Определение уровня L-цитруллина в амниотической жидкости у женщин с физиологической беременностью методом капиллярного электрофореза

биохимия

Bondar V.S. Detonation nanodiamonds in constructing systems for indication and target transportation of substances. In: "High Technologies, Fundamental and Applied Investigations in Medicine and Physiology": Proc. 1-st Int. Conf., St. Petersburg, 2010; 2: 213-4 (in Russian).

6. Bondar VS., Pozdnyakova I.O., Puzyr A.P. Applications of nanodiamonds for separation and purification of proteins. Phys. Solid State. 2004; 46: 758-60 (in Russian).

7. Bondar VS., Puzyr A.P. Nanodiamonds for biological investigations. Phys. Solid. State. 2004; 46: 716-9.

8. Clark R. et al. Rapid electrophoretic analysis of human serum proteins: qualitative comparison with high-throughput agarose gel electrophoresis. J. Chromatogr. 1996; 744: 205-13.

9. Gibson N., Shenderova O., Luo T.J.M., Moseenkov S., Bondar V., Puzyr A. et al. Colloidal stability of modified nanodiamond particles. Diam. Relat. Mater. 2009; 18: 620-6.

10. Mamaeva E.S., Baron A.V., Puzyr A.P., Burov A.E., Bondar V.S. Modified nanodiamonds obtained by detonation synthesis in constructing biochemical indication systems (as exemplified by the

glucose determination system). Dokl. Biochem. Biophys. 2011; 439: 182-4.

11. Mogilnaya O.A., PuzyrA.P., BaronA.V., Bondar VS. Hematological parameters and the state of liver cell of rats after oral administration of aflatoxin B1 alone and together with nanodiamonds. Nanoscale Res. Lett. 2010; 5: 908-12.

12. Puzyr A.P., Bondar VS., BukayemskyA.A., Selyutin G.E., Kargin V.F. Physical and chemical properties of modified nanodiamonds. NATO Sci. Ser. II. Math. Phys. Chem. 2005; 192: 261-70.

13. Puzyr A.P., Baron A.V., Purtov K.V., Bortnikov E.V., Skobelev N.N., Mogilnaya O.A., Bondar V.S. Nanodiamonds with novel properties: A biological study. Diam. Relat. Mater. 2007; 16: 2124-8.

14. Puzyr A.P., Purtov K.V., Shenderova O.A., Luo M., Brenner D.W., Bondar V.S. The adsorption of aflatoxin B1 by detonation-synthesis nanodiamonds. Dokl. Biochem. Biophys. 2007; 417: 299-301.

15. Purtov K.V., Burakova L.P., Puzyr A.P., Bondar V.S. Interaction of linear and ring forms of DNA molecules with nanodiamonds synthesized by detonation. Nanotechnology. 2008; 19: 1-3.

Поступила 22.04.13

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДк 618.446-008.834.66-074

Е.В. Нарежная1, И.И. Крукиер2, В.В. Авруцкая2, А.А. Никашина2, С.В. Серкова1

определение уровня l-цитруллина в АмниотичЕской жидкости у женщин с физиологической беременностью методом капиллярного электрофореза

'южный федеральный университет; 2фГУ Ростовский НИИ акушерства и педиатрии минздрава Рф, Ростов-на-Дону

Оптимизированы условия определения L-цитруллина без предварительной дериватизации методом капиллярного зонного электрофореза. Изучено влияние pH буферного электролита, температуры, времени ввода пробы в капилляр на результаты определения L-цитруллина. Проведено определение L-цитруллина в образцах биологической жидкости. Продолжительность анализа не превышает 15 мин.

Ключевые слова: цитруллин, аргинин, пролин, капиллярный электрофорез, амниотическая жидкость E.V. Narejnaya, I.I. Krukiyer, V.V. Avrutskaya, A.A. Nikashina, S.V Serkova

THE DETECTION OF CONCENTRATION OF L-CITRULLINE IN AMNIOTIC FLUID IN WOMEN WITH PHYSIOLOGIC PREGNANCY USING THE TECHNIQUE OF CAPILLARY ELECTROPHORESIS

The Southern federal university, Rostov-on-Don, Russia; The Rostov research institute of obstetrics and pediatrics on Minzdrav of Russia, Rostov-on-Don, Russia

The article discusses the optimized conditions of detection of L-citrulline without preliminary derivatization using the technique of capillary zonal electrophoresis. The effect ofpH of buffer electrolyte, temperature, time of introduction ofprobe into capillary on the results of detection of L-citrulline in samples of biological fluid is studied. The duration of analysis does not exceed 15 minutes.

Key words: citrulline, arginine, proline, capillary electrophoresis, amniotic fluid

Известно, что аминокислоты и их производные - биогенные амины - не только являются строительным материалом биологически важных соединений, в том числе белков, но и регулируют множество физиологических функций живых организмов. Для нормального функционирования и гармоничного развития организма человека большое значение имеет оптимальный аминокислотный состав. Избыточное или недостаточное содержание в тканях, органах, биожидкостях а-аминокислот является

Для корреспонденции:

Нарежная Елена Васильевна, канд. хим. наук, доц. каф. аналитической химии

Адрес: 344099, Ростов-на-Дону, ул. Зорге, корп. 7 Телефон: 8 (903) 431-39-00 E-mail: evn@sfedi.ru

важным диагностическим признаком и может свидетельствовать о возникновении различных патологий [1, 2]. Именно поэтому изучение аминокислотного состава на сегодняшний день является важной задачей как аналитической химии, так и клинической биохимии и медицины.

Одним из достижений современной медицины явилась возможность изучения околоплодных вод в разные сроки беременности для получения информации о состоянии внутриутробного плода. Имеющиеся данные о функциональной взаимозависимости между состоянием плода и составом амниотической жидкости свидетельствуют о важной диагностической ценности исследования этой биологической среды как в теоретических, так и в практических целях [3, 4].

Известно, что метаболизм L-аргинина идет как минимум двумя альтернативными путями: 1) окисным

клиническая лабораторная диагностика, № 11, 2013

61,4 mAU

S °

О о

0 щ ГЧ~ т-~ х X 5 5

1 I

Электрофореграмма модельной смеси L-цитруллина, L-аргинина и L-пролина. С = 0,05 г/л. По оси абсцисс

l l аминокислот 7

- время, мин; по оси ординат - площадь пика, mAU.

неокисным (аргиназным) с образованием L-орнитина и мочевины. Возможно и одновременное протекание этих двух процессов часть L-аргинина, не метаболизировав-шаяся в печени, используется как субстрат для продукции NO. Главной метаболической ролью цитруллина у всех млекопитающих является участие в синтезе мочевины (орнитиновый цикл или цикл Кребса-Гензелейта) [5, 6].

Целью настоящей работы стала разработка методики капиллярного электрофоретического определения свободных форм L-цитруллина в биологическом материале

- амниотических жидкостях и надежной его идентификации в смеси сопутствующих аминокислот.

Материалы и методы. Реагенты. Исходные растворы аминокислот готовили из химически чистых стандартов (L-citrulline, L-arginine monohydrochloride и L-proline, «Sigma», Reagent Grade > 98%). Для приготовления растворов в работе использовали бидистиллированную воду. Рабочие растворы готовили разбавлением исходного раствора непосредственно перед использованием. Буферный раствор готовили из тетрабората натрия (ч. д. а.), нужное значение pH устанавливали добавлением раствора гидроксида натрия и борной кислоты.

Аппаратура. Электрофоретические определения проводили при использовании системы капиллярного электрофореза «Капель-105» с переменной полярностью, УФ-детектором и пневматическим вводом пробы (НПФ АП «Люмэкс»). Сбор и обработку данных проводили с помощью IBM PC с программным обеспечением Мультихром (АО «Амперсенд»). Использовали немоди-фицированный кварцевый капилляр с внешней полиамидной пленкой общей (эффективной) длиной 60 (50) см и внутренним диаметром 75 мкм. Использовали прямое спектрофотометрическое детектирование при 200 нм. Тепло отводили через жидкостную систему термо-статирования капилляров (30°C).

Результаты и обсуждение. Исследовано влияние величины pH ведущего электролита, времени ввода пробы в капилляр, величины рабочего напряжения и температуры на результаты определения.

Влияние pH на время миграции L-цитруллина изучалось в среде боратного буфера. Показано, что в интервале pH 9,1-9,3 время миграции L-цитруллина и площадь пика практически не зависят от значения pH буферного раствора. При этом при концентрации буфера, лежащей в диапазоне 10-20 мМ, величина тока не превышает 2030 мкА, что позволяет применять максимально высокие напряжения в ходе анализа.

Для ввода пробы в капилляр использовали пневматический способ, при котором объем пробы можно регулировать изменением времени ввода. Время пневматического ввода варьировало от 5 до 30 с при давлении 30 мбар. Для изучения этой зависимости использовали стандартный раствор L-цитруллина, содержащий 0,5 г/л. Найдено, что зависимость площади пика L-цитруллина от времени ввода практически линейная, что свидетельствует об отсутствии перегрузки системы. Поскольку при уменьшении времени ввода пробы одновременно с шириной пиков уменьшаются и площади пиков определяемого компонента, а следовательно, снижается чувствительность электрофоретического определения L-цитруллина, нами как оптимальное было выбрано время ввода пробы 15 с при давлении 30 мбар.

Заметно изменение времени выхода L-цитруллина при изменении температурного режима. Чем выше температура, тем быстрее появляются пики на электрофоре-грамме. Время анализа уменьшается от 25 мин при 20°С до 7-8 мин при 50°С. Оптимальная температура определения, на наш взгляд, составляет 30°С.

Поскольку сопутствующими компонентами L-цит-руллина в биологических жидкостях являются другие аминокислоты, в частности аргинин и пролин, на наш взгляд, было целесообразно исследовать возможность их определения в выбранных условиях при совместном присутствии. Электрофореграмма модельной смеси L-цитруллина, L-аргинина и L-пролина в стандартном растворе представлена на рисунке. Рассчитаны хромато-графические параметры разделения смеси L-цитруллина, L-аргинина и L-пролина. Эффективность колонки достаточно высока (число теоретических тарелок составляет 25-30 тыс.), при этом наблюдается высокая степень разделения Rs (Я5 = 8 для системы аргинин-пролин и Rs = 12 для системы пролин-цитруллин), следовательно, достигается качественное разделение веществ.

Количественное определение L-цитруллина проводили методом внешнего стандарта по линейной зависимости между концентрацией аналита и площадью хро-матографического пика. Для построения градуировоч-ного графика готовили серию растворов, содержащих от 0,01 до 2 г/л аминокислот. Уравнение градуировочного графика найдено методом линейного регрессионного анализа ^ = 0,00801 х, R2 = 0,9970, где Y - площадь пика; х - концентрация аминокислоты, г/л; R2 - коэффици-

Таблица 1

Результаты определения Ь-цитруллина, Ь-аргинина и Ь-пролина методом капиллярного зонного электрофореза в модельной смеси

Объект Введено, мг/л Найдено, мг/л S

L-аргинин 50,00 51 ± 2,2 0,02

L-пролин 50,00 51 ± 2,3 0,03

L-цитруллин 50,00 50 ± 1,8 0,03

Таблица 2

Содержание свободных форм аминокислот в амниотической жидкости у женщин с физиологической беременностью

Аминокислота Найдено, мг/л s

L-аргинин 31 ± 3 0,08

L-пролин 74 ± 7 0,06

L-цитруллин 70 ± 5 0,07

иммунология

ент корреляции). Градуировочный график линеен в диапазоне концентраций 0,01-1 г/л. Предел обнаружения, рассчитанный по 35-критерию, составил 4 мг/мл. Правильность и воспроизводимость результатов определения аминокислот методом КЗЭ подтверждены способом «введено-найдено» (табл. 1).

Разработанная методика применена для анализа ам-ниотической жидкости, взятой у женщин с физиологической беременностью в сроки гестации 18-24 нед. До начала исследования образцы жидкости хранили в течение 1-25 сут при температуре -85°C. Непосредственно перед анализом подготовку пробы проводили обработкой 10% раствором трихлоруксусной кислоты с целью депротеи-низации с последующим центрифугированием в течение 15 мин при 5500 об/с. Результаты представлены в табл. 2.

Заключение. Предлагаемая методика определения L-цитруллина в присутствии L-пролина и L-аргинина методом капиллярного зонного электрофореза характеризуется правильностью результатов, простотой, экс-прессностью и отвечает требованиям, предъявляемым к современным методам мониторинга биообъектов.

ЛИТЕРАТУРА

1. ГраникВ.Г. Химико-фармацевтический журнал. 2003; 3: 3-20.

2. Хлыбова С.В., Циркин В.И. Содержание свободных аминокислот при физиологическом течении гестационного процесса и ряде аку-

шерских осложнений. Медицинский альманах. 2008; 5: 68-71.

3. Орлов В.И., Погорелова Т.Н., КрукиерИИ. Околоплодные воды. Химический состав и биологические функции. Ростов-на-Дону; 2009.

4. Крукиер И.И., Авруцкая В.В., Никашина А.А., Нарежная Е.В. Новые критерии диагностики задержки роста плода. Материалы XI Всероссийского научного форума «Мать и дитя». М.; 2010: 111-2.

5. Бабушкина А.В. L-аргинин с точки зрения доказательной медицины. Украинский медицинский журнал. 2009; 74 (6): 43-8.

6. Степанов Ю.М., Кононов И.Н., Журбина А.И., Филлипова А.Ю. Аргинин в медицинской практике. Журнал АМН Украины. 2004; 10 (1): 340-52.

REFERENCES

1. Granik V.G. The metabolism of L-arginine (review). Pharmaceutical Chemistry Journal. 2003; 37 (3): 3-20 (in Russian).

2. Khlybova S.V, Tsirkin V.I. The contents of free amino acids at physiological pregnancy and labor and obstetrics complications. Medical almanac. 2008; 5: 68-71 (in Russian).

3. Orlov V.I., Pogorelova T.N., Krukier I.I. Amniotic fluid. Chemical composition and biological functions. Roston-on-Don; 2009 (in Russian).

4. Krukier I.I., Avrutskaya V.V., Nikashina A.A., Narezhnaya E.V. New criteria for diagnosis of fetal growth restriction. In: Proc. XI All-Russian Scientific Forum "Mother and child". Moscow; n2010; 111-2 (in Russian).

5. BabushkinaA.V. L-arginine from the point of view of evidence-based medicine. Ukrainian Medical Journal. 2009; 6: 43-8 (in Russian).

6. Stepanov Yu.M., Kononov I.N., Zhurbina A.I., Fillipova A.Yu. Arginine in medical practice. Journal of the Academy of Medical Sciences of Ukraine. 2004; 1: 340-52 (in Russian).

Поступила 03.02.12

иммунология

© М.В. ЧЕПЕЛЕВА, 2013

УДк 616.717/.718+616.72]-002.3-018.1-092:612.017.1]-078.33

М.В. Чепелева

факторный анализ в оценке состояния клеточного иммунитета у пациентов с гнойно-воспАлитЕльными заболеваниями Длинных трубчатых костей и крупных суставов

ФГБУ РНЦ «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г.А. Илизарова Минздравсоцразвития России, Курган

Методом факторного анализа вычислены значения главных компонент, определяющих состояние клеточного иммуните-тау пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями длинных трубчатых костей и крупных суставов. Показано, что в условиях хронической гнойной инфекции основными являются факторы, связанные с регуляторными Т-лимфоцитами, участвующими в угнетении T-клеточного иммунитета. В случае развития свищевой формы остеомиелита важными становятся механизмы, связанные с маркерами активации Т-лимфоцитов, при инфицировании эндопротеза - с нарушением экспрессии HLA-DR на моноцитах.

Ключевые слова: факторный анализ, клеточный иммунитет, остеомиелит, инфицированный эндопротез крупных суставов

M.V. Tchepeleva

THE FACTORIAL ANALYSIS IN EVALUATION OF CELL IMMUNITY OF PATIENTS WITH PYO-INFLAMMA-TORY DISEASES OF LONG BONES AND LARGE JOINTS

The G.A. Ilizarov research center of reconstructive traumatology and orthopedics of Minzdrav of Russia, Kurgan, Russia

The factorial analysis was applied to calculate the values of main components determining condition of cell immunity in patients with pyo-inflammatory diseases of long bones and large joints. It is demonstrated that in conditions of chronic purulent infection the main are the factors related with regulative T-lymphocytes involved in suppression of T-cell immunity. In case of development of fistula form of osteomyelitis the main role is attached to mechanisms related to markers of activation of T-lymphocytes and to derangement of expression of HLA-DR on monocytes in case of infection ofprosthesis.

Key words: factorial analysis, cell immunity, osteomyelitis, infected prosthesis of large joint