Полиморфиз генов PRSSl, GSTM1 и GSTT1 при остром панкреатите

Панкреатит, как острый, так и хронический, является актуальной проблемой современного здравоохранения. Обусловлено это ростом заболеваемости, увеличением числа деструктивных форм. Основными причинами возникновения панкреатита считают желчекаменную болезнь и злоупотребление алкоголем. Однако существует группа больных, у которых не удается выяснить этиологический фактор. Данную группу классифицируют как идиопатический панкреатит [7].

Обзор данных современной зарубежной литературы свидетельствует о большом внимании исследователей к генетическим факторам риска развития панкреатита [5,6, 19]. Наследственный панкреатит с аутосомно-доминантным типом наследования и пенетрантностью 80% известен достаточно давно [13]. Однако молекулярно-генетические основы предрасположенности стали понятны лишь в последние годы.

Одним из основных генетических факторов предрасположенности к панкреатиту рассматриваются мутации в гене катионного трипсиногена PRSS1, картированного в 7q35 [20]. Наиболее распространенной мутацией гена является точковая замена G -* А, которая при экспрессии приводит к встраиванию аминокислоты гистидина в положении 122 вместо аргинина (R122H) [11, 21]. Такая замена оказывает влияние на сайт гидролиза в цепи трипсина, связывающей два глобулярных домена, и приводит к нарушению его авторегуляторной функции. Таким образом, устраняется важный безопасный механизм инактивации трипсина в поджелудочной железе [10]. В результате осуществляется избыточная активация каскада всех панкреатических ферментов, в конечном итоге приводящая к деструкции поджелудочной железы [15].

К генетическим факторам, провоцирующим развитие патологии, ряд исследователей относит полиморфизм генов, кодирующих ферменты системы биотрансформации ксенобиотиков [18]. Выявлено снижение активности ферментов GST, осуществляющих детоксикацию ксенобиотиков во второй фазе биотрансформации [14]. Причиной полного отсутствия синтеза белкового продукта служат протяженные делеции в генах классов (i и 0 данного суперсемейства. Делеционный вариант гена GSTM1 обусловливает многие метаболические нарушения и, по некоторым данным, может являться фактором риска для развития панкреатита [9]. В отношении других генов GST в ассоциации с панкреатитом исследований пока практически не проводилось.

Материалы и методы

В работе использовали образцы ДНК, полученные из 4 мл стабилизированной ЭДТА крови неродственных доноров русской национальности. Экстракцию осуществляли по стандартной методике с обработкой протеиназой К («СибЭнзим») и фенол-хлороформной смесью. Обследованы 52 здоровых донора (группа контроля: 32 мужчины, 20 женщин; средний возраст 30 лет), являющихся жителями Красноярска, и больные панкреатитом - 42 пациента хирургических отделений городской клинической больницы № 7 города Красноярска: 25 мужчин, 17 женщин; средний возраст 42 года, жители Красноярска и пригородов. В исследование включались больные с идиопатической формой заболевания. Диагноз устанавливался на основании анамнеза, данных объективного обследования, лабораторных и инструментальных методов. Для определения тяжести состояния больных использовали шкалу предложенную коллективом авторов из НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе (Санкт-Петербург) [1]. Состояние при поступлении у всех больных соответствовало средней степени тяжести.

Анализ генетического полиморфизма проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на программируемом амплификаторе «Mastercyclergradient» («Eppendorf», Germany).

Детекцию мутации R122H гена PRSS1 производили методом ПЦР-ПДРФ анализа. Готовилась ПЦР-смесь объемом 30 мкл, включающая буфер для Taq-ДНК-полимеразы («СибЭнзим»: бОмМ трис-HCl, рН 8,5; 1,5 мМ MgCI2; 25 мМ КС1; 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1% тритон Х-100), MgCI2 - 1 мМ, 0,5 мМ каждого dNTP, около 1 мкг геномной ДНК и 2U Taq-ДНК-полимеразы («СибЭнзим»). К смеси добавляли по 10 пмоль специфических олигонуклеотидных праймеров (F: 5' GTCCTGGGTCTCA-ТАССТТ 3' и R: 5' GGGTAGGAGGCTTCACACTT 3')-Условия амплификации включали: 95°С - 10 мин., 30 циклов (95°С - 1 мин., 60°С - 1 мин., 72°С - 1 мин.) и 72°С -5 мин. [16]. Рестрикцию амплифицированного продукта в модификации Simon с соавт. (2002) проводили в объеме 20 мкл, куда вносили 5U специфической эндонукле-азы BstFNl («СибЭнзим»), SE-буфер Y («СибЭнзим»: 33 мМ трис-ацетата, рН 7,9, 10 мМ CH3COOMg, 66 мМ СН3СООК, 1 мМ DTT). Инкубировали при 60°С в течение 2 часов [17].

Детекцию делеционных полиморфизмов генов GSTM1 и GSTT1 проводили методом ПЦР с использованием в качестве контроля амплификации гена цитохрома Р450 - CYP1A1. Использовали методы Иващенко с соавт. (2001) с модификациями [4]. Делеционные или «нулевые» варианты гомозиготных генотипов (0/0) выявлялись по отсутствию соответствующих амплифицированных фрагментов. Смеси для мультиплексных ПЦР генов GSTM1 и CYPIA1, GSTT1 и CYP1A1 объемом 30 мкл включали буфер для Taq-ДНК-полимеразы («СибЭнзим»), MgCI2-2 мМ, 0,5 мМ каждого dNTP, около 1 мкг геномной ДНК и 2U Taq-ДНК-полимеразы («СибЭнзим»). В каждую смесь добавляли по 30 пмоль специфических олигонуклеотидных праймеров для

GSTM1

F: 5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3';

R: 5' GTTGGG CTCAAATATACGGTGG 3';

CYP1A1F: 5' GAACTGCCACTTCAGCTGTCT 3',

R: 5' GAAAGACCTCCCAGCGGGCA 3'

или для GSTT1

F: 5TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC 3';

R 5TCACCGGATCATGCCAGCA 3';

CYP1A1 F: 5'CGGAAGTGTATCGGTGAGACC 3';

R5'GTAGACAGAGTCTAGGCCTCA3_(«Chhtcw»).

Условия амплификации для GSTM1 использовались следующие: 94°С - 7 мин., 30 циклов (94°С - 40 с, 55°С -40 с, 72°С - 1 мин.) и 72°С - 5 мин- для GSTT1: 94°С - 5 мин, 35 циклов (94°С - 40 с, 68°С - 40 с, 72°С - 40 с) и 72°С - 5 мин. Температура отжига при амплификации GSTT1 была оптимизирована с использованием градиента температур (61 ± 10°С).

Визуализацию результатов осуществляли электрофоретически в 3% агарозном геле, с добавлением бромистого этидия (0,5 мкг/мл). Результат просматривали в проходящем УФ-свете на трансилюминаторе и сохраняли с использованием гельдокументирующей системы Doc Print (Vilber LourmaFrance). Оценку размеров амплифицированных фрагментов производили с использованием программы Photo-CaptMw относительно маркера молекулярного веса (100-1000 п.н.).

Расчет частот аллелей и генотипов проводили по уравнению Харди-Вайнберга для аутосомных признаков; сравнение частот нулевых и нормальных генотипов в отношении генов GSTM1 и GSTT1 в исследованных группах проверяли по критерию %2 Пирсона. В качестве критерия, определяющего, является ли изучаемый признак фактором риска заболевания, использовали отношение шансов (odds ratio): OR = (A/B)/(C/D), где А и В - проценты носителей аллельного варианта признака и «дикого» аллеля признака в опытной группе соответственно, а С и D - проценты носителей аллельного варианта и дикого аллеля признака в группе сравнения.

Результаты и обсуждение

В результате исследования полиморфного варианта гена катионного трипсиногена среди 34 обследованных больных острым панкреатитом мутантный аллель гена зафиксирован у одного человека (2,5%). Обнаруженный вариант оказался гетерозиготой R/H (один из аллелей содержал замену R122H). В этом случае вследствие исчезновения сайта рестрикции при электрофорезе присутствует нерестрицированный фрагмент (911 п.н.) наряду с рестрицированными (566 п.н. и 345 п.н.).

Во всех остальных случаях наблюдалось полное разрезание амплифицированных фрагментов, что свидетельствовало о гомозиготности по нормальному аллелю (R/R).

Частота аллеля «R» составила 98,7%, мутантного аллеля «Н» - 1,3%. Для сравнения произведена амплификация гена PRSS1 у нескольких индивидуумов контрольной группы, где ни одного случая мутации не выявлено.

Можно заключить, что мутация гена PRSS1 в популяции обследованных жителей Красноярска не является предрасполагающим фактором развития панкреатита, по крайней мере, для пациентов с идиопатической формой данного заболевания.

Проведен анализ полиморфизма генов GSTM1 и Т1 в двух обследуемых группах для выявления ассоциации с риском развития панкреатита. При амплификации GSTM1 и GSTT1 в случае нормальных вариантов генов (гомо- и гетерозиготы) наблюдали соответствующие фрагменты: 219 п.н. - для GSTM1 (с внутренним контролем 187 п.н.) и 459 п.н. - для GSTT1 (с внутренним контролем 190 п.н.). При протяженных делециях (0/0-гено-тип) амплифицированные фрагменты не выявлялись.

Обнаружено, что частота гомозиготных делеционных вариантов генов для всех обследованных жителей Красноярска, включая здоровых и больных панкреатитом, для GSTM1 составила 29,7%, а для GSTT1 - 16,9%. Известно, что частота полиморфных делеционных вариантов по генам GSTM1 и GSTT1 широко варьирует в разных популяциях [2]. Так, по некоторым данным [8], частота нулевого генотипа GSTM1 составила 43% и GSTT1 - 22% в башкирской популяции; 27,05% и 9,7% соответственно для жителей новосибирского региона [3]. Распределение частот аллелей и генотипов в исследованных группах представлено в таблице 1.

Из приведенных данных видно, что частота встречаемости нулевого варианта GSTM1 гена значительно выше в группе больных панкреатитом (41%) по сравнению с контролем (21%).

Выявлено статистически значимое {у} = 6,44; р < 0,025) различие частот делеционного варианта гена GSTM1 в обследуемых группах. Величина OR для гена GSTM1 составила 2,09. Такие результаты свидетельствуют о возможной ассоциации полиморфизма гена GSTM1 с развитием острого панкреатита.

Поскольку фермент с этого гена экспрессируется в панкреатической паренхиме, он непосредственно при-

нимает участие в обезвреживании экзогенных токсинов, а его отсутствие ведет к деструкции ткани железы [12]. Полученные нами данные согласуются с рядом исследований патологий поджелудочной железы: по данным [9], ОЯ = 2,6 для гена 08ТМ1. Распределение частот полиморфного варианта гена 08ТТ1 и генотипа 08ТТ1 0/0 среди здоровых лиц и больных панкреатитом не различалось, что свидетельствует, по-видимому, об отсутствии взаимосвязи генотипа «нулевого» аллеля 08ТТ1 с риском развития панкреатита. Поскольку фермент этого класса экспрессируется в эритроцитах и печени, его значение при панкреатите возможно лишь косвенное.

Панкреатит, очевидно, представляет собой мультифакторную патологию, поэтому нельзя исключать роли полиморфизма нескольких генов в его этиологии.

В обследованной группе лиц не выявлена ассоциация с таким генетическим фактором, как полиморфизм Я122Н гена РЯ^! Вероятнее всего, он имеет место при ювенильных формах панкреатита. По результатам исследования полиморфизма генов 08ТМ1 и 08ТТ1 можно заключить, что генотип 08ТМ1 0/0 ассоциирован с предрасположенностью к панкреатиту.

Таблица1. Распределение частот генотипов и аллелей генов GSTM1 и GSTT1 в обследуемых группах

Ген Группы Количество исследовании Частота аллелей, % Частота генотипов, %

+ 0 +/+ +/0 0/0

GSTM1 Здоровые 52 54,2 45,8 29,4 49,6 21

Панкреатит 39 36 64 12,9 46,1 41

GSTT1 Здоровые 29 58,6 41,4 34,3 48,5 17,2

Панкреатит 42 59,3 40,7 35,2 48,2 16,6

Примечание. + — обычный (нормальный) аллель гена; 0 — делеционный («нулевой») аллель гена.