Изучение сорбции метилксантинов на силикагелях

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

М.Л. Пивовар, А.И. Жебентяев

ИЗУЧЕНИЕ СОРБЦИИ МЕТИЛКСАНТИНОВ НА СИЛИКАГЕЛЯХ

Витебский государственный медицинский университет

Определены оптимальные условия сорбции теобромина, теофиллина, кофеина и пентоксифиллина из водных растворов на немодифицированных и химически модифицированных силикагелях. Изучено влияние ионной силы и pH раствора на сорбционное равновесие. Рассчитаны предельная адсорбция, константы адсорбционного равновесия, свободная энергия Гиббса переноса из водной фазы в фазу сорбента и константы межфазного распределения метилксанти-нов на 6химически модифицированных силикагелях и 1 немодифицированном силикагеле. Установлено, что лучшими сорбентами для извлечения изученных веществ из водн ыхрастворов являются Диасорб-100- С8 и Диасорб-100-С16. Оптимальным диапазоном для извлечения изученных веществ является рН=3-7. Оптимальными растворителями для элюирования метилксантинов с химически модифицированных силикагелей являются этанол, ацетонитрил и ацетон.

Ключевые слова: теобромин, теофиллин, кофеин, пентоксифиллин, сорбция.

ВВЕДЕНИЕ

Кофеин является психостимулятором и ана-лептиком, входит в состав ряда лекарственных средств и продуктов питания. Пентоксифиллин улучшает микроциркуляцию и обладает ангиопротективной активностью. Теофиллин и теобромин обладают спазмолитическим действием. Теофиллин применяется при синдроме бронхо-легочной обструкции [1]. Использование данных лекарственных средств в медицинской практике обусловливает необходимость определять их содержание в био-

жидкостях или пробах тканей при проведении фармакокинетических исследований или в случае отравления.

Метод твердофазной экстракции широко применяется для извлечения веществ из различных объектов, в т.ч. из биоматериала. В литературе имеются сведения об использовании различных видов сорбентов (химически модифицированных силикагелей (ХМС) и полимеров) при пробоподготовке и анализе объектов, содержащих метилксантины. Например, группой авторов [2] предлагается при пробоподготовке использовать сорбент С18 (октадецилсиликагель) для определения содержания кофеина в китайских традиционных лекарственных средствах методом ВЭЖХ. Аналогичный сорбент предлагается использовать для выделения ряда лекарственных веществ (в т.ч. кофеина) из проб воды [3 7].

Для извлечения метилксантинов используются и другие сорбенты. Например, авторами статьи [8] изучена сорбция веществ разной химической природы (в т.ч. кофеина и его метаболитов) из проб воды при нейтральных значениях pH на сорбентах, сополимерах стирола и метакрилата, а также стирола и N-ви-нилпирролидона (Oasis HLB sorbent). Аналогичный сорбент (Oasis HLB) предложено использовать при определении содержания кофеина, никотина и других веществ в пробах вод [9, 10].

Для определения теофиллина и кофеина в плазме крови описано использование мо-лекулярно-импрегнированных полимеров [11-13].

Следует отметить, что использование полимерных сорбентов ограничивается их высокой стоимостью. Наиболее доступными и распространенными являются химически модифицированные силикагели. Но в литературных источниках отсутствует обоснование выбора сорбента для пробоподготовки, значительно различаются условия подготовки патронов твердофазной экстракции (ТФЭ) к работе, собственно пробоподготовки и элюирования веществ. Кроме того, нами не обнаружены данные, которые позволяли бы сделать вывод об эффективности различных ХМС для

сорбции метилксантинов.

Целью настоящей работы является изучение сорбционных характеристик метилксан-тинов на химически модифицированных и немодифицированных силикагелях для проведения пробоподготовки при химико-токсикологическом исследовании биоматериала.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали образцы теобромина, теофиллина (моногидрата), кофеина (моногидрата) и пентоксифиллина фармакопейной чистоты.

Для изучения сорбционных характеристик метилксантинов использовали модифицированные силикагели - Диасорб-100-CN, Диа-сорб-100-ЫН2, Диасорб-100-Фенил, Диасорб-100-C1, Диасорб-100-С8, Диасорб-100-С16 ("Биохиммак", Россия), а также немодифици-рованный силикагель - Силохром-С120 (диаметр пор 40-45 нм). Силохром-С120 перед экспериментом гидроксилировали кипячением (3 часа) в 0,1°М хлороводородной кислоте, после чего его отмывали водой очищенной до нейтральной реакции промывных вод и отрицательной реакции на хлорид ионы. После этого сорбент сушили до постоянной массы при температуре 70-75°C. Химически модифицированные силикагели дополнительной подготовке не подвергались.

Для создания ионной силы использовали натрия хлорид (ч.д.а.), значения pH создавали растворами хлористоводородной кислоты или натрия гидроксида и контролировали при помощи иономера И-160.

В работе использовали органические растворители: этанол (ч.д.а.), ацетон (ч.д.а.), ацетонитрил (2 сорт).

Для регулирования скорости пропускания жидкостей через патроны ТФЭ использовали систему вакуумной пробоподготовки Visiprep SPE Vacuum Manifolds (Supelco).

бавляли 10 мл водных растворов метилксан-тинов с известным значением pH и ионной силой и перемешивали на шейкере. По окончании флаконы центрифугировали при 3000 об/мин 5 мин для ускорения осаждения взвеси сорбента. Анализ водной фазы осуществляли УФ-спектрофотометрическим методом на регистрирующем спектрофотометре Specord 250.

Методика изучения десорбции метилк-сантинов в динамических условиях. Сорбционные патроны готовили непосредственно перед выполнением операции суспензионным методом. Навеску 1,00 г ХМС суспендировали в 3,0 мл этанола и переносили в полипропиленовые патроны длиной 80 мм и диаметром 10 мм. Слой сорбента уплотняли под вакуумом. Патрон кондиционировали 3 мл этанола, затем 1,5 мл воды очищенной дважды. Пропускали раствор аналита и промывали патрон 1,5 мл воды очищенной дважды. Патрон подсушивали в токе воздуха и элюировали аналит различными органическими растворителями (порциями по 0,5 мл). Скорость элюирования на всех этапах составляла 0,5 мл/ мин. Элюат высушивали в токе воздуха при температуре 40°С. Остаток растворяли в 500 мкл воды очищенной и анализировали на жидкостном хроматографе Agilent 1100 с фотодиодноматричным детектором. Условия хроматографирования: хроматографическая колонка

- Zorbax SB С-18 4,6x250 мм, зернение 5 мкм, температура колонки 30°С. Разделение проводили в градиентном режиме. Подвижная фаза А - вода деионизированная; подвижная фаза В - ацетонитрил. Расход элюента 1,0 мл/ мин. Детектирование осуществляли при длине волны А=273 нм, объем инжектируемой пробы 50 мкл. Режим элюирования представлен в таблице 1.

РЕЗУЛЬТАТЫИ ОБСУЖДЕНИЕ

Методика изучения сорбции метилксан-тинов в статических условиях. Температура при изучении сорбционных характеристик составляла 20±1°С. Точные навески сорбентов (0,100 г) помещали во флаконы объемом 12 мл. Перед добавлением водной фазы все ХМС смачивали 200 мкл этанола. Затем при-

Время установления равновесия. Зависимость сорбционного равновесия кофеина от времени показана на рисунке 1. Аналогичный вид имеют зависимости сорбции теобромина, теофиллина и пентоксифиллина от времени.

Как видно из приведенной графической за-

Таблица 1 - Режим градиентного элюирования метилксантинов

Время, мин Подвижная фаза А Подвижная фаза В Режим

0-15,0 95 ^ 70 5 ^ 30 градиентный

15,0-17,0 70 30 изократический

17,0-17,1 70 ^ 95 30 ^ 5 градиентный

17,1-20,0 95 5 изократический

Рисунок 1 - Зависимость сорбции пентоксифиллина от времени

висимости, сорбционное равновесие в системе устанавливается за 5-7 мин, что позволяет использовать данные сорбенты при выделении метилксантинов в динамических условиях.

Влияние pH и ионной силы водной фазы. Присутствие сильных электролитов в растворе оказывает одинаковое влияние на сорбцию всех изученных веществ. Ионная сила раствора в диапазоне значений 0,01-0,1 практически не влияет на сорбцию аналитических количеств изученных метилксантинов. При дальнейшем увеличении ионной силы до 0,5-1,0 наблюдается незначительное увеличение сорбции на всех изученных сорбентах. Данное явление можно объяснить, очевидно, высаливанием молекул изучаемых веществ из раствора.

Кофеин и пентоксифиллин являются слабыми органическими основаниями (рКВН+ =

0,3 [14]) и способны ионизироваться только в сильнокислой среде. Теобромин и теофиллин, кроме того, обладают слабыми кислотными свойствами (у теобромина рКа = 10,0, у тео-филлина рКа = 8,6 [14]) и ведут себя в раство-

ре как амфолиты. Исходя из вышесказанного, можно сделать вывод, что в диапазоне устойчивости изученных сорбентов (pH = 2-8) будет частично подвержен ионизации только теофиллин. Теобромин, кофеин и пентокси-филлин будут находиться в молекулярной форме, и изменение pH на сорбцию данных веществ не должно оказывать влияния.

На рисунке 2 представлена зависимость сорбции теофиллина от pH раствора. Исследования проводились при ионной силе 0,01. Как видно из приведенной графической зависимости, в изученном диапазоне значений pH сорбция теофиллина практически не изменяется. Только при pH 2 и 8 наблюдается незначительное снижение сорбции, вызванное, очевидно, увеличением содержания ионов теофиллина в растворе.

Нами экспериментально установлено, что при pH = 3-8 сорбция теобромина, кофеина и пентоксифиллина практически не изменяется. Только при pH = 2 наблюдается незначительное снижение сорбции изученных веществ из водных растворов, вызванное, очевидно, увеличением ионизации веществ в растворе.

Рисунок 2 - Зависимость сорбции

Изотермы сорбции. Определение параметров сорбции изучаемых веществ из водных растворов производилось при ионной силе 0,01 и pH = 5,0. Изотермы сорбции изучаемых метилксантинов удовлетворительно описываются уравнением Ленгмюра (1):

1

1

г к г +г 'с

ОО ОО

где: с - равновесная концентрация сорбата в растворе, М; Г - равновесная адсорбция при данной концентрации, моль/г; Г предельная адсорбция, моль/г; К - константа адсорбционного равновесия.

Константу межфазного распределения (Кй) и свободную энергию Гиббса переноса ме-тилксантинов из водной фазы в фазу сорбентов рассчитывали по уравнениям (2) и (3), соответственно:

Kd = К-Г (2),

АО0 = -2ДЙТ ^Kd (3).

Результаты определения сорбционных характеристик изучаемых метилксантинов приведены в таблице 2.

Как видно из полученных данных, все изученные метилксантины лучше сорбируются на гидрофобных сорбентах (Диасорб-100-С1, -С8, -С16 и -Фенил), чем на гидрофильных (Ди-асорб-100-С^ -NH2 и Силохром С120). Следует заметить, что сорбция изученных веществ возрастает с увеличением гидрофобности сор-

бента и достигает максимальных значений на сорбентах Диасорб-100-С8 и -C16. Данное явление можно объяснить преимущественным вкладом в сорбцию метилксантинов гидрофобных взаимодействий сорбата и сорбента. Это также объясняет описанную выше закономерность, что максимальная сорбция тео-филлина наблюдается при pH раствора 3-7. Молекулы теофиллина более гидрофобны, чем его ионы, и лучше переходят в привитой слой ХМС.

Данное предположение объясняет и то, что пентоксифиллин, как самое гидрофобное вещество из группы (logP (октанол/вода) = 0,3 [14]), лучше прочих сорбируется на гидро-фоб-ных сорбентах.

Десорбция метилксантинов. В связи с тем, что наиболее полная сорбция изученных веществ наблюдается при использовании сорбента Диасорб-100-С16, для изучения десорбции метилксантинов использовали патроны, заполненные данным сорбентом. В качестве элюентов использовали наиболее распространенные органические растворители: этанол, ацетонитрил и ацетон. Кривые десорбции пен-токсифиллина изображены на рисунке 3.

Как видно из приведенной диаграммы, изученные органические растворители равноэффективны, и для элюирования 95 % пенток-сифиллина с 1 г сорбента достаточно 2,5-3,0 мл элюента. Аналогичные зависимости на-

c

Таблица 2 - Параметры адсорбции метилксантинов на различных сорбентах

Сорбент a±Aa Ь10-3± ±AbT0"3 r Гш-10б, моль/г K-10'3, л/моль K, л/кг AG°, кДж/моль

Теобромин

Силохром C120 - - - - - - -

Диасорб-100-CN 1бб±б 131±23 0,99 7,б1 0,79 б -4,34

Диасорб-100-NH2 - - - - - - -

Диасорб-100-Фенил 43,3±0,4 17,4±3,7 0,99 57,3 0,40 23 -7,59

Диасорб-100-Cl 59,б±0,8 22,5±3,4 0,99 44,4 0,38 17 -б,82

Диасорб-100-C8 23,4±0,4 13,4±4,1 0,99 74,7 0,57 43 -9,08

Диасорб-100-C16 20,2±0,2 7,89±1,27 0,99 127 0,39 50 -9,43

Теофиллин

Силохром C120 - - - - - - -

Диасорб-100-CN 133±б 1б4±2б 0,99 б,08 1,24 8 -4,88

Диасорб-100-NH2 - - - - - - -

Диасорб-100-Фенил 81,8±2,3 75,8±24,б 0,99 13,2 0,93 12 -б,05

Диасорб-100-Cl 4б,2±1,1 32,1±5,8 0,99 31,2 0,70 22 -7,43

Диасорб-100-C8 17,2±0,4 11,5±5,8 0,99 87,0 0,б7 58 -9,81

Диасорб-100-C16 10,8±0,1 9,77±0,80 0,99 102 0,91 93 -11,0

Кофеин

Силохром C120 - - - - - - -

Диасорб-100-CN 88,б±1,8 б1,2±19,5 0,97 1б,3 0,б9 11 -5,8б

Диасорб-100-NH2 349±20 120±43 0,97 8,35 0,34 3 -2,54

Диасорб-100-Фенил 21,2±0,2 10,1±0,б 0,99 99,4 0,48 47 -9,31

Диасорб-100-Cl 2б,0±1,2 10,б±3,4 0,98 94,2 0,41 38 -8,82

Диасорб-100-C8 б,92±0,2б б,30±1,17 0,99 159 0,91 144 -12,0

Диасорб-100-C1б 3,88±0,34 7,б3±1,92 0,98 131 1,97 258 -13,4

Пентоксифиллин

Силохром C120 10б±19 139±53 0,97 7,21 1,31 9 -5,42

Диасорб-100-CN 30,4±0,8 10,8±2,8 0,98 92,2 0,3б 33 -8,44

Диасорб-100-NH2 393±11 9б,1±27,1 0,98 10,4 0,24 3 -2,2б

Диасорб-100-Фенил 4,72±0,38 11,0±2,2 0,98 91,0 2,33 212 -12,9

Диасорб-100-Cl 2,3б±0,27 10,4±2,2 0,98 9б,2 4,41 424 -14,б

Диасорб-100-C8 0,54±0,05 7,74±1,38 0,99 129,3 14,5 1870 -18,2

Диасорб-100-C1б 0,32±0,05 8,18±1,94 0,98 122,3 25,9 3170 -19,5

где: г - коэффициент корреляции уравнения Ленгмюра; а±да и Ь±дЬ - коэффициенты (с доверительными интервалами) уравнения Ленгмюра в линейной форме. Знак ” ” в ячейке указывает на отсутствие сорбции вещества на данном сорбенте.

блюдаются при десорбции теобромина, тео-филлина и кофеина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Определены оптимальные условия сорбции и десорбции теобромина, теофиллина, кофеина и пентоксифиллина на немодифици-рованных и химически модифицированных силикагелях.

2. Рассчитаны параметры адсорбции ме-тилксантинов на различных сорбентах.

3. Лучшими сорбентами для извлечения изученных веществ из водных растворов яв-

.raroTCfl fl,Hacop6-100-C8 u fl,Hacop6-100-C16.

SUMMARY

M.L. Pivavar, A.I. Zhebentyaev THE STUDY OF METHYLXANTHINES' SORPTION ON SILICAGELS The optimal conditions for sorption of theobromine, theophylline, caffeine and pentoxifylline from aqueous solutions on unmodified and chemically modified silicagels have been revealed. We have studied the effect of ionic strength and pH of the solution on the sorption equilibrium. The maximum adsorption, adsorption

Рисунок 3 - Кривые десорбции пентоксифиллина с Диасорба-100-C16

equilibrium constants, Gibbs free energy of transfer from the aqueous phase to the sorbent and constants of interfacial distribution of methylxanthines on б chemically modified silicagels and 1 unmodified silicagel have been calculated. We have established that the best sorbents for the extraction of the investigated substances from aqueous solutions are Diacorb-100-C8 and Diacorb-100-Об. The optimum range for the extraction of the investigated substances is pH = 3-7. The optimal solvents for the elution of methylxanthines from cartridges of solid phase extraction are ethanol, acetonitrile and acetone.

Keywords: theobromine, theophylline, caffeine, penthoxyphylline, sorption.

ЛИТЕРАТУРА

1. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в Беларуси: Справочник. - М.:Астра-ФармСервис, 2009. - 944с.

2. Solid-phase extraction for the determination of caffeine in traditional Chinese medicinal prescriptions containing Theae folium by high -performance liquid chromatography / Y.R. Ku [et al] // J. Pharm. Biomed. Anal. - 1999. - Vol. 20, № 1-2. - P. 351-35б.

3. Togola, A. Analytical development for analysis of pharmaceuticals in water samples by SPE and GC-MS / A. Togola, H. Budzinski // Anal. Bioanal. Chem.

- 2007. - Vol. 388, № 3. - P. б27-б35.

4. Verenitch, S.S. Determination of acidic drugs

and caffeine in municipal wastewaters and receiving waters by gas chromatography-ion trap tandem mass spectrometry / S.S. Verenitch, C.J. Lowe, A. Mazumder // J. Chromatogr. A. - 2006. - Vol. 1116, № 1-2. - P. 193-203.

5. Ternes, T Determination of neutral pharmaceuticals in wastewater and rivers by liquid chromatog-raphy-electrospray tandem mass spectrometry / T. Ternes, M. Bonerz, T. Schmidt // J. Chromatogr. A.

- 2001. - Vol. 938, № 1-2. - P. 175-185.

6. Batt, A.L. Simultaneous analysis of multiple classes of antibiotics by ion trap LC/MS/MS for assessing surface water and groundwater contamination / A.L. Batt, D.S. Aga // Anal. Chem. - 2005. - Vol. 77, № 9. - P. 2940-2947.

7. Hackett, J. Analysis of total caffeine and other xanthines in specialty coffees using mixed mode solid-phase extraction and liquid chromatography-diode-array detection after microwave digestion / J. Hackett, M.J. Telepchak, M.J. Coyer // J. Anal. Toxicol. -

2008. - Vol. 32, № 8. - P. 695-701.

8. Weigel, S. Simultaneous solid-phase extraction of acidic, neutral and basic pharmaceuticals from aqueous samples at ambient (neutral) pH and their determination by gas chromatography-mass spectrometry / S. Weigel, R. Kallenborn, H. Hjhnerfuss // J. Chromatogr. A. - 2004. - Vol. 1023, № 2. - P. 183-195.

9. Simultaneous analysis of neutral and acidic pharmaceuticals as well as related compounds by gas chromatography-tandem mass spectrometry in wastewater / M.J. Gimez [et al] // Talanta. - 2007. -

Vol. 73, № 2. - P. 314-320.

10. Pharmaceutical determination in surface and wastewaters using high-performance liquid chromatography-(electrospray)-mass spectrometry / M. Pedrouzo [et al] // J. Sep. Sci. - 2007. - Vol. 30, № 3. - P. 297-303.

11. Mullett, W.M. Rapid determination of theophylline in serum by selective extraction using a heated molecularly imprinted polymer micro-column with differential pulsed elution / W.M. Mullett, E.P Lai. // J. Pharm. Biomed. Anal. - 1999. - Vol. 21, №

4. - P. 835-843.

12. Theodoridis, G. Selective solid-phase extraction sorbent for caffeine made by molecular imprinting / G. Theodoridis, P. Manesiotis // J. Chromatogr. A. - 2002. - Vol. 948, № 1-2. - P. 163-169.

13. Khorrami, A.R. Design of a new cartridge for selective solid phase extraction using molecularly imprinted polymers: selective extraction of

theophylline from human serum samples / A.R. Khorrami, A. Rashidpur // Biosens. Bioelectron. -

2009. - Vol. 25, № 3. - P. 647-651.

14. Moffat, A.C. Clarke's isolation and identification of drugs in pharmaceuticals / A.C. Moffat. - Second Edition. - London: The pharmaceutical press, 1986. - 1684 p.

Адрес для корреспонденции:

210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27,

Витебский государственный медицинский университет, кафедра токсикологической и аналитической химии, тел. раб.: 8 (0212) 37-00-06.

Пивовар М.Л.

Поступила 06.12.2010 г.