Способ диагностики вируса папилломы человека по концентрации молекулярных маркеров
METHOD FOR DIAGNOSING HUMAN PAPILLOMAVIRUS BY THE CONCENTRATION OF MOLECULAR MARKERS

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии и онкологии, и может быть использовано для диагностики, прогнозирования и оценки эффективности лечения ВПЧ-инфекции, предраковых заболеваний шейки матки, ассоциированных с вирусом папилломы человека (ВПЧ) высокого онкогенного риска.
Проблема цервикальных интраэпителиальных неоплазий, ассоциированных с вирусом папилломы человека остается актуальной по сей день [1]. До 75% женщин, у которых обнаруживается ВПЧ-инфекция находятся в репродуктивном возрасте, а значит заболеваемость ВПЧ-инфекцией влияет на репродуктивное здоровье и рождаемость [2].
Ряд отечественных работ обосновывают необходимость персонифицированного подхода к ранней диагностике и прогнозированию заболеваний гинекологического тракта онкологического профиля и выделяют раннюю диагностику ВПЧ-инфекции как один из важнейших компонентов прогноза [3, 4, 5, 6].
Известен комплексный метод диагностики ВПЧ-инфекции (Патент РФ №2379690, опубл. 20.01.2010), который включает в себя изучение анамнеза и последующее комплексное клинико-лабораторное исследование. Для каждого признака определяют баллы, по сумме которых делается заключение о персистирующем или транзиторном течении ВПЧ-инфекции. Данный метод не принимает во внимание физический статус вируса, соматический статус пациентки и результаты иммуноцитохимического анализа.
Известен способ прогнозирования диспластических заболеваний шейки матки у пациенток с ВПЧ-инфекцией (патент РФ №2310197, опубл. 10.11.2007), при котором иммуногистохимическим методом исследуют серийные срезы слизистой оболочки шейки матки. Определяют апоптозный индекс, митотический индекс, индекс метки PCNA и индекс метки BCL-2, рассчитывают коррелятивный индекс пролиферации. Если у больных с цервикальной интраэпителиальнй неоплазией (CIN) I степени значение коррелятивного индекса пролиферации превышает 114,0, то предполагают высокую вероятность перехода заболевания в стадию CIN II степени, а если значение коррелятивного индекса пролиферации превышает 208,0, предполагают высокую вероятность перехода заболевания в стадию CIN III степени или развития рака шейки матки. Использование данного способа дает возможность осуществить раннюю диагностику развития опухолевого роста и подобрать лечение.
Однако данный способ инвазивен. Он не учитывает тип онкогенности ВПЧ.
Известен способ ранней диагностики рака шейки матки (изобретение по заявке CN 1570646, опубл. 26.01.2005), связанный с выявлением антител к белкам ВПЧ 16/18 с помощью специальных полипептидов.
Известно изобретение по выявлению неблагоприятного течения ВПЧ инфекции с помощью методов генной инженерии (патент LT 5228, опубл. 27.06.2005). В данном изобретении проводят раннюю диагностику in vitro с использованием меченных моноклональных антител (716-281 и 716-332) дисплазии шейки матки и рака, которая включает количественное определение онкобелка Е7 ВПЧ 16 и ВПЧ 18, а также проводят идентификацию различных антигенных детерминантов онкобелка Е7. Если уровень Е7 онкобелка вируса соответствует значениям 40 пг/мл-50 нг/мл, то это свидетельствует о дисплазии и раке шейки матки.
Известен in vitro метод скрининга персистирующей ВПЧ инфекции (изобретение по заявке US 2010330550, опубл. 30.12.2010), определяющий 5 типов ВПЧ (16, 18, 31, 33 и 45) и позволяющий оценить экспрессию мРНК вирусных онкогенов Е6 и/или Е7. В качестве молекулярного маркера клеточных изменений, ассоциированных с персистирующей ВПЧ-инфекцией, используются транскрипты Е6 и/или Е7 для различия цервикальных поражений высокой и низкой степени. Например, для различения CIN III с анеуплоидными клетками и гистологически верифицированной CIN III без анеуплоидных клеток. Отмечается, что РНК-тест имеет более высокую чувствительность, при сходной с гистологическим исследованием специфичностью. Этот метод может быть использован для скрининга рака шейки матки.
Во всех вышеперечисленных известных способах не учитываются физический статус вируса и весь класс высокоонкогенных ВПЧ. Не учитываются также индивидуальные клинические особенности пациентки.
Известен способ оценки состояния гиперпролиферативных заболеваний шейки матки (патент РФ №2503960, дата публикации 10.01.2014), основанный на определении порогового уровня вирусной нагрузки и физического состояния вируса, с целью прогнозирования негативного течения цервикальных интраэпителиальных неоплазий и возможного развития рака шейки матки.
В патенте РФ №2506892, от 20.02.2014, предложен способ дифференциальной диагностики цервикальной интраэпителиальной неоплазий III степени и преинвазивного рака шейки матки. Данный способ связан с определением следующих иммунологических показателей: уровня ИЛ-10 крови и уровней ИНФ- крови, концентрации CD 10, CD20, CD25 лимфоцитов периферической крови, функционального резерва нейтрофилов цервикальной слизи, и ФНО-цервикальной слизи.
Недостатками вышеупомянутых способов диагностики ВПЧ являются технические сложности работы с материалом и необходимость использования дорогостоящих реактивов. Это ограничивает возможность использования данных способов в рутинной практике большинства клинических лабораторий. Также не учитывается весь возможный класс высокоонкогенных ВПЧ, и индивидуальные клинические и соматотипологические особенности пациенток.
В связи с этим разработка новых современных экспрессных и недорогих методов ранней лабораторной диагностики ВПЧ-инфекции с последующим контролем качества лечения и составления прогноза течения заболевания, является актуальной задачей.
Технической задачей настоящего изобретения является разработка информативного способа диагностики ВПЧ путем идентификации специфического соотношения концентраций молекулярных маркеров в образце соскоба из цервикального канала.
Указанная проблема решается путем определения концентраций молекулярных маркеров ВПЧ, представляющих собой гидроксикислоты и высшие жирные кислоты в образце соскоба из цервикального канала методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС) с последующей оценкой полученных результатов по классификационным уравнениям линейного дискриминантного анализа, подтверждающей наличие или отсутствие ВПЧ у пациентки.
Известно, что при заражении вирусами меняется метаболический профиль как макроорганизма, так и микробиоценоза. В работе J. Munger, опубликованной в журнале Nat Biotechnol в 2008 г. показано, что синтез жирных кислот важен для репликации вирусов и что профилирование метаболического потока на системном уровне может идентифицировать метаболические мишени для противовирусной терапии. Вирусы полагаются на метаболическую сеть своих клеточных хозяев, чтобы обеспечить энергию и строительные блоки для своей репликации.
Впервые идею о том, что вся информация о функциональном состоянии организма отражена в качественном и количественном составе биологических жидкостей организма высказали Linus Pauling с соавторами в 1971 г. Позже Nicholson J.K. с соавторами (1999) ввел понятие «метабономика», означающее динамический метаболический ответ живых систем на биологические стимулы, в то время как под термином «метаболомика» понималась наука, изучающая метаболические профили на клеточном и органном уровне и связанная преимущественно с нормальным эндогенным метаболизмом.
Биологический объект это - единая система, проявляющая реакцию на эндогенные и экзогенные факторы воздействия. Большое количество факторов в многоуровневой системе взаимодействия всех компонентов объекта - это множество одновременно происходящих процессов, которые накладываются друг на друга, и дают нечеткий ответ. Для обработки таких данных применяются методы математического моделирования.
Использование концентраций гидроксикислот и высших жирных кислот для детекции ВПЧ с применением проекционных методов многомерной статистики позволяет эффективно детектировать инфекцию ВПЧ.
Наиболее простым и надежным методом математического моделирования является линейный дискриминантный анализ (ЛДА), который демонстрирует высокие показатели чувствительности и специфичности за счет алгоритма пошагового исключения малоинформативных компонентов и выявления специфического соотношения компонентов, характерного для состояния, заданного обучающей выборкой.
Технический результат предлагаемого метода детекции ВПЧ заключается в его универсальности, безопасности, неинвазивности выполнения. Предлагаемый метод является достаточно легко воспроизводимым, позволяющем выбрать правильную тактику лечения и составления прогноза течения заболевания.
Сущность изобретения: при исследовании образца соскоба из цервикального канала методом газовой хроматографии масс-спектрометрии определяют концентрации следующих молекулярных маркеров:
a15
антеизопентадекановой кислоты (C),
15:1d9
9,10-пентадеценовой кислоты (C),
10Me15
10-метилпентадекановой кислоты (C)
i16.1d9
9,10-изогексадеценовой кислоты (C),
2h14
2-гидроксимиристиновой кислоты (C),
3h16
3-гидрокси-пальмитиновой кислоты (C),
10h18
10-гидроксистеариновой кислоты (C) [7, 8].
Для расчета диагностических коэффициентов полученные значения концентраций молекулярных маркеров умножают на коэффициенты классификационных уравнений линейного дискриминантного анализа и суммируют с учетом знаков коэффициентов [9]. Затем по величине диагностических коэффициентов диагностируют ВПЧ-инфекцию или ее отсутствие.
Способ осуществляют следующим образом.
Необходимым условием проведения опыта является использование химически чистой посуды для хроматографии и особо чистых реактивов и газов для хроматографии и соблюдения правил работы с ПБА III-IV групп патогенности [11].
Для проведения хромато-масс-спектрометрического анализа используют следующее оборудование:
Проведение биохимического анализа соскобов из цервикального канала осуществляют в специализированной лаборатории специалистами, имеющими опыт работы с исследованием биологического материала хромато-масс-спектрометрическим методом.
Материалом для исследования служат соскобы из цервикального канала обследуемого, который собирается, хранится и доставляется в лабораторию согласно МУ 4.2.2039-05 Методические указания [11].
Техника сбора и транспортировки биоматериалов в микробиологические лаборатории.
Для анализа образцы соскобов из цервикального канала обрабатывают сразу или замораживают и хранят при - 5°-18°С в случае, когда немедленный анализ невозможен в течение 10 дней. Допускается транспортировка проб при нормальной температуре в течение пяти часов, в переносках или укладках с раздельными гнездами.
Суть анализа состоит в прямом извлечении с помощью химической процедуры молекулярных маркеров из подлежащего исследованию образца, их разделения на хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения с неподвижной фазой НР-5 ms., анализа состава в динамическом режиме на масс-спектрометре, и математической обработке с использованием прилагаемых программ.
Пробоподготовка: Для анализа биоматериал в количестве 40 мкл пипеткой переносят в виал емкостью 1,5 мл с завинчивающейся крышкой с тефлонированной прокладкой, подсушивают (при снятой крышке) в термостате при 80°С с добавлением 40 мкл метанола для ускорения сушки. Метанолиз проводят в 0,4 мл 1 М HCl в метаноле в течение 1 часа при 80°С. На этой стадии происходит освобождение жирных кислот и альдегидов из сложных липидов микроорганизмов и других клеток жидкости в виде метиловых эфиров и диметилацеталей. В пробу вводят 300 нг внутреннего стандарта - дейтерометилового эфира тридекановой кислоты, растворенного в гексане. Компоненты реакционной смеси экстрагируют гексаном (400 мкл) в течение 5 мин, гексановый экстракт аккуратно собирают не задев нижний слой, высушивают, в течение 5-7 минут при температуре 80°С, а сухой остаток обрабатывают 20 мкл N,O-бис(триметил-силил)-трифторацетамида (BSTFA) в течение 15 мин при 80°С для получения триметилсилильных эфиров окси-кислот и стеролов. К реакционной смеси эфиров добавляют 80 мкл гексана.
Сканирование пробы: Для проведения анализа смесь эфиров в количестве 2 мкл вводят в инжектор ГХ-МС системы АТ-5973 Аджилент Технолоджис (Agilent Technologies Inc.) (США) вручную или посредством автоматической системы ввода проб (автосэмплер), которая обеспечивает воспроизводимость времен удерживания хроматографических пиков и повышает точность автоматической обработки данных.
Хроматографическое разделение пробы осуществляют на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms Аджилент технолоджис длиной 25 м и внутренним диаметром 0,25 мм, газ-носитель -гелий. Режим анализа - программированный, скорость нагрева термостата колонки 7°С/мин в диапазоне 135-320°С. Выдержка при начальной температуре 1,5 мин. Температура испарителя - 250°С, интерфейса - 250-300°С. Масс-спектрометр - квадрупольный, с ионизацией электронами (70 эв) используют в режиме селективных ионов, или масс-фрагментографии (МФ), при периодическом сканировании до тридцати ионов в пяти интервалах времени. Интервалы и ионы выбирают таким образом, чтобы селективно детектировать маркеры определяемых видов микроорганизмов. В том числе используют сильный ион m/z=87 в спектрах жирных кислот для детектирования малых количеств микробных кислот С12-С15, С17, С19. Ион 175 включают в каждый интервал, кроме пятого для детектирования β-оксикислот, для которых он специфичен и интенсивен в спектре. Ионы 301, 315 и далее через 14 единиц массы включают в программу для подтверждения молекулярного иона оксикислот тридекановой, тетрадекановой и следующих в гомологическом ряду. Ион 312, как молекулярный, используют для выявления изомеров нонадекановой кислоты. Интерпретация данных масс-фрагментограмм состоит в соотнесении пиков к определенным веществам на основании их массы, соотношения интенсивности (площадей) и времени хроматографического удерживания.
Для получения диагностических коэффициентов значения концентраций молекулярных маркеров в наномоль/г подставляют в классификационные уравнения линейного дискриминантного анализа [9].
а15
15:1d9
10Me15
i16:Id9
2h14
3h16
10h18
F1=-9,644-1,6994×С+29,8836×C+7,7509×C-9,1165×C-18,173×C+7,9819×C+0,1347×C
a15
15:1d9
10Me15
i16:1d9
2h14
3h16
10h18
F2=-0,90924-0,36916×C+10,2623×C+1,19817×C-2,38212×C-1,00718×C+1,75767×C+0,0187×C
где:
F1 - диагностический коэффициент, указывающий на наличие ВПЧ-инфекции, при условии F1>F2;
F2 - диагностический коэффициент указывающий на отсутствие признаков ВПЧ-инфекции, при условии F1<F2;
Концентрации молекулярных маркеров во влагалищном секрете, наномоль/г
a15
C - антеизопентадекановой кислота,
15:1d9
С - 9,10-пентадеценовой кислота,
10Me15
C- 10-метилпентадекановой кислота,
i6:1d9
C - 9,10-изогексадеценовой кислота,
2h14
C - 2-гидроксимиристиновой кислота,
3h16
C- 3-гидрокси-пальмитиновой кислота,
10h18
C - 10-гидроксистеариновой кислота;
Изобретение иллюстрируют следующими примерами.
Пример 1. Пациентка И., 28 лет обратилась в консультативно-диагностический центр при МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского с целью профилактического обследования, в том числе на ИППП и дальнейшего планирования беременности. В гинекологическом анамнезе было 1 медикаментозное прерывание беременности. Со стороны гинекологической патологии отмечала в анамнезе наличие кандидоза влагалища 2 года назад, который был вылечен. Менструации с 14 лет, установились сразу, длительностью по 5 дней, через 28 дней, безболезненные, умеренные, регулярные. Половая жизнь с 19 лет. Контрацепция: презерватив и прерванный половой акт. Соматической патологии не выявлено.
Гинекологический осмотр выявил следующее: наружные половые органы сформированы правильно, область вульвы и ануса без изменений. Влагалище нерожавшей свободное, узкое. Своды свободные.
Осмотр на зеркалах: шейка матки конической формы, отверстие цервикального канала точечное, выделения умеренные, слизистые. Вокруг цервикального канала отмечается незначительная зона гиперемии. При проведении расширенной кольпоскопии отмечалось усиление капиллярного рисунка вокруг наружного зева, преимущественно на задней губе, открытые железы. При обработке 3% раствором уксусной кислоты - отмечается наличие патологических изменений в виде плотной ацетобелой реакции на указанном патологическом участке с грубой мозаикой, и йоднегативной зоной.
Цитологическое исследование: взят соскоб с поверхности шейки матки и цервикального канала. Цитограмма изменений плоского эпителия по типу ЦИН III
Диагноз: Цервикальная интраэпителиальная неоплазия 3 степени.
Было взято цервикальное содержимое для анализа методом ГХ-МС.
Анализ методом ГХ-МС на определение концентраций молекулярных маркеров вируса в соскобе из цервикального канала показал следующие значения концентраций:
антеизопентадекановой кислоты (C<sub>a15</sub>)
28,457 наномоль/г
9,10-пентадеценовой кислоты (C<sub>15</sub>;<sub>1d9</sub>)
0,22203 наномоль/г
10-метилпентадекановой кислоты (C<sub>10Me15</sub>)
4,6968 наномоль/г
9,10-изогексадеценовая кислоты (C<sub>i16:1d9</sub>)
0,7012 наномоль/г
2-гидроксимиристиновая кислоты (C<sub>2h14</sub>
0,50649 наномоль/г
3-гидрокси-пальмитиновой кислоты (C<sub>3h16</sub>)
6,23636 наномоль/г
10-гидроксистеариновой кислоты в соскобе (C<sub>10h18</sub>)
4,12630 наномоль/г
Для расчета значений диагностических коэффициентов полученные значения концентраций молекулярных маркеров умножены на коэффициенты классификационных уравнений линейного дискриминантного анализа и сложены с учетом знака. Полученные значения диагностических коэффициентов сравнивали между собой.
19,77319
F1=-9,644-1,6994×28,457+29,8836×0,22203+7,7509×4,6968-9,1165×0,7012-18,173×0,50649+7,9819×6,23636+0,1347×4,12630=
5,349951
F2=-0,90924-0,369×28,457+10,2623×0,22203+1,19817×4,696-2,38212×0,7012-1,00718×0,50649+1,75767×6,23636+0.0187×4.12630=
Максимальное значение диагностического коэффициента F1=19,77319 указывает на наличие ВПЧ.
Результаты ПЦР-анализа показали отсутствие хламидийной, цитомегаловирусной и герпесвирусной инфекций урогенитального тракта. Тест на определение ДНК ВПЧ высокого риска дал положительный результат. Пациентке проведено оперативное лечение в НЦ им Герцена. В настоящее время она здорова.
Пример 2. Пациентка К., 22 года. Обратилась к гинекологу с жалобами на обильные слизистые выделения из половых путей в течение месяца, наличие кондиломатозных разрастаний вульвы.
На момент осмотра в гинекологическом анамнезе 2 беременности: 1 роды, 2 медицинских аборта. Со стороны гинекологической патологии отмечала в анамнезе наличие острого аднексита 4 года назад, который был вылечен в стационаре. Менструации с 13 лет, установились сразу, длительностью по 5 дней, через 28 дней, безболезненные, умеренные, регулярные. Половая жизнь с 17 лет. Контрацепция: прерванный половой акт. Соматической патологии не выявлено.
Гинекологический осмотр выявил следующее: наружные половые органы сформированы правильно, на малых половых губах, на боковых стенках влагалища обнаружены незначительные кондиломатозные разрастания. Влагалище рожавшей, своды свободные.
Осмотр на зеркалах: шейка матки цилиндрической формы, отверстие цервикального канала щелевидное, выделения обильные, слизистые. Слизистая шейки матки гиперемирована, сосудистый рисунок усилен. При проведении расширенной кольпоскопии зона стыка цилиндрического и многослойного плоского эпителия по краю наружного зева, при обработке шейки матки 3% раствором уксусной кислоты, нежная ацетобелая реакция и нежная мозаика вокруг наружнего зева. Проба Шиллера отрицательная.
Цитологическое исследование: взят соскоб с поверхности шейки матки и цервикального канала. Цитограмма цервицита (возможно, связанного с ВПЧ инфекцией)
Диагноз: Цервицит. Кондиломы вульвы и влагалища. Было взято цервикальное содержимое для анализа методом ГХ-МС. Анализ методом ГХ-МС на определение концентраций молекулярных маркеров вируса в соскобе из цервикального канала показал следующие значения концентраций:
Антеизопентадекановой кислоты (С<sub>а15</sub>)
10,217 наномоль/г
9,10-пентадеценовой кислоты (С<sub>15:1d9</sub>)
0,1250 наномоль/г
10-метилпентадекановой кислоты (C<sub>10Me15</sub>)
0,1476 наномоль/г
9,10-изогексадеценовая кислоты (C<sub>i16:1d9</sub>)
0,1250 наномоль/г
2- гидроксимиристиновая кислоты (C<sub>2h14</sub>)
0,2250 наномоль/г
3- гидрокси-пальмитиновой кислоты (C<sub>3h16</sub>)
2,030 наномоль/г
10-гидроксистеариновой кислоты в соскобе (C<sub>10h18</sub>)
0,1221 наномоль/г
Для расчета значений диагностических коэффициентов полученные значения концентраций молекулярных маркеров умножены на коэффициенты классификационных уравнений линейного дискриминантного анализа и сложены с учетом знака. Полученные значения диагностических коэффициентов сравнивали между собой.
-11,1342
F1=-9,644-1,6994×10,217+29,8836×0,1250+7,7509×0,1476-9,1165×0,1250-18,173×0,2250+7,9819×2,030+0,1347×0,1221=
-0,17508
F2=-0.90924-0.369×10,217+10,2623×0,1250+1,19817×0,1476-2,38212×0,1250-1,00718×0,2250+1,75767×2,030+0,0187×0,1221=
Максимальное значение диагностического коэффициента F2=-0,17508 указывает на отсутствие признаков ВПЧ.
Результаты ПЦР-анализа показали отсутствие хламидийной, цитомегаловирусной и герпесвирусной инфекций урогенитального тракта. Тест на определение ДНК ВПЧ высокого риска дал отрицательный результат. Пациентке проведено лечение цервицита удаление кондилом. В настоящее время находится под наблюдением.
Литература
1. zur Hausen, Н. Papillomavirus in the causation of human cancers - a brief historical account / H. zur Hausen // Virology. - 2009. - 384. - P. 260-265.
2. Назарова H.M., Павлович С.В., Аттоева Д.И. ВПЧ-ассоциированные заболевания у женщин и мужчин: принципы диагностики, лечения, профилактики. Медицинский совет. 2019; 7: 82-86. DOI: https://doi.Org/10.21518/2079-701Х-2019-7-82-86.
3. Караулов А.В., Афанасьев С.С., Затевалов A.M., Несвижский Ю.В., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С., Бондаренко Н.Л., Миронов А.Ю., Борисова О.Ю., Урбан Ю.Н., Воропаев А.Д., Борисова А.Б. Дискриминантный анализ в установлении взаимозависимости патогенетических механизмов развития гестационных осложнений при урогенитальной инфекции беременных // Клиническая лабораторная диагностика. 2020. Т. 65. №7. С. 443-453.
4. Зур Н.В., Миронов А.Ю., Затевалов A.M. Оценка эффективности лечения урогенитального хламидиоза // Проблемы медицинской микологии. 2020. Т. 22. №3. с. 78.
5. Пальцев, М.А. Персонифицированная медицина / М.А. Пальцев // Наука в России.-2011. - №1. - С. 12-17.
6. Дедов, И.И. Персонализированная медицина: современное состояние и перспективы / И.И. Дедов, А.Н. Тюльпаков, В.П. Чехонин [и др.] // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2012. - Т. 67, №12. - С. 4-12.
7. Турова Е.С., Осипов Г.А. Изучение структуры микробного сообщества, активного в биотрансформации минералов железа в каолине // Микробиология, 1996, Т. 65, №5, с. 682-689.
8. Osipov G.A., Turova E.S. Studying species composition of microbial communities with the use of gas chromatography-mass spectrometry. Microbial community of kaolin.// FEMS Microbiol. Rev., 1997, Vol. 20, №3-4, p. 437-446.
9. Михалевич И.М. Основы прикладной статистики: методические рекомендации / И. М. Михалевич, Н.Ю.Рожкова. ИГИУВ. Иркутск, 2006. 90 с.
10. Кондрахина И.Н., Вербенко Д.А., Затевалов A.M., Кубанов А.А., Дерябин Д.Г. Значение генетических и негенетических факторов в возникновении и развитии андрогенной алопеции у мужчин: многопараметрический анализ // Вестник Российской академии медицинских наук. 2019. Т. 74. №3. С. 167-175.
11. Осипов Г.А. Демина A.M. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах // Вестник РАМН, 1996, Т. 13, №2, с. 52-59.