МАЛЕАТНЫЕ СОЛИ ПРОИЗВОДНОГО ХИНАЗОЛИНА, ПОЛЕЗНЫЕ В КАЧЕСТВЕ АНТИАНГИОГЕННОГО АГЕНТА
MALEATE SALTS OF QUINAZOLINE DERIVATIVE EFFECTIVE AS ANTIANGIOGENIC AGENT

Представленное изобретение касается малеатной соли AZD2171, в частности кристаллических форм малеатной соли AZD2171, способов их получения, фармацевтических композиций, которые их содержат как активный ингредиент, их применения при производстве медикаментов для продуцирования антиангиогенного действия и/или снижения васкулярной проницаемости у теплокровных животных, таких как люди, и их применения в способах лечения заболеваний, связанных с ангиогенезом и/или повышенной васкулярной проницаемостью.
Нормальный ангиогенез играет важную роль в разных процессах, включая развитие эмбриона, заживление ран и некоторых компонентов репродуктивных функций женщин. Нежелательный или патологический ангиогенез связывают с заболеваниями, к которым относятся диабетическая ретинопатия, псориаз, рак, ревматоидный артрит, атерома, саркома Капоси и гемангиома (Fan et al, 1995, Trends Pharmacol. Sci. 16: 57-66; Folkman, 1995, Nature Medicine 1: 27-31). Изменение васкулярной проницаемости играет важную роль и в нормальных, и в патологических физиологических процессах (Cullinan-Bove et al, 1993, Endocrinology 133: 829-837; Senger et al, 1993, Cancer and Metastasis Reviews, 12: 303-324). Были идентифицированы некоторые полипептиды, которые in vitro промотируют рост эндотелиальных клеток, включая кислотный и основный факторы роста фибробласта (aFGF & bFGF) и фактор роста васкулярного эндотелия (VEGF). В силу ограниченной экспрессии его рецепторов активность фактора роста VEGF, в отличие от FGF, является относительно специфичной по отношению к эндотелиальным клеткам. Недавние доказательства указывают на то, что VEGF является важным стимулятором и нормального, и патологического ангиогеназа (Jakeman et al, 1993, Endocrinology, 133: 848-859; Kolch et al, 1995, Breast Рак Research and Treatment, 36:139-155) и влияет на васкулярную проницаемость (Connolly et al, 1989, J. Biol. Chem. 264: 20017-20024). Антагонистическое действие по отношение к VEGF путем секвестрации VEGF, используя антитело, может приводить к ингибированию роста опухоли (Kim et al, 1993, Nature 362: 841-844).
Рецепторы тирозинкиназ (RTKs) являются важными в передаче биохимических сигналов через плазматическую мембрану клеток. Эти трансмембранные молекулы характеристично состоят из внеклеточного лиганд-связывающего домена, соединенного через сегмент в плазматической мембране с внутриклеточным доменом тирозинкиназы. Связывание лиганда с рецептором приводит к стимулированию связанной с рецептором активности тирозинкиназы, что в свою очередь приводит к фосфорилированию тирозиновых остатков и на рецепторе, и на других внутриклеточных молекулах. Изменения в фосфорилировании тирозина инициируют сигнальный каскад, который приводит к различным клеточным ответам. Получены данные по аминокислотной последовательности, по крайне мере, девятнадцати отдельных подсемейств RTK. Одно из этих подсемейств включает fms-подобный рецептор тирозинкиназы, Flt-1, киназа включает доменсодержащий рецептор, KDR (также относится к Flk-1), и другой fms-подобный рецептор тирозинкиназы, Flt-4. Два эти родственных RTK, Flt-1 и KDR, связывают VEGF с высоким степенью сродства (De Vries et al, 1992, Science 255: 989-991; Terman et al, 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm. 1992, 187: 1579-1586). Связывание VEGF с этими рецепторами, которые экспрессируются в гетерологичных клетках, связывают с изменением в статусе фосфорилирования тирозина клеточных протеинов и притоком кальция.
VEGF является ключевым стимулятором для васкулогеназа и ангиогенеза. Этот цитокин стимулирует фенотип васкулярного разрастания путем индуцирования пролиферации эндотелиальных клеток, экспрессию протеазы и миграцию и последующую организацию клеток с образованием капиллярных трубок (Keck, P.J., Hauser, S.D., Krivi, G., Sanzo, K., Warren, Т., Feder, J., and Connolly, D.T., Science (Washington DC), 246: 1309-1312, 1989; Lamoreaux, W.J., Fitzgerald, M.E., Reiner, A., Hasty, K.A., and Charles, S.T., Microvasc. Res., 55: 29-42, 1998; Pepper, M.S., Montesano, R., Mandroita, S.J., Orci, L. and Vassalli, J.D., Enzyme Protein, 49: 138-162, 1996.). Кроме того, VEGF индуцирует значительную васкулярную проницаемость (Dvorak, H.F., Detmar, M., Claffey, К.Р., Nagy, J.A., van de Water, L., and Senger, D.R., (Int. Arch. Allergy Immunol., 107: 233-235, 1995; Bates, D.O., Heald, R.I., Curry, F.E. and Williams, B.J.Physiol. (Lond.), 533: 263-272, 2001), промотирует образование гипер-проницаемой, недоразвитой васкулярной сетки, которая является характеристикой патологического ангиогенеза.
Было показано, что активация только KDR является достаточной для промотирования всех основных фенотипичных ответов на VEGF, включая пролиферацию эндотелиальных клеток, миграцию и жизнеспособность, и индуцирует васкулярную проницаемость (Meyer, M., Clauss, M., Lepple-Wienhues, A., Waltenberger, J., Augustin, H.G., Ziche, M., Lanz, C., Biittner, M., Rziha, H-J. and Dehio, C., EMBO J., 18: 363-374, 1999; Zeng, H., Sanyal, S. and Mukhopadhyay, D., J. Biol. Chem., 276: 32714-32719, 2001; Gille, H., Kowalski, J., Li, В., LeCouter, J., Moffat, B, Zioncheck, T.F., Pelletier, N. and Ferrara, N., J. Biol. Chem., 276: 3222-3230, 2001).
Соединения, которые ингибируют действие VEGF, являются ценными при лечении заболеваний, связанных с ангиогенезом и/или повышением васкулярной проницаемости, таких как рак (включая лейкемию, множественную миелому и лимфому), диабет, псориаз, ревматоидный артрит, саркома Капоси, гемангиома, острый и хронический нефрит, атерома, артериальный рестеноз, аутоиммунные заболевания, острое воспаление, образование чрезмерных рубцов и спаек, эндометриоз, лимфоэдема, дисфункциональное маточное кровотечение и заболевания глаз с пролиферацией ретинальных сосудов, включая макулярную дегенерацию.
Производные хиназолина, которые являются ингибиторами VEGF рецептора тирозинкиназы, описываются в WO 00/47212. Соединение AZD2171 является иллюстративным из WO 00/47212, (смотрите Пример 240), и представляет собой 4-((4-фтор-2-метил-1H-индол-5-ил)окси)-6-метокси-7-(3-(пирролидин-1-ил)пропокси)хиназолин формулы I:
50
50
50
**
***
***
**
***
AZD2171 проявляет отменную активность в in vitro исследованиях (а) фермента и (б) HUVEC, которые описаны в WO 00/47212 и тут далее. IC значения AZD2171 по ингибированию активности изолированной KDR (VEGFR-2) и Flt-1 (VEGFR-1) тирозинкиназы в исследовании фермента были <2 нМ и 5±2 нМ, соответственно. AZD2171 сильно ингибирует VEGF-стимулированную пролиферацию эндотелиальных клеток (IС значение составляет 0,4±0,2 нМ в исследовании HUVEC), но в заметной мере не ингибирует пролиферацию базальных эндотелиальных клеток при >1250 кратном увеличении концентрации (IC значение составляет >500 нМ). Рост Calu-6 опухолевого ксенотрансплантата в in vivo (в) модели солидной опухоли, описанной тут далее, ингибировался на 49%, 69% и 91% после 28-дневного перорального введения один раз в день 1,5, 3 и 6 мг/кг/день AZD2171, соответственно (Р<0,01, Р<0,0001; односторонний t тест).
Более стабильные формы фармацевтически активного соединения, например более стабильные кристаллические формы, являются предпочтительными с коммерческой точки зрения для рецептур и производства. Поскольку использование более стабильной формы снижает риск ее превращения в другую форму во время процедуры получения рецептуры, такой как прессование. Это в свою очередь обеспечивает большую предсказуемость свойств конечной рецептуры, таких как скорость растворения таблеток, биодоступность активного ингредиента. Использование более стабильной формы активного ингредиента позволяет увеличить контроль над физическими свойствами рецептуры.
Свободное основание AZD2171 (4-((4-фтор-2-метил-1H-индол-5-ил)окси)-6-метокси-7-(3-(пирролидин-1-ил)пропокси)хиназолин) при условиях окружающей среды представляет собой кристаллический моногидрат. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК), проведенная в соответствии со способом, описанным тут далее, показала большую широкую эндотерму между 95° и 170°С вследствие потери воды и плавления (Фигура 1). Термогравиметрический (ТГА) анализ (детали приведены тут далее) показывает потерю массы в 4,02% между 80°С и 115°С (Фигура 1). Анализ содержания воды по Карлу Фишеру (детали приведены тут далее) дает цифру 3,9%, что указывает на то, что вся потеря массы является следствием потери воды.
Понятно, что значения начала/пика температуры ДСК может незначительно изменяться от одного прибора к другому или от одного образца к другому, и поэтому приведенные значения не должны истолковываться как абсолютные.
Свободное основание AZD2171 характеризуется присутствием, по крайней мере, одного из следующих 20 значений, измеренных используя излучение СuKa: 18,3 и 20,8. Свободное основание AZD2171 характеризуется рентгенограммой на порошке, как показано на Фигуре 2. Десять наиболее выступающих пиков показаны в Таблице 1.
Таблица 1:Десять наиболее выступающих пиков рентгенограммы на порошке свободного основания AZD2171
Угол 2-Тета (2θ)
Значение интенсивности
Относительная интенсивность
18,287
100
ос
20,807
66,7
ос
27,277
48,9
ос
23,370
42,8
ос
14,684
39,8
ос
25,070
37,6
ос
13,966
32,2
ос
21,711
26,6
ос
22,898
23,1
ос
26,790
22,9
ос
ос = очень сильный
Было найдено, что когда образец свободного основания AZD2171 дегидратирует, например, при нагревании до 100°С, образец становится аморфным (Фигура 3) и потом не регидратирует, а остается после этого аморфным. Это может создавать проблемы, если свободное основание AZD2171 поддается манипуляциям по формированию фармацевтической композиции, поскольку свободное основание AZD2171 может дегидратировать во время некоторых процессов, например, уменьшения размера частичек (такого как измельчение), высушивание лекарственного средства в массе, формулирования, производства. Для того, чтобы сформулировать свободное основание AZD2171 в фармацевтическую композицию, бывает необходимо уменьшить размер частичек до некоторого предела, что может приводить к дегидратации и, поэтому, существует риск образования аморфного материала. Были приведены исследования по уменьшение размера частичек образца моногидрата свободного основания AZD2171 путем измельчения, и потом их исследовали на наличие аморфного материала. Фигура 4 показывает, что аморфный материал, на самом деле, образуется во время уменьшения размера частичек свободного основания AZD2171. Это подтверждается уширением пиков и образованием аморфного 'бугорка' - смотрите Фигуру 4. Аморфная или полуаморфная форма свободного основания AZD2171 может создавать проблемы во время производства и обуславливать нерепродуцируемую биодоступность.
Определение альтернативных форм AZD2171, форм, которые отличаются от свободного основания и которые имеют улучшенные свойства в твердом состоянии, является целью представленного изобретения.
Примером альтернативной формы является соль AZD2171. В WO 00/47212 говорится, что фармацевтически приемлемыми солями соединений изобретения могут быть кислотно-аддитивные соли соединений изобретения, которые являются достаточно основными для образования таких солей. Такими кислотно-аддитивными солями являются соли с неорганическими и органическими кислотами, которые образуют фармацевтически приемлемые анионы, такими как галогенводороды, особенно с хлорводородной или бромводородной кислотой, или серной, или фосфорной кислотой, или с трифторуксусной кислотой, лимонной или малеиновой кислотой. Кроме того, WO 00/47212 указывает на то, что когда соединения изобретения являются достаточно кислотными, могут образовываться фармацевтически приемлемые соли с неорганическими и органическими основаниями, которые образуют фармацевтически приемлемые катионы. Такими солями с неорганическими и органическими основаниями являются, как говорят, соль щелочного металла, такая как соль натрия или калия, соль щелочноземельного металла, такая как соль кальция или магния, соль аммония или, например, соль с метиламином, диметиламином, триметиламином, пиперидином, морфолином или трис(2-гидроксиэтил)амином.
Предпочтительными солями в WO 00/47212 являются гидрохлориды и гидробромиды, особенно гидрохлориды.
Нигде в WO 00/47212 не упоминается, что специфическая соль отдельного соединения проявляет неожиданно благоприятные свойства.
Непредвиденно и неожиданно мы установили, что малеатная соль AZD2171 является особенно стабильной формой AZD2171 с улучшенными свойствами в твердом состоянии, по сравнению со свободным основанием и по сравнению с другими солями, которые подвергались исследованию.
Малеат AZD2171 легко кристаллизуется, является высококристалличным, негигроскопичным и имеет репродуцируемое стехиометрическое соотношение лекарственное средство к противоиону 1:1.
Таким образом, малеат AZD2171 является легкокристаллизуемым, является высококристалличным, негигроскопичным и имеет репродуцируемое стехиометрическое соотношение лекарственное средство к противоиону приблизительно 1:1.
Было получено несколько солей AZD2171 и семь из которых были кристаллическими: малонат, сукцинат, фумарат, малеат, тартрат, адипат и малат. Исследовали твердотельные свойства этих 7 солей и результаты эти исследований приведены в Таблице 2:
Термин 'негигроскопичный' означает абсорбцию влаги <1% при ОВ 80%.
Малеатная соль AZD2171 была неожиданно лучше, чем другие, поскольку из 7 солей, которые было можно кристаллизовать, только она была негигроскопичной солью, была высококристалличной и имела репродуцируемое стехиометрическое соотношение лекарственное средство к противоиону 1:1.
Таким образом, было найдено, что малеат AZD2171 был не только негигроскопичной солью, был высококристалличным и имел репродуцируемое стехиометрическое соотношение лекарственное средство к противоиону приблизительно 1:1.
Малеатная соль AZD2171 является, по сути, свободной от аморфного материала и может, как ожидается, легче перерабатываться в рецептуры, нежели свободное основание AZD2171, и обеспечивает более репродуцируемые результаты дозирования. Выражение "по сути, свободная от аморфного материала" означает, что количество аморфного материала меньше нежели 10%, предпочтительно меньше нежели 5%, более предпочтительно меньше нежели 2%.
Малеатная соль AZD2171 является негигроскопичной, что должно предупреждать или уменьшать любые проблемы, связанные с изменением массы активного ингредиента во время процессов, таких как измельчение.
В соответствии с представленным изобретением, обеспечивается малеатная соль AZD2171.
Малеат AZD2171 имеет две кристаллические формы А и В.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде кристаллической формы, Форма А.
Форма А малеата AZD2171 характеризуется присутствием, по крайне мере, одного из следующих значений 2θ, измеренных используя излучение СuКа: 21,5 и 16,4. Форма А малеата AZD2171 характеризуется рентгенограммой на порошке, по сути, как показано на Фигуре 5. Десять наиболее выступающих пиков показаны в Таблице 3:
Таблица 3Десять наиболее выступающих пиков рентгенограммы на порошке Формы А малеата AZD2171
Угол 2-Тета (2θ)
Значение интенсивности
Относительная интенсивность
21,522
100
ос
16,366
78,3
ос
24,381
73,7
ос
20,721
71,7
ос
25,025
71,5
ос
16,921
55,5
ос
12,085
44,1
ос
22,177
42,2
ос
17,444
40,7
ос
17,627
39,1
ос
ос = очень сильный
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде первой кристаллической формы. Форма А, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с, по крайней мере, одним отдельным пиком приблизительно при 2-тета=21,5°.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде первой кристаллической формы. Форма А, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с, по крайней мере, одним отдельным пиком приблизительно при 2-тета=16,4°.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде первой кристаллической формы, Форма А, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с, по крайней мере, двумя отдельными пиками при 2-тета=21,5° и 16,4°.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде первой кристаллической формы. Форма А, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с отдельными пиками приблизительно при 2-тета=21,5, 16,4, 24,4, 20,7, 25,0, 16,9, 12,1, 22,2, 17,4 и 17,6°.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде первой кристаллической формы, Форма А, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке, по сути такую же, как рентгенограмма на порошке, показанная на Фигуре 5.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде первой кристаллической формы. Форма А, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с, по крайней мере, одним отдельным пиком при 2-тета=21,5° плюс или минус 0,5° 2-тета.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде первой кристаллической формы. Форма А, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с, по крайней мере, одним отдельным пиком при 2-тета=16,4° плюс или минус 0,5° 2-тета.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде первой кристаллической формы. Форма А, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с, по крайней мере, двумя отдельными пиками при 2-тета=21,5° и 16,4°, где упомянутые значения могут быть плюс или минус 0,5 2-тета.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде первой кристаллической формы. Форма А, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с отдельными пиками при 2-тета=21,5, 16,4, 24,4, 20,7, 25,0, 16,9, 12,1, 22,2, 17,4 и 17,6°, где упомянутые значения могут быть плюс или минус 0,5° 2-тета.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде первой кристаллической формы. Форма А, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с, по крайней мере, одним отдельным пиком при 2-тета=21,5°.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде первой кристаллической формы. Форма А, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с, по крайней мере, одним отдельным пиком при 2-тета=16,4°.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде первой кристаллической формы. Форма А, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с, по крайней мере, двумя отдельными пиками при 2-тета=21,5° и 16,4°.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде первой кристаллической формы. Форма А, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с отдельными пиками при 2-тета=21,5, 16,4, 24,4, 20,7, 25,0, 16,9, 12,1, 22,2, 17,4 и 17,6°.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде первой кристаллической формы. Форма А, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке, как показано на Фигуре 5.
ДСК анализ показал, что Форма А малеата AZD2171 представляет собой твердое вещество с высокой температурой плавления и началом плавления при 198,3°С и пиком при 200,08°С (Фигура 6).
Таким образом, ДСК анализ показал, что Форма А малеата AZD2171 представляет собой твердое вещество с высокой температурой плавления и началом плавления приблизительно при 198,3°С и пиком приблизительно при 200,08°С.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде второй кристаллической формы, Форма В.
Форма В малеата AZD2171, характеризуется присутствием, по крайне мере, одного из следующих значений 2θ, измеренных, используя излучение СuКа: 24,2 и 22,7. Форма В малеата AZD2171 характеризуется рентгенограммой на порошке, по сути, как показано на Фигуре 8. Десять наиболее выступающих пиков показаны в Таблице 4:
Таблица 4Десять наиболее выступающих пиков рентгенограммы на порошке Формы В малеата AZD2171
Угол 2-Тета (2θ)
Значение интенсивности
Относительная интенсивность
24,156
100
ос
22,740
84,3
ос
15,705
64,0
ос
11,995
63,7
ос
27,087
60,9
ос
25,032
56,8
ос
17,724
37,7
ос
15,044
35,4
ос
23,102
34,5
ос
12,625
34,2
ос
ос = очень сильный
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде второй кристаллической формы. Форма В, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с, по крайней мере, одним отдельным пиком приблизительно при 2-тета=24,2°.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде второй кристаллической формы. Форма В, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с, по крайней мере, одним отдельным пиком приблизительно при 2-тета=22,7°.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде второй кристаллической формы. Форма В, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с, по крайней мере, двумя отдельными пиками при 2-тета=24,2° и 22,7°.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде второй кристаллической формы. Форма В, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с отдельными пиками приблизительно при 2-тета=24,2, 22,7, 15,7, 12,0, 27,1, 25,0, 17,7, 15,0, 23,1 и 12,6°.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде второй кристаллической формы, Форма В, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке, по сути, такую же как рентгенограмма на порошке показанная на Фигуре 8.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде второй кристаллической формы. Форма В, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с, по крайней мере, одним отдельным пиком при 2-тета=24,2° плюс или минус 0,5° 2-тета.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде второй кристаллической формы. Форма В, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с, по крайней мере, одним отдельным пиком при 2-тета=22,7° плюс или минус 0,5° 2-тета.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде второй кристаллической формы. Форма В, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с, по крайней мере, двумя отдельными пиками при 2-тета=24,2° и 22,7°, где упомянутые значения могут быть плюс или минус 0,5° 2-тета.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде второй кристаллической формы, Форма В, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с отдельными пиками при 2-тета=24,2, 22,7, 15,7, 12,0, 27,1, 25,0, 17,7, 15,0, 23,1 и 12,6°, где упомянутые значения могут быть плюс или минус 0,5° 2-тета.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде второй кристаллической формы, Форма В, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с, по крайней мере, одним отдельным пиком при 2-тета=24,2°.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде второй кристаллической формы. Форма В, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с, по крайней мере, одним отдельным пиком при 2-тета=22,7°.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде второй кристаллической формы, Форма В, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с, по крайней мере, двумя отдельными пиками при 2-тета=24,2° и 22,7°.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде второй кристаллической формы, Форма В, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке с отдельными пиками при 2-тета=24,2, 22,7, 15,7, 12,0, 27,1, 25,0, 17,7, 15,0, 23,1 и 12,6°.
В соответствии с представленным изобретением обеспечивается малеатная соль AZD2171 в виде второй кристаллической формы. Форма В, где упомянутая соль имеет рентгенограмму на порошке, как показано на Фигуре 8.
ДСК анализ показал, что Форма В малеата AZD2171 представляет собой твердое вещество с высокой температурой плавления и началом плавления при 194,43°С и пиком при 195,97°С (Фигура 9).
Таким образом, ДСК анализ показал, что Форма В малеата AZD2171 представляет собой твердое вещество с высокой температурой плавления и началом плавления приблизительно при 194,43°С и пиком приблизительно при 195,97°С.
Форма В является метастабильной по сравнению с Формой А (точка плавления и нагревание плавления Формы В ниже чем у Формы А). Форма А является более термодинамически стабильной формой. Смесь Формы А и В превращается в Форму А при суспендировании в метаноле при 40°С на протяжении 4 дней (Фигура 10).
Форма А является более предпочтительной нежели Форма В.
Малеат AZD2171 является негигроскопичным абсорбирующим <1% влаги при относительной влажности 80% (Фигура 7).
Данные ЯМР анализа снятые после получения малеатной соли в Примере 1 указывают на стехиометрическое соотношение 1:1.
В соответствии с другим аспектом представленного изобретения обеспечивается дималеатная соль AZD2171. Дималеатную соль можно получить путем прибавления двух моль малеиновой кислоты к одному молю свободного основания AZD2171.
Когда указывается, что представленное изобретение касается кристаллической формы свободного основания AZD2171, или Формы А малеата AZD2171, или Формы В малеата AZD2171, степень кристалличности без труда составляет больше чем приблизительно 60%, более просто, больше чем приблизительно 80%, предпочтительно, больше чем приблизительно 90% и более предпочтительно больше чем приблизительно 95%. Наиболее предпочтительно степень кристалличности составляет больше чем приблизительно 98%.
Формы А и В малеатной соли AZD2171 имеют рентгенограммы на порошке, по сути, такие же, как рентгенограммы на порошке, показанные на Фигурах 5 и 8, соответственно, и имеют, по сути, десять наиболее выступающих пиков (значения угла 2-тета) показанные в Таблицах 3 и 4, соответственно. Понятно, что значения 2-тета рентгенограммы на порошке могут незначительно изменяться от одного прибора к другому или от одного образца к другому, и поэтому приведенные значения не должны истолковываться как абсолютные.
Известно, что рентгенограмму на порошке можно получить, когда имеется одна или несколько ошибок измерения зависящих от условий измерения (таких как оборудование или используемый прибор). В частности, общеизвестно, что интенсивность в рентгенограмме на порошке может меняться в зависимости от условий измерения. Поэтому должно быть понятно, что формы малеатной соли AZD2171 представленного изобретения не ограничиваются кристаллами, которые обеспечивают рентгенограммы на порошке, идентичные рентгенограммам на порошке, показанным на Фигурах 5 и 8, и любые кристаллы, обеспечивающие рентгенограммы на порошке, по сути, такие же самые, как показано на Фигурах 5 и 8, попадают в рамки представленного изобретения. Специалист в области рентгенографии на порошке способен оценить реальную идентичность рентгенограмм на порошке.
Специалистам в области рентгенографии на порошке будет понятно, что относительная интенсивность пиков может зависеть от, например, крупинок с размером больше 30 микрон и неоднородности соотношений, которые могут влиять на анализ образцов. Специалисту в данной области также должно быть понятно, что на расположение отражений может влиять точность расположения по высоте, на которой находится образец в дифрактометре и калибровка нуля дифрактометра. Незначительное влияние также может оказывать планарность поверхности образца. Поэтому приведенные данные дифракционной картины не должны рассматриваться как абсолютные значения (Jenkins, R & Snyder, R.L. 'Introduction to X-Ray Powder Diffractometry' John Wiley & Sons 1996; Bunn, C.W. (1948), Chemical Crystallography, Clarendon Press, London; Klug, H. P. & Alexander, L.E. (1974), X-Ray Diffraction Procedures).
Как правило, ошибка измерения угла дифракции в рентгеновской дифрактограмме на порошке составляет приблизительно 5% или меньше, в частности плюс или минус 0,5° 2-тета, и такая степень ошибки измерения должна браться во внимание, когда рассматривают рентгенограммы на порошке, приведенные на Фигурах 2, 3, 4, 5, 8 и 10, и когда анализируют Таблицы 1, 3 и 4. Кроме того, должно быть понятно, что интенсивности могут меняться в зависимости от условий эксперимента и полученного образца (предпочтительной ориентации).
Во избежание сомнений, термины, такие как 'малеатная соль AZD2171' и 'AZD2171 малеатная соль' касаются каждой и любой из форм малеатной соли AZD2171, где 'Форма А малеата AZD2171' относится от отдельной кристаллической форме, известной как Форма А и 'Форма В малеата AZD2171', относится от отдельной кристаллической форме известной как Форма В.
В соответствии со следующим аспектом изобретения обеспечивается фармацевтическая композиция, которая содержит малеатную соль AZD2171, как определено тут ранее, в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем или носителем.
Композиция может быть в форме, пригодной для перорального введения, (например, как таблетки, лепешки, твердые или мягкие капсулы, водные или масляные суспензии, эмульсии, диспергируемые порошки или гранулы, сиропы или эликсиры), для введения в помощью ингаляции (например, как хорошо измельченный порошок или жидкий аэрозоль), для введения с помощью вдувания (например, как хорошо измельченный порошок), для парентеральной инъекции (например, как стерильный раствор, суспензия или эмульсия для внутривенного, подкожного, внутримышечного, внутрисосудистого введения или путем вливания), для местного введения (например, как кремы, мази, гели или водные или масляные растворы или суспензии), или для ректального введения (например, как суппозиторий). Предпочтительно малеатную соль AZD2171 вводят перорально. Вообще, упомянутые выше композиции можно получить обычным образом, используя обычные наполнители.
Композиции представленного изобретения преимущественно существуют в виде единичной дозированной формы. Малеат AZD2171 будут вводить теплокровным животным в виде единичной дозы в интервале 1-50 мг на квадратный метр поверхности тела животного, например, приблизительно 0,03-1,5 мг/кг человеку. Предусматривается единичная доза в интервале, например, 0,01-1,5 мг/кг, например 0,05-0,75 мг/кг, предпочтительно 0,03-0,5 мг/кг, и она представляет собой терапевтически эффективную дозу. Единичная доза в такой форме как таблетка или капсула будет обычно содержать, например, 1-50 мг активного ингредиента. Предпочтительно используется дневная доза в интервале 0,03-0,5 мг/кг. Размер дозы, необходимой для терапевтического или профилактического лечения отдельного заболевания, будет неминуемо изменяться в зависимости от субъекта подвергающегося лечению, пути введения и сложности заболевания подвергающегося лечению. Соответственно, оптимальную дозу может определить профессионал, который назначает лечение любому отдельному пациенту.
В соответствии со следующим аспектом представленного изобретения обеспечивается применение малеатной соли AZD2171, как тут определено выше, в способе лечения человека или животного с помощью терапии.
Следующей характерной чертой представленного изобретения является малеатная соль AZD2171, как определено тут ранее, для применения как медикамента, удобным является применение малеатной соли AZD2171, как определено тут ранее, для получения ангиогенного действия и/или снижения васкулярной проницаемости у теплокровного животного, такого как человек.
Таким образом, в соответствии со следующим аспектом изобретения обеспечивается применение малеатной соли AZD2171, как определено тут ранее, при производстве медикамента используемого продуцировании ангиогенного действия и/или снижения васкулярной проницаемости у теплокровного животного, такого как человек.
В соответствии со следующим аспектом представленного изобретения, обеспечивается способ продуцирования ангиогенного действия и/или снижения васкулярной проницаемости у теплокровного животного, такого как человек, нуждающегося в таком лечении, который включает введение упомянутому животному эффективного количества малеатной соли AZD2171, как определено тут ранее.
Малеатная соль AZD2171 представляет собой агент с ангиогенным действием и/или агент снижающий васкулярную проницаемость и может быть использован как единственный терапевтический агент или может включать, в дополнение к малеату AZD2171, один или большее количество веществ и/или методик лечения. Такое совместное лечение может быть осуществлено путем одновременного, последовательного или раздельного введения индивидуальных компонентов лечения. В области медицинской онкологии является нормальным применение комбинации разных форм терапии для лечения каждого отдельного пациента с раком. В медицинской онкологии другим компонентом(ами) такого комбинированного лечения в дополнение к малеатной соли AZD2171 может быть: хирургическое вмешательство, радиотерапия или химиотерапия. Такая химиотерапия может охватывать три основных категории терапевтических агентов:
(i) другие ангиогенные агенты, такие как агенты, которые ингибируют действие фактора роста васкулярного эндотелия, (например, бевацизумаб [Avastin™] - антитело фактора роста клеток васкулярного эндотелия, и агенты, механизм действия которых отличается от определенного тут ранее (например, линомид, ингибиторы функционирования интегрина αvβ3, ангиостатин, разоксин, талидомид), и включая васкулярно-нацеленные агенты (например, комбретастатинфосфат и соединения, описанные в международных заявках WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 и WO 02/08213 и агенты, разрушающие васкулярную систему, описанные в международной заявке № WO 99/02166, полное описание которого включено сюда как ссылка (например, N-ацетилколхинол-O-фосфат));
(ii) цитостатические агенты, такие как антиэстрогены (например, томоксифен, торемифен, ралоксифен, дролоксифен, йодоксифен), даунрегуляторы рецептора эстрогена (например, фулвестрант), прогестогены (например, мегестролацетат), ингибиторы ароматазы (например, анастрозол, летразол, воразол, эксеместан), антипрогестогены, антиандрогены (например, флутамид, нилутамид, бикалутамид, ципротеронацетат), агонисты и антагонисты LHRH (гормон, высвобождающий лютеинизирующий гормон) (например, гозерелинацетат, лупролид, бузерелин), ингибиторы 5α-редуктазы (например, финастерид), антиинвазийные агенты (например, ингибиторы металлопротеиназы подобные маримастату и ингибиторы функционирования рецептора активатора плазминогена урокиназного типа) и ингибиторы функционирования фактора роста (такими факторами роста являются, например, тромбоцитарный фактор роста и гепатоцитный фактор роста), такими ингибиторами являются антитела фактора роста, антитела рецептора фактора роста (например, трацузумаб [Herceptin™] - антитело анти-еrbb2 и цетуксимаб [С225]) - антитело анти-erbb1, ингибиторы фарнезилтрансферазы, ингибиторы тирозинкиназы, например, ингибиторы семейства эпидермального фактора роста (например, ингибиторы тирозинкиназы семейства EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), такие как] N-(3-хлор-4-фторфенил)-7-метокси-6-(3-морфолинопропокси)хиназолин-4-амин (гефитиниб, AZD1839), N-(3-этинилфенил)-6,7-бис(2-метоксиэтокси)хиназолин-4-амин (эрлотиниб, OSI-774) и 6-акриламидо-N-(3-хлор-4-фторфенил)-7-(3-морфолинопропокси)хиназолин-4-амин (CI 1033)) и ингибиторы серин/треонинкиназы); и
(iii) антипролиферативные/антинеопластические лекарственные средства и их комбинации, используемые в медицинской онкологии, такие как антиметаболиты (например, антифолаты подобные метотрексату, фторпиримидины подобные 5-фторурацилу, тегафир, аналоги пурина и аденозина, цитозинарабинозид); противоопухолевые антибиотики (например, антрациклины подобные адриамицину, блеомицину, доксорубицину, даунорубицину, эпирубицину и идарубицину, митомицин-С, дактономицину, митрамицину); производные платины (например, цисплатин, карбоплатин); алкилирующие агенты (например, азотистый иприт, мелфалан, хлорамбуцил, бузулфан, циклофосфамид, ифосфамид, нитромочевины, тиотепа); антимитотические агенты (например, алкалоиды барвинка подобные винкристину, винбластину, виндесину, винорелбину, и таксоиды подобные токсолу, таксотеру); ингибиторы топоизомеразы (например, эпиподофиллотоксины подобные этопозиду и тенипозиду, амсакрин, топотекан, камптотецин, а также иринотекан); также ферменты (например, аспарагиназа); и ингибиторы тимидилатсинтазы (например, ралтитрексед);
и дополнительными типами химиотерапевтических агентов являются:
(iv) модификаторы биологического ответа (например, интерферон);
(v) антитела (например, эдреколомаб);
(vi) антисмысловые терапии, например, которые направлены на цели, упомянуты выше, такие как ISIS 2503, антисмысловая анти-ras;
(vii) геннотерапевтические подходы, включая, например, подходы по замене аберрантных генов, таких как аберрантный р53 или аберрантный BRCA1 или BRCA2, подходы GDEPT (пролекарственная терапия с применением геннаправленного фермента), такие как применение цитозиндеаминазы, тимидинкиназы или бактериальной нитроредуказы, и подходы, направленные на увеличение толерантности пациента к химиотерапии или радиотерапии, такие как генная терапия, направленная на увеличение резистентности ко многим лекарственным средствам; и
(viii) иммунотерапевтические подходы, включая, например, ex-vivo и in vivo подходы по увеличению иммуногенности опухолевых клеток пациента, такие как трансфекция цитокинами, такими как интерлейкин 2, интерлейкин 4 или фактор стимулирующий рост гранулоцит-макрофаговых колоний, подходы, направленные на уменьшение анергии Т-клеток, подходы, использующие трансфецированные иммунные клетки, такие как цитокин-трансфицированные дендритные клетки, подходы, использующие линии цитокин-трансфецированных опухолевых клеток, и подходы, использующие антиидиопатические антитела.
Например, такое комбинированное лечение может быть осуществлено путем одновременного, последовательного или раздельного введения малеатной соли AZD2171, как определено тут ранее, и васкулярно нацеленного агента, описанного в WO 99/02166, такого как N-ацетилколхинол-О-фосфат (Пример 1 WO 99/02166).
Из WO 01/74360 известно, что антиангиогенные агенты могут быть объединены с антигипертензивными агентами. Соль представленного изобретения также может быть введена в комбинации с антигипертензивным агентом. Антигипертензивным агентом является агент, который снижает давление крови, смотрите WO 01/74360, который включен сюда как ссылка.
Таким образом, в соответствии с представленным изобретением обеспечивается способ лечения заболевания, связанного с ангиогенезом, который включает введение эффективного количества комбинации малеатной соли AZD2171, как определено тут ранее, и антигипертензивного агента теплокровному животному, такому как человек.
В соответствии со следующим аспектом представленного изобретения обеспечивается применение комбинации малеатной соли AZD2171, как определено тут ранее, и антигипертензивного агента при производстве медикамента для лечения заболевания, связанного с ангиогенезом у теплокровного животного, такого как человек.
В соответствии со следующим аспектом представленного изобретения обеспечивается фармацевтическая композиция, которая содержит малеатную соль AZD2171, как определено тут ранее, и антигипертензивный агент для лечения заболевания, связанного с ангиогенезом у теплокровного животного, такого как человек.
В соответствии со следующим аспектом представленного изобретения обеспечивается способ продуцирования ангиогенного действия и/или снижения васкулярной проницаемости у теплокровного животного, такого как человек, нуждающегося в таком лечении, который включает введение упомянутому животному эффективного количества малеатной соли AZD2171, как определено тут ранее, и антигипертензивного агента.
В соответствии со следующим аспектом представленного изобретения обеспечивается применение комбинации малеатной соли AZD2171, как определено тут ранее, и антигипертензивного агента при производстве медикамента продуцирующего ангиогенное действие и/или снижающего васкулярную проницаемости у теплокровного животного, такого как человек.
Предпочтительными антигипертензивными агентами являются блокаторы кальциевых каналов, ингибиторы ангиотензинконвертирующего фермента (АСЕ ингибиторы), антагонисты рецептора ангиотензина II (A-II антагонисты), диуретики, блокаторы бета-адренергического рецептора (β-блокаторы), вазодилаторы и блокаторы альфа-адренергического рецептора (α-блокаторы). Особенно предпочтительными антигипертензивными агентами являются блокаторы кальциевых каналов, ингибиторы ангиотензинконвертирующего фермента (АСЕ ингибиторы), антагонисты рецептора ангиотензина II (А-II антагонисты) и блокаторы бета-адренергического рецептора (β-блокаторы), наиболее предпочтительными являются блокаторы кальциевых каналов.
Как указано выше, малеатная соль AZD2171 представляет интерес благодаря ее антиангиогенному действию и/или способности снижать васкулярную проницаемость. Малеатная соль AZD2171, как ожидается, будет полезна при лечении широкого перечня заболеваний, включая: рак, диабет, псориаз, ревматоидный артрит, саркома Капоси, гемангиома, лимфоэдема, острая и хроническая нефропатия, атерома, артериальный рестеноз, аутоиммунные заболевания, острое воспаление, образование чрезмерных рубцов и спаек, эндометриоз, лимфоэдема, дисфункциональное маточное кровотечение и заболевания глаз с пролиферацией ретинальных сосудов, включая макулярную дегенерацию. Рак может поражать любую ткань и включает лейкемию, множественную миелому и лимфому. В частности, такие соединения изобретения, как ожидается, преимущественно замедляют рост первичных и рецидивных солидных опухолей, например, толстой кишки, груди, простаты, легких и кожи. Более конкретно, такие соединения изобретения, как ожидается, ингибируют любые формы рака, связанного с VEGF, включая лейкемию, множественную миелому и лимфому, а также, например, рост первичных и рецидивных солидных опухолей, который связан с VEGF, особенно тех опухолей, рост и распространение которых сильно зависит от VEGF, включая, например, некоторые опухоли толстой кишки, груди, простаты, легких, мозга, вульвы и кожи.
В дополнение к их применению в терапевтической медицине малеатные соли AZD2171, как определено тут ранее, также полезны как фармакологические инструменты при исследовании и стандартизации in vitro и in vivo систем тестирования для оценки действия ингибиторов VEGF, активности рецептора тирозинкиназы у лабораторных животных, таких как кошки, собаки, кролики, обезьяны, крысы и мыши, как часть исследования новых терапевтических агентов.
Далее приведены исследования описанные в WO 00/47212 и используемые для исследования AZD2171:
(а) Тест по ингибированию In Vitro рецептора тирозинкиназы
Это исследование позволяет определить способность тестируемого соединения ингибировать активность тирозинкиназы. ДНК кодирующую цитоплазматические домены рецептора VEGF, FGF или EGF можно получить с помощью полного синтеза гена (Edwards M., International Biotechnology Lab 5(3), 19-25, 1987) или путем клонирования. Они могут быть экспрессированы в пригодной экспрессионной системе с получением полипептида с активностью тирозинкиназы. Например, было найдено, что цитоплазматические домены рецептора VEGF, FGF и EGF, которые были получены путем экспрессирования рекомбинантного протеина в клетках насекомых, проявляют значительную активность тирозинкиназы. В случае VEGF рецептора Flt-1 (инвентарный номер в банке генов Х51602), ДНК фрагмент 1,7 kb кодирующий наиболее цитоплазматический домен, начинающийся с метионина 783 и включающий терминальный кодон, описывается Shibuya et al (Oncogene, 1990, 5: 519-524), был выделен из кДНК и клонирован в смешанной форме бакуловирусного вектора (например, pAcYMl (смотрите The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, L.A. King и R. D. Possee, Chapman и Hall, 1992), или рАс360, или pBlueBacHis (доступен от Invitrogen Corporation)). Этим рекомбинантным конструктом трансфецировали клетки насекомых (например, Spodoptera frugiperda 21(Sf21)) с вирусной ДНК (eg Pharmingen BaculoGold) с получением рекомбинантного бакуловируса (Детали способов сборки рекомбинантных молекул ДНК, получения и применения рекомбинантного бакуловируса можно найти в стандартных текстах, например, Sambrook et al, 1989, Molecular cloning - A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbour Laboratory Press and O'Reilly et al, 1992, Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual, W.H.Freeman and Co, New York). Для KDR (инвентарный номер в банке генов L04947), цитоплазматический фрагмент, начинающийся с метионина 806, был клонирован и экспрессирован аналогичным образом.
Для экспрессии активности cFlt-1 тирозинкиназы, Sf21 клетки инфицировали тромбоциточистым рекомбинантным вирусом cFlt-1 с множественность заражения 3 и собирали клетки через 48 часов. Собранные клетки промывали ледяным забуференным фосфатом раствором салина (PBS) (10 мМ фосфата натрия рН 7,4, 138 мМ хлорида натрия, 2,7 мМ хлорида калия), потом ресуспендировали в охлажденном льдом HNTG/PMSF (20 мМ Hepes рН 7,5, 150 мМ хлорида натрия, 10% о/о глицерина, 1% о/о Triton X100, 1,5 мМ хлорида магния, 1 мМ этиленгликоль-бис(β-аминоэтилового эфира) N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (EGTA), 1 мМ PMSF (фенилметилсульфонилфторида); PMSF прибавляют только перед применением в виде свежеполученного 100 мМ раствора в метаноле), используя 1 мл HNTG/PMSF на 10 миллионов клеток. Суспензию центрифугировали на протяжении 10 минут при 13000 об/мин при 4°С, надосадочную жидкость (готовый фермент) удаляли и хранили в виде аликвоты при -70°С. Каждую новую партию готового фермента титровали в исследовании, используя разбавитель для фермента (100 мМ Hepes рН 7,4, 0,2 мМ ортованадата натрия, 0,1% о/о Triton X100, 0,2 мМ дитиотреитол). Для типичной партии готовый фермент разводят 1 к 2000 разбавителем для фермента, и 50 мкл разбавителя для фермента, используют в каждой лунке исследования.
Раствор готового субстрата получали из случайного сополимера, содержащего тирозин, например Poly (Glu, Ala, Тyr) 6:3:1 (Sigma P3899), хранили как 1 мг/мл готовый раствор в PBS при -20°С и разводили 1 к 500 PBS для нанесения на планшет.
За день до исследования 100 мкл раствора разведенного субстрата разделяли на все лунки исследуемых планшетов (96-луночные иммунопланшеты Nunc maxisorp), которые закрывали и оставляли на ночь при 4°С.
В день исследования, раствор субстрата отделяли и лунки исследуемого планшета один раз промывали PBST (PBS содержащий 0,05% о/о Tween 20) и один раз 50 мМ Hepes pH 7,4.
Тестируемые соединения разводили 10% диметилсульфоксидом (ДМСО) и 25 мкл разведенного соединения переносили в лунки промытых исследуемых планшетов. "Общие" контрольные лунки содержали 10% ДМСО вместо соединения. Двадцать пять микролитров 40 мМ хлорида марганца (II), которые содержат 8 мкМ аденозин-5'-трифосфат (AT) прибавляли ко всем тестируемым лункам, за исключением "пустых" контрольных лунок, которые содержали хлорид марганца (II) без АТР. Для начала реакций 50 мкл свежеразведенного фермента прибавляли к каждой лунке и планшеты инкубировали при комнатной температуре на протяжении 20 минут. Жидкость отделяли и лунки дважды промывали PBST. К каждой лунке прибавляли сто микролитров антитела мыши антифосфотирозина IgG (Upstate Biotechnology Inc. продукт 05-321), разводили 1 к 6000 PBST, который содержит 0,5% м/о бычьего сывороточного альбумина (BSA), и планшеты инкубировали на протяжении 1 часа при комнатной температуре и потом отделяли жидкость и лунки дважды промывали PBST. К каждой лунке прибавляли сто микролитров пероксидазы ложечницы приморской (НКР)-связанной с антимышиным Ig антителом овцы (Amersham продукт NXA 931), разведенным 1 к 500 PBST, который содержит 0,5% м/о BSA, инкубировали на протяжении 1 час при комнатной температуре и потом отделяли жидкость и дважды промывали PBST. К каждой лунке прибавляли сто микролитров раствора 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолина-6-сульфоновой кислоты) (ABTS), свежеполученного, используя одну 50 мг таблетку ABTS (Boehringer 1204 521) в 50 мл свежеполученного 50 мМ фосфат-цитратного буфера рН 5,0+0,03% пербората натрия (получали из 1 капсулы содержащей фосфат-цитратный буфер с перборатом натрия (PCSB) (Sigma P4922) на 100 мл дистиллированной воды). Планшеты потом инкубировали на протяжении 20-60 минут при комнатной температуре до значения оптической густоты "пустых" контрольных лунок, измеренного при 405 нм, используя спектрофотометр чтения планшетов, приблизительно 1,0. Контрольные значения "пустых" (нет АТР) и "общих" (нет соединения) лунок использовали для определения интервала разведения тестируемого соединения, которые дают 50% ингибирование активности фермента.
(б) In Vitro исследование HUVEC пролиферации
Это исследование позволяет определить способность тестируемого соединения ингибировать пролиферацию стимулированную фактором роста эндотелиальных клеток пуповинной вены человека (HUVEC).
2
HUVEC клетки выделяли в MCDB 131 (Gibco BRL)+7,5% о/о фетальной телячьей сыворотки (FCS) и наносили на планшет (в 2-8 прохождений), в MCDB 131+2% о/о FCS+3 мкг/мл гепарина + 1 мкг/мл гидрокортизона, в концентрации 1000 клеток/лунку на 96 луночных планшетах. После минимум 4 часов они дополнялись VEGF (3 нг/мл) и соединением. Культуры инкубировали на протяжении 4 дней при 37°С с 7,5% СО. На 4 день культуры обрабатывали 1 MKCi/лунку тритиированным-тимидином (Amersham product TRA 61) и инкубировали на протяжении 4 часов. Клетки собирали, используя сборщик клеток для 96-луночного планшета (Tomtek), и потом исследовали на включение трития, используя планшетный бета-счетчик. Включение радиоактивности в клетки, выражали в ивм (импульсов в минуту), использовали для измерения ингибирования соединениями пролиферации клеток, стимулированной фактором роста. Эту методологию также использовали для оценки действия соединений на базальный HUVEC рост (то есть пролиферация эндотелиальных клеток в MCDB 131+2% о/о FCS+3 мкг/мл гепарина+1 мкг/мл гидрокортизона без прибавления экзогенного VEGF).
(в) In Vivo модель солидной опухоли
Этот тест измеряет способность соединений ингибировать рост солидной опухоли.
Ксенотрансплантаты опухоли CaLu-6 вводили в бок самок атимических швейцарских nu/nu мышей с помощью подкожной инъекции 1×10 клеток Calu-6/мыши в 100 мкл 50% (о/о) раствора Матригеля в сывороткосвободной культуральной среде. Через десять дней после имплантации клеток мышей разделяли на группы по 8-10 особей, для того чтобы получить сопоставимые группы со средними значениями объемов. Измеряли опухоли, используя кронциркуль Вернье, и рассчитывали объемы как: (l×w)×√(l×w)×(π/6), где l является наиболее длинным диаметром и w является диаметром, перпендикулярным наиболее длинному. Тестируемые соединения вводили перорально один раз в день на протяжении минимум 21 дня, а контрольные животные получали разбавитель соединения. Размеры опухолей измеряли дважды в неделю. Рассчитывали уровень ингибирования роста путем сравнения среднего объема опухоли контрольной группы с группой подвергающейся лечению используя Т тест Студента и/или тест ранговой суммы Манна-Уитни. Ингибиторное действие исследуемых соединений рассматривалось как значительное в случае, когда р<0,05.
Малеатную соль AZD2171, как определено тут ранее, можно получить с помощью известных методик, применяемых для получения химически подобных соединений. Такими методиками являются, например, методики, показанные в международной заявке № WO 00/47212, которая включена сюда как ссылка. Такие методики включают также, например, твердофазный синтез. Такие методики составляют следующий аспект изобретения и описываются тут далее. Необходимые исходные материалы можно получить с помощью стандартных процедур органической химии. Свободное основание AZD2171 можно подучить в соответствии с методиками описанными в WO 00/47212, смотрите, в частности, Пример 240 WO 00/47212. Альтернативно необходимые исходные материалы можно получить с помощью методик, аналогичных описанным, и которые находятся в рамках знаний среднего специалиста в органической химии.
Приведенные далее способы (а) (б) и (в) обеспечивают следующее воплощение представленного изобретения.
Синтез Формы А малеатной соли AZD2171
(а) Такой способ обеспечивает следующий аспект представленного изобретения и включает, например, следующие стадии:
(i) растворение свободного основания AZD2171 в органическом растворителе с образованием раствора;
(ii) прибавление водного раствора малеиновой кислоты или прибавление раствора малеиновой кислоты в органическом растворителе;
(iii) обеспечение самопроизвольного зародышеобразования;
(iv) необязательно, отделение кристаллической смеси Форм А и В AZD2171 образовавшихся таким образом;
(v) суспендирование смеси в растворителе, например, метаноле, до полного превращения малеата AZD2171 в Форму А, (что может быть определено по дифракции рентгеновского излучения на порошке), например, это может продолжаться на протяжении 4 дней; и
(vi) выделение твердого кристаллического вещества, образовавшегося таким образом.
(б) Другой такой способ обеспечивает следующий аспект представленного изобретения и включает, например, следующие стадии:
(i) растворение свободного основания AZD2171 в органическом растворителе с образованием раствора;
(ii) прибавление водного раствора малеиновой кислоты или прибавление раствора малеиновой кислоты в органическом растворителе;
(iii) получение раствора, например, путем нагревания или прибавления дополнительного количества растворителя, и внесение затравки Формы А малеата AZD2171 для инициации кристаллизации Формы А малеата AZD2171; и
(iv) выделение твердого кристаллического вещества, образовавшегося таким образом.
Для части (i) способов (а) и (б) смесь может, если необходимо, нагреваться до температуры кипения с обратным холодильником для растворения твердых веществ. Альтернативно смесь может, например, нагреваться до температуры меньше нежели температура кипения растворителя, при условии, что растворятся более или менее все твердые материалы. Должно быть понятно, что незначительные количества нерастворимого материала могут быть удалены фильтрованием нагретой смеси.
Для части (i) способов (а) и (б) органическим растворителем предпочтительно является спирт, например, метанол или изопропанол.
Для части (ii) способов (а) и (б) органическим растворителем предпочтительно является спирт, например, метанол.
(в) Синтез Формы В малеатной соли AZD2171
Такой способ обеспечивает следующий аспект представленного изобретения и включает, например, следующие стадии:
(i) растворение малеата AZD2171 в органическом растворителе с образованием раствора;
(ii) прибавление раствора к растворителю, в котором малеат AZD2171 имеет растворимость ниже, чем в NMP, например, толуол или этилацетат;
(iii) кристаллизацию Формы В малеата AZD2171; и (iv) выделение твердого кристаллического вещества, образовавшегося таким образом.
В (в) предпочтительным органическим растворителем является растворитель с высокой растворяющей способностью, такой как 1-метил-2-пирролидинон.
Для части (i) способа (в), смесь может, если необходимо, нагреваться до температуры кипения с обратным холодильником для растворения твердых веществ. Альтернативно, смесь может, например, нагреваться до температуры меньше нежели температура кипения растворителя, при условии, что растворятся более или менее все твердые материалы. Должно быть понятно, что незначительные количества нерастворимого материала могут быть удалены фильтрованием нагретой смеси.
В (а), (б) и (в) выше, твердое кристаллическое вещество, образовавшееся таким образом, может быть выделено с помощью обычных способов, например, с помощью фильтрования.
Изобретение далее иллюстрируется с помощью неограничивающих Примеров, данных и Фигур, в которых, если не указано другое: -
(i) упаривание проводили на роторном испарителе в вакууме и обработку проводили после удаления оставшихся твердых веществ, таких как осушители, с помощью фильтрования;
(ii) выходы приведены только для иллюстрации и необязательно являются максимально возможными;
(iii) температуры плавления не корректировали и определяли используя прибор Mettler DSC820e;
6
(iv) структуры конечных продуктов формулы I подтверждали с помощью ядерного (обычно протонного) магнитного резонанса (ЯМР) и масспектров; значения химических сдвигов спектров протонного магнитного резонанса измеряли по шкале дельта и мультиплетность пиков была следующей: s, синглет; d, дублет; t, триплет; m, мультиплет; br, широкий; q, квартет, quin, квинтет; все спектры снимали на Bruker DPX 400 МГц при температуре 300 К в d-ДМСО, 16 сканирований, частота повторения импульсов 10 секунд;
(v) промежуточные соединения специально полностью на характеризовали и чистоту оценивали с помощью ЯМР анализа; и
(vi) использовали следующие аббревиатуры: -
ДМСО - диметилсульфоксид
NMP - 1-метил-2-пирролидинон
Пример 1: Форма А малеата AZD2171
В инертной атмосфере азота неочищенное свободное основание AZD2171 (4,52 г), (получали, например, как описано в Примере 240 WO 00/47212) суспендировали в изопропаноле (58,8 мл). Смесь нагревали с обратным холодильником на протяжении 15 минут, получая прозрачный темный раствор. Смесь охлаждали до 75°С и прибавляли уголь (0,226 г). Смесь снова нагревали с обратным холодильником и кипятили с обратным холодильником на протяжении часа. Смесь фильтровали горячей. Остаток угля на фильтре промывали горячим изопропанолом (9 мл). Температуру объединенного фильтрата и промывного раствора доводили до 55°С и по каплям на протяжении 5 минут прибавляли предварительно фильтрованный раствор малеиновой кислоты (1,173 г) в воде (2,71 мл). Неочищенное свободное основание, которое начало кристаллизоваться, растворялось во время прибавления. Прибавляли промывную воду (0,9 мл). Смесь выдерживали при 55°С на протяжении 15 минут и вносили затравку Формы А малеата AZD2171 (0,023 г). Смесь выдерживали при 55°С на протяжении 4 часов. Во время 4-часового выдерживания кристаллизация устанавливалась. Смесь охлаждали до 0°С на протяжении 8 часов. Смесь выдерживали при 0°С на протяжении минимум 8 часов. Смесь фильтровали. Остаток промывали изопропанолом (9 мл). Твердое вещество сушили в вакуумной печке при 50°С, получая 4-([4-фтор-2-метил-1H-индол-5-ил]окси)-6-метокси-7-(3-(пирролидин-1-ил)пропокси)хиназолина малеат, Форма А.
1
Н ЯМР спектр: (400 МГц, ДМСО): 11,36 (s, 1Н), 8,53 (s, 1H), 7,65 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 7,18 (d, 1H), 7,01 (d, 1H), 6,25 (s, 1H), 6,04 (s, 2H), 4,33 (t, 2H), 4,02 (s, 3H), 3,26-3,3,70 (b, 4H), 2,44, (s, 3H), 2,24 (m, 2H), 2,02 (m, 4H).
Т.пл.: ДСК анализ: начало плавления при 198,3°С и пик при 200,08°С.
Пример 2: Форма А малеата AZD2171
В инертной атмосфере азота неочищенное свободное основание AZD2171 (23,0 г) (получали, например, как описано в Примере 240 WO 00/47212) суспендировали в метаноле (223 мл) в колбе 1. Смесь дегазировали путем выдерживания в вакууме и потом заменяли вакуумом азотом. Это повторяли пять раз. Суспензию потом нагревали до температуры кипения с обратным холодильником и выдерживали на протяжении 15 минут, получая прозрачный темно-коричневый раствор. Раствор охлаждали до 60°С и потом фильтровали через слой Целит (4,00 г) в колбу 2. Слой Целита промывали горячим (60°С) метанолом (78 мл), фильтрат снова переносили в колбу 2.
В колбу 1 вводили метанол (111 мл), который был охлажден до 0°С. В колбу 1 потом вводили малеиновую кислоту (5,50 г) и смесь перемешивали при 0°С на протяжении 15 минут до растворения малеиновой кислоты.
Содержимое колбы 1 переносили в колбу 2 через проходной фильтр, поддерживая в это время температуру выше 52°С. В колбу 2 при 55°С вносили затравку Формы А малеата AZD2171 (0,0454 г) и смесь выдерживали при 55°С на протяжении 3 часов. Смесь потом охлаждали до 40°С на протяжении 7 часов, потом охлаждали дальше до -5°С на протяжении 6 часов. Твердое вещество фильтровали и промывали метанолом (100 мл) при -5°С. Продукт сушили в вакуумной печи на протяжении 24 часов, получая 4-([4-фтор-2-метил-1H-индол-5-ил]окси)-6-метокси-7-(3-(пирролидин-1-ил)пропокси)хиназолина малеат, Форма А.
Пример 3: Форма В малеата AZD2171
Форму А малеата AZD2171 (2,31 г) растворяли в горячем (-50°С) NMP. Этот раствор по каплям на протяжении 2 минут прибавляли к толуолу (23 мл) комнатной температуры. Материал сначала выпадал в осадок как твердое вещество, которое потом становилось маслом и потом снова твердело. После перемешивания на протяжении 10 минут при комнатной температуре, твердое вещество отфильтровывали и промывали толуолом (10 мл). Твердое вещество сушили в вакуумной печи при комнатной температуре на протяжении ночи получая 4-((4-фтор-2-метил-1H-индол-5-ил)окси)-6-метокси-7-(3-(пирролидин-1-ил)пропокси)хиназолина малеат, Форма В.
Т.пл.: ДСК анализ: начало плавления при 194,43°С и пик при 195,97°С
Короткое описание чертежей
Фигура 1: ДСК и ТГА термограммы для моногидрата свободного основания AZD2171 - с температурой в °С, нанесенной на горизонтальной оси, и тепловой поток/% потери массы на вертикальной оси.
Фигура 2: Рентгенограмма на порошке для свободного основания AZD2171 - с значениями 29, нанесенными на горизонтальной оси, и относительной линейной интенсивностью (импульсов), нанесенной на вертикальной оси.
Фигура 3: Рентгенограмма на порошке для моногидрата свободного основания AZD2171, нагретого до 100°С - с значениями 29, нанесенными на горизонтальной оси, и относительной линейной интенсивностью (импульсов), нанесенной на вертикальной оси.
Фигура 4: Рентгенограмма на порошке для измельченного свободного основания AZD2171 - с значениями 29, нанесенными на горизонтальной оси, и относительной линейной интенсивностью (импульсов), нанесенной на вертикальной оси.
Фигура 5: Рентгенограмма на порошке для Формы А малеатной соли AZD2171 - с значениями 29, нанесенными на горизонтальной оси, и относительной линейной интенсивностью (импульсов), нанесенной на вертикальной оси.
Фигура 6: ДСК термограмма для Формы А малеата AZD2171 - с температурой в С, нанесенной на горизонтальной оси, и эндотермическим тепловым потоком (миллиВатты (мВ)), нанесенным на вертикальной оси.
Фигура 7: Изотерма сорбции паров при 25°С Формы А малеата AZD2171 - с целевой относительной влажностью (0 В) (%), нанесенной на горизонтальной оси, и изменением сухой массы (%), нанесенным на вертикальной оси.
Фигура 8: Рентгенограмма на порошке Формы В малеатной соли AZD2171 - с значениями 2θ, нанесенными на горизонтальной оси, и относительной линейной интенсивностью (импульсов), нанесенной на вертикальной оси.
Фигура 9: ДСК термограмма для Формы В малеата AZD2171 - с температурой в °С, нанесенной на горизонтальной оси, и эндотермическим тепловым потоком (миллиВатты (мВ)), нанесенным на вертикальной оси.
Фигура 10: Рентгенограмма на порошке для экспериментальной суспензии малеата AZD2171 с значениями 29, нанесенными на горизонтальной оси, и относительной линейной интенсивностью (импульсов), нанесенной на вертикальной оси.
Детали используемых методик
Дифракция рентгеновского излучения на порошке
Таблица 5
% Относительная интенсивность*
Определение
25-100
ос (очень сильная)
10-25
с (сильная)
3-10
ср (средняя)
1-3
сл (слабая)
* Относительные интенсивности выводили из дифрактограмм, измеренных с фиксированными щелями
Аналитический прибор: Siemens D5000
Спектры дифракции рентгеновского излучения на порошке снимали путем внесения образца кристаллической соли на подложку из отдельного кристалла кремния (SSC) в приборе Siemens и расстилания образца тонким слоем с помощью предметного стекла микроскопа. Образец вращали со скоростью 30 оборотов минуту (до улучшения счетных статистических данных) и облучали рентгеновским излучением сгенерированным длиннофокусной медной пробиркой работающей при 40 кВ и 40 мА с длинной волны 1,5406 ангстрем. Коллимированный источник рентгеновского излучения пропускали через автоматически дивергентно изменяемую щель, расположенную в V20, а отраженное излучение ориентировали через 2 мм щель, расположенную напротив и 0,2 мм детекторную щель. Образец облучали на протяжении 1 секунды на каждые 0,02 градуса возрастания угла 2-тета (непрерывная методика сканирования) в интервале от 2 градусов до 40 градусов 2-тета в форме тета-тета. Время сканирования составляло 31 минуту и 41 секунду. Прибор был оснащен сцинтилляционным счетчиком как детектором. Контрольные и полученные данные были получены с помощью рабочей станции Dell Optiplex 686 NT 4.0 Workstation, работающей с программным обеспечением Diffract+. Специалистам в области рентгенографии на порошке будет понятно, что относительная интенсивность пиков может зависеть от, например, крупинок с размером больше 30 микрон и неоднородности соотношений, которые могут влиять на анализ образцов. Специалисту в данной области также должно быть понятно, что на расположение отражений может влиять точность расположения по высоте, на которой находится образец в дифрактометре, и калибровка нуля дифрактометра. Незначительное влияние также может оказывать планарность поверхности образца. Поэтому приведенные данные дифракционной картины не должны рассматриваться как абсолютные значения.
Просеивание/Измельчение
Свободное основание AZD2171 просеивали перед измельчением, используя 1 мм сито из нержавеющей стали, основание использовали для получения продукта и для ручной подачи непосредственно в устройство измельчения. Просевали приблизительно 7,5 г свободного основания AZD2171. Использовали чистый S/S футерированный 2" Microniser. Скорость ручной подачи: приблизительно 2/3 г в минуту. Размалывание при давлении воздуха в интервале 10/20 пси (0,67/1,33 атмосфер). Давление воздуха при использовании эффекта Вентури в интервале 20/25 пси (1,33/1,67 атмосфер).
Динамическая сорбция влаги
Аналитический инструмент: анализатор динамической сорбции влаги с системой измерения поверхности (Surface Measurements Systems Dynamic Vapour Sorption Analyser).
Приблизительно 5 мг материала, содержащегося в кварцевом держателе при 25°С, подвергали действия влажной атмосферы азота с относительными значениями относительной влажности (ОВ): 0, 20, 40, 60, 80, 95, 80, 60, 40, 20, 0% ОВ по два раза.
Дифференциальная сканирующая калориметрия
Аналитический инструмент: Mettler DSC820e.
Обычно меньше 5 мг материала, содержащегося в 40 мкл алюминиевом поддоне, снабженном прокалываемой крышкой, нагревали в интервале температур от 25°С до 325°С при постоянной скорости нагревания 10°С в минуту. В качестве продувочного газа использовали азот - скорость потока 100 мл в минуту.
Термогравиметрический анализ
Аналитический инструмент: Mettler TG851.
Обычно от 3 до 12 мг материала, содержащегося в 70 мкл тигле, изготовленном из оксида алюминия, нагревали в интервале температур от 25 до 325°С при постоянной скорости нагревания 10°С в минуту. В качестве продувочного газа использовали гелий - скорость потока 50 мл в минуту.
Определение воды по Карлу Фишеру
Аналитический инструмент: Mitsubishi Moisture Meter CA-05.
Обычно использовали приблизительно 50 мг материала.