Дормантные формы клеток и споры: кинетическая теория клеточных превращений

Дормантные формы клеток и споры: кинетическая теория клеточных превращений

Сыроешкин А.В.

(1)Государственный океанографический институт, (2)Учебно-исследовательский центр «Живое вещество», (3)Российский Университет Дружбы Народов, медицинский факультет, (4)ГНЦ "Институт прикладной микробиологии"

Рассмотрены современные представления о некультивируемых и метаболически неактивных формах бактерий и эукариотических клеток. Описаны изменения морфометрических и биохимических параметры при переходах клеток в споровое и дормантное состояния. Проведен обзор маркеров переходов при указанных процессах. На основании кинетики [Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В., 1990; Ершов Ю.А., 1997] развития клеточных культур и теории стационарных процессов сформулирована кинетическая теория клеточных превращений. Показано наличие промежуточного состояния при процессе гибели однолеточного модельного организма - инфузории Spirostomum ambigua, переход в который из любой стадии клеточного цикла обратим. Данное промежуточное состояния S. ambigua охарактеризовано с помощью статистического трехмерного морфометрического типирования клеток [Плетенев С.С. и др., 1998, 2000]. Для объяснения нарушения закона стационарных потоков в спорах предложен кинетический механизм осциллирующих споровых форм и мембранных футильных циклов. На основании кинетической теории клеточных превращений объяснены особенности разработки комбинированной химиотерапии при лечении различных инфекционных заболеваний, в частности, туберкулеза.

Введение

Хорошо известно, что клетка может существовать в нескольких морфофункциональных формах, отличающихся другу от друга метаболической. Такие отличия вызваны как чередованием форм в клеточном цикле, так и процессами старения и

гибели, спонтанной или индуцируемой [1]. Характерной особенностью большинства клеточных форм, как эукариот так и прокариот, является наличие детектируемой (по теплопродукции, дыханию или превращению субстрата) метаболической активности, в том числе и при внутриклеточном паразитировании [2]. Однако имеются два типа состояния клеток, для которых отмечена полная блокировка как основных путей катаболизма (например, окисления углеводов [3]), так и путей синтеза специфических факторов (например, факторов вирулентности [4]). Это споры и дормантные формы бактерий и эукариот. Ниже мы приведем краткий обзор, касающийся некультивируемых форм клеток, где будут описаны их известные характеристики. Так как клетка является стационарной системой, то явление спорообразования как бы нарушает закон стационарных потоков. Для объяснение этого противоречия нами предложена кинетическая гипотеза чередования клеточных форм.

Характеристика дормантных и споровых состяний. Основное отличие спор и дормантных форм бактерий заключается в формобразовании: хорошо известно, что у споровых форм резко изменены размеры тогда как дормантные формы имеют меньшие морофометрические отличия от стандартных форм [3]. Некультивируемые клеточнные формы описаны для бактерий, грибов и простейших и представлены двумя основными разровидностями, в значительной степени отличающимися друг от друга по морфологическим и функцирнальным характеристикам. Соответственно, в дальнейшем мы будем различать а) споры как резко морфологически видоизмененные клетки [5] и б) клетки в дормантном состоянии, морфологически сходные с культивируемыми формами, проходящими клеточный цикл, но функционально отличающиеся от последних. Уменьшение линейных размеров некультивируемых форм по сравнению с обычными клетками описано для Campylobacter jejuni [6], Yersenia pseudotuberculosis [5], Bacillus subtillis [7]. Споры, как правило, характеризуются округлой формой, уменьшенным размером клетки, увеличенной плотностью цитоплазмы и увеличенным объемным отношением цитоплазмы к ядру [5]. Клетки в дормантном состоянии, образующиеся, например, у дрожжей при азотном голодании (т. е. клетки, вышедшие из клеточного цикла в состояние G0), сохраняют метаболическую активность, несмотря на присутствие морфологических изменений в ядре и цитоплазме [8]. Такие клетки существенно отличаются от активно делящихся форм по устойчивости к heat-шоку [9]. В условиях недостатка или отсутствия кислорода для клеток Mycobacterium tuberculosis и M. bovis в дормантном состоянии характерна сильно утолщенная клеточная стенка, в особенности ее наружный слой [10].

Кроме того, выявляется высокий уровень экспрессии белка, ассоциированного с оболочкой клетки. Этот белок с массой 16 кДа гомологичен а-кристаллину и играет стабилизирующую роль для клеточных структур.

При образовании спор может происходить значительная морфофункциональная перестройка, сопровождающаяся изменением в химическом составе клетки. Так, при споруляции Bacillus subtillis в условиях голодания бактерии делятся на две неравные клетки [7]. Более крупная материнская клетка поглощает меньшую, так называемую предшественницу споры, которая подрастает внутри материнской и, в конце концов, высвобождается сформированная спора. Такие видоизменения обусловлены генетически и зависят от активности сигма-фактора, контролирующего РНК-полимеразную активность. Интересно, что пул мРНК в некультивируемых клеточных формах практически не изменен. что показано как для грибов (спорангиоспоры Mucor racemosus [11]), так и для низших ракообразных (эмбрионы Artemia franciscana [12]). Так как подобное явление характерно для столь различных групп организмов, можно высказать предположение о его универсальности.

Для Mycobacterium smegmatis недавно идентифицирован первый фермент - L-аланин дегидрогеназа, активность которого резко повышается (в три раза) при переходе в дормантное состояния после терминации аэробного роста [13]. Этот фермент общий для M. smegmatis и M. tuberculosis, у последнего он был сначала идентифицирован как характерный 40-кДа антиген. Увеличение специфической активности связано, по-видимому, со стабилизацией соотношения NAD+/NADH в условиях недостатка кислорода как терминального акцептора.

Маркеры перехода в дормантное состояние. Известно, что клетки в дормантном состоянии значительно отличаются от культивируемых форм по своему химическому составу. Так споры Dictiostellium discoideum отличаются высоким содержанием трегалозы (50 мМ), глутамина (73 мМ) и глутамата (20 мМ) [14]. При активации спор концентрация этих компонентов сильно понижается, иногда до полного исчезновения трегалозы, в то время как концентрация и состав свободных метаболитов остаются практически неизменными. Напротив, содержание нуклеотидов в дормантных формах сильно понижено. Корме того, половина молекулы актина споры находится в фосфорилированной форме, что приводит к значительному понижению двигательной активности клеточных органелл и циркуляции гиалоплазмы [15]. Таким образом, переход клеток из активного состояния в дормантное и обратно может быть маркирован присутствием характерных компонентов. Так в спорах B. cereus присутствует термоустойчивый кальций-связывающий белок с массой 24 кДа [16].

Сравнение культуры M. smegmatis, растущей в аэробных условиях, с анаэробными дормантными формами выявляет присутствие у последних гистон-подобного белка с массой

Кинетическая теория клеточных превращений

Недавно Ершовым Ю.А. предложена квазихимические модели роста биологических популяций [18] на основе математического аппарата кинетики цепных реакций, позволяющая отобразить действие химических соединений на развития популяций различного иерархического уровня - от клеток до биоценозов. Данные модели адекватно описывают кривые роста различных популяций, а также действие ингибиторов и промоторов роста. Результаты этой и других работ [19] позволяют констатировать применимость квазихимических моделей к описанию клеточных процессов. С нашей точки зрения, основа удачного применения этих моделей состоит в адекватности представлений клетки как мультиферментного химического реактора. В соответствии с этим деление клетки или ее гибель есть интегральное отражение усиления или прекращения тех или иных ферментативных химических процессов. Таким образом, для узкого, в иерархическом плане, описания клеточных превращений можно использовать аппарат и идеологию химических уравнений [18], в частности, уравнений ферментативных процессов. Последние характеризуются рассмотрением промежуточных состояний - комплексов фермента с субстратами/продуктами реакции, а также изменением конформационного состояния фермента и фермент-лигандных комплексов. Такой подход применим для описания клеточных превращений. Рассмотрим в качестве примера рост культуры клеток инфузории P. caudatum [20] (рис. 1):

27 кДа [17].

N, 60

-1

мл

30

90

Рисунок 1. Рост Paramecium caudatum в среде, содержащей сульфат никеля в концентрациях 0 мкм (1), 10 мкМ (1) и 20 мкМ.

0

10

20

30

Время, дни

Видно, что после 10 дней роста предстационарная фаза роста с преобладанием деления клеток над гибелью, сменяется стационарной фазой роста культуры, когда два процесса -деление и гибель уравновешивают друг друга. Одновременное протекание обоих процессов подтверждается как визуальным наблюдением, так и незначительными осциллирующими колебаниями численности. Соответственно, минимальная кинетическая модель выглядит следующим образом:

где fd - частота деления, £и - частота смерти. Статистические частоты данных процессов имеют размерность и близки по смыслу вероятности события к константе скорости химической реакции первого порядка. В присутствии токсиканта обязательно изменение либо частоты деления, либо частоты смерти, либо обеих величин. При уменьшении fd, £п -возрастает, что должно привести к новому стационарному состоянию (рис. 1, кривые 2,3). Но в соответствии с уравнением (1) fd и ^ должны одновременно либо увеличиваться, либо уменьшаться. Налицо противоречие, которое в практике химической кинетики требует усложнения кинетической схемы, как-то введение в процесс гибели промежуточного состояние. Переход исходной клетки в промежуточное состояние - обратим и характеризуется соотношением частот переходов £Я+=Кр. При этом собственно процесс гибели, протекающий с частотой £п - необратим. Приведем данную схему к стандартному виду михаэлисовской кинетики [21], когда £и много меньше £ или f+:

и

(1),

/т

>

>

При таком усложнении до двухстадийного процесса гибели уравнение для наблюдаемой частоты гибели будет иметь следующий вид:

°Ь%=fm / {1+Kp} (2),

где собственно частота смерти fm - константа, а Kp - есть функция от L (концентрация токсиканта), так как частоты переходов k+ и k- будут зависить от L. В соответствии с михаэлисовской моделью ферментативного катализа предположим, что Kp(L)=K'p/L, то есть только k+ - есть функция от L вида k+=k'+L.

Данная кинетическая модель гибели клетки, включающая обратимое образование промежуточного состояния, была апробирована на культуре клеток свободноживущей в объемной фазе среды инфузории S. ambigua. Принимая во внимание, что промежуточное состояние, предшествующее необратимым некротическим стадиям, должно характеризоваться изменением линейных размеров клетки [22], мы исследовали распределениям клеток по размеру и форме [23].

Рисунок 2. Действие токсикантов на формообразование (А) и кинетику гибели (В) инфузории S. ambigua. Кривые объемного распределения культуры клеток были получены с помощью лазерного дифракционного определителя размеров частиц (particle sizer) Malvern 3600 Ec: белые кружки соотвествуют контрольной культуре в отсутствии токсикантов (общее число клеток - 1000, концентрация 100 клеток / мл); концентрации токсикантов -5% ДМСО (черные кружки), 20 мМ сульфаметаксазол (черные квадраты). . Ось ординат-линейные размеры ширины клеток S.ambigua. Кинетику гибели исследовали для сульфаметаксазола. Все исследования проведены при 20 оС.

о4

12

щ &

СО

10-

8-

6-

4-

2-

B

10

100

80

120

160

200

Размер клеток,(г) мкм

Концентрация, мМ

8

4

0

0

Было обнаружено, что при действии токсиканта происходит изменение линейных размеров клеток S. ambigua. Оно выражалось в появлении новой субпопуляции, детектируемой как с

помощью статистической морфометрии по данным лазерной дифракции (рис. 2А), так и микроскопически. Кинетика токсикант-индуцируемой гибели инфузории также подчиняется уравнению (2), так как время жизни Ts обратно пропорционально частоте смерти fm, и. соответственно, Ts уменьшается по гиперболической зависимости при увеличении L (рис. 2В). Более того, введение при процессе гибели промежуточного состояния означает, что смерть клетки должна проходить при активации процесса деструкции клеточного химического реактора с затратой энергии. Действительно, оказалось, что кинетика гибели S. ambigua очень сильно зависит от температуры (рис. 3А), причем для однокомпонентных систем токсикантов эта зависимость линеаризуется в аррениусовских координатах с формальным значением энергии активации 156±21 кДж/моль (рис. 3B).

s =

а

0,0 -0,4 -0,8

18 20 22 24 26 28 Температура, оС

-1,2

3,32 3,36

3,40 3,44

1/T, K-1

Рисунок 3. Температрная зависимость кинетики гибели тест-культуры S. ambigua в 10% ДМСО: прямые (А) и аррениусовские (В) координаты .

Рассмотрим, какое место в предложенной кинетической схеме могут занять споровые состояния с точки зрения модели клетки как стационарного химического ферментативного реактора. Это могут быть формы, образующиеся как из основного, так и из промежуточного (активационного) состояния клетки подобно образованию фермент-ингибиторного комплекса (рис. 4, стадии 3,4). Действительно, для споровых форм в обзоре описана блокировка метаболических путей. Причем, если образование метаболически неактивного

состояния (спорового или дормантного) происходит быстро, то это соответствует кинетике обратимого ингибирования фермента, если медленно и f4_ << f+, £) - кинетике гистерезисного ингибирования [21, 24].

Рисунок 4. Квазиферментативная кинетическая схема клеточных превращений при лиганд-зависимой гибели (стадии 1,2) и образовании неактивных форм (стадии 3,4). Исходная клетка является участником клеточного цикла. Стадия 5 - осциллирование дормантных (споровых) форм. Каждой стадии п сопоставляется частота (константа скорости) прямого и обратного процесса/п.

пЬ

о\

ч

/-

КР=///+

/т, медленно

/Ч/Ч/У^-

2

А

I

4 О

( и

О

1

4

3

Блокировка метаболических путей возможна в двух случаях. Первый - при остановке входящего потока субстратов, например, вследствие изменения строения клеточных оболочек. Во втором случае нарушение закона стационарных потоков возможно, когда накопление промежуточного продукта не приводит к токсическим эффектам. Так, например, прерывание азотного метаболизма [12] приводит лишь к накоплению пула мРНК при отсутствии синтеза белка. Для процессов, приводящих к генерации потенциала на мембране, полностью прервать стационарное течение реакций невозможно. Снятие потенциала на мембране можно приравнивать к смерти клетки, вследствие нарушения ионных градиентов с окружающей средой или гистерезисного ингибирования Ддн+-зависимых ферментов. Так,

например, сброс потенциала приведет к квазинеобратимому (обратимому только in vitro) гистерезисному ингибированию I комплекса [25] и F1-ATPазы [26, 27]. Для экономии расхода запаса углеводов (для дышащих гетеротрофов) или иных источников энергии, а также для преодоления проблемы блокировки стационарных, использующих мембранный потенциал, реакций необходимы ввести в квазиферментативную схему клеточных превращений осциллирующие состояния (смена устойчивых стационарных состояний). Осциллирующие состояния на уровне клетки (стадии 5, рис. 4) отражают два состояния спор, превращающихся друг в друга. Этот процесс позволяет сохранить стационарные потоки с минимальным расходом энергии вследствие обеспечения холостых метаболических циклов без входных/выходных потоков - футильных циклов. Подобные превращения неактивных фермент-ингибиторных комплексов описаны для мебранносвязанных ферментов [25, 28]. На уровне мебранных ферментных систем также возможна организация футильных циклов за счет перераспределения пулов ферментов на потенциал-генерирующие и потенциал-потребляющие, что в принципе возможно для F1•FO-ATPaзы и NADH-убихинон оксидоредуктазы [26]. Схема образования метаболически неактивных форм, включающая их осциллирование, в практическом плане утверждает необходимость комбинированной химиотерапии инфекционных возбудителей, способных к образованию дормантных, споровых и иных форм, так как использование только одного вида лекарственного препарата открывает возможность выживания возбудителей инфекций и инвазий за счет превращений по путям 3,4,5, изображенных на рис. 4. Литература:

1. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле. - М.: KMK Scientific Press, 1997. - 144 c.

2. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. - М.: Медицина, 1999. - 366 с.

3. Хочака П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. - М.: Мир, 1988. - 568 с.

4. Туберкулез/под ред А.Г. Хоменко. - М.: Медицина, 1992. - 312 с.

5. Pushkareva V.I., Emel'ianenko E.N., Didenko L.V., Konstantinova N.D., Ponomareva L.V., Litvin V.iu., Gintsburg A.L. Dormant forms of Yersenia pseutuberculosis during interaction with green algae and their exometabolites// Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. - 1998. - №5. -P. 9-13.

6. Bovill R.A., Mackey B.M. Resuscitation of 'non-culturable' cells from aged cultures of Campylobacter jejuni // Microbiology. - 1997 -V. 143. - P. 1575-1581.

7. Kroos L., Zhang B., Ichikawa H., Yu Y.T. Control of sigma factor activity during Bacillus subtilis sporulation// Mol. Microbiol. - 1999 -V. 31. - P. 1285-9124.

8. Su S.S., Tanaka Y., Samejima I., Tanaka K., Yanagida M. A nitrogen starvation-induced dormant G0 state in fission yeast: the establishment from uncommitted G1 state and its delay for return to proliferation// J. Cell. Sci. - 1996 - V. 109. - P. 1347-1357.

9. Beaman T.C., Pankratz H.S., Gerhardt P. Heat shock affects permeability and resistance of Bacillus stearothermophilus spores// Appl. Environ. Microbiol. - 1988 - V. 54. - P. 2515-2520.

10. Cunningham A.F., Spreadbury C.L. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wallthickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog// J. Bacteriol. - 1998- V. 180. - P. 801-808.

11. Linz JE, Orlowski M. Regulation of gene expression during aerobic germination of Mucor racemosus sporangiospores// J. Gen. Microbiol. - 1987 - V. 133. - P. 141-148.

12. Hofmann G.E., Hand S.C. Comparison of messenger RNA pools in active and dormant Artemia franciscana embryos: evidence for translational control// J. Exp. Biol. - 1992 - V. 164. P. 103116.

13. Hutter B, Dick T. Increased alanine dehydrogenase activity during dormancy in Mycobacterium smegmatis// FEMS Microbiol. Lett. - 1998 - V. 167. - P. 7-11.

14. Klein G., Cotter D.A., Martin J.B., Satre M. A natural-abundance 13C-NMR study of Dictyostelium discoideum metabolism. Monitoring of the spore germination process// Eur. J. Biochem. - 1990 - V. 193. - P. 135-142.

15. Kishi Y., Clements C., Mahadeo D.C., Cotter D.A., Sameshima M. High levels of actin tyrosine phosphorylation: correlation with the dormantstate of Dictyostelium spores// J. Cell Sci. - 1998 -V. 111. - P. 2923-2932.

16. Shyu Y.T., Foegeding P.M. Purification and some characteristics of a calcium-binding protein from Bacilluscereus spores// J. Gen. Microbiol. - 1991 - V. 137 - P. 1619-1623.

17. Lee B.H., Murugasu-Oei B., Dick T. Upregulation of a histone-like protein in dormant Mycobacterium smegmatis// Mol. Gen. Genet. - 1998 - V. 260. - P. 475-479.

18. Ершов Ю.А. Квазихимические модели роста биологических популяций под действием ингибиторов и промоторов// Ж. физ. химии. - 1998 - Т. 72. - № 3. - С. 553-559.

19. Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Биотехнология. Кинетические основы микробиологических процессов. - М.: Наука, 1990. - 260 с.

20. Ershov Yu.A., Pleteneva T.V., Siniuk T.F., Dolgopolova V.A. Determination of growth parameters of the Paramecium caudatum test-systemduring standardization of studies of biological activity of chemicals// Biull. Eksp. Biol. Med. - 1999 - V. 127. - P. 717-720.

21. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. - М.: Мир, 1990. - 350 с.

22. Сыроешкин А.В., Синюк Т.Ф., Лебедев И.М., Плетенева Т.В., Кирьянов С.В. Изучение антагонизма в токсическом действии ионов меди и цинка в водных растворах// Метеорология и гидрология. - 2000 - № 10. - C. 55-61. http://mig.mecom.ru/mig/Annot/00-11 ann7r.html.

23. Плетенев С.С., Сыроешкин А.В., Гребенникова Т.В., Плетенева Т.В Способ диагностики заболеваний по распределению клеток по размерам и форме. Патентная заявка № 99125492/14(027369) в Федеральном институте промышленной собственности Роспатента. Приоритет от 08.12.99. Положительное решение экспертизы по существу от 17.08.2001.

24. Сыроешкин А.В., Галкин М.А., Седлов А.В., Виноградов А.Д. Кинетический механизм

2+

реакции гидролиза АТР митохондриальной F1-FO АТРазой: участие ионов Mg в гидролизе комплекса Mg*ATP// Биохимия. - 1999. -Т. 64. - Вып. 10. - С. 1337-1347. http://www.protein.bio.msu.su/biokhimiya/contents/v64/full/64101337.htm+

25. Maklashina E.O., Sled' V.D., Vinogradov AD. Hysteresis behavior of complex I from bovine heart mitochondria: kinetic andthermodynamic parameters of retarded reverse transition from the inactive toactive state // Biokhimiia. - 1994. -V. 59. - Вып. 7. - P. 946-957.

26. Syroeshkin A.V., Vasilyeva E.A., Vinogradov A.D. ATP synthesis catalyzed by the mitochondrial F1-FO ATPase is not reversal of its ATPase activity// FEBS Lett. - 1995 - V. 366. - P. 29-32.

27. Галкин М.А., Сыроешкин А.В. Кинетический механизм реакции синтеза АТР, катализируемой митохондриальной F1-FO АТРазой// Биохимия. - 1999 - Т. 64. - Вып. 10. -С. 1393-1403.

+ 2+

28. Buligin V.V., Syroeshkin A.V., Vinogradov A.D. Nucleotide/H -dependent change in Mg

affinity at the ATPase inhibitory site of the mitochondrial F1-FO ATPase// FEBS Lett. - 1993 -V. 328. - P. 193-196.