ПЛАСТИНА, ВЫПОЛНЕННАЯ С ВОЗМОЖНОСТЬЮ ПЕРЕВОРАЧИВАНИЯ ДЛЯ ОБРАЗОВАНИЯ ВИСЯЧИХ КАПЕЛЬ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК
PLATE CONFIGURED FOR TURNING TO FORM HANGING DROPLETS FOR CELL CULTURE

Настоящее изобретение относится к пластине, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с независимым пунктом.
Принято считать, что клетки, культивируемые в трехмерной конфигурации, физиологически более уместны, чем клетки в классических двухмерных (монослой) культурах в большинстве сфер применения и пробах, например, при обнаружении наркотиков или в пробах на токсичность. Капли клеточной питательной среды были предложены для образования таких трехмерных клеточных совокупностей. Капли клеточной питательной среды с взвешенными клетками помещаются в культуральную ячейку или лунку в такой пластине, затем пластину переворачивают. Так как нет подложки, к которой клетки могут прилипнуть, клетки скапливаются на вершине висячей капли и образуют трехмерную клеточную совокупность. Если используются зародышевые стволовые клетки, эти стволовые клетки опускаются к вершине капли, где образуют трехмерную клеточную совокупность, именуемую эмбриоидным телом.
Пластина с висячими каплями, в переворачивании которой нет необходимости, показана в заявке WO 2010/031194. Пластина, представленная в этой ссылке, содержит корпус, первую и вторую копланарные поверхности и множество каналов, пронизывающих корпус перпендикулярно от первой (верхней) поверхности ко второй (нижней) поверхности. Канал содержит воронкообразную впускную ячейку рядом с первой (верхней) поверхностью, перевернутую воронкообразную культуральную ячейку рядом со второй (нижней) поверхностью, и капиллярную часть, расположенную между впускной ячейкой и культуральной ячейкой. Предусмотрены рельефные структуры в виде отдельных ободков, выступающих из второй (нижней) поверхности корпуса и окружающих каждую культуральную ячейку. Эти ободки предотвращают растекание капель жидкости.
Ввод жидкости, содержащей клетки, в культуральную ячейку осуществляется через впускную ячейку и капиллярную часть. В качестве примера, жидкую питательную среду, содержащую стволовые клетки, можно ввести таким образом в культуральные ячейки, и затем пластину с висячими каплями можно выдержать в термостате в течение заданного времени, чтобы клетки соединились для образования трехмерных эмбриоидных тел. Если через некоторое время необходимо подать свежую жидкую питательную среду, это осуществляется отсасыванием «старой» жидкой питательной среды через впускную ячейку и капиллярную часть (например, с помощью пипетки) и затем подачей «свежей» жидкой питательной среды способом, описанным выше.
Хотя пластина, описанная в заявке WO 2010/031194, в основном, является подходящей для культивирования клеток с целью образования трехмерных клеточных совокупностей, имеются возможности для усовершенствования. Например, чтобы отсосать старую жидкую питательную среду через впускную ячейку и капиллярную часть, необходимо иметь отсасывающее устройство (например, пипетку), которое должно плотно прилегать к стенкам впускной ячейки для осуществления надлежащего отсасывания. То же самое применимо к последующей подаче свежей жидкой питательной среды. Однако, более важно, чтобы только ограничивалась стабильность висячей капли в соответствующей культуральной ячейке. Другой недостаток заключается в том, что жидкость может испаряться через открытую впускную ячейку с неконтролируемой скоростью.
Следовательно, целью изобретения является создание пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель для культивирования клеток, которая решает все вышеупомянутые проблемы, относящиеся к стабильности висячих капель и испарению жидкости. Также дополнительная подача или замена жидкой питательной среды должна быть проста для выполнения.
Для достижения вышеупомянутой(тых) цели(лей) в соответствии с настоящим изобретением предлагается пластина, выполненная с возможностью переворачивания для образования висячих капель, как она охарактеризована признаками независимого пункта, направленного на такую пластину, выполненную с возможностью переворачивания для образования висячих капель. Дополнительные варианты выполнения пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением, являются предметом зависимых пунктов.
В частности, предлагается пластина, выполненная с возможностью переворачивания для образования висячих капель, содержащая заданное количество ячеек с каплями, каждая из которых может принимать каплю жидкости. Соответствующая ячейка для капли содержит круговой микрожидкостный смачивающий барьер, выполненный с возможностью окружения полости ячейки для капли и предотвращающий растекание капли за пределы микрожидкостного смачивающего барьера. Более того, соответствующая ячейка содержит закрытое дно и, по меньшей мере, один дополнительный круговой микрожидкостный смачивающий барьер, каждый дополнительный круговой микрожидкостный смачивающий барьер выполнен с возможностью окружения предыдущего окружного микрожидкостного смачивающего барьера, при этом смачиваемый участок располагается между двух рядом расположенных микрожидкостных смачивающих барьеров.
Конфигурация закрытого дна культуральных ячеек наряду с круговым смачивающим барьером служит для повышенной стабильности капель, свисающих из соответствующих культуральных ячеек, в частности, при сравнении с пластинами с висячими каплями, показанными в WO 2010/031194, и считается, что это происходит благодаря отсутствию доступа воздуха в противоположность пластине с висячими каплями, показанной в WO 2010/031194, в которой имеется доступ воздуха во впускной ячейке. Также благодаря отсутствию доступа воздуха испарение жидкости значительно снижается.
Дополнительно, хотя пластину, выполненную с возможностью переворачивания для образования висячих капель следует снова переворачивать для дополнительной подачи капли жидкой питательной среды к капле, уже содержащейся в культуральной ячейке, для образования капли большего размера, это можно осуществить простым и удобным способом. Во-первых, это происходит благодаря достаточной стабильности капли и, во-вторых, благодаря дополнительному круговому микрожидкостному смачивающему барьеру и смачиваемому участку между дополнительным микрожидкостным смачивающим барьером и предыдущим микрожидкостным смачивающим барьером, что позволяет легко ввести дополнительную каплю жидкой питательной среды. Образованная таким образом капля большего размера защищена от растекания упомянутым дополнительным микрожидкостным барьером, чтобы поддерживалась достаточная стабильность капли большего размера после повторного переворачивания пластины для получения конфигурации с висячими каплями. Как правило, количество дополнительных микрожидкостных смачивающих барьеров не ограничивается, однако в практических вариантах осуществления можно использовать только один или два дополнительных микрожидкостных смачивающих барьера.
В одном варианте осуществления пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением, соответствующими культуральными ячейками являются лунки, а в другом варианте осуществления ячейки с каплями могут образовываться плоской поверхностью (окруженной микрожидкостными смачивающими барьерами соответственно).
В дополнительном варианте осуществления пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением, круговой микрожидкостный смачивающий барьер представляет собой круговую кромку, и, по меньшей мере, один дополнительный круговой микрожидкостный смачивающий барьер представляет собой, по меньшей мере, одну дополнительную круговую кромку. Каждая дополнительная круговая кромка выполнена с возможностью окружать предыдущую круговую кромку, при этом смачиваемый участок находится между двумя рядом расположенными круговыми кромками. В дополнительной версии этого варианта две соседние круговые кромки расположены ступенями.
В дополнительном варианте пластина, выполненная с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением, сделана из отдельно изготовленной пластины, имеющей заданное число отверстий, и соответствующего заданного числа отдельно изготовленных лунок, образующих ячейки для капли, при этом каждая отдельно изготовленная лунка запрессована в соответствующее отверстие отдельно изготовленной пластины. Это предусматривает простоту изготовления и пластины, и лунок, которые можно сделать из полистирола или другого подходящего материала. Отдельно изготовленные пластины и лунки можно легко собрать запрессовыванием лунок в отверстия. Хотя ультразвуковая сварка лунок к внутренней поверхности пластины также является вариантом (в этом случае пластина может не содержать отверстия), запрессовывание лунок в отверстия является предпочтительным, поскольку ультразвуковая сварка может затруднить проведение микроскопического анализа содержимого лунок.
В дополнительном варианте пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением отдельно изготовленные лунки запрессованы в отверстия со стороны пластины, образующей наружную поверхность пластины. Это предусматривает простоту сборки пластины и лунок, что можно выполнить автоматически. В предпочтительном варианте пластина, выполненная с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением, может содержать 24 лунки, 96 лунок или 384 лунки.
В другом варианте пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением, круговой микрожидкостный смачивающий барьер представляет собой круговой ободок, и, по меньшей мере, один дополнительный микрожидкостный смачивающий барьер представляет собой дополнительный круговой ободок, каждый дополнительный круговой ободок окружает предыдущий круговой ободок, при этом смачиваемый участок находится между двумя рядом расположенными круговыми ободками. По одной версии этого варианта осуществления находящиеся рядом круговые ободки расположены в виде ступеней, а по другой версии этого варианта осуществления круговые ободки расположены на плоской поверхности.
Дополнительный аспект изобретения относится к комплекту пластин для переноса трехмерных клеточных совокупностей, культивированных в висячих каплях, из пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в принимающую пластину, содержащему пластину, выполненную с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением, как описано выше, и принимающую пластину. Пластина, выполненная с возможностью переворачивания для образования висячих капель, имеет заданное число ячеек или лунок для капель, а принимающая пластина имеет число лунок, соответствующее заданному числу ячеек или лунок для капель пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель. Пластина, выполненная с возможностью переворачивания для образования висячих капель, и принимающая пластина собраны таким образом, чтобы в собранном состоянии лунки принимающей пластины были выполнены с возможностью совмещения с ячейками или лунками для капель пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель. Такой комплект позволяет легко перенести трехмерные клеточные совокупности из пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель, в лунки принимающей пластины путем центрифугирования комплекта.
Другой аспект изобретения относится к способу тестирования вещества на его токсичность по отношению к клеткам. Способ содержит следующие этапы:
a) ввод заданного числа капель жидкости в соответствующее число культуральных ячеек пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель, при этом каждая капля содержит заданный объем вещества, подлежащего тестированию, и жидкой питательной среды, обеспечивающей рост эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими, а также множество эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими;
b) переворачивание и инкубация пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в течение заданного периода времени, при этом пластина, выполненная с возможностью переворачивания для образования висячих капель, содержит капли таким образом, чтобы они свисали из соответствующих культуральных ячеек, чтобы дать возможность эмбриональным стволовым клеткам, не являющимся человеческими, сформировать трехмерные клеточные совокупности, представляющие собой эмбриоидные тела эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими, в соответствующих каплях;
c) дополнительная подача жидкой питательной среды, обеспечивающей рост эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими, в капли в культуральных ячейках с целью содействия росту трехмерных клеточных совокупностей, представляющих собой эмбриоидные тела эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими;
d) анализ трехмерных клеточных совокупностей, представляющих собой эмбриоидные тела эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими, чтобы оценить, является ли вещество, подлежащее тестированию, токсичным для трехмерных клеточных совокупностей, представляющих собой эмбриоидные тела эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими.
В способе в соответствии с изобретением пластина, выполненная с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением используется так, как описано выше, и этап с) выполняется повторным переворачиванием пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель, дополнительным добавлением капли жидкой питательной среды, обеспечивающей рост эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими, в соответствующие капли, содержащие трехмерные клеточные совокупности, представляющие собой эмбриоидные тела эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими, чтобы сформировать соответствующие капли большего размера в соответствующих культуральных ячейках. Затем пластина, выполненная с возможностью переворачивания для образования висячих капель снова переворачивается, чтобы позволить трехмерным клеточным совокупностям, представляющим собой эмбриоидные тела эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими, вырасти в соответствующие капли большего размера, свисающие из культуральных ячеек. Преимущества были уже упомянуты выше при обсуждении преимуществ пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением. В дополнение, допускается автоматизация, по меньшей мере, некоторых этапов процесса, например дополнительной подачи жидкой питательной среды, обеспечивающей рост эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими.
Один вариант осуществления способа в соответствии с изобретением дополнительно содержит этапы:
e) перенос выращенных трехмерных клеточных совокупностей, представляющих собой эмбриоидные тела эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими, из культуральных ячеек пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствующее число лунок принимающей пластины;
f) инкубация принимающей пластины с лунками, содержащими трехмерные клеточные совокупности, представляющие собой эмбриоидные тела эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими, в течение дополнительного заданного периода времени; и
g) после этапа инкубации анализ трехмерных клеточных совокупностей, представляющих собой эмбриоидные тела эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими, чтобы оценить, является ли вещество, подлежащее тестированию токсичным для трехмерных клеточных совокупностей, представляющих собой эмбриоидные тела эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими.
В предпочтительной версии этого варианта осуществления способа в соответствии с изобретением этап е) выполняется путем сборки пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель, и принимающей пластины таким образом, чтобы соответствующие лунки принимающей пластины располагались напротив соответствующих культуральных ячеек пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель с последующим выполнением центрифугирования собранных пластин. Это позволяет удобно и автоматически выполнить перенос трехмерных клеточных совокупностей, представляющих собой эмбриоидные тела эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими, из пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствующие лунки принимающей пластины.
В дополнительном варианте осуществления способа в соответствии с изобретением этап анализа трехмерных клеточных совокупностей, представляющих собой эмбриоидные тела эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими, чтобы оценить, является ли вещество, подлежащее тестированию, токсичным для трехмерных клеточных совокупностей, представляющих собой эмбриоидные тела эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими, выполняется путем анализа, содержат ли эмбриональные тела миокардиальные клетки. Этот вариант является подходящим, поскольку наличие миокардиальных клеток в трехмерных клеточных совокупностях можно легко обнаружить, так как миокардиальные клетки пульсируют.
Дополнительные выгодные особенности изобретения станут очевидными из следующего подробного описания вариантов осуществления со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых на:
Фиг. 1 показан вид в перспективе первого варианта осуществления пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением, при этом одна лунка содержит каплю и другая лунка содержит каплю, к которой добавлена дополнительная капля;
Фиг. 2 показан вид сверху варианта осуществления пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель согласно Фиг. 1;
Фиг. 3 показан разрез по линии III-III на Фиг. 2, при этом пластина, выполненная с возможностью переворачивания для образования висячих капель, повторно перевернута;
Фиг. 4 показан разрез по линии III-III на Фиг. 2, при этом пластина, выполненная с возможностью переворачивания для образования висячих капель, перевернута;
Фиг. 5 показано увеличенное изображение детали V на Фиг. 1;
Фиг. 6 показано увеличенное изображение одной лунки варианта осуществления пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель согласно Фиг. 1;
Фиг. 7 показан разрез лунки второго варианта осуществления пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением, при этом лунка содержит каплю;
Фиг. 8 показана лунка второго варианта осуществления пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель, при этом добавлена дополнительная капля;
Фиг. 9 показана лунка второго варианта осуществления пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель, при этом добавлена другая дополнительная капля;
Фиг. 10 показан разрез третьего варианта осуществления пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением, при этом ячейка для капель содержит каплю;
Фиг. 11 показан третий вариант осуществления пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением, при этом добавлена дополнительная капля;
Фиг. 12 показан третий вариант осуществления пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением, при этом добавлена другая дополнительная капля;
Фиг. 13 показан третий вариант осуществления пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением, при этом добавлена еще одна дополнительная капля;
Фиг. 14 показан четвертый вариант осуществления пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением, при этом добавлена еще одна дополнительная капля;
Фиг. 15 показан вариант пробы эмбриональных стволовых клеток, в которой используется пластина, выполненная с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением;
Фиг. 16 показана в перспективе отдельно изготовленная лунка варианта осуществления пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель с 24-мя лунками в соответствии с изобретением;
Фиг. 17 показана лунка на Фиг. 16 в поперечном разрезе;
Фиг. 18 показан вид сверху отдельно изготовленного пластины варианта осуществления пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель с 24-мя лунками в соответствии с изобретением, в отверстия которого можно вставить отдельно изготовленные лунки на Фиг. 16;
Фиг. 19 показан вид снизу пластины согласно Фиг. 18;
Фиг. 20 показано увеличенное изображение детали пластины согласно Фиг. 18 и Фиг. 19, включая одно из отверстий, в которое следует вставить лунки;
Фиг. 21 показан вид сверху пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель с 24-мя лунками, при этом лунки Фиг. 16 вставлены в отверстия пластины Фиг. 18;
Фиг. 22 показан разрез пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель с 24-мя лунками Фиг. 21;
Фиг. 23 показан вид снизу пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель с 24-мя лунками Фиг. 21;
Фиг. 24 показан разрез детали согласно Фиг. 22, включая одну лунку, вставленную в одно отверстие;
Фиг. 25 показан вид в перспективе варианта осуществления дополнительной пластины с 24-мя лунками, к которой можно прикрепить пластину, выполненную с возможностью переворачивания для образования висячих капель с 24-мя лунками, показанную на Фиг. 21 (подобно комплекту, показанному на Фиг. 15);
Фиг. 26 показан разрез варианта осуществления дополнительной пластины с 24-мя лунками на Фиг. 25;
Фиг. 27 показан вид в перспективе пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель с 24-мя лунками, показанной на Фиг. 21, прикрепленной к дополнительной пластине с 24-мя лунками;
Фиг. 28 показан разрез комплекта пластин, показанного на Фиг. 27;
Фиг. 29 показана отдельно изготовленная лунка варианта осуществления пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель с 96-ю лунками в соответствии с изобретением, в увеличенной перспективе;
Фиг. 30 показана лунка Фиг. 29 в поперечном разрезе;
Фиг. 31 показана деталь лунки Фиг. 29, включая ступенчатые круговые ободки, образующие микрожидкостные смачивающие барьеры;
Фиг. 32 показан вид сверху отдельно изготовленной пластины варианта осуществления пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель с 96-ю лунками в соответствии с изобретением, в отверстия которой можно вставить отдельно изготовленные лунки Фиг. 29;
Фиг. 33 показан разрез пластины Фиг. 32, включая отверстия, в которые можно вставить лунки Фиг. 29;
Фиг. 34 показан вид снизу пластины Фиг. 32;
Фиг. 35 показан вид сверху пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель с 96-ю лунками, при этом лунки Фиг. 29 вставлены в отверстия пластины Фиг. 32;
Фиг. 36 показан разрез пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель с 96-ю лунками Фиг. 35;
Фиг. 37 показан вид снизу пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель с 96-ю лунками Фиг. 35;
Фиг. 38 показан разрез детали на Фиг. 36, включая одну лунку, вставленную в одно отверстие;
Фиг. 39 показан вид сверху варианта осуществления дополнительной пластины с 96-ю лунками, к которой можно прикрепить пластину, выполненную с возможностью переворачивания для образования висячих капель с 96-ю лунками, показанную на Фиг. 35 (подобно комплекту, показанному на Фиг. 15);
Фиг. 40 показан разрез варианта осуществления дополнительной пластины с 96-ю лунками Фиг. 39, и
Фиг. 41 показан вид в перспективе пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель с 96-ю лунками Фиг. 35, прикрепленной к дополнительной пластине с 96-ю лунками.
На Фиг. 1 - Фиг. 6 показан первый вариант осуществления пластины 1, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением, или детали варианта в различных видах (см. выше). Пластина 1 содержит заданное число ячеек с каплями в виде лунок 10. Показанным вариантом осуществления является пластина с 24-мя лунками, однако допустимо иное число лунок. Предпочтительны пластины, имеющие стандартное число лунок, которые расположены в соответствии со стандартными пластинами с микролунками, например пластина с 96-ю лунками или пластина с 384 лунками.
Хотя приемлемы различные варианты осуществления лунок, предложены лунки 10 варианта осуществления пластины 1, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель, как показано в увеличенном изображении на Фиг. 6. Лунка 10 содержит первый круговой смачивающий барьер в виде острой круговой кромки 102, окружающей первую полость 100, имеющую закрытое дно 101. Первая круговая кромка 102 окружена второй острой круговой кромкой 104, при этом смачиваемый участок 103 расположен между первой круговой кромкой 102 и второй круговой кромкой. На Фиг. 6 видно, что круговые кромки расположены ступенями, хотя это не обязательно. Имеется кольцевой вырез, окружающий вторую круговую кромку 104.
Причина для использования геометрической формы лунок 10 становится яснее из Фиг. 3, Фиг. 4 и Фиг. 5, на которых показан процесс подачи капель в лунки 10 и вынуждения их свисания из лунок 10. На Фиг. 3 пластина 1, выполненная с возможностью переворачивания для образования висячих капель, показана в повторно перевернутом положении, т.е. с каплями, обращенными вверх. В этой лунке 10, которая расположена в крайнем левом положении, можно распознать небольшую каплю 20 жидкости. Во второй лунке 10 слева можно распознать каплю 21 большего размера, которая получена подачей другой капли жидкости к капле 20, чтобы образовать каплю 21 большего размера. Понятно, что подачу капли в лунки 10 можно осуществить, например, с помощью пипетки. В частности, подачу капель в лунки 10 можно осуществить с помощью пипеточного робота, но также это можно сделать вручную. Также, если нужно откачать жидкость из лунки (например, когда следует заменить «старую» жидкую питательную среду на «свежую» жидкую питательную среду), это можно легко сделать, так как к каплям имеется доступ.
На Фиг. 4 показана пластина 1, выполненная с возможностью переворачивания для образования висячих капель, где капля 20 меньшего размера и капля 21 большего размера свисают из соответствующих лунок 10, лучше всего это показано на Фиг. 5, на которой представлена деталь V Фиг. 4. Капля 20 меньшего размера свисает из крайней левой лунки 10, а капля 21 большего размера свисает из второй лунки 10 слева.
Из Фиг. 5 и Фиг. 6 становится более понятной функция первой и второй круговых кромок 102 и 104 в качестве микрожидкостных барьеров, предотвращающих растекание за пределы кромок капли 20 и капли 21 большего размера. Следовательно, первая и вторая круговые кромки 102 и 104 содействуют стабилизации свисания капли из соответствующей лунки 10. Что касается второй круговой кромки 104, это действие усиливается благодаря кольцевому вырезу 105. Смачиваемый участок 103, расположенный между первой и второй круговыми кромками 102 и 104 (см. Фиг. 6), позволяет легко добавить дополнительную жидкую каплю к капле 20, чтобы образовать каплю 21 большего размера (см. Фиг. 4 и Фиг. 5). Закрытое дно 100 лунок 10 предотвращает испарение жидкости через отверстие или канал, проходящий через дно, и также служит для стабилизации капель, свешивающихся из лунок, благодаря тому что предотвращается выталкивание капли воздухом «из-под низа».
Второй вариант осуществления пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением, показан на Фиг 7 - Фиг. 9, на которых представлена только одна лунка 30 пластины 3, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель, соответственно. Этот вариант осуществления, так или иначе, относится к первому варианту, описанному подробно выше, тем, что также содержит ступенчатую конфигурацию микрожидкостных барьеров, предотвращающих растекание капли за пределы соответствующего микрожидкостного барьера. Однако второй вариант отличается от первого варианта тем, что вместо острых кромок лунки 30 содержат полость 301, имеющую закрытое дно 300, которое окружено первым круговым ободком 302, окружающим полость 301 и выступающим за пределы полости в направлении к открытому концу лунки 30. На Фиг. 7 показана небольшая капля 40 жидкости, свисающая из лунки 30. Капля 40 задерживается в полости 301 первым круговым ободком 302, образующим микрожидкостный барьер.
Фиг. 8 отличается от Фиг. 7 тем, что к капле 40 жидкости добавлена другая капля жидкости для образования капли 41 жидкости большего размера. Капля 41 жидкости большего размера удерживается вторым круговым ободком 304, окружающим первый круговой ободок 302, при этом смачиваемый участок 303 расположен между первым круговым ободком 302 и вторым круговым ободком 304. Второй круговой ободок 304 снова действует как микрожидкостный барьер, препятствующий растеканию капли 41 большего размера за пределы ободка 304.
Фиг. 9 отличается от Фиг. 8 тем, что к капле 41 жидкости большего размера добавлена еще одна капля жидкости для образования капли 42 жидкости еще большего размера. Капля 42 удерживается третьим круговым ободком 306, окружающим второй круговой ободок 304, при этом другой смачиваемый участок 305 расположен между вторым круговым ободком 304 и третьим круговым ободком 306. Третий круговой ободок 306 снова действует как микрожидкостный барьер, препятствующий растеканию капли 42 еще большего размера за пределы ободка 306.
На Фиг. 10 - Фиг. 14 показана одна ячейка 50 для капли третьего варианта осуществления пластины 5, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением. Этот вариант осуществления пластины 5, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель, отличается от первого и второго вариантов, подробно описанных выше, тем, что ячейка 50 содержит микрожидкостные барьеры не в ступенчатой конфигурации, а в виде круговых ободков, расположенных на плоской нижней поверхности пластины 5. Хотя ячейка 50 снова содержит закрытое дно 500, полость 501 ограничена первым круговым ободком 502, окружающим полость 501 и выступающим из нижней поверхности пластины 5. На Фиг. 10 показана небольшая капля 64 жидкости, свисающая из ячейки 50. Капля 64 удерживается в полости 501 первым круговым ободком 502, образующим микрожидкостный барьер.
Фиг. 11 отличается от Фиг. 10 тем, что к капле 64 жидкости добавлена другая капля жидкости для образования капли 65 жидкости большего размера (также каплю 41 жидкости большего размера можно ввести в ячейку 50 для капли как первый этап). Капля 65 жидкости большего размера удерживается вторым круговым ободком 504, окружающим первый круговой ободок 302, при этом смачивающий участок 503 расположен между первым круговым ободком 502 и вторым круговым ободком 504. Второй круговой ободок 504 снова действует как микрожидкостный барьер, препятствующий растеканию капли 65 большего размера за пределы ободка 504.
На Фиг. 12 показана капля 66 еще большего размера, которая удерживается третьим круговым ободком 506, который окружает второй круговой ободок 504, при этом дополнительный смачиваемый участок 505 расположен между вторым круговым ободком 604 и третьим круговым ободком 506. Третий круговой ободок 506 снова действует как микрожидкостный барьер, препятствующий растеканию капли 66 за пределы ободка 506.
На Фиг. 13 показана капля 67 еще большего размера, которая удерживается четвертым круговым ободком 508, который окружает третий круговой ободок 506, при этом еще один дополнительный смачиваемый участок 507 расположен между третьим круговым ободком 506 и четвертым круговым ободком 508. Четвертый круговой ободок 508 снова действует как микрожидкостный барьер, препятствующий растеканию капли 67 за пределы ободка 508.
И, наконец, на Фиг. 14 показана капля 68 еще большего размера, которая удерживается пятым круговым ободком 510, который окружает четвертый круговой ободок 508, при этом другой смачиваемый участок 509 расположен между четвертым круговым ободком 508 и пятым круговым ободком 510. Таким же образом, как описано выше, пятый круговой ободок 510 действует как микрожидкостный барьер, препятствующий растеканию капли 68 еще большего размера за пределы ободка 510.
На Фиг. 15 показан вариант пробы эмбриональной стволовой клетки, представляющий вариант способа в соответствии с изобретением, в котором можно использовать любой из вышеописанных вариантов осуществления пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель. Для следующего описания пробы предполагается использование первого варианта осуществления пластины 1, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением. В этом варианте пробы проверяется токсичность вещества по отношению к эмбриоидным телам эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими. С этой целью заданное число капель жидкости вводится в соответствующее число ячеек или лунок для капель. Каждая капля содержит заданный объем вещества, подлежащего тестированию, а также жидкую питательную среду, обеспечивающую рост эмбриоидных тел эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими, а также множество стволовых клеток 82. В первом варианте осуществления пластины 1, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель, можно ввести 24 капли 20 в соответствующие лунки 10, при этом пластина 1 снова перевернута (см. Фиг. 4). После введения капель в лунки 10 пластину 1 переворачивают и монтируют с дополнительной пластиной 7, имеющей соответствующее число лунок 70, которые расположены напротив лунок 10 пластины 1, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель, чтобы сформировать замкнутый комплект. Лунки 70 также могут содержать питательную среду. Сформированный таким образом комплект может быть таким, чтобы капли 20 свисали из лунок 10, как было подробно объяснено выше. Сформированный таким образом комплект (см. Фиг. 15, вверху слева) инкубируется в течение заданного периода времени, например в течение трех дней. В течение данного инкубационного периода стволовые клетки 82, содержащиеся в соответствующих каплях, осаждаются и формируют трехмерное эмбриоидное тело 83 (более принято трехмерная клеточная совокупность) эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими, в соответствующей капле 20 на вершине капли, т.е. в самой нижней точке капли 20 (см. Фиг. 15 вверху справа).
После первого инкубационного периода может возникнуть необходимость в дополнительной подаче жидкой питательной среды в каплю 20, чтобы способствовать дополнительному росту эмбриоидных тел 83 эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими. С этой целью комплект снова открывается и пластина 1 снова переворачивается. В этом повторно перевернутом положении жидкую питательную среду дополнительно подают в соответствующие капли 20 в соответствующие лунки 10 для образования капель 21 большего размера. По завершении дополнительной подачи жидкой питательной среды для образования капель 21 большего размера, пластину 1 снова переворачивают и снова монтируют с дополнительной пластиной 7 (лунки 70 которого могут также содержать свежую жидкую питательную среду). Сформированный таким образом комплект инкубируется в течение дополнительного заданного периода времени, например в течение двух дней, чтобы способствовать дополнительному росту эмбриоидных тел эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими.
После дополнительного инкубационного периода эмбриоидные тела 83 можно перенести в лунки 70 пластины 7 (принимающая пластина) путем центрифугирования, что может быть выполнено посредством центрифугирующего устройства, хорошо известного в области техники. После центрифугирования эмбриоидных тел 83 в лунки 70 пластины 7, содержащего жидкую питательную среду, сборку можно инкубировать в течение другого заданного периода времени, например в течение пяти или семи дней. Эмбриоидные тела 83 осаждаются на плоское дно соответствующих лунок 70 пластины 7.
В продолжение этого инкубационного периода комплект можно снова открыть и проверить клеточные совокупности, представляющие собой эмбриоидные тела эмбриональных стволовых клеток, не являющихся человеческими, является ли тестируемое вещество токсичным по отношению к стволовым клеткам. Хотя предлагаются различные типы анализов, один тип анализа предназначен для анализа клеточных совокупностей с помощью микроскопа. Поскольку клеточные совокупности находятся на плоском дне лунок пластины 7, можно проводить микроскопический анализ. Например, можно тестировать содержат ли клеточные совокупности миокардиальные клетки, поскольку этот тип клеток можно легко идентифицировать под микроскопом, потому что эти клетки сжимаются и расширяются (пульсируют).
Вышеописанный перенос эмбриоидных тел или трехмерных клеточных совокупностей в лунки 70 дополнительной пластины 7 путем центрифугирования является необязательным. Альтернативно комплект можно снова открыть, и пластину 1 можно прикрепить к центрифуге таким образом, чтобы при центрифугировании эмбриоидные тела или трехмерные клеточные совокупности перемещались от вершины капли по направлению ко дну 101 лунки 10 (см. Фиг. 6). Следовательно, эмбриоидные тела можно анализировать в лунках 10 пластины с помощью микроскопа, поскольку они расположены на дне 101 лунки 10, что формирует устойчивый фон для микроскопического анализа.
На Фиг. 16 - Фиг. 24 показан дополнительный вариант осуществления пластины 6, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель (Фиг. 21 - Фиг. 23) в соответствии с изобретением. Этот вариант осуществления содержит отдельно изготовленные лунки 60 (см. Фиг. 16 - Фиг. 17), которые могут быть запрессованы в отверстия 610 отдельно изготовленной пластины 6 (см. Фиг. 18 - Фиг. 20). Как можно видеть из разреза отдельно изготовленной лунки 60, показанной на Фиг. 17, лунка 60 содержит первый круговой ободок 602, второй круговой ободок 604 и третий круговой ободок 606. Конструкции и функции лунки и первого, второго и третьего круговых ободков уже подробно описаны с помощью Фиг. 7, Фиг. 8 и Фиг. 9, и, следовательно, это относится к этим частям описания, представленного выше. В показанном варианте лунки 60 запрессованы в отверстия 610 пластины 61 с той стороны пластины 61, которая образует внешнюю поверхность 611 пластины 61. Как только все лунки 60 запрессовываются в отверстия 610, они жестко прикрепляются к пластине 61, и образование пластины 6 с висячими каплями завершается (см. Фиг. 21 - Фиг. 24).
Альтернативно, возможно, чтобы отдельно изготовленные лунки 60 прикреплялись к внутренней поверхности 612 пластины 61 (например, путем ультразвуковой сварки или склеиванием). В этом случае пластина 61 может не содержать отверстия. Однако места, где выполнялась ультразвуковая сварка или склеивание лунок 60 к внутренней поверхности 612 пластины 61 могут быть видимы и могут затруднить проведение микроскопического анализа содержимого лунок. Поэтому предпочтительно производить запрессовывание лунок 60 в отверстия 610 пластины 61.
На Фиг. 25 и Фиг. 26 показан вариант осуществления дополнительной пластины 8, которая содержит число лунок, соответствующее числу лунок 60 пластины 6, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель. Также лунки 80 дополнительной пластины 8 расположены в соответствии с расположением лунок 60 пластины 6, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель.
На Фиг. 27 и Фиг. 28 можно увидеть, что пластину 6, выполненную с возможностью переворачивания для образования висячих капель, можно уложить стопкой на дополнительной пластине 8 таким образом, чтобы каждая лунка 60 пластины 6, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель, располагалась над соответствующей лункой 80 дополнительной пластины 8. Одна цель такого комплекта уже описана подробно со ссылкой на Фиг. 15, и, следовательно, это относится к этим частям описания, представленного выше.
Со ссылкой на Фиг. 16 - Фиг. 28 описываются только пластины с 24-мя лунками или комплекты пластин с 24-мя лунками, однако подобные соображения применимы к пластинам с 96-ю лунками, что станет очевидно из нижеследующего описания.
На Фиг. 29 - Фиг. 38 показан еще один дополнительный вариант осуществления пластины 9, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель (Фиг. 35 - Фиг. 37) в соответствии с изобретением, которая представлена в виде пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель с 96-ю лунками. Подобно варианту с 24-мя лунками, вариант с 96-ю лунками содержит отдельно изготовленные лунки 90 (см. Фиг. 29 - Фиг. 31), которые запрессованы в отверстия 910 отдельно изготовленной пластины 91 (см. Фиг. 32 - Фиг. 34). Как видно из разрезов отдельно изготовленной лунки 90, показанных на Фиг. 30 и Фиг. 31, лунка 90 содержит первый круговой ободок 902, второй круговой ободок 904 и третий круговой ободок 906. Конструкции и функции лунки и первого, второго и третьего круговых ободков уже подробно описаны с помощью Фиг. 7, Фиг. 8 и Фиг. 9, и, следовательно, это относится к этим частям описания, представленного выше. В показанном варианте лунки 90 запрессованы в отверстия 910 пластины 91 с той стороны пластины 91, которая образует внешнюю поверхность 911 пластины 91. Как только все лунки 90 запрессовываются в отверстия 910, они жестко прикрепляются к пластине 91, и образование пластины 9, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель, завершается (см. Фиг. 35 - Фиг. 38).
На Фиг. 39 - Фиг. 41 показан вариант дополнительной пластины 92, которая содержит число лунок 920, соответствующее числу лунок 90 пластины 9, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель. Также лунки 920 дополнительной пластины 92 расположены в соответствии с расположением лунок 90 пластины 9, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель.
На Фиг. 41 можно увидеть, что пластину 9, выполненную с возможностью переворачивания для образования висячих капель, можно уложить стопкой на дополнительной пластине 92 таким образом, чтобы каждая лунка 90 пластины 9, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель, располагалась над соответствующей лункой 920 дополнительной пластины 92.
Все вышеописанные варианты являются лишь примерами различных сфер применения способа, пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель, и пластины, выполненной с возможностью переворачивания для образования висячих капель в соответствии с изобретением, поэтому изобретение не ограничивается этими описанными примерами. Вернее сказать, объем защиты определяется прилагаемой формулой изобретения.