Штамм бактерий Lisinibacillus fusiformis ВКМ В-2816D - деструктор нефти и нефтепродуктов
LISINIBACILLUS FUSIFORMIS VKM B-2816D BACTERIA STRAIN - OIL AND PETROLEUM PRODUCT DECOMPOSER

Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый бактериальный штамм бактерий Lisinibacillus fusiformis ВКМ B-2816D, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин).
Штамм может быть использован для очистки объектов окружающей среды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), в широком диапазоне температур от +5 до +37±1°С.
Уровень техники.
Бактерии Lisinibacillus - это грамположительные, спорообразующие бактерии семейства ВасШасеае.
Ранее бактерии этого рода рассматривались, как члены рода Bacillus, но таксономический статус этих микроорганизмов был изменен на род Lisinibacillus в 2007 году.
По сравнению с Bacillus, Lisinibacillus содержит лизин и аспартат в пептидогликане клеточной стенки как диагностические кислоты, в отличие от мезо-диаминопимеликовой кислоты рода Bacillus (1. Tanja В. Antimicribial Activity of Bacillus sp. Batumi Isolates and Their Potential Use in the Biocontrol of Phytopathogenic Bacteria [Text] / B. Tanja, K. Milan, S. Slavi, T. Ljub, D. Giuliano, M. Michael, V. Vitirio, F. Djordje // Journai - 2011).
Известны штаммы: Lysinibacillus xylantlyticus (2. Борисов В.Д., Калёнов С.В. Изучение ассоциированных с микроводорослью Dunaliella salina культур экстремального галофильного сообщества озера Шотт-Эль-Джерид // Успехи в химии и химической технологии. Том XXIX. 2015. №8. - С. 74-76.), обладающий высокой ферментативной активностью, способный потреблять широкий спектр субстратов, в том числе, целлюлозу, в качестве источника углерода; Lysinibacillus sphaericus (3. Saira A. Genetic, physiologicaland biochemical characterization of Bacillus sp.Strain RMB7 exhibiting plant growth promoting and broad spectrum antifungal activities [Text] / A. Saira, H. Sohail, I. Asma, I. Mazhar, L. George // Plant. Microbial Cell Factories - 2014. - V. 144. - N 13), способный продуцировать инсекцидный токсин, что может быть использовано при получении биопрепаратов для борьбы с насекомыми; Lysinibacillus fusiformis (4. Литфулин М.Т., Мочалова Н.К., Марданова A.M. Поиск бактерий с антагонистической активностью // Материалы Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Материалы и технология XXI века», 11-12 декабря 2014 г., Казань. - 42 с), выделенный из почвы, обладающий антагонистической активностью по отношению к отдельным видам бактерий, что делает его перспективным для использования в качестве биопрепарата для подавления роста фитопатогенов.
Однако, у известных видов рода Lysinibacillus не выявлена способность потреблять в качестве источника энергии и питания углеводороды нефти или нефтепродуктов.
Известны штаммы: Pseudomonas putida 36 (5. Авторское свидетельство СССР N1076446, Штамм Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. A1, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20 C02F 3/34, C02F 101:32, C12N 1/20, C12R 1:40. Заявка: 3474745, 22.07.1982. Опубликовано: 28.02.1984. Заявитель: Западно-Сибирский научно-исследовательский геологоразведочный нефтяной институт. Авторы: Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н.); Acinetronacter sp. НВ-1 (6. Патент RU N2077579. Штамм бактерий Acinetobacter species, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1: 01, C12N 1/20, В09С 101:00. Заявка: 94043331/13, 06.12.1994. Опубликовано: 20.04.1997. Заявитель: Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии. Авторы: Жиркова Н.А., Кобелев B.C., Холоденко В.П. Патентообладатель: Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии); Pseudomonas alcaligenes Е7 (7. Патент RU N2134723. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes Е7, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C12R 1:38. Заявка: 98105707/13, 25.03.1998. Опубликовано: 20.08.1999. Заявитель: Государственный научный центр прикладной микробилогии. Авторы: Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А. Патентообладатель: Государственный научный центр прикладной микробилогии).
Недостатком известных штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.
Известен консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов в составе Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ку-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении 3-12 мас. % каждого микроорганизма, при этом совместно с суспензией биопрепарата в загрязненную среду вводят ризоторфин в количестве 30-120 г/м3 (8. Патент RU 2191643. Способ очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. C1, В09С 1/10, C12N 1/20, C12N 1/20, C12R 1:01. Заявка: 2001119562/13, 09.07.2001. Опубликовано: 27.10.2002. Заявитель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ". Авторы: Саксон В.М., Кузнецов С.А., Бойкова И.В., Новикова И.И. Патентообладатель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ").
Недостатком является то, что при приготовлении рабочей суспензии микроорганизмов температура поддерживается на уровне +18+22°С, т.е. микроорганизмы, входящие в состав консорциума, не способны к деградации нефтепродуктов при пониженных положительных температурах (+5°С).
Известен нефтедеструктор, включающий культуру бактерий и микробное удобрение, содержащее нативные микроорганизмы: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliguefaciens, Micrococcus varians (9. Архипченко И.А., Загвоздкин B.K. Очистка нефтезагрязненных почв с помощью препаратов на основе микробных удобрений // Экология и промышленность России. Спецвапуск. 2004. С. 16-18).
Недостатком является то, что нефтедеструктирующая активность клеток микроорганизмов не достаточна для проведения нефтеочистки почвы в районах с коротким тепловым периодом.
Известен штамм бактерий Bacillus subtilis Zb52 (10. Патент KZ №27045. Штамм бактерий Bacillus subtilis Zb52, предназначенный для биоочистки сточных вод. А4, C12N 1/20, C12N 9/56, C12R 1/125. Заявка: 2012/1351.1. Опубликовано: 14.06.2013, бюл. №6. Авторы: Сармурзина З.С.; Ануарбекова С.С; Кулмамбетова Г.Н.; Алмагамбетов К.Х. Патентообладатель: Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения "Республиканская коллекция микроорганизмов" Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан), обладающий эффективностью для очистки сточных вод, активно расщепляющий животные жиры.
Недостатком известного штамма бактерий является не изученность окисляющей активности по отношению к нефти и нефтепродуктам, что не позволяет оценить его деструктирующую способность по отношению к нефтяным углеводородам.
Известен штамм бактерий Bacillus subtilis Колыма 7/2 (11. Патент RU №2446900. Способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis. С2. В09С 1/10 (2006.01). Заявка: 2010129158/13, 13.07.2010. Опубликовано: 10.04.2012. Авторы: Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Неустроев М.М., Сазонов Н.Н., Парникова СИ., Степанова A.M. Патентообладатель: Государственное научное учреждение Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии), обладающий способностью снижать концентрацию нефти в почве до 0,48% в течение 3 месяцев летнего периода.
Однако штамм осуществляет деградацию только нефти и не способен утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), в том числе в условиях широкого диапазона температур от +5 до +37°С.
В качестве прототипа служат штаммы: Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 (12. Патент RU 2482179. Штамм бактерий Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 - деструктор нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/26, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/57. Заявка №2012114907/10 от 04.2012 г. Опубликовано 20.05.2013 г. Бюллетень №14. Автор: Ерофеевская Л.А. Патентообладатель: ИПНГ СО РАН) и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 (13. Патент РФ №2525930. Штамм бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017-деструктор нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/07. Заявка: 2013113813/10, 27.03.2013. Дата подачи заявки: 27.03.2013. Опубликовано: 20.04.14 г. Бюл. №11. Автор: Ерофеевская Л.А. Патентообладатель: ИПНГ СО РАН), обладающие высокой утилизирующей эффективностью по отношению к нефти и нефтепродуктам.
Недостатком известных штаммов является то, что они не могут развиваться и утилизировать нефть и нефтепродукты при температурах +4+5°С, в том числе, не известна их способность утилизировать бензин и керосин авиационный, а также то, что для наращивания биомассы клеток штаммов Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 требуется специальная среда с добавлением перфторуглеродов в виде дефицитного и дорогостоящего препарата «Перфторан», что не экономично и усложняет процедуру накопления клеточной биомассы штаммов, используемых для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов.
Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов, обладающих утилизирующей способностью по отношению, как к нефти, так и нефтепродуктам (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +5 до +37±1°С, которые могут быть использованы для очистки объектов окружающей среды, как от нефти, так и от нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин).
Поставленная задача решена тем, что получен новый бактериальный штамм бактерий Lisinibacillus fusiformis ВКМ B-2816D, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин).
Штамм может быть использован для очистки объектов окружающей среды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), в широком диапазоне температур от +5 до +37±1°С), в относительно короткие сроки (7-60 суток).
Заявляемый штамм бактерий Lisinibacillus fusiformis ВКМ B-2816D (авторский номер LER-9.1), выделен из образцов снежного покрова, загрязненного нефтепродуктами (бензин, дизельное топливо), отобранных с территории автозаправочной станции «АЗС «Паркет», ул. Автострада 50 лет Октября 10/1а, г. Якутск, Республика Саха (Якутия).
Штамм идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) под регистрационным номером Lisinibacillus fusiformis ВКМ B-2816D.
Полученный штамм Lisinibacillus fusiformis ВКМ B-2816D характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки.
Грамположительные спорообразующие палочки.
Культуральные характеристики.
На мясопептонном агаре (МПА) (масс. %: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, рН 7,0-7,2) и ГРМ агаре (на основе гидролизата рыбной муки), масс. %: гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная остальное; рН 7,1-7,5, формирует непрозрачные беловатые, неправильной округлой формы колонии, диаметром до 5 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются.
На среде Сабуро (состав, г/л: пептон - 10,0 мальтоза-40,0; агар - 12,0±2,0; вода очищенная до 1 л), формирует непрозрачные беловатые слизистые колонии.
3
4
2
2
4
2
4
На агаризованной среде Мюнца (14. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки - Микробиология, 1963, №5 - С. 1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, бензин, керосин авиационный) следующего состава: (масс. %) KNO - 0,4; MgSO⋅7HO - 0,08; NaCl - 0,1; КНРО - 0,14; KHPO - 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты - 1,0; вода дистиллированная - остальное, рН - 7,2, растет в виде грязно-белых выпуклых колоний диаметром 1 мм.
В мясо-пептонном бульоне промышленного производства образует равномерную
муть.
Отношение к кислороду: аэробы.
Растет при рН 6,5-8,0.
Растет при температуре от +4 до +37±1°С.
В анаэробных условиях штамм сразу не погибает, но развивается медленнее.
Используемые источники углерода: сорбит.
Проверенные не используемые источники углерода: лактоза, глюкоза, цитрат натрия, малонат натрия.
Другие проверенные тесты: оксидаза-отрицательный, каталаза-положительный, не декарбоксилирует лизин и орнитин, не способен расщеплять фенилаланин, индол-отрицательный, сероводород не продуцирует, активен в отношении инозита, уреаза-отрицательный, тест с β-галактозидазой - отрицательный, в полужидком (1,5%) агаре подвижный.
При секвенировании вариабельных участков 16S rDNA получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:
Результаты определения родовой принадлежности штаммов и процента сходства с ближайшими известными видами, представлены в таблице №1.
Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (проверка проведена на белых мышах).
Штамм не патогенен для растений (проверка на фитотоксичность проведена на семенах овса посевного ( sativa) сорт «Скакун», пшеницы (ТгШсит) сорт «Приленская-19» и клевера лугового (Trifolium pretense).
Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 14 дней) на скошенном МПА или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре +4°С.
Штамм может быть получен в лаборатории №2 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук (ИПНГ СО РАН), по адресу: 677980, Республика Саха (Якутия), г. Якутск, ул. Октябрьская, 1.
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1. Выделение и культивирование штамма Lisinibacillus fusiformis ВКМ В-2816D
Штамм бактерий Lisinibacillus fusiformis ВКМ B-2816D выделен из снежного покрова, загрязненного нефтепродуктами (бензин, дизельное топливо), методом накопительных культур на минеральной среде с нефтью с последующим пересевом на МПА.
Для этого, пробу снежного покрова поместили в стерильную емкость с крышкой для оттаивания до жидкого состояния.
Оттаивание пробы проводили при комнатной температуре.
3
4
2
2
4
2
4
После чего, соблюдая правила асептики, 10 мл оттаявшей пробы, при помощи пипетки Пастера, вносили в колбы емкостью 250 мл, с содержанием 100 мл, заранее подготовленной минеральной среды следующего состава: (масс. %) KNO - 0,4; MgSO⋅7HO - 0,08; NaCl - 0,1; KHPO - 0,14; KHPO - 0,06; вода дистиллированная - остальное, рН 7,2.
3
В качестве источника углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в подготовленную среду в количестве 1000 мг на 1,0 дм среды.
Инкубация проводилась в качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин и температуре +20±1°С.
Рост бактерий наблюдали уже через 7 дней инкубации по образованию мутной эмульсии и дезинтеграции слоя нефти.
Чистая культура бактерий получена путем культивирования при выше перечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с МПА.
Далее посевы инкубировали в стационарных условиях при различных температурах (+4, +20, +30 и +37 (±1)°С).
Через 72 ч при культивировании штамма при температурах от +20 до +37°С и, через 2 недели, при культивировании при температуре +4°С, на поверхности МПА наблюдали появление беловатых (грязно-белых) колоний, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16SpPHK и ключевых фенотипических признаков, согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (15. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact; July 1985, p. 408.), идентифицированы, как штамм Lisinibacillus fusiformis.
Пример 2. Приготовление бактериального препарата на основе клеток штамма Lisinibacillus fusiformis ВКМ B-2816D
9
3
Изолированные колонии, полученные по примеру 1, пересевают на скошенный МПА и инкубируют 48-72 часов при температуре +20±1°С. Клетки смывают 0,9% раствором NaCl и готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята с титром 1×10 микробных клеток/см по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.
3
4
2
2
4
2
4
Для получения препарата готовят жидкую минеральную среду с нефтью (нефтепродуктами) следующего состава (масс. %): KNO - 0,4; MgSO⋅7HO - 0,08; NaCl - 0,1; КНРО - 0,14; КНРО - 0,06; нефть (нефтепродукты) - 1,0; вода дистиллированная - остальное; рН среды - 7,2 и культивируют в колбах в качалочных условиях в течение 48-72 часов, при температуре плюс 20±1°С, при 200 об/мин.
9
3
Получают жидкую мутноватую смесь клеток штамма Lisinibacillus fusiformis ВКМ B-2816D с титром 1-5×10 клеток/см, которую можно использовать в качестве препарата для обработки почвы или воды, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.
Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Lisinibacillus fusiformis ВКМ B-2816D
3
9
3
Клетки штамма Lisinibacillus fusiformis ВКМ B-2816D смывают 0,9% раствором NaCl со скошенного МПА (по примеру 2), готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см, с концентрацией 1×10 микробных клеток/см по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.
3
4
2
2
4
2
4
Полученный бактериальный изолят штамма Lisinibacillus fusiformis ВКМ B-2816D культивируют в водной среде с минеральным составом (масс. %): KNO - 0,4; MgSO⋅7HO - 0,08; NaCl - 0,1; KHPO - 0,14; KHPO - 0,06; вода дистиллированная - остальное; рН среды - 7,2.
3
3
В колбочки объемом 200,0 см вносят по 100,0 см готовой минеральной среды и 1000 мг нефти (нефтепродуктов).
9
3
Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1×10 клеток/см.
В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь.
Колбы культивируют при температурах +5±1°С, в течение 20 суток; и, при +20°С; +30°С; +37±1°С в течение 7 суток.
Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-0,25» (16. ФР.1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117. Методка выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-0,25»).
Данные эксперимента показывают, что в водной среде с минеральными компонентами предлагаемый штамм Lisinibacillus fusiformis ВКМ B-2816D утилизирует от 55,72 до 57,78% - при температуре +20°С; от 65,96 до 68,76% - при температуре +30°С; от 53,78 до 57,76% - при температуре +37°С; при температуре +5°С от 14,48 до 17,80% - нефти и нефтепродуктов (таблица 2).
Пример 4. Очистка воды от нефти с помощью клеток штамма Lisinibacillus fusiformis ВКМ B-2816D
3
3
В эксикатор объемом 5,0 дм вносят 3,0 дм водопроводной воды, отстоявшейся в течение суток при комнатной температуре.
3
9
3
В воду добавляют 30000 мг сырой нефти (нефтепродукта) и 30,0 см бактериального изолята штамма Lisinibacillus fusiformis ВКМ B-2816D, приготовленного по примеру 2, содержащего 1,0-10 клеток/см суспензии.
3
В качестве контроля используют воду в количестве 3,0 дм с добавлением 30000 мг нефти (нефтепродукта) и без внесения микробной суспензии бактериального изолята.
Эксперимент проводят в течение 60 суток, поддерживая температуру воды в интервале +15+20°С.
Полученные результаты (таблица 3) показали, что в воде, деструкция нефти под влиянием штамма Lisinibacillus fusiformis ВКМ B-2816D за 60 суток составила 67,93% для нефти и 69,33% для дизельного топлива.
Деструкция нефти (НП) в контрольной емкости существенно не изменилась (таблица 3).
Таким образом, показана способность штамма Lisinibacillus fusiformis ВКМ В-2816D к деструкции нефти и нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, керосин авиационный, бензин), в относительно короткие сроки (от 7 до 60 суток), в широком диапазоне температур от +5 до +37±1°С, что позволяет использовать заявляемый штамм для очистки объектов окружающей среды от нефтезагрязнений.