СЛИТЫЕ БЕЛКИ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ ИММУНОГЕННЫХ УСИЛИВАЮЩИХ АГЕНТОВ ДЛЯ ИНДУЦИРОВАНИЯ АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКОГО Т-КЛЕТОЧНОГО ОТВЕТА
FUSION PROTEINS FOR APPLICATION AS IMMUNOGENIC AMPLIFYING AGENTS TO INDUCE ANTIGEN-SPECIFIC T-CELL RESPONSE

Область техники
Настоящее изобретение относится в целом к слитым белкам и иммунологии.
Предшествующий уровень техники
Молекулярная биология обеспечила производство субъединичных вакцин, в которых иммуноген является фрагментом или субъединицей исходного белка или комплекса. Желательна разработка стабильной вакцины, которая могла бы вызвать ответы, опосредованные сенсибилизированными Т-клетками, и которая была бы достаточно гибкой для включения в нее последовательностей из многих штаммов инфекционных агентов.
Сущность изобретения
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к слитому белку, содержащему:
(a) домен связывания с антигенпрезентирующей клеткой (АПК) или домен связывания с рецептором CD91, расположенный на N-конце слитого белка;
(b) транслокационный пептид длиной от 34 до 112 аминокислотных остатков, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 4, 2, 3 или 6, расположенный на С-конце домена связывания с АПК или домена связывания с рецептором CD91;
(c) антиген патогена, расположенный на С-конце транслокационного пептида;
(d) сигнал ядерного экспорта, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и
(e) последовательность, обеспечивающую удержание в эндоплазматическом ретикулуме, расположенную на С-конце слитого белка.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен связывания с АПК или домен связывания с рецептором CD91 является полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1 и с 8 по 11.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения сигнал ядерного экспорта содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения последовательность, обеспечивающая удержание в эндоплазматическом ретикулуме, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения сигнал ядерного экспорта расположен между транслокационным пептидом и антигеном.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения сигнал ядерного экспорта расположен между антигеном и последовательностью, обеспечивающей удержание в эндоплазматическом ретикулуме.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения сигнал ядерного экспорта и последовательность, обеспечивающая удержание в эндоплазматическом ретикулуме, образуют слитый белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ IDNO: 12.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения транслокационный пептид имеет длину от 34 аминокислотных остатков до 61 аминокислотного остатка.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения транслокационный пептид имеет длину от 34 аминокислотных остатков до 46 аминокислотных остатков.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен связывания с АПК или домен связывания с рецептором CD91 не содержит аминокислотной последовательности домена I связывания экзотоксина А Pseudomonas (РЕ).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен связывания с АПК или домен связывания с рецептором CD91 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения аминокислотная последовательность домена связывания с АПК или домена связывания с рецептором CD91 является последовательностью SEQ ID NO: 1.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения антиген является слитым антигеном, состоящим из двух или более антигенных пептидов из патогена.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения последовательность, обеспечивающая удержание в эндоплазматическом ретикулуме, имеет длину более 4 аминокислотных остатков.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения транслокационный пептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична последовательностям SEQ ID NO: 4, 2, 3 или 6.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен связывания с АПК или домен связывания с рецептором CD91 обладает характеристиками распознавания и связывания с рецептором на антигенпрезентирующей клетке (АПК), выбранной из группы, состоящей из дендритных клеток, моноцитов, В-кпеток и лимфоцитов.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения патоген выбран из группы, состоящей из вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV; от англ.: porcine reproductive and respiratory syndrome virus), цирковируса свиней (PCV; от англ.: porcine circovirus), вируса ящура (FMDV; от англ.: foot-and-mouth disease virus), вируса классической чумы свиней (CSFV; от англ.: classical swine fever virus), вируса болезни Ньюкасла (NDV; ot англ.: Newcastle disease virus), вируса трансмиссивного гастроэнтерита (TGEV; от англ.: transmissible gastroenteritis virus), вируса эпидемической диареи свиней (PEDV; от англ.: porcine epidemic diarrhea virus), вируса гриппа, вируса псевдобешенства, парвовируса, вируса везикулярной болезни свиней (SVDV; от англ.: swine vesicular disease virus), вируса оспы, ротавируса, Mycoplasma pneumonia, вируса герпеса, вируса инфекционного бронхита и вируса инфекционного бурсита.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к слитому белку, по существу состоящему или состоящему из:
(a) домена связывания с антигенпрезентирующей клеткой (АПК) или домена связывания с рецептором CD91, расположенного на N-конце слитого белка;
(b) транслокационного пептида длиной от 34 до 112 аминокислотных остатков, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 4, 2, 3 или 6, расположенного на С-конце домена связывания с АПК или домена связывания с рецептором CD91;
(c) антигена патогена, расположенного на С-конце транслокационного пептида;
(d) сигнала ядерного экспорта, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и
(e) последовательности, обеспечивающей удержание в эндоплазматическом ретикулуме, расположенной на С-конце слитого белка.
Кроме того, в другом аспекте изобретение относится к композиции вакцины, содержащей слитый белок, описанный выше, и адъювант.
В еще одном аспекте изобретение относится к способу индуцирования усиленных антигенспецифических Т-клеточных ответов против патогенов, включающему: введение композиции вакцины, содержащей терапевтически эффективное количество слитого белка, описанного выше, нуждающемуся в этом субъекту и индуцирование за счет этого усиленного антигенспецифического Т-клеточного ответа против патогена.
Изобретение также относится к слитому белку или композиции вакцины, описанным выше, для применения для индуцирования усиленных антигенспецифических Т-клеточных ответов против патогена или применения слитого белка, описанного выше, для производства медикамента для индуцирования усиленных антигенспецифических Т-клеточных ответов против патогена.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1А является схематическим изображением, демонстрирующим полноразмерный экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (РЕ) и частичный фрагмент РЕ.
Фиг. 1В-С демонстрируют карты векторов транскрипции.
+
+
+
+
Фиг. 2-5 - это графики, изображающие слитые белки по настоящему изобретению, вызывающие усиленные иммуногенности, опосредованные CD8/IFN-γТ-клетками (Фиг. 2А-5А) и CD4/IFN-γT-клетками (Фиг. 2В-5В), соответственно.
Фиг. 6 изображает группы животных, вакцины и дозы, использованные для иммунизации животных, и графики иммунизации.
Фиг. 7 и 8 являются графиками, изображающими изменения размеров опухолей и процент мышей, не имеющих опухолей, в группах животных, вакцинированных различными слитыми белками или плацебо, соответственно.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Настоящее изобретение более конкретно описано в приведенных ниже примерах, которые являются лишь иллюстративными, поскольку для специалистов в данной области техники будут очевидными многочисленные модификации и вариации. Далее подробно описаны различные варианты осуществления настоящего изобретения. Что касается графических материалов, то одинаковые ссылочные номера обозначают одинаковые компоненты на всех графических материалах. При использовании в описании изобретения и во всех пунктах приведенной ниже формулы изобретения значение артиклей «а», «an» и «the» включает множественное число, если контекст однозначно не указывает иное. Также при использовании в описании изобретения и в приведенной ниже формуле изобретения значение предлога «in» включает «в» и «на», если контекст однозначно не указывает иное. Более того, для удобства читателя в описании могут быть использованы заголовки и подзаголовки, которые не оказывают влияния на объем настоящего изобретения. Кроме того, некоторые термины, использованные в описании, более конкретно определены ниже.
Определения
Термины, использованные в данном описании, в целом имеют стандартные значения, используемые в данной области техники, в контексте настоящего изобретения и в конкретном контексте, в котором использован каждый термин. Некоторые термины, использованные для описания настоящего изобретения, обсуждены ниже или в других местах описания в качестве дополнительного руководства для практиков, касающегося описания настоящего изобретения. Для удобства некоторые термины могут быть выделены, например, с использованием курсивного шрифта и/или кавычек. Использование выделения не оказывает влияния на объем и смысл термина; объем и смысл термина остаются одинаковыми в одном и том же контексте, независимо от того, выделен термин или нет. Следует понимать, что одно и то же понятие может быть сформулировано более чем одним способом. Вследствие этого альтернативные языки и синонимы могут быть использованы для одного или более терминов, обсуждаемых в данной публикации, и им не может быть придано никакое особое значение, независимо от того, конкретизированы эти термины или обсуждены в данной публикации. Приведены синонимы некоторых терминов. Указание одного или более синонимов не исключает использования других синонимов. Использование примеров в любой части данного описания, включая примеры любых терминов, обсуждаемых в данной публикации, является исключительно иллюстративным и ни в коей мере не ограничивает объем и содержание изобретения или любого приведенного термина. Сходным образом, изобретение не ограничено различными вариантами его осуществления, приведенными в данном описании.
Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в данной публикации, имеют те значения, которые обычно используют специалисты в той области техники, к которой относится настоящее изобретение. В случае конфликта определяющее значение имеет настоящий документ, включая определения.
+
Термин «антигенпрезентирующая клетка (АПК) или вспомогательная клетка (А-клетка)» относится к клетке, которая презентирует чужеродные антигены в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС; от англ.: major histocompatibility complex) на своей поверхности. Т-клетки могут распознавать эти комплексы с использованием рецепторов Т-клеток (TCR; от англ.: T-cell receptors). Эти клетки перерабатывают антигены и презентируют их Т-клеткам. Основными типами специализированных антигенпрезентирующих клеток являются дендритные клетки (DC; от англ.: dendritic cells), макрофаги, которые также являются CD-клетками и поэтому чувствительны к инфекции ВИЧ, моноциты и некоторые В-клетки.
Термин «домен связывания с антигенпрезентирующей клеткой (АПК)» относится к домену (который является полипептидом), который может связываться с антигенпрезентирующей клеткой (АПК). Домен связывания с АПК может быть полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1 и с 8 по 11. Домен связывания с АПК является лигандом, который распознает рецептор АПК и связывается с ним.
Кластер дифференциации 91 (CD91) является белком, который образует рецептор в мембране клеток и участвует в рецептор-опосредованном эндоцитозе.
t
Термин «PE» относится к транслокационному пептиду (или транслокационному домену) длиной от 34 до 112 аминокислотных остатков. PEt может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 2-4 и 6. Например, аминокислотная последовательность PEt может быть фрагментом, содержащим аминокислоты с 280 по 313 (SEQ ID NO: 4), аминокислоты с 268 по 313 (SEQ ID NO: 3), аминокислоты с 253 по 313 (SEQ ID NO: 2) или аминокислоты с 253 по 364 (SEQ ID NO: 6) РЕ. Это значит, что аминокислотная последовательность PEt может содержать любую область домена II РЕ (аминокислоты с 253 по 364: SEQ ID NO: 6), если она содержит аминокислоты с 280 по 313 (SEQ ID NO: 4) эссенциальной последовательности (то есть эссенциальный фрагмент).
407
Последовательность РЕ (SEQIDNO: 7) описана в более раннем патенте (7,335,361 В2) как РЕ(ΔIII).
253-313
Термин «минимальный транслокационный пептид» относится к последовательности РЕ (SEQIDNO: 2), которая может транслоцировать антиген в цитоплазму клетки-мишени.
Термин «последовательность, обеспечивающая удержание в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР)» относится к пептиду, функция которого состоит в том, чтобы способствовать транслокации антигена из цитоплазмы в ЭР и удерживать антиген в просвете ЭР. Последовательность, обеспечивающая удержание в ЭР, содержит последовательность Lys Asp Glu Leu (KDEL; SEQ ID NO: 15) или RDEL. Последовательность, обеспечивающая удержание в ЭР, может содержать последовательность KDEL, RDEL, KDELKDELKDEL (К3; SEQ ID NO: 16), KKDLRDELKDEL (К3; SEQ ID NO: 17), KKDELRDELKDEL (К3; SEQ ID NO: 18), или KKDELRVELKDEL (К3; SEQ ID NO: 19).
xx
xx
x
x
Термин «сигнал ядерного экспорта (NES; от англ: nuclear export signal)» относится к короткой аминокислотной последовательности, содержащей 4 гидрофобных остатка, в белке, которая направляет его для экспорта из ядра клетки в цитоплазму через ядерный поровый комплекс с использованием ядерного транспорта. NES распознается и связывается экспортинами. Наиболее распространенным расположением гидрофобных остатков является LKLLL (SEQ ID NO: 13), где «L» является лейцином, «К» - лизином, а «х» - любой существующей в природе аминокислотой. Например, искусственный NES может содержать последовательность Leu Gin Lys Lys Leu Glu Glu Leu Glu Leu Ala (LQKKLEELELA; SEQ ID NO: 14).
Термин «NESK» относится к слитому пептиду, состоящему из NES и сигнала удержания в ЭР (т.е. к NES, слитому с сигналом удержания в ЭР). Это искусственный пептид, обладающий функциями сигнала ядерного экспорта (NES) и последовательности, обеспечивающей удержание в ЭР. Соответственно, он может экспортировать антиген из ядра клетки в цитоплазму через ядерный поровый комплекс и способствовать транслокации антигена из цитоплазмы в ЭР и удерживать антиген в просвете ЭР. Например, аминокислотная последовательность NESK может быть следующей: LQKKLEELELAKDEL (SEQ ID NO: 12).
Антиген может быть белком, полипептидом или пептидом патогена, который ответственен за болезнь, вызываемую патогеном, или способен вызывать иммунологический ответ у организма-хозяина, инфицированного патогеном, или опухолеассоциированным антигеном (ТАА; от англ.: tumor-associated antigen), который является полипептидом, специфически экспрессируемым в опухолевых клетках. Антиген может быть выбран из патогенов или раковых клеток, включающих, но не ограничивающихся этим, вирус папилломы человека (HPV; от англ.: human papilloma virus), вирус репродуктивного и респираторнаого синдрома свиней (PRRSV), вирус-1 иммунодефицита человека (HIV-1; от англ.: human immunodeficiency virus-1), вирус лихорадки Денге, вирус гепатита С (HCV; от англ.: hepatitis С virus), вирус гепатита В (HBV; от англ.: hepatitis В virus), цирковирус 2 свиней (PCV2), вирус классической чумы свиней (CSFV), вирус ящура (FMDV), вирус болезни Ньюкасла (NDV), вирус трансмиссивного гастроэнтерита (TGEV), вирус эпидемической диареи свиней (PEDV), вирус гриппа, вирус псевдобешенства, парвовирус, вирус везикулярной болезни свиней (SVDV), вирус оспы, ротавирус, Mycoplasma pneumonia, вирус герпеса, вирус инфекционного бронхита или вирус инфекционного бурсита, немелкоклеточный рак легкого, карциному молочной железы, меланому, лимфомы, карциному толстого кишечника, гепатоклеточную карциному и любые их комбинации. Например, для разработки вакцины были выбраны белок Е7 HPV (Е7), белок ядра HCV (HCV core), белок X HBV (НВх). Антиген может быть слитым антигеном, полученным посредством слияния двух или более антигенов, выбранных из одного или более.бел ков патогенов. Например, он может быть слитым антигеном, состоящим из фрагментов PRRSV ORF6 и ORF7, или результатом слияния антигенных белков из патогенов PRRSV и PCV2.
Термин «обработка» или «лечение» относится к введению эффективного количества слитого белка нуждающемуся в этом субъекту, имеющему рак или инфекционное заболевание или симптом или предрасположенность к такому заболеванию, с целью лечения, облегчения симптомов, помощи, устранения, улучшения состояния или профилактики заболевания, его симптомов или предрасположенности к нему. Такой субъект может быть выявлен профессиональным медиком на основании результатов любого подходящего диагностического метода.
Термин «эффективное количество» относится к количеству активного соединения, которое необходимо для оказания терапевтического эффекта на субъект, проходящий лечение. Эффективные дозы будут различными, как известно специалистам в данной области техники, в зависимости от пути введения, использования наполнителя и возможности совместного использования с другими терапевтическими процедурами.
Изобретение относится к слитым белкам для усиления доставки антигена и модулирования клеточно-опосредованного иммунного ответа. Слитый белок содержит: (а) домен связывания с антигенпрезентирующей клеткой (АПК) или домен связывания с рецептором CD91, расположенный на N-конце слитого белка; (b) транслокационный пептид длиной от 34 до 112 аминокислотных остатков, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: со 2 по 4 и 6, и расположенный на С-конце домена связывания с АПК или домена связывания с рецептором CD91; (с) антиген патогена, расположенный на С-конце транслокационного пептида; (d) сигнал ядерного экспорта (NES); и (е) последовательность, обеспечивающую удержание в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), расположенную на С-конце слитого белка, причем NES содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.
313
313
При использовании слитого белка PE-ORF2-NESK в качестве примера стратегия состоит в том, что слитый белок по настоящему изобретению стимулирует продукцию и активацию Т-клеток, которые могут распознавать антиген капсидного белка ORF2 цирковируса 2 типа свиней (PCV2). Слитый белок содержит, по направлению от N-конца к С-концу, домен I РЕ (домен связывания с АПК), транслокационный пептид длиной от 34 до 112 аминокислотных остатков (например, аминокислоты с 253 по 313 домена II РЕ), белок ORF2 PCV2, подвергнутый посттрансляционной модификации (удален N-терминальный сигнал ядерной локализации), NES-сигнал и последовательность, обеспечивающую удержание в ЭР (KDEL). Базовые механизмы индуцирования усиленных ОЯР2-специфических Т-клеточных иммунных ответов слитым белком PE-ORF2-NESK включают следующие стадии: а) связывание с поверхностным рецептором (CD91) дендритной клетки (или антигенпрезентирующей клетки); b) интернализация посредством эндоцитоза; с) транспорт к ЭР и протеолитический гидролиз фурином перед транслокационным пептидом; d) процессинг и презентация комплексов с молекулами МНС класса I; и е) активация антигенспецифических CD4+ и CD8+ Т-клеток. CD4+ Th1-клетки способны эффективно стимулировать и усиливать цитотоксический иммунный ответ CD8+ Т-клеток. Эти две ветви адаптивной иммунной системы совместно обладают специфичностью и способностью убивать PCV2 и клетки, инфицированные PCV2.
313
407
313
407
Слитый белок PE-ORF2-NESK, описанный в данной публикации, отличается от вакцины на основе слитого белка РЕ-Ag-К3, описанной Lai в публикации US 7,335,361, по нескольким аспектам. Во-первых, длина PE (seq ID NO: 5), равная 94 аминокислотным остаткам, короче, чем длина РЕ (SEQ ID NO: 7), что обеспечивает преимущество, состоящее в том, что минимизируется или устраняется нежелательный гуморальный ответ, вызванные наличием дополнительного фрагмента РЕ. Во-вторых, укорочена последовательность, обеспечивающая удержание в ЭР. Вместо К3 (то есть, 3 KDER) необходима только одна последовательность KDER или RDER. В-третьих, только цитозольный антиген может быть подвергнут процессингу и представлен по пути МНС типа I, так что добавление NES-сигнала в слитый белок является выгодным для усиления антигенспецифических Т-клеточных ответов против патогенов, поскольку увеличивает возможность транслокации антигена в цитозоль. Антигены патогенов могут быть импортированы в ядро клетки. За счет включения NES-сигнала антиген, импортированный в ядро клетки, может быть экспортирован в цитоплазму за счет NES-сигнала слитого белка.
Описание примеров осуществления изобретения
Далее приведены не ограничивающие объем настоящего изобретения характерные приборы, аппаратура, способы и связанные с ними результаты в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения. Учтите, что в примерах для удобства читателя могут быть использованы заголовки и подзаголовки, которые никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения. Кроме того, в данной публикации предложены и раскрыты некоторые теории, однако, независимо от того, являются ли они верными или неверными, они никоим образом не должны ограничивать объем настоящего изобретения, поскольку изобретение осуществляют согласно настоящему изобретению безотносительно к какой-либо конкретной теории или схеме действия.
Пример 1
Конструкции векторов экспрессии
407
407
313
313
Фиг. 1А демонстрирует экзотоксин Pseudomonas aeruginosa (РЕ), содержащий 3 домена (I, II и III). РЕ является областью РЕ от аминокислоты 1 до аминокислоты 407. РЕ не содержит цитототоксического домена III и поэтому содержит домены I и II. РЕ - это область от аминокислоты 1 до аминокислоты 313 РЕ. Соответственно, РЕ содержит только домен Ia и частично N-терминальную область домена II РЕ.
313
407
268-313
268-313
313
407
268-313
268-313
Ndel
(EcoRI, Xhol)
Xhol
Ndel
(EcoRI, Xhol)
Xhol
Ndel
(EcoRI)
(EcoRI, Xhol)
Xhol
Ndel
(EcoRI)
(EcoRI, Xhol)
Xhol
Фиг. 1В-С демонстрирует конструкции векторов экспрессии, каждый из которых содержит домен связывания с антигенпрезентирующей клеткой (АПК), транслокационный пептид, антиген с сигналом ядерного экспорта (NES) (нижняя часть) или без него (верхняя часть) и последовательность, обеспечивающую удержание в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) (верхняя часть, К3, или нижняя часть, К), причем последовательность, обеспечивающая удержание в ЭР, расположена на С-конце слитого белка. Плазмиды pTac-2-PE-NESK, рТас-2-РЕ-К3, pTac-2-RAP1-PE-NESK и pTac-2-RAP1-PE-K3 были получены следующим образом: фрагменты PE--NESK, PE--K3, RAP1--PE--NESK и RAP1--PE--K3 были синтезированы способом ПЦР и затем лигированы в pUC18 обратной связью с геном резистентности к канамицину с получением соответствующих плазмид.
313
407
313
407
313
407
313
407
313
407
407
268-313
268-313
407
268-313
268-313
Затем можно было встроить целевую ДНК, кодирующую антиген или слитый антиген патогена, представляющего интерес, в вышеуказанные плазмиды с получением вектора экспрессии для экспрессии слитого белка. Например, фрагменты ДНК, кодирующие антигены ORF2 (SEQ ID NO: 20) цирковируса 2 типа свиней (PCV2), Е2 (SEQ ID NO: 21) вируса классической чумы свиней (CSFV), VP1-3А (SEQ ID NO: 24) вируса ящура (FMDV) и FHN (SEQ ID NO: 27) вируса болезни Ньюкасла (NDV) были синтезированы и встроены в плазмиды pTac-2-PE-NESK и рТас-2-РЕ-К3, соответственно, с получением следующих векторов экспрессии: (1) PE-ORF2-NESK; (2) PE-ORF2-K3; (3) PE-E2-NESK; (4) РЕ-Е2-К3; (5) РЕ-VP1-3A-NESK; (6) PE-VP1-3A-K3; (7) PE-FHN-NESK; и (8) PE-FHN-K3. Фрагменты ДНК, кодирующие антиген вируса типа 16Е7 папилломы человека (SEQ ID NO: 28) были синтезированы и встроены в плазмиды рТас-2-РЕ-К3, рТас-2-RAP1-PE-NESK и pTac-2-RAP1-PE-K3, соответственно, с получением следующих векторов экспрессии: (9) РЕ-Е7-К3, (10) RAP1-PE-E7-NESK и (11) RAP1-PE-E7-K3.
Пример 2
Экспрессия белка
313
407
313
407
313
407
313
407
407
268-313
268-313
Клетки BL21 Е. coli, содержащие плазмиды для экспрессии слитых белков (1) PE-ORF2-NESK; (2) PE-ORF2-K3; (3) PE-E2-NESK; (4) РЕ-Е2-К3; (5) РЕ-VP1-3A-NESK; (6) PE-VP1-3A-K3; (7) PE-FHN-NESK; (8) PE-FHN-K3; (9) РЕ-E7-K3; (10) RAP1-PE-E7-NESK и (11) RAP1-PE-E7-K3, соответственно, культивировали в бульоне Лурия-Бертани, содержавшем 25 частей/млн канамицина, при 37°С. Когда культура достигала ранней логарифмической фазы (А600 от 0,1 до 0,4), добавляли изопропил-1-тио-β-D-галактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации от 0,5 мМ до 2 мМ для индукции. Клетки собирали через 4 часа после индукции и сразу же сохраняли при -70°С. Слитые белки очищали посредством экстракции мочевиной, как описано ранее (Liao et al., 1995. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43: 498-507), и затем выполняли рефолдинг способом диализа против 50-кратного объема TNE-буфера (50 мМ Трис, 50 мМ NaCl и 1 мМ ЭДТА) при 4°С в течение ночи. Рефолдированные белки подвергали анализу способом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE; от англ.: sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) и проводили количественный анализ с использованием Набора для анализа белков способом Бредфорда (производства компании Pierce). Результаты показали, что большинство рефолдированных белков были мономерами в невосстановленном состоянии, что свидетельствует о том, что слитые белки легко подвергались рефолдингу и не агрегировали.
Пример 3
Анализ иммуногенности субъединичной вакцины против PCV2
313
407
8
Мышей вакцинировали 0,1 мл субъединичной вакцины против PCV2, содержавшей 40 мкл PE-ORF2-NESK или PE-ORF2-K3 с фосфатом алюминия (абсорбент белков для медленного выделения слитого белка; 10 об.%) и 10 мкг сапонина (адъювант, экстрагированный из Quillaja saponaria) посредством подкожной инъекции один раз в неделю в течение 3 недель. Контрольной группе (плацебо) инъецировали только адъювант без слитого белка. Всех мышей умертвили через 14 дней после последней иммунизации и извлекли у них селезенки. Выделили спленоциты и культивировали их в 6-луночном планшете (10 клеток/2 мл/лунку) с рекомбинантным белком ORF2 или без него в присутствии 1 мкг/мл реагента GolgiPlug (производства компании BD Pharmingen, Сан Диего, Калифорния) при 37°С в течение 16 часов. Стимулированные спленоциты затем промыли буфером FACScan и окрасили конъюгированными с фикоэритрином моноклональными антителами крысы к рецепторам CD8a мыши и конъюгированными с AF700 моноклональными антителами крысы к рецепторам CD4 мыши. Клетки окрасили на внутриклеточные цитокины с использованием набора Cytofix/Cytoperm согласно инструкциям производителя (компании BD Pharmingen). Внутриклеточный IFN-γ (интерферон-гамма; от англ.: interferon-gamma) окрасили конъюгированным с AF-488 антителом крысы к IFN-γ мыши для измерения иммунного ответа и концентраций цитокинов. Проточно-цитометрические анализы выполнили с использованием проточного цитометра Gallios с аналитическим программным обеспечением Kaluza (Beckman Coulter).
+
313
407
На Фиг. 2А-В показаны числа CD8- и CD4-позитивных Т-клеток, продуцирующих IFN-γ, в спленоцитах мышей, вакцинированных плацебо (только адъювантом без слитого белка) или слитыми белками, соответственно. Продукция IFN-γ CD4 и CD8+ Т-клетками в спленоцитах, стимулированных ORF2, была обнаружена при внутриклеточном окрашивании посредством проточной цитометрии. Столбчатые диаграммы демонстрируют числа ORF2-специфических IFN-γ+ CD4+ Т-клеток (Фиг. 2В) и IFN-γ+ CD8+ Т-клеток (Фиг. 2А) из каждой группы со стимуляцией (серые столбики) или без стимуляции (черные столбики) пептидом ORF2. Результаты показали, что мыши, вакцинированные PE-ORF2-NESK, имели больше ORF2-специфических CD4+ IFN-γ+ и CD8+ IFN-γ+ Т-клеток, стимулированных пептидом ORF2, чем мыши, которых вакцинировали PE-ORF2-К3.
Пример 4
Анализ иммуногенности субъединичной вакцины против CSFV
313
407
С использованием таких же графика иммунизации и дозировки мышей вакцинировали субъединичными вакцинами против CSFV, содержавшими РЕ-Е2-NESK или РЕ-Е2-К3, и спленоциты выделяли, культивировали и анализировали способом проточной цитометрии, как описано выше, за исключением того, что для стимуляции спленоцитов в культуре добавляли рекомбинантный белок Е2.
313
407
Фиг. 3А-В демонстрируют числа CD8- и CD4-позитивных Т-клеток, продуцирующих IFN-γ, в спленоцитах мышей, вакцинированных плацебо (только адъювантом без слитого белка) или слитыми белками, соответственно. Продукция IFN-γ CD4+ и CD8+ Т-клетками в спленоцитах, стимулированных Е2, была обнаружена при внутриклеточном окрашивании посредством проточной цитометрии. Столбчатые диаграммы демонстрируют числа Е2-специфических IFN-γ+ CD4+ Т-клеток (Фиг. 3В) и IFN-γ+ CD8+ Т-клеток (Фиг. 3А) из каждой группы со стимуляцией (серые столбики) или без стимуляции (черные столбики) пептидом Е2. Результаты показали, что мыши, вакцинированные PE-E2-NESK, имели больше Е2-специфических CD4+ IFN-γ+ и CD8+ IFN-γ+ Т-клеток, стимулированных пептидом Е2, чем мыши, которых вакцинировали РЕ-Е2-К3.
Пример 5
Анализ иммуногенности субъединичной вакцины против FMDV
313
407
С использованием таких же графика иммунизации и дозировки мышей вакцинировали субъединичными вакцинами против FMDV, содержавшими РЕ-VP1-3A-NESK или PE-VP1-3A-K3, и спленоциты выделяли, культивировали и анализировали способом проточной цитометрии, как описано выше, за исключением того, что для стимуляции спленоцитов в культуре добавляли рекомбинантный белок VP1-3A.
313
407
Фиг. 4А-В демонстрируют числа CD8- и CD4-позитивных Т-клеток, продуцирующих IFN-γ, в спленоцитах мышей, вакцинированных плацебо или слитыми белками. Продукция IFN-γ CD4+ и CD8+ Т-клетками в спленоцитах, стимулированных VP1-3A, была обнаружена при внутриклеточном окрашивании посредством проточной цитометрии. Столбчатые диаграммы демонстрируют числа VP1-3А-специфических IFN-γ+ CD4+ Т-клеток (Фиг. 4В) и IFN-γ+ CD8+ Т-клеток (Фиг. 4А) из каждой группы со стимуляцией (серые столбики) или без стимуляции (черные столбики) пептидом VP1-3A. Результаты показали, что мыши, вакцинированные PE-VP1-3A-NESK, имели больше VP1-3А-специфических CD4+ IFN-γ+ и CD8+ IFN-γ+ Т-клеток, стимулированных пептидом VP1-3А, чем мыши, которых вакцинировали PE-VP1-3A-K3.
Пример 6
Анализ иммуногенности субъединичной вакцины против NDV
313
407
С использованием таких же графика иммунизации и дозировки мышей вакцинировали субъединичными вакцинами против NDV, содержавшими PE-FHN-NESK или PE-FHN-K3, и спленоциты выделяли, культивировали и анализировали способом проточной цитометрии, как описано выше, за исключением того, что для стимуляции спленоцитов в культуре добавляли рекомбинантный белок FHN.
313
407
Фиг. 5А-В демонстрируют числа CD8- и CD4-позитивных Т-клеток, продуцирующих IFN-γ, в спленоцитах мышей, вакцинированных плацебо или слитыми белками. Продукция IFN-γ CD4+ и CD8+ Т-клетками в спленоцитах, стимулированных FHN, была обнаружена при внутриклеточном окрашивании посредством проточной цитометрии. Столбчатые диаграммы демонстрируют числа FHN-специфических IFN-γ+ CD4+ Т-клеток (Фиг. 5В) и IFN-γ+ CD8+ Т-клеток (Фиг. 5А) из каждой группы со стимуляцией (серые столбики) или без стимуляции (черные столбики) пептидом FHN. Результаты показали, что мыши, вакцинированные РЕ-FHN-NESK, имели больше FHN-специфических CD4+ IFN-γ+ и CD8+ IFN-γ+ Т-клеток, стимулированных пептидом FHN, чем мыши, которых вакцинировали РЕ-FHN-K3.
Пример 7
Усиленное ингибирование опухолевого роста, вызванного белком Е7 вируса папилломы человека типа 16
407
268
268-313
407
268-313
268-313
407
268-313
268-313
268-313
407
268-313
3
Слитые белки РЕ-Е7-К3, RAP1-PE-E7-K3 и RAP1-PE-E7-NESK экспрессировали и подвергли рефолдингу с использованием способов, сходных с описанными выше. Мышей нагрузили 2×10 клеток ТС-01 (клетки легочного эпителия мышей, несущие ген Е7 HPV типа 16) посредством подкожной инъекции с целью индуцирования карциномы HPV типа 16. Через двенадцать дней после введения клеток ТС-01 мышей вакцинировали посредством подкожной инъекции плацебо (фосфатный буферный раствор, PBS; от англ.: phosphate buffer saline), РЕ-Е7-К3 (100 мкг/дозу), RAP1-PE-E7-K3 (100 мкг/дозу) или RAP1-PE-E7-NESK (100 мкг/дозу) с AS04C (GlaxoSmithKline) в качестве адъюванта один раз в неделю в течение 3 недель (Фиг. 6). AS04C, который является адъювантом, стимулирующим цитотоксические Т-лимфоциты, содержит монофосфорил-липид A (MPL; от англ.: monophosphoryl-lipid А, иммуностимулятор) и фосфат алюминия (абсорбент белков для доставки антигенов). Термин «К3» относится к последовательности, обеспечивающей удержание в ЭР, содержащей KDEL. Например, К3 может быть последовательностью аминокислот KDELKDELKDEL (SEQ ID NO: 16). Термин «NESK» относится к слитому пептиду, содержащему сигнал ядерного экспорта и последовательность, обеспечивающую удержание в ЭР. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения NESK является последовательностью аминокислот LQKKLEELELAKDEL (SEQ ID NO: 12). Регистрировали размеры опухолей и число животных без опухолей в каждой группе (Фиг. 7 и Фиг. 8). Опухолевый рост значительно угнетался вакцинами РЕ-Е7-К3, RAP1-PE-E7-К3 и RAP1-PE-E7-NESK с AS04C в качестве адъюванта. Однако вакцина RAP1-PE-E7-NESK значительно превосходила РЕ-Е7-К3 и превосходила RAP1-РЕ-Е7-К3 в отношении угнетения опухолевого роста и увеличения процента животных без опухолей.
Пример 8
313
1-252
268-313
1-252
280-313
1-252
313
253-313
253-313
253-313
253-313
268-313
268-313
268-313
268-313
280-313
280-313
280-313
280-313
253-313
253-313
253-313
253-313
268-313
268-313
268-313
268-313
280-313
280-313
280-313
280-313
Создали следующие слитые белки: PE-NES-антиген-K, PE-PE-NES-антиген-К, РЕ-РЕ-NES-антиген-К. Кроме того, фрагмент домена Ia РЕ (РЕ) слитого белка РЕ-антиген-NESK заменили доменом 3 RAP1 (SEQ ID NO: 8), А2М минимум (SEQ ID NO: 9), HIV-Tat минимум (SEQ ID NO: 10) или HSPs минимум (SEQ ID NO: 11) для получения вакцин на основе слитых белков: домен 3 RAP1-PE-антиген-NESK, A2M-PE-антиген-NESK, Tat-РЕ-антиген-NESK и HSP- PE-антиген-NESK, домен 3 RAP1-PE-антиген-NESK, А2М-PE-антиген-NESK, Tat- PE-антиген-NESK и HSP-PE-антиген-NESK, домен 3 RAP1-PE-антиген-NESK, A2M-PE-антиген-NESK, Tat-PE-антиген-NESK и HSP-PE-антиген-NESK, соответственно, домен 3 RAP1-PE-NES-антиген-K, A2M-PE-NES-антиген-K, Tat-PE-NES-антиген-K и HSP-PE-NES-антиген-K, домен 3 RAP1-PE-NES-антиген-K, A2M-PE-NES-антиген-К, Tat-PE-NES-антиген-K и HSP-PE-NES-антиген-K, домен 3RAP1-PE-NES-антиген-K, A2M-PE-NES-антиген-K, Tat-PE-NES-антиген-K и HSP-PE-NES-антиген-K. Клеточно-опосредованные иммунные ответы, усиленные этими вакцинами, исследовали с использованием способов, сходных с описанными выше.
В таблице 1 приведены идентификационные номера последовательностей пептидов, использованных для получения различных слитых белков:
В целом, результаты подтвердили, что слитый белок, содержащий домен связывания с АПК на N-терминальном конце, транслокационный домен, затем - антиген патогена, а затем слитый пептид NESK на карбоксильном терминальном конце, обладает усовершенствованной конструкцией по сравнению со слитым белком на основе РЕ, который не содержит слитого пептида NESK на карбоксильном конце, в отношении усиления клеточно-опосредованного иммунного ответа, подавления опухолевого роста и/или повышения процента животных, не имеющих опухолей.
Несмотря на то что в данной публикации проиллюстрированы и описаны различные варианты осуществления настоящего изобретения, специалистами в данной области техники могут быть выполнены различные модификации и улучшения. Предполагается, что настоящее изобретение не ограничено конкретными проиллюстрированными формами, и что все модификации, не отклоняющиеся от сущности и объема настоящего изобретения, входят в его объем, определенный в прилагаемой формуле изобретения.
Варианты осуществления и примеры выбраны и описаны для того, чтобы разъяснить принципы настоящего изобретения и его практическое применения, чтобы обеспечить специалистам в данной области техники возможность использовать настоящее изобретение и различные варианты его осуществления с с различными модификациями, которые пригодны для предполагаемого конкретного применения. Специалистам в той области техники, к которой относится настоящее изобретение, будут очевидными альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения, не отклоняющиеся от его сущности и объема. Соответственно, объем настоящего изобретения определен прилагаемой формулой изобретения, а не приведенным выше описанием и характерными вариантами осуществления настоящего изобретения, описанными в данной публикации.
Некоторые ссылки, которые могут включать патенты, патентные заявки и различные публикации, процитированы и обсуждены в описании настоящего изобретения. Цитирование и/или обсуждение таких ссылок приведено исключительно для разъяснения описания настоящего изобретения и не является признанием того, что любая такая ссылка относится к «предшествующему уровню техники» относительно изобретения, описанного в данной публикации. Все ссылки, процитированные и обсужденные в данной публикации, полностью включены в нее посредством ссылки и в том же объеме, как если бы каждая ссылка была индивидуально включена в данную публикацию.