СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПОВЕРХНОСТИ ОБРАЗЦОВ КОСТНОЙ ТКАНИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЕЁ МИКРОСТРУКТУРЫ ПРИ ПОМОЩИ СКАНИРУЮЩЕГО ЭЛЕКТРОННОГО МИКРОСКОПА
METHOD FOR PREPARING THE SURFACE OF BONE TISSUE SAMPLES TO STUDY THEIR MICROSTRUCTURE USING A SCANNING ELECTRON MICROSCOPE

Изобретение относится к области биологии и экспериментальной медицины и может применяться при проведении исследовательских работ, связанных с изучением пространственной микроструктуры образцов костной ткани. Предназначен для подготовки образцов костной ткани для исследования их микроструктуры при помощи сканирующего электронного микроскопа.
Известен способ подготовки образцов недекальцинированного суставного хряща с подлежащей субхондральной костью для многоцелевых исследований, включая сканирующую электронную микроскопию. Способ отличается тем, что там берут образцы тканей 3-4 мм и дегидратируют в режиме плавного перехода от спирта к ацетону с увеличением времени на этапах от 70% до 96% спирта до 1 ч, обезвоживают в 2 сменах 70% спирта по 1 ч, в двух сменах 80% спирта по 1 ч, в двух сменах 90% спирта по 1 ч, в двух сменах 96% спирта по 1 ч, в двух сменах 100% спирта по 30 мин, в двух сменах 100% ацетона по 30 мин, затем осуществляют пропитку в режиме плавного перехода от ацетона до смолы: смесь смола-ацетон 100% 3:1 - 2 ч, смесь смола-ацетон 100% 1:1 - 2 ч, смесь смола-ацетон 100% 1:3 - 2 ч и перед полимеризацией пропитывают в смоле при комнатной температуре до 10 суток. (Патент 2466375 RU, опубл. 10.11.2012, Способ подготовки образцов биологических тканей для исследования в сканирующем электронном микроскопе).
Данная методика является сложной в исполнении и трудоемкой, требует значительных затрат времени и реагентов.
Известен способ подготовки образцов биологических тканей для многоцелевых исследований, в том числе для сканирующей электронной микроскопии. Способ включает фиксацию, промывку и обезвоживание тканей, при этом образцы после обезвоживания, не высушивая, переносят в смесь дегидранта и камфена, затем последовательно пропитывают в двух порциях расплавленного камфена при температуре 51-60°С. При этом, время каждого этапа подготовки образцов к микроскопическому исследованию подбирают индивидуально, в зависимости от размера образца (Патент 2397472 RU, опубл. 20.08.2010, Способ подготовки недекальцинированного суставного хряща с подлежащей субхондральной костью для многоцелевых исследований).
Однако данный способ также длителен по времени и требует применения труднодоступных реактивов (камфен).
Был предложен способ подготовки к исследованию методом сканирующей электронной микроскопии регенерата костной ткани (Ирьянов Ю.М. Особенности подготовки образца регенерата кости для исследования при помощи сканирующей электронной микроскопии / Ю.М. Ирьянов, Т.Ю. Ирьянова // Морфологические ведомости - 2010. - №1. - С.135-137). Регенераты фиксировали в 2% растворе параформальдегида, глутарового альдегида и 0,1% пикриновой кислоты на фосфатном буфере (рН 7,4) при температуре +4°С в течение 48 часов, промывали, обезвоживали и заливали в аралдит по следующей схеме: 100% ацетон + смесь аралдитов в соотношениях 3:1, 1:1 и 1:3 по 12 часов в каждой смеси; смесь аралдитов без ацетона - 24 часа. Ацетон использовали для уменьшения вязкости заливочной среды. Смесь аралдитов состояла из 50 мл аралдита М (Araldite М - Araldite CY212), 45 мл аралдита Н (Araldite Hardener HY964), 5 мл MNA (Methyl-endo methylene phathalic anhydride) и 1 мл катализатора полимеризации DMP-30 (Trimethylaminomethyl phenol). Аралдитовый блок обрезали, обнажали исследуемую поверхность регенерата, которую затем полировали мелкоабразивными материалами (водостойкой абразивной бумагой Р 200, Р 400, Р 1000).
Недостатком данного метода является необходимость применения дорогостоящих материалов, техническая сложность методики и длительность по времени.
Для подготовки образцов биологических тканей к СЭМ было предложено промывать образец изотоническим раствором хлорида натрия, после чего использовать водный раствор хлоридов одного из редкоземельных элементов или их смеси с экспозицией от 6 часов до 20 минут с целью суправитального контрастирования (Патент 2578977 RU, опубл. 27.03.2016, Способ подготовки биологического образца к исследованию при помощи сканирующей электронной микроскопии).
Данный метод не подходит для подготовки к исследованию костной ткани, так как не предполагает удаления остатков костного мозга, что затрудняет визуализацию трабекулярной микроструктуры образца ткани.
Задачей настоящего изобретения является упрощение методики, а также уменьшение времени и материальных затрат на подготовку образцов костной ткани для исследования при помощи сканирующего электронного микроскопа.
Технический результат заключается в упрощении методики и уменьшении времени и материальных затрат на ее осуществление. Способ не требует специального оборудования, применения токсичных и дорогостоящих реактивов, является простым, эффективным, быстрым и безопасным.
Заявляется способ подготовки образцов костной ткани для исследования в сканирующем электронном микроскопе, включающий фиксацию и удаление липофильных компонентов в виде остатков костного мозга, отличающийся тем, что образец нативной кости помещают в 100% ортофосфорную кислоту, экспозиция составляет 6 минут, далее его промывают под проточной водой в течение 5 минут и сушат при комнатной температуре в течение часа.
Изобретение поясняется следующими иллюстрациями.
На фиг. 1 показан фрагмент субхондральной костной ткани латерального мыщелка большеберцовой кости.
На фиг. 2 показаны образцы для исследования после обработки в ортофосфорной кислоте.
На фиг. 3 показан образец до обработки. Трабекулярную структуру кости оценить невозможно, так как костные поры заполнены липофильными компонентами в виде костного мозга, экранирующими поле зрения.
На фиг. 4 показан образец после обработки в 100% ортофосфорной кислоте в течение 6 минут. Липофильные компоненты полностью удалены, что дает возможность оценивать микроархитектонику костной ткани образца. Хорошо видна пористая структура кости и костные трабекулы.
Способ осуществляют следующим образом.
Способ включает фиксацию и удаление липофильных компонентов костного мозга. Образец нативной кости помещают в 100% ортофосфорную кислоту, экспозиция составляет 6 минут, после чего его промывают под проточной водой в течение 5 минут и сушат при комнатной температуре в течение одного часа.
При помощи остеотома готовится образец трабекулярной кости в форме прямоугольного параллелепипеда. Для фиксации ткани и удаления липофильного компонента в виде костного мозга образец помещают в 100% ортофосфорную кислоту, экспозиция составляет 6 минут, далее его промывают под проточной водой в течение 5 минут и сушат при комнатной температуре в течение часа, после чего осуществляется монтаж объекта на промежуточную подложку. После нанесения токопроводящего слоя препарат можно исследовать при помощи сканирующего электронного микроскопа.
Пример выполнения способа. Для исследования был взят фрагмент субхондральной костной ткани латерального мыщелка большеберцовой кости (фиг. 1). Из указанного фрагмента изготовили 6 образцов (фиг. 2). Три образца составляли группу контроля, они были исследованы без предварительной обработки (фиг. 3). Оставшиеся образцы готовились с использованием ортофосфорной кислоты по указанной выше методике, после чего также исследовались в сканирующем электронном микроскопе (фиг. 4). В ходе обработки была достигнута фиксация костной ткани и получена возможность оценить ее микроархитектонику.