КАПСИДЫ ВАРИАНТОВ АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫХ ВИРУСОВ И МЕТОДЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Вариант капсидного белка аденоассоциированного вируса (AAV), выбранный из группы, содержащей:
(i) капсидный белок AAV, содержащий пептидную вставку относительно соответствующего родительского капсидного белка AAV, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) или NKTTNKD (SEQ ID NO: 14), и где сайт встраивания расположен между двумя соседними аминокислотами в положении между аминокислотами 570 и 611 VP1 капсида AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV и
(ii) капсидный белок AAV, содержащий (а) аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 95% идентичную или на 100% идентичную полноразмерной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 62 и (b) следующие аминокислотные замены относительно капсида AAV5 (SEQ ID NO: 6): V229I+A490T+A581T,
где вариант капсидного белка AAV придает инфекционному рекомбинантному вириону AAV (rAAV) повышенную инфекционность мышечной клетки по сравнению с инфекционностью мышечной клетки вирионом AAV, содержащим капсидный белок AAV дикого типа.
1
2
1
2
3
4
5
6
7
3
1
3
1
3
4
5
6
7
2. Вариант капсидного белка AAV, содержащий пептидную вставку относительно родительского капсидного белка AAV, расположенную между двумя смежными аминокислотами в положении между аминокислотами 570 и 611 VP1 капсида AAV2, и где вставка содержит аминокислотную последовательность YYXXXXXXXY в которой каждый из Y-Y, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro; X выбран из Ala, Asn, Thr, Gly, Ser, Ala, Gln и Asp; X2 выбран из Lys, Asn, Thr, Ser, Ala и Gln; X выбран из Ile, Thr, Lys, Leu, Val, Asn, Asp и Arg; X выбран из Gln, Thr, Ile, Lys, Val, Ser и Tyr; X выбран из Arg, Asn, Gly, Lys, Leu, Thr, Ala, Ser и Gln; X выбран из Thr, Lys, Val, Gly, Ser, Ala, Arg и Pro; и X выбран из Asp, Thr, Asn, Ile, Ala и Ser.
1
2
3
4
5
6
7
3. Вариант капсидного белка AAV по п.2, где X выбран из Thr и Asn; X выбран из Asn и Lys; X выбран из Lys, Ile и Thr; X выбран из Ile, Gln и T ч; X выбран из Gly, Arg и Asn; X выбран из Val, Thr и Lys; и X выбран из Thr и Asp.
4. Вариант капсидного белка AAV по любому из пп. 1-3, где капсидный белок содержит пептидную вставку, и где сайт встраивания расположен между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или находится в соответствующем положении капсидного белка другого серотипа AAV.
5. Вариант капсидного белка AAV по любому из пп. 1-4, в котором капсидный белок AAV содержит пептидную вставку, и где пептидная вставка включает аминокислотную последовательность NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) или LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 26).
6. Вариант капсидного белка AAV по п.5, где капсидный белок AAV содержит аминокислотную замену V708I относительно VP1 капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или в соответствующем положении капсидного белка другого серотипа AAV.
7. Вариант капсидного белка AAV по п.6, где капсидный белок AAV дополнительно содержит одну или более аминокислотных замен: аминокислотную замену S109T, аминокислотную замену R588M и аминокислотную замену A593 относительно VP1 капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или в соответствующих положениях в капсидном белке другого серотипа AAV.
8. Вариант капсидного белка AAV по п.6, где капсидный белок AAV дополнительно содержит аминокислотную замену A35P относительно VP1 капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV.
9. Вариант капсидного белка AAV по п.6, в котором капсидный белок AAV содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 95% идентичную или на 100% идентичную полноразмерной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 43.
10. Вариант капсидного белка AAV по любому из пп. 1-4, в котором капсидный белок AAV содержит пептидную вставку, и где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) или LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 27).
11. Вариант капсидного белка AAV по п.10, в котором капсидный белок AAV содержит аминокислотную замену V708I относительно VP1 капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или в соответствующем положении капсидного белка другого серотипа AAV.
12. Вариант капсидного белка AAV по п.11, где капсидный белок AAV дополнительно содержит одну или более аминокислотных замен: аминокислотную замену S109T, аминокислотную замену W606C и аминокислотную замену W694C относительно VP1 капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или в соответствующем(их) положении(ях) капсидного белка другого серотипа AAV.
13. Вариант капсидного белка AAV по п.11, в котором капсидный белок AAV дополнительно содержит аминокислотную замену I698V относительно VP1 капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или в соответствующем положении(ях) капсидного белка другого серотипа AAV.
14. Вариант капсидного белка AAV по п.11, в котором капсидный белок AAV содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 95% идентичную или на 100% идентичную полноразмерной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 48.
15. Вариант капсида AAV по любому из пп. 1-14, где капсидный белок придает инфекционному вириону rAAV по меньшей мере 2-ух кратную или по меньшей мере 5-ти кратную повышенную инфекционность мышечных клеток по сравнению с инфекционностью мышечных клеток вириона AAV, содержащего капсидный белок AAV дикого типа.
16. Вариант капсидного белка AAV по любому из пп. 1-15, где капсидный белок дополнительно придает инфекционному вириону rAAV повышенную устойчивость, предпочтительно, по меньшей мере в 2 раза или по меньшей мере в 5 раз, к нейтрализации нейтрализующим антителом по сравнению с AAV, содержащим соответствующий родительский белок капсида AAV.
17. Выделенная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант капсидного белка AAV по любому из пп. 1-16.
18. Инфекционный рекомбинантный вирион AAV (rAAV), содержащий вариант капсидного белка AAV по любому из пп. 1-16.
19. Вирион rAAV по п.18, дополнительно содержащий гетерологичную нуклеиновую кислоту, предпочтительно гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую продукт гена.
20. Способ доставки генного продукта в мышечную клетку индивидуума, включающий введение индивидууму вириона rAAV по п.19, в котором, предпочтительно, вирион rAAV вводят внутривенно или внутримышечно.
21. Способ по п.20, в котором мышечная клетка представляет собой клетку сердечной и/или скелетной мышцы.
22. Способ по п.20, в котором продукт гена представляет собой белок, малую интерферирующую РНК, антисмысловую РНК, микроРНК, короткую шпилечную РНК или малую интерферирующую РНК.
23. Способ по п.20, в котором продукт гена представляет собой белок, выбранный из альфа галактозидазы A (GLA), фратаксина (FXN), дистрофина (DMD) или его функционального фрагмента, кислой альфа-глюкозидазы (GAA) и гликогенфосфорилазы мышц (PYGM), и в котором, предпочтительно, белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной любой из SEQ ID NO:64 и 66-69 или аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 80% идентичной аминокислотной последовательности, представленной любой из SEQ ID NO: 64 и 66-69.
24. Способ по п.20, в котором индивидуум имеет заболевание, выбранное из болезни Фабри, атаксии Фридрейха, мышечной дистрофии Дюшенна, мышечной дистрофии Беккера, болезни Помпе, дефицита миофосфорилазы, лице-лопаточно-плечевой мышечной дистрофии, мышечной дистрофии мышц плечевого и тазового поясов и миотонической дистрофии.
25. Фармацевтическая композиция, содержащая вирион rAAV по п.19 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
26. Вариант капсида AAV по п.15, где вариант капсида или химерный капсидный белок придает инфекционному рекомбинантному вириону AAV (rAAV) по меньшей мере в 50 раз повышенную инфекционность клеток сердечной мышцы и/или по меньшей мере в 2 раза повышенную инфекционность клеток скелетных мышц по сравнению с инфекционностью клеток сердечной мышцы или клеток скелетных мышц вирионом AAV, содержащим капсидный белок AAV9 дикого типа.
27. Инфекционный рекомбинантный вирион AAV (rAAV), содержащий вариант капсидного белка AAV, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере 95%, предпочтительно, по меньшей мере на 99% идентичную полноразмерной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 43, и дополнительно содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-галактозидазу А (GLA), функционально связанную с промотором CAG.
28. Инфекционный rAAV по п.27, включающий вариант капсидного белка AAV, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 43.
29. Способ доставки нуклеотидной последовательности, кодирующей GLA, млекопитающему, включающий введение rAAV по п.27 или 28 млекопитающему в условиях, приводящих к экспрессии GLA на уровне, обеспечивающем терапевтический эффект у указанного млекопитающего.
30. Способ по п.29, где rAAV вводят млекопитающему внутривенно и/или внутримышечно.
31. Способ по п.29 или 30, где млекопитающее является человеком с болезнью Фабри.
32. Способ по любому из пп. 27-31, в котором нуклеотидная последовательность кодирует полипептид GLA, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 67, или последовательности, по меньшей мере на 80% идентичной таковой.
33. Инфекционный рекомбинантный вирион AAV (rAAV), содержащий вариант капсидного белка AAV, имеющего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную полноразмерной аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 43, и дополнительно включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую гликогенфосфорилазу мышц (PYGM), функционально связанную с промотором CAG.
34. Инфекционный rAAV по п.33, содержащий вариант капсидного белка AAV, который содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 43.
35. Способ доставки нуклеотидной последовательности, кодирующей PYGM, млекопитающему, включающий введение rAAV по п.33 или 34 млекопитающему в условиях, приводящих к экспрессии PYGM на уровне, обеспечивающем терапевтический эффект у указанного млекопитающего.
36. Способ по п.35, где rAAV вводят млекопитающему внутривенно и/или вводят внутримышечно.
37. Способ по п.35 или 36, где млекопитающим является человек с дефицитом миофосфорилазы (болезнь Макардла).
38. Способ по любому из пп. 33-37, в котором нуклеотидная последовательность кодирует полипептид PYGM, содержащая или состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 66, или последовательности, по меньшей мере на 80% идентичной таковой.
39. Фармацевтическая композиция, содержащая вирион rAAV по любому из пп. 27, 28, 33 и 34, и фармацевтически приемлемый эксципиент.