ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ
INSECTICIDAL PROTEINS

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0001] Данное изобретение относится к областям белковой инженерии, молекулярной биологии растений и борьбы с вредителями. Более конкретно, данное изобретение относится к новым сконструированным белкам Cry1Ba и последовательностям нуклеиновых кислот, чья экспрессия дает в результате сконструированные Cry1Ba белки, и способам получения, и способам применения сконструированных Cry1Ba белков и соответствующих последовательностей нуклеиновых кислот для борьбы с насекомыми.
ПРЕДПОСЫЛКИ
[0002] Bacillus thuringiensis (Bt) белки Cry (также именуемые δ-эндотоксинами или Cry-токсинами) представляют собой белки, которые образуют кристаллический матрикс в Bacillus, которые, как известно, обладают инсектицидной активностью, когда поглощаются определенными насекомыми. Более 180 белков голотипа Cry в 58 семействах были определены и получили название. Различные белки Cry были классифицированы на основании их спектра активности и гомологии последовательности. До 1990 года, основные классы были определены с помощью их спектра активности (Hofte and Whitely, 1989, Microbiol. Rev. 53:242-255), но совсем недавно была разработана новая номенклатура, которая систематически классифицирует белки Cry на основе гомологии аминокислотной последовательности, а не целевых специфичностей по отношению к насекомым (Crickmore et al. 1998, Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62:807-813).
[0003] Большинство Cry белков, активных против чешуекрылых насекомых, формируются в кристаллическом матриксе как 130-140 кДа протоксина. У чешуекрылых насекомых щелочной рН кишки солюбилизирует кристалл и затем кишечные протеазы обрабатывают протоксин до токсичных белков приблизительно 60-70 кДа. Процессинг протоксина до токсина, как сообщалось, происходит путем удаления как N-, так и C-концевых аминокислот, причем точное положение процессинга зависит от специфического Cry белка и соответствующих специфических кишечных соков насекомого (Ogiwara et al., 1992, J. Invert. Pathol. 60:121-126). Протеолитическая активация Cry протоксина может играть существенную роль в определении его специфичности.
[0004] Была установлена трехмерная структура для некоторых Cry белков. Cry3A белок, который активен по отношению к жесткокрылым насекомым, имеет три структурных домена: N-концевой домен I из остатков 58-290 состоит из 7 альфа-спиралей, домен II из остатков 291-500 содержит три складчатых бета-слоя в так называемой конформации греческого ключа, и C-концевой домен III из остатков 501-644 является бета-сэндвичем в так называемой конформации типа "jelly roll". Была также установлена трехмерная структура для активного Cry1Aa токсина чешуекрылых (Grochulski et al., 1995, J. Mol. Biol. 254:447-464). Cry1Aa токсин также имеет три домена: N-концевой домен I из остатков 33-253, домен II из остатков 265-461 и домен III из остатков 463-609 с дополнительной внешней цепью в одном из β-листов, сформированной остатками 254-264. Если Cry3A и Cry1Aa структуры спроецировать на другие Cry1 последовательности, то домен I начинается с приблизительно аминокислотного остатка 28 до 260, домен II с приблизительно 260 до 460 и домен III с приблизительно 460 до 600. См. Nakamura et al., Agric. Biol. Chem. 54(3):715-724 (1990); Li et al., Nature 353:815-821 (1991); Ge et al., J. Biol. Chem. 266(27):17954-17958 (1991); и Honee et al., Mol. Microbiol. 5(11):2799-2806 (1991); каждая из которых включена в данный документ ссылкой. Таким образом, на данный момент известно, что на основе гомологии аминокислотной последовательности все Bt белки Cry имеют подобную трехмерную структуру, содержащую три домена.
[0005] На основе структуры была сформулирована гипотеза, касающаяся взаимосвязи структуры/функции Cry белков. В целом, считается, что домен I, наибольший N-концевой домен, в первую очередь отвечает за образование пор в кишечной мембране насекомого (Gazit & Shai, 1993, Appl. Environ. Microbiol. 57:2816-2820), домен II в первую очередь отвечает за взаимодействие с кишечным рецептором, таким образом, определяя специфичность токсина (Ge et al., 1991, J. Biol. Chem. 32:3429-3436) и домен III, наибольший C-концевой домен, наиболее вероятно связан с белковой стабильностью (Li et al. 1991, выше), а также оказывает регуляторное влияние на активность ионного канала (Chen et al., 1993, PNAS 90:9041-9045). Домен III также был вовлечен в определение специфичности (Патент США №6204246, включенный в данный документ ссылкой). Обмен доменом III между активными против чешуекрылых токсинами, например, с помощью in vivo рекомбинации между кодирующими участками, может привести к изменениям в специфической активности. Эксперименты по связыванию с использованием таких гибридов показали, что домен III участвует в связывании с предполагаемыми рецепторами целевых насекомых, подтверждая, что домен III может иметь некоторое влияние на специфичность, играя роль в распознавании рецептора.
[0006] Части токсина Bt Cry белков также характеризуются наличием пяти консервативных блоков в их аминокислотной последовательности (Hofte & Whiteley, выше). Консервативный блок 1 (СВ1) содержит приблизительно 29 аминокислот. Консервативный блок 2 (СВ2) содержит приблизительно 67 аминокислот. Консервативный блок 3 (СВ3) содержит приблизительно 48 аминокислот. Консервативный блок 4 (СВ4) содержит приблизительно 10 аминокислот. Консервативный блок 5 (СВ5) содержит приблизительно 12 аминокислот. Последовательности до и после этих пяти консервативных блоков являются высоко вариабельными и, таким образом, обозначаются как "вариабельные области" V1-V6. Домен I Bt Cry белка типично содержит C-концевую часть вариабельной области 1, полный консервативный блок 1, целую вариабельную область 2, и 52 N-концевых аминокислоты консервативного блока 2. Домен II типично содержит приблизительно 15 C-концевых аминокислот консервативного блока 2, вариабельную область 3 и приблизительно 10 N-концевых аминокислот консервативного блока 3. Домен III типично содержит приблизительно 38 C-концевых аминокислот консервативного блока 3, вариабельную область 4, консервативный блок 4, вариабельную область 5 и консервативный блок 5. Активные в отношении чешуекрылых токсины Cry1, среди прочих белков Cry, имеют вариабельную область 6 с приблизительно 1-3 аминокислотами, лежащими в домене III.
[0007] Некоторые белки Cry, например Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F и Cry2Ba были экспрессированы в трансгенных сельскохозяйственных растениях и коммерчески использованы для борьбы с определенными вредителями-чешуекрылыми насекомыми. Например, трансгенные гибриды кукурузы, экспрессирующие белок Cry1Ab, были коммерчески доступны в течение 10 лет. Белок Cry1Ab в этих гибридах кукурузы нацелен в первую очередь на кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), основного чешуекрылого вредителя в Кукурузном поясе США.
[0008] Один вопрос, возникший относительно широкого использования трансгенных сельскохозяйственных культур, экспрессирующих белок Cry, состоит в том, будут ли насекомые-вредители становиться устойчивыми к белку Cry. Насекомые, как было доказано, способны к развитию устойчивости к продуктам, содержащим белок Cry. Устойчивость у моли капустной (Plutella xylostella) и других вредителей овощей к коммерческим Bt-микробным опрыскиваниям, широко используемым в органическом земледелии, развилась в нескольких областях мира. Один недавний случай полевой устойчивости в популяции совки травяной (Spodoptera frugiperda), подвергнутой действию трансгенной кукурузы, экспрессирующей белок Cry1F, был зафиксирован документально на острове Пуэрто-Рико (Storer et al. 2010. J. Econ. Entomol. 103:1031-1038). Однако в Соединенных Штатах не было случаев неудач, связанных с устойчивыми полевыми популяциями кукурузных или хлопковых вредителей, подвергнутых действию трансгенных сельскохозяйственных культур с 1996, когда были впервые внедрены трансгенные сельскохозяйственные культуры, экспрессирующие белки Cry.
[0009] Промышленное семеноводство, университетские исследователи и Управление охраны окружающей среды США работали вместе над разработкой планов управления, чтобы помочь уменьшить возникновение устойчивости насекомых. Они основываются, в первую очередь, на стратегии высокой дозы и стратегии заказников. Стратегия высокой дозы для кукурузного мотылька у кукурузы, например, состоит в применении гибридов кукурузы, которые экспрессируют достаточно высокие уровни белка Cry, чтобы уничтожить даже частично устойчивых мотыльков кукурузных. Гипотеза, лежащая в основе этого, состоит в том, что уничтожение частично устойчивых ЕСВ (мотыльков кукурузных) и предупреждение их спаривания значительно замедляет развитие устойчивости. Успех стратегии высокой дозы зависит частично от специфической активности Cry-токсина в отношении кукурузного мотылька и того, как много этого Cry-токсина может быть экспрессировано в трансгенном растении кукурузы. Например, чем более высокая специфическая активность Cry-токсина в отношении вредителя, тем меньшее количество Cry-токсина должно экспрессироваться в трансгенном растении для достижения стратегии высокой дозы. Благодаря тому, что Cry1Ab является очень токсичным для личинок кукурузного мотылька (т.е. высокая специфическая активность), уровни экспрессии Cry1Ab, которые достигаются в трансгенных растениях, легко помещают такие гибриды кукурузы в категорию высокой дозы.
[0010] Другие возможные пути снизить развитие устойчивости включают постепенное увеличение содержания различных белков Cry в одном и том же трансгенном сельскохозяйственном растении или замещение существующих готовых продуктов новыми продуктами, которые продуцируют различные белки Cry. Например, как только устаревает рынок существующих кукурузных гибридов Cry1Ab, могут быть введены новые продукты, которые имеют белки Cry, отличные от Cry1Ab или другие белки Cry в дополнение к Cry1Ab. Предпочтительно, если белки, которые замещают Cry1Ab, будут иметь такую же или сходную специфическую активность против кукурузного мотылька, как и Cry1Ab.
[0011] Одним возможным Cry-токсином для замещения Cry1Ab может быть Cry1Ba-токсин. Голотипический Cry1Ba-токсин был впервые описан Brizzard et al. в 1988 (Nuc. Acids Res. 16:2723-2724). Впоследствии, были определены пять других Cry1Ba-токсинов, причем каждый имеет около 99% идентичность с голотипическим токсином. Cry1Ba-токсины, как сообщалось, обладают активностью в отношении определенных чешуекрылых вредителей, таких как белянка капустная (Pieris brassicae), моль капустная (Plutella xylostella), египетская совка (Spodoptera littoralis), совка малая (Spodoptera exigua) и кукурузный мотылек (Ostrinia nubilalis). Однако Cry1Ba, как сообщалось, является более чем в 2 раза менее активным в отношении кукурузного мотылька, чем Cry1Ab (См., например, патент США №5628995) и сообщалось, что он не имеет активности в отношении других основных кукурузных вредителей, например, гусеницы хлопковой совки (Helicoverpa zea) (См., например, Karim et al. 2000. Pestic. Biochem. Physiol. 67:198-216) и NAFTA-популяций совки травяной (Spodoptera frugiperda) (см., например, Monnerat et al. 2006. Appl. Environ. Microbiol. 72:7029-7035). Одной из причин того, что Cry1Ba является не таким активным как Cry1Ab в отношении по меньшей мере кукурузного мотылька, может быть его более низкая растворимость. Таким образом, существует необходимость улучшить специфическую активность Cry1Ba в отношении, по меньшей мере, кукурузного мотылька и, по возможности, расширить спектр его активности для повышения его потенциала в качестве заместителя Cry1Ab в трансгенной кукурузе.
[0012] Спектр инсектицидной активности отдельного Cry-токсина из Bt может быть достаточно узким, при этом данный Cry-токсин является активным только в отношении некоторых видов в пределах порядка. Например, белок Cry3A известен как очень токсичный для колорадского жука, Leptinotarsa decemlineata, но имеет очень низкую или вообще не токсичен для родственных жуков в роду Diabrotica (Johnson et al., 1993, J. Econ. Entomol. 86:330-333). К тому же небольшие изменения в аминокислотной последовательности в пределах класса белков Cry могут повлиять на инсектицидную активность. Например, von Tersch et al. (1991, Appl. Environ. Microbiol. 57:349-358) показал, что белки Cry1Ac, варьирующие по семи аминокислотам, показали существенные отличия в их спектре инсектицидной активности. Хотя рассматриваются в первую очередь активные в отношении чешуекрылых токсины, Cry1Ba-токсины, как было также показано, являются активными в отношении определенных жесткокрылых насекомых-вредителей, включая колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata), листоеда тополевого (Chrysomela scripta) и жука кофейного (Hypothenemus hampei).
[0013] Специфичность белков Cry является результатом эффективности различных этапов, вовлеченных в производство активного белка токсина и его последующего взаимодействия с эпителиальными клетками в средней кишке насекомого. Чтобы быть инсектицидными, большинство известных белков Cry должны сначала быть поглощенными насекомым и протеолитически активироваться для образования активного токсина. Активация инсектицидных кристаллических белков является многоэтапным процессом. После попадания внутрь кристаллы должны вначале быть солюбилизированы в кишке насекомого. После их солюбилизации белки Cry активируются специфическими протеолитическими отщеплениями. Протеазы в кишке насекомого могут играть роль в специфичности с помощью определения, где процессируется белок Cry. Как только Cry белок был солюбилизирован и процессирован, он связывается со специфическими рецепторами на поверхности эпителия средней кишки насекомого и впоследствии интегрируется в липидный бислой мембраны щеточной каймы. Затем образуются ионные каналы, нарушая нормальную функцию средней кишки, в конечном счете приводя к смерти насекомого. Существует явные различия в свойствах растворимости частей токсина белков Cry.
[0014] Определенные белки Cry, активные в отношении чешуекрылых, были сконструированы с целью улучшить специфическую активность или расширить спектр инсектицидной активности. Например, домен специфичности к шелкопряду тутовому (Bombyx mori) из Cry1Aa помещали на Cry1Ac, таким образом, наделяя полученный химерный белок новой инсектицидной активностью (Ge et al. 1989, PNAS 86:4037-4041). Также, Bosch et al. 1998 (патент США №5736131) создал новый активный в отношении чешуекрылых токсин путем замещения домена III Cry1E доменом III Cry1C, таким образом, получая Cry1E-Cry1C гибридный токсин с более широким спектром активности в отношении чешуекрылых.
[0015] Остается необходимость в разработке новых и эффективных средств борьбы с вредителями, которые обеспечивают экономическую пользу фермерам и которые приемлемы для окружающей среды. Необходимы белки с существенно измененными свойствами, такие как сконструированные белки Cry1Ba данного изобретения, которые имеют большую специфическую активность, чем нативные Cry1Ba белки в отношении, по меньшей мере, кукурузного мотылька, основного вредителя кукурузы в Соединенных Штатах, который может стать устойчивым к существующим средствам борьбы с насекомыми. Кроме того, сконструированные белки Cry1Ba, чье применение минимизирует вред на окружающую среду, посредством трансгенных растений, являются желательными.
[0016] При увеличении специфической активности Cry1Ba по меньшей мере к мотыльку кукурузному, будет необходимо, чтобы в растении маиса экспрессировалось меньше белка Cry1Ba, таким образом, снижая возможные негативные воздействия Cry1Ba на растение. К тому же, увеличенная специфическая активность позволяет применять сконструированный Cry1Ba в стратегии высокой дозы для ЕСВ.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
[0017] В виду этих потребностей, целью данного изобретения является обеспечить новые сконструированные белки Cry1Ba (eCry1Ba), имеющие по существу измененные свойства, которые являются улучшенными по сравнению с и отличаются от нативных Cry1Ba белков, в особенности, биохимические свойства, связанные с инсектицидной активностью к чешуекрылым вредителям кукурузы, включая без ограничения, таких вредителей как кукурузный мотылек (ЕСВ; Ostrinia nubilalis), хлопковая совка (CEW; Helicoverpa zea), кукурузная юго-западная огневка (SWCB; Diatraea grandiosella), тростниковая огневка (SCB; Diatraea saccharalis), соевая совка (SBL; Pseudoplusia includens), гусеница совки рода Anticarsia (VBC; Anticarsia gemmatalis) и т.п. Путем замещения аминокислот в ключевых определенных положениях в нативной Cry1Ba белковой последовательности или Cry1Ba белке дикого типа, как определено в данном документе, в соответствии с данным изобретением, разрабатывают белок eCry1Ba, имеющий по существу измененные свойства растворимости и/или инсектицидные свойства по сравнению с нативным Cry1Ba. Данное изобретение дополнительно относится к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим белки eCry1Ba, и к композициям, и составам, содержащим белки eCry1Ba, которые способны ингибировать способность насекомых-вредителей выживать, расти и размножаться, или ограничивать связанное с насекомыми повреждение или гибель сельскохозяйственных растений. Данное изобретение дополнительно относится к способу получения белков eCry1Ba и способам применения белков eCry1Ba, например, в трансгенных растениях для обеспечения защиты от повреждения насекомыми. Существенно измененные свойства белков eCry1Ba данного изобретения обеспечивают их применение в стратегии высокой дозы в отношении по меньшей мере ЕСВ, нуждаясь при этом в уровнях экспрессии в растениях кукурузы, которые являются легко достижимыми.
[0018] Новые белки eCry1Ba, описанные в данном документе, являются высоко активными в отношении насекомых. Например, белки eCry1Ba данного изобретения могут использоваться для улучшения борьбы с экономически важными насекомыми-вредителями, такими как ЕСВ или CEW, без негативного влияния на активность в отношении других важных вредителей кукурузы, таких как SWCB и SCB. Белки eCry1Ba данного изобретения могут использоваться отдельно или в комбинации с другими стратегиями борьбы с насекомыми для обеспечения максимальной эффективности борьбы с вредителями с минимальным воздействием на окружающую среду. Трансгенные растения, экспрессирующие белки eCry1Ba данного изобретения, обеспечивают средство, с помощью которого растениеводы могут бороться с основными чешуекрылыми вредителями сельскохозяйственных культур, например, без ограничения, кукурузы и сахарного тростника.
[0019] Согласно одному аспекту данное изобретение включает сконструированный белок Cry1Ba (eCry1Ba), содержащий мутацию в одном или нескольких положениях аминокислот в домене I, посредством чего сконструированный белок Cry1Ba имеет повышенную растворимость и/или инсектицидную активность в отношении, по меньшей мере, кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis) по сравнению с нативным или белком Cry1Ba дикого типа.
[0020] В другом аспекте мутация в одном или нескольких положениях аминокислот расположена в альфа-спирали 4 или альфа-спирали 5 домена I.
[0021] В дополнительном аспекте мутация имеет место в положении аминокислоты, соответствующем положению 150, 178, 189 или 199 SEQ ID NO:2.
[0022] В еще одном аспекте мутация имеет место в положении 150, 178, 189 или 199 SEQ ID NO:5.
[0023] В другом аспекте мутация имеет место в положении, соответствующем аминокислотам 2 и 150; или аминокислотам 2,150 и 178; или аминокислотам 2, 150 и 189; или аминокислотам 2, 150 и 199 SEQ ID NO:5.
[0024] В еще одном аспекте мутация имеет место по аминокислотам 2 и 150; или аминокислотам 2, 150 и 178; или аминокислотам 2, 150 и 189; или аминокислотам 2, 150 и 199 SEQ ID NO:5.
[0025] В одном аспекте данное изобретение включает сконструированный белок Cry1Ba (eCry1Ba), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, где X в положении 2 представляет собой любую аминокислоту и а) Х в положении 150 представляет собой Pro, Phe, Trp или Lys, и X в положении 189 представляет собой Leu и в положении 199 представляет собой Ser; или b) X в положении 189 представляет собой Ser, когда Х в положении 150 представляет собой Lys; или с) Х в положении 199 представляет собой Lys, когда Х в положении 150 представляет собой Lys.
[0026] В другом аспекте белок eCry1Ba данного изобретения содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10.
[0027] В еще одном аспекте белок eCry1Ba данного изобретения обладает активностью в отношении чешуекрылых или жесткокрылых насекомых, в частности чешуекрылых насекомых. Примеры таких чешуекрылых насекомых включают, но не ограничиваясь ими, следующие: кукурузный мотылек, кукурузная юго-западная огневка, тростниковая огневка, хлопковая совка, соевая совка и гусеница совки рода Anticarsia.
[0028] Данное изобретение также включает другие вариантные белки Cry1Ba (vCry1Ba), где тирозин (Tyr) или гистидин (His) в положении 150 (Y150 или Н150) замещен на аминокислоту, отличную от Tyr или His. В одном аспекте аминокислота, которая замещена на Y150 или Н150, представляет собой Lys, Phe, Trp, Pro, Thr, Leu, Ala, Val, Ser, Arg, Gly или Asp.
[0029] В другом аспекте данное изобретение включает белок vCry1Ba, который содержит SEQ ID NO:3.
[0030] В еще одном аспекте данное изобретение включает белок vCry1Ba, где Tyr или His в положении 150 замещен на аминокислоту, отличную от Tyr или His и также имеет валин (Val) в положении 81 (V81), замещенный на аминокислоту, отличную от Val; или аланин (Ala) в положении 155 (А155) и метионин (Met) в положении 178 (M178), замещенные на аминокислоты, отличные от Ala или Met, соответственно. В другом аспекте Val в положении 81 (V81) замещен на триптофан (Trp) (V81W). В еще одном аспекте вариантный белок Cry1Ba данного изобретения содержит SEQ ID NO:11.
[0031] В одном аспекте данное изобретение включает белок vCry1Ba с Y150, замещенным на другую аминокислоту и, где Ala в положении 155 (А155) замещен на аспарагиновую кислоту (Asp) (A155D) и Met в положении 178 (Met178) замещен на серии (Ser) (M178S). В другом аспекте вариантный белок Cry1Ba данного изобретения содержит SEQ ID NO:12.
[0032] Белки vCry1Ba данного изобретения обладают инсектицидной активностью в отношении чешуекрылых или жесткокрылых насекомых, в частности чешуекрылых насекомых. К таким чешуекрылым насекомым относятся без ограничения кукурузный мотылек, кукурузная юго-западная огневка, тростниковая огневка, хлопковая совка, соевая совка и гусеница совки рода Anticarsia. Однако такие белки vCry1Ba могут не обладать повышенной активностью по сравнению с белком Cry1Ba дикого типа в отношении таких вредителей.
[0033] В другом аспекте данное изобретение включает нуклеиновую кислоту, которая кодирует сконструированный белок Cry1Ba (eCry1Ba) данного изобретения или вариантный белок Cry1Ba (vCry1Ba) данного изобретения.
[0034] Данное изобретение также включает химерный ген, содержащий гетерологичную промоторную последовательность, функционально связанную с нуклеиновой кислотой, которая кодирует белок eCry1Ba или белок vCry1Ba. Данное изобретение также включает рекомбинантный вектор, содержащий такой химерный ген. Дополнительно, данное изобретение включает трансгенную не принадлежащую человеку клетку хозяина, содержащую такой химерный ген. Трансгенная клетка-хозяин согласно этому аспекту данного изобретения включает без ограничения бактериальную клетку или растительную клетку. Такая трансгенная растительная клетка может быть клеткой маиса или клеткой сахарного тростника.
[0035] Данное изобретение дополнительно обеспечивает трансгенное растение, содержащее такую растительную клетку. Белки eCry1Ba или белки vCry1Ba являются пригодными для экспрессии в любом трансгенном растении, где чувствительные насекомые-вредители являются проблемой. Другой аспект данного изобретения включает потомство растения, содержащее нуклеиновую кислоту данного изобретения, от любого поколения трансгенного растения и часть растения для размножения, содержащую нуклеиновую кислоту данного изобретения, от любого поколения трансгенного растения. В другом аспекте трансгенное растение представляет собой растение маиса или растение сахарного тростника. В еще одном аспекте часть растения для размножения представляет собой семя, орган вегетативного размножения или черенок.
[0036] Данное изобретение также включает инсектицидную композицию, содержащую эффективное для борьбы с насекомыми количество белка eCry1Ba или белка vCry1Ba по данному изобретению и дополнительно приемлемый сельскохозяйственный носитель. Такие сельскохозяйственные носители могут быть, например, пригодными для разбрызгивания составом или трансгенным растением.
[0037] В другом аспекте данное изобретение обеспечивает способ получения белка eCry1Ba или белка vCry1Ba, который активен в отношении насекомых, включающий: (а) получение клетки-хозяина, содержащей химерный ген, который сам по себе содержит гетерологичную промоторную последовательность, функционально связанную с нуклеиновой кислотой данного изобретения; и (b) экспрессию нуклеиновой кислоты в трансгенной клетке-хозяине, что дает в результате по меньшей мере один белок, который активен в отношении насекомых.
[0038] В дополнительном аспекте данное изобретение обеспечивает способ получения устойчивого к насекомым трансгенного растения, содержащий введение нуклеиновой кислоты данного изобретения в растение, таким образом производя трансгенное растение, где нуклеиновая кислота вызывает экспрессию белка eCry1Ba или белка vCry1Ba в трансгенном растении в эффективном количестве для борьбы с насекомыми. В еще одном аспекте насекомые являются чешуекрылыми или жесткокрылыми насекомыми. К таким чешуекрылым насекомым относятся без ограничения кукурузный мотылек, кукурузная юго-западная огневка, тростниковая огневка, хлопковая совка, соевая совка и гусеница совки рода Anticarsia.
[0039] В другом аспекте данное изобретение включает способ получения сконструированного белка Cry1Ba (eCry1Ba), включающий а) определение белка Cry1Ba, имеющего домен I; b) замещение по меньшей мере одной нативной аминокислоты на участке в домене I на по меньшей мере одну другую аминокислоту; и с) получение белка eCry1Ba, полученного таким образом, где eCry1Ba имеет повышенную растворимость и/или инсектицидную активность в отношении, по меньшей мере, кукурузного мотылька по сравнению с нативным белком Cry1Ba или Cry1Ba дикого типа. В еще одном аспекте нативная аминокислота расположена в альфа-спирали 4 или альфа-спирали 5 домена I.
[0040] В еще одном аспекте данное изобретение включает способ борьбы с чешуекрылым насекомым, включающий приведение в контакт насекомого с эффективным количеством белка eCry1Ba или белка vCry1Ba данного изобретения. Согласно другому аспекту к таким чешуекрылым насекомым относятся без ограничения кукурузный мотылек, кукурузная юго-западная огневка, тростниковая огневка, хлопковая совка, соевая совка и гусеница совки рода Anticarsia.
[0041] Предпочтительно, белок eCry1Ba или белок vCry1Ba доставляется насекомым перорально. В одном аспекте белки доставляются перорально посредством трансгенного растения, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует белок eCry1Ba или vCry1Ba данного изобретения.
[0042] Данное изобретение дополнительно обеспечивает способ борьбы с насекомыми, где трансгенное растение, содержащее нуклеиновую кислоту, кодирующую белок eCry1Ba или белок vCry1Ba, дополнительно содержит вторую последовательность нуклеиновой кислоты или множественные последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют по меньшей мере одно другое пестицидное действующее вещество. В одном аспекте вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует белок Cry отличный от белков eCry1Ba или vCry1Ba данного изобретения, такие, которые кодируют вегетативный инсектицидный белок, такие как те, которые раскрыты в патентах США №№5849870 и 5877012, которые включены в данный документ ссылкой, или те, которые кодируют путь для продукции небелкового пестицидного действующего вещества. В другом аспекте данного изобретения второе инсектицидное действующее вещество представляет собой белок Vip3.
[0043] Еще один аспект данного изобретения представляет собой обеспечение способа, обеспечивающего растениевода улучшенным средством борьбы с кукурузным мотыльком, кукурузной юго-западной огневкой, тростниковой огневкой, хлопковой совкой, соевой совкой и гусеницей совки рода Anticarsia, включающего поставку или продажу растениеводу трансгенных сеянцев, содержащих нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок eCry1Ba, имеющий мутацию в одном или нескольких положениях аминокислот в домене I, где белок eCry1Ba имеет повышенную растворимость или инсектицидную активность в отношении, по меньшей мере, кукурузного мотылька по сравнению с нативным белком Cry1Ba. В другом аспекте трансгенные сеянцы представляют собой семена, органы вегетативного размножения или черенки.
[0044] Другие аспекты и преимущества данного изобретения станут очевидными специалистам данной области техники после изучения следующего описания данного изобретения и неограничивающих примеров.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
[0045] Фиг.1 показывает выравнивание аминокислотных последовательностей известных нативных белков Cry1Ba. Аминокислоты в положении 150 выделены жирным шрифтом.
[0046] Фиг.2 показывает выравнивание аминокислотных последовательностей нативного полноразмерного Cry1Ab и Cry1Ba. Домены I и II и альфа-спирали 4 и 5 домена I показаны стрелками.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ПЕРЕЧНЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0047] SEQ ID NO:1 представляет собой кодирующую последовательность нативного полноразмерного cry1Ba.
[0048] SEQ ID NO:2 представляет собой аминокислотную последовательность нативного полноразмерного белка Cry1Ba.
[0049] SEQ ID NO:3 представляет собой мутированный полноразмерный Cry1Ba.
[0050] SEQ ID NO:4 представляет собой cry1Ba-Т25 кодирующую последовательность.
[0051] SEQ ID NO:5 представляет собой белок Cry1Ba-Т25 дикого типа.
[0052] SEQ ID NO:6 представляет собой белок eCry1Ba-Х150.
[0053] SEQ ID NO:7 представляет собой белок eCry1Ba-T2AY150K.
[0054] SEQ ID NO:8 представляет собой белок eCry1Ba-T2AY150KM178S.
[0055] SEQ ID NO:9 представляет собой белок eCry1Ba-T2AY150KL189S.
[0056] SEQ ID NO:10 представляет собой белок eCry1Ba-T2AY150KS199K.
[0057] SEQ ID NO:11 представляет собой вариантный Cry1Ba-ТМ21.
[0058] SEQ ID NO:12 представляет собой вариантный Cry1Ba-ТМ90.
[0059] SEQ ID NO:13 представляет собой оптимизированную для маиса последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок eCry1Ba-T2AY150KL189S.
[0060] SEQ ID NOs:14-41 представляют собой праймеры, пригодные в данном изобретении.
[0061] SEQ ID NO:42 представляет собой процессированный нативный Cry1Ba.
[0062] SEQ ID NO:43 представляет собой вариантный Cry1Ba-ТМ69.
[0063] SEQ ID NO:44 представляет собой вариантный Cry1Ba-ТМ61.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[0064] Для ясности некоторым выражениям, используемым в описании, даны определения, которые представлены ниже:
[0065] "Активность" белка eCry1Ba данного изобретения означает, что белки eCry1Ba функционируют как перорально активные средства борьбы с насекомыми, имеют токсический эффект или способны нарушать или ограничивать питание насекомого, что может вызывать или не вызывать смерть насекомого. Когда белок eCry1Ba данного изобретения доставляется насекомому, то это приводит, как правило, к смерти насекомого, или насекомое не питается от источника, который делает белок eCry1Ba доступным для насекомого.
[0066] "Связанный с/функционально связанный" относится к двум последовательностям нуклеиновых кислот, которые связаны физически или функционально. Например, указано, что промотор или регуляторная ДНК-последовательность является "связанной с" ДНК-последовательностью, которая кодирует РНК или белок, если две последовательности функционально связаны или расположены так, что регуляторная ДНК-последовательность будет влиять на уровень экспрессии кодирующей или структурной ДНК-последовательности.
[0067] "Химерный ген" или "химерный конструкт" представляет собой рекомбинантную последовательность нуклеиновой кислоты, в которой промотор или регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана или ассоциирована с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует мРНК или которая экспрессируется как белок, так что регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты способна регулировать транскрипцию или экспрессию ассоциированной нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность. Регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты химерного гена в норме не является функционально связанной с ассоциированной последовательностью нуклеиновой кислоты, обнаруживаемой в природе.
[0068] "Кодирующая последовательность" представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется в РНК, такую как мРНК, рРНК, тРНК, мяРНК, смысловая РНК или антисмысловая РНК. Предпочтительно РНК затем транслируется в организме с продуцированием белка.
[0069] "Бороться" с насекомыми означает ингибировать, посредством токсического эффекта, способность насекомых-вредителей выживать, расти, питаться и/или размножаться, или ограничивать связанное с насекомыми повреждение или гибель сельскохозяйственных растений. "Бороться" с насекомыми может означать или не означать уничтожение насекомых, хотя предпочтительно означает уничтожение насекомых.
[0070] Как используется в данном документе, выражение "кукуруза" означает Zea mays или маис и включает все сорта растений, которые можно вывести с кукурузой, включая вид дикого маиса.
[0071] "Соответствующий" в контексте данного изобретения означает, что когда аминокислотные последовательности белков Cry1B выравнивают друг с другом, аминокислоты, которые "соответствуют" определенным пронумерованным положениям в данном изобретении, являются теми, которые совпадают с этими положениями в нативном Cry1Ba-токсине (SEQ ID NO:2), но которые не обязательно находятся в тех же нумерационных положениях относительно конкретной аминокислотной последовательности Cry1Ba данного изобретения. Например, метионин в положении 1 процессированного белка Cry1Ba (SEQ ID NO:42) будет совпадать с метионином в положении 22 полноразмерного Cry1Ba (SEQ ID NO:2). Следовательно, по данному изобретению, аминокислота 129 SEQ ID NO:42 "соответствует" номеру аминокислоты 150 SEQ ID NO:2.
[0072] "Доставлять" токсин означает, что токсин приходит в контакт с насекомым, давая в результате токсический эффект и борьбу с насекомыми. Токсин может быть доставлен многими общепринятыми способами, например, перорально путем приема вовнутрь насекомым или путем контакта с насекомым посредством экспрессии в трансгенном растении, составленной белковой композиции(ями), пригодной для разбрызгивания белковой композицией(ями), основа с приманкой или любая другая признанная в области техники система доставки токсина.
[0073] "Эффективное для борьбы с насекомыми количество" означает, что концентрация токсина, которая ингибирует посредством токсического эффекта способность насекомых выживать, расти, питаться и/или размножаться или ограничивает связанное с насекомыми повреждение или гибель сельскохозяйственных растений. "Эффективное для борьбы с насекомыми количество" может уничтожать или не уничтожать насекомых, хотя предпочтительно означает уничтожение насекомых.
[0074] "Сконструированный белок Cry1Ba" (eCry1Ba) данного изобретения относится к полученному из белка Cry1Ba, имеющему по меньшей мере одну мутацию в домене I, которая, как известно, не встречается в природе в Cry1Ba белке, белок eCry1Ba не встречается в природе и, путем вмешательства человека, содержит аминокислотную последовательность, которая не является идентичной белку, для которого известно, что он существует в Bacillus thuringiensis. Белки Cry1Ba, которые были сконструированы по данному изобретению, имеют существенно измененные и улучшенные свойства по сравнению с нативными белками Cry1Ba. В частности, белки eCry1Ba данного изобретения имеют повышенную растворимость и/или инсектицидную активность в отношении по меньшей мере кукурузного мотылька по сравнению с нативным Cry1Ba, Cry1Ba дикого типа или вариантными белками Cry1Ba данного изобретения.
[0075] "Сконструированный ген cry1Ba" (ecry1Ba) согласно данному изобретению относится к нуклеиновой кислоте, содержащей кодирующую последовательность белка eCry1B. Сконструированный ген cry1Ba может быть получен из нативного гена cry1Ba или из синтетического гена cry1Ba.
[0076] "Кассета экспрессии", как используется в данном документе, означает последовательность нуклеиновой кислоты, способную управлять экспрессией конкретной последовательности нуклеиновой кислоты в приемлемой клетке-хозяине, содержащей промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты интереса, которая функционально связана с сигналами терминации. Она также типично содержит последовательности, необходимые для правильной трансляции последовательности нуклеиновой кислоты. Кассета экспрессии, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты интереса, может быть химерной, означая, что по меньшей мере один из ее компонентов является гетерологичным по отношению к по меньшей мере к одному из ее других компонентов. Кассета экспрессии может также быть такой, которая встречается в природе, но которая была получена в рекомбинантной форме, пригодной для гетерологичной экспрессии. Однако, как правило, кассета экспрессии является гетерологичной по отношению к хозяину, т.е., конкретная последовательность нуклеиновой кислоты кассеты экспрессии не встречается в природе в клетке-хозяине и должна была быть введена в клетку хозяина или предшественник клетки-хозяина с помощью события трансформации. Экспрессия последовательности нуклеиновой кислоты в кассете экспрессии может быть под контролем конститутивного промотора или индуцибельного промотора, который инициирует транскрипцию, только когда клетка-хозяин подвергается некоторому конкретному внешнему стимулу. В случае многоклеточного организма, такого как растение, промотор может также быть специфическим для конкретной ткани, или органа или стадии развития.
[0077] "Ген" представляет собой определенный участок, который расположен внутри генома и который, кроме вышеупомянутой кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты, содержит другие, в первую очередь, регуляторные последовательности нуклеиновых кислот, ответственные за контроль экспрессии, то есть транскрипции и трансляции кодирующего участка. Ген может также содержать другие 5’ и 3’ нетранслируемые последовательности и последовательности терминации. Дополнительные элементы, которые могут присутствовать, представляют собой, например, интроны.
[0078] "Ген интереса" относится к любому гену, который при переносе в растение придает растению необходимую характеристику, такую как устойчивость к антибиотику, устойчивость к вирусу, устойчивость к насекомому, устойчивость к заболеванию или устойчивость к другим вредителям, гербицидную устойчивость, улучшенную пищевую ценность, повышенную эффективность в производственном процессе или измененную репродуктивную способность. "Ген интереса" может также быть геном, который переносится в растения для получения коммерчески ценных ферментов или метаболитов в растении.
[0079] Как используется в данном документе, выражение "растениевод" означает физическое или юридическое лицо, которое занято сельским хозяйством, выращивая живые организмы, такие как сельскохозяйственные растения для пищи или сырьевых материалов.
[0080] "Кишечная протеаза" представляет собой протеазу, обнаруживаемую в природе в пищеварительном тракте насекомого. Эта протеаза обычно участвует в переваривании поглощенных белков.
[0081] "Гетерологичная" последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая в природе не связана с клеткой хозяина, в которую она введена, включая не встречающиеся в природе множественные копии встречающейся в природе последовательности нуклеиновой кислоты.
[0082] "Гомологичная" последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, связанную в природе с клеткой-хозяином, в которую ее вводят.
[0083] "Гомологичная рекомбинация" представляет собой реципрокный обмен фрагментов нуклеиновой кислоты между гомологичными молекулами нуклеиновой кислоты.
[0084] "Инсектицидная" определяется как токсическая биологическая активность, способная бороться с насекомыми, предпочтительно путем их уничтожения.
[0085] "Выделенная" молекула нуклеиновой кислоты или "выделенный" белок представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты или белок, который посредством вмешательства человека существует отдельно от его нативного окружения и, следовательно, не является продуктом природы. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты или выделенный белок могут существовать в очищенной форме или могут существовать в ненативном окружении, таком как, например, рекомбинантная клетка хозяина. Например, нативный белок Cry, встречающийся в природе в Bacillus thuringiensis, не является выделенным, но такой же белок Cry в трансгенном штамме Bacillus thuringiensis или трансгенном растении является выделенным.
[0086] "Нативный" белок Cry1Ba, как используется в данном документе, относится к приблизительно белку весом 140 кДа Bacillus thuringiensis (Bt), активному в отношении жесткокрылых или чешуекрылых, например SEQ ID NO:2, а также любому процессированному низкомолекулярному белку, полученному из нативного белка Cry1Ba, который имеет аминокислотную последовательность, обнаруживаемую в природе. Низкомолекулярный белок может быть получен с помощью протеазного отщепления встречающихся в природе сайтов распознавания протеазы нативного белка Cry1Ba или с помощью второго ко дона инициации трансляции в той же рамке, что и кодон инициации трансляции, кодирующий нативный белок Cry1Ba, например М22 SEQ ID NO:2. Аминокислотная последовательность нативного белка Cry1Ba и низкомолекулярных белков, полученных из него, может быть обнаружена в белке, встречающемся в природе у Bt. Например, шесть нативных белков Cry1Ba получили название и имеют следующие инвентарные номера Genbank, Cry1Ba1=САА29898; Cry1Ba2=САА65003; Cry1Ba3=AAK63251; Cry1Ba4=AAK51084; Cry1Ba5=AB020894; Cry1Ba6=ABL60921. Выравнивание последовательностей шести нативных белков Cry1Ba показано на Фиг.1. Нативный белок Cry1Ba может кодироваться нативной нуклеотидной последовательностью Bt, как представлено в SEQ ID NO:1 или синтетической кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательностью.
[0087] "Молекула нуклеиновой кислоты" или "последовательность нуклеиновой кислоты" представляет собой линейный сегмент одно- или двухцепочечной ДНК или РНК, который может быть выделен из любого источника. В контексте данного изобретения молекула нуклеиновой кислоты или последовательность нуклеиновой кислоты является предпочтительно сегментом ДНК.
[0088] "Растение" представляет собой любое растение на любой стадии развития, в частности семенное растение.
[0089] "Растительная клетка" представляет собой структурную и физиологическую единицу растения, содержащую протопласт и клеточную стенку. Растительная клетка может быть в форме выделенной отдельной клетки или культивируемой клетки, или как часть высоко организованной единицы, такой как, например, ткань растения, орган растения или целое растение.
[0090] "Растительная клеточная культура" означает культуры растительных единиц, таких как, например, протопласты, клетки клеточной культуры, клетки тканей растений, пыльца, пыльцевые трубки, семязачатки, зародышевые мешки, зиготы и зародыши на различных стадиях развития.
[0091] "Растительный материал" относится к листьям, стеблям, корням, цветкам или частям цветка, фруктам, пыльце, яйцеклеткам, зиготам, семенам, органам вегетативного размножения, черенкам, клеточным или тканевым культурам или любой другой части или продукту растения.
[0092] "Орган растения" представляет собой отдельную и визуально структурированную и дифференцированную часть растения, такую как корень, стебель, лист, цветочная почка или зародыш.
[0093] "Ткань растения", как используется в данном документе, означает группу растительных клеток, организованных в структурную и функциональную единицу. Подразумевается любая ткань растения in planta или в культуре. Это выражение включает, но не ограничивается этим, целые растения, органы растения, семена растения, тканевую культуру и любую группу растительных клеток, организованных в структурные и/или функциональные единицы. Применение этого выражения в отношении, или в отсутствии, любого специфического типа ткани растения, как перечислено выше, или иным образом включено в это определение, не подразумевается исключающим любой другой тип ткани растения.
[0094] "Промотор" представляет собой нетранслируемую ДНК-последовательность, расположенную выше кодирующего участка, которая содержит сайт связывания для РНК-полимеразы и инициирует транскрипцию ДНК. Промоторный участок может также включать другие элементы, которые действуют как регуляторы генной экспрессии.
[0095] "Сеянец" представляет собой любой растительный материал, используемый с целью размножения растения. Например, без ограничения, семена и черенки, или органы вегетативного размножения, являются сеянцами кукурузы и сахарного тростника, соответственно.
[0096] "Протопласт" представляет собой выделенную растительную клетку без клеточной стенки или лишь с частью клеточной стенки.
[0097] "Регуляторные элементы" относятся к последовательностям, вовлеченным в управление экспрессией последовательности нуклеиновой кислоты. Регуляторные элементы включают промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты интереса и сигналами терминации. Они также обычно включают последовательности, необходимые для правильной трансляции последовательности нуклеиновой кислоты.
[0098] Как используется в данном документе, "специфическая активность" относится к количеству белка, необходимому для получения инсектицидного эффекта. Следовательно, если первый белок имеет более высокую специфическую активность, чем второй белок, то это означает, что необходимо меньшее количество первого белка по сравнению со вторьм белком для получения инсектицидного эффекта на такую же долю насекомых.
[0099] "Растворимость", как используется в данном документе, относится к количеству нативного Cry1Ba-токсина, Cry1Ba дикого типа или eCry1Ba-токсина или vCry1Ba-токсина, которое может раствориться в конкретной жидкости, например, буфере, воде или кишечном соке насекомого при одинаковых окружающих условиях. Таким образом, как используется в данном документе, то, что eCry1Ba-токсин имеет "повышенную растворимость" или "повышение в растворимости" по сравнению с нативным или Cry1Ba-токсином дикого типа означает, что данный объем жидкости может содержать большее количество eCry1Ba-токсина, чем нативный Cry1Ba-токсин или Cry1Ba-токсин дикого типа при таких же условиях. Согласно данному изобретению нативные Cry1Ba и Cry1Ba дикого типа токсины имеют низкую растворимость и определенные eCry1Ba-токсины имеют высокую растворимость относительно друг друга.
[00100] "Трансформация" представляет собой процесс введения гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина или организм. В частности, "трансформация" означает устойчивую интеграцию ДНК-молекулы в геном организма интереса.
[00101] "Трансформированный/трансгенный/рекомбинантный" относится к организму-хозяину, такому как бактерия или растение, в который была введена гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может быть устойчиво интегрирована в геном хозяина, или молекула нуклеиновой кислоты может также присутствовать как внехромосомная молекула. Такая внехромосомная молекула может быть автореплицирующейся. Трансформированные клетки, ткани или растения понимаются как включающие не только конечный продукт процесса трансформации, но также их трансгенное потомство. "Нетрансформированный", "нетрансгенный" или "нерекомбинантный" хозяин относится к организму дикого типа, например, бактерии или растению, которое не содержит гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты.
[00102] "Вариантный белок Cry1Ba (vCry1Ba)" представляет собой ненативный мутантный белок, который имеет более низкую специфическую активность в отношении по меньшей мере кукурузного мотылька по сравнению с белком Cry1Ba дикого типа данного изобретения.
[00103] Белок "Cry1Ba дикого типа" представляет собой ненативный мутированный белок, который имеет сходные инсектицидные свойства, такие как специфическая активность, в отношении таких насекомых, как кукурузная юго-западная огневка, тростниковая огневка или кукурузный мотылек, или биохимические свойства, такие как растворимость, как у нативного Cry1Ba.
[00104] Нуклеиновые кислоты обозначаются их основаниями с помощью следующих стандартных сокращений: аденин (А), цитозин (С), тимин (Т) и гуанин (G). Аминокислоты обозначаются аналогичным образом с помощью следующих стандартных сокращений: аланин (Ala; А), аргинин (Arg; R), аспарагин (Asn; N), аспарагиновая кислота (Asp; D), цистеин (Cys; С), глутамин (Gln; Q), глутаминовая кислота (Glu; Е), глицин (Gly; G), гистидин (His; H), изолейцин (Ile; I), лейцин (Leu; L), лизин (Lys; K), метионин (Met; М), фенилаланин (Phe; F), пролин (Pro; P), серии (Ser; S), треонин (Thr; Т), триптофан (Trp; W), тирозин (Tyr; Y) и валин (Val; V).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[00105] Данное изобретение относится к новым сконструированным белкам Cry1Ba (eCry1Ba), имеющим существенно измененные свойства, улучшенные по сравнению с и отличные от нативных белков Cry1Ba, в частности биохимические свойства, связанные с инсектицидной активностью в отношении чешуекрылых вредителей кукурузы, к которым относятся без ограничения кукурузный мотылек (ЕСВ; Ostrinia nubilalis), хлопковая совка (CEW; Helicoverpa zed), кукурузная юго-западная огневка (SWCB; Diatraea grandioselld), тростниковая огневка (SCB; Diatraea saccharalis), соевая совка (SBL; Pseudoplusia includens), гусеница совки рода Anticarsia (VBC; Anticarsia gemmatalis) и т.п. Путем мутирования аминокислот в ключевых определенных положениях в нативной последовательности белка Cry1Ba в соответствии с данным изобретением разрабатан белок eCry1Ba, имеющий существенно измененную растворимость и/или инсектицидные свойства по сравнению с нативным Cry1Ba или Cry1Ba дикого типа, как определено в данном документе. Последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют белки eCry1Ba, могут использоваться, например, в трансгенных сельскохозяйственных растениях, чтобы вызывать экспрессию белков eCry1Ba для борьбы с насекомыми-вредителями, такими как кукурузный мотылек (ЕСВ; Ostrinia nubilalis), хлопковая совка (CEW; Helicoverpa zed), кукурузная юго-западная огневка (SWCB; Diatraea grandiosella), тростниковая огневка (SCB; Diatraea saccharalis), соевая совка (SBL; Pseudoplusia includens), гусеница совки рода Anticarsia (VBC; Anticarsia gemmatalis) и т.п.
[00106] В одном варианте осуществления данное изобретение включает сконструированный белок Cry1Ba (eCry1Ba), содержащий мутацию в одном или нескольких положениях аминокислот в домене I, посредством чего белок eCry1Ba имеет повышенную растворимость и/или инсектицидную активность в отношении, по меньшей мере, кукурузного мотылька по сравнению с нативным белком или белком Cry1Ba дикого типа.
[00107] В другом варианте осуществления мутация в одном или нескольких положениях аминокислот расположена в альфа-спирали 4 или альфа-спирали 5 домена I. Исследования структурно-функциональной взаимосвязи определенных белков Cry, таких как Cry1Aa, Cry1Ab, и Cry I Ac, включали мутагенез альфа-спиралей 4 и 5 домена I (Saraswathy et al. 2004, Electron. J. Biotech. 7:178-188). Результаты этих экспериментов связывают альфа-спираль 4 и 5 с образованием ионного канала и проводимостью. Неясно, будет ли любая мутация или комбинация мутаций в домене I белка Cry, в частности Cry1Ba, оказывать влияние на растворимость и специфическую активность. Следовательно, на домен I белка Cry1Ba, в частности, в положениях в альфа-спирали 4 или 5, был нацелен мутационный анализ для определения того, может ли быть повышена растворимость и/или может ли быть увеличена специфическая активность нативного белка Cry1Ba в отношении целевого насекомого, к которому относится кукурузный мотылек (ЕСВ), кукурузная юго-западная огневка (SWCB), тростниковая огневка (SCB), хлопковая совка (CEW), соевая совка (SBL) и гусеница совки рода Anticarsia (VBC), а также другие. На основе выравнивания последовательностей, альфа-спираль 4 Cry1Ba содержит аминокислоты 143-163 SEQ ID NO:2. Альфа-спираль 5 создает основную часть консервативного блока 1 и содержит аминокислоты 176-199 SEQ ID NO:2. Шесть известных нативных белков Cry1Ba отличаются лишь одной аминокислотой в альфа-спирали 4 в положении 150. Четыре из шести имеют тирозин (Tyr; Y) в положении 150 и другие два имеют гистидин (His; H) в положении 150. В данном изобретении показано, что аминокислота в положении 150 играет ключевую роль в токсичности белка Cry1Ba, и что мутации в альфа-спирали 4 и альфа-спирали 5 могут оказывать существенное влияние на растворимость белка, специфическую активность в отношении конкретного вредителя и увеличение в спектре активности Cry1Ba.
[00108] В другом варианте осуществления данное изобретение включает мутации в положении аминокислоты, соответствующем положению 150, 178, 189 или 199 SEQ ID NO:2. В еще одном варианте осуществления мутация имеет место в положении 150, 178, 189 или 199 SEQ ID NO:5.
[00109] В еще одном варианте осуществления данное изобретение включает мутации в Cry1Ba в положении, соответствующем аминокислотам 2 и 150; или аминокислотам 2, 150 и 178; или аминокислотам 2, 150 и 189; или аминокислотам 2, 150 и 199 SEQ ID NO:5. В другом варианте осуществления мутация имеет место на аминокислотах 2 и 150; или аминокислотах 2, 150 и 178; или аминокислотах 2, 150 и 189; или аминокислотах 2, 150 и 199 SEQ ID NO:5.
[00110] В одном варианте осуществления данное изобретение включает сконструированный белок Cry1Ba (eCry1Ba), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, где Хаа в положении 2 представляет собой любую аминокислоту, и а) Хаа в положении 150 представляет собой Pro, Phe, Trp или Lys, и Хаа в положении 189 представляет собой Leu, и в положении 199 представляет собой Ser; или b) Хаа в положении 189 представляет собой Ser, если Хаа в положении 150 представляет собой Lys; или с) Хаа в положении 199 представляет собой Lys, если Хаа в положении 150 представляет собой Lys.
[00111] В другом варианте осуществления данное изобретение включает белок eCry1Ba, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10.
[00112] В еще одном варианте осуществления белок eCry1Ba данного изобретения обладает активностью в отношении чешуекрылых или жесткокрылых насекомых, в частности, в отношении чешуекрылых насекомых. Примеры таких чешуекрылых насекомых включают, не ограничиваясь, следующие: кукурузный мотылек, кукурузная юго-западная огневка, тростниковая огневка, хлопковая совка, соевая совка и гусеница совки рода Anticarsia. Сконструированные белки Cry1Ba данного изобретения также обладают активностью в отношении гусеницы хлопковой совки, насекомого-вредителя, для которого нативный Cry1Ba является неактивным.
[00113] В еще одном варианте осуществления данное изобретение включает белок eCry1Ba, который имеет по меньшей мере в 3 раза более высокую специфическую активность, чем нативный белок Cry1Ba в отношении по меньшей мере кукурузного мотылька.
[00114] В другом варианте осуществления данное изобретение также включает вариантные белки Cry1Ba (vCry1Ba), где тирозин (Tyr) или гистидин (His) в положении 150 (Y150 или H150) замещен на аминокислоту, отличную от Туг или His. В одном аспекте аминокислота, которая замещена на Y150 или Н150, представляет собой Lys, Phe, Trp, Pro, Thr, Leu, Ala, Val, Ser, Arg, Gly или Asp.
[00115] В другом варианте осуществления данное изобретение включает мутированный белок Cry1Ba, который содержит SEQ ID NO:3.
[00116] В еще одном варианте осуществления данное изобретение включает белок vCry1Ba, где Tyr или His в положении 150 (Y150 или Н150) замещен на аминокислоту, отличную от Tyr или His и также имеет валин (Val) в положении 81 (V81), замещенный на аминокислоту, отличную от Val; или аланин (Ala) в положении 155 (А155) и метионин (Met) в положении 178 (M178) замещены на аминокислоты, отличные от Ala или Met, соответственно. В другом варианте осуществления Val в положении 81 (V81) замещен на триптофан (Trp) (V81W). В еще одном варианте осуществления данное изобретение включает вариантный белок Cry1Ba, который содержит SEQ ID NO:11.
[00117] В одном варианте осуществления данное изобретение включает белок vCry1Ba с Tyr в 150 (Y150), замещенным на любую другую аминокислоту, и где Ala в положении 155 (А155) замещен на аспарагиновую кислоту (Asp) (A155D), и Met в положении 178 (M178) замещен на серии (Ser) (M178S). В другом варианте осуществления данное изобретение включает белок vCry1Ba, содержащий SEQ ID NO:12.
[00118] Белки vCry1Ba, включенные в данное изобретение, имеют инсектицидную активность в отношении чешуекрылого или жесткокрылого насекомого. К таким чешуекрылым насекомым относятся без ограничения кукурузный мотылек, кукурузная юго-западная огневка, тростниковая огневка, хлопковая совка, соевая совка и гусеница совки рода Anticarsia. Активность белков vCry1Ba, как правило, меньше, чем у белка Cry1Ba дикого типа данного изобретения. Одно преимущество таких вариантных белков Cry1Ba состоит в их пользе в ситуациях, где не требуется высокая специфическая активность. Специалист в данной области техники установит другие применения и преимущества таких вариантных белков Cry1Ba.
[00119] Свойства для борьбы с насекомыми у белков eCry1Ba и белков vCry1Ba данного изобретения дополнительно проиллюстрированы в Примерах 2, 4, 5, 6 и 9.
[00120] В одном варианте осуществления данное изобретение включает нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок eCry1Ba данного изобретения или кодирует белок vCry1Ba данного изобретения. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота содержит SEQ ID NO:13.
[00121] Данное изобретение также включает химерный ген, содержащий гетерологичнную промоторную последовательность, функционально связанную с нуклеиновой кислотой, которая кодирует белок eCry1Ba или белок vCry1Ba. В одном варианте осуществления гетерологичный промотор выбирают из группы, которая включает промотор убиквитина маиса, вируса цестровых (cmp), TrpA кукурузы, актина риса, 5’UTR гена 9 бактериофага Т3, металлотионеина (mtl) маиса, сахароза-синтетазы 1 кукурузы, алкогольдегидрогеназы 1 кукурузы, светоулавливающего комплекса кукурузы, белка теплового шока кукурузы, малой субъединицы RuBP карбоксилазы гороха, опинсинтазы Ti плазмиды, нопалинсинтазы Ti плазмиды, халкон-изомеразы петунии, богатого глицином белка 1 бобов, пататина картофеля, лектина, 35S CaMV и малой субъединицы S-E9 RuBP-карбоксилазы.
[00122] Данное изобретение также включает рекомбинантные векторы, содержащие последовательности нуклеиновых кислот данного изобретения. Такие векторы включают, без ограничения, плазмидный, космидный, фагмидный вектор, вектор на основе искусственной хромосомы, фага или вируса. В таких векторах последовательности нуклеиновых кислот предпочтительно включены в кассеты экспрессии, содержащие регуляторные элементы для экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот в клетке-хозяине, способной экспрессировать последовательности нуклеиновых кислот. Такие регуляторные элементы обычно включают промотор и сигналы терминации и предпочтительно также включают элементы, позволяющие осуществляться эффективной трансляции полипептидов, которые кодируются последовательностями нуклеиновых кислот данного изобретения. Векторы, содержащие последовательности нуклеиновых кислот, обычно способны к репликации в конкретных клетках хозяина, предпочтительно как внехромосомные молекулы, и следовательно, используются для амплификации последовательностей нуклеиновых кислот данного изобретения в клетках-хозяевах. В одном варианте осуществления клетки-хозяева для таких векторов представляют собой микроорганизмы, такие как бактерии, включая без ограничения Е.coli, Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Agrobacterium или Pseudomonas. В другом варианте осуществления клетки-хозяева для таких рекомбинантных векторов представляют собой эндофиты или эпифиты. В другом варианте осуществления клетка-хозяин для таких векторов представляет собой эукариотическую клетку, такую как растительная клетка. Примеры таких растительных клеток, включенных в данное изобретение, включают, без ограничения, следующие: клетки сорго, пшеницы, подсолнечника, томата, картофеля, капустной культуры, хлопчатника, риса, сои, сахарной свеклы, сахарного тростника, табака, ячменя, масличного рапса или кукурузы.
[00123] В другом варианте осуществления такие векторы являются вирусными векторами и пригодны для репликации последовательностей нуклеиновых кислот в конкретных клетках хозяина, например, клетках насекомых или растительных клетках. Рекомбинантные векторы также используют для трансформации последовательностей нуклеиновых кислот данного изобретения в клетки-хозяева, посредством чего последовательности нуклеиновых кислот устойчиво интегрируются в ДНК таких клеток-хозяев. В одном варианте осуществления такие клетки-хозяева представляют собой прокариотические клетки. В другом варианте осуществления такие клетки-хозяева представляют собой эукариотические клетки, такие как растительные клетки. В другом варианте осуществления растительные клетки представляют собой клетки кукурузы.
[00124] В одном варианте осуществления данное изобретение включает трансгенные растения, содержащие нуклеиновую кислоту данного изобретения, которая кодирует белок eCry1Ba или белок vCry1Ba по данному изобретению. Белки eCry1Ba или белки vCry1Ba пригодны для экспрессии в любом трансгенном растении, где представляют проблему восприимчивые к нему насекомые-вредители. Такие трансгенные растения включают, без ограничения, однодольные растения и двудольные растения. В одном варианте осуществления однодольные растения включают кукурузу, пшеницу, овес, рис, ячмень, сахарный тростник, сорго, газонную траву и пастбищные растения. В другом варианте осуществления двудольные растения включают сою и другие бобовые, хлопчатник, подсолнечник, капустные культуры и другие овощи, сахарную свеклу, табак и масличный рапс.
[00125] В другом варианте осуществления данное изобретение включает потомство растения от любого поколения трансгенного растения, где потомство содержит нуклеиновую кислоту данного изобретения.
[00126] В еще одном варианте осуществления данное изобретение включает часть растения для размножения от любого поколения трансгенного растения, где часть растения для размножения содержит нуклеиновую кислоту данного изобретения. В еще одном варианте осуществления часть растения для размножения данного изобретения выбирают из группы, включающей семя, орган вегетативного размножения и черенок.
[00127] В другом варианте осуществления данное изобретение включает биологический образец из трансгенного растения данного изобретения, где биологический образец содержит белок eCry1Ba данного изобретения, и белок eCry1Ba способен бороться с насекомыми-вредителями. Примеры таких биологических образцов включают без ограничения любое производное кукурузы, которое содержит белок, такое как кукурузная мука или кукурузный крахмал, содержащий белок eCry1Ba, где белок eCry1Ba продолжает выполнять инсектицидную функцию, которую он имел в трансгенном растении кукурузы, из которого был получен биологический образец.
[00128] Данное изобретение также включает инсектицидную композицию, содержащую белок eCry1B или vCry1Ba по данному изобретению и приемлемый сельскохозяйственный носитель. В одном варианте осуществления сельскохозяйственный носитель может быть жидкостью, порошком или трансгенным растением, например, без ограничения, растением кукурузы или растением сахарного тростника.
[00129] В другом варианте осуществления данное изобретение включает способ получения белка eCry1B или белка vCry1Ba, который является активным в отношении насекомых, включающий: (а) получение клетки-хозяина, содержащей химерный ген, который сам по себе содержит гетерологичную промоторную последовательность, функционально связанную с нуклеиновой кислотой данного изобретения; и (b) экспрессию нуклеиновой кислоты в трансгенной клетке-хозяине, что дает в результате по меньшей мере один белок данного изобретения, который активен в отношении насекомых. В другом варианте осуществления насекомые представляют собой чешуекрылых насекомых или жесткокрылых насекомых. В еще одном варианте осуществления чешуекрылые насекомые выбирают из группы, которая включает кукурузного мотылька, кукурузную юго-западную огневку, тростниковую огневку, хлопковую совку, соевую совку и гусеницу совки рода Anticarsia.
[00130] В еще одном варианте осуществления данное изобретение включает способ получения устойчивого к насекомым трансгенного растения, включающий введение кассеты экспрессии, содержащей нуклеиновую кислоту данного изобретения, в растение с получением, таким образом, трансгенного растения, где кассета экспрессии вызывает экспрессию белка данного изобретения в количестве, которое делает растение устойчивым к насекомым. В другом варианте осуществления насекомые являются чешуекрылыми или жесткокрылыми насекомыми. К таким чешуекрылым насекомым, включенным в данное изобретение, относятся без ограничения кукурузный мотылек, кукурузная юго-западная огневка, тростниковая огневка, хлопковая совка, соевая совка и гусеница совки рода Anticarsia.
[00131] В другом варианте осуществления данное изобретение включает способ получения белка eCry1Ba, включающий а) определение белка Cry1Ba, имеющего домен I; b) замещение по меньшей мере одной нативной аминокислоты на участке в домене I по меньшей мере на одну другую аминокислоту; и с) получение белка eCry1Ba, полученного таким образом, где eCry1Ba имеет повышенную растворимость и/или инсектицидную активность в отношении по меньшей мере кукурузного мотылька по сравнению с нативным белком Cry1Ba. В другом варианте осуществления белок Cry1Ba представляет собой Cry1Ba1, имеющий инвентарный номер GenBank САА29898, Cry1Ba2 (САА65003), Cry1Ba3 (AAK63251), Cry1Ba4 (AAK51084), Cry1Ba5 (AB020894) или Cry1Ba6 (ABL60921). В еще одном варианте осуществления нативная аминокислота в Cry1Ba расположена в альфа-спирали 4 или альфа-спирали 5 домена I. В еще одном варианте осуществления аминокислота находится в положении, соответствующем положению 150, 178, 189 или 199 SEQ ID NO:2. В еще одном варианте осуществления аминокислота находится в положении 150, 178, 189 или 199 SEQ ID NO:5. В еще одном варианте осуществления аминокислота в Cry1Ba находится в положении, соответствующем аминокислотам 2 и 150; или аминокислотам 2,150 и 178; или аминокислотам 2,150 и 189; или аминокислотам 2, 150 и 199 SEQ ID NO:5. В другом варианте осуществления аминокислота находится в положениях 2 и 150; или положениях 2, 150 и 178; или в положениях 2, 150 и 189; или в положениях 2, 150 и 199 SEQ ID NO:5.
[00132] В еще одном варианте осуществления данное изобретение включает способ борьбы с насекомыми, включающий доставку насекомым или приведение в контакт насекомых с эффективным количеством белка eCry1Ba или белка vCry1Ba данного изобретения. Согласно этому варианту осуществления насекомые являются чешуекрылыми насекомыми или жесткокрылыми насекомыми. К таким чешуекрылым насекомым относятся без ограничения кукурузный мотылек, кукурузная юго-западная огневка, тростниковая огневка, хлопковая совка, соевая совка и гусеница совки рода Anticarsia. Предпочтительно, белок eCry1Ba или белок vCry1Ba доставляется насекомым перорально. В другом варианте осуществления белок доставляется перорально посредством трансгенного растения, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует белок eCry1B или белок vCry1Ba данного изобретения.
[00133] Данное изобретение дополнительно включает способ борьбы с насекомыми, где трансгенное растение данного изобретения дополнительно содержит вторую последовательность нуклеиновой кислоты или группы последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют второе пестицидное действующее вещество. В одном варианте осуществления вторые последовательности нуклеиновых кислот являются последовательностями, которые кодируют белок Cry, отличный от белка eCry1Ba или белка vCry1Ba данного изобретения, последовательностям, которые кодируют токсин-вегетативный инсектицидный белок, раскрытый в патентах США №№5849870 и 5877012, включенных в данный документ ссылкой, или последовательностями, которые кодируют пути для продукции небелкового действующего вещества. В другом варианте осуществления вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует белок Vip3. Специалист в данной области техники установит, что многие различные инсектицидные действующие вещества могут использоваться в комбинации с белком eCry1Ba или vCry1Ba данного изобретения.
[00134] В другом варианте осуществления данное изобретение включает способ обеспечения растениевода улучшенным средством борьбы, по меньшей мере, с кукурузным мотыльком, включающий поставку или продажу растениеводу трансгенных сеянцев, содержащих нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок eCry1Ba, имеющий мутацию в одном или нескольких положениях аминокислот в домене I, белок eCry1Ba, имеющий повышенную растворимость и/или инсектицидную активность в отношении по меньшей мере кукурузного мотылька по сравнению с нативным белком Cry1Ba. В другом варианте осуществления трансгенную часть растения для размножения выбирают из группы, включающей семя, орган вегетативного размножения и черенок.
[00135] В дополнительных вариантах осуществления последовательности нуклеиновых кислот данного изобретения могут быть дополнительно модифицированы с помощью включения случайных мутаций техникой, известной как in vitro рекомбинация или ДНК-перестановка. Эта техника описана в Stemmer et al., Nature 370:389-391 (1994) и патенте США №5605793, которые включены в данный документ ссылкой. Миллионы мутантных копий последовательности нуклеиновой кислоты получают на основе исходной последовательности нуклеиновой кислоты данного изобретения и отбирают варианты с улучшенными свойствами, такими как увеличенная инсектицидная активность, усиленная устойчивость, или различная специфичность, или диапазоны целевых насекомых-вредителей. Способ включает образование мутировавшей двухцепочечной полинуклеиновой кислоты из матричной двухцепочечной полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты по данному изобретению, где матричная двухцепочечная полинуклеиновая кислота была расщеплена на двухцепочечные случайные фрагменты необходимого размера, и включает этапы добавления к полученной популяции двухцепочечных случайных фрагментов одной или нескольких одно- или двухцепочечных олигонуклеиновых кислот, где указанные олигонуклеиновые кислоты содержат область идентичности и область гетерологичности с двухцепочечной матричной полинуклеиновой кислотой; денатурацию полученной смеси двухцепочечных случайных фрагментов и олигонуклеиновых кислот в одноцепочечные фрагменты; инкубацию полученной популяции одноцепочечных фрагментов с полимеразой при условиях, которые приводят к отжигу указанных одноцепочечных фрагментов на указанных областях идентичности с образованием пар отожженных фрагментов, где указанные области идентичности достаточны для того, чтобы один член пары затравливал репликацию другого, таким образом, формируя мутировавшую двухцепочечную полинуклеиновую кислоту; и повторение второго и третьего этапов в течение по меньшей мере двух дополнительных циклов, где полученная смесь на втором этапе дополнительного цикла включает мутировавшую двухцепочечную полинуклеиновую кислоту из третьего этапа предыдущего цикла, и дополнительный цикл образует дополнительную мутировавшую двухцепочечную полинуклеиновую кислоту. В предпочтительном варианте осуществления концентрация отдельного вида двухцепочечного случайного фрагмента в популяции двухцепочечных случайных фрагментов составляет менее 1% по весу общей ДНК. В еще одном варианте осуществления матричная двухцепочечная полинуклеиновая кислота содержит по меньшей мере приблизительно 100 видов полинуклеиновых кислот. В другом предпочтительном варианте осуществления размер двухцепочечных случайных фрагментов составляет от около 5 п.н. до 5 т.п.н. В еще одном дополнительном варианте осуществления четвертый этап способа включает повторение второго и третьего этапов в течение по меньшей мере 10 циклов.
Экспрессия последовательностей нуклеиновых кислот в гетерологичных микробных хозяевах
[00136] В качестве биологических средств борьбы с насекомыми инсектицидные белки eCry1Ba получают путем экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот в гетерологичных клетках-хозяевах, способных экспрессировать последовательности нуклеиновых кислот. В первом варианте осуществления получают клетки В. thuringiensis, содержащие модификации последовательности нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению. Такие модификации включают мутации или делеции существующих регуляторных элементов, таким образом, приводя к измененной экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты или включению новых регуляторных элементов, контролирующих экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты. В другом варианте осуществления дополнительные копии одной или нескольких последовательностей нуклеиновых кислот добавляют к клеткам Bacillus thuringiensis либо путем вставки в хромосому, либо путем введения внехромосомно реплицирующихся молекул, содержащих последовательности нуклеиновых кислот.
[00137] В другом варианте осуществления по меньшей мере одну из последовательностей нуклеиновых кислот данного изобретения вводят в подходящую кассету экспрессии, содержащую промотор и сигнал терминации. Экспрессия последовательности нуклеиновой кислоты является конститутивной, или используется промотор, индуцибельный в ответ на различные типы стимулов для инициации транскрипции. В предпочтительном варианте осуществления клетка, в которой экспрессируется белок, представляет собой микроорганизм, такой как вирус, бактерии или гриб. В одном варианте осуществления вирус, такой как бакуловирус, содержит последовательность нуклеиновой кислоты данного изобретения в своем геноме и экспрессирует большие количества соответствующего инсектицидного белка eCry1Ba или белка vCry1Ba после инфицирования подходящих эукариотических клеток, которые пригодны для репликации вируса и экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты. Инсектицидный белок, полученный таким образом, используют в качестве инсектицидного средства. Альтернативно, бакуловирусы, сконструированные с включением последовательности нуклеиновой кислоты, используют для инфицирования насекомых in vivo и уничтожения их либо путем экспрессии инсектицидного белка, либо путем комбинации вирусной инфекции и экспрессии инсектицидного белка.
[00138] Бактериальные клетки являются также хозяевами для экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот данного изобретения. В предпочтительном варианте осуществления используются непатогенные симбиотические бактерии, которые способны жить и реплицироваться внутри тканей растения, так называемые эндофиты, или непатогенные симбиотические бактерии, которые способны колонизировать филлосферу или ризосферу, так называемые эпифиты. Такие бактерии включают бактерии родов Agrobacterium, Alcaligenes, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Clavibacter, Enter obacter, Erwinia, Flavobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia, Streptomyces и Xanthomonas. Симбиотические грибы, такие как Trichoderma и Gliocladium, также являются возможными хозяевами для экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот по данному изобретению с той же целью.
[00139] Техники для этих генетических манипуляций являются специальными для различных доступных хозяев и известны в данном уровне техники. Например, векторы экспрессии pKK223-3 и pKK223-2 могут использоваться для экспрессии гетерологичных генов в Е.coli либо в транскрипционном или трансляционном слиянии под действием tac или trc промотора. Для экспрессии оперонов, кодирующих множественные ORF (открытые рамки считывания), простейшей процедурой является вставка оперона в вектор, такой как pKK223-3 в транскрипционном слиянии, что позволяет использовать родственный сайт связывания рибосомы гетерологичных генов. Техники для сверхэкспрессии в грам-положительном виде, таком как Bacillus, также известны в данном уровне техники и могут использоваться в контексте данного изобретения (Quax et al. В: Industrial Microorganisms:Basic and Applied Molecular Genetics, Eds. Baltz et al., American Society for Microbiology, Washington (1993)). Альтернативные системы для сверхэкспрессии основаны, например, на дрожжевых векторах и включают применение Pichia, Saccharomyces и Kluyveromyces (Sreekrishna, В:Industrial microorganisms: basic and applied molecular genetics, Baltz, Hegeman, and Skatrud eds., American Society for Microbiology, Washington (1993); Dequin & Barre, Biotechnology L2:173-177 (1994); van den Berg et al., Biotechnology 8:135-139 (1990)).
Трансформация растения
[00140] В одном варианте осуществления по меньшей мере один из инсектицидных белков eCry1B или белков vCry1Ba данного изобретения экспрессируется в высшем организме, например, растении. В данном случае трансгенные растения, экспрессирующие эффективные количества белков eCry1Ba или vCry1Ba, защищают самих себя от насекомых-вредителей. Когда насекомое начинает питаться на таком трансгенном растении, оно также проглатывает экспрессированный белок eCry1Ba или vCry1Ba. Это будет удерживать насекомое от дополнительного прокусывания ткани растения или может даже наносить вред или уничтожать насекомое. Последовательность нуклеиновой кислоты данного изобретения вводят в кассету экспрессии, которая затем предпочтительно устойчиво интегрируется в геном указанного растения. В другом варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты включена в непатогенный самореплицирующийся вирус. Растения, трансформированные в соответствии с данным изобретением, могут быть однодольными или двудольными и включают, но не ограничиваясь, кукурузу, пшеницу, ячмень, рожь, сладкий картофель, бобы, горох, цикорий, салат-латук, кочанную капусту, цветную капусту, брокколи, турнепс, редис, шпинат, спаржу, лук, чеснок, перец, сельдерей, тыкву крупноплодную, тыкву обыкновенную, коноплю, цукини, яблоко, грушу, айву, дыню, сливу, вишню, персик, нектарин, абрикос, клубнику, виноград, малину, ежевику, ананас, авокадо, папайю, манго, банан, сою, томат, сорго, сахарный тростник, сахарную свеклу, подсолнечник, рапс, клевер, табак, морковь, хлопчатник, люцерну, рис, картофель, баклажан, огурец, арабидопсис и древесные растения, такие как хвойные и лиственные деревья.
[00141] Как только желательная последовательность нуклеиновой кислоты была трансформирована в конкретный вид растения, она может размножаться в этом виде или переносится в другие сорта того же вида, в особенности, включая коммерческие сорта, с помощью традиционных методик селекции.
[00142] Последовательность нуклеиновой кислоты по данному изобретению может быть экспрессирована в трансгенных растениях, таким образом, вызывая биосинтез соответствующего белка eCry1Ba или vCry1Ba в трансгенных растениях. Таким способом создают трансгенные растения с усиленной устойчивостью к насекомым. Для их экспрессии в трансгенных растениях последовательности нуклеиновых кислот данного изобретения могут нуждаться в других модификациях и оптимизации. Хотя во многих случаях гены из микробных организмов могут быть экспрессированы в растениях при высоких уровнях без модификации, низкий уровень экспрессии в трансгенных растениях может быть результатом микробных последовательностей нуклеиновых кислот, имеющих кодоны, которые не являются предпочтительными в растениях. В области техники известно, что все организмы имеют специфические предпочтения для использования кодона, и кодоны последовательностей нуклеиновых кислот, описанных в данном изобретении, могут быть изменены для соответствия предпочтениям для растения при сохранении аминокислот, которые кодируются таким образом. Кроме того, высокая экспрессия в растениях лучше достигается от кодирующих последовательностей, которые содержат по меньшей мере приблизительно 35% GC, предпочтительно более чем около 45%, более предпочтительно более чем около 50%, и наиболее предпочтительно более чем около 60%. Микробные последовательности нуклеиновых кислот, которые имеют низкое содержание GC, могут экспрессироваться слабо в растениях из-за существования АТТТА мотивов, которые могут дестабилизировать трансткрипты, и ААТААА мотивов, которые могут вызывать неприемлемое полиаденилирование. Хотя предпочтительные генные последовательности могут быть должным образом экспрессированы как в однодольных, так и двудольных видах растений, последовательности могут быть модифицированы с учетом специфических кодоновых предпочтений и предпочтений содержания GC однодольных или двудольных, так как было показано, что эти предпочтения отличаются (Murray et al. Nucl. Acids Res. 17:477-498 (1989)). К тому же последовательности нуклеиновых кислот подвергаются скринингу на существование неприемлемых сайтов сплайсинга, которые могут вызывать процессинг транскрипта. Все изменения, которые необходимо произвести в последовательностях нуклеиновых кислот, такие как те, которые описаны выше, осуществляют, с помощью хорошо известных методик сайт-направленного мутагенеза, ПЦР и конструирования искусственных генов с помощью способов, описанных в опубликованных патентных заявках ЕР 0 385 962 (для Monsanto), EP 0 359 472 (для Lubrizol) и WO 93/07278 (для Ciba-Geigy).
[00143] В одном варианте осуществления данного изобретения кодирующую последовательность eCry1Ba получают согласно процедуре, раскрытой в патенте США №5625136, включенном в данный документ ссылкой. В этой процедуре применяют предпочтительные для маиса кодоны, т.е. один кодон, который наиболее часто кодирует такую аминокислоту в маисе. Предпочтительный для маиса кодон для конкретной аминокислоты может быть получен, например, из известных генных последовательностей маиса. Частота использования кодона у маиса для 28 генов из растений маиса представлена в Murray et al., Nucleic Acids Research 17:477-498 (1989), описание которого включено в данный документ ссылкой. Синтетическая последовательность, созданная с кодонами, оптимизированными для маиса, представлена в SEQ ID NO:13.
[00144] Таким способом последовательности нуклеиновых кислот могут быть оптимизированы для экспрессии в любом растении. Установлено, что вся или любая часть генной последовательности может быть оптимизированной или синтетической. То есть, синтетические или частично оптимизированные последовательности могут также быть использованы.
[00145] Для эффективной инициации трансляции последовательности, прилегающие к инициирующему метионину, могут требовать модификации. Например, они могут быть модифицированы путем включения последовательностей, известных как эффективные в растениях. Joshi предложил приемлемый консенсус для растений (NAR 15:6643-6653 (1987)) и Clonetech предлагает дополнительный консенсусный инициатор трансляции (каталог 1993/1994, страница 210). Эти консенсусы пригодны для применения с последовательностями нуклеиновых кислот данного изобретения. Последовательности встраиваются в конструкции, содержащие последовательности нуклеиновых кислот, до и включая ATG (в то же время оставляя вторую аминокислоту немодифицированной) или альтернативно до и включая GTC, следующий за ATG (с возможностью модификации второй аминокислоты трансгена).
[00146] Экспрессия последовательностей нуклеиновых кислот в трансгенных растениях управляется промоторами, которые функционируют в растениях. Выбор промотора будет изменяться в зависимости от временных и пространственных потребностей для экспрессии, а также в зависимости от целевого вида. Таким образом, экспрессия последовательностей нуклеиновых кислот по данному изобретению в листьях, в стеблях или стволах, в початках, в соцветиях (например, колосья, метелки, стержни початков кукурузы и т.п.), в корнях и/или в сеянцах является предпочтительной. Во многих случаях, однако, необходима защита от более чем одного типа насекомого-вредителя, и таким образом, желательна экспрессия в ряде тканей. Хотя многие промоторы из двудольных, как было показано, являются функциональными в однодольных и наоборот, в идеале выбирают промоторы двудольных для экспрессии в двудольных, и промоторы однодольных для экспрессии в однодольных. Однако нет ограничения относительно источника происхождения промоторов; достаточно, чтобы они были функциональными при управлении экспрессией последовательностей нуклеиновых кислот в требуемой клетке.
[00147] Промоторы, которые экспрессируются конститутивно, включают промоторы из генов, кодирующих актин или убиквитин, и 35S и 19S промоторы CaMV. Последовательности нуклеиновых кислот данного изобретения могут также экспрессироваться под контролем промоторов, которые являются химически регулируемыми. Это позволяет инсектицидным белкам eCry1Ba или вариантным белкам Cry1Ba синтезироваться только когда сельскохозяйственные растения обрабатываются индуцирующими химическими веществами. Предпочтительная технология для химической индукции генной экспрессии подробно описана в опубликованной заявке ЕР 0 332 104 (для Ciba-Geigy) и патенте США №5614395. Предпочтительный промотор для химической индукции представляет собой промотор PR-1a табака.
[00148] Другой категорией промоторов являются те, которые являются индуцируемыми ранением. Были описаны многочисленные промоторы, которые экспрессируются в местах ранения, а также в местах фитопатогенной инфекции. В идеале, такой промотор должен быть активен только локально в местах инфекции, и, таким образом, инсектицидные белки eCry1B или вариантные белки Cry1Ba накапливаются только в клетках, которые нуждаются в синтезе инсектицидных белков eCry1Ba или вариантных белков Cry1Ba для уничтожения внедряющегося насекомого-вредителя. Промоторы этого вида включают те, которые описаны Stanford et al. Mol. Gen. Genet. 215:200-208 (1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1:151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993), и Warner et al. Plant J. 3:191-201 (1993).
[00149] Тканеспецифичные или тканепредпочтительные промоторы, пригодные для экспрессии генов белка eCry1Ba или вариантного белка Cry1Ba в растениях, в частности, кукурузе, являются такими, которые управляют экспрессией в корне, сердцевине, листе или пыльце, в частности, корне. Такие промоторы, например, таковые выделенные из РЕРС или trpA, раскрыты в патенте США №5625136, или MTL, раскрытые в патенте США №5466785. Оба патента США включены в данный документ ссылкой в их полном объеме.
[00150] Дополнительные предпочтительные варианты осуществления представляют собой трансгенные растения, экспрессирующие последовательности нуклеиновых кислот способом индукции ранением или индукции патогенной инфекцией.
[00151] В дополнение к промоторам, разнообразные терминаторы транскрипции являются также доступными для применения при конструировании химерного гена с помощью генов белка eCry1Ba или вариантного белка Cry1Ba данного изобретения. Терминаторы транскрипции отвечают за терминацию транскрипции за пределами трансгена и его правильное полиаденилирование. Приемлемые терминаторы транскрипции и таковые, известные как функционирующие в растениях, включают терминатор 35S CaMV, терминатор tml, терминатор нопалинсинтазы, терминатор rbcS E9 гороха и другие, известные в уровне техники. Они могут использоваться как в однодольных, так и в двудольных. Любой доступный терминатор, известно как функционирующий в растениях, может использоваться в контексте данного изобретения.
[00152] Различные другие последовательности могут быть введены в кассеты экспрессии, описанные в данном изобретении. Они включают последовательности, которые, как было показано, усиливают экспрессию, такие как интронные последовательности (например, из Adhl и bronzel) и вирусные лидерные последовательности (например, из TMV, MCMV и AMV).
[00153] Предпочтительным является нацеливание экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот данного изобретения в различные клеточные локализации в растении. В некоторых случаях локализация в цитозоле может быть желательной, тогда как в других случаях, локализация в некоторой субклеточной органелле может быть предпочтительной. Субклеточная локализация кодируемых трансгеном ферментов обеспечивается с помощью методик, хорошо известных в данном уровне техники. Как правило, ДНК, кодирующая целевой пептид из известного нацеленного на органеллу генного продукта, подвергается манипуляции и сливается выше последовательности нуклеиновой кислоты. Многие такие нацеливающие последовательности известны для хлоропласта, и показано их функционирование в гетерологичных конструкциях. Экспрессия последовательностей нуклеиновых кислот данного изобретения также нацелена на эндоплазматический ретикулум или на вакуоли клеток-хозяев. Методики для достижения этого хорошо известны в данном уровне техники.
[00154] Векторы, пригодные для трансформации растений описаны в другом месте в этом описании. Для опосредованной Agrobacterium трансформации бинарные векторы или векторы, несущие по меньшей мере одну Т-ДНК граничную последовательность, являются пригодными, тогда как для прямого переноса генов является пригодным любой вектор, и линейная ДНК, содержащая только конструкцию интереса, может быть предпочтительной. В случае прямого переноса генов может использоваться трансформация одним видом ДНК или котрансформация (Schocher et al. Biotechnology 4:1093-1096 (1986)). Как для прямого переноса генов, так и для опосредованного Agrobacterium переноса, трансформацию обычно (но не обязательно) осуществляют с селектируемым маркером, который может обеспечивать устойчивость к антибиотику (канамицину, гигромицину или метотрексату) или гербициду (баста). Векторы трансформации растений, содержащие гены белка eCry1Ba или вариантного белка Cry1Ba данного изобретения, могут также содержать гены, например, фосфоманноза-изомеразу (pmi), которая обеспечивает положительную селекцию трансгенных растений, как раскрыто в патентах США №№5767378 и 5994629, включенных в данный документ ссылкой, или фосфинотрицин-ацетилтрансферазу (pat), которая обеспечивает устойчивость к гербициду фосфинотрицину (глюфозинату). Выбор селектируемого маркера, однако, не является ключевым для данного изобретения.
[00155] В другом варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок eCry1Ba или белок vCry1Ba данного изобретения, напрямую трансформируют в геном пластиды. Главное преимущество пластидной трансформации состоит в том, что пластиды, как правило, способны экспрессировать бактериальные гены без существенной оптимизации кодона, и пластиды способны к экспрессии множественных открытых рамок считывания под контролем одного промотора. Технология пластидной трансформации широко описана в патентах США №№5451513, 5545817 и 5545818, в РСТ заявке WO 95/16783 и в McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305. Базовая методика для трансформации хлоропластов включает введение участков клонированной пластидной ДНК, фланкирующей селектируемый маркер вместе с геном интереса, в пригодную целевую ткань, например, используя биолистику или трансформацию протопласта (например, трансформацию, опосредованную хлоридом кальция, или ПЭГ-опосредованную трансформацию). Фланкирующие участки 1-1,5 т.п.н., названные направляющими последовательностями, облегчают гомологичную рекомбинацию с пластидным геномом и, таким образом, обеспечивают замещение или модификацию специфических участков пластома. Вначале, точечные мутации в генах 16S рРНК и rps12 хлоропласта, обеспечивающие устойчивость к спектиномицину и/или стрептомицину, используют как селектируемые маркеры для трансформации (Svab, Z., Hajdukiewicz, Р., и Maliga, Р. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J. M., и Maliga, Р. (1992) Plant Cell 4, 39-45). Это приводило к стабильным гомопластидным трансформантам с частотой приблизительно один на 100 бомбардировок целевых листьев. Присутствие сайтов клонирования между этими маркерами обеспечивало создание нацеленного на пластиду вектора для введения чужеродных генов (Staub, J.M., и Maliga, Р. (1993) ЕМВО J. 12, 601-606). Существенные повышения частоты трансформации получали путем замещения рецессивных генов рРНК или r-белка устойчивости к антибиотику на доминантный селектируемый маркер, бактериальный ген aadA, кодирующий обезвреживающий спектиномицин фермент, аминогликозид-3’-аденилтрансферазу (Svab, Z., и Maliga, Р. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917). Ранее этот маркер был успешно использован для трансформации с высокой частотой пластидного генома зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii (Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4083-4089). Другие селектируемые маркеры, пригодные для пластидной трансформации, известны в данном уровне техники и включены в объем данного изобретения. Как правило, необходимо приблизительно 15-20 циклов клеточного деления после трансформации для достижения гомопластидного состояния. Пластидная экспрессия, при которой гены вставляются посредством гомологичной рекомбинации во все из нескольких тысяч копий кольцевого пластидного генома, присутствующих в каждой растительной клетке, пользуется преимуществом аномального количества копий по сравнению с генами, экспрессируемыми в ядре, чтобы обеспечить уровни экспрессии, которые могут легко превысить 10% от общего растворимого белка растений. В предпочтительном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты данного изобретения вставляют в нацеленный на пластиду вектор и трансформируют в геном пластиды желаемого растения хозяина. Получают растения, гомопластические в отношении пластидных геномов, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты данного изобретения, и они предпочтительно способны к высокой экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты.
Комбинации действующих веществ для борьбы с насекомыми
[00156] Белки eCry1Ba или vCry1Ba данного изобретения могут использоваться в комбинации с другими белками Cry Bt или другими пестицидными действующими веществами для повышения целевого спектра вредителей. Кроме того, применение белков eCry1Ba или vCry1Ba данного изобретения в комбинации с другими белками Cry Bt или другими пестицидными действующими веществами другой природы обладает особой пользой для предотвращения и/или управления устойчивостью насекомых. Другие инсектицидные действующие вещества включают, например, лектины, α-амилазу, пероксидазу и холестерол-оксидазу. Гены Вегетативного инсектицидного белка, такие как vip1A(a) и vip2A(a) или vip3, также пригодны в данном изобретении. В одном варианте осуществления белок eCry1Ba, обозначенный eCry1Ba-T2AY150KL189S (SEQ ID NO:9), комбинируют с белком Vip3A в трансгенном растении. Трансгенное растение проявляет комбинированный спектр инсектицидной активности, связанный как с eCry1Ba, так и с Vip3. В еще одном варианте осуществления трансгенное растение представляет собой растение кукурузы или растение сахарного тростника.
[00157] Такая коэкспрессия более чем одного инсектицидного действующего вещества в одном трансгенном растении может быть достигнута путем генетического конструирования в отношении растения, чтобы оно содержало и экспрессировало все необходимые гены в так называемом молекулярном пакете. Альтернативно, растение. Родитель 1, может быть генетически сконструировано для экспрессии генов данного изобретения. Второе растение, Родитель 2, может быть генетически сконструировано для экспрессии дополнительного действующего вещества для борьбы с насекомым. Путем скрещивания Родителя 1 с Родителем 2, получают потомство растения, которое экспрессирует все гены, введенные в Родителей 1 и 2. Например, без ограничения, Родитель 1 может содержать кодирующую последовательность eCry1Ba, и Родитель 2 может содержать кодирующую последовательность Vip3A. Некоторые потомки скрещивания Родителя 1 с Родителем 2 будет содержать как кодирующую последовательность eCry1Ba, так и кодирующую последовательность Vip3A.
[00158] Трансгенное семя данного изобретения может также быть обработано инсектицидным покрытием для семян, как описано в патентах США №№5849320 и 5876739, включенных в данный документ ссылкой. В случае, когда инсектицидное покрытие для семян и трансгенное семя данного изобретения являются активными в отношении одного и того же целевого насекомого, комбинация является пригодной (i) в способе для повышения активности белка eCry1Ba данного изобретения в отношении целевого насекомого и (ii) в способе профилактики развития устойчивости к белку eCry1Ba данного изобретения путем обеспечения второго механизма действия в отношении целевого насекомого. Таким образом, данное изобретение обеспечивает способ повышения активности в отношении целевого насекомого или профилактики развития устойчивости у целевого насекомого, например, кукурузного жука, включающий нанесение инсектицидного покрытия для семян на трансгенное семя, содержащее один или несколько белков eCry1Ba данного изобретения. Такие химические обработки могут включать инсектициды, фунгициды или нематоциды. Примеры таких инсектицидов включают, без ограничения, динотефуран, такой как тиаметоксам, имидаклоприд, ацетамиприд, нитенпирам, нидинотефуран, хлорфенапир, тебуфенпирад, тебуфенозид, метоксифенозид, галофенозид, триазамат, авермектин, спиносад, фипринол, ацефат, фенамифос, диазинон, хлорпирифос, хлорпирифон-метил, малатион, карбарил, алдикарб, карбофуран, тиодикарб и оксамил. Даже если инсектицидное покрытие для семян является активным в отношении другого насекомого, то инсектицидное покрытие для семян является пригодным для расширения диапазона борьбы с насекомыми, например, путем добавления инсектицидного покрытия для семян, которое обладает активностью в отношении чешуекрылых насекомых, к трансгенному семени данного изобретения, которое обладает активностью в отношении жесткокрылых насекомых, при этом покрытое трансгенное семя борется как с чешуекрылыми, так и с жесткокрылыми насекомыми-вредителями.
ПРИМЕРЫ
[00159] Данное изобретение будет дополнительно описано со ссылкой на следующие подробные примеры. Эти примеры представлены лишь для целей иллюстрации, и не подразумевается, что они являются ограничивающими, если иное не указано. Стандартные методики рекомбинантной ДНК и молекулярного клонирования, использованные в данном документе, являются хорошо известными в данном уровне техники и описаны в J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); T.J. Silhavy, M.L. Berman, and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) и Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley and Sons Inc., (1988), Reiter, et al.. Methods in Arabidopsis Research, World Scientific Press (1992), и Schultz et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers (1998).
Пример 1. Применение ПЦР для мутирования кодирующих последовательностей Cry1Ba
[00160] Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой повторяющийся, ферментативный, использующий затравку синтез последовательности нуклеиновой кислоты. Эта процедура является хорошо известной и широко используемой специалистами в данной области техники (Смотри Mullis, патенты США №№4683195,4683202 и 4800159; Saiki, Randall К., Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis, Glenn T. Horn, Henry A. Erlich, Norman Amheim [1985] "Enzymatic Amplification of β-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia," Science 230:1350-1354.). ПЦР основана на ферментативной амплификации ДНК фрагмента интереса, который фланкирован двумя праймерами олигонуклеиновой кислоты, которые гибридизуются с противоположными цепями целевой последовательности. Праймеры ориентированы 3’ концами, направленными друг к другу. Повторяющиеся циклы температурной денатурации матрицы, отжига праймеров до их комплементарных последовательностей и удлинения отожженных праймеров с помощью ДНК полимеразы приводят к амплификации сегмента, определенного 5’ концами ПЦР праймеров. Поскольку удлиненный продукт каждого праймера может служить как матрица для других праймеров, каждый цикл по существу удваивает количество ДНК фрагмента, полученного в предыдущем цикле. Это приводит к экспотенциальному накоплению специфического целевого фрагмента, вплоть до нескольких миллионов раз за несколько часов. Путем использования термостабильной ДНК полимеразы, такой как Taq полимераза, которую выделяют из термофильной бактерии Thermus aquaticus, процесс амплификации может быть полностью автоматизирован.
[00161] Кодирующие последовательности утантного Cry1Ba, описанные в следующих примерах, были сконструированы, используя QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (набор QuickChange для сайт-направленного мутагенеза) (Stratagene, Ла-Хойя, Калифорния) согласно инструкциям производителя и различные комбинации иллюстративных праймеров, показанных в Таблице 1. Специалист в данной области техники установит на основании данной заявки, что другие пары праймеров могут использоваться, чтобы мутировать любую кодирующую последовательность Cry1Ba.
Таблица 1
Праймеры, используемые для создания мутированной кодирующей последовательности, кодирующей белки eCry1Ba
Название праймера
Последовательность праймера
SEQ ID NO:
YG152
5’-agaagtgttcttnnsacccaatatatagctttagaacttg-3’
SEQ ID NO:14
YG153
5’-tatatattgggtsnnaagaacacttctcgttcttgcatc-3’
SEQ ID NO:15
YG154
5’-agaagtgttcttaagacccaatatatagctttagaacttg-3’
SEQ ID NO:16
YG155
5’-tatatattgggtcttaagaacacttctcgttcttgcatc-3’
SEQ ID NO:17
YG156
5’-agaagtgttctttggacccaatatatagctttagaacttg-3’
SEQ ID NO:18
YG157
5’-tatatattgggtccaaagaacacttctcgttcttgcatc-3’
SEQ ID NO:19
YG160
5’-atatgtttaaacatgacttcaaataggaaaaatgagaatgaa-3’
SEQ ID NO:20
YG161
5’-atatgtttaaacatggatctattaccagatgctcgtattg-3’
SEQ ID NO:21
YG162
5’-atatggcgcgcctatctttctaaatcatattctgcttcgaagg-3’
SEQ ID NO:22
YG163
5’-aattccatggcgtcaaataggaaaaatgagaatgaaattataaatgc-3’
SEQ ID NO:23
YG164
5’-aattccatggatctattaccagatgctcgtattg-3’
SEQ ID NO:24
YG165
5’-aattccatggaggatagcttgtgtatagccgagg-3’
SEQ ID NO:25
YG166
5’-aattgagctcttatctttctaaatcatattctgcttcgaagg-3’
SEQ ID NO:26
YG171
5’-agttttctttggggtgaattatggccccgc-3’
SEQ ID NO:27
YG172
5’-taattcaccccaaagaaaactataaaaactagc-3’
SEQ ID NO:28
YG175
5’-caatatatagatttagaacttgattttcttaatg-3’
SEQ ID NO:29
YG176
5’-aagttctaaatctatatattgggtataaagaac-3’
SEQ ID NO:30
YG179
5’-ttacacctatccttattgagagatgcctctc-3’
SEQ ID NO:31
YG180
5’-tctcaataaggataggtgtaaatttgcagcttg-3’
SEQ ID NO:32
YG183
5’-agaacgagaagtgaacttaagacccaatatatagc-3’
SEQ ID NO:33
YG184
5’-acccaatatatagatttagaacttgattttcttaatgcg-3’
SEQ ID NO:34
YG186
5’-gaagttccattattgccggtatatgctcaagctgc-3’
SEQ ID NO:35
YG188
5’-tttcttaataagatgccgcttttcgcaattagaaacc-3’
SEQ ID NO:36
YG189
5’-aagcggcatcttattaagaaaatcaagttctaaagctatatattggg-3’
SEQ ID NO:37
YG190
5’-ctttttggtaaggaatttgggcttacatcgcagg-3’
SEQ ID NO:38
YG191
5’-cccaaattccttaccaaaaagagaggcatctctcaat-3’
SEQ ID NO:39
YG192
5’-ccattattgagcgtatatgctcaagctgcaaatttacacc-3’
SEQ ID NO:40
YG193
5’-agcatatacgctcaataatggaacttcttggtttctaattgcg-3’
SEQ ID NO:41
Пример 2. Определение токсичности мутантов Cry1Ba
2
[00162] Активность мутантных белков Cry1Ba (описанных ниже) в отношении насекомых-вредителей, включающих кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), тростниковую огневку (Diatraea saccharalis), кукурузную юго-западную огневку (Diatraea grandiosella), хлопковую совку (Helicoverpa zea), соевую совку (Pseudoplusia includens), гусеницу совки рода Anticarsia (Anticarsia gemmatalis) и колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata), определяют с помощью способа заражения поверхности. Вкратце, искусственный рацион для конкретного вида наливают в 24-луночные планшеты для тканевой культуры или маленькие чашки Петри. Каждая лунка имеет площадь поверхности приблизительно 2 см. Жидкости, содержащие мутантные белки Cry1Ba, наносят на поверхность рациона в каждой лунке. После того, как жидкость абсорбируется и высыхает, испытуемые личинки помещаются в каждую лунку и затем планшет герметично закрывают. Активность сконструированного белка Cry1Ba сравнивают с нативным или Cry1Ba дикого типа и записывают в виде процента смертности или относительной активности.
Пример 3. Мутации в положении 150 в полноразмерном Cry1Ba.
[00163] Поскольку шесть нативных белков Cry1Ba отличаются только одной аминокислотой в альфа-спирали 4, например, 4/6 имеют тирозин (Y150) и 2/6 имеют гистидин (H150) (смотри Фигуру 1), то анализ начального мутагенеза исследовал влияние положения аминокислоты 150 в альфа-спирали 4 на инсектицидную активность полноразмерного Cry1Ba.
[00164] Нативную полноразмерную кодирующую последовательность cry1Ba (SEQ ID NO:1) клонировали в pUC18-полученный бифункциональный вектор Bt/E.coli под контролем Cry1Ac промотора. Используя эту полноразмерную кодирующую последовательность в качестве матрицы, мутантные белки Cry1Ba создавали путем случайного замещения тирозина (Tyr) в положении 150 на другие аминокислоты, используя QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, Ла-Хойя, Калифорния) согласно инструкциям производителя и праймеры YG152-YG157 Таблицы 1. Все мутантные белки Cry1Ba исследовали в отношении ЕСВ, используя способ, описанный в Примере 2.
[00165] Данные, представленные в Таблице 2, показывают, что положение 150 в полноразмерном белке Cry1Ba играет важную роль в модулировании по меньшей мере токсичности ЕСВ. Некоторые из мутаций снижали специфическую активность ЕСВ по сравнению с нативным Cry1Ba. Cry1Ab, белок с высокой специфической активностью в отношении ЕСВ, имеет аргинин (Arg) в положении, соответствующем Y150 последовательности Cry1Ba (положение 131 Cry1Ab последовательности; см. Фигуру 2А). Интересно, что Y150R мутант Cry1Ba имел только половину активности нативного белка Cry1Ba, используемого в эксперименте. Мутации, которые сохраняли или слегка увеличивали активность по сравнению с нативным Cry1Ba, включали Y150K, Y150F, Y150W и Y150P. Мутантные белки Cry1Ba, которые имели более низкую активность по сравнению с нативным Cry1Ba, были обозначены как вариантные белки Cry1Ba.
Таблица 2
Результаты биоанализа ЕСВ Cry1Ba-Y150X мутанта
Обозначение мутанта
Аминокислота в положении 150
Относительная смертность ЕСВ
М4
K
+++
М18
F
+++
М7
W
+++
М26
Р
+++
М12
Т
++
М14
L
++
М15
А
++
М23
V
++
М28
S
++
М38
R
+
М9
G
+
М24
D
+/-
Нативный Cry1Ba
Y
+++
Пустой вектор (контроль)
-
-
Пример 4. Токсичность укороченного Cry1Ba по сравнению с полноразмерным Cry1Ba
[00166] На основании того, что известно в данном уровне техники, не ясно, на какие точно протеолитические сайты в Cry1Ba направлены кишечные протеазы насекомых. Следовательно, последовательность активного токсина остается не ясной. Для этого примера сайты расщепления для протоксина Cry1Ba предсказали на основании выравнивания последовательностей с Cry1Ab (см. Фигуру 2), чьи сайты расщепления были установлены. Используя эту информацию, были сконструированы векторы, которые экспрессируют укороченные варианты Cry1Ba.
[00167] Укороченный фрагмент cry1Ba клонировали при помощи ПЦР в вектор pCIB5634 или рЕТ28а, используя полноразмерную нативную кодирующую последовательность cry1Ba (SEQ ID NO:1) в качестве матрицы и праймеры YG160 и YG162 или YG163 и YG166, соответственно. Полученный с помощью ПЦР фрагмент кодирует укороченный белок, содержащий аминокислоты 1-647 SEQ ID NO:2. Однако в ходе начального клонирования укороченной кодирующей последовательности cry1Ba в векторы вводили мутацию, посредством чего треонин в положении 2 (Т2) замещается на аланин (Ala; A) (T2A мутация). Определили, что эта T2A мутация не имеет негативного влияния на инсектицидную активность по сравнению с нативным Cry1Ba и, следовательно, ее использовали во всех последующих экспериментах с мутациями. Этот T2A мутант был обозначен Т25 Cry1Ba дикого типа.
[00168] Другой укороченный фрагмент cry1Ba клонировали при помощи ПЦР в вектор pCIB5634 или рЕТ28а, используя кодирующую последовательность Т25 в качестве матрицы и праймеры YG161 и YG162 или YG164 и YG166, соответственно. Полученный с помощью ПЦР фрагмент кодирует белок укороченный на N-конце и С-конце (SEQ ID NO:42), содержащий аминокислоты 22-647 SEQ ID NO:2 и был обозначен Т7.
[00169] Результаты вестерн-блоттинга показывают, что укороченный Т25 Cry1Ba (содержащий аминокислоты 1-647) как в pCIB5634, так и рЕТ28а векторах, был более стабильным, чем укороченный Т7 Cry1Ba-токсин в любом векторе. Результаты биоанализа (Таблица 3) показали, что Т25-токсин дикого типа был в 15 раз более активным, чем Т7-конструкт и в 3 раза более активным, чем полноразмерный белок Cry1Ba. Следовательно, дополнительные мутанты Cry1Ba были сконструированы с использованием укороченного Т25 Cry1Ba дикого типа.
Таблица 3
Активность укороченного по отношению к полноразмерному Cry1Ba в отношении ЕСВ
Клон
Аминокислоты
Активность относительно полноразмерного Cry1Ba
Т25
1-647
3,0
Т7
22-647
0,2
Клон
Аминокислоты
Активность относительно полноразмерного Cry1Ba
FL-Cry1Ba
1-1228
1,0
Контрольный вектор
-
0,0
Пример 5. Эффекты мутирования Y150 в укороченном Cry1Ba.
[00170] Мутации в положении аминокислоты 150, которые не уменьшали инсектицидную активность, включая Y150K, Y150F, Y150W и Y150P, полноразмерного белка Cry1Ba, испытывали в укороченном Т25 Cry1Ba-токсине. Y150K, Y150F, Y150W и Y150P мутации получали, как описано выше, используя праймеры YG152-YG157.
[00171] Создание этих мутаций в укороченном Т25 белке приводит к результатам, отличающимся от полноразмерного белка Cry1Ba. Например, мутация Y150P в укороченном Т25 токсине полностью сводит на нет активность ЕСВ. Однако такая же мутация в полноразмерном Cry1Ba не имела негативного влияния на активность ЕСВ (см. Пример 3). Удивительно, что все мутации, кроме мутации Y150K, снижали Т25 активность в отношении ЕСВ до некоторой степени (Таблица 4). Все известные нативные белки Cry1Ba имеют либо гистидин (Н), либо тирозин (Y) в положении 150. Мутация Y150K существенно изменяла биологические свойства мутанта eCry1Ba-Y150K по сравнению как с нативным Cry1Ba "Н150-типа", так и с нативным Cry1Ba "Y150-типа". Мутант Y150K был в 3 раза более активным, чем белок Cry1Ba с гистидином (His) в положении 150.
Таблица 4
Активность процессированных Y150X мутантов
Обозначение мутанта
Аминокислота в положении 150
Активность ЕСВ относительно Т25
ТМ9
Р
0,00
ТМ5
F
0,25
ТМ15
Н
0,58
ТМ27
W
0,75
ТМ2
K
1,60
Т25 (дикий тип)
Y
1,00
Пустой вектор (контроль)
-
0,00
[00172] Каждый из мутантных Т25 белков Cry1Ba был исследован на предмет его растворимости. Растворимость белков коррелировала с инсектицидной активностью. Например, белок eCry1Ba-Y150K был более растворимым, чем Т25-Cry1Ba дикого типа и любые другие мутантные белки. Следовательно, эти данные показывают, что изменение аминокислоты в положении 150 имеет большое влияние на растворимость и инсектицидную активность укороченного белка Cry1Ba. Например, мутирование тирозина (Tyr) в положении 150 до лизина (Lys) существенно повышает растворимость и специфическую активность укороченного Cry1Ba-токсина в отношении ЕСВ по сравнению с укороченным Cry1Ba-токсином (Т25) дикого типа. Белок eCry1Ba-Y150K (ТМ2) был использован для дополнительных экспериментов по мутационному анализу.
Пример 6. Конструирование и испытание дополнительных мутантов eCry1Ba
[00173] Cry1Ab имеет высокую специфическую активность в отношении ЕСВ. Следовательно, выравнивание последовательностей было проведено между Cry1Ab и Т25-белком Cry1Ba, чтобы помочь определить ключевые положения аминокислот в альфа-спирали 4 или 5, которые могут быть важными для активности или растворимости Cry1Ba. Выравнивание последовательностей между Cry1Ab и Cry1Ba показано на Фигуре 2. Сравнение структурных признаков Cry1Ab и Cry1Ba показано в Таблице 8 в Примере 10 ниже. Дополнительный мутационный анализ был проведен на определенных ключевых положениях аминокислот для определения того, будут ли мутации в дополнение к Y150K мутации дополнительно повышать специфическую активность этого белка eCry1Ba. TM2 кодирующую последовательность (SEQ ID NO:4) использовали в качестве матрицы для дополнительного сайт-направленного мутагенеза. Мутации были созданы, как описано выше, используя YG171-YG193 праймеры, перечисленные в Таблице 1.
[00174] Одиннадцать мутантов исследовали на предмет активности в отношении кукурузного мотылька. Таблица 5 показывает результаты биоанализов. Из 11 исследованных мутантов, две мутации, L189S и S199K, повышали специфическую активность мутанта TM2-Y150K в отношении ЕСВ, специфическая активность которой повысилась по меньшей мере в 3 раза по сравнению с Cry1Ba дикого типа (Т25). Они были обозначены как сконструированные белки Cry1Ba (eCry1Ba). Две мутации, V81W и M178S/A155S, имели такую же активность, что и TM2, и два мутанта, М178Р и R170S, имели меньшую активность, чем ТМ2. Эти мутанты классифицировали как вариантные белки Cry1Ba (vCry1Ba). Четыре мутации, V148E/A155D, A155K, A163K и A163K/L188P, полностью сводили на нет активность, указывая на то, что эти положения являются критическими для, по меньшей мере активности, в отношении ЕСВ.
Таблица 5
Активность мутантов ТМ2-Cry1Ba по сравнению с Cry1Ba дикого типа
Клон
Мутации
Относительная активность
SEQ ID NO:
Т25
Т2А (дикий тип)
1,0
SEQ ID NO:5
ТМ2
Y150K
2,0
SEQ ID NO:7
ТМ21
Y150K/V81W
1,0
SEQ ID NO:11
ТМ60
Y150K/V148E/A155D
0,0
-
ТМЗЗ
Y150K/L189S
3,0
SEQ ID NO:9
ТМ88
Y150K/M178S
2,0
SEQ ID NO:8
ТМ90
Y150K/M178S/A155S
1,0
SEQ ID NO:12
ТМ69
Y150K/M178P
0,5
SEQ ID NO:43
ТМ61
Y150K7R170S
0,5
SEQ ID NO:44
ТМ70
Y150K/A155K
0,0
-
ТМ78
Y150K/A163K
0,0
-
ТМ82
Y150K/A163K/L188P
0,0
-
ТМ83
Y150K/S199K
3,0
SEQ ID NO:10
Спектр белка eCry1Ba
[00175] Мутант ТМ33 (eCry1Ba-T2AY150KL189S) был исследован в отношении некоторых других чешуекрылых насекомых, включая тростниковую огневку (SCB; Diatraea saccharalis), кукурузную юго-западную огневку (SWCB; Diatraea grandiosella), хлопковую совку (CEW, Helicoverpa zed), гусеницу совки рода Anticarsia (VBC; Anticarsia gemmatalis) и соевую совку (SBL, Pseudoplusia includens, сейчас именуемая Chrysodeixis includens) с помощью биоанализов синтетического рациона на обработанной поверхности. Смертность личинок оценивали через приблизительно 4-6 дней, в зависимости от испытуемого вида насекомых.
[00176] Нативный Cry1Ba, как сообщалось, был активным в отношении тростниковой огневки, огневки кукурузной юго-западной и соевой совки и не обладал активностью в отношении гусеницы хлопковой совки. К тому же, некоторые публикации позволяют предположить, что штаммы Bt, содержащие белок Cry1B-типа, обладают активностью в отношении гусеницы совки рода Anticarsia (Bobrowski et al. 2001. Brazil. J. Microbol. 32:105-109), но из этой публикации не ясно, обусловлена ли эта активность белком Cry1Ba или некоторыми другими белками, экспрессируемыми в испытуемом штамме Bt. Другие публикации (например, Monnerat et al. 2007. Biological Control 41:291-295) показывают, что Cry 1B, присутствующий в штаммах Bt, вносит небольшой вклад в токсичность таких штаммов по отношению к личинкам VBC.
[00177] Результаты биоанализа мутанта eCry1Ba-T2AY150KL189S показали, что этот белок, как и нативный белок Cry1Ba, является активным в отношении тростниковой огневки, огневки кукурузной юго-западной и соевой совки. В отличие от нативного белка Cry1Ba, белок eCry1Ba был очень активным в отношении гусеницы бархатного боба. К удивлению, белок eCry1Ba также обладал некоторой активностью в отношении гусеницы хлопковой совки, насекомого, к которому нативный Cry1Ba не имеет активности. Активность белка eCry1Ba в отношении гусеницы бархатного боба и гусеницы хлопковой совки является другим указанием того, что eCry1Ba является, по существу, отличным от нативного белка Cry1Ba.
[00178] Поскольку нативный Cry1Ba, как известно, является активным в отношении как чешуекрылых, так и жесткокрылых насекомых, то белок eCry1Ba ТМ33 был исследован по отношению к жесткокрылому насекомому, колорадскому жуку (СРВ; Leptinotarsa decemlineata). Биоанализы проводили с использованием новорожденных личинок СРВ и стандартного анализа с использованием синтетического рациона, как описано выше в Примере 2. Как уже известно в данном уровне техники, нативный белок Cry1Ba был активным в отношении СРВ. Мутант Cry1Ba дикого типа, Т25, также был активным. К удивелнию Т33 белок eCry1Ba не был активным в отношении СРВ. Следовательно, хотя мутации в Т33 повышают специфическую активность в отношении, по меньшей мере, кукурузного мотылька, эти мутации выключали активность в отношении жесткокрылого насекомого, колорадского жука, что является еще одним указанием на то, что свойства белков eCry1Ba являются, по существу, отличными от нативных белков Cry1Ba и Cry1Ba дикого типа. С использованием этого подхода специалисту в данной области техники будет понятно, что мутация аминокислот в домене I, в частности, альфа-спирали 4 и альфа-спирали 5, Cry1Ba обеспечивает способ изменения спектра активности Cry1Ba.
[00179] Мутанты, описанные выше, были исследованы в отношении отличий в свойствах растворимости с использованием стандартных способов, известных в данном уровне техники. Вкратце, клеточный осадок после центрифугирования из индуцированных культур E.coli, экспрессирующих мутанты Cry1Ba и Cry1Ba дикого типа, были обработаны в реагенте для экстракции белка BugBuster™ (Novagen, Inc) ингибиторами протеазы и лизоназой согласно инструкциям производителя. Клеточные лизаты и растворимые фракции после центрифугирования клеточных лизатов были проанализированы на SDS-PAGE и вестерн-блоттинге с использованием антитела кролика к Cry1Ba и на вестерн-блоте количественно определили белок Cry1Ba с помощью AlphaImager (Cell Biosciences). Хотя мутант Cry1Ba и Т25 дикого типа показали сходный уровень экспрессии белка в клеточных лизатах, количество белка, присутствовавшего в растворимых фракциях, к удивлению, весьма различалось между мутантами и диким типом. Для сравнения растворимости мутантные белки Cry1Ba, присутствующие в растворимых фракциях, были нормализированы относительно Cry1Ba дикого типа. Результаты в Таблице 6 показывают, что мутанты eCry1Ba имели в диапазоне от 1,5 до 2,1 раз больше растворимого белка eCry1Ba, чем белка Cry1Ba Т25 дикого типа в том же количестве жидкости при таких же условиях окружающей среды. "SP" в Таблице 6 означает растворимый белок; и "ТР" означает общий белок.
Таблица 6
Сравнение растворимости белков eCry1Ba и белка Cry1Ba Т25 дикого типа
Клон
Мутации
Процент SP/TP
Степень увеличения по сравнению с диким типом (Т25)
Т25 (дикий тип)
Т2А
52
1,0
ТМ33
T2A, Y150K, L189S
76
1,5
ТМ2
T2A, Y150K
86
1,7
ТМ83
T2A, Y150K, S199K
107
2,1
Пример 7. Построение гена ecry1B, оптимизированного для маиса
[00180] Оптимизированная для маиса нуклеотидная последовательность (mocry1Ba-ТМ33), которая кодирует мутантный белок Cry1Ba ТМ33 (eCry1Ba-T2A:Y150K:L189S), была создана, как описано в патенте США №6051760, включенном в данный документ ссылкой. Кодирующая последовательность mocry1Ba-ТМ33 представлена в SEQ ID NO:13. Аминокислотная последовательность eCry1Ba-T2A:Y150K:L189S представлена в SED ID NO:9.
Пример 8. Трансгенный маис и сахарный тростник, экспрессирующие белок eCry1Ba
[00181] Два вектора трансформации растений сконструированы для введения кодирующей последовательности mocry1Ba-ТМ33 в маис: (а) первый вектор (18320), включающий две кассеты экспрессии, где первая кассета экспрессии содержит промотор убиквитина маиса (ZmUbiInt) (Christensen et al. 1992 PMB 18:675), функционально связанный с кодирующей последовательностью ТМ33, дополнительно функционально связанной с 3’ концевой последовательностью терминации транскрипции и полиаденилирования нопалинсинтазы, обозначенная как ZmUbi:mocry1Ba-TM33:NOS, и вторая кассета экспрессии содержит 35S:pat:NOS, и (b) второй вектор (18319), включающий две кассеты экспрессии, где первая кассета экспрессии содержит MTL промоторную последовательность (Патент США №6018099), функционально связанную с ТМЗЗ кодирующей последовательностью, дополнительно функционально связанной с 3’ концевой последовательностью терминации транскрипции и полиаденилирования нопалинсинтазы, обозначенная как MTL:mocry1Ba-TM33:NOS, и вторая кассета экспрессии содержит 35S:pat:NOS. Все векторы в этом примере содержат ген pat, кодирующий фосфинотрицин ацетилтрансферазу (PAT), которая придает устойчивость к гербициду фосфинотрицину для отбора трансгенных событий.
[00182] Оба вектора отдельно трансформируют в маис. Agrobacterium-трансформацию незрелых зародышей маиса проводят, главным образом, как описано в Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19:798-803. Для этого примера все компоненты сред являются, главным образом, такими, как описано в Negrotto et al., выше. Однако, различные компоненты сред, известные в данном уровне техники, могут быть заменены.
9
[00183] Вкратце, штамм Agrobacterium LBA4404 (pSB1), содержащий плазмиду для трансформации растений, выращивают на твердой среде, YEP (дрожжевой экстракт (5 г/л), пептон (10 г/л), NaCl (5 г/л), 15 г/л агара, рН 6,8), в течение 2-4 дней при 28°С. Приблизительно 0,8×10 Agrobacterium суспендируют в средах для инфицирования LS, дополненных 100 мкМ As (Negrotto et al., выше). Бактерии предварительно инкубируют в этой среде в течение 30-60 минут.
[00184] Незрелые зародыши из подходящего генотипа вырезают из 8-12 дневных початков в жидкую среду для инфицированя LS+100 мкМ As. Зародыши промывают один раз свежей средой для инфицирования. Затем добавляют раствор Agrobacterium и зародыши перемешивают на вортексе в течение 30 секунд и позволяют осесть с бактериями в течение 5 минут. Зародыши затем переносят вверх стороной щитка на среду LSAs и культивируют в темноте в течение двух-трех дней. После этого, от 20 до 25 зародышей на чашку Петри переносят в среду LSDc, дополненную цефотаксимом (250 мг/л) и нитратом серебра (1,6 мг/л) и культивируют в темноте при 28°С в течение 10 дней.
[00185] Незрелые зародыши, продуцирующие эмбриогенный каллюс, переносят на среду LSD1M0.5S. Культуры подвергают отбору на этой среде в течение около 6 недель с этапом пересева через приблизительно 3 недели. Выжившие каллюсы переносят на среду Reg1, дополненную маннозой. После культивирования при свете (режим 16 часов света / 8 часов темноты) зеленые ткани затем переносят на среду Reg2 без регуляторов роста и инкубируют в течение приблизительно 1-2 недель. Ростки переносят в ящики GA-7 Magenta (Magenta Corp, Чикаго, Иллинойс), содержащие среду Reg3 и выращивают при свете. Через примерно 2-3 недели растения исследуют на присутствие гена pat и кодирующей последовательности mocry1Ba-ТМ33. Положительные по результатам ПЦР анализа растения переносят в теплицу и исследуют на устойчивость, по меньшей мере, к мотыльку кукурузному.
Трансформация сахарного тростника
[00186] Вектор для трансформации растения (72581), содержащий две кассеты экспрессии, конструировали для введения кодирующей последовательности mocry1Ba-ТМ33 в сахарный тростник. Первая кассета экспрессии содержит промотор Ubi361 маиса (PCT/US10/37683), функционально связанный с кодирующей последовательностью ТМЗЗ, дополнительно функционально связанной с 3’ концевой последовательностью терминации транскрипции и полиаденилирования Ubi361 маиса (PCT/US10/37683), обозначенной как prZmUbi361-3:mocry1Ba-TM33:tZmUbi361. Вторая кассета экспрессии содержит промотор убиквитина маиса (ZmUbiInt) (Christensen et al. 1992 PMB 18:675), функционально связанный с кодирующей последовательностью pmi, дополнительно функционально связанной с 3’ концевой последовательностью терминации транскрипции и полиаденилирования нопалинсинтазы (nos). Кодирующая последовательность pmi кодирует фосфоманноза изомеразу (PMI), которая позволяет трансгенному сахарному тростнику утилизировать маннозу и функционирует как селективный маркер для трансформации. Вектор 72581 был трансформирован в сахарный тростник с применением Agrobacterium-трансформации. Трансгенные растения сахарного тростника исследовали в отношении новорожденной тростниковой огневки, как описано выше.
Пример 9. Инсектицидная активность трансгенных растений маиса и сахарного тростника
[00187] Отбирали образцы растений по мере их пересаживания из ящиков GA-7 Magenta в почву. Отбор образцов состоял в отрезании двух небольших кусочков листа (приблизительно 2-4 см в длину) и размещении каждого в небольшую чашку Петри или многолунковые планшеты. Отрицательными контролями были либо трансгенные растения, которые были ПЦР-отрицательными в отношении гена mocry1Ba-ТМ33 из того же эксперимента, либо из нетрансгенных растений (размера, сходного с испытуемыми растениями), которые выращивали в теплице или фитотроне.
[00188] Образцы листа от каждого растения заразили подходящим целевым насекомым-вредителем путем помещения приблизительно личинок первого возраста на каждый кусочек листа. Чашки Петри или многолунковые планшеты затем плотно закрыли.
[00189] Через приблизительно 3-4 дня после заражения собирали данные. Процент смертности личинок рассчитывали вместе с визуальной интенсивностью повреждения листа. Нарушение питания оценивают как высокое, умеренное, низкое или отсутствовало, и присваивают численное значение 3, 2, 1 или 0, соответственно. В таблицах ниже "+" указывает на то, что смертность была >80% и что повреждение листа было 0-1.
[00190] Результаты, показанные в Таблице 7, указывают на то, что трансгенные растения маиса, содержащие ген moTM33 и экспрессирующие мутантный белок eCry1Ba-T2A:Y150K:L189S, являются инсектицидными по меньшей мере к мотыльку кукурузному. Хотя оба конструкта давали трансгенные события, которые были очень активными в отношении по меньшей мере ЕСВ, как правило, трансгенные растения с промотором zmUbi, управляющим экспрессией кодирующей последовательности ТМ33, давали более высокие уровни белка eCry1Ba, чем трансгенные растения, содержащий промотор MTL. Концентрация белка eCry1Ba находилась в диапазоне от 460 до 681 мкг/мг растворимого белка для конструкта 18319 и от 509 до 2984 мкг/мг растворимого белка для конструкта 18320.
Таблица 7
Активность трансгенного маиса, экспрессирующего белки eCry1Ba
Конструкт
Событие маиса
Активность ЕСВ
Концентрация eCry1Ba (мкг/мг растворимого белка)
18319
9А
+
648
23А
+
676
38А
+
624
40А
+
460
52А
+
681
57А
+
618
18320
28А
+
1839
29В
+
2818
34С
+
2984
42А
+
1625
46А
+
1010
48В
+
509
[00191] Результаты, показанные в Таблице 8, указывают на то, что трансгенные растения сахарного тростника, экспрессирующие мутантный белок eCry1Ba-T2A:Y150K:L189S, являются инсектицидными по отношению к тростниковой огневке.
Таблица 8
Активность трансгенного сахарного тростника, экспрессирующего eCry1Ba и Vip3
Событие
SCB
72581-1А
+
72581-2А
+
72581-ЗА
+
72581-4А
+
72581-5А
-
Контроль
-
Пример 10. Структура белка Cry1Ba.
[00192] Таблица 9 показывает взаимоотношение между тремя доменами Cry1Ab и Cry1Ba с их соответственными вариабельными областями и консервативными блоками. Аминокислоты, содержащиеся в каждом домене, консервативном блоке и вариабельной области, показаны для обоих белков.
Таблица 9
Сравнение структуры Cry1Ab и Cry1Ba
ДОМЕН
УЧАСТОК
Cry1Ab (Фигура 2)
Cry1Ba (SEQ ID NO:2)
V1
1-32
1-47
I
V1
33-152
48-171
СВ1
153-182
172-201
V2
183-202
202-221
СВ2
203-254
222-270
II
255-269
271-288
V3
270-452
289-480
CB3
453-462
481-490
III
463-500
491-528
V4
501-520
529-548
СВ4
521-531
549-559
V5
532-596
560-624
СВ5
597-606
625-634
V6
607-610
635-638
Протоксин
611-1155
639-1228
[00193] Следует понимать, что примеры и варианты осуществления, описанные в данном документе, представлены лишь с иллюстративными целями, и что различные модификации или изменения в их свете могут быть предложены специалистам в данной области техники, и что они включены в сущность и область действия данной заявки и объем прилагаемой формулы изобретения.
[00194] Все публикации и патентные заявки, упомянутые в данном описании, являются указывающими на уровень квалификации специалистов в данной области техники, к которой относится данное изобретение. Все публикации и патентные заявки включены в данный документ ссылкой в той степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была в частности и отдельно указана как включенная с помощью ссылки.