ОБНАРУЖЕНИЕ ДНК, КОТОРАЯ ПРОИСХОДИТ ИЗ СПЕЦИФИЧЕСКОГО КЛЕТОЧНОГО ТИПА, И ОТНОСЯЩИЕСЯ К НЕМУ СПОСОБЫ

1. Способ обнаружения в образце от индивидуума количества вида ДНК, происходящего из клеток данного типа, образце, который содержит указанный вид ДНК в смеси с различным образом метилированной ДНК, не происходящей из клеток указанного типа; указанный способ включает стадии:
(a) обработку ДНК, присутствующей в указанном образце, реагентом, который дифференциально модифицирует метилированную и неметилированную ДНК;
(b) обнаружение в указанном образце присутствия метилирования в указанном виде ДНК в двух или более дифференциально метилированных областях (ДМО), которые являются различным образом метилированными при сравнении указанного вида ДНК и ДНК, не происходящей, из клеток указанного типа, модификация в ДНК такой ДМО указанным реагентом является чувствительной к метилированию ДНК, где присутствие метилированной ДНК в одной или более указанных ДМО указывает на присутствие указанного количества вида ДНК в указанном образце, а отсутствие метилированной ДНК в указанной ДМО указывает на отсутствие указанного вида ДНК в указанном образце; и
(c) обнаружение количества общей ДНК, присутствующей в указанном образце с использованием, по меньшей мере, одной другой области, которая не является различным образом метилированной при сравнении указанного вида ДНК и ДНК, не происходящей из клеток указанного типа, области (областей), модификация которых указанным реагентом является нечувствительной к метилированию ДНК,
где указанное обнаружение на стадии (b) и указанное обнаружение на стадии (c) выполняют, используя одинаковую аликвоту ДНК из указанного образца, и в одинаковой емкости, и по существу одновременно для такой ДМО и других области (областей), и используя: (x) одинаковые обнаруживаемые метку (метки) для каждой из указанных ДМО; и (y) различные обнаруживаемые метку (метки) для указанных других области (областей).
2. Способ по п. 1, где указанная другая область расположена между приблизительно 20 п.о. и приблизительно 20 т.н. против хода транскрипции или по ходу транскрипции от и/или внутри того же гена как, по меньшей мере, одна из указанных ДМО.
3. Способ по п. 1, где указанное обнаружение на стадии (c) включает использование, по меньшей мере, двух из указанных других областей; предпочтительно, где, число указанных других областей является одинаковым с числом ДМО, используемым на стадии (b); более предпочтительно, где, одна из указанных других областей расположена между приблизительно 20 п.о. и приблизительно 20 т.н. против хода транскрипции или по ходу транскрипции от ДМО, используемой на стадии (b) и каждая другая из указанных других областей расположена между приблизительно 20 п.о. и приблизительно 20 т.н. против хода транскрипции или по ходу транскрипции от одной другой из указанных ДМО.
4. Способ по п.3, где указанное обнаружение на стадии (c) проводят, используя: (x) одинаковые обнаруживаемые метку (метки) для каждой из указанных других областей или (y) различные обнаруживаемые метку (метки) для каждой из указанных других областей.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где указанное обнаружение на стадии (c) и указанное обнаружение на стадии (b) выполняют, используя одинаковую аликвоту ДНК из указанного образца, и в одинаковой емкости для обнаружения/реакции, и по существу одновременно друг с другом, и посредством мультиплексной, основанной на зонде, количественной ПЦР в режиме реального времени с использованием, по меньшей мере, одного меченого зонда, специфичного для каждой из указанных ДМО и другой области (областей).
6. Способ по любому одному из пп. 1-4, где указанный вид ДНК происходит из клеток плода и/или плаценты плода, и указанный образец берется от беременной особи женского пола; предпочтительно, где, указанный вид ДНК является циркулирующей бесклеточной ДНК, и указанный образец представляет собой фракцию крови, такую как плазму или сыворотку.
7. Способ по любому из пп.1-4, где указанный вид ДНК происходит из клеточного типа, ассоциированного с медицинским состоянием; предпочтительно, где указанное медицинское состояние является состоянием, выбранным из группы, состоящей из: клеточного пролиферативного расстройства, инфицирующего/инфекционного заболевания, расстройства, вызывающего истощение, дегенеративного заболевания, (ауто)иммунного расстройства, болезни почек, заболевания печени, воспалительного заболевания, острой токсичности, хронической токсичности, инфаркта миокарда и комбинации любых из приведенных выше; более предпочтительно, где, указанный вид ДНК является циркулирующей бесклеточной ДНК, и указанный образец представляет собой фракцию крови, такую как плазму или сыворотку.
8. Способ по любому из пп. 1-4, где указанный образец представляет собой образец ткани или образец биологической жидкости; предпочтительно, где указанный образец представляет собой образец биологической жидкости, выбранный из группы, состоящей из: цельной крови, фракции крови, мочи, слюны, пота, эякулята, слез, мокроты, вагинального секрета, вагинального смыва и смыва толстой кишки; более предпочтительно, где указанный образец представляет собой образец плазмы или сыворотки.
9. Способ по любому из пп. 1-4, где указанный реагент, который дифференциально модифицирует метилированную и неметилированную ДНК, содержит агент, который селективно расщепляет неметилированную ДНК по сравнению с метилированной ДНК, предпочтительно, где указанный агент содержит:
по меньшей мере, один фермент, чувствительный к метилированию;
по меньшей мере, один фермент рестрикции, чувствительный к метилированию; и/или
агент, выбранный из группы, состоящей из: AatII, AciI, AclI, AfeI, AgeI, AgeI-HF, AscI, AsiSI, AvaI, BceAI, BmgBI, BsaAI, BsaHI, BsiEI. BsiWI, BsmBI, BspDI, BsrFI, BssHII, BstBI, BstUI, ClaI, EagI, FauI, FseI, FspI, HaeII, HgaI, HhaI, HinP1I, HpaII, Hpy99I, HpyCH4IV, KasI, MluI, NaeI, NarI, NgoMIV, NotI, NotI-HF, NruI, Nt.BsmAI, Nt.CviPII, PaeR7I, PluTI, PmlI, PvuI, PvuI-HF, RsrII, SacII, SalI, SalI-HF, SfoI, SgrAI, SmaI, SnaBI, TspMI и ZraI.
10. Способ по любому из пп. 1-4, где каждая из указанных стадий включает количественное обнаружение, и указанное обнаруженное количество указанного вида ДНК выражают в виде относительной концентрации указанного вида ДНК к общей ДНК в указанном образце.
11. Способ по любому из пп. 1-4, дополнительно включающий стадии:
обнаружение количества общей ДНК в стандартном образце ДНК с известным количеством с использованием таких же других области (областей), как используют на стадии (c); и
сравнение сигнала, обнаруженного от указанного стандартного образца ДНК, с сигналом, обнаруженным на стадии (c).
12. Способ по п.11, где каждая из указанных стадий включает количественное обнаружение, и указанное обнаруженное количество указанного вида ДНК выражают в виде абсолютного количества указанного ДНК в указанном образце.
13. Способ по п.6, где указанные ДМО являются гиперметилированными в плодной ДНК и гипометилированными в материнской ДНК.
14. Способ по п.6, где, по меньшей мере, одна из указанных ДМО:
расположена в человеческой хромосоме, выбранной из списка, состоящего из: хромосомы 21, хромосомы 18, хромосомы 13, X-хромосомы и Y-хромосомы, предпочтительно, хромосомы 21, хромосомы 18 или хромосомы 13, более предпочтительно, хромосомы 21; и/или
содержит, по меньшей мере, один, предпочтительно, по меньшей мере, два сайта метилирования, специфичных для указанного реагента, и указанная ДМО расположена в областях и/или гене, выбранных из списка, состоящего из: maspin [предпочтительно части maspin (также известной как ʺSERPINB5ʺ) гене, который описан в EP 1751307, как являющаяся дифференциально метилированной в сравнении плода и его матери], CGI137, PDE9A, PPP1R2P2, Аналогии с Fem1A (C.elegans), CGI009, CBR1, DSCAM, C21orf29 и CGI13.
15. Способ по п.6, где, по меньшей мере, одна из указанных ДМО расположена в области и/или гене, выбранных из списка, состоящего из: RASSF1A, TBX3, ZFY, CDC42EP1, MGC15523, SOX14 и SPN.
16. Способ по п.1, где множество видов ДНК обнаруживают в указанном образце; предпочтительно, где, два вида ДНК обнаруживают в указанном образце.
17. Способ обнаружения хромосомной анеуплоидии у плода, вынашиваемого беременной особью женского пола, указанный способ включает стадии:
(A) определение, с использованием способа, приведенного в любом одном из предшествующих пунктов, в образце, взятом от указанной беременной особи женского пола количества первого вида ДНК, который происходит из клеток плода и/или плаценты плода, где указанный первый вид ДНК расположен в хромосоме, относящейся к хромосомной анеуплоидии или внутри участка хромосомы, относящегося к хромосомной анеуплоидии, и, где указанный первый вид ДНК, который происходит из клеток плода и/или плаценты плода, различается от его аналога материнского происхождения в образце вследствие дифференциального метилирования ДНК;
(B) определение, с использованием способа приведенного в любом одном из предшествующих пунктов, количества второго вида ДНК, который происходит из клеток плода и/или плаценты плода в указанном образце, где указанный второй вид ДНК расположен в эталонной хромосоме, и где указанный второй вид ДНК, который происходит из клеток плода и/или плаценты плода, различается от его аналога материнского происхождения в, образце вследствие дифференциального метилирования ДНК;
(C) определение относительного количества, предпочтительно, отношения количеств из (A) и (B); и
(D) сравнение указанного количества с пороговым значением и/или эталонным распределением количества (количеств) или отношением (отношениями), где: относительное количество или отношение, которое является более высоким или более низким, чем указанное пороговое значение и/или эталонное распределение количества (количеств) или отношения (отношений) указывает на присутствие хромосомной анеуплоидии у плода.
18. Способ обнаружения повышенного риска медицинского состояния или развития медицинского состояния у индивидуума; указанный способ включает стадии:
(i) проведение способа по п. 10 или 12; и
(ii) сравнение количества указанного вида ДНК, обнаруженного с использованием порогового количества и/или эталонного распределения количеств,
где увеличение или отклонение от количества указанного вида ДНК указывает на повышенный риск медицинского состояния или развития медицинского состояния у индивидуума.
19. Композиция, содержащая:
две пары праймеров ПЦР, каждая из которых предназначена для амплификации одной из указанных двух или более ДМО, как приведено в любом из пп. 1-18;
одну пару праймеров ПЦР для амплификации указанной другой области как приведено в любом из пп. 1-18;
два меченых зонда, каждый из которых является специфичным для одной из указанных ДМО; и
один меченый зонд, специфичный для одной из указанных других области (областей).
20. Набор, содержащий:
праймеры и зонды: как приведено в п. 19; и
необязательно, дополнительно содержащий: (i) печатное руководство или машиночитаемый носитель, содержащие инструкции по применению указанных праймеров и зондов, чтобы практически осуществить способ по любому из пп. 1-18 и/или получить или применять композицию по п. 19; и/или (ii) один или более других объектов, компонентов или реагентов, применимых для практического осуществления способа по любому из пп. 1-18 и/или получения или применения композиции по п. 19, включающих любой такой объект, компонент или реагент, раскрытые в данном описании, такой как реагент, который различным образом модифицирует метилированную и неметилированную ДНК, как приведено в любом одном из пп. 1-18.
21. Компьютерный программный продукт, содержащий: машиночитаемый носитель, закодированный с использованием множества инструкций по управлению вычислительной системой, чтобы выполнять и/или управлять операцией для определения: (x) повышенного риска медицинского состояния или развития медицинского состояния у индивидуума и/или (y) того, может ли выполняться диагностика аномалии вида ДНК, происходящего из клеток данного типа, в каждом случае из образца от индивидуума, содержащего вид ДНК, происходящий из клеток данного типа, в смеси с различным образом метилированной ДНК, не происходящей из клеток указанного типа, ДНК, присутствующую в указанном образце, обрабатывают реагентом, который дифференциально модифицирует метилированную и неметилированную ДНК, как приведено в любом одном из пп. 1-18; указанная операция содержит следующие стадии:
(i) одного сигнала, представляющего количественное обнаружение метилирования в одной или более ДМО, как приведено на стадии (b) любого из пп. 1-18; и (ii) одного сигнала, представляющего количественное обнаружение общей ДНК, с использованием, по меньшей мере, одной другой области, как приведено на стадии (c) любого из пп. 1-18;
определение параметра, исходя из сигналов (i) и (ii), где параметр представляет измеренное количество указанного вида ДНК;
сравнение параметра с пороговым количеством и/или эталонным распределением количеств; и
основанное на таком сравнении, определение классификации того, существует ли, соответственно, (x) повышенный риск медицинского состояния или развития медицинского состояния у индивидуума; и/или (y) может ли выполняться диагностика аномалии вида ДНК, происходящего из клеток данного типа.
22. Способ обнаружения в образце от индивидуума количества вида ДНК, происходящего из клеток данного типа, образце, который содержит указанный вид ДНК в смеси с дифференциально метилированной ДНК, не происходящей из клеток указанного типа; указанный способ включает стадии:
(a) обработку ДНК, присутствующей в указанном образце, реагентом который дифференциально модифицирует метилированную и неметилированную ДНК; и
(b) обнаружение в указанном образце присутствия метилирования в указанном виде ДНК в двух или более ДМО, которые являются различным образом метилированными при сравнении указанного вида ДНК и ДНК, не происходящей из клеток указанного типа, модификация ДНК такой ДМО указанным реагентом является чувствительной к метилированию ДНК, где присутствие метилированной ДНК в одной или более указанных ДМО указывает на присутствие указанного количества вида ДНК в указанном образце, а отсутствие метилированной ДНК в указанной ДМО указывает на отсутствие указанного вида ДНК в указанном образце,
где указанное обнаружение на стадии (b) проводят, используя одинаковую аликвоту ДНК из указанного образца, и в одинаковой емкости для обнаружения/реакции, и по существу одновременно для такой ДМО, и используя (x) мультиплексную количественную ПЦР в режиме реального времени; и (y), по меньшей мере, два меченых зонда, каждый из которых является специфичным для одной из указанных ДМО, и, которые метят одинаковыми обнаруживаемыми меткой (метками) для каждой из указанных ДМО; предпочтительно, где указанный реагент содержит агент как приведено в п. 9.