УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРОЦЕССОВ ПИЩЕВАРЕНИЯ В РУБЦЕ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ IN VITRO

Полезная модель относится к экспериментальной ветеринарии и физиологии животных, предназначена для моделирования физиологических и патофизиологических ситуаций в полости рубца у жвачных животных, может быть использована для изучения процессов пищеварения и механизмов их нарушений, оценки переваримости, биологической активности и безопасности кормов, фармакологических свойств и токсичности кормовых добавок и лекарственных средств.
Рациональное сочетание экономически приемлемого кормления и физиологических возможностей пищеварительной систем животных является одним из основных условий сохранения их здоровья, максимального проявления генетически обусловленного потенциала продуктивности и продолжительности жизни. Результатом эволюции пищеварительного тракта жвачных стал многокамерный желудок, приспособленный к переработке большого количества грубого растительного корма, в состав которого входит большое количество клетчатки. Сформированная при этом пищевая ниша обеспечила выживание их в дикой природе, а в сельском хозяйстве, создание перспективного направления животноводства со сравнительно низкой себестоимостью производства. В многокамерном желудке жвачных происходят сложные процессы симбионтного и полостного пищеварения, в результате, частично деструктурированные корма и биомасса микроорганизмов образуется питательная субстанция, приемлемая для метаболизма в последующих отделах желудочно-кишечного тракта. Преджелудки выполняют барьерную функцию, в их полости синтезируются витамины и другие, биологически активные вещества. При этом следует отметить, что многие процессы пищеварения в рубце не известны или недостаточно изучены. Так, активно ведутся поисковые исследования процессов образования в полости рубца антибиотиков, метана, кислорода и др. метаболитов. Многогранный спектр функций преджелудков обуславливает сравнительно высокий уровень их чувствительности к экзогенным и эндогенным факторам с соответствующим риском их нарушений, что указывает на необходимость контроля и при необходимости корректировки работы рубца. Актуальность исследования процессов пищеварения в преджелудках подтверждается большим количеством научных публикаций, изобретений и методической литературы (Тараканов Б.В. Методы исследования микрофлоры пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и птицы по данной теме. - Боровск, ВНИИФБиП с. -х. животных, 1998, 142 с., Нормы содержания микрофлоры в рубце крупного рогатого скота: методические рекомендации / Г.Ю. Лаптев, Н.И. Новикова, Л.А. Ильина и др. - Санкт-Петербург: Биотроф, 2016, 48 с.). Предлагаемые методы исследования процессов пищеварения в рубце можно разделить на две основные категории: методы in vitro и методы in vivo.
Наиболее широкие возможности проведения исследований имеет первая категория методов, в основе которых лежат различные технические решения, стремящиеся максимальном объеме воспроизвести работу рубца жвачных животных.
Данная модель позволяет провести исследования с соблюдением гуманного отношения к животным и принципов биоэтики, при этом без ущерба наукометрических показателей.
Известен патент (Искусственный рубец. SU 1336089 А1. Опубликован 09.07.1987) на конструкцию, включающую в себя емкость для раствора пищеварительных ферментов с вращающейся крышкой на которой закреплены прищепы для фиксации пакетов с пробами кормов. Данное техническое решение моделирует моторную функцию рубца, а питательные растворы, вносимые в емкость, создают необходимую ферментативную активность для воспроизведения процессов полостного пищеварения, что соответствует задаче данного изделия - оценка переваримости кормов. Однако, данная конструкция не имеет возможности удаления кислорода из питательной среды, отбора проб содержимого без нарушения герметизации емкости, что исключает возможность воспроизведения симбионтного пищеварения, т.е., создания условий для роста и размножения микрофлоры рубца.
Предложена конструкция «Искусственный рубец KPL 01» (Лампертер В. Методика проведения исследований in vitro с применением «Искусственного рубца KPL 01»/В.Лампертер. - ГДР, 1984. - 8 с.), в которой также пробы кормов размещались в общей емкости, что затрудняло объективную оценку переваривания конкретного корма, поэтому данная разработка была модернизирована (Патент на полезную модель РФ №106956. Устройство для исследований in vitro // К.Г. Логачев, С.А. Мирошников, А.Г. Мещеряков. Опубликовано 27.07.2011 г.). Разделив общую емкость на несколько камер, была создана возможность увеличить производительность оборудования. Авторы также предлагают проведение исследований не только с питательными (ферментативными) смесями, но и с содержимым рубца, полученным от животных. Однако в данной конструкции нет возможности создания анаэробных условий, что исключает имитацию физиологических условий. Поэтому «Искусственный рубец KPL 01» приемлем для проведения краткосрочных исследований качества кормов, но соответствует требованиям оборудования для экспериментов по моделированию микробиоты и созданию патологических изменений среды в рубце, по оценке токсичности и фармакологической эффективности лекарственных средств и кормовых добавок.
Компания ANKOM Technology (США) разработала несколько приборов ориентированных на проведение анализа качества кормов, в том числе инкубатор DAISY (Daisy Incubator), представляющий собой термостатическую камеру, в которой находятся четыре банки, внутренняя полость которых разделена щелевой перегородкой на две зоны, в которые вносят рубцовое содержимое от животных-доноров, буферные растворы и пакеты с образцами кормов. Банки вращаются вокруг своей оси, а наличие щелевой перегородки обеспечивает дополнительное перемешивание. Оценку деструкции кормов проводят на основании сравнении их анализа до и после их инкубации в течение 48 часов. Недостатком данного устройства является ограниченность его технологических возможностей - только для анализа переваримости кормов и не предназначена для проведения экспериментальных исследований в течение длительного времени.
Наиболее близким решением по назначению и технической сущности являются два следующих варианта конструкции. Во-первых, это система моделирования рубца (RUSITEC) Черкавского и Брекенриджа (1977), которая состоит из емкости-ферментатора, механизма перемещения (верх-вниз) контейнера с кормами со скоростью 6 раз в минуту и системы рециркуляции питательной и буферной жидкости. Недостатком данной системы является сложность конструкции, которая постоянно подвергается воздействию света с соответствующим риском синтеза хлорофилла, повышенная скорость перемещения камеры с кормами (6 сокращений/мин), что не согласуется с параметрами нормального сокращения рубца (2-4 сокращения в течение 2 минут), постоянный риск нарушения герметизации по причине использования для этой цели вазелина, отсутствие отбора проб содержимого в процессе эксплуатации прибора из средней, наиболее активной зоне ферментатора (Czerkawski, J. W., and Breckenridge, G. (1977). Design and development of a long-term rumen simulation technique (Rusitec). Br. J. Nutr. 38, 371-384. doi: 10.1079/bjnl9770102; Brede M, Orton T, Pinior B, Roch F-F, Dzieciol M, Zwirzitz B, Wagner M, Breves G and Wetzels SU (2020) PacBio and Illumina MiSeq Amplicon Sequencing Confirm Full Recovery of the Bacterial Community After Subacute Ruminal Acidosis Challenge in the RUSITEC System. Front. Microbiol. 11:1813. doi: 10.3389/fmicb.2020.01813; Wetzels, S. U., Eger, M., Burmester, M., Kreienbrock, L., Abdulmawjood, A., Pinior, В., et al. (2018). The application of rumen simulation technique (RUSITEC) for studying dynamics of the bacterial community and metabolome in rumen fluid and the effects of a challenge with Clostridium perfringens. PLoS One 13:e0192256. doi: 10.1371/journal.pone.0192256).
Вторым прототипом является система «Искусственный рубец», состоящая из ферментатора, на крышке которого расположен мотор с редуктором и выводные патрубки для отбора проб содержимого, выведения избытка газов, введения углекислого газа и раствора для коррекции рН среды. Мотор ферментатора соединен с контейнером для кормов, который в рабочем состоянии весь погружен в инкубируемую жидкость и вращается со скоростью 2 оборота в минуту (Алехин Ю.Н., Лебедева А.Ю. Экспериментальное исследование влияния уровня кислорода в содержимом рубца на микрофлору и процессы пищеварения в его полости Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2018. - №3. - С.200-203. Алехин Ю.Н., Лебедева А.Ю. Экспериментальное исследование влияния изменений кислотности на рубцовое пищеварение / Ученые записки учреждения образования Витебская ордена Знак почета государственная академия ветеринарной медицины. 2018. Т. 54. №4. С.9-12). Недостатком данного технического решения является отсутствие внешней системы терморегуляции, обеспечивающей быстрое прогревание ферментаторов и их защиту от света. Помимо этого, несмотря на вращение контейнера с кормами в нижней части ферментатора формировался осадок, который на 3-5 сутки подвергается гнилостному разложению. Общим недостатком обеих прототипов является сбои работы системы отвода избытка содержимого ферментатора. В системе моделирования рубца (RUSITEC) буферный раствор (слюна) поступает в нижнюю часть емкости, что не соответствует физиологическому аналогу, когда слюна поступает в верхнюю зону рубца, а другие буфер растворы диффундируют через его стенку. Выведение избытка жидкости в данной модели рубца осуществляется самотеком через патрубок в верхней части ферментатора при наличии в его полости повышенного давления, что в свою очередь создает риск нарушения герметизации и закупорки патрубка твердыми частицами.
Основным достоинством выбранных прототипов является то, что они создают техническую возможность проведения длительных исследований с моделированием состава среды и микробиты в ферментаторе. Однако отмеченные недостатки снижают их имитационную близость к физиологическому прототипу. Поэтому было разработано техническое задание для разработки новой конструкции лишенных указанных недостатков.
Технический результат полезной модели заключается в создании профессионального, доступного по стоимости, со сравнительно высоким уровнем идентичности с физиологическим прототипом устройства для проведения in vitro исследований процессов пищеварения в полости рубца жвачных животных с возможностью длительного сохранения стабильности среды и жизнедеятельности микрофлоры полученной от животных-доноров с целью моделирования физиологических и патофизиологических ситуаций в полости преджелудков, оценки переваримости, биологической активности и безопасности кормов, фармакологических свойств и токсичности кормовых добавок и лекарственных средств.
Технический результат достигается тем, что в устройстве для проведения исследований процессов пищеварения в рубце жвачных животных in vitro, состоящем из стеклянной вертикальной цилиндрической емкости (ферментатор), на крышке которой установлен мотор с валом для крепления контейнера с кормами, согласно полезной модели:
для обеспечения оптимальной теплопроводности стенки ферментатора и исключения риска синтеза хлорофилла он изготовлен из темного силикатного или акрилового стекла,
в зависимости от цели исследования конструкция позволяет использовать емкость (ферментатор) разного объема (500-1000 мл), но при условии соблюдения процентного соотношения газовой и субстратной полостей, а также компонентов содержимого,
для создания герметичных условий в ферментаторе крышка имеет уплотнительную прокладку и крепится резьбовым соединением,
для обеспечения возможности отбора проб содержимого на разных уровнях ферментатора крышка оборудована тремя патрубками разной длины,
для поддержания постоянного объема содержимого в ферментаторе с помощью перистальтического насоса обеспечивается одновременно ввод буферного раствора и отвод лишнего содержимого,
для более полной имитации сократительной функции рубца (2-4 сокращения в 2 минуты) система мотор - редуктором обеспечивает вращательное движение контейнера для кормов со скоростью 2 об/мин,
пластиковый щелевого контейнера для кормов (ширина щелей 3-5 мм), имеет четыре клиновидной лопасти на внешней стороне дна для перемешивания содержимого в нижней части ферментатора и два внутренних отсека для размещения в них мешков из нейлоновой сетки с размером отверстий 1-1,5 мм,
для обеспечения возможности мониторинга количества и концентрации газов емкость для их сбора имеет монтажные отверстия и разъемы для подключения газового счетчика и газонализатора. В оригинальном варианте использовали колбу Бунзена в пробке, которой имелись отверстия и разъемы для подключения газового счетчика и газонализатора, а тубус (отведение) обеспечивал выведение излишек газов,
2
для обеспечения мониторинга показателей содержимого средней и нижней части ферментатора разработан пробосборник, представляющий собой пластиковую емкость объемом 20 мл в крышке которой имеется отверстия для электродов (рН, О, ОВП и др.) и патрубок для откачивания воздуха из ее полости с помощью шприца.
Таким образом, полезная модель решает задачу разработки устройства для проведения исследований процессов пищеварения в рубце жвачных животных in vitro, имеющее сравнительно высокий уровень функционального моделирования, широкий спектр технологических возможностей и лишенное недостатков, указанных для известных прототипов.
На фиг. 1 представлена схема системы «Устройство для проведения исследований процессов пищеварения в рубце жвачных животных in vitro»: 1 - термостат, 2 - ферментатор, 3 - контейнер для корма (два отделения 3i и 3е), 4 - мотор с редуктором и валом на котором крепится контейнер для кормов, 5 - кран трехходовой (DN3), 6 - клиновидные лопасти (4 шт.), 7 - перистальтический насос, 8 - емкость для сбора газов, 9 - емкость для буферного раствора, 10 - емкость для сбора содержимого из средней части ферментатора, 11 - штатив с пробосборниками, патрубки (DN3): а - для отвода избытка газов (a1) и отбора их проб (а2), б - для отбора проб содержимого из средней части ферметатора (1б) и отвода излишек жидкости (б2), в - для ввода буферного раствора через перистальтический насос (в1) и отбора пробы содержимого из нижней части ферментатора (в2).
На фиг. 2 предоставлена схема емкостей для сбора газов (А, на фиг. 1-8) и пробосборник (Б, на фиг. 1-11). А: 12- колба Бунзена, 13 - трехходовой кран, 14 - патрубок для поступления газов из ферментатора, 15 - мешок для сбора газов, 16 - патрубок для присоединения мерных газосборных мешков, подключения анализатора и счетчика, 17 - тубус (отведение) для выведение излишек газов. Б: 18 - емкость для сбора содержимого, 19 - электрод (рН, O2, ОВП и др.), 20 - патрубок (игла) для откачивания воздуха из емкости, 21 - патрубок для поступления содержимого из ферментатора, 22 - штатив.
Порядок применения устройства для проведения исследований процессов пищеварения в рубце жвачных животных in vitro поясняется примерами из практики:
Пример 1. Задача исследования заключается в сравнительной оценке переваримости протеина разных составов монокорма у коров. Для проведения опыта были отобраны клинически здоровые коровы 1-2 лактации, с массой тела 552,3±7,99 кг. Животные получали суточный рацион в состав, которого входили 3 кг сена люцернового, 1,5 кг соломы ячменной, силоса кукурузного 22 кг и 5 кг комбикорма (в 1 кг: ячмень 200 г, пшеница 165 г, кукуруза 250 г, шрот подсолнечный - 150 г, шрот соевый - 100 г, трикальцияфосфат - 70 г и соль (поваренная) - 65 г).
В условиях лаборатории на 8-й день опыта подготовили рабочие составы рационов, аналогичные по структуре используемых для кормления животных. Состав комбикорма: ячмень 23%, пшеница, 19%, кукуруза 29% и шрот 29%. При этом в комбикорме №1 использовали подсолнечный, а №2 - соевый шрот. Состав рациона №1: сено люцерновое - 39,5%, солома ячменная - 4,8%, силос кукурузный - 69,8% и комбикорм №1 - 15,9%. В состав рациона №2 был аналогичным, но использовали комбикорм не №1, а №2. Отобрали пробу каждого монокорма, в которой определили содержание протеина.
Подготовили два устройства для имитации работу рубца. Порядок подготовки устройства №1: в нейлоновые мешочки №1 и №2 внесли по 5,0 г высушенного рациона №1 и разместили их соответственно в секции №1 и №2 контейнера для кормов, который прикрепили к валу редуктора. В ферментатор (500 мл) внесли 150 мл раствора Мак-Доугалла [Мс Doudall E.I. Studies on ruminant saliva. I. The composition and output of sheep's saliva. Biochem. J., 1948, 43, 1: 99-109.], закрыли крышку. Собранное устройство и емкость (коническая колба) с 1000 мл раствора Мак-Доугалла поместили на 30 минут в термостат при 39,0°С. Порядок подготовки устройства №2 был аналогичен, но в мешочки №1 и №2 внесли по 5 г высушенного рациона №2.
У животных с помощью зонда отобрали по 250-300 мл рубцового содержимого, которое смешали, профильтровали через четыре слоя марли и определили рН (6,58). Внесли в ферментаторы №1 и №2 по 300 мл жидкой фракции содержимого рубца. При закрытом патрубке «б», но открытом - «а» через трубку, присоединенную к патрубку «в», в течение 2 минут пропускали сероводород для удаления кислорода. Ферментаторы и емкость с раствором Мак-Доугалла разместили в термостат с температурой 39,0°С и включить мотор. Емкость для сбора газа (8) на 1/2 заполнили стерильной дистиллированной водой, в которую опустили конец трубки (а) обеспечив свободный выход избытка газов, но исключив их обратное поступление. Через перистальтический насос подключили трубку от патрубка «в» от емкости №9 с теплым раствором Мак-Доугалла для обеспечения поступлению его в ферментатор, а трубку от патрубка «б» присоединить к емкости №10 для перекачки в нее излишек содержимого. Скорость поступления в ферментатор буферного раствора, как и скорость выведения содержимого из него были равны и составляли 14 мл/час. Длительность инкубации 48 часов.
После инкубации отобрали пробу содержимого средней части ферментатора (б1), извлекли мешочки и направили их для исследования. Кислотность содержимого ферментатора №1 составила 6,30 и №2 - 6,37. Результаты анализа монокорма представлены в таблицах 1.
Из данных таблицы видно, что в рубце метаболизируется 77,0% протеина в составе монокорма №1и 71,5% - монокорма №2.
Таким образом, монокорм №2 в состав которого входит соевый шрот в сравнении с вариантом №1 содержащий подсолнечный шрот имеет более высокую защищенность протеина в рубце и выше уровень байпас протеина, величина которого составляет соответственно 28,5 и 23,0%.
Пример 2. Задача эксперимента заключается в изучении влияния разного количества меди на процессы симбионтного и полостного пищеварения в рубце жвачных.
Для проведения опыта были отобраны 6 клинически здоровых коровы голштинской породы с массой тела 580,5±8,26 кг. В условиях лаборатории у этих животных с помощью зонда отобрали по 300-350 мл рубцового содержимого, которое смешали, профильтровали через четыре слоя марли и определили рН (6,75). В прогретые (39,0°С) ферментаторы №1, №2, 3 и №4 (объем 500 мл) внесли по 100 мл теплого раствора Мак-Доугалла, 350 мл жидкой фракции и 30 г твердой фракции (нейлоновый мешок №1) содержимого рубца, в нейлоновый мешок №2 внесли 5,25 г измельченного сена разнотравного, 1,25 г измельченного зерна ячменя. Контейнер с мешками рубцового содержимого (№1) и кормами (№2) прикрепили в валу редуктора и зарыли крышку. При закрытом патрубке «б», но открытом - «а» через трубку, присоединенную к патрубку «в», в течение 2 минут пропускали сероводород для удаления кислорода. Ферментаторы и емкости с раствором Мак-Доугалла (по 500 мл) разместили в термостат с температурой 39,0°С и включить мотор. Емкость для сбора газа (8) на 1/2 заполнили стерильной дистиллированной водой, в которую опустили конец трубки (а) обеспечив свободный выход избытка газов, но исключив их обратное поступление. Через перистальтический насос подключили трубки от патрубка «в» от емкостей №9 с теплым раствором Мак-Доугалла для обеспечения поступлению его в ферментаторам, а трубки от патрубка «б» присоединили к емкостям №10 для перекачки в нее излишек содержимого. Скорость поступления в ферментатор буферного раствора, как и скорость выведения содержимого из него были равны и составляли 14 мл/час. На второй день опыта мешочек с твердой фракцией содержимого рубца (№1) заменили мешочком (№1) с измельченными 5,25 г сена и 1,25 г ячменя. После замены корма, подготовили устройство для дальнейшей работы: 1), добавили кипяченой воды до метки фиксирующей границу субстрата (470 мл) и полости газа (30 мл); 2) при закрытом патрубке «б», но открытом - «а» через трубку присоединенной к патрубку «в» в течение 2 минут пропускали сероводород для удаления кислорода; 3) в емкость для буфера внесли (500 мл) теплый раствор Мак-Доугалла и 4) ферментаторы и емкости с буфером поместили в термостат.
На третий день опыта извлекли мешочек №2 освободили его от остатков корма, промыли водой и внесли в него 4,2 г сена и 2,8 г ячменя. Затем подготовили устройство для дальнейшей работы, как это указано при описании проводимых действий на второй день эксперимента. На четвертый день извлекли мешочек №1 и освободили его от остатков корма, промыли водой и внесли в него 4,2 г сена и 2,8 г ячменя. Затем повторили тоже, что и на второй день эксперимента. Затем подготовили устройство для дальнейшей работы, как это указано при описании проводимых действий на второй день эксперимента.
В течение последующих 8 дней проводили аналогичные манипуляции со сменой мешочков, что обеспечивало метаболизма каждой новой порции кормов в течение 48 часов. Помимо этого, ежедневно проводили подготовительные работы как это указано при описании проводимых действий на второй день эксперимента.
4
2
С 5 по 12 день эксперимента, помимо кормов в ферментатор №2 вводили 0,1%-ный раствор меди сернокислой (CuSO⋅5HO) в количестве 4,2 мл, №3 - 5,2 мл и №4 - 6,4 мл, что соответствует 1,0; 1,25 и 1,5 мкг/мл элемента. В ферментатор №1 (контроль) медь сернокислую не вносили.
Анализ содержимого ферментаторов проводили на 5 день (до введения раствора меди), 8 и 12 сутки эксперимента. При этом перед очередной заменой кормов, отключали перистальтический насос, перекрывали трехходовой кран и через патрубок б1 отдирали с помощью шприца образец содержимого. Результаты исследований представлены в таблице 2, из данных которой видно, что в течение опыта состав содержимого ферментатора №1 существенно не изменился.
Введение меди в количестве 1,0 мкг/мл не вызвало достоверных изменений содержимого ферментатора. Хотя отмечено некоторое снижение количества инфузорий (на 6,4%) через 72 часа после первого применения минерала, а на 12-й день опыта (7 дней применения меди) имело место достоверное уменьшение показателей рН (на 1,9%) и активности уреазы (на 10,2%)). Внесение в ферментатор меди в дозе 1,25 мкг/мл стало причиной уменьшения активности уреазы на 18,6%, увеличения рН на 10,2%, числа инфузорий и бактерий соответственно на 9,4 и 28,7%. Увеличение концентрации микроэлемента до 1,5 мкг/мл уже трое суток вызвало снижения уровня рН (на 12,8%), количества инфузорий (на 62,8%) и бактерий (на 24,4%), но активации уреазы (на 10,0%) и накопления токсических метаболитов (МСМ).
Таким образом, медь оказывает влияние на процессы симбиотного и полостного пищеварения в рубце жвачных. Характер и выраженность выявленного воздействия зависит от дозы микроэлемента. Применение в течение недели меди в дозе 1,0 мкг/мл не оказало достоверного воздействия на микробиоту, но повысило кислотность среды и активность полостных ферментов. В дозе 1,25 мкг/мл данный микроэлемент стимулирует рост бактерий и в меньшей степени, - инфузории, ингибирует активность уреазы, что в результате привело к некоторому повышению рН. В концентрации 1,5 мкг/мл медь нарушает процессы симбиотного и полостного пищеварения, в частности, происходит инактивация полостных ферментов и гибель микрофлоры, что сопровождается увеличением количества ионов водорода и эндотоксинов до уровня клинического ацидоза и эндогенной интоксикации.
Представленные примеры показали, что разработанное устройство может быть использовано для проведения разносторонних, краткосрочных и долгосрочных in vitro исследований процессов пищеварения в полости рубца жвачных животных.