Влияние мутантных аллелей на поведение мышей в тесте открытого поля

Влияние мутантных аллелей на поведение мышей в тесте открытого поля

Ф.З. Магкоева1, Т.Б. Бескова1, И.Г. Лильп2, 1А.М. Малашенко! И.И. Полетаева3

Научный центр биомедицинских технологий РАМН,

2Медико-генетичекский научный центр РАМН,

3Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Изучены особенности поведения мышей нескольких линий и генотипов: СЗН/БпУ ТРБД ШЯ/Х ШЯ-аа+/К1Г-¥, ШЯ-ДУа, С57В_/10БпУ и В10.СШ Обнаружены межлинейные различия в уровнях исследовательской активности (число вертикальных стоек и норковых реакций) и эмоциональной реактивности (число дефекаций и уринаций). Наиболее высокое число вертикальных стоек было у мышей линий ТРБ/У и ШЯ/У по сравнению с мышами других линий и мутациями. Число норковых реакций оказалось наиболее высоким у мышей линий СЗН/БпУ и ТРБД самым низким - у мышей линии С57В_/10БпУ Мутантные гены К1Г-¥ (кодирующий экспрессивность рецепторов трансмембранной тирозин-киназы) и Тугс (ген альбинизма) не повлияли на показатели исследовательского поведения. У мышей, несущих аллель А”, детерминирующий синтез феомеланина и контролирующий распределение фео- и эумеланина по волосу, обнаружилась пониженная исследовательская активность. Поскольку наиболее низкие уровни испуга были у мутантных форм мышей В10.СШ и ШЯ-Д”а, то предполагается, что ген Тугс снижает эмоциональную реактивность мышей линии С57В_/10Бп, а ген и Д” влияет и на эмоциональное, и на исследовательское поведение мышей ШЯ. Не исключается, что эти гены вызывают какие-то изменения в мозговом «субстрате», фенотипически проявляющиеся у мышей изученных генотипов в виде изменений видоспецифических поведенческих актов. Обсуждаются возможные причины наблюдаемых межлинейных и генотипических различий поведенческих реакций у мышей.

Ключевые слова: мыши, генотип, мутации, исследовательское поведение, эмоциональное поведение, межлинейные различия.

Широкие возможности для изучения нейрогенетических, нейрохимических и молекулярных механизмов патологических расстройств, затрагивающих функции центральной нервной системы, дают исследования на экспериментально-биологических моделях с охарактеризованным поведенческим фенотипом [2, 13]. Это могут быть мыши разных генетических линий, мутантные, трансгенные или нокаутные животные. Бурный рост исследований с применением трансгенных животных не исключает проведения работ на линейных и мутантных животных, являющихся ценным объектом для исследования поведенческих реакций.

Более того, в области генетики поведения такие животные имеют даже некоторые преимущества, т.к. конечный эффект поведения у трансгенных и нокаут-ных животных нередко зависит от генетического бэкграунда [8, 9]. Животные с детально охарактеризованным поведенческим фенотипом дают также возможность «прицельного» и правильного выбора объекта для изучения механизмов поведения, моделирования наследственных неврологических и психических расстройств человека и разработки методов их коррекции [11]. «Good Genetics Need Good Phenotypes» — вряд ли можно выразиться точнее [12].

Ранее нами подробно было изучено поведение и морфология мозга у мышей линий СВА/LacSto, C3H/Sn и 101/HY (далее CBA, C3H, 101/H). У мышей 101/H, характеризующихся генетической нестабильностью предположительно обусловленной мутацией mut-1, был найден ряд особенностей в поведении: обнаружена аудиогенная эпилепсия, нарушения памяти и анатомической структуры гиппокампа [4]. Плейотропное действие этой и других мутаций на функции ЦНС и поведение пока изучено недостаточно.

В настоящей работе в унифицированных условиях теста изучено поведение мышей нескольких генотипов и их мутантных форм для оценки влияния некоторых мутаций на поведение животных и использования этих животных в последующих исследованиях для изучения основ функционирования ЦНС.

Материалы и методики

Экспериментальные животные. Анализировали поведение самцов мышей следующих линий и генотипов: C3H/SnY (далее С3Н), TPS/Y (далее TPS), WR/Y, мутации // WR-aa+/KtWY и WR-AWa, C57BL/10SnY (далее В10) и мутации В10.CW (генотип aa cc).

Мутация dominant spotting, известная сейчас как KitW-Y (ранее обозначалась как WY), была обнаружена у мышей линии C57BL/6JY (B6) в 1962 г. в питомнике «Столбовая» и затем введена в линию WR [5]. Ген KitW-Y кодирует экспрессивность рецепторов трансмембранной тирозинкиназы. Описан его эффект в сперматогенезе и эмбриогенезе [3]. Реверсия гена а к дикому типу AW произошла спонтанно в линии WR. Ген AW детерминирует синтез феомеланина и распределяет фео- и эумеланины по волосу.

Ген альбинизма с (Тут*5 — современный символ) введен серией возвратных скрещиваний от мышей CC57W в линию C57BL/10Sn.

Линия TPS выведена в НИЛ биомоделей РАМН при селекции на повышенную чувствительность к кластогенному эффекту тио-ТЭФ среди потомков от скрещивания мышей 8 линий, включая мышей 101/H. Возможно, мыши TPS унаследовали от мышей линии 101/Н дефект эксци-зионной репарации, обусловленный уже упомянутой мутацией mut-1 [6].

Все животные были получены из Научного центра биомедицинских технологий РАМН, после чего их содержали и разводили инбредно в виварии ГУ МГНЦ РАМН [1].

Эксперименты проводили на мышах 2-3-месячного возраста в осенний период 2004 г. Животных содержали в пластиковых клетках размером 26 х 20 х 15 см по 57 особей при 12-часовом световом режиме (освещение с 8 до 20 часов). Мыши получали натуральный и гранулированный комбинированный корма ПК-120-1 фирмы «Информкорм» и воду ad libitum. В каждой группе было исследовано не менее 7 животных.

Тестирование поведения. Поведение мышей оценивали в небольшой по размеру цилиндрической камере «открытое поле» (0 36 см, высота стенок 20 см) с 25 отверстиями в полу (0 1 см). В течение 3 мин теста визуально регистрировали число заглядываний в отверстия (норковые реакции), число вставаний на задние лапки (вертикальные стойки), число актов дефекации (по количеству болюсов) и уринации. Два первых показателя отражают исследовательское поведение животных, два последних — испуг животного, его эмоциональную реактивность. В процессе тестирования регистрировали также число эпизодов чистки шерсти — груминга. Этот показатель, формально относящийся к репертуару гигиенического поведения, нередко рассматривают и как индикатор уровня конфликта в поведении между мотивациями страха и исследования среды.

* - достоверно отлично от показателя у мышей

линии ШЯ при р<0,05;

ООО - достоверно отлично от показателя у мышей линии СЗН при р<0,001;

# - достоверно отлично от показателя у мышей

линии СЗН при р<0,001;

## - достоверно отлично от показателя у мышей линии СЗН при р<0,001.

b

Линии мышей

Рис. 1b:

* - достоверно отлично от показателя у мышей

линий WR и B10 при p<0,001;

# - достоверно отлично от показателя у мышей

линий C3H и B10 при p<0,01.

Статистическую обработку проводили с помощью многофакторного дисперсионного анализа ANOVA (стандартный пакет программ Statistica). Сравнивали показатели у мышей исходных линий с их мутантными формами (WR с WR aa +/Kitw-y и WR-Awa; B10 с B10.CW) и С3Н с TPS), а также показатели поведения у мышей WR, B10, C3H и TPS.

Результаты

Исследовательское поведение. Как видно из рис. 1а среднее число вертикальных стоек за 3 мин тестирования животных было достоверно выше у мышей WR по сравнению с мышами WR-Awa, несущими аллель дикого типа Awa (р < 0,01). Различий между самцами линии WR и мышами ее другой мутантной формы WR-aa+/Kitw-y не выявлено.

Более высокое число вертикальных стоек было также зарегистрировано у мышей линии ТРБ и WR в сравнении с мышами С3Н (р<0,001).

Число «норковых реакций» — другого показателя исследовательского поведения мышей — наиболее низким оказалось у мышей линии В.10 (рис. 1Ь). Ни один из мутантных аллелей не повлиял на этот показатель. Достоверные межлинейные различия по числу норковых реакций выявлены между мышами В10 и С3Н ( р<

0,001), а также между мышами WR и С3Н (р<0,001) и WR и ТРБ (р<0,01).

Эмоциональная реактивность. Число актов дефекации, являющихся одним из основных показателей испуга животного, оказалось достоверно более высоким у мышей WR по сравнению с возвратной мутацией WR-Awa, (р<0,05) и более низким у мутации B10.CW в сравнении с мышами В.10 (р<0,05) (рис. 2а). Самый низкий уровень дефекации обнаружился у мышей линии ТРБ (у 91% животных они вообще отсутствовали) по сравнению с мышами всех других изученных генотипов. Напомним, что у мышей этой линии был наиболее высокий уровень исследовательской активности. Самый высокий уровень испуга наблюдали у мышей линии WR, хотя у них же был и высокий уровень исследовательской активности.

Межлинейные различия по этому показателю были выявлены также между мышами линий С3Н и WR (р<0,001), В10 и WR (р<0,05) и С3Н и ТРБ (р<0,001) (Рис. 2а).

а

№Я-аа+/ЮГ'у №Я/У WR-Awa В10^ С57В1_/108ЫУ СЗН/БпУ ТРБД

Линии мышей

* - достоверно отлично от показателя у мышей

линий ШЯ при р<0,05;

# - достоверно отлично от показателя у мышей

линий В10 при р<0,05;

## - достоверно отлично от показателя у мышей линий ШЯ при р<0,05; л - достоверно отлично от показателя у мышей линий В10 при р<0,01 и ШЯ при р<0,01;

ОО - достоверно отлично от показателя у мышей линий СЗН при р<0,05.

Ь

WR-aa+/Kltw-y WR/Y WR-Awa В10^ С57В1/108ЫУ СЗН/БпУ ТРБ/У

Линии мышей

c

"-у WR/Y WR-Awa B10.CW С57В1_/108пУ СЗИ/Бп ТРБ/У

Линии мышей

Рис. 2 Эмоциональная реактивность мышей разных генотипов в установке «открытое поле»

На рис. 2Ь и 2с представлены данные по числу уринаций и эпизодов груминга — другим показателям эмоциональной реактивности. Различий между мышами изученных линий и мутаций по числу актов уринации не выявлено. По числу эпизодов груминга достоверные межлинейные различия обнаружились только между мышами WR и ТРБ (р<0,05) и т и С3Н (р<0,05).

Обсуждение результатов

При обсуждении полученных данных стоит обратить внимание на два взаимосвязанных вопроса. Первый — это возможный биологический смысл обнаруженных различий, второй — характер изменения анализируемых показателей внутри групп «исходная линия и мутантный генотип».

И норковые реакции, и вертикальные стойки относятся к репертуару исследовательского поведения домовой мыши. Можно было бы предположить, что между количеством этих «единиц поведения» должна была бы существовать положительная корреляция — чем выше уровень исследовательской мотивации, тем больше этих актов поведения должно обнаруживать животное. Однако у исследованных нами групп мышей этого обнаружено не было, за исключением мышей линии ТРБ, у которых и число стоек, и число норок было относительно высоким (рис. 1а и 1Ь). Если по уровням вертикальных стоек были найдены различия между мышами линии WR/Y и их мутантной формой — WR-Awa (р< 0,01), а также между мышами С3Н и ТРБ (р<0,001), то по другому показателю — норковым реакциям — таких различий не обнаружено. У мышей линий С3Н было наиболее низкое среднее число вертикальных стоек, но наиболее высокое число норковых реакций (рис. 1а и 1Ь). Такому, казалось бы, несоответствию по показателям, отражающим один и тот же

вид поведения животных, т.е. исследовательское поведение, можно дать два взаимно не исключающих объяснения. Во-первых, число вертикальных стоек в условиях небольшой тестовой камеры может быть проявлением высокого уровня локомоторной активности (которая также может служить показателем исследовательской мотивации, но в данном эксперименте специально не изучалась). Во-вторых, в силу генотипических особенностей у мышей одних линий (В10, WR/Y) исследовательская мотивация может обнаруживаться преимущественно в виде вертикальных стоек, а у других (СЗН) — в виде норковых реакций. Как уже говорилось, у мышей ТРБ исследовательская активность была высокой по обоим показателям. Преобладание норковых реакций (а не вертикальных стоек), характерное для мышей линии С3Н в нашем исследовании, свойственно и мышам линии СВА, что было обнаружено в сравнительном исследовании [7].

Хотя большинство поведенческих актов у мышей носят полигенный характер наследования [9], полученные результаты позволяют предположить, что сниженная исследовательская активность мышей WR-Awa (по уровню вертикальных стоек) в сравнении с мышами WR/Y может быть частично обусловлена влиянием аллельного гена А”а, поскольку мыши WR/Y и WR-Awa различаются только по этому гену, а эксперименты были проведены в идентичных условиях и исключали различия во влиянии средовых факторов.

У мышей ТРБ выявлен относительно высокий уровень исследовательской активности по обоим показателям. Напомним, что мыши линии ТРБ были получены от скрещивания 8 линий мышей, в числе которых были и мыши 101/Н, характеризующиеся, напротив, крайне низкой исследовательской активностью [4]. Поэтому здесь можно предположить, что исследовательская активность у мышей ТРБ

контролируется генами иными, чем этот же показатель поведения у мышей 101/Н.

Число актов дефекации в условиях тестов, вызывающих у животных испуг, служат мерой «эмоциональной реактивности» животных. При этом уровень актов дефекации и показатели исследовательского поведения находятся, как правило, в обратных соотношениях, т.е. чем выше реакция испуга, тем ниже исследовательская активность и наоборот.

В нашем эксперименте такие «классические» обратные соотношения обнаружились у мышей В10 — низкое число норок и высокое число дефекаций, у мышей B10.CW и ТРБ — высокое число вставаний и норок (только у ТРБ) и низкое дефекаций, и у С3Н — высокое число норок и низкое дефекаций. У мышей остальных генотипов таких обратных соотношений выявлено не было.

У мышей линии ТРБ уровень дефекаций был достоверно ниже, чем у С3Н, однако по вышесказанным причинам можно лишь с большой долей осторожности предположить, что ген ши—1, контролирующий генетическую нестабильность у мышей ТРБ, влияет на эмоциональную реактивность этих животных. Стоит, правда, отметить, что у самцов 101/Н число дефекаций также было невысоким [4].

Поскольку уровни испуга животных были ниже у мутантных форм B10.CW и WR- А^, то логично предположить, что ген альбинизма Тугс, оказывает определенное влияние на эмоциональное поведение мышей. А различия в поведении между мышами WR/Y и WR/Awa свидетельствуют о том, что меланиоты отличаются по поведению от мышей дикого типа. Напомним, что ген А"1 детерминирует синтез феомеланина и распределяет фео- и эумеланины по волосу. Вероятно, эти гены могут влиять на какие-то изменения в мозговом «субстрате», на процессы развития и/или функ-

ционирования ЦНС мыши. Это, в свою очередь, выражается в виде зарегистрированных нами фиксированных комплексов действий (fixed action patterns) и, возможно, в нарушениях соотношения показателей страха и исследовательского поведения.

По нашему мнению помещение мыши в установку «открытого поля» небольшого размера, как это было в нашем эксперименте, не должно вызывать сильного испуга животного, поэтому данные по уровням дефекации и уринации, можно частично трактовать также и как показатели, отражающие интенсивность обменных процессов. Однако этот вопрос требует дополнительных исследований.

Таким образом, в результате исследования были выявлены межлинейные и генотипические различия в исследовательском и эмоциональном поведении мышей, биологический смысл которых пока можно лишь предполагать. Однако полученные данные служат основанием для изучения механизмов и более глубокого анализа особенностей поведения у мышей, в т.ч. у носителей мутаций. В частности, перспективным направлением в этой области представляются исследования связанные с изучением влияния аллеля AW , детерминирующего синтез феомеланина, и гена альбинизма Туг^ которые, вероятно, влияют на уровни исследовательской и/или эмоциональной активности. Интересной экспериментальной моделью для будущих исследований являются и мыши линии WR, поведение которых не вписывается в рамки классических представлений — «высокий уровень исследовательской мотивации — низкий уровень испуга». У этих животных в условиях данного тестирования соотношение этих показателей не носило обратного характера и высокая исследовательская активность сопровождалась высоким же уровнем эмо-

циональной реактивности, несмотря на то, что помещение животных в небольшую по размерам камеру вызывает, как правило, умеренный уровень страха.

Следует также заметить, что во избежание получения ложноотрицательных результатов, исследования эффектов различных фармакологических препаратов на поведение было бы целесообразнее проводить не только на неинбредных мышах из различных стоков, но и на животных, имеющих определенные особенности поведения, выявляемые в различных ситуациях тестирования.

Литература

1. Бландова З.К., Душкина В.А., Mала-шенко A.M., Шмидт Е.Ф. Линии лабораторных животных для медико-биологических исследований. — M.: Наука, l89 с., l983.

2. Зорина З.А., Полетаева И.И., Резникова Ж.И. Основы этологии и генетики поведения. — M.: Изд-во Miy, ЗвЗ с., l999.

3. Коломиец О.Л., Курило Л.Ф., Mалашенко A.M., Сахарова Н.Ю., Чеботарева Т.А. Изучение эффектов мутантного гена dominant spotting-Yrlovo (Kitw-y) на сперматогенез, раннее эмбриональное развитие и плодовитость мышей линии C57BL/6JY. // Генетика, т. 4l, № l0, с. 377-l386, 2005.

4. Лильп И.Г., Бизикоева Ф.З., Ревищин A.В. и др. Генетическая модель некоторых наследственных заболеваний человека: особенности поведения, нейрохимии и морфологии мозга у мышей линии 101/HY. // Генетика, т. 36, №l2, с. l598-l6l3, 2000.

5. Mалашенко A.M., Суркова Н.И. Новая линия мышей WR — высокочувствительна к цитогенетическому эффекту тиоТЭФ. // Цитология и генетика, т. в, № 5, стр. 387-389, l979.

6. Mалашенко A.M., Крышкина В.П., Суркова Н.И. Влияние отбора на чувстви-

тельность лабораторных мышей к цитогенетическому эффекту тиоТЭФ. // Генетика, т. 18, № 2, с. 241-247, 1982.

7. Салимов Р.М., Полетаева И.И. Факторный анализ организации поведения мышей // Журн. высш. нервн. деят., т. 42, № 2, с. 314-324, 1992.

8. Clapcote St. et al. Effects of the rd1 Mutation and Host Strain on Hippocampal Learning in Mice // Behavior Genetics, v. 35, No. 5, p. 591-601(11). 2005.

9. Crawley J.N. What's Wrong with My Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. — NY: Wiley-Liss. 350p. 2000.

10. Genetically Defined Animal Models of Neurobehavioral Dysfunction. / Ed. P. Driscoll. — Boston Basel Berlin: BizkhKuser, 304p., 1992.

11. Pfaff D. Precision in mouse behavior genetics. // PNAS 98: 5957-5960. 2001.

12. Tarantino L., Bucan M. Dissection of behavior and psychiatric disorders using the mouse as a model. // Human Molecular Genetics. V. 9, No. 6, 953-965. 2000.

13. Vandenbergh J.G Use of House Mice in Biomedical Research // ILAR Journal (On line) V. 41, No. 3 http://dels.nas.edu/ ilar n/ilarjournal/41 3/41 3Introduction. shtml, 2000.

THE MUTANT ALLELS INFLUENCE ON THE BEHAVIOR MICE IN OPEN-FIELD TEST F.Z.Magkoeva1, T.B.Beskova1, lA.M.Malashenko'L I.I.Poletaeva3

1The Research Center for Biomedical Technologies of RAMS, Moscow Medical Genetic Scientific Center of RAMS, Moscow Moscow State University, Moscow

Key words: mice, genotype, investigatory activity, emotional reactivity, mutatations.

Male mice of several genotypes (C3H/SnY, TPS/Y, WR/Y, WR-aa+/Kitw-y, WR- Awa, C57BL/10SnY h B10.CW) were tested in the open-field test (the small arena version). TPS/Y and WR/Y mice revealed the highest scores of rearings. The highest number of hole pokes was characteristic for C3H/SnY and TPS, while C57BL/10SnY mice showed the lowest results. No influence of mutant alleles (Kitw-y — the expression of transmembrane tyrosine kinase receptors, and Tyrc-albinism) on exploration scores was revealed. Animals with Aw allele (pheomelanine synthesis and distribution along the hair) showed the decreased exploration level. The fear-induced behavior in B10.CW h WR- Awa genotypes had lower scores in comparison to wild type. It was suggested that Tyrc-allele decreased the emotional reactitity in C57BL/10Sn, while Aw allele affected both — emotional reactivity as well as exploration level in WR. The differences in behavior are discussed as the evidence of genotype influences on the brain mechanisms of the species-specific behavioral action patterns.