СПОСОБ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ
METHOD FOR CRYOGENIC PRESERVATION OF HAEMATOPOIETIC UMBILICAL CORD STEM CELLS

Изобретение относится к области медицины, в частности гематологии, и может быть использовано как технология криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.
Известен способ криоконсервации гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови Нью-Йорского Центра Крови, который включает в себя добавление в суспензию клеток криопротектора диметилсульфоксида, трехэтапное замораживание суспензии с последующим оттаиванием. На начальном этапе замораживание образца происходит со скоростью 10°С/мин до температуры -3°С, дальнейшее замораживание до температуры -12°С и последующее замораживание со скорость 2°С/мин до температуры -50°С/мин, после чего образец помещается в жидкий азот [Technicalservicesbulletin 040-017 BioArchiveFreezingCurveCordBlood].
Известен способ криоконсервации гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, заключающийся в добавлении ограждающего раствора криопротектора диметилсульфоксида во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками, подготовке к замораживанию, включающей охлаждение взвеси со стволовыми клетками в камере охлаждения до температуры +4°С и многоэтапное замораживание взвеси со стволовыми клетками, отличающийся тем, что в качестве криопротектора используют раствор 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40, который вносят во взвесь лейкоцитарного концентрата со стволовыми клетками, размещенными в криопакете, механически перемешивают в аппарате для перемешивания и добавляют криоконсервант при температуре +4°С, выпускают воздух из криопакета и часть взвеси, закрывают пакет, запаивают и помещают его в термоусадочный пакет и осуществляют программное многоэтапное замораживание, на первом этапе которого смесь взвеси со стволовыми клетками и криопротектором - образец замораживания - выдерживают 10 мин при температуре +4°С, затем охлаждают со скоростью 1°С/мин до температуры -12°С, далее охлаждают со скоростью 15°С/мин до температуры -60°С, после оттаивания образца со скоростью 15°С/мин до температуры -18°С охлаждают образец со скоростью 1°С/мин до -60°С и в конце программы замораживания образец охлаждают со скоростью 3°С до температуры -100°С, после окончания программы замораживания образец, помещенный в криокоробку, размещают в карантийный сосуд Дьюара с жидким азотом до определения результатов тестов на наличие или отсутствие инфекционных агентов и бактериологической и грибковой контаминации, по истечении карантинного срока хранения образец с гемопоэтическими стволовыми клетками, полученными из пуповинной крови, переносят на длительное хранение при температуре не менее -150°С в сосуд Дьюара с жидким азотом при условии отрицательных результатов тестирования, в случае положительных результатов тестов на инфекции и бактериальную и/или грибковую контаминацию образец с гемопоэтическими стволовыми клетками переносят в сосуд Дьюара для инфекционного материала длительного хранения. Патентное изобретение 2416197, класс изобретения A01N 1/02, А61К 35/14, А61К 35/44.
Недостатком указанного способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови является неудовлетворительная жизнеспособность клеток на выходе.
Цель изобретения - повысить жизнеспособность стволовых клеток.
Цель достигается тем, что способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, заключающийся в добавлении ограждающего раствора криопротектора диметилсульфоксида во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками, подготовке к замораживанию, включающей охлаждение взвеси со стволовыми клетками в камере охлаждения до температуры +4°С, и многоэтапное замораживание взвеси со стволовыми клетками, причем в качестве криопротектора используют раствор 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40, который вносят во взвесь лейкоцитарного концентрата со стволовыми клетками, размещенными в криопакете, механически перемешивают в аппарате для перемешивания и добавляют криоконсервант при температуре +4°С, выпускают воздух из криопакета и часть взвеси, закрывают пакет, запаивают и помещают его в термоусадочный пакет и осуществляют программное многоэтапное замораживание, на первом этапе которого смесь взвеси со стволовыми клетками и криопротектором - образец замораживания - выдерживают 10 мин при температуре +4°С, затем охлаждают со скоростью 1°С/мин до температуры -12°С, далее охлаждают со скоростью 15°С/мин до температуры -60°С, после оттаивания образца его охлаждают со скоростью 1°С/мин до -60°С и в конце программы замораживания образец охлаждают со скоростью 3° до температуры - 100°С, после окончания программы замораживания образец, помещенный в криокоробку, размещают в карантийный сосуд Дьюара с жидким азотом до определения результатов тестов на наличие или отсутствие инфекционных агентов и бактериологической и грибковой контаминации, по истечении карантийного срока хранения образец с гемопоэтическими стволовыми клетками, полученными из пуповинной крови, переносят на длительное хранение при температуре не менее -150°С в сосуд Дьюара с жидким азотом при условии отрицательных результатов тестирования, в случае положительных результатов тестов на инфекции и бактериальную и/или грибковую контаминацию образец с гемопоэтическими стволовыми клетками переносят в сосуд Дьюара для инфекционного материала длительного хранения, причем оттаивание образца осуществляется со скоростью 10°С/мин.
Способ реализуется следующим образом.
Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, заключающийся в добавлении ограждающего раствора криопротектора диметилсульфоксид во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками, подготовке к замораживанию, включающей охлаждение взвеси со стволовыми клетками в камере охлаждения до температуры +4°С, и многоэтапном замораживании взвеси со стволовыми клетками, причем в качестве криопротектора используют раствор 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40, который вносят во взвесь лейкоцитарного концентрата со стволовыми клетками, размещенными в криопакете, механически перемешивают в аппарате для перемешивания и добавляют криоконсервант при температуре +4°С, выпускают воздух из криопакета и часть взвеси, закрывают пакет, запаивают и помещают его в термоусадочный пакет и осуществляют программное многоэтапное замораживание, на первом этапе которого смесь взвеси со стволовыми клетками и криопротектором - образец замораживания - выдерживают 10 мин при температуре +4 C, затем охлаждают со скоростью 1°C 7 мин до температуры -12°C, далее охлаждают со скоростью 15°C/мин до температуры -60°C, после оттаивания образца его охлаждают со скоростью 1°С/мин до -60°С и в конце программы замораживания образец охлаждают со скоростью 3°C до температуры - 100°C, после окончания программы замораживания образец, помещенный в криокоробку, размещают в карантинный сосуд Дьюара с жидким азотом до определения результатов тестов на наличие или отсутствие инфекционных агентов и бактериологической и грибковой контаминации, по истечении карантинного срока хранения образец с гемопоэтическими стволовыми клетками, полученными из пуповинной крови, переносят на длительное хранение при температуре не менее -150°C в сосуд Дьюара с жидким азотом при условии отрицательных результатов тестирования, в случае положительных результатов тестов на инфекции и бактериальную и/или грибковую контаминацию образец с гемопоэтическими стволовыми клетками переносят в сосуд Дьюара для инфекционного материала длительного хранения, причем оттаивание образца осуществляется со скоростью 10°С/мин.
Приведем пример практической реализации предложенного способа.
В приведенной таблице 1 "Показатели концентрата пуповинной крови при выделении гемопоэтических стволовых клеток" показаны количественные изменения показателей концентрата пуповинной крови при выделении гемопоэтических стволовых клеток при двух различных способах криоконсервирования. Различие рассмотренных способов криоконсервации образцов заключается в заданной скорости оттаивания на программируемом замораживателе Кгуо 560-16 ("PlanerPlc". Великобритания). В первом способе скорость оттаивания составляла 15°C/мин, во втором - 10°C/мин. Из приведенной таблицы видно, что при криоконсервировании предложенным нами способом жизнеспособность клеток достоверно повысилась в среднем на 4.46% по сравнению с применяемым ранее способом криоконсервации гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.
В исследование были включены 85 образцов концентрата лейкоцитарной фракции пуповипной крови. Перед замораживанием выделение лейкоцитарной фракции проводилось на аппарате SepaxSlOO (Biosafe, Швейцария). Криопакет (Pail. США) с концентратом и криопротектором (раствор ДМСО 10%) замораживался упакованный в термоусадочный пакет (Thermogenesis, США). Первый способ замораживания концентрата осуществлялся в программируемом замораживателе Сгуо 560-16 (Planer. Великобритания) по следующей схеме (Hubeletal.. 2003 [6], в модификации Покровского банка стволовых клеток (Патент №2416197. Приоритет изобретения от 11 декабря 2009 г. )):
1) стартовая температура +4°C - удерживается в течение 10 минут;
2) образец охлаждается со скоростью - 1°C/мин до -12°C;
3) образец охлаждается со скоростью 15°С/мин до -60°C:
4) образец нагревается со скоростью 15°С/мин до -18 С;
5) образец охлаждается со скоростью - 1°С/мин до 60°С;
6) образец охлаждается со скоростью - 3°С/мин до -100°С.
Второй способ производился по следующей программе:
1) стартовая температура +4°С - удерживается в течение 10 минут;
2) образец охлаждается со скоростью -1°С/мин до -12 С;
3) образец охлаждается со скоростью -20 С/мин до 60 С;
4) образец нагревается со скоростью 10°С/мин до -18 С;
5) образец охлаждается со скоростью -1°С/мин до -60°С;
6) образец охлаждается со скоростью -3°С/мин до -100°С.
После размораживания все образцы обрабатывали (отмывали от криопротектора - раствор ДМСО 10% (Pall, Великобритания)) и проводили исследование качественных показателей.
+
+
Во всех образцах определялось количество ядерных клеток, абсолютное количество CD34/CD45 клеток и жизнеспособность в концентрате лейкоцитарной фракции до замораживания, после размораживания и отмывки клеток от криопротектора.
+
После размораживания и отмывки от криопротектора концентрата лейкоцитарной взвеси проводился подсчет количества ядерных клеток при помощи гематологического анализатора «ACTdiff 2» BeckmanCulter («BeckmanCulter», США), и количества и жизнеспособности CD34/45 клеток на проточном цитометре СуtomixFС500 (BeckmanCoulter).
Статистическая обработка данных осуществлялась по параметрическим статистическим методикам. Результаты представлены в виде М±m, где М - среднее арифметическое, m - стандартная ошибка среднего. Достоверными считались результаты при р<0,05. Статистический анализ полученных данных проводился с использованием пакета прикладных программ Microsoft Office Excel 2003 для Windows 2003 версия 1.0, IBM SPSS Statistics версия 19.0.
На графике "Зависимость температуры образца гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови от времени криовоздействия" представлепакривая замораживания концентрата пуповинной крови. По оси абсцисс задана продолжительность замораживания, по оси ординат - температура образца гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.
Выделение лейкоцитарной фракции с гемопоэтическими стволовыми клетками из образца пуповинной крови проводится методом автоматической сепарации на аппарате SepaxS100 (Biosafe, Швейцария) с использованием седементирующего средства гидроксиэтилкрахмала (ГЭК). С целью сохранения максимального количества гемопоэтических стволовых клеток при замораживании в фазе кристаллизации используют протектор, обладающий ограждающей способностью, диметилсульфоксид. Предварительно в него добавляется раствор декстран для уменьшения токсичности раствора. Криопротектор - расвор 55% демитилсульфоксида с 5% декстран 40 - вводят в клеточную взвесь с гемопоэтическими стволовыми клетками. Дальнейшее механическое перемешивание и охлаждение до температуры 4°С производят на аппарате для перемешивания CollMixAS-210 (Швейцария). По окончании процесса перемешивания из криопакета с содержимым выпускают воздух и часть клеточной взвеси, закрывают его и запаивают в нескольких местах трубку, идущую к нему, в аппарате для запаивания термоусадочного пакета «CryoFlex» (Nunc, Дания), создавая тем самым так называемые "спутники". В качестве криопакета используется система для сбора и хранения пуповинной крови MacoPharma (Франция).
Криопакет с клеточной взвесью, стволовыми клетками и криопротектором (образец) маркируют индивидуальным штрих-кодом с указанной концентрацией содержимого, условием хранения, состава криопротектора, даты криозаморажнвания и названия банка, осуществляющего и сохраняющего стволовые клетки.
После криопакет с содержимым упаковывают в специальный термоусадочный пакет - "CryoFlex" (Nunc, Дания), помещают его с криопакетом в кассету для программного замораживания и размещают в программируемый замораживатель - PlanerKryo 560-16 ("PlanerPlc.", Великобритания). Замораживание осуществляется по специальной программе, заданной программируемому замораживателю. Начальную температуру в замораживателе устанавливают равной +4°С и удерживают в течение 10 минут. На первом этапе замораживания лейкоцитарный концентрат с гемопоэтическими стволовыми клетками и криопротектором охлаждают со скоростью 1°С до температуры -12°С. На втором этапе охлаждения образец охлаждают со скоростью 15°С до температуры -60°С. Для компенсации выброса латентного тепла, что приводит к кратковременному повышению температуры, процесс оттаивания происходит со скоростью 10°С/мин до температуры -18°С. Данный процесс дает большую возможность обойти точку кристаллизации путем уменьшения градиента температур для увеличения жизнеспособности гемопоэтических стволовых клеток как в процессе замораживания, так и после размораживания. На третьем этапе после оттаивания образец охлаждается со скоростью 1°С/мин до температуры -60°С, в конце процесса замораживания, на 4 этапе, образец охлаждается со скоростью -3°С/мин до температуры -100°С. Данные по процедуре замораживания регистрируют в протоколе программного замораживания образца с гемопоэтическими стволовыми клетками. После замораживания в программируемом замораживателе криопакет с лейкоцитарным концентратом гемопоэтических стволовых клеток и криопротектором помещают в криокоробку с последующим размещением в карантинном сосуде Дьюара с жидким азотом. Образец находится в карантинном сосуде Дьюара до предоставления результатов тестов на наличие или отсутствие инфекционных агентов, бактериологической и грибковой контаминации. По прошествии карантинного срока хранения и при условии отрицательных результатов тестирования замороженный образец помещают на длительное хранение в сосуд Дьюара с жидким азотом при температуре не ниже -150°С.
Результаты всех исследований, характеризующие образец заготовленной клеточной взвеси с гемопоэтическими стволовыми клетками пуповинной крови и раствором криопротектора, все действия, осуществляемые с данным образцом, такие как изъятие образца, изменение локализации образца, вносят в базу данных предприятия "ООО Покровский Банк Стволовых клеток" и базу данных FreezerWork под единым идентификационным номером образца.