СПОСОБ АНАЛИЗА ПРИМЕСЕЙ В ЖИДКОСТЯХ ИЛИ ГАЗАХ ПРИ ИХ МИКРОКАНАЛЬНОМ ИСТЕЧЕНИИ В ВАКУУМ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ СВЕРХЗВУКОВОГО ГАЗОВОГО ПОТОКА, СОДЕРЖАЩЕГО ИОНЫ И МЕТАСТАБИЛЬНО ВОЗБУЖДЁННЫЕ АТОМЫ, С ФОРМИРОВАНИЕМ И ТРАНСПОРТИРОВКОЙ АНАЛИЗИРУЕМЫХ ИОНОВ В РАДИОЧАСТОТНОЙ ЛИНЕЙНОЙ ЛОВУШКЕ, СОПРЯЖЁННОЙ С МАСС-АНАЛИЗАТОРОМ
METHOD FOR ANALYZING IMPURITIES IN LIQUIDS OR GASES DURING THEIR MICROCHANNEL OUTFLOW IN VACUUM UNDER SUPERSONIC GAS FLOW INFLUENCE CONTAINING IONS AND METASTABLE EXCITED ATOMS WITH FORMATION AND TRANSPORTATION OF ANALYZED IONS IN RF LINEAR TRAP LINKED TO MASS ANALYZER

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к методам и технике химического анализа примесных соединений и ионов в газовых смесях и в жидких растворах, в том числе многозарядных ионов биомолекул, при их экстракции из жидкости или образования анализируемых ионов под воздействием газового потока, содержащего ионы и метастабильно возбужденные атомы. Эти методы могут включать сочетание разделения анализируемых ионов по адсорбционной способности на стенках напускной камеры, а для ионов биомолекул и по изоэлектрической точке перед вводом раствора в канал микронного диаметра и по подвижности при движении внутри канала. Регистрация и анализ молекулярных ионов и их ионов-продуктов по отношениям массы к заряду может производиться с помощью время-пролетного масс-спектрометра с ортогональным вводом ионов (орто-ВПМС) либо на каком-либо другом масс-анализаторе. Характеризация пространственной структуры ионов биомолекул может достигаться на основе декомпозиции многомерных зарядовых распределений их регистрируемых ионов, обусловленных удерживанием различных совокупностей носителей заряда, присутствующих в растворе.
Среди задач, для которых кроме чувствительности важны как разделительная способность, так и динамический диапазон измерений, может быть упомянут экспресс-анализ микропримесей в газах, в воде и других жидкостях применительно к использованию в системах безопасности, таможенного и экологического контроля. Анализ газовых и жидких смесей различного происхождения в реальном масштабе времени может быть также важен для разнообразных приложений технологического, медицинского и иного характера.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
После разработки и создания в нашем институте первых время-пролетных масс-спектрометров с ортогональным вводом ионов (орто-ВПМС) [1,2] приборы этого типа получили широкое распространение при решении разнообразных аналитических и структурных задач [3-5]. Удобство сочленения таких приборов, в частности, с источником ионов на основе электрораспыления жидкостей обусловило их эффективное применение для исследования состава и структуры ионов различной природы, изначально присутствующих в растворе. В то же время существуют важные проблемы в том числе и при анализе жидких образцов, для которых применимость, чувствительность, разделительная способность и «информационная производительность» известных приборных комплексов, включающих в свой состав орто-ВПМС, оказываются недостаточными. Для преодоления этих ограничений естественным является стремление ввести в масс-спектрометрический эксперимент альтернативные методы получения ионов, их транспортировки в вакуумную часть прибора и использовать дополнительные размерности измерений, связанные с контролируемыми превращениями исследуемых ионов и регистрацией данных в процессе этих превращений.
Возможным методом экстракции ионов из жидкости, по крайней мере с точки зрения ожидаемой чувствительности анализа, является полевое испарение ионов. Несмотря на то что явление полевого испарения ионов исследуется давно [6,7], детали и условия перехода ионов из жидкой фазы в газовую остаются до сих пор недостаточно изученными. В частности, это относится к вопросу о влиянии заряда ионов на эффективность их выхода из жидкости в электрических полях. Основная масса работ по полевому испарению ионов связана с изучением механизма образования ионов при электрораспылении полярных растворов [8,9]. Однако существующие экспериментальные методы, использующие электрораспыление растворов, не позволяют получать информацию о первичных ионах, покидающих заряженные микрокапли.
Электрораспыление растворов наиболее широко используется в масс-спектрометрии тяжелых органических ионов [10]. Считается, что полевое испарение ионов является одним из главных механизмов, ответственных за выход относительно малых ионов при электрораспылении. В то же время механизм экстракции из жидкости больших многозарядных ионов до сих пор остается предметом обсуждения [11-14]. Можно ожидать, что для многозарядных ионов, имеющих сложное строение, вопрос об эффективности полевого испарения из растворов не имеет столь однозначного ответа.
Следует учесть еще одну важную особенность полевого испарения ионов из жидкостей, а именно то, что границу раздела фаз преодолевает не изолированный ион, а ионный кластер, в состав которого входит несколько полярных молекул жидкости [8,9,15]. Это обстоятельство обычно затрудняет решение аналитических задач. Поэтому желательной является декластеризация исследуемых ионов перед их вводом в масс-анализатор.
Впервые возможность создания условий для прямого полевого испарения ионов из полярных растворов без его разбрызгивания была продемонстрирована в [16,17]. Стабилизация поверхности жидкости в сильном электрическом поле обеспечивалась за счет того, что содержащий ионы раствор, помещался в каналы полимерной трековой мембраны, диаметр которых составлял несколько десятков нанометров. Впоследствии было показано, что в стационарных условиях сильное локальное электрическое поле, способное стимулировать эффективный выход ионов из полярной жидкости, создается благодаря зарядке поверхности диэлектрической мембраны. Эта методика экстракции ионов из растворов имеет ряд существенных недостатков, ограничивающих ее использование, в частности, в аналитических приложениях.
Один из способов преодоления этих трудностей описан в патенте РФ на изобретение [18]. Основная идея этого подхода состоит в использовании импульсов электрического поля с длительностью, достаточной для экстракции относительно легких ионов из жидкости, но неспособных привести к существенному перемещению и вытеканию жидкости из каналов мембраны.
Воздействие на поверхность мембраны сверхзвукового газового потока, особенно при содержании в нем метастабильно возбужденных атомов, как описано в нашей заявке на изобретение [19], может также позволить преодолеть описанные трудности. Кроме этого ионы могут быть образованы из нейтральных молекул раствора, а изначально ионизированные соединения в растворе подвергнуты трансформации воздействием метастабильно возбужденных атомов, что может расширить аналитические возможности такого подхода. Описанный в этой заявке способ анализа является прототипом настоящего изобретения. Его основные недостатки связаны именно с использованием трековой мембраны, наноразмерные каналы которой в реальных условиях не способны к длительной работе. Это приводит к необходимости достаточно частой замены мембраны в описанном источнике. Кроме этого размещение мембраны на некотором удалении от радиочастотного квадруполя должно приводить к заметным потерям анализируемых ионов. Использование капилляров с каналом микронного размера, характерных для наноспрейных ионных источников, как предлагается в настоящем изобретении, и их введение внутрь радиочастотного квадруполя позволит в значительной степени снять эти проблемы.
В последние 20 лет широкое распространение в масс-спектрометрии получили газонаполненные радиочастотные мультиполи, устройства, содержащие набор параллельных друг другу стержней, симметрично расположенных вокруг оси устройства. Сдвинутые по фазе радиочастотные напряжения подаются на соседние стержни. Эти устройства обычно используются как средства фокусировки и эффективной транспортировки ионов или для накопления ионов (в этом случае они называются линейными радиочастотными ловушками или линейными ионными ловушками) с возможной изоляцией выбранных ионов и проведением контролируемой диссоциации и других структурных превращений [20-22]. В этих устройствах используется описанное еще в Механике Ландау и Лифшица [23] свойство высокочастотных силовых полей вызывать выталкивание частиц в таких полях в сторону уменьшения напряженности этих полей. Если говорить более точно, то усредненное движение частиц в таких полях описывается в первом приближении эффективным потенциалом, прямо пропорциональным квадрату напряженности высокочастотного электрического поля, умноженной на квадрат заряда частицы, и обратно пропорциональным массе частицы. Для частного случая идеального радиочастотного квадруполя эффективный потенциал квадратично зависит от обеих координат (в прямоугольной системе координат в плоскости, ортогональной оси квадруполя), достигая минимального значения на оси квадруполя. Усредненное свободное движение ионов в таком поле (при отсутствии других внешних полей, столкновений с молекулами остаточных газов и в пренебрежении ион-ионными взаимодействиями) - независимые гармонические колебания по обеим координатам. В этих устройствах, используемых как ионные накопители и реакторы, два важных в этом случае свойства - способность к накоплению ионов и способность разделять эти ионы могут вступать в противоречие друг с другом. Для того чтобы эффективно останавливать ионы внутри мультиполя, обычно нужна достаточно высокая плотность газа, а для высокой селективности изоляции выбранных ионов или возбуждения резонансных осцилляций ионов и их разогрева (для проведения фрагментации и других превращений) плотность газа должна быть относительно мала.
Один из возможных подходов для преодоления этого противоречия путем создания мало расходящегося сверхзвукового газового потока [24], направленного вдоль оси мультиполя и создающего повышенную плотность газа около этой оси, описан в наших патентах РФ [25-27]. При использовании многоканального сверхзвукового потока, направленного вдоль образующих слабо расходящегося клина, как описано в нашей заявке на патент РФ [28] чувствительность может быть заметно выше, чем при одноканальном таком же потоке. При этом время пребывания ионов внутри потока в многоканальном случае может быть существенно уменьшено, и в конце квадруполя анализируемые ионы могут быть сфокусированы вблизи оси радиочастотного квадруполя, где плотность газа будет близка к остаточной плотности. Таким образом, проблема экстракции ионов из газового потока, критичная при его распространении вдоль оси квадруполя, также практически может быть снята.
Программное обеспечение для анализа экспериментальных данных должно включать пакеты программ, реализующие в основных чертах разработанные нами оригинальные методы, описанные в [29-33]. Среди этих методов наиболее важными являются:
1. Метод коррекции эффектов насыщения и «мертвого» времени при использовании время-цифрового преобразования для регистрации данных ВПМС [31];
2. Метод выявления целевых соединений на основе селективной цифровой фильтрации серий масс-спектров, зарегистрированных для специфически меняющихся во времени потоков компонент анализируемой смеси [30];
3. Метод выявления экспоненциальных вкладов в совокупности кривых ионного тока, развитый ранее для анализа совокупности эффузиометрических кривых [32].
Использование дозвукового потока, проходящего через зону тлеющего разряда, для ионизации соосного потока исследуемой газовой пробы на входе в радиочастотный квадруполь описано в [34]. Давление газа в области ионизации этой пробы составляет от 0.03 до 3 миллибар, что, по крайней мере, в несколько сот раз превышает остаточное давление газа в квадруполе в нашем случае. Сечение области ионизации в нашем случае примерно в 25 меньше при сравнимой плотности газа в области ионизации, которая в нашем случае находится не на входе, а внутри квадруполя. Следует ожидать существенного повышения чувствительности анализа в нашем случае и уменьшения нагрузки на систему откачки.
Динамические методы захвата ионов в квадрупольную ловушку, когда обратный выход ионов запирается включением соответствующего потенциала (например, на входной диафрагме квадруполя) до момента возврата запущенного пакета ионов от точки разворота, позволяют использовать только небольшую часть исходного потока ионов, если последующие манипуляции с ионами требуют относительно большого времени. Исходный поток ионов должен быть заперт на это время, и соответствующие ионы обычно теряются.
Использование вращательного поля для селективной диссоциации накопленных в квадрупольной линейной ловушке ионов при столкновении с атомами или молекулами буферного газа описано в патенте США №7,351,965 В2 [35]. Регистрацию ионов-продуктов, также удаление нежелательных ионов предлагается производить через щели вдоль вершин основных электродов гиперболической формы. Нарушения квадрупольного поля вблизи этих щелей предлагается компенсировать с помощью тонких электродов, расположенных вдоль щелей посередине на выходе из них. При проведении диссоциации предлагается намеренно искажать квадрупольное поле заданием потенциалов на этих вспомогательных электродах, отличных от потенциалов основных электродов. Это полезно делать для смещения резонансных частот сильно раскрученных ионов для предотвращения их гибели на электродах квадруполя. В рассматриваемом патенте [35] предлагается производить захват ионов в ловушку динамически, поднимая напряжение на входной диафрагме, т.к. давление буферного газа в квадруполе недостаточно, чтобы остановить ионы, отраженные от запирающего потенциала на последней секции квадруполя. В этом случае в ловушке остаются ионы, совершившие отражение от этого потенциала и не успевшие выйти назад через выходную диафрагму квадруполя до установления на ней запирающего напряжения. В патенте [35] для обеспечения улавливания достаточно большого числа анализируемых ионов предполагается использование относительно длинного квадруполя (1000 мм). Такая длина не только увеличивает габариты прибора, но и предъявляет более жесткие требования к параллельности стержней квадруполя и соблюдению других условий его изготовления для обеспечения однородности резонансных частот свободных движений ионов в разных местах квадруполя. Предлагаемый в настоящем изобретении метод накопления ионов, как ожидается, позволит накапливать достаточное число ионов в квадруполе, на порядок менее длинном, при сравнимом остаточном давлении буферного газа.
Стандартным методом оценки сечений столкновений ионов, движущихся в газе, является та или иная разновидность измерения подвижности иона или коэффициента пропорциональности между стационарной скоростью иона и напряженностью электрического поля, вызывающего это движение. Часто это движение используется для предварительного разделения ионов. Поскольку в обычных вариантах реализации метода время движения ионов в дрейфовой трубе относительно невелико, наиболее приемлемым оказывается сочетание разделения ионов по подвижности с время-пролетным анализатором с ортогональным вводом ионов.
Серьезной проблемой такого сочетания является обеспечение высокой трансмиссии ионов через дрейфовую трубу в ВПМС. Одно из возможных решений было предложено нами в патенте США №6,992,284 [36], где приведен достаточно подробный обзор работ по разделению ионов по подвижности. В патенте 6,992,284 речь идет об использовании в дрейфовой трубе при давлении буферного газа в несколько Торр вместо однородного электрического поля последовательности чередующихся участков сильного и слабого поля. Это приводит к фокусировке ионов к оси квадруполя и позволяет несколько увеличить общее напряжение вдоль трубы, что благоприятно сказывается на разрешении пакетов ионов по подвижности. Все же во всех реализованных вариантах разделения ионов по подвижности достаточно высокого разрешения получить не удается. Даже для дрейфа ионов при атмосферном давлении не достигается разрешения более 100.
В предлагаемом изобретении подвижность ионов в их разделении реализуется при истечении раствора через капилляр после скачкообразного изменения направления электрического поля в капилляре. По существу, это некоторый вариант капиллярного электрофореза. Как и при движении в газе, подвижность иона здесь определяется отношением его заряда к сечению столкновений. Особенность состоит в том, что в растворе заряд иона может изменяться в зависимости от свойств раствора, в частности его рН. Для ионов биомолекул он даже может менять свой знак, а в изоэлектрической точке (при соответствующем значении рН раствора) он в среднем равен 0. Проводя такой капиллярный электрофорез при различных значениях рН раствора, можно реализовать фактически двумерное предварительное разделение компонент анализируемого раствора, включающее в себя и разделение по изоэлектрическим точкам.
Обычно для изоэлектрического разделения и фокусировки отдельных фракций смесей биополимеров используют электролиты, локально неоднородные по величине рН. Двигаясь под действием приложенного электрического поля, чаще всего близкого к однородному, ионы биомолекул, достигая зон с рН, близким к их изоэлектрическим точкам, перестают двигаться и накапливаются в этих зонах. Такой способ разделения не слишком хорошо приспособлен для сочетания с масс-спектрометрическим детектированием разделенных фракций. В работе Р.А. Зубарева с сотрудниками [37] описана конструкция устройства для изоэлектрической фокусировки и разделения смесей пептидов и белков, работающего в сопряжении с масс-спектрометром с ионным источником на основе электрораспыления растворов. В их же следующей работе [38] описан усовершенствованный вариант, такого устройства, предназначенный для собирания разделенных фракций. Принцип работы близок к только что описанному. Сама конструкция представляется достаточно сложной. Капилляр, в котором организуется изоэлектрическое фракционирование ионов, разделен на 8 секций. В них концентрируются биомолекулы с соответствующими изоэлектрическими точками в течение периода изоэлектрической фокусировки, когда в капилляре создано электрическое поле, направленное против потока в ионный источник. Секции контактируют с соответствующими буферными растворами через мембраны из нафиона. При выключенном поле потоком раствора накопленные пакеты ионов последовательно попадают в ионный источник и далее в масс-анализатор.
В предлагаемом нами капиллярном ионном источнике создаются поля противоположной направленности в напускной камере источника и внутри капилляра. Такие поля пропускают через капилляр только в среднем нейтральные ионы, изоэлектрическая точка которых совпадает с рН раствора. Меняя этот рН постепенным или одномоментным добавлением буферного раствора, можно обеспечивать выход в зону формирования анализируемых ионов биомолекул с различными значениями их изоэлектрической точки.
В Патенте США №7397029 от 8 июля 2008 г., В.Д. Беркута и В.М. Дорошенко [39], описан способ возбуждения фрагментации ионов метастабильно возбужденными частицами (атомами или молекулами). Выделение исходных ионов производится с помощью первичного масс-спектрометра, при этом они накапливаются в трехмерной или линейной ионной ловушке или движутся в транспортном мультиполе. Предусмотрена возможность дополнительного возбуждения исходных ионов или ионов-продуктов приложением переменного электрического поля с получением вторичных ионов-продуктов за счет столкновительной активации. Все эти получающиеся ионы регистрируются вторичным масс-спектрометром. Метастабильные атомы и молекулы предполагается получать с помощью газового разряда. Их ввод внутрь ионной ловушки предполагается производить по направлению, перпендикулярному оси ловушки.
В нашем случае метастабильные атомы или молекулы могут получаться в ионном источнике электронной ионизации в сверхзвуковом газовом потоке, и их плотность в потоке и распределение по энергиям возбуждения может регулироваться изменением потока или энергии ионизирующих электронов. Более того при использовании смеси инертных газов в качестве буферного газа изменением энергии электронов может достигаться изменение состава метастабильных атомов, что может позволить производить селективную ионизацию компонент анализируемого образца без изменения состава буферного газа.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Особенностями возможной реализации предлагаемых методов являются: Поток исследуемых ионов - это результат экстракции ионов из жидкой пробы, выходящей из капилляра, введенного внутрь радиочастотного квадруполя, либо такие ионы получаются из молекул анализируемых соединений в газовой фазе за счет перезарядки на ионах буферного газа или ионизации Пенинга на метастабильных атомах сверхзвукового газового потока. Экстракция ионов стимулируется воздействием «подогретого» сверхзвукового газового потока на поверхность выходящей жидкости. Для обеспечения большей эффективности использования этого потока для формирования анализируемых ионов капилляр вставлен внутрь канала большего диаметра так, что выходной кончик капилляра близок, но не выходит за окончание канала. На некотором протяжении до выхода капилляра имеется зазор между капилляром и внутренней стенкой канала. Выход из канала выполнен так, что сверхзвуковой поток, направленный на выход капилляра, основной своей частью попадает внутрь канала. На входном конце зазор между каналом и капилляром заполнен непроницаемым связующим материалом. Метастабильные атомы и ионы в упомянутом потоке образуются либо в высокочастотном газовом разряде, организуемом на выходе канала формирования сверхзвукового газового потока, либо этот поток пропускается через источник электронной ионизации с изменяемой кинетической энергией электронов. Струя сверхзвукового потока направлена на выходной кончик капилляра и проходит вблизи центра входной диафрагмы в этот квадруполь. Просачивание жидкости через капилляр обуславливается давлением насыщенного пара в напускной камере, содержащей анализируемый раствор, или специально организуемым перепадом давления. Выход газовой смеси через капилляр обеспечивается перепадом давления вдоль капилляра, которое поддерживается постоянным. Анализируемая газовая смесь вводится в напускную камеру однократно, либо непрерывно с помощью шприца. Для обеспечения постоянной скорости истечения газа через капилляр при однократном вводе газовой смеси в напускную камеру капиллярного ионного источника непрерывно вводится буферный газ при постоянном, например, атмосферном давлении. Скорость просачивания жидкой пробы может также регулироваться изменением температуры напускной камеры, создающим соответственное давление насыщенных паров в этой камере, содержащей анализируемый раствор.
Подогрев напускной камеры при анализе газовых смесей также играет важную роль. Переход к более высокой температуре этой камеры может приводить к наблюдению релаксационных процессов, которые будут нести дополнительную аналитическую информацию об анализируемых соединениях. Более высокая температура вызовет увеличение потока газа через выходной капилляр. Это приведет к первоначальному увеличению регистрируемого сигнала от ионизированных компонент газовой смеси. Следствием этого будет перераспределение плотности примесных соединений внутри напускной камеры и последующий релаксационное затухание этих сигналов с характеристическими временами, специфичными для различных соединений. Характеристические времена релаксации интенсивностей пиков ионов, соответствующих определенному соединению, будут определяться величиной коэффициента диффузии этого соединения и адсорбционной способностью этого соединения на стенках напускной камеры. Регистрация релаксационных кривых возможна также при уменьшении температуры напускной камеры.
Нарастание или снижение температуры в напускной камере требует заметного времени, а релаксационное затухание ионных токов будет происходить после установления нового уровня температуры. Ионные токи, соответствующие определенным соединениям, будут при последовательной регистрации выглядеть как унимодальные пики, форма которых будет специфичной для разных соединений при данных условиях измерений. Выявление таких пиков для целевых соединений в анализируемой смеси может быть проведено на основе нашего метода селективной цифровой фильтрации по известным масс-спектрам этих соединений [30]. Совпадение полученной формы пика с ожидаемой для данного целевого соединения будет критерием его обнаружения, а площадь этого пика будет определять относительное содержание этого соединения в анализируемой смеси. Для количественного определения этого содержания желательно предварительное проведение соответствующих калибровочных измерений, когда искомые целевые соединения добавляются в анализируемую смесь в известных концентрациях.
Для экспоненциально затухающих «хвостов» полученных распределений ионных токов с различными значениями miz может быть найдена наилучшая в среднеквадратичном матрица перехода от предыдущей совокупности значений упомянутых ионных токов к последующей такой совокупности. Вычислив собственные числа и собственные векторы полученной матрицы перехода, находим приемлемую по ожидаемой погрешности аппроксимацию упомянутых «хвостов» распределений линейной комбинацией минимального числа упомянутых собственных векторов с факторами экспоненциального затухания, определяемыми соответствующими собственными числами. Принимаем найденную совокупность таких собственных векторов за масс-спектры обнаруженных компонент в рассматриваемой совокупности данных, а вычисленные коэффициенты упомянутой линейной комбинации за приближенные оценки относительных вкладов этих компонент в анализируемую смесь. Эти оценки могут быть протестированы и уточнены путем проведения соответствующих калибровочных экспериментов.
После прохождения источника электронной ионизации или зоны газового разряда струя сверхзвукового газового потока вместе с ионами и с метастабильно возбужденными атомами буферного газа поступает внутрь радиочастотного квадруполя. Организованное в первой половине квадруполя тормозящее продольное поле, сочетающееся с относительно плотным газовым потоком приводит к накоплению значительного числа ионов буферного газа в этой половине квадруполя вокруг его оси. Эффективная температура этого облака ионов, как показывают проведенные нами измерения, может быть достаточно высокой (около 6000 K). Эту температуру можно еще значительно увеличить за счет вынужденных осцилляций или вращений ионов. При этом следует ожидать эффективного испарения и дробления капель раствора, выходящих из капилляра. Это будет происходить как за счет передачи энергии от осциллирующих «нагретых» ионов ионам на поверхности капли, так и их вхождения внутрь капли и увеличения плотности зарядов на этой поверхности. Эти капли, пройдя сквозь облако осциллирующих ионов буферного газа и расталкиваясь далее объемным зарядом этих ионов, будут частично подхватываться струями газового потока. Поскольку их подвижность существенно меньше подвижности ионов буферного газа, они будут сильнее увлекаться газовым потоком и более эффективно выводиться во вторую половину квадруполя.
Если в этой половине радиочастотное напряжение существенно больше, чем в первой, и выбрано оптимальным для фокусировки относительно больших ионов биомолекул, то ионы буферного газа будут гибнуть здесь на стержнях квадруполя. Анализируемые ионы, вышедшие из заряженных капель будут фокусироваться к оси квадруполя. При отсутствии продольного поля в этой половине квадруполя и наличии достаточно плотного облака накопленных ионов буферного газа в первой половине квадруполя возникнет электрическое поле, препятствующее возврату анализируемых ионов в первую половину квадруполя, и эти ионы будут накапливаться около оси квадруполя. Под действием их объемного заряда избыточная часть таких ионов будет выводиться через выходную диафрагму квадруполя в масс-анализатор. При этом недоиспарившиеся капли, обладая существенно большими значениями m/z, чем анализируемые ионы, тем же объемным зарядом будут выталкиваться на относительно большие удаления от оси квадруполя. Эти капли тем самым будут подвержены действию отталкивающего поля выходной диафрагмы квадруполя. Удерживаясь внутри квадруполя, эти капли будут нагреваться воздействием радиочастотного поля квадруполя и высоэнергичными малыми ионами, покидающими эти капли, и в конечном итоге высвобождать содержащиеся в них анализируемые ионы, которые после их фокусировки к оси и будут зарегистрированы в масс-анализаторе.
После выхода из квадруполя ионный пучок вводится в последующий масс-анализатор с помощью соосного конического или клинообразного скиммера с входным отверстием или щелью на его вершине. При этом большая часть газового потока рассеивается внешней поверхностью скиммера и поступает в первую ступень дифференциальной откачки.
-4
Особенности и преимущества предлагаемого подхода являются следствием малой расходимости сверхзвукового газового потока, выходящего из относительно тонкого и длинного канала с пониженным (по сравнению с атмосферным) давлением газа на их входе. При этом длина свободного пробега молекул основного компонента газового потока сравнима с диаметром канала. Можно подобрать условия формирования упомянутого потока, так чтобы в радиочастотном квадруполе плотность газа около его оси практически не отличалась от плотности остаточных газов на периферии радиочастотного квадруполя. Эта плотность для эффективного функционирования источника электронной ионизации должна быть достаточно мала, соответствуя давлению при комнатной температуре 10 Торр и менее. Таким образом, движение ионов вблизи оси квадруполя будет таким же, как в обычном квадруполе при такой же плотности остаточных газов. Разница будет в том, что относительно энергичные собственные колебания ионов в направлении смещения газовой струи будут значительно быстрее погашены газовым потоком в начале квадруполя. Тем самым будут обеспечены более благоприятные условия для регистрации масс-спектров исследуемого образца по сравнению с квадруполем вакуумным, газонаполненным квадруполем (меньший поток газа в масс-анализатор) или при наличии сверхзвуковой газовой струи вдоль его оси (больший поток ионов в масс-анализатор).
Если в напускной камере, содержащей анализируемый раствор, и внутри капилляра его истечения отсутствуют электрические поля, то будет регистрироваться обзорный масс-спектр в выбранном диапазоне m/z для данных условий ионизации. Если же в этой камере на поверхности вокруг входа в капилляр создать достаточно сильное напряжение при близком к 0 потенциале поверхности раствора, то около этого капилляра будут накапливаться ионы соответствующего знака заряда, а внутрь капилляра будут преимущественно поступать в среднем нейтральные молекулы из раствора. В том числе это могут быть биомолекулы, изоэлектрическая точка которых близка к рН раствора. Такая ситуация является следствием возникновения в капилляре поля обратной направленности из-за относительно небольшого потенциала на выходе капилляра, обусловленного контактом с облаком накопленных ионов буферного газа в квадруполе.
Переключением полярности запирающего напряжения часть накопленных ионов на входе в капилляр будет запущена внутрь капилляра. В соответствии с их подвижностью под действием электрического поля внутри капилляра эти ионы будут двигаться с разными скоростями и виде разделенных по времени выхода пакетов будут зарегистрированы масс-анализатором. После выхода последнего пакета будет продолжена регистрация квазинейтральных молекул. При выходе раствора из капилляра квазинейтральные молекулы могут изменить свое зарядовое состояние из-за проникновения ионов буферного газа внутрь раствора, и они смогут быть зарегистрированы в конечном итоге в масс-анализаторе. Для предотвращения электролиза анализируемого раствора на электродах капиллярного ионного источника эти электроды могут быть покрыты тонкой диэлектрической пленкой.
Если в анализируемый раствор была добавлена в подходящей концентрации соль щелочного металла, например, ацетат натрия, то могут наблюдаться двумерные зарядовые распределения многозарядных ионов биомолекул по числу удерживаемых этими ионами протонов и в данном случае ионов натрия. Используя развитую нами методику декомпозиции таких зарядовых распределений [33,40] можно определить вероятности удерживания различных носителей заряда отдельными ионогенными группами биомолекул. Если измерять рН основного раствора и концентрацию ионов натрия в нем, то получив вероятности удерживания протона и ионов натрия некоторыми сайтами биомолекул при различных рН или концентрациях ионов натрия, можно оценить отношения соответствующих констант равновесия для этих сайтов. Совокупность таких оценок может характеризовать пространственную структуру биомолекулы в растворе и практически не зависеть от изменения состава и вида ионов при переходе в газовую фазу и от их различных дискриминаций при их транспортировке и регистрации.
При значимом изменении рН раствора, например, при добавлении соответствующего буферного раствора, может измениться состав квазинейтральных молекул движущихся в каналах вместе с раствором. Т.е. фактически возможно разделение биомолекул в растворе по их изоэлектрическим точкам. В сочетании с описанным выше разделением ионов по подвижности на выходе из каналов это является важным преимуществом настоящего изобретения.
При анализе нейтральных микропримесей как в жидкой, так и газовой среде производится их детектирование в виде ионов, образовавшихся в газовой фазе под действием метастабильных атомов и ионов сверхзвукового газового потока. Здесь возможно некоторое дополнительное разделение анализируемых микропримесей при изменении энергии ионизирующих электронов в ионном источнике электронной ионизации. Для этого в качестве буферного газа при формировании сверхзвукового потока можно, например, использовать смесь инертных газов с близкими концентрациями: Не, Ne, Ar, Хе. Энергии ионизации этих газов и образования их метастабильно возбужденных атомов меняются в диапазоне около 10 эВ и покрывают разброс возможных энергий ионизации большинства известных соединений. Переход от одной энергии электронов к другой для интервала, специфичного для данного целевого соединения, может позволить выделить ионы, образованные из этого соединения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАЦИЙ
Для более полного понимания настоящего изобретения последующее описание соотнесено с соответствующими иллюстрациями.
Рис. 1. Общая схема газодинамического интерфейса орто-ВПМС с микроканальным ионным источником и сверхзвуковым газовым.
Рис. 2. Иллюстрация к предварительному разделению заряженных и квазинейтральных частиц в микроканальном ионном источнике.
Рис. 2а. Особенности функционирования микроканального ионного источника при анализе нейтральных примесей в жидкостях.
Рис. 3. Схематический вид поперечного сечения В-В, Рис. 1, интерфейса в расположении области доиспарения заряженных капель и декластеризации анализируемых ионов.
Рис. 4. Экспериментальные зависимости регистрируемых ионных токов для молекулярных и двух фрагментарных ионов циклогексана (2% примеси в гелии) от радиочастотного напряжения в квадруполе для комнатной (25°С) и увеличенной (100°С) начальной температуры газового потока.
Рис. 5. Экспериментальные зависимости регистрируемых ионных токов и их отношений для молекулярных и двух фрагментарных ионов циклогексана (2% примеси в аргоне) от осциллирующего напряжения для существующего интерфейса со смещенной сверхзвуковой газовой струей при радиочастотном квадрупольном напряжении, превышающем порог прохождения этих фрагментарных ионов через интерфейс.
Рис. 6. Аррениусовская аппроксимация относительной интенсивности фрагментов осциллирующих ионов циклогексана при среднем удалении от сверхзвуковой струи аргона около 1 мм при найденной оптимальной температуре накопленных в квадруполе молекулярных ионов циклогексана в ~6000 K.
Рис. 7. Экспериментальные зависимости регистрируемых ионных токов и их отношений для молекулярных и двух фрагментарных ионов циклогексана (2% примеси в гелии) от осциллирующего напряжения для существующего интерфейса со смещенной сверхзвуковой газовой струей при радиочастотном квадрупольном напряжении, превышающем порог прохождения этих фрагментарных ионов через интерфейс.
Рис. 8. Иллюстрация к формированию многомерных релаксационных данных.
вх
вх
вх
вх
2
Рис 9. Зависимость потока Q смеси 2% Хе в Ar через капилляр от давления р на входе капилляра: точки - экспериментальные данные, сплошная кривая - аппроксимация квадратичной функцией: Q≈а⋅р.
Все эти иллюстрации носят поясняющий характер и не накладывают каких-либо ограничений на возможную реализацию предлагаемого изобретения.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Новый подход для транспортировки ионов из области повышенного давления на выходе из ячейки подвижности в вакуумную часть масс-спектрометра с помощью сверхзвукового газового потока описан в нашем патенте США №7,482,582 от 27 января 2009 года [42]. Он был развит далее для обеспечения дополнительных аналитических возможностей за счет резонансного возбуждения вращения ионов [43] вокруг сверхзвукового потока в следующем нашем патенте США №7,547,878 от 16 июня 2009 года [44]. Специфическое развитие этих подходов для обеспечения эффективного количественного определения наличия примесей в газовых смесях и структурного анализа многозарядных ионов биомолекул описано в наших патентах РФ [25-27]. Реализация нового варианта накопления и изоляции анализируемых ионов из источника электронной ионизации в радиочастотном квадруполе, основанного на использовании внеосевого многоканального сверхзвукового потока описана в нашей заявке на патент РФ [28]. Струи этого потока направлены вдоль образующих расходящегося клина с осью симметрии, направленной вдоль оси радиочастотного квадруполя. В этом случае в отличие от описанного в патенте РФ [27] варианта ортогонального вывода ионов в масс-анализатор имеется возможность эффективного соосного сопряжения масс-анализатора с газодинамическим интерфейсом.
В настоящем изобретении струя сверхзвукового газового потока (5) из канала (4), Рис. 1, направлена на выходной кончик капилляра (89), проходя вблизи средней точки входной диафрагмы (8-9). Воздействием атомов (в том числе метастабильно возбужденных) и ионов из струи (5) на выходящий мениск (91) анализируемого раствора из капилляра (89) микроканального источника (82) стимулируется образование капель раствора и испарение растворителя. Чтобы более полно использовать для этих целей энергию струи (5) капилляр (89) помещен внутрь цилиндрического канала (84) так, что имеется некоторый зазор (210), Рис. 2, между внешней стенкой капилляра (89) на некотором его протяжении перед выходным концом капилляра и внутренней стенкой канала (84). В зоне близкой к входной стороне капилляра (89) зазор (210) заполнен непроницаемым связующим материалом (211). Выходное отверстие канала (84) выполнено так, чтобы основная часть струи (5) попадала внутрь зазора (210). Встретив препятствия внутри зазора струя (5) хаотизируется, образуя расходящийся поток (209) со средним направлением, близким к направлению навстречу струе (5), способствуя выходу и испарению раствора из капилляра.
r
H2O
Проведем необходимые оценки при просачивании водных растворов через канал диаметром 10μ, длиной 1.5 см. Средняя тепловая скорость молекул воды при комнатной температуре - T=293 K (k - постоянная Больцмана, M - молекул воды) равна:
sat
-3
Давление насыщенного пара воды при комнатной температуре - ~18 Торр, эквивалентная плотность - n, радиус канала r=0.5⋅10 см. Скорость испарения жидкости равна скорости конденсации в условиях равновесия:
-4
3
4
2
2
- из канала 10μ диам. Поток газа в нашей системе при остаточном давлении в интерфейсе 10 Торр - 0,75 sccm ≈9,5 см Торр/с. Таким образом, поток паров воды из канала при комнатной температуре на ~2% увеличит остаточное давление в интерфейсе. Поток жидкости (масса в секунду, Ландау Гидродинамика, стр. 82) через канал радиуса r и длины L при перепаде давления Δр (~2.4⋅10 дн/см для давления насыщенных паров воды при комнатной температуре 18 Торр) и динамической вязкости v=0.01 см/с для воды (Ландау стр. 74):
3
3
1 см Торр/с для водяного пара при комнатной температуре в массовой шкале соответствует - . Скорость истечения в объемных единицах (пара) будет Q≈0.04 см Торр/с.
3
-4
Таким образом, для канала с диаметром 10μ и длиной 1.5 см скорость испарения при комнатной температуре в ~5 раз больше скорости истечения воды при перепаде давления 18 Торр. Увеличить скорость истечения раствора из канала (89) можно увеличением давления в напускной камере (83) микроканального источника, например, подогревая (85) камеру (83). При 50°С в камере (83) давление насыщенного пара воды будет более 92 Торр, и скорость истечения превысит скорость испарения при комнатной температуре мениска раствора при его минимальной площади. При атмосферном давлении в камере (83) поток жидкости по газовому эквиваленту будет около 1.7 см/с или не более 18% от газового потока в 0.75sccm. Таким образом, истечение раствора при атмосферном давлении в напускной камере с газовым потоком около 0.6sccm обеспечат приемлемый уровень остаточного давления около 10 Торр.
Если 100% газового потока «работает» на подогрев раствора в канале (89), то при исходной температуре газа около 100° Цельсия энергии газовых атомов хватит с примерно 6-ти кратным запасом, чтобы поддерживать испарение воды из канала при комнатной температуре. Запас становится почти двадцатикратным для испарения при температуре, несколько большей 0°С. Таким образом, замерзание раствора в канале вряд ли возможно.
Кроме упомянутого выше подогрева (85) конструкция капиллярного ионного источника предполагает, что напускная камера (83) закрывается, например, резиновой прокладкой (87). Жидкая проба вводится через эту прокладку шприцем (88). Кроме варианта подогрева (85) возможны еще три режима работы капиллярного ионного источника. В первом случае шприц (88), содержащий в достаточном объеме анализируемую жидкую пробу оставляется на все время измерений, и жидкость из этого шприца под действием атмосферного давления на поршень шприца поступает внутрь камеры (83) источника, поддерживая в ней постоянный объем и состав анализируемого образца. Во втором режиме работы с помощью шприца (88) заводится некоторый фиксированный объем жидкой пробы, шприц с жидкостью удаляется и вставляется шприц, содержащий инертную газовую среду. Этот «газовый» шприц оставляется на все время измерений, и он поддерживает постоянное (около атмосферного) давление газовой среды над жидкой пробой, позволяя ей расходоваться просачиванием через капилляр (89). Последний вариант работы состоит в том, что после ввода фиксированного объема жидкой пробы, как во втором режиме, вместо «газового» шприца вставляется шприц (88), содержащий буферный раствор с рН, значительно отличающимся от начального рН раствора в камере (83). Если контролировать ионный состав анализируемого раствора (методика и аппаратура для этого известны - http://www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn-m82.tam?ofr=16544039), то можно регистрировать распределения многозарядных ионов биомолекул в этих меняющихся и известных условиях. Проводим декомпозицию получаемых многомерных зарядовых распределений (при наличии в растворе нескольких носителей заряда в растворе, которые могут удерживаться биомолекулами) по описанной нами методике [33]. Далее устанавливаем адекватность изменений вероятностей определяемых вероятностей удерживания носителей заряда отдельными ионогенными группами биомолекулы равновесным процессам в растворе. В случаях соответствия равновесным соотношениям для таких групп могут быть определены соответствующие константы равновесия удерживания различных носителей заряда, которые являются специфичными для тех или иных конформаций исследуемых биомолекул в растворе. Тем самым они могут быть использованы для характеризации таких форм в анализируемых смесях. Здесь проблемой может быть скорость установления допустимой однородности состава по всему объему раствора и соответствия измеряемых концентраций носителей заряда тем, которые реально определяют процессы замещения этих носителей для тех или иных ионогенных групп исследуемых биомолекул.
Заряженные капли и кластерные ионы, выходящие из капилляра (89) под действием фокусирующего радиочастотного входят в зону накопленных ионов (206) буферного газа из сверхзвуковой струи (5). Под действием достаточно энергичных столкновений с этими ионами (их измеренная температура может быть около 6000 K - Рис. 6) происходит дальнейшее испарение капель и декластеризация ионов. Под действием объемного заряда ионов (206) и потока (5) недоиспарившиеся капли и кластерные ионы переходят во вторую половину квадруполя (10). Радиочастотное квадрупольное напряжение здесь установлено таким, чтобы ионы буферного газа из первой половины квадруполя теряли устойчивость движения и гибли на стержнях квадруполя. В этом случае более тяжелые аналитические ионы (304), Рис. 3, фокусируются к оси квадруполя, и своим объемным зарядом выталкивают недоиспаривщиеся капли (308) с большими m/z на более удаленные от оси квадруполя орбиты. Подвергаясь более сильному отталкиванию поля (39) выходной диафрагмы (19) эти капли (12) будут сохраняться внутри квадруполя достаточное время, нагреваясь воздействием радиочастотного напряжения квадруполя и столкновениями с ионами и атомами остаточного газа, чтобы экстрагировать аналитические ионы (20), которые будут в конечном итоге поступать через диафрагму (19) и систему фокусирующих электродов (17) в виде пакета регистрируемых ионов (70) в систему транспортировки и регистрации орто-ВПМС.
Газодинамический интерфейс, схематически и показанный на Рис. 1, в основных частях близок к варианту, приведенному в заявке [28]. Отличительным моментом от этой заявки является то, что газовый поток (1) уже не содержит напускаемых через вентиль (53) анализируемых соединений. В этом случае в камере (2) при пониженном по сравнению с атмосферным давлении образуется смесь инертных газов (Не, Ne, Ar, Kr, Хе) в близких концентрациях, чтобы в источнике электронной ионизации (6) изменением энергии электронов иметь возможность получать разнообразные ионы и метастабильные атомы упомянутых инертных газов. Переход от одной энергии электронов к другой для интервала, специфичного для данного целевого соединения, может позволить выделить ионы, образованные из этого соединения. Нужная исходная температура этих газов поддерживается пропусканием тока через обмотку (3). Подогрев только входного кончика канала (4) достаточен для обеспечения повышенной кинетической энергии атомов струи (5), т.к. формирование этой струи происходит на сравнительно небольшом удалении от начала канала. Для диаметра канала около 0,2 мм для наших измерений [24] это расстояние не превышает 4 мм, далее атомы газа зеркально отражаются от стенок канала, практически не обмениваясь с ними энергией.
Такое поведение газового потока подтверждается нашими измерениями, приведенными на Рис. 4. Измерения проводились для смеси газов при содержании 2% циклогексана в гелии для интерфейса со смещенной газовой струей, показанной на схеме справа (404). На графике справа вверху показаны зависимости ионных токов молекулярных ионов циклогексана с m/z=84-(401) и его фрагментарных ионов с m/z=69-(402) и с m/z=56-(403) от радиочастотного напряжения при отсутствии нагрева кончика канала (3), начальная температура газа - 25°С. Распределение потенциала (405) продольного поля вдоль оси квадруполя показано на схеме справа. Осциллирующий характер полученных зависимостей обусловлен собственными колебаниями облаков ионов в фокусирующем радиочастотном поле квадруполя. Графики вверху слева демонстрируют зависимости тех же ионов при нагреве (3) кончика канала (4) до 100°С. Видно примерно двукратное падение начальных значений тока молекулярных ионов (406) и более, чем трехкратное увеличение тока ионов с m/z=56 (407), и относительно небольшое увеличение тока ионов с m/z=69 (408). Такое поведение можно объяснить уменьшением плотности газа в струе при нагреве и соответствующим ослаблением стабилизации молекулярных ионов и их увеличенным их распадом. Эти относительно малые ионы фокусируясь вокруг оси квадруполя будут расталкивать своим объемным зарядом молекулярные ионы на достаточно большое расстояние от оси квадруполя и приводить к их фрагментации и образованию новых фрагментных ионов. Т.е, процесс сам себя ускоряет и приводит к наблюдаемому значительному росту тока фрагментарных ионов. Если зависимости в верхней половине Рис. 4 были получены при относительно малом ионизирующем напряжении в 12В, то графики слева внизу (кривые (409) - m/z=84, (410) - m/z=56, (411) - m/z=69) демонстрируют дальнейшее значительное увеличение относительной интенсивности фрагментарных ионов при увеличении энергии ионизации до 40 эВ при сохранении нагрева кончика канала (4) до 100°С. Такое поведение подтверждает описанный механизм ускорения распада молекулярных ионов, поскольку увеличенная энергия ионизирующих электронов приводит к усилению начальной фрагментации, что делает еще более эффективным каскад описанных процессов. Наблюдаемое при этом примерно 4-х кратное превышение потока ионов с m/z=56 по сравнению с молекулярными ионами заметно отличается от их доли в 0.7 от тех же ионов с m/z=56 для масс-спектра из базы данных Национального института стандартов (412), полученного для энергии ионизации в 70 эВ.
Для адекватного функционирования всей системы величина газового потока (5)должна быть такова, чтобы плотность газового потока вблизи оси квадруполя при выходе из него была настолько малой, чтобы напуск (70) ионов с газом через скиммер (71) не приводил к недопустимому остаточному давлению внутри масс-анализатора. Поскольку газовый поток диффузно рассеивается (81) на скиммере (71) откачка (75) будет менее эффективной, чем для случая ортогонального вывода ионов [27]. Таким образом, при соосном сопряжении масс-анализатора с газодинамическим интерфейсом нужно использовать более мощную откачку, либо ограничиться напуском менее интенсивных газовых потоков, чтобы обеспечить работоспособность источника ионов (6). Нужно при этом учитывать и вклад потока из капилляра (89). Если при вводе водного раствора согласно проведенной выше оценки этот вклад не превышает 18% от максимально возможного потока (5) при атмосферном давлении внутри камеры (83), то для напуска газовых смесей оценка потока из капилляра (89) получается еще ниже (почти в три раза для потока аргона, как буферного газа).
0
Оценку сверху ожидаемого газового потока из капилляра (89) можно получить на основе предложенной нами модели формирования сверхзвуковой струи [24] и проведенных измерений. В этой модели ключевую роль играет критическая скорость потока , когда кинетическая энергия направленного движения его атомов становится равной половине исходной тепловой энергии этих атомов. Здесь и далее k - постоянная Больцмана, Т - исходная температура газа, М - масса атомов газа. Для аргона и комнатной температуры (293 K) эта скорость равна:
До достижения этой скорости зависимость плотности газа n в канале радиуса r от расстояния Z от начала канала при диффузном отражении атомов газа от его стенок в первом приближении определяется выражением (решение уравнения (1) в [24]):
0
Z
Z
где n - плотность газа на входе в канал, f=nV - плотность газового потока в канале, V - скорость газового потока. Для  Z(n) достигает максимального значения и далее начинает убывать, указывая на то, что упрощенная модель течения газа в канале, основанная на балансе импульсов атомов газа в тонком слое газового потока, перестает быть адекватной. Она не учитывает, например, вклад диффузии атомов газа, что принципиально важно вблизи критической точки. Введение диффузионного члена в уравнение газового потока (уравнение (3) в [24]) позволяет пройти критическую точку , но требует для получения осмысленного результата фактического отсутствия или очень малого сопротивления потоку в оставшейся части канала. Это условие может быть удовлетворено, если доминирующим здесь станет зеркальное отражение атомов от стенок канала, что представляется вполне вероятным для очень малых углов столкновения атомов со стенкой (при относительно большой продольной скорости этих атомов). Для проведенных измерений с каналом с диаметром 0.215 мм и величине потока F=0,75 sccm плотность потока такова:
Расстояние до критической точки, исходя из (99), будет около 4 мм:
Относительное сопротивление потоку газа при длине свободного пробега, сравнимой с радиусом канала, определяющееся в основном отношением площади боковой поверхности (с протяженностью около длины свободного пробега атомов газа) к площади поперечного сечения, обратно пропорционально этому радиусу. Поэтому плотность газового потока при данном начальном давлении будет примерно пропорциональна радиусу канала. Т.е. в рассматриваемом случае поток через канал с диаметром 10 мкм (пропорциональный кубу диаметра) при неизменном начальном давлении уменьшится примерно в 9940 раз по сравнению с каналом с диаметром около 0,215 мм. Увеличение начального давления до атмосферного в ~25 раз по сравнению с исходным (30 Торр) увеличит этот поток примерно квадратично в ~625 раз, т.е. фактор уменьшения потока для канала (∅10 мкм) составит около 16. Таким образом, для аргона величина потока через капилляр (89) при атмосферном давлении в камере (83) будет около 6% от потока 0.75 seem из канала (4) при условиях наших измерений. Для гелия из камеры (83), как показывают измерения, увеличение потока (по сравнению потоком аргона из канала (4)) будет примерно в 1.4 раза, т.е. это будет не более 9% от суммарного потока, что также вполне приемлемо. Квадратичная зависимость (902), Рис. 9, величины потока от начального давления была нами подтверждена экспериментальными измерениями для используемого в настоящее время в нашей системе канала формирования сверхзвуковой струи. Эти данные (901) указывают на то, что скорость потока при входе в канал в нашем случае пропорциональна начальному давлению. Поскольку плотность газа также пропорциональна давлению, то отсюда как раз и возникает квадратичная зависимость величины потока или плотности потока от давления. Таким образом, исходя из (99), расстояние до критической точки будет уменьшаться обратно пропорционально начальному давлению газа Качественно это понятно, так как ускорение газа вдоль канала, пропорциональное числу соударений атомов в объеме (или квадрату давления) и обратно пропорциональное плотности газа (массе ускоряющегося газа), будет в результате пропорционально давлению. Тем самым скорость потока будет достигать критического значения на расстоянии от начала канала обратно пропорциональном давлению. Если для нашего канала (∅215 мкм) критическая скорость достигалась на расстоянии около 3,6 мм от входа в канал, то для канала диаметром 10 мкм при давлении в ~25 раз большем, чем в исходном канале критическая длина будет около 0,14 мм. Таким образом, длина такого канала в 1.5 см будет более, чем достаточна для развития в нем сверхзвукового потока, если бы на выходе был вакуум. Наличие же некоторого давления на выходе капилляра может только уменьшить величину потока через него. Можно ожидать в нашем случае, что сверхзвуковой характер газового потока из капилляра (89) сохранится, несмотря на то что вблизи выходного конца капилляра (89) можно ожидать давления газов на уровне десятых долей Торр. Дело в том, для обеспечения в 16 раз меньшего потока из капилляра с площадью сечения в ~400 меньшей, чем для канала (4), плотность потока из капилляра (89) должна быть в ~25 раз больше, чем из канала (4). Если в последнем случае для потока 0.75 seem эта плотность соответствовала давлению газа при комнатной температуре ~0.6 Торр, то для капилляра (89) это будет 15 Торр. Такой поток почти не почувствует присутствия газа при давлении на уровне десятых долей Торр около конца капилляра (89). Лишь малая доля газа из потока (89) будет испытывать столкновения с атомами внешнего газа, и эта малая доля уйдет из потока.
-4
-7
-4
Таким образом, можно ожидать, что при той же скорости откачки давление остаточных газов в предлагаемой системе при атмосферном давлении в напускной камере ионного источника (83) будет близким, к тому, что имелось в существующем газодинамическом интерфейсе - около 10 Торр для начального давления в камере (2) ~30 Торр. Для этого надо немного уменьшить давление газа в этой камере: при напуске водного раствора это давление не должно превышать 25 Торр, а для газовой пробы оно может быть около 28 Торр. Как и в существующем интерфейсе конический скиммер (71) с входным отверстием с диаметром ~2 мм на оси квадруполя будет пропускать в масс-анализатор допустимый газовый поток, чтобы обеспечить в масс-анализаторе давление менее 10 Торр, если в интерфейсе при той же скорости откачки обеспечивается давление не хуже, чем 10 Торр. Регистрируемые ионы (20) при этом к концу квадруполя должны быть сконцентрированы в этой зоне около оси (38) и электрическими полями (31), (33) и (35) должны быть ускорены до энергии φ, а выпуклыми вверх распределениями потенциала (55) и (76) вдоль оси квадруполя, создающими фокусирующее распределение потенциала в плоскости, ортогональной оси, направлены внутрь скиммера (71). Эти поля создаются системой электродов (17). Величина потенциала φ (55) должна быть близка к оптимальной для регистрации на орто-ВПМС. Повышенная величина задерживающего потенциала (59) на выходной диафрагме (19), создающая поле (39), может задаваться для накопления ионов внутри квадруполя (10). Возбуждение нерезонансных осцилляций ионов (304) с частотой, значимо меньшей резонансной частоты выбранных ионов, позволяет ограничить диапазон m/z накапливаемых ионов. Отсечение ионов с относительно малыми m/z может быть проведено повышением величины радиочастотного напряжения (302), приводящего к потери устойчивости движения и гибели ионов с m/z, меньше заданного. Ионы с относительно большими m/z имеют большую амплитуду нерезонансных осцилляций по мере приближения к резонансу и будут эффективнее гибнуть за счет диффузии на стержнях квадруполя (301).
Ионный источник электронной ионизации (6) имеет катод (18) косвенного подогрева (22), который обеспечивает относительно небольшой разброс (на уровне 0,1 эВ) по управляемой энергии ионизирующих электронов, что позволяет с хорошей точностью задавать состав ионов и метастабильно-возбужденных атомов в газовом потоке и не допускать значительного образования ионов, наличие которых может приводить к гибели метастабильных атомов. Именно так могут быть интерпретированы данные, приведенные на Рис. 7.
Под действием электрических полей (28) и (29), направленных через входную диафрагму, состоящую из проводящих слоев (9) с непроводящими слоями (8) между ними, с круглым входным отверстием (48) ионы внутри газового потока и частично с его наружной стороны будут вводиться внутрь радиочастотного квадруполя (10). Созданием в первой половине квадруполя продольного электрического поля (13), направленного против потока (5) (противополя), поступление некоторых ионов во вторую половину квадруполя может быть прекращено. Прежде всего, это будут ионы, движущиеся вне газового потока, кинетическая энергия которых при входе в квадруполь не позволит преодолеть перепад напряжения в первой половине квадруполя (56)-(60), показанного на потенциальной кривой (57)-(27) газодинамического интерфейса, проведенной вблизи электродов, на которых заданы соответствующие потенциалы U.
Ионы, движущиеся внутри газового потока (5), будут тормозиться не перепадом напряжения, а напряженностью электрического поля. Для того чтобы воспрепятствовать обратному выходу заторможенных ионов через входную диафрагму (9) создается на ней потенциальный барьер (61). Имеет смысл также, как в нашем патенте РФ [41], секционировать внутреннюю поверхность входной диафрагмы (9) квадруполя (в сечении А-А, Рис. 1) и приложить к соседним секциям (46)-(47) достаточное, но не слишком большое радиочастотное напряжение в противоположных фазах. Накопление ионов в существующем интерфейсе со смещенной сверхзвуковой струей было подтверждено наблюдением соответствующих релаксационных кривых [19]. Данные, приведенные здесь на Рис. 4, если иметь в виду приведенную выше их интерпретацию, так же подтверждают значительное накопление ионов в нашем интерфейсе и, более того, их существенный разогрев, приводящий к значительной фрагментации накопленных молекулярных ионов циклогексана.
Прямое подтверждение такой фрагментации демонстрируют данные, приведенные на Рис. 5. Эти данные были получены для смеси аргона с 2% циклогексана, пропущенной в виде сверхзвуковой газовой струи через ионный источник с энергией ионизирующих электронов 40 эВ, при радиочастотном напряжении в квадруполе 40 В, при котором только молекулярные ионы циклогексана с m/z=84 могли пройти через квадруполь. Тем не менее, кроме этих ионов регистрировались также фрагментарные ионы с m/z=56 и с m/z=69, которые могли образоваться после квадруполя из возбужденных или «нагретых» ионов с m/z=84. Степень дополнительного нагрева этих ионов или их дополнительная эффективная температура задавалась наложением нерезонансного осциллирующего напряжения с частотой 50 кГц (более чем вдвое ниже резонансной частоты для ионов с m/z=84) в двух направлениях: в направлении смещения газовой струи (вертикальные осцилляции) и в ортогональном направлении (горизонтальные осцилляции). Такое значительное смещение частоты от резонансной дает практически однозначное соответствие между амплитудой осциллирующего напряжения и амплитудой колебаний рассматриваемых ионов, независимо от частоты столкновений с атомами газа и другими ионами. В соответствии с нашей моделью нагрева ионов при их движении в газе под действием электрического поля [45] имеет место в этом случае однозначная связь между осциллирующим напряжением и дополнительной эффективной температурой молекулярных ионов циклогексана.
Шкала этой температуры показана вверху графиков на Рис. 5. Кривая (501) демонстрирует убывание потока регистрируемых молекулярных ионов циклогексана с увеличением амплитуды осциллирующего напряжения для вертикальных осцилляций. Максимум этого напряжения соответствует амплитуде осцилляций этих ионов около 1 мм. Кривые (502) и (503) описывают поведение потоков (с увеличением в 20 раз) регистрируемых фрагментарных ионов с m/z=56 и с m/z=69. Эти кривые с хорошей точностью пропорциональны друг другу. Далее обе совокупности этих двух ионов анализируются суммарно. Суммарная кривая для них, нормированная на совпадение начальных значений с кривой (501) показана контурными окружностями (504). Отношение значений (504) и (501) показано на кривой (505). Близкие данные были получены в данном случае и для горизонтальных осцилляций. Кривая (506) представляет усредненные значения, аналогичные (505), для вертикальных и горизонтальных осцилляций. Видно заметное уменьшение шумовых осцилляций для кривой (506) по сравнению со значениями (505).
4
+
+
+
+
-4
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
Более корректно для кинетических расчетов использовать отношение потоков регистрируемых ионов с m/z=56 и с m/z=69 к полной сумме потоков всех трех рассматриваемых ионов с m/z=84, m/z=56 и m/z=69. Аррениусовская аппроксимация такого отношения от предполагаемой обратной абсолютной температуры молекулярных ионов циклогексана показана на Рис. 6 Величина постоянного вклада в такую температуру, оказавшегося около 6000К, была найдена из минимальности ошибки аппроксимации логарифмов зарегистрированных величин рассматриваемого отношения (601) линейной функцией (602). Величина получившейся энергии активации оказалась равной 1.33±0.04 эВ, а частотного фактора - (0.77±0.07)×10. Первая величина оказалась вполне разумной для процессов образования фрагментарных ионов: ⋅СНСНСНСНСНСН→СН2=СН2+⋅СНСНСНСН(m/z=56) и ⋅СНСНСНСНСНСН→⋅СН+СН=СНСНСНСН(m/z=69). Вторая с приемлемой точностью соответствует числу соударений молекулярных ионов с атомами остаточных газов при давлении 10 Торр. Полученные результаты говорят о том, что накопленный ансамбль ионов достаточно сильно разогрет.Его базовая температура 6000К соответствует средней энергии ионов ~0.74 эВ. При осцилляциях с амплитудой колебаний около 1 мм температура ансамбля ионов возрастает до 8700 K, что соответствует средней энергии ионов около 1.07 эВ. Это означает, что капли анализируемого раствора в среде таких ионов будут приобретать избыточный заряд. Так чтобы зарядить каплю диаметром 10μ до 1 В нужно примерно 3⋅10 зарядов на ее поверхности.
Рис. 7 демонстрирует данные, аналогичные показанным на Рис. 5, когда основным газом в сверхзвуковой струе вместо аргона является гелий. Если данные с аргоном были получены при энергии электронов (40 эВ) в источнике (6), превышающей энергию ионизации аргона (15.76 эВ), то в случае гелия энергия электронов (20 эВ) существенно меньше энергии ионизации гелия (24.59 эВ). В то же время энергии электронов 20 эВ достаточно для образования метастабильно возбужденных атомов гелия. В случае аргона не наблюдалось заметной разницы для наблюдаемых зависимостей ионных токов от осциллирующего напряжения при горизонтальных и вертикальных осцилляциях. Однако для гелия отношение токов молекулярных ионов циклогексана для вертикальных и горизонтальных осцилляций (705) имеет выраженный минимум при осцилляциях с амплитудой около 0.9 мм, что соответствует среднему удалению сверхзвуковой струи от оси квадруполя. Естественное объяснение этому - дополнительная гибель молекулярных ионов при их столкновениях с метастабильными атомами гелия в струе. В случае аргона, поскольку энергии электронов хватало на образование ионов аргона, эти ионы могли значительно уменьшить концентрацию метастабильных атомов аргона в струе за счет их гибели при поляризационном захвате этих атомов ионами аргона. Поэтому заметной дополнительной гибели молекулярных ионов циклогексана (701) на метастабильных атомах аргона нами в данном случае не наблюдалось. В случае гелия нормализованная суммарная кривая (704) для фрагментарных ионов циклогексана с m/z=56 (702) и с m/z=69 (703) не показывает в отличие от данных с аргоном растущего с осциллирующим напряжением отклонения от кривой (701). Такое поведение подтверждает, что для столкновений с атомами гелия увеличение эффективной температуры ионов при их осцилляциях существенно меньше, как и предсказывается нашей моделью [45], чем при столкновениях с атомами аргона. Возникает, однако, вопрос, почему не наблюдается значимого различия относительных интенсивностей фрагментарных ионов для потоков с гелием и аргоном при отсутствии вынужденных нерезонансных осцилляций. Возможное объяснение такого эффекта - это накопление достаточно большого ансамбля ионов, когда ион-ионные взаимодействия по своей значимости существенно превосходят ион-атомные столкновения. При включении осциллирующего напряжения, поскольку ансамбль накопленных ионов в данном случае - это однородный ансамбль молекулярных ионов циклогексана (остальные ионы с меньшими m/z гибнут на стержнях квадруполя при данном радиочастотном напряжении), то в соответствии теоремой о движении центра инерции этот ансамбль осциллирует как единое целое. Его дополнительная кинетическая энергия таких осцилляций преобразуется в дополнительную эффективную температуру именно при столкновении с атомами газа, а не ионов, так как относительная (нетепловая) скорость ионов при таких осцилляциях в среднем остается неизменной.
Этот вывод о превалирующем влиянии ансамбля накопленных ионов буферного газа в рассматриваемых условиях на релаксационные процессы в том числе и анализируемых ионов является очень важным для настоящего изобретения. В этом случае для фокусировки таких ионов в квадруполе не нужно использование дополнительных струй сверхзвукового газового потока, кроме той, что направлена на выход капилляра (89). Это существенно упрощает всю конструкцию. Такой достаточно плотный ансамбль относительно малых ионов буферного газа позволяет ожидать достаточно высокую эффективность ионизации исследуемых соединениях в газовых смесях и при испарении таких соединений из жидкостей. Аналитические ионы, как правило, обладающие большими m/z, чем ионы буферного газа, будут выталкиваться объемным зарядом этих относительно малых ионов на достаточное удаление от оси квадруполя. Подвергаясь по этой причине, а также из-за увеличенного сечения столкновений большему ускорению от атомов газовой струи (5) аналитические ионы будут более эффективно выходить во вторую половину квадруполя (10) и далее регистрироваться в орто-ВПМС. Этому также будет способствовать увеличение радиочастотного напряжения во второй половине квадруполя до величины, приводящей к гибели в этой половине ионов буферного газа и наличию по этой причине массового потока ионов буферного газа из первой половины квадруполя во вторую. Такой поток вызовет перепад плотности объемного заряда ионов при переходе из первой половины квадруполя во вторую и возникновение соответствующего электрического поля, двигающего аналитические ионы на выход из квадруполя и фокусирующего эти ионы к оси квадруполя. Достаточно высокая эффективная температура ионов буферного газа в накопленном относительно плотном ансамбле будет также способствовать доиспарению и дроблению капель раствора, а также декластеризации многозарядных ионов биомолекул. Этим процессам могут также способствовать вынужденные осцилляции или вращения вокруг оси квадруполя ансамбля накопленных ионов буферного газа.
Регистрируемый сигнал для соединения определенного типа при постоянной скорости потока газа или жидкости через капилляр (89) без поступления извне этого соединения в камеру (83) и при сохранении постоянным общего объема и давления газа или жидкости в камере (83) будет экспоненциально затухать с некоторым характеристическим временем. Это будет иметь место, по крайней мере начиная с достаточно малых концентраций этого соединения, когда отсутствуют нелинейные эффекты адсорбции, и скорость истечения мала по сравнению со скоростью установления адсорбционного и диффузионного равновесия в камере (83). При наличии среди этих соединений таких, которые дают ионы с совпадающими значениями m/z (или неразличимыми для данного масс-анализатора) будет наблюдаться сумма экспоненциально затухающих кривых с различными, вообще говоря, характеристическими временами. Если такую суммарную кривую разделить на экспоненциальные составляющие, то они будут соответствовать ионам для различных соединений.
k
kl
k
Нужно иметь в виду, что для каждого типа соединений, как правило, будет регистрироваться целый спектр ионов, обусловленных их взаимодействием с ионами и с метастабильно возбужденными частицами основных компонент газового потока. Релаксационные кривые для фрагментарных ионов, выходящих вместе с молекулярными ионами соединений некоторого типа, будут экспонентами с тем же характеристическим временем, что и для молекулярного иона. Для нескольких типов соединений эти кривые будут комбинироваться, например, так, как показано на Рис. 8. Уникальные фрагментарные ионы разного происхождения (800) и (803) спадают по своим экспонентам (801) и (804) соответственно. Фрагментарные ионы (805), имеющие вклады, происходящие от обоих типов молекулярных ионов, включают две экспоненты в свою релаксационную кривую. В этом случае возможно использование многомерных методов разделения совокупности релаксационных кривых, описанных, например, в наших патентах РФ [25,26] и в [32]. Отстоящие по времени измерения на постоянный интервал Δt (802) интенсивности пиков масс-спектра J(t+Δt) записываются в виде произведения матрицы перехода A на вектор предыдущих интенсивностей J(t) - уравнение (807):
Здесь l и k нумеруют измеряемые масс-спектральные пики (полное число - n).
Матричные элементы матрицы перехода могут быть вычислены по методу наименьших квадратов из условия наилучшего в среднеквадратичном выполнения равенства (807) для всех моментов измерения. Для этого число зарегистрированных масс-спектров (моментов измерения) должно быть не меньше числа пиков масс-спектра (n). Решением проблемы собственных значений (809) для матрицы перехода находятся собственные векторы  и собственные числа:
Собственные векторы  описывают распределения интенсивностей ионов или масс-спектры для каждого исходного соединения, которому соответствует собственное число (808), являющееся экспоненциальным фактором затухания числа этих ионов. После того, как масс-спектры исходных соединений и экспоненциальные факторы затухания или релаксации соответствующих сигналов, могут быть вычислены вклады масс-спектров во всех зарегистрированных отсчетах общего масс-спектра в последовательные равноотстоящие моменты времени решением соответствующих систем линейных алгебраических уравнений, исходя из требования минимума среднеквадратичной ошибки приближения. Таким образом, могут быть получены масс-спектры для каждого исходного соединения и их вклады в общий масс-спектр, как в случае их полного разделения перед измерениями. Эти оценки могут быть протестированы и уточнены путем проведения соответствующих калибровочных экспериментов.
3
3
3
Для эффективного использования описанного подхода в реальных аналитических измерениях нужно, чтобы характеристические времена затухания регистрируемых сигналов были в диапазоне, удобном для измерений. При анализе газовых смесей проведенная выше оценка скорости истечения из капилляра (89) при атмосферном давлении в камере (83) составляла для аргона около 45 мм/мин, а для гелия примерно 67 мм/мин. Для объема камеры (83) около 46 мм характеристическое время истечения неадсорбирующегося соединения с достаточно большим коэффициентом диффузии будет для аргона около 1 мин, а для гелия около 41 с. Если увеличения этого времени, связанные с адсорбцией и диффузией не превысят 1 мин, то это будет вполне удобно для измерений.
3
Хотя для жидкости скорость истечения из капилляра (89), пересчитанная в газовый объем, оказалась более, чем вдвое больше, чем для газа, эффективный объем камеры (83) оказался в этом случае слишком большим (для жидкости он примерно в 1000 раз больше, чем для газа). Таким образом, при полном заполнении камеры (83) жидкостью ожидаемое характеристическое время истечения анализируемого соединения примерно в 500 раз превысит это время для газа. Выход из этого проиллюстрирован на Рис. 2а. Если объем анализируемой жидкости (214) уменьшить раз в 50 до ~1 мм, то соответствующее характеристическое время будет около 10 мин, что менее удобно, чем 1 мин, но тоже приемлемо. Для поддержания постоянным этого объема шприц (88), содержащий буферный раствор, вставляется через резиновую крышку (87) в камеру (83) так, чтобы его игла (212) входила в объем (214). Поршень (213) шприца (88) открыт для атмосферы в комнате, и если атмосферное давление в комнате во время измерений можно считать постоянным, то объем (214) практически не будет меняться. Неизменной также остается поверхность камеры (83), доступная для адсорбции из жидкости и из газовой фазы анализируемых соединений, что должно приводить к неизменному вкладу адсорбционных и диффузионных процессов в характеристические времена релаксации соответствующих сигналов. Следствием этого будет применимость описанного подхода анализа многомерных релаксирующих данных и для этого случая.
Для того чтобы привести адсорбционные и диффузионные вклады анализируемых соединений в измеряемые характеристические времена к удобному диапазону можно использовать нагрев (85) камеры (83). Для каждого целевого соединения существует своя оптимальная температура или диапазон температур, наиболее подходящие для определения этого соединения. Когда примерно половина молекул этого соединения стационарно находится в объеме камеры (83), а вторая половина адсорбирована на ее стенках, характеристическое время истечения этого соединения удваивается по сравнению со случаем отсутствия адсорбции, если скорость диффузии много больше скорости истечения. При существенно более низких температурах, это характеристическое время становится слишком большим, а квазистационарная концентрация рассматриваемого соединения в камере (83) сильно уменьшается, также значительно снижаются регистрируемые ионные токи для этого соединения. При высоких температурах вклад адсорбции в характеристическое время истечения исчезает. Величина этого вклада, как было показано нами для случая эффузиометрических измерений [29] экспоненциально зависит от энергии адсорбции рассматриваемого соединения, деленной на температуру поверхности. Т.е. эта величина может быть существенно различной для разных соединений.
При скачкообразном увеличении мощности нагрева (85) выход температуры в камере (83) на новый стационарный уровень занимает некоторое время, в течение которого регистрируемые ионные токи будут возрастать и после прохождения максимальных значений будут релаксировать к 0 с характеристическими временами, специфичными для различных соединений. Также специфичными для каждого соединения могут быть скорость начального нарастания, локализация и величины максимумов соответствующих ионных токов. Если для данного целевого соединения подобные измерения были проведены заранее, то возникает возможность выявления присутствия и оценки относительной концентрации этого соединения в анализируемой смеси на основе разработанного нами ранее метода селективной цифровой фильтрации [30].
μ
μk
μ
μ
Селективная цифровая фильтрация включает в себя следующие шаги. После регистрации описанного массива ионных токов по всем пикам масс-спектра с выбранными значениями μ=m/z, строится линейный цифровой фильтр F с единичной суммой квадратов коэффициентов фильтра , максимально подавляющий в среднем наборы ионных токов Gв этом двумерном массиве со всеми номерами k при заданном подавлении масс-спектра целевого соединения J. Т.е. решается задача на условный экстремум - найти такие F, которые дают минимально возможное значение для
trans
где F - прозрачность фильтра, показывающая степень ослабления результирующего сигнала для анализируемого масс-спектра по сравнению с суммой интенсивностей всех используемых его линий. Эта величина является ключевой для количественной оценки относительной доли определяемого компонента в анализируемой смеси.
Сформулированная задача может быть решена минимизацией соответствующей функции Лагранжа:
μ
Величины параметров λ и η могут быть затем найдены при использовании выражений для соответствующих условий (813). После приравнивания 0 первых производных по значениям F функции (814) получаем следующую систему линейных алгебраических уравнений:
eff
eff
μk
eff
μ
μ
μk
где , F=1/λ, θ=-η/λ. Величина F может быть названа эффективностью фильтра, так как она связана со способностью фильтра подавить компоненты G (для F=0 величины F=θJ не зависят от набора G). Величина θ может быть найдена из условия
eff
trans
eff
trans
Значение F также могло бы быть найдено при заданной величине F из последнего условия (813). Однако проще использовать фильтры с различными значениями F и выбрать тот, который дает приемлемый результат, и использовать полученное из последнего равенства (813) значение F для количественной оценки относительной доли искомого вещества в анализируемой смеси.
В качестве оптимального фильтра можно взять тот, который обеспечивает получение максимального отношения сигнал/шум для максимального квадрата значения после фильтрации, принимая за шумовой уровень средний квадрат значений после фильтрации в массиве при удалении от локализации указанного максимального квадрата значения, большем заданного расстояния. Критериями обнаружения целевого соединения являются близкая к ожидаемой локализация максимального квадрата значения после фильтрации и достигнутый уровень отношения сигнал/шум для него. Количественные параметры этих критериев и оценки относительного содержания целевого соединения в анализируемой смеси вырабатываются на основе анализа калибровочных смесей известного состава, содержащих соответствующие целевые соединения. Это касается средних значений локализаций и их дисперсий для максимального значения квадрата отклика цифрового фильтра на зарегистрированные и преобразованные описанным выше способом данные для калибровочных смесей. Также определяются уровни отношения описанного отношения сигнал/шум, соответствующие определенным концентрациям целевых соединений в калибровочных смесях и строятся соответствующие калибровочные кривые.
При анализе ионных примесей в полярных жидкостях, в частности ионов биомолекул в водных растворах, возможна реализация следующих, проиллюстрированных на Рис. 2, способов предварительного разделения анализируемых компонент. Если на дне камеры (83) создать проводящий слой (86), изолированный от внешней оболочки (82) камеры (83) изолятором (90) и подать на него некоторое достаточно большое напряжение, например, отрицательное по отношению к оболочке (82), то между этой оболочкой и слоем (86) возникнет электрическое поле (200). Это поле будет сдвигать положительные ионы (203) к области входа в капилляр (89), а отрицательные (204) - к внешней оболочке (82). Часть положительных ионов будет под действием потока жидкости (201) даже заходить внутрь капилляра (89). Далее однако они не продвинутся, так как на них внутри капилляра будет действовать поле (202) противоположной направленности, т.к. потенциал слоя (86) существенно меньше потенциала в области облака накопленных ионов (206). Последний потенциал положительный и обычно не превышает 10 В. Только в среднем нейтральные частицы (208) будут свободно проникать внутрь капилляра (89) и далее с потоком жидкости выводиться в зону формирования анализируемых ионов (207). Для биомолекул это будет означать, что регистрируются только те из них, чья изоэлектрическая точка близка к рН раствора. Шприц (88), изображенный на Рис. 2, содержит некоторый буферный раствор, который под действием атмосферного давления на поршень (213), вытекает внутрь камеры (83). В результате постепенно изменяется рН раствора, и внутрь капилляра (89) будут поступать новые биомолекулы с соответствующей изоэлектрической точкой. Тем самым достигается разделение биомолекул по их изоэлектрическим точкам.
3
При изменении полярности напряжения, приложенного к слою (86) часть ионов (203), которые были заведены потоком жидкости (201) внутрь капилляра (89) начнут движение вдоль капилляра. В соответствии с их подвижностью эти ионы поочередно будут выходить из капилляра (89) в виде более или менее разделенных пакетов. Обычно для достижения наибольшей разрешенности подобных спектров подвижности требуется создание электрических полей возможно большей напряженности, что приводит к достаточно коротким временам выхода пиков такого спектра. В этом случае естественным ограничением является быстродействие масс-анализатора. Для используемого нами времяпролетного масс-спектрометра с ортогональным вводом ионов обычное время регистрации одного масс-спектра с диапазоном m/z до 1000 составляет 100 μс. Для приемлемого описания формы пиков спектра подвижности нужно около 10 масс-спектров на каждый такой пик. Т.е. длительность такого пика должна быть около 1 мс, что накладывает ограничение на величину напряженности электрического поля (202). Если нет других ограничений, то эта длительность определяет максимальную разрешенность таких спектров подвижности. Ожидаемое время выхода всех ионов из капилляра (89), включая ионы с нулевой подвижностью определяется скоростью истечения раствора из капилляра (89) и его длиной, которая в нашей системе около 1.5 см. При скорости истечения для атмосферного давления в камере (83) около 2.5 см/с, что соответствует полученной выше оценке объемной скорости потока водного раствора ~0.15 мм/мин из капилляра диаметром 10μ при атмосферном давлении в камере (83), это время будет около 600 мс. Это означает, в данном случае максимальное ожидаемое разрешение будет в районе 600, что является достаточно высоким разрешением по подвижности ионов.
Понятно, что для получения приемлемых спектров подвижности требуется их многократное накопление, например, в течение 600 с (10 мин), чтобы было накоплено по 1000 масс-спектров для каждой точки спектра подвижности. В течение этого времени условия в растворе не должны заметно измениться. Для этого достаточно, например, через шприц (88) подавать не буферный раствор, а сам анализируемый раствор, либо для поддержания постоянной скорости истечения раствора из капилляра (89) из шприца (88) подавать в камеру (83) некоторый инертный газ. Реализовать такое накопление можно, переключая с периодом 600 мс полярность напряжения на слое (89). В этом случае поочередно будут регистрироваться «одиночные» спектры подвижности положительных и отрицательных ионов, которые должны отдельно накапливаться, давая два финальных спектра подвижности положительных и отрицательных ионов. Общее время накопления этих двух спектров подвижности в описанных условиях будет 20 мин.
Такие спектры могут быть зарегистрированы для различных значений рН раствора и/или концентраций, например, ионов натрия, добавлением в раствор в камере (83) соответствующих буферных растворов. После установления постоянных значений датчиков рН (214) и концентрации ионов натрия (215) запускается описанная выше процедура получения спектров подвижности. Вся эта последовательность действий повторяется желаемое число раз до получения некоторой совокупности серий масс-спектров, зарегистрированных для выбранных интервалов значений рН и/или концентраций ионов натрия в растворе. Выбираем в каждой серии масс-спектров, те совокупности масс-спектров, которые могут относиться к интересующим биомолекулам, например, те, которые соответствуют их молекулярным массам с учетом возможного протонирования или депротонирования, вхождения в их состав катионов (ионов натрия) и анионов (ионы хлора, брома и т.д.). Выбор типа катионов и анионов зависит от той соли, что была использована при приготовлении буферного раствора. Суммируем масс-спектры, соответствующие разрешенным пикам спектров подвижности по соответствующим масс-спектральным пикам.
Для каждого из таких суммарных масс-спектров, составляющих распределение по числам удерживаемых носителей заряда запускаем процедуру декомпозиции таких многомерных зарядовых распределений [33]. В соответствии с критерием, сформулированным в [46], находим сайты и соответственные масс-спектры для каждой пары значений рН и концентраций ионов натрия, для которых найденные относительные вероятности удерживания протона и иона натрия наиболее хорошо описываются равновесными значениями для некоторого отношения соответствующих констант равновесия. Представляется, что совокупность таких отношений, наряду с изоэлектрической точкой соответствующей биомолекулы может быть принята за характеристику структуры этой биомолекулы в растворе и может быть использована для идентификации ее изоформ в биологических жидкостях. Это предположение, конечно, требует проведения соответствующих экспериментальных исследований и сопоставления с данными других методов.
При проведении описанных выше измерений при создании достаточно сильных электрических полей в камере (83) при наличии открытых металлических электродов могут происходить процессы электролиза, приводящие к травлению материала этих электродов, изменению состава анализируемого раствора и к превращению самих анализируемых компонент. Для предотвращения всех этих процессов, могущих иметь нежелательные последствия для проводимых анализов, возможно покрытие упомянутых электродов тонкой диэлектрической пленкой. Методика такого покрытия была разработана ранее при участии одного из авторов настоящего изобретения и использовалась для решения разнообразных технологических задач [47].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Додонов А.Ф., Чернушевич И.В., Додонова Т.Ф., Разников В.В., Тальрозе В.Л. Способ масс-спектрометрического анализа по времени пролета непрерывного пучка ионов Авторское Свидетельство №.1681340 с приоритетом от 25.02.87. Бюл. изобр. N36, 30.09.91.
2. Dodonov A., Loboda A. Kozlovski V., Raznikov V., Soulimenkov I., Tolmachev A., Zhen Z., Horwath Т., Wollnik H. High Resolution electrospray ionization orthogonal-injection time-of-flight mass spectrometer European Journal of Mass Spectrometry, 6, 481-490, 2000.
3. Shevchenko A., Chernushevich I., Ens W., Standing K.G., Thomson В., Wilm M., and Mann M., Rapid Commun. Mass Spectrom., 11, 1015-1024 (1997).
4. Morris H.R., Paxton T., Dell Α., Langhorn В., Berg M., Bordoli R.S., Hoyes J. and Bateman R.H. High sensitivity collisionally -activated decomposition tandem mass spectrometry on a novel quadrupole /orthogonal-acceleration time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom., 10, 889-896 (1996).
5. Chernushevich I.V., Ens W., Standing K.G. Orthogonal injection TOFMS for analysis of biomolecules. Anal.Chem.News & Features Julyl, 1999, 453 A-461 A.
6. Мюллер E.B., Цонг T.T. Полевая ионная микроскопия, полевая ионизация и полевое испарение. М.: Наука, 1980, 220 с.
7. Мюллер Э.В., Цонг Т.Т. Автоионная микроскопия (принципы и применение). М.: Металлургия, 1972. 360 с.
8. Iribarne J.V., Thomson В.Α. // J. Chem. Phys. 1976. V. 64, No 6, P. 2287-2294.
9. Labowsky M., Fenn J.B., de la Mora J.F. // Anal. Chem. Acta. 2000. V. 406. P. 105-118.
10. Fenn J.B., Mann M., Meng C.K., Wong S.F., Whitehouse CM. // Science. 1989. V. 246. No 4926. P. 64-71.
11.  F.W., Bramer-Weger E.,  L. // J. Phys. Colloques 1987. V. 48 (C6). P. 253-256.
12. Kebarle P., Peschke M. // Anal. Chem. Acta. 2000. V. 406. P. 11-35.
13. Nguyen S., Fenn J.B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104 / P. 1111-1117.
14. Wilm M. // Mol. Cell.& Proteomics. 2011: M111.009407.
15. Balakin Α.Α., Dodonov A.F., Novikova L.I., Talrose V.L. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2001. V. 15. No. 5. P. 489-495.
16. B.S. Yakovlev, V.L. Talrose, C. Fencelau. Membrane ion source for mass spectrometry. Anal. Chem, 1994, 66, 1704-1707.
17. Б.С. Яковлев. Использование трековых мембран для транспорта ионов из жидкости в газовую фазу. Химия высоких энергий, 1995, 29, 421-422).
18. А.А. Балакин, Е.А. Буйдо, С.Г. Хидиров. Способ транспорта ионов из полярной жидкости в вакуум и устройство для его осуществления. Патент РФ №2537961 от 14 ноября 2014 г. Опубл. 10.01.2015. Бюл. №1.
19. В.В. Разников, В.В. Зеленов, Е.В. Апарина, И.В. Сулименков, А.Р. Пихтелев, М.О. Разникова, Г.Н. Савенков. Способ анализа примесей в жидкостях при их просачивании через трековую мембрану с формированием и транспортировкой анализируемых ионов через радиочастотную линейную ловушку в масс-анализатор при воздействии сверхзвукового газового потока с возможным содержанием в нем метастабильно возбужденных атомов. Заявка на патент РФ №2015110662 от 26.03.2015 (прототип).
20. Douglas D.J., French J.B. Collisional focussing effects in radio frequency quadrupoles J. Am. Soc. Mass Spectrom. 3, 398-408 (1992).
21. Morris H.R., Paxton T., Panico M., McDowel R. and Dell Α., J. Prot. Chem. 16, 469-479(1997).
22. Tolmachev A.V., Chernushevich I.V., Dodonov A.F., Standing K.G., Nucl. Instrum. Methods Phys. Rev., В124, 112 (1997).
23. Ландау Л.Д., Лифшиц E.M. Механика, Наука, Москва, 1965, c. 119-121.
24. V.V. Raznikov, V.V. Zelenov New way to build a high-performance gas-dynamic interface to produce and transport ions into a mass analyzer. International Journal of Mass Spectrometry V. 325-327 (2012) 86-94.
25. В.В. Разников, В.В. Зеленов, Е.В. Апарина, М.О. Разникова, А.Р. Пихтелев, И.В. Сулименков, А.В. Чудинов, Г.Н. Савенков, Л.А. Тихомиров. Способ структурно-химического анализа органических и биоорганических соединений на основе масс-спектрометрического и кинетического разделения ионов этих соединений. Патент РФ №2402099 с приоритетом от 14.07.2009 г. Выдан 20.10.2010 г.
26. В.В. Разников, В.В. Зеленов, М.О. Разникова, А.Р. Пихтелев, И.В. Сулименков Способ структурно-химического анализа органических и биоорганических соединений при разделении ионов этих соединений в сверхзвуковом газовом потоке, направленном вдоль линейной радиочастотной ловушки. Патент РФ №2420826 от 10.06.2011 (аналог).
27. В.В. Разников, В.В. Зеленов, А.В. Апарина, М.О. Разникова, А.Р. Пихтелев, И.В. Сулименков, А.В. Чудинов. Способ разделения ионов органических и биоорганических соединений в сверхзвуковом газовом потоке, предварительной регистрации и транспортировки этих ионов в последующий масс-анализатор. Патент РФ №2474916 от 10.02.2013.
28. В.В. Разников, В.В. Зеленов, Чудинов А.В., И.В. Сулименков, А.Р. Пихтелев, М.О. Разникова, Савенков Г.Н. Способ анализа примесей в газовых смесях при их напуске в виде внеосевого сверхзвукового газового потока через источник электронной ионизации и радиочастотный квадруполь с последующим выводом ионов в масс-анализатор. Заявка 2014132341, 06 августа 2014 г.
29. Разников В.В., Разникова М.О. Информационно-аналитическая масс-спектрометрия "Наука", М., 1992 г.
30. Разников В.В., Пихтелев А.Р., Разникова М.О., Лобода А.В. Новые подходы к преобразованию и анализу масс-спектрометрической и хромато-масс-спектрометрической информации. Известия Академии Наук, Энергетика, N1, 1997, сс. 87-106.
31. Разников В.В., Пихтелев А.Р., Разникова М.О. Анализ не полностью разрешенных масс-спектрометрических данных. Масс-спектрометрия 3(2), 2006, стр. 113-130.
32. Разников В.В., Додонов А.Ф., Егоров В.А., Разникова М.О. Масс-эффузиометрический метод анализа газовых смесей. Всесоюзное науч.-техн. совещание «Разработка и применение специализированных масс-спектрометрических установок», Москва, 1983, Тезисы докладов, с. 100-101.
33. В.В. Разников, М.О. Разникова. Декомпозиция многомерных зарядовых распределений ионов биоорганических соединений при ионизации электрораспылением. Часть 1. Теоретические основы и реализация метода. Масс-спектрометрия, 2013, т. 10 (3), стр. 175-182.
34. Козловский В.И., Сулименков И.В., Брусов B.C., Зеленов В.В. Способ масс-спектрометрического анализа газовой пробы в тлеющем разряде и устройство для его осуществления. Патент РФ №2529009 от 30.07.2014 г (аналог).
35. Wells G.J. United States Patent 7,353,965 B2, April 1, 2008. Rotating excitation field in linear ion processing apparatus (аналог).
36. Schultz J.A. Raznikov V. United States Patent 6,992,284. January 28,2006. Ion mobility TOF/MALDI/MS using drift cell alternating high and low electric field.
37. K. Chingin, J. Astorga-Wells, M.P. Najafabadi, T. Lavold, R.A. Zubarev Separation of polypeptides by isoelectric point focusing in electrospray-friendly solution using a multiple-junction capillary fractionator. Anal. Chem. 2012, 84, 6856-6862.
38. M. Pirmoradian, B. Zhang, K. Chingin, J. Astorga-Wells, R.A. Zubarev Membrane-assisted isoelectric focusing device as a micropreparative fractionators for two-dimensional shotgun proteomics Anal. Chem. 2014, 86, 5728-5732.
39. Berkout V.D., Doroshenko V.M. United States Patent 7397029, July 8, 2008. Method and apparatus for ion fragmentation in mass spectrometry.
40. В.В. Разников, М.О. Разникова. Декомпозиция многомерных зарядовых распределений ионов биоорганических соединений при ионизации электрораспылением. Часть 2. Тестирование метода на одномерных данных. Масс-спектрометрия, 2013, т. 10 (3), стр. 183-190.
41. Разников В.В., Козловский В.И., Зеленов В.В., Сулименков И.В., Пихтелев А.Р., Разникова М.О. Способ анализа смесей химических соединений на основе разделения ионов этих соединений в линейной радиочастотной ловушке. Патент РФ №2502152 от 20.12.2013 (аналог).
42. Raznikov V.V., Schultz J.A., Egan T.F., Ugarov M.V., Tempez Α., Savenkov G.N., Zelenov V.V. United States Patent 7,482,582, January 27, 2009. Multi-Beam Ion Mobility Time-of-Flight Mass Spectrometry with Multi-Channel Data Recording.
43. Schultz J.Α., Raznikov V.V., Egan T.F., Ugarov M.V., Tempez Α., Raznikova M.O., Zelenov V.V., Pikhtelev A.R., Vaughn V. United States Patent 7,547,878, June 16, 2009. Neutral/Ion Reactor in Adiabatic Supersonic Gas Flow for Ion Mobility Time-Of-Flight Mass Spectrometry (аналог).
44. Raznikov V.V., Soulimenkov I.V., Kozlovski V.I., Pikhtelev A.R., Raznikova M.O., Horvath T., Kholomeev A.A., Zhou Z., Wollnik H., Dodonov A.F., "Ion rotating motion in gas-filled radio-frequency quadrupole ion guide as a new technique for structural and kinetic investigations of ions", Rapid Commun. Mass Spectrom. 15, 1912-1921 (2001) (аналог).
45. Raznikov V.V., Kozlovsky V.I., Dodonov A.F., Raznikova M.O. "Heating of Ions Moving in a Gas Under the Influence of a Uniform and Constant Electric Field", Rapid Commun. Mass Spectrom. 13, 370-375,1999.
46. М.О. Разникова, В.В. Разников Вероятностный расчет зарядовых состояний биомолекул, порождающих масс-спектры многозарядных ионов. Журнал молекулярной биологии 2015, том 49, N5, с. 817-825.
47. Г.Н. Савенков, Ю.П. Байдаровцев, К.Н. Янчивенко, А.Н.Пономарев Плазмохимическое формирование полимерных пленок на твердых поверхностях с использованием продуктов термической деструкции полимеров. Химия высоких энергий, 1996, т. 30, №1, с. 65-67.