ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕРЕНОСА ЗАРЯДА В БИОЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS МЕТОДОМ ЦИКЛИЧЕСКОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ

ХИМИЯ

УДК 543.55:579.222.2 DOI: 10.24412/2071-6176-2021-1-3-12

ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕРЕНОСА ЗАРЯДА В БИОЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS

МЕТОДОМ ЦИКЛИЧЕСКОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ

О.А. Елисеева, А.С. Харькова, В.А. Арляпов, О.Н. Понаморева

Определены константы скорости взаимодействия медиаторов различного строения с уксуснокислыми бактериями Gluconobacter oxydans в системе «угольно-пастовый электрод - медиатор - G.oxydans». Для определения констант скорости взаимодействия применили модель Николсона-Шайна, для этого регистрировали анодный ток в присутствии и отсутствии окисляемого субстрата для каждого исследуемого медиатора, что в дальнейшем позволило сопоставить ряд эффективности медиаторов в соответствии с полученными константами и моделирования по механизму «пинг-понг».

Ключевые слова: «индекс эффективности», механизм «пинг-понг», бактерии Gluconobacter oxydans, медиаторы электронного транспорта, модель Николсона-Шайна, циклическая вольтамперометрия.

Введение

Благодаря своим свойствам биосенсоры находят применение во многих областях человеческой деятельности, в частности в клинической диагностике и экологическом мониторинге, биотехнологии, медицине и пищевой промышленности. В настоящее время для создания биосенсоров в качестве биологического материала используют ферменты, ткани, бактерии, мембранные фракции. Часто в качестве биокатализаторов в медиаторных биосенсорах используют уксуснокислые бактерии рода Gluconobacter, имеющие мембранную локализацию основных ферментов катаболизма спиртов и углеводов - пирролохинолинхинон (PQQ)-зависимых альдоз- и алкогольдегидрогеназ, что облегчает их взаимодействие с медиаторами переноса электронов [1]. Кроме того, различные штаммы бактерий Gluconobacter oxydans широко используются в качестве биокатализаторов во многих биотехнологических процессах получения пищевых и биологически активных соединений.

При разработке биосенсоров и биотопливных элементов широко используют медиаторы электронного транспорта, которые способствуют переносу электронов от активного центра фермента на электрод. Использование медиаторов обеспечивает высокую чувствительность метода, короткое время анализа и возможность миниатюризации биосенсорных систем. На сегодняшний день формирование систем «микроорганизм - медиатор - электрод» или носит эмпирический характер

[2], или основан на моделировании функционирования медиаторных биосенсоров в рамках двухсубстратной ферментативной реакции и определении «индекса эффективности» - это расчетная величина, равная отношению максимального ответа биосенсора к концентрации медиатора, при которой ответ биосенсора равняется половине от максимального (Rmax/Км) [3]. В основу подхода выбора медиаторов электронного транспорта положена модель Икеды, позволяющая по отношению Rmax/KM оценить эффективности медиаторов, так как учитывает и максимальный ответ биосенсора, который можно получить с использованием определенного медиатора, и количество медиатора, которое для этого необходимо использовать. Соответственно, чем выше значение Rmax/KM, тем больший аналитический сигнал способен генерировать биосенсор при использовании меньших количеств медиатора, что позволяет количественно сравнить эффективность медиаторов электронного транспорта. Использование предложенной Икедой модели можно найти в работах Бабкиной [4], Инджгии [5], в которых на основе индекса эффективности была проведена оценка взаимодействия медиаторов ферроценового и хинонового ряда с клетками G. oxydans. Количественное сравнение эффективности взаимодействия медиаторов и бактерий позволило установить влияние различных заместителей на медиаторную способность производных ферроценов [6]. Кузьмичева использовала модель Икеды для оценки скорости диффузии медиаторов метиленового синего и галлоцианина между биокатализатором Escherichia coli и раствором при разработке макета биотопливного элемента [7]. Все измерения были проведены на стеклоуглеродном вращающемся дисковом электроде при постоянном потенциале. Индекс эффективности для галлоцианина в 1,6 раз меньше, чем для метиленового синего, что позволило автору заключить, что метиленовый синий диффундирует между биокатализатором и контактирующим с ним раствором быстрее, чем галлоцианин [7].

Метод циклической вольтамперометрии и математическая модель Николсона и Шайна [8] могут быть использованы как альтернативный метод оценки эффективности медиаторного переноса электронов, так как позволяют рассчитать константу взаимодействия биоматериала и медиатора [9 - 11]. При регистрации циклической вольтамперограммы биоэлектрода модифицированного медиатором в присутствии глюкозы происходит увеличение анодного тока за счет электрокаталитического окисления субстрата биоматериалом, протекающего по следующей схеме:

S+E0^P+E30C,

,

где S - субстрат - глюкоза; Р - продукт; E0K и EB0C - окисленная и восстановленная форма фермента микроорганизмов; Мвос и M0K -восстановленная и окисленная форма медиатора электронного транспорта, ж - число электронов, перенесенных на электрод; km - константа скорости взаимодействия медиатора и биоматериала.

Для того, чтобы медиатор был эффективным акцептором электронов для исследуемого биоматериала, необходимо, чтобы константа скорости ^з в уравнении (2) имела наибольшее значение, в этом случае медиатор будет успешно конкурировать с природным акцептором электронов - растворенным кислородом и при эксплуатации биосенсора не будет требоваться деаэрация ячейки.

Исходя из вышеизложенного, циклическая вольтамперометрия является полезным инструментом для исследования механизмов электродных реакций, а также нахождения констант скорости отдельных стадий. Подобный подход успешно использован в нашем научном коллективе для исследования электрохимических аспектов взаимодействия бактерий Paracoccus yeei ВКМ В-3302 с редокс-активными гидрогелями на основе ковалентно связанных медиаторов ферроцена и нейтрального красного. При этом показано, что константа скорости взаимодействия редокс-активных гелей с микроорганизмами мало зависит от используемой основы редокс-активного геля (белок - бычий сывороточный альбумин или полисахарид - хитозан) и определяется используемым для модификации медиатором [12, 13].

Материалы и методы

Реактивы, материалы и оборудование. Все требуемые реактивы имели степень чистоты х.ч. или ч.д.а. «Sigma» (США), «Merck» (Германия), «Amresco» (США), «Fluka» (Швейцария), «Диа-М» (Россия). Для приготовления среды и культивировании бактерий G. oxydans использовали D-сорбит («Sigma», США) и дрожжевой экстракт («Oxoid Ltd.», Великобритания). Для изготовления графито-пастовых электродов брали графитовую пудру («Fluka», Германия), минеральное масло («Fluka», Германия), ацетон («Диа-М», Россия), диализную мембрану («Roth», Германия) (предел пропускания 12 кДа). Для анализа использовали следующие медиаторы: ферроцен, 1,1'-диметилферроцен, ферроценацетонитрил («Aldrich», Германия), ферроценкарбальдегид («Sigma», США), 2,5-дибром-1,4-бензохинон («Fluka», Германия), 2,6-дихлорфенолиндофенол («Sigma», США), тионин, нейтральный красный, гексацианоферрат (III) калия (Диа-М», Россия). В качестве рабочего электролита применяли фосфатный калий-натриевый буферный раствор

(рН 6,8) (концентрация солей 33 мМ). В роли субстрата выступала D-(+)-Глюкоза моногидрат («АррНОДет», Германия). Опыт проводили на вольтамперометрическом анализаторе «Экотест-ВА» («Эконикс-Эксперт», Москва, Россия) под управлением ПК: пределы измерения тока 0,2 мкА; 2 мкА; 20 мкА; 200 мкА; 2 мА; скорости развертки от 10 до 50 мВ/сек; поляризующее напряжение от -3 В до +3 В. Измерение проводили с помощью программы «Экотест-ВА». Для обработки результатов эксперимента пользовались SigmaPlot 12.5.

Электрод. При использовании растворимых медиаторов рабочий электрод формировали, наполняя приготовленной пастой «графитовая пудра - минеральное масло» пластиковую трубку. Графитовую пасту готовили смешиванием 0,1 г графитовой пудры с 40 мкл парафинового масла. Пластиковая трубка содержала платиновую проволоку для электрического контакта с частицами графита. В случае использования в качестве медиаторов ферроцена, его производных и 2,5-дибром-1,4-бензохинон, навеску данных медиаторов, равную 0,09 г, растворяли в 500 мкл ацетона. Далее смешивали с 0,1 г графита и 40 мкл парафинового масла и так же заполняли пластиковую трубку. Клетки микроорганизмов смешивали с фосфатным буфером с рН=6,8 в отношении 1:1. Полученную смесь встряхивали в течение 5 минут. Далее эту смесь наносили по 10 мкм два раза на зачищенный угольно-пастовый электрод и ждали полного высыхания. В качестве удерживающего материала была использована диализная мембрана, которую закрепляли на конце электрода с помощью пластикового кольца.

Электрохимические измерения. Управление прибором проводилось с помощью встроенной программы «Экотест-ВА». Перед непосредственным измерением в трехэлектродной системе, включающей рабочий углеродно-пастовый электрод, хлорид-серебряный электрод сравнения и вспомогательный платиновый электрод меняли калий-натрий фосфатный буферный раствор с рН = 6,8 (концентрация солей 33 мМ) и добавляли 1 мл раствора медиатора. Скорость развертки от 10 до 50 мВ/с. После окончания измерений в систему добавлялось 20 мл глюкозы и при той же скорости развёртки снимали вольтамперограмму. После снятия двух зависимостей с глюкозой и без глюкозы из ячейки выливался раствор и перезаполнялся буфером и медиатором. При использовании ферроцена, его производных и 2,5-дибром-1,4-бензохинона, перед непосредственным измерением в трехэлектродной ячейке меняли калий-натрий фосфатный буферный раствор и проводили измерения также при скорости развертки от 10 до 50 мВ/с. После окончания измерений в систему добавлялось 20 мл глюкозы и при той же скорости развёртки снимали вольтамперограмму. После снятия двух зависимостей с глюкозой и без глюкозы из ячейки выливался раствор и перезаполнялся свежей порцией буферного раствора.

В ходе измерения на мониторе компьютера отображались изменения параметров системы, таких, как зависимость силы тока от потенциала.

Результаты и их обсуждения

В данной статье исследовано электрохимическое поведение бактерий Gluconobacter oxydans, являющихся перспективным биокатализатором в биосенсорах и биотопливных элементах, при биокаталитическом окислении субстрата с переносом заряда с различными медиаторами электронного транспорта для определения констант скорости их взаимодействия. Полное описание использования метода циклической вольтамперометрии для определения константы взаимодействия представлено в работах Николсона и Шайна [8]. Для того, чтобы реакция (2) стала скоростьопределяющей, требуется создать определенные условия. Во-первых, для того, чтобы реакция (1) не являлась лимитирующей, требуется использовать субстрат в концентрации, превышающей константу Михаэлиса. В этой связи все эксперименты осуществляли в условиях избытка концентрации субстрата; при этом конечная концентрация глюкозы составляла 50 мМ. Во-вторых, чтобы реакция (3) не являлась скоростьопределяющей - перенос электронов должен быть достаточно быстрым, а фиксируемый ток был диффузионно ограниченным. Для выявления скоростьопределяющей стадии переноса электронов проводили оценку соответствия исследуемой системы модели

Николсона (диагностическим критерием является линейная зависимость

1/2

предельного тока 1Р от обратной величины корня скорости развертки V ). Подобный подход апробирован нами на примере глюкозооксидазы, иммобилизованной на графито-пастовом электроде [12].

Предполагая, что ферментные системы используемого биоматериала находятся в восстановленном состоянии из-за высокой концентрации субстрата, можно найти константу взаимодействия дрожжей с исследуемыми медиаторами с помощью уравнения:

где Ь - предельный ток в присутствии субстрата; ^ - предельный ток в отсутствии субстрата; ^заим - константа скорости взаимодействия медиатора и биоматериала; [Щ] - концентрация фермента; R -универсальная газовая постоянная; Т - температура; п - число электронов; F - число Фарадея; V - скорость развертки.

После измерений на монитор компьютера выводились вольтамперопрограммы для каждого из медиаторов, где был зафиксирован ток в присутствии и отсутствии субстрата. На рис. 1 представлен пример такой циклической вольтамперограммы биоэлектрода на основе клеток

О. oxydans с медиатором ферроценом в присутствии и отсутствии глюкозы. Циклические вольтамперограммы остальных исследуемых электродов имели аналогичный вид.

Рис. 2. Циклическая вольтамперограмма биоэлектрода на основе бактерий О. oxydans с медиатором тионином: 1 - вольтамперограмма с добавлением глюкозы; 2 - вольтамперограмма без глюкозы

Для биоэлектрохимических систем «клетки О. oxydans - медиатор электронного транспорта - электрод» была применена модель Николсона-Шайна [8]. Для использования данной модели полученные отношения предельных анодных токов в присутствии и в отсутствии субстрата представляли в виде линейной зависимости от обратной величины корня скорости развертки (рис. 2), что позволяет по тангенсу угла наклона

\к [Е АКТ

линейной регрессии (tga = взаим —) рассчитать константу скорости

V пР

взаимодействия бактерий с исследуемым медиатором.

В таблице представлены значения полученных констант скорости взаимодействия с исследуемыми медиаторами.

В результате был получен следующий ряд эффективности нерастворимых медиаторов: 1,1'-диметилферроцен ^ ферроцен ^ ферроценацетонитрил ^ 2,5-дибром-1,4-бензохинон, который подтвердил, что электроноакцепторные заместители повышают активность ферроценового ядра, а электронодонорные снижают их активность. Следует отметить, что одной из возможных причин данной закономерности является увеличение стандартного окислительно-восстановительного потенциала медиатора при введении электроно-акцепторных заместителей, который приводит к увеличению и акцепторных свойства медиатора. При сравнении констант растворимых медиаторов их эффективность увеличивается в ряду: 2,6-дихлорфенолиндофенол ^ тионин ^ гексацианоферрат (III) калия ^

нейтральный красный. В данном ряду нет корреляции между значением окислительно-восстановительного потенциала и увеличением акцепторных свойств, вероятно, из-за структурных особенностей медиатора. Таким образом, наиболее эффективно процесс окисления глюкозы протекает с использованием 2,5-дибром-1,4-бензохинон и нейтрального красного.

1,05 -1,04 -1,03 -

1,01 -1,00 -0,99 -

Рис. 2. Зависимость отношения анодного тока с глюкозой и без глюкозы от обратной величины корня из скорости взаимодействия. Медиатор 2,6-дихлорфенолиндофенол

Константы скорости взаимодействия различных медиаторов _с бактериями G. oxydans__

Медиатор 3 Константа, дм /

1,1' - диметилферроцен 0,18±0,07

Ферроцен 0,19±0,08

Ферроценацетонитрил 0,4±0,2

2,5-дибром-1,4-бензохинон 0,4±0,2

2,6-дихлорфенолиндофенол 0,018±0,004

Тионин 0,06±0,02

Гексацианоферрат (III) калия 0,23±0,09

Нейтральный красный 1,0±0,4

Заключение

Сравнивая данные значения с результатами, полученными по механизму «пинг-понг» [6], можно заметить различия в ряду для растворимых медиаторов. Расхождение ряда эффективности связано с тем, что механизм «пинг-понг» учитывает, как взаимодействие медиатора с биоматериалом, так и его взаимодействие на поверхности электрода. У нерастворимых медиаторов гетерогенные константы скорости взаимодействия с электродом близки. В случае растворимых медиаторов,

5 6 7 8

данные константы различаются на порядок (2,6-дихлорфенолиндофенол: ks = 0,069 ± 0,004 смс-1; гексацианоферрат (III) калия: ks = 0,0067 ± 0,0009 смс-1), что объясняет большую эффективность 2,6-дихлорфенолиндофенола по механизму «пинг-понг» [14].

Работа выполнена при поддержке Государственного задания Минобрнауки РФ

Список литературы

1. Directing cell catalysis of glucose to 2-keto-D-gluconic acid using Gluconobacter oxydans NL71 / X. Zhou, Y. Shen, X. Yong [et al.] //Process Biochemistry. 2020. V. 94. Р. 365-369.

2. A mediated BOD biosensor based on immobilized B. subtilis on three-dimensional porous graphene-polypyrrole composite / J. Hu, Y. Li, G. Gao et al. // Sensors. 2017. V. 17. I. 11. P. 2594.

3. Графитовые печатные электроды, модифицированные проводящим белковым гидрогелем и бактериальными клетками, как основа амперометрического биосенсора / С.С. Каманин, В.А. Арляпов,

0.Н. Понаморёва [и др.] // Сенсорные системы. 2017. Т. 31. № 2. C. 159— 169.

4. Bioelectrocatalytic oxidation of glucose by immobilized bacteria Gluconobacter oxydans. Evaluation of water-insoluble mediator efficiency / E. Babkina, E. Chigrinova, O. Ponamoreva [et al.] // Electroanalysis. 2006. V. 18.

1. 19-20. P. 2023 - 2029.

5. Interaction of ferrocene mediators with Gluconobacter oxydans immobilized whole cells and membrane fractions in oxidation of ethanol / E. Indjgia, O. Ponamoreva, V. Alferov [et al.] // Electroanalysis. 2012. V 24. I. 4. P. 924 - 930.

6. Эффективность биоэлектрокаталитического окисления этанола целыми клетками и мембранной фракцией бактерий Gluconobacter oxydans в присутствии медиаторов ферроценового ряда / О.Н. Понаморева, Е.Ю. Инджгия, В.А. Алферов [и др.] // Электрохимия. 2010. Т. 46. №12. С. 15031508.

7. Кузьмичева Е. В. Кинетика процесса окисления глюкозы с помощью микроорганизма Eschrichia coli в присутствии экзогенных медиаторов: дис. ... канд. хим. наук. Саратов, 2009. 109 с.

8. Nicholson R. S., Shain I. Theory of stationary electrode polarography. Single scan and cyclic methods applied to reversible, irreversible, and kinetic systems // Analytical Chemistry. 1964. V. 36. №. 4. P. 706-723.

9. Unsubstituted phenothiazine as a superior water-insoluble mediator for oxidases / A. N. Sekretaryova, M. Yu. Vagin, V. Beni [et al.] //Biosensors and Bioelectronics. 2014. V. 53. P. 275-282.

10. The Role of the n Acceptor Character of Polypyridine Ligands on the Electrochemical Response of Co (II) Complexes and its Effect on the Homogenous Electron Transfer Rate Constant with the Enzyme Glucose Oxidase / V. Ramírez-Delgado, M. Cruz-Ramirez, L. F. Hernández-Ayala [et al.] // Journal of the Mexican Chemical Society. 2015. V. 59. I. 4. P. 282-293.

11. Heller A. Electrochemical glucose sensors and their application in diabetes management / A. Heller, B. Feldman // Applications of Electrochemistry in Medicine: MAOE book series. New York: Springer, 2013. P. 121-187.

12. Гибридный редокс-активный полимер на основе бычьего сывороточного альбумина, ферроцена, карбоксилированных углеродных нанотрубок и глюкозокозооксидазы / В.А. Арляпов, А.С. Харькова, Т.Н. Абрамова [и др.] // Журнал аналитической химии. 2020. № 9. С. 820-833.

13. Use of biocompatible redox-active polymers based on carbon nanotubes and modified organic matrices for development of a highly sensitive BOD biosensor / V. A. Arlyapov, A.S. Kharkova, S.K. Kurbanaliyeva [et al.] //Enzyme and Microbial Technology. 2021. V. 143. I. 109706.

14. A mediator microbial biosensor for assaying general toxicity/ A.S. Kharkova, V. A. Arlyapov, A.D. Turovskaya [et al.] // Enzyme and Microbial Technology. 2020. I. 109435.

Елисеева Ольга Андреевна, студент, oly021999@yandex.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Харькова Анна Сергеевна, канд. хим. наук, Anyuta_Zaytseva@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Арляпов Вячеслав Алексеевич, канд. хим. наук, доц., v.a.arlyapov@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Понаморева Ольга Николаевна, д-р хим. наук, доц., зав. кафедрой биотехнологии, olgaponamoreva@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет

RESEARCH OF CHARGE TRANSFER IN BIOELECTROCHEMICAL SYSTEMS BASED ON GLUCONOBACTER OXYDANS BACTERIA BY

CYCLIC VOLTAMPEROMETRY

O. A. Eliseeva, A.S. Kharkov, V.A. Arlyapov, O. N. Ponamoreva

In the work, the rate constants of the interaction of mediators with various structures with Gluconobacter oxydans bacteria in the system "carbon-paste electrode - mediator - G. oxydans" were determined. Rate constants of the interaction, the Nicholson-Schein model were measured via Nicholson-Schein model; for this, the anodic current was recorded in the presence and absence of an oxidizable substrate for each investigated mediator, which later made it possible to compare a number of mediator efficiencies in accordance with the obtained constants and modeling by the mechanism "Pingpong".

Key words: "efficiency index", "ping-pong" mechanism, bacteria Gluconobacter oxydans, electron transport mediators, Nicholson-Schein model, cyclic voltammetry.

Eliseeva Olga Andreevna, student, oly021999@yandex.ru, Russia, Tula, Tula State University,

Anna Sergeevna Kharkova, Candidate Chemical Sciences, Anyuta_Zaytseva@mail.ru, Russia, Tula, Tula State University,

Arlyapov Vyacheslav Alekseevich, Candidate Chemical Science, docent, v.a.arlyapov@gmail.com, Russia, Tula, Tula State University,

Olga Nikolaevna Ponamoreva, Doctor of Chemical Sciences, docent, Head of the Department of Biotechnology, olgaponamoreva@mail.ru, Russia, Tula, Tula State University