Изучение лекарственной формы глутарона -нового производного глутаминовой кислоты

ФАРМАКОЛОГИЯ, ТОКСИКОЛОГИЯ

Л. А. Смирнова, А. Ф. Рябуха, Е. А. Сучков, К. А. Кузнецов, В. Н. Перфилова, И. Н. Тюренков

Лаборатория фармакологической кинетики НИИ фармакологии ВолгГМУ, кафедра фармакологии и биофармации ФУВ, ГУ ВМНЦ

ИЗУЧЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ГЛУТАРОНА -НОВОГО ПРОИЗВОДНОГО ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ

УДК 615.214.31

Изучена относительная биодоступность глутарона у кроликов. Выявлено, что фармакокинетические свойства таблеток глутарона близки к фармакокинетическим свойствам субстанции данного вещества.

Ключевые слова: фармакокинетика, глутарон.

L. A. Smirnova, A. F. Ryabukha, E. A. Suchkov, K. A. Kuznetsov, V. N. Perfilova, I. N. Tyurenkov

STUDY OF A DOSAGE FORM OF A NEW DERIVATIVE OF GLUTAMINIC ACID GLUTARON

The relative bioavailability of glutaron was studied in rabbits. We have found that pharmacokinetic properties of glutaron tablets are similar to those of the active substance.

Key words: pharmacokinetics, glutaron.

Важнейшим этапом доклинических испытаний новых лекарственных веществ является изучение экспериментальной фармакокинетики, позволяющей проводить рациональное дозирование лекарственных средств, индивидуальный подбор оптимальной терапевтической дозы, выбор необходимых лекарственных форм. Для разработки наиболее эффективных лекарственных форм необходимо изучать их относительную биодоступность в сравнении с субстанцией вещества [1, 3].

На кафедре фармакологии и биофармации ФУВ ВолгГМУ изучена фармакология нового структурного аналога глутаминовой кислоты -глутарона, доказаны его антидепрессантные, анксиолитические и нейропротекторные свойства [4, 5].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучить относительную биодоступность таблеток глутарона.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Субстанция глутарона синтезирована на кафедре органической химии Российского педагогического университета им. Герцена, Санкт-Петербург; лекарственная форма получена на кафедре

фармацевтической технологии Пятигорского медико-фармацевтического института.

Количественное определение проводилось на жидкостном хроматографе Shimadzu (Япония) с флуоресцентным детектором на колонке SUPELCOSIL LC-18 (5 мкм; 150 мм х 4,6 мм). Детектирование проводилось при длине волны экстинкции 215 нм и длине волны эмиссии 285 нм. Мобильная фаза включала в себя ацетонитрил (УФ 210) (Россия) и буферную систему из 50 мМ раствора однозамещенного калия фосфата (рН 2,1) с добавлением 0,06%-й гептансульфо-новой кислоты [6, 7]. Соотношение ацетонитрил : буфер 10 % : 90 % v/v.

Экстракцию глутарона, а также одновременное осаждение белков из биологических проб производили из плазмы крыс 10 % ТХУ в соотношении 1 : 0,2. Степень экстракции соединения глутарон составила не менее 90 %. Чувствительность метода 0,5 мкг/мл.

Идентификацию исследуемого вещества и расчет концентрации проводили по методу абсолютных стандартов. Зависимость площадей пиков от концентрации глутарона анализировалась методом регрессионного анализа.

Валидация метода ВЭЖХ количественного определения глутарона осуществлялась в соответствии с ГОСТ 5725-1-2002 и Guidline on bioanalytical method Validation EMEA 2012.

Для валидации проводились калибровки по стандартным растворам соединения VMA-99-82 и по биологическому материалу с построением калибровочных кривых.

На основании полученных результатов измерений рассчитывались площадь хромато-графического пика по следующей формуле: 1 l х h,

где l - длина основания пика; h - высота пика.

Затем рассчитывались: среднее значение площади хроматографического пика для параллельных измерений, стандартное отклонение от среднего значения, средняя ошибка.

Определялись внутридневные процентные колебания (повторяемость метода) и междневные процентные колебания (воспроизводимость метода).

Повторяемость рассчитывали по формуле: (Сд - Сн) / Сн х 100 %, где Сд - действительная концентрация глутарона, рассчитанная по калибровочному графику; Сн - номинальная концентрация глутарона, добавленная к биологическому материалу.

Воспроизводимость бралась как среднее отклонение в процентах по всем трем дням измерений.

Также рассчитывали показатели прецизионности и точности.

Прецизионность рассчитывали по формуле: Со / СрЗ х 100 %, где Со - стандартное отклонение серии параллельных измерений; СрЗ - среднее значение серии параллельных измерений.

Точность рассчитывалась по формуле: Сд / Сн х 100 %, где Сд - действительная концентрация глутарона, рассчитанная по калибровочному графику; Сн - номинальная концентрация глутарона, добавленная к биологическому материалу.

Статистическая обработка данных проводилась при помощи компьютерной программы Microsoft Excel.

Для определения относительной биодоступности таблеток глутарона забор крови у кроликов при введении субстанции и таблеток производился через 30 минут, 1, 2, 4, 8, 12 часов.

Фармакокинетические параметры рассчитывались модельно независимым методом статистических моментов в моменты времени от 0 до ж. Для оценки фармакокинетических свойств изучаемого соединения рассчитывали следующие параметры:

• Площадь под фармакокинетической кривой «концентрация - время» (AUC) является основным фармакокинетическим параметром и характеризует биологическую доступность

лекарственного средства. Данный параметр рассчитывали модельно-независимым методом статистических моментов в программе Microsoft Excel.

С21д11 + 21+22Д12+С2+Сз

с

где AUC0CT = п

AUC =СтД11 + С1+С2Д12+С2+С3Д1з^+АиСо

Kel

• Общий (кажущийся) клиренс (с/), отражающий скорость освобождения от препарата единицы объема биожидкости, как отношение дозы ф) к АиС:

D

с/ =- (мл/ч).

АиС

• Константа элиминации (Ке/), характеризующая снижение концентрации препарата на конечном (моноэкспоненциальном) участке фармако-кинетической кривой:

Стах /п-

Kel = -

Спосл

(ч-1), Тпосл - Tmax

где Cmax и Tmax - максимальная концентрация

и время ее достижения; Спосл и Тпосл - последнее значение концентрации и время ее определения.

• Общий (кажущийся) объем распределения (Vd), под которым понимают такой объем, при распределении в котором, препарат имел бы ту же концентрацию, что и в плазме крови, как отношение клиренса (cl) к константе элиминации (Kel):

Cl , ч

Vd =- (мл).

Kel

• Период полувыведения (Т1/2), отражающий время, в течении которого концентрация ЛВ в крови снижается вдвое:

0,693 Т1/2 =- (ч).

Kel

• Среднее время удерживания, характеризующее среднее время пребывания в организме молекулы препарата (MRT):

AUMC MRT =- (ч),

AUC

где AUMC - площадь под кривой «произведение времени на концентрацию лекарственного вещества - время».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для изучения фармакокинетики лекарственной формы и субстанции глутарона была разработана методика количественного определения с применением метода высокоэффективной жидкостной хроматографии.

В ходе предварительных экспериментов разработаны оптимальные параметры методики высокоэффективной жидкостной хроматографии определения глутарона. При данных хромато-г рафических условиях время удерживания составило около 7-8 мин (рис. 1, 2).

Рис. 1. Хроматограмма соединения глутарон в водном растворе

Рис. 2. Хроматограмма соединения глутарон в биологическом материале

Для количественного определения использовали метод абсолютной калибровки. Посредством метода регрессионного анализа анализировалась зависимость площадей пиков от концентрации глутарона в диапазоне концентраций от 1 до 50 мкг/мл. Для каждого

значения концентрации проводилось 5 параллельных измерений.

В результате было установлено, что калибровочные кривые носят линейный характер, с коэффициентом аппроксимации ^2) равным 0,998 (рис. 3).

Рис. 3. Зависимость площади под хроматографическим пиком от концентрации вещества глутарон

Валидацию метода количественного определения глутарона проводили согласно Guideline on bioanalytical method validation (EMEA 2012).

По полученным результатам измерений были рассчитаны валидационные характеристики, точность и прецизионность (средняя ошибка измерения). Данные представлены в табл. 1.

Таблица 1

Валидационные характеристики метода ВЭЖХ количественного определения глутарона

Номинальная концентрация, мкг/мл Средние результаты измерения, mAUxмин, (M ± m) Средняя ошибка (прецизионность), % Расчетная концентрация, мкг/мл Точность, %

1 1,70 ± 0,07 4,31 0,996 99,60

2 3,91 ± 0,33 8,43 1,810 90,51

5 11,49 ± 1,16 10,13 4,612 92,24

10 25,40 ± 1,31 5,15 9,751 97,51

25 70,62 ± 0,16 0,23 26,470 105,88

50 132,55 ± 2,26 1,71 49,362 98,72

Точность составила в среднем 97,41 %. Прецизионность (средняя ошибка измерения) -4,99 %. Были определены внутридневные процентные колебания (повторяемость метода), которые не превышали 12 % в изучаемых диапазонах концентраций. Междневные процентные колебания (воспроизводимость метода) для изучаемого соединения не превышали в основном 10 %. Чувствительность метода (предел

количественного обнаружения) составил 1 мкг/мл. Предел обнаружения составил 250 нг/мл (табл. 2).

При повторном проведении анализа, после 72 часов хранения водных растворов соединения при комнатной температуре, средние абсолютные процентные колебания находились в тех же пределах, показывая стабильность изучаемого вещества.

Таблица 2

Основные аналитические параметры метода ВЭЖХ количественного определения глутарона

Параметры Показатель

Внутридневные колебания (повторяемость) 12 %

Междневные колебания (воспроизводимость) 10 %

Точность 97,41 %

Чувствительность 1 мкг/мл

Предел обнаружения 250 нг/мл

Прецизионность (средняя ошибка измерения) 4,99 %

При изучении влияния процессов замораживания и таяния, было обнаружено, что средние абсолютные процентные колебания для изучаемого вещества находились в тех же пределах, что определяет стабильность глутарона под влиянием данных факторов.

Разработанный в результате проведенных исследований метод ВЭЖХ количественного определения соединения глутарон обладает

достаточной для решения поставленных задач чувствительностью и селективностью.

Для изучения относительной биодоступности кроликам вводили субстанцию и таблетки глутарона в дозе 26 мг/кг.

Фармакокинетические кривые действующего компонента при введении таблеток представлены в сравнении с фармакокинетической кривой, полученной при введении субстанции (рис. 4).

a 2

10

15

20

25

30

час

Рис. 4. Содержание соединения глутарон в крови кроликов

после введения таблеток и субстанции в дозе 26 мг/кг: по оси абсцисс - время

Были рассчитаны фармакокинетические параметры таблеток и субстанции глутарона (табл. 3). Площадь под фармакокинетической кривой составила для субстанции 32,86 мкг/мл/ч и для таблеток 44,52 мкг/мл/ч. Значения периода полувыведения для субстанции и таблеток оказались весьма близки и составили 10,06 и 10,09 ч соответственно. Также сходны значения

Фармакокинетические свойства таблеток глутарона близки к свойствам субстанции данного вещества.

При введении таблеток статистически значимо снижается кажущийся клиренс и кажущийся объем распределения. С чем, вероятно, и связаны более высокие концентрации в крови при введении таблеток глутарона.

Относительная биодоступность составляет более 100 %.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, таблетки глутарона в дозе 26 мг/кг за счет более медленного выведения и поддерживания дольше более высоких концентраций, имеют площадь под фармакокинетической кривой в 1,36 раза выше, чем таковая у субстанции.

Это позволяет считать лекарственную форму таблетки перспективной для дальнейшего исследования.

среднего времени удерживания (7,71 и 8,11 ч). Выявлено снижение клиренса и кажущегося объема распределения, значения которых составили - 0,81 л/ч/кг (субстанция) и 0,61 л/ч/кг (таблетки) и 11,55 (субстанция) и 7,92 (таблетки).

Рассчитан показатель относительной биодоступности, величина которого 136,8.

ЛИТЕРАТУРА_

1. Жердев В. П., Бойко С. С., Месонжник Н. В. и др. // Эксперим. и клин. фармакол. - 2009. - № 3. - С. 16-21.

2. Миронов А. Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. -Тула: ЗАО «Гриф и К», 2012.

3. Спасов А. А, Смирнова Л. А, Иежица И. Н. и др. // Вопр. мед. химии. - 2002. - № 3. - С. 233-258.

4. Средство, обладающее антидепрессантным, анксиолитическим, нейропротекторным и иммуностимулирующим действием: патент РФ № 2429834 /

B. И. Петров, И. Н. Тюренков, В. В. Багметова, М. А. Самотруева, В. М. Берестовицкая, О. С. Васильева, Е. С. Остроглядов; заявл. 23.07.2010, опубл. 27.09.2011. - Бюл. 27. - 2011.

5. Тюренков И. Н., Багметова В. В., Чернышева Ю. В. // Вестник ВолгГМУ. - 2012. - № 3 (43). -

C. 21-24.

6. Тюренков И. Н., Перфилова В. Н., Смирнова Л. А. и др. // Хим.-фарм. журнал. - 2010. - Т. 44, № 12. -С. 68-70.

7. Тюренков И. Н., Перфилова В. Н., Смирнова Л. А. и др. // Хим.-фарм. журнал. - 2013. - Т. 47, № 3. -С. 55-56.

Таблица 3

Фармакокинетические параметры глутарона у кроликов при пероральном введении субстанции и таблеток в дозе 26 мг/кг

Лекарственная форма Фармакокинетические параметры

Аис, мкг/мл/ч Т1/2, ч 1ШТ, ч с1, л/ч/кг Vd, л/кг

Субстанция 32,86 ± 4,66 10,06 ± 3,68 7,71 ± 1,91 0,81 ± 0,12 11,55 ± 3,87

Таблетки 44,52 ± 10,04 10,09 ± 2,45 8,11 ± 1,52 0,61 ± 0,13* 7,92 ± 1,61*

Относительная биодоступность 136,8 ± 30,78

* статистически достоверно (р < 0,05).