ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ CAS МЫШИНЫЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ И МЫШИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Способ испытания способности CRISPR/Cas-нуклеазы модифицировать целевой геномный локус in vivo, предусматривающий:
(a) введение не являющемуся человеком животному гидовой РНК, предназначенной для нацеливания на целевую последовательность для гидовой РНК в целевом геномном локусе,
причем не являющееся человеком животное содержит геномно интегрированную экспрессионную кассету Cas, содержащую кодирующую последовательность для белка Cas, дополнительно содержащую один или несколько сигналов ядерной локализации, и
причем гидовую РНК вводят посредством опосредованной аденоассоциированным вирусом (AAV) доставки; и
(b) оценку модификации целевого геномного локуса.
2. Способ по п. 1, в котором AAV представляет собой AAV7, AAV8 или AAV9, и стадия (b) предусматривает оценку модификации целевого геномного локуса в печени.
3. Способ по п. 2, в котором AAV представляет собой AAV8.
4. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором путь введения AAV не являющемуся человеком животному представляет собой внутривенную инъекцию, интрапаренхиматозную инъекцию, интраперитонеальную инъекцию, закапывание в нос или интравитреальную инъекцию.
5. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят на стадии (a), причем экзогенная донорная нуклеиновая кислота предназначена для рекомбинации с целевым геномным локусом.
6. Способ по п. 5, в котором экзогенная донорная нуклеиновая кислота представляет собой одноцепочечный олигодезоксинуклеотид (ssODN).
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором не являющееся человеком животное представляет собой крысу или мышь.
8. Способ по п. 7, в котором не являющееся человеком животное представляет собой мышь.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором целевой геномный локус содержит целевой ген, и стадия (b) предусматривает измерение экспрессии целевого гена или активности белка, кодируемого целевым геном.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором стадия (b) предусматривает секвенирование целевого геномного локуса в одной или нескольких клетках, выделенных из не являющегося человеком животного.
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором стадия (b) предусматривает выделение целевого органа или ткани из не являющегося человеком животного и оценку модификации целевого геномного локуса в целевом органе или ткани.
12. Способ по п. 11, в котором стадия (b) предусматривает оценку модификации целевого геномного локуса в двух или более различных типах клеток в пределах целевого органа или ткани.
13. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором стадия (b) предусматривает выделение нецелевого органа или ткани из не являющегося человеком животного и оценку модификации целевого геномного локуса в нецелевом органе или ткани.
14. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором белок Cas представляет собой белок Cas9.
15. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором экспрессионная кассета Cas дополнительно содержит сигнал полиаденилирования выше кодирующей последовательности для белка Cas, причем сигнал полиаденилирования фланкирован сайтами распознавания рекомбиназы, и причем сигнал полиаденилирования в экспрессионной кассете Cas был вырезан тканеспецифическим образом.
16. Способ по п. 15, в котором сигнал полиаденилирования выше кодирующей последовательности для белка Cas был вырезан в печени.
17. Способ по п. 15 или 16, в котором рекомбиназа, которая распознает сайты распознавания рекомбиназы в экспрессионной кассете Cas, представляет собой Cre-рекомбиназу.
18. Способ по п. 17, в котором не являющееся человеком животное дополнительно содержит геномно интегрированную экспрессионную кассету Cre-рекомбиназы, содержащую кодирующую Cre-рекомбиназу последовательность, функционально связанную с тканеспецифическим промотором.
19. Способ по п. 17 или 18, в котором ген Cre-рекомбиназы функционально связан с одним из промоторов, представленных в таблице 2.
20. Способ по любому из пп. 1-14, в котором экспрессионная кассета Cas дополнительно содержит сигнал полиаденилирования выше кодирующей последовательности для белка Cas, причем сигнал полиаденилирования фланкирован сайтами распознавания рекомбиназы, и причем способ дополнительно предусматривает введение рекомбиназы не являющемуся человеком животному тканеспецифическим образом.
21. Способ по п. 20, в котором рекомбиназу вводят посредством опосредованной аденоассоциированным вирусом (AAV) доставки или опосредованной липидными наночастицами (LNP) доставки.
22. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором экспрессионная кассета Cas дополнительно содержит кодирующую флуоресцентный белок последовательность.
23. Способ по п. 22, в котором экспрессионная кассета Cas содержит мультицистронную нуклеиновую кислоту, содержащую кодирующую последовательность для белка Cas и кодирующую флуоресцентный белок последовательность, разделенные с помощью промежуточного участка внутренней посадки рибосомы (IRES) или промежуточной кодирующей пептид 2A последовательности.
24. Способ по п. 23, в котором мультицистронная нуклеиновая кислота в экспрессионной кассете Cas содержит кодирующую последовательность для белка Cas и кодирующую зеленый флуоресцентный белок последовательность, разделенные с помощью промежуточной кодирующей пептид P2A последовательности.
25. Способ по любому из пп. 1-21, в котором экспрессионная кассета Cas дополнительно не содержит кодирующую флуоресцентный белок последовательность.
26. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором белок Cas содержит метку белка.
27. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором 5’ конец экспрессионной кассеты Cas дополнительно содержит 3’ последовательность сплайсинга.
28. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором экспрессионная кассета Cas функционально связана с эндогенным промотором.
29. Способ по любому из пп. 1-27, в котором экспрессионная кассета Cas функционально связана с экзогенным, конститутивным промотором.
30. Способ по любому предыдущему пункту, в котором экспрессионная кассета Cas кодирует белок, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, 16, 19 или 22.
31. Способ по п. 30, в котором экспрессионная кассета Cas содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28, 29, 30 или 31.
32. Способ по п. 31, в котором экспрессионная кассета Cas содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, 12, 14, 15, 17, 18, 20 или 21.
33. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором экспрессионная кассета Cas интегрирована в локус «безопасная гавань».
34. Способ по п. 33, в котором локус «безопасная гавань» представляет собой локус Rosa26.
35. Способ по п. 34, в котором экспрессионная кассета Cas интегрирована в первый интрон локуса Rosa26.
36. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором не являющееся человеком животное является гетерозиготным в отношении экспрессионной кассеты Cas.
37. Способ по любому из пп. 1-35, в котором не являющееся человеком животное является гомозиготным в отношении экспрессионной кассеты Cas.
38. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором не являющееся человеком животное представляет собой мышь,
причем AAV представляет собой AAV8, доставленный не являющемуся человеком животному с помощью внутривенной инъекции,
причем экспрессионная кассета Cas функционально связана с эндогенным промотором Rosa26, вставлена в первый интрон локуса Rosa26 и содержит от 5’ к 3’ следующее: (i) 3’ последовательность сплайсинга; и (ii) кодирующая последовательность для белка Cas9, дополнительно содержащая один или несколько сигналов ядерной локализации, и
причем стадия (b) предусматривает оценку модификации целевого геномного локуса в печени не являющегося человеком животного.
39. Способ оптимизации способности CRISPR/Cas-нуклеазы модифицировать целевой геномный локус in vivo, предусматривающий:
(I) проведение способа по любому из предыдущих пунктов в первый раз у первого не являющегося человеком животного;
(II) изменение переменной и проведение способа согласно стадии (I) во второй раз с измененной переменной у второго не являющегося человеком животного; и
(III) сравнение модификации целевого геномного локуса на стадии (I) с модификацией целевого геномного локуса на стадии (II), и выбор способа, приводящего к модификации целевого геномного локуса, характеризующейся одним или несколькими из следующего: повышенная эффективность, повышенная точность, повышенная согласованность или повышенная специфичность.
40. Способ по п. 39, в котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой серотип AAV.
41. Способ по п. 39, в котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой путь введения гидовой РНК, вводимой не являющемуся человеком животному.
42. Способ по п. 39, в котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой концентрацию или количество гидовой РНК, введенной не являющемуся человеком животному.
43. Способ по п. 39, в котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой гидовую РНК, введенную не являющемуся человеком животному.
44. Способ по п. 39, причем способ предусматривает введение экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, и причем измененная переменная на стадии (II) представляет собой способ доставки для введения экзогенной донорной нуклеиновой кислоты не являющемуся человеком животному.
45. Способ по п. 39, причем способ предусматривает введение экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, и измененная переменная на стадии (II) представляет собой путь введения  экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, вводимой не являющемуся человеком животному.
46. Способ по п. 39, причем способ предусматривает введение экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, и измененная переменная на стадии (II) представляет собой концентрацию или количество экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, введенной не являющемуся человеком животному.
47. Способ по п. 39, причем способ предусматривает введение экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, и измененная переменная на стадии (II) представляет собой концентрацию или количество гидовой РНК, введенной не являющемуся человеком животному, по отношению к концентрации или количеству экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, введенной не являющемуся человеком животному.
48. Способ по п. 39, в котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой экзогенную донорную нуклеиновую кислоту, введенную не являющемуся человеком животному.
49. Не являющееся человеком животное, содержащее геномно интегрированную экспрессионную кассету Cas, содержащую кодирующую последовательность для белка Cas, дополнительно содержащую один или несколько сигналов ядерной локализации.
50. Клетка не являющегося человеком животного, содержащая геномно интегрированную экспрессионную кассету Cas, содержащую кодирующую последовательность для белка Cas, дополнительно содержащую один или несколько сигналов ядерной локализации.
51. Геном не являющегося человеком животного, содержащий геномно интегрированную экспрессионную кассету Cas, содержащую кодирующую последовательность для белка Cas, дополнительно содержащую один или несколько сигналов ядерной локализации.
52. Нацеливающий вектор, содержащий экспрессионную кассету Cas, фланкированную гомологичными плечами, причем экспрессионная кассета Cas содержит кодирующую последовательность для белка Cas, дополнительно содержащую один или несколько сигналов ядерной локализации, и причем гомологичные плечи являются подходящими для направления рекомбинации с требуемым целевым геномным локусом для облегчения геномной интеграции.
53. Способ получения не являющегося человеком животного по п. 49, предусматривающий:
(a) модификацию генома плюрипотентной клетки не являющегося человеком животного для содержания экспрессионной кассеты Cas, содержащей кодирующую последовательность для белка Cas, дополнительно содержащей один или несколько сигналов ядерной локализации;
(b) идентификацию или выбор генетически модифицированной плюрипотентной клетки, содержащей экспрессионную кассету Cas;
(c) введение генетически модифицированной плюрипотентной клетки в эмбрион-хозяин не являющегося человеком животного; и
(d) имплантацию и вынашивание эмбриона-хозяина не являющегося человеком животного в организме суррогатной матери.
54. Способ получения не являющегося человеком животного по п. 49, предусматривающий:
(a) модификацию генома эмбриона на стадии одной клетки не являющегося человеком животного для содержания экспрессионной кассеты Cas, содержащей кодирующую последовательность для белка Cas, дополнительно содержащей один или несколько сигналов ядерной локализации;
(b) выбор генетически модифицированного эмбриона на стадии одной клетки, содержащего экспрессионную кассету Cas; и
(c) имплантацию и вынашивание генетически модифицированного эмбриона на стадии одной клетки в организме суррогатной матери.