ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО, СОДЕРЖАЩЕЕ АНТАГОНИСТ IL-33, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЭНДОМЕТРИОЗА
THERAPEUTIC PRODUCT CONTAINING IL-33 ANTAGONIST FOR THE TREATMENT OF ENDOMETRIOSIS

Область техники
Настоящее изобретение имеет отношение к терапевтическому средству для лечения эндометриоза, содержащему антагонист интерлейкина-33 (IL-33) в качестве активного ингредиента.
Уровень техники
Эндометриоз является доброкачественным (незлокачественным) заболеванием, при котором эндометриальная ткань пролиферирует на участке вне полости матки, и затрагивает приблизительно 10% всех женщин репродуктивного возраста. Эндометриоз наблюдается у 25-50% бесплодных женщин.
Несмотря на то, что существуют разные теории в отношении причины возникновения эндометриоза, предполагается, что одной из причин является то, что эндометриальные клетки достигают другой ткани посредством менструальной крови, вызывая эктопическое формирование и пролиферацию эндометриальной ткани.
Аденомиоз матки представляет собой болезнь, при которой нарушение, сходное с эндометрием, наблюдается в миометрии. Хотя болезнь является гистологически похожей на эндометриоз, их лечат как разные болезни, поскольку механизм возникновения и клиническая картина разные. Эта болезнь имеет пиковый возраст проявления в пределах от сорока до сорока девяти лет и ассоциируется с дисменореей, болью внизу живота, болью в нижней части спины, бесплодием и гиперменореей. Типичным клиническим симптомом является менструальная боль, при этом многие пациенты жалуются на сильную боль такой степени, которая нарушает повседневную жизнь. Аденомиоз матки у пациентов также может быть осложнен эндометриозом и миомой матки.
Хотя способы лечения эндометриоза или аденомиоза матки заключаются в хирургическом вмешательстве и медикаментозном лечении, оба эти подхода являются видами симптоматического лечения, а фундаментального метода лечения не существует. Даже в тех случаях, когда выбирается хирургическое вмешательство, полное излечение не достигается вследствие необходимости сохранения детородной функции, и поэтому хирургическое лечение зачастую комбинируется с послеоперационной медикаментозной терапией с целью предотвращения рецидива. Примеры лекарственной терапии включают низкодозированные оральные контрацептивы, антагонисты гонадотропин-рилизинг гормона (GnRH) (такие как леуплин), андроген (такой как даназол) и прогестерон (такой как диеногест). Однако, все эти лекарственные средства оказывают нежелательные побочные действия вследствие воздействия на гормональный баланс. А именно, известно, что диеногест вызывает увеличение уровня смертности эмбрионов после введения беременным крысам. Поэтому использование всех этих лекарственных средств запрещается при беременности. Учитывая, что многие из этих лекарственных средств ассоциируются с симптомами псевдоменопаузы и ложной беременности, они обладают побочными эффектами, сходными с расстройствами в менопаузе, такими как бесплодие, приливы и остеопороз. Таким образом, предполагается создание профилактического средства или терапевтического средства для лечения эндометриоза или аденомиоза матки, которое является высокобезопасным и не оказывает влияния на беременность.
Интерлейкин-33 (IL-33) является цитокином, принадлежащим к семейству интерлейкина-1, который, как принято считать, играет роль в воспалительном состоянии. IL-33 постоянно экспрессируется в ядрах эпителиальных клеток и сосудистых эндотелиальных клеток и функционирует как алармин (молекулярный фрагмент, ассоциированный с повреждением), который высвобождается одновременно с разрушением клетки вследствие повреждения ткани, связанного с инфекцией или физическим или химическим стрессом. Также считается, что экспрессия IL-33 обладает неким механизмом, посредством которого увеличивается экспрессия и происходит секреция в ответ на стимулирование веществами, такими как липополисахариды. IL-33, высвобожденный наружу из клеток, связывается с IL-33 рецепторами, экспрессированными на клетках, благодаря чему активируется внутриклеточный сигнал. IL-33 рецепторы экспрессируются на различных клетках иммунной системы и эпителиальных клетках, и в этих клетках происходит индуцированная IL-33 внутриклеточная передача сигнала.
IL-33, как полагают, вызывает аллергическое воспаление (такое как астма, атопический дерматит, аллергический ринит или анафилактический шок), индуцируя выработку Th2 цитокинов (таких как IL-4, Il-5, IL-6 или IL-13) из Th2 клеток, мастоцитов, эозинофилов, базофилов, T-клеток натуральных киллеров (NK) и группы 2 врожденных лимфоидных клеток из числа клеток иммунной системы, экспрессирующих IL-33 рецепторы (NPL1: Tatsukuni Ohno et al., Allergy, 2012, Vol. 67, p.1203). Недавно были проведены клинические исследования на астме, атопическом дерматите и на аллергии к арахису в отношении показания к применению анти-IL-33 антител и анти-IL-33 рецепторных антител, которые являются антагонист IL-33 ами.
Mbarik, et al. (NPL2: Maruoa Mbarik et al., Immunol. Lett., 2015, Vol. 166, pl) сообщали, что, судя по результатам исследования сыворотки и асцитов у пациентов с эндометриозом, IL-33 увеличивается в асцитах у пациентов с эндометриозом, по мере того, как состояние (стадия) прогрессирует, что делает возможным использование его в качестве суррогатного маркера. Сообщалось об IL-33. Согласно сообщению Mbarik et al., концентрация растворимого рецептора IL-33 (sST2), который функционирует как антагонист IL-33, в асцитах приблизительно в 100 раз выше, чем концентрация IL-33, и увеличивается вместе с прогрессированием эндометриоза, так же, как и IL-33. Таким образом, является ли повышенная экспрессия IL-33 во время эндометриоза причиной болезни или ее результатом, и какой тип патологии срабатывает в ответ на это, остается непонятным.
Сообщалось, что антагонист IL-33 ы использовались при лечении локального фиброза (PTL1: WO 2016/140921). Хотя PTL1 упоминает эндометриоз как случай локального фиброза, терапевтический эффект против эндометриоза не исследовался в этих примерах. PTL1 только перечисляет эндометриоз как одну из форм фиброза, при этом ничего не говорится относительно роли IL-33 в эндометриозе и т.д.
Список литературы
Патентная литература
PTL1: WO 2016/140921
PTL2: WO 2014/164959
PTL3: WO 2015/099175
Непатентная литература
NPL1: Tatsukuni Ohno et al., Allergy, 2012, Vol. 67, p.1203
NPL2: Maruoa Mbarik et al., Immunol. Lett., 2015, Vol. 166, p.1
Раскрытие изобретения
[Техническая задача]
Найти средство для лечения эндометриоза или аденомиоза матки, которое является высокобезопасным и не оказывает влияния на беременность.
[Решение задачи]
В результате проведения обширных исследований для решения вышеупомянутых задач изобретатели настоящего изобретения идентифицировали IL-33 как усугубляющий фактор эндометриоза или аденомиоза матки. Изобретатели настоящего изобретения обнаружили, что антагонист IL-33, способный ингибировать действие IL-33, является пригодным для лечения, предотвращения или облегчения эндометриоза или аденомиоза матки, что тем самым привело к завершению настоящего изобретения.
Настоящее изобретение имеет отношение к перечисленному ниже.
[1] Терапевтическое средство для лечения эндометриоза или аденомиоза матки, содержащее антагонист IL-33 в качестве активного ингредиента.
[2] Терапевтическое средство, описанное в пункте 1, облегчающее боль при эндометриозе или аденомиозе матки.
[3] Терапевтическое средство, описанное в пункте 1 или 2, ингибирующее рост эктопической эндометриальной ткани (включая кисты) при эндометриозе или аденомиозе матки.
[4] Терапевтическое средство, описанное в любом из пунктов 1-3, ингибирующее ангиогенез в эктопической эндометриальной ткани (включая кисты) при эндометриозе или аденомиозе матки.
[5] Терапевтическое средство для лечения эндометриоза или аденомиоза матки, описанное в любом из пунктов 1 - 4, ингибирующее фиброзирование или пролиферацию в эктопической эндометриальной ткани (включая кисты).
[6] Терапевтическое средство, описанное в любом из пунктов 1-5, ингибирующее адгезию эктопической эндометриальной ткани (включая кисты) при эндометриозе к различным органам.
[7] Терапевтическое средство для лечения эндометриоза или аденомиоза матки, описанное в любом из пунктов 1 - 6, в котором антагонист IL-33 представляет собой анти-IL-33 антитело, антитело, направленное против рецептора IL-33, или растворимый IL-33 рецептор.
[8] Терапевтическое средство для лечения эндометриоза или аденомиоза матки, описанное в пункте 7, в котором IL-33 антитело представляет собой A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04 или A26-1F02.
[9] Терапевтическое средство для лечения эндометриоза или аденомиоза матки, описанное в пункте 7, в котором растворимый IL-33 рецептор представляет собой sST2-Fc.
[10] Терапевтический метод для лечения эндометриоза или аденомиоза матки, включающий введение антагонист IL-33 а.
[11] Применение антагонист IL-33 а в производстве терапевтического средства для лечения эндометриоза или аденомиоза матки.
[12] антагонист IL-33 для применения при лечении эндометриоза или аденомиоза матки.
[13] Терапевтический метод, применение или антагонист IL-33, описанный в любом из пунктов 10 - 12, который облегчает боль при эндометриозе или аденомиозе матки.
[14] Терапевтический метод, применение или антагонист IL-33, описанный в любом из пунктов 10 - 12, который ингибирует рост эктопической эндометриальной ткани (включая кисты) при эндометриозе или аденомиозе матки.
[15] Терапевтический метод, применение или антагонист IL-33, описанный в любом из пунктов 10 - 12, который ингибирует ангиогенез в эктопической эндометриальной ткани (включая кисты) при эндометриозе или аденомиозе матки.
[16] Терапевтический метод, применение или антагонист IL-33, описанный в любом из пунктов 10 - 12, который ингибирует фиброзирование или пролиферацию в эктопической эндометриальной ткани (включая кисты).
[17] Терапевтический метод, применение или антагонист IL-33, описанный в любом из пунктов 10 - 16, в котором антагонист IL-33 представляет собой анти-IL-33 антитело, антитело, направленное против рецептора IL-33, или растворимый IL-33 рецептор.
[Положительные эффекты изобретения]
Терапевтическое средство, направленное на эндометриоз или аденомиоз матки настоящего изобретения, обладает терапевтическим действием на эндометриоз или аденомиоз матки. Терапевтическое средство для лечения эндометриоза или аденомиоза матки настоящего изобретения демонстрирует по меньшей мере одно действие, выбранное из группы, состоящей из облегчения боли, ингибирования роста эктопической эндометриальной ткани (включая кисты), ингибирование ангиогенеза в эктопической эндометриальной ткани (включая кисты) и ингибирование фиброза или пролиферации в эктопической эндометриальной ткани (включая кисты), связанной с эндометриозом или аденомиозом матки.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - это график, показывающий ингибирование роста кистозного поражения, которое является эктопической эндометриальной тканью, у мышей с нокаутом гена IL-33 (IL-33KO) по сравнению с контрольными мышами дикого типа (контроль) на модели эндометриоза.
Фиг. 2 - это график, демонстрирующий содействие росту кистозного поражения, которое является эктопической эндометриальной тканью, у мышей с дозированным введением IL-33 (IL-33 ip) по сравнению с контрольными мышами (контроль) на модели эндометриоза.
Фиг. 3 - это график, демонстрирующий ингибирование роста кистозного поражения, которое является эктопической эндометриальной тканью, у мышей с дозированным введением антагонист IL-33 а (sST2-Fc) по сравнению с контрольными мышами (cont Fc) на модели эндометриоза.
Фиг. 4 демонстрирует окрашенные азаном изображения, показывающие ингибирование кистозного фиброза, которое является эктопической эндометриальной тканью, у мыши с дозированным введением антагонист IL-33 а (sST2-Fc) по сравнению с контрольной мышью (cont Fc) на модели эндометриоза.
Фиг. 5 - это график, демонстрирующий ингибирование роста кисты путем введения анти-IL-33 антитела (анти-IL-33) по сравнению с контрольным антителом (Control Ab) на модели эндометриоза, вызванного дозированием IL-33.
Фиг. 6 - это график, показывающий ингибирование клеточной пролиферации (процент Ki-67-позитивных клеток) в кистозном поражении при введении анти-IL-33 антитела (анти-IL-33 Ab) по сравнению с контрольным антителом (control Ab) на модели эндометриоза, вызванного дозированием IL-33.
Способ осуществления изобретения
Далее для облегчения понимания настоящего изобретения предоставляется объяснение терминов, использованных в настоящем изобретении.
[IL-33]
IL-33 - это цитокин, принадлежащий к семейству IL-1. Человеческий IL-33 состоит из 270 аминокислот, как показано в SEQ ID NO:1 перечня последовательностей, и мРНК последовательность показана в SEQ ID NO: 2. IL-33 имеет хроматиновый домен связывания на своем N-концевом участке, имеет IL-1-подобный цитокиновый домен с молекулярным весом 18 kD, который имеет 12 β цепочек на своем C-концевом участке, и имеет сайты расщепления катепсином G в положениях 95 и 109, сайты расщепления эластазой в положении 99 и сайты расщепления каспазой в положении 178. В ходе процесса некроза IL-33 расщепляется такими ферментами, как эластаза, катепсин G или протеиназа 3, продуцируемыми в лизосомах, что приводит к формированию различных фрагментов, содержащих зрелые формы IL-3, такие как IL-33 (остатки от 95 до 270) (IL-33, представленный аминокислотной последовательностью от остатка 95 до остатка 270 от N-конца в SEQ ID NO:1 перечня последовательностей, обозначается как “IL-33 (остатки от 95 до 270)” и применяется в дальнейшем подобным образом), IL-33 (остатки от 99 до 270), IL-33 (остатки от 109 до 270) или IL-33 (остатки от 112 до 270), и считается, что они функционируют как цитокины. С другой стороны, в том случае, когда смерть клетки происходит посредством апоптоза, считается, что IL-33 расщепляется в положении 178 каспазой, которая активируется в процессе апоптоза, и образуется неактивная форма IL-33, такая как IL-33 (остатки от 179 до 270).
При высвобождении наружу из клетки в качестве цитокина IL-33 связывается с рецептором IL-33 и несет функцию инициации внутриклеточной передачи сигнала в клетке, экспрессирующей указанный рецептор IL-33. Передача сигнала, индуцированная IL-33, без ограничения включает путь NF-κB и путь MAPKK, в конечном итоге вызывая продуцирование различных типов цитокинов, хемокинов и воспалительных медиаторов. Примеры цитокинов, индуцированных IL-33, включают TNF-α, IL-1β, IFN-γ, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 и IL-13 и т.д. Примеры хемокинов, индуцированных IL-33, включают CXCL2, CCL2, CCL3, CCL6, CCL17 и CCL24 и т.д. Примеры воспалительных медиаторов, индуцированных IL-33, включают PGD2 и LTB4 и т.д. Цитокины, хемокины и медиаторы воспаления, индуцированные IL-33, имеют отношение к миграции клеток иммунной системы, продуцированию цитокинов и дегрануляции, таким образом, вызывая воспаление. В настоящем изобретении IL-33 относится или к IL-33 полной длины или его активному фрагменту в случае действия путем связывания с рецептором IL-33, который описывается далее, и может быть его производным или мутантом. В настоящем изобретении IL-33 может быть человеческим IL-33 или IL-33 другого биологического происхождения. В настоящем изобретении IL-33 предпочтительно является человеческим IL-33, представленным аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 перечня последовательностей.
Рецептор IL-33, связываемый IL-33, состоит из гетеродимера ST2 и IL-1 рецепторного акцессорного белка (IL-1RAcP). В рецепторе IL-33 сайт, который специфически распознает IL-33 и связывается с ним, присутствует во внеклеточном участке ST2. Рецепторы IL-33 экспрессируются в различных клетках иммунной системы (таких как Th2 клетки, мастоциты, эозинофилы, базофилы, макрофаги, дендритные клетки, NK клетки, NKT клетки, врожденные лимфоидные клетки группы 2 (натуральные хелперы), неоциты или врожденные хелперные клетки 2 типа (Ih2)) и эпителиальных клетках, но не без ограничения этим.
[антагонист IL-33]
В настоящем изобретении “антагонист” имеет отношение к общему термину для вещества, которое действует напрямую на желаемую мишень, лиганд, рецептор или ген (включая мРНК) и оказывает нейтрализующее влияние на их функцию. Таким образом, антагонисты включают не только вещества, обладающие действием, напрямую нейтрализующим функционирование мишени, но также вещества, обладающие действием, нейтрализующим мишень опосредованно путем нейтрализации функции субстанции, взаимодействующей с белком-мишенью, или путем подавления экспрессии гена белка-мишени. А именно, “антагонист IL-33” может быть веществом, способным ингибировать какую-либо функцию IL-33 путем связывания с IL-33, или веществом, способным ингибировать функцию IL-33 путем связывания с рецептором IL-33. Кроме того, антисмысловые и миРНК, подавляющие экспрессию гена IL-33 или рецептор IL-33 а, также включаются в число антагонистов IL-3. Антагонисты IL-33 включают, например, но не ограничиваются этим, анти-IL-33 антитело, антитело, направленное против рецептора IL-33, растворимый рецептор IL-33 и аптамеры к IL-33 и рецептору IL-33. Анти-IL-33 антитело, антитело, направленное против рецептора IL-33, и аптамеры к IL-33 и рецептору IL-33 способны предотвратить связывание между IL-33 и рецептором IL-33 путем связывания с IL-33 и рецептором IL-33, которые, соответственно, являются их молекулами-мишенями. С другой стороны, растворимые рецепторы IL-33 способны предотвратить связывание между IL-33 и рецепторами IL-33 на клеточной поверхности путем связывания со свободным IL-33.
[рецептор IL-33]
Несмотря на то, что ST2 ген, кодирующий субъединицу рецептора IL-33, кодирует трансмембранный (ST2L) белок, он также кодирует секреторный белок, лишенный трансмембранного участка и внутриклеточного участка в результате селективного сплайсинга. Полноразмерная аминокислотная последовательность человеческого ST2L представлена SEQ ID NO: 3 из перечня последовательностей. В числе полноразмерной аминокислотной последовательности активируется система внутриклеточной передачи сигнала посредством связывания IL-33 с рецептором IL-33 (гетеродимер), образованным путем ассоциации ST2L с другой рецептор IL-33 ной субъединицей, такой как IL-1RAcP. IL-33 связывается с внеклеточным участком ST2L. Таким образом, ST2L также называется просто рецептором IL-33.
[Растворимый рецептор IL-33]
Растворимый рецептор IL-33 в настоящем изобретении представляет собой белок, содержащий весь или часть внеклеточного участка ST2L белка (остатки от 19 до 328 SEQ ID NO: 3 из перечня последовательностей) и функционирующий как антагонист IL-33 в результате связывания с IL-33. Растворимый рецептор IL-33 может быть необязательно модифицирован, например, может быть модифицирован полиэтиленгликолем или константным участком антитела. В частности, растворимый рецептор IL-33, имеющий константный участок иммуноглобулина, связанный с ним, называется sST2-Fc. Предпочтительным примером sST2-Fc является гибридный белок, состоящий из внеклеточного участка человеческого ST2L белка и константного участка человеческого IgG антитела, который представлен SEQ ID NO: 5 из перечня последовательностей.
[Антитело]
В настоящем изобретении термин “антитело” используется в самом широком смысле и включает моноклональное антитело и поликлональное антитело, а также он демонстрирует желательную специфическую способность к связыванию. В настоящем изобретении антитело может быть антителом любого животного, таким как мышиное антитело, человеческое антитело, крысиное антитело, кроличье антитело, козье антитело или верблюжье антитело.
[Моноклональное антитело]
Среди антител настоящего изобретения моноклональное антитело имеет отношение к антителу в пределах популяции антител, состоящей из одного клона (одномолекулярных видов), имея в виду желательную аминокислотную последовательность. Моноклональные антитела включают химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, мультиспецифические антитела и искусственные антитела, а также функционально модифицированные антитела, конъюгаты антител и их фрагменты. Моноклональное антитело настоящего изобретения может быть получено при помощи любого известного метода, такого как метод гибридомы, метод фагового дисплея или генно-инженерный метод.
[Химерное антитело]
Химерное антитело имеет отношение к антителу, у которого легкая цепь, тяжелая цепь или обе состоят из вариабельной области, происходящей из нечеловеческого иммуноглобулина, и константной области, происходящей из человеческого иммуноглобулина.
[Гуманизированное антитело]
Гуманизированное антитело имеет отношение к антителу, состоящему из определяющей комплементарность области, происходящей из нечеловеческого иммуноглобулина, вариабельной области, состоящей из каркасного участка, происходящего из человеческого иммуноглобулина, и константной области, происходящей из человеческого иммуноглобулина.
[Человеческое антитело]
Человеческое антитело имеет отношение к антителу, происходящему от человеческого иммуноглобулина в отношении обеих, как легкой, так и тяжелой цепей. Человеческое антитело классифицируется в зависимости от различия в константном участке тяжелой цепи, IgG (включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) имеет цепь γ тяжелой цепи, IgM имеет цепь μ тяжелой цепи, IgA (включая IgA1 и IgA2) имеет цепь α тяжелой цепи, IgD имеет цепь δ тяжелой цепи, и IgE имеет цепь ε тяжелой цепи. Легкая цепь, как правило, содержит или цепь κ или цепь λ.
[Мультиспецифическое антитело]
Мультиспецифическое антитело имеет отношение к антителу, способному быть асимметичным, которое имеет два или более независимых сайтов узнавания, обладающих двумя или более различными специфичностями к антигену, и их примеры включают биспецифическое антитело, обладающее двумя специфичностями, и триспецифическое антитело, обладающее тремя специфичностями. Один или более антигенов, распознаваемых мультиспецифическим антителом настоящего изобретения, являются молекулой IL-33 или молекулой рецептора IL-33.
[Искусственное антитело]
Искусственное антитело относится, например, к белковым каркасам, которые хотя и не имеют структуры иммуноглобулина, обладают функцией, сходной с функцией иммуноглобулина. В качестве белковых каркасов используются ингибиторный домен Кунитца сериновой протеазы человека, внеклеточный домен фибронектина человека, анкирин и липокалин, при этом в настоящем изобретении белковый каркас, связывающийся с эпитопом, может быть получен, если последовательность в целевом сайте связывания на каркасе является модифицированной (Clifford Mintz et al., BioProcess International, 2013, Vol. 11(2), pp40-48).
[Функционально модифицированное антитело]
Функционально модифицированное антитело в настоящей заявке имеет отношение к антителу, функция которого, отличная от антигенсвязывающей функции антитела, например, такая как функция уничтожения клетки, комплемент-активирующая функция или время полужизни в крови, регулируется путем модификации аминокислотной или сахарной цепи первичного константного участка иммуноглобулина.
[Конъюгированное антитело]
Конъюгированное антитело в настоящей заявке имеет отношение к антителу, в котором функциональная молекула, отличная от антитела, такая как непептидный полимер, например, полиэтиленгликоль (PEG), радиоактивная субстанция, токсин, низкомолекулярное соединение, цитокин, альбумин или фермент химически или при помощи генно-инженерных методов связывается с антителом.
[Фрагмент]
Фрагмент антитела в настоящей заявке имеет отношение к белку, содержащему часть антитела, которая способна связываться с антигеном. Примеры фрагментов антитела включают Fab фрагмент, Fv фрагмент, F(ab)'2 фрагмент, Fab' фрагмент и scFv.
Эти фрагменты антитела могут химически или при помощи генно-инженерных методов связываться с функциональной молекулой, отличной от антитела, такой как непептидный полимер, например, полиэтиленгликоль (PEG), радиоактивная субстанция, токсин, низкомолекулярное соединение, цитокин, альбумин или фермент.
[Человеческое моноклональное антитело]
Человеческое моноклональное антитело имеет отношение к моноклональному антителу, имеющему вариабельный участок и константный участок, происходящие из последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека. Сюда включается моноклональное антитело, полученное от трансгенной мыши с внесенным геном антитела человека, и антитело, полученное из генной библиотеки антител человека.
[Нейтрализация]
В настоящей заявке “нейтрализация” имеет отношение к действию, способному ингибировать какую-либо намеченную функцию. Ингибирование функции (биологической активности) IL-33 включает, но не ограничивается этим, ингибирование выработки IL-33-индуцированных цитокинов, таких как IL-6. Показатель биологической активности IL-33 может быть оценен при помощи одного или более in vitro или in vivo анализов, известных в данной области техники.
[Определяющая комплементарность область]
Определяющая комплементарность область имеет отношение к вариабельной области молекулы иммуноглобулина, которая формирует антигенсвязывающий участок, и называется также гипервариабельным участком, и демонстрирует большие изменения в аминокислотной последовательности в частности для каждой молекулы иммуноглобулина. Определяющая комплементарность область имеет три гипервариабельных участка в каждой легкой и тяжелой цепи (гипервариабельный участок 1, гипервариабельный участок 2 и гипервариабельный участок 3). В настоящей заявке определяющая комплементарность область молекулы иммуноглобулина определяется в соответствии со схемой нумерации Kabat (Kabat et al., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA).
[Аптамер]
Аптамер имеет отношение к молекуле нуклеиновой кислоты, которая специфически связывается с конкретной субстанцией, и в настоящей заявке имеет отношение к молекуле, функционирующей как антагонист при связывании с IL-33 или рецептором IL-33. Аптамер в настоящей заявке может включать молекулу искусственной нуклеиновой кислоты, отличной от молекул нуклеиновых кислот природного происхождения.
[Антисмысловая]
Термин «антисмысловая» имеет отношение к антисмысловой нуклеиновой кислоте (такой как РНК или ДНК), которая способна гибридизироваться с РНК гена-мишени и обладает функцией подавления экспрессии гена. В настоящей заявке «антисмысловая» относится к молекуле, функционирующей в качестве антагониста, который подавляет экспрессию гена путем связывания с мРНК IL-33 или рецептора IL-33. «Антисмысловая» в настоящей заявке также может включать молекулу искусственной нуклеиновой кислоты, отличной от молекул нуклеиновых кислот природного происхождения.
[миРНК]
Малая интерферирующая РНК (миРНК) имеет отношение к низкомолекулярной двухцепочечной РНК, состоящей из 15 - 30 пар оснований. миРНК участвует в явлении, называемом РНК-интерференция, и последовательность-специфичным образом подавляет экспрессию гена путем нарушения мРНК гена-мишени. В настоящей заявке миРНК имеет отношение к молекуле, функционирующей в качестве антагониста, который подавляет экспрессию гена путем нарушения мРНК IL-33 или рецептора IL-33. миРНК в настоящей заявке может включать молекулу искусственной нуклеиновой кислоты, отличную от молекул нуклеиновых кислот природного происхождения.
[Эндометриоз]
Эндометриоз является доброкачественным (незлокачественным) заболеванием, при котором эндометриальная ткань распространяется на участок вне полости матки, (эктопически), и примеры таких мест включают яичники, брюшную полость, брюшину, дугласово пространство, сигмовидную кишку, прямую кишку, крестцово-маточные связки, влагалище, наружные половые органы, мочевой пузырь, стенку брюшной полости и пупок. Эктопическая эндометриальная ткань может «сращиваться» с различными органами, образуя спайки. Гематома эндометриальной ткани, образовавшаяся в яичниках, может называться «шоколадной кистой». Чтобы поставить окончательный диагноз эндометриоза, проводится лапароскопия, при которой можно напрямую наблюдать эктопическую эндометриальную ткань. Чтобы классифицировать клиническую стадию эндометриоза используется Re-ASRM классификация, при этом эндометриоз разделяют по стадиям от 1 до 4 путем подсчета баллов в соответствии с местом патологического поражения, в зависимости от того, является ли поражение поверхностным или глубоким, и от степени адгезии с другими органами. Классификация Бичема используется для того, чтобы контролировать прогрессирование эндометриоза, при этом прогрессирование классифицируется от стадии 1 до стадии 4 в соответствии с развитием состояния.
[Аденомиоз матки]
Аденомиоз матки представляет собой заболевание, при котором в мышечном слое матки наблюдается эндометриальная ткань, и классифицируется на основании MRI диагностики как фокальный (очаговый) аденомиоз матки, который ограничивается участком матки, и как диффузный аденомиоз матки, который распространяется по всему объему матки.
Далее предоставляется объяснение вариантов осуществления настоящего изобретения. Следующие варианты осуществления являются иллюстративными в целях объяснения настоящего изобретения, причем настоящее изобретение не ограничивается только этими вариантами осуществления.
Настоящее изобретение имеет отношение к терапевтическому средству для лечения эндометриоза или аденомиоза матки, содержащему антагонист IL-33 в качестве активного ингредиента. Терапевтическое средство способно полностью излечить, облегчить симптомы или предотвратить обострение, будучи введенным пациенту, страдающему от эндометриоза или аденомиоза матки. Примеры антагонистов IL-33 включают анти-IL-33 антитело, антитело, направленное против рецептора IL-33, связывающий рецептор IL-33 аптамер и растворимый рецептор IL-33.
В другом аспекте настоящее изобретение имеет отношение к фармацевтической композиции для лечения, предотвращения или облегчения эндометриоза или аденомиоза матки, содержащей антагонист IL-33. В следующем аспекте настоящее изобретение имеет отношение к способу лечения, предотвращения или облегчения эндометриоза или аденомиоза матки, включающему введение антагониста IL-33. Настоящее изобретение также имеет отношение к использованию антагониста IL-33 настоящего изобретения для производства лекарственного средства для лечения, предотвращения или облегчения эндометриоза или аденомиоза матки. Настоящее изобретение также имеет отношение к антагонисту IL-33 для использования при лечении, предотвращении или облегчении эндометриоза или аденомиоза матки.
Эндометриоз представляет собой заболевание, при котором эндометриальная ткань вырастает в месте, отличном от местоположения эндометрия (слизистой оболочки матки). Болезнь, при которой эндометриальная ткань присутствует в мышечном слое матки, называется аденомиоз матки. Хотя эта эктопическая эндометриальная ткань претерпевает повторное образование и отторжение с кровотечением согласованно с менструальным циклом так же, как и эндометрий, причем, как в случае с менструальной кровью, может формироваться гематома при отсутствии выхода. Гематома, образованная таким образом, называется «шоколадная киста». В результате формирования кисты ткань подвергается фиброзу, что может привести к образованию адгезии (слипания) и затвердеванию. Когда эктопическая эндометриальная ткань оказывается «приращенной» к другим органам (таким как брюшина, кишечник или яичники), это вызывает боль. Адгезия фаллопиевых труб вызывает бесплодие. Как правило, для лечения эндометриоза используется гормональная терапия и удаление хирургическим путем. По меньшей мере, одно действие, выбранное из группы, состоящей из облегчения боли, связанной с эндометриозом или аденомиозом матки, ингибирование роста эктопической эндометриальной ткани (включая кисты), ингибирование ангиогенеза эктопической эндометриальной ткани (включая кисты), ингибирование адгезии между различными органами и эктопической эндометриальной тканью (включая кисты) и ингибирование фиброза или клеточной пролиферации проявляется при лечении, предотвращении или облегчении эндометриоза или аденомиоза матки.
У пациентов, страдающих от эндометриоза или аденомиоза матки, наблюдаются такие симптомы, как увеличенный менструальный объем и более сильная менструальная боль в сочетании с колебаниями менструального цикла. Таким образом, терапевтическое средство, содержащее антагонист IL-33, или фармацевтическая композиция для лечения, предотвращения или облегчения, может вводиться субъекту, у которого наблюдаются изменения симптомов, сопровождающиеся колебаниями в менструальном цикле, и субъектам, имеющим жалобы, сопровождающиеся колебаниями в менструальном цикле. Таких субъектов можно отличить от субъектов, просто имеющих локальный фиброз.
В другом аспекте настоящее изобретение также имеет отношение к болеутоляющему средству от боли, связанной с эндометриозом или аденомиозом матки, содержащему антагонист IL-33 в качестве активного ингредиента, ингибитору адгезии различных органов к эктопической эндометриальной ткани (включая кисты) при эндометриозе, содержащему антагонист IL-33 в качестве активного ингредиента, ингибитору роста эктопической эндометриальной ткани (включая кисты) при эндометриозе или аденомиозе матки, содержащему антагонист IL-33 в качестве активного ингредиента, ингибитору ангиогенеза в эктопической эндометриальной ткани (включая кисты) при эндометриозе или аденомиозе матки, содержащему антагонист IL-33 в качестве активного ингредиента, ингибитору фиброза эндометриальных стромальных клеток в эктопической эндометриальной ткани (включая кисты) при эндометриозе или аденомиозе матки, содержащему антагонист IL-33 в качестве активного ингредиента, ингибитору клеточной пролиферации в эндометриальной ткани (включая кисты) при эндометриозе или аденомиозе матки, содержащему антагонист IL-33 в качестве активного ингредиента, терапевтическому средству для лечения поверхностного эндометриоза, содержащему антагонист IL-33 в качестве активного ингредиента, терапевтическому средству для лечения глубокого эндометриоза, содержащему антагонист IL-33 в качестве активного ингредиента, терапевтическому средству для лечения фокального аденомиоза матки, содержащему антагонист IL-33 в качестве активного ингредиента, или терапевтическому средству для лечения диффузного аденомиоза матки, содержащему антагонист IL-33 в качестве активного ингредиента.
Антагонист IL-33 настоящего изобретения предпочтительно облегчает боль в нижней части спины, боль в нижней части живота или боль при дефекации в течение менструации у пациентов с эндометриозом или аденомиозом матки, или боль в нижней части спины, боль в нижней части живота или боль временами при дефекации, не связанную с менструацией, и более предпочтительно устраняет такую боль.
Антагонист IL-33 настоящего изобретения предпочтительно облегчает боль в тазу, яичниках, брюшной полости, брюшине, дугласовом пространстве, сигмовидной кишке, прямой кишке, крестцово-маточных связках, влагалище, наружных половых органах, мочевом пузыре, брюшной стенке и/или пупке у пациентов с эндометриозом и более предпочтительно устраняет такую боль.
Облегчение боли при помощи антагониста IL-33 настоящего изобретения может быть оценено, например, по шкале Бибероглу и Бермана, при помощи которой подсчитываются баллы в отношении качества жизни (QOL) в связи с болью (Biberoglu, KO и Behrman, SJ, Am. J. Obstet. Gynecol., 139: 645 (1981)). Согласно этой шкале такая боль, как тазовая боль, дисменорейная боль или коитальная боль, не связанная с менструацией, оценивается как субъективный симптом.
Облегчение боли при помощи антагониста IL-33 настоящего изобретения может быть оценено по уменьшению числа приемов обезболивающего средства или его дозировки. Обезболивающим средством является предпочтительно нестероидное противоспалительное средство, примеры которого включают локсопрофен натрия гидрат, диклофенак натрий и аспирин.
Антагонист IL-33 настоящего изобретения предпочтительно ингибирует адгезию эктопической эндометриальной ткани (включая кисты) в тазу, яичниках, брюшной полости, брюшине, дугласовом пространстве, сигмовидной кишке, прямой кишке, крестцово-маточных связках, влагалище, наружных половых органах, мочевом пузыре, стенке брюшной полости и/или пупке у пациентов с эндометриозом, и более предпочтительно устраняет такую адгезию. Антагонист IL-33 настоящего изобретения ингибирует адгезию матки, при этом предпочтительно уменьшается ограничение подвижности матки.
Антагонист IL-33 настоящего изобретения предпочтительно ингибирует рост эктопической эндометриальной ткани (включая кисты) в тазу, яичниках, брюшной полости, брюшине, дугласовом пространстве, сигмовидной кишке, прямой кишке, крестцово-маточных связках, влагалище, наружных половых органах, мочевом пузыре, стенке брюшной полости и/или пупке у пациентов с эндометриозом, и более предпочтительно уменьшает такую эктопическую эндометриальную ткань (включая кисты).
Антагонист IL-33 настоящего изобретения предпочтительно ингибирует ангиогенез эктопической эндометриальной ткани (включая кисты) в тазу, яичниках, брюшной полости, брюшине, дугласовом пространстве, сигмовидной кишке, прямой кишке, крестцово-маточных связках, влагалище, наружных половых органах, мочевом пузыре, стенке брюшной полости и/или пупке у пациентов с эндометриозом.
Антагонист IL-33 настоящего изобретения предпочтительно ингибирует фиброз или клеточную пролиферацию в эктопической эндометриальной ткани (включая кисты) в тазу, яичниках, брюшной полости, брюшине, дугласовом пространстве, сигмовидной кишке, прямой кишке, крестцово-маточных связках, влагалище, наружных половых органах, мочевом пузыре, стенке брюшной полости и/или пупке у пациентов с эндометриозом.
Антагонист IL-33 настоящего изобретения предпочтительно ингибирует выработку цитокинов и/или медиаторов в эктопической эндометриальной ткани (включая кисты) в тазу, яичниках, брюшной полости, брюшине, дугласовом пространстве, сигмовидной кишке, прямой кишке, крестцово-маточных связках, влагалище, наружных половых органах, мочевом пузыре, стенке брюшной полости и/или пупке у пациентов с эндометриозом, и более предпочтительно ингибирует выработку IL-6, TNF-α и/или простагландинов.
Антагонист IL-33 настоящего изобретения предпочтительно вылечивает пациентов, страдающих от Стадии 1, Стадии 2, Стадии 3 и/или Стадии 4 эндометриоза согласно анализу на основе классификации Beecham, и предпочтительно вылечивает пациентов со Стадией 1, Стадией 2, Стадией 3 и/или Стадией 4 эндометриоза в соответствии с оценкой в баллах согласно классификации Re-ASRM.
Антагонист IL-33 настоящего изобретения предпочтительно улучшает качество жизни (QOL), связанное с эндометриозом. Улучшение QOL можно оценить путем проведения интервью, используя, например, Endometriosis Health Profile-30 (EHP-30) (Jones, G. et al., Obstet. Gynecol., 98: 258 (2001)), EQD-5D (Brooks, R. et al., Health Policy, 37: 53 (1997), или Опросник удовлетворенности лечением эндометриоза (ETSQ) (Deal, LS et al., Qual. Life Res., 19(6), 899 (2010)). Примеры улучшения QOL включают улучшения затруднений при положении «стоя», затруднений в положении «сидя», трудностей при ходьбе, улучшение аппетита, уменьшение бессонницы, фрустрации, депрессии, слезливость, уныния, маниакальной депрессии, неуравновешенности, буйство, чувства одиночества, утраты уверенности и трудностей при коитусе.
Терапевтическое средство для лечения эндометриоза или аденомиоза матки, использующее антагонист IL-33, отличается от обычно применяемой лекарственной терапии, использующей гормональные регуляторы, тем, что он уменьшает бесплодие и нежелательные побочные эффекты, подобные менопаузальному расстройству. Таким образом, антагонист IL-33 настоящего изобретения предпочтительно является терапевтическим средством для лечения эндометриоза или аденомиоза матки, которое сохраняет способность к деторождению, не обладает токсичностью для эмбриона в период беременности и является терапевтическим средством для лечения эндометриоза или аденомиоза матки, лечение которым не сопровождается нежелательными побочными эффектами, подобными менопаузальному расстройству. Примеры подобных менопаузальному расстройству нежелательных побочных эффектов включают, но не ограничиваются этим, бесплодие, приливы, остеопороз и депрессию.
Анти-IL-33 антитело и антитело, направленное против рецептора IL-33, включают моноклональные антитела и поликлональные антитела. Антитело в настоящем изобретении может быть антителом, происходящим от любого вида животных, таким как мышиное антитело, человеческое антитело, крысиное антитело, кроличье антитело, козье антитело или антитело верблюда. L-33 антитело и антитело, направленное против рецептора IL-33, настоящего изобретения являются предпочтительно моноклональными антителами, и более предпочтительно анти-IL-33 антитело и антитело, направленное против рецептора IL-33, настоящего изобретения являются моноклональными антителами, которые представляют собой химерные антитела, гуманизированные антитела или человеческие антитела.
Анти-IL-33 антитело и антитело, направленное против рецептора IL-33, настоящего изобретения можно получить с помощью любого произвольно выбранного метода, известного в данной области техники. В случае моноклональных антител, антитела можно получить при помощи любого метода, такого как метод гибридомы, метод фагового дисплея или генно-инженерный метод.
В гибридомном методе гибридома образуется путем слияния B-клеток, полученных из селезенки или лимфатических узлов животного, такого как крыса или мышь, иммунизированная с помощью иммуногена, с иммортализованными клетками, такими как клетки миеломы, а затем путем скрининга гибридомы, которая продуцирует антитело, обладающее желательной способностью к связыванию, и продуцирования этого антитела при помощи отобранной гибридомы. Человеческое антитело может быть получено с помощью мыши, которой был «вставлен» ген человеческого антитела. В случае получения моноклонального антитела из гибридомы применяется метод, при котором гибридома культивируется согласно обычным методам с последующим получением антител в супернатанте клеточной культуры, или применяется метод, при котором гибридоме обеспечивается возможность пролиферации путем введения соответствующему млекопитающему с последующим получением антител в асците. Первый метод подходит для получения антител высокой чистоты, тогда как второй метод подходит для крупномасштабного производства антител. Для получения моноклонального антитела может использоваться известная технология, например, моноклональное антитело может продуцироваться, в частности, согласно описанию в Current Protocols Глава 2 в Immunology, Wiley и Sons Inc.
В методе фагового дисплея фаги, выбранные из произвольной библиотеки фаговых антител, подвергаются скринингу с использованием целевого антигена (IL-33 или рецептора IL-33 в настоящей заявке) с последующей селекцией фага, обладающего желаемой способностью к связыванию в отношении этого антигена. Затем, изолируют или идентифицируют антитело, соответствующее последовательности, содержащейся в фаге, и конструируется вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей моноклональное антитело, исходя из информации о выделенной или установленной последовательности. Затем линия клеток, трансфицированных этим вектором экспрессии, культивируется с целью получения моноклональных антител. Человеческое антитело, обладающее желаемой способностью к связыванию, может продуцироваться путем использования библиотеки антител человека с расчетом на библиотеку фаговых антител.
В генно-инженерном методе антитело, обладающее повышенной аффинностью, и/или модифицированной функцией, может быть получено путем введения мутации в последовательность, соответствующую определяющей комплементарность области (CDR) или другой последовательности в последовательности гена, кодирующего антитело, встраивания этой последовательности в вектор экспрессии и использования этого вектора для трансформации клетки-хозяина (смотри, например, Borrebaeck, C.A.K. and Larrick, J.W., Therapeutic Monoclonal Antibodies, Published in the United Kingdom by MacMillan Publishers, Ltd., 1990).
В настоящем изобретении химерное антитело, гуманизированное антитело, мультиспецифическое антитело или искусственное антитело, например, могут использоваться с целью понижения ксеноантигенности по отношению к человеку или добавления другой функции, при этом эти антитела могут продуцироваться при помощи известного метода, такого как генно-инженерный метод.
Химерное антитело получают в результате соединения ДНК, кодирующей вариабельную область нечеловеческого иммуноглобулина, с ДНК, кодирующей константный участок человеческого иммуноглобулина, встраивания этой ДНК в вектор экспрессии и введения вектора экспрессии хозяину для продуцирования химерного антитела (смотри EP 125023, WO 92/19759). Химерное антитело, используемое в настоящем изобретении, может быть получено при помощи этого известного метода.
Гуманизированное антитело получают в результате соединения определяющих комплементарность областей (CDR), происходящих от нечеловеческого иммуноглобулина, с ДНК, кодирующей другую часть областей человеческого иммуноглобулина, встраивания этой ДНК в вектор экспрессии и введения вектора экспрессии хозяину для продуцирования гуманизированного антитела.
Человеческое антитело получают, например, в результате использования метода, описанного в примерах, представленных ниже. Человеческое антитело также может быть получено при помощи метода триомы, технологии человеческой B-клеточной гибридомы (Kozbor, et al., 1983, Immunol. Today, 4, p.72) или технологии EBV гибридомы для продуцирования человеческих моноклональных антител (Cole, et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., p.77). Человеческое антитело также можно продуцировать, получив гибридому путем иммунизации трансгенной мыши с встроенным геном антитела человека антигенным белком (IL-33 или рецептором IL-33 в настоящей заявке). Примеры трансгенных мышей включают HuMab мышь (Medarex), KMTM мышь (Kirin Pharma), KM(FCγRIIb-KO) мышь и VelocImmune мышь (Regeneron).
Мультиспецифическое антитело может быть получено при помощи генно-инженерной технологии с использованием антигенсвязывающих участков двух или более типов моноклональных антител. Генно-инженерные методы уже разработаны в данной области техники. Например, желаемое биспецифическое антитело может быть получено с помощью технологии применения DVD-Ig, при которой антигенсвязывающие участки двух типов моноклональных антител соединяются непосредственно (Wu, et al., Nature Biotechnology, 25(11), 1290 (2007)), или технологии, применяющей ART-Ig, когда тяжелые цепи двух типов антител, которые связываются с различными антигенами, связываются посредством модификации константных участков иммуноглобулина (Kitazawa, et al., Nature Medicine, 18(10), 1570 (2012)).
Искусственное антитело может быть получено для использования в качестве искусственного антитела, связывающегося с желательной мишенью, например, путем использования 10-го домена фибронектина человека III типа (FNfn10) и введения мутации в петли BC, DE и/или FG этого домена. В дополнение к внеклеточному домену фибронектина, пептиды, такие как домен Куница ингибитора сериновой протеазы, анкирин или липокалин, могут использоваться в качестве искусственных антител. Эти искусственные антитела можно получить при помощи генно-инженерного метода путем введения вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, в клетки Escherichia coli, дрожжевые или животные клетки, культивирования клеток-хозяев и очистки из культуральной среды (PTL4, Clifford Mintz, et al., BioProcesses International, 2013, Vol. 11(2), pp.40-48).
Искусственные антитела также могут быть созданы на основе молекул низкомолекулярных пептидов, которые специфически связываются с эпитопом настоящего изобретения подобно антителу из библиотеки случайных последовательностей, в которых аминокислоты объединяются случайным образом, вместо использования специфического белка, как описано выше, или части его аминокислотной последовательности (смотри, например, Hipolito, et al., Current Opinion in Chemical Biology, 2012, Vol. 16, 196; Yamagishi, et al., Chemistry & Biology, 2011, Vol. 18, 1562). Такие пептиды также можно получить не только с помощью генно-инженерных методов, но также методом химического синтеза, таким как флуоренилметилоксикарбонильный метод или t-бутилоксикарбонильный метод.
Моноклональное антитело, использованное в настоящем изобретении, может быть, например, конъюгированным антителом, связанным с различными типами молекул, такими как непептидный полимер, например, полиэтилегликоль (PEG), радиоактивным веществом или токсином. Подобные конъюгированные антитела можно получить, осуществив химическую модификацию полученного антитела. Методы химической модификации известны в данной области техники. Моноклональное антитело в настоящем изобретении включает эти конъюгированные антитела (King, D.J., Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies, 1998, T.J. International Ltd.; Monoclonal Антитело-Based Therapy of Cancer, 1998, Marcel Dekker Inc..; Chari, et al., Cancer Res., 1992, Vol. 152, 127; Liu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, Vol. 93, 8681).
В настоящем изобретении фрагменты моноклональных антител, отделенные от целых антител, описанных выше, и их модифицированные формы также могут использоваться, в том случае, если они обладают способностью связываться с антигеном и демонстрируют антагонистическую активность. Примеры фрагментов антитела включают Fab фрагменты, Fv фрагменты, F(ab')2 фрагменты, Fab' фрагменты и одноцепочечные Fv фрагменты (scFv), в которых Fv H цепи и L цепи связываются с подходящим линкером. Эти фрагменты антитела также могут быть связаны с функциональной молекулой, отличной от антитела, такой как непептидный полимер, например, полиэтилегликоль (PEG), радиоактивное вещество, токсин, низкомолекулярное соединение, цитокин, альбумин или фермент, при помощи химического метода или генно-инженерного метода.
Системы для продуцирования моноклональных антител широко известны в данной области техники, и нужная система может быть выбрана в соответствии с характеристиками целевой композиции. Например, может использоваться система продуцирования in vitro или in vivo. Примеры систем для продуцирования in vitro включают системы с использованием эукариотических клеток, таких как животные клетки, растительные клетки или клетки грибков, и систем для продуцирования при помощи прокариотических клеток, таких как бактериальные клетки Escherichia coli или Bacillus subtilis. Также могут использоваться клетки млекопитающих, например, такие широко используемые клетки как CHO, COS, клетки миеломы, клетки BHK, HeLa и Vero, клетки насекомых или клетки растений. Примеры систем для продуцирования in vivo включают системы с использованием животных и растений. В случае использования животного, примеры включают системы, использующие млекопитающих и насекомых. Например, в качестве млекопитающих могут использоваться козы, свиньи, овцы, мыши или коровы (Vicki Glaser, Spectrum Biotechnology Applications, 1993). Тутовый шелкопряд, например, может использоваться в качестве насекомого. Табак, например, может использоваться в случае использования растения.
В случае продуцирования моноклонального антитела при помощи in vitro или in vivo системы продуцирования, как описано выше, ДНК, кодирующая тяжелую цепь (H цепь) или легкую цепь (L цепь) иммуноглобулина, может быть отдельно «вставлена» в векторы экспрессии, чтобы одновременно трансформировать хозяина, или ДНК, кодирующая H цепь и L цепь, может быть «вставлена» в один вектор экспрессии, чтобы трансформировать хозяина (смотри WO 94/11523).
Полученное моноклональное антитело может быть очищено до получения однородности. Для того, чтобы отделить и очистить моноклональное антитело, могут использоваться методы разделения и очистки, используемые при работе с обычными белками. Например, моноклональное антитело можно отделить и очистить, правильно подобрав колонку для хроматографии, например, колонку для аффинной хроматографии, а также фильтрации, ультрафильтрации, высаливания, диализа, электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия или изоэлектрического фокусирования (Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow и David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), однако, без ограничения этим. Примеры колонок, используемых для аффинной хроматографии, включают колонку на основе белка A и колонку на основе белка G. Примеры колонок на основе белка А включают Hyper D, POROS и Sepharose F.F. (Amersham Biosciences).
Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, такие как аптамер, антисмысловая или миРНК, могут быть синтезированы, например, фосфорамидитным методом с использованием молекулы нуклеиновой кислоты мономера для вещества. Фосфорамидитный метод может осуществляться в соответствии с методом, описанным, например, в WO 2014/046212. Аптамер настоящего изобретения предпочтительно связывается с белком IL-33 (SEQ ID NO: 1 из перечня последовательностей) или белком человеческого рецептора IL-33 (SEQ ID NO: 3 из перечня последовательностей), и антисмысловая или миРНК предпочтительно связывается с мРНК человеческого IL-33 (SEQ ID NO: 2 из перечня последовательностей) или мРНК человеческого рецептора IL-33 (SEQ ID NO: 4 из перечня последовательностей). Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в составе аптамера, антисмысловой и миРНК могут включать искусственные нуклеиновые кислоты, и примеры искусственных нуклеиновых кислот включают олигонуклеотиды (S-oligo) фосфортиоатного (S-PO3)-типа и 2',4'-мостиковые нуклеиновые кислоты (BNA)/2',4'-закрытые нуклеиновые кислоты (LNA) (WO 98/39352, WO 2005/021570, WO 2003/068795, WO 2011/052436).
Предпочтительным аспектом антагониста IL-33 настоящего изобретения является, например, аптамер, способный нейтрализовать действие IL-33 путем связывания с человеческим рецептором IL-33, и примером его является RBM-009.
Терапевтическое средство или фармацевтическая композиция, содержащая антагонист IL-33 настоящего изобретения, может дополнительно содержать фармакологически приемлемый носитель, разбавитель или основу в дополнение к IL-33 антителу, антителу к рецептору IL-33 или растворимому рецептору IL-33, или его соли, все из которых рассматриваются в качестве активного ингредиента, представляющего собой антагонист человеческого IL-33. Кроме того, в состав может быть включен активный ингредиент, отличный от антагониста IL-33 настоящего изобретения, такой как противовоспалительное средство или иммуносупрессор. Несмотря на то, что такая композиция предоставляется как лекарственная форма, подходящая для парентерального введения или перорального введения, парентеральное введение является предпочтительным. Примеры парентерального введения включают, но не ограничиваются этим, внутривенное, внутриартериальное, подкожное, местное, внутрибрюшинное, внутримышечное, трансназальное, введение малыми каплями (инстилляция), чрескожное, чресслизистое, внутримозговое, ректальное, внутримышечное и внутривлагалищное введение.
Для терапевтического средства или фармацевтической композиции настоящего изобретения может быть выбрана подходящая лекарственная форма, соответствующая способу введения, причем может использоваться любая лекарственная форма, такая как инъекционная форма, порошкообразная или инфузионная форма. С точки зрения парентерального введения предпочтительным является препарат для инъекции, инфузии или порошок, растворяемый в момент использования. Эти композиции также могут содержать различные адьюванты, используемые для фармацевтических препаратов, а именно, носители и другие вспомогательные средства, такие как стабилизирующие, консервирующие, обезболивающие средства, эмульгаторы и другие вспомогательные вещества.
Антагонист IL-33 настоящего изобретения может быть введен, например, при помощи непрерывной инфузии или путем болюсного введения с частотой один раз в день, один раз в неделю, один раз в месяц или от 1 до 7 раз в год. антагонист IL-33 может вводиться при помощи внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, местного, трансназального, ректального, внутримышечного или внутривагинального введения. Предпочтительный протокол дозирования включает максимальную дозу или частоту дозирования, которая помогает избежать серьезных вредных побочных эффектов. Дозировка в расчете на введение составляет в большинстве случаев по меньшей мере около 0,05 мкг/кг веса тела, более предпочтительно по меньшей мере около 0,2 мкг/кг, как правило по меньшей мере около 0,5 мкг/кг, часто, по меньшей мере около 1 мкг/кг, более типично по меньшей мере около 10 мкг/кг, наиболее типично по меньшей мере около 100 мкг/кг, предпочтительно по меньшей мере около 0,2 мг/кг, более предпочтительно, по меньшей мере около 1,0 мг/кг, наиболее предпочтительно по меньшей мере около 2,0 мг/кг, более допустимо по меньшей мере около 10 мг/кг, даже более допустимо, по меньшей мере около 25 мг/кг, и оптимально по меньшей мере около 50 мг/кг.
Примеры предпочтительных аспектов антагониста IL-33 настоящего изобретения включают человеческие IL-33 моноклональные антитела A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04 и A26-1F02. Соответствующими аминокислотными последовательностями легких цепей и тяжелых цепей этих моноклональных антител являются SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 из перечня последовательностей (A10-1C04), SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 (A23-1A05), SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 (A25-2C02), SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 (A25-3H04) и SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 (A26-1F02). Константными областями этих антител предпочтительно являются константные области человеческого антитела, и более предпочтительно константные области человеческого IgG1.
Другим аспектом антагониста IL-33 настоящего изобретения является, например, антитело, способное нейтрализовать действие IL-33 путем связывания с человеческим IL-33, и примеры включают этокимаб (также называемый ANB-020), REGN-3500 (также называемый SAR-440340), MEDI-3506, PF-06817024 и CBP-233.
Другим аспектом антагониста IL-33 настоящего изобретения является, например, антитело, способное нейтрализовать IL-33 путем связывания с человеческим рецептором IL-33, и примеры включают RG-6149 (также называемый AMG-282, MSTT1041A или RO-7187807), GSK-3772847 (также называемый CNTO-7160) и LY-3375880.
Хотя растворимый рецептор IL-33 является белком, содержащим весь или часть внеклеточного участка (от остатка 19 до остатка 328) ST2L SEQ ID NO: 3 из перечня последовательностей, может содержаться аминокислотная замена, делеция или вставка, в случае если растворимый рецептор IL-33 демонстрирует антагонистическое IL-33 действие. Исходя из требования сохранения антагонистического IL-33 действия, число замененных, удаленных или вставленных аминокислот составляет предпочтительно одну или несколько, и любое произвольное число аминокислот от 1 до 9 может быть заменено, удалено или вставлено. В другом аспекте растворимый рецептор IL-33 может обладать идентичностью по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, даже более предпочтительно по меньшей мере 95% и еще более предпочтительно по меньшей мере 98% относительно аминокислотной последовательности внеклеточного участка (от остатка 19 до остатка 328) ST2L SEQ ID NO: 3 из перечня последовательностей, при условии, что он демонстрирует антагонистическое IL-33 действие. С точки зрения улучшения фармакокинетики константный участок иммуноглобулина и полиэтилегликоль, например, могут быть «слиты» с растворимым рецептором IL-33. Растворимый рецептор IL-33, имеющий константный участок антитела, «слитый» с ним, может называться sST2-Fc. Хотя константная область иммуноглобулина, способная к связыванию, может быть константной областью, происходящей от любого произвольно выбранного вида, с точки зрения обеспечения низкого уровня антигенности предпочтительной является человеческая константная область. Предпочтительным примером человеческого sST2-Fc является гибридный белок, представленный SEQ ID NO: 5 из перечня последовательностей.
sST2-Fc может образовывать димер тем же самым образом, как иммуноглобулин. Аминокислота sST2-Fc может быть заменена, удалена или вставлена в исходную аминокислотную последовательность, такую как аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 5 или 6, при условии, что он демонстрирует антагонистическое IL-33 действие. Исходя из требования сохранения антагонистического IL-33 действия, число замененных, удаленных или вставленных аминокислот составляет предпочтительно одну или несколько, и любое произвольное число аминокислот от 1 до 9 может быть заменено, удалено или вставлено. В другом аспекте sST2-Fc может обладать идентичностью по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, даже более предпочтительно по меньшей мере 95% и еще более предпочтительно по меньшей мере 98% относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или 6 из перечня последовательностей, при условии, что он антагонист IL-33 действия. Эти sST2-Fc предпочтительно сохраняют способность к формированию димера.
Растворимый рецептор IL-33, такой как sST2-Fc, может быть получен при помощи in vitro системы продуцирования с использованием вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок растворимого рецептора IL-33. Примеры систем продуцирования in vitro включают системы, использующие эукариотические клетки, такие как клетки животных, клетки растений или клетки грибов, и системы продуцирования, использующие прокариотические клетки, например, бактериальные клетки, такие как Escherichia coli или Bacillus subtilis. Также могут использоваться клетки млекопитающих, например, такие широко используемые клетки как CHO, COS, клетки миеломы, BHK, HeLa и Vero клетки, 293, NSO, Namaiwa или YB2/0 клетки насекомых или клетки растений. Растворимый рецептор IL-33 может быть изолирован путем дальнейшей очистки белка, продуцированного таким образом.
Несмотря на то, что далее предоставляется более подробное объяснение настоящего изобретения с помощью примеров, настоящее изобретение не ограничивается следующими далее примерами, если специально не указано иначе. Все ссылки, упомянутые в настоящем описании, полностью включаются в настоящее описание путем отсылки.
Пример 1. Эффект отсутствия гена IL-33 на модели эндометриоза
В качестве животной модели эндометриоза использовали мышей с транплантированной маткой, которым вводили эстроген (Ricci, et al., Reprod. Sci., 2011, Vol. 18, p614). Мышам дикого типа, самкам мышей Balb/c 6-недельного возраста (Charles River Laboratories, Japan) или мышам с нокаутированным IL-33 на основе Balb/c (Yasuda, et al., PNAS, 2012, Vol. 130, p184) (обозначены “IL-33KO мыши”) была проведена ингаляционная анастезия изофлураном (анастезия проводилась при концентрации изофлурана 3,0% и скорости потока воздуха окружающей среды 300-400), потом был сделан небольшой разрез немного левее средней линии мыши, а затем были извлечены левый и правый рог матки из лапаротомического отверстия и отрезаны яичники, присоединенные к концу матки. Этим мышам подкожно вводили раствор эсрадиола валерата для инъекций (Fuji Pharma) (Estrogen), разведенный до концентрации 5 мкг/мл кукурузным маслом (Wako Pure Chemical Industries), под кожу в задней части шеи при помощи 22G шприца из расчета 0,5 мкг/100 мкл/организм в течение 2 недель (один раз в неделю), чтобы получить мышей-доноров и мышей-реципиентов. Через две недели мышей-доноров умерщвляли смещением шейных позвонков и производили лапаротомию с последующим удалением матки. Извлеченную матку нарезали равномерно на кусочки весом 40 г в чашки Петри. Затем, отрезанные кусочки матки помещали в 25 мл пробирки Spitz с закругленным дном и широким горлышком вместе с 400 мкл PBS, с растворенным в нем антибиотиком ампициллином (1 мг/мл), а затем нарезали тонкими пластинками со стороной 2 мм с помощью ножниц Купера. Измельченную ткань матки насасывали шприцом 2,5 мл. Делали небольшой разрез по средней линии мыши-реципиента, находящейся под ингаляционной анестезией, так же, как и в ходе овариектомии, ткань матки из шприца диспергировали в брюшной полости, и разрез ушивали с помощью нити Monocryl 3-0. После транплантации фрагмента матки мышам-реципиентам дополнительно вводили эстроген посредством подкожной инъекции в течение 2 недель (один раз/неделю). Через две недели после транплантации мышей подвергали эвтаназии и лапаротомии. Эктопическую эндометриальную ткань (кистозные поражения), образовавшуюся в брюшной полости, вырезали, по мере возможности избегая ее повреждения, а затем соответственно измеряли ее вес и объем. Объем кистозного поражения вычисляли, используя формулу V = (4/3)πb2A (b: малый диаметр, A: большой диаметр).
Как видно на фиг. 1, в случае использования IL-33KO мышей в качестве доноров и реципиентов, объем кистозного поражения значительно уменьшался по сравнению с использованием мышей дикого типа. Адгезия кистозных поражений у мышей IL-33 KO к ткани, например, брюшной полости, была подавлена при проведении удаления по сравнению с кистозными поражениями у контрольных мышей. Количество кровеносных сосудов в кистозных поражениях у мышей IL-33 KO кажется пониженным по сравнению с кистозными поражениями у контрольных мышей. Этот результат показывает, что IL-33 вовлечен в рост кистозных поражений и адгезию к различным органам (причем адгезия к различным органам является причиной боли), а также ангиогенез в модели эндометриоза, и что ингибирование IL-33 дает возможность ингибировать рост кистозных поражений и их адгезию к различным органам (боль), а также инигибировать ангиогенез.
Пример 2. Эффект введения IL-33 на модели эндометриоза
Модель эндометриоза была получена в соответствии с методом, описанным в Примере 1, на мышах дикого типа и самках мышей Balb/c 6-недельного возраста. Группе для дозирования IL-33 внутрибрюшинно вводили белок рекомбинантного человеческого IL-33 (от остатка 112 до остатка 270) (Kondo, et al., Int. Immunol., 2008, Vol. 20, p791), растворенный в PBS, начиная с момента трансплантации из расчета 100 нг/200 мкл/организм в расчете на введение три раза в неделю в течение 2 недель, всего 6 введений. Мышей подвергали эвтаназии и лапароскопии через две недели после трансплантации, и извлекали кистозные поражения, которые образовались в брюшной полости, и измеряли объем каждого поражения. Как показано на фиг. 2, объем кистозных поражений был значительно увеличен в дозовой группе IL-33 по сравнению с группой со средней дозой. Этот результат показывает, что IL-33 вовлечен в рост кистозных поражений. Поскольку концентрация IL-33 увеличивается в асцитах и сыворотке пациентов с эндометриозом (NPL2), считается, что модель эндометриоза с дозированием человеческого IL-33 является пригодной моделью заболевания, отражающей патологию эндометриоза.
Пример 3. Антагонисты IL-33
Пять типов человеческих IL-33 антител (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04 и A26-1F02) наряду с мышиным sST2-Fc, который является гибридным белком мышиного ST2 и константного участка человеческого IgG1, были получены при помощи рекомбинантных CHO клеток (WO 2015/099175). Их аминокислотные последовательности показаны в таблице ниже. Также была измерена аффинность пяти типов человеческих IL-33 антител к человеческому IL-33 белку (от остатка 112 до остатка 270) (ATGen, ILC070) с помощью KinExA, при этом значения Kd были 100.3 pM A10-1C04, 195.3 pM для A23-1A05, 700 fM для A25-2C02, 7.7 pM для A25-3H04 и 5.3 pM для A26-1F02.
Таблица 1
антагонист IL-33
Последовательность легкой цепи
Последовательность тяжелой цепи
A10-1C04
SEQ ID NO: 7
SEQ ID NO: 8
A23-1A05
SEQ ID NO: 9
SEQ ID NO: 10
A25-2C02
SEQ ID NO: 11
SEQ ID NO: 12
A25-3H04
SEQ ID NO: 13
SEQ ID NO: 14
A26-1F02
SEQ ID NO: 15
SEQ ID NO: 16
Мышиный sST2-Fc
SEQ ID NO: 6
Пример 4. Эффект антагониста IL-33 sST2-Fc на рост эктопической эндометриальной ткани
Поскольку IL-33 вовлечен в пролиферацию кистозных поражений, на модели эндометриоза было показано, что эндометриоз можно лечить путем ингибирования IL-33. Поэтому эндометриоз лечили введением антагониста IL-33. Мышиный sST2-Fc, полученный в примере 3, послужил антагонистом IL-33. Мышиный sST2-Fc вводили внутривенно в течение 2 недель каждые 3 дня в дозе 20 мг/кг после трансплантации фрагмента матки группам мышей по 6 животных в каждой группе, используя модель эндометриоза, полученную в соответствии с методом, описанным в Примере 1. Контрольным мышам вводили контрольный Fc (InVivoMab рекомбинантный человеческий Fc-G1 (Bio X Cell, кат. № Be0096) вместо мышиного sST2-Fc. После лечения мышиным sST2-Fc мышей подвергали эвтаназии и лапаротомии. Кистозные поражения, образованные в брюшной полости, иссекали и анализировали степень адгезии кистозных поражений, объем кистозных поражений и наличие кровеносных сосудов в кистозных поражениях. Как видно на фиг. 3, объем кистозных поражений в дозовой группе с мышиным sST2-Fc значительно понижен по сравнению с контрольной Fc дозовой группой. Попутно с этим уменьшением объема кистозных поражений, адгезия кистозных поражений в дозовой группе с мышиным sST2-Fc к брюшине и другим тканям была подавлена по сравнению с кистозными поражениями контрольных мышей. Было продемонстрировано явное снижение количества кровеносных сосудов в кистозных поражениях в дозовой группе с мышиным sST2-Fc по сравнению с кистозными поражениями контрольной мыши.
Исходя из представленных выше результатов, можно сделать вывод, что эндометриоз можно лечить путем введения мышиного sST2-Fc, причем рост, адгезию (адгезия к различным органам является причиной боли) и ангиогенез эктопической эндометриальной ткани при эндометриозе можно подавить.
Пример 5. Эффект антагониста IL-33 sST2-Fc на фиброз эктопической эндометриальной ткани
Кистозные поражения, иссеченные в Примере 4, зафиксировали параформальдегидом, залили в парафин, а затем готовили парафиновые срезы толщиной 8мкм. Фиброзную ткань окрашивали в синий цвет, используя окрашивающий раствор анилиновый синий Мэллори/краситель оранж G (Muto Pure Chemicals) согласно протоколу, рекомендованному Muto Pure Chemicals. Степень фиброза оценивали в соответствии с глубиной синего цвета при окрашивании азаном с помощью подсчета баллов от 1 (светлая окраска) до 3 (темная окраска). Как видно из Таблицы 2, фиброз кистозных поражений был ингибирован в группе, которой давали sST2-Fc, по сравнению группой, которой вводили контрольный Fc. Фиг. 4 показывает типичные окрашенные изображения в каждой группе (конкретное число D контрольной Fc дозовой группы и конкретное число C дозовой группы с мышиным sST2-Fc).
Таблица 2
A
B
C
D
E
F
G
Контрольная группа, которой вводили Fc
2
3
3
2
2
3
2.5
Группа, которой вводили мышиный sST2-Fc
1
2
1
3
3
1
1.8
Исходя из представленных выше результатов, эндометриоз можно лечить путем введения мышиного sST2-Fc, при этом можно подавить фиброз эктопической эндометриальной ткани при эндометриозе.
Пример 6. Эффект анти-IL-33 моноклонального антитела на рост эктопической эндометриальной ткани
Было показано, что кистозное поражение увеличивается в результате введения рекомбинантного человеческого IL-33 на модели эндометриоза, полученной у IL-33 KO мышей (Пример 2). С помощью этой модели было изучено действие человеческих анти-IL-33 моноклональных антител, полученных в Примере 3 (A10-1C04, A23-1A05, A25-2C02, A25-3H04 и A26-1F02). Человеческое анти-IL-33 антитело вводили внутривенно каждую неделю в дозе 10 мг/кг после трансплантации фрагмента матки с использованием модели эндометриоза с дозированием IL-33, полученной по методу, описанному в Примере 2. Контрольное антитело (контрольное полностью человеческое антитело изотипа IgG1 качества PC (Eureka, кат. № ET901)) вводили мышам контрольной группы вместо человеческого анти-IL-33 антитела. Мышей подвергали эвтаназии и лапаротомии после лечения с использованием человеческих анти-IL-33 антител, кистозные поражения, образовавшиеся в брюшной полости, были иссечены, а затем проанализирована степень адгезии кистозных поражений после иссечения, объем кистозных поражений и наличие кровеносных сосудов в кистозных поражениях. Как показано на фиг. 5 (показаны результаты для A10-1C04), объем кистозных поражений увеличивался в группе, которой вводили человеческий IL-33, по сравнению с группой, которой вводили PBS, и объем кистозных поражений значительно увеличивался даже после введения контрольного антитела. Увеличение объема кистозных поражений было значительно заингибировано при введении анти-IL-33 антитела. Попутно с этим уменьшением объема кистозных поражений, адгезия кистозных поражений в дозовой группе с анти-IL-33 антителом к брюшине и другим тканям была подавлена по сравнению с кистозными поражениями контрольных мышей. Было продемонстрировано явное снижение количества кровеносных сосудов в кистозных поражениях в группе, которой вводили мышиный sST2-Fc, по сравнению с кистозными поражениями мышей, которым вводили контрольное антитело. Наблюдалось явное снижение количества кровеносных сосудов в кистозных поражениях у мышей с введением анти-IL-33d по сравнению с кистозными поражениями контрольных мышей.
Исходя из представленных выше результатов, можно сделать вывод о том, что эндометриоз можно лечить путем введения анти-IL-33 антитела, а рост, адгезию (адгезия к различным органам является причиной боли) и ангиогенез эктопической эндометриальной ткани при эндометриозе можно подавить.
Пример 7. Эффект анти-IL-33 моноклонального антитела на клеточную пролиферацию эктопической эндометриальной ткани
Кистозные поражения, иссеченные в примере 6, фиксировали параформальдегидом, а затем заливали в парафин и готовили парафиновые срезы толщиной 8 мкм. Иммуноокрашивание маркера клеточной пролиферации, Ki-67 антигена, осуществляли при помощи анти-Ki-67 антител (“SP6”, Abcam, ab16667) и Dako Envision+ Dual Link (Agilent, K4063) согласно протоколу, рекомендованному Abcam, с целью изучения пролиферации кистозных поражений. Подсчитывали количество Ki-67-позитивных клеточных ядер в срезе на одно поле зрения микроскопа. Также подсчитывали количество Ki-67-позитивных клеток в трех положениях на слайд и определяли среднее значение. Как можно видеть на фиг. 6 (показаны результаты для A10-1C04), введение человеческого IL-33 вызывает повышение процента Ki-67-позитивных клеток, что является маркером клеточной пролиферации в клетках кистозных поражений, связанных с эндометриозом, по сравнению с группой, которой вводили PBS, хотя увеличение процента Ki-67-позитивных клеток наблюдалось даже после введения контрольного антитела, и увеличение было ингибировано введением анти-IL-33 антитела.
Исходя из предоставленных выше результатов, можно сделать вывод, что эндометриоз можно лечить введением анти-IL-33 антител, при этом может быть подавлена клеточная пролиферация эктопической эндометриальной ткани при эндометриозе.
Пример 8. Эффект анти-IL-33 моноклонального антитела на боль, связанную с эндометриозом
Эндометриоз и аденомиоз матки можно лечить путем введения анти-IL-33 моноклональных антител пациентам с эндометриозом и аденомиозом матки. Боль, такая как тазовая боль, дисменорейная боль или боль при коитусе, связанная с эндометриозом и аденомиозом матки, может быть облегчена. Может быть улучшено QOL в отношении затруднений при ходьбе и боли при коитусе, связанных с эндометриозом и аденомиозом матки.
Промышленная применимость
Терапевтическое средство настоящего изобретения, содержащее антагонист, направленный против IL-33, в качестве активного ингредиента, может использоваться в виде фармацевтической композиции для лечения, предотвращения или облегчения эндометриоза или аденомиоза матки.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation
<120>  A Therapeutic Agent for Endometriosis comprising IL-33 Antagonist
<130>  P180453
<150>  US 62/552,594
<151>  2017-08-31
<160>  16
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  270
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Met Lys Pro Lys Met Lys Tyr Ser Thr Asn Lys Ile Ser Thr Ala Lys
1               5                   10                  15
Trp Lys Asn Thr Ala Ser Lys Ala Leu Cys Phe Lys Leu Gly Lys Ser
20                  25                  30
Gln Gln Lys Ala Lys Glu Val Cys Pro Met Tyr Phe Met Lys Leu Arg
35                  40                  45
Ser Gly Leu Met Ile Lys Lys Glu Ala Cys Tyr Phe Arg Arg Glu Thr
50                  55                  60
Thr Lys Arg Pro Ser Leu Lys Thr Gly Arg Lys His Lys Arg His Leu
65                  70                  75                  80
Val Leu Ala Ala Cys Gln Gln Gln Ser Thr Val Glu Cys Phe Ala Phe
85                  90                  95
Gly Ile Ser Gly Val Gln Lys Tyr Thr Arg Ala Leu His Asp Ser Ser
100                 105                 110
Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr
115                 120                 125
Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu
130                 135                 140
Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu
145                 150                 155                 160
Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly
165                 170                 175
Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe
180                 185                 190
Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Cys
195                 200                 205
Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His
210                 215                 220
Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile
225                 230                 235                 240
Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser Glu
245                 250                 255
Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr
260                 265                 270
<210>  2
<211>  2689
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  2
agagcugcag cucuucaggg aagaaaucaa aacaagauca caagaauacu gaaaaaugaa       60
gccuaaaaug aaguauucaa ccaacaaaau uuccacagca aaguggaaga acacagcaag      120
caaagccuug uguuucaagc ugggaaaauc ccaacagaag gccaaagaag uuugccccau      180
guacuuuaug aagcuccgcu cuggccuuau gauaaaaaag gaggccuguu acuuuaggag      240
agaaaccacc aaaaggccuu cacugaaaac agguagaaag cacaaaagac aucugguacu      300
cgcugccugu caacagcagu cuacugugga gugcuuugcc uuugguauau caggggucca      360
gaaauauacu agagcacuuc augauucaag uaucacagga auuucaccua uuacagagua      420
ucuugcuucu cuaagcacau acaaugauca auccauuacu uuugcuuugg aggaugaaag      480
uuaugagaua uauguugaag acuugaaaaa agaugaaaag aaagauaagg uguuacugag      540
uuacuaugag ucucaacacc ccucaaauga aucaggugac gguguugaug guaagauguu      600
aaugguaacc cugaguccua caaaagacuu cugguugcau gccaacaaca aggaacacuc      660
uguggagcuc cauaagugug aaaaaccacu gccagaccag gccuucuuug uccuucauaa      720
uaugcacucc aacuguguuu cauuugaaug caagacugau ccuggagugu uuauaggugu      780
aaaggauaau caucuugcuc ugauuaaagu agacucuucu gagaauuugu guacugaaaa      840
uaucuuguuu aagcucucug aaacuuaguu gauggaaacc ugugagucuu ggguugagua      900
cccaaaugcu accacuggag aaggaaugag agauaaagaa agagacaggu gacaucuaag      960
ggaaaugaag agugcuuagc auguguggaa uguuuuccau auuauguaua aaaauauuuu     1020
uucuaauccu ccaguuauuc uuuuauuucc cucuguauaa cugcaucuuc aauacaagua     1080
ucaguauauu aaauagggua uugguaaaga aacggucaac auucuaaaga gauacagucu     1140
gaccuuuacu uuucucuagu uucaguccag aaagaacuuc auauuuagag cuaaggccac     1200
ugaggaaaga gccauagcuu aagucucucu guagacaggg auccauuuua aagagcuacu     1260
uagagaaaua auuuuccaca guuccaaacg auaggcucaa acacuagagc ugcuaguaaa     1320
aagaagacca gaugcuucac agaauuauca uuuuuucaac uggaauaaaa caccagguuu     1380
guuuguagau gucuuaggca acacucagag cagaucuccc uuacugucag gggauaugga     1440
acuucaaagg cccacauggc aagccaggua acauaaaugu gugaaaaagu aaagauaacu     1500
aaaaaauuua gaaaaauaaa uccaguauuu guaaagugaa uaacuucauu ucuaauuguu     1560
uaauuuuuaa aauucugauu uuuauauauu gaguuuaagc aaggcauucu uacacgagga     1620
agugaaguaa auuuuaguuc agacauaaaa uuucacuuau uaggaauaug uaacaugcua     1680
aaacuuuuuu uuuuuuaaag aguacugagu cacaacaugu uuuagagcau ccaaguacca     1740
uauaauccaa cuaucauggu aaggccagaa aucuucuaac cuaccagagc cuagaugaga     1800
caccgaauua acauuaaaau uucaguaacu gacugucccu cauguccaug gccuaccauc     1860
ccuucugacc cuggcuucca gggaccuaug ucuuuuaaua cucacuguca cauugggcaa     1920
aguugcuucu aauccuuauu ucccaugugc acaagucuuu uuguauucca gcuuccugau     1980
aacacugcuu acuguggaau auucauuuga caucugucuc uuuucauuuc uuuuaacuac     2040
caugcccuug auauaucuuu ugcaccugcu gaacuucauu ucuguaucac cugaccucug     2100
gaugccaaaa cguuuauucu gcuuugucug uuguagaauu uuagauaaag cuauuaaugg     2160
caauauuuuu uugcuaaacg uuuuuguuuu uuacugucac uagggcaaua aaauuuauac     2220
ucaaccauau aauaacauuu uuuaacuacu aaaggaguag uuuuuauuuu aaagucuuag     2280
caauuucuau uacaacuuuu cuuagacuua acacuuauga uaaaugacua acauaguaac     2340
agaaucuuua ugaaauauga ccuuuucuga aaauacauac uuuuacauuu cuacuuuauu     2400
gagaccuauu agauguaagu gcuaguagaa uauaagauaa aagaggcuga gaauuaccau     2460
acaaggguau uacaacugua aaacaauuua ucuuuguuuc auuguucugu caauaauugu     2520
uaccaaagag auaaaaauaa aagcagaaug uauaucaucc caucugaaaa acacuaauua     2580
uugacaugug caucugugca auaaacuuaa aaugauuauu aaauaaucaa auauaucuac     2640
auuguuuaua uuauugaaua aaguauauuu uccaaaaaaa aaaaaaaaa                 2689
<210>  3
<211>  556
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Met Gly Phe Trp Ile Leu Ala Ile Leu Thr Ile Leu Met Tyr Ser Thr
1               5                   10                  15
Ala Ala Lys Phe Ser Lys Gln Ser Trp Gly Leu Glu Asn Glu Ala Leu
20                  25                  30
Ile Val Arg Cys Pro Arg Gln Gly Lys Pro Ser Tyr Thr Val Asp Trp
35                  40                  45
Tyr Tyr Ser Gln Thr Asn Lys Ser Ile Pro Thr Gln Glu Arg Asn Arg
50                  55                  60
Val Phe Ala Ser Gly Gln Leu Leu Lys Phe Leu Pro Ala Ala Val Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Gly Ile Tyr Thr Cys Ile Val Arg Ser Pro Thr Phe Asn Arg
85                  90                  95
Thr Gly Tyr Ala Asn Val Thr Ile Tyr Lys Lys Gln Ser Asp Cys Asn
100                 105                 110
Val Pro Asp Tyr Leu Met Tyr Ser Thr Val Ser Gly Ser Glu Lys Asn
115                 120                 125
Ser Lys Ile Tyr Cys Pro Thr Ile Asp Leu Tyr Asn Trp Thr Ala Pro
130                 135                 140
Leu Glu Trp Phe Lys Asn Cys Gln Ala Leu Gln Gly Ser Arg Tyr Arg
145                 150                 155                 160
Ala His Lys Ser Phe Leu Val Ile Asp Asn Val Met Thr Glu Asp Ala
165                 170                 175
Gly Asp Tyr Thr Cys Lys Phe Ile His Asn Glu Asn Gly Ala Asn Tyr
180                 185                 190
Ser Val Thr Ala Thr Arg Ser Phe Thr Val Lys Asp Glu Gln Gly Phe
195                 200                 205
Ser Leu Phe Pro Val Ile Gly Ala Pro Ala Gln Asn Glu Ile Lys Glu
210                 215                 220
Val Glu Ile Gly Lys Asn Ala Asn Leu Thr Cys Ser Ala Cys Phe Gly
225                 230                 235                 240
Lys Gly Thr Gln Phe Leu Ala Ala Val Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr
245                 250                 255
Lys Ile Thr Asp Phe Gly Glu Pro Arg Ile Gln Gln Glu Glu Gly Gln
260                 265                 270
Asn Gln Ser Phe Ser Asn Gly Leu Ala Cys Leu Asp Met Val Leu Arg
275                 280                 285
Ile Ala Asp Val Lys Glu Glu Asp Leu Leu Leu Gln Tyr Asp Cys Leu
290                 295                 300
Ala Leu Asn Leu His Gly Leu Arg Arg His Thr Val Arg Leu Ser Arg
305                 310                 315                 320
Lys Asn Pro Ile Asp His His Ser Ile Tyr Cys Ile Ile Ala Val Cys
325                 330                 335
Ser Val Phe Leu Met Leu Ile Asn Val Leu Val Ile Ile Leu Lys Met
340                 345                 350
Phe Trp Ile Glu Ala Thr Leu Leu Trp Arg Asp Ile Ala Lys Pro Tyr
355                 360                 365
Lys Thr Arg Asn Asp Gly Lys Leu Tyr Asp Ala Tyr Val Val Tyr Pro
370                 375                 380
Arg Asn Tyr Lys Ser Ser Thr Asp Gly Ala Ser Arg Val Glu His Phe
385                 390                 395                 400
Val His Gln Ile Leu Pro Asp Val Leu Glu Asn Lys Cys Gly Tyr Thr
405                 410                 415
Leu Cys Ile Tyr Gly Arg Asp Met Leu Pro Gly Glu Asp Val Val Thr
420                 425                 430
Ala Val Glu Thr Asn Ile Arg Lys Ser Arg Arg His Ile Phe Ile Leu
435                 440                 445
Thr Pro Gln Ile Thr His Asn Lys Glu Phe Ala Tyr Glu Gln Glu Val
450                 455                 460
Ala Leu His Cys Ala Leu Ile Gln Asn Asp Ala Lys Val Ile Leu Ile
465                 470                 475                 480
Glu Met Glu Ala Leu Ser Glu Leu Asp Met Leu Gln Ala Glu Ala Leu
485                 490                 495
Gln Asp Ser Leu Gln His Leu Met Lys Val Gln Gly Thr Ile Lys Trp
500                 505                 510
Arg Glu Asp His Ile Ala Asn Lys Arg Ser Leu Asn Ser Lys Phe Trp
515                 520                 525
Lys His Val Arg Tyr Gln Met Pro Val Pro Ser Lys Ile Pro Arg Lys
530                 535                 540
Ala Ser Ser Leu Thr Pro Leu Ala Ala Gln Lys Gln
545                 550                 555
<210>  4
<211>  2573
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  4
gaggagggac cuacaaagac uggaaacuau ucuuagcucc gucacugacu ccaaguucau       60
ccccucuguc uuucaguuug guugagauau aggcuacucu ucccaacuca gucuugaaga      120
guaucaccaa cugccucaug uguggugacc uucacugucg uaugccagug acucaucugg      180
aguaaucuca acaacgaguu accaauacuu gcucuugauu gauaaacaga augggguuuu      240
ggaucuuagc aauucucaca auucucaugu auuccacagc agcaaaguuu aguaaacaau      300
cauggggccu ggaaaaugag gcuuuaauug uaagaugucc uagacaagga aaaccuaguu      360
acaccgugga uugguauuac ucacaaacaa acaaaaguau ucccacucag gaaagaaauc      420
guguguuugc cucaggccaa cuucugaagu uucuaccagc ugcaguugcu gauucuggua      480
uuuauaccug uauugucaga agucccacau ucaauaggac uggauaugcg aaugucacca      540
uauauaaaaa acaaucagau ugcaauguuc cagauuauuu gauguauuca acaguaucug      600
gaucagaaaa aaauuccaaa auuuauuguc cuaccauuga ccucuacaac uggacagcac      660
cucuugagug guuuaagaau ugucaggcuc uucaaggauc aagguacagg gcgcacaagu      720
cauuuuuggu cauugauaau gugaugacug aggacgcagg ugauuacacc uguaaauuua      780
uacacaauga aaauggagcc aauuauagug ugacggcgac cagguccuuc acggucaagg      840
augagcaagg cuuuucucug uuuccaguaa ucggagcccc ugcacaaaau gaaauaaagg      900
aaguggaaau uggaaaaaac gcaaaccuaa cuugcucugc uuguuuugga aaaggcacuc      960
aguucuuggc ugccguccug uggcagcuua auggaacaaa aauuacagac uuuggugaac     1020
caagaauuca acaagaggaa gggcaaaauc aaaguuucag caaugggcug gcuugucuag     1080
acaugguuuu aagaauagcu gacgugaagg aagaggauuu auugcugcag uacgacuguc     1140
uggcccugaa uuugcauggc uugagaaggc acaccguaag acuaaguagg aaaaauccaa     1200
guaaggagug uuucugagac uuugaucacc ugaacuuucu cuagcaagug uaagcagaau     1260
ggaguguggu uccaagagau ccaucaagac aaugggaaug gccugugcca uaaaaugugc     1320
uucucuucuu cgggauguug uuugcugucu gaucuuugua gacuguuccu guuugcuggg     1380
agcuucucug cugcuuaaau uguucguccu cccccacucc cuccuaucgu ugguuugucu     1440
agaacacuca gcugcuucuu uggucauccu uguuuucuaa cuuuaugaac ucccucugug     1500
ucacuguaug ugaaaggaaa ugcaccaaca accguaaacu gaacguguuc uuuugugcuc     1560
uuuuauaacu ugcauuacau guuguaagca ugguccguuc uauaccuuuu ucuggucaua     1620
augaacacuc auuuuguuag cgaggguggu aaagugaaca aaaaggggaa guaucaaacu     1680
acugccauuu cagugagaaa auccuaggug cuacuuuaua auaagacauu uguuaggcca     1740
uucuugcauu gauauaaaga aauaccugag acugggugau uuauaugaaa agagguuuaa     1800
uuggcucaca guucugcagg cuguauggga agcauggcgg caucugcuuc uggggacacc     1860
ucaggagcuu uacucauggc agaaggcaaa gcaaaggcag gcacuucaca caguaaaagc     1920
aggagcgaga gagaggugcc acacugaaac agccagaucu caugagaagu cacucacuau     1980
ugcaaggaca gcaucaaaga gauggugcua aaccauucau gaugaacuca cccccaugau     2040
ccaaucaccu cccaccaggc uccaccucga auacugggga uuaccauuca gcaugagauu     2100
ugggcaggaa cacagaccca aaccauacca cacacauuau cauuguuaaa cuuuguaaag     2160
uauuuaaggu acauggaaca cacgggaagu cugguagcuc agcccauuuc uuuauugcau     2220
cuguuauuca ccauguaauu cagguaccac guauuccagg gagccuuucu uggcccucag     2280
uuugcaguau acacacuuuc caaguacucu uguagcaucc uguuuguauc auagcacugg     2340
ucacauugcc uuaccuaaau cuguuugaca gucugcucaa cacgacugca agcuccauga     2400
gggcagggac aucaucucuu ccaucuuugg guccuuagug caauaccugg cagcuagcca     2460
gugcucagcu aaauauuugu ugacugaaua aaugaaugca caaccaaaaa aaaaaaaaaa     2520
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aauaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa            2573
<210>  5
<211>  541
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Fused Protein
<400>  5
Lys Phe Ser Lys Gln Ser Trp Gly Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile Val
1               5                   10                  15
Arg Cys Pro Arg Gln Gly Lys Pro Ser Tyr Thr Val Asp Trp Tyr Tyr
20                  25                  30
Ser Gln Thr Asn Lys Ser Ile Pro Thr Gln Glu Arg Asn Arg Val Phe
35                  40                  45
Ala Ser Gly Gln Leu Leu Lys Phe Leu Pro Ala Ala Val Ala Asp Ser
50                  55                  60
Gly Ile Tyr Thr Cys Ile Val Arg Ser Pro Thr Phe Asn Arg Thr Gly
65                  70                  75                  80
Tyr Ala Asn Val Thr Ile Tyr Lys Lys Gln Ser Asp Cys Asn Val Pro
85                  90                  95
Asp Tyr Leu Met Tyr Ser Thr Val Ser Gly Ser Glu Lys Asn Ser Lys
100                 105                 110
Ile Tyr Cys Pro Thr Ile Asp Leu Tyr Asn Trp Thr Ala Pro Leu Glu
115                 120                 125
Trp Phe Lys Asn Cys Gln Ala Leu Gln Gly Ser Arg Tyr Arg Ala His
130                 135                 140
Lys Ser Phe Leu Val Ile Asp Asn Val Met Thr Glu Asp Ala Gly Asp
145                 150                 155                 160
Tyr Thr Cys Lys Phe Ile His Asn Glu Asn Gly Ala Asn Tyr Ser Val
165                 170                 175
Thr Ala Thr Arg Ser Phe Thr Val Lys Asp Glu Gln Gly Phe Ser Leu
180                 185                 190
Phe Pro Val Ile Gly Ala Pro Ala Gln Asn Glu Ile Lys Glu Val Glu
195                 200                 205
Ile Gly Lys Asn Ala Asn Leu Thr Cys Ser Ala Cys Phe Gly Lys Gly
210                 215                 220
Thr Gln Phe Leu Ala Ala Val Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr Lys Ile
225                 230                 235                 240
Thr Asp Phe Gly Glu Pro Arg Ile Gln Gln Glu Glu Gly Gln Asn Gln
245                 250                 255
Ser Phe Ser Asn Gly Leu Ala Cys Leu Asp Met Val Leu Arg Ile Ala
260                 265                 270
Asp Val Lys Glu Glu Asp Leu Leu Leu Gln Tyr Asp Cys Leu Ala Leu
275                 280                 285
Asn Leu His Gly Leu Arg Arg His Thr Val Arg Leu Ser Arg Lys Asn
290                 295                 300
Pro Ile Asp His His Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
305                 310                 315                 320
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
325                 330                 335
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
340                 345                 350
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
355                 360                 365
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
370                 375                 380
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
385                 390                 395                 400
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
405                 410                 415
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
420                 425                 430
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
435                 440                 445
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
450                 455                 460
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
465                 470                 475                 480
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
485                 490                 495
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
500                 505                 510
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
515                 520                 525
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
530                 535                 540
<210>  6
<211>  537
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Fused Protein
<400>  6
Ser Lys Ser Ser Trp Gly Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile Val Arg Cys
1               5                   10                  15
Pro Gln Arg Gly Arg Ser Thr Tyr Pro Val Glu Trp Tyr Tyr Ser Asp
20                  25                  30
Thr Asn Glu Ser Ile Pro Thr Gln Lys Arg Asn Arg Ile Phe Val Ser
35                  40                  45
Arg Asp Arg Leu Lys Phe Leu Pro Ala Arg Val Glu Asp Ser Gly Ile
50                  55                  60
Tyr Ala Cys Val Ile Arg Ser Pro Asn Leu Asn Lys Thr Gly Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Asn Val Thr Ile His Lys Lys Pro Pro Ser Cys Asn Ile Pro Asp Tyr
85                  90                  95
Leu Met Tyr Ser Thr Val Arg Gly Ser Asp Lys Asn Phe Lys Ile Thr
100                 105                 110
Cys Pro Thr Ile Asp Leu Tyr Asn Trp Thr Ala Pro Val Gln Trp Phe
115                 120                 125
Lys Asn Cys Lys Ala Leu Gln Glu Pro Arg Phe Arg Ala His Arg Ser
130                 135                 140
Tyr Leu Phe Ile Asp Asn Val Thr His Asp Asp Glu Gly Asp Tyr Thr
145                 150                 155                 160
Cys Gln Phe Thr His Ala Glu Asn Gly Thr Asn Tyr Ile Val Thr Ala
165                 170                 175
Thr Arg Ser Phe Thr Val Glu Glu Lys Gly Phe Ser Met Phe Pro Val
180                 185                 190
Ile Thr Asn Pro Pro Tyr Asn His Thr Met Glu Val Glu Ile Gly Lys
195                 200                 205
Pro Ala Ser Ile Ala Cys Ser Ala Cys Phe Gly Lys Gly Ser His Phe
210                 215                 220
Leu Ala Asp Val Leu Trp Gln Ile Asn Lys Thr Val Val Gly Asn Phe
225                 230                 235                 240
Gly Glu Ala Arg Ile Gln Glu Glu Glu Gly Arg Asn Glu Ser Ser Ser
245                 250                 255
Asn Asp Met Asp Cys Leu Thr Ser Val Leu Arg Ile Thr Gly Val Thr
260                 265                 270
Glu Lys Asp Leu Ser Leu Glu Tyr Asp Cys Leu Ala Leu Asn Leu His
275                 280                 285
Gly Met Ile Arg His Thr Ile Arg Leu Arg Arg Lys Gln Pro Ile Asp
290                 295                 300
His Arg Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
305                 310                 315                 320
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
325                 330                 335
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
340                 345                 350
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
355                 360                 365
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
370                 375                 380
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
385                 390                 395                 400
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
405                 410                 415
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
420                 425                 430
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
435                 440                 445
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
450                 455                 460
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
465                 470                 475                 480
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
485                 490                 495
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
500                 505                 510
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
515                 520                 525
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
530                 535
<210>  7
<211>  215
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Light Chain of Antibody
<400>  7
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Val
20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Asp Ser Ser
85                  90                  95
Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100                 105                 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115                 120                 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130                 135                 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165                 170                 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180                 185                 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195                 200                 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210                 215
<210>  8
<211>  446
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Heavy Chain of Antibody
<400>  8
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Arg Tyr Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Ile Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115                 120                 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130                 135                 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145                 150                 155                 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165                 170                 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180                 185                 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195                 200                 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245                 250                 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260                 265                 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275                 280                 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290                 295                 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325                 330                 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340                 345                 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355                 360                 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370                 375                 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405                 410                 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420                 425                 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
<210>  9
<211>  216
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Light Chain of Antibody
<400>  9
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20                  25                  30
Ala Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Ala Ser Asn Met Arg Val Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Gln
85                  90                  95
Lys Ala Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100                 105                 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115                 120                 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145                 150                 155                 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165                 170                 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180                 185                 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195                 200                 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210                 215
<210>  10
<211>  449
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Heavy Chain of Antibody
<400>  10
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Ala Arg Ser Arg Tyr His Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Leu Ala Thr Arg His Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
Lys
<210>  11
<211>  216
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Light Chain of Antibody
<400>  11
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg Asn
20                  25                  30
Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Ala Ser Asn Met Arg Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Trp Ala Trp Asp Asp Ser Gln
85                  90                  95
Lys Val Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100                 105                 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115                 120                 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145                 150                 155                 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165                 170                 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180                 185                 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195                 200                 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210                 215
<210>  12
<211>  449
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Heavy Chain of Antibody
<400>  12
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Ala Arg Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Leu Ala Thr Arg Asn Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
Lys
<210>  13
<211>  216
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Light Chain of Antibody
<400>  13
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg Asn
20                  25                  30
Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Ala Ser Asn Met Arg Arg Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp Asp Asp Ser Gln
85                  90                  95
Lys Val Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100                 105                 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115                 120                 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145                 150                 155                 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165                 170                 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180                 185                 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195                 200                 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210                 215
<210>  14
<211>  449
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Heavy Chain of Antibody
<400>  14
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Ala Gln Ser Ser His Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Leu Ala Thr Arg Gln Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
Lys
<210>  15
<211>  216
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Light Chain of Antibody
<400>  15
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20                  25                  30
Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Ala Ser Asn Met Arg Arg Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Ala Trp Asp Asp Ser Gln
85                  90                  95
Lys Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100                 105                 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115                 120                 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145                 150                 155                 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165                 170                 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180                 185                 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195                 200                 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210                 215
<210>  16
<211>  449
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Heavy Chain of Antibody
<400>  16
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Leu Ala Thr Arg His Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
Lys
<---