РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ESCHERICHIA COLI-ПРОДУЦЕНТ L-ТРЕОНИНА
RECOMBINANT STRAIN OF ESCHERICHIA COLI L-THREONINE-PRODUCER

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологическому синтезу L-треонина с использованием рекомбинантного штамма рода Escherichia, в котором гены sstT и poxB инактивированы, а экспрессия гена galP и оперона thrABC усилена.
L-треонин является незаменимой аминокислотой, которую широко используют в качестве фуражной, кормовой добавки и стимулятора роста животного, а также в качестве компонента в лекарственных водных растворах и дополнительного сырья в медицинских продуктах. В настоящее время в развитых странах L-треонин производят всего пять компаний.
Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, выделенных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.
Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4278765). Указанные методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к обратному ингибированию продуцируемой L-аминокислотой (JP56-18596 (1981), WO 95/16042, US 5661012 и US 6040160).
442
442
442
442
Известный штамм - продуцент L-треонина Escherichia coli ВКПМ B-3996 (US 5175107 и US 5705371) является лучшим на сегодняшний день штаммом - продуцентом L-треонина. Для создания штамма ВКПМ B-3996 несколько мутаций и плазмида, описанная ниже, были введены в родительский штамм E.coli K-12 (ВКПМ B-7). Мутантный ген thrA (мутация thrA) кодирует белок аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, который устойчив к ингибированию треонином по типу обратной связи. Мутантный ген ilvA (мутация ilvA) кодирует белок треониндеаминазу, обладающую пониженной активностью, которая выражается в пониженном уровне биосинтеза изолейцина и в фенотипе с недостатком по изолейцину типа "leaky". В бактерии с мутацией ilvA транскрипция оперона thrABC не репрессируется изолейцином, что дает положительный эффект на продукцию треонина. Инактивация гена tdh приводит к предотвращению деградации треонина. В указанный штамм была введена генетическая детерминанта ассимиляции сахарозы (гены scrKYABR). Для увеличения экспрессии генов, контролирующих биосинтез треонина, в промежуточный штамм TDH6 была введена плазмида pVIC40, содержащая мутантный треониновый оперон thrA BC.
Общий подход к повышению уровня экспрессии конкретного гена предусматривает использование плазмиды, увеличивающей число копий гена с целью увеличения соответствующей информационной РНК (Sambrook et al., Molecular cloning, Second Edition, 1989, 1.3-1.5). Ген-мишень интегрируют в плазмиду, а микроорганизм-хозяин трансформируют рекомбинантной плазмидой с целью увеличения числа генов в микроорганизме-хозяине в соответствии с копийностью плазмиды. Об определенном успехе в подходе такого типа, предпринятом для увеличения продуктивности треонина, сообщается в патенте US 5538873. Однако большинство методов, использующих такие рекомбинантные плазмиды, характеризуются сверхпродукцией конкретного гена, что нежелательно для микроорганизма-хозяина и создает проблемы, связанные с неустойчивостью плазмиды, вследствие чего может происходить потеря плазмиды в ходе культивирования рекомбинантного штамма.
В качестве альтернативы данному подходу на сегодняшний день наиболее часто рассматривают интеграцию дополнительных копий целевого гена в хромосому микроорганизма-хозяина или замена промотора целевого гена на промотор, обеспечивающий более высокий уровень экспрессии.
araBAD
Инактивация хромосомных генов путем замены соответствующей открытой рамки считывания (далее ORF) последовательностью селективного маркера, может быть произведена с помощью трансформации штамма ПЦР-продуктом, содержащим последовательность маркера, фланкированную короткими (36-50 п.н.) участками, гомологичными хромосомальной последовательности выше и ниже целевого гена. В данном случае рекомбинацию осуществляет рекомбинационная система Red фага λ. Экспрессия генов рекомбинационной системы обеспечивается плазмидой pKD46, содержащей фрагмент ДНК фага, кодирующий гены gam, bet и exo под контролем промотора P. Продукт гена exo - ингибирует активность внутриклеточной эндонуклеазы, таким образом, становится возможна трансформация Е.coli линейным фрагментом ДНК. В свою очередь продукты генов gam и bet позволяют осуществлять рекомбинацию по коротким участкам гомологии (Datsenko, Wanner, PNAS vol. 97 no. 12 6640-6645, 2000)
В условиях, когда главный путь биосинтеза L-треонина изучен и достаточно хорошо оптимизирован, дальнейшее улучшение существующего штамма-продуцента L-треонина может быть достигнуто путем ослабления метаболических путей, не приводящих к синтезу целевого продукта, а также ослаблению обратного транспорта уже синтезированного продукта в клетку. Кроме того, штамм, модифицированный таким образом для осуществления сверхсинтеза какого-то одного соединения, может испытывать дефицит глюкозы. Как следствие, усиление транспорта глюкозы в клетку может благоприятно сказаться на уровне продукции.
Показано, что наряду с такими транспортерами L-треонина как livJ и tdcC в клетках Е.coli функционирует транспортер, осуществляющий транспорт L-треонина в клетку в симпорте с катионом натрия. Позже был идентифицирован ген, кодирующий указанный транспортер - ygjU, в настоящее время называемый sstT. В работе по изучению метаболизма штаммов Е.coli с минимизированным геномом показано, что делеция по гену sstT увеличивает накопление L-треонина в культуральной жидкости (Lee, J.H. et al. Microb Cell Fact 8,2; 2009).
Продукт гена poxB - пируватоксидаза катализирует окислительное декарбоксилирование пирувата с образованием ацетата, при котором акцептором электронов является убихинон. Несмотря на то, что в данном случае окисление сопряжено с работой электрон-транспортной цепи (далее ЭТЦ), такой путь метаболизма пирувата является менее энергетически выгодным, чем путь с участием пируватдегидрогеназного комплекса. Кроме того, образование ацетата не только замедляет рост культуры и снижает конверсию, но и затрудняет очистку конечного продукта. Ранее на Corynebacterium glutamicum было показано, что инактивация гена poxB приводит увеличению продукции лизина как минимум на 15% (RU 2000126983 и US 2005196848).
Как отмечалось выше, для эффективного биосинтеза любого соединения необходимо достаточное поступление продуктов гликолиза, а следовательно, и эффективный транспорт глюкозы в клетку. Известно, что основной системой транспорта глюкозы в клетках Е.coli является фосфотрансферазная система (ФТС). Компоненты этой системы используют энергию макроэргической связи в молекуле фосфоенолпирувата (ФЕП) для транспорта глюкозы через цитоплазматическую мембрану с ее одновременным фосфорилированием. Показано, что на долю ФТС приходится около половины всего ФЕП. В тоже время, именно реакция карбоксилирования ФЕП с образованием оксалоацетата является основной реакцией восполнения интермедиатов цикла Кребса в метаболизме Е.coli. Таким образом, дальнейшее увеличение активности ФТС, например, за счет ее дерепрессии путем инактивации гена mlc, приведет, с одной стороны к усилению транспорта глюкозы, но с другой стороны негативно скажется на синтезе оксалоацетата - важного предшественника в пути биосинтеза треонина. Альтернативой такому подходу может быть активация ФЕП-независимых транспортных систем, например, galP. Будучи транспортером галактозы, продукт гена galP демонстрирует достаточно высокое сродство к глюкозе. Как было показано, эффективность ФЕП-независимых транспортных систем достаточно высока, и даже достаточна, чтобы скомпенсировать отсутствие ФТС (Slivinskaya E.A. et al. Biotechnology (Moscow) 5, 24-37; 2007).
Ближайший аналог заявляемого штамма - известный продуцент L-тренина штамм Escherichia coli ВКПМ B-3996 (US 5175107)
Задача настоящего изобретения
Расширение ассортимента рекомбинантных штаммов Escherichia coli, способных продуцировать L-треонин.
Задача решена путем конструирования штамма Escherichia coli ВКПМ B-11820.
В основу конструирования положено установление того факта, что совместная инактивация генов poxB и sstT на фоне увеличенной экспрессии гена galP и генов оперона thrABC приводит к увеличеню продукции L-треонина у заявляемого штамма.
Характеристика заявляемого штамма Escherichia coli ВКПМ B-11820
Морфологические признаки.
Грамотрицательные слабо подвижные тонкие палочки с закругленными концами, размером 1,5-2 мкм в длину.
Культурально-физиологические признаки.
Мясо-пептонный агар. Через 24 ч роста при 37°C образует круглые, беловатые, полупрозрачные на свет колонии, диаметром 2-3 мм, поверхность колонки гладкая, края ровные или слегка волнистые, центр колоний приподнят, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется.
Агаризованная минимальная среда (Адамса) с глюкозой и изолейцином. Через 2-е сут роста при 37°C образует колонии диаметром 1-1,5 мм, серовато-белые, круглые с равными краями, слегка выпуклые, внутренняя структура однородная, поверхность блестящая, через 4-5 сут колонии приобретают слизистую (мукоидную) консистенцию.
Рост в мясо-пептонном бульоне.
После 24 ч роста при 37°C наблюдается сильное помутнение, небольшой осадок, запах характерный.
Рост в жидкой минимальной среде Адамса с изолейцином.
Через двое суток роста при 37°C аэрацией наблюдается сильное равномерное помутнение, запах отсутствует.
Рост по уколу в мясо-пептонном агаре
Хороший рост по всему уколу.
Рост на среде с желатином
Желатин - не разжижает.
Рост на срде с молоком
Рост хороший с коагуляцией молока.
Индол не образует.
Рост на различных углеводах.
Хорошо растет на глюкозе, лактозе, маннозе, галактозе, ксилозе, фруктозе, глицероле и маннитоле с образованием кислоты и газа.
Устойчивость к антибиотикам.
Устойчив к канамицину.
Штамм не патогенен.
Потребность в факторах роста.
Ауксотроф по изолейцину.
Пример 1. Замена природного промотора гена galP.
В настоящем примере последовательно описаны этапы сверхэкспрессии гена galP путем замены природного промотора на синтетический промотор Ptac3.
lac
ДНК плазмиды pMWPlacI-118-attL-Cm-attR (Katashkina Zh et al., Mol Biol (Mosk). 2005; 39(5): 823-31) обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BglII. и XbaI. Электрофоретическое разделение двух полученных фрагментов ДНК проводят в 1% агарозном геле. Фрагмент ДНК размером 1671 п.н., содержащий селективный маркер -ген устойчивости к хлроамфениколу, фланкированный последовательностями λattL и λattR (сайтами узнавания рекомбиназами Int/Xis) очищают методом экстракции из агарозного геля. Полученную ДНК обрабатывают Pfu-полимеразой в течение 2 часов при 72°C, в результате 5′-выступающие концы достраиваются.
ДНК фрагмент, содержащий кассету λattL-Cm-λattR лигируют с плазмидной ДНК pMW118 (Nippon Gene Co, GenBank AB005475.2), предварительно линеаризованной эндонуклеазой рестрикции SalI и обработанной Pfu-полимеразой. Полученной плазмидой трансформируют штамм Е.coli XL1 (Blue) методом электропорации. Клоны, содержащие необходимую вставку амплифицированной ДНК, отбирают на чашках с агаризованной средой LA по устойчивости к хлорамфениколу. Плазмидную ДНК, выделенную из отобранных клонов, проверяют рестрикционным анализом, используя эндонуклеазы рестрикции AatII и BglII, сайт узнавания последней восстанавливается при лигировании. Полученная плазмида, размером 5853 п.н. названа pMW-attL-Cm-attR.
ПЦР продукт, содержащий ген Bacillus subtilis SacB, амплифицируют с использованием Pfu-полимеразы (Ferments) и синтетических олигонуклеотидов:
и
,
Матрицей для ПЦР служит тотальная геномная ДНК Bacillus subtilis 168 ВКПМ B-1727. ПЦР продукт обрабатывают эндонуклеазой рестрикции PaeI. Проводят электрофорез и методом экстракции из агарозного геля выделяют фрагмент размером 2008 п.н., содержащий ген SacB. Около 0,2 мкг полученной ДНК лидируют с 0,1 мкг ДНК плазмиды pUC19, предварительно линеаризованной эндонуклеазой рестрикции PaeI. Полученной плазмидой трансформируют штамм Е.coli XL1 (Blue) методом электропорации. Клоны, содержащие необходимую вставку амплифицированной ДНК, отбирают на чашках с агаризованной средой LA (триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, натрия хлорид 10 г/л, агар бактериологический 20 г/л) по устойчивости к ампициллину и стандартному тесту на отсутствие активности β-галактозидазы. Двенадцать отобранных клонов пересевают на агаризованную среду LA с добавлением сахарозы (100 г/л). На среде с сахарозой у всех клонов наблюдается снижение жизнеспособности, образуются колонии значительно меньшие в размере, нежели чем на среде без сахарозы, что свидетельствует о токсичном действии SacB. Данный признак позволяет проводить негативную селекцию с используемым маркером SacB. Плазмидную ДНК, выделенную из отобранных клонов, проверяют рестрикционным анализом. Полученная плазмида, размером 4694 п.н. названа pUC19-SacB.
Далее в ДНК последовательность плазмиды pUC19-SacB вводят дополнительный селективный маркер - ген kan, кодирующий аминогликозид-3′-фосфотрансферазу, обеспечивающий устойчивость к антибиотику канамицину. Для этого плазмиду pUC4K (Amersham, GE Healtcare, USA) обрабатывают эндонуклеазой рестрикции PstI и проводят электрофоретическое разделение фрагментов расщепленной плазмидной ДНК. Фрагмент длиной 1240 п.н., содержащий ген kan, выделяют методом экстракции из 1%-го агарозного геля. Около 0,25 мкг полученной ДНК лигируют с 0,1 мкг ДНК плазмиды pUC19-SacB, обработанной сходным образом. Полученной плазмидой трансформируют штамм Е.coli XL1 (Blue) методом электропорации. Клоны, содержащие необходимую вставку амплифицированной ДНК, отбирают на чашках с агаризованной средой LA по устойчивости к канамицину (здесь и далее канамицина 0,1 г/л). Плазмидную ДНК, выделенную из отобранных клонов, проверяют рестрикционным анализом. Полученная плазмида, размером 5934 п.н. названа pSacB-Kan.
ДНК плазмиды pSacB-Kan обрабатывают эндонуклеазой рестрикции PaeI. Полученные фрагменты размерами 2008 п.н. и 3926 п.н. разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле. Фрагмент ДНК длиной 2008 п.н., содержащий ген SacB, экстрагируют из геля и лигируют с ДНК плазмиды pMW-attL-Cm-attR, предварительно линеаризованной эндонуклеазой рестрикции NheI и обработанной Pfu-полимеразой.
Полученным лигатом трансформирюут штамм Е.coli XL1 (Blue) методом электропорации. Трансформанты отбирают на чашках с агаризованной средой LA с добавлением хлорамфеникола. Далее устойчивые к хлорамфениколу клоны проверяют на способность расти на среде LA с добавлением 10% сахарозы. Чувствительные к сахарозе клоны пересевают в жидкую LB среду (триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, натрия хлорид 10 г/л). Выделенную плазмидную ДНК проверяют рестрикционным анализом. Полученная матричная плазмида была названа pMW-attL-SacB-Cm-attR.
В качестве исходного вектора для конструирования матрицы для получения интегративных кассет используют вектор pKK223-3 (Pharmacia, Milano, Italy). Вектор pKK223-3 обрабатывают эндонуклеазой рестрикции EcoRI с последующей обработкой Pfu-полимеразой для «затупливания» липких концов. Далее линеаризованную ДНК обрабатывают эндонуклеазой рестрикции PaeI, после чего методом экстракции из геля выделяют фрагмент 4400 п.н. Плазмиду pMW-attL-SacB-Cm-attR обрабатывают эндонуклеазами рестрикции MbiI и PaeI. После экстракции из геля получают фрагмент 3770 п.н. Фрагменты 4400 п.н. и 3770 п.н. после реакции лигирования используют для трансформации штамма XL1-Blue методом электропорации. Трансформанты отбирают на среде LA с ампициллином, хлорамфениколом и тетрациклином (здесь и далее ампициллина 0,125 г/л, хлорамфеникола 0,01 г/л, тетрациклина 0,0125 г/л). Наличие корректной вставки подтверждают методом рестрикционного анализа. Полученная плазмида размером 8170 п.н. названа pKK-cs-Ptrc.
В качестве матрицы для амплификации промотора Ptac3 используют коммерчески доступную плазмида pDR540. ДНК-фрагмент, содержащий промотор Ptac3, амплифицируют с использованием Pfu-полимеразы и синтетических олигонуклеотидов:
и
.
ПЦР продукт очищают методом экстракции из геля и после обработки эндонуклеазой рестрикции NcoI экстрагируют повторно. В результате получают фрагмент размером 126 п.о.
Для конструирования матричной плазмиды используют описанную выше плазмиду pKK-cs-Ptrc. После обработки плазмиды pKK-cs-Ptrc эндонуклеазой рестрикции Ecl136II, проводят неполную рестрикция с использованием эндонуклеазы NcoI. В результате получают набор фрагментов следующих размеров: 326 п.о., 3241 п.о., 4929 п.о., 7844 п.о. Фрагмент размером 7844 п.о. очищают методом экстракции из агарозного геля. Далее ДНК-фрагмент обрабатывают щелочной фосфатазой FastAP с последующей экстракцией из геля.
Полученные фрагменты лигируют, после чего штамм XL1-Blue трансформируют полученной лигазной смесью. Клоны отобрают на среде LA с добавлением тетрациклина (12,5 мкг/мл) и хлорамфеникола (10 мкг/мл). Корректность последовательности клонированного фрагмента подтверждают методом секвенирования по Сэнгеру. Полученная плазмида размером 7970 п.н. названа pKK-cs-Ptac3.
В качестве матрицы для синтеза используют плазмиду pKK-cs-Ptac3. Для специфической амплификации используют синтетические олигонуклеотиды:
и
содержащие участки по 48 п.н. (левый фланг) и 50 п.н. (правый фланг), гомологичные участкам, расположенным выше и ниже промотора PgalP на хромосоме. ПЦР амплификацию проводят с использованием полимеразы Pfu. Полученный ПЦР продукт размером 3891 п.н., содержит ген устойчивости к хлорамфениколу, ген контрселекции SacB, фланкированный последовательностями фага λ attL и attR (сайтами узнавания системы рекомбинации Int/Xis) и гомологичными участками выше и ниже нативного промотора PgalP. Фрагмент очищают методом экстракции из агарозного геля и далее используют для трансформации штамма TDH-6 (представляющего собой бесплазмидный вариант штамма Escherichia coli ВКПМ В-3996), несущего вспомогательную плазмиду pKD46. Трансформанты отбирают на среде LA с хлорамфениколом. Корректность последовательности вставки подтверждают методом секвенирования по Сэнгеру. Полученный штамм назван TDH-6-galP-tac3-cs.
Кассету att-Cm-SacB-att удаляют посредством трасформации штамма TDH-6-galP-tac3-cs ПЦР продуктом, две части которого гомологичны областям на хромосоме выше и ниже указанной кассеты. ПЦР продукт получают с использованием олигонуклеотидов
и
. Праймеры содержат области гомологичные хромосомальным участкам выше и ниже инсерции, соответственно. Амплификацию проводят без добавления хромосомальной ДНК в качестве матрицы поскольку олгонуклеотиды имеют область гомологии между собой. Полученный ПЦР продукт размером 98 п.н. очищают методом экстракции из геля и используют для трансформации штамма TDH-6-galP-tac3-cs. Отбирают трансформанты способные к росту на среде LA с, сахарозой и чувствительные к хлорамфениколу. Полученный штамм назван TDH-6-galP-tac3.
Пример 2. Инактивация гена sstT
В данном примере описана инактивация гена sstT путем замены его ORF последовательностью, несущей селективный маркер устойчивости к хлорамфениколу. Данную конструкцию получают методом ПЦР с использованием следующих олигонуклеотидов:
и
.
Олигонуклеотиды подбирают таким образом, чтобы после удаления маркера оставить делению in-frame, и таким образом не изменить уровень экспрессии нижележащих генов.
В качестве матрицы для синтеза используют плазмиду pMW-attL-SacB-Cm-attR (см. пример 1). ПЦР проводят с использованием полимеразы Pfu для того, чтобы избежать ошибок в последовательности. Полученный ПЦР продукт размером 3944 п.н., содержащий гены cat и sacB, фланкированные последовательностями фага λ attL и attR (сайтами узнавания системы рекомбинации Int/Xis) и гомологичными участками выше и ниже гена sstT, очищают методом экстракции из агарозного геля и далее используют для трансформации штамма TDH-6, несущего вспомогательную плазмиду pKD46. Отбор трансформантов проводят на среде LA с хлорамфениолом. Отобранные клоны далее проверяют методом ПЦР на наличие инсерции в локусе sstT. Для амплификации фрагмента используют следующие олигонуклеотиды:
и
.
Наличие продукта размером 4413 п.н. интерпретируют как интеграцию кассеты в целевой локус. Полученный штамм назван TDH-6-ΔsstT::att-Cm-SacB-att.
Пример 3. Инактивация гена poxB
В данном примере описана инактивация гена рохВ путем замены его ORF последовательностью, несущей селективный маркер устойчивости к хлорамфениколу. Данную конструкцию получают методом ПЦР с использованием следующих олигонуклеотидов:
и
.
Олигонуклеотиды подбирают таким образом, чтобы после удаления маркера оставить делению in-frame, и таким образом не изменить уровень экспрессии нижележащих генов.
В качестве матрицы для синтеза используют плазмиду pMW-attL-SacB-Cm-attR (см. пример 1). ПЦР проводят с использованием полимеразы Pfu для того, чтобы избежать ошибок в последовательности. Полученный ПЦР продукт размером 3944 п.н., содержащий гены cat и sacB, фланкированные последовательностями фага λ attL и attR (сайтами узнавания системы рекомбинации Int/Xis) и гомологичными участками выше и ниже гена poxB, очищают методом экстракции из агарозного геля и далее используют для трансформации штамма TDH-6, несущего вспомогательную плазмиду pKD46. Отбор трансформантов проводят на среде LA с хлорамфениколом. Отобранные клоны далее проверяют методом ПЦР на наличие инсерции в локусе poxB. Для амплификации фрагмента используют следующие олигонуклеотиды:
и
.
Наличие продукта размером 4413 п.н. интерпретируют как интеграцию кассеты в целевой локус. Полученный штамм назван TDH-6-ΔpoxB::att-Cm-SacB-att
Пример 4. Получение штамма TDH-6-galP-tac3-ΔsstT-ΔpoxB
На первом этапе фаг P1 выращивают на штамме TDH-6-ΔsstT::att-Cm-SacB-att устойчивом к хлорамфениколу. Реципиентом в этом случае выступает штамм TDH-6-galP-tac3, обладающий устойчивостью к канамицину. После проведения трансдукции отбирают клоны, содержащие оба генетических маркера на агаризованной среде LA с хлорамфениколом и канамицином. Полученный штамм, содержащий инсерцию ΔsstT::att-Cm-SacB-att и промотор Ptac3 перед геном galP назван TDH-6-galP-tac3-ΔsstT-cs.
Затем кассету, содержащую гены cat и sacB, фланкированные att-последовательностями, удаляют посредством трансформации указанного штамма плазмидой pMW-intxis-ts (Katashkina et al., Mol Biol (Mosk) 39, 823-831; 2005), несущей гены Int и Xis фага λ, кодирующие систему сайт-специфической рекомбинации. Отбор трансформантов проводят на агаризованной среде LA с сахарозой и по потере устойчивости к хлорамфениколу. Полученный штамм назван TDH-6-galP-tac3-ΔsstT.
Для переноса ΔpoxB::att-Cm-SacB-att в полученный штамм, фаг P1 выращивают на штамме TDH-6-ΔpoxB::att-Cm-SacB-att устойчивом к хлорамфениколу. Реципиентом в этом случае выступает штамм TDH-6-galP-tac3-ΔsstT, обладающий устойчивостью к канамицину. После проведения трансдукции отбирают клоны, содержащие оба генетических маркера на агаризованной среде LA с хлорамфениколом и канамицином. Полученный штамм, содержащий инсерцию ΔpoxB::Sitt-Cm-SacB-att, делецию ΔsstT и промотор Ptac3 перед геном galP был назван TDH-6-galP-tac3-ΔsstT-ΔpoxB-cs.
На финальном этапе кассету, содержащую гены cat и sacB, вновь удаляют с помощью плазмиды pMW-intxis-ts. В результате получают штамм TDH-6-galP-tac3-ΔsstT-ΔpoxB.
Пример 5. Модификация оперона thrABC.
A1
В данном примере описано введение интегративной конструкции в хромосому штамма TDH-6-galP-tac3-ΔsstT-Δpox. Данная конструкция заменят природный промотор оперона thrABC на фаговый промотор P, удаляет последовательность регуляторного пептида thrL, вводит точечную мутацию, вызывающую замену Gly433Arg в аминокислотной последовательности ThrA и заменяет природный. терминатор оперона терминатором TrrnB.
Фрагмент ДНК длиной 240 п.н. гомологичный хромосомальной последовательности выше треонинового оперона получают в ПЦР с Pfu-полимеразой. В качестве матрицы для синтеза используют препарат хромосомой ДНК штамма Е.coli MG1655. Для специфической амплификации используют синтетические олигонуклеотиды:
и
Полученый фрагмент очищают методом экстракции из агарозного геля и после обработки эндонуклеазами EheI и XagI экстрагируют повторно. В результате этого, получают фрагмент размером 226 п.н.
Векторную часть получают после обработки плазмиды pKK-cs-Ptrc (см. пример 1) эндонуклеазами EheI, XagI, щелочной фосфатазой FastAP и последующей экстракции из агарозного геля. Фрагменты лигируют и затем используют для трансформации штамма XL1-Blue. Клоны отбирают на среде LA с добавлением ампициллина, тетрациклина и хлорамфеникола. Корректность последовательности клонированного фрагмента подтверждают методом секвенирования по Сэнгеру. Полученная плазмида обозначена как pKK-up-cs и имеет размер 7816 п.н.
Фрагмент ДНК длиной 219 п.н. гомологичный хромосомальной последовательности, расположенной ниже треонинового оперона, получают в ПЦР с Pfu-полимеразой. В качестве матрицы для синтеза используют препарат хромосомой ДНК штамма Е.coli MG1655. Для специфической амплификации используют синтетические олигонуклеотиды:
и
Полученый фрагмент длиной 219 п.н. очищают методом экстракции из агарозного геля и после обработки эндонуклеазами PscI и PagI экстрагируют повторно. В результате получают фрагмент размером 209 п.н.
Векторную часть получают после обработки плазмиды pKK-up-cs эндонуклеазой рестрикции PagI, щелочной фосфатазой FastAP и последующей экстракции из геля. Фрагменты лигируют и используют для трансформации штамма XL1-Blue. Клоны отбирают на среде LA с добавлением тетрациклина и хлорамфеникола. Корректность последовательности клонированного фрагмента подтверждают методом секвенирования по Сэнгеру. Полученная плазмида обозначена как pKK-up-cs-dw и имеет размер 7017 п.н.
ПЦР продукт, содержащий гены Е.coli thrBC, амплифицируют с использованием Pfu-полимеразы и синтетических олигонуклеотидов:
.
Матрицей для ПЦР служит суммарная геномная ДНК Е.coli MG1655. ПЦР продукт длиной 2457 п.н. очищают методом экстракции ДНК из агарозного геля и обрабатывают эндонуклеазами рестрикции HindIII, Eco105I и Pfu-полимеразой для достройки 5′-выступающих концов. Около 0,2 мкг полученной ДНК лигируют с 0,1 мкг ДНК плазмиды pKK223-3, обработанной эндонуклеазой рестрикции HindIII. и Pfu-полимеразой. Методом электропорации полученной плазмидой трансформируют штамм Е.coli XL1 (Blue). Клоны, содержащие необходимую вставку амплифицированной ДНК, отбирают на чашках с агаризованной средой LA по устойчивости к ампициллину. Рестрикционным анализом подтверждают наличие вставки. Корректность последовательности клонированного фрагмента подтверждают методом секвенирования по Сэнгеру. Полученная плазмида размером 7049 п.н. названа pKK-thrBC.
Фрагмент ДНК размером 522 п.н. получают в процессе ПЦР с Pfu-полимеразой и вектором pKK233-2 в качестве матрицы, используя для специфической амплификации олигонуклеотиды:
и
Полученный фрагмент очищают методом экстракции из агарозного геля и используют в качестве матрицы в следующей ПЦР.
Во второй ПЦР также применяют Pfu-полимеразу и синтетические олигонуклеотиды:
и
Продукт размером 560 п.н. также очищают методом экстракции из агарозного геля и используют как матрицу в третей ПЦР с Pfu-полимеразой. Для третьей ПЦР применяют синтетические олигонуклеотиды:
и
Фрагмент 580 п.н. после очистки методом экстракции из агарозного геля обрабатывают эндонуклеазами рестрикции PaeI и PstI и повторно очищают. Полученный фрагмент размером 487 п.н. лигируют с фрагментом 6578 п.н., полученным после обработки плазмиды pKK-thrBC эндонуклеазами PaeI, PstI, щелочной фосфатазой. Лигазную смесь используют для трансформации штамма MG1655ΔppcF′ методом электропорации. Трансформанты отбирают на среде LA с ампициллином, канамицином и тетрациклином. Наличие корректной вставки подтверждают методом рестрикционного анализа и последующего секвенирования. Полученная плазмида размером 7065 п.н. названа pKK2233-Ptac-thrBC.
Фрагмент ДНК, содержащий мутантный вариант гена thrA, получают следующим обрзом. Проводят две ПЦР, используя Pfu-полимеразу и хромосому штамма MG1655 в качестве матрицы. Для специфической амплификации используют две пары синтетических олигонуклеотидов:
и
,
или
и
Полученные продукты длиной 1075 и 1591 п.н. очищают методом экстракции из агарозного геля и используют в качестве матрицы в третей ПЦР с Pfu-полимеразой и синтетическими олигонуклеотидами thrFnativ и seqthr7r. Продукт 2646 п.н. после экстракции из агарозного геля лигируют с вектором pUC19, линеаризованным эндонуклеазой рестрикции HincII (2686 п.н.). Лигазную смесь используют для трансформации штамма XL1-Blue. Клоны, содержащие необходимую вставку, отбирают на чашках с агаризованной средой LA, содержащей X-Gal (0,0008%) и IPTG (0,0008%), по устойчивости к ампициллину и стандартному тесту на отсутствие активности β-галактозидазы. Наличие правильной вставки подтверждают методом рестрикционного анализа. Корректность последовательности клонированного фрагмента подтверждают методом секвенирования по Сэнгеру. Полученная плазмида обозначена pUC19-thrA-345 и имеет размер 5332 п.н.
Плазмиду pKK2233-Ptac-thrBC обрабатывают эндонуклеазами рестрикции SmaI, Eco105I и щелочной фосфатазой FastAP, после чего фрагмент 6996 п.н. очищают методом экстракции из агарозного геля. Плазмиду pUC19-thrA-345 обрабатывают эндонуклеазами рестрикции Bsp68I и Eco105I После экстракции из агарозного геля получают фрагмент 2460 п.н. Фрагменты 6996 п.н. и 2460 п.н. лигируют и затем используют для трансформации штамма MG1655ΔppcF′ методом электропорации. Трансформанты отбирают на среде LA с ампициллином, канамицином и тетрациклином. Наличие корректной вставки подтверждают методом рестрикционного анализа. Корректность последовательности клонированного фрагмента подтверждают методом секвенирования по Сэнгеру. Полученная плазмида размером 9456 п.н. названа pKK2233-thrABC-345.
ПЦР продукт, содержащий ген E.coli rhtA, амплифицируют с использованием Pfu-полимеразы и синтетических олигонуклеотидов:
,
,
и
.
В качестве матрицы для ПЦР используют препарат хромосомной ДНК Е.coli MG1655. ПЦР продукты, полученные с использованием пар олигонуклеотидов FrhtABam и RrhtAmut-1 или FrhtAmut-1 и RrhtASph затем очищают методом экстракции из агарозного геля. Полученные фрагменты используют в качестве матриц при проведении амплификации с олигонуклеотидами FrhtABam и RrhtASph. Конечный ПЦР продукт длиной 1184 п.н. очищают методом экстракции из агарозного геля и обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamHI. и SphI. Около 0,2 мкг полученной ДНК лигируют с 0,1 мкг ДНК плазмиды pBR322, обработанной аналогичным образом. Полученной плазмидой трансформируют штамм Е.coli XL1 (Blue) методом электропорации. Клоны, содержащие необходимую вставку амплифицированной ДНК, отбирают на чашках с агаризованной средой LA по устойчивости к ампициллину с последующим пересевом на среду с тетрациклином. Клоны, чувствительные к тектрациклину, несут плазмиду с амплифицированной вставкой. Плазмидную ДНК, выделенную из отобранных клонов, проверяют рестрикционным анализом. Полученная плазмида размером 5364 п.н. названа pBR-rhtA.
Плазмиды pKK2233-thrABC-345 и pBR-rht последовательно обрабатывают эндонуклеазами рестрикции PaeI и BamHI. После этого, методом экстракции из агарозного геля выделяют фрагменты размером 9269 и 1373 п.н., соответственно. Далее, фрагменты объединяют в реакции лигирования и используют для трансформации штамма MG1655ΔppcF′ методом электропорации. Трансформанты отбирают на среде LA с ампициллином, канамицином и тетрациклином. Наличие корректной вставки подтверждают методом рестрикционного анализа. Полученная плазмида названа pKK-rhtA-thrABC-345 и имеет размер 10642 п.н.
Плазмиду pKK-up-cs-dw обрабатывают эндонуклеазами рестрикции VspI и PagI с последующей обработкой щелочной фосфатазой FastAP. Далее, методом экстракции из агарозного геля очищают фрагмент длиной 6466 п.н. Плазмиду pKK-rhtA-thrABC-345 также обрабатывают эндонуклеазами рестрикции VspI и PagI. После экстракции из геля получают фрагмент 5415 п.н. Фрагменты 6466 п.н. и 5415 п.н. после реакции лигирования используют для трансформации штамма MG1655ΔppcF′ методом электропорации. Трансформанты отбирают на среде LA с канамицином, хлорамфениколом и тетрациклином. Наличие корректной вставки подтверждают методом рестрикционного анализа. Полученная плазмида размером 11881 п.н. была названа pKK-up-cs-dw-thrABC-345.
433
Фрагмент ДНК содержащий мутантный вариант гена thrA получают в результате двух раундов ПЦР. Первоначально амплифицируют фрагмент размером 1457 п.н. В качестве матрицы используют препарат хромосомной ДНК штамма MG1655. Для специфической амплификации используют синтетические олигонуклеотиды:
и
Полученый фрагмент очищают методом экстракции из агарозного геля и используют как матрицу для второго раунда ПЦР. Во втором раунде ПЦР получают фрагмент ДНК размером 1491 п.н. с использованием синтетических олигонуклеотидов:
и
Полученый фрагмент очищают методом экстракции из агарозного геля и затем обрабатывают эндонуклеазой MunI. После очистки в агарозном геле получают фрагмент ДНК размером 1086 п.н., который используют для клонирования.
433
Плазмиду pKK-up-cs-dw-thrABC-345 последовательно обрабатывают эндонуклеазами рестрикции MunI и OliI, а затем очищают методом экстракции из агарозного геля фрагмент размером 10795 п.н., который используют в качестве вектора. Указанный выше фрагмент размером 1086 п.н., содержащий мутантный вариант гена thrA и вектор размером 10795 п.н. лигируют с помощью фермента T4 ДНК лигазы. Лигазную смесь используют для трансформации штамма MG1655ΔppcF′. Трансформанты отбирают на среде LA с хлорамфениколом и тетрациклином. Наличие корректной вставки подтверждают методом рестрикционного анализа. Полученную плазмиду размером 11881 п.н. назвали pKK-up-cs-dw-thrABC-433.
Плазмиду pKK-up-cs-dw-thrABC-433 обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Eco72I. Продукты рестрикции разделяют электрофоретически и фрагмент ДНК размером 9882 п.н. очищают методом экстракции из агарозного геля. Полученный фрагмент используют для трансформации штамма TDH-6-galP-tac3-ΔsstT-Δpox методом электоропорации. Трансформантов отбирают на чашках с агаризованной средой LA по устойчивости к хлорамфениколу. Интеграцию вставки в целевой локус подтверждают методом ПЦР. Полученный штамм был назван TDH-G-galP-tac3-ΔsstT-Δpox-thrA-433-CS.
A1
Фрагмент ДНК содержащий последовательность промотора P фага T7 получают в ПЦР с Pfu-полимеразой и препаратом геномной ДНК фага T7 в качестве матрицы. Для специфической амплификации используют синтетические олигонуклеотиды:
Полученный ПЦР продукт очищают методом экстракции из агарозного геля после чего используют для трансформации штамма TDH-6-galP-tac3-ΔsstT-Δpox-thrA-433-CS методом электропорации. Трансформантов отбирают на агаризованной среде LA с добавлением сахарозы до конечной концентрации 10%. Способные к росту на среде с сахарозой клоны затем проверяют на чувствительность к хлорамфениколу. Корректность последовательности вставки подтверждают методом секвенирования по Сэнгеру. Полученный в результате штамм назван TDH-6-galP-tac3-ΔsstT-Δpox-thrA-433. Во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) указанный штамм депонирован как Е.coli ВКПМ B-11820. Полученный штамм является сутью настоящего изобретения.
Пример 6. Продукция L-треонина штаммом ВКПМ B-11820
Для проверки эффекта введенных модификаций на продукцию L-треонина, полученный штамм ВКПМ В-11820 сравнивают по продуктивности с известным штаммом-продуцентом L-треонина Е.coli ВКПМ B-3996, который может быть получен путем трансформации штамма TDH-6 плазмидой pVIC40, описанной выше.
Для получения посевной культуры каждый из штаммов культивируют на роторной качалке (250 об/мин) при 32°C в течение 18 часов в пробирках 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 2% глюкозы. Затем в ферментационную среду вносят 0.21 мл (10%) посевного материала. Ферментацию проводят в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках 20×200 мм. Клетки культивируют в течение 24 часов при 32°C на роторной качалке - 250 об/мин.
Состав ферментационной среды (мас.%):
Глюкоза
2.0
(NH4)2SO4
2.2
NaCl
0.08
KH2PO4
0.2
MgSO4·7H2O
0.08
FeSO4·7H2O
0.002
MnSO4·5H2O
0.002
Тиамин HCl
0.00002
Дрожжевой экстракт
0.1
CaCO3
3.0
Вода
остальное
Глюкозу и сульфат марганца стерилизуют отдельно. CaCO3 стерилизуют сухим жаром при 180°C в течение 2 часов. pH доводят до 7.0. Антибиотик стрептомицин (100 мг/л) добавляют в среду после стерилизации (только для штамма ВКПМ B-3996).
После выращивания количество накопленного в среде L-треонина определяют с помощью бумажной хроматографии, при этом используют следующий состав подвижной фазы: бутанол : уксусная кислота : вода = 4:1:1 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне используют для визуализации. Пятна, содержащие L-треонин, вырезают, L-треонин элюируют 0.5% водным раствором CdC12, после чего количество L-треонина оценивают спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм.
Результаты пяти независимых пробирочных ферментации приведены в Таблице 1.
Таблица 1.
Штамм
Продукция треонина, г/л
ВКПМ В-3996
6,3±0.6
ВКПМ В-11820
7,1±0.4
В результате установлено, что заявляемый штамм Escherichia coli ВКПМ В-11820 способен эффективно продуцировать L-треонин.
Заявляемый штамм превосходит штамм - ближайший аналог Escherichia coli ВКПМ В-3996:
1) по продуктивности при культивировании в пробирках,
2) не нуждается в добавлении стрептомицина при культивировании.
Источники научно-технической информации
1. Datsenko, Wanner, PNAS vol. 97 no. 12 6640-6645, 2000.
One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.
2. Lee, J.H. et al. Microb Cell Fact 8, 2; 2009.
Systems metabolic engineering, industrial biotechnology and microbial cell factories.
3. Katashkina et al., Mol Biol (Mosk) 39, 823-831; 2005.
Application of the bacteriophage Mu-driven system for the integration/amplification of target genes in the chromosomes of engineered Gram-negative bacteria-mini review.
4. Sambrook et al., 1989, 1.3-1.5.
Molecular cloning, Second Edition.