ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, УПАКОВКА И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION, PACKAGING AND METHOD FOR ITS OBTAINING

Область техники, к которой относится изобретение
[0001] Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая в качестве активного ингредиента содержит разрушающий сахарид фермент, к упаковке, содержащей композицию, содержащуюся в контейнере, и к способу ее получения.
Уровень техники изобретения

[0002] Фармацевтические композиции, которые в качестве активных ингредиентов содержат разрушающие сахариды ферменты, используют для разных заболеваний. Например, фармацевтические композиции для лечения лизосомной болезни, такие как альдуразим, элапраза, наглазим, реплагал и вимизим, в которых активными ингредиентами являются разрушающие сахариды ферменты от приблизительно 3 мг/флакон до приблизительно 10 мг/флакон, продаются как жидкие препараты для инъекций. Также, в международной публикации № WO 2012/081227, например, описано терапевтическое средство для межпозвонковой грыжи, содержащее в качестве активного ингредиента разрушающий сахарид фермент (конкретно хондроитиназу ABC).
Сущность настоящего изобретения
[0003] Лиофилизированные препараты превосходят жидкие препараты с точки зрения сокращения стоимости реализации. С другой стороны, из-за лиофилизации титры фермента часто значительно снижаются и даже более того, когда фермент присутствует в следовых количествах, и по этой причине в производство лиофилизированных препаратов были внедрены некоторые идеи, чтобы обеспечить получение продуктов с нужной ферментативной активностью. Например, в примерах международной публикации № WO 2012/081227 описан пример, в котором учитывая резкое снижение титра, обусловленное лиофилизацией, лиофилизированный препарат получают путем лиофилизации после помещения в контейнер фермента с большим превышением количества единиц, необходимых для разовой дозы. Как описано в этой публикации, после растворения и разведения полученного лиофилизированного препарата его отделяют в количестве, необходимом для введения, с целью получения вводимого раствора, содержащего активный компонент в количестве, необходимом для разовой дозы.
[0004] В способе, в котором сперва получают лиофилизированный препарат в количестве, значительно превышающем стандартную дозу, а затем часть отделяют в качестве разовой дозы, большое остающееся количество фермента, который не используют для введения, выбрасывают. Даже были случаи, когда впустую расходовали большие остающиеся количества дорогого фермента.
[0005] Вследствие этого, одной целью одного аспекта настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента разрушающий сахарид фермент, причем предотвращается снижение титра, обусловленное получением посредством лиофилизации.
[0006] В результате интенсивных исследований автора настоящего изобретения в свете упомянутой выше проблемы было найдено средство для предоставления фармацевтической композиции, содержащей разрушающий сахарид фермент с предотвращением снижения титра перед и после лиофилизации, и, таким образом, было совершено настоящее изобретение.
[0007] Один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, которая представляет собой готовую форму со стандартной дозой, содержащей в качестве активного ингредиента лиофилизированный разрушающий сахарид фермент с титром не менее 0,3 единицы/мкг, и содержащей фермент в количестве не менее 2 мкг и не более 8 мкг.
[0008] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения упаковки, содержащей фармацевтическую композицию и контейнер, содержащий фармацевтическую композицию, причем способ включает в себя этап помещения в контейнер раствора, содержащего не менее 2 мкг и не более 8 мкг разрушающего сахарид фермента, и этап лиофилизации раствора, так чтобы можно было обеспечить стандартную дозу фармацевтической композиции.
Описание вариантов осуществления
[0009] Согласно одному аспекту настоящего изобретения можно обеспечить фармацевтическую композицию, содержащую лиофилизированный разрушающий сахарид фермент, в которой существенно подавлено снижение титра при лиофилизации.
[0010] Далее настоящее изобретение будет подробно описано с пониманием, что настоящее изобретение не ограничено описанными вариантами осуществления. В рамках настоящего изобретения термин «этап» относится не только к независимому этапу, но также включает в себя любой этап, который нельзя четко отличить от других этапов при достижении первоначальной цели этапа. Если не указано иное, когда в композиции имеется множество веществ, соответствующих каждому компоненту, содержание каждого компонента в композиции означает общее содержание множества веществ в композиции.
[0011] (1) Фармацевтическая композиция и упаковка
Фармацевтическая композиция представляет собой лиофилизированный препарат, содержащий в качестве активного ингредиента разрушающий сахарид фермент. Фармацевтическая композиция представляет собой готовую форму со стандартной дозой, содержащей в качестве активного ингредиента лиофилизированный разрушающий сахарид фермент с титром не менее 0,3 единицы/мкг и содержащей разрушающий сахарид фермент в количестве не менее 2 мкг и не более 8 мкг. В рамках настоящего изобретения «стандартная доза» означает необходимое количество, полученное для разового введения, причем готовую форму со стандартной дозой составляют с фармацевтической композицией в виде стандартной дозы. Стандартная доза может содержать в дополнение к эффективной дозе добавленное количество, необходимое для получения раствора с разовой дозой.
[0012] В этой фармацевтической композиции значительно уменьшено снижение титра разрушающего сахарид фермента из-за лиофилизации. Снижение титра вследствие хранения также значительно уменьшено. Кроме того, поскольку фармацевтическая композиция представляет собой лиофилизированный препарат, который заранее получают для каждой стандартной дозы, она также является превосходной с точки зрения удобства, гигиены, безопасности и т.д. В медицинском заведении.
[0013] Упаковка содержит по меньшей мере контейнер и фармацевтическую композицию, содержащуюся в контейнере, и, вследствие этого, имеет фармацевтическую композицию, содержащуюся в контейнере.
Actinomycetes,
Streptococcus
[0014] «Разрушающий сахарид фермент» специально не ограничен, при условии, что его можно применять в качестве лекарственного средства. Примеры разрушающих сахариды ферментов могут включать в себя, например, разрушающие гликозаминогликан ферменты; гликозидазу; пептиды: N-гликаназу (PNGaseF, эндогликозидазу H и т.д.), α-L-идуронидазу, α-галактозидазу, β-галактозидазу, β-глюкуронидазу, β-глюкоцереброзидазу, идурсульфазу, идуронат-2-сульфатазу, N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазу, N-ацетилгалактозамин-4-сульфатазу и т.д. Примеры разрушающие гликозаминогликан ферментов включают в себя, например, кератаназы, такие как кератаназа I и кератаназа II; гепариназы, такие как гепариназа I, гепариназа II и гепариназа III; гепаритиназы, такие как гепаритиназа IV, гепаритиназа В, гепаритиназа T-I, гепаритиназа T-II, гепаритиназа T-III и гепаритиназа T-IV; хондроитиназы, такие как хондроитиназа ABC, хондроитиназа ACI, хондроитиназа ACII, хондроитиназа ACIII, хондроитиназа B и хондроитиназа C; гиалуронидазы, такие как гиалуронидаза, полученная из  и гиалуронидаза, полученная из , и т.д. Примеры гликозидаз включают в себя, например, микробную β-галактозидазу, α-галактозидазу и т.д.
[0015] В одном варианте осуществления разрушающий гликозаминогликан фермент используют в качестве разрушающего сахарид фермента. Разрушающие гликозаминогликан ферменты включают в себя гиалуронидазы, хондроитиназы, гепариназы, кератаназы, гепараназы, гепаритиназы и т.д. Предпочтительными разрушающими сахариды ферментами являются хондроитиназы, среди которых хондроитиназа ABC, хондроитиназа B, хондроитиназа ACI и хондроитиназа ACII являются более предпочтительными, а хондроитиназа ABC является особенно предпочтительной. Хондроитиназа ABC также может представлять собой кондолиаза.
Bacillus
Escherichia
Pseudomonas
Flavobacterium
Proteus
Arthrobacter
Streptococcus
Bacteroides
Aspergillus
Elizabethkingia
Streptomyces
Proteus vulgaris
из Proteus vulgaris
[0016] Нет отдельных ограничений источника разрушающего сахарид фермента. В одном предпочтительном варианте осуществления используют микробный разрушающий сахарид фермент. Например, неограничивающие примеры микроорганизмов включают в себя тех, что относятся к , , , , , , , , , ,  и т.д. Когда разрушающим сахарид ферментом является, например, хондроитиназа ABC, примером может быть хондроитиназа, полученная из  (например, хондроитиназа ABC).
[0017] Способ получения разрушающего сахарид фермента и т.д. отдельно не ограничен. Иллюстративный способ получения разрушающего сахарид фермента включает в себя этап получения культуры микроорганизмов или клеток животных, которые продуцируют разрушающий сахарид фермент, и этап получения разрушающего сахарид фермента из культивируемого продукта.
Proteus vulgaris
[0018] Разрушающий сахарид фермент, продуцируемый микроорганизмами, может представлять собой исходный продукт микроорганизмов, или он может быть получен после модификации микроорганизмов методом генной инженерии и т.д., который описан ниже, для получения целевого фермента. Например, когда разрушающим сахарид ферментом является хондроитиназа ABC, ее можно получить путем культивирования таких микроорганизмов, как , или ее можно получить методом генной инженерии с использованием ДНК, кодирующей хондроитиназу ABC, и т.д. Разрушающий сахарид фермент может иметь такую же аминокислотную последовательность, как исходное продукт микроорганизма, но альтернативно он может иметь делецию, замену и/или добавление и т.д. Некоторых аминокислот при условии, что все-таки достигнута намеченная цель лекарственного средства.
Bacillus
Escherichia
Pseudomonas
Flavobacterium
Proteus
Arthrobacter
Streptococcus
Bacteroides
Aspergillus
Elizabethkingia
Streptomyces
[0019] Примеры микроорганизмов могут включать в себя, например, микроорганизмы, относящиеся к , , , , , , , , ,  и . Условия выращивания (например, культуральная среда, условия культивирования и т.д.) микроорганизмов специалист в данной области может устанавливать по необходимости, выбирая соответствующим образом согласно используемому микроорганизму. Используя микроорганизмы для получения разрушающего сахарид фермента, можно получать большие количества с более низкой стоимостью, чем при получении разрушающего сахарид фермента с использованием клеток животных.
Escherichia coli
E. coli
Bacillus subtilis
[0020] Способ получения разрушающего сахарид фермента может включать в себя этап встраивания в хозяина рекомбинантного вектора, который экспрессирует ген, кодирующий целевой разрушающий сахарид фермент. Используемым вектором может быть, например, подходящий вектор экспрессии (фаговый вектор, плазмидный вектор и тому подобное) (предпочтительно содержащий регуляторную последовательность, такую как промотер), который способен экспрессировать встроенный ген. Вектор выбирают соответствующим образом для клеток-хозяев. Более конкретно, примеры этих векторных систем хозяев включают в себя комбинации  () с векторами экспрессии прокариотических клеток, такими как pET Series, pTrcHis, pGEX, pTrc99, pKK233-2, pEZZ18, pBAD, pRSET и pSE420; или комбинации клеток млекопитающих, таких как клетки COS-7 или клетки HEK293 с векторами экспрессии клеток млекопитающих, такими как pCMV Series, pME18S Series или pSVL; а также клетки насекомых, дрожжи и клетки-хозяева и т.д. и их различные соответствующие векторы.
[0021] Также, в качестве описанных выше векторов можно использовать векторы, которые сконструированы таким образом, чтобы экспрессировать белки слияния белков, закодированных перенесенными генами, с маркерными пептидами или сигнальными пептидами. Примеры таких пептидов включают в себя, например, белок A, инсулиновую сигнальную последовательность, His, FLAG, CBP (связывающий калмодулин белок), GST (глутатион-S-трансферазу) и т.д. Независимо от используемого вектора можно использовать обычный способ лечения рестрикционными ферментами и т.д., которые обеспечивают последующее связывание вставки последовательности нуклеиновых кислот и вектора, причем связывание происходит после затупления или липкими концами, по необходимости.
[0022] Трансформацию хоязина вектором можно осуществлять обычным способом. Например, вектор может быть внедрен в хозяина для трансформации с помощью способа с использованием коммерчески доступного реагента для трансфекции или с помощью способа с использованием диэтиламиноэтилдекстрана, методом электропорации или методом с использованием генной пушки и т.д.
E. coli
[0023] Условия выращивания (культуральная среда, условия культивирования и т.д.) для клеток микроорганизмов или животных, которые продуцируют разрушающий сахарид фермент, соответствующим образом выбирают для используемых микроорганизмов или клеток. В случае использования в качестве главного компонента можно использовать, например, культуральную среду, подготовленную надлежащим образом со средой Лурия-Бертани, и т.д. Также, например, при использованиив качестве клеток-хозяев клеток COS-7 для культивирования в условиях 37°C можно использовать среду DMEM, содержащую приблизительно 2% (о/о) фетальной бычьей сыворотки.
[0024] Разрушающий сахарид фермент можно получать из выращенного продукта с помощью известных способов экстракции и очистки белков, в зависимости от формы получаемого разрушающего сахарид фермента. Например, когда разрушающий сахарид фермент получают в растворимой форме, секретируемой в среду (культуральный супернатант), среду можно собирать и использовать прямо в качестве разрушающего сахарид фермента. Когда разрушающий сахарид фермент получают в растворимой форме, секретируемой в цитоплазму, или в нерастворимой (связанной с мембраной) форме, его можно экстрактировать с помощью такого метода обработки, как экстракция путем разрушения клеток, такого как метод с использованием устройства кавитации в азоте, гомогенизация, метод размалывания стеклянными шариками, обработка ультразвуком, метод осмотического шока или метод замораживания-оттаивания или экстракция поверхностно-активными веществами, или комбинация этих способов. Разрушающий сахарид фермент также можно очищать с помощью обычных и широко известных методов предшествующего уровня техники, таких как высаливание, фракционирование сульфатом аммония, центробежное разделение, диализ, ультрафильтрация, адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография, гидрофобная хроматография, обращенно-фазовая хроматография, гельпроникающая хроматография, аффинная хроматография или электрофорез или комбинация этих методов, и т.д.
[0025] Разрушающий сахарид фермент можно использовать отдельно или в виде комбинации двух или более разных типов. Разрушающий сахарид фермент также может иметь добавку в виде химически модифицированных групп, которые являются широко известными в предшествующем уровне техники, например, путем ацетилирования, полиалкиленового гликирования (например, полиэтиленового гликирования), алкилирования, ацилирования, биотинилирования, мечения (например, мечения флуоресцентым веществом, люминисцентным веществом и т.д.), фосфорилирования или сульфатации.
[0026] Фармацевтическая композиция может содержать фармацевтически приемлемый носитель. В рамках настоящего изобретения «фармацевтически приемлемый носитель», как правило, представляет собой компонент, обычно используемый в лекарствах, например, обычно используемое вспомогательное вещество, связующее вещество, буферное средство, вода для инъекций, регулирующее тоничность средство, консервант или успокаивающее средство.
[0027] Примеры буферных средств включают в себя, например, буферные средства, содержащие одно или несколько из соляной кислоты, гидроксида натрия, карбоната натрия, бикарбоната натрия, фосфорной кислоты, дигидрофосфата калия, гидроортофосфата калия, дигидрофосфата натрия, гидроортофосфата натрия, аминоуксусной кислоты, бензоата натрия, лимонной кислоты, цитрата натрия, уксусной кислоты, ацетата натрия, винной кислоты, тартрата натрия, молочной кислоты, лактата натрия, этаноламина, аргинина, этилендиамина и т.д., причем предпочтительными являются дигидрофосфат натрия и гидроортофосфат натрия.
[0028] Примеры регулирующих тоничность средств включают в себя хлорид натрия, хлорид калия, глицерин, маннитол, сорбитол, борную ксилоту, боракс, глюкозу, пропиленгликоль и т.д.
[0029] Например, конкретные примеры других фармацевтически приемлемых носителей включают в себя декстраны, сахарозу, лактозу, мальтозу, ксилозу, трегалозу, маннит, ксилит, сорбит, инозит, сывороточный альбумин, желатин, креатинин, полиалкиленгликоль, неионные поверхностно-активные вещества (например, полиоксиэтиленовый эфир сорбитола и жирной кислоты, полиоксиэтиленовое гидрогенизированное касторовое масло, эфир сахарозы и жирной кислоты и полиоксиэтилен-полиоксипропиленгликоль), и т.д. Среди которых предпочтительной является сахароза и/или полиалкиленгликоль, а более предпочтительными являются сахароза и/или полиэтиленгликоль. Полиэтиленгликоль предпочтительно имеет среднюю молекулярную массу не менее 200 и не более 25000, а более предпочтительно он является твердым при обычной температуре, например, со средней молекулярной массой не менее 2000 и не более 9000, и еще более предпочтительно не менее 3000 и не более 4000. Примеры полиэтиленгликоля могут включать в себя, например, полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой 3250, 3350 и 4000. Когда в качестве фармацевтически приемлемого носителя используют смесь полиэтиленгликоля и сахарозы, их предпочтительно смешивают таким образом, чтобы массовое соотношение полиэтиленгликоля/сахарозы обычно находилось в диапазоне от 1/10 до 10/1, а более предпочтительно таким образом, чтобы массовое соотношение полиэтиленгликоля/сахарозы приблизительно было 2/1.
[0030] В рамках настоящего изобретения «контейнер» отдельно не ограничен при условии, что он способен содержать фармацевтическую композицию. Примеры контейнеров включают в себя шприцы, флаконы, ампулы, инъекторы и т.д., причем предпочтительными являются флаконы. Материалом контейнера может быть, например, стекло, пластмасса и т.д., причем предпочтительным является стекло. Стекло представляет собой, например, боросиликатное стекло, известково-натриевое стекло и т.д. Контейнер предпочтительно также имеет закупоривающий элемент или крышку, а более предпочтительно он имеет резиновую пробку. Нет особых ограничений размера контейнера, который может быть не менее 0,5 мл и не более 100 мл, например, предпочтительно не менее 1 мл и не более 10 мл, более предпочтительно не менее 2 мл и не более 4 мл, и еще более предпочтительно 3 мл. Упаковка, содержащая фармацевтическую композицию, содержащуюся в контейнере, может заключать в себе инертный газ, например, газообразный азот или газообразный аргон, или она может быть деаэрирована.
[0031] Содержание воды лиофилизированного препарата может составлять не более 5% (м/м), например, предпочтительно не более 3% (м/м), и более предпочтительно не более 2% (м/м). «Содержание воды» в рамках настоящего изобретения представляет собой значение, измеряемое методом кулонометрического титрования.
[0032] Настоящее изобретение отличается тем, что количество разрушающего сахарид фермента на стандартную дозу фармацевтической композиции составляет не менее 2 мкг и не более 8 мкг. Хотя меньшее количество фермента обычно соответствует более заметному снижению титра перед и после лиофилизации, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что ограничение количества разрушающего сахарид фермента на стандартную дозу фармацевтической композиции до диапазона не менее 2 мкг и не более 8 мкг может значительно подавлять снижение титра перед и после лиофилизации. В предпочтительном варианте осуществления с точки зрения эффекта подавления снижения титра перед и после лиофилизации, количество разрушающего сахарид фермента на стандартную дозу фармацевтической композиции составляет не менее 2 мкг и не более 7 мкг, не менее 2 мкг и не более 6 мкг или не менее 2,5 мкг и не более 6 мкг. В более предпочтительном варианте осуществления количество разрушающего сахарид фермента на стандартную дозу фармацевтической композиции составляет не менее 2 мкг и не более 5 мкг или не менее 2,5 мкг и не более 5 мкг. В конкретном предпочтительном варианте осуществления количество разрушающего сахарид фермента на стандартную дозу фармацевтической композиции составляет не менее 3 мкг и не более 5 мкг.
[0033] В предпочтительном варианте осуществления количество разрушающего сахарид фермента, содержащегося в контейнере, составляет не менее 2 мкг и не более 8 мкг. В более предпочтительном варианте осуществления количество разрушающего сахарид фермента, содержащегося в контейнере, составляет не менее 2 мкг и не более 7 мкг, не менее 2 мкг и не более 6 мкг или не менее 2,5 мкг и не более 6 мкг. В еще более предпочтительном варианте осуществления количество разрушающего сахарид фермента, содержащегося в контейнере, составляет не менее 2 мкг и не более 5 мкг или не менее 2,5 мкг и не более 5 мкг. В конкретном предпочтительном варианте осуществления количество разрушающего сахарид фермента, содержащегося в контейнере, составляет не менее 3 мкг и не более 5 мкг.
[0034] Термин «титр» означает ферментативную активность (единицы) на 1 мкг разрушающего сахарид фермента, и выражен в единицах в виде единицы/мкг. В настоящем изобретении титр лиофилизированного разрушающего сахарид фермента составляет не менее 0,3 (единицы/мкг). В одном варианте осуществления титр лиофилизированного разрушающего сахарид фермента составляет не менее 0,3 (единицы/мкг) и не более 1 (единицы/мкг). В другом варианте осуществления титр лиофилизированного разрушающего сахарид фермента составляет не менее 0,32 (единицы/мкг) и не более 1 (единицы/мкг). В более предпочтительном другом варианте осуществления титр лиофилизированного разрушающего сахарид фермента составляет не менее 0,34 (единицы/мкг) и не более 1 (единицы/мкг). В еще более предпочтительном другом варианте осуществления титр лиофилизированного разрушающего сахарид фермента составляет не менее 0,36 (единицы/мкг) и не более 1 (единицы/мкг). В конкретном предпочтительном другом варианте осуществления титр лиофилизированного разрушающего сахарид фермента составляет не менее 0,38 (единицы/мкг) и не более 1 (единицы/мкг).
[0035] В одном варианте осуществления титр лиофилизированного разрушающего сахарид фермента составляет не менее 0,3 (единицы/мкг) и не более 0,5 (единицы/мкг). В другом варианте осуществления титр лиофилизированного разрушающего сахарид фермента составляет не менее 0,36 (единицы/мкг) и не более 0,5 (единицы/мкг).
[0036] «Единица (U)» показывает активность разрушающего сахарид фермента, причем 1 ед представляет количество, которое освобождает эквивалент 1 микромоля продукта распада от субстрата за единицу времени, в условиях оптимальной температуры и оптимального pH. Например, когда разрушающим сахарид ферментом является хондроитиназа ABC, 1 единица представляет количество, которое освобождает 1 микромоль ненасыщенного дисахарида в минуту от хондроитинсульфата натрия (хондроитинсульфат натрия, соответствующего Japanese Pharmaceutical Codex 2002), в условиях pH 8,0, 37°C.
[0037] В одном варианте осуществления ферментативная активность (активность разрушающих сахарид ферментов) на стандартную дозу составляет, например, не менее 4 единиц. В другом варианте осуществления ферментативная активность на стандартную дозу составляет, например, не менее 0,1 единицы и не более 4 единиц. В предпочтительном варианте осуществления ферментативная активность на стандартную дозу составляет не менее 0,5 единицы и не более 3 единиц. В более предпочтительном варианте осуществления ферментативная активность на стандартную дозу составляет не менее 0,9 единицы и не более 3 единиц, или не менее 0,9 единицы и не более 2,5 единиц. В еще одном предпочтительном варианте осуществления ферментативная активность на стандартную дозу составляет не менее 0,9 единицы и не более 2 единиц, не менее 1,25 единицы и не более 2 единиц, или 1,5 единицы.
[0038] В одном варианте осуществления ферментативная активность на контейнер составляет, например, не более 4 единиц. В другом варианте осуществления ферментативная активность на контейнер составляет, например, не менее 0,1 единицы и не более 4 единиц. В предпочтительном варианте осуществления ферментативная активность на контейнер составляет не менее 0,5 единицы и не более 3 единиц. В более предпочтительном варианте осуществления ферментативная активность на контейнер составляет не менее 0,9 единицы и не более 3 единиц, или не менее 0,9 единицы и не более 2,5 единиц. В еще одном предпочтительном варианте осуществления ферментативная активность на контейнер составляет не менее 0,9 единицы и не более 2 единиц, или не менее 1,25 единицы и не более 2 единиц (например, 1,5 единицы).
[0039] Согласно настоящему изобретению предоставлена фармацевтическая композиция в виде готовой формы с лиофилизированной стандартной дозой, содержащей небольшое количество разрушающего сахарид фермента (не менее 2 мкг и не более 8 мкг) с высоким титром (не менее 0,3 единицы/мкг).
[0040] Ферментативная активность разрушающего сахарид фермента, содержащегося в фармацевтической композиции в виде лиофилизированного препарата, может составлять, например, не менее 75%, предпочтительно не менее 80%, более предпочтительно не менее 85%, и еще более предпочтительно не менее 90%, причем ферментативная активность перед лиофилизацией определяется, как 100%. Значение 100% означает, что ферментативная активность является одинаковой перед и после лиофилизации.
[0041] Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения можно обеспечить фармацевтическую композицию, обладающую стабильностью при хранении, например, в течение 12 месяцев или более. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция обладает стабильностью при хранении в течение 24 месяцев или более, и в более предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция обладает стабильностью при хранении в течение 36 месяцев или более. Хотя верхний предел стабильности при хранении отдельно не ограничен, он может составлять, например, 48 месяцев или менее (например, 36 месяцев или менее).
[0042] В данном случае фраза «обладает стабильностью при хранении» означает, что титр (%) после защищенного от света хранения в предписанных условиях (например, 12 месяцев или более при 5°C±3°C, 6 месяцев или более при 25°C±2°C, или 3 месяца или более или 6 месяцев или более при 40°C±2°C) сохраняется на фармацевтически приемлемом уровне. «Стабильность при хранении» в данном документе оценивают, например, по норме сохранения титра (%). Например, норма сохранения титра после защищенного от света хранения образца в течение 12 месяцев или более при 5°C±3°C составляет, например, не менее 90%, и предпочтительно не менее 95%. Норма сохранения титра после защищенного от света хранения образца в течение 24 месяцев или более при 5°C±3°C составляет, например, не менее 90%, и предпочтительно не менее 95%. Норма сохранения титра после защищенного от света хранения образца в течение 36 месяцев или более при 5°C±3°C составляет, например, не менее 90%, и предпочтительно не менее 95%. Норма сохранения титра после защищенного от света хранения образца в течение 6 месяцев или более при 25°C±2°C составляет, например, не менее 90%, и предпочтительно не менее 95%. Норма сохранения титра после защищенного от света хранения образца в течение 3 месяцев или более при 40°C±2°C составляет, например, не менее 90%, и предпочтительно не менее 95%. Норма сохранения титра после хранения образца в течение 6 месяцев или более при 40°C±2°C составляет, например, не менее 65%, предпочтительно не менее 70%, и более предпочтительно не менее 75%. Термин «норма сохранения титра (%)» означает значение титра (%) после защищенного от света хранения фармацевтической композиции или упаковки согласно настоящему изобретению в условиях предписанной температуры (5°C±3°C, 25°C±2°C или 40°C±2°C), рассчитанное относительно 100% титра в начале хранения. Значение 100% означает, что ферментативная активность является одинаковой при и после начала хранения.
[0043] Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения можно обеспечить фармацевтическую композицию, обладающую сроком годности 12 месяцев или более. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция имеет срок годности 24 месяца или более, и в более предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция имеет срок годности 36 месяца или более. Хотя верхний предел срока годности отдельно не ограничен, он может составлять, например, 48 месяцев или менее (например, 36 месяцев или менее).
[0044] В рамках настоящего изобретения «срок годности» означает период, в течение которого можно ожидать, что лекарственное средство будет иметь такую же эффективность с того момента, когда было подтверждено, что лекарственное средство обладает этой эффективностью, после последующего хранения с помощью определенного метода хранения (например, с защитой от света при 5°C±3°C, защитой от света при 25°C±2°C или защитой от света при 40°C±2°C).
[0045] Ссылки на фармацевтическую композицию в данном документе могут включать в себя «фармацевтические композиции, содержащиеся в контейнере». Фармацевтическая композиция, содержащаяся в контейнере, содержит стандартную дозу разрушающего сахарид фермента.
[0046] Использование фармацевтической композиции, которая описана в данном документе, можно выбрать из разных известных вариантов использования разрушающих сахариды ферментов. Например, примеры вариантов использования фармацевтических композиций, содержащих в качестве активных ингредиентов разрушающие сахариды ферменты, могут включать в себя, но без конкретного ограничения, лечение грыжи, лизосомной болезни, келоидных рубцов, гипертрофических рубцов, мышечной дистрофии и повреждений спинного мозга. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическую композицию используют для лечения грыжи. В более предпочтительном варианте осуществления ее используют для лечения межпозвонковой грыжи (например, поясничной межпозвонковой грыжи).
[0047] В рамках настоящего изобретения «лечение» включает в себя не только полное исцеление, но также уменьшение проявления всех или некоторых симптомов заболевания, и подавление (включая сохранение и замедленное прогрессирование) прогрессирования или предотвращение заболевания. В данном случае предотвращение включает в себя предотвращение возникновения симптомов, связанных с заболеванием, когда симптомы не проявляются. Предотвращение также включает в себя, например, предотвращение возникновения органических нарушений или подавление развития еще не проявившихся симптомов, когда симптомы, связанные с заболеванием, присутствуют, даже если не наблюдается явных органических поражений.
[0048] Термины «в качестве активного ингредиента» и «эффективная доза» в рамках настоящего изобретения означают количество ингредиента, подходящее для разумного соотношения риск/польза и достаточное для получения нужного ответа без чрезмерных вредных побочных эффектов (токсичность, раздражение и т.д.). Термины «в качестве активного ингредиента» и «эффективная доза» могут меняться в зависимости от различных факторов, таких как симптомы, физическая конституция, возраст и пол пациента, подлежащего лечению. Однако специалист в данной области может определить эффективную дозу на основе результатов одного или более конкретных примеров испытаний в сочетании с общедоступной общей технической информацией, без необходимости проведения отдельного теста для каждой комбинации разных факторов.
[0049] В рамках настоящего изобретения «пациент» означает животное, и предпочтительно млекопитающее (например, человека, мышь, крысу, хомяка, морскую свинку, кролика, собаку, кошку, лошадь и т.д.), а более предпочтительно человека.
[0050] В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция, содержащаяся в контейнере, предоставлена в стерильном состоянии. Нет особых ограничений способа стерилизации фармацевтической композиции, и стерилизацию можно осуществлять любым способом, известным в предшествующем уровне техники, таким как стерилизация фильтрацией или стерилизация сухим жаром.
[0051] Форма введения фармацевтической композиции также отдельно не ограничена, и ее можно выбрать соответствующим образом по подлежащему лечению заболеванию, симптомам, тяжести, характеристикам пациента (например, возрасту и т.д.) и т.д. лиофилизированный препарат можно использовать в качестве раствора в любом нужном растворителе (например, в воде для инъекций, физиологическом солевом растворе и т.д.). Формой введения может быть любой путь введения, например, такой как внутридисковая инъекция, внутривенная инъекция, внутримышечная инъекция, подкожная инъекция или капельное введение. Доза фармацевтической композиции также может быть надлежащим образом установлена специалистом в данной области в зависимости от заболевания, подлежащего лечению, симптомов, тяжести, характеристик пациента (например, возраста и т.д.) и т.д.
[0052] Далее предпочтительные конкретные режимы настоящего изобретения будут описаны в качестве примера, с пониманием, что они не предназначены для ограничения технического объема настоящего изобретения. Фармацевтическая композиция для лечения межпозвонковой грыжи может быть объяснена в качестве примера следующим образом. Но естественно, что использование фармацевтических композиций не может быть ограничено.
[0053] (Фармацевтическая композиция 1)
Активный ингредиент: Хондроитиназа ABC
Количество фермента на стандартную дозу: не менее 2 мкг и не более 7 мкг
Титр фермента: не менее 0,36 (единицы/мкг) и не более 1 (единицы/мкг)
Активность фермента на стандартную дозу: не менее 0,9 единицы и не более 3 единиц
Применение: Межпозвонковая грыжа
[0054] (Фармацевтическая композиция 2)
Активный ингредиент: Хондроитиназа ABC
Количество фермента на стандартную дозу: не менее 2 мкг и не более 5 мкг
Титр фермента: не менее 0,36 (единицы/мкг) и не более 0,5 (единицы/мкг)
Активность фермента на стандартную дозу: не менее 0,9 единицы и не более 2,5 единиц
Применение: Межпозвонковая грыжа
[0055] (Фармацевтическая композиция 3)
Активный ингредиент: Хондроитиназа ABC
Количество фермента на стандартную дозу: не менее 2 мкг и не более 5 мкг
Титр фермента: не менее 0,36 (единицы/мкг) и не более 0,5 (единицы/мкг)
Активность фермента на стандартную дозу: не менее 0,9 единицы и не более 2 единиц
Применение: Межпозвонковая грыжа
[0056] (Фармацевтическая композиция 4)
Активный ингредиент: Хондроитиназа ABC
Количество фермента на стандартную дозу: не менее 2 мкг и не более 5 мкг
Титр фермента: не менее 0,36 (единицы/мкг) и не более 0,5 (единицы/мкг)
Активность фермента на стандартную дозу: не менее 1,25 единицы и не более 2 единиц
Применение: Межпозвонковая грыжа
[0057] (Фармацевтическая композиция 5)
Активный ингредиент: Хондроитиназа ABC
Количество фермента на стандартную дозу: не менее 3 мкг и не более 5 мкг
Титр фермента: не менее 0,36 (единицы/мкг) и не более 0,5 (единицы/мкг)
Активность фермента на стандартную дозу: 1,5 единицы
Применение: Межпозвонковая грыжа
[0058] (2) Набор
В одном варианте осуществления предоставлен набор, содержащий упаковку, содержащую фармацевтическую композицию, содержащуюся в контейнере, и вкладыш в упаковке или этикетку, объясняющую использование фармацевтической композиции для лечения грыжи, лизосомной болезни, келоидных рубцов, гипертрофических рубцов, мышечной дистрофии или повреждений спинного мозга.
[0059] Достаточно, чтобы набор содержал упаковку, содержащую фармацевтическую композицию, содержащуюся в контейнере, и вкладыш в упаковке или этикетку, объясняющую использование фармацевтической композиции для лечения грыжи, лизосомной болезни, келоидных рубцов, гипертрофических рубцов, мышечной дистрофии или повреждений спинного мозга. Другими словами, он также может содержать другие составляющие компоненты.
[0060] (3) Способ получения
Один аспект настоящего изобретения относится к способу получения упаковки, содержащей фармацевтическую композицию, содержащуюся в контейнере, причем способ получения включает первый этап помещения в контейнер раствора, содержащего не менее 2 мкг и не более 8 мкг разрушающего сахарид фермента, и второй этап лиофилизации раствора для получения фармацевтической композиции в стандартной дозе.
[0061] На первом этапе, хотя растворитель, используемый для получения раствора, содержащего разрушающий сахарид фермент, отдельно не ограничен, можно использовать, например, буферный раствор, такой как вода, физиологический солевой раствор или фосфатный буфер. Как упоминалось выше, раствор также может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Хотя pH раствора, содержащего разрушающий сахарид фермент, содержащийся в контейнере, отдельно не ограничен, он предпочтительно находится в диапазоне от 6,5 или выше до 7,5 или ниже.
[0062] В предпочтительном варианте осуществления на первом этапе раствор, содержащий разрушающий сахарид фермент, находится в контейнере, так что ферментативная активность на контейнер составляет не более 4 единиц. В более предпочтительном варианте осуществления раствор находится в контейнере, так что ферментативная активность на контейнер составляет не менее 0,5 единицы и не более 4 единиц. В еще более предпочтительном варианте осуществления раствор находится в контейнере, так что ферментативная активность на контейнер составляет не менее 1 единицы и не более 3 единиц. В конкретном предпочтительном варианте осуществления раствор находится в контейнере, так что ферментативная активность на контейнер составляет не менее 1,25 единицы и не более 2,5 единиц.
[0063] Второй этап представляет собой этап лиофилизации, на котором раствор, содержащий разрушающий сахарид фермент, замораживают, а для сушки удаляют влагу путем сублимации в замороженном состоянии. На втором этапе сушку проводят до тех пор, пока содержание воды фармацевтической композиции после лиофилизации станет, например, не более 5% (м/м). Сушку на втором этапе предпочтительно осуществляют до тех пор, пока содержание воды фармацевтической композиции после лиофилизации станет не более 3% (м/м), и более предпочтительно сушку проводят до тех пор, пока содержание воды станет не более 2% (м/м).
[0064] В способе получения согласно настоящему изобретению можно прямо использовать описания, примеры, предпочтительные диапазоны и т.д. Для вышеописанной «(1) композиции и упаковки» или вышеописанного «(2) набора».
[0065] В другом режиме настоящее изобретение также включает в себя использование готовой формы со стандартной дозой при получении фармацевтической композиции, подлежащей использованию для лечения грыжи, лизосомной болезни, келоидных рубцов, гипертрофических рубцов, мышечной дистрофии или повреждений спинного мозга, которое представляет собой использование готовой формы со стандартной дозой, содержащей в качестве активного ингредиента лиофилизированный разрушающий сахарид фермент с титром не менее 0,3 единицы/мкг, и содержащей разрушающий сахарид фермент в количестве не менее 2 мкг и не более 8 мкг. Также, в другом режиме настоящее изобретение также включает в себя использование готовой формы со стандартной дозой для лечения грыжи, лизосомной болезни, келоидных рубцов, гипертрофических рубцов, мышечной дистрофии или повреждений спинного мозга, которое представляет собой использование в качестве активного ингредиента готовой формы со стандартной дозой, содержащей лиофилизированный разрушающий сахарид фермент с титром не менее 0,3 единицы/мкг, и содержащей разрушающий сахарид фермент в количестве не менее 2 мкг и не более 8 мкг. Кроме того, в другом режиме настоящее изобретение также включает в себя готовую форму со стандартной дозой, подлежащей использованию для лечения грыжи, лизосомной болезни, келоидных рубцов, гипертрофических рубцов, мышечной дистрофии или повреждений спинного мозга, которая представляет собой готовую форму со стандартной дозой, содержащей в качестве активного ингредиента лиофилизированный разрушающий сахарид фермент с титром не менее 0,3 единицы/мкг, и содержащей разрушающий сахарид фермент в количестве не менее 2 мкг и не более 8 мкг.
[0066] Далее иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения будут описаны с пониманием, что настоящее изобретение не ограничено этими вариантами осуществления.
[0067] <1> Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента лиофилизированный разрушающий сахарид фермент, имеющий титр не менее 0,3 единицы/мкг, и
при этом фармацевтическая композиция представляет собой готовую форму со стандартной дозой, в которой количество разрушающего сахарид фермента составляет не менее 2 мкг и не более 8 мкг.
[0068] <2> Фармацевтическая композиция по <1>, в которой ферментативная активность составляет не более 4 единиц.
[0069] <3> Фармацевтическая композиция по <1> или <2>, в которой ферментативная активность разрушающего сахарид фермента составляет не менее 75%, где 100% определяется, как значение перед лиофилизацией.
[0070] <4> Фармацевтическая композиция по любому из <1>-<3>, причем композиция обладает стабильностью при хранении в течение не менее 12 месяцев при 5°C±3°C.
[0071] <5> Фармацевтическая композиция по любому из <1>-<4>, в которой разрушающим сахарид ферментом является разрушающий гликозаминогликан фермент.
[0072] <6> Фармацевтическая композиция по <5>, в которой разрушающим гликозаминогликан ферментом является хондроитиназа.
[0073] <7> Фармацевтическая композиция по <6>, в которой хондроитиназой является хондроитиназа ABC.
[0074] <8> Фармацевтическая композиция по любому из <1>-<7>, в которой фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель.
[0075] <9> Фармацевтическая композиция по <8>, в которой носитель содержит по меньшей мере любое из полиалкиленгликоля и сахарозы.
[0076] <10> Фармацевтическая композиция по любому из <1>-<9>, причем фармацевтическая композиция предназначена для лечения образования грыжи, лизосомной болезни, келоидных рубцов, гипертрофических рубцов, мышечной дистрофии или повреждений спинного мозга.
[0077] <11> Упаковка, содержащая фармацевтическую композицию по любому из <1>-<10>, содержащуюся в контейнере.
[0078] <12> Упаковка по <11>, в которой контейнером является флакон, шприц или ампула.
[0079] <13> Набор, содержащий упаковку, содержащую фармацевтическую композицию по любому из <1>-<10>, содержащуюся в контейнере, и вкладыш в упаковке или этикетку, объясняющую использование фармацевтической композиции для лечения грыжи, лизосомной болезни, келоидных рубцов, гипертрофических рубцов, мышечной дистрофии или повреждений спинного мозга.
[0080] <14> Способ получения упаковки, содержащей контейнер, содержащий фармацевтическую композицию, причем способ включает:
этап помещения в контейнер раствора, содержащего не менее 2 мкг и не более 8 мкг разрушающего сахарид фермента, и
этап лиофилизации раствора, так чтобы можно было обеспечить стандартную дозу фармацевтической композиции.
[0081] <15> Способ получения по <14>, причем фармацевтическая композиция содержит разрушающий сахарид фермент, имеющий титр не менее 0,3 единицы/мкг.
[0082] <16> Способ получения по <14> или <15>, причем ферментативная активность раствора, содержащегося в контейнере, составляет не более 4 единиц.
[0083] <17> Способ получения по любому из <14>-<16>, причем ферментативная активность разрушающего сахарид фермента после лиофилизации составляет не менее 75%, где 100% определяется, как ферментативная активность перед лиофилизацией.
[0084] <18> Способ получения по любому из <14>-<17>, причем разрушающим сахарид ферментом является разрушающий гликозаминогликан фермент.
[0085] <19> Способ получения по <18>, причем разрушающим гликозаминогликан ферментом является хондроитиназа.
[0086] <20> Способ получения по <19>, причем хондроитиназой является хондроитиназа ABC.
[0087] <21> Способ получения по любому из <14>-<20>, причем фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель.
[0088] <22> Способ получения по <21>, причем носитель содержит по меньшей мере любое из полиалкиленгликоля и сахарозы.
[0089] <23> Способ получения по любому из <14>-<22>, причем фармацевтическая композиция предназначена для лечения грыжи, лизосомной болезни, келоидных рубцов, гипертрофических рубцов, мышечной дистрофии или повреждений спинного мозга.
[0090] <24> Способ получения по любому из <14>-<23>, причем контейнером является флакон, шприц или ампула.
Примеры
[0091] Далее настоящее изобретение будет описано более подробно. Однако это описание не предназначено для ограничения технического объема настоящего изобретения.
[0092] <Пример Получения>
1) Препарат хондроитиназы ABC
Proteus vulgaris
Хондроитиназу ABC получали согласно способу, описанному в опубликованной не прошедшей экспертизу заявке на получение патента Японии № H6-153947. То есть ее получали путем очистки от культурального супернатанта. Титр полученной хондроитиназы ABC составлял 0,4 ед/мкг.
[0093] 2) Измерение ферментативной активности и измерение концентрации хондроитиназы ABC
Ферментативную активность хондроитиназы ABC измеряли следующим способом.
T
S
B
Образец фермента (хондроитиназы ABC) разбавляли в 4000 раз 0,01% (м/о) казеиновым реагентом (20 мМ фосфатный буфер). К 100 мкл разбавленного образца фермента добавляли и перемешивали 400 мкл раствора субстрата (3 мг/мл хондроитинсульфата натрия (Japanese Pharmaceutical Codex), 50 мМ 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиола, 50 мм ацетата натрия, pH 8). После реакции раствора при 37°C в течение 20 минут его нагревали в течение 1 минуты в водяной бане при 100°C. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, и для получения раствора образца добавляли 5,0 мл 0,05 M соляной кислоты. Стандартную хондроитиназу ABC разбавляли в 400 раз 0,01% (м/о) казеиновым реагентом. Для получения стандартного раствора ту же процедуру для получения раствора образца проводили с 100 мкл раствора разбавленной стандартной хондроитиназы ABC. Для получения контрольного раствора ту же процедуру, что и для получения раствора образца, также осуществляли для 100 мкл 0,01% (м/о) казеинового реагента. Для раствора образца, стандартного раствора и контрольного раствора измеряли поглощение A, A и A при длине волны 232 нм с использованием спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой области спектра, и ферментативную активность каждого раствора (ед/мл) определяли по следующей формуле. В данном случае ферментативной активностью раствора является ферментативная активность на единицу объема жидкости.
T
B
S
B
[0094] Ферментативная активность раствора (ед/мл) = (A-A)/(A-A)×4000/400×Us
T
A: Поглощение раствора образца
B
A: Поглощение контрольного раствора
S
A: Поглощение стандартного раствора
Us: Ферментативная активность раствора стандартной хондроитиназы ABC (ед/мл)
[0095] 1 ед (единицу) определяли, как значение ферментативной активности, которая катализирует реакцию высвобождения 1 микромоля ненасыщенного дисахарида за 1 минуту в указанных выше реакционных условиях. Значения ферментативной активности, используемые в данном документе, определяли на основе ферментативной активности раствора.
[0096] Количество фермента хондроитиназы ABC (белок, мкг) измеряли с помощью следующего метода Лоури. То есть 2,5 мл медно-аммиачного реактива добавляли и смешивали с 0,5 мл образца фермента (хондроитиназы ABC), разбавленного в 50 раз чистой водой, и обеспечивали отстаивание смеси в течение 10 минут при комнатной температуре (20°C или выше и 25°C или ниже). Затем в жидкость добавляли 0,25 мл 1 моль/л фенольного реагента и обеспечивали отстаивание в течение 30 минут при комнатной температуре для получения раствора образца. Бычий сывороточный альбумин разводили в воде для получения раствора с концентрацией 30 мкг/мл, 40 мкг/мл, 50 мкг/мл, 60 мкг/мл или 70 мкг/мл, и ту же процедуру с разбавлением образца фермента в 50 раз проводили для 0,5 мл каждого раствора для получения стандартного раствора. Ту же процедуру с разбавлением образца фермента в 50 раз также осуществляли для 0,5 мл воды для получения холостого раствора. Измеряли поглощение каждого раствор при длине волны 750 нм. Поглощение и концентрации белка стандартного раствора наносили на график методом линейной регрессии для определения стандартной кривой с наиболее близкой аппроксимацией в каждой точке. Из полученной стандартной кривой и поглощения раствора образца определяли количество белка в каждом растворе образца.
[0097] 3) Получение буфера для раствора фермента
Буфер для раствора фермента получали таким образом, чтобы он имел следующий состав.
(Композиция; на 1 л дистиллированной воды для инъекций)
Гидрофосфат натрия (двузамещенный фосфорнокислый натрий): 1,125 мг
Однозамещенный фосфорнокислый натрий: 0,3 мг
Сахароза: 5 мг
Полиэтиленгликоль 3350: 10 мг
pH: 6,5 или выше и 7,5 или ниже
[0098] <Тестовый пример 1>
Раствор хондроитиназы ABC, полученный с использованием буфера для раствора фермента, заполняли в 3 мл стекляные флаконы (продукт Schott AG) со следующими количествами фермента.
Образец 1: 1,3 мкг/флакон (0,5 ед/флакон)
Образец 2: 2,5 мкг/флакон (1,00 ед/флакон)
Образец 3: 5,0 мкг/флакон (2,00 ед/флакон)
Образец 4: 9,1 мкг/флакон (3,63 ед/флакон)
[0099] Раствор фермента, содержащийся в каждом флаконе, лиофилизировали (до содержания воды не более 2% (м/м)) при следующих условиях. После лиофилизации давление внутри флакона восстанавливали с помощью газообразного азота и закрывали резиновой пробкой для получения готовой формы со стандартной дозой.
[0100] (Условия Лиофилизации)
Этап 1: для замораживания образца температуру охлаждали от комнатной температуры до минус 35°C при обычном давлении.
Этап 2: в течение 30 минут сохраняли состояние температуры минус 35°C, обычное давление.
Этап 3: в течение 5 часов сохраняли состояние температуры минус 35°C, разрежение 13,3 Па.
Этап 4: сохраняя разрежение 13,3 Па, температуру поднимали от минус 35°C до 25°C.
Этап 5: в течение 5 часов сохраняли состояние температуры 25°C, разрежение 13,3 Па.
[0101] после лиофилизации в каждом флаконе измеряли ферментативную активность (ед/стандартная доза). Также рассчитывали титр (ед/мкг) и относительную ферментативную активность (ферментативную активность после лиофилизации, где 100% определяется, как ферментативная активность перед лиофилизацией) (%). Результаты показаны в Таблице 1.
[0102] [Таблица 1]
Образец 1
Образец 2
Образец 3
Образец 4
Количество Фермента(мкг/стандартная доза)
1,3
2,5
5,0
9,1
Ферментативная активность перед лиофилизацией (ед/стандартная доза)
0,50
1,00
2,00
3,63
Ферментативная активность после лиофилизации (ед/стандартная доза)
0,43
0,94
1,96
3,13
Титр после лиофилизации(ед/мкг)
0,331
0,376
0,392
0,344
Относительная ферментативная активность(%)
86,0
94,0
98,0
86,3
Примечания
Сравнительный Пример
Пример
Пример
Сравнительный Пример
[0103] Результаты в таблице 1 демонстрируют что за счет ограничения количества разрушающего сахарид фермента на стандартную дозу до конкретного диапазона (не менее 2,0 мкг и не более 8,0 мкг) можно получить лиофилизированный препарат с очень высоким титром.
[0104] <Тестовый пример 2>
Буфер для раствора фермента использовали для получения раствора хондроитиназы ABC. Полученный раствор фермента помещали в стеклянный флакон таким же образом, как в тестовом примере 1, так чтобы количество фермента составляло 1,5 ед/флакон, и лиофилизировали (до содержания воды не более 2% (м/м)). После лиофилизации давление внутри флакона восстанавливали с помощью газообразного азота и закрывали резиновой пробкой для получения готовой формы со стандартной дозой.
[0105] Каждый, полученных готовая форма со стандартной дозой измеряли ферментативную активность (ед/флакон) после лиофилизации. В результате, ферментативная активность 1,5 ед/флакон сохранялась даже после лиофилизации.
[0106] <Тестовый пример 3>
Получали готовую форму со стандартной дозой (1,5 ед/флакон) согласно способу тестового примера 1. Полученную готовую форму со стандартной дозой хранили в следующих условиях 1 или 2. После каждого периода хранения определяли титр фермента.
[0107] Условия 1): 25°C±2°C с защитой от света
Условия 2): 5°C±3°C с защитой от света
[0108] В результате в условиях 1 норма сохранения титра в течение 1 месяца, 3 месяцев и 6 месяцев после начала хранения составляла не менее 95% относительно 100% в качестве титра в начале хранения. В условиях 2 норма сохранения титра в течение 3 месяцев, 6 месяцев, 12 месяцев, 24 месяцев и 36 месяцев после начала хранения составляла не менее 95% относительно 100% в качестве титра в начале хранения.
[0109] Хотя настоящее изобретение было описано в отношении конкретных примеров и различных вариантов осуществления, специалисту в данной области должно быть понятно, что множество модификаций и вариантов применения описанных в данном документе вариантов осуществления возможны без отклонения от сути и объема настоящего изобретения.
Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет заявки на получение патента Японии № 2018-35884 которая была подана в патентное ведомство Японии 28 февраля 2018 года, и все ее содержание включено в настоящую заявку посредством ссылки. Все документы, заявки на получение патента и технические стандарты, описанные в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы было специально и отдельно указано, что отдельные документы, заявки на получение патента и технические стандарты включены посредством ссылки.