Взаимодействие днк с краунсодержащими гетероциклическими соединениями

УДК 537.323.2 Вестник СПбГУ. Сер. 4, 2007, вып. 2

Е. Б. Морошкина

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДНК С КРАУНСОДЕРЖАЩИМИ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ*)

Молекула ДНК является мишенью действия многих агентов, обладающих биологической активностью. Среди них особое внимание вызывают противоопухолевые соединения, активность которых состоит в ингибировании матричной функции ДНК в результате их прямого взаимодействия с макромолекулой. Известно три типа взаимодействий низкомолекулярных соединений с ДНК: интеркаляционное, бороздочное и внешнее электростатическое [1, 2]. В лаборатории молекулярной биофизики НИИФ СПбГУ на основе комплекса спектральных, оптических и гидродинамических методов была разработана методика, позволяющая определять способ связывания с ДНК низкомолекулярных лигандов, содержащих плоский гетероциклический хромофор [3, 4]. С помощью этой методики было изучено взаимодействие с ДНК многих биологически активных соединений, в том числе противоопухолевого антибиотика актиномицина Б [5] и его многочисленных аналогов [5-8], синтезированных в Санкт-Петербургском государственном технологическом институте (СПбГТИ) в процессе направленного поиска активных противоопухолевых препаратов. Было показано, что способность актино-цинового хромофора интеркалировать в двойную спираль ДНК зависит от природы заместителей в 1-м и 9-м положениях хромофора. Пентапептидлактонные кольца актиномицина Б в положениях 1 и 9 хромофора могут подобно краунсоединениям ассоциировать ионы Ыа+ [9, 10]. Это явилось предпосылкой нового направления конструирования комплексонов ДНК на основе объединения в одной молекуле гетероциклического хромофора и краунфрагментов [11,12].

В настоящей работе методами спектрофотометрии, кругового дихроизма (КД), вискозиметрии и динамического двойного лучепреломления было исследовано взаимодействие ДНК с краунсодержащими соединениями феноксазонового и ксантонового рядов с целью определения влияния краунгруппировки на структуру образующихся комплексов. Структура исследованных соединений изображена на рис. 1.

Экспериментальная часть. Использовали ДНК из тимуса теленка фирмы «5еп/а» с молекулярной массой М = 107 Да. Коэффициент экстинкции'ДНК е259 = 6400-6700 М-1 • см-1. Все исследуемые соединения были синтезированы на кафедре органической химии СПбГТИ и любезно предоставлены доктором химических наук Е. Н. Глибиным. Комплексы этих соединений с ДНК были получены в результате добавления к водно-солевому раствору ДНК раствора лиганда в этиловом спирте, насыщенном ионами Ка+. Соотношение объемов исходных растворов, Лиганд / ^днк’ ПРИ приготовлении комплексов составляло не более 0,1. Ионная сила (ц) полученных растворов составляла 0,1 или 0,001 и в дальнейшем сохранялась при концентрационных измерениях. Количество связанного лиганда, приходящегося на пару азотистых оснований ДНК (г), определяли из данных спектрофотометрического титрования (СФТ) [6]. Константы связывания (К) и количество мест связывания на пару оснований (п) рассчитывали по методу Мак Ги и фон Хиппеля [13]. Спектры поглощения растворов регистрировали на спектрофотометре «5ресогс1 иУ-Х^в». Параллельно со спектрофотометрическим титрованием проводилось

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 05-03-32028а).

© Е. Б. Морошкина, 2006

о

•з '3

1. К = Ш(СН ) Ы(СН3)2

к.

2. Я = ШХ

3-5. И - Ш(СН2)яСОШХ, я - 1,2,5

X =

6. II, = СОЫН(СН2)3Ы(СН3); 1*2 = Н

7. Я, = Н; 112 - С(ЖН(СН2)3Ы(СН3)2

8. И, = СОЫНХ; И2 = Н

9. И - Н; Ы2 - CONHX

10,11. ^ = СОЫН(СН2)пСОЫНХ; 1*2 = Н, я = 1,2 "

12,13. И., - Н; И2 = СОШ(СН2)лСОШХ, п- 1,2

Рис. 1. Структура исследованных соединений.

спектрополяриметрическое. Спектры индуцированного кругового дихроизма (ИКД) регистрировались с помощью дихрографа «.ЬЫп-Ууоп Магк5».

Способ связывания соединений с ДНК определяли на основании анализа изменений характеристической вязкости ([т)]) и оптической анизотропии (а{ - а2) макромолекулы при комп-лексообразовании по методу, описанному ранее [3, 4]. Изменение оптической анизотропии при комплексообразовании находили методом динамического двойного лучепреломления, используя соотношение Петерлина [14], Дя/£(т) - Т)0), пропорциональное (от, - а2) , где Ап - величина двойного лучепреломления, определяемая с помощью экспериментальной оптической установки со слюдяным полутеневым эллиптическим компенсатором [15], ё - градиент скорости потока, Г| и Г)0 - вязкость раствора и растворителя соответственно, измеряемые с помощью магнитного ротационного вискозиметра [16].

Результаты и их обсуждение. СФТ. В случае взаимодействия гетероциклического хромофора соединений с ДНК при титровании растворов лиганда раствором ДНК происходят изменения в длинноволновой полосе поглощения хромофора: падение интенсивности и/или смещение максимума спектра. Они наблюдаются в случае титрования соединений 1-4, 6-10, 12. Рассчитанные параметры связывания этих соединений приведены в табл. 1. Форма спектра поглощения соединения 8 не позволяет из данных спектрофотометрического титрования определить параметры связывания, Для соединений 5, 11, 13 изменения спектров поглощения не наблюдаются, что свидетельствует об отсутствии связывания хромофора этих соединений с макромолекулой. И в ряду фе-ноксазонов, и в ряду ксантонов замещение диметиламинопропильной группы краун-группировкой вызывает уменьшение как константы связывания, так и количества мест связывания.

Соединение И К- Ю‘\ М'1 п

0,1 120 + 10 0,5 ±0,1

1

0,001 >1000 1,0 ±0,1

0,1 6 + 0,5 0,20 ± 0,05

2

0,001 80 ±5 0,5 ±0,1

0,1 80 ±5 0,30 ±0,05

3

0,001 >1000 <0,1

4 0,001 4 ±0,5 0,4 ±0,1

6 0,001 15 ±1 0,5 ±0,1

7 0,001 28 + 1 0,5 ±0,1

9 0,001 10 ±1 0,08 ±0,02

10 0,001 5 ± 1 0,30 ±0,05

12 0,001 25 + 5 0,12 + 0,02

Спектры ИКД. Все исследованные соединения оптически не активны. Характерным признаком взаимодействия хромофора с ДНК является появление ИКД, сопряженного с его длинноволновой полосой поглощения. ИКД наблюдается у соединений 1-4, 6-10, 12. На рис. 2 и 3 приведены так называемые «предельные» спектры КД, полученные при наличии в растворе избытка ДНК. Соотношения молярных концентраций ДНК и лиганда, Сднк/Слиганд, равны 0,01-0,03. В этих условиях практически весь лиганд находится в связанном состоянии. В некоторых случаях по знаку и форме такого спектра можно судить не только о факте взаимодействия хромофора с макромолекулой, но и об ориентации хромофора относительно плоскости азотистых оснований ДНК [17]. «Предельный» спектр КД соединений 1 и 4 (рис. 2, а) и 7, 9, 12 (рис. 2, б) представляет собой одиночную полосу. Соединения 2 (рис. 2, а) и 6, 8 (рис. 2, б) в этих условиях имеют спектр ИКД в виде двойной полосы разных знаков. У соединений 5,10,11,13 спектр ИКД отсутствует.

Появление ИКД, сопряженного с длинноволновой полосой поглощения, при взаимодействии оптически неактивных соединений с ДНК вызывается взаимодействием хромофоров лиганда с азотистыми основаниями ДНК и/или друг с другом [17]. Взаимодействие изолированного хромофора с азотистыми основаниями ДНК приводит к возникновению спектра ИКД в виде одиночной полосы, знак которой связан с взаимной ориентацией дипольных моментов взаимодействующих электронных переходов хромофора и пары азотистых оснований [18]. Длинноволновая полоса поглощения ак-тиноцинового хромофора соответствует электронному переходу, поляризованному вдоль длинной оси хромофора, в то время как длинноволновая полоса поглощения ксантоно-вого хромофора отвечает электронному переходу, поляризованному вдоль его короткой оси [19]. Разный знак ИКД соединений 1,4 и 7,9,12 соответствует одинаковой ориентации их хромофоров относительно азотистых оснований ДНК: в обоих случаях длинная ось хромофора параллельна длинной оси пары азотистых оснований. Взаимодействие хромофоров связанных с ДНК молекул лиганда между собой приводит к образованию экситонного спектра ИКД в виде двойной полосы разных знаков равной интенсивно-

X, нм

Рис. 2. Предельные спектры ИКД лигандов, связанных с ДНК при ц = 0,001, г =• 0,01.

а - производныеактиноцина: 1 - соединения 1,3,2 - соединение 2,3- соединение 4; б - производные ксантона: 1 - соединение 6,2- соединение 8,3 - соединения 7, 9, 12.

сти [20]. Такое взаимодействие имеет место у соединений 2, 6 и 8. При связывании с ДНК соединения 3 проявляются оба типа взаимодействия, вызывая асимметрию спектра ИКД.

Вискозиметрия и динамическое двойное лучепреломление. Для определения способа связывания исследуемых соединений с ДНК было проведено вискозиметрическое титрование ДНК растворами лигандов. Из рис. 3, а, б видно, что в группе феноксазоно-вых соединений значительный рост вязкости при увеличении содержания лиганда в растворе происходит только для соединений 1 и 3, незначительный - для соединения 4 и полное его отсутствие - для соединений 2 и 5. В группе производных ксантона рост вязкости ДНК при повышении концентрации лиганда наблюдается при ее взаимодействии с соединениями 6, 7 и 12. Значительные изменения в конформации двойной спирали возникают только при интеркаляционном связывании, в результате которого происходят локальное раскручивание двойной спирали [21] и увеличение контурной длины макромолекулы [22], вызывающее соответствующее изменение вязкости раствора.

Учитывая тот факт, что вязкость растворов конечной концентрации ДНК зависит не только от молекулярных параметров растворенной макромолекулы, но и от меж-молекулярных взаимодействий в растворе, мы провели измерение [г|] и соотношения д^n/g(r^ - Л0) комплексов ДНК с лигандами, увеличивающими вязкость растворов ДНК (табл. 2). Сопоставление изменения характеристической вязкости и оптической анизотропии ДНК при взаимодействии с соединениями 1, 3, 6, 7 и 12 позволяет сделать вывод о росте контурной длины ДНК пропорционально количеству лиганда в комплексе, что свидетельствует об их интеркаляционном связывании с ДНК [3, 22]. Взаимодей-

Таблица 2. Оптические и гидродинамические параметры комплексов при /л = 0,001

Соединение г [Г|], м3/кг [^компл / Мднк -107, м-с2/кг Л-Ло («. - «2)ком„л (а, - ос2)днк

ДНК 0 24 ± 1 - 23+1 -

ДНК + 1 0,1 29 + 1 1,20 24+1 1,04

ДНК+ 2 0,1 24 ± 1 1,0 23 ± 1 1,0

ДНК + 3 0,1 30±1 1,24 23 ± 1 1,0

ДНК+ 4 0,06 25 + 1 1,05 23 ± 1 1,0

ДНК + 6 0,08 28 + 1 1,17 24 ± 1 1,04

ДНК+ 7 0,1 28± 1 1,17 23 ±1 1,0

ДНК+ 8 0,1 21 ±1 0,88 24+1 1,04

ДНК+ 9 0,1 29 ± 1 1,15 23 ± 1 1,0

ДНК+10 0,06 25 ± 1 1,05 23 + 1 1,0

ДНК+12 0,08 28+1 1,17 23 ± 1 1,0

ствие с ДНК соединений 2,8 и 9 не вызывает заметных изменений в конформации ДНК, что говорит в пользу бороздочного связывания [23].

Таким образом, можно сделать вывод, что наличие краунгруппировки и ее расстояние от гетероциклического хромофора существенно влияют не только на параметры связывания, но и на способ связывания хромофора с ДНК. По нашему мнению, исследован-

Сиг / СДНК

Рис. 3. Относительное изменение специфической вязкости ДНК в зависимости от молярного соотношения концентраций лиганда и ДНК в растворе при Сднк = 0,002%. а - производные актиноцина: 1 - соединение 1,2- соединение 2,3 - соединение 3, 4 - соединение 4,

5 - соединение 5; б - производные ксантона: 1 - соединения 6, 7, 2 - соединение 12,3 - соединение 9, 4 - соединение 8, 5 - соединения 10, 11,13.

ные краунсодержащие соединения имеют два потенциальных центра связывания с ДНК: гетероциклический хромофор и краунгруппировка. Краунгруппа с ассоциированным ионом металла взаимодействует с отрицательно заряженными фосфатами ДНК. Связывание плоского гетроциклического хромофора при этом определяется длиной линкерной цепочки. Интеркаляция хромофора происходит только при ее оптимальной длине, которая имеется у соединений 3 и 12 и соответствует 6 элементам. При более коротком линкере (соединения 2,8 и 9) интеркаляция не происходит по стерическим причинам, и хромофор локализуется в одной из бороздок двойной спирали ДНК. При более длинной линкерной цепочке вероятность его сближения и связывания с двойной спиралью падает.

В случае соединений ксантонового ряда на способ связывания лиганда с ДНК оказывает влияние также положение заместителя на хромофоре. Для соединений 6 и 7, не содержащих краунгруппировку, положение заместителя сказывается на ориентации интеркалированного хромофора относительно оси пары азотистых оснований ДНК. При наличии краунгруппировки интеркаляция хромофора оказывается возможной только в случае локализации заместителя в положении 4 (соединение 12).

Summary

Morishkina Е. В. Interaction of DNA with crown containing heterocyclic compounds.

Interaction of DNA with actinocin diamides and xanton-2- and xanton-4 carbonic acids containing in the amide moiety benzo-18-crown-6 fragments are studied by spectrophotometer titration, circular dichroism, viscometry and flow birefringence methods. The models with two binding centers: selective toward Na+ ion benzocrown fragments and heterocyclic chromophore are proposed for the complexes of these compounds with DNA

Литература

1. Krug T. R. I I Curr. Ohin. Struct. Biology. 1994. Vol. 4. P. 351—364. 2. ChairesJ. В. 11 Curr. Ohin. Struct. Biology. 1998. Vol. 8. P. 314—320. 3. Морошкина E. Б., Шишов А. К, Кривцова М. А. и др. I I Молекулярная биология. 1975. Т. 9. С. 836—844. 4. Веселков А. Н., Морошкина Е. Б., Соболева О. И., Фрисман Э.В. И Молекулярная биология. 1984. Т. 18. С. 481—487.5. Кривцова М. А., Морошкина Е. Б., ХамманХ. и др.//Молекулярная биология. 1981. Т. 15. С. 613—621.6. КривцоваМ.А., Морошкина Е. Б., Глибин Е. Н., Фрисман Э. В. // Молекулярная биология. 1982. Т. 16. С. 149—155. 7. Кривцова М. А., Морошкина Е. Б., Глибин Е. Н., Фрисман Э. В. // Молекулярная биология. 1984. Т. 18. С. 950-956.

8. Морошкина Е. Б., Кривцова М. А., Глибин Е. Н.//Биофизика. 2002. Т. 47. С. 444—448.9. ХортиА. Г., Глибин Е. Н., Коршунова 3. И. и др. // Изв. АН СССР. Сер. химия. 1991. С. 2265—2269. 10. HortiA., Glibin Е., Nesterov W. 11 Chromatographia 1992. Vol. 34. P. 155—158. 11. Глибин E. H., Плеханова H. Г., Овчинников Д. В., Коршунова 3. Н. // Журн. орг. химии. 1996. Т. 32. С. 406—408. 12. Глибин Е. Н., Овчинников Д. В., Плеханова Н. Г.// Журн. орг. химии. 1997. Т. 33. С. 1573—1576.13. McGhee J. D., von Hippel P. N. Ц J. Mol. Biology. 1974. \bl. 86. P. 469-482. 14. Peterlin A, 11 J. Polym. Sci. 1950. \bl. 12. P. 45-52.15. Фрисман Э. В., Цветков В. Н. // Журн. экспер. и теор. физики. 1952. Т. 23. С. 690-702. 16. Фрисман Э. В., Щагина Л. В., Воробьев В. И. // Коллоидн. журн. 1965. Т. 27. С. 130—133.17. Nor-den В., TjemeldF. //Biopolymers. 1982. Vol. 21. P. 1713—1734.18. Tuite E., Norden B. //J. Amer. Chem. Soc. 1994. Vol. 116. P. 7548—7556.19. Ishijima S., HigashiМ., Yamaguchi H. //J. Phys. Chem. 1994. \bl. 98. P. 10432-10435.20. TinocoJ. /., Woody R. W.//J. Chem. Phys. 1963. Vol. 38. P. 1317-1325.21. WaringM. Ц J. Mol. Biology. 1970. Vol. 54. P. 247-279. 22. Lerman L, S. 11 J. Mol. Biology. 1961. Vol.3. P. 18-24. 23. Braitwaite A. W., Baguley В. C. // Biochemistry. 1980. \bl. 19. P. 1101—1106.

Статья принята к печати 23 ноября 2006 г.