ПЛАТФОРМА ДЛЯ ФЕНОТИПИРОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ РАСТЕНИЙ И СПОСОБ ФЕНОТИПИРОВАНИЯ
PLANT BIOTIC AGENT PHENOTYPING PLATFORM AND PROCESS OF PHENOTYPING

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к платформе для фенотипирования биологических возбудителей растений, в частности, платформе для фенотипирования почвенных паразитов, например, корневых паразитов, растительных паразитов (Orobanche), гриба, нематоды, симбиотических организмов. Эта платформа может применяться для определения взаимодействия (например, устойчивости, выносливости…) между растением и почвенным паразитом. Например, эта платформа может применяться для определения растений подсолнечника, которые устойчивы или выносливы по отношению к различным расам Orobanche.
Уровень техники
Orobanche (заразиха) представляют собой травянистые растения, не содержащие хлорофилл. Эти растения полностью зависят от растения-хозяина в отношении питательных элементов, в которых они нуждаются. После прорастания семена Orobanche образуют небольшие корни, которые укрепляются на корнях растения-хозяина и извлекают воду и питательные элементы из упомянутого растения-хозяина. Эти растения называются голопаразитными растениями. В частности, Orobanche Cumana Wallr (Orobanche подсолнечника) паразитирует на корнях и вызывает тяжелые повреждения у подсолнечника (Румыния, Болгария, Турция, Испания, Украина, Россия, Сербия, Венгрия и Франция). Существуют различные расы Orobanche Cumana Wallr, в соответствии с их локализацией. Внутренний опрос показал, что 60% посевной площади Европы (8,5 миллионов га) заражено Orobanche Cumana Wallr, расой E-G (главным образом, в Украине и России), при этом потеря урожая составляет от 10 до 100%. Кроме снижения урожая Orobanche также отвечает за снижение качества растения.
Таким образом, существует необходимость выведения различных сортов растений (в частности, сортов растений подсолнечника), которые могут быть устойчивыми или выносливыми по отношению к различным расам Orobanche.
При отборе подсолнечника в отношении устойчивости или выносливости к Orobanche применяют различные способы тестирования селекционных материалов, например, полевое испытание. Однако этот способ не является надежным, поскольку отсутствует контроль инокулята (фенотипирование основано лишь на семенах, присутствующих в поле в естественных условиях) и существуют различия вследствие выращивания в открытом грунте (средовое влияние, такое как ветер, дождь, температура…). Таким образом, фенотипирование проводится не для определенной расы паразита, а для паразитов, встречающихся в поле.
Таким образом, существует необходимость предоставления устройства и способа для изучения и определения взаимодействия между различными растениями и различными расами почвенных паразитов.
Раскрытие изобретения
Цель настоящего изобретения заключается в предоставлении платформы для фенотипирования биологических возбудителей растений, которая обеспечивает быстрое и надежное определение взаимодействий между различными растениями и различными почвенными паразитами.
Еще одна цель настоящего изобретения заключается в предоставлении средства для фенотипирования, которое обеспечивает контролируемые, точные и однородные условия выращивания для любого типа исследования взаимодействия корень-почва: например, взаимодействия между растениями и паразитами, например: растительным паразитом, нематодой, грибным или бактериальным паразитом, но также и для определения взаимодействия между растением и грибными или бактериальными симбиотическими организмами.
Другая цель элементов заключается также в предоставлении способа, который обеспечивает быстрое и надежное определение взаимодействия между растениями и различными расами почвенного паразита, например, определение устойчивости и выносливости различных растений подсолнечника к различным расам Orobanche.
Дополнительная цель настоящего изобретения заключается также в предоставлении такого способа, который обеспечивает прогноз поведения растений в поле.
Цель настоящего изобретения заключается в обеспечении быстрого скрининга нового разнообразия для нахождения новых источников устойчивости растений к эволюционирующим расам почвенного паразита.
Дополнительная цель настоящего изобретения заключается также в предоставлении платформы для фенотипирования, которая обеспечивает определение рас растительных паразитов в отношении их агрессивности. Цель также заключается в применении данного способа для извлечения после выращивания ДНК и/или РНК Orobanche с целью проведения генотипирования различных рас Orobanche.
Последняя цель настоящего изобретения заключается в применении данной платформы с контролируемой влажностью почвы и температурой почвы и воздуха для фенотипической характеристики растений: засуха, высокая и низкая температура.
Другие цели настоящего изобретения будут обозначены при чтении описания настоящего изобретения, которое следует далее.
Настоящее изобретение относится к платформе для фенотипирования биологических возбудителей растений, содержащей контейнер, герметически закрытый крышкой, ограничивающей внутреннее пространство, разделенное на два пространства:
- нижнее внутреннее пространство, которое содержит по меньшей мере одно средство контроля температуры, погруженное в жидкий теплоноситель; и
- верхнее внутреннее пространство, при этом поверхность жидкого теплоносителя находится на границе между нижним внутренним пространством и верхним внутренним пространством;
крышку, содержащую по меньшей мере одно отверстие, которое приспособлено под установку горшка, и по меньшей мере один горшок, нижняя часть которого находится в верхнем внутреннем пространстве и который приспособлен под прием семян растений и почвенного паразита, предпочтительно на почве, а также под обеспечение роста семян растений и развития таких почвенных паразитов.
Преимущественно присутствие горшка обеспечивает контаминацию корней растений в горшке инокулятом почвенного паразита. Кроме того, это обеспечивает ограничение корней во время выращивания растений, предупреждая контаминацию между корнями различных растений, помещенных в различные горшки платформы. Контаминация приводила бы к ненадежным результатам, как получается в случае фенотипирования при полевом испытании. Контаминацией могла бы быть, например, контаминация корней растения одного горшка, содержащего определенный почвенный паразит, другим почвенным паразитом, содержащимся в другом горшке.
Предпочтительно горшок имеет такой размер, что при помещении его в отверстие горшок имеет заранее определенный объем в верхнем внутреннем пространстве, а глубину горшка и объем жидкого теплоносителя регулируют таким образом, чтобы горшок никогда не контактировал с жидким теплоносителем. Предпочтительно уровень жидкого теплоносителя находится по меньшей мере на расстоянии 1 см от нижней части горшка, предпочтительно на расстоянии 1-4 см.
Предпочтительно горшок имеет такой диаметр, что при помещении его в отверстие он соответствует диаметру отверстия для того, чтобы внутреннее пространство внутри контейнера оставалось герметичным.
Предпочтительно горшок имеет форму трубки и диаметр от 2 до 10 см, предпочтительно от 4 до 6 см, и длину от 3 до 20 см, предпочтительно от 5 до 15 см. Предпочтительно применять горшок в форме трубки для того, чтобы облегчить рост корней. Как правило, она не нарушает развития корней растения и обеспечивает наблюдение за всей корневой системой. Можно применять прозрачную трубку, например, для наблюдения за всей корневой системой. Объем трубки предпочтительно приспособлен к росту корней во время теста.
Предпочтительно платформа настоящего изобретения содержит n количество отверстий, при этом n составляет от 1 до 1000, предпочтительно от 50 до 500, а также m количество горшков, при этом m составляет от 1 до n. Если m меньше, чем n, то платформа дополнительно содержит закрывающие элементы для того, чтобы закрыть любое отверстие, в которое не помещен горшок. Закрывающие элементы имеют размер, который соответствует отверстию, для того, чтобы герметически закрывать отверстия. Платформа также может содержать одинаковое число отверстий и горшков, а неиспользуемые горшки закупорены закрывающими элементами. Предпочтительно в каждый горшок высаживают лишь один тип семян растений и инокулируют лишь один тип почвенного паразита. Таким образом, при применении платформы согласно настоящему изобретению возможно изучение взаимодействия n растений по отношению к одному и тому же почвенному паразиту или n почвенных паразитов по отношению к тому же растению, или от 1 до n растений по отношению к от 1 до n почвенных паразитов.
Предпочтительно горшки сделаны из теплопроводящего материала, например, пластика, полистирола, поливинилхлорида (PVC), полиэтилена или полиэтилена высокой плотности (PHED).
Горшок согласно настоящему изобретению приспособлен содержать питательный субстрат, предпочтительно содержащий торф, например, сфагновый торф, в частности, белый сфагновый торф и удобрение, например, NPK удобрение.
Предпочтительно в платформе согласно настоящему изобретению по меньшей мере один из горшков содержит питательный субстрат, предпочтительно как определено выше.
Предпочтительно в платформе согласно настоящему изобретению горшки содержат семя почвенного паразита или инокулят, помещенный на питательный субстрат.
Согласно настоящему изобретению почвенный паразит означает любого паразита, который может взаимодействовать с корнями растения. Предпочтительно почвенного паразита выбирают из корневого паразита растений и он может представлять собой растение, например, Orobanche, в частности, Orobanche Cumana Wallr; а также гриб, нематоду, бактерию или симбиотический организм, предпочтительно выбранный из микоризы (например, Gigaspora rosea), способствующих росту растений ризобактерий (например, Azospirillum brasilense). Растительный паразит может быть выбран из Orobanche (например, Orobanche ramose, Orobanche ramosa, Orobanche aegyptica, Orobanche Cumana Wallr или Orobanche cernua), стриги (например, Striga hermonthica, Striga hermonthica или Striga hermonthica), нематод (например, мелойдогина), почвенного гриба (например, Verticilium dahlia, ризоптомии или Plasmodiaphora brassicae.
Если почвенный паразит представляет собой растительный паразит, то семена этого растительного паразита высевают в горшок. Если почвенный паразит представляет собой симбиотический организм, гриб, нематоды или бактерии, то соответствующий инокулят может быть непосредственно помещен в горшок перед высеванием семян растений или позже, после высевания, на любой заранее определенной стадии развития растения.
Предпочтительно горшок также может содержать семена растений-хозяев, для которых желательно было бы определить взаимодействие с почвенным паразитом. Растение-хозяина можно выбрать из однодольного или двудольного растения, такого как подсолнечник, рапс, маис, пшеница, рис, сорго, арабидопсис, горох, помидор.
Согласно одному варианту осуществления почвенный паразит представляет собой корневого паразита и предпочтительно Orobanche, в частности, Orobanche Cumana Wallr, а растение-хозяин представляет собой подсолнечник или рапс, предпочтительно подсолнечник.
Платформа согласно настоящему изобретению, например, обеспечивает определение степени взаимодействия между различными растениями и различными расами почвенного паразита. В случае, если почвенный паразит представляет собой, например, Orobanche, то степень взаимодействия соответствует выносливости или устойчивости растений по отношению к различным расам Orobanche. Таким образом, необходимо контролировать однородные условия внутреннего пространства (условия в контейнере) и, в частности, верхнего внутреннего пространства вблизи горшка и в горшке для того, чтобы способствовать росту растения и развитию почвенного паразита. Под условиями, в частности, понимают температуру верхнего внутреннего пространства. Условия вблизи горшка и в горшке являются контролируемыми, однородными и поддерживаются при температуре, которая обеспечивает развитие растений и почвенных паразитов за счет системы для контроля температуры и жидкого теплоносителя. Эти контролируемые условия также могут быть достигнуты с помощью уменьшения диаметра горшка, что обеспечивает проникновение тепла в горшок и таким образом однородность температурных условий в горшке. Система контроля температуры может представлять собой систему контроля нагрева или систему контроля охлаждения, поскольку желательно охлаждать верхнее внутреннее пространство или нагревать верхнее внутреннее пространство в соответствии с температурой окружающей среды и оптимальной температурой для развития корневого паразита. Температуру внутри контейнера можно поддерживать от 5 до 60°C, например, от 20 до 45°C. Например, если почвенный паразит представляет собой Orobanche, то температура в верхнем внутреннем пространстве и в горшке составляет от 26 до 30°C, предпочтительно от 27 до 28°C. Чтобы контролировать температуру, термометры помещают в горшки и необязательно в верхнее внутреннее пространство.
Система контроля температуры может содержать термостат.
Например, систему нагревания выбирают из такой системы, которую обычно применяют в данной области и предпочтительно система контроля нагревания представляет собой электрическое одеяло.
Например, систему охлаждения выбирают из такой системы, которую обычно применяют в данной области и, например, она состоит из системы трубок, наполненных жидким переносчиком, например, смесью воды и гликоля, которую охлаждают наружным блоком.
Согласно конкретному варианту осуществления система контроля температуры представляет собой систему контроля нагревания и, например, электрическое одеяло.
Жидким теплоносителем может быть любая жидкость, которая обеспечивает конвекцию тепла. Жидкий теплоноситель представляет собой не токсичную для растений жидкость и является предпочтительно водой. Систему контроля температуры погружают в жидкий теплоноситель и таким образом она обеспечивает образование определенной атмосферы в верхнем пространстве контейнера, либо водяного пара в случае средства контроля нагревания (подобно "водяной бане"), либо охлажденной атмосферы в случае средства контроля охлаждения. Например, если система контроля температуры представляет собой систему контроля нагревания, а жидкий теплоноситель представляет собой воду, то нагревание воды создает водяной пар вокруг горшка, который является однородным внутри верхнего пространства контейнера и контролируемым. Уровень жидкого теплоносителя в платформе можно контролировать, например, за счет полупрозрачной трубки, помещенной на конце платформы.
При применении платформы согласно настоящему изобретению все условия (температура, полив, внесенные растения и почвенные паразиты…) являются контролируемыми, непредвиденные проблемы из-за окружающей среды (изменения температуры, полива…) отсутствуют.
Предпочтительно влажность внутри горшков также контролируется и оптимизируется в соответствии с природой и происхождением семян, а также с почвенным паразитом для того, чтобы оптимизировать их взаимодействие и приспособить платформу ко всем патосистемам. Контроль сухости или влажности можно выполнять с применением распределителя для контроля влажности почвы. Например, емкостные зонды случайным образом помещают на платформе и соединяют со средством для полива, чтобы активизировать контролируемый полив, когда влажность опускается ниже заранее определенной величины, например, влажность в почве можно контролировать на уровне величины от 5 до 25%.
Определенные и оптимизированные контролируемые условия верхнего пространства контейнера и архитектура платформы и горшков (уменьшенный размер) обеспечивают использование сниженного количества почвенного паразита, по сравнению с другим известным протоколом. Эти определенные и оптимизированные контролируемые условия обеспечивают также анализ большого числа растений и почвенных паразитов и приспособление к оптимальным условиям для развития каждого почвенного паразита. Эта система обеспечивает быстрое выявление растения с низким взаимодействием или выносливостью по отношению к почвенному паразиту, поскольку испытание проводят на ранней стадии развития растений. В платформе применяли небольшие горшки и применяли небольшие количества семян, снижая стоимость каждого испытания. Сниженное количество субстрата в каждом горшке обеспечивает более легкие протоколы деконтаминации.
Предпочтительно контейнер изготовлен из алюминия, поливинилхлорида, полипропилена, полиэтилена, полистирола, предпочтительно алюминия или поливинилхлорида.
Преимущественно контейнер также содержит изоляционный материал, который может быть помещено над системой контроля температуры или между системой контроля температуры и внутренней поверхностью контейнера. Предпочтительно изоляционный материал помещают между системой контроля температуры и внутренней поверхностью контейнера для того, чтобы предупредить износ внутренней поверхности контейнера и повреждения использующих платформу людей вследствие низкой или высокой температуры. Например, изоляционным материалом может быть водянистый ворс.
Предпочтительно длина контейнера составляет от 1 до 3 м и ширина от 50 см до 1 м.
Платформа согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать над контейнером системы для полива, например, состоящие из капельной системы орошения, доставляющей независимым образом контролируемое и равное количество воды в каждый горшок. Она преимущественно обеспечивает однородные условия выращивания, сохранение структуры субстрата, который предполагают помещать в горшок, а также поддержание воздействия температуры на субстрат. Эта капельная система орошения согласно настоящему изобретению предпочтительно состоит по меньшей мере из одной сети трубок, в которых вода течет в двух противоположных направлениях, которые соединяются в центральной части сети. Сеть из трубок содержит также различные распылители, предпочтительно имеется столько распылителей, сколько горшков, и данные распылители размещаются перед каждым горшком. Это особым образом обеспечивает однородное распределение давления в сети. Следовательно, разница между расстоянием от входа в сеть до ближайшего распылителя и от входа в сеть до наиболее удаленного распылителя является как можно меньшей. Таким образом, разница в поливе между каждым горшком снижается.
Применение такой капельной системы орошения обеспечивает доставку необходимого количества воды растению и почвенному паразиту охлаждения горшка. Предпочтительно полив выполняют один раз или два раза в неделю, в частности, один раз в неделю в течение от 20 секунд до 4 минут. Специалист может определить оптимальные условия полива по отношению к растению и внесенному почвенному паразиту.
Предпочтительно средство для полива для одной платформы состоит из 2-10 различных рамп со средствами для полива, как описано выше. Это обеспечивает возможность только рампе поворачиваться перед горшками, а также предупреждать снижение давления и обеспечивать однородный полив различных горшков.
Предпочтительно система полива содержит краны, подающие воду в каждую рампу системы для того, чтобы поливать только применяемые горшки.
Предпочтительно дно горшков перфорировано и наполнено, например, ватными шариками для того, чтобы удалять избыточное количество воды, вызванное поливом, без потери субстрата.
Предпочтительно составляющие платформу элементы могут быть легко деконтаминированы (деконтаминация по отношению к семенам растений и почвенному паразиту). Крышку, контейнер, средство для контроля температуры и горшок можно промывать хлорированной водой, например, жавелевой водой.
Жидкие отходы (например, жидкий теплоноситель) можно нагревать от 50 до 150°C. Твердые отходы (например, субстрат и одежда рабочего) можно автоклавировать.
Это обеспечивает соблюдение норм в теплице, в которой внедряют такого почвенного паразита (S2 и L2).
Соответственно, платформа согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере одно средство для деконтаминации жидкого теплоносителя. Фактически жидкий теплоноситель может быть контаминирован почвенными паразитами или семенами растений, если дно горшков перфорировано, и лишняя вода, вследствие полива, вытекает в контейнер. Деконтаминацию предпочтительно выполняют нагреванием жидкого теплоносителя при температуре от 50 до 150°C в соответствии с применяемым жидким теплоносителем и устойчивостью почвенного паразита к температуре. Например, если почвенный паразит представляет собой Orobanche, а жидкий теплоноситель представляет собой воду, то деконтаминацию выполняют нагреванием при температуре от 70 до 90°C, например, при 80°C, в частности, от 30 мин. до 2 ч. Таким образом, средства для деконтаминации представляют собой средства, приспособленные для нагревания заранее определенного объема жидкого теплоносителя.
Платформа согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере одно средство для деконтаминации элементов, составляющих платформу (крышки, контейнера, средства для контроля температуры, горшков…). Этим средством может быть любое средство, приспособленное для содержания хлорированной воды, например, жавелевой воды.
Платформа может также содержать по меньшей мере одно средство для деконтаминации твердых отходов, например, субстрата или одежды рабочего после применения платформы. Этим средством может быть, например, автоклав.
Платформа может также содержать осветительные средства для освещения горшков. Средства для освещения могут быть выбраны из средств, обычно применяемых в сельском хозяйстве, например, натриевых газоразрядных ламп.
Настоящее изобретение относится также к набору, содержащему платформу для фенотипирования, как описано выше, и по меньшей мере одно средство для полива, как описано выше, и/или осветительные средства для освещения горшков и/или средство(-ва) для деконтаминации, как описано выше.
Настоящее изобретение также относится к теплице для фенотипирования, содержащей одну или несколько платформ для фенотипирования, как описано выше, по меньшей мере одно средство для полива, как описано выше, и/или осветительное средство для освещения горшков и/или средство для деконтаминации, как описано выше, и/или средство для контроля температуры и влажности внутри теплицы, например, посредством системы тонкого распыления. Предпочтительно влажность внутри теплицы составляет от 40 до 60%. Предпочтительно температура внутри теплицы составляет от 10 до 40°C, например, от 18 до 22°C.
Теплица может дополнительно содержать тамбур с ванной для мытья ног и/или гардеробную, например, с липким ковриком для захвата любого почвенного паразита для того, чтобы обеспечить контролируемые условия и предупредить загрязнение вблизи платформы.
Одежду рабочего можно обрабатывать с твердыми отходами и деконтаминировать автоклавированием.
Настоящее изобретение также относится к применению платформы, как описано выше, или теплицы, как описано выше, для скрининга и фенотипирования растений.
Настоящее изобретение также относится к способу выявления степени взаимодействия между различными растениями и различными расами почвенного паразита, включающему стадии:
- высевания семени растения на субстрат, содержащий стандартное количество почвенного паразита по меньшей мере в одном горшке платформы для фенотипирования согласно настоящему изобретению, а также;
- выращивания растения;
- извлечения растения после заранее определенного периода выращивания, который зависит от цикла развития упомянутого почвенного паразита;
- описания повреждения корней и/или надземного повреждения растения.
Преимущественно способ согласно настоящему изобретению обеспечивает получение результатов при раннем развитии растений. Он обеспечивает получение быстрых, однородных и воспроизводимых результатов и выполнение быстрого скрининга по сравнению с тем, что получают во время полевого испытания.
Способ согласно настоящему изобретению и применение платформы согласно настоящему изобретению обеспечивает получение результатов, которые коррелируют с результатами, полученными во время полевого испытания. Соответственно, способ согласно настоящему изобретению преимущественно делает возможным прогнозировать выносливость или устойчивость растения по отношению к почвенному паразиту и определять растения с наименьшими взаимодействиями с различными расами почвенного паразита.
Предпочтительно в способах согласно настоящему изобретению в каждом горшке платформы находится одна отличающаяся раса почвенного паразита и то же самое растение или одно отличающееся растение и тот же самый паразит, или одна отличающаяся раса почвенного паразита и одно отличающееся растение.
Почвенный паразит и растение (растение-хозяин) определены выше.
Систему почвенный паразит/растение, которую можно изучать, выбирают, например, из Gigaspora rosea и подсолнечника, ризобактерий (например, Azospirillum brasilense или Pseudomonas putida) и растений; Orobanche ramosa и Arabidopsis thaliana, Orobanche ramosa и Brassica napus, Orobanche aegyptica и Arabidopsis thaliana или Orobanche cernua и гороха, Striga hermonthica и маиса, Striga hermonthica и риса или Striga hermonthica и сорго, мелойдогина и маиса, сорго или помидора, Verticilium dahlia на подсолнечнике, ризоптомии на Brassica napus или Plasmodiaphora Brassicae на Brassica napus.
Предпочтительно в способах согласно настоящему изобретению после извлечения корней и перед описанием повреждения корней и/или надземного повреждения на растениях корни промывают водой. Деконтаминацию воды, вышедшей вследствие этого промывания, выполняют нагреванием, предпочтительно нагреванием от 70 до 90°C, например, 80°C, от 30 мин. до 2 ч. Если применяемый жидкий теплоноситель в платформе представляет собой воду, то извлеченную во время промывания корней воду перемешивают с упомянутым теплоносителем и совместно обрабатывают нагреванием, как упомянуто выше.
Предпочтительно способы согласно настоящему изобретению после извлечения корней предпочтительно включают различные стадии деконтаминации:
- элементы платформы (крышку, контейнер, систему контроля температуры, горшки…) деконтаминируют, как упомянуто выше; и/или
- жидкий теплоноситель и необязательно воду, извлеченную в результате промывания корней, нагревают, как описано выше;
- субстрат и необязательно одежду рабочего деконтаминируют, например, в автоклаве.
Согласно конкретному варианту осуществления почвенный паразит представляет собой Orobanche. Предпочтительно в данном случае растение представляет собой подсолнечник или рапс. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу выявления устойчивости или выносливости растения, в частности, подсолнечника или рапса, по отношению к Orobanche, включающему стадии:
- высевания семени упомянутого растения на субстрат, содержащий стандартное количество Orobanche, по меньшей мере в одном горшке платформы для фенотипирования согласно настоящему изобретению;
- выращивания растения;
- извлечения корней растения после заранее определенного периода выращивания, который зависит от цикла развития Orobanche (как правило, 5 недель);
- подсчета числа узелков, образованных паразитом на корнях растения;
- определения того, является ли растение устойчивым или выносливым по отношению к паразиту.
Если число узелков на корень равно 0, то растение устойчиво к Orobanche. Если число узелков на корень значимо отличается и ниже числа узелков, полученных для уязвимого растения, то растение является выносливым по отношению к Orobanche.
Предпочтительно данный способ может дополнительно включать стадию извлечения ДНК и/или РНК Orobanche для генотипирования.
Настоящее изобретение также относится к способу выявления агрессивности популяции почвенного паразита по отношению к растению, включающему стадии:
- высевания семени упомянутого растения на субстрат, содержащий различное количество почвенного паразита различного происхождения, по меньшей мере в одном горшке платформы для фенотипирования согласно настоящему изобретению;
- выращивание растения;
- извлечения растений после заранее определенного периода выращивания, который зависит от цикла развития почвенного паразита;
- описания повреждения корней и/или надземного повреждения растения.
Согласно конкретному варианту осуществления почвенный паразит представляет собой Orobanche. Предпочтительно в данном случае растение представляет собой подсолнечник или рапс. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу выявления агрессивности популяции патогена по отношению к растению, включающему стадии:
- высевания семян подсолнечника или рапса на субстрат, содержащий различное количество Orobanche различного происхождения, в различные горшки платформы для фенотипирования согласно настоящему изобретению;
- выращивания растения;
- извлечения растений после заранее определенного периода выращивания, который зависит от цикла развития Orobanche (как правило, 5 недель);
- подсчета числа узелков, образованных паразитом на корнях растения;
- определения того, является ли растение устойчивым или выносливым по отношению к паразиту.
Предпочтительно данный способ может дополнительно включать стадию извлечения ДНК и/или РНК Orobanche для генотипирования.
Способ согласно настоящему изобретению предпочтительно осуществляют в теплицах, содержащих по меньшей мере одну платформу согласно настоящему изобретению. Применение теплицы является экологически приемлемым по сравнению с ростовой камерой, которую можно применять в других способах, и обеспечивает скрининг большого числа растений и почвенных паразитов. Таким образом возможно, например, в одно и то же время проводить скрининг 1600 растений.
Производительность способа и платформы согласно настоящему изобретению можно легко сравнить с производительностью в поле, однако с существенным преимуществом получения эффективной и однородной инфекции.
Платформа и способ согласно настоящему изобретению являются хорошими прогностическими средствами для полевого испытания и могут применяться в качестве скрининговой платформы для выявления более интересных растений или рас растения перед переходом к полю.
Согласно способу настоящего изобретения почвенного паразита вносят в субстрат возле корня перед или после высевания семян растений или на другой стадии развития проростков.
Платформа и способ согласно настоящему изобретению обеспечивают получение результатов на ранней стадии развития растения и таким образом получение быстрых результатов без больших расходов.
Оценка на уровне корней обеспечивает открытие инфекции Orobanche на 3 основных стадиях:
- первоначальное развитие почвенного паразита (например, прорастание Orobanche);
- прикрепление;
- последующее прикрепление.
Таким образом возможно выявить различный механизм устойчивости и характеристики, подлежащие накоплению в одном и том же генотипе для усиления продолжительной устойчивости.
Соответственно, способы настоящего изобретения включают также, после описания повреждения корней и/или надземного повреждения растения, извлечение ДНК и/или РНК растений, которые имели слабое взаимодействие с почвенным паразитом, для генотипирования и отбора растений для дальнейших стадий селекции.
Платформу согласно настоящему изобретению можно также применять для тестирования выносливости растений по отношению к абиотическому стрессу. Например, она может применяться для анализа теплового стресса и/или водного голодания, а также испытания при низких температурах. Холодовой стресс может применяться также для определения качества партий семян перед коммерциализацией (контроль качества). Также для генотипирования возможно извлечение ДНК и/или РНК устойчивого растения.
Настоящее изобретение относится также к способу определения расы почвенного паразита, включающему стадии:
- осуществления способа определения взаимодействия различных растений с различным почвенным паразитом, как определено выше;
- помещения в каждый горшок платформы согласно настоящему изобретению почвенного паразита и различных растений, для которых взаимодействие с различным почвенным паразитом известно из предыдущей стадии;
- наблюдения растений, которые проявляют устойчивость, и определение расы помещенного в горшок почвенного паразита.
Предпочтительно данный способ может дополнительно включать стадию извлечения ДНК и/или РНК почвенного паразита (в частности, Orobanche) для генотипирования.
Настоящее изобретение относится также к способу выявления устойчивости или выносливости растения к засухе, включающему стадии:
- высевания семенного растения на субстрат со стандартной влажностью по меньшей мере в один горшок платформы для фенотипирования согласно настоящему изобретению;
- выращивания растения согласно контролируемым условиям сухости;
- извлечения растений после заранее определенного периода выращивания;
- описания роста корней и структуры растения.
Контроль сухости можно осуществлять с применением распределителя для контроля влажности почвы. Например, емкостные зонды случайным образом помещают на платформе и соединяют со средствами для полива, чтобы активировать контролируемый полив, когда влажность опускается ниже заранее определенной величины. Фенотипирование корней можно выполнять в конце выращивания с помощью измерения длины, диаметра или разветвленности корней, доступны компьютерные программы для выполнения такого измерения по анализу изображений.
Краткое описание фигур
На фигуре 1 представлена платформа (1) согласно настоящему изобретению, содержащая контейнер (2), герметически закрытый крышкой (5), содержащий два горшка (7) и ограничивающий внутреннее пространство (3), в которое помещены изоляционное средство (6) и средства для контроля температуры (4), погруженные в жидкий теплоноситель.
На фигуре 2 представлена платформа (1) согласно настоящему изобретению, содержащая контейнер (2), герметически закрытый крышкой (5), содержащий одиннадцать горшков (7) и ограничивающий внутреннее пространство (3), в которое помещены средства для контроля температуры (4), погруженные в жидкий теплоноситель. На фигуре 3 представлен блок из 5 платформ (I-V) согласно настоящему изобретению, при этом каждая платформа содержит 72 отверстия (12 рядов (9) (1-12) и 6 колонок (8) (А-F)).
На фигуре 4 представлена система для полива согласно настоящему изобретению, при этом стрелки представляют поток воды.
На фигурах 5-7 представлено, соответственно, распределение (гистограммы) частоты полученных данных посредством способа по настоящему изобретению для подсолнечника и расы Orobanche F (данные двух скринингов (фигуры 5 и 6) и данные с поля (фигура 7).
На фигурах 8-10 представлена, соответственно, корреляция (диаграммы рассеивания с коэффициентом корреляции Пирсона r) результатов, полученных в скрининге 1 и 2 (фигура 8), результатов, полученных в скрининге 1 и в поле (фигура 9), а также результатов, полученных в скрининге 2 и в поле (фигура 10).
Осуществление изобретения
Представленные ниже испытания проводили в теплице, которая содержит платформу, состоящую из алюминиевого контейнера (2500×800×200 мм) и крышки (толщиной 6 мм), состоящей из полиэтиленового листа толщиной 5,6 мм, покрытого с двух сторон алюминиевым листом 0,21 мм.
Крышка обеспечивает герметичное закрывание контейнера и поддерживается благодаря разделителю на заклепках. Крышка содержит 360 отверстий диаметром 4,5 или 5,5 см (12 рядов по 30 отверстий) и горшки. Горшки имеют диаметр 4,5 или 5,5 см для соответствия диаметру отверстия и длину 11 см.
Присутствующие горшки перфорированы, а в отверстие помещены ватные шарики. Затем горшки наполняются субстратом, содержащим белый сфагновый торф и удобрение NPK.
2
На дно контейнера помещают водянистый ворс. Кабель для нагрева (тепловая мощность которого составляет 300 Вт/м) помещают на водянистый ворс и добавляют 4 см воды (жидкий теплоноситель) (кабель для нагрева полностью погружен в воду).
30 рядов отверстий поливают с помощью 5 независимых блоков для полива, при этом каждый блок для полива приспосабливают для полива 6 рядов.
Каждый горшок может быть идентифицирован по номеру блока для полива от 1 до 5, по букве от А до Е для обозначения положения горшка на блоке для полива, а также по интервалу от 1 до 12 для обозначения положения горшка на столе.
Пример 1: Однородная и контролируемая температура вокруг горшка
Кабель для нагрева устанавливали для достижения температуры в контейнере, составляющей 27,5-28,5. Через 14 часов после запуска температуру в горшках измеряли. Результаты представлены в таблице ниже:
Температура изменялась от 27 до 29,5. Температура считалась однородной. Этот пример явно показывает, что платформа согласно настоящему изобретению обеспечивала получение контролируемых и однородных температурных условий вокруг каждого горшка.
Пример 2: Определение устойчивости и выносливости рас подсолнечника по отношению к Orobanche
Применяли теплицу и платформу из 360 горшков, раскрытые выше. Неиспользуемые горшки герметически закрывали.
Равное количество семян Orobanche расы F (Испания) помещали в каждый горшок с семенем подсолнечника. 300 различных генотипов подсолнечника помещали на платформу и изучали, от шести до двенадцати повторов исследовали генотипированием и данный эксперимент повторяли дважды (скрининг 1 и 2, соответственно, фигуры 5 и 6).
Кабель для нагрева устанавливали для достижения температуры в контейнере составляющей от 27,5 до 28,5. Температуру внутри горшков проверяли один раз в неделю и при необходимости регулировали благодаря термостату.
Платформу помещали в теплицу, где растения выращивали под натриевыми газоразрядными лампами (400 Вт) при температуре 18-22°C и влажности от 40 до 60%. Горшки поливали один раз в неделю в течение 50 секунд посредством капельной системы орошения.
Через пять недель после высевания кабель для нагрева, систему полива и освещение выключали. Корни каждого растения тщательно промывали в отдельном контейнере, содержащем воду. Подсчитывали число узелков на корнях.
Результаты представлены на гистограммах фигур 5 и 6. Распределение частот результатов первого и второго скрининга представлено на фигурах 5 и 6, соответственно. Среднее количество узелков на растения одного генотипа изменялось от 0 до 20 и представлено на гистограмме (ось х) для каждой линии подсолнечника, на оси у представлена частота генотипов подсолнечника с анализируемым средним числом узелков.
Сравнение результатов скрининга 1 и 2 представлено на фигуре 8. Каждый генотип, изученный в этом эксперименте, соответствует точке. Проекция точки на ось Y дает число узелков, полученных для первого скрининга, а проекция точки на ось X дает число узелков, полученных для второго скрининга.
Данный график обеспечивает расчет коэффициента корреляции Пирсона по следующей формуле:
xy
σ представляет собой ковариацию между переменной x и y
x
σ представляет собой стандартное отклонение переменной x
y
σ представляет собой стандартное отклонение переменной y
Коэффициент корреляции Пирсона, рассчитанный между скринингом 1 и скринингом 2, составляет 0,7. Результаты показывают, что способ согласно настоящему изобретению и применение платформы согласно настоящему изобретению являются воспроизводимыми.
Пример 3: Корреляция между данными, полученными в полях
Для расчета корреляции использовали данные, полученные из двух скринингов примера 2.
Те же самые 300 генотипов подсолнечника фенотипировали в поле для рассмотрения надежности теста и его способности прогнозировать поведение в поле. Один ряд на генотип с около 20 растениями высевали в поле Испании, которое, как предполагали, содержало семена Orobanche расы F. На определенной стадии развития растения оценивали число растений на ряд по меньшей мере с 1 появившимся растением Orobanche. На основании этой оценки рассчитывали процент растений на ряде по меньшей мере с одним появившимся растением Orobanche.
На фигуре 7 представлено распределение частоты процента растений по меньшей мере с одним появившимся растением Orobanche на генотип подсолнечника на основании эксперимента в поле Испании.
На фигурах 9 и 10 показана корреляция между, соответственно, скринингом 1 и 2 и оценкой в поле, проведенной для 300 генотипов подсолнечника с семенами Orobanche расы F (испанского происхождения) согласно настоящему изобретению, а также совокупности данных, полученных в поле на той же совокупности генотипов подсолнечника в Испании, которые, как известно, содержали семена Orobanche расы F.
Сравнение результатов скрининга 1 и оценки в поле, а также скрининга 2 и оценки в поле показано, соответственно, на фигурах 9 и 10. Каждый генотип представлен точкой. Проекция точки на ось Y дает среднее число узелков на растение, испытанное во время первого и/или второго скрининга (соответственно, фигуры 9 и 10), а проекция точки на ось X дает процент растений по меньшей мере с одним появившимся растением Orobanche во время скрининга в поле.
Эти графики обеспечивают расчет коэффициента корреляции Пирсона, который составляет от 0,41 для первого скрининга и 0,38 для второго скрининга.
Таким образом, способ согласно настоящему изобретению показывал, что он представляет собой точное прогностическое средство для полевого испытания (r=0,4) и может применяться в качестве средства предварительного скрининга в программах селекции. Результаты показывают, что применение платформы согласно настоящему изобретению обеспечивает определение устойчивости или выносливости растения по отношению к почвенному паразиту.
Пример 4: Разрушение отходов и очистка платформы
Воду, содержавшуюся в контейнере (воду, изначально добавленную в контейнер, и воду, вытекшую из горшков (лишнее количество воды после полива вытекает через отверстие в дне каждого горшка)), а также воду, полученную в результате промывки платформы, нагревали при 80°C в течение одного часа для уничтожения семян Orobanche и подсолнечника.
Твердые отходы (в частности, растения и субстраты) помещали в пакет для автоклавирования, содержащий два слоя. Пакет для автоклавирования помещали в другой пакет для автоклавирования, и затем закладывали в емкость для очистки, к которой подсоединяли парогенератор. Включали парогенератор. После обработки полученные отходы выбрасывали с бытовыми отходами.
Элементы платформы (контейнер, крышку, материал для нагревания) промывали путем выдерживания в жавелевой воде.