ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛА, ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ И/ИЛИ СТАДИЙ РАЗВИТИЯ ПТИЧЬИХ ЭМБРИОНОВ В ЯЙЦЕ
GENDER, VIABILITY AND / OR DEVELOPMENTAL STAGE DETERMINATION OF AVIAN EMBRYOS IN EGG

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к способу определения пола, стадий развития и/или жизнеспособности птичьего эмбриона в яйце путем установления присутствия маркеров развития в яйце, более конкретно в аллантоисной жидкости. Кроме того, данный способ относится к определению жизнеспособности птичьего эмбриона, отбору мужских и женских яиц и получению из этих отобранных яиц вакцин и/или цыплят.
Предпосылки создания изобретения
Из оплодотворенных яиц большинства птиц, в частности тех, которых разводят в промышленном масштабе, например, домашних кур (Gallus gallus domesticus), уток, гусей и индеек, обычно вылупляются мужские и женские особи в примерно равном соотношении. В работе инкубаторов может быть желательно разделять птиц на основе разных характеристик, в частности пола. Например, это может быть нужно для инокулирования мужских и женских особей птиц разными вакцинами или для разделения популяций с целью определения эффективного кормления, унификации обработки или снижения производственных затрат, поскольку мужские и женские особи птиц различаются по скорости роста и потребности в пище. К тому же при промышленном производстве яиц инкубация и выведение мужских особей в высшей степени нежелательны, т.к. это приводит к ежегодной выбраковке миллионов цыплят мужского пола.
Кроме того, некоторая доля яиц уже в начале инкубационного периода оказываются неоплодотворенными или содержащими нежизнеспособный эмбрион, что резко снижает производительность инкубаторов и инкубаторных цехов. До сих пор выявление жизнеспособных, т.е. живых эмбрионов, обычно проводили с применением методики, известной как «миражирование» (просвечивание) яиц, как это раскрыто, например, в ЕР-А-2369336 и US 7950349.
В этом случае яйцо проверяют с использованием источника света, излучающего свет такой длины волны, который по меньшей мере частично проходит через яйцо.
Хотя этот способ может показать, содержит ли яйцо живой эмбрион, однако для получения надежного результата необходимо выращивать яйцо по меньшей мере до 11 дня или даже до более поздней стадии развития. Кроме того, хотя такая методика позволяет различать живое и неживое яйцо, она не позволяет надежно определить пол и другие характеристики невылупившихся птиц.
В результате оказывается, что птицефабрикам необходимо иметь по меньшей мере вдвое более высокую производственную мощность по сравнению с той, которая могла быть при наличии ранней селекции по полу, позволяющей в первую очередь отбирать только женские эмбрионы цыплят.
Соответственно было бы очень ценно для окружающей среды в свете экономии энергии и других ресурсов, а также непроизводительной отбраковки мужских особей цыплят, а также уменьшения стресса вылупляющихся птиц, если бы существовал способ определения пола птичьих эмбрионов еще до стадии инкубации, что резко повысило бы производительность инкубационных цехов.
Способ, позволяющий отличать яйца с живыми эмбрионами от неоплодотворенных и/или других нежизнеспособных яиц, мог бы обеспечить дополнительное увеличение эффективности инкубации.
Y. Feng et al. описали в Appl. Magn. Reson. (2007), 32, 257-268 способ анализа метаболитов в аллантоисной жидкости куриных яиц на 9 сутки методом ЯМР спектроскопии высокого разрешения при 900 МГц.
Gu D.-C. et al, в Chinese Journal of Animal Science, Vol. 7, 23-25, описал способ определения концентрации свободной аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, аргинина и лейцина в аллантоисной и амниотической жидкостях во время инкубации яиц методом ВЭЖХ. Однако раскрытый способ не выходит за рамки определения базового уровня для сравнения яиц неуказанного срока хранения, а просто устанавливает базовый уровень для четырех аминокислот. Кроме того, раскрытый здесь способ исследования является деструктивным, т.к. он не позволяет использовать после исследования яйца с живыми эмбрионами для инкубации, либо применять для других целей, например, для получения вакцин.
В US-A-2003/0096319 и WO-A-2006124456 раскрыты способы определения пола птичьего эмбриона в яйце путем определения эстрогенного стероидного соединения, присутствующего в образце эмбриональной жидкости, такой как аллантоисная жидкость или кровь из яйца птицы. Хотя этот способ может быть использован без разрушения яйца, количества эстрогенного стероида минимальны и тест может быть успешным только после развития гонад, следовательно, на сравнительно позднем этапе развитии эмбриона. Кроме того, способ по WO-A-2006124456, по-видимому, требует модифицирования флуоресцентных маркеров для каждого образца и его подгруппы или генетического модифицирования таких образцов.
Ohta Y. et al., Poultry Science, Vol. 80, Nr. 10, 1430-1346, раскрывает влияние введения в яйцо аминокислот на концентрацию аминокислот в эмбрионе и другое содержимое бройлерных яиц. Однако этим способом нельзя определить пол, жизнеспособность и/или стадии развития яйца птицы. Сущность изобретения
Соответственно настоящее изобретение относится к способу определения пола, стадии развития и/или жизнеспособности птичьего эмбриона в яйце, включающему (а) определение по меньшей мере первого маркерного соединения развития, выбранного из Сахаров и/или аминокислот, их прекурсоров и метаболитов в яйце в период времени от начала инкубации яйца до вылупления; (b) измерение количества по меньшей мере первого обнаруженного маркерного соединения развития и (с) сравнение этого количества с базовым значением для мужского и женского пола, для стадии развития эмбриона и/или живого и погибшего или неразвившегося эмбриона для определения, является ли эмбрион живым, имеет мужской и/или женский пол и/или находится на соответствующей стадии развития.
В другом аспекте настоящий способ относится к способу определения пола и/или жизнеспособности птичьего эмбриона в яйце, включающему (а) определение по меньшей мере первого маркерного соединения развития, выбранного из Сахаров и/или аминокислот, их прекурсоров и метаболитов в яйце в период времени от начала инкубации яйца до вылупления; (b) измерение количества по меньшей мере первого обнаруженного маркерного соединения развития и (с) сравнение этого количества с базовым значением для мужского и женского пола и/или живого и погибшего или неразвившегося эмбриона для определения, является ли эмбрион жизнеспособным, мужским и/или женским.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу определения стадии развития птичьего эмбриона в яйце согласно любому из предшествующих пунктов, включающему (а) определение по меньшей мере первого маркерного соединения развития, выбранного из Сахаров и/или аминокислот, их прекурсоров и метаболитов в яйце; (b) измерение количества по меньшей мере первого обнаруженного маркерного соединения развития и (с) сравнение этого количества с базовым значением для данной стадии развития от закладки до вылупления для определения стадии развития эмбриона и возможного времени до вылупления.
1
1
Краткое описание Фигур. Фигура 1 показывает моделирование методом наименьших квадратов независимого многовариантного анализа данных Н ЯМР для группировки образцов на основе всех метаболитов, определенных методом Н ЯМР, в серии лабораторных анализов куриных яиц. F означает женский, M означает мужской.
1
1
Фигура 2 показывает моделирование методом наименьших квадратов независимого многовариантного анализа данных Н ЯМР для группировки образцов на основе всех метаболитов, определенных методом Н ЯМР, для более широкого набора данных из промышленного инкубатора цыплят. F означает женский, M означает мужской.
Подробное описание изобретения
Далее настоящее изобретение описано более подробно вместе с сопровождающим рисунком, на котором показан предпочтительный вариант. Однако данное изобретение можно представить в различных формах, и оно не ограничивается приведенными ниже вариантами; напротив, эти варианты приведены, чтобы раскрытие изобретения было тщательным и полным и с достаточной полнотой выражало объем изобретения для специалистов в данной области. Если не определено иначе, все использованные здесь технические и научные термины имеют тот же смысл, что и общепринятый для специалистов в той области, к которой относится данное изобретение. Использованная в описании изобретения терминология служит только для раскрытия конкретных вариантов и не предназначена для ограничения данного изобретения.
Использованный здесь термин «птичий» и «птица» включает самцов или самок любых видов птиц, но в первую очередь домашнюю птицу, которую производят в промышленном масштабе из-за яиц или мяса. Соответственно, термины «птица» и «птичий» особенно относятся к курам, индейкам, уткам, гусям, перепелам и фазанам.
Использованный здесь термин «инкубация» относится к способу, которым птицы высиживают свои яйца, и к развитию эмбриона в яйце после того, как оно покидает чрево курицы. Период инкубации относится к непрерываемому периоду времени, во время которого конкретное яйцо находится в условиях, имитирующих высиживание яиц до вылупления, т.е. появления птиц, включая любые манипуляции или переносы, например, из инкубатора в помещение для созревания, при условии, что развитие птицы не прекращается.
Использованный здесь термин «в яйце» («in ovo») относится к птичьим эмбрионам, содержащимся в яйце до вылупления. Настоящее изобретение можно применять на практике для любого типа птичьих яиц, включая, но не ограничиваясь яйцами (домашней) курицы, индейки, утки, гуся, перепелки и фазана.
Использованные здесь термины «инъекция» или «инъекционный» охватывают способы введения устройства (обычно пролонгированного устройства) в яйцо или эмбрион, включая способы доставки или высвобождения вещества в яйцо или эмбрион, способы удаления вещества (т.е. образца) из яйца или эмбриона, и/или способы введения детектирующего устройства в яйцо или эмбрион.
Согласно данному изобретению, анализы предпочтительно проводят не деструктивным способом, т.е., чтобы тестируемые таким способом птичьи эмбрионы росли, если нужно, или подвергались дальнейшим стадиям обработки, таким как типа получение вакцины in ovo, при условии, что эмбрион остается живым.
Использованный здесь термин «аллантоисная жидкость» включает аллантоисную жидкость с другими компонентами яйца или без них. Например, термин аллантоисная жидкость может включать смесь крови и аллантоисной жидкости. Варианты настоящего изобретения не ограничиваются экстрактивным материалом из аллантоисной жидкости или областей, расположенных рядом с верхней поверхностью яйца. Описанное здесь удаление материала из аллантоисной жидкости служит просто одним из примеров возможных вариантов по настоящему изобретению. Различные материалы, включая, но не ограничиваясь этим: амнион, желток, скорлупа, белок, ткань, мембрана и/или кровь могут быть получены из яйца и проанализированы для определения одного или нескольких маркеров развития, как показано ниже. Материал может быть извлечен из яиц практически с любой ориентацией.
Термин «предварительно определенная локализация» здесь обозначает фиксированную позицию или глубину внутри яйца. Например, устройство может быть введено в яйцо на фиксированную глубину и/или в фиксированное положение в яйце. В альтернативных вариантах можно провести инъекцию на основе информации, полученной из яйца, например, после касающейся положения эмбриона или подзародышевой полости в яйце.
Использованный здесь термин «сравнение количества» преимущественно включает моновариантный или предпочтительно многовариантный анализ изучаемых метаболитов и определение связи птичьего эмбриона с определенной популяцией. Стадия может включать установление присутствия аналитов, т.е. метаболитов, в образцах материала с помощью многовариантного статистического анализа масс-спектра, ЯМР или соответствующих данных, полученных другими способами. Предпочтительно, чтобы программа многовариантного статистического анализа включала программу анализа основных компонентов и/или программу дробного регрессионного анализа по методу наименьших квадратов. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу, устройству и системе определения пола, стадии развития и/или жизнеспособности птичьего эмбриона в яйце, включая программу многовариантного статистического анализа, а также имплементированному в микропроцессор методу их определения.
Способы и устройства в соответствии с вариантами настоящего изобретения можно использовать для идентификации одной или нескольких характеристик яйца в любой момент периода эмбрионального развития, также определяемого как период его инкубации. Варианты по настоящему изобретению не ограничены конкретным днем и течение периода эмбрионального развития.
В настоящем способе маркеры развития предпочтительно анализируют инвазивно или неинвазивно.
При инвазивном проведении анализа обычно получают образец материала яйца. Пробу предпочтительно отбирают из эмбриональной жидкости, предпочтительно из аллантоисной жидкости, т.к. это минимизирует вероятность повреждения эмбриона. Обычно аллантоисная жидкость является экскреторной средой для азотных метаболитов птичьего эмбриона. Аллантоисная жидкость начинает формироваться примерно на 3 день инкубации, как показали Hamburger, V and Hamilton, HL (1951). "A series of normal stages in the development of the chick embryo". Journal of Morphology 88 (1): 49-92.
Здесь показано, что аллантоис определялся на 65 час после инкубации в виде короткого толстостенного кармана; еще не везикулярного. Через 72 часа аллантоис становился везикулой разного размера, в среднем размера среднего мозга, и это указывает на то, что аллантоис и аллантоисная жидкость появляются на 3 сутки.
Он достигает максимального объема примерно на 13 сутки инкубации и при продолжении инкубации уменьшается в объеме из-за потери влаги и ресорбции жидкости, но на 18 день инкубации все еще присутствует в виде значительных объемов.
Аллантоисная жидкость отделена от яичной скорлупы внутренней и внешней оболочечными мембранами и хориоаллантоисными мембранами. Хотя аллантоисная жидкость охватывает всю периферию яйца с зародышем, обычно аллантоисная жидкость накапливается в вершине яйца непосредственно под мембранами, покрывающими воздушную полость.
Аллантоисная жидкость накапливается вверху яйца благодаря силе тяжести и вытеснению плотным эмбрионом и желточным мешком. Попытки аккуратно отобрать пробу аллантоисной жидкости через вершину яйца, поставленного вертикально, могут быть затруднены, т.к. воздушное пространство меняется от яйца к яйцу. Для того, чтобы собрать аллантоисную жидкость в локализованном центре, можно воспользоваться силой тяжести. При вращении яйца вдоль длинной оси аллантоисная жидкость будет собираться в вершине яйца прямо под скорлупой. Укладка яиц по длинной оси создает удобную возможность для отбора образца аллантоисной жидкости.
Получение материала, такого как аллантоисная жидкость из яйца, может быть осуществлено разными способами, включая проникновение через скорлупу яйца и введение канюли для отбора пробы через мембраны. Образец отбираемой жидкости можно затем вернуть обратно, если мембрану и/или скорлупу быстро заклеить подходящим веществом или дать закрыться самостоятельно.
Подходящие способы и устройства для проникновения в яйцо и инвазивного отбора материала яйца раскрыты, например, в US-A-20070137577, WO-A-00/22921 или WO-A-99/34667. Отобранную таким образом пробу далее используют с применением соответствующего протокола для определения маркеров развития и анализа относительных и/или абсолютных количеств присутствующих маркеров развития.
Образец может анализироваться любым способом, подходящим для определения и количественной оценки маркера или маркеров развития. Предпочтительно анализ проводят с использованием методов магнитного резонанса, включая методы ядерного резонанса; спектральных резонансных методов, включая инфракрасную или Раман-спектроскопию; и/или аналитическими методами, такими как ГХ (газовая хроматография) или ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) с соответствующими детекторами; методами флуоресцентной спектроскопии и/или иммуносорбентного анализа с иммобилизованными ферментами, включая влажный и сухой способы, такие как метод с индикаторными полосками. Хотя инвазивные способы позволяют напрямую отобрать пробу и проанализировать отобранную жидкость, предпочтительно проводить анализ неинвазивно, благодаря эффективности такого анализа при том, что скорлупа яйца и мембраны в нем остаются неповрежденными.
Для проведения неинвазивного анализа можно применять любой подходящий способ. Обычно применяют количественные спектральные резонансные методы, включая инфракрасную или Раман-спектроскопию, предпочтительно используя вторичные спектры для определения присутствия и абсолютных и/или относительных количеств маркеров развития в яйце. Несмотря на то, что использование неинвазивных способов было раскрыто в некоторых публикациях, например, в US-A-2011/144473 и US-A-7950349, эти публикации только в общем описывают суммарные эмиссионные спектры, которые на практике не позволяют определить стадию развития, жизнеспособность и/или пол эмбриона. Настоящий способ отличается от раскрытых способов в частности тем, что определяет присутствие некоторых компонентов в яйце с помощью вторичных производных спектров, позволяющих селективно определять абсолютные и относительные количества одного или нескольких маркерных соединений развития.
В частности для достижения необходимой точности и воспроизводимости можно использовать дифференциальную ИК-Фурье и Раман-Фурье спектроскопию или их комбинацию, тогда как методы ядерного магнитного резонанса можно применять для определения природы маркеров развития и установления базового уровня для калибровки системы.
Настоящий способ позволяет успешно определять жизнеспособность и/или пол эмбриона и/или предпочтительно стадии развития от начала инкубации яйца до вылупления.
Предпочтительно измерения проводят в период от 1 до 15 дней, более предпочтительно от 2 до 14 дней, еще более предпочтительно от 3 до 13 дней и даже более предпочтительно от 4 до 12 дней после начала инкубации, так например, стадию а) предпочтительно проводят в период от 6 до 12 суток после начала инкубации яйца.
Это позволяет избежать затрат на инкубирование яиц, которые имеют нежелательный пол и/или неживые. Более того, можно определять реальную стадию развития яйца. Для видов с более короткими или длинными периодами инкубации, чем у домашних кур, можно выбрать другие подходящие периоды.
Маркеры развития в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно выбирают из Сахаров, аминокислот и их соответствующих метаболитов и/или прекурсоров.
Из них особенно важные маркеры развития включают глюкозу, холин и валин, каждый из которых оказывает статистически значительное влияние на определение пола птичьего эмбриона.
Не желая быть связанным какой-либо конкретной теорией, можно считать, что холин и триметилглицин, его аминокислотное производное, особенно полезны для поддержания развития нервной системы плода. Было установлено, что соотношение холина и триметилглицина (бетаина) сильно отличается у мужских и женских эмбрионов, причем абсолютные количества холина также были выше в аллантоисной жидкости женских эмбрионов. В целом холин и его метаболиты необходимы для трех основных физиологических целей: структурная целостность и сигнальные функции для клеточных мембран; холинэргическая нейротрансмиссия (синтез ацетилхолина) и основной источник метильных групп через его метаболит триметилглицин (бетаин), который участвует в пути синтеза S-аденозилметионина (SAMe). С другой стороны, было установлено, что валин и глюкоза также заметно варьируются для мужских и женских эмбрионов.
В случае птиц Gallus gallus domesticus предпочтительно, чтобы первым или последующим маркером развития в аллантоисной жидкости была глюкоза в абсолютном количестве в интервале 30-70 мкмоль/мл для женских эмбрионов и 1-30 мкмоль/мл для мужских эмбрионов.
Другим первым или последующим предпочтительным маркером развития в аллантоисной жидкости для эмбрионов Gallus gallus domesticus является холин в абсолютном количестве для женских эмбрионов в интервале от 110 мкмоль/мл до 130 мкмоль/мл и для мужских эмбрионов от 90 мкмоль/мл, до, но не включительно, 110 мкмоль/мл.
Еще одним первым или последующим маркером развития для эмбрионов Gallus gallus domesticus предпочтительно является валин в аллантоисной жидкости в абсолютном количестве для женских эмбрионов в интервале от 110 мкмоль/мл до 130 мкмоль/мл и для мужских эмбрионов от 90 мкмоль/мл до, но не включительно, 110 мкмоль/мл.
Предпочтительно, чтобы в настоящем способе по меньшей мере второй маркер определялся на стадии (а), причем по меньшей мере первый и второй маркеры анализируют и сравнивают с базовым значением и с друг другом для установления соотношения маркеров развития.
Селективность определения жизнеспособности и пола может быть далее уточнена путем корреляции анализа для двух или трех маркеров. Соответственно предпочтительно, чтобы по меньшей мере первый и второй и/или следующий маркер развития определяли и анализировали, причем абсолютные количества и соотношение по меньшей мере первого и второго и/или следующих маркеров применяют для определения пола и/или жизнеспособности.
Настоящий способ далее предпочтительно включает определение того, является ли эмбрион в яйце жизнеспособным и мужским или жизнеспособным и женским, отделение группы жизнеспособных мужских яиц от группы жизнеспособных женских яиц, для формирования выборки преимущественно мужских или преимущественно женских яиц.
Полученные таким образом выборки живых женских или мужских яиц можно инкубировать и вылупливать с получением популяции преимущественно женских или мужских особей кур.
Представленный способ далее предпочтительно включает введение вируса или вирусоподобного материала в каждое яйцо, идентифицированное как содержащее живой эмбрион, и мужское или женское и, предпочтительно после инкубации, выделение из инкубированных яиц полученной вакцины.
После инъекции посевного вируса яйца, содержащие живые эмбрионы, предпочтительно переносят в инкубатор на предварительно определенный период времени. В конце этого периода времени яйца переносят на станцию получения вакцин, где из каждого яйца извлекают материал, например, амниотическую жидкость.
Соответственно настоящее изобретение предпочтительно также включает также стадии умерщвления эмбриона в инфицированном яйце и сбора амниотической жидкости из каждого подвергнутого эвтаназии яйца, причем амниотическая жидкость содержит вакцину; и, предпочтительно, выделение вакцины из амниотической жидкости. Предпочтительно, вирус включает вирус гриппа человека и, следовательно, собранная амниотическая жидкость содержит человеческую противогриппозную вакцину.
Маркеры развития согласно данному изобретению предпочтительно можно также использовать для определения возраста эмбриона, или можно использовать другие маркеры.
Маркеры развития, применяемые для определения возраста эмбриона, предпочтительно выбирают из аминокислот и их соответствующих метаболитов и/или прекурсоров. Заявители в частности обнаружили, что абсолютные и относительные количества аминокислот, более предпочтительно триметилглицина, также известного как бетаин, аспартата и аспарагина, глутамата и глутамина и пролина, могут напрямую быть связаны со стадией развития птичьего эмбриона в яйце. Это весьма существенно, поскольку существует несколько признаков, которые позволяют определять стадию развития или возраст птичьего эмбриона, в том числе на ранних стадиях развития.
Соответственно настоящее изобретение также позволяет отобрать яйца на практически одинаковой стадии развития или фактического возраста, и соединить множество яиц практически одного возраста, чтобы проводить контролируемую инкубацию. В результате период созревания должен стать более равномерным, что приведет к более однородной популяции кур, повышенному качеству благодаря уменьшению стресса и уменьшению числа рано вылупившихся птиц, которых дальше помещают в условия продолжительного искусственного инкубирования.
Полученная популяция вылупившихся птиц будет более качественной, что приведет к большему выходу и снижению последующих требований к популяции кур, например, уменьшенному количеству обработок.
Аналогично, использование популяции яиц выбранного возраста также позволит более эффективно готовить вакцины, т.к. здесь стадия развития птичьего эмбриона определяет момент времени, когда будет наиболее эффективно введение вируса, и сбор вакцины.
Настоящее изобретение также относится к селекции яиц и, после вылупления, к цыпленку или к популяции цыплят, получаемой этим способом.
Следующие неограничивающие примеры приведены для иллюстрации изобретения.
Пример 1
Протокол метаболического профилирования in ovo
Яйца кур Gallus gallus domesticus инкубировали при 37.8°С, переворачивая каждый час, в коммерчески доступном инкубаторе модели 50 от MS Broedmachines V.O.F.
Одну группу из 12 яиц инкубировали в течение 9 суток, вторую группу из 12 яиц инкубировали в течение 10 суток и третью группу из 12 яиц инкубировали в течение 11 суток.
Яйца извлекали из инкубатора и помещали в бумажный держатель под микроскопом воздушной полостью кверху. Скорлупу и мембрану прокалывали и разрушали вокруг воздушной полости, оставляя внутреннюю мембрану нетронутой. С помощью подсветки локализовывали кровеносные сосуды над внутренней мембраной, делали маленький прокол, избегая попадания в кровеносные сосуды, через внутреннюю и внешнюю мембраны в аллантоисную полость.
Яйцо наклоняли и с помощью 1 мл пипетки вводили воздух в эту полость, после чего извлекали пипеткой от 1.5 до 2 мл аллантоисной жидкости. Эту жидкость переносили в криопробирку, которую сразу же погружали в жидкий азот. Затем образцы извлекали и хранили при -80°С.
Эмбрион извлекали из яйца, отрезая мембраны с помощью маленькой ложечки. Эмбрион помещали в пробирку Falcon, наполненную 96%-м этанолом, и на лед, и хранили в темноте при комнатной температуре.
Аллантоисную жидкость, которая хранилась при -80°С, размораживали, отбирали образец объемом 1 мл и вносили в стеклянную пробирку.
К образцу стеклянной пастеровской пипеткой добавляли 1 мл хлороформа и 1 мл смеси метанол-вода (1:1). Пробирки закрывали крышкой и встряхивали 20 секунд, а затем охлаждали при 4°С в течение 10 минут. Затем с помощью стеклянной пастеровской пипетки отбирали 1 мл верхнего слоя смеси и помещали в криопробирку. В крышке криопробирки прокалывали отверстие и проводили лиофилизацию в течение ночи. Продукт лиофилизации использовали в качестве образца для ЯМР.
Пример 2
Протокол метаболического профилирования in ovo
Яйца кур Gallus gallus domesticus инкубировали при 37.8°С, поворачивая каждый час, в коммерчески доступном инкубаторе Petersime NV. Одну группу из 50 яиц инкубировали в течение 8 суток, вторую группу из 50 яиц инкубировали в течение 9 суток и третью группу из 50 яиц инкубировали в течение 10 суток.
Яйца извлекали из инкубатора и помещали в пластиковый держатель под микроскопом воздушной полостью кверху.
Прокалывали и разрушали скорлупу и мембрану вокруг воздушной полости, оставляя внутреннюю мембрану нетронутой. С помощью подсветки локализовывали кровеносные сосуды над внутренней мембраной, делали маленький прокол, избегая попадания в кровеносные сосуды, через внутреннюю и внешнюю мембраны в аллантоисную полость.
Яйцо наклоняли и с помощью 1 мл пипетки вводили воздух в полость, после чего извлекали пипеткой от 1.5 до 2 мл аллантоисной жидкости. Эту жидкость переносили в криопробирку, которую сразу же погружали в жидкий азот. Затем образцы извлекали и хранили при -80°С.
Эмбрион извлекали из яйца, срезая мембраны с помощью маленькой ложечки. Эмбрион помещали в пробирку Falcon, наполненную 96%-м этанолом, и на лед, и хранили в темноте при комнатной температуре.
Аллантоисную жидкость, которая хранилась при -80°С, размораживали и вносили 0.5 мл образца в криопробирку. В крышке криопробирки прокалывали отверстие и проводили лиофилизацию в течение ночи. Продукт лиофилизации использовали в качестве образца для ЯМР.
Определение пола - верификация:
Куриный эмбрион извлекали из этанола и оставляли для высушивания на 10 минут при комнатной температуре. Отрезали маленький кусочек левой ножки, который использовали для выделения ДНК, с помощью набора для выделения ДНК (коммерчески доступный Qiagen DNeasy kit), и затем определяли количество ДНК с помощью нанокапельного устройства.
Для определения пола эмбриона использовали ПЦР с праймерами 1272Н и 1237L (Sigma). Использовали программу ПЦР: 95°С в течение 5 минут, затем 36 раз 95°С в течение 45 секунд, 56°С в течение 45 секунд, 72°С в течение 1 минуты и затем один раз при 72°С в течение 5 минут. Пол эмбриона определяли на основании полученного ПЦР-продукта, кторый оценивали с использованием 2% агарозного геля.
Приготовление образца для ЯМР
1
1
Образец 50-100 мг материала, полученного как описано выше, изучали методом двумерной (2D)-Н-Н-J-разрешенной ЯМР спектроскопии с использованием 3-(триметилсилил)пропионовой-2,2,3,3-d4 кислоты (TSP) в качестве внутреннего стандарта, как описано в Nature Protocols, Vol. 5, No. 3, 2010, стр. 536-549, и Phytochemistry 71, 2010, 773-784.
Полученные данные для Примера 1 приведены в Таблице 1:
Многопараметрический анализ данных
1
1
1
Для группировки образцов по данным Н ЯМР спектроскопии для всех метаболитов, обнаруженных методом Н ЯМР, использовали моделирование методом дробных наименьших квадратов с многопараметрическим статистическим анализом. Наиболее важной полученной информацией оказалась корреляция между двумя наборами данных, а именно измеренные Н ЯМР сигналы (метаболиты) и данные для классификации образцов (групповая информация).
Такой анализ позволил определить не только абсолютные количества маркеров развития для мужских и женских эмбрионов, но также и их относительные количества. При добавлении второго и третьего маркеров, соответственно, селективность теста возрастала в еще большей степени. На Фигурах 1 и 2 показаны результаты многопараметрического анализа для Примеров 1 и 2, соответственно, и информация по определению пола эмбриона.
Пример 3. Определение возраста эмбриона
Пример 1 повторили, но при этом анализировали те маркеры развития, которые являлись релевантными для определения стадии развития или возраста эмбрионов.
Полученные данные четко показывают, что стадию развития эмбриона можно определить с помощью одного или более маркеров развития.
1
1
1
Для группировки образцов по данным Н ЯМР спектроскопии для всех метаболитов, обнаруженных методом Н ЯМР, использовали моделирование методом дробных наименьших квадратов с многопараметрическим статистическим анализом. Наиболее важной полученной информацией оказалась корреляция между двумя наборами данных, а именно измеренные Н ЯМР сигналы (метаболиты) и данные для классификации образцов (групповая информация).
Многопараметрическая модель показала связь между полом, возрастом и/или жизнеспособностью эмбриона и относительным количеством присутствующих метаболитов. Использование альтернативных аналитических методов, таких как, например, ГХ/МС, дает аналогичные результаты, тем самым подтверждая полученные результаты.
Проведенный анализ позволил определить не только абсолютные, но и относительные количества маркеров развития. Добавление второго, третьего и четвертого маркеров соответственно повышало селективность теста в еще большей степени.
Приведенные выше примеры ясно показывают преимущества способа и материалов настоящего изобретения. Хотя приведенное выше подробное описание содержит некоторые конкретные варианты настоящего изобретения, данное описание не имеет целью ограничить изобретение раскрытыми здесь конкретными примерами или вариантами, т.к. они являются лишь иллюстративными, а не ограничивающими, и для специалистов в данной области будет очевидно, что изобретение не ограничивается приведенными примерами.