Применение вольтамперометрического метода при изучении биоантиоксидантов

МЕТОДЫ И СРЕДСТВА КОНТРОЛЯ

Применение

вольтамперометрического метода

при изучении биоантиоксидантов

Л.В. Драчева

Международная академия информатизации Е.И. Короткова, Е. Дорожко

Томский политехнический университет

Оксидативный стресс негативно влияет на организм человека в виде активных форм кислорода (АФК). В умеренных концентрациях они выполняют важную роль медиаторов в процессах передачи клеточного сигнала в живом организме, но при повышенных концентрациях оказывают разрушающее действие. В процессе оксидативного стресса происходит повреждение ли-пидов, белков, ДНК, мембран клеток.

Против токсичных эффектов АФК клетки организма используют ферментативные (супероксиддисмутаза, ката-лаза и т.д.) и неферментативные (витамины А и С, глутатион и др.) механизмы защиты. Когда организм находится в состоянии здоровья, то эффективно реализуются оба механизма, поддерживая его гомеостаз. В случае заболеваний необходимо усиливать антиоксидантную защиту организма, например за счет использования экзогенных биоантиоксидантов.

При исследовании антиоксидантной активности биокомпозиций на основе пробиотиков (биоантиоксидантов) использовали вольтамперометрический метод. Для получения вольтамперо-грамм применяли анализатор антиок-сидантной активности «Антиоксидант АОА» (ООО «НПП «Полиант», Томск). Он имеет электрохимическую ячейку объемом 10 мл, в которой находятся индикаторный ртутно-пленочный электрод, хлорид-серебряный электрод сравнения и вспомогательный электрод.

Все необходимые растворы готовили с использованием фосфатного буфера с рН 6,86 (эквимолярная смесь Ыа3Р04 и КН2Р04).

Для приготовления индикаторного ртутно-пленочного электрода его предварительно очищали путем погружения на 10 мин в этиловый спирт, а затем полировали чистящей пастой. В качестве анода использовали платино-

вый электрод. Ртутную пленку наносили на поверхность серебряного электрода с помощью электролиза в электрохимической ячейке с раствором Нд(Ы03) 2 при постоянной величине тока (1А). Толщину ртутной пленки контролировали за счет времени электролиза. При длине серебряной проволоки 0,5 см, диаметре 0,05 см и при времени электролиза 20 с толщина ртутной пленки составляла 2,5Ч0-3см, которая оставалась постоянной при проведении в течение всего эксперимента. Для устранения мешающих примесей на поверхности электрода его подвергали поляризации в виде 20 вольтамперометрических циклов в области потенциалов от 0,0 В до -2,0 В при 0,1 В/с.

Для определения антиоксидантной активности анализируемых образцов вначале в электрохимическую ячейку помещали 10 см3 фосфатного буфера для получения фоновой вольтамперо-граммы. Затем регистрировали воль-тамперограммы катодного восстановления кислорода без и с последующим добавлением определенного объема анализируемых образцов биокомпозиций с помощью постоянно-токовой вольтамперометрии при следующих условиях: индикаторный - ртутно-пле-ночный электрод, электрод сравнения - хлорид-серебряный, область потенциалов Е от 0 до -0,8 В, амплитуда 10 мВ.

Для исследования суммарной анти-оксидантной активности образцов методом вольтамперометрии использовали модельную реакцию электровосстановления кислорода (ЭВ О2), протекающую на ртутно-пленочном электроде в несколько стадий в области потенциалов от 0 до -0,8 В по механизму, аналогичному восстановлению кислорода в живых клетках:

- Н 0/,

Н-,0, +2Н+ +2е~ 2Н-,0.

В данной методике за основу принята первая волна электровосстановления кислорода на ртутно-пленочном электроде:

02 + е-

~ 0Г

о;-+ н+н о/.

н о;+ н++ Н-,0,

Природные антиоксиданты по-разному влияют на данный процесс. Можно выделить три основных механизма взаимодействия антиоксидан-тов с кислородом и его активными радикалами.

Первый механизм обусловлен каталитическим влиянием веществ на процесс электровосстановления кислорода (рис. 1). Так ведут себя ферменты супе-роксиддисмутаза, каталаза и цитохром С. В данном случае ток ЭВ О2 увеличивается, и потенциал сдвигается в положительную область, так как данные вещества благодаря своим каталитичес-

02 + е-

~ 02"

I, ткА 10 3 23

8 Ял

6

4 / V

2

00 -0,1 -0,3 -0,5 Е, V

Рис. 1. Вольтамперограммы тока ЭВ О2: 1 - фоновый электролит (фосфатный буфер, рН 6,86) и в присутствии каталазы, 2 - С=0,002г/см3; 3 - С=0,005 г/см3

0-- + Н+

н 0/+ н++е-<=^НА„

METHODS AND MEANS OF CONTROL

I, mkA 10

8

6

4

2

0

I, mkA 10

8

6

4

2

0

0 -0,1

-0,3 а

-0,5 E, V

0 -0,1 -0,3

-0,5

E, V

б

Рис. 2. Вольтамперограммы тока ЭВ О2:

1 - фоновый электролит (0,025 М буфер, рН 6,86) и в присутствии:

2, а - раствора витамина Е, С = 0,005г/см3; 2, б - раствора глутатиона, С = 0,02г/см3;

3 - линия остаточного (фонового) тока в отсутствие кислорода в растворе

№ образца Образец К-концентрационный критерий (в данном случае объем добавляемого образца, см3) K-кинетический критерий, мкмоль/дм3^мин Sr-ста ндартное отклонение

1 Пробиотик 0,8 0,407 0,03

2 3 Пробиотик 0,8 0 5 0,953 -0 177 0,04 0 03

4 Пробиотик + белок 0,4 -0,040 0,03

ким свойствам по отношению к процессу восстановления кислорода уменьшают энергию активации процесса. И кинетически, и термодинамически процесс облегчается, что визуально отражается в увеличении тока ЭВ О2.

В случае электродных процессов (5) - (6) уравнение Нернста принимает вид:

RT. а ,. +—In—

ь/о, zF а .

Если супероксидный радикал в реакции (1) реагирует с антиоксидантом, то его концентрация значительно уменьшается, а потенциал увеличивается согласно уравнению (7), т.е. происходит сдвиг потенциала в положительную область. Схожие свойства проявили исследуемые образцы биоантиокси-дантов № 3 и № 4.

Химическая реакция взаимодействия другой исследуемой группы ан-тиоксидантов с активными кислородными радикалами отражает второй механизм антиоксидантного действия.

Проявление этого механизма связано с уменьшением величины тока ЭВ О2 и сдвиге потенциала в положительную область (рис. 2, а). Так ведут себя витамин Е, аскорбиновая кислота, глутатион и другие антиоксиданты.

Смещение потенциала в положительную область свидетельствует о том, что антиоксиданты преимуще-

ственно взаимодействуют с супероксидным радикалом, а не с молекулярным кислородом.

Схожие свойства проявили исследуемые образцы биоантиоксидантов № 1 и № 2.

Химическая реакция протонизации кислорода антиоксидантом отражает третий механизм антиоксидантного действия.

Визуально проявление этого механизма выражается в уменьшении тока ЭВ О2 и сдвиге потенциала в отрицательную область (рис. 2, б). Так ведут себя тиоловые (БИ-зависимые соединения), карбоновые кислоты, амины. Таких свойств биоантиокси-данты исследуемых образцов не проявили.

Была проведена оценка антиоксидантной активности при наиболее эффективных объемах (см. таблицу). Для этого был использован такой параметр, как кинетический критерий К (мкмоль/дм3^мин), отражающий количество активных кислородных радикалов, прореагировавших с антиоксидантом за 1 мин:

где I- ток электровосстановления кислорода в присутствии образца в растворе, мкА; 10 - ток электровосстановления кислорода в отсутствие образца в растворе, мкА; С0 - исходная концентрация кислорода в растворе, мкмоль/дм3; t- время протекания реакции, мин.

По результатам определений был построен график зависимости функции (1 - 1\10) от времени Тангенс угла наклона линейной части этого графика, умноженный на величину С0, является коэффициентом антиоксидантной активности образца К.

Значения коэффициентов антиоксидантной активности исследованных образцов показаны в таблице.

Таким образом, исследуемый образец № 2 показал более высокую анти-оксидантную активность по отношению к процессу восстановления кислорода по сравнению с образцом № 1 среди образцов, антиоксиданты которых проявляют каталитическую активность.

Образец № 3 показал более высокую антиоксидантную активность (сравнение по абсолютному значению) по отношению к образцу № 4 среди образцов, антиоксиданты которых проявляют антирадикальную активность.

Следует отметить, что каждый из исследованных образцов имеет определенную область эффективного объема.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о наличии ан-тиоксидантных свойств у изученных биокомпозиций на основе пробиоти-ков. Следовательно, их можно использовать в качестве биологически активных препаратов, которые могут быть рекомендованы как экзогенные для защиты организма человека от повреждающего действия свободных радикалов, в частности, его сердечно-сосудистой системы.

К = 1--