Влияние минерального состава питательных сред на адвентивный морфогенез из каллусов ягодных культур in vitro

УДК 339.54.012+338.001.36

DOI: 10.24411/2587-6740-2019-11012

ВЛИЯНИЕ МИНЕРАЛЬНОГО СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД НА АДВЕНТИВНЫЙ МОРФОГЕНЕЗ ИЗ КАЛЛУСОВ ЯГОДНЫХ КУЛЬТУР IN VITRO

H.В. Соловых

ФГБНУ «Федеральный научный центр имени И.В. Мичурина», г. Мичуринск, Россия

Изучено влияние концентрации азотсодержащих соединений и хелата железа в питательных средах на морфогенез из каллусов красной малины и ежевики на среде MS, содержащей 2 мг/л 6-БАП, 0,5 мг/л ИУК и 0,5 мг/л ГК. Уменьшение вдвое содержания нитратного азота (вариант 2) увеличивает частоту морфогенеза у обоих видов по сравнению с данным показателем на стандартной среде MS (вариант 1). Пересадка эксплантов через 10 дней культивирования с обедненной нитратным азотом среды (вариант 2) на полную среду увеличивала у красной малины частоту морфогенеза на 54,6% и среднее число авентивных побегов на 155%. Увеличение вдвое содержания в питательной среде MS хелата железа дает статистически несущественную тенденцию к увеличению частоты регенерации у обоих видов, но позволяет повысить среднее число побегов на один эксплант в

I,4 раза у красной малины и в 2,63 раза у ежевики. Развитие работ по генетической трансформации, тканевой селекции, андро- или гиногенезу в значительной степени зависит от надежности методов регенерации растений из изолированных тканей. Несмотря на большое количество исследований в области индукции морфогенеза, в настоящее время нет теории, обобщающей многочисленные экспериментальные данные, полученные для разных видов растений. Разработка протоколов регенерации для конкретных видов и сортов все еще носит эмпирический характер. В статье определяются возможности формирования целостной картины восприятия идентичности применяемого оборудования и методик. Сформированы практические рекомендации производству.

Ключевые слова: красная малина, ежевика, биотехнология, морфогенез, in vitro, питательные среды.

В области индукции морфогенеза растений рода Rubus in vitro достигнуты определенные успехи [1-6]. Однако все исследователи отмечают трудности регенерации из каллусов, прошедших длительное культивирование на искусственных питательных средах. Даже применение методов, дающих надежную регенерацию из листовых дисков, часто оказывается безуспешным в отношении длительно культивируемых на искусственных средах тканей.

Частота регенерации зависит от генотипа растений, выбора экспланта, минерального, гормонального и углеводного состава среды, а также от условий культивирования. Как правило, для индукции морфогенеза в изолированных тканях растений рода Rubus используют среду по прописи MS [7]. В качестве углевода выбирают сахарозу или глюкозу в концентрации 20-30 мг/л [6].

Ранее было установлено, что на начальных этапах морфогенеза растительным тканям необходимо снижение содержания в среде нитратного азота по отношению к аммонийному [6, 8]. Для растений рода Rubus часто используют более бедные как аммонийным, так и нитратным азотом среды Андерсона [9] или QL

[10] в модификации A. Standardi и F. Catalano

[11]. Для растений рода Rubus их использование положительно влияет на частоту морфогенеза [6]. Но поскольку перечисленные среды различаются не только по содержанию азота, но и по содержанию дигидрофосфата калия, иодида калия, сульфата магния и хелата железа, трудно определить действующий на морфогенез компонент. К тому же для роста и развития адвентивных побегов после инициирования их образования необходимо высокое содержание нитратного азота.

Целью проведенных исследований было изучение влияния соотношения азотсодержащих компонентов питательных сред, а также содержания солей железа на морфогенез из изолированных тканей растений рода Rubus.

Материалы и методика исследований

В процессе исследований были использованы каллусы, полученные из листовых эксплан-тов растений ежевики сорта Честер торнлесс и малины красной сорта Вольница, культивируемых in vitro. Культивирование растений, инициирование и культивирование каллусов проводили по методикам, разработанным во ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина [12, 13].

Сравнивали интенсивность морфогенети-ческих процессов в прошедших трехмесячное культивирование in vitro каллусах малины и ежевики на питательной среде с различным соотношением аммонийного и нитратного азота. В качестве базовой использовали среду по прописи MS. Стандартная среда MS содержит 2,06-10"2 М нитрата аммония и 1,88-10"2 М нитрата калия. Соотношение NO3- : NH4+ составляет приблизительно 2:1.

Использовали три варианта опыта:

• Вариант 1 — стандартная среда MS (контроль).

• Вариант 2 — среда MS с уменьшенным в 2 раза количеством нитратного азота (исключен нитрат калия). Соотношение NO3- : NH + составляет 1:1.

4

• Вариант 3 — обедненная нитратным азотом среда MS (соотношение NO3- : NH4+ составляет 1:1), через 10 дней культивирования пересадка на MS с полным содержанием KNO3 (соотношение NO3- : NH4+ составляет 2:1).

INTERNATIONAL AGRICULTURAL JOURNAL № 1 (367) / 2019

С целью изучения влияния содержания хелата железа в питательной среде на морфогенез культивирование каллусов проводили на стандартной среде MS, содержащей 1  10-4 М хелата железа, и на среде MS с удвоенной концентрацией данного вещества (2-10-4 М).

Гормональный состав сред во всех вариантах был идентичен: 0,5 г/л гибберелловой кислоты (ГК), 2 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП) и 0,5 мг/л, 13-инолил-3-уксусной кислоты (ИУК). В качестве источника углевода была использована сахароза в концентрации 20 г/л для малины красной и 30 г/л для ежевики (оптимальные концентрации для этих видов установлены ранее опытным путем [6]).

Экспланты содержали в темноте (термостате) при температуре 25±2оС и влажности 70%. Через 30 суток после высадки проведен учет числа каллусов, образовавших адвентивные побеги и число образовавшихся побегов. Математическая обработка экспериментальных данных проведена с помощью статистического пакета программы Microsoft excel.

Варианты питательных сред, на которых была зафиксирована наиболее высокая частота регенерации, использовали для получения адвентивных побегов из каллусов, прошедших культивирование in vitro продолжительностью 10 месяцев в процессе тканевой селекции на толерантность к пестицидам.

Результаты исследований и

обсуждение

Установлено, что снижение в питательной среде количества нитратного азота (вариант 2) приводит к увеличению частоты морфогенеза у обоих видов по сравнению с контролем (вариант 1). У ежевики рост данного показателя составил 28,5%, а у малины красной — 22,2%.

www.mshj.ru

НАУЧНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ И УПРАВЛЕНИЕ АГРОПРОМЫШЛЕННЫМ КОМПЛЕКСОМ

Ш

Рис. 1. Частота морфогенеза представителей рода ИиЬиз на средах:

1 — стандартная среда МВ. Соотношение N03 : ЫИ+ составляет 2:1;

2 — среда МВ с без нитрата калия. Соотношение N03 : N4+ составляет 1:1;

3 — обедненная азотом среда МВ (соотношение N03 : N4+ составляет 1:1.), через 10 дней пересев на полную среду МВ (соотношение N0': N4 * составляет 2:1).

Рис. 2. Среднее число побегов на один эксплант представителей рода Rubus на средах:

1 — стандартная среда МВ. Соотношение N03 : N4+ составляет 2:1;

2 — среда МВ с без нитрата калия. Соотношение N03 : N4+ составляет 1:1;

3 — обедненная азотом среда МВ (соотношение N03 : N4+ составляет 1:1), через 10 дней пересев на полную среду МВ (соотношение N03: N4+ составляет 2:1).

Последующая пересадка на богатую нитратным азотом среду (вариант 3) не дала статистически существенного положительного эффекта при регенерации ежевики, но у малины красной привела к увеличению частоты морфогенеза на 54,6% по сравнению с вариантом 2 (рис. 1).

Снижение содержания нитратного азота в питательной среде дает статистически несущественную тенденцию к увеличению среднего числа адвентивных побегов на один эксплант у малины красной, у ежевики рост данного показателя по сравнению с контролем составил 91,0% (рис. 2).

В варианте 3 пересадка через 10 дней культивирования на обедненной азотом среде на среду с большим количеством нитратного азота увеличила среднее число побегов на эксплант у малины красной на 155,0%, у ежевики по этому показателю положительного влияния обогащенной среды зафиксировать не удалось. Однако среднее число побегов на эксплант в варианте 3 у ежевики существенно превосходило контрольное (рис. 2).

Изучение влияния содержания хелата железа в питательной среде на морфогенез представителей рода ИиЬм показало, что увеличение концентрации данного вещества вдвое дает незначительную тенденцию (Р<0,20) к возрастанию частоты морфогенеза как у ежевики, так и у малины красной (рис. 3).

Однако у обоих видов достоверно увеличилось среднее число побегов на один эксплант (рис. 4), и при перенесении культуральных сосудов в условия интенсивного освещения (2500 Лк) в листьях быстро развивалась зеленая окраска.

Заключение

Для индукции адвентивного морфогенеза у малины красной и ежевики успешно может быть использована стандартная среда MS, содержащая 20-30 г сахарозы или глюкозы, 2 мг/л 6-БАП, 0,5 мг/л ИУК и 0,5 мг/л ГК.

Уменьшение вдвое содержания нитратного азота на первых этапах культивирования позволяет увеличить частоту морфогенеза у обоих видов.

Рис. 3. Частота регенерации адвентивных побегов

из каллусов ежевики и малины красной на средах с различным содержанием хелата железа

Рис. 4. Среднее число побегов на один эксплант ежевики и малины красной in vitro на средах с различным содержанием хелата железа

МЕЖДУНАРОДНЫЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЙ ЖУРНАЛ № 1 (367) / 2019

Пересадка эксплантов с обедненной азотом среды через 10 дней культивирования на богатую ионом 1\Ю3- среду увеличивает среднее число адвентивных побегов у обоих видов и частоту морфогенеза у малины красной, но не влияет на частоту морфогенеза у ежевики.

Увеличение вдвое содержания в питательной среде хелата железа дает статистически несущественную тенденцию к увеличению частоты регенерации у обоих видов, но позволяет повысить среднее число побегов на один эксплант в 1,4 раза у малины красной и в 2,63 раза у ежевики.

Литература

1. Высоцкий В.А., Хамукова Ф.М. Возможности регенерации растений земляники и малины из каллусов различного происхождения // Ягодоводство в

Нечерноземье: сборник научных трудов ВСТИСП. М., 1993. С. 19-24.

2. Хамукова Ф.Н. Регенерация растений земляники и малины из эксплантов различного происхождения: автореф. дис. ... канд. с.-х. наук: 06.01.07. М., 1996.

3. Расторгуев С.Л. Регенерация растений из изолированных соматических тканей земляники и малины // Индукция морфогенеза и тканевая селекция плодовых и ягодных культур: методические рекомендации. Мичуринск, 1996. С. 40-61.

4. Расторгуев С.Л. Индукция морфогенеза в культуре каллусной ткани малины // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2006. № 6. С. 41-43.

5. Расторгуев С.Л. Культура изолированных тканей и органов в селекции плодовых растений / Мичуринск-наукоград РФ; Изд-во Мичуринского государственного аграрного университета, 2009. 171 с.

6. Муратова С.А.. Соловых Н.В., Терехова В.И. Индукция морфогенеза из изолированных соматических тканей растений: монография. Мичуринск: Изд-во ФГБОУ ВПО МичГАУ, 2011. 107 с.

7. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962. Vol. 15. No. 13. Pp. 473-497.

8. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе: учебное пособие. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. 160 с.

9. Anderson W.C. Tissue culture propagation of red and black raspberries, Rubus idaeus and Rubus occidentalis. Acta Horticulturae. 1980. No. 112. Pp. 13- 20.

10. Quoirin M., Lepoivre P. Improved medium for in vitro culture of Prunus sp. Acta Hortic. 1977. Vol. 78. Pp.437-442.

11. Standardi A., Catalano F. Tissue culture propagation of kiwifruit. Comb. proc. Intern. plant propagators' soc. 1984. Vol. 34. Pp. 236-243.

12. Индукция морфогенеза и тканевая селекция плодовых и ягодных культур: методические рекомендации / под. ред. В.М. Тюленева. Мичуринск, 1996. 76 с.

13. Соловых Н.В. Использование биотехнологических методов в работе с ягодными культурами / Мичуринск-наукоград РФ; Издательско-полиграфический центр ФГОУ ВПО МичГАУ, 2009. 47с.

Об авторе:

Соловых Наталья Владимировна, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, natalyasolovykh@yandex.ru

INFLUENCE OF THE MINERAL COMPOSITION OF NUTRITIONAL MEDIA ON ADVENTITIOUS MORPHOGENESIS OF CALLI BERRY CULTURES IN VITRO

N.V. Solovykh

Federal scientific center named after I.V. Michurin, Michurinsk, Russia

The effect of the concentration of nitrogen-containing compounds and Iron chelate In nutrient media on the morphogenesis of red raspberry and blackberry calluses on MS medium containing 2 mg/l 6-BAP, 0.5 mg/l IAA and 0.5 mg/l ha has been studied. Halving the content of nitrate nitrogen (option 2) increases the frequency of morphogenesis in both species compared to this indicator on a standard MS medium (option 1). Explant transplantation after 10 days of cultivation with a medium depleted in nitrate nitrogen (variant 2) increased the rate of morphogenesis in red raspberries by 54.6% and the average number of adventitious shoots by 155% in red raspberries. A twofold increase in the content of MS chelate iron in the nutrient medium gives a statistically insignificant tendency to an increase in the frequency of regeneration in both species, but it can increase the average number of shoots per explant 1.4 times in red raspberries and 2.63 times in blackberries. The development of works on genetic transformation, tissue selection, androgenogenesis largely depends on the reliability of the methods of regeneration of plants from isolated tissues. Despite the large amount of research in the field of morphogenesis induction, there is currently no theory summarizing the numerous experimental data obtained for different plant species. The development of regeneration protocols for specific species and varieties is still empirical. The article identifies the possibility of forming a holistic picture of the perception of the identity of the equipment and techniques used. Formed practical recommendations for production. Keywords: red raspberry, blackberry, biotechnology, morphogenesis, in vitro, nutrition media.

References

1. Vysotskij V.A., Khamukova F.M. Possibilities of regeneration of strawberry and raspberry plants from calluses of various origin. Berry production in the Non-Black Earth Region: collection of scientific papers VSTISP. Moscow, 1993. Pp. 19-24.

2. Khamukova F.N. Plant regeneration of strawberries and raspberries from explants of different origin. Extended abstract of candidate's thesis: 06.01.07. Moscow, 1996.

3. Rastorguev S.L. Plant regeneration from isolated somatic tissues of strawberries and raspberries. Induction of morphogenesis and tissue selection of fruit and berry crops: guidelines. Michurinsk, 1996. Pp. 40-61.

4. Rastorguev S.L. Induction of morphogenesis in the culture of raspberry callus tissue. Vestnik Rossijskoj akademii selskokhozyajstvennykh nauk = Bulletin of the

About the author:

Natalya V. Solovykh, candidate of biological sciences,

Russian academy of agricultural sciences. 2006. No. 6. Pp.41-43.

5. Rastorguev S.L. Culture of isolated tissues and organs in the selection of fruit plants. Michurinsk-nauk-ograd of the Russian Federation; Ed. Michurinsk state agrarian university, 2009. 171 p.

6. Muratova S.A., Solovykh N.V., Terekhova V.I. Induction of morphogenesis from isolated somatic plant tissues: monograph. Michurinsk: publishing house of MGGAU, 2011. 107 p.

7. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962. Vol. 15. No. 13. Pp. 473-497.

8. Butenko R.G. Biology of higher plant cells in vitro and biotechnology based on them: tutorial. Moscow: FBK-PRESS, 1999. 160 p.

leading researcher, natalyasolovykh@yandex.ru

9. Anderson W.C. Tissue culture propagation of red and black raspberries, Rubus idaeus and Rubus occidentalis. Acta Horticulturae. 1980. No. 112. Pp. 13- 20.

10. Quoirin M., Lepoivre P. Improved medium for in vitro culture of Prunus sp. Acta Hortic. 1977. Vol. 78. Pp. 437-442.

11. Standardi A., Catalano F. Tissue culture propagation of kiwifruit. Comb. proc. Intern. plant propagators' soc. 1984. Vol. 34. Pp. 236-243.

12. Induction of morphogenesis and tissue selection of fruit and berry crops: guidelines. Under ed. V.M. Tyule-nev. Michurinsk, 1996. 76 p.

13. Solovykh N.V. The use of biotechnological methods in working with berry crops. Michurinsk-naukograd of the Russian Federation; Publishing and printing center FGOU VPO MichAU, 2009. 47 p.

natalyasolovykh@yandex.ru

INTERNATIONAL AGRICULTURAL JOURNAL № 1 (3б7) / 2019

www.mshj.ru