Интенсивность свободнорадикальных процессов в митохондриях печени крыс при глубокой гипотермии

ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ГЛУБОКОЙ ГИПОТЕРМИИ

С.И. Хизриева, Р.А. Халилов, А.М. Джафарова

ФГБОУ ВО «Дагестанский государственный университет», Махачкала

Abstract

The intensity of lipid peroxidation, the oxidative modification of proteins, and the content of sulfhydryl groups of the protein and non-protein fraction of rat liver mitochondria under hypothermia were studied. It was established that deep hypothermia is accompanied by oxidative modification of lipids and mitochondrial proteins. However, no significant changes in the level of sulfhydryl groups were observed.

Key words: oxidative modification of proteins, lipid peroxidation, hypothermia

Исследованы интенсивность перекисного окисления липидов, окислительной модификации белков и содержание сульфгидрильных групп белковой и небелковой фракции митохондрий печени крыс при гипотермии. Установлено, что глубокая гипотермия сопровождается окислительной модификацией липидов и белков митохондрий. Однако, значительных изменений в уровне содержания сульфгидрильных групп не обнаружено.

Ключевые слова: перекисное окисление липидов, окислительная модификация белков, гипотермия

Глубокая гипотермия применяется в медицине уже давно при ишемии мозга, инсульте, остановке сердца, гипоксии [4, 5]. Это связано с тем, что снижение температуры тела до 20 °С вызывает состояние так называемого холодового наркоза с резким угнетением подвижности, интенсивности метаболизма и исчезновением электрической активности головного мозга [3]. Этот защитный эффект глубокой гипотермии связан с уменьшением потребности клеток в энергии при различных травмах тела. Однако при эксидентальной (непреднамеренной) гипотермии, когда температура тела может снижаться до 25-20°С, происходит подавление процессов, генерирующих АТФ, и глубокая гипотермия становится сама фактором риска. Возможно, опасное влияние глубокой гипотермии основано на нарушении целостности мембран и функционировании ЭТЦ митохондрий, что может в конечном счете привести к активации свободнорадикальных процессов и окислительному стрессу.

В связи с этим, целью нашего исследования является изучение интенсивности свободнорадикальных процессов при глубокой гипотермии (температура тела 19-20°С) в митохондриях печени крыс.

Материалы и методы исследования Исследование проводилось на самцах белых беспородистых крыс массой 180-220 гр. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным

доступом к воде и пище. Гипотермию вызывали в холодовой камере, в которой циркулировала вода с температурой 4-5°С. Температуру тела снижали до 19-20°С в течение 60 минут (0,28 °С/ мин). Митохондрии печени выделяли методом дифференциального центрифугирования. Гомогенат печени центрифугировали при 2000 об/мин 10 мин на центрифуге Eppendorf, ротор F-34. Для осаждения митохондрий отобранный супернатант центрифугировали 10 мин при 10000 об/мин 2 раза. Осадок митохондрий ресуспензировали в небольшом количестве среды держали на льду. Интенсивность свободнорадикальных процессов определяли по содержанию продуктов ПОЛ и окислительной модификации белков - малонового диальдегида (МДА) и карбонильных групп, также по содержанию сульфгидрильных групп (SH-групп) белковой фракции мембран и матрикса и небелковой фракции (восстановленный глутатион) митохондрий. Содержание МДА определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой, в результате которой образуется окрашенный комплекс с максимумом поглощения при длине волны 532 нм [1]. Об уровне карбонильных производных белков судили по реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, которые регистрировали спектрофотометрически при длине волны 370 нм [2]. Концентрацию SH-групп белковой фракции измеряли колориметрическим методом [6]. Оптическую плотность проб измеряли при 412 нм против контроля. Содержание восстановленного глутатиона (GSH) определяли методом Эллмана [2]. Измерения параметров производились на спектрофотометре (Beckman Coulter DU730 UV-Vis Spectrophotometer, New Boston, USA). Обработку данных вели на компьютере, с использованием пакета СТАТИСТИКА.

Результаты

При исследовании продуктов ПОЛ и окислительной модификации белков при глубокой гипотермии в митохондриях печени крыс обнаружено повышение содержания МДА в опытной группе на 20% относительно контрольной группы, карбонильных групп в гипотермированной группе относительно контроля возросло почти в 2 раза. Однако, уровень сульфгидрильных групп в белковой фракции мембран и матрикса митохондрий не претерпел изменений. Наблюдается незначительное снижение восстановленного глутатиона у гипотермированных крыс.

Обсуждения и выводы

Повышение содержания уровня МДА и карбонильных групп в митохондриях печени крыс свидетельствует об интенсификации свободнорадикальных процессов в тканях при глубокой гипотермии. Можно предположить, что глубокая гипотермия способствует генерации АФК митохондриями, которые разрушают структуру мембран и белков самих органелл и клетки в целом. Вместе с тем, митохондрии печени обладают мощной антиоксидантной системой защиты, которая обеспечивает устойчивость клеток к окислительному стрессу. Известно, что восстановленный глутатион (GSH) поддерживает редокс-состояние сульфгидрильных групп белков. Возможно, в митохондриях печени при глубокой гипотермии активизируются механизмы

воостановления белковых тиоловых групп с участием восстановленного глутатиона.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют об интенсификации свободнорадикальных процессов, в то же время, наблюдается устойчивость SH-групп белков в митохондриях печени крыс.

Список литературы

1. Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. дело. 1988. №11. С. 41- 43.

2. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма. СПб.: Фолиант, 2000.

3. Эмирбеков Э.З., Кличханов Н.К. Свободнорадикальные процессы и состояние мембран при гипотермии. Ростов-на-Дону, 2011. 200 с.

4. Кламмер М.Е. Глубокая гипотермия при операциях на открытом сердце: Автореф. дисс. ... канд.мед. наук. М., 1965. 21 с.

5. Царев А.В. Целевой температурный менеджмент в клинической практике интенсивной терапии критических состояний // Медицина неотложных состояний. 2014. №7. С. 186-191.

6. Habeeb A. Reaction of protein sulfhydryl groups with Ellman's reagent // Methods in enzymology, 1972.