Вакцина для ранней защиты против ящура из штамма А 2205/G IV культуральная инактивированная эмульсионная
VACCINE FOR EARLY PROTECTION AGAINST FOOT-AND-MOUTH DISEASE FROM STRAIN A 2205/G IV CULTURAL INACTIVATED EMULSION

Ящур - это вирусное, остро протекающее заболевание домашних парнокопытных животных (КРС, свиньи, козы, олени, буйволы, верблюды), характеризующееся лихорадкой и афтозными поражениями слизистой оболочки в полости рта, кожи вымени (молочной железы) и конечностей. Болезни подвержены животные любого возраста. Молодняк легче заражается и тяжелее переносит заболевание (до 2-3 месяцев). Источником данного заболевания являются больные животные, переболевшие ящуром, а также содержавшиеся совместно с больными длительное время, находящиеся в инкубационном (скрытом) периоде болезни, выделяющие вирус во внешнюю среду с содержимым и стенками афт (изъязвления округлой формы) на языке по стенкам полости рта, с молоком, слюной и фекалиями [1, 2].
По причине легкого и быстрого распространения возбудителя ящура данное заболевание может приобретать размах эпизоотий [3, 4]. С целью недопущения возникновения болезни в хозяйствах Российской Федерации применяется система мероприятий по борьбе и профилактике ящура, которая направлена на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне, а также проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных. Рекомендуется обязательная вакцинация животных; всех вновь приобретенных животных регистрировать в учреждениях государственной ветеринарной службы и осуществлять карантинирование животных перед вводом в основное стадо; соблюдать требования зоогигиенических норм и правил содержания животных; приобретать корм из благополучной территории и др. [2].
Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса, гомологичного полевым изолятам [5, 6].
Возникающие в мире вспышки ящура демонстрируют, что данная крайне заразная вирусная инфекция продолжает оставаться значимой экономической проблемой во всем мире. Споры о наиболее эффективном способе реагирования на вспышки ящура в странах, свободных от болезней, по-прежнему сосредоточены на использовании вакцин [7]. Для проведения эффективной кампании по вакцинации нужно наличие эффективной, безопасной вакцины, содержащей в качестве иммуногенной части инактивированный антиген вируса, соответствующей эпизоотическому изоляту. Вакцина и схема ее применения должны достаточно быстро обеспечить иммунитет. Как правило, противоящурные вакцинные препараты создают напряженный иммунитет на 21 день после вакцинации. Уменьшение сроков по защите животных является актуальной задачей, чтобы остановить и замедлить передачу вируса другим животным. Достижение данной цели позволит эффективно применять вакцину в неблагополучном пункте и угрожаемой зоне для формирования раннего иммунитета.
Одной из нескольких мер, которые могут быть применены для борьбы со вспышками ящура, является экстренная вакцинация. Критерии, определяющие успешное проведение экстренной вакцинации, включают в себя доступ к вакцине, которая отличается следующими характеристиками: 1) содержит штамм вируса ящура с достаточным антигенным родством по отношению к изолятам, циркулирующим в очаге; 2) относится к требуемому виду среди разработанных вакцин; 3) характеризуется приемлемой безвредностью и эффективностью; 4) имеет соответствующий доступ, в том числе объем партий и своевременность их поставок.
Планирование на случай непредвиденных обстоятельств должно включать обеспечение экстренной вакцинации и учитывать возможность сложных решений не только в отношении того, когда, где и как применять вакцину, но и экономическую целесообразность ее использования [8].
По опубликованным данным, экстренная вакцинация крупного рогатого скота, овец и свиней может быть эффективной для профилактики заболевания в течение первых 4-5 дней после иммунизации [8, 9, 10]. Сведения из литературных источников показывают, что риск распространения инфекции уменьшается по мере увеличения интервала между вакцинацией и заражением вирусом. Известно, вакцинация может уменьшить количество выделяемого в окружающую среду вируса по сравнению с неиммунизированными животными [9, 10].
При наличии высокого уровня генетической и антигенной вариабельности вируса ящура в пределах даже одной генетической линии происходит возникновение новых полевых изолятов, отличающихся по показателям вирулентности и иммуногенности от ранее выделенных и охарактеризованных штаммов [11-14].
Для купирования вспышки ящура и предупреждения распространения вируса требуется быстрая типизация изолятов ящура и изучение их биологических свойств, что необходимо при выборе подходящего штамма для производства противоящурных вакцин [15, 16].
Учитывая опасность возникновения ящура в РФ и высокую вероятность в этом случае больших экономических потерь, особое значение приобретает проблема экстренной профилактики данного заболевания для формирования раннего иммунитета у животных.
Стратегия экстренной, вынужденной вакцинации при заносе возбудителя на территорию России приобретает особую важность, основанием для которой является необходимость создания ранней защиты всех восприимчивых животных. Сокращение времени для формирования иммунитета против ящура в организме восприимчивых животных является актуальной задачей.
По данным ряда авторов [17, 18], вакцинация может уменьшить количество выделяемого вируса по сравнению с неиммунизированными животными и снизить риск распространения инфекции по мере увеличения интервала между вакцинацией и заражением вирусом.
Для улучшения мер борьбы с заболеванием в эндемичных странах важно отслеживать текущие варианты распространения полевых изолятов вируса ящура для обеспечения того, чтобы в короткие сроки иметь возможность исследования биологических свойств интересующего изолята и разработать эффективную вакцину из вызвавшего вспышку штамма вируса [17-21].
В 2017-2018 гг. в некоторых странах Северо-Восточной Африки отмечали вспышки ящура типа А. Страны указанного региона активно развивают индустрию туризма и имеют торгово-экономические связи с Россией, вследствие чего всегда существует риск заноса заболевания на территорию РФ [22].
После проведения необходимых лабораторных исследований обнаруженных изолятов вируса ящура, особое внимание было обращено на один изолят, который выделен от крупного рогатого скота. По результатам ПЦР и нуклеотидного секвенирования с последующим филогенетическим анализом, проведенных специалистами Всемирной справочной лаборатории по ящуру (Пирбрайт, Великобритания) [22] и ФГБУ «ВНИИЗЖ», выявили, что изолят принадлежит топотипу AFRICA, генетической линии G IV.
По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный изолят принадлежит к топотипу ASIA, генетической линии G IV вируса ящура типа А, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура типа А.
Учитывая интенсивные торговые связи между Российской Федерацией и странами Северо-Восточной Африки, вероятность риска заноса ящура на территорию нашей страны остается очень высокой [23]. В связи с этим возникла необходимость разработать новую вакцину для ранней защиты из штамма (ранее эпизоотического изолята) вируса ящура серотипа А для обеспечения безопасности территории Российской Федерации и сопредельных государств.
3
Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного возбудителю ящура штамма А22 Ирак 24/64, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде масляного адъюванта в соотношении, мкг/см:
Антигенный материал
3,0
Масляный адъювант
500000,0÷600000,0
В качестве чувствительной биологической системы для репродукции вируса ящура используют перевиваемую суспензионную клеточную линию из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17, в качестве поддерживающей среды применяют раствор Эрла без внесения сыворотки, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого (ФГМС), гидролизата белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков при рН среды 7,4-7,6.
Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). При изготовлении эмульсионной вакцины в качестве адъюванта служит Montanide ISA-206 VG. Очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей осуществляют с применением полигексаметиленгуанидин гидрохлорид (ПГМГ).
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма типа А представляет собой суспензию, состоящую преимущественно из 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура.
Существенный недостаток вакцины-прототипа состоит в их недостаточной иммуногенной активности, что объясняется невысокой степенью защиты восприимчивых животных от эпизоотических изолятов вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Северо-Восточной Африки.
Для решения этой проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка противоящурной инактивированной культуральной эмульсионной вакцины, обеспечивающей эффективную раннюю защиту восприимчивых животных против полевых изолятов вируса ящура типа А топотипа AFRICA генетической линии G IV, распространенных на территории Северо-Восточной Африки.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала вакцин для ранней защиты против ящура типа А инактивированных культуральных эмульсионных.
Указанный технический результат достигнут созданием вакцины для ранней защиты против ящура типа А инактивированной культуральной эмульсионной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.
3
Разработанная вакцина в 1,0 см препарата содержит следующие компоненты: активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма A 2205/G IV вируса ящура, репродуцированного предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/2-17, в количестве не менее 6,0 мкг и масляный адъювант Montanide ISA-206 предпочтительно в количестве 500000,0-575000,0 мкг, соответственно.
Изолят, послуживший источником для получения штамма вируса ящура А 2205/G IV, был выделен в 2018 году от больных ящуром KPC на территории Северо-Восточной Африки (экспертиза №2205). Производственный штамм вируса ящура A 2205/G IV получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных клеточных линиях.
Штамм вируса ящура A 2205/G IV депонирован в Коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером: №339-деп / 20-127 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным клеткам свиной почки (СП) и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/2-17), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).
Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют предпочтительно перевиваемую суспензионную культуру клеток ВНК-21/2-17, а в качестве поддерживающей среды применяют раствор Эрла без внесения сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН среды 7,4-7,6. Инактивацию вируса проводят с использованием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с концентрацией 0,025-0,050% от объема вируссодержащей суспензии. Инактивированный антиген очищают от балластных примесей с помощью ПГМГ, который вносят в суспензию до концентрации 0,007% от общего объема.
3
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А 2205/G IV представляет собой суспензию, содержащую инактивирвоанный 146S иммуногенный компонент вируса ящура. Содержание компонента в продукте оценивают с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [24]. Для приготовления вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1,0 см не менее 1,5 мкг инактивированного 146S иммуногенного компонента вируса ящура. Необходимую концентрацию инактивированного 146S компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена с использованием тангенциальной установки фильтрации.
Вакцину для ранней защиты против ящура типа А инактивированную культуральную эмульсионную получают путем диспергирования при помощи гомогенизатора концентрата антигена (инактивированный 146S иммуногенный компонент) и масляного адъюванта в соотношении 1:1 по массе, соответственно. Для усиления иммунного ответа используют масляный адъювант Montanide ISA-206 VG («Seppic», Франция). Полученная вакцина представляет собой молокоподобную суспензию, не растворимую в воде.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:
1. Вакцина инактивированная культуральная эмульсионная для ранней защиты против ящура типа А.
2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штамма A 2205/G IV вируса ящура в эффективном количестве.
3. Целевые добавки.
Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антигенный материал из штамма А 2205/G IV в эффективном количестве.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
• Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма A 2205/G IV вируса ящура типа А, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой клеточной линии ВНК-21/2-17 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.
3
• Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма A 2205/G IV вируса ящура типа А, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток ВНК-21/2-17 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в количестве не менее 6,0 мкг в 1,0 см готового вакцинного препарата.
• Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант.
• Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-206 VG.
3
• Вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-206 в количестве 500000,0-575000,0 мкг в 1,0 см готового препарата.
3
• Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма A 2205/G IV вируса ящура, полученного предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток ВНК-21/2-17 и масляный адъювант Montanide ISA-206 VG в количестве, мкг/см готового препарата:
Авирулентный и очищенный антигенный материал вируса ящура
не менее 6,0
Масляный адъювант
500000,0-575000,0
Предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную раннюю защиту против вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Северо-Восточной Африки.
Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противоящурной вакцины в качестве активного вещества введен антигенный материал из штамма A 2205/G IV инактивированного вируса ящура, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную раннюю защиту восприимчивых животных против вируса ящура серотипа А, вызывающего в последние годы вспышки заболевания в странах Северо-Восточной Африки.
Сущность изобретения отражена на графических изображениях:
Фиг. 1 - Выравнивание нуклеотидных последовательностей гена 1D вируса ящура вакцинного штамма А22 Ирак 24/64 и щтамма A 2205/G IV (позиции 1…639 и.о.).
Фиг. 2 - Степень идентичности нуклеотидных последовательностей гена 1D вируса ящура вакцинного штамма А22 Ирак 24/64 и штамма A 2205/G IV.
Фиг. 3 - Нуклеотидная последовательность гена 1D вируса ящура штамма А 2205/G IV.
Фиг. 4 - Выравнивание аминокислотных последовательностей белка VP1 вируса ящура вакцинного штамма А22 Ирак 24/64 и штамма A 2205/G IV (213 аминокислот).
Фиг. 5 - Аминокислотная последовательность белка VP1 вируса ящура штамма A 2205/G IV.
1
Фиг. 6 - Положение штамма A 2205/G IV на филогенетическом древе вируса ящура типа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP).
1
Фиг. 7 - Положение штамма A 2205/G IV на филогенетическом древе вируса ящура типа А топотипа AFRICA. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP).
Фиг. 8 - Степень идентичности нуклеотидных последовательностей гена 1D вируса ящура референтного штамма А/21 Kenya_iso 77 и штамма A 2205/G IV.
Фиг. 9 - Кинетика инактивации вируса ящура штамма A 2205/G IV.
Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:
SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма A 2205/G IV вируса ящура типа А;
SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма А 2205/GIV вируса ящура типа А.
Штамм A 2205/G IV вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
Штамм вируса ящура A 2205/G IV типа А относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 22-25 нм. Вирион вируса ящура имеет диаметр около 23-25 нм [25].
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм вируса ящура A 2205/G IV вируса ящура относится к серотипу А. Вирус ящура стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе, реакции связывания комплемента и нейтрализации.
Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 штамма вируса ящура A 2205/G IV. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм A 2205/G IV принадлежит к генетической линии GIV топотипа AFRICA.
Антигенное родство штамма ВЯ A 2205/G IV с имеющимися производственными штаммами ВЯ серотипа А исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН матчинг) в соответствии с «Методическими указаниями по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации» [25]. Штамм А 2205/G IV антигенно отличается от производственных штаммов А №550/Азербайджан/64 (генетическая линия A/ASIA/Iraq-64), А22 Ирак 24/64 (генетическая линия генетическая линия A/ASIA/Iraq-64), А/Иран/97 (генетическая линия A/ASIA/Iran-96), А/Турция/06 (генетическая линия A/ASIA/Iran-05), А №2155/Забайкальский/2013 (генетическая линия A/ASIA/Sea-97), А №2166/Краснодарский/2013 (генетическая линия A/ASIA/Iran-05), А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (генетическая линия A/ASIA/G VII).
1
Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r) составило для А №550/Азербайджан/64 - 0,22; А22 Ирак 24/64 - 0,15; А/Иран/97 - 0,21; А/Турция/06 - 0,08; А №2155/Забайкальский/2013 - 0,06; А №2166/Краснодарский/2013 - 0,19; А №2269/ВНИИЗЖ/2015 - 0,25.
1
1
При значении r>0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса.
Биотехнологические характеристики
50
3
Штамм вируса ящура A 2205/G IV репродуцируется в перевиваемой культуре клеток почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21). В течение 17-20 часов культивирования титр инфекционной активности вируса достигает значений от 6,42 до 6,75 lg ТЦД/0,1 см (таблица 6) и сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 15 пассажей (срок наблюдения).
Гено- и хемотаксономическая характеристика.
6
Штамм A 2205/G IV вируса ящура является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10Д.
6
1
2
3
4
Нуклеиновая кислота представлена одноцепочечной линейной позитивной молекулой РНК с молекулярной массой 2,8×10Д и длиной 8500 н.о. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP, VP, VP и VP. Липопротеидная оболочка отсутствует.
1
66a
Основным антигенным белком является белок VP. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.
1
2
3
4
1
3
0
1
2
3
g
При репродукции в биосистеме вирус ящура образует 4 варианта компонентов: 146S частицы (вирионы), состоящие из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представлена комплексом белков VP-VP-VP-VP; 75S компонент, лишенный РНК и включающий в себя 60 копий полипептида VP-VP-VP; 12S частицы, представленные белками VP, VP, VP; 3,8S субъединицы, состоящие из неструктурного белка VP. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.
Физические свойства.
-18
3
Масса вириона составляет 8,4×10 г. Плавучая плотность 1,45 г/см.
Устойчивость к внешним факторам.
Штамм вируса ящура A 2205/G IV устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,5-7,8. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к щелочам, кислотам, формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, действию высоких температур.
Дополнительные признаки и свойства.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 15 пассажей на перевиваемой культуре клеток ВНК-21 (срок наблюдения).
При испытании проведено 15 последовательных пассажей штамма A 2205/G IV вируса ящура в перевиваемой культуре клеток ВНК-21. Для определения биологической активности проводили титрование вируса каждого пассажа в перевиваемой культуре клеток IB-RS-2.
Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм A 2205/G IV вируса ящура по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа А, обладает более высокой протективной и иммуногенной активностью.
Для снижения эпизоотической опасности ящура типа А и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки высокоиммуногенной вакцины.
Получена высокоиммуногенная инактивированная культуральная эмульсионная вакцина для ранней защиты против ящура типа А из штамма A №2205/G IV.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Генетическая характеристика штамма A 2205/G IV вируса ящура по результатам ПНР и нуклеотидного секвенирования
1
Проведенные исследования заключались в изучении первичной структуры гена 1D (белок VP) (652 и.о.) штамма A 2205/G IV вируса ящура методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера и определении положения данного штамма на филогенетическом древе вируса ящура типа А. Метод основан на определении первичной структуры гена 1D испытуемого изолята с последующим анализом филогенетического родства с другими изолятами вируса ящура типа А.
Было необходимо провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 1D, кодирующего белок VP1 вируса ящура референтного вакцинного штамма А22 Ирак 24/64 и исследуемого штамма A 2205/G IV. В базе данных GeneBank была найдена последовательность полного генома вируса ящура штамма А22 Ирак 24/64 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KY825717.1), которая была взята в качестве матрицы для сравнения с полным сиквенсом гена 1D вируса ящура штамма A 2205/G IV. Полная последовательность всего генома вируса ящура штамма А22 Ирак 24/64 (первая последовательность) и последовательность гена 1D вируса ящура штамма A 2205/G IV (вторая последовательность) были внесены в программу BioEdit.
Проведено выравнивание второй последовательности по первой. Лишние фрагменты удалены, поскольку вторая последовательность имеет длину 652 н.о. Далее по выравненным последовательностям проводили сравнительный анализ для оценки нуклеотидных замен. Полученные данные представлены на фиг. 1.
Определили степень родства между генами 1D штамма А22 Ирак 24/64 и штамма A 2205/G IV вируса ящура. По данным анализа степень идентичности составила 0,798 или 79,8% (фиг. 2). Степень различий по гену 1D - 20,2%.
Нуклеотидная последовательность гена 1D штамма A 2205/G IV вируса ящура представлена на фиг. 3.
Проводили сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белка VP1 вакцинного штамма А22 Ирак 24/64 и штамма A 2205/G IV. Первая последовательность выбрана в качестве референтной, относительно нее выявлены аминокислотные замены, которые представлены на фиг. 4 и в таблице 2.
Из 213 аминокислот 32 заменены, т.е. процент идентичности белка VP1 вакцинного и исследуемого штаммов составляет 85%, степень различий - 15%.
Аминокислотная последовательность белка VP1 штамма A 2205/G IV представлена на фиг. 5.
Проведен филогенетический анализ штамма A 2205/G IV. Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA6 и алгоритма Neighbor-Joining [26]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (100 повторов), показан рядом с ветвями [27]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [28] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 31 нуклеотидную последовательность. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 632 позиции. Эволюционный анализ проводился в MEGA 6 [29].
1
В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP) штамма A 2205/G IV и других изолятов/штаммов вируса ящура типа А определено положение исследуемого изолята на филогенетическом древе (фиг. 6).
Изучение первичной структуры участка генома методом нуклеотидного секвенирования показало, что штамм A 2205/G IV вируса ящура принадлежит к типу А, топотипу AFRICA и генетической линии G IV.
Отдельно представлена дендрограмма для типа А топотипа AFRICA (фиг. 7). Филогенетическое древо построено в данном случае с помощью численного ресэмплинга («Boostrap»), с указание boostrap-критерия. Указанный практический компьютерный метод исследования позволяет проводить распределение статистик вероятностных распределений, основанный на многократной генерации выборок на базе имеющейся выборки. Численный ресэмплинг дает возможность просто и быстро оценивать статистики рассматриваемых последовательностей нуклеотидов для сложных моделей. Общее количество событий для анализа составило 100. В качестве референтной последовательности использовали последовательность изолята А/21 Kenia_iso 77 (номер последовательности в GeneBankAY593761.1) в соответствии с рекомендациями OIE/FAOReferenceLaboratoryNetworkibrFMD. FMDV prototype strains (https://www.foot-and-mouth.org/FMDV-nomenclature-working-group/prototype-strains).
Определили степень родства между генами 1D референтного изолята А/21 Kenya_iso 77 и исследуемого штамма A 2205/G IV вируса ящура. По данным анализа степень идентичности составила 0,812 или 81,2% (фиг. 8). Степень различий по гену 1D - 18,8%.
По результатам всего анализа делаем вывод, что исследуемый изолят типа А относится к топотипу AFRICA генетической линии G IV, что подтверждают данные нуклеотидного, аминокислотного и общего филогенетического исследования.
Пример 2. Адаптация штамма A 2205/G IV к перевиваемой суспензионной культуре клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21
3
50
Для заражения клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 использовали 10%-ную афтозную суспензию вируса ящура, полученную из афт КРС (2 пассаж), зараженного вирусом ящура штаммом A 2205/G IV. Посевная концентрация клеток составляла 0,15-0,20 млн кл./см, доза заражения вирусом - 0,01 ТЦД/кл. Результаты репродукции культурального вируса ящура штамма А 2205/G IV в монослойной клеточной линии ВНК-21 продемонстрированы в таблице 3.
50
3
Из данных таблицы 3 следует, что репродукция вируса ящура штамма A 2205/G IV проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 16-22 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 5,08±0,30 до 6,75±0,14 lg ТЦД/0,1 см.
50
3
3
3
2
Максимальное значение титра вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (6,75±0,14 lg ТЦД/0,1 см). Концентрация 146S частиц с 1 по 6 пассажи изменялась с 0,40±0,13 до 1,25±0,03 мкг/см. При этом наибольшее количество 146S иммуногенного компонента отмечали на этапе 5-6 пассажей (1,25±0,03 мкг/см). Степень достоверности (R) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 95,28 до 99,79%. Таким образом, на протяжении 6-ти последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма A 2205/G IV вируса ящура к суспензионной перевиваемой клеточной линии ВНК-21.
Пример 3. Изучение условий монослойного культивирования вируса ящура штамма A 2205/G IV в промышленных масштабах
В процессе промышленного культивирования вируса ящура штамма A 2205/G IV в монослойной перевиваемой культуре клеток ВНК-21 осуществляли подбор оптимальных условий культивирования вируса, анализируя разный состав поддерживающей среды, температурный фактор и дозу заражения клеток.
3
50
На первом этапе исследования оценивали влияние состава поддерживающей среды на репродукцию вируса ящура штамма А 2205/G IV в монослойной культуре клеток ВНК-21 в масштабах производства (на этапе с 5-ого на 6-ой пассажи). Для сравнения применяли три среды с добавлением 2% фетальной сыворотки крови телят: 1) среда Игла MEM; 2) среда RPMI-1640; 3) раствор Хенкса с 2,5% ГБК. Посевная концентрация клеток составляла 0,15-0,20 млн кл./см, доза заражения вирусом - 0,1-0,0001 ТЦД/кл. Культивирование вируса осуществляли при температурах 35-38±0,2°С до разрушения клеточного монослоя на 90-100% в течение 16-32 ч. Результаты репродукции штамма А 2205/G IV вируса ящура с поддерживающими средами разного состава отражены в таблице 4.
3
3
50
Из данных таблицы 4 видно, что при репродукции вируса ящура штамма A 2205/G IV в монослойной культуре клеток ВНК-21 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда Игла MEM, позволяющая за 16-18 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100% с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 1,12±0,04 мкг/см и титром инфекционной активности 6,42±0,22 lg ТЦД/0,1 см. При использовании среды RPMI-1640 и раствора Хенкса с добавлением 2,5% ГБК показатели репродукции вируса были ниже на 28,6 и 17%, соответственно.
50
50
3
3
На следующем этапе изучения условий монослойного культивирования штамма A 2205/G IV вируса ящура в культуре клеток ВНК-21 в условиях производства оценивали влияние на процесс репродукции вируса температурного фактора. Для этого культивирование вируса проводили на среде Игла MEM с 2% сыворотки КРС при следующих температурах: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. В качестве поддерживающей среды использовали среду Игла MEM с добавлением 2% сыворотки крови КРС. Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,010-0,001 ТЦД/кл. Культивирование вируса осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 80-100% в течение 16-27 ч (таблица 4). По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма A 2205/G IV вируса ящура в монослойной культуре клеток ВНК-21 оптимальной является температура среды 37,0±0,02°С, при которой за 16-20 ч развитие ЦПД достигало 95-100% с накоплением 146S частиц, равным 1,13±0,10 мкг/см и титром вируса 6,25±0,14 lg ТЦД/0,1 см.
50
50
50
3
3
Оценивали также влияние дозы заражения монослоя клеток линии ВНК-21 штаммом А 2205/GIV при культивировании в масштабах производства. Для этого использовали разные дозы вируса: 0,10-0,01; 0,010-0,001; 0,0010-0,0001 ТЦД/кл. В качестве поддерживающей среды применяли среду Игла MEM. Репродукцию вируса проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 18-32 ч до специфического разрушения клеток на 90-100%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 4, наибольшее накопление «полных» частиц вируса достигалось при дозе заражения 0,1-0,01 ТЦД/кл. и составило 1,02±0,03 мкг/см с титром вируса, равным 6,75±0,14 lg ТЦД/см.
50
Таким образом, проведено изучение условий монослойного культивирования штамма A 2205/G IV в культуре клеток ВНК-21 в промышленных масштабах. В результате исследования определены следующие оптимальные параметры репродукции штамма A 2205/G IV в монослойной клеточной линии ВНК-21: 1) поддерживающая среда - среда Игла MEM; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,02°С; 3) доза заражения вирусом -0,1-0,01 ТЦД/кл.
Пример 4. Изучение условий суспензионного культивирования штамма A №2205/G IV вируса ящура в промышленных масштабах
При промышленном культивировании штамма A 2205/G IV в суспензионной перевиваемой культуре клеток ВНК-21 проводили поиск оптимальных параметров для успешной репродукции возбудителя ящура, используя разные концентрации клеток, температуру и дозу заражения.
3
50
На первом этапе работы определяли влияние посевной концентрации клеток линии ВНК-21 в суспензии на репродукцию штамма A 2205/G IV вируса ящура в промышленных масштабах. Для анализа подготовили суспензии со следующими концентрациями клеток: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 млн кл./см. Водородный показатель рН поддерживали в диапазоне 7,45-7,60. Температура культивирования вируса составляла 37,0±0,02°С, доза заражения вирусом - 0,1-0,01 ТЦД/кл. Репродукцию вируса проводили до специфической гибели клеток на 95-100%, которая осуществлялась в течение 16-20 ч. Результаты суспензионного культивирования штамма A 2205/G IV вируса ящура в суспензии с разными концентрациями клеток представлены в таблице 5.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
50
Как следует из таблицы 5, при культивировании вируса ящура штамма А 2205/G IV в суспензионной клеточной линии ВНК-21 с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 2,5 млн кл./см составило 1,08±0,03 мкг/см (в пересчете на 1,0 млн кл./см - 0,43±0,03 мкг/см), с концентрацией 3,0 млн кл./см - 1,34±0,10 мкг/см (в пересчете на 1,0 млн кл./см - 0,45±0,10 мкг/см), с концентрацией 3,5 млн кл./см - 1,96±0,02 мкг/см (в пересчете на 1,0 млн кл./см - 0,56±0,02 мкг/см), и с концентрацией 4,0 млн кл./см - 1,97±0,19 мкг/см (в пересчете на 1,0 млн кл./см - 0,49±0,19 мкг/см). Как следует из полученных данных в пересчете на концентрацию 1,0 млн кл./см для репродукции штамма A 2205/G IV вируса ящура оптимальной является концентрация клеток ВНК-21 в суспензии, равная 3,5 млн кл./см. Значение титра инфекционной активности вируса при этом также было наибольшим и составило 6,92±0,17 lg ТЦД/0,1 см.
50
50
3
3
На следующем этапе работы исследовали влияние фактора температуры на суспензионное культивирование штамма A 2205/G IV вируса ящура в культуре клеток ВНК-21 в промышленных масштабах. Для этого репродукцию вируса проводили при следующих температурных условиях: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,10-0,01 ТЦД/кл. Водородный показатель рН вирусной суспензии поддерживали в диапазоне 7,45-7,60. Культивирование вируса проводили до ЦПД, равного 90-100%, в течение 16-28 ч. По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма A 2205/G IV вируса ящура в суспензионной культуре клеток ВНК-21 оптимальной является температура среды 37,0±0,02°С, при которой в течение 16-18 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100% с высоким накоплением 146S компонента (1,97±0,11 мкг/см) и титром инфекционной активности вируса 6,75±0,29 lg ТЦД/0,1 см.
50
50
50
3
3
В ходе работы по изучению условий суспензионного культивирования штамма A 2205/G IV вируса ящура в промышленных масштабах с применением культуры клеток ВНК-21 оценивали влияние дозы заражения клеток. Для этого клеточные суспензии заражали вирусом в разных дозах: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД/кл. Репродукцию вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С в течение 19-29 ч до ЦПД, равного 90-95%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S частиц и титр вируса ящура. Как видно из данных таблицы 5, наибольшее накопление 146S компонента отмечали при дозе заражения 0,10-0,01 ТЦД/кл. (1,91±0,12 мкг/см) с титром инфекционной активности вируса, равным 6,75±0,38 lg ТЦД/см.
3
50
Таким образом, проведено изучение параметров суспензионного культивирования штамма А 2205/GIV вируса ящура в клеточной линии ВНК-21 в промышленных масштабах. Выявлены оптимальные условия репродукции штамма A 2205/G IV в суспензионной культуре клеток ВНК-21: 1) концентрация клеток перед заражением - 3,5 млн кл./см; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,02°С; 3) доза заражения вирусом - 0,10-0,01 ТЦД/кл.
Пример 5. Изучение стабильности репродукции штамма A 2205/G IV вируса ящура в течение 15 последовательных пассажей
После адаптации штамма A 2205/G IV вируса ящура к монослойной перевиваемой клеточной линии ВНК-21 провели изучение стабильности репродукции вируса данного штамма в суспензионной культуре клеток ВНК-21 в течение 15 последовательных пассажей.
3
3
3
50
50
Для заражения клеток ВНК-21 использовали вирус ящура, полученный в 6 пассаже с монослойной культуры клеток ВНК-21, где накопление 146S компонента составило 1,25±0,03 мкг/см, а значение титра инфекционной активности вируса - 6,75±0,14 lg ТЦД/см. Концентрация клеток ВНК-21 до заражения была равна 3,5 млн кл./см, доза заражения вирусом - 0,01 ТЦД/кл. Культивирование вируса проводили при температуре 37,0±0,2°C с поддержанием водородного показателя рН в диапазоне 7,45-7,60. По итогам каждого пассажа проводили определение концентрации 146S частиц и титр инфекционной активности вируса ящура. Результаты исследования показаны в таблице 6.
50
50
50
3
3
3
3
3
3
Из данных таблицы 6 следует, что репродукция штамма A №2205/G IV вируса ящура проходила при специфическом разрушении клеток в суспензии на 90-100% за 18-21 ч. В течение 1-15 последовательных пассажей значения титра инфекционной активности вируса незначительно колебались от 6,42±0,17 до 6,92±0,17 lg ТЦД/0,1 см. Среднее значение титра вируса составило 6,64±0,04 lg ТЦД/0,1 см. Максимальное значение титра вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (6,92 lg ТЦД/0,1 см). Концентрация 146S компонента в течение 15 пассажей изменялась с 1,40±0,10 до 1,84±0,13 мкг/см. Среднее значение количества 146S частиц составляло 1,59±0,03 мкг/см (р<0,005). При этом наибольшее количество 146S иммуногенного компонента регистрировали на этапе 5 пассажа (1,84±0,13 мкг/см).
2
Степень достоверности (R) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ была высокой и составляла 95,28-99,79%. Таким образом, на протяжении 15 последовательных пассажей отмечали стабильность репродукции штамма A 2205/G IV вируса ящура в суспензионной перевиваемой клеточной линии ВНК-21.
Пример 6. Изучение времени накопления штамма A 2205/G IV вируса ящура при суспензионном культивировании в клеточной линии ВНК-21
3
3
3
50
50
В процессе изучения биологических свойств штамма A 2205/G IV вируса ящура оценивали время его накопления при культивировании в суспензионной перевиваемой клеточной линии ВНК-21. Для заражения клеток использовали вирус ящура, полученный в 6 пассаже с монослойной культуры клеток ВНК-21. В данной суспензии концентрация 146S компонента составляла 1,25±0,03 мкг/см, а титр вируса - 6,75±0,14 lg ТЦД/см. Для репродукции вируса ящура указанного штамма использовали суспензии с концентрациями клеток линии ВНК-21 до заражения - 3,5±0,1 млн кл./см. Доза заражения вирусом составляла 0,01 ТЦД/кл. Процесс репродукции вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С с поддержанием значения рН в пределах от 7,45 до 7,60. Спустя 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22 ч после заражения клеток проводили отбор проб для определения концентрации 146S компонента и титра инфекционной активности вируса. Результаты анализа представлены в таблице 7.
3
3
3
3
3
3
2
50
50
50
Из таблицы 7 следует, что через 6 часов после заражения суспензионной культуры клеток ВНК-21 штаммом A 2205/G IV отмечается специфическое разрушение клеток на 12-14%. При этом количество 146S компонента составляло 0,15±0,03 мкг/см при титре инфекционности 3,42±0,22 lg ТЦД/0,1 см. При исследовании материала, полученного после 8-20 ч репродукции, отмечали рост содержания 146S частиц в суспензиях с 0,24±0,04 до 1,55±0,10 мкг/см и увеличение титра инфекционной активности с 4,00±0,14 до 6,83±0,10 lg ТЦД/0,1 см. При этом ЦПД соответствовало значениям 95-100%. Спустя 21-23 ч после инфицирования количество разрушенных клеток составляло 98-100%, однако концентрация 146S компонента снизилась с 1,55±0,10 до 1,21±0,12 мкг/см, а величина титра вируса уменьшилась с 6,83±0,10 до 6,50±0,14 lg ТЦД/см. Иными словами, наибольшее содержание 146S иммуногенного компонента и титра вируса определяли через 19-20 ч после заражения клеток. Степень достоверности (R) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ высокая и соответствовала 95,89-99,21%.
Таким образом, по результатам исследования определено оптимальное время репродукции штамма A 2205/G IV вируса ящура в суспензионной перевиваемой клеточной линии ВНК-21 для накопления достаточного для производства вакцины количества 146S компонента и достижения высокого значения титра инфекционной активности вируса.
Пример 7. Инактивация вируса ящура штамма A 2205/G IV
По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляли 15%-ный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ), подкисленный ледяной уксусной кислотой, корректируя рН до 8,2-8,6. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,05%. Инактивацию инфекционности вируса ящура штамма A 2205/G IV проводили в течение 12 часов при температуре 36-37°С и рН 7,2-7,6 с перемешиванием.
Для определения времени полной инактивации после добавления АЭЭИ каждый час производили отбор проб. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса ящура в культуре клеток почки свиньи СП. Результаты представлены в таблице 8 и на рисунке 9.
Как видно из таблицы 8, полная инактивация инфекционной активности культурального вируса ящура штамма А 2205/G IV, репродуцированного в культиваторах, произошла через 4 часа после внесения инактиванта.
3
3
Готовые вирусные инактивированные суспензии исследовали в РСК для оценки содержания в них компонентов вируса. При исследовании полученной суспензий вируса концентрация 146S компонента составила 1,93±0,10 мкг/см, а 146S+75S компонента - 2,65±0,13 мкг/см.
Пример 8. Подбор условий очистки штамма A 2205/G IV вируса ящура
Суспензию штамма A 2205/G IV, полученную при репродукции вируса ящура в суспензионной клеточной линии ВНК-21, подвергают инактивации и очистке. Для получения очищенного антигена вируса ящура использовали полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) с концентрациями 0,010 и 0,007%. До и после процесса очистки антигена вируса ящура штамма A 2205/G IV в количественном варианте РСК определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов. Результаты исследований отражены в таблице 9.
Как следует из данных таблицы 9, в результате очистки антигена вируса ящура штамма A 2205/G IV с помощью ПГМГ в концентрации 0,010% отмечали уменьшение содержания 146S компонента вируса по сравнению с исходными значениями (до очистки) на 9,3% в готовом продукте. При этом используя то же органическое соединение, но в концентрации 0,007%, получали очищенный конечный продукт с потерей 146S компонента только на 17%. Содержание балластного белка в очищенном антигене при использовании ПГМГ 0,010 и 0,007% снижается на 51 и 46%, соответственно. Таким образом, исследуя условия очистки штамма A 2205/G IV, пришли к выводу о том, что для получения очищенного антигена вируса ящура достаточно использовать ПГМГ с концентрацией 0,007%.
Пример 9. Подбор условий концентрирования штамма A №2205/G IV вируса ящур
Культуральную инактивированную суспензию штамма A 2205/G IV, полученную с применением суспензионной клеточной линии ВНК-21, подвергали концентрированию в 20 раз по объему. Для увеличения концентрации иммуногенных компонентов антигена вируса ящура использовали следующие приемы: 1) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 4 ч; 2) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч; 3) концентрирование при помощи системы тангенциальной фильтрации Centramate™ 500S CM500SE. Инактивированную очищенную культуральную суспензию вируса ящура пропускали через кассету тангенциальной фильтрации серии Omega CentrasetteTR=70 кД S=0,1 кв.м.
До и после процесса концентрирования антигена вируса ящура штамма A 2205/G IV определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов в количественном варианте РСК. Результаты исследований представлены в таблице 10.
Как следует из данных таблицы 10, при концентрировании антигена вируса ящура штамма A 2205/G IV с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 10 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 13 раз. Применяя метод ультрафильтрации, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена вируса ящура штамма A 2205/G IV в суспензии в 18 раз. Таким образом, исследуя условия концентрирования штамма A 2205/G IV, пришли к выводу о том, что оптимальным способом увеличения концентрации компонентов вируса ящура является метод ультрафильтрации.
Пример 10. Подбор адъюванта и соотношения антиген-адъювант
Для изготовления противоящурной моновалентной эмульсионной вакцины из штамма A 2205/G IV в качестве адъюванта был выбран Montanide ISA-206 VG, так как по литературным данным [30] этот адъювант способствует выработки антител на 3-5 сутки после иммунизации.
При изготовлении моновалентной эмульсионной вакцины против вируса ящура использовали соотношение 50:50 по массе в соответствии с рекомендациями изготовителя масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG.
Пример 11. Компоновка инактивированной эмульсионной вакцины против ящура для ранней защиты из штамма А 2205/GIV.
3
Из полученного концентрата вируса ящура штамма A 2205/G IV изготовили противоящурную моновалентную эмульсионную инактивированную вакцину для ранней защиты с применением адъюванта Montanide ISA-206 VG. Количество 146S иммуногенного компонента в 1,0 см готового антигена составило 32,58±0,12 мкг (таблица 10).
Пример 12. Иммунизация животных противоящурной эмульсионной инактивированной вакциной из штамма A 2205/G IV.
3
Из полученной противоящурной эмульсионной инактивированной вакцины был приготовлен ряд разведений для КРС с 4-х кратным шагом и для свиней с 5-ти кратным шагом. 15 голов КРС разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см. Первую группу КРС (№№1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую группу КРС (№№6-10) привили вакциной, разведенной 1/4, третья группа КРС (№№11-15) - вакциной, разведенной 1/16. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи. 2 головы без вакцинации оставили в качестве контроля вируса.
15 голов свиней разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. Первую группу свиней (№№1-5) привили вакциной без разведения, второй группе свиней (№№6-10) инокулировали вакцину, разведенной 1/5, третья группа свиней (№№11-15) - иммунизирована вакциной, разведенной 1/25. Препарат вводили внутримышечно в шею за ухом. 2 головы без вакцинации оставили в качестве контроля. Схема вакцинации представлена в таблице 11.
Пример 13. Исследование сывороток крови вакцинированных животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура

Сыворотки крови от КРС и свиней, полученные до иммунизации животных, через 14 суток после начала тестирования вакцины на авирулентность и безвредность и на 14 сутки после последней иммунизации, исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ) [3]. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы ИФА «PrioCHECKFMDVNSELISAfor in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Полученные результаты исследований отражены в таблицах 12, 13, из которых видно, что сыворотки крови животных не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения PI для сывороток крови КРС и свиней <50%).
Пример 14. Оценка авирулентности и безвредности инактивированной эмульсионной вакцины для ранней защиты против ящура из штамма A 2205/G IV.
3
Для определения авирулентности вакцины на свиньях отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно по 0,1 см в две точки венчика на каждой конечности. В исследовании использовали свиней массой 35-40 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.
3
Контроль безвредности продукта на свиньях проводили путем внутримышечного введения вакцины в область верхней трети шеи в дозе 6,0 см. Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после инокуляции температура тела животного может повышаться до 41°С, и удерживаться на этом уровне в течение 1-3 суток.
По результатам исследований вакцина была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.
Пример 15. Изучение иммуногенных свойств вакцины противоящурной инактивированной эмульсионной из штамма A 2205/G IV по способности индуцирования вируснейтрализующих антител у естественно восприимчивых животных
Спустя 4 суток после иммунизации от КРС и свиней отбирали кровь, и полученные сыворотки анализировали в реакции нейтрализации (РН) с целью определения количества вируснейтрализующих антител (ВНА). Титры антител от иммунизированных естественно восприимчивых животных указаны в таблицах 14, 15.
2
2
2
В таблице 14 показано, что у КРС, иммунизированных против ящура штамма A 2205/G IV вакциной без разведения, титры антител на 4 сутки после иммунизации против гомологичного штамма A 2205/G IV и гетерологичных штаммов А №550/Азербайджан/64 (генетическая линия A/ASIA/Iraq-64), А22 Ирак 24/64 (генетическая линия генетическая линия A/ASIA/Iraq-64), А/Египет/18/12 (генетическая линия A/AFRICA/G IV), А/Турция/06 (генетическая линия A/ASIA/Iran-05), А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (генетическая линия A/ASIA/G VII), А №2155/Забайкальский/2013 (генетическая линия A/ASIA/Sea-97) составили 4,25±0,71; 2,00±0,11; 2,00±0,18; 1,45±0,15; 1,35±0,17; 1,15±0,15; 1,10±0,10 log, соответственно. В данном исследовании отобрали сыворотки крови от КРС, иммунизированных вакциной в разведении 1/4. Титры антител по данным реакции нейтрализации с гомологичной сывороткой 3,15±0,22 log, с гетерологичными штаммами А №550/Азербайджан/64 и А22 Ирак 24/64 составляли 1,80±0,10 и 1,65±0,13 log2, соответственно. Содержание вируснейтрализующих антител в сыворотках крови КРС, привитых вакциной в разведении 1/16, соответствовало значению 2,50±0,41 log против гомологичного штамма A 2205/G IV. В сыворотках крови двух контрольных животных антитела против указанных штаммов вируса ящура не выявлены.
2
Таким образом, уже на 4 сутки после вакцинации КРС средние значения титров вируснейтрализующих антител составляли 3,45±0,44 log.
2
Из таблицы 15 следует, что у свиней, иммунизированных против ящура штамма A 2205/G IV вакциной без разведения, титры антител на 4 сутки после вакцинации против штаммов А №550/Азербайджан/64 (генетическая линия A/ASIA/Iraq-64), А22 Ирак 24/64 (генетическая линия генетическая линия A/ASIA/Iraq-64), А/Египет/18/12 (генетическая линия A/AFRICA/G IV), А/Турция/06 (генетическая линия A/ASIA/Iran-05), А №2269/ВИИИЗЖ/2015 (генетическая линия A/ASIA/G VII), А №2155/Забайкальский/2013 (генетическая линия A/ASIA/Sea-97) составили 3,30±0,27; 2,40±0,20; 2,30±0,10; 1,50±0,18; 1,75±0,11; 1,20±0,17; 1,60±0,10 log, соответственно.
2
2
2
В данном исследовании также были отобраны сыворотки крови от свиней, иммунизированных вакциной в разведении 1/5. Титры антител по результатам реакции с гомологичным штаммом составили 2,50±0,24 log, гетерологичными штаммами А №550/Азербайджан/64 и А22 Ирак 24/64 составили 1,95±0,22 и штаммами А №550/Азербайджан/64 и А22 Ирак 24/64 составили 1,95±0,22 и 1,85±0,12 log, соответственно. Содержание вируснейтрализующих антител в сыворотках крови свиней, привитых вакциной в разведении 1/25, соответствовало значению 2,00±0,14 log при анализе с гомологичным штаммом A 2205/G IV. В сыворотках крови контрольных животных антитела против указанных штаммов вируса ящура не выявлены.
2
Таким образом, уже на 4 сутки после вакцинации КРС средние значения титров вируснейтрализующих антител составляли 3,30±0,27 log.
Пример 16. Контрольное заражение естественно восприимчивых животных. Изучение защитной способности инактивированной эмульсионной вакцины против ящура из штамма A 2205/G IV на естественно восприимчивых видах животных
4,0
3
3
50
КРС и свиней, иммунизированных в количестве по 15 голов, заражали контрольным штаммом A 2205/G IV вируса ящура, адаптированного к этим животным в слизистую оболочку языка в дозе 10 ИД/0,20 см (в две точки по 0,10±0,05 см). Спустя 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и провели патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения. Первичные афты не учитывали.
3
Результаты контрольного заражения представлены в таблице 16, из которой следует, что вакцина противоящурная инактивированная эмульсионная из штамма A 2205/G IV, введенная в однократной дозе (2,0 см) и в разведении 1/4 защищает КРС от заражения гомологичным штаммом все пять животных.
50
Препарат, введенный в разведении 1/16, защитил 3 из 5 животных. По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 18,18 ПД для КРС.
3
Из данных таблицы 17 видно, что вакцина противоящурная инактивированная эмульсионная из штамма A 2205/G IV, введенная однократной дозе (2,0 см) защищает свиней от заражения гомологичным штаммом все пять животных. Введенная вакцина, в разведении 1/5 и 1/25 защитила 4 из 5 и 3 из 5 животных, соответственно, от заражения гомологичным штаммом вируса ящура.
50
По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 22,22 ПД для свиней.
Пример 17. Оценка гуморального иммунитета естественно восприимчивых животных на 28 сутки после введения эмульсионной инактивированной вакцины для ранней защиты против ящура из штамма A 2205/G IV.
2
2
2
2
2
2
2
На 28 сутки после введения эмульсионной инактивированной вакцины для ранней защиты против ящура из штамма A 2205/G IV у КРС и свиней отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции нейтрализации [3]. Выявлено, что у КРС, иммунизированных вакциной в цельной дозе, средние значения титра антител составили 6,00±0,14 log, с разведением 1/4 - 4,55±0,10 log, с разведением 1/16 - 2,85±0,12 log. У свиней, иммунизированных вакциной в цельной дозе, средние значения титра антител составили 5,95±0,13 log, с разведением 1/5- 4,75±0,10 log, с разведением 1/25 - 2,55±0,14 log. Полученные данные реакции нейтрализации после введения цельной дозы вакцины позволяют обеспечить формирование гуморального иммунитета с защитными титрами (5,5 и более log) в соответствии с требованиями международных стандартов [3].
Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина для ранней защиты против ящура из штамма А 2205/G IV культуральная инактивированная эмульсионная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена как экспериментальная резервная для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма A 2205/G IV в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить раннюю эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Северо-Восточной Африки.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина для ранней защиты против ящура из штамма А 2205/G IV культуральная инактивированная эмульсионная»:
1. Ящур. Меры профилактики. URL: http://89.rospotrebnadzor.ru/directions/epid_nadzor/146902 (Дата обращения: 21 января 2021 г.).
2. Опасность болезни ящура. URL: https://vet.astrobl.ru/press-release/opasnost-bolezni-yashchura (Дата обращения: 15 декабря 2020 г.).
3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. - Paris, 2015 - Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.
4. Бурдов A.H., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.
5. Пономарев А.П., Узюмов В.Л., Груздев К.Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.
6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Bamett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.
7. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp. 2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - p. 13-21.
8. Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response / T.G. William, J.M. Pachecoa, T. Doel [et al.] // Vaccine. - December 2005. - V. 23. - P. 5775-5782.
9. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.
10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.
11. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16. - P. 746-754.
12. Рахманов A.M. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля.//Ветеринарная медицина мiжвiд. тем. наук. Харкiв, 2013. - С. 37-38.
13. Jamal S.M., Ferrari G, Ahmed S., Normann P. Graham J. Belsham G.J. Genetic diversity of foot-and-mouth disease virus serotype О in Pakistan and Afghanistan, 1997-2009 S.M. Jamal et al. / Infection, Genetics and Evolution №11 (2011). - P. 1229-1238.
14. Longjam N., Tayo T. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. - 2011. - Vol. 4(10). - P. 475-479.
15. Мельник P.H., Хаустова H.B., Мельник H.B., Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Святенко М.С., Литенкова И.Ю. Антигенная вариабельность вируса ящура серотипа А и обоснование необходимости получения новых актуальных производственных штаммов/ Ветеринария и кормление. - 2019. - №3. - С. 29-31.
16. Paton D.J., Sumption К.J., Charleston В. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy/ Phil. Trans. R. Soc. В (2009) 364. - P. 2657-2667.
17. Bamett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.
18. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16. - P. 746-754.
19. Brown F.A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateries: Proc. Jnt. Symp. 2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - P. 13-21.
20. Grubman M.J. Development of novel trategies to control FMD: marker vaccines and antivirals Biologicals. - 2005. - Vol. 33. №4. - P. 227-234.
21. William T.G. Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response / T.G. William, J.M. Pachecoa, T. Doel [et al.] // Vaccine. - December 2005. - V. 23. - P. 5775-5782.
22. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL: http://www.wrlfmd.org/ref labs/fmd ref lab reports.htm (дата обращения 15 октября 2020 г.).
23. Россия и страны Африки. URL: https://export67.com/files/304/rossiya-i-strany-afriki d.pdfs (Дата обращения: 11 сентября 2020 г.).
24. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Утв. 21.09.17.
25. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.
26. Saitou N. and Nei М. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-42.
27. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791.
28. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.
29. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C, and Tamura K. (2018). MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.
30. Barnett P. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.
--->
Перечень последовательностей
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение
«Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ
«ВНИИЗЖ») Federal Governmental Budgetary Institution
«Federal Centre for Animal Health» (FGBI «ARRIAH»)
<120> Вакцина для ранней защиты против ящура из штамма
А 2205/G IV культуральная инактивированная эмульсионная
<160>        2
<210>        1
<211>        639
<212>        РНК
<213>        вирус ящура
<400>        1
1
ACCACCGTGGAGAACTACGGCGGTGAGACACAACACCAACGACGGTACCACACGGACGTT
60
37
ACCACCGTGGAGAACTACGGCGGTGAGACACAACACCAACGACGGTACCACACGGACGTT
96
61
GGCTTTATAATGGACAGATTTGTGAAGGTGAGCAGTTCCACCCCCACACACGTCATTGAT
120
97
GGCTTTATAATGGACAGATTTGTGAAGGTGAGCAGTTCCACCCCCACACACGTCATTGAT
156
121
CTCATGCAAACCCACCAACACGGGCTGGTAGGTGCGTTGTTGCGTTCAGCCACCTACTAT
180
157
CTCATGCAAACCCACCAACACGGGCTGGTAGGTGCGTTGTTGCGTTCAGCCACCTACTAT
216
181
TTCTCTGATCTGGAGATCGTGGTAAGACACCAGGGGAACCTGACCTGGGTGCCCAACGGC
240
217
TTCTCTGATCTGGAGATCGTGGTAAGACACCAGGGGAACCTGACCTGGGTGCCCAACGGC
276
241
GCCCCGGAGGGCGCCCTCTCGAACACGGGCAACCCCACAGCTTACCACAAAGCGCCGTTC
300
277
GCCCCGGAGGGCGCCCTCTCGAACACGGGCAACCCCACAGCTTACCACAAAGCGCCGTTC
336
301
ACGAGGCTGGCACTTCCCTACACCGCGCCACACCGCGTGCTGGCGACAGTGTACAACGGG
360
337
ACGAGGCTGGCACTTCCCTACACCGCGCCACACCGCGTGCTGGCGACAGTGTACAACGGG
396
361
ACGACCAAGTACACGGCAGATGCTTCACCCAGGCGAGGTGACCTGGGAGCCCTTGCGGCG
420
397
ACGACCAAGTACACGGCAGATGCTTCACCCAGGCGAGGTGACCTGGGAGCCCTTGCGGCG
459
421
AGACTCGCCACACAGCTCCCCTCCTCTTTCAACTATGGGGCGCTGCGCGCTGAGACCATC
480
457
AGACTCGCCACACAGCTCCCCTCCTCTTTCAACTATGGGGCGCTGCGCGCTGAGACCATC
516
481
CACGAGGTTCTCGTGCGCATGAAGCGGGCCGAGCTTTACTGCCCCAGACCGCTGTTGTCA
540
517
CACGAGGTTCTCGTGCGCATGAAGCGGGCCGAGCTTTACTGCCCCAGACCGCTGTTGTCA
576
541
ACAGAGGTGAGTTCAGCGGACAGACACAAACAGAAGATCATTGCGCCAGCCAAACAGCTC
600
577
ACAGAGGTGAGTTCAGCGGACAGACACAAACAGAAGATCATTGCGCCAGCCAAACAGCTC
636
601
CTT
603
637
CTT
639
<210>        2
<211>        217
<212>        ПРТ
<213>        вирус ящура
<400>        2
1
Thr Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln His Gln Arg Arg Tyr His Thr Asp Val
20
21
Gly PheIle Met Asp Arg Phe Val Lys Val Ser Ser Ser Thr Pro Thr His Val Ile Asp
40
41
Leu Met Gln Thr His Gln His Gly Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Ser Ala Thr Tyr Tyr
60
61
Phe Ser Asp Leu Glu Ile Val Val Arg His Gln Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly
80
81
Ala Pro Glu Gly Ala Leu Ser Asn Thr Gly Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Phe
100
101
Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly
120
121
Thr Thr Lys Tyr Thr Ala Asp Ala Ser Pro Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ala Leu Ala Ala
140
141
Arg Leu Ala Thr Gln Leu Pro Ser Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Leu Arg Ala Glu Thr Ile
160
161
His Glu Val Leu Val Arg Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ser
180
181
Thr Glu Val Ser Ser Ala Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln Leu
200
201
Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly
217
<---