Изменения в фетоплацентарном барьере при герпес-вирусной инфекции, приводящие к апоптозу ядер синцитиотрофобласта ворсинок плаценты

УДК 618.36:616.523:616.155.32 М.Т.Луценко

ИЗМЕНЕНИЯ В ФЕТОПЛАЦЕНТАРНОМ БАРЬЕРЕ ПРИ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ, ПРИВОДЯЩИЕ К АПОПТОЗУ ЯДЕР СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТА ВОРСИНОК ПЛАЦЕНТЫ

ГУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН

РЕЗЮМЕ

Проведен анализ, позволяющий оценить пути формирования апоптоза в ядрах синцитиотрофоб-ласта ворсинок плаценты при вспышке герпесвирусной инфекции в третьем триместре беременности.

Ключевые слова: апоптоз, плацента, герпес.

SUMMARY

M.T. Lutsenko

THE CHANGES IN FETOPLACENTAL BARRIER AT HERPES-VIRUS INFECTION THAT LEAD TO APOPTOSIS OF SYNCYTIOTROPHOBLAST NUCLEUS OF PLACENTA VILLI

The analysis that allows to estimate the ways of apoptosis formation in syncytiotrophoblast nucleus of placenta villi at herpes-virus infection episode at pregnancy in the third trimester was carried out.

Key words: apoptosis, placenta, herpes.

Для выявления роли вируса герпеса (Gi-G2) в организме беременной необходимо расширить представления о взаимодействии вируса на клеточном уровне (точнее на уровне синцитиотрофобласта фетоплацентарного барьера). Огромная роль отводится проявлению апоптоза в ядрах синцитиотрофобласта при проникновении вируса герпеса в фетоплацентарный барьер. Апоптоз может пойти в синцитиотро-фобласте фетоплацентарного барьера различными путями [1, 2, 4, 5, 7, 8]. Нами проведен анализ, позволяющий оценить пути формирования апоптоза в ядрах синцитиотрофобласта ворсинок плаценты при вспышке герпес-вирусной инфекции у беременных.

Материал и методы исследования

Работа была выполнена на 30 беременных, у которых в третьем триместре была вспышка герпесвирусной инфекции с титром антител к возбудителю 1:12800. Контрольную группу составили 25 беремен-

ных, у которых в течение беременности не было заболеваний. Все исследования проводились с учетом требований Хельсинской декларации «Рекомендации для врачей по биомедицинским исследованиям на людях» (2000 г.).

Ферменты апоптоза изучались в гомогенате плаценты, взятой после родов. Для получения экстрактов, отмытые кусочки плаценты слегка подсушивали на фильтровальной бумаге и взвешивали. Затем ткань растирали пестиком в фарфоровой ступке и гомогенизировали до однородной массы. К полученному гомогенату добавляли фосфатный буфер в объеме, равном изначальному весу ткани. Взвесь помещали в пластиковые пробирки Falcon и подвергали замораживанию при -200С в течение суток. Затем гомогенат размораживали и ультрацентрифугировали при 4000 об/мин при температуре +40С. Надосадочную жидкость разливали мелкими аликвотами и хранили при -200С до проведения ИФА.

Супернатант использовали для количественного определения ферментов, белков и метаболитов апоп-тоза: Bcl-2, каспаза-3, цитохром-С, NO2, NO3, TNFa, ЦИК, APO/FAS, р53, апексин V. Исследования проводились на ридере «Stat-Fax-2100» (USA) с использованием наборов «Bender Medsystems» (Austria). Морфологическая оценка апоптоза проводилась на парафиновых срезах плаценты по метке концов фрагментов ДНК in situ and labeling (ISEL-методу) [3].

Результаты исследования и их обсуждение

При обострении герпес-вирусной инфекции в период беременности в периферической крови увеличивается выработка интерлейкинов, таких как TNFa

- 90,4±0,8 пг/мл (контроль - 18,0±0,06 пг/мл). Инфекция оказывает прямое влияние на лимфоциты периферической крови беременной. При титре антител к вирусу герпеса снижается количество CD3, CD4-до 42,6±1,2 (контроль - 50,0±1,4; р<0,001), зато резко повышается содержание NK - до 18,8±0,5 (контроль

- 10,0±0,1; р<0,001). Инфекция оказывает прямое

влияние на лимфоциты периферической крови, что увеличивает до З% их в состоянии апоптоза (контроль - 0,5-1%). Лимфоциты, нагруженные интерлейкином TNFa, становятся сильным повреждающим фактором, действующим на мембрану фетоплацентарного барьера. Проточная цитофотометрия показывает, что у беременных при вспышке герпеса в третьем триместре происходят большие сдвиги в содержании лимфоцитов периферической крови (табл. 1).

Внешние стимулы апоптоза возникают вследствие взаимодействия синцитиотрофобласта с эффекторны-ми клетками иммунной системы, натуральными киллерами (NK) и цитотоксическими лимфоцитами (рис. 1). Клетки-киллеры находят на поверхности симпласта свои рецепторы - DED-R и вступают с ними в контакт, что позволяет экспрессировать продукцию в синци-тиотрофобласте белков характерных для индуцирования апоптоза - каспазный комплекс (см. схему). На этом этапе могут вступать в действие такие белки как р5З и Bcl-2, с противоположным вектором действия: проапоптозный - р5З и придерживающий повреждение концевых участков ДНП - белок Bcl-2.

Исследования показали, что при высоком титре антител вируса герпеса в третьем триместре в плаценте рожениц резко увеличивается содержание р5З и каспазы-З. Длительное время в плаценте (титр

Рис. 1. Люминесценция ЫК-лимфоцитов под действием люминесцирующих антител. Герпес, обострение, титр 1:12800, плацента роженицы.

1:3200; 1:6400) содержится большое количество Всі-2 (до 103 пг/мл), но затем при высокой агрессивности инфекции (титр антител 1:12800) содержание белка Вс1-2 в гомогенате начинает резко падать, доходя до 28,1 пг/мл (см. график).

Механизм регуляции фетоплацентарного барьера

Графическое отражение взаимоотношения каспазы-3 и Вс1-2 в гомогенате плаценты рожениц, после перенесенной гернес-вирусной инфекции

Это показывает, что по мере нарастания агрессивности герпес-вирусной инфекции компенсаторные возможности ферментативной защиты через Вс1-2 исчерпываются и каспаза-3 вступает активно в разрушение концевых отделов ДНП ядер, которые усиленно преждевременно вступают в апоптоз, процент которых насчитывается до 4,5±0,06% (контроль -1,0±0,02%). Однако при герпес-вирусной инфекции очень часто возбудитель внедряется в синцитиотро-фобласт фетоплацентарного барьера, что приводит с одной стороны к прямому контакту вируса с ядрами синцитиотрофобласта, а с другой стороны, токсическому воздействию подвергаются митохондрии симпласта. Увеличивается количество антиокислитель-ных факторов, что приводит к разрушению митохондрий и выбросу цитохромоксидазы в цитозоль. Цитохром С включается в апоптосомы совместно с кас-пазным комплексом. Защитные способности цитохрома С при высоком титре герпеса (1:12800) исчерпываются, что составляет 13,9±0,06 пг/мл (в контроле - 10,7±0,04 пг/мл) и каспаза-3 запускает эффек-торное протеолитическое действие, приводящее к конденсации ДНП ядер синцитиотрофобласта (см. график).

Наконец, вирусная инфекция может изменить через рецептор Ар£ который увеличивается в гомогенате при герпесе, фосфолипидную структуру фетоплацентарного барьера. Фосфатидилсерин покидает внутренний слой и перемещается наружу, вступая в контакт с вирусом, что запускает каскад реакции эндонуклеаз, формирующих уплотнение хроматина ядер синцитиотрофобласта - преждевременный апоптоз. Любой из этих путей отражается на метаболизме в синцитиотрофобласте фетоплацентарного барьера, вызывая глубокие нарушения гликолиза, выработки АТФ и синтеза холестерина, приводящих к нарушению выработки гормонов стероидного типа: эстрадиола, прогестерона, ДЭАС, кортизола (табл. 2).

Таким образом, фетоплацентарный барьер вследствие ферментативной и морфологической дезинтеграции становится проницаемым для циркулирующих иммунных тел и вирусов герпеса, которые попадают в пуповинную кровь и распространяются по ней

Таблица 1

Показатели клеточного иммунитета

Титр антител CD19+, CD3-В-лимфоциты CD3+, CD19-Т- лимфоциты CD3+, CD4-Т-хелперы CD3+, CD8-Т-супрес-соры CD3+, CD16+ NK CD3+, CD56+ T-NK CD3+, CD25+ CD3+, HLA DR

I триместр, титр антител 1:12800 14,3±0,8 р<0,001 52,1±1,2 р<0,001 42,6±1,2 р<0,001 9,5±0,9 р<0,001 15,8±0,7 р<0,001 14,4±0,8 р<0,001 12,5±0,4 р<0,001 8,4±0,4 р<0,001

II триместр, титр антител 1:3200 15,4±0,8 р<0,05 62,2±1,4 р<0,001 48,5±0,9 р<0,001 13,7±1,4 р<0,001 12,8±0,3 р<0,001 13,1±0,4 р<0,01 11,14±0,8 р<0,001 8,1 ±0,9 р<0,001

III триместр, титр антител 1:800 15,8±1,1 р<0,05 65,0±1,3 р<0,001 46,9±0,6 р<0,001 18,1±1,1 р<0,001 18,8±0,5 р<0,01 12,0±0,2 8,7±0,7 р<0,001 5,8±0,8 р<0,001

Контроль 19,6±1,2 70,9±0,9 50,0±1,4 20,0±1,5 10,0±0,1 12,0±0,1 2,0±0,1 4,5±0,6

Примечание: р - статистически достоверные различия по сравнению с контролем.

Таблица 2

Активность плацентарных гормонов при герпес-вирусной инфекции

Этапы беременности Эстрадиол, пмоль/л Прогестерон, нмоль/л Кортизол, нмоль/л Пролактин, мМЕ/л

10-12 недель обострение контроль 20589,9±203,1 20706,6±116,7 45,03±3,19** 83,96±5,31 1434,8±13,6*** 636,3±11,2 497,4±11,0*** 1491,1±18,6

14-24 недели обострение контроль 27192,2±852,2 27703,1±0,12 61,80±4,12** 111,28±5,89 1343,7±50,0*** 725,2±11,2 872,9±14,5*** 2486,3±39,5

28-34 недели обострение контроль 27800,8±240,6* 31000,0±596,2 123,76±9,31** 149,76±12,1 1251,4±38,2** 830,4±9,04 972,4±18,3*** 3736,2±52,1

В родах ХГВИ 29345±143,96* 186,98±11,4* 1152,7±12,6* -

Контроль 37602±203,44 217,52±14,7 1074,46±10,1 -

Примечание: * - статистически достоверные различия по сравнению с контролем.

в различные формирующиеся органы плода. Агрессия может быть настолько выраженной, что плод преждевременно погибает. У погибших от герпесной инфекции плодов отмечается деструктивные процессы в печени (увеличенное число гепатоцитов в состоянии апоптоза); в надпочечниках (разрушение коркового вещества); в тимусе (нарушение структуры корковой зоны); в легких (катаральное воспаление, цирротиче-ские изменения, гипоплазия) (см. рис. 2, 3).

ЛИТЕРАТУРА

1. Свободные радикалы в живых системах [Текст]/Владимиров Ю.А [и др.]//Итоги науки и техники. Серия Биофизика.-1991.-Т.29.

2. Апоптоз в онкоурологии [Текст]/ И.В.Князькин, В.Н.Цыган.-СПб.: Наука, 2007.-240 с.

3. Морфология апоптоза при нормальном и зло

качественном гемопоэзе [Текст]/В.М.Погорелов, Г.И.Козинец//Гематология и трансфузиология.-1995.-Т.43, №5.-С.21-24.

4. Энергетика биологических мембран [Текст]/В.П.Скулачев.-М.: Наука, 1989.-564 с.

5. Кислород в живой клетке: добро и зло [Текст]/В.П.Скулачев//Соросовский образовательный журнал.-1996.-№3.-С.4-16.

6. Феноптоз: запрограммированная смерть организма [Т екст]/В.П. Скулачев//Биохимия. -1999.-Т.64, вып.12.-СЛ679-1688.

7. Triggering caspase-independent cell death to combat cancer [Text]/I.S.Mathiasen, M.Jaattela//Trends. Mol. Med. -2002 (8).-P.212-220.

8. Caspase-9, BCL-XL and Apaf-1 form a ternary complex [Text]/G.Pan, K.O'Rourke, V.M.Dixit//J. Biol. Chem.-1998.-Vol.273.-P.5841-5845.

Поступила 05.11.2008