Клинико-диагностическое значение исследований структурно-функциональных характеристик сывороточного альбумина у больных мелкоклеточным раком легкого

Экспериментальные исследования

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА У БОЛЬНЫХ МЕЛКОКЛЕТОЧНЫМ РАКОМ ЛЕГКОГО

P.M. Смолякова, А.А. Машевский, П.И. Моисеев, В.В. Жарков

ГУ «НИИ онкологии и медицинской радиологии им. КН. Александрова»,

г. Минск, Беларусь

Проанализированы результаты комплексного исследования физико-химических характеристик конформационного состояния сывороточного альбумина у больных мелкоклеточным (п=25), немелкоклеточным (п=30) раком легкого и пациентов с хроническими незлокачественными заболеваниями легких (п=25) до начала специального лечения методом электронного парамагнитного резонанса. Установлено, что рак легкого приводит к выраженным нарушениям физико-химических свойств сывороточного альбумина. Локальные изменения конформационного состояния белкового биополимера наиболее выражены у больных мелкоклеточным раком легкого и проявляются неспецифическим увеличением удельной емкости в I центре связывания при сопряженном ее снижении во П центре, уменьшением внутримолекулярных объемов центров, понижением конформационной подвижности и лабильности центров связывания сывороточного альбумина. Оценка физикохимических характеристик альбумина информативна для дифференциальной диагностики мелкоклеточного рака легкого. Степень выраженности структурно-функциональных изменений у больных раком легкого коррелирует с морфологической формой опухоли.

CLINICODIAGNOSTIC SIGNIFICANCE OF THE TESTS OF STRUCTURAL AND FUNCTIONAL PROPERTIES OF SERUM

ALBUMIN IN SMALL-CELL LUNG CANCER PATIENTS R.M. Smolyakova, A.A. Mashevsky, P.I. Moiseyev, V.V. Zharkov State Institution «N.N. Alexandrov Research Institute of Oncology and Medical Radiology», Minsk, Belarus

The results of a comprehensive study of physicochemical properties of the conformational state of serum albumin by means of electron paramagnetic resonance (EPR) were analysed in small-cell cancer patients (n=25), non-small-cell cancer patients (n=30) and patients with chronic nonmalignant lung diseases (n=25) before special treatment. Lung cancer was established to cause marked disorders in physicochemical properties of serum albumin. Local changes in the conformational state of the protein biopolymer are expressed most of all in small-cell lung cancer patients and are manifested by nonspecific increase in specific capacity in the first binding centre with concurrent reduction of it in the 2nd centre, by decrease in intramolecular volumes of the centres, lowering conformational mobility and lability of serum albumin binding centres. The evaluation of albumin physicochemical properties is informative for differential diagnosis of small-cell lung cancer. The extent of structural and functional changes in lung cancer patients correlates with the morphological type of the tumor.

В настоящее время рак легкого занимает ведущее место по показателям заболеваемости и смертности, особенно среди мужского населения, в большинстве стран мира. Кроме того, в последние годы отмечается тенденция к росту заболеваемости раком легкого и среди женщин — до 5% в год [5].

По биологическим свойствам принято выделять наиболее злокачественный мелкоклеточный

рак (МРЛ), составляющий 25-30% всех форм рака легкого, и немелкоклеточный (НМРЛ), объединяющий аденокарциному, плоскоклеточный и крупноклеточный рак легкого. Мелкоклеточный рак легкого характеризуется' быстрым клиническим течением, высокой степенью злокачественности, интенсивным и обширным гематогенным и лимфогенным метастазированием, ведущим к неблагоприятному прогнозу.

Механизмы, определяющие способность опухолевых клеток к инвазии в окружающие ткани, в систему микроциркуляции, к лимфогенной или гематогенной диссеминации с последующей экстравазацией и образованием вторичных очагов опухолевого роста, до конца не изучены. Кроме того, способность к инвазии может быть выражена в разной степени в гетерогенной популяции клеток первичной опухоли. Своеобразие биологических свойств данной морфологической формы опухоли достаточно длительное время определяло отношение к данному заболеванию как к системному процессу. Диагноз МРЛ окончательно устанавливается при морфологическом исследовании и строится клинически на основании рентгенологических данных, при которых чаще всего обнаруживается центральное расположение опухоли, нередко с явлениями ателектаза и пневмонии, ранним поражением лимфатических узлов корня и средостения. Довольно часто у больных возникает медиастинальный синдром — признаки сдавливания верхней полой вены, а также обнаруживается метастатическое поражение надключичных и реже других периферических лимфатических узлов. Около двух третей больных, страдающих МРЛ, имеют симптомы, связанные с генерализацией процесса (метастатическое поражение печени, надпочечников, костей, костного мозга, центральной нервной системы).

Важнейшими факторами прогноза при МРЛ являются исходное состояние больного, пол, гистологический подтип опухоли, уровень лактат-дегидрогеназы и др. Плохим фактором прогноза служит исходный статус (менее 70 баллов по шкале Карновского) и повышенный уровень лейкоцитов (более 10 х 109/л). В современной литературе имеются данные о различных лабораторных параметрах, серологических маркерах, пара-неопластических и других синдромах в качестве диагностических и прогностических факторов. Однако они не нашли широкого применения в клинической практике и остаются предметом дальнейшего интенсивного научного изучения.

В последние десятилетия в связи с разработкой физико-химических методов флюоресцентного и электронного парамагнитно-резонансного (ЭПР) исследований в качестве интегрального биохимического критерия, отражающего состоя-

ние юмеосглза при различных патосризиологи-ческих процессах, используется изучение структурно-динамических характеристик конформационного состояния сывороточного альбумина [1, 2, 7]. Рядом авторов [2, 5, 6, 8] высказывается предположение, что при многих заболеваниях организма первичная, генетически заданная структура белковых молекул не изменена, последующая химическая модификация их в организме находится в пределах нормы, однако нарушена вторичная и/или третичная структура (конформация) белка. В работе Г.Е. Добрецова [2] отмечено, что развитие острых критических состояний организма вызывает быстрое изменение молекул альбумина (в течение 2—3 дней, иногда часов) и в таких ситуациях существенной химической модификации связывающих центров не происходит. Неоднозначным является решение вопроса о природе физико-химических нарушений конформационного состояния и связывающей способности сывороточного альбумина (САЧ) у пациентов с длительно текущими хроническими заболеваниями различной этиологии и у больных со злокачественными новообразованиями [3].

Цель настоящего исследования — определить значимость клинико-диагностического изучения структурно-функционального состояния сывороточного альбумина у больных мелкоклеточным раком легкого.

Материал и методы

В клинике института проведено комплексное исследование конформационного состояния сывороточного альбумина у 55 больных с впервые установленным диагнозом рака легкого (РЛ) I—IV стадии. Диагноз у всех пациентов установлен клинико-рентгенологически, эндоскопически и подтвержден морфологически. Среди больных раком легкого у 25 пациентов выявлен мелкоклеточный рак, у 30 — немелкоклеточный рак. В группе больных НМРЛ преобладающей морфологической формой опухоли был плоскоклеточный рак (68,9%).

Анализ распределения контингента больных МРЛ показал, что к моменту лечения I стадию имели 5,2% пациентов, IIIA стадию — 37,4%, ШБ стадию — 46,3%, IV стадию — 11,1%. В группе

больных НМРЛ I стадия опухолевого процесса диагностирована у 26,3% пациентов, II стадия - у 25,4%, IIIA стадия - у 25,5%, ШБ стадия - у 7,6%, ГУ стадия - у 15,2%. Средний возраст больных МРЛ составил 57,2 ± 0,9 лет, удельная частота пациентов старше 60 лет была равна 50%. В группе больных НМРЛ возраст пациентов варьировал от 41 до 75 лет при преобладании больных старше 60 лет в 65,6% случаев. Рассматриваемый контингент больных раком легкого представлен лицами мужского пола. В группе больных МРЛ центральная форма роста опухоли наблюдалась у 72,7% пациентов, периферическая - у 27,3%. Среди больных НМРЛ центральное расположение опухоли обнаружено в 53% случаев, периферическое - в 47%. Сопутствующие заболевания имели 43 (78,2%) больных, в структуре которых преобладали ишемическая болезнь сердца, гипертоническая болезнь, атеросклеротический кардиосклероз (62,1%), хронический простой бронхит и пневмосклероз легких (16,1%).

Группу сравнения составили 25 больных хроническими незлокачественными заболеваниями легких и бронхов. В структуре хронических незлокачественных заболеваний легких наблюдались: локальный пневмофиброз - у 5 (20%), абс-цедирующая' и хроническая пневмония — у 8 (32%), хондрома легкого - у 2 (8%), нейрофиброма - у 3 (12%), эхинококкоз - у 2 (8%), деструктивный эндобронхит — у 5 (20%).

Методом электронного парамагнитного резонанса с использованием спинового зонда 16-доксилстеариновой кислоты (Sigma) исследованы отдельные физико-химические параметры структурно-динамического состояния сывороточного альбумина: удельная емкость I(Ci) и П(Сг) центров связывания, внутримолекулярные объемы I(Vi) и П(Уг) центров, конфирмационная подвижность (ширина высокополевой — ШВЛ1, центральной - ТТТЦЛь низкополевой - IIIHAi спектральных линий) в I и II (ШВЛг, 1ТЩЛ2> ТТТНЛг) центрах, интегральный ЭПР-параметр альфа (ЭПР-ос). Метод определения и расчета параметров спектров ЭПР спинового зонда 16-доксилстеариновой кислоты (ДСК), иммобилизованного в центры связывания САЧ, представлен в работе [3]. Регистрация спектров ЭПР осуществлялась на спектрометре ЭПР ПС.100Х при следующих условиях: СВЧ-мощностъ 10 мВт,

амплитуда модуляции 0,7 мТл, центр развертки магнитного поля 339 мТл, температура образца в резонаторе 37 °С.

Исследуемые • показатели изучали в исходном периоде до выполнения всех видов лечения.

Результаты исследований обработаны методом вариационной статистики с расчетом средней арифметической (X), среднеквадратичного отклонения (а), ошибки средней арифметической (Sx) с помощью пакета прикладных программ «Statistica» и пакета анализа Microsoft Excel 7. Достоверность выявляемых различий вычисляли по t-критерию Стьюдента с уровнем значимости р<0,05.

Результаты и их обсуждение

Развитие злокачественной опухоли в орга-низме-опухоленосителе вызывает специфические изменения в составе белков крови, которые характеризуются состоянием выраженной гипопро-теинемии, обусловленной понижением уровня альбумина. У онкологических больных гипоаль-буминемия обусловлена рядом факторов: нарушением синтезирующей функции печени, мик-ро- и макрокровопотерями, расходом альбумина в качестве пластического материала для опухолевой ткани, нарушением питания, потерями белков при образовании экссудатов в брюшной и плевральной полостях, ускоренным катаболизмом. Наиболее значимые изменения в уровне содержания САЧ наблюдаются у больных раком желудка, легкого, желчного пузыря, толстой кишки, поджелудочной железы. Однако определяемые количественные изменения в белковом спектре крови у больных злокачественными новообразованиями носят в основном вторичный характер и приобретают диагностическое значение при высоком уровне распространенности основного процесса (III-IV стадии). Вместе с тем индуцированное формированием злокачественной опухоли в организме-опухоленосителе снижение комплексообразующей способности и структурно-динамические перестройки в молекуле САЧ фиксируются в начальном периоде заболевания.

При поступлении в кровь молекуАы физиологически активных веществ как эндогенного, так и экзогенного происхождения ассоциируют с молекулами белка плазмы сывороточного альбу-

мина. Такая ассоциация в значительной степени снижает токсичность попадающих в кровь соединений. При неопластическом процессе увеличение концентрации продуктов незавершенного метаболизма в организме больных приводит к блокированию или аллостерическим изменениям центров связывания на молекуле альбумина, что вызывает нарушение комплексообразующей способности и транспортной функции.

Исследования физико-химических характеристик центров связывания биомолекулы альбумина показали (таблица) статистически значимое увеличение удельной емкости I центра связывания у больных МРЛ по сравнению с таковым в группе больных НМРЛ и у пациентов с хроническими незлокачественными заболеваниями легких (р<0,05).

Статистически значимое повышение удельной емкости I центра связывания САЧ регистрировали у больных НМРЛ по отношению к значению показателя у пациентов с хроническими заболеваниями легких незлокачественной природы. В группе больных МРЛ отмечено снижение удельной емкости II центра связывания САЧ при одновременном ее повышении у пациентов с НМРЛ и в группе больных хроническими незлокачественными заболеваниями легких. Молекулярная емкость II центра связывания.сывороточ-ного биополимера у больных хроническими за-

болеваниями легких незлокачественного генеза статистически значимо выше, чем у больных НМРЛ. Рост злокачественной опухоли сопровождается существенными изменениями липидного обмена в тканях организма-хозяина вследствие активного транспорта липидов в растущую опухоль и нарушениями регуляции свободнорадикальных процессов в различных тканях и биологических жидкостях опухоленосителя. Повышенное поступление в циркулирующую кровь эндогенных липопероксидов, продуктов деградации белка, насыщенных и полиеновых жирных кислот приводит к уменьшению внутримолекулярных объемов центров связывания и снижению конформационной подвижности основного транспортного белка крови при МРЛ и НМРЛ. Результаты проведенных исследований показали, что у больных МРЛ и НМРЛ наблюдалась тенденция к уменьшению внутримолекулярного объема I центра связывания по сравнению с таковым у пациентов с хроническими незлокачественными заболеваниями легких. Аналогичная закономерность в уменьшении молекулярных объемов, представляемых биомолекулой альбумина для гидрофобных соединений и химически активных агентов, отмечена во II центре связывания у больных мелкоклеточным и немелкоклеточным раком легкого.

Физико-химические характеристики сывороточного альбумина больных мелкоклеточным, немелкоклеточным раком легкого и хроническими незлокачественными заболеваниями легких

Группа сравнения

Показатели МРЛ НМРЛ ХНЗЛ

С|, отн. ел. 0,56410,007* ** 0,52910,0012+ 0,50810,003

С2, отн. ед. 0,41710,004* ** 0,44910,003+ 0,47210,003

VI, Э 16,1810,021 16,2810,018 16,3210,0017

\г,Э 14,7410,017 14,7710,021 14,8010,00036

ШВЛ,, Э 3,2710,014* ** 3,1010,012 2,9310,011

ШЦЛі, э 2,6010,020 2,6110,023 2,59+0,0022

шнл2,э 2,5510,021* ** 2,4410,012+ 2,2010,011

швл2,э 7,8210,015 7,8010,026 7,6810,0094

ШЦЛ2,Э 3,4310,025* *♦ 3,1110,017 3,03+0,0008

шнл2,э 4,31Ю,019 4,3010,013 4,29+0,0012

ЭПР-параметр (X, отн. ед. 1,67910,120* ** 1,18610,240+ 0,95210,210

Примечания:* - достоверность различий в группах: мелкоклеточный рак - немелкоклеточный рак (р < 0,05);

** - достоверность различий в группах: мелкоклеточный рак — хронические незлокачественные заболевания легких (р < 0,05);

+ - достоверность различий в группах: немелкоклеточный рак - хронические незлокачественные заболевания легких (р < 0,05).

Молекула САЧ представляет собой гибкую динамическую структуру, тип и степень внутренней подвижности и функциональной активности которой моделируются состоянием центров связывания. Подтверждением сказанного служат данные о невозможности получить альбумин в кристаллическом виде. Известно, что вращательная подвижность нитроксильных радикалов и их экспонированность отражают конформацион-ную подвижность центров связывания молекулы альбумина в отдельности и биополимера в целом. Локальные изменения конформации молекулы САЧ сопряжены со снижением вращательной подвижности и уширением высокополевой, центральной и низкополевой линий спектра ЭПР у больных МРЛ и НМРЛ.

Так, среднестатистическое значение высокополевой спектральной линии в I центре связывания альбумина у больных МРЛ превышало величину показателя у больных НМРЛ и у пациентов с хроническими заболеваниями незлокачественного генеза (р<0,05). Аналогичные изменения показателя отмечены у больных НМРЛ по отношению к таковому в группе больных хронической незлокачественной патологией легких (р<0,05). Сравнительный анализ значений центральной спектральной линии в I центре связывания биомолекулы не выявил статистически значимых различий в исследуемых группах больных раком легкого и пациентов с хроническими незлокачественными заболеваниями легких. Величина низкополевой спектральной линии в I центре связывания повышена у пациентов с МРЛ по сравнению со значениями, установленными в группах больных НМРЛ и хроническими незлокачественными заболеваниями легких. Во II центре связывания молекулы САЧ у больных, страдающих МРЛ, наблюдалась тенденция к ушире-нию высокополевой, центральной, низкополевой спектральных линий по сравнению с таковыми у больных НМРЛ и у пациентов с хроническими заболеваниями легких незлокачественного генеза.

Исследования, проведенные в сравнительном аспекте, позволили установить наиболее значимые различия в значениях интегрального параметра ЭПР-а в обследуемых группах больных. В спин-меченой крови больных МРЛ значение ЭПР-ос в 1,8 раза выше, чем у пациентов с хронической незлокачественной патологией легких

(р<0,05). Величина показателя ЭПР-а в группе больных МРЛ в 1,4 раза превысила среднестатистическое значение анализируемого параметра у пациентов с НМРЛ (р<0,05). В ходе исследований установлено повышение уровня ЭПР-а в спин-меченой крови больных НМРЛ в 1,2 раза по отношению к таковой в группе больных хроническими незлокачественными заболеваниями легких.

Выводы

1. Рак легкого приводит к выраженным нару шениям физико-химических свойств сывороточ ного альбумина. Локальные изменения структур но-функционального состояния белкового био полимера наиболее выражены у больных мелкоклеточным раком легкого и проявляются повы шением удельной емкости в I центре связывания при сопряженном ее снижении во II центре, уменьшением внутримолекулярных объемов цен тров связывания, понижением конформационной подвижности и лабильности.

2. Оценка физико-химических характеристик подвижности спин-меченой жирной кислоты, иммобилизованной в специфические центры связывания сывороточного альбумина, высоко информативна для дифференциальной диагно стики мелкоклеточного рака легкого. Степень вы раженности структурно-функциональных изме нений по показателю ЭПР-а у больных раком легкого коррелирует с морфологической формой опухоли.

ЛИТЕРАТУРА

1. Владимиров В.А. II Эфферент. тер. 1999. Т.5, № 7. С. 18-27.

2. Добрецов Г.Е. II Эфферент. терапия. 1999. Т. 5, №4. С. 28-31.

3. Машевский А.А., Муравский В.А., Прохорова В.И., Милютин А.А. II Альбумин сыворотки крови в клиниче ской медицине. М.: Ириус, 1994. С. 177-181.

4. Харченко В.П., Чхиквадзе В.Д., Галил-Оглы Г.А. и др. IIВопр. онкол. 1999. Т. 45, № 1. С. 72-76.

5. Livshits VA., Marsh D. II J. Magn. Reson. 2000. Vol. 145, №1. P. 84-94.

6. Marinella Mark A. II Med. and Pediat. Oncol. 1999. Vol. 32, № 6. P. 464-465.

7. Trenzell K.L, Schneider P.M., Holscher A.H. II Atemwegs und Lungenkrakh. 2001. Vol. 27, № 4. P. 195-201.

8. Steinhoff H.J. II Front Biosci. 2002. Vol. 1, № 7. P. 97-110.

Поступила З.06.0З