Ферментативный синтез бутиленгликольлаурата

УДК 577.151

М. Е. Зиновьева, В. С. Гамаюрова, К. Л. Шнайдер, Е. В. Назаренко

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ БУТИЛЕНГЛИКОЛЬЛАУРАТА

Ключевые слова: бутиленгликольлаурат, панкреатическая липаза, ферментативный синтез.

Установлена возможность ферментативного получения и определены оптимальные условия синтеза бутиленгликольлаурата с помощью панкреатической липазы.

Keywords: lauric acid ester of butylene glycol, pancreatic lipase, enzymatic synthesis.

The possibility of the enzymatic synthesis of lauric acid ester of butylene glycol with pancreatic lipase as biocatalyst has been shown. The optimum conditions of esterification has been found.

Введение

Применение биологических катализаторов в тонком органическом синтезе представляется перспективным и во многих случаях имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с классическими методами химии. Это обусловлено, прежде всего, тем, что ферменты обладают уникальной специфичностью, то есть катализируемые ими реакции протекают, как правило, по единственному пути без побочных процессов. Более того, непревзойденная каталитическая активность ферментов обеспечивает проведение синтеза в мягких условиях. Следовательно, внедрение биокатализа в практику могло бы привести к экономии энергии и ресурсов и, кроме того, уменьшить ущерб, который наносит современная химическая технология окружающей среде. Эти моменты дают основания полагать, что сфера практического использования биокатализа в последующие годы будет расширяться.

Последние достижения химии белка, препаративной биохимии и энзимологии привели также к значительным успехам в исследовании липолитических ферментов. Липолитические ферменты по своей природе уникальны. Их уникальность состоит, главным образом, в способности гидролизовать водонерастворимые субстраты с сохранением при этом достаточно высокой каталитической активности [1, 2].

Из всех липолитических ферментов наиболее изученный и наиболее часто исследуемый фермент - это панкреатическая липаза. Поэтому панкреатическую липазу можно использовать в качестве модели и прототипа других участвующих в пищеварении липаз, а также липаз растительного и микробного происхождения и, в значительной степени, жиромобилизующих липаз тканей. Кроме того, данный фермент нашел широкое применение при исследованиях в области химии липидов и биохимии, поскольку он специфически гидролизует сложные эфиры первичных спиртов. Это его свойство широко использовалось для анализа и синтеза жиров и других глицеридов [3].

Бутиленгликольлаурат является

поверхностно-активным веществом, и находит применение в синтетических моющих средствах. В данной работе был исследован синтез

бутиленгликольлаурата с помощью панкреатической липазы.

Экспериментальная часть

В типичном эксперименте концентрация кислоты составляла 0,1 М/л, концентрация 1,4-бутиленгликоля изменялась от 0,1 до 1,0 М/л. Ферментный препарат панкреатической липазы добавляли из расчета 10 мг/мл (активность - 180 ед./мг, произведен Тукумским ферментным заводом (Латвия, Тукумс)).

Методика эксперимента: к сухому или увлажнённому (количество добавленной воды изменялось от 0,2 до 1,0 %) ферментному препарату добавляли раствор реагентов в одном из органических растворителей (гексан, гексан:бензол (1:1), гексан:диэтиловый эфир (1:1)). Полученную суспензию тщательно перемешивали и выдерживали в течение 24-48 часов без перемешивания.

Количество образовавшегося эфира определяли титриметрическим методом по изменению количества кислоты в системе. Титрование проводили спиртовым раствором щёлочи (0,1 N раствором NaOH в 80 % спирте) до устойчивой розовой окраски с фенолфталеином в качестве индикатора при температуре 20 °С. В контрольный образец вносили ферментный препарат непосредственно перед проведением титрования.

Все эксперименты проводили в 3-12 повторностях. Результаты обрабатывали с помощью пакета статистических программ «Statistica». Достоверность отличий контрольных и экспериментальных результатов оценивали при помощи t-критерия Стьюдента. Погрешность измерений не превышала 7 %.

Обсуждение результатов

Показана возможность синтеза эфира лауриновой кислоты и бутиленгликоля в среде гексана с помощью панкреатической липазы. На первом этапе были выбраны следующие условия проведения процесса: температура - 30 °С, время проведения процесса - 24 часа, соотношение реагентов 1:1 (М/М). Выход эфира в данных условиях через 24 часа составил 48 %.

В дальнейшем были рассмотрены различные условия, влияющие на выход целевого продукта и скорость протекания реакции.

На протекание любой химической реакции оказывает влияние соотношение реагентов. Поэтому были рассмотрены следующие соотношения лауриновой кислоты и 1,4-бутиленгликоля - 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 1:6; 1:10 (М/М).

Данные о влиянии соотношения лауриновой кислоты и 1,4-бутиленгликоля на выход целевого продукта приведены на рисунке 1.

1,0:0,0 1,0:1,0 1,0:2,0 1,0:3,0 1,0:4,0 1,0:5,0 1,0:6,0 1,0:1,1

Соотношение реагентов, М/М

Рис. 1 - Влияние соотношения реагентов на выход бутиленгликольлаурата

Из представленных на рисунке 1 данных видно, что при плавном повышении содержания 1,4-бутиленгликоля в смеси до соотношения кислота: спирт 1:5 наблюдалось повышение выхода эфира бутиленгликольлаурата. Выход эфира при данном соотношении максимален и составляет 78 %. Дальнейшее повышение содержания 1,4-бутиленгликоля в среде приводит к снижению выхода эфира, что связано с ингибирующим действием избытка субстрата на фермент и ухудшением диффузии субстратов к частицам фермента. Таким образом, оптимальным соотношением лауриновой кислоты и 1,4-бутиленгликоля для проведения ферментативного синтеза эфира является 1:5 (М/М).

Большое значение для ферментативных реакций в неводных средах имеет вода, которая в незначительных количествах необходима для проявления активности фермента.

В связи с этим, было изучено влияние воды на активность ферментного препарата панкреатической липазы в среде органического растворителя. Данные представлены на рисунке 2.

Рис. 2 - Влияние количества экзогенной воды на активность липазы

Из представленных данных видно, что добавление воды к реакционной смеси ухудшает процесс синтеза эфира 1,4-бутиленгликоля и лауриновой кислоты, выход эфира резко снижается.

Липолитические ферменты могут действовать в достаточно широком диапазоне температур. Например, некоторые липазы микроорганизмов активны при -20°С [4], а фермент из семян Увтвта апЖШтгМгка при 65 °С [5]. При работе с субстратами с более высокими температурами плавления, можно повысить температуру инкубации, например до 45 °С, чтобы с гарантией обеспечить жидкое состояние субстрата. Субстраты с высокой температурой плавления будут также легче эмульгироваться, если их в начале растворить в сорастворителях, таких как гексан [6], триолеин, трипальмитоолеин, метилпентадеканоат или метилолеат [7]. Так как, липазы могут действовать в широком диапазоне температур, то необходимо выявление оптимальной температуры для проявления максимальной активности фермента при синтезе

бутиленгликольлаурата в среде гексана. Поэтому было изучено изменение активности панкреатической липазы в диапазоне температур -10  +30 °С.

Данные о влиянии температуры приведены на рисунке 3.

Рис. 3 - Влияние различных температурных условий на активность ферментного препарата панкреатической липазы в среде гексана

Изучение влияния температуры на ферментативный синтез эфира лауриновой кислоты и 1,4-бутиленгликоля показало, что низкая температура -10°С значительно замедляет данный процесс. Тем не менее, даже при отрицательной температуре фермент сохраняет свою активность, что не наблюдается для этого фермента в водной среде. Повышение температуры от —10 до +4 °С приводит к резкому увеличению выхода бутиленгликольлаурата. Выход увеличился с 5 % до 53 %. Дальнейшее повышение температуры способствует плавному повышению выхода эфира лауриновой кислоты и 1,4-бутиленгликоля до 78 %.

Принята температура для проведения ферментативной реакции этерификации в среде гексана в присутствии панкреатической липазы +30°С.

Следующим этапом работы являлось изучение зависимости выхода эфира от продолжительности процесса. Данные представлены в таблице 1. Из данных представленных в таблице 1 видно, что выход эфира лауриновой кислоты и 1,4-бутиленгликоля с увеличением времени реакции меняется незначительно и, с технологической точки зрения, целесообразно проводить процесс в течение 24 часов.

Таблица 1 - Влияние продолжительности синтеза на выход бутиленгликольлаурата

Время, ч Выход эфира лауриновой кислоты и бутиленгликоля, %

24 78±0,52

28 80±0,16

32 83±0,37

48 84±0,37

Изучалась возможность повторного использования панкреатической липазы для синтеза эфира бутиленгликольлаурата.

Исследования, проведенные ранее, показали, что во многих случаях повторное использование панкреатической липазы оправдано. Например, при синтезе изоамилпропионата повторное использование липазы приводило к снижению выхода всего на 5 % [4]. Таким образом, повторное использование липолитического фермента может привести к снижению затрат на синтез эфиров. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Синтез эфира бутиленгликольлаурат при неоднократном использовании фермента

Кратность использования панкреатической липазы Выход эфира лауриновой кислоты и 1,4-бутиленгликоля, %

0 78±0,52

1 47±0,53

2 27±0,36

Из представленных в таблице 2 данных видно, что при повышении кратности использования панкреатической липазы для синтеза эфира бутиленгликольлаурата, до кратности равной 2, наблюдалось резкое понижение выхода эфира лауриновой кислоты и 1,4-бутиленгликоля до 27 %. Таким образом, в целях получения ПАВ повторное использование панкреатической липазы возможно, но выход эфира при этом значительно снижается и составляет 47 %.

Для проведения ферментативных процессов в неводных средах или водно-органических средах с

высоким содержанием неводного компонента, как правило, используют такие органические растворители, как гексан, бензол,

диметилсульфоксид и пр.[5]. Выбор того или иного растворителя является при этом в большинстве случаев, случайным, научно не обоснованным. Критерий для подбора оптимального растворителя (с точки зрения его влияния на фермент) можно обосновать, исходя из общих представлений об относительной роли сил, поддерживающих нативную структуру белковых молекул в водных растворах: доминирующую роль играют гидрофобные взаимодействия. Следовательно, подходящий для белка неводный растворитель не должен разрушать такие взаимодействия.

Поэтому было изучено влияние смены среды реакции на выход эфира. В качестве среды реакции использовались: гексан, смеси: гексан:бензол (1:1), гексан:диэтиловый эфир (1:1). Полученные данные приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Влияние среды реакции на выход эфира лауриновой кислоты и 1,4-бутиленгликоля

Среда реакции Выход эфира, %

Гексан 78±0,52

Гексан:Бензол (1:1) 43±0,45

Гексан :Диэтиловый эфир (1:1) 53±0,52

Из представленных данных видно, В связи с достаточно низким выходом бутиленгликольлаурата в среде гексан:бензол (43 %) и гексан:диэтиловый эфир (53 %) можно сделать вывод, что данные смеси растворителей не являются подходящими средами для проведения реакции этерификации. Наилучшей средой для проведения ферментативного синтеза бутиленгликольлаурата является гексан.

Исследован синтез эфира

бутиленгликольлаурата ферментным препаратом панкреатической липазой в среде органического растворителя и определены условия проведения реакции этерификации. При проведении процесса в течение 24 часов в оптимальных условиях выход эфира составил 78 %.

Литература

1. В.С. Гамаюрова, М.Е. Зиновьева, К. Л. Шнайдер Ферментативный гидролиз льняного масла в мицеллярных системах./ Вестник КГТУ, № 9, 2012 г. -С.143-145

2. Debajyoti Goswami, Ramkrishna Sen, Jayanta Kumar Basu, Sirshendu De/Surfactant enhanced ricinoleic acid production using Candida rugosa lipase// Bioresource Technology -2010. №101 Р. 6-13

3. Гамаюрова В.С., Зиновьева М.Е., Шнайдер К.Л. Сравнение синтетазной активности двух видов липаз в неводных средах / В. С. Гамаюрова, М. Е. Зиновьева, К. Л.

Шнайдер // Вестник Казанского технологического университета. - № 6. - С. 211-218 4. Ферментативный синтез душистых веществ Гамаюрова В.С., Зиновьева М.Е., Елизарова Е. В. Вестник КГТУ, № 1, 2005 г.-С. 239- 241

5. Ферментативные реакции в водно-органических смесях: критерий для выбора оптимального органического растворителя / А.М. Клибанов [и др.] // Биоорганическая химия. - 1978. - Т. 4, № 1. - С. 82-87.

© М. Е. Зиновьева - к.т.н., доц. каф. ПБТ КНИТУ; В. С. Гамаюрова - д.х.н., проф. той же кафедры, gamaur@kstu.ru; К. Л. Шнайдер - к.т.н., доц. той же кафедры; Е. В. Назаренко - магистрант той же кафедры.

©M. E. Zinoveva, cand. of tech. sciences, associate professor of department of food biotechnology of the KNRTU; V. S. Gamaurova, doctor of chemistry, prof. in the same department, gamaur@kstu.ru; K. L.Shnayder, cand. of tech. sciences, associate professor in the same department; E. V.Nazarenko, master student in the same department.