ЛЕЧЕНИЕ ГЛАУКОМЫ
GLAUCOMA TREATMENT

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящие варианты осуществления в общем относятся к профилактике, лечению или ингибированию глаукомы и, в частности, к применению декстрансульфата для профилактики, лечения или ингибирования глаукомы.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Глаукома описывает группу прогрессирующих невропатий зрительного нерва, которые могут вызвать необратимую слепоту, в которой основным фактором риска является повышение внутриглазного давления (ВГД). При первичной открытоугольной глаукоме (ПОУГ) увеличение ВГД происходит в случае, когда отток водянистой влаги (AqH) через трабекулярную сеть (ТС) уменьшается, как правило, в результате нарушений клеточности ТС, сокращения ТС и уровней внеклеточного матрикса (ВКМ). Эластичные волокна в ТС окружены оболочкой из тонких фибрилл, встроенных в аморфный ВКМ, состоящий из коллагена IV, ламинина и фибронектина. Наличие гемолитической бляшки, связанной с оболочками эластичных волокон в юкстаканаликулярной ткани (JCT) внутри ТС, так называемые бляшки, полученные из оболочки (SD), также являются патологическим признаком ПОУГ. Таким образом, пациенты с ПОУГ имеют значительно большее количество и более толстые SD бляшки в своей ТС по сравнению с контролем по возрастным группам. Однако считается, что эти SD бляшки не способствуют увеличению сопротивления оттоку, поскольку было показано, что глаза с псевдоэксфолиативной глаукомой имели сходные уровни материала SD бляшек по сравнению со здоровыми глазами, но все же имели более высокие уровни ВГД. Тем не менее, повышенные уровни ВКМ видны вокруг оболочек ТС, и это осаждение может способствовать увеличению сопротивления оттока. Эти клеточные и ВКМ изменения в ТС вместе с измененными сократительными способностями клеток ТС приводят к дисфункциональной ТС и, в конечном итоге, к потере строгого контроля оттока AqH.
Механизмы, которые приводят к дисфункции ТС в ПОУГ, вероятно, являются многофакторными, но считается, что этому способствуют патологически высокие уровни трансформирующего фактора роста-β (TGF-β) в AqH. Некоторые пациенты с ПОУГ имеют повышенный уровень TGF-β в их AqH по сравнению с AqH, взятым у пациентов соответствующего возраста с катарактой или другими формами глаукомы. Роль TGF-β в повышении отложения ТС ВКМ и ВГД была продемонстрирована в экспериментах по перфузии человеческого глаза и моделирования глаукомы на грызунах. Исследования экспрессии генов в культивируемых клетках ТС человека также подтверждают утверждение, что как изоформы TGF-β1, так и TGF-β2 индуцируют сверхэкспрессию белков ВКМ, которые могут способствовать изменениям ТС, наблюдаемым при глаукоме. Кроме того, TGF-β предотвращает распад ВКМ путем ингибирования активации матриксных металлопротеиназ (ММП) посредством увеличения уровней ингибитора активатора плазминогена (PAI)-1 и тканевых ингибиторов металлопротеиназ (TIMP). PAI-1 ингибирует превращение плазминогена в плазмин, что необходимо для плазмин-зависимой активации ММП. Повышающие ВГД эффекты TGF-β также связаны со способностью цитокина уменьшать пролиферацию и индуцировать апоптоз клеток TC, тем самым уменьшая общее количество клеток TC.
TGF-β также стимулирует сокращение клеток TC через сигнальный путь RhoA-Rho-ассоциированная протеинкиназа (ROCK), причем сократительная способность TC значительно влияет на ВГД. Исследования, которые уменьшали или устраняли опосредованное RhoA сокращение ТС с использованием ингибиторов Rho/ROCK, привели к появлению новых классов агентов, снижающих ВГД, для лечения глаукомы и других заболеваний, связанных с увеличением ВГД. Однако маловероятно, что только ингибиторы Rho/ROCK могут лечить хроническую фиброзную патологию, которая встречается у некоторых пациентов с ПОУГ, при этом их эффективность все еще находится под пристальным вниманием. В конечном итоге повышение ВГД приводит к метаболическим и биохимическим изменениям в клетках зрительного нерва и сетчатки. Кроме того, механическое сжатие аксонов влияет как на ретроградный, так и на антероградный аксональный транспорт. Метаболические и биохимические изменения вместе с механическим сжатием аксонов лишают ганглиозную клетку сетчатки (ГКС) нейротрофических факторов, что приводит к апоптозу ГКС и экскавации диска зрительного нерва, что является признаком диагностики глаукомы.
Целью любого лечения глаукомы является предотвращение потери зрения, поскольку потеря зрения в результате глаукомы необратима. В настоящее время глаукому лечат с помощью глазных капель, таблеток, лазерной хирургии, традиционной хирургии или комбинации данных методов. Большинство из этих методов лечения предназначены для снижения и/или контроля ВГД, которое может повредить зрительный нерв, который передает визуальную информацию в мозг. Однако контроль ВГД в лучшем случае несовершенен, и существует неудовлетворенная потребность в улучшенных способах лечения, которые могут ограничить или даже обратить вспять развитие заболевания.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Общей целью является лечение, ингибирование или предотвращение глаукомы у субъекта.
Данная и другие цели достигаются с помощью вариантов осуществления, раскрытых в данном документе.
Аспект вариантов осуществления относится к декстрансульфату или его фармацевтически приемлемой соли для применения при лечении, ингибировании или профилактике глаукомы у субъекта.
Другой аспект вариантов осуществления относится к декстрансульфату или его фармацевтически приемлемой соли для применения при лечении, ингибировании или профилактике глазной гипертензии у субъекта.
Дополнительный аспект вариантов осуществления относится к декстрансульфату или его фармацевтически приемлемой соли для применения в ингибировании потери ганглиозных клеток сетчатки и уменьшения слоя нервных волокон сетчатки у субъекта, страдающего глаукомой и/или глазной гипертензией.
Еще один аспект вариантов осуществления относится к декстрансульфату или его фармацевтически приемлемой соли для применения при снижении внутриглазного давления у субъекта, страдающего глаукомой.
Дополнительные аспекты вариантов осуществления относятся к применению декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства для лечения, ингибирования или профилактики глаукомы у субъекта; для лечения, ингибирования или профилактики глазной гипертензии у субъекта; для снижения внутриглазного давления у субъекта, страдающего глаукомой; или для лечения, ингибирования или профилактики потери ганглиозных клеток сетчатки и уменьшения слоя нервных волокон сетчатки у субъекта, страдающего глаукомой и/или глазной гипертензией.
Еще один аспект вариантов осуществления относится к способу лечения, ингибирования или предотвращения глаукомы. Способ включает введение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного субъекту, страдающему глаукомой.
Дополнительный аспект вариантов осуществления относится к способу лечения, ингибирования или профилактики глазной гипертензии. Способ включает введение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного субъекту, страдающему глазной гипертензией.
Другой аспект вариантов осуществления относится к способу ингибирования потери ганглиозных клеток сетчатки и уменьшения слоя нервных волокон сетчатки. Способ включает введение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного субъекту, страдающему глаукомой и/или глазной гипертензией.
Еще один аспект вариантов осуществления относится к способу снижения внутриглазного давления у субъекта, страдающего глаукомой. Способ включает введение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного субъекту, страдающему глаукомой.
Декстрансульфат по настоящему изобретению вызывает быстрое и воспроизводимое восстановление нормального ВГД у субъектов, страдающих глаукомой. Снижение ВГД до нормального диапазона здоровых субъектов было связано с сохранением ГКС в сетчатке и сохранением слоя нервных волокон сетчатки (СНВС). Предполагается, что восстановление нормальных уровней ВГД происходит в результате растворения установленных рубцовых элементов ТС, что подтверждается значительно сниженными уровнями ламинина и фибронектина у субъектов, получавших декстрансульфат.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Варианты осуществления вместе с другими объектами и их преимуществами могут быть лучше поняты путем ссылки на следующее описание вместе с прилагаемыми графическими материалами, на которых:
Фиг. 1 иллюстрирует изменения внутриглазного давления (ВГД) у субъектов, страдающих первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ) и получавших контрольный физиологический раствор или декстрансульфат в соответствии с вариантами осуществления.
Фиг. 2 иллюстрирует изменения количества ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) у субъектов, страдающих от ПОУГ и получавших контрольный физиологический раствор или декстрансульфат в соответствии с вариантами осуществления.
Фиг. 3 иллюстрирует изменения толщины слоя нервных волокон сетчатки (СНВС) у субъектов, страдающих от ПОУГ и получавших контрольный физиологический раствор или декстрансульфат в соответствии с вариантами осуществления.
Фиг. 4 иллюстрирует визуализацию переднего сегмента радужно-роговичного угла у субъектов, страдающих от ПОУГ и получавших контрольный физиологический раствор или декстрансульфат в соответствии с вариантами осуществления.
Фиг. 5 иллюстрирует изменения иммунореактивности ламинина у субъектов, страдающих от ПОУГ и получавших контрольный физиологический раствор или декстрансульфат в соответствии с вариантами осуществления.
Фиг. 6 иллюстрирует изменения иммунореактивности фибронектина у субъектов, страдающих от ПОУГ и получавших контрольный физиологический раствор или декстрансульфат в соответствии с вариантами осуществления.
Фиг. 7 иллюстрирует различия в массе тела у субъектов, страдающих ПОУГ и получавших контрольный физиологический раствор или декстрансульфат в соответствии с вариантами осуществления.
Фиг. 8 представляет собой репрезентативные изображения флуоресцеиновой ангиографии субъектов, страдающих от ПОУГ и получавших контрольный физиологический раствор или декстрансульфат в соответствии с вариантами осуществления.
Фиг. 9 иллюстрирует хориоидальную неоваскуляризацию с использованием окрашивания изолектином В4. Репрезентативные изображения неоваскуляризации в контрольной (Фиг. 9А) и экспериментальной группе (Фиг. 9В). (Фиг. 9C): Гистограмма показывает обычные неоваскулярные участки.
Фиг. 10 иллюстрирует хориоидальную неоваскуляризацию с использованием окрашивания коллагена IV. Репрезентативные изображения неоваскуляризации в контрольной (Фиг. 10А) и экспериментальной группе (Фиг. 10В). (Фиг. 10C): Гистограмма показывает обычные неоваскулярные участки.
На Фиг. 11 представлены результаты анализа оптической когерентной томографии (ОКТ) СНВС.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящие варианты осуществления обычно относятся к профилактике, лечению или ингибированию глаукомы и, в частности, к применению декстрансульфата для профилактики, лечения или ингибирования глаукомы.
Лечение декстрансульфатом привело к быстрому и воспроизводимому восстановлению нормального внутриглазного давления (ВГД) в глаукомных глазах у субъектов, страдающих глаукомой, и в частности первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ). Восстановление нормальных уровней ВГД было связано с сохранением ретинальных ганглиозных клеток (ГКС) в сетчатке, о чем свидетельствуют сохраняющиеся показатели ГКС и сохранение толщины слоя нервных волокон сетчатки (СНВС) в глазах у субъектов, получавших декстрансульфат. Лечение декстрансульфатом также приводило к растворению установленных рубцовых элементов трабекулярной сети (TC), так как уровни ламинина и фибронектина были значительно ниже у субъектов, которые получали лечение с помощью декстрансульфата.
Клиническое значение наблюдений заключается в следующем. Пациентов с глаукомой в настоящее время лечат с помощью глазных капель, которые снижают ВГД путем ограничения выработки глазной жидкости или увеличения оттока глазной жидкости. Данные способы лечения плохо соблюдаются, и, следовательно, ВГД плохо контролируется, что приводит к прогрессирующей потере зрения у большинства пациентов. Лечение, которое предотвращает и устраняет глазную патологию, приводящую к потере зрения и значительно улучшающую контроль ВГД, было бы очень ценно.
Потенциальные новые лекарственные средства, полезные при лечении глаукомы, не должны вызывать ангиогенез или неоваскуляризацию в глазах. Такой патологический ангиогенез в глазу может привести к серьезным нарушениям зрения. Экспериментальные данные, представленные в настоящем документе, указывают на то, что декстрансульфат не оказывал антиангиогенного или проангиогенного воздействия на глаза подвергнутых лечению субъектов. Соответственно, декстрансульфат может быть безопасно использован при глазных показаниях без риска патологического ангиогенеза в глазу.
Тем самым декстрансульфат вариантов осуществления можно эффективно использовать для профилактики, лечения ингибирования глаукомы.
Соответственно, аспект вариантов осуществления относится к декстрансульфату или его фармацевтически приемлемой соли для применения при лечении, ингибировании или профилактике глаукомы у субъекта.
Глаукома представляет собой группу заболеваний глаз, которые приводят к повреждению зрительного нерва и сетчатки с потерей зрения. Наиболее распространенным типом глаукомы является открытоугольная глаукома с менее распространенными типами, включая закрытоугольную глаукому и глаукому с нормальным давлением. Открытоугольная глаукома развивается медленно со временем и без боли. Боковое зрение может начать уменьшаться с последующей потерей центрального зрения, приводящей к слепоте, при отсутствии лечения. Закрытоугольная глаукома может проявляться постепенно или внезапно. Внезапное проявление может включать сильную боль в глазах, помутнение зрения, расширенный зрачок, покраснение глаз и тошноту. Потеря зрения вследствие глаукомы, в случае ее возникновения, происходит постоянно.
При раннем лечении возможно замедление или остановка прогрессирования глаукомы с помощью применения лекарственных средств, лазерного лечения или хирургического вмешательства. Современные цели лечения глаукомы - избежать глаукоматозного повреждения и повреждения нерва, а также сохранить поле зрения и общее качество жизни пациентов с минимальными побочными эффектами. Это требует соответствующих диагностических методов и последующих обследований, а также разумного выбора методов лечения для конкретного пациента. Хотя внутриглазное давление является лишь одним из основных факторов риска глаукомы, его снижение с помощью различных фармацевтических препаратов и/или хирургических методов в настоящее время является основой лечения глаукомы.
Внутриглазное давление может быть снижено с помощью лекарственного средства, обычно глазных капель. Несколько классов лекарственных средств используются для лечения глаукомы, с несколькими лекарственными средствами в каждом классе. Каждое из этих лекарственных средств может иметь местные и системные побочные эффекты. Соблюдение протокола приема лекарственных средств может быть сложным и дорогостоящим. Ненадлежащее применение лекарственных средств и несоблюдение последующих посещений врача являются основной причиной потери зрения у пациентов с глаукомой.
Для лечения глаукомы применяются как лазерная, так и обычная хирургия. Лазерная хирургия и хирургическая операция, как правило, являются временным решением, так как с их помощью невозможно вылечить глаукому.
Таким образом, существует давно назревшая необходимость в лекарственном средстве, которое могло бы использоваться для лечения, ингибирования или предотвращения глаукомы у субъекта.
Декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с вариантами осуществления при введении субъекту, страдающему повышенным ВГД, т.е. глазной гипертензией, такой как вызванная глаукомой, вызывает снижение ВГД. Фактически, ВГД нормализуется, то есть уменьшается до нормального диапазона ВГД у здоровых субъектов после введения декстрансульфата. Соответственно, декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с вариантами осуществления способны бороться и лечить один из наиболее вредных компонентов глаукомы, то есть аномальное и повышенное ВГД.
Кроме того, введение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с вариантами осуществления обеспечивает нейропротекторный эффект для ГКС. Более конкретно, введение декстрансульфата защищало ГКС от повреждения и гибели клеток, как видно из поддерживаемых показателей ГКС и сохранения толщины СНВС в глазах субъектов, подвергнутых лечению.
ГКС представляет собой тип нейрона, расположенный вблизи внутренней поверхности сетчатки глаза, обычно обозначаемый ганглиозным клеточным слоем. ГКС совместно передают формирующую изображение и не образующую визуальную информацию от сетчатки в форме потенциала действия к нескольким областям в таламусе, гипоталамусе и среднем мозге, или среднем мозге. ГКС значительно различаются по своим размерам, связям и реакциям на зрительную стимуляцию, но все они имеют общее свойство иметь длинный аксон, который проходит в мозг. Эти аксоны образуют зрительный нерв, зрительный хиазм и зрительный путь.
СНВС, иногда обозначаемый как слой нервных волокон или stratum opticum, образован расширением волокон зрительного нерва. СНВС является чувствительной структурой, и некоторые процессы, такие как высокое ВГД, могут вызывать его естественный апоптоз.
Нейропротективный эффект декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли в вариантах осуществления эффективно предотвращает повреждение и апоптоз ГКС и, следовательно, сохранение СНВС.
Как упомянуто выше, дисфункция ТС, такая как аномалии клеточности ТС и сокращение ТС, может быть основной причиной высокого ВГД, наблюдаемой у субъектов, страдающих глаукомой. Декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль в вариантах осуществления диспергирует и ослабляет образование рубцов ТС, установленное у субъектов с глаукомой. Это, в свою очередь, нормализует отток AqH через ТС.
Предполагается, что противорубцовое действие декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли в вариантах осуществления является результатом действия нескольких механизмов, индуцированных декстрансульфатом или его фармацевтически приемлемой солью. Так, декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль индуцирует матриксные металлопротеиназы (ММП), которые представляют собой ферменты, способные расщеплять белки внеклеточного матрикса (ВКМ) и подавлять активность тканевых ингибиторов металлопротеиназ (ТИМП). Декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль дополнительно индуцирует природные противорубцовые молекулы, такие как декорин, который, в свою очередь, блокирует TGF-β и различные факторы роста, такие как фактор роста гепатоцитов (HGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор некроза опухоли (TNF) и др. Декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль, также оказывает ингибирующее действие на активность TGF-β и ингибирует фиброз даже в присутствии избыточных уровней TGF-β. Декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль дополнительно ингибирует адгезию иммунных клеток и агрегацию клеток. Рубцевание обусловлено воспалительными цитокинами, в частности TGF-β, и подавляет уровни TGF-β-активированной протеинкиназы 1 (TAK-1). Декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль блокирует TGF-β и другие цитокины, которые способствуют образованию рубцов и фиброзу, и параллельно стимулирует противорубцовые молекулы. Взятые вместе, данные механизмы, индуцированные декстрансульфатом или его фармацевтически приемлемой солью, оказывают положительное влияние на глаукомные глаза, рассеивая и ослабляя рубцевание ТС.
Препараты против глаукомы из предшествующего уровня техники, как правило, не пригодны не для лечения глаукомы, ни для борьбы с основными причинами глаукомы, но скорее ослабляют симптомы глаукомы, такие как снижение ВГД, либо путем ограничения выработки глазной жидкости, либо путем увеличения оттока глазной жидкости. Тем не менее, лечение с использованием таких лекарственных средств, как правило, имеет плохое соблюдение и несовершенный контроль ВГД, что приводит к прогрессирующей потере зрения у большинства пациентов. Это представляет собой явный контраст с декстрансульфатом или его фармацевтически приемлемой солью вариантов осуществления, которые не только уменьшают и нормализуют ВГД, но также обеспечивают нейропротекторное действие на ГКС и СНВС, и растворяют установленные рубцовые элементы ТС, тем самым обеспечивая фактическое ингибирование и лечение глаукомы.
Декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль обеспечивает лечение, ингибирование или профилактику глаукомы, не вызывая патологического ангиогенеза в глазу. Таким образом, важно, чтобы лекарственное средство, используемое для лечения, ингибирования или профилактики глаукомы, не вызывало ангиогенез или неоваскуляризацию в глазах, что в противном случае привело бы к серьезным нарушениям зрения. Экспериментальные данные, представленные в настоящем документе, указывают на то, что декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль не оказывали ни антиангиогенного, ни проангиогенного действия на глаз и, следовательно, пригодны для применения при показаниях для лечения глаз.
Открытоугольная глаукома является наиболее распространенной формой глаукомы, на которую приходится не менее 90% всех случаев глаукомы. Это вызвано засорением дренажных каналов, что приводит к увеличению глазного давления. Открытый угол означает, что угол, при котором радужка встречается с роговицей, настолько широк и открыт, насколько это должно быть. Прямоугольная глаукома также называется первичной глаукомой, первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ) или хронической глаукомой в данной области техники.
В конкретном варианте осуществления декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль предназначены для применения при лечении, ингибировании или профилактике открытоугольной глаукомы, такой как ПОУГ, у субъекта.
Декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль эффективно снижает ВГД от диапазона глазной гипертензии до нормального уровня ВГД.
Таким образом, другой аспект вариантов осуществления относится к декстрансульфату или его фармацевтически приемлемой соли для применения при лечении, ингибировании или профилактике глазной гипертензии у субъекта.
В конкретном варианте осуществления декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль предназначены для снижения внутриглазного давления у субъекта, страдающего глазной гипертензией.
Следовательно, аспект вариантов осуществления относится к декстрансульфату или его фармацевтически приемлемой соли для применения при снижении внутриглазного давления у субъекта, страдающего глаукомой, предпочтительно страдающего открытоугольной глаукомой, такой как ПОУГ.
У людей нормальный диапазон ВГД обычно составляет от 10 мм рт.ст. до 20 мм рт.ст., со средним значением ВГД около 15,5 мм рт.ст. с колебаниями около 2,75 мм рт.ст. Глазная гипертензия (ГГТ) определяется как ВГД, которое выше нормального, то есть обычно выше 20 мм рт.ст. для человека.
Таким образом, в одном варианте осуществления снижение внутриглазного давления включает снижение внутриглазного давления или восстановление внутриглазного давления так, чтобы оно находилось в пределах нормального диапазона ВГД от 10 мм рт.ст. до 20 мм рт.ст., например, в диапазоне ВГД от 12,75 мм рт.ст. до 18,25 мм рт.ст.
В одном варианте осуществления, субъект страдает глазной гипертензией, вызванной глаукомой, предпочтительно открытоугольной глаукомой, такой как ПОУГ.
Хотя глаукома, в частности открытоугольная глаукома и ПОУГ, является основной причиной глазной гипертонии, существуют и другие возможные причины глазной гипертонии, включая, например, высокое кровяное давление; стресс; диета с избытком соли, гидрогенизированных масел, алкоголя и сахара; травма глаза; курение; диабет; и заболевание сердечно-сосудистой системы. Также, некоторые лекарственные средства имеют побочный эффект, вызывающий глазную гипертензию у некоторых людей. Например, стероидные лекарственные средства, используемые для лечения астмы и других состояний, повышают риск развития глазной гипертензии. Различные травмы глаза, которые могут повлиять на баланс выделения и оттока жидкости из глаз, могут вызвать глазную гипертензию. Глазная гипертензия также была связана с другими заболеваниями глаз, такими как повышенное ВГД в ночное время, всплески ВГД, синдром псевдоэксфолиации, синдром дисперсии пигмента и дугообразная оболочка роговицы.
Декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль обеспечивает нейропротекторный эффект для предотвращения или по меньшей мере уменьшения повреждений и гибели ГКС и сохранения целостности и толщины СНВС.
Таким образом, еще один аспект вариантов осуществления относится к декстрансульфату или его фармацевтически приемлемой соли для применения в ингибировании потери ганглиозных клеток сетчатки и уменьшении слоя нервных волокон сетчатки у субъекта, страдающего глаукомой, предпочтительно открытоугольной глаукомой, такой как ПОУГ и/или глазная гипертензия.
Увеличение ВГД и гибель ГКС могут также прямо или косвенно влиять на другие нейроны сетчатки, такие как интернейроны и фоторецепторы. Например, смерть ГКС может вызвать атрофию, которая, в свою очередь, вызывает потерю синапсов и гибель других нейронов сетчатки.
Соответственно, нормализация ВГД и уменьшение повреждений и гибели ГКС будут полезны при лечении, профилактике или ингибировании других состояний сетчатки, таких как диабетическая ретинопатия и различные генетические состояния, связанные с потерей фоторецепторов.
Декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль является уникальным средством для лечения, профилактики или ингибирования глаукомы и связанных с ней состояний сетчатки путем не только снижения ВГД, но и одновременно непосредственной защиты нейронов сетчатки от повреждения и смерти.
В одном варианте осуществления декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль составлены для системного введения субъекту. В одном варианте осуществления декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль составлены для парентерального введения в качестве примера системного введения.
Примеры способов парентерального введения включают внутривенное (в/в) введение, внутриартериальное введение, внутримышечное введение, внутрицеребральное введение, внутрицеребровентрикулярное введение, интратекальное введение и подкожное (п/к) введение.
В одном варианте осуществления декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль предпочтительно составляется для внутривенного (в/в) или подкожного (п/к) введения субъекту. Соответственно, в/в и п/к введение являются предпочтительными примерами системного введения декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли. В конкретном варианте осуществления декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль составлены для п/к введения субъекту.
В одном варианте осуществления декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль составляется в виде водного раствора для инъекций, предпочтительно в виде водного раствора для инъекций для в/в и п/к введения. Таким образом, декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль согласно вариантам осуществления предпочтительно составляется в виде водного раствора для инъекций с выбранным растворителем или вспомогательным веществом. Растворитель преимущественно представляет собой водный растворитель и, в частности, буферный раствор. Неограничивающим примером такого буферного раствора является буфер лимонной кислоты, такой как буфер моногидрата лимонной кислоты (САМ - citric acid monohydrate) или фосфатный буфер. Например, декстрансульфат в соответствии с вариантами осуществления может быть растворен в физиологическом растворе, таком как 0,9 % физиологический раствор NaCl, с последующим необязательным добавлением 75 мМ САМ и доведением рН до около 5,9 с использованием гидроксида натрия. Возможны также небуферизованные растворы, в том числе водные инъекционные растворы, такие как физиологический раствор, то есть NaCl (водный раствор). Кроме того, могут использоваться другие буферные системы, отличные от CAM и фосфатных буферов, если буферный раствор необходим.
Варианты осуществления не ограничиваются инъекциями, и альтернативно могут быть использованы другие пути введения, включая интраокулярное, интравитреальное, трансзонулярное, назальное, буккальное, кожное, трахеальное, бронхиальное или местное введение. Активное соединение, декстрансульфат, затем составляют с подходящим вспомогательным веществом, растворителем или носителем, который выбирают на основании конкретного пути введения.
Внутриглазное введение относится к введению в глазное яблоко субъекта. Интравитреальное введение относится к введению через глаз субъекта, предпочтительно непосредственно во внутреннюю полость глаза. Трансзонулярное введение относится к введению через цилиарную зону, которая представляет собой ряд волокон, соединяющих цилиарное тело и хрусталик глаза.
Носитель относится к веществу, которое служит носителем для повышения эффективности доставки и/или эффективности декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли.
Вспомогательное вещество относится к фармакологически неактивному веществу, которое составлено в комбинации с декстрансульфатом или его фармацевтически приемлемой солью, и включает, например, объемообразующие агенты, наполнители, разбавители и продукты, используемые для облегчения абсорбции или растворимости лекарственного средства или для других фармакокинетических применений.
Фармацевтически приемлемая соль декстрансульфата относится к соли декстрансульфата, обладающей эффектами, описанными в настоящем документе, и не оказывающей вредного действия для реципиента при введенной дозе(ах).
Декстрансульфат предпочтительно представляет собой так называемый низкомолекулярный декстрансульфат.
Далее ссылка на (среднюю) молекулярную массу и содержание серы в декстрансульфате относится также к любой фармацевтически приемлемой соли декстрансульфата. Следовательно, фармацевтически приемлемая соль декстрансульфата предпочтительно имеет среднюю молекулярную массу и содержание серы, как обсуждается в следующих вариантах осуществления.
Декстрансульфат представляет собой сульфатированный полисахарид и, в частности, сульфатированный глюкан, то есть полисахарид, состоящий из множества молекул глюкозы. Средняя молекулярная масса, как определено в настоящем документе, указывает на то, что отдельные сульфатированные полисахариды могут иметь молекулярную массу, отличную от этой средней молекулярной массы, но средняя молекулярная масса представляет собой среднюю молекулярную массу сульфатированных полисахаридов. Это также означает, что для образца декстрансульфата будет существовать естественное распределение молекулярных масс вокруг этой средней молекулярной массы.
w
Среднюю молекулярную массу (M) декстрансульфата обычно определяют с использованием косвенных методов, таких как гель-исключающая/проникающая хроматография, рассеяние света или вязкость. Определение средней молекулярной массы с использованием таких косвенных методов будет зависеть от ряда факторов, включая выбор колонки и элюента, скорость потока, процедуры калибровки и т.д.
w
w
w
w
Средняя молекулярная масса (M): , типичная для способов, чувствительных к размеру молекулы, а не к числовому значению, например, к методам рассеяния света и эксклюзионной хроматографии (SEC). Если предполагается нормальное распределение, то будет наблюдаться одинаковая масса на каждой стороне M, т.е. общая масса молекул декстрансульфата в образце, имеющем молекулярную массу ниже M, равна общей массе молекул декстрансульфата в образце, имеющем молекулярную массу выше M.
В одном варианте осуществления декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль предпочтительно имеет среднюю молекулярную массу, равную или ниже 40000 Да, более предпочтительно равную или ниже 20000 Да и, в частности, равную или ниже 10000 Да.
Декстрансульфат со средней молекулярной массой, превышающей 10000 Да, обычно имеет более низкий эффект по сравнению с профилем токсичности по сравнению с декстрансульфатом, имеющим более низкую среднюю молекулярную массу. Это означает, что максимальная доза декстрансульфата, которую можно безопасно вводить субъекту, ниже для более крупных молекул декстрансульфата (> 10000 Да) по сравнению с молекулами декстрансульфата, имеющими среднюю молекулярную массу в предпочтительном диапазоне. Как следствие, такие большие молекулы декстрансульфата менее пригодны для клинического применения, когда декстрансульфат следует вводить субъектам in vivo.
В одном варианте осуществления декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне от 2000 до 10000 Да. В другом варианте осуществления средняя молекулярная масса находится в диапазоне от 2500 до 10000 Да. В конкретном предпочтительном варианте осуществления средняя молекулярная масса находится в диапазоне от 3000 до 10000 Да.
В необязательном, но предпочтительном варианте осуществления, менее 40% молекул декстрансульфата имеют молекулярную массу ниже 3000 Да, предпочтительно менее 35 %, например менее 30 % или менее 25 % молекул декстрансульфата имеют молекулярную массу ниже 3000 Да. Кроме того, или альтернативно, менее 20 % молекул декстрансульфата имеют молекулярную массу выше 10000 Да, предпочтительно менее 15 %, например менее 10 % или менее 5 % молекул декстрансульфата имеют молекулярную массу выше 10000 Да. Таким образом, в конкретном варианте осуществления декстрансульфат имеет по существу узкое распределение молекулярной массы вокруг средней молекулярной массы.
В конкретном варианте осуществления средняя молекулярная масса декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли находится в диапазоне от 3500 до 9500 Да, например, в диапазоне от 3500 до 8000 Да.
В другом конкретном варианте осуществления средняя молекулярная масса декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли находится в диапазоне от 4500 до 7500 Да.
В еще одном конкретном варианте осуществления средняя молекулярная масса декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли находится в диапазоне от 4500 до 5500 Да.
Таким образом, в предпочтительном в настоящее время варианте осуществления средняя молекулярная масса декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли предпочтительно составляет около 5000 Да или по меньшей мере, по существу, близко к 5000 Да, например 5000 ± 500 Да, например 5000 ± 400 Да, предпочтительно 5000 ± 300 Да или 5000 ± 200 Да, например 5000 ± 100 Да. Следовательно, в одном варианте осуществления средняя молекулярная масса декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли составляет 4,5 кДа, 4,6 кДа, 4,7 кДа, 4,8 кДа, 4,9 кДа, 5,0 кДа, 5,1 кДа, 5,2 кДа, 5,3 кДа, 5,4 кДа или 5,5 кДа.
w
В конкретном варианте осуществления средняя молекулярная масса декстрансульфата или его фармацевтически солей, как представлено выше, представляет собой среднюю M и предпочтительно определяется гель-эксклюзионной/проникающей хроматографией, эксклюзионной хроматографией по размеру, методами рассеяния света или на основе вязкости.
В конкретном варианте осуществления декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль состоит, в среднем, около из или немного выше 5 единиц глюкозы и имеет среднее сульфатное число на единицу глюкозы по меньшей мере 2,0, например, по меньшей мере 2,5.
Декстрансульфат является полианионным производным декстрана и содержит серу. Среднее содержание серы для декстрансульфата в соответствии с вариантами осуществления предпочтительно составляет от 15 до 20 % и более предпочтительно приблизительно 17 %, как правило, соответствует приблизительно или по меньшей мере двум сульфатным группам на глюкозильный остаток. В конкретном варианте осуществления содержание серы в декстрансульфате предпочтительно равно или, по меньшей мере, близко к максимально возможной степени содержания серы в соответствующих молекулах декстрана.
n
В конкретном варианте осуществления декстрансульфат в вариантах осуществления имеет среднечисленную молекулярную массу (M), измеренную с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в интервале от 1850 до 3500 Да.
n
n
n,
n
Среднечисловая молекулярная масса (M):  обычно определяется с помощью анализов концевых групп, например, с помощью ЯМР-спектроскопии или хроматографии. Если предполагается нормальное распределение, то одинаковое количество молекул декстрансульфата с соответствующей массой может быть найдено на каждой стороне M, то есть число молекул декстрансульфата в образце, имеющем молекулярную массу ниже M равно числу молекул декстрансульфата в образце, имеющем молекулярную массу выше M.
n
В предпочтительном варианте осуществления декстрансульфат в вариантах осуществления имеет M, измеренную с помощью ЯМР-спектроскопии, в интервале от 1850 до 2500 Да, предпочтительно в интервале от 1850 до 2300 Да, и более предпочтительно в интервале от 1850 до 2000 Да.
В конкретном варианте осуществления декстрансульфат в вариантах осуществления имеет среднее сульфатное число на единицу глюкозы в интервале от 2,5 до 3,0, предпочтительно в интервале от 2,5 до 2,8 и более предпочтительно в интервале от 2,6 до 2,7.
В конкретном варианте осуществления декстрансульфат в вариантах осуществления имеет среднее количество единиц глюкозы в интервале от 4,0 до 6,0, предпочтительно в интервале от 4,5 до 5,5 и более предпочтительно в интервале от 5,0 до 5,2, например около 5,1.
n
В другом конкретном варианте осуществления декстрансульфат в вариантах осуществления имеет в среднем 5,1 единиц глюкозы и среднее сульфатное число на единицу глюкозы от 2,6 до 2,7, что обычно приводит к среднечисленной молекулярной массе (M), измеренной с помощью ЯМР-спектроскопии в интервале 1850 и 2000 Да.
Декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль, которые могут быть использованы в соответствии с вариантами осуществления, описаны в WO 2016/076780.
Декстрансульфат в соответствии с вариантами осуществления может быть составлен в виде фармацевтически приемлемой соли декстрансульфата. Такие фармацевтически приемлемые соли включают, например, натриевую или калиевую соль декстрансульфата.
+
n
В конкретном варианте осуществления натриевая соль декстрансульфата, включая противоионы Na, имеет M, измеренную с помощью ЯМР-спектроскопии, в интервале от 2000 до 2500 Да, предпочтительно в интервале от 2100 до 2300 Да.
Подходящие диапазоны доз для декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли в вариантах осуществления могут варьироваться в зависимости от размера и веса субъекта, состояния, для которого субъект получает лечение, и других соображений. В частности, для человека возможный диапазон доз может составлять от 1 мкг/кг до 150 мг/кг массы тела, предпочтительно от 10 мкг/кг до 100 мг/кг массы тела.
В предпочтительных вариантах осуществления декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль составлены для введения в дозировке в диапазоне от 0,05 до 50 мг/кг массы тела субъекта, предпочтительно от 0,05 или 0,1 до 40 мг/кг массы тела субъекта и более предпочтительно от 0,05 или 0,1 до 30 мг/кг, или от 0,1 до 25 мг/кг, или от 0,1 до 15 мг/кг, или от 0,1 до 10 мг/кг массы тела субъекта.
Введение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли в вариантах осуществления предпочтительно начинают как можно скорее после возникновения события или состояния, которое в противном случае может вызвать глаукому, глазную гипертензию и/или повреждения ГКС и СНВС у субъекта.
Введение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли необязательно должно быть ограничено лечением глаукомы, но может альтернативно или дополнительно использоваться для профилактики. Другими словами, декстрансульфат по вариантам осуществления можно вводить субъекту, имеющему повышенный риск развития глаукомы, глазной гипертензии и/или повреждений ГКС и СНВС
Ингибирование глаукомы, глазной гипертензии и/или потери ГКС и снижения СНВС, как используется в настоящем документе, подразумевает, что декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль уменьшает симптомы и эффекты состояния, даже при 100% лечении или отсутствия лечения. Например, ингибирование глазной гипертензии включает снижение ВГД, возможно, даже до нормального уровня ВГД, например, равного или ниже 20 мм рт.ст. Ингибирование потери ГКС включает уменьшение количества ГКС, которое в противном случае может быть повреждено или потеряно, в том числе вплоть до предотвращения любой потери ГКС выше любой нормальной потери ГКС, наблюдаемой у здоровых субъектов. Соответственно, ингибирование снижения СНВС включает остановку или по меньшей мере уменьшение любого уменьшения толщины СНВС, включая вплоть до предотвращения любого снижения СНВС выше любого нормального снижения СНВС, наблюдаемого у здоровых субъектов. Ингибирование глаукомы включает уменьшение или по меньшей мере смягчение симптомов и состояний, вызванных глаукомой, таких как уменьшение ВГД, уменьшение потери ГКС, снижение уменьшения СНВС и/или растворение рубцовых элементов ТС.
Декстрансульфат или его фармацевтически приемлемую соль согласно вариантам осуществления можно вводить при однократном введении, например, в форме однократной инъекции или болюсной инъекции. Эту болюсную дозу можно вводить пациенту довольно быстро, но ее предпочтительно вводить с течением времени, так что раствор декстрансульфата вводят пациенту в течение нескольких минут, например, в течение 5-10 минут или более.
Альтернативно, декстрансульфат или его фармацевтически приемлемую соль согласно вариантам осуществления можно вводить многократно, то есть, по меньшей мере два раза в течение периода лечения. Таким образом, декстрансульфат по вариантам осуществления можно вводить один или более раз в день, один или более раз в неделю, один или более раз в месяц в качестве иллюстративных примеров.
В конкретном варианте осуществления декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль составлен для введения несколько раз, например 2-14 раз, предпочтительно 2-7 раз, в течение одной или более последовательных недель, например, по меньшей мере 2-5 недель подряд. В конкретном варианте осуществления декстрансульфат или его фармацевтически приемлемая соль составлены для введения один или два раза в день в течение нескольких дней, таких как несколько последовательных дней, например, 2-14 дней.
В одном варианте осуществления субъект представляет собой млекопитающее, предпочтительно примата и более предпочтительно человека. Хотя варианты осуществления, в частности, направлены на лечение, ингибирование или предотвращение глаукомы у людей, варианты осуществления также могут, или альтернативно, использоваться при ветеринарном применении. Неограничивающие примеры животных-субъектов включают приматов, кошек, собак, свиней, лошадей, мышей, крыс.
Другие аспекты вариантов осуществления относятся к применению декстрансульфата или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства для лечения, ингибирования или профилактики глаукомы у субъекта; для лечения, ингибирования или профилактики глазной гипертензии у субъекта; для снижения внутриглазного давления у субъекта, страдающего глаукомой; или для снижения потери ГКС и снижения СНВС у субъекта, страдающего глаукомой, предпочтительно открытоугольной глаукомой и/или глазной гипертензией.
Еще один аспект вариантов осуществления относится к способу лечения, ингибирования или предотвращения глаукомы. Способ включает введение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного субъекту, страдающему глаукомой, предпочтительно открытоугольной глаукомой.
Дополнительный аспект вариантов осуществления относится к способу лечения, ингибирования или профилактики глазной гипертензии. Способ включает введение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного субъекту, страдающему глазной гипертензией.
Другой аспект вариантов осуществления относится к способу ингибирования потери ганглиозных клеток сетчатки и уменьшения слоя нервных волокон сетчатки. Способ включает введение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного субъекту, страдающему глаукомой, предпочтительно открытоугольной глаукомой и/или глазной гипертензией.
Еще один аспект вариантов осуществления относится к способу снижения внутриглазного давления у субъекта, страдающего глаукомой. Способ включает введение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного субъекту, страдающему глаукомой.
Примеры
Пример 1. Влияние декстрансульфата на глаукоматозные глаза.
Результаты
Внутриглазное давление (ВГД)
Повышенное ВГД индуцировали дважды в неделю внутрикамерными инъекциями воспалительного цитокина TGF-β в течение всего периода времени 28 дней. Это вызвало рубцевание дренажных порталов трабекулярной сети (TC) к 14 дню со связанным повышенным ВГД. Ежедневные подкожные обработки декстрансульфатом/физиологическим раствором начинали на 14 день.
ВГД повышалось на 14 день в обеих группах, при этом повышенное ВГД прогрессировало у животных, получавших подкожные инъекции физиологического раствора. Однако повышенное ВГД начало снижаться после 7 дней лечения декстрансульфатом, и к 24 дню наблюдалось значительно более низкое (Р <0,001) и нормализованное ВГД в группе декстрансульфата по сравнению с контрольной группой. ВГД оставалось значительно ниже (P> 0,001), чем контрольная группа в конце эксперимента на 28-й день (Фиг. 1).
Числа ганглиозных клеток сетчатки (ГКС)
Обработка декстрансульфатом значительно предотвратила (P> 0,001) снижение числа ГКС, присутствующих в сетчатке на 28-й день (Фиг. 2), предполагая нейропротекторный эффект декстрансульфата. Этот нейропротекторный эффект может быть прямым или косвенным из-за пониженного ВГД.
Оптическая когерентная томография (ОКТ) слоя нервных волокон сетчатки (СНВС)
СНВС включает аксоны, принадлежащие к ГКС, и теряется одновременно с потерей тела клетки ГКС. СНВС сохранялся после обработки декстрансульфатом по сравнению с физиологическим раствором (Фиг. 3 и 11), что свидетельствует о нейропротекторном эффекте декстрансульфата. Этот нейропротекторный эффект может быть прямым или косвенным из-за пониженного ВГД.
Переднесегментое изображения угла
Как в случае глаз, обработанных физиологическим раствором, так и декстрансульфатом, радужно-роговичный угол оставался «открытым», что свидетельствует о том, что увеличение ВГД не было связано с закрытием угла, см. Фиг. 4.
Рубцевание трабекулярной сети (ТС)
Обработка декстрансульфатом значительно ослабляла рубцевание ТС, о чем свидетельствует значительно сниженный уровень (P <0,001 ламинин; P <0,01 фибронектин) иммунореактивного ламинина (Фиг. 5) и фибронектина (Фиг. 6) угла.
Вес тела
Крысы в группе, обработанной декстрансульфатом, были более активными. Когда массу тела измеряли в обеих группах, наблюдалась небольшая, но несущественная разница, поскольку животные, получавшие декстрансульфат, набирали меньший вес в течение периода лечения, чем животные, получавшие физиологический раствор (Фиг. 7).
Выводы
Лечение декстрансульфатом привело к быстрому и воспроизводимому восстановлению нормального ВГД в глаукоматозных глазах. Восстановление нормальных уровней ВГД было связано с сохранением ГКС в сетчатке, о чем свидетельствуют поддерживаемые показатели ГКС и сохранение толщины СНВС в глазах у крыс, получавших декстрансульфат. Падение ВГД, вероятно, произошло в результате растворения установленных рубцовых элементов ТС, поскольку уровни ламинина и фибронектина были значительно ниже в углу у крыс, получавших декстрансульфат.
Клиническое значение наблюдений заключается в следующем. Пациентов с глаукомой в настоящее время лечат с помощью глазных капель, которые снижают ВГД путем ограничения выработки глазной жидкости или увеличения оттока глазной жидкости. Данные способы лечения плохо соблюдаются, и, следовательно, ВГД плохо контролируется, что приводит к прогрессирующей потере зрения у большинства пациентов. Лечение, которое обращает вспять глазную патологию, приводящую к потере зрения и значительно улучшающую контроль ВГД, было бы очень ценно. Декстрансульфат в соответствии с вариантами осуществления позволяет проводить такое лечение, приводящее к нормализованному ВГД, сохранению ГКС и СНВС, и растворению рубцовых элементов ТС.
Материалы и методы
Дизайн исследования
Глаукому вызывали у взрослых самцов крыс Sprague Dawley повторением дважды в неделю внутрикамерных (IC) инъекций трансформирующего фактора роста-β (TGF-β) для повышения внутриглазного давления (ВГД). Постоянное увеличение ВГД (через две недели) приводит к гибели ганглиозных клеток сетчатки (30-40%). Декстрансульфат (Tikomed AB, Швеция, WO 2016/076780) вводили в дозе 15 мг/кг с помощью ежедневной подкожной инъекции в начале эксперимента для оценки защиты ГКС по сравнению с контрольной группой.
Группа 1 n = 12 крыс; 24 глаза ВГД+IC TGF-β (два раза в неделю в течение 28 дней) между 0 и 28 днями + ежедневное подкожное введение декстрансульфата с 14 по 28 день.
Группа 2 n = 8 крыс; 16 глаз ВГД+IC TGF-β (два раза в неделю в течение 28 дней) между 0 и 28 днями + ежедневное подкожное введение носителя (физиологический раствор) с 14 по 28 день.
Группа 3 n = 8 крыс; 8 глаз ВГД + интактный (неповрежденный глаз) и 8 глаз ВГД + IC фосфатно-солевый буфер (PBS) ежедневно в течение 28 дней.
Измеренные конечные точки
• ВГД дважды в неделю в течение всего исследования с 0 по 28 день;
• Иммуногистохимия для подсчета ГКС, которые являются иммунореактивными для специфичного для мозга гомеобокса/ POU-домена белка 3А (Brn3a) на 28-й день (выживание ГКС);
• Иммуногистохимия ламинина и фибронектина для оценки рубцевания в трабекулярной сети на 28-й день в группах 1 и 2;
• Визуализация переднего сегмента и ОКТ на 28-й день для исследования угла и толщины слоя нервных волокон сетчатки, включающего аксоны ГКС; и
• массы тела на 28 день.
Животные и хирургические вмешательства
2
Для данных экспериментов использовали шестнадцать самцов крыс Sprague Dawley в возрасте от 8 до 10 недель весом 175-200 г (Charles River, Кент, Великобритания), которых содержали в условиях со свободным доступом к воде и питанию и 12-часовым циклом темнота/свет Операция проводилась в отделе биомедицинских услуг в Университете Бирмингема в соответствии с руководящими принципами Министерства внутренних дел, изложенными в Законе о животных 1986 года (Великобритания) и Заявлении Ассоциации по исследованиям зрения и офтальмологии по использованию животных в исследованиях. Все глазные хирургические процедуры и измерения ВГД были выполнены под ингаляционной анестезией с использованием 2-5% изофлуорана/95% O (National Vet Supplies, Сток, Великобритания) при скорости потока 1,5 л/мин. Послеоперационное состояние всех крыс тщательно контролировалось.
В день 0 был сделан один самоуплотняющийся разрез через роговицу в переднюю камеру обоих глаз с использованием одноразового лезвия 15°, позволяющего повторять два раза в неделю (раз в две недели) инъекции 3,5 мкл IC (каждый понедельник и четверг) через туннель, созданный с использованием самодельных одноразовых стерильных стеклянных микропипеток (Harvard Apparatus, Кент, Великобритания) в течение 28 дней, активного человеческого рекомбинантного TGF-β1 (5 нг/мкл; Peprotech, Лондон, Великобритания).
Измерения ВГД
С помощью рикошетного тонометра iCare Tonolab (Icare, Хельсинки, Финляндия) ВГД регистрировали раз в две недели с 9 до 11 утра в течение каждого эксперимента, чтобы избежать путаницы с циркадной изменчивостью. Сразу же после индукции анестезии 5%-ным изофлураном для каждого случая измерения было проведено шесть измерений отскока с помощью тонометра из центральной роговицы, чтобы предоставить общее среднее измерение ВГД (мм рт.ст.), и все графические точки данных представляют среднее значение ± СОС из 3 показаний ( из 6 подборов каждый), взятые последовательно для обеспечения точных измерений.
ОКТ и визуализация переднего сегмента
Оптическая когерентная томография позволяет измерять толщину сетчатки in vivo, и СНВС является суррогатной мерой плотности ГКС. ОКТ анализ слоя нервных волокон сетчатки проводили на 28-й день для всех крыс во время ингаляционной анестезии с использованием конфокального сканирующего лазерного офтальмоскопа Spectralis HRA3 (Heidelberg Engineering). Изображения переднего сегмента под углом были взяты вместе с ОКТ изображениями сетчатки вокруг головки зрительного нерва. Встроенное программное обеспечение использовалось для сегментирования изображений и количественного определения толщины СНВС.
Подготовка тканей для иммуногистохимии (ИГХ)
2
Крыс умерщвляли, подвергая воздействию повышенных концентраций СО, и транскардиально перфузировали 100 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) для вымывания крови перед дальнейшей перфузией 100 мл 4% параформальдегида (PFA) в PBS при pH 7,4. Рассеченные глаза для ИГХ после фиксации погружали в 4% PFA в PBS на 2 часа при 4°C до криозащиты путем погружения в увеличивающиеся концентрации растворов сахарозы (PBS с 10%, 20% и 30% сахарозой; все от Sigma, Пул, Великобритания) в течение 24 ч каждый при температуре 4°C, затем помещали в среду для заливки с оптимальной температурой резания (Thermo Shandon, Ранкорн, Великобритания) в разрывные контейнеры для форм (Agar Scientific, Эссекс, Великобритания). Глаза, погруженные в среду для погружения с оптимальной температурой резания, быстро замораживали в измельченном сухом льде перед хранением при -80°C, и затем разрезали в парасагиттальной плоскости через головку зрительного нерва при -22°C с использованием микротома Bright cryostat (Bright, Хантингдон, Великобритания) при толщине 15 мкм. Срезы устанавливали на положительно заряженные предметные стекла (Superfrost plus; Fisher Scientific, Питсбург, США), оставляли на 2 ч для сушки при 37°C и хранили при -20°C.
Иммуногистохимия
Замороженные срезы оставляли оттаивать в течение 30 мин, затем промывали 3 × 5 мин в PBS с последующей пермеабилизацией в течение 20 мин 0,1% Triton X-100 (Sigma). Срезы блокировали в течение 30 мин в 0,5% бычьем сывороточном альбумине (BSA) и 0,3% Tween-20 (все получены от Sigma) в PBS и инкубировали в течение ночи в растворе первичного антитела (таблица 1), затем промывали 3 × 5 мин в PBS и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре (к.т.; 20-25°C) с раствором вторичного антитела (таблица 1). Затем срезы промывали 3 × 5 мин в PBS и помещали в монтажную среду Vectorshield, содержащую 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (Vector Laboratories). Контрольные срезы тканей, инкубированные только с раствором вторичного антитела, окрашивали отрицательно (не показано).
Таблица 1. Антитела, используемые в иммуногистохимии
Антиген
Разведение
Источник (поставщик)
№ по каталогу
Для определения
Ламинин
1:200
Sigma
L9393
ТС фиброз
Фибронектин
1:200
Sigma
F3648
ТС фиброз
RPBMS<sup>*</sup>
1:200
Millipore
ABN1362
RGC
Alexa Fluor 594 меченный конъюгат антитела козы к IgG мыши
1:400
Molecular Probes
A-11032
Вторичный IgG для первичного антитела ED1
Alexa Fluor 488 меченный конъюгат антитела козы к IgG кролика
1:400
Molecular Probes
A-21206
Вторичный IgG для первичных антител кролика
* РНК-связывающий белок с множественным сплайсингом
Количественная оценка иммуногистохимии
После иммунофлуоресцентного окрашивания срезы просматривали на эпифлуоресцентном микроскопе Zeiss Axioplan 2 (Carl Zeiss Ltd) и снимки получали с использованием одинаковых времен экспозиции для каждого антитела с использованием Zeiss AxioCam HRc. ИГХ (иммуногистохимию, IHC) количественно оценивали согласно ранее описанным методам [1]. Вкратце, интересующая область, используемая для количественного определения ТС фиброза, была определена квадрантом одного и того же предписанного размера для всех глаз/обработок в пределах ТС, и отложение ВКМ было количественно определено в пределах этого определенного квадранта ТС и % иммунофлуоресцентных пикселей выше стандартизированного фонового порога, рассчитывали с использованием программного обеспечения ImageJ (Национальный институт здоровья, США). Для каждого антитела был установлен пороговый уровень яркости в области ТС с использованием неповрежденных необработанных участков глаза для определения контрольного уровня для анализа интенсивности пикселей в тестовой группе. Изображениям были назначены рандомизированные числа для обеспечения «слепоты» групп лечения во время количественной оценки оценщиком.
+
+
Для количественного определения ГКС в срезах сетчатки подсчитывали RPBMS/DAPI ГКС в парасагиттальных срезах сетчатки толщиной 15 мкм из линейного участка 250 мкм от слоя ганглиозных клеток по обе стороны от зрительного нерва. Четыре среза сетчатки каждого глаза в контрольной и лечебной группах были оценены количественно. Изображениям были назначены рандомизированные числа для обеспечения «слепоты» групп лечения во время количественной оценки оценщиком.
Статистические данные
Все статистические анализы были выполнены с использованием SPSS 20 (IBM, США). Были проведены тесты нормального распределения для определения наиболее подходящего статистического анализа для сравнения способов лечения. Статистическая значимость определялась при р <0,05. Данные ВГД, ТС фиброза и выживаемость ГКС были оценены на существенные различия с использованием t-критерия Стьюдента или одностороннего теста ANOVA для > 2 групповых сравнений ± СОС (SEM, стандартная ошибка среднего значения) и приведены в тексте или отображены графически как среднее значение ± СОС.
ПРИМЕР 2 - Исследование эффектов декстрансульфата на сосуды в мышиной модели неоваскулярной возрастной макулярной дегенерации (nAMD)
Патологический ангиогенез в глазу может привести к серьезным нарушениям зрения. Соответственно, лекарственные средства, которые вызывают неоваскуляризацию или усиливают неоваскулярные патологии, строго противопоказаны.
Мышиная модель лазерно-индуцированной хориоидальной неоваскуляризации (CNV) была ключевой моделью для исследований неоваскулярной возрастной макулярной дегенерации (AMD). При нанесении целевого лазерного повреждения пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) и мембраны Бруха процедура индуцирует ангиогенез, моделируя патологический признак, наблюдаемый при неоваскулярной AMD. Впервые разработанная для приматов, не являющихся людьми, лазерно-индуцированная модель CNV, стала применяться во многих других видах, самым последним из которых была мышь. Модель может быть применена для изучения многих аспектов глазной неоваскулярной биологии, таких как молекулярные механизмы, эффект генетических манипуляций и эффекты медикаментозного лечения.
Результаты
Визуализация хориоидальной неоваскуляризационной мембраны при флуоресцеиновой ангиографии глазного дна
Кровеносные сосуды сетчатки были четко визуализированы при флуоресцеиновой ангиографии глазного дна. Хориоидальные неоваскуляризации были показаны как участки с гиперфлуоресценцией. На Фиг. 8 представлены репрезентативные изображения флуоресцеиновой ангиографии от каждой мыши. Были найдены различия в размере CNV в разных глазах. Иногда два CNV объединялись вместе с интенсивной утечкой флуоресцеина, такие CNV были исключены из количественного анализа. Визуальный анализ изображений флуоресцеиновой ангиографии глазного дна не выявил существенных различий в размерах CNV между двумя группами.
Анализ CNV
2
В каждой группе было проведено семьдесят два точечных лазерных ожога. CNV, которые были объединены из двух лазерных точек или более (более 100000 мкм) из-за субретинального кровоизлияния или сильного воспаления, были исключены из окончательного анализа данных. Таблица 2 суммирует количество CNV, включенных в окончательный анализ данных.
Таблица 2. CNV в каждой экспериментальной группе
Группа
Лечение
№ лазерной точки
№ CNV для анализа данных
Группа 1
Декстран сульфат
72
58
Группа 2
Солевой раствор
72
56
Количественная оценка неоваскуляризации с использованием изолектина B4
2
2
+
Изолектин B4 (Griffonia simplicifolia лектин I-изолектин B4) использовался в качестве маркеров для кровеносных сосудов сетчатки, так как он экспрессируется в эндотелиальных клетках. Он также экспрессируется в активированной микроглии и инфильтрирующих макрофагах в сетчатке. Средняя положительная площадь по изолектину В4 составила 43972 ± 2302 мкм в группе, получавшей тестируемое соединение, и 42432 ± 2015 мкм в контрольной группе с физиологическим раствором (Фиг. 9). Не было статистической разницы в уровне лектина В4 между двумя группами при поражениях.
Количественная оценка площади новых кровеносных сосудов с использованием коллагена IV
2
2
Коллаген IV образует ламинарный слой матрикса кровеносных сосудов. Поэтому он был использован для демонстрации появления новых кровеносных сосудов. В группе лечения декстрансульфатом средняя площадь новых появившихся кровеносных сосудов составляла 54681 ± 2378 мкм по сравнению с 58215 ± 2293 мкм в контрольной группе, получавшей носитель (физиологический раствор) (Фиг. 10). Не было статистической разницы между двумя группами.
Выводы
Результаты показывают, что декстрансульфат не оказывает ни антиангиогенного, ни проангиогенного воздействия на индуцированную лазером CNV в дозе 0,6 мг/мл в день. Что указывает на применимость декстрансульфата в глазных показаниях.
Материалы и методы
Мыши
Двадцать четыре мыши C57BL/6J в возрасте от 10 до 12 недель были приобретены в отделе биологической службы Королевского университета в Белфасте. Всех мышей содержали в условиях со свободным доступом к воде и диетическому питанию и 12-часовым циклом темнота/свет. Все процедуры, касающиеся использования животных в данном исследовании, выполнялись в соответствии с Заявлением Ассоциации по исследованиям в области зрения и офтальмологии (ARVO) об использовании животных в исследованиях офтальмологии и зрения и в соответствии с положениями Закона о животных (научных процедурах) 1986 года (Соединенное Королевство). Протокол был одобрен Советом по защите животных и этике Королевского университета в Белфасте.
Тестовое соединение
Испытуемое соединение декстрансульфат (Tikomed AB, Sweden, WO 2016/076780) вводили в концентрации 6 мг/мл. Стерильный физиологический раствор (приобретенный у Aqupharm) использовали для разбавления соединения до рабочей концентрации (0,6 мг/мл).
Индукция CNV
Мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией 75 мг/кг кетамина и 7,5 мг/кг ксилазина. Зрачки были расширены 1% атропина и 2,5% фенилэфрина (Bausch & Lomb). Чтобы индуцировать CNV, разрыв мембраны сосудистой оболочки Бруха был достигнут лазерной фотокоагуляцией с использованием HGM Elite 532 Green Laser (Litechnica Ltd, Мидэсекс, Великобритания) с размером пятна 100 мкм, мощностью 250 мВт и длительностью 100 мс. Лазерные пятна были расположены между сосудами сетчатки и на расстоянии от 2 до 3 дисков зрительного нерва от диска зрительного нерва. Образование пузыря в месте обработки лазером свидетельствует об успешном разрыве мембраны Бруха. В исследование были включены только лазерные ожоги, при которых образовался пузырь. Кроме того, лазерные ожоги, которые показали сильное субретинальное кровоизлияние во время индукции CNV, были исключены из исследования. Три лазерных ожога были нанесены на каждую сетчатку.
Введение лекарственного средства
Сразу после индукции CNV всем мышам подкожно вводили 500 мкл декстрансульфата или физиологического раствора. Инъекцию повторяли один раз в день в течение 9 дней после индукции лазером CNV. Подробное лечение представлено в таблице 3.
Таблица 3. Экспериментальные группы
Группа
Лечение
Способ
Концентрация, объем
Группа 1 (G1)
Декстрансульфат
Подкожно, один раз в день
0,6 мг/мл, 500 мкл
Группа 2 (G2)
Физиологический раствор
Подкожно, один раз в день
500 мкл
Флуоресцентная ангиография
На 10 день после индукции CNV 3 мыши из каждой группы были случайным образом отобраны флуоресцеиновой ангиографии глазного дна. Мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией 75 мг/кг кетамина и 7,5 мг/кг ксилазина. Зрачки были расширены 1% атропина и 2,5% фенилэфрина. 100 мкл 1% соли флуоресцеина и натрия вводили внутрибрюшинно. Изображения глазного дна были получены с помощью микроскопа для ретинальной визуализации Micron IV (Phoenix Research Labs). Мышей умерщвляли после флуоресцеиновой ангиографии и собирали глаза.
Сбор образцов
На 10-й день после индукции CNV всех мышей умерщвляли и глаза осторожно удаляли. Все глаза фиксировали в 2% параформальдегиде/PBS (Sigma-Aldrich, Дорсет, Великобритания) в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем промывали и хранили в PBS при 4°С. Полные крепления РПЭ-сосудистой оболочки-склеры готовили по протоколу, описанному в [2, 3]. Вкратце, передний сегмент глаза, включая роговицу, ресничное тело, радужную оболочку и хрусталик, был удален. Было сделано пять вертикальных надрезов на глазной чаше, и ткань сетчатки была аккуратно удалена. Лишние ткани глаза, включая конъюнктиву и мышцы глаза, осторожно удаляли из глазной чаши (содержащей РПЭ/сосудистую оболочку/склеру). Полные крепления РПЭ/сосудистой оболочки/склеры были дополнительно обработаны для иммуноокрашивания Griffonia simplicifolia лектином I-изолектином B4 и коллаген IV.
Иммуноокрашивание крепления РПЭ/сосудистой оболочки/склеры
CNV был обнаружен с использованием хорошо зарекомендовавшей себя методики мечения изолектином B4 и коллагеном IV. Изолектин В4 метит как инфильтрирующие макрофаги, так и эндотелиальные клетки сосудов. Коллаген IV метит базальную пластинку кровеносных сосудов. Оба маркера широко использовались для обнаружения CNV.
Полные крепления РПЭ/сосудистой оболочки/склеры были пермеабилизированы 0,5% Triton X-100/PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем образцы блокировали 10% BSA в 0,5% Triton X-100/PBS в течение 1 ч и инкубировали с биотинилированным лектином I Griffonia simplicifolia I-изолектином B4 (GSL Isolectin B4, 1:50, Vector Laboratories Ltd, Великобритания) и коллагеном IV (1:50, BIO-RAD, Великобритания) в течение ночи при 4°С. После тщательной промывки в PBS (10 минут x 3) образцы инкубировали с изотиоцианатом стрептавидина-флуоресцеина (FITC) (1: 100, Vector laboratories, Великобритания) и антителом козы меченым AF594 кролика (1: 100, Invitrogen, Великобритания) в течение двух часов при комнатной температуре. Образцы монтировали на предметных стеклах с помощью Vectashield Mounting Medium (Vector Laboratories Ltd, Великобритания) и исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии.
Получение и анализ изображений
Для получения изображений с предварительно приготовленных образцов полных креплений РПЭ/сосудистой оболочки/склеры использовали флуоресцентный микроскоп Lecia. Для захвата всей области CNV использовали 10-кратный объектив. Для анализа изображений использовали программное обеспечение ImageJ. Чтобы измерить размер CNV, граница CNV была очерчена вручную, и размер был автоматически рассчитан с использованием программного обеспечения Image J.
Статистический анализ
Все данные (размер CNV в каждой группе) были выражены как среднее ± СОС. T-критерий Стьюдента использовали для сравнения разницы между группой декстрансульфата и контрольной группой с физиологическим раствором.
Дизайн исследования
В этом исследовании использовали 24 мыши C57BL/6J (10 ~ 12 недель). Мыши были рандомизированы на две группы (12 мышей на группу)
• Группа 1: введение декстрансульфата (500 мкл 0,6 мг/мл декстрансульфата в физиологическом растворе), подкожная инъекция, один раз в день после индукции CNV в течение 9 дней.
• Группа 2: введение носителя (500 мкл физиологического раствора), подкожная инъекция, один раз в день после индукции CNV в течение 9 дней.
На 10-й день после индукции CNV 3 мыши из каждой группы были случайным образом отобраны флуоресцеиновой ангиографии глазного дна. Всех мышей умерщвляли на 10-й день после индукции CNV. Глаза собирали и обрабатывали для иммуногистохимических исследований.
ПРИМЕР 3 - Анализ изменений в экспрессии генов, индуцированной декстрансульфатом в клетках Шванна
Результаты
Анализ экспрессии генов в клетках Шванна
Гены, не экспрессированные в клетках Шванна, были удалены до анализа данных. Уровень «ниже экспресии» был установлен на 5 для преобразованных log2 значений выражения. Это оставило 15 842 уникальных зонда для анализа в клеточных культурах Шванна. На следующем этапе анализа были проанализированы три набора данных (сравнение контроля D0 с контрольными образцами D2; сравнение контроля D0 с образцами, обработанными декстрансульфатом D2; сравнение контроля D2 с образцами, обработанными декстрансульфатом D2), чтобы установить эффект CM на клетки и относительные изменения, вызванные декстрансульфатом.
585 генов были дифференциально экспрессированы в клеточных культурах Шванна при сравнении контроля D0 с контрольными образцами D2. Молекулярные функции, на которые влияют эти гены, связаны с клеточным движением (1.14E-07-2.49E-03); морфологией клеток (5.56E-07-2.36E-03); развитием клеток (7.3E-06-2.48E-03); клеточным ростом и пролифераций (7.3E-06-2.48E-03); сборкой и организацией клеток (1.23E-05-2.36E-03); функционированием и поддержанием клеток (1.23E-05-2.47E-03); гибелью и выживанием клеток (1.53E-05-2.51E-03); метаболизмом липидов (8.14E-05-1.6E-03); биохимией малых молекул (8.14E-05-1.6E-03); молекулярным транспортом (1.18E-04-2.29E-03); транспортировкой белка (1.62E-04-1.6E-03); метаболизмом углеводов (3.22E-04-1.78E-03); экспрессией генов (3.98E-04-2.2E-03); передачей сигналов (4.39E-04-2.25E-03); межклеточной передачей сигналов и взаимодействием (5.05E-04-2.48E-03); клеточным компромисом (7.69E-04-1.58E-03); клеточным циклом (1.12E-03-1.8E-03); метаболизмом аминокислот (1.6E-03-1.6E-03); и метаболизмом нуклеиновых кислот (1.6E-03-1.6E-03).
Значения, представленные выше, представляют собой p-значения, представляющие статистическую значимость ассоциации этих генов с различными путями. Два значения р представляют нижний и верхний пределы наблюдаемой статистической значимости (р <0,05 является значимым).
Декстрансульфат индуцировал дифференциальную экспрессию в клеточной культуре Шванна 1244 генов, что оценивалось при сравнении контроля D0 с образцами, обработанными декстрансульфатом D2. Молекулярные функции, на которые влияют эти гены, связаны с морфологией клеток (1.43E-08-8.39E-04); клеточным движение (1.4E-07-9.6E-04); посттрансляционной модификацией (3.93E-07-6.71E-05); синтезом белка (3.93E-07-1.08E-04); транспортировкой белка (3.93E-07-1.26E-06); гибелью и выживанием клеток (2.13E-06-8.65E-04); сборкой и организацией клеток (7.46E-06-8.24E-04); репликацией, рекомбинация и восстановлением ДНК (7.46E-06-7.46E-06); функционированием и поддержанием клеток (9.53E-06-6.46E-04); экспрессией генов (1.27E-05-4.92E-04); развитием клеток (1.29E-05-9.06E-04); клеточным ростом и пролиферацией (1.29E-05-9.06E-04); межклеточной передачей сигналов и взаимодействием (1.97E-05-8.81E-04); метаболизмом аминокислот (4.22E-05-8.24E-04); биохимией малых молекул (4.22E-05-8.24E-04); метаболизмом липидов (4.81E-05-3.64E-04); молекулярным транспортом (3.64E-04-3.64E-04); и клеточным циклом (4.53E-04-4.86E-04).
Декстрансульфат индуцировал дифференциальную экспрессию в клеточной культуре Шванна 700 генов, что оценивалось при сравнении контроля D2 с образцами, обработанными декстрансульфатом D2. Молекулярные функции, на которые влияют эти гены, связаны с морфологией клеток (1.49E-07-5.62E-03); сборкой и организацией клеток (1.49E-07-5.95E-03); клеточным движением (7.24E-07-6.06E-03); гибелью и выживанием клеток (9.41E-06-5.95E-03); метаболизмом аминокислот (2.56E-05-3.7E-03); посттрансляционной модификацией (2.56E-05-1.05E-03); биохимией малых молекул (2.56E-05-3.7E-03); межклеточной передачей сигналов и взаимодействием (5.05E-05-5.76E-03); экспрессией генов (7.18E-05-4.94E-03); клеточным циклом (1.06E-04-5.95E-03); развитием клеток (1.06E-04-5.95E-03); функционированием и поддержанием клеток (1.96E-04-5.95E-03); клеточным ростом и пролиферацией (2.35E-04-5.95E-03); репликацией, рекомбинация и восстановлением ДНК (2.75E-04-5.95E-03); передачей сигналов (5.92E-04-2.54E-03); клеточным компромисом (6.26E-04-6.26E-04); метаболизмом липидов (6.26E-04-1.85E-03); молекулярным транспортом (6.26E-04-5.95E-03); синтезом белка (1.05E-03-1.93E-03); клеточным ответом на терапию (1.85E-03-1.85E-03); транспортировкой белка (2.66E-03-5.95E-03); и посттранскрипционной модификации РНК (4.32E-03-4.32E-03).
Модель механистической молекулярной сети имитирует влияние дифференциально регулируемых молекул декстрансульфатом, позволяя оценить функциональные последствия этих изменений. Модель in silico показала, что декстрансульфат ингибирует гибель нейрональных клеток; апоптоз; и синтез белка и активирует ангиогенез; миграцию клеток; жизнеспособность клеток; выживание клеток; движение клеток; пролиферацию клеток; дифференциирование клеток; клеточный гомеостаз; прогрессирование клеточного цикла; трансформацию клеток; и экспрессию РНК.
В таблице 4 приведены результаты изменений экспрессии генов в культивируемых клетках Шванна.
Таблица 4 - Общая картина изменений экспрессии генов в клетках Шванна
Отмененный эффект питательного вещества
Усиленный эффект на питательные вещества
Новый эффект, вызванный декстрансульфатом
Не отличается от контроля
Всего
нет эффекта
21
21
значительное подавление
1
122
352
42
517
значительное активирование
13
441
74
373
901
Всего
35
563
426
415
1439
21 ген, который имел измененную экспрессию в контрольных культурах в течение двух дней, не показал каких-либо изменений вообще в культурах, обработанных декстрансульфатом, в течение тех же двух дней. 1 ген, который имел повышенную экспрессию в контрольных культурах, подавлялся в культурах, обработанных декстрансульфатом, в течение тех же двух дней. 13 генов, которые подавлялись в контрольных культурах, были активированы в культурах, обработанных декстрансульфатом, в течение двух дней. 122 гена были значительно подавлены факторами роста в культуральной среде, и это подавление было еще сильнее в культурах, обработанных декстрансульфатом. 441 ген был активирован в контрольных культурах, и добавление декстрансульфата сделало эту активацию значительно сильнее.
Влияние декстрансульфата на клеточную адгезию
Одним из сильных заметных фенотипических эффектов декстрансульфата было влияние на клеточную адгезию.
Анализ экспрессии генов показал, что это связано с влиянием декстрансульфата на экспрессию ферментов, которые регулируют прикрепление клеток, включая металлопептидазы, также называемые матриксными металлопротеиназами (ММП), см. Таблицу 5.
Совокупное влияние этих молекул на пути, регулирующие движение и прикрепление клеток в клетках Шванна (17 молекул, см. Таблицу 5), было таким, что адгезия клеток будет ингибироваться, в то время как движение клеток будет активировано.
Таблица 5 - Молекулы пути, регулирующего движение и адгезию клеток в клетках Шванна
Условное обозначение
Название гена в базе данных Entrez
Место нахождения
Тип(ы)
A2M
альфа-2-макроглобулин
Внеклеточное пространство
Транспортер
ADAM10
ADAM металлопептидазный домен 10
Плазматическая мембрана
Пептидаза
ADAM23
ADAM металлопептидазный домен 23
Плазматическая мембрана
Пептидазы
ADAMTS9
АДАМ металлопептидаза с мотивом 9 тромбоспондина типа 1
Внеклеточное пространство
Пептидаза
CDH11
Кадгерин 11
Плазматическая мембрана
Другие
CSF3
Колониестимулирующий фактор 3
Внеклеточное пространство
Цитокин
FAS
Рецептор смерти на поверхности клетки Fas
Плазматическая мембрана
Трансмембранный рецептор
HIF1A
Альфа-субъединица индуцируемого гипоксией фактора 1
Ядро
регулятор транскрипции
IL6
Интерлейкин 6
Внеклеточное пространство
Цитокин
IL15
Интерлейкин 15
Внеклеточное пространство
Цитокин
LUM
Люмикан
Внеклеточное пространство
Другие
MMP3
Матричная металлопептидаза 3
Внеклеточное пространство
Пептидаза
POSTN
Периостин
Внеклеточное пространство
Другие
RECK
индуцирующий реверсию богатый цистеином белок с казальными мотивами
Плазматическая мембрана
Другие
SERPINA3
Член 3 семейства серпинов А
Внеклеточное пространство
Другие
TNC
Тенасцин С
Внеклеточное пространство
Другие
VCAM1
Молекула адгезии сосудистых клеток 1
Плазматическая мембрана
Трансмембранный рецептор
Это открытие привело к переоценке всех молекулярных взаимодействий, которые влияют на адгезию клеток и связанных с адгезией молекул и их влияние на адгезию клеток в клетках Шванна. Полный список из 217 связанных с адгезией молекул (197 генов и 20 лекарственных средств) представлен ниже:
2+
2+
ACE2, ACP1, ADAM15, ADGRB1, ADGRE2, ADIPOQ, AG490, AMBN, ANGPT1, ANTXR1, ARAP3, ARMS2, батимастат, BCAM, BCAP31, BCAR1, бензилоксикарбонил-Leu-Leu-Leu-альдегид, BMP2, BMP4, BTC, C1QBP, Ca, CA9, CADM1, CALR, каликулин A, каспаза, CBL, CD209, CD36, CD44, CD46, CDH13, церивастатин, хлорамфеникол, хондроитинсульфат, CLEC4M, колхицин, коллаген типа I, коллаген(ы), COMP, CRK, CRP, CSF1, CSF2RB, CTGF, куркумин, CXCL12, циклический АМФ, DAB2, DAG1, DCN, DDR1, десферриксохелин 772SM, DOCK2, DSG2, DSG4, дурапатит, Efna, EFNA1, EFNB, EFNB1, EGF, EGFR, EGR1, ELN, ENG, EP300, Eph рецептор, EPHA8, EPHB1, эптифибатид, этилендиаминтетрауксусная кислота, ETS1, F11R, F3, FBLN5, FBN1, Fc-рецептор, FCN2, FERMT2, FES, FGF2, FGFR1, фибрин, FN1, киназа фокальной адгезии, FSH, FUT3, FUT6, FUT7, FYN, HACD1, гепарин, гистон h3, гистон h4, HRAS, HSPG2, HTN1, гиалуроновая кислота, гидрокортизон, пероксид водорода, ICAM1, ICAM2, IGF1R, IgG, Igg3, IL1, IL1B, IL6, ILK, интегрин альфа 4 бета 1, интегрин α, IPO9, ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA5, ITGA6, ITGB1, ITGB2, ITGB3, ITGB5, JAK2, Jnk, KP-SD-1, LAMC1, ламинин, ламинин1, левотироксин, LGALS3, LIF, липополисахарид, LOX, LRP1, LRPAP1, MAD1L1, манноза, MAPK7, MBL2, MERTK, метронидазол, MGAT5, MMP2, Mn, NCK, NEDD9, NRG1, окадиевая кислота, OLR1, P38 MAPK, PDGF BB, фосфатидилинозитол, PKM, фактор активации тромбоцитов, PLD1, PLG, PMP22, PODXL, POSTN, PRKCD, PTAFR, PTEN, PTGER2, PTK2, PTK2B, PTN, PTPN11, PTPRZ1, пирролидин дитиокарбамат, Rac, RALB, RANBP9, RHOA, RHOB, RPSA, SDC3, SELE, селектин, SELL, SEMA3A, симвастатин, SIRPA, SPARC, сфингозин-1-фосфат, SPI1, SPP1, SPRY2, SRC, STARD13, SWAP70, TEK, TFPI, TFPI2, TGFA, TGFB1, TGFBI, TGM2, THBS2, THY1, гормон щитовидной железы, TIMP2, тирофибан, TLN1, TLN2, TNF, TP63, третиноин, VAV1, VCAM1, VCAN, Vegf, VHL, VTN, VWF и WRR-086.
Из 197 генов, регулирующих адгезию клеток, 17 молекул были дифференциально экспрессированы в клеточных культурах Шванна, что привело к общему слегка повышенному уровню адгезии.
Результаты имеют отношение к противо-рубцовому действию декстрансульфата (см. ПРИМЕР 1) за счет снижения сигналов фиброза ткани и адгезии иммунных клеток.
Регулирующие пути выше по сигнальным путям затронутые декстрансульфатом
В клетках Шванна анализ регулирующих путей выше по сигнальным путям показал, что декстрансульфат модулировал действие нескольких факторов роста, либо увеличивая их активацию, либо уменьшая их ингибирование в системе, как представлено в таблице 6.
Таблица 6 - Сравнение регулирующих путей выше по сигнальным путям в клетках Шванна
Анализ
Регулирующий путь выше по сигнальному пути
Прогнозируемое состояние активации относительно контроля D2
Активация Z-показателя
р-значение перекрытия
D2 контроль
ANGPT2
1,062
0,003
D2 обработка декстрансульфатом
Активирован
1,283
0,00373
D2 контроль
BMP2
0,674
0,0126
D2 обработка декстрансульфатом
Активирован
1,395
0,00326
D2 контроль
BMP4
-0,272
0,00253
D2 обработка декстрансульфатом
Активирован
0,927
0,000663
D2 контроль
BMP7
1,45
0,0346
D2 обработка декстрансульфатом
Активирован
1,86
0,0225
D2 контроль
EGF
-0,015
0,0000927
D2 обработка декстрансульфатом
Активирован
2,059
0,00735
D2 контроль
FGF2
1,366
0,0000142
D2 обработка декстрансульфатом
Активирован
2,37
0,000395
D2 контроль
GDF2
1,556
0,000299
D2 обработка декстрансульфатом
Активирован
2,561
0,000106
D2 контроль
HGF
-0,823
0,0114
D2 обработка декстрансульфатом
Активирован
1,432
0,0161
D2 контроль
IGF1
0,365
0,00883
D2 обработка декстрансульфатом
Активирован
1,332
0,0132
D2 контроль
NRG1
1,073
0,0473
D2 обработка декстрансульфатом
Активирован
1,768
0,143
D2 контроль
NRTN
0,0118
D2 обработка декстрансульфатом
Активирован
0,958
0,0149
D2 контроль
PGF
0
0,00185
D2 обработка декстрансульфатом
Активирован
0,254
0,00871
D2 контроль
TGFβ1
-1,239
0,0000354
D2 обработка декстрансульфатом
Менее подавлено
1,05
0,0000691
D2 контроль
VEGFA
1,909
0,00981
D2 обработка декстрансульфатом
Активирован
3,4
0,00186
D2 контроль
WISP2
-1,067
0,0323
D2 обработка декстрансульфатом
Менее подавлено
-0,896
0,0349
Декстрансульфат активирует ген декорина
Интересно, что данные по экспрессии генов показали, что декстрансульфат активировал выработку природной молекулы, снижающей уровень рубцевания, называемой декорином, которая еще больше блокирует образование рубцов путем «зачистки» факторов роста, которые стимулируют образование рубцов фибробластами.
Декорин представляет собой гликопротеин с молекулярной массой в среднем 90-140 кДа. Он относится к семейству протеингликанов с низким содержанием лейцина (SLRP) и состоит из белкового ядра, содержащего лейциновые повторы, с цепью глюкозаминогликана (GAG), состоящей из сульфата хондроитина или сульфата дерматана. Он связывается с коллагеновыми фибриллами I типа через область связывания коллагена декоринового I типа.
Декорин действует как антагонист трансформирующего фактора роста бета 1/2 (TGF-β1/2) и уменьшает образование рубцов. Отчеты показывают, что при острых рубцах доминирующее действие декорина является антифиброгенным за счет подавления воспалительного фиброза путем нейтрализации TGF-β1/2. Декорин также связывается непосредственно с коллагеном, и одной из его функций является влияние на организацию коллагена во время заживления ран.
Декорин ранее был описан при ингибировании рубцевания на модели поражения головного мозга, гидроцефалии и хронических ран спинного мозга. Декорин также вызывает фибролиз существующих трабекулярных сетчатых рубцов в модели глаукомы.
Декстрансульфат индуцировал увеличение экспрессии декорина с кратным изменением 1,242.
Выводы
В клетках Шванна, контрольных культурах, с высоким содержанием питательных веществ и глюкозы повторяют активацию клеток Шванна. Культуры, обработанные декстрансульфатом, имитировали действие декстрансульфата, добавленного после 24-часовой глиальной активации.
Из результатов ясно, что молекулярные эффекты, наблюдаемые в клетках Шванна, подтверждают роль декстрансульфата в защите от апоптоза; индукции ангиогенеза; усилении миграции и движения клеток; повышении жизнеспособности и выживаемости клеток; и индукции клеточного дифференциирования.
Декстрансульфат способствует клеточному откреплению и движению в клетках Шванна. Эффект на клеточную адгезию был обусловлен главным образом экспрессией ферментов типа металлопротеиназы, но модуляция других молекул адгезии также способствовала этому эффекту.
Это открытие также объясняет противорубцовый эффект декстрансульфата, как видно из ПРИМЕРА 1. Полученный результат свидетельствует о том, что противорубцовый эффект, наблюдаемый в ПРИМЕРЕ 1, опосредуется деградирующими ферментами активированными декстрансульфатом, которые помогают в ремоделировании тканей и блокируют фиброгенные (сигналы рубцевания) сигналы в поврежденных тканях.
Рубцевание как патологическая реакция вызвано TGF-β. TGF-β индуцирует большую взаимосвязанную сеть из 171 молекулы, вызывающую адгезию иммунных клеток, активацию клеток, движение клеток, агрегацию клеток, фиброз и индукцию TGF-β. Введение декстрансульфата полностью устраняло TGF-β-индуцированный эффект в адгезии иммунных клеток, активации клеток, агрегации клеток, фиброзе и самоактивации TGF-β. Данные инактивирующие эффекты декстрансульфата на молекулярные сети, управляемые TGF-β в клетках Шванна, также видны даже при активации TGF-β, то есть даже в присутствии избыточного TGF-β.
Анализ регулирующих путей выше по сигнальным путям генов, регулируемых декстрансульфатом, показал, что декстрансульфат усиливает действие существующих факторов роста на клетки, подобно действию гепарина. Гипотеза заключается в том, что декстрансульфат связывается с молекулами фактора роста и способствует связыванию с их рецепторами.
Противорубцовые действия декстрансульфата указывают на потенциальное применение для лечения фибропролиферативных (рубцовых) состояний, включая глаукому. Результаты экспериментов подтверждают роль декстрансульфата как в предотвращении развития фибропролиферативных (состояний с рубцеванием) состояний, так и в устранении уже установленных фиброзных рубцов в таких фибропролиферативных (условиях рубцевания) условиях.
Таким образом, декстрансульфат, обладающий противорубцовым эффектом, будет эффективен при ремоделировании тканей, при котором существует необходимость в растворении уже установленных рубцов. Предполагается, что этот противорубцовый эффект декстрансульфата является следствием ранее описанных механизмов действия декстрансульфата, включая, например, ингибирование клеточной адгезии, индукцию клеточной мобилизации, индукцию металлопротеаз и ферментов, растворяющих рубцы, и ингибирование TGF-β, в частности TGF-β1, посредством индукции декорина. Этот последний эффект, полученный с помощью декстрансульфата, также важен для предотвращения или, по меньшей мере, ингибирования фиброза и образования рубцов посредством индукции декорина.
Материалы и методы
Дизайн эксперимента
2
Были установлены колбы для культивирования n = 8 × 25 см. Клетки с двух колб собирали в день обработки (через 24 часа после посева). Это представляет момент времени День 0. Из оставшихся колб три колбы обрабатывали контрольной средой, а три колбы обрабатывали культуральной средой (КС), содержащей декстрансульфат, с получением его конечной концентрации 0,01 мг/мл. Клетки из обработанных колб собирали через 48 часов. Следовательно, собранные данные представляют собой (а) необработанные клетки (контроли День 0 и контроли День 2) и (b) клетки, обработанные декстрансульфатом в течение 48 часов (обработанные декстрансульфатом День 2).
Покрытие планшетов для тканевых культур для всех клеток
2
Колбы объемом 25 см покрывали добавлением 2 мл на колбу раствора 50 мкг/мл поли-d-лизина в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS) и инкубированием в течение ночи при 37°С в темноте. Колбы промывали водой для культивирования клеток и сушили на воздухе в течение 30 мин в темноте. Колбы покрывали путем добавления 1 мл на колбу раствора 25 мкг/мл ламинина в фосфатно-солевом буфере (PBS) и выдерживания в течение 2 часов при 37°C в темноте. Колбы с ламинином промывали PBS три раза перед тем, как добавить клетки.
Клетки Шванна человека
Среду для выращивания клеток Шванна готовили путем добавления 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) к DMEM с высоким содержанием глюкозы и предварительно нагревали до 37°C. Клетки оттаивали на водяной бане при 37°С в течение не более 2 мин.
2
2
Клетки из 12 флаконов осторожно переносили в пробирку, содержащую 10 мл среды DMEM с высоким содержанием глюкозы, и центрифугировали при 400 RCF в течение 10 минут. Гранулы ресуспендировали в культуральной среде. Клетки из 12 флаконов смешивали и равномерно распределяли в предварительно покрытые колбы объемом 25 см (n = 8). Клетки инкубировали при 37°C с 5% СО. Клеткам давали осесть в течение 24 часов до обработки декстрансульфатом.
Обработка лекарственным средством
Декстрансульфат (Tikomed AB, Швеция, WO 2016/076780) получали в исходной концентрации 20 мг/мл и хранили в холодильнике с контролируемой температурой при 4°С. Свежий 100X исходный раствор декстрансульфата (1,0 мг/мл) готовили в стерильной среде DMEM-F12. Концентрированный исходный раствор лекарственного средства стерильно фильтровали и добавляли в соответствующие питательные среды (19,6 мл КС и 0,4 мл исходного раствора декстрансульфата). Контроль получали с использованием 19,6 мл КС и 0,4 мл DMEM-F12. Декстрансульфат и КС добавляли в соответствующие колбы (по 5 мл каждого) для достижения концентрации декстрансульфата 0,01 мг/мл в каждой чашке с общим количеством 10 мл КС в каждой.
Сбор культуры и лизис клеток.
CM аспирировали в чистую и промаркированную 15 мл пробирку Falcon. Колбы (без культуральной среды) помещали в морозильную камеру при -80°С на 30 минут. КС в пробирках Falcon вращали при 3000 × g в течение 5 минут. Супернатант удаляли и маленький осадок повторно суспендировали в 2,5 мл раствора тризол: вода (4: 1) при комнатной температуре (к.т., ~ 22°C).
Замороженные колбы поочередно извлекали из морозильной камеры и смесь тризол-вода из соответствующих пробирок переносили в колбу. Колбы оставляли при комнатной температуре на 5 минут, после чего содержимое снова аспирировали в 15 мл пробирку Falcon (после тщательного промывания дна колбы раствором). Колбы осматривали под микроскопом для обеспечения полного удаления клеток. Собранные лизаты в 15 мл пробирки Falcon помещали в морозильную камеру при -80°C.
Извлечение РНК
Пробирки Falcon, содержащие гомогенаты, извлекали из морозильника и хранили в течение 5 минут при комнатной температуре для полной диссоциации комплексов нуклеопротеинов.
Из каждой пробы удаляли две аликвоты лизата объемом 1 мл и добавляли 200 мкл хлороформа (0,2 мл хлороформа на 1 мл реагента TRIzol, используемого на стадии лизиса клеток), и пробирку энергично встряхивали. Образцы хранили при комнатной температуре в течение 2-3 минут и затем центрифугировали при 12000 × g в течение 15 минут при 4°С.
Смесь разделялась на три слоя: нижняя красная фаза фенол-хлороформ, промежуточная фаза и бесцветная верхняя водная фаза. РНК оставалась в верхней водной фазе, ДНК в белой промежуточной фазе и белок в розовой нижней (органической) фазе. Верхние  водной фазы переносили в новую чистую пробирку Эппендорфа.
РНК осаждали из водной фазы путем добавления равного количества 100% этанола. Осажденную РНК фиксировали на спин-картридже, дважды промывали и сушили. РНК элюировали в 50 мкл теплой воды без РНКазы. Количество и качество очищенной РНК измеряли с помощью Nanodrop. РНК хранили при -80°С до переноса в Source Bioscience для анализа.
План анализа данных экспрессии
Данные экспрессии были загружены в отдельные файлы для каждой клеточной линии. Выражение «скорректированный фон» представляет собой данные из «gProcessedSignal» массивов, которые являются результатом фонового сигнала, извлеченного из фактического сигнала соответствующей пробы. Это наиболее часто используемая переменная в анализе массива. Откорректированный фоновый сигнал был преобразован log2 для всех выборок для статистического анализа. Чтобы уменьшить частоту ложного обнаружения в выборках, сигналы, которые были ниже «уровня экспрессии», были удалены. Уровень «ниже экспресии» был установлен на 5 для преобразованных log2 значений выражения.
Статистический анализ
На основании паттерна экспрессии контрольных проб на каждом массиве было решено выполнить медианное центрирование для всех массивов перед анализом, чтобы уменьшить изменчивость результатов. Данные были проанализированы с использованием следующих алгоритмов:
• Сравнение контроля D0 с контрольными образцами D2 - изменения экспрессии, наблюдаемые в клетках в нормальных культурах
• Сравнение контроля D0 с образцами, обработанными декстрансульфатом D2 - изменения экспрессии, наблюдаемые в клетках в культурах, обработанных декстрансульфатом
• Сравнение контроля D2 с образцами, обработанными декстрансульфатом D2 - дифференциальная экспрессия, индуцированная декстрансульфатом в культуре.
Предварительный анализ был проведен для скрининга генов, которые не были дифференциально выражены между какой-либо комбинацией трех наборов данных. Простой, нестрогий анализ ANOVA (р <0,05) был проведен для поиска паттернов экспрессии. Пробы без изменений в трех выборках данных были исключены. Остальные выборки проб были проанализированы на предмет кратного изменения и значимости с использованием графиков Volcano. Изменение экспрессии в пробе более чем на 20% (FC ≥ 1,2 или FC ≤ 0,84) было расценено как существенное в первом случае, что позволило выявить паттерны экспрессии.
Параметры качества
Плотность посева рассчитывали по количеству клеток, полученному из стоков клеток для клеток Шванна.
Дополнительный контроль качества от поставщика Array показал, что РНК была высокого качества (без деградации), и количества были в пределах параметров микроматрицы РНК с низким входом от Agilent.
Анализ необработанных данных показал, что, как и ожидалось, были найдены существенные различия между массивами. Эти различия (отраженные различиями в одних и тех же контрольных образцах, включенных во все массивы), однако, были легко устранены методами нормализации. Выбранное медианное центрирование данных, которое устраняет различия между массивами, не повлияло на общие различия, которые, как ожидается, будут видны между контролями, представляющими различные концентрации РНК.
Описанные выше варианты осуществления следует понимать как несколько иллюстративных примеров настоящего изобретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что различные модификации, комбинации и изменения могут быть сделаны в вариантах осуществления настоящего изобретения без отклонения от объема настоящего изобретения. В частности, различные части в разных вариантах осуществления могут быть объединены в других конфигурациях, где это технически возможно. Однако объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения.
Литература
[1] Hill et al., Decorin reduces intraocular pressure and retinal ganglion cell loss in rodents through fibrolysis of the scarred trabecular meshwork. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015, 56(6): 3743-3757
[2] Chen et al., RAGE regulates immune cell infiltration and angiogenesis in choroidal neovascularization. Plos One. 2014, 9 (2): e89548
[3] Chen et al., Age- and light- dependent development of localised retinal atrophy in CCL2 (-/-) CX3CR1 (GFP/GFP) mice. Plos One. 2013, 8(4): e61381