АНТИТЕЛА ПРОТИВ PD-1 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
ANTIBODIES AGAINST PD-1 AND THEIR USE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к антителам против PD-1 (белка 1 программируемой гибели клеток) и их применению.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В настоящее время злокачественные новообразования представляют собой один из типов заболеваний с наибольшей смертностью среди людей. Согласно статистическим данным Всемирной организации здравоохранения, в 2012 году количество случаев злокачественных новообразований и случаев смерти во всем мире достигло 14 миллионов и 8,2 миллионов, соответственно. В Китае количество случаев впервые диагностированных злокачественных новообразований составляет 3,07 миллиона, а число погибших составляет 2,2 миллиона.
Недавний клинический и коммерческий успех противоопухолевых антител привлек значительный интерес к терапевтическим средствам на основе антител. Существует потребность в разработке противоопухолевых антител для использования в различных терапевтических средствах на основе антител для лечения злокачественных новообразований.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к антителам против PD-1, их антигенсвязывающим фрагментам и их применению.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, связывающемуся с PD-1 (белком программируемой гибели клеток 1), содержащему: вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющие комплементарность области (CDR) 1, 2 и 3, где область CDR1 VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR1 VH, область CDR2 VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR2 VH, и область CDR3 VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR3 VH; и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR 1, 2 и 3, где область CDR1 VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR1 VL, область CDR2 VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR2 VL, и область CDR3 VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR3 VL, где выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2 и 3 VH и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2 и 3 VL являются одними из следующих:
(1) выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VH приведены в SEQ ID NO:1, 2, 3, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VL приведены в SEQ ID NO:4, 5, 6, соответственно;
(2) выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VH приведены в SEQ ID NO:7, 8, 9, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VL приведены в SEQ ID NO:10, 11, 12, соответственно;
(3) выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VH приведены в SEQ ID NO:7, 13, 14, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VL приведены в SEQ ID NO:10, 11, 15, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO:1, 2 и 3 соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO:4, 5 и 6, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO:7, 8 и 9, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO:10, 11 и 12, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO:7, 13 и 14, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO:10, 11 и 15, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с PD-1 человека. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент является гуманизированным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент является одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFV).
В другом аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий:
(1) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющие комплементарность области (CDR) 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO:1, 2 и 3, соответственно, и где VH при спаривании с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:29, 30, 31 или 40, связывается с PD-1;
(2) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO:4, 5 и 6, соответственно, и где VL при спаривании с VH, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:26, 27, 28 или 39, связывается с PD-1;
(3) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO:7, 8 и 9, соответственно, и где VH при спаривании с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:36, 37, 38 или 42, связывается с PD-1;
(4) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO:10, 11 и 12, соответственно, и где VL при спаривании с VH, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:32, 33, 34, 35 или 41, связывается с PD-1;
(5) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO:7, 13 и 14, соответственно, и где VH при спаривании с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:44, связывается с PD-1;
(6) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO:10, 11 и 15, соответственно, и где VL при спаривании с VH, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:43, связывается с PD-1.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO:1, 2 и 3, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO:4, 5 и 6, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO:7, 8 и 9, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO:10, 11 и 12, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO:7, 13 и 14, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO:10, 11 и 15, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления VH при спаривании с VL специфически связывается с PD-1 человека, или VL при спаривании с VH специфически связывается с PD-1 человека.
В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь иммуноглобулина или ее фрагмент является гуманизированной тяжелой цепью иммуноглобулина или ее фрагментом, и легкая цепь иммуноглобулина или ее фрагмент является гуманизированной легкой цепью иммуноглобулина или ее фрагментом.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота является кДНК.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вектору, содержащему одну или более нуклеиновых кислот, представленных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления вектор кодирует область VL и область VH, вместе связывающиеся с PD-1.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к паре векторов, где каждый вектор содержит одну из нуклеиновых кислот, представленных в настоящем описании, где пара векторов совместно кодирует область VL и область VH, вместе связывающиеся с PD-1.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке, содержащей вектор, представленный в настоящем описании, или пару векторов, представленную в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления клетка является клеткой CHO.
В одном из аспектов настоящее изобретение также относится к клетке, содержащей одну или более из нуклеиновых кислот, представленных в настоящем описании.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке, содержащей две из нуклеиновых кислот, представленных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления две нуклеиновые кислоты совместно кодируют область VL и область VH, вместе связывающиеся с PD-1.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Способы включают стадии
(a) культивирования клетки, представленной в настоящем описании в условиях, достаточных для того, чтобы клетка продуцировала антитело или антигенсвязывающий фрагмент; и
(b) сбора антитела или антигенсвязывающего фрагмента, продуцируемого клеткой.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, связывающемуся с PD-1, содержащему вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность, являющуюся по меньшей мере на 90% идентичной выбранной последовательности VH, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, являющуюся по меньшей мере на 90% идентичной выбранной последовательности VL, где выбранная последовательность VH и выбранная последовательность VL являются одной из следующих:
(1) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:26, 27, 28 или 39, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:29, 30, 31 или 40;
(2) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:32, 33, 34, 35 или 41, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:36, 37, 38 или 42;
(3) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:43, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:44.
В некоторых вариантах осуществления VH содержит последовательность SEQ ID NO:26, и VL содержит последовательность SEQ ID NO:31.
В некоторых вариантах осуществления VH содержит последовательность SEQ ID NO:27, и VL содержит последовательность SEQ ID NO:31.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с PD-1 человека.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент является гуманизированным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент является одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFV).
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к конъюгату антитело-лекарственное средство, содержащему антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, ковалентно связанные с терапевтическим средством. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство является цитотоксическим или цитостатическим средством.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения индивидуума, имеющего злокачественное новообразование. Способы включают стадии введения индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, или конъюгат антитело-лекарственное средство, представленный в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет солидную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование является неоперабельной меланомой или метастазирующей меланомой. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование является немелкоклеточным раком легких (NSCLC), плоскоклеточной карциномой головы и шеи (SCCHN), раком головы и шеи, почечноклеточной карциномой (RCC), меланомой, раком мочевого пузыря, раком желудка, уротелиальным раком, карциномой из клеток Меркеля, трижды негативным раком молочной железы (TNBC) или колоректальной карциномой.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам снижения скорости роста опухоли. Способы включают стадии приведения опухолевой клетки в контакт с эффективным количеством композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, или конъюгат антитело-лекарственное средство, представленный в настоящем описании.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам уничтожения опухолевых клеток. Способы включают стадии приведения опухолевых клеток в контакт с эффективным количеством композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, или конъюгат антитело-лекарственное средство, представленный в настоящем описании.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат антитело-лекарственное средство, представленный в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.
В рамках изобретения термин "злокачественное новообразование" относится к клеткам, способным к автономному росту. Примеры таких клеток включают клетки, имеющие аномальное состояние, отличающееся ростом быстро пролиферирующих клеток. Термин предназначен для включения злокачественного роста, например, опухолей; онкогенных процессов, метастатических тканей и злокачественно трансформированных клеток, тканей или органов, независимо от гистопатологического типа или стадии инвазивности. Термин также включает злокачественные опухоли различных систем органов, таких как респираторная, сердечно-сосудистая, почечная, репродуктивная, гематологическая, нервная, печеночная, желудочно-кишечная и эндокринная системы; а также аденокарциномы, включающие злокачественные опухоли, такие как большинство случаев рака толстого кишечника, почечноклеточная карцинома, рак предстательной железы и/или опухоли яичка, немелкоклеточная карцинома легких и рак тонкого кишечника. Злокачественные новообразования, являющиеся "естественно возникшими", включают любые злокачественные новообразования, не являющиеся экспериментально индуцированными посредством имплантации злокачественных клеток индивидууму, и включают, например, спонтанно возникающее злокачественное новообразование, злокачественное новообразование, возникшее при воздействии канцерогенов на пациента, злокачественное новообразование, возникшее в результате инсерции трансгенного онкогена или нокаута гена опухолевого супрессора, и злокачественное новообразование, вызванное инфекциями, например, вирусными инфекциями. Термин "карцинома" известен в этой области и относится к злокачественным опухолям эпителиальных или эндокринных тканей. Термин также включает карциносаркомы, включающие злокачественные опухоли, состоящие из карциноматозных и саркоматозных тканей. Термин "аденокарцинома" относится к карциноме, образующейся из железистой ткани, или в которой опухолевые клетки образуют распознаваемые железистые структуры. Термин "саркома" известен в этой области и относится к злокачественным опухолям мезенхимального происхождения. Термин "гемопоэтические неопластические нарушения" включает заболевания, включающие гиперпластические/неопластические клетки гемопоэтического происхождения. Гемопоэтическое неопластическое нарушение может возникать из миелоидного, лимфоидного или эритроидного ростков или их клеток-предшественников.
В рамках изобретения термин "антитело" относится к любой антигенсвязывающей молекуле, содержащей по меньшей мере одну (например, одну, две, три, четыре, пять или шесть) определяющую комплементарность область (CDR) (например, любую из трех CDR легкой цепи иммуноглобулина или любую из трех CDR тяжелой цепи иммуноглобулина) и способной специфически связываться с эпитопом. Неограничивающие примеры антител включают: моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), одноцепочечные антитела, химерные антитела, антитела человека и гуманизированные антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело может содержать Fc-область антитела человека. Термин "антитело" также включает производные, например, биспецифические антитела, одноцепочечные антитела, диатела, линейные антитела и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
2
В рамках изобретения термин "антигенсвязывающий фрагмент" относится к части полноразмерного антитела, где часть антитела может специфически связываться с антигеном. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере один вариабельный домен (например, вариабельный домен тяжелой цепи или вариабельный домен легкой цепи). Неограничивающие примеры фрагментов антител включают, например, Fab-, Fab’-, F(ab’)- и Fv-фрагменты.
В рамках изобретения термин "антитело человека" относится к антителу, кодируемому эндогенной нуклеиновой кислотой (например, реаранжированным локусом тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина человека), присутствующей у человека. В некоторых вариантах осуществления антитело человека получают из человека или получают в культуре клеток человека (например, гибридомных клеток человека). В некоторых вариантах осуществления антитело человека получают в клетке, не принадлежащей человеку (например, линии клеток мыши или хомяка). В некоторых вариантах осуществления антитело человека получают в бактериальной или дрожжевой клетке. В некоторых вариантах осуществления антитело человека получают в трансгенном, не являющимся человеком животном (например, корове), содержащем нереаранжированный или реаранжированный иммуноглобулиновый локус человека (например, локус тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина человека).
В рамках изобретения термин "химерное антитело" относится к антителу, содержащему последовательность, присутствующую в по меньшей мере двух разных антителах (например, антителах двух разных видов млекопитающих, таких как антитело человека и мыши). Неограничивающим примером химерного антитела является антитело, содержащее последовательности вариабельного домена (например, всю последовательность вариабельного домена легкой цепи и/или тяжелой цепи или ее часть) не принадлежащего человеку (например, мышиного) антитела и константные домены антитела человека. Дополнительные примеры химерных антител представлены в настоящем описании и известны в этой области.
В рамках изобретения термин "гуманизированное антитело" относится к не принадлежащему человеку антителу, содержащему минимальную последовательность, полученную из не принадлежащего человеку (например, мышиного) иммуноглобулина, и содержащему последовательности, полученные из иммуноглобулина человека. В неограничивающих примерах гуманизированные антитела являются антителами человека (реципиентным антителом), в которых остатки гипервариабельной области (например, CDR) реципиентного антитела заменяют остатками гипервариабельной области (например, CDR) из не принадлежащего человеку антитела (например, донорного антитела), например, антитела мыши, крысы или кролика, имеющего желаемую специфичность, аффинность и емкость. В некоторых вариантах осуществления каркасные остатки Fv иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками не принадлежащего человеку (например, мышиного) иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные антитела могут содержать остатки, необнаруживаемые в реципиентном антителе или донорном антителе. Эти модификации можно осуществлять для дополнительного улучшения свойств антитела. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит, по существу, все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или, по существу, все из гипервариабельных петель (CDR) соответствуют петлям из не принадлежащего человеку (например, мышиного) иммуноглобулина, и все или, по существу, все из каркасных областей являются каркасными областями иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также может содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, иммуноглобулина человека. Гуманизированные антитела можно получать известными в этой области способами молекулярной биологии. В настоящем описании представлены неограничивающие примеры способов получения гуманизированных антител.
В рамках изобретения термин "одноцепочечное антитело" относится к одному полипептиду, содержащему по меньшей мере два вариабельных домена иммуноглобулина (например, вариабельный домен тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина млекопитающего), способного специфически связываться с антигеном. В настоящем описании представлены неограничивающие примеры одноцепочечных антител.
В рамках изобретения термин "мультимерное антитело" относится к антителу, содержащему четыре или более (например, шесть, восемь или десять) вариабельных доменов иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления мультимерное антитело может перекрестно сшивать одну молекулу-мишень (например, PD-1) с по меньшей мере одной второй молекулой-мишенью (например, CTLA-4) на поверхности клетки млекопитающего (например, T-клетки человека).
В рамках изобретения термины "индивидуум" и "пациент" используют взаимозаменяемо на всем протяжении настоящего описания, они означают животного, человека или не являющегося человеком животного, которого подвергают лечению способами по настоящему изобретению. В настоящем изобретении предусмотрено ветеринарное и неветеринарное применение. Пациенты-люди могут являться взрослыми людьми или подростками (например, людьми возрастом менее 18 лет). В дополнение к людям, пациенты включают, в качестве неограничивающих примеров, мышей, крыс, хомяков, морских свинок, кроликов, хорьков, кошек, собак и приматов. Включены, например, не являющиеся человеком приматы (например, мартышки, шимпанзе, горилла и т.п.), грызуны (например, крысы, мыши, песчанки, хомяки, хорьки, кролики), зайцеобразные, свиньи (например, обычные свиньи, миниатюрные свиньи), лошади, собаки, кошки, коровы и другие домашние, сельскохозяйственные и зоопарковые животные.
В рамках изобретения в отношении антитела фразы "специфически связывающийся" и "специфически связывается" означают, что антитело преимущественно взаимодействует с молекулой-мишенью (например, PD-1) относительно других молекул, т.к. взаимодействие зависит от наличия конкретной структуры (т.е. антигенной детерминанты или эпитопа) на молекуле-мишени; другими словами, реагент распознает и связывает молекулы, включающие специфическую структуру, а не все молекулы в целом. Антитело, специфически связывающееся с молекулой-мишенью, можно обозначать как мишене-специфическое антитело. Например, антитело, специфически связывающееся с молекулой PD-1, можно обозначать как PD-1-специфическое антитело или антитело против PD-1.
В рамках изобретения термины "полипептид", "пептид" и "белок" используют взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины по меньшей мере из двух аминокислот.
В рамках изобретения термины "полинуклеотид", "молекула нуклеиновой кислоты" и "последовательность нуклеиновой кислоты" в настоящем описании используют взаимозаменяемо для обозначения полимеров нуклеотидов любой длины, по меньшей мере из двух нуклеотидов, и они включают, в качестве неограничивающих примеров, ДНК, РНК, гибриды ДНК/РНК и их модификации.
Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, обладают значением, общепринято понятным специалисту в области, к которой принадлежит изобретение. В настоящем описании представлены способы и материалы для использования в настоящем изобретении, но также можно использовать другие подходящие способы и материалы, известные в этой области. Материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными, и не предназначены для ограничения. Все публикации, патентные заявки, патенты, последовательности, записи в базах данных и другие источники, упомянутые в настоящем описании, включены в него в качестве ссылки в полном объеме. В случае противоречия настоящее описание, включая определения, будет обладать приоритетом.
Другие признаки и преимущества изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и фигур, а также формулы изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1
является схемой, на которой показана первая часть примера способа получения антител против hPD-1.
Фиг. 2
является схемой, на которой показана вторая часть примера способа получения антител против hPD-1.
Фиг. 3
является набором диаграмм проточной цитометрии, на которых показано, что антитела против hPD-1 блокируют связывание hPD-1 с hPD-L1.
Фиг. 4
является набором графиков, на которых показаны результаты проточной цитометрии при анализе перекрестной реактивности антител против hPD-1 в отношении PD-1 обезьяны (rmPD-1), PD-1 мыши (mPD-1) и химерного PD-1 человека-мыши (chiPD-1). "NC" означает отрицательный контроль.
Фиг. 5
является графиком, на котором показаны результаты поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием химерного антитела против hPD-1 1A7-mHvKv-IgG4-S228P и PD-1 человека.
Фиг. 6
является графиком, на котором показаны результаты поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием химерного антитела против hPD-1 3F1-mHvKv-IgG4-S228P и PD-1 человека.
Фиг. 7
является графиком, на котором показана масса тела с течением времени у мышей с гуманизированным PD-1 (B-hPD-1) с опухолевыми клетками MC-38, которым вводили антитела мыши против hPD-1 и Китруда. "PS" означает физиологический раствор.
Фиг. 8
является графиком, на котором показан процент изменения массы тела с течением времени у мышей с гуманизированным PD-1 (B-hPD-1) с опухолевыми клетками MC-38, которым вводили антитела мыши против hPD-1 и Китруда. "PS" означает физиологический раствор.
Фиг. 9
является графиком, на котором показан размер опухоли с течением времени у мышей с гуманизированным PD-1 (B-hPD-1) с опухолевыми клетками MC-38, которым вводили антитела мыши против hPD-1 и Китруда. "PS" означает физиологический раствор.
Фиг. 10
является графиком, на котором показана масса тела с течением времени у мышей с гуманизированным PD-1 (B-hPD-1) с опухолевыми клетками MC-38, которым вводили химерные антитела против hPD-1 и Китруда. "PS" означает физиологический раствор.
Фиг. 11
является графиком, на котором показан процент изменения массы тела с течением времени у мышей с гуманизированным PD-1 (B-hPD-1) с опухолевыми клетками MC-38, которым вводили химерные антитела против hPD-1 и Китруда. "PS" означает физиологический раствор.
Фиг. 12
является графиком, на котором показан размер опухоли с течением времени у мышей с гуманизированным PD-1 (B-hPD-1) с опухолевыми клетками MC-38, которым вводили химерные антитела против hPD-1 и Китруда. "PS" означает физиологический раствор.
Фиг. 13
является графиком, на котором показана масса тела с течением времени у мышей с гуманизированным PD-1 (B-hPD-1) с опухолевыми клетками MC-38, которым вводили гуманизированные антитела против hPD-1 и Китруда. "PS" означает физиологический раствор.
Фиг. 14
является графиком, на котором показан процент изменения массы тела с течением времени у мышей с гуманизированным PD-1 (B-hPD-1) с опухолевыми клетками MC-38, которым вводили гуманизированные антитела против hPD-1 и Китруда. "PS" означает физиологический раствор.
Фиг. 15
является графиком, на котором показано размер опухоли с течением времени у мышей с гуманизированным PD-1 (B-hPD-1) с опухолевыми клетками MC-38, которым вводили гуманизированные антитела против hPD-1 и Китруда. "PS" означает физиологический раствор.
фиг. 16
На приведены последовательности CDR антител мыши против hPD-1 (25-1A7, 18-3F1, 3-6G1) и последовательности CDR гуманизированных антител против hPD-1, определенные с помощью нумерации по Kabat.
фиг. 17
На  приведены последовательности CDR антител мыши против hPD-1 (25-1A7, 18-3F1, 3-6G1) и последовательности CDR гуманизированных антител против hPD-1, определенные с помощью нумерации по Chothia.
фиг. 18
На  приведены аминокислотные последовательности PD-1 человека (hPD-1), PD-1 мыши (mPD-1), PD-1 обезьяны (rmPD-1) и химерного PD-1 (chiPD-1).
фиг. 19
На приведены аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи гуманизированных антител против hPD-1.
фиг. 20
На  приведена аминокислотная последовательность вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи антител мыши против hPD-125-1A7, 18-3F1 и 3-6G1.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение относится к примерам антител и их антигенсвязывающим фрагментам, связывающимся с PD-1 (белком программируемой гибели клеток 1; также известным как CD279).
PD-1 и злокачественные новообразования
Иммунная система может различать нормальные клетки организма и клетки, которые она распознает как "чужеродные", что позволяет иммунной системе атаковать чужеродные клетки, оставляя нормальные клетки нетронутыми. Иногда этот механизм включает белки, названные иммунными контрольными точками. Иммунные контрольные точки являются молекулами в иммунной системе, включающими (костимуляторные молекулы) или отключающими сигнал.
Ингибиторы контрольных точек могут предотвращать атаку иммунной системы на нормальную ткань и, таким образом, предотвращать аутоиммунные заболевания. Многие опухолевые клетки также экспрессируют ингибиторы контрольных точек. Эти опухолевые клетки ускользают от иммунного надзора, задействуя некоторые пути иммунных контрольных точек, в частности, в T-клетках, являющихся специфическими в отношении опухолевых антигенов (Creelan, Benjamin C. "Update on immune checkpoint inhibitors in lung cancer." Cancer Control 21,1 (2014): 80-89). Т.к. многие иммунные контрольные точки инициируются взаимодействиями лиганд-рецептор, их легко можно блокировать с помощью антител против лигандов и/или их рецепторов.
PD-1 (белок программируемой гибели клеток-1) является иммунной контрольной точкой и защищает против аутоиммунитета с помощью двойного механизма стимуляции апоптоза (программируемой гибели клеток) в антиген-специфических T-клетках в лимфоузлах с одновременным уменьшением апоптоза в регуляторных T-клетках (противовоспалительных, супрессорных T-клетках).
PD-1, в основном, экспрессируется на поверхности T-клеток и первичных B-клеток; два лиганда PD-1 (PD-L1 и PD-L2) широко экспрессируются на антигенпрезентирующих клетках (APC). Взаимодействие PD-1 с его лигандами играет важную роль в отрицательной регуляции иммунного ответа. Ингибирование связывания между PD-1 и его лигандом может делать опухолевые клетки восприимчивыми к цитолитическому эффекту иммунной системы, и, таким образом, может позволить достичь эффекта уничтожения опухолевых тканей и лечения злокачественных новообразований.
PD-L1 экспрессируется на неопластических клетках множества разных злокачественных новообразований. В результате связывания PD-1 на T-клетках, приводящему к их ингибированию, экспрессия PD-L1 является основным механизмом, посредством которого опухолевые клетки могут ускользать от иммунного надзора. Гиперэкспрессия PD-L1, по существу, может являться результатом 2 механизмов, природного и адаптивного. Природная экспрессия PD-L1 на злокачественных клетках связана с клеточными/генетическими аберрациями в этих неопластических клетках. Активация клеточной передачи сигнала, включая пути AKT и STAT, приводит к повышенной экспрессии PD-L1. При первичной медиастинальной B-клеточной лимфоме происходит слияние генов трансактиватора MHC класса II (CIITA) с PD-L1 или PD-L2, что приводит к гиперэкспрессии этих белков. Амплификация хромосомы 9p23-24, на которой локализованы PD-L1 и PD-L2, приводит к повышенной экспрессии обоих белков при классической лимфоме Ходжкина. Адаптивный механизм связан с индуцированием экспрессии PD-L1 в микроокружении опухоли. PD-L1 может индуцироваться на неопластических клетках в ответ на интерферон γ. При раке толстого кишечника с микросателлитной нестабильностью PD-L1, в основном, экспрессируется на миелоидных клетках в опухолях, которые затем супрессируют функцию цитотоксических T-клеток.
Использование блокады PD-1 для повышения противоопухолевого иммунитета берет свое начало из наблюдения в моделях хронических инфекций, где предотвращение взаимодействий PD-1 реверсирует истощение T-клеток. Аналогично, блокада PD-1 предотвращает взаимодействие PD-1 T-клеток/PD-L1 опухолевых клеток или PD-1 T-клеток/PD-L2 опухолевых клеток, что приводит к восстановлению опосредованного T-клетками противоопухолевого иммунитета.
Подробное описание PD-1 и использования антител против PD-1 для лечения злокачественных новообразований приведено, например, в Topalian, Suzanne L., et al. "Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer." New England Journal of Medicine 366,26 (2012): 2443-2454; Hirano, Fumiya, et al. "Blockade of B7-H1 и PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity." Cancer research 65,3 (2005): 1089-1096; Raedler, Lisa A. "Keytruda (pembrolizumab): first PD-1 inhibitor approved for previously treated unresectable or metastatic melanoma." American health & drug benefits 8.Spec Feature (2015): 96; Kwok, Gerry, et al. "Pembrolizumab (Keytruda)." (2016): 2777-2789; патентной заявке США № 20170247454, патенте США № 9834606 B и патенте США № 8728474; каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Настоящее изобретение относится к нескольким антителам против PD-1, их антигенсвязывающим фрагментам и способам применения этих антител против PD-1 и антигенсвязывающих фрагментов для ингибирования роста опухоли и лечения злокачественных новообразований.
Антитела и антигенсвязывающие фрагменты
H
L
Настоящее изобретение относится к антителам против PD-1 и их антигенсвязывающим фрагментам. В основном, антитела (также называемые иммуноглобулинами) состоят из двух классов полипептидных цепей - легких цепей и тяжелых цепей. Неограничивающее антитело по настоящему изобретению может являться интактным антителом из четырех иммуноглобулиновых цепей, включающих две тяжелые цепи и две легкие цепи. Тяжелая цепь антитела может иметь любой изотип, включая IgM, IgG, IgE, IgA или IgD, или подизотип, включая IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE1, IgE2 и т.д. Легкая цепь может являться легкой каппа-цепью или легкой лямбда-цепью. Антитело может содержать две идентичные копии легкой цепи и две идентичные копии тяжелой цепи. Тяжелые цепи, каждая из которых содержит один вариабельный домен (или вариабельную область, V) и множество константных доменов (или константных областей), связываются друг с другом посредством дисульфидной связи между своими константными доменами с образованием "стебля" антитела. Легкие цепи, каждая из которых содержит один вариабельный домен (или вариабельную область, V) и один константный домен (или константную область), каждая из которых связывается с одной тяжелой цепью посредством дисульфидной связи. Вариабельная область каждой легкой цепи выровнена с вариабельной областью тяжелой цепи, с которой она связана. Вариабельные области легких цепей и тяжелых цепей содержат три гипервариабельные области, находящиеся между более консервативными каркасными областями (FR).
Эти гипервариабельные области, известные как определяющие комплементарность области (CDR), образуют петли, содержащие основную антигенсвязывающую поверхность антитела. Четыре каркасные области, главным образом, принимают конформацию бета-листа, и CDR образуют петли, соединяющие структуру бета-листа и в некоторых случаях образующие ее часть. CDR в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости каркасными областями и вместе с CDR другой цепи участвуют в образовании антигенсвязывающей области.
Способы идентификации областей CDR антитела посредством анализа аминокислотной последовательности антитела хорошо известны, и широко используют ряд определений CDR. Определение по Kabat основано на вариабельности последовательностей, а определение по Chothia основано на локализации структурных петлевых регионов. Эти способы и определения описаны, например, в Martin, "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains," Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439; Abhinandan, et al. "Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains," Molecular immunology 45,14 (2008): 3832-3839; Wu, T.T. and Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250; Martin et al., Methods Enzymol. 203:121-53 (1991); Morea et al., Biophys Chem. 68(1-3):9-16 (Oct. 1997); Morea et al., J Mol Biol. 275(2):269-94 (Jan.1998); Chothia et al., Nature 342(6252):877-83 (Dec. 1989); Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7:64 (2007); каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Если в настоящем описании конкретно не указано иное, по умолчанию в настоящем изобретении используют нумерацию по Kabat.
CDR важны для распознавания эпитопа антигена. В рамках изобретения "эпитоп" является наименьшей частью молекулы-мишени, способной быть специфически связанной антигенсвязывающим доменом антитела. Минимальный размер эпитопа может составлять приблизительно три, четыре, пять, шесть или семь аминокислот, но эти аминокислоты могут не находиться в последовательной линейной последовательности первичной структуры антигена, т.к. эпитоп может зависеть от трехмерной конфигурации антигена с учетом его вторичной и третичной структуры.
В некоторых вариантах осуществления антитело является интактной молекулой иммуноглобулина (например, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA). Подклассы IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) являются высококонсервативными, отличаются своей константной областью, в частности, шарнирными областями и верхними доменами CH2. Последовательности и различия подклассов IgG известны в этой области и описаны, например, в Vidarsson, et al, "IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions." Frontiers in immunology 5 (2014); Irani, et al. "Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases." Molecular immunology 67,2 (2015): 171-182; Shakib, Farouk, ed. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016; каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Антитело также может являться молекулой иммуноглобулина, полученной из любого биологического вида (например, человека, грызуна, мыши, верблюдовых). Антитела, представленные в настоящем описании, также включают, в качестве неограничивающих примеров, поликлональные, моноклональные, моноспецифические, полиспецифические антитела и химерные антитела, включающие иммуноглобулиновый связывающий домен, слитый с другим полипептидом. Термин "антигенсвязывающий домен" или "антигенсвязывающий фрагмент" означает часть антитела, сохраняющую специфическую связывающую активность интактного антитела, т.е. любую часть антитела, способную специфически связываться с эпитопом на молекуле-мишени интактного антитела. Она включает, например, Fab, Fab', F(ab')2 и варианты этих фрагментов. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может являться, например, scFv, Fv, Fd, dAb, биспецифическим антителом, биспецифическим scFv, диателом, линейным антителом, молекулой одноцепочечного антитела, мультиспецифическим антителом, образованным из фрагментов антител, и любым полипептидом, включающим связывающий домен, являющийся связывающим доменом антитела или являющийся гомологичным связывающему домену антитела. Неограничивающие примеры антигенсвязывающих доменов включают, например, CDR тяжелой цепи и/или легкой цепи интактного антитела, вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи интактного антитела, полноразмерные тяжелые или легкие цепи интактного антитела или отдельную CDR из тяжелой цепи или легкой цепи интактного антитела.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент может образовывать часть химерного антигенного рецептора (CAR). В некоторых вариантах осуществления химерные антигенные рецепторы представляют собой слитые белки одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), представленных в настоящем описании, слитых с трансмембранным доменом и эндодоменом CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор также содержит внутриклеточные сигнальные домены из различных костимуляторных белковых рецепторов (например, CD28, 41BB, ICOS). В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит множество сигнальных доменов, например, CD3z-CD28-41BB или CD3z-CD28-OX40, для повышения активности. Таким образом, в одном из аспектов настоящее изобретение дополнительно относится к клеткам (например, T-клеткам), экспрессирующим химерные антигенные рецепторы, представленные в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления scFv содержит один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен легкой цепи.
Антитела против PD-1 и антигенсвязывающие фрагменты
Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, специфически связывающимся с PD-1. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, могут связываться с PD-1 и могут стимулировать путь передачи сигнала PD-1, таким образом, повышая иммунный ответ. Настоящее изобретение относится, например, к антителам мыши против PD-1 25-1A7 ("1A7"), 18-3F1 ("3F1") и 3-6G1 ("6G1"), их химерным антителам и их гуманизированным антителам (например, антителам, представленным в таблице 2).
Последовательности CDR 1A7 и полученных из 1A7 антител (например, гуманизированных антител) включают CDR вариабельного домена тяжелой цепи, SEQ ID NO:1-3, и CDR вариабельного домена легкой цепи, SEQ ID NO:4-6, определенные с помощью нумерации по Kabat. CDR также можно определять по системе Chothia. При нумерации по Chothia последовательности CDR вариабельного домена тяжелой цепи приведены в SEQ ID NO:16, 17, 3 и последовательности CDR вариабельного домена легкой цепи приведены в SEQ ID NO:4-6.
Аналогично, последовательности CDR 3F1 и полученных из 3F1 антител включают CDR вариабельного домена тяжелой цепи, SEQ ID NO:7-9, и CDR вариабельного домена легкой цепи, SEQ ID NO:10-12, определенные с помощью нумерации по Kabat. При нумерации по Chothia последовательности CDR вариабельного домена тяжелой цепи приведены в SEQ ID NO:18, 19, 9, и CDR вариабельного домена легкой цепи приведены в SEQ ID NO:10-12.
Последовательности CDR 6G1 и полученных из 6G1 антител включают CDR вариабельного домена тяжелой цепи, SEQ ID NO:7, 13, 14, и CDR вариабельного домена легкой цепи, SEQ ID NO:10, 11, 15, определенные с помощью нумерации по Kabat. При нумерации по Chothia последовательности CDR вариабельного домена тяжелой цепи приведены в SEQ ID NO:20, 21, 14, и CDR вариабельного домена легкой цепи приведены в SEQ ID NO:10, 11, 15.
Настоящее изобретение также относится к аминокислотным последовательностям вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи гуманизированных антител. Т.к. существует множество способов гуманизации антитела мыши (например, последовательность можно модифицировать посредством разных замен аминокислот), тяжелая цепь и легкая цепь антитела могут иметь более одной версии гуманизированных последовательностей. Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи гуманизированного антитела 1A7 приведены в SEQ ID NO:26-28. Аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи гуманизированного антитела 1A7 приведены в SEQ ID NO:29-31. Любую из этих последовательностей вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO:26-28) можно спаривать с любой из этих последовательностей вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO:29-31).
Аналогично, аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 3F1 приведены в SEQ ID NO:32-35. Аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 3F1 приведены в SEQ ID NO:36-38. Любую из этих последовательностей вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO:32-35) можно спаривать с любой из этих последовательностей вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO:36-38).
Macaca fascicularis
Macaca fascicularis
Как показано на фиг. 19, термин "процент гуманизации" означает процент идентичности последовательности вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи по сравнению с последовательностями антител человека в базе данных International Immunogenetics Information System (IMGT). Термин "лучшее совпадение" означает, что последовательность вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи ближе к конкретному биологическому виду, чем к другому. Например, термин "лучшее совпадение" с человеком означает, что последовательность ближе к человеку, чем к другому биологическому виду. Лучшее совпадение с человеком и  означает, что последовательность имеет одинаковый процент идентичности в отношении последовательности человека и последовательности , и эти проценты идентичности являются наиболее высокими относительно последовательностей других биологических видов. В некоторых вариантах осуществления процент гуманизации составляет более 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% или 95%. Подробное описание, касающееся определения процента гуманизации и определения лучших совпадений, известно в этой области и представлено, например, в Jones, Tim D., et al. "The INNs and outs of antibody nonproprietary names." MAbs. Vol. 8. No. 1. Taylor & Francis, 2016, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Зачастую высокий процент гуманизации обладает различными преимуществами, например, антитело является более безопасным и более эффективным для людей, более вероятно, что оно будет хорошо переноситься человеком, и/или менее вероятно, что оно будет обладать побочными эффектами.
Кроме того, в некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, также могут содержать одну, две или три CDR вариабельной области тяжелой цепи, выбранные из группы SEQ ID NO:1-3, SEQ ID NO:7-9, SEQ ID NO:7, 13, 14, SEQ ID NO:16, 17, 3, SEQ ID NO:18, 19, 9, и SEQ ID NO:20, 21, 14; и/или одну, две или три CDR вариабельной области легкой цепи, выбранных из группы SEQ ID NO:4-6, SEQ ID NO:10-12 и SEQ ID NO:10, 11, 15.
В некоторых вариантах осуществления антитела могут содержать вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющие комплементарность области (CDR) 1, 2, 3, где область CDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, являющейся по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентичной в отношении выбранной аминокислотной последовательности CDR1 VH, область CDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, являющейся по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентичной в отношении выбранной аминокислотной последовательности CDR2 VH, и область CDR3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, являющейся по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентичной в отношении выбранной аминокислотной последовательности CDR3 VH, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR 1, 2, 3, где область CDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, являющейся по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентичной в отношении выбранной аминокислотной последовательности CDR1 VL, область CDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, являющейся по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентичной в отношении выбранной аминокислотной последовательности CDR2 VL, и область CDR3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, являющейся по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентичной в отношении выбранной аминокислотной последовательности CDR3 VL. Выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VH и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VL приведены на фиг. 16 (CDR по Kabat) и фиг. 17 (CDR по Chothia).
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO:1 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO:2 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO:3 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO:7 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO:8 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO:9 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO:7 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO:13 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO:14 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO:16 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO:17 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO:3 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO:18 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO:19 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO:9 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO:20 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO:21 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO:14 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO:4 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO:5 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO:6 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO:10 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO:11 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO:12 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO:10 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO:11 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO:15 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот.
Инсерции, делеции и замены могут находиться внутри последовательности CDR или на одном или обоих концах последовательности CDR.
Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, связывающимся с PD-1. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, являющейся по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентичной в отношении выбранной последовательности VH, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, являющейся по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентичной в отношении выбранной последовательности VL. В некоторых вариантах осуществления выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:26, 27, 28 или 39, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:29, 30, 31 или 40. В некоторых вариантах осуществления выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:32, 33, 34, 35 или 41, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:36, 37, 38 или 42. В некоторых вариантах осуществления выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:43, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:44.
Для определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновой кислоты последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения (например, можно включать пропуски в одну или обе из первой и второй аминокислотных последовательностей или последовательностей нуклеиновой кислоты для оптимального выравнивания, и в целях сравнения можно пренебрегать негомологичными последовательностями). Длина фрагмента референсной последовательности, выравниваемого в целях сравнения, составляет по меньшей мере 80% длины референсной последовательности, и в некоторых вариантах осуществления составляет по меньшей мере 90%, 95% или 100%. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или положениях нуклеотидов. Если положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и в соответствующем положении во второй последовательности, молекулы являются идентичными в этом положении. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, общих для последовательностей, с учетом количества пропусков и длины каждого пропуска, который необходимо включать для оптимального выравнивания двух последовательностей. В целях по настоящему изобретению сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно осуществлять с использованием матрицы весов Blossum 62 со штрафом за пропуск 12, штрафом за удлинение пропуска 4, и штрафом за пропуск со сдвигом рамки считывания 5.
Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или легкую цепь иммуноглобулина. Тяжелая цепь иммуноглобулина или легкая цепь иммуноглобулина содержит CDR, показанные на фиг. 16 или фиг. 17, или имеют последовательности, показанные на фиг. 19 или фиг. 20. Когда полипептиды спариваются с соответствующим полипептидом (например, соответствующей вариабельной областью тяжелой цепи или соответствующей вариабельной областью легкой цепи), спаренные полипептиды связываются с PD-1 (например, PD-1 человека).
Антитела против PD-1 и антигенсвязывающие фрагменты также могут являться вариантами (включая производные и конъюгаты) антител или фрагментов антител и мультиспецифическими (например, биспецифическими) антителами или фрагментами антител. Дополнительными антителами, представленными в настоящем описании, являются поликлональные, моноклональные, мультиспецифические антитела (мультимерные, например, биспецифические), антитела человека, химерные антитела (например, химеры человека-мыши), одноцепочечные антитела, внутриклеточно-образующиеся антитела (т.е. интратела) и их антигенсвязывающие фрагменты. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут иметь любой тип (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класс (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласс. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является антителом IgG или его антигенсвязывающим фрагментом.
Фрагменты антител подходят для использования в способах по настоящему изобретению при условии, что они сохраняют желаемую аффинность и специфичность полноразмерного антитела. Таким образом, фрагмент антитела, связывающийся с PD-1, будет сохранять способность связываться с PD-1. Fv-фрагмент является фрагментом антитела, содержащим полный участок распознавания и связывания антигена. Эта область состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, тесно связанных, например, ковалентно, например, в scFv. В этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют, определяя антигенсвязывающий участок на поверхности димера VH-VL. В совокупности, шесть CDR или их подгруппа придают антителу специфичность связывания с антигеном. Однако, даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфические в отношении антигена) может обладать способностью распознавать и связывать антиген, хотя, как правило, с более низкой аффинностью, чем в случае целого связывающего участка.
Одноцепочечные Fv-фрагменты антител (или scFv) содержат домены (или области) VH и VL антитела, где эти домены находятся в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид scFv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, позволяющий scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена.
Fab-фрагмент содержит вариабельный и константный домен легкой цепи и вариабельный домен и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. F(ab')2-фрагменты антител содержат пару Fab-фрагментов, как правило, ковалентно связанных вблизи своих карбокси-концов с помощью шарнирных цистеинов между ними. В этой области также известны другие химические соединения фрагментов антител.
Диатела являются небольшими фрагментами антител с двумя антигенсвязывающими участками, где фрагменты содержат VH, соединенный с VL в той же полипептидной цепи (VH и VL). Используя линкер, являющийся слишком коротким, чтобы позволить спариваться двум доменам на одной цепи, домены заставляют спариваться с комплементарными доменами другой цепи и получают два антигенсвязывающих участка.
Линейные антитела содержат пару тандемных сегментов Fd (VH-CH1-VH-CH1), которые совместно с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей. Линейные антитела могут являться биспецифическими или моноспецифическими.
Антитела и фрагменты антител по настоящему изобретению можно модифицировать в Fc-области для достижения желаемых эффекторных функций или времени полужизни в сыворотке.
1
Мультимеризации антител можно достигать с помощью природной агрегации антител или химических или рекомбинантных способов соединения, известных в этой области. Например, некоторый процент очищенных препаратов антител (например, очищенных молекул IgG) спонтанно образует белковые агрегаты, содержащие гомодимеры антител и другие мультимеры антител более высокого порядка.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
J. Immunol.
2
Альтернативно, гомодимеры антител можно получать способами химического соединения, известными в этой области. Например, для получения мультимеров антител можно использовать гетеробифункциональные перекрестно-сшивающие средства, включая, в качестве неограничивающих примеров, SMCC (сукцинимидил-4-(малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат) и SATA (N- сукцинимидил-S-ацетилтио-ацетат). Пример способа получения гомодимеров антител описан в Ghetie et al. ( 94: 7509-7514, 1997). Гомодимеры антител можно преобразовывать в гомодимеры Fab’ посредством расщепления пепсином. Другим способом получения гомодимеров антител является использование аутофильного пептида T15, описанного Zhao et al. ( 25:396-404, 2002).
В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело является биспецифическим антителом. Биспецифические антитела можно получать посредством конструирования области контакта между парой молекул антител для максимизации процента гетеродимеров, выделяемых из культуры рекомбинантных клеток. Например, область контакта может содержать по меньшей мере часть домена CH3 константного домена антитела. В этом способе одну или более аминокислот с небольшими боковыми цепями из области контакта первой молекулы антитела заменяют аминокислотами с более крупными боковыми цепями (например, тирозином или триптофаном). На области контакта второй молекулы антитела создают компенсаторные "впадины" идентичного или схожего размера для крупных боковых цепей, заменяя аминокислоты с крупными боковыми цепями аминокислотами с меньшими боковыми цепями (например, аланином или треонином). Это представляет собой механизм повышения выхода гетеродимера относительно других нежелательных конечных продуктов, таких как гомодимеры. Этот способ описан, например, в WO 96/27011, включенном в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Биспецифические антитела включают перекрестно сшитые или "гетероконъюгированные" антитела. Например, одно из антител в гетероконъюгате можно связывать с авидином, а другое - с биотином. Гетероконъюгированные антитела также можно получать любыми удобными способами перекрестной сшивки. Подходящие сшивающие средства и способы перекрестной сшивки хорошо известны в этой области и описаны в патенте США № 4676980, включенном в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Science
2
В этой области также известны способы получения биспецифических антител из фрагментов антител. Например, биспецифические антитела можно получать с использованием химического соединения. Brennan et al. ( 229:81, 1985) описывают способ, в котором интактные антитела протеолитически расщепляют для получения F(ab’)-фрагментов. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии дитиолового комплексообразователя арсенита натрия для стабилизации вицинальных дитиолов и предотвращают образование межмолекулярных дисульфидных связей. Затем полученные Fab'-фрагменты преобразуют в тионитробензоатные (TNB) производные. Затем одно из производных TNB-Fab’ преобразуют обратно в тиол-Fab’ посредством восстановления меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количество другого производного TNB-Fab’ для получения биспецифического антитела.
in vitro
in vivo
Любые из антител или антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем описании, можно конъюгировать со стабилизирующей молекулой (например, молекулой, повышающей время полужизни антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в организме индивидуума или в растворе). Неограничивающие примеры стабилизирующих молекул включают: полимер (например, полиэтиленгликоль) или белок (например, сывороточный альбумин, такой как сывороточный альбумин человека). Конъюгация стабилизирующей молекулы может повышать время полужизни или продлевать биологическую активность антитела или антигенсвязывающего фрагмента  (например, в культуре ткани или при хранении в виде фармацевтической композиции) или  (например, в организме человека).
В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, можно конъюгировать с терапевтическим средством. Конъюгат антитело-лекарственное средство, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, можно ковалентно или нековалентно связывать с терапевтическим средством. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство является цитотоксическим или цитостатическим средством (например, цитохалазином B, грамицидином D, бромистым этидием, эметином, митомицином, этопозидом, тенопозидом, винкристином, винбластином, колхицином, доксорубицином, даунорубицином, дигидроксиантрацином, майтанзиноидами, такими как DM-1 и DM-4, дионом, митоксантроном, митрамицином, актиномицином D, 1-дегидротестостероном, глюкокортикоидами, прокаином, тетракаином, лидокаином, пропранололооом, пуромицином, эпирубицином, циклофосфамидом и их аналогами).
Характеристики антител
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, могут блокировать связывание между PD-1 и PD-L1 и/или связывание между PD-1 и PD-L2.
В некоторых вариантах осуществления посредством связывания с PD-1 антитело может ингибировать путь передачи сигнала PD-1 и положительно регулировать иммунный ответ. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, являются антагонистами PD-1. В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты являются агонистами PD-1.
+
+
В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, могут повышать иммунный ответ, активность или количество T-клеток (например, CD8 и/или CD4 клеток) по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, в 2 раза, 3 раза, 5 раз, 10 раз или 20 раз. В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, могут снижать активность или количество T-клеток по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, в 2 раза, 3 раза, 5 раз, 10 раз или 20 раз.
off
off
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
В некоторых вариантах осуществления антитело (или его антигенсвязывающие фрагменты) специфически связывается с PD-1 (например, PD-1 человека, PD-1 обезьяны, PD-1 мыши и/или химерным PD-1) со скоростью диссоциации (k) менее 0,1 с, менее 0,01 с, менее 0,001 с, менее 0,0001 с или менее 0,00001 с. В некоторых вариантах осуществления скорость диссоциации (k) составляет более 0,01 с, более 0,001 с, более 0,0001 с, более 0,00001 с или более 0,000001 с.
on
on
2
3
4
5
6
5
6
7
В некоторых вариантах осуществления скорость ассоциации (k) составляет более 1×10/Мс, более 1×10/Мс, более 1×10/Мс, более 1×10/Мс или более 1×10/Мс. В некоторых вариантах осуществления скорость ассоциации (k) составляет менее 1×10/Мс, менее 1×10/Мс или менее 1×10/Мс.
off
on
-6
-7
-8
-9
-10
-7
-8
-9
-10
-11
-12
Аффинности можно выводить из отношения кинетических констант скорости (KD=k/k). В некоторых вариантах осуществления KD составляет менее 1×10M, менее 1×10M, менее 1×10 M, менее 1×10 M или менее 1×10 M. В некоторых вариантах осуществления KD составляет менее 50 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 9 нМ, 8 нМ, 7 нМ, 6 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ или 1 нМ. В некоторых вариантах осуществления KD составляет более 1×10M, более 1×10M, более 1×10 M, более 1×10 M, более 1×10 M или более 1×10 M. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с PD-1 человека с KD приблизительно 3 нМ или менее.
Общие способы измерения аффинности антитела к антигену включают, например, ELISA, RIA и поверхностный плазмонный резонанс (SPR). В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с PD-1 человека (SEQ ID NO:22), PD-1 обезьяны (например, PD-1 макака-резуса, SEQ ID NO:24), химерным PD-1 (SEQ ID NO:25) и/или PD-1 мыши (SEQ ID NO:23). В некоторых вариантах осуществления антитело не связывается с PD-1 человека (SEQ ID NO:22), PD-1 обезьяны (например, PD-1 макака-резуса, SEQ ID NO:24; PD-1 яванского макака), химерным PD-1 (SEQ ID NO:25) и/или PD-1 мыши (SEQ ID NO:23).
В некоторых вариантах осуществления определяют термостабильность. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, могут иметь Tm более 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 или 95°C.
Т.к. IgG можно описать как мультидоменный белок, на кривой плавления иногда наблюдают два перехода с первой температурой денатурации Tm D1 и второй температурой денатурации Tm D2. Наличие этих двух пиков зачастую свидетельствует о денатурации Fc-доменов (Tm D1) и Fab-доменов (Tm D2), соответственно. Если есть два пика, термин "Tm", как правило, относится к Tm D2. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, имеют Tm D1 более 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 или 95°C. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, имеют Tm D2 более 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 или 95°C.
В некоторых вариантах осуществления Tm, Tm D1, Tm D2 составляют менее 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 или 95°C.
В некоторых вариантах осуществления антитело имеет процент ингибирования роста опухоли (TGI%) более 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200%. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет процент ингибирования роста опухоли менее 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200%. TGI% можно определять, например, через 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 дней после начала лечения или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяца после начала лечения. В рамках изобретения процент ингибирования роста опухоли (TGI%) вычисляют по следующей формуле:
TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100
Ti является средним объемом опухоли в группе лечения в день i. T0 является средним объемом опухоли в группе лечения в нулевой день. Vi является средним объемом опухоли в контрольной группе в день i. V0 является средним объемом опухоли в контрольной группе в нулевой день.
В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, являются антагонистами PD-1. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты снижают передачу сигнала PD-1 в клетке-мишени, экспрессирующей PD-1.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты повышают функцию CD4 эффекторных T-клеток, например, посредством повышения пролиферации CD4 эффекторных T-клеток и/или повышения продукции интерферона-гамма CD4 эффекторными T-клетками (например, по сравнению с пролиферацией и/или продукцией цитокинов перед введением антител или антигенсвязывающих фрагментов). В некоторых вариантах осуществления цитокин является интерфероном-гамма. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты повышают количество внутриопухолевых (инфильтрирующих) CD4 эффекторных T-клеток (например, общее количество CD4 эффекторных T-клеток, или например, процент CD4 клеток среди CD45 клеток), например, по сравнению с количеством внутриопухолевых (инфильтрирующих) CD4 T-клеток перед введением антител или антигенсвязывающих фрагментов. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты повышают количество внутриопухолевых (инфильтрирующих) CD4 эффекторных T-клеток, экспрессирующих интерферон-гамма (например, всех экспрессирующих интерферон-гамма CD4 клеток или, например, процента экспрессирующих интерферон-гамма CD4 клеток среди всех CD4 клеток), например, по сравнению с количеством внутриопухолевых (инфильтрирующих) CD4 T-клеток, экспрессирующих интерферон-гамма, перед введением.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты повышают количество внутриопухолевых (инфильтрирующих) CD8 эффекторных T-клеток (например, общее количество CD8 эффекторных T-клеток или, например, процента CD8 клеток среди CD45 клеток), например, по сравнению с количеством внутриопухолевых (инфильтрирующих) CD8 эффекторных T-клеток перед введением. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты повышают количество внутриопухолевых (инфильтрирующих) CD8 эффекторных T-клеток, экспрессирующих интерферон-гамма (например, процент CD8 клеток, экспрессирующих интерферон-гамма, среди всех CD8 клеток), например, по сравнению с количеством внутриопухолевых (инфильтрирующих) CD8 T-клеток, экспрессирующих интерферон-гамма, перед введением антитела против PD-1 человека.
В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты повышают функцию T-клеток памяти, например, посредством повышения пролиферации T-клеток памяти и/или повышения продукции цитокинов (например, интерферона-гамма) клетками памяти.
reg
reg
reg
reg
+
+
+
В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты ингибируют функцию T, например, посредством снижения T-супрессии функции эффекторных T-клеток (например, пролиферации эффекторных T-клеток и/или секреции цитокинов эффекторными T-клетками). В некоторых вариантах осуществления эффекторная T-клетка является CD4 эффекторной T-клеткой. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты снижают количество внутриопухолевых (инфильтрирующих) T (например, общее количество T или например, процент Fox3p клеток среди CD4 клеток).
in vitro
+
reg
В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты представляют собой истощающее антитело против hPD-1 (например, оно истощает клетки, экспрессирующие PD-1 человека). В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты истощают клетки, экспрессирующие PD-1 человека, . В некоторых вариантах осуществления экспрессирующие PD-1 человека клетки являются CD4 эффекторными T-клетками или T-клетками. В некоторых вариантах осуществления истощение происходит посредством ADCC и/или фагоцитоза.
В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты имеют функциональную Fc-область. В некоторых вариантах осуществления эффекторная функция функциональной Fc-области является антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). В некоторых вариантах осуществления эффекторная функция функциональной Fc-области является фагоцитозом. В некоторых вариантах осуществления эффекторная функция функциональной Fc-области является ADCC и фагоцитозом. В некоторых вариантах осуществления Fc-область принадлежит IgG1 человека, IgG2 человека, IgG3 человека или IgG4 человека.
reg
В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты не индуцируют апоптоз PD-1-экспрессирующих клеток (например, T).
В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты не содержат функциональную Fc-область. Например, антитела или антигенсвязывающие фрагменты являются Fab-, Fab’-, F(ab’)2- и Fv-фрагментами.
Способы получения антител против PD-1
Выделенный фрагмент PD-1 человека можно использовать в качестве иммуногена для получения антител стандартными способами получения поликлональных и моноклональных антител. Поликлональные антитела можно индуцировать в животных посредством множественных инъекций (например, подкожных или интраперитонеальных инъекций) антигенного пептида или белка. В некоторых вариантах осуществления антигенный пептид или белок инъецируют по меньшей мере с одним адъювантом. В некоторых вариантах осуществления антигенный пептид или белок можно конъюгировать со средством, являющимся иммуногенным для биологического вида, подлежащего иммунизации. Животным можно инъецировать антигенный пептид или белок более одного раза (например, два, три или четыре раза).
В качестве иммуногенов можно использовать полноразмерный полипептид или белок или, альтернативно, их антигенные пептидные фрагменты. Антигенный пептид белка содержит по меньшей мере 8 (например, по меньшей мере 10, 15, 20 или 30) аминокислотных остатков из аминокислотной последовательности PD-1 и включает эпитоп белка таким образом, что антитело, индуцированное против пептида, образует специфический иммунный комплекс с белком. Как описано выше, в этой области известна полноразмерная последовательность PD-1 человека (SEQ ID NO:22).
Иммуноген, как правило, используют для получения антител посредством иммунизации подходящего индивидуума (например, человека или трансгенного животного, экспрессирующего по меньшей мере один иммуноглобулиновый локус человека). Подходящий иммуногенный препарат может содержать, например, рекомбинантно экспрессируемый или химически синтезируемый полипептид (например, фрагмент PD-1 человека). Препарат может дополнительно включают адъювант, такой как полный или неполный адъювант Фрейнда, или схожее иммуностимулирующее средство.
Nature
Immunol. Today
Поликлональные антитела можно получать, как описано выше, посредством иммунизации подходящего индивидуума полипептидом PD-1 или его антигенным пептидом (например, частью PD-1) в качестве иммуногена. Титр антител у иммунизированного индивидуума можно подвергать мониторингу с течением времени стандартными способами, такими как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) с использованием иммобилизованного полипептида или пептида PD-1. При желании, молекулы антител можно выделять из млекопитающего (например, из крови) и дополнительно очищать хорошо известными способами, такими как хроматография с протеином A или протеином G, для получения фракции IgG. Через соответствующее время после иммунизации, например, когда титры специфических антител являются наиболее высокими, можно получать антитело-продуцирующие клетки из индивидуума и использовать их для получения моноклональных антител стандартными способами, такими как гибридомный способ, исходно описанный Kohler et al. ( 256:495-497, 1975), способ с использованием гибридомы B-клеток человека (Kozbor et al.,  4:72, 1983), EBV-гибридомный способ (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985) или триомные способы. Технология получения гибридом хорошо известная (см., в целом, Current Protocols in Immunology, 1994, Coligan et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Гибридомные клетки, продуцирующие моноклональное антитело, определяют посредством скрининга супернатантов гибридомных культур на антитела, связывающиеся с интересующим полипептидом или эпитопом, например, с использованием стандартного анализа ELISA.
Варианты антител или антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем описании, можно получать посредством внесения соответствующих изменений нуклеотидов в ДНК, кодирующую антитело человека, гуманизированное антитело или химерное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленный в настоящем описании, или посредством пептидного синтеза. Такие варианты включают, например, делеции, инсерции или замены остатков в аминокислотных последовательностях, составляющих антигенсвязывающий участок антитела или антигенсвязывающего домена. В популяции таких вариантов некоторые антитела или антигенсвязывающие фрагменты будут иметь повышенную аффинность к белку-мишени, например, PD-1. Можно использовать любую комбинацию делеций, инсерций и/или комбинаций для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, имеющего повышенную аффинность связывания с мишенью. Изменения аминокислот, вносимые в антитело или антигенсвязывающий фрагмент, также могут изменять или вносить новые посттрансляционные модификации в антитело или антигенсвязывающий фрагмент, такие как изменение (например, повышение или снижение) количества участков гликозилирования, изменение типа участка гликозилирования (например, изменение аминокислотной последовательности таким образом, что ферменты, присутствующие в клетке, будут присоединять другой сахар) или встраивание новых участков гликозилирования.
Антитела, представленные в настоящем описании, можно получать из любого вида животного, включая млекопитающих. Неограничивающие примеры нативных антител включают антитела, полученные из людей, приматов, например, мартышек и человекообразных обезьян, коров, свиней, лошадей, овец, Верблюдовых (например, верблюдов и лам), кур, коз и грызунов (например, крыс, мышей, хомяков и кроликов), включая трансгенных грызунов, генетически сконструированных для получения антител человека.
in vitro
in vivo
Антитела человека и гуманизированные антитела включают антитела, имеющие вариабельные и константные области, полученные из (или имеющие ту же аминокислотную последовательность, что и полученные из) последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. Антитела человека могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека (например, мутации, встраиваемые с ходе случайного или сайт-специфического мутагенеза  или посредством соматической мутации ), например, в CDR.
Гуманизированное антитело, как правило, имеет каркас человека (FR), на который пересажены не принадлежащие человеку CDR. Таким образом, гуманизированное антитело содержит одну или более аминокислотных последовательностей, встроенных в него из источника, не принадлежащего человеку. Эти не принадлежащие человеку аминокислотные остатки часто обозначают как "импортируемые" остатки, как правило, взятые из "импортируемого" вариабельного домена. Гуманизацию можно осуществлять, по существу, например, заменяя последовательности CDR грызуна соответствующими последовательностями из антитела человека. Эти способы описаны, например, в Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Таким образом, "гуманизированные" антитела являются химерными антителами, где существенно меньший, чем интактный, V-домен человека заменяют соответствующей последовательностью не являющихся человеком видов. На практике, гуманизированные антитела, как правило, являются антителами мыши, в которых некоторые остатки CDR и некоторые остатки FR заменяют остатками из аналогичных участков в антителах человека.
Выбор доменов VH и VL человека для использования в получении гуманизированных антител очень важен для снижения иммуногенности. В так называемом способе "наилучшего совпадения" последовательность V-домена антитела мыши подвергают скринингу против целой библиотеки известных последовательностей доменов человека. Затем последовательность человека, наиболее близкую к последовательности мыши, принимают в качестве FR человека для гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)).
Также важно гуманизировать антитела с сохранением высокой специфичности и аффинности к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели гуманизированные антитела можно получать посредством анализа родительских последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов общедоступны и хорошо известны специалистам в этой области. Доступны компьютерные программы, с помощью которых иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных иммуноглобулиновых последовательностей-кандидатов. Осмотр этих отображений позволяет анализировать возможную роль остатков в функционировании иммуноглобулиновой последовательности-кандидата, т.е. анализировать остатки, влияющие на способность иммуноглобулина-кандидата связываться со своим антигеном. Таким образом, можно выбирать и комбинировать остатки FR из реципиентных и импортируемых последовательностей так, чтобы достигать желаемой характеристики антитела, такой как повышенная аффинность к антигенам-мишеням.
Как правило, варианты аминокислотной последовательности антитела человека, гуманизированного или химерного антитела против PD-1 будут содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности в отношении последовательности, присутствующей в легкой или тяжелой цепи исходного антитела.
Термин "идентичность" или "гомология" в отношении исходной последовательности, как правило, означает процент аминокислотных остатков, присутствующих в последовательности-кандидате, идентичных последовательности, присутствующей в антителе человека, гуманизированном или химерном антителе против PD-1 или его фрагменте, после выравнивания последовательностей и включения пропусков, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательности без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательности.
in vitro
in vivo
in vitro
in vivo
Cancer Res.
Anti-Cancer Drug Design
Можно осуществлять дополнительные модификации в антителах против PD-1 или антигенсвязывающих фрагментах. Например, можно встраивать остатки цистеина в Fc-область, таким образом, позволяя межцепочечной дисульфидной связи образовываться в этой области. Полученное таким образом гомодимерное антитело может иметь повышенное время полужизни и/или . Гомодимерные антитела с повышенным временем полужизни  и/или  также можно получать с использованием гетеробифункциональных кросс-линкеров, как описано, например, в Wolff et al. ( 53:2560-2565, 1993). Альтернативно, можно конструировать антитело, имеющее двойные Fc-области (см., например, Stevenson et al.,  3:219-230, 1989).
В некоторых вариантах осуществления можно осуществлять ковалентную модификацию в антителе против PD-1 или его антигенсвязывающем фрагменте. Эти ковалентные модификации можно осуществлять посредством химического или ферментативного синтеза или посредством ферментативного или химического расщепления. Другие типы ковалентных модификаций антитела или фрагмента антитела вносят в молекулу посредством реакции целевых аминокислотных остатков в антителе или фрагменте с органическим средством для дериватизации, способным реагировать с выбранными боковыми цепями или N- или C-концевыми остатками.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к вариантам антител, имеющим углеводную структуру, в которой отсутствует фукоза, присоединенная (прямо или косвенно) к Fc-области. Например, количество фукозы в таком антителе может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Количество фукозы определяют посредством вычисления среднего количества фукозы в сахарной цепи Asn297 относительно суммы всех гликоструктур, присоединенных к Asn 297 (например, комплексных, гибридных и высокоманнозных структур), что измеряют посредством масс-спектрометрии MALDI-TOF, как описано, например, в WO 2008/077546. Термин "Asn297" относится к остатку аспарагина, находящемуся приблизительно в положении 297 в Fc-области (при нумерация Eu остатков Fc-области; или в положении 314 при нумерации по Kabat); однако, Asn297 также может находиться приблизительно на ±3 аминокислоты выше или ниже положения 297, т.е. между положениями 294 и 300, из-за минорных вариантов последовательности в антителах. Такие варианты фукозилирования могут иметь улучшенную функцию ADCC. В некоторых вариантах осуществления для снижения гетерогенности гликанов Fc-область антитела можно дополнительно конструировать для замены аспарагина в положении 297 аланином (N297A).
В некоторых вариантах осуществления для улучшения эффективности продукции путем устранения обмена Fab-фрагментов Fc-область антител дополнительно конструировали, заменяя серин в положении 228 (нумерация EU) IgG4 пролином (S228P). Подробное описание, касающееся мутации S228, представлено, например, в Silva et al. "The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitative immunoassays and physiological matrix preperation." Journal of Biological Chemistry 290,9 (2015): 5462-5469, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Рекомбинантные векторы
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам (например, экспрессирующим векторам), включающим выделенный полинуклеотид, представленный в настоящем описании (например, полинуклеотид, кодирующий полипептид, представленный в настоящем описании), клеткам-хозяевам, в которые встраивают рекомбинантные векторы (т.е. таким образом, что клетки-хозяева содержат полинуклеотид и/или вектор, содержащий полинуклеотид), и получению полипептидов рекомбинантного антитела или их фрагментов рекомбинантными способами.
В рамках изобретения термин "вектор" означает любую конструкцию, с помощью которой можно доставлять один или более интересующих полинуклеотидов в клетку-хозяина, если вектор встраивают в клетку-хозяина. С помощью "экспрессирующего вектора" можно доставлять и экспрессировать один или более интересующих полинуклеотидов в виде кодируемого полипептида в клетке-хозяине, в которую встроен экспрессирующий вектор. Таким образом, в экспрессирующем векторе интересующий полинуклеотид располагают для экспрессии в векторе, функциональной связывая его с регуляторными элементами, такими как промотор, энхансер и/или поли-A-хвост, в векторе или геноме клетки-хозяина в участке встраивания интересующего полинуклеотида, или вблизи него, или фланкируя его таким образом, что интересующий полинуклеотид будет транслироваться в клетке-хозяине, в которую встроен в экспрессирующий вектор.
Вектор можно встраивать в клетку-хозяина известными в этой области способами, например, посредством электропорации, химической трансфекции (например, DEAE-декстраном), трансформации, трансфекции и инфекции и/или трансдукции (например, с использованием рекомбинантного вируса). Таким образом, неограничивающие примеры векторов включают вирусные векторы (которые можно использовать для получения рекомбинантного вируса), депротеинизированную ДНК или РНК, плазмиды, космиды, фаговые векторы и ДНК- или РНК-экспрессирующие векторы, связанные с катионными конденсирующими средствами.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, представленный в настоящем описании (например, полинуклеотид, кодирующий полипептид, представленный в настоящем описании) встраивают с использованием вирусной экспрессирующей системы (например, вируса осповакцины или другого поксвируса, ретровируса или аденовируса), которая может включать использование непатогенного (дефектного), репликационно-компетентного вируса, или в ней могут использовать репликационно-дефектный вирус. В случае последнего, размножение вируса, как правило, будет происходить только в соответствующих вирусу упаковочных клетках. Подходящие системы описаны, например, в Fisher-Hoch et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321; Flexner et al., 1989, Ann. N.Y. Acad Sci. 569:86-103; Flexner et al., 1990, Vaccine, 8:17-21; патентах США №№ 4603112, 4769330 и 5017487; WO 89/01973; патенте США № 4777127; GB 2200651; EP 0345242; WO 91/02805; Berkner-Biotechniques, 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., 1991, Science, 252:431-434; Kolls et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:215-219; Kass-Eisler et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11498-11502; Guzman et al., 1993, Circulation, 88:2838-2848; и Guzman et al., 1993, Cir. Res., 73:1202-1207. Способы встраивания ДНК в такие экспрессирующие системы хорошо известны специалистам в этой области. ДНК также может являться "депротеинизированной", как описано, например, в Ulmer et al., 1993, Science, 259:1745-1749, и Cohen, 1993, Science, 259:1691-1692. Захват депротеинизированной ДНК можно повышать посредством нанесения ДНК в виде покрытия на биодеградируемые частицы, эффективно транспортируемые клетки.
E. coli
Для экспрессии вставку ДНК, содержащую кодирующий антитело или кодирующий полипептид полинуклеотид, представленный в настоящем описании, можно функционально связывать с соответствующим промотором (например, гетерологичным промотором), таким как, помимо прочих, промотор PL фага лямбда, промоторыlac, trp и tac, ранний и поздний промоторы SV40 и промоторы ретровирусных LTR. Другие подходящие промоторы известны специалистам в этой области. Экспрессирующие конструкции могут дополнительно содержать участки инициации транскрипции, участки терминация транскрипции и, в транскрибируемой области, участок связывания рибосомы для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемых с помощью конструкций, могут включать участок инициации трансляции в начале полипептида и терминирующий кодон (UAA, UGA или UAG), соответствующим образом расположенный в конце полипептида, подлежащего трансляции.
E. coli
E. coli
Streptomyces
Salmonella typhimurium
Как указано, экспрессирующие векторы могут включать по меньшей мере один селективный маркер. Такие маркеры включают дигидрофолатредуктазу или ген резистентности к неомицину для культивирования эукариотических клеток и гены резистентности к тетрациклину или ампициллину для культивирования в  и других бактериях. Типичные неограничивающие примеры подходящих клеток-хозяев включают бактериальные клетки, такие как клетки,  и ; клетки грибов, такие как дрожжевые клетки; клетки насекомых, такие как клетки Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; клетки животного, такие как клетки CHO, COS, меланомы Боуэса и HK 293; и растительные клетки. Подходящие среды для культивирования и условия для клеток-хозяев, представленных в настоящем описании, известны в этой области.
Неограничивающие векторы для использования в бактериях включают pQE70, pQE60 и pQE-9, доступные в Qiagen; векторы pBS, векторы Phagescript, векторы Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, доступные в Stratagene; и ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, доступные в Pharmacia. Неограничивающие эукариотические векторы включают pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 и pSG, доступные в Stratagene; и pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL, доступные в Pharmacia. Другие подходящие векторы будут очевидны специалистам в этой области.
E. coli
Неограничивающие бактериальные промоторы, подходящие для использования, включают промоторы lacI и lacZ, промоторы T3 и T7, промотор gpt, промоторы PR и PL лямбда и промотор trp. Подходящие эукариотические промоторы включают предранний промотор CMV, промотор тимидинкиназы HSV, ранний и поздний промоторы SV40, промоторы ретровирусных LTR, такие как промоторы вируса саркомы Рауса (RSV), и промоторы металлотионеинов, такие как промотор металлотионеина-I мыши.
Saccharomyces cerevisiae
et al.
et al., Methods Enzymol., 153:
В дрожжах  можно использовать ряд векторов, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, такие как промоторы фактора альфа, алкогольоксидазы и PGH. Обзор см.Ausubel  (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, и Grant 516-544 (1997).
et al
Встраивание конструкции в клетку-хозяина можно осуществлять посредством трансфекции с фосфатом кальция, DEAE-декстран-опосредованной трансфекции, опосредованной катионными липидами трансфекции, электропорации, трансдукции, инфекции или других способов. Такие способы описаны во многих стандартных лабораторных руководствах, таких как Davis ., Basic Methods In Molecular Biology (1986), включенное в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Транскрипцию ДНК, кодирующей антитело по настоящему изобретению, высшими эукариотами можно повышать посредством встраивания энхансерной последовательности в вектор. Энхансеры являются цис-действующими элементами ДНК, как правило, приблизительно от 10 до 300 п.н., повышающими транскрипционную активность промотора в указанном типе клеток-хозяев. Примеры энхансеров включают энхансер SV40, локализованный в участке позднего начала репликации в положении пар оснований 100-270, ранний промотор-энхансер цитомегаловируса, полиомный энхансер в участке позднего начала репликации и энхансеры аденовируса.
В экспрессируемый полипептид можно встраивать подходящие сигналы секреции для секреции транслируемого белка в просвет эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточную среду. Сигналы могут являться эндогенными для полипептида или могут являться гетерологичными сигналами.
Полипептид (например, антитело) можно экспрессировать в модифицированной форме, такой как слитый белок (например, GST-слитый белок), или с гистидиновой меткой, и он может включать не только сигналы секреции, но также и дополнительные гетерологичные функциональные области. Например, на N-конец полипептида можно добавлять область дополнительных аминокислот, в частности, заряженных аминокислот, для улучшения стабильности и персистирования в клетку-хозяина во время очистки или последующей транспортировки и хранения. Кроме того, в полипептид можно добавлять пептидные остатки для облегчения очистки. Такие области можно удалять перед конечным получением полипептида. Добавление пептидных остатков в полипептиды для секреции или экскреции, для улучшения стабильности и для облегчения очистки, помимо прочего, являются известными и рутинными способами в этой области.
Способы лечения
Антитела, или антитело, или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению можно использовать для различных терапевтических целей. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам лечения злокачественного новообразования у индивидуума, способам снижения скорости увеличения объема опухоли у индивидуума с течением времени, способам снижения риска метастазирования или способам снижения риска развития дополнительных метастазов у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления с помощью лечения можно останавливать, замедлять, задерживать или ингибировать прогрессирование злокачественного новообразования. В некоторых вариантах осуществления лечение может приводить к снижению количества, тяжести и/или длительности одного или более симптомов злокачественного новообразования у индивидуума.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам, включающим введение терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, представленных в настоящем описании, нуждающемуся в этом индивидууму (например, индивидууму, имеющему или, как определено или диагностировано, имеющему злокачественное новообразование), имеющему, например, рак молочной железы (например, трижды негативный рак молочной железы), карциноидный рак, рак шейки матки, рак эндометрия, глиому, рак головы и шеи, рак печени, рак легких, мелкоклеточный рак легких, лимфому, меланому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, колоректальный рак, рак желудка, рак яичка, рак щитовидной железы, рак мочевого пузыря, рак уретры или гемобластоз. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование является неоперабельной меланомой или метастазирующей меланомой, немелкоклеточной карциномой легких (NSCLC), мелкоклеточным раком легких (SCLC), раком мочевого пузыря или метастазирующим гормон-рефрактерным раком предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет солиднкю опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование является плоскоклеточной карциномой головы и шеи (SCCHN), почечноклеточной карциномой (RCC), трижды негативным раком молочной железы (TNBC) или колоректальной карциномой. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет лимфому Ходжкина. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет трижды негативный рак молочной железы (TNBC), рак желудка, уротелиальный рак, карциному из клеток Меркеля или рак головы и шеи.
В некоторых вариантах осуществления композиции и способы, представленные в настоящем описании, можно использовать для лечения пациентов, имеющих риск развития злокачественного новообразования. Пациентов со злокачественным новообразованием можно идентифицировать различными известными в этой области способами.
В рамках изобретения термин "эффективное количество" означает количество или дозу, достаточную для получения благоприятных или желаемых результатов, включая остановку, замедление, прекращение или ингибирование прогрессирования заболевания, например, злокачественного новообразования. Эффективное количество будет варьироваться в зависимости, например, от возраста и массы тела индивидуума, которому вводят антитело, антигенсвязывающий фрагмент, кодирующий антитело полинуклеотид, вектор, содержащий полинуклеотид, и/или их композиции, тяжести симптомов и пути введения, и, таким образом, введение можно определять в индивидуальном порядке.
in vitro
Эффективное количество можно вводить за одно или более введений. В качестве примера, эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента является количеством, достаточным для улучшения, прекращения, стабилизации, реверсирования, ингибирования, замедления и/или задержки прогрессирования злокачественного новообразования у пациента, или количеством, достаточным для улучшения, прекращения, стабилизации, реверсирования, замедления и/или задержки пролиферации клеток (например, клеток в биоптате, любых из злокачественных клеток, представленных в настоящем описании, или линии клеток (например, линии злокачественных клеток)) . Как известно в этой области, эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента может варьироваться, помимо прочего, в зависимости от анамнеза пациента, а также других факторов, таких как тип (и/или доза) используемого антитела.
Эффективные количества и схемы введения антитела, кодирующих антитело полинуклеотидов и/или композиций, представленных в настоящем описании, можно определять эмпирически, как известно специалистам в этой области. Специалистам в этой области будет понятно, что доза, которую необходимо вводить, будет варьироваться в зависимости от, например, млекопитающего, которому будут вводить антитела, кодирующие антитело полинуклеотиды и/или композиции, представленные в настоящем описании, пути введения, конкретного типа используемых антител, кодирующих антитело полинуклеотидов, антигенсвязывающих фрагментов и/или композиций, представленных в настоящем описании и других лекарственных средств, вводимых млекопитающему. Руководство по выбору подходящих доз антитела или антигенсвязывающего фрагмента можно найти в литературе о терапевтическом использовании антител и антигенсвязывающих фрагментов, например, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., 1985, ch. 22 и pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York, 1977, pp. 365-389.
Типичная суточная доза эффективного количества антитела составляет от 0,01 мг/кг до 100 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления доза может составлять менее 100 мг/кг, 10 мг/кг, 9 мг/кг, 8 мг/кг, 7 мг/кг, 6 мг/кг, 5 мг/кг, 4 мг/кг, 3 мг/кг, 2 мг/кг, 1 мг/кг, 0,5 мг/кг или 0,1 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления доза может составлять более 10 мг/кг, 9 мг/кг, 8 мг/кг, 7 мг/кг, 6 мг/кг, 5 мг/кг, 4 мг/кг, 3 мг/кг, 2 мг/кг, 1 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,05 мг/кг или 0,01 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления доза составляет приблизительно 10 мг/кг, 9 мг/кг, 8 мг/кг, 7 мг/кг, 6 мг/кг, 5 мг/кг, 4 мг/кг, 3 мг/кг, 2 мг/кг, 1 мг/кг, 0,9 мг/кг, 0,8 мг/кг, 0,7 мг/кг, 0,6 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,2 мг/кг или 0,1 мг/кг.
В любых из способов, представленных в настоящем описании, по меньшей мере одно антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или фармацевтическую композицию (например, любые из антител, антигенсвязывающих фрагментов или фармацевтических композиций, представленных в настоящем описании) и, необязательно, по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство можно вводить индивидууму по меньшей мере раз в неделю (например, раз в неделю, дважды в неделю, трижды в неделю, четыре раза в неделю, раз в сутки, дважды в сутки или трижды в сутки). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два разных антитела и/или антигенсвязывающих фрагмента вводят в одной композиции (например, жидкой композиции). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело или антигенсвязывающий фрагмент и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство вводят в одной композиции (например, жидкой композиции). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело или антигенсвязывающий фрагмент и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство вводят в двух разных композициях (например, жидкой композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело или антигенсвязывающий фрагмент, и твердой пероральной композиции, содержащей по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство вводят в виде пилюли, таблетки или капсулы. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство вводят в пероральном составе с замедленным высвобождением.
В некоторых вариантах осуществления одно или более дополнительных терапевтических средств можно вводить индивидууму до или после введения по меньшей мере одного антитела, антигенсвязывающего фрагмента антитела или фармацевтической композиции (например, любого из антител, антигенсвязывающих фрагментов антител или фармацевтических композиций, представленных в настоящем описании). В некоторых вариантах осуществления одно или более дополнительных терапевтических средств и по меньшей мере одно антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела или фармацевтическую композицию (например, любое из антител, антигенсвязывающих фрагментов антител или фармацевтических композиций, представленных в настоящем описании) вводят индивидууму таким образом, что имеет место перекрывание биоактивного периода одного или более дополнительных терапевтических средств и по меньшей мере одного антитела или антигенсвязывающего фрагмента (например, любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем описании) у индивидуума.
В некоторых вариантах осуществления индивидууму можно вводить по меньшей мере одно антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела или фармацевтическую композицию (например, любое из антител, антигенсвязывающих фрагментов антител или фармацевтических композиций, представленных в настоящем описании) в течение длительного периода времени (например, в течение по меньшей мере 1 недели, 2 недель, 3 недель, 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 1 года, 2 лет, 3 лет, 4 лет или 5 лет). Специалист в области медицины может определять длительность периода лечения любыми способами, представленными в настоящем описании, для диагностики или отслеживания эффективности лечения (например, наблюдения по меньшей мере одного симптома злокачественного новообразования). Как представлено в настоящем описании, специалист в области медицины также может менять тип и количество (например, повышать или снижать) антител или антигенсвязывающих фрагментов антител (и/или одного или более дополнительных терапевтических средств), вводимых индивидууму, и также может корректировать (например, повышать или снижать) дозу или частоту введения по меньшей мере одного антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела (и/или одного или более дополнительных терапевтических средств) индивидууму с учетом оценки эффективности лечения (например, любыми способами, представленными в настоящем описании и известными в этой области).
В некоторых вариантах осуществления индивидууму можно вводить одно или более дополнительных терапевтических средств. Дополнительное терапевтическое средство может содержать один или более ингибиторов, выбранных из группы, состоящей из ингибитора B-Raf, ингибитора EGFR, ингибитора MEK, ингибитора ERK, ингибитора K-Ras, ингибитора c-Met, ингибитора киназы анапластической лимфомы (ALK), ингибитора фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), ингибитора Akt, ингибитора mTOR, двойного ингибитора PI3K/mTOR, ингибитора тирозинкиназы Брутона (BTK) и ингибитора изоцитратдегидрогеназы 1 (IDH1) и/или изоцитратдегидрогеназы 2 (IDH2). В некоторых вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство является ингибитором индоламин-2,3-диоксигеназы-1 (IDO1) (например, эпакадостатом).
В некоторых вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство может содержать один или более ингибиторов, выбранных из группы, состоящей из ингибитора HER3, ингибитора LSD1, ингибитора MDM2, ингибитора BCL2, ингибитора CHK1, ингибитора активированного пути передачи сигнала hedgehog и средства, селективно вызывающего деградацию эстрогеновых рецепторов.
В некоторых вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство может содержать одно или более терапевтических средств, выбранных из группы, состоящей из трабектедина, наб-паклитаксела, требананиба, пазопаниба, цедираниба, палбоциклиба, эверолимуса, фторпиримидина, IFL, регорафениба, реолизина, алимты, зикадии, сутента, темсиролимуса, акситиниба, эверолимуса, сорафениба, вотриента, пазопаниба, IMA-901, AGS-003, кабозантиниба, винфлунина, ингибитора Hsp90, Ad-ГМ-КСФ, темазоломида, ИЛ-2, ИФНα, винбластина, таломида, дакарбазина, циклофосфамида, леналидомида, азацитидина, леналидомида, бортезомида, амрубицина, карфилзомиба, пралатрексата и энзастаурина.
В некоторых вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство может содержать одно или более терапевтических средств, выбранных из группы, состоящей из адъюванта, агониста TLR, фактора некроза опухоли (ФНО) альфа, ИЛ-1, HMGB1, антагониста ИЛ-10, антагониста ИЛ-4, антагониста ИЛ-13, антагониста ИЛ-17, антагониста HVEM, агониста ICOS, лечения, направленного на CX3CL1, лечения, направленного на CXCL9, лечения, направленного на CXCL10, лечения, направленного на CCL5, агониста LFA-1, агониста ICAM1 и агониста селектина.
В некоторых вариантах осуществления индивидууму вводят карбоплатин, наб-паклитаксел, паклитаксел, цисплатин, пеметрексед, гемцитабин, FOLFOX или FOLFIRI.
В некоторых вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство является антителом против OX40, антителом против PD-L1, антителом против PD-L2, антителом против -3, антителом против TIGIT, антителом против BTLA, антителом против CTLA-4 или антителом против GITR.
Способы модификации и использования антител против PD-1 описаны, например, в патентных заявках США №№ US20170247454, US 20170081409 A1, US 20170044259 A1 и US 20160159905; каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Фармацевтические композиции и пути введения
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим по меньшей мере одно (например, одно, два, три или четыре) из антител или антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем описании. Два или более (например, два, три или четыре) из любых из антител или антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем описании, могут присутствовать в фармацевтической композиции в любой комбинации. Фармацевтические композиции можно составлять любым способом, известным в этой области.
Фармацевтические композиции составляют так, чтобы они были совместимыми с запланированным путем введения (например, внутривенным, внутриартериальным, внутримышечным, внутрикожным, подкожным или интраперитонеальным). Композиции могут включать стерильный дилюент (например, стерильную воду или физиологический раствор), жирное масло, полиэтиленгликоль, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители, антибактериальные или противогрибковые средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновая кислота, тиомерсал и т.п., антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия, хелатирующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота, буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и изотонические средства, такие как сахара (например, декстроза), полиспирты (например, маннит или сорбит), соли (например, хлорид натрия) или любую их комбинацию. В качестве фармацевтически приемлемых носителей также можно использовать липосомальные суспензии (см., например, патент США № 4522811). Препараты композиций можно составлять и заключать в ампулы, одноразовые шприцы или многодозовые флаконы. При необходимости (например, как в случае инъецируемых составов), правильную текучесть можно поддерживать, например, с использованием покрытия, такого как лецитин, или поверхностно-активного вещества. Абсорбцию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента можно пролонгировать посредством включения средства, замедляющего абсорбцию (например, моностеарата алюминия и желатин). Альтернативно, контролируемого высвобождения можно достигать с помощью имплантатов и микроинкапсулированных систем доставки, которые могут включать биодеградируемые, биосовместимые полимеры (например, этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, полиортоэфиры и полимолочную кислоту; Alza Corporation и Nova Pharmaceutical, Inc.).
Композиции, содержащие одно или более из любых из антител или антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем описании, можно составлять для парентерального (например, внутривенного, внутриартериального, внутримышечного, внутрикожного, подкожного или интраперитонеального) введения в стандартной лекарственной форме (т.е. физически дискретных единицах, содержащих заранее определенное количество активного соединения для простоты введения и однородности дозы).
Токсичность и терапевтическую эффективность композиций можно определять стандартными фармацевтическими способами в культурах клеток или экспериментальных животных (например, обезьянах). Например, можно определять LD50 (дозу, летальную для 50% популяции) и ED50 (дозу, терапевтически эффективную для 50% популяции), при этом терапевтический индекс представляет собой соотношение LD50:ED50. Предпочтительными являются средства, имеющие высокий терапевтический индекс. Если средство проявляет нежелательный побочный эффект, необходимо предпринять меры для минимизации возможного вреда (т.е. снизить нежелательные побочные эффекты). Токсичность и терапевтическую эффективность можно определять другими стандартными фармацевтическими способами.
Данные, полученные из анализов культур клеток и исследований на животных, можно использовать при составлении подходящих доз любого указанного средства для использования в отношении индивидуума (например, человека). Терапевтически эффективное количество одного или более (например, одного, двух, трех или четырех) антител или их антигенсвязывающих фрагментов (например, любых из антител или фрагментов антител, представленных в настоящем описании) будет количеством, с помощью которого лечат заболевание (например, уничтожают злокачественные клетки) у индивидуума (например, человека, идентифицированного как имеющего злокачественное новообразование), или индивидуума, идентифицированного как имеющего риск развития заболевания (например, индивидуума, у которого ранее развилось злокачественное новообразование, но которого излечили), снижают тяжесть, частоту и/или длительность одного или более симптомов заболевания у индивидуума (например, человека). Специалист в области медицины или ветеринарии может определять эффективность и дозу любых из антител или антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем описании, известными в этой области способами, а также посредством наблюдения одного или более симптомов заболевания у индивидуума (например, человека). Некоторые факторы могут влиять на дозу и временной режим, необходимые для эффективного лечения индивидуума (например, тяжесть заболевания или нарушения, предшествующее лечение, общее состояние здоровья и/или возраст индивидуума и наличие других заболеваний).
in vivo
Примеры доз включают миллиграммовые или микрограммовые количества любых из антител или антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем описании, на килограмм массы индивидуума (например, от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 500 мг/кг; от приблизительно 100 мкг/кг до приблизительно 500 мг/кг; от приблизительно 100 мкг/кг до приблизительно 50 мг/кг; от приблизительно 10 мкг/кг до приблизительно 5 мг/кг; от приблизительно 10 мкг/кг до приблизительно 0,5 мг/кг или от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 50 мкг/кг). Хотя эти дозы охватывают широкий диапазон, специалисту в этой области будет понятно, что терапевтические средства, включая антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, варьируются по своей активности, и эффективные количества можно определять известными в этой области способами. Как правило, сначала вводят относительно низкие количества, а затем специалист в области медицины или ветеринарии (в случае терапевтического использования) или исследователь (при работе на стадии разработки) может постепенно повышать дозу до достижения соответствующего ответа. Кроме того, следует понимать, что конкретный уровень дозы для любого конкретного индивидуума будет зависеть от различных факторов, включая активность конкретного используемого соединения, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и питания индивидуума, времени введения, пути введения, скорости экскреции и времени полужизни антитела или фрагмента антитела .
Фармацевтические композиции можно включать в контейнер, упаковку или диспенсер вместе с инструкциями по введению. Настоящее изобретение также относится к способам производства антител или их антигенсвязывающих фрагментов для различного применения, как представлено в настоящем описании.
ПРИМЕРЫ
Далее настоящее изобретение описано с использованием следующих примеров, неограничивающих объем изобретения, описанный в формуле изобретения.
Пример 1. Получение антител мыши против hPD-1
Для получения антител мыши против PD-1 человека (hPD-1; SEQ ID NO:22) самок мышей BALB/c возрастом 6-8 недель иммунизировали с использованием PD-1 человека. Антитела против hPD-1 собирали способами, описанными ниже и показанными на фиг. 1 и фиг. 2.
Иммунизация мышей
Самок мышей BALB/c возрастом 6-8 недель иммунизировали с использованием His-меченых белков PD-1 человека в количестве 20 мкг/мышь при концентрации 100 мкг/мл. His-меченые белки PD-1 человека эмульгировали с адъювантом и инъецировали в четырех положениях на спине мыши. Для первой подкожной (s.c.) инъекции разбавленный антиген эмульгировали с полным адъювантом Фрейнда (CFA) в равном объеме. При последующих подкожных инъекциях белок эмульгировали с неполным адъювантом Фрейнда (IFA) в равном объеме. Через три дня после третьей инъекции или бустерной иммунизации собирали кровь (сыворотку) и анализировали на титр антител с использованием ELISA.
В другом эксперименте самок мышей BALB/c возрастом 6-8 недель иммунизировали посредством инъекции мышам экспрессирующей плазмиды, кодирующей PD-1 человека. Плазмиды, кодирующие антиген, инъецировали в переднюю большеберцовую мышцу (внутримышечная инъекция; i.m. инъекция) мышей с использованием генной пушки в концентрации 1000 мкг/мкл в количестве 60 мкг на мышь. Осуществляли по меньшей мере четыре инъекции с по меньшей мере 14 днями между двумя инъекциями. Кровь (сыворотку) собирали через семь дней после последней иммунизации и тестировали сыворотку на титр антител посредством ELISA.
Также осуществляли способы для усиления иммунизации по меньшей мере через четырнадцать дней после предшествующей иммунизации (посредством инъекции плазмиды или инъекции белков). Клетки CHO, экспрессирующие антиген PD-1 на своей поверхности, инъецировали мышам внутривенно через хвостовые вены. Через четыре дня после инъекции получали селезенки.
Слияние клеток SP2/0 и клеток селезенки
Измельчали ткани селезенки. Клетки селезенки сначала подвергали селекции с помощью микрочастиц с CD3ε и микрочастиц с антителом против IgM мыши, а затем подвергали слиянию с клетками SP2/0. Затем клетки высевали в 96-луночные планшеты с гипоксантин-аминоптерин-тимидиновой средой (HAT).
Первичный скрининг гибридом
4
Первичный скрининг супернатанта гибридомы в 96-луночных планшетах осуществляли с использованием активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS) стандартными способами. Перед скринингом клетки яичника китайского хомяка (CHO) добавляли в 96-луночные планшеты (2×10 клеток на лунку). Использовали 50 мкл супернатанта. Используемые в экспериментах антитела являлись следующими
2
(1) флуоресцеин (FITC)-конъюгированный F(ab)-фрагмент козы против IgG мыши AffiniPure, Fcγ-фрагмент-специфический, и
2
(2) Alexa Fluor 647-уонъюгированный F(ab)-фрагмент козы против IgG человека AffiniPure, Fcγ-фрагмент-специфический.
Субклонирование
Субклонирование осуществляли с использованием ClonePix2. В кратком изложении, содержимое положительных лунок, идентифицированных в ходе первичного скрининга, переносили на полутвердую среду и идентифицировали и тестировали IgG-положительные клоны. Использовали FITC-конъюгированное антитело против Fc IgG мыши.
Антитела асцитной жидкости
6

1×10 положительных гибридомных клеток интраперитонеально инъецировали мышам B-NDG(Beijing Biocytogen, Beijing, China). Моноклональные антитела получали посредством выращивания гибридомных клеток в брюшной полости мыши. Гибридомные клетки делились и продуцировали асцитную жидкость в брюшной полости мышей. Жидкость содержала высокую концентрацию антитела, которое можно собирать для последующего использования.
Очистка антител
Антитела в асцитной жидкости очищали с использованием белковой хроматографии с помощью GE AKTA (GE Healthcare, Chicago, Illinois, United States). 25-1A7 ("1A7"), 18-3F1 ("3F1") и 3-6G1 ("6G1") были среди антител мыши, получаемых описанными выше способами.
Определяли VH, VL и области CDR антител. Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2, CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи 1A7 приведены в SEQ ID NO:1-6 (нумерация по Kabat) или SEQ ID NO:16, 17, 3, 4, 5, 6 (нумерация по Chothia).
Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2, CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи 3F1 приведены в SEQ ID NO:7-12 (нумерация по Kabat) или SEQ ID NO:18, 19, 9, 10, 11, 12 (нумерация по Chothia).
Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2, CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи 6G1 приведены в SEQ ID NO:7, 13, 14, 10, 11, 15 (нумерация по Kabat) или SEQ ID NO:20, 21, 14, 10, 11, 15 (нумерация по Chothia).
Пример 2. Гуманизация антител мыши
Отправной точкой гуманизации являлись антитела мыши (например, 1A7 и 3F1). Определяли аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи этих антител мыши.
Конструировали три гуманизированных варианта вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO:26-28) и три гуманизированных варианта вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO:29-31) 1A7, содержащие разные модификации или замены.
Конструировали четыре гуманизированных варианта вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO:32-35) и три гуманизированных варианта вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO:36-38) 3F1, содержащие разные модификации или замены.
Эти гуманизированные варианты вариабельной области тяжелой цепи можно комбинировать с любыми вариантами вариабельной области легкой цепи, основанными на том же антителе мыши. Например, 1A7-H1 (SEQ ID NO:26) можно комбинировать с любым гуманизированным вариантом вариабельной области легкой цепи, основанным на том же антителе мыши 1A7 (например, 1A7-K3 (SEQ ID NO:31)), и антитело метят таким образом (например,1A7-H1K3).
Затем эти гуманизированные антитела получали с использованием BioLuminate 1.0 (Schrodinger, Shanghai, China).
Пример 3. Тестирование
in vitro
антител мыши против hPD-1: блокирование связывания PD-1 человека (hPD-1) и PD-L1 человека (hPD-L1)
Осуществляли анализы блокирования для определения того, могут ли антитела против hPD-1 блокировать связывание hPD-1 с его лигандом hPD-L1.
Антитела против hPD-1 собирали из асцитной жидкости мыши и очищали посредством хроматографии. В каждую лунку планшета добавляли 25 мкл клеток CHO, транзиторно трансфицированных с использованием PD-1 человека. Очищенные антитела титровали до конечных концентраций 50, 5, 0,5, 0,05, 0,005 мкг/мл. Титруемые антитела добавляли в каждую лунку в количестве 25 мкл на лунку при 4°C и инкубировали в течение 30 минут.
В каждую лунку добавляли 50 мкл биотин-hPD-L1 (с конечной концентрацией 2 мкг/мл в каждой лунке). Клетки с биотин-hPD-L1 и антитела инкубировали при 4°C в течение 15 минут.
После двукратной промывки фосфатно-солевым буфером (PBS) в каждую лунку добавляли 50 мкл FITC-меченого антитела против Fc IgG мыши (против Fc mIgG-FITC) при разведении 1:100 и PE-меченого стрептавидина (стрептавидина-PE) при разведении 1:100 и инкубировали в течение 30 минут при 4°C с последующей промывкой PBS. Сигналы FITC и PE определяли посредством проточной цитометрии.
Как показано на фиг. 3, когда концентрация антител мыши против PD-1 25-1A7, 18-3F1 и 03-6G1 повышалась, сигнал клеток, связывающихся с PD-L1, снижался (ось y), в то время как сигнал клеток, связывающихся с антителами мыши против PD-1, повышался, что позволяет предполагать, что связывание между PD-1 человека и PD-L1 блокировали с помощью антител против hPD-1.
Пример 4. Перекрестная реактивность антител против hPD-1 против PD-1 обезьяны, PD-1 мыши и химерного PD-1 человека-мыши
В каждом эксперименте клетки CHO трансфицировали с использованием PD-1 мыши (mPD-1, SEQ ID NO:23), PD-1 обезьяны (макака-резуса) (rmPD-1, SEQ ID NO:24) или химерного PD-1 (мыши и человека) (chiPD-1, SEQ ID NO:25).
В каждую лунку добавляли 25 мкл клеток CHO. В каждую лунку добавляли 25 мкл очищенных антител против hPD-1 (1 мкг/мл) (1A7, 3F1 или 6G1) и инкубировали при 4°C в течение 30 минут.
После двукратной промывки PBS (1200 об./мин, 5 мин) в каждую лунку добавляли 50 мкл FITC-меченого антитела против Fc IgG мыши (против Fc mIgG-FITC) в разведении 1:500 с последующей инкубацией при 4°C в течение 30 минут и промывкой PBS (1200 об./мин, 5 мин). Сигналы FITC определяли посредством проточной цитометрии.
Как показано на фиг. 4, 1A7, 3F1 и 6G1 не реагировали перекрестно с PD-1 мыши, но имели сильную перекрестную реактивность с rmPD-1 и некоторую перекрестную реактивность с химерным PD-1. На фиг. 4 "NC" означает отрицательный контроль.
Пример 5. Аффинность связывания антител против hPD-1
Аффинность связывания антител против hPD-1 измеряли с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с помощью биосенсора Biacore T200 (Biacore, INC, Piscataway N.J.), оборудованного сенсорными чипами с предварительно иммобилизованным протеином A.
Антитело против hPD-1 1A7-mHvKv-IgG4-S228P (1 мкг/мл) впрыскивали на биосенсор Biacore T200 в количестве 10 мкл/мин в течение 30 секунд для достижения желаемой плотности белка (приблизительно 67 единиц ответа (RU)). Затем меченые гистидином белки PD-1 человека (hPD-1-His) в концентрации 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5625 нМ впрыскивали в количестве 30 мкл/мин в течение 100 секунд. Проводили мониторинг диссоциации в течение 400 секунд. Чип регенерировали глицином (pH 2,0, 30 мкл/мин в течение 12 секунд) после последней инъекции каждого титра. Результаты для 1A7-mHvKv-IgG4-S228P показаны на фиг. 5.
on
off
off
on
Кинетические скорости ассоциации (k) и скорости диссоциации (k) получали одновременно посредством глобальной аппроксимации данных по модели связывания Ленгмюра 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., 1994. Methods Enzymology 6. 99-110) с использованием программного обеспечения Biacore T200 Evaluation Software 3.0. Аффинности можно выводить из отношения кинетических констант скорости (KD=k/k).
Как будет понятно специалисту в этой области, тот же способ с соответствующей корректировкой параметров (например, концентрации антитела) осуществляли для каждого тестируемого антитела. Например, на фиг. 6 показан график, на котором представлены результаты для 3F1-mHvKv-IgG4-S228P. Результаты для тестируемых антител обобщены в таблице 1 ниже.
Таблица 1
<b>Антитела против hPD-1</b>
<b>Скорость ассоциации (k</b><sub><b>on</b></sub><b>) (1/Мс)</b>
<b>Скорость диссоциации (k</b><sub><b>off</b></sub><b>) (1/с)</b>
<b>Аффинность (KD) (M)</b>
1A7-mHvKv-IgG4-S228P
4,07E+05
9,56E-04
2,35E-09
1A7-H1K1-IgG4-S228P
5,68E+04
2,72E-03
4,79E-08
1A7-H1K2-IgG4-S228P
8,26E+04
2,65E-03
3,21E-08
1A7-H1K3-IgG4-S228P
1,18E+05
1,19E-03
1,01E-08
1A7-H2K1-IgG4-S228P
4,89E+04
2,80E-03
5,73E-08
1A7-H2K2-IgG4-S228P
4,88E+04
2,82E-03
5,78E-08
1A7-H2K3-IgG4-S228P
1,15E+05
1,36E-03
1,19E-08
1A7-H3K1-IgG4-S228P
6,62E+04
2,64E-03
3,99E-08
1A7-H3K2-IgG4-S228P
4,81E+04
2,80E-03
5,82E-08
1A7-H3K3-IgG4-S228P
1,02E+05
1,32E-03
1,29E-08
3F1-mHvKv-IgG4-S228P
3,70E+03
1,28E-03
3,46E-07
3F1-H1K1-IgG4-S228P
4,81E+03
1,81E-03
3,76E-07
3F1-H1K2-IgG4-S228P
5,27E+03
1,55E-03
2,94E-07
3F1-H1K3-IgG4-S228P
4,79E+03
1,32E-03
2,75E-07
3F1-H2K1-IgG4-S228P
4,55E+03
1,92E-03
4,22E-07
3F1-H2K2-IgG4-S228P
4,81E+03
1,70E-03
3,54E-07
3F1-H2K3-IgG4-S228P
4,41E+03
1,45E-03
3,29E-07
3F1-H3K1-IgG4-S228P
4,53E+03
1,79E-03
3,95E-07
3F1-H3K2-IgG4-S228P
5,06E+03
1,50E-03
2,96E-07
3F1-H3K3-IgG4-S228P
4,38E+03
1,39E-03
3,18E-07
3F1-H4K1-IgG4-S228P
4,42E+03
2,04E-03
4,60E-07
3F1-H4K2-IgG4-S228P
4,80E+03
1,77E-03
3,69E-07
3F1-H4K3-IgG4-S228P
4,06E+03
1,61E-03
3,97E-07
Среди этих тестируемых антител, 1A7 и 3F1 являются антителами мыши против hPD-1, описанными в примере 1. На основе 1A7 и 3F1 получали химерные антитела против hPD-1, включая 1A7-mHvKv-IgG4-S228P и 3F1-mHvKv-IgG4-S228P. Химерные антитела содержат вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи из соответствующих антител мыши против hPD-1 с константными доменами из антитела IgG4 человека (включая, например, домены CL, CH1, CH2 и CH3).
Тестируемые антитела также включают гуманизированные антитела, например, 1A7-H1K1-IgG4-S228P, 1A7-H1K2-IgG4-S228P, 1A7-H1K3-IgG4-S228P, 1A7-H2K1-IgG4-S228P, 1A7-H2K2-IgG4-S228P, 1A7-H2K3-IgG4-S228P, 1A7-H3K1-IgG4-S228P, 1A7-H3K2-IgG4-S228P, 1A7-H3K3-IgG4-S228P, 3F1-H1K1-IgG4-S228P, 3F1-H1K2-IgG4-S228P, 3F1-H1K3-IgG4-S228P, 3F1-H2K1-IgG4-S228P, 3F1-H2K2-IgG4-S228P, 3F1-H2K3-IgG4-S228P, 3F1-H3K1-IgG4-S228P, 3F1-H3K2-IgG4-S228P, 3F1-H3K3-IgG4-S228P, 3F1-H4K1-IgG4-S228P, 3F1-H4K2-IgG4-S228P и 3F1-H4K3-IgG4-S228P. Гуманизированные антитела содержат константные домены антитела IgG4 человека (включая, например, домены CL, CH1, CH2 и CH3). Гуманизированные вариабельные домены тяжелой цепи нумеруют как H1, H2, H3 и т.д.; и гуманизированные вариабельные домены легкой цепи нумеруют как K1, K2, K3 и т.д. Последовательности гуманизированных вариабельных доменов показаны на фиг. 19. Например, 1A7-H1K1-IgG4-S228P основано на антителе мыши 1A7 и содержит гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи H1 (SEQ ID NO:26) и гуманизированный вариабельный домен легкой цепи K1 (SEQ ID NO:29). Аналогично, 3F1-H1K1-IgG4-S228P основано на антителе мыши 3F1 и содержит гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи H1 (SEQ ID NO:32) и гуманизированный 9H3 вариабельный домен легкой цепи K1 (SEQ ID NO:36).
Названия и последовательности химерных антител против PD-1 и гуманизированных антител против PD-1 приведены в таблице 2 ниже. Для повышения эффективности продукции посредством устранения обмена Fab-фрагментов дополнительно конструировали Fc-область антител, заменяя серин в положении 228 (нумерация EU) пролином (S228P).
Таблица 2
<b>Тип</b>
<b>Название антитела</b>
<b>VH SEQ ID NO:</b>
<b>VL SEQ ID NO:</b>
<b>Константные области </b>
Химерное антитело на основе 1A7
1A7-mHvKv-IgG4-S228P
39
40
IgG4 человека с мутацией S228P
Гуманизированные антитела на основе 1A7
1A7-H1K1-IgG4-S228P
26
29
IgG4 человека с мутацией S228P
1A7-H1K2-IgG4-S228P
26
30
IgG4 человека с мутацией S228P
1A7-H1K3-IgG4-S228P
26
31
IgG4 человека с мутацией S228P
1A7-H2K1-IgG4-S228P
27
29
IgG4 человека с мутацией S228P
1A7-H2K2-IgG4-S228P
27
30
IgG4 человека с мутацией S228P
1A7-H2K3-IgG4-S228P
27
31
IgG4 человека с мутацией S228P
1A7-H3K1-IgG4-S228P
28
29
IgG4 человека с мутацией S228P
1A7-H3K2-IgG4-S228P
28
30
IgG4 человека с мутацией S228P
1A7-H3K3-IgG4-S228P
28
31
IgG4 человека с мутацией S228P
Химерное антитело на основе 3F1
3F1-mHvKv-IgG4-S228P
41
42
IgG4 человека с мутацией S228P
Гуманизированные антитела на основе 3F1
3F1-H1K1-IgG4-S228P
32
36
IgG4 человека с мутацией S228P
3F1-H1K2-IgG4-S228P
32
37
IgG4 человека с мутацией S228P
3F1-H1K3-IgG4-S228P
32
38
IgG4 человека с мутацией S228P
3F1-H2K1-IgG4-S228P
33
36
IgG4 человека с мутацией S228P
3F1-H2K2-IgG4-S228P
33
37
IgG4 человека с мутацией S228P
3F1-H2K3-IgG4-S228P
33
38
IgG4 человека с мутацией S228P
3F1-H3K1-IgG4-S228P
34
36
IgG4 человека с мутацией S228P
3F1-H3K2-IgG4-S228P
34
37
IgG4 человека с мутацией S228P
3F1-H3K3-IgG4-S228P
34
38
IgG4 человека с мутацией S228P
3F1-H4K1-IgG4-S228P
35
36
IgG4 человека с мутацией S228P
3F1-H4K2-IgG4-S228P
35
37
IgG4 человека с мутацией S228P
3F1-H4K3-IgG4-S228P
35
38
IgG4 человека с мутацией S228P
Пример 6. Термостабильность антител против hPD-1
Проводили анализ Thermofluor с использованием набора красителей Protein Thermal Shift™ (Thermo Fisher Scientific) и систем для ПЦР в реальном времени QuantStudio™ 5 (Thermo Fisher Scientific). В этом анализе измеряют термостабильность с использованием флуоресцентного красителя, связывающегося с гидрофобными участками, экспонируемыми при разворачивании белка.
Эксперимента осуществляли по инструкциям производителя. Смешивали 2 мкл антитела, 10,5 мкл воды, 5 мкл буфера Protein Thermal Shift и 2,5 мкл разведенного красителя Protein Thermal Shift. Образцы нагревали до 25°C со скоростью 1,6°C/секунду, а затем нагревали до 99 C со скоростью 0,05°C/секунду.
В таблице ниже приведены Tm четырех гуманизированных антител против hPD-1.
Таблица 3
<b>Антитело</b>
<b>Вариабельные домены</b>
<b>Тип (константные домены)</b>
<b>Термостабильность (Tm, °C)</b>
1A7-H1K3-IgG4-S228P
1A7 H1K3
IgG4 человека с мутацией S228P
75,94
1A7-H2K3-IgG4-S228P
1A7 H2K3
IgG4 человека с мутацией S228P
76,09
3F1-H1K2-IgG4-S228P
3F1 H1K2
IgG4 человека с мутацией S228P
82,82
3F1-H1K3-IgG4-S228P
3F1 H1K3
IgG4 человека с мутацией S228P
82,37
Пример 7. Тестирование
in vivo
антител мыши и химерных антител против hPD-1
in vivo
Для тестирования антител против hPD-1 и прогнозирования их эффектов в отношении человека получали модель гуманизированного PD-1 мыши. Гуманизированную модель PD-1 мыши конструировали для экспрессии химерного белка PD-1 (SEQ ID NO:25), где часть внеклеточной области белка PD-1 мыши заменяли соответствующей внеклеточной областью PD-1 человека. Аминокислотные остатки 31-141 PD-1 мыши (SEQ ID NO:23) заменяли аминокислотными остатками 31-141 PD-1 человека (SEQ ID NO:22). Гуманизированная модель на мышах (B-hPD-1) представляет собой новый инструмент для тестирования нового терапевтического лечения в клинических условиях благодаря значительному уменьшению различий между клиническим исходом у человека и обычных мышей, экспрессирующих PD-1 мыши. Подробное описание гуманизированной модели PD-1 мыши можно найти в международной заявке № PCT/CN2017/090320, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
in vivo
3
Антитела против hPD-1 тестировали на их эффект в отношении роста опухоли  в модели карциномы толстого кишечника. Опухолевые клетки MC-38 (клетки аденокарциномы толстого кишечника) подкожно инъецировали мышам B-hPD-1. Когда опухоли в мышах достигали объема 150 ± 50 мм, мышей случайным образом распределяли по разным группам на основе объема опухоли (по пять мышей в каждой группе).
Затем мышам инъецировали физиологический раствор (PS) и антитела против hPD-1 посредством интраперитонеального введения. Антитело вводили в первый день и четвертый день каждой недели в течение 3 недель (всего 6 инъекций).
2
Инъецируемый объем вычисляли с учетом массы мыши как 1 мг/кг. Измеряли опухоль по длинной оси и короткой оси и вычисляли объем опухоли как 0,5×(длинная ось)×(короткая ось). Также измеряли массу мыши перед инъекцией, когда мышей распределяли по разным группам (перед первой инъекцией антитела), дважды в неделю в период инъекций антитела и перед умерщвлением.
Процент ингибирования роста опухоли (TGI%) вычисляли по следующей формуле: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100. Ti является средним объемом опухоли в группе лечения в день i. T0 является средним объемом опухоли в группе лечения в нулевой день. Vi является средним объемом опухоли в контрольной группе в день i. V0 является средним объемом опухоли в контрольной группе в нулевой день.
Для статистического анализа использовали t-критерий Стьюдента. TGI% выше 60% свидетельствует о значительной супрессии роста опухоли. P<0,05 является пороговым значением статистической значимости.
Результаты in vivo для антител мыши против hPD-1 25-1A7 и 18-3F1
В каждой из четырех групп (G1, G2, G3, G4) мышам B-hPD-1 инъецировали физиологический раствор (PS) в качестве контроля (G1), Китруда (G2), антитело мыши против hPD-125-1A7 (G3) или антитело мыши против hPD-1 18-3F1 (G4). Проводили мониторинг массы мышей в течение всего периода лечения. Масса мышей во всех группах увеличивалась (фиг. 7 и фиг. 8). Не наблюдали значимых различий массы среди четырех групп. Результаты свидетельствуют о том, что 1A7 и 3F1 хорошо переносились и не были токсичными для мышей.
.
Размер опухоли в группах, которым вводили Китруда, 1A7 или 3F1, повышался в меньшей степени, чем в контрольной группе (фиг9). В частности, размер опухоли в G3 меньше, чем в G2; и размер опухоли в G4 меньше, чем в G2.
Также вычисляли TGI% в день 24 (через 24 дня после распределения по группам), как показано в таблице ниже.
Таблица 4
<b>Группа</b>
<b>Антитела</b>
<b>Средний размер опухоли ко дню 24</b>
<b>TGI%</b>
<b>Значение P (относительно контроля)</b>
G1
PS (1 мг/кг; i.p. введение; дважды в неделю, всего 6 инъекций)
1078
-
-
G2
Китруда (1 мг/кг) (1 мг/кг; i.p. введение; дважды в неделю, всего 6 инъекций)
842
25,3%
0,691
G3
25-1A7 (1 мг/кг) (1 мг/кг; i.p. введение; дважды в неделю, всего 6 инъекций)
258
87,9%
0,153
G4
18-3F1 (1 мг/кг) (1 мг/кг; i.p. введение; дважды в неделю, всего 6 инъекций)
646
46,3%
0,439
Результаты in vivo для химерных антител против hPD-1
Мышам B-hPD-1 (мышам с гуманизированным PD-1) вводили химерные антитела против hPD-1 03-6G1-mHvKv-IgG4-S228P (группа 2, G2), 18-3F1-mHvKv-IgG4-S228P (группа 3, G3), 25-1A7-mHvKv-IgG4-S228P (группа 4, G4) и Китруда (группа 5) посредством интраперитонеального введения. В качестве контроля инъецировали физиологический раствор (группа 1, G1). Инъецируемое количество антител вычисляли с учетом массы мыши как 1 мг/кг. Антитела вводили в первый день и четвертый день каждой недели (всего 6 инъекций).
Осуществляли мониторинг массы мышей в течение всего периода лечения. Во всех группах масса мышей увеличивалась (фиг. 10 и фиг. 11). Не наблюдали значимых различий массы в разных группах. Результаты свидетельствуют о том, что антитела против hPD-1 хорошо переносились и не были токсичными для мышей.
.
В группах, которым вводили химерные антитела, наблюдали значимые различия размера опухоли по сравнению с контрольной группой (фиг12).
TGI% в день 20 (через 20 дней после распределения по группам) для каждой группы лечения вычисляли, как показано в таблице ниже.
Таблица 5
<b>Группа</b>
<b>Антитела</b>
<b>Средний размер опухоли в день 20</b>
<b>TGI%</b>
<b>Значение P</b>
G1
PS
1427
-
-
G2
03-6G1-mHvKv-IgG4-S228P (1 мг/кг; i.p. введение; дважды в неделю, всего 6 инъекций)
564
66,0%
0,032
G3
18-3F1-mHvKv-IgG4-S228P (1 мг/кг; i.p. введение; дважды в неделю, всего 6 инъекций)
700
55,6%
0,056
G4
25-1A7-mHvKv-IgG4-S228P (1 мг/кг; i.p. введение; дважды в неделю, всего 6 инъекций)
356
81,9%
0,011
G5
Китруда (1 мг/кг; i.p. введение; дважды в неделю, всего 6 инъекций)
200
93,8%
0,005
Результаты свидетельствуют о том, что химерные антитела 03-6G1-mHvKv-IgG4-S228P и 25-1A7-mHvKv-IgG4-S228P значительно ингибировали рост опухоли. Среди трех химерных антител, 25-1A7-mHvKv-IgG4-S228P имело наиболее высокий TGI%.
Пример 8. Тестирование
in vivo
гуманизированных антител против hPD-1
in vivo
Гуманизированные антитела против hPD-1 тестировали на мышах с гуманизированным PD-1 (B-hPD-1) для демонстрации их эффекта в отношении роста опухоли .
3
Мышам B-hPD-1 подкожно инъецировали опухолевые клетки MC-38 (клетки аденокарциномы толстого кишечника). Когда опухоли у мышей достигали объема 150 ± 50 мм, мышей случайным образом распределяли по разным группам с учетом объема опухоли (по пять мышей в каждой группе).
Затем мышам инъецировали физиологический раствор в качестве контроля (G1), гуманизированное антитело против PD-1 1A7-H1K3-IgG4-S228P (G2), гуманизированное антитело против PD-1 1A7-H2K3-IgG4-S228P (G3) или Китруда (G4). Антитела вводили во второй день и пятый день каждой недели посредством интраперитонеальной инъекции в количестве 1 мг/кг в течение 3 недель (всего 6 инъекций).
Осуществляли мониторинг массы мышей в течение всего периода лечения. Во всех группах масса мышей увеличивалась (фиг. 13 и фиг. 14). Не наблюдали значимых различий массы в разных группах. Результаты свидетельствуют о том, что антитела против hPD-1 хорошо переносились и не были токсичными для мышей.
В группах, которым вводили антитела против hPD-1, наблюдали значимые различия размера опухоли (фиг. 15). В частности, размер опухоли в G2 меньше, чем в G4; и размер опухоли в G3 меньше, чем в G4.
Также вычисляли TGI% в день 21 (через 21 после распределения по группам) в каждой группе лечения, как показано в таблице ниже.
Таблица 6
<b>Группа</b>
<b>Антитела</b>
<b>Средний размер опухоли в день 18</b>
<b>TGI%</b>
<b>Значение P</b>
G1
PS
1986
-
-
G2
1A7-H1K3-IgG4 (1 мг/кг)
233
94,5%
0,001
G3
1A7-H2K3-IgG4 (1 мг/кг)
150
99,0%
0,001
G4
Китруда (1 мг/кг)
422
84,4%
0,006
Описанные выше результаты свидетельствуют о том, что все антитела против hPD-1 могут ингибировать рост опухоли. Среди них, 1A7-H2K3-IgG4 (1 мг/кг) имело наиболее высокий процент ингибирования роста опухоли (TGI%).
ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Следует понимать, что, хотя настоящее изобретение представлено в сочетании с подробным описанием, изложенное выше описание предназначено для иллюстрирования, а не для ограничения объема изобретения, определенного объемом формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации входят в объем формулы изобретения.