Способ дифференциальной диагностики гидроцефалий у новорожденных с экстремально низкой массой тела
METHOD FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSTICS OF HYDROCEPHALY IN NEWBORNS WITH EXTREMELY LOW BODY WEIGHT

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, и позволяет иммуногистохимическим методом на субклеточном уровне у погибших новорожденных с экстремально низкой массой тела (ЭНМТ) дифференцировать гидроцефалии: наследственную (сопряженную с аномалиями развития Сильвиева водопровода), поствоспалительную и постгеморрагическую.
Актуальность
Гидроцефалия (ГЦ), формирующаяся в перинатальном периоде, как правило, в дальнейшем сопровождается нарушениями со стороны высших психических и двигательных функций различной степени выраженности, становится причиной инвалидности детей, а потому, диагностированная при скрининговом ультразвуковом исследовании беременных, является показанием к прерыванию беременности в допустимые сроки [1, 2]. По литературным данным [3], ГЦ в популяции встречается с частотой от 0,2 до 4 случаев на 1000 новорожденных детей.
Известно, что комплексная патогенетическая терапия пациента существенно повышает уровень адаптационных возможностей организма [4]. А для осуществления этиологически и патогенетически направленного лечения необходимо располагать сведениями об особенностях морфологического субстрата гидроцефалий различного генеза.
Как свидетельствуют результаты научных исследований, доминирующими этиологическими факторами ГЦ являются хромосомные и генетические аномалии, персистирующие в ЦНС вирусные инфекции и внутрижелудочковые кровоизлияния [5]. В 43% случаев этиологический фактор врожденной гидроцефалии остается неуточненным [3].
Основной задачей врача-патологоанатома, производящего аутопсию погибшего новорожденного с ГЦ, является не только подтверждение правомочности клинической диагностики и врачебной тактики, но и определение причины заболевания, для чего необходим набор морфологических критериев дифференциальной диагностики ГЦ в зависимости от этиологического фактора, которого в настоящее время не существует.
3
В патологоанатомической практике известен «Способ диагностики тяжелой степени врожденной гидроцефалии», осуществляемый с помощью морфометрии ядер нейронов 3-го слоя поля N40. Согласно методике, при объеме ядер не более 270 мкм диагностируют тяжелую степень гидроцефалии (Патент №2318446, Российская Федерация. Способ диагностики тяжелой степени врожденной гидроцефалии / Воробьев A.M., Старых B.C., Зинчук С.Ф., Воробьев М.А. - Изобретения. Полезные модели. - 2008. - №7).
Основным недостатком способа является невозможность выявить этиологию ГЦ и выполнить сличение заключительного клинического и патологоанатомического диагнозов по основному заболеванию с учетом этиологического принципа, когда ГЦ является непосредственной причиной смерти пациента.
Существует способ диагностики гидроцефалии методом компьютерно-томографической морфометрии головного мозга, согласно которому объему ликворных пространств от 3,8% до 10% краниальной полости соответствует легкая степень гидроцефалии, от 10,1% до 30% - средняя, более 30% - тяжелая (Патент №2301625, Российская Федерация. Способ диагностики гидроцефалии головного мозга / Ларькин В.И., Ларькин И.И., Ларькин Д.В., Атрошенко А.В. // Изобретения. Полезные модели. - 2007. - №18).
Недостатки способа:
1) дорогостоящий;
2) не применим в патоморфологии, поскольку диагностические КТ-критерии гидроцефалии не сопоставимы с морфологическими;
3) не позволяет определять этиологический фактор гидроцефалии.
Существует способ диагностики прогрессирующей и непрогрессирующей гидроцефалии (Патент №2367351, Российская Федерация. Способ диагностики прогрессирующей и непрогрессирующей гидроцефалии у детей первого года жизни / Самсонова Т.В., Гоголев А.Ю. Изобретения. Полезные модели. - 2009. - №26), основанный на ультразвуковой допплерографии, позволяющий при значении индекса резистентности в передней мозговой артерии от 0,7 или более и средней скорости кровотока в вене Галена от 12 см/с или более диагностировать прогрессирующую гидроцефалию, при значениях ниже указанных - непрогрессирующую форму.
Недостатки способа:
1) не применим в патоморфологии, поскольку базируется на определении скорости кровотока;
2) не позволяет верифицировать этиологический фактор гидроцефалии.
Разработан способ дифференциальной диагностики вентрикуломегалии и гидроцефалии у новорожденных с экстремально низкой массой тела (Патент №2422805, Российская Федерация. Способ дифференциальной диагностики вентрикуломегалии и гидроцефалии у плодов и новорожденных 22-27 недель гестации / Проценко Е.В., Васильева М.Е., Перетятко Л.П., Кулида Л.В. - Изобретения. Полезные модели. - 2011. - №18, Ч. III. - С. 919), позволяющий у погибших новорожденных с экстремально низкой массой тела отличать гидроцефалию (по соотношению ширины герминативного матрикса к ширине неокортекса в области головки хвостатого ядра, равном 2:1) от вентрикуломегалии (при соотношении идентичных параметров, равном 1:2).
Основным недостатком способа является невозможность определить этиологический фактор гидроцефалии и, следовательно, оценивать качество проведенных при жизни профилактических и лечебных мероприятий.
Прототипом предлагаемого способа послужил способ дифференциальной диагностики вентрикуломегалии и гидроцефалии у погибших новорожденных с ЭНМТ (Патент №2432574, Российская Федерация. Способ дифференциальной диагностики вентрикуломегалии и гидроцефалии у плодов и новорожденных / Проценко Е.В., Васильева М.Е., Перетятко Л.П., Кулида Л.В. - Изобретения. Полезные модели. - 2011. - №18, Ч. II. - С. 580), позволяющий с помощью иммуногистохимического исследования по уровню экспрессии глиального белка S-100 отличать вентрикуломегалию (при окрашивании 30% или менее клеток вентрикулярной герминативной зоны в области задних рогов) от гидроцефалии (при окрашивании 50% или более идентичных клеток).
Основным недостатком способа является невозможность установить истинную причину гидроцефалии и, следовательно, качественно завершить патологоанатомическое исследование.
Способов морфологической дифференциальной диагностики различных этиологических вариантов гидроцефалий в доступных литературных источниках не выявлено. Указанные недостатки перечисленных способов предлагается устранить заявляемым способом.
Заявляемым техническим результатом является разработка способа морфологической дифференциальной диагностики гидроцефалии различной этиологии (наследственной, постгеморрагической и поствоспалительной) у погибших новорожденных детей, родившихся с ЭНМТ (от 500 до 1000 г), что позволит объективизировать морфологическую дифференциальную диагностику указанных вариантов внутренней водянки головного мозга и повысить качество патологоанатомического диагноза.
Технический результат достигается путем иммуногистохимического исследования паренхимы головного мозга в проекции цитоархитектонического поля N6. Определяют индекс экспрессии (ИЭ) ММР-9 в глиобластах вентрикулярной герминативной зоны и индекс экспрессии рилина в нейронах Кахаля-Ретциуса. При нулевых значениях ИЭ ММП-9 и ИЭ рилина в соответствующих клетках паренхимы мозга диагностируют наследственную гидроцефалию; при сочетании ИЭ ММР-9, равного 0,25 усл. ед. или более, с ИЭ рилина менее 2 усл. ед. - поствоспалительную ГЦ, при сочетании ИЭ ММР-9, равного 0,17 усл. ед. или менее, с ИЭ рилина, равным 2 усл. ед. или более - постгеморрагическую ГЦ.
Отличительные признаки способа: в проекции цитоархитектонического поля N6 определяют индекс экспрессии (ИЭ) ММР-9 в глиобластах и индекс экспрессии рилина в нейронах Кахаля-Ретциуса и при нулевых значениях обоих показателей диагностируют наследственную ГЦ, при сочетании ИЭ ММР-9, равного 0,25 усл. ед. или более, с ИЭ рилина менее 2 усл. ед. - поствоспалительную ГЦ, при сочетании ИЭ ММР-9, равного 0,17 усл. ед. или менее, с ИЭ рилина, равным 2 усл. ед. или более, - постгеморрагическую ГЦ.
Новизна способа
Впервые предложен способ морфологической дифференциальной диагностики гидроцефалий различной этиологии (сопряженной с аномалиями развития Сильвиева водопровода, или наследственной, поствоспалительной и постгеморрагической) у погибших новорожденных с ЭНМТ, основанный на объективной оценке результатов иммуногистохимической реакции. В качестве антигенов используют матриксную металлопротеиназу-9 (ММР-9), экспрессию которой оценивают в глиобластах вентрикулярной герминативной зоны (ВГЗ), и рилин, экспрессирующийся в нейронах Кахаля-Ретциуса цитоархитектонического поля N6, расположенного в передней трети прецентральной извилины неокортекса.
Из литературных источников известно, что ММР-9 является ферментом, непосредственно участвующим в ремоделировании тканей. Локальная активность ММР-9 в основном изучена в опухолях различной локализации (желудок, мочевой пузырь, яичники, матка и др.) с целью диагностики злокачественности новообразований [6]. Рилин рассматривается как фактор нейрональной миграции, определяющий окончательное расположение нейронов в неокортексе [7].
На основании собственных исследований установлено, что морфологический субстрат гидроцефалий у детей с ЭНМТ проявляется не только общеизвестными признаками, такими как дилятация вентрикулярной системы и атрофия вещества головного мозга от сдавления избыточным количеством ликвора [8], но и определенными структурными особенностями ВГЗ и неокортекса, взаимосвязанными с этиологическим фактором заболевания [9, 10, 11, 12]; доказана взаимосвязь особенностей экспрессии рилина с этиологией ГЦ [13].
На основании вышеизложенного возникло предположение о том, что гестационные структурные преобразования вентрикулярной герминативной зоны, возможно, осуществляются при участии матриксной металлопротеиназы-9, причем каждому из рассматриваемых этиологических факторов ГЦ соответствует определенный характер экспрессии ММР-9.
Следует учитывать, что в дифференциальной диагностике ГЦ различной этиологии использование только патоморфологических параметров (без учета иммуногистохимических) недостаточно корректно в связи с похожими, хоть и неидентичными, изменениями в ВГЗ при поствоспалительной и постгеморрагической гидроцефалиях (замедление редукции), а также в неокортексе при поствоспалительной ГЦ и вентрикуломегалии (замедление дифференцировки коры поля N6), что может смутить неопытного нейроморфолога. Точно так же не корректен расчет только одного иммуногистохимического показателя, например, ИЭ ММР-9 либо ИЭ рилина, поскольку компенсаторное увеличение экспрессии ММР-9 в глиобластах при поствоспалительной ГЦ или отсутствие уменьшения экспрессии рилина в кортикальных нейронах при постгеморрагической ГЦ без дополнительных критериев могут быть расценены как отсутствие ГЦ.
В связи с вышеизложенным для объективизации морфологической дифференциальной диагностики гидроцефалий разной этиологии у погибших новорожденных с ЭНМТ предлагаем использовать расчет одновременно двух иммуногистохимических параметров - ИЭ ММР-9 в глиобластах ВГЗ и ИЭ рилина в нейронах Кахаля-Ретциуса.
Способ осуществляется следующим образом
Головной мозг целиком фиксируют в 10% нейтральном формалине в течение 2-3 недель. Взятие материала для гистологического исследования осуществляют на горизонтальном срезе больших полушарий на уровне спайки свода в проекции поля N6 (передняя треть прецентральной извилины). Кусочки ткани мозга размерами 0,5×0,5 см, включающие ВГЗ и неокортекс, после обычной проводки заливают в парафин. Для проведения иммуногистохимического исследования используют парафиновые срезы толщиной 5 мкм, в качестве первичных антител - мышиные моноклональные антитела к ММР-9 в рабочем разведении 1:50 («Dako», Дания) и мышиные моноклональные антитела к рилину (рабочее разведение 1:250, «Dako», Дания). Для исключения возможности получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов каждое иммуногистохимическое исследование сопровождают постановкой положительного и отрицательного контролей в соответствии с инструкцией.
Экспрессию ММР-9 и рилина в структурах мозга оценивают при помощи светового микроскопа «Micros MS-300» (Австрия) полуколичественным способом, оценивая результат в баллах: 0 - отсутствие экспрессии, 1 - слабовыраженное окрашивание, 2 - умеренное окрашивание, 3 - максимальное окрашивание. Иммуногистохимическую реакцию оценивают в 10 полях зрения микроскопа при увеличении ×400 в 100 клетках каждого препарата, а индекс экспрессии изучаемых фермента (ММР-9) и белка (рилин) вычисляют по формуле [14]:
где ИЭ - это индекс экспрессии;
i - показатель интенсивности окрашивания клеток в баллах;
P(i) - процент позитивных клеток, окрашенных с разной степенью интенсивности;
результат обозначается условными единицами (усл. ед.).
При нулевых значениях обоих показателей диагностируют наследственную ГЦ, при сочетании ИЭ ММР-9, равного 0,25 усл. ед. или более, с ИЭ рилина менее 2 усл. ед. - поствоспалительную ГЦ, при сочетании ИЭ ММР-9, равного 0,17 усл. ед. или менее, с ИЭ рилина, равным 2 усл. ед. или более, - постгеморрагическую ГЦ.
Сущность способа поясним следующими примерами.
Пример 1.
Беременность (V) женщины И., 37 лет, завершилась самопроизвольными преждевременными родами на акушерском сроке 22-23 нед. в результате декомпенсированной хронической плацентарной недостаточности. Новорожденный ребенок мужского пола (масса тела при рождении 567 г, длина 27,5 см) прожил 21 сутки 18 часов.
Заключительный клинический диагноз
Гидроцефалия, постгеморрагическая, на фоне двустороннего внутрижелудочкового кровоизлияния III степени в постнатальном периоде (по данным нейросонографии).
Результат морфологической диагностики
Иммуногистохимически в глиобластах ВГЗ и нейронах Кахаля-Ретциуса, соответственно месту экспрессии, идентифицированы ММР-9 и рилин, рассчитаны их индексы экспрессии (ИЭ ММР-9=0,15 усл. ед., ИЭ рилина = 2,13 усл. ед.). Полученные параметры характерны для постгеморрагической гидроцефалии.
На аутопсии в головном мозге обнаружены следующие изменения: внутрижелудочковые кровоизлияния (ВЖК) III степени в области передних рогов и тел боковых желудочков (БЖ), дилятация всех отделов боковых желудочков (передние, задние, нижние рога и тела) до 2-2,5 см, истончение мозговой паренхимы до 0,5 см. Герминативный матрикс широкий, представлен гипер- и эухромными клетками. Сосуды типа капилляров расположены в толще герминативного матрикса. В неокортексе дифференцируются I (с разделением на подслои), II и III слои.
Таким образом, расчет ИЭ ММР-9 в глиобластах ВГЗ и рилина в нейронах Кахаля-Ретциуса позволил диагностировать постгеморрагическую гидроцефалию. Результаты иммуногистохимической диагностики подтверждены морфологическими критериями постгеморрагической ГЦ-дилятацией полостей БЖ до 2,5 см на фоне ВЖК III степени, отсутствием признаков редукции герминативного матрикса, соответствием гирификации и дифференцировки неокортекса гестационному возрасту погибшего ребенка.
При сличении клинического диагноза, оформленного с учетом результатов нейросонографии (постгеморрагическая гидроцефалия), и патологоанатомического диагноза (постгеморрагическая гидроцефалия) констатировано совпадение.
Пример 2.
Беременность (IV) женщины С., 30 лет, завершилась самопроизвольными преждевременными родами в 26 недель гестации вследствие острой плацентарной недостаточности, обусловленной преждевременной отслойкой нормально расположенной плаценты. Новорожденный ребенок мужского пола (масса тела при рождении - 800 г, длина - 29 см) погиб на 4 сутки жизни.
Заключительный клинический диагноз.
Гидроцефалия, постгеморрагическая, на фоне двустороннего внутрижелудочкового кровоизлияния III степени (по данным нейросонографии).
При посмертном иммуногистохимическом исследовании вещества головного мозга в глиобластах ВГЗ идентифицирован фермент - ММР-9, в нейронах Кахаля-Ретциуса - рилин. С учетом вышеобозначенной формулы рассчитаны индексы экспрессии ММР-9 (0 усл. ед.) и рилина (0 усл. ед.) в соответствующих клетках, что соответствует Х-сцепленной гидроцефалии, сопряженной с аномалией развития Сильвиева водопровода.
На аутопсии обнаружена микрополигирия, дилятация всех отделов боковых желудочков (передние, задние, нижние рога и центральные отделы) до 2,5-3 см, истончение вещества головного мозга до 0,5 см, двусторонние мелко- и среднеочаговые субэпендимальные кровоизлияния в области передних рогов и центральных отделов боковых желудочков, при наполнении вентрикулярной системы раствором желатина, маркированным черной тушью, - расщепление Сильвиева водопровода на два узкие канала, один из которых заканчивается слепо. ВГЗ представлена гипер- и эухромными клетками, капилляры локализуются преимущественно в субэпендимальной зоне. В неокортексе отсутствует дифференцировка цитоархитектонических слоев.
Таким образом, по значениям ИЭ ММР-9 в глиобластах ВГЗ и ИЭ рилина в нейронах Кахаля-Ретциуса диагностирована наследственная гидроцефалия, сопряженная с аномалией развития Сильвиева водопровода. Результаты иммуногистохимической диагностики подтверждены морфологическими признаками указанной патологии - выраженной дилятацией полостей БЖ головного мозга на фоне аномалии развития водопровода мозга, отсутствием редукции ВГЗ и дифференцировки цитоархитектонических слоев в неокортексе.
При сличении заключительного клинического диагноза, оформленного на основании результатов ультразвукового исследования новорожденного (основное заболевание - постгеморрагическая гидроцефалия), и патологоанатомического диагноза (основное заболевание - гидроцефалия, сопряженная с аномалией развития Сильвиева водопровода) констатировано расхождение по этиологическому принципу.
Пример 3.
Новорожденная девочка женщины М. (23 года) от первой беременности, осложнившейся внутриутробной инфекцией и многоводием, первых преждевременных родов в 27 недель гестации. Масса тела при рождении 980 г. Продолжительность жизни: 1 месяц и 2 дня.
Заключительный клинический диагноз
Гидроцефалия постгеморрагическая на фоне двустороннего внутрижелудочкового кровоизлияния III степени в постнатальном периоде (по данным нейросонографии).
Результат морфологической диагностики
Иммуногистохимически в глиобластах ВГЗ и нейронах Кахаля-Ретциуса, соответственно месту экспрессии, идентифицированы ММР-9 и рилин, рассчитаны их индексы экспрессии (ИЭ ММР-9=0,25 усл. ед., ИЭ рилина = 1,8 усл. ед.), что соответствует поствоспалительной гидроцефалии.
На аутопсии в головном мозге обнаружена выраженная дилятация всех камер БЖ, III и IV желудочков. Эпендима, выстилающая полости боковых желудочков (БЖ), тусклая, утолщенная, с симметричными мелкоочаговыми кровоизлияниями. В просвете БЖ - мутный ликвор. ВГЗ представлена эу- и гиперхромными клетками в равном соотношении. Сосуды типа капилляров в основном расположены субэпендимально. В неокортексе дифференцированы молекулярный, или I (без деления на подслои), и наружный зернистый (II) слои.
Таким образом, по уровню экспрессии ММР-9 в глиобластах ВГЗ (ИЭ=0,25 усл. ед.) и рилина в нейронах Кахаля-Ретциуса (ИЭ=1,8 усл. ед.) диагностирована поствоспалительная гидроцефалия. Результаты иммуногистохимической диагностики подтверждены морфологическими признаками указанной патологии - выраженной дилятацией полостей БЖ головного мозга при отсутствии ВЖК III степени, морфологическими признаками замедления редукции ВГЗ и дифференцировки слоев неокортекса (III и двух подслоев молекулярного слоя) на фоне атрофии мозговой паренхимы, включая кору.
При сличении заключительного клинического диагноза, оформленного с учетом результатов ультразвукового исследования (постгеморрагическая гидроцефалия), и патологоанатомического (врожденная гидроцефалия, поствоспалительная) констатировано расхождение основного заболевания по нозологическому принципу. Преимущества способа
1. Является объективным методом морфологической дифференциальной диагностики гидроцефалий, обусловленных различными этиологическими факторами.
2. Повышает качество оформления патологоанатомического диагноза и эпикриза.
3. Заявленный способ высокоинформативен.
ЛИТЕРАТУРА
1. Воробьёв А.М. Клинико-морфологическая оценка прогноза врожденной гидроцефалии // Вестник РГМУ. - 2007. - №4 (57). - С. 23-26.
2. Барашнев Ю.И. Перинатальная неврология. - М., 2005. - 672 с.
3. Congenital hydrocephalus-prevalence, prenatal diagnosis and outcome of pregnancy in four European regions / E. Garne [et al.] // Eur J Paediatr Neurol. - 2010. - Vol. 14. - P. 150.
4. Gretiz D., Gretiz T. A new view on the CSF circulation with the potential for pharmacological tretment of childhood hydrocephalus // Acta Paediatr. - 2004. - P.86
5. Богадельников И.В., Здырко Ε.В., Крюгер Е.А. Гидроцефалия у детей // Здоровье ребенка. - 2011. - №5. - С. 86-87.
6. Loskwood C.G., Oner С., Uz Y.H. Matrix metalloproteinase 9 (MMP 9) expression in preeclamptic decidua and MMP 9 induction by tumor necrosis factor alpha and interleukin 1 beta in human first trimester desidual cells // Biol. Reprod. - 2008. - Vol. 78 (6). - P. 1064-1072.
7. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse / S. Alcantara [et al.] // J. Neurosci. -1998. - Vol. 18, N 19. - P. 7779-7799.
8. The genesis of low pressure hydrocephalus / P.T. Akins [et al.] // Neurocrit Care. - 2011. - Vol. 15. - P. 461.
9. Проценко Ε.В., Губанова А.Н., Перетятко Л.П. Структурные особенности больших полушарий головного мозга плодов и новорожденных в зависимости от генеза гидроцефалии // Современные проблемы материнства и детства сб. науч. тр., посвящ. 25-летию со дня основания НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова. - Иваново: ОАО «Изд-во «Иваново», 2005. - С. 406-410.
10. Проценко Е.В., Губанова А.Н., Перетятко Л.П. Морфология неокортекса плодов и новорожденных с ЭНМТ при дилятации тел и задних рогов боковых желудочков головного мозга // Архив патологии. - 2009. - Т. 71, №3. - С. 12-15.
11. Проценко Е.В., Васильева М.Е., Кулида Л.В. Патоморфология гидроцефалии у плодов и новорожденных с экстремально низкой массой тела при задержке развития тимуса // Российский иммунологический журнал. - 2012. - Т. 6 (14), №2 (1). - С. 142-143.
12. Структурные изменения герминативного матрикса у плодов и новорожденных с вентрикуломегалией и врожденной гидроцефалией / Е.В. Проценко [и др.] // Архив патологии. - 2014. - Т. 76, №3. - С. 9-12.
13. Проценко Е.В., Васильева М.Е., Перетятко Л.П. Особенности экспрессии рилина в головном мозге плодов и новорожденных с внутренней гидроцефалией // Архив патологии. - 2016. - Т. 78 (№1). - С. 3-7.
14. Tavassoli F.A., Schnitt S.J. Pathologi of the Breast // New York: Prentice Hall. - 1992. - 669 p.