Ассоциация генетических маркеров с артериальной гипертензией в сибирской популяции

АССОЦИАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ С АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ

В СИБИРСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ

12 12 1 1 1 12 Максимов В. Н. ' , Орлов П. С. ' , Малютина С. К. , Маздорова Е. В. , Никитин Ю. П. , Воевода М. И. '

Цель. Проверить однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП), идентифицированные в недавних ассоциативных исследованиях на пригодность в качестве маркёров риска развития артериальной гипертензии (АГ) в сибирской популяции.

Материал и методы. Группа больных АГ и контрольная группа (отношение 2:1) были сформированы на основе популяционной выборки 45-69 летних жителей г. Новосибирска (9400 человек), которая была собрана в ходе работы по международному проекту HAPIEE. В исследование включены 514 человек, из них контрольная группа — 168 человек (127 мужчин и 41 женщина) с АД не выше "нормального" по данным 2-х и более обследований в течение нескольких лет с интервалом не менее 6 мес. Группа с АГ состоит из 346 человек (206 мужчин и 140 женщин) с установленным диагнозом АГ. Геномную ДНК выделяли из венозной крови методом фенол-хлороформной экстракции. Полиморфизм генов тестировали с помощью ПЦР в реальном времени в соответствии с протоколом фирмы производителя (зонды TaqMan, Applied Biosystems, USA) на приборе ABI 7900HT. В исследование были взяты следующие ОНП: rs699 ген AGT, rs5068 ген NPPB, rs17367504 ген MTHFR, rs2681492 ген ATP2B1, rs4343 ген АСЕ, rs1801253 ген ADRB1, rs11240692 ген REN, rs2846679 ген KCNJ1, rs239345 ген SCNN1B, rs1799983 ген NOS3. Результаты. Отношение шансов иметь АГ у мужчин — носителей генотипа GG rs699 гена AGT — составило 1,95 (95% ДИ 1,08-3,53; p=0,003) по сравнению с носителями двух других генотипов. Носительство генотипа АА rs699 напротив, является условно протективным фактором в отношении развития АГ у мужчин (ОШ 0,47; 95% ДИ 0,27-0,81; р=0,007).

Заключение. Для двух из десяти исследованных ОНП была подтверждена ассоциация с АГ у мужчин: rs699 гена AGT и rs5068 гена NPPB.

Российский кардиологический журнал 2014, 10 (114): 73-76

http://dx.doi.org/10.15829/1560-4071-2014-10-73-76

Ключевые слова: артериальная гипертензия, однонуклеотидный полиморфизм, rs699, AGT, rs5068, NPPB.

1ФГБУ Научно-исследовательский институт терапии и профилактической медицины СО РАМН, Новосибирск; 2ФГБУ Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия.

Максимов В. Н.* — д.м.н., зав. лабораторией молекулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний, Орлов П. С. — м.н.с. лаборатории молекулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний, Малютина С. К. — д.м.н., профессор, зав. лабораторией этиопатогенеза и клиники внутренних заболеваний, Маздорова Е. В. — к.м.н., н.с. лаборатории неотложной терапии, Никитин Ю. П. — д.м.н., профессор, академик РАМН, лаборатория этиопатогенеза и клиники внутренних заболеваний, Воевода М. И. — д.м.н., профессор, член-корреспондент РАМН, директор института.

*Автор, ответственный за переписку (Corresponding author): medik11@mail.ru

АГ — артериальная гипертензия, АД — артериальное давление, ДНК — дезок-сирибонуклеиновая кислота, ИБС — ишемическая болезнь сердца, ОНП — однонуклеотидный полиморфизм, ПЦР — полимеразная цепная реакция, ССЗ — сердечно-сосудистые заболевания, OMIM — Online Mendelian Inheritance in Man, HAPIEE — Health, Alcohol and Psychosocial factors In Eastern Europe.

Рукопись получена 01.04.2014 Рецензия получена 11.04.2014 Принята к публикации 18.04.2014

ASSOCIATION OF GENETIC MARKERS IN HYPERTENSIVE DISEASE IN SIBERIAN POPULATION

12 12 1 1 1 12 Maximov V. N. ' , Orlov P.S. ' , Malyutina S. K. , Mazdorova E. V. , Nikitin Yu. P. , Voevoda M. I. '

Aim. To check whether the mononucleotide polymorphisms (MNP), identified in recent studies do match a risk marker criteria for arterial hypertension (AH) in Siberian population.

Material and methods. The group of subjects with AH and control group (relation 2:1) were formed from the population selection of 45-69 years old citizens of Novosibirsk (9400 subjects), which had been collected during the work in HAPIEE project. Totally 514 subjects included, of those controls - 168 (127 men and 41 women) with BP not higher than "normal" by the data of 2 and more examinations during the last years, with interval not more than 6 months. Group with AH consists of 346 subjects (206 men and 140 women) with the diagnosis of AH. Genomic DNA was extracted from venous blood by the method of phenol-chloroform extraction. Gene polymorphism was tested by PCR in real time according to the protocol of equipment manufacturer (zonds TagMan, Applied Biosystems, USA) on the device ABI7900HT. These MNP were included into the study: rs699 gene AGT, rs5068 gene NPPB, rs17367504 gene MTHFR, rs2681492 gene ATP2B1, rs4343 gene ACE, rs1801253 gene ADRB1, rs11240692 gene REN, rs2846679 gene KCNJ1, rs239345 gene SCNN1B, rs1799983 gene NOS3.

Results. The risk relation to develop AH in men - carriers of GG rs699 gene AGT was 1,95 (95% CI 1,08-3,53; p=0,003) comparing to the carriers of two other genotypes. Carriage of AA genotype rs699, opposite, is probably protective factor for AH development in men (HR 0,47; 95% CI 0,27-0,81; p=0,007). Conclusion. For two from ten MNP studied the association with AH was confirmed in men: rs699 gene AGT and rs5068 gene NPPB.

Russ J Cardiol 2014, 10 (114): 73-76

http://dx.doi.org/10.15829/1560-4071-2014-10-73-76

Key words: arterial hypertension, mononucleotide polymorphism, rs699, AGT, rs5068, NPPB.

1FSBI Scientific-Research Institute for Therapy and Preventive Medicine of the SD RAMS, Novosibirsk; 2FSBI Institute for Cytology and Genetics of the SD RAMS, Novosibirsk; Russia.

В настоящее время эссенциальная артериальная гипертензия (АГ) является одним из основных факторов риска развития неблагоприятных исходов целого ряда внутренних болезней. Развитие артериальной гипертензии как мультифакториального заболевания определяется взаимодействием генетически детерми-

нируемой предрасположенности и средовых факторов. Распространённость наследственной отягощённости по АГ у мужчин в Новосибирске составляет 38,7% [1]. Многими работами установлен достаточно высокий уровень наследуемости фенотипической вариабельности артериального давления (АД) — от 30% до 50% [2].

В генетических исследованиях факторов развития АГ идентифицировано более 1500 генов, которые ассоциированы с повышением уровня АД [3]. Из них около 200 обнаружены или подтверждены при выполнении GWAS, ещё почти на 200 имеются мета-анализы, следовательно, выполнен колоссальный объём работы. В то же время, существенная доля результатов — противоречива, а полученные эффекты отдельных полиморфизмов — слабы [2]. Именно это, по сути, является подтверждением классического представления о множестве факторов, влияющих на артериальное давление, которое определяется вкладом многих генов с незначительным эффектом каждого во взаимодействии со средовыми факторами.

Несмотря на то, что в целом идентифицированные генетические маркеры объясняют небольшую долю фенотипической дисперсии (менее 5%), тем не менее, на их основе уже тестируются генетические рискоме-тры для заблаговременной оценки вероятности развития артериальной гипертензии. Причины недостаточной статистической значимости и отрицательных результатов репликации более ранних исследований, а также небольшая величина вклада генетических факторов по результатам полногеномных исследований могут быть связаны с методологией исследования (фенотип, дизайн), этническими особенностями, вкладом средовых факторов, недостаточной плотностью маркеров и другими технологическими параметрами, а также зависят собственно от сложности патогенеза АГ. Всё это делает актуальным проведение реплицирующих исследований на каждой этнической группе, популяции, проживающих в специфических условиях среды, отличающихся по характеру питания и целому ряду других факторов.

Материал и методы

В исследование включены 514 человек. В контрольную группу вошли 168 человек (127 мужчин и 41 женщина) с АД не выше "нормального" по данным 2-х и более обследований в течение нескольких лет с интервалом не менее 6 мес. Группа с АГ состоит из 346 человек (206 мужчин и 140 женщин) с установленным диагнозом АГ. Собраны медицинские данные на основании стандартизованного опросника и медицинской документации (история АГ и гипотензивная терапия; оценка наследственной отягощенности по АГ и ССЗ; социально-демографические характеристики). Выполнены клинические измерения АД в 2-сессиях, с промежутком в 1 неделю. Протокол исследования был одобрен Этическим комитетом ФГБУ "НИИТПМ" СО РАМН. До включения в исследование у всех участников было получено письменное информированное согласие. Группы были сформированы на основе популяци-онной выборки 45-69 летних жителей Октябрьского и Кировского районов г. Новосибирска (9400 человек), которая была собрана НИИ терапии СО РАМН в ходе

работы по международному проекту HAPIEE (Health, Alcohol and Psychosocial factors In Eastern Europe). Программа исследования включала: измерение артериального давления, антропометрия (рост, вес, объём талии, бёдер), социально-демографические характеристики, опрос о курении, потреблении алкоголя (частота и типичная доза), уровне физической активности, оценку липидного профиля (общий холестерин; три-глицериды, холестерин липопротеидов высокой плотности), опрос на выявление стенокардии напряжения (Rose), ЭКГ покоя в 12-ти отведениях.

Геномную ДНК выделяли из 10 мл венозной крови. Образцы крови для экстракции ДНК хранили при температуре -20° C. Экстракция ДНК из крови проводилась фенол-хлороформным методом. Однонуклеотид-ные полиморфизмы (ОНП) тестировали с помощью ПЦР в реальном времени, с анализом по конечной точке, в соответствии с протоколом фирмы производителя (зонды TaqMan, Applied Biosystems, USA) на приборе ABI 7900HT. Генотипирование было выполнено для 10 ОНП. Перечень ОНП с краткой информацией по каждому представлен в таблице 1.

Ассоциация ОНП с АГ проверялась с помощью таблиц сопряжённости с использованием критерия хи-ква-драт по Пирсону. В случае четырёхпольных таблиц сравнение выборок по частотам генотипов и аллелей применяли точный двусторонний критерий Фишера. Относительный риск заболевания по конкретному аллелю или генотипу вычисляли как отношение шансов.

Результаты и обсуждение

По результатам генотипирования, на первом этапе определяли частоты генотипов и аллелей, изучаемых ОНП в группе больных АГ и контрольной группе, затем оценивали соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга в контрольной группе (по критерию хи-квадрат). У всех исследуемых ОНП распределение частот генотипов соответствовало равновесию Харди-Вайнберга. Статистиче-

Таблица 1

Краткая информация по ОНП, отобранным для анализа

Rs Ген Хромосомная локализация Выборка Сссылка

rs699 AGT 1q42-q43 18436 4

rs5068 NPPB 1p36.2 29717 7

rs17367504 MTHFR 1 87273 8

rs2681492 ATP2B1 12 63659 9

rs4343 АСЕ 17q23 1699 10 11

rs1801253 ADRB1 10q24-q26 86588 4

7677 12

rs11240692 REN 1q32 2379 13

rs2846679 KCNJ1 11q24.3 2037 14

rs239345 SCNN1B 16p12.2 15

rs1799983 NOS3 7q36.1 18436 4

Таблица 2

Частоты генотипов ОНП в группе с АГ и контрольной группе

ОНП Генотипы Контрольная группа АГ р

n % n %

rs699 AA 45 28,8 62 21 0,092

AG 83 53,2 160 54,2

GG 28 17,9 73 24,7

rs4343 AA 42 26,8 86 29,3 0,103

AG 69 43,9 148 50,3

GG 46 29,3 60 20,4

rs5068 GG 132 86,3 268 91,2 0,110

GT 21 13,7 26 8,8

rs239345 AA 10 6,5 10 3,4 0,226

AT 59 38,6 105 35,8

TT 84 54,9 178 60,8

rs1799983 GG 86 55,1 168 57,3 0,672

GT 57 36,5 107 36,5

TT 13 8,3 18 6,1

rs1801253 CC 69 46,3 152 52,6 0,441

CG 70 47 118 40,8

GG 10 6,7 19 6,6

rs2846679 AA 1 0,6 4 1,4 0,177

AG 46 29,5 65 22,0

GG 109 69,9 227 76,7

rs11240692 CC 66 42,6 134 45,4 0,783

CT 71 45,8 125 42,4

TT 18 11,6 36 12,2

rs17367504 AA 115 73,2 222 76,0 0,703

AG 40 25,5 68 23,3

GG 2 1,3 2 0,7

rs2681492 CC 0 0 3 1,0 0,419

CT 40 25,5 70 23,6

TT 117 74,5 223 75,3

ски значимых различии по частотам генотипов исследованных ОНП между контрольной группой и группой с АГ не получено (табл. 2). Но по частотам аллелей rs699 гена AGT они имеются. Отношение шансов иметь АГ у носителей аллеля G составляет 1,34 (95% ДИ 1,02-1,77; р=0,042).

На следующем этапе анализа группы разделили по полу. У женщин статистически значимых различий по частотам генотипов исследованных ОНП между контрольной группой и группой с АГ не получено. В таблицу 3 включены данные по обнаруженным изолированно у мужчин достоверным связям ОНП с АГ.

Подтверждена ассоциация полиморфизма rs699 в гене AGT с артериальной гипертензией у мужчин. Ген AGT, расположен на длинном плече 1-й хромосомы (1q42-q43). Замена аминокислоты метионина на тирозин в белке (M235T) происходит вследствие замены тимина на цитозин в нуклеотидной последовательности (rs699). По данным Conen D. и соавторов, (2008) этот ОНП ассоциирован с развитием и прогрессированием артериальной гипертензии [4]. В недавнем мета-анализе Takeuchi et al., (2012) на 19426 обследованных японцев подтверждена связь rs699 гена AGT в японской популяции [5]. Вклад

полиморфизма AGT в развитие АГ связывают с повышением ангиотензиногена в плазме крови [6], влиянием на инсулинорезистентность. На нашей общей группе различий по частотам генотипов нет. При разделении по полу статистически значимые отличия обнаружены у мужчин (р=0,008). Отношение шансов иметь АГ у мужчин — носителей генотипа GG составило 1,95 (95% ДИ 1,08-3,53; p=0,003) по сравнению с носителями двух других генотипов. Носительство генотипа АА напротив, является условно протектив-ным фактором в отношении развития АГ у мужчин (ОШ 0,47; 95% ДИ 0,27-0,81; р=0,007). Различия в частотах аллелей между группами мужчин с АГ и нормотензией также оказались достоверными: носительство аллеля G ассоциировано с повышением риска иметь АГ (ОШ 1,66; 95% ДИ 1,19-2,31; р=0,003).

Генотип ОНП rs5068 расположен на коротком плече 1-й хромосомы (1p36.22), относится сразу к трём генам: 1) ген NPPB (OMIM 600295), natriuretic peptide precursor B, 2) ген NPPA-AS1 NPPA antisense RNA 1, 3) ген CLCN6 (OMIM 602726), chloride channel, voltage-sensitive 6. В обследованной выборке в отношении rs5068, ген NPPB была получена пограничная связь с артериальной гипертензией у мужчин, частота АГ

Таблица 3

Частоты генотипов ОНП, различающиеся в группах АГ и контроле у мужчин, 45-69 лет, г. Новосибирск

ОНП Генотипы Контрольная группа АГ Р

n % n %

rs699 AA 37 31,4 31 17,7 0,008

AG 61 51,7 96 54,9

GG 20 16,9 48 27,4

rs5068 GG 101 87,1 165 93,8 0,050

AG 15 12,9 11 6,3

была ниже у носителей гетерозиготного генотипа (р=0,05), таблица 3. Это соответствует данным литературы. В частности, в мета-анализе Newton-Cheh С, et а1., (2009) получено снижение АДС, АДД и шансов АГ (на 10%) у носителей минорного аллеля [7, 8]. Потенциальные механизмы ассоциации связывают с более высокими концентрациями плазменных предсердного и В-типа натрийуретических пептидов [7]. А по данным Fedorowski А и соавторов (2012) ге5068 ассоциирован с ортостатической гипотензией [16].

Таким образом, из 10 ОНП генов-кандидатов АГ на удовлетворительной по объёму и критериям формирования выборке удалось подтвердить ассоциацию только для двух — ге699 и ге5068.

Заключение

Относительно небольшое количество подтверждённых нами на сибирской популяции ассоциаций, с одной стороны, ещё раз доказывает, что необходимо проверять на возможность использования маркёры, обнаруженные при исследованиях других популяций, с другой, заставляет искать новые подходы к решению проблемы поиска прогностически информативных маркёров повышенного риска развития патологического фенотипа. Маркёры, обнаруженные при исследованиях других популяций, могут оказаться

мономорфными или с очень низкой частотой "аллеля риска", могут не ассоциироваться с фенотипом, к примеру, из-за принадлежности к другому блоку сцепления в нашей популяции. Дополнительные неизвестные в уравнение добавляют специфические климатические и диетические особенности нашей популяции. Как известно, внешние факторы могут влиять даже на экспрессивность и пенетрантность классических моногенных заболеваний и, тем более, их приходится учитывать при мультифакториальных заболеваниях. Задача усложняется, когда мы имеем дело не с обычным количественным признаком (артериальное давление), а с заболеванием (артериальная гипертензия) и называем преодоление какой-то условной границы. Одним из путей решения проблемы может стать формирование фенотипически однородных групп не только по полу и возрасту, но и по ведущим патогенетическим факторам.

Благодарность. Работа частично поддержана грантом фонда РФФИ № 13-04-01955, интеграционным проектом фундаментальных исследований СО РАН № 01201257565, грантом ФЦП № 2010-1.1-234-069058. Проект HAPIEE поддержан грантами Wellcome Trust (081081/Z/06/Z), National Institute of Aging (1R01 AG23522).

Литература

1. Nikitin IuP, Voevoda MI, Maksimov VN, et al. Arterial hypertension and its relation to hereditary burden (family history) in male population of Novosibirsk (WHO MONICA Program)]. Kardiologiia 2005; 45(8): 44-5. Russian (Никитин Ю. П., Воевода М. И., Максимов В. Н., и др. Артериальная гипертензия и её связь с наследственной отягощенностью в мужской популяции Новосибирска (программа ВОЗ MONICA). Кардиология 2005; 45(8): 44-5).

2. Snieder H, Harshfield GA, Treiber FA. Heritability of blood pressure and hemodynamics in African- and European-American youth. Hypertension. 2003 Jun; 41(6): 1196-201.

3. http://hugenavigator.net/ HuGENavigator/startPagePhenoPedia.do.

4. Conen D, Glynn RJ, Buring JE, et al. Association of renin-angiotensin and endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms with blood pressure progression and incident hypertension: prospective cohort study. J Hypertens. 2008 Sep; 26(9): 1780-6.

5. Takeuchi F, Yamamoto K, Katsuya T, et al. Reevaluation of the association of seven candidate genes with blood pressure and hypertension: a replication study and meta-analysis with a larger sample size. Hypertens Res. 2012; 35(8): 825-31.

6. Sethi AA, Nordestgaard BG, Tybjaerg-Hansen A. Angiotensinogen gene polymorphism, plasma angiotensinogen, and risk of hypertension and ischemic heart disease: a meta-analysis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003; Jul 1, 23(7): 1269-75.

7. Newton-Cheh C, Larson MG, Vasan RS, et al. Association of common variants in NPPA and NPPB with circulating natriuretic peptides and blood pressure. Nat Genet. 2009 Mar; 41(3): 348-53.

8. Newton-Cheh C, Johnson T, Gateva V, et al. Genome-wide association study identifies eight loci associated with blood pressure. Nat Genet. 2009 Jun; 41(6): 666-76.

9. Levy D, Ehret GB, Rice K, et al. Genome-wide association study of blood pressure and hypertension. Nat Genet. 2009 Jun; 41(6): 677-87.

10. Wenquan Niu, Yue Qi, Pingjin Gao, et al. Review: association between angiotensin converting enzyme G2350A polymorphism and hypertension risk: a meta-analysis. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 2011 Mar; 12(1): 8-14.

11. Chung CM, Wang RY Chen JW, et al. A genome-wide association study identifies new loci for ACE activity: potential implications for response to ACE inhibitor. Pharmacogenomics J. 2010 Dec; 10(6): 537-44.

12. Gjesing AP, Andersen G, Albrechtsen A, et al. Studies of associations between the Arg389Gly polymorphism of the beta1-adrenergic receptor gene (ADRB1) and hypertension and obesity in7677 Danish white subjects. Diabet Med. 2007 Apr; 24(4): 392-7.

13. Ehret GB, O'Connor AA, Weder A, et al. Follow-up of a major linkage peak on chromosome 1 reveals suggestive QTLs associated with essential hypertension: GenNet study. Eur J Hum Genet. 2009 Dec; 17(12): 1650-7.

14. Tobin MD, Tomaszewski M, Braund PS, et al. Common variants in genes underlying monogenic hypertension and hypotension and blood pressure in the general population. Hypertension. 2008 Jun; 51(6): 1658-64.

15. Zhao Q, Gu D, Hixson JE, et al. Genetic Epidemiology Network of Salt Sensitivity Collaborative Research Group. Common variants in epithelial sodium channel genes contribute to salt sensitivity of blood pressure: The GenSalt study. Circ Cardiovasc Genet. 2011 Aug 1; 4(4): 375-80.

16. Fedorowski A. Franceschini N, Brody J, et al. Orthostatic hypotension and novel blood pressure-associated gene variants: Genetics of Postural Hemodynamics (GPH) Consortium. Eur Heart J. 2012 Sep; 33(18): 2331-41.