МУТАЦИЯ SER315THR - ОСНОВНАЯ ПРИЧИНА УСТОЙЧИВОСТИ К ИЗОНИАЗИДУ У ИЗОЛЯТОВ mycobacterium tuberculosis, РАСПРОСТРАНЕННЫХ В НОВОСИБИРСКОЙ И КЕМЕРОВСКОЙ ОБЛАСТЯХ

Е.Н. Воронина, М.А. Вихрова, Е.А. Храпов, О.В. Норкина, В.В. Киншт, В.А. Краснов,

Е.В. Горбунова, А.В. Шабалдин, А.Н. Глушков, М.Л. Филипенко

Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН, Научно-исследовательский институт туберкулеза МЗ РФ, г. Новосибирск Отдел иммунологии рака Кемеровского научного центра СО РАН, Областной противотуберкулезный диспансер МЗ РФ, г. Кемерово

МУТАЦИЯ SER315THR -ОСНОВНАЯ ПРИЧИНА УСТОЙЧИВОСТИ К ИЗОНИАЗИДУ У ИЗОЛЯТОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, РАСПРОСТРАНЕННЫХ В НОВОСИБИРСКОЙ И КЕМЕРОВСКОЙ ОБЛАСТЯХ

Проведен скрининг 141 изониазид-(^Н)-резистентного изолята Mycobacterium tuberculosis, выделенного от пациентов Западно-Сибирского региона России, с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), с предшествующей по-лимеразно-цепной реакцией (ПЦР). Этот анализ, используя MspI рестрикцию амплифицированного фрагмента katG гена, определял трансверсию 315AGC^ACC (Ser^Thr), которая ассоциирована с INH-резистентностью. Этот анализ показал распространенность katG S315T мутации в Новосибирской и Кемеровской областях в 94 % и 92 % случаев, соответственно. Применение ПЦР-ПДРФ анализа позволяет быстро и однозначно идентифицировать мутантный аллель katG 315ACC. Простота анализа позволяет использовать его в клинических микробиологических лабораториях Западно-Сибирского региона России.

Ключевые слова: Мутация katG S315T, ПДРФ-анализ, изониазид-устойчивые изоляты Mycobacterium tuberculosis.

A total of 141 isoniazid- (INH)-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis isolated from different petients in the westsiberian region of Russia were screened by PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) assay. This assay used MspI cleavage of an amplified fragment of the katG gene to detect the transversion 315AGC^ACC (Ser^Thr), which is assotiated with INH resistance. This analysis revealed a 94 % and 92 % prevalence of the katG S315T mutation in strains from Novosibirsk and Kemerovo regions, accordingly. The design of this PCR-RFLP assay allows the rapid and unambiguous identification of the katG 315ACC mutant allele. The simplicity of the assay permits its implementation in clinical microbiology laboratories in westsiberian Russia.

Key words: katG S315T mutation, RFLP-assay, isoniazid (INH)-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis.

ВВЕДЕНИЕ

Основой терапевтического действия антибактериальных препаратов является подавление жизнедеятельности возбудителя инфекционной болезни, в результате угнетения более или менее специфичного для микроорганизмов метаболического про-

цесса. Угнетение происходит в результате связывания антибиотика с мишенью, в качестве которой может выступать либо фермент, либо структурная молекула микроорганизма.

Резистентность микроорганизмов к антибиотикам может быть природной и приобретенной. Истинная природная устойчивость характеризуется

(^¿Эищш Мо 1 2003

в Кузбассе № 1 2003

отсутствием у микроорганизмов мишени действия антибиотика, или недоступности мишени, вследствие первично низкой проницаемости или ферментативной инактивации. Под приобретенной устойчивостью понимают свойство отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при тех концентрациях антибиотиков, которые подавляют основную часть микробной популяции. Формирование резистентности в данном случае обусловлено либо приобретением новой генетической информации, либо изменением уровня экспрессии собственных генов.

Изониазид (гидразид изоникотиновой кислоты) был синтезирован в начале XX-го века, однако его эффективность в качестве противотуберкулезного средства обнаружили только в 1952 году. С тех пор изониазид и рифампицин формируют основу химиотерапии туберкулеза во всем мире. Интересно, что M. tuberculosis гиперчувствительна к изониазиду. Так, штаммы M. tuberculosis чувствительны к концентрации 0,02 мг/мл изониазида, в то время как большинство других видов микобактерий намного менее чувствительны, а бактерии из других родов являются практически нечувствительными к данному лекарству [28]. Возможно, это объясняется тем, что лекарственная мишень существует только в ми-кобактериях (например, в процессе синтеза мико-левой кислоты).

Особенности патогенеза туберкулеза и биологии возбудителя (медленная пролиферация, длительное персистирование в организме и последующая реактивация инфекции) накладывают определенные отпечатки на формирование устойчивости у микобактерий. Из-за крайне ограниченных возможностей генетического обмена между микобактериями, формирование у них резистентности практически всегда связано с накоплением хромосомных мутаций в генах, кодирующих мишени действия препаратов.

Целью нашей работы было исследовать изониа-зид-устойчивые (INHR) изоляты M. tuberculosis, распространенные в Новосибирской и Кемеровской областях, на наличие мутаций в генах, связанных с возникновением устойчивости к изониазиду. Так как недавнее исследование изолятов из Северо-Западного региона России показало значительное преобладание среди них мутации Ser315Thr [15], было принято решение начать работу с изучения распространения данной мутации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выборка. В работе были использованы 141 изо-лят M. tuberculosis, полученные от больных, проживающих в Западно-Сибирском регионе. Штаммы были получены от взрослых пациентов (15-65 лет), как с первично диагностированным туберкулезом, так и после лечения в течение 3-12 месяцев.

100 изолятов получены от больных, проживающих в Новосибирске или Новосибирской области,

и поступивших на лечение в Новосибирский НИИ туберкулеза (НИИТ).

41 изолят были из Кемеровской области, от больных, проходивших лечение в Кемеровском противотуберкулезном диспансере (ОКПТД).

Коллекция собиралась в течение 1998-2001 гг. Для каждого пациента в данном исследовании был использован только один изолят. Устойчивость к изониазиду определялась методом минимальных ингибирующих концентраций в НИИТ и ОКПТД. Изолят считался устойчивым при прекращении бактериального роста в присутствии изониазида в концентрации 1 мкг/мл.

Выделение ДНК. ДНК выделяли, как описано [9, 30].

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для

амплификации фрагмента, содержащего 315 кодон гена katG, использовали олигонуклеотидные прай-меры, ограничивающие район 520-1020 п.н.:

- KatG-4 - AATCGATGGGCTTCAAGACG;

- KatG-5 - CTCGTAGCCGTACAGGATCTCG.

Амплификацию проводили в 20 мкл буфера, содержащего 67 мМ Трис-HCl (pH 8,9), 16 мМ (NH4)2SO4, 1,5 мМ MgCl2, 0,01 %-ный Твин-20, 100 мкМ dNTP, 1 мкМ праймеры, 2 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы в следующем режиме: денатурация - 3 мин на первом цикле и 20 сек на последующих 35-ти циклах при 95°С; отжиг — 20 сек при 62°С; элонгация — 20 сек при 72°С. Использовали ДНК-амплификатор фирмы "Eppendorf". Наличие продукта амплификации проверяли электрофорезом в 1,5 % агарозном геле с последующей визуализацией ДНК бромистым этидием [1].

Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ). Мутация Ser315Thr (AGC^ACC) приводит к появлению дополнительного сайта для эндонуклеазы рестрикции MspI (CCGG). Таким образом, наличие данной мутации можно определить методом ПДРФ-анализа с помощью фермента MspI (рисунок 1). Рестрикцию проводили в объеме 15 мкл с использованием 10 мкл амплификационной смеси, содержащей фрагмент 520-1020 п.н. гена KatG. Одну единицу активности фермента добавляли дважды, с интервалом 1 час, и инкубировали при 37°С. Далее рестрикционную смесь анализировали в 8 %-ном акриламидном геле.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Всего 96 устойчивых и 45 чувствительных к изониазиду изолятов были проверены на наличие мутации Ser315Thr в гене katG. На рисунке 2 представлен типичный результат ПДРФ-анализа 10 изолятов M. tuberculosis.

Частота встречаемости дикого и мутантного аллелей 315 кодона гена katG в Новосибирской и Кемеровской областях представлена в таблице. Из таблицы видно, что распределение аллелей в обеих областях практически одинаково, что может отра-

№ 1 2m3 (^¿Эищш

|Ч- I 2003 в Куз6ассе

Рисунок 1

Модель электрофореза в 8 % акриламидном геле ПДРФ-анализа фрагмента 520-1020 п.н. гена katG эндонуклеазой рестрикции MspI

Рисунок 2

ПДРФ-анализ ПЦР-продуктов, полученных из ДНК изолятов M. tuberculosis, на наличие мутации Ser315Thr в гене katG

-400 -300

200 150

100

-70 -50

20 10

1 2 3

1 - дикий тип; 2 - мутация Ser315Thr; 3 - маркер молекулярного веса; стрелка указывает на фрагмент ДНК, отсутствие которого означает наличие мутации Ser315Thr в гене katG

жать распространение сходных штаммов M. tuberculosis в нашем регионе.

В результате нашего исследования показано, что в Западно-Сибирском регионе у INHR изолятов преобладает мутация Ser315Thr в гене katG: в 94 % случаев по Новосибирской области и 92 % — по Кемеровской области. Шесть (6 %) устойчивых к изо-ниазиду изолятов M. tuberculosis не имели мутаций в 315 кодоне гена katG (подтверждали секвениро-ванием). Это предполагает наличие мутаций в других районах гена katG, либо в других генах, продукты которых вовлечены в формирование устойчивости к изониазиду (inhA, ahpC, kasA и ndh).

В 12 % изониазид-чувствительных изолятах из Кемеровской области и в 28 % из Новосибирской области были найдены мутации в 315 кодоне гена katG. Наличие данной мутации в этих изолятах подтверждали повторными экспериментами. Однако, по литературным данным, мутация в 315 кодоне не может присутствовать в чувствительных штаммах M. tuberculosis, так как в результате замены Ser^Thr предотвращается активация изониазида [27]. Таким образом, данное несоответствие указывает на относительно низкую достоверность (92 %) метода минимальных ингибирую-щих концентраций при определе-

М - маркер молекулярного веса; 1-10 - различные изоляты M. tuberculosis; стрелка указывает на полосу, отсутствие которой означает наличие мутации Ser315Thr в гене katG

нии чувствительности к изониазиду. Подобные данные были получены Ван Ри и соавт. [3], при сравнении генотипического и фенотипического тестов в Кейптауне, где несоответствие между этими тестами проявилось в 28 % случаев. В дальнейшем было показано, что неправильным было определение именно фенотипа, а не генотипа.

Первые представления о механизмах действия изониазида появились в 1954 г., когда Мидлбрук описал изониазидустойчивый (INHR) штамм, у которого отсутствовала каталазная активность [20]. В дальнейшем эти исследования были продолжены, и показана обратная зависимость между MIC (минимальная ингибирующая концентрация) изониазида и каталаз-пероксидазной активностью в штаммах M. tuberculosis [14]. Занг и соавт. [31] в

Таблица

Частота встречаемости аллелей гена katG среди изолятов M. tuberculosis, распространенных в Новосибирской и Кемеровской областях

315 кодон Суммарное Дикий тип, Мутация, количество шт.

Новосибирская Изоляты, устойчивые область к изониазиду Новосибирская Изоляты, чувствительные область к изониазиду Кемеровская Изоляты, устойчивые область к изониазиду Кемеровская Изоляты, чувствительные область к изониазиду 4

Медицина № 1 2003

в Кузбассе № 1 2003 37

1992 году открыли молекулярные основы связи между каталазной активностью и устойчивостью к изониазиду, продемонстрировав, что некоторые каталаз-отрицательные штаммы имеют делецию гена katG и что экспрессия продукта гена katG увеличивает чувствительность к изониазиду у ка-талаз-негативных и INHR штаммов. Однако дальнейшие наблюдения показали, что большинство INHR изолятов не имеют полной делеции гена katG [23], возможно, благодаря важности перок-сидазной функции для жизнеспособности клетки. Поэтому, вероятно, в процессе возникновения устойчивости задействованы мутации, которые, нарушая каталазную функцию, не затрагивают пе-роксидазную активность продукта гена katG. Эти данные вызвали более детальный анализ гена katG M. tuberculosis. Наличие кристаллических структур родственных ферментов (например, дрожжевой цитохром С-пероксидазы [10]) позволило сделать некоторые выводы о структурно-функциональных особенностях продукта гена katG. Было показано, что делеция аминокислотных оснований 120-123 и инсерция Ile между ними приводят к уменьшению каталазной активности (до 10 %) [21], а замена в позиции 315 приводят к уменьшению способности фермента метаболизировать изониазид [27].

Продукт гена katG является каталаз-пероксида-зой, выполняющей большинство детоксицирующих функций в клетке. Изучение механизмов взаимодействия изониазида и белка katG показало, что katG окисляет изониазид через ряд высокоактивных промежуточных соединений, которые способны окислять нуклеофильные группы в белках [16]. Таким образом, изониазид активируется katG, и последующий эффект может развиваться в двух направлениях: нарушение синтеза миколевой кислоты или более общая токсичность для белков и нуклеиновых кислот. Устойчивость к изониазиду, появляющаяся в результате мутаций в гене katG, выражается для клетки повышенной чувствительностью к пероксидам. Возможный путь решения этой проблемы лежит в сверхэкспрессии другого детоксифицирующего фермента — алкилгидропе-роксидредуктазы (продукт гена ahpC) [25]. Данный фермент не имеет способности активировать изониазид. Таким образом, в данной модели при инактивации гена katG возникают мутации, приводящие к сверхэкспрессии ahpC. Исследование Сри-ватсона и соавт. [4] показало, что в 70 INHR изоля-тах мутации в промоторе гена ahpC встречались, чем в кодирующем районе. Однако большинство этих изолятов несли мутации и в katG гене. Интересно, что замена в 315 кодоне встречается совместно с мутациями в промоторе ahpC очень редко. По-видимому, 315 мутация, нарушая превращение изониазида, не сильно влияет на детоксифицирую-щие способности каталаз-пероксидазы [29].

Кроме того, было показано, что мутации в гене inhA, кодирующем NADH-зависимую енол-ацил--редуктазу, принимающую участие в биосинтезе ми-

колевой кислоты, также связаны с уменьшением у микобактерий чувствительности к изониазиду [33]. Идентификация продукта гена inhA в качестве мишени изониазида у Mycobacterium smegmatis вызвала энтузиазм по поиску мутаций в этом гене у клинических изолятов M. tuberculosis [7, 26]. В процессе скрининга сотен изолятов было обнаружено несколько полиморфизмов в кодирующей области гена, но ни один из них не привносил устойчивость при перемещении в чувствительный штамм. В то же время, у M. smegmatis и Mycobacterium bovis сверхэкспрессия белка inhA дикого типа увеличивает устойчивость к изониазиду [6]. Возможно, мутации в промоторном районе гена inhA, обнаруженные у большого числа INHR изолятов M. , приводят к сверхэкспрессии inhA, что увеличивает устойчивость к изониазиду [26, 33]. Однако проверка профиля биосинтеза липидов для M. smegmatis и M. tuberculosis вслед за обработкой изониазидом подтверждает предположение, что данные организмы имеют различные мишени действия изониазида. В M. smegmatis профиль липидов точно совпадает с предсказанным, если продукт гена inhA является мишенью. В M. tuberculosis профиль липидов выглядит совсем по-другому и наводит на мысль, что мишень находится дальше в цепи биосинтеза мико-левой кислоты [6]. В дальнейшем для M. tuberculosis было показано, что не inhA является первичной мишенью препарата, а acpM-kasA комплекс, также вовлеченный в синтез миколевой кислоты, который связывается с активированным изониази-дом. Тем не менее, обнаружены только 3 специфические мутации в гене kasA, которые в большинстве случаев сопутствовали мутациям в других генах, ответственных за развитие устойчивости к изониазиду [8]. Схема действия изониазида на M. tuberculosis приведена на рисунке 3.

Рисунок 3

Схема действия изониазида на M.tuberculosis

Изониазид

А

Ацетил Со-А или другие предшественники в синтезе жирных кислот

Повреждение у

белков и //

нуклеиновых У/

кислот УуТ

Недавно был идентифицирован новый механизм изониазид-устойчивости у M. smegmatis. Мутации

™ № i 2003 ^^«èva

3o № 1 2003 в Кузбассе

в ndh гене, кодирующем NADH-дегидрогеназу, вызывают дефект в активности фермента, что увеличивает NADH/NAD соотношение. Данный механизм не описан у M. tuberculosis, но при исследовании в Сингапуре 10 % INHR изолятов имели мутации в кодирующей области гена ndh, и 90 % из них не имели мутаций в katG, inhA, ahpC и kasA генах [19].

Детальный анализ молекулярных механизмов устойчивости к антимикробным агентам привел к разработке и применению нескольких подходов для быстрого определения мутаций, связанных с устойчивостью, с помощью ПЦР. Эти подходы включают прямое секвенирование ПЦР-продуктов, гетеродуплексный анализ, метод гибридизации, ПДРФ-анализ, SSCP-анализ и другие. Все эти методы основаны на анализе полиморфных сайтов, найденных в устойчивых штаммах и отсутствующих у чувствительных. Факт, что естественная популяция чувствительных M. tuberculosis имеет удивительно мало полиморфных районов в структурных генах [17], значительно облегчает интерпретацию подобных данных.

Корректность применения вышеописанных методов в значительной мере определяется изученностью молекулярного механизма устойчивости к изо-ниазиду в изучаемой выборке изолятов. Сложность применения генотипирования для определения устойчивости к изониазиду заключается в том, что в отличие, например, от механизма устойчивости к рифампицину (который опосредован мутациями в хорошо описанном компактном регионе гена rpoB), устойчивость к изониазиду связана с различными мутациями в разных генах. Это, в свою очередь, приводит к тому, что в разных популяциях наблюдается различный спектр мутаций. Например, в Сингапуре мутация в 315 кодоне гена katG встречалась в 26 % случаев, а анализ 3 генных локусов выявлял 62 % изониазид-устойчивых изолятов [8]. В то же время, в Санкт-Петербурге все изученные штаммы имели мутации в гене katG, из них 92 % — мутацию в 315 кодоне [2].

Несмотря на вышеописанные сложности, гено-типический подход в определении устойчивости к изониазиду во многих случаях дает достоверные результаты. Так, использование ПЦР-SSCP метода для определения мутаций в генах katG, inhA и ahpC изолятов M. tuberculosis в Испании привело к правильному определению изониазид-устойчивых изолятов в 91 % случаев [12]. В Италии подобный подход показал чувствительность в 88 % [5], в Кейптауне — в 75 % [11]. Воспроизводимость результатов была хорошей для генетического метода и неплохой для фенотипического.

Оба метода имеют свои недостатки. При фено-типическом тесте — это длительность определения. Обычно минимум 3-6 недель необходимо для позитивной культуральной диагностики, более 3 недель — для теста на чувствительность на твердой среде и 15 дней — для радиометрического метода на BACTEC. Далее идут проблемы со стандартиза-

цией, что включает размер инокулята и стабильность состава среды. И, наконец, это низкая достоверность результата. Молекулярно-генетический метод имеет следующие недостатки: необходим прескрининг на распространеность мутаций, не все мутации известны, для большинства описанных мутаций не показано причинной связи с резистентностью. Однако, высокая чувствительность, быстрая диагностика, высокая достоверность (надежность) данного метода делают его выгодным для широкого применения в клинической практике.

В среднем, 94 % устойчивых к изониазиду изо-лятов M. tuberculosis, распространенных в Западно-Сибирском регионе, имели мутацию Ser315Thr в гене katG. Наши данные согласуются с результатами, полученными в Северо-Западном регионе России, где описано преобладание (94 %) мутации Ser315Thr гена katG среди изониазид-устойчивых изолятов M. tuberculosis [15]. Также ранее отмечалось, что в странах с низкой или средней распространенностью туберкулеза эта мутация относительно редка (26-30 % в Сингапуре [8] и Испании [11], редкие случаи в Шотландии [22] и Финляндии [18]). Напротив, 52-64 % случаев в Африке [32], 58 % - в Нью-Йорке [11], 79 % - в Перу [13]. Только в России показано столь сильное превалирование данной мутации. Возможной причиной этого является преобладающее распространение в России штаммов типа Биджинг. Так, Нарвская Е.Б. и соавт. [24] продемонстрировали, что Бид-жинг семейство является доминантным в России (более 50 %), при этом 98 % Биджингов и 85 % изо-лятов с другими генотипами имели мутацию в 315 кодоне гена katG. В группе с первично выявленным туберкулезом соотношение было 100 % и 86 %. Эти результаты согласуются с данными, что эпидемическое распространение лекарственно-устойчивых штаммов M. tuberculosis в Северо-Западной России происходит, в значительной степени, благодаря клональной диссеминации Биджинг генотипа, чем других генотипов. Возможно, распространение именно этих штаммов может быть движущей силой такого большого превалирования мутации в 315 ко-доне гена katG в России.

ВЫВОД

У изолятов M. tuberculosis в Западно-Сибирском регионе выявлена высокая частота встречаемости мутации Ser315Thr в гене katG, что позволяет считать применение ПДРФ-анализа вполне адекватным методом для быстрого скрининга устойчивости M. tuberculosis к изониазиду.

ЛИТЕРАТУРА

1. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Маниатис Т., Фрич Э.,

Сэмбрук Дж. - М.: Мир, 1984. - 480 с.

2. A Ser315Thr substitution in KatG is predominant in genetically heterogeneous multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates origina-

^дицина № 1 2003

в Кузбассе № 1 2003

ting from the St. Petersburg area in Russia / Marttila H.J., Soini H., Eero-la E. et al. // Antimicrob. Agents Chemother. - 1998. - Vol. 42, N 9. -P. 2443-2445.

3. Analysis for a limited number of gene codons can predict drug resistance of Mycobacterium tuberculosis in a high-incidence community / Van Rie A., Warren R., Mshanga I. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2001. -Vol. 39, N 2. - P. 636-641.

4. Analysis of the oxyR-ahpC region in isoniazid-resistant and -susceptible mycobacterium tuberculosis complex organisms recovered from diseased humans and animals in diverse localities / Sreevatsan S., Pan X., Zhang Y. et al. // Antimicrob. Agents Chemother. - 1997. - Vol. 41, N 3. - P. 600-606.

5. Application of molecular methods for detection and transmission analysis of mycobacterium tuberculosis drug resistance in patients attending a reference hospital in Italy / Cingolani A., Antinori A., Sanguinet-ti M. et al. // J. Infect. Dis. - 1999. - Vol. 179, N 4. - P. 1025-1029.

6. Biochemical and genetic data suggest that InhA is not the primary target for activated isoniazid in mycobacterium tuberculosis / Mdluli K., Sherman D.R., Hickey M.J. et al. // J. Infect. Dis. - 1996. - Vol. 174, N 5. -P. 1085-1090.

7. Characterization of the catalase-peroxidase gene (katG) and inhA locus in isoniazid-resistant and -susceptible strains of Mycobacterium tuberculosis by automated DNA sequencing: restricted array of mutations associated with drug resistance / Musser J.M., Kapur V., Williams D.L. et al. // J. Infect. Dis. - 1996. - Vol. 173, N 1. - P. 196-202.

8. Contribution of kasA analysis to detection of isoniazid-resistant mycobacterium tuberculosis in Singapore / Lee A.S., Lim I.H., Tang L.L. et al. // Antimicrob. Agents Chemother. - 1999. - Vol. 43. -N 8. - P. 2087-2089.

9. DNA fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis / van Soolingen D., de Haas P.E., Hermans P.W., van Embden J.D. // Methods Enzymol. -1994. -Vol. 235. -P. 196-205.

10. Finzel, B.C. Crystal structure of yeast cytochrome c peroxidase refined at 1.7-A resolution / Finzel B.C., Poulos T.L., Kraut J. // J. Biol. Chem. -1984. - Vol. 259, N 21. - P. 13027-13036.

11. Genotypic analysis of Mycobacterium tuberculosis in two distinct populations using molecular beacons: implications for rapid susceptibility testing / Piatek A.S., Telenti A., Murray M.R. et al. // Antimicrob. Agents Chemother. - 2000. - Vol. 44, N 1. - P. 103-110.

12. Genotypic assessment of isoniazid and rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a blind study at reference laboratory level / Telenti A., Honore N., Bernasconi C. et al. // J. Clin. Microbiol. - 1997. - Vol. 35, N 3. - P. 719-723.

13. Genotypic characterization of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Peru / Escalante P., Ramaswamy S., Sanabria H. et al. // Tuber. Lung Dis. - 1998. - Vol. 79, N 2. - P. 111-118.

14. Hedgecock, L. Relation of pyrogallol-peroxidative activity to isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis / Hedgecock L., Faucher I.O. // Am. Rev. Tuberc. - 1957. - Vol. 75. - P. 670-674.

15. High prevalence of KatG Ser315Thr substitution among isoniazid-resis-tant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from northwestern Russia, 1996 to 2001 / Mokrousov I., Narvskaya O., Otten T. et al. // Antimicrob. Agents Chemother. - 2002. - Vol. 46, N 5. - P. 1417-1424.

16. Johnsson, K. Studies on the mechanism of action of isoniazid and ethi-onamid in the chemotherapy of tuberculosis / Johnsson K., King D.S., Schulz P.G. // J. Am. Chem. Soc. - 1995. - Vol. 117. - P. 5009-5010.

17. Kapur, V. Is Mycobacterium tuberculosis 15,000 years old? / Kapur V., Whittam T.S., Musser J.M. // J. Infect. Dis. - 1994. - Vol. 170, N 5. -P. 1348-1349.

18. KatG mutations in isoniazid-resistant mycobacterium tuberculosis isolates recovered from Finnish patients / Marttila H.J., Soini H., Huovinen P., Viljanen M.K. // Antimicrob. Agents Chemother. - 1996. - Vol. 40, N 9. - P. 2187-2189.

19. Lee, A.S. Novel mutations in ndh in isoniazid-resistant mycobacterium tuberculosis isolates / Lee A.S., Teo A.S., Wong S.Y. // Antimicrob. Agents Chemother. - 2001. - Vol. 45, N 7. - P. 2157-2159.

20. Middlebrook, G. Tuberculin reactivity and isoniazid / Middlebrook G. // N. Engl. J. Med. - 1970. - Vol. 283, N 2. - P. 101.

21. Molecular characterization of three mutations in katG affecting the activity of hydroperoxidase I of Escherichia coli / Loewen P.C., Switala J., Smolenski M., Triggs-Raine B.L. // Biochem. Cell Biol. - 1990. - Vol. 68, N 7-8. - P. 1037-1044.

22. Molecular evidence for heterogeneity of the multiple-drug-resistant mycobacterium tuberculosis population in Scotland (1990 to 1997) / Fang Z., Doig C., Rayner A. et al. // J. Clin. Microbiol. - 1999. - Vol. 37, N 4. - P. 998-1003.

23. Mutations in the catalase-peroxidase gene from isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates / Altamirano M., Marostenmaki J., Wong A. et al. // J. Infect. Dis. - 1994. - Vol. 169, N 5. - P. 1162-1165.

24. Nosocomial outbreak of multidrug-resistant tuberculosis caused by a strain of Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family in St. Petersburg, Russia / Narvskaya O., Otten T., Limeschenko E. et al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2002. - Vol. 21, N 8. - P. 596-602.

25. Oxidative stress response and its role in sensitivity to isoniazid in myco-bacteria: characterization and inducibility of ahpC by peroxides in mycobacterium smegmatis and lack of expression in M. aurum and M. tuberculosis / Dhandayuthapani S., Zhang Y., Mudd M.H., Deretic V. // J. Bacteriol. - 1996. - Vol. 178, N 12. - P. 3641-3649.

26. Rapid Mycobacterium species assignment and unambiguous identification of mutations associated with antimicrobial resistance in Mycobac-terium tuberculosis by automated DNA sequencing / Kapur V., Li L.L., Hamrick M.R. et al. // Arch. Pathol. Lab. Med. - 1995. - Vol. 119, N 2. -P. 131-138.

27. Recombinant Mycobacterium tuberculosis KatG(S315T) is a competent catalase-peroxidase with reduced activity toward isoniazid / Wengenack N.L., Uhl J.R., Amand A.L. et al. // J. Infect. Dis. - 1997. - Vol. 176, N 3. - P. 722-727.

28. Rouse, D.A. Molecular mechanisms of isoniazid resistance in mycobacterium tuberculosis and mycobacterium bovis / Rouse D.A., Morris S.L. // Infect. Immun. - 1995. - Vol. 63, N 4. - P. 1427-33.

29. Significance of ahpC promoter mutations for the prediction of isoniazid resistance in mycobacterium tuberculosis / Rinder H., Thomschke A., Rusch-Gerdes S. et al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 1998. -Vol. 17, N 7. - P. 508-511.

30. Strand displacement amplification and the polymerase chain reaction for monitoring response to treatment in patients with pulmonary tuberculosis / Hellyer T.J., Fletcher T.W., Bates J.H. et al. // J. Infect. Dis. - 1996. -Vol. 173, N 4. - P. 934-941.

31. The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of mycobacterium tuberculosis / Zhang Y., Heym B., Allen B. et al. // Nature. -1992. - Vol. 358, N 6387. - P. 591-593.

32. Usefulness of Mycobacterium tuberculosis genomic mutations in the genes katG and inhA for the prediction of isoniazid resistance / Dobner P., Rusch-Gerdes S., Bretzel G. et al. // Int. J. Tuberc. Lung Dis. - 1997. -Vol. 1, N 4. - P. 365-369.

33. UshA, a gene encoding a target for isoniazid and ethionamide in mycobacterium tuberculosis / Banerjee A., Dubnau E., Quemard A. et al. // Science. - 1994. - Vol. 263, N 5144. - P. 227-230.

40 № 1 2003 ^fe