Трансформант дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий фитазу Escherichia coli
PICHIA PASTORIS YEAST TRANSFORMER, PRODUCING ESCHERICHIA COLI PHYTASE

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения штаммов дрожжей Pichia pastoris, способных продуцировать фитазу.
Фосфор является важным минеральным питательным веществом для роста и развития животных. В большинстве источников сырья, используемого в животноводстве, такого, например, как зерновые и бобовые культуры, фосфор, в основном, содержится в форме фитата (мио-инозитол гексакисфосфат) {Advanced Food Research, 1982, 28, 1-92.]. Однако моногастричные животные не способны усваивать фитатный фосфор из-за отсутствия необходимого фермента в пищеварительном тракте [Can J Anim Sci., 2013, 93, 9-21.]. Кроме того, фитаты препятствуют эффективному усвоению кальция, магния, цинка, железа и других минеральных веществ комбикормов, а также связывают белки в недоступные для переваривания комплексы [Current Topics In Nutraceutical Research, 2008, 6(3), 131-144.].
Ферменты фитазы (мио-инозитол гексакисфосфат фосфогидролазы) гидролизуют фитат с отщеплением фосфатных групп и с успехом используются в качестве кормовой добавки, значительно повышая усвоение фосфора [J. Sci. Food Agric, 2015, 95, 878-896.]. Они обеспечивают высвобождение не только фитат-связанного фосфора, но также белков, макро- и микроэлементов, повышая питательные свойства кормов [British Poultry Science, 2004, 45(1), 101-108.].
В настоящее время фитазы получают микробиологическим путем с использованием рекомбинантных штаммов-продуцентов, потребность промышленности в которых постоянно растет [Afr. J. Biotechnol., 2009, 8(17), 4229-4232.]. Наиболее часто для высокоэффективной продукции гетерологичных белков используются метилотрофные дрожжи Pichia pastoris [J. Mol. Recognit, 2005, 18(2), 119-138. doi: 10.1002/jmr.687], которые обладают мощными системами экспрессии и секреции рекомбинантных белков (в том числе, фитаз) и для которых разработаны питательные среды и отработан процесс ферментации с использованием культуры высокой плотности.
Одним из востребованных на сегодняшний день ферментов является фитаза Escherichia coli. Она обладает промышленно-ценными свойствами и в настоящее время коммерчески доступна в форме препаратов Quantum и OptiPhos [J. Sci. Food Agric. 95:878-896. doi:10.1002/jsfa.6998]. Введение в корма данного фермента более эффективно влияет на зоотехнические показатели, чем добавление фитаз из Aspergillus и Peniophora, так как он более устойчив к действию пепсина и работает в более кислой области рН, что соответствует физиологическим условиям желудочно-кишечного тракта животных [J. Anim. Sci. 81:474-483.]. В настоящее время на основе Р pastoris получены штаммы, секретирующие фитазу Е. coli, продуктивность которых при культивировании в колбах составляет 112 ед/мл [J Agric Food Chem, 61(25), 6007-6015. doi: 10.1021/jf401853b] и 204 ед/мл [Enzym Microb Technol. 2004;35(4):315-20] за 76 ч, 978 ед/мл за 216 ч [CN101935617]. Однако, остается потребность в других штаммах Р pastoris с повышенной продукцией фитазы Е. coli.
Показано, что одним из способов, позволяющих повысить продукцию целевых белков в P. pastoris является суперэкспрессия генов-помощников, входящих в систему ответа клетки на несвернутый белок (UPR - unfolded protein response) [Экологическая генетика, 2017, 15(2), 21-30]. Так, суперэкспрессия генов-помощников НАС1 и ERO1 привела к увеличению продукции ксиланазы клетками P. pastoris на 15-25% [CN104152484]. Интеграция гена НАС1 из S. cervisiae в состав хромосомы рекомбинантных штаммов P. pastoris привела к увеличению продукции фитазы из Citrobacter amalonaticus на 40%, а липазы Rhizomucor miehei в 1,9 раза по сравнению с исходным штаммом [ВМС Biotechnology, 2015, 15:88; CN107083373]. Однако, суперэкспрессия гена НАС1 в P. pastoris может не только увеличивать продукцию некоторых гетерологичных ферментов, но и снижать, а также не оказывать никакого эффекта [Microb. Cell Factories, 2010,9,49].
Таким образом, суперэкспресия гена НАС1 по-разному влияет на продукцию различных ферментов, и, при существующем состоянии знаний в данной области, вспомогательные (хелперные) функции гена НАС1, а также других генов-помощников, не могут быть предсказаны даже в случае доступности последовательности ДНК всего генома организма-хозяина [ЕА017803].
В источниках информации сведений о влиянии суперэкспрессии гена НАС1 из S. cervisiae на продукцию клетками P. pastoris фитазы из Е. coli нами не выявлено.
Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих фитазу Е. coli.
Задача решена путем получения трансформанта дрожжей Pichia pastoris продуцента фитазы, несущего в составе хромосомы ген, кодирующий фитазу-из E.coli и ген НАС1 из Saccharomyces cerevisiae (включая их разновидности, полученные с использованием вырожденных кодонов).
Получение заявляемого трансформанта включает трансформацию в клетки дрожжей P. pastoris гена, кодирующего фитазу из E.coli, и гена НАС1 из Saccharomyces cerevisiae. Трансформация указанных генов может быть осуществлена в любой последовательности, любым подходящим методом, например, методом электоропорации [http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/pich_man.pdf] или методом с использованием полиэтиленгликоля или протопластов [http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K173001].
Получение заявляемого трансформанта может быть осуществлено также трансформацией в клетки дрожжей P. pastoris, продуцирующих фитазу из E.coli, гена НАС1 из Saccharomyces cerevisiae (включая его разновидности, полученные с использованием вырожденных кодонов) в составе экспрессионной кассеты, содержащей промотор, работающий в дрожжах P. pastoris, терминатор, маркерный ген и, предпочтительно, сайт для гомологичной интеграции в хромосому.
Интеграцию осуществляют путем как гомологичной, так и негомологичной рекомбинации.
Штаммы дрожжей Pichia pastoris, продуцирующие фитазу из E.coli, которые используют для введения гена НАС1 могут быть получены, например, путем введения в состав хромосомы одной или нескольких копий нуклеотидной последовательности (включая ее разновидности, полученные с использованием вырожденных кодонов), кодирующей фитазу из E.coli
Конструирование экспрессионных кассет осуществляют стандартными методами генетической инженерии [Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. - СПб.: СПбГТУ, 1999, Sambrook J., Maniatis Т., Fritsch Е. Molecular cloning: a laboratory manual. - N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.] с использованием генетических элементов, подходящих для работы с дрожжами Pichia pastoris. В качестве промоторов могут быть использованы АОХ1, DAS, FLD1, ICL1, РНO89, ТНI11, ADH1, ENO1, GUT1, GAP, TEF1, PGK1, GCW14, G1, G6 или другие [Appl Microbiol Biotechnol (2014) 98:5301-5317]. В качестве сигнальных пептидов используют α-фактор, PHO1, SUC2, РНА-Е, KILM1, pGKL, CLY, CLY-L8, K28 pre-pro-toxin или другие [Appl Microbiol Biotechnol (2014) 98:5301-5317]. В качестве селективных маркеров используют любые подходящие маркеры, например, гены резистентности к антибиотикам зеоцину, генетицину (G418) или бластицидину С, а также гены комплементирующие ауксотрофные мутации в геноме Pichia pastoris, например, HIS4, МЕТ2, ADE1, ARG4, URA3, URA5, GUT1 [Yeast 2005; 22: 249-270]. В качестве плечей для гомологичной интеграции используют, например, последовательности генов АОХ1, HIS4 [http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/V17520] или другие последовательности, гомологичные участкам хромосомы дрожжей Pichia pastoris. Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами:
Фиг. 1 Экспрессионная кассета 1
Фиг. 2 Экспрессионная кассета 2
Пример 1. Получение штамма P. pastoris, продуцирующего фитазу E.coli
При конструировании интегративной экспрессионной кассеты используют метод "фьюжн-ПЦР" [Gene. 1989 Apr 15;77(1):61-8.].
Известным методом [Journal of Microbiological Methods, 2010, 81(2), 147-152.] синтезируют ген phyEc-mod, кодирующий фитазу E.coli.
Полученную ДНК последовательность встраивают в экспрессионную кассету 1, размером 8830 п. н. (фиг. 1), в состав которой входят следующие генетические элементы:
1. Ген phyEc-mod, встроенный в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида α-фактора, под контролем модифицированного АОХ1 промотора [ВМС Biotechnology. - 2015, - V. 15, - Р. 88].
2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1
3. Дрожжевой селективный маркер HIS4, комплементирующий у дрожжей Pichia pastoris мутацию в гене HIS4, Cre-рекомбиназу под контролем промотора АОХ1, фланкированные сайтами lох 66 и lох 71
4. Область интеграции NS - фрагмент гена, кодирующего 18S rRNA.
-
8
9
Интегративную экспрессионную кассету 1 трансформируют в клетки штамма Pichia pastoris (HIS4) Y-4334, которые предварительно выращивают в жидкой питательной среде YP следующего состава (мас. %): пептон-2, дрожжевой экстракт-1, вода - остальное с добавлением глюкозы (2 мас. %) до концентрации 1×10 клеток на 1 мл. Клетки отделяют центрифугированием, промывают в ледяной стерильной воде, а затем в ледяном растворе 1М сорбитола. Затем клетки инкубируют в 25 мМ растворе дитиотрейтола в течение 15 минут и промывают в ледяном растворе 1М сорбитола. Далее клетки ресуспендируют в ледяном растворе 1 М сорбитола в концентрации 1-5×10 клеток на 1 мл. Аликвоту, объемом 40 мкл клеточной суспензии, переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 400 нг ДНК экспрессионной интеграционной кассеты, и инкубируют во льду 5 минут. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при следующих условиях: 1,5 кВ, 400 Ом, 25uF. После порации добавляют 1 мл ледяного раствора 1М сорбитола.
2
4
2
4
4
4
2
2
4
3
4
Селекцию трансформантов ведут в течение 5 суток при температуре 30°С на агаризованной среде М9 следующего состава (мас. %): NаНРO - 0,6; KНРО - 0,3; NaCl - 0,05; NHCl - 0,1; MgSO 7НO - 0,065; агар - 2; глюкоза - 2; СаСl - 0,07; биотин, мг - 0,0002; кальций пантотенат - 0,04; фолиевая кислота - 0,0002; ниацин -0,04; р-аминобензойная к-та - 0,02; пиридоксин гидрохлорид - 0,04; рибофлавин - 0,02; тиамин гидрохлорид - 0,04; борная кислота - 0,05; CuSO - 0,004; KJ - 0,01; FeCl - 0,02; натрий молибдат - 0,02; ZnSO - 0,04, вода - остальное.
Наличие целевого гена phyEc-mod в составе хромосомной ДНК полученных трансформантов определяют методом ПНР с использованием проверочных праймеров PhyEc-m-F catggcgtaagagcaccaac, PhyEc-m-R gcaggtattctagcctcgtt.
Наличие ПЦР-фрагмента размером 1172 п.н. подтверждает присутствие синтетического гена в составе хромосомы полученных трансформантов.
Для отбора наиболее продуктивных трансформантов проводят их культивирование в жидкой ферментационной питательной среде по следующей схеме.
Посевную культуру выращивают в пробирках (50 мл) с 5 мл жидкой питательной среды YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 30°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). Посев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/10.
Ферментацию проводят при 30°С на качалке (250 об/мин) в питательной среде YP с добавлением 1% глюкозы в течение 24 ч, затем индуцируют экспрессию гена фитазы путем добавления метанола до конечной концентрации 1% каждые 24 ч в течение 3 суток. Продуктивность трансформантов Pichia pastoris оценивают по активности фитазы, образовавшейся в культуральной жидкости. Для этого клетки трансформанта осаждают центрифугированием, а супернатант используют для определения фитазной активности модифицированным методом Фиске-Субарроу [. J Microbiol Methods, 1999, 39(1), 17-22.].
По результатам ферментации отбирают наиболее продуктивный трансформант Pichia pastoris, и делают высев клеток до единичных колоний на среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %). Далее полученные колонии тестируют на выщепление гена HIS4. Для этого каждую колонию пересевают на минимальную агаризованную среду М9 без добавления и с добавлением гистидина до конечной концентрации 1 мг/мл. Отбирают колонию, которая показала рост на среде с добавлением гистидина и не выросла на среде без его добавления. Далее в отобранную колонию клеток снова трансформируют экспрессионную кассету 1, как описано выше, и повторяют все действия, отбирая наиболее продуктивный трансформант, потерявший способность расти на минимальной среде М9 без добавления гистидина. Процедуру повторяют несколько раз. Отбирают штамм, продуцирующий фитазу из E.coli в количестве 635 ед/мл за 72 часа ферментации. Полученный штамм P. pastoris называют F.
Пример 2 Получение трансформантов, несущих в составе хромосомы ген НАС1 из S. cervisiae
В отобранный штамм F трансформируют, как описано выше, экспрессионную кассету 2 размером 5558 п. н., содержащую в своем составе следующие генетические элементы:
1. Ген НАС1, кодирующий HAC1p из S. cervisiae, под контролем GAP промотора
2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1
3. Дрожжевой селективный маркер HIS4, комплементирующий у дрожжей Pichia pastoris мутацию в гене HIS4
4. Область интеграции - 3'-фрагмент последовательности гена АОХ1
Наличие целевого гена НАС1 в составе хромосомной ДНК полученных трансформантов определяют методом ПЦР с использованием проверочных праймеров HACprF atggaaatgactgattttgaactaacta, Prov-r tctaaggcgaattaattcgcggc.
Наличие ПЦР-фрагмента размером 743 п. н. подтверждает присутствие гена НАС1 в составе хромосомы полученных трансформантов.
Пример 3. Оценка продуктивности трансформантов, несущих в составе хромосомы ген НАС1 из S. cervisiae
Для оценки влияния гена-помощника НАС1 из S. cervisiae на уровень продукции фитазы E.coli клетками штамма P. pastoris F произвольно отбирают двадцать трансформантов, содержащих ген НАС1 из S. cervisiae в составе хромосомы. Для контрольной ферментации используют штамм P. pastoris F, который не несет в составе хромосомы ген НАС1 из S. cervisiae. Ферментацию проводят при следующих условиях:
- Посевную культуру каждого трансформанта и контрольного штамма выращивают в пробирках (50 мл) с 5 мл жидкой питательной среды YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 30°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). Посев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/10.
- Ферментацию проводят при 30°С на качалке (250 об/мин) в питательной среде YP с добавлением 1% глюкозы в течение 24 ч, затем индуцируют экспрессию гена фитазы путем добавления метанола до конечной концентрации 1% каждые 24 ч в течение 3 суток.
Продуктивность трансформанта оценивают, измеряя фитазную активность в культуральной жидкости. Для этого клетки трансформанта осаждают центрифугированием, а супернатант используют для определения фитазной активности модифицированным методом Фиске-Субарроу [. J Microbiol Methods, 1999, 39(1), 17-22.].
В табл. 1 представлены продуктивность штамма F и среднее значение продуктивности, рассчитанное для 20 трансформантов, несущих в составе хромосомы ген НАС1 из S. cervisiae,
Из результатов измерения, представленных в табл. 1, следует, что экспрессия гена НАС1 повысила продуктивность трансформантов, секретирующих фитазу E.coli, в среднем, на 28%.
Таким образом, заявляемое изобретение позволяет получать трансформанты Pichia pastoris с повышенной продуктивностью фитазы из E.coli.