Тестирование аддитивных материалов на культурах клеток фибробластов человека

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕЖДИСЦИПЛИНАРНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ

ТЕСТИРОВАНИЕ АДДИТИВНЫХ МАТЕРИАЛОВ НА КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК ФИБРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА

Котельников Г.П., Колсанов А.В., Николаенко А.Н., Волова Л.Т., Россинская В.В Болтовская В.В., Попов Н.В., Щербовских А.Е., Приходько С.А.

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России

Актуальность. Для полного восстановления функциональности кисти после хирургических вмешательств или травм требуется максимально точно повторить анатомию ее утраченных сегментов. Эта амбициозная задача возможна при использовании 30-моделирования и аддитивных технологий.

Цель исследования - тестирование аддитивных материалов, полученных из титанового порошка марки ВТ1-00 методом лазерного спекания, на культурах клеток фибробластов человека. В рамках поставленной цели решались следующие задачи: определение цитотоксичности представленных материалов, определение влияния исследуемых материалов на пролиферативную активность дермальных фибробластов в культуре, определение адгезии дермальных фибробластов к исследуемым материалам. Проведенное исследование является проспективным, II уровня доказательности.

Материал и методы. Для исследования были представлены образцы аддитивного материала, полученного из титанового порошка марки ВТ1-00 методом лазерного сплавления. Тестирование проводилось на культуре дермальных фибробластов человека 7-го пассажа, согласно межгосударственному стандарту, методом прямого контакта (ГОСТ ISO 10993-5-2011). Результаты. Тестирование образцов аддитивного материала на адгезивность продемонстрировало, что число клеток, обнаруживаемых прикрепленными к поверхности исследуемого материала, составляет >97% (по сравнению с группой контроля - 81,5%). Отмечено отсутствие цитотоксичности исследуемых материалов в результате лактатдегидрогеназного теста. Грубых изменений морфофункциональных характеристик дермальных фибробластов в присутствии образцов аддитивного титана не выявлено. Также отмечена хорошая пролиферативная активность клеток в присутствии тестируемых материалов. При этом нежизнеспособные клетки составляли <5% на всех сроках эксперимента.

Заключение. Таким образом, тестирование представленных образцов на культуре дермальных фибробластов человека методом прямого контакта по рекомендациям межгосударственного стандарта ГОСТ ISO 10993-5-2011 показало отсутствие цитотоксичности, высокий пролифера-тивный потенциал и сохранение жизнеспособности клеток. Данные результаты входят в рамки доклинического испытания аддитивного материала для изготовления персонифицированных эндопротезов суставов кисти.

Клин. и эксперимент. хир. Журн. им. акад. Б.В. Петровского. 2018. Т. 6, № 2. С. 67-73.

doi: 10.24411/2308-1198-2018-12009.

Статья поступила в редакцию: 01.06.2017. Принята в печать: 20.04.2018.

Testing of additive materials in human fibroblast cell cultures CORRESPONDENCE

| Nikolaenko Andrey N. - MD,

Assistant of the Department

Kotelnikov G.P., Kolsanov A.V., Nikolaenko A.N., Volova L.T., Rossinskaya V.V., Boltovskaya V.V., of Traumatology, Orthopedics

Popov N.V., Shcherbovskih A.E., Prihod'ko S.A. and Extreme Surgery named after

academician of RAS A.F. Krasnov,

Samara State Medical University

Samara State Medical University E-mail: nikolaenko.83@inbox.ru

https://orcid.org/0000-0003-

3411-4172

ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ

Николаенко Андрей Николаевич -кандидат медицинских наук, ассистент кафедры травматологии, ортопедии и экстремальной хирургии им. акад. РАН А.Ф. Краснова ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России E-mail: nikolaenko.83@inbox.ru https://orcid.org/0000-0003-3411-4172

Ключевые слова:

кисть, суставы кисти, персонифицированные эндопротезы, аддитивные технологии, фибробласты человека

Keywords:

brush, hand joints, personalized endoprotheses, additive technologies, human fibroblasts

Relevance. To fully restore the functionality of the hand after surgery or trauma, it is required to repeat the anatomy of the lost segments of the hand as accurately as possible. This ambitious task is possible with the use of the 3D-modeling and additive technologies. The aim of the study is testing of additive materials obtained from a titanium powder of grade VT1-00 by laser sintering on cell cultures of human fibroblasts. Within the framework of the goal, the following tasks were solved: determination of the cytotoxicity of the presented materials; determination of the influence of the studied materials on the proliferative activity of dermal fibroblasts in culture; determination of the adhesion of dermal fibroblasts to the materials studied. The study is prospective, evidence level II.

Material and methods. For the study, samples of the additive material obtained from the titanium powder of grade VT1-00 by laser sintering were presented. The testing was carried out on the culture of human 7th passage dermal fibroblasts according to the interstate standard by the method of direct contact (GOST ISO 10993-5-2011).

Result. Testing of samples of additive material on adhesiveness has demonstrated that the number of cells detected by attached to the surface of the test material is not less than 97% (compared to the control group - 81.5%). We noted the absence of cytotoxicity of the materials studied as a result of the LDH test. There were no noticeable changes in the morphofunc-tional characteristics of dermal fibroblasts in the presence of samples of additive titanium. A good proliferative activity of cells in the presence of test materials was also noted. In this case, non-viable cells were less than 5% at all times of the experiment. Conclusion. Thus, testing of the submitted samples on the culture of human dermal fibroblasts by direct contact method according to the recommendations of the interstate standard GOST ISO 10993-5-2011 showed the absence of cytotoxicity, high proliferative potential and preservation of cell viability. These results are part of the preclinical test of the additive material for the manufacture of personalized endoprosthesis of the hand joints.

Clin. Experiment. Surg. Petrovsky J. 2018; 6 (2): 67-73.

doi: 10.24411/2308-1198-2018-12009. Received: 01.06.2017. Accepted: 20.04.2018.

Кисть человека, или дистальная часть верхней конечности, обладает особым значением [1-4]. С помощью рук и мелкой моторики, движений всех пальцев, люди познают мир и взаимодействуют с ним [5-8]. Кисть и пальцы - главные инструменты в любой работе. Снижение их функциональности во многом приводит к уменьшению трудоспособности, ограничению возможностей человека [9-10]. На современном этапе развития техники и технологий функция кисти должна быть восстановлена максимально, так как для управления сложными механизмами требуются точные, строго дозированные движения [11-12].

Цель исследования - тестирование аддитивных материалов, полученных из титанового порошка марки ВТ1-00 методом лазерного спекания, на культурах клеток фибробластов человека.

В рамках поставленной цели решались следующие задачи:

• определение цитотоксичности представленных материалов;

• определение влияния исследуемых материалов на пролиферативную активность дер-мальных фибробластов в культуре;

• определение адгезии дермальных фибробластов к исследуемым материалам.

Проведенное исследование является проспективным, II уровня доказательности.

Материал и методы

Тестируемые материалы. Для исследования были представлены:

- образцы аддитивного материала, полученного из титанового порошка марки ВТ1-00 методом лазерного сплавления, в виде квадратных пластин размером 0,5x0,5 см (24 образца) и дисков площадью 3,8 см2 (12 образцов); толщина образцов - 0,2 см;

- сырье для получения этого материала - мелкодисперсный титановый порошок марки ВТ1-00.

Образцы каждого вида были герметично упакованы в отдельные двойные пластиковые пакеты и стерилизованы оксидом азота (рис. 1).

Ход и методы эксперимента

Работа проведена в лаборатории культур клеток ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России. Данная лаборатория оснащена комплексом чистых помещений класса Б в соответствии со стандар-

том ISO5. Все работы с материалом выполняли в ламинарных боксах БАВп-01 «Ламинар-С» (ЗАО «Ламинарные системы», Миасс, Россия) II класса биологической защиты с применением всех правил асептики и антисептики. В исследовании использовали одноразовую пластиковую посуду квалификации «для культур клеток»: культураль-ные флаконы 25 и 75 см2, чашки Петри диаметром 3,5 см, 24-луночные планшеты с плоским дном (все - Orange Scientific, Бельгия), 12-луночные планшеты со вставками (NUNK, США). Все использованные реактивы производства ООО «Биолот» (Россия).

Тест-система. Тестирование проведено на культуре дермальных фибробластов человека 7-го пассажа, согласно межгосударственному стандарту методом, прямого контакта (ГОСТ ISO 10993-5-2011). Забор первичного материала (биоптаты кожи) проводили, основываясь на положениях Федерального закона РФ «О трансплантации органов и (или) тканей человека» от 22.12.1992 № 4180-1 и после одобрения Комитетом по биоэтике при ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России. Донор был соматически здоров.

Фибробласты выращивали по методике первичных эксплантатов с использованием полной ростовой среды [среда 199 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и 40 мкг/мл гентамицина] в СО2-инкубаторе (Sanyo - Incubator, MCO-17A, Япония) при температуре 37 °С, постоянной влажности и 5% СО2. Перед исследованием выращенную культуру идентифицировали с помощью морфологических и биохимических методов. Установлено, что клетки являются детерминированными и принадлежат к фибробласти-ческому дифферону; кариотипирование показало, что клетки являются диплоидными и имеют 46 хромосом. Обследование методом полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) показало отсутствие контаминации культуры инфекционными агентами, в том числе микоплазмами и цитомегаловирусами.

Для решения поставленных задач проведено 3 серии экспериментов.

Серия 1. Определение цитотоксичности представленных материалов при помощи лактатде-гидрогеназного (ЛДГ) теста.

Дермальные фибробласты высевали на дно лунок 24- и 12-луночных планшетов дозе 1х104 клеток/см2 и культивировали при 37 °С и постоянной влажности в условиях СО2-инкубатора (Sanyo - Incubator, MCO-18A, Япония) с использованием полной ростовой среды (среда 199 с добавлением 10% ЭТС) до образования равномерного конфлюэнтного монослоя.

Образцы аддитивного материала в виде квадратных пластин размером 0,5x0,5 см помещали на монослой в лунки 24-луночных планшетов. Порошок титана вносили на сетки планшетных вставок 12-луночных планшетов в дозе 0,2140 г. Расстояние нижнего края сетки до дна планшетов составляло 5 мм, что исключало механическое повреждающее действие порошка на клетки. Ростовую среду заменяли на свежую и продолжали культивирование в течение 48 ч.

Контролями служили полная ростовая питательная среда, образец экспериментального материала, погруженный в полную ростовую питательную среду, культура клеток в полной ростовой питательной среде. Всего в каждой позиции задействовано по 6 лунок.

Сущность ЛДГ-теста заключается в том, что, поскольку ЛДГ является цитоплазматическим ферментом, она появляется в культуральной жидкости только при нарушении целостности клеточных мембран, и соотношение ее активности в культуральной среде и в клетках на носителе (культуральном пластике исследуемом материале) отражает соотношение живых и поврежденных клеток в данной культуре [1].

Активность ЛДГ определяется следующим образом. Культуральную среду отбирали в эппен-дорфы и центрифугировали. Носитель дважды ополаскивали фосфатно-солевым буфером, помещали в эппендорфы, добавляли 0,001 моль фосфатного буфера (рН=7,4). Сохранившиеся на носителе живые клетки разрушали путем двукратного замораживания-оттаивания. Отбирали по 1 мл

культуральной среды и лизата клеток, добавляли к каждой аликвоте 1 ммоль пирувата и 0,2 ммоль восстановленного никотинамидадениндинуклео-тида (NADH), затем облучали на спектрофотометре (СФ-56, «ЛОМО», Санкт-Петербург) при длине волны 340 нм. Активность ЛДГ определяли по убыли NADH в ходе реакции превращения пирувата в лактат:

LDH

Piruvate+NADH -м- Lactate+NAD+.

Количество поврежденных клеток (DC) определяли как отношение активности ЛДГ в среде (LDHm) к суммарной активности ЛДГ в лизате (LDHL) и в ростовой среде и выражали в процентах:

DC (%)=(LDHm/LDHL + LDHm)x100.

Достоверность полученных данных оценивалась по U-критерию Манна-Уитни.

Серия 2. Определение влияния исследуемых материалов на пролиферативную активность и жизнеспособность дермальных фибробластов в культуре.

Посев и культивирование фибробластов осуществляли аналогично 1-й серии с той разницей, что материал вносили в планшеты через 24 ч после посева клеток, после того как клетки равномерно адгезировались к культуральному пластику и образовали контакты между собой. Контроль - культура фибробластов, в лунки с которой исследуемые материалы не вносили. Общая длительность эксперимента составляла 7 сут.

Ежедневно проводили визуальную оценку и фотографирование культуры с помощью инвертированного микроскопа «Olympus СКХ41» (Olympus Corporation, Япония) при увеличении 100, 200 и 400. Оценивали структурные особенности клеток и монослоя в целом, с помощью окулярной сетки Автандилова считали количество клеток в монослое, затем вычисляли плотность монослоя на единицу площади (мм2).

Через 24 ч (1 сут), 3, 5 и 7 сут от момента помещения материала на монослой часть чашек изымали из эксперимента. Препараты окрашивали гематоксилином Майера и суданом IV для выявления структурных изменений, а также трипановым синим для верификации жизнеспособных и поврежденных клеток в монослое. Препараты изучали и фотографировали с помощью автоматизированной аналитической системы, включающей микроскоп «Olympus ВХ41», цифровую фотокамеру ProgR CF, системный блок на базе процессора Intel Pentium 4. Была использована программа «Видеотест Морфология 5.2». В препаратах, окрашенных гематоксилином Майера и суданом IV, подсчитывали количество клеток на единицу площади; в препаратах, окрашенных трипановым синим, - процентное соотношение жизнеспособных и поврежденных (живых и мертвых) клеток.

На основании полученных данных рассчитывали индекс пролиферации, время удвоения и количество удвоений культуры.

Индекс пролиферации (1Р) определяли по формуле (1):

^=N2^1,

где N1 - количество клеток монослоя, принятое как исходное; N2 - количество клеток монослоя через 24 ч культивирования.

Индекс пролиферации высчитывали через каждые 24 ч культивирования. За первое значение N1 принимали плотность монослоя через 24 ч после посадки клеток.

Время удвоения культуры (Ю) рассчитывали по формуле (2):

Ю = 1х1д2/1д^^0),

где I - время роста культуры (ч); N0 - начальное количество клеток; N1 - количество клеток через I ч.

Количество удвоений культуры (К) вычисляли по формуле (3):

К=

где N0 - количество клеток в монослое через 24 ч после посадки; N1 - количество клеток в монослое по окончании эксперимента.

Серия 3. Определение адгезии дермальных фибробластов к исследуемым материалам.

На дно лунок 24-луночных планшетов помещали образцы аддитивного материала в форме дисков (по 1 в каждую лунку - всего 12 образцов). Сверху на б дисков и в б свободных лунок планшета высевали дермальные фибробласты в дозе 1х104 клеток/см2, б образцов оставляли в качестве контрольных. Во все лунки вносили полную ростовую среду до объема 2,5 мл. Культивирование проводили в тех же условиях, что и в сериях 1 и 2, в течение 48 ч.

Статистическая обработка результатов культу-ральных и морфологических исследований проведена с использованием ¿-критерия Стьюдента, биохимических - с использованием У-критерия Манна-Уитни для малых выборок. Результаты были представлены в виде среднего арифметического (М) и стандартной ошибки выборочной средней (т). Значимыми считались отличия при р<0,05(95%).

Результаты

Тестирование образцов аддитивного материала на адгезивность продемонстрировало, что число клеток, обнаруживаемых прикрепленными к поверхности материала, полученного методом лазер-

ного сплавления из порошка титана марки ВТ1-00, составляет 81,5% от числа клеток, находящихся на поверхности пластика (контроль) к моменту проведения ЛДГ-теста. В то же время индекс адгезии дермальных фибробластов к поверхности непористого титана данной марки составляет >97%.

При тестировании на цитотоксичность как образцов аддитивного материала (табл. 1), так и порошка титана марки ВТ1-00 (табл. 2) было выявлено, что различия показателей ЛДГ-теста между опытными и контрольными группами не достоверны - это говорит об отсутствии цитотоксично-сти исследуемых материалов.

Изучение морфофункциональных характеристик дермальных фибробластов, культивированных в присутствии образцов, показало, что на протяжении всего эксперимента ни в одной серии грубых изменений не происходило, клетки сохраняли присущий фибробластам человека характер роста (монослойный, в виде завитков), целостность монослоя, преимущественно веретеновидную форму, 2-4 отростка (рис. 2). Они содержали 1 овальное ядро, четко отграниченное от мелкозернистой ци-

топлазмы ядерной оболочкой. Плотность монослоя в непосредственной близости от образцов не отличалась от таковой в отдаленных зонах. Характерно, что все культуры за время эксперимента проходили одинаковое количество удвоений (от 4,18 до 4,25) и достигали плотности насыщения через 7 сут после посева (табл. 3-5), что говорит о хорошей про-лиферативной активности клеток в присутствии тестируемых материалов. Темпы пролиферации клеток в сериях также не отличались от контроля. Культура дермальных фибробластов как в контроле, так и в присутствии образцов исследуемых материалов активно пролиферировала первые 4 сут после посева, затем темп этого процесса замедлялся, о чем свидетельствуют прогрессивное снижение индекса пролиферации (1Р) и увеличение времени удвоения культуры (Ю) (табл. 3). Плотность насыщения, т.е. формирование полного равномерного плотного монослоя, резкое замедление пролиферации и переход культур в стационарное состояние были достигнуты одновременно - через 8 сут после посева клеток и через 7 сут после помещения образцов на монослой.

Таблица 1. Определение цитотоксичности аддитивного материала

Показатель Активность ЛДГ в клетках, нмоль на лунку планшета Активность ЛДГ в среде, нмоль на лунку планшета % поврежденных клеток в лунке планшета

клетки (контроль) клетки + титановые пластины клетки (контроль) клетки + титановые пластины клетки (контроль) клетки + титановые пластины

M±m 107,23+10,05 109,72+13,14 4,15+4,54 4,98+5,45 3,42+3,7б 3,45+3,78

n б б б б б б

Р >0,05 >0,05 >0,05

Таблица 2. Определение цитотоксичности порошка титана марки ВТ1-0

Показатель Активность ЛДГ в клетках, нмоль на лунку планшета Активность ЛДГ в среде, нмоль на лунку планшета % поврежденных клеток в лунке планшета

клетки (контроль) клетки + титановый порошок клетки (контроль) клетки + титановый порошок клетки (контроль) клетки + титановый порошок

M±m 290,72+41,б3 19б,05+23,б1 110,72+32,б0 59,71+4б,15 25,14+б,32 18,38+13,25

n б 4 б 4 б 4

Р >0,05 >0,05 >0,05

Таблица 3. Пролиферативная активность контрольной культуры дермальных фибробластов

Срок эксперимента, ч Плотность монослоя, кл/1 мм2 Индекс пролиферации, отн. ед. Время удвоения, ч Количество удвоений, отн. ед.

Исходные данные 88,7+1,2 - - -

24 173,3+3,1 1,95+0,13 24,9+1,1 -

48 362,1+1,5 2,10+0,09 24,0+0,8 -

72 716,2+5,3 1,98+0,17 24,4+0,3 -

96 1073,6+1,7 1,51+0,11 41,0+0,4 -

120 1356,7+20,8 1,32+0,07 72,0+0,4 -

144 1684,3+14,4 1,24+0,06 80,3+0,5 -

168 1736,4+9,1 - - -

4,25+0,31

Таблица 4. Пролиферативная активность культуры дермальных фибробластов в присутствии аддитивного материала, изготовленного порошка из титана марки ВТ1-00

Срок эксперимента, ч Плотность монослоя, кл/1 мм2 Индекс пролиферации, отн. ед. Время удвоения, ч Количество удвоений, отн. ед.

Исходные данные 88,7+1,2 - - -

24 173,3+1,15 1,95+0,07 24,9+0,5 -

48 346,7+2,3 2,00+0,11 24,1+0,5 -

72 686,3+4,62 1,98+0,10 24,4+0,5 -

96 1029,0+6,93 1,49+0,03 41,1+0,5 -

120 1296,7+9,24 1,26+0,03 72,2+0,5 -

144 1607,7+10,97 1,24+0,04 77,7+0,5 -

168 1704,8+8,1 - - -

4,19+0,27

Таблица 5. Пролиферативная активность культуры дермальных фибробластов в присутствии порошка титана марки ВТ1-00

Срок эксперимента, ч Плотность монослоя, кл/1 мм2 Индекс пролиферации, отн. ед. Время удвоения, ч Количество удвоений, отн. ед.

Исходные данные 88,7+1,2 - - -

24 175,3+1,2 1,98+0,06 24,4+0,5 -

48 355,7+2,1 2,03+0,09 24,08+0,3 -

72 709,3+1,22 1,99+0,04 24,2+0,5 -

96 1067,7+7,5 1,51+0,02 40,6+0,4 -

120 1330,0+8,6 1,25+0,02 72,24+0,7 -

144 1635,6+10,97 1,23+0,05 81,16+0,7 -

168 - - -

4,18+0,21

Рис. 3. Культивирование дермальных фибробластов в присутствии аддитивного материала. 7-е сутки эксперимента

Анализ окрашенных препаратов также не выявил существенных отличий между опытными и контрольными культурами. При окраске толуидиновым синим нежизнеспособные клетки (рис. 3) составляли <5% на всех сроках эксперимента.

Заключение

Таким образом, тестирование представленных образцов на культуре дермальных фибробластов человека методом прямого контакта по рекомендациям межгосударственного стандарта ГОСТ ISO 10993-5-2011 показало отсутствие цитотоксич-ности, высокий пролиферативный потенциал и сохранение жизнеспособности клеток. Данные результаты входят в рамки доклинического испытания аддитивного материала для изготовления персонифицированных эндопротезов суставов кисти.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Литература

1. Lopez E., Figueroa S., Oset-Gasque M J., Gonzalez M.P. Apopto-sis and necrosis: two distinct events induced by cadmium incortical neurons in culture // Br. J. Pharmacol. 2003. Vol. 138. P. 901-911.

2. Булычева И.В., Соловьев Ю.Н. Морфология протезированных суставов. Семинары по костной патологии // Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи. 2012. № 3. С. 57-64.

3. Гатитулин М.Н., Башарин И.А. Ротационное измельчение порошков для аддитивных технологий и порошковой металлургии // Вестн. соврем. науки. 2015. № 1. С . 26-33.

4. Куньпэн Х., Беспальчук П.И. Эндопротезирование проксимального межфалангового сустава пальца кисти при его разрушении и энхондроме основной фаланги // Мед. журн. 2015. № 2. С. 155-158.

5. Баева Л.С., Маринин А.А. Современные технологии аддитивного изготовления объектов // Вестник МГТУ. 2014. Т. 17. № 1. С. 7-12.

6. Дудариков С.А., Емец А.Н., Шарофеев А.Н., Семикин Е.Е., Сахарюк А.П., Цыганчук Е.В., Петрищенко Д. Эндопротезирова-

ние мелких суставов кисти и стопы // Амурский мед. журн. 2015. № 4. С. 196-198.

7. Михалкевич Д.И., Беспальчук П.И. Эндопротезирование суставов кисти // Мед. журнал. 2015. № 1. С. 143-145.

8. Мурадов М.И., Байтингер В. Ф., Камолов Ф.Ф., Сайк П.Ю., Курочкина О.С. Оценка отдаленных результатов эндопротезирова-ния суставов пальцев кисти // Вопр. реконструкт. и пласт. хир. 2016. Т. 19, № 1. С. 33-41.

9. Щедрина М.А., Новиков А.В., Носов О.Б. Первый опыт реабилитации больных после эндопротезирования суставов кисти // Вопр. травматол. и ортопедии. 2014. № 2. С. 31-35.

10. Дюрягин Н. М. Новая методология и технологии реконструкции нижней челюсти и височно-нижнечелюстного сустава эндопротезами из материалов никелида титана // Омский науч. вестн. 2010. № 1. С. 45-49.

11. Любченко О.Д. Разработка современных материалов для эндопротезирования // АсШаиа'епсе. 2016. Т. 2, № 7. С. 5-6.

References

1. Lopez E., Figueroa S., Oset-Gasque M.J., Gonzalez M.P. Apoptosis and necrosis: two distinct events induced by cadmium incortical neurons in culture. Br J Pharmacol. 2003; 138: 901-11.

2. Bulycheva I.V., Solovyev Yu.N. The morphology of the prosthetic joint. Seminars on bone pathology. Sarkomy kostey, myagkikh tkaney i opukholi kozhi. [Sarcoma Bones, Soft Tissue and Skin Tumors]. 2012;

3. Gatitulin M.N., Basharin I.A. Rotary grinding powders for additive technology and powder metallurgy. Vestnik sovremennoy nauki [Bulletin of modern science]. 015;

4. Kunpen H., Bespalchuk P.I. Endoprosthesis of the proximal interphalangeal joint of the finger brush with its destruction and the main phalanx enhondrome. Meditsinskiy zhurnal [Medical Journal]. 2015; 2: 155-8.

5. Baeva L.S., Marinin A.A. Modern technologies of additive manufacturing facilities. Vestnik MGTU [Proceedings of the MSTU]. 2014; 17

6. Dudaryk S.A., Yemets A.N., Sharofeev A.N., Semikin E.E., Saharyuk A.P., Tsyganchuk E.V., Petrishchenko D. Endoprosthesis

small joints of the hands and feet. Amurskiy meditsinskiy zhurnal [Amur Medical Journal]. 2015;

7. Mikhalkevich D.I., Bespalchuk P.I. Endoprosthesis hand joints. Meditsinskiy zhurnal [Medical Journal]. 2015;

8. Muradov M.I., Baytinger V.F., Kamolov F.F., Sike P.Y., Kurochkin O.S. Evaluation of long-term results of arthroplasty fingers. Voprosy rekonstruktivnoy i plasticheskoy khirurgii [Issues of Reconstructive and Plastic Surgery]. 2016; 19

9. Shchedrin M.A., Novikov A.V., Nosov O.B. The first experience of rehabilitation of patients after joint replacement brush. Voprosy rekonstruktivnoy i plasticheskoy khirurgii [Issues of Reconstructive and Plastic Surgery]. 2014;

10. Dyuryagin N.M. New Methodology and technology of reconstruction of the mandible and temporomandibular joint endoprosthesis materials NiTi. Omskiy nauchnyy vestnik [Omsk Scientific Bulletin]. 2010;

11. Lubchenco O.D. The development of advanced materials for the replacement. Actualscience. 2016; 2