КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ АЛЬФА-ЛИПОЕВУЮ КИСЛОТУ И ГОНОКИОЛ, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОПАТИЙ
COMPOSITION CONTAINING ALPHA-LIPOIC ACID AND HONOKIOL, FOR TREATMENT OF NEUROPATHIES

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композиции для лечения нейропатий, и, в частности, к композиции для лечения болезненных сенсорных синдромов периферической нейропатии.
Уровень техники
Известны многочисленные композиции, используемые для введения лицам, страдающим от нейропатий.
В частности, известно, что композиции, содержащие альфа-липоевую кислоту, оказывают благотворное воздействие при лечении нейропатий, особенно приобретенных периферических нейропатий. В действительности, альфа-липоевая кислота улучшает антиоксидантный барьер и уменьшает окислительный стресс, увеличивая уровни глутатиона, повышает скорость проводимости нервов, тем самым оптимизируя их функциональность, и, наконец, оказывает нормализующее действие на нервную чувствительность, таким образом, снижая как боль, так и сенсорную мутность.
Последние in vivo исследования подтвердили нейропротекторные и кардиопротективные эффекты альфа-липоевой кислоты.
Известны композиции с быстрым либо обычным высвобождением, содержащие альфа-липоевую кислоты для одного ежедневного приема 300 мг или 600 мг альфа-липоевой кислоты в рационе питания.
Опубликованные исследования "Oral Treatment With α-Lipoic Acid Improves Symptomatic Diabetic Polyneuropathy - The SYDNEY 2 trial" Dan Ziegler et. al., Diabetes Care 20 November 2006 vol. 29 no. 11, p. 2365-2370 и "Thioctic Acid and Acetyl-L-Carnitine in the Treatment of Sciatic Pain Caused by a Herniated Disc" Memeo Antonio and Mario Loiero, Clin. Drug Investigation 2008, Vol. 28, p. 495-500, сообщают, что суточная доза 600 мг альфа-липоевой кислоты обеспечивает наилучшее соотношение риск/польза для лечения симптомов диабетической полинейропатии и боли седалищного нерва. В соответствии с первым исследованием, по сравнению с суточной дозой 600 мг, более высокие дозы 1200 мг и 1800 мг не обеспечивают лучшую реакцию с точки зрения улучшения симптомов диабетической полинейропатии. Исследование также показывает зависимое от дозы увеличение побочных эффектов, связанных с альфа-липоевой кислотой, таких как тошнота, рвота и головокружение.
Известно также, что кора магнолии, фитопроизводное, полученное из Magnolia Officinalis, принадлежащего к семейству Magnoliacee, содержит два фенольных соединения, гонокиол и магнолол. Ряд фармакологических свойств, такие как антитревожность, противовоспалительные, противомикробные, антиоксидантные, антитромбоцитарные и нейротрофические свойства, приписывают коре магнолии.
Y. Fukuyama, Nakade K., Minoshima Y., Yokoyama, A., H. Zhai, Y. Mitsumoto "Neurotrophic activity of honokiol on the cultures of fetal rat cortical neurons," Bioorg. Med Chem. Lett 2002 Apr. 22; 12 (8): 1163-6 описывает нейротрофические действия гонокиола в концентрациях от 0,1 до 10 μМ на культивированные кортикальные нейроны крыс. В кортикальных нейронах гонокиол способен стимулировать нейритный рост. Кроме того, гонокиол оказался способен увеличить выживаемость и развитие нейронов первичных культур.
Что касается нейротрофической активности гонокиола, Lee YJ. et al. "Therapeutic applications of compounds in the magnolia family," Pharmacol. Ther. 2011, 130 (2): 157-76 описывает эффективные дозы для крыс в диапазоне от 0,01 г/кг и 0,25 г/кг. Какого-либо известного исследования, которое показывает эффективную дозу для человека, там нет.
US 2006251608 описывает составы для лечения стареющей кожи, содержащие антиоксиданты, сопромоторы антиокисления, противовоспалительные средства, витамины, минералы и промоторы синтеза коллагена. Не упоминается какая-либо эффективность таких композиций для лечения нейропатий. Альфа-липоевая кислота и гонокиол оба упоминались в качестве возможных антиоксидантов в таких препаратах, но сочетание таких соединений специально не описано.
Известны пищевые добавки для спортсменов, полезные для улучшения мышечной массы, силы и физической силы, которые включают, среди многих других компонентов, также альфа-липоевую кислоту и кору магнолии, содержащую 2% гонокиола. Эффект указанных добавок для лечения нейропатий не сообщается, а количество гонокиола в таких добавках сильно снижено. В частности, соотношение гонокиола и альфа-липоевой кислоты в таких известных добавках оказывается меньше чем 0,3%.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является таким образом создание композиции, содержащей альфа-липоевую кислоту и имеющей улучшенную активность в лечении симптомов и нейропатической боли. Указанная задача достигается с помощью композиции, основные признаки которой приведены в первом пункте формулы изобретения, и фармацевтическая или диетическая композиция, признаки которых указаны в пункте 9. Другие признаки композиции и состава в соответствии с настоящим изобретением указаны в остальных пунктах формулы.
Композиция согласно настоящему изобретению включает в себя альфа-липоевую кислоту, или ее соль, или комплекс и гонокиол и характеризуется тем, что количество по массе гонокиола составляет от 1% до 30% по отношению к общей массе двух компонентов гонокиола и альфа-липоевой кислоты.
Альфа-липоевая кислота, содержащаяся в композиции в соответствии с настоящим изобретением, может быть в рацемической форме, т.е. кислота может быть смесью из двух энантиомерных форм R и S, и/или ее солями, или комплексами, или композиция в соответствии с настоящим изобретение может содержать только биологически активную R энантиомерную форму, или ее соль, или комплекс.
В действительности, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что эффективность альфа-липоевой кислоты в лечении нейропатий и болевых синдромов, связанных с ними, усиливается, когда указанная альфа-липоевая кислота связана с гонокиолом в определенных пропорциях, из-за синергетического эффекта.
В частности, исследования, проведенные авторами изобретения, показали, что в первичных культурах нейронов, введение композиций альфа-липоевой кислоты и гонокиола согласно изобретению является эффективным в промотировании расширения аксонов и выживаемости клеток, тогда как аналогичное введение композиций, содержащих альфа-липоевую кислоту и гонокиол в количестве от 0 до менее чем 1%, не является существенно эффективным в промотировании расширения аксонов.
Предпочтительно, количество по массе гонокиола в композиции по настоящему изобретению находится в диапазоне от 2% до 15%, более предпочтительно от 3% до 10% по отношению к общей массе гонокиола и альфа-липоевой кислоты.
Действительно, было обнаружено, что перечисленные выше диапазоны являются оптимальными соотношениями между концентрациями альфа-липоевой кислоты и гонокиола, и в этих соотношениях два активных вещества имеют четкий синергетический эффект, о чем свидетельствует сравнение значительной активности на фоне активности альфа-липоевой кислоты и гонокиола, при использовании отдельно.
В качестве солей или комплексов альфа-липоевой кислоты, например водорастворимые соли, такие как R-липоаты натрия или калия, и другие растворимые соли R-энатиомера или RS-рацемата могут быть использованы в композиции по настоящему изобретению.
Композиция по настоящему изобретению предпочтительно дополнительно включает другие активные вещества, которые образуют, в сочетании с альфа-липоевой кислотой, или ее солью, или комплексом и гонокиолом, особенно эффективную композицию для лечения не диабетических и периферических нейропатий.
Предпочтительно, композиция в соответствии с настоящим изобретением, таким образом, включает в себя гамма-линоленовую кислоту, или ее соль, или комплекс, например натриевую соль гамма-линоленовой кислоты. Предпочтительно, количество по массе указанной гамма-линоленовой кислоты в композиции согласно настоящему изобретению находится в диапазоне от 2% до 30% по отношению к общей массе гонокиола и альфа-липоевой кислоты. Более предпочтительно, количество по массе указанной гамма-линоленовой кислоты в композиции согласно настоящему изобретению находится в диапазоне от 15% до 25% по сравнению с общей массой гонокиола и альфа-липоевой кислоты.
Композиция по настоящему изобретению предпочтительно также содержит физиологически приемлемый источник селена. Под физиологически приемлемым источником селена в настоящем описании и в формуле изобретения подразумевается любой источник усваиваемого селена, используемого в диетических или фармацевтических композициях, например соль селена или комплекс селена с аминокислотой. Предпочтительно, соединение, выбранное из группы, состоящей из селенометионина, селенита натрия, селената натрия и селениевых дрожжей, используется в качестве физиологически приемлемого источника селена.
Предпочтительно, количество по массе указанного физиологически приемлемого источника селена в композиции согласно настоящему изобретению соответствует для обеспечения количества селена от 0,0001% до 2% по отношению к общей массе гонокиола и альфа-липоевой кислоты. Более предпочтительно, количество по массе указанного физиологически приемлемого источника селена в композиции по настоящему изобретению соответствует для обеспечения количества селена от 0,0001% и 0,1% по отношению к общей массе гонокиола и альфа-липоевой кислоты.
Композиция по настоящему изобретению, предпочтительно, содержит также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из витамина С, витамина Е и витаминов группы В, например витамины В1, В2, В5, В6 и В12.
Композиция согласно изобретению может быть приготовлена в любой подходящей форме для перорального введения. В частности, в одном аспекте, данное изобретение относится к диетическому или фармацевтическому препарату для перорального введения, содержащему композицию, как определено выше, в виде пилюли, таблетки, капсулы, жевательной таблетки, жевательной резинки, пеллет, порошка для пероральной суспензии, гранулированного порошка, который должен быть восстановлен, или буккального порошка, пероральной суспензии, сиропа.
Композиция по настоящему изобретению может также содержать эксципиенты, отдушки и другие вещества, одобренные для пищевого использования в соответствии с типом требуемого фармацевтического препарата. Подходящими эксципиентами для производства таблеток или капсул являются, например, картофельный, пшеничный или кукурузный крахмал, частично предварительно желатинированный крахмал, микрокристаллическая целлюлоза, двухосновный фосфат кальция, карбонат кальция, полиолы, такие как маннит и сорбит, мальтодекстрин, лактоза, коллоидный диоксид кремния, высокодисперсный диоксид кремния, глицерилбегенат, пропиленгликоль, поливинилпирролидон, сшитый поливинилпирролидон, сложные эфиры и простые эфиры целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза), кроскармеллоза натрия, альгинаты, каррагенаны, стеарат магния, стеарилфумарат натрия, диоксид титана, желатин, растительные масла, такие как соевое или подсолнечное масло, полиглицерилолеат, глицерин, триглицериды жирных кислот, лецитин.
Предпочтительно, препарат в соответствии с изобретением находится в форме таблеток или капсул, подходящих для ежедневного приема количества альфа-липоевой кислоты от 200 мг до 1300 мг и количества гонокиола от 2,5 мг до 150 мг.
Более предпочтительно, препарат в соответствии с изобретением находится в форме таблеток или капсул, подходящих для ежедневного приема в количестве 580 мг до 620 мг альфа-липоевой кислоты и в количестве от 45 мг до 60 мг гонокиола или подходящих для ежедневного приема в количестве от 280 мг до 320 мг альфа-липоевой кислоты и от 20 мг до 30 мг гонокиола.
Еще более предпочтительно, препарат в соответствии с изобретением находится в форме таблеток или капсул, подходящих для ежедневного приема в количестве 600 мг альфа-липоевой кислоты и в количестве 54 мг гонокиола или подходящих для ежедневного приема в количестве 300 мг альфа-липоевой кислоты и 27 мг гонокиола.
Под выражением «подходит для ежедневного приема», в настоящем описании и в формуле изобретения подразумевается, что каждая капсула или таблетка содержит либо общее количество указанных активных ингредиентов или доли тех же величин, так чтобы разрешить прием общего количества за счет применения больше капсул или таблеток. Например, капсулы или таблетки, содержащие около 300 мг альфа-липоевой кислоты и 15 мг гонокиола, считаются подходящими для ежедневного приема приблизительно 600 мг альфа-липоевой кислоты и 30 мг гонокиола.
Гамма-линоленовая кислота, или ее соль, или комплекс, содержатся в составе в соответствии с настоящим изобретением в количествах в диапазоне от 10 мг до 300 мг.
Предпочтительный препарат согласно изобретению пригоден для ежедневного приема в количестве от 580 мг до 620 мг альфа-липоевой кислоты, в количестве от 45 мг до 60 мг и гонокиола и в количестве от 125 мг до 140 мг гамма-линоленовой кислоты и находится в форме мягких капсул из желатина. Другой предпочтительный препарат согласно изобретению, в виде мягких капсул из желатина, подходит для ежедневного приема в количестве от 280 мг до 320 мг альфа-липоевой кислоты, в количестве от 20 мг до 30 мг гонокиола и в количестве от 60 мг до 70 мг гамма-линоленовой кислоты.
Уже описанный физиологически приемлемый источник селена содержится в составе в соответствии с настоящим изобретением в количестве, например, чтобы обеспечить количество селена от 1 мкг до 90 мкг.
Витамин С предпочтительно включен в препарат по настоящему изобретению в количестве, составляющем от 20 мг до 1000 мг.
Витамин Е предпочтительно включен в препарат в соответствии с настоящим изобретением в количестве от 1 мг до 100 мг.
Витамин В1 предпочтительно включен в препарат в соответствии с настоящим изобретением в количестве от 1 до 5 мг.
Витамин В2 предпочтительно включен в препарат в соответствии с настоящим изобретением в количестве от 1 до 5 мг.
Витамин В5 предпочтительно включен в препарат в соответствии с настоящим изобретением в количестве от 1 мг до 20 мг.
Витамин В6 предпочтительно включен в препарат в соответствии с настоящим изобретением в количестве от 1 мг до 8 мг.
Витамин В12 предпочтительно включен в препарат в соответствии с настоящим изобретением в количестве, изменяющемся от 0,001 мг до 0,020 мг.
Предпочтительный препарат согласно изобретению содержит около 600 мг альфа-липоевой кислоты, приблизительно 54 мг гонокиола, около 140 мг гамма-линоленовой кислоты и примерно 0,110 мг селенита натрия.
Другой предпочтительный препарат согласно изобретению содержит около 300 мг альфа-липоевой кислоты, приблизительно 27 мг гонокиола и около 66 мг гамма-линоленовой кислоты и примерно 0,055 мг селенита натрия.
Методику приготовления композиции в соответствии с настоящим изобретением выбирают в зависимости от типа введения и других практических соображений.
Для приготовления препаратов в соответствии с настоящим изобретением любой способ, который известен специалистам в данной области техники для изготовленная таблеток с низкой температурой плавления активного ингредиента, может быть использован, например прямое прессование после смешивания порошков, влажное или сухое прессование после гранулирования (например, в псевдоожиженном слое), прессование гранул или пеллетов. Производство капсул может быть проведено, например, путем заполнения предварительно сформованных оболочек (корпуса) порошками, гранулами, маленькими таблетками или пеллетами и последующего закрытия, применяя крышечку; путем формирования возможно окрашенных листов желатина, в которые включен подходящий пластификатор, и одновременное наполнение их жидкостями (например, метод Шерера (Sherer)) или твердыми веществами (например, метод Accogel); формированием капель желатина с пластификатором и, возможно, активных компонентов в холодных масляных растворах (например, капельным способом).
Преимущества композиций и препаратов в соответствии с настоящим изобретением станут очевидными для специалистов в данной области из следующих примеров, со ссылками на прилагаемые фигуры, на которых:
- Фигура 1а отображает фотографию первичной клеточной культуры кортикальных нейронов крысы через 7 дней в 0,5% EtOH;
- Фигура 1b отображает фотографию первичной клеточной культуры кортикальных нейронов крысы через 7 дней в 0,5% EtOH, дополненным 40 нг мл-1 bFGF;
- Фигура 1c отображает фотографию первичной клеточной культуры кортикальных нейронов крысы через 7 дней в 0,5% EtOH, дополненным 10 μМ раствором 99,7% альфа-липоевой кислоты и 0,3% гонокиола;
- Фигура 1d отображает фотографию первичной клеточной культуры кортикальных нейронов крысы через 7 дней в 0,5% EtOH, дополненным 10 μМ раствором 95,5% альфа-липоевой кислоты и 4,5% гонокиола;
- Фигура 1e отображает фотографию первичной клеточной культуры кортикальных нейронов крысы через 7 дней в 0,5% EtOH, дополненным 10 μM раствором 91% альфа-липоевой кислоты и 9% гонокиола;
- Фигура 1f отображает фотографию первичной клеточной культуры кортикальных нейронов крысы через 7 дней в 0,5% EtOH, дополненным 10 μМ раствором 46% альфа-липоевой кислоты и 54% гонокиола;
- Фигура 1g отображает фотографию первичной клеточной культуры кортикальных нейронов крысы через 7 дней в 0,5% EtOH, дополненным 10 μМ раствором только альфа-липоевой кислоты;
- Фигура 1h отображает фотографию первичной клеточной культуры кортикальных нейронов крысы через 7 дней в 0,5% EtOH, дополненным 10 μМ раствором только гонокиола;
- Фигура 2а отображает фотографию первичной клеточной культуры кортикальных нейронов крысы через 4 дня в 0,5% EtOH;
- Фигура 2b отображает фотографию первичной клеточной культуры кортикальных нейронов крысы через 4 дня в 0,5% EtOH, дополненным 10 μМ раствором 99,7% альфа-липоевой кислоты и 0,3% гонокиола;
- Фигура 2c отображает фотографию первичной клеточной культуры кортикальных нейронов крысы через 4 дня в 0,5% EtOH, дополненным 10 μМ раствором 91% альфа-липоевой кислоты и 9% гонокиола;
- Фигура 2d отображает фотографию первичной клеточной культуры кортикальных нейронов крысы через 4 дня в 0,5% EtOH, дополненным 10 μМ раствором 46% альфа-липоевой кислоты и 54% гонокиола.
Материалы и методы
1
13
Чистоту используемых соединений проверяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, один пик), ядерного магнитного резонанса (Н) и (С) и масс-спектрометрии с высоким разрешением.
Культуральная среда представляла собой культуральную модифицированную среду Дульбекко (DMEM), фетальная бычья сыворотка (FBS) и В27 добавка были получены от Gibco BRL (Нью-Йорк, США). Реагенты PD98059 [2-(2-амино-3-метоксифенил)-4Н-бензопиран-4-он], LY294002 [2-(4-морфолинил)-8-фенил-1(4Н)-бензопиран-4он], и KN93 [N-[2-[N-(4-хлорциннамил)-N-метиламинометил] фенил]-N-(2-гидроксиэтил)-4-метоксибензолсульфонамида фосфатная соль] были приобретены у Sigma (МО, USA). Человеческие рекомбинантные факторы роста фибробластов (bFGF) были поставлены Upstate Biotechnology Inc. (Нью-Йорк, США). Все другие использованные реагенты являются реагентами самой высокой чистоты на рынке.
Пример 1 - Морфологический
Восемь первичных клеточных культур были приготовлены, как описано в Abe K et al. "Effects of recombinant human basic fibroblast growth factor and its modified protein CS23 on survival of primary cultured neurons from various regions of fetal rat brain.", Jpn J Pharmacol 1990, 53 (2): 221-7. Все операции проводились в стерильных условиях.
-2
Нейронные клетки отделяли от полушарий головного мозга плода 18-дневных крыс (Japan SLC, Inc.) и суспендировали в 10% FBS/MEM, а затем высеивали в количестве 9000 клеток см на планшетах, обработанных поли-L-лизином.
Через 24 часа культуральную среду заменяли на среду без содержания сыворотки, определенную для роста нейронов (Neurobasal среда), дополненную В27.
Затем использовали первую культуру (А) в качестве контрольной культуры.
-1
Вторая культура (В) была дополнена 40 нг мл bFGF.
Третья культура (С) была дополнена 99,7% по массе альфа-липоевой кислотой и 0,3% по массе гонокиола с общей концентрацией 10 μМ.
Четвертая культура (D) была дополнена 95,5% по массе альфа-липоевой кислотой и 4,5%) по массе гонокиола с общей концентрацией 10 μМ.
Пятая культура (Е) был дополнена 91% по массе альфа-липоевой кислотой и 9% по массе гонокиола с общей концентрацией 10 μМ.
Шестая культура (F) была дополнена с 46% по массе альфа-липоевой кислотой и 54% по массе гонокиола с общей концентрацией 10 μМ.
Седьмая культура (G) был дополнена только альфа-липоевой кислотой в общей концентрации 10 μМ.
Восьмая культура (Н) был дополнена только гонокиолом при общей концентрации 10 μМ.
После 6 дней инкубации клетки из восьми культур стабилизировали 4% формальдегидом.
Восемь культур затем оценивали в отношении длины нейритов на микроскопическом уровне. Нейроны подвергали иммуногистохимическому окрашиванию на ассоциированном с микротрубочками белке-2 (МАР2) в соответствии с гистохимическим методом для длины нейритов, как описано в Fukuyama Y et al. "Neurotrophic activity of honokiol on the cultures of fetal rat cortical neurons" Bioorg. Med Chem. Lett 12, 1163-66 (2002). Длина самого расширенного нейрита всего клеточного тела была измерена и подсчитана с помощью программных продуктов Lumina Vision и Мас-SCOPE, в соответствии с вышеупомянутым способом, описанным в Е. Fukuyama et al. (2002). Морфометрические исследования были выполнены с помощью измерения длины самого длинного нейрита от каждого нейрона, используя Lumina Vision, и программного обеспечения Mac-Scope (Yoshiyasu Fukuyama et al. 2002).
Полученные результаты приведены в таблице 1, в которой p обозначает статистическую значимость и ns означает "не имеет существенного значения".
Длина нейритов в культурах, обработанных тестируемыми композициями в соответствии с изобретением, с концентрацией гонокиола от 4,5% до 9%, в результате была значительно увеличена (p<0,001), в то время как культуры, обработанные композицией, содержащей альфа-липоевую кислоту 99,7% и 0,3% гонокиола, не показывают статистически значимого увеличения в длине нейритов. Композиция, содержащая 95,5% по массе альфа-липоевой кислоты и 4,5% по массе гонокиола, и композиция, содержащая 91% по массе альфа-липоевой кислоты и 9% по массе гонокиола, были признаны эффективными в промотировании значительно значительного расширения нейритов (аксонов) по сравнению с контролем (культура А) и культурой с добавлением факторов роста (культура В) и, в особенности, также по отношению к дополненной культуре композиции, содержащей 99,7% по массе альфа-липоевой кислоты и 0,3% по весу/массе гонокиола (культура С). Следует отметить, что результат от композиции в соответствии с изобретением, как в пропорции 95,5% альфа-липоевой кислоты и 4,5% гонокиола, так и 91% альфа-липоевой кислоты и 9% гонокиола, оказался более значительным, чем результат, полученный с фактором роста bFGF. Композиция, содержащая 46% по массе альфа-липоевой кислоты и 54% по массе гонокиола, ингибировала рост нейритов в культуре F.
Композиции, содержащие только альфа-липоевую кислоту или один гонокиол, стимулировали рост нейритов (аксонов) незначительным образом. Результатом является значение, существенно не отличающееся от контрольной композиции.
-1
Фигура 1 показывает также, что через 7 дней клеточная культура, в культурах С, D и Е (фигуры 1c, 1d и 1c) нейроны показали расширенные нейриты, которые содержат более заметные и темные нейронные хромосомы по сравнению с контрольной культурой А (фигура 1a), и были лучше, особенно, что касается культур D и Е (фигуры 1d и 1е), по отношению к культурам В (фигура 1b) соответственно, содержащей 40 нг мл bFGF и культуры индивидуальной альфа-липоевой кислоты (фигура 1d) или гонокиола (фигура 1h).
Результаты испытаний показывают, что композиции в соответствии с изобретением имеют несомненное и непредсказуемое воздействие на дифференциацию кортикальных нейронов.
Пример 2 - Оценка жизнеспособности нейронов
-2
Четыре первичные клеточные культуры готовили, как описано в Abe K et al. "Effects of recombinant human basic fibroblast growth factor and its modified protein CS23 on survival of primary cultured neurons from various regions of fetal rat brain", Jpn J Pharmacol 1990, 53 (2): 221-7. Все операции проводились в стерильных условиях. Нейронные клетки отделяли от полушарий головного мозга плода 18-дневных крыс (Japan SLC, Inc.) и суспендировали в 10% FBS/MEM, а затем высевали в количестве 20000 клеток см в планшеты, обработанные поли-L-лизином. После 24 часов культуральную среду заменяли на среду, не содержащую сыворотку, определенную для роста нейронов (Neurobasal среда), дополненную В27.
-2
Процедура клеточных культур была по существу такой же, которую применяли в примере с NBM/B27, за исключением того, что культуральная среда свободна от сыворотки, DMEM дополненный N2 был использован (Cestelli A et al. "Formulation of a novel synthetic medium for selectively culturing rat CNS neurons". Dev Brain Res 1985, 22.219); а также, что планшеты имели плотность клеток, равную 2×10 см.
Затем культуру (I) использовали в качестве контрольной культуры.
Культуру (L) дополнили 99,7% по массе альфа-липоевой кислотой и 0,3% по массе гонокиола с концентрацией 10 μМ.
Культуру (М) дополнили 91% массе альфа-липоевой кислотой и 9% по массе гонокиола с концентрацией 10 μМ.
Культуру (N) дополнили 46% по массе альфа-липоевой кислотой и 54% по массе гонокиолом с концентрацией 10 μМ.
После инкубации в течение 3 дней клетки из четырех культур стабилизировали 4% формальдегидом.
Выживание нейронов оценивали методом WST-8 Н Tominaga et al. "A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay", Anal Commun 1999, 36.47. Этот метод использует соль 2-(2-метокси-4-нитрофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-(2,4-disolfofenil)-2Н-тетразолия в качестве индикатора хромогена, чтобы оценить WST-8 жизнеспособность клеток, и получает результаты на жизнеспособность клеток, которые находятся в соответствии с данными, полученными соответственно с методом МТТ с использованием 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромида и с методом поглощения тритий-тимидина.
Результаты приведены как в таблице 2, в которой значения выражаются в средних величинах, так и на фигуре 2. В таблице 2 p означает статистическую значимость и ns означает "не имеет существенного значения".
Культура М имеет значения, которые значительно выше, чем в контроль I.
Ссылочная культура I, в отсутствие активных компонентов, определила на выживание небольшое число нейронов. Напротив, в культуре М присутствие композиций согласно настоящему изобретению в концентрации 10 μМ показало высокую способность к росту и выживанию нейронов.
Пример 3
Четыре первичные клеточные культуры готовили, как описано в примере 2 (как в Abe K et al. "Effects of recombinant human basic fibroblast growth factor and its modified protein CS23 on survival of primary cultured neurons from various regions of fetal rat brain", Jpn. J. Pharmacol. 1990; 53 (2): 221-7).
Затем культуру (О) использовали в качестве контрольной культуры.
Культура (Р) была дополнена 91% по массе альфа-липоевой кислотой и 9% по массе гонокиолом с общей концентрацией 10 μМ.
Культура (Q) была дополнена 91% по массе альфа-липоевой кислотой и 9% по массе гонокиолом с концентрацией 10 μМ и 0,003 μМ селена.
Культура (R) была дополнена 91% по массе альфа-липоевой кислотой и 9% по массе гонокиола с концентрацией 10 μМ и 0,24 μМ гамма-линоленовой кислоты.
После инкубации в течение 3 дней клетки из четырех культур стабилизировали 4% формальдегидом.
Выживание нейронов оценивали тестом восстановления WST-8 (Tominaga et al., 1999). Результаты показаны в таблице 3, в которой величины выражены как средние. Кроме того, p обозначает статистическую значимость.
Результаты, представленные в таблице 3, показывают, что, на удивление, композиции в соответствии с предпочтительными вариантами осуществления изобретения, включающие селен и/или гамма-линоленовую кислоту, являются особенно эффективными в повышении выживание культур нейронов. В частности, композиции, используемые в культурах Q и R, являются значительно более эффективным, чем композиции, которые используются для культивирования ссылочной О, и композиции, используемой в культуре Р.