АНТИТЕЛА К CD40L И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С CD40L ЗАБОЛЕВАНИЙ И НАРУШЕНИЙ
CD40L ANTIBODIES AND METHODS OF TREATING CD40L RELATED DISEASES AND DISORDERS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка PCT заявляет приоритет по предварительной заявке США №62,111,261, поданной 3 февраля 2015 года, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Антитела к CD40L, композиции, содержащие антитела, и способ их использования для лечения связанных с CD40L заболеваний или расстройств.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0003] В данную заявку включен перечень последовательностей, который подан в формате, пригодном для чтения в электронном виде. Электронный файл перечня последовательностей, который был создан 2 февраля 2016 г., имеет название "384897ST25.txt" и размер 32,6 Кбайт. Полное содержание перечня последовательностей в электронном файле "384897ST25.txt" включено в данный документ посредством данной ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] Взаимодействие CD40 с его лигандом CD40L играет решающую роль в регуляции иммунных реакций. Связывание CD40L с CD40 инициирует активацию пути CD40, который активирует костимулирующие молекулы, такие как CD80 и CD86. Показано, что блокада взаимодействия между CD40 и CD40L с помощью моноклональных антител приводит к защите от аутоиммунного ответа и отторжения трансплантата в различных доклинических моделях. В последнее время модели амиотрофического бокового склероза у мышей показано, что антитело к CD40L задерживает начало развития заболевания и увеличивает выживаемость в начале заболевания. (ЗАЯВКА НА ПАТЕНТ США №8,435,514, включенная в настоящий документ посредством ссылки). В ранних клинических исследованиях гуманизированное анти-CD40L-антитело hu5c8 показало эффективность у пациентов с волчанкой и у пациентов с иммунной тромбоцитопенической пурпурой. Однако, случаи тромбоэмболии у пациентов, получавших hu5c8, остановили дальнейшие исследования. Далее in vitro и доклинические исследования на животных установили, что взаимодействие Fc с Fc-рецептором FcγRIIa вызывает активацию тромбоцитов и агрегацию, что приводит к тромбоэмболическим событиям. Были приняты различные подходы к уменьшению или исключению взаимодействия Fc-области иммуноглобулина с FcγRIIa, включая введение точечной мутации в Fc-область, чтобы получить агликозилированный анти-IC40L IgG1, который не обладал эффекторной функцией Fc. Другие подходы используют фрагменты антител, лишенных области Fc или антител, которые содержат множественные аминокислотные замены в области Fc. Хотя анти-CD40L-антитело, hu5c8, показало эффективность у пациентов, на рынке нет анти-CD40L-антител. Соответственно, существует потребность в улучшенных анти-CD40L-антителах для введения людям, которые не вызывают активацию или агрегацию тромбоцитов, но являются стабильными и связываются с CD40L.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005] Настоящее изобретение относится к анти-CD40L-антителам, имеющих домен Fc, который был разработан для уменьшения или устранения агрегации тромбоцитов и сопутствующего риска тромбоэмболии, подходящим для использования у людей и других приматов. В одном аспекте изобретения настоящее изобретение относится к антителам, которые являются гуманизированными версиями мышиного античеловеческого CD40L-антитела 5c8. В одном варианте реализации изобретения антитело содержит консенсусную конструкцию человеческого IgG1, в которой вариабельная легкая цепь и вариабельная тяжелая цепь содержат последовательности CDR 5c8.
[0006] Одним из аспектов настоящего изобретения является выделенное антитело, которое связывается с CD40L и которое содержит легкую цепь и тяжелую цепь, где (i) легкая цепь содержит вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 1; (ii) тяжелая цепь содержит вариабельный участок тяжелой цепи и область Fc, где а) вариабельный участок тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2; и b) область Fc содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 3, где Fc-область содержит одно замещение или комбинацию замещений, выбранных из группы, состоящей из C11S, C14S и P23S. Необязательно область Fc включает еще одну аминокислотную замену C5S.
[0007] Другим аспектом настоящего изобретения является способ лечения субъектов с заболеванием или расстройством, связанным с CD40L, включающим введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела в соответствии с изобретением. Один из вариантов реализации изобретения является способом лечения субъектов с нейродегенеративным или нервномышечным заболеванием или расстройством; воспалительным или иммунным заболеванием, или расстройством; или аутоиммунным заболеванием, включающее введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела в соответствии с изобретением. Другой вариант реализации изобретения является способом лечения субъектов с заболеванием или расстройством, связанным с CD40L, включающим введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела в соответствии с изобретением, вводимого в комбинации с соединением, которое блокирует взаимодействие между CD28 и CD86 или между CD28 и CD80.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0008] На фигурах 1А, 1В и 1С показаны аминокислотные последовательности тяжелой цепи hu5c8 (ФИГ. 1A), JB5 (ФИГ. 1B) и JB5-K74R (ФИГ. 1C). Аминокислоты, которые отличаются в последовательностях тяжелой цепи 5c8 и последовательностях тяжелой цепи JB5 и JB5-K74R выделены жирным шрифтом.
[0009] На фигурах 2А-2D показана аминокислотная последовательность легкой цепи для JB5 (ФИГ. 2А), аминокислотная последовательность легкой цепи JB5-R28K (ФИГ. 2B), аминокислотная последовательность Fc-области hu5c8 (ФИГ. 2C), и аминокислотную последовательность Fc-области JB5 (ФИГ. 2D). Аминокислоты, которые отличаются в последовательностях легкой цепи 5c8 и JB5-R28K и в областях Fc hu5c8 и JB5, выделенные жирным шрифтом.
[0010] Фигура 3 представляет собой график, показывающий относительное связывание антитела JB5 с CD40L человека (Круги, пунктирная линия), hu5c8-антитело (квадраты, сплошная линия) и контрольный CTLA4-IgG1 (треугольники)
[0011] Фигура 4 представляет собой график, показывающий связывание антитела hu5c8 с FCGR1A (круг, сплошная линия)(SEQ ID NO: 22), FCGR2A (круг, пунктирная линия) (SEQ ID NO: 23), изоформы FCR3A (SEQ ID NO: 24) и FCR3B (SEQ ID NO: 25) белка Fc гамма-рецептора человека.
[0012] Фигура 5 представляет собой график, показывающий, что антитело JB5 не связывается с изоформами FCGR1A (SEQ ID NO: 22), FCGR2A (SEQ ID NO: 23), FCR3A (SEQ ID NO: 24) или FCR3B (SEQ ID NO: 25) белка Fc человеческого гамма-рецептора.
[0013] На фигуре 6 показан профиль аналитического хроматографического элюирования для антитела JB5, проведенного при 30°C с применением эксклюзионной колонки.
[0014] На фигуре 7 показан профиль элюции аналитической хроматографии для hu5c8 антитела, проведенной при 30°C с применением эксклюзионной колонки.
[0015] Фигура 8 представляет собой график, показывающий связывание антитела с маркером активации тромбоцитов PAC1 с необработанными образцами тромбоцитов (отрицательный контроль), оцененное методом сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS).
[0016] Фигура 9 представляет собой график, показывающий связывание анти-PAC1 антитела, оцененное по методу FACS.
[0017] Фигура 10 представляет собой график, показывающий связывание анти-PAC1 антитела с тромбоцитами после инкубации тромбоцитов с CD40L, оцененное по методу FACS.
[0018] Фигура 11 представляет собой график, показывающий связывание анти-PAC1 антитела с тромбоцитами после инкубации тромбоцитов с иммунным комплексом, состоящим из CD40L и hu5c8 антитела, оцененное по методу FACS.
[0019] Фигура 12 представляет собой график, показывающий связывание анти-PAC1 антитела с тромбоцитами после инкубации тромбоцитов с иммунным комплексом, состоящим из CD40L и JB5-антитела, оцененное по методу FACS.
2
[0020] Фигура 13 представляет собой график, показывающий связывание, оцениваемое методом FACS, анти-PAC1 антитела с тромбоцитами после инкубации тромбоцитов с иммунным комплексом CD40L и hu5c8 F (ab').
2
[0021] На фигуре 14 показана активация тромбоцитов, полученных у трех человек, после инкубации тромбоцитов с 20 мкМ ADP, 5 мкг/мл CD40L, иммунным комплексом CD40L и hu5c8, иммунным комплексом CD40L и JB5-антитела или иммунным комплексом CD40L с hu5c8 F (ab').
[0022] На фигуре 15 представлена аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи анти-CD40L-антител JB5 и hu5c8 (SEQ ID NO: 1), аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи анти-CD40L-антител JB5 и hu5c8 (SEQ ID NO: 2), аминокислотная последовательность Fc-области анти-CD40L-антитела hu5c8 (SEQ ID NO: 3), аминокислотная последовательность Fc-области анти-CD40L-антитела JB5 (SEQ ID NO: 4), аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи анти-CD40L-антитела JB5-R28K (SEQ ID NO: 5), аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи анти-CD40L-антитела JB5-K74R (SEQ ID NO: 6) и аминокислотная последовательность легкой цепи анти-CD40L-антитела JB5 (SEQ ID NO: 7)
[0023] На фигуре 16 представлена синтетическая нуклеотидная последовательность легкой цепи, которая кодирует анти-CD40L-антитело JB5 (SEQ ID NO: 8), буквами верхнего регистра представлены экзоны, а буквами нижнего регистра представлены интронные последовательности синтетического гена, а также представлена аминокислотная последовательность тяжелой цепи анти-CD40L-антитела JB5 (SEQ ID NO: 9).
[0024] На фигуре 17 представлена синтетическая нуклеотидная последовательность, которая кодирует тяжелую цепь анти-CD40L-антитела JB5 (SEQ ID NO: 10), буквами верхнего регистра представлены экзоны, а буквами нижнего регистра представлены последовательности интронов синтетического гена.
[0025] На фигуре 18 представлена аминокислотная последовательность анти-CD40L-антитела JB5-R28K (SEQ ID NO: 11), синтетическая нуклеотидная последовательность, которая кодирует легкую цепь анти-CD40L-антитела JB5-R28K (SEQ ID NO: 12), буквами верхнего регистра представлены экзоны, а буквами нижнего регистра представлены последовательности интронов синтетического гена, а также представлена аминокислотная последовательность тяжелой цепи анти-CD40L-антитела JB5-K74R (SEQ ID NO: 13).
[0026] На фигуре 16 представлена синтетическая нуклеотидная последовательность легкой цепи, которая кодирует анти-CD40L-антитело JB5 (SEQ ID NO: 8), буквами верхнего регистра представлены экзоны, а буквами нижнего регистра представлены интронные последовательности синтетического гена, а также представлена аминокислотная последовательность тяжелой цепи анти-CD40L-антитела JB5 (SEQ ID NO: 9).
[0027] На фигуре 20 представлены аминокислотные последовательности CDR тяжелой и легкой цепи анти-CD40L-антитела JB5 (SEQ ID NO: 15-20 соответственно), а также представлена аминокислотная последовательность тяжелой цепи hu5C8 (SEQ ID NO: 21).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0028] ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[0029] Такие термины, как "содержит", "содержащий" и т.п. имеют значение, приписываемое им в соответствии с патентным законодательством Соединенных Штатов; они являются охватывающими или открытыми и не исключают дополнительные, не перечисленные элементы или стадии способа. Такие термины, как "состоящий по существу из" и "состоит по существу из" имеют значение, приписываемое им в соответствии с патентным законодательством Соединенных Штатов; они позволяют включение дополнительных ингредиентов или действий, которые существенно не влияют на основные и новые характеристики изобретения. Термины "состоит из" и "состоящий из" имеют значение, приписываемое им в соответствии с патентным законодательством Соединенных Штатов; эти термины являются закрытыми.
[0030] Термины "лечить", "лечение" и пр. включают в себя терапевтическое и профилактическое лечение. Терапевтическое лечение - это лечение субъекта, который имеет признаки или симптомы заболевания, состояния или расстройства, подлежащих лечению. Под профилактическим лечением понимается лечение субъекта, который предрасположен к заболеванию, состоянию или расстройству, которое не проявляет явных признаков заболевания, состояния или расстройства. Таким образом, лечение может приводить к остановке, частичному или полному облегчению, или уменьшению признаков или симптомов болезни и, в частности, включает, без ограничения, продление выживания.
[0031] "Около" означает, что указанное числовое значение допускает некоторую небольшую неточность (с некоторым приближением к точности значения; приблизительно или достаточно близким к значению; приблизительно). Если неточность, подразумеваемая словом «около», в данной области не известна, то «около», в данном контексте, указывает, по меньшей мере, на варианты, которые могут быть при обычных способах измерения и использования таких параметров. Кроме того, диапазоны включают все значения и отдельные ряды значений в пределах диапазона.
[0032] Использование соединения «или» используется взаимозаменяемо с «по меньшей мере один из». Например, в случае, когда композиция содержит A или B, способ должен содержать по меньшей мере один из A или B, но также может содержать как A, так и B. Подобным образом композиция, содержащая «A, B, C или D», должна содержать по меньшей мере одну из групп A, B, C и D, но также может содержать все или любые комбинации A, B, C и D.
[0033] Аминокислотные замены обозначаются по правилу, согласно которому идентифицирована исходная аминокислота, положение аминокислоты в указанной последовательности и замещающая аминокислота, например, C11S указывает, что цистеин в положении 11 полипептидной последовательности заменен серином.
[0034] Под "5c8" понимается мышиное античеловеческое антитело, которое связывается с CD40L и продуцируется гибридомой, доступной по каталогу ATCC, имеющей номер доступа HB10916 и описан публикации патента США № 5,474,771. Под "Hu5c8" понимается гуманизированная версия 5c8, последовательность которого представлена в публикации Karpusas, et al., Structure vol. 9, pp 321-329, (2001).
[0035] Ссылка в описании делается на процент идентичности между полипептидными или аминокислотными последовательностями. Процентная идентичность между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений в обеих последовательностях, принимая во внимание количество пробелов и длину каждого пробела, который необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Идентичность можно определить, как "локальную идентичность" или "глобальную идентичность". Под локальной идентичностью понимается степень родства последовательностей между полипептидами, как определено соответствием между строками таких последовательностей. Под глобальной идентичностью понимается степень родства последовательность полипептида по сравнению с полной последовательностью эталонного полипептида. Если не указано другое, используемая в настоящем документе идентичность, означает глобальную идентичность. В данном описании процентные значения глобальной идентичности вычислены с использованием алгоритма Needleman and Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 444-453) с использованием матрицы подсчета Blossum 62 с штрафом за пропуск равным 12, штрафом за открывающий пропуск равным 4 и штрафом за сдвиг рамки считывания равным 5 баллов. Существует много общедоступных программ, которые включают алгоритмы Needleman и Wunsch, например. Программа GAP в программном пакете GCG.
[0036] CD40L также известен как CD154, gp39, T-BAM, 5c8 антиген или TNF-ассоциированный активирующий белок (TRAP).
[0037] ВАРИАНТЫ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0038] Данное изобретение относится к терапевтическим античеловеческим CD40L антителам и способам использования этих антител для лечения пациентов с ассоциированным с CD40L заболеваниями или расстройствами. Представлены различные типовые варианты реализации изобретения, однако изобретение должно быть ограничено формулой изобретения, а не описанными вариантами реализации данного изобретения.
[0039] В одном аспекте изобретения данное изобретение относится к антителам, которые являются модифицированными версиями анти-CD40L антитела hu5c8, которые содержат консенсусную конструкцию человеческого IgG1, имеющую CDR последовательности вариабельной легкой цепи и вариабельной тяжелой цепи hu5c8 с доменом Fc, модифицированным для предотвращения активации тромбоцитов.
[0040] В таблице 1 приведено описание последовательностей, упомянутых в заявке.
Таблица 1
SEQ ID NO:
Описание последовательности
1
Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (hu5c8 и JB5)
2
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (hu5c8 и JB5)
3
аминокислотная последовательность Fc области (hu5c8)
4
Аминокислотная последовательность Fc области JB5
5
Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи JB5-R28K
6
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи JB5-K74R
7
Аминокислотная последовательность легкой цепи JB5
8
Нуклеотидная последовательность легкой цепи JB5
9
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи JB5
10
Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи JB5
11
Аминокислотная последовательность легкой цепи JB5-R28K
12
Синтетическая нуклеотидная последовательность легкой цепи JB5-R28K
13
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи JB5-K74R
14
Синтетическая нуклеотидная последовательность тяжелой цепи JB5-K74R
15
CDR-1 аминокислотная последовательность вариабельной легкой цепи JB5
16
CDR-2 аминокислотная последовательность вариабельной легкой цепи JB5
17
CDR-3 аминокислотная последовательность вариабельной легкой цепи JB5
18
CDR-1 аминокислотная последовательность вариабельной тяжелой цепи JB5
19
CDR-2 аминокислотная последовательность вариабельной тяжелой цепи JB5
20
CDR-3 аминокислотная последовательность вариабельной тяжелой цепи JB5
21
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи Hu5c8
[0041] Один вариант реализации изобретения (вариант А) представляет собой выделенное антитело, которое имеет возможность связываться с CD40L и которое содержит легкую цепь и тяжелую цепь, где легкая цепь содержит вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% или по меньшей мере 91% или по меньшей мере 92% или по меньшей мере 93% или по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95% или по меньшей мере 96% или по меньшей мере 97% или по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 1, и тяжелая цепь, которая содержит вариабельный участок тяжелой цепи и область Fc, в которой вариабельный участок тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% или по меньшей мере 91% или по меньшей мере 92% или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95% или по меньшей мере 96% или, по меньшей мере, 97% или по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 2 и Fc-области содержит Аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере 91% или по меньшей мере 92% или по меньшей мере 93% или по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95% или по меньшей мере 96% или по меньшей мере 97% или по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 3, где Fc-область содержит одну или комбинацию замещений, выбранных из группы, состоящей из C11S, C14S и P23S.
[0042] Другой вариант реализации изобретения (вариант Б) представляет собой выделенное антитело в соответствии с вариантом реализации изобретения A, где область Fc дополнительно включает аминокислотную замену C5S.
[0043] В вариантах реализации изобретения А и Б антитело содержит вариабельный участок легкой цепи, который не содержит никаких замещений T33W, S26D и Q27E.
[0044] В других вариантах реализации изобретения А и Б вариабельный участок легкой цепи включает аминокислотную замену R28K.
[0045] В некоторых вариантах реализации изобретения А и Б CDR-последовательности тяжелой и легкой цепи имеют последовательности, приведенные в таблице 2
Таблица 2
Последовательность CDR1 легкой цепи
ISCRASQRVSSSTYSYMH (SEQ ID NO: 15)
Последовательность CDR2 легкой цепи
YASNLES (SEQ ID NO: 16)
Последовательность CDR3 легкой цепи
QHSWEIPPT (SEQ ID NO: 17)
Последовательность CDR1 тяжелой цепи
SYYMY (SEQ ID NO: 18)
Последовательность CDR2 тяжелой цепи
EINPSNGDTNFNEKFKS (SEQ ID NO: 19)
Последовательность CDR3 тяжелой цепи
SDGRNDMDS (SEQ ID NO: 20)
[0046] В еще одной разновидности вариантов реализации изобретения А и Б вариабельный участок легкой цепи содержит аминокислотную последовательность ICRRASQRVSSSTYSYMH (SEQ ID NO: 15). В других вариантах реализации изобретения вариабельный участок легкой цепи содержит аминокислотную последовательность ICRRASQRVSSSTYSYMH (SEQ ID NO: 15) и одну или обе аминокислотные последовательности YASNLES (SEQ ID NO: 16) и QHSWEIPPT (SEQ ID NO: 17).
[0047] В некоторых вариантах реализации изобретения А и Б вариабельный участок легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. В других вариантах реализации изобретения вариабельный участок легкой цепи состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь целиком состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7. В других вариантах реализации изобретения легкая цепь состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7. В других вариантах реализации изобретения легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В других вариантах реализации изобретения легкая цепь целиком состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11. В других вариантах реализации изобретения легкая цепь состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11.
[0048] В других вариантах реализации изобретения А и Б антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, который не содержит никаких замещений T30H, Y33W или S54N. В некоторых вариантах реализации изобретения А и Б вариабельная область легкой цепи антитела не содержит никаких замещений T33W, S26D и Q27E. В других вариантах реализации изобретения А и Б вариабельная область легкой цепи не содержит никаких замещений T33W, S26D и Q27E, а вариабельная область тяжелой цепи не содержит никаких замещений T30H, Y33W или S54N.
[0049] В других вариантах реализации изобретения А и Б вариационный участок тяжелой цепи включает аминокислотную замену K74R. В одном варианте реализации изобретения вариабельный участок тяжелой цепи содержит одну или любую комбинацию аминокислотных последовательностей SYYMY (SEQ ID NO: 18), EINPSNGDTNFNEKFKS (SEQ ID NO: 19) и SDGRNDMDS (SEQ ID NO: 20).
[0050] В другом варианте реализации изобретения вариабельный участок тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В еще одном варианте реализации изобретения вариабельный участок тяжелой цепи целиком состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В еще одном варианте реализации изобретения вариабельный участок тяжелой цепи состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах реализации изобретения вариабельный участок тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В еще одном варианте реализации изобретения вариабельный участок тяжелой цепи целиком состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6. В других вариантах реализации изобретения вариабельный участок тяжелой цепи состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.
[0051] Один из вариантов реализации изобретения является выделенным антителом, в котором легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, а тяжелая цепь состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.
[0052] Другим вариантом реализации изобретения является выделенное антитело, в котором легкая цепь состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, а тяжелая цепь состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.
[0053] Еще одним вариантом реализации изобретения является выделенное антитело, в котором вариабельный участок легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, а тяжелая цепь состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.
[0054] Еще одним вариантом реализации изобретения является выделенное антитело, в котором легкая цепь состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, а тяжелая цепь состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.
[0055] Еще одним вариантом реализации изобретения является выделенное антитело, в котором легкая цепь состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, а тяжелая цепь состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13.
[0056] Другим вариантом реализации изобретения является выделенное антитело, в котором легкая цепь состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, а тяжелая цепь состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13.
[0057] В предпочтительных вариантах реализации изобретения антитело является стабильным при 37°С в течение по меньшей мере 12 часов.
[0058] В другом аспекте данное описание предлагает способы лечения субъектов, имеющих ассоциированное с CD40L заболевание или расстройство, включающее введение субъекту терапевтически эффективной дозы антитела согласно данному изобретению. Предполагается, что антитело согласно данному изобретению или его смеси можно вводить субъекту в виде монотерапии, которая, в данном контексте, означает, что антитело является единственным лекарственным средством, вводимым пациенту, которое направлено на лечение основного заболевания или расстройства. Монотерапия с использованием антитела согласно данному изобретению не исключает введения других лекарств, неограничивающими примерами которых являются миорелаксанты, нестероидные противовоспалительные препараты, обезболивающие препараты и антидепрессанты. Соответственно, в различных вариантах реализации изобретения одно антитело либо смесь антител согласно данному изобретению является единственным лекарственным средством, направленным на лечение основного заболевания или расстройства.
[0059] Также предполагается, что антитела согласно данному изобретению или их смеси можно вводить в комбинации с другими лекарственными средствами. "В сочетании с" включает, но не ограничивается ими, введение лекарственных средств в разное время, с различной частотой, одновременно или в виде единой лекарственной формы.
[0060] Один из вариантов реализации изобретения представляет собой способ лечения субъектов с нейродегенеративным или нервно-мышечным заболеванием или расстройством, включающий введение субъектам терапевтически эффективного количества антитела согласно данному изобретению. Нейродегенеративные или нервно-мышечные заболевания и расстройства включают, но не ограничиваются ими, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, мультифокальную моторную невропатию, первичный боковой склероз, спинальную мышечную атрофию, болезнь Кеннеди и спиноцеребеллярную атаксию.
[0061] Другим вариантом реализации изобретения является способ лечения субъекту с амиотрофическим боковым склерозом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела согласно данному изобретению.
[0062] Одним из вариантов реализации изобретения является способ лечения субъектов с воспалительным или иммунным заболеванием, или нарушением, включающий введение субъектам терапевтически эффективного количества антитела согласно данному изобретению. Воспалительные или иммунные заболевания и нарушения включают, но не ограничиваются ими, колит, вызванный лекарствами волчаночный нефрит, болезнь "трансплантат против хозяина" (GvHD), отторжение трансплантата и атеросклероз
[0063] Еще один вариант реализации изобретения представляет собой способ лечения субъектов, имеющих аутоиммунное заболевание, включающий введение субъектам терапевтически эффективного количества антитела согласно данному изобретению. Аутоиммунные заболевания включают, но не ограничиваются ими, системную красную волчанку, диабет 1-го типа, миастению, воспалительное заболевание кишечника, иммунную тромбоцитопеническую пурпуру и ревматоидный артрит.
[0064] Еще одним вариантом реализации изобретения является способ ингибирования иммунного ответа у субъектов, включающий введение субъектам терапевтически эффективного количества антитела согласно данному изобретению. В одном варианте реализации изобретения иммунный ответ представляет собой болезнь "трансплантат против хозяина"(GvHD). В другом варианте реализации изобретения иммунный ответ являет собой отторжение трансплантата.
[0065] В некоторых вариантах реализации изобретения антитело согласноданному изобретению вводят в виде монотерапии. В одном варианте реализации изобретения антитело представляет собой JB5, вводимое в виде монотерапии. В другом варианте реализации изобретения антитело JB5-K74R вводят в виде монотерапии. В еще одном варианте реализации изобретения антитело JB5-R28K вводят в виде монотерапии. В еще одном варианте реализации изобретения антитело JB5-R28K-K74R вводят в виде монотерапии.
[0066] В некоторых вариантах осуществления способов в соответствии с настоящим изобретением антитело вводят в комбинации с другим лекарственным средством.
[0067] В некоторых вариантах реализации изобретения антитело согласно данному изобретению вводят в комбинации с соединением, которое блокирует взаимодействие между CD28 и CD86 или между CD28 и CD80.
[0068] В некоторых вариантах реализации изобретения соединение, которое блокирует взаимодействие между CD28 и CD86 или между CD28 и CD80, представляет собой гибридный белок CTLA4-Ig. В одном варианте реализации изобретения соединение, которое блокирует взаимодействие между CD28 и CD86, или между CD28 и CD80, представляет собой абатацепт или белатецепт или галиксимаб.
[0069] Фармацевтические композиции и способы введения.
[0070] Для лечения любого из вышеуказанных нарушений фармацевтические композиции для использования в соответствии со способами данного описания могут быть составлены обычным способом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей. Фармацевтически приемлемые носители частично определяются конкретной вводимой композицией, а также конкретным способом, используемым для введения композиции. Соответственно, существует широкий спектр подходящих составов соединений, полезных в способах данного описания (см., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Gennaro et al. Eds., Lippincott Williams and Wilkins, 2000).
[0071] Композиции, подходящие для парентерального введения, включают водные и неводные изотонические стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические вещества и растворенные вещества, которые делают композицию изотоничной по отношению к крови предполагаемого реципиента, а также водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты.
[0072] В соответствии с данным описанием соединения могут вводиться любыми подходящими способами, которые могут варьироваться в зависимости от типа расстройства, подвергаемого лечению и от природы самого соединения. Например, для антител по данному изобретению, предпочтительные пути введения включают парентеральные, например, внутримышечный, внутривенный, внутриартериальный, внутрибрюшинный или подкожный. Парентеральное дозирование вводят предпочтительно инъекционным способом, наиболее предпочтительно внутривенной, внутримышечной или подкожной инъекцией. Доза, подлежащая введению, будет зависеть от целого ряда факторов, таких как клинические симптомы, вес индивидуума и других препаратов. Следует принимать во внимание, что определение подходящих лекарственных форм, дозированных количеств и путей введения находятся в пределах уровня обычных навыков в фармацевтике и медицине.
Примеры
[0073] Следующие примеры иллюстрируют способы, используемые для изготовления и испытания антител по данному изобретению. Специалистам в данной области техники будут очевидны подходящие модификации и адаптации описанных условий и параметров, обычно встречающихся в области молекулярной биологии и иммунологии.
[0074] Пример 1: Производство антител
[0075] Для получения антител по данному изобретению, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь желаемого антитела, сконструированы так, чтобы быть пригодными для экспрессии в клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (CHO). Затем нуклеиновые кислоты искусственно синтезировали и лигировали в экспрессирующий вектор антитела BPJPuro с использованием стандартных методов молекулярной биологии. BPJPuro представляет собой вектор экспрессии двойного гена млекопитающих, оптимизированный для селективной и стабильной экспрессии иммуноглобулинов в клетках яичника китайского хомячка (CHO). Затем вектор трансфицируют в клетки СНО и выбирают стабильные трансфектанты.
[0076] Получение антител JB5
[0077] Нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 10), кодирующая тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и нуклеиновая кислота (SEQ ID NO: 8), кодирующая легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, были синтезированы и лигированы в экспрессирующий вектор антитела BPJPuro.
[0078] Полученный вектор экспрессии, кодирующий тяжелую и легкую цепи, трансфицировали в линию СНО (CHO SA, Cellectis SA, Париж, Франция) с использованием липосомной трансфекции. Стабильные трансфектанты были выделены путем выращивания на селективной среде с пиромицином и субклонированы для получения клональных клеточных линий. Линии клеток-кандидатов были адаптированы к существованию в суспензионной культуре без сыворотки и скринированы на продуцирование IgG и устойчивый рост. Одна из клеточных линий была выбрана и названа JB5, клеточная линия культивировалась в биореакторах экспериментального масштаба, а антитело JB5 очищали из кондиционированной среды путем последовательной концентрации, аффинной хроматографии на белке A/G и эксклюзионной хромотографии.
[0079] Пример 2: Анализ связывания CD40L
[0080] Для определения кинетики связывания антитела JB5 по сравнению с родительским антителом hu5c8 использовали трехкомпонентный ИФА анализ. Все промывки проводили трижды с использованием 250 мкл ФСБ (фосфатно-солевом буфере). На 96-луночный планшет из полистирола наносили антитело JB5 или hu5c8 (в количестве 100 мкл/лунку, 2 мкг/мл) в течение 16 часов при 4°C. Планшет промывали и затем блокировали раствором 2% альбумина бычьей сыворотки/ФСБ в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшет промывали, а рекомбинантный белок CD40L человека (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Круз, Калифорния, США) добавляли к планшету, путем титрования двукратным разбавлением, начиная с 2000 нг/мл. После связывания и промывки связанный белок CD40L детектировали с использованием 100 мкл биотинилированного козьего античеловеческого CD40L-поликлонального антитела (200 нг/мл) и 100 мкл конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена при 100 нг/мл. Колориметрическое детектирование проводили с использованием хромагена ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидина) и спектрофотометрического анализа поглощения при 450 нм. Полученные кривые связывания (ФИГ. 3) показывают, что JB5 (круги) имеет очень сходное связывание с CD40L относительно родительского антитела hu5c8 (квадраты). Контрольный белок CTLA4-IgG1 (треугольники), имеющий тот же домен Fc, что и JB5, не обнаруживал значительного связывания. Вычисленные значения EC50 для hu5c8 и JB5 составляют 114 и 137 нМ соответственно. JB5-R28K и JB5-K74R показали связывание, аналогичное JB5.
[0081] Пример 3: Анализ связывания с гамма-рецептором Fc
[0082] Анализ связывания Hu5c8/человеческого гамма-рецептора Fc
[0083] Для определения уровня связывания четырех изоформ человеческого гамма-рецептора Fc с родительским hu5c8-антителом проводили твердофазный ИФА анализ связывания. 100 мкл/лунку hu5c8 (2 мкг/мл в фосфатном буферном солевом растворе) добавляли в лунки 96-луночного планшета из полистирола и инкубировали в течение 16 часов при 4°С. Планшет блокировали и рекомбинантные белки Fc-гамма-рецептора (FCGR) (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Круз, Калифорния) титровали при 2-кратном разведении с начальной концентрацией 5 мкг/мл. Анализ четырех рекомбинантных изоформ FCGR проводили по-отдельности следующим образом:FCGR1A (CD64)(SEQ ID NO: 22), FCGR2A (CD32)(SEQ ID NO: 23), FCGR3A (CD16a)(SEQ ID NO: 24), FCGR3B (CD16b)(SEQ ID NO: 25). После связывания и промывки FCGR детектировали с использованием подходящего изоформ-специфического мышиного моноклонального FCGR антитела (1000 нг/мл) и конъюгата пероксидазы хрена с козьим антимышиным IgG-детекторным антителом. Колориметрическое детектирование проводили с использованием хромагена ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидина) и спектрофотометрического анализа поглощения при 450 нм. Полученные кривые связывания (ФИГ. 4) демонстрируют, что родительское антитело hu5c8 связывает рецептор с высокой аффинностью FCGR1A (круги, сплошная линия) (SEQ ID NO: 22) и рецептор FCGR2A (круги, пунктирная линия) (SEQ ID NO: 23), экспрессируемые на активированных тромбоцитах, с высоким сродством. Антитело hu5c8 не демонстрирует связывания с изоформами FCR3A (SEQ ID NO: 24) или FCR3B(SEQ ID NO: 25).
[0084] Анализ связывания человеческого Fc гамма-рецептора с JB5
[0085] Анализ твердофазного связывания использовали для проверки связывания изоформ человеческого гамма-рецептора Fc с мутантным антителом JB5. На 96-луночный планшет из полистирола наносили 100 мкл/лунку JB5 (2 мкг/мл в солевом фосфатном буфере) в течение 16 часов. Планшет блокировали и рекомбинантные белки Fc гамма рецептора (FCGR) (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Круз, Калифорния) титровали при 2-кратном разведение с начальной концентрацией 5 мкг мл. Анализ четырех рекомбинантных изоформ FCGR проводили по-отдельности следующим образом:FCGR1A (CD64) (SEQ ID NO: 22), FCGR2A (CD32) (SEQ ID NO: 23), FCGR3A (CD16a) (SEQ ID NO: 24), FCGR3B (CD16b) (SEQ ID NO: 25). После связывания и промывки FCGR детектировали с использованием подходящего изоформ-специфического мышиного моноклонального FCGR антитела (1000 нг/мл) и конъюгата пероксидазы хрена с козьим антимышиным IgG-детекторным антителом. Колориметрическое детектирование проводили с использованием хромагена ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидина) и спектрофотометрического анализа поглощения при 450 нм. Полученные кривые связывания (ФИГ. 5) демонстрируют, что в этом анализе антитело JB5 не связывает ни рецептор FCGR1A (SEQ ID NO: 22) с высокой афинностью, ни рецептор FCGR2A (SEQ ID NO: 23), экспрессируемые на активированных тромбоцитах. Подобно родительскому антителу hu5c8, не наблюдалось связывание FCGR3A (SEQ ID NO: 24) или FCGR3B (SEQ ID NO: 25).
[0086] Пример 4: Стабильность JB5 при 22°C и при 37°C
[0087] Из-за отсутствия у JB5 трех дисульфидных связях в антителах IgG1 дикого типа, JB5 тестировали с использованием эксклюзионной хроматографии, чтобы определить было ли антитело стабильным, то есть существовало как тетрамерное полностью интактное антитело. Hu5c8, который имеет три дисульфидные связи, использовался в качестве контроля.
[0088] Были проведены два эксперимента, в каждом из которых сравнивали JB5 с hu5c8. В первом эксперименте антитела находились при комнатной температуре (22°С) до и во время хроматографии. Для имитации условий in vivo во втором эксперименте антитела инкубировали в плазме человека при 37°С в течение 30 минут перед хроматографией при 30°С. Двадцать микрограмм JB5 или hu5c8 в ФСБ инъецировали в TSK-гель G3000SW (7,8 мм × 30 см, размер частиц 5 мкм), снабженный предварительным фильтром TSKgel Guard SW xl (6,0 мм × 4,0 см, размер частиц 7 мкм) (Tosoh Bioscience, King of Prussia, PA). Подвижной фазой был ФСБ, а скорость элюирования составляла 1,0 мл/мин, и поглощение измеряли при 280 нм. При 22°C и при 30°C JB5 имел наблюдаемый молекулярный вес 183 кДа (ФИГ. 6), а hu5c8 (ФИГ. 7) имел молекулярный вес 164 кДа, в соответствии с тем, что антитело находится в тетрамерной, бивалентной форме. Наблюдаемая разница в 19 кДа между антителом hu5c8 и JB5 может быть обусловлена увеличением гликозилирования Fc-домена JB5.
[0089] Пример 5: Устранение активации тромбоцитов
5
2
[0090] Чтобы определить влияние JB5 на активацию тромбоцитов, опосредуемую CD40L-иммунным комплексом, антитело анализировали на его способность индуцировать маркерный белок поверхности клеток тромбоцитов PAC-1. Цельная кровь была взята у трех здоровых добровольцев в пробирки с 3,2% цитратом натрия, отбрасывая первые 2 мл крови. Богатую на тромбоциты плазму готовили центрифугированием в течение 15 минут при 120 g, количество тромбоцитов нормировали с фосфатно-солевым буфером до 1×10 клеток/мл. Иммунные комплексы рекомбинантного человеческого CD40L (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Круз, Калифорния, США) и тестовых антител hu5c8, JB5 и hu5c8 F (ab') были получены при молярном соотношении CD40L: антитело равном 3:1 (0,6944 нмоль CD40L: 0,2315 нмоль антитела) путем предварительной инкубации при комнатной температуре в течение 15 минут. Смесь иммунного комплекса разбавляли до конечной концентрации 5 мкг/мл CD40L в нормированном растворе тромбоцитов в ФСБ и инкубировали при 37°C в течение 30 минут. Негативным контролем были необработанные тромбоциты и несвязанный CD40L. Позитивный контроль активации тромбоцитов был получен путем добавления ADP до конечной концентрации 20 микромолей в нормированном растворе ФСБ с тромбоцитами. После 30 минут инкубации ко всем образцам добавляли античеловеческое PAC-1-FITC антитело и инкубировали в течение 15 минут. Образцы разбавляли 1:1 в 2% растворе параформальдегид: ФСБ, фиксировали на льду в течение 30 минут, центрифугировали при 100 g в течение 5 минут для осаждения клеток. Клетки ресуспендировали в ФСБ. Сортировку клеток с активированной флуоресценцией (FACS) проводили на проточном цитометре Guava easyCyte (EMD Millipore, Inc., Биллерика, Массачусетс, США). Анализ после сбора данных проводился с использованием программного обеспечения FlowJo (FlowJo, LLC, Ашленд, Орегон, США).
2
2
2
[0091] Контрольный образец необработанных тромбоцитов использовали для установки отрицательных и положительных ворот активации PAC-1 (Фигура 8). Тромбоциты, активированные с помощью 20 мкмолярного ADP, имели значительное увеличение экспрессии PAC-1 на поверхности клетки (Фигура 9). В соответствии с опубликованными наблюдениями см., например, Mirabet, M., et al., Molecular Immunology 45, 937-944 (2008), несвязанный CD40L имел низкий уровень активации тромбоцитов (Фигура 10). Эта активация была значительно увеличена, в случае если CD40L присутствовал с hu5c8 антителом в качестве иммунного комплекса (Фигура 11). Напротив, разработанное антитело JB5 в комплексе с CD40L продемонстрировало очень низкие уровни активации тромбоцитов (Фигура 12). Это уменьшение активационного потенциала иммунного комплекса CD40L:JB5 опосредуется потерей взаимодействия FcR, потому что иммунный комплекс hu5c8 F (ab'): CD40L (Фигура 13) также не активировал тромбоциты по сравнению с иммунным комплексом hu5c8-IgG1:CD40L (Фигура 11). На фигуре 14 показана активация тромбоцитов, полученных у трех человек, после инкубации тромбоцитов с 20 мкМ ADP, 5 мкг/мл CD40L, иммунным комплексом CD40L и hu5c8, иммунным комплексом CD40L и JB5-антитела или иммунным комплексом CD40L с hu5c8 F (ab'). Иммунный комплекс JB5 не показал значимой активации тромбоцитов по сравнению с иммунным комплексом CD40L с тромбоцитами hu5c8 F (ab') (p <0,34 (Unpaired T test, 2 tailed; t=1.013, df=4). Кроме того, иммунный комплекс JB5 показал значительно меньшую активацию тромбоцитов по сравнению с иммунным комплексом hu5c8 (р <0,005 (Unpaired T test, 2 tailed; t=5.586, df=4).
[0092] Хотя описан ряд вариантов реализации изобретения раскрыты в данном описании, очевидно, что основные примеры могут быть изменены специалистом в данной области техники, чтобы обеспечить другие варианты реализации изобретения, которые используют или заключают в себе способы данного изобретения. Варианты реализации изобретения и примеры приведены для иллюстративных целей и не должны интерпретироваться как ограничивающие объем данного изобретения, который определяется приложенной формулой изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ALS THERAPY DEVELOPMENT INSTITUTE
<120>  АНТИТЕЛА К CD40L И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С CD40L ЗАБОЛЕВАНИЙ И НАРУШЕНИЙ
<130>  224823-384897
<150>  PCT/US2016/016165
<151>  2016-02-02
<150>  62/111,261
<151>  2015-02-03
<160>  25
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  111
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  1
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1. 5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Thr Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85                  90                  95
Glu Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  2
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1. 5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  3
<211>  232
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  3
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1. 5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  4
<211>  232
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  4
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala
1. 5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  5
<211>  111
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  5
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1. 5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Lys Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Thr Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85                  90                  95
Glu Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  6
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1. 5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  7
<211>  218
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  7
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1. 5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Thr Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85                  90                  95
Glu Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165                 170                 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180                 185                 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195                 200                 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  8
<211>  660
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  8
gacatcgtgc tgacccagtc ccccgccacc ctgtccgtgt cccccggcga gagggccacc       60
atctcctgca gggcctccca gagggtgtcc tcctccacct actcctacat gcactggtac      120
cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatcaagt acgcctccaa cctggagtcc      180
ggcgtgcccg ccaggttctc cggctccggc tccggcaccg acttcaccct gaccatctcc      240
tccgtggagc ccgaggactt cgccacctac tactgccagc actcctggga gatccccccc      300
accttcggcg gcggcaccaa gctggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc      360
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg      420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg      480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc      540
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc      600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttagtga      660
<210>  9
<211>  448
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1. 5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr
210                 215                 220
His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
<210>  10
<211>  1956
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  10
caggtgcagc tggtgcagtc cggcgccgag gtggtgaagc ccggcgcctc cgtgaagctg       60
tcctgcaagg cctccggcta catcttcacc tcctactaca tgtactgggt gaagcaggcc      120
cccggccagg gcctggagtg gatcggcgag atcaacccct ccaacggcga caccaacttc      180
aacgagaagt tcaagtccaa ggccaccctg accgtggaca agtccgcctc caccgcctac      240
atggagctgt cctccctgag gtccgaggac accgccgtgt actactgcac caggtccgac      300
ggcaggaacg acatggactc ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc ctccgctagc      360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca      420
gcagccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac      480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc      540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc      600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttgg tgagaggcca      660
gcacagggag ggagggtgtc tgctggaagc caggctcagc gctcctgcct ggacgcatcc      720
cggctatgca gccccagtcc agggcagcaa ggcaggcccc gtctgcctct tcacccggag      780
gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc cccaggctct      840
gggcaggcac aggctaggtg cccctaaccc aggccctgca cacaaagggg caggtgctgg      900
gctcagacct gccaagagcc atatccggga ggaccctgcc cctgacctaa gcccacccca      960
aaggccaaac tctccactcc ctcagctcgg acaccttctc tcctcccaga ttccagtaac     1020
tcccaatctt ctctctgcag agcccaaatc tagtgacaaa actcacacaa gcccaccgag     1080
cccaggtaag ccagcccagg cctcgccctc cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt     1140
agcctgcatc cagggacagg ccccagccgg gtgctgacac gtccacctcc atctcttcct     1200
cagcacctga actcctgggg ggatcctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca     1260
ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag     1320
accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa     1380
agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc     1440
accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag     1500
cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aaggtgggac ccgtggggtg cgagggccac     1560
atggacagag gccggctcgg cccaccctct gccctgagag tgaccgctgt accaacctct     1620
gtccctacag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag     1680
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc     1740
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg     1800
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg     1860
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca     1920
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa taatga                               1956
<210>  11
<211>  218
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  11
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1. 5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Lys Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Thr Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85                  90                  95
Glu Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165                 170                 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180                 185                 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195                 200                 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  12
<211>  660
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  12
gacatcgtgc tgacccagtc ccccgccacc ctgtccgtgt cccccggcga gagggccacc       60
atctcctgca gggcctccca gaaggtgtcc tcctccacct actcctacat gcactggtac      120
cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatcaagt acgcctccaa cctggagtcc      180
ggcgtgcccg ccaggttctc cggctccggc tccggcaccg acttcaccct gaccatctcc      240
tccgtggagc ccgaggactt cgccacctac tactgccagc actcctggga gatccccccc      300
accttcggcg gcggcaccaa gctggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc      360
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg      420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg      480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc      540
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc      600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttagtga      660
<210>  13
<211>  448
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1. 5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr
210                 215                 220
His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
<210>  14
<211>  1956
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  14
caggtgcagc tggtgcagtc cggcgccgag gtggtgaagc ccggcgcctc cgtgaagctg       60
tcctgcaagg cctccggcta catcttcacc tcctactaca tgtactgggt gaagcaggcc      120
cccggccagg gcctggagtg gatcggcgag atcaacccct ccaacggcga caccaacttc      180
aacgagaagt tcaagtccaa ggccaccctg accgtggaca ggtccgcctc caccgcctac      240
atggagctgt cctccctgag gtccgaggac accgccgtgt actactgcac caggtccgac      300
ggcaggaacg acatggactc ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc ctccgctagc      360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca      420
gcagccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac      480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc      540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc      600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttgg tgagaggcca      660
gcacagggag ggagggtgtc tgctggaagc caggctcagc gctcctgcct ggacgcatcc      720
cggctatgca gccccagtcc agggcagcaa ggcaggcccc gtctgcctct tcacccggag      780
gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc cccaggctct      840
gggcaggcac aggctaggtg cccctaaccc aggccctgca cacaaagggg caggtgctgg      900
gctcagacct gccaagagcc atatccggga ggaccctgcc cctgacctaa gcccacccca      960
aaggccaaac tctccactcc ctcagctcgg acaccttctc tcctcccaga ttccagtaac     1020
tcccaatctt ctctctgcag agcccaaatc tagtgacaaa actcacacaa gcccaccgag     1080
cccaggtaag ccagcccagg cctcgccctc cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt     1140
agcctgcatc cagggacagg ccccagccgg gtgctgacac gtccacctcc atctcttcct     1200
cagcacctga actcctgggg ggatcctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca     1260
ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag     1320
accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa     1380
agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc     1440
accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag     1500
cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aaggtgggac ccgtggggtg cgagggccac     1560
atggacagag gccggctcgg cccaccctct gccctgagag tgaccgctgt accaacctct     1620
gtccctacag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag     1680
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc     1740
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg     1800
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg     1860
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca     1920
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa taatga                               1956
<210>  15
<211>  18
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  15
Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Tyr
1. 5                   10                  15
Met His
<210>  16
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  16
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1. 5
<210>  17
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  17
Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Pro Thr
1. 5
<210>  18
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  18
Ser Tyr Tyr Met Tyr
1. 5
<210>  19
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  19
Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1. 5                   10                  15
Ser
<210>  20
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  20
Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser
1. 5
<210>  21
<211>  448
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1. 5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210                 215                 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
<210>  22
<211>  374
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  22
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1. 5                   10                  15
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20                  25                  30
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35                  40                  45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50                  55                  60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65                  70                  75                  80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85                  90                  95
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100                 105                 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115                 120                 125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130                 135                 140
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145                 150                 155                 160
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165                 170                 175
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180                 185                 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195                 200                 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210                 215                 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225                 230                 235                 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245                 250                 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260                 265                 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro
275                 280                 285
Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe Leu
290                 295                 300
Val Asn Thr Val Leu Trp Val Thr Ile Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys
305                 310                 315                 320
Lys Lys Trp Asp Leu Glu Ile Ser Leu Asp Ser Gly His Glu Lys Lys
325                 330                 335
Val Ile Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu Lys
340                 345                 350
Cys Gln Glu Gln Lys Glu Glu Gln Leu Gln Glu Gly Val His Arg Lys
355                 360                 365
Glu Pro Gln Gly Ala Thr
370
<210>  23
<211>  317
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  23
Met Thr Met Glu Thr Gln Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Arg Asn Leu
1. 5                   10                  15
Trp Leu Leu Gln Pro Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp
20                  25                  30
Ser Gln Ala Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro
35                  40                  45
Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly
50                  55                  60
Ala Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn
65                  70                  75                  80
Leu Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn
85                  90                  95
Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser
100                 105                 110
Asp Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr
115                 120                 125
Pro His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His
130                 135                 140
Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ser Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln
165                 170                 175
Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly
180                 185                 190
Tyr Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro
195                 200                 205
Ser Met Gly Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile Ile Val Ala Val Val Ile
210                 215                 220
Ala Thr Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr
225                 230                 235                 240
Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Ser Thr Asp Pro Val Lys Ala
245                 250                 255
Ala Gln Phe Glu Pro Pro Gly Arg Gln Met Ile Ala Ile Arg Lys Arg
260                 265                 270
Gln Leu Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr
275                 280                 285
Met Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr
290                 295                 300
Leu Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn
305                 310                 315
<210>  24
<211>  254
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  24
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1. 5                   10                  15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20                  25                  30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35                  40                  45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50                  55                  60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65                  70                  75                  80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85                  90                  95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100                 105                 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115                 120                 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130                 135                 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145                 150                 155                 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe
165                 170                 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180                 185                 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195                 200                 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210                 215                 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225                 230                 235                 240
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245                 250
<210>  25
<211>  233
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  25
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1. 5                   10                  15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20                  25                  30
Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35                  40                  45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50                  55                  60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65                  70                  75                  80
Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85                  90                  95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100                 105                 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115                 120                 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130                 135                 140
Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro
145                 150                 155                 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165                 170                 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180                 185                 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln
195                 200                 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210                 215                 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile
225                 230
<---