Иммобилизация и стабилизация ферментных препаратов липаз

УДК 577.15

В. С. Гамаюрова, М. Е. Зиновьева, Е. В. Елизарова,

К. Л. Васина

ИММОБИЛИЗАЦИЯ И СТАБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ЛИПАЗ

Показана возможность иммобилизации ферментных препаратов липаз методом включения в агаровый гель; изучено влияние СаС12 на сохранение активности иммобилизованных препаратов; показана возможность синтеза сложных эфиров высших жирных кислот и алифатическииих спиртов и гидролиза льняного масла иммобилизованными ферментными препаратами.

В настоящее время изучение липолитических ферментов является перспективным с точки зрения гетерогенного ферментативного катализа, а также в связи с тем, что контролируемый и избирательный липолиз успешно применяется в различных сферах практической деятельности человека: в медицине, в пищевой, легкой, химической промышленности [1-5].

Основой для создания принципиально новых биотехнологических процессов альтернативных традиционным химическим производствам могут служить гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных ферментов или бактериальных клеток [6].

Хорошо известно, что любая иммобилизация ферментов позволяет получать технологические биокатализаторы, которые могут быть многократно использованы, легко отделяться от реакционной смеси фильтрацией или каким-либо другим методом и прерывать реакцию в любой заданный момент времени [7].

В связи с этим в настоящее время интенсивно изучаются различные методы иммобилизации липаз: физическая сорбция на гидрофильных адсорбентах, включение в гидрофобные гели, а также включение в гидрофобные конпреципитаты и обработка фермента синтетическими липидоподобными реагентами. Различные методы иммобилизации дают возможность получать катализаторы с широко варьируемыми свойствами и изменять направление их применения [7].

Целью настоящей работы являлось изучение иммобилизации ферментных препаратов липаз в агаровый гель и их стабилизация.

Результаты и обсуждения

Известно, что активность ряда ферментов зависит от присутствия определенных групп небелковой природы - кофакторов. Для многих липаз кофактором являются ионы кальция, они могут служить мостиками, связывающими фермент с субстратом, или могут непосредственно выполнять каталитическую функцию [8]. Поэтому в процессе работы рассматривалось влияние ионов Са 2+ на активность иммобилизованных препаратов панкреатической липазы и «Novozyme 868».

При иммобилизации обоих ферментных препаратов в агаровый гель без внесения хлорида кальция активность полученных иммобилизованных препаратов была чрезвычайно низкой, практически равной нулю. Это можно объяснить денатурацией молекул белка при температуре расплавленного агара 50°С. Введение ионов Са 2+ на стадии приготовления агарового геля способствует повышению термостабильности липаз,

тем самым активность ферментных препаратов сохраняется после иммобилизации. Полученные данные представлены на рисунке 1.

Рис. 1 - Зависимость активности иммобилизованных препаратов липаз от концентрации СаС12 в среде агарового геля: 1 - липаза, содержащаяся в препарате <^оуогуше 868»; 2 - панкреатическая липаза.

На рисунке 1 показано, что активность иммобилизованных ферментных препаратов плавно возрастала с повышением концентрации ионов Са 2+ и достигала максимального значения при содержании ионов Са 2+ в агаре 0,9 - 1 моль/л и для панкреатической липазы, и для «Коуо2уше 8682. Дальнейшее увеличение содержания хлорида кальция в среде не привело к значительным изменениям активности.

Было показано, что введение в агар ионов Са 2+ не только повышало активность иммобилизованного фермента, но и способствовало образованию более прочного геля. Это связано, с тем, что хлорид кальция является электростатическим модификатором. Известно, что на активность иммобилизованных ферментов в значительной степени влияет длительность хранения и условия хранения. Поэтому в процессе работы рассматривалось влияние этих факторов на активность иммобилизованных ферментных препаратов. Для хранения применялся способ, рекомендуемый в литературе при температуре 4°С в закрытой емкости. Данные по влиянию продолжительности хранения на активность иммобилизованных ферментных препаратов приведены в таблице 1. Использование такого способа хранения не приводило к снижению активности иммобилизованных липаз в течение 3 суток.

Также был рассмотрен метод хранения иммобилизованных ферментных препаратов при комнатной температуре в закрытой емкости. Было показано, что иммобилизованные ферменты также не теряли активность к третьим суткам хранения.

В дальнейшем был изучен ферментативный гидролиз льняного масла без добавления эмульгаторов с помощью иммобилизованных липаз. С этой целью были выбраны наиболее оптимальные концентрации хлорида кальция в толще агара. Для

иммобилизованной панкреатической липазы эта величина составила 0,9 моль/л; для иммобилизованного препарата «Коуо2уше 868» - 1,0 моль/л.

Таблица 1 - Влияние на активность иммобилизованных ферментных препаратов, стабилизированных СаС12, продолжительности хранения при 1 = 4°С, в закрытой емкости

Ферментн Время Активность иммобилизованного фермента

ый хранен

препарат ия, сут Концентрация хлорида кальция, моль/л

0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4

0 183 199 216 216 216 216 232 216 232

Панкреати ческая 1 166 216 183 199 199 199 199 199 216

липаза 2 183 183 183 199 216 199 199 199 199

3 183 183 166 199 216 199 199 199 199

0 152 178 185 183 210 200 210 192 201

«К0У02уШ е 868» 1 169 185 185 176 210 192 210 209 194

2 169 185 194 183 210 209 210 201 209

3 169 178 178 183 179 209 203 192 209

В процессе работы рассматривалось влияние количества субстрата и продолжительности проведения эксперимента на выход жирных кислот. Данные о влиянии вышеперечисленных факторов на гидролиз масла иммобилизованной панкреатической липазой представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Влияние количества субстрата и времени на выход жирных кислот

Условия проведения гидролиза льняного масла Количество субстрата, мл Выход жирных кислот, мкмоль/мг

Время, час

2 4 6 18 24 48

Панкреатическая липаза - 0,1 мг/г иммоб. фермента с концентрацией СаС12 0,9 моль/л 0,5 1,0 2,0 14.8 14.8 38,5 23,7 26,6 44,5 26,6 35,6 38,5 32.6 35.6 41,5 32,6 44.5 44.5 32,6 44.5 44.5

Из данных представленных в таблице 2 видно, что с увеличением количества субстрата выход целевого продукта возрастает. При этом при всех рассматриваемых концентрациях льняного масла к концу первых суток выход жирных кислот становится величиной постоянной, и дальнейшее увеличение продолжительности эксперимента к ее изменению не приводит.

При использовании для гидролиза льняного масла иммобилизованной липазы, содержащейся в препарате «Коуо2уше 868» получена аналогичная зависимость, представленная в таблице 3.

Таблица 3 - Влияние количества субстрата на гидролиз льняного масла иммобилизованным препаратом <^оуогуше 868»

Условия Количество субстрата, мл Выход жирных кислот, мкмоль/мг

проведения гидролиза Время, час

льняного масла 2 4 6 18 24 48

«Коуо2уше 868» -0,1 мг/г иммоб. фермента с концентрацией СаС12 1 моль/л 0,5 1,0 2,0 ,6 ,6 ,5 ^ ^ т сч 35.6 26.6 41,5 44.5 32.6 41 50.4 53.4 88,9 47,5 53,4 88,9 50.4 53.4 88,9

Из данных, приведенных в таблице 3, видно, что с увеличением концентрации субстрата выход жирных кислот увеличивается, достигая своего максимума через 18 часов. Более длительное проведение ферментативного гидролиза нецелесообразно, так как выход целевого продукта остается постоянным.

Поскольку считается, что гидролиз чистого масла протекает недостаточно эффективно в связи с его высокой вязкостью, то можно предположить, что применение органических растворителей будет способствовать увеличению выхода целевых продуктов реакции. В связи с этим, наряду с гидролизом чистого льняного масла проводился гидролиз в среде масла с органическим растворителем. В качестве органического растворителя был выбран гексан. Проведение ферментативного гидролиза в среде с органическим растворителем не дало положительных результатов.

Литературные данные [9] показывают, что липаза способна осуществлять и синтетазные реакции в неводных средах, а именно, катализировать синтез сложных эфиров различных спиртов и кислот. Сложные эфиры являются одной из основных групп душистых веществ, они весьма широко распространены в природе и содержатся во всех эфирных маслах, обуславливая в значительной степени аромат многих цветов, запах плодов и ягод.

На следующем этапе работы исследовалась возможность синтеза душистого вещества - изоамилвалериата - с помощью иммобилизованного препарата панкреатической липазы.

Полученные ранее результаты показывают, что лиофильно высушенный препарат панкреатической липазы способен синтезировать изоамилвалериат в гексане [10]. Поэтому была изучена возможность синтеза этого эфира иммобилизованным препаратом панкреатической липазы.

Результаты синтеза изоамилвалерата с помощью иммобилизованной панкреатической липазы, стабилизированной ионами Са 2+, показаны в таблице 4.

Таблица 4 - Синтез изоамилвалериата панкреатической липазы иммобилизованным препаратом

Условия проведения синтеза изоамилвалериата в среде гексана Синтетазная активность липазы, мкмоль/мг Выход, %

Лиофильно высушенный фермент - 10 мг/мл Иммобилизованный фермент - 0,1 мг/г иммоб. 18,8 86

фермента с концентрацией СаС12 0,9 моль/литр 120 86

На основании данных, приведенных в таблице 4, можно сделать вывод о том, что синтетазная активность липазы, включенной в гель, выше, чем при применении лиофильно высушенного ферментного препарата панкреатической липазы.

Экспериментальная часть

В работе использовались:

- ферментный препарат панкреатической липазы, лиофильновысушенный, марки Б. Порошок светло-коричневого цвета. Производитель: SIGMA - ALDRICH CHEMIE, Germany.

- ферментный препарат, содержащий липазу, “Novozyme 868”. Жидкость темнокоричневого цвета. Производитель Novo Nordisk A/S, Novo Alle, DK-2880 Bagsvaerd (Дания).

Иммобилизацию фермента проводили методом включения в агаровый гель. Для получения агарового геля 100 мг агара суспендировали в 4,5 мл физиологического раствора. Затем вносили хлористый кальций в концентрации от 0,0 моль/л до 1,5 моль/л. Агар нагревали на кипящей водяной бане до образования однородного раствора. Полученный гель охлаждали до 50° С.

Для приготовления ферментного раствора 10 мг сухого препарата панкреатической липазы (10 мкл жидкого препарата «Novozyme 868») разбавляли в 2,5 мл фосфатно-цитратного буфера (рН = 7,0) и 7,5 мл дистиллированной воды.

Включение фермента в агар: 1 мл ферментного раствора добавляли к 9 мл раствора агара при 50°С и перемешивали полученную смесь. Выливали смесь в чашку Петри и охлаждали до 5°С. Полученную мембрану хранили в закрытой чашке Петри при 4°С до использования.

Определение активности иммобилизованных препаратов панкреатической липазы и “Novozyme 868” осуществляли согласно стандартной методике Ота и Ямада [8].

Для изучения процесса ферментативного гидролиза льняного масла иммобилизованными ферментными препаратами липаз в плотно закрывающиеся пробирки помещали 0,5; 1,0 и 2,0 мл масла соответственно. В каждую пробирку вносили по 0,5 г иммобилизованного ферментного препарата липазы. Пробы перемешивали и выдерживали на водяной бане при 30°С в течение 2; 4; 18; 24 и 48 часов. По истечении указанного времени в образцы добавляли по 2 мл 96 %-го этилового спирта. Пробы тщательно перемешивали и методом титрования определяли количество выделившихся жирных кислот. Титрование проводили 0,1N водным раствором NaOH в присутствии 1 % раствора фенолфталеина до устойчивой розовой окраски.

Для изучения синтетазных реакций, осуществляемых панкреатической липазой в неводных средах, использовали системы твёрдая фаза: жидкость. Эксперимент проводили следующим образом: к 1 мл 0,2 М раствора валериановой кислоты в гексане добавляли изоамиловый спирт и 500 мг иммобилизованного препарата панкреатической липазы. Изоамиловый спирт вносили, исходя из мольного соотношения кислота : спирт (1:4). Пробы тщательно перемешивали, плотно закрывали и выдерживали в термостате 24 ч при 30°С. К контрольной пробе, фермент добавляли непосредственно перед титрованием.

По истечении времени реакции, остаточное количество кислоты определяли титрометрическим методом. Титрование проводили 0.1N раствором NaOH в 80 % этаноле. В качестве индикатора использовали фенолфталеин.

Заключение

В процессе работы была исследована иммобилизация ферментного препарата панкреатической липазы и липазы, содержащейся в препарате «Novozyme 868» путем включения в агаровый гель. Изучено влияние хлорида кальция на сохранение активности иммобилизованных ферментных препаратов. Получены данные о том, что наиболее высокая активность наблюдается при содержании хлорида кальция в толще агара 0,9 - 1 моль/л и для панкреатической липазы, и для препарата «Novozyme 868».

Установлено, что введение в агар ионов Са 2+ повышает активность иммобилизованного фермента.

Показана возможность ферментативного гидролиза льняного масла с помощью иммобилизованных ферментных препаратов.

Иммобилизованный препарат панкреатической липазы способен осуществлять синтез изоамилвалерата, и его активность выше, чем при применении лиофильно высушенного ферментного препарата панкреатической липазы.

Литература

1. Synthesis of fatty esters by polyethylene glycol - modified lipase / B. Mahiran, A. Kamaruzaman, J. Zinwan, R. Che Nyonya, S. Bakar // J. Chem. Technol. and Biotechnol. 1995. V. 64, №1. P. 10 - 16.

2. Глижа А.А. Микробные ферменты в народном хозяйстве. М.: Мир, 1985. 188с.

3. Братус И.Н. Химия дущистых веществ. М.: Агропромиздат, 1992. 240с.

4. Исагулянц В. И. Синтетические душистые вещества. М.: Мир, 1936. 590с.

5. Грачева И.МТехнология ферментных препаратов. М.: Агропромиздат, 1987. С. 233 - 244.

6. Углеродсодержащие макроструктурированные керамические носители для адсорбционной иммобилизации ферментов и микроорганизмов. L Адсорбция глюкоамилазы / Г.А. Коваленко и др. // Биотехнология. 2002. № 3. С. 55-66.

7. Неклюдов А.Д. Биохимическая переработка жиров и масел в новые липидные продукты с

улучшенными биологическими и физико-химическими свойствами (обзор) / А.Д. Неклюдов, А.М.

Иванкин // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т. 38, № 5. С. 469-481.

8. Брокерхоф Х. Липолитические ферменты /Х. Брокерхоф, Р. Джексен. М.: Мир, 1978. 388 с.

9. Claon P. A. Lipase - catalyzed synthesis of terpene esters by transesterification in n- hexane / P. A Claon, C. C. Akoh // Biotechnol. Lett. 1994. 16, №3. P. 235 - 240.

10. Ферментативный синтез душистых веществ/ Гамаюрова В.С., Зиновьева М.Е., Елизарова Е.В.// Вестник Казанского технол. ун-та. №1. 2005. С.239-241.

© В. С. Гамаюрова - д-р хим. наук, проф. зав. каф. пищевой биотехнологии КГТУ; М. Е. Зиновьева - канд. техн. наук, доц. той же кафедры; Е. В. Елизарова - асп. той же кафедры; К. Л. Васина - асп. той же кафедры