Иммуногенность и безопасность вакцинных препаратов на основе циркулирующих штаммов bordetella pertussis

ВАКЦИНОЛОГИЯ И ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014

Е.М.Зайцев, Н.У.Мерцалова, М.В.Брицина, М.Н.Озерецковская, И.Г.Бажанова, А.С.Шинкарев, А.В.Поддубиков

ИММУНОГЕННОСТЬ И БЕЗОПАСНОСТЬ ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ШТАММОВ BORDETELLA PERTUSSIS

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва

Цель. Исследование специфической активности и безопасности вакцинных препаратов, приготовленных из циркулирующих штаммов B. ре11ш818 с преобладающими в настоящее время аллель-ными вариантами генов коклюшного токсина (ptxAl) и пертактина (prn2). Материалы и методы. Штаммы B. рег1ш818, выделенные от больных коклюшем в г. Москва в 2001 — 2010 гг., выращивали на плотных и жидких питательных средах. Содержание отдельных антигенов в штаммах B. рег1ш818 определяли в ИФА. Иммуногенность и безопасность препаратов определяли на мышах линии F1(CBAxC57Bl6). Результаты. Все исследованные циркулирующие штаммы B. рег1ш818 экспресси-ровали коклюшный токсин (КТ), филаментозный гемагглютинин (ФГА) и соответствующие серо-вару агглютиногены. На основе циркулирующих штаммов изготовлены цельноклеточные и бесклеточные коклюшные вакцины, в результате изучения иммуногенных, токсических и сенсибилизирующих свойств которых был отобран высокопродуктивный свежевыделенный ток-сигенный штамм B. реГ:ш818, который может быть использован для производства коклюшных вакцин. Заключение. Установлено, что вакцинные препараты, приготовленные на основе адаптированного к росту в жидких питательных средах штамма B. рег1ш818 с характерной для современной популяции аллельной вариацией по генам коклюшного токсина и пертактина ptxAl — prn2, специфически активны и безопасны.

Журн. микробиол., 2014, № 4, С. 18—22

Ключевые слова: штаммы B. реГ:ш818, генетическая структура, коклюшные вакцины, иммуноген-ность, безопасность

E.M.Zaitsev, N.U.Mertsalova, M.V.Britsina, M.N.Ozeretskovskaya, I.G.Bazhanova, A.S.Shinkarev, A.V.Poddubikov

IMMUNOGENICITY AND SAFETY OF VACCINE PREPARATIONS BASED ON CIRCULATING BORDETELLA PERTUSSIS STRAINS

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

Aim. Study specific activity and safety of vaccine preparations based on circulating B. рertussis strains with currently predominating allele variants of pertussis toxin (ptxA1) and pertactin (prn2) genes. Materials and methods. B. pertussis strains isolated from pertussis patients in Moscow in 2001-2010 were grown in dense and liquid media. The content of separate antigens in B. pertussis strains was determined by EIA. Immunogeni-city and safety of the preparations was determined in F1(СBAxС57Bl6) line mice. Results. All the studied circulating B. pertussis strains expressed pertussis toxin (PT), filamentous hemagglutinin (FHA) and agglutinogens corresponding to the serovar. Whole-cell and acellular pertussis vaccines were prepared based on the circulating strains, and a highly productive recently isolated toxigenic B. pertussis strain that could be used for production of pertussis vaccines was selected as a result of studies of immunogenic, toxic and sensibilizing properties. Conclusion. Vaccine preparations based on a B. pertussis strain adapted to growth in liquid media with pertussis toxin and pertactin ptxA1 — prn2 gene allele variation characteristic for contemporary population are specifically active and safe.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 4, P. 18—22

Key words: B. pertussis strains, genetic structure, pertussis vaccines, immunogenicity, safety

ВВЕДЕНИЕ

Эпидемический процесс коклюшной инфекции продолжается, в том числе, в странах с высоким уровнем противококлюшной вакцинации. Одной из причин поддержания эпидемического процесса коклюшной инфекции является изменчивость B. pertussis, лежащая в основе его адаптация к меняющимся условиям внешней среды. Генетическая структура современных штаммов B. pertussis с аллельными вариациями генов, кодирующих основные патогенные факторы коклюшного микроба, отличается от генетической структуры вакцинных штаммов. Среди циркулирующих в настоящее время штаммов B.pertus-sis наблюдается доминирование аллельной вариации по генам коклюшного токсина и пертактина ptxA1 — prn2, отличающихся по нуклеотидному составу от соответствующих аллелей вакцинных штаммов (ptxA2 и ptxA4; prn1), выделенных от больных коклюшем в 50 — 60 гг. ХХ века [6].

Одной из вероятных причин эпидемических вспышек коклюша в старших возрастных группах может быть циркуляция вирулентных штаммов возбудителя на фоне возрастного снижения противококлюшного иммунитета.

Имеющиеся генетические различия между вакцинными и циркулирующими штаммами коклюшного микроба указывают на необходимость совершенствования средств вак-цинопрофилактики коклюша.

Цель работы — исследование специфической активности и безопасности вакцинных препаратов, приготовленных из штаммов B. рertussis с характерной для современной популяции возбудителя генотипической характеристикой субъединиц ptxA коклюшного токсина (ptxA1) и пертактина (prn2). МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Использовали штаммы B. pertussis, выделенные от больных в 2001 — 2010 гг. в Москва. Питательные среды: среда Борде-Жангу с кровью, казеиново-угольный агар (КУА), жидкие питательные среды. Животные: мыши-гибриды линии Fl(СВАxС57Bl6). Обезвреженные корпускулярные препараты из свежевыделенных штаммов B. рertussis готовили в соответствии с [2]. Бесклеточные коклюшные вакцины получали в соответствии с [1].

Содержание отдельных антигенов в среде культивирования коклюшных микробов определяли в ИФА, который проводили в 96-луночных полистироловых планшетах производства фирмы «Nunc» (Дания) и «Биомедикал» (Россия). Оптическую плотность субстратной смеси измеряли с помощью многоканального спектрофотометра вертикального сканирования «Униплан» («Пикон», Россия) при длине волны 450 нм. Для адсорбции на полистероле и в составе пероксидазных конъюгатов использовали гамма-глобулиновые фракции антисывороток к коклюшному токсину, филаментозному гемагглютинину и агглютиногенам 1, 2 и 3.

Иммунобиологические свойства вакцин определяли в соответствии с [2, 3], а специфическую активность — с помощью протективного теста на мышах при внутримозговом введении заражающей дозы нейротропного штамма B. рertussis 18323.

Специфическую токсичность определяли с помощью теста увеличения массы тела мышей путем введения животным внутрибрюшинно дозы цельноклеточной вакцины, рекомендованной для человека (10 МОЕ в объеме 0,5 мл) или дозы бесклеточной коклюшной вакцины, предполагаемой для введения человеку (25 мкг в объеме 0,5 мл).

Остаточную токсичность определяли в тесте отека лапки мыши (ОЛ). Группе из 10 мышей в подушечку задней правой лапки вводили 0,05 мл (1 МОЕ) вакцины, в подушечку задней левой лапки — апирогенный р-р NaCl в том же объеме. Через 5 — 6 часов задние конечности предварительно получивших Рауш-наркоз животных ампутировали по голеностопному суставу и взвешивали. Вычисление остаточной токсичности вакцины проводили согласно [4].

Лейкоцитозстимулирующую активность (ЛСА) вакцин определяли путем подсчета количества лейкоцитов в 1 мм3 периферической крови опытных и контрольных (получивших инъекцию р-р NaCl) животных через 3 суток после внутрибрюшинного введения препарата в дозе 2,5 МОЕ в объеме 0,5 мл.

Хроническую токсичность определяли в группах опытных и контрольных мышей в соответствии с [4]. В опытных группах мышей иммунизировали внутрибрюшинно в течение 10 дней. За курс иммунизации была введена доза вакцины, эквивалентная человеческой. Мыши в контрольной группе получали инъекцию раствора натрия хлорида. Во время

курса прививок и в течение последующих 7 сут регистрировали массу тела мышей. После окончания наблюдения по 5 особей из каждой группы (иммунизированных и контрольных мышей) были препарированы, и их органы (легкие, печень, почки, селезенка) подвергнуты осмотру и взвешиванию.

Определение гистаминсенсибилизирующей активности (ГСА) вакцин проводили согласно [2]. Индекс ГСА рассчитывали как отношение ГСД50 0со5 к ГСД50 вакц , где ОСО 5 — отраслевой стандартный образец. РЕЗУЛЬТАТЫ

На плотных питательных средах (среде Борде-Жангу и казеиново-угольном агаре) микробные клетки штаммов образовывали типичные для B. pertussis колонии. Все исследованные штаммы имели характерные признаки гладкой формы (фаза I) бактерий.

Ранее было установлено [5], что из 35 исследованных штаммов 32 штамма относились к серовару 1.0.3, 2 штамма — к серовару 1.2.3 и 1 штамм к серовару 1.2.0, а по структуре гена ptхА все изученные штаммы (35) относились к аллельной вариации ptхА1. Нуклеотидная последовательность гена prn у большинства штаммов характеризовалась как prn 2, два штамма имели аллели prn3 и prn1, соответственно.

На основании иммуноферментного анализа было установлено, что все штаммы экс-прессировали коклюшный токсин, ФГА и соответствующие серовару штамма агглютино-гены.

Содержание коклюшного токсина в современных штаммах варьировало в широких пределах (от 3 нг до 68 нг/МОЕ/мл) и в среднем соответствовало количеству КТ в вакцинных штаммах (МЕ=16,3±3,4 и 13,6+3,2 нг/МОЕ/мл, соответственно), т.е. не зависело от генотипической характеристики ptхА штаммов. Вместе с тем, 24% изученных свежевыде-ленных штаммов по уровню токсинообразования достоверно превышали средний показатель и содержали от 20 до 80 нг/МОЕ/мл КТ.

Содержание филаментозного гемагглютинина и агглютиногенов 1, 2, 3 в свежевыде-ленных штаммах не отличалось от их содержания в вакцинных штаммах.

На основе циркулирующих штаммов изготовлены цельноклеточные вакцинные препараты (ЦКВ). В качестве препаратов сравнения были использованы вакцины ЦКВ из трех вакцинных штаммов (№ 305, № 267 и № 475).

В протективном тесте было установлено, что из 14 препаратов достаточный уровень защиты в тесте на выживаемость (от 60 до 90%) обеспечивали цельноклеточные препараты, приготовленные из 7 штаммов. Остальные цельноклеточные препараты были неим-

Токсические и сенсибилизирующие свойства иммуногенных цельноклеточных вакцин из свежевыделенных штаммов B.pertussis

Хроническая токсичность

№ штаммов Защитная активность (% выжив.) Тест на увеличение массы мышей (%) Тест ОЛ (%) к контролю Печень Почки Селезенка ЛСА (ед.) Индекс ГСА

к контролю Весовой индекс Р Весовой индекс р Весовой индекс р

162-01 89 74,2 17,8 0,075 >0,2 0,017 >0,05 0,009 >0,2 0,88 0,36

186-01 60 71,1 20,8 0,055 <0,001 0,014 <0,02 0,006 <0,01 0,67 7,63

151-03 70 9,5 25,0 0,052 <0,001 0,013 <0,02 0,007 <0,05 1,32 1,72

11-04 75 <10,0 38,7 0,06 <0,005 0,015 >0,1 0,008 >0,1 1,09 3/05

6-05 90 35,9 23,2 0,07 < 0,005 0,015 <0,02 0,007 <0,02 0,87 0,32

15-05 62 74,7 24,7 0,07 >0,1 0,017 >0,2 0,009 >0,5 0,90 2,25

19-05 65 100 29,4 0,06 <0,002 0,014 <0,001 0,008 <0,05 1,72 1,32

475 82 62,7 37,6 0,066 >0,05 0,019 >0,2 0,007 <0,05 0,43 1,44

305 86 50,2 66,6 0,078 >0,5 0,016 >0,05 0,008 >0,2 0,58 1,1

267 контроль 74 77,2 38,5 0,068 0,076 <0,02 0,03 0,017 <0,001 0,007 0,01 <0,02 0,54 6,7

муногенны, т.к. после введения разрешающей дозы вирулентного штамма 18323 выживаемость подопытных животных составляла от 20 до 50% .

Цельноклеточные коклюшные препараты, приготовленные из вакцинных штаммов, защищали 74 — 86 % животных от заражающей дозы вирулентного штамма B.pertussis 18323.

В табл. представлены результаты оценки токсических и сенсибилизирующих свойств иммуногенных цельноклеточных вакцин, приготовленных из свежевыделенных и вакцинных штаммов.

Общепринятым критерием безопасности коклюшных препаратов [4] является тест на увеличение массы тела животных. Как следует из табл., вакцины из 4 циркулирующих штаммов отвечали установленным требованиям, т.к. увеличение массы тела животных превышало 60% по сравнению с контролем, вакцины из производственных штаммов (№ 475 и № 267) также отвечали этому тесту.

При определении токсичности по тесту отека лапки мыши вакцины из циркулирующих штаммов, кроме штамма № 11-04, оценивались как слаботоксичные. Вакцины из производственных штаммов № 475, № 267 и из циркулирующего штамма № 11-04 являлись среднетоксичными. Вакцины из производственного штамма № 305 обладали выраженной токсичностью.

Безопасность вакцин из циркулирующих штаммов была также оценена в тесте хронической токсичности. Одним из критериев, отражающих влияние вводимой вакцины на организм животных является весовой индекс, т.е. отношение массы органа к массе тела. Представленные в таблице данные свидетельствуют о том, что хроническое введение большинства вакцин оказывает негативное влияние на 1, 2 или 3 органа животного, вызывая уменьшение массы, наименее уязвимыми оказались легкие животных: в табл. не приводится, т.к. только одна вакцина из производственного штамма № 475 вызывала достоверное снижение массы легких.

Наиболее уязвимой оказалась печень (у 7 групп из 11), затем почки и селезенка (у 5 групп). Введение препаратов из штаммов 305, 162-01 и 15-05 не оказало влияния на органы мышей.

Выраженными лейкоцитозстимулирующими свойствами обладали вакцины из циркулирующих штаммов 151-03, 11-04 и 19-05 (ЛС-активность >1).

При оценке сенсибилизирующих свойств было установлено, что большинство препаратов обладало выраженными гистаминсенсибилизирующими свойствами независимо от генотипической принадлежности штаммов B. pertussis, т.к. индекс гистаминсенсиби-лизирующей активности превышал 1,0.

Таким образом, только одна из иммуногенных вакцин, приготовленная из циркулирующего штамма № 162-01, оказалась специфически безопасна и не обладала выраженной ГС-активностью. ОБСУЖДЕНИ Е

Разработана технология получения бесклеточных коклюшных вакцин (БКВ) из свежевыделенных штаммов B. pertussis, соответствующих по структуре гена коклюшного токсина ptхА и гена пертактина prn циркулирующим штаммам возбудителя и адаптированных к росту в жидких питательных средах. Полученные препараты обладали выраженной протективной активностью и содержали не менее 4 МЗЕ в дозе 25 мкг белка, предполагаемой для введения человеку, что соответствует требованиям ВОЗ [4]. Полученные препараты были специфически безопасны, увеличение массы тела составляло 72 — 77% по сравнению с контролем и не сенсибилизировали животных к гистамину гидрохлориду в дозе, четырехкратно превышающей иммунизирующую дозу для человека.

Полученные нами [5] и другими исследователями ранее [7] результаты свидетельствуют о наличии в популяции свежевыделенных штаммов В. pertussis штаммов с повышенным уровнем токсинообразования. Имеющиеся генетические отличия между вакцинными и циркулирующими в настоящее время штаммами, а также наличие в популяции возбудителя коклюша штаммов с повышенным уровнем токсинообразования и высокой вирулентностью диктует необходимость исследования возможности создания на их основе вакцинных препаратов. Ведущим фактором патогенеза коклюшной инфекции является коклюшный токсин. В связи с этим, важное практическое значение имеет отбор цирку-

лирующих штаммов с высоким уровнем токсинопродукции. Способность к росту в культуре также является важной характеристикой штаммов.

В результате проведенных исследований был отобран циркулирующий штамм серо-вара 1.0.3., имеющий типичные для циркулирующих штаммов генотипические характеристики, но отличающийся высоким уровнем токсинообразования. Штамм M 162-01 депонирован в коллекции штаммов ГИСК им. Л.А.Тарасевича, получен патент на изобретение M 2407788, 2009 г. «Свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis — продуцент коклюшного токсина». Штамм перспективен для включения в состав корпускулярных и бесклеточных коклюшных вакцин.

ЛИТЕРАТУРА

1. Захарова Н.С., Брицина M.ß., Mерцалова Н.У. и др. Отечественная бесклеточная коклюшная вакцина. Журн. микробиол. 2008, 1:35-41.

2. Инструкция по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий. M., 1987.

3. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. Сороковой доклад ВОЗ. Женева, 1992.

4. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (иммунобиологические лекарственные препараты). M., 2012.

5. Шинкарев А.С., Mерцалова Н.У., Mазурова И.К. и др. Современные штаммы B. рertussis: иммунобиологические свойства и совершенствование вакцин. Журн. микробиол. 2007, 4: 20-25.

6. Mooi F.R. Bordetella pertussis and vaccination: the persistence of a genetically monomorphic pathogen. Infect. Genet. Evol. 2010, 10 (1): 36-49.

7. Mooi F.R., van Loo I.H., van Gent M. et al. Bordetella pertussis strains with increased toxin production assotiated with pertussis resurgence. Emerg. Infect. Dis. 2009, 15 (8): 1206 — 1213.

Поступила 17.10.13

Контактная информация: Зайцев Евгений Mихайлович, д.м.н., 105064, Mосква, M. Казенный пер, 5а, р.т. (495)916-22-63

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014

Н.И.Микшис, П.Ю.Попова, О.М.Кудрявцева, А.П.Семакова, Л.В.Новикова, А.Л.Кравцов, С.А.Бугоркова, Т.Н.Щуковская, Ю.А.Попов, В.В.Кутырев

ИММУНОГЕННОСТЬ И БЕЗОПАСНОСТЬ ПРОТОТИПА ХИМИЧЕСКОЙ СИБИРЕЯЗВЕННОЙ ВАКЦИНЫ НА МОДЕЛИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов

Цель. Оценить иммуностимулирующее и токсическое действие белковых компонентов прототипа вакцины. Материалы и методы. Линейных мышей, морских свинок и кроликов иммунизировали подкожно однократно или двукратно рекомбинантным протективным антигеном (рПА), белком S-слоя (ЕА1) или их комплексом. Активацию структур врожденного иммунитета регистрировали по изменению экспрессии Toll-подобных рецепторов (TLR). Показатели адаптивного иммунитета определяли установленными способами. Токсичность препаратов выявляли с использованием проточной цитофлуориметрии и денситоморфометрии. Результаты. Установлена способность рПА и ЕА1 активировать структуры врожденного иммунитета линейных мышей — TLR 2 и 6 типа. Определены особенности динамики титров анти-ПА антител для каждого вида животных, осуществлено сравнение с антителообразованием при иммунизации Bacillus anthracis СТИ-1. Показано, что двукратная иммунизация биомоделей комплексным препаратом в сочетании с адъювантом обеспечивает защиту от заражения тест-штаммом, сопоставимую с протективностью живой вакцины. В ходе исследования не было выявлено свидетельств повреждающего действия рПА и ЕА1 на клетки и ткани макроорганизма. Заключение. На основании результатов комплексного тестирования прототип разрабатываемой химической сибиреязвенной вакцины обладает высокой иммуногенно-стью, а его белковые компоненты не токсичны для лабораторных животных.

Журн. микробиол., 2014, № 4, С. 22—30

Ключевые слова: Bacillus anthracis, сибирская язва, рекомбинантный протективный антиген, белок S-слоя ЕА1, вакцины