Биоактивная композиция на основе сшитой соли гиалуроновой кислоты, содержащая ресвератрол, и способ ее получения
BIOACTIVE COMPOSITION BASED ON A CROSSLINKED HYALURONIC ACID SALT CONTAINING RESVERATROL AND A METHOD OF ITS PREPARATION

Изобретение относится к природным полимерам из класса полисахаридов, а именно к биоактивной композиции на основе химически модифицированной ресвератролом сшитой соли гиалуроновой кислоты и способу ее получения.Композицияможет найти применение в различных областях медицины, в косметике, например, в эстетической дерматологии и пластической хирургии, а также в качестве компонента пищевых добавок.
14
12
3
-3
Ресвератрол (фитоалексин) представляет собой нефлавоноидное полифенольное соединение, порошок почти белого цвета. Химическое название 5-[(1E)-2-(4-Гидроксифенил)этенил]-1,3-бензендиол (синоним 3,4',5-Тригидрокси-транс-стильбен), молекулярная формула CHO, молекулярная масса 228,24 г/моль,структурная формула представлена на фиг.1. Ресвератрол относится к обширной группе природных полифенолов, синтезируемых во многих типах растений как средство защиты от патогенов. Молекулы ресвератрола существуют в природе в двух конфигурациях (т.н., цис/транс- структуры). Его гидрофобность обусловлена полифенольной структурой, что делает ее практически нерастворимой в воде - растворимость в воде 0,003 г/100 мл (3*10% мас.) в соответствии с европейским определением Фармакопеи 3,1.10.
Известно, что ресвератрол демонстрирует плейотропные положительные эффекты, включая антиоксидантную, противовоспалительную, кардиозащитную, нейрозащитную и химиопрофилактическую и омолаживающую активность, увеличивая продолжительность жизни [Baur, J.A. Therapeutic potential of resveratrol: the in vivo evidence / J.A. Baur, D.A. Sinclair // Nat. Rev. Drug Discov. - 2006. - №5. - P. 493-506].
Известно множество данных об эффективности ресвератрола в отношении рака (от опухолей головного мозга до рака молочной железы, толстой кишки, простаты и многих других) [Rauf, A.; Imran, M.; Butt, M.S.; Nadeem, M.; Peters, D.G.; Mubarak, M.S. Resveratrol as an anti-cancer agent: A review. Crit Rev. Food Sci. Nutr. 2018, 58, 1428–1447], кардиоваскулярных заболеваний - атеросклероза, гипертонической болезни, тромбообразования; диабета 2-го типа и ожирения; связанных с диабетом возрастзависимых офтальмологических заболеваний (катаракта и ретинопатия, глаукома); остеопороза; деменции и болезни Альц-геймера [Vingtdeux, V. Therapeutic potential of resveratrol in Alzheimer's disease / Valerie Vingtdeux, Ute Dreses-Werringloer, Haitian Zhao, Peter Davies and Philippe Marambaud // BMC Neuroscience 2008, 9(Suppl 2):S6 (from 8th International Conference on Alzheimer's Disease Drug Discovery New York, NY, USA. 15-16 October 2007)].
Известно также, что ресвератрол может оказывать антидиабетическое действие, активируя ген SIRT1 непосредственно в головном мозге, он значительно снижал уровень глюкозы в крови у пациентов с диабетом 1-го типа через инсулинзависимые и независимые от инсулина пути [Kaneko, Н. Resveratrol prevents the development of abdominal aortic aneurysm through attenuation of inflammation, oxidative stress, and neovascularization / H. Kaneko, T. Anzai, M. Morisawa, T. Kohno, T. Nagai et al. // 2011 Aug; 217(2):350-7]. В моделях сердечно-сосудистых заболеваний животных было показано, что ресвератрол защищает сердце от ишемии - реперфузионного повреждения тканей, снижает артериальное давление и сердечную гипертрофию у гипертоников и замедляет прогрессирование атеросклероза [Li, Н. Cardiovascular effects and molecular targets of resveratrol / H. Li, N. Xia, U. Forstermann // Nitric Oxide. 2012. Feb. 15; 26(2): 102-10; A.M. Моисеева, Н.В. Железняк, А.Г. Генералова, Д.В. Моисеев / Фитоалексин ресвератрол: методы определения, механизмы действия, перспективы клинического применения // Вестник фармации №1 (55) 2012].
К 2020-му году были закончены или продолжались более 140 клинических испытаний и было опубликовано более 10 000 научных статей [A Shaito , A. M. Posadino et al. Potential Adverse Effects of Resveratrol: A Literature Review. International Journal of Molecular Sciences, ,21,2084, 2020].
Вместе с тем существует опасение, что биодоступность ресвератрола может ограничить часть его клинической пользы.Актуальной задачей является создание новых форм биоактивных композиций, в состав которых входит ресвератрол, совместимых с биологическими тканями организма и обеспечивающих поступление в них необходимого количества ресвератрола, не оказывающих вредного влияния и сохраняющих его эффективность в конкретных целевых применениях. Трудность в решении этой задачи – очень низкая, практически нулевая растворимость ресвератрола в воде, что сводит на нет использование его водных растворов при изготовлении кремов, мазей, гелей, лубрикантов и т.п., а также в производстве ряда лекарственных препаратов.
Таким образом, перевод ресвератрола в совместимую с организмом человека форму, сохраняющую вышеописанную эффективность и повышенную биодоступность к тканям организма, является приоритетом разрабатываемых препаратов на его основе. Целью ряда исследований и технических решений по повышению биодоступности были повышение скорости растворения и перорального гипогликемического и гиполипидемического эффекта ресвератрола.
В последние годы эксперименты с целью улучшить физиологические свойства ресвератрола активизировались по двум направлениям: а) создание нано-носителей для его таргетной доставки и б) его химической модификации для снижения биодеградации при одновременном повышении водорастворимости, повышающей биодоступность ресвератрола для сред организма[Д.А. Гусева и др. Влияние встраивания ресвератрола и дигидрокверцетина в фосфолипидные частицы на их биодоступность и специфическую активность. - Биомедицинская химия, 2015 том 61, вып. 5, с. 598-605. - Intagliata, S.; Modica, M.N.; Santagati, L.M.; Montenegro, L. Strategies to Improve Resveratrol Systemic and Topical Bioavailability: An Update. Antioxid (Basel) 2019, 8, 244.; - Pantusa, M.; Bartucci, R.; Rizzuti, B. Stability of trans-resveratrol associated with transport proteins. J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 4384–4391; - Penalva et al., Increased Oral Bioavailability of Resveratrol by Its Encapsulation in Casein Nanoparticles. International Journal of Molecular Sciences 19(9):2816 September 2018; - De Vries, K.; Strydom, M.; Steenkamp, V. Bioavailability of resveratrol: Possibilities for enhancement. J. Herb. Med. 2018, 11, 71–77; - Santos, A.C.; Pereira, Iю et al. Targeting Cancer Via Resveratrol-Loaded Nanoparticles Administration: Focusing on In Vivo Evidence. Aaps J. 2019, 21, 57; - Sonali Nashine et al. Role of Resveratrol in Transmitochondrial AMD RPE Cells/ Nutrients, 12, 159, 6 January 2020].
Эти направления отражены в ряде патентов, защищающих технические решения по повышению биодоступности ресвератрола в водных средах организма.
Известен ряд смесовых композиций, включающие биоактивное соединение, например, ресвератрол или витамины и вещества, способствующие биодоступности активных компонентов для косметического ухода за кожей. В составе таких композиций биоактивное соединение совмещают с функциональными добавками и носителем частиц ресвератрола, что частично решает проблемы совместимости с организмом человека.
Известнабиоактивная композиция, представляющая собой суспензионную смесовую систему с антиоксидантной активностью для лечения заболеваний головного мозга, преимущественно капсулированная, содержащая в эффективных количествах (а) эдаравон и (б) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из эбселена, ресвератрола, мочевой кислоты, дегидроаскорбиновой кислоты и дисуфентона, и действующие вещества находятся в суточных дозировках: эдаравон 30 - 700 мг/сут; эбселен 200 - 3 600 мг/сут; ресвератрол 2 - 5 000 мг/сут; мочевая кислота 250 - 2000 мг/сут; дегидроаскорбиновая кислота 7 000 - 35 000 мг/сут; дисуфентон натрия 500 - 6 000 мг/сут. Добавки мочевой и диаскорбиновой кислот способствуют биодоступности антиоксидантов, в т.ч. ресвератрола [патент RU 2693627, кл. A61K31/4152, A61K31/40, A61K31/047, опублик. 03.07.2019].
Известна биоактивная композиция, представляющая собой суспензию на базе водного раствора казеината натрия и основной аминокислоты, в котором инкапсулированы биологически активные соединения на базе полифенолов, ресвератрол, в частности, в виде непосредственно в растворе полученных наночастиц, путем добавления к смеси водного раствора соли двух- или трехвалентного металла при массовом соотношении металл:казеин от 1:5 до 1:15, предпочтительно от 1:7 до 1:10, более предпочтительно приблизительно 1:8,5, способствующей агломерации и высаждению наночастиц полифенолов равномерно в объеме. Казеинат способствует стабилизации частиц в растворе, что позволяет получить наночастицы с повышенной стабильностью и низким значением полидисперсности. Суспензию дополнительно подвергают стабилизирующей обработке, предусматривающей воздействие на суспензию, содержащую сформированные наночастицы, гидравлическим высоким давлением, например, давлением, лежащим в интервале от 100 до 800 МПа, как правило, от 350 до 600 МПа. В конкретном варианте осуществления указанная обработка предусматривает воздействие на суспензию наночастиц циклами от 3 до 5 минут давления от 100 МПа до 800 МПа, как правило, от 350 до 600 МПа; в действительности давление 400 МПа обеспечивает положительные результаты. Наночастицы ресвератрола, полученные вышеуказанным способом, используют в сочетании с носителем для приготовления продуктов питания, в также в фармацевтической и косметической отраслях, в системах, подходящих для местного введения, например, в форме геля, мази, крема и т.п. [патент RU 2552957, кл. A23L 1/30, A23L 1/302, A23L 1/305, A61K 9/51, A61K 8/11, опублик. 10.06.2015].
Известна также биоактивная фармацевтическая композиция на основе фитонутриентов, в том числе ресвератрола, с повышенной биодоступностью, обладающая противоопухолевой активностью, включающая, по меньшей мере, один фитонутриент из ряда: эпигаллокатехин-3-галлат, дииндолилметан, гинестеин, ресвератрол, куркумин, и солюбилизатор – привитый сополимер поливинилкапролактам/поливинилацетат/полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой 90000- 140000 г/моль при массовом соотношении, по меньшей мере, одного фитонутриента и солюбилизатора от 1:5 до 1:1. Способ получения композиции композиции заключается в том, что растворяют солюбилизатор в органическом растворителе, растворяют, по меньшей мере, один фитонутриент в таком же органическом растворителе, смешивают полученные растворы и отгоняют растворитель в вакууме, после смешивания растворов нагревают полученную смесь до 45-50°C при постоянном перемешивании, а после отгонки сушат продукт в вакууме [патент RU 2494733, кл. A61K 31/047, A61K 31/121, A61K 31/353, A61K 31/404, A61K 47/30, A61P 35/00, опублик.10.10.2013].
Известны также смесовые эмульсионные, водоэмульсионные и гелевые композиции с ревератролом, используемые в фармацевтике, пищевых добавках и косметологии, характерной чертой которых является система где ресвератрол, или его химическим путем полученное производное, вводится в твердой форме экстракта и смешивается с жидким или гелеобразным носителем до однородной субстанции.
2
4
Известна биоактивная композиция для восстановления кожи, в форме водной эмульсии, содержащей неионное органическое поверхностно-активное вещество - алкоксилированный спирт, химический солнцезащитный материал, активатор гена clock или per1, пептидный активатор sirt1, фермент репарации ДНК, масляный компонент, структурирующий агент водной фазы, содержащий полисахарид, акриловый полимер или их смеси; увлажнитель - C-С алкиленгликоль или глицерин, а также производное ресвератрола, выбранное из группы: ресвератрола трифосфат, ресвератола бутираты, производное ресвератрола, содержащее одну или более сахаридсодержащих групп, таких как глюкоза, галактоза, манноза, фруктоза, азотсодержащие производные ресвератрола, и которое инкапсулировано в липосомы, как отдельно, так и в комбинации с ферментом репарации ДНК для более эффективной их доставки в дерму кожи. Производные ресвератрола могут присутствовать в данной косметической композиции в диапазоне от примерно 0,001% до примерно 95%, предпочтительно, от примерно 0,005% до примерно 90%, более предпочтительно, от примерно 0,1% до примерно 20% общей массы всей композиции.
Способ получения этой композиции учитывает тот факт, что применение ресвератрола в виде химически модифицированных производных обусловлено потенциально неустойчивым состоянием в определенных косметических готовых формах, в частности, восприимчивости ресвератрола к гидролизу в составах на водно-спиртовой основе. Способ справиться с неустойчивостью ресвератрола в составах на водной основе состоит в модификации ресвератрола замещением гидроксигрупп в положении 3, 5 и 4' другими функциональными группами для образования устойчивых в косметических смесях производных ресвератрола. Производные ресвератрола с функциональными группами из неорганических кислот, органических карбоновых кислот, моно-, ди- или полисахаридов, как показано в патенте, более устойчивы в составах на водно-спиртовой основе. Замещающие группы функционируют для защиты и стабилизации фенольных групп ресвератрола и делают производное ресвератрола более подходящими для применения в косметических составах на водной основе. Замещающие группы могут также легко гидролизованы из соединения после нанесение на кожу, предпочтительно, ферментами и другими ингредиентами на поверхности кожи, для высвобождения активной формы ресвератрола в кожу [патент RU 2494756, кл. A61K38/04, A61K45/06, A61P17/00, опублик. 10.10.2013].
Известна также подобная биоактивная эмульсионная композиция на водно-спиртовой основе для доставки лекарственных веществ в кожу и волосяной покров головы содержащая хитозан или гидроксипропилхитозан или его физиологически приемлемую соль, фармацевтически активный ингредиент, выбранный из ингибиторов 5-альфа-редуктазы, антиандрогенных гормонов агонистов кальциевых каналов, аминокислот, растительных экстрактов, антиоксидант - ресвератрол, и этанол или изопропанол в качестве растворителя антиоксиданта. [патент PCT/EP2009/059807, кл.A61K 31/722, A61K 47/36, A61K 31/506, A61K 31/56, A61K 31/585, опублик. 2011.08.30].
-3
Общим недостатком известных биоактивных композиций, содержащих ресвератрол, и представляющих собой механические смеси ресвератрола или его производных с функциональными компонентами, в основном нерастворимых в воде  (масляных или углеводородных компонентов, наполнителей, связующих, оболочек и т.п. технологических добавок), является низкая биодоступность ресвератрола в тканях организма, или биологических жидкостях организма, где без спиртовой добавки проникновение ресвератрола невозможно.  С учетом низкой водорастворимости ресвератрола  (максимально 2,3-3,0*10% масс.) из подобных смесей тканями усваивается очень малая доля действующего субстрата ресвератрола, даже применение химически модифицированных производных с последующим гидролизом до начальной формы ресвератрола не решает проблему его биодоступности, что снижает эффективность его терапевтического действия независимо от метода введения – на кожу, перрорально, инвазивно.
Близкими к данному изобретению являются композиции, включающие ресвератрол и другие полифенолы и флаваноиды, растительные экстракты и полисахариды, в том числе гиалуроновую кислоту (ГК), рассмотренные ниже. Эти композиции предназначены для регенерации и защиты кожи от вредного воздействия свободных радикалов и используются для приготовления различных гелей и косметических кремов, пищевых добавок и фармацевтических композиций.
Выбор высокомолекулярных полисахаридов в качестве носителей ресвератрола обусловлен их высокой биосовместимостью с тканями организма. Так, ГК присутствует в большинстве тканей живых организмов. Химическое сшивание и/или другие модификации молекул ГК позволяют получать различные биоактивные композиции перспективные для медицинского применения. ГК часто используют в качестве носителя лекарственных или иных средств в организме человека.
Известные биоактивные композиции на основе высокомолекулярных полисахаридов, содержащие ряд биологически активных веществ, например, витаминов, полифенолов и целый ряд технологических добавок, как правило, хорошо растворимых в воде. Эти добавки повышают совместимость с тканями организма, но в целом не решают кардинально проблему повышения биодоступности ресвератрола.
Известна биоактивная композиция в виде косметической маски-пленки для ухода за кожей лица, включающей гелеобразующий агент ионогенный полисахарид альгинат натрия 0,5-1,0%, пленкообразователи: анионный полисахаридкарбоксиметилцеллюлозу 0,5-1,0%, поливиниловый спирт 4,0-7,6%, полиэтиленгликоль ПЭГ-4000 0,5-1,0 %, порошкообразный наполнитель со следующими витаминами в липосомах: ресвератрол и витамин Е, при составе липосом и их содержимого: порошкообразный наполнитель - натрий хлор и буферный состав для поддержания рН 4,7-7,0; в качестве оболочки липосом - липоид С 100 и холестерол, а в качестве содержимого липосом в оболочке и ядре - витамин Е и ресвератрол, при следующем содержании указанных компонентов в составе маски, мас.%: натрий хлор - 0,61%; буферный состав - 0,28-0,95%; липоид С 100 - 0,91%; холестерол - 0,1%; витамин Е и ресвератрол - 0,12-0,96%, а также  функциональные добавки13,0-18,4 % и воду – остальное до 100%. Композиция обеспечивает расширение спектра косметического воздействия маски на кожу за счет содержания в маске витаминов и ресвератрола в липосомах и повышение удобства пользования косметической маской за счет быстрого образования упруго-эластичной пленки после нанесения на кожу геля на основе полисахаридов. Однако, по мнению авторов, кардинально изменить растворимость ресвератрола в водных средах не удается, да и общее содержание ресвератрола в композиции не превышает 1%. [Патент RU 2715231, кл. A61K 8/14, A61K 9/127, A61P 17/18, опублик. 26. 02. 2020]
Известны также технические решения, включающие композиции ресвератрола, или его химических модификаций с ГК, применяемые в косметических целях или в качестве лекарственных средств.
о
Известна биоактивная композиция для защиты и лечения патологий кожи, включающая наночастицы биологически активных веществ из класса флаваноидов, в частности, гидратированного ресвератрола, размером 50-1000 нм, и гиалуроновую кислоту в качестве носителя этих частиц. Ресвератрол гидратируют в водно-спиртовой среде щелочной обработкой до растворимого состояния, после чего подкисляют раствор кислотным, предпочтительно органическим агентом до рН < 7, оптимально рН 4-7, высаживая наночастицы ресвератрола, фильтруя затем частицы через фильтр с размером пор. Далее смешивают эту суспензию в присутствии полисорбата с водным раствором ГК при повышенной температуре 50-70С, получают гелевую композицию, содержащую взвешенные наночастицы ресвератрола. Частицы гидратированного ресвератрола имеют большую совместимость с эпидермисом, чем у исходного. [выложенная заявка на патент США US 2012/0213842 А1, кл. A6IK 3I/352 A6IK 3I/05 A6IK 9/14 A6IK 47/36, опублик. 23.08.2012].
Известны биоактивные композиции, содержащие ресвератрол и ГК, относящиеся к области стерильных инъекцируемых композиций наполнителя мягких тканей, в частности для аугментации и/или восстановления мягкой ткани, включая периодонт, и в особенности для лечения дефектов и несовершенств кератиновых материалов, таких как кожа.
2
4
2
4
Известна биоактивная композиция, в виде водной системы для инъекций, содержащей от 50 до 99 масс. %, более предпочтительно от 70 до 95 масс. % ГК, находящейся в форме перекрестно-сшитого геля, для чего в качестве сшивающего агента для ГК используют гексаметилендиамин в количестве 0,05-15% масс., и от 1 до 50 масс. %, предпочтительно от 5 до 30 масс. % ГК, находящейся в свободной форме, или ее физиологически приемлемой соли, при соотношении между массой геля перекрестно-сшитой ГК и массой свободной ГК от 1:1 до 1:0,02; а также анестезирующее средство мепивакаин от 0,05 до 3,0% масс, антиоксидант ресвератрол до 0,1-0,2% масс. и солевой раствор фосфатный буфер KHPO/KHPO. [Патент RU 2670617, кл. A61K31/728, А61P17/00, A61K 31/451, A61K 31/167, опублик. 24.10.2018].
Известна биоактивная дермальная стерильная композиция для инъекций на основе водного геля сшитой ГК с использованием сшивающего агента - эндогенного полиамина из группы спермидина, спермина, их смеси, и активный агент – антиоксидант ресвератрол, а также обезболивающее средство, выбранное из группы амбукаин, амоланон, амилокаин, артикаин, беноксинат, бензокаин. [патент RU 2653729 C2, кл. C08B 37/08, опублик. 14.05.2018].
В известных композициях ресвератрол находится в форме дисперсии микро- или наночастиц. Биодоступность и растворимость в воде ресвератрола при этом не меняется.
Для решения задачи повышения биодоступности в известной фармацевтической биокомпозиции с противоопухолевой функцией, ресвератрол смешивают в органическом растворителе этаноле, изопропаноле, ацетоне с солюбилизатором (ПАВ) - привитым сополимером,  поливинилкапролактам /поливинилацетат /полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой 90000-140000 г /моль при массовом соотношении, по меньшей мере, ресвератрола и солюбилизатора от 1:5 до 1:1, с последующим высушиванием. Сополимер способен образовывать "твердые растворы" с малорастворимыми активными ингредиентами лекарственных средств, повышая тем самым их усвояемость организмом человека. К сухому осадку, содержащему росвератрол добавляют порошок носителя – полисахарида типа альгината натрия, или карбоксиметилцеллюлозы. При этом образуется твердый водорастворимый продукт, который при смешении с водной средой формирует коллоидные мицеллы, лучше усвояемые организмом. Увеличение биодоступности ресвератрола при сухом смешении происходит в 3,2 раза, но при этом увеличения растворимости ресвератрола в воде не происходит [патент РСТ/RU2013/000568, WO 2014/062083 А 1, кл. А 61К 31/047, А 61К 31/404, А 61К 31/121, А 61 47/30, А 61К 31/353, А 61Р 35/00].
].
Наиболее близким к заявленному изобретению является биокомпозиция ГК с ресвератролом, предназначенная для стимулирования синтеза ГК, т.е. повышенной выработки гиалуроновой кислоты. Было найдено, что исходная, т.е. полученная согласно изобретению композиция ресвератрола с ГК при контакте с тканями организма провоцирует повышенную выработку ГК естественным образом присутствующей в клетках человеческого организма. В состав композиции входит транс-ресвератрол или цис-ресвератрол в мономерной или олигомерной форме, модифицированный до сложного эфира, преимущественно в виде метилированного или ацетилированного ресвератрола, или содержащего по крайней мере одну группу сложного эфира формулы -O-CO-A, или в  виде олигомера, сформированного отдельными модифицированными молекулами, содержащими и связанными -O-CO-R-CO-O-группы, а также ГК, имеющая средний молекулярный вес между 50 -100 кДа. В случае использования немодифицированного ресвератрола и ГК их смесь используют в виде липосом, микрочастиц или мицелл. В случае использования модифицированного ресвератрола он входит в химическое соединение с ГК в виде ковалентно связанного либо через связь –С-С-, либо через эфирные группы, преимущественно через ядро В (фиг.1) с гидроксильными группами ГК. В зависимости от метода применения композиции, соотношение ресвератрол : ГК  может составлять:  для косметического применения 0,01-1% : 0-0,4% вес. (липосомный вариант), для парентерального маршрута 1 - 100 мг/мл ресвератрола и 0 - 100 мг/мл ГК (в виде водной композиции). Композиция может использоваться для местного применения в форме геля, сливок, лосьона, эмульсии, гидрогеля, маски, молоко, масла, бальзама, пены, сыворотки, мази, аэрозоля, для перрорального применения в форме в форме таблеток, капсул, порошков, гранул, лиофилизатов, растворов. [патент WO 2016/193791 Al, кл. A61K 8/34, A61Q 19/08, A61K 8/73, A61K 8/02, A61Q 19/00, опублик. 08.12.2016
Недостатком этой известной композиции с ресвератролом является его применение либо в твердом состоянии, либо после необходимой модификации, значительно усложняющей технологию получения композиции, и приводящей к снижению или потере  ресвератролом ряда своих необходимых качеств, в частности, снижению антиоксдантной, противовоспалительной и антидиабетической способности. Этим объясняется иная целевая направленность биокомпозиции – инициирование синтеза ГК в клетках.
Низкая биодоступность ресвератрола является общим недостатком всех известных биокомпозиций.
Не известны биоактивные водорастворимые композиции, состоящие из ГК с химически связанным немодифицированным ресвератролом, сохраняющим свою антиоксидантную, противовоспалительную, кардиозащитную, нейрозащитную и химиопрофилактическую активность, предназначенные для косметических или медицинских целей.
Предложенное техническое решение позволяет одновременно сохранить полезные свойства и повысить водорастворимость и биодоступность ресвератрола в составе биоактивных композиций с высокомолекулярной ГК, получаемых оригинальным механохимическом способом при совместном воздействии высоких давлений и сдвиговых деформаций на сухую смесь ГК и ресвератрола.
Техническим результатом изобретения является получение композиции, в которой макромолекулярные цепи ГК перекрестно сшиты ресвератролом, который выступает в роли бифункционального сшивающего агента. При этом сам ресвератрол в результате этой модификации ГК при последующем растворении входит в состав гидрогеля, сохранив основную структуру. Техническим результатом данного изобретения является также экологически безопасный принципиально новый способ получения композиции, позволяющий получать неизвестные ранее сшитые соли ГК, химически модифицированные ресвератролом, в одностадийном технологическом режиме в отсутствие жидкой среды, без больших энерго- трудо- и водозатрат, при этом получать целевые продукты с высоким выходом.
о
В изобретении для получения биоактивной композиции применены основные операции твердофазного способа механохимического синтеза, используемый ранее авторами данного изобретения для получения водорастворимых сшитых солей ГК, модифицированных витаминами [см. патент RU 2382052 C1 кл. А61К 31/728, А61К 8/60, С08В37/08, опублик.20.02.2010. – Хабаров В.Н. и др.- Способ получения модифицированной токоферолом сшитой соли гиалуроновой кислоты и биоактивная композиция на ее основе; патент RU 2386641 кл. С08В37/08, С08L5/00, A61K31/728, A23L1/03, опублик. 20.04.2010. - Хабаров В.Н. и др.- Способ получения модифицированной ретинолом сшитой соли гиалуроновой кислоты]. В известном способе реагенты в сухом виде в присутствии по крайней мере одного сшивающего агента- диглицидилового эфира этиленгликоля, подвергают одновременному воздействию давления в пределах от 5 до 1000 МПа и деформации сдвига в механохимическом реакторе при температуре 20-50С.
о
о
Экспериментально было установлено, что ресвератрол при определенных условиях обработки его предварительно полученной в мельнице при 15-40⁰С в течение 10-15 минут сухой смеси с ГК с молекулярной массой от 80 до 1800 кДа (далее в экспериментах использовалась ГК со средней молекулярной массой 1800 кДа) в механохимическом реакторе - двухшнековом экструдере – давлении 500-600 МПа, угле деформации суммарного сдвига 180 в течение 2-4 минут в токе азота при температуре в диапазоне 5-100С в разных секциях (зонах) реактора (трех последовательных реакционных зонах обработки смеси реагентов при температуре в первой зоне 5-10⁰С, во второй 90-100⁰С, в третьей 5-15⁰С) и в среде инертного газа - азота сшивает ГК до нужного уровня, зависящего от их соотношения, образуя одновременно химическую связь с ГК. Это позволило исключить из реакционной смеси сшивающие агенты. Соотношение зон по длине цилиндра реактора с обрабатывающими шнеками: первая зона -15-25% от общей длины, вторая зона – 35-45% и третья зона – 35-45%.
-3
-2
Предложенная композиция после механохимической обработки представляет собой сухой почти белый порошок, содержащий 0,5-1,5% масс. ресвератрола химически связанного с ГК, дающий при растворении в воде прозрачный слегка опалесцирующий устойчивый гидрогель без видимых механических включений. Таким образом, растворимость ресвератрола в воде в 2% масс. растворе композиции ГК+ресвератрол может достигать уровня 5*10-3*10 масс.%, что примерно в 2-10 раз выше его предела растворимости. Композиция может быть использована в качестве водного геля, биодоступного наполнителя в косметических мазях и кремах, где диспергируется без осадка, а также в сухом виде в пищевых добавках и т.п. продуктах, потребляемых перрорально.
-1
-1
-1
-1
374
Доказательством образования химической связи ресвератрола с ГК, образующейся в ходе механохимической реакции является образование гликозидной связи, идентифицированной методом ИК-спектроскопии растворов полученного соединения ресвератрола с ГК. В ходе анализа спектральных данных следует особо обращать внимание на структурные фрагменты ресвератрола, взаимодействующие с группами молекул ГК, а именно, 4’-OH кольца В, 3-OH или 5-OH и кольца А (см. фиг.1). Снятые на ИК-спектрометре (Tensor 27, Bruker) спектры выявили все характерные максимумы поглощения для полифенольной структуры флаваноида: для ресвератрола двойная связь ν(С=С) обычно в диапазоне 1613-1556 см, для ν(С-О-С) 1310-1246 см и для гидроксильных групп ν(OH) 3600-3000 см . Появление полосы поглощения 950-1050 сми 1115-1061 (С-О связи гликозида), характерной для образования гликозидного типа связи из углевода и агликона, может быть отнесено к соединению полифенола ресвератрола с глюкозой или полисахаридом, что ранее было показано исследователями соединений ресвератрола с сахарами. Присоединение гликозидной группы и, возможно, сшивка ГК, по мнению исследователей происходит в положениях 4’кольца В и 5 кольца А (фиг.2).   [G. Regev-Shoshani et.al. Glycosylation of resveratrol protects it from enzymic oxidation. Biochem. J. (2003) , 157–163; - Le Bourvellec C. and Renard C. Interactions between polyphenols and macromolecules: quantification methods and mechanisms. Crit. Rev. Food Sci. 52, 213–248 (2012); - А.М. Моисеева, Н.В. Железняк, А.Г. Генералова, Д.В. Моисеев Фитоалексин ресвератрол: методы определения, механизмы действия, перспективы. Вестник фармации №1 (55), с.63-73, 2012].
G’
G”
-1
Доказательством сшивки ГК является оценка вязкоупругости систем ГК+ресвератрол: гели по определению характеризуются независимостью модуля упругости от частоты деформации и существенным повышением модуля упругости и модуля потерь вязкости при сшитой структуре. Для водных 2% растворов композиции ресвератрола с ГК с содержанием ресвератрола 0,5-1,5% масс., полученной в ходе механохимического процесса, при исследовании вязкостных характеристик наблюдали с ростом частоты деформации как рост модуля упругости  (черные символы), так и рост модуля потерь  (полые символы) на 2-3 порядка (фиг.3) С повышением частоты модуль упругости начинает превышать модуль потерь, что говорит о переходе к высокоэластичному состоянию образцов, характерного для полимерных растворов, что свидетельствует об образовании высокомолекулярной сшитой структуры ГК. Исследование реологии образцов проводили на ротационном реометре DHR-2 (TA Instruments, США) при 25°С с использованием измерительного узла конус-плоскость (диаметр конуса 25 мм, угол между образующей конуса и плоскости 2°). Испытания проводили в режиме: изменение частотных зависимостей линейных модулей упругости и потерь при постоянной амплитуде относительной деформации 10% и ступенчатом изменении угловой частоты от 0.05 до 250 с. Погрешность измерения реологических характеристик не превышала 5%. Результаты экспериментов представлены на фиг. 3. Кривые 1-4 – частотные зависимости линейных модулей упругости и потерь 4-х отдельно приготовленных 2% водных растворов с разной концентрацией ресвератрола в композиции ГК+ресвератрол.
Фигура 1. Структурная формула ресвератрола с выделенными положениями реакционно-способных групп.
Фигура 2. Структурные формулы ресвератрола с выделенными положениями присоединений гликозидных групп полисахаридов: 4- в положении 4’ кольца В, 5- в положении 5 кольца А.
G’
G”
Фигура 3.  Зависимость параметров модуля упругости  (черные символы) и модуля потерь  (полые символы) 2% водных растворов композиции ГК+ресвератрол с разным содержанием ресвератрола от частоты деформации.
1- 2% масс. водный раствор композиции ГК+ресвератрол (99,5:0,5 % масс.)
2- 2% масс. водный раствор композиции ГК+ресвератрол (99,0:1,0 % масс.)
3- 2% водный раствор композиции ГК+ресвератрол (98,75:1,25 % масс.)
4- 2% водный раствор композиции ГК+ресвератрол (98,5:1,5 % масс.)
G’
Модуль упругости  (черные символы)
G”
Модуль потерь  (полые символы)
Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами:
Пример 1
-3
-4
о
о
о
о
о
-1
о
о
о
5,0 г (12,5*10 моля) порошкообразной натриевой соли ГК со средней молекулярной массой 1800 кДа и 0,025 г (1,1*10моля или 0,5 % масс. от массы ГК) порошка ресвератрола белого цвета гомогенизируют в мельнице при 15С в течение 10-15 мин. Затем полученную однородную порошкообразную смесь подают в зону питания двухшнекового экструдера, где смесь захватывают транспортирующие элементы и перемещают ее по длине цилиндра при вращении. Во второй и третьей зонах механохимической обработки материал подвергается деформации сдвига, благодаря смесительным элементам, состоящим из кулачков, набранных по пять штук с углом поворота между кулачками 45,90,45 (обратный) в сумме 180. Соотношение зон по длине цилиндра с обрабатывающими шнеками: первая зона-20% от общей длины, вторая зона - 40% и третья зона -40%. Размещение элементов под разными углами способствует образованию запоров в движении смеси и вследствие этого его лучшему перемешиванию и большим физическим воздействиям. Процесс проводят при автоматической загрузке смеси в токе инертного газа азота, скорость подачи реакционной смеси поддерживалась при скорости вращения шнеков в пределах 20-200 об*мин; нагрузка, определяемая по величине тока привода шнеков экструдера в пределах 10-15 А, соответствует давлению 500 МПа. Температура в первой зоне 10С, во второй 90С, в третьей зоне 5С. Продолжительность процесса 2 минуты. Выход продукта составляет 4,9г (98%).
-3
-1
-1
-1
-1
G’
G”
G’
G”
При растворении продукта в воде (2% масс. раствор) образуется прозрачный гель. Доля связанного с ГК ресвератрола в водном растворе составляет 5*10% масс., что в 2 раза выше предела растворимости ресвератрола в воде. Замеры модуля упругости и потерь раствора на ротационном реометре DHR-2 (TA Instruments, США) при 25°С по описанной выше методике дали результаты: при начальной частоте деформации ω =0,05с модуль упругости  = 0,1Па, модуль потерь  = 0,9 Па, при росте частоты деформации до значения ω = 200с модуль упругости  = 10 Па, модуль потерь  = 9 Па (фиг.3, позиция 1). В ИК-спектре раствора продукта реакции отчетливо выявляется полоса с максимумами 950-1050 сми 1115-1061 см (С-О связи гликозида ресвератрола), что свидетельствует о наличии химической связи ресвератрола и ГК.
Пример 2
-3
-4
о
-1
о
о
о
5,0 г (12,5*10 моля) порошкообразной натриевой соли ГК, аналогичной примеру 1, и 0,050 г (2,2*10моля или 1,0% масс. от массы ГК) порошка ресвератрола белого цвета гомогенизируют в мельнице при 25С в течение 10-15 мин. Затем однородную порошкообразную смесь подают в зону питания двухшнекового экструдера, где смесь захватывают транспортирующие элементы и перемещают ее по длине цилиндра при вращении в трех зонах, аналогично примеру 1. Процесс проводят при автоматической загрузке смеси в токе азота, скорость подачи реакционной смеси поддерживалась при скорости вращения шнеков в пределах 20-200 об*мин; нагрузка, определяемая по величине тока привода шнеков экструдера в пределах 15-20 А, соответствует давлению 550 МПа. Температура в первой зоне 5С, во второй 95С, в третьей зоне 10С. Продолжительность процесса 3 минуты. Выход продукта составляет 4,9 г (97%),
-2
-1
-1
-1
-1
G’
G”
G’
G”
При растворении продукта в воде (2% масс. раствор) образуется прозрачный гель. Доля связанного с ГК ресвератрола в водном растворе составляет 1,3-1,5-*10% масс., что в 5 раз превышает предел растворимости ресвератрола в воде. Вязкостные показатели раствора: при начальной частоте деформации ω =0,05с модуль упругости  = 0,9 Па, модуль потерь  = 0,03 Па, при росте частоты деформации до значения ω = 200с модуль упругости  = 30 Па, модуль потерь  = 25 Па  (фиг.3, позиция 2). Полоса с максимумами 950-1050 сми 1115-1061 смв ИК- спектре присутствует.
Пример 3
-3
-4
о
-1
о
о
о
5,0 г (12,5*10 моля) порошкообразной натриевой соли ГК, аналогичной примеру 1, и 0,0625 г (2,7*10моля или 1,25% масс. от массы ГК) порошка ресвератрола белого цвета гомогенизируют в мельнице при 25С в течение 10-15 мин. Затем однородную порошкообразную смесь подают в зону питания двухшнекового экструдера, где смесь захватывают транспортирующие элементы и перемещают ее по длине цилиндра при вращении в трех зонах, аналогично примеру 1. Процесс проводят при автоматической загрузке смеси в токе азота, скорость подачи реакционной смеси поддерживалась при скорости вращения шнеков в пределах 20-200 об*мин; нагрузка, определяемая по величине тока привода шнеков экструдера в пределах 15-20 А, соответствует давлению 550 МПа. Температура в первой зоне 5С, во второй 95С, в третьей зоне 10С. Продолжительность процесса 3 минуты. Выход продукта составляет 4,9 г (97%),
-2
-1
-1
-1
-1
G’
G”
G’
G”
При растворении продукта в воде (2% масс. раствор) образуется прозрачный гель. Доля связанного с ГК ресвератрола в водном растворе составляет 1,9-2,0*10% масс., что в 7 раз превышает предел растворимости ресвератрола в воде. Вязкостные показатели раствора: при начальной частоте деформации ω =0,05с модуль упругости  = 0,8 Па, модуль потерь  = 0,02 Па, при росте частоты деформации до значения ω = 200с модуль упругости  = 50 Па, модуль потерь  = 30 Па  (фиг.3, позиция 3). Полоса с максимумами 950-1050 сми 1115-1061 смв ИК- спектре присутствует.
Пример 4
-3
-4
о
-1
о
о
о
5,0 г (12,5*10 моля) порошкообразной натриевой соли ГК, аналогичной примеру 1, и 0,075 г (3,3*10моля или 1,5% масс. от массы ГК) порошка ресвератрола белого цвета гомогенизируют в мельнице при 40С в течение 10-15 мин. Затем однородную порошкообразную смесь подают в зону питания двухшнекового экструдера, где смесь захватывают транспортирующие элементы и перемещают ее по длине цилиндра при вращении в трех зонах, аналогично примеру 1. Процесс проводят при автоматической загрузке смеси в токе азота, скорость подачи реакционной смеси поддерживалась при скорости вращения шнеков в пределах 20-200 об*мин; нагрузка, определяемая по величине тока привода шнеков экструдера в пределах 20-25 А, соответствует давлению 600 МПа. Температура в первой зоне 5С, во второй 100С, в третьей зоне 15С. Продолжительность процесса 4 минуты. Выход продукта составляет 4,95г (97,5%).
-2
-1
-1
-1
-1
G’
G”
G’
G”
При растворении продукта в воде (2% масс. раствор) образуется прозрачный гель. Доля связанного с ГК ресвератрола в водном растворе составляет 2,8-3,0*10% масс., что в 10 раз превышает предел растворимости ресвератрола в воде. Вязкостные показатели раствора: при начальной частоте деформации ω =0,05с модуль упругости  = 1,1 Па, модуль потерь  = 5 Па, при росте частоты деформации до значения ω = 200с модуль упругости  = 110 Па, модуль потерь  = 50 Па  (фиг.3, позиция 4). Показатели вязкости аналогичны показателям продукта по примеру 1. Полоса с максимумами 950-1050 сми 1115-1061 смв ИК- спектре присутствует.