Олигонуклеотидные праймеры и флюоресцентный зонд с внутренним гасителем, комплементарные участку гена Р30 (CP204L) вируса африканской чумы свиней, для использования в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND FLUORESCENT PROBE WITH INNER DAMPER, COMPLEMENTARY TO THE GENE SECTION P30 (CP204L) OF THE AFRICAN SWINE FEVER VIRUS, FOR USE IN POLYMERASE CHAIN REACTION IN REAL TIME

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к синтетическим олигонуклеотидным зондам и праймерам, комплементарным консервативной области гена P30 (CP204L) вируса африканской чумы свиней, для выявления ДНК вируса африканской чумы свиней. Предложенное изобретение может быть использовано в генодиагностике инфекционных болезней свиней и ветеринарной вирусологии. Способ выявления вируса АЧС основан на постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени с использованием олигонуклеотидных праймеров и флюоресцентного зонда с внутренним гасителем, комплементарных участку гена P30 (CP204L) вируса АЧС. Разработанный зонд и олигонуклеотидные праймеры позволяют повысить чувствительность и специфичность ПЦР для выявления ДНК вируса АЧС по сравнению с системой, основанной на выявлении гена р72 (B646L) вируса АЧС. Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики.
Африканская чума свиней - контагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, цианозом кожных покровов, тяжелыми дистрофическими и некротическими поражениями клеток ретикулоэндотелиальной системы. Восприимчивы домашние и дикие свиньи независимо от породы и возраста. Различают сверхострое, острое, хроническое и бессимптомное течение болезни [1, 2].
Заболеванию подвержены свиньи всех возрастных групп. Естественным резервуаром вируса являются дикие свиньи Африканского континента [3].
Предварительный диагноз устанавливают комплексно на основании эпизоотологического обследования, клинических признаков, патоморфологических изменений. Окончательный диагноз на АЧС устанавливают с учетом лабораторных исследований, включающих в себя полимеразную цепную реакцию [4], реакцию прямой иммунофлюоресценции [5], реакцию гемадсорбции [6] и биопробу на восприимчивых животных [7].
Существуют функциональные аналоги предложенного изобретения, основанные на «классическом» TaqMan зонде и паре праймеров на ген р72 (B646L) для выявления генома вируса АЧС. Однако флюоресцентных зондов с внутренним гасителем и праймеров на ген P30 (CP204L) для выявления вируса АЧС в России не зарегистрировано. Ране сотрудниками ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии был получен патент на тест-систему для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР с электрофоретической детекцией. Как известно, технология ПЦР в режиме реального времени, для проведения которой и предназначены олигонуклеотидный зонд и праймеры, комплементарные консервативной области гена P30 (CP204L) вируса АЧС, позволяет значительно увеличить чувствительность и специфичность теста. На российском рынке представлены несколько диагностикумов АЧС методом ПЦР в режиме реального времени, в состав которых входят синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды, которые могут служить прототипами данного изобретения. Примерами таких диагностикумов могут служить тест-система «АЧС» для выявления вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции (ФБУН ЦЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва), тест-система для выявления вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции (АНО «НИИ ДПБ», г. Москва, тест-система для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени (ГНУ Всероссийский НИИ Ветеринарной Вирусологии и Микробиологии Россельхозакадемии, п. Вольгинский). В данных тест-системах используются классические зонды (краситель и гаситель на 5' и 3' концах), что может приводить к образованию ложноположительных результатов за счет высокого уровня фоновой флюоресценции. Предложенные олигонуклеотидный зонд с внутренним гасителем флюоресценции и олигонуклеотидные праймеры, комплементарные участку гена P30 (CP204L) вируса АЧС, позволяют выявлять геном вируса АЧС с более высокой чувствительностью, чем запатентованные и представленные на рынке тест-системы и наборы.
Целью изобретения является дизайн олигонуклеотидного зонда с внутренним гасителем и двух олигонуклеотидных праймеров, комплементарных консервативной области гена p30 (CP204L) вируса АЧС, для выявления генома вируса АЧС методом ПЦР в режиме реального времени.
Для достижения поставленной цели были подобраны и синтезированы специфические олигонуклеотидные праймеры и зонд, которые используются в ПЦР для идентификации вируса АЧС (Таблица 1).
Способ обнаружения ДНК вируса АЧС в пробах органов, образцах крови инфицированных свиней методом ПЦР в режиме реального времени с использованием предложенных олигонуклеотидного зонда с внутренним гасителем и двух олигонуклеотидных праймеров, комплементарных к консервативной области гена p30 (CP204L) вируса АЧС, включает предварительный этап денатурации ДНК при 94°C в течение 2 мин. ПЦР включает 35 циклов амплификации: 94°C - 30 с, 56°C - 30 с, 68°C - 30 с. Затем проводят оценку и учет результатов реакции.
Техническим результатом изобретения является общедоступность, безопасность, высокая диагностическая чувствительность (100% по сравнению с применением олигонуклеотидных праймеров и зонда на ген Р72), а также сокращение времени проведения диагностической работы (на 5-10 минут) с целью выявления генома вируса африканской чумы свиней.
Сущность изобретения заключается в том, что выявление генома вируса АЧС проводят методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, с использованием олигонуклеотидного зонда с внутренним гасителем флюоресценции. Применение зонда с внутренним гасителем позволяет увеличить эффективность накопления флуоресценции в ходе ПЦР в реальном времени.
Существенным отличием заявляемого способа является то, что применение зонда с двумя гасителями позволяет значительно снизить фоновую флуоресценцию и повысить четкость флуоресцентного сигнала при учете результатов ПЦР в режиме реального времени.
Пример 1. Постановка ПЦР в режиме реального времени с использованием олигонуклеотидного зонда с внутренним гасителем и двух олигонуклеотидных праймеров, комплементарных консервативной области гена p30 (CP204L) вируса АЧС.
Состав реакционной смеси для постановки ПЦР в режиме реального времени представлен в таблице 2. В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на N образцов, в число которых входят положительный контроль (с водным раствором ДНК вируса АЧС) и отрицательный контроль (с бидистиллированной водой). Реактивы вносят в последовательности, приведенной в таблице 2. Фермент добавляют в последнюю очередь. В пробирке объемом 0,2 мл вносят общую реакционную смесь в объеме 20 мкл.
В реакции используют 5 мкл ДНК, полученной при выделении.
ПЦР проводят в амплификаторах ДТ-96 (ДНК-Технология, Россия), Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия) и других приборах с флуоресцентной детекцией по каналу FAM/Green. При следующих режимах (Таблица 3):
Пример 2. Определение специфичности и чувствительности метода выявления генома вируса АЧС с использованием олигонуклеотидного зонда с внутренним гасителем и двух олигонуклеотидных праймеров, комплементарных консервативной области гена p30 (CP204L) вируса АЧС.
Синтетические олигонуклеотидные зонды были проверены на специфичность и чувствительность. Установлено, что в ПЦР с использованием разработанных праймеров и зондов не амплифицируется ДНК других бактерий и вирусов, что показывает диагностическую специфичность и чувствительность 100%.
Диагностическая чувствительность. Была подтверждена на панели 20 (14 положительных и 6 отрицательных) проб патологического материала (легкое, селезенка, лимфоузлы), полученных от павших от АЧС (Таблица 4).
Диагностическая специфичность. В результате исследований было показано, что отсутствуют неспецифические реакции при тестировании образцов геномной ДНК свиньи и следующих микроорганизмов: вирус классической чумы свиней (штаммы Ши-Мынь, ЛК-ВНИИВВиМ, ЛК-К), вирус болезни Ауески (интактный), цирковирус свиней-1 и цирковирус свиней 2.
Выделение нуклеиновых кислот. ДНК выделяют из вируссодержащего материала с использованием коммерческих наборов.
Постановка ПЦР в режиме реального времени. На N количество образцов готовят реакционную смесь согласно таблице 2. Амплификация и детекция флюоресценции производятся согласно температурным режимам, указанным в таблице 3.
Учет результатов амплификации. Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне (0.05) пороговой линии - значение Ct.
Образец считается положительным на наличие генома вируса АЧС при значении Ct<33. Образцы, не пересекающие пороговую линию, и образцы со значением Ct>33 считаются отрицательными.
Источники информации
1. Бакулов, И.А. Проблемы современной эволюции африканской чумы свиней / И.А. Бакулов, В.В. Макаров // Вестник сельскохозяйственных наук. - 1990. - №12. - С. 122-128.
2. Бакулов, И.А. Эпизоотология: африканская чума свиней / И.А. Бакулов. - Москва: Колос, 1969. - С. 267-290.
3. Козлова, Д.И. Современные проблемы африканской чумы свиней / Д.И. Козлова, В.А. Бесхлебнов. - М.: ВНИИТЭИСХ, 1980. - 60 с.
4. A highly sensitive and specific gel-based multiplex RT-PCR assay for the simultaneous and differential diagnosis of African swine fever and Classical swine fever in clinical samples / M. Aguero, J. Fernandez, L.J. Romero, M.J. Zamora, C. Sanchez, S. Belak, M. Arias, J.M. Sanchez-Vizcaino // Vet Res. - 2004. - Vol. 35. - P. 551-563.
5. Heuschele, W.P. Fluorescent antibody studies on African swine fever virus / W.P. Heuschele, L. Coggins, S.S. Stone // Amer. J. vet. Res. - 1966. - №27. - 477-484.
6. Malmquist, W.A. Hemadsorption and cytopathic effect produced by African swine fever virus in swine bone marrow and buffy coat cultures/ W.A. Malmquist, D. Hay // Am J Vet Res. - 1960. - №21. - P. 104-108.
7. Sanchez - Botija, C. African swine fever / C. Sanchez- Botija, A. Ordas // Seminar in the EEC Programme. Madrid, 1976. - P. 658-668.