СРЕДСТВО, ПРОЯВЛЯЮЩЕЕ ПРОТИВИРУСНУЮ АКТИВНОСТЬ В ОТНОШЕНИИ ДНК-ВИРУСОВ
AGENT SHOWING ANTIVIRAL ACTIVITY ON DNA-VIRUSES

Изобретение относится к области химии и биомедицины, а именно к средствам, проявляющим противовирусную активность в отношении ДНК-вирусов.
Вирусные заболевания представляют собой общую угрозу здоровью населения во всем мире. Вирусы, содержащие геном в виде ДНК, вызывают целый ряд серьезных заболеваний животных (домашних и диких) и являются одними из наиболее опасных для человека. ДНК-вирусы обладают способностью трансформировать клетки, которые они заражают. Так, вирусы папиллом являются этиологическим фактором опухолей шейки матки [Adams, М. et. al., Vaccine, 2007, 25 (16), 3007-3013], вирус гепатита В является ассоциированным с опухолями печени [Chu, CM., J Gastroenterol Hepatol., 2000, Е25-30], вирус Эпштейна-Барра ассоциирован с раком носоглотки и лимфомой Беркитта [Moormann, AM. et al., Curr Opin Infect Dis., 2011, 24 (5), 435-41], а вирус герпеса типа 8 связан с саркомой Капоши [Cai, Q et al., Adv Virus Res. 2010, 78, 87-142].
Опасность заболеваний, вызванных ДНК-вирусами, делает разработку новых противовирусных препаратов и новых средств и способов их инактивации одной из наиболее актуальных задач сегодняшнего дня.
В настоящее время в качестве средств инактивации вирусов используют физические методы (облучение ультрафиолетовым светом, ионизирующее излучение, нагревание при повышенном давлении) и целый ряд химических соединений (формалин, вторичный этиленимин, ряд детергентов), которые различаются механизмом действия и, следовательно, областью применения, токсичностью, эффективностью инактивации вируса и стоимостью (De Benedictis, P. et al. Zoonoses Public Health. 2007, 54 (2), 51-68.).
Спектр соединений, позволяющих инактивировать вирус, в том числе и для получения цельновирионных вакцин, ограничен несколькими соединениями: это формальдегид, бинарный этиленимин (Hulskotte E.G.J., Vaccine, 1997, 15, 1839-1845), каприлат (Korneyeva М et.al., Biologicals, 2002, 30, 153-162), окисленные полиамины (Bachrach U., Amino Acids, 2007, 33 (2), 267-272), облучение длинноволновым УФ-светом в присутствии соединений, повышающих фоточувствительность вируса (Hanson C.V., et.al., J. gen. Virol., 1978, 40, 345-358; Specht, K.G. Photochem Photobiol. 1994, 59, 506-514). Известно, что обработка вируса такими соединениями приводит к частичному разрушению вирусных антигенных детерминант, и, тем самым, к снижению иммуногенных свойств вакцин, а выборочное разрушение формалином антигенных детерминант поверхностных гликопротеидов вирусов может индуцировать развитие несбалансированного иммунного ответа (Kasermann F., et al., Antiviral Res., 2001, 52, 33-41).
Наиболее ближайшим к заявляемому средству прототипом является средство, представляющее собой производные 1,4-диазабицикло[2.2.2.]октана общей формулы Dxn, обладающее высокой рибонуклеазной активностью [N.Koval'ov, et al., Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 2004, 32, 981-985.] На Фиг.1 представлена структурная формула соединений Dxn, где n=1, 4, 6 или 12, x - положение в бензольном кольце - орто, мета или пара. Однако в доступной литературе отсутствуют данные о противовирусной активности данных соединений в отношении ДНК-вирусов.
Задачей изобретения является получение эффективного, низкотоксичного средства, обладающего противовирусной активностью в отношении ДНК-вирусов.
Поставленная задача решается применением известных производных N-замещенного 1,4-диазабицикло[2.2.2.]октана общей формулы (I):
где R=1,4-замещенный бут-2-ин - для (1), 1,5-замещенный пентан - для (2), 1,4-диметилфенил для (3), у которых выявлена новая биологическая активность, заключающаяся в противовирусном действии в отношении ДНК-вирусов.
На фигуре 2 представлены структурные формулы соединений (1), (2), (3).
2
Известные соединения (1-3), общей формулы (I) были получены по общей схеме, представленной на фигуре 3. Процесс получения заявляемых известных соединений включает в себя реакцию коммерчески доступных 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана (D) с додецилхлоридом, с образованием монозамещенного 1,4-диазабицикло-[2.2.2]октана (DR), как описано в (Katritzky A.R.; Rao M.S.C. J.Heterocyclic Chem. 1991, 28, 1115), которое далее вступает в реакцию с коммерчески доступными дигалоген производными различных углеводородов. В результате реакции с высокими выходами образуется продукт [D(R)]L, содержащий два N-замещенных остатка 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, связанных различными линкерами (бутин-2 - в случае (1), пентан - в случае (2), бензол - в случае (3)).
Сопоставительный анализ заявляемых известных соединений с широко используемыми соединениями, такими как формалин, УФ-свет или мономерный или бинарный этиленимин (Hulskotte E.G.J., Vaccine, 1997, 15, 1839-1845), показал, что предлагаемые соединения обладают следующими преимуществами:
1) Заявляемые известные соединения обладают противовирусной активностью в отношении ДНК-вирусов, что позволяет рассматривать их как перспективные обеззараживающие агенты для применения в ветеринарии и здравоохранении.
2) Заявляемые известные соединения малотоксичны для человека и не требуют особых мер предосторожности (противогаз, перчатки, работа под вытяжкой) при работе с ними. Кроме того, эти соединения стабильны при хранении в виде концентрированных водных растворов или растворов в апротонных растворителях, таких как диметилсульфоксид.
3) Заявляемые соединения обладают мембранолитической активностью, что позволяет рассматривать их как перспективные агенты против ДНК-вирусов. Под «мембранолитической» активностью понимается «способность соединения дезинтегрировать липидные мембраны, включая оболочки вирионов».
2
Поиск по источникам научно-технической и патентной литературы показал, что противовирусная активность в отношении ДНК-содержащих вирусов для производных N-замещенного 1,4-диазабицикло[2.2.2.]октана общей формулы [D(R)]L в известных источниках не описана.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение 1,4-бис-(4-додецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октил-1-метил)бут-2-ина тетрахлорида (1)
Схема синтеза соединения (1) представлена на фигуре 4. К раствору хлорида 1-додецил-4-аза-1-азониабицикло[2.2.2]октана (4) (349 мг, 1.1 ммоль) в 20 мл ацетонитрила добавили по каплям раствор 1,4-дихлоробут-2-ина (5) (61.5 мг, 0.5 ммоль) в 5 мл ацетонитрила. После перемешивания в течение 24 ч выпавший осадок отфильтровали, промыли ацетонитрилом (3×15 мл) и высушили в вакууме. Продукт - гигроскопичный мелкокристаллический порошок желтоватого цвета. Масса полученного соединения (1) 296 мг (выход 78%).
1
+
+
+
+
+
+
+
13
+
+
+
+
+
+
+
+
H
H
H
H
H
H
H
С
C
C
C
C
C
C
C
C
3
2
11
3
2
9
2
2
3
2
9
2
2
3
2
10
2
2
2
3
2
3
2
11
3
2
9
2
2
3
2
2
10
3
2
2
2
8
2
3
2
10
2
2
2
3
2
2
Спектр ЯМР H, δ, м.д. (J, Гц): 0.89 (уш. т, 6Н, C(CH)N, J 6.6), 1.27 (м, 36Н, CH(C)CHCHN); 1.73 (м, 4Н, CH(CH)CCHN); 3.55 (м, 4Н, CH(CH)CN); 4.15 (м, 24Н, N(CC)N); 5.09 (с, 4Н, CHCN). Спектр ЯМР С, δ, м.д.: 13.73 (Н(СН)N); 21.27 (CH(CH)HCHN); 21.88 (CHH(CH)N); 25.43, 28.27, 28.50, 28.56, 28.74, 28.82, 31.10 (CH(CH)(H)CHN); 53.22 (CH(CH)HN); 50.31 и 50.97 (N(HH)N); 63.62 (CHN); 80.16 (CHN).
ИК спектр: 850.7, 1061, 1113, 1173, 1468, 1636, 2058 (мал), 2853, 2923, 3417.
Пример 2. Получение 1,5-бис-(4-додецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан дихлорид дибромида (2)
Схема синтеза соединения (2) представлена на фигуре 5. К раствору хлорида 1-додецил-4-аза-1-азониабицикло[2.2.2]октана (4) (349 мг, 1.1 ммоль) в 10 мл диметилформамида добавили по каплям 1,5-дибромидпентана (6) (115 мг, 0.5 ммоль). После перемешивания в течение 24 ч при 80°С выпавший осадок соединения (2) отфильтровали, промыли ацетонитрилом (3 раза по 15 мл) и высушили в вакууме. Получено гигроскопичное мелкокристаллическое вещество. Масса полученного соединения (2) 247 мг (выход 57%).
1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
13
+
+
+
+
+
2
2
3
+
H
H
H
H
H
H
H
H
Н
Н
C
C
С
C
C
C
C
3
2
11
3
2
9
2
2
2
2
2
2
2
3
2
9
2
2
2
2
2
2
2
3
2
10
2
2
2
2
2
3
3
2
11
3
2
9
2
2
3
2
2
10
3
2
2
2
8
2
2
Спектр ЯМР H, δ, м.д. (J, Гц): 0.93 (уш. т, 6Н, C(CH)N, J 6.6), 1.32-1.45 (м, 36Н, CH(C)CHCHN); 1.32 (м, 2Н, NCHCHCCHCHN); 1.88 (м, 4Н, CH(CH)CCHN); 1.98 (м, 4Н, NCHCCHCCHN); 3.62 (м, 4Н, CH(CH)CN); 3.75 (м, 4Н, CHCN); 4.07-4.12 (м, 24Н, N(СС)N). Спектр ЯМР С, δ, м.д.: 12.95 (H(CH)N); 21.27 (CH(CH)HCHN); 21.64 (СНН(СН)N); 22.21, 25.63, 28.66, 28.95, 29.10, 29.21, 31.54 (CH(CH)(H)CHN); 50.81 и 51.03 (N(HH)N); 64.71 (CHN).
Пример 3. Получение 1,4-бис-[(4-додецилазониа-1-азониабицикло[2.2.2]октил)метил] бензола тетрахлорид (3 Dp12)
Схема синтеза соединения (3) представлена на фигуре 6. К раствору n-бис(хлорметил)бензола (7) в 5 мл ацетонитрила (175 мг, 1 ммоль) добавили раствор хлорида 1-додецил-4-аза-1-азониабицикло[2.2.2]октана (4) (349 мг, 2.1 ммоль) в 20 мл ацетонитрила. После перемешивания в течение 30 ч при 24°С выпавший осадок соединения (3) отфильтровали, промыли ацетонитрилом (3 раза по 15 мл) и высушили в вакууме. Получено гигроскопичное мелкокристаллическое вещество. Масса полученного соединения (3) 526 мг (выход 65%).
1
+
+
+
+
+
+
аром
13
+
+
+
+
+
+
+
бензол
H
H
H
H
H
H
С
C
C
C
C
C
C
C
3
2
11
3
2
9
2
2
3
2
9
2
2
3
2
10
2
2
2
3
3
2
11
3
2
9
2
2
3
2
2
10
3
2
2
2
8
2
2
2
3
3
2
10
2
2
Спектр ЯМР H, δ, м.д. (J, Гц): 0.86 (уш. т, 6Н, C(CH)N, J 6.3), 1.28-1.41 (м, 36Н, CH(C)CHCHN); 1.83 (м, 4Н, CH(CH)CCHN); 3.71 (м, 4Н, CH(CH)CN); 4.18-4.22 (м, 24Н, N(CC)N), 7.96 (уш. с, 4Н, Н). Спектр ЯМР С, δ, м.д.: 14.55 (Н(СН)N); 22.61 (CH(CH)HCHN); 22.61 (CHH(CH)N); 23.29, 26.62, 29.68, 30.01, 30.08, 32.62, 31.10 (CH(CH)(H)CHN); 51.80 и 52.14 (N(HH)N); 66.08 (CH(CH)HN); 68.98 (CHN); 129.37, 135.01 (6C).
Пример 4. Инактивация вируса осповакцины соединениями (1),
(2), (3).
Противовирусную активность соединений (1), (2), (3) изучали на модели вируса осповакцины штамм ЛИ ВП.
5
Использовали вирус осповакцины (ВОВ) с инфекционным титром 10 бляшко-образующих единиц (БОЕ) вируссодержащего материала. Инфекционную активность вируса определяли методом подсчета БОЕ на клетках CV-1 (клетки почки обезьян). В основе метода лежит способность вируса образовывать единичные участки лизированных клеток (бляшек) на клеточном монослое после заражения одной клетки определенным количеством вирусных частиц, минимально необходимых для инфицирования одной клетки. При заражении клеточного монослоя последовательными разведениями вируса и последующего окрашивания живых клеток красителем «гентиановым фиолетовым», происходит визуализация числа лизированных бляшек, являющихся мерой количества вируса. Инактивацию вируса осповакцины соединениями (1), (2), (3) проводили при 37°С в 50 мМ Трис-HCl буфере, pH 7.0, содержащем 0.2 М КСl и 2 мМ EDTA, в течение 24 ч при 37°С при концентрациях соединений (1), (2), (3) от 0,04 мкМ до 1 мМ.
Соединения (1), (2), (3) эффективно инактивируют ВОВ, причем уровень инактивации вируса повышается с увеличением концентрации соединений, при которой проводили инактивацию вируса. Так, инкубация вируса в течение 24 ч при 37°С с соединением (1) в концентрации 0,05 мМ, с соединением (2) - 0,01 мМ, с соединением (3) - 0,025 снижает титр вируса приблизительно на 1 порядок по сравнению с контролем. При увеличении концентрации соединений (1), (2), (3) до 0,1, 0,06 и 0,5 мМ, соответственно, наблюдается полная инактивация ВОВ. В таблице 1 представлены данные по противовирусному действию соединений (1), (2), (3).
Таблица 1
Название соединения
Вирус осповакцины
Концентрации соединений, использованных для инактивации вируса
Титр вируса при инкубации 18 ч при 37°С, lg(БОЕ/мл)
(1)
0,1 мМ
<1
(2)
0,06 мМ
<1
(3)
0,5 мМ
<1
контроль
-
5
Полученные результаты однозначно свидетельствуют о высокой противовирусной активности соединений (1), (2), (3).
Пример 5. Исследование мембранолитической активности соединений (1), (2), (3).
6
Мембранолитическую активность соединений исследовали в экспериментах с эритроцитами барана. Способность соединений вызывать лизис мембран эритроцитов оценивали после инкубации эритроцитов барана в концентрации 15×10 в присутствии одного из соединений (1), (2), (3) в диапазоне концентраций от 0.001 до 2 мМ в течение 120 минут при 37°С. После инкубации эффективность лизиса оценивали по изменению окрашивания фосфатного буфера, измеренному на спектрофотометре на длине волны 550 нм. В качестве положительного контроля за 100% принимали мембранолитическую активность равного объема дистиллированной воды. В качестве негативного контроля использовали 100 мМ фосфатный буфер, в присутствии которого в обозначенных условиях эффективность лизиса мембран эритроцитов не превышала 2%.
Соединения (1), (2), (3) вызывали лизис мембран эритроцитов, причем его эффективность возрастала с увеличением концентрации соединений, при которой проводили инкубацию суспензии эритроцитов. Так, инкубация вируса в течение 2 ч при 37°С с соединением (1) в концентрации 0,1 мМ, с соединениями (2), (3) - 0,05 мМ приводила к полному лизису мембран эритроцитов, сопоставимому с лизисом эритроцитов, инкубированных в присутствии дистиллированной воды. Снижение концентрации соединений до 0,001 мМ в случае (1), 0,005 мМ в случае (2) и 0,001 мМ в случае (3) приводило к полной потере мембранолитической активности данными соединениями. В таблице 2 представлены значения эффективности лизиса мембран эритроцитов соединениями (1), (2), (3).
Таблица 2
Название соединения
Мембранолитическая активность соединений
Концентрации соединений, при которой наблюдается лизис мембран эритроцитов, мМ
Эффективность лизиса при инкубации 2 ч при 37°С, %
(1)
0,1
100
(2)
0,05
100
(3)
0,05
100
Буфер фосфатный
100
2
Вода дистиллированная
-
100
Таким образом, было продемонстрировано, что соединения (1), (2), (3) обладают высокой мембранолитической активностью.
Пример 6. Исследование морфологии вирусных частиц в процессе инактивации с помощью соединения (1).
Исследование морфологии вирусных частиц после инкубации с соединением (1) проводили с помощью электронной микроскопии методом негативного контрастирования. Исследуемые образцы сорбировали на опорные электронно-микроскопические сетки, покрытые формваровой пленкой, в течение 30 секунд, остаток жидкости убирали, сетку высушивали и помещали в контрастирующий раствор (2% раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты в дистиллированной воде) на 30 сек, остаток раствора убирали, сетку высушивали. Образцы (4-6 сеток) изучали в трансмиссионном электронном микроскопе Jem 1400 при увеличениях от 10000 до 200000.
Электронно-микроскопическое исследование морфологии вирусных частиц, инактивированных соединением (1), выявило вирионы с поврежденной липидной оболочкой, у небольшой части вирусных частиц также наблюдали изменение толщины липидного слоя (Фиг.7А), контроль представлен на фиг.7Б. Степень повреждения структуры вирионов прямо зависел от концентрации соединения (1). По мере возрастания концентрации соединения с 0,05 до 0,5 мМ происходило развитие повреждений их структуры. На основании результатов электронно-микроскопических исследований можно заключить, что соединение (1) дезинтегрирует липидные оболочки вирионов, то есть обладает мембранолитической активностью, что косвенно доказывает возможность инактивации ДНК-вирусов.
Пример 7. Влияние соединений (1), (2), (3) на жизнеспособность
клеток CV-1
2
Клетки линии CV-1 (клетки почки африканской зеленой мартышки) культивировали в среде DMEM, содержащей 5%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина) и антимикотик амфотерицин (0.25 мкг/мл), в атмосфере 5%-ного CO при 37°С.
3
-7
-3
570
630
Жизнеспособность клеток после инкубации с соединениями (1), (2), (3) определяли с помощью МТТ теста, который основан на способности живых клеток превращать соединения на основе тетразола (МТТ) в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты (15×10 клеток на лунку). Через 48 ч в лунках меняли среду, и к клеткам добавляли равный объем водного раствора соединения (1), (2), или (3) до конечной концентрации в среде от 10 до 10 М. Клетки инкубировали в присутствии соединений еще в течение суток в тех же условиях. По окончании инкубации без смены среды к клеткам добавляли раствор МТТ (5 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере до концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 3 ч в тех же условиях. Среду удаляли, к клеткам добавляли по 100 мкл диметилсульфоксида, в котором происходит растворение образовавшихся в клетках кристаллов формазана, и измеряли оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре на длинах волн 570 и 630 нм, где А - поглощение формазана, а А - фон клеток.
50
50
Из экспериментальных данных вычисляли значение IC, концентрацию соединений, при которой наблюдается гибель 50% клеток. Значения IC соединений (1), (2) и (3) для клеток CV-1 приведены в таблице 3.
Таблица 3
Соединение
IC<sub>50</sub>, мМ
(1)
0.035
(2)
0.015
(3)
0.02
Из приведенных данных видно, что обработка клеток соединениями (1), (2) или (3) вызывает их эффективную гибель только при концентрациях соединений выше 0.05 мкМ, что свидетельствует о низкой токсичности соединений.
Таким образом, приведенные примеры однозначно указывают на высокую мембранолитическую и противовирусную активность соединений (1), (2), (3), что позволяет использовать их в качестве активных компонентов для разработки лекарственных форм препаратов, предназначенных для лечения вирусных заболеваний.