Изменение иммунных показателей крови и концентрации оксида азота в плазме в зависимости от давности наступления смерти

© ДЕНИСЕНКО А.Г, 2011

ИЗМЕНЕНИЕ ИММУННЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КРОВИ И КОНЦЕНТРАЦИИ НИТРАТОВ/НИТРИТОВ В ПЛАЗМЕ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ДАВНОСТИ НАСТУПЛЕНИЯ СМЕРТИ

ДЕНИСЕНКО А.Г

УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет»,

кафедра судебной медицины

Резюме. С целью установления давности наступления смерти (ДНС) определяли в динамике изменение функциональной активности лейкоцитов (спонтанный и индуцированный НСТ-тест), фагоцитарное число (ФЧ), фагоцитарный индекс (ФИ), количество Т- и В-лимфоцитов методом розеткообразования с эритроцитарными CD3, CD4, CD8, CD25, CD22 - диагностикумами и концентрации продуктов деградации N0 в плазме.

Выявлены нарушения клеточного и гуморального иммунитета, что подтверждалось статистически значимым снижением стимулированного НСТ-теста и повышением спонтанного НСТ-теста, показателей фагоцитоза, изменением количества Т- и В-лимфоцитов, экспрессирующих молекулы-маркеры CD3, CD4, CD8, CD25, CD22.

В период времени 2-6 часов наблюдалось резкое увеличение концентрации продуктов деградации N0 в плазме. В дальнейшем отмечалось снижение его концентрации при ИБС в промежутке времени от 7 до 16 часов, а при смерти от механических травм - от 12 до 21 часа.

Обнаруженные изменения иммунных показателей и концентрации продуктов деградации N0 в плазме могут быть использованы в судебно-медицинской практике для установления ДНС.

Ключевые слова: давность наступления смерти, НСТ-тест, фагоцитоз, Т-, В-лимфоциты, оксид азота.

Abstract. To establish the remoteness of death changes of leukocytes functional activity (the spontaneous and induced NST-test), phagocytic number, phagocytic index, the amount of T- and B-lymphocytes were analyzed in dynamics by the method of rosetting with erythrocytic CD3, CD4, CD8, CD25, CD22 diagnosticum sets, and NO degradation products concentration in plasma was determined, as well.

Disturbances of cellular and humoral immunity were revealed which were confirmed by statistically significant reduction of the induced NST-test and elevation of the spontaneous NST-test, phagocytosis characteristics, changes in the amount of T- and B-lymphocytes expressing molecules-markers CD3, CD4, CD8, CD25, CD22.

Dramatic elevation of NO degradation products concentration in plasma was observed in 2-6 hours time interval. Further the decrease of NO degradation products concentration was recorded in 7-16 hours time interval in case of deaths due to CHD and in the time interval 12-21 hours in case of deaths due to mechanical traumas.

The detected changes of immune indices and NO degradation products concentration in plasma may be used to establish the remoteness of death in medicolegal practice.

Проблема диагностики давности наступления смерти (ДНС) разрабатывается на протяжении полутора столетий

Адрес для корреспонденции: 210027, г. Витебск, ул.Чкалова, д. 11, кор. 10, кв. 91. Тел.: +375 29 811-1892 - Денисенко А.Г.

многими учеными мира. Наиболее перспективным в разработке этих вопросов оказался подход, связанный с моделированием процесса изменения температуры тела [1-3]. Последующий методологический анализ и апробация полученных результатов на практике показали перспективность моделирования и некоторых других

посмертных процессов. Одним из основных направлений в разработке данной проблемы являются исследования посмертных явлений, протекающих в органах, тканях и жидкостях [4, 5].

Исследованиями [6-8] установлено, что нейтрофилы достаточно быстро разрушаются в крови в посмертном периоде и при хранении крови в пробирках, в то время как лимфоциты крови сохраняются значительно более длительный срок. Исследования Мишина М.Ю. [9, 10] показали, что изменения иммунного статуса наблюдаются при внезапной сердечной смерти, алкогольной кардиомиопатии, остром инфаркте миокарда. Был предложен алгоритм дифференциальной диагностики алкогольной карди-омиопатии и атеросклеротической болезни сердца, основанный на комплексе иммунологических показателей. Однако эта проблема требует дальнейшего изучения.

Установлено участие нитропроизводных (производных нитритов и нитратов) во многих патологических процессах [11, 12]. В литературе имеются единичные сообщения о роли оксида азота в определении давности повреждения по изменению показателей системы оксида азота. Так, исследованиями [13] установлено, что в миокарде в первые 3 часа после травмы количество индуцибельной NO-синтазы изменялось незначительно. Через 12 часов отмечалось резкое уменьшение активности этого фермента.

Таким образом, анализ литературы и собственные данные [14-16] свидетельствуют об актуальности изучения посмертных изменений показателей клеточного и гуморального иммунитета для дальнейшего совершенствования диагностики ДНС.

Цель - определить в крови показатели функциональной активности лейкоцитов (спонтанного и индуцированного НСТ-теста, ФЧ, ФИ), а также количества Т- и В-лимфоцитов, экспрессирующих молекулы-маркеры CD3, CD4, CD8, CD25, CD22 и продуктов деградации NO (нитратов и нитритов) в плазме в зависимости от ДНС.

Методы

В трупной крови определяли показатели спонтанного и индуцированного НСТ-те-

ста, ФЧ, ФИ, количество Т- и В-лимфоцитов, экспрессирующих молекулы-маркеры (CD3, CD4, CD8, CD25, CD22) и нитрозилирующе-го стресса (NO).

Для определения функциональной активности лейкоцитов (спонтанный и индуцированный НСТ-тест, ФЧ, ФИ) исследовали кровь в динамике через 2-6, 7-11, 12-16 и 1721 час от 13 умерших в результате ишемической болезни сердца (ИБС). Группу сравнения составили 15 практически здоровых лиц, являющихся донорами Витебской областной станции переливания крови.

Для определения спонтанного и индуцированного НСТ-теста кровь обрабатывали методом цитохимического анализа, разработанного Smithwick E. et all [17], в модификации Шубича М.Г. [18]. При микроскопии учитывалось количество формазан-положительных гра-нулоцитов (содержащих черные глыбки форма-зана). ФИ и ФЧ определяли по методу [19].

Для определения количества Т- и В-лим-фоцитов исследовали кровь, взятую из правого отдела сердца и крупных сосудов у трупов людей, умерших от множественных травм (11) и от ИБС (17). Из них мужчин - 20 , женщин - 8. Трупы находились в морге при температуре от 15 до 20°С (осенне-зимний период) и от 20 до 25° (весенне-летний период).

Забор крови от трупов людей осуществляли стерильными шприцами из правого отдела сердца и бедренной вены в объеме по 10 мл. Кровь брали в динамике, через 2-6, 7-11, 12-16 и 17-21 час после наступления смерти.

Изменение экспрессии CD22 В-лимфо-цитами, CD3, CD4, CD8, CD25 Т-лимфоцита-ми определяли методом розеткообразования с помощью соотвествующих эритроцитарных диагностикумов, любезно предоставленных профессором Д.К. Новиковым [20]. Подсчитывали процент розеткообразующих лимфоцитов при обычной световой микроскопии, явно имевших не менее 3-х прикрепившихся эритроцитов к диагностикумам с анти-CD моноклональными антителами [20].

Концентрацию продуктов деградации (нитраты/нитриты) монооксида азота определяли в плазме трупной крови по методике, основанной на восстановлении нитратов до нит-

ритов цинковой пылью в щелочной среде в присутствии аммиачного комплекса сульфата меди с последующей фотометрией [21]. Кровь от трупов людей брали через 2-6, 7-11 и 12-16 часов после наступления смерти. Исследовали плазму крови, взятой из правого отдела сердца и крупных сосудов у трупов людей, умерших от множественных травм (11) и от ИБС (17). С целью депротеинизации к 1 мл плазмы добавляли 1 мл 6% раствора цинка сульфата. Оставляли на 1 час при температуре ниже 15°С. Центрифугировали при 6000 об/ мин. После депротеинизации к 1 мл супернатанта добавляли эквивалентное количество гидроксида натрия. Затем опять проводили центрифугирование и 1 мл надосадочной жидкости переносили в соответствующую по нумерации пластиковую пробирку с предварительно добавленными туда 0,11 г цинковой пыли, 0,5 мл аммиачного буфера, 20 мкл аммиачного комплекса сульфата меди. Далее пробирки встряхивали в течение 30 минут. Цинковую пыль осаждали центрифугированием при 3000 об/мин - 10 минут. Из каждой пластиковой пробирки переносили по 1 мл супернатанта в соответствующую по нумерации стеклянную пробирку. В каждую пробирку добавляли по 1 мл сульфаниловой кислоты и оставляли в холодильнике на 10 минут до завершения реакции диазотирования. Затем в каждую пробирку вносили по 1 мл раствора ацетата натрия и 1 мл раствора 1-нафтилами-

на солянокислого. Измеряли оптическую плотность спустя 30 минут при длине волны 520 нм. Концентрацию нитритов/нитратов рассчитывали по уравнению калибровочного графика с учетом разведения при депротеи-низации.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Р^ег of Biostatistics, версия 4.05. Приведенные результаты представлены в виде медианы и интер-квартильной широты. При сравнении достоверности различий между группами был использован и-критерий Манна-Уитни [22]. Статистически достоверными считали различия при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Нами установлено, что через 7-11 часов после смерти (табл. 1) от ИБС медиана (ин-терквартильная широта; уровень значимости по сравнению с предыдущим показателем временного интервала) спонтанного НСТ-теста составила 7,1% [4,1;7,8] (р<0,01). Через 12-16 часов показатель спонтанного НСТ-теста в этой группе составил 4,2% [3,3;6,7] (р<0,001), а спустя 17-21 час 3,4% [3,1;3,7] (р<0,001).

При смерти от ИБС установлено статистически значимое снижение показателей индуцированного НСТ-теста через 7-11 часов 42% [37;48] (р<0,01) по сравнению с предыдущим показателем временного интервала),

Таблица 1

Показатели НСТ-теста в зависимости от ДНС у лиц, умерших от ИБС

Вид теста Процент формазан-положительных гранулоцитов, медиана

Доноры п=15 Время, прошедшее с момента наступления смерти

2-6 7-11 12-16 17-21

индуцированный НСТ-тест, ИБС, % (п=13) 54,2 (52,7-55,2) 47 (41-55) 42 (37-48)** 36 (29-50)** 31 (22-47)*

спонтанный НСТ-тест, ИБС, % (п=13) 8,9 (7,9-9,5) 8,2 (7,1-8,7) 7,1 (4,1-7,8)* * 4,2 (3,3-6,7)*** 3,4 (3,1-3,7)* * *

Примечание: * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001, отсутствие звездочки - р>0,05.

Таблица 2

Показатели функциональной активности фагоцитов трупной крови в зависимости от ДНС у лиц, умерших от ИБС

Вид показателя Показатели фагоцитоза, %, медиана

Доноры п=15 Время, прошедшее с момента наступления смерти

2-6 7-11 12-16 17-21

ФИ, % (п=13) 79,1 (74,4-79,7) 67 (64-74) 61 (58-68)*** 51 (45-56)*** 47 (41-50)***

ФЧ,% (п=13) 10,1 (9,4-10,5) 8,3 (6,5-8,5) 7,5 (5,8-8)** 6,6 (5,2-7,3)*** 5,9 (3,5-6,9)*

Примечание: * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001, отсутствие звездочки - р>0,05.

Таблица 3

Показатели клеточного и гуморального иммунитета у лиц, умерших от механических травм

Рецепторы Процент CD-положительных лимфоцитов, медиана

Доноры п=15 Время, прошедшее с момента наступления смерти

7-11 12-16 17-21

СБ3 медиана 58,1 (55-59,1 54 (52-55) 51 (47-53)*** 47 (44-50)***

СБ4 42 (40,3-53,5 38 (34-38) 35 (31-36)* 32 (28-35)**

СБ8 22,6 (21,5-24) 19 (18-19) 18 (17-18)*** 16 (15-17)**

СБ25 17 (15,9-18,1) 16 (15-17) 15 (13-16)** 14 (12-15)**

СБ22 19,4 (18,3-20,3) 15 (14-16) 14 (13-15)** 12 (11-16)**

Примечание: * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001, отсутствие звездочки - р>0,05.

через 12-16 часов 36% [29;50] (р<0,01) и спустя 17-21 час 31% [22;47] (р<0,05).

Показатели ФЧ и ФИ, полученные через 711 часов после смерти от ИБС, сравнивали с предыдущим показателем временного интервала.

При смерти от ИБС установлено статистически значимое снижение ФЧ (табл. 2) через 7-11 часов после смерти 7,5% [5,8;8] (р<0,01), через 12-16 часов 6,6% [5,2;7,3] (р<0,001) и через 17-21 час 5,9% [3,5;6,9] (р<0,05).

При смерти от ИБС установлено статистически значимое снижение ФИ через 7-11 часов 61% [58;68] (р<0,001), 12-16 часов 51% [45;56] (р<0,001) и спустя 17-21 час 47% [4150] (р<0,001).

Нижеприведенные показатели Т- и В-лимфоцитов, полученные через 12-16 часов после смерти от механических травм, асфиксий от повешения и ИБС, сравнивали с предыдущим показателем временного интервала.

Снижение показателей Т-лимфоцитов (табл. 3), экспрессирующих рецептор CD3, отмечалось в интервалах времени 12-16 часов 51% [47-53] (р<0,001) и 17-21 часов после смерти 47% [44-50] (р<0,001). Количество CD4 (Т-хелперов) также достоверно снижалось в интервалах времени 12-16 часов - 35% [31-36] (р<0,05) и 17-21 час - 32% [28-35] (р<0,01).

Статистически значимое снижение CD8 (маркера цитотоксических лимфоцитов) опре-

Таблица 4

Концентрация нитратов/нитритов в плазме крови в зависимости от ДНС у лиц, умерших от ИБС и механических травм

Причина смерти Концентрация нитратов/нитритов в плазме, мколь/л, медиана

Доноры п=15 Время, прошедшее с момента наступления смерти

2-6 7-11 12-16 17-21

ИБС, % (п=17) 22 (20,5-28,5) 61,5 (59-66) 35 (32-38)*** 9 (6-12)***

Механические травмы и асфиксии от повешения, % (п=11) 22 (20,48-28,5) 28 (22-30) 17 (14-19)*** 5 (4-8)**

Примечание: * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001, отсутствие звездочки - р>0,05.

Заключение

1. Таким образом, при оценке динамики показателей иммунной системы в раннем посмертном периоде у лиц, умерших от ИБС и механических травм, установлены статистически значимые изменения функциональной активности лейкоцитов, содержания Т- и В-лимфоцитов в крови и концентрации оксида азота в плазме.

2. Начиная с 7 часов после наступления смерти в крови снижались показатели спонтанного и индуцированного НСТ-теста, фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа, Т-клеточного звена иммунитета с подавлением активности CD3, CD4, CD8, CD25 и снижение экспрессии на В-лимфоцитах к CD22.

3. В период 2-6 часов после смерти от ИБС и механических травм наблюдали резкое повышение концентрации продуктов деградации монооксида азота в плазме крови. Начиная с 7 часов после наступления смерти этот показатель прогрессивно снижался и к концу суток доходил до нуля.

4. Полученные результаты позволяют выделить в раннем посмертном периоде три значимо различающихся временных промежутка (7-11, 12-16 и 17-21 час).

5. Обнаруженные изменения показателей иммунной системы и нитрозилирующего стресса могут быть использованы в судебномедицинской практике для оценки давности наступления смерти.

делялось в интервалах времени 12-16 часов 18% [17-18] (р<0,001) и 17-21 час 16% [15-17] (р<0,01).

Снижение экспрессии рецептора на Т-лимфоцитах к ИЛ-2 (CD25) отмечалось через 12-16 часов 15% [13-16] (р<0,01) и спустя 1721 часов после смерти 14% [12-15] (р<0,01).

Снижение экспрессии рецептора CD22 на В-лимфоцитах отмечалось в интервалах времени: 12-16 часов 14% [13-15] (р<0,01) и 17-21 часов 12% [11-16] (р<0,01).

При оценке динамики концентрации продуктов деградации N0, отражающей выраженность нитрозилирующего стресса (табл. 4), установлено, что через 7-11 часов после смерти от механических травм медиана (интерквартиль-ная широта) концентрация N0 составила 28 [22;30] мкмоль/л. Это оказалось статистически значимо выше по сравнению с контрольной группой доноров - 22 [20,5;28,5] мкмоль/л. Но через 12-16 часов после смерти концентрация N0 в плазме оказалась ниже и составила 17 мкмоль/л [14;19] (р<0,001), а через 17-21 час снизилась до 5 мкмоль/л [4;8] (р<0,01).

При оценке концентрации продуктов деградации N0 через 2-6 часов после смерти от ИБС концентрация составила 61,5 мкмоль/л [59;66], что оказалось намного выше, чем в контрольной группе доноров - 22 мкмоль/л [20,4828,5]. Через 9-11 часов этот показатель составил 35 мкмоль/л [32;38] (р<0,001), а через 12-16 часов - 9 мкмоль/л [6;12] (р<0,001).

Литература

1. Витер, В.И. Современное состояние математического моделирования посмертной термодинамики для определения давности смерти / В.И. Витер, А.Ю. Вавилов // Суд.-мед. экспертиза. - 2008. - Т. 51, №»1.

- С. 15-18.

2. Погодные условия и их влияние на процесс изменения температуры тела при диагностике давности наступления смерти / П.И. Новиков [и др.] // Суд.-мед. экспертиза, - 2004. - J№1. - С. 13-15.

3. Швед, Е.Ф. Методика автоматизированного поиска момента начала процесса постмортального охлаждения (времени смерти) с использованием стандартного табличного процессора Microsoft Office Exell / УФ. Швед, А.Ю. Вавилов // Проблемы экспертизы в медицине. -2005. - J№3. - С. 36-39.

4. Кадиев, Б.Б. Установление давности наступления смерти по динамике посмертных изменений в форменных элементах крови / Б.Б. Кадиев // Суд.-мед. экспертиза. - 1987. - №»1.- С. 14-17.

5. Мельников Ю.Л., Жаров В.В. Судебно-медицинское определение времени наступления смерти. - М. : Медицина, 1978. - 165с.

6. Warner, B. A. A field evaluation of the Coulter-STKS /

B. A. Warner, D. M. Reardon // Am. J. Clin. Pathol. 1991. - Vol. 95. - P 207-217.

7. Changes in automated complete blood cell count and differential leukocyte count results induced by storage of blood at room temperature / G.L. Gulatti [et al.] // Arch. Pathol. Lab. Med. - 2001. - Vol. 126, N 3. - P. 336-342.

8. Blood sample stability at room temperature for counting red and white blood cells and platelets / S.A. Vogelaar [et al.] // Vascul. Pharmacol. 2002. - Vol.39, N 3. - P. 123-125.

9. Мшин, М.Ю. Особливосп процеав перекисного окисления при раптовш кардiальнiй смерп / М.Ю. Мшин // Украш. Суд. -мед. вюн. - 2006. - №»2 (19). -

C. 23-25.

10. Мшин, М.Ю. Особливосп процеав перекисного окислення при раптовш кардiальнiй смерп / М.Ю. Мшин // Украш. Суд.-мед. вюн. - 2007.-№1 (20). - С. 40-42.

11. Ahygard, E. Nitric oxide: mediator, murderger, and medicine / E. Ahygard // The Lancet. - 1994. - Vol. 343.

- P 1199-1206.

12. Каштанов, С.И. Монооксид азота в механизмах устойчивости сердечно-сосудистых функций при эмоциональном стрессе / С.И. Каштанов, М.А. Звягинцева, И.Л. Кошарская // Вестн. Росс. АМН. - 2000. -№4. - С. 21-25.

13. Соляний, А.Н. Возможность судебно-медицинского определения давности повреждения по изменениям фермента NO-синтазы в миокарде / А.Н. Соляний // Украин. морфол. альманах. - 2008. - Т. 11, №4. - С. 143-144.

14. Денисенко, А.Г. Определение функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов для установления давности наступления смерти / А.Г. Денисенко // Вестн. ВГМУ - Витебск, Т. 9. - №9 2. 2010. -

С. 161-166.

15. Денисенко, А.Г. Некоторые показатели Т-клеточно-го иммунитета в различные промежутки после наступления смерти / А.Г. Денисенко // Вестн. ВГМУ

- Витебск. - 2011, Т. 10. - №> 2.. - С. 161-166.

16. Денисенко, А.Г. Определение В-лимфоцитов методом фенотипирования с анти-CD22 диагностику-мом в различные промежутки после наступления смерти / А.Г. Денисенко // Вестн. ВГМУ - Витебск.

- 2011 - Т. 10. - №> 1. - С. 132-137.

17. Smithwick E. Infection and nitroblue-tetrasolium reduction by neutrophils: A diagnostic acid / E. Smithwick, SM. Fikrig [et al.]// - Lancet. J bid. - 1968.

- Vol.2. - P 532-534.

18. Шубич, М.Г. НСТ-тест у детей в норме и при гнойно-бактериальных инфекциях / М.Г. Шубич // Лаб. дело. - 1978. - №> 9. - С. 515-518.

19. Новиков, Д.К. Клеточные методы иммунодиагностики / Д.К. Новиков, В.И. Новикова. - Минск: Беларусь, 1979. - 169 с.

20. Новиков, Д.К. Методы определения Т- и В-лимфо-цитов диагностикумами на основе моноклональных антител / Д.К. Новиков, П.Д. Новиков, В.В. Ян-ченко // Иммунопатология, аллергология, инфек-тология. - 2000. - .№ 2. - С. 31-33.

21. Фотометрический метод определения нитратов и нитритов в биологических жидкостях: инструкция по применению / А.П. Солодков [и др.]. - Утв. МЗ РБ №>91-0008 от 19.03.2001. - 8 с.

22. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О.Ю. Реброва. - М.: Медиа Сфера, 2006.- 312 с.

Поступила 23.05.2011 г. Принята в печать 03.06.2011 г.