Особенности определения специфической активности биотехнологических лекарственных средств

ОБЗОРЫ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 615.072

Особенности определения специфической активности биотехнологических лекарственных средств

Н. А. Алпатова, Л. А. Гайдерова, А. К. Яковлев, Е. В. Мотузова, С. Л. Лысикова, А. А. Солдатов, Ж. И. Авдеева

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, Россия

Поступила 04.10.2016 г. Принята к публикации 07.02.2017 г.

Обзор посвящен вопросам оценки специфической активности биотехнологических лекарственных средств, которая является одним из основных показателей их качества. Подходы к изучению данного показателя и выбор методик зависят от природы и свойств лекарственного препарата. Методики должны быть адекватными и обладать достаточной чувствительностью и специфичностью. Для оценки специфической активности указанной группы лекарственных препаратов могут быть использованы биологические методы исследования как в условиях in умо на лабораторных животных, характеризующихся наиболее адекватным ответом на исследуемый препарат, так и в условиях in vitro с использованием чувствительных клеточных линий. Оценка специфической биологической активности позволяет охарактеризовать фармакологическое действие препарата и направленно изучить механизмы его терапевтических эффектов при клиническом применении. Поэтому специфическую активность биотехнологических препаратов предпочтительно оценивать с использованием методов, соответствующих предполагаемому механизму действия препарата. Для многих биотехнологических лекарственных средств, включая препараты системы цитокинов, МкАТ, белков слияния/фьюжен белков и др., используются индивидуальные методы оценки специфической активности. Биотехнологические лекарственные препараты успешно применяются для лечения заболеваний аутоиммунной природы, инфекционных, онкологических и аллергических заболеваний.

Ключевые слова: биотехнологические лекарственные препараты; цитокины; моноклональные антитела; специфическая биологическая активность; методы исследования в условиях in vitro и in vivo; линии клеток. Библиографическое описание: Алпатова НА, Гайдерова ЛА, Яковлев АН, Мотузова ЕВ, Лысикова СЛ, Солдатов АА, Авдеева ЖИ. Особенности определения специфической активности биотехнологических лекарственных средств. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение 2017; 17(1): 13-26.

Биотехнологические лекарственные препараты занимают одно из ведущих мест на современном фармацевтическом рынке. Разработка новых лекарственных препаратов указанной группы является одним из перспективных направлений в области создания лекарственных средств для лечения тяжелых хронических прогрессирующих аутоиммунных, онкологических, инфекционных заболеваний в связи с их высокой специфичностью по отношению к факторам, связанным с патогенезом заболевания, что позволяет достигать высокой клинической эффективности.

Биотехнологические лекарственные препараты — лекарственные препараты, производство которых осуществляется с использованием биотехнологических процессов и методов (в том числе ДНК-рекомбинантной технологии, технологии контролируемой экспрессии генов, кодирующих биологически активные белки в прокариотах и эукариотах, включая измененные клетки млекопитающих), гибридомного метода и метода моноклональных антител [1].

Действующим веществом в биотехнологических лекарственных препаратах являются белки, принадлежащие к различным группам биологически активных веществ — рекомбинантные цитокины человека, моноклональные антитела (МкАТ), белки слияния/фьюжен белки и др. Учитывая, что биотехнологические лекарственные средства являются сложными препаратами белковой природы, которые длительно, а в некоторых случаях и пожизненно, применяются для лечения хронических тяжело протекаю-

щих заболеваний, необходимо уделять особое внимание качеству лекарственных препаратов данной группы.

Оценка подлинности препарата, его физико-химических свойств, количественных характеристик и показателей чистоты (определение содержания родственных соединений и посторонних примесей, молекулярно-массо-вое распределение и др.) должна проводиться с использованием современных высокочувствительных физико-химических, иммунохимических, биохимических методов и высокотехнологичного оборудования. Однако на основании результатов оценки физико-химических показателей биотехнологических препаратов невозможно в полном объеме прогнозировать проявления их биологической активности и клинических эффектов при использовании в медицинской практике.

Целью настоящего обзора является анализ особенностей определения биологической активности различных групп биотехнологических лекарственных средств в зависимости от механизмов их действия.

Специфическая биологическая активность, т.е. специфическая способность препарата вызывать определенный биологический эффект, является одним из наиболее важных показателей качества биотехнологических лекарственных препаратов. Подходы к изучению данного показателя и выбор методик зависят от природы и свойств лекарственного препарата. Используют методики in vitro и in vivo, основанные на различных принципах, с помощью которых можно показать специфичность действия активного компонента лекарственного препарата. Методики должны

быть адекватными и обладать достаточной чувствительностью и специфичностью [2-5].

Точность результатов, полученных при определении специфической активности, — необходимое условие обеспечения качества лекарственных препаратов. В связи с этим, аналитические методики, используемые для оценки активности, должны быть откалиброваны/стандартизо-ваны с использованием международного или национального стандартного образца. Если такие стандарты недоступны, должен быть разработан рабочий стандартный образец (стандартный образец предприятия) в соответствии с рекомендациями ВОЗ [2]. В настоящее время для многих рекомбинантных цитокинов человека разработаны Международные стандарты и стандарты Европейской фармакопеи как для оценки физико-химических свойств, так и для определения специфической активности.

Разработка отечественных стандартных образцов для оценки качества лекарственных средств является в настоящее время одной из приоритетных задач. В ФГБУ «НЦЭСМП» Миздрава России в рамках выполнения НИР «Совершенствование системы разработки и применения стандартных образцов, предназначенных для оценки качества, эффективности и безопасности лекарственных средств» разработан и аттестован отраслевой стандартный образец (ОСО) активности филграстима, проводятся исследования по аттестации ОСО активности эритропоэти-на [6, 7].

Для препаратов на основе МкАТ и белков слияния Международные и фармакопейные стандартные образцы не разработаны, в этом случае производителем разрабатывается стандартный образец предприятия, который и используется при оценке качества каждого конкретного препарата.

Оценка специфической биологической активности позволяет охарактеризовать фармакологическое действие препарата и изучить механизмы его терапевтических эффектов при клиническом применении. Поэтому специфическую активность биотехнологических препаратов предпочтительно оценивать с использованием методов, соответствующих предполагаемому механизму действия препарата. Для многих биотехнологических лекарственных препаратов, включая препараты системы цитокинов, МкАТ и др., используются индивидуальные методы оценки специфической активности [3, 4].

Цитокины — белковые или полипептидные факторы, которые в основном продуцируются активированными клетками кроветворной и иммунной систем и опосредуют межклеточные взаимодействия при кроветворении, воспалении, иммунных процессах в организме. Они являются универсальными регуляторами жизненного цикла клеток, контролируют процессы дифференцировки, пролиферации, функциональной активации и апоптоза клеток. Одной из важнейших особенностей цитокинов является их способность влиять на все клетки организма, обеспечивая межклеточное взаимодействие и контроль внутренней среды [8, 9]. Система цитокинов включает клетки, продуцирующие цитокины, растворимые цитокины, клетки, экс-прессирующие рецепторы для цитокинов (клетки-мишени), белки-антагонисты цитокинов или их рецепторов.

Активная продукция цитокинов происходит в ответ на воспалительные или антигенные стимулы. Действие цитокинов осуществляется через рецепторы, количество которых значительно увеличивается при активации клеток. Связывание цитокина со специфическим рецептором вызывает активацию клетки, пролиферацию, дифференци-

ровку или ее гибель. Знание природы таких рецепторов имеет значение для разработки препаратов, блокирую-щихэти рецепторы [8].

Цитокины подразделяются на несколько классов — интерлейкины (ИЛ), интерфероны (ИФН а, р, у), факторы некроза опухолей (ФНО а, р), факторы роста гемопоэтиче-ских клеток (колониестимулирующие факторы (Г-КСФ, М-КСФ, ГМ-КСФ), эритропоэтин, тромбопоэтин и др.), факторы роста нелимфоидных клеток (фактор роста фиброб-ластов, фактор роста эндотелиальных клеток, эпидер-мальный фактор роста и трансформирующие факторы роста (ТФРр, ТФРа)).

Интерлейкины — биологически активные вещества, являются главными участниками развития иммунного ответа на внедрение микроорганизмов, формирования воспалительной реакции, осуществления противоопухолевого иммунитета и др. Они подразделяются на провоспали-тельные и противовоспалительные, ростовые и дифференцировочные факторы лимфоцитов, хемокины, отдельные регуляторные цитокины [9].

Провоспалительные цитокины — ИЛ-1, ФНОа и ИЛ-6 являются главными медиаторами острофазной реакции организма, развивающейся в процессе инфекционного заболевания или механического повреждения тканей.

Важным иммунорегуляторным цитокином, участвующим в развитии иммунного ответа и обладающим множеством системных эффектов, является ИЛ-1. Он играет существенную роль в активации Т-Лф, стимулируя продукцию ИЛ-2, активирует ТИ1 звено иммунного ответа. ИЛ-1 стимулирует выработку гепатоцитами белков острой фазы, при действии на центр терморегуляции гипоталамуса вызывает развитие лихорадки. Также ИЛ-1 стимулирует пролиферацию и дифференцировку различных типов клеток. Усиливая экспрессию рецепторов для колониести-мулирующих факторов, ИЛ-1 способствует усилению ге-мопоэза, с чем связано его радиозащитное действие, стимулирует выход лейкоцитов из костного мозга [8-10] (рис. 1).

На основе рекомбинантного цитокина ИЛ-1Ь человека разработан отечественный лекарственный препарат «Беталейкин» (ФГУП ГосНИИ ОЧБ ФМБА России, С.-Петербург).

Фактор некроза опухолей альфа (ФНОа) — провоспа-лительный цитокин с широким спектром активности, является членом большого семейства молекул суперсемейства ФНО, к которому относят лимфотоксины а и р и др. Основные продуценты ФНОа как и ИЛ-1 — моноциты (Мо) и макрофаги (Мф). ФНОа усиливает экспрессию молекул адгезии, синтез провоспалительных цитокинов и хемоки-нов, белков острой фазы и т.д. Наряду с ИЛ-1, ФНОа участвует в формировании всех основных местных, а также некоторых системных проявлений воспаления [8, 9].

ИЛ-6 является провоспалительным цитокином широкого действия, участвует в индукции практически всего комплекса местных проявлений воспаления. Однако его провоспалительные свойства выражены слабее, ИЛ-6 сочетает свойства про-и противовоспалительных цитокинов и участвует не только в развитии, но и в ограничении воспалительной реакции [8].

ИЛ-2 является специфическим ростовым фактором для Т-клеток. Продуцируемый активированными Т-Лф, ИЛ-2 выполняет ключевую роль в процессе инициации и развития иммунного ответа. Он стимулирует активацию Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток, В-Лф, естественных (нормальных) киллеров (ЫК-клеток) и Мф. При стиму-

Рис. 1. Участие интерлейкина-1 в защитных реакциях организма: плейротропность эффектов [11].

Рис. 2. Механизм действия интерферона [15].

ляции ИЛ-2 формируются лимфокин-активированные киллеры (ЛАК), обладающие высокой противоопухолевой активностью. От присутствия ИЛ-2 зависит развитие цито-литической активности NK-клеток и цитотоксических Т-Лф [8, 9, 12, 13].

ИЛ-2 играет основную роль не только в клональной пролиферации активированных Т-Лф, но и является фактором их жизнеспособности, поскольку в отсутствие ИЛ-2 активированные клетки подвергаются апоптозу. На основе рекомбинантного белка ИЛ-2 человека разработаны лекарственные препараты — отечественный препарат Ронколейкин (ООО «НПК «БИОТЕХ», С.-Петербург) и зарубежный препарат Пролейкин (Альдеслейкин) («Cetus», США и «Chiron», Нидерланды).

Интерфероны (ИФН) — защитные вещества белковой природы, вырабатываемые клетками в ответ на вирусную инфекцию и другие стимулы, обладают противовирусной,

противоопухолевой, иммуномодулирующей активностью. Известно около 20 разновидностей ИФН, объединенных в 3 вида и 2 типа. Наиболее важное свойство ИФН — способность оказывать противовирусное действие. Противовирусная активность наиболее высока у ИФН типа I (а, ю, ß), при этом ИФН не проникает в клетки, а взаимодействует с рецепторами на их поверхности. Далее происходит активация генов, кодирующих ферменты с прямым противовирусным действием, вызывающих блокаду синтеза белков и разрушение вирусной мРНК (рис. 2). Противовирусная активность ИФН типа III также сильно выражена, хотя и обусловлена другими механизмами и развивается несколько медленнее. Также подобно другим цитокинам, ИФН участвуют в регуляции иммунных процессов. Сочетание указанных свойств ИФН служит основанием для их широкого применения в качестве лекарственных препаратов [14].

Рис. 3. Синтез и действие эритропоэтина [19].

К факторам гемопоэтических клеток, основной биологической функцией которых является поддержание жизнеспособности и пролиферации кроветворных клеток, относятся колониестимулирующие факторы, эритропо-этин, тромбопоэтин и др. Колониестимулирующие факторы (Г-КСФ, M-КСФ и ГМ-КСФ) продуцируются различными типами клеток, такими как эндотелиальные клетки, фиб-робласты, а также Мо/Мф и Т-Лф. Г-КСФ регулирует пролиферацию и дифференцировку клеток-предшественников в костном мозге и высвобождение нейтрофилов в периферической крови; является регулятором гранулопоэза, повышает эффекторные функции нормальных зрелых нейтрофилов. Свою активность Г-КСФ проявляет за счет связывания со специфическим трансмембранным рецептором, экспрессированным на различных гемопоэтических клетках. В клинической практике используются препараты Г-КСФ, полученные с использованием технологии реком-бинантной ДНК в системе клеток Escherichia coli (филгра-стим) или в системе клеток яичника китайского хомячка (СНО) (ленограстим) для лечения нейтропении после ци-тотоксической химиотерапии по поводу злокачественных заболеваний и др. [16].

Основным регулятором эритропоэза является эритро-поэтин, он способствует пролиферации и дифференциров-ке клеток эритроидного ростка костного мозга, в организме человека в основном вырабатывается клетками почек [8, 9]. Главным фактором, регулирующим выработку эритропоэтина в организме, является гипоксия. Продукция эритропоэтина имеет обратную зависимость от парциального давления кислорода в крови [17, 18] (рис. 3).

Эритропоэтин является гетерогенным гликопротеи-ном, состоящим из нескольких различных изоформ, образующихся преимущественно путем гликозилирования. В медицинской практике применяется 14 лекарственных препаратов на основе рекомбинантного эритропоэтина (эпоэтина) человека. Гликозилирование молекул реком-бинантного эритропоэтина приводит к образованию нескольких биологически активных форм с различной молекулярной массой и биологической активностью. В настоящее время существует девять международных непатентованных наименований (МНН) рекомбинантного эри-тропоэтина (эпоэтины альфа, бета, гамма, дельта, эпсилон, каппа, омега, тета и дзета) [17, 18].

Для оценки специфической активности препаратов системы цитокинов могут быть использованы биологиче-

ские методы исследования как в условиях in vivo на лабораторных животных, характеризующихся наиболее адекватным ответом на исследуемый препарат, так и в условиях in vitro с использованием клеточных линий, чувствительных к определенному цитокину. В зависимости от основных биологических свойств цитокинов и их механизмов действия на клетки-мишени, специфическая активность указанной группы препаратов может оцениваться по стимуляции пролиферации клеток-мишеней, цитотокси-ческому эффекту, индукции дифференцировки костномозговых предшественников, противовирусному действию [5, 20].

Метод определения пролиферативной активности клеток является одним из наиболее часто используемых методов оценки специфической биологической активности лекарственных препаратов цитокинов. В данном тесте используются соответствующие линии клеток, рост и пролиферация которых зависит от присутствия цитокина в среде культивирования и обусловлена его взаимодействием со специфическими рецепторами на их поверхности. В настоящее время большое количество клеточных линий, чувствительных к различным цитокинам человека, присутствует в каталогах международных и отечественных коллекций клеточных культур.

Разновидности указанного метода определяются стимулирующим или ингибирующим действием препарата на уровень пролиферации, видом используемой клеточной культуры, способом детекции результатов. Методы оценки влияния изучаемого препарата на жизнеспособность и пролиферацию клеток, а также на различные метаболические процессы основаны на определении количественного содержания бластных клеток по включению радиоактивной или другой метки в пролиферирующие клетки; использовании витальных или флуоресцентных красителей, с помощью МТТ-теста, XTT-теста и т.д. [20, 21] (табл. 1).

Как видно из данных, представленных в таблице 1, для оценки специфической активности препаратов цитокинов используют методы исследования как в условиях in vitro, так и в условиях in vivo, в частности для препаратов на основе филграстима или эритропоэтина. Гемостимули-рующую активность филграстима оценивают на модели индуцированной цитостатической миелосупрессии, определяя количественное содержание лейкоцитов и нейтрофилов у животных с иммуносупрессией после введения филграстима. Активность эритропоэтина оценивают по стимулирующему влиянию на эритропоэз у соответствующих линий нормоцитемических мышей, определяя количество ретикулоцитов после введения препаратов.

Специфическую противовирусную активность лекарственных препаратов на основе ИФН определяют по их защите чувствительных культур клеток от цитопатического действия вирусов-индикаторов.

Специфическая активность ФНОа может быть оценена по цитолитическому действию на чувствительные к нему линии клеток (например, клеток фибробластов мышей линий L-929, клеток фибросаркомы WEHI-164). Оценка результатов проводится по уровню сохранения жизнеспособности клеток, учитываемой по включению метки, аналогично определению уровня пролиферации клеток.

В клинической практике выделяют основные направления использования цитокинов — цитокиновая иммунотерапия, при которой цитокины выступают в роли лекарственных средств; антицитокиновая терапия, направленная на блокирование биологического действия или удаление избытка цитокинов из организма. Цитокинотерапия мо-

Таблица 1. Лекарственные препараты на основе рекомбинантных цитокинов человека

Группа лекарственных препаратов на основе цитокинов Показания для клинического применения Биологическое действие Метод определения специфической активности

Колониестимулирующие факторы - Г-КСФ (филграстим, ленограстим), - ГМ-КСФ (молграмостим), - М-КСФ Стимуляция лейкопоэза для восстановления нормального числа лейкоцитов, сниженного после химиотерапии у онкологических больных Стимуляция пролиферации, дифференцировки и функциональной активности гемопоэтических клеток, активация процессов кроветворения, регуляция гранулопоэза Гемостимулирующая активность (in vivo) на модели цитостатической миелосупрессии; Стимулирующее действие на пролиферацию (in vitro) - клеток костного мозга, - клеток миелолейкоза мышей, - клеток эритролейкемии, чувствительных к ГМ-КСФ

Зритропоэтины эпоэтины - альфа, - бета, - каппа, - тета, - зета и др. Лечение анемии различного генеза

Интерлейкины - ИЛ-1 бета

Интерфероны а-лейкоцитарный р-фибробластный у-иммунный Использование в терапии различных вирусных инфекций и онкологических заболеваний Наличие противовирусной активности, участие в регуляции иммунных процессов Оценка противовирусного действия

Зпидермальный фактор роста (ЗФР) При синдроме диабетической стопы у пациентов с трофическими и невропатичными язвами 3 и 4 степени Стимуляция пролиферации фибробластов, кератиноцитов, эндотелиальных и других клеток, участвующих в заживлении ран Стимуляция пролиферации линии клеток, чувствительных к фактору роста

жет использоваться как самостоятельный метод лечения или входить в состав комплексной терапии ряда заболеваний [8].

МкАТ представляют собой относительно новую группу лекарственных препаратов, успешно применяемых при лечении онкологических, аутоиммунных, инфекционных, аллергических и ряда других заболеваний. Терапия с помощью препаратов МкАТ высокоспецифична и эффективна, поскольку направлена на определенные патогенетически значимые механизмы развития заболевания, которые ранее не удавалось контролировать с помощью фармакологических средств [8, 22, 23]. Использование лекарственных препаратов МкАТ в качестве терапевтических агентов явилось для медицины стратегическим этапом в смене концепции лечения — от неспецифической к специфической (таргетной) терапии [24].

С каждым годом на фармацевтическом рынке увеличивается количество лекарственных препаратов МкАТ и расширяется диапазон их клинического применения. Разработка новых препаратов позволяет ожидать появления в ближайшем будущем еще более разнообразных и эф-

фективных лекарственных средств на основе модифицированных МкАТ или их производных [25].

При оценке специфической активности препаратов МкАТ, определяющей их клиническую эффективность, используют методы, соответствующие предполагаемому механизму действия МкАТ, воспроизводимые в условиях in vitro. Направленность действия МкАТ осуществляется за счет использования лиганд-опосредованного механизма, который способствует связыванию препарата с соответствующими антигенами (АГ) на поверхности клеток. В связи с этим, в методиках определения специфической активности необходимо использование клеточных линий, которые несут на своей поверхности соответствующие опухоле-ассоциированные АГ (различные культуры опухолевых тканей человека); экспрессируют рецепторы к ростовым факторам и биологически активным цитокинам, а также иные мембранные молекулы, на которые направлены МкАТ. Все большее распространение получают линии клеток, трансфицированные геном люциферазы, которая может использоваться для оценки уровня АТФ в клетках, что позволяет оценить жизнеспособность или

Таблица 2. Механизм действия МкАТ и методы оценки их специфической активности [8, 25, 26]

Механизм действия моноклональных антител Метод оценки специфической активности

Иммуноопосредованная (антитело-и комплементзависимая цитотоксичность) Стимуляция фагоцитоза опухолевых клеток Блокада рецепторов факторов роста Торможение роста опухоли за счет подавления пролиферации эндотелиальных клеток сосудов Ингибиция проявлений биологически активных цитокинов Индукция апоптоза 1) Оценка комплементзависимой цитотоксичности — происходит активация комплемента, обусловленная реакцией АГ-АТ, которая приводит к повреждению клеточной мембраны и гибели клетки 2) Оценка антителозависимой цитотоксичности — разрушение клеток-мишеней происходит под воздействием эффекторных клеток в присутствии специфических антител 3) Оценка активности люциферазы, вырабатываемой клетками, рост и пролиферация которых зависит от присутствия факторов роста 4) Оценка ингибиции пролиферации клеток, обусловленной нейтрализацией активности цитокина, от присутствия которого зависит рост и пролиферация исследуемых клеток 5) Оценка нейтрализации цитопатогенного действия цитокинов с помощью исследуемых специфических МкАТ

Рецепторные антагонисты га11_-1

Растворимые рецепторы эТ^Ш!

Гуманизированные монокпональные антитела к цитокинам Антитела к ТЫ Ра

011.-11*

14 гаИ-1 11.-1

0гк

вТОРГО! Т^а

Анти-ТМРа

Рис. 4. Средства антицитокиновой терапии и принципы их использования при системных воспалительных процессах [27]: га!1_-1 — рецеп-торный антагонист интерлейкина 1; !1_-Ш — рецептор к интерлейкину 1; ТМРа — фактор некроза опухолей альфа; вТМРР!! — растворимый рецептор к фактору некроза опухолей альфа !! типа.

активность клеток. При увеличении в культуре количества жизнеспособных клеток возрастает количество АТФ и добавление к клеткам субстрата люциферина способствует повышению уровня люминесценции, опосредованного взаимодействием фермента с люциферином и АТФ (кофактор реакции).

В связи с высокой избирательностью и специфичностью действия на определенные звенья патогенеза заболевания, МкАТ в минимальной степени затрагивают процессы нормального функционирования иммунной системы и обладают способностью подавлять системные реакции воспаления при аутоиммунных заболеваниях и активировать иммунную систему при новообразованиях [26].

Для лечения аутоиммунных заболеваний широко используются лекарственные препараты МкАТ, действие которых направлено на подавление активности провоспа-лительных цитокинов. При системных воспалительных заболеваниях аутоиммунной природы наблюдается избыточная продукция провоспалительных цитокинов (ФНОа, ИЛ-1 и ИЛ-6), при этом их концентрация в сыворотке кро-

ви значительно повышается. Это сопровождается проявлением системных эффектов провоспалительных цитокинов, поскольку они являются главными медиаторами острофазной реакции организма, обладают пироген-ным эффектом, способны вызывать синдром повышения проницаемости капилляров.

Лекарственные препараты, направленные на ослабление действия биологически активных цитокинов, могут реализовать свое действие на разных уровнях: подавлять синтез или секрецию цитокина, связывать секретирован-ный цитокин, конкурировать с ним за взаимодействие с рецептором на клетке-мишени и блокировать передачу сигнала с цитокинового рецептора в клетку-мишень [8, 27].

На рисунке 4 представлена схема механизмов действия указанных групп лекарственных препаратов.

Наиболее важной мишенью для антицитокиновой терапии является ФНОа. К препаратам, обнаружившим высокую эффективность при лечении ревматоидного артрита, псориаза, анкилозирующего спондилита, относятся

Таблица 3. Лекарственные препараты, нейтрализующие действие провоспалительных цитокинов

Лекарственный препарат Показания для клинического применения Биологическое действие Метод определения специфической активности

Инфликсимаб химерные МкАТ к ФНОа Адалимумаб полностью человеческие МкАТ к ФНОа Голимумаб полностью человеческие МкАТ к ФНОа Этанерцепт белок слияния

Тоцилизумаб гуманизированные МкАТ к рецептору ИЛ-6 Ревматоидный артрит Связывание растворимых и мембранных рецепторов ИЛ-6

Канакинумаб полностью человеческие МкАТ к ИЛ-1 р Острый подагрический артрит Активная фаза системного ювенильного идиопатического артрита у детей Связывание ИЛ-1 р, нейтрализация его биологического действия за счет блокады взаимодействияИЛ-1 р с его рецепторами Подавление ИЛ-1 b зависимой индукции люциферазной активности клеток соответствующей линии

блокаторы ФНОа или его рецепторов [28, 29]. МкАТ к ФНОа связывают как растворимые, так и трансмембранные формы ФНОа и препятствуют их взаимодействию со специфическим рецептором на мембране клеток-мишеней. В медицинской практике для лечения указанных заболеваний используются лекарственные препараты — ин-фликсимаб, адалимумаб, голимумаб (МкАТ к ФНОа); белок слияния этанерцепт, включающий рецептор к ФНОа и и Ре-фрагмент 1д31 человека. Также при лечении ревматоидного артрита применяются МкАТ к рецептору ИЛ-6 (то-цилизумаб), при лечении острого подагрического артрита — МкАТ к ИЛ-1 р (канакинумаб) (табл. 3).

Для оценки специфической активности данной группы препаратов используют следующие методы: нейтрализация цитолитического действия ФНОа на чувствительных линиях клеток; подавление пролиферации клеток, чувствительных к ИЛ-6.

В основе механизмов действия другой группы лекарственных препаратов лежит их способность оказывать модулирующее влияние на костимулирующие сигналы в процессе развития иммунного ответа. Известно, что для активации цитотоксических клеток / Т-Лф необходимо взаимодействие рецептора Т-клеток с АГ в комплексе с антигенами главного комплекса гистосовместимости (АГ ГКГ) класса II. Кроме активирующего сигнала нужны костимулирующие сигналы для индукции пролиферации Т-клеток, секреции цитокинов, проявления эффекторных функций и активации цитотоксических Т-Лф. Костимули-рующие сигналы возникают благодаря взаимодействию маркера ранней активации Сй28 на Т-Лф с костимулирую-щими молекулами Сй80 и Сй86 на антигенпрезентирую-щих клетках (АПК). Взаимодействие маркера поздней активации цитотоксических СТ1_Д-4 на Т-Лф с Сй80 и Сй86 на АПК приводит к регулированию и подавлению активации Т-Лф [8].

Лекарственные препараты (абатацепт, белатацепт), активным компонентом которых является рекомбинант-ный белок слияния, состоящий из домена СТ1_Д-4 и Ре-фрагмента 1дС1 человека, взаимодействуя с костиму-

лирующими молекулами Сй80 и Сй86 на АПК, блокируют избыточную стимуляцию Т-Лф, осуществляемую за счет Сй28 (рис. 5). Указанные препараты используются для лечения аутоиммунной патологии, при трансплантации органов для предотвращения реакции отторжения (табл. 4).

Лекарственный препарат на основе МкАТ к антигену СТ1_Д-4 (ипилимумаб) применяется для лечения онкологических заболеваний, так как блокада СТ1_Д-4 специфическими МкАТ приводит к подавлению супрессирующих сигналов, следствием чего является активация цитотоксических Т-Лф, за счет воздействия которых отмечается подавление роста опухолевых клеток [31, 32].

Специфическая активность указанных лекарственных препаратов оценивается по подавлению синтеза ИЛ-2 в культуре клеток или оценке степени активации Т-Лф при совместном культивировании Т- и В-клеток.

иммунным ответ путем

Ч связывания с СР80/СР86 на АПК, предупреждая

/таким образом связывание С080ДЮ86 с Сй28 Т-клеток, Абатацепт и ослабляет активацию

Т-клеток.

Абатацепт отменяет активацию Т-клеток, блокируя костимуляцию.

Рис. 5. Механизм действия абатацепта [30]: TCR — Т-клеточный рецептор; МНС — главный комплекс гистосовместимости; АПК — антигенпрезентирующие клетки.

Таблица 4. Лекарственные препараты, модулирующие костимулирующие сигналы

Лекарственный препарат Показания для клинического применения Биологическое действие Метод определения специфической активности

Абатацепт Белатацепт рекомбинантный белок слияния

2. Комплемент-зависимая клеточная цитотоксичност

В-клеточная деплеция

Рис. 6. Механизмы возможного действия ритуксимаба [30, 34, 35].

Наиболее широко лекарственные препараты МкАТ применяются в онкологии. Разработан целый ряд препаратов МкАТ, направленных к различным опухолеассоции-рованным АГ [33]. При лечении лейкозов используют препараты, активным компонентом которых являются МкАТ к мембранным молекулам, характерным для клеток, вовлеченных в лейкозный процесс. В этом случае специфическое связывание МкАТ с трансмембранным антигеном CD20 на опухолевых В-клетках способствует элиминации клеток за счет комплементзависимого цитолиза или анти-телозависимого контактного цитолиза. Регионы АТ, ответственные за распознавание АГ, связываются с CD20 на опухолевой В-клетке, а Fc-регионы путем связывания с первым компонентом комплемента или Fc-рецепторами на эффекторных клетках инициируют иммунные механизмы разрушения клетки (рис. 6).

Лекарственные препараты на основе МкАТ, специфичных к CD20 (ритуксимаб, обинутузумаб, офатумумаб), используются при лечении неходжкинской лимфомы и хронического лимфолейкоза, а также ревматоидного артрита, поскольку в настоящее время доказана возможность эффективного контроля аутоиммунных патологических состояний путем истощения (и/или модуляции функции) активированных В-клеток [21, 36-39]. Специфическая активность препаратов данной группы оценивается биологическими методами in vitro: метод комплементза-висимой цитотоксичности с использованием В-лимфобла-стоидных клеток линии WIL2-S, экспрессирующих CD20;

метод антитело-зависимой цитотоксичности с использованием клеток, экспрессирующих Сй20, и клеток-эффекторов (табл. 5).

Важными факторами функционирования клеток, в том числе опухолевых, являются регуляция процессов сигнальной трансдукции, включая активность факторов роста, транскрипционных факторов и тесно связанных с ними процессов клеточной пролиферации, ангиогенеза, а для опухолевых клеток — инвазии и метастазирования [40].

Факторы роста обеспечивают и регулируют рост, диф-ференцировку и функциональную активность клеток. К факторам роста, играющим важную роль в опухолевых процессах, относятся эпидермальный фактор роста (ЭФР), фактор роста эндотелия сосудов (УБСР), фактор роста фиб-робластов и др. [8-10].

Одним из наиболее изученных противоопухолевых препаратов МкАТ является трастузумаб (гуманизированные МкАТ к внеклеточному домену рецептора эпидер-мального фактора роста 2 типа (НБР2)). Гиперэкспрессия указанного рецептора на поверхности опухолевых клеток связана с неблагоприятным течением заболевания. Поэтому он является важной мишенью для противоопухолевой терапии. Трастузумаб обладает комплексным механизмом противоопухолевого действия, который обусловлен блокадой внутриклеточных путей передачи сигнала, которые запускает НБР2, а также стимуляцией противоопухолевого иммунного ответа. Он подавляет пролифера-

Таблица 5. Лекарственные препараты моноклональных антител, специфичных к CD20

Лекарственный препарат Показания для клинического применения Биологическое действие Метод определения специфической активности

Ритуксимаб химерные МкАТ к молекуле СР20 на В-Лф и опухолевых клетках Офатумумаб полностью человеческие МкАТ к молекуле СР20 Обинутузумаб гуманизированные МкАТ!! типа к молекуле СР20 с модифицированной схемой гликозилирования Неходжкинская лимфома Ревматоидный артрит Хронический лимфолейкоз Хронический лимфолейкоз Специфическое связывание МкАТ с CD20 В-Лф приводит к элиминации клеток Комплементзависимая цитотоксичность с использованием В-лимфобластоидных клеток, экспрессирующих CD20

Активированный HER2

Рис. 7. Механизм действия трастузумаба [41, 44]: НБР2 — внеклеточный домен рецептора эпидермального фактора роста 2 типа.

цию, восстанавливает способность опухолевых клеток к апоптозу и др. [41] (рис. 7).

В комбинации с пертузумабом (гуманизированные МкАТ к домену димеризации рецептора НБР2) клиническая эффективность трастузумаба значительно повышается. Считается, что механизмы действия трастузумаба и пертузумаба дополняют друг друга, так как оба препарата связываются с НБР2-рецептором, но в разных областях [41-43].

Специфическая активность указанных препаратов оценивается по их антипролиферативному действию на культурах клеток карциномы молочной железы человека (табл. 6).

Одним из основных факторов микроокружения опухоли, приводящим к росту и метастазированию заболевания, является ангиогенез. Взаимодействие фактора роста эндотелия сосудов с его рецепторами приводит к пролиферации эндотелиальных клеток и образованию новых

Таблица 6. Лекарственные препараты, подавляющие активность факторов роста

Лекарственный препарат Показания для клинического применения Биологическое действие Метод определения специфической активности

Трастузумаб гуманизированные МкАТ к внеклеточному домену рецептора НЕР2 Диссеминированный рак молочной железы с гиперэкспрессией НЕР2 Связывание с !У доменом НЕР2-рецептора, блокирует НЕР2-опосредованные сигнальные пути, активирует клеточную цитотоксичность Подавление пролиферации клеток линий карциномы молочной железы человека

Пертузумаб гуманизирован-ные МкАТ к домену димеризации рецептора НЕР2 Метастатический или местнорецидивирующий неоперабельный рак молочной железы с гиперэкспрессией НЕР2 Связывание с доменом димеризации блокирует гиперактивацию сигнальных путей, опосредованных как через НЕР2, так и через рецепторы НЕР1/3/4

Бевацизумаб гуманизирован-ные МкАТ кУЕЭР Метастатический колоректальный рак Местно рецидивирующий или метастатический рак молочной железы Распространенный и/или метастатический почечно-клеточный рак Глиобластома Зпителиальный рак яичника, маточной трубы и первичный рак брюшины Связывание сУЕЭР предотвращает его взаимодействие с рецепторами на поверхности эндотелиальных клеток сосудов, подавляя их рост Подавление пролиферации эндотелиальных клеток пупочной вены человека, экспрессирующих рецептор к VEGF

Афлиберцепт

Рабинизумаб РаЬ-фрагмент человеческих МкАТ кУЕЭР А Зкссудативно-геморрагическая форма возрастной макулярной дегенерации и отек макулы на фоне сахарного диабета и тромбоза вен сетчатки Обладает антиангиогенным эффектом за счет связывания с эндотелиальным фактором роста сосудов. Зто подавляет пролиферацию сосудов и неоваскуляризацию Подавление пролиферации эндотелиальных клеток пупочной вены человека, экспрессирующих рецептор к VEGF

кровеносных сосудов. Специфическое связывание соответствующих МкАТ с УБОР предотвращает его взаимодействие с рецепторами на поверхности клеток эндотелия опухолевых клеток, что приводит к снижению васкуляри-зации опухоли и угнетению ее роста (рис. 8).

Для лечения онкологических заболеваний используются лекарственные препараты МкАТ — бевацизумаб (МкАТ к УБОР), панитумумаб (МкАТ к рецептору УБОР); препарат на основе белка слияния — афлиберцепт, который содержит в своей структуре домены рецепторов УБОР и

Рис. 8. Действие УЕЭР и результаты блокирования его активности с помощью моноклональных антител [45].

Fc-фрагмент IgG1 человека. Лекарственные препараты на основе Fab-фрагмента человеческих МкАТ к фактору роста эндотелия сосудов А (рабинизумаб), а также афлиберцепт применяются в офтальмологии для лечения неоваскуляр-ной (влажной) формы возрастной макулярной дегенерации.

Специфическую активность указанных препаратов оценивают по подавлению пролиферации эндотелиаль-ных клеток пупочной вены человека HUVEC, экспресси-рующих рецептор к VEGF, или по снижению активности люциферазы, вырабатываемой клетками в ответ на стимуляцию VEGF (табл. 6).

Индуцированный различными стимуляторами, мито-генами синтез цитокинов отражает потенциальную, резервную способность клеток отвечать на антигенный стимул (в частности, на действие лекарственных препаратов). Сниженная индуцированная продукция цитокинов может служить одним из признаков иммунодефицитного состояния.

У лекарственных препаратов с иммуномодулирующей активностью, а также многих препаратов МкАТ, специфическая активность может быть определена по их влиянию на активацию клеток, оцениваемую по способности клеток продуцировать цитокины (например, такие как ИЛ-2, ФНОа и др.). Для препаратов МкАТ, в соответствии с их механизмом действия, в данном случае характерно подав-

ление активации клеток и дозозависимое снижение уровня синтезируемых цитокинов.

Для выявления синтезированных цитокинов в супер-натанте культивируемых клеток или цитокин-продуци-рующих клеток используют методы, основанные на следующих принципах:

- выявление цитокинов (внутриклеточных и мембра-ноассоциированных) соответствующими МкАТ, меченными флуорохромами, путем регистрации клеток, экспресси-рующих цитокины, на проточном цитофлуориметре;

- выявление клеток, секретирующих определенные цитокины (метод EliSpot);

- оценка интенсивности пролиферации соответствующих цитокин-зависимых клеточных линий под влиянием цитокинов, содержащихся в супернатанте культивируемых клеток;

- иммуноферментный анализ для выявления секре-тируемых цитокинов [25].

При оценке качества биотехнологических лекарственных препаратов также применяются методы, характеризующие специфичность связывания АГ с соответствующими АТ. С этой целью могут быть использованы методы иммуноферментного анализа (ИФА), поверхностного плазмонного резонанса, а также методы, основанные на технологии Alpha (AlphaScreen, AphaLISA и AlphaPlex™) и др. Метод поверхностного плазмонного резонанса позволяет оценить биоспецифичное связывание иммобилизованного АТ с соответствующим АГ при их взаимодействии на биосенсорном чипе по изменению показателя преломления электромагнитной волны. Технология Alpha представляет собой люминесцентную технологию, основанную на взаимодействии частиц (гранул), разработанную для измерений биологических взаимодействий. Следует учитывать, что указанные методы не характеризуют проявления биологической активности лекарственных препаратов.

Таким образом, биотехнологические препараты в настоящее время достаточно широко применяются в медицинской практике. Одним из основных показателей, характеризующих качество лекарственных средств, является специфическая активность, позволяющая оценить способность препарата проявлять определенный биологический эффект. Охарактеризованные в обзоре методы исследования в условиях in vivo и in vitro позволяют эффективно оценивать специфическую активность современных биотехнологических лекарственных препаратов и могут быть использованы при разработке, создании и испытаниях новых лекарственных средств, относящихся к данной категории.

С каждым годом количество данных препаратов увеличивается, на фармацевтическом рынке появляются новые препараты как для лечения онкологических и аутоиммунных заболеваний, так и для использования в схемах лечения заболеваний другого профиля. Расширяется и спектр аналитических методик для оценки специфической активности новых биотехнологических лекарственных препаратов.

Литература

1. Федеральный закон Российской Федерации от 12.04.2010 г.

№ 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств».

2. Guidelines on the quality, safety, and efficacy of biotherapeutic

protein products prepared by recombinant DNA technology. Replacement of Annex 3 of WHO Technical Report Series, No. 814.

WHO. 2013.

3. Авдеева ЖИ, Волкова PA, Алпатова НА, Борисевич ИВ. Общие принципы разработки программы доклинических испытаний иммунобиологических лекарственных препаратов, полученных с использованием методов генной инженерии. Цитокины и воспаление 2011; 10(4): 5-10.

4. Авдеева ЖИ, Алпатова НА, Солдатов АА, Бондарев ВП, Бу-нятян НД, Меркулов ВА и др. Особенности доклинических исследований биотехнологических лекарственных препаратов. Иммунология 2015; 36(5): 306-12.

5. Алпатова НА, Авдеева ЖИ, Солдатов АА, Бондарев ВП, Ме-дуницын НВ. Принципы оценки специфической активности биотехнологических лекарственных препаратов. Цитокины и воспаление 2015; 14(3): 12-6.

6. Яковлев АН, Гайдерова ЛА, Алпатова НА, Лобанова ТН, Постнова ЕЛ, Юрчикова ЕИ и др. Изучение принципов стандартизации фармакологической активности препаратов рекомбинантных эритропоэтинов. Стандартные образцы 2016; (1): 8-20.

7. Мотузова ЕВ, Алпатова НА, Гайдерова ЛА, Рунова ОБ, Волкова РА, Мыца ЕД и др. Разработка и аттестация отраслевого стандартного образца активности филграстима. Биопрепараты. Профилактика, диагростика, лечение 2016; 16(3): 172-8.

8. ЯрилинАА. Иммунология. М.: ГЗОТАР-Медиа; 2010.

9. Нетлинский СА, Симбирцев АС. Цитокины. СПб: Фолиант; 2008.

10. Симбирцев АС. Цитокины — новая система регуляции защитных реакций организма. Цитокины и воспаление 2002. 1(1): 9-16.

11. Баринов АН. Тазовые боли с позиции невролога. Available from: http://inmeda.info/images/restricted/pelvicpain.pdf.

12. Медуницын НВ, Авдеева ЖИ, Алпатова НА. Препараты на основе цитокинов для иммунотерапии. В кн.: Сб. трудов 5-го Нонгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». Т. 1. Актовые и пленарные лекции. М., 2002. С. 381-97.

13. Авдеева ЖИ. Лекарственные препараты цитокинов. Биопрепараты. Профилактика, диагростика, лечение 2005; (1): 17-21.

14. Попов ВФ, Попов ОВ. Лекарственные формы интерферонов: Справ. Врача. М.: Триада-X, 2002.

15. Ржешевский АВ. Золотой век вирусов. Популярная механика 2015; (9): 410-44.

16. Авдеева ЖИ, Солдатов АА, Алпатова НА, Ниселевский МВ, Лысикова СЛ, Бондарев ВП и др. Биоаналоговые (биоподобные) лекарственные препараты рекомбинантного грануло-цитарного колониестимулирующего фактора. Оценка качества. Биопрепараты. Профилактика, диагростика, лечение 2015; (1): 4-14.

17. Elliotts, Pham E, Macdougall IC. Erythropoietins: a common mechanism of action. Exp Hematol. 2008; 36(12): 1573-84.

18. Меркулов ВА, Солдатов АА, Авдеева ЖИ, Алпатова НА, Гай-дерова ЛА, Яковлев АН, Медуницын НВ. Препараты рекомби-нантных эритропоэтинов и их характеристика. Биопрепараты. Профилактика, диагростика, лечение 2013; (3): 4-11.

19. Шестакова МВ, Мартынов СА. Анемия при диабетической нефропатии: прогностическое значение, диагностика и лечение. Consilium medicum 2006; (9): 39-43.

20. Новальчук ЛВ, Ганковская ЛВ, Мешкова РЯ. Нлиническая иммунология и аллергология с основами общей иммунологии. М.: ГЗОТАР-Медиа; 2012.

21. Лягоскин ИВ, Берестовой МА, Потеряев ДА, Зейналова ЗС, Вишневский АЮ, Назаров АА. ВалидацияХТТ-теста для оценки антипролиферативной активности препаратов на основе моноклональных антител. Биопрепараты. Профилактика, диагростика, лечение 2015; (1): 45-50.

22. Guideline on development, production, characterization and specifications for monoclonal antibodies and related products. London, EMA. 2008.

23. Авдеева ЖИ, Алпатова НА, Волкова РА, Лаптева ЛН. Лекарственные препараты на основе генно-инженерных монокло-нальных антител. Биопрепараты. Профилактика, диагростика, лечение 2011; (2): 14-9.

24. Иванов АА, Белецкий ИП. Терапия моноклональными антителами — панацея или паллиатив? Ремедиум 2011; (3): 12-6.

25. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (иммунобиологические лекарственные препараты). Часть вторая. М.: Гриф и Н, 2013.

26. Авдеева ШИ, Солдатов АА, Алпатова НА, Медуницын НВ, Бондарев ВП, Миронов АН и др. Лекарственные препараты моноклональных антител нового поколения (проблемы и перспективы). Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение 2015; (1): 21-35.

27. Хаитов РМ, ЯрилинАА, Пинегин БВ. Иммунология. Атлас. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2011. С. 302; 333.

28. СигидинЯА, Лукина ГВ. Биологическая терапия в ревматологии. М.: Практическая медицина; 2009.

29. Елисеев МС, Барскова ВГ, Насонов ЕЛ. Роль фактора некроза опухоли-а (ФНОа) в развитии обменных нарушений и атеросклероза и влияние на них ингибиторов ФНОа у больных ревматическими заболеваниями. Научно-практическая ревматология 2009; (2): 67-73.

30. Новаленко ВН, Головач ИЮ, Борткевич ОП. Современные мишени для целевой терапии ревматоидного артрита: от мо-ноклональных антител до блокаторов сигнальных молекул. Украинский ревматологический журнал 2012; 49(3): 5-14.

31. Tarhini AA, Iqbal F. CTLA-4 blockade: therapeutic potential in cancer treatments. Onco Targets Ther. 2010; 3: 15-25.

32. Демидов ЛВ, Харкевич ГЮ, Михайлова ИН, Петенко ИН, Само-йленко ИВ, Утяшев ИА. Новые направления в лечении больных меланомой кожи. Вестник московского онкологического общества. Информационный бюллетень 2011; 9(580): 4-6.

33. Моисеенко ВМ. Возможности моноклональных антител в лечении злокачественных опухолей. Практическая онкология 2002; 3(4): 253-61.

34. Проценко ГА. Перспективы применения ритуксимаба в ревматологии. Украинский ревматологический журнал 2009; (1): 44-7.

35. Cohen SB, Emery P, Greenwald MW, Dougados M, Eurie RA, Geno-vese MC, et al. Rituximab for rheumatoid arthritis refractory to an-

ti-tumor necrosis factor therapy: results of a multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, phase III trial evaluating primary efficacy and safety at twenty-four weeks. Arthritis Rheum. 2006; 54(9): 2793-806.

36. Насонов ЕЛ. Ритуксимаб в лечении ревматических болезней. Научно-практическая ревматология 2008. Приложение к № 1:3-10.

37. Насонов ЕЛ, ред. Анти-В-клеточная терапия в ревматологии: фокус на ритуксимаб. Монография. М.: ИМА-ПРЕСС; 2012.

38. Maddocks KJ, Lin TS. Update in the management of chronic lymphocytic leukemia. J Hematol Oncol. 2009; 2:2-29.

39. Taylor RP, Lindorfe MA. Drug Insight: the mechanism of action of Rituximab in autoimmune disease-the immune complex decoy hypothesis. Nat Clin Pract Rheumatol. 2007; 3(2): 86-95.

40. Мирошника OA, ред. Иммуномодуляторы в России: Справочник. Т. 1. Омск: ГП «Омская областная типография»; 2014.

41. Бесова НС. Продолжительность терапии Герцептином при HER2-позитивном раке молочной железы. Эффективная фармакотерапия. Онкология, гематология и радиология 2012; (1): 14-21.

42. Ганьшина ИП, Жукова ЛГ, Тюрин ИЕ. Пертузумаб — новый взгляд на HER2-nоложительный метастатический рак молочной железы. Фарматека 2014; (17): 52-9.

43. Baselga J, Gelmon KA, Verma S, WardleyA, Conte P, Miles D, et al. Phase II trial of pertuzumab and trastuzumab in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer that progressed during prior trastuzumab therapy. J Clin Oncol. 2010; 28(7): 1138-44.

44. Jones K, Buzdar AU. Evolving novel anti-HER2 strategies. Lancet Oncol. 2009; 10(12): 1179-87.

45. Норман ДБ. Мишени и механизмы действия противоопухолевых препаратов. М.: «Практическая медицина», 2014. С. 150.

Об авторах

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Российская Федерация, 127051, Москва, Петровский бульвар, 8, стр. 2. Алпатова Наталья Александровна. Главный эксперт лаборатории иммунологии Испытательного центра экспертизы качества МИБП, канд. биол. наук.

Гайдерова Лидия Александровна. Начальник лаборатории иммунологии Испытательного центра экспертизы качества МИБП, канд. мед. наук.

Яковлев Алексей Константинович. Ведущий микробиолог лаборатории иммунологии Испытательного центра экспертизы качества МИБП.

Мотузова Екатерина Валерьевна. Главный эксперт управления экспертизы аллергенов, цитокинов и других иммуномодуляторов Центра экспертизы и контроля МИБП, канд. биол. наук.

Лысикова Светлана Леонидовна. Эксперт 1-й категории лаборатории иммунологии Испытательного центра экспертизы качества МИБП, канд. мед. наук.

Солдатов Александр Алексеевич. Главный эксперт управления экспертизы аллергенов, цитокинов и других иммуномодуляторов Центра экспертизы и контроля МИБП, д-р мед. наук.

Авдеева Жанна Ильдаровна. Главный эксперт управления экспертизы аллергенов, цитокинов и других иммуномодуляторов Центра экспертизы и контроля МИБП, д-р мед. наук, профессор.

Адрес для переписки: Алпатова Наталья Александровна; naal-cytok@yandex.ru

Assessment of biotechnological products specific activity

N. A. Alpatova, L. A. Gayderova, A. K. Yakovlev, E. V. Motuzova, S. L. Lysikova, A. A. Soldatov, Zh. I. Avdeeva

Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russia

The review looks into various aspects of assessing specific activity of biotechnological products, which is one of their key quality parameters. Approaches to the analysis of this parameter and the choice of test procedures are governed by the nature and characteristics of a medicinal product. Test procedures should be adequate and have sufficient sensitivity and specificity. Specific activity of the products in question can be assessed by biological methods both in vivo using laboratory animals, which demonstrate the most adequate response to the tested product, and in vitro using sensitive cell lines. As-

sessment of specific biological activity helps to characterize the product's pharmacological action and systematically examine the mechanisms of therapeutic effects in clinical practice. Therefore, specific activity of biotechnological products should be assessed using methods appropriate for the proposed mechanism of action. Many biotechnological products, such as cytokine system products, mAbs, fusion proteins and some others call for individual methods for assessment of their specific activity. Biotechnological products are successfully used in the treatment of autoimmune, infectious, oncological, and allergic diseases.

Key words: biotechnological products; cytokines; monoclonal antibodies; specific biological activity; in vitro and in vivo test methods; cell lines.

For citation: Alpatova NA, Gayderova LA, Yakovlev AK, Motuzova EV, Lysikova SL, Soldatov AA, Avdeeva ZhI. Assessment of biotechnological products specific activity. BlOpreparations. Prevention, diagnosis, treatment 2017; 17(1): 13-26.

References

1. Federal Law of 12.04.2010, №61-FZ «On Circulation of Medicines» (in Russian).

2. Guidelines on the quality, safety, and efficacy of biotherapeutic protein products prepared by recombinant DNA technology. Replacement of Annex 3 of WHO Technical Report Series, No. 814. WHO. 2013.

3. Avdeeva ZhI, Volkova RA, Alpatova NA, Borisevich IV. General principles of development of preclinical studies program for im-munobiological medicinal preparations produced using genetic engineering methods. Tsitokiny i vospalenie. 2011; 10(4): 5-10 (in Russian).

4. Avdeeva ZhI, Alpatova NA, Soldatov AA, Bondarev VP, Bunyatyan ND, Merkulov VA, et al. Aspects of preclinical studies of biotech drugs. Immunologiya 2015; 36(5): 306-12 (in Russian).

5. Alpatova NA, Avdeeva ZhI, Soldatov AA, Bondarev VP, Medunitsyn NV. Basis of measurement the specific activity of biotech medicinal preparations. Tsitokiny i vospalenie 2015; 14(3): 12-6 (in Russian).

6. YakovlevAK, Gayderova LA, Alpatova NA, Lobanova TN, Postnova EL, Yurchikova EI, et al. Studying of the standardization principles of pharmacological activity of recombinant erythropoietin preparations. Standartnye obraztsy 2016; (1): 8-20 (in Russian).

7. Motuzova EV, Alpatova NA, Gayderova LA, Runova OB, Volkova RA, Mytsa ED, et al. Development and certification of an industrial reference standard for determination of filgrastim activity. Biop-reparations. Prevention, Diagnosis, Treatment 2016; 16(3): 172-8 (in Russian).

8. Yarilin AA. Immunology. Moscow: GEOTAR-Media; 2010 (in Russian).

9. Ketlinskij SA, Simbircev AS. Cytokines. St. Petersburg: Foliant; 2008 (in Russian).

10. Simbirtsev AS. Cytokines — a new system of regulation of defense reactions. Tsitokiny i vospalenie. 2002; 1(1): 9-16 (in Russian).

11. Barinov AN. Pelvic pain from the position of neurologist. Available from: http://inmeda.info/images/restricted/pelvicpain.pdf (in Russian).

12. Medunitsyn NV, Avdeeva ZhI, Alpatova NA. Preparations based on cytokines for immunotherapy. In: Sb. trudov5-go Kongressa «Sov-remennye problemy allergologii, immunologii i immunofarmako-logii». V. 1. Aktovye i plenarnye lektsii. Moscow. 2002. P. 381-97 (in Russian).

13. Avdeeva ZhI. Medications of cytokines. Biopreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment 2005; (1): 17-21 (in Russian).

14. Popov VF, Popov OV. Dosage forms of interferon: Ref. Physician. Moscow: Triada-X, 2002 (in Russian).

15. Rzheshevskiy AV. The golden age of viruses. Populyarnaya mekha-nika 2015; (9): 410-44 (in Russian).

16. Avdeeva ZhI, Soldatov AA, Alpatova NA, Kiselevskiy MV, Lysikova SL, Bondarev VP, et al. Recombinant granulocyte colony stimulating factor biosimilars. Quality assessment. Biopreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment 2015; (1): 4-14 (in Russian).

17. Elliott S, Pham E, Macdougall IC. Erythropoietins: a common mechanism of action. Exp Hematol. 2008; 36(12): 1573-84.

18. Merkulov VA, Soldatov AA, Avdeeva ZhI, Alpatova NA, Gayderova LA, Yakovlev AK, Medunitsyn NV. Recombinant erythropoietin preparations and their characteristics. Biopreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment 2013; (3): 4-11 (in Russian).

19. Shestakova MV, MartynovSA. Anemia in diabetic nephropathy: prognostic value, diagnosis and treatment. Consilium medicum 2006; 9: 39-43 (in Russian).

20. Koval'chuk LV, Gankovskaya LV, Meshkova RYa. Clinical immunology and allergology with the basics of immunology. Moscow: GEO-TAR-Media; 2012 (in Russian).

21. Lyagoskin IV, Berestovoy MA, Poteryaev DA, Zeynalova ES, Vishnevsky AYu, Kazarov AA. Validation of the XTT-test for assessing the antiproliferative activity of biologics on the basis of monoclonal antibodies. Biopreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment 2015; (1): 45-50 (in Russian).

22. Guideline on development, production, characterization and specifications for monoclonal antibodies and related products. London: EMA. 2008.

23. Avdeeva ZhI, Alpatova NA, Volkova RA, Lapteva LK. Medicinal preparations based on monoclonal antibodies. Biopreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment 2011; (2): 14-9 (in Russian).

24. IvanovAA, Beletskiy IP. Monoclonal antibody therapy—panacea or palliative? Remedium 2011; (3): 12-6 (in Russian).

25. Guidelines for conducting preclinical studies of drugs (immunobio-logical medicines). V. II. Moscow: Grief and K; 2013 (in Russian).

26. Avdeeva ZhI, Soldatov AA, Alpatova NA, Medunitsyn NV, Bondarev VP, Mironov AN, et al. Preparations of next generation monoclonal antibodies (issues and prospects). Biopreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment 2015; (1): 21-35 (in Russian).

27. Khaitov RM, Yarilin AA, Pinegin BV. Immunology. Atlas. Moscow: GEOTAR-Media; 2011. P. 302 (in Russian).

28. Sigidin YaA, Lukina GV. Biological therapy in rheumatology. Moscow: Practical Meditsine; 2009 (in Russian).

29. Eliseev MS, Barskova VG, Nasonov EL. Tumor necrosis factor a (TNFa) role in the development of metabolic disturbances and atherosclerosis and TNFa antagonists influence on them in patients with rheumatic diseases. Rheumatology Science Practice 2009; 2: 67-73 (in Russian).

30. Kovalenko VN, Golovach IYu, Bortkevych OP. Current objectives for target treatment of rheumatoid arthritis: from monoclonal antibodies to blockers of signaling pathways molecules. Ukrainskiy rev-matologicheskiy zhurnal 2012; 49(3): 5-14 (in Russian).

31. TarhiniAA, Iqbal F. CTLA-4 blockade: therapeutic potential in cancer treatments. Onco Targets Ther. 2010; 3:15-25.

32. Demidov LV, Kharkevich GYu, Mikhaylova IN, Petenko IN, Samoy-lenko IV, Utyashev IA. New trends in the treatment of patients with melanoma. Vestnik moskovskogo onkologicheskogo obshchestva. Informatsionnyy byulleten 2011; 9(580): 4-6 (in Russian).

33. Moiseenko VM. Options of monoclonal antibodies in the treatment of malignant tumors. Practical oncology 2002; 3(4): 253-61 (in Russian).

34. Protsenko GA. The prospects of rituximab usage in rheumatology. Ukrainskiy revmatologicheskiy zhurnal 2009; 1(35): 44-7.

35. Cohen SB, Emery P, Greenwald MW, Dougados M, Eurie RA, Geno-vese MC, et al. Rituximab for rheumatoid arthritis refractory to anti-tumor necrosis factor therapy: results of a multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, phase III trial evaluating primary efficacy and safety at twenty-four weeks. Arthritis Rheum. 2006; 54(9): 2793-806.

36. Nasonov EL. Rituximab in the treatment of rheumatic diseases. Na-uchno-prakticheskaya revmatologiya 2008. Prilozhenie k № 1: 3-10 (in Russian).

37. NasonovEL, ed. Anti-B-cell therapy in rheumatology: a focus on ri-tuximab. Monograph. Moscow: IMA-PRESS; 2012 (in Russian).

38. Maddocks KJ, Lin TS. Update in the management of chronic lymphocytic leukemia. J Hematol Oncol. 2009; 2:2-29.

39. Taylor RP, Lindorfe MA. Drug insight: the mechanism of action ofRi-tuximab in autoimmune disease-the immune complex decoy hypothesis. Nat Clin Pract Rheumatol. 2007; 3(2): 86-95.

40. Miroshnika OA, ed. Immunomodulators in Russia: Spravochnik. Omsk: GP «Omskaya oblastnaya tipografiya»; 2014. V. 1 (in Russian).

41. Besova NS. Duration of therapy by Herceptin at a HER2 positive breast cancer. Effektivnaya farmakoterapiya. Onkologiya, gematolo-giya i radiologiya 2012; 1: 14-21 (in Russian).

42. Gan'shina IP, Zhukova LG, Tyurin IE. Pertuzumab — a new view on HER2-positive metastatic breast cancer. Farmateka 2014; (17): 52-9 (in Russian).

43. Baselga J, Gelmon KA, Verma S, WardleyA, Conte P, Miles D, et al. Phase II trial of pertuzumab and trastuzumab in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer that progressed during prior trastuzumab therapy. J Clin Oncol. 2010; 28(7): 1138-44.

44. Jones K, Buzdar AU. Evolving novel anti-HER2 strategies. Lancet Oncol. 2009; 10(12): 1179-87.

45. Korman DB. Targets and mechanisms of action of antineoplastic preparations. Moscow: Prakticheskaya meditsina 2014. P. 150 (in Russian).

Authors

Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, Petrovsky boulevard 8, bld. 2, Moscow 127051, Russian Federation.

Alpatova NA. Chief expert of the Laboratory of Immunology of the Testing Centre for Evaluation of Medicinal Immunobiological Products' Quality. Candidate of Biological Sciences.

Gayderova LA. Head of the Laboratory of Immunology of the Testing Centre for Evaluation of Medicinal Immunobiological Products' Quality. Candidate of Medical Sciences.

YakovlevAK. Leading microbiologist of the Laboratory of Immunology of the Testing Centre for Evaluation of Medicinal Immunobiological Products' Quality.

Motuzova EV. Chief expert of the Division for Expert Evaluation of Allergens, Cytokines and other Immunomodulators of the Centre for Evaluation and Control of Medicinal Immunobiological Products. Candidate of Biological Sciences.

Lysikova SL. 1st professional category expert of the Laboratory of Immunology of the Testing Centre for Evaluation of Medicinal Immunobiological Products' Quality. Candidate of Medical Sciences.

Soldatov AA. Chief expert of the Division for Expert Evaluation of Allergens, Cytokines and other Immunomodulators of the Centre for Evaluation and Control of Medicinal Immunobiological Products. Doctor of Medical Sciences.

Avdeeva ZhI. Chief expert of the Division for Expert Evaluation of Allergens, Cytokines and other Immunomodulators of the Centre for Evaluation and Control of Medicinal Immunobiological Products. Doctor of Medical Sciences, professor.