EGFL6-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
EGFL6-SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODIES AND THEIR APPLICATION METHODS

Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/291987, поданной 5 февраля 2016 года, полный объем которой включен в данный документ посредством ссылки.
Уровень техники
1. Область изобретения
Данное изобретение в целом относится к области биологии рака. Более конкретно, оно касается моноклональных антител, нацеленных на EGFL6, для лечения и выявления рака.
2. Описание связанной области техники
Белок «Human epidermal growth factor (EGF)-like domain multiple 6 (EGFL6)» был впервые обнаружен в опухолях и тканях плода и является членом суперсемейства повтора EGF. EGFL6 идентифицировали как секретируемый белок с четырьмя с половиной EGF-подобными повторяющимися доменами, двумя сайтами N-опосредованного гликозилирования, одним мотивом ассоциации интегрина (RGD), сайтом фосфорилирования тирозина и доменом MAM (Yeung et al., 1999). Исследования показали, что высокий уровень экспрессии EGFL6 связан с опухолевыми тканями в некоторых типах рака, таких как рак яичника и рак легкого, тогда как ограниченная экспрессия была обнаружена в здоровой ткани у взрослых (Buckanovich et al., 2007; Chim et al., 2011 и Oberauer et al., 2010). Тем не менее, по-прежнему существует потребность в реагентах и терапевтических средствах для лечения EGFL6-положительных раковых заболеваний.
Краткое описание изобретения
В данном документе описаны моноклональные антитела против EGFL6, которые связываются с EGFL6. В дальнейших аспектах предложенные EGFL6-связывающие антитела, уменьшают сигналинг EGFL6 и могут быть применены для ингибирования пролиферации раковых клеток. Таким образом, в первом варианте осуществления предложено выделенное или рекомбинантное моноклональное антитело, которое специфически связывается с EGFL6. В некоторых аспектах предложено антитело, которое конкурирует за связывание EGFL6 с моноклональным антителом E1-33, E1-34, E1-80, E1-89, E2-93, E1-38, E1-52, E2-36, E1-95, E2-116, E2-135 или E1-142. В некоторых аспектах антитело может содержать всю или часть вариабельной области тяжелой цепи и/или вариабельной области легкой цепи моноклональных антител E1-33, E1-34, E1-80, E1-89, E2-93, E1-38, E1-52, E2-36, E1-95, E2-116, E2-135 или E1-142. В другом аспекте антитело может содержать аминокислотную последовательность, которая соответствует первой, второй и/или третьей области определения комплементарности (CDR) из вариабельной области легкой цепи и/или вариабельной области тяжелой цепи моноклональных антител E1-33, E1-34, E1-80, E1-89, E2-93, E1-38, E1-52, E2-36, E1-95, E2-116, E2-135 или E1-142 данных вариантов реализации изобретения.
H
H
H
L
L
L
H
H
H
H
H
H
L
L
L
L
L
L
В некоторых аспектах выделенное антитело содержит последовательности CDR по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичные областям CDR аминокислотных последовательностей тяжелых и легких цепей E1-33, E1-34, E1-80, E1-89, E2-93, E1-38, E1-52, E2-36, E1-95, E2-116, E2-135 или E1-142. В других аспектах антитело содержит области CDR, идентичные областям CDR E1-33, E1-34, E1-80, E1-89, E2-93, E1-38, E1-52, E2-36, E1-95, E2-116, E2-135 или E1-142, за исключением одной или двух аминокислотных замен, делеций или вставок в одной или более CDR. Например, антитело может содержать CDR, причем последовательности CDR содержат 1 или 2 аминокислотные замены в V CDR1, V CDR2, V CDR3, V CDR1, V CDR2 и/или V CDR3 по сравнению с CDR моноклонального антитела E1-33, E1-34, E1-80, E1-89, E2-93, E1-38, E1-52, E2-36, E1-95, E2-116, E2-135 или E1-142. Таким образом, в некоторых конкретных аспектах антитело согласно вариантам осуществления содержит (a) первую CDR V по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную CDR1 V E1-33 (SEQ ID NO: 4), E1-34 (SEQ ID NO: 10), E1-80 (SEQ ID NO: 16), E1-89 (SEQ ID NO: 22), E2-93 (SEQ ID NO: 28), E1-38 (SEQ ID NO: 34), E1-52 (SEQ ID NO: 40), E2-36 (SEQ ID NO: 46), E1-95 (SEQ ID NO: 52), E2-116 (SEQ ID NO: 58), E2-135 (SEQ ID NO: 64) или E1-142 (SEQ ID NO: 70); (b) вторую CDR V по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную CDR2 V E1-33 (SEQ ID NO: 5), E1-34 (SEQ ID NO: 11), E1-80 (SEQ ID NO: 17), E1-89 (SEQ ID NO: 23), E2-93 (SEQ ID NO: 29), E1-38 (SEQ ID NO: 35), E1-52 (SEQ ID NO: 41), E2-36 (SEQ ID NO: 47), E1-95 (SEQ ID NO: 53), E2-116 (SEQ ID NO: 59), E2-135 (SEQ ID NO: 65) или E1-142 (SEQ ID NO: 71); (c) третью CDR V по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную CDR3 V E1-33 (SEQ ID NO: 6), E1-34 (SEQ ID NO: 12), E1-80 (SEQ ID NO: 18), E1-89 (SEQ ID NO: 24), E2-93 (SEQ ID NO: 30), E1-38 (SEQ ID NO: 36), E1-52 (SEQ ID NO: 42), E2-36 (SEQ ID NO: 48), E1-95 (SEQ ID NO: 54), E2-116 (SEQ ID NO: 60), E2-135 (SEQ ID NO: 66) или E1-142 (SEQ ID NO: 72); (d) первую CDR V по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную CDR1 V E1-33 (SEQ ID NO: 76), E1-34 (SEQ ID NO: 82), E1-80 (SEQ ID NO: 88), E1-89 (SEQ ID NO: 93), E2-93 (SEQ ID NO: 99), E1-38 (SEQ ID NO: 104), E1-52 (SEQ ID NO: 108), E2-36 (SEQ ID NO: 113), E1-95 (SEQ ID NO: 117), E2-116 (SEQ ID NO: 121), E2-135 (SEQ ID NO: 126) или E1-142 (SEQ ID NO: 131); (e) вторую CDR V по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную CDR2 V E1-33 (SEQ ID NO: 77), E1-34 (SEQ ID NO: 83), E1-80 (SEQ ID NO: 77), E1-89 (SEQ ID NO: 94), E2-93 (SEQ ID NO: 100), E1-38 (SEQ ID NO: 100), E1-52 (SEQ ID NO: 77), E2-36 (SEQ ID NO: 83), E1-95 (SEQ ID NO: 83), E2-116 (SEQ ID NO: 100), E2-135 (SEQ ID NO: 127) или E1-142 (SEQ ID NO: 100); и (f) третью CDR V по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную CDR3 V E1-33 (SEQ ID NO: 78), E1-34 (SEQ ID NO: 84), E1-80 (SEQ ID NO: 89), E1-89 (SEQ ID NO: 95), E2-93 (SEQ ID NO: 101), E1-38 (SEQ ID NO: 105), E1-52 (SEQ ID NO: 109), E2-36 (SEQ ID NO: 114), E1-95 (SEQ ID NO: 118), E2-116 (SEQ ID NO: 122), E2-135 (SEQ ID NO: 128) или E1-142 (SEQ ID NO: 132). В некоторых аспектах такое антитело представляет собой гуманизированное или деиммунизированное антитело, содержащее вышеуказанные CDR на каркасе IgG (например, IgG1, IgG2, IgG4 или генетически модифицированного IgG) человека.
H
H
H
L
L
L
В других аспектах выделенное антитело содержит последовательность CDR первой V, второй V, третьей V, первой V, второй V и третьей V на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную соответствующей последовательности CDR моноклонального антитела E1-33, которые представлены в SEQ ID NO: 4, 5, 6, 76, 77 и 78, соответственно. В одном аспекте выделенное антитело содержит последовательности CDR, которые идентичны последовательностям CDR моноклонального антитела E1-33.
H
H
H
L
L
L
H
H
L
L
H
H
L
L
H
L
В другом аспекте выделенное антитело содержит домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E1-33 (SEQ ID NO: 157) или гуманизированному домену VmAB E1-33; и домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E1-33 (SEQ ID NO: 158) или гуманизированному домену V mAB E1-33. Например, антитело может содержать домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E1-33 и домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E1-33. Так, в некоторых аспектах, антитело может содержать домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E1-33 и домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E1-33. В конкретном примере выделенное антитело может содержать домены V и V, идентичные доменам моноклонального антитела E1-33.
H
H
H
L
L
L
В других аспектах выделенное антитело содержит последовательность CDR первой V, второй V, третьей V, первой V, второй V и третьей V на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную соответствующей последовательности CDR моноклонального антитела E1-34, которые представлены в SEQ ID NO: 10, 11, 12, 82, 83 и 84, соответственно. В одном аспекте выделенное антитело содержит последовательности CDR, которые идентичны последовательностям CDR моноклонального антитела E1-34.
H
H
H
L
L
L
H
H
L
L
H
H
L
L
H
L
В другом аспекте выделенное антитело содержит домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E1-34 (SEQ ID NO: 159) или гуманизированному домену VmAB E1-34; и домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E1-34 (SEQ ID NO: 160) или гуманизированному домену V mAB E1-34. Например, антитело может содержать домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E1-34 и домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E1-34. Так, в некоторых аспектах, антитело может содержать домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E1-34 и домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E1-34. В конкретном примере выделенное антитело может содержать домены V и V, идентичные доменам моноклонального антитела E1-34.
H
H
H
L
L
L
В других аспектах выделенное антитело содержит последовательность CDR первой V, второй V, третьей V, первой V, второй V и третьей V на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную соответствующей последовательности CDR моноклонального антитела E1-80, которые представлены в SEQ ID NO: 16, 17, 18, 88, 77 и 89, соответственно. В одном аспекте выделенное антитело содержит последовательности CDR, которые идентичны последовательностям CDR моноклонального антитела E1-80.
H
H
H
L
L
L
H
H
L
L
H
H
L
L
H
L
В другом аспекте выделенное антитело содержит домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E1-80 (SEQ ID NO: 161) или гуманизированному домену VmAB E1-80; и домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E1-80 (SEQ ID NO: 162) или гуманизированному домену V mAB E1-80. Например, антитело может содержать домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E1-80 и домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E1-80. Так, в некоторых аспектах, антитело может содержать домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E1-80 и домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E1-80. В конкретном примере выделенное антитело может содержать домены V и V, идентичные доменам моноклонального антитела E1-80.
H
H
H
L
L
L
В других аспектах выделенное антитело содержит последовательность CDR первой V, второй V, третьей V, первой V, второй V и третьей V на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную соответствующей последовательности CDR моноклонального антитела E1-89, которые представлены в SEQ ID NO: 22, 23, 24, 93, 94 и 95, соответственно. В одном аспекте выделенное антитело содержит последовательности CDR, которые идентичны последовательностям CDR моноклонального антитела E1-89.
H
H
H
L
L
L
H
H
L
L
H
H
L
L
H
L
В другом аспекте выделенное антитело содержит домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E1-89 (SEQ ID NO: 163) или гуманизированному домену VmAB E1-89; и домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E1-89 (SEQ ID NO: 164) или гуманизированному домену V mAB E1-89. Например, антитело может содержать домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E1-89 и домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E1-89. Так, в некоторых аспектах, антитело может содержать домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E1-89 и домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E1-89. В конкретном примере выделенное антитело может содержать домены V и V, идентичные доменам моноклонального антитела E1-89.
H
H
H
L
L
L
В других аспектах выделенное антитело содержит последовательность CDR первой V, второй V, третьей V, первой V, второй V и третьей V на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную соответствующей последовательности CDR моноклонального антитела E2-93, которые представлены в SEQ ID NO: 28, 29, 30, 99, 100 и 101, соответственно. В одном аспекте выделенное антитело содержит последовательности CDR, которые идентичны последовательностям CDR моноклонального антитела E2-93.
H
H
H
L
L
L
H
H
L
L
H
H
L
L
H
L
В другом аспекте выделенное антитело содержит домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E2-93 (SEQ ID NO: 165) или гуманизированному домену VmAB E2-93; и домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E2-93 (SEQ ID NO: 166) или гуманизированному домену V mAB E2-93. Например, антитело может содержать домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E2-93 и домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E2-93. Так, в некоторых аспектах, антитело может содержать домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E2-93 и домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E2-93. В конкретном примере выделенное антитело может содержать домены V и V, идентичные доменам моноклонального антитела E2-93.
H
H
H
L
L
L
В других аспектах выделенное антитело содержит последовательность CDR первой V, второй V, третьей V, первой V, второй V и третьей V на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную соответствующей последовательности CDR моноклонального антитела E1-38, которые представлены в SEQ ID NO: 34, 35, 36, 104, 100 и 105, соответственно. В одном аспекте выделенное антитело содержит последовательности CDR, которые идентичны последовательностям CDR моноклонального антитела E1-38.
H
H
H
L
L
L
H
H
L
L
H
H
L
L
H
L
В другом аспекте выделенное антитело содержит домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E1-38 (SEQ ID NO: 167) или гуманизированному домену VmAB E1-38; и домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E1-38 (SEQ ID NO: 168) или гуманизированному домену V mAB E1-38. Например, антитело может содержать домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E1-38 и домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E1-38. Так, в некоторых аспектах, антитело может содержать домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E1-38 и домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E1-38. В конкретном примере выделенное антитело может содержать домены V и V, идентичные доменам моноклонального антитела E1-38.
H
H
H
L
L
L
В других аспектах выделенное антитело содержит последовательность CDR первой V, второй V, третьей V, первой V, второй V и третьей V на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную соответствующей последовательности CDR моноклонального антитела E1-52, которые представлены в SEQ ID NO: 40, 41, 42, 108, 77 и 109, соответственно. В одном аспекте выделенное антитело содержит последовательности CDR, которые идентичны последовательностям CDR моноклонального антитела E1-52.
H
H
H
L
L
L
H
H
L
L
H
H
L
L
H
L
В другом аспекте выделенное антитело содержит домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E1-52 (SEQ ID NO: 169) или гуманизированному домену VmAB E1-52; и домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E1-52 (SEQ ID NO: 170) или гуманизированному домену V mAB E1-52. Например, антитело может содержать домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E1-52 и домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E1-52. Так, в некоторых аспектах, антитело может содержать домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E1-52 и домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E1-52. В конкретном примере выделенное антитело может содержать домены V и V, идентичные доменам моноклонального антитела E1-52.
H
H
H
L
L
L
В других аспектах выделенное антитело содержит последовательность CDR первой V, второй V, третьей V, первой V, второй V и третьей V на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную соответствующей последовательности CDR моноклонального антитела E2-36, которые представлены в SEQ ID NO: 46, 47, 48, 113, 83 и 114, соответственно. В одном аспекте выделенное антитело содержит последовательности CDR, которые идентичны последовательностям CDR моноклонального антитела E2-36.
H
H
H
L
L
L
H
H
L
L
H
H
L
L
H
L
В другом аспекте выделенное антитело содержит домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E2-36 (SEQ ID NO: 171) или гуманизированному домену VmAB E2-36; и домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E2-36 (SEQ ID NO: 172) или гуманизированному домену V mAB E2-36. Например, антитело может содержать домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E2-36 и домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E2-36. Так, в некоторых аспектах, антитело может содержать домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E2-36 и домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E2-36. В конкретном примере выделенное антитело может содержать домены V и V, идентичные доменам моноклонального антитела E2-36.
H
H
H
L
L
L
В других аспектах выделенное антитело содержит последовательность CDR первой V, второй V, третьей V, первой V, второй V и третьей V на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную соответствующей последовательности CDR моноклонального антитела E1-95, которые представлены в SEQ ID NO: 52, 53, 54, 117, 83, 119, соответственно. В одном аспекте выделенное антитело содержит последовательности CDR, которые идентичны последовательностям CDR моноклонального антитела E1-95.
H
H
H
L
L
L
H
H
L
L
H
H
L
L
H
L
В другом аспекте выделенное антитело содержит домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E1-95 (SEQ ID NO: 173) или гуманизированному домену V mAB E1-95; и домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E1-95 (SEQ ID NO: 174) или гуманизированному домену V mAB E1-95. Например, антитело может содержать домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E1-95 и домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E1-95. Так, в некоторых аспектах, антитело может содержать домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E1-95 и домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E1-95. В конкретном примере выделенное антитело может содержать домены V и V, идентичные доменам моноклонального антитела E1-95.
H
H
H
L
L
L
В других аспектах выделенное антитело содержит последовательность CDR первой V, второй V, третьей V, первой V, второй V и третьей V на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную соответствующей последовательности CDR моноклонального антитела E2-116, которые представлены в SEQ ID NO: 58, 59, 60, 121, 100 и 122, соответственно. В одном аспекте выделенное антитело содержит последовательности CDR, которые идентичны последовательностям CDR моноклонального антитела E2-116.
H
H
H
L
L
L
H
H
L
L
H
H
L
L
H
L
В другом аспекте выделенное антитело содержит домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E2-116 (SEQ ID NO: 175) или гуманизированному домену VmAB E2-116; и домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E2-116 (SEQ ID NO: 176) или гуманизированному домену V mAB E2-116. Например, антитело может содержать домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E2-116 и домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E2-116. Так, в некоторых аспектах, антитело может содержать домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E2-116 и домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E2-116. В конкретном примере выделенное антитело может содержать домены V и V, идентичные доменам моноклонального антитела E2-116.
H
H
H
L
L
L
В других аспектах выделенное антитело содержит последовательность CDR первой V, второй V, третьей V, первой V, второй V и третьей V на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную соответствующей последовательности CDR моноклонального антитела E2-135, которые представлены в SEQ ID NO: 64, 65, 66, 126, 127 и 128, соответственно. В одном аспекте выделенное антитело содержит последовательности CDR, которые идентичны последовательностям CDR моноклонального антитела E2-135.
H
H
H
L
L
L
H
H
L
L
H
H
L
L
H
L
В другом аспекте выделенное антитело содержит домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E2-135 (SEQ ID NO: 177) или гуманизированному домену VmAB E2-135; и домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E2-135 (SEQ ID NO: 178) или гуманизированному домену V mAB E2-135. Например, антитело может содержать домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E2-135 и домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E2-135. Так, в некоторых аспектах, антитело может содержать домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E2-135 и домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E2-135. В конкретном примере выделенное антитело может содержать домены V и V, идентичные доменам моноклонального антитела E2-135.
H
H
H
L
L
L
В других аспектах выделенное антитело содержит последовательность CDR первой V, второй V, третьей V, первой V, второй V и третьей V на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную соответствующей последовательности CDR моноклонального антитела E1-142, которые представлены в SEQ ID NO: 70, 71, 72, 131, 100 и 132, соответственно. В одном аспекте выделенное антитело содержит последовательности CDR, которые идентичны последовательностям CDR моноклонального антитела E1-142.
H
H
H
L
L
L
H
H
L
L
H
H
L
L
H
L
В другом аспекте выделенное антитело содержит домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E1-142 (SEQ ID NO: 179) или гуманизированному домену VmAB E1-142; и домен V на по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичный домену V E1-142 (SEQ ID NO: 180) или гуманизированному домену V mAB E1-142. Например, антитело может содержать домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E1-142 и домен V на по меньшей мере 95% идентичный домену V гуманизированного mAB E1-142. Так, в некоторых аспектах, антитело может содержать домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E1-142 и домен V идентичный домену V гуманизированного mAB E1-142. В конкретном примере выделенное антитело может содержать домены V и V, идентичные доменам моноклонального антитела E1-142.
В некоторых аспектах антитело по вариантам осуществления может представлять собой IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), IgM, IgA, генетически модифицированный изотип IgG, или их антигенсвязывающий фрагмент. Антитело может представлять собой Fab', F(ab')2, F(ab')3, моновалентный scFv, бивалентный scFv, биспецифическое или однодоменное антитело. Антитело может представлять собой антитело человека, гуманизированное или деиммунизированное антитело. В другом аспекте выделенное антитело представляет собой антитело E1-33, E1-34, E1-80, E1-89, E2-93, E1-38, E1-52, E2-36, E1-95, E2-116, E2-135, или E1-142.
В некоторых аспектах антитело может быть конъюгировано с визуализирующим агентом, химиотерапевтическим агентом, токсином или радионуклидом. В конкретных аспектах антитело может быть конъюгировано с ауристатином или с монометилауристатином E (MMAE), в частности.
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
В некоторых вариантах осуществления предложен рекомбинантный полипептид, содержащий домен V антитела, содержащий CDR 1-3 домена V E1-33 (SEQ ID NO: 4, 5 и 6); CDR 1-3 домена V E1-34 (SEQ ID NO: 10, 11 и 12); CDR 1-3 домена V E1-80 (SEQ ID NO: 16, 17 и 18); CDR 1-3 домена V E1-89 (SEQ ID NO: 22, 23 и 24); CDR 1-3 домена V E2-93 (SEQ ID NO: 28, 29 и 30); CDR 1-3 домена V E1-38 (SEQ ID NO: 34, 35 и 36); CDR 1-3 домена V E1-52 (SEQ ID NO: 40, 41 и 42); CDR 1-3 домена V E2-36 (SEQ ID NO: 46, 47 и 48); CDR 1-3 домена V E1-95 (SEQ ID NO: 52, 53 и 54); CDR 1-3 домена V E2-116 (SEQ ID NO: 58, 59 и 60); CDR 1-3 домена V E2-135 (SEQ ID NO: 64, 65 и 66) или CDR 1-3 домена V E1-142 (SEQ ID NO: 70, 71 и 72). В других вариантах осуществления предложен рекомбинантный полипептид, содержащий домен V антитела, содержащий CDR 1-3 домена V E1-33 (SEQ ID NO: 76, 77 и 78); CDR 1-3 домена V E1-34 (SEQ ID NO: 82, 83 и 84); CDR 1-3 домена V E1-80 (SEQ ID NO: 88, 77 и 89); CDR 1-3 домена V E1-89 (SEQ ID NO: 93, 94 и 95); CDR 1-3 домена V E2-93 (SEQ ID NO: 99, 100 и 101); CDR 1-3 домена V E1-38 (SEQ ID NO: 104, 100 и 105); CDR 1-3 домена V E1-52 (SEQ ID NO: 108, 77 и 109); CDR 1-3 домена V E2-36 (SEQ ID NO: 83, 83 и 114); CDR 1-3 домена V E1-95 (SEQ ID NO: 117, 83 и 118); CDR 1-3 домена V E2-116 (SEQ ID NO: 121, 100 и 122); CDR 1-3 домена V E2-135 (SEQ ID NO: 126, 127 и 128) или CDR 1-3 домена V E1-142 (SEQ ID NO: 131, 100 и 132).
H
L
В некоторых вариантах осуществления предложена выделенная молекула полинуклеотида, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело или полипептид, содержащий домен V или V антитела, описанный в данном документе.
В других вариантах осуществления предложена клетка-хозяин, которая продуцирует моноклональное антитело или рекомбинантный полипептид согласно вариантам осуществления. В некоторых аспектах клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, клетку дрожжей, клетку бактерий, клетку Ресничных или клетку насекомых. В некоторых аспектах клетка-хозяин представляет собой клетку гибридомы.
L
H
В других вариантах осуществления предложен способ получения антитела по данному изобретению, включающий экспрессию одной или более полинуклеотидных молекул, кодирующих цепь V или V антител, раскрытого в данном документе в клетке и очищение антитела от клетки.
В дополнительных вариантах осуществления существуют фармацевтические композиции, содержащие антитело или фрагмент антитела, как обсуждалось в данном документе. Такая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель и может содержать или не содержать дополнительные активные ингредиенты.
В вариантах осуществления данного изобретения предложен способ лечения субъекта, имеющего рак, включающий введение эффективного количества описанного в данном документе антитела. В некоторых аспектах антитело представляет собой моноклональное антитело по вариантам осуществления данного изобретения, такое как антитело E1-33, E1-34, E1-80, E1-89, E2-93, E1-38, E1-52, E2-36, E1-95, E2-116, E2-135 или E1-142 или рекомбинантный полипептид, содержащий сегмент антитела, полученный из него.
В некоторых аспектах рак представляет собой рак молочной железы, рак легкого, рак головы и шеи, рак предстательной железы, рак пищевода, рак трахеи, рак мозга, рак печени, рак мочевого пузыря, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак яичников, рак матки, рак шейки матки, рак яичек, рак толстой кишки, рак прямой кишки или рак кожи. В конкретных аспектах рак представляет собой эпителиальный рак. В других аспектах рак может представлять собой колоректальную аденокарциному, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак молочной железы, гепатоцеллюлярную карциному, рак яичников, светлоклеточную карциному почек, рак легкого или рак почки.
В одном аспекте антитело можно вводить системно. В дополнительном аспекте антитело можно вводить внутривенно, внутрикожно, внутриматочно, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно или применяют местно. Способ может дополнительно включать применение по меньшей мере второй противораковой терапии к субъекту. Примеры второй противораковой терапии включают, но не ограничиваются ими, хирургическую терапию, химиотерапию, лучевую терапию, криотерапию, гормональную терапию, иммунотерапию или цитокиновую терапию.
В дальнейших аспектах способ может дополнительно включать введение композиции по данному изобретению более одного раза субъекту, такое как, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или более раз.
В других вариантах осуществления предложен способ обнаружения рака у субъекта, включающий тестирование на наличие повышенного EGFL6 относительно контроля в образце от субъекта, причем тестирование включает приведение образца в контакт с антителом, раскрытым в данном документе. Например, способ можно осуществлять in vitro или in vivo.
Некоторые варианты осуществления направлены на антитело или рекомбинантную полипептидную композицию, содержащую выделенное и/или рекомбинантное антитело или полипептид, которое специфически связывает EGFL6. В некоторых аспектах антитело или полипептид имеет последовательность, которая составляет, по меньшей мере на, или не более чем на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична (или любой диапазон, в пределах данных значений) ко всему или части любого моноклонального антитела, представленного в данном документе. В еще одном аспекте выделенное и/или рекомбинантное антитело или полипептид имеет, по меньшей мере, или не более чем 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или более смежных аминокислот из любой из представленных в данном документе последовательностей или комбинацию таких последовательностей.
В еще одном аспекте антитело или полипептид согласно вариантам осуществления содержит один или более аминокислотных сегментов любой из аминокислотных последовательностей, раскрытых в данном документе. Например, антитело или полипептид могут содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более сегментов аминокислот, содержащих, по меньшей мере, или не более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 к 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 или 200 аминокислот в длину, включая все значения и диапазоны между ними, которые являются по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичными любой из аминокислотных последовательностей, раскрытых в данном документе. В некоторых аспектах аминокислотные сегмент(ы) выбирают из одной из аминокислотных последовательностей EGFL6-связывающего антитела, как указано в данном документе.
В еще одном аспекте антитело или полипептид согласно вариантам осуществления содержит аминокислотный сегмент любой из аминокислотных последовательностей, раскрытых в данном документе, причем сегмент начинается в аминокислотном положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 к 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 или 200 в любой последовательности, указанной в данном документе, и заканчивается в аминокислотном положении 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 к 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 или 200 в той же предложенной последовательности. В некоторых аспектах аминокислотные сегмент(ы), или их части, выбирают из одной из аминокислотных последовательностей EGFL6-связывающего антитела, как указано в данном документе.
В еще нескольких аспектах антитело или полипептид согласно вариантам осуществления содержит аминокислотный сегмент, который является по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичным (или любой диапазон, в пределах данных значений) домену V, VJ, VDJ, D, DJ, J или CDR EGFL6-связывающего антитела (как указано в таблицах 1 и 2). Например, полипептид может содержать 1, 2 или 3 аминокислотных сегмента, которые по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны (или любой диапазон, в пределах данных значений) CDR 1, 2 и/или 3 EGFL6-связывающего антитела, как указано в таблицах 1 и 2.
Варианты осуществления, обсуждаемые в контексте способов и/или композиций согласно изобретению, могут быть использованы в отношении любого другого способа или композиции, описанных в данном документе. Таким образом, вариант осуществления, относящийся к одному способу или композиции, может быть применен и к другим способам и композициям изобретения.
Используемые в данном документе определения в единственном числе могут означать один или более. Используемые в формуле изобретения данного документа определения в единственном числе вместе с термином «содержать» могут означать один или более.
Использование термина «или» в формуле изобретения используется для обозначения «и/или», если явно не указано только на альтернативы, или альтернативы являются взаимоисключающими, хотя описание поддерживает определение, которое относится только к альтернативам и «и/или». Используемый в данном документе термин «другой» может означать, по меньшей мере, второй или более.
Во всем объеме данной заявки термин «около» используется для обозначения того, что значение включает в себя неотъемлемую вариацию ошибки для устройства, способа, используемого для определения значения, или вариацию, существующую среди субъектов исследования.
Другие цели, признаки и преимущества данного изобретения станут очевидными из следующего подробного описания. Следует, однако, понимать, что подробное описание и конкретные примеры с указанием предпочтительных вариантов осуществления изобретения приведены только для иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в рамках сущности и объема изобретения станут очевидными для специалистов в данной области техники из данного подробного описания.
Краткое описание графических материалов
Следующие фигуры являются частью данного описания и включены для дальнейшей демонстрации определенных аспектов данного изобретения. Изобретение может быть лучше понято посредством ссылки на одну или более из этих фигур в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов осуществления, представленных в данном документе. Патент или файл приложения содержат по меньшей мере одну фигуру, выполненную в цвете. Копии данного патента или публикации патентной заявки с цветными фигурами будут предоставлены Оффисом по запросу и с оплатой необходимой пошлины.
Фиг. 1. Схематическая диаграмма, иллюстрирующая принципы работы ADC (конъюгат антитело-лекарственное средство). После связывания с его целевым антигеном комплекс MAb-антиген интернализуется в эндосомы, которые затем сливается с лизосомами, где MAb деградирует и лекарственное средство высвобождается.
Фиг. 2. Обнаружение антител с высоким связыванием EGFL6 с помощью ИФА. Белок EGFL6 (Sino Biologicals) человека (левые столбцы) или мыши (правые столбцы) наносили на 96-луночные высокосвязывающие планшеты в течение ночи при 4°C в PBS. Супернатанты культуры B-клеток (5 мкл среды и 95 мкл PBS) добавляли для связывания с антигеном EGFL6, нанесенным на планшеты. Связанное антитело было обнаружено с использованием вторичного антитела против IgG кроликов, конъюгированного с HRP (пероксидазой хрена) и субстратом TMB (тетраметилбензидиновый субстрат). Эксперименты повторяли 2 раза для подтверждения.
Фиг. 3. Определение аффинности связывания антител EGFL6 в ИФА. Ряд концентраций антител анализировали в ИФА, и для определения аффинности связывания антител использовали 4-параметрическое приближение. Эксперименты имеют 3 повтора, а планки погрешностей обозначают стандартное отклонение.
Фиг. 4A-D. EGFL6 активируется в эндотелиальных клетках, ассоциированных с опухолью, но не в нормальной ткани и заживающей раневой ткани яичника. A) Общая схема выделения эндотелиальных клеток. B) Генный микрочип эндотелиальных клеток из нормального яичника, заживающей раневой ткани и эндотелиальных клеток, ассоциированных с опухолью яичника. C) Экспрессия EGFL6, CD31 и VEGF у пациентов с раком яичников. D) Проверка данных микрочипов гена с использованием Q-RT ПЦР. Шкала=100 мкм.
Фиг. 5A-H. Сайленсинг гена EGFL6 не ухудшал заживление ран, а уменьшал нагрузку на опухоль в ортотопической модели рака яичника мыши A2780ip2. A) Экспрессия EGFL6 в дермальных эндотелиальных клетках, обработанных siControl (сайленсинг, контроль) и siEGFL6 (сайленсинг, EGFL6). B) Влияние сайленсинга EGFL6 на заживление ран in vitro. C) Гистограмма представляет собой область заживления ран. D) Влияние сайленсинга EGFL6 на заживление ран E) объем раны F) Репрезентативные изображения опухолевой массы G) масса опухоли и H) опухолевые узлы.
Фиг. 6A-K. TWIST1 индуцирует экспрессию EGFL6 при гипоксии. A,B) EGFL6 репортерный анализ промотора при нормоксии и гипоксическом состоянии. C) TWIST1 увеличивает экспрессию EGFL6 при гипоксическом состоянии. D) TWIST1 связывается с промоторной областью EGFL6. E и F) Эктопическая экспрессия TWIST1 увеличивает экспрессию EGFL6 в клетках RF24. G) ChIP-анализ связывания TWIST1 с промоторной областью EGFL6 при гипоксии по сравнению с нормоксией. EGFL6 и ChIP-анализ связывания TWIST1 с промотором EGFL6 в эндотелиальных клетках яичника человека (RF24). Поперечно сшитый хроматин из клеток RF24, обработанных TWIST1, и иммунопреципитированных с помощью контрольных антител EGFL6 или IgG. Входную и иммунопреципитированную ДНК подвергали ПЦР с использованием праймеров, соответствующих парам оснований, перед сайтом начала транскрипции EGFL6. Продукты ПЦР исследовали на агарозном геле, окрашенном этидиумбромидом. H) Загрязнение гена EGFL6 с использованием миРНК приводит к увеличению гибели клеток в состоянии гипоксии. I) Ишемия конечностей. После артериального лигирования бедренную артерию вырезали и мышей разделяли на 3 группы (n=5): нормальная, ишемия-24 ч и ишемия-96 ч. Поток крови контролировали до и после лигирования артерии бедренной кости с использованием последовательного лазерного допплера. В каждый момент времени ткань собирали и замораживали для проведения иммунофлуоресценции. J,K) экспрессия EGFL6 была увеличена в эндотелиальных клетках при ишемическом (гипоксическом) состоянии по сравнению с нормальным состоянием.
Фиг. 7A-K. Обработка эндотелиальных клеток EGFL6 активирует сигналинг киназа PI3/AKT. A) Анализ RPPA в контроле и обработанных EGFL6 клетках RF24. B) Вестерн-блоттинг EGFL6-опосредованной активации сигналинга киназа PI3/AKT. C) Вестерн-блоттинг EGFL6-опосредованной активации рецепторов IGF-R, EGFR и Tie2. D) Tie2-антитела, осаждающие интегриновые белки. E) путь сигнала Tie2 и AKT в цитозоле и мембранные фракционированные белки. F) путь сигнала Tie2 и AKT в клетках RF24, обработанных siITGB1 и siTie2.G, H) Сайленсинг интегрина и Tie2 с использованием специфических миРНК уменьшает EGFL6-опосредованное образование трубки (G) и миграцию (H) в эндотелиальных клетках. I) RGD-блокирующий пептид уменьшает связанный с интегрином сигнальный путь J) миграция K) и образование трубки в эндотелиальных клетках.
Фиг. 8A-G. Функциональное блокирующее антитело EGFL6 уменьшает ангиогенез и рост опухоли. A) Линейная диаграмма представляет собой аффинность связывания антитела. B) Эффект EGFL6-блокирующих антител на активацию Tie2/AKT в клетках RF24. Контроль, рабочая концентрация mAb93 и mAb135 составляет 10 мкг/мл. C) Эффект EGFL6 блокирующих антител в анализе заживления ран с дермальными эндотелиальными клетками. D) Эффект EGFL6-блокирующих антител на образование трубки и E) миграцию в клетках RF24. F) Эффект EGFL6-блокирующих антител на массу опухолей, опухолевые узлы мышей-носителей опухоли SKOV3ip1. G) Экспрессия Ki67 и CD31 продемонстрировала пролиферацию клеток и плотность сосудов. Через семь дней после инъекции опухолевых клеток мышей случайным образом делили на три группы (10 мышей/группа) для приема терапии: (1) Контрольное АТ (5 мг/кг), (2) АТ EGFL6 93 (5 мг/кг) и (3) АТ EGFL6 135 (5 мг/кг). Антитело давали один раз в неделю. Опухоли собирали, как описано в примерах в данном документе. Раны наносили и опухоли собирали, как описано в примерах в данном документе. Планки погрешностей обозначают SEM (стандартную ошибку среднего значения). *P<0,05 против контрольного АТ.
ФИГ. 8H. Ингибирование образования трубок эндотелиальных клеток (RF24) антителами EGFL6. Антитела (концентрация 5 мкг/мл) добавляли к культуре клеток (RF24) по сравнению с контрольным антителом. Количество пробирок подсчитывали после 48-часовой обработки в 96-луночном аналитическом планшете. ФИГ. 8H демонстрирует представителя для каждой группы, а гистограмма иллюстрирует среднее количество трубок в каждой обработанной группе. Планки погрешностей обозначают стандартную ошибку, а n=3.
f/f
Фиг. 9A-C. Создание нокаутных мышей Tie2-cre; EGFL6. A) Создание нокаутных мышей Tie2 cre; EGFL6. B) экспрессия CD31 в изолированной эндотелиальной клетке с однопометной и нокаутной мышью EGFL6. C) экспрессия EGFL6 в выделенных эндотелиальных клетках.
Фиг. 9D-G. Сайленсинг гена EGFL6 уменьшает опухолевую нагрузку и ангиогенез в ортотопической модели яичника мыши SKOV3ip1. D) Экспрессия EGFL6 в различных раковых клетках яичников. E, F) Эффекты эндотелиальной клетки (миРНК mEGFL6) или опухоли (миРНК hEGFL6) на которые нацелены миРНК EGFL6 на массу опухоли и опухолевые узлы в ортотопической модели рака яичника мыши SKOV3ip1. Через семь дней после инъекции опухолевых клеток мышей случайным образом делили на четыре группы (10 мышей/группа) для приема терапии: (1) Контрольная миРНК, (2) миРНК mEGFL6, (3) миРНК hEGFL6 (4) миРНК mEGFL6+миРНК hEGFL6. Мышей умерщвляли, когда все животные в группе контроля или лечения становились агонирующими (после 3-4 недель терапии) и записывали массу опухоли (E) и количество опухолевых узлов (F). Планки погрешностей обозначают SEM. G) Эффект целевых миРНК EGFL6 на пролиферацию и плотность микрососудов. Собранные опухоли окрашивали на пролиферацию Ki67 и CD31. Шкала=50 мкм. Столбцы на графиках последовательно соответствуют помеченным колонкам изображений слева. Планки погрешностей обозначают SEM.
Фиг. 10A-E. EGFL6 регулирует ангиогенез опухоли. A) Нормальный яичник человека, опухоль яичников и заживающие раневые ткани были диссоциированы, а выделенные эндотелиальные клетки и образцы были обработаны для микрочипов. B) Экспрессия VEGF в образцах нормального яичника человека, раны и опухолей яичников. C), D), E) Клетки RF24, обработанные контрольной миРНК и миРНК EGFL6 и охарактеризованные в отношении формирования и миграция трубок. Типичные изображения сосудистой сети яичников человека с низким или высоким иммуногистохимическим окрашиванием на EGFL6. Шкала=200 мкм. Планки погрешностей обозначают SEM (стандартную ошибку среднего значения). *p<0,05 против контрольной миРНК.
Фиг. 11A-B. Животных лечили либо контрольной миРНК-CH, либо миРНК-CH mEGFL6 с ранением или без него. Собранные опухоли окрашивали на Ki67 (пролиферация) и CD31 (микрососуды). Планки погрешностей обозначают SEM.
Фиг. 12A-D. Обработка эндотелиальных клеток EGFL6 активирует сигналинг PI3K/AKT. A) Представление тепловой карты анализа RPPA, демонстрирующее изменение экспрессии белка в контрольных эндотелиальных клетках и эндотелиальных клетках RF24, обработанных EGFL6. A) Представление тепловой карты анализа RPPA, демонстрирующее изменение экспрессии белка в контрольных клетках яичника и клетках яичника RMG2, обработанных EGFL6. C), D) EGFL6-опосредованная миграция и образование трубок (нижняя панель) уменьшаются ингибированием PI3K в эндотелиальных клетках.
Описание иллюстративных вариантов осуществления
EGFL6 представляет собой член повторного надсемейства EGF (эпидермального фактора роста), который участвует в заживлении ран. Тем не менее, повышенный EGFL6 также был обнаружен в различных типах раковых клеток, таких как рак яичника и рак легкого. Исследования в данном документе демонстрируют, что ингибирование активности EGFL6 эффективно для ингибирования пролиферации раковых клеток и ангиогенеза в опухолевых тканях. Более того, EGFL6-связывающие антитела, представленные в данном документе, оказались эффективными для ингибирования активности EGFL6 и роста раковых клеток. Таким образом, антитела в вариантах осуществления обеспечивают новые эффективные способы лечения рака и ингибирования ангиогенеза.
I. Антитела по вариантам осуществления
В некоторых вариантах осуществления предложено антитело или его фрагмент, который связывается, по меньшей мере, с частью белка EGFL6 и ингибирует сигналинг EGFL6 и пролиферацию раковых клеток. Используемый в данном документе термин «антитело» предназначен для широкого определения любого иммунологического связывающего агента, такого как IgG, IgM, IgA, IgD, IgE и генетически модифицированный IgG, а также полипептидов, содержащих домены CDR антитела, которые сохраняют антигенсвязывающую активность. Антитело может быть выбрано из группы, состоящей из химерного антитела, антитела с созревшей аффинностью, поликлонального антитела, моноклонального антитела, гуманизированного антитела, антитела человека или антигенсвязывающего фрагмента антитела, или природного, или синтетического лиганда. Предпочтительно антитело против EGFL6 представляет собой моноклональное антитело или гуманизированное антитело.
Таким образом, известными способами и, как описано в данном документе, могут быть созданы поликлональные или моноклональные антитела, фрагменты антитела и связывающие домены и CDR (включая модифицированные формы любого из вышеперечисленного), которые являются специфичными по отношению к белку EGFL6, одному или более его соответствующим эпитопам, или конъюгатам любого из вышеперечисленных, независимо от того, выделены ли такие антигены или эпитопы из природных источников или являются синтетическими производными или вариантами природных соединений.
L
H
L
H1
H
H1
L
H
H
H
L
H
L
[0001] Примеры фрагментов антител, пригодных для данных вариантов осуществления, включают, без ограничения: (i) фрагмент Fab, состоящий из доменов V, V, C, и C; (ii) фрагмент ʺFdʺ, состоящий из доменов V и C; (iii) фрагмент ʺFvʺ, состоящий из доменов V и V одного антитела; (iv) фрагмент ʺdAbʺ, который состоит из домена V; (v) выделенные области CDR; (vi) фрагменты F(ab')2 - бивалентный фрагмент, содержащий два связанных фрагмента Fab; (vii) одноцепочечные молекулы Fv (ʺscFvʺ), в которых домен V и домен V связаны пептидным линкером, что позволяет двум доменам связываться для формирования связывающего домена; (viii) биспецифические одноцепочечные димеры Fv (см. патент США № 5091513); и (ix) диатела - мультивалентные или мультиспецифические фрагменты, сконструированные путем слияния генов (публикация заявки на патент США 20050214860). Молекулы Fv, scFv или диател могут быть стабилизированы путем введения дисульфидных мостиков, связывающих домены V и V. Также могут быть созданы минитела, содержащие scFv присоединенный к домену CH3 (Hu et al., 1996).
[0002] Антителоподобные связывающие пептидомиметики также рассматриваются в вариантах осуществления. Liu et al. (2003) описывают «антителоподобные связывающие пептидомиметики» (ABiPs), которые представляют собой пептиды, которые действуют как урезанные антитела и обладают определенными преимуществами более длительного периода полувыведения в сыворотке, а также менее громоздкими способами синтеза.
[0003] Животные могут быть инокулированы антигеном, таким как белок внеклеточного домена EGFL6 (ECD), для получения антител, специфичных к белку EGFL6. Часто антиген связывают или конъюгируют с другой молекулой для усиления иммунного ответа. Используемый в данном документе конъюгат представляет собой любой пептид, полипептид, белок или небелковое вещество, связанное с антигеном, который используется для вызывания иммунного ответа у животного. Антитела, продуцируемые животным в ответ на антигенную инокуляцию, включают множество неидентичных молекул (поликлональных антител), полученных из множества индивидуальных антител, продуцируемых В-лимфоцитами. Поликлональное антитело представляет собой смешанную популяцию видов антител, каждое из которых может распознавать разный эпитоп на одном и том же антигене. Учитывая правильные условия для получения поликлональных антител у животного, большинство антител в сыворотке животного распознают коллективные эпитопы на антигенном соединении, которым иммунизировали животное. Эта специфичность дополнительно усиливается с помощью аффинной очистки для отбора только тех антител, которые распознают интересующий антиген или эпитоп.
[0004] Моноклональное антитело представляет собой единственный вид антитела, в котором каждая молекула антитела распознает один и тот же эпитоп, потому что все клетки, продуцирующие антитела, получены из одной линии клеток В-лимфоцитов. Способы получения моноклональных антител (MAb) обычно начинаются также, как и способы получения поликлональных антител. В некоторых вариантах осуществления грызуны, такие как мыши и крысы, используются для создания моноклональных антител. В некоторых вариантах осуществления клетки кролика, овец или лягушек используют для получения моноклональных антител. Использование крыс хорошо известно и может дать определенные преимущества. Мышей (например, мышей BALB/c) обычно используют и они обычно обеспечивают высокий процент стабильных слияний.
[0005] Технология гибридомы включает слияние одного В-лимфоцита от мыши, ранее иммунизированной антигеном EGFL6, с клеткой бессмертной миеломы (обычно миеломой мышей). Эта технология обеспечивает способ размножения одной клетки, продуцирующей антитело, на неопределенное количество поколений, так что может быть получено неограниченное количество структурно идентичных антител, имеющих такую же антигенную или эпитопную специфичность (моноклональные антитела).
В-клетки плазмы (CD45+CD5-CD19+) могут быть выделены из свежеприготовленных мононуклеарных клеток периферической крови кроликов иммунизированных кроликов и дополнительно отобраны на клетки, связывающие EGFL6. После обогащения антител, продуцирующих В-клетки, можно выделить суммарную РНК и синтезировать кДНК. Последовательности ДНК вариабельных областей антитела как из тяжелых цепей, так и из легких цепей могут быть амплифицированы, сконструированы в вектор экспрессии Fab на основе фагового дисплея и трансформированы в E.coli. Специфическое связывание EGFL6 Fab может быть выбрано путем сквозного пэнинга в несколько раундов и секвенирования. Отобранные EGFL6-связывающие домены могут быть экспрессированы в виде полноразмерных IgG кролика и химерных форм IgG кролика/человека с использованием векторной системы экспрессии млекопитающих в клетках эмбриональной почки человека (HEK293) (Invitrogen) и очищены с использованием смолы белка G с быстрой белковой жидкостной хроматографией (FPLC).
[0006] В одном варианте осуществления антитело представляет собой химерное антитело, например, антитело, содержащее антигенсвязывающие последовательности от донора, отличного от человека, присоединенные к гетерологичной нечеловеческой, человеческой или гуманизированной последовательности (например, каркасные последовательности и/или последовательности константного домена). Методы были разработаны для замены константных доменов легкой и тяжелой цепи моноклонального антитела на аналогичные домены человеческого происхождения, оставляя неповрежденные вариабельные области чужеродного антитела. Альтернативно, «полностью человеческие» моноклональные антитела продуцируются у мышей, трансгенных в отношении генов иммуноглобулина человека. Также были разработаны способы превращения вариабельных доменов моноклональных антител в более человеческую форму путем рекомбинантного конструирования вариабельных доменов антитела, имеющих как аминокислотную последовательность грызунов, например, мыши, так и аминокислотную последовательность человека. В «гуманизированных» моноклональных антителах только гипервариабельный CDR получают из моноклональных антител мыши, а каркас и константные области получают из аминокислотных последовательностей человека (см. патенты США № 5091513 и 6881557). Считается, что замена аминокислотных последовательностей в антителе, которые характерны для грызунов на аминокислотные последовательности, обнаруженные в соответствующем положении антител человека, уменьшит вероятность неблагоприятной иммунной реакции во время терапевтического использования. Гибридома или другая клетка, продуцирующая антитело, также могут быть подвергнуты генетической мутации или другим изменениям, которые могут или не могут изменять специфичность связывания антител, продуцируемых гибридомой.
[0007] Способы получения поликлональных антител у разных видов животных, а также получения моноклональных антител разных типов, в том числе гуманизированных, химерных и полностью человеческих, хорошо известны в данной области техники и весьма предсказуемы. Например, следующие патенты США и заявки на патент предоставляют возможность описания таких методов: заявки на патент США № 2004/0126828 и 2002/0172677; и патенты США № 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4196265; 4275149; 4277437; 4366241; 4469797; 4472509; 4606855; 4703003; 4742159; 4767720; 4816567; 4867973; 4938948; 4946778; 5021236; 5164296; 5196066; 5223409; 5403484; 5420253; 5565332; 5571698; 5627052; 5656434; 5770376; 5789208; 5821337; 5844091; 5858657; 5861155; 5871907; 5969108; 6054297; 6165464; 6365157; 6406867; 6709659; 6709873; 6753407; 6814965; 6849259; 6861572; 6875434 и 6891024. Все патенты, публикации заявок на патент и другие публикации, приводимые в данном документе и в указанных документах, включены в данный документ посредством ссылки.
[0008] Антитела могут быть получены из любого источника животных, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительно, антитела являются овечьими, мышиными (например, мышь и крыса), кроличьими, козьими, антителами морской свинки, верблюжьими, лошадиными или куриными. Кроме того, более новая технология позволяет разработку и скрининг антител человека из библиотек комбинаторных антител человека. Например, бактериофаговая технология экспрессии антител позволяет получать специфические антитела в отсутствие иммунизации животных, как описано в патенте США № 6946546, который включен в данный документ посредством ссылки. Эти методики дополнительно описаны в: Marks (1992); Stemmer (1994); Gram et al. (1992); Barbas et al. (1994) и Schier et al. (1996).
[0009] Ожидается, что антитела к EGFL6 будут обладать способностью нейтрализовать или противодействовать эффектам EGFL6 независимо от вида животных, линии моноклональных клеток или другого источника антитела. Некоторые виды животных могут быть менее предпочтительными для создания терапевтических антител, поскольку они могут более вероятно вызывать аллергический ответ за счет активации системы комплемента через часть «Fc» антитела. Однако цельные антитела можно ферментативно обработать до фрагмента «Fc» (кристаллизующийся фрагмент) и до фрагментов антител, имеющих связывающий домен или CDR. Удаление Fc-части уменьшает вероятность того, что антигенный фрагмент антитела вызовет нежелательный иммунологический ответ, и, таким образом, антитела без Fc могут быть предпочтительными для профилактических или терапевтических процедур. Как описано выше, антитела также могут быть сконструированы так, чтобы быть химерными или частично или полностью человеческими, с тем чтобы уменьшить или устранить неблагоприятные иммунологические последствия, возникающие в результате введения животному антитела, которое было продуцировано или имеет последовательности от других видов.
[0010] Варианты замещения обычно содержат замену одной аминокислоты на другую в одном или более сайтах внутри белка и могут быть сконструированы для модуляции одного или более свойств полипептида с потерей других функций или свойств или без них. Замены могут быть консервативными, то есть одна аминокислота заменяется другой, имеющей похожую форму и заряд. Консервативные замены хорошо известны в данной области техники и включают, например, замены: аланина на серин; аргинина на лизин; аспарагина на глутамин или гистидин; аспартата на глутамат; цистеина на серин; глутамина на аспарагин; глутамата на аспартат; глицина на пролин; гистидина на аспарагин или глутамин; изолейцина на лейцин или валин; лейцина на валин или изолейцин; лизина на аргинин; метионина на лейцин или изолейцин; фенилаланина на тирозин, лейцин или метионин; серина на треонин; треонина на серин; триптофана на тирозин; тирозина на триптофан или фенилаланин; и валина на изолейцин или лейцин. Альтернативно, замены могут быть неконсервативными, так что затрагивается функция или активность полипептида. Неконсервативные замены обычно включают замещение остатка тем, который является химически несходным, таким как полярная или заряженная аминокислота для неполярной или незаряженной аминокислоты и наоборот.
[0011] Белки могут быть рекомбинантными или синтезированными in vitro. Альтернативно, из бактерий можно выделить нерекомбинантный или рекомбинантный белок. Также предполагается, что бактерии, содержащие такой вариант, могут быть реализованы в композициях и способах. Следовательно, белок не нужно выделять.
[0012] Предполагается, что в композициях содержится от около 0,001 мг до около 10 мг общего полипептида, пептида и/или белка на мл. Таким образом, концентрация белка в композиции может быть примерно равной, по меньшей мере, около или не более чем 0,001, 0,010, 0,050, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0 мг/мл или более (или любой возможный в данном случае диапазон). Из этого, около, по меньшей мере около или не более чем около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% может представлять собой антитело, которое связывает EGFL6.
[0013] Антитело или предпочтительно иммунологическая часть антитела могут быть химически конъюгированы или экспрессированы как слитый белок с другими белками. Для целей данного описания и прилагаемой формулы изобретения все такие слитые белки включены в определение антител или иммунологической части антитела.
[0014] В вариантах осуществления предложены антитела и антителоподобные молекулы против EGFL6, полипептиды и пептиды, которые связаны, по меньшей мере, с одним агентом с образованием конъюгата антитела или нагруженного антитела. Чтобы повысить эффективность молекул антител в качестве диагностических или терапевтических агентов, общепринято связывать или ковалентно связывать или образовывать комплекс с по меньшей мере одной желаемой молекулой или фрагментом. Такая молекула или фрагмент может быть, но не ограничивается, по меньшей мере одной эффекторной или репортерной молекулой. Эффекторные молекулы включают молекулы, имеющие желаемую активность, например, цитотоксическую активность. Неограничивающие примеры эффекторных молекул, которые были присоединены к антителам, включают токсины, терапевтические ферменты, антибиотики, радиомеченые нуклеотиды и тому подобное. Напротив, репортерная молекула определяется как любая часть, которая может быть обнаружена с использованием анализа. Неограничивающие примеры молекул-репортеров, которые были конъюгированы с антителами, включают ферменты, радиоактивные метки, гаптены, флуоресцентные метки, фосфоресцирующие молекулы, хемилюминесцентные молекулы, хромофоры, люминесцентные молекулы, молекулы фотоаффинности, красящие частицы или лиганды, такие как биотин.
[0015] В данной области техники известно несколько способов присоединения или конъюгации антитела к его конъюгатной части. Некоторые способы прикрепления включают использование хелатного комплекса металла, использующего, например, органический хелатирующий агент, такой как ангидрид диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA); этилентриаминтетрауксусная кислота; N-хлор-п-толуолсульфонамид; и/или тетрахлор-3-6α-дифенилгликурид-3, присоединенный к антителу. Моноклональные антитела также могут быть подвергнуты взаимодействию с ферментом в присутствии связующего агента, такого как глутаральдегид или периодат. Конъюгаты с флуоресцеиновыми маркерами получают в присутствии этих связующих агентов или путем взаимодействия с изотиоцианатом.
II. Лечение заболеваний
[0016] Некоторые аспекты данных вариантов осуществления могут быть использованы для предотвращения или лечения заболевания или расстройства, связанного с сигналингом EGFL6. Сигналинг EGFL6 может быть уменьшен с помощью любых пригодных препаратов для предотвращения пролиферации раковых клеток. Предпочтительно такие вещества представляют собой антитело против EGFL6.
[0017] «Лечение» и «лечить» относятся к введению или применению терапевтического агента к субъекту или выполнению процедуры или способа воздействия на субъекта с целью получения терапевтического улучшения состояния заболевания или состояния здоровья. Например, лечение может включать введение фармацевтически эффективного количества антитела, которое ингибирует сигналинг EGFL6.
[0018] «Субъект» и «пациент» относятся к человеку или не являются человеком, например, относятся к приматам, млекопитающим и позвоночным. В конкретных вариантах осуществления субъект представляет собой человека.
[0019] Термин «терапевтическая выгода» или «терапевтически эффективный», используемый во всей данной заявке, относится ко всему, что способствует или повышает благополучие субъекта в отношении медицинского лечения данного состояния. Это включает, без ограничения, снижение частоты или тяжести признаков или симптомов заболевания. Например, лечение рака может включать, например, уменьшение размера опухоли, снижение инвазивности опухоли, снижение скорости роста рака или предотвращение образования метастазов. Лечение рака также может относиться к продлению выживания пациента, имеющего рак.
A. Фармацевтические препараты
[0020] Когда проводится клиническое применение терапевтической композиции, содержащей ингибирующее антитело, в целом полезно получить фармацевтическую или терапевтическую композицию, пригодную для предполагаемого применения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции могут содержать, например, по меньшей мере около 0,1% активного соединения. В других вариантах осуществления активное соединение может составлять от около 2% до около 75% от массы единицы или от около 25% до около 60%, например, и любой диапазон, возможный в данных границах.
[0021] Терапевтические композиции по данному изобретению преимущественно вводят в виде инъекционных композиций либо в виде жидких растворов, либо суспензий; твердые формы, пригодные для растворения в жидкости или суспензии в жидкости, также могут быть получены перед инъекцией. Эти препараты также могут быть эмульгированы.
[0022] Фразы «фармацевтические или фармакологически приемлемые» относятся к молекулярным объектам и композициям, которые не приводят к неблагоприятной, аллергической или другой неблагоприятной реакции при введении животному, например, человеку. Получение фармацевтической композиции, содержащей антитело или дополнительный активный ингредиент, будет известно специалистам в данной области техники в свете данного раскрытия. Кроме того, для введения животным (например, человеку) следует понимать, что препараты должны соответствовать стерильности, пирогенности, общей безопасности и стандартам чистоты, как того требует ведомство по биологическим стандартам FDA (Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов).
[0023] Используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все водные растворители (например, вода, спиртовые/водные растворы, солевые растворы, парентеральные носители, такие как хлорид натрия, декстроза Рингера и т.д.), неводные растворители (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат), дисперсионные среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные или противогрибковые агенты, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы), изотонические агенты, средства, замедляющие абсорбцию, соли, лекарственные средства, стабилизаторы лекарственных средств, гели, связующие вещества, эксципиенты, разрыхляющие агенты, смазывающие вещества, подсластители, ароматизаторы, красители, жидкости и питательные вещества, такие как материалы и их комбинации, известные специалисту в данной области техники. pH и точная концентрация различных компонентов в фармацевтической композиции регулируются в соответствии с хорошо известными параметрами.
[0024] Термин «единичная доза» или «дозировка» относится к физически дискретным единицам, подходящим для использования у субъекта, причем каждая единица содержит предопределенное количество терапевтической композиции, рассчитанной для получения желаемых ответов, обсуждаемых выше в связи с ее введением, то есть посредством соответствующих путей и режимов лечения. Количество, которое должно вводиться, как по количеству процедур, так и по единице дозы, зависит от желаемого эффекта. Фактическое количество дозы композиции согласно данному варианту осуществления, вводимой пациенту или субъекту, может определяться физическими и физиологическими факторами, такими как масса тела, возраст, здоровье и пол субъекта, тип заболевания, подлежащего лечению, степени проникновения болезни, предшествующие или одновременные терапевтические вмешательства, идиопатии пациента, способа введения и эффективности, стабильности и токсичности конкретного терапевтического вещества. Например, доза может также содержать от около 1 мкг/кг/массы тела до около 1000 мг/кг/массы тела (этот диапазон включает в себя промежуточные дозы) или больше для каждого введения и любой диапазон, выводимый в нем. В неограничивающих примерах выводимого диапазона от приведенных в данном документе чисел можно вводить диапазон от около 5 мкг/кг /массы тела до около 100 мг/кг/массы тела, от около 5 мкг/кг/массы тела до около 500 мг/кг/масса тела и т.д.. Медицинский сотрудник, ответственный за введение, в любом случае определит концентрацию активного ингредиента (ингредиентов) в композиции и соответствующую дозу(ы) для отдельного субъекта.
[0025] Активные соединения могут быть приготовлены для парентерального введения, например, для инъекций через внутривенные, внутримышечные, подкожные или даже внутрибрюшинные пути. Обычно такие композиции могут быть получены в виде жидких растворов или суспензий; твердых форм, пригодных для использования с целью получения растворов или суспензий при добавлении жидкости до инъекции, также могут быть получены; и препараты также могут быть эмульгированы.
[0026] Фармацевтические формы, пригодные для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы или дисперсии; составы, включая кунжутное масло, арахисовое масло или водный пропиленгликоль; и стерильные порошки для немедленной подготовки стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть жидкой до такой степени, чтобы ее можно было легко вводить. Она также должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы.
[0027] Белковые композиции могут быть составлены в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли (образованные со свободными аминогруппами белка) и которые образованы с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная, и тому подобное. Соли, образованные с помощью свободных карбоксильных групп, также могут быть получены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или трехвалентного железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и тому подобное.
[0028] Фармацевтическая композиция может содержать растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), подходящие их смеси и растительные масла. Соответствующую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и с использованием поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может быть вызвано различными антибактериальными и противогрибковыми агентами, например парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбиновой кислотой, тимеросалом и тому подобным. Во многих случаях предпочтительно включать изотонические агенты, например, сахара или хлорид натрия. Длительное поглощение инъекционных композиций может быть вызвано использованием в композициях агентов, замедляющих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.
B. Комбинированные способы лечения
[0029] В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по данному изобретению содержат антитело или фрагмент антитела против EGFL6 для ингибирования его активности в пролиферации раковых клеток в сочетании со вторым или дополнительным лекарственным препаратом. Такой лекарственный препарат может применяться при лечении любого заболевания, которое связано с EGFL6-опосредованной клеточной пролиферацией. Например, заболевание может представлять собой рак.
[0030] Способы и композиции, включая комбинированную терапию, усиливают терапевтический или защитный эффект и/или усиливают терапевтический эффект другой антираковой или антигиперпролиферативной терапии. Терапевтические и профилактические способы и композиции могут быть представлены в объединенном количестве, эффективном для достижения желаемого эффекта, такого как уничтожение раковой клетки и/или ингибирование клеточной гиперпролиферации. Этот процесс может включать контактирование клеток как с антителом, так и с фрагментом антитела и вторым лекарственным препаратом. Ткань, опухоль или клетка могут контактировать с одной или более композицией или фармакологическим препаратом (препаратами), содержащим один или более агентов (например, антитело или фрагмент антитела или противораковый агент) или путем контактирования ткани, опухоли и/или клетки с двумя или более отдельными составами или композициями, причем одна композиция обеспечивает 1) антитело или фрагмент антитела, 2) противораковый агент или 3) как антитело или фрагмент антитела, так и противораковый агент. Кроме того, предполагается, что такая комбинированная терапия может использоваться в сочетании с химиотерапией, лучевой терапией, хирургической терапией или иммунотерапией.
[0031] Термины «контактирует» и «подвергается воздействию» при применении к клетке, используются в данном документе для описания процесса, посредством которого терапевтическая конструкция и химиотерапевтический или радиотерапевтический агент доставляются в клетку-мишень или помещаются в прямое соприкосновение с клеткой-мишенью. Для достижения гибели клеток, например, оба агента доставляются в клетку в суммарном количестве, эффективном для уничтожения клетки или предотвращения ее деления.
[0032] Ингибирующее антитело можно вводить до, во время, после или в различных комбинациях относительно противоракового лечения. Введения могут находиться в интервале от одновременного до нескольких минут, до нескольких суток, до нескольких недель. В вариантах осуществления, в которых антитело или фрагмент антитела предоставляется пациенту отдельно от противоракового агента, обычно можно было бы гарантировать, что значительный промежуток времени не истекал между временем каждой доставки, так чтобы эти два соединения все еще были бы способны оказывать совместное воздействие на пациента. В таких случаях предполагается, что можно предоставить пациенту терапию антителом и противораковую терапию в пределах от 12 до 24 или 72 часов друг от друга и, более конкретно, в течение около 6-12 часов друг от друга. В некоторых ситуациях может быть желательно значительно увеличить период времени для лечения, с интервалом от нескольких суток (2, 3, 4, 5, 6 или 7) до нескольких недель (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) между соответствующими введениями.
[0033] В некоторых вариантах осуществления курс лечения длится 1-90 суток или более (этот диапазон включает промежуточные сутки). Предполагается, что один агент может быть предоставлен в любые сутки с 1-х суток до 90-х суток (этот диапазон включает промежуточные сутки) или любую их комбинацию, а другой агент предоставляется в любые сутки с 1-х суток до 90-х суток (этот такой диапазон включает промежуточные сутки) или любую их комбинацию. В течение одних суток (24-часовой период) пациенту может быть назначено одно или более введение агента(ов). Кроме того, после курса лечения предполагается, что существует период времени, при котором не проводится противораковая терапия. Этот период может длиться 1-7 суток и/или 1-5 недель, и/или 1-12 месяцев, или более (этот диапазон включает промежуточные сутки), в зависимости от состояния пациента, например, его прогноза, силы, здоровья и т.д. Ожидается, что циклы лечения будут повторяться по мере необходимости.
[0034] Могут использоваться различные комбинации. Для примера ниже терапия антителом обозначена как «А», а противораковая терапия обозначена как «В»:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
[0035] Введение любого соединения или терапии по данному варианту осуществления пациенту будет следовать общим протоколам для введения таких соединений с учетом токсичности агентов, если таковая имеется. Поэтому в некоторых вариантах осуществления существует этап мониторинга токсичности, который можно отнести к комбинированной терапии.
i. Химиотерапия
[0036] В соответствии с данными вариантами осуществления можно использовать широкий спектр химиотерапевтических агентов. Термин «химиотерапия» относится к применению лекарственных средств для лечения рака. «Химиотерапевтический агент» используется для обозначения соединения или композиции, которая вводится при лечении рака. Эти агенты или лекарственные средства классифицируются по их способу активности внутри клетки, например, независимо от того, влияют ли они на какой-либо этап клеточного цикла. Альтернативно, агент может быть охарактеризован на основе его способности напрямую сшивать ДНК, встраиваться в ДНК или индуцировать хромосомные и митотические аберрации, влияя на синтез нуклеиновых кислот.
[0037] Примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карцелезин и бизелезин); криптофицины (в частности криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги - KW-2189 и CB1-TM1); элейтеробин; панкратистатин; саркодиктин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамин оксид гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид и урациловый иприт; нитрозмочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как ендииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II); динемицин, включая динемицин A; бисфосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также неокарзиностатин хромофор и связанные хромопротеиновые ендииновые антибиотические хромофоры, аклациномизины, актиномицин, аутрарницин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин (включая морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин и дезоксидоксирубицин), эпирубицин, эзорубицин, идаруцибин, марцеломицин, митомицины, таких как митомицин C, микофеноловая кислота, ногаларницин, оливомицины, пепломицин, потифиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, циностатин и зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, птероптерин и триметрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн и тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин и флуксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан и тестолактон; средства, угнетающие функции надпочечников, такие как митотан и трилостан; восполнятель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; алдофосфамид гликозид; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; эльформитин; эллиптиний ацетат; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лониданин; мейтансиноиды, такие как майтансин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK-полисахаридный комплекс; разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2ʺ,2ʺ-трихлортриэтиламин; трихотецины (особенно токсин T-2, верракурин A, роридин A и ангидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (ʺAra-Cʺ); циклофосфамид; таксоиды, например, паклитаксел и доцетаксел гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; платиновые координационные комплексы, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; иринотекан (например, CPT-11); ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; карбоплатин, прокарбазин, пликомицин, гемцитабин, навелбин, ингибиторы фарнезил-протеинтрансферазы, трансплатина и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленного.
ii. Радиотерапия
[0038] Другие факторы, которые вызывают повреждение ДНК и широко используются, включают то, что широко известно как γ-лучи, рентгеновские лучи и/или направленная доставка радиоизотопов в опухолевые клетки. Также предполагаются другие формы факторов повреждения ДНК, такие как микроволны, облучение пучком протонов (патенты США 5760395 и 4870287) и УФ-облучение. Скорее всего, все эти факторы влияют на широкий диапазон повреждений ДНК, на предшественников ДНК, на репликацию и восстановление ДНК, а также на сборку и поддержание хромосом. Диапазоны дозировки для рентгеновских лучей варьируют от суточных доз, равных от 50 до 200 рентген в течение длительных периодов времени (от 3 до 4 недель) до единичных доз, равных от 2000 до 6000 рентген. Диапазоны дозировки для радиоизотопов сильно различаются и зависят от периода полураспада изотопа, силы и типа излучения, а также поглощения неопластическими клетками.
iii. Иммунотерапия
[0039] Специалист в данной области техники поймет, что дополнительные иммунотерапии могут использоваться в комбинации или в сочетании со способами вариантов осуществления. В контексте лечения рака иммунотерапия, как правило, полагается на использование иммунных эффекторных клеток и молекул для нацеливания и уничтожения раковых клеток. Ритуксимаб (RITUXAN) является таким примером. Иммуногенным эффектором может быть, например, антитело, специфичное для некоторого маркера на поверхности опухолевой клетки. Антитело само по себе может служить эффектором терапии или может рекрутировать другие клетки, чтобы фактически повлиять на убийство клеток. Антитело также может быть конъюгировано с лекарственным средством или токсином (химиотерапевтический агент, радионуклид, цепь рицина А, холерный токсин, коклюшный токсин и т.д.) и служить в качестве целевого агента. Альтернативно, эффектор может представлять собой лимфоцит, несущий поверхностную молекулу, которая прямо или косвенно взаимодействует с мишенью опухолевой клетки. Различные эффекторные клетки включают цитотоксические Т-клетки и NK-клетки
Конъюгаты антитело-лекарственное средство появились как прорывный подход к развитию терапии рака. Рак является одной из ведущих причин смертей в мире. Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) содержат моноклональные антитела (MAb), которые ковалентно связаны с лекарственными средствами, уничтожающими клетки (фиг. 1). Этот подход сочетает в себе высокую специфичность MAb против их антигенных мишеней с сильнодействующими цитотоксическими препаратами, в результате чего «вооруженные» MAb доставляют полезный груз (лекарственное средство) в опухолевые клетки с обогащенными уровнями антигена (Carteretal., 2008; Teicher 2014; Lealetal., 2014). Целенаправленная доставка лекарственного средства также минимизирует его воздействие в нормальных тканях, что приводит к снижению токсичности и улучшению терапевтического индекса. Утверждение двух препаратов ADC, ADCETRIS (брантуксимаб ведотин) в 2011 и KADCYLA (трастузумаб эмтанзин или T-DM1) в 2013 FDA подтвердило подход. В настоящее время в различных стадиях клинических испытаний для лечения рака насчитывается более 30 кандидатов лекарственных средств ADC.(Lealetal.,2014). Поскольку оптимизация антител и оптимизация линкера-полезной нагрузки становятся все более зрелыми, открытие и развитие новых ADC все в большей степени зависят от идентификации и проверки новых целей, подходящих для этого подхода (Teicher2009) и создания нацеливающих MAb. Двумя критериями для целей ADC являются повышенный/высокий уровень экспрессии в опухолевых клетках и надежная интернализация.
[0040] В одном аспекте иммунотерапии опухолевая клетка должна иметь некоторый маркер, который поддается нацеливанию, то есть не присутствует в большинстве других клеток. Существует множество маркеров опухолей, и любой из них может быть подходящим для нацеливания в контексте данных вариантов осуществления. Общие опухолевые маркеры включают CD20, карциноэмбриональный антиген, тирозиназу (p97), gp68, TAG-72, HMFG, антиген Сиалил Льюис, MucA, MucB, PLAP, ламининовый рецептор, ErbB и p155. Альтернативным аспектом иммунотерапии является сочетание противораковых эффектов с иммуномодулирующими эффектами. Иммуностимулирующие молекулы также существуют, включая: цитокины, такие как ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-12, GM-CSF, гамма-ИФН, хемокины, такие как MIP-1, MCP-1, ИЛ-8, и факторы роста, такие как лиганд FLT3.
[0041] Примерами иммунотерапии, которые в настоящее время исследуются или используются, являются иммунные адъюванты, например Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, динитрохлорбензол и ароматические соединения (патенты США 5801005 и 5739169; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998); цитокиновая терапия, например, интерфероны α, β, и γ, ИЛ-1, GM-CSF, и ФНО (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998); генная терапия, например, ФНО, ИЛ-1, ИЛ-2 и p53 (Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; патенты США 5830880 и 5846945); и моноклональные антитела, например, против CD20, против ганглиозида GM2 и против p185 (Hollander, 2012; Hanibuchi et al., 1998; патент США 5824311). Предполагается, что одна или более противораковых терапий могут использоваться с описанными в данном документе терапиями антител.
iv. Хирургия
[0042] Приблизительно 60% людей, больных раком будут подвергаться хирургическому вмешательству какого-либо типа, которое включает профилактическую, диагностическую или хирургическую, лечебную и паллиативную хирургию. Лечебная операция включает резекцию, при которой вся или часть раковой ткани физически удаляются, вырезаются и/или разрушаются и могут использоваться в сочетании с другими видами терапии, такими как лечение согласно данным вариантам осуществления, химиотерапия, лучевая терапия, гормональная терапия, генная терапия, иммунотерапия и/или альтернативные методы лечения. Резекция опухоли относится к физическому удалению, по меньшей мере, части опухоли. В дополнение к резекции опухоли лечение хирургическим путем включает в себя лазерную хирургию, криохирургию, электрохирургию и микроскопическую хирургию (микрохирургическая операция по Моху).
[0043] При удалении части или всех раковых клеток, ткани или опухоли в организме может образовываться полость. Лечение может быть выполнено путем перфузии, прямой инъекции или местного применения на области дополнительной противораковой терапии. Такое лечение может быть повторено, например, каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток, или каждые 1, 2, 3, 4 и 5 недель или каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. Эти лечения могут также иметь различные дозы.
v. Другие агенты
[0044] Предполагается, что другие агенты могут использоваться в сочетании с некоторыми аспектами данных вариантов осуществления для улучшения терапевтической эффективности лечения. Эти дополнительные агенты включают агенты, которые влияют на регуляцию рецепторов клеточной поверхности и щелевых контактов, цитостатические и дифференцирующие агенты, ингибиторы клеточной адгезии, агенты, которые повышают чувствительность гиперпролиферативных клеток к апоптотическим индукторам или другим биологическим агентам. Увеличение межклеточного сигналинга за счет увеличения количества щелевых контактов увеличило бы антигиперпролиферативный эффект на соседнюю популяцию гиперпролиферативных клеток. В других вариантах осуществления цитостатические или дифференцирующие агенты могут использоваться в сочетании с некоторыми аспектами данных вариантов осуществления для улучшения антигиперпролиферативной эффективности лечения. Предполагается, что ингибиторы клеточной адгезии улучшают эффективность данных вариантов осуществления. Примерами ингибиторов клеточной адгезии являются ингибиторы киназы фокальной адгезии (FAK) и ловастатин. Кроме того, предполагается, что другие агенты, повышающие чувствительность гиперпролиферативной клетки к апоптозу, такие как антитело c225, могут быть использованы в сочетании с некоторыми аспектами данных вариантов осуществления для улучшения эффективности лечения.
III. Наборы и диагностика
[0045] В различных аспектах вариантов осуществления предлагается набор, содержащий терапевтические агенты и/или другие терапевтические средства и средства доставки. В некоторых вариантах осуществления данные варианты осуществления предусматривают комплект для приготовления и/или введения терапии согласно вариантам осуществления. Набор может содержать один или более герметичных флаконов, содержащих любую из фармацевтических композиций по данному варианту осуществления. Набор может включать, например, по меньшей мере одно антитело EGFL6, а также реагенты для получения, создания и/или введения компонентов вариантов осуществления или выполнения одного или более этапов способов изобретения. В некоторых вариантах осуществления набор может также содержать подходящий контейнер, который представляет собой контейнер, который не будет взаимодействовать с компонентами набора, такой как пробирка эппендорф, аналитический планшет, шприц, бутылка или пробирка. Контейнер может быть изготовлен из стерилизуемых материалов, таких как пластик или стекло.
[0046] Набор может дополнительно содержать лист инструкций, который описывает процедурные этапы способов, изложенных в данном документе, и будет следовать по существу тем же самым процедурам, которые описаны в данном документе или известны специалистам в данной области техники. Информация инструкции может находиться на машиночитаемом носителе, содержащем машиночитаемые инструкции, которые при исполнении с использованием компьютера вызывают отображение реальной или виртуальной процедуры доставки фармацевтически эффективного количества терапевтического агента.
IV. Примеры
Следующие примеры включены для демонстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что методики, описанные в следующих далее примерах, представляют собой методики, которые, как было обнаружено изобретателем, хорошо функционируют в осуществлении изобретения и, таким образом, могут считаться предпочтительными способами для его осуществления. Однако специалистам в данной области техники следует, в свете данного раскрытия, понять, что в конкретных раскрытых вариантах осуществления, могут быть сделаны многие изменения без отхода от сущности и объема изобретения и могут быть получены аналогичные или сходные результаты.
Пример 1 - Создание и клонирование моноклональных антител, нацеленных на EGFL6 человека
6
Белок EGFL6 (номер доступа Genebank Q8IUX8) был использован для иммунизации новозеландских кроликов в RevMAb Biosciences USA, Inc. Титр антител против EGFL6 в сыворотке определяли серией разведений сыворотки в ИФА для связывания путем покрытия белка EGFL6 на 96-луночных планшетах (планшеты с максимальной сорбцией, Nunc) и были обнаружены анти-кроличьим антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) и субстратом TMB. После 2-3 актов иммунизации титр достигал> 10, и образцы периферической крови собирали у иммунизированных кроликов для выделения В-клеток (CD45+CD5-CD19+) из свежеприготовленных мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) с применением сортировки клеток с использованием флуоресценции (FACS) (BD FACSAria™ III, BD Biosciences). Выделенные В-клетки высевали в виде отдельных В-клеток и культивировали в течение 7-10 суток. Супернатанты культуры анализировали на связывание EGFL6. Клетки из положительных лунок лизировали, выделяли суммарную РНК и синтезировали кДНК с использованием надстрочной обратной транскриптазы II (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Последовательности ДНК вариабельной области антитела как из тяжелых цепей, так и легких цепей амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием набора разработанных праймеров и секвенировали. Как последовательности ДНК, так и аминокислотные последовательности перечислены в разделе V ниже. CDR моноклональных антител против EGFL6 идентифицировали с использованием программы IMGT, они приведены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1. CDR вариабельных последовательностей тяжелой цепи антител EGFL6.
Тяжелая цепь
mAb
CDR1
CDR2
CDR3
E1-33
ggactcgacctcagtagctactactac(SEQ ID NO: 1)
atttatgctggtagtagtggtagcact(SEQ ID NO: 2)
gcgagaggtggtggtagtacttatgctcaatattttaacttg (SEQ ID NO: 3)
GLDLSSYYY (SEQ ID NO: 4)
IYAGSSGST (SEQ ID NO: 5)
ARGGGSTYAQYFNL (SEQ ID NO: 6)
E1-34
ggattctccttcagtagtatttattgg(SEQ ID NO: 7)
attcagattactagtggtatcact(SEQ ID NO: 8)
agaaggggatatggtgcctatgctggtactggtgcctctgacttg(SEQ ID NO: 9)
GFSFSSIYW (SEQ ID NO:10)
IQITSGIT (SEQ ID NO: 11)
RRGYGAYAGTGASDL (SEQ ID NO: 12)
E1-80
ggattcaccctcaatagttattat(SEQ ID NO: 13)
attgatagtgatagtcctactacg(SEQ ID NO: 14)
gcgagaggctatggtcctgttcgattggatctc(SEQ ID NO: 15)
GFTLNSYY (SEQ ID NO: 16)
IDSDSPTT (SEQ ID NO: 17)
ARGYGPVRLDL (SEQ ID NO: 18)
E1-89
ggattctccttcagtagcggctactgg(SEQ ID NO: 19)
atttatgctggtagtagtggtgggcac(SEQ ID NO: 20)
tgtacaagagataattatggtggtggtggttctgcttccaaattg(SEQ ID NO: 21)
GFSFSSGYW (SEQ ID NO: 22)
IYAGSSGGH(SEQ ID NO: 23)
CTRDNYGGGGSASKL(SEQ ID NO: 24)
E2-93
ggattctccttcagtagttatgga(SEQ ID NO: 25)
attggtcttagtagtgagatc(SEQ ID NO: 26)
gtgagagatctttatcatagtaatggtttg(SEQ ID NO: 27)
GFSFSSYG (SEQ ID NO: 28)
IGLSSEI (SEQ ID NO: 29)
VRDLYHSNGL (SEQ ID NO: 30)
E1-38
ggattctccttcaatagcggctactgg(SEQ ID NO: 31)
atctatactagtagtcctactggtgcc(SEQ ID NO: 32)
tgtacaagagataattttggtggtggtggttctgcttccaaattg(SEQ ID NO: 33)
GFSFNSGYW(SEQ ID NO: 34)
IYTSSPTGA(SEQ ID NO: 35)
CTRDNFGGGGSASKL(SEQ ID NO: 36)
E1-52
ggattcaccctcagtagctactac(SEQ ID NO: 37)
attgatactgataatgatattagg(SEQ ID NO: 38)
gggagaggctatggtgcgcttcggttggatctc(SEQ ID NO: 39)
GFTLSSYY (SEQ ID NO: 40)
IDTDNDIR (SEQ ID NO: 41)
GRGYGALRLDL (SEQ ID NO: 42)
E2-36
ggattctccctcagtagctaccac(SEQ ID NO: 43)
attaataattatggtgccaca(SEQ ID NO: 44
gccagaagtcctgggattcctggttataattcg(SEQ ID NO: 45)
GFSLSSYH (SEQ ID NO: 46)
INNYGAT (SEQ ID NO: 47)
ARSPGIPGYNS (SEQ ID NO: 48)
E1-95
ggattctccttcagtagcaattca(SEQ ID NO: 49)
attgctagtagtagtagtcatagt(SEQ ID NO: 50)
gcgagagattctggtaatcgtggttacctttatgcgggcgactttaacttg(SEQ ID NO: 51)
GFSFSSNS (SEQ ID NO: 52)
IASSSSHS (SEQ ID NO: 53)
ARDSGNRGYLYAGDFNL (SEQ ID NO: 54)
E2-116
ggattcgacctcagtagctcctactac(SEQ ID NO: 55)
attgacggtggtgggggtgagcccact(SEQ ID NO: 56)
gcgagacgagatgctggtgctgggaacgcctttagcttg(SEQ ID NO: 57)
GFDLSSSYY (SEQ ID NO: 58)
IDGGGGEPT (SEQ ID NO: 59)
ARRDAGAGNAFSL (SEQ ID NO: 60)
E2-135
ggattcgacttcagtagcagctacttt(SEQ ID NO: 61)
atttatactgttattagtcgtaagact(SEQ ID NO: 62)
gcgagatcggcaacaattgaaagattggatctc(SEQ ID NO: 63)
GFDFSSSYF (SEQ ID NO: 64)
IYTVISRKT (SEQ ID NO: 65)
ARSATIERLDL (SEQ ID NO: 66)
E1-142
ggattcaccatcaataactacaac(SEQ ID NO: 67)
atttggaatggtgatggcagc(SEQ ID NO: 68)
gcgagaaattttaacttg(SEQ ID NO: 69)
GFTINNYN (SEQ ID NO: 70)
IWNGDGS (SEQ ID NO: 71)
ARNFNL (SEQ ID NO: 72)
Таблица 2. CDR вариабельных последовательностей легкой цепи антител EGFL6.
Легкая цепь
CDR1
CDR2
CDR3
E1-33
ccgagtgtttataggcactac(SEQ ID NO: 73)
tgggcttcc(SEQ ID NO: 74)
gcaggcgaatatgctagtgatagtgataatcat(SEQ ID NO: 75)
PSVYRHY(SEQ ID NO: 76)
WAS(SEQ ID NO: 77)
AGEYASDSDNH(SEQ ID NO: 78)
E1-34
cagagtgtttataataacaacaac(SEQ ID NO: 79)
gaagcatcc(SEQ ID NO: 80)
gcaggcggttatgctggctacatttgggct(SEQ ID NO: 81)
QSVYNNNN(SEQ ID NO: 82)
EAS(SEQ ID NO: 83)
AGGYAGYIWA(SEQ ID NO: 84)
E1-80
aagaacgcctatttatcctactac(SEQ ID NO: 85)
tgggcttcc(SEQ ID NO: 86)
gcagccgaatatagtaatgatagtgataatggt(SEQ ID NO: 87)
KNAYLSYY(SEQ ID NO: 88)
WAS(SEQ ID NO: 77)
AAEYSNDSDNG(SEQ ID NO: 89)
E1-89
cagagtgtttatagtaacaaccgc(SEQ ID NO: 90)
tatgcagcc(SEQ ID NO: 91)
gcaggatataaaactgctgattctgatggtattgct(SEQ ID NO: 92)
QSVYSNNR(SEQ ID NO: 93)
YAA(SEQ ID NO: 94)
AGYKTADSDGIA(SEQ ID NO: 95)
E2-93
gagagcgtttataataataaccgc(SEQ ID NO: 96)
tatgcatcc(SEQ ID NO: 97)
gtagcctttaaaggttatggtactgacggcaatgct(SEQ ID NO: 98)
ESVYNNNR(SEQ ID NO: 99)
YAS(SEQ ID NO: 100)
VAFKGYGTDGNA(SEQ ID NO: 101)
E1-38
gagagtgtttatagtaacaaccgc(SEQ ID NO: 102)
tatgcatcc(SEQ ID NO: 97)
gcaggatataagactgccgattctgatggtcttggt(SEQ ID NO: 103)
ESVYSNNR(SEQ ID NO: 104
YAS(SEQ ID NO: 100)
AGYKTADSDGLG(SEQ ID NO: 105)
E1-52
ccgagtgtttataggcactac(SEQ ID NO: 106)
tgggcttcc(SEQ ID NO: 86)
gcaggcgaatatgctagtgatagtgataatcat(SEQ ID NO: 107)
PSVYRHY(SEQ ID NO: 108)
WAS(SEQ ID NO: 77)
AGEYASDSDNH(SEQ ID NO: 109)
E2-36
cagaatgtttatagttacaaccgc(SEQ ID NO: 110)
gaagcatcc(SEQ ID NO: 111)
gcaggcggttatgattgtaggagttctgattgtgatgct(SEQ ID NO: 112)
QNVYSYNR(SEQ ID NO: 113)
EAS(SEQ ID NO: 83)
AGGYDCRSSDCDA(SEQ ID NO: 114)
E1-95
cagagcattaatagttgg(SEQ ID NO: 115)
gaagcatcc(SEQ ID NO: 111)
caacagggttatagttatagtaatgttgataataatatt(SEQ ID NO: 116)
QSINSW(SEQ ID NO: 117)
EAS(SEQ ID NO: 83)
QQGYSYSNVDNNI(SEQ ID NO: 118)
E2-116
caaagtgtttatcttcagaacaac(SEQ ID NO: 119)
tatgcatcc(SEQ ID NO: 97)
cagggcggttacagtggatatatcaattct(SEQ ID NO: 120)
QSVYLQNN(SEQ ID NO: 121)
YAS(SEQ ID NO: 100)
QGGYSGYINS(SEQ ID NO: 122)
E2-135
gagagtgtttataataactaccgc(SEQ ID NO: 123)
gctgcatcc(SEQ ID NO: 124)
gtaggatataaaagtggttatattgatagtattcct(SEQ ID NO: 125)
ESVYNNYR(SEQ ID NO: 126)
AAS(SEQ ID NO: 127)
VGYKSGYIDSIP(SEQ ID NO: 128)
E1-142
gcgagtgtttatagtaacaactac(SEQ ID NO: 129)
tatgcatcc(SEQ ID NO: 97)
gcaggcgattatagtagtagtagtgatatgtgtatt(SEQ ID NO: 130)
ASVYSNNY(SEQ ID NO: 131)
YAS(SEQ ID NO: 100)
AGDYSSSSDMCI(SEQ ID NO: 132)
Выбранные связывающие EGFL6 домены экспрессировали в виде полноразмерных IgG кролика и химерных форм IgG кролика/человека с использованием векторной системы экспрессии млекопитающих в эмбриональных клетках почки человека (HEK293) (Invitrogen). Антитела очищали с использованием колонки со смолой на белок А посредством блока разделения быстрой белковой жидкостной хроматографии (FPLC). Очищенные связывающие EGFL6 антитела были охарактеризованы относительно их биологических свойств.
Пример 2. Аффинность связывания моноклональных антител против EGFL6 с белком EGFL6
D
D
off
on
Связывание EGFL6 с помощью моноклональных антител сначала подвергали скринингу с помощью ИФА с использованием супернатантов, собранных из культур В-клеток (фиг. 2). Титрование ИФА использовали для определения аффинности связывания группы моноклональных антител с антигеном EGFL6 (фиг. 3). Константы связывания (K и/или EC 50) группы моноклональных антител были оценены с использованием 4-х параметрической кривой, построенной при помощи программного обеспечения Prism GraphPad. Для анализа Biacore все эксперименты проводили при 25°C со скоростью потока, равной 45 мкл/мин. Антитело против Fc IgG человека (от ThermoFisher по 50 мкг/мл каждый в ацетатном буфере, рН 5,0) иммобилизовали на сенсорном чипе карбоксиметил декстрана (CM5), используя методики аминного связывания на основании инструкции изготовителя. Очищенное химерное антитело кролика/человека, которое должно быть протестировано, разводили в концентрации 5 мкг/мл в 0,5% P20, буфере HBS-EP и вводили в FC2 для достижения 500-1000 ОЕ. FC1 использовался как эталонную ячейку. Конкретные сигналы соответствуют разности сигналов, полученных на FC2 по сравнению с FC1. Аналит (рекомбинантный EGFL6 человека, кажущаяся молекулярная масса 60 кДа на геле SDS-PAGE) вводили в течение 90 секунд при серии концентрационных разведений (100, 50, 25, 12,5, 6,25 и 3,13, 1,56 нМ) в 0,5% P20, буфер HBS-EP. Эти концентрации были получены из исходного раствора в 0,5% P20, HBS-EP. Фазу диссоциации аналита контролировали в течение 30 минут. Подвижный буфер также вводили в тех же условиях, что и контрольный. После каждого рабочего цикла обе проточные ячейки регенерировали путем инъекции от 20 до 45 мкл буфера Глицин-HCl с рН 1,5. K связывания на EGFL6 рассчитывали посредством степени кинетики k/k для каждого моноклонального антитела EGFL6 (таблица 3).
Таблица 3. Аффинность связывания антитела EGFL6, определяемая методом ИФА или Biacore.
Название антитела
EC50 (нг/мл)
E1-34
0,78
E1-38
5,81
E2-93
0,37
E1-142
1,91
E2-135
0,44
Пример 3 - Экспериментальные процедуры и способы
2
Клеточные линии и культура: Линии рака эпителиальных клеток яичника человека, SKOV3ip1 и A2780ip2 выращивали, как описано (Sood, A.K. et al. Molecular determinants of ovarian cancer plasticity. American Journal of Pathology 158, 1279-1288, 2001). Человеческие иммортализованные пупочные эндотелиальные клетки (RF24) выращивали в среде MEM с добавками (пируват натрия, незаменимые аминокислоты, витамины по MEM (модифицированная среда Игла) и глутамин, Life Technologies). Получение и характеристика эндотелиальных клеток яичника мыши (MOEC) описаны ранее (Langley, R.R. et al. Tissue-specific microvascular endothelial cell lines from H-2K(b)-tsA58 mice for studies of angiogenesis and metastasis. Cancer Research 63, 2971-2976, 2003). Культуры клеток поддерживали при 37 °С в инкубаторе с 5% СО и влажностью 95%. Для инъекций in vivo клетки трипсинизировали и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин при 4 °С, дважды промывали PBS и воссоздавали в бессывороточном растворе солей Хэнкса (Life Technologies, Гранд Айленд, штат Нью-Йорк, США). Для внутривенных инъекций in vivo использовали только одноклеточные суспензии с жизнеспособностью более 95% (как определено исключением трипанового синего).
Изоляция эндотелиальных клеток: Образцы свежих тканей (5 нормальных яичников, 5 раневых тканей и 10 эпителиальных высокодифференцированных, инвазивных серозных раковых опухолей яичников III или IV стадий) были получены у пациентов, подвергшихся первичному хирургическому обследованию в Центре рака M.D. Anderson после одобрения Совета по институциональному контролю. Суммарную РНК из очищенных эндотелиальных клеток подвергали анализу микрочипов с использованием платформы Affymetrix Human U133 plus 2.0 GeneChip (Lu, C. et al. Gene alterations identified by expression profiling in tumor-associated endothelial cells from invasive ovarian carcinoma. Cancer Research 67, 1757-1768, 2007).
-ΔΔCT
Количественная валидация ПЦР в реальном времени: Количественную ПЦР в реальном времени проводили, используя 50 нг суммарной РНК из очищенных эндотелиальных клеток, выделяли с использованием набора RNeasy mini (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали из 0,5-1 мкг общей РНК с использованием набора кДНК Verso (Thermo Scientific). Количественный анализ ПЦР (qPCR) проводили в трех повторностях с использованием SYBR Green ER qPCR SuperMix Universal (Invitrogen) и Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, штат Калифорния, США). Относительную количественную оценку рассчитывали с использованием метода 2, нормализованного для контроля за процентными изменениями (Donninger, H. et al. Whole genome expression profiling of advance stage papillary serous ovarian cancer reveals activated pathways. Oncogene 23, 8065-8077, 2004).
Конструкции и доставка миРНК: миРНК были приобретены у Sigma-Aldrich (Вудлендс, штат Техас, США). В качестве контроля мишеней миРНК использовалась не сайленсинговая миРНК, которая не имела гомологии последовательности с любой известной мРНК человека на основе BLAST-поиска. In vitro транзиентную трансфекцию проводили, как описано в (Landen, C.N., Jr. et al. Therapeutic EphA2 gene targeting in vivo using neutral liposomal small interfering RNA delivery. Cancer Research 65, 6910-6918, 2005). Вкратце, миРНК (4 мкг) инкубировали с 10 мкл реагента для трансфекции липофектамин 2000 (Lipofectamine) в течение 20 мин при комнатной температуре в соответствии с инструкциями производителя и добавляли к клеткам в культуре с 80% слиянием в культуральных планшетах 10 см.
Обращенно-фазный белковый анализ (RPPA) и вестерн-блоттинг анализ: RF24 и OVCAR3 в присутствии или в отсутствие человеческого рекомбинантного белка EGFL6 подвергали анализу RPPA. Вестерн-блот-анализ проводили как ранее (Landen, C.N., Jr. et al. 2005, ibid; Halder, J. et al. Focal adhesion kinase targeting using in vivo short interfering RNA delivery in neutral liposomes for ovarian carcinoma therapy. Clinical Cancer Research: an official journal of the American Association for Cancer Research 12, 4916-4924, 2006). Клеточный лизат клеток RF24, обработанных человеческим рекомбинантным белком EGFL6 или антителами против EGFL6, и проверял на активацию сигнальной передачи PI3 киназы и AKT с использованием антител против EGFL6, PI3 киназы и AKT человека, за которыми следуют вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP).
5
Анализ клеточной миграции: Используя модифицированные камеры Бойдена, покрытые 0,1% желатином, миграцию клеток RF24 оценивали в присутствии или отсутствии миРНК hEGFL6. После посттрансфекции 48 ч с помощью hEGFL6 или интегрина миРНК или с антителом EGFL6 или ингибитором PI3-киназы в течение 6 часов клетки RF24 (1,0 × 10) в среде MEM, свободной от сыворотки, высевали в верхнюю камеру Transwell pore Polycarbonate Membrane insert (Corning, Лоувел, штат Массачусетс, США). Камеру помещали в 24-луночный планшет, содержащий среду MEM с 15% сывороткой в нижней камере в качестве химио-аттрактанта. Клетки оставляли мигрировать во влажном инкубаторе в течение 6 часов. Клетки, которые мигрировали, окрашивали с использованием окрашивания гематоксилином и подсчитывали с помощью световой микроскопии в пяти случайных полях (200-кратное исходное увеличение) на образец. Эксперименты проводили в двух экземплярах и выполняли три раза.
Анализ образования трубки: Матригель (12,5 мг/мл) расплавляли при 4 °С и 50 мкл быстро добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета и оставляли затвердевать в течение 10 мин при 37 °С. Затем лунки инкубировали в течение 6 ч при 37 °С с клетками RF24 (20000 на лунку), которые ранее обрабатывали EGFL6 или миРНК интегрина (в течение 48 часов) или антитела EGFL6 или ингибитора PI3-киназы (в течение 6 часов). Эксперименты проводили в трех повторностях и повторяли дважды. Используя инвертированный микроскоп Olympus IX81, пять изображений на лунку были взяты с увеличением × 100. Количество узлов (определенных как образование одной точки из по меньшей на мере трех клеток) на изображение было количественно определено. Чтобы учесть сгущение клеток, наивысшее и наименьшее значение было удалено из каждой группы.
TM
Анализ промотора и анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP): Клетки RF24 культивировали в среде с низким содержанием сыворотки (0,5% сыворотки) в течение 18 ч и затем обрабатывали либо EGFL6, либо HIF1 (50 нг/мл) в течение 6 часов. После обработки анализы ChIP проводили с использованием набора EZ ChIP (Milllipore, Темекула, штат Калифорния, США) как описано изготовителем. Вкратце, сшитые клетки собирали, лизировали, обрабатывали ультразвуком и затем подвергали иммунопреципитации с помощью антитела EGFL6 (Abchem) или IgG. Иммунокомплексы собирали с помощью гранул агарозы белка G и элюировали. Перекрестные ссылки были отменены путем инкубации при 65 °С. ДНК затем экстрагировали и очищали для ПЦР с использованием пар праймеров перед сайтом начала транскрипции EGFL6.
Анализ проточной цитометрии: Клетки RF24 промывали PBS и собирали PBS-ЭДТА 5 мМ. Клетки затем иммунометили с помощью различных первичных антител интегрина (Sigma-Aldrich) и затем окрашивали вторичными антителами (Invitrogen). Образцы были получены на FACS Calibur с программным обеспечением Cell Quest, и данные были проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo.
6
Ортотопическая in vivo модель рака яичника и обработки тканей: Женские атимичные голые мыши (NCr-nu) были приобретены в центре исследований и развития рака NCI-Frederick (Фредерик, штат Мэриленд, США) и культивировали, как описано выше (Landen, C.N., Jr. et al. 2005, ibid). Все исследования на мышах были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных. За мышами ухаживали в соответствии с руководящими принципами, установленными Американской ассоциацией по аккредитации лабораторного ухода за животными и Политикой общественного здравоохранения США по уходу и использованию лабораторных животных. Для инъекций опухолевых клеток, клетки A2780ip2 или SKOV3ip1, или OVCAR3 (1 × 10) вводили внутрибрюшинно (в/б). Для терапевтических экспериментов каждую миРНК давали два раза в неделю в дозе 150 мкг/кг массы тела. Во время умерщвления регистрировались масса мыши и опухоли, количество и распределение опухолей. Лица, которые выполняли вскрытия, не имели данных об назначении группы лечения. Образцы тканей фиксировали либо формалином, OCT (Miles, Inc., Элькхарт, штат Индиана, США) или замораживали в жидком азоте. Для внецелевых эффектов мышей, несущих опухоль SKOV3ip1, обрабатывали двумя различными последовательностями миРНК EGFL6, как указано выше.
2
2
Иммуногистохимическое и иммунофлуоресцентное окрашивание ксенотрансплантатов: Анализ IHC клеточной пролиферации (Ki67, 1:200, Zymed), плотность микрососудов (MVD, CD31, 1:500, Pharmingen) и гипоксию (карбоангидраза Anti-CA9, 1:500, Novus), все проводили, как описано в (Thaker, P.H. et al. Chronic stress promotes tumor growth and angiogenesis in a mouse model of ovarian carcinoma. Nature Medicine 12, 939-944, 2006; Lu, C. et al. Regulation of tumor angiogenesis by EZH2. Cancer Cell 18, 185-197, 2010). Для статистического анализа участки из пяти случайно выбранных опухолей на группу окрашивали и оценивали 5 случайных полей на опухоль. Изображения были сделаны с увеличением x200 или x100. Для количественного определения MVD (плотности микрососудов) в образцах опухоли мыши количество положительных на CD31 кровеносных сосудов регистрировалось в 10 случайных 0,159 мм полях при увеличении x200. Для количественной оценки экспрессии PCNA количество положительных клеток (окрашивание 3,3'-диаминобензидином) подсчитывали в 10 случайных 0,159 мм полях с увеличением × 100 (Thaker, P.H. et al. 2006, ibid; Lu, C. et al. 2010, ibid). Все окрашивание подсчитывали 2 исследователя независимо друг от друга. Окрашивание для EGFL6 (Santa Cruz) и CD31 осуществляли с использованием замороженной ткани, как описано в (Lu, C. et al. 2010, ibid).
Анализ со вставкой матригеля: Анализ in vivo со вставкой матригеля проводили путем инъекции «пробок» магригеля мышам подкожно. Пробка матригелем включала либо полную среду MEM с сывороткой (в качестве отрицательного контроля), VEGF (в качестве положительного контроля), так и EGFL6 (в качестве тестовой группы). Через 6 часов после инъекции животных умерщвляли и собирали матригель, и проводили анализ гемоглобина.
Анализ заживления ран: На 1-е сутки клетки A2780 ip2 вводили голым мышам, а на вторые сутки рана была создана на задней части мышей, несущих опухоль. Животные получали ветеринарный уход и содержались в отдельных клетках. Мышей разделили на две группы (n=10).
CH/контрольная миРНК и CH/mEGFL6 наночастицы миРНК: лечение миРНК было начато на 3-и сутки и осуществлялось два раза в неделю (150 мкг/кг). Рану измеряли на 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 15 сутки (до завершения заживления ран). Опухоли были собраны, когда животные в любой группе стали агонизировать.
Ишемия задней конечности: Критическая ишемия задней конечности, как описано ранее (Baluk, P., Hashizume, H. & McDonald, D.M. Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer. Current Opinion in Genetics & Development 15, 102-111, 2005) была индуцирована у самок голых мышей после анестезии с помощью кетамина (100 мг/кг) путем внутрибрюшинной инъекции, а бедренная артерия была вырезана от ее проксимального конца в качестве ветви внешней подвздошной артерии до дистальной точки, где она раздваивается на сафенную и подколенную вены. После артериального лигирования мышей сразу распределяли по следующим экспериментальным группам (n=5): контрольная группа, ишемия-24 ч и ишемия-96 ч. Последовательный лазерный доплеровский анализ изображений (Moor Instruments, Девон, Великобритания) был выполнен для контроля кровотока задних конечностей до и после лигирования бедренной артерии (через 24 часа и 96 часов). Цифровые цветные изображения были проанализированы для количественного определения кровотока в области от колена до пальца ноги; были рассчитаны средние значения перфузии. В каждый момент времени ткань из ишемической конечности собирали и замораживали в среде OCT. Моноклональный антитела против CD31 мыши использовали для определения MVD (плотности микрососудистой сети), а поликлональные антитела против EGFL6 мыши для определения экспрессии EGFL6 на замороженных зафиксированных тканях с использованием стандартной методики иммунологического окрашивания.
Образцы рака яичника человека: После утверждения Институциональным советом по обзору, из опухолевого банка Карманосского института рака были получены 180 заключенных в парафин образцов рака эпителия яичника (собранных в период с 1985 по 2004 г.) с доступными данными клинических исходов и диагнозом, подтвержденным сертифицированным советом гинекологическим патологоанатомом.
Для образцов рака яичников человека проводили иммуногистохимию на EGFL6, CD34 и VEGF, как описано ранее (Ali-Fehmi, R. et al. Expression of cyclooxygenase-2 in advanced stage ovarian serous carcinoma: correlation with tumor cell proliferation, apoptosis, angiogenesis, and survival. American Journal of Obstetrics and Gynecology 192, 819-825, 2005). Окрашивание EGFL6 проводили с использованием антитела против EGFL6 человека (Sigma‐Aldrich). Коротко, фиксированные в формалине, заключенные в парафин срезы тканей были депарафинизированы и регидратированы. После извлечения антигена раствором Дивы эндогенную пероксидазу блокировали 3% перекисью водорода в метаноле в течение 15 мин. После промывания PBS срезы блокировали блокирующим белком (5% нормальной сыворотки лошади и 1% сыворотки козла) в течение 20 мин при комнатной температуре (КТ) с последующей инкубацией с антителом против EGFL6 (Sigma-Aldrich) в течение ночи при 4 °C. После промывания PBS срезы инкубировали с козьим анти-кроличьим антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) (1:250, Jackson ImmunoResearch) в течение 1 часа при комнатной температуре. Наконец, визуализация была достигнута с помощью 3,3'-диаминобензидина (Research Genetics) и контрастного окрашивания гематоксилином Гилла (BioGenex Laboratories). Отрицательное окрашивание помечалось как 0 балл, для повышения интенсивности EGFL6 использовались баллы 1-4. Окрашенные препараты были оценены двумя исследователями на основе гистохимического показателя (H-балл, >100, определяемого как высокая экспрессия и ≤100, низкая экспрессия), в соответствии с описанным выше способом (Ali-Fehmi, et al., 2005 ibid), который учитывает как интенсивность окрашивания, так и процент окрашивания клеток.
Статистический анализ: Для экспериментов с животными десять мышей назначались на одну группу лечения. Этот размер образца обеспечил 80% мощности для обнаружения 50% -ного уменьшения массы опухоли с 95% -ной достоверностью. Масса опухолей и количество опухолевых узелков для каждой группы сравнивались с использованием t-критерия Стьюдента (для сравнения двух групп). Значение P менее 0,05 считалось статистически значимым. Все статистические тесты были двухсторонними и выполнялись с использованием SPSS версии 12 для статистического программного обеспечения Windows (SPSS, Inc., Чикаго, штат Иллинойс, США).
Пример 4 - экспрессия EGFL6, повышенная в опухолевых эндотелиальных клетках
Было получено пять нормальных яичников, пять образцов ткани раны и 10 инвазивных опухолей эндотелия яичника и были подвергнуты отрицательной и положительной иммуноселекции. Перед проведением анализа микрочипов чистота всех образцов в отношении эндотелиальных клеток была установлена с использованием маркеров эндотелиальных клеток P1H12 и фактора фон Виллебранда (фиг. 4A). Иммуноокрашивание показало, что метод иммуноочистки позволил получить чистоту эндотелиальных клеток > 95% во всех образцах. Анализ данных показал, что 375 генов были активированы в эндотелиальных клетках опухолей яичника по сравнению с нормальными и раневыми эндотелиальными клетками (фиг. 4B). Среди них EGFL6 продемонстрировал наивысшую дифференциальную экспрессию в эндотелиальных клетках опухоли по сравнению с нормальными и раневыми эндотелиальными клетками (фиг. 4B). Определяли экспрессию EGFL6, VEGF и CD31 в образцах яичника пациентов (фиг. 4C). Чтобы дополнительно подтвердить этот результат, эндотелиальные клетки были выделены из нормального яичника, опухоли яичника и заживающей ткани раны, и экспрессию EGFL6 определяли с использованием ПЦР. EGFL6 преимущественно экспрессируется только в опухолевых эндотелиальных клетках по сравнению с нормальными или раневыми эндотелиальными клетками (фиг. 4D). Было также продемонстрировано повышение активности EGFL6 в эндотелиальных клетках опухоли. EGFL6 экспрессировали в эндотелиальных клетках и тестировали большинство клеток рака яичников. Чтобы продемонстрировать роль EGFL6 в опухолевом ангиогенезе, клетки RF24 обрабатывали siEGFL6, что приводило к более чем 80% нокдауну в уровнях белка на 72 час по сравнению с контрольными клетками. Клетки EGFL6, обработанные миРНК, продемонстрировали значительно меньшую миграцию и образование трубки по сравнению с контрольными клетками, обработанными миРНК, что указывает на важность EGFL6 в ангиогенезе.
Пример 5 - сайленсинг EGFL6 не влиял на заживление ран у мышей
Роль EGFL6 в заживлении ран была рассмотрена с использованием ран, полученных с использованием человеческих дермальных микрососудистых эндотелиальных клеток (HDMEC). Определение эффектов на заживление ран проводили с использованием следующих процедур. На 1-е сутки клетки SKOV3ip1 вводили голым мышам, а на вторые сутки рана была создана на задней части мышей, несущих опухоль (2 см x 2 см). Животных случайным образом разделяли на две группы (n=10), одну с введением контрольного антитела, а другую группу мышей лечили антителом EGFL6. Лечение антителом было начато на 3-и сутки и осуществлялось один раз в неделю (5 мг/кг). Рану (площадь=длина X ширина) контролировали в течение 2 недель до завершения заживления раны. Антитело EGFL6 не предотвращало заживление ран при тестировании с использованием исследования заживления раны in vivo (фиг. 9C).
В анализе заживления ран выяснилось, что через 24 ч обработанные siControl клетки и обработанные siEGFL6 клетки не влияли на способность заживления раны (фиг. 5A-5C). Кроме того, аналогичные раны, полученные на мышах, несущих опухоль, использовали для определения влияния на заживление раны для замораживания EGFL6 в компартменте эндотелиальных клеток с использованием последовательности миРНК мыши. Как показано на фиг. 5D и 5E, не было обнаружено существенной разницы в заживлении ран у животных, получавших контрольные миРНК или миРНК EGFL6 мыши, и обе группы также показали сходные закономерности заживления ран.
Однако животные, леченые с помощью миРНК EGFL6 мыши, продемонстрировали значительное снижение опухолевой нагрузки (фиг. 5F-5H), подтверждая, что сайленсинг EGFL6 в компартменте эндотелиальных клеток оказывает существенное влияние на рост опухоли, но не ставит под угрозу заживление ран. Сайленсинг гена EGFL6 также приводил к значительному снижению пролиферации опухолевых кровеносных сосудов (фиг. 11A-11B).
Пример 6 - EGFL6 усиливает ангиогенез в эндотелиальных клетках
Чтобы установить, что EGFL6 приводит к увеличению выживаемости эндотелиальных клеток в гипоксических условиях, EGFL6 был сайленсирован в гипоксических клетках RF24 при гипоксии с использованием миРНК EGFL6 и была исследована клеточная смерть. Как показано на фиг. 6А, почти 50% клеток выживали при гипоксии даже через 5 суток по сравнению с нормоксией. В противоположность этому, сайленсинг EGFL6 при гипоксии приводил к 75% гибели клеток по сравнению с нелечеными клетками при гипоксии и нормоксии (фиг. 6H). Ишемия задней конечности была создана у мышей путем иссечения бедренной артерии на задней конечности мыши, что привело к прекращению подачи крови и кислорода к задней конечности (фиг. 6I). Как показано на фиг. 6J-6K, ишемические мыши показали значительное снижение MVD (кровеносных сосудов) и увеличение экспрессии EGFL6 в эндотелиальных клетках. Миграция (фиг. 12C) и формирование трубки (фиг. 12D) клеток RF24 увеличивалось после лечения EGFL6.
Пример 7 - сайленсинг EGFL6 ингибирует рост и ангиогенез опухоли
6
Терапевтическая эффективность EGFL6 при сайленсинге гена изучалась с использованием двух ортотопических опухолевых моделей рака яичника - SKOV3ip1 и OVCAR5. Женские атимичные голые мыши (NCr-nu) были приобретены в центре исследований и развития рака NCI-Frederick (Фредерик, штат Мэриленд) и все исследования на мышах были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных. За мышами ухаживали в соответствии с руководящими принципами, установленными Американской ассоциацией по аккредитации лабораторного ухода за животными и Политикой общественного здравоохранения США по уходу и использованию лабораторных животных. Для инъекций опухолевых клеток, клетки SKOV3ip1 (1 × 10) вводили внутрибрюшинно (в/п). Для групп лечения антителами очищенное моноклональное антитело еженедельно в течение 5 недель вводили в дозе 5 мг/кг массы тела. Во время умерщвления регистрировались масса мыши и опухоли, количество и распределение опухолей. Лица, которые выполняли вскрытия, не имели данных об назначении группы лечения. Образцы тканей фиксировали либо формалином, OCT (Miles, Inc., Элькхарт, штат Индиана) или замораживали в жидком азоте.
Как показано на фиг. 8F, лечение животных SKOV3ip1, имеющих опухоль только с помощью миРНК EGFL6 мыши и в сочетании с человеческой РНК EGFL6 приводило к значительному уменьшению роста опухоли по сравнению с мышами, имеющими опухоль, которые получали контрольную миРНК. миРНК EGFL6 человека сама по себе не оказала большого влияния на уменьшение опухоли. Эффект EGFL6 на количество опухолевых узелков и наблюдаемую опухолевую нагрузку представлен на фиг. 8F. Мыши OVCAR5, имеющие опухоль, леченые только миРНК EGFL6 мыши и в сочетании с миРНК EGFL6 человека, также продемонстрировали значительное снижение массы опухоли и узелков.
Животные SKOV3ip1, имеющие опухоль, леченые миРНК mEGFL6, и комбинация миРНК EGFL6 мыши и человека продемонстрировали значительное снижение пролиферирующих клеток и плотности микрососудов по сравнению с животными, лечеными контрольной миРНК (фиг. 8C-8D). Животные OVCAR5, имеющие опухоль, также продемонстрировали сходные результаты. Чтобы определить внецелевые эффекты последовательностей миРНК EGFL6 мыши, влияние сайленсинга гена EGFL6 на рост опухоли SKOV3ip1 проверяли с использованием двух других последовательностей миРНК мыши, и обе последовательности продемонстрировали значительное снижение роста опухоли и опухолевых узлов.
Лечение антителами Mab № 135 и № 93 (E2-135 и E2-93) против EGFL6 значительно подавляет рост опухоли (фиг. 8F) и только остаточные раковые клетки были обнаружены у мышей, леченых антителом EGFL6, но у нелеченых контрольных мышей наблюдалась большая опухолевая нагрузка и распространение опухоли, как указано по количеству опухолевых узлов. Лечение антителами против EGFL6 (Mab E2-93 и E2-135) также ингибировало пролиферацию раковых клеток (окрашивание Ki67) и уменьшало плотность микрососудов (опухолевый ангиогенез, ИГС-окрашивание CD31) по сравнению с группами, лечеными контрольным антителом (фиг. 8G).
Пример 8 - Блокирующее антитело против EGFL6 уменьшает ангиогенез в эндотелиальных клетках
Чтобы продемонстрировать, что блокирование EGFL6 влияет на его ангиогенные опосредованные функции, функциональное блокирующее антитело EGFL6 было разработано и проверено на его активность в отношении ангиогенеза. Несколько клонов антител EGFL6, связывающихся с EGFL6 человека и мыши, были скринированы с сопоставимой аффинностью. Два антитела (93 и 135) соответствовали всем аффинности связывания, и критерии активности in vitro были выбраны для проведения дальнейших исследований. Как показано на фиг. 8B, лечение эндотелиальных клеток рекомбинантным белком EGFL6 увеличивало экспрессию как фосфорилированных Tie2, так и AKT-белков. В отличие от этого, EGFL6-блокирующие антитела 93 и 135 приводили к уменьшению экспрессии обоих фосфорилированных белков. Как показано на фиг. 8D-E, лечение эндотелиальных клеток рекомбинантным белком EGFL6 усиливало миграцию и образование трубок в этих клетках. Тем не менее, EGFL6-опосредованные функциональные эффекты образования и миграции трубок значительно снижались с помощью блокирующих антител против EGFL6.
Одно из антител было подвергнуто гуманизации, при которой оно помещалось в ген IgG1 человека, чтобы можно было использовать у пациентов, больных раком человека, и было продемонстрировано, что после гуманизации сохраняется аффинность связывания и активность антитела in vitro.
Пример 9 - Блокирующее антитело против EGFL6 имело антиангиогенез и противоопухолевое действие в моделях рака яичника
Активность in vitro EGFL6, описанная выше, продемонстрировала, что блокирующая функция EGFL6 повысит способность повреждать опухолевые сосуды, тем самым увеличивая противоопухолевую эффективность. Чтобы проверить это, была исследована способность антитела EGFL6 блокировать активность EGFL6 и ингибировать ангиогенез, рост и ангиогенез опухоли.
Мыши SKOV3-ip1, имеющие опухоль лечили контрольным антителом и антителами против EGFL6. После 5 недель лечения опухоли собирали и анализировали на противоопухолевую и антиангиогенную активность. Лечение антителами против EGFL6 приводило к сильной противоопухолевой активности по сравнению с лечением контрольным антителом. Лечение антителами 93 и 135 против EGFL6 приводило к значительному уменьшению массы опухоли и опухолевых узлов (фиг. 9E и 9F). Животные, леченые блокирующим антителом EGFL6, также продемонстрировали снижение MVD по сравнению с группами, получавшими контрольные антитела (фиг. 9F), указывая, что блокирование активности EGFL6 ингибирует рост и ангиогенез опухоли. Антитела EGFL6 не предотвращали заживление ран in vitro или in vivo (фиг. 9G), демонстрируя, что они могут регулировать ангиогенез опухоли, не влияя на нормальное восстановление тканей.
V. Вариабельные последовательности антител
Вариабельные последовательности ДНК антител против EGFL6 представлены ниже.
>E1-33H
CAGTCGCTGGAGGAGTCCGAGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCTGCAAAGCCTCTGGACTCGACCTCAGTAGCTACTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTTATGCTGGTAGTAGTGGTAGCACTTACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGGTGGTGGTAGTACTTATGCTCAATATTTTAACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCAG (SEQ ID NO: 133)
>E1-33K
GAGCTCGATATGACCCANACACCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCAGCATCAATTGCCAGTCCAGTCCGAGTGTTTATAGGCACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACTGGGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGAATATGCTAGTGATAGTGATAATCATTTCGGCGGAGGGACCGAGCTGGAGATCCTAG (SEQ ID NO: 134)
>E1-34H
GAGCAGTCGGTGAAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCTGCACAGCTTCTGGATTCTCCTTCAGTAGTATTTATTGGATATGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTTGATCGCATGCATTCAGATTACTAGTGGTATCACTTACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAATGTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGTCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGGGAGAAGGGGATATGGTGCCTATGCTGGTACTGGTGCCTCTGACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCTTCAG (SEQ ID NO: 135)
>E1-34K
GAGCTCGATCTGACCCAGACTGCATCGTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACCGTCACCATCAATTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAATAACAACAACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACGAAGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTATTGTGCAGGCGGTTATGCTGGCTACATTTGGGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAG (SEQ ID NO: 136)
>E1-80H
GAGCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGTTCCAGCCTGGGGGATCCCTGGCACTCACCTGCAAAGCCTCTGGATTCACCCTCAATAGTTATTATATGTCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATGCATTGATAGTGATAGTCCTACTACGACTGCCTACGCGAACTGGGCGAGAGGCCGATTCACCATCTCCAAGACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGGCTATGGTCCTGTTCGATTGGATCTCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCTTCAG (SEQ ID NO: 137)
>E1-80K
ACCCAGACACCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCAGCATCAATTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAAGAACGCCTATTTATCCTACTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACTGGGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGCCGAATATAGTAATGATAGTGATAATGGTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGAAATCAAAG (SEQ ID NO: 138)
>E1-89H
GAGCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCTGCGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCGGCTACTGGATATGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATGCATTTATGCTGGTAGTAGTGGTGGGCACATTTATTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCCAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACATATTTCTGTACAAGAGATAATTATGGTGGTGGTGGTTCTGCTTCCAAATTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCTTCAG (SEQ ID NO: 139)
>E1-89K
GAGCTCGTGATGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAACTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAGTAACAACCGCTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGGTCTATTATGCAGCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCGTCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATATGGGACACAGTCCACTCTCACCATCGCCGATGTGGTGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGATATAAAACTGCTGATTCTGATGGTATTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGAAATCAAAG (SEQ ID NO: 140)
>E2-93H
CAGTCGGTGAAGGAGTCCGAGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCTGCAAAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGTTATGGAGTGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCGTATATTGGTCTTAGTAGTGAGATCACTTACTACGCGGGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAGCCCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGTGAGAGATCTTTATCATAGTAATGGTTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCTTCAG (SEQ ID NO: 141)
>E2-93K
GAGCTCGATCTGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCGTCAGTTGCCAGGCCAGTGAGAGCGTTTATAATAATAACCGCTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCGTGCAATGTGCTGATGCTGCCACGTATTATTGTGTAGCCTTTAAAGGTTATGGTACTGACGGCAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGAAATCAAAG (SEQ ID NO: 142)
>E1-38H
GAGCAGTCGGTGAAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCTTCAATAGCGGCTACTGGGTATGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCTTGCATCTATACTAGTAGTCCTACTGGTGCCATATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCCAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTACAAGAGATAATTTTGGTGGTGGTGGTTCTGCTTCCAAATTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCTTCAG (SEQ ID NO: 143)
>E1-38K
GAGCTCGTGATGACCCAGACTCCATCTTCCAAGTCTGTCCCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCGATTGCCAGGCCAGTGAGAGTGTTTATAGTAACAACCGCTGTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCGTCGCGGTTCAAATGCAGTGGATCTGGGACACGGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGAAGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGATATAAGACTGCCGATTCTGATGGTCTTGGTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 144)
>E1-52H
GAGCAGTCGGTGAAGGAGTCCGAGGGAGACCTGGTCAAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCGCCTGCACAGCTTCTGGATTCACCCTCAGTAGCTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGCATGCATTGATACTGATAATGATATTAGGACTGCCTACGCGAGCTGGGCGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGGACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGGGAGAGGCTATGGTGCGCTTCGGTTGGATCTCTGGGGCCAGGGCCCCTGGTCACCGTCTCTTCAG (SEQ ID NO: 145)
>E1-52K
GAGCTCGATCTGACCCAGACACCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCAGCATCAATTGCCAGTCCAGTCCGAGTGTTTATAGGCACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACTGGGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGAATATGCTAGTGATAGTGATAATCATTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGAAATCAAAG (SEQ ID NO: 146)
>E2-36H
CAGTCGGTGAAGGAGTCCGAGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTACCACATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGAATCATTAATAATTATGGTGCCACATACTACGCGAGCTGGGCAAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAAGTCCTGGGATTCCTGGTTATAATTCGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCAG (SEQ ID NO: 147)
>E2-36K
GAGCTCGATCTGACCCAGACTCCATCTTCCACGTCTGCGGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAACTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAGTTACAACCGCTTATCCTGGTTTCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACGAAGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGGTTATGATTGTAGGAGTTCTGATTGTGATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGAAATCAAAC (SEQ ID NO: 148)
>E1-95H
AGCAGTTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCCGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCAATTCAATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATGCATTGCTAGTAGTAGTAGTCATAGTACTTACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACATGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGATTCTGGTAATCGTGGTTACCTTTATGCGGGCGACTTTAACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCTTCAG (SEQ ID NO: 149)
>E1-95K
GAGCTCGTGCTGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAATAGTTGGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGTCCCAAACTCCTGATCTACGAAGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAGTTATAGTAATGTTGATAATAATATTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAG (SEQ ID NO: 150)
>E2-116H
CAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCGACCTCAGTAGCTCCTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGTCTGTATTGACGGTGGTGGGGGTGAGCCCACTGCCTACCCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCGTCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTTCAAATGACCAGTCTGACAGTCGCGGACACGGCCACGTATTTCTGTGCGAGACGAGATGCTGGTGCTGGGAACGCCTTTAGCTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCAG (SEQ ID NO: 151)
>E2-116K
GAGCTCGATATGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAGTTGCCAGTCCAGTCAAAGTGTTTATCTTCAGAACAACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAGGGCGGTTACAGTGGATATATCAATTCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGAAATCAAAG (SEQ ID NO: 152)
>E2-135H
CAGTCGGTGAAGGAGTCCGAGGGAGACCTGGTCAAGCCTGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCAAAGCCTCTGGATTCGACTTCAGTAGCAGCTACTTTATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAGGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTTATACTGTTATTAGTCGTAAGACTTATTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGGCGACCACGGTGGATCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGATCGGCAACAATTGAAAGATTGGATCTCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG (SEQ ID NO: 153)
>E2-135K
GAGCTCGATCTGACCCAGACTCCATCGCCCGTGTCTGCACCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGAGTGTTTATAATAACTACCGCTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTAATCTATGCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCGCCATCAGCGATGTGGTGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGTAGGATATAAAAGTGGTTATATTGATAGTATTCCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAG (SEQ ID NO: 154)
>E1-142H
CAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCTGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCACAGCTTCTGGATTCACCATCAATAACTACAACATTAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCACGTATTTGGAATGGTGATGGCAGCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTACAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAAATTTTAACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCTTCAG (SEQ ID NO: 155)
>E1-142K
GAGCTCGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGTCCAGTGCGAGTGTTTATAGTAACAACTACTTATCCTGGTTTCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCCCCTGATCTATTATGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTTAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGATTATAGTAGTAGTAGTGATATGTGTATTTTCGGCGGAGGGACCGAGCTGGAAATCAAAG (SEQ ID NO: 156)
Вариабельные аминокислотные последовательности антител против EGFL6 представлены ниже.
>E1-33H
QSLEESEGGLVQPEGSLTLTCKASGLDLSSYYYMCWVRQAPGKGLEWIACIYAGSSGSTYYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARGGGSTYAQYFNLWGPGTLVTISS (SEQ ID NO: 157)
>E1-33L
ELDMTTPASVSAAVGGTVSINCQSSPSVYRHYLSWYQQKPGQPPKLLIYWASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISGVQCDDAATYYCAGEYASDSDNHFGGGTELEIL (SEQ ID NO: 158)
>E1-34H
EQSVKESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFSFSSIYWICWVRQAPGKGLELIACIQITSGITYYASWAKGRFTISKMSSTTVTLQMTSLTVADTATYFCGRRGYGAYAGTGASDLWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 159)
>E1-34L
ELDLTQTASSVSAAVGGTVTINCQSSQSVYNNNNLAWYQQKPGQPPKLLIYEASKLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCAGGYAGYIWAFGGGTEVVVK (SEQ ID NO: 160)
>E1-80H
EQSVEESGGGLFQPGGSLALTCKASGFTLNSYYMSWVRQAPGKGLEWIGCIDSDSPTTTAYANWARGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARGYGPVRLDLWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 161)
>E1-80LK
TQTPASVSAAVGGTVSINCQSSQSVYKNAYLSYYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCAAEYSNDSDNGFGGGTEVEIK (SEQ ID NO: 162)
>E1-89H
EQSLEESGGDLVKPEGSLTLTCAASGFSFSSGYWICWVRQAPGKGLEWIGCIYAGSSGGHIYYATWAKGRFTISQTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCTRDNYGGGGSASKLWGPGTLVTISS (SEQ ID NO: 163)
>E1-89L
ELVMTQTPSPVSAAVGGTVTINCQSSQSVYSNNRLAWYQQKPGQPPKLLVYYAATLASGVPSRFKGSGYGTQSTLTIADVVCDDAATYYCAGYKTADSDGIAFGGGTEVEIK (SEQ ID NO: 164)
>E2-93H
QSVKESEGGLVQPEGSLTLTCKASGFSFSSYGVNWVRQAPGKGLEWIAYIGLSSEITYYAGWAKGRFTISKPSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCVRDLYHSNGLWGPGTLVTISS (SEQ ID NO: 165)
>E2-93L
ELDLTQTPSPVSAAVGGTVTVSCQASESVYNNNRLSWYQQKPGQPPKLLIYYASTLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISSVQCADAATYYCVAFKGYGTDGNAFGGGTEVEIK (SEQ ID NO: 166)
>E1-38H
EQSVKESGGDLVKPEGSLTLTCTASGFSFNSGYWVCWVRQAPGKGLEWIACIYTSSPTGAIYYATWAKGRFTISQTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCTRDNFGGGGSASKLWGPGTLVTISS (SEQ ID NO: 167)
>E1-38L
ELVMTQTPSSKSVPVGGTVTIDCQASESVYSNNRCAWYQQKPGQPPKLLIYYASTLASGVPSRFKCSGSGTRFTLTISGVQCEDAATYYCAGYKTADSDGLGFGGGTEVEIK (SEQ ID NO: 168)
>E1-52H
EQSVKESEGDLVKPEGSLTLACTASGFTLSSYYMCWVRQAPGKGLEWIACIDTDNDIRTAYASWARGRFTISRTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCGRGYGALRLDLWGQGTLVTISS (SEQ ID NO: 169)
>E1-52L
ELDLTQTPASVSAAVGGTVSINCQSSPSVYRHYLSWYQQKPGQPPKLLIYWASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISGVQCDDAATYYCAGEYASDSDNHFGGGTEVEIK (SEQ ID NO: 170)
>E2-36H
QSVKESEGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYHMGWVRQAPGKGLEYIGIINNYGATYYASWAKGRFTISRTSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARSPGIPGYNSWGPGTLVTISS (SEQ ID NO: 171)
>E2-36L
ELDLTQTPSSTSAAVGGTVTINCQSSQNVYSYNRLSWFQQKPGQPPKLLIYEASKLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCAGGYDCRSSDCDAFGGGTEVEIK (SEQ ID NO: 172)
>E1-95H
SSSVEESGGDLVKPGASLTLTCTASGFSFSSNSMCWVRQAPGKGLEWIGCIASSSSHSTYYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADMATYFCARDSGNRGYLYAGDFNLWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 173)
>E1-95L
ELVLTQTPASVEVAVGGTVTINCQASQSINSWLSWYQQKPGQRPKLLIYEASTLASGVSSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQQGYSYSNVDNNIFGGGTEVVVK (SEQ ID NO: 174)
>E2-116H
QSLEESGGGLVKPEGSLTLTCTASGFDLSSSYYMCWVRQAPGKGLEWIVCIDGGGGEPTAYPSWAKGRFTVSKTSSTTVTLQMTSLTVADTATYFCARRDAGAGNAFSLWGPGTLVTISS (SEQ ID NO: 175)
>E2-116L
ELDMTQTPSPVSAAVGGTVTISCQSSQSVYLQNNLAWYQQKPGQPPKLLIYYASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQGGYSGYINSFGGGTEVEIK (SEQ ID NO: 176)
>E2-135H
QSVKESEGDLVKPGASLTLTCKASGFDFSSSYFMCWVRQAPGRGLEWIACIYTVISRKTYYASWAKGRFTISKTSATTVDLQMTSLTAADTATYFCARSATIERLDLWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 177)
>E2-135L
ELDLTQTPSPVSAPVGGTVTINCQASESVYNNYRLSWYQQKPGQPPKLLIYAASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLAISDVVCDDAATYYCVGYKSGYIDSIPFGGGTEVVVK (SEQ ID NO: 178)
>E1-142H
QSLEESGGDLVKPGASLTLTCTASGFTINNYNINWVRQAPGKGLEWIARIWNGDGSTYYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARNFNLWGPGTLVTISS (SEQ ID NO: 179)
>E1-142L
ELVLTQTPSPVSAAVGGTVTINCQSSASVYSNNYLSWFQQKPGQPPKPLIYYASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCAGDYSSSSDMCIFGGGTELEIK (SEQ ID NO: 180)
* * *
Все способы, раскрытые и заявленные в данном документе, могут быть осуществлены и выполнены без излишних экспериментов в свете данного раскрытия. Хотя композиции и способы по данному изобретению были описаны с точки зрения предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области техники будет очевидно, что вариации могут применяться к способам и стадиям или в последовательности этапов описанного способа без отступа от концепции, сущности и объема изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что некоторые агенты, которые являются как химически, так и физиологически родственными, могут быть заменены агентами, описанными в данном документе, в то время как будут достигнуты одинаковые или сходные результаты. Все подобные аналогичные замены и модификации, очевидные для специалистов в данной области техники, считаются находящимися в пределах сущности, объема и концепции изобретения, что определено прилагаемой формулой изобретения.
Ссылки
Следующие ссылки, в той степени, в которой они предоставляют примерные процедурные или другие детали, дополняющие приведенные в данном документе, специально включены в данный документ посредством ссылки.
Заявка на патент США № 2002/0172677
Заявка на патент США № 2004/0126828
Заявка на патент США № 2005/0214860
Патент США № 3817837
Патент США № 3850752
Патент США № 3939350
Патент США № 3996345
Патент США № 4196265
Патент США № 4275149
Патент США № 4277437
Патент США № 4366241
Патент США № 4469797
Патент США № 4472509
Патент США № 4606855
Патент США № 4703003
Патент США № 4742159
Патент США № 4767720
Патент США № 4816567
Патент США № 4867973
Патент США № 4870287
Патент США № 4938948
Патент США № 4946778
Патент США № 5021236
Патент США № 5091513
Патент США № 5164296
Патент США № 5196066
Патент США № 5223409
Патент США № 5403484
Патент США № 5420253
Патент США № 5565332
Патент США № 5571698
Патент США № 5627052
Патент США № 5656434
Патент США № 5739169
Патент США № 5760395
Патент США № 5770376
Патент США № 5789208
Патент США № 5801005
Патент США № 5821337
Патент США № 5824311
Патент США № 5830880
Патент США № 5844091
Патент США № 5846945
Патент США № 5858657
Патент США № 5861155
Патент США № 5871907
Патент США № 5969108
Патент США № 6054297
Патент США № 6165464
Патент США № 6365157
Патент США № 6406867
Патент США № 6709659
Патент США № 6709873
Патент США № 6753407
Патент США № 6814965
Патент США № 6849259
Патент США № 6861572
Патент США № 6875434
Патент США № 6881557
Патент США № 6891024
Патент США № 6946646
Ali-Fehmi et al., Expression of cyclooxygenase-2 in advanced stage ovarian serous carcinoma: correlation with tumor cell proliferation, apoptosis, angiogenesis, and survival. American journal of obstetrics and gynecology 192, 819-825, 2005.
Baluk et al., Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer. Current opinion in genetics & development 15, 102-111, 2005.
Buckanovich et al. Tumor vascular proteins as biomarkers in ovarian cancer. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology 25, 852-861, 2007.
Chim et al. EGFL6 promotes endothelial cell migration and angiogenesis through the activation of extracellular signal-regulated kinase. The Journal of biological chemistry 286, 22035-22046, 2011.
Donninger et al., Whole genome expression profiling of advance stage papillary serous ovarian cancer reveals activated pathways. Oncogene 23, 8065-8077, 2004.
Halder et al., Focal adhesion kinase targeting using in vivo short interfering RNA delivery in neutral liposomes for ovarian carcinoma therapy. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 12, 4916-4924, 2006.
Landen et al., Therapeutic EphA2 gene targeting in vivo using neutral liposomal small interfering RNA delivery. Cancer research 65, 6910-6918, 2005.
Langley et al., Tissue-specific microvascular endothelial cell lines from H-2K(b)-tsA58 mice for studies of angiogenesis and metastasis. Cancer Research 63, 2971-2976, 2003.
Lu et al., Gene alterations identified by expression profiling in tumor-associated endothelial cells from invasive ovarian carcinoma. Cancer research 67, 1757-1768, 2007.
Lu et al., Regulation of tumor angiogenesis by EZH2. Cancer cell 18, 185-197, 2010.
Oberauer et al.,,EGFL6 is increasingly expressed in human obesity and promotes proliferation of adipose tissue-derived stromal vascular cells. Molecular and cellular biochemistry 343, 257-269, 2010.
Sood et al.,, Molecular determinants of ovarian cancer plasticity. American Journal of Pathology 158, 1279-1288, 2001.
Thaker et al., Chronic stress promotes tumor growth and angiogenesis in a mouse model of ovarian carcinoma. Nature medicine 12, 939-944, 2006.
Yeung et al., Cloning of a novel epidermal growth factor repeat containing gene EGFL6: expressed in tumor and fetal tissues. Genomics 62, 304-307, 1999.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  THE BOARD OF REGENTS OF THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM
<120>  EGFL6-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130>  UTFH.P0324WO
<140>  Неизвестно
<141>  2017-02-06
<150>  62/291987
<151>  2016-02-05
<160>  180
<170>  PatentIn версии 3.5
<210>  1
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  1
ggactcgacc tcagtagcta ctactac                                           27
<210>  2
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  2
atttatgctg gtagtagtgg tagcact                                           27
<210>  3
<211>  42
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  3
gcgagaggtg gtggtagtac ttatgctcaa tattttaact tg                          42
<210>  4
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  4
Gly Leu Asp Leu Ser Ser Tyr Tyr Tyr
1               5
<210>  5
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  5
Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr
1               5
<210>  6
<211>  14
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  6
Ala Arg Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Ala Gln Tyr Phe Asn Leu
1               5                   10
<210>  7
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  7
ggattctcct tcagtagtat ttattgg                                           27
<210>  8
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  8
attcagatta ctagtggtat cact                                              24
<210>  9
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  9
agaaggggat atggtgccta tgctggtact ggtgcctctg acttg                       45
<210>  10
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  10
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ile Tyr Trp
1               5
<210>  11
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  11
Ile Gln Ile Thr Ser Gly Ile Thr
1               5
<210>  12
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  12
Arg Arg Gly Tyr Gly Ala Tyr Ala Gly Thr Gly Ala Ser Asp Leu
1               5                   10                  15
<210>  13
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  13
ggattcaccc tcaatagtta ttat                                              24
<210>  14
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  14
attgatagtg atagtcctac tacg                                              24
<210>  15
<211>  33
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  15
gcgagaggct atggtcctgt tcgattggat ctc                                    33
<210>  16
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  16
Gly Phe Thr Leu Asn Ser Tyr Tyr
1               5
<210>  17
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  17
Ile Asp Ser Asp Ser Pro Thr Thr
1               5
<210>  18
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  18
Ala Arg Gly Tyr Gly Pro Val Arg Leu Asp Leu
1               5                   10
<210>  19
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  19
ggattctcct tcagtagcgg ctactgg                                           27
<210>  20
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  20
atttatgctg gtagtagtgg tgggcac                                           27
<210>  21
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  21
tgtacaagag ataattatgg tggtggtggt tctgcttcca aattg                       45
<210>  22
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  22
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Trp
1               5
<210>  23
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  23
Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Gly His
1               5
<210>  24
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  24
Cys Thr Arg Asp Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Lys Leu
1               5                   10                  15
<210>  25
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  25
ggattctcct tcagtagtta tgga                                              24
<210>  26
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  26
attggtctta gtagtgagat c                                                 21
<210>  27
<211>  30
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  27
gtgagagatc tttatcatag taatggtttg                                        30
<210>  28
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  28
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr Gly
1               5
<210>  29
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  29
Ile Gly Leu Ser Ser Glu Ile
1               5
<210>  30
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  30
Val Arg Asp Leu Tyr His Ser Asn Gly Leu
1               5                   10
<210>  31
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  31
ggattctcct tcaatagcgg ctactgg                                           27
<210>  32
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  32
atctatacta gtagtcctac tggtgcc                                           27
<210>  33
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  33
tgtacaagag ataattttgg tggtggtggt tctgcttcca aattg                       45
<210>  34
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  34
Gly Phe Ser Phe Asn Ser Gly Tyr Trp
1               5
<210>  35
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  35
Ile Tyr Thr Ser Ser Pro Thr Gly Ala
1               5
<210>  36
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  36
Cys Thr Arg Asp Asn Phe Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Lys Leu
1               5                   10                  15
<210>  37
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  37
ggattcaccc tcagtagcta ctac                                              24
<210>  38
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  38
attgatactg ataatgatat tagg                                              24
<210>  39
<211>  33
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  39
gggagaggct atggtgcgct tcggttggat ctc                                    33
<210>  40
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  40
Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr Tyr
1               5
<210>  41
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  41
Ile Asp Thr Asp Asn Asp Ile Arg
1               5
<210>  42
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  42
Gly Arg Gly Tyr Gly Ala Leu Arg Leu Asp Leu
1               5                   10
<210>  43
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  43
ggattctccc tcagtagcta ccac                                              24
<210>  44
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  44
attaataatt atggtgccac a                                                 21
<210>  45
<211>  33
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  45
gccagaagtc ctgggattcc tggttataat tcg                                    33
<210>  46
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  46
Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr His
1               5
<210>  47
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  47
Ile Asn Asn Tyr Gly Ala Thr
1               5
<210>  48
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  48
Ala Arg Ser Pro Gly Ile Pro Gly Tyr Asn Ser
1               5                   10
<210>  49
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  49
ggattctcct tcagtagcaa ttca                                              24
<210>  50
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  50
attgctagta gtagtagtca tagt                                              24
<210>  51
<211>  51
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  51
gcgagagatt ctggtaatcg tggttacctt tatgcgggcg actttaactt g                51
<210>  52
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  52
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Asn Ser
1               5
<210>  53
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  53
Ile Ala Ser Ser Ser Ser His Ser
1               5
<210>  54
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  54
Ala Arg Asp Ser Gly Asn Arg Gly Tyr Leu Tyr Ala Gly Asp Phe Asn
1               5                   10                  15
Leu
<210>  55
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  55
ggattcgacc tcagtagctc ctactac                                           27
<210>  56
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  56
attgacggtg gtgggggtga gcccact                                           27
<210>  57
<211>  39
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  57
gcgagacgag atgctggtgc tgggaacgcc tttagcttg                              39
<210>  58
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  58
Gly Phe Asp Leu Ser Ser Ser Tyr Tyr
1               5
<210>  59
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  59
Ile Asp Gly Gly Gly Gly Glu Pro Thr
1               5
<210>  60
<211>  13
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  60
Ala Arg Arg Asp Ala Gly Ala Gly Asn Ala Phe Ser Leu
1               5                   10
<210>  61
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  61
ggattcgact tcagtagcag ctacttt                                           27
<210>  62
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  62
atttatactg ttattagtcg taagact                                           27
<210>  63
<211>  33
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  63
gcgagatcgg caacaattga aagattggat ctc                                    33
<210>  64
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  64
Gly Phe Asp Phe Ser Ser Ser Tyr Phe
1               5
<210>  65
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  65
Ile Tyr Thr Val Ile Ser Arg Lys Thr
1               5
<210>  66
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  66
Ala Arg Ser Ala Thr Ile Glu Arg Leu Asp Leu
1               5                   10
<210>  67
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  67
ggattcacca tcaataacta caac                                              24
<210>  68
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  68
atttggaatg gtgatggcag c                                                 21
<210>  69
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  69
gcgagaaatt ttaacttg                                                     18
<210>  70
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  70
Gly Phe Thr Ile Asn Asn Tyr Asn
1               5
<210>  71
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  71
Ile Trp Asn Gly Asp Gly Ser
1               5
<210>  72
<211>  6
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  72
Ala Arg Asn Phe Asn Leu
1               5
<210>  73
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  73
ccgagtgttt ataggcacta c                                                 21
<210>  74
<211>  9
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  74
tgggcttcc                                                                9
<210>  75
<211>  33
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  75
gcaggcgaat atgctagtga tagtgataat cat                                    33
<210>  76
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  76
Pro Ser Val Tyr Arg His Tyr
1               5
<210>  77
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  77
Trp Ala Ser
1
<210>  78
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  78
Ala Gly Glu Tyr Ala Ser Asp Ser Asp Asn His
1               5                   10
<210>  79
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  79
cagagtgttt ataataacaa caac                                              24
<210>  80
<211>  9
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  80
gaagcatcc                                                                9
<210>  81
<211>  30
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  81
gcaggcggtt atgctggcta catttgggct                                        30
<210>  82
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  82
Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Asn
1               5
<210>  83
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  83
Glu Ala Ser
1
<210>  84
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  84
Ala Gly Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Trp Ala
1               5                   10
<210>  85
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  85
aagaacgcct atttatccta ctac                                              24
<210>  86
<211>  9
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  86
tgggcttcc                                                                9
<210>  87
<211>  33
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  87
gcagccgaat atagtaatga tagtgataat ggt                                    33
<210>  88
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  88
Lys Asn Ala Tyr Leu Ser Tyr Tyr
1               5
<210>  89
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  89
Ala Ala Glu Tyr Ser Asn Asp Ser Asp Asn Gly
1               5                   10
<210>  90
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  90
cagagtgttt atagtaacaa ccgc                                              24
<210>  91
<211>  9
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  91
tatgcagcc                                                                9
<210>  92
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  92
gcaggatata aaactgctga ttctgatggt attgct                                 36
<210>  93
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  93
Gln Ser Val Tyr Ser Asn Asn Arg
1               5
<210>  94
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  94
Tyr Ala Ala
1
<210>  95
<211>  12
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  95
Ala Gly Tyr Lys Thr Ala Asp Ser Asp Gly Ile Ala
1               5                   10
<210>  96
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  96
gagagcgttt ataataataa ccgc                                              24
<210>  97
<211>  9
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  97
tatgcatcc                                                                9
<210>  98
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  98
gtagccttta aaggttatgg tactgacggc aatgct                                 36
<210>  99
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  99
Glu Ser Val Tyr Asn Asn Asn Arg
1               5
<210>  100
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  100
Tyr Ala Ser
1
<210>  101
<211>  12
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  101
Val Ala Phe Lys Gly Tyr Gly Thr Asp Gly Asn Ala
1               5                   10
<210>  102
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  102
gagagtgttt atagtaacaa ccgc                                              24
<210>  103
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  103
gcaggatata agactgccga ttctgatggt cttggt                                 36
<210>  104
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  104
Glu Ser Val Tyr Ser Asn Asn Arg
1               5
<210>  105
<211>  12
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  105
Ala Gly Tyr Lys Thr Ala Asp Ser Asp Gly Leu Gly
1               5                   10
<210>  106
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  106
ccgagtgttt ataggcacta c                                                 21
<210>  107
<211>  33
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  107
gcaggcgaat atgctagtga tagtgataat cat                                    33
<210>  108
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  108
Pro Ser Val Tyr Arg His Tyr
1               5
<210>  109
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  109
Ala Gly Glu Tyr Ala Ser Asp Ser Asp Asn His
1               5                   10
<210>  110
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  110
cagaatgttt atagttacaa ccgc                                              24
<210>  111
<211>  9
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  111
gaagcatcc                                                                9
<210>  112
<211>  39
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  112
gcaggcggtt atgattgtag gagttctgat tgtgatgct                              39
<210>  113
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  113
Gln Asn Val Tyr Ser Tyr Asn Arg
1               5
<210>  114
<211>  13
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  114
Ala Gly Gly Tyr Asp Cys Arg Ser Ser Asp Cys Asp Ala
1               5                   10
<210>  115
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  115
cagagcatta atagttgg                                                     18
<210>  116
<211>  39
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  116
caacagggtt atagttatag taatgttgat aataatatt                              39
<210>  117
<211>  6
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  117
Gln Ser Ile Asn Ser Trp
1               5
<210>  118
<211>  13
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  118
Gln Gln Gly Tyr Ser Tyr Ser Asn Val Asp Asn Asn Ile
1               5                   10
<210>  119
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  119
caaagtgttt atcttcagaa caac                                              24
<210>  120
<211>  30
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  120
cagggcggtt acagtggata tatcaattct                                        30
<210>  121
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  121
Gln Ser Val Tyr Leu Gln Asn Asn
1               5
<210>  122
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  122
Gln Gly Gly Tyr Ser Gly Tyr Ile Asn Ser
1               5                   10
<210>  123
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  123
gagagtgttt ataataacta ccgc                                              24
<210>  124
<211>  9
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  124
gctgcatcc                                                                9
<210>  125
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  125
gtaggatata aaagtggtta tattgatagt attcct                                 36
<210>  126
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  126
Glu Ser Val Tyr Asn Asn Tyr Arg
1               5
<210>  127
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  127
Ala Ala Ser
1
<210>  128
<211>  12
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  128
Val Gly Tyr Lys Ser Gly Tyr Ile Asp Ser Ile Pro
1               5                   10
<210>  129
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  129
gcgagtgttt atagtaacaa ctac                                              24
<210>  130
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  130
gcaggcgatt atagtagtag tagtgatatg tgtatt                                 36
<210>  131
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  131
Ala Ser Val Tyr Ser Asn Asn Tyr
1               5
<210>  132
<211>  12
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность CDR
<400>  132
Ala Gly Asp Tyr Ser Ser Ser Ser Asp Met Cys Ile
1               5                   10
<210>  133
<211>  364
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  133
cagtcgctgg aggagtccga gggaggcctg gtccagcctg agggatccct gacactcacc       60
tgcaaagcct ctggactcga cctcagtagc tactactaca tgtgctgggt ccgccaggct      120
ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgc atttatgctg gtagtagtgg tagcacttac      180
tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgtcgac cacggtgact      240
ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gagaggtggt      300
ggtagtactt atgctcaata ttttaacttg tggggcccag gcaccctggt caccatctcc      360
tcag                                                                   364
<210>  134
<211>  331
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (18)..(18)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<400>  134
gagctcgata tgacccanac accagcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcagc       60
atcaattgcc agtccagtcc gagtgtttat aggcactact tatcctggta tcagcagaaa      120
ccagggcagc ctcccaagct cctgatctac tgggcttcca ctctggcatc tggggtccca      180
tcgcggttca gcggcagtgg atctgggaca gagttcactc tcaccatcag cggcgtgcag      240
tgtgacgatg ctgccactta ctactgtgca ggcgaatatg ctagtgatag tgataatcat      300
ttcggcggag ggaccgagct ggagatccta g                                     331
<210>  135
<211>  370
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  135
gagcagtcgg tgaaggagtc cgggggaggc ctggtccagc ctgagggatc cctgacactc       60
acctgcacag cttctggatt ctccttcagt agtatttatt ggatatgctg ggtccgccag      120
gctccaggga aggggctgga gttgatcgca tgcattcaga ttactagtgg tatcacttac      180
tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa tgtcgtcgac cacggtgact      240
ctgcaaatga ccagtctgac agtcgcggac acggccacct atttctgtgg gagaagggga      300
tatggtgcct atgctggtac tggtgcctct gacttgtggg gcccaggcac cctggtcacc      360
gtctcttcag                                                             370
<210>  136
<211>  331
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  136
gagctcgatc tgacccagac tgcatcgtcc gtgtctgcag ctgtgggagg caccgtcacc       60
atcaattgcc agtccagtca gagtgtttat aataacaaca acttagcctg gtatcagcag      120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tacgaagcat ccaaactggc atctggggtc      180
ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcggcgtg      240
cagtgtgacg atgctgccac ttactattgt gcaggcggtt atgctggcta catttgggct      300
ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa g                                     331
<210>  137
<211>  355
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  137
gagcagtcgg tggaggagtc cgggggaggc ctgttccagc ctgggggatc cctggcactc       60
acctgcaaag cctctggatt caccctcaat agttattata tgtcctgggt ccgccaggct      120
ccagggaagg ggctggagtg gatcggatgc attgatagtg atagtcctac tacgactgcc      180
tacgcgaact gggcgagagg ccgattcacc atctccaaga cctcgtcgac cacggtgact      240
ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gagaggctat      300
ggtcctgttc gattggatct ctggggccag ggcaccctgg tcaccgtctc ttcag           355
<210>  138
<211>  334
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  138
acccagacac cagcctccgt gtctgcagct gtgggaggca cagtcagcat caattgccag       60
tccagtcaga gtgtttataa gaacgcctat ttatcctact acttagcctg gtatcagcag      120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tactgggctt ccactctggc atctggggtc      180
ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacgtg      240
cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcagccgaat atagtaatga tagtgataat      300
ggtttcggcg gagggaccga ggtggaaatc aaag                                  334
<210>  139
<211>  370
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  139
gagcagtcgt tggaggagtc cgggggagac ctggtcaagc ctgagggatc cctgacactc       60
acctgcgcag cctctggatt ctccttcagt agcggctact ggatatgctg ggtccgccag      120
gctccaggga aggggctgga gtggatcgga tgcatttatg ctggtagtag tggtgggcac      180
atttattacg cgacctgggc gaaaggccga ttcaccatct cccaaacctc gtcgaccacg      240
gtgactctgc aaatgaccag tctgacagcc gcggacacgg ccacatattt ctgtacaaga      300
gataattatg gtggtggtgg ttctgcttcc aaattgtggg gcccaggcac cctggtcacc      360
atctcttcag                                                             370
<210>  140
<211>  337
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  140
gagctcgtga tgacccagac tccatccccc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc       60
atcaactgcc agtccagtca gagtgtttat agtaacaacc gcttagcctg gtatcagcag      120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctggtc tattatgcag ccactctggc atctggggtc      180
ccgtcgcggt tcaaaggcag tggatatggg acacagtcca ctctcaccat cgccgatgtg      240
gtgtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcaggatata aaactgctga ttctgatggt      300
attgctttcg gcggagggac cgaggtggaa atcaaag                               337
<210>  141
<211>  346
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  141
cagtcggtga aggagtccga gggaggcctg gtccagcctg agggatccct gacactcacc       60
tgcaaagcct ctggattctc cttcagtagt tatggagtga actgggtccg ccaggctcca      120
gggaaggggc tggagtggat cgcgtatatt ggtcttagta gtgagatcac ttactacgcg      180
ggctgggcga aaggccgatt caccatctcc aagccctcgt cgaccacggt gactctgcaa      240
atgaccagtc tgacagccgc ggacacggcc acctatttct gtgtgagaga tctttatcat      300
agtaatggtt tgtggggccc aggcaccctg gtcaccatct cttcag                     346
<210>  142
<211>  337
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  142
gagctcgatc tgacccagac tccatccccc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc       60
gtcagttgcc aggccagtga gagcgtttat aataataacc gcttatcctg gtatcagcag      120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tattatgcat ccactctggc atctggggtc      180
ccatcgcggt tcagcggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcagcgtg      240
caatgtgctg atgctgccac gtattattgt gtagccttta aaggttatgg tactgacggc      300
aatgctttcg gcggagggac cgaggtggaa atcaaag                               337
<210>  143
<211>  370
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  143
gagcagtcgg tgaaggagtc cgggggagac ctggtcaagc ctgagggatc cctgacactc       60
acctgcacag cctctggatt ctccttcaat agcggctact gggtatgctg ggtccgccag      120
gctccaggga aggggctgga gtggatcgct tgcatctata ctagtagtcc tactggtgcc      180
atatactacg cgacctgggc gaaaggccga ttcaccatct cccaaacctc gtcgaccacg      240
gtgactctgc aaatgaccag tctgacagcc gcggacacgg ccacctattt ctgtacaaga      300
gataattttg gtggtggtgg ttctgcttcc aaattgtggg gcccaggcac cctggtcacc      360
atctcttcag                                                             370
<210>  144
<211>  336
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  144
gagctcgtga tgacccagac tccatcttcc aagtctgtcc ctgtgggagg cacagtcacc       60
atcgattgcc aggccagtga gagtgtttat agtaacaacc gctgtgcctg gtatcagcag      120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tattatgcat ccactctggc atctggggtc      180
ccgtcgcggt tcaaatgcag tggatctggg acacggttca ctctcaccat cagcggcgtg      240
cagtgtgaag atgctgccac ttactactgt gcaggatata agactgccga ttctgatggt      300
cttggtttcg gcggagggac cgaggtggaa atcaaa                                336
<210>  145
<211>  354
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  145
gagcagtcgg tgaaggagtc cgagggagac ctggtcaagc ctgagggatc cctgacactc       60
gcctgcacag cttctggatt caccctcagt agctactaca tgtgctgggt ccgccaggct      120
ccagggaagg ggctggaatg gatcgcatgc attgatactg ataatgatat taggactgcc      180
tacgcgagct gggcgagggg ccgattcacc atctccagga cctcgtcgac cacggtgact      240
ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgg gagaggctat      300
ggtgcgcttc ggttggatct ctggggccag ggcccctggt caccgtctct tcag            354
<210>  146
<211>  331
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  146
gagctcgatc tgacccagac accagcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcagc       60
atcaattgcc agtccagtcc gagtgtttat aggcactact tatcctggta tcagcagaaa      120
ccagggcagc ctcccaagct cctgatctac tgggcttcca ctctggcatc tggggtccca      180
tcgcggttca gcggcagtgg atctgggaca gagttcactc tcaccatcag cggcgtgcag      240
tgtgacgatg ctgccactta ctactgtgca ggcgaatatg ctagtgatag tgataatcat      300
ttcggcggag ggaccgaggt ggaaatcaaa g                                     331
<210>  147
<211>  343
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  147
cagtcggtga aggagtccga gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc       60
tgcacagtct ctggattctc cctcagtagc taccacatgg gctgggtccg ccaggctcca      120
gggaaggggc tggaatacat cggaatcatt aataattatg gtgccacata ctacgcgagc      180
tgggcaaaag gccgattcac catctccaga acctcgacca cggtggatct gaaaatgacc      240
agtctgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcca gaagtcctgg gattcctggt      300
tataattcgt ggggcccagg caccctggtc accatctcct cag                        343
<210>  148
<211>  340
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  148
gagctcgatc tgacccagac tccatcttcc acgtctgcgg ctgtgggagg cacagtcacc       60
atcaactgcc agtccagtca gaatgtttat agttacaacc gcttatcctg gtttcagcag      120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tacgaagcat ccaaactggc atctggggtc      180
ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcggcgtg      240
cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcaggcggtt atgattgtag gagttctgat      300
tgtgatgctt tcggcggagg gaccgaggtg gaaatcaaac                            340
<210>  149
<211>  373
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  149
agcagttcgg tggaggagtc cgggggagac ctggtcaagc ccggggcatc cctgacactc       60
acctgcacag cctctggatt ctccttcagt agcaattcaa tgtgctgggt ccgccaggct      120
ccagggaagg ggctggagtg gatcggatgc attgctagta gtagtagtca tagtacttac      180
tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgtcgac cacggtgact      240
ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac atggccacct atttctgtgc gagagattct      300
ggtaatcgtg gttaccttta tgcgggcgac tttaacttgt ggggcccagg caccctggtc      360
accgtctctt cag                                                         373
<210>  150
<211>  334
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  150
gagctcgtgc tgacccagac tccagcctct gtggaggtag ctgtgggagg cacagtcacc       60
atcaattgcc aggccagtca gagcattaat agttggttat cctggtatca gcagaaacca      120
gggcagcgtc ccaaactcct gatctacgaa gcatccactc tggcatctgg ggtctcatcg      180
cggttcagtg gcagtggatc tgggacacag ttcactctca ccatcagcgg cgtgcagtgt      240
gacgatgctg ccacttacta ctgtcaacag ggttatagtt atagtaatgt tgataataat      300
attttcggcg gagggaccga ggtggtggtc aaag                                  334
<210>  151
<211>  361
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  151
cagtcgttgg aggagtccgg gggaggcctg gtcaagcctg agggatccct gacactcacc       60
tgcacagcct ctggattcga cctcagtagc tcctactaca tgtgctgggt ccgccaggct      120
ccagggaagg ggctggagtg gatcgtctgt attgacggtg gtgggggtga gcccactgcc      180
tacccgagct gggcgaaagg ccgattcacc gtctccaaaa cctcgtcgac cacggtgact      240
cttcaaatga ccagtctgac agtcgcggac acggccacgt atttctgtgc gagacgagat      300
gctggtgctg ggaacgcctt tagcttgtgg ggcccaggca ccctggtcac catctcctca      360
g                                                                      361
<210>  152
<211>  331
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  152
gagctcgata tgacccagac tccatccccc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc       60
atcagttgcc agtccagtca aagtgtttat cttcagaaca acttagcctg gtatcagcag      120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tattatgcat ccactctggc atctggggtc      180
tcatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacctg      240
gagtgtgacg atgctgccac ttactactgt cagggcggtt acagtggata tatcaattct      300
ttcggcggag ggaccgaggt ggaaatcaaa g                                     331
<210>  153
<211>  355
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  153
cagtcggtga aggagtccga gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc       60
tgcaaagcct ctggattcga cttcagtagc agctacttta tgtgctgggt ccgccaggct      120
ccagggaggg ggctggagtg gatcgcatgc atttatactg ttattagtcg taagacttat      180
tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcggcgac cacggtggat      240
ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gagatcggca      300
acaattgaaa gattggatct ctggggccag ggcaccctgg tcaccgtctc ctcag           355
<210>  154
<211>  337
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  154
gagctcgatc tgacccagac tccatcgccc gtgtctgcac ctgtgggagg cacagtcacc       60
atcaattgcc aggccagtga gagtgtttat aataactacc gcttatcctg gtatcagcag      120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctaatc tatgctgcat ccactctggc atctggggtc      180
ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcgccat cagcgatgtg      240
gtgtgtgacg atgctgccac ttactactgt gtaggatata aaagtggtta tattgatagt      300
attcctttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaaag                               337
<210>  155
<211>  334
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  155
cagtcgttgg aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc       60
tgcacagctt ctggattcac catcaataac tacaacatta actgggtccg ccaggctcca      120
gggaaggggc tggagtggat cgcacgtatt tggaatggtg atggcagcac atactacgcg      180
agctgggcga aaggccgatt caccatctcc aaaacctcgt cgaccacggt gactctacaa      240
atgaccagtc tgacagccgc ggacacggcc acctatttct gtgcgagaaa ttttaacttg      300
tggggcccag gcaccctggt caccatctct tcag                                  334
<210>  156
<211>  337
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид
<400>  156
gagctcgtgc tgacccagac tccatctccc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc       60
atcaattgcc agtccagtgc gagtgtttat agtaacaact acttatcctg gtttcagcag      120
aaaccagggc agcctcccaa gcccctgatc tattatgcat ccactctggc atctggggtc      180
ccatcgcggt ttaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacgtg      240
cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcaggcgatt atagtagtag tagtgatatg      300
tgtattttcg gcggagggac cgagctggaa atcaaag                               337
<210>  157
<211>  121
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  157
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Leu Asp Leu Ser Ser Tyr Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50                  55                  60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Ala Gln Tyr Phe Asn Leu Trp Gly
100                 105                 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115                 120
<210>  158
<211>  109
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  158
Glu Leu Asp Met Thr Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Val Ser Ile Asn Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Tyr Arg His Tyr
20                  25                  30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Trp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys
65                  70                  75                  80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Glu Tyr Ala Ser Asp Ser
85                  90                  95
Asp Asn His Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Leu
100                 105
<210>  159
<211>  123
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  159
Glu Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ile
20                  25                  30
Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu
35                  40                  45
Ile Ala Cys Ile Gln Ile Thr Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50                  55                  60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Met Ser Ser Thr Thr Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Gly Arg Arg Gly Tyr Gly Ala Tyr Ala Gly Thr Gly Ala Ser Asp Leu
100                 105                 110
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  160
<211>  110
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  160
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Ala Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn
20                  25                  30
Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Ala Gly
85                  90                  95
Tyr Ile Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100                 105                 110
<210>  161
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  161
Glu Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Phe Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Ala Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asn Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Cys Ile Asp Ser Asp Ser Pro Thr Thr Thr Ala Tyr Ala Asn Trp
50                  55                  60
Ala Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Tyr Gly Pro Val Arg Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  162
<211>  111
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  162
Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Ser
1               5                   10                  15
Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Lys Asn Ala Tyr Leu Ser
20                  25                  30
Tyr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val
65                  70                  75                  80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Glu Tyr Ser Asn
85                  90                  95
Asp Ser Asp Asn Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  163
<211>  123
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  163
Glu Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly
20                  25                  30
Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Gly His Ile Tyr Tyr Ala
50                  55                  60
Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Thr Ser Ser Thr Thr
65                  70                  75                  80
Val Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr
85                  90                  95
Phe Cys Thr Arg Asp Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Lys Leu
100                 105                 110
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115                 120
<210>  164
<211>  112
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  164
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Ser Asn
20                  25                  30
Asn Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Val Tyr Tyr Ala Ala Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Gln Ser Thr Leu Thr Ile Ala Asp Val
65                  70                  75                  80
Val Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Lys Thr Ala
85                  90                  95
Asp Ser Asp Gly Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  165
<211>  115
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  165
Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr Gly
20                  25                  30
Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala
35                  40                  45
Tyr Ile Gly Leu Ser Ser Glu Ile Thr Tyr Tyr Ala Gly Trp Ala Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Pro Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu Gln
65                  70                  75                  80
Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg
85                  90                  95
Asp Leu Tyr His Ser Asn Gly Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Ile Ser Ser
115
<210>  166
<211>  112
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  166
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Val Ser Cys Gln Ala Ser Glu Ser Val Tyr Asn Asn
20                  25                  30
Asn Arg Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
65                  70                  75                  80
Gln Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Ala Phe Lys Gly Tyr
85                  90                  95
Gly Thr Asp Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  167
<211>  123
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  167
Glu Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Ser Gly
20                  25                  30
Tyr Trp Val Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Ala Cys Ile Tyr Thr Ser Ser Pro Thr Gly Ala Ile Tyr Tyr Ala
50                  55                  60
Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Thr Ser Ser Thr Thr
65                  70                  75                  80
Val Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr
85                  90                  95
Phe Cys Thr Arg Asp Asn Phe Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Lys Leu
100                 105                 110
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115                 120
<210>  168
<211>  112
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  168
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Lys Ser Val Pro Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Asp Cys Gln Ala Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asn
20                  25                  30
Asn Arg Cys Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50                  55                  60
Lys Cys Ser Gly Ser Gly Thr Arg Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Gln Cys Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Lys Thr Ala
85                  90                  95
Asp Ser Asp Gly Leu Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  169
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  169
Glu Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Ala Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Cys Ile Asp Thr Asp Asn Asp Ile Arg Thr Ala Tyr Ala Ser Trp
50                  55                  60
Ala Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Gly Arg Gly Tyr Gly Ala Leu Arg Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Ile Ser Ser
115
<210>  170
<211>  110
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  170
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Ser Ile Asn Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Tyr Arg His
20                  25                  30
Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln
65                  70                  75                  80
Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Glu Tyr Ala Ser Asp
85                  90                  95
Ser Asp Asn His Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  171
<211>  114
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  171
Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr His
20                  25                  30
Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35                  40                  45
Ile Ile Asn Asn Tyr Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50                  55                  60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65                  70                  75                  80
Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Pro
85                  90                  95
Gly Ile Pro Gly Tyr Asn Ser Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile
100                 105                 110
Ser Ser
<210>  172
<211>  113
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  172
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Asn Val Tyr Ser Tyr
20                  25                  30
Asn Arg Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Asp Cys
85                  90                  95
Arg Ser Ser Asp Cys Asp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210>  173
<211>  124
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  173
Ser Ser Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Asn
20                  25                  30
Ser Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Cys Ile Ala Ser Ser Ser Ser His Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50                  55                  60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Ser Gly Asn Arg Gly Tyr Leu Tyr Ala Gly Asp Phe Asn
100                 105                 110
Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  174
<211>  111
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  174
Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Trp
20                  25                  30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Glu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys
65                  70                  75                  80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Tyr Ser Asn
85                  90                  95
Val Asp Asn Asn Ile Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100                 105                 110
<210>  175
<211>  120
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  175
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Glu Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Leu Ser Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Val Cys Ile Asp Gly Gly Gly Gly Glu Pro Thr Ala Tyr Pro Ser Trp
50                  55                  60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Asp Ala Gly Ala Gly Asn Ala Phe Ser Leu Trp Gly Pro
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115                 120
<210>  176
<211>  110
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  176
Glu Leu Asp Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Leu Gln
20                  25                  30
Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu
65                  70                  75                  80
Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Tyr Ser Gly
85                  90                  95
Tyr Ile Asn Ser Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  177
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  177
Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Phe Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Cys Ile Tyr Thr Val Ile Ser Arg Lys Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50                  55                  60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ala Thr Thr Val Asp
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Ala Thr Ile Glu Arg Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  178
<211>  112
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  178
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Pro Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Val Tyr Asn Asn
20                  25                  30
Tyr Arg Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Ala Ile Ser Asp Val
65                  70                  75                  80
Val Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gly Tyr Lys Ser Gly
85                  90                  95
Tyr Ile Asp Ser Ile Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100                 105                 110
<210>  179
<211>  111
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  179
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Asn Tyr Asn
20                  25                  30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala
35                  40                  45
Arg Ile Trp Asn Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu Gln
65                  70                  75                  80
Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg
85                  90                  95
Asn Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
100                 105                 110
<210>  180
<211>  112
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  180
Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Ala Ser Val Tyr Ser Asn
20                  25                  30
Asn Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Pro
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val
65                  70                  75                  80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Asp Tyr Ser Ser
85                  90                  95
Ser Ser Asp Met Cys Ile Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<---