ПОЛУЧЕНИЕ АЛЬГИНАТНОГО ГИДРОГЕЛЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЛИПАЗ
PRODUCTION OF ALGINATED HYDROGEL WITH LIPASES APPLICATION

Область изобретения
Данное изобретение относится к усовершенствованному способу получения гидрогелей, в частности альгинатных гидрогелей. Гидрогели данного изобретения имеют широкую область применения и, в частности, используются для иммобилизации биологического материала, в частности, для иммобилизации и сохранения клеточного материала, такого как, например, сперматозоиды.
Уровень техники
Гидрогели состоят из полимерных цепей, образующих гидрофильную, содержащую воду сеть, имеющую широкую область применения в различных отраслях промышленности, в частности в биотехнологической и фармацевтической промышленности. Например, гидрогели используются для иммобилизации биологического материала, такого как клетки для трансплантации, или в качестве системы доставки, например, для фармацевтически активных ингредиентов или питательных веществ. Гидрогели также могут быть использованы в качестве раневых повязок. Кроме того, гидрогели, в частности, альгинатные гидрогели, широко используются в качестве загустителей.
Широко используемым полимером для формирования гидрогелей является альгинат. Альгинаты представляют собой анионные полисахариды природного происхождения, состоящие из 1,4-связанной-β-D-маннуроновой кислоты (М) и α-L-глюкуроновой кислоты (G). (Smidsrod and Skjåk-Bræk, 1990, Trends in biotechnology, vol. 8, no. 3, pp 71-78). Коммерческие альгинаты извлекают из морских водорослей, таких как Ascophyllum nodosum, Macrocystis pyrifera, u Laminaria hyperborea, а также в некоторой степени Laminaria digitate, Laminaria japonica, Eclonia maxima, Lesonia negrescens и Sargassum sp.
Альгинаты могут быть изготовлены из некоторых бактерий, продуцирующих альгинаты, например, из некоторых видов Pseudomonas и из Azotobacter vinelandii (Smidsr∅d and Skjåk-Bræk, 1990, см. выше).
Альгинаты широко используются, в частности, в пищевой промышленности, например, в качестве стабилизаторов для контроля вязкости или в качестве загустителей. Альгинаты также широко используются в фармацевтической промышленности и косметической промышленности, а также в качестве стабилизаторов, загустителей или дезинтегрирующих агентов. Для различных целей доступны альгинаты, богатые либо гулуроновой кислотой, либо I маннуроновой кислотой, соответственно (Mancini et al. (1999), Journal of Food Engineering 39, 369-378, WO 8603781, US 4990601, US 5639467).
Благодаря биосовместимости и способности альгинатов образовывать гель в присутствие двухвалентных катионов, таких как, например, ионы кальция, альгинаты также широко используются для инкапсуляции клеток (Nebel, R.L, Baime, J., Saacke, R.G. and Lim. F. (1985), J. Anim. Sci. 60:1631-1639, Lim, F and Sun, A.M., (1980) Science 210: 908-9100, WO 2006/106400, EP 0922451, US 6596310, Torre et al. (1998), S.T.P. Pharma Sciences, 8 (4), pp. 233-236, Torre et al. (2000), Biomaterials, 21, pp. 1493-1498, Torre et al. (2002), Journal of Controlled Release, 85, pp.83-89, Faustini et al. (2004), Theriogenology, 61, 173-184, Weber et al. (2006), Journal of Biotechnology, 123, pp. 155-163).
Альгинатные гели также могут быть использованы для иммобилизации различных материалов. Например, в WO 2008/004890 описаны биополимерные частицы, используемые для сохранения сперматозоидов, где биологический материал внедрен в полимерную частицу и находится в твердом состоянии на всем диаметре частицы. При внедрении сперматозоидов в альгинатные гидрогели вместо инкапсуляции сперматозоидов, при которой сперматозоиды остаются в жидкой сердцевине капсул, клетки иммобилизованы в альгинатной гелевой сети, что ограничивает подвижность клеток во время хранения.
2
Альгинатные гидрогели, например альгинатные гели, используемые для инкапсуляции или захвата различных материалов, могут быть получены путем смешивания раствора материала, который должен быть внедрен, с раствором альгината натрия, и добавления этого раствора в раствор, содержащий многовалентные катионы, обычно двухвалентные катионы, такие как ионы кальция (например, раствор CaCl) (Smidsr∅d and Skjåk-Bræk, 1990, см. выше).
В US 6497902 раскрыт другой способ получения биосовместимых гидрогелей, таких как альгинатные гидрогели, включающий смешивание клеток, которые будут внедрены, соли альгината и агента, высвобождающего кальций, с последующим добавлением соединения, высвобождающего кальций, к указанной смеси с образованием поперечно-сшитого геля. В соответствии с патентом США 6497902 агентом, высвобождающим кальций, может быть D-глюконо-δ-лактон (GDL).
3
3
2
+
-
2+
2+
Способ, раскрытый в патенте США 6497902, может быть использован для иммобилизации сперматозоидов, используемых для искусственного оплодотворения (например, для изготовления альгинатных гидрогелей, описанных в WO 2008/004890). Например, разведенные и охлажденные (4°C) сперматозоиды можно добавить к раствору, содержащему растворенный альгинат натрия и суспендированный карбонат кальция и, возможно, криопротектор, такой как глицерин, и после этого инициировать гелеобразование и получить нужный альгинатный гидрогель путем добавления раствора, содержащего GDL. Добавление GDL приводит к формированию глюконовой кислоты, которая, в свою очередь, вступает в реакцию с водой и формирует HO. Повышение уровня HO и присутствие карбоната кальция приводит к высвобождению СО и Са. Введение Са путем добавления GDL приводит к формированию альгинатного гидрогеля с внедренными сперматозоидами.
После того как гелеобразование произошло, контейнеры, заполненные сперматозоидами, внедренными в альгинат, можно криоконсервировать в жидком азоте, обеспечивая тем самым криоконсервацию сперматозоидов с исключительно длительным сроком хранения.
Тем не менее, авторы данного изобретения обнаружили, что применение GDL в изготовлении альгинатных гидрогелей в соответствии со способом, описанным в патенте США 6497902, имеет несколько недостатков. При изготовлении альгинатного геля, содержащего иммобилизованные сперматозоиды, в соответствии со способом, описанным выше, очень важно добавлять GDL к раствору сразу после приготовления раствора GDL, чтобы избежать спонтанного гелеобразования. GDL нужно добавлять в растворенном виде, а не в виде порошка, чтобы избежать на начальном этапе локальных областей/зон с высокой концентрацией глюконовой кислоты, которые были бы вредны для сперматозоидов. Кроме того, после добавления GDL будет идти период повышения вязкости в результате инициации реакции гелеобразования. В связи с увеличением вязкости контейнер, используемый для формирования гидрогеля, нужно заполнять довольно быстро. Поэтому за время, полученное для преобразования растворенного GDL в глюкуроновую кислоту, раствор переносят в соответствующие контейнеры (такие как, например, мини-пробирки, полученные от IMV, L’Aigle, Франция) для дальнейшего гелеобразования и иммобилизации желаемого биологического материала. Таким образом, способ, описанный в предшествующем уровне техники, приводит к достаточно короткому и негибкому графику изготовления гидрогелей, содержащих желаемый биологический материал, и является существенным недостатком с промышленной точки зрения.
По причине недостатков описанного выше способа существует потребность в усовершенствованном способе получения гидрогелей, в частности в способе, пригодном для изготовления гидрогелей в промышленных масштабах.
Различные другие способы получения гидрогелей описаны в предшествующем уровне техники. Различные отчеты раскрывают применение ферментов, которые, воздействуя на специфический субстрат, обеспечивают различные реакции, которые, в конце концов, приводят к поперечному связыванию различных типов полимеров.
Например, CN 101439206 раскрывает, в частности, применение полимеров, содержащих фенольную гидроксильную единицу и диоксигеназу в катализируемом ферментом процессе получения полимерных гелей.
2
2
2
2
Johnsen et al. (2010), ACS Applied Materials & Interfaces, 2(7), pp.1963-1972, сообщают об изготовлении гидрогеля на основе ПЭГ, который полимеризуется с помощью глкжозооксидазы. Глюкозооксидаза катализирует окисление β-D-глюкозы, и последующее применение кислорода для образования ферментного кофактора флавинадениндинуклеотида приводит к формированию HO. При объединении ионов железа с этой ферментативной продукцией HO образуются первичные гидроксильные радикалы, которые далее реагируют с акрилатными мономерами.
2
2
О применении HO и пероксидазы хрена в изготовлении гидрогелей также сообщалось, например, в Kurisawa et al. (2010), J. of Materials Chemistry, 20(26), pp. 5371-5375, Sakai et al. (2009), Biomaterials, 30(20), pp. 3371-3377, Sakai and Kawakami (2006), Acta Biomaterialia, 20017, 3, pp. 495-501, Lee et al. (2009), J. of Controlled Release, 134, pp. 186-193, Wang et al. (2010), Biomaterials, 31, pp. 1148-1157.
2
2
2
2
Гидрогели, изготовленные с использованием оксидаз и HO, не подходят для некоторых применений, так как НО является сильным окислителем.
Следовательно, все еще существует потребность в усовершенствованном и упрощенном процессе получения альгинатных гидрогелей, в частности гидрогелей, пригодных для иммобилизации биологического материала.
Сущность изобретения
Задачей данного изобретения является создание усовершенствованного способа получения альгинатных гидрогелей без недостатков способов предшествующего уровня техники.
Другой задачей данного изобретения является создание упрощенного способа получения альгинатных гидрогелей, пригодных для иммобилизации биологического материала.
3
+
Таким образом, изобретение относится к альгинатному гидрогелю, где гелеобразование инициируется посредством использования гидролазы и субстрата, гидролизуемого гидролазой, что приводит к образованию HO и последующему высвобождению двухвалентного катиона из-за присутствия агента, высвобождающего двухвалентные катионы.
3
3
+
-
В соответствии с одним аспектом данного изобретения предлагается способ получения альгинатного гидрогеля, причем указанный способ включает смешивание раствора, содержащего гидролазу, с раствором, содержащим субстрат, гидролизуемый гидролазой, при этом раствор, содержащий гидролазу, или раствор, содержащий субстрат, гидролизуемый гидролазой, также содержит альгинат и агент, высвобождающий двухвалентные катионы. При смешивании двух растворов связывание субстрата с гидролазой приводит к гидролизу указанного субстрата и последующему образованию HO. Образование HO также приводит к высвобождению двухвалентных катионов, которые, таким образом, инициируют формирование гидрогеля.
В соответствии с одним воплощением соединение, высвобождающее двухвалентные катионы, и альгинат присутствуют в растворе, содержащем гидролазу. В соответствии с другим воплощением соединение, высвобождающее двухвалентные катионы, и альгинат присутствуют в растворе, содержащем указанный субстрат.
Указанная гидролаза может представлять собой эстеразу, например, липазу. В соответствии с одним воплощением данного изобретения гидролаза, используемая в способе в соответствии с изобретением, представляет собой триглицеридлипазу.
2+
2+
2+
В соответствии с еще одним воплощением изобретения соединение, высвобождающее двухвалентные катионы, высвобождает двухвалентные катионы, выбранные из группы, состоящей из Са, Ва и Sr.
В соответствии с другим воплощением данного изобретения соединение, высвобождающее двухвалентные катионы, представляет собой соединение, высвобождающее кальций, такое как, например, карбонат кальция.
В соответствии с еще одним воплощением данного изобретения субстрат представляет собой сложный эфир органической кислоты.
В соответствии с еще одним воплощением данного изобретения предлагается способ, включающий этапы смешивания раствора, содержащего триацилглицеридлипазу, с раствором, содержащим субстрат, гидролизуемый указанной гидролазой, при этом субстрат представляет собой соединение формулы I:
1
2
3
1
12
1
2
3
1
12
1
3
где R, R и R независимо друг от друга являются одинаковыми или различными и представляют собой линейную или разветвленную, замещенную или незамещенную C-C-алкил карбонильную цепь, и где раствор, содержащий указанную липазу, или раствор, содержащий соединение формулы I, также содержит альгинат и соединение, высвобождающее двухвалентные катионы. В соответствии с одним воплощением R, R и R независимо друг от друга являются одинаковыми или различными и представляют собой линейную или разветвленную, замещенную или незамещенную C-C-алкил карбонильную цепь, например, линейную незамещенную C-С-алкил карбонильную цепь.
1
2
3
1
3
В соответствии с еще одним воплощением данного изобретения R, R и R формулы I являются одинаковыми или различными и представляют собой линейную или разветвленную, замещенную или незамещенную C-С-алкил карбонильную цепь.
1
2
3
В соответствии с одним воплощением данного изобретения R, R и R формулы I выбраны из группы, состоящей из метанона, этанона, ацетона, бутанона, пентанона, гексанона, гептанона, октанона, нонанона, деканона или додеканона.
В частности, например, когда сперматозоиды должны быть внедрены в альгинатный гидрогель, субстрат может быть выбран из группы, состоящей из триацетина, трипропионина и трибутирина, предпочтительно трипропионина и трибутирина.
В соответствии с другим воплощением данного изобретения раствор, содержащий гидролазу, или раствор, содержащий субстрат, гидролизуемый гидролазой, может также содержать объект, который должен быть внедрен в альгинатный гидрогель.
Объект, который будет внедрен в альгинатный гель, может в соответствии с одним аспектом данного изобретения представлять собой биологический материал, например, клеточный материал, такой как сперматозоиды.
В соответствии с одним воплощением данного изобретения предлагается способ получения альгинатных гидрогелей, содержащих сперматозоиды, где способ включает этапы
i) формирования первого раствора путем разведения сперматозоидов раствором, содержащим триацилглицеридлипазу;
ii) добавления к первому раствору, полученному на этапе i), второго раствора, содержащего альгинат, соединение, высвобождающее двухвалентные катионы, и соединение формулы I:
1
2
3
1
12
где R, R и R независимо друг от друга являются одинаковыми или различными и представляют собой линейную или разветвленную, замещенную или незамещенную С-С-алкил карбонильную цепь, инициируя гелеобразование;
ill) переноса раствора, полученного на этапе ii), в контейнер для гелеобразования альгинатного гидрогеля;
iv) возможно, криоконсервации альгинатного гидрогеля iii).
В соответствии с еще одним воплощением данного изобретения предлагается способ получения альгинатных гидрогелей, содержащих сперматозоиды, где способ включает этапы
i) формирования первого раствора путем разведения сперматозоидов раствором, содержащим соединение формулы I:
1
2
3
1
12
где R, R и R независимо друг от друга являются одинаковыми или различными и представляют собой линейную или разветвленную, замещенную или незамещенную С-С-алкил карбонильную цепь;
ii) добавления к раствору, полученному на этапе i), второго раствора, содержащего альгинат, соединение, высвобождающее двухвалентные катионы, и триглицеридлипазу, что инициирует гелеобразование;
iii) переноса раствора, полученного на этапе ii), в контейнер для гелеобразования альгинатного гидрогеля;
iv) возможно, криоконсервации альгинатного гидрогеля iii).
В соответствии с одним воплощением первый и второй растворы i) и ii) также содержат криопротектор, а раствор, полученный в iii), также подвергают криоконсервации. Кроме того, при изготовлении альгинатных гидрогелей, содержащих сперматозоиды, в соответствии с данным изобретением, как в целом описано выше, контейнеры, полученные в iii), могут быть также подвергнуты криоконсервации, и где раствор этапа i) и/или этапа II) включает криопротектор.
Криопротектор, присутствующий в растворе этапа i) и/или этапа ii) в соответствии с этим воплощением данного изобретения, может быть выбран из группы, состоящей из глицерина, этиленгликоля, метанола, DMA, DMSO, пропиленгликоля, трегалозы, глюкозы.
При изготовлении альгинатных гидрогелей, содержащих сперматозоиды, в соответствии с данным изобретением, соединение, высвобождающее двухвалентные катионы, предпочтительно может представлять собой карбонат кальция, а субстрат, гидролизуемый гидролазой, предпочтительно может быть выбран из группы, состоящей из триацетина, трипропионина и трибутирина.
В соответствии с одним воплощением данного изобретения альгинат представляет собой альгинат, богатый гулуроновой кислоты.
В соответствии с другим аспектом данного изобретения предложен альгинатный гидрогель, полученный в соответствии сданным изобретением.
Альгинатный гидрогель в соответствии с данным изобретением в одном воплощении данного изобретения может включать:
а. альгинат;
b. возможно, объект для внедрения в альгинатный гидрогель;
с. гидролазу, используемую в изготовлении альгинатного гидрогеля.
Альгинатный гидрогель в соответствии с данным изобретением формируется путем гелеобразования альгината, где гелеобразование достигается за счет высвобождения двухвалентных катионов из соединения, высвобождающего двухвалентные катионы, в результате гидролиза гидролазного субстрата. Таким образом, образованный гидрогель включает гидролазу, используемую в формировании геля. Присутствие гидролазы в гидрогеле в соответствии с данным изобретением, таким образом, показывает, что был применен способ изобретения.
В соответствии с другим воплощением альгинатный гидрогель в соответствии с изобретением содержит внедренный объект. В соответствии с другим воплощением указанный объект для внедрения является биологическим материалом, таким как клеточный материал, например, сперматозоиды.
В соответствии с еще одним аспектом данного изобретения предложен набор альгинатного гидрогеля, включающий один контейнер с гидролазой и второй контейнер с субстратом, гидролизуемым гидролазой.
Одно воплощение в соответствии с этим аспектом данного изобретения касается набора альгинатного гидрогеля, включающего один контейнер с раствором, содержащим гидролазу, и второй контейнер с раствором, содержащим альгинат, соединение, высвобождающее двухвалентные катионы, и субстрат, гидролизуемый гидролазой.
Еще одно воплощение этого аспекта касается набора альгинатного гидрогеля, включающего один контейнер с раствором, содержащим субстрат, гидролизуемый гидролазой, и второй контейнер с раствором, содержащим альгинат, соединение, высвобождающее двухвалентные катионы, и гидролазу.
Наконец, данное изобретение относится к применению гидролазы и субстрата, гидролизуемого гидролазой, в изготовлении альгинатного гидрогеля. В соответствии с одним воплощением фермент, используемый в соответствии с этим аспектом, представляет собой эстеразу, такую как липаза, например, триацилглицеридлипаза.
В соответствии с одним воплощением данного аспекта изобретение предусматривает применение гидролазы и субстрата в изготовлении альгинатного гидрогеля с внедрением биологического материала, предпочтительно сперматозоидов.
Подробное описание изобретения
Данное изобретение предусматривает новый способ изготовления альгинатных гидрогелей, используемых в различных областях применения. В частности, данное изобретение предусматривает новый способ изготовления гидрогелей, которые, в частности, используются для внедрения и иммобилизации биологических материалов.
Различные типы альгината могут быть использованы для изготовления гидрогелей в соответствии с данным изобретением. Соотношение гулуроновой кислоты и маннуроновой кислоты не является критическим, т.е. тип альгината и содержание гулуроновой кислоты по сравнению с маннуроновой кислотой могут быть выбраны в зависимости от желаемой прочности, стабильности, способности к набуханию, эрозионных характеристик и т.д. Применение G-богатых альгинатов будет, например, давать более прочные, более стабильные гидрогели.
В соответствии с одним воплощением альгинат, используемый для формирования гидрогелей, представляет собой альгинат, богатый гулуроновой кислотой. Термин «альгинат, богатый гулуроновой кислотой» или «G-богатый альгинат», используемый в данном документе, означает альгинат, содержащий большее количество гулуроновой кислоты по сравнению с маннуроновой кислотой в полисахаридной полимерной цепи используемого альгината. Напротив, термин «М-богатый альгинат» или «альгинат, богатый маннуроновой кислотой», используемый в данном документе, означает альгинат, содержащий более высокие количества маннуроновой кислоты по сравнению с гулуроновой кислотой. Термин «богатый», используемый в связи с альгинатами, содержащими большее количество маннуроновой кислоты или гулуроновой кислоты, соответственно, хорошо известен и обычно используется специалистами в данной области, например, в Britt Iren Glaerum Svanem et al. Journal of Biological Chemistry Vol 276, No 34, Aug 24 2001 pp31542-31550, Sumita Jain et al. Molecular Microbiology (2003) 47(4), pp1123-1133, Marco Mancini et al. Journal of Food Engineering 39 (1999) pp369-378, Applied and Environmental Microbiology, Sept 1982, Vol.44 No.3 pp754-756, патенте США 5639467, публикации патента США 2006/0159823, Ji Minghou (M.H. Chi) et al. Hydrobiologia 116/117 (1984), pp554-556.
Неограничивающие примеры подходящих типов альгината, которые будут использоваться в соответствии с данным изобретением, включают FMC LF 10/40, FMC LF 10/60 и FMC LF 20/60, доступные от FMC Biopolymer AS, Драммен, Норвегия, А2033 от Sigma, Осло, Норвегия, или альгинаты Pronova UP MYG, Pronova UP LVG, доступные, например, от NovaMatrix, Сандвика, Норвегия.
Функция альгинатного гидрогеля в соответствии с данным изобретением не зависит от трехмерной формы образованного гидрогеля, т.е. альгинатный гидрогель может иметь различную форму, такую как, например, сферическая или цилиндрическая. Различные формы альгинатного геля могут быть получены в зависимости от используемого контейнера для гелеобразования.
Также в соответствии с данным изобретением могут быть использованы другие полимеры, которые после воздействия фермента и субстрата, приводящего к высвобождению двухвалентных катионов, формируют гидрогели.
3
+
В соответствии с данным изобретением фермент, т.е. гидролаза, вместе с соответствующим субстратом к ней используется для инициации гелеобразования альгината. Термин «гидролаза», используемый в данном документе, охватывает гидролазы, способные продуцировать HO при смешивании раствора, содержащего субстрат(ы), с другим раствором, содержащим гидролазу. В соответствии с одним воплощением данного изобретения гидролаза представляет собой липазу. В соответствии с еще одним воплощением данного изобретения липаза представляет собой ацилгидролазу, более предпочтительно триглицеридлипазу, такую как, например, триацилглицеридлипаза, выделенная из дрожжей Candida rugosa. Подходящая липаза доступна от Sigma-Aldrich Co. LLC (L1754 - тип VII или L3001 тип I, CAS №9001-62-1).
3
+
Следует понимать, что любая гидролаза, приводящая к чистой продукции HO при гидролизе ее субстрата, может быть использована в соответствии с данным изобретением. Гидролаза, которая может быть использована, таким образом, может быть выбрана из группы, состоящей из гидролаз эфиров карбоновых кислот, гликозидаз и ферментов, действующих на углерод-углеродные связи в кетоновых веществах.
Неограничивающие примеры гидролаз эфиров карбоновых кислот включают карбоксилэстеразу, триглицеридлипазы, ацетилэстеразу, стеролэстеразу, L-арабинонолактоназу, глюконолактоназу, ацилглицероллипазу, y-ацетилглюкозо-деацетилазу, липопротеинлипазу, синтазу этиловых эфиров жирных кислот и диацилглицерол-ацилгидролазу.
Неограничивающие примеры гидролаз, воздействующих на углерод-углеродные связи в кетоновых веществах, включают ацилпируват-гидролазу и ацетилпируват-гидролазу.
Неограничивающим примером гликозидазы является α-галактуронидаза.
При формировании альгинатного геля в соответствии с данным изобретением гидролаза и ее субстрат присутствуют в различных растворах, которые при перемешивании инициируют процесс гелеобразования, где один из указанных двух растворов в дополнение содержит альгинат и соединение, высвобождающее двухвалентные катионы. Последовательность смешивания, т.е. добавляют ли раствор, содержащий фермент, к раствору, содержащему субстрат, или наоборот, или же это раствор, содержащий фермент, который в дополнение содержит альгинат и соединение, высвобождающее двухвалентные катионы, или наоборот, не является критической.
3
+
Субстрат, используемый в формировании альгинатного гидрогеля в соответствии с данным изобретением, является субстратом, который после связывания с ферментом приводит к продукции HO. Субстрат, таким образом, может варьировать в зависимости от типа используемой гидролазы в соответствии с данным изобретением.
Подходящими субстратами в соответствии с данным изобретением являются сложные эфиры органических кислот, таких как карбоновые кислоты.
В соответствии с одним воплощением данного изобретения субстрат представляет собой соединение формулы I:
1
2
3
1
12
1
2
3
1
2
3
1
2
3
где R, R и R независимо друг от друга являются одинаковыми или различными и представляют собой линейную или разветвленную, замещенную или незамещенную C-C-алкил карбонильную цепь, такую как, например, метанон, этанон, ацетон, бутанон, пентанон, гексанон, гептанон, октанон, нонанон, деканон, додеканон и т.д. В соответствии с одним воплощением R, R и R являются метанонами. В соответствии с одним воплощением R, R и R являются этанонами. В соответствии с еще одним воплощением R, R и R являются ацетонами. Субстраты формулы I, в частности, используются в формировании альгинатных гидрогелей с помощью триацилглицеридпипазы в качестве гидролазы в соответствии с данным изобретением.
3
+
После связывания с ферментом, присутствующим в первом разбавителе, указанный сложный эфир формулы I разделяется на глицерин и карбоновую кислоту, т.е. образует, таким образом, HO.
3
+
Алкильная карбонильная цепь может быть разветвленной или неразветвленной. Алкильная карбонильная цепь также может быть замещенной или незамещенной. Специалист в данной области на основании изложенной здесь идеи поймет, что могут быть использованы различные субстраты, покрываемые формулой I, и сможет на основании идей данного документа выбрать правильный субстрат для применения в соответствии с данным изобретением. Таким образом, специалист в данной области будет иметь в виду, что длина алкильной цепи может изменяться без влияния на способность фермента продуцировать глицерин и карбоновую кислоту субстрата, что приводит к высвобождению ионов HO.
В соответствии с предпочтительным воплощением данного изобретения субстрат выбирают из группы триацетина, трипропионина и трибутирина с формулами:
1
2
3
1
4
Таким образом, в соответствии с одним воплощением R, R и R представляют собой С-С-алкилкарбонил.
В соответствии с еще одним воплощением данного изобретения присутствующий субстрат выбирают из группы, состоящей из трипропионина и трибутирина.
3
3
+
+
2+
2+
2+
В соответствии с данным изобретением смешивание гидролазы и субстрата, определенного выше, приводит к продукции HO. Указанный HO, кроме того, приводит к высвобождению двухвалентных катионов из агента, высвобождающего двухвалентные катионы. Термин «агент, высвобождающий двухвалентные катионы» охватывает соединения, приводящие к высвобождению, например, Са, Br или Sr.
3
3
3
В соответствии с одним воплощением данного изобретения агент, высвобождающий двухвалентные катионы, представляет собой карбонатную соль, например СаСО, BrCO или SrCO. В соответствии с предпочтительным воплощением агент, высвобождающий двухвалентные катионы, представляет собой агент, высвобождающий кальций, такой как, например, карбонат кальция.
В соответствии с одним воплощением данного изобретения предусматривает способ по данному изобретению для внедрения различных материалов в полимерную матрицу гидрогеля. Термин «внедрение» или «внедренный», используемый в данном документе, следует понимать как иммобилизацию материала в альгинатных гидрогелях данного изобретения, где альгинатная сеть присутствует во всем диаметре гидрогеля (в отличие от инкапсуляции, где гидрогель образует стенку вокруг жидкого ядра, не содержащего полимерную сеть).
Термин «биологический материал» следует понимать как охватывающий любой тип биологического материала, подходящего для иммобилизации или инкапсулированного в биосовместимые гидрогели. Неограничивающий список биологических материалов включает, например, клетки для трансплантации, такие как, например, инсулин-продуцирующие клетки, клетки гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, или сперматозоиды для применения в искусственном оплодотворении и других репродуктивных технологиях.
В случае если материал для внедрения представляет собой сперматозоиды, внедрение приводит к тому, что сперматозоиды не имеют возможности проявлять свою природную способность двигаться. Степень иммобилизации может изменяться в зависимости от характеристик альгинатного гидрогеля, например, от механической прочности и способности к дезинтеграции, например, после осеменения животного-реципиента.
В соответствии с одним предпочтительным воплощением биологический материал для иммобилизации в соответствии с данным способом, представляет собой сперматозоиды. Сперматозоиды, иммобилизованные в альгинатном гидрогеле, полученном в соответствии с данным изобретением, возможно, могут быть подвергнуты криоконсервации для хранения в жидком азоте. Альгинатный гидрогель, содержащий иммобилизованные сперматозоиды, полученный в соответствии с данным изобретением, может быть изготовлен в виде готовых к применению доз осеменения путем иммобилизации подходящего числа сперматозоидов в альгинатном гидрогеле, а также путем выполнения гелеобразования в контейнере, таком как пробирка, обычно используемом в процедурах искусственного осеменения и имеющем нужный размер, форму и объем.
Для встраивания (иммобилизации) сперматозоидов в гидрогель в соответствии с одним воплощением данного изобретения сперматозоиды после сбора разводят в разбавителе, содержащей либо фермент, либо субстрат. Указанный разбавленный раствор сперматозоидов, возможно, охлаждают примерно до 4°C. Раствор, используемый для разведения сперматозоидов, в данном документе также называют раствором-наполнителем (см., например, пример 1).
В соответствии с предпочтительным воплощением данного изобретения сперматозоиды сначала разводят в растворе-наполнителе, не содержащем субстрат или фермент. Затем, на втором этапе разведения, добавляют субстрат или фермент, при этом раствор-наполнитель, который затем используют, в дополнение содержит либо фермент, либо субстрат.
3
2
+
2+
2+
В соответствии с одним воплощением сперматозоиды разводят во второй раз в растворе-наполнителе, содержащем фермент гидролазу. Полученный таким образом раствор затем смешивают со вторым раствором, содержащим альгинат, карбонат кальция и, возможно, криопротектор, такой как глицерин, и субстрат для фермента, присутствующего в первом растворе, содержащем разведенные сперматозоиды и фермент. После добавления и смешивания двух растворов фермент связывается с субстратом, что приводит к образованию кислоты и, следовательно, повышению уровня HO. Карбонат кальция, действующий как буфер, будет предотвращать повышение pH, приводя к высвобождению Са и продукции CO. Высвобождение Са приводит к поперечному сшиванию полисахаридных цепей альгината и, таким образом, формированию альгинатного гидрогеля.
Следует понимать, что сперматозоиды также могут быть разведены в растворе-наполнителе, содержащем субстрат, гидролизуемый ферментом, который будет использоваться в соответствии с данным изобретением, который затем смешивают со вторым раствором, содержащим фермент, карбонат кальция и, возможно, криопротектор.
Таким образом, сперматозоиды сначала могут быть разведены в растворе-наполнителе и затем подвергнуты второму разведению путем добавления большего количества раствора-наполнителя, также содержащего субстрат. Полученный таким образом раствор затем может быть смешан с раствором, содержащим фермент, альгинат, карбонат кальция и, возможно, криопротектор, такой как глицерин. При смешивании двух растворов инициируется гелеобразование.
Температура растворителя, используемого для разведения сперматозоидов, и температура дальнейших этапов формирования геля может изменяться в зависимости, например, от типа и источника сперматозоидов. Способ данного изобретения, таким образом, может быть осуществлен в холодильнике или при комнатной температуре (например, 20-24°C) или даже при более высокой температуре, такой как, например, 30-35°C.
Способ по изобретению делает возможным контроль скорости процесса гелеобразования путем варьирования количества используемого фермента. Кроме того, концентрация используемого альгината влияет на механические характеристики образованного гидрогеля и, следовательно, на характеристики растворения гидрогеля. Концентрация альгината, таким образом, может варьировать в зависимости от желаемых характеристик гидрогеля в зависимости от области применения гидрогеля. Специалист в данной области на основании идей данного документа сможет выбрать подходящее количество используемого фермента, субстрата и альгината для получения заданной прочности геля и желаемого времени гелеобразования.
Например, применение 3 г триацилглицеридлипазы на литр и 0,3-1 г субстрата на 100 мл в растворе сперматозоидов/альгината, полученном после смешивания двух растворов в соответствии с данным изобретением, дает время гелеобразования примерно 2-3 ч, если раствор хранят при температуре примерно 4°C. Количество субстрата может дополнительно варьировать в зависимости от типа используемого фермента.
3
+
Кроме того, количество кислоты и, таким образом, количество HO, полученного при смешивании двух растворов, можно регулировать с помощью количества субстрата, присутствующего во втором разбавителе. Таким образом, можно контролировать как скорость гелеобразования, так и конечный pH процесса, что является преимуществом с промышленной точки зрения. Это обеспечивает улучшенный и более легкий процесс производства, которым можно выполнить гелеобразование, когда оно подходит с точки зрения производства, так как гелеобразование начинается при смешивании сперматозоидов, разведенных в растворе-наполнителе, содержащем либо фермент, либо субстрат.
При внедрении биологического материала следует понимать, что смешиваемый раствор в дополнение может содержать соединения, используемые, например, с целью консервации, такие как, например, антибиотики, наполнители, антиоксиданты, буферы и т.д., см. WO 2008/004890.
Концентрация биологического материала, например живых клеток, внедренных в альгинатные гидрогели в соответствии с данным изобретением, может варьировать в зависимости от типа/источника материала. В случае внедрения сперматозоидов концентрация также может варьировать в зависимости от породы, животного-реципиента, методик осеменения, наличия дополнительных соединений (например, с целью консервации) и т.д., см., например, WO 2008/004890.
Хотя данное изобретение особенно полезно для внедрения в альгинатный гель биологического материала в виде клеток или тканей, следует понимать, что альгинатные гели, полученные в соответствии с данным изобретением, также имеют ряд других применений, в том числе внедрение или иммобилизацию, других объектов, отличных от биологического материала, а также применений, включающих гидрогели сами по себе. Данное изобретение, таким образом, не должно быть истолковано как ограниченное применениями, конкретно раскрытыми в примерах, приведенных в описании.
Таким образом, другие объекты, представляющие интерес, также могут быть встроены в альгинатный гидрогель, полученный в соответствии с данным изобретением. Термин «объект для внедрения в альгинатный гидрогель», используемый в данном описании, охватывает любой материал, который пригоден для иммобилизации в гидрогеле. Например, в случае, когда альгинатный гидрогель в соответствии с данным изобретением должен быть использован в качестве системы с контролируемым высвобождением, объект для внедрения может быть фармацевтически активным ингредиентом. Например, альгинатные гели, полученные в соответствии с данным изобретением, могут быть использованы в качестве системы доставки с контролируемым высвобождением или замедленным высвобождением для диапазона соединений, таких как фармацевтически активные соединения, см., например, WO 98/46211, US 4695463, US 6656508, которые включены в данный документ посредством ссылки. Неограничивающая группа фармацевтически активных ингредиентов, которые будут внедрены в альгинатный гидрогель в соответствии с данным изобретением, включает, например, рекомбинантные или природные белки или полипептиды, природные или синтетические или полусинтетические соединения, такие как факторы роста, гормоны, антитела, интерфероны, интерлейкины и т.д. Альгинатные гидрогели в соответствии с данным изобретением также могут применяться в пищевой промышленности, например, для внедрения питательных веществ.
Гидрогели, полученные в соответствии с данным изобретением, также могут быть использованы сами по себе для других промышленных целей, таких как фармацевтическая промышленность или косметическая промышленность (например, в качестве загустителя, в раневых повязках, в стоматологических продуктах и способах), или в пищевой промышленности для человека и животных (например, в изготовлении реструктурированной пищи, в качестве загустителя и т.д.).
Данное изобретение предусматривает преимущества по сравнению с известным уровнем техники. Например, при применении методики, описанной в US 6497902, на скорость реакции, а также на количество образованной кислоты можно влиять, изменяя концентрацию GDL. Изменения в концентрации GDL, тем не менее, будут одновременно также влиять на количество образованной кислоты и, таким образом, на конечное значение pH в геле. Изготовление альгинатного гидрогеля с помощью фермента и субстрата, гидролизуемого указанным ферментом, чтобы инициировать гелеобразование, позволяет значительно лучше контролировать скорость реакции и количество образованной кислоты (pH в геле), так как скорость реакции и конечное значение pH могут по отдельности контролироваться путем изменения концентрации фермента и субстрата, соответственно.
В соответствии с еще одним аспектом данное изобретение предусматривает набор альгинатного гидрогеля, включающий контейнер с гидролазой и другой контейнер с субстратом, гидролизуемым гидролазой.
Набор в соответствии с данным изобретением также может содержать другие соединения, необходимые для заливки альгинатного гидрогеля в соответствии с данным изобретением. Таким образом, набор также может включать альгинат и соединение, высвобождающее двухвалентные катионы. Указанные соединения могут содержаться в контейнере с гидролазой, в контейнере с субстратом, гидролизуемым указанной гидролазой, или они могут содержаться в отдельном контейнере(ах).
Контейнеры также могут содержать другие соединения, представляющие конкретный интерес в зависимости от применения альгинатного гидрогеля, залитого с помощью набора данного изобретения.
Например, в случае, если набор следует использовать для заливки гелей, содержащих биологический материал, такой как клеточный материал, например, сперматозоиды, и если полученный альгинатный гидрогель должен быть далее подвергнут криоконсервации, то набор также может содержать криопротектор, такой как, например, глицерин, этиленгликоль, метанол, DMA, DMSO, пропиленгликоль, трегалозу, глюкозу. Указанный криопротектор(ы) может содержаться в контейнере с гидролазой, в контейнере с субстратом, гидролизуемым указанной гидролазой, или он может содержаться в отдельном контейнере(ах).
Набор может также содержать другие соединения, используемые с целью консервации, такие как, например, антибиотики, наполнители, антиоксиданты, буферы и т.д., известные специалисту в данной области, см., например, WO 2008/004890.
Для иллюстративных целей даны следующие примеры. Следует понимать, что приведенные ниже примеры не должны быть истолкованы как ограничивающие объем данного изобретения. Приведенное выше описание различных воплощений данного изобретения раскрывает общий характер изобретения, и специалист в данной области сможет применить общие знания в области гидрогелей, легко модифицировать и/или адаптировать способ данного изобретения без излишнего экспериментирования, не отходя от общей концепции данного изобретения и объема прилагаемой формулы изобретения. Таким образом, такие адаптации или модификации включают диапазон эквивалентов раскрытых воплощений, основанный на идеях и рекомендациях, представленных в данном документе. Следует понимать, что терминология, используемая в данном документе, служит для описания, а не ограничения. Таким образом, терминология данного описания должна быть интерпретирована специалистом в данной области в свете идей и рекомендаций, представленных в данном описании; в сочетании со знаниями в данной области.
Пример 1: Иммобилизация бычьих сперматозоидов
Материалы и методы
Материалы
3
Использовали следующие химические вещества: тризма гидрохлорид и EDTA от Sigma (Сент-Луис, США), NaHCO, NaCl, глицерин (>99%), цитрат натрия и пируват натрия от Riedel de Haën (Зельце, Германия), моногидрат фруктозы и глюкозы от Norsk Medisinaldepot (Осло, Норвегия), карбонат кальция от KSL staubtechnik gmbh (Лауинген, Германия) и альгинат натрия (PROTANAL LF 10/60) от FMC Biopolymer A/S (Драммен, Норвегия).
Источник сперматозоидов
Бычьи сперматозоиды собирали с объектов Geno Hallsteingard в Тронхейме и Store Ree в Штанге, Норвегия.
Буферные растворы
Использовали следующие растворы-наполнители:
Наполнитель для первого разведения сперматозоидов: 1,45 г/л тризма гидрохлорид глюкозы, 0,4 г/л цитрата натрия, 1 г/л фруктозы, 0,22 г/л пирувата натрия и 200 мл/л яичного желтка. pH раствора доводили до 6,4 добавлением NaOH.
3
Раствор-наполнитель для второго разведения сперматозоидов: 4 г/л карбоната кальция (если не указано иное), 54 г/л фруктозы, 170 г/л глицерина и 24 г/л альгината натрия LF10/60. Оба наполнителя содержат стандартный коктейль антибиотиков с конечной концентрацией, по меньшей мере требуемой в директиве ЕС 88/407. Модификации IVT: 3 г/л глюкозы, 20 г/л цитрата натрия, 2,1 г/л NaHCO, 1,16 г/л NaCl, 3 г/л EDTA, pH 7,35. В растворы-наполнители добавляли либо фермент (Sigma L1754), либо субстрат, как указано ниже.
Разведение, иммобилизация и криоконсервация бычьих сперматозоидов
6
Бычьи сперматозоиды собирали с объектов Geno и разводили, как описано ниже: сразу же после сбора сперматозоиды разводили до концентрации 219×10клеток/мл в растворе-наполнителе для первого разведения. Затем этот раствор немедленно смешивали с равным объемом наполнителя для дальнейшего разведения, где указанный наполнитель теперь содержал либо фермент, либо субстрат. Затем полученный раствор, содержащий разведенные сперматозоиды, охлаждали до 4°C.
После охлаждения до 4°C раствор смешивали с равным объемом раствора-наполнителя для третьего разведения, где указанный наполнитель теперь содержал либо субстрат (триацетин, трипропионин или трибутирин), если разведенные сперматозоиды из предыдущего этапа содержали фермент, либо фермент, если разведенные сперматозоиды из предыдущего этапа содержали субстрат. Кроме того, наполнитель теперь содержал карбонат кальция в качестве соединения, высвобождающего двухвалентные катионы, и альгинат. Затем полученные растворы переносили в пробирки для осеменения и уравновешивали при 4°C в течение примерно 3 часов. Затем пробирки для осеменения переносили в Na-морозильную камеру и замораживали в соответствии со стандартными процедурами для спермы быков.
Оценка подвижности
Подвижность сперматозоидов оценивали в микроскопическом исследовании. Замороженные пробирки для осеменения размораживали в водяной бане при температуре 37°C в течение 30 секунд. Перед измерением альгинатный гель разжижали в модифицированном IVT растворе. Содержимое пробирки для осеменения добавляли к 0,9 мл раствора IVT и осторожно встряхивали на устройстве для переворачивания пробирок в течение примерно 10 минут. Перед оценкой подвижности пробирки предварительно нагревали в течение минимум 15 минут в нагревательном блоке при 37°C. Примерно 3 мкл раствора вносили на предварительно нагретое предметное стекло для микроскопии и сразу же изучали его при помощи светового микроскопа. Число подвижных сперматозоидов в каждой пробе оценивали с ближайшим интервалом 5%. Если практически это было возможно, оператор в ходе оценки не знал об источнике образца.
Результаты
a) Иммобилизация бычьих сперматозоидов с использованием триацетина в качестве субстрата
Сперматозоиды собирали и разводили в соответствии с процедурами, описанными выше. В раствор-наполнитель для второго разведения добавляли фермент (Sigma L1754) до концентрации 6 г/л в конечном растворе, содержащем сперматозоиды. Раствор-наполнитель для третьего разведения содержал 8 г/л карбоната кальция, и в него добавляли триацетин до концентрации 0,5 г/100 мл. Примерно через 4 часа после второго разведения формировали гель для иммобилизации сперматозоидов. Примерно после 24 часов хранения при 4°C гель разжижали и оценивали подвижность иммобилизованных сперматозоидов. Примерно 60% сперматозоидов в это время были подвижными.
b) Иммобилизация бычьих сперматозоидов с использованием трипропионина в качестве субстрата
Сперматозоиды собирали, разводили, иммобилизовали и криоконсервировали в соответствии с процедурами, описанными выше. В раствор-наполнитель для второго разведения добавляли фермент (Sigma L1754) до концентрации 6 г/л в конечном растворе, содержащем разведенные сперматозоиды. Раствор-наполнитель для третьего разведения содержал 4 г/л карбоната кальция, и в него добавляли трипропионин до концентрации 0,30 г на 100 мл. Приблизительно через 3 часа после второго разведения формировали гель и замораживали пробирки, содержащие иммобилизованные сперматозоиды. Пробирки для осеменения хранили в жидком Na в течение нескольких дней до размораживания и оценки подвижности. Примерно 60% сперматозоидов были подвижны после размораживания и разжижения геля.
c) Иммобилизация бычьих сперматозоидов с использованием трипропионина в качестве субстрата
Сперматозоиды собирали, разводили, иммобилизовали и криоконсервировали в соответствии с процедурами, описанными выше. В раствор-наполнитель для второго разведения добавляли трипропионин до концентрации 0,30 г/100 мл в конечном растворе, содержащем разведенные сперматозоиды. Раствор-наполнитель для третьего разведения содержал 4 г/л карбоната кальция, и в него добавляли фермент Sigma L1754 до концентрации 6 г/л. Приблизительно через 2 часа после второго разведения формировали гель. Примерно после 24 часов хранения при 4°C гель разжижали и оценивали подвижность иммобилизованных сперматозоидов. Примерно 60% сперматозоидов в это время были подвижными.
d) Иммобилизация бычьих сперматозоидов с использованием трибутирина в качестве субстрата
2
Сперматозоиды собирали, разводили, иммобилизовали и криоконсервировали в соответствии с процедурами, описанными выше. В раствор-наполнитель для второго разведения добавляли фермент (Sigma L1754) до концентрации 6 г/л в конечном растворе, содержащем разведенные сперматозоиды. Раствор-наполнитель для третьего разведения содержал 4 г/л карбоната кальция, и в него добавляли трибутирин до концентрации 0,35 г на 100 мл. Приблизительно через 3 часа после второго разведения формировали гель и замораживали пробирки, содержащие иммобилизованные сперматозоиды. Пробирки для осеменения хранили в жидком N в течение нескольких дней до размораживания и оценки подвижности. Примерно 60% сперматозоидов были подвижны после размораживания и разжижения геля.
Пример 2: Контролируемое изготовление кальций-альгинатного геля с использованием фермента липазы и субстратов триацетина или триоктаноата
Материалы и методы
Материалы
Альгинат натрия (PROTANAL LF 10/60) от FMC Biopolymer A/S (Драммен, Норвегия), ферменты L3001 и L1754 от Sigma (Сент-Луис, США), триацетин и триоктаноат от Sigma (Сент-Луис, США), карбонат кальция от KSL staubtechnik GmbH (Лауинген, Германия).
Растворы
Использовали следующие растворы. Раствор L1.1: 10 г/л раствор фермента L3001 в дистиллированной воде, раствор L1.2: 0,2 г/л триацетина в дистиллированной воде. Раствор L2.1: 4 г/л карбоната кальция, 24 г/л альгината натрия LF10/60 и 0,1 г/л триацетина в дистиллированной воде. Раствор L2.2: 4 г/л карбоната кальция, 24 г/л альгината натрия LF10/60 и 0,2 г/л триацетина в дистиллированной воде. Раствор L2.3: 4 г/л карбоната кальция, 24 г/л альгината натрия LF10/60 и 0,3 г/л триацетина в дистиллированной воде. Раствор L2.4: 4 г/л карбоната кальция, 24 г/л альгината натрия LF10/60 и 10 г/л фермента L3001 в дистиллированной воде. Раствор L2.5: 4 г/л карбоната кальция, 24 г/л альгината натрия LF10/60 и 0,3 г/л триоктаноата в дистиллированной воде.
Инициирование гелеобразования
Гелеобразование инициировали путем смешивания одного из Li-растворов с равным объемом одного из L2-растворов. Растворы смешивали в соответствии с таблицей 1.
Таблица 1
Экспериментальные исследования гелеобразования с использованием фермента L3001 и субстрата триацетина. В таблице приведены комбинации исследуемых растворов, а также используемые концентрации фермента и субстрата триацетина.
Исследование
Растворы
Концентрации
1
L1.1+L2.1
10 г/л фермента L3001, 0,1 г/л триацетина
2
L1.1+L2.2
10 г/л фермента L3001, 0,2 г/л триацетина
3
L1.1+L2.3
10 г/л фермента L3001, 0,3 г/л триацетина
4
L1.2+L2.4
0,2 г/л триацетина, 10 г/л фермента L3001
0,2 г/л триацетина, 0,2 г/л триацетина (без добавления фермента)
5
L1.2+L2.2
6
L1.3+L2.5
110 г/л фермента L1754, 0,4 г/л триоктаноата
Все растворы перед смешиванием имели комнатную температуру, и растворы оставляли при комнатной температуре на время гелеобразования. За временным ходом реакции гелеобразования следили путем визуального осмотра растворов.
Результаты
3
+
Ферменты L3001 (липаза из зародышей пшеницы) и L1754 (липаза из Candida rugosa) и субстраты триацетин и триоктаноат использовали для контролируемого гелеобразования натрий-альгинатных растворов. Растворы фермента и субстрата готовили и смешивали в соответствии с таблицей 1. Реакция между ферментом и субстратом давала HO-ионы, которые реагировали с суспендированным карбонатом кальция в растворах. Эта реакция высвобождала ионы кальция, которые взаимодействовали с альгинатными полимерными цепями в растворе, и формировался гель. Время до формирования геля в экспериментальных испытаниях приведено в таблице 2. Гель не сформировался в экспериментальном испытании 5, в котором фермент добавлен не был. Результаты показывают, что время реакции зависит и от выбранного типа субстрата, и от типа фермента, а также от используемых концентраций фермента и субстрата.
Таблица 2
Наблюдаемое время до гелеобразования, происходящего после смешивания растворов, содержащих ферменты (Sigma L3001 или L1754) и/или субстрат (триацетин или триоктаноат).
Исследование
Растворы
Время до гелеобразования (ч:м)
1
L1.1+L2.1
2:00
2
L1.1+L2.2
1:50
3
L1.1+L2.3
1:30
4
L1.2+L2.4
1:50
5
L1.2+L2.2
Гель не сформировался
6
L1.3+L2.5
0:30