МЕТИОНИНСИНТАЗЫ С ПОНИЖЕННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ К ИНГИБИРОВАНИЮ ПРОДУКТОМ РЕАКЦИИ

1. Нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, который представляет собой ферментативно активную кобаламинзависимую метионинсинтазу и несет по меньшей мере одну мутацию в его аминокислотной последовательности по сравнению с аминокислотной последовательностью дикого типа, в результате которой ферментативная активность указанной ферментативно активной кобаламинзависимой метионинсинтазы ингибируется метионином в меньшей степени, чем ферментативная активность ферментативно активной кобаламинзависимой метионинсинтазы или ее функционального фрагмента с аминокислотной последовательностью дикого типа.
2. Нуклеотидная последовательность по п.1, где указанная ферментативно активная кобаламинзависимая метионинсинтаза или ее функциональный фрагмент, с пониженной способностью к ингибированию продуктом реакции метионином, несет мутацию в гомоцистеинсвязывающем домене.
3. Последовательность ДНК по п.1 или 2, выбранная из группы последовательностей ДНК, включающей:
а) последовательности ДНК, содержащие нуклеотидную последовательность, которая кодирует ферментативно активную кобаламинзависимую метионинсинтазу с пониженной способностью к ингибированию продуктом реакции метионином с по меньшей мере одной мутацией в SEQ ID No.1,
б) последовательности ДНК, содержащие нуклеотидную последовательность с мутацией в SEQ ID No.23,
в) последовательность ДНК, которая по меньшей мере 90% идентична последовательности ДНК, представленной в а) или б),
г) последовательность ДНК или по меньшей мере ее часть, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеотидной последовательностью, представленной в а), б) или в).
4. Последовательность ДНК по п.1 или 2, выбранная из группы, включающей:
а) последовательности ДНК, содержащие нуклеотидную последовательность, которая кодирует по меньшей мере одну ферментативно активную кобаламинзависимую метионинсинтазу или функциональный фрагмент с пониженной способностью к ингибированию продуктом реакции метионином с по меньшей мере одной мутацией в SEQ ID No.2,
б) последовательности ДНК, содержащие нуклеотидную последовательность, которая несет мутацию в SEQ ID No.24,
в) последовательность ДНК, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности ДНК, представленной в а) или б),
г) последовательность ДНК или по меньшей мере ее часть, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеотидной последовательностью, представленной в а), б) или в).
5. Последовательность ДНК по п.3, которая кодирует ферментативно активную кобаламинзависимую метионинсинтазу, имеющую SEQ ID NO:1, которая несет по меньшей мере одну мутацию в положениях 33, 86 или 134.
6. Последовательность ДНК по п.5, где одна или более замен имеет место в SEQ ID NO:1: метионин в положении 33 заменен глицином или аланином, фенилаланин в положении 86 заменен лейцином и серин в положении 134 заменен аспарагином.
7. Последовательность ДНК по п.6, кодирующая полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID N. 19, 20, 21 или 22.
8. Вектор, который содержит в направлении 5'→3':
а) промоторную последовательность, функционально активную в отношении экспрессии нуклеотидных последовательностей в клетке-хозяине,
б) функционально связанную с нуклеотидной последовательностью по одному из пп.1-7,
в) терминирующую последовательность.
9. Полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью по одному из пп.1-7.
10. Клетка-хозяин, содержащая нуклеотидную последовательность по одному из пп.1-7.
11. Клетка-хозяин по п.10, где клетка-хозяин представляет собой микроорганизм, выбранный из группы, включающей С. glutamicum, E. coli, S. coel и Т. maritima.
12. Клетка-хозяин по п.10 или 11, в которой эндогенный(ые) ген(ы) кобаламинзависимой(ых) метионинсинтазы(з) удален(ы) в результате делеции или его(их) функция нарушена.
13. Клетка-хозяин по п.10 или 11, в которой уровень и/или активность по меньшей мере одной из следующих нуклеотидных последовательностей повышены по сравнению с соответствующим исходным организмом-хозяином:
нуклеотидная последовательность, кодирующая аспартаткиназу lysC,
нуклеотидная последовательность, кодирующая глицеринальдегид-3-фосфатдегидрогеназу gap,
нуклеотидная последовательность, кодирующая 3-фосфорглицераткиназу pgk,
нуклеотидная последовательность, кодирующая пируваткарбоксилазу рус,
нуклеотидная последовательность, кодирующая триозофосфатизомеразу tpi,
нуклеотидная последовательность, кодирующая гомосерин-0-ацетилтрансферазу metA,
нуклеотидная последовательность, кодирующая цистатион-гамма-синтазу metB,
нуклеотидная последовательность, кодирующая цистатион-гамма-лиазу metC,
нуклеотидная последовательность, кодирующая серингидроксиметилтрансферазу glyA,
нуклеотидная последовательность, кодирующая O-ацетилгомосеринсульфгидрилазу metY,
нуклеотидная последовательность, кодирующая фосфосеринаминотрансферазу serC,
нуклеотидная последовательность, кодирующая фосфосеринфосфатазу serB,
нуклеотидная последовательность, кодирующая серинацетилтрансферазу cysE,
нуклеотидная последовательность, кодирующая гомосериндегидрогеназу hom,
нуклеотидная последовательность, кодирующая метионинсинтазу metE,
нуклеотидная последовательность, кодирующая фосфоаденозинфосфосульфатредуктазу cysH,
нуклеотидная последовательность, кодирующая субъединицу I сульфатаденилилтрансферазы,
нуклеотидная последовательность, кодирующая субъединицу 2 CysN-сульфатаденилилтрансферазы,
нуклеотидная последовательность, кодирующая ферредоксин-НАДФ-редуктазу,
нуклеотидная последовательность, кодирующая ферредоксин,
нуклеотидная последовательность, кодирующая глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, и/или
нуклеотидная последовательность, кодирующая фруктозо-1,6-бисфосфатазу.
14. Клетка-хозяин по п.13, в которой уровень и/или активность по меньшей мере одной из следующих нуклеотидных последовательностей понижены по сравнению с соответствующим исходным организмом-хозяином:
нуклеотидная последовательность, кодирующая гомосеринкиназу thrB,
нуклеотидная последовательность, кодирующая треониндегидратазу ilvA,
нуклеотидная последовательность, кодирующая треонинсинтазу thrC,
нуклеотидная последовательность, кодирующая мезо-диаминопимелат-D-дегидрогеназу ddh,
нуклеотидная последовательность, кодирующая фосфоенолпируваткарбоксикиназу pck,
нуклеотидная последовательность, кодирующая глюкозо-6-фосфат-6-изомеразу pgi,
нуклеотидная последовательность, кодирующая пируватоксидазу рохВ,
нуклеотидная последовательность, кодирующая дигидродипиколинатсинтазу dapA,
нуклеотидная последовательность, кодирующая дигидродипиколинатредуктазу dapB,
нуклеотидная последовательность, кодирующая диаминопиколинатдекарбоксилазу lysA,
нуклеотидная последовательность, кодирующая гликозилтрансферазу, и/или
нуклеотидная последовательность, кодирующая лактатгидрогеназу.
15. Способ получения метионина в организме-хозяине, в котором осуществляют следующие стадии:
а) культивируют клетку-хозяина по любому из пп.10-14 и
в) выделяют метионин.
16. Способ по п.15, в котором осуществляют следующие стадии:
а) трансфектируют вектором по п.8 клетку-хозяина,
б) культивируют клетку-хозяина и необязательно
в) выделяют метионин.