Влияние адсорбированных на мембране эритроцитов белков на параметры биоимпедансной спектроскопии красных клеток крови

БИОЛОГИЯ

УДК 591. 111

М. В. Малахов, А. А. Мельников, А. Д. Викулов

ВЛИЯНИЕ АДСОРБИРОВАННЫХ НА МЕМБРАНЕ ЭРИТРОЦИТОВ БЕЛКОВ НА ПАРАМЕТРЫ БИОИМПЕДАНСНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ КРАСНЫХ КЛЕТОК КРОВИ

Изучено влияние белков, адсорбированных на мембране красных клеток крови, на параметры биоимпедан-сной спектроскопии (БИС) эритроцитарных суспензий. Исследовались суспензии обработанных и необработанных трипсином эритроцитов в растворе альбумина. Параметры БИС (сопротивление внеклеточной Re и внутриклеточной Ri жидкости, характеристическая частота Fchar, емкость клеточных мембран Cm и параметр Alpha) суспензий определялись на биоимпедансном анализаторе АВС-01 «Медасс». Установлено, что Ri и Cm суспензий обработанных трипсином эритроцитов были меньше, чем необработанных. Таким образом, адсорбированные на поверхности мембраны белки влияют на параметры БИС эритроцитов.

Ключевые слова: эритроциты, биоимпедансная спектроскопия, адсорбированные на мембране белки.

Введение. Для оценки показателей крови может быть использован метод биоимпедансной спектроскопии (БИС) [1, с. 115]. С помощью этого метода можно определить гематокрит [2, с. 299; 3, с. 653], содержание гемоглобина, концентрацию эритроцитов [4]. На параметры БИС крови влияют белки плазмы [5, с. 179; 6, с. 181]. В работе Zhao [5, с. 179] указывается, что плазменные протеины повышают сопротивление внеклеточной жидкости и емкость клеточных мембран. Однако известно, что белки могут находиться в плазме как в свободном состоянии, так и быть адсорбированными на поверхности эритроцитов [7, с. 501]. Исследований, посвященных влиянию белков, адсорбированных на мембране красных клеток крови, на электрические свойства эритроцитов в литературе нет. Можно предположить, что протеины, адсорбированные на поверхности красных клеток крови, в основном вызовут изменение электрической емкости мембран.

Целью нашей работы было выявить влияние белков, адсорбированных на мембране эритроцитов, на параметры биоимпедансной спектроскопии суспензий красных клеток крови.

Материалы и методы. Приготовление суспензий эритроцитов. Образцы венозной крови (n = 11) объемом 9 мл центрифугировали на 3 000 об/ мин в течение 10 мин на центрифуге ОПн-8, затем надосадочную жидкость полностью удаляли. Поученную концентрированную суспензию эритроцитов отмывали трехкратным центрифугированием в

6 мл 0.9 % раствора хлорида натрия по 10 мин на 3 000 об/мин, надосадочную жидкость также полностью удаляли. Концентрированную суспензию отмытых эритроцитов делили на две равные порции.

Одну из порций инкубировали с трипсином (10 мг кристаллического трипсина в 6 мл 0.9 % раствора хлорида натрия) в течение часа. Затем концентрированную суспензию эритроцитов отмывали по описанной выше методике.

После этого обе порции (как обработанных, так и не обработанных трипсином эритроцитов) инкубировали в 10 % растворе альбумина в течение часа. Затем суспензии центрифугировали на

3 000 об/мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость после центрифугирования удаляли, гематокрит доводили до 93-94 %. Гематокрит (Ht) суспензий контролировался центрифугированием в гематокритном капилляре на 5 000 об/мин в течение 15 мин.

Биоимпедансная спектроскопия. Электрические измерения суспензий эритроцитов выполнялись при комнатной температуре (21+1 оС) на биоимпедансном анализаторе «АВС-01 Медасс» в диапазоне частот 5-500 кГц. Исследуемые образцы объемом 1 мл помещали в измерительную камеру, которая представляет собой пластиковую трубку с двумя парами потенциальных и токовых электродов. Методика измерения подробно описана в нашей предыдущей работе [4]. С использованием программного обеспечения «АВС01-024 Медасс» определялись параметры биоимпедансной спектроскопии: сопротивление внеклеточной (Re) и внутриклеточной (Ri) жидкости, характеристическую частоту (Fchar), параметр Alpha и емкость клеточных мембран (Cm).

Результаты и их обсуждение. Известно, что трипсин отщепляет сиаловые кислоты от мембраны эритроцитов, вследствие чего уменьшается количество протеинов, адсорбированных на поверхности красных клеток крови [8, с. 350]. Таким

образом, в суспензиях эритроцитов в растворе альбумина количество белка, адсорбированного на поверхности красных клеток крови, обработанных трипсином, очевидно, было меньше, чем на поверхности необработанных. Гематокрит измеряемых суспензий был стандартным (Ш = 94.3 ± 2.1 % и 93.8 ± 3.3 % для необработанных и обработанных трипсином суспензий соответственно), а значит, не влиял на их электрические свойства. Следовательно, можно предположить, что полученные различия показателей БИС суспензий обусловлено разным количеством белков на мембранах красных клеток крови. Значения параметров БИС суспензий обработанных и необработанных трипсином эритроцитов представлены в таблице.

Параметры БИС суспензий обработанных и не обработанных трипсином эритроцитов

Параметры БИС Не обработанные Обработанные

Re, Ом б1б.7 і 107.8 б49.7 і 102.0

Ri, Ом 58.9 і 3.9 55.7 і 4.5*

Fchar, кГц 239.7 і 43.4 23б.5 і 32.1

Alpha 0.31б і 0.002 0.317 і 0.003

Cm, пФ 50.4 і 5.1 47.0 і 5.0*

* - p < 0.05.

Известно, что сопротивление внеклеточной и внутриклеточной жидкости отражают объем соответственно внеклеточной и внутриклеточной жидкости [9, с. 337]. Поскольку общий объем внеклеточной и внутриклеточной жидкости измеряемых суспензий в нашем исследовании был одинаковым, можно было бы ожидать, что Re и Ш также не изменятся. И действительно, Re измеряемых суспензий не различались (табл.). Однако Ш обработанных трипсином эритроцитов было меньше, чем необработанных (таблица). Поскольку сопротивление внутриклеточной жидкости связано с емкостью клеточных мембран [3, с. 653], уменьшение емкости вследствие удаления с поверхности красных клеток крови белков, по-видимому, приводит к снижению Ri.

По данным литературы, характеристическая частота обратно пропорциональна емкости и сопротивлению измеряемого биологического объекта

[10, с. 187]. Поскольку сопротивление и общая электрическая емкость измеряемых суспензий, по-видимому, не различались, Fchar суспензий обработанных и необработанных трипсином эритроцитов была одинаковой (таблица).

В литературе указывается, что Alpha зависит от формы и размеров клеточных элементов измеряемых биообъектов, а также от степени их неоднородности [10, с. 210; 11, с. 2643]. Очевидно, в нашем исследовании трипсин не влиял на форму и размеры эритроцитов, и однородность измеряемых суспензий не менялась, поэтому Alpha суспензий обработанных и необработанных трипсином эритроцитов не различались (таблица).

Cm суспензий обработанных трипсином эритроцитов была меньше, чем необработанных (таблица). Известно, что трипсин отщепляет сиало-вые кислоты и уменьшает количество белков, адсорбированных на мембранах красных клеток крови [8, с. 350]. Так как концентрация альбумина в суспендирующих растворах была одинаковой, можно предположить, что снижение емкости клеточных мембран связано именно с устранением протеинов с их поверхности. В работах [5, с. 179; 6, с. 181] также говорится, что влияние белков плазмы на Cm может быть обусловлено их адсорбцией на мембране эритроцитов.

Следует отметить, что клеточные мембраны играют важнейшую роль в жизнедеятельности клеток [12, с. 8]. Кроме того, изучение мембран эритроцитов может помочь в диагностике ряда заболеваний [13, с. 31]. Возможно, дальнейшее изучение клеток крови и других тканей методом БИС позволит глубже изучить структуру клеточных мембран и физиологические процессы, происходящие в них.

Выводы. Результаты нашего исследования показали, что после инкубации красных клеток крови с трипсином снизились емкость клеточных мембран и сопротивление внутриклеточной жидкости эритроцитарных суспензий в растворе альбумина, что связано с уменьшением количества белков, адсорбированных на мембранах эритроцитов. Значения остальных параметров БИС не менялись.

Список литературы

1. Zhao T. X . New applications of electrical impedance of human blood // J . Med . Eng . Technol . 1996 . № 20 (3) . P. 115 .

2 . Zhao T. X . Electrical impedance and haematocrit of human blood with various anticoagulants // Physiol . Meas . 1993. № 14 (3) . P. 299 .

3 . Ulgen Y. , Sezdi M . Physiological quality assessment of stored whole blood by means of electrical measurements // Med . Bio . Eng . Comput. 2007 .

№ 45 P 653

4 . Malahov M . V., Smirnov A . V. , Nikolaev D . V. et al . Bioimpedance spectroscopy as technique of hematological and biochemical analysis of blood

// J . Phys .: Conf. Ser. 2010 . 224 (1) . Doi 0121302010 .

5 . Zhao T. X . Contributions of suspending medium to electrical impedance of blood // Biochim . Biophys .Acta . 1994. № 1201 (2) . P. 179 .

6 . Zhao T. X ., Jacobson B . Quantitative correlations among fibrinogen concentration, sedimentation rate and electrical impedance of blood // Med .

Biol . Eng . Comput. 1997 . № 35 (3) . P. 181.

7 . Frommel D . , Grob P. J ., Masouredis S . P. et . al . Studies on the mechanism of Immunoglobulin binding to red cells // Immunology. 1967 . № 13 .

P. 501.

— б7 —

8 . Ponder E . Effects produced by trypsin on certain properties of the human red cell // Blood . 1951. № 6 (4) . P. 350 .

9 . Cornisht B . H . et al . Improved prediction of extracellular and total body water using impedance loci generated by multiple frequency bioelectrical

impedance analysis // Phys . Med . Biol . 1993. № 38 . P. 337 .

10 . Grimnes S ., Martinsen O . G . Bioimpedance and bioelectricity basics (2nd ed .) . L .: Academic Press, 2008. 391 p .

11. Martinsen 0 . G . et al . Interface phenomena and dielectric properties of biological tissue // 2002 . Encyclopedia of Surface and Colloid Science . P. 2643.

12 . Артюхов В . Г ., Наквасина М . А. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими аген-

тами . Воронеж: Изд-во Ворон . гос. ун-та, 2000 . 296 с.

13 . Новицкий В . В . и др . Концентрация сульфгидрильных групп и липопротеинового комплекса в эритроцитах периферической крови у де-

тей с аутоиммунным тиреоидитом (АНТ) и диффузным нетоксическим зобом (ДНЗ) // Вестн . Томского гос . пед . ун-та . 2000 . Вып . 9 . С . 30 .

Малахов М. В., аспирант.

Ярославский государственный педагогический университет им. К. Д. Ушинского.

Ул. Республиканская, 108, г. Ярославль, Ярославская область, Россия, 150000.

E-mail: malahovmv@mail.ru

Мельников А. А., доктор биологических наук, доцент, зав. кафедрой.

Ярославский государственный педагогический университет им. К. Д. Ушинского.

Ул. Республиканская, 108, г. Ярославль, Ярославская область, Россия, 150000.

E-mail: a.melnikov@yspu.yar.ru

Викулов А. Д., доктор биологических наук, профессор, декан, зав. кафедрой.

Ярославский государственный педагогический университет им. К. Д. Ушинского.

Ул. Республиканская, 108, г. Ярославль, Ярославская область, Россия, 150000.

E-mail: vic@yspu.yar.ru

Материал поступил в редакцию 30.08.2010. M. V. Malakhov, A. A. Melnikov, A. D. Vikulov

influence of proteins adsorbed on erythrocyte membranes on bioimpedance spectroscopy

parameters of red blood cells suspensions

The influence of the proteins adsorbed on the red blood cells membranes on the bioimpedance spectroscopy (BIS) parameters of the erythrocyte suspensions was studied. The suspensions of the erythrocytes treated and untreated with trypsin were estimated. The BIS parameters: extracellular (Re) and intracellular (Ri) fluid resistance, characteristic frequency (Fchar), cell membranes capacitance (Cm) and Alpha parameter of the suspensions were measured on the BIA analyzer ABC-01 «Medass». It was found that Ri and Cm of the suspensions of treated erythrocyte were lower than that of the untreated one. So the proteins adsorbed on the membrane surface influence the BIS parameters.

Key words: Erythrocytes, bioimpedance spectroscopy, adsorbed membrane proteins.

Malakhov M. V

Yaroslavl State Pedagogical University named after K. D. Ushinskiy.

Ul. Respublikanskaya, 108, Yaroslavl, Yaroslavl region, Russia, 150000.

E-mail: malahovmv@mail.ru

Melnikov A. A.

Yaroslavl State Pedagogical University named after K. D. Ushinskiy.

Ul. Respublikanskaya, 108, Yaroslavl, Yaroslavl region, Russia, 150000.

E-mail: a.melnikov@yspu.yar.ru.

Vikulov A. D.

Yaroslavl State Pedagogical University named after K. D. Ushinskiy.

Ul. Respublikanskaya, 108, Yaroslavl, Yaroslavl region, Russia, 150000.

E-mail: vic@yspu.yar.ru