Применение панели локусов тандемных повторов переменной копийности для типирования штаммов Coxiella burnetii

ЯНВАРЬ №1

39

ПРИМЕНЕНИЕ ПАНЕЛИ ЛОКУСОВ ТАНДЕМНЫХ ПОВТОРОВ ПЕРЕМЕННОЙ КОПИЙНОСТИ ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ

COXIELLA BURNETII

Ю.А. Панфёрова

APPLICATION FOR COXIELLA BURNETII STRAINS GENOTYPING USING PANEL OF VARIABLE NUMBER TANDEM REPEATS

Yu.A. Panferova ФБУН НИИ Эпидемиологии и Микробиологии имени Пастера

Проведено генотипирование 11 штаммов Coxiella burnetii различного географического происхождения с помощью анализа локусов тандемных повторов переменной копийности (VNTR). Выявлена ассоциация генотипических кластеров с источником происхождения штамма. Установлено, что анализ шести локусов VNTR обладает высокой дискриминационной и типирующей способностью.

Ключевые слова: Coxiella burnetii, VNTR-анализ, молекулярная эпидемиология.

Eleven Coxiella burnetii strains from different geographical areas were genotyped using multilocus analysis of variable number tandem repeats (VNTR). Distinct genetic clasters were associated with geographical source of isolates. Typeability and high discriminatory power of six VNTR locuses panel was established. Keywords: Coxiella burnetii, VNTR-analysis, molecular epidemiology.

Метод мультилокусного анализа тандемных повторов переменной копийности (VNTR) применяется в мировой практике для типирова-ния штаммов С. burnetii с целью мониторинга за циркуляцией отдельных генотипов патогена на определенной территории и возможности установления источника инфекции {2, 4]. В настоящее время создание баз данных с учетом территориальной распространенности изолятов С. burnetii является достаточно острой проблемой в связи с существованием энзоотических очагов коксиеллезной инфекции на территории России и республик бывшего СССР, а также в связи с возможностью проникновения «новых» генотипов (в том числе обладающих высокой па-тогенностью) из удаленных регионов.

Целью данного исследования являлся анализ распределения аллелей локусов, содержащих тандемные повторы переменной копийности, и выбор панели локусов, позволяющих дифференцировать штаммы различного географического происхождения как возможного инструмента для молекулярно-эпидемиологического мониторинга Ку-лихорадки в очагах.

Материалы и методы. Было исследовано 11 штаммов C. burnetii коллекции штаммов НИИЭМ им. Пастера. Штаммы были выделены на территории России (группа штаммов Луга, в том числе Ixodes-3, Cimex-2, Желтогорлая мышь; штаммы Ленинград-2, Вологда-2, Уфа-1), Казахстана (Казахстанский-4, Чередов), МНР (Монголия-1), Западной Европы (Henzerling), а также атеньюированный штамм М44, входя -щий в состав вакцины Ку-лихорадки. В качестве референса был выбран штамм Henzerling; полная нуклеотидная последовательность данного штамма опубликована, размеры локусов VNTR для него были рассчитаны с помощью базы данных тандемных повторов прокариот (http:// minisatellites.u-psud.fr). Выделение ДНК проводили методом лизиса с использованием гуа-

нидинизотиацианата с сорбцией на силикагеле. Для проведения амплификации использовали термоциклер MyCycler (BioRad) в режимах, обеспечивающих специфичность реакции для каждой пары праймеров.

Для проведения анализа было выбрано 7 локусов мини- и микросателлитных тандемных повторов различной длины мотива (единицы повтора), копийности и локализации в геноме (характеристика локусов представлена в таблице). Максимальная и минимальная длина локусов у штаммов, полная нуклеотидная последовательность генома которых известна, была рассчитана с помощью пакета программ в базах данных VNTR (http://minisatellites.u-psud.fr) и Entrez Nucleotide (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore).

Для оценки видоспецифичности использованных праймеров и потенциальной возможности применения данного метода генотипиро-вания в биологических образцах без выделения чистой культуры коксиелл было проведено исследование органов белых мышей на 7-й день после инфекции (внутрибрюшинное заражение суспензией штаммов Вологда-2 и Чередов, 2 х 107 кл). Проведен анализ тотальной ДНК, выделенной из суспензии почек и селезёнки, после подтверждения наличия в пробах ДНК С. burnetii методом ПЦР с видоспецифичными праймерами к фрагменту гена groEL.

Путем анализа парных аллельных отличий локусов VNTR с помощью метода «объединения ближайших соседей» была создана дендро-грамма; родство между аллельными профилями штаммов было установлено с использованием метода иерархического алгоритма связывания, основанного на вычислении коэффициента сходства (UPGMA). Для оценки дискриминационной способности было также проведено сравнение кластеризации штаммов коксиелл при исследовании их методом MLVA и методом

40

ЗНиСО ЯНВАРЬ №1

Таблица. Характеристика локусов VNTR

Номер локуса Название локуса Размер мотива

1 Cbu1941_ms36 9 474-601

2 Cbu1471_ms34 6 227-1600

3 Cbu0988_ms07 126 734-1112

4 Cbu1316_ms12 126 570-1200

5 Cbu1941_ms20 18 384-528

6 Cbu0831_ms26 9 109-244

7 Cbu0259_ms24 7 204-344

мультилокусного сиквенс-типирования, проведенного для тех же штаммов ранее [3].

Результаты и обсуждение. Оптимизация ПЦР включала подбор температуры отжига прайме-ров для специфического связывания с ДНК-матрицей методом температурного градиента: для локусов 1, 3, 5 она составила 61 °С, для локусов 2, 6, 7 — 62 °С. Был выявлен генетический полиморфизм всех исследованных локусов, содержащих тандемные повторы переменной ко-пийности, причем степень полиморфизма отдельных локусов различалась. Во всех случаях длина амплифицированных локусов референс-штамма Henzerling соответствовала рассчитанной с помощью анализа базы данных. Продукты ПЦР локуса 4 были получены только для 4 штаммов даже при варьирующих параметрах амплификации, возможно из-за наличия мутаций в точках связывания праймеров прочих штаммов, поэтому из дальнейшего анализа он был исключен, хотя и характеризовался полиморфностью.

По представленной на рис. 1 дендрограмме видно, что коэффициент сходства между исследованными штаммами варьирует от 0,33 до 1,0. Штаммы, выделенные на территории России, за исключением штамма Ленинград-2, а также штаммы Монголия-1 и Казахстанский-4 образуют единую группу (VNTR-тип 1). Размеры всех исследованных локусов VNTR в пределах этой группы были одинаковы, и коэффициент сходства для нее составил 1,0. Данная группа представлена штаммами С. burnetii, выделенными на территории европейской части России (штаммы группы Луга, Вологда-2; штамм Уфа-1), в том числе Северо-Западного федерального округа, а также штаммами, выделенными на территории Казахстана (Казахстанский-4) и Монголии. Наибольшая степень сходства этой группы отмечена с западно-европейским штаммом Henzerling, представляющим отдельную ветвь, (VNTR-тип 2) на основании оценки генетического сходства штаммов; из шести полностью

проанализированных локусов VNTR по размеру у этих групп различался лишь локус 6. Коэффициент сходства этих двух групп составил 0,833. Вместе со штаммом М-44, который по профилям локусов VNTR также представляет несколько обособленную ветвь (VNTR-тип 3), эти две группы объединяются в кластер, коэффициент сходства составляет при этом 0,33 (различаются 4 локуса из 6).

Второй кластер представлен штаммами Ленинград-2 и Чередов, представляющими отдельные филогенетические ветви (различаются два из шести локусов VNTR; VNTR-типы 4 и 5 соответственно), коэффициент сходства этих двух штаммов составляет 0,666. Между двумя кластерами штаммов не выявлено сходства, что свидетельствует о значительной генетической удаленности этих групп штаммов.

При исследовании органов зараженных кок-сиеллами белых мышей профили VNTR совпадали с профилями, характерными для профилей чистых культур штаммов Вологда-2 и Чередов, неспецифические продукты амплификации обнаружены не были.

Генотипические группы, кластеризуемые с помощью MLVA, сравнивались с исследованными ранее генотипическими характеристиками — сиквенс-типами, выделяемыми на основании анализа нуклеотидных последовательностей межгенных спейсеров, для которых была отмечена ассоциация с географическим источником штамма. Исследованные штаммы представляют 5 типов локусов VNTR (в составе 2 кластеров) и 5 сиквенс-типов (в составе 2 монофилетических групп), распределение штаммов при этом совпадает. Учитывая, что отмечалась ассоциация сиквенс-типов с географическим источником штаммов и изолятов [3] и что в исследованиях западно-европейских и американских штаммов коксиелл с помощью MLVA также показана ассоциация с географическим источником, можно предположить,

ЯНВАРЬ №1

41

Рис. 1. Дендрограмма генетических расстояний штаммов С. burnetii по данным мультилокусного VNTR-анализа

что выявление в достаточно однородной популяции С. burnetii, циркулирующей на территории России, штаммов с сильно отличающимися генотипическими свойствами может быть связано с проникновением таких штаммов из удаленных энзоотических районов. Так, штаммы Ленинград-2 и Чередов отличаются от других исследованных штаммов по всем изученным генотипическим маркерам. Это может свидетельствовать, о происхождении этих штаммов из одного географического региона и завозном характере вспышки, в ходе которой был выделен штамм Ленинград-2; гипотеза о распространении данного штамма с сырьем животного и растительного происхождения была выдвинута при ретроспективном анализе вспышек Ку-лихорадки в 1955-1958 гг. в г. Ленинграде [1].

Таким образом, обнаруженное количество группируемых в отдельные кластеры генотипов, выявляемых с помощью MLVA, свидетельствует в пользу высокой дискриминационной возможности данного метода. Панель из шести локусов тандемных повторов позволяет с высокой долей вероятности установить источник происхождения штаммов C. burnetii.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Васильева Л.Д. О вспышках лихорадки Ку профессионального характера в Ленинграде в 1959 г. //Риккетсиозы. Болезни с природной очаговостью / Труды Ленинградского института эпидемиологии и микробиологии им. Пастера. — Л. — 1961. - Т. XXIII. - С. 196.

2. Chmielewski T, Sidi-Boumedine K., Duquesne V., Podsiadly E., Thiery R., Tylewska-Wierzbanowska S. Molecular epidemiology of Q fever in Poland // Pol. J. Microbiol. - 2009. - V. 58. - P. 9-13.

3. Glazunova O., Roux V., Freylikhman O., Sekeyova Z., Fournous G., Tyczka J., Tokarevich N., Kovacava E., Marrie T., Raoult D. Coxiella burnetii genotyping // Emerg. Infect. diseases. 2005. Vol. 11. P. 1211-1217.

4. Klaassen C., Nabuurs-Franssen M., Tilburg J., Hamans M., Horrevots A. Multigenotype Q fever outbreak, the Netherlands // J. Emerg. Infect. Dis. 2009. V. 15. P. 613-614.

Контактная информация:

Панфёрова Юлия Александровна, тел. +7-904-552-5858, e-mail: ersvart@inbox.ru

Contact information: Panferova Yuliha, phone: +7-904-552-5858, e-mail: ersvart@inbox.ru