Экспресс-метод определения чувствительности грамотрицательных бактерий к бактериофагам
EXPRESS METHOD FOR DETERMINING THE SENSITIVITY OF GRAM-NEGATIVE BACTERIA TO BACTERIOPHAGES

Изобретение относится к области микробиологии и касается способа быстрого определения чувствительности грамотрицательных палочковидных бактерий к бактериофагам с помощью устройства, обеспечивающего выращивание бактерий совместно с бактериофагами в лунках с плотной питательной средой.
Бактериальные инфекции, в том числе связанные с оказанием медицинской помощи (ИСМП), представляют собой актуальную проблему современного здравоохранения, занимающую десятое место среди причин смертности населения. В настоящее время во всем мире отмечается глобальная тенденция к росту устойчивости бактерий к антибактериальным препаратам, а разработка новых препаратов идет крайне медленными темпами. Если эта тенденция продолжится, то перечень средств для борьбы с устойчивыми микроорганизмами может быть исчерпан, что приведет к тяжелым последствиям (Rhee С, Kadri SS, Dekker JP, et al. Prevalence of Antibiotic-Resistant Pathogens in Culture-Proven Sepsis and Outcomes Associated With Inadequate and Broad-Spectrum Empiric Antibiotic Use. JAMA Netw Open. 2020;3(4):e202899. Published 2020 Apr 1. DOI: 10.1001/jamanetworkopen.2020.2899). Наибольшую обеспокоенность вызывает дальнейшее распространение в стационарах возбудителей бактериальных осложнений новой коронавирусной инфекции COVID-19 (Bengoechea J A, Bamford CG. SARS-CoV-2, bacterial co-infections, and AMR: the deadly trio in COVID-19? EMBO Mol Med. 2020; 12(7):e 12560. DOI: 10.15252/emmm.202012560). Пот данным ряда авторов наиболее частым возбудителем бактериальных осложнений при COVID-19 являются грамотрицательные палочки, особенно Klebsiella pneumoniae. Они часто обладают множественной устойчивостью к антибиотикам. По некоторым данным доля резистентных штаммов может достигать 95%. По данным AMRmap - Российской онлайн платформы анализа данных резистентности к антимикробным препаратам, - резистентность российских штаммов является одной из самых высоких в мире. Поэтому необходимо вести научно-исследовательские работы для создания новых средств лечения, эффективных против инфекций с множественной лекарственной устойчивостью.
Оказание качественной медицинской помощи всецело зависит от эпидемиологической безопасности организации лечебно-диагностического процесса (Национальная концепция профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.11.2011) // Справочно-правовая система «Консультант Плюс»: [Электронный ресурс] /Компания «Консультант Плюс»). Поэтому приоритетным является разработка и применение дополнительных средств борьбы с инфекционными заболеваниями, в том числе бактериофагов.
После некоторого ослабления интереса к бактериофагам в эпоху успешного применения антибиотиков медицинское сообщество вновь обратило свой взор на альтернативный антимикробный препарат. Распоряжением правительства РФ 25 сентября 2017 г. принята «Стратегия предупреждения распространения антимикробной резистентности в РФ на период до 2030 года», в которой указывается на необходимость «разработки и внедрения биологических лекарственных препаратов, в том числе препаратов на основе бактериофагов; разработки регламентов применения бактериофагов в различных областях здравоохранения, ветеринарии и растениеводстве; усовершенствования методов профилактики и лечения инфекционных заболеваний с помощью бактериофагов путем поэтапного введения препаратов бактериофагов в отраслевые стандарты в качестве противомикробных средств». В настоящее время медицинская промышленность России производит ряд бактериофаговых препаратов против ряда патогенных и условно-патогенных возбудителей инфекций. Для более быстрого выбора эффективных терапевтических фагов в качестве альтернативного антибактериального препарата необходимо в самые коротки сроки определить чувствительность выделенных культур микроорганизмов к предполагаемым к использованию бактериофагам. Однако стандартное время данного исследования (16-24 часа) слишком велико для быстрого принятия решения о выборе препарата для терапии. В связи с этим особого внимания заслуживает разработка экспресс-методов определения чувствительности бактерий к фагам. Неоспоримым преимуществом экспрессных методов определения чувствительности к бактериофагам является возможность значительного ускорения процесса назначения лечения, особенно в тех случаях, когда возбудитель инфекции устойчив к антибиотикам и единственной альтернативой может быть использование бактериофагов.
В настоящее время рядом исследователей описаны современные методы исследования чувствительности бактерий к фагам. Так, предложен способ постановки и учета результатов чувствительности к бактериофагам в иммунологических планшетах (Negm, AC, Sandulescu О, Рора М, et al. Experimental approach for bacteriophage susceptibility testing of planktonic and sessile bacterial populations - Study protocol. Germs. 2014;4(4):92-96. Published 2014 Dec 1. doi:10.11599/germs.2014.1062). Такой способ постановки удобен в реализации, однако он занимает, как и в классических методах исследования (Национальная ассоциация специалистов по контролю инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (НП «НАСКИ») - Федеральные клинические рекомендации «Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике», 2014 г. ), 18-24 часа.
К более быстрым методам исследования чувствительности бактерий к бактериофагам относится когерентная флуктуационная нефелометрия (Экспресс-диагностика чувствительности проблемных микроорганизмов к бактериофагам с использованием отечественного когерентного флуктуационного нефелометра / В.В. Щелкова, Е.В. Русанова, А.С.Гурьев [и др.] // Проблемы медицинской микологии. - 2020. - Т. 22. - №3. - С. 152). Однако этот метод позволяет получить результат не ранее чем через 6 часов.
Более быструю оценку восприимчивости Staphylococcus aureus к стафилококковому бактериофагу удавалось получить за 3 часа с помощью безлинзового визуализирующего устройства (Perlemoine Р, Marcoux PR, Picard Е, Hadji Е, Zelsmann М, Mugnier G, Marchet A, Resch G, O'Connell L, Lacot E. Phage susceptibility testing and infectious titer determination through wide-field lensless monitoring of phage plaque growth. PLoS One. 2021 Mar 23;16(3):e0248917. doi: 10.1371/journal.pone.0248917. PMID: 33755710; PMCID: PMC7987195). Однако описанная методика на позволяет осуществлять подобные исследования без специального устройства, компьютерной программы, связанной с ним, и самое главное - не предлагает критериев оценки чувствительности и резистентности бактерий к фагу. Таким образом, оно не может быть воспроизведено в рутинной практике бактериолога.
Также описана экспрессная методика оценки эффективности специфических бактериофагов на культуре клеток (Захарова Ю. А., Федотова О. С, Шмелева Н. А. Новый способ оценки специфической активности бактериофага с использованием клеточной культуры ЛЭЧ-3 // Медицинский алфавит. Серия «Обозрение». - 2019. - Т. 3. - 32 (407). - С. 16-18), позволяющая получить результат через 3 часа. Однако для постановки этого метода необходимы специальные диплоидные клетки легкого эмбриона человека (ЛЭЧ - 3), которые должны быть стандартизированы и поддерживаться в определенных условиях. Это также неудобно для использования в рутинной практике бактериологической лаборатории.
Изобретение направлено на разработку экспрессного определения чувствительности грамотрицательных бактерий к бактериофагам. При этом сокращено время определения чувствительности, что способствует более быстрому назначению терапии, и количества реагентов, используемых для постановки метода, что делает этот способ более экономически выгодным.
Экспресс-метод определения чувствительности грамотрицательных бактерий к бактериофагам предусматривает внесение в питательную среду инокулята бактерии и исследуемые жидкие препараты бактериофагов. Через 2,5-3 часа нахождения исследуемого образца при температуре 36,8+0,2°С его рассматривают под микроскопом с увеличением не менее 400 крат. Затем подсчитывают в поле зрения микроскопа количество выросших микроколоний грамотрицательных бактерий, которое сравнивают с количеством микроколоний в образце без бактериофага. Далее рассчитывают коэффициент, по значению которого судят о степени чувствительности бактерии к бактариофагу. Коеффициент рассчитывают по формуле:
где K - количество микроколоний в поле зрения контрольного образца, В - количество микроколоний в поле зрения образца с бактериофагом, а о степени чувствительности бактерии к бактариофагу судят по значению коэффициента, причем, если значение коэффициента k больше или равно 10, исследуемый микроорганизм считают чувствительным к бактериофагу, если значение k лежит в интервале от 2 до 10, исследуемый микроорганизм считают слабо чувствительным к бактериофагу, при значении к меньше 2, исследуемый микроорганизм считают не чувствительным к бактериофагу.
Пограничные значения коэффициентов получены путем сопоставления с результатами исследования чувствительности к бактериофагам, полученными с использованием классического метода (Федеральные клинические рекомендации «Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике», (2014 г.)).
Время выращивания бактерий определено эмпирическим путем, так как в течение этого времени вырастает достаточное количество микроколоний. Температура инкубации является стандартной при такого рода исследованиях.
Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фигуре 1 представлен вид слайда с культурами бактерий и бактериофагами.
8
Изобретение реализуется следующим образом: слайд FAST, который представляет из себя пластиковую рамку с 16-ю сквозными отверстиями размерами 6x6x2 мм (2 ряда по 8 в каждом ряду) располагается в стерильной чашке Петри (рис. 1); лунки заполняются питательным агаром (температура 45°С), приготовленным из сухой среды промышленного производства в соответствии с инструкцией изготовителя; после застывания и подсушивания поверхности агара в лунки закапывается по 1 капле (25 мкл) инокулята бактерии в концентрации 1,5⋅10 КОЕ/мл (как и при определении чувствительности к АБП в соответствии с МУК 4.12.1890-04), приготовленный на физиологическом растворе NaCl; через несколько минут после подсыхания культуры на ее поверхность наносят по капле исследуемые жидкие препараты бактериофагов, предварительно промаркировав лунки (при этом одна или две лунки остаются свободными от бактериофагов, так как они будут служить контролями при подсчете колоний); чашка Петри накрывается крышкой и ставится в термостат на 3 часа при температуре 37°С; после этого чашка достается из термостата, крышка открывается, нижняя часть чашки вместе со слайдом устанавливается под объектив микроскопа с увеличением в 40 раз (таким образом, при увеличении окуляра в 10 раз достигается увеличение в 400 раз) и производится фокусировка над лункой с контролем культуры; подсчитывается количество микроколоний изучаемых бактерий в поле зрения, о чем производится запись; далее объектив перемещается к лунке с бактериофагом, производится подсчет микроколоний в поле зрения; рассчитывается коэффициент по формуле:
где k - коэффициент, K - количество микроколоний в поле зрения контрольного образца, В - количество микроколоний в поле зрения образца с бактериофагом.
В зависимости от полученных результатов в заключении указывается степень чувствительности конкретного микроорганизма к действию конкретного бактериофага:
1) k больше или равно 10 - исследуемый микроорганизм чувствителен к бактериофагу;
2) k больше или равно 2, но менее 10 - исследуемый микроорганизм слабо чувствителен к бактериофагу;
3) k менее 2 - исследуемый микроорганизм не чувствителен к бактериофагу.
В случае, если В равно 0, считаем, что этот показатель равен 1, и штамм признается чувствительным к бактериофагу.
Примеры, подтверждающие результаты от реализации способа, представлены в таблицах 1 и 2.
При подсчете микроколоний необходимо иметь в виду, что учету подлежат только сформировавшиеся микроколонии; отдельно лежащие бактериальные клетки не
учитываются, как клетки, не имеющие возможности выжить и/иди сформировать колонию.
Все проведенные эксперименты сверяли с классическим методом определения чувствительности к бактериофагам согласно Федеральным клиническим рекомендациям «Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике», (2014 г, зудьтате уже через 2,5-3 часа можно судить об отношении бактериального штамма к бактериофагам. Этот способ не требует дополнительного оснащения, легко выполним в бактериологической лаборатории любого уровня. Он позволит получать результат в 6-8 раз быстрее, чем при использовании классической методики, что в свою очередь позволит своевременно назначить пациенту адекватную терапию, а значит, улучшить его состояние здоровья.