СПОСОБ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ ОРГАНИЗМА ЖИВОТНОГО К ТУБЕРКУЛЕЗУ
METHOD OF ESTIMATION OF TOLERANCE OF ORGANISM OF ANIMAL TO TUBERCULOSIS

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано при оценке устойчивых и восприимчивых к туберкулезу лабораторных и сельскохозяйственных животных.
Известно широкое использование биохимических тестов в медицине, в частности для диагностики и прогнозирования состояния больных в послеоперационный период и при развитии острого воспалительного процесса. Так, известен способ оценки состояния больного, основанный на определении активности аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы (патент РФ №2103692 по кл. МПК G01N 33/53, опубл. 27.01.98 г.).
Однако способ предназначен только для человека и используется для прогнозирования течения заболевания у больных.
Известны способы определения активности туберкулеза по биохимическим показателям крови (например, а.с. СССР №1287010, патенты РФ №2187818, №2238564, №2161313, №2305286). В частности, известен способ диагностики степени тяжести туберкулеза (а.с. СССР №1287010 по кл. МПК G01N 33/68, опубл. 30.01.87) путем определения в крови больного содержания глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6ФДГ). В способе по патенту РФ №2187818 (по кл. МПК G01N 33/68, опубл.20.08.02) определяют соотношение церулоплазмин (Цп)/трансферрин (Тр) и наличие свободнорадикальных соединений (СРС) методом электронного парамагнитного резонанса.
Известен также способ оценки тяжести туберкулезной инфекции путем определения концентрации в плазме крови таурина и глутаминовой кислоты (патент РФ №2305286 по кл. МПК G01N 33/68, опубл. 27.08.2007). При этом способ проверен только в эксперименте на морских свинках.
Однако все вышеуказанные способы, как и предыдущий аналог, используются только в медицине и предназначены для оценки состояния уже больных людей.
Известен способ прогнозирования продуктивности коров по биохимическому анализу крови (патент РФ №2214709, кл МПК А01К 67/02, опубл. 27.10.03 г.). Определяют уровень калия в эритроцитах телок и при содержании калия до 19 мэкв/л животных относят к высокопродуктивным с укороченным сроком хозяйственного использования и низкой пожизненной продуктивностью; при содержании калия свыше 26 мэкв/л животных относят к низкопродуктивным, но с высокой пожизненной продуктивностью и длительным сроком хозяйственного использования.
Данный способ позволяет в раннем возрасте прогнозировать пожизненную продуктивность и срок хозяйственного использования здоровых животных. Однако он не предназначен для оценки устойчивости организма животных к заболеванию туберкулезом.
Наиболее близким к заявляемому является способ отбора крупного рогатого скота на устойчивость к туберкулезу здоровых животных (см. патент РФ №2080061 по кл. МКИ А01К 67/02, опубл. 27.05.97). Способ основан на отборе животных по комплексу аллелей групп крови и антигенов BoLA-системы, маркирующих устойчивость. Данный метод направлен на решение задачи определения генетической устойчивости животных и позволяет отбирать для воспроизводства животных конкретной породы - крупный рогатый скот.
Однако способ длителен и сложен в исполнении, требует большого количества ингредиентов. Кроме этого, способ не позволяет определять устойчивость к туберкулезу других видов животных (свиней, овец), включая и лабораторных (морских свинок, мышей, крыс, кроликов).
Изобретение направлено на решение задачи создания способа оценки восприимчивости организма здорового животного к туберкулезу на основе изучения его биохимических показателей крови.
Техническим результатом изобретения является быстрота и простота исполнения способа при снижении затрат и расширении области применения за счет возможности использования как для сельскохозяйственных, так и лабораторных животных.
Для решения поставленной задачи в способе оценки устойчивости организма животного к туберкулезу путем исследования крови согласно изобретению формируют группу клинически здоровых животных одного вида, исследуют активность креатинкиназы и лактатдегидрогеназы, определяют среднее значение каждого из этих показателей для конкретной группы животных, сравнивают значение показателя каждого животного со средней величиной этого же показателя для конкретной группы животных, при повышении активности креатинкиназы и одновременном понижении активности лактатдегидрогеназы относительно среднего значения каждого показателя для конкретной группы животных судят об устойчивости организма животного к туберкулезу.
Для повышения точности оценки устойчивости организма животного к туберкулезу дополнительно исследуют активность аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы, определяют среднее значение каждого из показателей для конкретной группы животных, сравнивают значение аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы только у животных с повышенной активностью креатинкиназы и пониженной активностью лактатдегидрогеназы со средней величиной аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы соответственно для конкретной группы животных, при понижении активности аланинаминотрансферазы и/или повышении активности аспартатаминотрансферазы относительно среднего значения каждого из этих показателей для конкретной группы животных судят об устойчивости организма животного к туберкулезу.
В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано способа оценки устойчивости организма животного к туберкулезу, позволяющего проводить дифференциацию здоровых животных на восприимчивых и устойчивых к заболеванию туберкулезом по некоторым биохимическими показателям крови. При этом при повышении активности креатинкиназы (КК) и одновременном понижении активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) относительно среднего значения каждого показателя для конкретной группы животных одного вида судят об устойчивости организма животного к туберкулезу.
ЛДГ - фермент, катализирующий реакцию превращения пирувата в лактат, которая является конечной реакцией анаэробного пути окисления глюкозы. Поэтому повышение активности ЛДГ свидетельствует о повышении активности гликолиза, т.е. о повышении анаэробной доли окислительного процесса.
КК - фермент, катализирующий реакцию фосфорилирования креатина, протекающую в аэробных условиях с использованием энергии связи АТФ в тканях и органах с высокой активностью анаэробного окисления. Поэтому увеличение значения КК говорит о возрастании аэробного окисления.
Следовательно, низкие значения ЛДГ и высокие КК свидетельствуют о возрастании доли аэробного окисления. Возрастание доли аэробного окисления, в свою очередь, говорит об увеличении кислородзависимой килинговой активности нейтрофилов в отношении микобактерий, что приводит, в конечном итоге, к устойчивости животных к заражению туберкулезом.
Для повышения точности оценки устойчивости организма здорового животного к туберкулезу дополнительно исследуют активность аспартатаминотрансферазы (ACT) и аланинаминотрансферазы (АЛТ).
ACT - фермент, катализирующий перенос аминогруппы с аспарагиновой кислоты на α-кетоглутарат. Активность этого фермента высока в органах и тканях с преобладанием аэробного окисления.
АЛТ - фермент, катализирующий перенос аминогруппы с аланина на α-кетоглутарат. Активность этого фермента высока в органах и тканях с преобладанием анаэробного окисления, например в печени. Поскольку холестерин синтезируется в печени, целесообразно определять его уровень для того, чтобы убедиться, что снижение активности АЛТ связано не с угнетением функциональной активности гепатоцитов, а именно со снижением доли анаэробного окисления.
Следовательно, у животных с высоким относительно среднего значением ACT, низким значением АЛТ и повышенным содержанием холестерина преобладает высокая доля аэробного окисления, что также свидетельствует об устойчивости животных к заражению туберкулезом.
Таким образом, авторами впервые выявлено, что увеличение доли аэробного процесса окисления в организме и снижение доли анаэробного процесса окисления способствуют формированию защитных сил организма и, как следствие - повышению устойчивости животных к заражению туберкулезом.
Все известные на сегодняшний день методы связаны с исследованиями уже инфицированного организма. Авторами выявлен лишь один источник информации, являющийся прототипом данного изобретения (см. патент РФ №2080061), в котором была решена задача выявления устойчивых к заражению туберкулезом здоровых животных (крупного рогатого скота). Однако он основан на определении генетической устойчивости организма.
Кроме этого, авторами запатентованы методы оценки устойчивости здорового организма животных к туберкулезу. В одном случае - путем определения поглотительной способности нейтрофилов и наличия микобактерий на лимфоцитах (патент РФ №2295725), а в другом случае - путем постановки реакции агломерации лейкоцитов (РАЛ) и определения индекса агломерации лейкоцитов (патент РФ №2280872).
Задачу выявления устойчивого к заражению туберкулезом здорового организма животного на основе изучения его биохимических показателей крови, никто не ставил.
Сказанное позволяет нам сделать вывод о наличии в заявляемом способе критерия «изобретательский уровень».
Все ферменты (КК, ЛДГ, ACT, АЛТ) определялись кинетическими методами.
КК - методом Оливера и Розальского (Recommendation of the German Society for Clinical Chemistry. Standartization of methods for the estimation of enzyme activities in biological fluids: Standard method for the determination of creatine kinase activity. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1977; 15: 255-260; Stein W. Creatine kinase (total activity), creatine kinase isoenzymes and variants, In: Tomas L., ed. Clinical laboratory diagnostics. Frankfurt: TH-Books Verlagsgesellschaft; 1998., p.71-80), основанным на способности КК катализировать разрушение креатин-фосфата с одновременным превращением АДФ в АТФ, которое далее участвует в ферментативном фосфорилировании глюкозы.
ЛДГ - методом Врублевского и Ля Дью (Wilkinson J., Qureshi A. Catabolism of plasma enzymes, as Studied I-125 labeled lactate dehydrogenase-I in the rabbit. - Clin. chem., 1976, v.22, p.1269-1276), основанным на оптическом тесте Варбурга.
rd
ACT - методом без применения фосфопиридоксаля Кармен (Moss D.W., Henderson A.R. Clinical enzymology. In: Burtis C.A., Ashwood E.R., editors. Tietz Textbook of Clinical Chemistry. 3 ed. Philadelphia: W.B. Saunders Company; 1999), основанным на способности ACT катализировать перенос аминогруппы с аспарагиновой кислоты на α-кетоглутарат.
АЛТ - методом без применения фосфопиридоксаля Генлей, Врублевского и Ля Дью (Bergmeyer H.U., Horder M., Rej R. International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) Scientific Committee. Analitical section: approved recommendation (1985) on IFCC methods for the measurement of catalytic concentration of enzymes. Part 3. IFCC methods for alanine aminotransferase (L-alanine:2-oxoglutarate aminotransferase, EC 2.6.1.2; J. Clin. Biochem. 1986; 24: 481-495), основанным на способности АЛТ катализировать перенос аминогруппы с аланина на α-кетоглутарат.
Для проверки устойчивости к заражению туберкулезом проводили контрольное заражение лабораторных животных. Морским свинкам, крысам, кроликам вводили 0,1 мл суспензии, содержащей 1 мг/мл культуры M.bovis.
За телятами вели наблюдения в течение 4 лет.
Способ осуществляется следующим образом.
1. Формируют группу клинически здоровых животных одного вида (кролики, крысы, морские свинки, телята, цыплята-бройлеры) в количестве до 100 животных в группе.
2. У этих животных берут кровь, стабилизируют гепарином, получают плазму и определяют в ней активность КК и ЛДГ.
3. По каждому показателю в каждой группе животных находят среднее арифметические значение.
4. Выявляют животных, у которых активность ЛДГ ниже найденного среднего арифметического значения для конкретной группы, а активность КК - выше. Этих животных считают устойчивыми к заражению туберкулезом.
5. При необходимости более точной оценки, в этой группе животных дополнительно определяют значения ACT и АЛТ.
При понижении активности АЛТ и/или повышении активности ACT относительно среднего значения каждого из этих показателей для конкретной группы животных судят об устойчивости организма животного к туберкулезу.
Пример 1.
Формируют группу морских свинок в количестве 7 голов.
Берут у них кровь, стабилизируют гепарином, получают плазму и определяют в ней активность ЛДГ, КК. Для повышения точности оценки устойчивости определяют ACT и АЛТ. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Биохимические показатели плазмы крови морских свинок
№ животного
ЛДГ (Е/л)
КК (Е/л)
АЛТ (Е/л)
АСТ (Е/л)
1
343,5
1134,2
59,9
77,0
2
430,9
486,0
56,2
77,8
3
12,2
577,2
40,0
48,8
4
305,9
901,6
59,8
41,4
5
167,4
302,4
43,2
34,6
6
523,6
244,2
30,8
70,4
7
305,3
239,6
178,1
38,2
Ср. зн.
298,4
421,95
66,86
55,46
Как видно из таблицы 1, из 7 животных показатель КК выше среднего наблюдался у животных №1-4, а показатель ЛДГ ниже среднего - у животных №3 и №5.
В данной группе животных только одна морская свинка (№3) соответствует критерию отбора на устойчивость.
Дополнительные критерии оценки по значениям АЛТ и ACT выявили уровень активности АЛТ у животного №3 ниже среднего, что подтверждает вывод о его высокой устойчивости.
При экспериментальном заражении животных туберкулезом путем подкожного введения 0,1 мл суспензии, содержащей 1 мг/мл культуры M.bovis, животное №3 не заболело. Остальные морские свинки заболели.
Всего было обследовано в опытах 25 морских свинок.
Пример 2.
Формируют 2 группы телят в возрасте до одного месяца и в возрасте 3-4 месяца из неблагополучных по туберкулезу хозяйств.
Берут у них кровь, стабилизируют гепарином, получают плазму и определяют в ней активность ЛДГ, КК, ACT и АЛТ.
Результаты исследований представлены в таблицах 2 и 3.
Таблица 2
Биохимические показатели плазмы крови телят в возрасте до одного месяца
№ п/п
ACT (Е/л)
АЛТ (Е/л)
КК (Е/л)
ЛДГ (Е/л)
1
17,8
5,6
144,3
1475,2
2
16,6
1,1
199,8
1167,7
3
18,9
3,3
142,1
1275,3
4
16,6
3,3
153,2
1301,6
5
20,0
2,2
133,2
1231,5
6
16,6
2,2
177,6
1772,4
7
18,9
1,1
146,5
2003,6
8
17,8
3,3
180,9
1633,9
9
14,4
1,1
194,2
1461,9
Ср
17,51
2,58
163,53
1480,34
Таблица 3
Биохимические показатели плазмы крови телят в возрасте 3-4 месяцев
№ п/п
ACT (Е/л)
АЛТ (Е/л)
КК (Е/л)
ЛДГ (Е/л)
1
47,7
7,8
228,7
1806,0
2
78,8
14,4
385,2
2704,0
3
63,3
13,3
444,0
2716,2
4
51,4
12,2
254,8
2344,8
5
60,9
12,1
428,0
2431,0
6
75,6
13,8
339,7
2064,6
7
104,3
20,0
906,9
3506,0
8
36,6
7,8
226,4
1536,2
9
45,5
5,6
258,6
1511,8
10
41,4
6,6
243,9
1534,0
Ср.
60,55
1136
371,62
2215,46
В первой группе (см. таблицу 2) у 4 животных (№2, №6, №8, №9) из 9 показатель КК выше среднего значения и у 6 животных (№1-5, №9) ЛДГ ниже среднего значения. В данной группе животных только у двух телят (№2 и №9) значения КК и ЛДГ соответствуют условиям отбора.
У отобранных телят (№2 и №9) произвели сравнение показателей ACT и АЛТ и ОХс.
Уровень АЛТ у обоих животных оказался ниже среднего.
Концентрация холестерина у животного №2 ниже, а у животного №9 выше среднего.
Совокупность полученных данных позволяет сделать вывод о высокой устойчивости к туберкулезу животных №2 и №9, причем у животного №9 она выше.
Таким образом, 22% животных будут устойчивы к туберкулезу.
Из таблицы 3 следует, что показатели ЛДГ ниже среднего значения наблюдались у животных №1, 6, 8, 9, 10, показатель КК выше среднего был у животных №2, 3, 5, 7.
Поскольку ни одно животное не удовлетворяло требуемому условию (одновременно превышения КК и понижения ЛДГ относительно среднего значения), делаем вывод об отсутствии устойчивых к туберкулезу животных в этой группе.
Всего в опытах было использовано 40 телят. В дальнейшем, за этими телятами вели наблюдения в течение 4 лет.
Животные №2 и №9 (таблица 2) туберкулезом не заразились. Животные №1, 3-8, 10 (таблица 2), находясь в естественных условиях неблагополучного хозяйства, заразились туберкулезом.
Все животные, указанные в таблице 3, в дальнейшем также заразились.
Пример 3. Исследования проводились на крысах.
Берут у них кровь, стабилизируют гепарином, получают плазму и определяют в ней активность ЛДГ, КК.
Для повышения точности оценки устойчивости определяют ACT и АЛТ. Результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4
Биохимические показатели плазмы крови крыс
№ животного
ЛДГ (Е/л)
КК (Е/л)
АЛТ (Е/л)
АСТ (Е/л)
1
307,5
411,0
40,0
88,0
2
352,8
421,8
346,3
279,7
3
853,9
390,6
24.4
108,8
4
743,9
137,6
71,0
93,2
5
328,5
501,7
42,2
108,9
6
184,6
380,7
35,5
95,5
7
330,2
515,0
57,7
117,7
8
479,5
148,5
55,5
99,9
9
319,7
473,1
35,5
102,1
10
392,6
799,2
113,2
137,6
11
417,4
474,3
144,8
254,7
12
1430,7
148,5
59,9
88,9
13
1045,5
190,9
17,8
51,1
14
443,7
466,2
24,4
102,1
15
240,9
478,5
28,9
139,9
16
424,9
586,1
26,6
104,3
17
332,7
697,1
51,1
91,0
18
283,0
410,7
31,1
66,6
19
438,7
768,1
46,6
128,8
20
495,8
558,9
24,4
68,8
21
503,9
475,3
20,0
68,9
22
528,4
577,4
17,8
66,6
23
514,4
555,8
35,5
55,5
24
196,5
455,4
59,9
84,5
25
1233,6
137,6
42,3
59,9
26
1285,3
146,5
24,4
102,1
Ср. зн.
550,18
427,32
56,8
106,38
Как видно из таблицы 4, у 15 из 26 крыс (57,6%) значения КК и ЛДГ соответствуют условиям отбора: одновременно показатель КК выше среднего и показатель ЛДГ ниже среднего значения (№5, 7, 9-11, 14-17, 19-24).
Дополнительные критерии оценки по значениям АЛТ и ACT выявили, что у одних животных отобранной группы уровень активности АЛТ ниже среднего (№9, 14, 16, 17, 20-23), у других уровень активности ACT - выше среднего (№7, 10, 11), а у третьей - одновременно уровень активности АЛТ ниже среднего и активности ACT выше среднего (№5, 15, 19).
Все крысы были также подвергнуты экспериментальному заражению туберкулезом путем подкожного введения 0,1 мл суспензии, содержащей 1 мг/мл культуры M.bovis. Отобранные 15 крыс, кровь которых удовлетворяла критерию устойчивости, не заболели, остальные заболели.
Из 100 крыс, всего использованных в эксперименте, 75 удовлетворяли необходимому условию, из них при экспериментальном заражении животных 68 крыс не заболели (90%). Из оставшихся 25 при экспериментальном заражении заболели все животные.
Пример 5.
Исследования проводились на кроликах. Определяли активность ЛДГ, КК, ACT и АЛТ.
Результат представлен в таблице 5.
Таблица 5
Биохимические показатели плазмы крови кроликов
№ животного
ЛДГ (Е/л)
КК (Е/л)
АЛТ (Е/л)
АСТ (Е/л)
1
277,0
568,0
25,4
39,2
2
487,0
871,0
25,3
38,5
3
399,0
771,0
35,1
44,4
4
963,0
958,0
36,3
46,2
5
631,0
609,0
39,7
21,8
6
963,0
487,0
163,9
358,1
7
587,0
450,0
28,7
37,2
8
299,0
245,0
35,2
41,8
9
509,0
718,0
29,1
29,7
10
465,0
656,0
19,8
12,1
11
399,0
529,0
33,2
38,1
12
819,0
972,0
80,3
458,2
13
252,31
690,0
43,73
51,75
14
498,85
310,0
100,17
235,72
Ср. зн.
539,23
631,0
49,71
103,77
Как видно из таблицы 5, у 5 кроликов из 14 (35,7%) одновременно показатель КК выше среднего и показатель ЛДГ ниже среднего значения - животные №2, 3, 9, 10, 13. Дополнительные критерии оценки по значениям ACT и АЛТ выявили у всех 5 животных данной отобранной группы уровень активности АЛТ ниже среднего.
Из 30 кроликов, использованных в эксперименте, только 10 удовлетворяли критерию отбора на устойчивость.
Кролики также подвергались экспериментальному заражению туберкулезом путем подкожного введения 0,1 мл суспензии, содержащей 1 мг/мл культуры M.bovis.
Животные, кровь которых удовлетворяла критерию отбора, не заболели, а остальные 20 кроликов заболели.
Пример 6.
Исследования проводились на цыплятах - кросса «Родонит-2» в возрасте до 110 дней (яйценоские) и кросса «Иза» (бройлеры) в возрасте до 45 дней.
Из 100 цыплят кросса «Родонит-2» и 50 цыплят-бройлеров кросса «Иза» необходимому условию не удовлетворял никто. Все цыплята при экспериментальном заражении туберкулезом путем подкожного введения 0,1 мл суспензии, содержащей 1 мг/мл культуры M.avium, заболели.
В таблицах 6 и 7 представлены результаты исследований.
Таблица 6
Биохимические показатели плазмы крови цыплят кросса «Родонит-2»
№ животного
ЛДГ (Е/л)
КК (Е/л)
АЛТ (Е/л)
АСТ (Е/л)
1
955,5
1634,8
11,4
171,5
2
800,0
1488,0
14,8
194,4
3
713,3
1262,0
9,6
177,8
4
692,5
1178,8
2,2
142,5
5
885,6
1594,7
8,9
175,6
6
738,7
1438,7
6,6
168,0
7
1278,9
2322,8
4,4
192,2
8
787,8
1501,0
3,3
183,3
Ср. зн.
856,54
1552,6
7,65
175,66
Таблица 7
Биохимические показатели плазмы крови цыплят кросса «Иза»
№ животного
ЛДГ (Е/л)
КК (Е/л)
АЛТ (Е/л)
АСТ (Е/л)
1
3104,0
4407,0
9,4
155,2
2
3059,0
4466,0
10,7
161,0
3
2894,0
3936,0
10,8
144,7
4
3232,0
4751,0
10,2
190,1
5
2846,0
3988,0
11,4
149,8
6
3604,0
5694,0
9,8
156,7
7
3392,0
5224,0
10,1
154,2
8
2559,0
3327,0
7,8
139,1
9
3628,0
4680,0
11,8
162,7
10
2768,0
4484,0
8,7
141,2
11
2856,0
3284,0
10,2
127,7
12
3371,0
5258,0
12,9
179,3
13
4528,0
6113,0
7,8
185,6
14
3211,0
4810,0
11,4
177,4
15
3321,0
4483,0
2,4
184,1
16
2557,0
4525,0
12,7
236,0
Ср. зн.
3183,13
4589,38
9,88
165,3
Таким образом, заявляемый метод позволяет эффективно выявлять среди здоровых животных (как лабораторных, так и сельскохозяйственных) устойчивых к заболеванию туберкулезом.