Способ диагностики предрасположенности к почечно-клеточному раку на основе ПЦР-ПДРФ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR PREDISPOSITION TO RENAL CELL CARCINOMA BASED ON PCR-RFLP

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности онкологии, и может быть использовано для диагностики предрасположенности к почечно-клеточному раку человека из европейской популяции людей (код EUR в соответствии с номенклатурой проекта 1000 Genomes).
Почечно-клеточный рак (ПКР) составляет приблизительно 4,6% всех новых злокачественных новообразований, со средним возрастом в котором ставят диагноз - 62,1 года [Tsimafeyeu et al. 2017. Five-year Survival of Patients With Metastatic Renal Cell Carcinoma in the Russian Federation: Results From the RENSUR5 Registry. Clin Genitourin Cancer. 15(6), e1069-e1072.]. В России по состоянию на 2017 год заболеваемость раком почки составила 3,4% среди женщин и 4,8% среди мужчин от общего числа заболеваемости раком. ПКР - наиболее распространенная форма рака почки. ПКР встречается как в единичных, так и в наследственных формах. Исследования факторов окружающей среды и образа жизни, способствующих риску ПКР, сосредоточены почти исключительно на спорадических ПКР. Развитие ПКР является сложным процессом, при котором найдены изменения более чем в 20 генах, расположенных на разных хромосомах [Velickovic М., Delahunt В., Grebe S.K. 1999. Loss of heterozygosity at 3p14.2 in clear cell renal cell carcinoma is an early event and is highly localized to the FHITgene locus. Cancer Res. 59, 1323-1326; Lam JS, Leppert JT, Figlin RA, Belldegrun AS. 2005. Role of molecular markers in the diagnosis and therapy of renal cell carcinoma. Urology. 66, 1-9]. Для диагностики рака почки используют неинвазивные методы: ультразвуковая и рентгеновская компьютерная томография, магнитно-резонансная томография. Реже используют пункционную биопсию опухоли почки с последующим гистологическим исследованием. Часто рак почки выявляют на ранних стадиях только благодаря случайным обнаружениям при ультразвуковом обследовании. Около четверти пациентов на момент установления диагноза уже имеют метастазы.
Выявление предрасположенности к данному типу раку человека позволило бы вовремя выявлять появление ПКР и осуществлять лечение данного заболевания на ранних стадиях формирования злокачественных новообразований.
Известен способ прогнозирования риска возникновения злокачественных новообразований женских половых органов и молочных желез (RU 2578459 С1, опубл. 27.03.2016, Бюл. №9). Для осуществления проверки у женщин репродуктивного возраста выявляют признаки наследственных нарушений (ННСТ) соединительной ткани в разных системах и органах, как минимум одного генетического и как минимум одного анамнестического факторов тромбогенного риска (ФТР) и инфицирования генитального тракта. В соответствии с выявленными признаками устанавливают низкий, средний или высокий риск возникновения злокачественных новообразований женских половых органов и молочных желез. Важным недостатком данного способа является потребность в оценки сразу нескольких факторов, в том числе генетических, что длительно как по времени, так и по трудозатратам. Способ не позволяет выявить предрасположенность к почечно-клеточному раку.
Известен способ прогнозирования наследственной предрасположенности к раку молочной железы на основе идентификации мутации в гене BLM (RU 2522501 С1, опубл. 20.07.2014, Бюл. №20). Способ характеризуется тем, что проводят амплификацию коротких фрагментов гена BLM протяженностью до 200 п.о., с последующим высокоразрешающим плавлением, включающим оптимизированный для гена BLM этап формирования гетеродуплексов: быстрый нагрев до 95°C и медленное снижение температуры до 50°C; выбирают один фрагмент с аберрантным профилем плавления для секвенирования, секвенируют выбранный фрагмент и при выявлении мутации гена BLM прогнозируют наследственную предрасположенность к раку молочной железы. Недостатком данного способа является потребность в секвенировании фрагмента ДНК, что увеличивает трудоемкость, время и стоимость анализа. Способ не позволяет выявить предрасположенность к почечно-клеточному раку.
Известен способ диагностики предрасположенности к раку молочной железы (RU 2470998 С2, опубл. 27.12.2012, Бюл. №36). Это способ выявления повышенного риска заболевания субъекта-человека раком молочной железы, основан на результатах анализа образца ДНК на наличие SNP в позициях 142, 355 и 4326 гена CYP1B1; делеционных вариантов 1100 delC, del5395, а также IVS2+1G>A гена СНЕК2 и замены С5972Т в гене BRCA2. При этом в способе определены комбинированные генотипы по всем указанным позициям трех названных генов, при которых риск развития рака молочной железы превышает сумму эффектов, определяемых соответствующими вариантами каждого из трех генов в отдельности, которые рассматриваются как признак особой предрасположенности субъекта к заболеванию (непропорционально высокого риска заболевания) раком молочной железы. Данный способ определения предрасположенности к раку путем идентификации генотипических комбинаций специфичных вариантов генов cyp1b1, brca2 и СНЕК2 взят за прототип. Недостатком данного способа является отсутствие лабораторной методики детекции приведенных мутаций, ассоциированных с предрасположенностью к раку почки. Кроме того, в способе не уточняется, для какого именно рака почки определяется предрасположенность.
В ходе проведенных исследований на базе Воронежского государственного университета, при котором с помощью высокопроизводительного секвенирования были проанализированы генотипы пациентов больных почечно-клеточным раком, была выявлена мутация chr11:108200993_G/C (регион COSM6196808), которая ассоциирована с почечно-клеточным раком.
Идентификация мутаций в описываемом способе осуществляется на основе рестрикционного анализа путем проведения ПЦР-ПДРФ (полимеразной цепной реакции - полиморфизма длин рестрикционных фрагментов).
Технический результат - выявление предрасположенности к почечно-клеточным раку у человека из европейской популяции в течение 4,5-6 часов (в зависимости от выбранного способа выделения ДНК) без необходимости секвенирования образцов ДНК.
Технический результат достигается тем, что в способе диагностики предрасположенности к почечно-клеточному раку на основе ПЦР-ПДРФ, включающем выделение ДНК из предварительно отобранного биологического материала пациентов с проведением реакции ПНР, согласно изобретению используют прямой праймер GCAAGATACACAGTAAAGG (SEQ ID NO: 1) и обратный праймер ACTTGCCTTCATCATGCC (SEQ ID NO: 2), проводят рестрикционный анализ полученного ампликона, при этом для рестрикции ампликона используют рестриктазу ApaLI, которая образует уникальные фрагменты рестрикции при наличии мутаций и в норме - 55 п.н. и 164 п.н. в норме; 219 п.н. при наличии мутации, при выявлении мутации в ходе реакции человек из европейской популяции имеет предрасположенность к почечно-клеточному раку по отношению к общей европейской популяции людей.
Способ выявления предрасположенности к ПКР на основе амплификации региона COSM6196808 с последующим рестрикционным анализом амплифицированного региона реализуется следующим образом:
1. Осуществляется выделение ДНК из крови пациента. Для этого могут быть использованы как методы органической экстракции, так и коммерческие доступные наборы для выделения ДНК и крови.
2. Проводится реакция ПНР со следующими праймерами и условиями реакции: прямой праймер GCAAGATACACAGTAAAGG (SEQ ID NO: 1), обратный праймер ACTTGCCTTCATCATGCC (SEQ ID NO: 2); условия реакции: 94°C 4 мин, 35 циклов: 94°C 30 сек, 55°C 30 сек, 72°C 30 сек., конечная элонгация 72°C 5 мин. В ходе реакции ПНР формируется продукт ПЦР длиной 219 п.н., который используется для реакции рестрикции по следующей схеме: берут 10 мкл ПЦР продукта, добавляют 1,5 мкл 10Х реакционного буфера, и 5 ед. рестриктазы ApaLI. Объем доводят до 15 мкл деионизированной водой. Инкубируют смесь в течение 1,5 часов при 37°C, фермент инактивируют нагревом до 75°C в течение 15 минут. Визуализацию продуктов рестрикции проводят с помощью электрофореза в 3% агарозном геле. В отсутствии мутации (в норме) будут два фрагмента рестрикции длиной 55 п.н. и 164 п.н. При наличии мутации на электрофореграмме будет виден один продукт длиной 219 п.н.
При выявлении мутации в ходе реакции человек из европейской популяции имеет предрасположенность к почечно-клеточному раку.
Предлагаемый способ выявления предрасположенности к ПКР на основе амплификации региона COSM6196808 с последующим рестрикционным анализом амплифицированного региона является высокочувствительным, хорошо воспроизводимым и экономичным. В зависимости от способа выделения ДНК из биологических образцов анализ занимает от 4,5 до 6 часов. Анализ можно проводить в лабораториях, имеющих термоциклер, центрифугу, камеру для электрофореза и сопутствующие реактивы, и расходные материалы.
Перечень последовательностей праймеров