Способ количественного определения антипролиферативной активности интерферона-бета человека
METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF ANTI-PROLIFERATIVE ACTIVITY OF HUMAN INTERFERON-BETA

Область техники
Изобретение относится к биохимии и фармакологии, в частности, к способу определения  антипролиферативной активности интерферона-бета человека, и может быть использовано для количественного измерения активности препаратов интерферона-бета в антипролиферативном тесте на опухолевых клетках.
Уровень техники
Для уничтожения опухолевых клеток сегодня существует множество разнообразных субстанций, но интерфероны 1 типа в этом ряду занимают незаслуженно скромное место. Эти белки не обладают иммуногенностью, действуют через множество эффекторных клеток и сигнальных путей (Свешников П.Г., Малайцев В.В., Богданова И.М., Солопова О.Н. Введение в молекулярную иммунологию и гибридомную технологию. Издательство МГУ, Москва. 2006), поэтому могут быть эффективными и при длительном применении. в отличие от большинства цитостатических препаратов. В настоящее время ведется целый ряд исследований по поиску способов направления интерферонов непосредственно на опухоль и значительного уменьшения их системного действия (Doherty M.R., Cheon H., Junk D.J. et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017. Vol.114, N 52. P.13792-13797; Lykhova A.A., Kudryavets Y.I., Strokovska L.I., Bezdenezhnykh N.A., Semesiuk N.I., Adamenko I.N., Anopriyenko O.V., Vorontsova A.L. Cytokine. 2015. Vol.71, N 2, P. 318-326). Параллельно встает задача количественной оценки антипролиферативного действия препаратов интерферона на различные виды опухолей.
Известен способ определения биологической активности интерферонов первого типа, в том числе интерферона бета по их действию на вирусы (ОФС.1.7.2.0002.15 Биологические методы испытания препаратов интерферона с использованием культур клеток).  Метод определения специфической активности основан на способности интерферона бета подавлять цитопатическое действие индикаторного вируса в культуре клеток в сравнении со стандартным образцом интерферона (СО). Испытания проводят с использованием соответствующих линий клеток, чувствительных к определенному типу интерферона и к индикаторному вирусу. Наиболее часто используют следующие комбинации клетка/вирус:
линия клеток карциномы легкого человека А-549, линия клеток почки африканской зеленой мартышки Vero, линия клеток карциномы гортани человека Нер-2с, линия клеток фибробластов мыши L-929/ вирус энцефаломиокардита мышей (EMCV);
клетки бычьих почек Madin-Darby MDBK, линия клеток почки африканской зеленой мартышки Vero, линия лимфоидных клеток человека Л-41, линия клеток карциномы легкого человека А-549, линия клеток фибробластов мыши L-929, линия клеток амниона человека WISH/ вирус везикулярного стоматита (VSV);
клетки фибробластов человека/ вирус леса Семлики (SFV), вирус Синдбис (virus Sindbis) или иные.
Выбор комбинации «клеточная культура/вирус» основывается на том, какая из них обеспечивает наиболее чувствительный ответ для определяемого типа интерферона.
В качестве стандарта может быть использован международный стандартный образец активности интерферона соответствующего типа или стандартный образец, откалиброванный в Международных единицах (МЕ) по соответствующему международному стандарту.
Описываемый способ определения активности интерферона бета позволяет определять количественное значение антивирусной активности интерферона бета, что не является эквивалентом антипролиферативного действия.
Раскрытие изобретения
Технической проблемой, решаемой изобретением, является отсутствие известных способов количественного определения антипролиферативной активности ИФНб в отношении опухолевых клеток, малочувствительных к прямому действию ИФНб.
Техническим результатом является осуществление заявленного способа, количественная оценка антипролиферативной активности ИФНб в отношении опухолевых клеток, в том числе при недостаточно выраженном прямом действии ИФНб на опухоль или его полном отсутствии. Для решения поставленной технической проблемы предлагается способ количественного определения антипролиферативной активности интерферона-бета характеризующийся тем, что количественное определение антипролиферативной активности осуществляют в антипролиферативном тесте на опухолевых клетках в присутствии эффекторных клеток человека.
В  качестве эффекторных клеток человека используют мононуклеары периферической крови человека.
В качестве опухолевых клеток в антипролиферативном тесте используют клетки аденокарциномы человека.
В качестве опухолевых клеток в антипролиферативном тесте используют клетки аденокарциномы человека HT-29.
В антипролиферативном тесте используют мононуклеары периферической крови человека в количественном соотношении в пределах 5:1 – 10:1 по отношению к клеткам опухоли.
В антипролиферативном тесте культивирование опухолевых клеток в присутствии эффекторных клеток человека осуществляют в течение 5 суток.
Краткое описание чертежей
Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:
Фиг.1. Антипролиферативное действие ИФНб на клетки НТ29 при различных концентрациях моноцитов периферической крови человека (МПК). Количество МПК на лунку: 1 - без МПК; 2 – 25 тыс. клеток на лунку; 3 –50 тыс. клеток на лунку; 4 –100 тыс. клеток на лунку.
Фиг.2. Доказательство подлинности определения антипролиферативной активности ИФНб. Нейтрализация действия ИФНб антителом В16 при различных сроках культивирования.
1 – неспецифическое антитело, 8 суток; 2 – 4 суток; 3 – 5 суток; 4 – 6 суток; 5 – 7 суток; 6 – 8 суток
Фиг. 3. Антипролиферативная активность препаратов ИФНб и ИФНб производства ООО «Фармапарк». 1 – ИФНб производства ООО «Фармапарк»; 2 – Синновекс; 3 – Ребиф; 4 - Бетаферон*,  «*» - для препарата Бетаферон концентрации в 10 раз больше указанных на шкале значений.
Осуществление изобретения
Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения, которые более подробно описывают возможность осуществления заявляемого изобретения с достижением заявляемого технического результата.
Пример 1. Определение антипролиферативного действия ИФНб на клетки НТ29 при различных концентрациях МПК
Прямое действие ИФНб на опухоль может быть недостаточно выраженным или полностью отсутствовать. Для усиления действия на опухоль ИФНб в методике использовали иммунные эффекторные клетки: в первую очередь цитотоксические Т-лимфоциты в составе МПК. Сами по себе МПК обладают цитостатическим действием на опухоль, поэтому было определено оптимальное соотношение МПК: клетки опухоли.
Влияние эффекторных клеток человека на антипролиферативное действие ИФНб оценивали, проводя анализ в присутствии различных концентраций МПК: 100 тыс./лунку, 50 тыс./лунку, 25 тыс./лунку и без МПК, получая при этом соотношения МПК:клетки опухоли - 20:1; 10:1; 5:1 и 0:1, соответственно.
В отсутствие эффекторных клеток ИФНб оказывает умеренное действие на пролиферацию аденокарциномы толстой кишки НТ29 - ингибирование пролиферации не превышает показатель в 30% даже при высоких концентрациях ИФНб (кривая «без МПК», фиг. 1). При культивировании клеток опухоли с мононуклеарами крови наблюдается антипролиферативное действие МПК в отсутствие ИФНб, причем для соотношения МПК:клетки опухоли 5:1 и 10:1 оно не превышает 10%, а для соотношения 20:1  ингибирование пролиферации превысило показатель 50% (нулевые точки для всех кривых на фиг. 1). При всех исследованных концентрациях МПК наблюдается полное торможение роста опухоли НТ29 ИФНб, при этом концентрация ИФНб, необходимая для полного ингибирования пролиферации, зависит от соотношения МПК:клетки опухоли.  Для количественной оценки антипролиферативного действия ИФНб на данной клеточной линии установлено оптимальное соотношение МПК:клетки опухоли в пределах 5:1 – 10:1.
Пример 2. Доказательство подлинности определения антипролиферативной активности ИФНб
Для подтверждения подлинности действия ИФНб на скорость пролиферации клеток был поставлен анализ с использованием мышиного антитела В16, нейтрализующего действие ИФНб. На основании результатов, представленных на фиг. 1, были выбраны следующие параметры проведения анализа: 50 тыс. МПК/лунку и концентрация ИФНб 100 пг/мл, соответствующая полному торможению роста клеток НТ29 при данном содержании МПК. Кроме того, были исследованы разные сроки культивирования клеток НТ29 (4-8 суток) в присутствии ИФНб и МПК (фиг. 2). Результаты исследования свидетельствуют о специфическом антипролиферативном действии ИФНб, которое ингибируется нейтрализующим мышиным антителом В16 и не ингибируется неспецифическим антителом.
Процент нейтрализации действия ИФНб рассчитывается относительно лунок без интерферона, в которых клетки при длительном культивировании могут гибнуть от избыточной плотности, поэтому в лунках с интерфероном и нейтрализующим антителом этот показатель может превышать значение 100%.
Пример 3. Методика количественного определения антипролиферативной активности ИФНб
По результатам, приведенным на фиг. 1 и 2, была разработана методика количественного определения антипролиферативной активности ИФНб, включающая в себя следующие этапы:
1) В лунки 96-луночного культурального планшета вносят серийные разведения образцов ИФНб в полной ростовой среде DMEM с содержанием бычьей сыворотки 2%. Диапазон разведений 0-2000 пг/мл в объеме 50 мкл/лунку.
2) Готовят суспензию клеток в полной ростовой среде, состоящую из опухолевых клеток НТ29 и МПК человека из расчета 5 тыс. клеток НТ29 и 50 тыс. МПК в лунку. Вносят суспензию клеток в лунки с серийными разведениями ИФНб в объеме 50 мкл/лунку. Итоговый объем в лунках составляет 100 мкл, разведения ИФНб от 0 до 1000 пг/мл.
2
3) Культивируют в течение 5 суток при 37°С и 5% СО во влажной атмосфере.
4) Содержание живых клеток в лунках определяют методом МТТ. По значениям оптических плотностей в лунках оценивают ингибирование пролиферации относительно лунок без интерферона.
Пример 4. Исследование антипролиферативной активности аптечных препаратов ИФНб в сравнении с активностью гликозилированного ИФНб производства ООО «Фармапарк»
Исследовали антипролиферативную активность аптечных препаратов «Ребиф», «Синновекс», «Бетаферон» и гликозилированный ИФНб производства ООО «Фармапарк» (фиг. 3).
Результаты измерения антипролиферативного действия аптечных интерферонов (параметры IC50 и IC90) хорошо согласуются с их заявленной противовирусной активностью (таблица).
Таблица.
Заявленные производителем показатели активности и определенные в антипролиферативном тесте показатели IC50, IC90 аптечных препаратов ИФНб и ИФНб производства ООО «Фармапарк».
Заявленная производителем активность по результатам  противовирусного теста,МЕ/мг
IC50, пг/мл
IC50, М<sup>-12</sup>
IC90, пг/мл
IC90, M<sup>-12</sup>
Ребиф
273 млн
23,8
1,06
105,7
4,70
Синновекс
200 млн
42,3
1,88
132,8
5,90
Бетаферон
32 млн
177
9,57
747,4
40,40
Фармапарк
н.о.
48,7
2,16
111,0
4,93