ЛУПАНОВЫЕ А-СЕКОТРИТЕРПЕНОИДЫ, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ ПРОТИВОВИРУСНУЮ АКТИВНОСТЬ
LUPANE A-SECO-TRITERPENOIDS EXHIBITING ANTIVIRAL ACTIVITY

Изобретение относится к новым химическим соединениям класса А-секотритерпеноидов.
Известна высокая перспективность лупановых тритерпеноидов для медицины, подтвержденная результатами многочисленных исследований, касающихся синтеза и изучения биологической активности производных бетулина и бетулиновой кислоты [Бетулин и его производные. Химия и биологическая активность / Г.А.Толстиков, О.Б.Флехтер, Э.Э.Шульц, Л.А.Балтина, Г.А.Толстиков // Химия в интересах устойчивого развития. - 2005. - №1. - С.1-30; Терпеноиды ряда лупана - биологическая активность и фармакологические перспективы. II. Полусинтетические производные лупана / Т.Г.Толстикова, И.В.Сорокина, Г.А.Толстиков, А.Г.Толстиков, О.Б.Флехтер // Биоорганическая химия. - 2006. - Т.32. - №3. - С.291-307; Birch bark research and development / P.A.Krasutsky // Natural Product Reports - 2006. - Vol.23. - №6. - С.919-942; Pharmacological properties of the ubiquitous natural product betulin / S.Alakurtti, T.Mäkelä, S.Koskimies, J.Yli-Kauhaluoma // European Journal of Pharmaceutical Sciences. - 2006. - V.29. - №1. - P.1-13]. При этом существенная доля исследований затрагивает изучение ингибирующей активности полусинтетических тритерпеноидов в отношении оболочечных вирусов, в т.ч. ВИЧ-1, вирусов герпеса и гриппа. А-Секоинтермедиаты химической и микробной трансформации тритерпеноидов лупанового типа зачастую проявляют более высокую биологическую активность по сравнению с исходными циклическими соединениями [Preparation and antibacterial activity of di-, tri- and tetraoic acids derived from 3,4-secolupane / I.Valterová, J.I.Klinot, A.Vystrčil // Collection of Czechoslovak Chemical Communications - 1983. - V.48. - Р.649-661; Microbial transformations of two lupane-type triterpenes and anti-tumor-promoting effects of the transformation products / T.Akihisa, Y.Takamine, K.Yoshizumi, H.Tokuda, Y.Kimura, M.Ukiya, T.Nakahara, T.Yokochi, E.Ichiishi, H. Nishino // Journal of Natural Products. - 2002. - V.65. - P.278-282]. Известны 2,3-секотритерпеноиды, эффективно ингибирующие ВИЧ-1, вирусы герпеса простого, вируса везикулярного стоматита [Synthesis of dammarane-type triterpene derivatives and their ability to inhibit HIV and HCV proteases / Y.Wei, C.-M.Maa, M.Hattori // Bioorganic & Medicinal Chemistry - 2009. - V.17. - P.3003-3010; Синтез и противовирусная активность 2,3-секопроизводных бетулоновой кислоты / И.А.Толмачева, В.В.Гришко, Е.И.Бореко, О.В.Савинова, Н.И.Павлова // Химия природных соединения. - 2009. - №5. - С.566-568; Противовирусная активность лупановых и 19β,28-эпокси-18α-олеанановых 2,3-секотритерпеновых гидразонов / H.В.Галайко, И.А.Толмачева, В.В.Гришко, Л.В.Волкова, E.H.Перевозчикова, С.А.Пестерева // Биоорганическая химия. - 2010. - Т.36. - №4. - С.556-562].
50
Аналогами описываемых соединений по структуре являются не обладающий противовирусной активностью 28-метил-28-оксо-1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3-аль [Синтез лупановых и 19β,28-эпокси-18α-олеанановых 2,3-секопроизводных на основе бетулина / И.А.Толмачева, А.В.Назаров, О.А.Майорова, В.В.Гришко // Химия природных соединений. - 2008. - №5. - С.491-494] и 1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3-аль-28-овая кислота, проявляющая противовирусную активность в отношении вируса герпеса простого типа I в культуре клеток рабдомиосаркомы (ЕС 0,9 мкг/мл) [Патент RU №2410390 2,3-Секо-производные бетулиновой кислоты. Опубл. 27.01.2011 БИ №3]. Однако высокий уровень цитотоксической активности (максимальная подавляющая концентрация - 12,5 мкг/мл) не позволяет рассматривать 1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3-аль-28-овую кислоту в качестве перспективного противовирусного агента.
Задачей изобретения является синтез новых тритерпеновых производных, проявляющих противовирусную активность, для расширения сырьевой базы противовирусных средств, а также перспективных в качестве ключевых интермедиатов для получения новых биологически активных соединений.
Для решения поставленной задачи синтезированы
1. Лупановые А-секотритерпеноиды общей формулы
,
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
5
2
2
2
5
2
3
3
2
2
2
3
2
2
3
2
3
2
2
3
2
2
3
где R=НСО, R=CONHCHCHCOOCH или R=НСО, R=тиазол-2-ил, R=R=CONHCHCHCOOCH, или R=CHОСОСН, R=СООСН или R=CHOCOCHCHCOOH, R=СООСН или R=CHOCOCHC(СН)СООН, R=СООСН или R=CHOCOCHC(СН)СНСООН, R=СООСН.
2. Соединения по п.1, проявляющие ингибирующую активность в отношении вируса герпеса простого I типа (ВГП-1, штамм 1С).
1
2
2
2
5
3. Соединение по п.1, где R=R=CONHCHCHCOOCH, проявляющее ингибирующую активность в отношении ВИЧ-1.
1
1
1
1
3
1
1
1
2
2
2
5
2
2
2
5
2
3
2
2
2
3
2
2
3
2
3
2
2
3
2
2
3
Получены соединения общей формулы, где R=НСО, R=CONHCHCHCOOCH (соединение I); R=НСО, R=тиазол-2-ил (соединение II); R=R=CONHCHCHCOOCH (соединение III); R=CHOCOCH, R=СООСН (соединение IV); R=CHOCOCHCHCOOH, R=СООСН (соединение V); R=CHOCOCHC(СН)СООН, R=СООСН (соединение VI) и R=CHOCOCHC(СН)СНСООН, R=СООСН (соединение VII), которые представляют собой мелкокристаллические вещества белого цвета.
Указанные соединения хорошо растворимы в хлороформе, дихлорметане, четыреххлористом углероде, этиловом спирте, бензоле, толуоле, диметилсульфоксиде, плохо растворимы в гексане и не растворимы в воде.
Синтез соединений I-III проводили способом, включающим взаимодействие хлорангидридов 1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3-аль-28-овой (для соединений I и II) или 1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3,28-диовой (для соединения III) кислот в безводном дихлорметане с соответствующими аминопроизводными в присутствии триэтиламина. Синтез соединений IV-VII проводили путем этерификации метилового эфира 3-гидрокси-1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-28-овой кислоты в присутствии 4-диметиламинопи-ридина и ангидрида уксусной (для соединения IV), янтарной (для соединения V), 2,2-диметилянтарной (для соединения VI) или 3,3-диметилглутаровой (для соединения VII) кислот.
-1
1
13
3
2
4
Структура заявляемых соединений подтверждена методами ИК и ЯМР спектроскопии. Спектральные характеристики соединений I-VII приведены в таблице 1. ИК-спектры (ν, см) регистрировали на ИК-Фурье-спектрометре IFS 66/S Bruker (Германия) в пасте с вазелиновым маслом. Спектры Н- и С-ЯМР (δ, м.д.; J, Гц) записывали для растворов в CDCl на спектрометре Varian Mercury+ (США) при рабочей частоте прибора 300,0 МГц, внутренний стандарт - гексаметилдисилоксан. Пороговое значение температуры в точке плавления при скорости нагрева 1°С/мин определяли на приборе OptiMelt МРА100 (США). ТСХ-анализ проводили на пластинах Sorbfil (Россия) в системе гексан-этилацетат. Обнаружение веществ осуществляли обработкой 5% HSO с последующим прогреванием пластины при 95-100°C в течение 2-3 мин. Для колоночной хроматографии использовали силикагель 60-200 µm марки Merck (Германия), элюент для каждого соединения подбирали индивидуально.
Заявляемые соединения проявляют противовирусную активность (изучена на культурах клеток) в отношении вирусов герпеса простого I типа (ВГП-1) и вируса иммунодефицита человека I типа (ВИЧ-1).
Описания заявляемых соединений и их свойств в источниках информации не обнаружено.
Сущность предлагаемого решения и возможность его осуществления подтверждается примерами 1-9 и результатами исследований, приведенными в таблицах 1 и 2.
Пример 1. Получение этил-N-[1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3-аль-28-оил]-β-аланината (соединение I).
f
К раствору 1,1 ммоль 1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3-аль-28-овой кислоты в 10 мл безводного хлористого метилена в атмосфере аргона добавляли 2,2 ммоль (0,2 мл) оксалилхлорида. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 6 ч. Растворитель отгоняли досуха в вакууме водоструйного насоса при температуре водяной бани 30°C. К остатку добавляли 10 мл безводного хлористого метилена, растворитель отгоняли. Процедуру повторяли трижды. К суспензии полученного таким образом хлорангидрида 2,3-секокислоты в 10 мл безводного дихлорметана в атмосфере аргона добавляли 1,2 ммоль гидрохлорида этилового эфира β-аланина и 2,4 ммоль (0,34 мл) триэтиламина. Реакционную смесь в течение 4-6 ч перемешивали при комнатной температуре. Контроль за ходом реакции осуществляли методом ТСХ. Растворитель упаривали, остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле. Выход 43%. R 0,7 (гексан:этилацетат - 7:3). Т. пл. 80,2°C (гексан:этилацетат).
f
Пример 2. N-[1-Циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3-аль-28-оил]-2-аминотиазол (соединение II) получали по методике, описанной в примере 1, добавляя триэтиламин в количестве 1,2 ммоль (0,17 мл). Выход 40%. R 0,2 (гексан:этилацетат - 7:3). Т.пл. 151,4°C (гексан:этилацетат).
f
Пример 3. Диэтил-N,N'-(1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3,28-диоил)ди-β-аланинат (соединение III) получали по методике, описанной в примере 1, добавляя триэтиламин в количестве 3,6 ммоль (0,51 мл). Выход 52%. R 0,3 (хлороформ-этилацетат - 10:1). Т.пл. 83,8° (гексан:этилацетат).  (с 0,6; хлороформ).
Пример 4. Получение метилового эфира 3-O-ацетил-1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-28-овой кислоты (соединение IV).
f
Смесь 0,5 ммоль метилового эфира 3-гидрокси-1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-28-овой кислоты, 0,5 ммоль 4-диметиламинопиридина и 1,5 ммоль уксусного ангидрида кипятили в 5 мл безводного пиридина при 95°С. Ход реакции контролировали методом ТСХ. Реакционную смесь разбавляли 20%-ным раствором соляной кислоты и экстрагировали этилацетатом (3×20 мл). Органический слой сушили над безводным сульфатом магния, растворитель упаривали, остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, элюент гексан:этилацетат - 7:1. Выход 71%. R 0,44 (гексан-этилацетат - 7:3). Т.пл. 150,7°C (гексан-этилацетат).  (с 0,5; хлороформ).
f
Пример 5. Метиловый эфир 3-O-сукцинил-1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-28-овой кислоты (соединение V) получали по методике, описанной в примере 4. Выход 27%. R 0,13 (гексан:этилацетат - 1:1). Т.пл. 61,9°C.
f
Пример 6. Метиловый эфир 3-O-3',3'-диметилсукцинил-1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-28-овой кислоты (соединение VI) получали по методике, описанной в примере 4. Выход 40%. R 0,25 (гексан:этилацетат - 7:3). Т.пл. 68,7°С.
f
Пример 7. Метиловый эфир 3-O-3',3'-диметилглутарил-1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-28-овой кислоты (соединение VII) получали по методике, описанной в примере 4. Выход 55%. R 0,25 (гексан:этилацетат - 1:1). Т.пл. 66,4°С.
Пример 8. Исследование противовирусной активности в отношении вируса герпеса простого I типа.
50
50
50
При проведении исследований использовали перевиваемую культуру клеток рабдомиосаркомы (RD) и вирус герпеса простого I типа (ВГП-1, штамм 1С). Монослойную культуру клеток RD, выращенную в лунках пластиковой 96-луночной панели, отмывали от ростовой среды, инфицировали 0,01-0,001 ТЦИД/клетка ВГП-1 путем нанесения на клетки разведений вируссодержащей суспензии в объеме 0,1 мл на 1 ч при 37°C. Затем жидкость удаляли и клетки покрывали средой поддержки (среда DMEM), содержащей различные концентрации исследуемых веществ. Водонерастворимые вещества предварительно растворяли в 10% этаноле. При последующем разведении использовали DMEM. Содержание этанола в конечных концентрациях веществ для исследования не превышало 1%. На каждую концентрацию изучаемого вещества использовали по 2-4 лунки с культурой клеток, инфицированной одним разведением вируса. Для изучения противовирусных свойств каждого вещества использовали 3-4 разведения вируса. После 48 ч инкубации при 37°C регистрировали морфологические изменения монослоя клеток (цитопатическое действие (ЦПД) вируса, увеличение ×80). На основе наличия/отсутствия ЦПД вируса в лунках с разными концентрациями вещества вычисляли титр вируса. Первичным критерием противовирусного действия считали наличие различий в сравнении с контролем вируса. На основе значений титра вируса вычисляли среднеэффективную концентрацию вещества (ЕС). Рассчитывали также отношение максимально переносимой концентрации (МПК) соединения к ЕС. МПК определяли как максимальную концентрацию вещества, не оказывающую влияния на морфологию неокрашенной культуры клеток за период инкубации (48 ч).
50
50
50
Установлено, что соединения I-VII обладают способностью подавлять репродукцию ВГП-1 в диапазонах концентраций от МПК до 1/4 МПК со снижением титра вируса, достигающим у соединений V-VII более 2,2 lg ТЦИД/мл. Вычисленные значения ЕС, а также отношения МПК/ЕС приведены в таблице 2.
Пример 9. Методика исследования противовирусной активности в отношении ВИЧ-1.
5
zmb
50
2
Испытания проводили на перевиваемой суспензионной Т-лимфобластоидной линии клеток человека МТ-4 (плотность 4-5×10клеток/мл) на питательной среде RPMI-1640 Sigma-Aldrich (США). В качестве инфекционного агента использовали высокорепликативный изолят ВИЧ-1 с титром 6,0 Ig ТЦД. Определение наличия анти-ВИЧ активности проводили с помощью формазанового теста в МТТ-варианте. Исходный раствор препарата (5,0 мг/мл) готовили ex tempore путем растворения в 10% этаноле. Базовый раствор титровали в лунках 96-луночной панели с 5-кратным шагом, после чего в лунки последовательно вносили клетки и вирус (терапевтическая схема). Конечный объем реакционной смеси составлял 200 мкл/лунку. Контролями служили необработанные препаратом ВИЧ-инфицированные клетки (контроль вируса) и необработанные препаратом неинфицированные клетки (контроль клеток). Панели инкубировали в атмосфере, содержащей 5% CO при 37°C. Учет результатов осуществляли через 72 ч. В качестве позитивного контроля на анти-ВИЧ активность в каждой серии экспериментов использовали коммерческий препарат азидотимидина, который титровали параллельно с исследуемым образцом.
50
50
Методика базируется на определении интенсивности образования формазанового продукта при внесении в клеточную культуру реагента МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид). После 3-часовой экспозиции при 37°C надосадок удаляли, а образовавшийся формазановый продукт растворяли в диметилсульфоксиде, затем проводили измерение интенсивности развившегося окрашивания на спектрофотометре Plate Reader DAS A3 (Италия) при длине волны 550/630 нм. Результаты теста учитывали путем определения индекса защиты клеток, который в положительных случаях должен быть не ниже 50%. Вычисляли ЕС препарата и соотношение МПК/ЕС, характеризующее широту спектра его нетоксических эффективных концентраций.
Установлено, что соединение III обладает способностью подавлять репродукцию ВИЧ-1 в диапазонах концентраций от 1/5 МПК до 1/125 МПК (таблица 2). Полученные результаты подтверждены с помощью методики непрямой иммунофлуоресценции.
Заявляемые соединения могут быть использованы для разработки противовирусных средств и в качестве ключевых интермедиатов для получения новых биологически активных соединений.
1
13
Данные ИК, ЯМР H и С спектров соединений I-VII
Таблица 1
№ соединения
ИК спектр (ν, см<sup>-1</sup>):
Спектр <sup>1</sup>Н ЯМР (300 МГц, CDCl<sub>3</sub>, δ, м.д., J/Гц):
I
1636 (CONH), 1723 (СООС<sub>2</sub>Н<sub>5</sub>),2237 (C≡N), 3375 (NH)
0,89, 0,94, 1,01, 1,08, 1,13 (15Н, 5с, 5СН<sub>3</sub>); 1,25 (3Н, т, J 7.1, СООСН<sub>2</sub><u>СН</u><sub>3</sub>); 1,66 (3Н, с, СН<sub>3</sub>-30); 2,21 и 2,59 (2Н, 2д, J<sub>AB</sub> 18,3, CH<sub>2</sub>-1, AB-система); 2,51 (2Н, т, J 7.1, <u>CH</u><sub>2</sub>COOC<sub>2</sub>H<sub>5</sub>); 3,09 (1Н, тд, J 11,1, 4,5, СН-19); 3,42-3,55 (2Н, м, <u>CH</u><sub>2</sub>NH); 4,14 (2Н, к, J 7,1, COO<u>CH</u><sub>2</sub>CH<sub>3</sub>); 4,59 и 4,72 (2Н, 2с, СН<sub>2</sub>-29); 6,19 (1Н, т, J 5,9, NH); 9,66 (1Н, с, СН-3)
II
1656 (CONH), 1718 (CHO), 2246 (C≡N), 3183 (NH)
0,89, 0,91, 1,05, 1,07, 1,12 (15Н, 5с, 5СНз); 1,70 (3Н, с, СН<sub>3</sub>-30); 3,10 (1Н, тд, J 11,0, 6,3, СН-19); 4,63 и 4,76 (2Н, 2 с, СН<sub>2</sub>-29); 6.98 и 7.44 (2Н, 2д, J=3.8, тиазолил); 9.98 (1Н, уш.с, NH)
III
1636 (CONH), 1732 (СООС<sub>2</sub>Н<sub>5</sub>), 2237 (C≡N), 3366 (NH)
0,89, 0,94, 1,02, 1,06, 1,08 (15Н, 5с, 5СН<sub>3</sub>); 1,23 и 1,26 (6Н, 2 т, J 7.2, 2<u>CH</u><sub>3</sub>CH<sub>2</sub>O-); 1,67 (3Н, с, СН<sub>3</sub>-30); 2,51 (4Н, т, J 6,0, 2C<sub>2</sub>OOC<u>CH</u><sub>2</sub>-) 2,21 и 2,59 (2Н, 2д, J<sub>AB</sub> 18,2, С<sub>2</sub>Н-1, АВ-система); 3,06-3,14 (1Н, м, СН-19); 3,39-3,56 (4Н, м, 4Н, т, J 6,0, 2<u>CH</u><sub>2</sub>NH-); 4,14 (4Н, к, J 6,0, 2CH<sub>3</sub><u>CH</u><sub>2</sub>OOC-); 4,59 и 4,72 (2Н, 2с, СН<sub>2</sub>-29); 5,16 и 6,19 (2Н, уш.т., J 6,2, 2NH-)
Продолжение таблицы 1
IV
1716, 1734 (ОСОСН<sub>3</sub>), 2234 (C≡N)
0,93, 0,96, 0,98, 1,00, 1,15 (15H, 5с, 5СНз); 1,68 (3Н, с, СН<sub>3</sub>-30); 2,12 (3Н, с, <u>СН</u><sub>3</sub>СОО); 2,60 (2Н, с, CH<sub>2</sub>-1); 3,00 (1Н, тд, J9,9, 5,4, СН-19); 3,66 (3Н, с, СОО<u>СН</u><sub>3</sub>); 3,72 и 4,08 (2Н, 2д, J<sub>AB</sub> 11,3, СН<sub>2</sub>-3, АВ-система); 4,61 и 4,72 (2Н, 2 с, СН<sub>2</sub>-29)
V
1724 (COOR), 2241 (C≡N)
0,93, 0,94, 0,96, 0,98, 1,00 (15H, 5с, 5СН<sub>3</sub>); 1,67 (3Н, с, СН<sub>2</sub>-30); 2,60 (2Н, с, СН<sub>2</sub>-1); 2,71 (4Н, с, НООС-(<u>СН</u><sub>2</sub>)<sub>2</sub>-СОО-); 2,99 (1Н, тд, J 11,0, 5,7, СН-19); 3,65 (3Н, с, СОО<u>СН</u><sub>3</sub>); 3,74 и 4,12 (2Н, 2д, J 10,8, СН<sub>2</sub>-3); 4,59 и 4,72 (2Н, 2с, СН<sub>2</sub>-29)
VI
1725 (СООСН<sub>3</sub>), 2240 (C≡N)
0,92, 1,00, 1,17, 1,28, 1,30 (15H, 5с, 5СН<sub>3</sub>); 0,95 (6Н, с, 2СН<sub>3</sub>); 1,67 (3Н, с, СН<sub>3</sub>-30); 2,61 (2Н, с, СН<sub>2</sub>-1); 2,73 (2Н с, -С(СН<sub>3</sub>)<sub>2</sub><u>СН</u><sub>2</sub>-); 2,99 (1Н, тд, J 10,7, 5,1, СН-19); 3,65 (3Н, с, СОО<u>СН</u><sub>3</sub>); 3,63 и 4,16 (2Н, 2д, J 11,1, СН<sub>2</sub>-3); 4,60 и 4,72 (2Н, 2с, СН2-29)
VII
1713 (COOR), 2244 (C≡N)
0,93, 0,96, 0,98, 0,99, 1,16 (15H, 5с, 5СН<sub>3</sub>); 1,16 (6Н, с, 2СН<sub>3</sub>); 1,67 (3Н, с, СН<sub>3</sub>-30); 2,49 (4Н, уш.с, -<u>СН</u><sub>2</sub>С(СН<sub>3</sub>)<sub>2</sub><u>СН</u><sub>2</sub>-); 2,61 (2Н, с, СН<sub>2</sub>-1); 2,94-3,04 (1Н, м, СН<sub>2</sub>-19); 3,66 (3Н, с, СОО<u>СН</u><sub>3</sub>); 3,67 и 4,10 (2Н, 2д, СН<sub>2</sub>-3); 4,60 и 4,72 (2Н, с, СН<sub>2</sub>-29)
Таблица 2
Противовирусные свойства исследованных соединений I-VII
№ соединения
Токсичность для культур клеток, МПК (RD/MT-4), мкг/мл
Противовирусные свойства
ВГП-1
ВИЧ-1
ЕС<sub>50</sub> (I<sub>95</sub>) мкг/мл
отношение МПК/ЕС<sub>50</sub>
EC<sub>50</sub> (I<sub>95</sub>) (мкг/мл)
отношение МПК/ЕС<sub>50</sub>
I
200/15
4,9 (6,3÷3,8)
40,8
н.а.
н.а.
II
100/15
10,1 (11,1÷9,1)
9,9
н.а.
н.а.
III
50/50
3,0 (3,9÷2,3)
16,7
3,78(6,39÷1,17)
13,2
IV
400/20
26,7 (30,9÷23,0)
15,0
н.а.
на.
V
12,5/150
2,2 (2,4÷2,1)
5,7
н.а.
н.а.
VI
12,5/225
2,2 (2,3÷2,0)
5,7
н.а.
н.а.
VII
25 / 125
2,5 (2,7÷2,4)
10,0
н.а.
н.а.
Обозначения: I<sub>95</sub> - доверительный интервал;
н.а. - соединение не активно.