Способ ректального применения озона на модели язвенного колита
METHOD FOR RECTAL APPLICATION OF OZONE IN A MODEL OF ULCERATIVE COLITIS

Изобретение относится к медицине, точнее к гастроэнтерологии, и может быть использовано в комплексном лечении воспалительных заболеваний кишечника.
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) - в частности, язвенный колит (ЯК) представляет собой хроническое заболевание толстой кишки, характеризующееся наличием выраженного иммунного компонента воспалительного процесса слизистой оболочки. Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) - полиэтиологичные заболевания в условиях взаимодействия наследственных факторов и внешней среды. [1]. Этиология и патогенез ВЗК до конца не изучены, включают механизмы аутоиммунного воспаления в генетически восприимчивом организме. На роль ключевого фактора повреждения стенки кишечника претендует оксидативный стресс [2]. Одним из факторов в запуске и поддержании воспалительного процесса в стенке кишечника имеют значение активные формы кислорода (АФК), генерируемые активированными нейтрофилами, моноцитами/макрофагами, эндотелиоцитами, эпителиоцитами в условиях дефицита факторов антиокислительной защиты. В связи с тем, что патогенез ЯК до конца не изучен, а также учитывая широкий спектр возможных побочных эффектов вследствие применения существующих методов лечения, поиск новых способов применения терапевтических агентов остается актуальной задачей.
Известен способ лечения язвенного колита в виде внутриартериального введения в регион пораженной ободочной кишечной стенки микрокристаллической суспензии гидрокортизона. Способ обеспечивает локальное депонирование препарата и пролонгированный лечебный эффект [патент RU 2215546, 2003]. Однако известно, что гидрокортизон способен вызывать широкий спектр побочных явлений, возникающих у пациентов, что может существенно повлиять на качество их жизни. Кроме того, вместе с предложенным способом необходимо одновременное введение дезагрегантов и гепарина.
Следующий способ включает пероральное введение пробиотика бифиформа в дозе 2-3 капсулы с последующим 4-5-кратным введением мезенхимальных стволовых клеток в слизистую оболочку измененных участков кишки, в количестве 150-200 млн клеток в объеме от 0,5 до 1,5 мл. В последующем вводят бифиформ в дозе по 1 капсуле 3 раза в день в течение 3 недель [патент RU 2460554, 2012]. Недостатком данного метода является достаточно сложный способ получения и размножения мезенхимальных стволовых клеток, полученных в результате пункции стернальной или гребня подвздошной кости донора.
Описан способ получения клинической ремиссии в течении неспецифического язвенного колита, путем восстановления уровня сывороточного кортизола до физиологической нормы [патент RU 2200007 С2, 2003]. Пациенту вводят этимизол в таблетированной форме по 0,3 г в сутки в течение 30-40 дней либо по 0,6-0,8 г в сутки в течение 10-15 дней после предварительного определения суточных уровней утреннего и вечернего сывороточного кортизола при значении последнего ниже физиологического уровня. Способ позволяет сократить время приема глюкокортикостероидов, уменьшить нежелательные эффекты этих препаратов и избавить пациентов от "синдрома отмены". При этом данный способ не применим к пациентом с опухолью надпочечника. Кроме того, длительное применение глюкокортикостероидных препаратов способствует интенсивному размножению грибов рода Candida на всем протяжении пищеварительного тракта.
Известен следующий способ применения экстракта плаценты для инъекций. [патент RU 23282982008]. Больному с диагнозом неспецифический язвенный колит производят лечебную клизму с экстрактом плаценты для инъекций в дозе 0.4 г/кг массы тела. На курс лечения назначают 2-3 процедуры, с интервалом 1-2 недели. Способ, основан на применении плацентарной ткани, содержащей значительное число биологически активных веществ (простагландины, пептиды, гормоны, глобуллины и др.), позволяет активизировать процессы репаративной регенерации в тканях, достигнуть хорошего клинического эффекта. Но способ описан лишь у 4 больных, также ограничивает применение у пациентов с заболеванием щитовидной железы, у беременных женщин.
Известен способ лечения ЯК путем приема новых лекарственных средств, увеличения лечебной дозы, изменения схемы терапии для устранения энергодефицита и воспалительного процесса в кишечнике, что приведет к восстановлению функциональных возможностей кишечника и всего организма, [патент RU 2165758 С1, 2001]. Длительность приема препаратов, их сочетание, а также эффективные лечебные дозы подбирались опытным путем. Экспериментально установленная оптимальная суточная доза для аминокислотного препарата Big One составляет 1,8-5,4 г, а для 5-ASA - 1,0-4,0 г, а длительность приема - 30 дней. Лечение в меньших дозах и в течение более короткого периода неэффективно, а при лечении большими дозами или более длительно улучшение уже не наступает, а могут начаться нежелательные последствия: гнилостные процессы (для Big One) и нарушение функции почек (для 5-ASA). Недостатками данного способа является достаточно широкий диапазон дозировок, для подбора оптимальной лечебной дозы, а также дороговизна препарата Big One в пределах 3000 руб.
Известен способ, технический результат изобретения достигается тем, что больным язвенным колитом, получающим ГКС терапию и препараты 5-аминосалициловой кислоты, дополнительно вводят препарат Витафлор per os по 1 капсуле, покрытой кишечнорастворимой оболочкой, два раза в день в течение периода лечения ГКС [патент RU 2419443 С1, 2011]. Недостатком данного метода является то, что препарат не активен в отношении Candida albicans, только проявляет свою антагонистическую активность в отношении грибов рода Candida, видов Candida glabrata, Candida crusei и Candida tropicalis.
Известен способ лечения синдрома раздраженной кишки (Пат РФ №2178700, кл. А61К 33/00, 2002 г.), который включает комплексную терапию, заключающуюся в приеме лекарственных средств и ректальное введение озонокислородной смеси в комплексе с колегелем и димексидом. Данный способ взят за прототип, однако димексид может имееть побочные эффекты в виде аллергических реакций, дерматита, эритемы, сухости кожи, жжения.
Изучение лечебного свойства озона проводили на модели экспериментального язвенного колита. Исследование выполнено на базе вивария ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России (вет. свидетельство 250 №36971962 от 11 декабря 2017 г, выдан государственной ветеринарной службой Московской области) на 83-х крысах самцах линии Wistar массой 250±15 г. Возраст животных составлял более 6 месяцев.
Эксперименты выполнялись в соответствии с нормами гуманного обращения с животными, которые регламентированы «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. №755) и №48 от 23.01.85 г. «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных», а также основывались на положениях Хельсинской Декларации Всемирной Медицинской Ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг.), согласно протоколу, одобренному Комитетом по биомедицинской этике.
Животные содержались в стандартных условиях вивария, при естественном освещении, t воздуха +20-22С и влажности 55-60%, в полепропеленовых клетках Velaz тип 3. В качестве подстилочного материала использовались опилки нехвойных пород деревьев (береза). Животные потребляли сбалансированный полнорационный комбикорм для лабораторных животных. Соответствие по содержанию питательных веществ, витаминов и минералов ГОСТ Р 50258-92. Также был обеспечен свободный доступ к свежей воде в поилках, объемом 500,0 мл. Перед экспериментом животные прошли двухнедельный период карантина и адаптации. Животные были случайным образом разделены на 3 группы: группа 1 (n=23) - интактный контроль, группа 2 (n=30) - животные с ЭК, группа 3 (n=30) - животные с ЭК на фоне ректальной инсуффляции озонокислородной смеси (ОКС). Моделирование ЭК осуществляли за счет двухэтапного ректального введения 3% раствора оксазолона («Sigma-aldrich», USA). На первом этапе модели проводили накожную сенсибилизацию животного нанесением на предварительно выбритую межлопаточную область 150 мкл 3% спиртового раствора оксазолона. Второй этап заключался в ректальном введении на глубину 7 см 3% спиртового раствора оксазолона. Для анестезии использовали препарат «Золетил-100» (МНН: тилетамина гидрохлорид) (Virbac Sante Animale; Франция) в дозе 20 мг/кг.
Животным третьей группы ежедневно ректально вводили 10 мл ОКС с концентрацией озона 2,5 мг/л, в дозе 0,1 мг/кг, курс 6 дней.
Озонокислородную смесь получают на специальной установке-озонаторе - ex temporo. Установка озонотерапевтическая автоматическая с деструктором озона УОТА-60-01-«Медозон» (ООО «МЕДОЗОН», Москва), пластиковый контейнер 1000 мл, Germany, «Dora», регистрационный №ФСЗ 2011/10918 -2011.
Забор крови для исследования осуществлялся под общим наркозом (препарат «Золетил-100» (МНН: тилетамина гидрохлорид, «Virbac Sante Animale», Франция) в дозе 20 мг/кг). Забор крови осуществлялся пункцией сердца в левый желудочек в вакуумные пробирки «Vacuette» («Greiner Bio-One», Австрия) с антикоагулянтом (КЗ ЭДТА) для иммунологических исследований.
Технический результат осуществляется за счет воздействия озона, вводимого ректально в виде озонокислородной смеси определенным способом. Концентрация озона 2,5 мг/л разработана специально для лечения экспериментального ЯК. Доза озона в ОКС 0,1 мг/кг. Курсовая доза 0,6 мг/кг. Курс 6 дней.
Способ осуществляется следующим образом:
1. Забор озонокислородной смеси производится непосредственно из клапана озонатора, вначале в специальный пластиковый мешок, а затем в шприц объемом 20 мл (ООО «МПК «Елец»).
2. Животное удерживают за основание хвоста головой вниз, через одноразовый пластиковый полиуретановый катетер (ОАО «Синтез»; Россия) диаметром 2 мм на глубину 7 см в прямую кишку инъецируют газовую смесь в объеме 10 см3, процедуры проводят после опорожнения ампулы recti - дефекации.
Курс 6 процедур, 1 раз в сутки.
В предлагаемом способе исследование ректального введения озонокислородной смеси используется впервые.
В условиях ректального применения ОКС у животных с ОИК улучшилась клиническая картина: увеличилось потребление корма, повысилась двигательная активность крыс в клетках, животные больше времени уделяли грумингу. С 4-х суток наблюдения отмечен более оформленный стул и отсутствие кишечного кровотечения в виде крови в каловых массах и окрашивания ануса. Указанные симптомы нашли отражение в оценке DAI: по сравнению с экспериментальным колитом приводит к снижению на 4-е, 6-е сутки индекса активности болезни (р>0,05) (фиг. 1). На фоне ректального применения озона уменьшаются воспалительные изменения в крови в виде снижения уровня СРБ, нормализации лейкоцитарной формулы(фиг. 2, 3). Результаты морфометрических исследований в очаге повреждения толстой кишки позволяют говорить о репаративном действии озона в виде снижения лейкоцитарной инфильтрации, уменьшении размера язвенного дефекта и снижении индекса повреждения тканей (TDI) (фиг. 4).
Предложенный способ отличается от стандартных методов лечения ЯК высокой эффективностью, отсутствием побочных эффектов, аллергических реакций, не развивается резистентность к данному методу, возможно применение в широком диапазоне заболеваний. Это дает возможность проводить лечение амбулаторно, отказаться от применения антибиотиков, гормональных препаратов, снизить негативное влияние лекарств на организм.
Полученные результаты иллюстрируются (фиг. 5, фиг. 6, фиг. 7) и свидетельствуют о выраженном противовоспалительном и репаративном эффекте медицинского озона, что дает возможность рекомендовать его в качестве одного из актуальных направлений терапии ЯК.
Литература:
1. Stylianou, Е. Recent Advances in the Etiopathogenesis of Inflammatory Bowel Disease: The Role of Omics / E. Stylianou // Molecular diagnosis and therapy. - 2018. - Vol.22, №1. - P. 11-23.
2. Tian Т., Wang Z., Zhang J. Pathomechanisms of oxidative stress in inflammatory bowel disease and potential antioxidant therapies // Oxid. Med. Cell. Longev. 2017. Vol.2017. ID 4535194. doi: 10.1155/2017/4535194