Оценка противоопухолевого действия погруженной культуры ophiocordyceps sinensis и Cordyceps militaris

Оценка противоопухолевого действия погруженной культуры Ophiocordyceps sinensis и Cordyceps militaris

А. В. АВТОНОМОВА', Л. М. КРАСНОПОЛЬСКАЯ', М. И. ШУКТУЕВА', Е. Б. ИСАКОВА', В. М. БУХМАН2

1 НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН, Москва

2 Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина, Москва

Assessment of Antitumor Effect of Submerged Culture of Ophiocordyceps sinensis and Cordyceps militaris

A. V. AVTONOMOVA, L. M. KRASNOPOLKAYA, M. I. SHUKTUEVA, E. B. ISAKOVA, V. M. BUKHMAN,

G. F. Gause Research Institute of New Antibiotics, Moscow N. N. Blokhin Russian Scientific Cancer Centre, Moscow

Метаболиты кордицепсов, относящихся к видам Ophiocordyceps sinensis и Cordyceps militaris, обладают высоким потенциалом для возможного использования в лечении различных опухолей и других заболеваний. Поиск и изучение биологической активности кордицепсов сохраняет актуальность в настоящее время. Были изучены противоопухолевые свойства погруженного мицелия O.sinensis и C.militaris. Сухая биомасса O.sinensis в дозе 50 мг/кг в сутки тормозила рост лимфолейкоза Р388, привитого подкожно мышам, на 65%. Сухая биомасса C.militaris была менее активна и тормозила рост опухоли на 54%. Водный экстракт погруженной культуры O.sinensis проявил высокую стимулирующую рост опухоли активность. Опухолевый узел лимфолейкоза Р388 у мышеи под действием экстракта O.sinensis рос почти в два раза быстрее, чем в контрольной группе. Использование O.sinensis в качестве источника биологически активных субстанций требует особой тщательности и повышенного внимания, т.к. препараты этого гриба могут вызвать стимуляцию опухолевого роста.

Ключевые слова: метаболиты кордицепсов, Ophiocordyceps sinensis, Cordyceps militaris, противоопухолевое действие.

Ophiocordyceps sinensis and Cordyceps militaris metabolites showed a high potential in the treatment of tumors as well as some other diseases. Antitumor properties of O.sinensis and C.militaris submerged mycelium were investigated. It was found that the O.sinensis dry biomass in a dose of 50 mg/kg administered once a day to the mice with subcutaneously inoculated P388 lymp-holeucosis lowered the tumor growth by 65% vs. 54% for the C.militaris dry biomass. The water extract of O.sinensis submerged culture however accelerated the growth of the Р388 lympholeucosis tumor node in the mice almost two times, compared to the control. A greater caution in using this fungus as a source of biologically active substances is required since unwanted tumor-stimulating effects can arise.

Key words: fungi metabolites, Ophiocordyceps sinensis, Cordyceps militaris, antitumor properties.

Введение

Одним из наиболее таинственных и загадочных лекарственных средств Тибета и Китая является «ярсагумба». Это средство, как оказалось, создается на основе удивительных по своей экологии и биологии грибов-эндопаразитов насекомых из отдела сумчатых грибов (Ascomycota). Представители нескольких близкородственных родов этой группы, по сведениям медицины стран Юго-Восточной Азии, являются афродизи-аком и обладают сильным адаптогенным и имму-номодулирующим действием. Ophiocordyceps sinensis (Berk.) G. H. Sung, J. M. Sung, Hywel-Jones & Spatafora — кордицепс китайский и Cordyceps

© Коллектив авторов, 2015

Адрес для корреспонденции: 119021, Москва, Б. Пироговская ул., 11. НИИНА им Г. Ф. Гаузе РАМН

militaris (Ь.) Бг.-кордицепс военный — самые популярные виды этой группы.

В народной медицине около двух тысяч лет использовали плодовые тела кордицепсов, найденных в природе. Теперь в основном используются плодовые тела, выращенные искусственно.

За последние пятьдесят лет были обнаружены иммуномодулирующие, противоопухолевые, антидиабетические, гиполипидемические, антиок-сидантные свойства культивируемых плодовых тел и мицелия O.sinensis и C.militaris [1]. В последние годы особенно популярным субстратом для получения биологически активных веществ кор-дицепсов стала мицелиальная культура, выращенная при погруженном культивировании.

Из плодовых тел, мицелия и культуральной жидкости были выделены разнообразные биологически активные вещества, обладающие пере-

численными свойствами. Это внутриклеточные и внеклеточные полисахарида:; нуклеозиды (кор-дицепин, аденозин, гуанозин и др.); стеролы (эр-гостерол, ситостерол и др.); пептиды (кордимин, мириоцин, циклодипептиды); статины и др [1].

Противоопухолевые свойства кордицепсов обусловлены в первую очередь прямым действием кордицепина — З'-дезоксиаденозина, а также опосредованным действием через иммунную систему упомянутого выше кордицепина и содержащихся в кордицепсах полисахаридов. И кордицепин, и полисахариды содержатся в плодовых телах и мицелии O.sinensis и C.militaris и в их водных экстрактах.

Мицелий O.sinensis индуцировал апоптоз мышиных опухолевых клеток Leydig МА-10 [2]. Погруженная мицелиальная культура C.militaris значительно тормозила пролиферацию клеток глиобластомы человека линий GBM8401 и U-87MG, вызывая остановку клеточного цикла в фазах G0/G1 и G2/M соответственно [3].

Водный экстракт из культивированных плодовых тел O.sinensis в экспериментах in vitro проявлял цитотоксичность в отношении клеток мышиной меланомы B16-BL6, мышиной карциномы Льюиса LLC [4], фибросаркомы HT1080 человека, карциномы толстой кишки человека [5]. В опытах in vivo водный экстракт O.sinensis увеличивал продолжительность жизни мышей с привитой фибросаркомой Meth A, карциномой Эрлиха [6]. На мышиной меланоме B16-BL6 водный экстракт плодовых тел O.sinensis усиливал действие метотрексата, увеличивая продолжительность жизни мышей [7]. Экстракт C.militaris ингибировал ангиогенез и рост опухолевых клеток меланомы человека [8, 9]. Экстракт C.militaris ингибировал рост клеток карциномы почки, вызывая апоптоз клеток и остановку клеточного цикла значительно сильнее, чем корди-цепин в чистом виде [10]. Этилацетатный экстракт мицелия O.sinensis ингибировал пролиферацию и вызывал апоптоз клеток проми-елоцитарного лейкоза человека HL-60 [11].

Кордицепин был впервые выделен из C.militaris в 1950 году [12]. Затем он был обнаружен и в других видах кордицепса [13]. В опытах in vitro было показано, что кордицепин обладает прямой цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток, вызывая апоптоз клеток рака простаты человека PC-3 [13], тормозя рост мышиной меланомы B16-BL6, мышиной карциномы Льюиса LLC. Кордицепин, выделенный из жидкой культуры C.militaris, in vivo тормозил рост мышиной асцитной опухоли Эрлиха и увеличивал продолжительность жизни мышей с опухолью [14], проявлял антиметастатическую активность [15]. Пероральное введение кордицепина ингибировало рост меланомы В16 у мышей без каких-либо системных побочных эффектов [13].

Экзополисахариды, полученные из культу-ральной жидкости кордицепсов, обладают имму-номодулирующими и противоопухолевым действием, способны напрямую индуцировать дифференциацию опухолевых клеток, повышать противоопухолевую активность организма путём активации его иммунных реакций. Полисахриды, выделенные из погруженной культуры ОМпгт1$, повышали активность перитонеальных макрофагов и лимфоцитов селезёнки у мышей с привитой опухолью, что приводило к проявлению противоопухолевого действия [16]. Экзополисахариды ОМпгт1$ индуцировали созревание дендритных клеток, которые запускают иммунные реакции, ведущие к активации цитотоксических Т-лимфо-цитов, которые в свою очередь играют одну из ключевых ролей в процессах иммунотерапии опухоли [17]. Помимо опосредованных через иммунную систему реакций, был показан эффект полисахаридов непосредственно на опухолевые клетки. Из погруженной культуры ОМпгт1$ был выделен манноглюкан, обладающий невысокой ингибирующей активностью в отношении опухолевых клеток лёгкого линии 8РС-1 [18].

Поиск перспективных противоопухолевых субстанций ведётся непрерывно, поэтому неудивительно, что исследователи во всём мире, работающие с природными биологически активными субстанциями, проявляют постоянный интерес к кордицепсам вот уже более пятидесяти лет. Поиск, обнаружение и синтез новых субстанций для разработки эффективных лекарственных препаратов может напрямую повлиять на развитие отечественной фарминдустрии.

Целью настоящей работы было оценить противоопухолевое действие мицелиальной биомассы нескольких штаммов О.81пвт18 и С.тИИапя.

Материал и методы

В работе использовали штаммы 4 и 7 Омпвж18 и штаммы 1002 и 1003 С.тййап8 из коллекции лаборатории биосинтеза биологически активных соединений ФГБУ «НИИНА» РАМН.

Погруженное культивирование О.8твт18 и С.тййат осуществляли в колбах вместимостью 0,75 л на ротационной качалке при 220 об/мин. Температура культивирования составляла 25°С. Среду стерилизовали при 1,2 атм в течение 30 мин. Среда содержала глюкозу — 20 г/л, соевую муку — 10 г/л, жидкий кукурузный экстракт — 0,5% по объёму, Щ804 -7 Н20 — 0,25 г/л и КН2Р04 — 2,5 г/л. Длительность процесса культивирования составляла 7 сут. Опыты ставили в трёх повторностях. Сухую погруженную биомассу получали путём отделения мицелия от культуральной жидкости центрифугированием при 3000 об/мин, с последующим промыванием дистиллированной водой и высушиванием до постоянного веса при температуре, не превышающей 45°С. Сухую погруженную биомассу Озтепт и С.тййат дробили в порошок с использованием бытовой кофемолки.

Экстракт погруженной культуры О.8твж18 получали путем автоклавирования погруженной культуры, содержащей культуральную жидкость и мицелий. Режим автоклавирова-ния — 1,2 атм. 2 часа. Жидкую фазу автоклавированной погруженной культуры (экстракт) отделяли от мицелия с использованием бумажного фильтра и хранили при — 20°С.

Таблица 1. Противоопухолевое действие воздушно-сухой биомассы штамма 4 O.sinensis

Группа 14-е сут 18-е сут

РМО*, мг ТРО**, % p-value РМО*, мг ТРО**, % p-value

Контроль роста опухоли 193+54 O.sinensis, штамм 4 67+31 65 0,065 1348+306 608+171 55 0,053

Примечание. Здесь и в табл. 2-5: * РМО - расчётная масса опухоли; ** ТРО - торможение роста опухоли. Таблица 2. Противоопухолевое действие воздушно-сухой биомассы штамма 7 O.sinensis

Группа 14-е сутки 17-е сутки

РМО*, мг ТРО**, % p-value РМО*, мг ТРО**, % p-value

Контроль роста опухоли 132+ 33 O.sinensis, штамм 7 48+32 63 0,090 715 + 106 441 +143 38 0,098

Таблица 3. Противоопухолевое действие воздушно-сухой биомассы штамма 1002 C.militaris

Группа 14-е сутки 18-е сутки

РМО*, мг ТРО**, % p-value РМО*, мг ТРО**, % p-value

Контроль роста опухоли 193+54 — — 1348+306 — —

C.militaris штамм 1002 203+102 -5 0,929 899+268 33 0,285

Таблица 4. Противоопухолевое действие воздушно-сухой биомассы штамма 1003 C.militаris

Группа _14-е сутки_18-е сутки_

РМО*, мг ТРО**, % р-уа1ие РМО*, мг ТРО**, % р-уа1ие

Контроль роста опухоли 193+54 — — 1348+306 — —

С.тШат штамм 1003 127+56 34 0,416 620+188 54 0,062

Таблица 5. Эффект экстракта погруженной культуры O.sinensis на модели привитого подкожно Т-лимфо-лейкоза Р388

Группа _14-е сутки_17-е сутки_

РМО*, мг ТРО**, % р-уа1ие РМО*, Мг ТРО**, % р-уа1ие

Контроль роста опухоли 164+34 — — 1354+261 — —

O.sinensis, штамм 7 319+58 -95 0,100 1367+215 -1 0,996

Противоопухолевое действие препаратов кордицепсов оценивали на мышах с привитым подкожно лимфолейкозом P388. Мышей получали из питомника РАМН «Крюково» и выдерживали в карантине 21 день. Количество мышей в контрольных и экспериментальных группах составляло 8—11 животных. Опухоли прививали гибридным мышам C57B1/6J x DBA/2)F1 (BDF1), самцам. Мышам в день «0» опыта подкожно вводили суспензию клеток лимфолейкоза P388 1х106 опухолевых клеток. Лечение проводили в течение 10 сут (с 3 по 12-е сут) и в течение 15 сут (с 3 по 17-е сут). Суточная доза сухой погруженной биомассы составляла 50 мг/кг, экстракт погруженной культуры — 0,25 мл/мышь. Препараты вводили внутрижелудочно с помощью зонда. Сухую биомассу вводили в виде суспензии в крахмальном клейстере (0,25 мл/мышь). В течение опытов следили за общим состоянием мышей, изменением массы тела, динамикой роста опухоли. Торможение роста опухоли (ТРО) рассчитывали по формуле: ТРО (%)=(Мк-Мо)/(Мк)х100, где Мк и Мо — средняя расчётная масса опухоли (РМО) в контроле и опыте соответственно. Массу опухоли рассчитывали по формуле М (мг) = (aXbXc)/2, где М -расчётная масса опухоли, a, b, c — три наибольших вза-имоперпедикулярных диаметра опухолевого узла в мм. Достоверность различий средних определяли по t-критерию Стъю-дента. За достоверные принимали различия при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Противоопухолевое действие мицелиальной биомассы O.sinensis и C.militaris оценивали in vivo. Мышам BDF1 с привитым подкожно лимфолейко-

зом Р388 вводили внутрижелудочно сухую биомассу кордицепсов в виде суспензии в дозе 50 мг/кг.

Воздушно-сухая мицелиальная биомасса O.sinensis оказывала умеренное противоопухолевое действие, выражавшееся в торможении роста подкожного опухолевого узла. Ежедневное внут-рижелудочное введение в течение 10 суток биомассы O.sinensis штамм 4 привело к торможению роста опухоли на 65% (табл. 1). Торможение роста опухоли при введении биомассы штамма 7 O.sinensis составило на 14-е сутки 63% (табл. 2).

Противоопухолевое действие мицелиальной биомассы С.тйиапя в наших опытах было мало выражено. В группе животных, получавших биомассу штамма 1002 С.тйиапя, противоопухолевый эффект отсутствовал (табл. 3). Мицелиальная биомасса штамма 1003 C.militaris проявила невысокий противоопухолевый эффект. На 18-е сутки опыта ТРО в группе, получавшей мицелиальную биомассу штамма 1003 С.тйиапя, составило 54 % (табл. 4).

В отличие от воздушно-сухой мицелиальной биомассы экстракт погруженной культуры O.sinensis штамм 7 оказал сильное стимулирующее действие на рост подкожного опухолевого узла лимфолейкоза Р388 (табл. 5). В опытных группах у

мышей, которым вводили водный экстракт этого гриба, опухоль росла в два раза быстрее, чем в контроле. Стимулирующий рост опухоли эффект экстракта был получен, несмотря на то что способ приготовления экстракта погруженной биомассы был ранее опробирован на других культурах грибов. Ранее в наших работах подобная экстракция всегда давала положительные результаты. Так, смесь приготовленных по описанной выше методике экстрактов погруженной культуры видов Ganoderma lucidum, Ttrametes versicolor и Hypsizygus ulmarius, проявляла достоверный выраженный противоопухолевый эффект на той же модели опухоли, которая описана в настоящей статье [19]. Результаты говорят о том, что приготовление новых экстрактов по уже отработанным методикам не всегда ведёт к положительному результату. Это особенно важно иметь в виду при приготовлении лекарственных препаратов из новых субстанций.

Заключение

Метаболиты кордицепсов, относящихся к видам O.sinensis и C.militaris, обладают высоким по-

ЛИТЕРАТУРА

1. Lo H.C., Hsieh C, Lin F.Y., Hsu T.H. A systematic review of the mysterious caterpillar fungus Othiocordyceps sinensis in Dong-ChongXiaCao and related bioactive ingredients. J Tradit Complement Med, 2013; 3: 16—32.

2. YangH.Y., Leu S.F., Wang Y.K., Wu C.S., HuangB.M. Cordycepssinensis mycelium induces MA-10 mouse Leydig tumor cell apoptosis by activating the caspase-8 pathway and suppressing the NF-kappaB pathway. Arch Androl, 2006; 52: 103—110.

3. Yang C.H, Kao Y.H, Huang K.S., Wang C.Y., Lin L.W. Cordyceps militaris and mycelial fermentation induced apoptosis and autophagy of human glioblastoma cells. Cell Death Dis,2012; 3: e431.

4. Nakamura K, Yamaguchi Y, Kagota S, Kwon Y.M., Shinozuka K. and Kunitomo M.Inhibitory effect of Cordyceps sinensis on spontaneous liver metastasis of Lewis lung carcinoma and B16 melanoma cells in syngeneic mice. Jpn J Pharmacol, 1999; 79: 335—341.

5. Yoshikawa N, Nishiuchi A., Kubo E, Yamaguchi Y, Kunitoma M, Kagota S. et al. Cordyceps sinensis acts as an adenosine A3 receptor against on mouse melanoma and lung carcinoma cells, and human fibrosarcoma and coloncarcinova cells. Pharmacol Pharm, 2011; 2: 266—270.

6. Yoshida J., Takamura S,. Yamaguchi N, Ren L.J., Chen H, Koshimura S, Suzuki S. Antitumor activity of an extract of Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. against murine tumor cell lines. Jpn J Exp Med, 1989; 59: 157—161.

7. Nakamura K, Konoha K, Yamaguchi Y, Kagota S, Shinozuka K, Kunitoma M. Combined effects of Cordyceps sinensis and methotrexate onhemato-genic lung metastasis in mice. Recept Channel, 2003; 9: 329—334.

8. Ruma I.M., Putranto E.W., Kondo E, Watanabe R., Saito K, Inoue Y, Yamamoto K, Nakata S, Kaihata M, Murata H, Sakaguchi M. Extract of Cordyceps militaris inhibits angiogenesis and suppresses tumor growth of human malignant melanoma cells. Int J Oncol, 2014; 45: 209—218.

9. Yoo H.S, Shin J.W., Cho J.H, Son C.G., Lee Y.W, Park S.Y., Cho C.K. Effects of Cordyceps militaris extract on angiogenesis and tumor growth. Acta Pharmacol Sin, 2004; 25: 657—665.

10. Yamamoto K, Shichiri H, Uda A., Yamashita K, Nishioka T, Kume M, Makimoto H, Nakagawa T, Hirano T, Hirai M. Apoptotic effects of the

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Автономова Анастасия Витальевна — к. б. н., старший научный сотрудник, НИИНА им. Г. Ф. Гаузе, Москва

Краснопольская Лариса Михайловна — д. б. н, заведующий лабораторией, НИИНА им. Г. Ф. Гаузе, Москва

тенциалом для использования в медицине для поддерживающего и сочетанного лечения различных опухолей и других заболеваний.

В работе было показано, что сухая биомасса обоих исследованных штаммов ОМпгт1$ обладала противоопухолевым эффектом, выражавшимся в достижении 63—65% торможения опухоли. Сухая биомасса штамма С.т1Шап5 была малоактивна. Биомасса только одного штамма О.$1пгт1$ 1003 проявила противоопухолевую актвность. Было отмечено торможение роста опухоли на 54%.

Экстракт погруженной культуры ОМпгт1$ штамм 7 проявил высокую активность, стимулирующую рост опухоли почти в два раза. Использование О.$1пгт1$ для создания новых биологически активных субстанций требует повышенного внимания, а проведение работы и разработка методики получения субстанции — особой тщательности, т. к. возможна стимуляция опухолевого роста под влиянием препаратов из кордицепсов.

extracts of Cordyceps militaris via erk phosphorylation in a renal cell carcinoma cell line. Phytother Res, 2015; 29: 707—713.

11. ZhangQ, Wu J., Hu Z, Li D. Induction of HL-60 apoptosis by ethyl acetate extract of Cordyceps sinensis fUngal mycelium. Life Sci, 2004; 75: 2911—2919.

12. Cunningham K.G., Manson W, SpringF.S, Hutchinson S.A. Cordycepin, a metabolic product isolated from cultures of Cordyceps militaris (Linn.) Link. Nature, 1950; 166: 949

13. Yoshikawa N, Nakamura K, Yamaguchi Y, Kagota S, Shinozuka K, Kunitomo M. Antitumor activity of cordycepin in mice. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol, 2004; 31: 351—353

14. JaggerD.V. KredichN.M., GuarinoA.J.Inhibition of Ehrlich mouse ascites tumor growth by cordycepin. Cancer Res, 1961; 21: 216—220.

15. Nakamura K, Konoha K, Yoshikawa N, Yamaguchi Y, Kagota S, Shinozuka K, Kunitomo M.Effect of cordycepin (3'-deoxyadenosine) on hematogenic lung metastatic model mice. In Vivo, 2005; 19: 135—142.

16. Zhang W, Li J., Qiu S, Chtn J., Zheng Y. Effects of the exopolysaccharide fraction (EPSF) from cultivated Cordyceps sinensis on immunocytes ofH22 tumor bearing mice. Fitoterapia, 2008; 79: 168—173.

17. Song D, Lin J. Y, Yuan F. J., Zhang W. Ex vivo stimulation of murine dendritic cells by an exopolysaccharide from one of the anamorph of Cordyceps sinensis. Cell Biochemistry and Function, 2011; 29: 555—561.

18. Wu Y, Hu N, Pan Y, Zhou L, Zhou X. Isolation and characterization of a mannoglucan from edible Cordyceps sinensis mycelium. Carbohydr Res, 2007; 342: 870—875.

19. Бухман B.M, Исакова Е.Б, Антимонова A.B., Белицкий И.В, Либензон A.B., Краснопольская Л.М. Изучение противоопухолевых свойств мицелия лекарственного гриба Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P. Karst в опытах in vivo. Успехи медицинской микологии. Материалы первого всероссийского конгресса по медицинской микологии. М.: 2003; 1: 245-247. / Buhman V.M., Isakova E.B., Antimonova A.V., Belickij I.V., Libenzon A.V., Krasnopol'skaja L.M. Izuchenie protivoopuholevyh svojstv micelija lekarstvennogo griba Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P. Karst v opy-tah in vivo.Uspehi medicinskoj mikologii. Materialy pervogo vserossijskogo kongressa po medicinskoj mikologii. M.: 2003; 1: 245—247. [in Russian]

Шуктуева Мария Ильинична — научный сотрудник, НИИНА им. Г. Ф. Гаузе, Москва

Исакова Елена Борисовна — научный сотрудник, НИИНА им. Г. Ф. Гаузе, Москва

Бухман Владимир Михайлович — д. м. н., профессор, заведующий лабораторией, НИИНА им. Г. Ф. Гаузе, Москва