ЛИПОСОМНЫЙ ПРЕПАРАТ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА
LIPOSOME FORMULATION SUITABLE FOR TREATING OR PREVENTING TUBERCULOSIS

Введение и предшествующий уровень техники
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к липосомным препаратам, включающим фрагменты, происходящие от штамма комплекса бактерий Mycobacterium tuberculosis, а также к суспензиям и к фармацевтическим композициям, содержащим эти препараты и к их применению в способе лечения, а в частности, лечения или предупреждения туберкулеза. Препарат согласно изобретению содержит сахарозу и/или имеет более низкий средний размер частиц, чем агенты стандартных липосомных препаратов, применяемых для лечения туберкулеза, а поэтому такой препарат имеет более высокую биологическую доступность и эффективность.
Предшествующий уровень техники
Туберкулез представляет собой хроническое инфекционное заболевание, вызываемое комплексом бацилл Mycobacterium tuberculosis (MTB-C), который включает бактерии видов Mycobacterium: M. tuberculosis, M. bovis, M. microti и M. africanum. Главным отличительным признаком клеточной оболочки микобактерий является то, что она имеет толстую и восковидную клеточную стенку. Барьерные свойства такой клеточной стенки также позволяют этому микроорганизму выживать внутри клеток благодаря своему действию как прямого модулятора иммунологических реакций между хозяином и бациллой MTB-C. Оболочка бациллы состоит из двух различных частей, а именно, из плазматической мембраны и стенки, окружающей эту мембрану. Клеточная стенка представляет собой скелет, образованный посредством ковалентного связывания структуры пептидогликана с полисахаридом с разветвленной цепью, а именно, с арабиногалактаном, присоединенным посредством фосфодиэфирных связей. Дистальные концы арабиногалактана этерифицированы высокомолекулярными жирными кислотами, а именно, миколовыми кислотами, размеры и структуры которых являются уникальными для микобактерий.
Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, каждый год во всем мире регистрируется 9000000 новых случаев заболевания туберкулезом, и каждый год от этого заболевания умирает приблизительно 2000000 человек. Считается, что во всем мире, более чем 2700000000 человек являются носителями туберкулезной инфекции, и каждый год регистрируется 90-100 миллионов новых случаев заражения туберкулезом.
В литературе уже были описаны различные вакцины против туберкулеза, полученные на основе фрагментов клеточных стенок вирулентных или авирулентных штаммов Mycobacterium. Вакцина, которая используется в настоящее время для профилактики туберкулеза, получена на основе бактериального штамма, обозначаемого БКГ (бацилла Кальметта-Герена), то есть аттенюированного варианта M. bovis. Также известно, что адъювант, используемый в этом вакцинном препарате, может значительно влиять на его эффективность.
Миколяты трегалозы, а в частности, димиколят трегалозы, являются наиболее биологически активными липидами в экстрактах M. tuberculosis и индуцируют каскад провоспалительных реакций, которые вызывают образование гранулемы. Следует отметить, что в литературе отсутствуют какие-либо данные о количестве указанных соединений, присутствующих в клеточной стенке M. tuberculosis. Любой образец, происходящий от этого вида, имеет очень сложную биологическую структуру. Поэтому, для осуществления количественного анализа требуется создание агрессивной комплексной среды и проведение длительных стадий очистки, а это значит, что количество очищенного соединения будет слишком мало для осуществления последующих структурных анализов. Именно поэтому, в литературе отсутствуют точные процентные величины содержания каждого соединения в клеточной стенке M. tuberculosis. Типичными компонентами клеток МТВ-C являются несколько гликолипидов, таких как липоарабиноманнан. Липоарабиноманнан ассоциируется с вирулентностью MTB-C.
В статье E. Ribi et at., Nature 1963, 198, страницы 1214-1215, описаны анализы по иммунизации, осуществляемые с использованием композиции, содержащей фрагменты клеточной стенки авирулентного штамма бациллы Кальметта-Герена (БКГ) и минеральное масло. Указанные фрагменты были получены путем гомогенизации культуры указанного штамма в минеральном масле. Такая композиция является более эффективной, чем стандартная вакцина (БКГ). Тем не менее, в той же самой статье указано, что фрагменты клеточной стенки не индуцируют какого-либо иммунологического ответа, если они были получены путем гомогенизации в воде и в отсутствии минерального масла.
В статье D.P. Pal et al., Indian J. Med. Res. 1977, 65, страницы 340-345, описана вакцина, полученная с использованием фрагментов клеточной стенки вирулентного штамма H37Rv и минерального масла. В этом случае, фрагменты клеточной стенки получают путем гомогенизации погибших клеток в водной фазе, а затем в композицию добавляют минеральное масло. Также указывается, что фрагменты клеточной стенки, гомогенизированные в водной фазе, не являются иммуногенными, и что присутствие минерального масла необходимо для сообщения вакцине еще большей эффективности.
В статье G.K. Khuller et al., Folia Microbiol., 1992, 37, страницы 407-412, описана протективная эффективность различных фракций клеточной стенки авирулентного штамма H37Ra M. tuberculosis, полученных с использованием неполного адъюванта Фрейнда, где указанные фракции также включали минеральное масло.
В статье E.M. Agger et al., Scand. J. Immunol., 2002, 56, страницы 443-447, описаны вакцины, которые содержат фрагменты клеточной стенки вирулентного штамма H37Rv, и которые являются эффективными, если они включают катионное поверхностно-активное вещество, такое как бромид диметилдиоктадециламмония, в качестве адъюванта. В этой статье также указывается, что в анализах, проводимых с использованием гомогенизированных бацилл M. tuberculosis, которые не содержали вышеупомянутого адъюванта, не наблюдалось каких-либо уровней резистентности к туберкулезу у мышей-моделей.
В статье I.M. Orme Vaccine, 2006, 24, страницы 2-19, которая представляет собой обзорную статью, посвященную вакцинам против туберкулеза, указано, что стандартная вакцина на основе бациллы Кальметта-Герена (БКГ) является, в основном, неэффективной для предупреждения туберкулеза у взрослых.
Индивидуумы, у которых может наблюдаться положительный эффект после проведения лечения или профилактики туберкулеза, могут быть подразделены на нижеследующие четыре подгруппы:
(I) Индивидуумы, которые не находились в контакте с инфицированным больным. Профилактическая вакцинация может предупреждать инфицирование данного индивидуума.
(II) Индивидуумы, которые находились в контакте с инфицированным больным, но сами не были инфицированы. У них, туберкулиновая проба (TST) является отрицательной. Первичная профилактика может предупреждать инфицирование таких индивидуумов.
(III) Индивидуумы с латентным туберкулезом, которые не считаются больными. Риск прогрессирования этого заболевания может быть снижен путем применения химиотерапии. Химиотерапия также имеет те преимущества, что она, по существу, устраняет источник инфекции, который является высоким фактором риска развития данного заболевания у этих индивидуумов.
(IV) Индивидуумы, которые являются больными, то есть страдают данным заболеванием, обычно его первичными формами заболевания, которые являются почти неконтагиозными или вообще неконтагиозными. Химиотерапия позволяет избежать заражения этих индивидуумов.
Как описано в литературе, после инфицирования проводят различные курсы лечения для предотвращения развития острого туберкулеза у инфицированных индивидуумов, то есть у индивидуумов с латентным туберкулезом.
Так например, в патентной заявке EP2196473 A1 описано, что для лечения туберкулеза у инфицированных индивидуумов, у которых еще не было диагностировано заболевание, а также у индивидуумов, у которых уже было диагностировано заболевание, могут быть введены различные лекарственные средства, включая изониазид, в течение нескольких месяцев.
В патентной заявке ES 2231037 A1 описано применение иммунотерапевтического средства, который включает клеточные фрагменты вирулентного штамма комплекса туберкулезных микобактерий Mycobacterium tuberculosis (MTB-C), в целях приготовления лекарственного препарата для лечения туберкулеза у инфицированных индивидуумов в комбинации с другими лекарственными средствами, такими как изониазид или рифампицин. В этой патентной заявке также описан способ получения иммунотерапевтического средства, содержащего фрагменты клеточной стенки штамма MTB-C.
Как указано в WO 2010/031883 A1, передача латентной туберкулезной инфекции происходит, главным образом, воздушно-капельным путем от индивидуумов, инфицированных M. tuberculosis. Следовательно, в группу риска входят индивидуумы, находящиеся в непосредственном контакте с пациентами, страдающими туберкулезом легких, а поэтому способными распространять воздушно-капельную инфекцию, а именно индивидуумы, которые живут вместе с такими пациентами или находятся в каком-либо другом тесном или частом контакте с ними.
В настоящее время, первичной профилактикой инфекции, обычно проводимой для индивидуумов группы I (описанных выше), является первичная химиопрофилактика, осуществляемая путем ежедневного введения изониазида в дозе от 5 мг/кг до 300 мг/день, но не более. Это лечение показано для всех индивидуумов любого возраста, которые имеют отрицательную TST-пробу, и которые живут вместе и/или имеют другой тесный контакт с инфицированными индивидуумами. В этом случае, химиопрофилактика должна проводиться в течение трех месяцев после прекращения контакта с источником инфекции или после устранения данного источника инфекции. Однако, в некоторых случаях, химиопрофилактика может приводить к нежелательным побочным эффектам, описанным в статье Martinez et al., Arch. Bronchoneumol., 2005, 41 (1), страницы 27-33.
Лекарственные препараты, содержащие фрагменты вирулентного штамма комплекса M. tuberculosis (MTB-C), были описаны, например, в EP1690549 B1, EP2090318 A1 и PCT/ES2009/000436. В EP2090318 A1 и PCT/ES2009/000436 описаны фармацевтические композиции, содержащие фрагменты вирулентного штамма комплекса M. tuberculosis (MTB-C) и используемые в качестве лекарственного препарата, который может быть применен для профилактики туберкулеза, необязательно, в комбинации с другими лекарственными средствами. С другой стороны, в EP1690549 B1 описаны фармацевтические композиции, которые могут быть использованы для лечения туберкулеза и содержат фрагменты MTB-C, необязательно, в комбинации с другими лекарственными средствами.
В патентной заявке EP 2090318 A1 сообщалось, что введение лекарственного средства, содержащего агент на основе фрагментов клеточной стенки вирулентного штамма MTB-C, способен индуцировать вырабатывание интерферона-γ клетками типа Th1 в качестве ответа на M. tuberculosis-специфические антигены. Указанными антигенами являются Ag85B и Ag85A, которые представляют собой часть комплекса Ag85, состоящего из семейства низкомолекулярных белков, играющих важную роль в биосинтезе клеточной стенки и продуцирующихся в значительном количестве при достижении культивируемой бактериальной культурой фазы логарифмического (log) роста. В EP2090318 A1 также сообщалось, что стандартная вакцина на основе бациллы Кальметта-Герена (БКГ) не вырабатывает иммунопротективного ответа на антигены комплекса Ag85. Продуцирование интерферона-γ специфическими лимфоцитами играет ключевую роль, то есть оно сообщает инфицированным макрофагам способность прекращать рост бацилл (North & Young, Ann. Rev. Immunol., 2004, 22:599-623).
По оценкам специалистов Всемирной организации здравоохранения, риск развития туберкулеза (ТБ) в 20-37 раз выше у ВИЧ-инфицированных людей, чем у людей не инфицированных ВИЧ. Краткий обзор этих данных приводится в руководстве «Guidelines for intensified tuberculosis case-finding and isoniazid preventive therapy for people living with HIV in resource-constrained settings» WHO Guidelines 2011, ISBN: 978 924 1500708). Однако превентивная терапия изониазидом не является вакцинацией, которая могла бы обеспечивать длительную защиту для ВИЧ-положительных индивидуумов. Точнее говоря, изониазид требует регулярного введения, и вырабатываемая резистентность к изониазиду только подтверждает необходимость в такой терапии. Таким образом, необходимость в разработке более эффективных курсов профилактического и терапевтического лечения ВИЧ-положительных индивидуумов остается актуальной.
Задача настоящего изобретения
Задачей настоящего изобретения состоит в обеспечении более эффективного средства, подходящего для предупреждения или лечения туберкулеза, например, для профилактики латентного туберкулеза, а также для первичной профилактики и/или лечения латентной или острой формы туберкулеза у ВИЧ-положительных и у ВИЧ-отрицательных индивидуумов. Другой задачей изобретения является получение штамма MTB-C, подходящего для приготовления указанного средства. Еще одной задачей настоящего изобретения является разработка способа получения указанного средства.
Определения
«FCMtb» означает фрагменты, происходящие от штамма комплекса Mycobacterium tuberculosis (MTB-C).
«Размер частиц» означает, если это не оговорено особо, диаметр частиц. Если размер частицы не может быть точно определен, то приводится приблизительный размер.
«z-среднее» означает средний размер частиц, определяемый как описано в разделе «Материалы и методы».
Обозначения
СПИД – синдром приобретенного иммунодефицита
BCG - бацилла Кальметта-Герена
CFU – колониеобразующая единица (к.о.е)
DP – лекарственный продукт (ЛП)
DS – лекарственное вещество (ЛВ)
ELISA – твердофазный иммуноферментный анализ
ELISPOT - иммуноферментный анализ в «горячей точке»
EMEA – Европейское агенство по стандартизации и контролю лекарственных препаратов
FCMtb – фрагменты клеток M. tuberculosis
FIM – впервые у мужчин
ВИЧ – вирус иммунодефицита человека
IFN-γ - интерферон гамма
IGTIP – Научно-исследовательский институт при госпитале «Germans Trias i Pujol» (Institut per a la Recerca en Ciences de la Salut Germans Trias i Pujol)
IMP – исследуемый лекарственный продукт
IPC – при непрерывном контроле
LCS – суспензия липосомного концентрата
LTBI – латентная туберкулезная инфекция
LPS - липополисахарид
Mtb - Mycobacterium tuberculosis
Mtb – комплекс Mycobacterium tuberculosis
NZB – Новозеланские черные
NZW - Новозеланские белые
PPD – очищенное белковое производное
q.s. – достаточное количество
TB – туберкулез
TST – кожная проба на туберкулез
WHO – Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ)
w/v - масса/объем
w/w - масса/масса
Описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к липосомным препаратам, содержащим фрагменты штамма комплекса Mycobacterium tuberculosis (MTB-C) (FCMtb) и агент, образующий липосому.
В конкретном варианте изобретения, z-средний размер частиц, как было определено, например, методом динамического рассеяния света, составляет 120 нм или менее, предпочтительно 110 нм или менее, более предпочтительно 95 нм или менее, а наиболее предпочтительно 80 нм или менее. В альтернативном варианте изобретения, липосомный препарат содержит 1-20% (масс./об.) сахарозы, предпочтительно 2-12% (масс./об.) сахарозы, более предпочтительно 3-8% (масс./об.) сахарозы, а наиболее предпочтительно 4-6% (масс./об.) сахарозы. Важно отметить, что хотя каждый из этих двух вариантов может удовлетворять требованиям в любом конкретном случае, однако эти варианты не рассматриваются как взаимоисключающие, и могут быть с успехом использованы в комбинации.
В одном из конкретных вариантов изобретения, вышеописанный липосомный препарат имеет z-средний размер частиц в пределах 40-120 нм, предпочтительно 50-110 нм, более предпочтительно 55-95 нм, а наиболее предпочтительно 55-80 нм.
В альтернативном конкретном варианте изобретения, вышеупомянутый липосомный препарат может иметь меньший средний размер частиц, например, если такой липосомный препарат представляет собой эмульсию, то есть в этом конкретном варианте изобретения, z-средний размер частиц предпочтительно составляет менее 40 нм.
В предпочтительном варианте любого одного или более из вышеописанных вариантов, липосомным препаратом является такой липосомный препарат, в котором показатель полидисперсности частиц составляет 0,4 или менее, а предпочтительно, 0,3 или менее.
В более предпочтительном варианте любого из вышеописанных вариантов, штамм комплекса Mycobacterium tuberculosis (MTB-C) представляет собой вирулентный штамм комплекса Mycobacterium tuberculosis (MTB-C).
В любом из вышеописанных вариантов, более предпочтительно, чтобы отношение (a): фрагментов штамма комплекса Mycobacterium tuberculosis (MTB-C) и (b) агента, образующего липосому, составляло 0,01:1-1:1, а предпочтительно, 0,06:1–0,1:1.
В более предпочтительном варианте любого из вышеописанных вариантов, липосомный препарат также содержит: (d) тензиоактивный агент. В еще более предпочтительном варианте, липосомным препаратом, содержащим (d) тензиоактивный агент, является такой липосомный препарат, в котором отношение (a):(d) составляет 0,1:1-10:1 (масс./масс.), предпочтительно 0,5:1-2:1 (масс./масс.), в более предпочтительно 0,6:1–0,8:1 (масс./масс.).
В конкретном варианте вышеописанных вариантов изобретения, образующий липосому агент, присутствующий в липосомном препарате, представляет собой фосфолипид, предпочтительно лецитин, более предпочтительно агент, выбранный из группы, состоящей из яичного лецитина или соевого лецитина, а наиболее предпочтительно соевого лецитина, где каждый из этих агентов может быть гидрогенизированным, частично гидрогенизированным или негидрогенизированным.
В предпочтительном варианте липосомного препарата, содержащего поверхностно-активное вещество, тензиоактивный агент выбран из холата, дезоксихолата, холестерина и гемисукцината холестерина.
В более предпочтительном варианте изобретения, описанным выше липосомным препаратом является липосомный препарат, в котором фрагменты клеток MTB-C представляют собой или содержат фрагменты клеточной стенки.
В другом более предпочтительном варианте изобретения, описанный выше липосомный препарат содержит фрагменты штамма MTB-C NCTC 13536, который был депонирован в 2010 г. в NCTC в Лондоне. Этот штамм имеет другое название 511, то есть могут быть в равной степени использованы обозначения NCTC 13536 или 511.
В еще более предпочтительном варианте изобретения, описанный выше липосомный препарат содержит по меньшей мере два, предпочтительно три, более предпочтительно четыре, а наиболее предпочтительно все нижеуказанные компоненты:
(i) первый полипептид, имеющий молекулярную массу приблизительно 70 кДа, аналогичную молекулярному фингерпринту белка HSP70 M. tuberculosis (Rv0350),
(ii) второй полипептид, имеющий молекулярную массу приблизительно 38 кДа, аналогичную молекулярному фингерпринту белка 38 кДа M. tuberculosis (Rv 0934),
(iii) третий полипептид, имеющий молекулярную массу приблизительно 30 кДа, аналогичную молекулярному фингерпринту белка Ag85B M. tuberculosis (Rv 1866c),
(iv) четвертый полипептид, имеющий молекулярную массу приблизительно 10 кДа, аналогичную молекулярному фингерпринту белка CFP10 M. tuberculosis (Rv3874), и
(v) пятый полипептид, имеющий молекулярную массу приблизительно 8 кДа, аналогичную молекулярному фингерпринту белка ESAT-6 M. tuberculosis (Rv3875).
В еще более предпочтительном варианте изобретения, липосомный препарат содержит липополипептид, имеющий молекулярную массу приблизительно 19 кДа, аналогичную молекулярному фингерпринту антигена-предшественника липопротеина LpqH M. tuberculosis, 19 кДа (Rv 3763).
Еще более предпочтительно, описанный выше липосомный препарат также отличается тем, что в нем присутствуют по меньшей мере один из нижеследующих антигенов Mycobacterium tuberculosis, или их фрагментов: HSP70, белок 38 кДа и Ag85B. В этом контексте, фрагмент представляет собой любую часть, например, продукт разложения любого из этих полипептидов.
В более предпочтительном варианте изобретения, описанный выше липосомный препарат содержит липиды, которые обычно присутствуют в Mycobacterium tuberculosis или их производные, такие как конъюгированные продукты, а именно, конъюгированные с сахаром липиды. Также предпочтительно, чтобы присутствовали одна или несколько миколовых кислот, предпочтительно принадлежащих к любому одному или более типам I, III или IV. Альтернативно или дополнительно, указанный препарат может содержать конъюгированный с сахаром миколят, а предпочтительно димиколят трегалозы. Также предпочтительно, чтобы, альтернативно или дополнительно, в липосомном препарате согласно изобретению присутствовал по меньшей мере один гликолипид, происходящий от MTB-C, где предпочтительным гликолипидом является липорабиноманнан.
Описанный выше липосомный препарат может дополнительно содержать одно или более поверхностно-активных веществ, предпочтительно выбранных из группы неионных поверхностно-активных веществ.
В более предпочтительном варианте, липосомный препарат согласно любому из предшествующих вариантов дополнительно содержит одну или более солей или растворов, где предпочтительной солью является хлорид натрия.
В еще более предпочтительном варианте любого из вышеописанных вариантов, липосомный препарат согласно изобретению является лиофилизованным.
Настоящее изобретение также относится к суспензии, в которой липосомный препарат согласно любому из предшествующих вариантов разведен в растворителе. В предпочтительном варианте, растворитель для этой суспензии является водным, и предпочтительно, представляет собой или содержит физиологическую сыворотку.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей липосомный препарат, описанный в любом одном или более из вышеописанных вариантов, или суспензию, описанную в любом одном или более из вышеописанных вариантов, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель, где в качестве носителя, разбавителя или наполнителя может быть использовано любое подходящее для этих целей вещество. В предпочтительном варианте изобретения, такая фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый адъювант.
Настоящее изобретение также относится к продукту, который может быть использован в терапевтическом способе лечения человека или животного. То есть настоящее изобретение относится к липосомному препарату согласно любому одному или более из вышеописанных вариантов, к суспензии согласно любому одному или более из вышеописанных вариантов или к фармацевтической композиции согласно любому одному или более из вышеописанных вариантов, которые могут быть использованы в терапевтическом способе лечения человека или животного. В своем конкретном варианте, настоящее изобретение относится к указанным липосомному препарату, суспензии или фармацевтической композиции, вводимым путем инъекции. В другом своем конкретном варианте, настоящее изобретение относится к указанным липосомному препарату, суспензии или фармацевтической композиции, которые могут быть использованы в способе лечения или предупреждения туберкулеза. Эти конкретные варианты могут рассматриваться отдельно или в комбинации.
В более конкретном варианте, настоящее изобретение относится к указанным липосомному препарату, суспензии или фармацевтической композиции согласно любому одному или более из вышеописанных вариантов, которые могут быть использованы в терапевтическом способе лечения человека или животного, где указанные липосомный препарат, суспензию или фармацевтическую композицию вводят человеку в дозе, составляющей 1-1000, предпочтительно 3-250, более предпочтительно 4-80, а наиболее предпочтительно приблизительно 5, приблизительно 25 или приблизительно 50 мкг/дозу FCMtb.
В трех более конкретных вариантах (a)-(c), липосомный препарат, суспензию или фармацевтическую композицию, описанные выше в варианте, относящемся к применению в способе терапевтического лечения человека или животного, используют: (a) в способе предупреждения острого туберкулеза у индивидуумов с латентным туберкулезом, (b) в способе первичной профилактики туберкулеза для предупреждения инфицирования индивидуумов, которые находились в контакте с инфицированными больными, но сами не являются инфицированными, или (c) в способе лечения или предупреждения латентного туберкулеза.
В предпочтительном варианте вышеописанного варианта, липосомный препарат, суспензию или фармацевтическую композицию, применяемые в способе терапевтического лечения человека или животного, используют в комбинированной терапии или во вспомогательной терапии. Вспомогательная терапия представляет собой дополнительную или вторичную терапию, применяемую в комбинации с первичной терапией в целях повышения эффективности лечения патологического состояния. Конкретным вариантом комбинированной терапии является вариант, где комбинированная терапия включает введение антибиотика, а предпочтительно, одного или более препаратов, таких как изониазид и ансамицин, где наиболее предпочтительным ансамицином является рифампицин. В конкретном варианте настоящего изобретения, вспомогательную терапию назначают ВИЧ-положительному человеку, при этом, предпочтительной дозой является разовая доза, составляющая 25 мкг FCMtb.
Настоящее изобретение также относится к способу получения любых агентов, которые представляют собой липосомный препарат, суспензию или фармацевтическую композицию.
Настоящее изобретение также относится к штамму MTB-C NCTC 13536, депонированному в 2010 году в NCTC в Лондоне.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к липосомным препаратам, содержащим фрагменты штамма комплекса Mycobacterium tuberculosis (MTB-C) (FCMtb) и агент, образующий липосому.
Если это не оговорено особо, то термин «включающий», используемый в описании настоящей заявки, означает, что объект, по отношению к которому употребляется этот термин, может, помимо компонентов, перечисленных после слова «включающий», иметь, но необязательно, дополнительные компоненты. Однако, в конкретном варианте изобретения, может подразумеваться, что термин «включающий» не охватывает каких-либо дополнительных компонентов, то есть в этом варианте изобретения термин «включающий» имеет значение «состоящий из».
В подробном описании раскрываются конкретные и/или предпочтительные варианты отдельных отличительных признаков настоящего изобретения. В настоящем изобретении, в качестве особенно предпочтительных вариантов также рассматриваются варианты, которые представляют собой комбинацию двух или более конкретных и/или предпочтительных вариантов, описанных для двух или более признаков настоящего изобретения.
В общих чертах, целью приготовления липосом является создание липидной среды, повышающей растворимость и образующей суспензию веществ, таких как FCMtb. В соответствии с настоящим изобретением, липосомы могут представлять собой однослойные или многослойные липосомы или их комбинации.
FCMtb могут представлять собой вещества любого типа, происходящие от штамма MTB-C, где предпочтительными являются фрагменты, происходящие от белков и/или липидов. В контексте настоящего изобретения, FCMtb обычно представляет собой смесь различных белковых антигенов и липидов, происходящих от клеток MTB-C.
Клеточные фрагменты могут быть получены любым известным методом, подходящим для фрагментации микробных или бактериальных клеток, а в частности, клеток MTB-C, например, путем гомогенизации. Гомогенизация может быть осуществлена путем обработки ультразвуком или с использованием небольших сфер диаметром приблизительно 0,1 мм, например, сфер из двуокиси кремния или двуокиси циркония/кремния, на механическом гомогенизаторе. Таким механическим гомогенизатором, который может быть использован в этих целях, является, например, гомогенизатор модели BioSpec BeadBeater. Клетки MTB-C разрушают указанным методом гомогенизации, так, чтобы получить небольшие клеточные фрагменты, обычно включающие небольшие фрагменты клеточной стенки. Типичным релевантным признаком получения клеточных фрагментов является «детоксификация» фрагментов клеточной стенки методом делипидизации, хорошо известным специалистам, то есть методом, который позволяет удалять эндотоксин-подобные молекулы. Поэтому, FCMtb предпочтительно подвергают детоксификации и пастеризации, в результате чего полученный липосомный препарат становится стерильным и не содержит эндотоксинов. Дисперсия клеточных фрагментов в буфере может быть, но необязательно, лиофилизована для повышения срока ее хранения. Для этой цели, дисперсия может быть распределена по сосудам и лиофилизована при температуре в пределах от -15°C до -120°C, так например, при -45°C в вакууме, под давлением, например, от 0,1 до 0,5 мбар.
Липосомы согласно изобретению обычно имеют распределение по размерам, при котором по меньшей мере 99,9% (по числу частиц) составляют частицы размером менее, чем 1 мкм. В конкретном варианте изобретения, z-средний размер частиц, как было определено методом динамического рассеяния света, составляет 120 нм или менее, предпочтительно 110 нм или менее, более предпочтительно 95 нм или менее, а наиболее предпочтительно 80 нм или менее. В методе динамического рассеяния света, параметр «z-среднее» рассматривается как стабильный и важный показатель, который может быть получен указанным методом, и его численная величина может оказаться предпочтительной для оценки контроля качества. Предпочтительно, чтобы липосомы препарата согласно изобретению были мономодальными, то есть обнаруживали только один пик при измерениях методом динамического рассеяния света. Более предпочтительно, чтобы липосомы препарата согласно изобретению были сферическими, как может быть определено с помощью электронной микроскопии образцов липосомного препарата, приготовленных методом получения замороженных сколов, как описано в примере 9. Поэтому, термин «сферический» означает, что по меньшей мере для 90% липосомных частиц (по числу частиц), все точки поверхности отдельной частицы находятся на аналогичном или идентичном расстоянии от центра липосомы, то есть отношение минимального радиуса такой частицы к ее максимальному радиусу составляет 0,6 или более, 0,7 или более, 0,8 или более или 0,9 или более. Липосомный препарат согласно изобретению может содержать многослойные или однослойные липосомы или их смесь. Как известно специалистам в данной области, измерения, проводимые методом динамического рассеяния света, должны быть осуществлены в подходящем буфере, то есть в буфере, который сам по себе не вызывает разрушения, дезинтеграции или слияния липосом, или какой-либо значительной физической дестабилизации по любому другому механизму. Согласно правилу «правой руки», подходящим может быть любой буфер, при условии, что он будет иметь ионную силу и величину рН, совместимую с ионной силой и величиной pH буфера, подходящего для получения липосом. При этом предпочтительно использовать буфер, состав которого будет аналогичен или идентичен составу буфера, используемого для получения липосом.
В альтернативном варианте изобретения, липосомный препарат дополнительно содержит 1-20% (масс./об.) сахарозы, предпочтительно 2-12% (масс./об.) сахарозы, более предпочтительно 3-8% (масс./об.) сахарозы, а наиболее предпочтительно 4-6% (масс./об.) сахарозы. Особенно предпочтительным является препарат, содержащий приблизительно 5% сахарозы.
Важно отметить, что хотя каждый из этих вариантов, относящихся к конкретному размеру частиц и к количеству сахарозы, может удовлетворять требованиям в каждом отдельном случае, однако, эти варианты не рассматриваются как взаимоисключающие, и могут быть с успехом использованы в комбинации.
В одном из конкретных вариантов изобретения, вышеописанный липосомный препарат имеет z-средний размер частиц в пределах от 40 до 120 нм, предпочтительно от 50 до 110 нм, более предпочтительно от 55 до 95 нм, а наиболее предпочтительно от 55 до 80 нм. Z-средний размер частиц предпочтительно измеряют методом динамического рассеяния света, как в общих чертах описано выше и подробно описано в разделе «Материалы и методы».
В альтернативном конкретном варианте изобретения, вышеупомянутый липосомный препарат может иметь меньший z-средний размер частиц, например, если такой липосомный препарат представляет собой эмульсию, то есть в конкретном варианте изобретения, z-средний размер частиц предпочтительно составляет менее 40 нм.
В предпочтительном варианте любого одного или более из вышеописанных вариантов, липосомы препарата согласно изобретению также являются монодисперсными, и это означает, что такие липосомы не имеют значимых отклонений от ширины наблюдаемой кривой распределения по размерам. Технически, это может быть определено по низкому показателю полидисперсности (PDI) методом динамического рассеяния света, где указанный показатель составляет 0,4 или менее, а предпочтительно, 0,3 или менее. Следовательно, указанным липосомным препаратом является липосомный препарат, в котором показатель полидисперсности частиц, определяемый методом динамического рассеяния света, составляет 0,4 или менее, предпочтительно 0,3 или менее, а наиболее предпочтительно 0,25 или менее.
Фрагменты штамма комплекса Mycobacterium tuberculosis (MTB-C) могут быть получены методом, включающим способы первичной и вторичной (последующей) обработки. В целях иллюстрации, ниже вкратце описаны пять основных стадий, а конкретные варианты осуществления такого способа приводятся ниже в примерах 2 и 3.
Способ первичной обработки (пример 2):
Стадия 1: Культивирование Mycobacterium tuberculosis
Стадия 2: Сбор Mycobacterium tuberculosis и замораживание сырого экстракта
Способ вторичной обработки (пример 3):
Стадия 3: Фрагментация и делипидизация клеток
Стадия 4: Пастеризация
Стадия 5: Лиофилизация (необязательно).
В более предпочтительном варианте любого из вышеописанных вариантов, штамм комплекса Mycobacterium tuberculosis (MTB-C) представляет собой вирулентный штамм комплекса Mycobacterium tuberculosis (MTB-C). Термин «вирулентный» относится к патогенности бацилл, приобретенной в определенных условиях, и/или к способности этих бацилл проникать в ткани хозяина. Вирулентным штаммом может быть любой вирулентный штамм, принадлежащий к виду MTB-C, но предпочтительным является штамм, принадлежащий к виду M. tuberculosis. Штамм MTB-C согласно изобретению может быть культивирован путем инокуляции в культуральные среды, хорошо известные специалистам, например, в агар Мидлбрука 7H10 или 7H11, в среду Сутона или в среду Проскауэра-Бека. Культивирование вирулентного штамма предпочтительно осуществляют в течение длительного периода времени, например, в течение периода времени, составляющего три недели или более предпочтительно в течение 3-4 недель. Температура культивирования предпочтительно составляет 34-38°C. После завершения культивирования, клетки собирают и выделяют методами, хорошо известными специалистам, такими как методы, описанные в патентной заявке ES2231037-A1.
Липосомный агент липосомного препарата предпочтительно представляет собой гидрогенизированный, частично гидрогенизированный или негидрогенизированный фосфолипид. Используемый фосфолипид может представлять собой или содержать, например, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин и фосфатидилинозит. Наиболее распространенным является фосфатидилхолин, который может быть синтезирован или выделен из различных природных источников. Предпочтительный агент, образующий липосому, представляет собой или содержит лецитин, выбранный из группы, состоящей из яичного лецитина и соевого лецитина. Соевый лецитин представляет собой сложную смесь фосфолипидов, включая inter alia фосфатидилхолин, и такой лецитин является особенно предпочтительным. Типичными липидами, которые могут также присутствовать в указанном препарате, либо в виде самого агента, образующего липосому, либо в виде дополнительного компонента, являются дицетилфосфат (DCP), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG), диолеоилфосфатидилхолин (DOPc), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), диолеоилфосфатидилсерин (DOPS), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), фосфатидилхолин (PC) и/или фосфатидилсерин (PS), где соответствующий липид может быть гидрогенизированным, частично гидрогенизированным или негидрогенизированным. Липосомы могут быть получены с использованием стандартных вспомогательных липидов методами, хорошо известными специалистам, такими как методы, описанные в патентной заявке ES2231037-A1.
Также предпочтительно, чтобы в любом из вышеописанных вариантов, отношение (a): фрагментов штамма комплекса Mycobacterium tuberculosis (MTB-C) к (b) агенту, образующему липосому, составляло 0,01:1-1:1, а предпочтительно, 0,06:1–0,1:1. В более предпочтительном варианте любого из вышеописанных вариантов, липосомный препарат дополнительно содержит: (d) тензиоактивный агент. Вообще говоря, в контексте настоящего изобретения, в качестве тензиоактивного агента могут быть использованы агенты всех типов, способные изменять величину поверхностного натяжения, за исключением соединений, которые входят в описанное выше определение агента, образующего липосому. Тензиоактивные агенты различных типов известны специалистам и могут быть использованы в липосомном препарате согласно изобретению. Как известно специалистам, тензиоактивными агентами обычно являются химические вещества, имеющие полярную-неполярную структуру. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, можно лишь отметить, что тензиоактивные агенты обычно имеют тенденцию локализоваться на поверхности частиц, что приводит к образованию мономолекулярного слоя на границе раздела фаз, снижающего величину поверхностного натяжения. Тензиоактивные агенты также называются поверхностно-активными веществами или поверхностно-активными агентами. В предпочтительном варианте липосомного препарата, содержащего поверхностно-активное вещество, тензиоактивный агент выбран из стеролов и их производных, таких как холестерин, и/или солей желчных кислот или их производных, таких как холат. Особенно предпочтительными вариантами являются варианты, в которых тензиоактивный агент выбран из холата, дезоксихолата, холестерина и гемисукцината холестерина. Подходящим, но неограничивающим вариантом осуществления изобретения, является вариант, в котором липосомы указанного препарата содержат соевый лецитин и холат натрия.
В еще более предпочтительном варианте изобретения, липосомный препарат, содержащий (d) тензиоактивный агент, представляет собой липосомный препарат, в котором отношение (a) к (d) составляет 0,05:1-3:5 (масс./масс.). Могут быть использованы различные типы агентов, образующих липосому, которые хорошо известны специалистам.
Липосомы могут содержать, но необязательно, добавки, повышающие их стабильность, например, витамин Е, который, очевидно, действует как липидный антиоксидант.
В более предпочтительном варианте изобретения, описанным выше липосомным препаратом является липосомный препарат, в котором фрагменты клеток MTB-C представляют собой или содержат фрагменты клеточной стенки.
Может быть использован любой штамм, принадлежащий к MTBC, а предпочтительно, любой штамм, принадлежащий к Mycobacterium tuberculosis. В другом более предпочтительном варианте, описанный выше липосомный препарат содержит фрагменты штамма MTB-C NCTC 13536, депонированногоо в 2010 году в NCTC в Лондоне (пример 1). Другой штамм, который может быть использован в липосомном препарате, и его фрагменты, которые могут содержаться в этом препарате, обозначаются H37Rv, и эти штаммы и фрагменты могут быть, например, получены из Национальной коллекции типовых культур (NCTC), Лондон, Великобритания (номер депозита NC007416) и часто используются исследователями, работающими в этой области. При этом, может быть также использован более, чем один штамм, то есть указанный липосомный препарат может содержать фрагменты различных штаммов, например, двух, трех или более штаммов.
Считается, что если присутствует приблизительно 4000 предполагаемых антигенов M. tuberculosis, то невозможно провести анализ лекарственного вещества на все эти белки. Тем не менее, было показано, что некоторые белки MTB-C могут вырабатывать нужный иммунный ответ. Имеется пять белковых полос размером приблизительно 6, 10, 30, 38 и 70 кДа (Renshaw, et al., 2005, EMBO Journal 24, 2491-2498; Singh, et al., 2005, Clin, Diagn. Lab. Immunol. 12(2), 354-358). Поэтому, В еще более предпочтительном варианте изобретения, описанный выше липосомный препарат содержит по меньшей мере два, предпочтительно три, более предпочтительно четыре, а наиболее предпочтительно все нижеуказанные компоненты:
(i) первый полипептид, имеющий молекулярную массу приблизительно 70 кДа, как было определено с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН), где указанный первый полипептид имеет молекулярный фингерпринт, аналогичный молекулярному фингерпринту белка HSP70 M. tuberculosis (Rv0350),
(ii) второй полипептид, имеющий молекулярную массу приблизительно 38 кДа, как было определено с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН), где указанный второй полипептид имеет молекулярный фингерпринт, аналогичный молекулярному фингерпринту белка 38 кДа M. tuberculosis (Rv 0934),
(iii) третий полипептид, имеющий молекулярную массу приблизительно 30 кДа, как было определено с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН), где указанный третий полипептид имеет молекулярный фингерпринт, аналогичный молекулярному фингерпринту белка Ag85B M. tuberculosis (Rv1866c),
(iv) четвертый полипептид, имеющий молекулярную массу приблизительно 10 кДа, как было определено с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН), где указанный четвертый полипептид имеет молекулярный фингерпринт, аналогичный молекулярному фингерпринту белка CFP10 M. tuberculosis (Rv3874), и
(v) пятый полипептид, имеющий молекулярную массу приблизительно 6 кДа, как было определено с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН), где указанный пятый полипептид имеет молекулярный фингерпринт, аналогичный молекулярному фингерпринту белка ESAT-6 M. tuberculosis (Rv3875).
В еще более предпочтительном варианте изобретения, липосомный препарат также содержит липополипептид, имеющий молекулярную массу приблизительно 19 кДа, как было определено с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН), где указанный липополипептид имеет молекулярный фингерпринт, аналогичный молекулярному фингерпринту белка антигена-предшественника липопротеина LpqH M. tuberculosis, 19 кДа (Rv 3763). Соответствующая полоса может быть визуализирована известными методами, такими как окрашивание серебром. Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что этот полипептид индуцирует высокие уровни общих гуморальных IgG-ответов, которые могут быть самыми высокими ответами на все антигены в данном препарате.
Примеры идентификации полипептидов или липополипептидов приводятся в примере 4.
В еще более предпочтительном варианте, описанный выше липосомный препарат также отличается тем, что в нем присутствуют по меньшей мере один из нижеследующих антигенов Mycobacterium tuberculosis или их фрагментов, а именно, HSP70, 38 кДа-белок, Ag85B, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере один из HSP70, 38 кДа-белка и Ag85B. В этом контексте описания, «фрагмент» означает любую часть, например, продукт разложения любого из этих полипептидов. Такие фрагменты могут быть получены известными методами, например, путем химического или ферментативного гидролиза, причем, абсолютно неважно, проводится ли такая фрагментация до или после образования липосомы. При этом предпочтительно, чтобы было установлено происхождение соответствующего фрагмента, например, по значительному перекрыванию в аминокислотной последовательности, например, по меньшей мере в 5, по меньшей мере в 10 и по меньшей мере в 20 непрерывных участках аминокислотной последовательности.
Фрагменты согласно изобретению предпочтительно получают из бацилл, культивированных в условиях стресса, таких как голодание, низкое содержание кислорода и низкий рН. Низкое содержание кислорода обусловлено ростом бактерий в процессе культивирования на планшетах, которые находятся в герметичных пакетах, в течение приблизительно 21 дня, что создает микроаэробную среду. Низкий рН создается следующим образом: в начале культивирования величина pH составляет 7,0-6,8, а в конце, обычно после культивирования в течение 21 дня, величина pH составляет 6,4-6,5. В этих условиях, метаболизм бактерий замедляется, что приводит к их росту в стационарной фазе. Очевидно, что это сообщает бациллам повышенную резистентность к стрессу. Бациллы, культивированные в таких условиях, приобретают свойства, аналогичные свойствам латентных бацилл in vivo при LTBI (латентной туберкулезной инфекции). Таким образом, предполагается, что антигены, присутствующие в FCMtb, будут индуцировать новый иммунологический ответ на антигены, вырабатываемые латентными бациллами, то есть так называемые «структурные» антигены, а также антигены, ассоциированные с ответами в условиях стресса.
Уже давно известно, что микобактериальные гликолипиды обладают иммуномодулирующей активностью, а именно, способностью индуцировать гранулематозные ответы и продуцировать сильные эффекты, подобные эффектам, продуцируемым адъювантами. Поэтому, в более предпочтительном варианте изобретения, описанный выше липосомный препарат содержит липиды, которые обычно присутствуют в Mycobacterium tuberculosis, или их производные, такие как продукты конъюгирования, а именно, липиды, конъюгированные с сахаром. Некоторые иммуногенные липидные компоненты были идентифицированы в образцах M. tuberculosis (Brennan, Tuberculosis (Edinburgh), 2003, 83(1-3), 91-97) и были разработаны аналитические методы для их определения (электрофорез, электрофорез в ДСН-ПААГ, тонкослойная хроматография). Хотя выделение каждого липидного компонента требует присутствия агрессивной среды, которая будет затруднять получение количественных данных или процентов для каждого компонента, детектируемого в экстракте MTB-C или в липосомном препарате, однако, в другом предпочтительном варианте изобретения, для характеризации может быть проведена качественная оценка. В соответствии с этим другим предпочтительным вариантом может присутствовать одна или более миколовых кислот, предпочтительно принадлежащих к любому одному или более типам I, III или IV. Альтернативно или дополнительно, в указанном препарате может присутствовать конъюгированный с сахаром миколят, а предпочтительно, димиколят трегалозы. Альтернативно или дополнительно, в указанном препарате может присутствовать гликолипид липоарабиноманнан (LAM). Кроме того, очевидно, что мультиантигенная природа фрагментов (смесь мультиантигенных белков и липидов вместо отдельно взятых очищенных антигенов) имеет определенное преимущество, а поэтому, способ фрагментации клеток может быть адаптирован специалистом в целях получения оптимальной смеси клеточных антигенов.
Гомогенизацию клеток MTB-C осуществляют в присутствии одного или более поверхностно-активных веществ, а предпочтительно, неионного поверхностно-активного вещества. Следовательно, описанный выше липосомный препарат может дополнительно содержать одно или более таких поверхностно-активных веществ. Специалистам известно большое число таких поверхностно-активных веществ. Используемое неионное поверхностно-активное вещество предпочтительно выбрано из группы, состоящей из этоксилатов алкилфенола и этоксилатов сложного эфира сорбитана. Более предпочтительно, неионное поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из этоксилатов октилфенола. Еще более предпочтительно использовать этоксилаты октилфенола, в которых содержание этиленоксида составляет 7-8 моль, и такие поверхностно-активные вещества имеются в продаже под названием Triton X-114. Гомогенизированную массу, содержащую фрагменты клеточной стенки, подвергают стандартной обработки для отделения и разделения нефрагментированных клеток и солюбилизированных компонентов. Могут быть, например, проведены центрифугирование при различных скоростях и промывка буферным раствором как описано в патентной заявке ES2231037-A1. После проведения вышеупомянутых процедур очистки получают осадок, содержащий фрагменты клеточной стенки. Указанный осадок диспергируют в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) и подвергают стандартной обработке для гарантии полной инактивации клеток MTB-C, которые могут сохранять жизнеспособность после проведения фрагментации и очистки. Вышеупомянутой обработкой может быть химическая обработка, например, обработка формальдегидом, или физическая обработка, например, автоклавирование или пастеризация. Примеры характеризации липидов приводятся ниже в примере 5.
В другом предпочтительном варианте изобретения, вышеописанный липосомный препарат дополнительно содержит одну или более солей или их растворов, где предпочтительной солью является хлорид натрия.
В еще более предпочтительном варианте любого из вышеописанных вариантов, липосомный препарат является лиофилизованным. Липосомы могут быть подвергнуты лиофилизации для получения иммунотерапевтического средства в форме лиофилизованных липосом. Для этой цели, дисперсия может быть распределена по сосудам и лиофилизована при низкой температуре, такой как температура от -15°C до -120°C, например, при -45°C в вакууме, под давлением, например, от 0,1 до 0,5 мбар. Сосуды, полученные после лиофилизации, содержат липосомный препарат, подходящий для его использования в качестве иммунотерапевтического средства, и такие сосуды предпочтительно хранят при очень низких температурах, например, при -70°C.
Настоящее изобретение также относится к суспензии, в которой липосомный препарат согласно любому из предшествующих вариантов разведен в растворителе. В предпочтительном варианте, растворитель для этой суспензии является водным, и предпочтительно, представляет собой или содержит физиологическую сыворотку. Методы суспендирования липосомных препаратов в растворителе хорошо известны специалистам. Особенно преимущественным свойством препарата согласно изобретению является то, что он может быть суспендирован быстрее, чем стандартные липосомные препараты, содержащие фрагменты MTB-C (см. пример 9).
Одной из целей настоящего изобретения является получение агента, содержащего фрагменты клеточной стенки штамма МТВ-C, для приготовления фармацевтической композиции, где указанный агент представляет собой или содержит описанный выше липосомный препарат согласно любому из описанных вариантов или их комбинации. Главной целью приготовления фармацевтического препарата/галенова препарата, содержащего лекарственное вещество, является получение суспензии, которая является достаточно эффективной и стабильной для надежного распознавания клетками, и которая может инициировать вырабатывание релевантного клеточного иммунного ответа в организме человека или животного. В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей липосомный препарат или суспензию, описанные в любом одном или более из представленных выше вариантов, и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель. Такие различные носители, наполнители и разбавители известны специалистам, и не ограничиваются представленным здесь описанием. Точнее говоря, в качестве носителя, наполнителя или разбавителя может быть использовано любое вещество. В предпочтительном варианте изобретения, такая фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый адъювант. Следует отметить, что в данном варианте изобретения рассматривается адъювант, представляющий собой вещество, которое, при его введении человеку или животному, способно стимулировать ответ иммунной системы к антигену-мишени, при этом, указанный адъювант сам по себе не сообщает иммунитет. Не ограничиваясь каким-либо конкретным веществом-адъювантом, можно лишь отметить, что в предпочтительных вариантах изобретения, указанный адъювант представляет собой соль алюминия, такую как хлорид алюминия, или минеральное масло, или композицию, содержащую минеральное масло, например, такой адъювант представляет собой неполный адъювант Фрейнда (НАФ) или полный адъювант Фрейнда (ПАФ), или галогенд аммония, такой как алкилированный бромид аммония, например, бромид диметилдиоктадециламмония.
Настоящее изобретение также относится к продукту, используемому в способе терапевтического лечения человека или животного. То есть настоящее изобретение относится к липосомному препарату согласно любому одному или более из вышеописанных вариантов, к суспензии согласно любому одному или более из вышеописанных вариантов, или к фармацевтической композиции согласно любому одному или более из вышеописанных вариантов, используемым в способе терапевтического лечения человека или животного.
Лекарственное средство может быть введено в слизистую, например, офтальмически, интраназально, перорально, в желудок, в тонкую кишку, вагинально или в слизистую мочевых путей, или парентерально, например, подкожно, интрадермально, внутримышечно, внутривенно или внутрибрюшинно. Предпочтительным является парентеральное введение. В своем конкретном варианте, настоящее изобретение относится к указанным липосомному препарату, суспензии или фармацевтической композиции, вводимым путем инъекции.
В другом своем конкретном варианте, настоящее изобретение относится к указанным липосомному препарату, суспензии или фармацевтической композиции, которые могут быть использованы в способе лечения или предупреждения туберкулеза. Эти конкретные варианты могут рассматриваться отдельно или в комбинации. Авторами настоящего исследования было обнаружено, что препарат согласно изобретению повышает клеточный иммунный ответ, а также регулирует процесс непрерывного повторного инфицирования, который, так или иначе, может происходить при латентной туберкулезной инфекции, благодаря усилению иммунитета к размножению бацилл и индуцированию иммунитета к нереплицирующимся бациллам.
Подходящая доза липосомного препарата, суспензии или фармацевтической композиции, описанных выше в разделе, относящемся к их применению в способе терапевтического лечения человека, зависит от различных факторов, включая способ введения и конкретного индивидуума, подвергаемого лечению. В предпочтительном варианте изобретения, такому лечению подвергается человек. В предпочтительном варианте изобретения, вводимая доза составляет 1-1000, предпочтительно 3-250, более предпочтительно 4-80, а наиболее предпочтительно приблизительно 5, приблизительно 25 или приблизительно 50 мкг/дозу FCtb. Особенно предпочтительной является доза 25 мкг.
В трех более предпочтительных вариантах (a)-(c), липосомный препарат, суспензию или фармацевтическую композицию, описанные выше в варианте, относящемся к применению в способе терапевтического лечения человека или животного, используют: (a) в способе предупреждения острого туберкулеза у индивидуумов с латентным туберкулезом. В альтернативном, более конкретном варианте, указанные липосомный препарат, суспензию или фармацевтическую композицию используют (b) в способе первичной профилактики туберкулеза для предупреждения инфицирования индивидуумов, которые находились в контакте с инфекцией, вызывающей данное заболевание, но еще не были инфицированы, или (c) в способе лечения или предупреждения латентного туберкулеза.
Липосомный препарат, суспензия или фармацевтическая композиция, используемые в способе терапевтического лечения человека или животного, могут быть введены в виде одной или нескольких доз, например, в виде двух, трех, четырех, пяти или более доз, повторно вводимых через определенные интервалы времени. Две дозы предпочтительно вводить отдельно с интервалом в 2-5 недель, а предпочтительно, в 3-4 недели.
В примерах 8, 10 и 12 описаны способы введения человеку или животному липосомного препарата согласно изобретению.
Предпочтительным вариантом вышеописанного вещества являются липосомный препарат, суспензия или фармацевтическая композиция, которые могут быть использованы в комбинированной или во вспомогательной терапии. Практические врачи часто применяют вспомогательную терапию для достижения лучших показателей эффективности лечения или более быстрого ответа на первичное лечение. Комбинированная или вспомогательная терапия включают использование более, чем одного лекарственного препарата для терапевтического лечения человека или животного. Первым конкретным вариантом комбинированной терапии является вариант, в котором такая комбинированная терапия включает введение антибиотика, а предпочтительно, одного или нескольких препаратов, таких как изониазид и ансамицин, где наиболее предпочтительным ансамицином является рифампицин. Вторым конкретным вариантом является комбинированная терапия, которая включает введение других профилактических вакцин против туберкулеза, таких как вакцины, упомянутые в публикации S.H.E. Kaufmann, Nature Rev. Immunol., 2006, 6, страницы 699-704, например, вакцина Кальметта-Герена (БКГ), субъединичные вакцины или рекомбинантные вакцины БКГ. Первый и второй конкретные варианты могут быть объединены.
В комбинированной или во вспомогательной терапии, введение этих двух (или более) веществ может быть осуществлено одновременно, либо эти два (или более) вещества могут быть введены через определенный период времени. Период между введениями может даже составлять несколько лет. В случае комбинированной терапии, введение может быть осуществлено через определенные промежутки времени, то есть сначала предпочтительно вводить профилактическую вакцину против туберкулеза, а затем лекарственное средство, которое содержит фрагменты клеточной стенки вирулентного штамма MTB-C, и которое действует как (бустер)-агент, рестимулирующий первоначально введенную вакцину. В одном из вариантов изобретения, человеку вводят только одну дозу, предпочтительно составляющую 25 мкг FCMtb.
Альтернативно, во вспомогательной терапии может быть одновременно применено несколько различных стратегий или видов лечения. В конкретном варианте настоящего изобретения, вспомогательную терапию назначают человеку с ослабленной иммунной системой, например, индивидууму с ВИЧ-инфекцией, или любому индивидууму с подтвержденной туберкулезной инфекцией и/или индивидууму, нуждающемуся в такой терапии. В случае вспомогательной терапии может быть также введен изониазид. Кроме того, вспомогательная терапия может включать введение любого лекарственного средства или комбинации лекарственных средств для лечения индивидуума с ослабленной иммунной системой, например, для лечения ВИЧ-инфекции. Типичные лекарственные средства для лечения ВИЧ-инфекций представляют собой антиретровирусные лекарственные средства, и их неограничивающее описание можно найти в руководстве «Antiretrovirai therapy for HIV infection in adults and adolescents Recommendations for a public health approach: 2010 revision», изданном Всемирной организацией здравоохранения, ISBN: 9789241599764.
Таким образом, авторами настоящего изобретения было найдено решение проблемы, связанной с необходимостью в разработке эффективной защиты от туберкулеза, такое как вакцинация ВИЧ-положительных пациентов.
Является ли данный индивидуум ВИЧ-положительным или нет (то есть ВИЧ-отрицательным) может быть определено с помощью любого теста, который позволяет детектировать присутствие вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), то есть вируса, вызывающего синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), в физиологической жидкости, взятой у обследуемого индивидуума, где указанной физиологической жидкостью обычно является любая физиологическая жидкость, выбранная из сыворотки, слюны или мочи. Такие тесты позволяют детектировать антитела, антигены или РНК. Обзор подходящх скрининг-тестов можно найти в публикации Chou et al., Ann. Intern. Med. 2005 Jul 5; 143(1):55-73.
Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что одна доза в 25 мкг FCMtb, введенная ВИЧ-положительному человеку вызывает интенсивный ответ.
Одна доза в 25 мкг FCMtb также является эффективной при введении ВИЧ-отрицательному человеку. Авторами настоящего изобретения было показано, что такая доза является особенно подходящей для введения индивидуумам, страдающим латентным туберкулезом (пример 12). Таким образом, одна доза в 25 мкг FCMtb, введенная ВИЧ-положительному или ВИЧ-отрицательному индивидууму, является предпочтительным вариантом изобретения.
Настоящее изобретение также относится к способу приготовления, отличающемуся тем, что он является подходящим для получения липосомного препарата согласно любому одному или более из вышеописанных вариантов, а также суспензии или фармацевтической композиции, содержащей указанный препарат. Один из неограничивающих примеров приводится ниже в примере 11.
Настоящее изобретение также относится к штамму MTB-C NCTC 13536, депонированному в 2010 году в NCTC в Лондоне. Этот штамм имеет низкий полиморфизм генов. Поэтому, препараты, содержащие фрагменты NCTC 13536, имеют то преимущество, что они являются в очень высокой степени репродуцируемыми из-за низкого полиморфизма генов.
Предпочтительный способ осуществления изобретения
Предпочтительные конкретно используемые дозы составляют 50 мкг FCMtb/дозу или 25 мкг FCtb/дозу или 5 мкг FCMtb/дозу. Так, например, если доза составляет 50 мкг FCMtb, то в одном сосуде с препаратом присутствуют вещества в количестве, представленном в таблице 1:
Таблица 1
Компоненты
Единиц на сосуд
Функция
Лекарственное вещество
FCMtb
66,7 мкг
Иммуноген
Другие компоненты
Сахароза
20000,0 мкг
Вещество, сообщающее заряд (лиофилизованное) и обладающее криозащитными свойствами
Соевый лецитин<sup>1</sup>
845,8 мкг
Агент, образующий липосому
Холат натрия
92,0 мкг
Тензиоактивный
Хлорид натрия<sup>2</sup>
20,8 мкг
Растворитель
Характеризация частиц
z-средний размер частиц
75±20 нм
Показатель полидисперсности
≤0,350
<sup>1</sup> Содержит фосфатидилхолин (94,0% (масс./масс.))
<sup>2</sup> Добавляли в виде 0,9% раствора NaCl.
Для введения 25 мкг/дозу или 5 мкг/дозу могут быть получены другие сосуды, где все численные величины, представленные в таблице 1, за исключением сахарозы, должны быть поделены на 2 или 10, соответственно. Содержание сахарозы в указанных препаратах (50 мкг, 25 мкг и 5 мкг) всегда составляет 20000 мкг единиц/сосуд.
Было показано, что липосомный препарат, приготовленный из соевого лецитина (агента, образующего липосому) с высоким содержанием фосфатидилхолина (94,0% (масс./масс.)) и холата натрия (тензиоактивного агента), является подходящим для обеспечения более высокой растворимости лекарственного вещества в процессе приготовления препарата, а также в разведенной суспензии. Одним из важных параметров стабильности FCMtb в липосомном препарате являются свойства компонентов, составляющих липосому. После тестирования различных отношений FCMtb/липидный компонент было установлено, что очень хорошим является отношение приблизительно 0,03:0,2:0,7 (FCMtb:холат натрия:соевый лецитин, масс./масс./масс.). Также наблюдалось, что образование липосом улучшалось в присутствии солей в водной фазе. Поэтому, в этот конкретный препарат был включен хлорид натрия.
Таблица 2Лекарственный продукт (FCMtb), оцененный после разведения лиофилизованной липосомной композиции
Параметр
Критерии приемлемости
Методы тестирования
Внешний вид
Белый или не совсем белый порошок
Визуальный осмотр
Морфология осадка на фильтре
Плоский или почти плоский и гомогенный
Визуальный осмотр
Однородность лекарственной формы
Постоянство массы (мг/сосуд)
21,02± 15%
Взвешивание, лабораторный метод
Средняя масса (мг/сосуд)
Масса ± 5%
Взвешивание, лабораторный метод
Содержание воды (%)
≤3%
Колориметрический анализ Карла Фишера, Ph.Eur.2.5.12 (USP<921>)
Содержание общего белка FCMtb
90-140 мкг/мг FCMtb
ВСА-анализ, Ph.Eur.2.5.33 (USP<1057>)
Время до разведения (с)
Тщательно разведенный ≤10 с
Визуальный осмотр
рН
7-8
Потенциометрия, Ph.Eur.2.2.3 (USP<791>)
Размер частиц
z-среднее (нм)(Показатель полидисперсности)
75± 20 (≤0,310)
Динамическое рассеяние света, Ph.Eur.2.9.31
Иммуногенная активность у мышей-моделей с инфекцией M. tuberculosis
Антиген-специфический IFN-γ, ореол-образующие единицы
PPD
3-12 Отношение SFU/10<sup>6</sup> клеток, соответствующее базальной величине (базальная величина в SFU/10<sup>6</sup> клеток)
ELISpot
Профиль белка
Электрофорез в ДСН-ПААГ
Позитивный на полосы: 70, 38, 30, 10, 6 кДа
Электрофорез в ДСН-ПААГ
Вестерн-блот-анализ
Позитивный на HSP70 (Rv0350), 38 кДа (Rv0934), Ag85B (Rv1866c)
Вестерн-блот-анализ
Стерильность
Стерильный
Ph.Eur.2.6.1 (USP<71>)
Бактериальные эндотоксины (МЕ/дозу)
≤10 МЕ/сосуд
Ph.Eur.2.6.14, метод D (USP<85>)
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, липосомный препарат имеет свойства, описанные в таблице 2.
Для введения инъекции индивидууму in vivo, содержимое сосуда может быть разведено 0,4 мл воды для инъекций с получением суспензии, содержащей 166,7 мкг/мл FCMtb.
В таблице 3 представлена концентрация каждого компонента на сосуд после разведения в концентрации 50 мкг/дозу. Для введения 25 мкг/дозу или 5 мкг/дозу могут быть использованы и другие сосуды, приготовленные приблизительно как указано выше в таблице 1, где все численные величины, представленные в таблице 3, за исключением сахарозы, должны быть поделены на 2 или 10, соответственно. Содержание сахарозы в указанных препаратах (50 мкг, 25 мкг и 5 мкг) всегда составляет 50000 мкг/мл.
Таблица 3Концентрация компонентов после разведения в 0,4 мл воды для инъекций
Компоненты
Концентрация на мл
Лекарственное вещество
FCMtb
166,7 мкг/мл
Наполнители
Сахароза
50000,0 мкг/мл
Соевый лецитин
2114,4 мкг/мл
Холат натрия
230,0 мкг/мл
Хлорид натрия
52,1 мкг/мл
Материалы и методы
Исходные материалы
a) Моноклональные антитела: Специфические моноклональные антитела (анти-HSP70 антитело, антитело против 38 кДа-белка, анти-Ag85B антитело (от Lionex Diagnostic GmbH, Braunschweig, Germany)) были использованы для идентификации белкового профиля партий FCMtb.
b) Альбуминовый стандарт: Этот стандарт был использован для определения содержания белка и состоял из бычьего альбумина в 0,9% физиологическом растворе (2 мг/мл), содержащимся в азиде натрия (производитель: Pierce).
c) 6,6’-димиколят трегалозы от стандартной бациллы Mycobacterium tuberculosis (TDM):
Коммерчески доступный TDM (Sigma) использовали для идентификации TDM партий FCMtb.
d) Миколовые кислоты от стандартной бациллы Mycobacterium tuberculosis
Коммерчески доступную миколовую кислоту (Sigma) использовали для идентификации миколовой кислоты партий FCMtb.

e) Маркер молекулярной массы: Был использован коммерчески доступный маркер молекулярной массы, называемый «предварительно окрашенным стандартом SeeBlue Plus» (Invitrogen).
Определение параметров
a) pH
pH разведенной суспензии FCMtb (20 мг/мл) определяли потенциометирическим методом в соответствии с Ph. Eur. 2.2.3 и USP<791>.
b) Содержание воды
Тест для определения остаточного количества воды в лиофилизованном FCMtb осуществляли с использованием колориметрического оборудования Карла Фишера и в соответствии с общими указаниями, приведенными в Европейской фармакопее Ph. Eur., метод 2.5.12, и в Американской фармакопее (USP <921>) в разделе «Определение содержания воды» (Water determination).
c) Определение содержания общего белка
Тест для определения содержания общего белка в FCMtb осуществляли с использованием коммерчески доступного набора (набор с BCA, Pierce) и методом, описанным в Европейской фармакопее (Ph. Eur., метод 2.5.33, метод 4 (анализ с использованием бицинхониновой кислоты или BCA)) и в фармакопее США (USP <1057>).
d) Идентификация белкового профиля с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ)
Этот тест осуществляли в соответствии с Ph. Eur., метод 2.2.31 и USP <726>; детектирование белков в геле осуществляли адаптированным методом окрашивания кумасси или серебром. Тест-образцы: FCMtb разводили в очищенной воде при концентрации 40 или 20 мг/мл. Исходные растворы: маркер молекулярной массы, очищенные антигены, исходный FCMtb-стандарт
Таблица 4Исходные антигены
Очищенные антигены
Белок HSP70 (Rv 0350) M. tuberculosis
38 кДа-белок (Rv0934) M. tuberculosis
Белок Ag85B (Rv1886c) M. tuberculosis
19 кДа-белок (Rv 3763) M. tuberculosis
Белок CFP10 (Rv3874) M. tuberculosis
Белок ESAT6 (Rv3875) M. tuberculosis
Для окрашивания кумасси использовали раствор реагента Gel-Code Blue Stain (Pierce) в соответствии с инструкциями производителя. Для окрашивания серебром использовали набор PROTSIL1 от Invitrogen в соответствии с инструкциями производителей. Для вестерн-блот-анализа, белки разделяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ стандартными методами, известными специалистам, а затем электрофоретически переносили на PVDF-мембрану для иммунодетектирования, проводимого с использованием специфических моноклональных антител. Взаимодействия антиген-антитело визуализировали путем инкубирования с анти-антителом, запускающим хемилюминесцентную реакцию. Были использованы антигены от Lionex (Braunschweig, Germany) (белок HSP70 (70 кДа) M. tuberculosis, 38 кДа-белок M. tuberculosis, белок Ag85B (30 кДа) M. tuberculosis, и специфические моноклональные антитела против белка HSP70, 38 кДа-белка и белка Ag85B от Lionex.
e) Идентификация миколовых кислот
Миколовые кислоты в FCMtb оценивали с помощью одномерной ТСХ в соответствии с описанием, приведенным в Ph. Eur., метод 2.2.27. Тест-образцы: лиофилизованный FCMtb; 40 мг; исходные растворы: миколовая кислота, используемая в качестве стандарта (Sigma). Процедура:
a) Способ экстракции: Образец экстрагировали смесью хлороформ:метанол (1:1), а затем инкубировали в течение ночи. Фракцию супернатанта удаляли.
b) Этерификация миколовой кислоты: В каждую пробирку добавляли 2 мл смеси метанол:толуол:серная кислота (30:15:1; об./об.), и проводили реакцию этерификации в течение ночи. Затем добавляли 4 мл н-гексана, сушили в потоке азота и ресуспендировали в 500 мкл гексана.
c) ТСХ: 10 мкл каждого образца наносили в виде параллельных линий на край планшета (силикагель 60 (20×20 см) (Merck). Хроматографическое разделение осуществляли три раза в сатураторе с подвижной фазой (этиловый эфир: н-гексан (15:85, об./об.)). Затем планшет оставляли сушиться на воздухе.
d) Миколовые кислоты выделяли путем распыления на планшеты раствора фосфономолибденовой кислоты в 96° этаноле и нагревали при 120°C в течение 10 минут.
Миколовые кислоты в образцах FCMtb определяли путем сравнения с коммерчески доступным стандартным образцом миколовой кислоты. Результаты выражали как качественные данные (присутствие (положительный результат)/отсутствие (отрицательный результат)) для оцениваемой миколовой кислоты.
f) Идентификация 6,6’-димиколята трегалозы (TDM): Тест-образцы: лиофилизованный FCMtb; 40 мг; исходные растворы: TDM стандарт (Sigma). Процедура:
(i) Способ экстракции: Образец экстрагировали смесью хлороформ:метанол (1:1 об./об.), а затем инкубировали в течение ночи. Фракцию супернатанта сушили в потоке азота и взвешивали. И наконец, осушенные образцы ресуспендировали в хлороформе в конечной концентрации 40 мг/мл.
(ii) ТСХ: 10 мкл каждого образца наносили в виде параллельных линий на край планшета (силикагель 60 (20×20 см) (Merck). Хроматографическое разделение осуществляли в сатураторе с подвижной фазой (хлороформ:метанол:вода (60:12:1 об./об.)). Затем планшет оставляли сушиться на воздухе.
(iii) Детектирование: TDM выделяли путем распыления на планшеты раствора 1% антрона в серной кислоте и нагревали при 120°C в течение 5 минут.
(iv) Идентификация: TDM в образцах FCMtb определяли путем сравнения с коммерчески доступным TDM, используемым для получения стандартного образца. Результаты выражали как качественные данные, то есть присутствие (положительный результат)/отсутствие (отрицательный результат) оцениваемого TDM.
g) Идентификация липоарабиноманнана (LAM): Для вестерн-блот-анализа LAM, соединения разделяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ стандартными методами, а затем электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану для иммунодетектирования с использованием специфического антитела CS35. Взаимодействие антиген-антитело визуализировали путем инкубирования с анти-антителом (козьим антителом против мышиных IgG IR Dye 800 CW), запускающим флуоресцентную реакцию.
h) Стерильность
Все способы, которые, как известно специалистам, требуют стерильности, осуществляли в стерильных условиях; причем, даже если необходимость в стерильности для любой из данных стадий точно не оговорена, то и в этом случае она должна соблюдаться. Тест на стерильность проводили в соответствии с описанием, представленным в Ph. Eur. 2.6.1 (USP <71>).
i) Инактивация микобактерий
Инактивацию микобактерий оценивали в соответствии с описанием, представленным в Ph. Eur. 2.6.2.
j) Бактериальные эндотоксины
Тест на бактериальные эндотоксины (LAL-тест, люмулис-тест с амебоцитным лизатом) осуществляли согласно общим указаниям, приведенными в Ph. Eur., метод 2.6.14, в соответствии с методом D (хромогенным кинетическим методом), а также в USP <85>.
Фрагментация бацилл
Совершенно очевидно, что правильный выбор метода фрагментации бацилл позволяет осуществлять оптимальную презентацию клеточных антигенов, а в частности, антигенов клеточной стенки. Фрагментацию FCMtb определяли методом динамического рассеяния света (описанным ниже) и лазерной дифракции.
Лазерная дифракция позволяет оценивать фрагментацию в пределах 0,04 мкм - 2000 мкм. Этот анализ был проведен сотрудниками Научно-технической службы в Университете Барселоны, Испания, на оборудовании Coulter LS 13320, снабженном универсальным жидкостным модулем (ULM). Растворитель: очищенная вода/минеральное масло. Результаты: Данные представлены на гистограмме и выражены как относительная частота различных частиц (%) по диаметру (0,04 мкм - 2000 мкм).
Определение z-среднего размера частиц и показателя полидисперсности
Средний размер частиц, описанный в этом документе, определяли методом динамического рассеяния света (ДРС), основанным на физической концепции броуновского движения частиц, выражаемой уравнением Стокса-Эйнштейна:
kT
где:
d(H) = гидродинамический диаметр
D = коэффициент диффузного перехода
k – константа Больцмана
T = абсолютная температура
η = вязкость
Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, можно лишь отметить, что уравнение Стокса-Эйнштейна указывает на то, что частицы, суспендированные в жидкой среде, находятся в постоянном и хаотическом движении, скорость которого зависит от размера частиц, то есть чем больше частица, тем медленнее ее броуновское движение.
В измерениях, проводимых методом динамического рассеяния света, образец, содержащий измеряемые частицы, облучают источником монохроматического света, предпочтительно лазером, и оценивают по корреляционной функции как интенсивность рассеянного света в зависимости от времени. Если, например, измеряют крупные частицы, то, поскольку они движутся медленно, то интенсивность рассеянного света изменяется медленно, и корреляция сигнала занимает много времени до затухания; и с другой стороны, если, например, измеряют небольшие частицы, то, поскольку они движутся быстро, то интенсивность рассеянного света изменяется быстро, и корреляция сигнала затухает быстрее.
В соответствии с настоящим изобретением, частицы предпочтительно измеряют на следующем оборудовании: Zetasizer nano zs (оборудование Malvern), с использованием очищенной воды/минерального масла в качестве растворителей.
Если это не оговорено особо, то такое оборудование используют в соответствии с инструкциями производителя, и корректировку и калибровку, если они проводятся, также осуществляют в соответствии с инструкциями производителя.
Размер вычисляют по функции корреляции с использованием различных алгоритмов. В настоящем изобретении применяют «анализ кумулятивных данных», описанный в ISO13321 в части 8. Путем подбора функции корреляции строят одну экспоненциальную кривую, и по этой кривой вычисляют следующие параметры:
- Средний размер или z-средний диаметр распределения частиц. Этот средний размер имеет среднюю интенсивность.
- Показатель полидисперсности (pdi), то есть величину, соответствующую ширине распределения частиц по размеру.
Результаты обычно представляют в виде гистограммы и выражают как относительную частоту различных частиц (%) с соответствующим диаметром, который может иметь любую величину и составляет в пределах от 1 нм до 3 мкм.
Тесты для оценки эффективности
6-7-недельные самки мышей C57BL/6, не зараженных специфическими патогенами, были закуплены у Harlan Iberica (Испания). Тест-образцы: препарат, представленный в таблице 3 и плацебо (вакцинный препарат без активного компонента).
4
2
a) Мышей-моделей, инфицированных in vivo бактериями M. tuberculosis, вакцинировали одной дозой. Протокол эксперимента включал: День 0: Подкожное инфицирование нижней части брюшины мышей пастеровским штаммом Mtb H37Rv Pasteur (4×10 к.о.е.). День 14: Химиопрофилактическая обработка животных одной пероральной дозой рифапентина (25 мг/кг) и изониазида (10 мг/кг), которые действуют как антибиотик в течение 1 недели. День 21: Вакцинация одной дозой вакцины/плацебо и/или HO подкожно в область шеи. Все образцы получали и анализировали для каждой отдельной мыши. Каждый эксперимент включал: базальную группу инфицированных мышей плюс плацебо и экспериментальную группу инфицированных мышей плюс вакцинацию. Эти группы состояли из 6-7 животных, а эксперименты проводили в дубликате. День 28: Животных анестезировали изофлуораном.
4
2
2
b) Мышей-моделей, инфицированных in vivo бактериями M. tuberculosis, вакцинировали двумя дозами. Протокол эксперимента включал: День 0: Подкожное инфицирование нижней части брюшины мышей пастеровским штаммом Mtb H37Rv Pasteur (4×10 к.о.е.). День 14: Химиопрофилактическая обработка животных одной пероральной дозой рифапентина (25 мг/кг) и изониазида (10 мг/кг), которые действовали как антибиотик в течение 1 недели. День 21: Вакцинация одной дозой вакцины/плацебо и/или HO подкожно в область шеи. День 36: Вакцинация второй дозой вакцины/плацебо и/или НО подкожно в область шеи. Все образцы получали и анализировали для каждой отдельной мыши. Каждый эксперимент включал: базальную группу инфицированных мышей плюс плацебо и экспериментальную группу инфицированных мышей плюс вакцинацию. Эти группы состояли из 6-7 животных, а эксперименты проводили в дубликатах. День 42: Животных анестезировали изофлуораном.
В соответствии с вышеописанными протоколами a) и b), после умерщвления мышей проводили ex vivo анализ параметров ореол-образующих единиц (SFU) по интерферону-γ с помощью ELISPOT с использованием суспензий клеток селезенки для оценки клеточного иммунного ответа.
2
2
Определение иммуногенной активности M. tuberculosis у здоровых мышей, используемых в качестве модели. 6-7-недельные самки мышей C57BL/6, не зараженных специфическими патогенами, были закуплены у Harlan Iberica (Испания). Здоровых мышей, используемых в качестве моделей in vivo-инфекции M. tuberculosis, вакцинировали двумя дозами. Протокол эксперимента включал: День 0: Вакцинация первой дозой вакцины, проводимая в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения или плацебо и/или HO подкожно в область шеи. День 21: Вакцинация второй дозой вакцины/плацебо и/или HO, проводимая подкожно в область шеи. Все образцы получали и анализировали для каждой отдельной мыши. Каждый эксперимент включал: базальную группу здоровых мышей мышей плюс плацебо-группу и экспериментальную группу здоровых мышей плюс вакцинацию. День 28: Животных анестезировали изофлуораном. После умерщвления мышей проводили анализ антител IgG с помощью ELISA с использованием мышиной сыворотки для оценки гуморального иммунного ответа.
Диагностика туберкулеза
Методы диагностики туберкулеза хорошо известны специалистам. Известно, что для получения надежных результатов проводят квантифероновый тест и TST, которые могут быть проведены отдельно или в комбинации в целях распределения индивидуумов по группам в соответствии с их восприимчивостью к терапии, проводимой с использованием продукта согласно изобретению. Квантиферон, известный также как QFT, является коммерчески доступным продуктом, используемым в анализе на туберкулезную инфекцию или латентный туберкулез и производимым компанией Cellestts Limited, Chadstone, Melbourne, Victoria, Australia. QFT-тест представляет собой анализ на высвобождение интерферона-γ (IGRA), применяемый для диагностики туберкулеза. Этот анализ проводят в соответствии с инструкциями производителя. Реакция Манту (также известная как кожный скрининг-тест Манту, тест на восприимчивость к туберкулину (TST-тест), проба Перке или PPD-тест (на очищенное белковое производное) представляет собой метод диагностики туберкулеза. Описание обоих тестов можно найти в работе Franken et al., Clin Vaccine Immunol. 2007, April; 14(4): 477-480.
ПРИМЕРЫ
В представленных ниже примерах описаны технические методы осуществления изобретения и дано объяснение некоторых его конкретных вариантов. Эти примеры приводятся в целях иллюстрации и никоим образом не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.
Пример 1: Выделение штамма NCTC 13536 Mycobacterium tuberculosis
Исходным материалом для продуцирования FCMtb является инокулят штамма NCTC 13536, также называемый 511 или NCTC 13536 Mycobacterium tuberculosis, то есть штамм Mycobacterium tuberculosis, выделенный у иммунокомпетентного пациента, у которого был диагностирован туберкулез легких, в Барселоне (Испания). Этот штамм был депонирован в 2010 году в депозитарии NCTC в Лондоне, который представляет собой Государственный депозитарий, созданный в соответствии с Будапештским договором. Этот штамм был также депонирован в Коллекции штаммов Отделения Микробиологии при клинике Сант-Пау, Барселона, Испания (de Sant Pau, Barcelona, Spain).
Два пассажа исходного штамма было проведено в 1995 и в 1996 годах, соответственно. MSL PB#1 соответствует второму пассажу исходного штамма NCTC 13536 M. tuberculosis, который был проведен в октябре 1996 года в 100 сосудах (в стерильных стеклянных 3 мл-сосудах), и эти сосуды хранили при -70± 5°C. Этот штамм имел низкий полиморфизм генов, как было определено известными стандартными методами.
Пример 2: Способ первичной обработки для продуцирования клеток MTB-C
7
Блок-схема этого способа представлена на фиг. 1. Исходным материалом для продуцирования FCMtb является инокулят штамма Mycobacterium tuberculosis NCTC 13536 (пример 1). Для гарантии непрерывного поступления этого исходного материала предпочтительнее использовать систему посевных партий. Следовательно, для продуцирования FCMtb использовали рабочую посевную партию (WSL), взятую из основной посевной партии (MSL). Штамм NCTC 13536 Mycobacterium tuberculosis (пример 1) культивировали в течение 3-5 недель в среде Левенштайна-Йенсена. Затем бактериальную культуру субкультивировали в среде Проскауэра-Бека при температуре 37± 2°C с одновременным перемешиванием при 100± 5 об/мин. После достижения максимальной концентрации бактерий (как показал визуальный осмотр) начинали субкультивирование в среде Проскауэра-Бека, и полученную культуру инкубировали. После достижения аналогичной концентрации бактерий брали небольшие аликвоты. Количество жизнеспособных бактериальных клеток определяли по числу колониеобразующих единиц (к.о.е.), полученных в агаровой среде Миддлбрука после инкубирования при 37± 2°C в течение 3-4 недель. Число бактерий должно составлять 2-5×10 к.о.е./мл.
(1) Культивирование Mycobacterium tuberculosis
Продуцирование FCMtb начинали с посева 0,2 мл WSL в планшете с агаром 7H11 и инкубирования при 37± 1°C в течение 15± 2 дней. Затем колонии переносили в пробирку, содержащую несколько стеклянных сфер. После смешивания добавляли приблизительно 5 мл воды для инъекций (WFI) с получением бактериальной суспензии. На этой стадии подсчитывали число жизнеспособных клеток в планшете и проводили тест на стерильность. Приблизительно 100 планшетов с агаром 7H11 Миддлбрука засевали M. tuberculosis с использованием тампонов, пропитанных бактериальной суспензией, с получением конфлюэнтных культур. Планшеты инкубировали при 37± 1°C в течение 21± 2 дней.
Тест на стерильность при непрерывном контроле осуществляли следующим образом:
Тесты на стерильность проводили в целях подтверждения отсутствия грибков и бактерий, не принадлежащих к Mycobacteria. Эти тесты осуществляли путем прямой инокуляции в условиях, описанных в руководстве Ph. Eur 2.6.1 для проведения теста на стерильность. Тестируемые образцы должны быть стерильными. Вместо среды 7H10 (упоминаемой в Ph. Eur. 2.6.2) использовали среду 7H11. Среда 7H11 была получена на основе среды 7H10, в которую был добавлен один грамм панкреатического казеинового гидролизата для усиления роста штаммов Mycobacterium tuberculosis.
(2) Сбор Mycobacterium tuberculosis и замораживание сырого экстракта
После инкубирования, чистоту бактериальной культуры контролировали путем визуального наблюдения агаровых планшетов и проводили тест на стерильность. Затем из агаровых планшетов собирали бактериальную культуру, и эту культуру переносили в стерильную пробирку. Полученный сырой экстракт взвешивали (20-22 г). Смесь выдерживали при -80°C± 5°C.
Пример 3: Способ вторичной обработки для получения липосом, выделенных из сырого экстракта
Блок-схема данного способа представлена на фиг. 2.
(3) Фрагментация клеток и делипидизация
Замороженный сырой экстракт (пример 2) оттаивали при 37± 1°C, а затем добавляли стерильный PBS-буфер с 4% (масс./масс.) тритоном-X114 (pH 7,0-7,5) при 4°C. После перемешивания, этот экстракт переносили в стерильный поликарбонатный контейнер, содержащий сферы из двуокиси кремния/двуокиси циркония. Затем осуществляли фрагментацию клеток на устройстве Beadbeater путем проведения нижеследующего метода фрагментации: 3 цикла, каждый из которых состоит из 5 стадий ON/OFF с 10-минутными интервалами. После проведения этого способа, фракцию фрагментированных клеток отделяли от сфер путем последовательных промывок (с повторяющимися встряхиванием и осаждением) в стерильном PBS-буфере с 4% тритоном-X114 (pH 7–7,5). Затем брали аликвоту промытой суспензии фракции фрагментированных клеток для регуляции значений рН и осуществляли конечное центрифугирование при 845×g при 4°C в течение 30 минут.
Для удаления цитозольной фракции и получения суспензии, обогащенной клеточными фрагментами, два раза проводили высокоскоростное центрифугирование при 20000×g приблизительно в течение 60 минут при 4°C. После первого центрифугирования, желтоватый супернатант (обогащенный растворимыми белками и липидами) отбрасывали, и полученный осадок ресуспендировали в PBS, а затем снова центрифугировали в условиях, описанных выше. После центрифугирования, удаленный супернатант должен быть на вид прозрачным и бесцветным. И наконец, полученный осадок ресуспендировали в конечном объеме 50-60 мл PBS (суспензия FCMtb).
(4) Пастеризация
Затем суспензию FCMtb пастеризовали при 65± 2°C в течение 60 минут. После пастеризации, конечный pH пастеризованного FCMtb определяли по окрашиванию лакмусовой бумаги. Приемлемым считается рН в пределах 6,5–7,5. Стерильные и апирогенные сосуды заполняли 0,5 мл суспензии продукта и проводили IPC-тесты на стерильность и инактивацию микобактерий. И наконец, заполненные сосуды замораживали при -80± 5°C. После пастеризации данного материала, его физически отделяли от необработанного материала, то есть часть, используемую перед пастеризацией, полностью отделяли от части, используемой в последующем процессе заполнения.
(5) Лиофилизация
2
Все сосуды, содержащие замороженный продукт, лиофилизовали при температуре приблизительно от -45°C до 30°C и под давлением 0,310 мбар приблизительно в течение 18 часов (в объеме 0,5 мл на сосуд). Сосуды закрывали в асептических условиях и в атмосфере N, а затем их помечали. После этого, упакованное лекарственное вещество хранили при -20°± 5°C в течение периода времени до 12 месяцев.
Пример 4: Характеризация белка
На фиг. 3 представлен краткий обзор стратегии характеризации белкового профиля.
Как описано в литературе (Andersen P., 1997, Scand J. Immunol.; 45(2): 115-31; Getsel et al., 2005, J. Immunol.; 174(8): 5007-15; Stewart et al., 2005, Infect. immun., 73(10):6831-7, Wang et al., 2007, J. Mol. Biol., 366(2):375-81) было выбрано 6 полос белка как полосы, удовлетворяющие критериям оценки профиля белков: белка HSP70 (Rv0350), 38 кДа-белка (Rv 0934), (Rv 1866c), 19 кДа-белка (Rv 3763), белка CFP10 (Rv3874) и белка ESAT-6 (Rv3875).
А. Определение содержания общего белка: Уровни общего белка в FCMtb количественно оценивали методом с использованием бицинхониновой кислоты (BCA). Количество общего белка составляет приблизительно 10% (масс./масс.) от содержания FCMtb. Сравниваемые стандарты FCtb-0429-16 и FCMtb-52.1 содержали 167 мкг белка/мг FCMtb и 115 мкг белка/мг FCMtb, соответственно.
В. Идентификация белкового профиля с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ): Белковый профиль лекарственного вещества FCMtb определяли путем сравнения с исходными антигенами Mycobacterium tuberculosis, соответствующими ESAT6 (6 кДа) (7); CFP10 (10 кДа) (6); Ag85B (30 кДа) (1); 38 кДа (2); HSP70 (70 кДа) (4) а также маркеру молекулярной массы MW (5) (см. фиг. 4). Определение белкового профиля лекарственного вещества FCMtb и идентификацию полос (приблизительно 70 кДа, 38 кДа, 30 кДа, 10 кДа и 6 кДа) осуществляли путем окрашивания кумасси. Идентификацию 19 кДа-полосы (липополипептида) осуществляли путем окрашивания серебром.
С. Идентификация белкового профиля с помощью Вестерн-блот-анализа с использованием специфических моноклональных антител: Белковый профиль лекарственного вещества FCMtb определяли с помощью паттернов, полученных путем проведения Вестерн-блот-анализов с использованием моноклональных антител (mAb): анти-HSP70 антитела (70 кДа, фиг. 5c), анти-38 кДа антитела (фиг. 5d), анти-Ag85B антитела (30 кДа, фиг. 5e).
FCMtb-52.1 представляет собой исходную партию для FCMtb в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения.
Пример 6: Характеризация липидов
Характеризация липидного профиля FCMtb включает способ фракционирования на основе экстракции смесью хлороформ:метанол (1:1). Способ фракционирования, осуществляемый в этих исследованиях, проводили в соответствии с процедурой, описанной в публикации Delmas et al., 1997, Glycobiology 7(6), 811-7. Тонкослойная хроматография (ТСХ) представляет собой метод, применяемый для анализа содержания липидов и гликолипидов, присутствующих в FCMtb. В частности, полиацилтрегалоза (PT), димиколят трегалозы (TDM), диацилтрегалоза (DAT), маннозиды фосфатидилинозита (PIM) и другие фосфолипиды, а также димикоцерозаты фтиоцерола (PDIM) и миколовые кислоты были идентифицированы с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) в исходных штаммах H37rv и NCTC 13536, а также в различных партиях FCMtb. См. фиг. 7a. Содержание 6,6’-димиколята трегалозы (TDM) определяли с помощью ТСХ в супернатанте. Определение миколовых кислот проводили в осадке после осуществления ТСХ. Хотя какой-либо оценки количественных данных для липидного профиля MTB-C пока не проводилось, однако, специалистам, занимающимся этими исследованиями, уже давно известен способ определения качественного липидного профиля, позволяющий осуществлять стандартную характеризацию иммуногенных липидов. FCMtb сравнивали с липидной фракцией целых клеток штаммов NCTC 13536 и H37Rv M. tuberculosis и коммерчески доступного TDM-стандарта (см. фиг. 7a и 7b). Было показано, что в целом, содержание липидов соответствует содержанию липидов в других партиях FCMtb-содержащих липосом согласно изобретению. На фиг. 7d проиллюстрирована идентификация LAM.
Пример 6: Характеризация фрагментированного клеточного материала
Предварительные результаты, полученные с применением обоих методов, показали, что размер фрагментов FCMtb составляет, главным образом, менее 1 мкм (99% <1 мкм), как было подтверждено с помощью электронной микроскопии FCMtb: размер фрагмента составляет, главным образом, в пределах от 100 до 300 нм.
Уровни остаточной ДНК после экстракции смесью фенола/хлороформа оценивали по оптической плотности на 260 нм (предел детектирования: 0,2 мкг ДНК/мг FCMtb). Типичные результаты, полученные ранее, составляют менее 15 мкг ДНК/мг FCMtb.
Стабильность процесса продуцирования лекарственного вещества определяется липидным и белковым профилем, который является воспроизводимым для различных партий FCMtb.
Пример 7: Иммунизация мышей и визуализация биологической активности
Взаимодействие полос белка FCMtb с мышиной иммунологической сывороткой: С применением вестерн-блот-анализа могут быть визуализированы полосы белка FCMtb, которые взаимодействуют с антителами IgG, присутствующими в сыворотке, взятой у инфицированных мышей, два раза инокулированных вакциной на основе липосомного препарата согласно изобретению. Такое взаимодействие рассматривается как показатель биологической активности (фиг. 6).
Пример 8: In vivo активность липосомного препарата, содержащего FCMtb
Биологическую активность вакцины исследовали на модели in vivo путем оценки иммуногенной активности FCMtb без липосом (с разведением водой для инъекций, WFI) и FCMtb в липосомном препарате в соответствии с наилучшим способом осуществления изобретения (5% сахароза, см.выше) (фиг. 8). Эти результаты выявили явные преимущества использования липосомного препарата, содержащего сахарозу.
Агрегация или слияние липосом представляют собой параметры, которые, как было продемонстрировано, оказывают значительное влияние на биологическую активность вакцины. Поэтому, авторами настоящего изобретения был проведен полный контроль размера частиц и показателя полидисперсности в процессе приготовления и выпуска партий вакцин.
Пример 9: Действие сахарозы
В предварительном тесте, один из нижеследующих наполнителей, а именно, (a) 1,5% глицин и (b) 5% сахароза, соответственно, могут быть введены, но необязательно, в липосомный препарат, содержащий фрагменты штамма MTB-C NCTC 13536. Затем проводят сравнительный анализ физико-химических свойств и биологической активности обоих препаратов.
Результаты, полученные путем измерения после разведения лиофилизованной липосомной композиции и после тестирования конкретных параметров спецификации для выпуска текущих партий продукта представлены в таблице 5.
Таблица 5Результаты по спецификациям для 3 различных препаратов, оцененных после разведения лиофилизованной липосомной композиции
Параметр
Критерии приемлемости
FCMtb, приготовленные в липосомной суспензии
Без наполнителя
5% сахароза
1,5% глицин
FCMtb, приготовленные в липосомной суспензии
Внешний вид
Белый или не совсем белый порошок
ND
Удовлетворяет нужным требованиям
Удовлетворяет нужным требованиям
Морфология осадка на фильтре
Плоский или почти плоский и гомогенный
ND
Удовлетворяет нужным требованиям
Удовлетворяет нужным требованиям
Содержание воды (%)
≤3%
ND
1,4
3,0
Время до разведения (с)
Тщательно разведенный ≤10 с
ND
5
12
рН
7-8
8,1
7,4
7,0
Размер частиц
z-среднее (нм) Pdi<sup>(a)</sup>
75± 20 (≤0,250)
370<sup>(1)</sup>(0,492)
66(0,215)
504<sup>(1)</sup>(0,569)
Иммуно-генная активность у мышей-моделей с инфекцией M. tuberculosis
Антиген-специфи-ческий IFN-γ, ореол-образующие единицы
PPD
3-12Отношение SFU/10<sup>6</sup> клеток, соответствующее базальной величине (базальная величина в SFU/10<sup>6</sup> клеток)
3,6(183)
5,1(183)
2,8(183)
Ag85B (30 кДа)
5-20Отношение SFU/10<sup>6</sup> клеток, соответствующее базальной величине (базальная величина в SFU/10<sup>6</sup> клеток)
5,5(73)
9,6(73)
5,4(73)
<sup>(а)</sup> Показатель полидисперсности
<sup>(1)</sup> Присутствие липосомных агрегатовND = не определяли
Авторами данного исследования было неожиданно обнаружено, что препарат, содержащий 5% сахарозу, имеет то преимущество, что он обладает лучшими физико-химическими свойствами, такими как содержание воды или время до разведения, соответственно. Но решающим фактором является значительное снижение липосомной агрегации (размер частиц, z-среднее), на что указывает сравнение препарата, содержащего сахарозу, с двумя другими препаратами. Анализ, проводимый методом динамического рассеяния света, показал, что z-среднее составляет 75 ±  20 нм (показатель полидисперсности ≤0,350) для липосом, содержащих сахарозу. Электронная микроскопия липосомного препарата, содержащего сахарозу и приготовленного способом получения замороженных сколов, указывала на смесь многослойных и однослойных липосом размером 40-100 нм (фиг. 9).
Было высказано предположение, что препарат, содержащий 5% сахарозу, благодаря своему улучшенному параметру, а также меньшему наблюдаемому уровню содержания воды (≤2%), должен иметь более высокую стабильность. И этот факт действительно подтвердился. Данные, полученные авторами настоящего исследования экспериментальных партий, приготовленных с использованием 1,5% глицина и хранящихся при комнатной температуре в течение 3 месяцев, указывали на резкое снижение биологической активности (иммуногенной активности) PPD. В противоположность этому, биологическая активность PPD оставалась, в основном, на том же уровне при исследовании препарата, содержащего 5% сахарозу, после 3-месячного хранения при комнатной температуре. Следовательно, сахароза также имеет преимущество с точки зрения более длительного сохранения биологической активности.
Пример 10: Биологические свойства препарата, содержащего сахарозу
Препарат, описанный в таблице 3, был использован в биологических исследованиях. Клеточный иммунный ответ, запускаемый посредством введения вакцины в соответствии с предпочтительным способом осуществления изобретения (одной инокуляции) мышам с моделью заражения Mycobacterium tuberculosis, может быть определен с помощью анализа ELISPOT, результаты которого представлены в таблице 6.
Таблица 6Клеточный ответ после инокуляции мышей
Параметр
Партия (50 мкг/дозу, 166,7 мкг/мл)
a09
c09
d09
e09
Антиген-специфический IFN-γ, ореол-образующие единицы (SFU)
PPDОтношение SFU/10<sup>6</sup> клеток, соответствующее базальной величине (базальная величина в SFU/10<sup>6</sup> клеток)
5,1(базальный уровень: 183 SFU/10<sup>6</sup> клеток)
6,3(базальный уровень: 98 SFU/10<sup>6</sup> клеток)
7,2(базальный уровень: 164 SFU/10<sup>6</sup> клеток)
6,5(базальный уровень: 164 SFU/10<sup>6</sup> клеток)
Ag85BОтношение SFU/10<sup>6</sup> клеток, соответствующее базальной величине (базальная величина в SFU/10<sup>6</sup> клеток)
9,6(базальный уровень: 73 SFU/10<sup>6</sup> клеток)
9,9(базальный уровень: 44 SFU/10<sup>6</sup> клеток)
11,9(базальный уровень: 90 SFU/10<sup>6</sup> клеток)
12,3(базальный уровень: 88 SFU/10<sup>6</sup> клеток)
ND: Не определяли
Введение вакцины на основе липосомного препарата приводило к значительному увеличению клеточного иммунного ответа in vivo по сравнению с базальными величинами у инфицированных животных в том случае, если для определения уровней ответов применяли метод ELISPOT. Уровни иммунного ответа превышали уровни базальных ответов в 4-8 раз для PPD и в 8-14 раз для Ag85B. Вакцина, приготовленная на основе липосомного препарата, также индуцировала полиантигенный гуморальный ответ, который дает протективный эффект, особенно в случае высокого уровня диссеминирования инфекции (Guirado et al., 2006, Microbes Infect. 8, 1252-1259).
В частности, было проведено сравнение данных иммуногенной активности, полученных для препарата, не содержащего сахарозу, и препарата, содержащего сахарозу в качестве главного наполнителя. Полученные результаты четко указывают на то, что клеточный иммунный ответ, вырабатываемый при введении 50 мкг дозы FCMtb-препарата, содержащего сахарозу, приблизительно в 1,5 раз превышал ответ, достигаемый путем введения идентичной дозы препарата без сахарозы у модели с одной вакцинацией. Эти более высокие уровни клеточных иммунных ответов были получены в обоих тестах на активность, то есть в одном тесте, который проводили в соответствии с требованиями, предъявляемыми к спецификации для выпуска партий продукта (у модели с одной вакцинацией), и в дополнительном тесте, который осуществляли для сравнения (у модели с двумя вакцинациями). Кроме того, в обоих тестах на активность, уровни клеточного иммунного ответа, вырабатываемого при введении 50 мкг дозы FCMtb-препарата, содержащего сахарозу, были аналогичны уровням, наблюдаемым в случае введения 200 мкг FCMtb-препарата, не содержащего сахарозу. Результаты, полученные после разведения лиофилизованной липосомной композиции, представлены на фиг. 10a и 10b. Препарат, содержащий сахарозу, обнаруживал значительное снижение уровня липосомной агрегации. Вероятно, что это обусловлено более высокой иммуногенностью. Клеточный иммунный ответ, достигаемый при введении 50 мкг дозы нового препарата, был почти сравним с клеточным иммунным ответом, наблюдаемым при введении 200 мкг-дозы препарата, не содержащего сахарозы. Специалистам в данной области известно, что такой клеточный ответ может рассматриваться как релевантный ответ (North RJ, Jung YJ (2004). Annu. Rev. Immunol. 22; 599-623).
Пример 11: Способ приготовления лиофилизованного липосомного препарата
Один из вариантов способа приготовления фармацевтической композиции, включающей липосомный препарат согласно изобретению, представлен на фиг. 11. Вкратце, этот способ включает нижеследующие стадии 1-5.
(1) Получение компонентов нерасфасованной LCS
Соевый лецитин нерасфасованной LCS растворяли в этаноле (1:1; масс./масс.), а холат натрия растворяли в воде (1:5; масс./масс.). Растворы стерилизовали путем фильтрации. После смешивания раствора натрия-лецитина и раствора холата натрия добавляли лиофилизованный FCMtb (пример 1) и перемешивали. Отношение компонентов составляло 0,03:0,2:0,7 (FCMtb:холат натрия:соевый лецитин; масс./масс./масс.).
(2) Получение нерасфасованной LCS
Водную фазу переносили в стерилизованный миксер из нержавеющей стали. Жидкую фазу (1), содержащую соевый лецитин, холат натрия и FCMtb, добавляли в отношении 0,7:0,3 (водная фаза:жидкая фаза, масс./масс.). Фазы смешивали при 2200 радиан/с в течение 3 минут для гомогенизации и образования липосом. После гомогенизации, нерасфасованную LCS переносили в другой сосуд и оставляли по меньшей мере на 5 минут. Размер частиц нерасфасованной LCS определяли IPC-методом.
(3) Разведение нерасфасованной LCS, конечного препарата липосомной суспензии
Был получен 10% (масс./масс.) раствор сахарозы, и этот раствор стерилизовали. Раствор сахарозы смешивали с водой и с нерасфасованной LCS в адекватных соотношениях с получением конечной нерасфасованной липосомной суспензии (LS), состоящей из 21 мг LCS/мл в 5% растворе сахарозе. pH, стерильность и размер частиц тестировали при непрерывном контроле.
(4) Заполнение
Сосуды заполняли 0,4 мл LS (при непрерывном перемешивании), а затем неплотно закрывали для замораживания и лиофилизации.
(5) Лиофилизация, упаковка и маркировка
2
Сосуды замораживали при -80°C± 5°C до лиофилизации. Лиофилизацию осуществляли при температуре от -45°C до 25°C, под давлением 0,150 мбар. Эту процедуру проводили в течение 24 часов. По окончании лиофилизации, сосуды плотно закрывали в атмосфере N, инкапсулировали, маркировали и хранили при 5± 3°C.
Пример 12: Вспомогательная терапия LTBI требует введения только одной разовой дозы в 25 мкг FCMtb
Клинические рандомизированные испытания фазы II, проводимые двойным слепым методом, осуществляли для оценки эффекта 3 доз FCMtb (5, 25, 50 мкг, каждую из которых получали как описано в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения) и плацебо у 96 ВИЧ-положительных (ВИЧ+) и ВИЧ-отрицательных (ВИЧ-) индивидуумов с латентной туберкулезной инфекцией (LTBI) (TST+ и квантиферон+), которые, после 1-месячного лечения изониазидом, были произвольно распределены по группам n=12 на группу. Индивидуумы были два раза инокулированы дозами FCMtb (5, 25, 50 мкг, каждая из которых была получена, как описано в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения) сразу после химиотерапии изониазидом и через 4 недели.
+
Иммунолологический профиль: FCMtb (дозы 5, 25, 50 мкг, каждая из которых была получена как описано в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения) вырабатывал полиантигенный ответ в параболической форме (в форме колокола) против секретированных (ESAT-6, Ag85B) и структурных (16 кДа, 38 кДа) антигенов, которые были стимулированы при всех дозах (фигуры 12 и 13). FCMtb (дозы 5, 25, 50 мкг, каждая из которых была получена как описано в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения) вырабатывал длительный анамнестический ответ (WHO-тест) при более высоких дозах, совместимых с дозами, дающими профилактический эффект. Неожиданно было обнаружено, что хотя, в целом, иммунные ответы были более интенсивными у ВИЧ-индивидуумов, чем у ВИЧ-индивидуумов, однако, одна инокуляция 25 мкг FCMtb (дозы 5, 25, 50 мкг, каждая из которых была получена как описано в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения) давала наилучший иммунный ответ у индивидуумов обеих групп (фигуры 12 и 13).
Заключение: Разовая инокуляция дозой 25 мкг представляет собой наилучший выбор для вспомогательной терапии LTBI у ВИЧ-отрицательных и ВИЧ-положительных индивидуумов.
Краткое описание графического материала
На Фиг. 1 представлена блок-схема, иллюстрирующая предварительный способ получения лекарственного вещества FCMtb, и включающая материалы и реагенты, используемые в этом способе и подходящие для осуществления непрерывного контроля.
На Фиг. 2 представлена блок-схема, иллюстрирующая способ вторичной обработки для получения лекарственного вещества FCMtb, и включающая материалы и реагенты, используемые в этом способе и подходящие для осуществления непрерывного контроля.
На Фиг. 3 представлена блок-схема характеризации белка.
На Фиг. 4 показана идентификация антигенов методом электрофореза в ДСН-ПААГ и методом окрашивания кумасси синим. Представлены исходные антигены ESAT6 (6 кДа) (7); CFP10 (10 кДа) (6); Ag85B (30 кДа) (1); 38 кДа (2); HSP70 (70 кДа) (4), а также маркеры молекулярной массы MW (5).
На Фиг. 5 представлена характеризация белка. Фиг. 5a: Белковый профиль; белковый профиль исходного стандарта FCMtb-52.1 (1-6) в конечных концентрациях 5,6 г FCMtb/мл (1, 2), 6,25 мкг FCMtb/мл (3, 4) и 1,56 мкг FCMtb/мл (5, 6), электрофорез в ДСН-ПААГ, а затем окрашивание кумасси. MW в кДа. 5b: идентификация 19 кДа-полосы, электрофорез в ДСН-ПААГ, а затем окрашивание серебром. 5c: Белковый профиль: идентификация полос (10 кДа и 6 кДа) в указанных FCMtb-партиях методом электрофореза в ДСН-ПААГ и методом окрашивания серебром вместе с ESAT-6-стандартом от Lionex. Различные FCMtb-партии (1, 2, 3, 9, 10, 11 (партия FCMtb-52.1 на дорожке 9)), ESAT-6-стандарт от Lionex в различных концентрациях (4-8); 5d: Вестерн-блот-идентификация антигена M. tuberculosis HSP70 (Rv 0350) в FCMtb-партиях, проводимая с помощью Вестерн-блот-анализа с использованием специфических антител одновременно с Вестерн-блот-анализом M. tuberculosis HSP70, используемого в качестве стандарта. Различные FCMtb-партии (1, 2, 3, 4, 7, 8, 9), HSP70-стандарт (5, 6); 5e: Идентификация 38 кДа-антигена М. tuberculosis (Rv 0934) в FCMtb-партиях с помощью Вестерн-блот-анализа, проводимого с использованием специфического антитела и осуществляемого одновременно с 38 кДа-стандартом M. tuberculosis от Lionex. Детектирование флуоресценции, осуществлямое с использованием системы Odyssey. Различные FCMtb-партии (1, 2, 3, 6, 7), 38 кДа-стандарт (4, 5). 5f: Идентификация антигена Ag85B (Rv 1886c) в FCMtb-партиях, осуществляемая Вестерн-блот-методом с использованием специфического антитела одновременно с Ag85B-стандартом M. tuberculosis от Lionex. Детектирование флуоресценции осуществляли с использованием системы Odyssey. FCMtb-партии (1, 2, 3, 5, 6, 7), Ag85B-стандарт (4).
На Фиг. 6 показано взаимодействие указанных белковых полос различных FCMtb-партий (50 мкг/дорожку) с 1/8000-разведением сыворотки, взятой у инфицированных мышей, которые были два раза инокулированы фармацевтической вакцинной композицией на основе липосомного препарата согласно изобретению, где указанное взаимодействие было оценено Вестерн-блот-методом.
На Фиг. 7 представлен анализ липидов. 7a: Идентификация полиацилтрегалозы (PT), 6,6’-димиколята трегалозы (TDM) и диацилтрегалозы (DAT) в исходных штаммах (H37Rv (2) и NCTC 13536 (1), в других FCMtb-партиях (3-9) и TDM-стандарте (10) с помощью ТСХ. 7b: Идентификация 6,6’-димиколята трегалозы (TDM) в FCMtb-партиях с помощью ТСХ. Панели (A) и (B) представляют два независимых анализа. (A) TDM-стандарт (11) и (12), другие дорожки – различные FCMtb-партии. B: (1) TDM-стандарт (1), другие дорожки – различные FCMtb-партии. 7c: Определение паттерна миколовых кислот I, III и IV в FCMtb-партиях с помощью ТСХ. Панели (A), (B) и (C) представляют три независимых анализа. (A) FCMtb-партии (1-6 (FCMtb-51.2-стандарт 6)). (B) для иллюстрации/сравнения, (C) партия FCMtb-47b (1) по сравнению с миколовой кислотой, используемой в качестве стандарта (2). 7d: Идентификация LAM (на левой дорожке; на остальных дорожках, образцы, полученные из липосом согласно изобретению).
На Фиг. 8 представлено сравнение клеточной иммунологической активности для FCMtb, ресуспендированного в воде для инъекций (WFI), с активностью для FCMtb, полученным в липосомах (вакцина, обозначенная RUTI, партия 10a), в одной и той же дозе (50 мкг/дозу).
На Фиг. 9 показан способ получения замороженных сколов нерасфасованного липосомного концентрата (LCS) (для электронной микроскопии).
На Фиг. 10 показан: a: клеточный иммунный ответ на партию, оцениваемый по двум вакцинным препаратам в тесте на активность (одна вакцинация), b: как в (a), но с двумя вакцинациями. «Препарат II»: препарат, содержащий 5% (масс./масс.) сахарозу, в соответствии с таблицей 1 настоящего документа. «Препарат I»: препарат, аналогичный препарату II, за исключением того, что в данном препарате отсутствует сахароза; «мкг» означает мкг FCMtb/дозу. 85B: Ag85B.
На Фиг. 11 представлена блок-схема способа согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения.
На Фиг. 12 представлен иммунологический профиль после одной инокуляции 25 мкг RUTI, как описано в примере 12.
На Фиг. 13 показана иммуногенность (ВИЧ- и ВИЧ+) как описано в примере 12.