СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО КОМПЛЕКСА И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ БЕЛКОВО-ПОЛИПЕПТИДНЫЙ КОМПЛЕКС
METHOD FOR PREPARING BIOLOGICALLY ACTIVE COMPLEX AND BIOLOGICALLY ACTIVE PROTEIN-POLYPEPTIDE COMPLEX

Изобретение относится к способу получения биологически активного комплекса и биологически активному белково-полипептидному комплексу. Данный комплекс представляет собой биологически активную субстанцию, получаемую из эмбриональной ткани мозга копытных сельскохозяйственных животных для фармацевтического производства препаратов, стимулирующих физиологическую и репаративную регенерацию нервной ткани, для применения в производстве лекарственных препаратов при заболеваниях центральной и периферической нервной системы и способу ее получения.
В настоящее время, на фоне неуклонного роста заболеваний нервной системы сосудистого, токсического, инфекционного и аутоиммунного генеза, не существует препаратов группы прямых репарантов, специфичных для нервной ткани. Целью данного изобретения явилось создание биологически активной субстанции, обладающей тканеспецифическим репаративнорегенеративным действием на нервную ткань, путем выделения белково-полипептидного комплекса из мозга эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных.
Субстанция представляет собой биологически активный белково-полипептидный комплекс с молекулярной массой входящих в него белково-полипептидных компонентов в пределах от 5 до 200 кДа и содержанием среднемолекулярной фракции в пределах от 10 до 120 кДа не менее 80%, с общей концентрацией белка 0,8-4,2 мг/мл. Субстанция получена путем ионообменной хроматографии фильтрата гомогената ткани, в присутствии буферного раствора, детергентов, ингибиторов протеолиза и солюбилизаторов из мозга эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети до середины последней трети беременности.
Биологическая и фармакологическая активность заявляемого белково-пептидного комплекса осуществляется за счет наличия эффективных концентрационных соотношений водорастворимых отрицательно заряженных слабо кислых, нейтральных белков и полипептидов, относящихся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, обеспечивая тем самым тканеспецифическое репаративно-регенеративное действие.
Известен целый ряд препаратов белково-пептидной природы из сырья животного происхождения, обладающих ноотропной и нейрометаболической активностью, которые используются для лечения заболеваний нервной системы. К этим препаратам относятся:
1. Церебролизин - средство для лечения геморрагического или ишемического инсультов, фирмы «Ebewe» (Австрия) [1], который является продуктом обработки мозга интактных свиней.
2. Цереброкурин - лечебное средство при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функций центральной нервной системы, фирмы ООО «НИР» (Украина) [2], который является продуктом обработки мозга эмбрионов животных.
3. Кортексин - препарат полипептидной природы, получаемый путем экстракции из коры головного мозга крупного рогатого скота и свиней, фирмы ООО «Герофарм» (Россия) [3], обладающий ноотропным, церебропротекторным, противосудорожным и антиоксидантным действием.
4. Церебролизат - препарат, повышающий устойчивость ткани головного мозга к интоксикации, гипоксии, гипогликемии, механической травме, фирмы «Микроген» НПО ФГУП (Иммунопрепараг) [4], обладающий ноотропным действием, представляющий собой гидролизат коры головного мозга крупного рогатого скота.
В состав "Церебролизина" входят аминокислоты (-85%), низкомолекулярные пептиды (-15%), микроэлементы, сырьем для получения которых служит мозг свиней. Нейропротективное и трофическое действие препарата осуществляется за счет специфических пептидов и аминокислот, молекулярной массы не выше 10000 Дальтон, из которых доминирующими и определяющими свойствами препарата являются аланин, лейцин и лизин. Препарат предназначен для внутримышечного, внутривенного введения и обладает невысокой концентрацией биологически активных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время. Недостатками известного препарата являются значительная продолжительность курса лечения, низкая активность и специфичность препарата в связи со слабым нейропротективным действием, обладая и крайне низким регенеративным, в том числе и репаративным потенциалом для нервной ткани.
В состав «Цереброкурина» входят водорастворимые пренатальные нейропептиды и продукты расщепления неактивных высокомолекулярных предшественников из гомогенизата мозга эмбрионов животных, который после разбавления физиологическим раствором подвергают взаимодействию с иммобилизованным протеолитическим ферментом, причем режим взаимодействия устанавливают исходя из контрольной пробы получаемого средства и полученный раствор выдерживают в течение 30 суток при температуре не выше 10°С. С помощью данной технологии достигается более высокая (по сравнению с Церебролизином) активность получаемого средства и значительно расширяется спектр его действия за счет более высокой массы содержащихся пептидов и низкомолекулярных белков, оставшихся после протеолиза. Однако несмотря на длительное формирование раствора до окончания процессов агрегации и протеолиза, данная технология не позволяет получить фракцию необходимой степени очистки для применении препарата внутривенно, что значительно затрудняет его биодоступность. Водная экстракция без буферизации раствора, детергентов, ингибиторов протеолиза и солюбилизаторов на этапах получения Цереброкурина, а также неопределенные сроки гестации эмбрионального мозга животных не позволяют обеспечить необходимую степень стандартизации, что допускает значительный разброс по составу полученных эволюционно закрепленных белково-пептидных концентрационных соотношений, снижая его тканеспецифическую нейрорегенеративную активность и стабильность фармакологического действия, ограничиваясь биологическим действием по типу обратной связи за счет сигнальной функции продуктов протеолиза ткани.
В состав «Кортексина» входит комплекс водорастворимых биологически активных щелочных, кислых и нейтральных полипептидов с мол. м. от 500 до 15000 Да и изоэлектрической точкой 3,5-9,5, получаемых из измельченной замороженной ткани головного мозга скота, путем экстракции раствором уксусной кислоты, содержащей хлористый цинк, отделения осадка, обработки надосадочной жидкости ацетоном, промывки образовавшегося осадка ацетоном, высушивании с последующей очисткой, стерилизации и лиофилизации целевого продукта.
Препарат предназначен для внутримышечного введения и обладает невысокой концентрацией биологически активных низкомолекулярных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время. Несмотря на то, что препарат участвует в регуляции соотношений тормозных и возбуждающих аминокислот, концентрации серотонина и дофамина, оказывая ГАМК-позитивное влияние, снижает токсические эффекты нейротропных веществ, улучшает процессы обучения и памяти, ускоряет восстановление функций головного мозга после стрессорных воздействий. Кортексин имеет не высокую активность и специфичность в связи со слабым нейропротективным действием, обладая и низким регенеративным, в том числе незначительным репаративным потенциалом для нервной ткани, что требует значительной продолжительности курсового лечения.
В состав «Церебролизата» также входят водорастворимые полипептиды, как результат гидролиза коры головного мозга крупного рогатого скота, обладающие слабой ферментативной активностью, с молекулярной массой не более 15000 Да. Обозначенная в патенте вариация аминокислотного состава препарата допускает значительный разброс по составу полученных пептидных концентрационных соотношений, определяя низкую тканеспецифическую активность и стабильность фармакологического действия - со слабым нейрометаболическим и невыраженным ноотропным эффектом.
Задачей настоящего изобретения является создание биологически активной субстанции с расширенными свойствами и высокой биологической активностью, обладающей тканеспецифическим репаративно-регенеративным действием на нервную ткань, и разработка способа ее получения путем выделения биологически активного белково-полипептидного комплекса из мозга эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных, которая решается за счет выбранной совокупности действий и режимов. Особенно важным оказалось определение оптимальных сроков гестации эмбрионального мозга, а также подбора реагентов, их доз, режимов экстракции, буферизации и регуляции протеолитической активности для сохранения эффективных концентрационных соотношений белков и полипептидов, закрепленных эволюционно и определяющих биологическую активность субстанции, обеспечивая репаративно-регенеративное тканеспецифическое действие.
Поставленная задача достигается соблюдением всех параметров заготовки и характеристик сырья, а также заявленного способа получения субстанции из эмбрионального мозга копытных сельскохозяйственных животных на определенных сроках гестации, биологическая активность которой доказана экспериментально.
Предлагаемый способ получения биологически активного белково-полипептидного комплекса заключается том, что быстрозамороженный мозг эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных, сроком гестации от середины первой трети до середины последней трети беременности, размораживают и поэтапно при режимах температур от 2° до 28°С:
- гомогенизируют в буферном растворе, с одновременной экстракцией в присутствии обратимых ингибиторов протеолиза и неионных детергентов при рН не менее 5,2 и не выше 8,5, в объемных соотношениях раствора и ткани не менее 1:0,5;
- отделяют гомогенат от нерастворившихся тканевых и клеточных компонентов центрифугированием при значении g в интервале 10000-30000 в течение 90-30 мин, соответственно;
- фильтруют супернатант поэтапно, заканчивая фильтрами с величиной пор не более 0,45 мкм;
- фильтрат подвергают анионообменной хроматографии, используя в качестве подвижной фазы солевой буферный раствор, разделяя связавшиеся с сорбентом белки и полипептиды ступенчатым градиентом с помощью элюента, имеющего ионную силу в интервале от 0,08 до 0,26 моль/л и рН от 5,2 до 8,5, повышая ионную силу подвижной фазы с шагом 0,02 моль/л, начиная собор целевых фракций с раствором, ионная сила которого не ниже 0,1;
- собранные целевые фракции обессоливают методом диализа или гель-фильтрации и после добавления консервантов с бактериостатическим и фунгицидным действием в общей концентрации не более 0,06 мг/мл и солюбилизатора в общей концентрации не более 0,01 мг/мл проводят ультрафильтрацию с величиной пор не более 0,22 мкм и стерильно упаковывают.
Другим изобретением заявленной группы является сам биологически активный белково-полипептидный комплекс, полученный вышеуказанным способом, обладающий тканеспецифическпм репаративным действием на нервную ткань и включающий отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющие его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем не менее 80% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, и характеризующийся наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений р1 от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле.
При выделения целевого продукта важно, чтобы на стадиях гомогенизации и анионообменной хроматографии рН буферных сред находился в диапазоне 5,2-8,5; обязательное присутствие в буферном растворе, на стадии гомогенизации и экстракции детергентов и ингибиторов протеолиза в достаточных концентрациях; на стадии анионообменной хроматографии использовались в качестве подвижной фазы растворы, имеющие ионную силу в интервале от 0,08 до 0,26 моль/л, с шагом 0,02 моль/л, рН от 5,2 до 8,5 и сбор целевых фракций начинался с элюента, ионная сила которого не ниже 0,1; в полученных целевых фракциях содержатся белки и полипептиды с молекулярными массами от 5 кДа до 200 кДа, причем содержание в комплексе белков и полипептидов с молекулярными массами от 10 кДа до 120 кДа было не менее 80% от общего содержания белка; полученный комплекс характеризуется наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений р1 от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле, а также наличием протеолитической активности входящих в него протеолитических белков; в качестве сырья использовался быстрозамороженный эмбриональный мозг копытных сельскохозяйственных животных со сроком гестации от конца первой трети до середины последней трети беременности. При других параметрах белково-полипептидный состав комплекса и концентрационные соотношения входящих биологически активных компонентов будут иными.
Выделяемая биологически активная субстанция, представляющая собой белково-полипептидный комплекс, отличается от полученных ранее субстанций, выделенных из головного мозга животных, по источнику сырья, взятого на определенных сроках гестации, молекулярным массам входящих в него белково-полипептидных фракций, их качественному составу, по эволюционно закрепленным в онтогенезе концентрационным соотношениям белков роста, факторов дифференцировки и сигнальных молекул, по биологической и фармакологической активности, по специфичности этой активности. Выделенный методом анионообменной хроматограии, позволяющей получать целевые фракции водорастворимых белков и полипептидов, уровень заряда которых зависит от ионной силы элюента, белково-пептидный комплекс состоит из слабокислых и нейтральных протеиновых и полипептидных компонентов за счет эмпирически подобранных условий, описанных выше. Одной из отличительной особенностью в получаемом комплексе является наличие достаточно больших молекул протеинов (до 200 кДа) с отсутствием аллергезирующих и иммунотоксических свойств, что в первую очередь связано с характеристиками органоспецифического сырья (быстрозамороженный эмбриональный мозг на определенных стадиях гестации органа). Именно характеристики сырья, из которого выделяется заявляемый белково-полипептидный комплекс, обуславливают не только наличие необходимых для получения всего спектра биологической активности составляющих - факторов роста, дифференцировки тканей и клеток, сигнальных молекул, но и их концентрационные соотношения. Причем несмотря на то что на разных стадиях гестации в определенной мере меняется качественный белково-полипептидный состав эмбрионального мозга, как сырья для выделения, при заявленном способе получения целевые компоненты, оставаясь в эволюционно закрепленных концентрационных соотношениях, обеспечивают необходимую биологически активную активность субстанции. Изменение характеристик сырья и параметров получения заявляемого белково-пептидного комплекса не только значительно снижает его биологическую активность, но и может проявится в нежелательных явлениях, таких как канцерогенность, аллергенность, иммунотоксичность и др. Лиофильное высушивание заявляемой биологически активной субстанции также значительно (до 70%) снижает его биологическую, ткане- и органоспецифическую активность.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Способ получения биологически активного комплекса.
2
Получение белковой фракции из эмбрионального мозга овец. 200 г быстрозамороженного головного мозга эмбрионов ягнят сроком гестации 16-18 недель размораживают и гомогенизируют в 1000 мл 0,05 М ТРИС-глициново-фосфатного буфера, рН 8,0, содержащего 1 мМ этилендиамино-тетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 0,1% маннит, в течение 5 минут при 4°С. Гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 20 000 g в течение 60 минут и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 4°С. Фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами 0,05 М глициново-фосфатного буфера, рН 8,0, содержащего 0,1 мМ ЭДТА, хроматографическую колонку объемом 200 мл с анионообменным носителем Toyopearl DEAE-650M. Разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом 0,05 М глициново-фосфатного буфеpa pH 8,0, содержащего 0,04 М КСl, повышая концентрацию соли с шагом 0,02 М, начиная сбор целевых фракций с концентрации соли 0,06 М. Хроматографический процесс производят при температуре 2-4°С. Целевую фракцию поэтапно подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см через материалы с задерживающей способностью 5 кДа и 200 кДа, обессоливают, разводят 0,05 М раствором глицин-NaOH, pH 7,4, до концентрации белка 1,2 мг/мл, добавляя моноолеат полиоксиэтиленсорбита (Твин-80) до его общей концентрации 0,01 мг/мл. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм. Для характеристики полученной белково-полипептидной фракции использовали методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 280±5 нм. Молекулярную массу белков и полипептидов, входящих в комплекс, определяют следующими методами: - гель-хроматографии на Superdex 75 («GE Healthcare») и методом денатурирующего «SDS-Page» электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков. Для калибровки колонки используют белковые стандарты с диапазоном молекулярных масс от 13 кДа до 250 кДа. Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят белки и полипептиды с молекулярной массой от 5 кДа до 200 кДа, из которых 82% имеют молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа. Аминокислотный анализ (%): Asp - 10,82+2,5; Thr - 5,4+1,2; Ser - 5,2+1,3; Glu - 16,2+3,1; Pro - 7,045+2,4; Gly - 5,2+2,2; Ala - 5,4+1,2; Val - 7,08+2,7; Met - 2,65+1,3; He - 4,45+1,5; Leu - 9,4+2,2; Туr - 4,02+1,1; Phe - 4,8+1,3; Orn - 0,48+0,1; Lys - 8,48+2,1; His - 2,8+0,8; Arg - 6,52+2,1.
Пример 2. Способ получения биологически активного комплекса.
Получение белковой фракции из эмбрионального мозга поросят. 200 г быстрозамороженного головного мозга эмбрионов поросят сроком гестации от 20 до 22-х недель размораживают и гомогенизируют в 800 мл 50 мМ Трис-малеатного буферного раствора, рН 5,8, содержащего 1 мМ (ЭДТА) и 0,1% мальтозу, в течение 5 минут при 25°С. Гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 30000 g в течение 30 минут и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 25°С. Фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами малеатного буферного раствора рН 5,8, содержащего 0,1 мМ ЭДТА, хроматографическую колонку объемом 250 мл с анионообменным носителем DEAE-Сефароза. Разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом малеатного буферного раствора рН 5,8, содержащего 0,04 М NaCl, повышая концентрацию соли с шагом 0,02 М, начиная сбор целевых фракций с концентрации соли 0,06 М. Хроматографический процесс производят при температуре 2-4°С. Целевую фракцию поэтапно подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см через материалы с задерживающей способностью 5 кДа и 250 кДа, обессоливают, разводят 50 мМ раствором аспартата-NaOH, рН 7,4, до концентрации белка 1,0 мг/мл, добавляя моноолеат полиоксиэтиленсорбита (Твин-80) до его общей концентрации 0,005 мг/мл. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм. Для характеристики полученной белково-полипептидной фракции использовали методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 280±5 нм. Молекулярную массу белков и полипептидов, входящих в комплекс, определяют следующими методами: - гель-хроматографии на Superdex 75 («GE Healthcare») и методом денатурирующего «SDS-Page» электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков. Для калибровки колонки используют белковые стандарты с диапазоном молекулярных масс от 13 кДа до 250 кДа. Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят белки и полипептиды с молекулярной массой от 5 кДа до 200 кДа, из которых 82% имеют молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа. Аминокислотный анализ полученного комплекса (%): Asp - 10,82+1,3; Thr - 5,4+0,9; Ser - 5,2+1,1; Glu - 16,2+1,9; Pro - 7,045+1,7; Gly - 5,2+0,8; Ala - 5,4+1,1; Val - 7,08+2,3; Met - 2,65+0,6; He - 4,45+0,8; Leu - 9,4+2,5; Туr - 4,02+0,6; Phe - 4,8+1,1; Orn - 0,48+0,1; Lys - 8,48+2,3; His - 2,8+0,7; Arg - 6,52+2,1.
Пример 3. Влияние биологически активного комплекса (препарата) на развитие эксплантатов головного мозга.
Эксперименты проведены на 52 фрагментах коры головного мозга и 40 фрагментах спинномозговых ганглиев 10-12-суточных эмбрионов цыпленка. Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из 35% раствора Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, 35% раствора Хенкса, 5% куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл), пенициллин (100 ед./мл), глютамин (2 мМ). Фрагменты коры головного мозга или спинномозговых ганглиев помещали в эту среду и культивировали на коллагеновой подложке в чашках Петри в термостате при температуре 36,7°С в течение 2 суток. В экспериментальную среду добавляли исследуемый белково-полипептидный комплекс и как положительный контроль - церебролизин и кортексин в концентрациях 0,5, 1,2, 10, 20, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 нг/мл. Критерием биологической активности служил индекс площади (ИП) - соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента головного мозга. Достоверность различия сравниваемых средних значений ИП оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%. Зону роста контрольных эксплантатов головного мозга составляли короткие нейриты, а также выселяющиеся клетки глии и фибробластоподобные клетки. При исследовании непосредственного влияния препаратов на фрагменты головного мозга были поставлены следующие серии опытов. В питательную среду эксплантатов коры головного мозга и спинномозговых ганглиев эмбрионов цыплят добавляли церебролизин и кортексин в различных концентрациях. На 3-и сутки культивирования с добавлением церебролизина при концентрации 100 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов коры головного мозга на 24±3,5%, по сравнению с контрольными значениями ИП. Достоверных значений ИП эксплантатов коры при действии других концентраций церебролизина не наблюдалось. На 3-и сутки культивирования с добавлением кортексина при концентрации 50 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов коры головного мозга на 32±4%, по сравнению с контрольными значениями ИП. Отмечалось достоверное повышение ИП эксплантантов коры головного мозга при концентрации кортексина 100 нг/мл на 28+3,5%, концентрации 200 нг/мл на 23+2%. Достоверные значения ИП эксплантатов коры при действии других концентраций кортексина не наблюдались. Отчетливая стимуляция развития эксплантатов коры головного мозга выявилась при действии исследуемого комплекса в концентрации 20 нг/мл, когда ИП экспериментальных эксплантатов на 48±4,5% был достоверно выше, чем ИП контрольных эксплантатов и эксплантатов сравнения при действии кортексина и церебролизина. При добавлении церебролизина в среду для культивирования эксплантатов спинномозговых ганглиев достоверного увеличения ИП эксплантатов не отмечалось, в то время как при добавлении в среду кортексина наблюдалось увеличение ИП эксплантата на 22±3%. При добавлении исследуемого комплекса в среду для культивирования эксплантатов спинномозговых ганглиев наблюдалось увеличение ИП эксплантата на 36±3,5%. При исследовании эксплантатов коры головного мозга и спинномозговых ганглиев на более длительных сроках культивирования - 7 дней - выявились те же эффекты нейрит-стимулирующего действия в тех же концентрациях исследуемого комплекса. Таким образом, в отношении тканей головного мозга наблюдалось уменьшение порога эффективных концентраций для исследуемого белково-полипептидного комплекса по сравнению с церебролизином и кортексином. Так увеличение зоны роста эксплантатов фрагментов коры головного мозга выявлялось при действии церебролизина только в концентрации 100 нг/мл, кортексина только в концентрациях 50 и 100 нг/мл, а при действии исследуемого белково-полипептидного комплекса - в концентрации 20, 10, 50 и 100 нг/мл соответственно. При этом интенсивность стимулирующего действия белково-полипептидного комплекса была достоверно выше, чем кортексина и церебролизина. На увеличение зоны роста эксплантатов спинномозговых ганглиев церебролизин достоверного действия не оказывал, кортексин достоверно увеличивал ИП на 24%, в то время как исследуемый белково-полипептидный комплекс способствовал увеличению ИП на. 36%. Это свидетельствует о выраженном и направленном стимулирующем действии препарата на нейроны различных отделов головного мозга.
Пример 4. Изучение токсичности биологически активного комплекса.
Общетоксическое действие белково-полипептидного комплекса исследовали в режимах острой токсичности при однократном введении, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении комплекса [5]. Исследование по изучению острой токсичности проведено на 72 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 20-22 г. Животные были рандомизированно разделены на 6 равных групп. Комплекс вводили животным однократно внутримышечно в дозах 5 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг, 200 мг/кг, 500 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,05 М глицин-NaOH раствора рН 7,5. Животным контрольной группы в том же объеме вводили стерильный 0,05 М глицин-NaOH раствор, рН 7,5. Исследование по изучению подострой токсичности проведено на 95 белых беспородных крысах-самцах с массой тела 150-180 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили белково-полипептидный комплекс внутримышечно в течение 90 дней в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 50 мг/кт, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,05 М глицин-NaOH раствора, рН 7,5. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,05 М глицин-NaOH раствор, рН 7,5. До введения комплекса и на 30, 60 и 90 сутки после начала введения у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.
Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев на 112 морских свинках-самцах с массой тела 250-280 г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно внутримышечно белково-полипептидный комплекс в течение 6 мес в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,05 М глицин-NaOH раствора, рН 7,5. В контрольной группе животным вводили по аналогичной схеме стерильный 0,05 М глицин-NaOH раствор, рН 7,5, в том же объеме. У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли: количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинномозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга. При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого комплекса животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 5000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте комплекса.
Изучение подострой и хронической токсичности комплекса свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при его длительном применении в дозах, превышающих предполагаемую терапевтическую в 3000 раз. При исследовании влияния комплекса на морфологический состав и биохимические показатели периферической крови морских свинок через 3 и 6 месяцев после начала его введения достоверного изменения показателей не выявлено.
При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены. Следовательно, белково-полипептидный комплекс, полученный предлагаемым способом, при длительном введении животным не обладает токсическими свойствами, препятствующими дальнейшему его применению в качестве лекарственного средства, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения.
Пример 5. Мутагенность субстанции.
Для оценки мутагенных свойств заявляемого белково-полипептидного комплекса применили набор следующих тестов: - учет генных мутаций в тесте Эймса Salmonella /микросомы с использованием в качестве тест-объектов штаммов Salmonella typhimurium ТА 97, ТА 98 и ТА 100; - учет микроядер в клетках костного мозга мышей. Испытан образец белково-полипептидного комплекса, представляющий собой прозрачную жидкость, стерильно упакованную во флакон темного стекла в количестве 20 мл, содержащую субстанцию в концентрации 2,3 мг/мл.
Оценка мутагенных свойств белково-полипептидного комплекса в тесте Эймса.
Мутационный тест на Salmonella typhimurium является бактериальной тест-системой для учета генных мутаций к прототрофности по гистидину при действии химических соединений и (или) их метаболитов, индуцирующих мутации типа замены оснований или сдвига рамки считывания в геноме этого организма. Мутагены, индуцирующие замены пар оснований, - агенты, вызывающие мутации замены пар оснований в молекуле ДНК. Мутагены, индуцирующие мутации сдвига считывания генетического кода (фреймшифт мутации), - агенты, вызывающие добавление или нехватку одиночных или множественных пар оснований в молекуле ДНК.
Данный метод предназначен для выявления способности фармакологических веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов Salmonella typhimurium. Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой метаболической активации (СМ+) или без метаболической активации (СМ-). После инкубации в течение определенного периода времени подсчитывается количество ревертантных колоний у разных тестерных штаммов в сравнении с количеством спонтанных ревертантов в вариантах негативного контроля (необработанные культуры или культуры, обработанные растворителем). Если тестируемое соединение и (или) его метаболиты обладают мутагенной активностью, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у гистидин-зависимых штаммов Salmonella typhimurium.
Для тестирования использовали набор индикаторных штаммов Salmonella typhimurium, позволяющий регистрировать мутации типа сдвига рамки считывания генетического кода (ТА 98 и ТА 97) и замены пар оснований (ТА 100). Штаммы получены из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика.
Регламент работы с бактериальными культурами, проверка генотипов штаммов, правила их музейного хранения, необходимые для проведения экспериментов оборудование, посуда, реактивы и питательные среды и растворы, проведение работ по получению гомогената печени крыс и составление активирующей смеси, а также методы статистического анализа полученных результатов соответствовали стандартным, подробно описанным в соответствующей литературе.
Для метаболической активации использовали фракцию S9 печени самцов крыс Wistar, которым за 5 дней до забоя вводили индуктор микросомальных ферментов - совол (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно). Для контроля активности системы метаболической активации использовали бромид этидия (10 мкг/чашку) на штамме ТА 98 при СМ+.
Белково-полипептидный комплекс в виде стерильного раствора с содержанием белка 2,3 мг/мл исследовали 0,3 и 0,1 мл исходного раствора на чашку и три 10-кратных разведения в физиологическом растворе (по 0,1 мл/ч). Тестируемые дозы субстанции составили 690; 230; 23; 2,3 и 0,23 мкг на чашку.
Эксперимент сопровождали положительными контролями, в качестве которых использовали вещества, индуцирующие мутации у соответствующих штаммов-тестеров при наличии или отсутствии условий активации. Для вариантов без активации использовали азид натрия в количестве 10 мкг на чашку для штамма ТА 100 при СМ-; 2,7-диамино-4,9-диокси-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазопирен (ДИАМ) - 10 мкг на чашку для штамма ТА 98 при СМ-; 9-аминоакридин (9АА) - 50 мкг/чашку для штамма ТА 97 при СМ-. Для контроля активности системы метаболической активации использовали этидиум бромид - 10 мкг на чашку на штамме ТА 98 при СМ+. В качестве негативного контроля использовали физиологический раствор (0,1 мл на чашку).
Селективный полуобогащенный агар (0,7%) в пробирках плавили в водяной бане при 100°С и помещали в термостатируемую водяную баню с температурой 45-46°С.
Сначала в пробирки с агаром вносили 0,1 мл образца в необходимых разведениях, затем - 0,1 мл суспензии бактерий и 0,5 мл микросомальной активирующей смеси (для варианта с метаболической активацией). Затем содержимое пробирки быстро перемешивали и выливали на слой нижнего минимального агара в чашки Петри. Продолжительность времени внесения микросомальной активирующей смеси и розлива полужидкого агара на чашку не превышала 10-15 секунд. Чашки оставляли при комнатной температуре на 30-40 минут и после полного застывания агара переносили в термостат при 37°С. Учет результатов проводили через 48 часов инкубации.
Параллельно в опыт включали варианты без системы метаболической активации (СМ-) и в присутствии системы метаболической активации (СМ+). В варианте СМ- может быть зарегистрировано действие прямых мутагенов, то есть препаратов, проявляющих мутагенный эффект за счет активности исходной структуры вещества. Действие же промутагенов, то есть соединений, эффект которых связан с образованием мутагенных метаболитов, может быть учтено при сравнении результатов, полученных при анализе данных испытаний вещества в вариантах СМ- и СМ+. В каждом контрольном и опытном вариантах использовали по 2 чашки. Мутагенный эффект считали значимым, если среднее количество колоний ревертантов на чашку в опытном варианте превышало таковое в контрольном варианте в 2 и более раз. Результаты эксперимента учитывали при наличии стандартного ответа во всех вариантах позитивного и негативного контроля. Количество колоний ревертантов в контроле с растворителем в вариантах СМ- и СМ+ было в пределах колебаний спонтанного уровня для данных штаммов. Ответ штаммов на стандартные мутагены был в пределах обычных уровней.
Исследованный белково-полипептидный комплекс во всех тестируемых концентрациях не показал мутагенного эффекта на штаммах ТА 100, ТА 98 и ТА 97 в вариантах без и в присутствии системы метаболической активации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ: белково-полипептидный комплекс не обладает способностью индуцировать генные мутации на тестерных штаммах Salmonella typhimurium во всем диапазоне испытанных концентраций.
Оценка мутагенных свойств белково-полипептидного комплекса микроядерным методом в клетках млекопитающих.
Цитогенетическая активность - способность вещества вызывать структурные и численные хромосомные нарушения в соматических и зародышевых клетках.
Микроядра - небольшие ДНК-содержащие образования, состоящие из ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии анателофазы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или множественные микроядра в цитоплазме.
Цель исследования - выявление и количественная оценка цитогенетической (мутагенной) активности фармакологических средств в полихроматофильных эритроцитах (ГТХЭ) костного мозга млекопитающих. Метод основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами.
Эксперименты проводили на самцах и самках мышей-гибридов F1(CBAx C57BI6/J) двухмесячного возраста массой 18-20 г. В состав каждой группы входило по 6 особей. Животных содержали при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. Эксперименты на животных по оценке мутагенных свойств белково-полипептидного комплекса при однократном и пятикратном введении осуществляли в соответствии с официальными протоколами. Проведено 3 серии экспериментов с соответствующими контролями: терапевтическая доза испытана на самцах при однократном введении; субтоксическая доза испытана на самцах при однократном введении; терапевтическая доза испытана на самцах и самках при пятикратном введении.
Учитывая, что возможным предполагаемым способом применения биологически активного белково-полипептидного комплекса в клинике является внутривенный или эндолюмбальный, в данном исследовании использовали внутрибрюшинное введение субстанции мышам. Дозу белково-полипептидного комплекса для оценки мутагенной активности рассчитывали исходя из наибольшей рекомендованной суточной терапевтической дозы (ТД) для человека. Рекомендовано внутривенное введение белково-полипептидного комплекса в количестве 2 мл при концентрации 0,5 мг/мл. При этом терапевтическая доза (ТД) для человека, в том числе для ребенка, может составить 0,05 мг/кг/сутки. Для расчета дозы в экспериментах на мышах рекомендуется использовать коэффициент пересчета, учитывающий соотношение площади поверхности тела и массы тела человека и мыши. В нашем исследовании он составил 8,33. Поэтому в качестве ТД для мышей использовали дозу, приблизительно равную 8,33 ТД для человека (0,42 мг/кг).
В качестве субтоксической использовали максимально возможную в условиях данного эксперимента дозу 23 мг/кг, поскольку вещество было предоставлено в концентрации 2,3 мг/мл, а общепринятое количество вещества, вводимое мышам, составляет 0,1 мл на 10 г веса. Соответственно в пересчете для человека максимальная испытанная доза составляет 2,76 мг/кг. Было сформировано 7 групп животных (табл.2): четыре опытных и три соответствующих контрольных. Субстанцию в дозе 0,42 мг/кг вводили пятикратно с интервалом 24 часа самцам и самкам. Забой во всех группах проводили через 6 часов после последнего введения белково-полипептидного комплекса.
В двух других опытных группах белково-полипептидный комплекс вводили однократно самцам в дозах 0,42 мг/кг и 23 мг/кг.
В качестве негативного контроля использовали растворитель - физраствор. Его вводили внутрибрюшинно самцам и самкам двух контрольных групп в те же сроки и в тех же объемах, что и животным опытных серий. В качестве позитивного контроля использовали циклофосфамид в дозе 20 мг/кг, растворенный ex tempore в физрастворе при однократном внутрибрюшинном введении за 24 часа до забоя.
Препараты клеток костного мозга для учета микроядер готовили общепринятым способом в соответствии с методическими рекомендациями «Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом». Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации через 6 часов после последнего введения препарата. Выделяли обе бедренные кости и очищали их от мышц. Для вымывания костного мозга использовали эмбриональную телячью сыворотку (НПП ПанЭ-КО). Костный мозг из обеих бедренных костей вымывали шприцем в микропробирку. Суспензию центрифугировали при 1000 об/мин, в течение 5 минут, супернатант удаляли, осадок осторожно ресуспендировали. Из капли суспензии готовили мазок, высушивали его на воздухе. Фиксировали метанолом 3 минуты. Окрашивали по методу Романовского-Гимза. Анализировали на зашифрованных препаратах по 2000 полихроматофильных эритроцитов от каждого животного. При подсчете 500 эритроцитов определяли соотношение полихроматофильных и нормохромных эритроцитов. Препараты расшифровывали по окончании анализа.
Критерием позитивного результата является воспроизводимое и статистически значимое увеличение числа полихроматофильных эритроцитов с микроядрами по крайней мере в одной из опытных групп по сравнению с контрольной. Полученный положительный результат свидетельствует, что вещество индуцирует хромосомные повреждения и/или нарушения митотического аппарата клеток у экспериментальных животных.
Статистическую обработку результатов по учету микроядер проводили путем сравнения опытных серий с контрольными по критерию Х2; межгрупповое сравнение доли полихроматофильных эритроцитов проводили с помощью критерия Манна-Уитни.
Результаты учета микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей: во всех вариантах опыта белково-полипептидный комплекс не вызывал увеличения частоты клеток с микроядрами в костном мозге мышей при сравнении опытных и соответствующих контрольных серий. Циклофосфамид (позитивный контроль) при внутрибрюшинном введении самцам мышей в дозе 20 мг/кг вызывал повышение частоты клеток с микроядрами в 19,6 раза (62,1‰ против 3,16‰ в контроле, Р<0,001). Доля ПХЭ от общего числа эритроцитов костного мозга была приблизительно на одном уровне в группах опытных и контрольных серий, что свидетельствует об отсутствии токсического действия субстанции в испытанных дозах на кроветворение. При действии позитивного контроля (циклофосфамида) отмечен сдвиг соотношения полихроматофильных и нормохромных эритроцитов в сторону последних (при сравнении с контролем Р<0,005).
Таким образом, мутагенная активность белково-полипептидного комплекса не выявлена в тесте на индукцию микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей при условии однократного и пятикратного введения самцам и самкам внутрибрюшинно в дозе 0,42 мг/кг массы тела, что в пересчете соответствует суточной терапевтической дозе для человека. Мутагенная активность не выявлена также в условиях однократного введения белково-полипептидного комплекса самцам в максимально возможной дозе - 23 мг/кг. Белково-полипептидный комплекс не проявил токсического действия по показателю «доля полихроматофильных эритроцитов».
Заключение по оценки мутагенных свойств белково-полипептидного комплекса
Белково-полипептидный комплекс не обладает мутагенной активностью в тесте Эймса Salmonella /микросомы и в тесте на индукцию микроядер в клетках костного мозга мышей в условиях экспериментов, проведенных в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.
Пример 6. Специфическая активность субстанции [6, 7].
Местнораздражающее действие.
Проведенные исследования показали, что при подкожном, внутривенном и интраназальном введении субстанции биологически активного белково-полипептидного комплекса не оказывается местнораздражающего действия. При быстром внутривенном введении возможны эффекты гипертермии. Не обнаружено местнораздражающего действия на слизистую носа и горла при интраназальном введении кроликам в течение 1 месяца.
Исследование иммуннотоксических и аллергизирующих свойств
Активная кожная анафилаксия
Опыт проводили на морских свинках в количестве по 10 голов в группе, всего 3 группы. Сенсибилизировали животных по схеме: первая инъекция подкожно, две последующие внутримышечно через день в область бедра. На 14 день на выстриженных участках спины морским свинкам вводили субстанцию внутрикожно, в двукратных разведениях. Для контроля реактивности кожи вводили физиологический раствор тому же животному на другой выстриженный участок кожи. Контрольным животным вводили разрешающую инъекцию субстанции (равную сенсибилизирующей дозе). Затем животным вводили внутривенно по 0,5 мл 1% раствора синего Эванса. Через 30 минут животных умерщвляли эфиром и определяли размер синего пятна на внутренней стороне кожи в месте введения. Положительной считается реакция при размере пятна выше 6 мм, не более 3 мм в контроле. В трех случаях отмечена положительная реакция в группе животных, получавшей препарат в дозе, 10-кратно превышающей терапевтическую. Количество реакций свидетельствует о возможности индивидуальных реакций.
Реакция гиперчувствительности замедленного типа на мышах.
Опыты проводили на нелинейных мышах массой 18-20 г, по 10 животных в группе. Общее количество животных в опыте - 30. Животных однократно сенсибилизировали внутрикожно в основании хвоста эмульсией препарата в НАФ (1:1). Доза введения составила 60 мкл. Контрольных животных сенсибилизировали эмульсией ПАФ с раствором Хенкса (1:1). Для выявления сенсибилизации через 5 суток мышам в подушечку задней лапы ввели 40 мкл раствора тест-препарата в растворе Хенкса. Через 24 часа после тестирования измеряли величину отека с помощью инженерного микрометра МК-0-25. При статистической обработке полученных результатов не обнаружена достоверная разница в толщине лапок опытных групп и контрольной (Р>0,05). Введение субстанции не вызывает реакции гиперчувствительности замедленного типа.
Исследование фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов.
3
Постановку реакции проводили на белых крысах массой 180-200 г. Общее число животных в опыте 30, по 10 в каждой группе. Исследовали две дозы препарата: терапевтическую и десятикратно ее превышающую, треть группа - контроль. Метод основан на определении оптической плотности лизирующего раствора после разрушения фагоцитов, поглотивших частицы нейтрального красного. Крыс, подвергнутых воздействию исследуемого препарата, забивали методом декапитации. Асептически внутрибрюшинно вводили 5 мл среды 199, содержащей 20% ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка). После массажа брюшной полости среду отсасывали шприцем. Порции клеточной суспензии, полученные от всей группы животных, объединяли в общий пул. Концентрацию живых клеток доводили до 1,5×10 клеток/мл. Суспензию клеток стерильно разливали по 2 мл в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм. Чашки инкубировали 2 часа при 37°С. Надосадок, содержащий не прилипшие клетки, сливали, а фиксированный на пластике монослой дважды промывали средой 199. В слегка подсушенные чашки наливали раствор, содержащий нейтральный красный, и выдерживали при 37°С в течение 1 часа. Раствор сливали. Клетки промывали средой 199. В каждую чашку вносили по 3 мл лизирующего раствора. Клетки тщательно обрабатывали вращательным движением чашки. Раствор сливали в пробирки и на спектрофотометре при длине волны 540 нм измеряли оптическую плотность.
При введении субстанции фагоцитарная активность магрофагов не снижается. Статистически достоверных различий между показателями в опытных группах и контрольной нет.
Реакция дегрануляции тучных клеток
Постановку реакции проводили на крысах массой 180-200 г, самках. Общее количество животных в опыте - 30. Раствор субстанции внутрибрюшинно в терапевтической дозе и десятикратно ее превышающей, контролем служила интактная группа. Для получения взвеси тучных клеток животных забивают декапитацией, в брюшную полость вводили буфер; после массажа передней брюшной стенки взвесь тучных клеток собирали в центрифужные пробирки. Препараты готовили на предметных стеклах, окрашенных 0,3% спиртовым раствором нейтрального красного. К 0,03 мл взвеси тучных клеток добавляли 0,03 мл сыворотки опытного животного и 0,03 мл исследуемого препарата в разведении 1:100. В контроле дегрануляция не превышала 5%. Препараты накрывали покровным стеклом, края которого герметизировали парафином. Затем инкубировали 15 минут в термостате при 37°С. Препараты микроскопировали под увеличением Х40, подсчитывая тучные клетки, подвергшиеся дегрануляции и нормальные, в сумме 100. Реакцию считали положительной, если степень дегрануляции превышала 20%.
Введение субстанции в концентрации 0,01 мг/кг не вызывает дегрануляции тучных клеток, не отличается от контроля, и превысило пороговое значение 5%. Реакция в группе с введением в дозе десятикратного превышения терапевтической - слабо положительная, однако эти значения не выходят за статистический процент ошибки.
Исследование на прионы.
Пробы брали из 4-х флаконов. Реакцию проводили методом иммуноферментного анализа, на 96-луночном полистироловом планшете. Диагностическая тест-система - PrionScreen. Спектрофотометр Digiscan. Каждую пробу ставили в 4-х повторностях. Контроли: К-: 8 лунок, К+: 8 лунок. Полученные оптические плотности контролей и исследуемых образцов соответствовали условиям проведения реакции. Результаты: инфекционные белки, прионы в исследуемой субстанции не обнаружены.
Общее заключение.
Проведены исследования токсичности в остром и субхроническом эксперименте оригинальной субстанции биологически активного белково-полипептидного комплекса, а также изучение его местнораздражающего, иммунотоксического действия, аллергизирующих свойств и выявление наличия прионовых инфекций.
Острую токсичность препарата изучали в эксперименте на мышах линии BALB/C. Препарат вводили тремя способами: подкожно, внутрибрюшинно и перорально. Максимально возможная для введения мышам доза составляет 0,2 мл, что составило 10 мг/кг. Было выявлено, что в указанной дозе во всех трех способах введения препарат не вызывал гибели животных, симптомов острого отравления получено не было.
Исследования в субхроническом эксперименте проводили на половозрелых и отдельно на неполовозрелых крысах линии Wistar. Исследуемый препарат вводили подкожно в терапевтической дозе 0,01 мг/кг и десятикратно превышающей 0,1 мг/кг; внутривенно в дозе 0,0025 мг/кг и ×10-0,025 мг/кг. Интраназально по 1 впрыску 1 раз в день, что составило 1,5 мг/мл 0,2 мл, изучали на кроликах породы Шиншилла. При исследовании токсичности использовали общепринятые методы исследования гематологических, биохимических показателей крови, а также гистологических исследований внутренних органов.
Было получено, что введение субстанции различными способами как в терапевтической дозе, так и в десятикратно превышающих в течение 1 месяца не вызывало изменений внутренних органов, не оказывало токсического действия на систему крови. Не оказывало местнораздражающего действия при различных способах введения.
Исследование аллергизирующих свойств проводили на морских свинках при внутрикожных аппликациях. Было обнаружено, что субстанция не вызывает аллергических реакций в терапевтических дозах. Отмечено 3 случая повышенной чувствительности животных к препарату в дозе, в 10 раз превышающей терапевтическую. Исследование иммуннотоксичности проведено на макрофагах крыс линии Вистар и не обнаружило данного эффекта.
Проведены исследования препарата на наличие прионовых инфекций методом иммунноферментного анализа. Препарат оказался свободным от искомых возбудителей.
Пример 7. Действие на цитокинетические параметры клеточной популяции.
Материалы и методы. Мышиные фибробласты 3Т3 культивировали на среде ДМЕМ (ПанЭко, Москва) с добавлением 584 мг/л глютамина, противогрибково-противомикробного препарата (Sigma, США) согласно инструкции производителя, и 10% по объему стандартизованной эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США). Для проведения экспериментов клетки высаживали на 24-луночные планшеты (Corning) в концентрации 3000 клеток на мл (на лунку). Для морфологических исследований в лунки планшета помещали покровные стекла диаметром 12 мм (Ted Pella, США) и высаживали клетки на них.
Внесение тестируемых веществ. По достижении клеточной культурой требуемой плотности заменяли среду культивирования на свежую того же состава (контроль), на ДМЕМ без сыворотки с добавлением 2 мг/мл БСА (Sigma) (отрицательный контроль), ДМЕМ без сыворотки с добавлением 10% по объему биологически активной субстанции (опыт 1) и ДМЕМ с добавлением 10% сыворотки и 10% биологически активной субстанции (опыт 2).
Экспериментальные процедуры. Клетки анализировали через 8, 24 и 48 часов после внесения тестируемых реактивов. Состояние культуры in vivo анализировали и фотографировали клетки с помощью фазово-контрастного инвертированного микроскопа Axiovert 200M (Carl Zeiss, Германия), оснащеного объективом ЕС Plan-Nefluar 10x NA 0,5 и цифровой камерой ORCA II Erg-2 (Hamamatsu Photonics, Япония). Для определения количества клеток диссоциировали клеточный пласт смесью р-ра Версена (ПанЭко) и 0,025% р-ра трипсина (ПанЭко) в отношении 3:1. Полученную суспензию центрифугировали при 300g, осадок ресуспендировали в растворе Хэнкса (ПанЭко) и считали в камере Горяева. Для анализа цитокинетических параметров популяции клетки, выращенные на покровных стеклах, фиксировали 1% глютаровым альдегидом на 0,1 М фосфатном буфере при +4°С, пермеабилизировали 0,5% р-ром Тритона Х-100 на PBS 10 минут, промывали дистиллированной водой и окрашивали гематоксилином Майера (90 секунд) (Sigma), обезвоживали и заключали в DePeX. После пермеабилизации также окрашивали клетки DAPI (0,1 мкг/мл) и заключали в Moviol. Полученные препараты изучали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioskop П (Carl Zeiss), используя объективы Plan-Neofluar 40x NA 1,2 и 100х NA 1,3.
Результаты. Цитокинетические параметры популяций.
Контроль. 8 часов. Митотический индекс - 8%. Апоптоз и некроз - 0%.
24 часа. Митотический индекс - 11,9%. Апоптоз и некроз - 0%. Количество клеток в лунке - 265000.
48 часов. Митотический индекс - 9%. Апоптоз и некроз - 0%. Количество клеток в лунке - 780000.
БСА. 8 часов. Митотический индекс - 5%. Апоптоз и некроз - 0%.
24 часа. Митотический индекс - 5,5%. Апоптоз и некроз - 0%. Количество клеток в лунке - 167500.
48 часов. Митотический индекс - 3%. Апоптоз и некроз - 0%. Количество клеток в лунке - 625000.
Биологически активная субстанция.
8 часов. Митотический индекс - 6%. Апоптоз и некроз - 0%.
24 часа. Митотический индекс - 7,1%. Апоптоз и некроз - 0%.
Количество клеток в лунке - 250000.
48 часов. Митотический индекс - 6%. Апоптоз и некроз - 0%. Количество клеток в лунке: посчитано 187000, реально ≈ 400000 (выброс).
Сыворотка + биологически активная субстанция.
8 часов. Митотический индекс - 8%. Апоптоз и некроз - 0%.
24 часа. Митотический индекс - 4,5% (выброс). Апоптоз и некроз -0%.
Количество клеток в лунке - 317500.
48 часов. Митотический индекс - 9%. Апоптоз и некроз - 1%. Количество клеток в лунке - 680000.
Все экспериментальные линии демонстрируют прирост биомассы, не наблюдается цитотоксического действия ни в одном из случаев. В отрицательном контроле эффективность пролиферации минимальна, в присутствии белково-полипептидного комплекса наблюдается стимуляция пролиферации по сравнению с отрицательным контролем. Положительный контроль и среда с добавлением субстанции и сыворотки показывают одинаковый уровень пролиферации.
Клетки, инкубированные в присутствии субстанции, формируют тонкие длинные отростки. Особенно хорошо заметно на первые сутки эксперимента. В присутствие сыворотки на фоне субстанции эффект сохраняется.
Выводы: 1) Биологически активная субстанция, состоящая из белково-полипептидного комплекса, не является цитотоксичным препаратом.
2) Субстанция содержит ростовые факторы, однако не так эффективна в качестве стимулятора пролиферации, как эмбриональная сыворотка крови.
3) Субстанция вызывает изменение формы клеток с хорошо заметным формированием отростков.
Пример 8. Влияние на кровоснабжение мозга и выживаемость крыс в условиях его ишемического поражения.
Исследование проводили на крысах-самцах линии Вистар массой 180-250 г в условиях необратимой двусторонней окклюзии общих сонных артерий по общеизвестной методике [8-10]. Все ветеринарные манипуляции проводились в асептических условиях, позволяющие сохранить статус экспериментальных животных. Для содержания экспериментальных животных использовали стандартные условия [11].
У крыс под эфирным наркозом (эфир диэтиловый х/ч, ОАО «Медхимпром») в области шеи по средней линии делали небольшой разрез кожи длиной 8-10 мм для обеспечения доступа к сонным артериям. Выделяли обе сонные артерии, отделяя блуждающий и симпатический нервы, проходящие вместе с артериями. Под сосуды подводили шелковые лигатуры (Silk blk 17×45 см/M3/USP2/ Non needled/ «Ethicon Johnson & Johnson», кат.№W203) и вместе с ассистентом производили одномоментную перевязку обеих сонных артерий тройным хирургическим узлом. Кожный разрез зашивали хирургическим шелком (Silk blk 100 cм/M5/Sgle armed KP-3USP2/ Non needled/ «Ethicon Johnson & Johnson», кат. №W794), накладывая один или два хирургических кожных шва, с последующей обработкой раны 5% раствором настойки йода. Физиологический раствор или целлекс вводили внутрибрюшинно. Продолжительность всех манипуляций составляет 8-10 минут, затем животных помещают в клетку.
Выживаемость животных отслеживали сразу после проведения процедуры перевязки и в течение первых суток, т.е. конечную выживаемость фиксировали через 24 часа. Биологическая активность препарата в виде защиты головного мозга в условиях неполной глобальной ишемии при одномоментной перевязке сонных артерий оценивалась следующим образом:
- выраженная - при выживании более 80% крыс
- средневыраженная - при выживании 70-80% крыс
- невыраженная - при выживании менее 70% крыс
Статистическую обработку данных проводили с использованием точного критерия Фишера с учетом множественности сравнений.
Опыт 1.
Для исследования использовали три группы животных:
- группа 1 - контрольные животные после перевязки сонных артерий, получавшие физиологический раствор стерильным одноразовым инсулиновым шприцем 0,5 мл на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов после перевязки сонных артерий;
- группа 2 - ложнооперированные животные, у которых проводились те же манипуляции, что и у контрольных, только без перевязки сонных артерий, которым вводили физиологический раствор 0,5 мл на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов;
- группа 3 - животные после перевязки сонных артерий, которым вводили биологически активную субстанцию в дозе 0,5 мл 0,1% раствора (0,2 мг/кг) на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов.
Проведенные опыты показали, что в контрольных опытах после перевязки обеих сонных артерий в первый час погибает наибольшее количество животных, т.е. 11 из 24, а через сутки еще 4 животных, всего погибло 15 крыс из 24 (63%, табл.1). Среди ложнооперированных животных погибло 2 крысы сразу после операции (17%). Биологически активная субстанция при введении крысам через 1 час и 5 часов по 0,2 мг/кг (0,5 мл 0,1% раствора) внутрибрюшинно вызывал гибель только двух животных, а 34 из 36 крыс выжило. Увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем составляет 95%. Полученные данные представлены в Таблице 1.
Таблица 1
Влияние биологически активной субстанции на выживаемость крыс в условиях перевязки обеих сонных артерий
Группы животных
Выраженная биоактивность
выжившие
умершие
1 группаКонтроль - 24 крысы
9 из 24 (37%)
15 из 24 (63%)
2 группа
10 из 12*
2 из 12
Ложнооперированные
(83%)
(17%)
12 крыс
3 группа
34 из 36*
2 из 36
Субстанция 0,2 мг/кг
(95%)
(5%)
36 крыс
*-Р≤0,01 по сравнению с контролем.
Таким образом биологически активная субстанция, представляющая собой белково-полипептидный комплекс, оказывает статистически значимое увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем в условиях неполной глобальной ишемии мозга, вызываемой одномоментной перевязкой обеих сонных артерий.
Опыт 2.
Для исследования использовали три группы животных:
- группа 1 - контрольные животные после перевязки сонных артерий, получавшие физиологический раствор стерильным одноразовым инсулиновым шприцем 0,5 мл на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов после перевязки сонных артерий;
- группа 2 - животные после перевязки сонных артерий, которым вводили биологически активную субстанцию в дозе 0,5 мл 0,1% раствора (0,2 мг/кг) на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов;
- группа 3 - животные после перевязки сонных артерий, которым вводили лиофилизированную биологически активную субстанцию в дозе 0,2 мг/кг, сухую навеску 0,1 мг разводили 1,0 мл физиологическим раствором и вводили на крысу 0,5 мл через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов.
Проведенные опыты показали, что в контрольной группе после перевязки обеих сонных артерий в первый час погибает наибольшее количество животных, т.е. 11 из 24, а через сутки еще 4 животных, всего погибло 15 крыс из 24 (63%, табл.1). Разведенная лиофилизированная биологически активная субстанция при введении крысам через 1 час и 5 часов по 0,2 мг/кг (0,5 мл 0,1% раствора) внутрибрюшинно вызывает гибель четырех животных, а 8 из 12 крыс выжило. Биологически активная субстанция при введении крысам через 1 час и 5 часов по 0,2 мг/кг (0,5 мл 0,1% раствора) внутрибрюшинно вызывает гибель только двух животных, а 34 из 36 крыс выжило. Увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем составляет 95%. Полученные данные представлены в таблице 2.
Таблица 2. Влияние биологически активной субстанции на выживаемость крыс в условиях перевязки обеих сонных артерий
Группыживотных
Выраженнаябиоактивность
Выжившие
Умершие
1 группа
9 из 24
15 из 24
Контроль - 24 крысы
(37%)
63%
2 группа
8 из 12*
4 из 12
Лиофилизат
(66,7%)
(33,3)%
12 крыс
3 группа
34 из 36*
2 из 36
Субстанция 0,2 мг/кг
(95%)
(5%)
36 крыс
*-Р≤0,01 по сравнению с контролем.
Таким образом, биологически активная субстанция, представляющая собой белково-полипептидный комплекс, оказывает статистически значимое увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем в условиях неполной глобальной ишемии мозга, вызываемой одномоментной перевязкой обеих сонных артерий.
Биологическая активность в условиях неполной глобальной ишемии мозга, вызываемой одномоментной перевязкой обеих сонных артерий, лиофильной фракции белково-полипептидного комплекса значительно ниже по сравнению с жидкой субстанцией.
Источники информации
1. Энциклопедия лекарств. 2006, с.970.
2. Патент РФ №2128511 (1999).
3. Патент РФ №2104702 (1999).
4. Патент РФ №2049472 (1999).
5. Методические указания по оценке канцерогенности свойств фармакологических средств и вспомогательных веществ в краткосрочных тестах.// Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р.У.Хабриева.- 2 изд., перераб. и доп. - М.: ОАО Издательство «Медицина» - 2005, с.131-170.
6. Методические указания по оценке мутагенных свойств фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМП, проф. Р.У.Хабриева.- 2 изд., перераб. и доп. - М.: ОАО Издательство «Медицина» - 2005, с.100-122.
7. Методические указания по оценке канцерогенности свойств фармакологических средств и вспомогательных веществ в краткосрочных тестах.// Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р.У.Хабриева.- 2 изд., перераб. и доп. - М.: ОАО Издательство «Медицина» - 2005, с.131-170.
8. И.В.Силкина, Т.С.Ганьшина, С.Б.Серединин, Р.С.Мирзоян, Усиление кровоснабжения ишемизированного мозга под влиянием афобазола, Ж. Эксперимен. и клин. Фармакология, 2004, т.67, №5, с.9-13.
9. Smith M.L., Bendek G., Dahlgen N. at all. Models for studing, long-term recovery following forebrain ischemia in the rat. A 2-vessell occlusion model.// Neurol. can., 1984, v.69, p.385-400.
10. Y.Wang-Fisher. Manual of Stroke Models in rats. CRC press, 2008, p.3-4
11. Программа по уходу и содержанию лабораторных животных НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН от ноября 2005 г.