Биохимические маркёры костного и остеокластического дифферонов в плазме крови при подострой интоксикации дихлорэтаном

Все животные контрольных и экспериментальных групп после выхода из наркоза идентично восстановили пищевое поведение, физическую активность и поведенческие стереотипы.

ВЫВОДЫ

1. Из сапропеля выделен и очищен от примесей антикоагулянт, специфично угнетающий заключительный этап свёртывания крови. По химической природе выделенный и очищенный эффектор является пептидом.

2. Как в модельных пробирочных тестах, так и при введении животным выделенный пептид тормозит тромбиновое время плазмы крови, а его эффект сохраняется не менее 60 мин.

3. Введение антикоагулянта не приводит к гибели животных или явным нарушениям их физического состояния, что свидетельствует об отсутствии острого токсического действия.

4. Выделенный пептидный антикоагулянт из сапропеля можно рассматривать как основу для разработки фармакологического средства коррекции гемостаза.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., Умутбаева М.К. О возможной роли ингибитора самосборки фибрина в регуляции свёртывания крови // Гематол. и трансфу-зиол. - 1985. - Т. 30, №1. - С. 35-38. [Byshevskiy A.Sh., Chiryat'ev E.A., Umutbaeva M.K. The possible role of fibrin self-assemble inhibitor in blood clotting regulation. Gematologiya i Transfuziologiya. 1985; 30 (1): 35-38. (In Russ.)]

2. Дарбре А. Практическая химия белка / Под ред. УДК 612.753: 612.084: 616-008.853.8: 615.917: 616.15

А. Дарбре. - М.: Мир, 1989. - 621 с. [Practical protein chemistry — a handbook. Ed. by A. Darbre. John Wiley and Sons, Chichester. 1986; 620 p. Russ Ed.: A. Darbre. Prakticheskaya khimiya belka. Moscow: Mir. 1989; 621 p.]

3. Дементьева И.А. Защитное действие недиализую-щейся фракции экстракта медуницы при угрозе тромбоза / В кн.: Обмен веществ в норме и патологии. / Под ред. А.Ш. Бышевского. — Тюмень: ТюмГМИ, 1992. — С. 30. [Dement'eva I.A. Protective activity of nondialyzable fraction of lungwort extraction at the risk of thrombosis, in Obmen veshchestv v norme i patologii. (Metabolism in health and disease.) Ed. by A.Sh. Byshevskiy. Tyumen: Tyumen State Medical Institute. 1992; 30 р. (In Russ.)]

4. Калинин Е.П., Русакова О.А., Чирятьев Е.А. Способ получения антикоагулянта из сапропеля. Патент на изобретение №RUS2175552 от 16.03.2000. [Kalinin E.P., Rusakova O.A., Chiryat'ev E.A. A method for obtaining anticoagulant from peloid. Patent for invention №RUS2175552, issued at 16.03.2000. (In Russ.)]

5. Государственный реестр лекарственных средств. — http://www.grls.rosminzdrav.ru (дата обращения: 30.08.2015). [State Drug Registry. http://www.grls. rosminzdrav.ru (Access date: August 30, 2015).]

6. Суханова Г.А., Меликян А.Л., Вахрушева М.В. и др. Варфариновый некроз кожи у пациента с дефицитом протеина С // Тромбоз, гемостаз и реология. — 2014. — №1. — С. 75-82. [Sukhanova G.A., Melikyan A.L., Vachrusheva M.V. Varfarin-induced skin necrosis in patient with deficiency of protein С. Tromboz, gemostaz i reologiya. 2014; 1: 75-82. (In Russ.)]

7. Чирятьев Е.А., Бышевский А.Ш, Яковлева Н.В., Платонов Е.В. Способ получения средства, обладающего антикоагулянтной активностью Патент на изобретение №RUS2101023 от 10.01.1998. [Chiryat'ev E.A., Byshevskiy A.Sh., Yakovleva N.V., Platonov E.V. A method for obtaining a substance with anticoagulant activity. Patent for invention №RUS2101023, issued at 10.01.1998. (In Russ.)]

8. Dimova N. RP-HPLC analysis of amino acids with UV-detection // Compter rendus l'Academie bulgare des Sciences. — 2003. — Vol. 56, N 12. — P. 75-78.

9. Ellis G, Camm A.J., Datta S.N. Novel anticoagulants and antiplatelet agents; a guide for the urologist // BJU International. — 2015, Mar 23. — DOI: 10.1111/bju.13131. [Epub ahead of print]

биохимические маркёры костного и остеокластическош дифферонов в плазме крови при подострой интоксикации

дихлорэтаном

Феликс Хусаинович Камилов', Екатерина Рафаэловна Фаршатова1, Дамир Ахметович Еникеев1, Галина Васильевна Иванова2*

'Башкирский государственный медицинский университет, г. Уфа, Россия;

2ООО «Проммедэко», г. Уфа, Россия

Реферат DOI: 10.17750/KMJ2015-828

цель. Исследовать в плазме крови содержание растворимого лиганда рецептора активатора ядерного фактора кВ (RANKL), остеопротегерина и склеростина в модели подострой интоксикации дихлорэтаном у крыс.

Методы. Эксперименты проведены на 20 половозрелых самцах крыс с массой тела 180-200 г. Крысам опытной группы ежедневно внутрижелудочно в течение 2 мес вводили дихлорэтан в оливковом масле из расчёта 0,84 мг/кг массы тела, что в суммарной дозе составило 0,1 ЛД50. Животным контрольной группы вводили соответствующий объём оливкового масла. С использованием коммерческих наборов реагентов методом иммунофер-ментного анализа в плазме крови определяли содержание растворимого RANKL (реагенты «Free RANKL»), остеопротегерина («Osteoprotegerin») и склеростина («Sderostin») фирмы «Biomedica Medizinprodukte Gmb and CoKG».

Адрес для переписки: bro-raops@yandex.ru 828

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием пакета программы Statistica 6,0 (Stat Soft).

Результаты. При действии дихлорэтана у животных в плазме крови повышался уровень растворимого RANKL, снижалось содержание остеопротегерина, отражая интенсификацию остеокластогенеза и функциональное состояние остеокластов. Содержание склеростина — негативного регулятора остеобластогенеза — увеличивалось, свидетельствуя об ингибировании дифференцировки преостеобластов и функции остеобластов

Вывод. При подострой интоксикации дихлорэтаном в плазме крови содержание лиганда рецептора активатора ядерного фактора кВ (RANKL) увеличивается, остеопротегерина — уменьшается, склеростина — повышается.

ключевые слова: костная ткань, RANKL, остеопротегерин, склеростин, интоксикация дихлорэтаном.

BIOCHEMICAL MARKERS OF BONE AND OSTEOCLASTIC DIFFERONS IN PLASMA AT SUBACUTE DICHLOROETHANE INTOXICATION

F.Kh. Kamilov', E.R. Farshatova', D.A. Enikeev', G.V. Ivanova2

'Bashkir State Medical University, Ufa, Russia;

2OOO «Prommedeko» Ufa, Russia

Aim. To explore the plasma level of soluble receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL), osteoprotegerin and sclerostin in a model of subacute dichloroethane intoxication in rats.

Methods. Experiments were carried out on 20 adult male rats weighing 180-200 g. The rats of the experimental group were administered dichloroethane at the dose of 0.84 mg/kg, mixed with olive oil by a gastric tube daily for two months, which amounted to 0,1 LD50. Control animals received an adequate amount of olive oil. Levels of soluble RANKL, osteoprotegerin and sclerostin were determined in blood serum by ELISA using commercially available reagent kits (reagents «Free RANKL», «Osteoprotegerin» and «Sclerostin» by «Biomedica Medizinprodukte Gmb and CoKG» company. Statistical data processing was performed using the Statistica 6.0 (Stat Soft) software package.

Results. Exposure to dichloroethane resulted in increased levels of soluble RANKL, reduced levels of osteoprotegerin, reflecting the intense new bone formation and the functional state of osteoclasts. The level of sclerostin, which is the negative regulator for new bone formation, was elevated, indicating osteoblast precursors' differentiation inhibition and decreased function of osteoblasts.

Conclusion. In subacute dichloroethane intoxication, the serum level of soluble receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) increases, osteoprotegerin level reduces, sclerostin level increases.

Keywords: bone, RANKL, osteoprotegerin, sclerostin, dichloroethane intoxication.

В формировании и поддержании структуры костной ткани принимают участие клетки двух дифферонов — костного и остео-кластического [6], участвующих в процессах ремоделирования. Остеокластогенез с активацией фазы резорбции в процессах ремоде-лирования, так же как и фаза остеогенеза, регулируется многоуровневой системой, включающей кальций-регулирующие (па-ратиреоидный гормон, кальцитонин, каль-цитриол) и другие гормоны (инсулин, со-матотропин, половые), системные ростовые факторы (макрофагально-колониестимули-рующий, инсулиноподобные, фактор роста фибробластов и др.), локальные (коротко-дистантные) факторы: трансформирующие факторы роста, простагландины, костные морфогенетические белки и др. Взаимосвязь и дублирование их регулирующих эффектов значительно повышает их надёжность.

В механизмах контроля метаболических функций и ремоделирования костной ткани особую роль играет цитокиновая система рецептора активатора ядерного фактора кв (RANK) — его лиганд (RANKL), остеопротегерин (OPG) [5, 10]. RANKL синтезируется остеобластами. Взаимодействуя с RANK на предшественниках остеокластов, он активирует созревание остеокластов, осуществляющих интенсивную резорбцию костной ткани. Одновременно регистрируется торможение апоптоза остеокластов с удлинением периода их функциональной активности [5, 9].

OPG — растворимый рецептор RANKL, также экспрессируется остеобластами и связывает RANKL, являясь специфической «ловушкой» данного лиганда. Взаимодействие RANKL с OPG задерживает пролиферацию остеокластов, их дифференцировку, что в конечном итоге снижает резорбцию кости [10]. Таким образом, общее «конвергентное» соотношение RANKL/OPG контролирует выраженность остеокластной дифференци-ровки, активность и апоптоз остеокластов.

Для дифференцировки преостеобластов в зрелые остеобласты необходимо участие транскрипционного фактора Osterix/Sp7 и RUNX-2 [7]. Снижают остеогенную дифференциацию транскрипционные факторы Twist [8]. Важнейшими регуляторами осте-огенной дифференциации служат секреторные белки семейства морфогенов Wnt: трансформирующие ростовые факторы-р1, -Р2 и -р3, активины, ингибины, факторы роста фибробластов-2, и -9, инсулиноподоб-ный фактор роста-1, костные морфогенети-ческие белки [2].

Сигнальную систему Wnt/p-catenin ин-гибирует склеростин, который в постна-тальном периоде вырабатывается только остеоцитами и гипертрофированными минерализованными хондроцитами [1]. Склеростин взаимодействует с рецептором липопротеинов низкой плотности 5, который вместе с корецептором липопротеинов низкой плотности 6 служит основным мем-

Таблица 1

содержание регуляторных цитокинов в плазме крови (пмоль/л) при 2-месячной нодострой интоксикации

дихлорэтаном, Ме [Qi; Q3]

Цитокины Контрольная группа, n=10 Основная группа (дихлорэтан 0,1 ЛД50), n=10 Критерий Манна-Уитни

sRANKL 0,60 [0,12; 1,29] 0,74 [0,73; 0,76] 0,0405

OPG 0,41 [0,40; 0,43] 0,26 [0,11; 0,34] 0,0029

Склеростин 12,3 [12,2; 12,5] 18,5 [12,9; 18,7] 0,0206

Примечание: sRANKL — растворимый рецептор активатора ядерного фактора кВ; OPG — остеопротегерин: ЛД50 -полулетальная доза.

браносвязанным кофактором Wnt/p-catenin сигнального пути, стимулирующим остео-бластогенез и функции остеобластов [9], являющимся негативным регулятором остео-бластогенеза [11].

Проведённые ранее эксперименты показали, что подострая интоксикация дихлорэтаном в суммарных дозах 0,05 полулетальной дозы (ЛД50) и 0,1 ЛД50 у экспериментальных животных вызывает изменения ремоделирования костной ткани с превалированием процессов резорбции, повышение катаболизма костного коллагена и угнетение его биосинтеза [3].

Цель настоящего исследования — оценить изменения содержания в плазме крови растворимого лиганда RANKL, OPG и склеростина при подострой интоксикации дихлорэтаном у крыс.

Эксперименты проведены на 20 половозрелых самцах крыс c массой тела 180-200 г. Крысам основной группы (n=10) ежедневно внутрижелудочно в течение 2 мес вводили дихлорэтан в оливковом масле из расчёта 0,84 мг/кг массы, что в суммарной дозе составило 0,1 ЛД50 [4]. Животным контрольной группы (n=10) вводили соответствующий объём оливкового масла.

С использованием коммерческих наборов реагентов методом иммуноферментно-го анализа в плазме крови определяли содержание растворимого RANKL (реагенты «Free RANKL»), OPG («Osteoprotegerin») и склеростина («Sclerostin») фирмы «Biomedica Medizinprodukte Gmb and CoKG». Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием пакета программы Statistica 6,0 (Stat Soft).

У экспериментальных животных при подострой интоксикации дихлорэтаном в малой дозе в плазме крови наблюдалось снижение содержания OPG и повышение sRANKL (табл. 1).

При этом «Конвергентное» соотношение RANKL/OPG существенно повышалось с 1,46±0,22 (X±Sx) у контрольной группы жи-830

вотных и до 2,84±32 (р <0,02) в основной группе, что отражает активацию процессов дифференцировки и созревания остеокластов. Угнетение экспрессии OPG наблюдают при состояниях, протекающих с превалированием резорбции кости над формированием новой ткани, — гипоэстрогене-мии, гиперпаратиреоидизме, длительной стероидной терапии, усилении секреции провоспалительных интерлейкинов, проста-гландина Е2 и др. [1, 5, 9].

Содержание склеростина у животных опытной группы увеличивалось, отражая подавление процессов остеобластогенеза при действии дихлорэтана. Роль этого ци-токина как одного из важных регуляторов ремоделирования показана в экспериментальных и клинических исследованиях при использовании моноклональных антител к склеростину [1].

Уровень циркулирующего в крови скле-ростина повышается при глюкокортикоид-ной терапии, анкилозирующем спондилоар-трите [9, 11].

ВЫВОД

При подострой интоксикации дихлорэтаном в плазме крови содержание лиганда рецептора активатора ядерного фактора кВ увеличивается, а остеопротегерина — уменьшается, отражая активацию процессов остеокластогенеза. В эксперименте уровень склеростина повышается, свидетельствуя о подавлении дифференцировки клеток костного дифферона.

ЛИТЕРАТУРА

1. Дыдыкина С.И., Веткова Е.С. Склеростин и его роль в регуляции метаболизма кости // Науч.-практ. ревматол. — 2013. — Т. 51, №3. — С. 296-301. [Dydykina I.S., Vetkova E.S. Sderostin and its role in the régulation of bone metabolism. Nauchno-prakticheskaya revmatologiya. 2013; 51 (3): 296-301. (In Russ.)]

2. Захаров Ю.М., Макарова Э.Б. Регуляция остео-генной дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток костного мозга // Рос. физиол. ж. им. И.М. Сече-

нова. - 2013. - Т. 99, №4. - С. 417-432. [Zakharov Yu. M., Makarova E.B. Regulation of osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells of bone marrow. Rossiyskiy fiziologicheskiy zhurnal im. I.M. Sechenova. 2013; 99 (4): 417-432. (In Russ.)]

3. Камилов Ф.Х., Ганеев Т.И., Фаршатова Е.Р. и др. Ремоделирование костной ткани при действии хлорированных низкомолекулярных алифатических углеводородов // Мед. вестн. Башкортостана. — 2011. — Т. 6, №2. — С. 305-309. [Kamilov F.Kh., Ganeyev T.I., Farshatova Ye.R. et al. Remodelling of bone tissues by the action of chlorinated aliphatic hydrocarbons. Meditsinskiy vestnik Bashkortostana. 2011; 6 (2): 305-309. (In Russ.)]

4. Карпищенко А.И., Глушков С.И., Смирнов В.В. Глутатион-зависимая антиоксидантная система в некоторых тканях крыс в условиях острого отравления дихлорэтаном // Токсикол. вестн. — 1997. — №3. — С. 17-23. [Karpishchenko A.I., Glushkov S.I., Smirnov V.V. Glutathione-dependent antioxidant system in some tissues in rats at acute dichloroethane poisoning. Toksikologicheskiy vestnik. 1997; 3: 17-23. (In Russ.)]

5. Кушлинский Н.Е., Тимофеев Ю.А., Герштейн Е.С. Система RANK/RANKL/OPG при метастазах и первичных новообразованиях костей // Молекулярн. мед. — 2013. — №6. — С. 3-10. [Kushlinskii N.E., Timofeev Yu.A., Gershtein E.S. RANK/RANKL/OPG system in bone

УДК 57.087.1: 612.087: 612.432: 612.441: 612.084: 616.441-008.64

metastases and primary bone tumors. Molekulyarnaya meditsina. 2013; 6: 3-10. (In Russ.)]

6. Омельяненко Н.П., Слуцкий Л.И. Соединительная ткань (патогистология и биохимия). В 2 т. / Под ред. С.П. Миронова. — М.: Известия, 2010. — T. 2. — 600 с. [Omel'yanenko N.P., Slutskiy L.I. at al. Soedinitel'naya tkan (patogistologiya i biokhimiya). (Connective tissue — pathohistology and biochemistry.) Ed. by S.P. Mironov. Moscow: Izvestiya. 2010; 2: 600 p.]

7. Chen G, Deng С, Li Y.P. FGF-p and BMP signaling in osteoblast differentiation and bone formation // Jnt. J. Biol. Sci. — 2012. — Vol. 8, N 2. — P. 272-288.

8. Isenmann S, Arthur A., Sannetino A.C. et al. TWIST family of basic belix-loop-helix transcription factors mediate human mesenchimal stem cell growth and commitment // Stem. Cells. — 2009. — Vol. 26. — P. 2457-2468.

9. Kabayashi Y. Roles of Wnt signaling in bone metabolism // Clin. calcium. — 2012. — Vol. 22, N 11. — P. 1701-1706.

10. Sigalovski S., Shonert M. RANKL-RANK-OPG system and bone remodeling: a new approach on the treatment of osteoporosis // Clin. Exper. Pathol. — 2011. — Vol. 10, N 2. — P. 146-153.

11. Van Bezooijen R.L., ten Dijka P., Papapoulos S.E., Lowil C.W. SOST/Sclerostin, in osteocyte — derived negative regulator of bone formation // Cytokine Growth factor Rev. — 2005. — Vol. 16. — P. 319-327.

исследование соотношений гипофизарно-тиреоидных гормонов на основе регрессионного анализа

Феликс Хусаинович Камилов', Валерий Николаевич Козлов2*, Валерий Нурмухаметович Байматов3, Александр Николаевич Мамцев2, Денис Юрьевич Смирнов2

'Башкирский государственный медицинский университет, г. Уфа, Россия;

2Филиал Московского государственного университета технологий и управления им. К.Г. Разумовского,

г. Мелеуз, Россия;

3Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина,

г. Москва, Россия

Реферат DOI: 10.т50/ЮШ2015-831

цель. Разработка математической модели, позволяющей рассчитывать уровни гормонов гипофизарно-тирео-идной системы методом наименьших квадратов у крыс при экспериментальном гипотиреозе.

Методы. Для исследования взаимосвязи уровней гормонов использовали регрессионный анализ. Поиск коэффициентов осуществляли методом наименьших квадратов. Исследования проводили на крысах, которые были разделены на шесть групп по 12 крыс в каждой: первая группа — контрольная, у животных второй, третьей, четвёртой, пятой и шестой групп вызывали гипотиреоз ежедневным внутрижелудочным введением тиамазола соответственно в дозах 2,5; 20,0; 10,0; 5,0 и 1,0 мг на 100 г массы тела крысы в течение 3 нед.

Результаты. Проведён регрессионный анализ, выбран вид регрессии и вычислены параметры, на основе полученных результатов проведён статистический анализ взаимосвязи гормонов. Путём сопоставления результатов расчёта лабораторного анализа установлена достаточно высокая надёжность разработанной модели. Отклонение среднего арифметического значения уровня тиреотропного гормона, полученное на основе экспериментальных и расчётных данных, составляет 2,7%. При уменьшении дозы тиреостатика повышалась и точность расчётов уровня тиреотропного гормона. При этом относительная погрешность при расчётах свободного тироксина в этих же группах крыс не превышала 2,15%, составляя 1,64; 1,34; 0,36 и 2,15% соответственно при ежедневном введении 20,0; 10,0; 5,0 и 1,0 мг антитиреоидного препарата на 100 г массы тела. Можно утверждать о надёжности построенной модели для воспроизведения показателей уровня содержания гормонов гипофизарно-тиреоидной системы.

Вывод. При отсутствии современных высокочувствительных иммунохемилюминесцентных методов диагностики полученные результаты можно использовать для расчёта уровня тиреотропного гормона как одного из ведущих маркёров функционального состояния щитовидной железы.

ключевые слова: крысы, экспериментальный гипотиреоз, гипофизарно-тиреоидные гормоны, регрессионный анализ.

Адрес для переписки: bioritom@mail.ru