СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА
METHOD FOR OBTAINING DIHYDROQUERCETIN

Изобретение относится к способу переработки различный пород древесины в ценные химические продукты, в частности к способу получения дигидрокверцетина.
Дигидрокверцетин (Dihydroquercetin) – это биологически активное вещество растительного происхождения с выраженными антиоксидантными свойствами.
Общая характеристика
(
Антиоксидантная активность - показатель, отражающий способность инактивировать свободные радикалы кислорода. Антиоксидантная активность дигидрокверцетина (ДКВ) проявляется при его концентрациях 10-4-10-5. Это минимальная концентрация вещества с антиоксидантной активностью по сравнению со всеми известными экзогенными антиоксидантами. Исследования показали, что дигидрокверцетин обладает очень высокой антиоксидантной активностью, равной 32743.81 µM TE/g,  что превосходит многие известные антиоксиданты в 11 и более раз Advanced Botanical Consulting&Testing,Inc. и Brunswick Laboratories).
Молекулярно-биологические эффекты дигидрокверцитина
Сигнальный путь JAK-STAT представляет собой цепочку взаимодействий между белками в клетке и участвует в таких процессах, как иммунитет, деление клеток, гибель клеток и образование опухолей. Этот путь передает информацию от химических сигналов за пределами клетки к клеточному ядру, что приводит к активации генов посредством процесса, называемого транскрипцией. Существует три ключевых компонента Jak-STAT сигнализации: Янус-киназы (JAKs), преобразователь сигналов и активатор транскрипционных белков (STATs) и ядерные рецепторы.
Дигидрокверцитин (ДКВ) усиливает фосфорилирование янус-киназы 2 типа с последующей активацией сигнального пути  JAK2/STAT3, которые модулируют экспрессию белков антиапоптоза семейства Bcl-2.
Дигидрокверцитин функционирует как ловушка активных форм кислорода.
Это способствует торможению перекисного окисления липидов как в водорастворимых, так и в жирорастворимых соединениях, и замедляет развитие атеросклероза. Важнейший антиоксидантный эффект дигидрокверцитина – защита ДНК от окислительного повреждения. Большая часть регуляции транскрипции, по-видимому, связана с ингибированием сигнальных каскадов фосфорилирования или специфических киназ.
Формирование свободных радикалов в митохондриях играет ключевую роль в развитии апоптоза. Активируется каскад перекисного окисления липидов, высвобождается цитохром С из митохондрий и запускается процесс апоптоза (запрограммированной клеточной смерти). Антиоксидантный эффект дигидрокверцитина способствует защите клеток от апоптоза и улучшает функциональное состояние митохондрий.
Дигидрокверцитин способствует повышению стабильности мембраны эритроцитов, улучшает устойчивость эритроцитов к окислительному стрессу и гемолизу.
Вышеуказанные молекулярно-биологические свойства дигидрокверцитина определяют его противовоспалительную и противовирусную активность.
Отличительной особенностью нового коронавируса COVID-19 является его способность подавлять синтез интерферонов – сигнальный белков, запускающих антивирусный ответ организма. Заражённая вирусом клетка усиливает выделение интерферонов, которые дают сигнал соседним непоражённым клеткам о необходимости снизить активность синтеза белков, чтобы в случае проникновения вируса было приостановлено его внутриклеточное размножение. Кроме того, интерфероны запускают в заражённой клетке апоптоз – программу самоубийства, чтобы эта клетка погибла вместе с патогенным вирусом.
Острые вирусные инфекции SARS-CoV MERS-CoV протекают с тяжёлым поражением лёгких, других органов мишеней и с  высокой летальностью. Это связано с приобретённой способностью этих патогенов подавлять противовирусный иммунитет, блокировать синтез интерферонов и усиливать механизмы апотоза клеток – мишеней на фоне оксидантного стресса. Эффективная доза дигидрокверцитина обладает в этом отношении защитным эффектом. Она активирует сигнальный путь янус-киназы и синтез интерферонов участвующих в противовирусной защите.
Биодоступность
Всасывание в кровь дигидрокверцитина через стенку кишечника в 3 раза превосходит его всасывание через стенку желудка. Биодоступность ДКВ возрастает, если он поступает в стенку кишечника в жировом растворе. Не существует единого мнения по поводу терапевтических дозировок дигидрокверцитина. Вещество безвредно для организма даже в высоких дозах. Суточная физиологическая потребность в биофлавоноидах (природных антиоксидантах) составляет 150-250 мг для детей старше 7 лет и 200-250 мг для взрослых (согласно Методическим рекомендациям МР 2.3.1.2432 -08 физиологические потребности в энергии и питании различных групп населения в пределах Российской Федерации).
Для достижения терапевтической концентрации в органе-мишени следует принимать дозу препарата 20-30 мг на кг веса тела. Возможно повышение биодоступности при доставке непосредственно в верхние дыхательные пути с помощью небулайзера. Поэтом актуально развитие технологий выделения препарата из растительного сырья с более высоким процентом полезного выхода биологически активного изомера ДКВ.
Несмотря на наличие ряда патентов на способы выделения дигидрокверцетина из растительного сырья, сохраняется актуальность совершенствования адекватных методов получения высокоочищенного продукта. Методы переосаждения растворителя приводят к получению низкоочищенного продукта с большим количеством нежелательных добавок и растительных смол, которые невозможно идентифицировать. Это существенно снижает биологически активные свойства дигидрокверцитина и его водорастворимость.
Ранее известные способы получения дигидрокверцитина из древесины хвойных пород основаны на экстракции его водой, водно-органическими или монокомпонентными органическими растворителями.
Вода является неэффективным экстрагентом, так как дигидрокверцитин имеет низкую водорастворимость и требуется дополнительное использование дорогого полиамидного сорбента (патент РФ №2000797).
Вышеуказанные недостатки имеются и в способе получения дигидрокверцитина согласно патенту РФ №2114631, согласно которому исходное сырьё обрабатывается кипящей водой с последующей экстракцией ацетоном. Способ имеет низкую производительность и высокие энергозатраты, используются пожароопасные материалы, конечный продукт может подвергнуться ацетилированию, имеется риск наличия в нём токсичных добавок.
Имеются патенты, в которых в качестве растворителей используются гексан, этилацетат, диэтиловый эфир (патенты РФ № 2034559, № 2252220, №2135510, №2211836, № 2165416). Растворители контактируют между собой, образуют азеотропные смеси, оказывают химическую модификацию конечного продукта, требуют больших энергетических затрат, они токсичны для организма при использовании в медицинских целях.
Наиболее близким аналогом  предлагаемому изобретению является способ получения дигидрокверцитина согласно патенту РФ № 2454410, опубликованный 27.06.12 МПК C07D311/32  Способ получения дигидрокверцетина заключается в том, что измельченную до частиц размером 1-3 мм древесину лиственницы подвергают экстракции 10-25% водным раствором этилового спирта при кипячении в течение 1-2 часов на гидромодуле, затем экстракт фильтруют, концентрируют под вакуумом, охлаждают и смешивают с 4-кратным объемом 96%-ного этилового спирта, высаживая арабиногалактан, оставшийся раствор концентрируют до образования сухого остатка, который смешивают с 96%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:50-70, добавляют активированный уголь и кипятят в течение 10-15 минут, раствор фильтруют через слой оксида алюминия и концентрируют под вакуумом с получением дигидрокверцетина.
Недостатком способа является использование малоэффективного водного экстрагента исходного сырья, длительность осуществления способа, его многостадийность, энергозатратность, низкий выход конечного продукта.
Технической проблемой является разработка способа получения дигидрокверцетина с максимальной степенью извлечения биологически активных веществ, в том числе арабиногалактана.
Считается, что широко доступный в форме пищевой добавки арабиногалактан обладает целым рядом полезных для здоровья свойств. Главным из них является стимуляция иммунной системы и профилактика вирусных и бактериальных инфекций.
Технический результат заключается в упрощении способа получения и степени чистоты конечного продукта дигидрокверцетина, а также  возможность реутилизации биологически нейтрального растворителя.
Повышение полезного выхода дигидрокверццетина и степени его биологической очистки.
Способ получения дигидрокверцетина, заключающийся в том, что измельченную до частиц размером 1-3 мм древесину хвойных пород подвергают экстракции в среде сжиженного углекислого газа  при соотношении углекислого газа к древесине 2-8:1 с последующей выдержкой при температуре 20,0-31,5°С в течение 2 часов, после чего раствор отделяют от плотного остатка фильтрованием и осуществляют концентрирование под вакуумом на ротационном испарителе, затем в полученный концентрат добавляют  этиловый спирт (объём его колеблется от двухкратного до пятикратного по отношению к субстрату), после чего  выпавший в осадок арабиногалактан отделяют фильтрованием и высушивают. Маточный раствор концентрируют под вакуумом до полного удаления растворителя, затем сухой остаток помещают в реактор с сжиженным углекислым газом в вышеуказарном объёмном соотношении, добавляют осветляющий активированный уголь и выдерживаю 30 минут при температуре выше 30°С. Рабочий раствор фильтруют и затем концентрируют в ротационном испарителе с получением конечного продукта  порошка дигидрокверцитина.
C 01 января 2017 года утверждён ГОСТ 33504-2015 «Добаки пищевые. Дигидрокверцитин. Технические условия», в котором определены методы контроля качества дигидрокверцитина с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектором.
Полученный продукт в соответствии с разработанным способом подвергался анализу с применением жидкостного хроматографа «Маэстро ВЭЖК» с детектором на диодной матрице
Колонка  Phenomenex Luna  C18(2) 5 мкм  150x4,6 мм
Скорость  потока  1 мл/мин.
Длина волны 290 нм, которая согласно ГОСТ используется для определения дигидрокверцетина.
Для анализа использовали чистые вещества фирмы Fluka:
Дигидрокверцитин стандарт, не менее 98%
Ацетронил для ВЭЖХ
На рисунке 1 представлена хроматограмма стандартного образца с массовой долей ДГК 98%.
На рисунке 2 представлена хроматограмма ДКВ-сырца с массовой долей ДГК 98%. При сопоставлении последней с хроматограммой стандарта не выявлено различий, что свидетельствут о высоком содержании ДКВ в сырце – не менее 98%. При этом имеется минимальное допустимое количество  дополнительных соединений, проявляющееся следовым низкоамплитудным пиком хроматограммы.
Сопоставительный анализ предлагаемого изобретения с прототипом показывает, что отличительными от прототипа признаками являются:
Использование углекислого газа в сжиженном состоянии в процессе  первичной и вторичной экстракции
В предлагаемом новом способе в качестве исходного экстрагента используется сжиженный углекислый газ.
Преимущества экстракции диоксида углерода в сжиженном состоянии:
-энергосберегающий и пожаробезопасный процесс;
-высокая  скорость диффузии, хорошая проникающая способность жидкой углекислоты;
- максимальная степень извлечения биологически активных веществ;
- отсутствие химической и термической деградации материалов, так как используется инертная растворяющая среда.
Преимущества предлагаемого  способа
- экстракции без каких-либо химических соединений, которые могут изменять нативную форму молекул ДГК;
- низкая энергозатратность;
- использование пожаробезопасных и легко утилизируемых растворителей;
- максимальный полезный выход конечного продукта;
Преимущества способа экстракции с помощью диоксида углерода в сжиженном состоянии:
В известных способах по патентам, отраженным в уровне техники, экстракцию дигидрокверцитина осуществляли с помощью этилового спирта, который сам вступал в химическую реакцию с исходным сырьём и не мог обеспечить извлечение в полном объёме биологически активных веществ.
Преимущества экстракции диоксида углерода в сжиженном состоянии:
- энергосберегающий и пожаробезопасный процесс;
- высокая  скорость диффузии, хорошая проникающая способность диоксида углерода в сжиженном состоянии;
- максимальная степень извлечения биологически активных веществ;
- отсутствие химической и термической деградации материалов, так как используется инертная растворяющая среда;
Примеры способа получения дигидрокверцитина и арабиногалактана
Пример 1.
В биореактор объёмом 3 литра, снабженный терморегулятором и системой поддержания повышенного парциального давления во внутренней среде, заполненный углекислым газом в виде диоксида углерода в сжиженном состоянии, загружают 150 г древесины хвойных пород в мелкодиспесном состоянии (от 1 до 3 мм) с влажностью до 5%  ( Соотношение углекислого газа к древесине 2 : 1) и выдерживают при температуре 31,5°С в течение 2 часов. Затем раствор отделяют от плотного остатка фильтрованием и концентрируют под вакуумом на ротационном испарителе. Углекислый газ реутилизируют. Затем в концентрат добавляют пятикратный объём этилового спирта.  Выпавший в осадок арабиногалактан отделяют фильтрованием и высушивают. Маточный раствор концентрируют под вакуумом до полного удаления растворителя. Затем сухой остаток помещают в реактор с жидким углекислым газом, добавляют осветляющий активированный уголь и выдерживаю 30 минут при температуре 40°С.
Рабочий раствор фильтруют и затем концентрируют в ротационном испарителе.
Остаётся порошок дигидрокверцитина светло-жёлтого цвета, степень чистоты – 98%, полезный выход – до 2 грамм от сухого исходного сырья.
Выход ДКВ составил 2 %, выход арабиногалактана – 19,6%.
Пример 2.
Процесс выделения дигирокверцетина проводят аналогично примеру 1, выдержка при температуре 20°С в течение 3 часов.  Отличие заключается в том, что маточный концентрат дополнительно кипятят в воде с добавлением активированного угля для выделения серосодержащих смол и повторно концентрируют под вакуумом. Выход ДКВ составил 1,9% степень чистоты – 98%, выход арабиногалактана – 19,6%.
Пример 3.
Выделение дигирокверцетина и арабиногалактана проводят аналогично примеру 1.
Отличие заключается в том, что используется трёхкратный объём углекислого газа. (Соотношение 3:1)  Выход ДКВ составил 2,1%, выход арабиногалактана – 20,1%. Степень чистоты – 98%.
Пример 4.
Выделение дигирокверцетина и арабиногалактана проводят аналогично примеру 1. Отличие заключается в том, что используется пятикратный объём углекислого газа. (Соотношение 5:1)  Выход ДКВ составил 2,1%, выход арабиногалактана – 20,1%. Степень чистоты - 98%.
Пример 5.
Выделение дигирокверцетина и арабиногалактана проводят аналогично примеру 1.
Отличие заключается в том, что используется восьмикратный объём углекислого газа.  (Соотношение 8:1)  Выход ДКВ составил 2,2%, выход арабиногалактана – 20,1%. Степень чистоты – 98%.
Как  видно из приведенных примеров реализации способа получения дигидрокверцетина с максимальной степенью извлечения биологически активных веществ, в том числе арабиногалактана, обеспечивается повышения выхода дигидрокверцетина более 2% высокой степени чистоты по данным хроматографического анализа.