СПОСОБ СКРИННИНГА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ КОМПОЗИЦИЙ, ПРИГОДНЫХ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕПРИЯТНОГО ЗАПАХА ИЗО РТА, СВЯЗАННОГО С КУРЕНИЕМ ТАБАЧНЫХ ИЗДЕЛИЙ
METHOD OF SCREENING TO IDENTIFY COMPOSITIONS SUITABLE TO TREAT BAD BREATH RELATED TO TOBACCO GOODS SMOKING

Область применения настоящего изобретения
Настоящее изобретении в основном касается способа скрининга в целях идентификации композиций, пригодных для применения в составах для ухода за полостью рта (например, кондитерские изделия или жевательные резинки), которые эффективны при лечении неприятного запаха из рта, связанного с курением табачных изделий. В частности, настоящее изобретение касается способа скрининг для определения способности композиции снижать концентрацию пиридинового или пиразинового соединения, присутствующего в синтетическом образце или в растворе, моделирующих полость рта субъекта после курения им табачных изделий;
указанный способ используют как индикатор того, что конкретная композиция эффективна при лечении неприятного запаха из рта, связанного с курением табачных изделий.
Предпосылки настоящего изобретения
Подсчитано, что в мире более 1,2 млрд людей курят табачные изделия. Известно, что у людей, курящих эти изделия, пиролизованный табак часто вызывает продолжительный запах изо рта. Помимо этого, для курильщиков и окружающих их людей очевидно, что рот, воздушные пути и легкие курильщика выделяют быстро испаряющийся пиролизованный табак, испарения которого присутствуют в дыхании курильщика в таком количестве, которое могут ощутить окружающие. Эти запахи самим курильщиком обычно воспринимаются как послевкусие, но это происходит по принципу, согласующимся с концепцией привыкания в запаху; таким образом, при постоянном воздействии запаха с течением времени его восприятие снижается, и со временем курильщик может стать невосприимчивым по меньшей мере к одному из признаков неприятного запаха, который могут ощущать другие люди.
Широкое распространение табачных изделий и связанный с этим неприятный запах вызывает постоянную необходимость в продуктах, освежающих дыхание. Однако было подсчитано, что при пиролизе табака может образоваться приблизительно 4800 соединений. Кроме того, курение табачных изделий также приводит к пиролизу различных добавок, обнаруживаемых в сигаретах, а их возможное количество может достигать 600.
Вплоть до настоящего времени было сложно разработать успешную стратегию улучшения запаха из рта, связанного с курением табачных изделий. Это вызвано, по меньшей мере частично тем, что количество возможных источников неприятного запаха огромно. Помимо этого, для того чтобы вещество обладало ароматом, обычно оно должно быть летучим и проходить через эпителий носа в направлении от носа (например, через рот) субъекта или вертикально через нос (например, при вдыхании).
Краткое содержание настоящего изобретения
Следовательно, коротко говоря, настоящее изобретение направлено на способы идентификации композиций, пригодных для применения в составах для ухода за полостью рта (например, кондитерские изделия или жевательные резинки), которые эффективны при лечении неприятного запаха из рта, связанного с курением табачных изделий; и/или на получение композиций, эффективных для снижения неприятного запаха из рта, связанного с курением табака. В одном варианте настоящего изобретения указанный способ включает: осуществляемый внутри сосуда контакт исследуемой композиции и синтетического раствора, который содержит присутствующее в табачном дыме пиридиновое или пиразиновое соединение; определение способности исследуемой композиции снижать концентрацию пиридинового или пиразинового соединения в свободном пространстве указанного сосуда; а также получение состава для ухода за полостью рта, содержащего исследуемую композицию. В этом и/или других описанных здесь вариантах настоящего изобретения исследуемые композиции содержат экстракт клюквы, экстракт дикой яблони, экстракт ягод боярышника, экстракт сливы, экстракт чернослива, экстракт виноградных косточек, экстракт кожуры винограда, масло кардамона, экстракт люцерны, экстракт жимолости, экстракт розмарина, экстракт базилика, экстракт тимьяна, экстракт алое, экстракт хризантемы, экстракт зеленого чая, экстракт плодов кофейного дерева, цикорий, масло семян петрушки, экстракт сосны, экстракт кофе, экстракт женьшеня, экстракт корня одуванчика, аскорбиновую кислоту, кофеиновую кислоту, лактат цинка, силикагель, лимонную кислоту, малеиновую кислоту, виннокаменную кислоту, эвгенол, α-циклодекстрин, β-циклодекстрин, γ-циклодекстрин, хинную кислоту, активированный уголь или их комбинации.
В другом варианте настоящего изобретения способ включает: контакт исследуемой композиции и синтетического раствора внутри сосуда, причем указанный синтетический раствор содержит пахучие вещества табачного дыма, в состав которых входят пиридин, 2-этилпиридин, 3-этилпиридин и этилпиразин; а также определение способности исследуемой композиции снижать концентрацию одного или более пахучих веществ синтетического раствора в свободном пространстве сосуда.
В еще одном варианте настоящего изобретения способ включает:
приготовление большого количества синтетических растворов, причем внутри сосуда каждая исследуемая композиция контактирует отдельно с каждым из указанных растворов, содержащих пиридиновые или пиразиновые соединения, присутствующие в табачном дыме; определение способности каждой из исследуемых композиций снижать концентрацию пиридиновых или пиразиновых соединений в свободном пространстве сосуда; а также выявление одной или более исследуемых композиций в качестве эффективных средств снижения концентрации пиридиновых или пиразиновых соединений по меньшей мере на 50%.
Настоящее изобретении направлено также на способы лечения неприятного запаха из рта, связанного с табачным дымом. В одном варианте настоящего изобретения указанный способ включает введение субъекту состава для ухода за полостью рта (например, кондитерского изделия или жевательной резинки), содержащего ингредиент, явно снижающий в полости рта этого субъекта концентрации пиридиновых или пиразиновых соединений, являющихся результатом курения табачных изделий.
В другом варианте настоящего изобретения указанный способ включает введение субъекту состава для ухода за полостью рта, содержащего ингредиент, эффективно снижающий в полости рта этого субъекта концентрацию пахучих веществ табачного дыма, являющихся результатом курения табачных изделий, по меньшей мере приблизительно на 50%. Указанные пахучие вещества содержат 2,4,6-триметилпиридин, 2,6-диметилпиридин, 3-этилпиридин, а также 2-этил-3-метилпиразин.
В еще одном варианте настоящего изобретения указанный способ включает: распределение состава для ухода за полостью рта, содержащего ингредиент, явно снижающий в полости рта этого субъекта концентрации пиридиновых или пиразиновых соединений, являющихся результатом курения табачных изделий; а также поощрение субъекта потреблять или жевать продукт для улучшения неприятного запаха изо рта, возникающего в результате курения табачных изделий.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 представляет хроматограмму, полученную с помощью детектора плазменной ионизации (FID) так, как это описано в примере 1.
Фиг.2 представляет хроматограмму (TIC), полученную на ионном хроматографе так, как это описано в примере 1.
Фиг.3 представляет наложение аромаграммы и хроматограммы (TIC), описанной в примере 1.
Фиг.4 демонстрирует изменение концентрации пахучих компонентов после обработки синтетического раствора с помощью Applephenon, происходящее в свободном пространстве, как это описано в примере 2.
Фиг.5 представляет результаты сенсорного анализа синтетического раствора, обработанного с помощью Applephenon, как это описано в примере 2; в строке об ошибках указаны стандартные погрешности.
Фиг.6 демонстрирует процентное снижение концентрации различных пахучих компонентов после обработки синтетического раствора с помощью Applephenon, происходящее в свободном пространстве, как это описано в примере 3.
Фиг.7 представляет результаты сенсорного анализа, в которых субъекты, выкурившие сигареты, сравнивают интенсивность послевкусия после жевания ими контрольной жевательной резинки и резинки, содержащей добавку активнодействующих веществ (Applephenon), как это описано в примере 4.
Фиг.8 представляет результаты сенсорного анализа, в которых субъекты, выкурившие сигары, сравнивают интенсивность послевкусия после жевания ими контрольной жевательной резинки и резинки, содержащей добавку активнодействующих веществ (Applephenon), как это описано в примере 5.
Фиг.9 представляет эффективность экстракта клюквы в снижении концентрации пахучих веществ синтетического раствора, происходящее в свободном пространстве, как это описано в примере 6; в строке об ошибках указаны стандартные погрешности.
Фиг.10 представляет эффективность масла кардамона в снижении концентрации пахучих веществ синтетического раствора, происходящее в свободном пространстве, как это описано в примере 6; в строке об ошибках указаны стандартные погрешности.
Фиг.11 представляет действие экстракта клюквы на снижение запаха пиридиновых и пиразиновых компонентов табачного дыма в синтетическом растворе, указанное снижение представлено в процентах относительно контроля, описанного в примере 6; в строке об ошибках указаны стандартные погрешности, а также погрешности сенсорного анализа, проведенного с использованием штриховой шкалы 0-10.
Фиг.12 представляет действие масла кардамона на снижение запаха пиридиновых и пиразиновых компонентов табачного дыма в синтетическом растворе, указанное снижение представлено в процентах относительно контроля, описанного в примере 6; в строке об ошибках указаны стандартные погрешности, а также погрешности сенсорного анализа, проведенного с использованием штриховой шкалы 0-10.
Фиг.13 представляет высвобождение масла кардамона (выраженное в процентах кардамона от времени), как это описано в примере 7.
Фиг.14 представляет высвобождение масла кардамона (количество кардамона со временем), как это описано в примере 8.
Подробное описание предпочтительных вариантов настоящего изобретения
В соответствии с настоящим изобретением, а также подробно описанным далее, обнаружено, что компоненты неприятного запаха изо рта, связанные с курением табачных изделий (такие как пиридиновые и/или пиразиновые соединения), можно использовать для приготовления синтетических образцов или растворов, предназначенных для оценки или скрининга потенциально активных или исследуемых композиций (например, Applephenon, масло кардамона или экстракт клюквы). Оценивалась способность или эффективность снижения концентрации указанных индикаторов или целевых соединений в газообразной атмосфере или в свободном пространстве содержащего их сосуда. Также было обнаружено, что способность или эффективность активных или исследуемых композиций снижать концентрации указанных индикаторных соединений в свободном пространстве сосуда является показателем способности или эффективности того, какая из композиций снижает концентрацию легколетучих и вызывающих запах соединений, находящихся в полости рта субъекта после курения им табачных изделий. Поэтому такие активные или исследуемые композиции могут хорошо подходить для включения их в составы для ухода за полостью рта (включая кондитерские изделия, жевательные резинки, таблетки, съедобные пленки, аэрозоли для рта, зубные эликсиры, или зубные пасты; однако не ограничиваясь ими), которые пригодные для лечения неприятного запаха изо рта, связанного с курением табачных изделий.
Соединения, вызывающие запах
1
2
3
4
Обнаружено, что различные ароматические азотсодержащие соединения, включая пиридиновые и/или пиразиновые соединения, вносят вклад в формирование неприятного запаха изо рта, связанного с курением табачных изделий. В частности, было обнаружено, что вклад в такой запах вносят ди- и тризамещенные пиридиновые и/или пиразиновые соединения, включая, например, низший алкил (например С, С, С, С), замещенные пиридиновые и/или пиразиновые соединения (типа метил, этил, пропил, бутил и/или циклобутил, ди- или три-замещенные пиридиновые и/или пиразиновые соединения). Вне связи с определенной теорией, в настоящее время предполагают, что различные пиридиновые и пиразиновые соединения могут представлять собой побочные продукты пиролиза никотина, в частности, в случае пиридиновых соединений предполагают, что пиролиз приводит к расщеплению связи между вторым и третьим углеродами в пирролидиновом фрагменте никотина (а именно, в 3-(метил-2-пирролидинил)пиридине; это проиллюстрировано ниже).
Было установлено, что с неприятным табачным запахом, помимо различных пиридиновых и пиразиновых соединений, связано присутствие пиррола (например, этилпиррола), а также соединений, не содержащих азота, типа ацетофенона (а именно, 1-фенилэтанона) и диацетила (а именно, 2,3-бутандиона).
-6
-9
В соответствии с настоящим изобретением установлены примеры пахучих компонентов, ответственных за неприятный запах изо рта, вызванный курением табачных изделий; их перечень приведен в таблице 1 примера 1. Некоторые из этих веществ, которые выделяют запах и присутствуют в табачном дыме, могут находиться в нем в крайне низких концентрациях (например, 1×10, или 1×10), однако при этом вносят вклад в ощутимый запах. Например, сообщалось, что в случае пиридина его запах создает пороговая концентрация в воде, составляющая 840 частей на миллиард (Flavor Base Software, Leffingwell and Associates, Canton, GA, 2004).
Методика выявления соединений, вызывающих запах В соответствии с настоящим изобретением для того, чтобы идентифицировать упомянутые выше соединения в качестве основных источников запаха в полости рта субъекта после курения им табачных изделий, использовалась методика, стандартная для данной области знаний. В общем случае пахучие соединения табачного дыма можно экстрагировать из ротовой полости субъекта, курящего табачные изделия, по известным методикам, которые включают, например, обработку тампоном языка курильщика, проводимую в целях получения образца для анализа на содержание определенных соединений, вносящих вклад в описываемый неприятной запах. Подтверждение присутствия на поверхности тампона пахучих веществ табачного дыма обычно проводится специально обученными «нюхачами» (специалистами с очень тонким обонянием). Отбором проб воздуха из полости рта субъекта, курящего табачные изделия, можно собрать пахучие соединения табачного дыма; это делают с помощью разнообразных стандартных методик. Например, для отбора проб на анализ субъект может сделать выдох в сосуд, содержащий искусственную слюну (например, приготовленную так, как это описано ниже в примере 1 и представляющую собой раствор, содержащий хлорид натрия, бикарбонат натрия и бикарбонат калия в деионизированной воде).
После сбора находящихся в образцах соединений, вызывающих запах, связанный с курением табачных изделий, идентификацию указанных соединений можно провести по разнообразным методикам. Например, свободное пространство воздухонепроницаемого или герметичного сосуда с указанными веществами (например, сосуда, содержащего тампон с мазком из полости рта курильщика, или часть жидкого образца, содержащего пахучие вещества табачного дыма, типа искусственной слюны) можно изолировать, провести микроэкстракцию в твердой фазе (SPME), а затем проанализировать (например, газовой хроматографией, используемой в сочетании с устройством, пригодным для выявления или идентификации соединения, типа масс-спектрометра) с целью определения отдельных соединений, вносящих вклад в формирование описываемого неприятного запаха.
Микроэкстракция в твердой фазе представляет собой хорошо известный способ, пригодный для экстракции образца, содержащего пахучие компоненты из полости рта субъекта в целях последующего анализа (”Смотри, например, Released Oral Malodors Measured by Solid Phase Microextraction/Gas Chromatography Mass Spectrometry (HS-SPME-GC-MS), Payne, R., Labows, J., Liu, X, Proceeding ofACS-Flavor Release No 0841236925, 2000). Например, при экстракции воздуха изо рта с помощью газового шприца с последующим разделением на колонке и определением на пламенном фотометрическом детекторе были выявлены сероводород. Метилмеркаптан и диметилсульфид (Смотри, например, Direct Gas Chromatograph Analysis of Suphur Compounds in Mouth Air in Man, Tonzetich, J., Archs, Oral Biol. 1971, 16, 587-597). В частности, было доказано, что микроэкстракция в твердой фазе (SPME) пригодна для экстракции легколетучих компонентов из свободного пространства сосуда, содержащего необычные пахучие вещества в целях последующего анализа методами газовой хроматографии-ольфактометрии (GCO) и газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (GC/MS). (Смотри, например, Headspace Solid Phase Microextraction, Zhang, Z., Pawliszyn, J., Anal. Chem. 1993, 65 1843-1852). Успешность микроэкстракции в твердой фазе содержит несколько требований, касающихся подготовки образца, незначительной потребности в растворителе, а также сравнительно краткого времени экстракции. Пригодная аппаратура для анализа методами GC/MS включает, например, газовый хроматограф Agilent 6890 в сочетании с масс-спектрометром (GC)/(MS); получен от Agilent Technologies (Palo Alto, CA).
Следует отметить, что все упоминаемые выше литературные данные включены в виде ссылки для всех существенных назначений.
В одном варианте образец, который, как известно, содержит пахучие вещества, можно проанализировать с помощью газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией. Идентификацию компонентов, вызывающих запах, обычно можно осуществить, сопоставляя полученный спектр с базой данных (например, Wiley Registry of Mass Spectral Data, 7 th Edition, John Wiley & Sons, Inc., 2000) и/или сопоставляя индексы задержки компонентов образца с известными стандартами.
В альтернативном варианте идентификацию пахучих веществ можно провести методом газовой хроматографии в сочетании с олфактометрией (GCO). Этот способ включает определение того, какие порции элюента хроматографической колонки обладают характеристиками запаха табачного дыма, а также проводя дальнейший анализ этих порций элюента (например, масс-спектрометрией) с целью установления их состава. В литературе описаны разнообразные методики GCO. Одна из этих методик, включающая газовую хроматографию в сочетании с олфактометрией, описана в работе Odor Analysis of Pinot Noir Wins from Grapes of Different Maturitis by a Gas Chromatography-Olfactometry Technique (Osme), Miranda-Lopez R., Libbey, L.M., Watson, B.T., McDaniel, M.R., J. Food sci., 1992, 57: 985-993, 1019. Другой способ включает анализ CHARM, описанный в работе A procedure for the sensory analysis of gas chromatographic effluents, Acree, Т.Е., Bamard, J. Cunningham, D.G., Food Chem. 1984, 41, 1698-1703. Еще один способ включает экстракцию ароматических веществ методикой разведения, этот способ описан в работе Characterization of saffron flavor by aroma extract dilution analysis, Cadwallader, K.R., Baek H.H., Cai M., Spices; Shahidi, F., American Chemical Society: Washington, DC, 1997, 66-79.
Синтетические растворы
В соответствии с настоящим изобретением после идентификации упомянутых выше соединений, являющихся причиной запаха, их можно использовать для приготовления растворов, моделирующих или имитирующих слюну полости рта курильщика табачных изделий. Эти синтетические растворы можно использовать для определения эффективности композиций (например, исследуемых композиций), потенциально активных в снижении неприятного запаха изо рта, связанного с курением табачных изделий; а именно указанные синтетические растворы можно использовать для определения способности исследуемых композиций снижать концентрацию одного или более соединений, вызывающих запах в газообразной среде, или в свободном пространстве сосуда, содержащего этот синтетический раствор, что в свою очередь является индикатором способности исследуемых композиций достигать аналогичных результатов в полости рта.
Схожесть характера запаха и концентрации синтетического раствора с дыханием субъекта, курящего табачные изделия, могут определить специально обученные «нюхачи». Обычно синтетический раствор готовят, добавляя в жидкую (например, водную) среду или в растворитель одно или более пахучих соединений, которые определяют запах табачного дыма. Синтетический раствор также можно получить, вводя жидкую среду или растворитель в сосуд, содержащий одно или более пахучих соединений, которые определяют запах табачного дыма. Обычно жидкая среда содержит воду, и она также может содержать (необязательно) один или более дополнительных компонентов (например спирт типа этанола или метанола). В различных вариантах водная среда, в которую добавляют пахучие соединения табачного дыма, может содержать сочетание спирта (например, этанола) и воды в различных концентрациях или соотношениях. Например, пригодная водная среда обычно содержит спирт (типа этанола) в количестве, составляющем от приблизительно 1% до приблизительно 20% (по весу), или от приблизительно 1% до приблизительно 10% (по весу), а также воду в количестве от приблизительно 80% до приблизительно 99% (по весу);
например, водный раствор, содержащий по весу 5% этанола/95% воды, или водный раствор, содержащий по весу 1% этанола/99% воды).
-6
-6
-6
-6
-6
Обычно синтетические растворы готовят такими, чтобы было гарантировано, что исходная и конечная концентрации пахучих веществ в свободном пространстве содержащего их сосуда выше, чем предел обнаружения для данного метода анализа; таким образом, ошибки выявления/измерения минимизированы или совсем исключены. Поэтому обычно синтетические растворы готовят таким образом, чтобы была обеспечена минимальная концентрация пахучих веществ в свободном пространстве сосуда, составляющая приблизительно 10 частей на миллион (10×10), по меньшей мере приблизительно 50×10, по меньшей мере приблизительно 100×10, по меньшей мере приблизительно 150×10, или по меньшей мере приблизительно 250×10.
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
Синтетический раствор обычно содержит одно или более пахучих веществ табачного дыма, таким образом суммарная концентрация пахучих веществ в указанном растворе составляет по меньшей мере приблизительно 200 частей на миллион (200×10), более обычно по меньшей мере приблизительно 600×10, еще более обычно по меньшей мере приблизительно 1000×10, а наиболее обычно суммарная концентрация пахучих веществ составляет по меньшей мере приблизительно 1500×10. Предпочтительно, чтобы суммарная концентрация пахучего вещества (или пахучих веществ) в синтетическом растворе составляла от приблизительно 600×10 до приблизительно 2000×10, более предпочтительно, чтобы она составляла от приблизительно 600×10 до приблизительно 1750×10, а наиболее предпочтительна концентрация, составляющая от приблизительно 1000×10 до приблизительно 1750×10. Жидкая (например, водная) среда или растворитель (например, вода, и, необязательно, спирт или некоторые другие компоненты) обычно составляют остальную часть синтетического раствора.
Обычно синтетический раствор содержит пиридиновое или пиразиновое соединение, а в различных вариантах синтетический раствор содержит и пиридиновое, и пиразиновое соединение. В одном предпочтительном варианте указанный раствор содержит большое количество пиридиновых соединений и/или большое количество пиразиновых соединений. Пиридиновое соединение (соединения) можно выбрать из 2,4,6-триметилпиридина, 2,6-диметилпиридина, 3,5-диметил-пиридина, 2-этилпиридина, 3-этилпиридина, пиридина, или некоторых их комбинаций. Пиразиновое соединение (соединения) можно выбрать из этилпиразина, 2,3-диметилпиразина, 2,5-диметилпиразина и 2-этил-3-метилпиразина, или некоторых их комбинаций. Например, по меньшей мере в некоторых вариантах синтетический раствор содержит 2,4,6-триметилпиридин, 2,6-диметилпиридин, 2-этилпиридин, 3-этилпиридин, пиридин, этилпиразин, и/или 2-этил-3-метилпиразин. В других вариантах синтетический раствор дополнительно (или необязательно) содержит пиридин, 2-этилпиридин, 3-этилпиразин и/или этилпиразин.
В соответствии с настоящим изобретением были идентифицированы различные синтетические растворы, которые являются частными репрезентативными примерами пахучих веществ табачного дыма, или веществ, аналогичных им. Один такой раствор содержит пиридин, 2-этилпиридин, 3-этилпиразин и этилпиразин. Синтетические растворы могут также (необязательно) содержать указанные компоненты, а также 2,4,6-триметилпиридин, 2,6-диметилпиридин, 3-этилпиридин, 2-этил-3-метилпиразин или их комбинации. Указанные синтетические растворы могут, помимо этого, содержать (необязательно) 3,5-диметилпиридин, 2-этилпиридин, 3-этилпиридин, 2,3-диметилпиразин, 2,5-диметилпиразин или их комбинации.
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
В случае описанного здесь одно или более синтетических растворов (например, раствора, содержащего пиридин, 2-этилпиридин, 3-этилпиразин и этилпиразин) обычно суммарная концентрация пахучих веществ составляет по меньшей мере приблизительно 200×10, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 600×10, а более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1200×10; при этом указанные концентрации варьируются от приблизительно 200×10 до приблизительно 1200×10, или от приблизительно 200×10 до приблизительно 800×10. Например, если синтетический раствор содержит пиридин, 2-этилпиридин, 3-этилпиразин, этилпиразин, 2,4,6-триметилпиридин, 2,6-диметилпиридин, 3-этилпиридин, и 2-этил-3-метил-пиразин, то суммарная концентрация пахучих веществ обычно составляет по меньшей мере приблизительно 400×10, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 800×10; а более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1200×10; при этом указанные концентрации варьируются от приблизительно 400×10 до приблизительно 1400×10, или от приблизительно 800×10 до приблизительно 1400×10. Более конкретно, в случае описанного здесь одного или более синтетических растворов, концентрация каждого из пахучих веществ, присутствующих в растворе, составляет 1×10, по меньшей мере приблизительно 50×10, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 75×10, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 100×10; при этом концентрация каждого из пахучих веществ варьируются от приблизительно 1×10 до приблизительно 200×10, от приблизительно 125×10 до приблизительно 175×10, или от приблизительно 75×10 до приблизительно 150×10.
Способ скрининга
В соответствии с настоящим изобретением описанный выше синтетический раствор может быть применен в виде составляющей способа скрининга композиции с целью определения, является ли она эффективной для снижения концентрации пахучих веществ в газообразной атмосфере свободного пространства сосуда, в котором указанный синтетический раствор содержится. Обычно сосуд, в котором содержится этот раствор, имеет объем, пригодный для обеспечения минимальной требуемой концентрации пахучих веществ в свободном пространстве сосуда, содержащего эти пахучие вещества. В целом способ скрининга согласно настоящему изобретению включает контакт синтетического раствора с исследуемой композицией. Обычно исследуемая композиция может иметь вид масла (например, кардамоновое масло), раствора этой композиции в водной среде (например, в воде), или твердого вещества, растворяющегося при контакте с синтетическим раствором. Способность исследуемой композиции снижать концентрацию пиридинового или пиразинового соединения в свободном пространстве сосуда, в котором находится синтетический раствор, содержащий пахучее вещество (вещества), можно определять по методике, известной в данной области знаний. В частности, такое определение можно осуществить, если, например, измерить концентрацию пиридинового или пиразинового соединения в свободном пространстве сосуда, содержащего указанный раствор, до проведения контакта с исследуемой композицией, а затем измерить эту же концентрацию в свободном пространстве того же сосуда после контакта. Таким образом, разница исходной и конечной концентрации пиридинового соединения (соединений) и/или пиразинового соединения (соединений) в свободном пространстве указанного сосуда определит эффективность исследуемой композиции в снижении концентрации пахучих веществ.
В этой связи следует отметить, что (как это подробно описывается далее) установлено наличие связи между количественным определением эффективности исследуемой композиции по снижению концентрации пахучих веществ в свободном пространстве и качественными характеристиками состава для ухода за полостью рта, содержащего такую композицию и предназначенного для лечения неприятного запаха изо рта, связанного с курением табачных изделий.
Обычно как исходную, так и конечную концентрации пиридинового соединения (соединений) и/или пиразинового соединения (соединений) в свободном пространстве указанного сосуда определяют способами, известными в данной области знаний. Эти способы включают отбор образца из свободного пространства сосуда, а также анализ испарений части образца методом разделения (типа хроматографического разделения) и обнаружения (например, масс-спектрометрией). Отбор проб из свободного пространства сосуда может быть проведен при контакте свободного пространства с волокном, эффективным для абсорбции части испарений, содержащих пиридиновое или пиразиновое соединение, или при контакте свободного пространства над продуктом с воздухонепроницаемым шприцом, эффективным для экстракции части испарений, содержащих пиридиновое или пиразиновое соединение. Отбор проб или экстракция части свободного пространства обычно проводят при температуре, составляющей от приблизительно 20°С до приблизительно 100°С, или от приблизительно 20°С до приблизительно 40°С, предпочтительно от приблизительно 20°С до приблизительно 25°С, а еще более предпочтительно - от приблизительно 20°С до приблизительно 22°С. Далее, отбор проб или экстракцию части свободного пространства обычно проводят в течение по меньшей мере приблизительно 5 минут, в течение по меньшей мере приблизительно 10 минут, в течение по меньшей мере приблизительно 20 минут, в течение по меньшей мере приблизительно 30 минут или в течение по меньшей мере приблизительно 1 часа. Обычно отбор проб или экстракция части свободного пространства занимает период времени, составляющий до приблизительно 2 часов, до приблизительно 3 часов, до приблизительно 4 часов, до приблизительно 6 часов, до приблизительно 8 часов или до приблизительно 10 часов. В других вариантах отбор проб и экстракция могут протекать в течение значительно более продолжительного периода времени (например, до приблизительно 12 часов, до приблизительно 24 часов, или до приблизительно 48 часов). Отобрать большое количество проб из свободного пространства можно последовательно, и, на самом деле, большое количество проб можно подвергнуть экстракции, время которой составляет столько же, сколько указанное выше время отбора одной или более проб. Помимо этого, образцы можно отбирать с перерывами, причем интервалы между отборами проб не являются слишком узкими.
В связи с этим необходимо отметить, что анализ образца и определение концентрации соединения, вызывающего данный запах, в свободном пространстве сосуда, который осуществляют или перед контактом с исследуемой композицией, или после такого контакта, можно проводить по другим известным методикам или методологиям, не отступая при этом от границ настоящего изобретения.
Синтетический раствор и исследуемая композиция обычно контактируют между собой в воздухонепроницаемом или в герметичном сосуде. Для того, чтобы гарантировать, что контакта между синтетическим раствором и исследуемой композицией достаточно для определения конечных концентраций пиридина и/или пиразина, синтетический раствор и указанная композиция находятся в контакте в течение по меньшей мере приблизительно 5 минут, в течение по меньшей мере приблизительно 10 минут, в течение по меньшей мере приблизительно 20 минут, в течение по меньшей мере приблизительно 30 минут, или в течение по меньшей мере приблизительно 1 часа. Обычно контакт исследуемой композиции и синтетического раствора в целях определения конечных концентраций пиридина и/или пиразина проводят в течение периода времени, составляющего до приблизительно 2 часов, до приблизительно 3 часов, до приблизительно 4 часов, до приблизительно 6 часов, до приблизительно 8 часов, или до приблизительно 10 часов. В других вариантах контакт исследуемой композиции и синтетического раствора происходит в течение значительно более продолжительного периода времени (например, до приблизительно 12 часов, до приблизительно 24 часов, или до приблизительно 48 часов).
Подходящую температуру контакта исследуемой композиции и синтетического раствора выбирают таким образом, чтобы она предпочтительно имитировала те условия в полости рта субъекта, использующего средства для ухода за полостью рта (например, жевательная резинка или кондитерское изделие), в которых указанная исследуемая композиция должна использоваться. Поэтому обычно контакт исследуемой композиции и синтетического раствора происходит при температуре, составляющей от приблизительно 20°С до приблизительно 100°С, от приблизительно 20°С до приблизительно 40°С, или от приблизительно 20°С до приблизительно 30°С, а предпочтительно от приблизительно 20°С до приблизительно 25°С, а еще более предпочтительно - от приблизительно 20°С до приблизительно 22°С.
Сосуд, в котором содержатся исследуемая композиция и синтетический раствор, также можно перемешивать, например, имитируя условия потребления (например, жевание). Степень и способ перемешивания не особенно критичны, и его можно проводить в соответствии с известными в технологии способами.
Обычно синтетический раствор контактирует с количеством исследуемой композиции, репрезентативным для такого количества указанной композиции, которое в конечном счете должно быть использовано в таком средстве для ухода за полостью рта, как жевательная резинка или кондитерское изделий. Поскольку пропорции исследуемой композиции, включенной в состав для ухода за полостью рта могут меняться (в зависимости, например, от типа указанного состава, а также от его целевого аромата), то и количество указанной исследуемой композиции, контактируемой с синтетическим раствором может меняться аналогично в сравнительно широких пределах. Например, в некоторых вариантах настоящего изобретения синтетический раствор может контактировать по меньшей мере приблизительно с 0,01 мг исследуемой композиции на 1 мл синтетического раствора, по меньшей мере приблизительно с 0,1 мг исследуемой композиции на 1 мл синтетического раствора, по меньшей мере приблизительно с 0,5 мг исследуемой композиции на 1 мл синтетического раствора, или по меньшей мере приблизительно с 1 мг исследуемой композиции на 1 мл синтетического раствора. По меньшей мере в некоторых вариантах синтетический раствор контактирует с исследуемой композицией, количество которой составляет от приблизительно 0,01 мг до приблизительно 1 мг на 1 мл раствора, от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 0,8 мг на 1 мл раствора, или от приблизительно 0,2 мг до приблизительно 0,7 мг на 1 мл раствора. В других вариантах настоящего изобретения синтетический раствор обычно контактирует с исследуемой композицией, количество которой составляет от приблизительно 1 мг до приблизительно 75 мг на 1 мл раствора, чаще от приблизительно 5 мг до приблизительно 60 мг на 1 мл раствора, предпочтительно от приблизительно 10 мг до приблизительно 50 мг на 1 мл раствора, а наиболее предпочтительно - от приблизительно 15 мг до приблизительно 30 мг на 1 мл раствора.
Следует отметить, что способ скрининга по настоящему изобретению ответственен за тестирование большого количества композиций с помощью комбинации известных методик. В таких вариантах можно приготовить большое количество исследуемых композиций (например, серию из по меньшей мере приблизительно 5, по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 15, по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 25 по меньшей мере приблизительно 30, по меньшей мере приблизительно 40, по меньшей мере приблизительно 50 или большего их количества), и осуществить их контакт с одним и тем же или с разными синтетическими растворами. Указанный контакт происходит, например, в отдельных герметически закрытых сосудах, или в отдельных герметически закрытых ячейках. Для того чтобы настоящий способ было легче использовать с помощью промышленно доступной автоматизации (например, промышленно доступные устройства для автоматического отбора проб, которые можно применять в сочетании с доступным устройством GC/MS) предпочтительно, чтобы большое количество исследуемых композиций располагались в некотором пространственном формате, типа ячеек из стандартного субстрата в пространственном формате (например, микротитровальная пластина), преимущественно параллельно. В каждом сосуде можно определять возможность каждой из большого количества исследуемых композиций снижать концентрацию пиридинового или пиразинового соединения. По меньшей мере в определенных вариантах состав для ухода за полостью рта (например, кондитерское изделие или жевательная резинка) приготавливают исходя по меньшей мере из двух исследуемых композиций, эффективность которых для снижения концентраций пиридина и/или пиразина установлена.
Вне связи с определенной теорией, снижение концентрации пиридинового и/или пиразинового соединения в свободном пространстве объясняется контактом с исследуемыми композициями, который, как полагают, протекает в соответствии с одним или более механизмами.
Одним возможным механизмом является действия добавки исследуемой композиции на рН синтетического раствора. Например, обычно синтетические растворы, содержащие пиридиновые и/или пиразиновые соединения, имеют нейтральное значение рН (а именно, рН от приблизительно 6 до приблизительно 8). При добавлении различных исследуемых композиций к таким синтетическим растворам наблюдалось падение рН (а именно, подкисление раствора). Например, добавка Applephenon к синтетическому раствору (подробно описано в примере 2) приводит к получению кислого раствора, рН которого составляет приблизительно 3,7. Такое падение рН, который, как полагают в настоящее время, приписывают основному компоненту Applephenon - полифенольной кислоте, выделяющей хлор. Пиридин (рКа которого составляет 5,2), содержащийся в подкисленном растворе, первоначально присутствует в виде катиона. В настоящее время полагают, что водородная связь образцов пиридина, несущих заряд, приводит к протонированной форме, обладающей пониженной летучестью, и, следовательно, уменьшенной концентрацией в свободном пространстве. Помимо этого, заряженные (положительно или отрицательно) компоненты синтетического раствора обычно более сильно растворимы в воде, чем незаряженные образцы. Увеличение растворимости пахучих компонентов обычно связано с более сильным слюнотечением в полости рта, которое может привести к тому, что растет удаление указанных пахучих веществ путем проглатывания, к которому побуждает указанное усиленное слюнотечение. Удаление растворимых компонентов из полости рта также может протекать при полоскании водой или другими напитками.
С точки зрения описанного выше необходимо отметить, что для того, чтобы оценить влияние рН на действия исследуемой композиции, в некоторых вариантах способ скрининга по настоящему изобретению может дополнительно (необязательно) включать скрининг одних и тех же исследуемых композиций и/или синтетических растворов, проводимый, однако, при различных значениях рН. Например, в таком варианте содержание исследуемой композиции можно регулировать таким образом, чтобы получаемые в результате контакта с синтетическим раствором смесь или раствор имели рН менее чем приблизительно 7, при этом диапазон рН варьируется от приблизительно 2 до приблизительно 6.
Другой возможный механизм включает влияние компонентов определенной активнодействующей композиции на продуцирование белков слюны. Полифенолы представляют собой компоненты таких активнодействующих композиций (например, Applephenon и экстракт клюквы) по настоящему изобретению. Известно, что полифенолы, в частности танины, осаждают белки слюны. В настоящее время предполагают, что летучие компоненты адсорбируют белки слюны, делая менее возможным их высвобождение в свободное пространство над раствором. Помимо этого, полагают, что часть летучих компонентов должна быть удалена из полости рта благодаря проглатыванию белков слюны с адсорбированными в них летучими компонентами.
Вне зависимости от того, согласно какому механизму достигается снижение концентрации, следует отметить, что настоящее изобретение делает возможным скрининг исследуемых композиций количественным и/или аналитическим путем; это делается для того, чтобы оценить возможность использования указанных композиций в составах для ухода за полостью рта (типа жевательной резинки или кондитерского продукта), при этом отсутствует необходимость первоначального приготовления такого типа состава. Таким образом можно произвести оценку большого количества образцов быстрее, а также более результативно и эффективно с точки зрения стоимости. Например, в предпочтительном варианте настоящее изобретение можно использовать для скрининга большого количества исследуемых композиций с целью их более эффективной идентификации, а также отбора таких композиций, которые эффективны в снижении концентрации одного или более пиридиновых и/или пиразиновых соединений в свободном пространстве сосуда, содержащего синтетический раствор, по меньшей мере приблизительно на 20% или по меньшей мере приблизительно на 30%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 40%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90%, а наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 100% (согласно анализу, проведенному по известной методике методом масс-спектрометрии). После идентификации эти композиции можно (необязательно) подвергнуть дальнейшему тестированию. В некоторых случаях получившиеся композиции (например, жевательная резинка или кондитерские изделия) могут обеспечить такое же или аналогичное снижение концентрации в полости рта субъекта.
Как отмечалось ранее для того, чтобы некоторое вещество имело аромат, обычно оно должно быть летучим и должно пройти через эпителий носа субъекта ретроназально или ортоназально. Поэтому снижение в свободном пространстве концентрации пахучих летучих веществ синтетического раствора обычно указывает на эффективность снижения летучего компонента, находящегося в полости рта субъекта после курения им табачного изделия, и, следовательно, на эффективность лечения неприятного запаха из полости рта, вызванного присутствием там указанных летучих компонентов. Поэтому после того, как исследуемая композиция успешно проидентифицирована в соответствии с настоящим изобретением, в целях снижения концентрации соединения, вызывающего запах, затем указанная композиция может быть (необязательно) использована для приготовления состава для ухода за полостью рта (например, жевательной резинки и/или кондитерского изделия), а также для дальнейшего анализа или применения человеком.
Используя для этого описанный здесь процесс можно провести скрининг различных композиций с целью определения их способности снижать концентрацию пахучих веществ в свободном пространстве синтетических растворов. Эти композиции включают композиции, полученные из различных фруктов (например, клюквы, яблок, лесных яблок, ягоды боярышника, слив, чернослива и винограда), овощей и растений.
Например, композиции, которые нуждаются в скрининге по настоящему изобретению, могут включать, или в основном состоять из экстрактов, масел, соединений и т.д., выбранных из группы, включающей: экстракт клюквы, Applephenon, экстракт дикой яблони, экстракт ягод боярышника, экстракт сливы, экстракт чернослива, экстракт виноградных косточек, экстракт кожуры винограда, экстракт семян кардамона (например, масло кардамона), экстракт люцерны, экстракт жимолости, экстракт розмарина, экстракт базилика, экстракт тимьяна, экстракт алое, экстракт хризантемы, экстракт зеленого чая, экстракт плодов кофейного дерева, цикорий, масло семян петрушки, экстракт сосны, экстракт кофе, экстракт женьшеня, экстракт корня одуванчика, аскорбиновую кислоту, кофеиновую кислоту, лактат цинка, силикагель, лимонную кислоту, малеиновую кислоту, виннокаменную кислоту, эвгенол, α-циклодекстрин, β-циклодекстрин, γ-циклодекстрин, хинную кислоту, а также их комбинации.
Для дальнейшего примера, композиции, которые нуждаются в скрининге по настоящему изобретению, могут включать, или в основном состоять из экстрактов, масел, соединений и т.д., выбранных из группы. включающей: экстракт клюквы, экстракт дикой яблони, экстракт ягод боярышника, экстракт сливы, экстракт чернослива, экстракт виноградных косточек, экстракт кожуры винограда, экстракт семян кардамона (например, масло кардамона), экстракт люцерны, экстракт жимолости, экстракт розмарина, экстракт базилика, экстракт тимьяна, экстракт алое, экстракт хризантемы, экстракт зеленого чая, экстракт плодов кофейного дерева, цикорий, масло семян петрушки, экстракт сосны, экстракт кофе, экстракт женьшеня, экстракт корня одуванчика, аскорбиновую кислоту, кофеиновую кислоту, лактат цинка, силикагель, лимонную кислоту, малеиновую кислоту, виннокаменную кислоту, эвгенол, α-циклодекстрин, β-циклодекстрин, γ-циклодекстрин, хинную кислоту, а также их комбинации.
В некоторых вариантах настоящего изобретения композиции, которые необходимо подвергнуть скринингу, могут быть получены из фруктов, включая, например, экстракт клюквы, экстракт дикой яблони, экстракт ягод боярышника, экстракт сливы, экстракт чернослива, экстракт виноградных косточек, экстракт кожуры винограда, а также их комбинации. В других вариантах настоящего изобретения композиции, которые необходимо подвергнуть скринингу, могут быть получены из растений, включая, например, экстракт семян кардамона (например, масло кардамона), экстракт люцерны, экстракт жимолости, экстракт розмарина, экстракт базилика, экстракт тимьяна, экстракт алое, экстракт хризантемы, экстракт зеленого чая, экстракт плодов кофейного дерева, цикорий, масло семян петрушки, экстракт сосны, экстракт кофе, экстракт женьшеня, экстракт корня одуванчика, а также их комбинации. В других вариантах настоящего изобретения композиции, которые необходимо подвергнуть скринингу, содержат аскорбиновую кислоту, кофеиновую кислоту, лактат цинка, силикагель, лимонную кислоту, малеиновую кислоту, виннокаменную кислоту, эвгенол, α-циклодекстрин, β-циклодекстрин, γ-циклодекстрин, хинную кислоту, a также их комбинации.
В соответствии с настоящим изобретением скринингу также можно подвергнуть уголь (например, активированный уголь), полученный, например, из древесины или ореховой скорлупы. В частности, было установлено, что Applephenon, кардамоновое масло и экстракт клюквы эффективны в снижении концентрации пахучих веществ в свободном пространстве.
Применение композиций в составах для ухода за полостью рта
Композициями, признанными эффективными для снижения концентрации пиридинового или пиразинового соединения в свободном пространстве содержащего эти вещества сосуда по меньшей мере на приблизительно 50% (или выше) в основном являются композиции, которые хорошо подходят для включения в составы для ухода за полостью рта (включая кондитерские изделия, жевательные резинки, таблетки, съедобные пленки, аэрозоли для рта, зубные эликсиры, или зубные пасты; однако не ограничиваясь ими), пригодные для лечения неприятного запаха изо рта, связанного с курением табачных изделий. В частности, в соответствии со способом скрининга, исследуемые или активные композиции, которые определены как эффективные для снижения концентрации соединений, вызывающих запах, в свободном пространстве содержащего их сосуда, пригодны для включения в кондитерские изделия или жевательные резинки;
указанное включение проводят согласно со способами, известными в данной технологии и описанными, например, в патенте США №6,627,234 (полное содержание которого включено здесь в виде ссылки).
Активные композиции могут быть включены в состав для ухода за полостью рта без разведения, или их можно разбавлять перед включением в состав. В любом случае, активная композиция может содержаться в кондитерском изделии или в жевательной резинке в концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 0,1% по весу, обычно по меньшей мере приблизительно 0,5% по весу, а чаще - по меньшей мере приблизительно 1% по весу. Предпочтительно, чтобы концентрация активной композиции, содержащейся в кондитерском изделии или в жевательной резинке, составляла от приблизительно 0,1% по весу до приблизительно 5% по весу, более предпочтительно от приблизительно 0,5% по весу до приблизительно 2% по весу, а еще более предпочтительно от приблизительно 0,5% по весу до приблизительно 1% по весу.
Способ лечения неприятного запаха изо рта
Обычно лечение неприятного запаха изо рта, связанного с табачным дымом, осуществляется путем введения субъекту состава для ухода за полостью рта (например, одного или более кусочков кондитерских изделий или жевательной резинки), который содержит активную композицию, выявленную в соответствии с настоящим изобретением; то есть, неприятный запах изо рта в соответствии с настоящим изобретением можно лечить введением субъекту состава для ухода за полостью рта, который, как установлено, снижает концентрацию пахучих веществ табачного дыма. В частности, неприятной запах изо рта можно лечить введением субъекту композиции, эффективной в снижении концентрации пиридинового или пиразинового соединения, находящегося в полости рта субъекта, и являющегося результатом курения табачного изделия. Указанное снижение концентрации при использовании состава для ухода за полостью рта (типа жевательной резинки или кондитерского изделия) происходит по меньшей мере на приблизительно 20%, по меньшей мере на приблизительно 30%, по меньшей мере на приблизительно 40%, по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 60%, по меньшей мере на приблизительно 70%, по меньшей мере на приблизительно 80%, или по меньшей мере на приблизительно 90%. Желательно, чтобы продолжительность пребывания продукта в полости рта, а также скорость высвобождения активной композиции из указанного состава для ухода за полостью рта регулировались таким образом, чтобы оптимизировать эффективность указанного продукта в отношении неприятного запаха, вызванного табачным дымом. Например, при введении жевательной резинки обычно ее жевание продолжается в течение по меньшей мере приблизительно 5 минут, чаще - в течение от приблизительно 5 минут до приблизительно 60 минут, еще чаще - в течение от приблизительно 10 минут до приблизительно 20 минут, а еще чаще - в течение приблизительно 20 минут. В случае жевательной резинки в первые несколько минут жевания (например, приблизительно 2 минут, приблизительно 3 минут, приблизительно 4 минут, или даже приблизительно 5 минут) из нее высвобождается активная композиция в количестве, составляющем по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 75% или даже по меньшей мере приблизительно 100%. Чаще в течение первых 20 минут жевания из жевательной резинки высвобождается по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 75% или даже по меньшей мере приблизительно 100% активной композиции.
Однако в этой связи отмечалось, что в различных альтернативных вариантах настоящего изобретение может быть желательна более продолжительная доставка активной композиции в полость рта. В таких вариантах может быть желательно, чтобы в течение нескольких первых минут введения (например, в течение первых приблизительно 2 минут, приблизительно 3 минут, приблизительно 4 минут, или даже приблизительно 5 минут) в полость рта высвобождалось не более чем приблизительно 25% активной композиции, не более чем приблизительно 50%, не более чем приблизительно 75%. Аналогично, может быть желательно, чтобы в течение первых 20 минут введения в полость рта высвобождалось не больше чем приблизительно 50% или не больше, чем приблизительно 75% активной композиции.
Способ содействия использованию композиции
Настоящее изобретение направлено также на способ, содействующий использованию состава для ухода за полостью рта, содержащего композицию, эффективную для снижения концентрации пиридинового или пиразинового соединения, присутствующего в полости рта субъекта в результате курения им табачных изделий. Обычно этот процесс включает:
распределение потребителю (или субъекту, который, в свою очередь, распределит потребителю) состава для ухода за полостью рта (включая кондитерские изделия, жевательные резинки, таблетки, съедобные пленки, аэрозоли для рта, зубные эликсиры, или зубные пасты; однако не ограничиваясь ими); а также поощрение субъекта потреблять или жевать этот продукт в целях исправления неприятного запаха изо рта, являющегося результатом курения табачных изделий. Указанный состав содержит композицию, которая, как установлено, снижает концентрацию пиридинового или пиразинового соединения, находящегося в полости рта субъекта в результате курения им табачных изделий. Обычно указанный продукт описывают как содержащий некоторый ингредиент, который, как установлено, снижает концентрацию пиридинового или пиразинового соединения, находящегося в полости рта субъекта и являющегося результатом курения этим субъектом табачных изделий. В частности, выявление эффективности ингредиента проводят путем описанного здесь скрининга. В случае жевательной резинки, содержащей такой ингредиент, обычно субъекта поощряют к жеванию этой резинки в течение определенного периода времени (например, по меньшей мере приблизительно 5 минут или приблизительно 20 минут).
Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые не следует рассматривать в качестве ограничивающих границы настоящего изобретения, или способов его реализации.
Примеры
Пример 1
В этом примере подробно описывается идентификация пахучих компонентов, отвечающих за неприятный запах, вызванный курением табачных изделий.
Указанный способ идентификации пахучих компонентов включает:
получение мазка из полости рта субъекта, которое проводят перед курением им табачных изделий и после курения; а также анализ с использованием микроэкстракции в твердой фазе (SPME) и хроматографии-олфактометрии (GCO), и газовой хроматографии/масс-спектроскопии (GC/MS).
Анализ пахучих соединений проводили в лаборатории Microanalytics (Microanalytics, A MOCON company Round Rock, TX) с использованием сигары Macanudo (Macanudo robusto brand, Dominican republic). В анализе принимало участие 2 эксперта, перед курением в течение 2 часов они не употребляли еды или питья, а также не использовали средства гигиены полости рта. За 1 час перед опытом указанные эксперты воздерживались от курения и приема любой пищи, за исключением воды. Ни один из экспертов не курил регулярно, и оба они имели хорошее состояние полости рта. Каждый из экспертов выкуривал по Ѕ сигары (это составило приблизительно 20 минут курения).
Пахучие соединения табачного дыма выделяли из полости рта экспертов, для этой цели мазки с поверхности языка делали до курения и после него. Использовался валик с нейлоновой ручкой и нейлоновой сеткой (TX 714A, The Texwipe Co., Upper Saddle river, NJ). После того как было подтверждено, что мазки имеют табачный запах (два «нюхача» нюхали мазки и пришли к соглашению о мазках с наиболее сильным запахом), полипропиленовую рукоятку отрезали, а сам тампон для дальнейшего отбора проб был помещен в герметичный стеклянный 40 мл пузырек с винтовой пластиковой крышкой. В качестве контрольных для анализа использовалась верхняя часть тампонов, полученных из полости рта экспертов за 10 минут до курения.
Свободное пространство пузырька, содержащего верхние части тампонов, подвергли экстракции в течение 60 минут. Для этого использовался способ микроэкстракции в твердой фазе (SPME) (Supeico, Bellefonte, PA). Процесс проводили с использованием Carboxen - полидиметилсилоксанового волокна (75 мкм, 23 калибр).
В газовый хроматограф (GC) Agilent 6890/масс-спектрометр (MS), модифицированный для многомерного анализа (Agilent Technologies, Palo Alto, CA), и снабженный программным обеспечением Aroma Trax (Microanalytics, Round Rock, TX) провели инжекцию устройства с волокном SPME для анализа; описанный хроматограф имел специальное отверстие для втягивания носом (sniff port). Указанные волокна сохранялись в инжекционном порте газового хроматографа в течение 5 минут после инжекции. Первоначально анализ проводился в ручном варианте микроэкстракции.
Рабочие параметры GC/MS были следующие: скорость тока Не в качестве газа-носителя составила 6,5 мл/мин, режим расщепления (2:1). Инжектор был установлен на 250°С. Высота колонки 1-15 м, ее внутренний диаметр - 0,53 мм, толщина пленки - 1 мкм, стационарная фаза - 5% фенилметилполисилоксан (SGE ВР 5); колонка работала под постоянным давлением, составляющим 16 фунтов на квадратный дюйм, со средней скоростью 66 см/с. Высота колонки 2-30 м, ее внутренний диаметр - 0,53 мм, толщина пленки - 1 мкм, стационарная фаза - 5% фенилметилполисилоксан (SGE ВР 5); колонка работала под постоянным давлением, составляющим 5,7 фунтов на квадратный дюйм, со средней скоростью 56 см/с. Печь была запрограммирована таким образом, что в течение 3 минут она выдерживала температуру, составляющую 40°С, а затем происходил рост температуры до 220°С со скоростью 7°С/мин, финальное значение температуры поддерживали в течение 20 мин. Масс-спектрометр работал при 70 эВ в режиме электронного удара.
Отверстие для втягивания носом газового хроматографа использовали для того, чтобы определить конкретные промежутки времени, в течение которых элюант колонки имеет характеристики запаха табачного дыма;
основные фракции (небольшие сегменты) эффлюента, содержащие пики указанного запаха, в целях их дальнейшей оценки и идентификации подвергались селективному анализу с помощью детектора масс-спектрометра и указанного отверстия. Затвор для основной фракции располагался между первой и второй колонкой. Элюант второй колонки разделялся между детектором масс-спектрометра и отверстием для втягивания в соотношении 50:50, в то время как элюант из первой колонки проходил исключительно на пламенно-температурный детектор (если только затвором основной фракции он не подвергался избирательной отправке на вторую колонку или удалению).
Дополнительный анализ и дальнейшая очистка активных пахучих соединений проводили на аппаратуре Wrigley Chicago Research and Development facility с использованием установки газовой хроматографии и масс-спектрометрии (Microanalytics GC/MS), характеристики которой аналогичны характеристикам используемой ранее установки, за исключением того, что аппаратура Chicago включала прибор для автоматического отбора проб Leap Technologies CombiPal, на котором можно было применять автоматизированный вариант микроэкстракци в твердой фазе, SPME (Leap Technologed, Carrboro, NC). Для того чтобы отделение основной фракции было более точным и четким в установке газовой хроматографии и масс-спектроскопии (GC/MS) имелась прямая связь выходного отверстия первой колонки с отверстием для втягивания носом. В анализах, проводимых раньше, с использованием отбора проб вручную, отверстие для втягивания было присоединено только к выходному отверстию второй колонки. Время, используемое для основной фракции основывалось на обратном подсчете периода времени, в течение которого пик пахучести, имеющий специфическое временя задержки у масс-спектрометра и у отверстия для втягивания носом (у выходного отверстия второй колонки), проходит через первую колонку (затвор для основной фракции расположен у выходного отверстия первой колонки). В этой системе, включающей устройство для автоматического отбора проб, отверстие для втягивание имеет отвес, который допускает непосредственное присоединение к выходному отверстию первой колонки, таким образом, основные фракции могут быть составлены на основе времени определения запаха. Указанное отверстие для втягивания носом так же, как и раньше, может быть присоединено к выходному отверстию второй колонки.
Для компонентов, которые проявляют запах, но идентичность которых не может быть установлена точно, в целях дополнительного разделения пиков эффлюент основной фракции собирают в верхней части второй колонки с помощью криогенной техники. Время экстракции свободного пространства также было увеличено до 24 ч в целях полного заполнения волокна летучими компонентами из указанного пространства. В отличие от отмеченного выше, колонки, печь и другие аналитические параметры остаются прежними.
Фиг.1 представляет хроматограмму, полученную с помощью детектора плазменной ионизации (FID). На ней показаны экстрагированные компоненты табачного дыма основной фракции, отобранные в течение промежутка времени от 13,75 мин до 14,25 мин после инъекции образца в хроматограф.
Фиг.2 представляет хроматограмму (TIC) эффлюента основной фракции из выходного отверстия колонки 1, полученную в течение промежутка времени от 13,75 мин до 14,25 мин после инъекции образца в хроматограф 1, указанная хроматограмма сделана на ионном хроматографе.
Идентификацию пахучих компонентов, отвечающих за табачный запах, также проводили путем захвата летучих веществ дыма в синтетической слюне и их последующих анализов методами микроэкстрации в твердой фазе, газовой хроматографией-офлактометрией, и газовой хроматографией в сочетании с масс-спектроскопией. Синтетическую слюну готовили в соответствии с собственным способом путем растворения в деионизированной воде хлорида натрия, бикарбоната натрия и бикарбоната калия, при этом был получен раствор, концентрация электролитов в котором аналогична концентрации в слюне. Этот раствор использовали для измерения остаточных компонентов запаха табака, которое проводили после воздействия в режиме, аналогичном действию слюны во рту. Для того чтобы получить растворы, аналогичные слюне, находящейся под действием табачного дыма, экспертами делалась затяжка дымом сигар (Onyx brand;
Dominican Republic, mini Belicoso), а затем 4 раза по 2 сек - затяжки обычной питьевой воды через соломинку в 22,5 мл сосуд, опыт проводился таким образом, чтобы дым пробулькивал через раствор. После этого для гарантии того, что адсорбция любых летучих компонентов дыма на поверхности стекла исключена, жидкие компоненты были перенесены в отдельный сосуд.
Два эксперта оценивали экстракты, полученные методом SPME, используя для этого газовую хроматографию в сочетании с олфактометрией. Анализ каждого пика проводился трижды, а пики, имеющие самую высокую интенсивность, затем были проанализировали дополнительно. Дополнительный анализ методами газовой хроматографией в сочетании с олфактометрией обеспечил более высокую точность. Подтверждение идентичности пиков осуществлялось путем сравнения времени удержания и запахов соединений, прошедших идентификацию, с временем удержания и запахом стандартных соединений.
Фиг.3 представляет наложение аромаграммы и хроматограммы, полученной методом TIC. Проведен анализ эффлюента экстракта синтетической слюны из свободного пространства (23 часа экстракции при комнатной температуре) с последующим удалением основной фракции и криогенным фокусированием (которое проводили за 30 с до удаления основной фракции, в процессе ее удаления и 30 с спустя указанного удаления); приведена шкала интенсивности запаха и его характера.
Соединения, обладающие ароматическим действием, были проанализированы в лаборатории Microanalytics и классифицированы как Tier 1, Tier 2 или Tier 3. Наиболее сильным ароматом обладали соединения с Tier 1. В последующих тестах, проведенных в Wrigley R&D, соединениям с ароматическим действием приписали числовые индексы (Таблица 1).
th
Идентификацию компонентов проводили по спектрам с использованием базы данных Wiley (например, Wiley Registry Mass Spectral Data, 7 Edition, John Wiley & Sons, Inc., 2000) и с учетом индексов удержания. Полученные результаты приведены в таблице 1.
Таблица 1
Предварительная идентификация соединений, ответственных за запах табачного дыма и экстрагированных из полости рта
Интенсивность запаха (0-100)
Индекс удержания (Kovats)
Идентификатор
Идентичность
67<sup>1</sup>
1046
Табачный, плесневый
2,3,5-триметилпиридин<sup>3,4</sup>
45<sup>1</sup>
945
Табачный землистый
4-этил-3-метилпиридин<sup>3,4</sup>
50<sup>1</sup>
967
Острый
2-этил-3,5-диметилпиридин<sup>3,4</sup>
58<sup>1</sup>
844
Чабер
2,5-диметилпиразине<sup>3,4</sup>
47<sup>1</sup>
972
Острый
2,6-диэтилпиразин<sup>3</sup>
45<sup>1</sup>
1034
Табачный, плесневый
2, 4,6-триметилпиридин (коллидин)<sup>3,4</sup> и 2-этил-5-метил-пиридин<sup>1</sup>
45<sup>1</sup>
401
Цветочный
Ацетофенон<sup>3</sup>
Tier 1<sup>2</sup>
979
Плесневый
Этилпиррол<sup>3</sup>
Tier 2<sup>2</sup>
856
Чабер
2,3-диметилпиразин<sup>3,4</sup>
Tier 3<sup>2</sup>
830
Острый
Метилпиридин<sup>3</sup>
Tier 3<sup>2</sup>
945
Табачный
Циклобутилпиридин<sup>3</sup>
Tier 3<sup>2</sup>
525
Масляный
Диацетил<sup>3</sup>
<sup>1</sup>Ароматические активнодействующие соединения, оцененные с помощью смеси синтетической слюны.
<sup>2</sup>Ароматические активнодействующие соединения, оцененные с использованием мазков, интенсивность классифицировалась согласно Tier 1, Tier 2 и Tier 3.
<sup>3</sup>Соединения, идентификация которых проведена с корреляцией по спектрометрической базе данных Willey.
<sup>4</sup>Соединения, идентификация которых проведена с помощью индексов задержки аутентичных стандартов.
Пример 2
В этом примере подробно описаны оценка свободного пространства и сенсорного восприятия Applephenon (порошок натурального яблочного экстракта в короткоцепных полифенолах, хорошо растворимый в воде; A.M. Todd Co., Kalamazoo, дистрибьютер Applephenon для Asahi Corp., Japan), проведенные in vitro методом GC/MS; полученные данные сравнивали с запахом табака в синтетическом растворе.
1
-6
2
Определение соотношения концентрации пахучего вещества табака в свободном пространстве и массы добавляемого активнодействующего вещества (в зависимости от дозы) включало: приготовление синтетического раствора, содержащего соединения, аромат которого и его интенсивность были аналогичны тем же параметрам в полости рта после потребления двух сигарет Мальборо (легких) или / крепких сигар (типа Partagas 1845). Эти соединения помещали в раствор, содержащий 1% этанола/99% воды, каждое из веществ присутствовало в концентрации составляющей 150×10 и включало: коллидин (2,4,6-триметилпиридин), лютидин (2,6-диметилпиридин), 2-этилпиридин, 3-этилпиридин, пиридин, этилпиразин, 2-этил-3-метилпиразин.
Для того чтобы некоторое вещество имело аромат, обычно оно должно пройти через эпителий носа субъекта ретроназально или ортоназально. Слюна содержит 99% воды, ее рН приблизительно составляет 7 (реальное значение рН зависит от расхода слюны). Поэтому для первичной оценки эффективности был использован синтетический раствор, имитирующий запах табачного дыма с 99% содержанием воды. За счет снижения концентрации ароматических веществ водного раствора в свободном пространстве можно получить менее сильное восприятие запаха ретро- или ортоназальным способом.
Идентичность характера запаха и интенсивности синтетического раствора с неприятным запахом табачного дыма в полости рта определялась 10 экспертами, имеющими опыт в органолептических анализах. «Нюхачи» оценивали характер запаха и его интенсивность, используя для анализа 5 мл водного раствора, содержащиеся в 22,5 мл емкостях.
Синтетический раствор (5 мл) был обрабатан обладающим потенциальной активностью составом Applephenol (вес/вес). Свободное пространство полученного в результате водного раствора экстрагировали в 22 мл емкости, процесс проводили в течение 10 мин при 35°C с использованием волокна для микроэкстракции в твердой фазе (Stabilflex, Carboxen, PDMS, DVB). Анализ осуществляли методами газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (GC/MS), при этом применяли автоматический отборник проб CombiPal и действовали так, как это описано в примере 1. Сделано три повтора, относительная ошибка в анализах оценивалась как относительное стандартное отклонение, выраженное в процентах (RSD). При превышении величины в 15%, были сделаны повторы. Процентное уменьшение свободного пространства оценивали, сравнивая полученные величины со значениями для свободного пространства без каких-либо добавок активнодействующих составляющих. Из результатов, приведенных на фиг.4, видно, что концентрации пиридина в свободном пространстве уменьшились на величину, составляющую более 75%.
Водные растворы, содержащие пиразин/пиридин, имели рН 7. После введения полифенола рН раствора снизился до 3,7 (падение величины рН приписывают основному компоненту Applephenol - полифенольной хлорсодержащей кислоте). Пиридин имеет рКа 5,2, а аналогичная величина для пиразина составляет 1,1. В растворе, в который добавлен полифенол, пиридин существует в основном в виде катиона, а пиразин остается нейтральным. Водородные связи в водном растворе можно считать ответственными за снижение летучести пиридина в его протонированной форме. Сделано предположение о коэффициенте разделения для пиразина в условиях кислого водного раствора, таким образом предпочтительно газообразное состояние, увеличивающее концентрацию в свободном пространстве.
Органолептический анализ идентичных растворов проводился 20 экспертами, которые оценивали интенсивность запаха синтетического раствора с добавками активнодействующих компонентов и без указанных добавок. Интенсивность оценивалась по 100 бальной шкале, в которой 0 означал отсутствие запаха, а 100 - очень сильный запах. Статистическую значимость определяли для усредненных повторов методом дисперсионного анализа. На фиг.5 приведены результаты органолептического анализа идентичных (но отдельных) растворов пахучих веществ, использованных ранее для аналитических анализов. Экспертами (N=10) обнаружено, что растворы с добавкой полифенола имели более низкую интенсивность табачного запаха по сравнению с контролем, Р<0,05. Это согласуется с обсужденным ранее снижением концентрации азотсодержащих компонентов в свободном пространстве.
Пример 3
После тестов, проведенных in vitro и показавших потенциально активнодействующие вещества в отношении табачного запаха, были сделаны анализы для определения остаточных изменений находящихся на языке соединений табачного дыма и экстрагированных с помощью мазка (как это было описано ранее).
1
2
Оценка эффективности активнодействующих веществ проводилось с использованием мазков, полученных после курения / сигары Оnух, при удалении с языка субъекта тампоном Texwipe образца летучих веществ. На остаточный запах табачного дыма изучалось воздействие трех факторов:
жевательной резинки с яблочным вкусом Orbit (получена от Wm. Wrigrley Jr. Company (Chicago, IL)) вместе с 78 мг Applephenol; жевательной резинки Orbit в чистом виде; и отсутствия жевательной резинки; анализ проводили GC/MS. Указанные жевательные резинки жевали сразу же после курения. Исследовались мазки, полученные от 2 экспертов. Анализ проводили поздним утром. За 2 ч до испытания эксперты получали легкий завтрак. Эксперты не являлись курильщиками сигарет, и у них не было проблем здоровья, связанных с состоянием полости рта.
Проводился анализ мазков, полученных из четырех групп: а) от экспертов, куривших только сигару, б) от экспертов, куривших сигару + контрольная жевательная резинка, в) от экспертов, куривших сигару + жевательная резинка с активнодействующим веществом, г) от экспертов, не куривших никакой сигары; анализ осуществляли до и после указанных обработок. Полученные результаты приведены на фиг.6. Жевательная резинка, содержащая активнодействующее вещество и контрольная жевательная резинка, снизили концентрацию пиридина (100% и 91% снижение, соответственно) и 4-метилпиридина (обе жевательные резинки снижают концентрацию ниже предела определения) очень сильно, указанное снижение было ниже концентрации, обнаруживаемой в полости рта после выкуривания сигары при отсутствии использования жевательной резинки. Концентрация 2-метилпиридина снижалась на 45% при использовании жевательной резинки с активнодействующим веществом и на 35% при использовании жевательной резинки без активнодействующего вещества. Концентрации снижения концентрации пиразина были приблизительно одинаковыми для обеих типов жевательной резинки, они составили 28% и 25%. Мазки, полученные из полости рта не подвергавшейся воздействию сигарного дыма, не содержали пиридинов, однако содержали низкие концентрации этилпиразина.
Поскольку данные по анализу (in vitro) свободного пространства синтетических растворов свидетельствуют от увеличении концентрации пиразинов в результате обработки активнодействующим веществом, то в образцах, полученных после обработки жевательной резинкой + активнодействующее вещество не ожидалось (и не наблюдалось) снижения концентрации этилпиразина ниже величины, наблюдаемой для контрольной жевательной резинки. В целом, разница в концентрациях следов пиридина, экстрагированного в случае сигары + контрольная жевательная резинка и в случае сигары + активнодействующее вещество, была очень незначительна. Эта незначительная разница между контрольной и активнодействующей жевательными резинками может быть отнесена к сложности экстракции пиридинов, абсорбированных на поверхности языка, а также к точности измерения их концентрации. Помимо этого, статистические анализы, сделанные двумя экспертами, не представляли собой содержательные данные. Тем не менее, действие жевательной резинки, активнодействующей или контрольной, на снижение концентрации пахучих веществ в свободном пространстве, очевидно.
Пример 4
В этом примере подробно описывается клиническая оценка того, является ли яблочная жевательная резинка Orbit с добавкой активнодействующего вещества (Applephenol) агентом, снижающим интенсивность неприятного запаха, вызванного сигаретами, действие этой резинки сравнивают с контрольной жевательной резинкой без добавки активнодействующих веществ и с использованием стандартных жевательных резинок.
Группа из 102 экспертов была набрана Tragon Corp.(Tragon, Buffalo Grove, IL). Эксперты должны были выкурить по две сигареты Мальборо (легкие), после этого им было необходимо установить интенсивность табачного послевкусия в момент времени 0 (сразу же после курения), а также через 1, 5,10, 15, 20, 21, 25, 30, 35, 50, 60, 80 и 90 мин после курения. В течение трех последующих дней каждый из экспертов подвергался различной обработке в случайном режиме. Протокол испытаний включал следующее:
участников опыта просили за 90 мин перед испытанием не есть, не пить, не курить и не использовать никаких средств гигиены полости рта (включая зубные щетки и зубные эликсиры). Эксперты проводили оценку всех образцов и проводимых обработок на протяжении 6 дней, по 1 образцу ежедневно. Сеансы продолжались 2 ч, в каждом из них участвовало 25-30 экспертов, в день происходило по 4 сеанса. В зависимости от своих привычек к курению участники эксперимента были разделены на группы, все они употребляли жевательную резинку, и не имели никаких проблем по состоянию здоровья зубов, или других медицинских проблем. За 2 ч перед каждым сеансом эксперты не употребляли еды или питья, и не пользовались никакими средствами гигиены полости рта. На выкуривание двух сигарет им отводилось 15 мин (или менее). Курение проводилось в специально отведенной зоне вне здания. Сразу же после курения эксперты возвращались обратно в здание, в котором они оценивали интенсивность табачного послевкусия по линейной шкале.
Одна обработка заключалась в жевании порции жевательной резинки, в сердцевину которой было подмешано активнодействующее вещество (яблочный Orbit + Applephenol). Использовалась жевательная резинка в виде таблетки (порция равнялась 2 таблеткам), ее жевали в течение 20 мин после курения. Вторая обработка заключалась в жевании контрольной жевательной резинки, изготовленной способом, аналогичным описанному выше, однако не содержащей активнодействующего вещества. При третьей обработке не использовали никакой жевательной резинки, эксперты просто курили сигареты, и в указанные моменты времени отмечали интенсивность послевкусия. Экспертов не обучали оценке послевкусия, просто их просили высказывать мнение об интенсивности послевкусия на основе способа, который обычно используется для распознавания свежести дыхания. Повторные измерения методом ковариационного анализа проводили по данным интенсивности во всех моментах времени, а один тест использовали для определения уровня достоверности.
На фиг.7 показано влияние активнодействующего вещества (Applephenol, 78 мг) на восприятие послевусия табачного дыма в результате выкуривания двух сигарет Мальборо (легкие). Полученные результаты показывают, что, по общему мнению 102 экспертов, интенсивность послевкусия, определенного консенсусом в результате жевания ими яблочной жевательной резинки Orbit вместе с 78 мг активнодействующего вещества была во все моменты времени ниже, чем контроль, а в моменты времени 20, 21 и 25 отмечено значительное (Р 0,05) снижение. Помимо этого, жевательная резинка с активнодействующим веществом имела значительно более низкую среднюю высоту кривой, чем контроль. Использование и активнодействующей, и контрольной жевательной резинки для устранения сигарного послевкусия во все моменты времени признано значительно более лучшим, чем неиспользование жевательной резинки (Р 0,05).
Пример 5
В этом примере описывается клиническая оценка эффективности действия яблочной жевательной резинки Orbit с добавкой активнодействующего вещества (Applephenol) на снижение интенсивности восприятия самим субъектом неприятного запаха, вызванного курением сигар.
В 5 отдельных сеансах принимали участие 7 экспертов. На каждом из сеансов курили сигары Оnух, процесс проводили описанным выше способом. После выкуривания 1/2 сигары эксперты оценивали собственное восприятие интенсивности неприятного запаха, для этого использовалась линейная шкала 0-10, а время оценки было идентично времени, указанному для сигарет. Испытания проходили в течение 4 дней (два дня в неделю в течение двух последовательных недель). Проводился анализ 4 отдельных обработок (одна обработка в день в течение 4 последовательных дней) с 90 мин интервалом в случайном порядке. Обработки были следующими: одна порция жевательной резинки Eclipse Winterfresh, полученной от Wrigley Jr. Company (Chicago, IL); одна порция жевательной резинки компании Wrigley Orbit яблочный; одна порция жевательной резинки компании Wrigley Orbit яблочный с добавкой активнодействующего вещества (Applephenol). После выкуривания сигар и последующего 20-минутного жевания жевательной резинки эксперты оценивали собственное восприятие неприятного запаха дыхания. Спустя 30 мин, 60 мин и 90 мин после отхаркивания вновь проводилась оценка собственного восприятия запах.
Предварительная оценка собственного восприятия послевкусия в результате курения сигар указала потенциальную эффективность активнодействующих веществ. На фиг.8 приведены полученные результаты, которые показывают, что интенсивность послевкусия сильнее всего снижалась и сохранялась самой низкой в результате использования жевательной резинки Orbit яблочный с 78 мг добавкой активнодействующего вещества (Applephenol). Интенсивность послевкусия в баллах для каждого периода времени была существенно ниже, чем в случае использования контрольной жевательной резинки (Р0,05). Помимо этого, интенсивность послевкусия, полученная в результате жевания жевательной резинки с добавкой 78 мг активнодействующего вещества, была значительно ниже интенсивности (в баллах) в результате жевания резинки Eclipse Winterfresh в моменты времени 60 мин и 90 мин. И, наконец, любая жевательная резинка значительно снижает интенсивность послевкусия от курения сигар по сравнения с теми случаями, когда жевательную резинку не используют.
Пример 6
-6
По общему мнению «нюхачей» характер запаха табачного дыма и его интенсивность можно наилучшим образом представить, если к раствору, содержащему 5% этанола и 95% воды, добавить синтетический раствор, содержащий по 150×10 (мкг/мл) пиридина, 2-этипиридина. 3-этилпиридина и этилпиразина.
Синтетический раствор (5 мл), находящийся в разных сосудах, обрабатывали каждым из двух потенциально активных веществ. Первым из указанных веществ был экстракт клюквы, представляющий собой природный экстракт порошка клюквы, растворенный в воде (Ocean Spray Corp., Winthrop, MA). Анализ проводился с использованием 50 мг, 100 мг, 150 мг и 200 мг вещества. Вторым потенциально активным веществом являлось масло кардамона, представляющее собой природный экстракт дробленных семян кардамона (Treatt Flavors, Lakeland, FL). Анализ был проведен с использованием растворов указанного вещества в следующих концентрациях: 54 мкг/мл, 156 мкг/мл, 207 мкг/мл и 642 мкг/мл.
Свободное пространство водного раствора экстрагировали в 22 мл емкости, процесс проводили в течение 10 мин при 35°С, используя волокно для экстракции в твердой фазе (Stabilflex, Carboxen, PDMS, DVB). Анализ осуществлялся методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (GC/MS), устройство для автоматического отбора проб CombiPal использовалось так, как это было описано ранее. Сделано три повтора, при этом оценивалось относительное стандартное отклонение, выраженное в процентах (RSD). При превышении величины в 15%, были сделаны повторы. Процентное уменьшение свободного пространства оценивали путем сравнения полученных величин со стандартными значениями (в отсутствии добавки активных веществ).
Для того чтобы некоторое вещество имело аромат, обычно оно должно пройти через эпителий носа субъекта ретроназально или ортоназально. Слюна содержит 99% воды, ее рН приблизительно составляет 7 (реальное значение рН зависит от расхода слюны). Поэтому для первичной оценки эффективности использовали синтетический раствор, имитирующий запах табачного дыма и содержащий 99% воды. Снижение концентрации ароматических веществ водного раствора в свободном пространстве может привести к менее сильному восприятию запаха ретро- или ортоназальным способом.
Фиг.9 демонстрирует результаты, полученные при добавлении 50 мг, 100 мг, 150 мг и 200 мг экстракта клюквы. В таблице 5 приведены аналитические дозировки, отвечающие за снижение концентрации свободного пространства, связанное с пиридином, 2-этилпиридином, этилпиразином и 3-этилпиридином соответственно.
Таблица 2
Снижение концентрации пиридина в свободном пространстве с помощью экстракта клюквы (выражено в мг клюквы на мл раствора): аналитические дозировки
Площадь пика GC/MS
Контроль
40 мг/мл
30 мг/мл
20 мг/мл
10 мг/мл
Серия 1
14444526
n.d.<sup>1</sup>
n.d.<sup>1</sup>
n.d.<sup>1</sup>
1558183
Серия 2
14571161
n.d.<sup>1</sup>
n.d.<sup>1</sup>
n.d.<sup>1</sup>
1572148
Серия 3
16085301
n.d.<sup>1</sup>
n.d.<sup>1</sup>
n.d.<sup>1</sup>
1579508
Среднее
15033663
n.d.<sup>1</sup>
n.d.<sup>1</sup>
n.d.<sup>1</sup>
1569946
Стандартное отклонение
912943.9
n.d.<sup>1</sup>
n.d.<sup>1</sup>
n.d.<sup>1</sup>
10831.64
Стандартная ошибка
527088.4
n.d.<sup>1</sup>
n.d.<sup>1</sup>
n.d.<sup>1</sup>
6253.65
Относительное стандартное отклонение, %
6.07
n.d.<sup>1</sup>
n.d.<sup>1</sup>
n.d.<sup>1</sup>
0.69
<sup>1</sup>n.d. означает, что пиридин не был выявлен
Таблица 3
Снижение концентрации 2-этилпиридина в свободном пространстве с помощью экстракта клюквы (выражено в мг клюквы на мл раствора): аналитические дозировки
Площадь пика GC/MS
Контроль
40 мг/мл
3 0 мг/мл
20 мг/мл
10 мг/мл
Серия 1
160109870
1368141
1645724
1948092
6876637
Серия 2
142768839
1496262
1565780
2264499
6660330
Серия 3
173862114
1538198
1372219
1913381
6356517
Среднее значение
158913607.7
1467533. 6
1527907. 6
2041990. 6
6631161.3
Стандартное отклонение
15581117.4
88593.6
140630.6
193477.8
261283.9
Стандартная ошибка
8995762.3
51149.5
81193.1
111704.4
150852.3
Относительное стандартное отклонение, %
9.81
6.04
9.19
9.47
3.94
Таблица 4
Снижение концентрации этилпиразина в свободном пространстве с помощью экстракта клюквы (выражено в мг клюквы на мл раствора): аналитические дозировки
Площадь пика GC/MS
Контроль
40 г/мл
30 мг/мл
20 мг/мл
10 мг/мл
Серия 1
35558030
76470454
71101842
73272062
82832901
Серия 2
31179441
77280290
68358517
78616280
80690737
Серия 3
36276405
76581435
66278482
73562475
74884246
Среднее значение
34337959
76777393
68579614
75150272
79469295
Стандартное отклонение
2758839
439042.4
2419269
3005161
4112690
Стандартная ошибка
1592816
253481.3
1396766
1735030
2374463
Относительное стандартное отклонение, %
8.03
0.57
3.53
4.01
5.18
Таблица 5
Снижение концентрации 3-этилпиридина в свободном пространстве с помощью экстракта клюквы (выражено в мг клюквы на мл раствора): аналитические дозировки
Площадь пика GC/MS
Контроль
40 мг/мл
30 мг/мл
20 мг/мл
10 мг/мл
Серия 1
1.81×10<sup>8</sup>
1096887
1365358
2109647
7721021
Серия 2
1.61×10<sup>8</sup>
1361864
1130701
2107292
7025718
Серия 3
1.86×10<sup>8</sup>
1201307
1193170
2357495
7174169
Среднее значение
1.76×10<sup>8</sup>
1220019
1229743
2191478
7306969
Стандартное отклонение
13293496
133475.9
121528.5
143779.8
366181
Стандартная ошибка
7675003
77062.35
70164.49
83011.28
211414.7
Относительное стандартное отклонение, %
7.55
10.94
9.88
6.56
5.01
Фиг.10 демонстрирует результаты, полученные при добавке 54 мкг/мл, 156 мкг/мл, 207 мкг/мл, и 642 мкг/мл масла кардамона к синтетическому раствору, содержащему пиридин, 2-этилпиридин, 3-этилпиридин и этилпиразин. В таблицах 6-10 приведены аналитические дозировки, отвечающие за снижение концентрации свободного пространства, связанное с пиридином, 2-этилпиридином, этилпиразином и 3-этилпиридином соответственно.
Таблица 6
Снижение концентрации пиридина в свободном пространстве с помощью масла кардамона (выражено в мкг масла кардамона на мл раствора): аналитические дозировки
Площадь пика GC/MS
Контроль
642 мкг/мл
207 мкг/мл
15 6 мкг/мл
54 мкг/мл
Серия 1
15992341
4784811
6911030
7410541
10584810
Серия 2
15965030
4659265
7052210
7928636
11057573
Серия 3
15177671
4650976
7387559
8581892
11536473
Среднее значение
15711680.6
4698350.6
7116966.3
7973689.6
11059618.6
Стандартное отклонение
462667.5
74991.4
244824.0
586973.7
475834.7
Стандартная ошибка
267121.2
43296.3
141349.2
338889.4
274723.3
Относительное стандартное отклонение, %
2.94
1.59
3.44
7.36
4.31
Таблица 7
Снижение концентрации 2-этилпиридина в свободном пространстве с помощью масла кардамона (выражено в мкг масла кардамона на мл раствора): аналитические дозировки
Площадь пика GC/MS
Контроль
642 мкг/мл
207 мкг/мл
15 6 мкг/мл
54 мкг/мл
Серия 1
184268848
112408826
94359048
97679714
122375677
Серия 2
182003143
105790353
91684882
100144739
122903012
Серия 3
173676457
97123074
90300102
101340819
124912319
Среднее значение
179982816
105107417.7
92114677.3
99721757.3
123397002.7
Стандартное отклонение
5577721.5
7665725.9
2063323.4
1866844.2
1338528.3
Стандартная ошибка
3220299.0
4425808.9
1191260.3
1077823.0
772799.7
Относительное стандартное отклонение, %
3.09
7.29
2.24
1.87
1.08
Таблица 8
Снижение концентрации этилпиразина в свободном пространстве с помощью масла кардамона (выражено в мкг масла кардамона на мл раствора): аналитические дозировки
Площадь пика GC/MS
Контроль
642 мкг/мл
207 мкг/мл
156 мкг/мл
54 мкг/мл
Серия 1
40331343
9935627
12937889
13960096
20136295
Серия 2
38850725
9687259
13204900
15240288
21393217
Серия 3
36946768
9619715
13946772
16060245
22360332
Среднее значение
38709612
9747533.6
13363187
15086876.3
21296614.6
Стандартное отклонение
1696694.32
166357.6
522735.4
1058445.9
1115161.0
Стандартная ошибка
979586.92
96046.6
301801.4
611094.0
643838.5
Относительное стандартное отклонение, %
4.38
1.71
3.91
7.02
5.24
Таблица 9
Снижение концентрации 3-этилпиридина в свободном пространстве с помощью масла кардамона (выражено в мкг масла кардамона на мл раствора): аналитические дозировки
Площадь пика GC/MS
Контроль
642 мкг/мл
207 мкг/мл
15 6 мкг/мл
54 мкг/мл
Серия 1
185543821
52981160
70792235
75103881
103474622
Серия 2
176086450
50707967
73101477
80706289
107019840
Серия 3
168268511
50069965
75972042
85414846
111211778
Среднее значение
176632927.3
51253030.6
73288584.6
80408338.6
107235413.3
Стандартное отклонение
8650610.4
1530223.8
2594967.6
5161935.7
3873080.1
Стандартная ошибка
4994432.3
883475.1
1498205.2
2980244.9
2236123.8
Относительное стандартное отклонение, %
4.89
3.98
3.54
6.42
3.61
В случае экстракта клюквы все концентрации пиридина в свободном пространстве были снижены более чем на 85%. Концентрации пиразина в свободном пространстве выросли, этот эффект, как полагают, связан с рН раствора, содержащего экстракт клюквы.
Органолептический анализ синтетических растворов, содержащих экстракт клюквы и масло кардамона, проводился 10 экспертами, которые оценивали интенсивность табачного запаха синтетических растворов при наличии активнодействующих веществ и в их отсутствии. Интенсивность оценивали по 100 бальной шкале, в которой 0 означал отсутствие запаха, а 100 - очень сильный запах. Статистическую значимость определяли для усредненных повторов с помощью дисперсионного анализа.
Фиг.11 и таблица 10 приводят результаты, полученные экспертами для различных количеств экстракта клюквы в качестве активнодействующего вещества.
Таблица 10
Оценка экспертами (N=10) интенсивности запаха табачного дыма в растворах (пиридины и пиразины в воде), обработанных различными концентрациями экстракта клюквы (выражено в мг клюквы/мл синтетического раствора)
Эксперт
40 мкг/мл
30 мкг/мл
20 мкг/мл
10 мкг/мл
1
DP
3
5
8
7
2
DC
2
2
5
5
3
CD
7
5
6
8
4
CM
3
2
5
10
5
DB
2
2
3
7
6
BP
1
3
2
3
7
RB
1
1
4
5
8
MT
1
1
1
2
9
LD
0
5
3
7
10
MD
1
2
1
2
Среднее значение
2.1
2.8
3.8
5.6
Стандартное отклонение
1.868154
1.536229
2.135416
2.537716
Стандартная ошибка
0.590762
0.485798
0.675278
0.802496
Фиг.12 и таблица 11 приводят результаты, полученные экспертами для различных количеств масла кардамона в качестве активнодействующего вещества.
Таблица 11
Оценка экспертами (N=10) интенсивности запаха табачного дыма в растворах (пиридины и пиразины в воде), обработанных различными концентрациями масла кардамона (выражено в мг масла кардамона/мл синтетического раствора)
Эксперты
25 мкг/мл
150 мкг/мл
630 мкг/мл
1
JK
8
7
3.5
2
SM
1
3
1
3
ВМ
5
4
1
4
DB
9
7
6
5
SM
8
10
2
6
LD
5
2
2
7
RB
0
0
0
8
MT
3
1
0
9
МН
1
3
0
10
MD
4
2
3
Среднее значение
4.4
3.9
1.85
Стандартное отклонение
3.2
3.14
1.91
Стандартная ошибка
1.0
0.99
0.60
Как показано, эксперты (N=10) установили, что растворы с добавкой активнодействующего вещества имели существенно более низкую интенсивность табачного запаха по сравнению с контролем (Р<0,05).
Пример 7
В этом примере подробно описано высвобождение активнодействующих веществ из жевательной резинки.
Способ измерения высвобождения из жевательной резинки активнодействующих компонентов и скорости указанного высвобождения был реализован 5 экспертами. Каждый из экспертов жевал одну порцию жевательной резинки (2 таблетки) в течение следующих промежутков времени: 0 мин, 10 мин, 10 мин и 25 мин. После этого были собраны жвачки (минимум 6 штук), которые были растворены в хлороформе. Ундекан использовался в качестве внешнего стандарта. Для того чтобы гарантировать сальватацию полученный раствор встряхивали в течение 6 часов, после этого жидкую фазу удалили. Провели ее очистку, используя экстракцию в твердой фазе с помощью Millipore (Billerica, MA) Millex-FH гидрофобного 0, 4 мкм политетрафторэтилена (PTFE).
В случае нелетучих активных компонентов (типа компонентов экстракта клюквы) водный слой был удален в целях его последующего анализа методом высокоэффективной газожидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В качестве индикатора соединений клюквы использовали хинную кислоту (процентное содержание хинной кислоты в клюкве известно, поэтому количественным анализом хиной кислоты в жевательной резинке можно оценить количество клюквы в жевательной резинке). Другие рабочие характеристики ВЭЖХ включали следующее: обращенная фаза; колонка Restek Allure с размерамиы 5 мк 300×4,6 мм; мобильная фаза представляла собой 100% 0.1М фосфатный буфер, рН 2,5. Дополнительные условия:скорость=0,3 мл/мин, температура колонки 15°С, время прогона 45 мин, длина волны 210 нм. Инжектируемый объем составил 10 мл.
Для летучих компонентов, таких как компоненты масла кардамона, в качестве внешнего стандарта использовали ундекан. Слой хлороформа (нижний слой) удалили пипеткой Пастера, поместили в сосуд для газовой хроматографии и закрыли завинчивающейся крышкой. Жидкость трижды инжектировали для анализа газовой хроматографией. Последующее количественное определение активнодействующих веществ проводили с использованием прибора для автоматического отбора проб Agilent 7683 Series Autosampler (Agilent Technologies, Palo Alto, CA), установленного на 5 мкл впрыск.
При производстве стандартной жевательной резинки в ее сердцевину поместили экстракт клюквы. Экстракт содержал 2,3% хинной кислоты. Полученные результаты показали, что одна порция жевательной резинки (сердцевина + оболочка) содержала 1,5 мг (0,05%) хинной кислоты, это количество эквивалентно 65 мг клюквы в одной порции жевательной резинки (2 таблетки). После жевания резинки в течение 20 мин в ней не было выявлено хинной кислоты, таким образом, в процессе 20-минутного жевания в слюну из жевательной резинки выделилось все количество клюквы.
В таблице 12 суммированы данные процентного снижения пиридина и 3-этилпиридина в свободном пространстве и снижения восприятия интенсивности запаха. В таблице 13 приведены данные, касающиеся высвобождения клюквы в течение 20 минутного жевания.
Таблица 12
Суммарная эффективность клюквы in vitro
Концентрация экстракта клюквы (мкг/мл синтетического раствора)
Снижение концентрации пиридина в свободном пространстве, %
Снижение концентрации 3-этилпирдина в свободном пространстве, %
Снижение восприятия интенсивности запаха, %
10
90
96
44
20
100
98
62
30
100
99
72
40
100
99
79
Таблица 13
Высвобождение клюквы из состава
Время жевания, мин
% в образце
Обнаружено, мг
Высвобождено, %
Высвобождено, мг
Исследуемая жевательная резинка
0
100
65
0
0
20
0
0
100
65
Как показано, при жевании в течение 20 мин из жевательной резинки высвобождается 100% или 65 мг экстракта клюквы. На основании этих результатов предполагают, что при добавлении в 5 мл синтетического раствора указанное количество экстракта клюквы должно снизить концентрацию пиридина в свободном пространстве более чем на 90%, а интенсивность запаха должна снизиться на 44-62%.
Масло кардамона добавляли только в оболочку стандартной жевательной резинки, в сердцевину резинки его не вносили; α-терпинилацетат содержит 37% масла кардамона.
Несмотря на то, что d-лимонел также присутствует в масле кардамона в больших количествах, однако для этого эксперимента был выбран α-терпинилацетат, поскольку 1,8-цинеол нельзя отделить от d-лимонела. Фиг.13 демонстрирует высвобождение масла кардамона в результате использования α-терпинилацетата. На фиг.14 показано высвобождение масла кардамона (мг) в зависимости от времени.
Основное количество масла кардамона высвобождается из жевательной резинки в период времени от 0 до 5 мин (в этот период времени количество масла кардамона в резинке снижается на 33%). В таблице 14 продемонстрировано высвобождение масла кардамона в течение 25 мин цикла жевания; после жевания, как показано, из жевательной резинки высвобождается 0,49 мг или 33% масла кардамона.
Таблица 14
Высвобождение кардамона из состава
Время жевания, мин
% в образце
Обнаружено, мг
Высвобождено, %
Высвобождено, мг
Исследуемая жевательная резинка
0
0.05
1.46
0
0
5
0.03
0.97
33
0.49
25
0.03
0.97
33
0.49
В таблице 15 суммированы данные процентного снижения пиридина и 3-этилпиридина в свободном пространстве, а также снижения восприятия интенсивности запаха. Величина высвобождаемого кардамона должна обеспечить снижение запаха табака из 5 мл синтетического раствора более чем на 60%. Помимо этого, такое количество высвобождаемого масла кардамона должно снизить концентрацию всех летучих компонентов, включая пиразин, в свободном пространстве синтетического раствора более чем на 50%.
Таблица 15
Суммарная эффективность кардамона in vitro
Концентрация кардамона (мкг/мл синтетического раствора)
Снижение концентрации пиридина в свободном пространстве, %
Снижение концентрации 3-этилпирдина в свободном пространстве, %
Снижение восприятия интенсивности запаха, %
25
-
-
56
54
29.6
39.2
-
150
-
-
61
156
49.3
54.4
-
207
54.7
58.5
-
630
-
-
82
642
70.1
70.9
-
- не измерялось
Настоящее изобретение не ограничено приведенными выше вариантами, и они могут быть различным образом модифицированы. Описание предпочтительных вариантов настоящего изобретения, включая приведенные примеры, предназначено только для ознакомления с изобретением, его принципами и его практическим применением деквалифицированных в данной области людей. Это делается в целях адаптации и применения настоящего изобретения в его многочисленных формах таким образом, чтобы это наилучшим образом удовлетворяло требованиям практического использования.
Что касается использования слов в настоящем описании (включая формулу изобретения), то, если иного не оговорено, эти слова используются на основании их ясного понимания. Их не следует интерпретировать как эксклюзивные, заявители предназначают эти слова для интерпретации приведенного описания в целом.