Штамм бактерий Bifidobacterium longum ICIS-505 - продуцент биологически активных веществ, обладающих антиперсистентной активностью в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов
BACTERIAL STRAIN BIFIDOBACTERIUM LONGUM ICIS-505 - PRODUCER OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES POSSESSING ANTIPERSISTENT ACTIVITY WITH RESPECT TO OPPORTUNISTIC AND PATHOGENIC BACTERIA AND YEAST FUNGI

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для получения пробиотических препаратов, оказывающих антиперсистентное влияние на условно-патогенные и патогенные бактерии и дрожжевые грибы.
Аналогов изобретения в патентной и научно-технической литературе не обнаружено.
Известно, что среди ключевых механизмов защитного действия нормофлоры выделяют способность бифидобактерий потенцировать чувствительность патогенов к антибактериальным факторам хозяина, точнее подавлять их персистентные свойства [Бухарин, О.В. Ассоциативный симбиоз / О.В. Бухарин [и др.]. - Екатеринбург: УрО РАН, 2007 а. - 264 с.].
Персистентные свойства микроорганизмов определяются как основная «мишень» для отбора наиболее эффективных препаратов в борьбе с патогенной флорой, в том числе и с антибиотикорезистентными штаммами. Подавление персистентных свойств возбудителя «отменяет» его паразитирование в организме человека и тем самым повышает эффективность лекарственных воздействий. Этот принцип применим для выбора действия химических средств и отбора биологически активных препаратов [Бухарин О.В., Перунова Н.Б. Микросимбиоценоз. Екатеринбург: УрО РАН. 2014. 260 с].
Все это обусловливает использование бифидобактерий в качестве бактерийных препаратов как при лечении и профилактике острых кишечных инфекций, санации бактерионосительства и преодолении негативных последствий антибиотикотерапии, так и при производстве кисломолочных продуктов.
Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении сырья, являющегося источником биологически активных веществ, подавляющих персистентные свойства условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов.
Указанный технический результат достигнут получением нового штамма бактерий Bifidobacterium longum ICIS-505.
Штамм Bifidobacterium longum ICIS-505 выделен из испражнений пациента при обследовании микробиоценоза дистального отдела толстого кишечника в 2014 году в лаборатории биомониторинга и молекулярно-генетических исследований Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук г. Оренбурга.
Полученный штамм Bifidobacterium longum ICIS-505 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под коллекционным номером 1260.
Штамм Bifidobacterium longum ICIS-505 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.
Культурально-морфологические признаки:
Клетки представляют собой грамположительные, неподвижные полиморфные палочки с раздвоениями или булавовидными утолщениями на одном или двух концах длиной от 4,0 до 5,0 мкм, располагающиеся в виде отдельных клеток или скоплений.
В анаэробных условиях на поверхности Schaedler-агар и МРС-5 (38±1°С, 48 часов) образуют круглые мелкие белые колонии.
В полужидких средах (печеночная среда Блаурокка, казеиново-дрожжевой (КД-5), гидролизатно-молочный (ГМ) при 38±1°С, 48 часов бактерии вырастают в виде рыхлой массы, оставляя прозрачной верхнюю часть среды (зона аэробиоза). Отдельные колонии бифидобактерий при росте на печеночной среде Блаурокка имеют шаровидную форму белого цвета и образуют при встряхивании крошковатую массу.
Физиолого-биохимические признаки:
Строгий анаэроб.
Температурный диапазон роста 38±1°С, фаза максимального накопления микробных клеток заканчивается к 24-48 ч.
Оптимум рН 7,2-7,6.
Не ферментируют индол, уреазу, салицин, трегалозу, маннотол, рамнозу, N-ацетил-β-D-глюкозаминидазу, эскулин, целлобиозуарабинозу и сорбитол. Ферментируют мальтозу, глюкозу, фруктозу, галактозу, лактозу, мелезитозу, нитраты, сукрозу, β-глюкозидазу, маннозу, раффинозу, ксилозу и арабинозу.
Условия хранения лиофильно высушенной культуры: в герметичной упаковке при температуре 4±2°С в защищенном от прямых солнечных лучей месте при относительной влажности воздуха не более 70% - срок хранения не более 12 месяцев.
Условия и среды для размножения:
1. плотные среды: МРС-5, Schaedler-агар (48 часов, 38±1°С, анаэробные условия);
2. полужидкие среды: печеночная среда Блаурокка, казеиново-дрожжевая (КД-5), гидролизатно-молочная (ГМ) (48 часов, 38±1°С, анаэробные условия);
3. жидкие среды: Schaedler-бульон (24-48 часов, 38±1°С, анаэробные условия).
При проведении полногеномного секвенирования, включая 16rRNA-типирование штамм В. longum ICIS-505 идентифицирован как штамм вида Bifidobacterium longum. Анализ генома В. longum ICIS-505 не выявил генетических детерминант вирулентности и токсигенности, что позволяет говорить о том что данный штамм безвреден, не токсичен и авирулентен.
С целью изучения специфической антиперсистентной активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом В. longum ICIS-505, было изучено их влияние на антилизоцимную активность (АЛА) и биопленкообразование (БПО) условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов.
Антилизоцимная активность и биопленкообразование являются базовыми и универсальными характеристиками патогенных и условно-патогенных микроорганизмов [Бухарин О.В., Перунова Н.Б. Микросимбиоценоз. Екатеринбург: УрО РАН. 2014. 260 с.].
Для определения антилизоцимной активности условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов использовали известный способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов [патент РФ 2126051, C12Q 1/02, 1999].
Биопленкообразование условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов проводили фотометрическим методом по интенсивности поглощения красителя (кристалл-виолета) микробной биопленкой, адгезированной к поверхности лунки полистиролового планшета  G.А., Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol 1998, 30, P. 295-304;  G.A., Pratt L.A., Watnick P.I., Newman D.K., Weaver V.В., Kolter R. Genetic approaches to the study of biofilms. Methods Enzymol 1999, 310, P. 91-109].
Уровень антиперсистентной активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом В. longum ICIS-505, выражают в процентах (%) подавления персистентных свойств условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов в опыте по сравнению с контролем.
Пример осуществления изобретения.
С целью изучения антиперсистентных свойств биологически активных веществ, продуцируемых предлагаемым штаммом, проведено культивирование В. longum ICIS-505 на жидкой питательной среде следующего состава: гидролизат казеина - 5,67 г.; протеозопептон - 5,00 г.; папаиновый перевар соевой муки - 1,00 г.; дрожжевой экстракт - 5,00 г.; глюкоза - 5,83 г.; NaCl -1,67 г.; калия гидрофосфат - 0,83 г.; трис - 3,00 г.; L-цистин - 0,40 г.; гемин -0,01 г. рН=7,6±0,2. Температура 38±1°С, время инкубации 24-48 часа в анаэробных условиях.
Далее получали культуральную жидкость путем центрифугирования бульонной культуры В. longum ICIS-505 (при 3000 оборотах в минуту в течение 15 минут) и отделения ее от бактериальных клеток стеклянной стерильной пипеткой в отдельную емкость.
Данная культуральная жидкость В. longum ICIS-505 представляет собой неочищенный продукт, продуцируемый штаммом, - биологически активные вещества, оказывающие антиперсистентное влияние на условно-патогенные и патогенные бактерии и дрожжевые грибы.
9
Параллельно из выросших 24 часовых культур условно-патогенных и патогенных бактерий (Sh. zonnei 177б, Sh. flexneri 337, Sh. flexneri 170, E. coli 157, P. mirabilis 50/10, P. vulgaris 401, K. pneumoniae 278, S. aureus 209 и S. aureus 19) и дрожжевых грибов (С. albicans 24433 АТСС, С. albicans 14, С. albicans 38, С. albicans 85, С. albicans 102) готовили одномиллиардную взвесь по стандарту мутности (1×10 КОЕ/мл, 3 McF).
9
Для определения специфической активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом В. longum ICIS-505, исследовали антиперсистентную активность культуральной жидкости в отношении антилизоцимной активности и биопленкообразования условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов. Исследование осуществляли путем добавления культуральной жидкости штамма (в соотношении 1:9) в питательный бульон со взвесью условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов (1×10 КОЕ/мл, 3 McF). В качестве контроля на каждом этапе исследований вместо культуральной жидкости Bifidobacterium longum ICIS-505 использовали эквивалентное количество питательного бульона.
Для определения антилизоцимной активности условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов использовали известный способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов [патент РФ 2126051, C12Q 1/02, 1999]. Согласно способу для определения АЛА в качестве тест-культуры использовали суточную агаровую культуру Micrococcus lysodeikticus (штамм №2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Культуру растворяли в физиологическом растворе, доводили оптическую плотность (ОП) тест-штамма до 0,300 (0,28-0,32). На 1/15М фосфатном буфере (рН=6,2) готовили раствор лизоцима с концентрацией 20 мкг/мл.
9
Для определение специфической активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом Bifidobacterium longum ICIS-505, в отношений антилизоцимной активности условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов одномоментно вносилось по 2800 мкл питательного бульона, 100 мкл суспензии суточной агаровой культуры патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (в концентрации 1×10 КОЕ/мл) и 100 мкл супернатанта В. longum ICIS-505 (опыт) или 100 мкл питательного бульона (контроль). Все пробы инкубировались 24 часов статически при 37°С.
Контрольные и опытные пробы отделяли от микробных клеток центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут и получали супернатант. Супернатант объемом 0,9 мл смешивали с 0,1 мл приготовленного раствора лизоцима и инкубировали 60-120 мин при 37°С. Затем смесь супернатанта с лизоцимом помещали в полистеролловый планшет и вносили суспензию микрококка. Замер оптической плотности проводили через 30 с и 150 с после внесения в лунки микрококка.
Антилизоцимную активность исследуемого штамма рассчитывали по формуле:
где
А - антилизоцимная активность в микрограммах инактивированного лизоцима/мл супернатанта * ед. оптической плотности бульонной культуры, мкг/мл*OD:
V1 - объем (0,1 мл) раствора лизоцима исходной концентрации (20 мкг/мл);
V2 - объем (0,9 мл) супернатанта бульонной культуры исследуемого штамма;
С - исходная концентрация лизоцима (20 мкг/мл);
Y - оптическая плотность бульонной культуры исследуемого штамма, ед. оптической плотности;
0
0
0
ΔD - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в опыте между 30 и 150 секунд [D(30'')-D(150'')];
к
к
ΔDk - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в контроле между 30 и 150 секунд [D(30'')-D(150'')].
Антилизоцимную активность опытных и контрольных проб выражали в мкг/мл*OD.
Биопленкообразование условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов проводили фотометрическим методом по интенсивности поглощения красителя (кристалл-виолета) микробной биопленкой, адгезированной к поверхности лунки полистиролового планшета  G.А., Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol 1998, 30, P. 295-304;  G.A., Pratt L.A., Watnick P.I., Newman D.K., Weaver V.В., Kolter R. Genetic approaches to the study of biofilms. Methods Enzymol 1999, 310, P. 91-109].
9
630
В лунки 96-луночных стерильных плоскодонных планшетов одномоментно вносилось по 100 мкл питательного бульона, 135 мкл суспензии суточной агаровой культуры патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (в концентрации 1×10 КОЕ/мл, 3 McF) и 15 мкл супернатанта В. longum ICIS-505 (опыт) или 15 мкл питательного бульона (контроль). Все пробы инкубировались 24 часа при 37°С. Для учета биопленкообразования после удаления планктонных (свободноплавающих) клеток микроорганизмов трехкратной промывкой лунок дистиллированной водой (200 мкл) и подсушивания планшетов на воздухе (30 мин), осуществлялось окрашивание сформированных биопленок внесением в лунки 1% раствора кристалл-виолета (45 мин при комнатной температуре). Отмывание свободного красителя выполняли трехкратной обработкой лунок дистиллированной водой, а экстракцию фиксированного в биопленках красителя проводили добавлением к пробам 200 мкл 96% этанола. Интенсивность окрашивания последнего, соответствующая значению показателя биопленкообразования условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов, определяли на спектрофотометре (BioTek, США) при длине волны 630 нм. Показатель биопленкообразования опытных и контрольных проб выражали в условных единицах оптической плотности (ОП).
Далее вычисляли уровень антиперсистентной активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом В. longum ICIS-505 в процентах (%) подавления АЛА И БПО условно-патогенных и патогенных бактерией дрожжевых грибов в опыте по сравнению с контролем.
Суммированные результаты на основании 3 кратного повторения опытов приведены в таблице 1, 2.
В таблице 1 приведены результаты исследований по определению уровня антиперсистентной активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом Bifidobacterium longum ICIS-505, в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий.
В таблице 2 приведены результаты исследований по определению уровня антиперсистентной активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом Bifidobacterium longum ICIS-505, в отношении дрожжевых грибов.
Как видно из таблиц уровень антиперсистентной активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом Bifidobacterium longum ICIS-505 в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов составляет от 60% до 100%, что свидетельствует о его способности ингибировать персистентные свойства условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов в 2 и более раза.
Таким образом, заявляемый штамм бактерий Bifidobacterium longum ICIS-505 перспективен для целей получения пробиотических препаратов, оказывающих антиперсистентное влияние на условно-патогенные и патогенные бактерии и дрожжевые грибы.