СПОСОБ СКРИНИНГА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
METHOD FOR CELL-BASED DRUG SCREENING AND USE THEREOF

Настоящее изобретение относится к способу скрининга лекарственных веществ на клетках, культивируемых в культуральной среде согласно преамбуле независимого пункта 1.
Способы скрининга на основе клеток представляют собой важный источник информации в процессе принятия решении при оценке пути воздействия, такой как эффективность и токсичность новых веществ, таких как, например, противоопухолевые лекарственные вещества, на ранних стадиях доклинической разработки лекарственных веществ (Michelini, Cevenini et al., (2010) "Cell-based assays: fuelling drug discovery." Anal Bioanal Chem 398(1): 227-238.; An and Tolliday (2010), "Cell-based assays for high-throughput screening". Mol Biotechnol 45(2): 180-186; Sharma, Haber et al., (2010) "Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents". Nature Reviews Cancer 10: 241-253.).
Учитывая их ключевую роль в разработке лекарственных веществ, за последнее десятилетие было исследовано большое количество новых подходов к разработке анализов большей степени учитывающих физиологические процессы способов анализа на основе клеток (Yamada and Cukierman (2007), "Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D". Cell 130(4): 601-610; Pampaloni, Reynaud et al. (2007); "The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue". Nat Rev Mol Cell Biol 8(10): 839-845). К примеру, в области биологии раковой клетки и разработки противоопухолевых препаратов растет объем научных свидетельств того, что способы, позволяющие раковым клеткам организовываться и расти в трехмерных структурах (трехмерные модели культур), более точно отражают поведение, наблюдаемое in vivo, чем обычные культуры на плоских пластиковых поверхностях (двумерные модели культур), в частности, в отношении роста клеток, клеточного сигналинга и экспрессии генов (Abbott (2003). "Cell culture: Biology's new dimension". Nature 424(6951): 870-872, Kunz-Schughart, Freyer et al. (2004), "The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model". J Biomol Screen 9(4): 273-285; Bissell (2007), "Modelling molecular mechanisms of breast cancer and invasion: lessons from the normal gland". Biochem Soc Trans 35(Pt 1): 18-22.; Friedrich, Seidel et al. (2009). "Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach". Nat Protoc 4(3): 309-324; Debnath and Brugge (2005), "Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures". Nat Rev Cancer 5(9): 675-688).
Несколько различных методик применяется для создания более физиологичных трехмерных моделей культур для тестирования противораковых лекарственных веществ (Nyga 2011, Cheema et al. (2011), "3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies" J. Cell Commun. Signal. 5, 239-248). В наиболее распространенных трехмерных методиках используются либо (i) гелевые матриксы природного (Weaver, Petersen et al. (1997), "Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies". J Cell Biol 137(1): 231-245.; Fiebig, Maier et al. (2004), "Clonogenic assay with established human tumour xenografts: correlation of in vitro to in vivo activity as a basis for anticancer drug discovery". Eur J Cancer 40(6): 802-820; Krausz, de Hoogt et al. (2013), "Translation of a tumor microenvironment mimicking 3D tumor growth co-culture assay platform to high-content screening". J Biomol Screen 18(1): 54-66) или синтетического (Loessner, Stok et al. (2010). "Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells". Biomaterials 31(32): 8494-8506; Sieh, Taubenberger et al. (2012), "Phenotypic characterization of prostate cancer LNCaP cells cultured within a bioengineered microenvironment". PLoS One 7(9): e40217.; Yang and Zhao (2011). "A 3D model of ovarian cancer cell lines on peptide nanofiber scaffold to explore the cell-scaffold interaction and chemotherapeutic resistance of anticancer drugs". Int J Nanomedicine 6: 303-310) происхождения для инкапсуляции клеток, либо (ii) жесткие полимерные трехмерные основы (Fischbach, Chen et al. (2007), "Engineering tumors with 3D scaffolds". Nat Methods 4(10): 855-860; Knight, Murray et al. (2011). "Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture". Methods Mol Biol 695: 323-340) for cell seeding, or (iii) matrix-free cell aggregation processes (WO 2010/031194 A1; (Friedrich, Seidel et al. (2009), "Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach". Nat Protoc 4(3): 309-324; Karlsson, Fryknas et al. (2012). "Loss of cancer drug activity in colon cancer HCT-116 cells during spheroid formation in a new 3-D spheroid cell culture system". Exp Cell Res 318(13): 1577-1585; Tung, Hsiao et al. (2011). "High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array". Analyst 136(3): 473-478; Lama, Zhang et al. (2013). "Development, validation and pilot screening of an in vitro multi-cellular three-dimensional cancer spheroid assay for anti-cancer drug testing". Bioorg Med Chem 21(4): 922-931) для выращивания трехмерных структур раковых клеток (например, сфероиды, ткани).
Отсутствие учета вариабельности в прогрессировании заболевания может повысить вероятность отбора ложноположительных лекарственных веществ-кандидатов (лекарственных веществ, которые не будут работать при введении человеку) и отсева ложноотрицательных лекарственных веществ-кандидатов (лекарственных веществ, которые работали бы при введении человеку).
Таким образом, задача настоящего исследования состояла в том, чтобы преодолеть недостатки известных способов скрининга лекарственных веществ, и, в частности, получить данные относительно активности лекарственных веществ, протестированных на профильных клетках, демонстрирующих различные ключевые физиологические болезненные состояния in vivo. Эта задача решена благодаря способу скрининга лекарственных веществ согласно пункту 1 формулы изобретения.
В соответствии с настоящей инновацией способ скрининга лекарственных веществ на основе клеток учитывает клетки, а также их физиологические изменения и динамику поведения, что позволяет понять механизм действия лекарственного вещества. Он включает определение как минимум двух моментов времени мониторинга в зависимости от типа клеток, культуральной среды, физиологических характеристик клеток, физиологических характеристики клеточных популяций, физиологических характеристик образованной ткани или вида лекарственного вещества, например, направленного механизма действия лекарственного вещества. Обработку культивируемых клеток лекарственными веществами проводят по меньшей мере в один момент времени обработки. Мониторинг влияния типа лекарственного вещества на кинетику роста клеток, поведение и/или физиологические характеристики, осуществляют по меньшей мере по двум указанным моментам времени. Эти моменты времени могут представлять собой как определенный момент (точку), так и некоторый период времени.
Культуральная среда включает физиологически релевантные микросреды с учетом специфических физических, биологических и биохимических характеристик, включая межклеточное взаимодействие и взаимодействие клетка-матрикс для конкретных клеток и/или образуемых тканей.
Мониторинг пролиферации клеток, который проводят по меньшей мере в два момента времени, например, на «ранней стадии» и на «поздней стадии», может обеспечить возможность сравнения двух стадий клеточного роста, и/или развития физиологических характеристик, и/или эффекта лечения лекарственным веществом. Среда, в которой происходит рост клеток, и физиологические характеристики могут потребовать модификации для определенного типа клеток или лекарственных веществ. Соответственно, в предпочтительном варианте момент времени для мониторинга выбирают таким образом, чтобы получить информацию, относящуюся к механизму действия лекарственного вещества, например, на ранних стадия рака, определенный вид рака может считаться находящимся на «ранних стадиях» предпочтительно в течение от четырех до семи дней культивирования в физиологически релевантной среде, и находящимся на «поздних стадиях» предпочтительно в течение от четырнадцати до семнадцати дней культивирования в физиологически релевантном окружении. «Поздняя стадия» может так же быть определена как отсутствие или присутствие специфических физиологических характеристик свойств, например, гипоксии или изменений в кинетике роста или строении клеток.
Мониторинг клеток может продолжаться от одного до семи дней после прекращения применения лекарственного вещества. Начало и конец периода времени без лекарственного вещества должно определяться для определенного типа клеток и лекарственного вещества. Клеткам дают время для восстановления после обработки лекарственным веществом, этот период называется «периодом восстановления». Включение моментов времени, относящихся к восстановлению после первой и/или второй обработки лекарственным веществом, может быть необходимо для определения эффективных лекарственных веществ или лекарственных веществ, которые не оказывают немедленного воздействия на клетки.
Предпочтительные варианты реализации могут относиться, например, к способу, включающему обработку на «ранней стадии» и мониторинга в по меньшей мере два соответствующих момента времени с «периодом восстановления» или без него, или обработку на «поздней стадии» и мониторинга в по меньшей мере два соответствующих момента времени с «периодом восстановления» или без него, или обработки на «ранней стадии» и на «поздней стадии» и мониторинга в по меньшей мере два соответствующих момента времени с «периодом восстановления» или без него.
Среда, используемая для культивирования клеток, может включать субстратный матрикс или среду, которая повторяет, имитирует микроокружение клетки, предпочтительно трехмерный матрикс, который состоит из структурного соединения и линкерного соединения, которое способствует полимеризации.
Структурное соединение может быть разветвленным полиэтиленгликолем, содержащим ненасыщенные концевые группы, предпочтительно виниловые группы. Линкерное соединение включает пептид с по меньшей мере двумя цистеинами или тиольным группами, обеспечивающими полимеризацию структурного соединения посредством мостиков, образуемых линкерным соединением. Трехмерный матрикс предпочтительно состоит из матриксного соединения, описанного в европейской публикации №2561005.
Среда, применяемая для культивирования клеток, может способствовать трехмерному росту (i) единичной клетки с формированием многоклеточного образования или (ii) множества клеток с формированием многоклеточного образования, когда их высевают в указанную среду. В предпочтительном варианте клетки растут до образования клеточной колонии или клеточной популяции. Например, колонии раковых клеток образуют сфероиды, которые имитируют трехмерную структуру опухолей, где клетки, расположенные снаружи, более легко доступны, и в тоже время преграждают доступ к клеткам внутри.
Для того чтобы создать трехмерную среду с заданной жесткостью и составом и с подходящими физиологическими и биологическими характеристиками, могут быть использованы резервуар или стандартное устройство для культивирования, предпочтительно 384-луночный планшет. Указанная среда и клетки могут быть распределены в устройстве, содержащем культуральную клеточную среду, которое может быть помещено в инкубатор для клеток. Мониторинг пролиферации клеток и их активности может быть проведен путем с использованием оборудования для получения изображений и сенсорного оборудования, которое совместимо с резервуаром или устройством, в предпочтительном варианте, оборудования, которое автоматизировано и максимизирует воспроизводимость выходных данных мониторинга.
Клетки, используемые для культивирования в указанной среде могут быть клетками любого типа любого организма, клеткой или клеточной линией, культивируемой in vitro, дифференцированной или стволовой клеткой, происходящей из организма, предпочтительно, раковой клеткой толстого кишечника, поджелудочной железы или яичника, но также и здоровой клеткой, рост которой стимулируется.
Лекарственные вещества, которыми обрабатывают культивируемые клетки, могут быть любыми веществами, выбранными из группы, состоящей из любых химических, природных или синтетических веществ, веществами из любой известной панели лекарственных веществ или веществами, которые являются ранее признанными лекарственными веществами. Лекарственные вещества могут применяться в жидкой форме, где жидкость может быть органическим растворителем или водным буфером, содержащим лекарственное вещество, в виде порошка, в виде таблетки, или могут быть заключены в носитель, предпочтительно наночастицу.
Способы измерений данного анализа, необходимых для мониторинга кинетики клеточного роста или активности, могут включать в предпочтительном варианте любой способ (i), выбранный группы, состоящей из метаболической активности, предпочтительно с использованием AlamarBlue (R), проточной цитометрии, анализа содержания дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), количественного анализа белков, подсчета клеток, анализа изображений, определения уровней экспрессии генов, масс-спектрометрии, измерениями с использованием меток (таких как методика репортерных генов, резонансного переноса энергии, анализ фрагментов белков или комплементарности расщепленных участков) или измерений без использования меток (таких как системы измерения электропроводимости/биосенсоры, системы измерения поверхностного плазмонного резонанса, акустические биосенсорные системы и системы, использующие калориметрию, изменения электрической активности) или (ii) комбинации любых из перечисленных способов. Мониторинг клеточной пролиферации дает прямую информацию о влиянии лекарственного вещества на форму и строение клеток.
Способы измерений для определения других физиологических и биологических характеристик (например, маркеров гипоксии и/или ингиогенеза) могут включать предпочтительно любые (i) способы, выбранные из группы, состоящей из определения уровней рибонуклеиновой кислоты (РНК), уровней экспрессии белков, масс-спектрометрии, иммуногистохимии, анализа изображений, способов протеомики или (ii) любой комбинации вышеупомянутых способов мониторинга.
Может быть определена максимальная переносимая доза или концентрация используемого лекарственного вещества для данной клетки и типа клеток. Определение приемлемой дозы лекарственного вещества для клетки, типа клеток или ткани позволяет адаптировать применяемые дозы для направленного воздействия на больные клетки, предпочтительно опухолевые клетки.
Может быть определенная минимальная эффективная доза используемого лекарственного вещества может для данной клетки и типа клеток. Определение минимальной эффективной дозы лекарственного вещества для клетки, типа клеток или ткани позволяет адаптировать применяемые дозы для направленного воздействия на больные клетки, предпочтительно опухолевые клетки.
Другая цель задача настоящего изобретения состоит в обеспечении применения способа для мониторинга (i) лечения или уничтожения больных клеток, поддержания индукции перехода здоровых клеток в болезненное состояние в результате обработки лекарственным веществом или (ii) перепрограммирования и/или дифференцировки клеток.
Перепрограммирование дифференцированных клеток в стволовые клетки или клетки-предшественники под действием применяемого лекарственного вещества может быть исследовано с использованием любого метода (i), выбранного группы, состоящей из метаболической активности, предпочтительно с использованием AlamarBlue (R), проточной цитометрии, анализа содержания дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), количественного анализа белков, подсчета клеток, анализа изображений, определения уровней экспрессии белков, масс-спектрометрии, измерениями с использованием меток (таких как методика репортерных генов, резонансного переноса энергии, анализ фрагментов белков или комплементарности расщепленных участков) или измерений без использования меток (таких как системы измерения электропроводимости/биосенсоры, системы измерения поверхностного плазмонного резонанса, акустические биосенсорные системы и системы, использующие калориметрию, изменения электрической активности) или (ii) комбинации любых из перечисленных способов. Дифференцированная клетка может представлять собой любую клетку, тип клеток, клетка, полученная из клеточной культуры, или клетка, полученная из определенной ткани. Здесь, применяемое лекарственное вещество может запускать процесс перепрограммирования.
Этот способ можно применять для анализа дифференцировки стволовых клеток в дифференцированную клетку под действием применяемого лекарственного вещества в соответствии с кинетикой роста и активности клеток, включая любой способ (i), выбранный группы, состоящей из метаболической активности, предпочтительно с использованием AlamarBlue (R), проточной цитометрии, анализа маркеров гипоксии и ангиогенеза, анализа уровней рибонуклеиновой кислоты (РНК), определения уровней экспрессии белков, масс-спектрометрии, определения уровней ДНК, количественного анализа белков, подсчета клеток, анализа на основе изображений и иммуногистохимии или (ii) любую комбинацию любых из перечисленных способов. Здесь, применяемое лекарственное вещество может запускать процесс дифференцировки.
Дальнейшие аспекты и детали изобретения станут известны из фигур и примеров представленных далее:
фигура 1 - графики и изображения, демонстрирующие профили колоний клеток и гипоксические состояния клеток колоректальной карциномы человека в трехмерном матриксе;
фигура 2 - схематическое представление, показывающее определение графика применения лекарственного вещества для трехмерной физиологической среды и для обычной двумерной монослойной культуры;
фигура 3 - график, на котором проводится сравнение между двумерным и трехмерным скринингом лекарственных веществ, с определенного графика применения лекарственного вещества на фигуре 2;
фигура 4 - графики и изображения, показывающие определение дозозависимых профилей эффективности лекарственного вещества после обработки на «ранней» и «поздней» стадии;
фигура 5 - график, на котором проводится сравнение эффективности активности препаратов, измеренное сразу после окончания обработки и после периода без обработки лекарственным веществом;
фигура 6 - таблица, в которой суммируются данные по эффективности действия лекарственного вещества 5-флюороурацила на колонию клеток НСТ-116, выращенную в трехмерной среде, и на обычную двумерную клеточную культуру;
фигура 7 - график, показывающий двумерный рост клеток колоректальной карциномы (НСТ-116);
фигура 8 - графики и изображения, демонстрирующие сравнение профилей роста и экспрессии генов маркеров гипоксии в трехмерных средах для раковых клеток толстого кишечника, поджелудочной железы и яичника;
фигура 9 - графики, показывающие профили роста двумерных и трехмерных культур клеток с независимыми графиками обработки;
фигура 10 - график, демонстрирующий обработку раковых клеток поджелудочной железы Гемцитабином: сравнение измерения активности препарата сразу после обработки и после четырех и семи дней периода восстановления без обработки лекарственным веществом.
На фигуре 1 показан профиль роста клеток колоректальной карциномы (НСТ-116) в трехмерном физиологическом микроокружении без обработки лекарственным веществом. На А) клетки растут как колония клеток или как сфероиды из раковых клеток, имитируя мини-опухоли, при инкапсуляции в форме отдельных клеток. Размер сфероидов увеличивается со временем. На левой панели показаны гистограммы, полученные по результатам анализа изображений, демонстрирующие количественное распределение сфероидов, сформированных в различные периоды времени, по размерам. Диаметр сфероидов из раковых клеток увеличивается с 35 микрометров в день до 155 микрометров на двадцать первый день роста. На правой панели показана прижизненная флуоресцентная окраска кальцеином растущих раковых клеток. Кинетика роста сфероидов, состоящих из раковых клеток, в трехмерном матриксе показана на В). Приведены результаты измерения метаболической активности с использованием Alamar Blue(R) и подсчета клеток способом проточной цитометрии, оба анализа проведены в оптимизированных условиях и показывают схожие профили роста клеток, характеризуемые вначале быстрой, а затем замедляющейся кинетикой роста. В С) клеточные сфероиды окрашивали кальцеином (зеленый), показывающим живые клетки, и красителем гипоксисенс (красный), показывающим клетки в состоянии гипоксии. В данной линии раковых клеток гипоксия определяется по красному цвету (в норме в центре клеточных сфероидов) и наблюдалась приблизительно с 14 дня культивирования. Для визуализации в черно-белом изображении, красная окраска обозначена в виде кругов с точками. Красное окрашивание наиболее интенсивно в центре сфероидов.
Профилирование раковых клеток является ключевым этапом настоящего изобретения и позволяет определить и исследовать физиологические характеристики (например, гипоксию) сфероидов, состоящих из раковых клеток, в различные периоды роста. Важно, что эти характеристики сильно зависят от источника происхождения опухолевой ткани (как показано в фигуре 8). Дополнительно, влияние лекарственных веществ на опухоль сильно зависит от физиологических характеристик опухоли (как показано на фигурах 3 и 4). На основании профиля физиологических характеристик сфероидов, состоящих из раковых клеток, в представленном изобретении, моменты времени для скрининга лекарственного вещества могут быть адаптированы для имитации различных стадий развития опухоли in vivo. Сфероиды в гелевом матриксе, отражающие различные стадии пролиферации клеток и их физиологические характеристики, показаны в фигурах 1 и 8.
На фигуре 2 показано определение режима обработки лекарственным веществом и времени измерения на основании профиля роста клеток и физиологических характеристик рака. Приведен пример, включающий обработку лекарственным веществом клеток в трехмерном матриксе, находящихся в «ранней» и «поздней стадии». Определены условия различных стадий рака на основании анализа профиля роста, как показано на фигуре 1, и соответственно определены режимы обработки лекарственным веществом. Здесь, различные стадии рака для клеток, культивируемых в трехмерных матриксах, определяются как обработка «на ранней стадии» и «обработку на поздней стадии».
«Ранняя стадия» включает два момента времени для измерений. Первый момент времени в день семь соответствует окончанию обработки лекарственным веществом, а второй момент времени в одиннадцатый день соответствует периоду без обработки лекарственным веществом. «Поздняя стадия» включает два момента времени для измерений. Первый момент на семнадцатый день соответствует концу второго (независимого от «ранней стадии») периода обработки лекарственным веществом. Вторая точка, на двадцать первый день соответствует периоду восстановления без обработки лекарственным веществом. Могут осуществляться измерения в дополнительные моменты до начала обработки и/или после различных периодов восстановления без обработки лекарственным веществом.
На «ранней стадии», в день четыре или семь, наблюдаются сфероиды диаметром 35 мкм, состоящие из высоко клеток с высокой степенью пролиферации (показано на фигуре 9), измерение экспрессии маркеров гипоксии или другими биохимическими способами (фигура 1С) не показало присутствия гипоксии. Напротив, для «поздней стадии» показано присутствие больших по размеру сфероидов диаметром 155 мкм, с низкой степенью пролиферации клеток (показано на фигуре 9), и выявлено состояние гипоксии (фигура 1С). В обоих случаях измерения проводили сразу после обработки лекарственным веществом для того, чтобы оценить его эффективность, и после четырехдневного периода без обработки лекарственным веществом, чтобы оценить вероятность рецидивов роста «миниопухолей» и/или отложенных эффектов лекарственного вещества, которые наблюдались в случае с Гемицитабином (фигура 10).
В двумерных массивах сравнения клетки исследуют обычным образом во время логарифмической фазы роста между первым и четвертым днями (фигура 9).
На фигуре 3 показан скрининг с использованием режима обработки, приведенного на фигуре 2, на колониях клеток колоректальной карциномы НСТ-116. В качестве примера получения положительного результата («Hit») использована подборка лекарственных веществ из доступной на рынке библиотеки лекарственных веществ (Prestwick). В А) показано влияние шестидесяти лекарственных веществ на метаболические параметры, измеряемые с использованием красителя AlamarBlue(R). Вещества исследовали в трех повторностях при концентрациях 10 мкМ. Показаны средние значения и стандартные отклонения. Лекарственное вещество считается действующим, если в трех повторностях значение выше порога попадания (Hit) (среднее значение +/- трехкратное стандартное отклонение отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля используются условия с основой ДМСО без лекарственного вещества). На верхнем графике показано сравнение ранней обработки раковых клеток, выращенных в двух измерениях и клеток, выращенных в трехмерном матриксе, на нижнем графике показано сравнение обработки клеток, выращенных в трехмерном матриксе, находящихся на «ранней» и «поздней стадии». Графики показывают, что введение «ранней» и «поздней стадии» позволяет исключить ложноположительную идентификацию лекарственных веществ и снизить число попаданий.
На фигуре 3В показан анализ изображений, на котором проводился подсчет распределения диаметров колоний клеток, в частности, сфероидов раковых клеток, проведенный сразу после обработки клеток на «ранней» и «поздней» стадиях лекарственными веществами из панели, представленной на фигуре 3A, при концентрации 10 мкМ. Сплошные кривые соответствуют «попаданию», а не пустые кривые отвечают за «непопадание», и определяются на основании измерения метаболических параметров в конце «ранней стадии» и «поздней стадии» (положительный контроль: клетки, обработанные сульфатом меди; отрицательный контроль: клетки, обработанные ДМСО).
На фигуре 4 показано определение концентрации полумаксимального ингибирования (IC50) в качестве параметра, измеряемого с использованием красителя AlamarBlue(R), для отобранных «попаданий» на фигуре 2, пример 5-Флуороурацила (5-FU), в колониях клеток колоректальной карциномы НСТ-116. Измерения проводили на клетках, выращенных на трехмерном матриксе, при обработке на «ранних» и «поздних стадиях». Дозозависимость эффективности лекарственного вещества показана на фигуре 4А. Стрелка указывает на сдвиг к более высоким концентрациям IC50 от «ранней» к «поздней» обработки. Это указывает на то, что 5-FU менее эффективен при лечении рака на поздней стадии, и подтверждает статус «непопадания», полученный для этого препарата в скрининге на «поздней стадии», показанном на фигуре 3. Кривые IC50, полученные для двумерных эталонных массивов часто похожи на кривые, полученные для условий обработки на «ранней стадии» согласно настоящему изобретению (трехмерное). Это так же видно по корреляции «попаданий» двух анализов, показанной на фигуре 3А (верхняя панель). Сводка определенных значений концентраций IC50 для экспериментов с различным числом повторов показана на фигуре 6. На фигуре 4B показаны результаты анализа изображений сфероидов из раковых клеток, выращенных в трехмерном матриксе, обработанных на «ранней» и «поздней» стадиях выбранными концентрациями лекарственного вещества, IC50 и 1 мкМ. На верхней панели показано распределение размеров сфероидов, на нижней панели показаны соответствующие флуоресцентные изображения, полученные после окраски кальцеином. 5-FU показал сильное ингибирование роста сфероидов на «ранней» стадии, но не показал на «поздней», как видно из результатов анализа метаболических показателей (фигуры 3A и 4A). Эти результаты сходятся с результатами клинического использования 5-FU, который больше не используется самостоятельно в клиническом лечении рака толстой кишки.
На фигуре 5 показано сравнение эффективности лекарственных веществ сразу после обработки и после периода без обработки лекарственным веществом, названного периодом «восстановления». Здесь в качестве примера приведены обработка колоний раковых клеток 5-FU. Измеряли профили дозозависимой эффективности для обработки согласно режиму на «ранней стадии» (левая панель) и на «поздней стадии» до и после четырехдневного периода восстановления без обработки лекарственным веществом согласно режиму, приведенному на фигуре 2. Не наблюдалось значимых различий в кривых концентраций IC50 для периодов до и после восстановления (фигура 6). Интересен тот факт, что для другой клеточной линии, полученной из клеток поджелудочной железы, и препарата Гемцитабина период восстановления являлся ключевым для определения эффективности лекарственного вещества согласно настоящему изобретению (фигура 10). Настоящее изобретение позволяет выявлять лекарственные вещества в случае определения эффекта применяемого лекарственного вещества после периода без обработки лекарственным веществом.
На фигуре 6 собраны результаты по концентрациям IC50 препарата 5-FU, определенные с использованием настоящего изобретения и референсных двумерных анализов на культурах клеток с клетками рака кишечника. Показаны результаты трех независимых повторных экспериментов.
Раковые клетки обычно растут как двумерный монослой на культуральном пластике, как описано поставщиками клеток и в научных публикациях.
На фигуре 7 показан рост клеток колоректальной карциномы НСТ-116 в двумерной среде. При достижении конфлюэнтности вся пластиковая поверхность планшета для тканевой культуры покрывается клетками, и клетки обычно престают расти в связи с пространственными ограничениями. Недостаток этой ситуации заключается в том, что состояние in vitro не отражает адекватным образом физиологического состояния in vivo (например, в двумерных способах культивирования клетки образуют один слой, в отличие трехмерных агломераций in vivo и в трехмерных способах культивирования; в двумерных способах всем клеткам открыт доступ к кислороду и питательным веществам, против отличия низкой доступности для клеток, находящихся внутри сфероидов, in vivo и в трехмерных способах культивирования).
На фигуре 8 показаны значительные различия в росте колоний и образовании сфероидов для клеток различных видов рака, что отражает ключевые физиологические характеристики in vivo, в частности, при росте из одной клетки в трехмерном окружении в отличие от других трехмерных способов культивирования, основанных на агрегации клеток, в которых размер сфероидов и их рост зависят от количества агрегировавших клеток. Слева показаны изображения клеток на четырнадцатый день культивирования. Сравнивались три линии раковых клеток, рака толстого кишечника НСТ-116, поджелудочной железы Panc-1 и яичника. Флуоресцентные фотографии, полученные при окраске сфероидов, выращенных на трехмерном матриксе, на четырнадцатый день культивирования показаны на левой стороне А). Справа приведен анализ изображений в виде гистограмм распределения по размерам сфероидов из раковых клеток на четырнадцатый день культивирования. В целом, клетки рака яичников формируют самые крупные сфероиды, а клетки рака поджелудочной железы формируют сфероиды самого маленького размера среди исследованных раковых клеток, что сравнимо с ростом опухолей in vivo. На В) показаны кривые роста сфероидов различных раковых клеток, полученные по флуоресценции после окраски красителем AlamarBlue(R).
Раковые клетки яичника и толстого кишечника достигли плато роста между одиннадцатым и пятнадцатым днями, раковые клетки поджелудочной железы достигали плато на двадцать первый день. Формирование колоний раковых клеток яичника и толстого кишечника демонстрировало более быструю начальную кинетику роста с более ранним уплощением кривой, по сравнению с раковыми клетками поджелудочной железы.
На фигуре 8C) показано сравнение роста трех линий раковых клеток в трехмерных средах согласно настоящему изобретению по динамике экспрессии маркерных генов, которые наблюдаются при гипоксии. Сравнивали клеточные линии колоректальной карциномы (НСТ-116), рака поджелудочной железы (Panc-1) и клетки рака яичника (А2780). Исследуемыми маркерами гипоксии были HIF-1a (индуцируемый фактор гипоксии 1 альфа; главный регулятор гипоксии); VEGFA (фактор роста сосудистого эндотелия A, который участвует в ангиогенезе); CAIX (углеродная ангидраза IX), связанная с регуляцией pH; GLUT-1 (транспортер глюкозы 1), связанный с продукцией энергии; LDHA (лактатдегидрогеназа А), связанная с продукцией энергии; BNIP3 (белок 3, взаимодействующий с BCL-2/ 19-КДа аденовируса), связанный с процессом апоптоза. Поведение исследуемых клеточных линий на генном уровне сильно различается (профили экспрессии во времени). Экспрессия гена HIF-1a остается на базовом уровне у клеток А2780 и НСТ-116, но увеличивается у клеток Panc-1 со временем. Экспрессия VEGFA остается на одном уровне у клеток А2780 и увеличивается в шесть раз у клеток НСТ-116 и Panc-1. Экспрессия CAIX увеличивается со временем у всех линий, но величина изменения экспрессии значительно различается. Самая высокая экспрессия генов CAIX наблюдалась для клеток А2780 (в 4000 раз), за ней следует НСТ-116 (увеличение в 400-500 раз) и клетки Panc-1 (60-80 кратное увеличение). Профили экспрессии генов BNIP3, GLUT-1 и LDHA обладают сходной тенденцией увеличения со временем. Профилирование экспрессии генов раковых клеток позволяет определять и изучить физиологические характеристики сфероидов из раковых клеток в различные моменты роста. Фигуры 8А), В) и С) показывают, что физиологические характеристики сильно зависят от происхождения опухолевых клеток и/или от стадии роста клеток. На фигуре 8C) представлены количественные данные, которые подтверждают важность определения ранней и поздней фаз раковых клеток, для того чтобы производить представленный скрининг в релевантных стадиях.
На фигуре 9 показан режим, составленный с учетом профилей роста раковых клеток НСТ-116, согласно настоящему изобретению с использованием клеток к трехмерной физиологической среде (верхняя панель). Для сравнения показан двухмерный референсный анализ (нижняя панель). Двумерный референсный анализ охватывает только фазу начального роста между первым и четвертым днями культивирования. Разделение обработки лекарственным веществом согласно настоящему изобретению покрывает «ранний трехмерный период обработки» (четвертый-седьмой дни) и «поздний трехмерный период обработки» (дни четырнадцать-семнадцать). Первый характеризуется начальной фазой роста сфероидов, когда сфероиды относительно невелики, условия гипоксии отсутствуют, а уровни пролиферации высоки, а второй характеризуется наличием стационарной фазы с большим размером сфероидов, гипоксическим условиями и прекращением пролиферации клеток. Эти данные сходны с ростом опухоли in vivo.
На фигуре 10 показаны клетки рака поджелудочной железы, обработанные Гемицитабином. Показаны профили дозозависимой эффективности для обработки на «поздней стадии» Гемицитабином клеток рака поджелудочной железы, культивируемых в трехмерном матриксе, измеренные по метаболическим показателям, с использованием красителя AlamarBlue(R), до и после периода восстановления без обработки лекарственным веществом, длящегося от четырех до семи дней.
Согласно результатам полученных референсных двумерных анализов и трехмерных анализов сразу после обработки, Гемицитабин не показал активности. Однако когда измерения проводили после периода восстановления, наблюдали, что Гемицитабин обладает сильной ингибирующей активностью в отношении раковых клеток в трехмерной среде. Гемицитабин используется как самостоятельное действующее вещество для клинического лечения рака поджелудочной железы. С помощью представленного изобретения было определено сильное лекарственное вещество, которое является эффективным в определенных условиях, таких как, например, гипоксические условия или стационарная пролиферация клеток, и/или которое показывает отложенную эффективность в отношении клеток.