Теоретическое и экспериментальное обоснование выбора перспективных методов оценки количественного содержания иммуноглобулинов классов G, А и М в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека

© Коллектив авторов, 2019

Нечаев А.В., Кудашева Э.Ю., Лешина С.А., Корнилова О.Г., Коновалова Е.С., Стручкова И.Н., Борисевич И.В., Лебединская Е.В.

Теоретическое и экспериментальное обоснование выбора перспективных методов оценки количественного содержания иммуноглобулинов классов G, А и М в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека

ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, 127051, г. Москва, Россия

Выбор перспективных методов и экспериментальное обоснование их пригодности для оценки содержания примеси иммуноглобулина (Ig) класса А и/или изучения состава основного действующего вещества лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека нормальных [IgG + IgM + IgA] является актуальной необходимостью совершенствования качества этих препаратов. Цель исследования - теоретическое и экспериментальное обоснование выбора перспективных методик с использованием наборов иммунохимических реагентов для оценки количественного содержания IgA, IgM и IgG в препаратах Ig человека.

Материал. Образцы Ig человека с известным содержанием соответствующих классов Ig. Представлены результаты оценки правильности, повторяемости (сходимости), внутрилабораторной (промежуточной прецизионности) аналитических методик кинетической нефелометрии, иммуно-ферментного анализа и радиальной иммунодиффузии по Манчини с использованием доступных коммерческих иммунохимических наборов реагентов. Обоснована пригодность и перспективность данных аналитических методик для определения количественного содержания Ig классов G, А и М в препаратах Ig человека. Сделан вывод, что достоверные результаты, не зависящие от выбранных методик и наборов иммунохимических реагентов, возможны только, если при испытании препарата используют стандартные образцы свойств и/или состава основного действующего вещества, аттестованного по отношению к международному стандартному образцу.

Ключевые слова: препараты иммуноглобулинов человека; иммуноглобулины классов A, M, G; иммуно-ферментный анализ; радиальная иммунодиффузия по Манчини; кинетическая нефелометрия; международный стандартный образец; критерии приемлемости аналитических методик

Статья поступила 05.03.2019. Принята в печать 16.04.2019.

Для цитирования: Нечаев А.В., Кудашева Э.Ю., Лешина С. А., Корнилова О.Г., Коновалова Е.С., Стручкова И.Н., Борисевич И.В., Лебединская Е.В. Теоретическое и экспериментальное обоснование выбора перспективных методов оценки количественного содержания иммуноглобулинов классов G, А и М в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека Иммунология. 2019; 40 (3): 41-50. doi: 10.24411/0206-4952-2019-13005.

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России № 056-00154-19-00 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР AAAA-A18-118021590046-9).

Для корреспонденции

Нечаев Алексей Викторович -ведущий эксперт лаборатории иммуноглобулинов и препаратов крови Испытательного центра экспертизы качества медицинских иммунобиологических препаратов ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, Москва, Россия E-mail: Nechaev@expmed.ru https://orcid.org/0000-0003-2747-6239

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Nechaev A.V., Kudasheva E.Yu., Leshina S.A., Kornilova O.G., Konovalova E.S., Struchkova I.N., Borisevich I.V., Lebedinskaya E.V.

Theoretical and experimental rationale of the selection of promising methods for quantitative determinationof immunoglobulins G, A and M in human immunoglobulin products

Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products, 127051, Moscow, Russia

The selection of advantageous methods and experimental substantiation of their suitability for quantitative determination of immunoglobulin A impurity and/or for studying the composition of the main active ingredient in normal human immunoglobulins [IgG + IgM + IgA] is a pressing challenge brought about by the need to improve the quality of these products. The aim of the study is theoretical and experimental justification of the selection of promising analytical techniques using immunochemical reagent kits for determination of immunoglobulins A, M and G content in human immunoglobulin products.

For correspondence

Nechaev Alexey V. -Leading Expert of Laboratory of Immunoglobulins and Blood Products of Testing Centre for Evaluation and Control of Medicinal Immunobiological Products' Quality, Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products, Moscow, Russia E-mail: Nechaev@expmed.ru https://orcid.org/0000-0003-2747-6239

Materials. Human immunoglobulin samples for intravenous administration with a known content of immunoglobulins belonging to specific classes. The paper presents the results of assessment of accuracy, repeatability, and intermediate precision of Kinetic nephelometry, ELISA and Mancini radial immunodiffusion method using available commercial immunochemical reagent kits. The paper substantiates suitability and promising outlook of these analytical methods for quantitative determination of immunoglobulins G, A and M in human immunoglobulin products. It was concluded by the authors that reliable results, independent of the chosen method and immunochemical reagent kit, can only be obtained if the test sample was studied using reference standards (showing properties and/or composition of the main active ingredient) calibrated against the international reference standard.

Keywords: human immunoglobululin products; immunoglobulins A, M, G; ELISA; Mancini radial immunodiffusion; Kinetic nephelometry; international reference standard; analytical methods acceptability criteria

Received 22.03.2019. Accepted 16.04.2019.

For citation: Nechaev A.V., Kudasheva E.Yu., Leshina S.A., Kornilova O.G., Konovalova E.S., Struchkova I.N., Borisevich I.V., Lebedinskaya E.V. Theoretical and experimental rationale of the selection of promising methods for quantitative determinationof immunoglobulins G, A and M in human immunoglobululin products. Immunologiya. 2019; 40

Acknowledgments. Work is performed within the state task of the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products fgbi ntsesmp Ministry of health of Russia No. 056-00154-19-00 to conduct applied scientific research (the number of state accounting research AAAA-A18-118021590046-9).

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Иммуноглобулины (]£) человека - группа иммунобиологических лекарственных препаратов, основным действующим веществом которых являются плазмы крови, обладающие специфичностью в отношении широкого спектра антител донорской популяции либо антительной активностью против определенного инфекционного или неинфекционного антигена [1].

Независимо от специфичности антител, сконцентрированных в основном действующем веществе препаратов ]£ человека, его состав должен быть представлен преимущественно фракцией (> 95%), визуализируемой в электрическом поле в виде интенсивной линии преципитации с присутствием не более четырех дополнительно определяемых линий других фракций плазмы крови человека (альбумина, ]^А, и др. ) -примесей [2-7].

Исключением служат препараты ]£ человека, обогащенные ]£ классов А и М, присутствие которых в составе основного действующего вещества обеспечивает эффективность применения лиофилизатов для приготовления раствора для приема внутрь в комплексной терапии вирусных и бактериальных кишечных инфекций у детей с 1 мес и взрослых и растворов для инфузий для лечения бактериальных инфекций при одновременном использовании антибиотиков1.

Методы кинетической нефелометрии, иммуно-ферментного анализа (ИФА) и радиальной иммуно-диффузии (РИД) по Манчини широко используются в клинико-диагностических лабораториях для определения содержания ]£ классов в, А, М в биологических жидкостях человека (сыворотка крови и/или спинномозговая жидкость) для контроля иммунного статуса пациента, а также в комплексной диагностике ряда патологий. Указанные иммунохимические методы перспективны и для количественной оценки содержания классов ^ в лекарственных препаратах ^ человека.

Единственным подверждением пригодности указанных методов для оценки содержания примеси IgA в препаратах Ig человека всех форм введения и/или изучения состава основного действующего вещества препаратов Ig человека нормальных [IgG + IgM + IgA] является экспериментальное обоснование возможности использования аналитических методик для решения поставленных задач.

Цель исследования - теоретическое и экспериментальное обоснование выбора перспективных методик с использованием наборов иммунохимических реагентов для оценки количественного содержания Ig классов А, М и G в препаратах Ig человека.

Материал и методы

Пробы Ig человека с известным содержанием Ig классов G, А и М использовали в качестве испытуемых образцов. Пробы № 1 - IgA (0,9 мг/мл), № 2 - IgA (0,3 мг/мл), № 3 - IgA (0,1 мг/мл), № 4 - IgM (0,5 мг/мл), № 5 - IgM (0,2 мг/мл), № 6 - IgM (0,09 мг/мл), № 7 - IgG (53,4 мг/мл). Кроме того, исследованы пробы № 8 - Плацебо (0,9% раствор натрия хлорида), № 9 - «ОСО 28-442 ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России количественного содержания иммуноглобулинов классов G, A, M» (ОСО 28-442). ОСО 28-442 калиброван по отношению к международному стандартному образцу WHO International Standard Immunoglobulins G, A and M, Human Serum, NIBSC 67/86. ОСО 28-442 представляет собой нормальную сыворотку крови человека, полученную от 1000 здоровых доноров и разлитую по 2,0 мл во флаконы без добавления стабилизаторов и консервантов. Значения аттестуемых характеристик ОСО 28-442 составляют: IgG - 7,19 ± 0,29 мг/мл (метод нефелометрии); 6,60 ± 0,58 мг/мл (метод РИД); 8,35 ± 1,19 мг/мл (метод ИФА); IgA - 1,25 ± 0,06 мг/мл (метод нефелометрии); 1,31 ±

1 Государственный реестр лекарственных средств Министерства здравоохранения Российской Федерации. Доступен по ссылке: Нир:/^гЬ. гоят1п1ёгт. ги^гЬ.аярх.

0,12 мг/мл (метод РИД); 1,76 ± 0,38 мг/мл (метод ИФА); IgM - 0,52 ± 0,04 мг/мл (метод нефелометрии); 0,51 ± 0,08 мг/мл (метод РИД); 1,03 ± 0,17 мг/мл (метод ИФА).

Пробуобразцов подготовили следующим образом: для методики кинетической нефелометрии пробы № 1-8 использовали без разведения; пробу № 9 (ОСО 28442) - в разведении 1/10; для оценки содержания IgG методом ИФА использовали разведения: № 9 (ОСО 28442) - 1/1969, 1/2953, 1/4429, 1/6644, 1/9966; № 1-3 -1/10 000, 1/15 000, 1/22 500, 1/33 750, 1/50 625; IgA: № 9 (ОСО) - 1/3000, 1/4500, 1/6750, 1/10 125, 1/15 187; № 1-3 - 1/40, 1/60, 1/80, 1/100, 1/120; IgM: № 9 (ОСО 28-442) - 1/2000, 1/3000, 1/4500, 1/6750, 1/10 125; для методики радиальной иммунодиффузии по Манчини использовали следующие разведения: № 1-8, № 9 (ОСО 28-442) - без разведения, 1/2, 1/4, 1/8.

В работе использованы наборы реагентов Beckman Coulter: «Иммуноглобулин M в низкой концентрации (Low Concentration Immunoglobulin M, IGMLC)», «Иммуноглобулин А в низкой концентрации (Low Concentration Immunoglobulin А, IGALC), «Иммуноглобулин G (Immunoglobulin G, IGG)» - в методике кинетической нефелометрии для количественного определения содержания Ig классов G, А и М; наборы реагентов «Моно-РИД-G, A, M. Сыворотки диагностические моноспецифические против IgG(H), IgA(H), IgM (H) сухие» (ФГУП «НПО «Микроген») - в методике радиальной им-мунодиффузии по Манчини; наборов реагентов «IgG общий - ИФА-БЕСТ», (Вектор-БЕСТ); «IgM общий - ИФА-БЕСТ», (Вектор-БЕСТ); «^А общий - ИФА-БЕСТ», (Вектор-БЕСТ) - в методике ИФА с использованием анализатора Multiskan GO (Thermo Scientific).

Диаметры колец преципитации измеряли с использованием программного обеспечения для общего анализа различных двумерных изображений Image-ProPremier. Все экспериментальные исследования проводили в Испытательном центре экспертизы качества медицинских

иммунобиологических препаратов ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России на (аттестованном, калиброванном) оборудовании, прошедшем метрологическую поверку. Статистические параметры рассчитывали с достоверностью 95% с помощью формул и табличных данных [8].

Все наборы реагентов использовали согласно инструкциям производителя. Каждое определение проводили 2 аналитика в 10 повторах.

Результаты

Для экспериментального доказательства пригодности аналитических методик кинетической нефелометрии, ИФА и РИД по Манчини с использованием коммерческих наборов иммунохимических реагентов для определения количественного содержания ^ классов в, А и М в лекарственных препаратах ^ человека оценивали такие их характеристики, как правильность, повторяемость (сходимость), внутрилабораторная (промежуточная прецизионность).

Все три изученные методики отвечают критерию правильности, так как аттестованные значения содержания 1^А, IgM и в ОСО находятся внутри соответствующих доверительных интервалов среднего значения (табл. 1-3), а также удовлетворяют критерию сходимости, поскольку максимальные значения коэффициентов вариации результатов определения содержания ^в, ^А, ^М в образцах препаратов и ОСО 28-442, полученные каждым аналитиком, не превышают допустимых значений Я^Б (табл. 4-12).

Методики кинетической нефелометрии, ИФА и РИД по Манчини отвечают критерию промежуточной (внутрилабораторной) прецизионности, так как максимальные значения общего коэффициента вариации содержания ^А, ^М, ^в, рассчитанные исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не превышают допустимых значений общего Я^Б. Средние значения

Таблица 1. Результаты определения количественного содержания иммуноглобулинов классов А, М, О в ОСО 28-442 ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России с использованием методики кинетической нефелометрии

Статистический параметр Содержание ^А, мг/мл Содержание ^М, мг/мл Содержание IgG, мг/мл

аналитик I

Среднее арифметическое х 1,28 1,29 0,55 0,58 7,04 6,99

Дисперсия 53 0,003 0,004 0,00 0,01 0,39 0,14

Стандартное отклонение 0,06 0,07 0,04 0,08 0,62 0,37

Граничное значение доверительного интервала среднего значения ±Дх 0,04 0,05 0,03 0,06 0,41 0,25

Доверительный интервал среднего значения 1,24-1,32 1,24-1,34 0,52-0,58 0,52 - 0,64 6,62 - 7,45 6,74 - 7,23

Аттестуемая характеристика 1,25 0,52 7,19

Номинальный интервал содержания иммуноглобулинов 1,13-1,37 0,44-0,60 6,61-7,77

Примечание. Значения аттестуемых характеристик ОСО, определенные методом нефелометрии (по паспорту): 1§А -1,25 ± 0,06мг/мл; Ig№ - 0,52 ± 0,04мг/мл; IgG - 7,19 ± 0,29 мг/мл.

двух параллельных серий определений статистически эквивалентны, например, 1 меньше табличного значе-

^ А 1 ^ расч

ния. Существенных различий в точности данных, полученных двумя аналитиками, нет - Б меньше таблич-

^ расч

ного значения (табл. 13-18).

В результате оценки характеристик методики кинетической нефелометрии сформулированы следующие критерии приемлемости: общее Я^Б (для двух аналитиков) содержания ^А, рассчитанное исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не должно

Таблица 2. Результаты определения количественного содержания иммуноглобулинов классов А, М, О в ОСО 28-442 ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России количественного содержания ^ классов О, А, М» с использованием методики иммуноферментного анализа

Статистический параметр Содержание ^А, мг/мл Содержание ^М, мг/мл Содержание IgG, мг/мл

аналитик I

Среднее арифметическое х 1,64 1,67 0,94 1,04 8,39 8,15

Дисперсия 53 0,11 0,10 0,03 0,04 0,28 0,71

Стандартное отклонение 0,33 0,31 0,18 0,21 0,53 0,84

Граничное значение доверительного интервала среднего значения ±Дх 0,23 0,22 0,13 0,15 0,38 0,60

Доверительный интервал среднего значения 1,41-1,87 1,45-1,89 0,81-1,07 0,89-1,19 8,01-8,77 7,55-8,75

Аттестуемая характеристика 1,76 1,03 8,35

Номинальный интервал содержания ^ 1,0-2,52 0,69-1,37 5,97-10,73

Примечание. Значения аттестуемых характеристик ОСО, определенные методом ИФА (по паспорту): - 1,76 ± 0,38мг/мл; IgМ -1,03 ± 0,17мг/мл; ^О - 8,35 ± 1,19 мг/мл.

Таблица 3. Результаты определения количественного содержания иммуноглобулинов классов А, М, О в ОСО 28-442 ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России с использованием методики радиальной иммуно-диффузии по Манчини

Статистический параметр Содержание IgА, мг/мл Содержание ^М, мг/мл Содержание IgG , мг/мл

аналитик I

Среднее арифметическое х 1,28 1,29 0,55 0,58 7,04 6,99

Дисперсия 53 0,003 0,004 0,00 0,01 0,39 0,14

Стандартное отклонение 5 0,06 0,07 0,04 0,08 0,62 0,37

Граничное значение доверительного интервала среднего значения ±Дх 0,04 0,05 0,03 0,06 0,41 0,25

Доверительный интервал среднего значения 1,24-1,32 1,24-1,34 0,52-0,58 0,52 - 0,64 6,62 - 7,45 6,74 - 7,23

Аттестуемая характеристика 1,25 0,52 7,19

Номинальный интервал содержания иммуноглобулинов 1,13-1,37 0,44-0,60 6,61-7,77

Примечание. Значения аттестуемых характеристик ОСО, определенные методом РИД по Манчини (по паспарту): IgА - 1,31 ± 0,12 мг/мл; ^- 0,51 ± 0,08 мг/мл; ^О - 6,60 ± 0,58 мг/мл.

Таблица 4. Результаты определения количественного содержания иммуноглобулинов класса А в испытанных образцах с использованием методики кинетической нефелометрии

Статистический параметр Результаты определения количественного содержания IgА в пробе

1-й 2-й 3-й 9-й

Аналитик (п = 10) I II I II I II I II

Среднее арифметическое х 0,93 0,92 0,32 0,32 0,11 0,11 1,28 1,29

Дисперсия 53 0,0017 0,0019 0,0004 0,0004 0,0001 0,0001 0,0033 0,0044

Стандартное отклонение 5 0,0408 0,0437 0,0202 0,02 0,0113 0,0105 0,0575 0,0665

Коэффициент вариации Е55П, % 4,39 4,75 6,31 6,2 10,12 9,49 4,50 5,17

превышать 15,0%; общее Я^Б (для двух аналитиков) содержания иммуноглобулинов М, рассчитанное, исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не должно превышать 15,0%; общее Я^Б (для двух аналитиков) содержания ^в, рассчитанное, исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не должно превышать 10,0%; средние значения двух параллельных серий определе-

ний должны быть статистически эквивалентны, а различия в точности данных, полученных двумя аналитиками, отсутствовать.

В методиках ИФА сформулированы следующие критерии приемлемости: общее Я8Б (для двух аналитиков) содержания ^А, рассчитанное, исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не должно

Таблица 5. Результаты определения количественного содержания иммуноглобулинов класса М в испытанных образцах с использованием методики кинетической нефелометрии

Статистический параметр Результаты определения количественного содержания 1§М в пробе

4-й 5-й 6-й 9-й

Аналитик (п = 10) I II I II I II I II

Среднее арифметическое х 0,51 0,50 0,22 0,22 0,10 0,10 0,55 0,58

Дисперсия 53 0,0007 0,0007 0,0002 0,0002 0,0000 0,0000 0,0016 0,0061

Стандартное отклонение 5 0,0264 0,0267 0,0140 0,0137 0,0052 0,0052 0,0395 0,0781

Коэффициент вариации Е55П, % 5,17 5,31 6,41 6,2 5,38 5,38 7,21 13,48

Таблица 6. Результаты определения количественного содержания иммуноглобулинов класса О в испытанных образцах с использованием методики кинетической нефелометрии

Статистический параметр Результаты определения количественного содержания 1§С в пробе

7-й 9-й

Аналитик (п = 10) I II I II

Среднее арифметическое х 53,47 53,47 7,04 6,99

Дисперсия 53 0,0047 0,0055 0,3885 0,1399

Стандартное отклонение 5 0,0685 0,0739 0,6233 0,3741

Коэффициент вариации Е55П, % 0,13 0,14 8,86 5,35

Статистический параметр Результаты определения количественного содержания 1§А в пробе

1-й 2-й 3-й 9-й

Аналитик (п = 10) I II I II I II I II

Среднее арифметическое х 0,97 0,97 0,35 0,35 0,11 0,12 0,97 1,67

Дисперсия 53 0,0054 0,0033 0,0007 0,0002 0,0002 0,0003 0,0054 0,0973

Стандартное отклонение 5 0,07 0,06 0,03 0,02 0,01 0,02 0,07 0,31

Коэффициент вариации Е55П, % 7,52 5,91 7,69 4,47 12,04 15,59 7,52 18,71

Таблица 8. Результаты определения количественного содержания иммуноглобулинов класса А в испытанных образцах с использованием методики иммуноферментного анализа

Статистический параметр Результаты определения количественного содержания 1§А в пробе

4-й 5-й 6-й 9-й

Аналитик (п = 10) I II I II I II I II

Среднее арифметическое х 0,56 0,59 0,24 0,24 0,10 0,10 0,94 1,04

Дисперсия 53 0,0086 0,0076 0,0015 0,0018 0,0001 0,0000 0,0338 0,0442

Стандартное отклонение 5 0,09 0,09 0,04 0,04 0,01 0,01 0,18 0,21

Коэффициент вариации Е55П, % 16,60 14,92 16,31 17,78 7,73 5,38 19,63 20,23

Таблица 7. Результаты определения количественного содержания иммуноглобулинов класса А в испытанных образцах с использованием методики иммуноферментного анализа

превышать 20,0%; общее (для двух аналитиков) содержания ^М, рассчитанное, исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не должно превышать 25,0%; общее (для двух аналитиков) содержания ^в, рассчитанное, исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не должно превышать 10,0%. Сред-

ние значения двух параллельных серий определений должны быть статистически эквивалентны. Различия в точности данных, полученных двумя аналитиками, должны отсутствовать.

В результате оценки характеристик методики РИД по Манчини сформулированы следующие критерии прием-

Таблица 9. Результаты определения количественного содержания иммуноглобулинов класса О в испытанных образцах с использованием методики иммуноферментного анализа

Статистический параметр Результаты определения количественного содержания иммуноглобулинов G в пробе

7-й 9-й

Аналитик (п = 10) I II I II

Среднее арифметическое х 50,47 52,01 8,39 8,15

Дисперсия 53 2,635 6,69 0,28 0,71

Стандартное отклонение 5 1,62 2,59 0,53 0,84

Коэффициент вариации % 3,22 4,97 6,34 10,34

Таблица 10. Результаты определения количественного содержания иммуноглобулинов класса А с использованием методики радиальной иммунодиффузии по Манчини в испытанных образцах

Статистический параметр Результаты определения количественного содержания ^А с использованием методики РИД по Манчини в пробе, мг/мл

1- й 2- й 9- й

Аналитик I II I II I II

Среднее арифметическое х 0,95 0,94 0,33 0,32 1,28 1,29

Дисперсия 53 0,0022 0,0025 0,0007 0,0004 0,0033 0,0044

Стандартное отклонение 5 0,0477 0,0504 0,0258 0,0200 0,0575 0,0665

Коэффициент вариации % 5,04 5,34 7,82 6,20 4,50 5,17

Таблица 11. Результаты определения количественного содержания иммуноглобулинов класса М с использованием методики радиальной иммунодиффузии по Манчини

Статистический параметр Результаты определения количественного содержания ^М с использованием методики РИД по Манчини в пробе, мг/мл

4-й 5-й 6-й 9-й

Аналитик I II I II I II I II

Среднее арифметическое х 048 0,50 0,22 0,22 0,10 0,10 0,55 0,58

Дисперсия 53 0,0020 0,0011 0,0002 0,0002 0,0000 0,0000 0,0016 0,0061

Стандартное отклонение 5 0,0446 0,0330 0,0140 0,0137 0,0052 0,0052 0,0395 0,0781

Коэффициент вариации % 9,31 6,60 6,41 6,20 5,38 5,38 7,21 13,48

Таблица 12. Результаты определения количественного содержания иммуноглобулинов класса О с использованием методики радиальной иммунодиффузии по Манчини в испытанных образцах

Статистический параметр Результаты определения количественного содержания IgG с использованием методики РИД по Манчини в пробе, мг/мл

7-й 9-й

Аналитик I II I II

Среднее арифметическое х 52,37 52,35 7,04 6,99

Дисперсия 53 5,9724 8,7093 0,3885 0,1399

Стандартное отклонение 5 2,4438 2,9512 0,6233 0,3741

Коэффициент вариации % 4,67 5,64 8,86 5,35

лемости: общее Я^Б (для двух аналитиков) содержания ^А, рассчитанное, исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не должно превышать 10,0%; общее Я^Б (для двух аналитиков) содержания IgМ, рассчитанное, исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не должно превышать 15,0%; общее Я^Б (для двух аналитиков) со-

держания ^в, рассчитанное, исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не должно превышать 10,0%. Средние значения двух параллельных серий определений должны быть статистически эквивалентны. Различия в точности данных, полученных двумя аналитиками, должны отсутствовать.

Таблица 13. Результаты оценки промежуточной прецизионности методики кинетической нефелометрии для определения количественного содержания иммуноглобулинов классов А, М, О в испытанных образцах

Статистический параметр Значение статистического параметра результатов определения

IgA, проба IgM, проба IgG, проба

1-я 2-я 3-я 4-я 5-я 6-я 7-я

Общее среднее арифметическое 0,92 0,32 0,11 0,51 0,22 0,10 53,47

Средневзвешенное значение дисперсии 5с2р 0,0018 0,0004 0,0001 0,0007 0,0002 0,0000 0,0051

Дисперсия разности 0,0357 0,0081 0,0026 0,0141 0,0038 0,0005 0,1015

Критерий Фишера Р г г г расч 0,87 1,02 1,14 0,98 1,04 1,00 0,86

Табличное значение критерия Фишера Ртаб 3,18 3,18 3,50 3,18 3,18 3,18 3,18

Критерий Стьюдента /расч 0,04 0,02 0,00 0,06 0,05 0,0000 0,01

Табличное значение критерия Стьюдента /таб 2,10 2,10 2,13 2,10 2,10 2,10 2,10

Коэффициент вариации Е55П, % 4,47 6,10 9,48 5,15 6,18 5,24 0,13

Таблица 14. Результаты оценки промежуточной прецизионности методики кинетической нефелометрии для определения количественного содержания иммуноглобулинов классов А, М, О в испытанных образцах

Статистический параметр Значение статистического параметра результатов определения

Общее среднее арифметическое 1,28 0,56 7,93

Средневзвешенное значение дисперсии 5с2р 0,0039 0,0038 0,0994

Дисперсия разности 0,0774 0,0766 1,9887

Критерий Фишера Р г г г расч 0,75 0,26 1,46

Табличное значение критерия Фишера Ртаб 3,18

Критерий Стьюдента /расч 0,02 0,00 0,05

Табличное значение критерия Стьюдента /таб 2,10

Коэффициент вариации Е55П, % 4,72 5,24 3,90

Таблица 15. Результаты оценки промежуточной прецизионности методики иммуноферментного анализа для определения количественного содержания иммуноглобулинов классов А, М, О

Статистический параметр Значение статистического параметра результатов определения

IgA

1-я 2-я 3-я 4-я 5-я 6-я 7-я

Общее среднее арифметическое 0,97 0,35 0,11 0,57 0,24 0,10 51,24

Средневзвешенное значение дисперсии 5с2р 0,0043 0,0005 0,0003 0,0081 0,0016 0,0000 4,6603

Дисперсия разности 0,0867 0,0096 0,0044 0,1626 0,0327 0,0008 93,2058

Критерий Фишера Р г г г расч 1,62 2,91 2,07 1,13 1,17 2,29 2,54

Табличное значение критерия Фишера Ртаб 3,18 3,18 3,87 3,18 3,18 3,23 3,18

Критерий Стьюдента /расч 0,003 0,03 0,18 0,07 0,01 0,18 0,16

Табличное значение критерия Стьюдента /таб 2,10 2,10 2,16 2,10 2,10 2,11 2,10

Коэффициент вариации Е55П, % 6,58 6,12 14,79 15,52 16,60 6,99 4,38

Таким образом, аналитические методики кинетической нефелометрии, ИФА и РИД по Манчини с использованием коммерческих наборов иммунохимических реагентов пригодны для количественного определения содержания ^ классов в, А и М в лекарственных препаратах ^ человека.

Обсуждение

Коммерческие наборы иммунохимических реагентов для кинетической нефелометрии, ИФА и РИД по Манчини, разрешенные к применению в нашей стране, отличаются аналитическими и диагностическими характеристиками в зависимости от вида тестируемой жид-

Таблица 16. Результаты определения количественного содержания иммуноглобулинов классов А, М, О в ОСО 28-442 ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России с использованием методики иммуноферментного анализа

Статистический параметр Значение статистического параметра результатов определения

1§Л 1§М 1§С

Общее среднее арифметическое 1,65 0,99 8,27

Средневзвешенное значение дисперсии 5с2р 0,1026 0,0390 0,4963

Дисперсия разности 2,0523 0,7799 9,9264

Критерий Фишера Р 11 1 расч 1,11 1,31 2,50

Табличное значение критерия Фишера Ртаб 3,18

Критерий Стьюдента /расч 0,02 0,12 0,08

Табличное значение критерия Стьюдента /таб 2,10

Коэффициент вариации % 18,87 20,16 8,43

Таблица 17. Результаты определения количественного содержания иммуноглобулинов классов А, М, О в испытанных образцах с использованием методики радиальной иммунодиффузии по Манчини

Статистический параметр Значение статистического параметра результатов определения

1§Л

1-я 2-я 4-я 5-я 6-я 7-я

Общее среднее арифметическое 0,95 0,33 0,49 0,22 0,10 52,37

Средневзвешенное значение дисперсии 5с2р 0,0024 0,0005 0,0015 0,0002 0,0000 7,3408

Дисперсия разности 0,0474 0,0107 0,0308 0,0038 0,0005 146,8169

Критерий Фишера Р г г г расч 0,90 1,66 1,83 1,04 1,00 0,69

Табличное значение критерия Фишера Ртаб 3,18 3,18 3,18 3,18 3,18 3,18

Критерий Стьюдента /расч 0,02 0,07 0,12 0,05 0,0000 0,002

Табличное значение критерия Стьюдента /таб 2,10 2,10 2,10 2,10 2,10 2,10

Коэффициент вариации % 5,02 6,98 8,10 6,18 5,24 5,04

Таблица 18. Результаты определения количественного содержания иммуноглобулинов классов А, М, О в ОСО 28-442 ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России с использованием методики радиальной им-мунодиффузии по Манчини

Статистический параметр Значение статистического параметра результатов определения

1§Л 1§М 1§С

Общее среднее арифметическое 1,28 0,56 7,93

Средневзвешенное значение дисперсии 5с2р 0,0039 0,0038 0,0994

Дисперсия разности 0,0774 0,0766 1,9887

Критерий Фишера Р г г г расч 0,75 0,26 1,46

Табличное значение критерия Фишера Ртаб 3,18

Критерий Стьюдента /расч 0,02 0,00 0,05

Табличное значение критерия Стьюдента /таб 2,10

Коэффициент вариации % 4,72 5,24 3,90

кости, составом калибраторов (калибровочных проб) и контрольных сывороток и референс-материала(ов), по отношению к которому они аттестованы (калиброваны).

Несмотря на отсутствие в инструкциях по применению изученных наборов иммунохимических реагентов информации о возможности применения в качестве испытуемых образцов лекарственных препаратов, теоретически их можно использовать и для оценки содержания классов ^ в лекарственных препаратах ^ человека.

Для решения этой задачи исследователь (аналитик) должен выбрать метод оценки, исходя из предполагаемого содержания определяемого класса ^ в препарате, данных о производителе и наименования набора имму-нохимических реагентов требуемого аналитического диапазона, вида тестируемой биологической жидкости (сыворотка крови и/или спинномозговая жидкость), наименования соответствующего стандартного образца состава и/или свойств, разведения испытуемых и стандартного образцов, порядка расчета (вычисления) содержания класса ^ в лекарственном препарате.

В соответствии с инструкциями по применению препаратов ^ человека для внутривенного введения, разрешенных к применению в нашей стране, предполагаемое содержание примеси ^А составляет от 0 до 2,5 мг/мл2.

В составе основного действующего вещества препаратов ^ человека нормальных [^в + ^А + IgM], растворов для инфузий содержание классов ^ должно быть следующим: - 38 мг/мл, ^А - 6 мг/мл, IgM - 6 мг/мл, лиофи-лизатов для приготовления раствора для приема внутрь: ДО - 30-42 г/л, ^А - 4-8,0 г/л, ^ - 4,5-8,0 г/л. Соответственно, для оценки содержания примеси ^А в препаратах ^ человека для внутривенного введения целесообразно использовать наборы реагентов для определения содержания ^А методом кинетической нефелометрии в спинномозговой жидкости с низким аналитическим диапазоном, например, от 0,00025 до 0,42 мг/мл - (для ^А). Для испытаний препаратов обогащенных ^в, IgM и ^А, можно применять реагенты с более высокой аналитической чувствительностью, предназначенные для сыворотки крови, например, 0,333-216,0 мг/мл (для ^в), 0,067-0,0252 (^А) мг/мл, 0,042-144,0 мг/мл (IgM).

Воспроизведение методики кинетической нефелометрии не требует предварительного разведения испытуемых образцов, так как определение проводится с помощью автоматизированных аналитических систем, имеющих калибровочную систему и статистические программы расчета содержания концентрации ^ соответствующего класса.

Чувствительность ИФА наборов реагентов также позволяет использовать их для оценки содержания примеси ^А, а также для изучения состава основного действующего вещества препаратов ^ человека нормальных + ^А + ^М], но для каждого наименования набора необходимо экспериментальным путем подбирать разведения испытуемых образцов, обосновывать

методику разведения испытуемого препарата с учетом данных по валидации и выбранного диапазона значений калибровочной кривой.

Экспериментально подтверждено, что методика РИД по Манчини пригодна для оценки содержания классов ^ в составе основного действующего вещества препаратов ^ человека нормальных [^в + IgM + ^А] Использование современного программного обеспечения для измерения диаметра колец преципитации вместо визуальной оценки с помощью линейки позволяет исключить субъективность получаемых результатов.

Получение достоверных результатов, не зависящих от выбранных методик и наборов иммунохимических реагентов, возможно только, если при испытании препарата используют стандартные образцы свойств и/или состава основного действующего вещества. Например, использование «ОСО 28-442 ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России количественного содержания ^ классов в, А, М», который является стандартным образцом состава и свойств основного действующего вещества.

Критерием приемлемости результатов испытаний служит соответствие содержания ^ классов в, А, М аттестованным величинам ОСО. Содержание классов ^ в лекарственном препарате вычисляют, сравнивая со стандартным образцом, аттестованным по содержанию ^ классов в, А и М в мг/мл, используя значения концентраций, полученные методом кинетической нефелометрии, а также калибраторы (калибровочные пробы) и/или контрольные сыворотки и референс-материал(ы), входящие в состав набора, только для оценки правильности его работы. При сомнениях или разногласиях окончательное заключение о содержании класса ^ принимают на основании результатов, полученных при испытаниях методом кинетической нефелометрии. Следовательно, аналитические методики кинетической нефелометрии, иммуно-ферментного анализа и РИД по Манчини пригодны (могут быть применены) для количественного определения состава основного действующего вещества препаратов ^ человека нормальных [^в + ^А + IgM], а также для оценки количественного содержания примеси ^А в лекарственных препаратов ^ человека (за исключением препаратов ^ человека нормальных [^в + ^А + ^М]).

Заключение

Таким образом, аналитические методики кинетической нефелометрии, ИФА и РИД по Манчини отвечают критериям правильности, повторяемости (сходимости), внутрилабораторной (промежуточной прецизионности) при оценке количественного содержания классов ^ в испытуемых пробах с известным содержанием соответствующих классов ^ человека.

Методики кинетической нефелометрии, ИФА и РИД по Манчини с использованием коммерческих иммуно-химических наборов реагентов целесообразно приме-

2 Государственный реестр лекарственных средств Министерства здравоохранения Российской Федерации. Доступно по ссылке: Нир:/^гЬ. гояттЕёгт. ги^гк.аярх.

нять для оценки содержания примеси IgA в препаратах Ig человека всех форм введения и/или изучения состава основного действующего вещества препаратов Ig человека нормальных [IgG + IgM + IgA] после валидацион-ных исследований. Получение достоверных результатов, не зависящих от производителя и наименования набора иммунохимических реагентов, выбранной методики, возможно в случае, если одновременно в испытании используют стандартный образец свойств и/или состава основного действующего вещества, аттестованный по отношению к международному стандартному образцу.

Литература

1. ОФС.1.8.1.0001.15 Лекарственные препараты из плазмы крови человека. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. II. М., 2018.

2. Супотницкий М.В., Елапов А.А., Борисевич И.В., Кудашева Э.Ю. и др. Препараты крови человека и животных в аспекте показателей качества, эффективности и безопасности. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2015; (3): 33-48. URL: https:// doi.org/10.30895/2221-996X-2015--3-33-48.

3. ФС.3.3.2.0008.15 Иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного введения. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. IV. М., 2018.

4. ФС.3.3.2.0007.15 Иммуноглобулин человека нормальный. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. IV. М., 2018.

References

1. General Monograph 1.8.1.0001.15 Pharmaceuticals from human plasma. The State Pharmacopoeia of Russian Federation. 14th ed. Vol. 2. Moscow, 2018.

2. Supotnitskiy M.V., Elapov A.A., Borisevich I.V., Kudasheva E.Yu., at al. Blood preparations of humans and animals in terms of their quality, efficacy and safety. BIOpreparaty. Profilaktika, diagnostika, lechenie. 2015; (3): 33-48. (in Russian). URL: https:// doi.org/10.30895/2221-996X-2015--3-33-48.

3. Monograph 3.3.2.0008.15 Human immunoglobulin normal for intravenous administration. The State Pharmacopoeia of Russian Federation. 14th ed. Vol. 4. Moscow, 2018.

4. Monograph 3.3.2.0007.15 Human immunoglobulin is normal. The State Pharmacopoeia of Russian Federation. 14th ed. Vol. 4. Moscow, 2018.

Теоретические и экспериментальные исследования явились основой для разработки общей фармакопейной статьи «Количественное определение содержания классов иммуноглобулинов в, А и М в препаратах иммуноглобулинов человека», включенной в Государственную фармакопею Российской Федерации XIV издания (ГФ РФ XIV) [9]. В соответствии с требованиями фармакопейной статьи ГФ РФ XIV «Иммуноглобулин человека для внутривенного введения» оценка содержания ^А стала обязательной для анализа качества указанной группы препаратов [2].

5. Human normal immunoglobulin for intramuscular administration 01/2015:0338. European Pharmacopoeia 9.0 [Электронный ресурс]. URL: http://online6.edqm.eu/ep900/#

7. Human normal immunoglobulin for subcutaneous administration 01/2015:2788. European Pharmacopoeia 9.0 [Электронный ресурс]. URL: http://online6.edqm.eu/ep900/#

8. Гланц С. Биомедицинская статистика. М. : Практика, 1999.

9. 0ФС.1.8.2.0012.18 Количественное определение содержания иммуноглобулинов классов А, М и G в препаратах иммуноглобулинов человека. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. II. М., 2018.

5. Human normal immunoglobulin for intramuscular administration 01/2015:0338. [Electronic Resource]. URL: http://online6.edqm.eu/ ep900/#

6. Human normal immunoglobulin for intravenous administration 01/2012:0918. European Pharmacopoeia 9.0 [Electronic Resource]. URL: http://online6.edqm.eu/ep900/#

7. Human normal immunoglobulin for subcutaneous administration 01/2015:2788. European Pharmacopoeia 9.0 [Electronic Resource]. URL: http://online6.edqm.eu/ep900/#

8. Glants S. Biomedical statistics. Moscow: Praktika, 1999.

9. General Monograph 1.8.2.0012.18 Quantitative determination of the content of immunoglobulins of classes A, M and G in preparations of human immunoglobulins. The State Pharmacopoeia of Russian Federation. 14th ed. Vol. 2. Moscow, 2018.