СИСТЕМЫ И СПОСОБЫ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ БИОПЛЁНКИ ПРОБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ НА ТВЁРДЫХ ЧАСТИЦАХ С ЦЕЛЬЮ КОЛОНИЗАЦИИ КИШЕЧНИКА БАКТЕРИЯМИ
SYSTEMS AND METHODS FOR GROWING PROBIOTIC BACTERIUM BIOFILM ON SOLID PARTICLES FOR INTESTINE COLONIZATION BY BACTERIA

Перекрестная ссылка на родственные заявки
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/159,846, поданной 11 мая 2015 года, и предварительной заявки на патент США №62/159,849, поданной 11 мая 2015 года, полное содержание которых включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Область техники
[0002] Настоящее изобретение относится к системе и способу выращивания и инкапсуляции по меньшей мере одного штамма бактерий в форме биопленки, выполненной с возможностью рН-зависимого направленного высвобождения бактериальной биопленки в желудочно-кишечном тракте.
Краткое описание изобретения
[0003] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ,
причем указанный способ приводит к образованию биопленки,
причем указанная биопленка содержит популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам,
причем указанная биопленка выполнена с возможность колонизации кишечника субъекта, который нуждается в такой колонизации, в течение по меньшей мере пяти дней при принятии внутрь субъектом, причем указанный способ включает:
a. обеспечение популяции, содержащей по меньшей мере один штамм бактерий;
b. инокуляцию среды для роста, которая содержит частицы, популяцией, содержащей по меньшей мере один штамм бактерий;
c. инкубирование частиц с популяцией, содержащей по меньшей мере один штамм бактерий, в течение времени, достаточного для того, чтобы популяция по меньшей мере одного штамма бактерий прикрепилась к частицам; и
d. культивирование популяции, содержащей по меньшей мере один штамм бактерий, прикрепленной к частицам, в среде для роста в течение времени, достаточного для образования биопленки.
[0004] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения биопленка, содержащая популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, инкапсулирована соединением, приспособленным для высвобождения по меньшей мере одного штамма бактерий при рН, обнаруженном в кишечнике животного.
[0005] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения соединение, приспособленное для высвобождения по меньшей мере одного штамма бактерий при рН, обнаруженном в кишечнике животного, представляет собой альгинат.
[0006] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, культивируют в среде для роста в проточных условиях.
[0007] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, культивируют в среде для роста в статических условиях.
[0008] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, сначала культивируют в среде для роста в статических условиях, а затем культивируют в среде для роста в проточных условиях.
[0009] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, культивируют в анаэробных условиях.
[0010] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, культивируют в аэробных условиях.
[0011] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения частицы являются пористыми и выбраны из группы, состоящей из: семян, дикальция фосфата, глины, песка и целлюлозы.
[0012] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения популяция, содержащая по меньшей мере один штамм бактерий, получена из микрофлоры кишечника.
[0013] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения популяция, содержащая по меньшей мере один штамм бактерий, представляет собой Lactobacillus plantarum.
[0014] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения популяция, содержащая по меньшей мере один штамм бактерий, представляет собой Acetobacter pomorum.
[0015] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения биопленка, образованная в результате способа, выполнена с возможностью рН-зависимого направленного высвобождения бактериальной биопленки в желудочно-кишечном тракте.
[0016] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения биопленка содержит два или более штаммов бактерий.
Краткое описание чертежей
[0017] На Фиг. 1 представлен пример иллюстративного варианта реализации настоящего изобретения, который демонстрирует проточную систему, использованную в соответствии со способами согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения.
[0018] На Фиг. 2А-2С представлены изображения некоторых иллюстративных вариантов реализации биопленок, полученных посредством способов согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения.
[0019] Фиг. 3 демонстрирует устойчивость биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения к кислоте.
[0020] Фиг. 4 демонстрирует устойчивость другой биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения к кислоте.
[0021] Фиг. 5 демонстрирует устойчивость биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения к лиофилизации.
[0022] Фиг. 6 демонстрирует устойчивость другой биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения к кислоте.
[0023] Фиг. 7 демонстрирует способность биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонизировать кишку на модели на животных с использованием указанных композиций.
[0024] Фиг. 8 демонстрирует рН-зависимое высвобождение бактерий из биопленок согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения.
[0025] Фиг. 9 демонстрирует способность другой биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонизировать кишку на модели на животных.
[0026] Фиг. 10 демонстрирует способность другой биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонизировать кишку на модели на животных по сравнению с другими биопленками, образованными с применением других способов.
Подробное описание изобретения
[0027] Для ясности описания, а не в качестве ограничения подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, в которых описаны или проиллюстрированы определенные свойства, варианты реализации или варианты применения настоящего изобретения.
[0028] По всему тексту описания и формулы изобретения следующие термины имеют значения, однозначно связанные с указанными терминами, если контекст однозначно не диктует обратное. Фразы «согласно одному варианту реализации настоящего изобретения» и «согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения» в настоящей заявке не обязательно относятся, хотя и могут относиться, к одному варианту или к одним и тем же вариантам реализации. Более того, фразы «согласно другому варианту реализации настоящего изобретения» и «согласно некоторым другим вариантам реализации настоящего изобретения» в настоящей заявке не обязательно относятся, хотя и могут относиться, к различным вариантам реализации. Таким образом, как описано ниже, различные варианты реализации настоящего изобретения можно с легкостью объединить, оставаясь в пределах объема или духа настоящего изобретения.
[0029] Кроме того, в настоящей заявке термин «или» представляет собой включающий оператор «или» и эквивалентен термину «и/или», если контекст однозначно не диктует обратное. Термин «на основе» не является исключающим и включает варианты на основе дополнительных не описанных факторов, если контекст однозначно не диктует обратное. Кроме того, по всему настоящему описанию объекты в единственном числе включают упоминания объектов во множественном числе. Значение «в» включает «в» и «на».
[0030] Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение относится к системе и способу для выращивания и инкапсуляции по меньшей мере одного штамма бактерий в форме биопленки, выполненной с возможностью рН-зависимого направленного высвобождения бактериальной биопленки в желудочно-кишечном тракте.
[0031] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ,
причем указанный способ приводит к образованию биопленки,
причем указанная биопленка содержит популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам,
причем указанная биопленка выполнена с возможностью колонизации кишечника субъекта, который нуждается в такой колонизации, в течение по меньшей мере пяти дней при принятии внутрь субъектом, причем указанный способ включает:
a. обеспечение популяции, содержащей по меньшей мере один штамм бактерий;
b. инокуляцию среды для роста, которая содержит частицы, популяцией, содержащей по меньшей мере один штамм бактерий;
c. инкубирование частиц с популяцией, содержащей по меньшей мере один штамм бактерий, в течение времени, достаточного для того, чтобы популяция по меньшей мере одного штамма бактерий прикрепилась к частицам; и
d. культивирование популяции, содержащей по меньшей мере один штамм бактерий, прикрепленной к частицам, в среде для роста в течение времени, достаточного для образования биопленки.
[0032] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для прикрепления популяции по меньшей мере одного штамма бактерий к частицам, составляет от 2 часов до 12 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для прикрепления популяции по меньшей мере одного штамма бактерий к частицам, составляет 2 часа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для прикрепления популяции по меньшей мере одного штамма бактерий к частицам, составляет 4 часа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для прикрепления популяции по меньшей мере одного штамма бактерий к частицам, составляет 6 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для прикрепления популяции по меньшей мере одного штамма бактерий к частицам, составляет 8 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для прикрепления популяции по меньшей мере одного штамма бактерий к частицам, составляет 10 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для прикрепления популяции по меньшей мере одного штамма бактерий к частицам, составляет 12 часов.
[0033] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет от 12 часов до 48 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 12 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 14 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 16 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 18 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 20 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 22 часа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 24 часа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 26 часов Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 28 часов Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 30 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 32 часа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 34 часа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 36 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 38 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 40 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 42 часа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 44 часа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 46 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 48 часов.
[0034] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, культивируют в среде для роста в проточных условиях. В настоящей заявке термин «проточные условия» означает движение культуральной среды относительно бактерий, прикрепленных к поверхности, причем движение культуральной среды оказывает на бактерии усилие сдвига.
[0035] Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, считают, что культивирование популяции по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленной к частицам, в проточных условиях создает даже слабые усилия сдвига в отношении растущей биопленки и усиливает быстрое образование биопленки (например, в течение более короткого периода времени по сравнению с типичными способами стационарного роста). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточная система обеспечивает введение свежей культуральной среды в растущую биопленку и удаление отходов бактерий.
[0036] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую от 10 мл/час до 100 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 20 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 30 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 40 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 50 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 60 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 70 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 80 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 90 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 100 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 10 мл/час.
[0037] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают встряхивание культуры бактерий при от 90 до 150 об./мин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают встряхивание культуры бактерий при 100 об./мин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают встряхивание культуры бактерий при 110 об./мин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают встряхивание культуры бактерий при 120 об./мин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают встряхивание культуры бактерий при 130 об./мин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают встряхивание культуры бактерий при 140 об./мин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают встряхивание культуры бактерий при 150 об./мин.
[0038] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения культивирование популяции по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленной к частицам, в проточных условиях приводит к получению прочной и здоровой биопленки в течение более короткого периода времени по сравнению с типичными способами (например, но не ограничиваясь указанными, в течение периода времени, меньшего на 5, 10, 20, 25, 50%). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полученная в результате биопленка характеризуется увеличенной устойчивостью к жестким условиям по сравнению с другими способами культивирования и более подробно описана ниже.
[0039] На Фиг. 1 представлен пример иллюстративного варианта реализации настоящего изобретения, который демонстрирует проточную систему согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения. На Фиг. 1 система содержит контейнер, содержащий твердые частицы для культивирования биопленки, источник среды для роста, трубки, по которым среда для роста поступает в контейнер и из контейнера, и насос, который перемещает среду по трубкам. Жидкость, которая выходит из контейнера, может возвращаться в резервуар со средой для повторного использования либо может вытекать. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данная проточная система может являться закрытой, открытой или полузакрытой. Стрелки, направленные по часовой стрелке на Фиг. 1, представляют направление потока и предназначены исключительно для целей иллюстрации.
[0040] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, культивируют в среде для роста в статических условиях. В настоящей заявке термин «статические условия» означает условия культивирования, в которых в отношении бактерий не оказывается усилие сдвига.
[0041] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, сначала культивируют в среде для роста в статических условиях, а затем культивируют в среде для роста в проточных условиях.
[0042] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, культивируют в анаэробных условиях. В настоящей заявке термин «анаэробные условия» означает условия культивирования, включающие отсутствие свободного или связанного кислорода.
[0043] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, культивируют в аэробных условиях. В настоящей заявке термин «аэробные условия» означает условия культивирования, включающие присутствие свободного или связанного кислорода.
Частицы
[0044] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения частицы являются пористыми и выбраны из группы, состоящей из: семян, дикальция фосфата, глины, песка и целлюлозы.
[0045] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения семена выбирают из группы, состоящей из: семян граната и семян страстоцвета съедобного. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения семена являются измельченными.
[0046] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения частицы целлюлозы включают целлюлозу, продаваемую под торговой маркой AVICEL. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения частицы целлюлозы включают целлюлозу, продаваемую под торговой маркой SOLKA.
[0047] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в способе для образования биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения используют множество частиц. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц варьирует от 5 микрон до 1 см. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 5 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 10 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 15 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 20 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 30 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 40 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 50 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 60 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 70 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 80 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 90 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 100 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 200 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 300 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 400 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 500 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 600 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 700 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 800 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 900 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 1 см.
Штаммы бактерий
[0048] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяция, содержащая по меньшей мере один штамм бактерий, получена из флоры кишечника.
[0049] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяция, содержащая по меньшей мере один штамм бактерий, представляет собой пробиотический штамм. В настоящей заявке термин «пробиотический» означает штамм бактерий, который стимулирует рост микроорганизмов, в особенности таковых с полезными свойствами (таких как таковые флоры кишечника).
[0050] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяция, содержащая по меньшей мере один штамм бактерий, представляет собой Lactobacillus plantarum.
[0051] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяция, содержащая по меньшей мере один штамм бактерий, представляет собой Acetobacter pomorum.
[0052] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биопленка, образованная в результате способа, выполнена с возможностью рН-зависимого направленного высвобождения бактериальной биопленки в желудочно-кишечном тракте.
[0053] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биопленка содержит два или более штаммов бактерий.
[0054] На Фиг. 2А представлены изображения некоторых иллюстративных вариантов реализации биопленок, полученных посредством способов согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения были исследованы несколько типов твердых частиц, подходящих для выращивания пробиотических бактерий, и результаты представлены в настоящей заявке. На Фиг. 2А представлены электронно-микроскопические изображения биопленки Lactobacillus plantarum, выращенной на различных твердых частицах, таких как, например, семена страстоцвета съедобного, измельченные семена граната, бентонитовая глина, частицы песка, белая глина, волокна SOLKA, дикальция фосфат (ДКФ), AVICEL. За исключением белой глины, бактерии росли на всех типах частиц.
[0055] На Фиг. 2В представлены изображения некоторых иллюстративных вариантов реализации биопленок, полученных посредством способов согласно настоящему изобретению, демонстрирующие рост биопленки Acetobacter pomorum на измельченных семенах страстоцвета съедобного, измельченных семенах граната и песке. Acetobacter pomorum рос и образовывал биопленку на семенах граната. Однако на песке наблюдался весьма незначительный рост. Acetobacter pomorum не рос на семенах страстоцвета съедобного. Другие исследованные виды бактерий, например, Pseudomonas spp, не росли на исследованных твердых частицах, как показано на Фиг. 2С.
[0056] Не опираясь на какую-либо теорию, считают, что различные частицы обеспечивают различимые варианты микроокружения для бактерий, растущих на данных частицах, такие как размер пор, неровность поверхности, питательные вещества, доступные в частицах, вязкость, заряд поверхности и т.д., которые могут оказывать влияние на способность различных бактерий прикрепляться и расти на различных видах частиц.
[0057] Согласно некоторым вариантам реализации способов согласно настоящему изобретению способ
[0058] позволяет получить биопленку, содержащую по меньшей мере два штамма пробиотических бактерий (например, но не ограничиваясь указанными, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.), причем биопленку получают с применением комбинации по меньшей мере двух различных частиц (например, но не ограничиваясь указанными, семян страстоцвета съедобного, измельченных семян граната и т.д.). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения для получения таких комбинаций условия роста (и, например, но не ограничиваясь указанными, тип частицы или частиц) выбирают в соответствии со штаммом (штаммами), применяемыми при получении биопленки. Согласно иллюстративному варианту реализации настоящего изобретения, если два штамма бактерий будут в конечном итоге объединены для получения биопленки, каждый из штаммов бактерий будут выращивать с применением частицы, наилучшим образом подходящей для роста каждого штамма. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, когда два или более штаммов бактерий растут отдельно, штаммы бактерий объединяют в ходе процесса инкапсуляции.
Лечение
[0059] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биопленку вводят животному, которое нуждается в таком введении, чтобы биопленка колонизировала кишку животного.
[0060] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биопленка, содержащая популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, инкапсулирована соединением, приспособленным для высвобождения по меньшей мере одного штамма бактерий при рН, обнаруженном в кишечнике животного.
[0061] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения соединение, приспособленное для высвобождения по меньшей мере одного штамма бактерий при рН, обнаруженном в кишечнике животного, представляет собой альгинат.
[0062] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения значение рН, обнаруженное в кишечнике животного, составляет рН 8.
[0063] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биопленку вводят животному, которое нуждается в таком введении, в количестве, достаточном для колонизации кишечника. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонизацию подтверждают на основании наличия по меньшей мере одной популяции бактерий, присутствующей в фекалиях животного в течение по меньшей мере 5 дней после введения.
[0064] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонизирующие бактерии, полученные из биопленки, могут населять кишку млекопитающего в течение по меньшей мере одной недели (например, но не ограничиваясь указанными, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д. недель). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонизирующие бактерии, полученные из биопленки, являются устойчивыми в кишечнике млекопитающего, т.е. не гибнут через 3 дня.
4
9
4
6
[0065] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет от 2×10 до 2×10 бактерий в день в течение от 1 до 5 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет от 2×10 до 2×10 бактерий в день в течение от 1 до 5 дней.
4
[0066] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 5 дней.
5
6
7
8
9
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 5 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 5 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 5 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 5 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 5 дней.
4
5
6
7
8
9
[0067] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 4 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 4 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 4 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 4 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 4 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 4 дней.
4
5
6
7
8
9
[0068] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 3 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 3 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 3 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 3 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 3 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 3 дней.
4
5
6
7
8
9
[0069] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 2 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 2 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 2 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 2 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 2 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 2 дней.
4
5
6
7
8
9
[0070] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 1 дня. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 1 дня. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 1 дня. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 1 дня. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 1 дня. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10 бактерий в день в течение 1 дня.
[0071] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения достаточное количество вводят на одной частице. В качестве альтернативы, достаточное количество вводят на множестве частиц.
[0072] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения достаточное количество смешивают с пищей и проглатывают.
[0073] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биопленку вводят животному немедленно после культивирования биопленки. В качестве альтернативы, биопленку можно хранить перед введением. Биопленку можно хранить в замороженном состоянии или, в качестве альтернативы, в лиофилизированной форме.
[0074] Теперь приводится ссылка на следующие примеры, которые вместе с приведенным выше описанием неограничивающим способом иллюстрируют некоторые варианты реализации настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1: Устойчивость биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения к кислоте
[0075] Исследовали устойчивость биопленки, выросшей на твердых частицах в проточной системе, как описано выше. Более конкретно, первый исследованный параметр представлял собой устойчивость к кислоте; результаты представлены на Фиг. 3.
[0076] Матрицу граната, вымоченную в 25% среде MRS (чтобы способствовать образованию биопленки, использовали условия голодания (т.е. менее 100% концентрации среды для роста)), инокулировали культурой L. plantarum в течение ночи в контейнере для матрицы и оставляли еще на 2,5 часа (т.е. без перемешивания), а затем инициировали проточную систему. Среду перемещали из резервуара со средой в контейнер для матрицы с применением перистальтического насоса со скоростью 12 мл/час в течение 5 дней. Среду повторно не использовали. Свежая среда поступала в культуру, и из выходного отверстия вытекала использованная среда. В качестве контроля использовали бактерии, выросшие планктонным способом (т.е. не прикрепленные к частицам), что приводило к отсутствию образования биопленки. В случае планктонного контроля 6 мл 100% бульона MRS инокулировали 4-5 колониями L. plantarum и оставляли в инкубаторе при температуре 37°С в течение ночи.
[0077] Для исследования устойчивости к кислоте набор флаконов ФБР (фосфатного буферного раствора) с откорректированными с применением НС1 (исходный раствор 0,5 М) повышающимися значениями рН, приготовленный заранее, для получения рН 1, 2, 3, и 2 грамма частиц, содержащих биопленку, переносили во флаконы и инкубировали в течение 1 ч. Затем бактерии промывали в ФБР, и 5 микролитров высевали, как показано на Фиг. 3.
[0078] В случае планктонного контроля из культуры в течение ночи отбирали по 100 мкл во флаконы с рН и инкубировали в течение 1 ч; затем бактерии промывали в ФБР, и 5 микролитров высевали, как показано на Фиг. 3. Как показано на Фиг. 3, бактерии биопленки продемонстрировали большую устойчивость к кислоте, поскольку хорошо выживали при рН 2, тогда как планктонные бактерии не выжили.
[0079] Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, считают, что рН желудка составляет приблизительно рН 2. Таким образом, после введения биопленки субъекту биопленка выживет в условиях желудка субъекта (т.е. рН 2) и колонизирует субъекта.
Пример 2: Устойчивость другой биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения к кислоте
[0080] Проводили вторую серию экспериментов, в которых была продемонстрирована устойчивость бактерий к кислоте (т.е. в форме биопленки), как описано на Фиг. 4 и показано в Таблицах 1 и 2 ниже.
[0081] 7 грамм частиц семян граната (ГРАН), вымоченных в 25% среде MRS (в условиях голодания), инокулировали культурой L. plantarum в течение ночи и оставляли еще в течение 2,5 часов. Затем устанавливали проточную систему в течение 5 дней с применением перистальтического насоса, который перемещал среду при максимальной скорости (приблизительно 380 мл/час). В данном эксперименте среду использовали повторно для сравнения с непроточным/стационарным контролем. В случае планктонного контроля 6 мл 100% бульона MRS инокулировали 4 колониями L. plantarum и оставляли в инкубаторе при температуре 37°С в течение ночи +5 часов.
Результаты представлены в Таблицах 1 и 2.
[0082] Как показано на Фиг. 4, планктонные бактерии продемонстрировали уменьшенную выживаемость после воздействия понижающихся значений рН.
Пример 3: Восстановление биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
[0083] Биопленка, выращенная и захваченная в альгинат, восстанавливалась после высушивания. L. plantarum выращивали в 25 мл 100% MRS + 2 гр. ГРАН в течение 4 дней при комнатной температуре для образования биопленок. В случае планктонного контроля L. plantarum выращивали в 25 мл 100% MRS в течение 4 дней при комнатной темп. Один образец ГРАН + биопленка и контроль высевали на планшеты с MRS в серийных разведениях. Другой образец каждого варианта быстро центрифугировали, ресуспендировали в 5 мл буфера для лиофилизации, лиофилизировали в течение 24 часов и суспендировали в 25 мл MRS. На данной стадии (после лиофилизации, но перед последующим ростом) образцы высевали посредством серийных разведений. Остаток образца оставляли расти в течение дополнительных 48 часов и снова высевали. Как показано на Фиг. 5, бактерии, которые росли на твердых частицах в виде биопленки, продемонстрировали усиленную устойчивость и выживаемость в отношении лиофилизации (т.е. восстановление после высушивания).
Пример 4: Устойчивость клеток DH5a Е. coli к кислоте
[0084] Устойчивость штамма DH5a Е. coli к кислоте исследовали в трех условиях:
1. Планктонные - Е. coli выращивали в 20 мл стартовой LB на шейкере в течение 5 дней при температуре 23°С.
2. Биопленка, статические - Е, coli выращивали в 20 мл LB с 2 гр. различных матриц, выращивали в течение 5 дней в статических условиях при температуре 37°С.
3. Биопленка, проточные - Е. coli выращивали в колонной проточной системе с ДКФ в течение 5 дней при комнатной температуре со скоростью приблизительно 12 мл/час свежей 25% LB. Образцы отбирали сверху колонны (близко к поверхности воздуха) и снизу колонны.
[0085] Закваску штамма DH5a Е. coli выращивали в течение ночи при температуре 37°С на шейкере. 100 мкл из закваски переносили в:
1. 2 гр. Avicel + 20 мл LB - для статической культуры биопленки.
2. 2 гр. волокна Solka + 20 мл LB - для статической культуры биопленки.
3. 3 гр. ДКФ + 20 мл LB - для статической культуры биопленки.
4. 20 мл LB - для планктонной культуры.
[0086] 2 мл закваски в течение ночи переносили в 20 мл LB и инокулировали в колонну проточной системы. Поток прекращали на 2 часа, чтобы позволить Е. coli прикрепиться к ДКФ. Через 2 часа поток включали на 5 дней при комнатной температуре.
[0087] Через 5 дней инкубации образец от каждой матрицы для статических экспериментов (ДКФ, Avicel и Solka) и образец от ДКФ сверху колонны и ДКФ снизу колонны отбирали и помещали в пять различных пробирок Eppendorf («эппендорфы»). Образцы аккуратно промывали один раз ФБР.
[0088] Из каждого образца в два флакона отбирали следующее количество матрицы:
1. Статические, ДКФ - 0,02 гр.
2. Статические, Avicel - 0,03 гр.
3. Статические, Solka - 0,02 гр.
4. Проточные, ДКФ, верх - 0,03 гр.
5. Проточные, ДКФ, низ - 0,03 гр.
[0089] Содержимое каждого эппендорфа аккуратно промывали один раз ФБРХ1. Для каждой пары эппендорфов (от каждого образца) добавляли 1 мл ФБРХ1 (рН 7,4) или 1 мл ФБР (рН 2). Эппендорфы инкубировали лежа в течение 1 часа при комнатной темп. Затем эппендорфы центрифугировали при 13000 об./мин в течение 2 мин., супернатант отбрасывали. В каждый эппендорф добавляли 1 мл ФБРХ1, и эппендорфы перемешивали на вортексе при полной мощности в течение 30 сек. для освобождения бактерий от матрицы.
[0090] Обработка планктонной культуры: 1 мл культуры переносили в эппендорф и центрифугировали на полной скорости в течение 2 мин. Супернатант отбрасывали и добавляли 1 мл ФБР. 100 мкл из данной смеси добавляли в:
1. Эппендорф с 1 мл ФБРХ1 (рН 7,4)
2. Эппендорф с 1 мл ФБР (рН 2)
[0091] Эппендорфы инкубировали в течение 1 часа при комнатной темп.лежа, и после данной инкубации осуществляли центрифугирование при 13000 об./мин. в течение 2 мин. В каждый эппендорф добавляли 100 мкл ФБРХ1.
Определение количества жизнеспособных организмов:
[0092] 10 мкл из каждого эппендорфа переносили в 90 мкл ФБРХ1. Проводили семь серийных разведений в соотношении 1:10. 3 мкл из каждого разведения высевали на планшете с LB и оставляли в инкубаторе в течение ночи.
[0093] Расчеты являлись следующими для сохранения размерности «бактерий/мл» для планктонных бактерий или «бактерий/гр.»:
количество разведений
[0094] Для матриц: Количество колоний X 10Х333,33Х(1/отобранных гр.)
количество разведений
[0095] Для планктонных: Количество колоний X10 X333,3
[0096] В данном эксперименте все материалы автоклавировали для стерилизации. Результаты, представленные в таблицах ниже и на Фиг. 6, демонстрируют, что биопленка увеличивала устойчивость бактерий к кислоте в статических условиях и демонстрировала большее увеличение в проточных условиях.
Пример 5: Колонизация кишечника мышей с применением композиции согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
[0097] Для исследования того, будут ли бактерии, выросшие в форме биопленки, демонстрировать увеличенную способность колонизировать кишку, получали биопленку, как описано выше, и биопленкой кормили бестимусных мышей. Исследовали присутствие бактерий в фекалиях мышей. Результаты представлены на Фиг. 7.
Протокол:
1. 6 безмикробных мышей
2. Биопленка Lactobacillus plantarum, выросшая на матрице.
3. Исключительно измельченная пища для мышей, перемешанная со стерильной матрицей (совместное измельчение).
4. Измельченная пища для мышей, перемешанная с биопленкой L. plantarum на матрице (совместное измельчение).
5. Измельченная пища для мышей, перемешанная с биопленкой L. plantarum в гранулах альгината.
6. Набор для окрашивания живых и мертвых клеток (для определения присутствия живых бактерий).
7. Автоклавированная матрица для контрольных мышей.
8. Мышей разделяли на 3 группы (по 2 мыши в каждой группе):
a. Контроль - мыши, которых кормили исключительно пищей + матрицей.
b. Биопленка - мыши, которых кормили пищей + биопленкой на матрице.
c. Биопленка, альгинат - мыши, которых кормили пищей + биопленкой на матрице в гранулах альгината.
9. Мышей кормили соответствующей пищей в течение 7 дней (Д1 - Д7).
10. Отбирали образец фекалий в день 8 (Д8), день 9 (Д9), день 10 (Д10), день 11 (Д11), день 12 (Д12), день 13 (Д13) и день 14 (Д14).
11. Анализировали присутствие L. plantarum в образцах фекалий.
12. Получали срез с внутренней стороны кишечника для визуализации биопленки L. plantarum на кишечнике и окрашивали для определения живых и мертвых клеток с применением указанного набора для окрашивания.
[0098] Фиг. 7 демонстрирует, что бактерии колонизировали кишку мышей. Кишка мышей была колонизирована бактериями, полученными из биопленки, в течение более 3 дней, и, фактически, в течение более, но не ограничиваясь указанными, 14 дней.
Пример 6: рН-зависимое высвобождение бактерий из композиции согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
2
[0099] Биопленку, содержащую Е. coli на ДКФ, инкапсулировали в альгинат посредством смешивания ДКФ с биопленкой в 4% альгинате и нанесения капель с материалом в 2% раствор CaCl, и биопленку, содержащую L. plantarum, выращивали на поверхности гранул альгината. Затем полученные в результате композиции обрабатывали согласно примеру 1 выше. Результаты представлены на Фиг. 8.
[00100] Когда гранулы вводили в раствор при рН 2, высвобождались исключительно Lactobacillus plantarum. При рН=8 из гранул высвобождались как Е. coli, так и L. plantarum.
Пример 7: Колонизация кишечника мышей с применением композиции, содержащей С. minuta. согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
7
[00101] Мыши SPF получали перемешанную с пищей биопленку, содержащую С. minuta на семенах граната, один раз в концентрации 2*10 бактерий в день 1 эксперимента. Фекалии анализировали в день 1 (до лечения пробиотиками), 2, 4, 7, 11 и 15 для определения % С. minuta в фекалиях.
[00102] Животные получали лечение следующим образом (по три мыши на группу лечения):
1. Контроль - Исключительно пища (6 гр.).
2. Контроль - Исключительно пища (3 гр.), смешанная с зернами граната (3 гр.)
3. Эксперимент - Пища (3 гр.), смешанная с биопленкой С. minuta на зернах граната (3 гр.)
7
[00103] Мышам SPF вводили 2*10 клеток С. minuta в биопленке на зернах граната (С. minuta), зерна граната (исключительно ГРАН) или только рацион (HFD, high fat diet, рацион с высоким содержанием жиров) в первый день эксперимента. Образцы фекалий отбирали до лечения пробиотиками (день 1), через 2 дня, 4 дня, 7 дней, 11 дней и 15 дней после лечения пробиотиками и направляли на 16S-секвенирование. Рассчитывали присутствие С. minuta в общей популяции бактерий в каждом образце фекалий. Результаты представлены на Фиг. 9. Полученные данные демонстрируют, что биопленка, содержащая С. minuta, была способна к колонизации кишечника мышей в течение до 15 дней, когда эксперимент был окончен, что подтверждается присутствием С. minuta в образцах фекалий.
Пример 8: Колонизация кишечника мышей с применением композиции согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения - сравнение с другими способами
9
[00104] Биопленку, содержащую L. plantarum, выращивали согласно условиям, представленным ниже, и давали мышам SPF один раз в день в концентрации 2*10 бактерий в течение 5 дней. После данного периода времени мышей кормили пищей самой по себе в течение еще 5 дней.
[00105] Животные получали лечение следующим образом (по две мыши на группу лечения):
1. Контроль - Исключительно пища
2. Контроль - Исключительно пища с частицами (зернами граната ГРАН).
3. Планктонные. L. plantarum выращивали в течение ночи при встряхивании при температуре 37°С в бульоне MRS.
6
4. Биопленка, статические, на зернах граната (ГРАН) - 5 гр. частиц с бактериями (приблизительно 10 бактерий/день) (согласно способам, описанным в публикации DE 202013103204).
5. Биопленка, проточные, на зернах граната (ГРАН) - 1,5 гр. частиц с бактериями.
6. Биопленка, проточные, на зернах граната (ГРАН) с лиофилизацией - 1,5 гр. частиц с бактериями (согласно способам, описанным в публикации Biomacromolecules 2013, 14, 3214-3222).
7. Коммерческая пробиотическая добавка - 2 драже в день в течение 5 дней.
[00106] Количество Lactobacillus определяли с применением подсчета колоний в фекалиях мышей, отобранных в день 5 (последний день приема образца), день 3 и день 5 (через 3 и 5 дней после прекращения приема образца). Результаты представлены на Фиг. 10. Полученные данные демонстрируют, что биопленка, содержащая L. plantarum, образованная в соответствии со способами согласно настоящему изобретению, была способна к колонизации кишечника мышей в течение до 5 дней, когда эксперимент был окончен, что подтверждается присутствием L. plantarum в образцах фекалий. Однако композиции, полученные согласно способам, описанным в публикациях DE 202013103204 или Biomacromolecules 2013, 14, 3214-3222, не были способны к колонизации кишечника мышей в течение до 5 дней.
[00107] Публикации, упомянутые в данном документе, включены в настоящую заявку посредством ссылки. Несмотря на то, что выше были проиллюстрированы различные аспекты настоящего изобретения со ссылкой на примеры и предпочтительные варианты реализации, очевидно, что объем настоящего изобретения определен не представленным выше описанием, а приведенной ниже формулой изобретения, которую следует надлежащим способом истолковывать в соответствии с принципами патентного права.