Определение ионов тяжелых металлов в сывороточном альбумине методом импульсной фосфориметрии

УДК 577.345

Е.В. Наумова, А.Г. Мельников, А.А. Поляков ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В СЫВОРОТОЧНОМ АЛЬБУМИНЕ МЕТОДОМ ИМПУЛЬСНОЙ ФОСФОРИМЕТРИИ

Предложен люминесцентно-кинетический способ определения наличия ионов тяжелых металлов в сыворотке крови, основанный на измерении кинетики затухания фосфоресценции люминесцентного зонда, связанного с белками. Установлено, что тяжелые металлы и люминесцентные зонды сорбируются на глобулах белка. Уменьшение интенсивности и времени жизни фосфоресценции зонда под их воздействием являлось аналитическим сигналом определения тяжелых металлов в белках. Создан импульсный фосфориметр для определения тяжелых металлов в сыворотке крови человека.

Тяжелые металлы, сывороточный альбумин человека,

фосфоресценция, люминесцентный зонд

Е^. Naumova, А^. Меlnikov, A.A. Polyakov HEAVY METALS IONS DETECTION IN THE HUMAN SERUM BY THE METHOD OF PULSE PHOSPHORESCENCE

Luminescent-kinetic method for determination of heavy metal ions in blood serum based on measurements of the kinetics of quenching of the luminescent probes bound to proteins is proposed. It is established that both heavy metals and luminescent probes are localized in the protein globules. The decrease of intensity and lifetime of the phosphorescence of probe under the action of heavy metals was the analytical signal of the determination of heavy metals in the proteins. Pulse phosphorimeter for detection of heavy metals in human blood plasma was developed.

Heavy metals, human serum albumin, phosphorescence, fluorescent

probe

В связи со значительной интенсификацией техногенной деятельности человека увеличивается содержание ксенобиотиков в том числе и тяжелых металлов (ТМ) в объектах окружающей среды [1]. Различными путями эти ксенобиотики попадают в живые организмы, приводя к необратимым негативным изменениям в них. Поэтому возникает необходимость в разработке новых способов своевременного и общедоступного контроля содержания тяжелых металлов в живых организмах. Известно [2], что, попадая в организм, ионы тяжелых металлов связываются с макромолекулами альбумина -основным белком плазмы крови. Плазма крови - жидкая часть крови, состоящая из воды, в которой растворены альбумины, гормоны, витамины, ферменты, продукты обмена веществ и другие соединения. Масса САЧ, находящегося в плазме крови, составляет 4762% от всех ее белков. Альбумин выполняет следующие функции: транспортные,

35

связывающие, поддержание внутриклеточного давления. Взаимодействие с ионами тяжелых металлов приводит к изменению физико-химических свойств белков и нарушает их функционирование.

Для аналитического определения содержания ТМ в сывороточном альбумине человека нами разработан люминесцентно-кинетический способ определения наличия тяжелых металлов основанный на явлении тушения фосфоресценции люминесцентного наномаркера - эозина [3] связанного с белками.

Для осуществления этого способа был применен созданный нами импульсный фосфориметр, конструкция которого представлена на рис. 1.

Под воздействием лазерного излучения 2 молекулы люминесцентного наномаркера, связанные с молекулами белка и являющиеся индикаторами изменения микроокружения, переходят в возбужденное состояние. При дезактивации этого возбужденного состояния происходит испускание кванта фосфоресценции. Световой поток излучения фосфоресценции, проходя через конденсорную систему 6, попадает на фотоэлектронный умножитель 7, преобразуется в электрический сигнал и передается на блок усиления сигнала 8. Далее через блок АЦП 9 сигнал поступает на ПК 10. Прошедшее через кювету 4 лазерное излучение попадает в оптическую ловушку 12.

Рис. 1. Конструкция импульсного фосфориметра:

I - блок питания источника света; 2 - импульсный источник света - лазер; 3 - поворотное зеркало;

4 - кювета с исследуемым раствором;

5 - диафрагма; 6 - двухлинзовый конденсор;

7 - фотоэлектронный умножитель;

8 - усилитель импульсов; 9 - аналого-цифровой преобразователь; І0 - персональный компьютер;

II - блок питания ФЭУ; 12 - оптическая ловушка

Рис. 2. Зависимость относительной интенсивности излучения фосфоресценции эозина в присутствии тяжелых металлов от времени, прошедшего после импульса

По полученным экспериментальным данным [4] построены градуировочные зависимости константы скорости затухания фосфоресценции от концентрации тяжелых металлов.

Согласно уравнению Штерна-Фольмера (1), определены константы скорости тушения [5] в допущении равномерного распределения тушителя по объему: для таллия 3300 с-1, для свинца 1500 с-1, для цезия 670 с-1.

1/т = 1/т0 + кя ^],

где 1/т, 1/т0 - наблюдаемые константы скорости дезактивации триплетных состояний молекул люминофоров; т и то - времена жизни люминофоров при определенной концентрации тушителей и без него соответственно; И - концентрация тушителя.

Однако водный раствор белка является микрогетерогенной средой. Неравномерность распределения обусловлена локализацией эозина и тушителя в белковой

36

микрофазе. Для определения константы скорости тушения триплетных состояний эозина с учетом неравномерного распределения ионов тушителя и эозина в водном растворе белка предложена математическая модель, описывающая процессы дезактивации триплетных состояний эозина солями тяжелых металлов в водной фазе и в глобулах белка.

Пользуясь формализмом химической кинетики, составлены два дифференциальных уравнения первого порядка для скорости дезактивации триплетных состояний молекул эозина в белковой и водной среде:

d C

dt

d {С[

dt

где Cl (Э) - концентрация эозина в триплетном состоянии в глобуле белка, М; C(r) -концентрация глобул белка, М; С] (Э) - концентрация эозина в триплетном состоянии в воде, М; C(T) - концентрация тушителя (тяжелых металлов), М; ki - константа скорости диффузии эозина в водной фазе, М-1с-1; k-2 - константа скорости выхода эозина из глобулы белка (число молекул, вышедших в единицу времени), с-1; k3 - константа скорости тушения фосфоресценции эозина ионами тяжелых металлов, М-1с-1; k4 -константа скорости мономолекулярного процесса дезактивации триплетных состояний эозина в глобуле белка в результате излучательных процессов, с-1; k5 - константа скорости мономолекулярного процесса дезактивации триплетных состояний эозина в водной микрофазе, с-1.

Решение системы уравнений (4) получено аналитически.

С]

На рис. 2 представлены результаты математического моделирования. Крестиками и точками обозначены экспериментальные данные. Кривые являются теоретическим результатом математического моделирования. Наилучшее согласие теоретических кривых с экспериментальными точками получено для следующих значений констант тушения: для таллия 3533 с-1, для свинца 1733 с-1, для цезия 866 с-1, полученных методом математического моделирования. Значительное увеличение теоретических констант тушения по сравнению с экспериментальными свидетельствует о высокой локальной концентрации эозина и тушителя в глобуле белка.

Сравнение экспериментальных данных с результатами проведенного математического моделирования показало, что для количественной оценки концентрации тяжелых металлов, содержащихся в исследуемом сывороточного альбумина, необходима градуировочная зависимость с учетом неоднородного распределения частиц по объему.

ЛИТЕРАТУРА

1. Williams A.P.The metals of life / A.P. Williams // New York : Willey, 1971.

2. Петрова Г.П. Образование дипольных комплексов в растворах белков с малой концентрацией ионов тяжелых металлов: диагностика методом лазерного светорассеяния / Г.П. Петрова, Ю.М. Петрусевич, Д.И. Тен // Квантовая электроника. 2002. №10. С. 110123.

3. Заявка на патент РФ № 2010119360 Люминесцентно-кинетический способ определения наличия тяжелых металлов в водных растворах и устройство для его осуществления / Г.В. Мельников и др.; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО Сарат. гос. техн. ун-т (СГТУ); заявл. 17.05.10, 10 с.

4. Лось Е.В. Эффекты тяжелого атома в изучении структурных изменений в белках люминесцентными методами / Е.В. Лось, А.Г. Мельников // Симпозиум «Нанофотоника»: сборник тезисов докладов / Черноголовка, 2007.

5. Рубин А.Б. Биофизика. Биофизика клеточных процессов / А.Б. Рубин. М: Изд-во МГУ, 2005. 468 с.

Наумова Екатерина Викторовна -аспирантка кафедры «Приборостроение» Саратовского государственного технического университета

Мельников Андрей Г еннадиевич -ассистент кафедры «Прикладная физика» Саратовского государственного технического университета

Поляков Андрей Андреевич -инженер отдела эксплуатации ЗАО «НСС»

Статья поступила в редакцию 01.11.10, принята к опубликованию 15.11.10