Моделирование реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белковом комплексе RasGAP

УДК 539.196

МОДЕЛИРОВАНИЕ РЕАКЦИИ ГИДРОЛИЗА ГУАНОЗИНТРИФОСФАТА В БЕЛКОВОМ КОМПЛЕКСЕ RasGAP

М.Г. Хренова, Е.Д. Коц, А. М. Кулакова, И.В. Поляков

Сопоставлены результаты расчетов структур и энергий интермедиатов для реакции гидролиза гуанозинтрифосфата белковым комплексом Ras-GAP, полученные с помощью комбинации методов квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ) и фрагментных молекулярных орбиталей. Были подтверждены полученные ранее результаты, показывающие, что гидролиз связи P-O приводит к образованию фосфата H2PO4- и имидной формы функциональной группы боковой цепи каталитического остатка Gln61.

Ключевые слова: GTP, Ras, GAP, ферментативный гидролиз.

Реакция гидролиза гуанозинтрифосфата (GTP) с образованием гуанозиндифосфата (GDP) и неорганического фосфата H2PO4- (Pi) белком Ras происходит крайне медленно с константой скорости 2,110-4 с-1, однако при образовании комплекса с белком-ускорителем GAP скорость реакции увеличивается на пять порядков. Последний процесс является важным для функционирования клеток, и его нарушение приводит к развитию онкологических заболеваний [1, 2].

Реакция гидролиза GTP белковым комплексом RasGAP состоит из четырех стадий: связывание белка GAP с комплексом RasGTP, гидролиз GTP в активном центре RasGAP, выход неорганического фосфата в раствор и диссоциация комплекса RasGAP. Для определения скорости химической стадии GAPRasGTP ^ GAPRasGDPPi, проходящей в активном центре фермента, используется метод остановленной струи с последующим определением соотношения GTP и GDP в условиях избытка фермента по сравнению с субстратом [3-5], что приводит к зна-

чению константы скорости к2, равной 19 с-1. Расчетные работы в этом направлении ведутся более 20 лет и сходятся в том, что гидролиз гуанозинтрифосфата проходит в результате ну-клеофильной атаки каталитической молекулы воды с последующим переносом протона с этой молекулы на у-фосфатную группу через 01п61 с образованием его таутомерной имидной формы (рис. 1). Однако количественные оценки для рассматриваемой схемы существенно различаются. В работе [б] впервые предложен механизм реакции гидролиза: проведены расчеты методом КМ/ММ с описанием квантовой подсистемы, состоящей из 43 атомов, методом Хартри-Фока с базисом 6-310; взаимодействие подсистем КМ и ММ описывалось в рамках метода потенциалов эффективных фрагментов. В рамках такой модели барьер на первой и второй стадиях составлял соответственно 8,6 и 14,2 ккал/моль, при этом положение Р' оказывалось на 6,6 ккал/моль ниже фермент-субстратного комплекса. Проведенный в более поздних работах расчет профилей

Рис. 1. Схема реакции гидролиза молекулы вТР белковым комплексом РазвАР

поверхности свободной энергии [7, 8] показал, что на первой стадии барьер составляет порядка 10-15 ккал/моль, а вторая стадия проходит практически безбарьерно, при этом Р' находится значительно выше реагентов. Выполненные ранее работы не лишены недостатков, и остается непонятным, связан ли такой разброс результатов с разными методами описания системы или переходом от потенциальной энергии к свободной. Важно отметить, что в результате второй стадии реакции образуется таутомерная имидная форма глютамина, и возникает необходимость дальнейших превращений для восстановления амидной формы. Такие превращения возможны путем поворотов ОН-групп вокруг одинарных Р-О-связей неорганического фосфата и переноса протонов; энергетические барьеры таких процессов, как правило, не превышают 10-12 ккал/моль. Сами по себе все барьеры элементарных стадий в соответствии с теорией активированного комплекса соответствуют гораздо большей скорости, чем экспериментальное значение 19 с 1, что указывает на важность оценки их относительного положения.

Для этой оценки в данной работе выбраны два разных подхода: 1) комбинация методов квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ) и метода фрагментных молекулярных орбиталей (БМО), 2) расчет относительной энергии минимумов на поверхности потенциальной энергии.

Для расчетов в качестве начальной структуры использовали кристалл белкового комплекса Яа8-ОЛР, содержащий аналог интермедиата, который был заменен на молекулу ОТР. В кристаллическую структуру были добавлены атомы водорода, и система была сольватирована молекулами воды. Далее для расчетов система была уменьшена до 5000 атомов (рис. 2). При

расчете методом КМ/ММ квантовая подсистема описывалась методом теории функционала электронной плотности с функционалом PBE0 [9] с дисперсионной поправкой D3 и базисом cc-pvdz, ММ-подсистема описывалась с помощью силового поля AMBER [10], взаимодействие КМ- и ММ-подсистем описывалось в рамках электронного внедрения; расчеты проводились в программе NWChem [11]. Расчеты методом FMO[12] проводились в программном пакете GAMESS US[13].

Расчеты методом КМ/ММ проводили с двумя разными разбиениями на КМ- и ММ-подстистемы. На рис. 2 показана меньшая КМ-часть (КМ1), состоящая из 89 атомов. В нее входят метилтрифос-фат от молекулы GTP, каталитическая молекула воды, заряженные остатки (аргинин и лизин), катион магния и его координационная сфера. По результатам расчетов с таким протоколом было получено, что барьер на первой стадии составляет 6 ккал/моль, а на второй - 1,9 ккал/моль, при этом минимумы, соответствующие Int и P' находятся выше ES (таблица). Дальнейшее расширение КМ-части (КМ2) с добавлением в нее всех основных цепей белка, образующих водородные связи с ß- и у-фосфатными группами, не приводит к заметным изменениям.

Принципиально другим является подход фрагментных молекулярных орбиталей, в рамках которого вся система описывается кванто-во-механическими методами, при этом она разбивается на фрагменты, в каждом из которых проводится процедура самосогласования, ко -торая потом корректируется с учетом взаимодействия фрагментов. Для выбора разбиения проводилась серия расчетов с молекулярным кластером, состоящим из 272 атомов и включавшим молекулу GTP и окружающие ее аминокис-

Рис. 2. Модельная система белкового комплекса КаБОАР с молекулой ОТР, сольвати-рованная водой

Относительная энергия стационарных точек, полученных методами КМ/ММ и FMO

Структура КМ/ММ (КМ1) КМ/ММ (КМ2) FMO2 2 слоя* FMO2* FMO2 2 слоя** FMO2**

ES 0 0 0 0 0 0

Int 4,9 4,6 2,4 4,8 2,3 2,0

P' 4,2 3,8 0,8 2,4 -1,3 1,0

лотные остатки, молекулы воды и катион магния. В ходе расчетов расширялся реакционный фрагмент, в котором происходит химическая реакция, до тех пор, пока разности энергий, полученных методом FMO и PBE0/6-31G** не стали меньше 0,1 ккал/моль. Результирующий размер фрагмента составил 174 атома и включал в себя метилтрифосфат, боковые цепи Lys 16, Gln61, Thr35, Ser17, Arg789, катион магния, две молекулы воды из его координационной сферы и каталитическую молекулу воды.

Далее применяли два разных подхода: 1) расчет энергий во всех фрагментах проводили методом PBE0/6-31G**; 2) систему разбивали на два слоя, реакционный фрагмент и ближайшие к нему фрагменты описывались методом PBE0/6-31G**, а все остальные фрагменты - методом HF/3-21G. Второй подход примерно в 10 раз менее затратный, чем первый и, как видно из таблицы, дает сопоставимые результаты с более затратным подходом. Проводили также оптимизацию методом FMO, при этом все фрагменты, кроме реакционного, были заморожены, что могло внести ошибку в расчет. Для полученных

%

100

80

60

40

20

GDP Pi

/

/ ° \

/ ° О GTP n-----п г

0,2

0,4

0,6

Время, с

Рис. 3. Кинетическая кривая расходования GTP и накопления GDP с неорганическим фосфатом

равновесных геометрических конфигураций проводили расчет энергии двумя описанными выше подходами (таблица). Суммируя результаты, можно отметить, что для всех выбранных протоколов расчетов Int по энергии находится выше, чем ES; P' стабилизирован по сравнению с Int, и для всех, кроме одной, схем расчета выше, чем ES. Результаты данной работы показывают необходимость учета динамической электронной корреляции и выбора базисного набора, включающего в себя поляризационные функции. Это связано с тем, что система сильно поляризована, так как содержит большое количество положительно заряженных групп (Arg789, Lys16 и Mg2+) и отрицательно заряженную группу (GTP4-). Результаты работ [7, 8] находятся в качественном согласии с данной работой. Большие величины барьеров и относительных энергий Int и P' могут быть обусловлены сканированием поверхности свободной энергии. Это связано с тем, что процедура поиска профиля на поверхности потенциальной энергии приводит к наименее энергетически затратному пути, в то время как профиль свободной энергии является суперпозицией всех возможных (в том числе и менее выгодных) путей реакции.

При объединении полученных результатов расчета стадии разрыва связи P-O с оценочными значениями для стадии регенерации глюта-мина оказалось, что первые две стадии имеют гораздо меньшие барьеры, поэтому между ES, Int и P' устанавливается квазиравновесие, а суммарная скорость образования продукта определяется как произведение константы равновесия между P' и ES и константы скорости следующей за ней стадии. Полученные кинетические кривые приведены на рис. 3 и соответствуют эффективной константе скорости, равной ~15 с-1, что согласуется с экспериментальными данными. Работа выполнена с использованием ресурсов суперкомпьютерного комплекса МГУ имени М.В. Ломоносова [14].

Работа выполнена в рамках проекта РФФИ № 15-33-20579 мол_а_вед.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. CoxA.D., Der C.J. // Small GTPases. 2010. Vol. 1. P. 2.

2. Malumbres M., Barbacid M. // Nat. Rev. Cancer. 2003. Vol. 3. P. 459.

3. Gideon P., John J., Frech M., et al. // Mol. Cell Biol. 1992. Vol. 12. P. 2050.

4. Schweins T., Geyer M., Scheffzek K., et al. // Nat. Struct. Biol. 1995. Vol. 2. P. 36.

5. Phillips R.A., Hunter J.L., Eccleston J.F., et al. // Biochemistry. 2003. Vol. 42. P. 3956.

6. Grigorenko, B.L.; Nemukhin, A.V.; Topol, I.A., et al. // Proteins: Struct. Funct. Bioinf. 2005. Vol. 60. P. 495.

7. Prasad B.R., Plotnikov N.V., Lameira J., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. Vol. 110. P. 20509.

8. Mironov V. A., KhrenovaM. G., Lychko L. A., et al. // Proteins. 2015. Vol. 83. P. 1046.

9. Adamo C., Barone V. // J. Chem. Phys. 1999. Vol. 110. P. 6158.

10. Cornell W.D., Cieplak P., Bayly C.I., et al. // J. Am. Chem. Soc. 1995. Vol. 117. P. 5179.

11. Valiev M., Bylaska E.J., Govind N., et al. // Comput. Phys. Commun. 2010. Vol. 181. P. 1477.

12. Kitaura K., Ikeo E., Asada T. // Chem. Phys. Lett. 1999. Vol. 313. P. 701.

13. Schmidt M. W., Baldridge K. K., Boatz J. A., et al. // J. Comput. Chem. 1993. Vol. 14. P. 1347.

14. Воеводин В., Жуматий С., Соболев С. и др. // Открытые системы. 2012. Т. 7. 2012. С. 36.

Поступила в редакцию 01.08.15

MODELING GTP HYDROLYSIS IN PROTEIN COMPLEX RasGAP M.G. Khrenova, E.D. Kots, A.M. Kulakova, I.V. Polyakov

Fragmented molecular orbitals and combined quantum mechanics / molecular mechanic methods are applied to calculate geometry configurations and relative energies of the intermediates of GTP hydrolysis in protein complex RasGAP. It was proved that hydrolysis of the GTP P-O bond results in the formation of inorganic phosphate H2PO4- and tautomerization of the side chain of Gln61 to the imide form.

Key words: GTP , Ras, GAP, enzymatic hydrolysis.

Сведения об авторах: Хренова Мария Григорьевна - вед. науч. сотр. лаборатории химической кибернетики кафедры физической химии химического факультета МГУ, канд. физ.-матем. наук (wasabiko13@gmail.com); Коц Екатерина Дмитриевна - мл. науч. сотр. лаборатории химической кибернетики кафедры физической химии химического факультета МГУ (kots.katya@gmail.com); Кулакова Анна Михайловна - студентка химического факультета МГУ (kulakovaam@gmail.com); Поляков Игорь Вадимович - науч. сотр. лаборатории химической кибернетики кафедры физической химии химического факультета МГУ, канд. физ.-матем. наук (polyakoviv@gmail.com).