СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУБПОПУЛЯЦИОННОГО СОСТАВА КЛЕТОК КОЖИ И ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОИММУНОГРАММЫ КОЖИ
METHOD FOR DETERMINING SUBPOPULATION COMPOSITION OF SKIN CELLS AND OBTAINING SKIN CYTOIMMUNOGRAM

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для определения субпопуляционного состава клеток кожи и получения цитоиммунограммы кожи.
Наиболее близким к предлагаемому является способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи [Патент РФ №2502999, кл. G01N 33/48, C12N 5/071, 2013], включающий забор биоптата кожи на глубину 2 мм, гомогенизацию ткани в 0,9%-ном водном растворе хлорида натрия при температуре +23…+25°С, извлечение гомогената, фильтрование гомогената через инертную фильтровальную перегородку с диаметром пор 20 мкм, центрифугирование гомогената при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°С.
Известной причиной, препятствующей достижению технического результата, обеспечиваемого предлагаемым изобретением, является невысокая информативность способа.
Задачами, на решение которых направлено предлагаемое изобретение, являются определение субпопуляционного состава клеток кожи и получение цитоиммунограммы кожи.
При осуществлении изобретения поставленные задачи решаются за счет достижения технического результата, который заключается в определении фенотипа клеток кожи и количества клеток кожи определенного фенотипа.
Указанный технический результат достигается способом определения субпопуляционного состава клеток кожи и получения цитоиммунограммы кожи, включающим в себя забор биоптата кожи на глубину 2 мм, гомогенизацию ткани в 0,9%-ном водном растворе хлорида натрия при температуре +23…+25°С, извлечение гомогената, фильтрование гомогената через инертную фильтровальную перегородку с диаметром пор 20 мкм, центрифугирование гомогената при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°С, определение жизнеспособности клеток кожи, инкубирование в течение 20 минут в защищенном от света месте клеток кожи с моноклональными антителами меченые флюорохромами, фенотипирование клеток кожи, определение количества клеток кожи определенного фенотипа.
Жизнеспособность клеток кожи определяют методом проточной цитометрии с помощью внутриклеточного красителя 7-amino-actinomycin D RUO (7AAD). Идентификацию жизнеспособных клеток выполняют путем регистрации двух параметров: бокового светорассеяния (side scatter) и регистрацией флюоресценции по 3 каналу (FL3). Если не определить жизнеспособность клеток кожи, то полученные результаты окажутся менее точными, т.к. некоторые клетки разрушаются.
Инкубирование клеток кожи проводят в течение 20 минут в защищенном от света месте с моноклональными антителами меченые флюорохромами: флюоресцеинизотиоцианатом (FITC), фикоэритрином (РЕ), РЕ - Texasred (ESD), PE/CY5(PC5), PE/CY7(PC7) (Beckman Coulter, USA). Выбор типа и количества флюоресцентных красителей определяется поставленной задачей для данного исследования. Если время инкубирования будет менее 20 минут, то не все антитела свяжутся с рецепторами. Продолжительность инкубирования в 20 минут является оптимальной для данного способа. Попадание света во время инкубирования недопустимо, т.к. приведет к разрушению флюорохромов.
Фенотипирование клеток кожи проводят методом проточной цитометрии с помощью специфических маркеров: CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD19, CD34, CD44, CD45, CD49, CD54, CD63, CD80, CD146, CD203c; CD207, CD249. В процессе дифференцировки клеток на их поверхности появляются специфические мембранные молекулы. Такие молекулы обнаруживают с использованием набора специфических моноклональных антител, с помощью которых идентифицируют субпопуляции клеток и определяют их фенотип.
Методом проточной цитометрии определяют количество клеток кожи определенного фенотипа, используя моноклональные антитела меченые флюорохромами и связывающиеся с определенными рецепторами на мембране клетки.
Пример осуществления предлагаемого способа приведен ниже.
Забор биоптата кожи размером 2×2×2 мм проводили с ягодичной области человека с помощью дракара DERMO-PUNCH (2 мм) (STERYLAB, Италия). Далее биоптат кожи и 1 мл 0,9% водного раствора хлорида натрия помещали в рабочую камеру автоматической системы для механической гомогенизации ткани Medimachine (Becton Dickinson, США). Гомогенизацию ткани проводили в течение 30 секунд при температуре +23…+25°С. Затем извлекали гомогенат стерильным шприцем и трижды вымывали рабочую камеру гомогенизатора 0,9% водным раствором хлорида натрия по 1 мл.
После чего фильтровали гомогенат через фильтр для клеток Falcon (Becton Dickinson, США) с нейлоновой сетчатой структурой и диаметром пор 20 мкм. Далее центрифугировали гомогенат для удаления надосадочной жидкости при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°С.
После этого, определяли жизнеспособность клеток кожи с помощью внутриклеточного красителя 7-amino-actinomycin D RUO (7AAD) (Beckman Coulter, США), анализируя на проточном цитофлюориметре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США). Идентификацию клеток выполняли путем регистрации двух параметров: бокового светорассеяния (side scatter) и регистрацией флюоресценции по 3 каналу (FL3). Жизнеспособность клеток кожи составила 90,8%.
Далее клетки кожи инкубировали в течение 20 минут в защищенном от света месте с моноклональными антителами меченые флюорохромами: флюоресцеинизотиоцианатом (FITC), фикоэритрином (РЕ), РЕ - Texasred (ESD), PE/CY5(PC5), PE/CY7(PC7) (Beckman Coulter, USA).
Затем методом проточной цитометрии проводили фенотипирование клеточной суспензии на проточном цитофлюориметре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, USA) с помощью специфических маркеров: CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD19, CD34, CD44, CD45, CD49, CD54, CD63, CD80, CD146, CD203c; CD207, CD249.
После этого, методом проточной цитометрии на Cytomics FC500 (Beckman Coulter, USA) определяли количество клеток кожи определенного фенотипа, используя моноклональные антитела, меченые флюорохромами и связывающиеся с определенными рецепторами на мембране клетки.
Результаты осуществления предлагаемого способа приведены в таблице.
Приведенные данные в таблице показывают, что в коже практически отсутствуют В-лимфоциты. Однако в ней присутствует несколько разновидностей Т-лимфоцитов (CD3-лимфоцитов), локализующихся преимущественно в трех наружных слоях эпидермиса. CD4-клетки несколько превалируют численно над CD8-клетками. До 5% Т-клеток кожи лишены корецепторов CD4 и CD8, что рассматривают не как признак незрелости, а как признак особой субпопуляции зрелых Т-лимфоцитов.
Для анализа получаемых результатов и удобства пользования разработан бланк медицинского документа «Цитоиммунограмма кожи». В верхней части документа указаны эмблема медицинского учреждения, знак обслуживания, почтовый адрес, контактные телефоны, сайт медицинского учреждения, а также свободные участки для заполнения лаборантом идентификационного номера цитоиммунограммы кожи с датой проведения анализа, фамилии, имени, отчества пациента и его возраста.
В средней части документа в две колонки представлен состав клеток кожи, с указанием фенотипа каждой популяции: кератиноциты CD49f+, из них активированные CD49f+HLA-DR+; фибробласты (фиброциты) CD45-CD14-CD44+, из них активированные CD45-CD14-CD44+CD80+; тучные клетки CD249+, из них активированные CD249+CD63+; моноциты (макрофаги) CD45+CD14+, из них активированные CD45+CD14+HLA-DR+; внутриэпидермальные макрофаги CD207+, их них активированные CD207+CD80+, CD207+HLA-DR+, CD207+CD80+HLA-DR+; эндотелиальные клетки CD146+, их них активированные CD146+CD34+, CD146+HLA-DR+, CD146+CD54+, CD146+CD54+HLA-DR+; лимфоцитарные популяции: Т-лимфоциты CD45+CD3+, Т-хелперы CD45+CD3+CD4+CD8-, Т-супрессоры CD45+CD3+CD4-CD8+, В-лимфоциты CD45+CD3-CD19+, NK-лимфоциты CD45+CD3-CD16+CD56+. Напротив каждой группы клеток кожи предусмотрены пустые поля в виде сдвоенных прямоугольников для заполнения лаборантом числовых данных в относительных и/или абсолютных единицах по результатам экспериментов. Представленные числовые данные указывают количество клеток кожи определенного фенотипа.
В нижней части документа имеются свободные участки, предназначенные для заполнения врачом информации о результатах исследования фенотипа клеток кожи, которые могут свидетельствовать: о динамической оценке течения заболевания, эффективности использования назначенных лекарственных или косметических средств, оценке возрастных изменений кожи, индивидуальном подборе лекарственных препаратов, оценке степени реагирования клеток кожи на те или иные воздействия, а также заполняются лаборантом в свободные участки сведения об исполнителе и враче, направившим на проведение анализа.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить субпопуляционный состав клеток кожи и получить цитоиммунограмму кожи, тем самым составить подробную количественную и функциональную характеристику всех составляющих элементов кожи, что открывает перспективу его использования в практической медицине и биологии.