СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ
METHOD OF PRODUCTION OF PEPTIDES

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения пептидов из дрожжевых автолизатов.
В современных технологических процессах дрожжи используют в качестве сырья для получения различных продуктов, биологически активных веществ, аминокислот, нуклеиновых компонентов, витаминов и т.д. К числу известных способов переработки дрожжевой биомассы относится автолиз, осуществляемый собственными гидролитическими ферментами дрожжей. В ходе автолиза происходит накопление в автолизате свободных аминокислот, низших (ди-, три-, тетра-) пептидов и пептидов с более высокой молекулярной массой.
Известны способы получения биологически активных пептидов-аналогов природных пептидных регуляторов, иммуномодуляторов, морфиноподобных пептидов, антимикробных пептидов и других методами химического синтеза или химической модификации природных пептидных регуляторов или активной части их структуры (патенты РФ №№2043769, 2047621, 2060998, 2067000, 2087480, 2107691, 2126014, 2141527, 2145233, 2145234, 2146262, 2316336, 2478105, 2494105, 2182155, 2111215). Недостатком известных способов является необходимость информации о точной структуре природного аналога, дорогостоящая и сложная процедура пептидного синтеза из исходных производных аминокислот, не позволяющая зачастую получить промышленные количества продукта.
Известны способы получения природных пептидов из органов и тканей сельскохозяйственных животных (патенты РФ №№2075944, 2104702, 2161501, 2043364). Недостатком этого способа является дефицит этого вида природного сырья.
Известен способ получения продукта, содержащего гипотензивные пептиды и его применения в качестве антигипертензивного, годного в пищу продукта (патент РФ №2276689, МПК С12Р 21.02; A23J 1/20, публикация 2006 г.). Способ включает стадии ферментации казеинсодержащего заквасочного материала молочно-кислой бактерией, нанофильтрации полученного пептидсодержащего ферментационного продукта и выделения продукта. Полученный продукт используют в качестве антигипертензивного агента, а также как годный в пищу продукт.
Недостатком известного способа является невысокая степень очистки пептидов.
Известен способ получения пептидов и аминокислот из белкового сырья (патент РФ №2333663, МПК A23J 3/04, публикация 2008 г.), по которому сырьем служит казеин молока, а гидролиз его осуществляют в присутствии эндогенных ферментов и далее подвергают разделительной обработке, включающей коагуляцию белковых остатков.
Известен также способ получения пептидов с высоким содержанием триптофана (патент РФ №2043364, МПК C07K 1/12; A61K 38/01, публикация 1995 г.), включающий суспендирование белка фибриногена в воде, последующий щелочной и ферментативный гидролиз белка, инактивирование фермента при 90-100°C в течение 15-20 мин, центрифугирование гидролизата, осаждение конечного продукта из надосадочной жидкости ацетоном и сушку осадка.
Недостатком указанных способов является использование дефицитного сырья и экзогенных ферментов.
Известны способы получения смеси аминокислот и низших пептидов путем автолиза дрожжей с последующей очисткой целевого продукта на ионитах (например, патент США №2272982, патент Великобритании №952713, авт. свидетельства СССР №№957835, 1369300, 1731806).
Известен также способ получения смеси аминокислот и пептидов путем фильтрации автолизата через слабоосновный анионит ИА-1р с последующей сорбцией из фильтрата аминокислот и низших пептидов на сульфокатионите КУ-2×8, упариванием элюата и сушкой готового продукта (авт. свидетельство СССР №602543).
Существенными недостатками известных способов является высокое содержание в целевом продукте аминокислот, составляющих 70-76% от общего количества продукта, что обусловливает ограничение сферы использования продукта в качестве средства пищевого и фармакологического назначения, а также в виде пептидного компонента при создании микробиологических питательных сред и парфюмерных композиций.
Известен способ получения низкомолекулярных пептидов, обладающих интерферонстимулирующей активностью (патент РФ №2409678, МПК С12Р 21/00; C07K 1/34, публикация 2011 г.), согласно которому в качестве сырья используют отход при производстве препарата лактоглобулина, который подвергают диализу на полисульфидных мембранных фильтрах с диаметром пор 1 кДа против дистиллированной воды до достижения концентрации общего белка в препарате 3 мг/мл с последующим концентрированием методом ионообменной хроматографии в геле и элюцией 0,5М раствором хлорида натрия. Исходным сырьем для получения низкомолекулярных пептидов служит отход производства лактоглобулина против условно патогенных бактерий и сальмонелл (патент РФ №2298409, публикация 2007 г.), в соответствии с которым иммунное молозиво коров подвергают сбраживанию пепсином, удаляют творожную массу. Из полученной иммунной сыворотки молозива коров методом ультрафильтрации удаляют денатурированные белки и жир, получая очищенную лактосыворотку. Полученную лактосыворотку разделяют на ультрафильтрационной установке на две фракции: высокомолекулярную фракцию (лактоглобулин) и содержащий низкомолекулярные (1-5 кДа) пептиды фильтрат в качестве отхода производства, который и используют для получения НМП.
Существенным недостатком указанного способа является дефицит сырья (молозиво коров), крайне низкое содержание целевого продукта в отходе, требующее предварительной концентрации на мембранных фильтрах.
Известен способ получения смеси аминокислот и низших пептидов, включающий автолиз дрожжей, отделение клеточных оболочек центрифугированием и очистку автолизата на ионитах, отличающийся тем, что в качестве ионита используют гелевый сульфокатионит в водородной форме, содержащий в качестве сшивающего агента 12-16% дивинилбензола (патент РФ №2284356, МПК С12Р 13/06; A23J 1/18, публикация 2006 г. - ближайший аналог).
Недостатком указанного способа является то, что в отходе (проскоке с катионита) содержится ценный продукт - пептиды, который можно извлечь только с применением дополнительных операций выделения и очистки.
Целью настоящего изобретения является создание эффективного и экономичного способа получения высокоочищенной смеси пептидов из практически неограниченного возобновляемого сырья - дрожжей.
Указанная цель достигается тем, что в качестве сырья используется отход при производстве смеси аминокислот и низших пептидов из дрожжей, содержащий пептиды.
Сущность предложенного способа заключается в следующем.
Способ получения пептидов включает автолиз дрожжей, отделение клеточных оболочек центрифугированием, очистку автолизата на ионитах и получение водного раствора пептидов (проскок), при этом в качестве ионита используют гелевый сульфокатионит в водородной форме, содержащий в качестве сшивающего агента 12-16% дивинилбензола, при этом полученный водный раствор пептидов пропускают последовательно через гелевый анионит до получения раствора с pH 2,0-2,6, а затем через гелевый катионит с содержанием дивинилбензола 1-2% или макропористый катионит.
В ходе производственного процесса по выделению аминокислот и низших пептидов автолизат обрабатывают следующим образом: отделяют клеточные оболочки центрифугированием, полученный раствор подвергают ультрафильтрации через мембраны с номинальной отсекаемой молекулярной массой (НОММ) 5-15 кДа, ультрафильтрат подкисляют до pH 3,0 и пропускают через сульфокатионит в водородной форме, содержащий в качестве сшивающего агента 12-16% дивинилбензола. При этом аминокислоты и низшие пептиды сорбируются на катионите, а пептиды с более высокой молекулярной массой не сорбируются и концентрируются в отходе (проскоке). Это позволяет практически полностью отделить индивидуальные (свободные) аминокислоты от пептидов в одноактном процессе сорбции из автолизата, при этом целевой продукт - пептиды остаются в растворе.
Проскок представляет собой водный раствор целевого продукта (пептидов) с низким pH (1,0-1,2), перегруженный балластными органическими (пигментированными) и минеральными веществами. Сущность предложенного способа получения смеси пептидов заключается в выделении пептидов из проскока. Для этого проскок фильтруют через колонку с анионитом до получения раствора с pH 2,0-2,6 (предпочтительно 2,4), а затем пропускают через гелевый сульфокатионит в водородной форме с содержанием ДВБ 1-2% или через макропористый сульфокатионит. Десорбцию с катионита ведут 2,5-3,0% водным раствором аммиака, полученный элюат упаривают для отгонки аммиака и сушат на сублимационной сушилке.
Существенными преимуществами предлагаемого изобретения по сравнению с известными является то, что в ходе процесса достигается высокая степень очистки продукта от сопутствующих минеральных и органических веществ. Способ позволяет получать пептиды, не
содержащие аллергены и нуклеиновые компоненты, жиры, сахара и соли. Способ позволяет получать пептиды из практически неограниченного возобновляемого сырья - пекарских или пивных дрожжей. Получаемый по заявляемому способу продукт обладает выраженной биологической активностью.
Физико-химический анализ продукта показал, что содержание пептидов в сухом продукте составляет 88-92%, аминокислот 6-9%. Продукт состоит из смеси 22 индивидуальных пептидов с молекулярной массой от 0,8 до 2,5 кДа. В экспериментальном исследовании продукт показал выраженную противоишемическую активность, перспективен в плане профилактики и терапии ишемической болезни сердца.
Пример №1
35 л проскока, полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с сильно сшитым (12% ДВБ) сильноосновным анионитом Dowex 550А, объем анионита 3,5 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 1,0 л дистиллированной воды. Получают 36 л раствора с pH 2,2. Полученный раствор фильтруют через колонну с макропористым сульфокатионитом Dowex MSC-1C в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3%) аммиаком. Получают 3 л элюата (pH 10,2), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,43 кг продукта, содержащего 90% пептидов и 7% аминокислот.
Пример №2
-
35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с сильноосновным высокоемким полиакриловым гелевым анионитом Purolite А830 в ОН форме, объем анионита 2,0 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды. Получают 35,5 л раствора с pH 2,4. Полученный раствор фильтруют через колонну с макропористым сульфокатионитом Dowex MSC-1C в H+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 3 л элюата (pH 10,2), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,44 кг продукта, содержащего 89% пептидов и 7% аминокислот.
Пример №3
-
35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом Purolite А830 в ОНформе, объем анионита 2,0 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды. Получают 35,5 л раствора с pH 2,4. Полученный раствор фильтруют через колонну с макропористым сульфокатионитом КУ-23 в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 3,2 л элюата (pH 10,4), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,3 кг продукта, содержащего 76% пептидов и 8% аминокислот.
Пример №4
-
35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом Purolite А830 в ОН форме, объем анионита 2,0 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды. Получают 35,5 л раствора с pH 2,4. Полученный раствор фильтруют через колонну с гелевым слабо сшитым (1% ДВБ) катионитом Dowex W50×l в Н+ форме, объем катионита 13 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 3,2 л элюата (pH 10,3), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,42 кг продукта, содержащего 91% пептидов и 5% аминокислот.
Пример №5
35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом, объем анионита 2 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды. Получают 35,5 л раствора с pH 2,4. Полученный раствор фильтруют через колонну с гелевым сульфокатионитом Dowex W50×2, содержащим 2% сшивки (ДВБ) в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 2,7 л элюата (pH 10,1), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,4 кг продукта, содержащего 88% пептидов и 9% аминокислот.
Пример №6
35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом, объем анионита 2 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды. Получают 35,5 л раствора с pH 2,4. Полученный раствор фильтруют через колонну с гелевым сульфокатионитом Dowex W50×4 (4% ДВБ) в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 2,7 л элюата (pH 10,1), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,22 кг продукта, содержащего 75% пептидов и 8% аминокислот.
Пример №7
-
35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом Purolite А830 в ОН форме, объем анионита 2,2 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды и получают 35,5 л раствора с pH 2,7. Полученный раствор фильтруют через колонну с макропористым сульфокатионитом Dowex MSC-1C в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 3 л элюата (pH 10,2), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,40 кг продукта, содержащего 87% пептидов и 9% аминокислот.
Пример №8
-
35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом Purolite А830 в ОН форме, объем анионита 1,8 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды и получают 35,5 л раствора с pH 1,9. Полученный раствор фильтруют через колонну с макропористым сульфокатионитом Dowex MSC-1C в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 3 л элюата (pH 10,2), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,39 кг продукта, содержащего 85% пептидов и 9% аминокислот.
Пример №9
35 л проскока с pH 1,2, полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с макропористым сульфокатионитом Dowex MSC-1C в H+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, и поступают, как в примере №1. Получают 0,15 кг продукта, содержащего 91% пептидов и 8% аминокислот.
Пример №10
-
28 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом Purolite А830 в ОН форме, объем анионита 1,6 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды. Получают 28,5 л раствора с pH 2,3. Полученный раствор фильтруют через колонну с макропористым сульфокатионитом Dowex MSC-1C в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3%>аммиаком. Получают 2,9 л элюата (pH 10,1), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационной сушилке. Получают 0,33 г продукта, содержащего 90% пептидов и 7% аминокислот.
Пример №11
Продукт «Поликардин», полученный по примеру №2, использовали для изучения биологической активности при экспериментальном инфаркте миокарда. Моделирование инфаркта миокарда проводили перевязкой левой коронарной артерии крыс. Препаратом сравнения служил стандартный лекарственный препарат - антигипоксант «Ренитек». Препараты вводили интрагастрально 1 раз в сутки курсом 5 дней до экспериментального инфаркта миокарда и курсом 7 дней после, в виде водных растворов, Ренитек в дозе 1 мг/кг. Поликардин в дозе 100 мг/кг. Обнаружено, что БАД «Поликардин» достоверно обладает противоишемическим действием, сопоставимым с таковым у препарата «Ренитек», препятствует формированию очага некроза и достоверно повышает выживаемость экспериментальных животных в условиях острой гипоксии.