КОМБИНИРОВАННЫЙ КРИОПРОТЕКТОР "ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИД/РЕОПОЛИГЛЮКИН" ДЛЯ КРИОКОНСЕРВАЦИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И СПОСОБ ИХ КРИОКОНСЕРВАЦИИ ДЛЯ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ
COMBINATION CRYOPROTECTOR "DIMETHYL SULPHOXIDE/RHEOPOLYGLUCIN" FOR STEM CELL CRYOPRESERVATION AND METHOD FOR CRYOPRESERVATION THEREOF FOR CLINICAL APPLICATIONS

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в работе банков стволовых клеток для клинического применения.
Одним из наиболее перспективных направлений является поиск оптимального комбинированного криопротектора, способного сохранить стволовые клетки из различных источников (пуповинная/периферическая кровь, костный мозг, плацента и др.) для дальнейшего клинического применения.
Для длительного хранения заготовленных образцов стволовых клеток из различных источников (например, гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), мезенхимальных стволовых клеток или др.) необходимо применение методов криоконсервации. Криоконсервация (воздействие низких температур) - это комплекс мероприятий, обеспечивающих хранение биологических объектов при сверхнизких температурах, с возможностью восстановления их биологических функций после размораживания. Этапы замораживания и размораживания клеточных концентратов являются наиболее ответственными моментами для сохранения стволовых клеток в жизнеспособном состоянии.
Даже простое охлаждение клетки до 0°C существенно ограничивает время ее жизни, что обусловлено изменениями фазового состояния липидов в клеточной мембране, изменением pН среды, выключением «Na-насоса» и набуханием клеток. И только использование сверхнизких температур с соблюдением точных режимов охлаждения позволяет обратимо приостановить все биохимические процессы в клетке.
Поэтому разработка и усовершенствование методов криоконсервации стволовых клеток являются наиболее актуальными задачами.
В период криоконсервации факторами, ответственными за развитие различных криоповреждений, являются:
1. образование кристаллов льда и их размеры (фаза кристаллизации);
2. обезвоживание клетки;
3. осмотический шок из-за увеличения концентрации электролитов в клетке.
На сегодняшний день оптимальной температурой для длительного хранения стволовых клеток принята температура жидкого азота от -80° до -196°C.
Под воздействием данных факторов в клетке возникают первичные криоповреждения, заключающиеся в изменении формы и размера клеток, нарушении целостности мембраны, изменении конформации макромолекул.
В процессе рекристаллизации и оттаивания первичные криоповреждения могут явиться причиной вторичных изменений, которые, в свою очередь, вызовут лизис клетки и приведут к несостоятельности трансплантата.
Однако, несмотря на существующие проблемы, в настоящее время удается успешно замораживать и размораживать стволовые клетки, сохраняя при этом их биологические свойства. Это обеспечивается проведением ряда мероприятий по подготовке пуповинной крови перед криоконсервацией:
- введение комбинированных криопротекторов;
- соблюдение методов замораживания и размораживания;
- соблюдение строгих температурных режимов хранения криоконсервированных образцов пуповинной крови.
Криопротекторы - это вещества с низкой температурой замерзания, которые способны предупреждать развитие криоповреждений в клетке. Молекулы криопротекторов начинают взаимодействовать с мембранами стволовых клеток уже при комнатной температуре, приводя к изменению их физико-химических характеристик и температуры главного фазового перехода. Также в присутствии криопротекторов отмечается понижение температуры, при которой регистрируется формирование внутриклеточного льда.
Основные механизмы действия всех криопротекторов обусловлены следующими феноменами:
- частичная осмотическая дегидратация клеток;
- витрификация клеточной воды благодаря замедлению образования внутриклеточных кристаллов льда, что позволяет сохранить внутриклеточную воду при взаимодействии с макромолекулами, необходимую для их гидратации и стабилизации.
Обязательные качества, которыми должны обладать криопротекторы при заготовке стволовых клеток, это:
1. безопасность по отношению к криоконсервированному материалу и биологическому объекту;
2. высокая гидрофильность;
3. снижение количества вымораживаемой воды и предотвращение кристаллизации воды в криозащитной смеси;
4. поддержание белков и солей в растворенном состоянии вплоть до эвтектического перехода в аморфное состояние.
Все известные криопротекторы в зависимости от их молекулярной массы и способности проникать внутрь клетки разделены на экстра-, эндоцеллюлярные и смешанные. Выбор криопротектора зависит от его химического строения, типа криоконсервированных клеток и условий криоконсервации.
Общепринятым криопротектором для стволовых клеток является эндоцеллюлярный криопротектор диметилсульфоксид (ДМСО), который способен легко проникать через мембрану клеток и образовывать большое количество водородных связей с молекулами жидкой фазы клетки. Это приводит к снижению кристаллообразования внутри клетки, а также к снижению концентрации внутриклеточных солей при сверхнизких температурах, что уменьшает степень криоповреждения клетки. Его рекомендуют добавлять в клеточную суспензию при постоянной скорости и перемешивании непосредственно перед этапом замораживания. Это обеспечивает равномерное распределение криопротектора во всем объеме концентрата клеток и максимально сокращает время его контакта со стволовыми клетками. Для нейтрализации выделяющегося тепла в результате экзотермической реакции при введении ДМСО, клеточные концентраты рекомендовано охлаждать до температуры от 0 до 4°C.
Для реципиента ДМСО является относительно нетоксичным веществом. Однако, при увеличении его концентрации в конечном растворе возможно развитие токсических реакций у пациента. В литературе встречаются немногочисленные публикации, в которых описано развитие острых токсических реакций непосредственно на фоне инфузии или после введения размороженных стволовых клеток. В основном нежелательные симптомы были кратковременными и проявлялись в виде тошноты, рвоты, болей в животе, головокружения. В двух исследованиях были описаны случаи с развитием тяжелых неврологических осложнений (токсической комы) и случай со смертельным исходом, непосредственно связанным с введением ДМСО.
В 2005 году были опубликованы результаты многоцентрового исследования трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток из 97 трансплантационных центров ЕВМТ, где сообщалось о развитии побочных эффектов после введения криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток в конечной концентрации ДМСО от 5-10%. Развитие тяжелых токсических осложнений было отмечено в 1 случае, что составило 2,1% от всех зарегистрированных случаев. В основном побочные эффекты наблюдались со стороны сердечно-сосудистой и дыхательной систем (27% и 17% соответственно), нейро- и нефротоксичность были зарегистрированы в 5% случаев.
Для снижения токсичности ДМСО на организм пациента рядом авторов были проведены исследования по удалению ДМСО из криоконсервированной пуповинной крови непосредственно после ее размораживания различными методами, при этом была отмечена существенная потеря ГСК - до 30%.
Для компенсации токсического действия и повышения цитопротективных свойств ДМСО необходим подбор оптимальной его концентрации, обеспечивающей максимальные криопротекторные свойства при минимальном повреждающем действии на клетки.
Наиболее безопасной и эффективной для криоконсервации стволовых клеток и применения в клинической практике признана 10% концентрация ДМСО в конечном растворе.
Рядом авторов были проведены исследования по уменьшению конечной концентрации ДМСО. В результате данных работ было показано, что снижение концентрации ниже 7-5% способно привести к существенным потерям стволовых (в ряде исследований наблюдалась фатальная гибель клеток).
Вопрос об оптимальном составе комбинированных криоконсервирующих растворов ДМСО для хранения стволовых клеток в жидком азоте остается открытым. На сегодняшний день наиболее перспективным направлением является модификация методик криоконсервации стволовых клеток, направленная на уменьшение токсичности ДМСО за счет его сочетания с различными непроникающими криопротекторами (человеческий альбумин, аутологичная сыворотка, гидроксиэтилкрахмали др.).
Однако поскольку отсутствуют какие-либо нормативные документы по использованию ДМСО в качестве криопротектора, большинство исследователей разрабатывают свои собственные протоколы для криоконсервации стволовых клеток.
Поэтому исследования, направленные на поиск новых оптимальных комбинированных криопротекторов с использованием отечественных материалов, которые обеспечивали бы достаточное количество и функциональную сохранность стволовых клеток после криохранения, остаются актуальными.
Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови (RU 2416197, 20.04.2011), согласно которому проводят добавление криопротектора - 55% раствора диметилсульфоксида с 5% декстран 40 в концентрацию взвеси ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками, размещенными в криопакете.
Недостатками прототипа являются использование декстрана с более высокой молекулярной массой, что приводит к развитию нежелательных побочных эффектов при размораживании клеток. Кроме того, использование высокой концентрации ДМСО в исходном растворе приводит к такому соотношению ДМСО и декстрана в конечном растворе, при котором удаление криопротектора при размораживании затруднено и приводит к гибели части деконсервированных клеток вследствие малого объема размораживаемой взвеси.
Технической задачей настоящего изобретения является разработка криопротектора, содержащего декстран с более низкой молекулярной массой и более низкой концентрацией ДМСО, что позволит обеспечить максимальные криопротекторные свойства при минимальном повреждающем действии на клетки.
Техническим результатом заявленного изобретения является создание криопротектора с более низкой молекулярной массой и более низкой концентрацией ДМСО для улучшения сохранности ГСК после размораживания и способа использования разработанного криопротектора для криоконсервации ГСК, позволяющего максимально сохранить ГСК при минимальном их повреждении. Заявленный криопротектор обеспечивает высокую жизнеспособность (89,93±0,69%) гемопоэтических стволовых клеток при длительном (3 года и более) криохранении в замороженном состоянии, при этом отсутствует слипание клеток, упрощается методика размораживания клеток для трансплантации.
В процессе решения технической задачи нами был разработан способ криоконсервации стволовых клеток, включающий получение взвеси стволовых клеток и добавление к ней комбинированного криопротектора, представляющего собой 50% раствор ДМСО в реополиглюкине, представляющем собой декстран со средней молекулярной массой 30000-40000 в 0,9% растворе натрия хлорида, до конечной концентрации ДМСО в получившейся суспензии 10%, с последующим ее криоконсервацией.
Также мы предлагаем разработанный нами комбинированный криопротектор, представляющий собой 50% раствор ДМСО в реополиглюкине представляющем собой 10% декстрана со средней молекулярной массой 30000-40000 в 0,9% растворе натрия хлорида.
Изобретение осуществляется следующим образом.
1. Сбор материала стволовых клеток, например пуповинной крови (ПК), после получения информированного согласия донора (роженицы, рождения ребенка и отделения его от последа) и проверке на носительство гепатита B, C, ВИЧ, сифилис, осуществляют стандартным способом. В частности, можно использовать закрытые системы для сбора крови с гемоконсервантом CPDA (цитрат-фосфат-декстроза-аденин). Обработка полученных образцов проводится не позднее, чем через 24 часа от момента сбора стволовых клеток. Из полученной крови выделяют концентрат ядросодержащих клеток стандартным методом, например описанным в статье Гришина В.В. «Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантаций. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия». №1(3), с. 52-59, где пуповинную кровь разделяют на фракции путем добавления равного объема полиглюкина. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают в течение 50-60 минут, отделяют супернатант, центрифугируют его при 2000 об/мин, плазму удаляют. В результате получают осадок, представляющий собой концентрат ядросодержащих клеток.
Сепарацию столовых клеток можно провести и любым другим методом, например методом выделения стволовых клеток в градиенте плотности фиколла или ускоренной седиментации с использованием раствора желатина или гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), которые позволяют получить от 80% до 90% стволовых клеток.
К полученной взвеси стволовых клеток (концентрат ядросодержащих клеток пуповинной крови) в условиях постоянного перемешивания добавляют разработанный нами комбинированный криопротектор, представляющий собой 50% раствор ДМСО в реополиглюкине (10% декстрана ср. молекулярная масса 30000-40000 в 0,9% растворе натрия хлорида), до конечной концентрации ДМСО в получившейся суспензии 10% по объему, после чего ее подвергают криоконсервации, например, в автоматизированной системе «BioArchive» или любым другим стандартным методом.
2. Способ приготовления комбинированного криопротектора.
Приготовление комбинированного криопротектора «Диметилсульфоксид/реополиглюкин» осуществляется следующим способом: ДМСО смешивается со стерильным раствором реополиглюкина в объемном соотношении 1:1. В комбинированном криопротекторе конечная концентрация ДМСО в реополиглюкине составляет 50% по объему.
Пример
Для оценки влияния разработанного нами комбинированного криопротектора ДМСО/реоплогиглюкин, было изъято из автоматизированной системы «BioArchive» 100 ранее криоконсервированных концентратов пуповинной крови с применением данного криоконсервирующего раствора ДМСО/реополиглюкин (50% раствор ДМСО в реополиглюкине (10% декстрана ср. мол. масса 30000-40000 в изотоническом растворе) - 100 образцов пуповинной крови.
Характеристика криоконсервированных концентратов пуповинной крови представлена в табл. 1. Как видно из представленной таблицы, медиана криохранения концентратов пуповинной крови составила 2 года (1-3). Методом автоматического выделения клеток (МАВК) было обработано 64 образца. 36 образцов пуповинной крови были обработаны методом двойного центрифугирования (МДЦ). Концентрация ДМСО в концентратах пуповинной крови составила 10,1% (9,8-10,2).
При анализе абсолютного количества клеток до и после криохранения, а также процента сохранения клеток в концентрате пуповинной крови после криохранения были получены результаты, представленные в табл. 2.
Сравнение содержания жизнеспособных ядросодержащих стволовых клеток (ЯСК) до и после криохранения представлено в табл. 3.
При оценке абсолютного количества CD45+/CD34+ до и после криохранения, а также процента их сохранения после криохранения концентратов пуповинной крови представлено в табл. 4.
Колониеобразующая активность ГСК ПК до и после криохранения представлена в табл. 5.
В проведенном исследовании достоверных различий в клеточном составе концентратов пуповинной крови, количестве CD45+/CD34+, жизнеспособности ЯСК и колониеобразующей активности ГСК пуповинной крови до и после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive» выявлено не было.
Таким образом, экспериментальными исследованиями показано, что комбинированный криопротектор ДСМО/реополюглюкин обеспечивает высокую жизнеспособность (89,93±0,69%) стволовых клеток при длительном (3 года и более) криохранении в замороженном состоянии, при этом отсутствует слипание клеток, упрощается методика размораживания клеток для трансплантации, клетки менее травмированы.