Гистологические особенности липографта с плазмой, обогащенной тромбоцитами, после подкожной трансплантации in vivo

ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЛИПОГРАфТА С ПЛАЗМОй,

обогащенной тромбоцитами, после подкожной

ТРАНСПЛАНТАЦИИ IN VIVO

И.Р. Дзампаева 1, И.В. Гайворонский 2, И.В. Крайник 3, А.Ю. Дробышев 1, И.Я. Бозо 14-5, АВ. Глушко 1, Р.В. Деев 4

1Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова, Москва, Россия

2 Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия

3Национальный медико-хирургический центр им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия

4 Институт стволовых клеток человека, Москва

5Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна, Москва, Россия

Histological features of the lipograft with platelet-rich plasma after subcutaneous transplantation in vivo

I.R. Dzampaeva 1, I.V. Gaivoronskiy2, I.V. Krainik 3, A.Y. Drobyshev1, I.Y. Bozo 145, A.V. Glushko 1, R.V. Deev4

1 A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry, Moscow, Russia

2 S.M. Kirov Military Medical Academy, Saint-Petersburg, Russia

3 National Medical Surgical Center, Moscow, Russia

4 Human Stem Cells Institute, Moscow, Russia

5 A.I. Burnazyan Federal Medical Biophysical Center, Moscow, Russia

Аутотрансплантация жировой ткани является одним из наиболее распространенных методов коррекции объемов и формы мягких тканей . Однако эффект липофилинга является краткосрочным в связи с низкой выживаемостью жирового трансплантата

Данное исследование было направлено на оценку влияния плазмы, обогащенной тромбоцитами (platelet-rich plasma, PRP), на динамику инволютивных изменений липо-графта в экспериментальной модели с подкожным введением жировой ткани в ушную раковину кролика .

Каждому животному (n = 9) выполнялась подкожная аутотрансплантация жировой ткани: в левую ушную раковину — без PRP, в правую — смешанной с PRP . На сроках 1, 2, 4, 8 и 36 нед . выполняли гистологический анализ полученных материалов, оценивая количество жировых элементов, процессы фиброза, выраженность макрофагально-гистио-цитарной реакции (выявление Сй163+-клеток).

Было установлено, что на ранних сроках наблюдения — вплоть до 4 нед . — признаки фиброза (толщина соединительнотканной капсулы, междольковых и межадипоци-тарных септ) менее выражены в случае применения PRP . Однако в дальнейшем гистологическая характеристика выравнивалась в обеих группах

Таким образом, PRP может оказать положительное влияние на выживаемость жирового аутотрансплантата, однако требуются дополнительные исследования для выбора оптимального протокола обработки липографта PRP и дальнейший анализ причин, механизмов и признаков инволюции трансплантированной жировой ткани

Ключевые слова: плазма, обогащенная тромбоцитами, жировая ткань, трансплантация, липографтинг

Autologous adipose tissue transplantation is one of the most common methods of soft tissue volume and shape correction . However, the effect of fat grafting is short due to the low survival rate of a fat graft

This study was designed to evaluate the influence of the platelet-rich plasma (PRP) on the dynamics of involutive changes of the fat graft in an experimental model with subcutaneous injection in the rabbit ear shell .

Each animal (n = 9) underwent subcutaneous autologous fat grafting: in the left ear — without PRP, in the right one — mixed with PRP . We performed the histological analysis of the materials estimating the number of fat elements, fibrosis processes, and severity of the macrophage-histiocytic reaction (identification of CD163+-cells) in 1, 2, 4, 8, 36 weeks after surgery .

We found that in the early stages of observation, up to 4 weeks, the signs of fibrosis (the thickness of the connective tissue capsule, interlobular and interadipocyte fibrous septums) were less pronounced in the case of PRP . However, further histologic characteristic became similar in the both groups

Thus, PRP can have a positive impact on the autologous fat graft survival, but more research is needed to select the optimal PRP processing protocol for autologous fat graft and further analysis of the causes, mechanisms and symptoms of the transplanted fat tissue involution

Keywords: platelet-rich plasma, adipose tissue, transplantation, fat grafting .

Введение

Эффективное реконструктивно-восстановитель-ное лечение пациентов с дефектами и деформациями мягких тканей лица является важной задачей челюстно-лицевой хирургии, решение которой требует применения материалов, способных восполнить утраченные объемы мягких тканей [1—3].

e-mail: ilonadzampaeva@yahoo . com

За многолетнюю историю развития методов оперативного лечения при данных показаниях было предложено значительное количество различных материалов, но в клинической практике закрепились только безопасные, биосовместимые и длительно сохраняющие объем после имплантации / трансплантации [4].

Современные материалы, применяющиеся для восстановления формы, контуров мягких тканей лица, по происхождению могут быть разделены на три группы: аутогенные (дерма, фасция, жир, хрящ, скелетные мышцы, капсула молочной железы и др . ); алло- и ксеногенные (хрящ, коллагеновый ма-трикс, дерма, фасция, твердая мозговая оболочка, гиалуроновая кислота); синтетические (силикон, по-лиметилметакрилат, изделия на основе полимеров органических кислот и др . ) [4].

Большинство авторов отдают предпочтение материалам первой группы, так как они отличаются наибольшей безопасностью: отсутствием токсического воздействия, аллергических реакций, низким риском инфицирования по сравнению с материалами других групп [5].

Учитывая требования, предъявляемые к материалам, а также накопленный опыт успешного применения, в последние годы все более широко используется аутотрансплантация жировой ткани [1—3, 6, 7]. Впервые, использование собственного жира пациента для увеличения объема мягких тканей описал G . Nueber в 1893 г . [8], заложив, тем самым, основы для внедрения данного метода в клиническую практику . Дальнейший опыт использования аутогенного жира связан с трудами Е . Hollander (1912) [9] и H . Neuhof (1923) [10]. Однако результаты первых случаев свободной аутотрансплантации жировой ткани не были долгосрочными

Временность эффекта липофилинга в виду быстрой биорезорбции трансплантированной жировой ткани, особенно под действием механических нагрузок, давления, вплоть до настоящего времени является основной проблемой, ограничивающей эффективность подхода [7]. Так, показано, что в течение первых 6—12 мес . после трансплантации от 20 до 70% введенной жировой ткани (липографта) может резорбироваться [11]. Описаны различные факторы, влияющие на выживаемость жирового трансплантата: способ его забора (ручной или механический); вид анестезии и метод инфильтрации донорской и реципиентной областей; разведение анестетика; метод очистки жировой ткани от крови и других смежных компонентов (отстаивание, центрифугирование, промывание в закрытой или открытой фильтрационных системах); техника и объем введения; послеоперационные процедуры [7].

В основе резорбции лежат недостаточное кровоснабжение трансплантированных липографтов, гипоксия, негативное воздействие продуктов разрушения клеток, влекущие к активации апоптоза адипоцитов, пролиферации фибробластов, образованию «жировых кист» и фиброзированию . В этой связи, наилучшей приживаемостью и длительностью эффекта характеризуются цельные жировые аутотрансплантаты Однако их получение и введение требует открытых операционных доступов, то есть не осуществимо в малоинвазивном варианте

Наиболее очевидными и широко применяющимися способами для увеличения продолжительности эффекта липофилинга являются гиперкоррекция (введение несколько больших, чем нужно, объемов жировой ткани), повторные вмешательства, а также применение наиболее щадящих методов технологической обработки липографтов [11, 12]. Однако понимание основных механизмов и патогенетических факторов биорезорбции жировых аутотранплантатов формирует основы для разработки потенциально

более эффективных методов увеличения сроков «выживаемости» липографтов [13, 14]. К таким методам относятся добавление к жировым трансплантатам плазмы, обогащенной тромбоцитами (platelet-rich plasma, PRP) [15], плазмы, обогащенной факторами роста (plasma rich in growth factors, PRGF), клеток стромально-васкулярной фракции жировой ткани [16], фибрина, обогащенного тромбоцитами [17]. В ряде работ уже показано положительное влияние тромбоцитарных факторов роста на сохранность липографтов: отмечается снижение воспалительной реакции и количества жировых кист, увеличение количества жизнеспособных ади-поцитов и кровеносных сосудов [15, 18]. Однако опубликованные гистологические данные, зачастую, противоречивы, не содержат детального анализа компенсаторно-адаптационных реакций на клеточном и тканевом уровнях

В этой связи, целью исследования являлся анализ структурных изменений липографтов после их аутотрансплантации, а также влияние PRP на этот процесс

Материал и методы

Дизайн исследования

Экспериментальное исследование выполнено на кроликах-самцах породы Шиншилла (n = 9), средним весом 2—2,5 кг, возрастом 10—12 мес . , с соблюдением международных правил гуманного обращения с лабораторными животными От каждого животного забирали 2 образца жировой ткани, один из которых смешивали с PRP (экспериментальная группа); контролем служил липографт без PRP трансплантаты вводили подкожно через дорсальную поверхность наружного уха: образцы контрольной группы — в левое, а экспериментальное — в правое ухо . Животных выводили из эксперимента на сроках 1, 2, 4, 8 и 36 нед , зоны трансплантации подвергали гистологическому исследованию

Эксплантация жировой ткани

После премедикации (Атропин 0,04 мг/кг, Цефа-золин 25 мг/кг) внутримышечно и внутримышечной седации (Sol . Zoletili 100 — 0,5 мл) под местным обезболиванием (Sol . Ultracaini 1,7 мл в 7 мл 0,9% раствора NaCL) осуществлялась эксплантация жировой ткани кроликов из лопаточной области На спине, по средним линиям правой и левой лопаточных областей выполнялись вертикальные разрезы кожи длиной 12 мм При помощи ножниц обнажались и отсекались фрагменты подкожно расположенной жировой ткани, объемом около 1 см3 . Послеоперационные раны ушивались узловыми швами SurgiPro 4/0

Подготовка жировых трансплантатов

Непосредственно после эксплантации фрагменты жировой ткани помещались в отдельные стерильные пробирки, трижды отмывались 10 мл стерильного 0,9% раствора NaCL, измельчались при помощи скальпеля

Из краевой вены уха кролика в пробирку с раствором цитрата натрия забирали 5 мл крови Пробирки цетрифугировали на скоростных режимах, предусмотренных компанией Biotechnology institute (Испания), которые не допускают разрушение эритроцитов,

в течение 8 мин . Две верхние фракции (плазма крови и лейкоцитарно-тромбоцитарный слой) объемом 1 мл помещали в отдельную стерильную емкость и добавляли 3-4 капли 10% раствора хлористого кальция (для активации) . Один из двух образцов жировой ткани, полученных от каждого животного, пропитывался 1 мл активированной PRP непосредственно перед введением под кожу правого уха

Липографтинг

Под местным обезболиванием (Sol . Ultracaini 0,5 мл) в нижней трети каждого уха, по средней линии дорсальной поверхности выполнялся поперечный разрез кожи длиной 10 мм . С помощью зажима создавался подкожный карман — реципиентное ложе для подготовленных липографтов . Жировые трансплантаты вводились через произведенный доступ, послеоперационные раны ушивались узловыми швами SurgiPro 5/0 .

Гистологический анализ

От животных, выведенных на сроках 1, 2, 4, 8 и 36 нед . , забирали фрагменты ушных раковин с зоной ранее выполненного липографтинга и фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина Срезы изготавливали по стандартной методике, окрашивали гематоксилином и эозином, а также выполняли иммуногистохимический анализ с антителами к CD163 — маркеру моноцитов/макрофагов .

Статистический анализ

На первом этапе статистического анализа использовались описательные методы: определение средних значений, стандартных ошибок средних значений, верхних и нижних квартилей, межквар-тильных интервалов . Учитывая непараметрическое распределение количественных признаков, для сравнения групп применяли непараметрический метод — U-критерий Манна — Уитни .

Результаты и обсуждение

Жировой аутотрансплантат без PRP

В ходе исследования было установлено, что уже через 1 нед . жировые аутотрансплантаты без PRP были окружены соединительнотканной капсулой толщиной до 187,5±49,65 мкм (рис . 1А). При этом реактивно измененная рыхлая волокнистая соединительная ткань (РВСТ) капсулы включала в себя элементы организующейся интраоперационной гематомы Снаружи, непосредственно к капсуле прилежала грануляционная ткань При этом жировой аутотрансплантат претерпевал ряд изменений: обнаруживались несколько деформированные и сплющенные оптически пустые вакуоли; междольковая соединительная ткань подвергалась гиперплазии, вследствие чего поперечные размеры междоль-ковых перегородок по ширине были сопоставимы с капсулой, окружающей трансплантат

Необходимо отметить, что происходило увеличение межадипоцитарных зон липографта за счет пролиферации клеточных элементов реактивно измененной РВСТ . Данные участки были заполнены активными фибробластами, клетками гемопоэтиче-ского ряда, включая гранулоциты, а также кровеносными сосудами, что «роднит» данную ткань с грануляционной (рис . 1А).

Преимущественно в структуре формирующейся соединительнотканной капсулы, но также и в составе жирового аутотрансплантата обнаруживались клеточные элементы макрофагально-гистиоцитар-ной реакции (рис. 2). В составе последнего гистиоциты располагались в межадипоцитарной РВСТ, вблизи сосудов, что, вероятно, обусловлено их миграцией из кровотока . Однако нельзя исключить, что макрофаги достигали жирового транплантата, двигаясь в матриксе РВСТ, врастающей со стороны формирующейся капсулы . Это положение отчасти подтверждает тот факт, что в центральных участках липографта количество гистиоцитов было наименьшим

1 нед. 2 нед. 4 нед. 8 нед. 36 нед.

Рис. 1. Липографты без РРР (А) и смешанные с РРР (Б) в различные сроки после подкожной трансплантации в ушную раковину кролика: 1 — жировая ткань; 2 — соединительнотканная капсула; 3 — соединительнотканные междольковые перегородки; 4 — сохранившиеся островки гипотрофичных адипоцитов; 5 — плотная волокнистая соединительная ткань; 6 — кровеносные сосуды . Окраска: гематоксилин и эозин .

Ув . : А - 1, 36 нед . х100; А - 2 нед . х200; А - 4, 8 нед . х40; Б - 1 нед . х40; Б - 2 нед . х100; Б - 4-36 нед . х200

Через 2 нед . отмечалось увеличение интенсивности раннее выявленных изменений. Вследствие потери жиров и развития межадипоцитарной соединительной ткани усиливалась гетероморфность ади-поцитов (рис . 1А). Так же, как и на предыдущем сроке, признаки выраженной воспалительной реакции не обнаруживались . При этом толщина соединительнотканных тяжей, разделяющих жировые дольки, достигала несколько сотен мкм . У некоторых животных не выявлялась гиперплазия соединительной ткани, хотя объем долек жирового трансплантата снижался за счет уменьшения жировых вакуолей адипоцитов .

Через 4 нед . жировой аутотрансплантат почти полностью замещался волокнистой соединительной тканью При этом единичные крупные адипоциты или свободные капли жира оказывались «разбросанными» по структуре соединительнотканного рубца (рис . 1А) .

Через 8 нед . жировой аутотрансплантат полностью замещался плотной волокнистой соединительной тканью, вокруг которой определялась капсула толщиной 300—330 мкм . Указанные гистологические характеристики сохранялись до крайнего срока наблюдения — 36 нед . (рис . 1А) .

Жировой аутотрансплантат с PRP

Добавление PRP к жировому аутотранспланта-ту приводило к некоторым изменениям в динамике посттрансплантационных процессов, охарактеризованных выше . Так, через 1 нед . вокруг жирового ауто-транплантата с PRP определялась соеднительноткан-ная капсула и умеренная гиперплазия междольковой РВСТ, однако столь выраженных, как в контрольной группе, пролиферативных изменений РВСТ межади-поцитарных зон не наблюдалось (рис . 1Б) . Толщина капсулы была статистически значимо меньшей, чем в контроле, составляя в среднем 123,1 ±60 мкм . Аналогичная разница наблюдалась и на последующем сроке

В последующие сроки наблюдалось прогрессивное снижение количества адипоцитов, площадей, занятых жировыми дольками, что сопровождалось уменьшением объемов трансплантатов и их фибро-зированием . Однако вплоть до 4 нед . содержание жировых элементов трансплантата было большим в случае применения PRP (рис . 1Б).

Только на сроке в 8 нед . жировой аутотрансплантат с PRP подвергался практически полному замещению РВСТ . Разницы в гистологических особенностях инволютивных изменений трансплантатов экспериментальной и контрольной групп на сроке 36 нед . не наблюдалось: на месте липографта обнаруживалось «соединительнотканное образование», выполненное преимущественно плотной неоформленной волокнистой соединительной тканью (рис . 1Б) .

Воздействие PRP на жировую ткань было ранее изучено как in vitro, так и in vivo . Полученные нами результаты, отчасти, коррелируют с данными других экспериментальных исследований, свидетельствующих о положительном влиянии PRP на трансплантированный липографт [19—22]. Однако, если в других исследованиях авторы показали, что количество жизнеспособных адипоцитов и кровеносных сосудов в группах с PRP выше, чем в контрольных, характеризующихся наличием участков некроза жировых трансплантатов, то в нашей работе разница между группами не была столь существенной . Положительное влияние PRP в значительной степени проявлялось в виде замедления классической динамики инволютивных изменений, характерных для липографта без PRP Важно отметить, что в нашем исследовании гистологические характеристики изменения жировых трансплантатов оценивались на протяжении 9 мес . , тогда как стандартные сроки наблюдения, как правило, не превышают 6 мес . [21, 22]. Однако разницы на крайних сроках наблюдения мы не обнаружили, что позволяет считать сроки до 6 мес достаточными для оценки посттрансплантационных изменений липографтов

Необходимо отметить, что не все исследования по данной теме имеют сходные результаты . Так, Y . C . Por с соавт . (2009) в эксперименте на имму-нодефицитных мышах показали отсутствие статистически значимой разницы между результатами липографтинга с PRP и без нее [23]. Противоречия в результатах указанных исследований могут быть обусловлены как различиями экспериментальных моделей, методик очистки жировой ткани и обработки липографтов PRP, так и с разницей в полученных образцах PRP

1

2

-T.--J

Рис. 2. Липографт без РРР через 1 нед . просле подкожной трансплантации, макрофагально-гистиоцитарная реакция: 1 — соединительнотканная капсула; 2 — жировая ткань трансплантата . Иммуногистохимическая реакция с антителами к Сй163 (коричневый цвет), докраска гематоксилином . Ув .: А х200, Б х400

Заключение

Динамика тканевых реакций, происходящих со свободным жировым аутотрансплантатом, представлена последовательной сменой нескольких этапов: потеря жирового компонента (уменьшение жировых вакуолей, количества адипоцитов) с постепенным формированием отграничивающей соединительнотканной капсулы; пролиферация клеточных элементов реактивно измененной РВСТ с постепенным врастанием в структуру трансплантата и полным его замещение соединительнотканным рубцом

Указанные изменения были характерны для обеих групп, однако применение PRP в ранние сроки

наблюдения приводило к формированию соединительнотканной капсулы с меньшей толщиной, а также менее выраженной гиперплазией РВСТ меж-адипоцитарных зон . В результате, вплоть до 4 нед . наблюдения выживаемость жирового трансплантата с PRP была большей, чем без PRP .

таким образом, PRP может оказать положительное влияние на выживаемость жирового аутотран-сплантата, особенно в ранние сроки после операции, однако требуются дополнительные исследования для выбора оптимального протокола обработки ли-пографта PRP и дальнейший анализ причин, механизмов и признаков инволюции трансплантированной жировой ткани

ЛИТЕРАТУРА:

1. Pasquale P ., Gaetano M ., Giovanni D . O . et al . Autologous fat grafting in facial volumetric restoration . J . Craniofac . Surg . 2015; 26(3): 756-9 .

2 . Arcuri F., Brucoli M ., Baragiotta N . et al . The role of fat grafting in the treatment of posttraumatic maxillofacial deformities . Craniomaxillofac . Trauma Reconstr. 2013; 6(2): 121-6 .

3 . Zellner E . G . , Pfaff M . J ., Steinbacher D . M . Fat grafting in primary cleft lip repair. Plast . Reconstr. Surg . 2015;135(5): 1449-53 .

4 . Born T. M ., Airan L ., Motakis D . et al . Soft tissue fillers in aesthetic facial surgery . In: Nahai F . The art of aesthetic surgery . 2nd ed . Qual . Med . Publ . 2005; p . 329-350 .

5 . Шарова А .А ., Губанова Е . И ., Парсагашвили Е . З . и др . Новая косметология . Инъекционные методы в косметологии . Москва: Косметика и медицина; 2014 .

6 . Coleman S . R . Structural fat grafts: the ideal filler? Clin Plast Surg . 2001; 28: 111-9 .

7 . Coleman S . R ., Ricardo F . M . Fat injection: from filling to regeneration St Louis; 2009 800 p

8 . Neuber G . Uber die Wiederanheilung vollstandig vom Korper gentrennter, die ganze Fettschicht enthaltender Hautstucke . Zbl f Chirurgie . 1893; 30: 16 .

9 . Hollander E . Die kosmetische chirurgie . In Joseph M, ed . Handbuch der kosmetik . Leipzig; 1912 . p . 5 689-690 .

10 . Neuhof H . The Transplantation of Tissues . New York; 1923

11 Monfort A , Izeta A Strategies for Human Adipose Tissue Repair and Regeneration J Cosmetics, Dermatol Sci Applic 2012; 2: 93-107 .

12 . Clauser L . C ., Tieghi R ., Galie M . et al . Structural fat grafting: facial volumetric restoration in complex reconstructive surgery J Craniofac . Surg . 2011; 22(5): 1695-701.

13 Meier J D , Glasgold R A , Glasgold M J et al Autologous fat grafting: long-term evidence of its efficacy in midfacial rejuvenation Arch . Facial . Plast . Surg . 2009; 11(1): 24-8 .

14 Gerth D J , King B , Rabach L et al Long-term volumetric retention of autologous fat grafting processed with closed-membrane filtration . Aesthet . Surg . J . 2014; 34(7): 985-94 .

15 Coleman S R Structural fat grafting St Louis; 2004

16 Sasaki G H The safety and efficacy of cell-assisted fat grafting to traditional fat grafting in the anterior mid-face: an indirect assessment by 3D imaging . Aesthetic Plast . Surg . 2015; 39(6): 833-46 .

17 Keyhan S O , Hemmat S , Badri A A et al use of platelet-rich fibrin and platelet-rich plasma in combination with fat graft: which is more effective during facial lipostructure J Oral Maxillofac Surg 2013; 71(3): 610-21.

18 Jin R , Zhang L , Zhang Y G Does platelet-rich plasma enhance the survival of grafted fat? An update review Int J Clin Exp Med 2013; 6(4): 252-8

19 Oh D S , Cheon Y W , Jeon Y R et al Activated platelet-rich plasme improves fat graft survival in nude mice: a pilot study Dermatol Surg . 2011; 37: 619-25 .

20 . Rodriguez-Flores J ., Palomar-Gallego M .A ., Enguita-Valls A . B . et al Influence of platelet-rich plasma on the histologic characteristics of the autologous fat graft to the upper lip of rabbits Aesthetic Plast Surg . 2011; 35: 480-6 .

21 Pirres Fraga M F , Nishio R T , Ishikawa R S et al Increased survival of free fat grafts with platelet-rich plasma in rabbits J Plast Reconstr . Aesthet . Surg . 2010; 63(12): 818-22 .

22 Nakamura S , Ishihara M , Takikawa M et al Platelet-rich plasma (PRP) promotes survival of fat-grafts in rats Ann Plast Surg 2010; 65(1): 101-6 .

23 . Por Y . C . , Yeow V . K ., Louri N . et al . Platelet-rich plasma has no effect on increasing free fat graft survival in the nude mouse J Plast Reconstr . Aesthet . Surg . 2009; 62: 1030-4 .

Поступила: 20.09.2015