Антитела против анафилатоксина C5a человека
ANAPHYLATOXIN C5A ANTIBODIES TO HUMAN

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к моноклональным антителам против компонента комплемента, а именно мышиным и химерным моноклональным антителам против анафилатоксина С5а комплемента человека, а также к гемосорбенту для сорбции анафилатоксина С5а комплемента человека из крови и ее производных.
Анализ механизмов патогенеза ряда воспалительных болезней, включая синдром системного воспалительного ответа (ССВО) и сепсис, позволил сделать выбор главных мишеней, которые играют ключевую роль в развитии этих тяжелых состояний [Chousterman B.G., Swirski F.K., Weber G.F. Cytokine storm and sepsis disease pathogenesis // Semin Immunopathol, 2017; 39(5): 517-528]. Вызванная бактериями и продуктами их распада активация клеток иммунной системы: нейтрофилов, макрофагов и мононуклеарных лейкоцитов, делает их главным источником эндогенных провоспалительных агентов - цитокинов. Провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухолей альфа (ФНОα), интерлейкин-1 бета (ИЛ-1β), интерлейкин-6 (ИЛ-6), интерлейкин-8 (ИЛ-8), появляются в крови относительно быстро после бактериального стимула. В свою очередь ФНОα и ИЛ-1β стимулируют продукцию других провоспалительных цитокинов, а ИЛ-6 стимулирует синтез белков острой фазы воспаления. В конечном итоге это приводит к гиперпродукции цитокинов и опасной для жизни больного эскалации генерализованного воспаления [McILwain R.B., Timpa J.G., Kurundkar A.R., et al. Plasma concentrations of inflammatory cytokines rise rapidly during ECMO- related SIRS due to the release of preformed stores in the intestine // Lab Invest., 2010; 90(1): 128-139].
Важными патогенетическими факторами при сепсисе являются продукты активации комплемента. Активация комплемента может происходить через взаимодействие бактерий и продуктов их распада с лектин-связывающим белком MBL (лектиновый путь), С3 компонентом (альтернативный путь), а при появлении антител и образовании иммунных комплексов, с C1q субкомпонентом (классический путь) [Charchaflieh J., Rushbrook J., Worah S., Zhang M. Activated Complement Factors as Disease Markers for Sepsis // Dis Markers., 2015; 2015: 382463]. По какому бы пути ни проходила активация комплемента, ее результатом является появление малых молекул - анафилатоксинов С3а, С4а, С5а, - продуктов ограниченного протеолиза соответствующих компонентов комплемента. Они взаимодействуют со специфическими рецепторами и опосредуют множество воспалительных реакций [Hawksworth O.A., Li X.X., Coulthard L.G., et al. New concepts on the therapeutic control of complement anaphylatoxin receptors // Mol Immunol., 2017; 89: 36-43]. Установлено, что при сепсисе С5а наиболее опасен, поскольку он стимулирует множество функциональных нарушений в различных органах и тканях, например, способствует нарушению функции сердца и коагуляции крови. Действуя синергично ряду цитокинов, С5а вызывает окислительный взрыв в нейтрофилах, усиливает фагоцитоз и высвобождение гранулярных ферментов, он является сильным хемоаттрактантом для нейтрофилов, а также для макрофагов и моноцитов, а также повышает проницаемость стенок сосудов [Ward P.A. Role of C5 activation products in sepsis // Scientific World Journal., 2010; 10:2395-2402; Ward P.A. The harmful role of c5a on innate immunity in sepsis // J Innate Immun., 2010; 2(5):439-445]. Избыточное накопление в крови С5а опасно для жизни больного [Fattahi F., Ward P.A. Complement and sepsis-induced heart dysfunction // Mol Immunol., 2017; 84: 57-64]. Показано, что нейтрализация или удаление молекул С5а положительно влияют на исход болезней, приводящих к ССВО и септическому шоку, а также ряда инфекционных заболеваний [Guo R.F., Ward P.A. C5a, a therapeutic target in sepsis // Recent Pat Antiinfect Drug Discov., 2006; 1(1):57-65; Niederbichler A.D., Hoesel L.M., Westfall M.V., et al. An essential role for complement C5a in the pathogenesis of septic cardiac dysfunction // J Exp Med., 2006; 203(1):53-61].
Для нейтрализации или удаления из кровотока С5а целесообразно применять антитела, специфически связывающие данный белок. В частности, антитела, блокирующие связывание С5а с рецепторами, целесообразно вводить больному парентерально, также можно применять иммобилизованные антитела, связывающие С5а, для гемосорбции.
Известны различные антитела против С5а человека (ЕА 028899, ЕА 201691764, ЕА 201691481, ЕА 201200795, WO 0115731, WO 0305819, WO 2018175833, WO 2018184739, WO 20160181133, WO 212088247, ЕР 3372243).
Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является расширение спектра антител, связывающих анафилатоксин С5а человека. Другой технической задачей является создание гемосорбента, способного к удалению из крови человека и ее производных (сыворотки и плазмы крови) анафилатоксина С5а.
D
-11
Технический результат достигался созданием моноклонального антитела мыши к белку С5а человека, специфически связывающего белок С5а человека, а также созданием химерного антитела к белку С5а человека, которое специфически и с высокой аффинностью (K=5,976⋅10 M) связывается с С5а человека. Кроме того, на основе заявленных антител был создан иммуносорбент, который позволяет производить эффективное удаление белка С5а из крови человека и ее производных, в частности сорбент с 66 мкг заявленных мышиных или химерных моноклональных антител связывает из 70 мл активированной плазмы крови около 90% С5а.
Мышиное моноклональное антитело содержит гипервариабельные участки вариабельной области тяжелой цепи по SEQ ID NO: 3-5 и гипервариабельные участки вариабельной области легкой цепи по SEQ ID NO: 6-8. Химерное моноклональное антитело, содержит тяжелую цепь по SEQ ID NO: 9 и легкую цепь по SEQ ID NO: 10. Сравнительный анализ последовательностей CDR тяжелой и легкой цепей показал отсутствие гомологий между известными антителами к С5а и заявленными антителами.
Технология получения мышиного антитела включала в себя иммунизацию животных антигеном, представляющим собой белок С5а из активированной сыворотки крови доноров. В качестве антигенов для отбора позитивных продуцентов моноклональных антител при постановке иммуноферментного анализа (ИФА) использовали тот же белок, что и для иммунизации. В дальнейшем в последовательностях легкой и тяжелой цепей полученного мышиного моноклонального антитела была произведена замена константных областей на константные области иммуноглобулина G человека с получением химерного (мышь-человек) антитела. Химерное антитело к С5а человека было наработано в трансфицированных культивируемых клетках китайского хомячка линии CHO-K1, очищено и иммобилизовано на инертном носителе.
Заявленная группа изобретений иллюстрируются следующими графическими материалами:
На Фиг. 1 показаны результаты электрофореза очищенного белка С5а человека в 15-25% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. 1 - маркеры молекулярного веса, 2 - С5а.
На Фиг. 2 показана динамика удаления С5а из модельной плазмы крови с помощью иммуносорбентов, содержащих моноклональные антитела к белку С5а человека.
Сущность и промышленная применимость изобретения поясняются следующими примерами:
Пример 1. Получение мышиных моноклональных антител к анафилатоксину С5а человека.
Пример 1.1. Получение белка С5а человека. Анафилатоксин С5а получали из активированной сыворотки крови доноров. Для активации сыворотки использовали пекарские дрожжи, которые предварительно готовили инкубацией дрожжевой суспензии в кипящей бане 20 мин, а затем трехкратно отмывали с последующим центрифугированием. Один литр сыворотки нагревали до температуры 37°С, добавляли в нее хлорид магния до конечной концентрации 10 мМ, ингибитор карбоксипептидазы-Б (MERGEPTA) до конечной концентрации 0,1 нМ и подготовленные дрожжи из расчета 20 г/л. Обработанную таким образом сыворотку оставляли на 1 час при температуре 37°С и перемешивании. Реакцию активации останавливали добавлением этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) до конечной концентрации 20м М и ингибитора сериновых протеаз фенилметил- сульфонилфторида (ФМСФ) до конечной концентрации 0,5 мМ. Активированную сыворотку наносили на колонку с коммерческим иммуносорбентом антиС5а-Сефароза (Берингер, Германия). После удаления неспецифически сорбированного материала элюцией с помощью 1М NaCl, адсорбированный С5а элюировали 0,1 М глицин-HCl-буферным раствором, pH 2,2. Элюат нейтрализовывали, концентрировали и освобождали от избытка антител гель-фильтрацией на колонке TSK G-2000SW 21.5×600 мм (Тойо Сода, Япония) в режиме ВЭЖХ. Чистоту препаратов проверяли электрофорезом по Лэммли в градиенте полиакриламидного геля 15-25% (Фиг. 1). Полученный белок имел характерную для С5а молекулярную массу около 10 кДа, его чистота составила не менее 98% по результатам денситометрии окрашенного геля. С помощью тест-системы (ООО «Цитокин», Россия) было показано, что полученный белок связывается с антителами к анафилатоксину С5а человека. Выход белка С5а из 1 л сыворотки составил 0,52 мг.
-4
-7
-5
Пример 1.2. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела мыши к белку С5а человека. Для получения моноклональных антител (МАТ) мышей линии Balb/c иммунизировали полученным белком С5а. Для первой иммунизации антиген эмульгировали в полном адьюванте Фрейнда (ПАФ), после чего вводили в подошвенный апоневроз задних конечностей в дозе 5-10 мкг/мышь. Через 4 недели проводили бустирование иммунизированных мышей путем внутривенного введения 5 мкг антигена. На четвертый день после инъекции у наркотизированных животных отбирали лимфоциты паховых и брюшных лимфоузлов для гибридизации с миеломой. Полученные лимфоциты смешивали с клетками миеломы SP 2/0 в соотношении 2:1. Гибридизацию в 50% растворе полиэтиленгликоля проводили по методу Мильштейна и Келлера [ G. and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature, 1975, 256 (5517): 495-497]. Селекцию гибридов проводили в среде RPMI-1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки, содержащей 10 М гипоксантина, 4⋅10 М аминоптерина и 1,6⋅10 М тимидина, после чего рассевали на отдельные клоны, которые культивировали в лунках 96-луночных культуральных планшетов в среде RPMI-1640 с 10% телячьей эмбриональной сыворотки.
Для отбора клонов, стабильно продуцирующих антитела к белку С5а, в образцах культуральной жидкости, кондиционированной полученными клонами, определяли концентрацию антител к белку С5а методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, регистрируя связывание антител с белком С5а. Для этого белок С5а, полученный в примере 1.1., иммобилизовали в лунках планшета с высокой сорбционной емкостью в количестве 5 мкг белка на лунку. В лунки с иммобилизованным С5а вносили образцы кондиционированной культуральной жидкости и выдерживали в течение 1 часа при температуре 37°С, затем отмывали, в лунки планшетов добавляли антитела против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой хрена («Sigma», США). Планшет инкубировали при температуре 37°С в течение 40 мин, отмывали, после чего добавляли хромогенный субстрат тетраметилбензидин (ТМБ). После остановки реакции добавлением серной кислоты планшеты сканировали на планшетном анализаторе, измеряя оптическую плотность при 450 нм.
Отобранные положительные клоны многократно клонировали методом конечных разбавлений на перитонеальных макрофагах с отбором наиболее продуктивных и стабильных клонов. В результате было отобрано три клона, обозначенные, как АС5а-2, АС5а-7 и АС5а-11.
5
С целью проверки стабильности гибридом проводили их культивирование в среде RPMI-1640, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина. Пересев клеток гибридомы проводили 2 раза в неделю с кратностью разведения 1:2-1:3. Посевная концентрация клеток составляла 10 в 1 мл среды.
5
Максимальная концентрация гибридных клеток при культивировании составляла 10 в 1 мл среды. Исследуемые гибридные клоны АС5а-2, АС5а-7 и АС5а-11 не теряли способности к синтезу антител в течение всего срока наблюдения (15 пассажей), что свидетельствовало об их стабильности.
6
Пример 1.3. Очистка моноклональных антител. Наработку моноклональных антител, продуцируемых клонами АС5а-2, АС5а-7, АС5а-11, осуществляли в перитонеальной полости инбредных мышей линии BALB/c, которым до введения клеток гибридомы внутрибрюшинно вводили 0,5 мл 14-тетраметиленпентадекана (пристана). Через 14 дней животным также внутрибрюшинно вводили по 10 гибридных клеток на мышь. По достижении брюшной полостью заметного объема отбирали асцитическую жидкость (3-5 мл/мышь), содержавшую моноклональные антитела, в которой определяли концентрацию антител методом ИФА. Концентрация моноклональных антител в образцах асцитических жидкостей мышей варьировала от 2 до 7 мг/мл.
Моноклональные антитела выделяли из асцитической жидкости осаждением сульфатом аммония с последующей хроматографией на колонке с аффинным сорбентом MabSelect («GE-healthcare Life Science», США). После выделения и очистки каждое антитело концентрировали с помощью ультрафильтрации на ячейке с полиэфирсульфоновой мембраной и номинальной массой удержания 30 кД («Sartorius», Германия) до концентрации белка приблизительно 10 мг/мл. В результате были получены моноклональные антитела (МАТ) АС5а-2 в количестве 117,7 мг, АС5а-7 в количестве 97,8 мг и 107,1 мг МАТ АС5а-11.
Пример 2. Исследование свойств моноклональных антител АС5а-2, АС5а-7, АС5а-11 к белку С5а человека.
Антитела характеризовали методом электрофореза в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях, который показал наличие двух полипептидных цепей с молекулярными массами 53 и 23 кДа, что соответствует тяжелой и легкой цепям иммуноглобулинов. Изотипирование полученных МАТ с использованием коммерческого набора ISO-2 (Sigma, США) показало, что все три типа МАТ относятся к IgG1.
2
Измерение параметров взаимодействия МАТ с C5a проводили методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) при температуре 25°C с использованием чипов с карбоксиметилированным декстраном (CM5), на приборе Biacore X100 с двойной проточной ячейкой (GE-Healthcare Life Science, США). Чип активировали эквимолярной смесью N-этил-N'-диметиламинопропилкарбодиимида и N-гидроксисукцинимида (0,2 M), затем со скоростью 5 мкл/мин в течение 18 мин инъецировали раствор вторичных (антивидовых) антител против IgG мыши (5 мкг/мл в 10 мМ натрий- ацетатном буферном растворе, pH 5,0). Затем свободные группы чипа блокировали 1 M этаноламином, pH 8,5. Итоговый уровень иммобилизации вторичных (антивидовых) антител составил 4890 резонансных единиц (RU), что соответствует 4,9 нг антител на 1 мм поверхности чипа.
Возрастающие концентрации белка C5a в диапазоне 12,5-800 нМ инъецировали над чипом после инъекции МАТ и промывки буферным раствором HBS-P+ (150 мМ NaCl, 10 мМ Hepes-NaOH, pH 7,5, 0,05% полиоксиэтиленсорбитана) со скоростью 10 мкл/мин. Каждый эксперимент состоял из 6 стадий:
1) инъекция HBS-P+ в течение 1 мин;
2) инъекция МАТ к C5a в течение 3 мин;
3) промывка HBS-P+ в течение 2 мин;
4) инъекция C5a в течение 1 мин;
5) стадия диссоциации (промывка HBS-P) в течение 5 мин;
6) регенерация с помощью 3M раствора хлорида магния в течение 2 мин.
D
Часть проточной ячейки без иммобилизованных вторичных (антивидовых) антител против IgG мыши использовали как контроль для определения неспецифического связывания МАТ к C5a и C5a с чипом (<2% от Rmax). В итоге для каждой концентрации C5a контрольную кривую связывания вычитали из соответствующей кривой связывания с иммобилизованными вторичными (антивидовыми) антителами. Равновесная константа диссоциации K комплекса «МАТ к C5a - C5a» была определена по зависимости установившегося значения ответа (RU) от концентрации C5a, при этом данные соответствовали уравнению Ленгмюра для модели одноцентрового связывания:
eq
max
a
d
D
max
где R - ответ (RU) при достижении равновесия, R - ответ (RU) при насыщении поверхности аналитом. Кинетические параметры: k - константа скорости ассоциации, k - константа скорости диссоциации, K - равновесная константа диссоциации и R - максимальная связывающая способность поверхности чипа, были рассчитаны с использованием модели связывания 1:1.
Результаты представлены в таблице 1.
Анализ данных таблицы 1 показывает:
a
D
d
-9
- МАТ АС5а-2 по сравнению с двумя другими МАТ характеризуются наибольшей константой ассоциации K=83,95 1/Ms, наименьшим значением равновесной константы диссоциации K=5,69⋅10 M и средней величиной кинетической константы диссоциации K =0,477 1/s. Следовательно, МАТ АС5а-2 обладает наибольшей аффинностью по отношению к белку С5а.
d
- МАТ АС5а-11 показывает самое большое значение Rmax и, следовательно, оно обладает способностью связывать (адсорбировать) наибольшее количество антигена. Кроме того, МАТ АС5а-11 характеризуется наименьшим значением К=0,0027 1/s, что свидетельствует о его свойстве связывать антиген необратимо.
- МАТ АС5а-7 обладают наихудшими параметрами взаимодействия с антигеном.
Пример 3. Получение и исследование эффективности иммуносорбентов при удалении анафилатоксина С5а из модельного раствора.
С целью выбора оптимальных антител для удаления С5а из раствора синтезировали три образца иммуносорбентов с использованием в качестве лигандов МАТ АС5а-2, АС5а-7 и АС5а-11, а в качестве матрицы - CNBr- активированной Сефарозы-4 FF («GE Healthcare Life Science», США). Иммуносорбенты обозначили как ИС-(АС5а-2), ИС-(АС5а-7), ИС-(АС5а-11). Синтез проводили по инструкции производителя, с получением концентрации лиганда 10 мг МАТ/мл сорбента.
Полученные иммуносорбенты объемом 0,2 мл каждый помещали в хроматографические колонки размером 5×10 мм. Емкость колонок оценивали, пропуская через них плазму крови, в которую добавляли белок С5а до конечной концентрации 1,5 мкг/мл. Через каждую колонку пропускали 150 мл такой плазмы в режиме непрерывного цикла в течение 16 ч. После окончания цикла колонку отмывали сначала физиологическим буферным раствором, а затем буферным раствором, содержащим 1 М хлорида натрия. После этого адсорбированный С5а элюировали с колонки глициновым буферным раствором, рН 2,5, и с помощью ИФА определяли количество адсорбированного белка. Емкость у всех сорбентов была приблизительно одинаковой и равной 110 мкг.
Для исследования эффективности удаления белка С5а полученными иммуносорбентами подготавливали плазму крови, которую активировали с помощью пекарских дрожжей по методике, изложенной в примере 1. Концентрация С5а в активированной плазме, определенная методом ИФА, составила 550 нг/мл.
Через колонки с иммуносорбентами ИС-(АС5а-2), ИС-(АС5а-7), ИС- (АС5а-11) пропускали по 120 мл активированной плазмы с концентрацией С5а 0,55 мкг/мл. Хроматографию проводили со скоростью 0,5 мл/мин, отбирая пробы через каждые 10 мл. Последнюю пробу отбирали после нанесения всего объема сыворотки. Концентрацию С5а в пробах определяли методом ИФА. Полученные результаты представлены на Фиг. 2, из этих результатов следует, что все три образца иммуносорбентов обладали способностью удалять С5а из модельного раствора. При этом наибольшей эффективностью обладал иммуносорбент ИС-(АС5а-2) с иммобилизован- ными антителами АС5а-2, с помощью которого в условиях модельного эксперимента можно было удалить около 90% С5а при прохождении 70 мл модельной плазмы крови, в то время, как иммуносорбенты ИС-(АС5а-7) и ИС-(АС5а-11) удаляли 90% белка С5а при прохождении 10 и 30 мл плазмы крови соответственно, после чего эффективность связывания белка С5а этими иммуносорбентами снижалась. На основании результатов, полученных в примерах 2 и 3, для дальнейшей работы было выбрано моноклональное антитело АС5а-2.
Пример 4. Определение нуклеотидных последовательностей и анализ генов вариабельных областей легкой и тяжелой цепей мышиного моноклонального антитела АС5а-2.
Пример 4.1. Получение и анализ последовательностей ДНК, кодирующих вариабельные области тяжелой и легкой цепей мышиного моноклонального антитела АС5а-2. Рибонуклеиновую кислоту (РНК) из клеток клона АС5а-2 выделяли с помощью набора GeneJET RNA Purification kit (Thermo scientific, Lithuania) и затем на матрице данной РНК методом обратной транскрипции получали кДНК с помощью праймера oligo(dT)18 и обратной транскриптазы MMLV (ЗАО «Евроген», Росссия) по инструкции изготовителя. Далее с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием известных наборов праймеров и высокоточной смеси ДНК- полимераз High Fidelity PCR Enzyme Mix (Thermo scientific, Lithuania) получали фрагменты ДНК, кодирующие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей антитела. Реакцию проводили в термоциклере С1000 (Bio-Rad, США) при следующих условиях:
- первичная денатурация при температуре 94°С - 5 мин.;
- последующие 37 циклов:
- денатурация при температуре 95°С - 15 сек.;
- отжиг при температуре 55°С - 20 сек.;
- амплификация при температуре 72°С - 20 сек.;
- финальная амплификация при температуре 72°С - 15 мин.
ПЦР-продукты вариабельных фрагментов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулинов анализировали с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле. Полосы продуктов ожидаемого размера в районе 450 пар оснований вырезали из геля, элюировали с помощью набора реагентов для выделения ДНК из агарозного геля (ЗАО «Евроген», Россия). После этого полученные ПЦР-продукты анализировали секвенированием. Секвенирование проводили на капиллярном секвенаторе AB3500 (Applied Biosystems, США) с помощью коммерческого набора BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США), очистку образцов перед анализом проводили с помощью набора BigDye XTerminator™ Purification Kit (Applied Biosystems, США).
Найденные последовательности полученных фрагментов ДНК, кодирующих вариабельные области тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела АС5а-2 представлены в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 соответственно.
Функциональный и структурный анализ вариабельных фрагментов легкой и тяжелой цепи исследуемого антитела, проведенный с помощью инструмента IMGT/V-QUEST и базы данных IMGT [www.imgt.org], показал расположение рамочных и образующих комплементарность участков (CDR- участков). Найденные последовательности CDR-участков представлены в перечне последовательностей в соответствии с таблицей 2, в которой CDR участки тяжелой цепи обозначены, как CDRH, а CDR-участки легкой цепи обозначены, как CDRL.
Пример 5. Получение генов химерного (мышь-человек) антитела к белку С5а человека и плазмидных векторов, экспрессирующих легкую и тяжелую цепи данного химерного антитела.
Амплификацию последовательностей генов константных областей легкой (IGKC) и тяжелой (IGHG1) цепи иммуноглобулина G1/каппа человека проводили на матрице кДНК из мононуклеарных клеток крови человека, при этом обратные праймеры содержали сайт узнавания для рестрикционной нуклеазы XhoI. В качестве основной последовательности мРНК для подбора праймеров для клонирования гена константной части тяжелой цепи IgG1 человека использовали аннотированную последовательность мРНК BC090940.1 (Homo sapiens immunoglobulin heavy constant gamma 1 (G1m marker), mRNA).
В качестве основной последовательности мРНК для подбора праймеров для клонирования гена константной части легкой каппа-цепи человека использовали аннотированную последовательность гена каппа-локуса J00241.1 (Homo sapiens immunoglobulin kappa chain constant region (IGKC) gene).
Последовательность сигнального пептида, включающую сайт узнавания для рестриктазы EcoRI, искусственно синтезировали. Амплификацию вариабельных областей легкой и тяжелой цепей мышиных антител проводили с помощью специально подобранных праймеров, которые включали в себя участки, комплементарные фланкирующим вариабельную область химерного антитела участкам сигнальной последовательности и константной области.
Амплифицированные фрагменты ДНК очищали при помощи препаративного электрофореза в 1,5% агарозном геле (Gibco, США). Участок агарозы, содержащий полосу ДНК необходимого размера, вырезали, и фрагмент ДНК очищали с помощью набора для очистки ДНК из геля (ЗАО «Евроген», Россия) в соответствии с инструкциями производителя.
Для сборки последовательностей, содержащих открытую рамку считывания для полноразмерной легкой или тяжелой цепи химерного антитела, использовали метод Splicing by Overlap-Extension PCR (SOE-PCR). В качестве исходных элементов использовали синтезированную последовательность сигнального пептида и очищенные на предыдущем этапе ПЦР-продукты, содержащие последовательности вариабельной области легкой или тяжелой цепей мышиного антитела и константной области легкой или тяжелой цепей IgG человека соответственно. Последовательности полученных тяжелой и легкой цепей химерного (мышь-человек) антитела, проверенные секвенированием, представлены в SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10. Далее фрагменты ДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи химерного антитела к С5а, обрабатывали рестриктазами EcoRI и XhoI (Fermentas, Литва) и лигировали с обработанным рестриктазами EcoRI и XhoI вектором pOptiVec.
После окончания реакции лигирования полученными плазмидами трансформировали компетентные клетки Е. coli. Трансформированные клетки рассевали на отдельные клоны, из которых выделяли плазмидные ДНК, правильность сборки которых и отсутствие возможных мутаций проверяли секвенированием. Таким образом, были получены плазмиды pOptiVec/C5a2H и pOptiVec/C5a2L, кодирующие тяжелую и легкую цепь химерного (мышь-человек) антитела к белку С5а человека соответственно.
Пример 6. Получение химерного антитела и исследование параметров его связывания с белком С5а человека.
5
7
Пример 6.1. Временная экспрессия рекомбинантных иммуноглобулинов в клетках линии HEK293. Плазмиды pOptiVec/C5a2H и pOptiVec/C5a2L выделяли из клеток E. coli с помощью коммерческого набора реагентов QIAGEN Plasmid Mini Kit (Qiagen, США). Трансфекцию клеток HEK293, предварительно засеянных в лунки 24-луночного планшета по 1,3⋅10 клеток на лунку в среде DMEM (Биолот, Россия) проводили с помощью липосомального реагента TurboFect™ (Fermentas, Литва) по инструкции производителя, при этом в лунки добавляли 1 мкг плазмид pOptiVec/C5a2H и pOptiVec/C5a2L в соотношении 1:1, 1:2, 2:1, 3:2, 2:3. Трансформированные клетки культивировали в течение 3 и 4 суток, после чего из лунок отбирали культуральную среду, в которой определяли концентрацию IgG человека с помощью иммуноферментного анализа с МАТ мыши против IgG человека (ФГУП ГосНИИ ОЧБ, Россия) по методике изготовителя. Максимальная концентрация IgG человека была получена при использовании плазмидных ДНК в соотношении 2:3 на 4 сутки культивирования и составила 1,38 мкг/мл. Дальнейшую наработку химерного моноклонального антитела проводили в 5 культуральных флаконах Т175 (Costar, США), в каждый из которых засевали по 2,7⋅10 клеток HEK293 с последующей трансфекцией плазмидными ДНК (по 50 мкг pOptiVec/C5a2H и 50 мкг pOptiVec/C5a2L на флакон) по описанной выше методике. Через 5 суток культивирования из культуральной среды очищали химерное антитело против белка С5а, как описано в примере 3.
Определение связывания химерного антитела с белком С5а проводили методом поверхностного плазмонного резонанса, как изложено в примере 2, с использованием иммобилизованных в проточной ячейке прибора антител к IgG человека. В результате были получены следующие характеристики связывания антитела с белком С5а человека:
a
8
константа ассоциации К=2,245⋅10 1/Ms;
d
константа диссоциации К=0,01342 1/s;
D
-11
равновесная константа диссоциации K=5,976⋅10 М.
Пример 7. Получение и исследование эффективности иммуносорбента на основе химерного антитела при удалении белка С5а из модельного раствора. Иммобилизацию 2 мг очищенного химерного антитела против С5а и изучение эффективности связывания белка С5а из активированной сыворотки крови человека полученным иммуносорбентом проводили, как описано в примере 3. Было показано, что не менее 90% белка С5а было удалено при прохождении через колонку 70 мл активированной сыворотки, таким образом, эффективность связывания белка С5а с иммобилизованным химерным антителом не отличается от эффективности связывания белка С5а иммобилизованным мышиным моноклональным антителом АС5а-2.
--->
Перечень последовательностей
<110> Федеральное государственное унитарное предприятие
«Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства
Federal State Unitary Enterprise «State Research Institute of Highly Pure
Biopreparations» of the Federal Medical and Biological Agency
<120> Антитела против анафилатоксина С5а человека
<130>
<160> 10
<210> 1
<211> 355
<212> ДНК
<213> Mus musculus
<220>
<222> (1)…(355)
<223> Последовательность ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела С5а-2
<400> 1
GAA GTG AAA CTT GAG GAG TCT GGA GGA GGC TTG GTG CAA CCT GGA GGA 48
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
TCC ATG AAA CTC TCT TGT GTT GCC TCT GGA TTC ACT TTT AGT GAC GCC 96
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
TGG ATG GAC TGG GTC CGC CAG TCT CCA GAG AAG GGG CTT GAG TGG GTT 144
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
GCT GAA GTT AGA ATC AAA ACT AAT AAT CAT GCA ACA TAC TAT GCT GAG 192
Ala Glu Val Arg Ile Lys Thr Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
TCT GTG AAA GGG AGG TTC ACC ATC TCA AGA GAT GAT TCC AAA AGT AGT 240
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
GTC TAC CTG CAA ATG AAC AGC TTA AGA CCT GAA GAC ACT GCC ATT TAT 288
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
TAC TGT ACT ATG ATT GAT TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC 336
Tyr Cys Thr Met Ile Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
TCA GTC ACC GTC TCC TCA G 355
Ser Val Thr Val Ser Ser
115 118
<210> 2
<211> 319
<212> ДНК
<213> Mus musculus
<220>
<222> (1)…(319)
<223> Последовательность ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи мышиного моноклонального антитела С5а-2
<400> 2
CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG 48
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG 96
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
TAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT 144
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC AGT 192
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA 240
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT AGT TAC CCG CTC ACG 288
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA C 319
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 106
<210> 3
<211> 8
<212> белок
<213> Mus musculus
<220>
<222> (1)…(8)
<223> Последовательность аминокислот участка CDR-1 вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела С5а-2
<400> 3
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp
1 5 8
<210> 4
<211> 10
<212> белок
<213> Mus musculus
<220>
<222> (1)…(10)
<223> Последовательность аминокислот участка CDR-2 вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела С5а-2
<400> 4
Val Arg Ile Lys Thr Asn Asn His Ala Thr
1 5 10
<210> 5
<211> 9
<212> белок
<213> Mus musculus
<220>
<222> (1)…(9)
<223> Последовательность аминокислот участка CDR-3 вариабельной области тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела С5а-2
<400> 5
Thr Met Ile Asp Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 9
<210> 6
<211> 5
<212> белок
<213> Mus musculus
<220>
<222> (1)…(5)
<223> Последовательность аминокислот участка CDR-1 вариабельной области легкой цепи мышиного моноклонального антитела С5а-2
<400> 6
Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 7
<211> 3
<212> белок
<213> Mus musculus
<220>
<222> (1)…(3)
<223> Последовательность аминокислот участка CDR-2 вариабельной области легкой цепи мышиного моноклонального антитела С5а-2
<400> 7
Asp Thr Ser
1 3
<210> 8
<211> 9
<212> белок
<213> Mus musculus
<220>
<222> (1)…(9)
<223> Последовательность аминокислот участка CDR-3 вариабельной области легкой цепи мышиного моноклонального антитела С5а-2
<400> 8
Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5 9
<210> 9
<211> 470
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<222> (1)…(470)
<223>  Последовательность  аминокислот  тяжелой  цепи  химерного антитела С5а-2х
<400> 9
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Ile Ser Arg Gly Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Val Arg Ile Lys Thr Asn Asn His
65 70 75 80
Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
85 90 95
Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro
100 105 110
Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr Met Ile Asp Tyr Ala Met Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225 30 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 10
<211> 235
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<222> (1)…(235)
<223> Последовательность аминокислот легкой цепи химерного антитела С5а-2х
<400> 10
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Ile Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
20 25 30
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser
50 55 60
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
100 105 110
Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130 135 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<---