СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТАДИИ ФИБРОЗА ПЕЧЕНИ У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМ ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ В
METHOD FOR DIAGNOSING THE STAGE OF HEPATIC FIBROSIS IN PATIENTS WITH CHRONIC VIRAL HEPATITIS B

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для оценки состояния печени у больных хроническим вирусным гепатитом В с использованием в качестве критерия стадии фиброза печени
Хронический вирусный гепатит В (ХВГВ) и хронический вирусный гепатит С (ХВГС) в настоящее время представляют собой актуальную проблему: по оценкам экспертов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), вирусом гепатита В во всем мире инфицировано 240-250 миллионов человек, а вирусом гепатита С - 150-500 миллионов. При этом более 50% живущих с вирусным гепатитом, не знают о своем заболевании по причине бессимптомного течения инфекции, что приводит к постоянному росту заболеваемости.
Прогноз для пациентов с хроническим вирусным гепатитом В (ХВГВ) (точно так же, как для пациентов с хроническим вирусным гепатитом С) зависит в целом от своевременной диагностики фиброза печени на начальных стадиях (F0-2 по классификации METAVIR), поскольку многочисленными исследованиями установлено, что ведущими процессами в прогрессировании заболевания являются фиброз печени и деструкция ДНК, приводящая к мутационным изменениям. При своевременном и эффективном лечении на этих стадиях возможно избежать формирования цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), ассоциированных с вирусом гепатита С (ВГС) и вирусом гепатита В (ВГВ) и, более того, добиться полного регресса фиброза.
В настоящее время «золотым» стандартом в диагностике заболеваний печени, включая стадию фиброза, является тонкоигольная аспирационная пункционная биопсия печени с последующим гистологическим определением стадии фиброза (Leftkowich J.H. Liver biopsy assessment in chronic hepatitis // Arch. Med. Res. - 2007. - Vol. 38. - №6. - P. 634-643). Однако известный способ является трудоемким, занимает продолжительное время и требует высокой квалификации морфологов, при этом инвазивный метод не всегда позволяет получить материал из нужного участка с максимально выраженным фиброзом, имеет ряд противопоказаний к применению и может сопровождаться развитием осложнений после выполнения процедуры.
Другой используемый на практике способ диагностики стадии фиброза печени осуществляемый с помощью Фибротеста (Biopredictive, Франция), описан в работе Poynard Т., Imbert-Bismut F., Munteanu М. Overview of the diagnostic value of biochemical markers of liver fibrosis (FibroTest, HCV FibroSure) and necrosis (ActiTest) in patients with chronic hepatitis C. (Comp Hepatol 2004; 3:8). В соответствии с известным способом, по стандартной методике в сыворотке крови определяют значение шести специфических маркеров, включающих гаптоглобулин, альфа-2-макроглобулин, аполипопротеин А1, гамма-глутамилтранспептидазу (ГГТП), аланинаминотрансферазу (АЛТ) и общий билирубин. На основании полученных данных, с помощью программного обеспечения по разработанному алгоритму, с учетом пола и возраста, вычисляют результирующую величину, определяющую степень активности гепатита и стадию фиброзных изменений в печени по классификации METAVIR. К недостаткам известного метода, в первую очередь, следует отнести его высокую стоимость, а также ряд ограничений, связанных с тем, что значения тестируемых маркеров меняются не только при патологии печени, но и при заболеваниях других органов, а также под влиянием различной терапии, что может существенно искажать объективную картину.
Известные на текущий момент технические решения, в том числе выполненные на уровне изобретений, не дают исчерпывающего решения проблемы, создание и внедрение в практику малоинвазивных, доступных и простых способов определения стадии фиброза печени, в частности, с применением маркеров, полученных из периферической крови, остаются актуальными.
Наиболее близким к заявляемому способу является метод диагностики фиброза печени при хроническом вирусном гепатите, основанный на генотоксическом эффекте влияния вирусов гепатита В и С на ДНК лимфоцитов, который включает оценку степени повреждения ДНК методом ДНК-комет в щелочной среде (Эпидемиология и инфекционные болезни. 2015. 20(2). С. 29-33). Согласно известному методу, в лимфоцитах, выделенных известным методом из разовой пробы крови, степень повреждения ДНК оценивают с помощью показателя содержания ДНК в хвосте комет (DNA t, %), регистрируют количество комет с повреждениями ДНК более 50%, определяют уровень общей антиоксидантной активности по содержанию 8-нитрогуанина (8-NO2G) и 8-оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозина (8-OHdG), после чего путем статистической обработки данных устанавливают коэффициент корреляции между исследуемыми параметрами в группах больных ХВГС и ХВГВ и степенью фиброза.
Учитывая тот факт, что определяющую роль в развитии и прогрессировании хронического гепатита играет иммунная система, а ВГ-индуцированное поражение печени в большей степени опосредовано иммунными механизмами, чем прямыми цитопатическими эффектами самого вируса, характер иммунного ответа может служить одним из критериев прогрессирования фиброза и, в конечном итоге, развития цирроза печени. Оценка полученных результатов по критерию % ДНК в «хвосте» кометы свидетельствует, что уровень показателей изменяется в зависимости от степени проявления фиброза.
Однако точность известного способа, обеспечивающего только качественную оценку уровня фиброза печени, которую, вдобавок, можно считать однозначной только в случае пациентов с ХВГС 1 генотипа, является недостаточной, что служит причиной того, что в оценке формирования фиброза печени метод ДНК-комет играет вспомогательную роль.
Задачей изобретения является разработка доступного, не требующего значительных затрат способа диагностики, позволяющего однозначно и с высокой вероятностью определять стадии фиброза печени при ХВГВ у пациентов с естественным течением заболевания, т.е. не получавших ранее лечение.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение достоверности определения стадии фиброза печени при одновременном расширении области его применения за счет возможности диагностики фиброза печени у пациентов с гепатитом В всех генотипов.
s1
s2
Указанный технический результат достигают способом диагностики фиброза печени у пациентов с хроническим вирусным гепатитом В, в соответствии с которым в лимфоцитах периферической крови методом ДНК-комет определяют процент повреждений ДНК, проводят дополнительный анализ крови и с помощью полученных данных оценивают стадии фиброза печени у больных ХВГВ, при этом, в отличие от известного способа, оценку осуществляют с использованием предсказательной математической модели, при этом выполняют клинический и общетерапевтический биохимический анализ крови, по результатам анализов находят коэффициенты порядковой логистической регрессии с регуляризацией для пациентов с гепатитом В, рассчитывают значения вспомогательных показателей e и e, подставляя полученные коэффициенты в следующие формулы:
es1=ехр(6,354 - 0,019*⋅Возраст - 0,096*⋅Лейкоциты - 0,066*⋅СОЭ - 0,770*⋅%ДНК в хвосте кометы);
es2=ехр(11,944-0,019*⋅Возраст - 0,096*⋅Лейкоциты - 0,066*⋅СОЭ - 0,770*⋅%ДНК в хвосте кометы);
где ехр - экспоненциальная функция,
возраст - возраст пациента, лет,
СОЭ - скорость оседания эритроцитов, мм/ч,
9
лейкоциты - содержание лейкоцитов в периферической крови пациента, 10/л,
ДНК в хвосте кометы - содержание ДНК в хвосте кометы лимфоцита, %, после чего находят значения вероятности Р для каждой стадии фиброза по формулам:
и определяют в качестве наиболее вероятной стадию фиброза печени, которая соответствует максимальному значению вероятности.
Предварительно была обследована группа пациентов с хроническим вирусным гепатитом В (ХВГВ) при этом критериями исключения из исследуемой группы служили: наличие коинфекции вирусных гепатитов С и D, признаки хронической артериальной недостаточности, ишемическая болезнь сердца, сердечная недостаточность, сахарный диабет; другие инфекционные и сопутствующие заболевания внутренних органов в стадии обострения. Исключены из исследования были также беременные, пациенты с психическими заболеваниями, курильщики. Все больные получали стандартную патогенетическую терапию ХВГВ.
Проведенные исследования включают детальный анализ клинико-лабораторных данных, при этом диагноз хронического вирусного гепатита устанавливали на основании выявленных методом иммуноферментного анализа (ИФА) суммарных антител к ВГВ с давностью заболевания более 6 месяцев, идентифицированной методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК ВГВ, с чувствительностью не менее 15 МЕ/мл. Стадию фиброза печени определяли на аппарате FibroScan по шкале METAVIR: F0 (нет фиброза) - не более 6,2 кПа; F1 (слабый фиброз) - 6,2-8,3 кПа; F2 (умеренный фиброз) - 8,3-10,8 кПа; F3 (тяжелый фиброз) - 10,8-14 кПа; F4 (цирроз печени) - более 14 кПа.
У всех пациентов проводили стандартные исследования, включающие физикальное обследование; общеклинический анализ крови на гематологическом анализаторе с определением скорости оседания эритроцитов (СОЭ) по Панченкову; общий анализ мочи, биохимическое исследование крови с определением содержания общего билирубина, холестерина, общего белка, альбуминов, глобулинов, креатинина, мочевины, глюкозы, сывороточного железа, протромбинового индекса (ПТИ), активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспарагинаминотрансферазы (АСТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТП), амилазы; исследование профиля маркеров для пациентов с ХВГВ: HBs-антиген, НВе-антиген, антитела классов IgM и IgG к НВ-core антигену, антитела к НВе-антигену, определение ДНК ВГВ количественно - вирусная нагрузка (ВН); инструментальные методы обследования: ультразвуковое исследование (УЗИ) органов брюшной полости и щитовидной железы, рентгенография легких, электрокардиография (ЭКГ), эзофагогастродуоденоскопия (ЭГДС). Также у всех пациентов определялась степень деструкции ДНК лимфоцитов.
Результаты показали наличие деструктивного процесса ДНК лимфоцитов практически у всех пациентов, а стадии фиброза обнаружили прямую зависимость со степенью повреждения ДНК, при этом пробы пациентов с ХВГВ обнаруживают наименьшее содержание ДНК в хвосте кометы лимфоцита, равное 5,1%.
На основании детального изучения полученных данных была разработана предсказательная математическая модель для оценки стадии фиброза печени у больных ХВГВ с использованием порядковой логистической регрессии с регуляризацией.
Способ осуществляют следующим образом.
На первом этапе определяют этиологию вирусного гепатита по общепринятым методикам и делают анализ крови пациента, включающий клинические показатели и биохимический анализ.
Оценку стадии фиброза печени пациентов с хроническим вирусным гепатитом В (ХВГВ) выполняют, опираясь на предсказательную математическую модель, в которой упомянутая стадия является наблюдаемой переменной, принимающей дискретные значения 1, 2, 3 (F0, F1-2 и F3-4, соответственно).
Поиск модели проводился на подвыборке пациентов с гепатитом В, причем при выборе оптимальной предсказательной модели была использована процедура кросс-валидации, которая позволяет при небольшом объеме выборки получить более корректные оценки качества классификации при использовании модели на наблюдениях, не входящих в имеющуюся выборку.
Согласно этой модели, количественный показатель выраженности у пациента определенной стадии фиброза является ненаблюдаемой непрерывной переменной (FIB*):
i
где i - номер наблюдения;  - вектор объясняющих переменных (включая константу); β - коэффициенты регрессионной модели; ε - независимые случайные величины, имеющие одинаковое распределение.
i
Наблюдаемой переменной является стадия фиброза, которая была зафиксирована по результатам эластометрии печени для пациента i (FIB) и которая в нашем случае может принимать дискретные значения 1, 2, 3 (F0, F1-2 и F3-4, соответственно). Поэтому фактически вместо модели (1) мы можем оценить модель вида:
j
i
j
где i - номер наблюдения;  - вектор объясняющих переменных (включая константу); β - вектор коэффициентов при объясняющих переменных (включая константу), который может зависеть от стадии фиброза j (j=1, 2, 3); ε - независимые случайные величины, имеющие одинаковое логистическое распределение; γ - неизвестные границы.
Предсказанная по результатам оценки модели (2) вероятность j-й стадии фиброза для i-го пациента будет следующей:
j
j
где  - гамма-функция,  - вектор объясняющих переменных (включая константу); β - вектор коэффициентов при объясняющих переменных (включая константу), который может зависеть от стадии фиброза j (j=1, 2, 3); ε - независимые случайные величины, имеющие одинаковое логистическое распределение.
j
Оценки параметров β могут быть получены с помощью метода максимального правдоподобия.
Для определения стадии фиброза вероятность каждой стадии представляют следующим образом:
Вероятность F0:
Вероятность F1-2:
Вероятность F3-4:
Соответственно, по той вероятности, которая окажется наибольшей из этих трех, можно будет предсказать, какая стадия фиброза, вероятнее всего, имеется у данного пациента.
Для отбора предикторов и получения оценок коэффициентов регрессионной модели используют оценку порядковой логистической регрессии по штрафам и оценку с помощью метода эластичной сети.
Во избежание переобучения модели (чрезмерной подгонки под имеющуюся выборку), используют процедуру кросс-валидации по K блокам, при этом для выборки пациентов с гепатитом В берут K=5. Для каждой из K обучающих подвыборок поиск оптимального значения регуляризационного параметра (λ) производится с помощью оценки модели по 20 различным значениям λ с выбором того из них, при котором значение информационного критерия Акаике (AIC) является минимальным. Для ряда предикторов после регуляризации с тем или иным параметром λ коэффициенты регрессии могут оказаться нулевыми - эти переменные не будут участвовать в предсказании стадии фиброза.
Результаты оценки порядковой логистической регрессии с регуляризацией по методу эластичной сети по 5 блокам выборки пациентов с гепатитом В представлены в таблице 1 Содержащиеся в ней значения параметра регуляризации λ - это те, с которыми в оценке модели по обучающей подвыборке соответствующего блока было получено минимальное значение AIC. В среднем ошибка классификации по всем блокам составила около 20%.
Полученные с выделенным выше значением X ненулевые оценки коэффициентов представлены в таблице 2.
Для расчета стадии фиброза печени у пациентов с ХВГВ используют следующие данные:
- возраст (лет),
9
- содержание лейкоцитов (10/л),
- СОЭ (мм/ч),
- Содержание ДНК в хвосте кометы лимфоцита (%).
Для дальнейших расчетов используют значения коэффициентов, представленные в таблице 2.
s1
s2
Для i-того пациента с гепатитом В с определенной стадией фиброза вычисляют вспомогательные показатели e, e, представляющие собой переменные коэффициенты формул (4, 5, 6), по следующим формулам, разработанным методом порядковой логистической регрессии с использованием эластичной сети и кросс-валидации:
s1
i
i
i
i
e = ехр(6.354 - 0.019 * Boзpacт - 0.096 * Лейкоциты - 0.066 * СОЭ - 0.770 * %ДНК)
s2
i
i
i
i
e = ехр(11.944 - 0.019 * Boзpacт - 0.096 * Лейкоцит, - 0.066 * СОЭ - 0.770 * %ДНК)
где ехр - экспоненциальная функция; 6,354, 0,019, 0,096, 0,066, 0,770 - константы;
%ДНК (в хвосте кометы) - содержание ДНК в хвосте кометы лимфоцитов периферической крови у i-того пациента (в %);
9
лейкоциты- содержание лейкоцитов в периферической крови у i-того пациента (10/л);
СОЭ - скорость оседания эритроцитов у i-того пациента (мм/ч); возраст - возраст i-того пациента (в годах).
s1
s2
Путем подстановки полученных значений e, e, в формулы (4, 5, 6) получают численное выражение вероятностей, наибольшее из которых указывает, какая стадия фиброза, вероятнее всего, имеется у данного пациента.
Соотношение фактической и предсказанной по этим формулам степеней фиброза для полной выборки пациентов с гепатитом В представлено в таблице 3. Подсчитанная по этой таблице ошибка классификации составляет 8%.
Пример конкретного осуществления способа
Пациент Ж. (40 лет) обратился на прием по поводу положительного анализа крови на HBsAg и положительной ПЦР ДНК ВГВ (качественно).
Получены следующие результаты обследований (значимые для расчета стадии фиброза):
s1
s2
1) Подставляют данные значения в формулы для e и e:
s1
e = ехр(6,354 - 0,019*40 - 0,096*5,2 - 0,066*7 - 0,770*10,35)=0,037165302;
s2
e = ехр(11,944 - 0,019*40 - 0,096*5,2 - 0,066*7 - 0,770* 10,35)=9,950475267.
s1
s2
2) Полученные значения e и e используют для подсчета вероятности по формулам (4, 5 и 6). В соответствии с выбранной предсказательной математической моделью, максимальное значение вероятности соответствует прогнозируемой стадии фиброза. После подсчета вероятности выбирают ее максимальное значение и определяют стадию фиброза.
Вероятность F0:
Вероятность F1-2:
Вероятность F3-4:
Полученное максимальное значение вероятности соответствует стадии фиброза F1-F2. Фактическая степень фиброза печени у данного пациента по результатам эластометрии - F2.
Простота технического выполнения, а также интерпретации результатов исследования, малая инвазивность; безопасность для пациентов, а именно отсутствие противопоказаний и потенциального риска развития осложнений, позволяют рекомендовать предлагаемый способ к применению в клинической практике.
К дополнительным преимуществам способа можно отнести невысокие затраты средств; кратковременное ожидание заключения с момента проведения диагностики; возможность повторного исследования, осуществляемого с необходимой частотой в динамике; применение не только «рутинных» биохимических, но и специфических показателей в качестве маркеров фиброзного перерождения печени, повышающее точность диагностики.