ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ ИЛИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ АГЕНТ ПРОТИВ ВИРУСНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ
PREVENTIVE OR THERAPEUTIC AGENT AGAINST VIRAL DISEASE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к профилактическому или терапевтическому агенту против вирусного заболевания, который отличается тем, что в нем объединены 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диол и интерферон.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
По оценочным данным в Японии 1,5-2 миллиона человек хронически инфицированы вирусом гепатита С (HCV), и считается, что большинство носителей имеют симптомы хронического гепатита (см. непатентную ссылку 1). Что касается гепатита В, то для него в многих случаях инфекция не вызывает хронический гепатит, но в результате развивается рак печени. В противоположность этому у 80-90% инфицированных HCV людей развивается хроническое заболевание печени, что было установлено из наблюдений за тканью печени, и есть вероятность, что у 50-60% инфицированных HCV людей развивается цирроз или гепатоцеллюлярная карцинома в результате хронического гепатита (см. непатентную ссылку 2). Во всем мире инфекция HCV стала основной клинической проблемой.
Интерфероны представляют собой семейство высокогомологичных и видоспецифичных белков, которые регулируют иммунный ответ, ингибируя репликацию вирусов и пролиферацию клеток; известно также, что у человека существует 4 класса интерферонов (непатентная ссылка 3).
Поскольку интерфероны имеют противовирусный эффект, то их применяют при различных вирусных заболеваниях. В частности, при лечении хронического гепатита С, который вызывает инфекция HCV, вирусом с (+)РНК-геномом, для удаления HCV широко используются интерфероны. Однако известно, что интерфероны обладают слабым терапевтическим эффектом в отношении пациентов, которые инфицированы HCV с генотипом 1b или которые имеют высокую вирусную нагрузку (1 Meq или выше) (см. непатентные ссылки 4 и 5). Данный генотип и высокая вирусная нагрузка являются факторами, которые влияют на терапевтический эффект интерферона, а в Японии такие пациенты составляют 70% или больше из пациентов с хроническим гепатитом С. В дополнение, часто наблюдаются побочные эффекты, такие как лихорадка, слабость и психиатрические расстройства.
В качестве стандартного лечения пациентов, инфицированных вирусом гепатита С с генотипом 1b и имеющих высокую вирусную нагрузку, известны комбинированная терапия рибавирином с интерфероном и комбинированная терапия рибавирином с ПЭГ-интерфероном α-2а (PEG-IFN α-2а) или ПЭГ-интерфероном α-2b (PEG-IFN α-2b). Терапевтическое действие этих комбинаций (уровень полного ответа) является недостаточным. Даже наиболее эффективная комбинированная терапия рибавирином с PEG-IFN в настоящее время дает уровень полного ответа, самое большее, приблизительно 50%. Кроме того, по сравнению с лечением только одним интерфероном при лечении комбинацией рибавирина с интерфероном часто наблюдаются побочные эффекты, такие как снижение уровня гемоглобина, снижение количества эритроцитов и лейкоцитов. При использовании PEG-IFN α-2а гриппозные симптомы проявляются слабее, чем те, что вызывает интерферон, но более часто наблюдаются реакции кожи и снижение количества лимфоцитов, тромбоцитов и эритроцитов. При комбинированной терапии рибавирином и PEG-IFN α-2b часто возникают поражения кожи в месте инъекции, слегка замедляется восстановление нарушенных гематологических показателей; а у пожилых пациентов обычно повышается частота аномальных показателей лабораторных тестов, и им часто необходимо снижение дозировки. В данных обстоятельствах требуется разработка методов лечения, которые эффективны в случае, если лечение интерфероном не дает достаточного эффекта, в случае, если не ожидают, что введение интерферона будет эффективным вследствие инфекции вирусом с генотипом 1b и высокой вирусной нагрузки, в случае пожилых пациентов, в случае, когда при инфекции развивается цирроз, и т.д.
22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диол представляет собой соединение со следующей структурой, и известно, что оно ингибирует нарушение работы печени (см. патентные ссылки 1 и 2).
Кроме того, было опубликовано, что 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диол обладает эффектом против HCV (см. непатентную ссылку 6), и ожидают, что из этого соединения будет разработан терапевтический агент против вирусных заболеваний печени. Однако эффекты, полученные в результате объединения этого соединения с другими лекарственными соединениями, изучены не были.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПРОБЛЕМЫ, РЕШАЕМЫЕ ИЗОБРЕТЕНИЕМ
Для решения перечисленных выше проблем авторы изобретения провели интенсивные исследования агентов, которые обладают профилактическим или лечебным эффектом в отношении вирусных заболеваний, в частности инфекционных заболеваний, вызываемых вирусом с (+)РНК-геномом; в результате исследований авторы обнаружили, что комбинация 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диола с интерфероном увеличивает ингибирование репликации HCV и может представлять собой лекарственное соединение, пригодное для профилактики или лечения вирусных заболеваний; тем самым изобретение было завершено.
СРЕДСТВО РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ
Настоящее изобретение относится к:
[1] профилактическому или терапевтическому агенту против вирусного заболевания, который отличается тем, что в качестве действующих ингредиентов в нем объединены 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диол и интерферон;
[2] профилактическому или терапевтическому агенту по п. [1], в котором вирусное заболевание вызвано РНК-вирусом;
[3] профилактическому или терапевтическому агенту по п. [2], в котором РНК-вирус имеет (+)РНК-геном;
[4] профилактическому или терапевтическому агенту по п. [3], в котором РНК-вирусом является вирус гепатита С;
[5] профилактическому или терапевтическому агенту по п. [1], в котором вирусным заболеванием являются гепатит С, или цирроз, или гепатоцеллюлярная карцинома, вызванные гепатитом С;
[6] способу профилактики или лечения вирусного заболевания, который включает в себя введение субъекту, который нуждается в этом, эффективного количества 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диола и интерферона;
[7] способу по п.[6], в котором вирусное заболевание вызвано РНК-вирусом;
[8] способу по п.[7], в котором РНК-вирус имеет (+)РНК-геном;
[9] способу по п.[8], в котором РНК-вирусом является вирус гепатита С;
[10] способу по п.[6], в котором вирусным заболеванием являются гепатит С, или цирроз, или гепатоцеллюлярная карцинома, вызванные гепатитом С;
[11] применению 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диола и интерферона в изготовлении профилактического или терапевтического агента против вирусного заболевания;
[12] применению по п.[11], в котором вирусное заболевание вызвано РНК-вирусом;
[13] применению по п.[12], в котором РНК-вирус имеет (+)РНК-геном;
[14] применению по п.[13], в котором РНК-вирусом является вирус гепатита С; и
[15] применению по п.[11], в котором вирусным заболеванием являются гепатит С, или цирроз, или гепатоцеллюлярная карцинома, вызванные гепатитом С.
ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Профилактический или терапевтический агент по настоящему изобретению проявляет сильные профилактический или терапевтический эффекты в отношении вирусных заболеваний, предпочтительно вирусных заболеваний, вызванных РНК-вирусами, более предпочтительно вирусных заболеваний, вызванных вирусами, которые имеют (+)РНК-геном, наиболее предпочтительно гепатита С, вызванного вирусом гепатита С, или цирроза, или гепатоцеллюлярной карциномы, вызванных гепатитом С, путем введения комбинации 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диола и интерферона.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фигуре 1 представлен график, отражающий ингибиторный эффект только 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диола, только интерферона и комбинации 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диола и интерферона на репликацию HCV в день 1 после инфекции Ad-T7pol.
На фигуре 2 представлен график, отражающий ингибиторный эффект только 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диола, только интерферона и комбинации 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диола и интерферона на репликацию HCV в день 2 после инфекции Ad-T7pol.
На фигуре 3 представлен график, отражающий ингибиторный эффект только 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диола, только интерферона и комбинации 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диола и интерферона на репликацию HCV в день 3 после инфекции Ad-T7pol.
НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Термин «вирусные заболевания» обозначает болезни, вызванные вирусами. Вирусы, вызывающие заболевания, включают ДНК-вирусы и РНК-вирусы. Примерами ДНК-вирусов могут служить вирус гепатита В, вирус оспы, вирус герпеса, аденовирус и парвовирус. Примерами РНК-вирусов являются реовирус, тогавирус, коронавирус, рабдовирус, парамиксовирус, ортомиксовирус, буньявирус, аренавирус, ретровирус, пикорнавирус и калицивирус.
В качестве вирусов, на которые действует профилактический или терапевтический агент по настоящему изобретению, предпочтительны РНК-вирусы, более предпочтительны - РНК-вирусы с (+)РНК-геномом, а наиболее предпочтителен - вирус гепатита С. Примерами РНК-вирусов, которые имеют (+)РНК-геном, могут служить полиовирус, коксакивирус, эховирус, энтеровирус, риновирус, вирус гепатита А, вирус гепатита Е, вирус краснухи, вирус восточного энцефалита лошадей, вирус западного энцефалита лошадей, вирус желтой лихорадки, вирус лихорадки денге, вирус энцефалита Сент-Луис, вирус гепатита С, вирус гепатита G, коронавирус, вирус Западного Нила и вирус везикулярного стоматита.
Репликация вирусов, имеющих (+)РНК-геном, происходит обычным образом. А именно: клетки инфицируются вирусом и в клетку проникает вирусная РНК. С попавшей в клетку вирусной РНК происходит прямая трансляция вирусных белков, таких как РНК-зависимая РНК-полимераза, которая необходима для репликации вирусной РНК. С помощью этих транслированных белков реплицируется вирусная РНК на матрице вирусной РНК, проникшей в клетку. Реплицированная вирусная РНК встраивается в синтезируемые с нее белки, и образовавшиеся вирусы высвобождаются из клетки (см. JP 2005-35913А).
Противовирусный механизм действия интерферона предложен, например, в JP 2005-35913А: интерферон связывается с рецептором на поверхности клетки, а затем в клетке индуцируется белок, имеющий противовирусное действие. Например олиго-2'-5'-аденилат образуется в результате действия 2'-5'-аденилат-синтетазы, индуцируемой интерфероном. Полагают, что олиго-2'-5'-аденилат активирует РНК-зависимую РНКазу, активированная РНК-зависимая РНКаза разрушает вирусную РНК, и в результате проявляется противовирусный эффект интерферона. В соответствии с приведенным выше механизмом действия полагают, что профилактический или терапевтический агент по настоящему изобретению эффективен против РНК-вирусов, которые имеют (+)РНК-геном.
Для вирусных заболеваний примеры заболеваний, вызванных вирусами гепатита (такими, как вирус гепатита В (HBV) и вирус гепатита С (HCV)), включают заболевания печени и т.п. в результате острого или хронического вирусного гепатита (такого, как гепатит В и гепатит С), предпочтительно, гепатит С, или цирроз, или гепатоцеллюлярная карцинома, вызванные гепатитом С. Гепатит В определяют как гепатит, который вызывает инфекция HBV, а гепатит С определяют как гепатит, который вызывает инфекция HCV. Хронический гепатит определяют как клиническое состояние постоянного воспаления в печени, которое присутствует или по-видимому присутствует в течение 6 месяцев или больше. Заболевания печени определяют как воспалительные заболевания в печени, и этот термин может применяться как общий, включающий ожирение печени, цирроз и гепатоцеллюлярную карциному в соответствии с развитием симптомов.
22β-Метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диол, который может применяться как один из действующих ингредиентов для профилактического или терапевтического агента по настоящему изобретению, является известным соединением, и его можно получить, например, способом, описанным в примере 22 (соединение 27) из WO97/03088.
В общем 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диол можно принимать перорально как стандартный фармацевтический состав, такой как капсулы, микрокапсулы, таблетки, гранулы, тонкодисперсные гранулы, порошки и т.п. Кроме того, его можно вводить парентерально (например, внутривенной инъекцией, внутримышечной инъекцией, введением подкожно, введением интраперитонеально, ректальным введением, введением через кожу) как стандартный фармацевтический состав, такой как состав для инъекций (внутривенных, внутримышечных и т.п.) и т.п. Эти составы можно получить стандартным способом с использованием инертного наполнителя, заполнителя, связывающего вещества, увлажнителя, разрыхлителя, поверхностно-активного вещества, смазки, диспергирующего агента, буферного соединения, консерванта, солюбилизатора, антисептического средства, ароматизатора, успокаивающего средства, стабилизатора и т.п. Примеры перечисленных выше добавок, которые нетоксичны и подходят для фармацевтических препаратов, включают лактозу, фруктозу, глюкозу, крахмал, желатин, карбонат магния, синтетический силикат магния, тальк, стеарат магния, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу или ее соль, гуммиарабик, полиэтиленгликоль, сироп, вазелин, глицерин, этанол, пропиленгликоль, лимонную кислоту, хлорид натрия, сульфит натрия, фосфат натрия и т.п.
В профилактическом или терапевтическом агенте по настоящему изобретению форму, путь введения, дозу, период введения и т.п. 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диола можно соответственно выбрать в зависимости от, например, веса, возраста, симптомов и т.п. пациента. Кроме того, эти величины конкретно не ограничены, пока противовирусный эффект 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диола усиливается при совмещении его с интерфероном. Например, дневную дозу в 1-1000 мг вводят перорально или парентерально как разовую дозу или как несколько дробных доз. Предпочтительно разделять дневную дозу 25-800 мг на две дозы, которые вводят перорально или парентерально.
Выбор интерферона, который можно использовать в качестве другого действующего ингредиента профилактического или терапевтического агента по настоящему изобретению, не ограничен. Доступные в продаже интерфероны или интерфероны на стадии клинических испытаний включают, например, природный IFNα (Sumiferon, производства Dainippon Sumimoto Pharma Co., Ltd.), IFNα-2а, IFNα-2b (Intron А, производства Schering-Plough), полиэтиленгликоль(PEG)-природный IFNα, PEG-IFNα-2а (Pegasys, производства Chungai Pharmaceutical Co., Ltd.), PEG-IFNα-2b (PEG-Intron А), природный IFNβ (IFNβ Mochida, производства Mochida Pharmaceutical Co., Ltd., и Feron, производства Toray Industries, Inc.), PEG-природный IFNβ, природный IFNγ, консенсусный IFN (Advaferon, производства Astellas Pharma Inc.), PEG-консенсусный IFN, их комбинации и т.п.
В случае профилактического или терапевтического агента по настоящему изобретению доза, длительность, схема, путь и т.п. при введении интерферона конкретно не ограничены, пока он действует как профилактическое или терапевтическое средство против вирусных заболеваний. Например, в случае гепатита С обычно дневную дозу от 100000 МЕ до 10000000 МЕ вводят подкожно, внутримышечно или внутривенно как разовую дозу или несколько дробных доз, постоянно или периодически (например, три раза в неделю) на протяжении от 2 до 48 недель; но эту схему введения можно изменить в зависимости от типа или количества вируса, веса или возраста пациента и т.п. Предпочтительной схемой является введение дневной дозы от 6000000 до 10000000 МЕ постоянно на протяжении от 2 до 8 недель с последующим периодическим введением на протяжении от 22 до 46 недель; но эту схему можно модифицировать в соответствии с типом и формой используемого интерферона.
Соотношение в комбинации (соотношение при использовании или соотношение в композиции) соединений 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диола и интерферона конкретно не ограничено, пока это соотношение эффективно для профилактики или лечения вирусных заболеваний. Например, в случае гепатита С соотношение в комбинации соответственно можно выбрать из диапазона от 1мг/100000МЕ до 1000мг/10000000МЕ, предпочтительно, от 25мг/1000000 МЕ до 800мг/10000000МЕ, в качестве дневной дозы.
В профилактическом или терапевтическом агенте по настоящему изобретению 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диол и интерферон вводятся в комбинации. Термин «введение в комбинации» включает вариант осуществления, в котором монопрепарат 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диола и другой монопрепарат интерферона вводятся одновременно или через промежуток времени. В этом варианте осуществления изобретения количество введений одного препарата может совпадать или отличаться от количества введений другого препарата.
Соответствующие дозировки и промежутки времени между введениями 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диола и интерферона можно выбрать в соответствии с контролируемым клиническим испытанием.
Профилактический или терапевтический агент по настоящему изобретению может представлять собой одну лекарственную форму, которая содержит два действующих ингредиента в композиции, или две лекарственные формы, которые по отдельности содержат два действующих ингредиента в разных композициях.
ПРИМЕРЫ
Далее настоящее изобретение проиллюстрировано на примерах, которые ни в коей мере его не ограничивают.
Пример 1: Подтверждение ингибиторного эффекта комбинации 22
-метоксиолеан-12-ен-3
,24(4
)-диола и интерферона на репликацию HCV
βββ
В этом примере для оценки профилактического или терапевтического агента по настоящему изобретению используется описанная в непатентной ссылке 6 модель репликации HCV с полноразмерным геномом.
Была получена кДНК из полноразмерного клона вируса инфекционного гепатита С (HCV) Н77 [GenBank AF011751; Yanagi M., Purcell R.H., Emerson S.U., Bukh J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94(16), 8738-8743 (1997)] с генотипом 1a, который является невосприимчивым к лечению интерфероном, и встроена в плазмиду (рТ7-flHCV-Rz), в которой кДНК находилась под контролем промотора Т7, а на ее 5' и 3'-концах находился ген рибозима вируса гепатита дельта. Трансфекцию клеток HepG2 (номер источника: JCRB1054) плазмидой рТ7-flHCV-Rz (3 мкг/лунку) проводили в 6-луночных культуральных планшетах. Через 24 часа после трансфекции клетки HepG2 заражали рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим Т7-полимеразу (Ad-T7pol) (10 БОЕ/лунка) для экспрессии гена HCV в клетках-хозяевах. В этой модели репликации в клетках транскрибируется РНК, полностью гомологичная гену HCV (положительная (+) цепь). Эта положительная цепь транслируется в белок NS5B, который имеет РНК-зависимую РНК-полимеразную активность. В результате транскрибируется отрицательная (-) цепь HCV, и в клетке наблюдается репликация HCV.
Через 3 часа после заражения Ad-T7pol к клеткам добавляли 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диол и/или IFN-α 2b (Intron А, Schering-Plough), по отдельности или в комбинации, для исследования их способности ингибировать репликацию HCV. К каждой культуральной среде (2 мл) добавляли 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диол и IFN-α 2b в конечной концентрации 0,1 мкмоль/л и 100 МЕ/мл соответственно. Через один день после заражения Ad-T7pol культуральную среду заменяли на среду, содержащую вышеупомянутые тестируемые соединения в таких же концентрациях. В качестве контроля в среду добавляли ДМСО, используемый в качестве растворителя для 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диола, до конечной концентрации 0,1%. Этот эксперимент проводили при условиях, когда цитотоксичность каждого из тестируемых соединений не наблюдалась.
Клетки собирали в первый, второй и третий день после заражения Ad-T7pol и выделяли из них РНК. Проводили количественный анализ экспрессии РНК HCV с помощью ПЦР в режиме реального времени (термоциклер серии Light Cycler от компании Roche Diagnostics) на матрице, полученной в результате обратной транскрипции с использованием rTth ДНК-полимеразы. Экспрессию мРНК глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH), гена домашнего хозяйства (постоянно экспрессирующегося) клеток-хозяев, оценивали количественно с помощью ПЦР в режиме реального времени на матрице, полученной в результате реакции обратной транскрипции с MuLV-обратной транскриптазой.
В ПЦР в режиме реального времени использовали следующие праймеры:
для РНК HCV:
Смысловой праймер:
5'-GCA GAA AGC GTC TAG CCA TGG CGT-3' (SEQ ID NO.: 1, нуклеотиды 68-91 из 5'-UTR (нетранслируемой области)), и
Антисмысловой праймер:
5'-CTC GCA AGC ACC CTA TCA GGC AGT-3' (SEQ ID NO.: 2, нуклеотиды 311-288 из 5'-UTR);
а для HCV РНК использовали набор праймеров, доступный в продаже (Human GAPDH primer set, от компании Search LC).
Результаты показаны на фигурах 1-3. На фигурах 1-3 дорожка 1 представляет собой контроль, дорожка 2 - результат воздействия одного 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диола (0,1 мкмоль/л), дорожка 3 - результат воздействия одного интерферона (100 МЕ/мл), а дорожка 4 - результат воздействия комбинации 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диола и интерферона.
В результате было получено подтверждение, что ингибиторный эффект на репликацию HCV синергически увеличивается при объединении 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диола с интерфероном в значительной степени по сравнению с применением каждого соединения по отдельности.
ПРОМЫШЛЕННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
По настоящему изобретению можно получить профилактический или терапевтический агент, эффективный против вирусных заболеваний (предпочтительно, агент против инфекции, вызванной вирусом с (+)РНК-геномом, более предпочтительно, агент, эффективный против гепатита С, вызванного вирусом гепатита С, или цирроза, или гепатоцеллюлярной карциномы, вызванных гепатитом С), который отличается тем, что в нем объединены 22β-метоксиолеан-12-ен-3β,24(4β)-диол с интерфероном.
Хотя описание настоящего изобретения дано со ссылкой на конкретные варианты осуществления изобретения, различные изменения и модификации, очевидные для специалистов в данной области, являются возможными, и при этом они не выходят из объема приложенной формулы.