СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РЕПРОДУКТИВНЫХ ПОТЕРЬ В ВИДЕ НЕРАЗВИВАЮЩЕЙСЯ БЕРЕМЕННОСТИ И САМОПРОИЗВОЛЬНОГО ВЫКИДЫША У ЖЕНЩИН С УГРОЖАЮЩИМ РАННИМ ВЫКИДЫШЕМ
METHOD FOR PREDICTION OF REPRODUCTIVE LOSS IN THE FORM OF NON-DEVELOPING PREGNANCY AND SPONTANEOUS MISCARRIAGE IN WOMEN WITH THREATING EARLY MISCARRIAGE

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования репродуктивных потерь в виде неразвивающейся беременности и самопроизвольного выкидыша в сроке гестации до 22 недель, у женщин с угрожающим ранним выкидышем в 5-12 недель беременности.
Актуальность
предлагаемого способа определяется тем, что репродуктивные потери имеют не только медицинское, но и большое социальное значение. Это связано с наметившейся в последние годы неблагоприятной демографической тенденцией к снижению рождаемости в нашей стране [Акушерство: национальное руководство / под ред. Г.М. Савельевой, Г.Т. Сухих, В.Н. Серова, В.Е. Радзинского. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. - 1080 с.]. Несмотря на достижения в развитии акушерско-гинекологической службы и репродуктивной медицины, частота самопроизвольного прерывания беременности в России остается высокой - от 15 до 23% от всех зарегистрированных беременностей [Подзолкова Н.М., Скворцова М.Ю., Денисова Т.В. Самопроизвольное прерывание беременности: современные подходы к диагностике, лечению и профилактике. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2018. - 224 с.].
Разработанный способ прогнозирования репродуктивных потерь в виде неразвивающейся беременности и самопроизвольного выкидыша в сроке до 22 недель гестации у женщин с угрожающим ранним выкидышем в 5-12 недель беременности позволит обеспечить персонифицированный подход к тактике ведения пациенток, своевременно провести профилактические и лечебные мероприятия с целью сохранения желанной беременности.
Известен способ прогнозирования исхода беременности у женщин с угрожающим выкидышем ранних сроков (до 12 недель), включающий исследование спермы отца ребенка, путем количественного определения плацентарного альфа-2 микроглобулина (ПАМГ-2). При уровне ПАМГ-2 в сперме мужа менее или равном 8 мкг/мл прогнозируют самопроизвольный выкидыш. При уровне ПАМГ-2 в сперме 16-64 мкг/мл прогнозируют донашивание беременности [Патент № 2103686. Российская Федерация. Способ прогнозирования исхода беременности у женщин с угрожающим выкидышем ранних сроков / Посисеева Л.В., Бойко Е.Л. // Изобретения. - 1998. - № 3, Ч.2. - С. 332].
Способ имеет недостатки:
- необходимость обследования отца ребенка;
- исследование ПАМГ-2 не может объективно отражать качество спермы в момент зачатия, так как впоследствии его уровень может изменяться при инфекционно-воспалительных процессах, под действием неблагоприятных факторов окружающей среды, в стрессовых ситуациях и др.;
- длительность проведения реакции (18-24 ч).
Известен способ прогнозирования репродуктивных потерь в сроке до 22 недель беременности у женщин с угрожающим выкидышем и привычным невынашиванием в анамнезе, при котором в периферической венозной крови беременных с угрожающим выкидышем в сроке 5-12 недель гестации и привычным невынашиванием в анамнезе до назначения сохраняющей терапии определяют относительное содержание IL-10+ клеток среди СD20+ В-лимфоцитов, и при его значении равном 4,5% или менее прогнозируют репродуктивные потери в виде неразвивающейся беременности и самопроизвольного выкидыша в сроке гестации до 22 недель [Патент № 2746033. Российская Федерация. Способ прогнозирования репродуктивных потерь в сроке до 22 недель беременности у женщин с угрожающим выкидышем и привычным невынашиванием в анамнезе / Малышкина А.И., Сотникова Н.Ю., Воронин Д.Н., Куст А.В., Таланова И.Е. // Изобретения. Полезные модели. - 2021. - № 10].
Способ имеет следующие недостатки:
- способ является менее точным (87,9%) и специфичным (82,6%), по сравнению с заявляемым;
- способ сложен в исполнении и менее доступный, так как требует дорогостоящего оборудования и реактивов, которыми обеспечены только учреждения родовспоможения 3 уровня;
- способ предназначен для прогнозирования репродуктивных потерь в виде неразвивающейся беременности и самопроизвольного выкидыша только у женщин с привычным невынашиванием в анамнезе, что ограничивает применение данного способа у женщин без привычного невынашивания в анамнезе.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ прогнозирования репродуктивных потерь в виде неразвивающейся беременности и самопроизвольного выкидыша до 22 недель беременности у женщин с угрожающим ранним выкидышем в 5 - 12 недель беременности путем определения до начала сохраняющей терапии содержания антагониста рецептора IL-1 (IL-1RA), при значении которого равном или более 208,3 пг/мл прогнозируют репродуктивные потери в виде неразвивающейся беременности и самопроизвольного выкидыша в сроке гестации до 22 недель с точностью 90,5% [Сывороточное содержание про- и противовоспалительных цитокинов у женщин с угрожающим ранним выкидышем в зависимости от исхода беременности / А.В. Фарзалиева, Н.Ю. Сотникова, Н.Ю. Борзова, Н.В. Крошкина // Женское здоровье и репродукция: сетевое издание. - 2022. - № 2(53). URL: https://whfordoctors.su/bez-rubriki/syvorotochnoe-soderzhanie-pro-i-protivovospalitelnyh-citokinov-u-zhenshhin-s-ugrozhajushhim-rannim-vykidyshem-v-zavisimosti-ot-ishoda-beremennosti].
Данный способ был выбран в качестве прототипа, однако он имеет ряд недостатков:
- способ является менее точным (90,5%), чувствительным (93,7%) и специфичным (88%), по сравнению с заявляемым.
Технический результат
направлен на повышение точности и расширение арсенала средств прогнозирования репродуктивных потерь в виде самопроизвольного выкидыша и неразвивающейся беременности в сроке гестации до 22 недель у женщин с угрожающим ранним выкидышем в 5-12 недель беременности.
Заявляемый технический результат достигается тем, что в периферической венозной крови беременных с угрожающим ранним выкидышем в сроке 5 - 12 недель гестации до начала сохраняющей терапии определяют содержание CD163+ клеток в гейте альтернативно активированных моноцитов CD14+CD16++ и при его значении равном 15,6% или более прогнозируют репродуктивные потери в виде неразвивающейся беременности и самопроизвольного выкидыша в сроке гестации до 22 недель с точностью 93,75%.
Способ осуществляется следующим образом:
1. К 3 мл гепаринизированной крови из кубитальной вены добавляют 3 мл Среды 199 и выделяют обогащенную суспензию мононуклеарных клеток стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина d-1,078.
6
2. Для оценки мембранной экспрессии CD маркеров периферическими моноцитами к 50 мкл суспензии мононуклеарных клеток в концентрации 1х10 клеток/мл одновременно добавляли анти-CD14, анти-CD16 (Beckman Coulter, USA) и анти-CD163 (Invitrogen,USA) моноклональные антитела по 20 мкл каждого, конъюгированных с флюоресцеин изотиоционатом (FITC), фикоэритрином (PE) и с алофикоцианидом (APC).
3. Далее клетки инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут, затем отмывают в 1 мл фосфатного буфера (PBS), содержащего 0,1% азид натрия, и фиксируют реагентом CellFix (eBioscience, Belgium) в соответствии со стандартной методикой.
4. Содержание CD163+ клеток в гейте альтернативно активированных моноцитов CD14+CD16++, определяют методом многоцветной проточной цитофлюорометрии (FACScanto II, Becton Dickinson, USA) с использованием программного обеспечения FACSDiva, и при его значении равном 15,6% или более прогнозируют репродуктивные потери в виде неразвивающейся беременности и самопроизвольного выкидыша в сроке гестации до 22 недель у женщин с угрожающим ранним выкидышем в сроке 5 - 12 недель беременности.
Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается прогнозировать репродуктивные потери в виде неразвивающейся беременности и самопроизвольного выкидыша по определению в периферической крови содержания CD163+ клеток в гейте альтернативно активированных моноцитов CD14+CD16++.
Известно, что иммунные клетки играют центральную роль в установлении баланса между иммунной толерантностью и провоспалительными реакциями, что имеет решающее значение для правильной имплантации и пролонгирования беременности [Роль клеток врожденного иммунитета в обеспечении успеха беременности на ранних сроках гестации / Н.Ю. Сотникова, Ю.С. Анциферова, Н.В. Крошкина, Д.Н. Воронин // Журнал акушерства и женских болезней. - 2013. - Т.  62, № 2. - С. 151-159].
Моноциты осуществляют важные регуляторные и эффекторные функции как во врожденном, так и в адаптивном иммунитете при беременности. Взаимодействуя с микроРНК, моноциты усиливают экспрессию программируемого лиганда-1 клеточной гибели, который угнетает адаптивную иммунную систему за счет даун-регуляции гомолога фосфатазы и тензина в моноцитах. Известно, что при беременности моноциты проявляют иммуносупрессорный фенотип за счет снижения экспрессии генов активации моноцитов, угнетают активацию Т-клеток, презентацию антигена на транскрипционном уровне. Также во время беременности происходит сдвиг моноцитов в сторону альтернативно активированных, которые подавляют пролиферацию Т-хелперов и цитотоксических Т лимфоцитов, повышая экспансию регуляторных T клеток. [Human placental exosomes induce maternal systemic immune tolerance by reprogramming circulating monocytes / K. Bai, C.L. Lee, X. Liu et al. // J. Nanobiotechnology. - 2022. - Vol. 20, № 1. - P. 86. doi: 10.1186/s12951-022-01283-2].
Все популяции моноцитов несут на себе скавенджер рецептор CD163 [Kowalska W. Expression of CD163 and HLA-DR molecules on the monocytes in chronic lymphocytic leukemia patients // Folia Histochem Cytobiol. - 2020. - Vol. 58, № 1. - P. 17-24.  DOI:10.5603/FHC.a2020.0002]. CD163 выполняют протективные, противовоспалительные и иммуномодулирующие функции. CD163 служит диагностическим параметром активации моноцитов при воспалительных заболеваниях. [CD163 expression profles in classical monocytes as biomarkers to discriminate idiopathic pulmonary fbrosis from idiopathic nonspecifc interstitial pneumonia / M.Yamashita, Y. Utsumi, H. Nagashima et al. // Scientifc Reports. - 2021. - № 11. - P. 12135. https://doi.org/10.1038/s41598-021-91407-9]. Показано, что CD163 является маркером активации клеток при аутоиммунных заболеваниях, [The expansion of CD14+ CD163+ subpopulation of monocytes and myeloid cells-associated cytokine imbalance; candidate diagnostic biomarkers for celiac disease (CD) / O. Babania, S. Mohammadi, E. Yaghoubi et al. // J. Clin. Lab. Anal. - 2021. - Vol. 35, № 10. - e23984. doi: 10.1002/jcla.23984], CD163 является прогностическим биомаркером при различных типах рака [CD163 as a Biomarker in Colorectal Cancer: The Expression on Circulating Monocytes and Tumor-Associated Macrophages, and the Soluble Form in the Blood / D. Krijgsman, N.L. De Vries, M.N. Andersen et al. // Int. J. Mol. Sci. - 2020. - Vol. 21, № 16. - P. 5925. doi: 10.3390/ijms21165925], ишемическом инсульте [CD163 as a Potential Biomarker of Monocyte Activation in Ischemic Stroke Patients / R. Greco, C. Demartini, A.M. Zanaboni et al. // Int. J. Mol. Sci. - 2021. - Vol. 22. - P. 6712. doi.org/10.3390/ijms22136712].
У женщин с тяжелыми формами преэклампсии выявлено снижение экспрессии CD163 и концентрации растворимой формы CD163 в плазме, которое предположительно связано с нарушением иммуномодуляции [Downregulation of CD163 in monocytes and its soluble form in the plasma is associated with a pro-inflammatory profile in pregnant women with preeclampsia / P.R. Nunes,  et al. // Immunol. Res. - 2019. - Vol. 67, № 2-3. - P. 194-201. doi: 10.1007/s12026-019-09078-8].
Вероятно CD163+ альтернативно активированные моноциты CD14+CD16+ при неосложненной беременности необходимы для блокирования избыточной воспалительной реакции. Повышение содержания альтернативно активированных моноцитов, экспрессирующих CD163, может быть отражением чрезмерного воспалительного процесса и нарушения иммунного гомеостаза, ведущего к самопроизвольному выкидышу.
Отличительные признаки способа:
определяют содержание CD163+ клеток в гейте альтернативно активированных моноцитов CD14+CD16++ и при его значении равном 15,6% или более прогнозируют репродуктивные потери в виде неразвивающейся беременности и самопроизвольного выкидыша.
Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами:
Пример 1.
Пациентка С., 29 лет, данная беременность третья, желанная, в зарегистрированном браке. В анамнезе 1 погибшая беременность и 1 своевременные роды. Поступила в гинекологический стационар с жалобами на тянущие боли внизу живота, кровянистые выделения. На основании клинических и функциональных методов исследования поставлен диагноз: Беременность 11 недель. Угрожающий ранний выкидыш.
До начала сохраняющей терапии проведено обследование по заявляемому способу: содержание CD163+ клеток в гейте альтернативно активированных моноцитов CD14+CD16++ составило 53,4%.
Заключение: прогноз - репродуктивные потери в виде неразвивающейся беременности и самопроизвольного выкидыша в сроке до 22 недель беременности.
После проведения сохраняющей терапии женщина выписана с диагнозом: Прогрессирующая беременность 13 недель.
В сроке 18 недель беременности женщина повторно поступила в стационар с клиническими признаками угрожающего самопроизвольного выкидыша. Начата сохраняющая терапия, без эффекта, произошел самопроизвольный выкидыш в 18 недель беременности.
Прогноз по заявляемому способу подтвердился.
Пример 2.
Пациентка В., 24 года, данная беременность вторая, желанная, в незарегистрированном браке. В анамнезе одни своевременные роды. Поступила в гинекологический стационар с жалобами на тянущие боли внизу живота, кровянистые выделения. На основании клинических и функциональных методов исследования поставлен диагноз: Беременность 6 недель. Угрожающий ранний выкидыш.
До начала сохраняющей терапии было проведено обследование по заявляемому способу: содержание CD163+ клеток в гейте альтернативно активированных моноцитов CD14+CD16++ составило 15,6%.
Заключение: прогноз - репродуктивные потери в виде неразвивающейся беременности и самопроизвольного выкидыша в сроке до 22 недель беременности.
Несмотря на проведенную сохраняющую терапию, в течение недели уровень показателей хорионического гонадотропина человека снижался, по данным ультразвукового исследования размеры плода не соответствовали сроку гестации, сердцебиение плода не определялось, на основании чего у пациентки диагностирована неразвивающаяся беременность в сроке 7 недель.
Прогноз по заявляемому способу подтвердился.
Пример 3.
Пациентка М., 27 лет, данная беременность четвертая, желанная, в зарегистрированном браке. В анамнезе один самопроизвольный выкидыш, один медицинский аборт и одни своевременные роды. Поступила в гинекологический стационар с жалобами на тянущие боли внизу живота, кровянистые выделения. На основании клинических и функциональных методов исследования поставлен диагноз: Беременность 5 недель. Угрожающий ранний выкидыш.
До начала сохраняющей терапии было проведено обследование по заявляемому способу: содержание CD163+ клеток в гейте альтернативно активированных моноцитов CD14+CD16++составило 4,9 %.
Заключение: прогноз - пролонгирование беременности.
Пациентке проведена сохраняющая терапия с положительным эффектом, после которой женщина выписана под наблюдение врача женской консультации с диагнозом: Прогрессирующая беременность 8 недель. Беременность завершилась своевременными родами в 39 недель гестации. Родился живой доношенный мальчик массой 2950 г, ростом 51 см, с оценкой по шкале Апгар 8 - 9 баллов.
Прогноз по заявляемому способу подтвердился.
Указанным способом обследованы 32 женщины с угрожающим ранним выкидышем в сроке 5 - 12 недель.
Результаты исследования приведены в таблице 1.
Таблица №1
Показатель
Количество обследованных
Всего женщин
32
Истинно-положительный результат
20
Ложно-положительный результат
1
Истинно-отрицательный результат
10
Ложно-отрицательный результат
1
Точность способа
93,75%
Чувствительность
95,2%
Специфичность
90,9%
Преимущества способа:
1. Способ имеет высокую точность 93,75%, чувствительность 95,2% и специфичность 90,9%..
2. Предлагаемый способ позволяет применить персонифицированный подход к ведению пациенток с угрожающим ранним выкидышем, своевременно провести профилактические и лечебные мероприятия с целью снижения риска репродуктивных потерь в виде неразвивающейся беременности и самопроизвольного выкидыша.