ПАРТНЕРЫ ПО СЛИЯНИЮ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ

1. Рекомбинантный слитый белок, в котором содержится: N-концевой партнер по слиянию, причем N-концевой партнер по слиянию представляет собой бактериальный шаперон или модулятор фолдинга; представляющий интерес полипептид; и линкер, содержащий сайт расщепления между N-концевым партнером по слиянию и представляющим интерес полипептидом.
2. Рекомбинантный слитый белок по п. 1, в котором N-концевой партнер по слиянию выбран из: DnaJ-подобного белка; белка FklB или его усеченной формы; белка FrnE или его усеченной формы; белка FkpB2 или его усеченной формы; белка EcpD или его усеченной формы; или белка Skp или его усеченной формы.
3. Рекомбинантный слитый белок по п. 1, в котором N-концевой партнер по слиянию выбран из: DnaJ-подобного белка P. fluorescens; белка FklB P. fluorescens или его С-концевой усеченной формы; белка FrnE P. fluorescens или его усеченной формы; белка FkpB2 P. fluorescens или его С-концевой усеченной формы; или белка EcpD Р. fluorescens или С-концевой усеченной формы.
4. Рекомбинантный слитый белок по п. 3, в котором N-концевой партнер по слиянию представляет собой белок FklB P. fluorescens, усеченный так, чтобы удалить от 1 до 200 аминокислот с С-конца, белок EcpD P. fluorescens, усеченный так, чтобы удалить от 1 до 200 аминокислот с С-конца, или белок FrnE P. fluorescens, усеченный так, чтобы удалить от 1 до 180 аминокислот с С-конца.
5. Рекомбинантный слитый белок по любому из пп. 1-4, в котором представляющий интерес полипептид является трудно экспрессируемым белком, выбранным из: небольшого или быстро деградируемого пептида; белка с легко деградируемым N-концом; и белка, обычно экспрессируемого в бактериальной системе экспрессии в нерастворимой форме.
6. Рекомбинантный слитый белок по любому из пп. 1-5, в котором представляющий интерес полипептид представляет собой небольшой или быстро деградируемый пептид, где представляющий интерес полипептид выбран из: hPTH1-34, Glp1, Glp2, эксенатида (Exenatide) IGF-1 (SEQ ID NO: 37), тедуглутида (Teduglutide) (SEQ ID NO: 38), прамлинтида (Pramlintide) SEQ ID NO: 39), циконида (Ziconotide) (SEQ ID NO: 40), бекаплермина (Becaplermin) (SEQ ID NO: 42), энфувиртиада (Enfuvirtide) (SEQ ID NO: 43), или незиритида (Nesiritide) (SEQ ID NO: 44).
7. Рекомбинантный слитый белок по любому из пп. 1-5, в котором представляющий интерес полипептид представляет собой белок с легко деградируемым N-концом, где упомянутый представляющий интерес полипептид представляет собой N-мет-GCSF или циркумспорозоитный белок P. falciparuma.
8. Рекомбинантный слитый белок по любому из пп. 1-5, в котором представляющий интерес полипептид представляет собой белок, который обычно экспрессируется в бактериальной системе экспрессии как нерастворимый белок, причем представляющий интерес полипептид представляет собой проинсулин, который превращается в инсулин или аналог инсулина, N-met-GCSF, GCSF или IFN-β.
9. Рекомбинантный слитый белок по п. 7, в котором проинсулин содержит С-пептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из: SEQ ID NO: 97; SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; или SEQ ID NO: 100.
10. Рекомбинантный слитый белок по п. 8 или 9, в котором аналог инсулина представляет собой инсулин гларгин, инсулин аспарта, лизпро, глулизин, детемир или делюдук.
11. Рекомбинантный слитый белок по п. 3, в котором N-концевой партнер по слиянию представляет собой DnaJ-подобный белок P. fluorescens, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.
12. Рекомбинантный слитый белок по п. 3, в котором N-концевой партнер по слиянию представляет собой FklB белок P. fluorescens, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 61, или SEQ ID NO: 62.
13. Рекомбинантный слитый белок по п. 3, в котором N-концевой партнер по слиянию представляет собой белок FrnE P. fluorescens, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 63 или SEQ ID NO: 64.
14. Рекомбинантный слитый белок по п. 3, в котором N-концевой партнер по слиянию представляет собой белок EcpD P. fluorescens, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 или SEQ ID NO: 67.
15. Рекомбинантный слитый белок по любому из пп. 1-14, в котором сайт расщепления распознается расщепляющим ферментом в группе, состоящей из: энтерокиназы; трипсина, фактора Ха; и фурина.
16. Рекомбинантный слитый белок по любому из пп. 1-15, в котором линкер содержит аффинную метку.
17. Рекомбинантный слитый белок по любому из пп. 1-16, в котором линкер имеет аминокислотную последовательность, выбранную из: SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; и SEQ ID NO: 226.
18. Рекомбинантный слитый белок по п. 6, в котором представляющим интерес полипептидом является hPTH1-34, и причем рекомбинантный слитый белок содержит аминокислотную последовательность, выбранную из: SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; и SEQ ID NO: 47.
19. Вектор экспрессии для экспрессии рекомбинантного слитого белка по любому из пп. 1-18, в котором вектор экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный слитый белок.
20. Способ получения представляющего интерес полипептида, включающий:
(i) культивирование микробной клетки-хозяина, трансформированной вектором экспрессии, содержащим экспрессирующую конструкцию, причем данная экспрессирующая конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный слитый белок по любому из пп. 1-19;
(ii) индуцирование клетки-хозяина на стадии (i) для экспрессии рекомбинантного слитого белка;
(iii) очистку рекомбинантного слитого белка, экспрессированного в индуцированных клетках-хозяевах на стадии (ii); и
(iv) отщепление очищенного рекомбинантного слитого белка стадии (iii) путем инкубации с расщеплящим ферментом, который распознает сайт расщепления в линкере, для высвобождения представляющего интерес полипептида; тем самым получая представляющий интерес полипептид.
21. Способ по п. 20, дополнительно содержащий измерение уровня экспрессии слитого белка, экспрессированного на стадии (ii), измерение количества рекомбинантного слитого белка, очищенного на стадии (iii), или измерение количества представляющего интерес полипептида, полученного на стадии (iv), который был надлежащим образом высвобожден, или их комбинацию.
22. Способ по п. 21, в котором количество представляющего интерес полипептида, полученного на стадии (iii) или стадии (iv), составляет от около 0,1 г/л до около 25 г/л.
23. Способ по п. 21, в котором полученный надлежащим образом высвобожденный полипептид, представляющий интерес, является растворимым, интактным или как растворимым, так и интактным.