К характеристике изменчивости бактериальных патогенов под влиянием бактериофагов

К характеристике изменчивости бактериальных патогенов под влиянием бактериофагов.

Э.А.Дадашев

АзГИУВ им. А.Алиева, кафедра микробиологии и эпидемиологии

В статье представлены данные по изменчивости культурально - морфологических, биохимических свойств первично - высеянных культур бактерий с использованием феномена фаголизиса с детекцией во «вторичных» культурах либо «атипичных» форм исследуемого патогена, включая «некультиви-руемые», либо наличие в микробной популяции особей, резистентных по отношению к бактериофагу.

Несмотря на большое внимание к острым кишечным инфекциям (ОКИ), в первую очередь у детей дошкольного возраста, они до сих пор представляют серьёзную проблему здравоохранения [1,2], особенно с учётом их роли в причинах смерти детей [3].

В связи с этим актуальным является поиск новых подходов к выявлению особенностей заболеваемости диареями как основы для повышения эффективности профилактических мероприятий.

В плане актуальности проблемы и установленного факта высокого процента кишечных инфекций неустановленной этиологии представляется насущной необходимостью этиологическая расшифровка отмеченных инфекций, особо в период первых 2 - х лет жизни, где заболеваемость колиэнтери-том имеет наибольшее значение, занимая 2 -е место среди всех ОКИ [1].

Острые кишечные инфекции (ОКИ) остаются одной из важных проблем здравоохранения. Следует при этом отметить, что ежегодно регистрируется до 1млн. случаев ОКИ, около половины которых остаются этиологически нерасшифрованными [4,5,6,7].

В Азербайджане, несмотря на значимые достижения в области изучения эпидемиологии, микробиологии кишечных инфекций человека, проблема борьбы с инфекционной патологией человека, в частности с кишечными инфекциями остаётся актуальной проблемой современности.

Особо следует отметить вопросы изменчивости нормальной микрофлоры у детей

младшего возраста при острых кишечных расстройствах.

Вопрос об изменении нормальной микрофлоры- дисбактериозе и его значении в патологии привлекает внимание исследователей и по сей день.

Ряд авторов (Маслова М.С., Давыдова В.М., Лосева А., Цимблер И.В., 1963г.) отмечают, что дисбактериоз был выражен уменьшением числа колоний кишечной палочки, наличием атипичных культур, пара-агглютинирующими кишечными палочками, наличием Proteus Hauseri и паракишечных палочек[8].

Из ещё относительно давних научных исследований известно о наличии бактериовы-делителей патогенных кишечных палочек без признаков болезни. Причём, по данным Гудчинсон (по С.Я. Берман, 1963) [8], у маленьких детей таких выделителей к числу больных является наиболее высоким.

Наряду с возможным значением состояния иммунного статуса в проявлении данного явления, вышеотмеченное говорит о том, что не всегда выделенный штамм при той или иной патологии является этиологическим патогеном, что подтверждает необходимость изучения и выявления истинных возбудителей с возможным их обнаружением во «вторичных» культурах после воздействия бактериофагами, то есть «некультиви-руемой», «покоящейся», «сессильной» флоры.

Подтверждением отмеченного являются показатели заболеваемости кишечной патологией по г. Баку и по Республике с установленной и неустановленной этиологией с выявлением значимого количества заболеваний ОКИ с неустановленной этиологией (Графики 1-4). Вышеотмеченное явилось основанием для выбора предметом исследования кишечную патологию.

Учитывая факт значимого процента этиологически неустановленной кишечной инфекционной патологии (ОКИ) целью исследования было установление изменчивости и

,возможно, наличия «некультивируемых», «покоящихся» патогенов в организме человека при ОКИ [10] с возможной их рекультивацией [9] с последующей этиологической ролью в возникновении данной патологии.

За период с 2010 по 2015 годы проведены бактериологические исследования по установлению этиологии диспептических расстройств преимущественно у детей перинатального и постнатального возраста.

Было исследовано 1676 проб фекалий от больных ОКИ в возрасте от 0 месяцев до18 лет и выше с выделением 233 штаммов Proteus mirabilis, что составило 13,9% из исследованных проб и 26,87% из выделенных патогенов.

Исходя из целевой установки данного исследования, было проведено изучение ряда параметров изменчивости бактериальных микроорганизмов с использованием феномена фаголизиса.

Предметом изучения были избраны 23 штамма патогенов по культурально- морфологическим свойствам, отнесённые к Proteus mirabilis.

Исследование включало ряд этапов, предусматривающих решение следующих задач:

1. Выделение чистой культуры бактерий из исследуемых образцов фекалий больных.

2. Изучение культурально- морфологических, биохимических свойств выделенных штаммов патогенов.

3. Получение «вторичных культур» после воздействия на изучаемую культуру типо-специфическими фагами.

4. Изучение культурально- морфологических, биохимических свойств фагорези-стентных штаммов бактерий из «вторичной» культуры.

5. Проведение сравнительной характеристики измененийкультурально - морфологических, биохимических свойств патогенов исходных культур и патогенов из «вторичных культур», полученных под воздействием бактериофагов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. При выполнении исследования были применены общепринятые бактериологические методы исследования, основанные на выделении чистой культуры возбудителя и её последующей идентификации на основа-

нии морфологических, культуральных, биохимических признаков с включением теста фаголизабельности [11,12,13,14].

В ходе исследования были применены селективные среды: мясо- пептонный агар, ЖСА, Эндо, Плоскирёва, Сабуро.

С целью изучения фаголизабельности выделенных патогенов были применены бактериофаги:

1. «Интести- бактериофаг», включающий смесь стерильных фильтратов фаголизатов Shigella flexneri 1,2,3,4,6 серотипов, Shigel-lasonnei,Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Salmonella typhimurium, Salmonella infantis, Salmonella choleraesuis, Salmonella oranienburg, Salmonella enteridis, энте-ропатогенная E. Coli различных серогрупп, наиболее значимых в этиологии энтеральных заболеваний, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Enterococcus, Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa.

2. Бактериофаг сальмонеллёзный: групп A,B,C,D,E.

3. Coli- Proteus bacteriophage.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В результате исследований были получены следующие данные:

Культурально- морфологические свойства исходных штаммов Proteusmirabilis. Большинство штаммов Proteusmirabilis представляли собой мелкие грамотрицательные палочки; характерный протеям полиморфизм наблюдался у 14-ти штаммов.

На поверхности мясо-пептонного агара «Н» - формы (от нем. Hauch- дыхание) росли в виде нежного вуалеобразного налёта, «О» -формы (от нем. ohne - hauch - бездыхания) давали рост в виде крупных колоний с ровными краями.

Биохимическая характеристика выделенных исходных штаммов. Суть исследования заключалась в учёте ферментативных особенностей изучаемых бактерий, выражающиеся в разложении ферментов исследуемого микроба под действием углеводов или аминокислот.

Изменения реакции среды, наступающие в результате деятельности ферментных систем микроба, проявлялись изменениемцвета среды. Был применён «пёстрый ряд» пробирок для определения углеводного обмена у

бактерий семейства кишечных. Применённый «пёстрый ряд» содержал среду Гисса, включающий: контроль культуры, цитрат Симмонс, Клиглер, полужидкий агар, глюкозу, лактозу, сахарозу, сорбит, маннит, мальтозу, ацетат маланат мясо - пептон-

ный бульон с индикаторным фильтром для подтверждения индола.

Биохимическая характеристика выделенных штаммов характеризовалась выраженной способностью вырабатывать сероводород, не образовывать индол.

Энтериты, колиты, гастроэнтериты, пищевые отравления с установленной этиологией

( в абсолютных числах) 4541

3614 3138 3050 3143 _ ^---

2047 2052 2453 2309 2320|  1 "

2005-ci ¡1 2006-CI ¡1 2007-ci ¡1 2008-ci il 2009-cu il 2010-cu il 2011-ci il 2012-ci ¡1 2013-cu ¡1 2014-cu ¡1 2015-ci il

Рис. 1. Динамика заболеваемости энтеритами, гастроэнтеритами, пищевыми отравлениями с установленной этиологией по Республике в период 2005-2015

Результаты индикации и идентификации бактериальной флоры во «вторичной» культуре после воздействия бактериофагом культуральным методом. Далее наши исследования включали изучение культурально - морфологических, биохимических свойств «вторичных» культур, полученных после воздействия на исходные культуры бактериофагами.

Ход исследования. В 2 пробирки с мясо-пептонным бульоном была внесена исходная проба с культурой Proteus mirabilis и через сутки роста патогена в пробирки был внесён бактериофаг: в 1-ю пробирку- «Интести-бактериофаг», а во 2-ую- комбинация из взятых в опыт бактериофагов, включающих бактериофаги 1,2,3 указанных в «материалах и методах».

Через сутки было отмечено просветление во второй пробирке, т.е. лизис культуры в

пробе с Proteus mirabilis; ещё через сутки наблюдалось повторное помутнение, т.е. рост фагорезистентной флоры («вторичной культуры») во 2 - ой пробирке после просветления (лизиса).

Культурально- морфологические изменения выросшей «вторичной культуры» выражались в появлении большого количества фагорезистентных форм микробов. Высев такой бульонной культуры на чашки давал рост самых разнообразных форм колоний, среди которых встречались и нормальные колонии, схожие с колониями исходной культуры.

Следует отметить, что при посеве на ЖСА «вторичной культуры» не отмечено роста колоний, на Эндо- были заметны мелкие колонии, но без покрывающей их «вуалеобраз-ной» слизи. Биохимические изменения были выражены в следующем: при тестировании с

ацетатом № свойства исследуемых патогенов оказались неизменёнными. Также неизменёнными были свойства исследуемых штаммов относительно сахарозы, маннита,

сорбита; некоторое изменение- на 3 + отмечено относительно глюкозы (цвет не изменён) и относительно лактозы и маланата № (цвет изменён).

Энтериты, колиты. гастроэнтериты, пищевые отравления с установленной этиологией ( в абсолютных числах) 2904

1092 1139 1519 1378 1874 1796 1819 1986 2020 -f ' ^

2005-ci il 2006-CI il 2007-ci il 2008-ci il 2009-cu il 2010-cu il 2011-ci il 2012-ci il 2013-cii il 2014-cu il 2015-ci il

острые кишечные инфекции, пищевые отравления с неустановленной этиологией

8190 93619228 1°i7° ^86 10693 10Q11 10779 -»-_----- 9669

2005-ci il 2006-ci il 2007-ci il 2008-ci il 2009-cu il 2010-cu il 2011-ci il 2012-ci il 2013-cii il 2014-cu il 2015-ci il

Рис. 2. Динамика заболеваемости острыми кишечными инфекциями, пищевыми токсикоинфекциями с неустановленной этиологией по Республике в период 2005 - 2015 гг.

98,12 острые кишечные инфекции, пищевые отравления с неустановленной этиологией (интенсивный показатель на 100000 населения) 129 91 110 96 щ 118,31 105 70 112,72 105 97 115,79 105 63 112,36 99,62

-

2005-ci il 2006-ci il 2007-ci il 2008-ci il 2009-cu il 2010-cu il 2011-ci il 2012-ci il 2013-cii il 2014-cu il 2015-ci il

Энтериты, колиты, гастроэнтериты, пищевые отравления с установленной

этиологией (интенсивный показатель на 100000 населения) 130,47

58,86 80,23 60,78 70,99 89-56 84,63 85/71 91,03

2005-ci il 2006-ci il 2007-CÏ il 2008-ci il 2009-cu il 2010-cu il 2011-ci il 2012-ci il 2013-cu il 2014-cu il 2015-ci il

Рис. 3. Динамика заболеваемости энтеритами, колитами, гастроэнтеритами, пищевыми отравлениями с установленной этиологией по г. Баку за период 2005-2015 гг.

Резюмируя всё вышеизложенное, следует отметить, что результаты изучения культу-рально- морфологических, биохимических свойств фагорезистентных патогенов из «вторичных культур» являются определённым вкладом в дело изучения изменений, происходящих в микробной культуре под воздействием бактериофага, учитывая, что роль условно - патогенных микроорганизмов в инфекционной патологии человека по-

стоянно возрастает. Одной из причин эпидемиологического неблагополучия, связанного с этой группой микроорганизмов, является их высокая экологическая пластичность, позволяющая адаптироваться к различным условиям внешней среды, что обусловливает их широкое распространение в почве, поверхностных водоёмах, живых организмах [15,16,17].

острые кишечные инфекции, пищевые отравления с неустановленной этиологией

2005-а ¡1 2006-С1 ¡1 2007-а ¡1 2008-а ¡1 2009-си ¡1 2010-си ¡1 2011-а ¡1 2012-а ¡1 2013-си ¡1 2014-сй ¡1 2015-а ¡1

острые кишечные инфекции, пищевые отравления с неустановленной этиологией

262,36

215,34 219,73 1д? 86 218,91

169,6

172,43

236,87

230,39

Рис. 4. Динамика заболеваемости острыми кишечными инфекциями, пищевыми отравлениями с неустановленной этиологией по г. Баку за период 2005 - 2015

ЛИТЕРАТУРА

1. Артёмов В.Г., Замотин Б.А., Кондрохи-на О.К., Гордов В.В. Структура, уровень заболеваемости и кратность заболеваний острыми диареями в дошкольный период жизни детей (когортное лонгитудинальное исследование) // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. М.: Медицина, 1987, №12, с.33-37.

2. Хазенсон Л.Б. Всероссийский съезд микробиологов и эпидемиолог 5-ый / Тезисы докладов М., 1985, с.293-296.

3. Солодовникова В.А. Укрепление семьи и охрана здоровья населения в системе мер демографической политики. М., Ростов и /Д, 1984, с.136-137.

4. Сперанская Е.В., Козлов Л.Б., Мефодь-ев В.В.Электрическое сопротивление взвеси бактериальной культуры как индикатор эпидемических и спорадических вариантов ши-гелл. // ЖМЭИ, 2008, №3, с. 10-13.

5. Марков В.Ю. Шигеллёз Зонне в России: эпидемиологическая ситуация // Эпиде-миол. вакцинопрофилактика, 2003, №5, с.58-60.

6. ОнищенкоГ.Г. Устойчивое обеспечение питьевой водой населения России для профилактики заболеваемости инфекционными и неинфекционными болезнями // Гигиена и санитария, 2003, №2, с.3-6.

7. ЧеркасскийБ.Л. Современные особенности эпидемиологии кишечных инфекций в

Российской Федерации // Журн. микробиологии, 1997, №5, с.2-14.

8. Берман С.Я., Гамзаева И.А., Бабаев А.Ю., Агаева Р.А.Микрофлора кишечника у детей дома грудного ребёнка в динамике / Труды Азербайджанского Научно -исследовательского института Эпидемиологии, микробиологии и гигиены им. Г.М. Му-сабекова, Баку, 1963, с.43-147.

9. Романова Ю.М., Бошнаков Р.Х., Баскакова Т.В., Гинцбург А.Л. Механизмы активации патогенных бактерий в организме хозяина // ЖМЭИ, 2000, №4, с. 7-11.

10. Гордеева Р.В. Изменения бактерий паратифа В под влиянием VI - бактериофага in vitro // Изменчивость микроорганизмов. М.: Медгиз, 1956, с. 188-196.

11. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследова-ния.Под ред. М.О. Биргера. М.: Медицина, 1982, с.3-445.

12. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. академика РАМН А.А. Воробьева. М.: Мед. информ. агентство, 2008, с. 14-695.

13. Поздеев.О.К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В.И. Покровского. М.: ГЭОТАР - Медиа, 2010, 736 с

14. Тимаков В.Д. Закономерности изменчивости микроорганизмов / Изменчивость микроорганизмов.Под ред. действ. члена АМН СССР проф В.Д. Тимакова. М.: Медгиз, 1956, 205с.

15. Маркова Ю.А., Беловежец Л.Р., Барков И.Ю., Савилов Е.Д. Возможности адаптации условно- патогенных энтеробактерий

к различным температурам // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 2009,№2, с. 15-19.

16. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пуш-карёваВ.И., и др. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М.: Фармус-Принт., 1998.

17. Мамонтова Л.М., Савилов Е.Д., Протодьяконов А.Т., Маркова Ю.А. Инфекционная «агрессивность» окружающей среды / Концепция микробиологического мониторинга. Н. Наука, 2000

SUMMARY

About characterize the variability of bacterial pathogens under the influence of bacteriophages. E.A. Dadashev

AzGiUV them. A.Aliyeva, Department of Microbiology and Epidemiology

Suppression of model strains of Proteus mirabilis under the impact of Intesti-bacteriophage is not observed. Strengthening the addition of page lysis coli - proteus bacteriophage (Coli-Proteus bacteriohage) was obtained by the effect of "clarification" of bacterial growth to produce a "secondary culture" after daily temperature control. Detection of cultural, morphological and biochemical difference of the "secondary culture" from the primary planted culture raises the probability of either detection of an "atypical" form (including non-cultivated form) of the studied pathogen or existence of bacteriophage-resistant individuals in the microbe culture.

_Поступила: 24.06.2016