АНТИТЕЛО К EPHA4
EphA4 ANTIBODY

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0001] Настоящее изобретение относится к антителу, связывающемуся с EphA4.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] EphA4 является представителем семейства рецепторных тирозинкиназ. Эфрины типа А и типа В известны в качестве лигандов EphA4. При связывании EphA4 со своим лигандом эфрином индуцируются сигналы деадгезии. EphA4 экспрессируется в двигательных нейронах и регулирует надлежащий аксональный поиск пути при помощи эфрина, экспрессируемого в непроективных областях двигательных нейронов в спинном мозге во время стадии образования нейронной сети.
[0003] Предыдущие исследования свидетельствуют о том, что функциональное ингибирование EphA4 является эффективной терапевтической процедурой для лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз (далее в данном документе также обозначаемый как "ALS"), болезнь Альцгеймера и повреждение спинного мозга.
[0004] Сообщалось, что ген EphA4 регулирует фенотип ALS (патентный литературный источник 1; непатентный литературный источник 1). Было обнаружено, что генетический дефект EphA4 или антагонизм посредством EphA4-Fc или подобное активируют элонгацию аксонов или функциональное восстановление во время повреждения спинного мозга у мышей или крыс (непатентный литературный источник 2; непатентный литературный источник 3).
Пептид KYL и соединение 1 известны в качестве применяемых ингибиторов передачи сигнала EphA4 (патентный литературный источник 1; непатентный литературный источник 1; непатентный литературный источник 2). Однако сообщения об антителе, характеризующемся нейтрализующей активностью, отсутствуют.
ИЗВЕСТНЫЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0005] Патентный литературный источник 1: WO2012/156351 A1
[0006] Непатентный литературный источник 1: Van Hoecke et al., Nature Medicine, vol. 18: 1418-1422, 2012
Непатентный литературный источник 2: Goldschmit et al., PLoS one, vol. 6: e24636, 2011
Непатентный литературный источник 3: Spanevello et al., Journal of Neurotrauma, vol. 30: 1023-1034, 2013
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0007] Целью настоящего изобретения является получение антитела к EphA4 или его EphA4-связывающего фрагмента, которые способны связываться с EphA4 и ингибировать связывание между EphA4 и его лигандом, и фармацевтической композиции, содержащей антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент в качестве активного компонента.
[0008] Авторы настоящего изобретения провели необходимые исследования для достижения цели и затем дополнили настоящее изобретение получением антитела к EphA4, способного связываться с EphA4 и ингибировать связывание между EphA4 и его лигандом.
В частности, согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к следующим изобретениям.
[0009] (1) Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент, содержащие
(a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 27;
(b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 28 или SEQ ID NO: 29;
(c) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 30;
(d) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 31;
(e) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 32; и
(f) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 33.
[0010] (2) Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1), где
антитело или его EphA4-связывающий фрагмент являются гуманизированными.
[0011] (3) Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1) или (2), где
антитело или его EphA4-связывающий фрагмент специфически связываются с EphA4 и ингибируют связывание между EphA4 и эфрином.
[0012] (4) Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по любому из (1)-(3), где
антитело или его EphA4-связывающий фрагмент содержат тяжелую цепь и легкую цепь, и
каждая константная область тяжелой цепи и каждая константная область легкой цепи содержат последовательность, полученную из человеческого антитела.
[0013] (5) Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (4), где
константная область тяжелой цепи получена из человеческого IgG.
[0014] (6) Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (5), где
1
2
человеческий IgG представляет собой человеческий IgG или человеческий IgG.
[0015] (7) Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по любому из (4)-(6), где
константная область легкой цепи получена из человеческого Igκ.
[0016] (8) Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по любому из (1)-(7), где
2
EphA4-связывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab') и Fv.
[0017] (9) Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (8), где
2
EphA4-связывающий фрагмент представляет собой F(ab').
[0018] (10) Фармацевтическая композиция, содержащая антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по любому из (1)-(9).
[0019] (11) Фармацевтическая композиция по (10), дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель.
[0020] (12) Фармацевтическая композиция по (10) или (11), где
фармацевтическую композицию применяют для лечения бокового амиотрофического склероза (ALS).
[0021] Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение также относится к следующим изобретениям.
(1') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент, содержащий тяжелую цепь и легкую цепь, где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74 или 76, или аминокислотную последовательность, полученную из указанной последовательности в результате замены, добавления и/или делеции одной или нескольких аминокислот,
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 78, 80, 82 или 84, или аминокислотную последовательность, полученную из указанной последовательности в результате замены, добавления и/или делеции одной или нескольких аминокислот, и
антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент специфически связываются с EphA4 и ингибируют связывание между EphA4 и эфрином.
[0022] (2') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74 или 76, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 78, 80, 82 или 84.
[0023] (3') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 66, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 78.
[0024] (4') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 68, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 78.
[0025] (5') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 70, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 78.
[0026] (6') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 72, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 78.
[0027] (7') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 74, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 78.
[0028] (8') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 76, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 78.
[0029] (9') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 66, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 80.
[0030] (10') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 68, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 80.
[0031] (11') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 70, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 80.
[0032] (12') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 72, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 80.
[0033] (13') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 74, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 80.
[0034] (14') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 76, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 80.
[0035] (15') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 66, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 82.
[0036] (16') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 68, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 82.
[0037] (17') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 70, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 82.
[0038] (18') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 72, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 82.
[0039] (19') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 74, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 82.
[0040] (20') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 76, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 82.
[0041] (21') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 66, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 84.
[0042] (22') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 68, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 84.
[0043] (23') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 70, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 84.
[0044] (24') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 72, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 84.
[0045] (25') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 74, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 84.
[0046] (26') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (1') или (2'), где
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 76, и
вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 84.
[0047] (27') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по любому из (1')-(26'), где
антитело или его EphA4-связывающий фрагмент специфически связываются с EphA4 и ингибируют связывание между EphA4 и эфрином.
[0048] (28') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по любому из (1')-(27'), где
каждая константная область тяжелой цепи и каждая константная область легкой цепи содержат последовательность, полученную из человеческого антитела.
[0049] (29') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (28'), где
константная область тяжелой цепи получена из человеческого IgG.
[0050] (30') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (29'), где
2
1
2
человеческий IgG представляет собой человеческий IgG, состоящий из человеческого IgG или комбинации человеческого IgG и человеческого IgG.
[0051] (31') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (30'), где
2
человеческий IgG представляет собой человеческий IgG.
[0052] (32') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (31'), где
2
человеческий IgG содержит мутацию C131S, C219S, V234A и/или G237A по нумерации Eu и не имеет лизинового остатка на карбоксильном конце.
[0053] (33') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (32'), где
2
человеческий IgG содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 62.
[0054] (34') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (30'), где
1
2
человеческий IgG представляет собой человеческий IgG, состоящий из комбинации человеческого IgG и человеческого IgG.
[0055] (35') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (34'), где
1
2
1
2
в человеческом IgG, состоящем из комбинации человеческого IgG и человеческого IgG, область CH1 и шарнирная область представляют принадлежат к человеческому IgG, и область CH2 и область CH3 принадлежат к человеческому IgG.
[0056] (36') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (35'), где
1
2
человеческий IgG, состоящий из комбинации человеческого IgG и человеческого IgG, содержит мутацию V234A и/или G237A по нумерации Eu и не содержит лизинового остатка на карбоксильном конце.
[0057] (37') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (36'), где
1
2
человеческий IgG, состоящий из комбинации человеческого IgG и человеческого IgG, содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 60.
[0058] (38') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по любому из (28')-(37'), где
константная область легкой цепи получена из человеческого Igκ.
[0059] (39') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по любому из (1')-(38'), где
2
EphA4-связывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab') и Fv.
[0060] (40') Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по (39'), где
2
EphA4-связывающий фрагмент представляет собой F(ab').
[0061] (41') Фармацевтическая композиция, содержащая
антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по любому из (1')-(40').
[0062] (42') Фармацевтическая композиция по (41'), дополнительно содержащая
фармацевтически приемлемый носитель.
[0063] (43') Фармацевтическая композиция по (41') или (42'), где
фармацевтическую композицию применяют для лечения бокового амиотрофического склероза (ALS).
[0064] Одна из комбинаций или любая комбинация из двух или более аспектов настоящего изобретения, упомянутых выше, также включена в объем настоящего изобретения.
[0065] Настоящее изобретение предусматривает антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент, которые способны связываться с EphA4 и ингибировать связывание между EphA4 и его лигандом, и фармацевтическую композицию, содержащую антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент в качестве активного компонента.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0066] На ФИГ. 1 показана аффинность связывания моноклонального антитела к EphA4 (антитела A) с человеческим EphA4 и мышиным EphA4.
На ФИГ. 2 показано ингибирование связывания мышиного EphA4 с мышиным эфрином A1 и мышиным эфрином B2 моноклональным антителом к EphA4 (антителом A), пептидом KYL и соединением 1.
На ФИГ. 3 показано ингибирование связывания человеческого EphA4 с человеческим эфрином A5 и человеческим эфрином B3 моноклональным антителом к EphA4 (антителом A) и пептидом KYL.
На ФИГ. 4A показана аффинность связывания антитела A-IgG (антитела A) и антитела A-Fab с мышиным EphA4.
2
На ФИГ. 4В показана аффинность связывания антитела A-IgG (антитела A) и антитела A-F(ab') с мышиным EphA4.
На ФИГ. 4С показана аффинность связывания антитела A-IgG (антитела A) и антитела A-Fab с человеческим EphA4.
2
На ФИГ. 4D показана аффинность связывания антитела A-IgG (антитела A) и антитела A-F(ab') с человеческим EphA4.
2
На ФИГ. 5 показано ингибирование связывания между мышиным EphA4 и мышиным эфрином B2 антителом A-IgG (антителом A), антителом A-F(ab'), антителом A-Fab и пептидом KYL.
На ФИГ. 6 показана специфичность связывания антитела A с человеческим Eph-рецептором (ФИГ. 6A) и мышиным Eph-рецептором (ФИГ. 6B).
На ФИГ. 7 показана активность связывания антитела A к мышиному, крысиному, обезьяньему и человеческому EphA4.
На ФИГ. 8 показано, что антитело A подавляет концентрационно-зависимым образом аутофосфорилирование EphA4, индуцированное эфрином A1 в нейронах гиппокампа. На ФИГ. 8 pY представляет собой фосфорилированный EphA4.
На ФИГ. 9 показано, что антитело A подавляет концентрационно-зависимым образом ослабление конуса роста, индуцированное эфрином A1 в нейронах гиппокампа.
На ФИГ. 10 показано, что антитело A подавляет аутофосфорилирование EphA4, индуцированное эфрином A1 в мозге новорожденной мыши. На ФИГ. 10 pY представляет собой фосфорилированный EphA4.
На ФИГ. 11 показан схематический вид системы оценивания, проводимого в примере 13.
in vitro
На ФИГ. 12 показано, что антитело A защищает двигательные нейроны в моделях ALS  с использованием мышиных ES-клеток.
На ФИГ. 13 показан схематический вид системы оценивания, проводимого в примере 14.
in vitro
На ФИГ. 14 показано, что антитело A защищает двигательные нейроны в моделях ALS  с использованием человеческих iPS-клеток.
На ФИГ. 15 показаны аминокислоты связывающего домена лиганда EphA4 (EphA4-LBD) на оси абсцисс и структурная область Fab на оси ординат. Черные фрагменты означают точки пересечения комбинаций, характеризующихся взаимодействием. Несколько фрагментов, представляющих одну аминокислоту, соответствуют типам взаимодействия (водородная связь, поверхностный контакт и т.д.). Аминокислота, содержащая большее число фрагментов, означает, что аминокислота связывается с Fab с различными взаимодействиями.
На ФИГ. 16 показана поверхностная структура связывающего домена лиганда EphA4 (EphA4-LBD). На ФИГ. 16 участки темного цвета соответствуют Fab-связывающим областям. На этой фигуре названия и число остатков аминокислот, содержащихся в связывающихся областях, показаны в соответствующих положениях, а связывающиеся CDR Fab H-цепи и L-цепи показаны при помощи ленточных моделей.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0067] Настоящее изобретение относится к антителу к EphA4, которое связывается с EphA4.
Антитело к EphA4, используемое в настоящем изобретении, представляет собой антитело, которое может распознавать EphA4 и связываться с ним. Как упомянуто ниже, антитело может представлять собой интактное антитело или может представлять его антигенсвязывающий фрагмент или синтетическое антитело (например, рекомбинантное антитело, химерное антитело и гуманизированное антитело), при условии, что оно характеризуется аффинностью связывания с EphA4. Согласно настоящему изобретению можно понять, что EphA4 относится к EphA4 человеческого, мышиного, крысиного или обезьяньего происхождения. EphA4 человеческого, мышиного, крысиного или обезьяньего происхождения может быть получен из общедоступных баз данных, в которых информация о последовательностях является зарегистрированной, таких как GenBank, предоставляемая Национальным центром биотехнологической информации (США). Альтернативно праймеры разрабатывают на основе информации о нуклеотидных последовательностях EphA4 видов животных, тесно связанных с ними, и информация о последовательностях гена EphA4 может быть получена при помощи клонирования из РНК, экстрагируемой из желательных видов животных. Например, информация о нуклеотидных последовательностях EphA4 человеческого, мышиного, крысиного или обезьяньего происхождения зарегистрирована под номерами доступа в GenBank NM_004438.4, NM_007936.3, NM_001162411.1 и NM_001260870 соответственно в базе данных.
[0068] Согласно одному аспекту настоящего изобретения EphA4 содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 1, или аминокислотную последовательность, полученную из этой аминокислотной последовательности в результате замены, добавления и/или делеции одной или нескольких аминокислот, или аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 3, или аминокислотную последовательность, полученную из этой аминокислотной последовательности в результате замены, добавления и/или делеции одной или нескольких аминокислот. Согласно настоящему изобретению термин "или несколько", используемый по отношению к EphA4, не ограничен, при условии, что полученная в результате последовательность сохраняет функциональные характеристики, эквивалентные исходной последовательности. Термин "или несколько" означает от 2 до 100, например, от 2 до 90, от 2 до 80, от 2 до 70, от 2 до 60, от 2 до 50, от 2 до 40, от 2 до 30, от 2 до 20, от 2 до 10 или от 2 до 5 или представлен в пределах 10%, например, в пределах 9%, в пределах 8%, в пределах 7%, в пределах 6% или в пределах 5% от числа аминокислот в аминокислотной последовательности.
-7
-8
-9
-10
-11
-12
[0069] Согласно одному аспекту настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент представляют собой антитело, специфически связывающееся с EphA4. Термин "специфически связывающийся" представляет собой термин, хорошо известный специалистам в данной области, и способ определения специфического связывания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с антигеном или эпитопом также хорошо известен. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения необходимо понимать, что "специфическое связывание" означает, что антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент способны связываться с EphA4 в результате иммунологической реакции быстрее и/или с более высокой аффинностью связывания или с большей активностью связывания по сравнению с его связыванием с другими целевыми молекулами. Согласно этому контексту специфическое связывание с другими мишенями антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с одной мишенью, не исключается. Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения "специфическое связывание" можно указать при помощи антитела, имеющего KD, составляющую по меньшей мере примерно 10 M, по меньшей мере примерно 10 M, по меньшей мере примерно 10 M, по меньшей мере примерно 10 M, по меньшей мере примерно 10 M или по меньшей мере примерно 10 M или более по отношению к EphA4. Согласно дополнительному альтернативному варианту осуществления настоящего изобретения необходимо понимать, что "специфическое связывание" представляет собой связывание с EphA4 в результате иммунологической реакции, но не значительное связывание с другими подклассами и подтипами Eph-рецепторов.
[0070] Согласно одному аспекту настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению представляют собой антитело, связывающееся с внеклеточной областью EphA4. Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению могут представлять собой, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 2, или аминокислотную последовательность, полученную из этой аминокислотной последовательности в результате замены, добавления и/или делеции одной или нескольких аминокислот, или содержат аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 4, или аминокислотную последовательность, полученную из этой аминокислотной последовательности в результате замены, добавления и/или делеции одной или нескольких аминокислот, и связываются с любым сайтом во внеклеточной области EphA4. Согласно настоящему изобретению термин "или несколько", используемый по отношению к внеклеточной области EphA4, означает без ограничений от 2 до 100, например, от 2 до 50, от 2 до 45, от 2 до 40, от 2 до 35, от 2 до 30, от 2 до 25, от 2 до 20, от 2 до 15, от 2 до 10 или от 2 до 5 или в пределах 10%, например, в пределах 9%, в пределах 8%, в пределах 7%, в пределах 6% или в пределах 5% от числа аминокислот в аминокислотной последовательности.
[0071] Согласно одному аспекту настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент могут специфически связываться с EphA4 и ингибировать связывание между EphA4 и эфрином.
[0072] Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент могут специфически связываться по меньшей мере с одним из человеческого EphA4, мышиного EphA4, крысиного EphA4 и обезьяньего EphA4 и ингибировать их связывание со своими лигандами. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент могут специфически связываться с двумя или несколькими из человеческого EphA4, мышиного EphA4, крысиного EphA4 и обезьяньего EphA4 и ингибировать их связывание со своими лигандами. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент могут специфически связываться со всеми из человеческого EphA4, мышиного EphA4, крысиного EphA4 и обезьяньего EphA4 и ингибировать их связывание со своими лигандами.
[0073] Способ, общеизвестный специалистам в данной области, можно применять в качестве способа измерения антигенсвязывающих свойств (например, аффинности связывания и межвидовой перекрестной реактивности) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Например, аффинность связывания может быть измерена при помощи биосенсора Biacore(R), биосенсора KinExA, сцинтиляционного анализа сближения, ELISA, иммуноанализа ORIGEN (IGEN International), проточной цитометрии, гашения флуоресценции, переноса флуоресценции, дрожжевого дисплея и/или иммуноокрашивания, хотя способ не ограничен этим. Нейтрализующая активность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в отношении связывания между EphA4 и его лигандом может быть измерена при помощи биосенсора Biacore(R), ELISA и/или проточной цитометрии, хотя способ не ограничен этим.
[0074] Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению могут представлять собой любое из моноклонального антитела, поликлонального антитела и их EphA4-связывающего фрагмента, при условии, что он связывается с EphA4, предпочтительно специфически связывается с EphA4.
1
2
3
4
1
2
[0075] Согласно настоящему изобретению антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению могут относиться к любому классу, такому как IgG, IgA или IgM (или их подклассу), и не ограничены конкретным классом. Иммуноглобулины классифицируются на различные классы в зависимости от аминокислотных последовательностей их константных областей тяжелой цепи (также называемой H-цепью) антитела. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, некоторые из которых могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG, IgG, IgG, IgG, IgA и IgA. Константные области тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, соответственно называются α, δ, ε, γ и μ. Типы легкой цепи (также называемой L-цепью) антител представляют собой цепи λ и κ.
1
2
[0076] Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению могут представлять собой антитело IgG или могут представлять собой, например, антитело IgG или антитело IgG. Также антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению в некоторых случаях могут представлять собой мономер, димер или мультимер.
1
2
[0077] Согласно одному аспекту настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению могут представлять собой комбинацию антител IgG, полученных из различных подклассов, таких как антитело IgG, состоящее из комбинации антитела IgG и антитела IgG.
2
2
[0078] Согласно настоящему описанию антигенсвязывающий фрагмент антитела не ограничен определенным образом при условии, что антигенсвязывающий фрагмент представляет собой функциональный и структурный фрагмент антитела и сохраняет активность связывания по отношению к антигену, с которым может связываться антитело. Примеры антигенсвязывающего фрагмента антитела включают без ограничений Fab, Fab', F(ab'), Fv и одноцепочечный Fv (scFv), их варианты, слитые белки, содержащие фрагмент антитела, и другие модифицированные структуры иммуноглобулиновых молекул, содержащих сайт распознавания антигена. Согласно одному аспекту связывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению представляет собой F(ab').
E. coli
E. coli
E. coli
2
2
2
[0079] Антигенсвязывающий фрагмент антитела может быть получен, например, при помощи белкового расщепления целого антитела протеазой, такой как папаин или пепсин, или может быть получен непосредственно при помощи рекомбинантных клеток-хозяев (например, эукариот, таких как дрожжевые клетки, растительные клетки, клетки насекомых или клетки млекопитающих, или прокариот, таких как ). Например, Fab'-SH фрагменты могут быть извлечены непосредственно из  и химически связаны с образованием фрагмента F(ab'). Альтернативно F(ab') может быть получен при помощи лейциновой застежки GCN4, которая активирует сборку молекул F(ab'). В случае получения scFv при помощи методики химического синтеза можно использовать автоматический синтезатор. В случае получения scFv при помощи методики рекомбинации генов подходящая плазмида, содержащая полинуклеотид, кодирующий scFv, может быть перенесена в подходящие клетки-хозяева (например, эукариоты, такие как дрожжевые клетки, растительные клетки, клетки насекомых или клетки млекопитающих, или прокариоты, такие как ). Полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес scFv, может быть получен при помощи хорошо известной операции, такой как лигирование полинуклеотидов. Полученный в результате scFv может быть выделен при помощи стандартной методики очистки белка, известной из уровня техники.
th
[0080] Согласно настоящему изобретению вариабельная область антитела может означать вариабельную область легкой цепи антитела и/или вариабельную область тяжелой цепи антитела, а константная область антитела может означать константную область легкой цепи антитела и/или константную область тяжелой цепи антитела. Каждая вариабельная область тяжелой цепи и каждая вариабельная область легкой цепи состоят из четырех каркасных областей (FR), соединенных посредством трех CDR, также известных как гипервариабельные области. CDR в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости при помощи FR и способствуют совместно с CDR в другой цепи образованию антигенсвязывающего сайта антитела. Примеры методик определения CDR включают без ограничений (1) подход на основе межвидовой вариабельности последовательностей (например, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD) и (2) подход на основе кристаллографического исследования комплекса антиген-антитело (Al-lazikani et al., 1997 J. Molec. Biol. 273: 927-948). Эти подходы или другие подходы можно использовать в комбинации. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, т. е., CH1, CH2 и CH3 и шарнирной области, и они располагаются от аминоконца (N-конца) к карбоксильному концу (C-концу) в порядке CH1, шарнирная область, CH2 и CH3. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL.
[0081] Согласно настоящему изобретению моноклональное антитело может означать антитело, которое получают из популяции практически гомогенных антител. В частности, отдельные антитела, содержащиеся в популяции, являются идентичными, за исключением природных мутантов, которые могут присутствовать до некоторой степени. Моноклональное антитело направлено на один антигенный сайт и является высокоспецифическим. Более того, в отличие от типичного поликлонального антитела, направленного на разные антигены или разные эпитопы, каждое моноклональное антитело направляется на один эпитоп в антигене. Определение "моноклональный" означает характеристики антитела, которое получают из популяции практически гомогенных антител, и его не следует трактовать ограниченно как требующее получения антитело определенным способом.
[0082] Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению могут представлять собой химерное антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело, антитело отличного от человека млекопитающего (например, обезьянье, мышиное, крысиное, кроличье, бычье, лошадиное или козье) или его EphA4-связывающий фрагмент. Химерное антитело, например, представляет собой антитело, содержащее вариабельные области отличного от человеческого антитела (например, мышиного или крысиного), соединенные с константными областями человеческого антитела, и может относиться, например, к антителу, содержащему вариабельные области, полученные из отличного от человеческого антитела, и константные области, полученные из человеческого антитела. Гуманизированное антитело, например, представляет собой антитело, содержащее гипервариабельные области (также обозначаемые как определяющие комплементарность области (CDR)) отличного от человеческого антитела, введенные в человеческое антитело, и может относиться, например, к антителу, содержащему CDR, полученные из отличного от человеческого антитела, и другие области антитела, полученные из человеческого антитела. Однако согласно настоящему изобретению различие между химерным антителом и гуманизированым антителом не обязательно должно быть четким, и антитело может находиться в форме, которая может рассматриваться и как химерное антитело, и как гуманизированное антитело. Предпочтительным аспектом гуманизированного антитела согласно настоящему изобретению является антитело, содержащее CDR, полученные из антитела грызуна, и другие области антитела, полученные из человеческого антитела, в частности предпочтительно антитело, содержащее CDR, полученные из мышиного антитела, и другие области антитела, полученные из человеческого антитела. Гуманизация может быть выполнена при помощи способа CDR-привития (Kontermann and Dubel, Antibody Engineering, Springer Lab Manual (2001); и Tsurushita et al., Methods 36: 69-83 (2005)) и также может быть выполнена при помощи способа, известного из уровня техники (см., например, Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); и Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)), который включает замену последовательностей CDR на соответствующие последовательности человеческого антитела. Гуманизированное антитело обычно представляет собой человеческое антитело, некоторые остатки CDR и необязательно некоторые остатки FR которого замещают остатками, полученными из аналогичных сайтов отличного от человеческого антитела.
[0083] Для снижения антигенности при получении гуманизированного антитела может быть важным выбор применения человеческих вариабельных областей как в легкой, так и в тяжелой цепях. Согласно способу "наилучшего соответствия" целую библиотеку известных человеческих последовательностей FR подвергают скринингу относительно последовательностей вариабельных областей антитела грызуна. Затем человеческие последовательности, наиболее похожие на последовательности грызуна, принимают в качестве человеческих FR гуманизированного антитела. См., например, Sims et al., J. Immunol. 151: 2296-2308 (1993) и Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987). Согласно другому способу используют определенные каркасы, полученные из общих последовательностей всех человеческих антител, в отношении определенных подгрупп легких цепей или тяжелых цепей. Одинаковые каркасы можно использовать для некоторых отличающихся гуманизированных антител. См., например, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Set USA 89: 4285-4289 (1992) и Presta et al., J. Immunol. 151: 2623-2632 (1993).
[0084] Более того, как правило, желательно, чтобы гуманизированное антитело сохраняло высокую аффинность связывания с антигеном и другие предпочтительные биологические свойства. Для достижения этой цели согласно одному способу гуманизированное антитело получают с использованием стадии анализа родительских последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов, используя трехмерные модели родительских последовательностей и гуманизированных последовательностей. Как правило, можно использовать трехмерную иммуноглобулиновую модель, и она известна специалистам в данной области. Можно использовать компьютерную программу, которая иллюстрирует и показывает потенциальные трехмерные конформации некоторых кандидатных иммуноглобулиновых последовательностей. Эти данные можно изучать для анализа возможной роли остатков в функциях кандидатных иммуноглобулиновых последовательностей, т. е. для анализа остатков, которые влияют на способность кандидатных иммуноглобулинов связываться с антигеном. При помощи этого способа остатки FR можно выбирать из реципиентной последовательности и импортируемой последовательности и комбинировать таким образом, чтобы получать желаемые характеристики антител, такие как повышенная аффинность связывания с одним или несколькими целевыми антигенами (например, EphA4 или его фрагментом).
2
[0085] Совершенно очевидно, что антитело по настоящему изобретению также включает антитело, полученное из химерного антитела или гуманизированного антитела, приведенных в качестве примера выше, при помощи соответствующей разработки (например, модификации антитела или частичной замены, добавления и/или делеции аминокислотной последовательности антитела) таким образом, что антитело сохраняет свои функции (или функция антитела нарушена, или функция антитела улучшена). В частности, антитело, у которого отсутствует лизин (Lys), расположенный на карбоксильном конце (C-конце) тяжелой цепи при помощи искусственного способа, такого как генная инженерия, с целью снижения гетерогенности антител, продуцируемых антитело-продуцирующими клетками, также включено в объем настоящего изобретения. Также антитело, имеющее модифицированные аминокислотные последовательности в константной области для модификации эффекторной функции антитела, такого как антитело, в котором валин (Val) в положении 234 человеческого антитела IgG по нумерации Eu был замещен на аланин (Ala) и глицин (Gly) в положении 237 был замещен на аланин (Ala) с тем, чтобы снизить выраженность антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) и/или антителозависимого клеточно-опосредованного фагоцитоза (ADCP), также включено в объем настоящего изобретения. Более того, биспецифическое антитело (Kontermann (2012), mAbs 4, 182-97), которое содержит наряду с антителосвязывающей областью, содержащей последовательности CDR антитела по настоящему изобретению, антигенсвязывающую область, которая связывается с другим антигеном, также включено в объем настоящего изобретения.
[0086] Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению могут быть модифицированы при необходимости. Модификация антитела к EphA4 или его EphA4-связывающего фрагмента по настоящему изобретению может представлять собой модификацию, которая изменяет (a) трехмерную структуру аминокислотной последовательности в модифицированной области, такую как листовая или спиральная конформация; (b) электрический заряд или состояние гидрофобности молекулы по целевому сайту или (c) эффекты модификации в направлении сохранения объема боковой цепи, или может представлять собой модификацию, при которой эти изменения не являются четко выраженными.
[0087] Модификация антитела к EphA4 или его EphA4-связывающего фрагмента по настоящему изобретению может быть получена, например, при помощи замены, делеции и/или добавления составного(составных) аминокислотного(аминокислотных) остатка(остатков).
in vivo
[0088] Согласно настоящему описанию аминокислота используется в самом широком своем смысле и включает не только природные аминокислоты, например, серин (Ser), аспарагин (Asn), валин (Val), лейцин (Leu), изолейцин (Ile), аланин (Ala), тирозин (Tyr), глицин (Gly), лизин (Lys), аргинин (Arg), гистидин (His), аспарагиновую кислоту (Asp), глутаминовую кислоту (Glu), глутамин (Gln), треонин (Thr), цистеин (Cys), метионин (Met), фенилаланин (Phe), триптофан (Trp) и пролин (Pro), но и неприродные аминокислоты, такие как варианты и производные аминокислот. Специалистам в данной области естественным образом понятно, принимая во внимание это определение в широком смысле, что примеры аминокислот в настоящем описании включают L-аминокислоты; D-аминокислоты; химически модифицированные аминокислоты, такие как варианты аминокислот и производные аминокислот; аминокислоты, такие как норлейцин, β-аланин и орнитин, которые не выступают в роли соединений, входящих в состав белков ; и химически синтезированные соединения, имеющие характеристики аминокислот, общеизвестных специалистам в данной области. Примеры неприродных аминокислот включают α-метиламинокислоты (α-мелиталанин и т. д.), D-аминокислоты (D-аспарагиновая кислота, D-глутаминовая кислота и т. д.), подобные гистидину аминокислоты (2-аминогистидин, β-гидроксигистидин, гомогистидин, α-фторметилгистидин, α-метилгистидин и т. д.), аминокислоты, содержащие дополнительный метилен в своих боковых цепях ("гомо"аминокислоты) и аминокислоты, в которых функциональная группа карбоновой кислоты в боковой цепи замещена группой сульфоновой кислоты (цистеиновая кислота и т.д.).
[0089] Встречающиеся в природе аминокислотные остатки могут быть классифицированы, например, на следующие группы на основе общих характеристик боковых цепей:
(1) гидрофобные остатки: Met, Ala, Val, Leu и Ile;
(2) нейтральные гидрофильные остатки: Cys, Ser и Thr;
(3) кислые остатки: Asp и Glu;
(4) основные остатки: Asn, Gln, His, Lys и Arg;
(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly и Pro; и
(6) ароматические остатки: Trp, Tyr и Phe.
[0090] Неконсервативная замена аминокислотной последовательности, составляющей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, может быть выполнена путем замены аминокислоты, принадлежащей к одной из этих групп, на аминокислоту, принадлежащую к любой из других групп. Более консервативная замена может быть выполнена путем замены аминокислоты, принадлежащей к одной из этих групп, на другую аминокислоту, принадлежащую к той же группе. Аналогично может быть соответствующим образом выполнена делеция или замена в аминокислотной последовательности.
[0091] Модификация аминокислоты(аминокислот), составляющей(составляющих) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, может представлять собой, например, посттрансляционную модификацию, такую как гликозилирование при помощи сахара, ацетилирование или фосфорилирование. Антитело может быть гликозилировано в консервативном положении в своей константной области. Гликозилирование антитела обычно относится к N-связанному или O-связанному типу. N-связанное гликозилирование означает связывание углеводного фрагмента с боковой цепью аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности аспарагин-X-серин, аспарагин-X-треонин и аспарагин-X-цистеин (где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от пролина) являются последовательностями распознавания для ферментативного добавления углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагина. Любая из этих трипептидных последовательностей присутствуют в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте таким образом, что присутствует потенциальный сайт гликозилирования. O-связанное гликозилирование может представлять собой связывание N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы с гидроксиаминокислотой (например, серином или треонином) или в некоторых случаях может представлять собой их связывание с 5-гидроксипролином или 5-гидроксилизином. Специалисты в данной области техники могут соответствующим образом выбирать условия гликозилирования (в случае выполнения гликозилирования при помощи биологического подхода, например, клеток-хозяев и типа и pH среды для культивирования клеток) согласно цели.
[0092] Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению могут быть дополнительно модифицированы при помощи других способов модификации отдельно или в комбинации на основе технических общих принципов, общеизвестных специалистам в данной области.
E. coli
[0093] Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению могут быть получены при помощи способа, хорошо известного специалистам в данной области. Например, для получения антитела может быть использована гибридома, продуцирующая антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению, или ген, кодирующий антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению может быть интегрирован в вектор экспрессии, который затем может быть перенесен в клетки , клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (CHO) или подобные для продуцирования антитела. Ген, кодирующий антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению, предпочтительно содержит ДНК, кодирующую сигнальную последовательность, и более предпочтительно содержит ДНК, кодирующую сигнальную последовательность в каждом из 5'-концов ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, и ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи. Сигнальная последовательность представляет собой аминокислотные остатки, расположенные на N-конце белка, которые требуются для секреторного белка или интегрального мембранного белка, чтобы пройти через липидный бислой после синтеза на рибосоме. Сигнальная последовательность согласно настоящему изобретению не ограничена определенным образом при условии, что последовательность имеет эту функцию. Примеры сигнальной последовательности, которая может содержаться в антителе к EphA4 или его EphA4-связывающем фрагменте по настоящему изобретению, включают сигнальные последовательности, полученные от человека, мыши, крысы, кролика, осла, козы, лошади, цыпленка, собаки, кошки, дрожжей и т.п. Специфический аспект сигнальной последовательности включает пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 55, в качестве сигнальной последовательности для тяжелой цепи и пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 58, в качестве сигнальной последовательности для легкой цепи. Аминокислотная последовательность, представленная под SEQ ID NO: 10, аминокислотная последовательность, представленная под SEQ ID NO: 55, аминокислотная последовательность, представленная под SEQ ID NO: 12, или аминокислотная последовательность, представленная под SEQ ID NO: 58, могут характеризоваться заменой, добавлением и/или делецией одной или нескольких (например, 2, 3, 4 или 5) аминокислот при условии, что полученная в результате последовательность является функционально эквивалентной им.
[0094] Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению могут быть выделены или очищены согласно способу, общеизвестному специалистам в данной области. Согласно данному контексту термин "выделенный" или "очищенный" означает искусственно выделенный или очищенный из природного состояния. Если встречающаяся в природе молекула или композиция изменена или удалена из исходного окружения или и то и то другое, то молекула или композиция является "выделенной" или "очищенной". Примеры способа выделения или очищения включают электрофоретические, молекулярно-биологические, иммунологические и хроматографические подходы и, в частности, включают без ограничений ион-обменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, обращенно-фазовую ВЭЖХ и электрофорез с изоэлектрическим фокусированием.
[0095] Согласно альтернативному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент содержат следующие CDR:
(a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 27;
(b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 28 или SEQ ID NO: 29;
(c) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 30;
(d) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 31;
(e) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 32; и
(f) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 33.
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент представляют собой гуманизированное антитело или химерное антитело, предпочтительно гуманизированное антитело.
[0096] Согласно альтернативному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент содержат следующие CDR:
(a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 26;
(b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 28;
(c) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 30;
(d) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 31;
(e) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 32; и
(f) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 33.
[0097] Согласно альтернативному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент содержат следующие CDR:
(a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 27;
(b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 29;
(c) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 30;
(d) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 31;
(e) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 32; и
(f) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 33.
[0098] Согласно альтернативному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент содержат тяжелую цепь и легкую цепь, при этом вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 11, или аминокислотную последовательность, полученную из этой последовательности в результате замены, добавления и/или делеции одной или нескольких аминокислот, и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 13, или аминокислотную последовательность, полученную из этой последовательности в результате замены, добавления и/или делеции одной или нескольких аминокислот.
[0099] Согласно альтернативному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент содержат тяжелую цепь и легкую цепь, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74 или 76, или аминокислотную последовательность, полученную из указанной последовательности в результате замены, добавления и/или делеции одной или нескольких аминокислот, и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 78, 80, 82 или 84, или аминокислотную последовательность, полученную из указанной последовательности в результате замены, добавления и/или делеции одной или нескольких аминокислот.
[0100] Согласно данному контексту термин "или несколько", используемый по отношению к вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи в антителе к EphA4 или его EphA4-связывающем фрагменте по настоящему изобретению, не ограничен при условии, что он сохраняет аффинность связывания с EphA4 и подавляет связывание между EphA4 и эфрином. Термин "или несколько" означает от 2 до 15, более предпочтительно от 2 до 10, например, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2, или представлен в пределах10, например, в пределах 9%, в пределах 8%, в пределах 7%, в пределах 6%, в пределах 5%, в пределах 4%, в пределах 3%, в пределах 2% или в пределах 1% от числа аминокислот в аминокислотной последовательности.
[0101] Согласно альтернативному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 11, и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 13.
[0102] Согласно альтернативному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74 или 76, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 78, 80, 82 или 84.
[0103] Согласно альтернативному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 66, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 78, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 68, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 78, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 70, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 78, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 72, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 78, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 74, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 78, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 76, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 78.
[0104] Согласно альтернативному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 66, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 80, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 68, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 80, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 70, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 80, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 72, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 80, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 74, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 80, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 76, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 80.
[0105] Согласно альтернативному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 66, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 82, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 68, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 82, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 70, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 82, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 72, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 82, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 74, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 82, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 76, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 82.
[0106] Согласно альтернативному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 66, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 84, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 68, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 84, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 70, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 84, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 72, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 84, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 74, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 84, или
указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 76, и указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 84.
2
2
2
2
2
[0107] Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент содержат константную область человеческого IgG. Предпочтительно указанная константная область человеческого IgG имеет по меньшей мере одну аминокислотную мутацию, выбранную из C131S, C219S, V234A и G237A (нумерация EU). Согласно одному варианту осуществления указанная константная область человеческого IgG2 содержит комбинацию из аминокислотных мутаций C131S и C219S. Согласно одному варианту осуществления указанная константная область человеческого IgG содержит комбинацию из аминокислотных мутаций V234A и G237A. Согласно другому варианту осуществления указанная константная область человеческого IgG содержит все аминокислотные мутации из C131S, C219S, V234A и G237A. Согласно дополнительному альтернативному варианту осуществления указанная константная область человеческого IgG не содержит лизинового остатка на C-конце.
2
[0108] Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения константная область человеческого IgG содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 62.
1
2
1
2
[0109] Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент содержат константную область человеческого IgG, состоящего из комбинации человеческого IgG и человеческого IgG. Предпочтительно в указанной константной области человеческого IgG CH1 и шарнирная область принадлежат к человеческому IgG, а CH2 и CH3 принадлежат к человеческому IgG. Согласно одному варианту осуществления указанная константная область человеческого IgG содержит аминокислотную мутацию V234A или G237A (нумерация Eu). Согласно другому аспекту указанная константная область человеческого IgG содержит аминокислотные мутации V234A и G237A. Согласно дополнительному альтернативному аспекту указанная константная область человеческого IgG не содержит лизинового остатка на C-конце.
1
2
[0110] Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения константная область человеческого IgG, состоящего из комбинации человеческого IgG и человеческого IgG, содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 60.
[0111] Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению.
[0112] Фармацевтическая композиция, содержащая антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению, может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель и/или стабилизатор в форме водного или сухого препарата. Примеры приемлемого носителя, наполнителя и/или стабилизатора включают физиологический раствор; буферные растворы фосфата, цитрата или других органических кислот; антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные полипептиды; белки (например, сывороточный альбумин, желатин и иммуноглобулины); гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкозу, маннозу и декстрины; хелатирующие средства, такие как EDTA; сахароспирты, такие как маннит и сорбит; противоионы, образующие соль, такие как натрий; и неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN (торговое название), PLURONICS (торговое название) и PEG.
[0113] Фармацевтическая композиция, содержащая антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению, может быть включена, например, в микрокапсулу, коллоидную систему доставки лекарственного средства (например, липосому, альбуминовую микросферу, микроэмульсию или наночастицу) или микроэмульсию. При необходимости введения препарата с замедленным высвобождением антитела, обладающего свойствами высвобождения, подходящими для любого заболевания, требующего введения антитела, может быть предусмотрено микроинкапсулирование антитела. Примеры матрицы с замедленным высвобождением включают полиэстер, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) и поли(виниловый спирт)), полимолочные кислоты, сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, не поддающийся разрушению этиленвинилацетат, поддающиеся разрушению сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты (микросферы для инъекций, образованные сополимером молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролида ацетатом), такие как LUPRON DEPOT (торговая марка), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.
[0114] Согласно одному аспекту антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению может ингибировать связывание между EphA4 и его лигандом. Таким образом, фармацевтическая композиция, содержащая антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению, может быть полезной при лечении ALS. В частности, альтернативный аспект настоящего изобретения охватывает способ лечения ALS, предусматривающий стадию введения терапевтически эффективного количества антитела к EphA4 или его EphA4-связывающего фрагмента по настоящему изобретению субъекту. Альтернативный аспект настоящего изобретения охватывает применение антитела к EphA4 или его EphA4-связывающего фрагмента по настоящему изобретению для получения терапевтического средства для ALS. Альтернативный аспект настоящего изобретения охватывает антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент для применения в способе лечения ALS.
[0115] Антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению может быть использован отдельно или в комбинации с дополнительным лекарственным средством или композицией в способе лечения. Например, антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению могут быть введены в одно и то же время или в разные моменты времени с дополнительным лекарственным средством. Такая комбинированная терапия включает комбинированное введение (два или более лекарственных препаратов содержатся в одном и том же препарате или отдельных препаратах) и раздельное введение (например, одновременное или непрерывное). В случае раздельного введения двух или более лекарственных средств антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению могут быть введены до или после сопутствующего способа лечения.
[0116] Субъект для введения фармацевтической композиции, содержащей антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению, не ограничен, и фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть использована, например, для человека или отличного от человека млекопитающего (обезьяны, мыши, крысы, кролика, крупного рогатого скота, лошади, козы и т.д.).
[0117] Способ введения фармацевтической композиции, содержащей антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент по настоящему изобретению, субъекту (способ введения, доза, число доз в день, время введения и т. д.) не ограничен и может быть соответствующим образом определен специалистами в данной области техники (например, врачом) исходя из состояния здоровья субъекта, тяжести заболевания, типа лекарственного средства, применяемого в комбинации с ней, и т.д.
[0118] Специалисты в данной области техники должны понимать, что настоящее изобретение можно осуществлять при помощи любого одного из или соответствующей комбинации из двух или более из всех аспектов, описанных в настоящем описании, если не возникает техническое противоречие. Также специалисты в данной области техники должны понимать, что настоящее изобретение можно предпочтительно осуществлять при помощи соответствующей комбинации из всех предпочтительных или преимущественных аспектов, описанных в настоящем описании, если не возникает техническое противоречие.
[0119] Литературные источники, цитируемые в настоящем описании, следует понимать в качестве четко включенных в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Специалисты в данной области техники могут понимать связанное содержание, раскрытое в этих литературных источниках посредством ссылки в качестве части настоящего описания, без выхода за пределы сути и объема настоящего изобретения согласно контексту настоящего описания.
[0120] Литературные источники, цитируемые в настоящем описании, представлены лишь с целью раскрытия связанных методик до даты подачи настоящей заявки. Следует понимать, что авторы настоящего изобретения признают, что не обладают правом, предшествующим такому раскрытию, по причине существования предшествующих изобретений или любых других причин. Все положения из этих литературных источников основаны на информации, которая была доступна заявителю настоящего изобретения, и признание того, что содержание этих положений является точным, отсутствует.
[0121] Термины в настоящем описании применяются для иллюстрации определенных вариантов осуществления и не предусмотрены для ограничения настоящего изобретения.
[0122] Термин "содержать", используемый в настоящем описании, означает, что описываемые объекты (представителей, стадии, факторы, числа и т. д.) присутствуют, и присутствие других объектов (представителей, стадий, факторов, чисел и т.д.) не исключается из них, если в контексте явным образом не требуется другое понимание. Термин "состоять из" охватывает аспекты, описанные терминами "состоять из" и/или "состоять по сути из".
[0123] Термин "нейтрализующая активность", используемый в настоящем описании, означает активность ингибирования связывания между EphA4 и его лигандом и/или активность ингибирования передачи сигнала или ответ в виде экспрессии молекул или функциональное изменение клеток, индуцированное связыванием между EphA4 и его лигандом в живом организме человека.
[0124] Все термины (в том числе технические термины и специфические термины), используемые в данном документе, имеют те же значения, что и понимаемые в широком смысле специалистами в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение, если не указано иное. Термины, используемые в данном документе, следует понимать как имеющие значения, согласующиеся со значениями в настоящем описании и связанных технических областях, и не следует понимать в идеализированном или крайне формальном смысле, если не указано иное.
[0125] Термины, такие как "первый" или "второй", используются для выражения различных факторов. Однако эти факторы понимаются как неограничивающиеся самими этими терминами. Эти факторы используют лишь для отличия одного фактора от других факторов. Например, первый фактор может быть описан в качестве второго фактора и наоборот, не выходя за пределы объема настоящего изобретения.
[0126] Согласно настоящему описанию следует понимать, что численные значения, используемые для указания содержания компонентов, численные диапазоны и т. д. модифицируются термином "примерно", если не указано иное. Например, "4°C" понимается как означающее "примерно 4°C", если не указано иное. Специалистам в данной области рационально естественным образом понятна их степень согласно техническим общим принципам и контексту настоящего описания.
[0127] Следует понимать, что каждый аспект, указанный в форме единственного числа, используемый в настоящем описании и формуле изобретения, может быть использован в форме множественного числа, и наоборот, если в контексте явным образом не требуется иное понимание и если не возникает техническое противоречие.
[0128] Далее в данном документе настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Однако настоящее изобретение может быть осуществлено при помощи различных аспектов и не должно истолковываться как ограничиваемое примерами, описываемыми в данном документе. Специалисты в данной области техники могут осуществить настоящее изобретение с различными модификациями, добавлениями, делециями, заменами и т.д. без изменения сути или объема настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Получение моноклонального антитела к мышиному EphA4
[0129]
Получение мышиного моноклонального антитела к мышиному EphA4
Для получения моноклонального антитела, связывающегося с мышиным EphA4 (№ доступа в GenBank NP_031962.2, SEQ ID NO: 1), внеклеточную область белка мышиного EphA4 (положения 20-547) (SEQ ID NO: 2), слитую с секретируемой щелочной фосфатазой (SEAP) и гистидиновой меткой (далее в данном документе обозначаемую как "белок внеклеточной области мышиного EphA4-SEAP-His", SEQ ID NO: 43) получали при помощи следующих стадий.
2
[0130] Во-первых, последовательность ДНК, кодирующую сигнальную последовательность (SEQ ID NO: 42) и внеклеточную область (SEQ ID NO: 2) мышиного EphA4, амплифицировали при помощи RT-PCR с использованием общей РНК, полученной из мозга мыши, и клонировали в сайт SalI/NotI вектора pENTR1A (Invitrogen/Life Technologies), имеющего последовательность ДНК, кодирующую SEAP и гистидиновую метку. Затем последовательность ДНК, кодирующую сигнальную последовательность и внеклеточную область мышиного EphA4, SEAP и гистидиновую метку, переносили в вектор pcDNA3.1_rfcB при помощи LR реакции с использованием Gateway System (Invitrogen/Life Technologies) с конструированием вектора экспрессии pcDNA3.1-внеклеточная область мышиного EphA4-SEAP-His. Клетки HEK293EBNA (Invitrogen/Life Technologies) трансфицировали при помощи сконструированного вектора экспрессии pcDNA3.1-внеклеточная область мышиного EphA4-SEAP-His с использованием TransIT-LT1 (TAKARA). После инкубации (5% CO, 37°C) в течение 6 дней извлекали супернатант культуры. Из извлеченного супернатанта культуры белок внеклеточной области мышиного EphA4-SEAP-His (SEQ ID NO: 43) очищали при помощи колонки Protino (MACHEREY-NAGEL).
2
[0131] 20 мкг белка внеклеточной области мышиного EphA4-SEAP-His смешивали с одинаковым количеством адъюванта TiterMax Gold (TiterMax, США) или адъювантом GERBU (GERBU Biotechnik) и смесь вводили подкожно в подушечку стопы мыши линии Balb/c. Затем в дни 3, 7 и 10 белок внеклеточной области мышиного EphA4-SEAP-His вводили тем же способом, как описано выше. В этой процедуре адъювант TiterMax Gold (TiterMax, США) использовали только в день 10, а адъювант GERBU (GERBU Biotechnik) использовали в дни 3, 7 и 10. В день 13 мышь умерщвляли и извлекали периферический лимфатический узел для получения клеток лимфатического узла. Полученные клетки лимфатического узла и клетки миеломы P3U1 (любезно предоставленные Киотским университетом) сливали в соотношении 5:1 в присутствии GenomONE-CF (Ishihara Sangyo Kaisha). Слитые клетки культивировали в 96-луночном пластиковом планшете. После инкубации (5% CO, 37°C) в течение 7 дней извлекали супернатант культуры.
[0132] Полученный супернатант культуры использовали для захвата лунки, характеризующейся реактивностью в отношении мышиного, крысиного и человеческого EphA4 и ингибирующей активностью по отношению к связыванию между мышиным EphA4 и мышиным эфрином A1.
[0133] Реактивность в отношении мышиного, крысиного и человеческого EphA4 оценивали при помощи ELISA с использованием белка внеклеточной области мышиного EphA4, внеклеточной области (положения 20-547) крысиного EphA4 (№ доступа в GenBank NP_001155883.1) или внеклеточной области (положения 20-547) (SEQ ID NO: 4) человеческого EphA4 (№ доступа в GenBank NP_004429.1, SEQ ID NO: 3), слитых с Fc-областью человеческого IgG1 и гистидиновой меткой (далее в данном документе обозначаемых как "белок внеклеточной области мышиного EphA4-Fc-His", "белок внеклеточной области крысиного EphA4-Fc-His" или "белок внеклеточной области человеческого EphA4-Fc-His" соответственно).
2
[0134] Белок внеклеточной области мышиного, крысиного или человеческого EphA4-Fc-His получали при помощи следующих стадий. Во-первых, конструировали вектор экспрессии pcDNA3.1-внеклеточная область мышиного, крысиного или человеческого EphA4-Fc-His. Прежде всего последовательность ДНК, кодирующую сигнальную последовательность и внеклеточную область мышиного, крысиного или человеческого EphA4, амплифицировали при помощи RT-PCR с использованием общей РНК, полученной из мозга мыши, крысы или человека, и клонировали в сайт SalI/NotI вектора pENTR1A (Invitrogen/Life Technologies), содержащего последовательность ДНК, кодирующую Fc и гистидиновую метку. Затем последовательность ДНК, кодирующую сигнальную последовательность и внеклеточную область мышиного, крысиного или человеческого EphA4, Fc и гистидиновую метку, переносили в вектор pcDNA3.1_rfcB при помощи LR реакции с использованием Gateway System (Invitrogen/Life Technologies) с конструированием вектора экспрессии pcDNA3.1-внеклеточная область мышиного, крысиного или человеческого EphA4-Fc-His. Клетки HEK293EBNA (Invitrogen/Life Technologies) трансфицировали при помощи каждого из сконструированных векторов экспрессии с использованием TransIT-LT1 (TAKARA). После инкубации (5% CO, 37°C) в течение 6 дней извлекали супернатант каждой культуры.
2
4
[0135] ELISA с использованием белка внеклеточной области мышиного, крысиного или человеческого EphA4-Fc-His проводили при помощи следующих стадий. Каждую лунку 96-луночного планшета (Nunc) покрывали антителом к человеческому IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories). После инкубации в течение ночи при температуре 4°C каждую лунку блокировали с помощью 1 × BlockAce (Sumitomo Dainippon Pharma) при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания с помощью 0,02% Tween 20/PBS (Nacalai Tesque) супернатант культуры, содержащий белок внеклеточной области мышиного, крысиного или человеческого EphA4-Fc-His добавляли (конечная концентрация 1 нМ) в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания супернатант культуры слитых клеток добавляли в каждую лунку. После инкубации при комнатной температуре в течение 1 часа и последующего трехкратного промывания туда добавляли меченое пероксидазой хрена антитело к мышиному IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания в каждую лунку добавляли раствор TMBZ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин, Sigma-Aldrich) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5-20 минут. В каждую лунку добавляли равное количество раствора, останавливающего реакцию (2N HSO, Wako Pure Chemical Industries). Поглощение при длине волны 450 нм считывали при помощи микропланшетного ридера (PerkinElmer).
2
4
[0136] Ингибирующую активность по отношению к связыванию мышиного EphA4 и мышиного эфрина A1 оценивали при помощи следующих стадий. Каждую лунку 96-луночного планшета (Nunc) покрывали антителом к щелочной фосфатазе (Seradyn). После инкубации в течение ночи при температуре 4°C каждую лунку блокировали с помощью 1 × BlockAce (Sumitomo Dainippon Pharma) при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания с помощью 0,02% Tween 20/PBS (Nacalai Tesque) белок внеклеточной области мышиного EphA4-SEAP-His добавляли (конечная концентрация 10 нМ) в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания химеру эфрин A1-Fc (R&D Systems, конечная концентрация 20 нМ) и супернатант культуры слитых клеток добавляли в каждую лунку. После инкубации при комнатной температуре в течение 1 часа и последующего трехкратного промывания туда добавляли меченое пероксидазой хрена антитело к человеческому IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания в каждую лунку добавляли раствор TMBZ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин, Sigma-Aldrich) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5-20 минут. В каждую лунку добавляли равное количество раствора, останавливающего реакцию (2N HSO, Wako Pure Chemical Industries). Поглощение при длине волны 450 нм считывали при помощи микропланшетного ридера (PerkinElmer).
[0137] Из лунки, захваченной в процессе этих стадий, гибридому клонировали методом серийного разведения. В конечном итоге получали клон гибридомы, экспрессирующей мышиное антитело к EphA4, характеризующееся реакционной активностью по отношению к мышиному, крысиному и человеческому EphA4 и характеризующееся ингибирующей активностью по отношению к связыванию мышиного EphA4 и мышиного эфрина A1.
[0138] Полученный клон гибридомы культивировали и антитело к EphA4 (антитело A) очищали из супернатанта культуры при помощи белка A (GE Healthcare). Изотип антитела A определяли при помощи набора для изотипирования моноклональных антител (Serotec), и он представлял собой IgG1 для тяжелой цепи и κ для легкой цепи.
Анализ последовательности антитела A
[0139]
Последовательности ДНК, кодирующие сигнальные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи и вариабельные области антитела A, амплифицировали при помощи 5'-RACE (5'-быстрой амплификации концов cDNA). Общую РНК получали из гибридомы при помощи TRIZOL (Invitrogen/Life Technologies) и обрабатывали ДНКазой (Qiagen N.V., набор ДНКазы, не содержащий РНКазу). Двухцепочечную cDNA получали из общей РНК при помощи набора для синтеза cDNA (TAKARA). 5'-адаптор, полученный путем отжига олигоДНК ad29S (ACATCACTCCGT) (SEQ ID NO. 5) и олигоДНК ad29AS (ACGGAGTGATGTCCGTCGACGTATCTCTGCGTTGATACTTCAGCGTAGCT) (SEQ ID NO: 6), добавляли к cDNA. Полученную cDNA амплифицировали при помощи 5'-прямого праймера (праймер 5'-PCR4, AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG) (SEQ ID NO: 7), и 3'-обратный праймер (GCCAGTGGATAGACTGATGG (SEQ ID NO: 8) использовали для амплификации гена тяжелой цепи мышиного IgG, и GATGGATACAGTTGGTGCAGC (SEQ ID NO: 9) использовали для амплификации гена легкой цепи мышиного Igκ). Амплифицированную cDNA вставляли в вектор pCR2.1 (Invitrogen/Life Technologies). Последовательность гена антитела A анализировали при помощи ABI3130XL. Что касается аминокислотной последовательности, кодируемой последовательностью гена антитела A, идентифицированной при помощи данного анализа, то сигнальная последовательность тяжелой цепи показана под SEQ ID NO: 10; вариабельная область тяжелой цепи показана под SEQ ID NO: 11; сигнальная последовательность легкой цепи показана под SEQ ID NO: 12; и вариабельная область легкой цепи показана под SEQ ID NO: 13. Что касается нуклеотидной последовательности, кодирующей последовательность гена антитела A, то сигнальная последовательность тяжелой цепи показана под SEQ ID NO: 14; вариабельная область тяжелой цепи показана под SEQ ID NO: 15; сигнальная последовательность легкой цепи показана под SEQ ID NO: 16; и вариабельная область легкой цепи показана под SEQ ID NO: 17.
[0140] Полноразмерные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи антитела A получали при помощи следующих стадий. Общую РНК получали из гибридомы при помощи TRIZOL (Invitrogen/Life Technologies) и обрабатывали ДНКазой (Qiagen N.V., набор ДНКазы, не содержащий РНКазу). cDNA получали из общей РНК при помощи набора для синтеза cDNA (TAKARA). Полученную cDNA использовали в качестве матрицы в ПЦР для амплификации последовательностей гена, кодирующих тяжелую цепь и легкую цепь антитела A при помощи 5'-прямого праймера (GCGAAGCTTGCCGCCACCATGGCTTGGGTGTGGACCTTGC (SEQ ID NO: 18) использовали для амплификации гена тяжелой цепи и GCGAAGCTTGCCGCCACCATGAGTGTGCCCACTCAGGTCC (SEQ ID NO: 19) использовали для амплификации гена легкой цепи) и 3'-обратного праймера (GCGGAATTCATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC (SEQ ID NO: 20) использовали для амплификации гена тяжелой цепи и CGCGAATTCACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGAC (SEQ ID NO: 21) использовали для амплификации гена легкой цепи). Продукты амплификации клонировали в векторы pEE6.4 и pEE12.4 (Lonza) соответственно. Эти последовательности генов анализировали при помощи ABI3130XL. Что касается аминокислотной последовательности, кодируемой последовательностью гена антитела A, идентифицированной при помощи данного анализа, то константная область тяжелой цепи показана под SEQ ID NO: 22; и константная область легкой цепи показана под SEQ ID NO: 23. Что касается нуклеотидной последовательности, кодирующей последовательность гена антитела A, то константная область тяжелой цепи показана под SEQ ID NO: 24; и константная область легкой цепи показана под SEQ ID NO: 25.
[0141] CDR антитела A определяли при помощи нумерации аминокислотной последовательности антитела A с использованием компьютерной программы Abysis (UCL) согласно системе нумерации Kabat и CDR выявляли согласно способу определения Kabat или способу определения AbM на основе численных показателей. Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности CDR антитела A показаны в таблицах 1 и 2 соответственно.
[0142] [Таблица 1]
Таблица 1. Аминокислотные последовательности CDR антитела А
Название
Последовательность
CDR 1 тяжелой цепи(определение Kabat)
DYSMH (SEQ ID NO: 26)
CDR 1 тяжелой цепи(Определение AbM)
GYTFTDYSMH (SEQ ID NO: 27)
CDR 2 тяжелой цепи(определение Kabat)
WINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 28)
CDR 2 тяжелой цепи(Определение AbM)
WINTETGEPT (SEQ ID NO: 29)
CDR 3 тяжелой цепи
IPLYYYGSRYWYFDV (SEQ ID NO: 30)
CDR 1 легкой цепи
RASENIYRNLA (SEQ ID NO: 31)
CDR 2 легкой цепи
AATNLAD (SEQ ID NO: 32)
CDR 3 легкой цепи
QHFWGTPWT (SEQ ID NO: 33)
[0143] [Таблица 2]
Таблица 2. Последовательности нуклеиновой кислоты CDR антитела А
Название
Последовательность
CDR 1 тяжелой цепи(определение Kabat)
GACTATTCAATGCAC (SEQ ID NO: 34)
CDR 1 тяжелой цепи(Определение AbM)
GGTTATACCTTCACAGACTATTCAATGCAC (SEQ ID NO: 35)
CDR 2 тяжелой цепи(определение Kabat)
TGGATAAACACTGAGACTGGTGAGCCAACATATGCAGATGACTTCAAGGGA (SEQ ID NO: 36)
CDR 2 тяжелой цепи(Определение AbM)
TGGATAAACACTGAGACTGGTGAGCCAACA (SEQ ID NO: 37)
CDR 3 тяжелой цепи
ATTCCCCTCTATTACTACGGTAGTAGGTACTGGTACTTCGATGTC (SEQ ID NO: 38)
CDR 1 легкой цепи
CGAGCAAGTGAGAATATTTACAGAAATTTAGCA(SEQ ID NO: 39)
CDR 2 легкой цепи
GCTGCAACAAACTTAGCAGAT (SEQ ID NO: 40)
CDR 3 легкой цепи
CAACATTTTTGGGGTACTCCGTGGACG (SEQ ID NO: 41)
Пример 2: Аффинность связывания моноклонального антитела к EphA4 по отношению к мышиному и человеческому EphA4
[0144]
1
1
2
Аффинность связывания антитела A, полученного в примере 1, по отношению к мышиному и человеческому EphA4 определяли при помощи поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием Biacore A100 (GE Healthcare). Сначала крысиное антитело к мышиному IgG, полученное при помощи стандартной процедуры в результате иммунизации крысы мышиным антителом IgG, иммобилизовали на сенсорном чипе CM5. Иммобилизацию крысиного антитела к мышиному IgG1 на сенсорном чипе CM5 выполняли при помощи метода конъюгации аминов с использованием N-гидроксисукцинимида (NHS) и N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида хлорида (EDC). При блокировании использовали этаноламин (сенсорный чип и реагенты для иммобилизации были произведены GE Healthcare). Антитело разводили буферным раствором для иммобилизации (10 мМ ацетата натрия, pH 4,5) до 1-2 мкг/мл и иммобилизовали на сенсорном чипе согласно протоколу, прилагаемому к Biacore A100. Антитело A разводили подвижным буферным раствором HBS-EP (GE Healthcare, BR-1001-88), вводили в проточную ячейку на 120 секунд и захватывали (количество захваченного антитела примерно 70-100 RU). Затем внеклеточную область мышиного или человеческого EphA4-SEAP-His, серийно разведенного в диапазоне 50, 25, 12,5, 6,3, 3,1, 1,6, 0,8 и 0 нМ с использованием HBS-EP, добавляли к сенсорному чипу на 120 секунд. Кривые реакций связывания последовательно наблюдали во время добавления (фаза ассоциации, в течение 120 сек) и после завершения добавления (фаза диссоциации, в течение 900 сек). После завершения каждого наблюдения сенсорный чип восстанавливали добавлением 3 M MgCl (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (на 30 сек). Полученные кривые реакций связывания подгоняли под модели связывания 1:1 при помощи оценивания с использованием компьютерной программы BIA, прилагаемой к системе, для расчета аффинности связывания (KD=kd/ka) по отношению к мышиному и человеческому EphA4.
-10
-10
[0145] Аффинность связывания (KD) антитела A по отношению к мышиному и человеческому EphA4 составляла 7,29×10 M и 6,61×10 M соответственно (ФИГ. 1). Другие параметры связывания для мышиного и человеческого EphA4 были почти эквиваленты. Соответственно, считается, что антитело A характеризуется эквивалентной аффинностью связывания по отношению к мышиному и человеческому EphA4.
Пример 3. Ингибирующая активность моноклонального антитела к EphA4 по отношению к связыванию мышиного EphA4 и мышиного лиганда
[0146]
2
4,
Антитело A, полученное в примере 1, оценивали в отношении его ингибирующей активности по отношению к связыванию между мышиным EphA4 и его мышиным лигандом согласно следующим стадиям. Каждую лунку 96-луночного планшета (Nunc) покрывали антителом к щелочной фосфатазе (Thermo Fisher Scientific). После инкубирования в течение ночи при температуре 4°C, каждую лунку блокировали 1% BlockAce (DS Pharma Biomedical) при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания с помощью 0,05% Tween 20/PBS (Thermo Fisher Scientific) белок внеклеточной области мышиного EphA4-SEAP-His, полученный при помощи способа примера 1, добавляли (конечная концентрация 10 нМ) в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания лиганды и серийно разведенное антитело A (0, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,3, 10, 30, 100, 300 и 1000 нМ), или известный ингибитор EphA4 пептид KYL (KYLPYWPVLSSL, 0, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 и 100 мкМ, для его синтеза привлекали Hokkaido System Science), или соединение 1 (0, 0,03, 0,1, 0,3, 1,3, 10, 30, 100, 300 и 1000 мкМ, формула 1, Matrix Scientific) добавляли в каждую лунку. Используемыми лигандами были химера мышиный эфрин A1-Fc (R&D Systems, конечная концентрация: 20 nM) и химера мышиный эфрин B2-Fc (R&D Systems, конечная концентрация: 0,6 нМ). После инкубации при комнатной температуре в течение 1 часа и последующего трехкратного промывания туда добавляли меченое пероксидазой хрена антитело к человеческому IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания в каждую лунку добавляли раствор TMBZ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин, Sigma-Aldrich) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 минут. В каждую лунку добавляли равное количество стоп-раствора для остановки реакции (1N HSOWako Pure Chemical Industries). Поглощение при длине волны 450 нм считывали при помощи микропланшетного ридера (Molecular Devices).
[0147] Формула 1
[Формула 1]
50
50
Антитело A подавляло связывание между мышиным EphA4 и его мышиным лигандом концентрационно-зависимым образом при значениях IC, составляющих примерно 1,2 и 1,2 нМ, по отношению к связыванию с мышиными эфрином A1 и эфрином B2 соответственно. Значения IC существующего ингибитора EphA4 пептида KYL составляли примерно 1,3 и 1,3 мкМ по отношению к связыванию с мышиными эфрином A1 и эфрином B2 соответственно (ФИГ. 2). Соединение 1 характеризовалось более слабой активностью, а зависимости от концентрации обнаружено не было. Соответственно, было обнаружено, что антитело А ингибирует связывание между мышиным EphA4 и мышиным лигандом с активностью в 1000 или более раз выше, чем существующий ингибитор EphA4 пептид KYL.
Пример 4. Ингибирующая активность моноклонального антитела к EphA4 по отношению к связыванию человеческого EphA4 и человеческого лиганда
[0148]
2
4
Антитело A, полученное в примере 1, оценивали в отношении его ингибирующей активности по отношению к связыванию между человеческим EphA4 и его человеческим лигандом согласно следующим стадиям. Каждую лунку 96-луночного планшета (Nunc) покрывали антителом к щелочной фосфатазе (Thermo Fisher Scientific). После инкубирования в течение ночи при температуре 4°C, каждую лунку блокировали 1% BlockAce (DS Pharma Biomedical) при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания с помощью 0,05% Tween 20/PBS (Thermo Fisher Scientific) белок внеклеточной области человеческого EphA4-SEAP-His, полученный при помощи способа примера 1, добавляли (конечная концентрация 10 нМ) в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания лиганды и серийно разведенное антитело A (0, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 и 3000 нМ) или ингибитор EphA4 пептид KYL (KYLPYWPVLSSL, 0, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 и 3000 мкМ, для его синтеза привлекали Toray Research Center) добавляли в каждую лунку. Используемыми лигандами были химера биотинилированный мышиный эфрин A5-Fc (R&D Systems, конечная концентрация: 0,7 нM) и химера биотинилированный человеческий эфрин B3-Fc (R&D Systems, конечная концентрация: 2,3 нМ). После инкубирования при комнатной температуре в течение 1 часа и последующего трехкратного промывания туда добавляли меченный пероксидазой хрена стрептавидин (GE Healthcare) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания в каждую лунку добавляли раствор TMBZ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин, Sigma-Aldrich) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 минут. В каждую лунку добавляли равное количество раствора, останавливающего реакцию (1 н. HSO, Wako Pure Chemical Industries). Поглощение при длине волны 450 нм считывали при помощи микропланшетного ридера (Molecular Devices или PerkinElmer).
50
50
[0149] Антитело A подавляло связывание между человеческим EphA4 и его человеческим лигандом концентрационно-зависимым образом при значениях IC, составляющих примерно 2,7 и 1,9 нМ, по отношению к связыванию с человеческими эфрином A5 и эфрином B3 соответственно. Значения IC ингибитора EphA4 пептида KYL составляли примерно 6,1 и 1,6 мкМ по отношению к связыванию с человеческими эфрином A5 и эфрином B3 соответственно (ФИГ. 3). Соответственно, было обнаружено, что антитело A значительно ингибирует связывание между человеческим EphA4 и его человеческим лигандом.
Пример 5. Аффинность связывания EphA4-связывающего фрагмента по отношению к мышиному и человеческому EphA4
[0150]
2
2
Прежде всего фрагмент Fab и фрагмент F(ab') антитела A (далее в данном документе обозначаемые как антитело A-Fab и антитело A-F(ab') соответственно) получали в виде EphA4-связывающих фрагментов.
[0151] Получение антитела А-Fab выполняли согласно следующим стадиям. В пробирке на 1,5 мл (Eppendorf) смешивали антитело A (4,36 мг/мл, 1 мл), 10 мМ L-цистеина (Wako Pure Chemical Industries), 1 мМ EDTA (Gibco) и 2,18 мкг/мл папаина (Sigma-Aldrich) и инкубировали при температуре 37°C в течение 12 часов. После инкубации в пробирку добавляли иодоацетамид (Wako Pure Chemical Industries) в конечной концентрации 50 мМ. После завершения реакции раствор антитела диализировали против PBS (Sigma-Aldrich). К раствору антитела добавляли равное количество 0,1 M трис (Sigma-Aldrich)-HCl/5 M NaCl (pH 8,0, Wako Pure Chemical Industries), затем проводили очистку с использованием смолы с рекомбинантным белком А FF. Пробирку на 2 мл заполняли 800 мкл рекомбинантного белка A FF, которую затем уравновешивали добавлением по 3,5 C.V. каждого из сверхчистой воды и связывающего буфера (0,1 M трис (Sigma-Aldrich)-HCl/3 M NaCl (pH 8,0, Wako Pure Chemical Industries)) в данном порядке. Раствор антитела, дополненный равным количеством 0,1 M трис (Sigma-Aldrich)-HCl/5 M NaCl (Wako Pure Chemical Industries) (pH 8,0), вводили в колонку. Раствор, элюированный из колонки (проточная фракция) извлекали и снова добавляли в колонку. Эту операцию повторяли три раза. Затем извлекали проточную фракцию конечного цикла. Промывание повторяли дважды добавлением 2,5 мл связывающего буфера. Проточную и промывочную фракции диализировали против PBS с получением антитела A-Fab.
2
2
2
[0152] Получение антитела A-F(ab') выполняли согласно следующим стадиям. Антитело A диализировали против 0,2 M ацетатного буфера (pH 4,0, Wako Pure Chemical Industries) в течение ночи при температуре 4°C. Диализированный раствор извлекали и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм (Merck Millipore), затем количественно определяли и доводили концентрацию антитела до 4,0 мг/мл. Пепсин (Sigma-Aldrich) возвращали до состояния комнатной температуры и доводили до 2,0 мг/мл с использованием 0,2 M ацетатного буфера (pH 4,0, Wako Pure Chemical Industries). В пробирке на 1,5 мл (Eppendorf) смешивали антитело A (4,0 мг/мл, 800 мкл), раствор пепсина (2,0 мг/мл, 16 мкл) и 0,2 M ацетатный буфер (pH 4,0, Wako Pure Chemical Industries) при концентрации 64 мкл/пробирка и инкубировали при температуре 37°C в течение 15 часов. Реакцию завершали добавлением 2 M трис-основания (Sigma-Aldrich) при концентрации 112 мкл/пробирка в пробирку после инкубации. Затем молекулярные частицы подтверждали при помощи SDS-PAGE. После завершения реакции раствор антитела диализировали против 100 мМ трис-HCl (pH 8,0). Затем антитело A-F(ab') очищали с использованием рекомбинантного белка A FF (GE Healthcare, 17-1279-02). Пробирку на 5 мл заполняли 1 мл смолы с рекомбинантным белком A FF, которую затем уравновешивали добавлением по 3,5 C.V. каждого из сверхчистой воды и связывающего буфера в данном порядке. Раствор диализированного антитела, уравновешенный добавлением равного количества 0,1 M трис (Sigma-Aldrich)-HCl/5 M NaCl (pH 8,0, Wako Pure Chemical Industries) вводили в колонку. Проточную фракцию извлекали и снова добавляли в колонку. Эту операцию повторяли три раза. Затем извлекали проточную фракцию конечного цикла. После этого промывание повторяли дважды добавлением 5 мл связывающего буфера. Для удаления непрореагировавшего IgG и т.д. элюирование выполняли с использованием 0,1 M цитрата (pH 3,0, Wako Pure Chemical Industries). Затем молекулярные частицы подтверждали при помощи SDS-PAGE. Проточную и промывочную фракции диализировали против PBS с получением антитела А-F(ab').
2
[0153] После этого аффинность связывания антитела A-Fab и антитела A-F(ab') по отношению к мышиному и человеческому EphA4 определяли при помощи поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием Biacore T200 (GE Healthcare). Антитело A, полученное в примере 1, использовали в качестве контроля для сравнения каждого фрагмента. Сначала антитело к His-метке иммобилизовали на сенсорном чипе CM5. Иммобилизацию антитела к His-метке на сенсорном чипе CM5 выполняли при помощи способа конъюгации аминов с использованием N-гидроксисукцинимида (NHS) и N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (EDC). При блокировании использовали этаноламин (сенсорный чип и реагенты для иммобилизации были произведены GE Healthcare). Антитело разводили буферным раствором для иммобилизации (10 мМ ацетата натрия, pH 4,5) до 3 мкг/мл и иммобилизовали на сенсорном чипе согласно протоколу, прилагаемому к Biacore T200.
2
2
[0154] Белок внеклеточной области мышиного или человеческого EphA4-SEAP-His разводили подвижным буферным раствором HBS-EP (GE Healthcare, BR-1001-88), вводили в проточную ячейку на 120 секунд и захватывали (количество захваченного белка примерно 10-20 RU). Затем антитело A (50, 16,7, 5,6, 1,9, 0,6 и 0 нМ), антитело A-Fab (500, 166,7, 55,6, 18,5, 6,2 и 0 нМ) или антитело A-F(ab') (50, 16,7, 5,6, 1,9, 0,6 и 0 нМ), серийно разведенное с использованием HBS-EP, добавляли к сенсорному чипу на 120 секунд. Кривые реакций связывания последовательно наблюдали во время добавления (фаза ассоциации, в течение 120 сек) и после завершения добавления (фаза диссоциации, в течение 900 сек). После завершения каждого наблюдения сенсорный чип восстанавливали добавлением 3 M MgCl(Wako Pure Chemical Industries) (на 30 сек). Полученные кривые реакций связывания подгоняли под модели связывания 1:1 при помощи оценивания с использованием программного обеспечения BIA, прилагаемого к системе, для расчета аффинности связывания (KD=kd/ka) по отношению к мышиному и человеческому EphA4.
-8
-8
-11
-11
2
[0155] Аффинность связывания (KD) антитела A-Fab по отношению к мышиному и человеческому EphA4 составляла 4,51×10 M и 4,04×10 M соответственно (ФИГ. 4A и 4C). С другой стороны, аффинность связывания (KD) антитела A-F(ab') по отношению к мышиному и человеческому EphA4 составляла 2,29×10 M и 5,30×10 M соответственно (ФИГ. 4B и 4D).
Пример 6. Ингибирующая активность EphA4-связывающего фрагмента по отношению к связыванию мышиного EphA4 и мышиного лиганда
[0156]
2
2
4
Антитело A-Fab и антитело A-F(ab'), полученные в примере 5, оценивали в отношении их ингибирующей активности по отношению к связыванию между EphA4 и его лигандом согласно следующим стадиям. Каждую лунку 96-луночного планшета (Nunc) покрывали антителом к щелочной фосфатазе (Thermo Fisher Scientific). После инкубирования в течение ночи при температуре 4°C, каждую лунку блокировали 1% BlockAce (DS Pharma Biomedical) при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания с помощью 0,05% Tween 20/PBS (Thermo Fisher Scientific) белок внеклеточной области мышиного EphA4-SEAP-His, полученный при помощи способа примера 1, добавляли (конечная концентрация 10 нМ) в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания лиганд и серийно разведенное антитело A (0, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 и 3000 нМ), антитело A-Fab (0, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 и 3000 нМ), антитело A-F(ab') (0, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 и 3000 нМ) или ингибитор EphA4 пептид KYL (KYLPYWPVLSSL, 0, 0,0003, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 и 3000 мкМ, для его синтеза привлекали Toray Research Center) добавляли в каждую лунку. Используемым лигандом была химера биотилинилированный мышиный эфрин В2-Fc (R&D Systems, конечная концентрация: 2,5 нМ). После инкубации при комнатной температуре в течение 1 часа и последующего трехкратного промывания туда добавляли меченный пероксидазой хрена стрептавидин (GE Healthcare) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания в каждую лунку добавляли раствор TMBZ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин, Sigma-Aldrich) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 минут. В каждую лунку добавляли равное количество раствора, останавливающего реакцию (1 н. H2SO, Wako Pure Chemical Industries). Поглощение при длине волны 450 нм считывали при помощи микропланшетного ридера (Molecular Devices или PerkinElmer).
50
2
2
[0157] Значения IC антитела A (антитело A-IgG), антитела A-Fab, антитела A-F(ab') и пептида KYL составляли 2,6 (или 3,6) нМ, 438,5 нМ, 2,9 нМ и 5,293 мкМ соответственно (ФИГ. 5). Антитело A и антитело A-F(ab') характеризовались активностью в 1000 или более раз выше по сравнению с пептидом KYL, и антитело A-Fab также характеризовалось активностью в 10 или более раз выше по сравнению с пептидом KYL.
Пример 7. Избирательность моноклонального антитела к EphA4 по отношению к человеческому Eph-рецептору
[0158]
Согласно способу, описанному в примере 1, последовательность ДНК, кодирующую сигнальную последовательность и внеклеточную область каждого человеческого Eph-рецептора (EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4 и EphB6), амплифицировали при помощи RT-PCR с использованием полученной из тканей общей РНК и клонировали в вектор pENTR1A (Invitrogen/Life Technologies), содержащий последовательность ДНК, кодирующую Fc-область человеческого IgG1 и гистидиновую метку. Затем последовательность ДНК, кодирующую сигнальную последовательность и внеклеточную область каждого человеческого Eph-рецептора, Fc и гистидиновую метку, переносили в вектор pcDNA3.1_rfcB при помощи LR реакции с использованием Gateway System (Invitrogen/Life Technologies) с конструированием вектора для экспрессии белка внеклеточной области каждого человеческого Eph-рецептора с Fc-областью человеческого IgG1 и His-меткой (обозначаемого как «белок внеклеточной области Eph-рецептора-Fc-His») (этот вектор обозначается как «вектор экспрессии белка внеклеточной области Eph-рецептора-Fc-His»).
2
[0159] После этого клетки HEK293EBNA (Life Technologies) вносили в планшет на 10 см (Falcon) и культивировали при температуре 37°C в течение 1 дня. Клетки HEK293EBNA трансфицировали при помощи вектора экспрессии белка внеклеточной области каждого человеческого Eph-рецептора-Fc-His, полученного выше с использованием TransIT-LT1 (TAKARA). После инкубации (5% CO, 37°C) в течение 4 дней супернатант культуры извлекали и центрифугировали при 1500 об/мин при комнатной температуре в течение 5 минут. Супернатант, полученный после центрифугирования, фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм (Merck Millipore) и к нему добавляли Hepes (Dojindo Laboratories) и азид натрия (Wako Pure Chemical Industries) в конечных концентрациях 20 мМ и 0,02% соответственно.
[0160] Антитело A оценивали в отношении его активности связывания по отношению к каждому человеческому Eph-рецептору согласно следующим стадиям.
2
4
Каждую лунку 96-луночного планшета (Nunc) покрывали ослиным антителом к человеческому IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories). После инкубирования в течение ночи при температуре 4°C, каждую лунку блокировали 1% BlockAce (DS Pharma Biomedical) при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания с помощью 0,05% Tween 20/PBS (Nacalai Tesque) белок внеклеточной области каждого человеческого Eph-рецептора-Fc-His вносили (конечная концентрация 1 нМ) в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания раствор человеческого IgG (100 мкг/мл, Mitsubishi Pharma) и антитело A (10 мкг/мл) добавляли в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Туда добавляли меченое пероксидазой хрена ослиное антитело к мышиному IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания в каждую лунку добавляли раствор TMBZ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин, Sigma-Aldrich). После подтверждения появления умеренного окрашивания в каждую лунку добавляли равное количество раствора, останавливающего реакцию (1 н. HSO, Wako Pure Chemical Industries). Поглощение при длине волны 450 нм считывали при помощи микропланшетного ридера (PerkinElmer).
Антитело A, в частности, характеризовалось реакционной активностью лишь по отношению к человеческому EphA4 среди членов семейства человеческих Eph-рецепторов (ФИГ. 6A).
Пример 8. Избирательность моноклонального антитела к EphA4 по отношению к мышиному Eph-рецептору
[0161]
Согласно способу, описанному в примере 1, последовательность ДНК, кодирующую сигнальную последовательность и внеклеточную область каждого мышиного Eph-рецептора (EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4 и EphB6), амплифицировали при помощи RT-PCR с использованием полученной из тканей общей РНК и клонировали в вектор pENTR1A (Invitrogen/Life Technologies), содержащий последовательность ДНК, кодирующую Fc-область человеческого IgG1 и гистидиновую метку. Затем последовательность ДНК, кодирующую сигнальную последовательность и внеклеточную область каждого мышиного Eph-рецептора (EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4 и EphB6), Fc и гистидиновую метку, переносили в вектор pcDNA3.1_rfcB при помощи LR реакции с использованием Gateway System (Invitrogen/Life Technologies) с конструированием вектора экспрессии белка внеклеточной области каждого мышиного Eph-рецептора-Fc-His. Для конструирования вектора экспрессии белка внеклеточной области мышиного EphA2-Fc-His последовательность ДНК, кодирующую сигнальную последовательность и внеклеточную область мышиного EphA2, амплифицировали при помощи RT-PCR с использованием полученной из тканей общей РНК и клонировали в вектор pcDNA3.1, содержащий последовательность ДНК, кодирующую Fc и гистидиновую метку, с конструированием вектора экспрессии белка внеклеточной области мышиного EphA2-Fc-His.
2
[0162] После этого клетки HEK293EBNA (Life Technologies) вносили в планшет на 10 см (Falcon или BD Biosciences) и культивировали при температуре 37°C в течение 1 дня. Клетки HEK293EBNA трансфицировали при помощи вектора экспрессии белка внеклеточной области мышиного EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4 или EphB6-Fc-His, полученного, как описано выше, с использованием TransIT-LT1 (TAKARA). После инкубации (5% CO, 37°C) в течение 4 дней супернатант культуры извлекали и центрифугировали при 1500 об/мин при комнатной температуре в течение 5 минут. Супернатант, полученный после центрифугирования, фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм (Merck Millipore) и к нему добавляли Hepes (Dojindo Laboratories) и азид натрия (Wako Pure Chemical Industries) в конечных концентрациях 20 мМ и 0,02% соответственно.
[0163] Антитело A оценивали в отношении его активности связывания по отношению к каждому мышиному Eph-рецептору согласно следующим стадиям.
2
4
Каждую лунку 96-луночного планшета (Nunc) покрывали ослиным антителом к человеческому IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories). После инкубирования в течение ночи при температуре 4°C, каждую лунку блокировали 1% BlockAce (DS Pharma Biomedical) при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания с помощью 0,05% Tween 20/PBS (Thermo Fisher Scientific) белок внеклеточной области каждого мышиного Eph-рецептора-Fc-His вносили (конечная концентрация 1 нМ) в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания раствор человеческого IgG (100 мкг/мл, Sigma-Aldrich) и антитело A (10 мкг/мл) добавляли в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Туда добавляли меченое пероксидазой хрена ослиное антитело к мышиному IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания в каждую лунку добавляли раствор TMBZ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин, Sigma-Aldrich). После подтверждения появления умеренного окрашивания в каждую лунку добавляли равное количество раствора, останавливающего реакцию (1 н. HSO, Wako Pure Chemical Industries). Поглощение при длине волны 450 нм считывали при помощи микропланшетного ридера (PerkinElmer).
Антитело A, в частности, характеризовалось реакционной активностью лишь по отношению к мышиному EphA4 среди членов семейства мышиных Eph-рецепторов (ФИГ. 6В).
Пример 9. Реактивность моноклонального антитела к EphA4 по отношению к мышиному, крысиному, обезьяньему и человеческому EphA4
[0164]
2
Белки внеклеточной области мышиного, крысиного, обезьяньего и человеческого EphA4-Fc-His получали согласно следующим стадиям. Сначала согласно способу, описанному в примере 1, конструировали вектор экспрессии белка внеклеточной области обезьяньего EphA4-Fc-His. Аминокислотная последовательность обезьяньего EphA4, используемая в конструкции вектора, показана под SEQ ID NO: 44, а его внеклеточная область показана под SEQ ID NO: 45. После этого клетки HEK293EBNA (Life Technologies) высевали в планшет размером 10 см (Falcon) и культивировали при температуре 37°C в течение 1 дня. Клетки HEK293EBNA трансфицировали при помощи вектора экспрессии белка внеклеточной области EphA4-Fc-His или вектора экспрессии белка внеклеточной области мышиного EphA4, крысиного EphA4 или человеческого EphA4-Fc-His, описанных в примере Example 1, с использованием TransIT-LT1 (TAKARA). После инкубации (5% CO, 37°C) в течение 4 дней супернатант культуры извлекали и центрифугировали при 1500 об/мин при комнатной температуре в течение 5 минут. Супернатант, полученный после центрифугирования, фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм (Merck Millipore) и к нему добавляли Hepes (Dojindo Laboratories) и азид натрия (Wako Pure Chemical Industries) в конечных концентрациях 20 мМ и 0,02% соответственно.
[0165] Антитело A оценивали в отношении его активности связывания по отношению к различным Eph-рецепторам согласно следующим стадиям.
2
4
Каждую лунку 96-луночного планшета (Nunc) покрывали ослиным антителом к мышиному IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories). После инкубации в течение ночи при температуре 4°C каждую лунку блокировали с помощью 1% BlockAce (Sumitomo Dainippon Pharma) при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания с помощью 0,05% Tween 20/PBS (Nacalai Tesque) белок внеклеточной области мышиного, крысиного, обезьяньего или человеческого EphA4-Fc-His вносили (конечная концентрация 1 нМ) в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания раствор человеческого IgG (100 мкг/мл, Mitsubishi Pharma) и антитело A (0, 0,00128, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4 и 20 мкг/мл) добавляли в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Туда добавляли меченое пероксидазой хрена ослиное антитело к мышиному IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания в каждую лунку добавляли раствор TMBZ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин, Sigma-Aldrich). После подтверждения появления умеренного окрашивания в каждую лунку добавляли равное количество раствора, останавливающего реакцию (1 н. HSO, Wako Pure Chemical Industries). Поглощение при длине волны 450 нм считывали при помощи микропланшетного ридера (PerkinElmer).
[0166] Антитело A характеризовалось эквивалентной реакционной активностью по отношению ко всем из мышиного, крысиного, обезьяньего и человеческого EphA4 (ФИГ. 7).
Пример 10. Ингибирующий эффект моноклонального антитела к EphA4 на индуцированное лигандом аутофосфорилирование EphA4 в нейронах гиппокампа
[0167]
2
4
Нейроны гиппокампа крысы получали согласно следующим стадиям. Плод извлекали из беременной крысы сроком 18 дней (Charles River Laboratories Japan) и разрезали голову для выделения головного мозга. Область гиппокампа разрезали под стереоскопическим микроскопом, затем помещали в дигестирующий раствор (137 мM NaCl (Wako Pure Chemical Industries), 5 мM KCl (Wako Pure Chemical Industries), 7 мM NaHPO (Wako Pure Chemical Industries), 25 мM Hepes (Dojindo Laboratories), 0,5 мг/мл ДНКазы (Sigma-Aldrich) и 0,25% раствор трипсина (Life Technologies)) и встряхивали при температуре 37°C в течение 10 минут. Раствор удаляли и к тканям гиппокампа добавляли 20% фетальной бычьей сыворотки/буферного раствора Хенкса (Sigma-Aldrich). Раствор удаляли и ткани гиппокампа дважды промывали буферным раствором Хенкса, а затем капали из пипетки в буферный раствор Хенкса с получением клеточной суспензии. Клетки высевали в 6-луночный планшет (Falcon), покрытый раствором для культивирования, содержащим поли-L-лизин (нейробазальная среда (Life Technologies), 1 × добавку B-27 (Life Technologies) и 0,5 мM L-глутамина (Life Technologies)).
[0168] Оценку ингибирующей активности на аутофосфорилирование EphA4 с использованием нейронов гиппокампа проводили согласно следующим стадиям. Нейроны гиппокампа крысы, высеянные в 6-луночный планшет (Falcon), обрабатывали химерой мышиный эфрин A1-Fc (R&D Systems, конечная концентрация 10 нМ), антителом A (0, 1, 10, 100 и 1000 нМ) или пептидом KYL (KYLPYWPVLSSL, ингибитор EphA4, для его синтеза привлекали Hokkaido System Science, 0, 0,01, 0,1, 1, 10 и 100 мкМ) и через 45 минут промывали холодным PBS (Wako Pure Chemical Industries). Для извлечения клеток туда добавляли лизирующий буфер (20 мM трис, 150 мM NaCl, 1 мM EDTA, 1% Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries), 1 × ингибитор протеазы (Nacalai Tesque) и 1 × ингибитор фосфатазы (Nacalai Tesque)). После перемешивания при температуре 4°C в течение 15 минут супернатант извлекали с помощью охлажденного центрифугирования при 15000 об/мин при температуре 4°C в течение 15 минут. Кроличье поликлональное антитело к EphA4 (Medical & Biological Laboratories) добавляли к супернатанту и давали прореагировать в течение 90 минут. После этого туда добавляли гранулы белка G (GE Healthcare) и давали дополнительно прореагировать в течение 30 минут. Супернатант удаляли с помощью охлажденного центрифугирования при 3000 об/мин при температуре 4°C в течение 1 минуты, затем добавляли 1 мл лизирующего буфера. Эту операцию выполняли три раза. Затем 2 × буфера для образца с SDS добавляли к каждому образцу, который после этого кипятили в течение 10 минут. Этот образец использовали в SDS-PAGE и вестерн-блоттинге с использованием антитела к фосфорилированному тирозину (Santa Cruz Biotechnology). Дополнительно проводили вестерн-блоттинг с использованием моноклонального антитела к EphA4 (Abnova) и количественно определяли интенсивность полос для расчета величины отношения фосфорилированный EphA4/общий EphA4. Моноклональное антитело к EphA4 (Abnova), иммуногеном которого являлся синтетический пептид для C-концевой области человеческого EphA4, распознавалось в качестве антитела, у которого отсутствовала нейтрализующая активность по отношению к человеческому EphA4, содержащему N-концевую внеклеточную область.
50
[0169] Антитело A и пептид KYL (ингибитор EphA4) подавляли концентрационно-зависимым образом аутофосфорилирование EphA4, индуцированное мышиным эфрином A1 в нейронах гиппокампа, и значения IC составили 24,2 нМ и 9,91 мкМ соответственно (ФИГ. 8). Данные результаты показали, что антитело A антагонизирует передачу сигнала EphA4/эфрин, подобно пептиду KYL, в клеточных системах.
Пример 11. Ингибирующий эффект моноклонального антитела к EphA4 по отношению к коллапсу конуса роста в нейронах гиппокампа
[0170]
Нейроны гиппокампа крысы получали, как описано выше в примере 10. Клетки высевали в 96-луночный планшет (Greiner Bio-One), покрытый раствором для культивирования, содержащим поли-L-лизин.
[0171] Анализ коллапса конуса роста с использованием нейронов гиппокампа проводили согласно следующим стадиям. Нейроны гиппокампа дня 2 культивирования, высеянные в 96-луночный планшет (Greiner Bio-One), обрабатывали PBS (Wako Pure Chemical Industries), антителом A (0,1, 0,3 и 1 мкМ) или ингибитором EphA4 пептидом KYL (KYLPYWPVLSSL, 10, 30 и 100 мкМ, для его синтеза привлекали Toray Research Center) в течение 15 минут и затем обрабатывали химерой козье антитело к человеческому Fcγ-фрагменту IgG1 (Jackson ImmunoResearch Laboratories)-предварительно кластеризованный мышиный эфрин A1-Fc (R&D Systems, конечная концентрация 1 мкг/мл) (соотношение 1:5) в течение 30 минут. Затем раствор для культивирования удаляли, добавляли раствор 2% PFA (Wako Pure Chemical Industries)/4% сахарозы (Wako Pure Chemical Industries)/PBS и оставляли на 20 минут для фиксации клеток. Раствор удаляли и клетки промывали PBS три раза, затем добавляли 0,25% Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries)/PBS для обработки с целью проникновения в клетки в течение 15 минут. Раствор удаляли и блокировали в течение 1 часа добавлением раствора 2% BSA (Sigma-Aldrich)/0,25% Triton X-100/Opti-MEM (Life technologies), а затем обеспечивали возможность реакции с антителом к Tau-1 (Merck Millipore) и антителом к MAP-2 (Merck Millipore) в течение 2 часов. Раствор первичного антитела удаляли, промывали PBS три раза и обеспечивали возможность реакции со вторичным антителом и Alexa Fluor 546 Phalloidin (Molecular Probes) в течение 1 часа. Раствор вторичного антитела удаляли, промывали PBS три раза и затем отделяли добавлением реагентов, препятствующих выгоранию флуоресценции SlowFade Gold (Molecular Probes), и наблюдали при помощи BIOREVO (Keyence). Нейроны, образующие конус роста, подсчитывали в 30 полях зрения на образец для расчета части нейронов, вызывающих коллапс конуса роста.
[0172] Антитело A и ингибитор EphA4 пептид KYL подавляли концентрационно-зависимым образом коллапс конуса роста, индуцированный мышиным эфрином A1, в нейронах гиппокампа (ФИГ. 9). Соответственно, показано, что антитело A функционально ингибирует EphA4, подобно пептиду KYL, в клеточных системах.
Пример 12. Антагонистический эффект моноклонального антитела к EphA4 на лиганды in vivo
[0173]
in vivo
Конкурентный анализ с использованием новорожденных мышей проводили согласно следующим стадиям. PBS (Wako Pure Chemical Industries), антитело A или контрольное антитело (мышиное антитело к динитрофенолу), полученные при помощи стандартной процедуры иммунизации крысы динитрофенолом, вводили подкожно в дозе 300 мг/кг (30 мл/кг) каждой мыши в возрасте 8 дней (Charles River Laboratories Japan). Через 24 часа скальп разрезали под анестезией 4% изофлураном (Intervet) и в боковой желудочек вводили химеру мышиный эфрин A1-Fc (300 пмоль/голова, R&D Systems) или PBS (Wako Pure Chemical Industries). Через 1 час мышь подвергали эвтаназии путем декапитации, затем иссекали полушарие головного мозга. Полученное полушарие головного мозга помещали в фильтровальную пробирку, вставленную в пробирку для экстрагирования от BioMasher(R) I (Nippi). После введения стержня дробилки полушарие головного мозга гомогенизировали с помощью охлажденного центрифугирования при 15000 об/мин при температуре 4°C в течение 2 минут. Гомогенат суспендировали в буфере TNE (20 мM трис, 150 мM NaCl, 1 мM EDTA, 1 × ингибитор протеазы (Nacalai Tesque), 1 × ингибитор фосфатазы (Nacalai Tesque)). 3 × буфер для образца с SDS добавляли к части гомогената, который затем кипятили в течение 10 минут, затем проводили количественное определение белка. Этот образец использовали в SDS-PAGE и вестерн-блоттинге с использованием ослиного антитела к человеческому IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories), моноклонального антитела к EphA4 (Abnova) и антитела к актину (Sigma-Aldrich). В оставшемся гомогенате проводили количественное определение белка и затем его распределяли в количестве, соответствующем 3 мг белка, туда добавляли 1% Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries) и 0,1% SDS (Nacalai Tesque). После перемешивания при температуре 4°C в течение 15 минут супернатант извлекали с помощью охлажденного центрифугирования при 15000 об/мин при температуре 4°C в течение 15 минут. 3 × буфер для образца с SDS добавляли к части супернатанта, который затем кипятили в течение 10 минут для получения входного образца. Этот образец использовали в SDS-PAGE и вестерн-блоттинге с использованием моноклонального антитела к EphA4 (Abnova) и антитела к актину (Sigma-Aldrich). Кроличье поликлональное антитело к EphA4 (Santa Cruz Biotechnology) добавляли к оставшемуся супернатанту и обеспечивали возможность реакции в течение 60 минут. После этого туда добавляли гранулы белка G (GE Healthcare) и давали дополнительно прореагировать в течение 30 минут. Супернатант удаляли с помощью охлажденного центрифугирования при 3000 об/мин при температуре 4°C в течение 2 минут, затем добавляли 0,5 мл лизирующего буфера (20 мM трис, 150 мM NaCl, 1 мM EDTA, 1% Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries), 0,1% SDS (Nacalai Tesque), 1 × ингибитор протеазы (Nacalai Tesque), 1 × ингибитор фосфатазы (Nacalai Tesque)). Эту операцию выполняли три раза. Затем 1 × буфер для образца с SDS добавляли к гранулам, которые затем кипятили в течение 10 минут для получения образца гранул. Этот образец использовали в SDS-PAGE и вестерн-блоттинге с использованием антитела к фосфорилированному тирозину (Santa Cruz Biotechnology). Дополнительно проводили вестерн-блоттинг с использованием моноклонального антитела к EphA4 (Abnova) и количественно определяли интенсивность полос для расчета величины отношения фосфорилированный EphA4/общий EphA4. Моноклональное антитело к EphA4 (Abnova), иммуногеном которого являлся синтетический пептид для C-концевой области человеческого EphA4, распознавалось в качестве антитела, у которого отсутствовала нейтрализующая активность по отношению к человеческому EphA4, содержащему N-концевую внеклеточную область.
in vivo
[0174] Введение мышиного эфрина A1 в боковой желудочек новорожденной мыши индуцировало аутофосфорилирование EphA4 в полушарии головного мозга. Антитело A подавляло индуцированное мышиным эфрином A1 аутофосфорилирование EphA4 на 66% (ФИГ. 10). Соответственно, показано, что антитело A также ингибирует связывание между EphA4 и его лигандом .
Пример 13. Защитный эффект моноклонального антитела к EphA4 в отношении двигательных нейронов в модели ALS
, полученных из мышиных ES-клеток
in vitro
[0175]
2
2
Мышиные ES-клетки поддерживали и культивировали согласно следующим стадиям. Мышиные ES-клетки (129×1/SvJ), криоконсервированные при температуре -80°C, размораживали в термостатической бане и затем разводили средой для культивирования мышиных ES-клеток (KnockOut(TM) DMEM (Gibco), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Gibco), 0,1 мM β-меркаптоэтанола (Gibco), 1 мM пирувата натрия (Invitrogen), 2 мM L-глутамина (Invitrogen), 1% заменимых аминокислот (Invitrogen), 100 единиц/мл пенициллина-100 мкг/мл стрептомицина (Invitrogen) и 1000 единиц/мл фактора, ингибирующего лейкемию, ESGRO(R) (Merck Millipore)), подогретой до 37°C. Каждую клеточную суспензию центрифугировали (1500 об/мин, 3 минуты, комнатная температура), затем удаляли супернатант. Клетки суспендировали в свежей среде, затем переносили в планшет для культивирования с питающими клетками, высеянными заранее, поддерживали и культивировали в CO-инкубаторе (5% CO, 37°C).
2
2
[0176] Астроциты извлекали из новорожденной мыши, поддерживали и культивировали согласно следующим стадиям. Новорожденную мышь дикого типа в возрасте двух дней (C57BL/6JJmsSlc (Japan SLC)) и гибридную новорожденную мышь, полученную от мыши дикого типа и мыши с вариантом человеческого SOD1 (G93A) Tg-(B6.Cg-Tg(SOD1_G93A)1Gur/J (Jackson ImmunoResearch Laboratories)) подвергали эвтаназии путем ингаляционной анестезии с изофлураном (Intervet) или декапитации. После этого у каждой мыши отделяли кору головного мозга и диспергировали при помощи обработки 0,25% трипсином-EDTA (Invitrogen) при температуре 37°C в течение 15 минут. После ферментативной обработки клетки разводили 4 мл модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (Gibco), содержащей 10% FBS (Gibco) и 1% пенициллина-стрептомицина (Invitrogen) (10% FBS-DMEM), для завершения ферментативного расщепления. Затем примеси, отличные от единичных клеток, подвергали фильтрации при помощи клеточного сита (BD Biosciences), и клетки центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут. Супернатант отсасывали, разводили 4 мл свежего 10% FBS-DMEM, вносили в чашку для культивирования на 60 мм на индивидуальной основе и культивировали при температуре 37°C. Через два дня после внесения среду отсасывали и заменяли добавлением 4 мл свежего 10% FBS-DMEM. После достижения конфлюентности супернатант культуры, содержащий неприкрепленные клетки, извлекали и подвергали генотипированию в отношении измененной человеческой SOD1 (G93A). 2 мл PBS (Wako Pure Chemical Industries) вновь добавляли к супернатанту и повторно отсасывали. 1 мл 0,25% трипсина-EDTA добавляли к клеткам и инкубировали при температуре 37°C в течение 3 минут. Ферментативную обработку завершали добавлением 3 мл 10% FBS-DMEM и клетки центрифугировали при 1500 об/мин в течение 3 минут. После центрифугирования среду отсасывали и к клеткам добавляли 6 мл свежей 10% FBS-DMEM, каждую из которых вводили в чашку для культивирования на 100 мм и субкультивировали (количество пассажей 2). После достижения конфлюентности среду отсасывали, затем к клеткам добавляли 3 мл PBS (Wako Pure Chemical Industries) и отсасывали повторно. 2 мл 0,25% трипсина-EDTA добавляли к клеткам и инкубировали при температуре 37°C в течение 3 минут. Ферментативную обработку завершали добавлением 4 мл 10% FBS-DMEM и клетки центрифугировали при 1500 об/мин в течение 3 минут. После центрифугирования среду отсасывали и к клеткам добавляли 12 мл свежей 10% FBS-DMEM, затем 6 мл из которой вводили в чашку для культивирования на 100 мм и субкультивировали (количество пассажей 3). Среду для культивирования астроцитов после 3 пассажа отсасывали, к клеткам добавляли 2 мл PBS (Wako Pure Chemical Industries) и отсасывали повторно. 2 мл 0,25% трипсина-EDTA добавляли к клеткам и инкубировали при температуре 37°C в течение 3 минут. Ферментативную обработку завершали добавлением 4 мл 10% FBS-DMEM. Суспензию извлекали, центрифугировали при 1500 об/мин в течение 3 минут, разводили Cell banker (Nippon Zenyaku Kogyo) и криоконсервировали при температуре -80°C до выполнения исследования. При выполнении исследования каждую суспензию криоконсервированных клеток размораживали в термостатической бане и затем разводили 10% FBS-DMEM, нагретой до 37°C. После центрифугирования (1500 об/мин, 3 минуты, комнатная температура) каждой клеточной суспензии супернатант удаляли, клетки суспендировали в свежей среде, затем вносили в 8-луночную камеру (ibidi), поддерживали и культивировали в CO инкубаторе (5% CO, 37°C).
[0177] Генотипирование измененной человеческой SOD1 (G93A) проводили с использованием набора для ПЦР тканей REDExtract-N-Amp(TM) (Sigma-Aldrich). На стадии поддержания и культивирования мышиных ES клеток супернатант культуры, содержащий неприкрепленные клетки астроцитов, экспрессирующих измененную человеческую SOD1 (G93A), извлеченные во время субкультивирования, извлекали в пробирку на 1,5 мл и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 3 минут. После центрифугирования супернатант отсасывали, клетки промывали добавлением 1 мл PBS и центрифугировали повторно, затем отсасывали PBS. 50 мкл экстрактного раствора и 12,5 мкл раствора препарата ткани смешивали и добавляли в каждый образец. После смешивания смесь переносили в пробирку для полимеразной цепной реакции (ПЦР), затем проводили экстракцию генома в цикле с температурой 55°C в течение 10 минут → температуры 95°C в течение 3 минут → температуры 4°C ∞ с использованием GeneAmp(R)PCR system 9700 (Applied Biosystems(R)). Затем реакционный раствор нейтрализовали добавлением 50 мкл нейтрализующего раствора В.
[0178] Экстрагированный геном использовали в ПЦР генома согласно композиции, показанной в таблице 3. Праймерные последовательности, используемые в ПЦР, показаны в таблице 4. Каждый полученный в результате продукт ПЦР подвергали электрофорезу на 1% агарозном геле при 100 V в течение 20 минут. Обнаруженные образцы с двумя полосками с внутренним стандартом из 324 п.о. и измененной человеческой SOD1 (G93A) из 236 п.о. выявляли в качестве астроцитов, экспрессирующих измененную человеческую SOD1 (G93A).
[0179] [Таблица 3]
Таблица 3. ПЦР-смесь для геномной ДНК
Название реагента
Объем жидкости
Матрица:
1 мкл
Смесь Red:
5 мкл
Праймер 1 (100 мкмоль/л)
0,05 мкл
Праймер 2 (100 мкмоль/л)
0,05 мкл
Праймер 3 (100 мкмоль/л)
0,05 мкл
Праймер 4 (100 мкмоль/л)
0,05 мкл
Дистиллированная вода
3,8 мкл
Всего:
10 мкл
Смесь Red=смесь для реакции ПЦР REDExtract-N-Amp
[0180] [Таблица 4]
Таблица 4. Нуклеотидные последовательности праймеров
Праймер 1
Вариант человеческойSOD1 (G93A)
CATCAGCCCTAATCCATCTGA
Праймер 2
Вариант человеческойSOD1 (G93A)
CGCGACTAACAATCAAAGTGA
Праймер 3
Внутренний стандарт
CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT
Праймер 4
Внутренний стандарт
GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC
in vitro
5
[0181] Защитный эффект в отношении двигательных нейронов в моделях ALS  оценивали согласно следующим стадиям. Культивируемые и поддерживаемые мышиные ES клетки обрабатывали раствором 0,25% трипсина/0,05% EDTA (Gibco) для отсоединения клеток от чашки для культивирования. Клетки извлекали при помощи центрифугирования, затем получали суспензию и вводили при концентрации 1,2×10 клеток/мл в 12-луночный планшет с низкой адсорбцией (Nunc) (день 0). Плавающую культуру агрегатов поддерживали в течение 2 дней в среде DFK (улучшенная среда DMEM/F-12 (Invitrogen):нейробазальная среда (Invitrogen) [1:1], содержащая 5% заменителя сыворотки KnockOut (Invitrogen), 2 мM L-глутамина, 100 единиц/мл пенициллина-100 мкг/мл стрептомицина и 0,1 мM β-меркаптоэтанола). В день 2 среду DFK заменяли средой DFK, содержащей 1 мкМ ретиноевой кислоты (Sigma-Aldrich) и 2 мкМ пурморфамина (Stemgent). Затем замену среды выполняли с частотой раз в два дня. Дифференцировку в двигательные нейроны индуцировали культивированием в течение 5 дней (3-7 дни).
5
[0182] На 7 день клеточные массы дифференцированных двигательных нейронов помещали в раствор для диспергирования клеток Accumax (MS Tech) и превращали в суспензии, имеющую плотность клеток, составляющую 5,5×10клеток/мл. Суспензию вводили в концентрации 200 мкл/лунка в 8-луночную камеру, содержащую культивированные астроциты, полученные от мыши дикого типа или астроциты, экспрессирующие измененную человеческую SOD1 (G93A) и поддерживаемые заранее, а полученные в результате кокультивированные клетки астроцитов и двигательных нейронов использовали для оценивания.
2
[0183] Число двигательных нейронов, наблюдаемое при кокультивировании астроцитов дикого типа и двигательных нейронов, использовали в качестве контроля. Для группы с обработкой лекарственным препаратом астроциты, экспрессирующие измененную человеческую SOD1 (G93A), и двигательные нейроны кокультивировали при условии, включающем добавление носителя (IgG и 0,1% сверхчистой воды), антитела A (10, 30 и 100 нМ), EphA4-Fc (R&D Systems, 3, 10 и 30 нМ) или пептида KYL (Toray Research Center, 1, 3 и 10 мкМ). После культивирования в течение 2 дней при температуре 37°C в среде 5% CO при каждом условии двигательные нейроны окрашивали иммуногистохимически антителом к кроличьему ISL1 (Abcam) и Hoechst 33342 (Molecular Probes). ISL1/Hoechst 33342-коположительные клетки на единицу площади подсчитывали в качестве живых двигательных нейронов, а уровень выживаемости двигательных нейронов рассчитывали в виде процента (%) по отношению к контролю. На ФИГ.11 показано простое схематическое изображение, показывающее стадии в системе оценивания.
[0184] Уровень выживаемости двигательных нейронов был значимо снижен в кокультуре астроцитов, экспрессирующих измененную человеческую SOD1 (G93A)/двигательных нейронах, полученных из мышиных ES клеток (40-50%). Антитело A подавляло концентрационно-зависимым образом гибель двигательных нейронов, полученных из мышиных ES клеток, индуцированную астроцитами, экспрессирующими измененную человеческую SOD1 (G93A) (ФИГ.12). Было подтверждено, что обработка пептидом KYL или EphA4-Fc, как и антителом A, имеет защитный эффект в отношении двигательных нейронов в этой экспериментальной системе, показывая, что антитело A способствует выживанию двигательных нейронов, полученных из мышиных ES клеток, в результате подавления передачи сигнального пути EphA4/эфрин в этой модели ALS in vitro.
Пример 14: Защитный эффект моноклонального антитела к EphA4 в отношении двигательных нейронов в модели ALS
, полученных из человеческих iPS клеток
in vitro
[0185]
2
2
2,
Человеческие iPS клетки поддерживали и культивировали согласно следующим стадиям. Человеческие iPS-клетки (201B7), криоконсервированные в жидком азоте с использованием сита для стволовых клеток (TAKARA), извлекали из газовой фазы жидкого азота, сразу же суспендировали и размораживали в 5 мл среды для культивирования человеческих iPS-клеток (Essential 8, Thermo Fisher Scientific), предварительно нагретой до 37°C. Клеточную суспензию извлекали в коническую пробирку на 15 мл (Falcon) и центрифугировали (1000 об/мин, 5 минут, комнатная температура), затем удаляли супернатант. Клетки суспендировали в свежей среде и затем переносили в чашку для культивирования клеток на φ60 мм (Falcon BD), заранее покрытую 0,5 мкг/см человеческим рекомбинантным витронектином (Invitrogen). Туда добавляли 10 мкМ Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries), а клетки поддерживали и культивировали в CO инкубаторе (5% CO 37°C). Замену среды выполняли каждый день и при достижении конфлюентности клетки подвергали эксперименту.
in vitro
2
2
2
2
2
2
2
2
2
5
4
[0186] Защитный эффект в отношении двигательных нейронов в моделях ALS  оценивали согласно следующим стадиям. Среду для культивирования поддерживаемых и культивируемых человеческих iPS клеток отсасывали и клетки промывали 2 мл PBS (Wako Pure Chemical Industries). После отсасывания PBS 500 мкл 0,5 мM EDTA добавляли к клеткам, которые затем инкубировали в течение 2-3 минут в CO-инкубаторе (5% CO, 37°C) (клетки верифицировали под микроскопом каждые 30 секунд и инкубирование прекращали при ослаблении внутриклеточной связи). Реакцию с EDTA завершали суспендированием в 5 мл среды для культивирования человеческих iPS клеток и клетки извлекали в коническую пробирку на 15 мл. Клетки центрифугировали при 1000 об/мин при комнатной температуре в течение 5 минут и супернатант отсасывали. Клеточную суспензию, содержащую массы человеческих iPS-клеток, вводили в количестве, составляющем примерно 1/10 на лунку, в 6-луночный планшет для культивирования клеток с низкой адгезией (Nunclon Sphere, Nunc) и культивировали в CO-инкубаторе (5% CO, 37°C) с использованием среды DFK (улучшенная среда DMEM/F-12 (Invitrogen):нейробазальная среда (Invitrogen) [1:1], содержащая 2% добавки B27, 5% заменителя сыворотки KnockOut (Invitrogen), 2 ммоль/л L-глутамина, 100 единиц/мл пенициллина-100 мкг/мл стрептомицина и 0,1 ммоль/л β-меркаптоэтанола), дополненной 2 мкМ SB431542 (Sigma-Aldrich), 300 нМ LDN193189 (Sigma-Aldrich) и 3 мкМ CHIR99021 (Sigma-Aldrich). Замену среды выполняли через каждые 2 дня при помощи следующего способа. Прежде всего агрегаты дифференцированных клеток, полученные из человеческих iPS клеток (SFEB), извлекали на основание среды в коническую пробирку на 15 мл и оставляли при обычной температуре на 5 минут для осаждения клеточных масс. Этот супернатант отсасывали, добавляли свежую среду DFK и 2 мкМ SB431542 (Sigma-Aldrich), 300 нМ LDN193189 (Sigma-Aldrich, 3 мкМ CHIR99021 (Sigma-Aldrich) и затем возвращали в исходную лунку для замены среды. В день 8 культивирования SFEB извлекали на основу среды в коническую пробирку на 15 мл и оставляли при обычной температуре на 5 минут для осаждения SFEB. Этот супернатант отсасывали, добавляли свежую среду DFK и затем 0,1 мкМ ретиноевой кислоты (Sigma-Aldrich) и 0,5 мкМ пурморфамина (Miltenyi Biotec), затем возвращали в исходную лунку и культивировали в CO инкубаторе (5% CO, 37°C). Замену среды выполняли через каждые 2 дня. В день 12 культивирования SFEB извлекали на основу среды в коническую пробирку на 15 мл и оставляли при обычной температуре на 5 минут для осаждения SFEB. Супернатант отсасывали, 500 мкл Accumax (MS TechnoSystems) добавляли к клеткам, которые затем пипетировали несколько раз и затем инкубировали в течение 5 минут в CO-инкубаторе (37°C, 5% CO). Клетки извлекали из инкубатора, суспендировали в 5 мл среды DFK и капали из пипетки несколько раз для распределения клеточных масс. Клеточную суспензию разделяли на отдельные клетки при помощи фильтрации через клеточное сито (Falcon). Затем при помощи счетной камеры подсчитывали количество клеток. Клеточную суспензию извлекали в другую коническую пробирку на 15 мл и центрифугировали при 1000 об/мин при комнатной температуре в течение 5 минут. Суспензию, имеющую плотность клеток, составляющую 5,5×10 клеток/мл, получали с использованием среды для культивирования двигательных нейронов (улучшенная среда DMEM/F-12 (Invitrogen):нейробазальная среда (Invitrogen) [1:1], содержащая 2% добавки B27, 1% лошадиной сыворотки, 2 ммоль/л L-глутамина, 100 единиц/мл пенициллина-100 мкг/мл стрептомицина и 0,1 ммоль/л β-меркаптоэтанола) и вводили в концентрации 200 мкл/лунку в 8-луночную камеру, содержащую астроциты дикого типа, полученные от мыши, или астроциты, экспрессирующие вариант человеческой SOD1 (G93A), заранее введенные в концентрации 8×10 клеток/лунку. Полученные совместно культивированные клетки астроцитов и двигательных нейронов использовали при оценивании (получение, замораживание, размораживание, внесение, поддержание и культивирование астроцитов дикого типа и астроцитов, экспрессирующих вариант человеческой SOD1 (G93A), выполняли так же, как и в примере 13). Число двигательных нейронов, наблюдаемое при кокультивировании астроцитов дикого типа и двигательных нейронов, использовали в качестве контроля. Для группы с обработкой лекарственным препаратом астроциты, экспрессирующие измененную человеческую SOD1 (G93A), и двигательные нейроны кокультивировали при условии, включающем добавление носителя (IgG и 0,1% сверхчистой воды), антитела A (10, 30 и 100 нМ), ингибитора EphA4 пептида KYL (KYLPYWPVLSSL, 1, 3 и 10 мкМ, для его синтеза привлекали Toray Research Center) или EphA4-Fc (3, 10 и 30 нМ, R&D systems). После культивирования в течение 2 дней при температуре 37°C в среде 5% CO при каждом условии двигательные нейроны окрашивали иммуногистохимически антителом к ISL1 (полученному из банка гибридом для исследований развития) и Hoechst 33342 (Molecular Probes). ISL1/Hoechst 33342-коположительные клетки на лунку подсчитывали в качестве живых двигательных нейронов, а уровень выживаемости двигательных нейронов рассчитывали в виде % по отношению к контролю. На ФИГ.13 показано простое схематическое изображение, показывающее стадии в системе оценивания.
[0187] Уровень выживаемости двигательных нейронов был значимо снижен (примерно на 50%) в кокультуре астроцитов, экспрессирующих измененную человеческую SOD1 (G93A)/двигательных нейронов, полученных из человеческих iPS клеток, как и в системе анализа с использованием мышиных ES клеток. Антитело A подавляло концентрационно-зависимым образом гибель двигательных нейронов, полученных из человеческих iPS клеток, индуцированную астроцитами, экспрессирующими измененную человеческую SOD1 (G93A) (ФИГ.14). Было подтверждено, что обработка пептидом KYL или EphA4-Fc, как в случае с антителом A, оказывало защитный эффект в отношении двигательных нейронов, полученных из человеческих iPS, в этой экспериментальной системе. Соответственно, показано, что антитело A также способствует выживанию двигательных нейронов в результате ингибирования связывания между EphA4 и его лигандом in vivo.
Пример 15: Картирование эпитопа лиганд-связывающего домена EphA4 (EphA4-LBD) при помощи рентгеноструктурной кристаллографии
[0188]
Для получения антитела A-Fab, полученного в примере 5, и антигена EphA4-LBD, получали EphA4-LBD (Qin H. et al., J. Biol. Chem., 283: 29473-29484 (2008)). 1,33⋅моль (950⋅M, 1,4 мл) EphA4-LBD и 0,9⋅моль (150⋅M, 6 мл) антитела A-Fab смешивали таким образом, чтобы EphA4-LBD имел примерно в 1,5 раза большее молярное отношение, чем антитело A-Fab. Смесь инкубировали на льду в течение 30 минут. После этого смешанный раствор наносили на HILOAD 26/60 Superdex 75 prep grade (GE Healthcare), затем элюировали буферным раствором для хроматографии (25 мM Tris/HCl (pH 7,5), 100 мM NaCl). Фракции, содержащие комплекс, анализировали при помощи SDS PAGE, фракции высокой чистоты собирали и концентрировали до 34 мг/мл. Данный концентрат использовали в кристаллизации.
[0189] Кристаллизацию комплекса выполняли при помощи метода диффузии паров в сидячей капле с использованием автоматического кристаллизационного препарата системы Hydra II Plus One (Matrix Technologies). Использовали пластину MRC-2 (Molecular Dimensions). Состав резервуарвного раствора представлял собой 100 мM Tris/HCl (pH 7,5-8,5) и 30% полиэтиленгликоль 400. Этот резервуарвный раствор и раствор комплекса, описанный выше, смешивали в объемном отношении 1:1 с получением кристаллизационных капель. Полученную кристаллизационную пластину оставляли при температуре 20°C.
[0190] В результате осуществления кристаллизации в условиях, описанных выше, получали кристаллы, имеющие пространственную группу из P212121, период кристаллической решетки a, составляющий 70,0 ангстрем, период кристаллической решетки b, составляющий 82,3 ангстрем и период кристаллической решетки c, составляющий 216,0. Дифракционные данные при 2,1 ангстремах получали при помощи рентгеновских лучей в синхротоне (1,0 ангстрем) по отношению к полученным кристаллам. Дифракционные данные обрабатывали с использованием HKL2000 (HKL Research Inc.), а фазовое определение выполняли при помощи метода молекулярного замещения. Для метода молекулярного замещения использовали программу PHASER (версия 2.5.0, McCoy A.J. et al., J. Appl. Cryst. 40: 658-674 (2007)), содержащуюся в пакете программ CCP4 (Collaborative computational project number 4, [CCP4] version 6.5.0, Acta Cryst. D 67: 235-242 (2011)). Поисковые модели, используемые в методе молекулярного замещения, представляли собой кристаллическую структуру (PDBID:3CKH) EphA4-LBD и кристаллическую структуру Fab другого антитела, определенного в прошлом авторами настоящего изобретения. Молекулярную модель, подходящую для электронной плотности, полученной из определяемой фазы, конструировали при помощи программы COOT (Emsley P. et al., Acta Cryst. D 60: 2126-2132 (2004)) и выполняли утончение структуры при помощи программы REFMAC (Murshudov G.N., Acta Cryst. D 53: 240-255 (1997)).
В этом отношении кристаллическую структуру комплекса, имеющую разрешение, составляющее 2,1 ангстрема, получали при помощи расчета структуры (R=0,234, Rfree=0,288).
[0191] Полученную кристаллическую структуру комплекса Fab/EphA4-LBD анализировали при помощи средства обнаружения взаимодействия, инсталлированного в вычислительную химическую систему MOE 2011.10 (Chemical Computing Group Inc.) для идентификации аминокислотных остатков EphA4-LBD, непосредственно взаимодействующих с Fab (ФИГ.15). Использовали стандартные настройки MOE в виде протокола обнаружения. Выявленными аминокислотными остатками были Ser58, Met60, Gln71, Val72, Cys73, Thr104, Arg106, Gln156, Asp161, Arg162, Ile163, Cys191 и Ile192. На ФИГ.16 показана поверхностная структура EphA4-LBD, полученная при помощи Maestro (версия 10.6, Schrodinger). В результате авторы настоящего изобретения сделали заключение, что области, имеющие эти аминокислотные остатки, представляют собой Fab-связывающие области EphA4-LBD.
Пример 16: Получение гуманизированного антитела из антитела A
[0192]
Получение гуманизированного антитела к человеческому EphA4
2
1
2
Конструировали вариабельные области каждого гуманизированного антитела. На основе высокой гомологии каркасных областей (FR) антитела A FR легкой цепи человеческого антитела IGKV1-NL1*01 (SEQ ID NO: 50) или IGKV3D-15*01 (SEQ ID NO: 51) и JK1 (SEQ ID NO: 52) и FR тяжелой цепи IGHV7-4-1*02 (SEQ ID NO: 53) и JH6 (SEQ ID NO: 54) выбирали в качестве FR гуманизированного антитела. Затем аминокислоты FR, взаимодействующие с аминокислотами CDR, вычисляли при помощи модели прогнозирования трехмерной структуры мышиного антитела A и использовали при привитии CDR (SEQ ID NO: 26-30 и 31-33). С учетом усиления фосфорилирования EphA4 и активности ADCC константную область тяжелой цепи человеческого IgG (SEQ ID NO: 62), которая имела мутации C131S, C219S, V234A и G237A и в которой отсутствовал C-концевой лизиновый остаток, или константную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 60), которая содержала CH1 и шарнирную область, полученную из человеческого IgG, CH2 и CH3, полученные из человеческого IgG, содержащую мутации V234A и G237A и в которой отсутствовал C-концевой лизиновый остаток, использовали в качестве константной области тяжелой цепи. Константную область легкой цепи человеческого Igκ (SEQ ID NO: 64) использовали в качестве констатной области легкой цепи. HK1 (SEQ ID NO: 72), HK2 (SEQ ID NO: 74) и HK4 (SEQ ID NO: 76) разрабатывали в качестве вариабельных областей тяжелой цепи гуманизированного антитела, несущих привитые CDR (SEQ ID NO: 26, 28 и 30), определяемые по методу определения Kabat. HA1 (SEQ ID NO: 66), HA2 (SEQ ID NO: 68) и HA4 (SEQ ID NO: 70) разрабатывали в качестве вариабельных областей тяжелой цепи гуманизированного антитела, несущих привитые CDR (SEQ ID NO: 27, 29 и 30), определяемые по методу определения AbM. L1-4 (SEQ ID NO: 78), L1-5 (SEQ ID NO: 80) и L1-6 (SEQ ID NO: 82) разрабатывали в качестве вариабельных областей легкой цепи гуманизированного антитела с использованием IGKV1-NL1*01 и JK1. L2-4 (SEQ ID NO: 84) разрабатывали в качестве вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела с использованием IGKV3D-15*01 и JK1. Случайным образом при разработке константных областей тяжелой цепи фосфорилирование EphA4 подтверждали тем же путем, как описано в примере 10.
2
1
2
[0193] Последовательность гена, кодирующую аминокислотную последовательность HK1, HK2 или HK4, синтезировали при помощи превращения аминокислотной последовательности CDR тяжелой цепи (SEQ ID NO: 26, 28 и 30) антитела A, привитого в IGHV7-4-1*02 (SEQ ID NO: 53) и JH6 (SEQ ID NO: 54) с сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 55), дополнительно добавленной к N-концу, в последовательность гена согласно GenScript USA Inc., и полученной при помощи ПЦР-мутагенеза (HK1: SEQ ID NO: 73, HK2: SEQ ID NO: 75, HK4: SEQ ID NO: 77, сигнальная последовательность SEQ ID NO: 57). Последовательность гена, кодирующую аминокислотную последовательность HA1, HA2 или HA4, синтезировали при помощи превращения аминокислотной последовательности CDR тяжелой цепи (SEQ ID NO: 27, 29 и 30) антитела A, привитого в IGHV7-4-1*02 (SEQ ID NO: 53) и JH6 (SEQ ID NO: 54) с сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 55), дополнительно добавленной к N-концу, в последовательность гена согласно GenScript USA Inc., и полученной при помощи ПЦР-мутагенеза (HA1: SEQ ID NO: 67, HA2: SEQ ID NO: 69, HA4: SEQ ID NO: 71, сигнальная последовательность SEQ ID NO: 56). Гены, кодирующие эти вариабельные области тяжелой цепи гуманизированного антитела и сигнальные последовательности, вводили в векторы экспрессии (pcDNA3.4), содержащие последовательность гена (SEQ ID NO: 63), кодирующего константную область человеческого IgG (SEQ ID NO: 62), которая имела мутации C131S, C219S, V234A и G237A и у которой отсутствовал C-концевой лизиновый остаток, или векторы экспрессии (pcDNA3.4), содержащие последовательность гена (SEQ ID NO: 61), кодирующего константную область (SEQ ID NO: 60), которая содержала CH1 и шарнир, полученные из человеческого IgG, и CH2 и CH3, полученные из человеческого антитела IgG, имеющую мутации dV234A и G237A. Последовательность гена, кодирующую аминокислотную последовательность L1-4, L1-5 или L1-6, синтезировали при помощи превращения аминокислотной последовательности CDR легкой цепи (SEQ ID NO: 31-33) антитела A, привитого в IGKV1-NL1*01 (SEQ ID NO: 50) и JK1 (SEQ ID NO: 52) с сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 58), дополнительно добавленной к N-концу, в последовательность гена согласно GenScript USA Inc., и полученной при помощи ПЦР-мутагенеза (L1-4: SEQ ID NO: 79, L1-5: SEQ ID NO: 81, L1-6: SEQ ID NO: 83, сигнальная последовательность SEQ ID NO: 59). Последовательность гена, кодирующую аминокислотную последовательность L2-4, синтезировали при помощи превращения аминокислотной последовательности CDR легкой цепи (SEQ ID NO: 31-33) антитела A, привитого в IGKV3D-15*01 (SEQ ID NO: 51) и JK1 (SEQ ID NO: 52) с сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 58), дополнительно добавленной к N-концу, в последовательность гена согласно GenScript USA Inc., и полученной при помощи ПЦР-мутагенеза (L2-4: SEQ ID NO: 85, сигнальная последовательность SEQ ID NO: 59). Гены, кодирующие эти вариабельные области легкой цепи гуманизированного антитела и сигнальные последовательности, вводили в векторы экспрессии (pcDNA3.4), содержащие последовательность гена (SEQ ID NO: 65), кодирующую константную область человеческого Igκ (SEQ ID NO: 64). В данном контексте термин «C131S» относится к мутации, которая заменяет цистеин в положении 131 по нумерации Eu на серин. Термин «C219S» относится к мутации, которая заменяет цистеин в положении 219 по нумерации Eu на серин. Термин «V234A» относится к мутации, которая заменяет валин в положении 234 по нумерации Eu на аланин. Термин «G237A» относится к мутации, которая заменяет глицин в положении 237 по нумерации Eu на аланин. В данном контексте CH1 относится к области в положениях 118-215 по нумерации Eu в константной области человеческого IgG. Шарнир относится к области в положениях 216-230 по нумерации Eu в константной области человеческого IgG. CH2 относится к области в положениях 231-340 по нумерации Eu в константной области человеческого IgG. CH3 относится к области в положениях 341-446 по нумерации Eu в константной области человеческого IgG. Для получения этих гуманизированных антител векторы экспрессии, описанные выше, использовали в комбинации, как показано в таблице 5, при помощи системы экспрессии Expi293 (Gibco/Thermo Fisher Scientific) для трансфицирования клеток Expi293F (Gibco/Thermo Fisher Scientific). Каждый супернатант извлекли и очищали с использованием белка A (GE Healthcare).
[0194] [Таблица 5]
Гуманизированное антитело №
L-цепь
H-цепь
Вариабельная область
Вариабельная область
Константная область
Название
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO)
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO)
Название
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO)
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO)
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO)
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO)
75
L1-4
78
79
HA1
66
67
60
61
76
L1-4
78
79
HA2
68
69
67
L1-4
78
79
HA4
70
71
77
L1-4
78
79
HK1
72
73
78
L1-4
78
79
HK2
74
75
69
L1-4
78
79
HK4
76
77
81
L1-5
80
81
HA1
66
67
82
L1-5
80
81
HA2
68
69
83
L1-5
80
81
HA4
70
71
84
L1-5
80
81
HK1
72
73
85
L1-5
80
81
HK2
74
75
86
L1-5
80
81
HK4
76
77
87
L1-6
82
83
HA1
66
67
88
L1-6
82
83
HA2
68
69
89
L1-6
82
83
HA4
70
71
90
L1-6
82
83
HK1
72
73
91
L1-6
82
83
HK2
74
75
92
L1-6
82
83
HK4
76
77
93
L2-4
84
85
HA1
66
67
94
L2-4
84
85
HA2
68
69
71
L2-4
84
85
HA4
70
71
95
L2-4
84
85
HK1
72
73
96
L2-4
84
85
HK2
74
75
73
L2-4
84
85
HK4
76
77
139
L1-4
78
79
HA1
66
67
62
63
140
L1-4
78
79
HA2
68
69
138
L1-4
78
79
HA4
70
71
141
L1-4
78
79
HK1
72
73
142
L1-4
78
79
HK2
74
75
143
L1-4
78
79
HK4
76
77
152
L1-5
80
81
HA1
66
67
153
L1-5
80
81
HA2
68
69
151
L1-5
80
81
HA4
70
71
154
L1-5
80
81
HK1
72
73
145
L1-5
80
81
HK2
74
75
155
L1-5
80
81
HK4
76
77
157
L1-6
82
83
HA1
66
67
158
L1-6
82
83
HA2
68
69
156
L1-6
82
83
HA4
70
71
144
L1-6
82
83
HK1
72
73
159
L1-6
82
83
HK2
74
75
160
L1-6
82
83
HK4
76
77
133
L2-4
84
85
HA1
66
67
134
L2-4
84
85
HA2
68
69
132
L2-4
84
85
HA4
70
71
135
L2-4
84
85
HK1
72
73
136
L2-4
84
85
HK2
74
75
137
L2-4
84
85
HK4
76
77
Пример 17: Аффинность моноклонального гуманизированного антитела к EphA4 по отношению к человеческому EphA4
[0195]
1
1
2
Аффинность связывания каждого моноклонального гуманизированного антитела к EphA4, полученного в примере 16, по отношению к человеческому EphA4 определяли при помощи поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием Biacore Т200 (GE Healthcare). Сначала для анализа антитела А крысиное антитело к мышиному IgG, полученное при помощи стандартного способа в результате иммунизации крысы мышиным антителом IgG, иммобилизовали на сенсорном чипе CM5. Иммобилизацию крысиного антитела к мышиному IgG1 на сенсорном чипе CM5 выполняли при помощи метода конъюгации аминов с использованием N-гидроксисукцинимида (NHS) и N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида хлорида (EDC). При блокировании использовали этаноламин (сенсорный чип и реагенты для иммобилизации были произведены GE Healthcare). Антитело разводили буферным раствором для иммобилизации (10 мМ ацетата натрия, pH 4,5) и иммобилизовали на сенсорном чипе согласно протоколу, прилагаемому к Biacore T200. Для анализа каждого гуманизированного моноклонального антитела использовали чип для белка A (GE Healthcare, 29-1383-03). Антитело A или гуманизированное моноклонально антитело разводили подвижным буферным раствором HBS-EP (GE Healthcare), вводили лишь в проточную ячейку 2 на 120 секунд и захватывали (захваченное количество примерно 30-60 RU). Затем белок внеклеточной области человеческого EphA4-SEAP-His, серийно разведенный в диапазоне 50, 16,7, 5,6, 1,9 и 0,6 нМ с использованием HBS-EP, последовательно добавляли от более низких до более высоких границ концентрации без операции восстановления. Кривые реакций связывания последовательно наблюдали во время добавления (фаза ассоциации, в течение 120 сек) и после завершения добавления (фаза диссоциации, в течение 900 сек). После завершения каждого наблюдения сенсорный чип восстанавливали добавлением 3 M MgCl (на 60 сек) или 10 мМ глицина-HCl pH 1,5 (на 30 сек). Полученные кривые реакций связывания подгоняли под модели связывания 1:1 при помощи оценивания с использованием компьютерной программы BIA, прилагаемой к системе, для расчета аффинности (KD=kd/ka) по отношению к человеческому EphA4 (таблица 6).
[0196] Было обнаружено, что все из гуманизированных антител, описанных в таблице 5, проявляли аффинность, в значительной степени эквивалентную своему родительскому антителу A (таблица 6).
[0197] [Таблица 6]
Гуманизированное антитело №
ka1/Mc
kd1/c
KDM
RmaхlRU
Chi<sup>3</sup>RU<sup>2</sup>
75
3,6E+05
4,2E-04
1,2E-09
29
0,17
76
3,3E+05
3,4E-04
1,0Е-09
29
0,18
67
3,3E+05
3,5E-04
1,1E-09
28
0,15
77
4,1 E+05
5,8E-04
1,4E-09
27
0,20
78
3,4E+05
3,9E-04
1,1E-09
30
0,17
69
3,4E+05
3,7E-04
1,1E-09
29
0,19
81
3,4E+05
5,4E-04
1,6E-09
24
0,12
82
2,9E+05
4,6E-04
1,6E-09
24
0,10
83
2,9E+05
5,4E-04
1,9E-09
20
0,06
84
3,5E+05
5,8E-04
1,7E-09
25
0,13
85
3,1E+05
5,0E-04
1,6E-09
26
0,12
86
3,1 E+05
4,6E-04
1,5E-09
26
0,13
87
3,5E+05
5,1E-04
1,5E-09
27
0,12
88
3,0E+05
4,2E-04
1,4E-09
26
0,13
89
3,1E+05
4,1E-04
1,3E-09
24
0,13
90
3,6E+05
5,5E-04
1,5E-09
27
0,14
91
3,3E+05
4,4E-04
1,3E-09
25
0,13
92
3,3E+05
4,3E-04
1,3E-09
27
0,16
93
3,1E+05
2,4E-04
7,7E-10
24
0,10
94
2,6E+05
2,4E-04
9,5E-10
25
0,06
71
2,8E+05
2,3E-04
8,2E-10
25
0,09
95
3,0E+05
3,1E-04
1,0E-09
27
0,08
96
2,7E+05
3,1E-04
1,1E-09
28
0,07
73
2,9E+05
2,7E-04
9,3E-10
27
0,09
139
3,7E+05
5,3E-04
1,4E-09
29
0,15
140
3,2E+05
4,3E-04
1,4E-09
29
0,12
138
3,3E+05
4,3E-04
1,3E-09
29
0,12
141
3,9E+05
6,2E-04
1,6E-09
26
0,14
142
3,4E+05
5,0E-04
1,5E-09
28
0,12
143
3,5E+05
5,1E-04
1,5E-09
26
0,12
152
4,0E+05
8,2E-04
2,0E-09
23
0,09
153
2,8E+05
6,0E-04
2,1E-09
24
0,07
151
3,2E+05
5,3E-04
1,7E-09
26
0,13
154
3,9E+05
8,5E-04
2,2E-09
24
0,10
145
3,3E+05
6,5E-04
2,0E-09
27
0,11
155
3,3E+05
6,4E-04
1,9E-09
27
0,11
157
3,5E+05
6,8E-04
2,0E-09
24
0,09
158
3,1E+05
6,1E-04
1,9E-09
24
0,06
156
3,1E+05
5,6E-04
1,6E-09
24
0,08
144
4,0E+05
7,8E-04
2,0E-09
23
0,09
159
3,1E+05
6,1E-04
2,0E-09
22
0,07
160
3,2E+05
6,1E-04
1,9E-09
25
0,06
133
3,0E+05
3,2E-04
1,1E-09
26
0,07
134
2,6E+05
3,2E-04
1,2E-09
24
0,06
132
2,7E+05
3,1E-04
1,2E-09
26
0,06
135
3,2E+05
4,0E-04
1,3E-09
26
0,08
136
2,9E+05
3,9Е-04
1,4E-09
25
0,07
137
2,9E+05
3,8Е-04
1,3E-09
27
0,09
антитело A
4,2E+05
2,5E-04
6,0E-10
37
0,19
Пример 18: Ингибирующая активность моноклонального гуманизированного антитела к EphA4 по отношению к связыванию человеческого EphA4 и человеческого лиганда
[0198]
2
4,
Каждое моноклонально гуманизированное антитело к EphA4, полученное в пример 16, оценивали в отношении его ингибирующей активности по отношению к связыванию между человеческим EphA4 и его человеческим лигандом при помощи следующих стадий. Каждую лунку 96-луночного планшета (Nunc) покрывали антителом к щелочной фосфатазе (Thermo Fisher Scientific). После инкубирования в течение ночи при температуре 4°C, каждую лунку блокировали 1% BlockAce (DS Pharma Biomedical) при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания 0,05% Tween 20/PBS (Thermo Fisher Scientific) белок внеклеточной области человеческого EphA4-SEAP-His, полученный при помощи способа примера 2, добавляли (конечная концентрация 10 нМ) в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания лиганд и каждое серийно разведенное гуманизированное антитело из антитела A (0, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 и 3000 нM) добавляли в каждую лунку. Используемым лигандом была химера биотинилированный мышиный эфрин A5-Fc (R&D Systems, конечная концентрация: 0,7 нМ). После инкубирования при комнатной температуре в течение 1 часа и последующего трехкратного промывания туда добавляли меченый пероксидазой хрена стрептавидин (GE Healthcare) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания в каждую лунку добавляли раствор TMBZ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин, Sigma-Aldrich) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 минут. В каждую лунку добавляли равное количество стоп-раствора для остановки реакции (1N HSOWako Pure Chemical Industries). Поглощение при длине волны 450 нм считывали при помощи микропланшетного ридера (PerkinElmer).
[0199] Было обнаружено, что все из гуманизированных антител, описанных в таблице 5, проявляли ингибирующую активность, в значительной степени эквивалентную своему родительскому антителу A (таблица 7).
[0200] [Таблица 7]
Гуманизированное антитело №
IC<sub>50</sub>, нM
75
2,9
76
2,9
67
4,4
77
3,5
78
2,8
69
3,1
81
4,0
82
4,1
83
3,7
84
4,8
85
4,0
86
4,0
87
3,0
88
3,6
89
4,3
90
4,5
91
4,9
92
3,5
93
2,5
94
2,7
71
2,5
95
3,1
96
3,7
73
2,4
139
3,3
140
2,4
138
2,9
141
3,0
142
3,7
143
5,3
152
2,0
153
2,3
151
2,0
154
2,5
145
3,7
155
2,4
157
2,6
158
2,8
156
2,5
144
3,6
159
2,6
160
2,2
133
3,0
134
3,0
132
3,1
135
2,5
136
2,5
137
2,5
Пример 19: Избирательность моноклонального гуманизированного антитела к EphA4 по отношению к человеческому Eph-рецептору
[0201]
Согласно способу, описанному в примере 7, последовательность ДНК, кодирующую сигнальную последовательность и внеклеточную область каждого человеческого Eph-рецептора (EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4 и EphB6), амплифицировали при помощи RT-PCR с использованием полученной из тканей общей РНК и клонировали в вектор pENTR1A (Invitrogen/Life Technologies), содержащий последовательность ДНК, кодирующую белок SEAP и гистидиновую метку. Затем последовательность ДНК, кодирующую сигнальную последовательность и внеклеточную область каждого человеческого Eph-рецептора, белок SEAP и гистидиновую метку, переносили в вектор pcDNA3.1_rfcB при помощи LR реакции с использованием Gateway System (Invitrogen/Life Technologies) с конструированием вектора для экспрессии белка внеклеточной области каждого человеческого Eph-рецептора, слитого с белком SEAP и His меткой (обозначаемого как «белок внеклеточной области Eph-рецептора-SEAP-His») (этот вектор обозначается как «вектор экспрессии белка внеклеточной области Eph-рецептора-SEAP-His»).
2
[0202] Затем вектор экспрессии белка внеклеточной области каждого человеческого Eph-рецептора-SEAP-His переносили в клетки Expi293F (Gibco/Thermo Fisher Scientific) при помощи системы экспрессии Expi293 (Gibco/Thermo Fisher Scientific). После инкубации (5% CO, 37°C) в течение 5 дней супернатант культуры извлекали и центрифугировали при 1500 об/мин при комнатной температуре в течение 5 минут. Супернатант, полученный после центрифугирования, фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм (Merck Millipore).
Каждое моноклональное гуманизированное антитело к EphA4, полученное в примере 16, оценивали в отношении его активности связывания по отношению к каждому человеческому Eph-рецептору согласно следующим стадиям.
2
4
Каждую лунку 96-луночного планшета (Nunc) покрывали кроличьим антителом к 6-His (Bethyl Laboratories). Каждую лунку блокировали при комнатной температуре на 1 час и затем инкубировали в течение ночи 1% BlockAce (DS Pharma Biomedical) при температуре 4°C. После трехкратного промывания 0,05% Tween 20/PBS (Nacalai Tesque) белок SEAP-His человеческого EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4 или EphB6 добавляли (конечная концентрация 1 нМ) в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания в каждую лунку добавляли гуманизированное антитело и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания туда добавляли меченое пероксидазой хрена ослиное антитело к мышиному IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратного промывания TMB Microwell Peroxidase Substrate System (Kirkegaard & Perry Laboratories (KPL)) добавляли в каждую лунку. После подтверждения появления умеренного окрашивания в каждую лунку добавляли равное количество раствора, останавливающего реакцию (1 н. HSO, Wako Pure Chemical Industries). Поглощение при длине волны 450 нм считывали при помощи микропланшетного ридера (Thermo Fisher Scientific).
[0203] Проценты по отношению к поглощению при длине волны 450 нм для человеческого EphA4 (hEphA4-SEAP-His) в виде 100% обобщены в таблице 8. В результате было обнаружено, что все из гуманизированных антител, описанных в таблице 5, специфически связывались с человеческим EphA4, как и со своим исходным антителом A (таблица 8).
[0204] [Таблица 8]
Пример 20: Защитный эффект гуманизированного моноклонального антитела к EphA4 в отношении двигательных нейронов в модели ALS
, полученных из человеческих iPS-клеток
in vitro
[0205]
2
2
2
Человеческие iPS-клетки поддерживали и культивировали согласно следующим стадиям. Человеческие iPS-клетки (201B7), криоконсервированные в жидком азоте с использованием сита для стволовых клеток (TAKARA), извлекали из газовой фазы жидкого азота, сразу же суспендировали и размораживали в 5 мл среды для культивирования человеческих iPS-клеток (Essential 8, Thermo Fisher Scientific), предварительно нагретой до 37°C. Клеточную суспензию извлекали в коническую пробирку на 15 мл (Falcon) и центрифугировали (1000 об/мин, 5 минут, комнатная температура), затем удаляли супернатант. Клетки суспендировали в свежей среде и затем переносили в чашку для культивирования клеток на φ60 мм (Falcon BD), заранее покрытую 0,5 мкг/см человеческим рекомбинантным витронектином (Invitrogen). Туда добавляли 10 мкМ Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries) и клетки поддерживали и культивировали в CO-инкубаторе (5% CO, 37°C). Замену среды выполняли каждый день и при достижении конфлюентности клетки подвергали эксперименту.
in vitro
2
2
2
2
2
2
2
2
2
5
4
[0206] Защитный эффект моноклонального гуманизированного антитела к EphA4, полученного в примере 16, в отношении двигательных нейронов в моделях ALS  оценивали согласно следующим стадиям. Среду для культивирования поддерживаемых и культивируемых человеческих iPS-клеток отсасывали и клетки промывали 2 мл PBS (Wako Pure Chemical Industries). После отсасывания PBS 500 мкл 0,5 мM EDTA добавляли к клеткам, которые затем инкубировали в течение 2-3 минут в CO-инкубаторе (5% CO, 37°C) (клетки верифицировали под микроскопом каждые 30 секунд и инкубирование прекращали при ослаблении внутриклеточной связи). Реакцию с EDTA завершали суспендированием в 5 мл среды для культивирования человеческих iPS-клеток и клетки извлекали в коническую пробирку на 15 мл. Клетки центрифугировали при 1000 об/мин при комнатной температуре в течение 5 минут и супернатант отсасывали. Клеточную суспензию, содержащую массы человеческих iPS-клеток, вводили в количестве, составляющем примерно 1/10 на лунку, в 6-луночный планшет для культивирования клеток с низкой адгезией (Nunclon Sphere, Nunc) и культивировали в CO-инкубаторе (5% CO, 37°C) с использованием среды DFK (улучшенная среда DMEM/F-12 (Invitrogen):нейробазальная среда (Invitrogen) [1:1], содержащая 2% добавки B27, 5% заменителя сыворотки KnockOut (Invitrogen), 2 ммоль/л L-глутамина, 100 единиц/мл пенициллина-100 мкг/мл стрептомицина и 0,1 ммоль/л β-меркаптоэтанола), дополненной 2 мкМ SB431542 (Sigma-Aldrich), 300 нМ LDN193189 (Sigma-Aldrich) и 3 мкМ CHIR99021 (Sigma-Aldrich). Замену среды выполняли через каждые 2 дня при помощи следующего способа. Сначала агрегаты дифференцированных клеток, полученные из человеческих iPS-клеток (SFEB), извлекали на основу среды в коническую пробирку на 15 мл и оставляли при обычной температуре на 5 минут для осаждения клеточных масс. Этот супернатант отсасывали, добавляли свежую среду DFK и 2 мкМ SB431542 (Sigma-Aldrich), 300 нМ LDN193189 (Sigma-Aldrich), 3 мкМ CHIR99021 (Sigma-Aldrich) и затем возвращали в исходную лунку для замены среды. В день 8 культивирования SFEB извлекали на основу среды в коническую пробирку на 15 мл и оставляли при обычной температуре на 5 минут для осаждения SFEB. Этот супернатант отсасывали, добавляли свежую среду DFK и затем 0,1 мкМ ретиноевой кислоты (Sigma-Aldrich) и 0,5 мкМ пурморфамина (Miltenyi Biotec), затем возвращали в исходную лунку и культивировали в CO-инкубаторе (5% CO, 37°C). Замену среды выполняли через каждые 2 дня. В день 12 культивирования SFEB извлекали на основу среды в коническую пробирку на 15 мл и оставляли при обычной температуре на 5 минут для осаждения SFEB. Супернатант отсасывали, 500 мкл Accumax (MS TechnoSystems) добавляли к клеткам, которые затем пипетировали несколько раз и затем инкубировали в течение 5 минут в CO-инкубаторе (5% CO, 37°C). Клетки извлекали из инкубатора, суспендировали в 5 мл среды DFK и пипетировали несколько раз для распределения клеточных масс. Клеточную суспензию разделяли на отдельные клетки при помощи фильтрации через клеточное сито (Falcon). Затем при помощи счетной камеры подсчитывали количество клеток. Клеточную суспензию извлекали в другую коническую пробирку на 15 мл и центрифугировали при 1000 об/мин при комнатной температуре в течение 5 минут. Суспензию, имеющую плотность клеток, составляющую 5,5×10 клеток/мл, получали с использованием среды для культивирования двигательных нейронов (улучшенная среда DMEM/F-12 (Invitrogen):нейробазальная среда (Invitrogen) [1:1], содержащая 2% добавки B27, 1% лошадиной сыворотки, 2 ммоль/л L-глутамина, 100 единиц/мл пенициллина-100 мкг/мл стрептомицина и 0,1 ммоль/л β-меркаптоэтанола) и вводили в концентрации 200 мкл/лунку в 8-луночную камеру, содержащую астроциты дикого типа, полученные от мыши, или астроциты, экспрессирующие вариант человеческой SOD1 (G93A), заранее введенные в концентрации 8×10 клеток/лунку. Полученные совместно культивированные клетки астроцитов и двигательных нейронов использовали при оценивании (получение, замораживание, размораживание, внесение, поддержание и культивирование астроцитов дикого типа и астроцитов, экспрессирующих вариант человеческой SOD1 (G93A), выполняли также, как и в примере 13). Число двигательных нейронов, наблюдаемое при совместном культивировании астроцитов дикого типа и двигательных нейронов, использовали в качестве контроля. Для группы с обработкой лекарственным средством астроциты, экспрессирующие вариант человеческой SOD1 (G93A), и двигательные нейроны совместно культивировали при условии, включающем добавление среды (IgG и 0,1% сверхчистой воды) и гуманизированного антитела. После культивирования в течение 2 дней при температуре 37°C в среде с 5% CO при каждом условии двигательные нейроны иммуногистохимически окрашивали антителом к ISL1 (полученному из банка гибридом для исследований развития) и Hoechst 33342 (Molecular Probes). ISL1/Hoechst 33342-коположительные клетки на лунку подсчитывали в качестве живых двигательных нейронов, а уровень выживаемости двигательных нейронов рассчитывали в виде % по отношению к контролю.
[0207] Уровень выживаемости двигательных нейронов был значимо снижен в совместной культуре астроцитов, экспрессирующих вариант человеческой SOD1 (G93A)/двигательных нейронов, полученных из человеческих iPS-клеток. Гуманизированное антитело, описанное в таблице 5, подавляло концентрационно-зависимым образом гибель двигательных нейронов, полученных из человеческих iPS-клеток, индуцированную астроцитами, экспрессирующими вариант человеческой SOD1 (G93A). Соответственно, было показано, что моноклональное гуманизированное антитело к EphA4 способствовало выживанию двигательных нейронов в клетках человека.
Промышленная применимость
[0208] Настоящее изобретение может предусматривать антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент, которые способны связываться с EphA4 и ингибировать связывание между EphA4 и его лигандом, и фармацевтическую композицию, содержащую антитело к EphA4 или его EphA4-связывающий фрагмент в качестве активного компонента. Антитело или фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению могут быть полезы при лечении заболеваний, вызванных связыванием между EphA4 и его лигандом, например, ALS.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  EISAI R&D MANAGEMENT CO., LTD.
<120>  АНТИТЕЛО К EPHA4
<130>  ESAP1505F
<150>  JP2015-177081
<151>  2015-09-08
<160>  85
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  986
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  1
Met Ala Gly Ile Phe Tyr Phe Ile Leu Phe Ser Phe Leu Phe Gly Ile
1               5                   10                  15
Cys Asp Ala Val Thr Gly Ser Arg Val Tyr Pro Ala Asn Glu Val Thr
20                  25                  30
Leu Leu Asp Ser Arg Ser Val Gln Gly Glu Leu Gly Trp Ile Ala Ser
35                  40                  45
Pro Leu Glu Gly Gly Trp Glu Glu Val Ser Ile Met Asp Glu Lys Asn
50                  55                  60
Thr Pro Ile Arg Thr Tyr Gln Val Cys Asn Val Met Glu Ala Ser Gln
65                  70                  75                  80
Asn Asn Trp Leu Arg Thr Asp Trp Ile Thr Arg Glu Gly Ala Gln Arg
85                  90                  95
Val Tyr Ile Glu Ile Lys Phe Thr Leu Arg Asp Cys Asn Ser Leu Pro
100                 105                 110
Gly Val Met Gly Thr Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Tyr Glu
115                 120                 125
Ser Asp Asn Asp Lys Glu Arg Phe Ile Arg Glu Ser Gln Phe Gly Lys
130                 135                 140
Ile Asp Thr Ile Ala Ala Asp Glu Ser Phe Thr Gln Val Asp Ile Gly
145                 150                 155                 160
Asp Arg Ile Met Lys Leu Asn Thr Glu Ile Arg Asp Val Gly Pro Leu
165                 170                 175
Ser Lys Lys Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Val Gly Ala Cys Ile
180                 185                 190
Ala Leu Val Ser Val Arg Val Phe Tyr Lys Lys Cys Pro Leu Thr Val
195                 200                 205
Arg Asn Leu Ala Gln Phe Pro Asp Thr Ile Thr Gly Ala Asp Thr Ser
210                 215                 220
Ser Leu Val Glu Val Arg Gly Ser Cys Val Asn Asn Ser Glu Glu Lys
225                 230                 235                 240
Asp Val Pro Lys Met Tyr Cys Gly Ala Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro
245                 250                 255
Ile Gly Asn Cys Leu Cys Asn Ala Gly His Glu Glu Gln Asn Gly Glu
260                 265                 270
Cys Gln Ala Cys Lys Ile Gly Tyr Tyr Lys Ala Leu Ser Thr Asp Ala
275                 280                 285
Ser Cys Ala Lys Cys Pro Pro His Ser Tyr Ser Val Trp Glu Gly Ala
290                 295                 300
Thr Ser Cys Thr Cys Asp Arg Gly Phe Phe Arg Ala Asp Asn Asp Ala
305                 310                 315                 320
Ala Ser Met Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro Leu Asn Leu Ile
325                 330                 335
Ser Asn Val Asn Glu Thr Ser Val Asn Leu Glu Trp Ser Ser Pro Gln
340                 345                 350
Asn Thr Gly Gly Arg Gln Asp Ile Ser Tyr Asn Val Val Cys Lys Lys
355                 360                 365
Cys Gly Ala Gly Asp Pro Ser Lys Cys Arg Pro Cys Gly Ser Gly Val
370                 375                 380
His Tyr Thr Pro Gln Gln Asn Gly Leu Lys Thr Thr Arg Val Ser Ile
385                 390                 395                 400
Thr Asp Leu Leu Ala His Thr Asn Tyr Thr Phe Glu Ile Trp Ala Val
405                 410                 415
Asn Gly Val Ser Lys Tyr Asn Pro Ser Pro Asp Gln Ser Val Ser Val
420                 425                 430
Thr Val Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Ser Ile Ala Leu Val Gln
435                 440                 445
Ala Lys Glu Val Thr Arg Tyr Ser Val Ala Leu Ala Trp Leu Glu Pro
450                 455                 460
Asp Arg Pro Asn Gly Val Ile Leu Glu Tyr Glu Val Lys Tyr Tyr Glu
465                 470                 475                 480
Lys Asp Gln Asn Glu Arg Ser Tyr Arg Ile Val Arg Thr Ala Ala Arg
485                 490                 495
Asn Thr Asp Ile Lys Gly Leu Asn Pro Leu Thr Ser Tyr Val Phe His
500                 505                 510
Val Arg Ala Arg Thr Ala Ala Gly Tyr Gly Asp Phe Ser Glu Pro Leu
515                 520                 525
Glu Val Thr Thr Asn Thr Val Pro Ser Arg Ile Ile Gly Asp Gly Ala
530                 535                 540
Asn Ser Thr Val Leu Leu Val Ser Val Ser Gly Ser Val Val Leu Val
545                 550                 555                 560
Val Ile Leu Ile Ala Ala Phe Val Ile Ser Arg Arg Arg Ser Lys Tyr
565                 570                 575
Ser Lys Ala Lys Gln Glu Ala Asp Glu Glu Lys His Leu Asn Gln Gly
580                 585                 590
Val Arg Thr Tyr Val Asp Pro Phe Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Gln Ala
595                 600                 605
Val Arg Glu Phe Ala Lys Glu Ile Asp Ala Ser Cys Ile Lys Ile Glu
610                 615                 620
Lys Val Ile Gly Val Gly Glu Phe Gly Glu Val Cys Ser Gly Arg Leu
625                 630                 635                 640
Lys Val Pro Gly Lys Arg Glu Ile Cys Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys
645                 650                 655
Ala Gly Tyr Thr Asp Lys Gln Arg Arg Asp Phe Leu Ser Glu Ala Ser
660                 665                 670
Ile Met Gly Gln Phe Asp His Pro Asn Ile Ile His Leu Glu Gly Val
675                 680                 685
Val Thr Lys Cys Lys Pro Val Met Ile Ile Thr Glu Tyr Met Glu Asn
690                 695                 700
Gly Ser Leu Asp Ala Phe Leu Arg Lys Asn Asp Gly Arg Phe Thr Val
705                 710                 715                 720
Ile Gln Leu Val Gly Met Leu Arg Gly Ile Gly Ser Gly Met Lys Tyr
725                 730                 735
Leu Ser Asp Met Ser Tyr Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile
740                 745                 750
Leu Val Asn Ser Asn Leu Val Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Met Ser
755                 760                 765
Arg Val Leu Glu Asp Asp Pro Glu Ala Ala Tyr Thr Thr Arg Gly Gly
770                 775                 780
Lys Ile Pro Ile Arg Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ile Ala Tyr Arg Lys
785                 790                 795                 800
Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Val Met Trp Glu
805                 810                 815
Val Met Ser Tyr Gly Glu Arg Pro Tyr Trp Asp Met Ser Asn Gln Asp
820                 825                 830
Val Ile Lys Ala Ile Glu Glu Gly Tyr Arg Leu Pro Pro Pro Met Asp
835                 840                 845
Cys Pro Ile Ala Leu His Gln Leu Met Leu Asp Cys Trp Gln Lys Glu
850                 855                 860
Arg Ser Asp Arg Pro Lys Phe Gly Gln Ile Val Asn Met Leu Asp Lys
865                 870                 875                 880
Leu Ile Arg Asn Pro Asn Ser Leu Lys Arg Thr Gly Ser Glu Ser Ser
885                 890                 895
Arg Pro Asn Thr Ala Leu Leu Asp Pro Ser Ser Pro Glu Phe Ser Ala
900                 905                 910
Val Val Ser Val Gly Asp Trp Leu Gln Ala Ile Lys Met Asp Arg Tyr
915                 920                 925
Lys Asp Asn Phe Thr Ala Ala Gly Tyr Thr Thr Leu Glu Ala Val Val
930                 935                 940
His Met Ser Gln Asp Asp Leu Ala Arg Ile Gly Ile Thr Ala Ile Thr
945                 950                 955                 960
His Gln Asn Lys Ile Leu Ser Ser Val Gln Ala Met Arg Thr Gln Met
965                 970                 975
Gln Gln Met His Gly Arg Met Val Pro Val
980                 985
<210>  2
<211>  528
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  2
Val Thr Gly Ser Arg Val Tyr Pro Ala Asn Glu Val Thr Leu Leu Asp
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Val Gln Gly Glu Leu Gly Trp Ile Ala Ser Pro Leu Glu
20                  25                  30
Gly Gly Trp Glu Glu Val Ser Ile Met Asp Glu Lys Asn Thr Pro Ile
35                  40                  45
Arg Thr Tyr Gln Val Cys Asn Val Met Glu Ala Ser Gln Asn Asn Trp
50                  55                  60
Leu Arg Thr Asp Trp Ile Thr Arg Glu Gly Ala Gln Arg Val Tyr Ile
65                  70                  75                  80
Glu Ile Lys Phe Thr Leu Arg Asp Cys Asn Ser Leu Pro Gly Val Met
85                  90                  95
Gly Thr Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Tyr Glu Ser Asp Asn
100                 105                 110
Asp Lys Glu Arg Phe Ile Arg Glu Ser Gln Phe Gly Lys Ile Asp Thr
115                 120                 125
Ile Ala Ala Asp Glu Ser Phe Thr Gln Val Asp Ile Gly Asp Arg Ile
130                 135                 140
Met Lys Leu Asn Thr Glu Ile Arg Asp Val Gly Pro Leu Ser Lys Lys
145                 150                 155                 160
Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Val Gly Ala Cys Ile Ala Leu Val
165                 170                 175
Ser Val Arg Val Phe Tyr Lys Lys Cys Pro Leu Thr Val Arg Asn Leu
180                 185                 190
Ala Gln Phe Pro Asp Thr Ile Thr Gly Ala Asp Thr Ser Ser Leu Val
195                 200                 205
Glu Val Arg Gly Ser Cys Val Asn Asn Ser Glu Glu Lys Asp Val Pro
210                 215                 220
Lys Met Tyr Cys Gly Ala Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro Ile Gly Asn
225                 230                 235                 240
Cys Leu Cys Asn Ala Gly His Glu Glu Gln Asn Gly Glu Cys Gln Ala
245                 250                 255
Cys Lys Ile Gly Tyr Tyr Lys Ala Leu Ser Thr Asp Ala Ser Cys Ala
260                 265                 270
Lys Cys Pro Pro His Ser Tyr Ser Val Trp Glu Gly Ala Thr Ser Cys
275                 280                 285
Thr Cys Asp Arg Gly Phe Phe Arg Ala Asp Asn Asp Ala Ala Ser Met
290                 295                 300
Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro Leu Asn Leu Ile Ser Asn Val
305                 310                 315                 320
Asn Glu Thr Ser Val Asn Leu Glu Trp Ser Ser Pro Gln Asn Thr Gly
325                 330                 335
Gly Arg Gln Asp Ile Ser Tyr Asn Val Val Cys Lys Lys Cys Gly Ala
340                 345                 350
Gly Asp Pro Ser Lys Cys Arg Pro Cys Gly Ser Gly Val His Tyr Thr
355                 360                 365
Pro Gln Gln Asn Gly Leu Lys Thr Thr Arg Val Ser Ile Thr Asp Leu
370                 375                 380
Leu Ala His Thr Asn Tyr Thr Phe Glu Ile Trp Ala Val Asn Gly Val
385                 390                 395                 400
Ser Lys Tyr Asn Pro Ser Pro Asp Gln Ser Val Ser Val Thr Val Thr
405                 410                 415
Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Ser Ile Ala Leu Val Gln Ala Lys Glu
420                 425                 430
Val Thr Arg Tyr Ser Val Ala Leu Ala Trp Leu Glu Pro Asp Arg Pro
435                 440                 445
Asn Gly Val Ile Leu Glu Tyr Glu Val Lys Tyr Tyr Glu Lys Asp Gln
450                 455                 460
Asn Glu Arg Ser Tyr Arg Ile Val Arg Thr Ala Ala Arg Asn Thr Asp
465                 470                 475                 480
Ile Lys Gly Leu Asn Pro Leu Thr Ser Tyr Val Phe His Val Arg Ala
485                 490                 495
Arg Thr Ala Ala Gly Tyr Gly Asp Phe Ser Glu Pro Leu Glu Val Thr
500                 505                 510
Thr Asn Thr Val Pro Ser Arg Ile Ile Gly Asp Gly Ala Asn Ser Thr
515                 520                 525
<210>  3
<211>  986
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Met Ala Gly Ile Phe Tyr Phe Ala Leu Phe Ser Cys Leu Phe Gly Ile
1               5                   10                  15
Cys Asp Ala Val Thr Gly Ser Arg Val Tyr Pro Ala Asn Glu Val Thr
20                  25                  30
Leu Leu Asp Ser Arg Ser Val Gln Gly Glu Leu Gly Trp Ile Ala Ser
35                  40                  45
Pro Leu Glu Gly Gly Trp Glu Glu Val Ser Ile Met Asp Glu Lys Asn
50                  55                  60
Thr Pro Ile Arg Thr Tyr Gln Val Cys Asn Val Met Glu Pro Ser Gln
65                  70                  75                  80
Asn Asn Trp Leu Arg Thr Asp Trp Ile Thr Arg Glu Gly Ala Gln Arg
85                  90                  95
Val Tyr Ile Glu Ile Lys Phe Thr Leu Arg Asp Cys Asn Ser Leu Pro
100                 105                 110
Gly Val Met Gly Thr Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Tyr Glu
115                 120                 125
Ser Asp Asn Asp Lys Glu Arg Phe Ile Arg Glu Asn Gln Phe Val Lys
130                 135                 140
Ile Asp Thr Ile Ala Ala Asp Glu Ser Phe Thr Gln Val Asp Ile Gly
145                 150                 155                 160
Asp Arg Ile Met Lys Leu Asn Thr Glu Ile Arg Asp Val Gly Pro Leu
165                 170                 175
Ser Lys Lys Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Val Gly Ala Cys Ile
180                 185                 190
Ala Leu Val Ser Val Arg Val Phe Tyr Lys Lys Cys Pro Leu Thr Val
195                 200                 205
Arg Asn Leu Ala Gln Phe Pro Asp Thr Ile Thr Gly Ala Asp Thr Ser
210                 215                 220
Ser Leu Val Glu Val Arg Gly Ser Cys Val Asn Asn Ser Glu Glu Lys
225                 230                 235                 240
Asp Val Pro Lys Met Tyr Cys Gly Ala Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro
245                 250                 255
Ile Gly Asn Cys Leu Cys Asn Ala Gly His Glu Glu Arg Ser Gly Glu
260                 265                 270
Cys Gln Ala Cys Lys Ile Gly Tyr Tyr Lys Ala Leu Ser Thr Asp Ala
275                 280                 285
Thr Cys Ala Lys Cys Pro Pro His Ser Tyr Ser Val Trp Glu Gly Ala
290                 295                 300
Thr Ser Cys Thr Cys Asp Arg Gly Phe Phe Arg Ala Asp Asn Asp Ala
305                 310                 315                 320
Ala Ser Met Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro Leu Asn Leu Ile
325                 330                 335
Ser Asn Val Asn Glu Thr Ser Val Asn Leu Glu Trp Ser Ser Pro Gln
340                 345                 350
Asn Thr Gly Gly Arg Gln Asp Ile Ser Tyr Asn Val Val Cys Lys Lys
355                 360                 365
Cys Gly Ala Gly Asp Pro Ser Lys Cys Arg Pro Cys Gly Ser Gly Val
370                 375                 380
His Tyr Thr Pro Gln Gln Asn Gly Leu Lys Thr Thr Lys Val Ser Ile
385                 390                 395                 400
Thr Asp Leu Leu Ala His Thr Asn Tyr Thr Phe Glu Ile Trp Ala Val
405                 410                 415
Asn Gly Val Ser Lys Tyr Asn Pro Asn Pro Asp Gln Ser Val Ser Val
420                 425                 430
Thr Val Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Ser Ile Ala Leu Val Gln
435                 440                 445
Ala Lys Glu Val Thr Arg Tyr Ser Val Ala Leu Ala Trp Leu Glu Pro
450                 455                 460
Asp Arg Pro Asn Gly Val Ile Leu Glu Tyr Glu Val Lys Tyr Tyr Glu
465                 470                 475                 480
Lys Asp Gln Asn Glu Arg Ser Tyr Arg Ile Val Arg Thr Ala Ala Arg
485                 490                 495
Asn Thr Asp Ile Lys Gly Leu Asn Pro Leu Thr Ser Tyr Val Phe His
500                 505                 510
Val Arg Ala Arg Thr Ala Ala Gly Tyr Gly Asp Phe Ser Glu Pro Leu
515                 520                 525
Glu Val Thr Thr Asn Thr Val Pro Ser Arg Ile Ile Gly Asp Gly Ala
530                 535                 540
Asn Ser Thr Val Leu Leu Val Ser Val Ser Gly Ser Val Val Leu Val
545                 550                 555                 560
Val Ile Leu Ile Ala Ala Phe Val Ile Ser Arg Arg Arg Ser Lys Tyr
565                 570                 575
Ser Lys Ala Lys Gln Glu Ala Asp Glu Glu Lys His Leu Asn Gln Gly
580                 585                 590
Val Arg Thr Tyr Val Asp Pro Phe Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Gln Ala
595                 600                 605
Val Arg Glu Phe Ala Lys Glu Ile Asp Ala Ser Cys Ile Lys Ile Glu
610                 615                 620
Lys Val Ile Gly Val Gly Glu Phe Gly Glu Val Cys Ser Gly Arg Leu
625                 630                 635                 640
Lys Val Pro Gly Lys Arg Glu Ile Cys Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys
645                 650                 655
Ala Gly Tyr Thr Asp Lys Gln Arg Arg Asp Phe Leu Ser Glu Ala Ser
660                 665                 670
Ile Met Gly Gln Phe Asp His Pro Asn Ile Ile His Leu Glu Gly Val
675                 680                 685
Val Thr Lys Cys Lys Pro Val Met Ile Ile Thr Glu Tyr Met Glu Asn
690                 695                 700
Gly Ser Leu Asp Ala Phe Leu Arg Lys Asn Asp Gly Arg Phe Thr Val
705                 710                 715                 720
Ile Gln Leu Val Gly Met Leu Arg Gly Ile Gly Ser Gly Met Lys Tyr
725                 730                 735
Leu Ser Asp Met Ser Tyr Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile
740                 745                 750
Leu Val Asn Ser Asn Leu Val Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Met Ser
755                 760                 765
Arg Val Leu Glu Asp Asp Pro Glu Ala Ala Tyr Thr Thr Arg Gly Gly
770                 775                 780
Lys Ile Pro Ile Arg Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ile Ala Tyr Arg Lys
785                 790                 795                 800
Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Val Met Trp Glu
805                 810                 815
Val Met Ser Tyr Gly Glu Arg Pro Tyr Trp Asp Met Ser Asn Gln Asp
820                 825                 830
Val Ile Lys Ala Ile Glu Glu Gly Tyr Arg Leu Pro Pro Pro Met Asp
835                 840                 845
Cys Pro Ile Ala Leu His Gln Leu Met Leu Asp Cys Trp Gln Lys Glu
850                 855                 860
Arg Ser Asp Arg Pro Lys Phe Gly Gln Ile Val Asn Met Leu Asp Lys
865                 870                 875                 880
Leu Ile Arg Asn Pro Asn Ser Leu Lys Arg Thr Gly Thr Glu Ser Ser
885                 890                 895
Arg Pro Asn Thr Ala Leu Leu Asp Pro Ser Ser Pro Glu Phe Ser Ala
900                 905                 910
Val Val Ser Val Gly Asp Trp Leu Gln Ala Ile Lys Met Asp Arg Tyr
915                 920                 925
Lys Asp Asn Phe Thr Ala Ala Gly Tyr Thr Thr Leu Glu Ala Val Val
930                 935                 940
His Val Asn Gln Glu Asp Leu Ala Arg Ile Gly Ile Thr Ala Ile Thr
945                 950                 955                 960
His Gln Asn Lys Ile Leu Ser Ser Val Gln Ala Met Arg Thr Gln Met
965                 970                 975
Gln Gln Met His Gly Arg Met Val Pro Val
980                 985
<210>  4
<211>  528
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  4
Val Thr Gly Ser Arg Val Tyr Pro Ala Asn Glu Val Thr Leu Leu Asp
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Val Gln Gly Glu Leu Gly Trp Ile Ala Ser Pro Leu Glu
20                  25                  30
Gly Gly Trp Glu Glu Val Ser Ile Met Asp Glu Lys Asn Thr Pro Ile
35                  40                  45
Arg Thr Tyr Gln Val Cys Asn Val Met Glu Pro Ser Gln Asn Asn Trp
50                  55                  60
Leu Arg Thr Asp Trp Ile Thr Arg Glu Gly Ala Gln Arg Val Tyr Ile
65                  70                  75                  80
Glu Ile Lys Phe Thr Leu Arg Asp Cys Asn Ser Leu Pro Gly Val Met
85                  90                  95
Gly Thr Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Tyr Glu Ser Asp Asn
100                 105                 110
Asp Lys Glu Arg Phe Ile Arg Glu Asn Gln Phe Val Lys Ile Asp Thr
115                 120                 125
Ile Ala Ala Asp Glu Ser Phe Thr Gln Val Asp Ile Gly Asp Arg Ile
130                 135                 140
Met Lys Leu Asn Thr Glu Ile Arg Asp Val Gly Pro Leu Ser Lys Lys
145                 150                 155                 160
Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Val Gly Ala Cys Ile Ala Leu Val
165                 170                 175
Ser Val Arg Val Phe Tyr Lys Lys Cys Pro Leu Thr Val Arg Asn Leu
180                 185                 190
Ala Gln Phe Pro Asp Thr Ile Thr Gly Ala Asp Thr Ser Ser Leu Val
195                 200                 205
Glu Val Arg Gly Ser Cys Val Asn Asn Ser Glu Glu Lys Asp Val Pro
210                 215                 220
Lys Met Tyr Cys Gly Ala Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro Ile Gly Asn
225                 230                 235                 240
Cys Leu Cys Asn Ala Gly His Glu Glu Arg Ser Gly Glu Cys Gln Ala
245                 250                 255
Cys Lys Ile Gly Tyr Tyr Lys Ala Leu Ser Thr Asp Ala Thr Cys Ala
260                 265                 270
Lys Cys Pro Pro His Ser Tyr Ser Val Trp Glu Gly Ala Thr Ser Cys
275                 280                 285
Thr Cys Asp Arg Gly Phe Phe Arg Ala Asp Asn Asp Ala Ala Ser Met
290                 295                 300
Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro Leu Asn Leu Ile Ser Asn Val
305                 310                 315                 320
Asn Glu Thr Ser Val Asn Leu Glu Trp Ser Ser Pro Gln Asn Thr Gly
325                 330                 335
Gly Arg Gln Asp Ile Ser Tyr Asn Val Val Cys Lys Lys Cys Gly Ala
340                 345                 350
Gly Asp Pro Ser Lys Cys Arg Pro Cys Gly Ser Gly Val His Tyr Thr
355                 360                 365
Pro Gln Gln Asn Gly Leu Lys Thr Thr Lys Val Ser Ile Thr Asp Leu
370                 375                 380
Leu Ala His Thr Asn Tyr Thr Phe Glu Ile Trp Ala Val Asn Gly Val
385                 390                 395                 400
Ser Lys Tyr Asn Pro Asn Pro Asp Gln Ser Val Ser Val Thr Val Thr
405                 410                 415
Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Ser Ile Ala Leu Val Gln Ala Lys Glu
420                 425                 430
Val Thr Arg Tyr Ser Val Ala Leu Ala Trp Leu Glu Pro Asp Arg Pro
435                 440                 445
Asn Gly Val Ile Leu Glu Tyr Glu Val Lys Tyr Tyr Glu Lys Asp Gln
450                 455                 460
Asn Glu Arg Ser Tyr Arg Ile Val Arg Thr Ala Ala Arg Asn Thr Asp
465                 470                 475                 480
Ile Lys Gly Leu Asn Pro Leu Thr Ser Tyr Val Phe His Val Arg Ala
485                 490                 495
Arg Thr Ala Ala Gly Tyr Gly Asp Phe Ser Glu Pro Leu Glu Val Thr
500                 505                 510
Thr Asn Thr Val Pro Ser Arg Ile Ile Gly Asp Gly Ala Asn Ser Thr
515                 520                 525
<210>  5
<211>  12
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический праймер
<400>  5
acatcactcc gt                                                   12
<210>  6
<211>  50
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический праймер
<400>  6
acggagtgat gtccgtcgac gtatctctgc gttgatactt cagcgtagct          50
<210>  7
<211>  26
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический праймер
<400>  7
agctacgctg aagtatcaac gcagag                                    26
<210>  8
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический праймер
<400>  8
gccagtggat agactgatgg                                           20
<210>  9
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический праймер
<400>  9
gatggataca gttggtgcag c                                         21
<210>  10
<211>  19
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  10
Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1               5                   10                  15
Ile Gln Ala
<210>  11
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  11
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Pro Leu Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp
100                 105                 110
Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  12
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  12
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Asp Ala Arg Cys
20
<210>  13
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Arg Asn
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  14
<211>  57
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  14
atggcttggg tgtggacctt gctattcctg atggcagctg cccaaagtat ccaagca      57
<210>  15
<211>  372
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  15
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc   60
tcctgcaagg cttctggtta taccttcaca gactattcaa tgcactgggt gaagcaggct  120
ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat  180
gcagatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat  240
ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc tagaattccc  300
ctctattact acggtagtag gtactggtac ttcgatgtct ggggcgcagg gaccacggtc  360
accgtctcct ca                                                      372
<210>  16
<211>  60
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  16
atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt   60
<210>  17
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  17
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc   60
atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agaaatttag catggtatca gcagaaacag  120
ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca  180
aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct  240
gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtggac gttcggtgga  300
ggcaccaagc tggaaatcaa a                                            321
<210>  18
<211>  40
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический праймер
<400>  18
gcgaagcttg ccgccaccat ggcttgggtg tggaccttgc                         40
<210>  19
<211>  40
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический праймер
<400>  19
gcgaagcttg ccgccaccat gagtgtgccc actcaggtcc                         40
<210>  20
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический праймер
<400>  20
gcggaattca tcatttacca ggagagtggg agaggc                             36
<210>  21
<211>  40
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический праймер
<400>  21
cgcgaattca ctaacactca ttcctgttga agctcttgac                         40
<210>  22
<211>  324
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  22
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50                  55                  60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65                  70                  75                  80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85                  90                  95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100                 105                 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115                 120                 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130                 135                 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145                 150                 155                 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165                 170                 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180                 185                 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195                 200                 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210                 215                 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225                 230                 235                 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245                 250                 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260                 265                 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275                 280                 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290                 295                 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305                 310                 315                 320
Ser Pro Gly Lys
<210>  23
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  23
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35                  40                  45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50                  55                  60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85                  90                  95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100                 105
<210>  24
<211>  975
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  24
gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac   60
tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc  120
tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac  180
ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc  240
acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg  300
gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc  360
cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg  420
gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag  480
gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc  540
agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc  600
aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg  660
aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc  720
agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg  780
aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct  840
tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc  900
acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac  960
tctcctggta aatga                                                   975
<210>  25
<211>  324
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  25
cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct   60
ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag  120
tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac  180
agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa  240
cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag  300
agcttcaaca ggaatgagtg ttag                                         324
<210>  26
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  26
Asp Tyr Ser Met His
1               5
<210>  27
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  27
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Met His
1               5                   10
<210>  28
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  28
Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  29
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  29
Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr
1               5                   10
<210>  30
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  30
Ile Pro Leu Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1               5                   10                  15
<210>  31
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  31
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Arg Asn Leu Ala
1               5                   10
<210>  32
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  32
Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1               5
<210>  33
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  33
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp Thr
1               5
<210>  34
<211>  15
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  34
gactattcaa tgcac                                                    15
<210>  35
<211>  30
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  35
ggttatacct tcacagacta ttcaatgcac                                    30
<210>  36
<211>  51
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  36
tggataaaca ctgagactgg tgagccaaca tatgcagatg acttcaaggg a            51
<210>  37
<211>  30
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  37
tggataaaca ctgagactgg tgagccaaca                                    30
<210>  38
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  38
attcccctct attactacgg tagtaggtac tggtacttcg atgtc                   45
<210>  39
<211>  33
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  39
cgagcaagtg agaatattta cagaaattta gca                                33
<210>  40
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  40
gctgcaacaa acttagcaga t                                             21
<210>  41
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  41
caacattttt ggggtactcc gtggacg                                       27
<210>  42
<211>  19
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  42
Met Ala Gly Ile Phe Tyr Phe Ile Leu Phe Ser Phe Leu Phe Gly Ile
1               5                   10                  15
Cys Asp Ala
<210>  43
<211>  1030
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  43
Val Thr Gly Ser Arg Val Tyr Pro Ala Asn Glu Val Thr Leu Leu Asp
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Val Gln Gly Glu Leu Gly Trp Ile Ala Ser Pro Leu Glu
20                  25                  30
Gly Gly Trp Glu Glu Val Ser Ile Met Asp Glu Lys Asn Thr Pro Ile
35                  40                  45
Arg Thr Tyr Gln Val Cys Asn Val Met Glu Ala Ser Gln Asn Asn Trp
50                  55                  60
Leu Arg Thr Asp Trp Ile Thr Arg Glu Gly Ala Gln Arg Val Tyr Ile
65                  70                  75                  80
Glu Ile Lys Phe Thr Leu Arg Asp Cys Asn Ser Leu Pro Gly Val Met
85                  90                  95
Gly Thr Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Tyr Glu Ser Asp Asn
100                 105                 110
Asp Lys Glu Arg Phe Ile Arg Glu Ser Gln Phe Gly Lys Ile Asp Thr
115                 120                 125
Ile Ala Ala Asp Glu Ser Phe Thr Gln Val Asp Ile Gly Asp Arg Ile
130                 135                 140
Met Lys Leu Asn Thr Glu Ile Arg Asp Val Gly Pro Leu Ser Lys Lys
145                 150                 155                 160
Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Val Gly Ala Cys Ile Ala Leu Val
165                 170                 175
Ser Val Arg Val Phe Tyr Lys Lys Cys Pro Leu Thr Val Arg Asn Leu
180                 185                 190
Ala Gln Phe Pro Asp Thr Ile Thr Gly Ala Asp Thr Ser Ser Leu Val
195                 200                 205
Glu Val Arg Gly Ser Cys Val Asn Asn Ser Glu Glu Lys Asp Val Pro
210                 215                 220
Lys Met Tyr Cys Gly Ala Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro Ile Gly Asn
225                 230                 235                 240
Cys Leu Cys Asn Ala Gly His Glu Glu Gln Asn Gly Glu Cys Gln Ala
245                 250                 255
Cys Lys Ile Gly Tyr Tyr Lys Ala Leu Ser Thr Asp Ala Ser Cys Ala
260                 265                 270
Lys Cys Pro Pro His Ser Tyr Ser Val Trp Glu Gly Ala Thr Ser Cys
275                 280                 285
Thr Cys Asp Arg Gly Phe Phe Arg Ala Asp Asn Asp Ala Ala Ser Met
290                 295                 300
Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro Leu Asn Leu Ile Ser Asn Val
305                 310                 315                 320
Asn Glu Thr Ser Val Asn Leu Glu Trp Ser Ser Pro Gln Asn Thr Gly
325                 330                 335
Gly Arg Gln Asp Ile Ser Tyr Asn Val Val Cys Lys Lys Cys Gly Ala
340                 345                 350
Gly Asp Pro Ser Lys Cys Arg Pro Cys Gly Ser Gly Val His Tyr Thr
355                 360                 365
Pro Gln Gln Asn Gly Leu Lys Thr Thr Arg Val Ser Ile Thr Asp Leu
370                 375                 380
Leu Ala His Thr Asn Tyr Thr Phe Glu Ile Trp Ala Val Asn Gly Val
385                 390                 395                 400
Ser Lys Tyr Asn Pro Ser Pro Asp Gln Ser Val Ser Val Thr Val Thr
405                 410                 415
Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Ser Ile Ala Leu Val Gln Ala Lys Glu
420                 425                 430
Val Thr Arg Tyr Ser Val Ala Leu Ala Trp Leu Glu Pro Asp Arg Pro
435                 440                 445
Asn Gly Val Ile Leu Glu Tyr Glu Val Lys Tyr Tyr Glu Lys Asp Gln
450                 455                 460
Asn Glu Arg Ser Tyr Arg Ile Val Arg Thr Ala Ala Arg Asn Thr Asp
465                 470                 475                 480
Ile Lys Gly Leu Asn Pro Leu Thr Ser Tyr Val Phe His Val Arg Ala
485                 490                 495
Arg Thr Ala Ala Gly Tyr Gly Asp Phe Ser Glu Pro Leu Glu Val Thr
500                 505                 510
Thr Asn Thr Val Pro Ser Arg Ile Ile Gly Asp Gly Ala Asn Ser Thr
515                 520                 525
Ala Ala Ala Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp Phe Trp Asn
530                 535                 540
Arg Glu Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ala
545                 550                 555                 560
Gln Thr Ala Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly
565                 570                 575
Val Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Lys Asp
580                 585                 590
Lys Leu Gly Pro Glu Ile Pro Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Val
595                 600                 605
Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Val Asp Lys His Val Pro Asp Ser Gly
610                 615                 620
Ala Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Phe Gln Thr
625                 630                 635                 640
Ile Gly Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg
645                 650                 655
Gly Asn Glu Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys
660                 665                 670
Ser Val Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala
675                 680                 685
Gly Thr Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp
690                 695                 700
Val Pro Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln
705                 710                 715                 720
Leu Ile Ser Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys
725                 730                 735
Tyr Met Phe Arg Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Tyr
740                 745                 750
Ser Gln Gly Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp
755                 760                 765
Leu Ala Lys Arg Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu
770                 775                 780
Met Gln Ala Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe
785                 790                 795                 800
Glu Pro Gly Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser Thr Leu Asp
805                 810                 815
Pro Ser Leu Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Arg Leu Leu Ser Arg
820                 825                 830
Asn Pro Arg Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His
835                 840                 845
Gly His His Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Thr Ile Met
850                 855                 860
Phe Asp Asp Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser Glu Glu Asp
865                 870                 875                 880
Thr Leu Ser Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly
885                 890                 895
Gly Tyr Pro Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys
900                 905                 910
Ala Arg Asp Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly Asn Gly Pro
915                 920                 925
Gly Tyr Val Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr Glu Ser Glu
930                 935                 940
Ser Gly Ser Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro Leu Asp Glu
945                 950                 955                 960
Glu Thr His Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln
965                 970                 975
Ala His Leu Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile Ala His Val
980                 985                 990
Met Ala Phe Ala Ala Cys Leu Glu  Pro Tyr Thr Ala Cys  Asp Leu Ala
995                 1000                 1005
Pro Pro  Ala Gly Thr Thr Asp  Ala Ala His Pro Gly  His His His
1010                 1015                 1020
His His  His His His His His
1025                 1030
<210>  44
<211>  986
<212>  БЕЛОК
<213>  Macaca mulatta
<400>  44
Met Ala Gly Ile Phe Tyr Phe Ala Leu Phe Ser Cys Leu Phe Gly Ile
1               5                   10                  15
Cys Asp Ala Val Thr Gly Ser Arg Val Tyr Pro Ala Asn Glu Val Thr
20                  25                  30
Leu Leu Asp Ser Arg Ser Val Gln Gly Glu Leu Gly Trp Ile Ala Ser
35                  40                  45
Pro Leu Glu Gly Gly Trp Glu Glu Val Ser Ile Met Asp Glu Lys Asn
50                  55                  60
Thr Pro Ile Arg Thr Tyr Gln Val Cys Asn Val Met Glu Pro Ser Gln
65                  70                  75                  80
Asn Asn Trp Leu Arg Thr Asp Trp Ile Thr Arg Glu Gly Ala Gln Arg
85                  90                  95
Val Tyr Ile Glu Ile Lys Phe Thr Leu Arg Asp Cys Asn Ser Leu Pro
100                 105                 110
Gly Val Met Gly Thr Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Tyr Glu
115                 120                 125
Ser Asp Asn Asp Lys Glu Arg Phe Ile Arg Glu Asn Gln Phe Val Lys
130                 135                 140
Ile Asp Thr Ile Ala Ala Asp Glu Ser Phe Thr Gln Val Asp Ile Gly
145                 150                 155                 160
Asp Arg Ile Met Lys Leu Asn Thr Glu Ile Arg Asp Val Gly Pro Leu
165                 170                 175
Ser Lys Lys Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Val Gly Ala Cys Ile
180                 185                 190
Ala Leu Val Ser Val Arg Val Phe Tyr Lys Lys Cys Pro Leu Thr Val
195                 200                 205
Arg Asn Leu Ala Gln Phe Pro Asp Thr Ile Thr Gly Ala Asp Thr Ser
210                 215                 220
Ser Leu Val Glu Val Arg Gly Ser Cys Val Asn Asn Ser Glu Glu Lys
225                 230                 235                 240
Asp Val Pro Lys Met Tyr Cys Gly Ala Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro
245                 250                 255
Ile Gly Asn Cys Leu Cys Asn Ala Gly His Glu Glu Arg Ser Gly Glu
260                 265                 270
Cys Gln Ala Cys Lys Ile Gly Tyr Tyr Lys Ala Leu Ser Thr Asp Ala
275                 280                 285
Thr Cys Ala Lys Cys Pro Pro His Ser Tyr Ser Val Trp Glu Gly Ala
290                 295                 300
Thr Ser Cys Thr Cys Asp Arg Gly Phe Phe Arg Ala Asp Asn Asp Ala
305                 310                 315                 320
Ala Ser Met Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro Leu Asn Leu Ile
325                 330                 335
Ser Asn Val Asn Glu Thr Ser Val Asn Leu Glu Trp Ser Ser Pro Gln
340                 345                 350
Asn Thr Gly Gly Arg Gln Asp Ile Ser Tyr Asn Val Val Cys Lys Lys
355                 360                 365
Cys Gly Ala Gly Asp Pro Ser Lys Cys Arg Pro Cys Gly Ser Gly Val
370                 375                 380
His Tyr Thr Pro Gln Gln Asn Gly Leu Lys Thr Thr Lys Val Ser Ile
385                 390                 395                 400
Thr Asp Leu Leu Ala His Thr Asn Tyr Thr Phe Glu Ile Trp Ala Val
405                 410                 415
Asn Gly Val Ser Lys Tyr Asn Pro Ser Pro Asp Gln Ser Val Ser Val
420                 425                 430
Thr Val Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Ser Ile Ala Leu Val Gln
435                 440                 445
Ala Lys Glu Val Thr Arg Tyr Ser Val Ala Leu Ala Trp Leu Glu Pro
450                 455                 460
Asp Arg Pro Asn Gly Val Ile Leu Glu Tyr Glu Val Lys Tyr Tyr Glu
465                 470                 475                 480
Lys Asp Gln Asn Glu Arg Ser Tyr Arg Ile Val Arg Thr Ala Ala Arg
485                 490                 495
Asn Thr Asp Ile Lys Gly Leu Asn Pro Leu Thr Ser Tyr Val Phe His
500                 505                 510
Val Arg Ala Arg Thr Ala Ala Gly Tyr Gly Asp Phe Ser Glu Pro Leu
515                 520                 525
Glu Val Thr Thr Asn Thr Val Pro Ser Arg Ile Ile Gly Asp Gly Ala
530                 535                 540
Asn Ser Thr Val Leu Leu Val Ser Val Ser Gly Ser Val Val Leu Val
545                 550                 555                 560
Val Ile Leu Ile Ala Ala Phe Val Ile Ser Arg Arg Arg Ser Lys Tyr
565                 570                 575
Ser Lys Ala Lys Gln Glu Ala Asp Glu Glu Lys His Leu Asn Gln Gly
580                 585                 590
Val Arg Thr Tyr Val Asp Pro Phe Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Gln Ala
595                 600                 605
Val Arg Glu Phe Ala Lys Glu Ile Asp Ala Ser Cys Ile Lys Ile Glu
610                 615                 620
Lys Val Ile Gly Val Gly Glu Phe Gly Glu Val Cys Ser Gly Arg Leu
625                 630                 635                 640
Lys Val Pro Gly Lys Arg Glu Ile Cys Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys
645                 650                 655
Ala Gly Tyr Thr Asp Lys Gln Arg Arg Asp Phe Leu Ser Glu Ala Ser
660                 665                 670
Ile Met Gly Gln Phe Asp His Pro Asn Ile Ile His Leu Glu Gly Val
675                 680                 685
Val Thr Lys Cys Lys Pro Val Met Ile Ile Thr Glu Tyr Met Glu Asn
690                 695                 700
Gly Ser Leu Asp Ala Phe Leu Arg Lys Asn Asp Gly Arg Phe Thr Val
705                 710                 715                 720
Ile Gln Leu Val Gly Met Leu Arg Gly Ile Gly Ser Gly Met Lys Tyr
725                 730                 735
Leu Ser Asp Met Ser Tyr Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile
740                 745                 750
Leu Val Asn Ser Asn Leu Val Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Met Ser
755                 760                 765
Arg Val Leu Glu Asp Asp Pro Glu Ala Ala Tyr Thr Thr Arg Gly Gly
770                 775                 780
Lys Ile Pro Ile Arg Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ile Ala Tyr Arg Lys
785                 790                 795                 800
Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Val Met Trp Glu
805                 810                 815
Val Met Ser Tyr Gly Glu Arg Pro Tyr Trp Asp Met Ser Asn Gln Asp
820                 825                 830
Val Ile Lys Ala Ile Glu Glu Gly Tyr Arg Leu Pro Pro Pro Met Asp
835                 840                 845
Cys Pro Ile Ala Leu His Gln Leu Met Leu Asp Cys Trp Gln Lys Glu
850                 855                 860
Arg Ser Asp Arg Pro Lys Phe Gly Gln Ile Val Asn Met Leu Asp Lys
865                 870                 875                 880
Leu Ile Arg Asn Pro Asn Ser Leu Lys Arg Thr Gly Thr Glu Ser Ser
885                 890                 895
Arg Pro Asn Thr Ala Leu Leu Asp Pro Ser Ser Pro Glu Phe Ser Ala
900                 905                 910
Val Val Ser Val Gly Asp Trp Leu Gln Ala Ile Lys Met Asp Arg Tyr
915                 920                 925
Lys Asp Asn Phe Thr Ala Ala Gly Tyr Thr Thr Leu Glu Ala Val Val
930                 935                 940
His Val Asn Gln Glu Asp Leu Ala Arg Ile Gly Ile Thr Ala Ile Thr
945                 950                 955                 960
His Gln Asn Lys Ile Leu Ser Ser Val Gln Ala Met Arg Thr Gln Met
965                 970                 975
Gln Gln Met His Gly Arg Met Val Pro Val
980                 985
<210>  45
<211>  528
<212>  БЕЛОК
<213>  Macaca mulatta
<400>  45
Val Thr Gly Ser Arg Val Tyr Pro Ala Asn Glu Val Thr Leu Leu Asp
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Val Gln Gly Glu Leu Gly Trp Ile Ala Ser Pro Leu Glu
20                  25                  30
Gly Gly Trp Glu Glu Val Ser Ile Met Asp Glu Lys Asn Thr Pro Ile
35                  40                  45
Arg Thr Tyr Gln Val Cys Asn Val Met Glu Pro Ser Gln Asn Asn Trp
50                  55                  60
Leu Arg Thr Asp Trp Ile Thr Arg Glu Gly Ala Gln Arg Val Tyr Ile
65                  70                  75                  80
Glu Ile Lys Phe Thr Leu Arg Asp Cys Asn Ser Leu Pro Gly Val Met
85                  90                  95
Gly Thr Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Tyr Glu Ser Asp Asn
100                 105                 110
Asp Lys Glu Arg Phe Ile Arg Glu Asn Gln Phe Val Lys Ile Asp Thr
115                 120                 125
Ile Ala Ala Asp Glu Ser Phe Thr Gln Val Asp Ile Gly Asp Arg Ile
130                 135                 140
Met Lys Leu Asn Thr Glu Ile Arg Asp Val Gly Pro Leu Ser Lys Lys
145                 150                 155                 160
Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Val Gly Ala Cys Ile Ala Leu Val
165                 170                 175
Ser Val Arg Val Phe Tyr Lys Lys Cys Pro Leu Thr Val Arg Asn Leu
180                 185                 190
Ala Gln Phe Pro Asp Thr Ile Thr Gly Ala Asp Thr Ser Ser Leu Val
195                 200                 205
Glu Val Arg Gly Ser Cys Val Asn Asn Ser Glu Glu Lys Asp Val Pro
210                 215                 220
Lys Met Tyr Cys Gly Ala Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro Ile Gly Asn
225                 230                 235                 240
Cys Leu Cys Asn Ala Gly His Glu Glu Arg Ser Gly Glu Cys Gln Ala
245                 250                 255
Cys Lys Ile Gly Tyr Tyr Lys Ala Leu Ser Thr Asp Ala Thr Cys Ala
260                 265                 270
Lys Cys Pro Pro His Ser Tyr Ser Val Trp Glu Gly Ala Thr Ser Cys
275                 280                 285
Thr Cys Asp Arg Gly Phe Phe Arg Ala Asp Asn Asp Ala Ala Ser Met
290                 295                 300
Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro Leu Asn Leu Ile Ser Asn Val
305                 310                 315                 320
Asn Glu Thr Ser Val Asn Leu Glu Trp Ser Ser Pro Gln Asn Thr Gly
325                 330                 335
Gly Arg Gln Asp Ile Ser Tyr Asn Val Val Cys Lys Lys Cys Gly Ala
340                 345                 350
Gly Asp Pro Ser Lys Cys Arg Pro Cys Gly Ser Gly Val His Tyr Thr
355                 360                 365
Pro Gln Gln Asn Gly Leu Lys Thr Thr Lys Val Ser Ile Thr Asp Leu
370                 375                 380
Leu Ala His Thr Asn Tyr Thr Phe Glu Ile Trp Ala Val Asn Gly Val
385                 390                 395                 400
Ser Lys Tyr Asn Pro Ser Pro Asp Gln Ser Val Ser Val Thr Val Thr
405                 410                 415
Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Ser Ile Ala Leu Val Gln Ala Lys Glu
420                 425                 430
Val Thr Arg Tyr Ser Val Ala Leu Ala Trp Leu Glu Pro Asp Arg Pro
435                 440                 445
Asn Gly Val Ile Leu Glu Tyr Glu Val Lys Tyr Tyr Glu Lys Asp Gln
450                 455                 460
Asn Glu Arg Ser Tyr Arg Ile Val Arg Thr Ala Ala Arg Asn Thr Asp
465                 470                 475                 480
Ile Lys Gly Leu Asn Pro Leu Thr Ser Tyr Val Phe His Val Arg Ala
485                 490                 495
Arg Thr Ala Ala Gly Tyr Gly Asp Phe Ser Glu Pro Leu Glu Val Thr
500                 505                 510
Thr Asn Thr Val Pro Ser Arg Ile Ile Gly Asp Gly Ala Asn Ser Thr
515                 520                 525
<210>  46
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический праймер
<400>  46
catcagccct aatccatctg a                                             21
<210>  47
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический праймер
<400>  47
cgcgactaac aatcaaagtg a                                             21
<210>  48
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический праймер
<400>  48
ctaggccaca gaattgaaag atct                                          24
<210>  49
<211>  25
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический праймер
<400>  49
gtaggtggaa attctagcat catcc                                         25
<210>  50
<211>  96
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Ser
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro
85                  90                  95
<210>  51
<211>  96
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  51
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
85                  90                  95
<210>  52
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  52
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  53
<211>  98
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50                  55                  60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg
<210>  54
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  54
Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
1               5                   10                  15
Thr Val Ser Ser
20
<210>  55
<211>  19
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  55
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser
<210>  56
<211>  57
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  56
atggaatggt catgggtctt tctgttcttt ctgtcagtca caaccggggt ccacagt      57
<210>  57
<211>  57
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  57
atggaatggt cttgggtctt tctgttcttt ctgtccgtca ctaccggggt ccactca      57
<210>  58
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  58
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Asp Ala Arg Cys
20
<210>  59
<211>  60
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  59
atgtccgtgc ctactcaggt gctggggctg ctgctgctgt ggctgaccga cgctagatgt   60
<210>  60
<211>  328
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  60
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115                 120                 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130                 135                 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
145                 150                 155                 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165                 170                 175
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
180                 185                 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195                 200                 205
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
210                 215                 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225                 230                 235                 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245                 250                 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260                 265                 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275                 280                 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290                 295                 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305                 310                 315                 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210>  61
<211>  984
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  61
gctagcacta aaggaccaag cgtgttccct ctggctccaa gcagcaaatc aacctcaggc   60
ggcacagcag cactggggtg tctggtgaag gactacttcc cagagcccgt caccgtgtca  120
tggaacagcg gagcactgac tagcggagtc cacacctttc cagccgtgct gcagagctcc  180
ggactgtact ccctgtctag tgtggtcaca gtgccttcaa gctccctggg gactcagacc  240
tatatctgca acgtgaatca caagccctcc aatactaagg tcgacaaacg agtggagcct  300
aagtcttgtg ataaaacaca tacttgcccc ccttgtcctg ctccaccagc cgctgcacca  360
agcgtgttcc tgtttcctcc aaagcccaaa gacacactga tgatcagcag aactcctgag  420
gtcacctgcg tggtcgtgga cgtgtcccac gaggatcccg aagtccagtt taactggtac  480
gtggatgggg tcgaagtgca taatgcaaag actaaacctc gggaggaaca gttcaactct  540
acctttagag tcgtgagtgt gctgacagtc gtgcaccagg actggctgaa cggaaaggag  600
tataagtgca aagtgtctaa taagggcctg cccgccccta tcgagaaaac aattagtaag  660
actaaaggcc agccaaggga accccaggtg tacacactgc cccctagtcg cgaggaaatg  720
acaaagaacc aggtctcact gacttgtctg gtgaaagggt tctatccatc cgacattgcc  780
gtggagtggg aatctaatgg acagcccgaa aacaattaca agaccacacc acccatgctg  840
gacagcgatg gatccttctt tctgtattca aagctgaccg tggataaaag ccggtggcag  900
cagggcaatg tcttttcctg ctctgtgatg cacgaagccc tgcacaacca ctacactcag  960
aagtccctgt ccctgtctcc tggc                                         984
<210>  62
<211>  325
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  62
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100                 105                 110
Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195                 200                 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210>  63
<211>  975
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  63
gctagcacaa aaggcccctc tgtcttccct ctggctccct cctcccgctc cacctccgag   60
tccactgccg ctctgggctg tctggtcaag gattacttcc ctgagccagt cactgtgagt  120
tggaactcag gcgccctgac cagcggagtc cacacatttc ccgctgtgct gcagagctcc  180
ggcctgtact ccctgtctag tgtggtcacc gtgccttcaa gcaatttcgg gactcagacc  240
tatacatgca acgtggacca taagccatct aatactaagg tcgataaaac cgtggagcga  300
aaatcctgcg tggaatgccc accttgtcct gctccaccag ccgctgcacc aagcgtgttc  360
ctgtttcctc caaagcccaa agacacactg atgatcagca gaactcctga ggtcacctgc  420
gtggtcgtgg acgtgtccca cgaggatccc gaagtccagt ttaactggta cgtggatggg  480
gtcgaagtgc ataatgcaaa gactaaacct cgggaggaac agttcaactc tacctttaga  540
gtcgtgagtg tgctgacagt cgtgcaccag gactggctga acggaaagga gtataagtgc  600
aaagtgtcta ataagggcct gcccgcccct atcgagaaaa caattagtaa gactaaaggc  660
cagccaaggg aaccccaggt gtacacactg ccccctagtc gcgaggaaat gacaaagaac  720
caggtctcac tgacttgtct ggtgaaaggg ttctatccat ccgacattgc cgtggagtgg  780
gaatctaatg gacagcccga aaacaattac aagaccacac cacccatgct ggacagcgat  840
ggatccttct ttctgtattc aaagctgacc gtggataaaa gccggtggca gcagggcaat  900
gtcttttcct gctctgtgat gcacgaagcc ctgcacaacc actacactca gaagtccctg  960
tccctgtctc ctggc                                                   975
<210>  64
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  64
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35                  40                  45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50                  55                  60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85                  90                  95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100                 105
<210>  65
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  65
cgtacggtcg ccgccccctc cgtgtttatt tttcctccat ctgacgaaca gctgaagagt   60
gggaccgcct ccgtggtgtg cctgctgaac aatttctacc cccgggaggc caaggtgcag  120
tggaaagtcg acaacgctct gcagtctggc aatagtcagg agtcagtgac tgaacaggac  180
agcaaggatt ccacctattc tctgagctcc accctgacac tgagcaaagc agattacgaa  240
aagcacaaag tctatgcctg cgaagtgacc caccaggggc tgagcagtcc agtgaccaag  300
tcctttaaca ggggagagtg t                                            321
<210>  66
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  66
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50                  55                  60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Pro Leu Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp
100                 105                 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  67
<211>  372
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  67
caggtccagc tggtccagtc agggagcgaa ctgaagaaac caggcgcatc agtgaaggtc   60
agctgcaaag cctccgggta taccttcaca gactactcta tgcactgggt gcggcaggct  120
ccaggacagg gactggagtg gatggggtgg atcaacactg agaccggaga acctacctat  180
gctcagggct tcaccggcag attcgtgttt agcctggaca catctgtcag tactgcatac  240
ctgcagatca gctccctgaa ggccgaagat accgctgtct actattgtgc caggattccc  300
ctgtactatt acgggagcag gtattggtat tttgatgtct gggggcaggg aacaaccgtc  360
actgtcagca gc                                                      372
<210>  68
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  68
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50                  55                  60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Pro Leu Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp
100                 105                 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  69
<211>  372
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  69
caggtccagc tggtccagtc agggagcgaa ctgaagaaac caggcgcatc agtgaaggtc   60
agctgcaaag cctccgggta taccttcaca gactactcta tgcactgggt gcggcaggct  120
ccaggacagg gactgaagtg gatggggtgg atcaacactg agaccggaga acctacctat  180
gctcagggct tcaccggcag attcgtgttt agcctggaca catctgtcag tactgcatac  240
ctgcagatca gctccctgaa ggccgaagat accgctgtct actattgtgc caggattccc  300
ctgtactatt acgggagcag gtattggtat tttgatgtct gggggcaggg aacaaccgtc  360
actgtcagca gc                                                      372
<210>  70
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  70
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50                  55                  60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Pro Leu Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp
100                 105                 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  71
<211>  372
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  71
cagatccagc tggtccagtc agggagcgaa ctgaagaaac caggcgcatc agtgaaggtc   60
agctgcaaag cctccgggta taccttcaca gactactcta tgcactgggt gcggcaggct  120
ccaggacagg gactgaagtg gatggggtgg atcaacactg agaccggaga acctacctat  180
gctcagggct tcaccggcag attcgtgttt agcctggaca catctgtcag tactgcatac  240
ctgcagatca gctccctgaa ggccgaagat accgctgtct actattgtgc caggattccc  300
ctgtactatt acgggagcag gtattggtat tttgatgtct gggggcaggg aacaaccgtc  360
actgtcagca gc                                                      372
<210>  72
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  72
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Pro Leu Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp
100                 105                 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  73
<211>  372
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  73
caggtgcagc tggtgcagtc tgggagcgaa ctgaagaaac caggggcatc agtgaaggtc   60
agctgcaaag cctccggata taccttcaca gactactcta tgcactgggt gcggcaggct  120
ccaggacagg gactggagtg gatgggatgg atcaacactg agaccggcga acctacctat  180
gctgacgatt ttaagggcag attcgtgttt agcctggaca catctgtcag tactgcatac  240
ctgcagatca gctccctgaa agccgaagat acagctgtct actattgtgc caggattccc  300
ctgtactatt acggaagcag gtattggtat tttgatgtct gggggcaggg aacaactgtg  360
actgtgtcct cc                                                      372
<210>  74
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  74
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Pro Leu Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp
100                 105                 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  75
<211>  372
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  75
caggtgcagc tggtgcagtc tgggagcgaa ctgaagaaac caggggcatc agtgaaggtc   60
agctgcaaag cctccggata taccttcaca gactactcta tgcactgggt gcggcaggct  120
ccaggacagg gactgaagtg gatgggatgg atcaacactg agaccggcga acctacctat  180
gctgacgatt ttaagggcag attcgtgttt agcctggaca catctgtcag tactgcatac  240
ctgcagatca gctccctgaa agccgaagat acagctgtct actattgtgc caggattccc  300
ctgtactatt acggaagcag gtattggtat tttgatgtct gggggcaggg aacaactgtg  360
actgtgtcct cc                                                      372
<210>  76
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  76
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Pro Leu Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp
100                 105                 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  77
<211>  372
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  77
cagatccagc tggtgcagtc tgggagcgaa ctgaagaaac caggggcatc agtgaaggtc   60
agctgcaaag cctccggata taccttcaca gactactcta tgcactgggt gcggcaggct  120
ccaggacagg gactgaagtg gatgggatgg atcaacactg agaccggcga acctacctat  180
gctgacgatt ttaagggcag attcgtgttt agcctggaca catctgtcag tactgcatac  240
ctgcagatca gctccctgaa agccgaagat acagctgtct actattgtgc caggattccc  300
ctgtactatt acggaagcag gtattggtat tttgatgtct gggggcaggg aacaactgtg  360
actgtgtcct cc                                                      372
<210>  78
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  78
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Arg Asn
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  79
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  79
gatatccaga tgacccagtc tccttcctct ctgagtgctt cagtgggcga ccgggtcacc   60
atcacatgca gagcaagcga gaacatctac aggaatctgg cctggtatca gcagaagccc  120
ggcaaagctc ctaagctgct ggtgtacgcc gctaccaacc tggcagatgg agtgccaagc  180
cggttcagcg gatccggatc tggaacagac tatactctga ccatcagctc cctgcagccc  240
gaagattttg ccacttacta ttgtcagcat ttctggggca caccttggac cttcgggcag  300
ggaactaaag tggagattaa g                                            321
<210>  80
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  80
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Arg Asn
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  81
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  81
gatatccaga tgacccagtc tccttcctct ctgagtgctt cagtgggcga ccgggtcacc   60
atcacatgca gagcaagcga gaacatctac aggaatctgg cctggtatca gcagaagccc  120
ggcaaagctc ctaagctgct gctgtacgcc gctaccaacc tggcagatgg agtgccaagc  180
cggttcagcg gatccggatc tggaacagac tatactctga ccatcagctc cctgcagtcc  240
gaagattttg ccacttacta ttgtcagcat ttctggggca caccttggac cttcgggcag  300
ggaactaaag tggagattaa g                                            321
<210>  82
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Arg Asn
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Leu
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  83
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  83
gatatccaga tgacccagtc tccttcctct ctgagtgctt cagtgggcga ccgggtcacc   60
atcacatgca gagcaagcga gaacatctac aggaatctgg cctggtatca gcagaagccc  120
ggcaaagctc ctcaactgct gctgtacgcc gctaccaacc tggcagatgg agtgccaagc  180
cggttcagcg gatccggatc tggaacagac tatactctga ccatcagctc cctgcagccc  240
gaagattttg ccacttacta ttgtcagcat ttctggggca caccttggac cttcgggcag  300
ggaactaaag tggagattaa g                                            321
<210>  84
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  84
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Arg Asn
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  85
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  85
gaaatcgtga tgacccagtc tcccgccact ctgtctgtga gtccaggcga gcgggctacc   60
ctgtcttgca gagcaagcga aaacatctac aggaatctgg cctggtatca gcagaagcca  120
ggacagtctc ctcgactgct gatctacgcc gctacaaacc tggcagacgg gattcccgca  180
cgattctcag gaagcggatc cggaaccgag tataccctga caattagctc cctgcagagc  240
gaagatttcg ccgtctacta ttgtcagcat ttctggggaa caccttggac attcgggcag  300
ggaactaaag tggagattaa g                                            321
<---