СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ АМИЛОИДНОЙ ТИРЕОПАТИИ У КРЫС
METHOD FOR SIMULATING EXPERIMENTAL AMYLOID THYREOPATHY IN RATS

Изобретение относится к медицине и экспериментальной биологии и может быть применено для экспериментального моделирования амилоидной тиреопатии у крыс для выявления новых механизмов развития и способов профилактики данной патологии. Тироепатия (от греч. «thyreo» - щитовидная железа и «pathos» -поражение, патология, страдание) - патологическое состояние, которое сопровождается нарушением структурно-функционального состояния щитовидной железы как органа эндокринной системы вследствие различных этиотропных факторов.
Амилоидоз - стромально-сосудистый диспротеиноз, характеризующийся отложением в межуточном веществе различных органов и тканей особого фибриллярного белка - амилоида.
Известен способ моделирования экспериментального амилоидоза у крыс, (патент РФ на изобретение 2410761), заключающийся в введении экспериментальным животным равнодолевой смеси нативного яичного альбумина и полного адъюванта Фрейнда из расчета по 0,2 мл в каждую из пяти точек инъекций.
Недостатками этого способа является отсутствие органной специфичности при моделирования экспериментальной амилоидной тиреопатии.
Известен способ моделирования экспериментального амилоидоза у животных, (патент РФ на изобретение №2306617, заключающийся во введении белкового препарата подкожно. В качестве белкового препарата вводят сирийским хомякам нативную бычью плазму через день из расчета 0,025 мл/г массы тела в течение 60 дней эксперимента. Недостатками данного способа является необходимость многократного введения белкового препарата подкожно через день в течение 60 дней эксперимента, а также относительно малые размеры животных, что затрудняет проведение морфологических методов исследования модели. Помимо этого, сирийские хомяки труднодоступны и экономически невыгодны.
Наиболее близким к предполагаемому изобретению является способ моделирования экспериментального амилоидоза у крыс (патент РФ на изобретение 2556571), заключающийся в однократном введении старым крысам-самцам смеси, состоящей из гомогенизированной ткани миокарда крыс - 25%, яичного альбумина - 25% и адъюванта Фрейнда - 50% по 0,3 мл в каждую из пяти точек инъекции: внутрибрюшинно, в паховые и подмышечные области подкожно слева и справа.
Недостатками прототипа является специфическое воздействие на миокард без вовлечения в патологический процесс тканей щитовидной железы и более затратная с экономической точки зрения технология. В связи с актуальностью проблемы изучения амилоидной тиреопатии возникла необходимость разработки способов ее моделирования у экспериментальных животных. Для этого авторами были взяты крысы самцы линии Wistar, которые являются одним из представителей классических модельных объектов, так как они неприхотливы к условиям содержания и рациону и у них небольшая стоимость.
Цель изобретения - создание новой более эффективной модели экспериментальной амилоидной тиреопатии у крыс.
Поставленная цель достигается тем, что экспериментальным животным (старым крысам-самцам в возрасте 18-24 мес., массой тела 350-400 гр.) однократно вводят в каждую из пяти точек инъекций (внутрибрюшинно и в паховые и подмышечные области подкожно слева и справа) селективную тиреопатическую амилоидогенную смесь, состоящую из 30% гомогенизированной ткани щитовидной железы кроликов, 30% яичного куриного альбумина и 40% полного адъюванта Фрейнда из расчета по 0,1 мл что обеспечивает достижение поставленной цели.
Сущность заявляемого способа подтверждается морфологически. Спустя 60 дней после введения селективной тиреопатической амилоидогенной смеси экспериментальные животные забивались путем дислокации шейных позвонков с последующим исследованием внутренних органов. Морфологическому исследованию подвергались все внутренние органы крыс, при этом особое внимание уделялось изменениям в щитовидной железе.
При проведении экспериментов авторы руководствовались статьей 11-й Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации, «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» и Правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г.).
Биологический материал, полученный в ходе экспериментов был подвергнут морфологическому исследованию с применением общеизвестных методик окрашивания микропрепаратов - гематоксилином и эозином, а также конго-красным (фиг.1) с последующим изучением в поляризованном свете (фиг. 2).
Примеры конкретного выполнения.
Все серии опытов проводилась в 4 группах животных.
Пример 1.
1 группа - контрольная группа животных (20 крыс-самцов линии «Wistar» в возрасте 18-24 мес., массой тела 350-380 г), которые содержались в равнозначных условиях, что и животные из других групп, но им не вводилась селективная тиреопатическая амилоидогенная смесь.
Пример 2.
2 группа - подбора оптимальной дозировки селективной тиреопатической амилоидогенной смеси (30 крыс-самцов линии «Wistar» в возрасте 18-24 мес., массой тела 350-380 г) была разбита на 6 подгрупп по 5 крыс, в которых селективная тиреопатическая амилоидогенная смесь вводилась однократно в каждую из пяти точек инъекций (внутрибрюшинно, в паховые и подмышечные области подкожно слева и справа) с шагом уменьшения на 0,05 мл в каждую точку инъекции. В ходе эксперимента определена оптимальная дозировка селективной тиреопатической амилоидогенной смеси равная 0,1 мл.
Пример 3.
3 группа (20 крыс-самцов линии «Wistar» возраст 18-24 мес., масса тела 350-380 г) - подбора оптимального процентного содержания полного адъюванта Фрейнда в составе селективной тиреопатической амилоидогенной смеси - была разбита на 2 подгруппы по 10 крыс, в которых селективная тиреопатическая амилоидогенная смесь вводилась однократно по 0,1 мл в каждую из пяти точек инъекций (внутрибрюшинно, в паховые и подмышечные области подкожно слева и справа) с шагом уменьшения процентного содержания полного адъюванта Фрейнда на 10%. При снижении процентного содержания полного адъюванта Фрейнда в составе селективной тиреопатической амилоидогенной смеси на 10% отмечалось сохранение тиреопатического амилоидогенного эффекта. При дальнейшем уменьшении концентрации уже на 20% необходимого эффекта достигнуть не удалось. Таким образом, в ходе эксперимента определена оптимальная концентрация полного адъюванта Фрейнда в составе селективной тиреопатической амилоидогенной смеси которая равна 40%, что на 10% ниже, чем у прототипа.
Пример 4.
4 группа (20 крыс-самцов линии «Wistar» возраст 18-24 мес., масса тела 350-380 г) - опытная - старым крысам-самцам однократно вводили селективную тиреопатическую амилоидогенную смесь, состоящую из гомогенизированной ткани щитовидной железы кролика (30%), яичного куриного альбумина (30%) и адъюванта Фрейнда (40%), по 0,1 мл в каждую из пяти точек инъекции: внутрибрюшинно, в паховые и подмышечные области подкожно слева и справа.
Все изменения в органах и тканях у крыс во всех группах экспериментального исследования подтверждались морфологически. Гистологически в стромально-сосудистых структурах щитовидной железы крыс определялись амилоидные массы в виде отложений, окрашенных в кирпично-красный цвет (фиг. 1). В последующем предметные стекла подвергались микроскопическому изучению в поляризованном свете, где амилоидные отложения давали характерное яблочно-зеленое свечение (фиг. 2), что согласно общеизвестным знаниям достоверно подтверждает наличие экспериментальной амилоидной тиреопатии. В других органах также отмечались незначительные изменения в виде накопления амилоидных масс, но они не коррелировали в морфологическом отношении со степенью поражения стромально-сосудистых структур в щитовидной железе.
Одной из основных теорий развития амилоидоза является аутоиммунная, которая базируется на извращенном синтезе белка амилоида в ходе реакции образования комплемента (антиген + антитело). Исходя из этого, целесообразно применять в качестве антигена белковые фракции от особей другой видовой принадлежности, что будет способствовать развитию амилоидогенного эффекта.
Известно, что яичный куриный альбумин, введенный парентерально, стимулирует развитие аллергических реакций, то есть провоцирует формирование иммунного ответа с образованием комплекса антиген + антитело, а введение гомогената тканей щитовидной железы от особей другой видовой принадлежности усиливает данный эффект и формирует именно органоспецифический иммунный ответ. Поэтому, для получения органоспецифичной амилоидной тиреопатии у крыс, авторами было решено взять одним из компонентов амилоидогенной смеси гомогенат ткани щитовидной железы кроликов. Кролики являются относительно крупными животными по сравнению с крысами с более крупной щитовидной железой, что способствует приготовлению большего количества амилоидогенной смеси с забитием меньшего числа животных. Таким образом, применение в эксперименте указанных животных является более выгодным с экономической точки зрения.
Адъюванты - соединения или комплексы веществ, используемые для усиления и пролонгирования иммунного ответа при введении одновременно с иммуногеном. В продаже имеется готовый препарат полного адъюванта Фрейнда, который содержит убитые туберкулезные микобактерии, суспензированные в масляной фазе водяной эмульсии. Данные факты свидетельствуют об обоснованности применения адъюванта Фрейнда в составе селективной тиреопатической амилоидогенной смеси для потенцирования и пролонгации иммунного ответа с последующим формированием амилоидной тиреопатии у экспериментальных животных при однократном введении, что снимает необходимость ежедневного введения антигена.
Учитывая высокую аллергенную активность и токсичность селективной тиреопатической амилоидогенной смеси для уменьшения числа сопутствующих осложнений, частично смазывающих картину основной модели экспериментальной амилоидной тиреопатии у крыс, в ходе исследования удалось уменьшить общую дозу вводимой селективной тиреопатической амилоидогенной смеси относительно прототипа с 0,3 мл до 0,1 мл в каждую точку инъекции, при этом развившиеся патологические изменения в щитовидной железе с морфологической точки зрения значительно не отличались от животных с введением более высоких доз смеси. Дальнейшие попытки уменьшения дозировки ниже 0,1 приводили к отсутствию необходимого результата.
Таким образом, в ходе проведенных серий экспериментального исследования было доказано, что для эффективного моделирования экспериментальной амилоидной тиреопатии у крыс необходимо и достаточно однократного введения селективной тиреопатической амилоидогенной смеси в дозировке по 0,1 мл в каждую из пяти точек инъекции (подкожно в паховые и подмышечные области и слева и справа, а так же внутрибрюшинно).
Принимая во внимание высокую экономическую стоимость готового препарата «полный адъювант Фрейнда» авторами была принята попытка уменьшить количество этого компонента в составе селективной тиреопатической амилоидогенной смеси на 10% относительно прототипа, что в ходе экспериментов сохранило положительный амилоидогенный результат. При дальнейших попытках еще большего снижения процентного содержания полного адъюванта Фрейнда в составе селективной тиреопатической амилоидогенной смеси развитие модели амилоидной тиреопатии достигнуто не было, что доказывает определение авторами уровня оптимальной дозировки полного адъюванта Фрейнда. Остальные компоненты, являющиеся чужеродными белками (яичный куриный альбумин и гомогенат ткани щитовидной железы кроликов) были взяты в равных пропорциях.
Из выше изложенного следует, что для запуска каскада патологических аутоиммунных реакций организма, ведущих к синтезу и накоплению амилоидных масс в строме щитовидной железы у крыс необходимо и достаточно применения разработанной авторами селективной тиреопатической амилоидогенной смеси, состоящей из 40% полного адъюванта Фрейнда, 30% яичного куриного альбумина и 30% гомогенизированной ткани щитовидной железы кролика. Для достижения оптимального эффекта селективная тиреопатическая амилоидогенная смесь вводится парентерально однократно, аналогично прототипу в каждую из пяти точек инъекций: внутрибрюшинно, а также подкожно в паховые и подмышечные области слева и справа.
Заявляемый способ является высоко результативным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.
Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, может быть многократно использована в лабораторных и иных научных исследованиях с целью изучения новых механизмов развития и патогенетических механизмов, с последующей разработкой эффективных способов профилактики и лечения амилоидной тиреопатии, заключающегося эффективном и легко воспроизводимом способе моделирования экспериментальной амилоидной тиреопатии у крыс.