СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ С ПОВЕРХНОСТЕЙ
METHOD FOR DETECTING OF MYCOBACTERIA FROM SURFACES

Изобретение относится к микробиологии, в частности к медицинской и ветеринарной микробиологии, и может быть использовано в эпидемиологических целях для выявления массивного загрязнения поверхностей микобактериями.
Исследования поверхностей различных материалов применяются для контроля качества дезинфекционных мероприятий, а также при обследовании очагов туберкулезной инфекции в эпидемиологических целях.
Наиболее опасными объектами, подлежащими обязательному исследованию на загрязненность микобактериями, являются поверхности, находящиеся в зоне дыхания больного в палатах, кабинетах и местах наибольшего скопления больных (процедурных кабинетах), а также оборудование кабинетов для ингаляций, бактериологических лабораторий, кабинетов для сбора мокроты.
Важнейшим задачей этих исследований является быстрое получение результатов, характеризующих массивную загрязненность, позволяющее незамедлительно принять меры, предотвращающие возникновение эпидемиологической опасности, при этом точному определению количественных показателей отводится второстепенная роль.
Все известные способы выявления микобактерий с поверхностей основаны на взятии смыва с поверхности смоченным тампоном, обработке исследуемого материала перед посевом для устранения посторонней микрофлоры и посеве на питательные среды. О наличии микобактерий и их количестве на исследуемых поверхностях судят на основании их роста на питательной среде [Приказ МЗ РФ № 109 от 21 марта 2003 года «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской федерации», Приложение 11 «Инструкция по унифицированным микробиологическим исследованиям при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза» с. 205-206].
3
4
Известен способ выявления микобактерий с различных поверхностей, включающий смыв ватным тампоном, смоченным изотоническим раствором хлорида натрия с последующим перенесением материалов в банку с бусами, добавлением 10-ного раствора NaPO и встряхиванием в течение 10 мин, инкубацию в термостате при 37°С в течение 24 ч, перенос материала в пробирки, центрифугирование при скорости 1500 оборотов в 1 мин в течение 15 мин и посев осадка в 3-4 пробирки с питательными средами Левенштейна-Иенсена и Финн-2 (Н.И.Любкина, Бактериовыделители в условиях современной эпидемической ситуации по туберкулезу. Дис… канд. мед. наук. - М., - 1989).
Известный способ не позволяет в кратчайшие сроки определить наличие массивного бактериального загрязнения на поверхностях и, следовательно, обеспечить своевременное принятие мер по удалению этого загрязнения. Способ позволяет получить результаты лишь через 30±10 дней.
Многочисленные манипуляции по переносу материала при обработке перед посевом повышают риск его дополнительного загрязнения другими микроорганизмами, что в дальнейшем приводит к увеличению числа проростов посторонней микрофлоры. Наличие проростов снижает выявляемость микобактерий туберкулеза, то есть точность лабораторной диагностики.
Культивирование в 3-4 пробирках с питательной средой ведет к дроблению посевного материала, следовательно, к снижению выявляемое микобактерий туберкулеза и удлинению сроков их роста.
Известен также способ выявления микобактерий с поверхностей ватным тампоном, смоченным 5%-ным раствором хлорида натрия, включающий обработку перед посевом 4%-ным раствором КОН, нейтрализацию тампона и осадка 5%-ной лимонной кислотой, посев на плотные питательные среды Левенштейна-Иенсена и "Новая" (Н.В.Попцова \\ Пробл. туберкулеза - 1974. - 8. - С.17-20).
Известный способ также не позволяет в кратчайшие сроки определить наличие массивного бактериального загрязнения и, следовательно, обеспечить своевременное принятие мер по удалению этого загрязнения. Способ позволяет получить результаты не ранее, чем через 30 дней.
Недостатком указанного способа является еще и то, что при его осуществлении не обеспечивается необходимая точность лабораторной диагностики из-за количественных потерь исследуемого материала, нарушения жизнеспособности в нем микобактерий туберкулеза.
Обработка материала перед посевом для уничтожения посторонней микрофлоры 4%-ным раствором сильной щелочи снижает жизнеспособность микобактерий, так как не обеспечивает для них щадящих условий, что приводит к уменьшению выявляемости и более поздним срокам роста на питательных средах.
Наиболее близким к заявляемому является способ выявления микобактерий с поверхностей путем сбора исследуемого материала тампоном из эластичного мелкопористого материала, смоченным в растворе, ингибирующем развитие других микроорганизмов, с последующим выдерживанием его в этом же растворе в течение 18-24 часов, отделения исследуемого материала от тампона, ценрифугиругирования и посева осадка, адсорбированного на тампоне и выделенного из раствора центрифугированием, раздельно на питательных средах с последующим культивированием [Патент РФ 2180690].
Использование в качестве материала тампона мелкопористого материала (поролона), который хорошо адсорбирует микроорганизмы при смыве и легко выделяет их при дальнейшем культивировании, позволяет снизить количественные потери микобактерий.
3
4
Применение для смачивания тампона раствора, ингибирующего развитие других микроорганизмов (5%-ного раствора NaPO), который одновременно служит для обработки материала от посторонней микрофлоры, позволяет увеличить выявляемость микобактерий, так как не нарушает их жизнеспособность и уменьшает число проростов посторонней микрофлоры, что повышает точность лабораторной диагностики.
Хотя последующее культивирование микобактерий, адсорбированных на тампоне и выделенных из раствора центрифугированием, а также использование для культивирования микобактерий, адсорбированных на тампоне жидкой или полужидкой питательной среды, обеспечивающей более полный контакт микобактерий с питательным субстратом, и ведет к сокращению сроков роста и повышению выявляемости микобактерий туберкулеза, тем не менее с его помощью невозможно в короткий срок выявить наличие микобактерий и определить степень загрязнения ими обследуемых поверхностей.
В основу изобретения положена задача сокращения времени лабораторных исследований для выявления массивного загрязнения поверхностей микобактериями.
Поставленная задача решается тем, что в способе выявления микобактерий с поверхностей путем сбора исследуемого материала тампоном из эластичного мелкопористого материала, смоченным в растворе, ингибирующем развитие других микроорганизмов, с последующим выдерживанием его в этом же растворе в течение 18-24 часов, отделения исследуемого материала от тампона и ценрифугиругирования согласно изобретению, от осадка отделяют не более третьей части исследуемого материала, помещают ее на предметное стекло микроскопа, с фазоконтрастной приставкой и проводят фазоконтрастную микроскопию.
Оставшаяся часть осадка может быть помещена на питательную среду с последующим культивированием в случае необходимости более точной количественной оценки бактериального загрязнения исследуемых поверхностей микобактериями туберкулеза.
Проведение фазоконтрастной микроскопии материала, собранного с поверхностей тампоном из мелкопористого материала, обеспечивающим минимальные потери исследуемого материала, обработанного в растворе, ингибирующем развитие других микроорганизмов, но не нарушающем жизнеспособность микобактерий, позволяет в течение нескольких минут выявить в обработанном по заявляемому способу исследуемом материале наличие массивного загрязнения поверхностей микобактериями, если таковое имеется.
Сбор материала тампоном и его обработка в растворе, ингибирующем развитие других микроорганизмов, позволяет максимально собрать имеющиеся микроорганизмы и удалить посторонние, что повышает объективность выявления микобактерий фазоконтрасным микроскопрованием, основанным на изменении фазы волны проходящего света, благодаря чему повышается контрастность изображения.
Таким образом, в случае возможной сложной эпидемиологической обстановки, заявляемым способом получают результаты, позволяющие при наличии бактериологического загрязнения быстро его ликвидировать, а затем, если это необходимо, выяснить более точные масштабы загрязнения путем посева оставшейся части исследуемого материала на питательную среду.
Осуществление посева и культивирования оставшейся после отделения для фазоконтрастной микроскопии части, необходимость в котором возникает для более точной количественной оценки бактериального загрязнения исследуемых поверхностей микобактериями туберкулеза, осуществляют путем посева этой части исследуемого материала на питательную среду с последующим культивированием.
Пример выполнения способа. Тампон из мелкопористой поролоновой губки размером 15 мм × 15 мм × 15 мм (размер пор 0,1-0,3 мм) берут стерильным пинцетом, погружают в центрифужную пробирку с 5 мл 5%-ного раствора фосфорнокислого натрия трехзамещенного, отжимают слегка о стенки пробирки, производят смыв с поверхности предмета. После смыва тампон вновь погружают в смачивающий раствор. Пинцет перед очередным смывом стерилизуют обжиганием над пламенем спиртовки. Пробирки нумеруют и отправляют в лабораторию с сопроводительной документацией, где указаны дата проведения исследований, название учреждения, помещение и предметы, с которых взяты смывы. Для взятия смывов используют трафареты из алюминиевой или другой металлической проволоки, размером 10 см × 10 см.
2
2
Площадь смыва зависит от вида материала исследуемой поверхности. Одним тампоном брали смыв в одной точке, площадью 100 см (например, с квадрата 10 см × 10 см). Соответственно пятью тампонами смыв брали в 5 точках, десятью - в 10 и т.д. Если площадь исследуемого объекта меньше 100 см, то смыв берут одним тампоном с нескольких предметов, изготовленных из одного материала: с двух вентилей кранов, с трех дверных ручек и т.п. Для проведения исследования предметов, имеющих изогнутую поверхность (раковина), однократно используют гибкие бумажные трафареты.
Доставленные в лабораторию пробирки со смывами выдерживают в термостате в течение 18-24 ч при температуре 37°С для уничтожения микрофлоры загрязнения. По окончании тампон берут стерильным пинцетом, отмывают в пробирке со смачивающим раствором, ингибирующим развитие посторонней микрофлоры, в которую он был погружен, отжимают о стенки пробирки и удаляют.
После удаления тампона раствор центрифугируют при скорости 3000 оборотов в 1 мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость сливают, осадок нейтрализуют 1%-ным раствором лимонной кислоты (в соотношении 1:1).
Отделяют от осадка 1/3 исследуемого материала для подготовки к последующей фазоконтрастной микроскопии. С помощью пипетки этот исследуемый материал помещают на приборное стекло бинокулярного микроскопа с встроенным осветителем - «Микмед-6" фирмы «ЛОМО» (Ленинградское оптико-механическое объединение) с фазоконтрастной приставкой КФК-4.
Сверху кладут покровное стекло, края которого для предохранения исследуемого материала от высыхания смазывают кисточкой с расплавленным парафином, и вводят приборное стекло в микроскоп.
Наличие массивного загрязнения исследуемых поверхностей микобактериями визуально определяют с помощью фазоконтрастной микроскопии за счет изменения фазы волны проходящего света, обеспечивающего высокую контрастность изображения и тем самым позволяющей увидеть в микроскоп масштабы загрязнения.
37
В таблице 1 представлены данные по выявлению микобактерий стандартного лабораторного штамма HRv бактериоскопическими методами.
Таблица 1
Метод выявления
Количество положительных бактериологических находок при различных способах выявления в %
Достоверность (P)
Концентрация микробных тел мкг/мл
Заявляемый
Известный
100 (1)
1000 (2)
10000 (3)
100 (1a)
1000 (2a)
10000 (3а)
Фазоконтрастная микроскопия
2,0±0,6
11,32±0,2
47,2±1,3
1,0±0,1
8,0±0,1
36,1±0,6
P<sub>2-2a</sub><0,001P<sub>3-3a</sub><0,001
Световая с окраской по Ziehl-Neelsen
0
2,7±0,2
8,4±1,0
0±0,4
7,0±0,6
29,4±1,9
P<sub>2-2а</sub><0,01P<sub>3-3a</sub><0,01
Как видно из таблицы 1, при использовании заявляемого способа при концентрации микробных тел 1000 и 10000 мкг/мл достоверность выше на 3,3% и 11,1% соответственно, что способствует ускорению визуального определения массивных загрязнений кислотоустойчивых микобактерий.
Если необходимо более точно определить количественные показатели бактериального загрязнения, оставшуюся часть исследуемого материала засевают поровну в 2 пробирки с плотной питательной средой (например, со средами Левенштейна-Иенсена и "Новая").
Пробирки с посевами на плотных питательных средах помещают в термостат при 37°С на 10 суток в горизонтальном положении, затем переводят в вертикальное положение и инкубируют до 3 месяцев. Просмотр посевов осуществляют еженедельно для выявления роста микобактерий и удаления пробирок с проростами. Дальнейшие исследования проводят по общепринятым методикам.
В таблице 2 представлены данные по выявлению кислотоустойчивых микобактерий с различных предметов и поверхностей.
Таблица 2
Предмет исследования
Кол-во исследований (n)
Выявляемость микобактерий посевом
Выявляемость микобактерий фазоконтрастной микроскопией
абс
%±m
Дверные ручки, краны выключатели
110
32
6,0
18,2
Мебель и мед. оборудование
105
17
3,0
18,0
Стены, рамы, потолки, двери,
98
9
0
0
Медицинские халаты, белье
35
0
0
0
Как видно из таблицы 2, выявляемость с помощью фазоконтрастной микроскопии значительно ниже по сравнению с посевом, но посев не позволяет на вторые сутки после осуществления смыва с исследуемой поверхности дать ответ о наличии массивного загрязнения микобактериями и, следовательно, незамедлительно принять меры по обеззараживанию обследуемых поверхностей.