СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНДУЦИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ГРАНЗИМА В НА АПОПТОЗ ЯДЕР СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТА ПЛАЦЕНТЫ, ВЫЗВАННОГО ОБОСТРЕНИЕМ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ВО ВРЕМЯ БЕРЕМЕННОСТИ
METHOD OF ESTIMATING INDUCING ACTION OF GRANZYME B ON APOPTOSIS OF PLACENTA SYNCYOTROPHOBLAST NUCLEI CAUSED BY EXACERBATION OF HERPES-VIRUS INFECTION DURING PREGNANCY

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностическим методам.
Цель исследования показать нарушение синцитиотрофобласта ворсинок плаценты вследствие увеличения числа ядер, вступающих в апоптоз за счет повышенного содержания в гомогенате плаценты гранзима В, при обострении герпес-вирусной инфекции во время беременности.
Гранзим В освобождается в цитозоль клетки-мишени при ее соприкосновении с NK-лимфоцитами. Проникающий гранзим В в цитозоль является протеолитическим ферментом, превращающим прокаспазу-3 в активную каспазу-3, под влиянием которой инициируется апоптоз ядер (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7).
Однако в доступной литературе мы не нашли сведений, отражающих влияние герпес-вирусной инфекции на увеличение содержания гранзима В в плаценте родильниц, перенесших во время беременности обострение герпес-вирусной инфекции, что повлияло бы на увеличение процентного содержания ядер в состоянии апоптоза в синцитиотрофобласте.
Заявленный способ имеет следующие приемы.
1. Исследовали периферическую кровь у 15 беременных, перенесших в третьем триместре вспышку герпес-вирусной инфекции, и у 20 беременных, не болевших в течение всего периода гестации (контроль). Исследования проводились на базе стационара акушерского отделения клиники Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН. Все исследования были проведены с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с учетом человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266.
2. Активность гранзима В в гомогенате плаценты здоровых беременных и беременных, перенесших в третьем триместре вспышку герпес-вирусной инфекции, определяли иммуноферментным методом (ИФА) с использованием реагентов «Bender MedSystems» (Austria) на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (США).
3. Титр антител к вирусу герпеса определяли иммуноферментным методом (ИФА) на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (США).
Морфологическая классификация апоптоза проводилась на парафиновых срезах плаценты по метке, повреждающихся концов фрагментов ДНК in situ end-labeling (ISEL - метод) [8]. Срезы после дегидратации в дистиллированной воде в течение 30 мин инкубируют в 3% растворе перекиси водорода и отмывают 0,15 М забуференным солевым раствором (PBS) (0,15 M NaCl на 0,1 М фосфатном буфере pH 7,5). Затем срезы инкубируют в смеси 0,3 М NaCl и 30 мМ цитрата натрия (pH 7,0; 80°C, 20 мин) и отмывают в 0,15 М PBS. После чего срезы инкубируют в растворе проназы при комнатной температуре в течение 30 мин (Calbiochem; 1 мг/мл на 0,15 М PBS). Отмывают в 0,15 М PBS и буфером А (50 мМ трисгидрохлорид, 5 мМ хлорид магния, 10 мМ β-меркаптоэтанол и 0,005% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА), рН 7,5).
Последовательно инкубируют (18°C, 2 час) в смеси из 4 нуклеотидов (0,01 мМ dATF, dCTF, dGTF; "Puomega Madison WI", 0.001 мМ biotin-II-dUTP, "Sigma") и ДНК полимеразе-1 E coli (20 ед/мл; "Promega"), приготовленный на буфере А. Затем отмывают буфером А, а вслед за ним 0,5 М PBS (0,5 М NaCl на 0,1 М фосфатном буфере pH 7,5).
Окончательно срезы инкубируют с конъюгатом пероксидазы (Vectastam Elite ABC Kit-Vector, Burliname, СА), разведенным 1:25 0,5 М PBS, в который введены 1% БСА (бычьего сывороточного альбумина) и 0,5% твин-20, и в течение 10 мин окрашивают 0,04% раствором ДАБ (3,3-диамино-бензидинтетрахлорид) на 0,05 М трис-буфере pH 7,5 и перекиси водорода в конечной концентрации 0,015% из 30% раствора. Промывают дистиллированной водой, обезвоживают и заключают в бальзам.
Метод обладает высокой чувствительностью даже для ядер, которые только начинают запрограммированную гибель. С помощью этого метода можно увидеть конденсацию хроматина, плотно прилегающего к ядерной оболочке.
Исследования показали, что по мере нарастания титра антител в периферической крови беременных в третьем триместре увеличивается содержание гранзима В в гомогенате плаценты родильниц, перенесших в третьем триместре обострение герпес-вирусной инфекции.
При титре антител 1:3200 содержание гранзима В в гомогенате плаценты составляло 283,14±18,00 пг/мл; при титре антител к вирусу герпеса его содержание было 712,84±23,00 пг/мл, а при титре антител к вирусу герпеса 1:12800 содержание гранзима В в гомогенате плаценты увеличилось до 1007,53±31,50 пг/мл (контроль 251,10±31,00 пг/мл).
Одновременно нами подсчитывалось количество ядер синцитиотрофобласта, находившихся в состоянии апоптоза. На 2000 ядер в ворсинках плаценты при содержании гранзима В 283,14±18,00 пг/мл насчитывалось 1,5±0,09% ядер в состоянии апоптоза. При 712,84±23,00 пг/мл гранзима В процент ядер в состоянии апоптоза составил 2,0±0,12%, а при 1007,53±31,50 пг/мл число ядер в синцитиотрофобласте возрастало до 3,50±0,08% (контроль - 1,0±0,009%).
Таким образом, вспышка герпес-вирусной инфекции у беременных в третьем триместре увеличивает содержание гранзима В в плаценте, что инициирует формирование апоптоза ядер синцитиотрофобласта и тем в большем количестве, чем больше в гомогенате плаценты определяется гранзима В.
Литература
1. Козлов В.К., Молчанов О.Е., Жаринов Г.Ц. Иммунотерапия рекомбинантными цитокинами в лечении онкологических больных // Успехи клинической иммунологии и аллергологии. т.III под. редак. А.В.Караулова. М.: Изд-во регионального отделения РАЕН, 2002. с.263-279.
2. Евдонин А.Л., Медведева Н.Д. Внеклеточный белок теплового шока 70 и его функция // Цитология. 2009, т.51. №2. с.130-137.
3. Синцов А.В., Коваленко Е.И., Ханин М.А. // Апоптоз, индуцированный гранзимом В. Биоорг. химия 2008, 34(6), с.725-733.
4. Агол В.Н. Генетически запрограммированная смерть клетки // Саратовский образовательный журнал 1996, №6, с.20-24.
5. Kawaguchi Y., Kono K., Mizukami Y., Mimura K., Fujii H // Mechanisms of escape from trastuzumal-mediated ADCC in esophageal sguamous cell carcinoma: relation to susceptibility to perforin-granzyme. Anticancer Res. 2009; 29(6), 2137-2146.
6. Podack E.R., Hengartner H., Lihtenheld M.G. A central role of perform in cytolisis // Annu. Res. Immunol. - 1991. - Vol.9, p.129-157.
7. Fuwthrop D.J., Boobis A.R., Davies D.S. Mechanisms of cell death // Arch. Toxicol. - 1991. - Vol.65. - p.437-444.
8. Погорелов В.М. Морфология апоптоза при нормальном и злокачественном гемопоэзе / В.М.Погорелов, Г.И.Козинец // Гематология и трансфузиология - 1995. - Т. 43 - №5. - с.21-24.