СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR CEREBRAL MALIGNANCIES

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины, в частности к онкологии и нейрохирургии.
Диагностика опухолей головного мозга основывается на методах КТ (компьютерная томография) и МРТ (магнитная резонансная томография), которые позволяют в большинстве случаев различить внутри- и внемозговые опухоли, определить локализацию и масштаб патологического процесса, однако далеко не всегда способны достоверно определить тип опухоли (1).
Известен стандартный способ диагностики степени злокачественности опухолей головного мозга, который заключается в гистологическом исследовании ткани опухолевого образования, на основании которого чаще всего ставится окончательный диагноз (2).
Образец ткани опухоли, полученный в момент ее хирургического удаления, фиксируют между предметными стеклами, получая четкий мазок. Далее предметное стекло с отпечатком помещают в фиксатор (формалин).
Впоследствии полученный мазок подсушивают на воздухе (10-15 мин), фиксируют в этаноле 96%, окрашивают гематоксилин-эозином, помещают в бальзам под покровное стекло, а через 24 часа готовят гистологический препарат. В общей сложности на диагностику уходит 4-5 суток. Если позволяет количество материала биопсии, то применяют также цитологические методы исследования, которые, в свою очередь, могут быть использованы для дополнительных методов исследования: иммуноцитохимических, флюоресцентных, электронно-микроскопических.
Известен способ диагностики глиом, включающий выделение микроРНК из образца опухолевой ткани головного мозга, измерение уровня экспрессии диагностических микроРНК с помощью микрочипа с последующим сравнительным анализом изменения уровня экспрессии диагностических микроРНК и составлением заключения о типе глиальной опухоли и степени ее злокачественности. При этом измеряют уровень экспрессии 7 микроРНК, выбранных из общего количества проанализированных 756 микроРНК (3). Этот способ выбран нами в качестве прототипа. Недостатками известного способа являются сложность и многоэтапность определения и анализа. Кроме того, диапазон количественных измерений при использовании микрочипов значительно уже, вследствие чего данный метод дает значительно менее точные результаты, чем метод ПЦР в реальном времени.
Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является упрощение способа диагностики злокачественных опухолей головного мозга, сокращение его длительности, повышение точности.
Предлагаемый способ решения данной задачи заключается в следующем. Производится забор образца опухолевой ткани головного мозга человека при операции или с помощью биопсии. Из полученных образцов выделяют общую РНК любым пригодным методом выделения РНК. Проводят синтез 1-й цепи кДНК в реакции обратной транскрипции. Осуществляют ПЦР в реальном времени с праймерами, подобранными к экзонным участкам генов GUSB (F CTTCTCTGACAACCGACGCC, R ACACCCAGCCGACAAAATGC) и HPRT (F TGAGGATTTGGAAAGGGTGT, R GAGCACACAGAGGGCTACAA). Протокол реакции ПЦР: предварительный прогрев при 95°С - 5 мин, 40 основных циклов: денатурация при 95°С - 10 сек, отжиг и элонгация: 60°С - 30 сек. Измеряют пороговые циклы реакции и их соотношение.
Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:
1) В образцах опухолевой ткани головного мозга измеряют уровни экспрессии (пороговые циклы реакции ПЦР РВ) экспериментально подобранных 2-х маркеров - GUSB и HPRT, что позволяет упростить способ в сравнении с прототипом, ускорить проведение диагностики (5-6 часов или один рабочий день, вместо минимум трех рабочих дней по прототипу);
2) Заключение о наличии злокачественной опухоли головного мозга составляют на основании соотношения пороговых циклов GUSB и HPRT на платформе РТ ПЦР, что по сравнению с прототипом упрощает проведение способа и повышает точность результата.
Предварительно, для определения и обоснования диагностических значений соотношения уровней экспрессии (пороговых циклов) GUSB и HPRT проведен сравнительный анализ материала человеческих биоптатов из тканей глиомы и контрольных образцов.
Различия в выборках достоверны по U-критерию Манна-Уитни, р<0,01. Достоверность различий подтверждают критерий Хи-квадрат (с поправкой Йейтса), а также критерий Фишера (двусторонний).
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.
Пример 1.
Больная З., 34 лет, проведена операция по удалению внутримозговой опухоли левой теменной и лобной долей.
Биоптат опухоли поместили в контейнер со средой DMEM/F12 при 4°С, доставили в лабораторию и обследовали заявленным способом.
Выделение РНК. В микропробирке «Эппендорф» гомогенизировали навеску ткани 100 мг в 200 мкл «ТР1 reagent» MRC пластиковым пестиком, после чего добавили еще 1 мл «ТР1 reagent». 10 минут перемешивали на роторном смесителе, затем центрифугировали 5 минут при 10000 об./мин. Отбирали 1 мл супернатанта, смешивали с 200 мкл хлороформа и встряхивали на шейкере 15 сек. В течение 10 минут пробирку оставляли при комнатной температуре, а затем центрифугировали 15 мин при 4°С и 12000 об./мин. Супернатант в объеме 600 мкл смешивали с 700 мкл изопропанола. Пробирку оставляли на столе, а через 10 мин РНК осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 12000 и 4°С. Осадок РНК промывали 75% этанолом, центрифугировали при тех же условиях, высушивали на вакуумном центробежном концентраторе и растворяли в 50 мкл ДЭПК воды с добавлением 1 мкл ингибитора рнк-аз RiboLock Thermo Scientific. Определяли концентрацию РНК на спектрофотометре Biowave II, после чего обрабатывали ДНК-зой DNase I Thermo Scientific согласно прилагаемому протоколу. Повторяли процедуры осаждения изопропанолом, промывания 75% этанолом, высушивания осадка РНК и растворения в ДЭПК воде с добавлением RiboLock. Измеряли концентрацию РНК и оценивали степень ее деградации, проводя электрофорез в 1% агарозном геле.
Реакция обратной транскрипции. Реакцию обратной транскрипции для получения кДНК проводили в объеме 25 мкл. Использовали готовые наборы реагентов «ОТ-1» для обратной транскрипции компании СИНТОЛ. Реакция обратной транскрипции содержала: 2 мкг выделенной РНК, 1 мкл Random-б праймера, 10 мкл 2,5х Реакционной смеси, 1 мкл (50 ед) обратной транскриптазы MMLV-RT и 0,5 мкл RiboLock. Реакцию проводили в течение 40 мин при 42°С, после чего реакционную смесь инкубировали 4 мин при 92°С для инактивации обратной транскриптазы. Полученную реакционную смесь, содержащую кДНК, сразу использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР.
ПЦР в реальном времени. Измерение уровней экспрессии HPR и GUSB проводили методом ПЦР в реальном времени готовыми наборами реактивов «Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии красителя SYBR Green I R-402» компании СИНТОЛ на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). Реакцию проводили в объеме 25 мкл согласно протоколу набора, смесь прямого и обратного праймеров в концентрации 1,5 мкМ каждого добавляли в объеме 5 мкл. Ставили каждую реакцию в трех параллельных пробах.
Протокол реакции ПЦР: предварительный прогрев при 95°С - 5 мин, 40 основных циклов: денатурация при 95°С - 10 сек, отжиг и элонгация: 60°С - 30 сек.
Значения пороговых циклов реакции определяли, используя программное обеспечение прибора.
Ct HPRT = 29,85
Ct GUSB = 28,47
Ct HPRT - Ct GUSB = 1,38.
1,38≥0, следовательно опухоль злокачественная.
Гистологический анализ впоследствии подтвердил диагноз, у больного анапластическая астроцитома. WHO grade III.
Пример 2.
Больная К., 35 лет. Прооперирована по поводу опухоли головного мозга.
Материал мозга исследован заявленным способом.
Результаты, полученные при измерении уровней экспрессии генов HPRT и GUSB:
Ct HPRT = 28,45
Ct GUSB = 30,59
Ct HPRT - Ct GUSB = -2,14
-2,14<0, следовательно это не злокачественная опухоль.
Заключение прижизненого патолого-анатомического исследования: Пилоидная астроцитома, WHO Grade I
Заявленный способ может служить быстрым, простым и удобным дополнительным способом для диагностики опухолей мозга.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Hashemi R.H., Bradley W.G., Lisanti C.J. MRI: the basics. Lippincott Williams & Wilkins, 2004. C. 353.
2. Батороев Ю.К. Цитологическая диагностика опухолей центральной нервной системы, возможности и особенности: возможности и границы применения. Сибирский медицинский журнал. - 2009. - №2. - с. 5-9.
3. Somasundaram K., Mahabala RAO S.A., Santosh V. MicroRNAa (miRNA) as biomarkers for diagnosing different grades of gliomas and pathways of glioma progression. - Patent WO 2011121610 A1, Pub. 25.10.2011.