СПОСОБЫ СОХРАНЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ РИБОНУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
METHODS FOR PRESERVING BIOLOGICAL ACTIVITY OF RIBONUCLEIC ACIDS

Настоящее изобретение относится к контролю экспрессии генов с помощью двухнитевой РНК. В частности, настоящее изобретение относится к способу повышения способности двухнитевой РНК, вводимой экзогенно, т.е. извне по отношению к целевому организму и в относительно суровых условиях окружающей среды, осуществлять сайленсинг экспрессии генов в этом организме. Настоящее изобретение также относится к композициям для применения в способе и к применению в способе конкретных известных сшивающих средств и/или кислот.
Явление РНК-интерференции, потенциально способное обеспечивать сайленсинг экспрессии генов, является хорошо известным.
РНК является относительно нестабильной и может быстро разрушаться, например, с помощью рибонуклеаз, которые повсеместно присутствуют вне клеток. Проблема с применением dsRNA либо непосредственно по отношению к целевым организмам, либо посредством экзогенного введения в участок, в котором они находятся, связана с плохой стабильностью РНК. Под экзогенным применением подразумевают применение по отношению к целевому организму таким образом, что организм может включать ее, или что dsRNA продуцируется первым организмом, который отличается от целевого организма, и что целевой организм включает первый организм или его часть, содержащую dsRNA, так что указанная dsRNA способна осуществлять посттранскрипционный сайленсинг гена, содержащего нуклеотидную последовательность, соответствующую нуклеотидной последовательности, содержащейся в dsRNA. Экзогенное применение отличается от эндогенного продуцирования, под которым подразумевается продуцирование (обычно посредством экспрессии соответствующей гетерологичной последовательности) в клетках целевого организма двухнитевой РНК, способной осуществлять посттранскрипционный сайленсинг генов, на которые она нацеливается.
Хотя экзогенно применяемая dsRNA обычно способна оказывать соответствующий биологический эффект в течение короткого периода времени, возможно даже на протяжении нескольких дней после применения, данный эффект обычно быстро снижается при применении dsRNA, которая, как правило, имеет период полужизни, например в почве, составляющий только приблизительно 12-24 часа, и дополнительно зависит от определенных условий окружающей среды, в которую ее вводят. Были предложены различные решения этой проблемы, в том числе стабилизация dsRNA посредством инкапсулирования или ее связывание иным образом с полимером, который повышает ее стабильность, за счет чего обеспечивается увеличенная продолжительность действия. Существует 2 аспекта в отношении продолжительности эффекта. Ген, осуществляющий сайленсинг самого себя, перестанет действовать в зависимости от скорости обмена соответствующего белка. При инкубировании с почвой в условиях окружающей среды dsRNA разрушается в течение приблизительно 2 дней. Хотя dsRNA может обладать значительно более длительным эффектом, чем этот, преимуществом настоящего изобретения является увеличение стойкости dsRNA в окружающей среде.
Таким образом, настоящее изобретение относится к решению проблемы относительно быстрой инактивации dsRNA, которую применяют по отношению к организму экзогенно, как правило, в полевых условиях, которые обычно способствуют ее быстрому разрушению или инактивации.
В соответствии с настоящим изобретением предусматривается способ, по существу, поддержания или обеспечиваемого иным образом сохранения биологической активности dsRNA, присутствующей в клетке, для осуществления посттранскрипционного сайленсинга экспрессии гена в целевом организме, включающий стадию добавления к композиции, содержащей клетку, соединения, имеющего функцию средства, сшивающего белок или амин, и/или кислоты.
В одном аспекте настоящего изобретения полиамин или белок добавляют к композиции с клеткой перед добавлением средства, сшивающего белок или амин, в результате чего полиамин или белок будут связываться с группами карбоновой кислоты на клеточной поверхности и будут образовывать внешний стабилизирующий слой после сшивания, что приводит к большему сохранению биологической активности dsRNA, присутствующей в клетке.
Сшивающее средство и/или кислоту можно добавлять к композиции, содержащей клетку, перед введением композиции в участок. Под участком понимают местоположение, в которое вводят композицию с клеткой, содержащую средство, и которое включает поле, на котором растут растения, или на котором высевают семена культурных растений, или почву, в которую будут помещать такие семена или растения, или фактически поле, почву, семена и/или растения per se.
В предпочтительном варианте осуществления способа участок представляет собой почву, и композицию применяют по отношению к ней вблизи растений, которые требуется защитить посредством нацеливания dsRNA на необходимый ген у насекомого-вредителя, такого как, например, кукурузный жук.
Сшивающее средство может быть выбрано из группы, состоящей из полиальдегидов, диальдегидов, диэпоксидов, полиэпоксидов, пиридилдисульфидов, карбодиимидов, ди- или полиизоцианатов, полифункциональных малеимидов, сложных ди- или полиимидоэфиров, бисдиазония, сложных н-гидроксисукцинимидных эфиров и галогенацеталей, а также фактически любых других известных сшивающих средств, которые содержат по меньшей мере две функциональные группы, которые могут быть одинаковыми или различными. Некоторые сшивающие средства умеренно растворимы в воде, и в этом случае их можно удобно применять в растворах в подходящих растворителях или смесях воды и таких растворителей. Более предпочтительно средство выбрано из группы, состоящей из полиальдегидов и диальдегидов, и еще более предпочтительно диальдегидов. Наиболее особенно предпочтительным диальдегидом является глутаральдегид, конкретное применение которого в способе по настоящему изобретению проиллюстрировано ниже. Глутаральдегид является предпочтительным, поскольку его реакционная способность такова, что реакция проходит довольно быстро, но не настолько быстро, что ее трудно проводить. Он относительно нетоксичный, легко растворяется в воде, легкодоступный и недорогой.
Кислота может представлять собой органическую кислоту или неорганическую кислоту. Предпочтительно кислота представляет собой слабую кислоту, более предпочтительно органическую кислоту, более предпочтительно органическую кислоту, содержащую 1-5 атомов углерода, и наиболее предпочтительно молочную кислоту или муравьиную кислоту. Не ограничиваясь какой-либо конкретной интерпретацией механизма действия, подразумевается, что применение кислоты для инактивации клеток согласно настоящему изобретению может приводить к денатурации белков, что приводит к большей устойчивости dsRNA в окружающей среде.
В конкретном варианте осуществления клетки представляют собой бактериальные клетки, хотя можно использовать и другие клетки, в том числе клетки водорослей и даже растительные или другие эукариотические клетки.
В случае, если клетки представляют собой бактериальные клетки, сшивающее средство и/или кислоту можно применять по отношению к клеткам для их инактивации. Соответственно, сшивающее средство и кислота могут иметь две функции. Первая функция состоит в инактивации клеток, а вторая в сохранении биологической активности dsRNA, присутствующей в клетке.
В качестве альтернативы, сшивающее средство и/или кислоту применяют по отношению к клеткам, которые предварительно были инактивированы, и они имеют одну функцию, которая состоит в сохранении биологической активности dsRNA, присутствующей в клетке. Из уровня техники известны различные способы инактивации, в том числе инактивация нагреванием (при условиях температуры и продолжительности, варьирующих в довольно широком пределе), химическая инактивация посредством таких веществ как перуксусная кислота, аскорбат меди(II), гипохлорит натрия, пероксид водорода, тиоцианат гуанидиния, формальдегид и другие моноальдегиды, и подвергание их воздействию ионизирующего излучения.
Сшивающее средство можно добавлять к композиции с клеткой без кислоты, кислоту можно добавлять без сшивающего средства, или, в качестве альтернативы, и то и другое добавляют к композиции с клеткой последовательно в любом порядке.
Независимо от того, какой способ применяют, полученная в результате композиция с клеткой не содержит каких-либо бактерий, которые являются биологически жизнеспособными.
Клетки, которые могут являться прокариотическими или эукариотическими, сконструированы так, чтобы содержать последовательность ДНК, которая при транскрибировании дает двухнитевую РНК, по меньшей мере часть которой содержит последовательность, которая по существу идентична последовательности мРНК гена в прокариотической или эукариотической клетке, в частности клетке вредителя растений, такого как, например, насекомое. Типичные примеры таких насекомых-вредителей включают Diabrotica virgifera virgifera (западный кукурузный жук), Diabrotica barberi (северный кукурузный жук), Diabrotica undecimpunctata howardi (южный кукурузный жук), Diabrotica virgifera zeae (мексиканский кукурузный жук) и Diabrotica speciosa (тыквенный жук). Вредители, в отношении которых dsRNA может являться эффективной, также включают различных вредителей, хорошо известных агроному, таких как нематоды, проволочные черви и червовидные личинки, а также соответствующие почвенные патогены, такие как бактерии и грибы.
Концентрация сшивающего средства, присутствующего в композиции с клеткой или добавленного к ней, является относительно значительной. В случае, если сшивающее средство присутствует в слишком большом или слишком малом количестве, или его добавляют в слишком большом или слишком малом количестве, или, в ином случае, находится в участке, в который добавили композицию с клеткой, в слишком большом или слишком малом количестве, то dsRNA, способная проявлять эффект посттранскрипционного сайленсинга генов, не так эффективна. В случае, если средство представляет собой глутаральдегид, средство присутствует в композиции с клеткой/в участке в количестве от 5 до 0,001%, более предпочтительно от 2,5 до 0,005% и наиболее предпочтительно от 1 до 0,01%, где % приведен в пересчете на конечный объем композиции с клеткой. Специалисту в данной области будет понятно, что с целью получения благоприятного эффекта как от инактивации клеток, так и от стабилизирующего эффекта сшивающего средства в отношении dsRNA потребуется более высокая концентрация, чем в случае, когда сшивающее средство добавляют к клеткам, которые предварительно инактивировали.
Соответственно, в случае применения как для инактивации клеток, так и для стабилизации dsRNA, концентрация сшивающего средства (в частности глутаральдегида) составляет по меньшей мере приблизительно 0,1%, и предпочтительно средство присутствует в композиции с клеткой/в участке в количестве от 1 до 0,1%. В качестве альтернативы, когда сшивающее средство применяют для стабилизации dsRNA, и клетки предварительно инактивировали, концентрация сшивающего средства (в частности глутаральдегида) составляет по меньшей мере приблизительно 0,01%, и предпочтительно средство присутствует в композиции с клеткой/в участке в количестве от 1 до 0,01%.
В предпочтительном варианте осуществления способа клетка представляет собой бактериальную клетку, и средство представляет собой глутаральдегид, который присутствует в композиции с клеткой в количестве от 1 до 0,01% конечного объема композиции. Не ограничиваясь какой-либо конкретной интерпретацией механизма действия, подразумевается, что избыточное количество сшивающего средства снижает биодоступность dsRNA, тогда как слишком малое количество сшивающего средства не обеспечивает требуемого улучшения стабильности и не обеспечивает инактивацию клеток.
В предпочтительном варианте осуществления способа клетка представляет собой бактериальную клетку, и кислота представляет собой муравьиную кислоту или молочную кислоту, которая присутствует в композиции с клеткой в количестве от 1 М до 0,1 М в композиции.
Применение способа по настоящему изобретению обеспечивает весьма значительное продление продолжительности биологической активности, связанной с dsRNA, присутствующей в клетке, как правило, поддерживая активность в почвенной среде при температуре выше приблизительно 12 градусов Цельсия в течение периодов до 21 дня и более по сравнению с dsRNA, которую вводили в почву, но при этом не применяли сшивающее средство.
Настоящее изобретение также предусматривает композицию, содержащую клетку и средство, сшивающее белок, характеризующуюся тем, что композиция содержит почву, клетка содержит dsRNA, и средство представляет собой глутаральдегид.
Настоящее изобретение также предусматривает композицию, содержащую клетку и кислоту, характеризующуюся тем, что композиция содержит почву, клетка содержит dsRNA, и кислота представляет собой молочную кислоту или муравьиную кислоту.
Настоящее изобретение также предусматривает композицию с клеткой, содержащую средство, сшивающее белок, и/или кислоту, добавленные с целью поддержания биологической активности dsRNA, гетерологично экспрессируемой в клетке, а также применение средства, сшивающего белок, и/или кислоты для, по существу, стабилизации или обеспечиваемого иным образом сохранения биологической активности dsRNA, присутствующей в клетке.
Настоящее изобретение будет более очевидным из следующих неограничивающих примеров.
ПРИМЕРЫ
Получение тестируемых образцов ферментация
Плазмиду, содержащую кассету экспрессии dsRNA, управляемую Т7, вводили посредством трансформации в клетки Е. coli HT115(DE3).
Для получения dsRNA культуру инокулировали из одной колонии и выращивали в течение ночи в среде LB, содержащей соответствующие антибиотики.
Затем ночную культуру разбавляли до OD600=1 с применением LB, содержащей соответствующие антибиотики. Для индуцирования транскрипции dsRNA IPTG добавляли до конечной концентрации, составляющей 1,0 мМ. Затем культуру инкубировали в течение 3,5 часов при 37°С со встряхиванием при 250 об./мин.
После индукции культуру центрифугировали, ресуспендировали при соответствующей OD600, как правило, от 50 до 100 единиц/мл (где 1 единица соответствует 1 мл клеток при OD600=1), и удаляли надосадочную жидкость. Затем осадок инактивировали для дальнейших экспериментов.
Инактивация нагреванием. Бактерии уничтожали посредством термообработки, как правило, с помощью обработки HTST, способа "кратковременной обработки при высокой температуре", который состоит в нагревании бактериального бульона в проточном потоке, как хорошо известно для способов пастеризации. Нежизнеспособность бактерий подтверждали посредством посева штрихом аликвоты обработанного бульона на чашку с LB и инкубирования в течение ночи при 37°С.
Состав для повышенной стабильности в почве (фигура 1).
1) Обработка спиртом: осадки бактерий ресуспендировали в 100% метаноле или 100% изопропаноле и хранили при 4°С. Перед проведением биологических анализов образцы высушивали в speedvac и ресуспендировали в воде при соответствующей OD600.
2) Обработка кислотой: осадки бактерий ресуспендировали в кислоте с конечной концентрацией 0,5 М, включая лимонную, муравьиную или молочную кислоту, рН 3,5. Образцы инкубировали в течение 4 часов при комнатной температуре со встряхиванием при 35 об./мин. на роллерных шейкерах, после этого образцы центрифугировали, дважды промывали водой и ресуспендировали при соответствующей OD600. Образцы хранили при 4°С до проведения биологического анализа.
3) Обработка глутаральдегидом: осадки бактерий ресуспендировали в глутаральдегиде с конечной концентрацией 0,1% или 0,5%. Образцы инкубировали в течение 2 часов, 4 часов или 72 часов при комнатной температуре со встряхиванием при 35 об./мин. на роллерных шейкерах, затем образцы центрифугировали, дважды промывали и ресуспендировали при соответствующей OD600. Образцы хранили при 4°С до проведения биологического анализа.
Для каждого способа инактивации нежизнеспособность бактерий подтверждали посредством посева штрихом аликвоты обработанного бульона на чашку с LB и инкубирования в течение ночи при 37°С.
ТЕМ микроскопия
Целостность клеточной мембраны и общий вид клеток после стадии инактивации проверяли посредством ТЕМ микроскопии. Вкратце, образцы фиксировали в буфере на основе какодилата натрия, содержащем 2% параформальдегида и 2% глутаральдегида, в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем образцы промывали и фиксировали второй раз с помощью 1% водного OsO4 и дополнительно ополаскивали. После инкубирования в течение ночи с блокирующим раствором для окрашивания, 0,5% водным уранилацетатом, образцы дополнительно промывали, затем дегидратировали с помощью этанола и заключали в смолу Spurr с последующей инкубацией в течение 10 часов в печи для обеспечения полимеризации. Образцы визуализировали посредством ТЕМ (фигура 2).
Результаты указывали, что клетки являются интактными в образцах, инактивированных с помощью муравьиной кислоты, молочной кислоты и глутаральдегида, тогда как в других образцах, обработанных с помощью метанола, изопропанола и лимонной кислоты, клеточные структуры и клеточная стенка оказались разрушенными.
Анализ биологической активности в почве. Анализ проводили с применением таких же образцов. Вкратце, различные аликвоты активного ингредиента получали посредством смешивания инактивированного образца, экспрессирующего либо контроль GFP-dsRNA, либо активную в отношении Dvs006.5 dsRNA. Тестируемые образцы включали образцы бактерий, инактивированные посредством термообработки, обработки глутар альдегидом, обработки кислотой или обработки спиртом. По отношению к почве в 48-луночных планшетах применяли различные количества образцов для достижения конечных концентраций dsRNA, эквивалентных 2,5 мкг, 25 мкг или 50 мкг. Планшеты инкубировали при 25°С в течение 0, 3 и 7 дней перед заражением личинками.
После 24-часового инкубирования в планшетах с почвой по меньшей мере 30 личинок на обработку переносили в планшеты с искусственной питательной средой (1 личинка на лунку). Смертность личинок оценивали ежедневно в течение 7 дней. Представлены данные о смертности личинок через 7 дней после заражения (фигуры 3, 4 и 5). При добавлении активного ингредиента в планшеты с почвой в день заражения личинками (день 0) все образцы вызывали значительную смертность, включая инактивированные посредством термообработки (HTST), обработок спиртом, обработок кислотой или обработок глутаральдегидом. Это указывало на то, что различные способы инактивации не влияли на биодоступность dsRNA.
После 3 или 7 дней инкубирования в почве, как и ожидалось, явное снижение активности наблюдали для образцов HTST (<60% смертности в день 3 и <25% смертности в день 7). Для обработок спиртом, метанолом и изопропанолом соответственно улучшения по сравнению с контролем HTST не наблюдали (фигура 3).
Интересно отметить, что для образцов, обработанных муравьиной и молочной кислотой, наблюдали явное улучшение по сравнению с контролем HTST, при этом приблизительно 80% смертности все еще наблюдали после 3 и 7 дней инкубирования в почве. Лимонная кислота не показала улучшения по сравнению с контролем (фигура 4).
Для образцов, обработанных с помощью 0,1 или 0,5% глутар альдегида, эффект был еще большим, и смертность, достигаемая на 3 и 7 день, сохранялась на уровне выше 90%, которая была значительно выше, чем у контроля HTST (фигура 5).
Данные показывают, что dsRNA в образцах бактерий, обработанных с помощью 0,5 М муравьиной кислоты или молочной кислоты (фигуры 4.В и С) или глутар альдегида с конечной концентрацией 0,1 или 0,5% (фигуры 5.А и В), была устойчивой в почве до 7 дней; такие обработки обеспечивали способ, при котором активный ингредиент был защищен от разрушения в почве, что, таким образом, продлевало устойчивость dsRNA.
Описание графических материалов
Фигура 1. Представление способов инактивации.
Фигура 2. ТЕМ микроскопия инактивированных клеток.
Фигура 3. Сравнение смертности личинок через 7 дней после заражения почвы, обработанной с помощью образцов, инактивированных нагреванием (черные столбцы), или с помощью образцов, обработанных (А) метанолом или (В) изопропанолом (полосатые столбцы). Во всех образцах целевой ген соответствовал мишени Dvs006.5. Образцы применяли по отношению к почве в день 0, за 3 дня и за 7 дней до заражения личинками.
Фигура 4. Сравнение смертности личинок через 7 дней после заражения почвы, обработанной с помощью образцов, инактивированных нагреванием (черные столбцы), или с помощью образцов, обработанных (А) лимонной кислотой, (В) муравьиной кислотой или (С) молочной кислотой (полосатые столбцы). Во всех образцах целевой ген соответствовал мишени Dvs006.5. Образцы применяли по отношению к почве в день 0, за 3 дня и за 7 дней до заражения личинками.
Фигура 5. Сравнение смертности личинок через 7 дней после заражения почвы, обработанной с помощью образцов, инактивированных нагреванием (черные столбцы), или с помощью образцов, обработанных (А) 0,1% глутар альдегидом или (В) 0,5% глутар альдегидом (полосатые столбцы). Во всех образцах целевой ген соответствовал мишени Dvs006.5. Образцы применяли по отношению к почве в день 0, за 3 дня и за 7 дней до заражения личинками.