Способ забора крови у крыс из периферических вен хвоста
BLOOD SAMPLING METHOD IN RATS FROM PERIPHERAL TAIL VEINS

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использовано для быстрого забора крови высокого качества у лабораторных животных.
Кровь у крыс, которую забирают для оценки биохимического и клеточного состава крови, может быть получена различными способами. Способы забора крови различаются по количеству забираемой крови - тотальные (терминальные) и нетерминальные, по месту, откуда ведется забор крови, а также по тому, требует ли данный способ наркоза или нет. Наиболее часто забор крови ведут из ретроорбитального венозного сплетения, большой подкожной вены и вен хвоста.
Существуют различные способы взятия крови у крыс, однако, известные способы обладают рядом недостатков: они достаточно травматичны (вплоть до гибели животного), не позволяют получить должного количества крови за один забор, либо состав крови не соответствует желаемому.
Описан способ забора крови из подкожных вен конечностей /Иванова Д.Ю. Сравнительный анализ методов взятия проб крови у экспериментальных крыс // 1, Научное сообщество студентов XXI столетия. Естественные науки: сб. ст. по мат. XLII междунар. студ. науч.-практ. конф. №6(41)/. Процедура обычно выполняется без общей анестезии, но для ее выполнения необходимо надежно зафиксировать животное. На лапке в области кисти бритвой делают разрез и просовывают ее сквозь резиновую манжетку в толстостенную пробирку (гусек), из которой вакуумным насосом откачивают воздух. Кровь собирается на дне пробирки.
Недостатки данного способа заключаются в том, что длительная иммобилизация животного без общей анестезии в рамках подготовки к забору значительно стрессирует животное, что изменяет клеточный и биохимический состав крови. Процедура довольно травматична - в некоторых случаях после данной процедуры животное может хромать, щадя травмированную конечность, что нарушает нормальную жизнедеятельность.
Существует способ забора крови из яремной вены /2, Способ взятия крови из яремной вены А.Л. Валентюкевич, Н.А. Тарасов, К.Д. Лапчук // Сборник материалов конференции студентов и молодых ученых, посвященной 90-летию со дня рождения профессора Борец Валентины Максимовны, 20-21 апреля 2017 г., [Гродно] / М-во здравоохранения Респ. Беларусь, УО "Гродн. гос. мед. ун-т"; отв. ред. В.А. Снежицкий. - Гродно: ГрГМУ, 2017. - С. 90. - 1 эл. опт. диск/. Под эфирным наркозом по закрытом контуру производят удаление шерсти (выщипывание с последующим выбриванием) и обработку раствором септоцида подчелюстной области. Производят разрез кожи длиной до 1 см параллельно и ниже нижней челюсти, отступая от последней расстояние длиной 3-5 мм. Разводят края раны зажимом, в ране четко визуализируется яремная вена, имеющая диаметр до 3 мм. Скальпелем производят вскрытие яремной вены, после чего кровь самотеком поступает в предварительно подставленные к краям раны пробирки. После взятия крови рану тампонируют и зашивают.
Такая процедура взятия крови имеет ряд недостатков, таких как сложность процедуры, возможность образования сгустка, гемолиз, большая травматичность и долгий период восстановления животного после вмешательства.
Существует способ забора крови из ретроорбитального венозного сплетения /3, Методические рекомендации по освоению дисциплины «Молекулярные основы рецепции фармакологических агентов». Образовательная программа «Фармакология, клиническая фармакология». Направление подготовки 30.06.01 Фундаментальная медицина/ М.В. Черников, М.А. Оганова. - Пятигорск: ПМФИ - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ, 2015. - 68 с.//. Методика отличается скоростью проведения процедуры - за короткое время можно собрать образцы крови у большой группы животных. Наркотизированную крысу захватывают левой рукой за кожу шеи большим и указательным пальцами, а другими пальцами надежно удерживают за кожу спины. Микропипетку берут в правую руку. Концом пипетки пробуравливающими движениями прокалывают конъюнктиву внутреннего угла глаза и проводят ее на глубину 1-2 мм за глазное яблоко, где находится венозное сплетение. При правильном введении в капилляр микропипетки из ретроорбитального сплетения самотеком поступает кровь.
К недостаткам данного способа относят высокий риск осложнений - от воспалений в области глазницы до слепоты. Возможно загрязнение образцов крови слезной жидкостью или местноанестезирующим препаратом. Повторный забор крови возможен не менее, чем через 10 дней после процедуры.
Есть способ взятия крови путем пункции хвостовой вены /4, Сюрин В.Н. Методы лабораторной диагностики и вирусных болезней животных: справочник. М.: Агропромиздат, 1986. - 351 с./. Перед взятием крови опускают хвост в теплую +35°С (по некоторым данным в очень горячую 45-50°С) воду или натирают 70%-ым этиловым спиртом (ксилолом или толуолом), а затем сдавливают вену у корня хвоста. Для пункции применяют шприц или катетер-бабочку. Кровь насасывают, создавая небольшое отрицательное давление в шприце, чтобы избежать разрушения форменных элементов крови. После процедуры хвост обрабатывают дезинфицирующим средством. Данный способ используем в качестве прототипа.
Недостатки данного способа - возможность ожога хвоста, что приводит к повреждению его тканей вплоть до некроза. Хвост в процессе работы остывает, потому взятие крови с течением времени утрачивает свою эффективность.
Техническая проблема, решаемая данным изобретением, состоит в создании минимально травматичного для крысы способа получения достаточного количества крови для дальнейшего исследования, снижая риск загрязнения крови чужеродными элементами. А также возможность повторного забора крови через небольшой промежуток времени.
Сущность способа заключается в том, что при использовании тканного полотна, предварительно смоченного в воде, подогретой до 45°С, происходит равномерное прогревание хвоста крысы, путем обертывания отжатой ткани вокруг хвоста, вследствие чего расширяются хвостовые сосуды. Проводят 3 цикла прогревания по 15 с. Это способствует ускорению процесса забора крови и лучшей визуализации сосудов для последующего их прокола. В дальнейшем используют жгут, путем накладывания на основание хвоста. Иглу вводят на 1/3 в вену под углом 15°, отводят поршень на себя для уточнения проникновения. После производят снятие жгута и повторно отводят поршень. Допустимый забираемый объем крови при этом способе - до 1 мл.
Способ забора крови у крыс из периферических вен хвоста осуществляется по следующему плану. Крысу извлекают из клетки, удерживая ее за основание хвоста, помещают на ровную поверхность и фиксируют ее. Фиксация производится с помощью различных устройств или ручным способом: животное с умеренной силой придавливают к поверхности стола, держа за шкуру на спине, тем самым, обездвиживая его. Емкость объемом 300 мл предварительно заполняют водой, которую подогревают до температуры 45°С. Тканую салфетку помещают в нагретую воду и слегка отжимают. Салфетку помещают на ровную поверхность и визуально делят на две части. На первой части размещают хвост, второй частью ткани закрывают хвост сверху, таким образом, хвост оказывается внутри салфетки. Длительность прогрева хвоста - 15 секунд. Манипуляция повторяется 3 раза. С помощь тканевого полотна достигается равномерный нагрев поверхности хвоста. Это способствует притоку крови и, следовательно, расширению сосудов. После проведенных действий начинается этап непосредственно взятия крови из хвостовой вены: на основании хвоста фиксируют отрезок эластичной резиновой материи шириной 1-2 мм, которая пережимает сосуды и является аналогом жгута. Производят обработку хвоста дезинфицирующим раствором. При осмотре хвоста необходимо обнаружить сосуд, прокол которого будет в последующем осуществляться. После идентификации вены выполняют ее прокол под углом 15° шприцом объемом 1 мл с иглой 27G и продвигают иглу на 1/3. Далее тянут поршень на себя; наличие крови в шприце - индикатор нахождения иглы в полости вены. Вслед за этим жгут развязывают, и поршень повторно тянут на себя. В этом момент кровь должна поступать в шприц. Допустимый объем взятой крови - до 1 мл. После того, как кровь набрана, шприц с иглой извлекают и обрабатывают область прокола дезинфицирующим раствором.
Способ забора крови у крыс из периферических вен хвоста осуществляется двумя путями: с применением наркоза и без. В первом случае на крысе после того, как ее вытаскивают из клетки, используют препараты для наркоза с различными способами введения: ингаляционно, внутрибрюшинно, орально, подкожно и внутримышечно. Все дальнейшие действия осуществляются по вышеописанному алгоритму.
Изобретение было проверено путем успешного взятия по 1 мл венозной крови у 55 половозрелых белых крыс линии Wistar. Было произведено количественное исследование клеток крови в камере Горяева и при микроскопии мазков крови, предварительно окрашенных по Романовскому-Гимзе. Окраска осуществлялась путем фиксации в растворе эозина метиленового синего по Май-Грюнвальду - 5 минут и непосредственно окрашивания в растворе азур-эозина по Романовскому - 10 минут. Данные электронной микроскопии демонстрировали сохранение структур клеток, отсутствие посторонних частиц.
В сравнение с прототипом, предлагаемый способ обладает рядом преимуществ. В прототипе хвост опускают в горячую воду. Частое воздействие непосредственно горячей воды приводит к ожогам и даже некрозу. При некрозе состав крови сильно изменяется - как в клеточном отношении, так и в биохимическом. Использование тканой салфетки позволяет удобно регулировать температуру прогрева. Если хвост остыл в процессе забора крови, и это мешает работе, то салфетку можно повторно опустить в воду и обернуть ею хвост. В прототипе, где салфетка не используется, пришлось бы вытаскивать иглу из хвоста, хвост помещать обратно в воду, после этого повторно проводить прокол. Повторное нарушение целостности структур хвоста приводит к уменьшению объема крови в проколотом сосуде вследствие стресса и активации систем гемостаза. Далее, в прототипе описан вариант способа, где используется ксилол и толуол для протирания хвоста. Ксилол и толуол относят к высокотоксичным веществам. Они могут привести к гибели животного, не говоря о том, что они впитываются и попадают в кровь, тем самым, загрязняет ее и опять-таки изменяет клеточный состав разными механизмами. Использование салфетки позволяет избежать такое явление, как токсинемия - загрязнение крови токсинами - и ее последствий.
Технический результат от использования способа - получение достаточного объема крови для дальнейшего исследования, максимальное уменьшение травматизации тканей хвоста крысы, отсутствие загрязнения полученной крови чужеродными частицами, сведение к минимуму количества осложнений, возможность повторного забора крови через короткий промежуток времени.