СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ПЕРЕВИВНОЙ СОЕДИНИТЕЛЬНОТКАННОЙ САРКОМЫ М-1 КРЫС ПРИ КОМБИНИРОВАННОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ И ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ
METHOD FOR TREATMENT OF RAT M-1 TRANSFERABLE CONNECTIVE TISSUE SARCOMA UNDER COMBINED IMPACT OF PHOTODYNAMIC THERAPY AND RADIATION THERAPY

Изобретение относится к экспериментальной медицине, конкретно к онкологии, в частности к комбинированной терапии (фотодинамической терапии (ФДТ) и лучевой терапии (ЛТ)) перевивной поверхностной солидной соединительнотканной опухоли саркома М-1 крыс.
На протяжении многих лет борьбы с онкологическими заболеваниями происходит совершенствование уже хорошо изученных методов лечения и активная разработка новых методов противоопухолевой терапии. Все методы лечения направлены на максимальное уничтожение опухолевых клеток. Для каждого метода характерны различные механизмы воздействия на опухолевые клетки, вызывающие их гибель. Эффективность лечебного воздействия определяется длительностью задержки роста опухоли от начала воздействия.
ФДТ имеет преимущества перед лучевой и химиотерапией. Это локальная форма терапии, которая обладает отсутствием тяжелых местных и системных осложнений. Основными преимуществами ФДТ перед общепринятыми методами лечения злокачественных опухолей являются избирательность поражения, отсутствие риска хирургического вмешательства и тяжелых системных осложнений, низкая стоимость лечения. При ФДТ в клетках происходит очень сложный комплекс изменений. Мишенями фотохимических воздействий являются многие клеточные структуры: клеточные мембраны, митохондрии, ДНК и микротрубочки. По мере прогрессирования повреждения мембран могут наблюдаться и другие электролитные нарушения. Сублетальное повреждение клеток посредством вовлечения многих сигнальных систем может вызывать апоптоз. Тем не менее, in vivo важными могут быть и непрямые эффекты, такие как ишемический некроз вследствие повреждения сосудов. ФДТ, кроме того, является «пусковым» механизмом в активации противоопухолевого иммунного ответа, связанного с усилением процесса гибели опухолевых клеток, а также развития острого воспалительного процесса. Таким образом, механизм действия ФДТ включает целый комплекс прямых и непрямых реакций взаимодействия различных компонентов, в конечном итоге приводящих к цитотоксическим эффектам. В то же время ФДТ нельзя назвать панацеей от рака, метод имеет свои пределы. Это, прежде всего, ограниченная глубина повреждения опухолевой ткани (до 1,0 см).
фиг. 1
Во многих странах мира сегодня ученые и клинические специалисты ведут исследования, направленные на создание новых более эффективных и безопасных лекарственных средств – фотосенсибилизаторов (ФС). В настоящее время большой интерес в ФДТ злокачественных новообразований в качестве ФС вызывают производные ряда хлорофилла, одним из которых является ФС амидоаминхлорин (), разработанный профессором Г.В. Пономаревым (Институт биомедицинской химии РАМН).
а
Фотосенсибилизатор – Амидоаминхлорин е6 (ААХ е6)разработан на основе взаимодействия метилфеофорбида с различными первичными аминами и является химической модификацией периферических заместителей хлорина е6. Характерной особенностью хлорина е6 является тот факт, что в зависимости от растворителя его спектральные характеристики сильно варьируют. Так, известно, что в водных средах его максимум поглощения смещается в коротковолновую область от 662 нм. Для экспериментальных исследований может применяться раствор в водном димексиде для внутрибрюшинного введения. Один из пиков поглощения находится на волне 662 нм, что коррелируется с высоким квантовым выходом синглетного кислорода.
Лучевая терапия (ЛТ) (радиотерапия) метод лечения злокачественных новообразований. Он является наиболее доступным и одним из самых распространенных методов лечения рака. Опухолевые клетки оказались наиболее ранимыми, потому что интенсивное деление клеток делает их особенно чувствительными к воздействию радиации. В ходе такой терапии оказывается разрушительное воздействие на раковые клетки, останавливается процесс их деления и роста. Задержка клеточного деления, может быть временной, преходящей и не сказывается на жизнеспособности облученной клетки. К реакциям такого типа — обратимым реакциям — относятся также различные нарушения метаболизма, в т.ч. угнетение обмена нуклеиновых кислот и окислительного фосфорилирования, слипание хромосом и др. Обратимость этого типа лучевых реакций объясняется тем, что они являются следствием повреждения части множественных структур, утрата которых очень быстро восполняется или просто остается незамеченной. Существенно иную природу имеют эффекты, приводящие облученную клетку к гибели — летальные лучевые реакции. Под клеточной гибелью в радиобиологии понимают утрату клеткой способности к делению. Сравнительно невысокие показатели местного лечения и побочные реакции после ЛТ диктуют необходимость поиска новых подходов к этому методу лечения.
С целью усиления противоопухолевого воздействия, а также с целью расширения сферы применения ФДТ, как эффективного противоопухолевого, но щадящего органосохраняющего метода лечения, была разработана схема комбинированной терапии, совмещающая ФДТ и ЛТ саркомы М-1.
Использование ФДТ для улучшения результатов комбинированного лечения ставит задачу поиска ее оптимального места в терапевтических схемах. Необходимо определить практическую возможность комбинирования методов, наилучшую временную последовательность их проведения, а также безопасность их совместного использования. С целью определения непосредственного вклада ФДТ в результаты комбинированного лечения были сравнены результаты лечения животных, получавших только ФДТ или только ЛТ и ФДТ с предшествующей или последующей ЛТ.
2
Известен способкомбинированного органосохраняющего лечения злокачественных опухолей орбиты Российский патент 2006 года по МПК A61N5/67 A61F9/08 Описание патента на изобретение RU2286187C1. Облучение орбиты проводят с помощью дистанционной гамма-терапии. Целью лучевой терапии является постлучевая регрессия остаточной опухоли (радикальная программа облучения) или предотвращение рецидива. При этом суммарная доза дистанционной гамма-терапии зависит от стадии неопластического процесса и колеблется от 40 до 60 Гр (1,5-1,8 Гр за фракцию). Технический результат достигается благодаря комбинации трех способов: орбитотомии с иссечением опухоли ad maximum, фотодинамической терапии с использованием дозы фотосенсибилизатора Фотосенса 10 мг/кг и при равномерном распределении световой энергии в полости орбиты после иссечения опухоли и при выбранном режиме лазерного воздействия, а также химиотерапии. Облучение лазерным излучением с длиной волны 670 нм, находящейся в максимуме спектра поглощения применяемого фотосенсибилизатора с суммарной плотностью мощности 120-800 мВт/см.
Известен способ cочетанной ФДТ и ЛТ в лечении рака легкого (Рагулин Ю. А., Каплан М. А., Медведев В. Н., Афанасова Н. В., Капинус В. Н. Российский биотерапевтический журнал. 2011. Т. 10. № 2. С. 33-36). В исследование включено 57 больных, имевших обтурационные вентиляционные нарушения, обусловленные опухолевым стенозом главного или долевого бронха, которые получили лучевое и химиолучевое лечение. Всем больным проводилась лучевая терапия по методике дробления дневной дозы 2,5 Гр на две фракции 1 Гр и 1,5 Гр с интервалом 4–5 ч. ФДТ с фотосенсибилизаторами хлоринового ряда (фотолон, фотодитазин) проводили за 10–14 дней до начала лучевой терапии. По 10 больных из каждой группы получали одновременную химиотерапипо схеме цисплатин+этопозид или карбоплатин+паклитаксел. 28 больным перед лучевой (или химиолучевой) терапией проводилась ФДТ с целью реканализации бронха и восстановления пневматизации легочной ткани, 29 больных составили контрольную группу. В исследовании показана высокая клиническая эффективность ФДТ и безопасность ее использования. Проведение ФДТ перед лучевой терапией у больных с опухолевым стенозом крупных бронхов позволяет добиться выраженного положительного эффекта, заключающегося в ликвидации ателектаза и устранении гиповентиляции (у 85,7 больных против 62,1 % положительного эффекта у пациентов, получающих только лучевую терапию). Всем больным проводилась лучевая терапия по методике дробления дневной дозы 2,5 Гр на две фракции 1 Гр и 1,5 Гр с интервалом 4–5 ч. ФДТ с фотосенсибилизаторами хлоринового ряда (фотолон, фотодитазин) проводили за 10–14 дней до начала лучевой терапии. По 10 больных из каждой группы получали одновременную химиотерапипо схеме цисплатин+этопозид или карбоплатин+паклитаксел.
У известных способов, применяемых при лечении рака легкого методов, есть свои достоинства и недостатки. Обычно комбинирование двух или трех методов ведет к увеличению вероятности излечения опухоли. При этом удается потенцировать преимущества обоих методов и минимизировать их недостатки. Так, ФДТ обладает высокоэффективным местным действием, но недостаточно воздействует на микрометастазы в нормальной ткани и региональных коллекторах. Лучевая терапия, наоборот, достаточно эффективно воздействует на микрометастазы, но в то же время, в ряде случаев, не достигает полного эффекта при воздействии на саму опухоль. Учитывая все вышеизложенное, представляется возможным и весьма перспективным сочетание лучевой терапии и ФДТ.
2
2
Известен способ рентгеновской индуцированной фотодинамической терапии: сочетание лучевой терапии и фотодинамической терапии (X-Ray Induced Photodynamic Therapy: A Combination of Radiotherapy and Photodynamic Therapy. PNAS. August 20, 2019.  vol. 116. no. 34. 16823–16828). В данном способе используют рентгеновское излучение в качестве источника энергии для активации процесса ФДТ. В дополнение к разрыву догмы проникновения мелкой ткани, исследования показали более эффективное уничтожение опухолевых клеток с помощью X-ФДТ (100 Дж/см, плотность мощности ~ 0.2 Вт/см), чем только при радиотерапии (ЛТ). Исследуемый PS представлял собой крем Metvix (Galderma, Франция), поскольку его липофильность обеспечивает относительно глубокое проникновение в опухоли. Этот PS второго поколения содержит метиламинолевулинат (MAL) в виде гидрохлорида (C6H11NO3 • HCl) (160 мг/г) и, среди прочего, цетостеариловый спирт (40 мг/г), метилпарагидроксибензоат (2 мг/г), пропилпарагидроксибензоат (1 мг/г) и арахисовое масло (30 мг/г). Metvix представляет максимумы возбуждения при 405 и 635 нм. Содержащийся метиламинолевулинат метаболизируется до внутриклеточных порфиринов, включая протопорфирин IX (PpIX), который обладает высокой светочувствительностью и в основном накапливается в опухоли, а не в здоровых клетках. Однако механизмы цитотоксичности не были выяснены. В настоящем авторы исследуют механизмы действия X-ФДТ на раковые клетки. Результаты показывают, что X-ФДТ больше, чем просто производная ФДТ, но по существу является комбинацией ФДТ и ЛТ. Эти две модальности нацелены на различные клеточные компоненты (клеточная мембрана и ДНК соответственно), что приводит к усиленным терапевтическим эффектам. В результате X-ФДТ не только снижает краткосрочную жизнеспособность раковых клеток, но и их клоногенность в долгосрочной перспективе. С этой точки зрения, X-ФДТ можно также рассматривать как уникальный метод радиочувствительности, и как таковой он дает явные преимущества перед ЛT в терапии опухолей, особенно для радиорезистентных клеток. Это продемонстрировано не только in vitro, но и in vivo с опухолями H1299, которые либо подкожно инокулируются, либо имплантируются в легкие мышей. Эти результаты и достижения имеют большое значение для развития X-ФДТ как нового метода лечения против рака.
Однако, в данном исследовании крем-фотосенсибилизатор наносили на опухоль, а не вводили внутривенно, а также количество животных составляло всего 4 особи, причем одно из животных было контрольным, что является недостаточным, для достоверного установления противоопухолевой эффективности. Кроме того, противоопухолевую эффективность определяли только по весу опухоли на 12 сутки после воздействия.
Известен cравнительный анализ рентгенологических результатов самостоятельной лучевой терапии и лучевой терапии с предшествующей фотодинамической терапией (Рагулин Ю.А., Каплан М.А., Медведев В.Н., Афанасова Н.В., Кудрявцев Д.В., Капинус. Радиация и риск/ Бюллетень Национального радиационно-эпидемиологического регистра. 2015. Т. 24, №4. С. 53-61). Проводилась лучевая терапия по методике дробления дневной дозы 2,5 Гр на две фракции 1 Гр и 1,5 Гр с интервалом 4-5 часов. 24 больным за 2-4 недели до начала курса лучевой терапии проводили эндоскопическую ФДТ. Контрольное рентгенологическое исследование выполнялось при достижении СОД-45-50 Гр. Группы больных были сопоставимы по полу, возрасту, морфологическому строению опухолей. Положительная рентгенологическая динамика была достигнута у 17 (65,4%) больных группы ЛТ и у 20 (83,3%) группы ЛТ+ФДТ. Разрешение ателектаза с полным восстановлением пневматизации наблюдалось у 4-х больных из 10-ти (40%) группы ФДТ+ЛТ, в то время как в контрольной группе данное событие отмечено лишь в 2-х случаях из 10-ти (20%). Отсутствие эффекта и отрицательная динамика были зафиксированы у 9 (34,6%) больных группы №1, в группе №2 нарастания вентиляционных расстройств не наблюдалось, отсутствие динамики отмечено у 4-х (16,7%). Осложнения (пневмонии) наблюдались у 3-х (15%) больных в группе ЛТ+ФДТ и у 2-х (7,7%) в группе ЛТ.
Однако, при анализе частоты осложнений в группе ЛТ+ФДТ отмечено, что у 14 пациентов, которые сразу после ФДТ получали антибактериальную терапию, пневмония развилась только в одном случае (7,1%). Использование ФДТ перед лучевой терапией у пациентов с опухолевыми стенозами крупных бронхов, обуславливающими расстройства вентиляции, позволяет добиться лучших непосредственных результатов лечения, заключающихся в устранении ателектаза и гиповентиляции.
2
2
2
2
2
Известен сравнительный анализ эффективности лучевого фотодинамического лечения экспериментальной опухоли (Н.М. Ростовцев, Н. А. Котляров. Педиатрический вестник Южного Урала. 2015. № 1. С. 29-32). Для опытов использовали 258 мышей беспородных и линий СВА, С57В1, СЗНА, гибриды (СВА* С57В1). Средняя масса тела опытного животного была около 25 ± 2,5 г. Животные-опухоленосители выводились из эксперимента на 7-е, 14-е, 21-е, 28-е сутки от момента перевивки карциномы Эрлиха, полученную от мышей-доноров. В работе использовали фотосенсибилизатор 2-го поколения — производное хлорина Е 6 — Радахлорин (производства Россия), который вводили внутрибрюшинно. Для близкофокусной лучевой терапии животных однократным рентгеновским облучением в дозе 5 Гр использовалась рентгеновская установка. Также включалась резекции опухоли. Лечение животных начинали на 7-е сутки от момента перевивки опухоли. Все опытные животные были разделены на 6 групп, включая контрольную группу. В 1-Ш группах животным-опухоленосителям проводили ФДТ, применяя дозу лазерного облучения 100 Дж/см, 200 Дж/см, 400 Дж/см соответственно. Для близкофокусной лучевой терапии в IV группе животных однократным рентгеновским облучением в дозе 5 Гр использовалась рентгеновская установка. Эффективность проведенного лечения определяли по торможению роста опухоли (ТРО%) и частичной регрессии опухоли (ЧР%) в установленные сроки. По сравнению с данными группами значительно меньший объем опухоли на всех сроках эксперимента регистрировался после рентгенотерапии (Р < 0,05). Наиболее выраженное и сохраняющееся на протяжении всего периода наблюдения подавление темпов роста опухоли отмечалось при ФДТ в дозе 400 Дж/см. Заключение. В результате проведенных экспериментальных исследований на перевиваемой асцитной карциноме Эрлиха установлено, что оптимальная доза лазерного облучения соответствует 400 Дж/см. Полная регрессия опухоли была достигнута при комбинации резекции опухоли и интраоперационной ФДТ в данной дозе на остаточную опухоль.
2
Однако, в данной публикации в описании метода не указана плотность мощности лазерного излучения, что не позволяет сравнить с нашим исследованием, кроме того, использовалась большая доза ФС – 5,0 мг/кг и высокая плотность энергии – до 400 Дж/см.
Техническим решением является определение оптимальных условий проведения комбинированной терапии в различной последовательности ее проведения (ФДТ + ЛТ или ЛТ + ФДТ), при разных временных интервалах, с малой дозой фотосенсибилизатора и невысокими параметрами γ-излучения для достижения выраженного положительного эффекта, заключающегося в ликвидации новообразования.
Технический результат достигается тем, что так же, как и в известном способе для лечения экспериментальной опухоли используют фотодинамическую терапию (ФДТ).
2
2
Особенностью заявляемого способа является то, что проводят комбинированное воздействие лучевой терапии и фотодинамической терапии по схеме: ЛТ + ФДТ, с интервалом времени 48 часов, сеанс ФДТ проводят с фотосенсибилизатором амидоаминхлорином е6 (ААХ), который вводят интраперитонеально в дозе 1,25 мг/кг массы животного, что при экстраполяции на дозу человека составляет 0,21 мг/кг, лекарственно-световой интервал между введением препарата и лазерным облучением составляет  3,0 часа, параметры лазерного воздействия: плотность энергии Е = 300 Дж/см, плотность мощности Ps = 0,48 Вт/см, при проведении лучевой терапии доза γ-излучения составляла 20 Гр.
Изобретение поясняется подробным описанием, сериями опытов, таблицами и иллюстрациями, на которых изображено:
Фиг.1 – Формула фотосенсибилизатора амидоаминхлорина.
Фиг.2 – Динамика накопления ААХ е6 в опухоли и здоровой ткани бедра крыс после интраперитонеального введения в дозе 2,5 мг/кг. По оси абсцисс – срок после интраперитонеального введения ФС; по оси ординат: слева интенсивность флуоресценции в усл. ед., справа – индекс контрастности (красные линии на графиках).
2
2
Фиг. 3 - Процент животных с полной регрессией саркомы М-1 на 21 сутки после комбинированной терапии в различной последовательности ее проведения (ФДТ +ЛТ или ЛТ + ФДТ), при разных временных интервалах (24 ч или 48 ч) и параметрах лазерного облучения (ФДТ - E = 150 или 300 Дж/см, Ps = 0,34 или 0,48 Вт/см); ФС амидоаминхлорин в дозе 1,25 мг/кг; ЛТ - доза γ-излучение 20 Гр:
- I серия опытов (ФДТ + ЛТ) - четыре группы животных с разными параметрами лазерного облучения и с различными интервалами времени;
- II серия опытов (ЛТ + ФДТ) - четыре группы животных с различными интервалами времени и с разными параметрами лазерного облучения;
- Монотерапия - три группы животных. Две группы животных с проведением ФДТ с разными параметрами лазерного облучения и одна группа с проведением ЛТ.
Способ осуществляют следующим образом:
В эксперименте in vivo нами использовались белые беспородные лабораторные крысы, в качестве экспериментальной модели опухоли использовали саркому М-1. Работа выполнена с соблюдением международных рекомендаций по проведению исследований с использованием лабораторных животных, изложенных в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях» (Страсбург, 1987).
Источником лазерного излучения служил полупроводниковый лазерный аппарат «Аткус – 2» производства ЗАО «Полупроводниковые приборы» (Санкт-Петербург) с длиной волны излучения 662 ± 1 нм. Диаметр светового пятна составлял 1,5 см. Животныепри облучении находились под общим тиопенталовым наркозом (внутрибрюшинно 2,5 % раствор в объеме 0,2 мл/100г массы животного).
60
Источником γ– излучения являлась установка «Луч – 1» (гамма-терапевтическая установка с источником Со). ЛТ проводили дистанционно (ДЛТ), расстояние по шкале 65 см, локально однократно с малой дозой облучения 20 Гр.
Половозрелым самкам крыс массой тела 160–195 г на 7-9 сутки после перевивки при достижении наибольшего диаметра опухолевых узлов 0,8-1,0 см
Экспериментальная часть, доказывающая эффективность предложенного способа.
Работа выполнена на 119 половозрелых самках крыс массой тела 165–190 г с имплантированной подкожно с внешней стороны бедра саркомой М-1. При достижении наибольшего диаметра опухолевых узлов 0,8-1,0 см животных методом рандомизации распределяли на опытные и контрольные группы.
2
2
2
2
Опытным животным проводят комбинированное воздействие фотодинамической терапии и лучевой терапии по схемам: ФДТ + ЛТ или ЛТ + ФДТ, с интервалом времени 24 или 48 часов. При проведении ФДТ ФС амидоаминхлорин е6 (ААХ) вводили в дозе 1,25 мг/кг массы животного (что при экстраполяции на дозу человека составляет 0,21 мг/кг),  лекарственно-световой интервал составлял 3,0 часа, с параметрами лазерного излучения  плотность энергии Е = 150 Дж/см, плотность мощности Ps = 0,34 Вт/см или Е = 300 Дж/см, Ps = 0,48 Вт/см лазерного излучения и  при проведении лучевой терапии (доза γ-излучения  20 Гр).
Доза ФС 1,25 мг/кг и доза гамма-излучения 20 Гр была одинаковой при всех проведенных исследованиях.
Контрольные животные-опухоленосители без какого-либо воздействия.
in vivo
Для установления времени лазерного облучения после введения ФС определяли лекарственно световой интервал (ЛСВИ). Фотодинамическая активность фотосенсибилизаторов и сохранность окружающих тканей реализуются за счет селективного накопления фотосенсибилизаторов в опухолевой ткани. Поэтому их регистрация с целью определения концентрации и динамики содержания в тканях  необходима для определения оптимального времени от момента введения ФС до лазерного воздействия – ЛСВИ. Динамику накопления ФС в опухоли и здоровой ткани бедра изучали методом лазерной спектрометрии с помощью установки ЛЭСА-01-Биоспек. Уровень концентрации ФС оценивали по интенсивности флуоресценции, селективность определяли по индексу контрастности (опухоль/здоровая ткань). ФС ААХ вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 1,25 мг/кг. Первое измерение проводили до введения препарата (0 часа), а затем через 20 минут; 1,0; 1,5; 3,0 часа и 4,0 и 5,5 часа.
0
Объём опухоли измеряли: до проведения лечения (V), и на 3, 7, 10, 14, и 21 сутки после терапии. Конечный срок исследования был выбран исходя из необходимости сравнения динамики роста опухоли у крыс с продолженным ростом после терапии с контрольными животными, так как на данный срок исследования уже начинается гибель контрольных животных.
Проведение комбинированной терапии:
Первая серия опытов (ФДТ + ЛТ) - четыре группы животных. Сеанс ФДТ с дозой фотосенсибилизатора ААХ е6 1,25 мг/кг, с разными параметрами лазерного излучения  и через интервалы времени (24 или 48 ч) проведение ЛТ (лучевое воздействие – γ-излучение – 20 Гр):
2
2
1. группа. ФДТ (E = 150 Дж/см, Ps = 0,34 Вт/см) и через 24 ч. ЛТ;
2
2
2. группа. ФДТ (E = 300 Дж/см, Ps = 0,48 Вт/см) и через 24 ч. ЛТ;
2
2
3. группа. ФДТ (E = 150 Дж/см, Ps = 0,34 Вт/см) и через 48 ч. ЛТ;
2
2
4. группа. ФДТ (E = 300 Дж/см, Ps = 0,48 Вт/см) и через 48 ч. ЛТ.
Вторая серия опытов (ЛТ + ФДТ) - четыре группы животных. Проведение ЛТ (лучевое воздействие – γ-излучение – 20 Гр) и через интервалы времени (24 или 48 ч) сеанс ФДТ с дозой фотосенсибилизатора ААХ хе6 1,25 мг/кг, с разными параметрами лазерного излучения:
2
2
1. группа. ЛТ и через 24 ч. ФДТ (E = 150 Дж/см, Ps = 0,34 Вт/см);
2
2
2. группа. ЛТ и через 24 ч. ФДТ (E = 300 Дж/см, Ps = 0,48 Вт/см);
2
2
3. группа. ЛТ и через 48 ч. ФДТ (E = 150 Дж/см, Ps = 0,34 Вт/см);
2
2
4. группа.  ЛТ и через 48 ч. ФДТ (E = 300 Дж/см, Ps = 0,48 Вт/см).
Монотерапия - три группы животных.  Две группы животных с проведением ФДТ с дозой фотосенсибилизатора 1,25 мг/кг и разными параметрами лазерного и одна группа с проведением ЛТ (лучевое воздействие – γ-излучение – 20 Гр):
2
2
1. группа. ФДТ (1,25 мг/кг, E = 150 Дж/см, Ps = 0,34 Вт/см);
2
2
2. группа.  ФДТ (1,25 мг/кг, E = 300 Дж/см, Ps = 0,48 Вт/см);
3. группа.  ЛТ однократно в дозе гамма-излучения 20 Гр.
Контролямислужили крысы-опухоленосители без какого-либо воздействия.
В качестве критериев определения противоопухолевой эффективности использовали:
1. Коэффициент абсолютного прироста опухоли (К). Для этого сначала вычисляли объёмы опухолей по формуле:
(1)
1,
2
3,
где: dd,d- три взаимно перпендикулярные диаметры опухоли,
3
V - объем опухоли в см.
Коэффициент абсолютного прироста опухоли (К) рассчитываем по формуле:
(2)
0
где: V -объем опухоли до воздействия,
t
V – объем опухоли на определенный срок наблюдения;
2. Процент частичной регрессии опухоли (ЧР %). За ЧР принимали уменьшение роста опухоли от первоначального объема (-1,00 < К  <0). Значимая ЧР ≥50%.
3. Процент животных в группе с полной регрессией (ПР) опухоли (К = -1,00). За полную регрессию опухоли принимали отсутствие видимой и пальпируемой опухоли.
Статистическую обработку результатов для независимых групп выполняли с использованием программ Statistica 6.0. Описательная статистика представлена в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего (M±m). Для оценки уровня значимости межгрупповых различий использовали U-критерий Манна–Уитни при p<0,05.
I. Изучение динамики накопления ФС в опухоли и здоровой ткани.
Уровень и селективность накопления ФС в опухоли, а также скорость его выведения из нормальной ткани являются важнейшими характеристиками для ФДТ. Они влияют как на эффективность метода, так и на вероятность снижения побочных эффектов (Фиг. 2).
Из данных, представленных на фиг. 2 видно, что в течение 5,5 часов после внутрибрюшинного введения ААХ е6 в дозе 2,5 мг/кг происходит постепенное увеличение уровня накопления его, как в опухоли, так и в здоровой ткани бедра.
Максимальный уровень накопления ФС в опухоли наблюдался через 3,0 – 5,5 часа после введения ФС. Что касается индекса контрастности, то самый высокий (1,8) определяли через 3 часа.
Таким образом, оптимальное время проведения лазерного облучения после введения ФС наступает через 3 часа – т.е. в это время мы имеем высокое накопление ФС в опухолевой ткани и минимальное содержание его в здоровых тканях.
II. Изучение противоопухолевой эффективности
Первая серия опытов   ФДТ + ЛТ (табл. 1, фиг. 3)
.
2
2
0
Группа 1 При проведении комбинированной терапии (ФДТ - E =150 Дж/см, Ps = 0,34 Вт/сми через 24 часа ЛТ) получен незначительный ингибирующий эффект на 21 сутки после лечения. ПР наблюдалась у 30% животных. ЧР отмечалась у 10 % животных, процент регрессии от V не превышал 32 % и на 21 сутки у данных особей наблюдался рост опухоли. Коэффициент абсолютного прироста опухоли на 21 сутки у животных с продолженным ростом снижен по сравнению с контролем, но недостоверно значим.
2
2
0
Группа 2. (ФДТ - E=150 Дж/см, Ps=0,34 Вт/см и через 48 часов ЛТ) получен более значительный ингибирующий эффект на 21 сутки исследования по сравнению с группой 1 при тех же параметрах лазерного излучения. Полная регрессия опухоли отмечалась у 50% животных. ЧР наблюдалась у значительного количества животных, и процент регрессии более 50 % от V. Коэффициент абсолютного прироста у животных с ростом опухоли снижен и значим по сравнению с контролем (p < 0,050).
2
2
)
0
Группа 3. При увеличении плотности энергии и плотности мощности лазерного излучения (ФДТ - E = 300 Дж/см; Ps = 0,48 Вт/см и через 24 часа ЛТ получили увеличение ингибирующего эффекта по сравнению с группами 1 и 2. ПР опухоли на 21 сутки после терапии уже у 66,7% животных. ЧР не превышала 39% от V и на 21 сутки у них наблюдался рост опухоли. Коэффициент абсолютного прироста у животных с ростом опухоли достоверно ниже, чем в контроле (p < 0,050).
2
2
)
0
Группа 4. (ФДТ - E = 300 Дж/см; Ps = 0,48 Вт/см и через 48 часов ЛТ - получили усиление ингибирующего эффекта. ПР опухоли составляла на 21 сутки после комбинированного воздействия 64,5%. ЧР наблюдалась и составляла 54 % от V и в дальнейшем наблюдалась полная регрессия опухоли. Темп прироста у животных с продолженным ростом опухоли уже значительно ниже по сравнению с контролем (p < 0,010).
ФДТ + ЛТ
E
300 Дж/см
; Ps = 0,48 Вт/
E=150 Дж/см
, Ps=0,34 Вт/см
2
2
2
2
Таким образом, на 21 сутки после комбинированной терапии в последовательности  противоопухолевый эффект зависел в первую очередь от параметров лазерного излучения. При световой дозе  = см противоопухолевый эффект оказался более значительным 66,7% и 64,5% по сравнению со  – только у 30% и 50% животных наблюдалась полная регрессия опухоли.
E=150 Дж/см
, Ps=0,34 Вт/см
2
2
При параметрах лазерного облучения  более выраженный эффект отмечался через 48 часов (50%) против (30%) – через 24 часа.
E=300 Дж/см
, Ps=0,48 Вт/см
2
2
При параметрах лазерного облучения  противоопухолевая эффективность была практически одинаковой как через 24 часа (66,7%) так и через 48 часов (64,5%).
Вторая серия опытов ЛТ + ФДТ(табл. 1, Фиг. 3)
(ЛТ
и через 24 часа ФДТ - E=150 Дж/см
, Ps=0,34 Вт/см
2
2
0.
Группа 1. При проведении комбинированной терапии ) на 21 сутки исследования у 50% животных наблюдалась ПР опухоли, что выше, чем в I серии опытов при тех же параметрах. ЧР наблюдалась у значительного количества животных и составляла от 40 % до 54 % от VВ дальнейшем у этих животных наблюдалась ПР опухоли.Темп прироста у животных с продолженным ростом опухоли достоверно ниже, чем в контроле (p < 0,050).
ЛТ
через 48 часов ФДТ
(E = 150 Дж/см
; Ps = 0,34 Вт/см
2
2
Группа 2. ( и  при тех же параметрах лазерного излучения как в группе 1 )на 21 сутки исследования наблюдался значительный ингибирующий эффект. На этот срок после комбинированного воздействия ПР опухоли отмечалась уже у 77,8% животных. Это больше, чем в I серии при данных параметрах. Снижение коэффициента абсолютного прироста у животных с ростом опухоли значимо по сравнению с контролем (p < 0,050).
ЛТ и через 24 часа ФДТ
(E = 300 Дж/см
; Ps = 0,48 Вт/см
)
2
2
0
Группа 3. (, но при увеличении параметров лазерного излучения– ПР опухоли на 21 сутки у 75 % животных. ЧР наблюдалась у значительного количества животных, отмечалась до 80 % от V. Продолженный рост опухоли наблюдался только у одного животного.
ЛТ и через 48 часов ФДТ
(E
300 Дж/см
; Ps = 0,48 Вт/см
2
2
Группа 4. ( при тех же параметрах лазерного излучения как в группе 3  = ) получили усиление ингибирующего эффекта. ПР составляла на 21 сутки после лечения уже у 90% животных. По сравнению с I серией опытов – это значительное увеличение противоопухолевого эффекта. Продолженный рост опухоли также наблюдался только у одного животного. Коэффициент абсолютного прироста равен почти нулю (К = 0,09).
ЛТ
Таким образом, на 21 сутки после комбинированной терапии в последовательности  + ФДТ противоопухолевый эффект был значительно выше, чем в первой серии опытов (ФДТ + ЛТ) и зависел, как от параметров лазерного излучения, так и от интервала времени.
E
300 Дж/см
; Ps = 0,48 Вт/
E=150 Дж/см
, Ps=0,34 Вт/см
2
2
2
2
При интервале времени 48 часов противоопухолевый эффект оказался более значительным 90% ( = см) и 77,8% () по сравнению с интервалом времени через 24 часа - только у 75% и 50% животных наблюдалась полная регрессия опухоли при тех же параметрах лазерного воздействия.
Использование ЛТ перед ФДТ (с интервалом времени 48 часов) у животных с саркомой М-1 позволяет добиться выраженного положительного эффекта, заключающегося в полной регрессии злокачественных образований у 90% животных.
Таблица 1.
Динамика саркомы М-1 крыс после комбинированной терапии в различной последовательности ее проведения ФДТ и ЛТ или ЛТ и ФДТ,
с различными временными интервалами, с дозой фотосенсибилатора е6 1,25 мг/кг,
2
2
2
2
ФДТ (Е = 150 Дж/см, Ps = 0,34 Вт/см или Е = 300 Дж/см, Ps = 0,48 Вт/см); ЛТ (20 Гр)
№
Параметры лазерного- и гамма- излучения
Интервал времени
Коэффициент абсолютного прироста опухоли (К) (М±m) у крыс с ростом опухоли
Полная регрессия опухоли  (ПР %)
Частичная регрессия опухоли (ЧР %)
3 сутки
7 сутки
10 сутки
14 сутки
21 сутки
<b>ФДТ + ЛТ</b>
1.
Е=150Дж/см<sup>2</sup>,P<sub>S</sub>=0,34Вт/см<sup>2</sup>20 Гр
24 часа
1,82 ± 1,0220, 0 %10,0 %
1,34 ± 0,39 *20,0 %10,0 %
4,47 ± 1,66*20,0 %10,0 %
4,90 ± 1,86 *30,0 %0 %
12,39, ± 2,7230,0 %0 %
2.
Е=150Дж/см<sup>2</sup>,P<sub>S</sub>=0,34Вт/см<sup>2</sup>20 Гр
48 часов
0,29 ± 0,11*11,1%33,3 %
0,12 *44,4 %44,4 %
0,78 ± 0,00 *55,6 %22,2 %
0,82 ± 0,24*50,0 %0 %
3,09 ± 0,83 *50,0 %0 %
3.
Е=300Дж/см<sup>2</sup>,P<sub>S</sub>=0,48Вт/см<sup>2</sup>20 Гр
24 часа
0,86 ± 0,42 *66,7 %0 %
1,29*88,7 %0 %
0,47*77,8 %11,1 %
1,14 ± 1,00*77,8 %0 %
3,27 ± 1,94*66,7 %0 %
4.
Е=300Дж/см<sup>2</sup>,P<sub>S</sub>=0,48Вт/см<sup>2</sup>20 Гр
48 часов
1,31 ± 1,1775,0 %12,5 %
1,8887,5 %0 %
0,5087,5 %0 %
0,5087,5 %0 %
0,90 ± 0,36*64,5 %0 %
<b>ЛТ + ФДТ</b>
1.
20 Гр Е=150Дж/см<sup>2</sup>,P<sub>S</sub>=0,34Вт/см<sup>2</sup>
24 часа
0,70 ± 0,37*12,5 %37,5 %
1,07 ± 0,96*50,0 %25,0 %
1,99 ± 0,13*50,0 %25,0 %
1,64 ± 1,09*50,0 %0 %
5,36 ± 2,66*50,0 %0 %
2.
20 Гр Е=150Дж/см<sup>2</sup>,P<sub>S</sub>=0,34Вт/см<sup>2</sup>
48 часов
6,4388,9 %0 %
3,99*77,8 %11,1 %
4,7*77,8 %11,1 %
4,66 ± 3,03*77,8 %0 %
7,43 ± 6,72*77,8 %0 %
3.
20 Гр Е=300Дж/см<sup>2</sup>,P<sub>S</sub>=0,48Вт/см<sup>2</sup>
24 часа
1,16 ± 0,3311,1 %44,4 %
0,76 ± 0,10*44,4 %33,3 %
0,64 ± 0,04*44,4 %33,3 %
0,59*66,7 %33,3 %
0,57*75,0 %12,5  %
4.
20 Гр Е=300Дж/см<sup>2</sup>,P<sub>S</sub>=0,48Вт/см<sup>2</sup>
48 часов
1,97±0,180 %0 %
0,25±0,17*50,0 %0 %
0,15*80,0 %10,0%
0,12*90,0 %0 %
0,09*90,0 %0 %
<b>Контроль  (K)</b>
<b>2,11±0,25</b>
<b>8,08±0,95</b>
<b>17,49±2,54</b>
<b>43,78±10,23</b>
<b>81,94±22,56</b>
Примечание:уровень достоверной значимости по сравнению с контролем – *  p < 0,050
Монотерапия   (табл. 2, Фиг. 3)
ФДТ -  E=150 Дж/см
, Ps=0,34 Вт/см
2
2
Группа 1. При проведении на 21 сутки после лечения только у 30% животных наблюдалась полная регрессия опухоли. У животных с продолженным ростом опухоли, хотя, наблюдалось снижение коэффициента абсолютного прироста опухоли, но это снижение не достоверно по сравнению с контролем.
ФДТ-
300 Дж/см
,Ps = 0,48 Вт/см
2
2
Группа 2. При проведенииE = на 21 сутки после лечения уже у 40% животных наблюдалась полная регрессия опухоли и коэффициент абсолютного прироста опухоли  (p < 0,050)  по сравнению с контролем.
ЛТ с дозой γ-излучение – 20 Гр
Группа 3. При проведении  на 21 сутки после лечения только у 30% животных наблюдалась полная регрессия опухоли. У животных с продолженным ростом опухоли, но коэффициент абсолютного прироста опухоли (p < 0,050)  по сравнению с контролем.
Таблица 2.
Динамика саркомы М-1 крыс после монотерапии:
2
2
2
2
ФДТ (Е = 150 Дж/см, Ps = 0,34 Вт/см или Е = 300 Дж/см, Ps = 0,48 Вт/см); ЛТ (20 Гр)
№
Монотерапия
Параметры лазерного-и гамма-излучения
Коэффициент абсолютного прироста опухоли (К) (М±m) у крыс с ростом опухоли
Полная регрессия опухоли  (ПР %)
Частичная регрессия опухоли (ЧР %)
3 сутки
7 сутки
10 сутки
14 сутки
21 сутки
1.
ФДТ
Е=150Дж/см<sup>2</sup>,P<sub>S</sub>=0,34Вт/см<sup>2</sup>
-0,85 ± 0,10*50,0 %0 %
-0,14 ± 0,52*40,0 %0 %
0,70 ± 1,17*30,0 %0 %
5,52 ± 4,32*30,0 %0 %
28,11 ± 14,3430,0 %0 %
2.
ФДТ
Е=300Дж/см<sup>2</sup>,P<sub>S</sub>=0,48Вт/см<sup>2</sup>
-0,90 ± 0,15*70,0 %0 %
-0,10 ± 0,64*70,0 %0 %
0,34 ± 1,90*50,0 %0 %
3,28 ± 3,02*50,0 %0 %
7,34 ± 2,93*40,0 %0 %
3.
ЛТ
20 Гр
0,53 ± 0,12*0 %10 %
0,81 ± 0,34*0 %40 %
1,76 ± 0,47*15,0 %15,0 %
3,20 ± 0,83*25,0 %10,0 %
8,81 ± 2,02*30,0 %0 %
<b>Контроль  (K)</b>
<b>2,97 ± 0,50</b>
<b>14,01 ± 2,05</b>
<b>20,73 ± 2,04</b>
<b>36,00 ± 3,85</b>
<b>65,31 ± 7,70</b>
Примечание:уровень достоверной значимости по сравнению с контролем  –  *  p < 0,050
Эффективность комбинированной терапии превышает лечебное воздействие монотерапии, проведенной при тех же условиях, что выражалось в увеличении процента животных с частичной и полной регрессией опухоли и значительным снижением коэффициента абсолютного прироста у животных с продолженным ростом опухоли при всех параметрах проведения опытов.
В контрольной группе по всем срокам исследования наблюдался прогрессирующий рост опухоли.
2
2
.
Проведенные исследования установили преимущество второй схемы лечения (ЛТ + ФДТ). Наиболее эффективной оказалось проведение опытов при использовании ЛТ и через 48 часов ФДТ (E = 300 Дж/см, Ps = 0,48 Вт/см) животных с саркомой М-1, что позволяет добиться выраженного положительного эффекта, заключающегося в ликвидации новообразования у 90% против 30% положительного эффекта у крыс, получающих только лучевую терапию и 40% - только ФДТ
Предложенный способ лечения позволяет добиться выраженного положительного эффекта и  ликвидировать новообразования, что  имеет большое значение для развития комбинированного воздействия, как нового метода лечения рака.