Изучение возможностей использования биомаркеров galektin-3, HBME-1, Fas, FasL в дооперационной диагностике высокодифференцированного рака щитовидной железы

SUMMARY

V. I. Amosov, E. V. Bubnova, V. N. Shchetinin,

S. G. Mosyagina, S. V. Bryzgalova, I. V. Putilova

Ultrasound identification of small concrements in hepatico-choledochus

The work deals with some ultrasound methods in detection of small calculi in hepaticocholedochus, their diagnostic value as well as advantages and disadvantages of the methods. Our experience in

performance of endoscopic retrograde cholangiopancreatography (ERChPG) in the period of 2000 through 2008 yrs is presented. A new method for roentgen diagnosis of small concrements in endoscopic cholangiopancreaticography was developed. It proved to be more effective in concrement identification during ERChPG. Of particular interest were small calculi (from 0.1 cm to 0.5 cm) in patients with choledocholithiasis).

Key words: small concrements, hepaticocholedochus, endoscopic retrograde cholangiopancreaticography.

© Коллектив авторов, 2009 г. УДК

Д. Ю. Семенов, Л. Б. Гинкул, М. Е. Борискова, С. А. Александрова, П. А. Панкова, Н. С. Фещенко, У. В. Фарафонова

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОМАРКЕРОВ GALEKTIN-3, HBME-1, FAS, FASL В ДООПЕРАЦИОН-НОЙ ДИАГНОСТИКЕ ВЫСОКО-ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОГО РАКА ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

ВВЕДЕНИЕ

Узловые образования щитовидной железы (ЩЖ) являются широко распространенной клинической проблемой. Большинство узловых образований щитовидной железы являются доброкачественными. По данным разных авторов, лишь от 1 % [6] до 5 % узлов щитовидной железы имеют злокачественную природу [7].

Традиционно для дифференциальной диагностики узловых образований ЩЖ используется тонкоигольная аспирационная биопсия (ТАБ) под контролем УЗИ с цитологическим исследованием биоптата. Однако цитологический метод имеет ряд ограничений, а именно: неинформативные мазки и фолликулярная неоплазия. Чувствительность ТАБ зависит от опыта цитолога, просматривающего стекла, а также от методики отбора образцов и технологии окрашивания [1]. Неопределенные результаты ТАБ связаны с отсутствием точных цитологических критериев для дифференциальной диагностики ряда доброкачественных и злокачественных заболеваний ЩЖ. Доля таких аспиратов весьма высока и составляет в среднем около 30 % [2, 3]. Таким образом, невозможность на дооперационном этапе имеющимися методами исключить опухолевую природу узла ЩЖ

является показанием к выполнению диагностической операции. При хирургическом вмешательстве лишь в 15-20 % неопределенных ТАБ выявляется злокачественный процесс [5, 7]. На сегодняшний день окончательный диагноз может быть установлен только в результате гистологического исследования.

Таким образом, поиск новых методов дооперацион-ной дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы является одной из актуальных проблем современной тиреодологии, что позволило бы улучшить диагностику рака щитовидной железы и сократить количество диагностических операций.

В настоящее время одним из перспективных направлений медицины и биологии является поиск онкомар-керов, которые могут быть использованы для диагностики рака ЩЖ.

Одним из изучаемых онкомаркеров стал галек-тин-3 - белок из семейства лектинов, который является маркером развития неопластических процессов. Этот белок принимает участие в межклеточных, клеточно-мат-риксных взаимоотношениях, играет роль в опухолевой прогрессии и апоптозе, стимулирует ангиогенез и мета-стазирование, оказывает иммуносупрессивное действие [11, 12]. В последнее время большое внимание уделяется сочетанию маркеров, особенно перспективным является галектин-3 и HBME-1 [10]. В ряде работ было показано, что галектин-3 может играть роль маркера злокачественного роста опухолей щитовидной железы [4]. Совместное использование галектина-3 с HBME-1 (антигеном мезотелиальных клеток) увеличивало диагностическую точность [9]. Общеизвестно, что течение и исход злокачественных заболеваний зависит от ряда факторов и, в частности, от способности опухолевых клеток противостоять иммунным реакциям организма. Среди этих реакций существенную роль играет апоптоз, а именно -устойчивость опухолевых клеток к индукции апоптоза, вызываемого лимфоцитами, а также индукция опухолевыми клетками апоптоза в лимфоцитах, что может создать для опухолевых клеток состояние иммунологической толерантности. Изучение экспрессии белков апопто-за Fas и FasL в опухолевых клетках больных высокодифференцированным раком щитовидной железы представляет значительный интерес.

Таким образом, целью настоящего исследования явилось изучение возможности использования опреде-

ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

V*/

ч СПбГМУ

ления экспрессии биомаркеров HBME-1, galectin-3, Fas и FasL в дооперационной диагностике высокодиф-ференцированного рака щитовидной железы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе выполнения данного проекта нами были обследованы 46 пациентов с узловыми образованиями щитовидной железы, поступивших в клинику общей хирургии СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова в 20062007 гг. Все пациенты были обследованы по стандартному алгоритму: клинические и лабораторно-инстру-ментальные методы, такие как определение уровня ТТГ, УЗИ и ТАБ под контролем УЗИ. Соотношение заболевших мужчин и женщин было 1:5. Средний возраст составил 45± 12 лет. Всем пациентам была выполнена пункционная биопсия под контролем УЗИ. На основании данных цитологического исследования пун-ктата из образований щитовидной железы были выделены следующие группы (табл. 1).

Исследуемую группу составили 19 пациентов, из которых у 11 больных по данным ТАБ были поставлены диагнозы «папиллярный рак» или «подозрение на папиллярный рак», а у 8 человек цитологический диагноз носил неопределенный характер - «фолликулярная или гюртлеклеточная опухоль». Контрольную группу составили 27 пациентов с доброкачественными изменениями по данным ТАБ (узловой коллоидный зоб).

Все пациенты исследуемой группы были оперированы. Показанием к операции были папиллярный рак, подозрение на папиллярный рак и фолликулярная опухоль по данным ТАБ. Следует отметить, что у 2 пациентов с цитологическим диагнозом «фолликулярная опухоль», клинически имела место токсическая аденома.

У 10 пациентов контрольной группы показанием к операции были больших размеров узловой зоб со смещением органов шеи, остальные 17 пациентов находятся под наблюдением эндокринолога.

Помимо цитологического исследования, всем пациентам было выполнено иммуноцитохимическое определение экспрессии белков Fas, FasL, галектина-3 и HBME-1.

В качестве материала для исследования были использованы аспирационные биоптаты узловых образований щитовидной железы. Экспрессия белков Fas, FasL, галектина-3 и HBME-1 была исследована методом непрямой иммунофлуоресценции. На стекла с лунками («Биовитрум», Санкт-Петербург), обработанные раствором поли^-лизина, наносили биопсий-ный материал или наносили суспензию клеток крови. После высыхания клетки на стеклах фиксировали 2 мин ацетоном, 5 мин метанолом и высушивали. Затем наносили 12 мкл первичных антител НВМЕ-1 (в разведении 1:100, Dako, США), галектина-3 (в разведении 1:60, Novocastra, Великобритания), Fas (в разведении 1:18), FasL (в разведении 1:40, BD Biosciences -Pharmingen) на лунку в буфере Antibody Diluent with Background Reducing Components (Dako, США) и ин-

Т а блица 1 Расфеделенв uimieuas id групвмв зависимсти (ff цигоигичес иго диагша

Групп тцие1тав KmiHeCTBa тщ^^ов P етультат ТАБ

Кшгршьтя 27 (из шх у 10 Дa5p(кaчecтвeнъй

пдтвepждeн

гист aiawiecraM

иccлeцœaIиeM

11 3 л(кaчecтвeньй

8 ^e(Ipeдглeннй

кубировали 0,5-1 ч при 20 0С. Затем проводили отмывку три раза по 5 мин в PBS и наносили 12 мкл вторичных козьих антител против IgG антител мыши, меченных FITC (0,5 мг/мл «Becton Dickinson») в буфере DAKO. Инкубацию со вторичными антителами проводили в течение 15-30 мин при 4 0С. Стекла отмывали три раза по 5 мин в PBS. Наносили 5 мкл DakoCytomation Fluorescent Mounting Medium (Dako, США) на лунку и анализировали иммунофлуоресцен-цию клеток на микроскопе «Axioskop». В качестве положительного контроля использовали клетки линии Jurkat (Музей клеточных культур Института цитологии РАН), экспрессирующие FasL. Подсчитывали число окрашенных и неокрашенных клеток на 100 клеток, а также фиксировали интенсивность их свечения.

В качестве отрицательного контроля использовали клетки, не окрашенные первичными антителами. Анализ флуоресценции окрашенных клеток проводили при увеличении 10x20, 10x40 и 10x100, используя стандартный набор фильтров № 10 для анализа люминесценции зеленой области. Запись изображения осуществлялась черно-белой камерой VarioCam (РСО, ФРГ) с охлаждением до +10 оС, 750x570 пикселов. Для изучения распределения метки использовали также лазерный сканирующий конфокальный микроскоп LEICA TCS SL (Leica, Германия). Характер свечения флуоресцент-ноокрашенных белков различался на разных препаратах. В основном можно было наблюдать отдельные светящиеся клетки или очаговые скопления светящихся клеток. Для возбуждения флуоресценции на микроскопе Leica TCS SL (объектив HCX PLAPO CS 63 X /1.32) применяли аргоновый лазер (спектральная область -488 нм). Флуоресцентную эмиссию регистрировали на зеленом (500-560 нм) канале. Для обработки изображений, полученных на конфокальном микроскопе, использовали программы Leica TCS SL и Photoshop.

Результаты выявления экспрессии белков Fas, FasL, галектина-3 и HBME-1 в материале аспирационных биоптатов и сопоставление с диагнозами, сделанными по морфологическим критериям на послеоперационном материале, были оценены по следующим критериям [8]:

- предсказательная ценность положительного теста;

- чувствительность теста;

- предсказательная ценность отрицательного теста;

- специфичность теста;

- диагностическая точность метода.

Таблица 2

Результаты планового гистологического исследования у больных контрольной

и исследуемой групп

Цитологическое заключение Кол-во Окончательный гистологический диагноз Кол-во

Узловой 10 Узловой коллоидный зоб 10

коллоидный зоб

Папиллярный 11 Папиллярный рак 10

рак Фолликулярный вариант папиллярного рака 1

Фолликулярная 8 Фолликулярная аденома 4

опухоль Фолликулярный вариант папиллярного рака Фолликулярный рак 1 3

Всего 29 Узловой коллоидный зоб Фолликулярная аденома Папиллярный рак Фолликулярный вариант папиллярного рака Фолликулярный рак 10 4 10 2 3

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Всем оперированным больным было выполнено гистологическое исследование операционного материала, по результатам которого проведен сравнительный анализ данных цитологического и гистологического исследований. У всех оперированных пациентов контрольной группы (10 человек) дооперационный цитологический диагноз «узловой коллоидный зоб» был подтвержден при гистологическом исследовании. Цитологические диагнозы «папиллярный рак» или «подозрение на папиллярный рак» были подтверждены в 100 % случаев при гистологическом исследовании у пациентов исследуемой группы. Интересным оказалось распределение верифицированных при гистологическом исследовании диагнозов в группе пациентов с неопределенным диагнозом по данным ТАБ. У 4-х пациентов диагностирована фолликулярная аденома, у 1-го - папиллярный рак фолликулярный вариант, в 3-х случаях - фолликулярный рак (табл. 2).

Результаты иммуноцитохимического исследования. В контрольной группе пациентов наблюдалось флуоресцентное свечение изучаемых белков менее чем у 30 % человек. Чаще всего (26 %) выявлялась экспрессия белков Fas и галектина-3. Экспрессия FasL наблюдалась в 14 % случаев, экспрессия HBME-1 -в 7 % случаев (табл. 3).

В исследуемой группе пациентов было выявлено флуоресцентное свечение изучаемых белков у 53 % человек (табл. 4, 5). Экспрессия Fas наблюдалась у 50 %, экспрессия FasL - у 44 %, галектина-3 - у 44 %, а HBME-1 - 22 % больных. В большинстве случаев

Таблица 3

Иммуноцитохимическое выявление экспрессии белков системы Еав/РавЬ и специфических гистотипических маркеров галектина-3 и НВМЕ-1 в контрольной группе пациентов

Белок Fas FasL Галектин-3 HBME-1

Экспрессиия + - + - + - + -

Кол-во 7 20 4 23 7 20 2 25

% 26 14 26 7

(70 %) наблюдалась совместная экспрессия белков 3-4 маркеров, при этом чаще всего были отмечены маркеры Fas, FasL и галектин-3.

Следует отметить, что у пациентов с выявленным свечением большинства изучаемых маркеров имел место более агрессивный характер опухолевой прогрессии, а именно: инвазия опухоли за пределы капсулы щитовидной железы и/или метастазы в регионарные лимфатические узлы. В случае с фолликулярной карциномой наблюдалась низкодифференци-рованная форма, потенциально наиболее способная к быстрой прогрессии. В одном случае была диагностирована муль-тицентричная форма папиллярного рака щитовидной железы. У двух пациентов с морфологически диагностированной фолликулярной аденомой и выявленной экспрессией изучаемых маркеров клинически имела место токсическая аденома.

В задачи нашего исследования входило выявление экспрессии основных белков Fas-опосредованного апоптоза и перспективных гистотипических прогностических опухолевых маркеров галектина-3 и HBME-1 в опухолевых клетках больных высокодифференциро-ванным раком щитовидной железы. Мы провели изучение корреляции полученных данных с морфологическими формами опухоли, а также оценили значение изучаемых маркеров в диагностике высокодифферен-цированного рака щитовидной железы на доопераци-онном этапе (табл. 6).

Полученные в настоящей работе данные показывают, что, несмотря на невысокую чувствительность, метод ИЦХ имеет довольно высокую специфичность, причем она имеет сходные значения для всех используемых маркеров. Следует отметить, что ТАБ с цитологическим исследованием аспирата имеет высокую чувствительность, но низкую специфичность в выявлении злокачественных опухолей, а именно - фолликулярного рака. Используя в рутинной практике более простой, экономически выгодный и чувствительный метод цитологического исследования в качестве скрининга, при выявлении подозрительных результатов (подозрительные на рак и неопределенные результаты) возможно использование более высокотехнологичного и специфичного метода иммуноцитохимического исследования.

Эти же данные показывают, что предсказательная ценность положительного правила наиболее высока для таких маркеров, как Fas и галектин-3, и в 43 % случаев с помощью этих маркеров был уточнен диагноз цитологического исследования на дооперационном этапе. Интересно, что предсказательная ценность отрицательного теста оказалась гораздо выше, чем положительного, что может быть очень важным для ис-

ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

ч СПбГМУ ..

Таблица 4

Иммуноцитохимическое выявление экспрессии белков системы и специфических гистотипических маркеров

галектина-3 и НВМЕ-1 в группе пациентов с папиллярным раком щитовидной железы по данным ТАБ

Диагноз Fas FasL Галектин-3 HBME-1

ПК + ни 0 0

ПК 0 0 0 0

ПК + 0 + 0

ПК 10+++/0 10/15 15/+++ Ни

ПК 0 0 0 0

ПК 0 ++/50 +++/20 +/30

ПК 0 0 0 Ни

ПК 0 0 0 0

ПК 0 0 0 0

ПК + ++ + 0

ПК 0 0 0 0

Примечание: ПК - папиллярная карцинома; Ни - не исследовали.

ключения ложноположительных результатов. Это правило оказалось верным примерно для 70 % пациентов.

Таким образом, при выявлении по данным цитологического исследования пунктата из узла щитовидной железы подозрения на злокачественную опухоль (неопределенный результат) для уточнения диагноза необходимо выполнить ИЦХ-исследование биомаркеров рака щитовидной железы. Соответственно, совместное использование данных методик позволит улучшить диагностику высокодифференцированного рака щитовидной железы на дооперационном этапе.

Важно отметить, что наибольшей диагностической ценностью обладает выявление экспрессии не одного какого-то белка, а совокупности маркеров, в частности, галектина-3 и Fas. Интересным является тот факт, что не только наличие экспрессии галектина-3, но и его локализация в клетке имеет существенное диагностическое и прогностическое значение. В задачи данного проекта входила отработка методики ИЦХ исследования экспрессии белков Fas, FasL, галектина-3 и HBME-1, а также выявление возможности использования определения их экспрессии в дооперационной диагностике высокодифференцированного рака щитовидной железы. Однако в дальнейшем нам кажется перспективным использование в диагностической панели большего числа онкомаркеров, отвечающих за различные звенья канцерогенеза, а также исследование внутри- и внеклеточной локализации белка галектина-3.

Таким образом, выбранные нами для исследования белки, принимающие участие в Fas-опосредован-ном апоптозе, оказались довольно значимыми маркерами для выявления характера опухолевого роста и могут быть использованы в качестве дополнительного уточняющего метода в дооперационной диагностике высокодифференцированного рака щитовидной железы.

Проведенное исследование позволило сделать следующий вывод: выявление экспрессии белков галек-тина-3 и Fas может быть использовано в качестве до-

Таблица 5

Иммуноцитохимическое выявление экспрессии белков системы Fas/FasL и специфических гистотипических маркеров галектина-3 и HBME-1 в группе пациентов с неопределенным результатом по данным ТАБ

Диагноз Fas FasL Галектин-3 HBME-1

ФА 4 15,7 8,7 ++

ФА + +/7 +/5 +/5

ФА 0 0 0 0

ФА 0 0 0 0

ПК 1 5 +/12,5 Ни

ФК 1 1 1,7 +

ФК + <1 0 0

ФК 0 0 0 0

Примечание: ФА - фолликулярная аденома; ПК - папиллярная карцинома; ФК - фолликулярная карцинома; Ни - не исследовали.

Таблица 6

Количественная оценка маркеров опухолевого роста Fas, FasL, галектина-3 и HBME-1 у больных с подозрением на рак щитовидной железы

Параметр Fas FasL Галектин-3 HBME-1

Предсказательная ценность 0,55 0,38 0,46 0,17

положительного теста

Чувствительность теста 0,43 0,45 0,43 0,33

Предсказательная ценность 0,69 0,76 0,68 0,82

отрицательного теста

Специфичность теста 0,78 0,70 0,71 0,64

Диагностическая точность 0,65 0,63 0,61 0,59

метода

полнительного метода дооперационной диагностики высокодифференцированного рака щитовидной железы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Хмельницкий, О. К. Цитологическая и гистологическая диагностика заболеваний щитовидной железы / О. К. Хмельницкий. - СПб. : Сотис, 2002. - 288 с.

2. Abir, A. Galectin-3 for indeterminate thyroid cytology / A. Abir, C. Bernard, M. Schlumberger // The Lancet Oncology. -2008. - Vol. 9. - Is. 6. - P. 508-510.

3. Bartolazzi, A. Galectin-3-expression analysis in the surgical selection of follicular thyroid nodules with indeterminate fine-needle aspiration cytology : a prospective multicentre study / A. Bartolazzi // Lancet Oncol. - 2008. - Vol. 9 (6). - P. 508-510.

4. Bernet, V. J. Determination of galectin-3 messenger ribonucleic Acid overexpression in papillary thyroid cancer by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction / V. J. Bernet [et al] // J. Clin Endocrinol Metab. - 2002. - № 87 (10). - P. 4792-4796.

5. Cibas, E. S. Cytology. Diagnos principles and clinical correlates. WB Sunders company. A division of Harcourt Brace Company / E. S. Cibas, B. S. Ducatmann. - Philadelphia ; London ; Toronto ; Montreal ; Sydney ; Tokyo, 1996. - P. 217-242.

6. Feld, S. AACE Clinical Practice Guidelines for the Diagnosis and Management of Thyroid Nodules / S. Feld, M. Garcia // Endocrine Practice. - 1996. - Vol. 2. - № 1. - P. 78-84.

7. Gharib, H. Fine-needle aspiration biopsy of thyroid nodules : advantages, limitation, and effect / H. Gharib // Mayo Clin. Proc. -1994. - Vol. 69. - P. 44-49.

8. Linn, S. A new conceptual approach to teaching the interpretation of clinical tests / S. Linn // Journal of Statistics Education. -2004. - Vol. 12. - № 3.

9. Rossi, E. D. Simultaneous immunohistochemical expression of HBME-1 and galectin-3 differentiates papillary carcinomas from