СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПОЛОВОЗРЕЛЫХ ОСОБЕЙ НЕМАТОД ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ МЕТОДОМ MALDI TOF МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
METHOD FOR PREPARATION OF MATURE NEMATODES FOR IDENTIFICATION BY MALDI TOF MASS SPECTROMETRY

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине, а именно к паразитологии, и может быть использовано для идентификации половозрелых особей нематод Dirofilaria, Enterobius и Ascaris методом MALDI ToF масс-спектрометрии.
Уровень техники
Протеомные исследования (определение возбудителя на основе его белкового спектра) являются относительно новым направлением лабораторной диагностики инфекционных болезней. Метод MALDI ToF масс-спектрометрии стали применять для идентификации гельминтов с 2007 года [1]. В дальнейшем этот метод был использован для идентификации белков протосколексов альвеококка, клонорха, шистосом, фитонематод, а также нематод, имеющих медицинское значение [2, 3, 4, 5].
Известны способы идентификации гельминтов с использованием макроскопических и микроскопических методов, с помощью которых в биоматериале возможно идентифицировать паразитарного возбудителя на какой-либо из его стадий [7]. Наиболее эффективные методы требуют предварительной пробоподготовки, далее следует макроскопия и/или микроскопия (рутинная или автоматизированная). Эффективность макро- и микроскопии базируется на достаточных знаниях морфологии микроскописта, а также косвенно зависит от регулярности работы с музейными макро- и микропрепаратами паразитарных возбудителей.
Дирофиляриоз - трансмиссивный природно-очаговый биогельминтоз. Возбудитель относится к классу круглых червей. Вероятность заражения дирофиляриозом не связана с профессиональными или социальными группами [9]. Лабораторная диагностика заключается в паразитологическом подтверждении этиологии после операционного вмешательства или самопроизвольного выхода гельминта. Материалом являются взрослые особи дирофилярий или их фрагменты, гистологические препараты внутренних органов и тканей, удаленные подкожные образования или их пунктаты [8]. Достоверность видовой идентификации при нарушении целостности удаленного гельминта невысокая.
Энтеробиоз - контактный биогельминтоз, самое распространенное паразитарное заболевание на территории РФ, в основном среди детского населения. В последние годы отмечается тенденция к снижению заболеваемости энтеробиозом, однако это может быть связано с ухудшением работы по обследованию пациентов и групп риска [6]. Лабораторная диагностика энтеробиоза сводится к обнаружению яиц остриц при микроскопии перианального соскоба (отпечатка), что является специальным методом для подтверждения энтеробиоза, или ректальной слизи. Возможна макроскопическая/микроскопическая идентификация половозрелых остриц, обнаруженных в фекальных массах или на перианальной области. В случае обнаружения фрагментов гельминта и отсутствии яиц остриц в материале вероятность достоверной идентификации снижается [7]. Получение белковых спектров остриц на сегодня представляет скорее научный интерес, нежели практический.
Аскаридоз - геогельминтоз, распространенный в РФ из-за высокой устойчивости яиц к воздействию различных факторов внешней среды. Прямая паразитологическая диагностика возможна в кишечной фазе аскаридоза (микроскопия фекалий и макроскопия особей), в миграционной фазе возможна только косвенная инструментальная диагностика [7]. Получение белковых спектров аскарид широкодоступным технологическим способом представляет актуальный научный интерес.
Известен способ подготовки проб биоматериала для идентификации нематод методом MALDI-ToF масс-спектрометрии [5]. Данный способ был апробирован для получения протеомных профилей нематод (Ascaris, Dirofilaria). Способ заключается в следующем: первичная гомогенизация особи нематоды, предварительно многократно отмытой в 0,9% растворе NaCl; далее следует обработка антимикробными препаратами (образец помещают на 24 часа в 0,9% раствор NaCl с добавлением 100 ед./мл феноксиметилпенициллина (пенициллин V) и 100 мкг/мл стрептомицина). Далее от особи нематоды отделяют головной конец длиной 2 см и помещают его в стерильный 0,9% раствор NaCl в соотношении 1:3 (m-паразита: V-раствора NaCl). Полученную взвесь замораживают при -18°С на 30 минут. Далее на ледяной бане проводят механическую гомогенизацию замороженного материала до получения суспензии с последующим повторным замораживанием. Данный этап выполняется 5 кратно. Полученную после многоэтапной подготовки биомассу перемещают в пробирки типа Эппендорф, которые помещают в замороженный 70% этиловый спирт; далее проводят ультразвуковую гомогенизацию при 70 кГц в течение 30 секунд пятикратно. К полученному образцу добавляют 200 мкл лизис-буфера из набора MALDI Sepsityper, перемешивают на аппарате Vortex. Центрифугируют 2 минуты в режиме 13000 об/мин. Удаляют супернатант. Суспендируют осадок в промывочном буфере пипетированием. Центрифугируют 2 минуты на 13000 об/мин. Затем суспендируют осадок в 300 мкл деионизированной воды и 900 мкл этанола. Далее в пробирку добавляют определенное количество 70% муравьиной кислоты и ацетонитрила (согласно расчетной таблице) и перемешивают. После отбирают 1 мкл супернатанта, наносят на точку мишени MALDI. После высушивания на воздухе экстракт покрывают 1 мкл раствора матрицы СНСА (α-Суапо-4-hydroxycirmamicacid) и дают полностью высохнуть при комнатной температуре. Проводят идентификацию в приборе MALDI Biotyper в соответствии с инструкцией к прибору и авторской методикой. Данный способ принимается за прототип.
Недостатком данного способа является длительная многоэтапная пробоподготовка, которая требует использования дорогостоящего оборудования и реактивов и может быть недоступна большинству лабораторий. Для идентификации используется только головной фрагмент нематоды.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого изобретения является улучшение подготовки половозрелых особей нематод для их идентификации методом MALDI ToF масс-спектрометрии для диагностики паразитарных заболеваний.
Это достигается тем, что в отличие от известных способов подготовки проб биоматериала для видовой идентификации нематод фрагмент крупной нематоды (аскариды, дирофилярии) или мелкая нематода целиком (острица) предварительно отмытые однократно в растворе 0,9% NaCl гомогенизируется стерильным пестиком. 50 мкл полученной массы перемещается в пробирку типа Эппендорф, центрифугируется 11 минут в режиме RPM=13300 об/мин. (RCF=9888 g), после удаления супернатанта добавляется 30 мкл стандартного раствора OS (50% ацетонитрила, 47,5% воды и 2,5% трифторуксусной кислоты). Полученная суспензия перемешивается на вортексе 1 минуту, к ней добавляется 30 мкл 70% муравьиной кислоты, суспензия повторно перемешивается на вортексе 1 минуту и центрифугируется 11 минут в режиме RPM=13300 об/мин. (RCF=9888 g). После удаления супернатанта, полученный осадок наносится с помощью одноразовой петли на мишень, высушивается при комнатной температуре и покрывается матрицей СНСА (α-Cyano-4-hydroxycirmamicacid), остается при комнатной температуре до полного высыхания; далее следует идентификация на MALDI ToF масс-спектрометре.
Технический результат изобретения заключается в том, что заявленный способ подготовки биопроб нематод позволяет выделить достаточное количество биологической массы для получения масс-спектров методом MALDI ToF масс-спектрометрии.
Осуществление изобретения
Сущность предложенного способа заключается в следующем: фрагмент крупной нематоды (аскариды, дирофилярии) или мелкая нематода целиком (острица) предварительно отмытые однократно в растворе 0,9% NaCl гомогенизируется в чистой одноразовой пластиковой посуде стерильным пестиком. Далее 50 мкл полученной массы перемещается дозатором в пробирку типа Эппендорф и частично обезвоживается путем центрифугирования в течение 11 минут в режиме RPM=13300 об/мин. (RCF=9888 g), после удаления дозатором надосадочной жидкой фракции добавляется 30 мкл стандартного раствора OS. Полученная суспензия перемешивается на вортексе 1 минуту, к ней добавляется 30 мкл 70% муравьиной кислоты, суспензия повторно перемешивается на вортексе 1 минуту и центрифугируется 11 минут в режиме RPM=13300 об/мин. (RCF=9888 g). После удаления пипеткой жидкого супернатанта, полученный осадок наносится с помощью одноразовой петли на гладкую мишень в двух последовательностях, высушивается при комнатной температуре, покрывается матрицей СНСА (α-Cyano-4-hydroxycirmamicacid), остается при комнатной температуре до полного высыхания; далее следует идентификация на MALDI ToF масс-спектрометре.
Предлагаемый способ позволяет провести подготовку половозрелых особей нематод для идентификации методом MALDI ToF масс-спектрометрии.
Использование предлагаемого способа существенно снижает временные затраты, не требует применения дорогостоящего оборудования и реактивов, позволяет получить необходимое количество биоматериала для идентификации различных видов нематод методом MALDI ToF масс-спектрометрии.
Осуществление предлагаемого способа можно продемонстрировать на следующих примерах:
На фигуре 1 представлены масс-спектры, иллюстрирующие полученный результат при использовании предлагаемого метода пробоподготовки. Четыре образца, предварительно отмытые в растворе 0,9% NaCl: 1 - передняя треть половозрелого самца Dirofilaria repens; 2 - средняя треть половозрелого самца Dirofilaria repens; 3 - задняя треть половозрелого самца Dirofilaria repens; 4 - средняя треть половозрелой самки Dirofilaria repens.
На фигуре 2 представлены масс-спектры, иллюстрирующие полученный результат при использовании предлагаемого метода пробоподготовки. Два образца предварительно отмытые в растворе 0,9% NaCl: 1 из которых - половозрелая самка целиком Enterobius vermicular is; 1 -половозрелая самка фрагментарно Enterobius vermicularis.
На фигуре 3 представлены масс-спектры, иллюстрирующие полученный результат при использовании предлагаемого метода. Два образца половозрелого самца Ascaris lumbricoides, предварительно отмытых в растворе 0,9% NaCl, разрезали в асептичных условиях, получив поперечные срезы тела в передней (образец 1) и хвостовой (образец 2) части стробилы (кутикула и внутреннее содержимое гельминта) объемом по 30-50 мкл чистыми инструментами помещали в пробирки типа Эппендорф.
Список использованной литературы.
1. Leon IR, Neves-Ferreira AG, Valente RH, Mota EM, Lenzi HL, Perales J. Improved protein identification efficiency by mass spectrometry using N-terminal chemical de-rivatization of peptides from Angiostrongylus costaricensis, a nematode with unknown genome. J Mass Spectrom. 2007, 42(6):781-92.
2. Wang Y, Cheng Z, Lu X, Tang C. Echinococcus multilocularis: Proteomic analysis of the protoscoleces by two-dimentional electrophoresis and mass spectrometry. Exp Parasitol. 2009, 123(2): 162-7.
3. Yuan SS, Xing XM, Liu JJ, Huang QY, Yang SQ, Peng F. Screening and identification of diferentially expressed proteins between adult female and male worms of Schistosoma japonicum. Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi. 2009 Aug; 4398):695-9.
4. Ahmad F, Gopal J, Wu HF. Rapid and high sensitive detection of single nematode via direct MALDI Mass Spectrometry. Talanta. 2012, 93:182-5.
5. Патент на изобретение RU 2703280 C1, Способ получения проб материала для идентификации нематод методом MALDI TOFF Biotyper. 07.11.2018 Алешукина А.В., Алешукина И.С., Ермакова Л.А., Нагорный С.А.; Пшеничная Н.Ю., Криворотова Е.Ю.
6. Информационное письмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 30.12.2019 г. «О заболеваемости энтеробиозом в Российской Федерации в 2018 году».
7. МУК 4.2.3145-13 «Лабораторная диагностика гельминтозов и протозоозов».
8. МУК 3.2.3469-17 «Профилактика дирофиляриоза».
9. Информационное письмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 09.09.2013 г. №01/10330-13-32 «О ситуации по дирофиляриозу в Российской Федерации».