Формирование внеклеточного пула БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток

ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2012

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 612.017.1.014.083

А. М. Сапожников, А. В. Зяблицин, Э. А. Алекперов, А. А. Бойко, О. А. Шустова,

Н. И. Яуцан

формирование внеклеточного пула БтШ70 в популяциях лимфоидных клеток

УРАН Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

В литературе подробно освещено активирующее действие экзогенных белков теплового шока (БТШ), в частности БТШ70, на антигенпредставляющие клетки. Отмечено, что экзогенные БТШ70 взаимодействуют и с другими звеньями иммунной системы, например с популяциями Т-лимфоцитов и NK-клеток. В последние годы появились сведения о существовании в сыворотке крови человека и животных циркулирующего внеклеточного пула БТШ70 эндогенного происхождения. Кроме этого, накопленные данные указывают на то, что внеклеточный пул БТШ70 вовлечен в иммунные процессы. Причем клетки иммунной системы могут быть не только мишенями для этих протеинов, но и источником внеклеточных БТШ70. Данная работа посвящена изучению феномена секреции БТШ70 в популяциях лимфоцитов. Полученные результаты свидетельствуют о способности всех типов лимфоидных клеток продуцировать внеклеточную форму БТШ70. Это позволяет рассматривать лимфоидные клетки как один из источников сывороточных БТШ70, циркулирующих в организме.

Ключевые слова: иммунорегуляция, белки теплового шока, лимфоциты, экзоцитоз Sapozhnikov A.M., ZyablitsinA.V., Alekperov E.A., BoikoA.A., Shustova O.A., Lutsan N.I.

generation of the extracellular pool of hsp-70 in lymphoid cell populations

The current literature contains a wealth of the data that shed light on the activating effect of extracellular heat shock proteins, in the first place HSP-70, on the antigen-presenting cells. Moreover, they give evidence that exogenous HSP-70 interacts with other components of the immune system, such as T-lymphocytes and natural killer cells. A number of reports published in the last years have demonstrated the existence of the extracellular pool of HSP-70 in peripheral blood sera of humans and laboratory animals. The extracellular HSP-70 molecules have been shown to participate in the immune processes. Besides, the immunocompetent cells can be not only the targets for HSP-70 molecules but also produce this extracellular protein themselves. The objective of the present study was to analyse the phenomenon of HSP-70 exocytosis in the populations of lymphocytes. The results obtained indicate that the pool of extracellular HSP-70 can be generated in the populations of different types of lymphoid cells. They suggest that populations of lymphoid cells play the role of the source of extracellular HSP-70 that enters the systemic circulation.

Key words; immunoregulation, heat shock proteins, lymphocytes, exocytosis

В настоящее время достаточно подробно описано активирующее действие экзогенных белков теплового шока (БТШ), в частности БТШ70 и БТШ90, на антигенпредставляющие клетки. Показано, что с влиянием на это звено иммунной системы связаны уникальные иммуностимулирующие свойства данных протеинов, позволяющие использовать их для создания эффективных вакцин [21]. Продемонстрировано также, что экзогенные БТШ взаимодействуют и с другими звеньями иммунной системы, например с популяцией Т-лимфоцитов [23], NK-клеток [15] и с системой комплемента [16]. В свете этих данных представляют несомненный интерес опубликованные в последние годы сведения о существовании в сыворотке крови человека и животных циркулирующего внеклеточного пула БТШ70 эндогенного происхождения, повышенный уровень которого наблюдается при различных патологиях и в условиях стресса [2, 10]. Появление в организме внеклеточных БТШ70 рассматривается многими авторами как сигнал тревоги для иммунной системы [13]. Очевидно, что эти циркулирующие протеины способны влиять на иммунные процессы,

Сапожников Александр Михайлович - д-р биол. наук, проф., зав. лаб., тел. 8 (495) 330-40-11, e-mail: amsap@mx.ibch.ru

воздействуя на различные звенья иммунной системы. Это дает основание для предположения о вовлеченности сывороточных циркулирующих БТШ70 в систему иммунорегуляции. Однако источник присутствующего в организме внеклеточного пула данных протеинов пока не идентифицирован. В то же время в опытах in vitro было продемонстрировано, что способностью к секреции БТШ в окружающую среду обладают разные типы клеток. Так, в 1989 г. впервые была зарегистрирована продукция внеклеточной формы БТШ70 и БТШ110 в культуре эмбриональных клеток крысы [9]. В последующие годы феномен секреции БТШ70 был описан для других типов клеток, в том числе для клеток иммунной системы [10].

Изучение механизмов секреции БТШ70 находится пока на начальном этапе. К настоящему времени целым рядом авторов показано, что секреция БТШ70 осуществляется неклассическим, аппарат Гольджи независимым путем. Было также установлено, что один из механизмов такой секреции связан с продукцией клетками в окружающее пространство экзосом. Продукция экзосом зарегистрирована у клеток многих типов [5], в том числе и иммунокомпетентных, в частности у мононуклеаров периферической крови человека [11]. В целом ряде работ продемонстрирова-

- 20 -

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

но, что в экзосомах, продуцируемых клетками разных типов, присутствуют БТШ70 [24]. Однако выброс БТШ70 в окружающую среду в составе экзосом не является единственным путем секреции этих протеинов, так как основная часть пула внеклеточных БТШ70 обнаруживается в растворимой форме, не связанной с экзосомами [3].

Таким образом, накопленные за последнее время данные свидетельствуют о том, что циркулирующий внеклеточный пул БТШ70 способен вовлекаться в процессы иммунорегуляции. Причем клетки иммунной системы могут являться не только мишенями для этих протеинов, но и источником внеклеточных БТШ70. Данная работа посвящена изучению феномена секреции БТШ70 в популяциях лимфоцитов.

Материалы и методы. В экспериментах использовали самок мышей инбредных линий C57BL/6 из питомника экспериментальных животных (ФИБХ РАН, г. Пущино, Московской области) в возрасте 8-12 нед с исходной массой тела 16-18 г Суспензии клеток костного мозга (КМ), лимфатических узлов (ЛУ), селезенки и тимуса получали общепринятым способом. Для удаления эритроцитов использовали стандартный протокол с применением раствора Бройля. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью трипано-вого синего.

Клетки культивировали в 24-луночных планшетах (“Nunk”, США) и культуральных флаконах (25 см2 фирмы «Costar», США) в питательной среде RPMI 1640 («Flow Laboratories», Великобритания), содержащей 5% фетальной сыворотки (FCS), 20 ммоль HEPES; 0,2% NaHCO3; 50 мкг/мл гентамицина (все фирмы «Sigma», США) в 5% СО2 при 37oC. При пересеве исходная концентрация клеток лимфомы EL4 составляла 2 • 105 кл/мл, пересев проводили через 2 сут, при этом клетки нарастали до 1-1,5 • 106/мл.

Для получения культур КонА-активированных лимфоцитов использовали клетки селезенки. Активация Т-клеток проводилась в течение 2 сут в присутствии КонА в концентрации 3 мкг/мл. После этого остатки КонА элиминировали с помощью а-метилмонозида. В последующий период инкубации клеточная культура периодически освобождалась от не-крозных и апоптозных клеток пропусканием через градиент фиколла.

Цитофлюориметрический анализ уровня экспрессии поверхностных и внутриклеточных протеинов проводили на приборе EPICS XL («Coulter Corporation», США). Уровень экспрессии исследуемых протеинов оценивали по изменению средней интенсивности флюоресценции (Mean) клеток в образцах, окрашенных антителами к этим молекулам, по сравнению со свечением контрольных клеток (обработанных контрольными антителами соответствующего изотипа). В каждом образце измеряли не менее 10 • 103 клеток в регионе, соответствующем по характеристикам светорассеяния жизнеспособным клеткам. Цитофлюориметрическая регистрация процентного содержания в клеточных культурах апоп-тозных клеток проводилась стандартно с помощью анализа внутриклеточного содержания ДНК с использованием ДНК-специфичного флюоресцентного красителя пропидия иоди-да (PI) [22]. Статистический анализ результатов цитометрических измерений проводился с использованием /-критерия Стьюдента с помощью программы WinMdi, предназначенной для обработки данных, полученных во время цитофлюори-метрического анализа.

В опытах использовали моноклональные антитела к индуцируемой форме БТШ70 (клон SPA810, «Stressgen», Канада), к конститутивной форме БТШ70 (клон SPA815, «Stressgen») и общему пулу БТШ70 (клон BRM22, «Sigma»). В качестве вторых антител для цитофлюориметрического анализа использовали ФИТЦ-меченные Fab фрагменты антимышиного IgG («Sigma»), а для вестерн-блот-анализа - анти-

мышиные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена («Amersham», Великобритания).

Кондиционированный супернатант для анализа получали после культивирования клеток EL4 и КонА-активированных лимфоцитов в течение 12-24 ч при начальной концентрации 106/мл. Для минимизации содержания в образцах сывороточного альбумина, имеющего молекулярную массу, очень близкую к таковой у БТШ70, для культивирования использовали бессывороточную питательную среду. Проверка показала, что при такой клеточной плотности в культуре жизнеспособность клеток на протяжении 24 ч не снижается по сравнению со стандартными условиями культивирования. Полученные образцы супернатанта очищали от дебриса путем центрифугирования при 10 • 103 g. Затем супернатант диализировали против дистиллированной воды рН 9,0 в течение ночи при температуре 4oC, измеряли концентрацию белка и образцы лиофилизировали. Полученные образцы концентрированного супернатанта использовали для вестерн-блот-анализа в количестве 10-50 мкг на лунку. Вестерн-блот-анализ проводили по стандартной методике [4]. Образцы супернатанта подвергались ДСН-ПААГ-электрофорезу с использованием как обычного, так и градиентного геля.

В ряде экспериментов по анализу механизмов секреции клетками БТШ70 использовали моненсин и брефелдин A («Sigma»), блокирующие классический путь секреции протеинов за счет ингибиции их транспорта из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи [6]. В разных экспериментах применяемые концентрации ингибиторов варьировали от 0,1 до 10 мкг/мл.

Экзосомы выделяли по описанному ранее методу [12] из кондиционированного супернатанта, полученного после стандартного культивирования клеток EL-4 при начальной концентрации 106 кл/мл в течение 24-48 ч. После осаждения клеток 200g (10 мин), супернатант центрифугировали при 20 • 103 g (20 мин) для удаления клеточного дебриса. На следующем этапе осуществляли седиментацию экзосом центрифугированием супернатанта при 100 • 103 g (60-90 мин). Осадок, содержащий экзосомы, отмывали 1-2 раза в большом объеме PBS, осаждали и ресуспендировали в 50-200 мкл РВS, содержащем 0,05% NaN3.

Аффинную сепарацию БТШ70 проводили на колонке с АТФ-агарозой. Данный метод основан на уникальном свойстве молекул БТШ70 образовывать очень прочные комплексы с молекулами АТФ, что используется для выделения высокоочищенной формы этих протеинов из биологических образцов различного происхождения [14].

Результаты и обсуждение. Для изучения феномена секреции БТШ70 лимфоидными клетками мы использовали культуры как опухолевых, так и нормальных лимфоцитов мыши. 1-я серия экспериментов проведена с культивируемыми in vitro клетками лимфомы EL-4. Эта модель выбрана в связи с тем, что в наших предыдущих работах продемонстрировано присутствие на поверхности этих клеток БТШ70 и высказано предположение о возможности сбрасывания этих протеинов в окружающую среду [18, 19]. Для проверки данного предположения мы протестировали присутствие БТШ70 в образцах кондиционированного супернатанта, полученных из культур клеток лимфомы EL-4. Вестерн-блот-анализ свидетельствовал о значительном содержании БТШ70 в протестированных образцах кондиционированного супернатанта. Полуколичественная оценка концентрации белка в данных образцах позволила определить ориентировочную интенсивность экзоцитоза БТШ70 в нашей модели. Оказалось, что 1 млн клеток EL-4 продуцирует в нормальных условиях за 24 ч около 5-10 мкг внеклеточных БТШ70. Такое существен-

- 21 -

ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2012

ное количество секретируемых БТШ70, несомненно, указывает на выполнение этими внеклеточными протеинами вполне определенных функций в клеточном сообществе.

В следующей серии экспериментов, проведенных с культурой Кон-А активированных Т-лимфоцитов мыши, было продемонстрировано, что продукция внеклеточного пула БТШ70 характерна не только для трансформированных клеток, но и для популяций нормальных лимфоцитов. Так, вестерн-блот-анализ обнаружил присутствие БТШ70 в образцах супернатанта 10-дневной культуры Кон-A активированных спленоцитов мыши.

Описанные выше результаты, подтверждающие способность лимфоидных клеток секретировать БТШ70, получили с использованием популяций активированных лимфоцитов. Однако известно, что покоящиеся лимфоциты также экспрессируют эти протеины. В частности, нами было показано, что тимоциты мыши, культивируемые in vitro, характеризуются существенным уровнем содержания БТШ70, причем этот уровень значительно возрастает под действием физиологического медиатора стресса - адреналина [1]. С целью проверки возможности продукции внеклеточных БТШ70 неактивированными лимфоцитами мы проанализировали содержание БТШ70 в супернатанте культуры тимоцитов, инкубированных в течение 4 ч в присутствии и отсутствии адреналина. Очевидно, что предполагаемая продукция внеклеточных БТШ70 в краткосрочной культуре покоящихся тимоцитов может привести к формированию лишь незначительного пула этих протеинов. Поэтому в данных опытах вестерн-блот-анализу подвергались не образцы супернатанта клеточных культур, а БТШ70, аффинно выделенные из всего объема супернатанта с использованием АТФ-агарозы. Такой подход позволил значительно увеличить чувствительность детекции БТШ70.

В результате было обнаружено, что для in vitro культуры покоящихся тимоцитов мыши характерна спонтанная продукция внеклеточной формы БТШ70. Существенное количество этих протеинов регистрировалось в супернатанте культуры тимоцитов уже через 4 ч инкубации. При такой же продолжительности инкубации уровень свободной формы БТШ70, содержащийся в культуральной среде тимоцитов, обработанных адреналином (10 мкМ), был достоверно выше по сравнению с контролем. Таким образом, наши эксперименты продемонстрировали способность различных популяций лимфоидных клеток формировать внеклеточный пул БТШ70, размер которого может увеличиваться под действием сигналов стресса.

Зарегистрированное присутствие БТШ70 в межклеточном пространстве культур лимфоидных клеток может отражать защитную реакцию клеточного сообщества на неблагоприятные внешние условия (в наших моделях к таким неблагоприятным условиям можно отнести прежде всего культивирование клеток in vitro). Действительно, БТШ70 являются про-тективными протеинами, увеличивающими сопротивляемость клеток к стрессирующим воздействиям [7]. Известно также, что клетки приобретают повышенную резистентность к неблагоприятным факторам не только при усиленном синтезе этих протеинов

de novo, но и при добавлении в питательную среду экзогенной формы данных молекул [8]. Поэтому очевидно, что «выброс» БТШ70 погибающими клетками в межклеточное пространство и последующее поглощение этих протективных протеинов живыми клетками может увеличить сопротивляемость последних к неблагоприятным условиям. Приведенное объяснение присутствия БТШ70 в супернатанте культур лимфоидных клеток согласуется и дополняет концепцию социального контроля клеточного выживания [17]. В соответствии с этой концепцией, продуцируемые клетками аутокринные факторы обеспечивают выживание и функциональную активность родственных клеток, объединяя тем самым клетки одной ткани в социальное сообщество, каждый элемент которого подчинен интересам всей клеточной популяции. Развивая эти представления с учетом наших данных, можно предположить, что в экстремальных условиях, приводящих к программированной гибели части клеточного сообщества, регулирующие аутокринные/ паракринные взаимодействия живых клеток дополняются продукцией погибающих клеток протективных БТШ70, направленной на «социальную защиту» жизнеспособных клеток от индуцирующих апоптоз неблагоприятных воздействий.

Механизмы экзоцитоза БТШ70 лимфоидными клетками находятся в стадии изучения. В работах, посвященных этому явлению в культурах клеток нелимфоидного происхождения, показано, что секреция БТШ70 осуществляется неклассическим, аппарат Гольджи независимым путем. Поэтому мы проанализировали влияние ингибиторов классического пути секреции моненсина и брефелдина А на содержание БТШ70 в супернатанте культуры лимфомы EL-4. Результаты вестерн-блот-анализа образцов супернатанта свидетельствовали о парадоксальном эффекте монен-сина и брефелдина А. Оказалось, что в нашей модели они не только не препятствовали экзоцитозу БТШ70 клетками EL-4, но и значительно стимулировали этот процесс. Использование моноклональных антител к индуцируемой и конститутивной формам БТШ70 позволило установить, что рост внеклеточного пула БТШ70 происходит в основном за счет конститутивной изоформы данного протеина. Таким образом, было показано, что в культуре клеток лимфомы EL-4 продукция БТШ70 в межклеточное пространство осуществляется, как и в описанных в литературе культурах нелимфоидных клеток, неклассическим, аппарат Гольджи независимым путем.

Анализ наших результатов и литературных данных указывает на то, что продукция клетками БТШ70 в окружающую среду не является уникальным феноменом, а скорее всего сопутствует процессу жизнедеятельности различных клеточных популяций, в частности популяций лимфоцитов. Механизмы такой продукции в настоящее время не установлены, хотя в литературе имеются сообщения о присутствии БТШ70 в экзосомах, выбрасываемых в межклеточное пространство некоторыми разновидностями клеток [11, 12, 20, 24]. Продукция клетками экзосом является одной из разновидностей клеточного экзоцитоза, осуществляемого без участия аппарата Гольджи. В данной работе мы проверили возможность такого пути экзоцитоза БТШ70 в культуре клеток EL-4. С этой це-

- 22 -

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

лью мы применили описанную методику выделения экзосом с использованием ультрацентрифугирования [12]. В результате оказалось, что в кондиционированном супернатанте культуры клеток EL-4, действительно, присутствуют очень мелкие частицы, образующие осадок при 100 000 g. Вестерн-блот-анализ этого осадка выявил в нем фракцию БТШ70. Эти данные можно рассматривать как свидетельство продукции экзосом, содержащих БТШ70, клетками лимфомы EL-4, однако мы не исключаем, что данный подход мог выявить в супернатанте не только экзосомы, но и крупные агрегаты («пэтчи») БТШ70, сбрасываемые в межклеточное пространство с поверхности клеток в результате «шеддинга». Действительно, результаты наших опытов с ингибиторами классического пути секреции протеинов говорят о тесной взаимосвязи изменений поверхностной экспрессии БТШ70 в культуре клеток EL-4 с содержанием этих протеинов в межклеточном пространстве.

Таким образом, проведенное исследование продемонстрировало способность различных популяций лимфоидных клеток формировать внеклеточный пул БТШ70, содержащий как индуцируемую, так и конститутивную разновидности этого протеина. Одним из механизмов формирования такого пула связан с продукцией клетками экзосом, содержащих в своем составе БТШ70. Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что экзоцитоз БТШ70 в популяциях лимфоцитов является нормальным физиологическим процессом. Это позволяет сделать предположение о вовлеченности эндогенных внеклеточных БТШ70 в процессы иммунорегуляции.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант 10-04-01095-а) и программы «Молекулярная и клеточная биология» президиума РАН.

ЛИТЕРАТУРА

1. Сапожников A. M. и др. Адреналинопосредованная активация экспрессии белков теплового шока 70 кДа в популяции тимоцитов // Докл. РАН. - 2003. - Т. 392. - С. 277-279.

2. AseaA. Initiation ofthe immune response by extracellular Hsp72: chaperokine activity of Hsp72 // Curr. Immunol. Rev. - 2006. -Vol. 2. - P. 209-215.

3. Asea A. Mechanisms of HSP72 release // J. Biosci. - 2007. - Vol. 32. - P. 579-584.

4. Burnette W. N. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A // Analyt. Biochem. - 1981. - Vol.

12. - P. 195-203.

5. DenzerK. et al. Exosome: from internal vesicle of the multivesicular body to intercellular signaling device // J. Cell Sci. - 2000. - Vol. 113. - P 3365-3374.

6. Dinter A., Berger E. G. Golgi-disturbing agents // Histochem. Cell Biol. - 1998. - Vol. 109. - P 571-590.

7. Gabai V. L., Zamulaeva I. V., Mosin А. F. et al. Resistance of Ehrlich tumor cells to apoptosis can be due to accumulation of heat shock proteins // FEBS Lett. - 1995. - Vol. 375. - P. 21-26.

8. Guzhova I. V., Arnholdt A. C. V., Darieva Z. A. et al. Effects of exogeneous stress protein 70 on the functional properties of human promonocytes through binding to cell surface and internalization // Cell Stress Chaperones. - 1998. - Vol. 3. - P. 67.

9. Hightower L. E., Guidon P. T. Selective release from cultured mammalian cells of heat-shock (stress) proteins that resemble glia-axon transfer proteins // J. Cell. Physiol. - 1989. - Vol. 138.

- P. 257-266.

10. Johnson J. D., Fleshner M. Releasing signals, secretory pathways, and immune function of endogenous extracellular heat shock protein 72 // J. Leukoc. Biol. - 2006. - Vol. 79. - P. 425-434.

11. Lancaster G. I., Febbraio M. A. Exosome-dependent trafficking of HSP70: a novel secretory pathway for cellular stress proteins // J. Biol. Chem. - 2005. - Vol. 280. - P 23 349-23 355.

12. Mathew A., Bell A., Johnstone R. M. Hsp-70 is closely associated with the transferrin receptor in exosomes from maturing reticulocytes // Biochem. J. - 1995. - Vol. 308. - P. 823-830.

13. Matzinger P. The danger model: a renewed sense of self // Science. - 2002. - Vol. 296. - P. 301-305.

14. MenoretA. Purification of recombinant and endogenous HSP70s // Methods. - 2004. - Vol. 32. - P. 7-12.

15. Multhoff G. Activation of natural killer cells by heat shock protein 70 // Int. J. Hypertherm. - 2002. - Vol. 18. - P. 576-585.

16. Prohaszka Z. et al. Heat shock protein 70 is a potent activator of the human complement system // Cell Stress Chaperones. - 2002.

- Vol. 7. - P. 17-22.

17. Raff M. C. Social controls on cell survival and cell death // Nature. - 1992. - Vol. 356. - P. 397-400.

18. Sapozhnikov A. M., Ponomarev E. D., Tarasenko T. N., Telford W. G. Spontaneous apoptosis and expression of cell surface heat-shock proteins in cultured EL-4 lymphoma cells // Cell Prolif.

- 1999. - Vol. 32. - P 363-378.

19. Sapozhnikov A. M., Gusarova G. A., Ponomarev E. D., Telford W. G. Translocation of cytoplasmic HSP70 onto the surface of EL-4 cells during apoptosis // Cell Prolif. - 2002. - Vol. 35. - P. 193-206.

20. Skokos D., Botros H. G., Demeure C. et al. Mast cell-derived exosomes induce phenotypic and functional maturation of dendritic cells and elicit specific immune responses in vivo // J. Immunol. - 2003. - Vol. 170. - P 3037-3045.

21. Srivastava P. Roles of heat-shock proteins in innate and adaptive immunity // Nature Rev. Immunol. - 2002. - Vol. 2. - P. 185194.

22. Telford W. G., King L. E., Fraker P. J. Rapid quantitation of apoptosis in pure and heterogeneous cell populations using flow cytometry // J. Immunol. Meth. - 1994. - Vol. 172. - P. 1-16.

23. van Eden W., van der Zee R., Prakken B. Heat-shock proteins induce T-cell regulation of chronic inflammation // Nature Rev. Immunol. - 2005. - Vol. 5. - P. 318-330.

24. Zitvogel L. et al. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes // Nature Med. - 1998. - Vol. 4. - P. 594-600.

Поступила 15.09.11

- 23 -