Способ лечения травматического повреждения спинного мозга
METHOD FOR TREATING TRAUMATIC SPINAL CORD INJURY

Изобретение относится к медицине, а именно к способам посттравматического восстановления спинного мозга с помощью сочетанного применения методов клеточно-опосредованной генной терапии и двухуровневой эпидуральной электростимуляции спинного мозга, которые могут быть использованы в медицинских учреждениях для нейрореабилитации пациентов с травмой спинного мозга.
Проблема терапии травмы спинного мозга остается одной из актуальных в практической медицине. Эта патология, независимо от причины или степени травмы, характеризуется гибелью нейронов и глиальных клеток, дегенерацией аксонов и нарушением функций иннервируемых органов-мишеней. Несмотря на прогресс в тактике лечения травмы спинного мозга, пациенты получают базовую симптоматическую терапию, которая направленна на уменьшение таких вторичных повреждений, как отек и воспаление нервной ткани, а также на регуляцию функций органов дыхательной, сердечно-сосудистой, мочевыделительной систем, коррекцию биохимических показателей гомеостаза, профилактику инфекционных осложнений и пролежней. Таким образом, с целью повышения эффективности нейрореабилитации пациентов с травмой спинного мозга требуются разработки и внедрения принципиально новых способов терапии, включающих воздействие на посттравматический спинной мозг различных методологических подходов.
В настоящее время для лечения пациентов с травмой спинного мозга активно разрабатываются две основные стратегии: биотехнологическая - генная и клеточная терапия и электрофизиологическая - стимуляция электрическим током.
Известен способ лечения травматических повреждений спинного мозга с помощью физиотерапевтического электростимулятора с набором электродов большой площади. Электроды устанавливают в области спины так, чтобы в зону стимуляции попали сегменты спинного мозга на уровне поражения, выше и ниже этого уровня. Процедура включает воздействие постоянным экспоненциальным электрическим током частотой 50 Гц, длительностью импульса 50 мс, напряжением 10-40 В, посылками импульсов от непрерывного до 20 с в экспоненциальной форме (Патент RU №2578860 С1, МПК A61N 1/18 - 27.03.2016 Бюл. №9). Недостатком данного способа является использование чрескожной стимуляции с помощью электродов большой площади, что не позволяет достичь точной сегментной локализации и нужной интенсивности электростимуляции.
Эпидуральную электростимуляцию спинного мозга проводят электродами, наложенными на твердую мозговую оболочку спинного мозга. Способ эпидуральной электростимуляции применяют для активации генераторов шагания, обеспечивающих "шагательный" характер вызванных электростимуляцией движений ног. У лабораторных животных с полной перерезкой спинного мозга в нижнегрудном отделе активацию генераторов шагания осуществляли способом эпидуральной электростимуляции с помощью электродов, вживленных ниже эпицентра травмы в L2 и S1 сегменты (Патент RU №2418319 С2, МПК G09B 23/28, A61N 1/32 - 10.05.2011, Бюл. №13).
Для лечения больных с хроническим поражением спинного мозга известен способ стимуляции с помощью парой проволочных электродов, установленных на уровне Th12-L1 позвонков. Эпидуральная электростимуляция импульсами тока прямоугольной формы длительностью 0,5-1 мс, амплитудой 0,1-7 мА, с индивидуально подобранной частотой в диапазоне 2-100 Гц, обеспечивала координированное "шагательное" движение ног (Патент RU №2204423 С2, МПК A61N 1/36 - 20.05.2003, Бюл. №14). Недостатком приведенных примеров является проведение эпидуральной стимуляции лишь ниже уровня поражения спинного мозга, что потенциально имеет более низкую эффективность нейрореабилитационных мероприятий.
Положительный эффект генной терапии при травме спинного мозга установлен в многочисленных экспериментах на лабораторных животных. Из исследованного уровня техники известен метод стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга путем введения генетического вектора на основе двухкассетной плазмиды pBud-VEGF-FGF2, одновременно экспрессирующей сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и фактор роста фибробластов 2 (FGF2) (Патент RU №2459630, МПК A61K 48/00, А61Р 25/28, C12N 15/79 - 27.08.2012, Бюл. №24), выше и ниже области повреждения спинного мозга. Недостатком этого метода является применение плазмидного вектора, который имеет низкий уровень трансфекции клеток реципиента и, как следствие, низкий уровень продукции VEGF и FGF2.
В другом известном способе генетически модифицированные мононуклеарные клетки крови пуповины, трансдуцированные аденовирусным вектором, содержащего ген глиального нейротрофического фактора (GDNF), вводили непосредственно в ткань мозга выше и ниже эпицентра травмы (Патент RU №2521225, МПК A61K 48/00, А61Р 43/00 - 27.06.2014 Бюл. №18). Недостатком этого способа является прямое введение генетически модифицированных мононуклеарных клеток в здоровую нервную ткань, что может повлечь дополнительные дегенеративные изменения в мозге.
Одним из перспективных подходов доставки рекомбинантных генов, кодирующих биологически активные молекулы нейропротекторного действия в центральную нервную систему, является интратекальная инъекция генетического материала. В моделях контузионной травмы спинного мозга на крысах комбинацию трех генов, кодирующих сосудистый эндотелиальный фактор роста (англ. Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF), глиальный нейротрофический фактор (англ. Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor, GDNF) и нейрональную молекула клеточной адгезии (англ. Neural Cell Adhesion Molecule, NCAM), доставляли в спинной мозг путем интратекальной инъекции с помощью аденовирусных векторов, или на клеточных носителях с помощью мононуклеарных клеток крови пуповины человека [Izmailov А.А., Povysheva T.V., Bashirov F.V., et al. Spinal Cord Molecular and Cellular Changes Induced by Adenoviral Vector - and Cell-Mediated Triple Gene Therapy after Severe Contusion // Front. Pharmacol. 2017; 8: 813]. Недостатком приведенного примера является тот факт, что данные, полученные на крысах, не могут быть прямо транслированы на пациентах. Кроме того, прямое действие терапевтических генов, стимулирующих нейрорегенерацию, продолжается не более 3-4 недель после введения препарата, содержащего генетический материал.
Большинство новых способов терапии травмы спинного мозга выполнено с применением одной стратегии, например, воздействие только генной терапии или только электростимуляции. Однако представляется целесообразным их одновременное применение, поскольку каждая из указанных выше стратегий имеют положительное влияние на посттравматическое восстановление спинного мозга. Кроме того, электрическая стимуляция не только поддерживает функциональное состояние двигательных нейронов, но также способствует экспрессии в клетках мозга нейротрофических факторов, таких как мозговой нейротрофический фактор (англ. Brain derived neurotrophic factor, BDNF), нейроторофин 3 и нейротрофин 4 (англ. Neurotrophin, NT-3 и NT-4). В совокупности, сочетание двух подходов для повышения продукции различных нейротрофических факторов может иметь положительное синергетическое действие на усиление регенераторного ответа в спинном мозге после травматического повреждения.
Проведенный информационный поиск в области регенеративной медицины и электрофизиологии свидетельствует, что способы клеточно-опосредованной генной терапии в сочетании с электростимуляцией спинного мозга для преодоления последствий нейродегенерации и стимулирования нейрорегенерации при травме спинного мозга в настоящее время не известны.
Задачей заявленного изобретения является способ лечения травматического повреждения спинного мозга, включающий клеточно-опосредованную генную терапию в сочетании с двухуровневой эпидуральной электростимуляцией.
Полезность заявленного способа заключается в повышении эффективности нейрореабилитации пациентов с травмой спинного мозга.
Техническим результатом заявленного изобретения является морфологическое и функциональное восстановление спинного мозга после контузионной травмы.
6
Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что способ лечения травматического повреждения спинного мозга, включающий генную терапию и эпидуральную электростимуляцию, заключается в том, что через четыре часа после травмы спинного мозга путем интратекальной инъекции вводят 2×10 генетически модифицированные мононуклеарные клетки крови пуповины человека, сверхэкспрессирующие рекомбинантные гены человека, кодирующие нейротрофические факторы, а именно сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF и глиальный нейротрофический фактор GDNF и нейрональную молекулу клеточной адгезии NCAM, в 200 мкл физиологического раствора - 0,9% NaCl, а затем после купирования спинального шока начинают двухуровневую эпидуральную электростимуляцию спинного мозга однонаправленным током с частотой 25-35 Гц, силой тока 7-25 мА и длительностью импульса 0,2 мс с помощью электростимулятора Digitimer DS7A в течение шести недель через день продолжительностью 30 мин в утреннее время, при которой процедура включает стимуляцию выше травмы на уровне С5 позвонка и силу тока подбирают таким образом, чтобы она не вызывала болевых ощущений, и продолжительностью 30 мин в вечернее время, при которой процедура направлена на возбуждение генераторов шагания ниже травмы на уровне L2 позвонка одновременно с тренировкой на беговой дорожке, при этом сила тока подбирается индивидуально так, чтобы возникали шагательные движения.
Преимуществом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является получение положительного синергетического действия генной терапии и эпидуральной электростимуляции на посттравматическую регенерацию спинного мозга и восстановление функциональной активности спинного мозга.
Осуществление изобретения.
6
Сущность предлагаемого изобретения иллюстрируется примером клеточно-опосредованной генной терапии в сочетании с двухуровневой эпидуральной электростимуляцией в моделях на мини-свиньях с травмой спинного мозга в нижнегрудном отделе на уровне Th8-Th9 позвонков. Генетически модифицированные мононуклеарные клетки крови пуповиньг человека (2×10 в 200 мкл 0,9% NaCl), сверхэкспрессирующие рекомбинантные гены человека, кодирующие нейротрофические факторы VEGF и GDNF и нейрональную молекулу клеточной адгезии NCAM, вводят путем интратекальной инъекции через 4 часа после моделирования нейротравмы. Процедуру эпидуральной электростимуляции проводят выше эпицентра травмы на уровне С5 позвонка и ниже - на уровне L2 позвонка после купирования спинального шока.
Пример клеточно-опосредованной генной терапии в сочетании с двухуровневой эпидуральной электростимуляцией в моделях на мини-свиньях с контузионной травмой спинного мозга.
Первый этап. Рекомбинантные репликативно-дефектные вирусные векторы, несущие ген сосудистого эндотелиального фактора роста (vegf165), ген глиального нейротрофического фактора (gdnf) и ген нейрональной молекулы клеточной адгезии (ncam1) созданы на основе аденовируса человека 5 серотипа (Ad5) в Национальном исследовательском центре эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Москва), как было описано ранее [Islamov R.R. et al. Symptomatic improvement, increased life-span and sustained cell homing in amyotrophic lateral sclerosis after transplantation of human umbilical cord blood cells genetically modified with adeno-viral vectors expressing a neuroprotective factor and a neur // Curr. GeneTher. 2015. Vol. 15, №3. P. 266-276.]. В настоящей заявке были использованы аденовирусные вектора (Ad5), несущие ген vegf165 (Ad5-VEGF), ген gdnf (Ad5-GDNF) и ген ncam1 (Ad5-NCAM).
Второй этап. Генетически модифицированные мононуклеарные клетки крови пуповины человека (МККП), одновременно сверхэкспрессирующие нейротрофические факторы VEGF и GDNF и нейрональную молекулу адгезии NCAM, готовили из мононуклеарной фракции свежей крови пуповины человека и трех аденовирусных векторов (Ad5-VEGF, Ad5-GDNF и Ad5-NCAM).
6
Заготовку крови пуповины производили по инструкции Банка стволовых клеток КГМУ. Выделение МККП проводили в градиенте плотности фиколла по стандартной методике [Islamov R.R. et al. Symptomatic improvement, increased life-span and sustained cell homing in amyotrophic lateral sclerosis after transplantation of human umbilical cord blood cells genetically modified with adeno-viral vectors expressing a neuro-protective factor and a neur // Curr. GeneTher. 2015. Vol. 15, №3. P. 266-276.]. Сразу после выделения МККП высевали на 6 см культуральный планшет и одновременно трансдуцировали тремя аденовирусными векторами в комбинации Ad5-VEGF+Ad5-GDNF+Ad5-NCAM в равном соотношении каждого вектора Ad5-VEGF (1/3), Ad5-GDNF (1/3), Ad5-NCAM (1/3), где MOI (multiplicity of infection - множественность инфицирования) был равен 10. Через 12 часов культивирования генетически модифицированные МККП собирали и концентрировали в стерильном физиологическом растворе из расчета 2×10 клеток в 200 мкл. Полученные генетически модифицированные МККП являются лекарственным препаратом (МККП+Ad5-VEGF+Ad5-GDNF+Ad5-NCAM), содержащим генетический материал.
Третий этап. Имплантация электродов для эпидуральной электрической стимуляции спинного мозга. В работе были использованы половозрелые самки вислобрюхих вьетнамских мини-свиней весом 15-20 кг. Все хирургические манипуляции были выполнены в стерильных условиях под наркозом, который поддерживали путем внутримышечного введения растворов Золетила 100 (Virbac Sante Animale, Франция) 3 мг/кг и ингаляционным наркозом Изофлуран (Laboratories Karizoo, S.A., Spain) в 2,0-2,5% в смеси с кислородом. Имплантацию электродов для эпидуральной стимуляции выполняли поэтапно. На первом этапе коннектор, защищенный латексной трубкой, выводили в область холки и фиксировали 3-4 хирургическими швами к коже. Для фиксации электродов к твердой мозговой оболочке производили ламинэктомию С5 и L2 позвонков. Электроды (AS632, Cooner Wire Company, USA) проводили подкожно. Стимулирующие электроды фиксировали эпидурально на уровне С5 и L2 позвонков. Референсные электроды погружали в толщу мышц шеи и субфасциально в области живота, соответственно уровням имплантации стимулирующих электродов.
Четвертый этап. Моделирование травмы спинного мозга. На седьмые сутки после имплантации электродов у животных моделировали контузионную травму спинного мозга на уровне Th8-Th9 позвонков при помощи импактора (металлический цилиндр со штативом, с вертикально падающим внутри цилиндра металлическим стержнем весом 50 г). Доступ к спинному мозгу получали после ламинэктомии на уровне соответствующих позвонков. Металлический цилиндр импактора фиксировали на расстоянии 50 см от открытой поверхности спинного мозга. Удар металлическим стержнем по спинному мозгу наносился однократного при фиксации животного с вытянутым прямым позвоночником.
6
Пятый этап. Клеточно-опосредованная генная терапия. Через 4 часа после моделирования контузионной травмы спинного мозга животным в глубоком наркозе производили ламиноэктомию на уровне L4-L5 и интратекально вводили 2×10 генетически модифицированные МККП (МККП+Ad5-VEGF+Ad5-GDNF+Ad5-NCAM) в 200 мкл физиологического раствора (0,9% NaCl).
Шестой этап. Эпидуральная электростимуляция. Эпидуральную электростимуляцию однонаправленным током с частотой 25-35 Гц, силой тока 7-25 мА и длительностью импульса 0,2 мс проводили с помощью электростимулятора Digitimer DS7A (Digitimer Ltd., UK). Параметры электростимуляци задавали с помощью программного обеспечения LabChart (ADInstruments Inc., USA). Процедуру эпидуральной электростимуляции начинали через две недели при условии, что подопытные животные находились вне шоковой фазы и вне острого периода осложнений после нанесения травмы, и проводили в течение шести недель. Процедуру эпидуральной электростимуляции осуществляли через день в течение 30 мин в утреннее время и в течение 30 мин в вечернее время. Утренний сеанс включал стимуляцию выше травмы на уровне С5 позвонка, при этом силу тока подбирали индивидуально к каждому подопытному животному таким образом, чтобы она не вызывала болевые ощущения и составила 7-15 мА. Вечерний сеанс был направлен на возбуждение генераторов шагания ниже травмы на уровне L2. Силу тока, которая составила 13-25 мА, подбирали индивидуально так, чтобы у животного возникали шагательные движения. Данный вид стимуляции совмещали с тренировкой животного на беговой дорожке. Для того чтобы животное оставалось в пределах беговой дорожки и нагрузка на задние конечности составляла от 5% до 20% от ее собственного веса, мини-свинью фиксировали с помощью бандажной повязки на туловище.
Животным контрольной группы после имплантации электродов, моделировали контузионную травму и через 4 часа интратекально вводили 200 мкл физиологического раствора (0,9% NaCl).
Седьмой этап. Оценка эффективности клеточно-опосредованной генной терапии в сочетании с эпидуральной электростимуляцией через 60 суток после моделирования контузионной травмой спинного мозга. Через 60 суток после нейротравмы у мини-свиней из терапевтической группы во время тестов на кожную чувствительность документированы голосовая и моторная реакция. Анализ кинематики суставов в момент эпидуральной электростимуляции поясничного отдела (L2) продемонстрировал увеличение объема движений в коленном и голеностопном суставах животных из терапевтической группы. У животных на фоне комбинированной генной и электротерапии через 8 недель после моделирования нейротравмы двигательная активность была выше, чем у контрольных мини-свиней. Электромиографические показатели камбаловидной мышцы животных из терапевтической группы, в отличие от контрольной, соответствовали значениям интактных мини-свиней. Анализ площади мышечных волокон передней болынеберцовой мышцы показал, что средняя площадь мышечных волокон у мини-свиней терапевтической группы была выше по сравнению с контрольной группой. Морфометрический анализ каудального сегмента спинного мозга (ниже эпицентра травмы) выявил лучшую сохранность серого вещества в терапевтической группе по сравнению с контрольной группой. Через 60 суток после моделирования нейротравмы в спинном мозге животных терапевтической группы наблюдается уменьшение уровня экспрессии белка KCC2 (регулятор клеточного объема), снижение количества апоптозных (Caspase3-позитивных) клеток и увеличение количества Нзр27-позитивных клеток, что свидетельствует о нейропротекторном действии комбинированной генной и электротерапии. Более высокий уровень экспрессии синаптических белков (синаптофизина и PSD95) в спинном мозге мини-свиней терапевтической группы, по сравнению с контрольной, указывает на функциональное восстановление нейронов. Положительное влияние комбинированной генной и электротерапии в процессе ремоделирования спинного мозга после контузионной травмы у мини-свиней выражалось в уменьшении количества астроцитов и микроглиальных клеток (сдерживание формирования глиального рубца) и в увеличении количества клеток олигодендроглии (стимулирование миелинизации нервных волокон).
Таким образом, клинические и поведенческие наблюдения, электрофизиологические и гистологические методы исследования свидетельствуют о положительном синергетическом действии клеточно-опосредованной генной терапии и эпидуральной электростимуляции на морфологическое и функциональное восстановление спинного мозга мини-свиней после моделирования нейротравмы.
Заявляемый способ клеточно-опосредованной генной терапии в сочетании с эпидуральной электростимуляцией может быть использован в лечебных целях по прямому назначению у пациентов с травмой спинного мозга для более полного функционального восстановления. Предлагаемое изобретение способствует внедрению в практическую медицину эффективного способа нейрореабилитации пациентов с травмой спинного мозга.