КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ КОНЪЮНКТИВИТОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ВИРУСОМ ГЕРПЕСА I СЕМЕЙСТВА КОШАЧЬИХ
COMPOSITIONS AND METHODS USED FOR PREVENTING AND TREATING CONJUNCTIVITES ASSOCIATED WITH FELINE HERPES VIRUS I

Родственные заявки
Эта заявка претендует на приоритет заявки на патент США серийный No. 11/805,813, зарегистрированной 24 мая 2007, которая представляет собой частично продолжающуюся заявку, претендующую на все преимущества предварительной заявки на патент США серийный No. 11/544, 120, зарегистрированной 6 октября 2006, которая претендует на приоритет предварительной заявки на патент США серийный No. 60/724, 214, зарегистрированной 6 октября 2005, раскрытия которых включены в этот документ путем отсылки во всей своей полноте.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение в целом имеет отношение к пробиотикам и, в особенности, к применению пробиотиков для улучшения врожденного и приобретенного иммунитета, для усиления эффективности вакцины, снижения заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I, и предупреждения или лечения конъюнктивитов.
Уровень техники
Пробиотики можно определить как живые микроорганизмы, которые, при введении в необходимом количестве, приносят пользу для здоровья хозяина. Исходя из теоретических оценок, пробиотики могут передавать свои полезные для здоровья свойства как путем увеличения устойчивости организма к заселению слизистых оболочек патогенными бактериями (устойчивость к заселению), так и оказывая прямое воздействие на связанную с кишечником лимфоидную ткань (GALT), активируя образование иммуномодуляторов.
Пробиотики применяются для модуляции динамики развития разнообразных инфекционных заболеваний при лечении заболеваний человека. Напротив, в области лечения заболеваний животных проводилось мало исследований. Большинство ветеринарных исследований проводили для крупных животных, у них пробиотики применяли для изменения высевания патогенных микроорганизмов с калом или для улучшения параметров продуктивности, таких как прирост массы, конверсия кормов и снижение падежа.
В одном из исследований на животных сравнивали группу щенков, вакцинированных вирусом собачьей чумы (CDV) и получавших Enterococcus faecium штамм NCEMB 10415 (SF68), с контрольной группой, которая получала только вакцинацию. У щенков, дополнительно получавших SF68, была увеличена концентрация общего IgA в сыворотке и в кале, увеличена концентрация CDV-специфичного IgG и IgA в сыворотке и увеличен процент циркулирующих в крови В-лимфоцитов по сравнению с контрольными щенками, что доказывает индуцированное этим пробиотиком усиление влияния на иммунитет.
Вирус герпеса кошек 1 (FHV-I) представляет собой обычную инфекцию у кошек и чрезвычайно контагиозен среди кошек. FHV-I часто приводит к тяжелому клиническому заболеванию у кошек во всем мире. В острой фазе инфекции может возникнуть лихорадка, чихание, выделение из носа, конъюнктивит, кашель, затрудненное дыхание и смерть. Персистенция FHV-I протекает в форме латентной инфекции после первичной инфекции. После того, как произошло инфицирование вирусом FHV-I, кошки в течение некоторого времени могут находиться в клинически нормальном состоянии, инфекция может быть активирована из-за окучивания, других одновременно протекающих заболеваний и других форм стресса. Рецидивирующий конъюнктивит, кератит, чихание и выделения из носа представляют собой обычные проявления заболевания. Кроме того, в периоды активации, скорости высевания FHV-I высоки, что потенциально может приводить к заражению других кошек.
Вирус панлейкопении кошек (FPV) представляет собой вирус, заражение которым приводит к вирусемии с последующим тяжелым желудочно-кишечным заболеванием. Показано, что соответствующим образом вакцинированные котята имеют абсолютный иммунитет. Вирус кошачьего ринотрахеита (FHV-I) и кальциновирус кошек (FCV) представляют собой два вирусных патогена, вовлеченных в этот синдром. Поскольку FCV-вакцины индуцируют >95% относительной эффективности у вакцинированных, по сравнению с невакцинированными контролями после заражения патогенным штаммом, FHV-I вакцины индуцируют только приблизительно 60%-ную относительную защиту. Таким образом, FHV-I остается серьезной проблемой, несмотря на широкомасштабную вакцинацию. Предыдущие попытки улучшения эффективности вакцинации включали интраназальное введение. Однако такое введение приводит к значительным побочным эффектам и генетическому воздействию на вирулентные штаммы, что, в свою очередь, приводит к снижению тяжести заболевания, но не снижает распространенность носительства вируса. Состояние носительства вируса может приводить к рецидиву заболевания или повторному заражению хозяина, а также к переносу вируса на обитателей дома. Были попытки применить множественные терапии хронических инфекций FHV-I, включая интерферон альфа, трефинацию, противовирусные лекарственные препараты, ринотомию, глюкокортикоиды, местные противоотечные лекарственные средства и антибиотики, направленные на вторичные бактериальные инфекции. Однако введение вакцин, содержащих FHV-I, не защищало от инфекции, и в настоящее время не существует лекарственных препаратов, удаляющих FHV-I из организма. Лекарственные препараты, применяемые для лечения перорально, дороги, могут быть неэффективны и могут быть токсичны. Ни одно из этих лечений не способно освободить от хронической вирусной инфекций. Следовательно, рецидивы высевания вируса и клинического заболевания представляют собой обычные явления. Важными для предупреждения и контроля онгерпесвирусной инфекции считаются иммунные ответы, опосредуемые как клетками, так и IgA слизистой.
Конъюнктивит («красный глаз» или «мадрасские глаза») представляет собой воспаление конъюнктивы. Конъюнктивит обычно возникает в результате аллергических реакций или заражения бактериальными или вирусными агентами. Блефароконъюнктивит представляет собой сочетание конъюнктивита с блефаритом (воспалением век). Кератоконъюнктивит представляет собой комбинацию конъюнктивита и кератита (воспаления роговицы).
Хотя существует несколько известных способов воздействия на иммунитет, эффективность вакцины и инфекцию FHV-I, по-прежнему существует необходимость в новых композициях и способах, которые улучшают врожденный и приобретенный иммунитет, для усиления эффективности вакцины и снижения заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I. К тому же, существует необходимость в композициях и способах для предупреждения или лечения конъюнктивитов у животных.
Раскрытие изобретения
Следовательно, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способов и композиций, которые модулируют иммунитет, усиливают эффективность вакцины, снижают заболеваемость, связанную с хроническими инфекциями FHV-I, и служат для предупреждения или лечения конъюнктивитов.
Еще одна цель изобретения заключается в обеспечении способов предупреждения или лечения конъюнктивитов.
Дополнительная цель изобретения заключается в обеспечении изделий промышленного производства в форме наборов, которые содержат комбинации пробиотиков, кормов, лекарственных соединений и устройств, применяемых для улучшения врожденного и приобретенного иммунитета, усиления эффективности вакцин, снижения заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I, и для предупреждения или лечения конъюнктивитов у животных.
Одну или несколько из этих иных целей достигают путем введения пробиотиков животным в количествах, эффективных для одной или нескольких из следующих целей:
улучшение врожденного и приобретенного иммунитета, усиление эффективности вакцин, снижение заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I, и для предупреждения или лечения конъюнктивитов у животных. Пробиотики, примененные в настоящем изобретении, включают, по меньшей мере, один Enterococcus spp., поодиночке или в комбинации с другими пробиотиками, такими как Streptococcus spp; Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Bacillus spp., Bifldobacterium spp. или Saccharomyces spp. В предпочтительных воплощениях пробиотик представляет собой Enterococcus faecium NCIMB 10415 (SF68).
Другие и дополнительные цели, характерные черты и преимущества настоящего изобретения хорошо понятны специалисты в этой области техники.
Краткое описание чертежей
8
Фигура 1. Массы тела (а) и оценки консистенции кала в баллах (b) за время, в течение которого котята получали 150 мг куриных переваров РО (плацебо, n=9) или 150 мг куриных переваров, смешанных с 5×10 КОЕ/день Enterococcus faecium штамм NCIMB 10415 (SF68) (обработка, n=9), ежедневно, начиная с 7-й недели жизни до 27-й недели жизни. Котят вакцинируют подкожно коммерчески доступным, модифицированным, живым FHV-I, на 9-й и 12-й неделе жизни. Прямоугольники и шум (разброс) означают минимум, максимум, среднюю величину и 25-й и 75-й проценты, р>0,05 при всех временных точках.
Фигура 2. Результаты по FHV-1-специфическому IgA в сыворотке (а) и слюне (b) котят, получавших (обработка) или не получавших (плацебо) SF68. Прямоугольники и разброс (шум) означают минимум, максимум, среднюю величину и 25-й и 75-й проценты, р>0,05 для всех временных точек.
Фигура 3. Результаты по FHV-1-специфическому IgG в сыворотке котят, получавших (обработка) или не получавших (плацебо) SF68. Прямоугольники и шум (разброс) означают минимум, максимум, среднюю величину и 25-й и 75-й проценты, р>0,05 для всех временных точек.
Фигура 4. Результаты по FHV-1-специфическому IgG котят, получавших (обработка) или не получавших (плацебо) SF68. Прямоугольники и разброс означают минимум, максимум, среднюю величину и 25-й и 75-й проценты, р>0,05 для всех временных точек.
Фигура 5. Результаты по FHV-1-специфическому IgG котят, получавших (обработка) или не получавших (плацебо) SF68. Прямоугольники и разброс означают минимум, максимум, среднюю величину и 25-й и 75-й проценты, р>0,05 для всех временных точек.
Фигура 6. Общий IgG (а) и IgA (b) в экстрактах кала котят, получавших (обработка) или не получавших (плацебо) SF68. Прямоугольники и разброс означают минимум, максимум, среднюю величину и 25-й и 75-й проценты, р>0,05 для всех временных точек.
Фигура 7. Процент лимфоцитов, дающих сигнал выше порогового значения при измерении методом проточной цитометрии, положительных по CD4 (а) и CD 8 (b) в периферической крови у котят, получавших (обработка) или не получавших (плацебо) SF68. Прямоугольники и разброс означают минимум, максимум, среднюю величину и 25-й и 75-й проценты, указывает на временные точки, в которых величины для группы «обработка» были значительны выше, чем для группы «плацебо».
Осуществление изобретения
Определения
Следующие аббревиатуры могут быть применены в описании изобретения и в примерах: FHV-I - вирус кошачьего ринотрахеита; FCV - калицивирус кошек; FPV - вирус панлейкопении кошек; spp. - виды; ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ; DM - сухая масса; КОЕ - колониеобразующие единицы; кг - килограмм и BW - масса тела.
Термин «животное» означает любое животное, которое может получить пользу от улучшенного врожденного и приобретенного иммунитета, усиленной эффективности вакцины или сниженной заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I, или любое животное, восприимчивое к конъюнктивиту или страдающее от него. Способы и композиции изобретения полезны для множества домашних и не домашних животных, включая птиц, коров, собак, лошадей, кошек, коз, мышей, овец и свиней, и, в особенности, полезны для животных-компаньонов, таких как собачьи и кошачьи, включая собак и кошек.
Термины «приобретенный иммунитет» или «приобретенный иммунный ответ», применяемые в этом документе взаимозаменяемо и в широком смысле, означают иммунный ответ на стимуляцию антигеном, включая развитие иммунологической памяти.
Приобретенный иммунный ответ включает, без ограничений, гуморальный и клеточный иммунитет.
Термины «клеточный иммунитет», или «клеточный иммунный ответ», или «опосредуемый клеткой иммунитет», применяемые в этом документе взаимозаменяемо, означают активацию цитотоксических Т-лимфоцитов или Т-лимфоцитов-хелперов, мононуклеарных клеток и цитокинов в ответ на стимуляцию антигеном. Термин охватывает весь приобретенный иммунитет, который не может быть передан интактному реципиенту с антителами.
Термин «животное-компаньон» означает любое домашнее животное и включает, без ограничений, кошек, собак, кроликов, морских свинок, хорьков, хомяков, мышей, песчанок, лошадей, коров, коз, овец, ослов, свиней и им подобных. Собаки и кошки наиболее предпочтительны, и кошки приводятся в качестве примера в этом документе.
Термин «полный и сбалансированный по питательным веществам корм для домашних и других животных» означает корм, который содержит все известные необходимые питательные вещества в соответствующих количествах и соотношениях, на основании рекомендаций признанных авторитетов в области питания животных, и следовательно, который способен служить единственным источником пищевого рациона для поддержания жизнеспособности или стимуляции продуктивности, без введения дополнительных источников питания. Сбалансированные по питательным веществам кормовые композиции для домашних и других животных широко известны и широко применяются в этой области техники.
Термин «лекарственное средство для лечения конъюнктивита» означает любое соединение, композицию или лекарственный препарат, употребляемые для предупреждения или лечения конъюнктивитов, за исключением композиции настоящего изобретения.
Термин «пищевая добавка» означает изделие, которое предназначено для принятия внутрь, дополнительно к нормальному питанию животного.
Термин «эффективное количество» означает количество соединения, вещества или композиции, эффективной для достижения определенного биологического результата. Это включает, но не ограничивается, модулирование иммунитета, усиление эффективности вакцин или снижение заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I, у животного. Такое эффективное воздействие может быть достигнуто, например, путем введения композиции настоящего изобретения животному.
Термин «пищевое изделие, составленное для применения человеком» означает любую композицию, предназначенную для принятия внутрь человеком.
Термины «гуморальный иммунитет» или «гуморальный иммунный ответ», применяемые в этом документе взаимозаменяемо, означают продукцию молекул иммуноглобулинов в ответ на стимуляцию антигеном.
Термин «совместно с» означает, что один или несколько пробиотиков или других лекарственных соединений или композиций настоящего изобретения вводят животному (1) вместе с кормовой композицией или кормовой добавкой или (2) отдельно, с той же или различной частотой, применяя те же самые или другие способы введения, примерно в то же время или периодически. «Периодически» означает, что лекарственный препарат вводят по схеме применения, подходящей для специфического лекарственного препарата, и что пробиотик вводят животному по стандартной методике, подходящей для определенного животного. «Примерно в то же время» обычно означает, что пробиотик и лекарственное средство вводят в то же время или в течение примерно 72 часов между приемами. «Совместно с» специфически включает схемы введение, в которых лекарственное средство вводят в течение указанного периода и пробиотики вводят в течение неопределенного времени.
Термин «врожденный иммунитет» означает неспецифические механизмы устойчивости организма к патогенам, которые не усиливаются при последующем заражении определенным антигеном.
Термин «модулировать иммунитет» или «модуляция иммунитета» означает любое усиление или ингибирование способности организма создавать врожденный или приобретенный иммунный ответ на стимуляцию антигеном, которое может быть определено с помощью любого способа, применяемого в этой области техники.
Термины «корм для домашних животных», или «кормовая композиция для домашних животных», или «корм для животных», или «кормовая композиция для животных» означают композицию, которая предназначена для принятия внутрь животными, в особенности животными-компаньонами.
Термин «пробиотик (пробиотики)» означает любой организм, в особенности, микроорганизм, который проявляет положительное воздействие на животное-хозяина, такое как улучшение здоровья или устойчивость к заболеванию. Пробиотики могут проявлять одно или несколько из следующих неограничивающих характерных свойств: не патогенны или не токсичны по отношению к хозяину; присутствуют в виде жизнеспособных клеток, предпочтительно в большом числе; способны к выживанию, метаболизму и длительному существованию в кишечной среде (например, устойчивость к низкому рН и желудочно-кишечным кислотам и секретам); способны к адгезии на эпителиальных клетках, в особенности, на эпителиальных клетках желудочно-кишечного тракта; к бактерицидной или бактериостатической активности или влиянию на патогенные бактерии; к антиканцерогенной активности; к иммуномодулирующей активности, в особенности, к усилению иммунитета; к модулирующей активности по отношению к эндогенной флоре; к улучшению состояния урогенитального тракта; к антисептической активности в ранах или вокруг них и к ускорению заживления ран; ослаблению диареи; ослаблению аллергических реакций; ослаблению неонатального некротизирующего энтероколита; ослаблению воспалительного заболевания кишечника; и снижению кишечной проницаемости.
Термин «единая упаковка» означает, что компоненты набора физически связаны в одном или нескольких контейнерах или с одним или несколькими контейнерами, и их рассматривают в качестве единого целого для производства, распределения, продажи или применения. Контейнеры включают, но не ограничивается, пакеты, коробки, бутылки, упаковки в термоусадочной пленке, сшитые скобами или другим способом скрепленные компоненты или их комбинации. Единая упаковка может представлять собой контейнеры с индивидуальными пробиотиками, кормовыми композициями и т.п., физически связанными так, что они рассматриваются в качестве единого целого для производства, распределения, продажи или применения.
Термин «эффективность вакцины» означает способность вакцины вызывать желаемый терапевтический или защитный эффект у животного против специфического патогена. Термин «усиление эффективности вакцины» имеет отношение любому улучшению в способности вакцины вызывать желаемый терапевтический или защитный эффект у животного против специфического патогена, который определяют с помощью любого способа, применяемого в этой области техники.
Термин «виртуальная упаковка» означает, что компоненты набора связаны инструкциями с одним или несколькими физическими или виртуальными компонентами набора, которые инструктируют пользователя, как получить другие компоненты, например, в пакете, содержащем один компонент, и инструкции, рекомендующие пользователю обратиться к веб-сайту, обратиться к записанному на носителе посланию, просмотреть визуальное послание, или обратиться к лицу, ухаживающему за пациентом, или к инструктору, для получения инструкций о том, как применять набор.
Все проценты, приведенные в этом документе, даны к массе композиции на основе сухого веса, если специально не указано другое. Термин «сухой вес» означает, что концентрация ингредиентов в композиции измеряют после того, как любая влага будет удалена из композиции.
Изобретение не ограничено определенными методиками, протоколами и реагентами, описанными в этом документе, поскольку они могут изменяться. Дополнительно, терминология, примененная в этом документе, служит только для целей описания определенных воплощений и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения. Так как применены в этом документе и в прилагаемой формуле изобретения, форма записи в единственном лице включает и множественное лицо, если из контекста не следует обратное. Подобным образом, слова «включают», «включает» и «включающий» следует интерпретировать включительно, чем исключительно.
Если не указано иначе, все технические и научные термины и любые аббревиатуры, примененные в этом документе, имеют те же значения, что обычно понятны среднему специалисту в области техники, к которой имеет отношение изобретение. Хотя любые композиции, способы, изделия промышленного производства или изделия, произведенные другим способом, или материалы, похожие или эквивалентные тем, что описаны в этом документе, могут быть применены при практическом применении настоящего изобретения, предпочтительных композиций, способов, изделий промышленного производства или изделий, произведенных другим способом, или материалов, описанных в этом документе.
Все патенты, патентные заявки, публикации и другие ссылки, процитированные или к которым отсылают в этом документе, включены в этот документ путем отсылок в той степени, в которой это допускается законом. Обсуждение этих ссылок предназначено только для того, чтобы суммировать сделанные в них утверждения. Не было сделано никаких допущений в отношении того, что любой из таких патентов, патентных заявок, публикаций и других ссылок или любая их часть представляет собой соответствующий известный уровень техники для настоящего изобретения, и определенно сохраняется право оспорить достоверность и применимость таких патентов, патентных заявок, публикаций и других ссыпок.
В одном из аспектов настоящее изобретение обеспечивает композиции, применимые для модулирования иммунитета, усиления эффективности вакцин, снижения заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I, и/или для предупреждения или лечения конъюнктивитов у животных. Композиции включают один или несколько пробиотиков в количестве, эффективном для модулирования иммунитета (например, для улучшения врожденного и приобретенного иммунитета), усиления эффективности вакцин, снижения заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I, или для предупреждения или лечения конъюнктивитов у животных.
Не будучи связанными теорией, считают, что введение пробиотиков, таких как Enterococcus faecium NCIMB 10415 (SF68), животному увеличивает число CD4+-лимфоцитов и воздействует на иммунитет и протекание определенных инфекций и заболеваний.
Пробиотики, примененные в настоящем изобретении, включают, по меньшей мере, один из любых подходящих штаммов или подвидов Enterococcus faecium, поодиночке или в комбинации с другими пробиотикам, которые входят в такие рода как Streptococcus., Lactobacillus., Lactococcus., Bacillus, Bifidobacterium или Saccharomyce. Виды Enterococcus faecium включают, без ограничений, Enterococcus faecium, в особенности, Е. faecium штамм NCIMB 10415 (SF68), а также другие Enterococci, такие как Е. faecium DSM 10663 (M74), Е. faecium GHR 017 DSM 7134, Е. faecium CECT 4515, Е. faecium CL15/ATCC 19434, Е. faecium NCIMB 11181/DSM 5464, Е, faecium 1MB 52/DSM 3530, Е. faecium CNCM MA 17/5U, Е. faecium 202 DSM 4788/ATCC53519, Е. faecium 301 DSM 4789/ATCC 55593, Е. faecium ATCC 19434, Е. faecium EF-101 ATCC 19434, и Е. faecium AK 2205 BCCM/LMG S-16555. Виды Streptococcus включают, без ограничений. Streptococcus faecium, Streptococcus thermophilus и Streptococcus salivarus. Виды Lactobacillus включают, без ограничений, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus GG {Lactobacillus rhamnosus или Lactobacillus casei, подвиды rhamnosus), Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii LA1, Lactobacillus acidophilus NCFB 1748, Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus acidophilus NCFM, Lactobacillus acidophilus DDS-I, Lactobacillus delbrueckii, подвиды delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii, подвиды bulgaricus, тип 2038, Lactobacillus acidophilus SBT-2062, Lactobacillus salivarius UCC 118, Lactobacillus paracasei STI1, и Lactobacillus paracasei, подеид, paracasei F 19. Виды Lactococcus включают, без ограничений, Lactococcus lactis и Lactococcus plantarum. Виды Bacillus включают, без ограничений. Bacillus subtilis. Виды Bifidobacterium включают, без ограничений, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium thermophilum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium infantis и Bifidobacterium lactis. Виды Saccharomyces включают, без ограничений, Saccharomyces boulardii (cerevisiae). Пробиотики могут быть прокариотами, эукариотами или археобактериями.
В одном из воплощений композиции изобретения представляют собой кормовые композиции для домашних животных и прочих животных. Они преимущественно включают корма, предназначенные обеспечивать необходимые требования, предъявляемые к кормлению и к кормам, таким как лакомства и игрушки, которые дополняют диету. Необязательно, кормовые композиции для домашних животных и прочих животных могут быть сухой композицией, полувлажной композицией, влажной композицией или любыми их смесями. В особом воплощении композиции составлены для потребления кошачьими, включая, но, не ограничиваясь, домашнюю кошку.
В другом воплощении композиции изобретения представляет собой пищевые изделия, составленные для потребления человеком. Эти композиции преимущественно включают пищу и питательные вещества, предназначенные для обеспечения необходимых потребностей в питании людей, а также другие пищевые добавки, предназначенные для людей. В конкретном воплощении пищевые изделия, составленные для потребления человеком, представляют собой полное и сбалансированное по питательным веществам пищевые изделия.
В другом воплощении композиция представляет собой пищевую добавку, такую как подливка, питьевая вода, напиток, жидкий концентрат, йогурт, порошок, гранулы, пасту, суспензию, жвачку, закуску, угощение, снек, гранулированный продукт, пилюлю, капсулу, таблетку или любую другую форму доставки. Пищевые добавки могут быть составлены специально для потребления определенным животным, таким как животное-компаньон или животное-некомпаньон, в особенности, кошка или человек. В одном из полных воплощений пищевая добавка может включать пробиотики в высокой концентрации, так что добавка может быть введена животному в небольшом количестве или, наоборот, может быть разбавлена перед введением животному. Может потребоваться перемешать пищевую добавку с водой перед введением животному. В одном воплощении добавка находится в пакетике, поодиночке или подмешанная к другим пробиотикам или к другим материалам.
Композиция может быть охлаждена или заморожена. Пробиотики могут быть предварительно смешаны с другими компонентами композиции для обеспечения необходимого полезного количества, могут быть покрыты слоем кормовой композиции для домашних животных, пищевой добавки, или пищевого изделия, составленного для применения человеком, или могут быть добавлены к композиции перед тем, как предложить ее животному, например, применяя порошок или смесь.
2
11
Композиции изобретения включают пробиотики в количестве, эффективном для улучшения врожденного и приобретенного иммунитета, усиления эффективности вакцин, снижения заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I, и/или для предупреждения или лечения конъюнктивитов. Корма для домашних животных и пищевые изделия, составленные для применения человеком, могут быть составлены так, что содержат пробиотики в диапазоне примерно от 10 примерно до 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) на грамм композиции. Пищевые добавки могут быть составлены так, что они будут содержать в несколько раз более высокие концентрации пробиотиков, пригодные для введения животному в форме таблетки, капсулы, жидкого концентрата или других похожих лекарственных форм, или могут быть разбавлены перед введениями, с помощью таких способов как разведение водой, обрызгивание или увлажнение корма для домашних животных, и другие похожие способы введения.
В одном из воплощений концентрация пробиотиков в композиции представляет собой функцию количества, необходимого для модулирования функций иммунитета, включая увеличение доли и/или числа СD4+-лимфоцитов в крови животного. В другом воплощении концентрация пробиотиков в композиции представляет собой функцию количества, необходимого для увеличения концентрации иммуноглобулинов, реактивных в отношении антигенов специфического патогена в сыворотке крови, кале и секретах, таких как молоко, слезы и слюна. Уровень СD4+-лимфоцитов и концентрация иммуноглобулинов в сыворотке крови, кале и секретах, таких как молоко, слезы и слюна животного, могут быть определены с помощью любого способа, понятного и признанного специалистом в этой области техники.
Композиции изобретения могут необязательно включают дополнительные вещества, такие как минералы, витамины, соли, приправы, красители и консерванты. Неограничивающие примеры дополнительных минералов включают кальций, фосфор, калий, натрий, железо, хлор, вор, медь, цинк, магний, марганец, йод, селен и им подобные. Неограничивающие примеры дополнительных витаминов включают витамин А, различные витамины В, витамин С, витамин D, витамин Е и витамин К. Дополнительные пищевые добавки могут также включать, например, ниацин, пантотеновую кислоту, инулин, фолиевую кислоту, биотин, аминокислоты и им подобные.
Композиции изобретения могут необязательно включать одно или несколько дополнительных веществ, которые стимулируют или поддерживают здоровую иммунную систему, или дополнительно модулируют иммунитет. В одном из воплощений композиции изобретения дополнительно включают одно или несколько веществ, эффективных для модулирования иммунитета, усиления эффективности вакцин или снижения заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I, у животных. Такие вещества включают, без ограничений, L-аргинин, стероиды, такие как 7-оксо-дегидроэпиандростерон (7-оксо-DHEA), каротиноиды, такие как альфа- и бета-каротин, антиоксиданты и травы или экстракты трав, такие как астрагал и эхинацея.
В различных воплощениях корм для животных или пищевая добавка композиции изобретения могут включать, на основе сухого веса, примерно от 15% примерно до 50% общего белка, от массы композиции. Материал общего белка может включать растительные белки, такие как соевый, семян хлопчатника и арахисовый белок, или животные белки, такие как казеин, альбумин и мясной белок. Неограничивающие примеры мясного белка, примененного в этом документе, включают свинину, баранину, конину, мясо домашних птиц, рыбу и их смеси.
Композиции могут дополнительно включать жиры, примерно от 5% примерно до 40% на основе сухого веса от массы композиции. Композиции могут дополнительно включать источник углеводов. Композиции могут включать углеводы, примерно от 15% примерно до 60% на основе сухого веса от массы композиции. Неограничивающие примеры таких углеводов включают зерна или крупы, такие как рис, кукуруза, сорго, люцерна, ячмень, соевые бобы, канола, овес, пшеницу и их смеси. Композиции могут также необязательно включать другие материалы, такие как сухая сыворотка и другие побочные продукты переработки молока.
Композиции могут также включать, по меньшей мере, один источник волокон, но не более чем 1% от конечной пищевой композиции. Может быть применено множество растворимых или нерастворимых волокон, как известно средним специалистам в этой области техники. Источником волокон могут быть свекловичный жом (из сахарной свеклы), аравийская камедь, камедь Talha, псиллиум, рисовые отруби, камедь из рожков бобового дерева, цитрусовый жом, пектин, фруктоолигосахарид, дополнительный к короткоцепочечной олигофруктозе, маннаноолигофруктоза, соевые волокна, волокно из люпина, арабиногалактан, галактоолигосахарид, арабиноксилан или их смеси. Альтернативно, источником волокна может быть волокно, поддающееся ферментации. Волокно, поддающееся ферментации, было описано ранее как имеющее полезный эффект на иммунную систему животных-компаньонов. Волокно, поддающееся ферментации, или другие известные специалистам в этой области техники композиции, которые обеспечивают пребиотическую композицию, которая способна усиливать рост пробиотических микроорганизмов в кишечнике, могут также быть включены в композицию с целью усиления пользы, обеспечиваемой настоящим изобретением иммунной системе животного.
В одном из воплощений композиция представляет собой полный и сбалансированный по питательным веществам корм для домашних животных и других животных. В этом контексте, корм для домашних животных может быть влажным кормом, сухим кормом или корм с промежуточным содержанием влаги, что понятно специалистам в области составления и производства кормов для домашних животных. Термин «влажный корм» означает такой корм для домашних животных, который обычно продают в консервных банках или пакетах из фольги, и который имеет содержание влаги обычно в диапазоне примерно от 70% примерно до 90%. Термин «сухой корм» означает такой корм для домашних животных, который представляет собой композицию, сходную с композицией влажного корма, но содержащую ограниченное количество влаги, обычно в диапазоне примерно от 5% примерно до 15%, и, следовательно, представлен, например, небольшими похожими на бисквиты гранулами. Композиции и пищевые добавки могут быть специально составлены для взрослых животных, или для старых или молодых животных, например, составы для «щенков», «котят» или «взрослых». В общем, специализированные составы включают энергетические и питательные потребности, подходящие для животных на разных стадиях развития или разного возраста.
Некоторые аспекты изобретения предпочтительно применяют в комбинации с полным и сбалансированным кормом (например, таким как описан в издании National Research Council, 2006, Nutritional Requirements for Dogs and Cats, National Academy Press, Washington D.C., или в издании Association of American Feed Control Officials, Official Publication 1996). Значит, композиции, включающие пробиотики в соответствии с некоторыми аспектами этого изобретения, предпочтительно применяют вместе с высококачественным коммерческим кормом. Так как применен в этом документе, термин «высококачественный коммерческий корм» означает пищу, произведенную для того, чтобы обеспечить усвояемость ключевых питательных веществ, равную 80% или более, в соответствии, например, с рекомендациями Национального научно-исследовательского совета, приведенными выше для собак и кошек, или следуя рекомендациям Ассоциации американских официальных контролеров по качеству кормов. Подобные высокие стандарты в отношении питательных веществ применяются и для других животных.
Специалисту в этой области техники понятно, как определить соответствующее количество пробиотиков, которое необходимо добавить к данной композиции. Факторы, которые следует принять во внимание, включают тип композиции (например, кормовая композиция для домашних животных, пищевая добавка, или пищевое изделие, составленное для потребления человеком), среднее потребления определенных типов композиций разными животными, и условия производства, в которых получают композицию. Концентрация пробиотиков, в которой их следует вносить в композицию, может быть рассчитана на основе энергетических и пищевых потребностей животного. В соответствии с некоторыми аспектами изобретения, пробиотики могут быть добавлены в любое время в процессе производства и/или приготовления композиции. Это включает, без ограничений, как часть состава кормовой композиции для домашних животных, пищевую добавку, или пищевое изделие, составленное для потребления человеком, или как покрытие, наносимое на кормовую композицию для домашних животных, пищевую добавку, или пищевое изделие, составленное для потребления человеком.
Композиции могут быть выполнены в соответствии с любым способом, применяемым в этой области техники, таким, например, как способ, описанный в книге Waltham Book of Dog and Cat Nutrition, Ed. ATB Edney, раздел, написанный A. Rainbird и озаглавленный как "A Balanced Diet" на страницах 57-74, Pergamon Press Oxford.
В различных воплощениях композиции пробиотики находятся в композиции в качестве ингредиента или в качестве добавки или находятся на композиции, например, нанесены на композицию с помощью распыления.
В другом аспекте изобретение обеспечивает способы модулирования иммунитета, усиления эффективности вакцин и снижения заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I у животного. Способы включают введение животному одного или нескольких пробиотиков в количестве, эффективном для модулирования иммунитета, усиления эффективности вакцин и/или снижения заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I.
Пробиотики вводят с помощью любого способа введения пробиотиков животному. В одном из воплощений пробиотики вводят перорально, применяя композиции настоящего изобретения, включая кормовую композицию для домашних животных или кормовую композицию для животных, пищевую добавку, или пищевое изделие, составленное для потребления человеком.
Если человека инструктируют, как скармливать композицию животному, такая инструкция может иметь вид инструкции, которая обучает и/или информирует человека, о том, что применение композиции может обеспечить и/или обеспечивает сравнительную пользу, например, такую как модуляция иммунитета или усиление эффективности вакцины у животного. Такая инструкция может быть устной инструкцией (например, устной инструкцией, полученной, например, от врача, ветеринара или другого специалиста в области здравоохранения, или по радио или по телевиденью (т.е., из рекламного объявления), или письменной инструкцией (например, письменной инструкцией, полученной, например, от врача, ветеринара или другого специалиста в области здравоохранения (например, из рецептов), от продавцов или организации (например, из рекламных брошюр, проспектов или других инструктирующих рекламных средств), средства массовой информации, передающие информации в виде текстов (например, через Интернет, по электронной почте или с помощью других компьютерных средства информации), и/или из упаковки, связанной с композицией (например, этикетка, находящаяся на контейнере, в который помещена композиция).
Введение может быть проведено по необходимости или по желанию, например, раз в месяц, раз в неделю, ежедневно или чаще, чем один раз в день. Подобным образом, введение может быть проведено через день, через неделю или через месяц, через два дня, две недели или два месяца на третий, через три дня, недели или месяца на четвертый, и т.д. Введение может быть проведено несколько раз за день. При использовании в качестве добавки к обычным питательным потребностям, композиция может быть введена непосредственно животному или, наоборот, присоединена или подмешана к ежедневному корму или пище. Введение в ежедневный корм или еду хорошо известно средним специалистам.
Введение может быть также выполнено на регулярной основе, например, в качестве режима питания животного. Режим питания может включать принуждение животного к регулярному потреблению композиции, включающей один или несколько пробиотиков в количестве, эффективном для модулирования иммунитета или для усиления эффективности вакцины у животного. Регулярное потребление может быть один раз в день, или два, три, четыре или более раз в день, на ежедневной или еженедельной основе. Подобным образом, регулярное введение может быть через день, через неделю, через два дня или через две недели, через три дня, или через три недели, через четыре дня или через четыре недели, или через пять дней или через пять недель, и при таком режиме питания введение может быть проведено несколько раз в день. Цель регулярного введения заключается в обеспечении животного предпочтительной ежедневной дозой пробиотиков, как приведено в качестве примера в этом документе.
В соответствии со способами изобретения введение композиции, включающей один или несколько пробиотиков, включая введение в качестве части режима питания, можно проводить в период времени, длящийся от беременности и на протяжении полного периода жизни животного.
В одном из воплощений пробиотики модулируют врожденный иммунитет у животного. В другом воплощении пробиотик модулирует приобретенный иммунный ответ у животного. В дополнительном воплощении пробиотики усиливают эффективность вакцины, вводимой животному. В другом воплощении пробиотики снижают заболеваемость, связанную с хроническими инфекциями FHV-I. В дополнительном воплощении пробиотики предупреждают или лечат конъюнктивиты. В предпочтительном воплощении пробиотики усиливают эффективность вакцины против FHV-I, FCV и FPV у животного.
В некоторых воплощениях вакцина представляет собой вакцину против вируса панлейкопении кошек, вируса кошачьего ринотрахеита или калицивируса кошек.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы предупреждения или лечения конъюнктивитов у животного. Способы включают введение животному композиции, включающей один или несколько пробиотиков Enterococcus bacteria, в количестве, эффективном для предупреждения или лечения конъюнктивитов.
Пробиотики, применяемые в способах изобретения, представляют собой, по меньшей мере, один из видов Enterococcus faecium spp., предпочтительно Е. faecium, наиболее предпочтительно штамм NCIMB 10415 (SF68), поодиночке или в комбинации с другим пробиотиком, включая один или несколько Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Bacillus spp., Bifidobacterium spp. или Saccharomyces spp., таких как описаны в этом документе.
5
12
7
9
8
Ежедневная доза пробиотиков может измеряться в терминах колониеобразующих единиц (КОЕ), вводимых одному животному в день. Ежедневная доза пробиотиков может варьировать примерно от 10 примерно до 10 КОЕ/день. Более предпочтительно, ежедневная доза пробиотиков равна примерно от 10 примерно до 10 КОЕ/день. Более предпочтительно, ежедневная доза пробиотиков равна примерно от 10 примерно до 10 КОЕ/день. Наиболее предпочтительно, ежедневная доза пробиотиков равна примерно 10КОЕ/день. В одном из воплощений пробиотики вводят совместно с одним или несколькими лекарственными средствами для лечения конъюнктивита.
В особом воплощении различные способы настоящего изобретения имеют отношение к членам семейства Felidae, семейства кошачьи, к которым изобретение может быть применено в случаях, когда кошка способная получить введение пробиотической композиции (например, в зоопарке, в ветеринарных заведениях, охотничьем угодье и им подобных). Помимо домашней кошки, Felis catfus, Felidae включают членов родов: (1) Acinonyx, таких как гепард (A. jubatus), (2) Neofelis, таких как дымчатый леопард (N. nebulosd), (3) Panthera, таких как лев (Р. led), ягуар (Р. опса), леопард (Р. pardus),nsrp (P. tigris); (3) Uncia, таких как снежный барс (U. uncial); (4) Рита, таких как кугуар, горный лев или пума (Р. concolor) и (5) различные виды неодомашненных кошек (Felis), включая, но, не ограничиваясь, калимантанскую кошку (F. badid), каракала (F. caracal), китайскую горную кошку (F. bieti), камышовую кошка (F. chaus), барханного кота (F. margaritd), черноногую кошку (F. nigripes), диких кошек (F. sylvestris, F. lybicd), ягуарунди (F. yagouraroundi), оцелота (F. pardalis), онциллу (F. tigrind), длиннохвостую кошку (F. wieldi), сервала (F. serval), рысь (F. lynx), рысь рыжую (F. rufus), пампасскую кошку (F. colocolo), кошку Жоффруа (F. geqffroyi), андскую кошку (F. jacobitd), манула (F. manuf), чилийскую кошку (F. guignd), бенгальскую кошку (F. bengalensis, F. iriomotensis), суматранскую кошку (F. planiceps), пятнисто-рыжую кошку (F. rubiginosus), вивьеровую кошку (F. viverrina) и золотую кошку (F. aurata). Так как применен в этом документе, термин «кошачьи» имеет отношение к членам семейства кошачьих, если не указано иначе.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает наборы, применяемые для модулирования иммунитета, усиления эффективности вакцин, снижения заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I, и/или для предупреждения или лечения конъюнктивитов у животных. Наборы включают отдельные контейнеры в единой упаковке или отдельные контейнеры в виртуальной упаковке, как соответствует компоненту набора, пробиотик Enterococcus bacteria и, по меньшей мере, одно из следующего: (1) один или несколько различных пробиотиков Enterococcus bacteria, (2) один или несколько ингредиентов, подходящих для потребления животным, (3) одну или несколько вакцин, подходящих для введения животному, (4) один или несколько других типов пробиотиков, (5) одно или несколько лекарственных средств для лечения конъюнктивитов, (6) один или несколько пребиотиков, (7) инструкцию, в которой сообщается, как объединять пробиотики и другие компоненты набора для модулирования иммунитета, усиления эффективности вакцин, снижения заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I, и/или для предупреждения или лечения конъюнктивитов у животных, и (8) инструкцию, в которой сообщается, как применять пробиотики и другие компоненты набора, в особенности, для модулирования иммунитета, усиления эффективности вакцин, снижения заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I, или для предупреждения или лечения конъюнктивитов у животных.
Если набор включает виртуальную упаковку, то набор ограничен инструкцией в виртуальной среде в комбинации с одним или несколькими физическими компонентами набора. Набор содержит пробиотики и другие компоненты в количествах, достаточных для модулирования иммунитета, усиления эффективности вакцин, снижения заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I, или для предупреждения или лечения конъюнктивитов у животных. Обычно, пробиотики и другие подходящие компоненты набора объединяют или смешивают непосредственно перед потреблением или применением животными. Наборы могут содержать компоненты набора в любых различных комбинациях и/или смесях. В одном из воплощений набор содержит упаковку, содержащую один или несколько пробиотиков, и контейнер с кормом для потребления животным. Набор могут содержать дополнительные элементы, такие как устройство для перемешивания пробиотика и ингредиентов или устройство, в которое будет помещена смесь, например, миску для корма. В другом воплощении пробиотики смешивают с дополнительными питательными добавками, такими как витамины и минералы, которые полезны для здоровья животного. В другом воплощении набор содержит пребиотики.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает средства передачи информации об одном или нескольких из следующих пунктов или инструкцию для них: (1) применение пробиотика Enterococcus bacteria для модулирования иммунитета, (2) применение пробиотика Enterococcus bacteria для усиления эффективности вакцины, (3) применение пробиотика Enterococcus bacteria для снижения заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I, (4) применение пробиотика Enterococcus bacteria для предупреждения или лечения конъюнктивитов, (5) смешивание пробиотиков с другими компонентами настоящего изобретения, (6) введение пробиотика животному, одного или в комбинации с другими элементами изобретения, и (7) применение наборов настоящего изобретения для модулирования иммунитета, усиления эффективности вакцин, снижения заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I, или для предупреждения или лечения конъюнктивитов у животных. Это средство включает документ, информацию на цифровом носителе, оптические устройства для хранения информации, звуковое представление информации или визуальный показ информации, содержащие информацию или инструкцию. В некоторых воплощениях средства передачи информации представляют собой выведенный на экран веб-сайт, визуальный интерактивный терминал, брошюру, этикетку на изделии, вкладыш в упаковку, рекламное объявление, рекламный листок, публичное объявление, аудиопленку, видеопленку, DVD, CD-ROM, чип, считываемый компьютером, карточку, считываемую компьютером, диск, считываемый компьютером, компьютерную память или их комбинация, содержащие такую информацию или инструкцию. Полезная информация включает один или несколько из следующих пунктов: (1) способы и методики для объединения и введения пробиотиков и/или других компонентов набора и (2) контактная информация для животных или лиц, ухаживающих за ними, о применении, в случае, если у них есть вопрос об изобретение и его применении. Применяемые инструкции включают количество для смешивания и количество для введения и частоту введения. Средства передачи информации применяют для инструктирования о пользе применения настоящего изобретение и сообщают о проверенных способах введения изобретения животному.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение композиции, включающей один или несколько пробиотиков Enterococcus bacteria для приготовления лекарственного средства. В другом аспекте изобретение обеспечивает применение таких композиций для приготовления лекарственного средства для модулирования иммунитета, усиления эффективности вакцин, снижения заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I, и/или для предупреждения или лечения конъюнктивитов у животных. В целом, лекарственные средства получают с помощью перемешивания одного или нескольких пробиотиков изобретения с эксципиентами, буферными растворами, связующими, пластификаторами, красителями, разбавителями, уплотняющими средствами, смазывающими веществами, ароматизаторами, увлажняющими средствами и другими ингредиентами, известными специалисту в этой области техники как применяемые для получения лекарственных средств и составления лекарственных средств, которые подходят для введения животному. Лекарственное средство содержит пробиотики в количествах, применяемых для модулирования иммунитета, усиления эффективности вакцин, снижения заболеваемости, связанной с хроническими инфекциями FHV-I, и/или для предупреждения или лечения конъюнктивитов у животных.
ПРИМЕРЫ
Изобретение может быть дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, однако, следует понимать, что эти примеры включены только для целей иллюстрации и не предназначенные для ограничения объема изобретения, если специально не указано другое.
Пример 1
Животные и экспериментальные параметры
Популяция кошачьих для исследования. Двадцать шестинедельных котят SPF получали из Liberty Laboratories (Liberty, NY). Методом ELISA (Snap Combo, ШЕХХ Laboratories, Portland, ME) было показано, что котята были сероотрицательны в отношении антигена кошачьего лейкемивируса и антител к вирусу кошачьего иммунодефицита.
9
8
Проведение эксперимента. После 10-дневного периода адаптации, котят случайным образом разделили на две группы по десять котят в каждой и опыт с обработкой начали на 7-ой недели жизни. LBC ME5 PET E. faecium NCIMB 10415 (SF68) (Cerbios-Pharma SA, Switzerland) вводили в количестве от 0,25 до 0,28 г (~5×10 КОЕ на основании подсчета клеток после разведения) в индивидуальные 50-мл конические полипропиленовые центрифужные пробирки, закрывали крышками и хранили при 4°С в течение времени эксперимента. Такие же препараты применяли для аликвот усилителя вкусовой привлекательности (применяли обычное покрытие для корма для домашних животных, включающее печеночный перевар в качестве основного компонента), применяя 150 мг на пробирку. Аликвоты контролировали на поглощение влаги и отбрасывали в случае, если происходило какое-либо образование комочков как пробиотика, так и усилителя вкусовой привлекательности. Непосредственно перед введением одну аликвоту усилителя вкусовой привлекательности переносили в одну из хранившихся пробирок SF68 (группа с обработкой) или в пустую пробирку (группа плацебо) и разводили водопроводной водой комнатной температуры до общего объема, равного 10 мл. Содержимое перемешивали с помощью вортекса, по меньшей мере, в течение трех минут и натягивали в 12-кубиковый шприц. Сразу же после перемешивания суспензии на вортексе, соответствующим котятам вводили перорально по 1 мл или SF68 (общая ежедневная доза 5×10 КОЕ в день), или только усилителя вкусовой привлекательности (котята с плацебо) до их 27-ой недели жизни. Обе группы кормили сухим кормом для котят ad Ubitum (обычная питательная смесь для котят, отвечающая всем требованиям AAFCO и основанная на цыпленке и рисе в качестве основных применяемых ингредиентов) и подгруппы помещали в два отдельных помещения для предотвращения взаимной контаминации пробиотиком. На 9-й и 12-й неделе жизни, всех котят вакцинировали подкожно модифицированной живой комбинированной вакциной (Pfizer Animal Health, Exton, PA) против кошачьего герпесвируса-1, калицивируса и вируса панлейкопении согласно рекомендациям American Association of Feline Practitioners. (Richards Jetal. (2001)).
Статистические оценки. Для каждого набора данных рассчитывали среднее значение в группе для всех измеряемых параметров. Разницу между группой с обработкой пробиотиком и группой с плацебо анализировали, применяя смешанную модель ANOVA, подходящую для эксперимента с многократно повторяющимися измерениями. Время было включено в модель в качестве непрерывной переменной. Процент кошек, позитивных по энтеротоксинам С.perfringens или токсинам А или В С.difficile, и процент дающих сигнал выше порогового клеток, положительных по маркерам клеточной поверхности, рассчитывали для каждой группы кошек на протяжении всего времени эксперимента и сравнивали с помощью двустороннего t-критерия (GRAPHPAD Prism, GRAPHPAD Software, Inc., San Diego, CA). Статистически достоверными данными считали те, где р<0,05.
Пример 2
Перечень образцов и клинический контроль
Состояние и поведение котят контролировали ежедневно на протяжении всего исследования. Массу тела измеряли еженедельно. Кровь, слюну и кал собирали от всех кошек перед началом введения пробиотика или усилителя вкусовой привлекательности на 7-й неделе жизни и на 9, 15, 21 и 27 неделе жизни. Кроме того, у котят в группе с обработкой собирали кал на 28 недели жизни. Для каждой группы котят из общего кошачьего туалета случайным образом отбирали по 5 образцов кала в день и подсчитывали баллы, применяя стандартизированную карточку-таблицу для подсчета баллов, и определяли ежедневные значения для группы. Экстракты кала для измерений на общий IgA и общий IgG подготавливали в соответствии с протоколом, описанными в работе Benyacoub J et al. (2003). До проведения измерений все образцы хранили при -80°С, расфасованными по партиям.
Стул у всех котят был нормальным в начале периода добавок (7-я неделя жизни). По одному котенку было удалено из исследования по причинам, не связанным с экспериментом и, следовательно, они были удалены из заключительного анализа данных. Масса тела и оценки кала в баллах статистически не различались между двумя группами в течение всего времени или в любой индивидуальной временной точке (фигура 1).
Полный общий анализ крови, биохимические параметры и массы тела были одинаковыми между группами кошек в течение всего времени исследования. Оценки кала в баллах были одинаковыми между группами, что также позволяет предположить, что применение SF68 в дозах, описанных в этом документе, не индуцируют никаких заметных клинических отклонений.
Пример 3
Исследование кала
2
Для каждого набора данных кал от каждого котенка высевали в восьми серийных 10-кратных разведениях на KF Streptococcus Agar и инкубировали в течение 48 часов при 37°С аэробно. Десять колоний каждого морфологического типа были отобраны, применяя стерильные петли, и помещали в 1,2 мл среды с сердечно-мозговым настоем (BHI) (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), и хранили при -80°С в ожидании анализа. Проводили RAPD-PCR на бактериальных изолятах из каждого образца для определения, есть ли жизнеспособные Е. faecium NCEMB 10415 (SF68) в стуле обработанных кошек, и для оценки того, передается ли случайно пробиотик от обработанных котят к контрольным котятам. Параметры термоциклера были следующими: 30 циклов по одной минуте денатурации при 95°С, одна минута отжига при 40°С, четыре минуты элонгация при 72°С. 25,5 мкл реакционной среды включали 2,45 мкл 10 х свободного от магния буфера (100 мМ Трис-HCl, рН 8,3, 500 мМ КС1), 3,22 мМ MgCl, 0,4 мкл (1 Ед.), JumpStart Taq ДНК-поимеразы (Sigma D-4184, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, МО), 1,9 мкл dNTP-микс (2,5 мМ), 1 мкл праймер (100 мкМ), 15,47 мкл воды для PCR и 1 мкл бактериальной культуры. Последовательность примененного праймера была следующей: 5'-GGTTGGGTGAGAATTGCACG-3'. От пяти до десяти мкл PCR-продукта анализировали с помощью электрофореза в двухпроцентном агарозном геле, и образцы разделения сравнивали с положительным SF68 контролем. Коммерчески доступные наборы для ELISA применяли для определения того, присутствуют ли энтеротоксины Clostridium perfringens или токсины А/В С.difficile в кале всех котят(С.perfringens (ELISA, Kit No. 92-000-22) и С, difficile (ELISA, Kit No. 94-0150-KT), Techlabs, Blacksburg, VA.). Рутинные определения аэробных культур для Salmonella spp.и Campylobacter spp. в кале проводили в диагностической лаборатории университета Колорадо (Colorado State University Diagnostic Laboratory).
Кал семи из девяти обработанных кошек был положительным по SF68, по меньшей мере, в одной временной точке в ходе исследования. Однако SF68 ДНК не была амплифицирована из кала какой-либо обработанной кошки через 1 неделю после прекращения введения добавки (неделя 28). Из кала не были выделены ни Salmonella spp., ни Campylobacter spp. Все образцы от кошек плацебо были отрицательными по SF68 согласно RAPD PCR. Число положительных образцов токсинов А/В С.difficile или энтеротоксина С.perfringens (таблица 1) не варьирует между группами в течение курса исследования.
Выделение Salmonella spp. и Campylobacter spp. не было индуцировано добавлением SF68. Несколько образцов кала в обеих группах котят были положительными по токсинам С.difficile или С.perfringens; однако не было значительной разницы в числе положительных образцов между группами и положительные результаты не коррелировали с наличием диареи. SF68 был обнаружен в кале большинства обработанных кошек в период получения добавки, но больше не обнаруживался в кале через 1 неделю после прекращения получения добавки, указывая на то, что организм персистировал в кошках только временно. Таким образом, введение SF68, при применении дозировки, описанной в этом документе, не имело вредного влияния, и было безопасным для введения во время исследованного периода.
Пример 4
Иммунологические исследования
Общий анализ крови, биохимические показатели в сыворотке и анализ мочи проводили лаборатории клинической патологии Колорадского университета. Антиген-специфические гуморальные иммунные ответы определяли путем измерения сывороточного FHV-1-специфичного IgG, FHV-1-специфичного IgA, FCV-специфичного IgG и специфичного для панлейкопения кошек IgG в сыворотке, а также уровня FHV-I-специфичных IgG и IgA в слюне, с помощью модификаций ранее опубликованных ELISA анализов. (Lappin MR et al. (2002); и Dinner DA et al. (1998). Для FHV-1-специфичных IgG и IgA, результаты рассчитывали как по поглощению тройных тестируемых лунок для каждого образца, так и путем расчета процента единиц ELISA (среднее поглощение анализируемого образца минус среднее поглощение образца негативного контроля / среднее поглощение образца позитивного контроля минус среднее поглощение образца негативного контроля, умноженное на 100). Для FCV и FPV применяли среднее поглощение. Концентрацию общего IgG и IgA в сыворотке, экстрактах кала и слюне оценивали, применяя коммерчески доступные ELISA или анализ методом радиальной иммунодиффузии. (Bethyl Laboaratories, hie., Montgomery, TX).
4
3
-4
6
Клеточные иммунные ответы измеряли с помощью проточной цитометрии и пролиферационного анализа цельной крови. Проточную цитометрию проводили в течение 12 часов после отбора крови, применяя 500 мкл крови, которую предохраняли от свертывания (EDTA) и которую инкубировали при комнатной температуре в буфере для лизиса эритроцитов (0,155 М BHCl/0,010 М KНСО/5 Х 10% Phenol Red (0,5%). Клетки дважды промывали PBS и полученные осадки клеток ресуспендировали в FACS-буфере, содержавшем PBS, 0,1% азид натрия и 2% эмбриональной бычьей сыворотки до достижения концентрации, равной 1×10 клеток/100 мкл, если это возможно. Образцы с недостаточными клетками, по меньшей мере, для 500 мкл вышеуказанной суспензии подсчитывали и концентрацию клеток регистрировали. Сто мкл каждой клеточной суспензии добавляли в индивидуальные лунки в круглодонный 96-луночный планшет для иммуноокрашивания. Неспецифическое связывание блокировали добавлением 10%-ной нормальной кошачьей сыворотки (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA). Иммуноокрашивание проводили при 4°С в темноте в FACS-буфере. Лимфоциты прокрашивали на экспрессию CD4 и CD8 (vpg34; антитела против CD4-FITC, vpg9; антитела против CD8-RPE; Serotec, Raleigh, NC (Oxford, UK)) и на экспрессию CD44 (IM7; антитела против CD44-PE/CY5; Pharmingen, Franklin Lakes, NJ). Для анализа В-клеток, лизированную цельную кровь подвергали иммуноокрашиванию кросс-реактивными антителами к В220 (ra3-b62; антитела к биотинилированному В220; eBioscience, San Diego, CA), CD21 (b-ly4; антитела к CD21-APC; BD-Biosciences, Franklin Lakes, NJ), и МНС класс II (антитела к FITC-меченному МНС класс II; клон CAG5-3D1, Serotec, Raleigh, NC (Oxford, UK)). Клетки для анализа подсчитывали по популяции живых лимфоцитов на основании характеристик прямого и рассеянного света. Данные получали с помощью цитометра Cyan MLE и анализировали с помощью программы Summit software (Dako-Cytomation, Fort Collins, CO).
2
2
Измерения пролиферации проводили в тройных повторах, применяя 10 мкл цельной гепаринизированной крови, подготовленной с помощью инкубации в 100 мкл полной опухолевой среды при 37°С с 5% СО в течение 30 минут перед добавлением митогена или антигена. (Полная опухолевая среда: модифицированная среда Игла, дополненная незаменимыми и заменимыми аминокислотами +10% FBS). Клетки поддерживали только в среде (нестимулированной) или стимулировали конканавалином А (10 мкг/мл: Con A, Sigma-Aldrich, St. Louis, МО), или препаратом FHV-I антигена (1 мкл/лунку, подготовлен перед началом эксперимента и хранился по аликвотам при -80°С) в течение 96 часов при 37°С с 5% СO. (Veir JK et al. (2005)). К клеткам пульсом добавляли 1 µCi меченого тритием тимидина на лунку и собирали через 18 часов на фильтры из стекловолокна (Wallac-Microbeta Perkin-Elmer, Boston, MA). Радиоактивность фильтров регистрировали с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика MicroBetas. Средний индекс стимуляции (средний максимальный счет на стимулированный образец, деленный на средний максимальный счет на нестимулированный образец) рассчитывали для всех образцов.
Общий анализ крови и биохимические показатели были в границах нормы для возрастной группы для всех кошек при всех временных точках. Не было статистических различий между группами в течение всего времени или при каких-либо индивидуальных временных точках среди всех проанализированных измерений. На 21-й и 27-й неделе жизни средний уровень FHV-1-специфичного IgA в сыворотке и слюне был количественно выше в группе с обработкой по сравнению с группой плацебо, но различия не были статистически различимы (фигура 2). На 15-й, 21-й и 27-й неделе жизни средний уровень FHV-1-специфичного сывороточного IgG был количественно выше в группе с обработкой по сравнению с группой плацебо при применении обоих анализов, но различия не представляли собой статистически значимые различия (фигура 3). FHV-I-специфичный IgG не был зарегистрирован в слюне. Уровни FCV-специфичного IgG в сыворотке не отличались в группах (фигура 4). На 15-й недели жизни в группе с обработкой средний уровень FPV-специфичного IgG в сыворотке был количественно выше, чем тот же уровень в группе плацебо, но различия не представляли собой статистически значимые различия (фигура 5).
Концентрации общего IgG и IgA в сыворотке были похожими для обеих групп (данные не приведены). Общий IgG не был обнаружен в слюне, и концентрации общего IgA в слюне были похожими для обеих групп (данные не приведены). На 27-й неделе жизни в группе с обработкой средние концентрации общего IgG в экстрактах кала были количественно выше, чем те же концентрации в группе плацебо, но различия не были статистически значимы (фигура 6). Концентрации общего IgA в экстрактах кала были похожими для обеих групп (фигура 6).
Анализ пролиферации с применением как 10 мкг/мл конканавалина А, так и 1 мкл препарата антигена FHV-I в качестве стимуляторов не обнаружил существенных различий в средних значения максимального счета между группами при любых временных точках. Не было обнаружено статистических различий между группами для какого-либо маркера клеточной поверхности в первых четырех временных точках (фигура 7). На 27-й неделе жизни группа с обработкой (среднее 13,87%) имела существенно более высокий процент зарегистрированных лимфоциты позитивных по CD4, по сравнению с группой плацебо (среднее 10,61%, р=0,0220). Никакие другие сравниваемые параметры не имели существенных различий.
Увеличение в счете CD4+в группе с обработкой по сравнению с группой плацебо без одновременного увеличения в счете CD8+на 27 неделе жизни демонстрирует системные иммуномодулирующие эффекты, вызываемые пробиотиками.
После вакцинации у каждого котенка развивались FHV-I-, FCV- и FPV-ответы специфичных сывороточных антител, которые были похожи на другие исследования, что указывает на то, что они были иммунокомпетентными, и что примененная модифицированная живая вакцина была жизнеспособной (Lappin MR et al. (2002)). Некоторые результаты также указывают на то, что скармливание пробиотика оказывает влияние на гуморальные и опосредуемые клетками иммунные ответы этих котят. Это включает обнаружение статистически значимого повышения счета CD4+лимфоцитов на 27-й неделе жизни и численной увеличение средних величин для FHV-1-специфичного IgA в сыворотке и слюне на 21-й и на 27-й неделе жизни, уровня FHV-1-специфичного IgG в сыворотке на 15-й, 21-й и 27-й неделе жизни, уровня FPV-специфичного IgG в сыворотке на 15-й неделе жизни при сравнении с группой плацебо.
Пример 5
Влияние пробиотика Enterococcus bacteria на конъюнктивит
Молодые взрослые разного пола кошки с хронической FHV-I инфекцией (n=12) были взяты из другого исследования и им вводили или SF68, или плацебо в течение 5,5 месяцев. Кошек ежедневно контролировали на предмет конъюнктивита, чихания и выделения из носа в течение периода адаптации и после введения добавки. В течение периода введения добавки кошек переводили из группового содержания на индивидуальное содержание и хирургически стерилизовали с целью активировать латентную инфекцию FHV-I. Животных контролировали на предмет конъюнктивита.
Результаты показали, что, в целом, конъюнктивит был обычным, появившийся в 122 из 750 (16,3%) и в 210 из 755 (27,8%) наблюдаемых точках для SF68-обработанных кошек и кошек-плацебо, соответственно. В течение периода адаптации, число точек наблюдения, в которых отмечали конъюнктивит, не различался между двумя группами, но после инициации введения SF68 или плацебо, кошки, получавшие SF68, имели существенно меньше случаев конъюнктивита, по сравнению с кошками плацебо в течение каждого периода обработки. Результаты показывают, что SF68 снижает заболеваемость, связанную с хроническими инфекциями FHV-I.
В описании изобретения были раскрыты типичные предпочтительные воплощения изобретения и, хотя были применены специфические термины, их применяли только, в общем, и в описательном смысле, и не для целей ограничения объема изобретения, изложенного в формуле изобретения. Очевидно, что возможно множество модификаций и вариаций изобретения в свете вышеизложенных идей изобретения.
Следовательно, нужно понимать, что в рамках объема изобретения прилагаемая формула изобретение может быть применена на практике, отличной от той, что была описана в этом документе.