Программа маркерной селекции по пирамидированию генов расоспецифической устойчивости к пирикуляриозу в отечественные сорта риса

№ 12 (79), 2010 г.

Аграрный вестник Урала

21

Агрономия

семян и растений биологически активными веществами. Так, в среднем за годы наблюдений урожайность на контроле у гибрида Ригасол колебалась от 2,09 до 2,29 т/га, на варианте с Флор-Гуматом - от 2,45 до 2,69, с Мастер С -от 2,32 до 2,50 т/га и с бишофитом - от 2,19 до 2,45 т/га. То есть разница в пользу вариантов с регуляторами роста по оптимальному варианту составила, соответственно, 0,40, 0,31 и 0,16 т/га. Аналогичные показатели были получены и по гибридам Опера и PR63A90.

Изучаемые в опытах факторы оказывали влияние не только на величину урожая, но и на его качество. По содержанию масла в семенах во все годы исследования наибольшие показатели имел гибрид Опера.

В среднем за три года у этого гибрида содержание масла колебалось по вариантам от 51,33 до 51,84 %, у гибридов Ригасол и PR63A90 - от 50,10 до 51,00 и от 50,77 до 51,40 % соответственно. Структуры урожая заметно превосходили контроль, но несколько

уступали варианту с ФлорГуматом.

Выводы.

На основании проведенных исследований можно заключить, что в подзоне южных черноземов Волгоградской области наиболее продуктивным, в среднем за три года, оказался гибрид Ригасол, при норме высева 60 тыс/га и обработке семян и растений препаратом ФлорГумат. Наиболее высокой масличностью семян во все годы обладал гибрид Опера.

Литература

1. Шевцова Л. П., Жильцов А. Н. Влияние ростостимулирующих и бактериальных защитных препаратов на продуктивность подсолнечника // Вестник Саратовского госагроуниверситета. 2006. № 5. Вып. 2. С. 39-43.

2. Жильцов А. Н.Опыт адаптивной технологии выращивания подсолнечника на черноземах Саратовского Правобережья / Адаптивный потенциал полевых культур Поволжья : сборник научных статей. Саратов, 2005. С. 98-101.

3. Веретин К. П. Влияние густоты стояния растений и сроков сева на линейный рост подсолнечника / Материалы регион. науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов : сб. материалов. Оренбург, 2005. С. 114-115.

4. Орешкин А. Ю. Влияние агротехнических мероприятий на урожайность подсолнечника // Вестник АПК.-Волгоград. 2003. № 12. С. 26-27.

ПРОГРАММА МАРКЕРНОЙ СЕЛЕКЦИИ ПО ПИРАМИДИРОВАНИЮ ГЕНОВ РАСОСПЕЦИФИЧЕСКОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К ПИРИКУЛЯРИОЗУ В ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ СОРТА РИСА

Ю. А. МЯГКИХ,

аспирант, Всероссийский научно-исследовательский институт риса

350920, г. Краснодар, п. Белозерный; тел. 8 (861) 2294447

Ключевые слова: рис, пирикуляриоз риса, маркерная селекция, молекулярные маркеры, целевые гены.

Создание устойчивых к неблагоприятным факторам внешней среды сортов риса является одной из главных задач современной селекции данной культуры. Несовершенный гриб Magnaporthe grisea (Hebert) Barr (Pyricularia oryzae Cavara (L.)) является возбудителем одного из наиболее вредоносных заболеваний риса (Oryza sativa (L.)) - пирикуляриоза. Потери урожайности от него достигают в Краснодарском крае в среднем 25-30 % [2].

Разработка сортов, несущих совокупность генов устойчивости к пири-куляриозу, является наиболее перспективным решением в борьбе с заболеванием. Однако оценка селекционного материала по фенотипу классическими фитопатологическими методами затруднительна ввиду перекрывающихся фенотипических эффектов разных генов устойчивости.

Развитие современных ДНК технологий привело к появлению маркерной селекции (marker assisted selection (MAS)), которая в настоящее время успешно применяется в селекционных программах. Использование молекулярных маркеров, тесно сцепленных с генами, обеспечивающими устойчи-

вость растений к патогену, значительно облегчает селекционную работу [5].

Существуют гены и локусы, детерминирующие устойчивость широкого спектра и являющиеся важным генетическим ресурсом для селекции. К таковым генам широкого спектра устойчивости относят Рi 1, Рi 2, Рi 33 [3]. Исследования показывают, что наибольший эффект перечисленные гены проявляют при совместном действии [4].

Цель и методика исследований.

Целью исследований является создание исходного материала риса с пи-рамидированными генами расоспецифической устойчивости Pi 1, Pi 2, Pi 33 с помощью методов молекулярного маркирования. Для этого проводится серия беккроссов отечественного сорта риса Виктория и донорных линий С101 А 51 и С101 Lac. Контроль донор-ных аллелей целевых генов проводится тесно сцепленными ДНК маркерами.

В качестве доноров генов устойчивости риса к пирикуляриозу Pi 1, Pi 2, Pi 33 использованы линии риса С101 А 51 и С101 Lac, несущие гены Pi 2, Pi 1 +Pi 33 соответственно. В качестве

реципиентной родительской формы был выбран новый сорт отечественной селекции Виктория. Растения родительских форм высаживались в вазоны, с учетом разницы в периоде вегетации. Гибридизацию растений проводили с помощью пневмокастрации и "твел" метода [1].

Ниже представлена схема проводимых исследований (Рис. 1).

Экстракцию ДНК из растений на стадии 2-3 листьев осуществляли СТАВ методом [6].

Донорные аллели визуализировали тесно сцепленными микросателлит-ными маркерами: для гена Pi 2 использованы SSR 140, для Pi 1 - Rm 224, для гена Pi 33 - Rm 72, Rm 310 (сиквенс прай-мерных пар доступен на сайте gramene.com). Тесное сцепление указанных маркеров с целевыми генами продемонстрировано ранее на использованных в данном исследовании до-норных линиях риса.

Rice, rice blast disease, marker-assisted selection, molecular markers, major genes.

22

Ген Маркер Кол-во исследованных растений Кол-во растений, несущих доминантную аллель гена

Pi1 Rm 224 98 19

Pi33 Rm 72 98 25

P i 2 Ssr 140 75 23

Аграрный вестник Урала

№ 12 (79), 2010 г.

Агрономия

PiPi

До норные линии риса X Р і pi

ВС1 Гибриды первого

поколения F1

pipi

Сорт В икто р и я

pi pi

Сорт Ви кто р ия

BC2 BC2 F1

ПЦР анализ

I

Pi pi pi pi

Сегрегирующая популяция PiPi Pi pi pipi

s \

Отбор растений в услов иях поля

ПЦР анализ и д а ль н е й ш е е беккроссирование

Рисунок 1

Схема проводимых исследований

б б 7 В

Рисунок 2

Аллельное разнообразие в локусе Rm 72 у растений из сегрегирующей

популяции ВС2F1

1

2

З

4

Для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали следующий состав реакционной смеси:

2.5 |jl 10XExTaq Polymerase буфер, 0,5 |jl

2.5 мМ dNTPs, 0,2 jl, Taq-ДНК полимеразы (5u/jl), 2jl каждого праймера, 4050 ng ДНК в общем реакционном объеме 25 jl.

ДНК амплификацию осуществляли в ДНК-амплификаторе "Терцик" (НПО "ДНК-Технология", Россия) при следующих условиях: начальная денатурация ДНК при 94°С - 5 минут; следующие 35 циклов - 30 секунд - денатурация при 94°С, 30 секунд - отжиг праймеров при 56°С, 35 секунд - элонгация при 72°С; последний цикл синтеза - 3 минуты при 72°С.

Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 8 % полиакриламидном геле на основе 1ХТрис боратного буфера (0,09 М Трис, 0,09 М Борной кислоты, 2 мМ ЭДТА, рН = 8,2), с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете после окраски раствором бромистого этидия (5 мкг/мл).

Результаты исследований.

Полученные гибриды первого поколения задействовали в возвратных скрещиваниях с сортом Виктория. Среди популяции BC1F отбирались растения, несущие целевые гены в гетерозиготном состоянии, и вовлекались в дальнейшие беккроссы.

Примечание: 8 - Виктория - сорт-реципиент; 7 - Pi 33 - линия C101-Lac -донор гена Pi 33; 1-6 - анализируемые BC1F растения.

Так, на рисунке 2 представлены результаты ДНК-анализа растений из поколения ВС2 F1 комбинации C101 Lac X Виктория. Образцы 5 и 6 являются гетерозиготными по локусу Rm72, сцепленному с геном Pi 33. Из популяции растений ВС2 F1 одна часть потомства была оставлена для фитопатологической оценки на устойчивость к пирику-лярозу, другая - для проведения дальнейшего беккроссирования.

Выводы.

Рекомендации. Работа по данному исследованию продолжается. Планируется получить сортообразец риса, близкий по морфотипу к реципиентно-му родителю и несущий доминантные аллели трех целевых генов в гомозиготном состоянии. Молекулярное мар-

кирование, используемое в данной работе, позволяет в значительной степени повысить эффективность процес-

Таблица 1

Результаты проверки гибридов ВС2F1

са создания исходного материала для дальнейшей селекционной работы.

Литература

1. Лось Г. Д. Методика гибридизации риса // Рисоводство. 2007. № 10. С. 42-51.

2. Система рисоводства Краснодарского края: рекомендации / Под общ. ред. Е. М. Харитонова. Краснодар : ВНИИ риса, 2005. 340 с.

3.Deng Y, Zhu X.,Shen Y., He Z. Genetic characterization and fine mapping of the blast resistance locus Pigm(t) tightly linked to

Pi2 and Pi9 in a broad-spectrum resistant Chinese variety // Theor. Appl. Genet. 2006. V. 113. P. 705-713.

4. Hittalmani S., Parco A., Mew T. V. Fine mapping and DNA marker-assisted pyramiding of three major genes for blast resistance

in rice // Theor. Appl. Genet.- 2000. Vol. 100. P. 1121-1128.

5. Jena Kshirod K., Moon Huhn-Pal, David J. Mackill. Marker Assisted Selection - A New Paradigm in Plant Breeding // Korean J. Breed. 2003. Vol. 35. P. 133-140.

6. Murray M. G., Thompson W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA // Nucleic Acids Research. 1980. V. 10. P. 43214325.