ШТАММ RHODOTORULA SP. ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ, ВОД, СТОЧНЫХ ВОД, ШЛАМОВ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ
STRAIN RHODOTORULA SP FOR CLEANING SOIL, WATER, WASTE WATER, SLUDGE FROM CRUDE OIL AND PETROLEUM PRODUCTS

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий, эффективного для очистки нефтезагрязненных почв, водоемов, сточных вод загрязненных нефтью и нефтепродуктами.
Известны штаммы Micobacterium flavescens ВКПМ - В-6000, Micobacterium sp. ИЖ-4, Rhodococcus sp. 56д, Acinetobacter sp. HB-1 (Патент РФ №2191752, опубликовано 27.10.2002 г., приоритет 27.09.1999 г.; Патент РФ №2191753, опубликовано 27.10.2002 г., приоритет 27.09.1999 г.). Недостатком этих культур является узкий диапазон pH среды 6,8-8,0).
Известны штаммы Mycobacterium phlei и Pseudomonas aeruginosa (Патент РФ №2053206, опубликовано 27.01.1996 г., приоритет 29.09.1994 г.), применяемые для биодеструкции углеводородов нефтепродуктов в окружающей среде в теплое время года. Однако эти штаммы неэффективны в воде ниже 12°C. Кроме того, вид Pseudomonas aeruginosa относится к условно-патогенным микроорганизмам и использование в открытых системах недопустимо.
Задачей изобретения является получение нового штамма бактерии, обеспечивающего разрушение растворенных в воде нефтепродуктов загрязненных водоемов и сточных вод, а также нефти и нефтепродуктов в загрязненной почве.
Штамм Rhodotorula sp. 51-18-2 (номер, присвоенный штамму авторами) выделен в 2001 году из пробы почвы Усинского района Республики Коми, изъятой в подфакельной зоне после завершения эксплуатации объекта. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов, номер VKM Y-2993D.
В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.
3
2
4
4
2
Описание условий, необходимых для культивирования штамма: среда для культивирования следующего состава: на 1000 мл воды - сахароза 20 г, NaNO - 3,0 г; KHPO - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO×5HO - 0,5 г; Алканы - 10 г, 15-25°C, 3-5 суток в условиях жидкофазной ферментации.
Штамм характеризуется следующими признаками: Колонии ярко-розовые, выпуклые, гладкие, блестящие слизистые, край ровный. Клетки овальные, крупные, 3-7 X 4-15 мкм, почкование полярное.
3
2
4
4
2
Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды - сахароза 30 г, NaNO - 3,0 г; KHPO - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO×5HO - 0,5 г; агар микробиологический - 20,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°C.
Способность штамма к биодеструкции нефти и нефтепродуктов изучали в лабораторных опытах со сточной водой и почвенными пробами загрязненных нефтью, результаты приведены в примерах ниже.
Пример 1. Разрушение углеводородов в воде
3
2
4
4
2
Для изучения углеводородокисляющих свойств штамма был проведен опыт в присутствии сырой нефти. На 1 л воды добавляли NaNO - 2,0 г; KHPO - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO×5HO - 0,5 г, раствор разливали в 250 мл колбы по 100 мл стерилизовали их в течение часа в автоклаве, охлаждали до комнатной температуры, затем до температуры экспозиции в холодильнике, после чего проводили заражение содержимого колбы предварительно приготовленной суспензией живой культуры Rhodotorula sp. 51-18-2 Р-Y-2993D с титром живых клеток 10 млрд. клеток/1 мл в количестве 1 мл на колбу. Контрольную колбу микроорганизмами не заражали. Во все колбы добавляли по 0,5 г сырой нефти. Условия опыта - температура 0+2°C, +25°C(таблица 1). Длительность 10 суток.
Таблица 1
Обозначение вариантов опыта
Варианты опыта
1. t +2°C
2. t +25°C
1. Контроль
1-1
1-2
2. Rhodotorula sp. 51-18-2 P-Y-2993D
2-1
2-2
Содержание нефти в почве анализировали методом флуориметрии на анализаторе жидкости «Флюорат-02» в соответствии с ПНД Ф 16.1.21-98 [Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в пробах почв на анализаторе жидкости «Флюорат-02». ПНД Ф 16.1.21-98. -M., 1998. - 15 с.]. Результаты анализа концентрации углеводородов приведены в таблице 2. Как видно из данных анализа, в присутствие штамма Rhodotorula sp. 51-18-2 Р-Y-2993D происходит снижение концентрации растворенных в воде углеводородов, усиливающееся при повышении температуры от +2 до +25°C от 56 до 91%.
Таблица 2
Изменение концентрации растворенных в воде углеводородов в опыте
Вариант
Температура, °C
Концентрация растворенных углеводородов, мг/дм<sup>3</sup>
Общая степень деструкции, %
1-1
2
13,0
0
1-2
25
24
0
2-1
2
5,7
56
2-2
25
2,2
91
Пример 2. Разрушение углеводородов в почве.
Для опыта брали почву (песок), загрязняли ее нефтью в количестве 150 мг/г. В почвенные пробы вносили суспензию штамма Rhodotorula sp. 51-18-2 Р-Y-2993D с титром клеток 1010 в количестве мл на 1 кг пробы. Условия опыта - температура 25°C и 5°C в течение 15 суток. Содержание нефти в почве анализировали методом флуориметрии на анализаторе жидкости «Флюорат-02» в соответствии с ПНД Ф 16.1.21-98 [Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в пробах почв на анализаторе жидкости «Флюорат-02». ПНД Ф 16.1.21 - 98. - М., 1998. - 15 с.]. Результаты приведены в таблице 3.
Как видно из представленных в таблице результатов - в сравнении с контролем, в почвенных пробах произошло снижение концентрации нефти в течение опыта как при комнатной температуре, так и в более холодных условиях. Таким образом, штамм Rhodotorula sp. 51-18-2 Р-Y-2993D можно использовать для очистки нефтезагрязненных почв и водоемов как в нормальных условиях, так и в условиях холодного климата.
Таблица 3
Изменение уровня нефтяного загрязнения в опыте
Варианты опыта
Длительность экспозиции, суток
Концентрация нефтепродуктов в пробах почвы, мг/дм<sup>3</sup>
Контроль
15, температура 25°C
55,0
Контроль
15, температура +5°C
78,0
Rhodotorula sp. 51-18-2 Р-Y-2993D
15, температура 25°C
14,9
Rhodotorula sp. 51-18-2 P-Y-2993D
15, температура 5°C
30,7