СПЕЦИФИЧЕСКИЕ И ВЫСОКОАФИННЫЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ SH3-ДОМЕНЫ КИНАЗЫ FYN

1. Рекомбинантный связывающий белок, содержащий, по меньшей мере, одно производное домена 3 (SH3) Src-гомологии киназы Fyn, в котором
(a) по меньшей мере, одна аминокислота, находящаяся в src-петле или на расстоянии вплоть до двух аминокислот рядом с src-петлей и
(b) по меньшей мере, одна аминокислота, находящаяся в RT-петле или на расстоянии вплоть до двух аминокислот рядом с RT-петлей,
заменена, делегирована или добавлена, причем указанное производное SH3-домена имеет, по меньшей мере, 85%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 98-100%-ю идентичность относительно домена 3 (SH3) Src-гомологии киназы FYN вне src- и RT-петель и предпочтительно при условии, что этот рекомбинантный связывающий белок не является существующим в природе белком, содержащим природный SH3-домен.
2. Связывающий белок по п.1, содержащий, по меньшей мере, два производных SH3-домена, предпочтительно двухвалентный связывающий белок.
3. Связывающий белок по п.1, содержащий один или предпочтительно два измененных остатка в положениях 37 и/или 50 производного SH3-домена, предпочтительно, два гидрофобных измененных остатка, более предпочтительно, Trp37 и/или Tyr50, причем Trp37 и Tyr50 являются наиболее предпочтительными.
-7
-12
-8
-12
4. Связывающий белок по п.1, имеющий специфическую аффинность связывания 10-10 М, предпочтительно 10-10 М, в отношении внеклеточного домена онкофетального фибронектина (ED-B).
5. Связывающий белок по любому из пп.1-4, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.
6. Слитый белок, содержащий связывающий белок по любому из пп.1-5, слитый с фармацевтически и/или диагностически активным компонентом.
7. Слитый белок по п.6, где указанный компонент выбран из группы, состоящей из
(i) цитокинов, предпочтительно, цитокинов, выбранных из группы, состоящей из IL-2, IL-12, TNF-альфа, IFN-альфа, IFN-бета, IFN-гамма, IL-10, IL-15, IL-24, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, LIF, CD80, B70, TNF-бета, LT-бета, лиганда CD-40, Fas-лиганда, TGF-бета, IL-1-альфа и IL-1-бета;
(ii) токсичных соединений, предпочтительно, низкомолекулярных органических соединений или полипептидов, предпочтительно, токсичных соединений, выбранных из группы, состоящей из калихеамицина, неокарциностатина, эсперамицина, динемицина, кедарцидина, мадуропептина, доксорубицина, даунорубицина, ауристатина, А-цепи рицина, модеккина, укороченного экзотоксина A Pseudomonas, дифтерийного токсина и рекомбинантного гелонина;
(iii) хемокинов, предпочтительно, хемокинов, выбранных из группы, состоящей из IL-8, GRO-альфа, GRO-бета, GRO-гамма, ENA-78, LDGF-PBP, GCP-2, PF4, Mig, IP-10, SDF-1 альфа/бета, BUNZO/STRC33, I-TAC, BLC/BCA-1, MIP-1-альфа, MIP-1-бета, MDC, TECK, TARC, RANTES, HCC-1, HCC-4, DC-CK1, MIP-3-альфа, MIP-3-бета, MCP-1-5, эотаксина, эотаксина-2, I-309, MPIF-1, 6Ckine, CTACK, MEC, лимфотактина и фракталкина;
(iv) флуоресцентных красителей, предпочтительно, компонента, выбранного из Alexa Fluor или красителей Су;
6
6
(v) фотосенсибилизаторов, предпочтительно, бис(триэтаноламин)Sn(IV)хлорин е (SnChe);
(vi) прокоагулянтных факторов, предпочтительно, тканевых факторов;
(vii) ферментов для активации пролекарств, предпочтительно, ферментов, выбранных из группы, состоящей из карбоксипептидаз, глюкуронидаз и глюкозидаз;
99m
123
111
18
64
68
86
124
131
90
177
67
213
211
(vii) радионуклидов, либо из группы гамма-излучающих изотопов, предпочтительно, Tc, I, In, либо из группы излучателей позитронов, предпочтительно, F, Cu, Ga, Y, I, или из группы бета-излучателей, предпочтительно, I, Y, Lu, Cu, либо из группы альфа-излучателей, предпочтительно, Bi, At; и
(viii) функциональных Fc-доменов, предпочтительно, функциональных Fc-доменов человека.
8. Слитый белок по п.6, дополнительно содержащий компонент, модулирующий время полужизни в сыворотке, предпочтительно компонент, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), иммуноглобулина и альбуминсвязывающих пептидов.
9. Слитый белок по любому из пп.6-8, содержащий связывающий белок по п.5 или 6.
10. Полинуклеотид, кодирующий связывающий белок или слитый белок по любому из пп.1-9.
11. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.10.
12. Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по п.10 и/или вектор по п.11.
13. Применение связывающего или слитого белка по любому из пп.1-9 для получения лекарственного средства или диагностического средства, предпочтительно лекарственного средства для лечения рака или диагностического средства для диагностики рака.
14. Фармацевтическая или диагностическая композиция, содержащая связывающий или слитый белок по любому из пп.1-9, и при необходимости фармацевтически приемлемый эксципиент.
15. Способ получения библиотеки, содержащей связывающие белки по любому из пп.1-4, включающий стадии:
(i) генерирование полинуклеотидов, кодирующих связывающие белки по любому из пп.1-4, предпочтительно одновременной рандомизацией, по меньшей мере, одной аминокислоты, находящейся в src-петле или на расстоянии вплоть до двух аминокислот рядом с src-петлей и случайной заменой, делегированием или добавлением, по меньшей мере, одной аминокислоты, находящейся в RT-петле или на расстоянии вплоть до двух аминокислот рядом с RT петлей,
(ii) составление библиотек, предпочтительно библиотек фагового дисплея, экспрессирующих указанные связывающие белки,
(iii) при необходимости подвергание указанных библиотек селекционному скринингу.
16. Библиотека, полученная способом по п.17, предпочтительно библиотека, содержащая более 1 миллиарда связывающих белков.