КОРМА ДЛЯ ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ, СОДЕРЖАЩИЕ ПРОБИОТИЧЕСКИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ
DOMESTIC ANIMAL FODDERS CONTAINING PROBIOTIC MICROORGANISMS

Настоящее изобретение относится к области кормов для домашних животных. В частности, настоящее изобретение обеспечивает композиции кормов для домашних животных, содержащие нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы. Эти нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы могут быть, например, биологически активными пробиотическими микроорганизмами, подвергнутыми тепловой обработке. Настоящее изобретение также относится к обеспечиваемой этими нереплицирующимися пробиотическими микроорганизмами пользе для здоровья.
При этом полезные для здоровья эффекты пробиотиков широко используются в данной области и в обобщенном виде представлены, например, Blum и др. в Curr Issues Intest Microbiol. 2003 сентябрь; 4(2):53-60. Часто пробиотики применяются в симбиотических рецептурах совместно с пребиотиками, которые могут еще больше усиливать полезные для здоровья эффекты.
Хорошее самочувствие домашних животных тесно связано с их питанием. Следствием правильного питания должно быть здоровое и находящееся в хорошей физической форме домашнее животное. Помимо обеспечения питательной ценности, композиция пищи оказывает влияние на уравновешенность кишечной микрофлоры и может стать причиной или же, наоборот, барьером для развития желудочно-кишечных расстройств. Поэтому сведения относительно желудочно-кишечного тракта и процессов пищеварения у здоровых животных являются неотъемлемой частью понимания практики осуществления кормления.
Желудочно-кишечные расстройства у собак и кошек часто бывают связаны с чрезмерно быстрым развитием микрофлоры и выработкой энтеротоксинов, продуцируемых патогенными бактериями.
В течение нескольких прошедших лет исследования сосредотачивались на некоторых полезных штаммах молочнокислых бактерий и потенциале их применения в качестве пробиотических агентов. Пробиотиками считаются жизнеспособные микробные препараты, которые способствуют поддержанию здоровья млекопитающих посредством сохранения естественной микрофлоры кишечника. Полагают, что пробиотики прикрепляются к слизистой оболочке кишечника, колонизируют кишечный тракт и таким образом препятствуют закреплению на ней вредных микроорганизмов. Условие для осуществления их активности состоит в том, что они должны достичь слизистой оболочки кишечника в надлежащей и жизнеспособной форме и, в частности, чтобы не подвергались разрушительному действию преобладающего в желудке низкого pH. При этом физиология пищеварительного тракта кошек и собак отличается от физиологии людей. Например, средний показатель pH в желудке собак составляет около 3,4, а у кошек 4,2.
Патент US 7189390 описывает новые молочнокислые бактериальные микроорганизмы, которые были выделены и отобраны из-за их пробиотического потенциала, а также их применение в целях приготовления композиций кормов для домашних животных, предназначенных для улучшения состояния здоровья домашних животных.
Так как вплоть до 70% компонентов иммунной системы содержатся внутри пищеварительного тракта животных, пробиотики оказывают содействие не только здоровому состоянию пищеварительной системы животного, но и всей иммунной системы домашнего животного.
Пробиотические бактерии, как известно, способны прилипать к клеткам кишечника и вытеснять с клеток кишечника патогенные бактерии. Для того, чтобы обладать такой активностью, пробиотические бактерии должны оставаться жизнеспособными в продукте до момента его употребления. Добавление живых бактерий в гранулы корма для домашних животных таким образом, чтобы они оставались жизнеспособными до тех пор, пока продукт не будет употреблен, а бактерии сохраняли бы свою жизнеспособность в кишечном тракте, остается важной задачей, и ее решение требует значительных технический усилий.
Было бы желательно располагать композицией корма для домашних животных, способной обеспечивать полезное пробиотическое действие даже после длительных сроков хранения в критических для пробиотиков условиях и являющейся при этом простой в приготовлении. Было бы предпочтительным достичь этого посредством применения натуральных ингредиентов, которые являются безопасными для употребления, не обладая при этом побочными эффектами, и которые легко вводятся в композиции кормов для домашних животных с использованием промышленных технологий существующего уровня техники.
Также для таких препаратов было бы желательным дальнейшее улучшение укрепляющего иммунную систему действия пробиотиков.
Помимо этого, было бы желательным дальнейшее улучшение противовоспалительного эффекта пробиотиков в таких препаратах.
Настоящее изобретение обращается именно к этой потребности. То есть цель настоящего изобретения состоит в улучшении существующего уровня техники и предоставлении композиций кормов для домашних животных, которые отвечали бы обозначенной выше потребности.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что они могут достигнуть этого с помощью объектов независимых пунктов формулы изобретения. Основную идею настоящего изобретения развивают дополнительные пункты формулы изобретения.
Авторы настоящего изобретения смогли показать, что нереплицирующиеся пробиотики также могут приносить здоровью ту пользу, которую обеспечивают пробиотики, и, возможно, даже в еще большей степени.
Следовательно, представляются излишними усложненные меры по сохранению пробиотиков в конечном продукте в живом состоянии и обеспечению их поступления в живом состоянии в кишечник.
Соответственно, настоящее изобретение предлагает обеспечить композиции кормов для домашних животных, содержащие нереплицирующиеся пробиотичекие микроорганизмы.
Композиции кормов для домашних животных для целей настоящего изобретения содержат различные композиции, например, пищевые продукты, питательные диеты, биологически активные добавки к пище, лакомства и съедобные игрушки, такие как жевательные и съедаемые игрушки.
Для целей настоящего изобретения домашние животные включают таких домашних животных, как, например, собаки, кошки, птицы, кролики, морские свинки, козы, коровы, лошади, свиньи.
В некоторых воплощениях такие композиции являются кормами в любой подходящей форме, например, жидкими или твердыми кормами. Когда корма являются жидкими кормами, нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы могут к кормам примешиваться. Когда корма являются твердыми кормами, нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы могут наноситься на корма, вноситься в корма или же могут использоваться оба этих способа. При нанесении или внесении в корма нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы могут быть гомогенно или же негомогенно распределены по поверхности или внутри корма.
Композиции корма для домашних животных настоящего изобретения в типичном случае содержат углеводную часть, белковую часть и жировую часть.
Проценты, если не указывается иного, являются массовыми процентами (масс.%) в отнесении на сухую массу.
Композиция корма для домашних животных может содержать от около 12% до около 70%, предпочтительно от около 16% до около 65%, более предпочтительно от около 20% до около 60%, наиболее предпочтительно от около 30% до около 60% углеводной части; от около 12% до около 50%, предпочтительно от около 16% до около 45%, более предпочтительно от около 18% до около 40%, наиболее предпочтительно от около 20% до около 35% белковой части; и от около 4% до около 40%, предпочтительно от около 6% до около 30%, более предпочтительно от около 8% до около 25%, наиболее предпочтительно от около 10% до около 20% жировой части.
Для некоторых композиций корма для домашних животных, например, в случае лакомства для домашних животных, композиции могут содержать от около 1 до около 12% жира, в типичном случае в форме покрытия, предназначенного для усиления вкусовой привлекательности.
Композиция корма для домашних животных может также содержать пищевые волокна в количестве от около 0,5% до около 40%, предпочтительно от около 0,5% до около 30%, более предпочтительно от около 1% до около 20%, наиболее предпочтительно от около 1% до около 10%
Также могут быть добавлены средства обеспечения сбалансированности питания (то есть витамины, минеральные вещества, микроэлементы и их комбинации). В типичном случае такие средства обеспечения сбалансированности питания могут добавляться в количестве от около 0,01% до около 15%, предпочтительно от около 0,05% до около 10%, более предпочтительно от около 1% до около 5%, наиболее предпочтительно от около 1% до около 3%
Конкретные количества, подходящие для каждого ингредиента в композиции, будут зависеть от множества факторов, таких как вид потребляющего композицию животного, наличие определенных включенных в композицию ингредиентов; возраста, массы, общего состояния здоровья, пола и диеты животного; нормы потребления данного животного и т.п. Поэтому количества таких ингредиентов могут варьировать в широких пределах и могут даже отклоняться от представленных здесь предпочтительных соотношений. Выбор таких компонентов и количеств компонентов находится в рамках компетенции специалистов в данной области. Для некоторых животных-компаньонов, таких как собаки и кошки, рекомендованные количества таких ингредиентов обеспечиваются Ассоциацией американских официальных контролеров по качеству кормов (AAFCO).
Источник белка для корма может быть получен из множества различных источников, имеющих растительное или животное происхождение, или же из тех, и других. Животный белок включает мясо, мясные субпродукты, молочные продукты и яйца. Мясо включает плоть домашней птицы, рыбы и животных, таких как рогатый скот, свиньи, овцы, козы и другие подобные. Мясные субпродукты включают легкие, почки, мозг, печень, желудки и кишки. Белковый ингредиент корма может быть также представлен свободными аминокислотами и/или пептидами. Предпочтительно белковый ингредиент корма содержит мясо, мясной субпродукт, молочные продукты или яйца.
Источник жиров и углеводов для корма может быть получен из разнообразных источников, таких как животный жир, рыбий жир, растительное масло, мясо, мясные субпродукты, зерновые, другие животные или растительные источники и их смеси. Зерновые включают пшеницу, кукурузу, овес и рис.
Волоконный ингредиент корма может быть получен из разнообразных источников, таких как источники растительного волокна, например, целлюлоза, свекловичный жом, оболочки арахиса и волокно сои.
В частности, когда композиция является кормом для животных, предпочтительно включаются витамины и минеральные вещества в количествах, необходимых для избежания их дефицита и поддержания здорового состояния. Сведения об этих количествах хорошо известны в данной области. Данные по рекомендованным количествам таких ингредиентов для сельскохозяйственных животных обеспечиваются Национальным научно-исследовательским советом (National Research Council, NRC). См., например, Nutrient Requirements of Swine (Потребности свиней в питательных веществах), 10 исправленное издание, Nat'l Academy Press, Wash. D.C., 1998, Nutrient Requirements of Poultry (Потребности домашней птицы в питательных веществах), 9 исправленное издание, Nat'l Academy Press, Wash. D.C., 1994), Nutrient Requirements of Horses (Потребности лошадей в питательных веществах), 5 исправленное издание, Nat'l Academy Press, Wash. D.C., 1989 и др. Ассоциация американских официальных контролеров по качеству кормов (AAFCO) обеспечивает данные по рекомендованным количествам таких ингредиентов для собак и кошек. См. American Feed Control Officials, Inc, Официальная публикация, страницы 126 140 (2003). Обычно полезные для применения в качестве добавки к пищевому продукту витамины включают витамин A, витамин B1, витамин B2, витамин B6, витамин B12, витамин C, витамин D, витамин E, витамин H (биотин), витамин К, фолиевую кислоту, инозитол, ниацин и пантотеновую кислоту. Минеральные вещества и микроэлементы, обычно подходящие для применения в качестве добавки к пищевому продукту, включают кальций, фосфор, натрий, калий, магний, медь, цинк, холин и железо.
Данные композиции могут содержать такие дополнительные ингредиенты, как витамины, минеральные вещества, наполнители, усилители вкусовой привлекательности, связующие вещества, вкусоароматические добавки, стабилизаторы, эмульгаторы, подслащивающие вещества, красители, буферные вещества, соли, покрытия, приправы, консерванты и другие подобные, известные специалистам в данной области. Стабилизаторы включают вещества, которые проявляют тенденцию увеличивать продолжительность хранения композиции, такие как консерванты, синергисты и комплексообразователи, упаковочные газы, стабилизаторы, эмульгаторы, загустители, желирующие вещества и увлажняющие вещества. Примеры эмульгаторов и/или загустителей включают желатин, эфиры целлюлозы, крахмал, эфиры крахмала и модифицированные крахмалы. Конкретные количества каждого компонента композиции, ингредиента корма и других ингредиентов будут зависеть от различных факторов, таких как вид определенных компонентов и ингредиентов, включенных в композицию; вид пациента; возраст пациента, масса тела, общее состояние здоровья, пол диета; норма потребления пациента; вид заболевания, от которого осуществляется лечение (при наличии); и т.п. Поэтому количества ингредиентов могут изменяться в широких пределах и могут отклоняться от описанных здесь предпочтительных соотношений. Количество таких добавок в композиции в типичном случае достигают вплоть до около 5 масс.%.
Композиции могут представлять собой или могут содержать дополнительные ингредиенты, предназначенные для поддержания или улучшения состояния здоровья животного, например, биологически активные добавки к пище, лекарства, травы, холистические препараты и композиции, и другие подобные.
Биологически активные добавки к пище (БАД к пище), подходящие для применения в настоящем изобретении, включают корм, используемый совместно с другим кормом в целях улучшения питательной сбалансированности или его эффективности в целом. БАД к пище включают композиции, которые скармливаются в неразбавленном виде в качестве добавок к другим кормам, предлагают свободный выбор с другими частями рациона животного, которые являются доступными индивидуально или разбавляются и смешиваются с регулярным питанием животного для получения сбалансированного корма. AAFCO приводит касающиеся БАД к пище обсуждения в American Feed Control Officials, Inc. Official Publication, стр.220 (2003). БАД к пище могут быть представлены в различных формах, включая порошки, жидкости, сиропы, пилюли, инкапсулированные композиции и другие подобные.
Лакомства включают композиции, которые даются животному, чтобы привлечь животное к еде в течение неурочного для приема пищи времени, например, жевательные кости для собак. Лакомства могут быть питательными, композиция которых содержит одно или несколько питательных веществ, и могут иметь композицию в соответствии с описанной выше для корма. Лакомства, не являющиеся питательными, охватывают любые другие лакомства, которые не являются токсичными. Нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы наносятся на лакомства, вводятся в лакомство или применяются обоими этими способами.
Игрушки включают жевательные игрушки, такие как искусственные кости. Нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы могут образовывать покрытие на поверхности игрушки или на поверхности компонента игрушки, могут быть частично или полностью включенными по всей игрушке, или же могут применяться обоими эти способами. В одном воплощении Нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы являются перорально доступными для желаемого пользователя. Имеется широкий ассортимент подходящих игрушек, в настоящее время предлагаемых на рынке, например, патент US 5339771, патент US 5419283 и представленная в них библиография. Это изобретение обеспечивает как частично потребляемые игрушки, например, игрушки, содержащие пластмассовые компоненты, так и полностью потребляемые игрушки, например, изготовленные из сыромятной кожи и различные искусственные кости. Кроме того, изобретение обеспечивает игрушки, предназначенные как для человека, так и для животного, в частности, для животного-компаньона, сельскохозяйственного животного, животного, содержащегося в зоопарке и, в частности, для собак, кошек или птиц.
При приготовлении композиций настоящего изобретения компоненты подбираются таким образом, чтобы нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы присутствовали в композиции в концентрации по меньшей мере 0,01%, предпочтительно от около 0,01% до около 4%, наиболее предпочтительно от около 0,5% до около 2 масс.% от массы композиции. Нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы могут быть включены в композицию в ходе приготовления рецептуры, например, в течение и/или после смешивания других компонентов композиции. Распределение этих компонентов в композиции выполняется обычными средствами.
Композиции изобретения (в частности, корма) могут быть приготовлены в сухой форме с помощью обычных способов. В одном воплощении сухие ингредиенты, включая источники животного белка, источники растительного белка, зерновые и т.д., являются измельченными и смешанными друг с другом. После этого добавляются и смешиваются с сухой смесью влажные или жидкие ингредиенты, включая жиры, масла, источники животного белка, воду и т.д. Затем смесь перерабатывается в гранулы или в другие подобные сухие кусочки. Гранула часто формуется с помощью прессования, при котором смесь сухих и влажных ингредиентов подвергается механическому воздействию под высокими давлением и температурой, проталкивается через небольшие отверстия и обрезается в гранулу вращающимся ножом. Влажная гранула после этого высушивается и при необходимости покрывается одним или несколькими наружными покрытиями, которые могут включать ароматические вещества, жиры, масла, порошки и подобные материалы. Гранула также может изготавливаться из густой массы с использованием способа запекания, а не экструзии, при котором густая масса помещается в форму перед обработкой сухим жаром.
Нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы могут быть добавлены к композиции корма для домашних животных при ее обычной процедуре приготовления, такой как смешивание, экструзия, подвергание тепловой обработке и других подобных, или же предпочтительно добавляются после выполнения ее экструзионной обработки, например, напылением или нанесением покрытия на поверхность корма. Особенно желательно для сухих кормов, чтобы выходящий из экструдера непрерывный поток материала входил в контакт с нереплицирующимися пробиотическими микроорганизмами (или содержащим нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы раствором) при напылении или покрытии экструдированного материала до того, как этот материал нарезается на гранулы, или же гранулы вводятся в контакт с нереплицирующимися пробиотическими микроорганизмами (или содержащим нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы раствором) напылением, нанесением покрытия или окунанием гранулы per se.
Для наружного нанесения на корм нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы смешиваются с композицией носителя, чтобы способствовать нанесению на поверхность пищевой композиции. В качестве носителя для соединения(-й) данной композиции могут применяться, например, жидкость, суспензия, легкий гель или влажное твердое вещество. Для нанесения соединения(-й) на поверхность пищевой композиции используется стандартное напылительное или макательное оборудование. Примером такого носителя являются обработанные протеазами молотые субпродукты животного происхождения в сочетании с аминокислотами, восстанавливающим сахаром(-и) и тиамином. Носитель после этого смешивается с нереплицирующимися пробиотическими микроорганизмами и наносится на гранулу, таким образом, приводя к получению обладающего высокой вкусовой привлекательностью и хорошо воспринимаемого сухого корма. В определенном предпочтительном воплощении нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы могут просто смешиваться с промышленно выпускаемым жидким усилителем вкусовой привлекательности или другой вкусоароматической композицией для создания нового вкусоароматического палатанта, который затем может быть наружно нанесен на композицию. Подходящие для применения с нереплицирующимися пробиотическими микроорганизмами промышленно выпускаемые жидкие усилители вкусовой привлекательности в настоящем изобретении включает любые известные или коммерчески доступные жидкие усилители вкусовой привлекательности из предлагаемых в продаже усилителей вкусовой привлекательности кормов для домашних животных или других ароматизаторов, известных специалистам в данной области.
Композиции настоящего изобретения (в частности, корма) могут быть приготовлены в консервированной или во влажной форме с использованием обычных для кормов для домашних животных способов. В одном воплощении измельченные белковые ткани животного происхождения (например, млекопитающих, домашней птицы, рыбы и/или морепродуктов) смешиваются с другими ингредиентами, включая рыбий жир, зерно хлебных злаков, другие обеспечивающие питательный баланс ингредиенты, специальные добавки (например, витаминные и минеральные смеси, неорганические соли, целлюлозу и свекловичный жом, наполнители и другие подобные). Также может быть добавлена достаточная для выполнения обработки вода. Ингредиенты во влажной форме в типичном случае смешиваются в емкости, подходящей для нагревания при выполнении смешивания компонентов. Нагревание смеси может обеспечиваться любым подходящим способом, таким как прямое впрыскивание пара или посредством использования емкости, оснащенной теплообменником. После добавления последнего ингредиента смесь нагревается до температуры в диапазоне от около 50°F до около 212°F. Температуры вне пределов этого диапазона являются приемлемыми, но без использования других технологических пищевых добавок могут быть промышленно неоправданными. В нагретом до надлежащей температуры состоянии в типичном случае материал будет находиться в форме вязкой жидкости. Вязкая жидкость фасуется в банки. Накладывается крышка, и контейнер герметично закупоривается. Закупоренная банка после этого может быть помещена в обычное предназначаемое для стерилизации содержимого оборудование. Это обычно достигается нагреванием до температур, превышающих около 230°F, в течение надлежащего времени, которое зависит от применяемой температуры и композиции.
В случае влажных кормов нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы могут быть включены во влажную пищевую композицию вместе с носителем, таким как спиртовая композиция (то есть пропиленгликоль или дипропиленгликоль), циклодекстрин, мальтодекстрин или крахмал. В качестве варианта, нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы могут быть замешаны в сухие материалы перед образованием влажной пищевой композиции.
Лакомства настоящего изобретения могут быть приготовлены экструзией или способом запекания, подобным описанному выше для сухого корма. Также могут использоваться другие способы, чтобы либо нанести вкусоароматическую композицию на наружные стороны имеющихся форм лакомства, либо ввести ее в имеющуюся форму лакомства.
Игрушки для животных настоящего изобретения в типичном случае готовятся нанесением на любую имеющуюся игрушку покрытия с вкусоароматической композицией, содержащей примешанные к ней нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы.
6
12
Количество нереплицирующихся пробиотических микроорганизмов в композиции корма для домашних животных настоящего изобретения может соответствовать от около 10 до 10 КОЕ на одну порцию.
4
12
Очевидно, что нереплицирующиеся микроорганизмы не образуют колоний, поэтому этот термин следует понимать как количество нереплицирующихся микроорганизмов, которое получается из от 10 до 10 КОЕ/г реплицирующихся бактерий. Они включает микроорганизмы, которые являются инактивированными, мертвыми, нежизнеспособными и/или присутствуют в виде фрагментов, таких как ДНК или цитоплазматические соединения. Другими словами, количество микроорганизмов, которое содержит данная композиция, вне зависимости от того, являются ли они на самом деле живыми, инактивированными, мертвыми или фрагментированными, или же представляют собой смесь любых из этих состояний, выражается в терминах способности данного количества микроорганизмов образовывать колонии (КОЕ), как если бы все эти микроорганизмы являлись бы живыми.
Композиция корма для домашних животных может также содержать пребиотики.
Под «пребиотиком» подразумеваются пищевые продукты, которые поддерживают рост пробиотиков в кишечнике. Они не подвергаются расщеплению в желудке и/или верхних отделах кишечника и не всасываются желудочно-кишечным трактом принимающего их человека, но они ферментируются желудочно-кишечной микрофлорой и/или пробиотиками. Пребиотики, например, определяются публикацией Glenn R. Gibson and Marcel B. Roberfroid Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota: Introducing the Concept of Prebiotics (Диетическое модифицирование толстокишечной микробиоты человека: представление концепции пребиотиков), J. Nutr. 1995 125: 1401-1412.
Пребиотики, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, специальным образом не ограничиваются и включают все пищевые продукты, которые способствуют росту пробиотиков в кишечнике. Предпочтительно они могут выбираться из группы, состоящей из олигосахаридов, необязательно содержащих фруктозу, галактозу, маннозу; пищевых волокон, в частности, растворимых волокон, волокон сои; инулина или их смесей. Предпочтительные пребиотики являются фруктоолигосахаридами (FOS), галактоолигосахаридами (IOS), изомальтоолигосахаридами, ксилоолигосахаридами, олигосахаридами сои, гликозилсахарозой (GS), лактосахарозой (LS), лактулозой (LA), палатинозоолигосахаридами (РАО), мальтоолигосахаридами (MOS), камедями и/или их гидролизатами, пектинами и/или их гидролизатами.
Типичные примеры пребиотиков представляют олигофруктоза и инулин.
Количество пребиотиков в композиции корма для домашних животных согласно изобретению зависит от их способности поддерживать развитие молочнокислых бактерий. Как общее правило, данная композиция может содержать от 0,1 до 20% таких пребиотиков (масс.% по отношению к содержанию сухого вещества).
3
4
7
Композиция корма для домашних животных может содержать нереплицирующиеся пробиотики в количестве, соответствующем, например, по меньшей мере 10 КОЕ на 1 г пребиотика, предпочтительно от 10 до 10 КОЕ/г пребиотика.
Авторы данного изобретения неожиданно обнаружили, что, например, в отношении укрепления иммунной системы и/или с точки зрения противовоспалительного действия нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы могут быть даже более эффективными, чем реплицирующиеся пробиотические микроорганизмы.
Это является удивительным, так как пробиотики часто определяются как «живые микроорганизмы, которые при введении в надлежащих количествах приносят пользу здоровью организма» (Руководящие принципы FAO/WHO). Огромное большинство литературных публикаций касается живых пробиотиков. При этом в нескольких исследованиях изучалась полезность для здоровья введения нереплицирующихся бактерий, и большинство из них показало, что инактивация пробиотиков, например, тепловой обработкой приводит к потере их подразумеваемой пользы для здоровья (Rachmilewitz, D. и др., 2004, Gastroenterology 126:520-528; Castagliuolo и др., 2005, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 43:197-204; Gill, H.S. и K.J. Rutherfurd, 2001, Br. J. Nutr. 86:285-289; Kaila, M. и др., 1995, Arch. Dis. Child 72:51-53.). Некоторые исследования показали, что мертвые пробиотики могут сохранять некоторую способность влиять на состояние здоровья (Rachmilewitz, D., и др., 2004, Gastroenterology 126:520-528; Gill, H.S. и K.J. Rutherfurd, 2001, Br. J. Nutr. 86:285-289), но, очевидно, живые пробиотики с этой точки зрения были оценены как намного более эффективные.
«Нереплицирующиеся» пробиотические микроорганизмы включают пробиотические бактерии, подвергнутые тепловой обработке. Они включают микроорганизмы, которые являются инактивированными, мертвыми, нежизнеспособными и/или присутствующими в виде фрагментов, таких как ДНК, метаболиты, цитоплазматические соединения или материалы клеточной оболочки.
«Нереплицирующиеся» означает, что никаких жизнеспособных клеток и/или колониеобразующих единиц классическими методами культивирования обнаружено быть не может. Такие классические методы культивирования сведены воедино в книге по микробиологии James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden. 2005. Modern food microbiology («Современная микробиология пищевых продуктов»). 7 издание, Springer Science, Нью-Йорк, N.Y. 790 стр. Как правило, отсутствие жизнеспособных клеток может быть показано следующим образом: отсутствие каких-либо видимых колоний на чашках с агаровой средой или отсутствие возрастающего помутнения в жидкой среде для выращивания после засева бактериальными препаратами в различных концентрациях («Нереплицирующиеся» образцы) и выдерживания в подходящих условиях (аэробная и/или анаэробная атмосфера на протяжении по меньшей мере 24 час).
Пробиотики для целей настоящего изобретения определяются как «препараты микробиологических клеток или компоненты микробиологических клеток, обладающие благотворным воздействием на состояние здоровья или самочувствие организма». (С Salminen, Ouwehand A. Benno Y. и др. "Probiotics: how should they be defined" («Пробиотики: как их следует определять») Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107-10).
Композиции настоящего изобретения могут содержать пробиотические микроорганизмы и/или нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы в количестве, достаточном для по меньшей мере частичного обеспечения благотворного воздействия на здоровье. Подходящее для обеспечения такого действия количество определяется как «терапевтически эффективная доза». Эффективные для этих целей количества зависят от многих известных специалистам в данной области факторов, таких как масса тела и общее состояние здоровья животного, а также от эффекта, оказываемого матрицей пищевого продукта.
При профилактических применениях композиции согласно изобретению назначаются восприимчивым или иным образом подверженным риску развития определенного заболевания потребителям в количестве, которое является достаточным для по меньшей мере частичного снижения риска развития такого заболевания. Такое количество определяется как представляющее собой «профилактически эффективную дозу». Аналогично, точные количества зависят от ряда таких факторов, как состояние здоровья и масса животного, а также от эффекта, оказываемого матрицей пищевого продукта.
Специалисты в данной области смогут отрегулировать терапевтически эффективную дозу и/или, соответственно, профилактически эффективную дозу.
В целом композиция настоящего изобретения содержит нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы в терапевтически эффективной дозе и/или в профилактически эффективной дозе.
Например, терапевтически эффективная доза и/или профилактически эффективная доза может находиться в диапазоне около 0,005 мг - 1000 мг нереплицирующихся пробиотических микроорганизмов в сутки.
4
9
5
9
Нереплицирующиеся микроорганизмы могут быть представлены в количестве, эквивалентном величине между 10 и 10 КОЕ/г сухой композиции, еще более предпочтительно в количестве, эквивалентном величине между 10 и 10 КОЕ/г сухой композиции.
Пробиотики могут быть приведены в нереплицирующееся состояние любым известным в данной области способом.
Имеющиеся в настоящее время технологии, пригодные для приведения пробиотика в нереплицирующееся состояние, обычно представлены тепловой обработкой, γ-облучением, ультрафиолетовым светом или применением химических реагентов (формалин, параформальдегид).
4
12
В численном выражении, например, подвергнутые «кратковременной высокотемпературной» обработке нереплицирующиеся микроорганизмы могут присутствовать в композиции в количествах, эквивалентно соответствующих между 10 и 10 КОЕ/г сухой композиции.
Предпочтительной для приведения пробиотика в нереплицирующееся состояние была бы технология, которая является относительно простой в применении в производственных условиях пищевой промышленности.
Большинство представленных в настоящее время на рынке продуктов содержат пробиотики, подвергнутые в процессе их изготовления тепловой обработке. Поэтому было бы удобным иметь возможность обрабатывать пробиотики нагреванием либо вместе с вырабатываемым продуктом, либо по меньшей мере подобным способом, при том, чтобы пробиотики сохраняли или улучшали свои полезные качества, или даже приобретали бы новые полезные для потребителя свойства.
Однако инактивация пробиотических микроорганизмов тепловой обработкой по литературным данным, как правило, связана с по меньшей мере частичной потерей активности пробиотика.
Авторы настоящего изобретения в настоящее время с удивлением обнаружили, что приведение пробиотических микроорганизмов в нереплицирующееся состояние, например, тепловой обработкой не приводит к потере полезных для здоровья качеств пробиотика, но, наоборот, может усиливать имеющийся благотворный эффект и даже привести к созданию новых благоприятствующих здоровью свойств.
В этой связи одним воплощением настоящего изобретения является композиция корма, в которой нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы переводятся в нереплицирующееся состояние тепловой обработкой.
Такая тепловая обработка может выполняться при по меньшей мере 71,5°C в течение по меньшей мере 1 секунды.
Может применяться как длительная тепловая обработка, так и кратковременная тепловая обработка.
В промышленных масштабах в настоящее время предпочтительными обычно являются способы краткосрочной тепловой обработки, такие как подобные UHT (ультравысокотемпературная) тепловой обработке. Этот вид тепловой обработки снижает бактериальную нагрузку и сокращает продолжительность обработки, тем самым снижая ухудшение качества питательных веществ.
Авторы данного изобретения впервые продемонстрировали, что пробиотические микроорганизмы, подвергнутые тепловой обработке при высоких температурах в течение непродолжительного времени, демонстрируют противовоспалительные иммунные профили независимо от своих исходных свойств. В частности, либо вырабатывается новой противовоспалительный профиль, либо существующий противовоспалительный профиль в результате такой тепловой обработки усиливается.
Поэтому теперь оказывается возможным вырабатывать нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы с противовоспалительными профилями, применяя специальные параметры тепловой обработки, которые соответствуют типичным применяемым при тепловой обработке в промышленности, даже если их живые аналоги не являются штаммами, обладающими противовоспалительной активностью.
Поэтому тепловая обработка может представлять собой, например, высокотемпературную обработку при около 71,5-150°C в течение около 1-120 секунд. Высокотемпературная обработка может являться высокотемпературной/кратковременной (HTST) обработкой или ультравысокотемпературной (UHT) обработкой.
Пробиотические микроорганизмы могут быть подвергнуты высокотемпературной обработке при около 71,5-150°C в течение короткого времени около 1-120 секунд.
Более предпочтительно микроорганизмы могут быть подвергнуты высокотемпературной обработке при около 90-140°C, например, при 90-120°C в течение короткого времени около 1-30 секунд.
Эта высокотемпературная обработка переводит микроорганизмы, по меньшей мере частично, в нереплицирующееся состояние.
Высокотемпературная обработка может проводиться при нормальном атмосферном давлении, но также может быть выполнена под повышенным давлением. Типичные диапазоны давлений составляют от 1 до 50 бар, предпочтительно от 1 до 10 бар, еще более предпочтительно от 2 до 5 бар. Очевидно, что предпочтительным будет, если пробиотики подвергаются тепловой обработке в питательной среде, которая при приложении теплоты является жидкостью или твердым веществом. Поэтому идеальная величина прикладываемого давления будет зависеть от природы композиции, которая обеспечивается микроорганизмами, и от используемой температуры.
Высокотемпературная обработка может выполняться в интервале температур около 71,5-150°C, предпочтительно около 90-120°C, еще более предпочтительно около 120-140°C.
Высокотемпературная обработка может выполняться в течение короткого времени около 1-120 секунд, предпочтительно около 1-30 секунд, еще более предпочтительно около 5-15 секунд.
Данный временной интервал относится ко времени, в течение которого Пробиотические микроорганизмы подвергаются воздействию данной температуры. Следует заметить, что в зависимости от природы и количества обеспечиваемой микроорганизмами композиции, а также в зависимости от конструкции применяемого нагревательного устройства, продолжительность применяемого нагревания может изменяться.
Однако, как правило, композиция настоящего изобретения и/или микроорганизмы подвергаются высокотемпературной кратковременной (HTST) обработке, мгновенной пастеризации или ультравысокотемпературной (UHT) обработке.
Обработка является ультравысокотемпературной обработкой или ультратепловой обработкой (обе сокращаются аббревиатурой UHT), включающей по меньшей мере частичную стерилизацию композиции при нагревании ее в течение короткого времени, приблизительно 1-10 секунд, при температуре, превышающей 135°C (275°F), которая является температурой, необходимой для уничтожения в молоке спор бактерий. Например, такая обработка молока с помощью температур, превышающих 135°C, делает возможным снижение величины бактериальной нагрузки при таком обязательным времени пребывания (до 2-5 с), которое позволяет использовать режим непрерывного потока.
Есть два основных типа UHT-систем: прямые и непрямые системы. В прямой системе продукты обрабатываются впрыскиванием пара или нагнетанием пара, тогда как в непрямой системе продукты подвергаются тепловой обработке с помощью пластинчатого теплообменника, трубчатого теплообменника или скребкового теплообменника. В процессе обработки продукта комбинации UHT-систем могут применяться на любом этапе или на ряде этапов.
Обработка HTST определяется следующим образом (высокая температура/короткое время): способ пастеризации, предназначенный для пятикратного по логарифмической шкале снижения количества жизнеспособных микроорганизмов в молоке с уничтожением 99,9999% их общего содержания. Это считается подходящим для истребления почти всех дрожжей, плесневых грибков и обычных вызывающих порчу бактерий, а также для обеспечения надлежащего уничтожения обычных патогенных теплоустойчивых организмов. При способе HTST молоко на 15-20 секунд нагревается до 71,7°C (161°F).
Мгновенная пастеризация является способом тепловой пастеризации скоропортящихся напитков, таких как фруктовые и овощные соки, пиво и молочные продукты. Она выполняется перед расфасовкой в контейнеры для уничтожения вызывающих порчу микроорганизмов, придания продуктам большей безопасности и увеличения продолжительности их хранения. Жидкость двигается в контролируемом непрерывном потоке и при этом в течение около 15-30 секунд подвергается воздействию температур от 71,5°C (160°F) до 74°C (165°F).
Для целей настоящего изобретения термин «кратковременная высокотемпературная обработка» включает, например, кратковременную обработку при высокой температуре (HTST), UHT-обработку и мгновенную пастеризацию.
Так как такая тепловая обработка придает нереплицирующимся пробиотикам улучшенный противовоспалительный профиль, композиция настоящего изобретения может быть применена в профилактике или терапии воспалительных нарушений.
Воспалительные нарушения, которые могут быть излечены или предупреждены с помощью композиции настоящего изобретения, специальным образом не ограничивается. Например, они могут быть выбраны из группы, состоящей из острых воспалений, таких как сепсис; ожогов; хронических воспалений, таких как воспалительные заболевания кишечника, например, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, научит; некротизирующего энтероколита; кожных воспалений, таких как УФ- или химически индуцированное воспаление кожи, экзема, реактивная кожа; синдрома раздраженного кишечника; воспалений глаз; аллергии, астмы и их комбинаций.
Если для приведения пробиотических микроорганизмов в нереплицирующееся состояние применяется длительная тепловая обработка, такая тепловая обработка может осуществляться в интервале температур около 70-150°C в течение около 3 минут - 2 часов, предпочтительно в диапазоне 80-140°C от 5 минут до 40 минут.
В то время как существующий уровень техники в основном указывает, что бактерии, приведенные в нереплицирующееся состояние с помощью длительной тепловой обработки, в отношении проявления их пробиотических качеств обычно менее эффективны, чем живые клетки, авторы настоящего изобретения смогли продемонстрировать, что подвергнутые длительной тепловой обработке пробиотики превосходят свои живые аналоги в способности стимулировать иммунную систему.
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей пробиотические микроорганизмы, приведенные в нереплицирующееся состояние тепловой обработкой в течение по меньшей мере около 3 минут при по меньшей мере около 70°C.
Усиливающее иммунную систему действие нереплицирующихся пробиотиков было подтверждено in vitro иммунным профилем. В применяемой in vitro модели используется цитокиновый профиль человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) и хорошо принимается в данной области в качестве стандартной модели для исследования иммуномодулирующих соединений (Schultz и др., 2003, Journal of Dairy Research 70, 165-173; Taylor и др., 2006, Clinical and Experimental Allergy, 36, 1227-1235; Kekkonen и др., 2008, World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203).
Испытания РВМС in vitro применялись несколькими авторами/ исследовательскими группами, например, для классифицирования пробиотиков согласно их иммунным профилям, то есть по их анти- или провоспалительным показателям (Kekkonen и др., 2008, World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203). Было показано, например, что такие испытания позволяют прогнозировать противовоспалительное действие исследуемых пробиотиков в отношении кишечного колита в моделях на мышах (Foligne В. и др., 2007, World J. Gastroenterol. 13:236-243). Более того, это испытание регулярно применяется в качестве показательного в клинических исследованиях и была продемонстрирована его способность представлять результаты, согласующиеся с клиническими данными (Schultz и др., 2003, Journal of Dairy Research 70, 165-173; Taylor и др., 2006, Clinical and Experimental Allergy, 36, 1227-1235).
За последние десятилетия непрерывно увеличивается распространенность аллергических заболеваний и в настоящее время они рассматриваются ВОЗ в качестве эпидемических. В общих чертах аллергия, как полагают, является следствием дисбаланса между иммунными ответами Th1 и Th2, приводящего к сильному сдвигу в сторону продуцирования медиаторов Th2. Поэтому аллергия может быть смягчена, подавлена или предотвращена посредством восстановления надлежащего соответствия между Th1 и Th2 компонентами иммунной системы. Это подразумевает необходимость в снижении Th2-ответов или усилении, по меньшей мере временном, ответа Th1. Последнее было бы показателем укрепления иммунной системы, часто сопровождаемого, например, высокими уровнями IFNγ, TNF-α и IL-12 (World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203; Viljanen M. и др., 2005, Allergy, 60, 494-500).
Композиция корма для домашних животных настоящего изобретения позволяет поэтому излечивать или предупреждать нарушения, связанные с повреждениями иммунной защиты.
Соответственно, нарушения, связанные с повреждениями иммунной защиты, которые могут быть излечены или предупреждены с помощью композиции настоящего изобретения, специальным образом не ограничивается.
Например, они могут выбираться из группы, состоящей из инфекций, в частности, бактериальных, вирусных, грибковых и/или паразитарных инфекций; фагоцитарного дефицита; угнетения иммунитета слабой или тяжелой степени, вызванного стрессом или действием иммунодепрессивных лекарственных препаратов, химиотерапии или лучевой терапии; натуральных состояний сниженной иммунокомпетентности иммунной системы, например, у новорожденных; аллергий и их комбинаций.
Описанная в настоящем изобретении композиция корма позволяет также усиливать реакцию животного на вакцины, в частности, на вакцины перорального введения.
Эффективными могут быть любые количества нереплицирующихся микроорганизмов. Однако предпочтительно, чтобы в целом по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%, идеально по меньшей мере 99,9%, наиболее идеально все пробиотики являлись бы нереплицирующимися.
В одном воплощении настоящего изобретения все микроорганизмы являются нереплицирующимися.
Соответственно, в композиции настоящего изобретения по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%, идеально по меньшей мере 99,9%, наиболее идеально все пробиотики могут быть нереплицирующимися.
Для целей настоящего изобретения могут применяться любые пробиотические микроорганизмы.
Например, пробиотические микроорганизмы могут быть выбраны из группы, состоящей из бифидобактерий, молочнокислых бактерий, пропионовокислых бактерий или их комбинаций, например, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactococcus diacetylactis, Lactococcus cremoris, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Escherichia coli и/или их смесей.
Композиция в соответствии с настоящим изобретением может, например, содержать, пробиотические микроорганизмы, выбранные из группы, состоящей из Bifidobacterium longum NCC 3001, Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus johnsonii La1, Lactobacillus paracasei NCC 2461, Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus reuteri DSM 17983, Lactobacillus reuteri ATCC55730, Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC 6002 (NCC 1825), Escherichia coli Nissle, Lactobacillus bulgaricus NCC 15, Lactococcus lactis NCC 2287 или их комбинаций.
Все эти штаммы были или депонированы согласно Будапештскому договору, и/или являются предлагаемыми в продаже.
Депонированными согласно Будапештскому договору являются следующие штаммы:
Bifidobacterium longum NCC 3001:
ATCC BAA-999
Bifidobacterium longum NCC 2705:
CNCM I-2618
Bifidobacterium breve NCC 2950
CNCM I-3865
Bifidobacterium lactis NCC 2818:
CNCM I-3446
Lactobacillus paracasei NCC 2461:
CNCM I-2116
Lactobacillus rhamnosus NCC 4007:
CGMCC 1.3724
Streptococcus themophilus NCC 2019:
CNCM I-1422
Streptococcus themophilus NCC 2059:
CNCM I-4153
Lactococcus lactis NCC 2287:
CNCM I-4154
Lactobacillus casei NCC 4006:
CNCM I-1518
Lactobacillus casei NCC 1825:
ACA-DC 6002
Lactobacillus acidophilus NCC 3009:
ATCC 700396
Lactobacillus bulgaricus NCC 15:
CNCM I-1198
Lactobacillus johnsonii La1
CNCM I-1225
Lactobacillus reuteri DSM17983
DSM1 7983
Lactobacillus reuteri ATCC55730
ATCC 55730
Escherichia coli Nissle 1917:
DSM 6601
Штаммы, именуемые ATCC, были депонированы в Американской коллекции типовых культур (ATCC Patent Depository), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, США.
Штаммы, именуемые CNCM, были депонированы в COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, Франция.
Штаммы, именуемые CGMCC, были депонированы в Китайском главном коллекционном центре микробиологических культур. Институт микробиологии Академии наук Китая, Zhongguancun, P.O. Box2714, Пекин 100080, Китай.
Штаммы, именуемые ACA-DC, были депонированы в Греческом координационном центре коллекций микроорганизмов. Лаборатория молочных продуктов, Отдел теоретических основ и технологии пищевых продуктов. Сельскохозяйственный университет Афин, 75, Iera odos, Botanikos, Афины, 118 55, Греция.
Штаммы, именуемые DSM, были депонированы в DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr., 7 В, 38124 Braunschweig, Германия.
Специалистам в данной области очевидно, что они могут свободно объединять все описанные здесь признаки настоящего изобретения без отступления от его раскрываемого здесь объема.
Дальнейшие признаки и преимущества настоящего изобретения будут явствовать из следующих далее Фигур и Примеров.
Фигуры 1A и B показывают усиление противовоспалительных иммунных профилей пробиотиков, подвергнутых «кратковременной высокотемпературной обработке».
Фигура 2 показывает штаммы пробиотиков, не обладающие противовоспалительными качествами, которые становились противовоспалительными, то есть демонстрирующими выраженный противовоспалительный профиль in vitro после «кратковременной высокотемпературной» обработки.
Фигуры 3A и B показывают штаммы пробиотиков, применяемые в коммерчески доступных продуктах, которые демонстрируют усиленные или новоприобретенные противовоспалительные иммунные профили in vitro после «кратковременной высокотемпературной» обработки.
Фигуры 4A и B показывают штаммы молочной закваски (то есть заквасочные штаммы Lc1), которые демонстрируют усиленные или новоприобретенные противовоспалительные иммунные профили in vitro после кратковременной обработки при высоких температурах.
Фигура 5 показывает штамм пробиотика, не обладающий противовоспалительными качествами, который демонстрирует противовоспалительный иммунный профиль in vitro после HTST-обработки.
Фигура 6. Метод главных компонент на данных РВМС (IL-12p40, IFN-γ, TNF-α, IL-10), демонстрируемых пробиотическими и молочными заквасочными штаммами в их живом и подвергнутом тепловой обработке (140°C в течение 15 секунд) состоянии. Каждая точка представляет один штамм, живой либо подвергнутый тепловой обработке и идентифицируемый его NCC-номером или названием.
Фигура 7 показывает отношения IL-12p40/IL-10 живых и подвергнутых тепловой обработке (85°C, 20 мин) штаммов. В целом тепловая обработка в течение 20 минут при 85°C приводит к возрастанию величин отношения IL-12p40/IL-10 по сравнению с кратковременной высокотемпературной обработкой настоящего изобретения (Фигуры 1, 2, 3, 4 и 5).
Фигура 8 показывает повышение in vitro секреции цитокина из человеческих РВМС, стимулируемой подвергнутыми тепловой обработке бактериями.
Фигура 9 показывает процентную интенсивность диареи, наблюдаемой у OVA-сенсибилизированных мышей, подвергнутых провокации солевым раствором (отрицательный контроль), OVA-сенсибилизированных мышей, подвергнутых провокации OVA (положительный контроль) и OVA-сенсибилизированных мышей, подвергнутых провокации OVA и терапии подвергнутыми тепловой обработке или живыми Bifidobacterium breve NCC2950. Результаты отображены в виде процента от интенсивности диареи (среднее ±SEM, рассчитанное по 4 независимым экспериментам) со 100% интенсивностью диареи, соответствующей симптомам, развившимся в группе с положительным контролем (сенсибилизация и провокация аллергеном).
Пример 1.
Методика.
Бактериальные препараты.
Польза, предоставляемая живыми пробиотиками иммунной системе организма, как правило, рассматривается как штамм-специфичная. Было показано, что пробиотики, приводящие к высоким уровням IL-10 и/или вызывающие снижение уровней провоспалительных цитокинов in vitro (испытание РВМС), являются действенными противовоспалительными штаммами in vivo (Foligné В. и др., 2007, World J. Gastroenterol. 13:236-243).
При исследованиях противовоспалительных свойств подвергнутых тепловой обработке пробиотиков было использовано несколько пробиотических штаммов. Это были Bifidobacterium longum NCC 3001, Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus paracasei NCC 2461, Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC 6002 (NCC 1825) и Escherichia coli Nissle. Были также исследованы несколько штаммов заквасочных культур, включая некоторые штаммы, применяемые промышленно для получения ферментированных Lc1 продуктов Nestle: Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus bulgaricus NCC 15 и Lactococcus lactis NCC 2287.
2
2
Бактериальные клетки культивировались в условиях, оптимизированных для каждого штамма, в 5-15 л биореакторах. Пригодными являются любые стандартные среды для выращивания бактериальных культур. Такие среды известны специалистам в данной области. После доведения pH до 5,5 в непрерывном режиме добавлялся 30% основной раствор (либо NaOH, либо Ca(ОН)). Когда это было необходимо, создавались анаэробные условия заполнением свободного пространства газообразным CO. E. coli выращивалась при стандартных аэробных условиях.
9
10
Бактериальные клетки собирались центрифугированием (5000×g, 4°C) и ресуспендировались в фосфатно-солевом буфере (PBS) в объемах, подходящих для достижения конечной концентрации около 10-10 КОЕ/мл. Часть препарата была заморожена при -80°C с 15% глицерином. Другая часть клеток была подвергнута тепловой обработке с помощью:
- ультравысокой температуры: 140°C в течение 15 с впрыскиванием глухого пара;
- высокой температуры в течение короткого времени (HTST): 74°C, 90°C и 120°C в течение 15 с впрыскиванием глухого пара;
- низкой температуры в течение длительного времени (85°C, 20 мин) на водяной бане.
При тепловой обработке образцы перед применением сохранялись в замороженном при -80C состоянии.
Оценка in vitro иммунного профиля бактериальных препаратов.
5
6
Были выполнены оценки иммунных профилей живых и подвергнутых тепловой обработке бактериальных препаратов (то есть способности индуцировать секрецию специфических цитокинов клетками крови человека in vitro). Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) человека были выделены из фильтров для крови. После разделения по градиенту плотности клеток были отобраны мононуклеарные клетки и дважды промыты сбалансированным солевым раствором Хэнкса. Клетки затем были ресуспендированы в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков, (IMDM, Sigma), дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Bioconcept, Париж, Франция), 1% L-глютамина (Sigma), 1% пенициллина/стептомицина (Sigma) и 0,1% гентамицина (Sigma). РВМС (7×10 клеток на лунку) затем инкубировались с живыми и подвергнутыми тепловой обработке бактериями (эквивалент 7×10 КОЕ на лунку) в 48-луночных планшетах в течение 36 час. Влияние живых и подвергнутых тепловой обработке бактерий было проверено на РВМС, полученных от 8 различных доноров, разделенных на два отдельных эксперимента. После 36 час инкубации культуральные планшеты были заморожены и до измерений цитокинов сохранялись при -20°C. Определение цитокиновых профилей выполнялось параллельно (то есть в одном эксперименте на одной и той же серии РВМС) для живых бактерий и для их экземпляров, подвергнутых тепловой обработке.
После 36 час инкубации в супернатантах клеточной культуры были определены уровни цитокинов (IFN-γ, IL-12p40, TNF-α и IL-10) методом ELISA (иммуноферментный анализ) (R&D DuoSet Human IL-10, BD OptEIA Human IL12p40, BD OptEIA Human TNFα, BD OptEIA Human IFN-γ) согласно инструкциям производителя. IFN-γ, IL-12p40 и TNF-α являются провоспалительными цитокинами, тогда как IL-10 является мощным противовоспалительным медиатором. Результаты выражены в виде среднего (пг/мл) +/- SEM по 4 индивидуальным донорам и являются репрезентативными для двух отдельных экспериментов, выполненных с 4 донорами в каждом. Для каждого штамма было вычислено соотношение IL-12p40/IL-10 в качестве прогностического показателя in vivo противовоспалительного эффекта (Foligné В. и др., 2007, World J. Gastroenterol. 13:236-243).
Численные характеристики цитокинов (пг/мл), определенные по данным ELISA (см. выше) для каждого штамма, были введены в программу BioNumerics v5.10 ((Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Бельгия). К этому набору данных был применен метод главных компонент (РСА, методика задания размерности). В этот анализ было включено определение разницы средних величин по признакам и деление полученного показателя на величину дисперсии по этим признакам.
Результаты.
Противовоспалительные профили, обеспечиваемые видами обработки, сходными с ультравысокотемпературной (UHN)/кратковременной высокотемпературной (HTST) обработкой.
Штаммы пробиотиков при исследовании были подвергнуты серии тепловых обработок (ультравысокотемпературная (UHT), кратковременная высокотемпературная (HTST) и 20 мин при 85°C), и их иммунные профили были сравнены с аналогичными профилями живых клеток in vitro. Живые микроорганизмы (пробиотики и/или молочные заквасочные культуры) при инкубации с человеческими РВМС индуцировали различные уровни продуцирования цитокинов (Фигуры 1, 2, 3, 4 и 5). Тепловая обработка этих микроорганизмов модифицировала уровни продуцируемых РВМС цитокинов температурно зависимым образом. «Кратковременная высокотемпературная» обработка (120°C или 140°C в течение 15 с) приводила к получению нереплицирующихся бактерий с противовоспалительными иммунными профилями (Фигуры 1, 2, 3 и 4). Фактически штаммы, подвергнутые обработке, подобной ультравысокотемпературной (140°C, 15 с), индуцировали меньше провоспалительных цитокинов (TNF-α, IFN-γ, IL-12p40) при сохранении или стимулировании продуцирования дополнительного IL-10а (в сравнении с живыми аналогами). Полученные величины соотношения IL-12p40/IL-10a для всех штаммов, подвергнутых UHT-подобной обработке, по сравнению с живыми клетками были сниженными (Фигуры 1, 2, 3 и 4). Это наблюдение было также действительно и для бактерий, подвергнутых HTST-подобной обработке, то есть 15 с при 120°C (Фигуры 1, 2, 3 и 4), или 15 с при 74°C и 90°C (Фигура 5). Тепловые обработки (UHT-подобные или HTST-подобные) имели сходное воздействие на in vitro иммунные профили штаммов пробиотиков (Фигуры 1, 2, 3 и 5) и молочных заквасочных культур (Фигура 4). Метод главных компонент на данных РВМС, полученных с живыми и подвергнутыми тепловой обработке (140°C, 15 с) штаммами пробиотиков и молочных заквасок, выявил, что живые штаммы распределяются по всей оси X, что показывает, что эти штаммы демонстрируют сильно различающиеся иммунные профили in vitro, от слабой (левая сторона) до сильной (правая сторона) индукции провоспалительных цитокинов. Группа подвергнутых тепловой обработке штаммов с левой стороны графика показывает, что подвергнутыми тепловой обработке штаммами провоспалительные цитокины индуцируются в значительно меньшей степени (Фигура 6). В отличие от этого, бактерии, подвергнутые тепловой обработке в течение 20 мин при 85°C, индуцировали больше провоспалительных цитокинов и меньше IL-10a, чем живые клетки, приводя к более высоким показателям отношения IL-12p40/IL-10a (Фигура 7).
Противовоспалительные профили, усиленные или полученные в результате UHT-подобной и HTST-подобной обработки.
Подвергнутые UHT- и HTST-обработке штаммы демонстрируют противовоспалительные профили независимо от их соответствующих исходных иммунных профилей (живые клетки). Было показано, что штаммы пробиотиков, известные в качестве противовоспалительных in vivo и демонстрирующие противовоспалительные профили in vitro (B. longum NCC 3001, B. longum NCC 2705, B. breve NCC 2950, B. lactis NCC 2818), демонстрируют усиленные противовоспалительные профили in vitro после «кратковременной высокотемпературной» обработки. Как показано на Фигуре 1, соотношения IL-12p40/IL-10a подвергнутых UHT-подобной обработке штаммов Bifidobacterium были ниже, чем у живых аналогов, тем самым показывая улучшенные противовоспалительные профили образцов, подвергнутых UHT-подобной обработке. Еще более удивительно образование противовоспалительных профилей под действием UHT-подобной и HTST-подобной обработки, подтвержденное также и у не обладавших противовоспалительной активностью живых штаммов. Оба штамма живых L. rhamnosus NCC 4007 и L. paracasei NCC 2461 показывают высокие величины соотношения IL-12p40/IL-10a in vitro (Фигуры 2 и 5). Было показано, что эти два живых штамма не обладают защитным действием против TNBS-индуцированного колита у мышей. Величины индуцированного L. rhamnosus NCC 4007 и L. paracasei NCC 2461 отношения IL-12p40/IL-10a резко снижались после «кратковременной высокотемпературной» обработки (UHT или HTST), достигая столь же низких уровней, как и полученные со штаммами Bifidobacterium. Такие низкие показатели соотношения IL-12p40/IL-10a являются результатом низких уровней продуцирования IL-12p40 в сочетании с отсутствием изменений (L. rhamnosus NCC 4007) или сильным индуцированном секреции IL-10a (L. paracasei NCC 2461) (Фигура 2).
Как следствие:
- противовоспалительные профили живых микроорганизмов могут быть усилены UHT-подобной и HTST-подобной тепловой обработкой (например, B. longum NCC 2705, B. longum NCC 3001, B. breve NCC 2950, B. lactis NCC 2818);
- противовоспалительные профили могут быть получены у не обладающих противовоспалительной активностью живых микроорганизмов (например, L. rhamnosus NCC L. paracasei NCC 2461, молочные закваски S. thermophilus NCC 2019) посредством применения UHT-подобной и HTST-подобной тепловой обработки;
- продемонстрировано также наличие противовоспалительных профилей у штаммов, выделенных из представленных в продаже продуктов (Фигуры 3A и B), включая штамм пробиотической E. coli.
Действие UHT/HTST-подобной обработки было сходным для всех исследовавшихся пробиотиков и молочных заквасок, например, молочнокислых бактерий, бифидобактерий и стрептококков.
UHT/HTST-подобная обработка применялась к нескольким видам молочнокислых бактерий, бифидобактерий и стрептококков, демонстрирующим различные in vitro иммунные профили. Все штаммы после UHT/HTST-подобной обработки индуцировали меньше провоспалительных цитокинов, чем их живые экземпляры (Фигуры 1, 2, 3, 4, 5 и 6), демонстрируя, что действие UHT/HTST-подобной обработки на иммунные свойства конечных нереплицирующихся бактерий может быть обобщено на все пробиотики, в частности, на молочнокислые бактерии, бифидобактерий и определенные штаммы E. coli, а также на все молочные заквасочные культуры, в частности, стрептококки, лактококки и молочнокислые бактерии.
Пример 2.
Методика.
Бактериальные препараты.
При исследовании усиления иммунных свойства нереплицирующихся пробиотиков было использовано пять пробиотических штаммов: 3 вида бифидобактерий (B. longum NCC3001, B. lactis NCC2818, B. breve NCC2950) и 2 молочнокислых бактерий (L. paracasei NCC2461, L. rhamnosus NCC4007).
10
Бактериальные клетки выращивались на среде MRS в режиме периодического культивирования в течение 16-18 час при 37C без контроля pH. Бактериальные клетки центрифугировались (5000 g, 4°C) и ресуспендировались в фосфатно-солевом буфере перед разведением в водно-солевом растворе до достижения конечной концентрации около 10 КОЕ/мл. B. longum NCC3001, B. lactis NCC2818, L. paracasei NCC2461, L. rhamnosus NCC4007 подвергались тепловой обработке в течение 20 мин при 85C на водяной бане. B. breve NCC2950 нагревались 30 минут на водяной бане при 90°C. Подвергнутые тепловой обработке бактериальные суспензии аликвотировались и до применения сохранялись в замороженном при -80°C состоянии. Живые бактерии до применения сохранялись при -80°C в смеси PBS-глицерин (15%).
Оценка in vitro иммунного профиля бактериальных препаратов.
5
6
Были выполнены оценки иммунных профилей живых и подвергнутых тепловой обработке бактериальных препаратов (то есть способность индуцировать секрецию специфических цитокинов клетками крови человека in vitro). Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) человека были выделены из фильтров для крови. После разделения по градиенту плотности клеток были отобраны мононуклеарные клетки и дважды промыты сбалансированным солевым раствором Хэнкса. Клетки затем были ресуспендированы в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков, (IMDM, Sigma), дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Bioconcept, Париж, Франция), 1% L-глютамина (Sigma), 1% пенициллина/стептомицина (Sigma) и 0,1% гентамицина (Sigma). РВМС (7×10 клеток на лунку) затем инкубировались с живыми и подвергнутыми тепловой обработке бактериями (эквивалент 7×10 КОЕ на лунку) в 48-луночных планшетах в течение 36 час. Влияние живых и подвергнутых тепловой обработке бактерий было проверено на РВМС, полученных от 8 различных доноров, при разделении на два отдельных эксперимента. После 36 час инкубации культуральные планшеты были заморожены и до измерений цитокинов сохранялись при -20°С. Определение цитокиновых профилей выполнялось параллельно (то есть в одном эксперименте на одной и той же серии РВМС) для живых бактерий и для их экземпляров, подвергнутых тепловой обработке.
После 36 час инкубации в супернатантах клеточной культуры были определены уровни цитокинов (IFN-γ, IL-12p40, TNF-γ и IL-10) методом ELISA (иммуноферментный анализ) (R&D DuoSet Human IL-10, BD OptEIA Human IL12p40, BD OptEIA Human TNFα, BD OptEIA Human IFN-γ) согласно инструкциям производителя. IFN-γ, IL-12p40 и TNF-γ являются провоспалительными цитокинами, тогда как IL-10 является мощным противовоспалительным медиатором. Результаты выражены в виде среднего (пг/мл) +/- SEM по 4 индивидуальным донорам и являются репрезентативными для двух отдельных экспериментов, выполненных с 4 донорами в каждом.
Эффект in vivo живых и подвергнутых тепловой обработке Bifidobacterium breve NCC2950 в профилактике аллергической диареи.
9
Для проверки Th1-промотирующего действия B. breve NCC2950 использовалась модель аллергической диареи на мышах (Brandt E.B и др. JCI 2003; 112 (II): 1666-1667). После сенсибилизации (2 интраперитонеальные инъекции яичного альбумина (OVA) и алюминиевокалиевых квасцов с интервалом в 14 дней; дни 0 и 14), самцы мышей линии Balb/c были подвергнуты 6-кратной пероральной провокации OVA (дни 27, 29, 32, 34, 36, 39), приводящей к кратковременным клиническим симптомам (диарея) и изменению иммунных параметров (плазменная концентрация общего IgE, OVA-специфического IgE, протеазы-1 тучных клеток мышей, то есть ММСР-1). Bifidobacterium breve NCC2950, живые или подвергнутые 30 мин тепловой обработке при 90°C, вводились чреззондовым питанием за 4 дня до OVA-сенсибилизации (дни -3, -2, -1, 0 и дни 11, 12, 13 и 14) и во время провокационного периода (дни 23-39). Использовалась суточная доза бактерий около 10КОЕ или эквивалентные количества в выражении КОЕ/мышь.
Результаты.
Индукция секреции «провоспалительных» цитокинов после тепловой обработки.
Была оценена in vitro способность подвергнутых тепловой обработке бактериальных штаммов стимулировать секрецию цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС) человека. Иммунные профили, основанные на четырех цитокинах, продуцируемых при стимулировании PBMCs подвергнутыми тепловой обработке бактериями, сравнивались с индуцируемыми живыми бактериальными клетками в условиях одинаковых испытаний in vitro.
Подвергнутые тепловой обработке препараты высевались на чашки и оценивались на отсутствие какого-либо количества жизнеспособных микроорганизмов. Подвергнутые тепловой обработке бактериальные препараты не образовывали колоний после высевания на чашки.
Живые пробиотики при инкубации с человеческими PBMCs индуцировали различные и зависящие от вида штамма уровни цитокинов (Фигура 8). Тепловая обработка пробиотиков модифицировала уровни продуцируемых PBMCs цитокинов по сравнению с их живыми аналогами. Подвергнутые тепловой обработке бактерии индуцировали больше провоспалительных цитокинов (TNF-α, IFN-γ, IL-12p40), чем их живые аналоги. Напротив, подвергнутые тепловой обработке бактерии в сравнении с живыми клетками индуцировали подобные или более низкие количества IL-10a (Фигура 8). Эти данные показывают, что подвергнутые тепловой обработке бактерии способны в большей степени стимулировать иммунную систему, чем их живые аналоги, и поэтому могут эффективнее укреплять ослабленную иммунную защиту. Другими словами, in vitro данные иллюстрируют улучшение эффекта укрепления иммунитета бактериальными штаммами после тепловой обработки.
Для того, чтобы показать повышенную эффективность подвергнутых тепловой обработке B. breve NCC2950 (по сравнению с живыми клетками) в отношении действия на иммунную систему, и живые, и подвергнутые тепловой обработке B. breve NCC2950 (штамм А) были проверены в модели аллергической диареи на животных.
По сравнению с группой позитивного контроля интенсивность диареи после терапии с подвергнутыми тепловой обработке B. breve NCC2950 была значительно и устойчиво снижена (41,1±4,8%), тогда как интенсивность диареи после терапии с живыми B. breve NCC2950 была снижена только на 20±28,3%. Эти результаты показывают, что подвергнутые тепловой обработке B. breve NCC2950 демонстрируют более выраженное защитное действие против аллергической диареи, чем их живые эквиваленты (Фигура 9).
В результате показано улучшение способности пробиотиков усиливать иммунную защиту после подвергания их тепловой обработке.
Дополнительный пример.
С использованием стандартной, описанной в этой патентной заявке методики может быть приготовлена следующая композиция корма для домашних животных.
Ингредиент
г/100 г
Жиры
15
Белки
29
Углеводы
46
Пищевое волокно
7
Средства обеспечения питательного баланса
2
Подвергнутые кратковременной тепловой обработке Lactobacillus johnsonii La1
1