СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФИБРОБЛАСТОВ ИЗ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА

2
1. Способ выделения фибробластов из кожи человека, заключающийся в воздействии на образец кожи человека в чашке Петри механическим очищением режущим инструментом от подкожной жировой клетчатки, измельчении его, растворении фрагментов в ростовой среде, инкубации при 37°С, изъятии остатков кусочков кожи, оставшиеся после растворения фибробласты промывают дважды в фосфатно-солевом буфере, после переноса фибробластов в пробирку центрифугируют, ресуспендируют в ростовой среде и переносят их во флакон для дальнейшего культивирования, отличающийся тем, что перед механическим очищением кожи приготавливают питательную среду, содержащую 40 мл MEM, 10 мл фетальной бычьей сыворотки, 0,5 мл глутамина и 1 мл пенициллина со стрептомицином, после инкубации ее при 37°С в течение 30 мин промывают образец кожи в 30 мл фосфатно-солевом буфере с удалением из образца остатков крови, после помещения образца в чашку Петри с приготовленной питательной средой, удаления режущим инструментом от оставшейся подкожной жировой клетчатки и механического измельчения образца режущими инструментами размещают измельченные фрагменты кожи в коническую пробирку, заполненную фосфатно-солевым буфером, центрифугируют содержимое со скоростью 800 об/мин в течение 3-х минут и после удаления супернатанта повторяют промывку образца фосфатно-солевым буфером с центрифугированием с такой же скоростью с удалением в промежутке процедур супернатанта, затем приготавливают смесь ферментов, содержащую коллагеназу IV, диспазу, трипсин, с полученным образцом, инкубируя ее в течение 30 мин при температуре 37°С, пропускают обработанные смесью ферментов фрагменты образца через отверстие пипетки с их дальнейшим механическим разрушением, добавляют к ним раствор фосфатно-солевого буфера и центрифугируют смесь со скоростью 1700 об/мин в течение 10 мин, после удаления супернатанта добавляют в смесь 15 мл фосфатно-солевого буфера и снова центрифугируют ее со скоростью 1200 об/мин в течение 5 мин с повтором этого этапа, после окончания ресуспендирования осадка в 2 мл питательной среде сеют клетки на дно культурального флакона с площадью дна 75 см с добавлением к ним 10 мл питательной среды и инкубации их при 37°С с 5% СО, через несколько дней из флакона отбирают питательную среду с неприкрепившимися клетками и остатками дебриса и добавляют к культуре клеток 10 мл питательной среды.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при общем объеме смеси ферментов с образцом в 5 мл объемы коллагеназы IV составляет 2,5 мл, диспазы - 250 мкл, трипсина 10 мкл, при объеме смеси в 10, 20, 50 мл объемы ферментов увеличиваются пропорционально числу раз увеличения общего объема смеси.