СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ
METHOD OF PREPARING ORGANIC SOLVENTS

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения органических растворителей - бутанола, ацетона и этанола путем биосинтеза углеводсодержащих материалов.
Наиболее ценным из перечисленных растворителей, в настоящее время, является бутанол.
Бутанол - это дорогостоящий органический растворитель, широко применяется при изготовлении нитролаков и масляных лаков, в производстве сложных растворителей, синтетической резины и шелка, при экстрагировании сырья для получения фармацевтических препаратов, служит сырьем для производства практически всех пластмасс и их растворителей, поэтому на рынке химических реактивов и веществ имеет постоянно большой спрос.
Бутанол, как и этанол, может быть использован также и в качестве компонента моторного топлива.
В промышленности бутанол получают оксосинтезом из пропилена с использованием никель-кобальтовых катализаторов при 130-150°С и давлении 20-35 МПа.
Микробиологическим путем бутанол начали производить в 10-х годах XX века с использованием бактерии вида Clostridium acetobutylicum. Сырьем для производства была глюкоза сахарного тростника, свеклы, кукурузы, пшеницы, маниоки, т.е. пищевое сырье.
В настоящее время в связи с появлением новых экономичных технологий производства резко возрос интерес к получаемому микробиологическим путем бутанолу и его использованию в качестве биотоплива.
Сейчас основными направлениями исследований в области получения органических растворителей и биотоплива в Великобритании, США, Германии, Китае и Японии являются конструирование новых штаммов ацетонобутиловых бактерий методами генной инженерии, повышение продуктивности процесса биосинтеза и разработка новых технологических приемов выделения конечных целевых продуктов (US 2007259411 2007-11-08, US 2007259410 2007-11-08, WO 2007050671 2007-05-03).
Обычно микробиологический процесс получения органических растворителей из растительного сырья включает несколько стадий, осуществляемых отдельно и последовательно: гидролиз предварительно подготовленного растительного сырья, ферментолиз (осахаривание), ферментация с помощью бактерий, продуцирующих бутанол, ацетон и этанол, и выделение целевых продуктов, т.е органических растворителей.
Так, например, известен способ производства спиртов (WO 2008025522, 06.03.2008), в частности этанола или бутанола из растительного сырья, при этом, способ осуществляют периодически последовательно: измельчение растительного сырья, его необязательное разжижение, затем осахаривание энзимами, отделение нерастворимых компонентов и/или не сбраживаемых сахаров, сбраживание, отделение дрожжей и/или бактерий, отгонка и ректификация спирта. В данном случае растительное сырье представляет собой зерновые культуры.
Известен способ (US 20070178569, 2007-08-02) получения топлива из растительного сырья, включающий следующие последовательные стадии: измельчение растительной массы перед гидролизом, гидролиз под действием серной кислоты, осахаривание с получением простых углеводов под действием энзимов, например эндоглюканазы, целлобиогидралазы, сбраживание с использованием бактерии Clostridium phytofermentans в среде, где концентрация углеводов больше 20 мМ, при температуре не выше 45°С и рН не выше 9,5.
В свете вышесказанного весьма привлекательным было бы техническое решение, позволяющее осуществлять процессы осахаривания и сбраживания одновременно, т.е. таким образом, чтобы образующиеся сахара не накапливались и только потом передавались на сбраживание, а сбраживались сразу же по мере их образования.
Это позволило бы оптимизировать процесс получения органических растворителей, сократить время, упростить и удешевить процесс за счет исключения отдельных аппаратов и ряда операций, например, концентрирования и стерилизации сахаров перед их подачей на сбраживание.
Однако существует ряд серьезных препятствий для такого осуществления процесса. Дело в том, что как правило, процессы ферментолиза растительного сырья и сбраживания полученных сахаров протекают при разных режимах, температуре и рН.
Важным является также тот факт, что применяемые для сбраживания (ферментации) сахаров бактерии вида Clostridium acetobutylicum являются весьма требовательными и прихотливыми к условиям реакции.
Поэтому известно, что из-за ряда недостатков, присущих бактерии Clostridium acetobutylicum (относительный недостаток генетических инструментов для манипуляций с ее метаболизмом, медленный рост, интолерантность к концентрации бутанола, возможность получения побочных продуктов бутирата, ацетата, ацетона и этанола), рядом исследователей (Eric J. Steen, et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol. Microbial Cell Factories, 7:36, 03.12.2008 и Inui M. et al. Expression of Clostridium acetobutylicum butanol synthetic genes in Escherichia coli, Appl. Microbiol. Biotechnology 2008, 77(6): 1305-16) Alexandra M. Goho, Industrial News, 31.03.2008) для получения бутанола были предприняты попытки генетически модифицировать бактерии Escherichia coli и Saccharomyces cerevisie.
В литературе есть краткое упоминание о возможности осуществления способа получения органических растворителей - бутанола, ацетона, этанола (Ed./Green Car Congress (2008, October 17) Integrated SSFR Process Could Make Cellulosic Biobutanol More Competitive with Ethanol. [WWW document]. URL http://www.greencarcongress.com/2008/10/integrated-ssfr.html#more) из остатков сельскохозяйственных культур (соломы пшеницы, стеблей кукурузы), когда предварительно обработанную разбавленной серной кислотой солому пшеницы под действием ферментов осахаривают, а сахара сразу же после получения сбраживают под действием культуры С.beijerinckii P260, получая ацетон, этанол и бутанол.
Однако известный способ не описан с подробностями, необходимыми для его осуществления, также не отмечена возможность непрерывного осуществления процесса.
В качестве недостатков этого способа сами авторы упоминают о том, что скорость процесса сбраживания значительно выше, чем скорость образования сахаров. Поэтому для оптимального протекания процесса авторы вынуждены осуществлять дополнительную подпитку культуры сахарами.
К недостаткам способа следует отнести также и необходимость предварительной обработки растительного сырья разбавленной серной кислоты, что влечет за собой известные сложности при организации процесса, и невозможность использования в качестве растительного сырья отходов деревоперерабатывающей промышленности древесных опилок, особенно опилок хвойных пород с высоким содержанием смолы, наиболее устойчивых к ферментативному гидролизу.
С другой стороны известные ферментационные способы получения бутанола и других органических растворителей предусматривают сбраживание раствора сахаров в ферментере на питательной среде с использованием различных штаммов бактерий, а выделение органических растворителей и газов, образующихся в процессе ферментации, осуществляют, например, активированными сорбентами или с помощью мембран (US 5753474 1988 г.).
Основные недостатки ферментационных способов получения органических растворителей в основном связаны со сложностями выделения растворителей из ферментационной среды, поскольку это наиболее энергоемкое и дорогостоящее звено в технологии их получения, в связи с чем ведутся интенсивные разработки энергосберегающих методов разделения, в том числе мембранных.
Известен способ (US 5755967, 26.05.1998) селективного удаления через твердую мембрану ацетона и бутанола из ферментационных жидких сред. Мембрана представляет собой частицы силикалита, нанесенные на матрицу из полидиметилсилоксана или ацетата целлюлозы.
Известна попытка использования жидкой мембраны в процессе выделения бутанола (реферат, Matsumura et al., Energy saving effect of pervaporation using oleyl alcohol liquid medium in butanol purification, Bioprocess Engineering 3, 93-100, 1988). На 25 мм микропористый тонкий полипропиленовый лист наносили слой олеилового спирта; такая мембрана имела высокую селективность, и по ожиданиям авторов, этот способ выделения должен был демонстрировать очень низкий уровень энергопотребления, однако мембрана оказалась нестабильной.
Технической задачей настоящего изобретения является создание способа получения органических растворителей, лишенного вышеописанных недостатков и обеспечивающего возможность создания непрерывного процесса с использованием непищевого возобновляемого растительного сырья, в частности отходов деревоперерабатывающей промышленности, в котором процессы ферментолиза растительного сырья, сбраживания полученных сахаров и выделение органических растворителей из ферментационной среды осуществляют преимущественно в одну стадию и в одном объеме.
Техническим результатом изобретения является сокращение времени процесса, его упрощение и удешевление за счет исключения отдельных аппаратов и ряда операций, например, концентрирования и стерилизации сахаров перед их подачей на сбраживание.
Для достижения этого технического результата авторами предложен способ получения органических растворителей, включающий ферментолиз предварительно измельченного растительного сырья до получения раствора сахаров путем обработки его ферментами, сбраживание полученных сахаров на питательной среде с помощью бактерий Clostridium acetobutylicum, продуцирующих бутанол, ацетон и этанол и выделение органических растворителей из ферментационной среды, причем весь процесс проводят, по крайней мере, в одну стадию, а выделение органических растворителей осуществляют путем их диффузионного испарения через жидкую мембрану с использованием вакуума.
Данный прием в настоящем процессе является предпочтительным, однако, авторы не исключают возможности использования диффузионного испарения через жидкую мембрану с использованием газа.
Предпочтительно, все процессы осуществлять в одном объеме.
Предпочтительно, что жидкая мембрана представляет собой слой гидрофобной жидкости, размещаемой на поверхности ферментационной среды, при этом в качестве гидрофобной жидкости может быть использовано синтетическое или растительное масло.
В качестве синтетического масла предпочтительно использовать силиконовое масло. Слой гидрофобной жидкости на поверхности ферментационной среды должен составлять 3-30 мм.
При этом для поддержания скоростей ферментолиза растительного сырья и сбраживания полученных сахаров одинаковыми осуществляют периодические замеры концентрации сахаров и образующихся растворителей.
Скорости ферментолиза растительного сырья и сбраживания полученных сахаров предпочтительно поддерживать такими, чтобы концентрация сахаров в среде составляла 1,2-2,5%;
Процессы ферментолиза растительного сырья и сбраживания полученных сахаров предпочтительно осуществлять при рН - 4,2-5,0 и температуре 33-55°С.
Растительное сырье может представлять собой древесные опилки, в том числе опилки хвойных пород, из которых предварительно осуществляют экстракцию смолы.
Предпочтительно, при ферментолизе использовать комплекс ферментов, соответствующий полисахаридному составу используемого сырья, например комплекс ферментов целлюлазы, ксиланазы, целлобиазы и/или маннаназы.
3
4
2
4
При этом бактерией, продуцирующей бутанол, ацетон и этанол, является бактерия вида Clostridium acetobutylicum, а в качестве питательной среды для подготовки культуры используют картофельно-глюкозную среду, имеющую следующий состав: г/л: картофель - 37, глюкоза - 0.75, СаСО - 0.3, (NH)SO - 0.225.
Предварительная подготовка растительного сырья в данном случае включает грубый помол и тонкий помол. Грубый помол растительного сырья осуществляют до размеров частиц 1-2 мм на пригодных для такого процесса мельницах, например, шаровых, предпочтительно одновременно с сушкой, путем продувки воздухом с температурой 120-130°С, что позволяет удалить влагу из сырья и подготовить его к тонкому помолу. Тонкий помол растительного сырья осуществляют до размеров частиц предпочтительно 1-5 мкм.
Хотя в предлагаемом способе могут быть использованы любые возобновляемые источники растительного сырья, такие например, как солома, травяные растительные отходы и т.п., но преимуществом предлагаемого способа является возможность использования отходов деревоперерабатывающей промышленности - древесных опилок.
В качестве опилок возможно использование наиболее трудно ферментализуемых опилок деревьев хвойных пород.
Перед тонким помолом древесных опилок из них предпочтительно удалять смолу, что дает возможность осуществить полный ферментолиз целлюлозы и гемицеллюлозы, поскольку в противном случае в силу гидрофобности часть ферментов сорбируется не обратимо смолой и не участвует в процессе ферментолиза.
Удаление смолы предпочтительно осуществляют экстракцией органическими растворителями, ацетоном и/или этанолом с модулем 1:7-1:10.
Проведенная предварительная подготовка растительного сырья и использование данного комплекса ферментов позволяет в максимальной степени «извлечь» из исходного сырья сахара, обеспечить оптимальную скорость образования сахаров для сбраживания их на питательной среде. При этом в предлагаемом способе, в отличие от всех известных, количество сахара, переходящегося в раствор при ферментолизе за единицу времени близко к количеству сбраживаемого сахара с получением растворителей.
Выделение полученных растворителей из ферментационной среды осуществляют путем их диффузионного испарения через жидкую мембрану с использованием вакуума. Гидрофобную жидкость, например силиконовое масло, размещают до начала брожения непосредственно в ферментере.
При достижении концентрации растворителей в ферментере, приближающейся к ингибирующей для продуцирующей культуры, в ферментере понижают давление и отгоняют через слой гидрофобной жидкости образующиеся растворители, а затем конденсируют их в холодильном устройстве.
Таким образом, может быть решен один из важнейших вопросов выделения растворителей из ферментационной среды, поскольку это наиболее энергоемкое и дорогостоящее звено в технологии их получения. Одновременно решаются и вопросы сепарации не подвергнутых ферментолизу опилок, которые могут находиться в ферментационной среде.
Изобретение поясняется примерами, которые не носят ограничивающего характера:
Пример 1 (известный).
В устройство для ферментолиза к древесной пыли размером 1-5 мкм добавляют воду до образования суспензии плотностью 0,1 г/мл, к полученной суспензии добавляют комплекс гидролитических ферментов (целлюлаза, ксиланаза и целлобиаза), в соотношении 2,5 г/кг пыли. Процесс ферментолиза проходит при температуре 55°С и рН 5,5 и протекает в течение 12 часов, до 45% сахаров переходит в раствор.
Образующийся лигнин отделяют от раствора сахаров центрифугированием.
9
Получаемый 2,7% раствор сахаров древесины стерилизуют и подают в предварительно стерилизованный ферментер, туда же подают инокулят, состоящий из муки (40 г/л), воды и бактерий Clostridium acetobutylicum CK 425, регистрационный номер ВКПМ В-4786 с плотностью 1-2·10 Кл /мл.
Осуществляют непрерывное ацетонобутиловое брожение при температуре 37°С и рН 3,8 в течение 48 часов. Конденсацией отогнанных паров во время всей ферментации получают раствор, содержащий ацетон, бутанол, и этанол в соотношении 10:88:2.
После удаления растворителей и сопутствующих газов путем вакуумирования, в ферментер на 48 часе брожения начинают постоянно вводить питательную среду со скоростью 100 мл/час, содержащую сахара из расчета 75 г/сутки.
Раз в два дня в питательную среду добавляют 28 г дрожжевого автолизата.
Продуктивность процесса по растворителям составляет в среднем 7-8 г/л/ день. Выход растворителей от сахаров 27-33%. Выход сахаров от использованной древесной пыли составляет 14,0-16.0%
Пример 2.
Предварительно измельченную до размера частиц 1-2 мм солому пшеницы подвергают тонкому размолу на струйной мельнице ВИТ (Институт теплофизики СО РАН, Новосибирск) до размера частиц 1-5 мкм.
3
В предварительно стерилизованный ферментер с рабочим объемом 3 л вводят размолотую солому с частицами размером 1-5 мкм, добавляют воду до образования суспензии плотностью 1 г/см, к полученной суспензии в соотношении 2,5 г/кг сырья добавляют комплекс гидролитических ферментов, представляющий собой лиофильно высушенную культуральную жидкость, полученную культивированием штамма Penicillium funiculosum BKM F-3887D (активности авицелазы, карбоксиметилцеллюлазы, β-глюкозидазы, манноназы, ксиланазы, ксилоглюканазы в сухом комплексе составляют 870, 13100, 13500, 610, 22900, 5760 ед/г соответственно).
9
В этот же ферментер подают инокулят, состоящий из муки (40 г/л), воды и бактерий Clostridium beijermckii, регистрационный номер КМ МГУ №101 с плотностью 1-2·10 Кл/мл. Наслаивают на поверхность жидкости в ферментере силиконовое масло, слоем в 10 мм.
Процессы ферментолиза и брожения протекают в одном объеме одновременно при температуре 35°С и рН 4.2, в течение 48 часов, концентрация сахаров в растворе поддерживается постоянной и равна 2%. При снижении прироста концентрации сахаров в растворе, в ферментер добавляют свежеприготовленную суспензию размолотой соломы в воде и указанный комплекс ферментов.
Для образующихся растворителей, обладающих дифильными свойствами, состояние минимальной энергии достигается путем ориентации молекул на поверхности среды или вблизи нее таким образом, что гидрофобные группы (углеводородные радикалы) стремятся расположиться в слое масла, а полярные группы обращены в сторону водной фазы.
2
При снижении давления в ферментере до -0,94 кг/см растворители переходят в газообразное состояние и под действием вакуума направляются в конденсатор. Слой силиконового масла не позволяет воде, которая имеет температуру кипения ниже, чем у бутанола, попадать в конденсатор. Незначительное количество воды в полученном конденсате объясняется тем, что газ, выделяющийся во время процесса ферментации, проходит через мембрану, и в этот момент вода попадает в холодильное устройство вместе с растворителями.
Конденсацией отогнанных паров во время всей ферментации получают 75 мл водного раствора (органические растворители 64 мл, 11 мл - вода), содержащего 45 мл бутанола, 15 мл ацетона и 4 мл этанола, соотношение растворителей 70:23:7.
После удаления растворителей и сопутствующих газов в ферментер начинают постоянно вводить суспензию размолотой соломы в воде, указанный комплекс ферментов и питательную среду со скоростью 100 мл/час.
Раз в два дня в питательную среду добавляют 28 г дрожжевого автолизата.
Продуктивность процесса по растворителям составляет в среднем 8,3 г/л/ день. Выход растворителей от сахаров 35%. Выход сахаров от использованной размолотой соломы составляет 18%.
Пример 3.
Древесную щепу хвойных пород измельчают на шаровой мельнице (Институт химии твердого тела и механохимии СО РАН, Новосибирск) до размера частиц 1-2 мм. Из полученных опилок удаляют смолу экстракцией ацетоном с модулем 1:8. Опилки отделяют от экстрагента на центрифуге, остатки экстрагента удаляют продувкой сухим паром.
Обессмоленные опилки с влажностью 3-4% измельчают на активадионной мельнице, например ОГО-3 (Институт химии твердого тела и механохимии СО РАН, Новосибирск), до размера 1-5 мкм.
3
В предварительно стерилизованный ферментер с рабочим объемом 3 л вводят полученную древесную пыль с частицами размером 1-5 мкм, добавляют воду до образования суспензии плотностью 1 г/см, к полученной суспензии в соотношении 2,5 г/кг пыли добавляют комплекс гидролитических ферментов, представляющий собой лиофильно высушенную культуральную жидкость, полученную культивированием штамма Penicillium yerruculosum BKM F-3984D (целлобиогидролазная активность сухого комплекса составляет 900-920 ед/г, эндоглюканазная активность - 14500-14900 ед/г, β-глюкозидазная активность - 1200-1250 ед/г, целлобиазная активность - 600-670 ед/г, ксиланазная активность - 23000-24000 ед/г, ксилоглюканазная активность - 7500-8200 ед/г).
9
В этот же ферментер подают инокулят, состоящий из муки (40 г/л), воды и бактерий Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D с плотностью 1-2·10 Кл/мл. На поверхности среды в ферментере размещают жидкую мембрану, представляющую собой соевое масло, иммобилизованное в порах микропористого тонкого полипропиленового листа.
Процессы ферментолиза и брожения протекают в одном объеме одновременно при температуре 35°С и рН 4.2, в течение 48 часов, концентрация сахаров в растворе поддерживается постоянной и равна 2%. При снижении прироста концентрации сахаров в растворе в ферментер добавляют свежеприготовленную суспензию древесной пыли в воде и указанный комплекс ферментов.
2
При достижении концентрации бутанола в среде, оказывающей ингибирующее действие на продуцирующий микроорганизм, в ферментере понижают давление. При снижении давления в ферментере до -0,94 кг/см, растворители переходят в газообразное состояние и под действием вакуума направляются в конденсатор. Жидкая мембрана не позволяет воде, которая имеет температуру кипения ниже, чем у бутанола, попадать в конденсатор.
Конденсацией отогнанных паров во время всей ферментации получают в среднем 250 мл раствора, содержащего 6,5% бутанола, 2% ацетона и 0,75% этанола (соотношение растворителей 90:9:1).
После удаления растворителей и сопутствующих газов в ферментер начинают постоянно вводить суспензию древесной пыли в воде, указанный комплекс ферментов и питательную среду со скоростью 100 мл/час.
Раз в два дня в питательную среду добавляют 28 г дрожжевого автолизата. Продуктивность процесса по растворителям составляет в среднем 8 г/л/день. Выход растворителей от сахаров 32%. Выход сахаров от использованной древесной пыли составляет 16%.
Преимущества предложенного способа состоят в возможности создания непрерывного процесса получения органических растворителей с использованием непищевого возобновляемого растительного сырья, в частности отходов деревоперерабатывающей промышленности, в котором процессы ферментолиза растительного сырья, сбраживания полученных сахаров и отгонки органических растворителей осуществляют одновременно и, преимущественно, в одном объеме, сокращении времени процесса, уменьшении числа аппаратов и их габаритов.