ЦЕНТРАЛЬНЫЕ Т-КЛЕТКИ ПАМЯТИ ДЛЯ АДОПТИВНОЙ Т-КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ
CENTRAL MEMORY T-CELLS FOR ADOPTIVE T-CELL THERAPY

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В отношении противоопухолевого лечения исследовали иммунотерапии на основе опухолеспецифичных Т-клеток, включая терапии с использованием генетически модифицированных Т-клеток. В некоторых случаях Т-клетки, используемые в таких терапиях, не остаются активными in vivo в течение достаточно длительного периода времени. В некоторых случаях опухолеспецифичность Т-клеток является относительно низкой. Следовательно, в данной области существует потребность в опухолеспецифичных противораковых терапиях с более долговременным противоопухолевым функционированием.
Адоптивная Т-клеточная терапия (ACT) с использованием генетически модифицированных Т-клеток с химерным антигенным рецептором (CAR) может обеспечивать безопасный и эффективный способ уменьшения частоты рецидивов MG (злокачественная глиома), так как Т-клетки с CAR могут быть генетически модифицированы для специфичного распознавания антигенно отличных популяций опухолей (Cartellieri et al. 2010 J Biomed Biotechnol 2010:956304; Ahmed et al. 2010 Clin Cancer Res 16:474; Sampson et al. 2014 Clin Cancer Res 20:972; Brown et al. 2013 Clin Cancer Res 2012 18:2199; Chow et al. 2013 Mol Ther 21:629), и Т-клетки могут мигрировать через паренхиму мозга к мишени и умерщвлять инфильтрирующие злокачественные клетки (Hong et al. 2010 Clin Cancer Res 16:4892; Brown et al. 2007 J Immunol 1799: 3332; Hong et al. 2010 Clin Cancer Res 16:4892; Yaghoubi 2009 Nat Clin PRact Oncol 6:53). Доклинические исследования продемонстрировали то, что Т-клетки CAR+, нацеленные на IL13Rα2, демонстрируют мощную, независимую от главного комплекса гистосовместимости (МНС), IL13Rα2-специфическую цитолитическую активность против как стволоподобных, так и дифференцированных глиомных клеток, и индуцируют регрессию прижившихся глиомных ксенотрансплантатов in vivo (Kahlon et al. 2004 Cancer Res 64: 9160; Brown et al. 2012 Clin Cancer Res 18: 2199).
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
СМ
В данном документе описаны популяции клеток, которые содержат центральные Т-клетки памяти (T). Данные популяции клеток включают и Т-клетки CD4+, и Т-клетки CD8+. Клетки в данных популяциях клеток являются полезными для экспрессии химерных трансмембранных иммунорецепторов (химерные антигенные рецепторы или «CAR»), которые содержат внеклеточный домен (например, scFv, который связывается с выбранной мишенью), трансмембранную область и внутриклеточный домен сигнализации, например, внутриклеточный домен, который включает домен сигнализации из зета цепи комплекса человеческого CD3 (CD3ζ) и один или более чем один костимулирующий домен, например, костимулирующий домен 4-1ВВ. Внеклеточный домен обеспечивает то, что CAR, при экспрессии на поверхности Т-клетки, направляет активность Т-клетки на те клетки, которые экспрессируют мишень, распознаваемую внеклеточным доменом. Включение костимулирующего домена, такого как костимулирующий домен 4-1BB (CD137), расположенного последовательно с CD3ζ во внутриклеточную область, обеспечивает принятие Т-клеткой костимулирующих сигналов.
СМ
СМ
СМ
Клетки T, описанные в данном документе, например, специфичные для пациента аутологические или аллогенные клетки T, могут быть генетически модифицированы для экспрессии желательного CAR, и данные генетически модифицированные клетки можно размножать и использовать в ACT. Популяция клеток T представляет собой CD45RO+CD62L+ и включает клетки CD4+ и CD8+.
СМ
СМ
СМ
СМ
В разных воплощениях популяция человеческих Т-клеток содержит вектор, экспрессирующий химерный антигенный рецептор; популяция человеческих центральных Т-клеток памяти (клетки T) содержит по меньшей мере 10% клеток CD4+ и по меньшей мере 10% клеток CD8+ (например, по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% клеток представляют собой клетки T; по меньшей мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35% клеток T представляют собой CD4+, и по меньшей мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35% клеток T представляют собой клетки CD8+).
Также описан способ лечения рака у пациента, включающий введение популяции аутологических или аллогенных человеческих Т-клеток (например, аутологических или аллогенных Т-клеток, включающих клетки Tcm, например, по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% клеток представляют собой клетки Tcm; по меньшей мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35% клеток Tcm представляют собой CD4+; и по меньшей мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35% клеток Tcm представляют собой клетки CD8+), трансдуцированных вектором, содержащим экспрессионную кассету, кодирующую химерный антигенный рецептор.
В данном документе описана популяция человеческих Т-клеток, трансдуцированных вектором, экспрессирующим химерный антигеный рецептор, где по меньшей мере 50% трансдуцированных человеческих Т-клеток представляют собой центральные Т-клетки памяти. В разных воплощениях по меньшей мере 10% трансдуцированных центральных Т-клеток памяти представляют собой CD4+; по меньшей мере 10% трансдуцированных центральных Т-клеток памяти представляют собой CD8+; по меньшей мере 15% центральных Т-клеток памяти представляют собой CD4+, и по меньшей мере 15% представляют собой CD8+; и по меньшей мере 50% трансдуцированных человеческих Т-клеток представляют собой CD4+/CD8+/CD62L+.
В данном документе также описана популяция человеческих Т-клеток, трансдуцированных вектором, экспрессирующим химерный антигенный рецептор, где по меньшей мере 50% трансдуцированных человеческих Т-клеток представляют собой CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, по меньшей мере 10% клеток представляют собой CD4+, и по меньшей мере 10% клеток представляют собой CD4+. В разных воплощениях по меньшей мере 10% клеток, которые являются CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, также являются CD4+, и по меньшей мере 10% клеток, которые являются CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, также являются CD8+; и по меньшей мере 15% клеток, которые являются CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, также являются CD4+, и по меньшей мере 15% клеток, которые являются CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, также являются CD4+.
Также описан способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, содержащей описанные в данном документе центральные Т-клетки памяти. Данные Т-клетки могут быть аутологическими по отношению к пациенту или аллогенными по отношению к пациенту.
Также описан способ получения популяции центральных Т-клеток памяти, включающий: получение популяции Т-клеток от субъекта-человека; обеднение популяции Т-клеток клетками, которые экспрессируют CD25, клетками, которые экспрессируют CD14, и клетками, которые экспрессируют CD45+, с получением популяции обедненных Т-клеток; обогащение популяции обедненных Т-клеток клетками, экспрессирующими CD62L, получая, посредством этого, популяцию центральных Т-клеток памяти, где данный способ не включает стадию обеднения популяции клеток клетками, экспрессирующими CD4, и не включает стадию обеднения популяции клеток клетками, экспрессирующими CD8+. В разных воплощениях по меньшей мере 50% (например, по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90% или 95%) клеток в популяции центральных Т-клеток памяти являются CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, по меньшей мере 10% клеток являются CD4+, и по меньшей мере 10% клеток являются CD4+; по меньшей мере 50% (например, по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90% или 95%) клеток в популяции центральных Т-клеток памяти являются CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, по меньшей мере 15% клеток являются CD4+, и по меньшей мере 15% клеток являются CD4+; по меньшей мере 50% клеток в популяции центральных Т-клеток памяти являются CD45R0+, CD62L+ и CD45Ra-, по меньшей мере 20% (например, по меньшей мере 30%, 40% или 50%) клеток являются CD4+, и по меньшей мере 20% (например, по меньшей мере 30%, 40% или 50%) клеток являются CD4+. Данный способ может дополнительно включать стимулирование популяции центральных Т-клеток памяти (например, посредством приведения в контакт данной популяции центральных Т-клеток памяти с CD3 и/или CD28); может включать трансдуцирование данных клеток вектором, экспрессирующим рекомбинантный белок для создания популяции генетически модифицированных центральных Т-клеток памяти; и может включать размножение популяции генетически модифицированных центральных Т-клеток памяти (например, размножение популяции генетически модифицированных центральных Т-клеток памяти посредством подвергания клеток воздействию одного или обоих из IL-2 и IL-15.
ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
4
Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение CAR IL13(E13Y)-зетакин (слева), состоящего из варианта человеческого IL-13, специфичного в отношении IL13Rα2 (huIL-13(E13Y)), спейсера на основе Fc человеческого lgG4 (huγFc), части в виде человеческого трансмембранного CD4 (huCD4 tm) и цитоплазматической части цепи человеческого CD3ζ (huCD3ζ cyt), как указано. Также показан CAR IL13(EQ)BBζ, который является таким же как и IL13(E13Y)-зетакин, за исключением двух точечных мутаций - L235E и N297Q, указанных красным, которые располагаются в домене СН2 спейсера на основе lgG4, и добавления костимулирующего цитоплазматического домена 4-1BB (4-1BB cyt).
На Фиг. 2А-В показаны открытые рамки считывания определенных векторов. А представляет собой диаграмму открытой рамки считывания кДНК из 2670 нуклеотидов конструкции IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t, где показаны последовательности IL13Rα2-специфичного лиганда IL13(E13Y), шарнира Fc lgG4(EQ), трансмембранного CD4, цитоплазматического домена сигнализации 4-1BB, трехглицинового линкера и цитоплазматического домена сигнализации CD3ζ CAR IL13(EQ)BBZ, а также перескакивания рибосомы Т2А и усеченного CD19. Также показаны сигнальные последовательности человеческого рецептора альфа GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) и CD19, которые управляют поверхностной экспрессией CAR IL13(EQ)BBζ и CD19t. Б представляет собой диаграмму последовательностей, фланкированных длинными концевыми повторами (показанными как «R»), которые будут интегрированы в геном хозяина. В представляет собой карту плазмиды IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7.
На Фиг. 3 показана конструкция pHIV7.
На Фиг. 4 показаны элементы pHIV7.
CM
На Фиг. 5 показана схема получения IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T.
см
CM
На Фиг. 6А-В показаны результаты анализа экспрессии поверхностного трансгена и маркера Т-клеток посредством проточной цитометрии. IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T HD006.5 и HD187.1 совместно окрашивали антителом против IL13-PE (фикоэритрин) и антителом против CD8-FITC (флуоресцеина изотиоцианат) для выявления клеток CD8+ CAR+ и CD4+ (т.е. CD8-негативных) CAR+(А), или антителом против CD19-PE и антителом против CD4-FITC для выявления клеток CD4+ CD19t+ и CD8+ (т.е. CD4-негативных) CAR+ (Б). IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T HD006.5 и HD187.1 окрашивали антителами против CD3, TCR, CD4, CD8, CD62L и CD28, конъюгированными с флуорохромом (серые гистограммы) или изотипическими контролями (черные гистограммы) (В). Во всех случаях процентные доли основаны на жизнеспособных лимфоцитах (негативных в отношении DAPI (4',6-диамидин-2-фенилиндол)), которые окрашивались сильнее, чем изотипический контроль.
CM
CM
CM
51
На Фиг. 7А-Б показана функциональная характеризация in vitro эффекторной функции IL13Rα2-специфичного IL13(EQ)BBZ+T. IL13(EQ)BBZ/CD19t+ T. HD006.5 и HD187.1 использовали в качестве эффекторов в 6-часовом анализе высвобождения Cr с использованием соотношения Е:T (эффектор: мишень) 10:1 на основе экспрессии CD19t. IL13Rα2-позитивными опухолями-мишенями были K562, генетически модифицированная для экспрессии IL13Rα2 (K562-IL13Rα2), И линия первичной глиомы РВТ030-2, а IL13Rα2-негативной контрольной опухолью-мишенью была родительская линия K562 (А). IL13(EQ)BBZ/CD19t+ T HD006.5 и HD187.1 оценивали на антигензависимую продукцию цитокинов после совместной культуры в течение ночи при соотношении Е:Т 10:1 с использованием IL13Rα2-позитивных и негативных мишеней. Уровни цитокинов измеряли с использованием набора для анализа Bio-Plex Pro Human Cytokine TH1/TH2, и приводится уровень IFN-γ (Б).
CM
CM
CM
CM
CM
CM
5
6
6
6
На Фиг. 8А-В показан результат исследований, демонстрирующих регрессию прижившихся ксенотрансплантатов глиомной опухоли после адоптивного переноса IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T. Опухолевые клетки EGFP-ffLuc+РВТ030-2 (1×10) стереотактически имплантировали в правую часть переднего мозга мышей NSG. В сутки 5 мыши получали либо 2×10 IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T (1,1×10 CAR+; n равно 6), либо 2×10 имитации T (без CAR; n равно 6), либо PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) (n равно 6). Репрезентативные мыши из каждой группы, демонстрирующие относительную опухолевую нагрузку с использованием Xenogen Living Image (А). Количественное измерение потока ffLuc (фотоны/с) показывает то, что IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T индуцирует регрессию опухоли по сравнению с T с имитацией трансдукции и с PBS (# р меньше 0,02; * р меньше 0,001, ANOVA (дисперсионный анализ) с повторными измерениями) (Б). Кривая выживания Каплана-Мейера (n равно 6 на группу), демонстрирующая значимо улучшенное выживание (р равно 0,0008; логранговый критерий) для мышей, обработанных IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T (В).
CM
CM
CM
CM
5
6
6
6
6
На Фиг. 9А-В показаны результаты исследований, сравнивающих противоопухолевую эффективность клонов IL13(EQ)BBZ T и CTL (цитолитический Т-лимфоцит) IL13-зетакин. EGFP-ffLuc+РВТ030-2 TSs (1×10) стереотактически имплантировали в правую часть переднего мозга мышей NSG. В сутки 8 мыши получали либо 1,6×10 имитации трансдукции T (без CAR), либо 1,0×10 CAR+IL13(EQ)BBζ T (всего 1,6×10 Т-клеток; 63% CAR), либо 1,0×10 CTL IL13-зетакин CD8+, клон 2D7 (клональный CAR+), либо не получали обработки (n равно 6 на группу). Репрезентативные мыши из каждой группы, демонстрирующие относительную опухолевую нагрузку с использованием Xenogen Living Image (А). Линии линейной регрессии натурального log потока ffLuc (фотоны/с) с течение времени, значения Р приводятся для сравнений взаимодействия групп по времени (Б). Анализ выживания Каплана-Мейера (n равно 6 на группу) демонстрирует значимо улучшенное выживание (р равно 0,02; логранговый критерий) для мышей, обработанных IL13(EQ)BBζ T по сравнению с CTL IL13-зетакин CD8+, клон 2D7 (В).
CM
CM
CM
CM
CM
CM
5
6
6
6
6
6
На Фиг. 10А-В показаны результаты исследований, сравнивающих противоопухолевую эффективность клонов IL13(EQ)BBζ T и CTL IL13-зетакин. EGFP-ffLuc+РВТ030-2 TSs (1×10) стереотактически имплантировали в правую часть переднего мозга мышей NSG. В сутки 8 мыши получали либо 1,3×10 T с имитацией трансдукции (без CAR; n равно 6), либо 1,0, 0,3 или 0,1×10 CAR+IL13(EQ)BBζ T (78% CAR+; n равно 6-7), либо 1,0, 0,3 или 0,1×10 клона 2D7 CTL IL13-зетакин CD8+ (клональный CAR+; n равно 6-7), либо не получали обработки (n равно 5). Xenogen Imaging репрезентативных мышей из каждой группы, демонстрирующее относительную опухолевую нагрузку (А). Линии линейной регрессии натурального log потока ffLuc (фотоны/с) показывают то, что IL13(EQ)BBζ T достигают превосходящей регрессии опухоли по сравнению с первым поколением клона 2D7 CTL IL13-зетакин, T с имитацией трансдукции и только опухолью (Б). Средний поток на группу в сутки 27 после инъекции опухоли, демонстрирующий то, что доза 0,1×10 IL13(EQ)BBζ T превосходит по эффективности в десять раз большую дозу клона 2D7 CTL IL13-зетакин CD8+ - 1,0×10 (р равно 0,043; двухвыборочный t-критерий Уелча) (В).
CM
CM
На Фиг. 11 показаны результаты исследований, демонстрирующих то, что IL13(EQ)BBζ T показывают лучшую стойкость по сравнению с клонами CTL IL13-зетакин. Иммуногистохимия CD3, оценивающая стойкость Т-клеток в сайте опухоли через 7 суток после инфузии Т-клеток. Значительное число Т-клеток выявляется для IL13(EQ)BBζ T (верхняя панель). В отличие от этого выявляется очень мало жизнеспособных Т-клеток CD3+ IL13-зетакин (нижняя панель).
5
6
6
6
6
6
6
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
На Фиг. 12А-Г показаны результаты экспериментов, сравнивающих путь доставки Т-клеток CAR+ (в.ч. (внутричерепно) по сравнению с в.в. (внутривенно)) для больших установившихся опухолей. EGFP-ffLuc+РВТ030-2 TSs (1×10) имплантировали в правую часть переднего мозга мышей NSG. В сутки 19 и 26 мышам в.в. инъецировали через хвостовую вену либо 5×10 CAR+ IL13(EQ)BBζ + T (всего 11,8×10 клеток; n равно 4), либо T с имитацией трансдукции (11,8×10клеток; n равно 4). В качестве альтернативы, в сутки 19, 22, 26 и 29 мышам в.ч. инъецировали либо 1×10 CAR+ IL13(EQ)BBζ + T (всего 2,4×10 клеток; n равно 4), либо T с имитацией трансдукции (2,4×10 клеток; n равно 5). Средний поток ffLuc (фотоны/с) с течением времени показывает то, что IL13(EQ)BBζ T, доставленные в.ч., опосредует регрессию опухоли 19-суточных опухолей. В отличие от этого, Т-клетки, доставленные в.в., не демонстрируют уменьшения опухолевой нагрузки по сравнению с необработанными или имитирующими T контролями (А). Кривая выживания Каплана-Мейера демонстрирует улучшенное выживание для мышей, обработанных в.ч. IL13(EQ)BBZ T, по сравнению с мышами, обработанными в.в. введенными T CAR+ (р равно 0,0003, логранговый критерий) (Б). Репрезентативное окрашивание Н&Е (гематоксилином и эозином) и IHC (иммуногистохимия) CD3 мышей, обработанных IL13(EQ)BBZ+ T в.в. (В) по сравнению с в.ч. (Г). Т-клетки CD3+ выявляли только в группе, обработанной в.ч., при отсутствии клеток CD3+, выявленных в опухоли или в окружающей паренхиме мозга для мышей, обработанных в.в.
5
6
6
CM
На Фиг. 13А-Б показаны результаты исследований, демонстрирующих то, что Т-клетки CAR+, инъецированные внутричерепно, либо внутриопухолево (в.о.), либо внутрижелудочково (в.ж.), могут транспортироваться в опухоли на противоположном полушарии. EGFP-ffLuc+РВТ030-2 TSs (1×10) стереотактически имплантировали в правую и левую части переднего мозга мышей NSG. В сутки 6 мышам в.ч. инъецировали в место правой опухоли 1,0×10 IL13(EQ)BBζ + T (всего 1,6×10 клеток; 63% CAR; n равно 4). Схема экспериментальной модели множественной глиомы (A). IHC CD3, демонстрирующая Т-клетки, инфильтрующие и правый, и левый сайты опухолей (Б).
На Фиг. 14 показана аминокислотная последовательность IL13(EQ)BBζ/CD19t+(SEQ ID NO: 10).
На Фиг. 15 показано сравнение последовательности IL13(EQ)41BBζ [IL13{EQ}41BBζ T2A-CD19t_epHIV7; pF02630] (SEQ ID NO:12) и CD19Rop_epHIV7 (pJ01683) (SEQ ID NO:13).
Выделение желтым показывает область IL-13 с оптимизированными кодонами, включающую сигнальную последовательность GMCSF (IL13op).
выделение показывает область lgG4 с оптимизированными кодонами (lgG4op [L235E, N297Q]).
выделение показывает две предполагаемые замены аминокислот в пределах шарнирной области lgG4 (L235E и N297Q).
выделение показывает область трансмембранного CD4 с оптимизированными кодонами.
выделение показывает цитоплазматическую область сигнализации 41ВВ (41ВВ cyto).
выделение показывает 3-глициновые линкеры (g3).
Выделение серым показывает область CD3 зета с оптимизированными кодонами (zeta op).
Выделение показывает последовательность Т2А (Т2А).
Выделение показывает последовательность усеченного CD19 (CD19t).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
CM
CM
CM
CM
Ниже описана популяция клеток T, которая включает клетки CD4+ и клетки CD8+ (популяция клеток «T CD4+/CD8+). Клетки популяции клеток T CD4+/CD8+ могут быть активированы с использованием антител против CD3/CD28 и трансдуцированы, например, лентивирусным вектором SIN, который управляет экспрессией CAR, с созданием генетически модифицированных клеток. Активированные/генетически модифицированные клетки можно размножать in vitro с использованием IL-2/IL-15 и затем использовать или криоконсервировать и использовать позднее. Описан пример применения популяции клеток T CD4+/CD8+ для экспрессии CAR, нацеленного на IL13Rα2.
CAR, используемый в приведенных ниже примерах, называется IL13(EQ)BBζ. Данный CAR включает целый ряд важных элементов, включая: лиганд IL13α2, имеющий аминокислотную замену, которая улучшает специфичность связывания с IL13Rα2; домен CD137 (4-1ВВ) последовательно с CD3ζ, для обеспечения полезной костимуляции; и область Fc lgG4, которая мутирована в двух сайтах в пределах области СН2 (L235E; N297Q) таким способом, который уменьшает связывание рецепторами Fc (FcR). Данный CAR и другие могут быть получены с использованием вектора, в котором после открытой рамки считывания CAR следует последовательность перескакивания рибосомы Т2А и усеченный CD19 (CD19t), у которого отсутствует цитоплазматический сигнальный хвост (усеченный в аминокислоте 323). При данной организации коэкспрессия CD19t дает инертный неиммуногенный маркер поверхности, который обеспечивает точное измерение генно-модифицированных клеток и делает возможными позитивную селекцию генно-модифицированных клеток, а также эффективное отслеживание и/или визуализацию терапевтических Т-клеток in vivo после адоптивного переноса. Коэкспрессия CD19t дает маркер иммунологического нацеливания трансдуцированных клеток in vivo с использованием клинически доступных антител и/или реактивов на основе иммунотоксинов для селективного удаления терапевтических клеток и, посредством этого, функционирования в качестве суицидного переключателя.
Глиомы экспрессируют рецепторы IL13 и, в частности, высокоаффинные рецепторы IL13. Однако, в отличие от рецептора IL13, глиомные клетки сверхэкспрессируют уникальную цепь IL13Rα2, способную к связыванию IL13 независимо от требования IL4Rβ или γc44. Подобно его гомологу - IL4, IL13 имеет плеотропную иммунорегуляторную активность вне ЦНС.И IL13, и IL4 стимулируют продукцию IgE В-лимфоцитами и подавляют продукцию провоспалительных цитокинов макрофагами.
Подробные исследования с использованием ауторадиографии с радиоактивно меченым IL13 продемонстрировали обильное связывание IL13 почти на всех исследованных злокачественных глиомных тканях. Это связывание является высокогомогенным в пределах срезов опухоли и при анализе одиночных клеток. Однако анализ с молекулярным зондом, специфичным в отношении мРНК IL13Rα2 не выявил экспрессии глиомоспецифичного рецептора элементами нормального мозга, и авторадиография с радиоактивно меченым IL13 также не могла выявить специфичное связывание IL13 в нормальной ЦНС. Данные исследования свидетельствуют о том, что общий рецептор IL13Rα1/IL4β/γc не экспрессируется выявляемо в нормальной ЦНС. Следовательно, IL13Rα2 является очень специфичной мишенью поверхности клетки для глиомы и является подходящей мишенью для CAR, разработанных для лечения глиомы.
Связывание терапевтических молекул на основе IL13 с широко экспрессируемым рецепторным комплексом IL13Rα1/IL4β/γc, однако, имеет потенциал опосредования нежелательных токсичностей в отношении нормальных тканей вне ЦНС, и, таким образом, ограничивает системное введение данных агентов. Замена аминокислоты - нативной глутаминовой кислоты на тирозин в альфа-спирали A IL13 в аминокислотном остатке 13 селективно уменьшает аффинность IL13 в отношении рецептора IL13Rα1/IL4β/γc. Связывание данного мутанта (названного IL13(E13Y)) с IL13Rα2, однако, увеличивается относительно IL13 дикого типа. Таким образом, данный минимально измененный аналог IL13 одновременно увеличивает специфичность и аффинность IL13 в отношении глиомных клеток. Следовательно, описанный в данном документе CAR включает IL13, содержащий мутацию (от Е до Y или от Е до некоторой другой аминокислоты, такой как K или R, или L, или V) в аминокислотном остатке 13 (согласно нумерации Debinski et al. 1999 Clin Cancer Res 5: 3143s). Однако IL13, имеющий природную последовательность, также можно использовать, и он может быть полезным, особенно в ситуациях, когда модифицированные Т-клетки подлежат местному введению, как, например, посредством инъекции непосредственно в опухолевую массу.
CAR, описанный в данном документе, может быть получен любыми способами, известными в данной области, хотя предпочтительно его получают с использованием методик генной инженерии. Нуклеиновые кислоты, кодирующие несколько областей химерного рецептора, можно получать и собирать в полную кодирующую последовательность стандартными методиками молекулярного клонирования, известными в данной области (скрининг геномной библиотеки, ПЦР (полимеразная цепная реакция), лигирование с помощью праймеров, сайт-направленный мутагенез и т.д.), в зависимости от того, что является удобным. Образующаяся кодирующая область предпочтительно вставляется в экспрессионный вектор и используется для трансформации подходящей экспрессионной линии клетки-хозяина, предпочтительно линии клеток Т-лимфоцитов и наиболее предпочтительно аутологической линии клеток Т-лимфоцитов.
Пример 1: конструирование и структура IL13Rα2- специфичного CAR
Структура полезного IL13Rα2-специфичного CAR описывается ниже. Последовательность CAR с оптимизированными кодонами содержит связанный с мембраной лиганд - IL13, мутированный в одном сайте (E13Y) для уменьшения потенциального связывания с IL13Rα1, спейсер на основе Fc lgG4, содержащий две мутации (L235E; N297Q), которые значительно ослабляют модели распознавания, опосредованные рецептором Fc, трансмембранный домен CD4, костимулирующий цитоплазматический домен сигнализации 4-1ВВ и цитоплазматический домен сигнализации CD3ζ. Последовательность перескакивания рибосомы Т2А отделяет эту последовательность CAR IL13(EQ)BBζ от CD19t - инертного, неиммуногенного маркера поверхности клетки для выявления/селекции. Эта Т2А-связка приводит к координированной экспрессии и IL13(EQ)BBζ, и CD19t от одного транскрипта. Фиг. 1А представляет собой схематический рисунок открытой рамки считывания из 2670 нуклеотидов, кодирующей конструкцию IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t. На этом рисунке показаны все: IL13Rα2- специфичного лиганд - IL13(E13Y), Fc lgG4(EQ), трансмембранный домен CD4, цитоплазматический домен сигнализации 4-1ВВ, трехглициновый линкер и цитоплазматический домен сигнализации CD3ζ CAR IL13(EQ)BBZ, а также последовательности перескакивания рибосомы Т2А и усеченного CD19. Также показаны сигнальные последовательности человеческого рецептора GM-CSF альфа и CD19, которые управляют поверхностной экспрессией CAR IL13(EQ)BBZ и CD19t. Таким образом, конструкция IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t включает последовательность IL13Rα2- специфичного, оптимизированного в отношении шарнирной области, костимулирующего химерного иммунорецептора (обозначенного IL13(EQ)BBZ), последовательность перескакивания рибосомы Т2А и последовательность CD19t.
Последовательность IL13(EQ)BBZ получали посредством слияния лидерного пептида человеческого рецептора GM-CSF альфа с последовательностями лиганда - IL13(E13Y), L235E/N297Q-модифицированного шарнира Fc lgG4 (где двойная мутация препятствует распознаванию FcR), трансмембранного CD4, цитоплазматического домена сигнализации 4-1BB и цитоплазматического домена сигнализации CD3ζ. Данную последовательность синтезировали de novo после оптимизации кодонов. Последовательность Т2А получали в результате расщепления плазмиды, содержащей Т2А. Последовательность CD19t получали из последовательности, охватывающей последовательность лидерного пептида с трансмембранными компонентами (т.е. пары оснований 1-972) плазмиды, содержащей CD19. Все три фрагмента: 1) IL13(EQ)BBZ, 2) Т2А и 3) CD19t клонировали в сайт множественного клонирования лентивирусного вектора epHIV7. При трансфекции в подходящие клетки данный вектор интегрирует в геном клеток-хозяев последовательность, схематически показанную на Фиг. 1Б. На Фиг. 1В приведен схематический рисунок 9515 пар оснований самой плазмиды IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7.
Как схематически показано на Фиг. 2, CAR IL13(EQ)BBZ отличается в нескольких важных аспектах от описанного ранее IL13Rα2- специфичного CAR, названного IL13(E13Y)-зетакин (Brown et al. 2012 Clinical Cancer Research 18:2199). IL13(E13Y)-зетакин состоит из IL13Rα2-специфичного мутеина человеческого IL-13 (hulL-13(E13Y)), спейсера на основе Fc человеческого lgG4 (huγ4Fc), части в виде трансмембранного человеческого CD4 (huCD4 tm) и цитоплазматической части цепи человеческого CD3ζ (huCD3ζ cyt), как показано. В отличие от него, IL13(EQ)BBζ имеет две точечные мутации - L235E и N297Q, которые расположены в домене СН2 спейсера на основе lgG4, и костимулирующий цитоплазматический домен 4-1ВВ (4-1ВВ cyt).
Пример 2: конструирование и структура epHIV7, используемого для экспрессии IL13Rα2- специфичного CAR
Плазмида pHIV7 представляет собой родительскую плазмиду, из которой был получен клинический вектор IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7 в исследовательской лаборатории терапевтических средств на основе Т-клеток (TCTRL) в City of Hope (СОН). Вектор epHIV7, используемый для экспрессии CAR, получали из вектора pHIV7. Важно то, что в данном векторе для управления экспрессией CAR используется человеческий промотор EF1. И 5', и 3' последовательности данного вектора получали из pv653RSN, полученного ранее из провируса НХВс2. Вытесняемые последовательности ДНК полипуринового участка (рРРТ) происходили из штамма pNL4-3 HIV-1 (вирус иммунодефицита человека-1) из репозитория реактивов СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита человека) NIH (Национальный институт здравоохранения США). Последовательность посттранскрипционного регуляторного элемента лесного сурка (WPRE) была описана ранее.
Конструирование pHIV7 схематически показано на Фиг. 3. Вкратце, pv653RSN, содержащую 653 п. о. из gag-pol плюс 5' и 3' длинных концевых повторов (LTR) с находящимся между ними геном SL3-неомицинфосфотрансферазы (Neo), субклонировали в pBluesript следующим образом: на стадии 1 из последовательностей от 5' LTR до отвечающего элемента rev (RRE) создавали p5'HIV-1 51, и затем 5' LTR модифицировали посредством удаления последовательностей, расположенных выше ТАТА-бокса, и лигировали сначала с энхансером CMV (цитомегаловирус) и затем с репликатором SV40 (p5'HIV-2). На стадии 2 после клонирования 3' LTR в pBluesript с получением p3'HIV-1 делали делецию 400 п. о. в 3' LTR энхансера/промотора с удалением цис-регуляторных элементов в U3 HIV и образованием p3HIV-2. На стадии 3 фрагменты, выделенные из p5'HIV-3 и p3'HIV-2, лигировали с получением pHIV-3. На стадии 4 p3'HIV-2 дополнительно модифицировали посредством удаления дополнительных, расположенных выше последовательностей HIV с получением p3'HIV-3, и к p3'HIV-3 добавляли фрагмент из 600 п. о. BamHI-Sall, содержащий WPRE, с получением p3'HIV-4. На стадии 5 уменьшали размер RRE pHIV-3 посредством ПЦР и лигировали с 5' фрагментом из pHIV-3 (не показано) и с p3'HIV-4 с получением pHIV-6. На стадии 6 фрагмент из 190 п. о. BgIII-BamHI, содержащий вытесняемую последовательность ДНК рРРТ из pNL4-3 (55) HIV-1, амплифицировали из pNL4-3 и размещали между последовательностями RRE и WPRE в pHIV6 с получением pHIV-7. Эту родительскую плазмиду pHIV7-GFP (GFP - зеленый флуоресцентный белок) использовали для упаковки родительского вектора с использованием четырехплазмидной системы.
Упаковочный сигнал - пси ψ - требуется для эффективной упаковки вирусного генома в вектор. RRE и WPRE усиливают транспорт РНК-транскрипта и экспрессию трансгена. Было продемонстрировано, что вытесняемая последовательность в комбинации с WPRE усиливает эффективность трансдукции лентивирусного вектора в клетках млекопитающих.
Хелперные функции, требующиеся для получения вирусного вектора, разделены на три отдельные плазмиды для уменьшения вероятности получения лентивируса, компетентного к репликации, посредством рекомбинации: 1) pCgp кодирует белок gag/pol, требующийся для сборки вирусного вектора; 2) pCMV-Rev2 кодирует белок Rev, который действует на последовательность RRE, помогая транспорту вирусного генома для эффективной упаковки и 3) pCMV-G кодирует гликопротеин вируса везикулостоматита (VSV), который требуется для инфективности вирусного вектора.
Имеется минимальная гомология последовательности ДНК между геномом вектора, кодируемого pHIV7, и хелперными плазмидами. Области гомологии включают область упаковочного сигнала из приблизительно 600 нуклеотидов, расположенную в последовательности gag/pol хелперной плазмиды pCgp; последовательность промотора CMV во всех трех хелперных плазмидах и последовательность RRE в хелперной плазмиде pCgp. Весьма маловероятно, что компетентный к репликации рекомбинантный вирус мог бы быть генерирован из-за гомологии в данных областях, так как потребовались бы многие события рекомбинации. Кроме того, у любых образующихся в результате рекомбинантов отсутствовали бы функциональные LTR и последовательности tat, требующиеся для репликации лентивируса.
Промотор CMV заменяли промотором EF1α-HTLV (EF1p), и новую плазмиду называли epHIV7 (Фиг. 4). EF1p имеет 563 п.о., и его вводили в epHIV7 с использованием Nrul и Nhel после вырезания промотора CMV.
Лентивирусный геном, исключая gag/pol и rev, которые необходимы для патогенности вируса дикого типа и требуются для продуктивной инфекции клеток-мишеней, удаляли из данной системы. Кроме того, конструкция вектора IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t_epHIV7 не содержит интактный промотор 3'LTR, таким образом, образующийся экспрессируемый и подвергающийся обратной транскрипции в клетках-мишенях провирусный геном на основе ДНК будет иметь неактивные LTR. В результате этой конструкции из провируса не будут транскрибироваться последовательности, происходящие из HIV-I, и от их соответствующих промоторов будут экспрессироваться только терапевтические последовательности. Ожидается, что удаление активности промотора LTR в векторе SIN значительно уменьшает вероятность ненамеренной активации генов хозяина (56). В Таблице 4 обобщены разные регуляторные элементы, присутствующие в IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t_epHIV7.
Пример 3: получение векторов для трансдукции Т-клеток пациента
Для каждой плазмиды (IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7, pCgp, pCMV-G и pCMV-Rev2) генерируется семенной банк, который используется для инокуляции ферментера для продукции достаточных количеств плазмидной ДНК. Плазмидную ДНК тестируют на идентичность, стерильность и уровень эндотоксинов до ее применения в продуцировании лентивирусного вектора.
Вкратце, клетки размножали от рабочей клетки 293Т (WCB), которая была протестирована на соответствие стерильности и отсутствию вирусного загрязнения. Флакон с клетками 293Т из WCB 293Т оттаивали. Клетки выращивали и размножали до тех пор, пока не образовалось достаточное число клеток для посева в подходящее число 10-слойных клеточных фабрик (CF) для продукции вектора и поддержания линии клеток. Для продукции можно использовать одну линию клеток.
4
2
Лентивирусный вектор продуцировали в подпартиях из вплоть до 10 CF. В ту же самую неделю можно продуцировать две подпартии, что приводит к продукции приблизительно 20 л лентивирусного супернатанта/неделю. Материал, продуцированный из всех подпартий, объединяли во время фазы последующей переработки для того, чтобы получить одну партию продукта. Клетки 293Т высевали в CF в среду 293Т (DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко) с 10% FBS (фетальная телячья сыворотка)). Фабрики помещали в инкубатор при 37°C  выравнивали горизонтально для того, чтобы получать равномерное распределение клеток на всех слоях CF. Через двое суток клетки трансфицировали четырьмя лентивирусными плазмидами, описанными выше, с использованием способа с CaPO, который включает смесь Tris:EDTA, 2 М CaCl, 2× HBS и четырех ДНК-плазмид. В сутки 3 после трансфекции собирали супернатант, содержащий секретированные лентивирусные векторы, очищали и концентрировали. После удаления супернатанта из CF из каждой CF отбирали клетки конечной продукции. Клетки из каждой фабрики трипсинизировали и собирали центрифугированием. Клетки ресуспендировали в среде для замораживания и криоконсервировали. Данные клетки позднее использовали для тестирования лентивируса, компетентного в отношении репликации (RCL).
-1
Для очистки и приготовления векторов неочищенный супернатант осветляли фильтрованием через мембрану для удаления клеточных обломков. ДНК клетки-хозяина и остаточную плазмидную ДНК деградировали эндонуклеазным расщеплением (Benzonase). Вирусный супернатант осветляли от клеточных обломков с использованием 0,45 мкм фильтра. Осветленный супернатант собирали в предварительно взвешенный контейнер, в который добавляли Benzonase (конечная концентрация 50 U(единиц)/мл). Эндонуклеазное расщепление остаточной плазмидной ДНК и геномной ДНК хозяина проводится при 37°C в течение 6 ч. Для удаления из неочищенного супернатанта остаточных низкомолекулярных компонентов использовали концентрирование обработанного эндонуклеазой супернатанта с использованием исходной ультрафильтрации с тангенциальным потоком (TFF), концентрируя вирус ~ в 20 раз. Осветленный вирусный супернатант, обработанный эндонуклеазой, циркулировал через картридж на основе полых волокон с порогом отсечения молекулярной массы 500 кДа, и скорость тока продумывали так, чтобы поддерживать скорость сдвига ~ 4000 с или менее при максимизации скорости тока. Диафильтрацию супернатанта, обработанного нуклеазой, инициировали во время процесса концентрирования для поддержания эффективности работы картриджа. Устанавливали скорость замены пермеата 80% с использованием 4% лактозы в PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) в качестве диафильтрационного буфера. Вирусный супернатант доводили до намеченного объема, обеспечивая 20-кратное концентрирование неочищенного супернатанта, и диафильтрацию продолжали с использованием 4 дополнительных замен объемов со скоростью замены пермеата 100%.
Дополнительное концентрирование вирусного продукта осуществляли с использованием методики высокоскоростного центрифугирования. Каждую подпартию лентивируса осаждали с использованием центрифуги Sorvall RC-26 plus при 6000 об./мин (RCF 6088) при 60°C в течение 16-20 ч. Вирусный осадок из каждой подпартии затем растворяли в объеме 50 мл с использованием 4% лактозы в PBS. Растворенный в данном буфере осадок представляет собой конечную композицию препарата вируса. Весь способ концентрирования вектора приводил приблизительно к 200-кратному уменьшению объема. После завершения получения всех подпартий материал затем помещали при -80°C, в то время как образцы из каждой подпартии тестировали на стерильность. После подтверждения стерильности образцов подпартии быстро оттаивали при 37°C с частым втряхиванием. Данный материал затем объединяли и вручную делили на аликвоты в боксе микробиологической безопасности класса II типа A/B3 в кабинете для получения вирусных векторов. Использовали конфигурацию заполнения 1 мл концентрированного лентивируса в стерильных криофлаконах класса 6 USP (фармакопея Соединенных Штатов) с наружной резьбой и О-кольцом. Системы контроля качества (QS) Центра разработки прикладных технологий (CATD) в СОН выпускали все материалы согласно политике и стандартному регламенту работы для CBG и в соответствии с современной надлежащей производственной практикой (cGMP).
Для обеспечения чистоты препарата лентивирусного вектора его тестировали на остаточные загрязнения ДНК хозяина и перенос остаточной ДНК хозяина и плазмиды. Среди других анализов идентичность вектора оценивали посредством ПЦР-ОТ (полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой) для того, чтобы убедиться, что присутствует правильный вектор. Для вектора, предназначенного для применения в данном исследовании, удовлетворяются все критерии выпуска.
CM
Пример 4: получение популяции клеток T CD4+/CD8+, подходящих для применения в ACT
CM
CM
С
Краткий обзор стратегии изготовления популяции клеток T CD4+/CD8+ проиллюстрирован на Фиг. 8 (схема изготовления IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T). В частности, продукты афереза, полученные от участников исследования, подписавших информированное согласие, разделяли на фиколе, промывали и инкубировали в течение ночи. Затем клетки обедняли популяциями моноцитов, регуляторных Т-клеток и наивных Т-клеток с использованием реактивов на основе антитела против CD14, антитела против CD25 и антитела против CD45RA уровня качества GMP (Miltenyi Biotec) и прибора для разделения CliniMACS™. После обеднения негативные фракции клеток обогащаются в отношении клеток Тм CD62L+ с использованим DREG56-биотина (клинический уровень качества СОН) и микрошариков против биотина (Miltenyi Biotec) на приборе для разделения CliniMACSTM. Клетки не обедняются ни в отношении клеток CD4+, ни в отношении клеток CD8+.
CM
5
6
9
После обогащения клетки T CD4+/CD8+ готовят в виде препарата в полной X-Vivo15 плюс 50 IU (Международные единицы)/мл IL-2 и 0,5 нг/мл IL-15 и переносят в тефлоновый мешок для культуры клеток, где они стимулируются шариками Dynal ClinEx™ Vivo CD3/CD28. Вплоть до пяти суток после стимулирования клетки трансдуцируются желательным вектором, экспрессирующим CAR (например, лентивирусным вектором IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7) при множественности инфекции (MOI), например, от 1,0 до 0,3. Культуры поддерживаются в течение вплоть до 42 суток с добавлением полной X-Vivo15 и цитокина IL-2 и IL-15 по мере необходимости для размножения клеток (поддерживая плотность клеток от 3×10 до 2×10 жизнеспособных клеток/мл и осуществляя дополнение цитокинами каждый понедельник, среду и пятницу культуры). При данных условиях клетки типично размножаются до приблизительно 10 клеток в пределах 21 суток. В конце периода культивирования клетки отбирают, дважды промывают и готовят в криоконсервирующей среде клинического уровня качества (Cryostore CS5, BioLife Solutions).
В сутки инфузии Т-клеток криоконсервированный и высвобожденный продукт оттаивают, промывают и готовят для повторной инфузии. Криоконсервированные флаконы, содержащие высвобожденный клеточный продукт, удаляют из хранилища с жидким азотом, оттаивают, охлаждают и промывают промывочным буфером на основе PBS/2% человеческого сывороточного альбумина (HSA). После центрифугирования супернатант удаляется и клетки ресуспендируются в инфузионном разбавителе на основе нормального физиологического раствора, не содержащего консерванты (PFNS)/2% HSA. Образцы удаляются для тестирования для контроля качества.
Два квалификационных прогона на клетках, полученных от здоровых доноров, осуществляли с использованием производственной платформы, описанной выше. Каждому продукту доклинического квалификационного прогона присваивали номер донора-человека (HD) - HD006.5 и HD187.1. Важно то, что как показано в Таблице 5, данные клетки квалификационных прогонов размножались более чем 80 раз в пределах 28 суток, и размноженные клетки экспрессировали трансгены IL13(EQ)BBγ/CD19t.
CM
Пример 5: анализ экспрессии трансгена поверхности и маркера Т-клеток в IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T посредством проточной цитометрии
CM
CM
В доклинических исследованиях использовали продукты двух доклинических квалификационных прогонов, описанные в Примере 4, как описано ниже. На Фиг. 6А-В показаны результаты анализа экспрессии трансгена поверхности и маркера Т-клеток посредством проточной цитометрии. IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T HD006.5 и HD187.1 совместно окрашивали антителом против IL13-PE и антителом против CD8-FITC для выявления клеток CD8+ CAR+ и CD4+ (т.е. CD8-негативных) CAR+ (Фиг. 6А), или антителом против CD19-PE и антителом против CD4-FITC для выявления клеток CD4+ CD19t+ и CD8+ (т.е. CD4-негативных) CAR+ (Фиг. 6Б). IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T HD006.5 и HD187.1 окрашивали антителами против CD3, TCR, CD4, CD8, CD62L и CD28, конъюгированными с флуорохромом (серые гистограммы), или изотипическими контролями (черные гистограммы). (Фиг. 6В). На каждой из Фиг. 6А-В указанные процентные доли основаны на жизнеспособных лимфоцитах (негативных в отношении DAPI), которые окрашивались сильнее, чем изотипический контроль.
CM
Пример 6: Эффекторная активность IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T
CM
CM
51
Оценивали эффекторную активность IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T, и результаты данного анализа показаны на Фиг. 7А-Б. Вкратце, IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T HD006.5 и HD187.1 использовали в качестве эффекторов в 6-часовом анализе высвобождения  Cr с использованием соотношения 10Е:1Т на основе экспрессии CD19t. IL13Rα2-позитивными опухолями-мишенями были K562, генетически модифицированная для экспрессии IL13Rα2 (K562-IL13Rα2), и линия первичной глиомы РВТ030-2, а IL13Rα2-негативной контрольной опухолью-мишенью была родительская линия K562 (Фиг. 7А). IL13(EQ)BBγ/CD19t+ HD006.5 и HD187.1 оценивали на антигензависимую продукцию цитокинов после совместной культуры в течение ночи при соотношении 10Е:1Т с использованием таких же IL13Rα2-позитивных и негативных мишеней, как описано выше. Уровни цитокинов измеряли с использованием набора для анализа Bio-Plex Pro Human Cytokine TH1/TH2, и показаны уровени IFN-γ (Фиг. 7Б).
CM
Пример 7: противоопухолевая активность IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T in vivo
CM
CM
CM
CM
CM
CM
6
6
6
6
6
6
Описанные ниже исследования демонстрируют то, что IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T показывают противоопухолевую эффективность в мышиных моделях in vivo. В частности, авторы изобретения оценили противоопухолевую эффективность IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T против линии РВТ030-2 IL13Rα2+ сфер первичной глиобластомной опухоли с малым числом пассажей, которую генетически модифицировали для экспрессии репортерных генов: и EGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок), и люциферазы светляка (ffLuc) (РВТ030-2 EGFP:ffLuc) (). Ряд первичных линий (РВТ) из образцов глиобластомы пациента выращивали в виде сфер опухоли (TS) в бессывороточных средах. Данные размноженные линии TS демонстрируют характеристики, подобные стволовым клеткам, включающие экспрессию маркеров стволовых клеток, многолинейную дифференциацию и способность к инициации ортотопических опухолей у иммунодефицитных мышй (NSG) при малом числе клеток. Модель TS-инициированного ксенотрансплантата РВТ030-2 EGFP:ffLuc (0,1×10 клеток; 5 суток после приживления) ранее использовали для оценки противоопухолевой активности in vivo Т-клеток, экспрессирующих IL13Rα2-специфичный CAR, у мышей NSG, при этом было показано, что три инъекции 2×10 цитолитических Т-лимфоцитов (CTL) на протяжении 2 недель уменьшают рост опухоли. Однако в данных экспериментах большинство опухолей РВТ030-2 в конечном счете давали рецидив. По сравнению с этим однократная инъекция IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T (1,1×10 CAR+ T; общее число Тcм 2×10) демонстрировала надежную противоопухолевую активность против TS-инициированных опухолей РВТ030-2 EGFP:ffLuc (0,1×10 клеток; 5 суток после приживления), как показано на Фиг. 8А-В. По сравнению с мышами NSG, обработанными либо PBS, либо T с имитацией трансдукции (без CAR), IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T значимо уменьшают поток ffLuc (р меньше 0,001 в моменты времени больше, чем 18 суток) и значительно улучшают выживание (р равно 0,0008).
5
6
6
6
CM
CM
CM
CM
CM
Вкратце, опухолевые клетки EGFP-ffLuc+РВТ030-2 (1×10) стереотактически имплантировали в правую часть переднего мозга мышей NSG. В сутки 5 мыши получали либо 2×10 IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T (1,1×10 CAR+; n равно 6), либо 2×10 имитации трансдукции T (без CAR; n равно 6), либо PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) (n равно 6). На Фиг. 8А показаны репрезентативные мыши из каждой группы, демонстрирующие относительную опухолевую нагрузку с использованием Xenogen Living Image. Количественное измерение потока ffLuc (фотоны/с) показывает то, что IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T индуцируют регрессию опухоли по сравнению с T с имитацией трансдукции и с PBS (# р меньше 0,02; * р меньше 0,001, ANOVA с повторными измерениями) (Фиг. 8Б). Как показано на Фиг. 8В, кривая выживания Каплана-Мейера (n равно 6 на группу) демонстрирует значимо улучшенное выживание (р равно 0,0008; логранговый критерий) для мышей, обработанных IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T.
CM
CM
Пример 8: сравнение клонов IL13(EQ)BBCζ+ T и CTL, не являющихся T, IL13-зетакин CD8+ по противоопухолевой эффективности и стойкости Т-клеток
CM
В исследованиях, описанных ниже, сравниваются IL13(EQ)BBζ+ T и созданные ранее IL13Rα2-специфичные человеческие CTL CD8+ (CTL IL13-зетакин CD8+ (описанные в Brown et al. 2012 Clin Cancer Res 18: 2199 и Kahlon et al. 2004 Cancer Res 64: 9160). В IL13-зетакин используется стимулирующий домен CD3ζ, отсутствует костимулирующий домен и используется тот же самый вариант IL13, что и в IL13(EQ)BBζ+.
Получали ряд первичных линий (РВТ) из образцов глиобластомы пациента, выращенных в виде сфер опухолей (TS) в бессывороточных средах (Brown et al. 2012 Clin Cancer Res 18:2199; Brown et al. 2009 Cancer Res 69:8886). Данные размноженные линии TS демонстрируют характеристики, подобные стволовым клеткам, включающие экспрессию маркеров стволовых клеток, многолинейную дифференциацию и способность к инициации ортотопических опухолей у иммунодефицитных мышй (NSG) при малом числе клеток. Для экспериментов, описанных ниже, использовали IL13Rα2+ линию TS первичной глиобластомы с малым числом пассажей РВТ030-2, которая была генетически модифицирована для экспрессии репортерных генов: и EGFP, и люциферазы светляка (ffLuc) (РВТ030-2 EGFP: ffLuc) (Brown et al. 2012 Clin Cancer Res 18:2199).
6
6
CM
CM
CM
CM
Сначала сравнивали одну дозу (1×10 Т-клеток CAR) продукта IL13(EQ)BBζ+ T с клонами CTL IL13-зетакин CD8+, оцениваемыми относительно TS-инициированных ксенотрансплантатов РВТ030-2 EGFP:ffLuc в сутки 8 (0,1×10 клеток). В то время как и Т-клетки с IL13Rα2-специфичным CAR (CTL с IL13-зетакин и IL13(EQ)BBζ+ T) демонстрировали противоопухолевую активность против прижившихся опухолей РВТ030-2 по сравнению с необработанным контролем или контролем в виде T с имитацией трансдукции (CAR-негативным) (Фиг. 9А и 9Б), IL13(EQ)BBZ+ T опосредовали значимо улучшенное выживание и надежную ремиссию опухоли с мышами, живущими больше 150 суток, по сравнению с первым поколением клонов CTL IL13-зетакин CD8+ авторов изобретения (Фиг. 9В).
6
6
6
CM
CM
CM
Для дальнейшего сравнения терапевтических эффективностей данных двух Т-клеточных продуков IL13Rα2-CAR осуществляли титрование дозы - 1,0, 0,3 и 0,1×10 Т-клеток с CAR относительно TS-инициированных опухолей РВТ030-2 EGFP:ffLuc в сутки 8 (Фиг. 10А-В). Наивысшая доза (1×10) клона 2D7 CTL IL13-зетакин CD8+ опосредовала противоопухолевые ответы при измерении потока посредством Xenogen у 3 из 6 животных (Фиг. 10В), но при меньших дозах Т-клеток с CAR не наблюдали значимых противоопухолевых ответов. По сравнению с этим, инъекция продукта IL13(EQ)BBζ+ T опосредовала полную регрессию опухоли у большинства мышей при всех уровнях дозы, включая обработку всего-лишь 0,1×10 Т-клеток с CAR. Эти данные демонстрируют то, что IL13(EQ)BBζ+ T являются по меньшей мере в 10 раз более эффективными по противоопухолевой эффективности, чем клоны CTL IL13-зетакин CD8+. Улучшенная противоопухолевая эффективность обусловлена улучшенной стойкостью Т-клеток в микроокружении опухоли. Оценка Т-клеток CD3+ через 7 суток после в.ч. инъекции выявила значимое число IL13(EQ)BBζ+ T в микроокружении опухоли, тогда как присутствовало очень мало CTL первого поколения IL13-зета (Фиг. 11).
Пример 9: сравнение пути доставки Т-клеток с CAR для лечения больших, РВТ опухолей, инициированных TS
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
6
6
Ниже описаны исследования, в которых сравнивается влияние пути доставки - внутривенного (в.в.) или внутричерепного (в.ч.) - на противоопухолевую активность против линий инвазивных первичных РВТ. В пилотных исследованиях (данные не показаны) неожиданно наблюдали то, что в.в. введенные IL13(EQ)BBζ+ T не давали терапевтической пользы по сравнению с PBS для лечения маленьких (сутки 5) опухолей РВТ030-2 EGFP:ffLuc. Это отличается от надежной терапевтической эффективности, наблюдаемой с в.ч. введенными Т-клетками CAR+. Обоснованием является то, что в сутки 5 опухоли РВТ030-2 возможно были слишком маленькими для рекрутирования терапевтических Т-клеток с периферии -делали сравнение в.в. относительно в.ч. доставки против больших опухолей РВТ030-2 EGFP:ffLuc в сутки 19. Для этих исследований мышей с прижившимися РВТ030-2 обрабатывали либо двумя в.в. инфузиями (5×10 CAR+ T; сутки 19 и 26), либо четырьмя в.ч. инфузиями (1×10 CAR+ T; сутки 19, 22, 26 и 29) IL13(EQ)BBZ+ T, или T с имитацией трансдукции (без CAR). Здесь также не отслеживали терапевтической пользы посредством визуализации Xenogen или анализом выживания Каплана-Мейера в отношении в.в. введенных Т-клеток CAR+ (Фиг. 12А и 12Б). В отличие от этого, для в.ч. введенных IL13(EQ)BBζ+ T наблюдали мощную противоопухолевую активность (Фиг. 12А-Б). Затем отбирали мозги из когорты мышей 7 суток после инъекции Т-клеток и оценивали на человеческие клетки CD3+ посредством IHC. Неожиданно, для мышей, обработанных в.в. либо T с имитацией трансдукции, либо IL13(EQ)BBζ+ T, в опухоли или в других областях мозга мыши, где типично находятся человеческие Т-клетки (т.е. мягкая и паутинная оболочки мозга), не было выявляемых человеческих Т-клеток CD3+ (Фиг. 12В), свидетельствуя о недостатке в тропизме в опухоль. Это отличается от значительного числа Т-клеток, выявленного у мышей, обработанных в.ч. (Фиг. 12Г).
CM
Цитокины, происходящие из опухоли, в частности, MCP-1/CCL2, являются важными в рекрутировании Т-клеток в опухоль. Таким образом, оценивали клетки опухоли РВТ030-2, и обнаружили, что данная линия продуцирует высокие уровни MCP-1/CCL2, сравнимые с клетками U251T (данные не показаны) - линией глиомы, для которой ранее было показано, что она привлекает в.в. введенные эффекторные Т-клетки CD8+ к в.ч. прижившимся опухолям. Злокачественные глиомы представляют собой высокоинвазивные опухоли и часто являются множественными по проявлению. В исследованиях, описанных выше, установлено то, что IL13BBZ T могут устранять инфильтрующие опухоли, такие как РВТ030-2, и опосредовать долговременную надежную противоопухолевую активность. Также проверили способность Т-клеток с CAR, доставленных внутричерепно, к транспорту в многоочаговое заболевание. Для этого исследования TS РВТ030-2 EGFP:ffLuc имплантировали как в левое, так и в правое полушария (Фиг. 13А), и Т-клетки CAR+ инъецировали только сайт правой опухоли. Ободряющим было то, что для всех оцененных мышей (n равно 3) авторы изобретения выявили Т-клетки посредством IHC против CD3 через 7 суток после инфузии Т-клеток как в месте инфекции (т.е. в правой опухоли), так и в опухоли на левом полушарии (Фиг. 13Б). Эти данные дают доказательство того, что Т-клетки CAR+ способны транспортироваться к и инфильтровать очаги опухоли в удаленных сайтах. Аналогичные данные также наблюдали во второй модели опухоли с использованием линии клеток глиомы U251T (данные не показаны).
Пример 10: последовательности IL13(EQ)BBζ/CD19t
Полная аминокислотная последовательность IL13(EQ)BBζ/CD19t показана на Фиг. 17. Полная последовательность (SEQ ID NO:1) включает: сигнальный пептид GMCSF из 22 аминокислот (SEQ ID NO:2), последовательность IL-13 из 112 аминокислот (SEQ ID NO:3, замена аминокислоты E13Y показана жирным шрифтом); последовательность lgG4 из 229 аминокислот (SEQ ID NO:4, с заменами аминокислот L235E и N297Q, показанными жирным шрифтом), трансмембранную последовательность CD4 из 22 аминокислот (SEQ ID NO:5), последовательность 4-1ВВ из 42 аминокислот (SEQ ID NO:6), 3-аминокислотный Gly линкер; последовательность CD3ζ из 112 аминокислот (SEQ ID NO:7), последовательность Т2А из 24 аминокислот (SEQ ID NO:8) и последовательность CD19t из 323 аминокислот (SEQ ID NO:9).
Последовательность зрелого химерного антигенного рецептора (SEQ ID NO:10) включает: последовательность IL-13 из 112 аминокислот (SEQ ID NO:3, замена аминокислоты E13Y показана жирным шрифтом); последовательность lgG4 из 229 аминокислот (SEQ ID NO:4, с заменами аминокислот L235E и N297Q, показанными жирным шрифтом), последовательность CD4 из 22 аминокислот (SEQ ID NO:5), последовательность 4-1ВВ из 42 аминокислот (SEQ ID NO:6), 3-аминокислотный Gly линкер и последовательность CD3ζ из 112 аминокислот (SEQ ID NO:7). В пределах данной последовательности CAR (SEQ ID NO:10) присутствует последовательность IL-13/lgG4/CD4t/41-BB (SEQ ID NO: 11), которая включает: последовательность IL-13 из 112 аминокислот (SEQ ID NO:3, замена аминокислоты E13Y показана жирным шрифтом); последовательность lgG4 из 229 аминокислот (SEQ ID NO:4, с заменами аминокислот L235E и N297Q, показанными жирным шрифтом), последовательность CD4 из 22 аминокислот (SEQ ID NO:5) и последовательность 4-1ВВ из 42 аминокислот (SEQ ID NO:6). Последовательность IL-13/lgG4/CD4t/4-1BB (SEQ ID NO:11) может быть соединена с последовательностью CD3ζ из 112 аминокислот (SEQ ID NO:7) посредством линкера, такого как GlyGlyGly линкер. Последовательности CAR (SEQ ID NO:10) может предшествовать сигнальный пептид GMCSF из 22 аминокислот (SEQ ID NO:2). На Фиг. 18 показано сравнение последовательностей IL13(EQ)41BBζ[IL13{EQ}41BBζ; T2A-CD19t_epHIV7; pF02630] (SEQ ID NO:12) и CD19Rop_epHIV7 (pJ01683) (SEQ ID NO:13).
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> CITY OF HOPE
<120> ЦЕНТРАЛЬНЫЕ Т-КЛЕТКИ ПАМЯТИ ДЛЯ АДОПТИВНОЙ Т-КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ
<130> 40056-0002WO2
<140> PCT/US2015/051280
<141> 2015-09-21
<150> 62/053,068
<151> 2014-09-19
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 889
<212> ПТР
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 1
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1               5                   10                  15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg
20                  25                  30
Tyr Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro
35                  40                  45
Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met
50                  55                  60
Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala
65                  70                  75                  80
Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val
85                  90                  95
Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu
100                 105                 110
Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe
115                 120                 125
Arg Glu Gly Arg Phe Asn Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
130                 135                 140
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
145                 150                 155                 160
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
165                 170                 175
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
180                 185                 190
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
195                 200                 205
Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
210                 215                 220
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
225                 230                 235                 240
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
245                 250                 255
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
260                 265                 270
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
275                 280                 285
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
290                 295                 300
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
305                 310                 315                 320
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
325                 330                 335
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
340                 345                 350
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Ala Leu Ile Val
355                 360                 365
Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe
370                 375                 380
Phe Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
385                 390                 395                 400
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
405                 410                 415
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val
420                 425                 430
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
435                 440                 445
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
450                 455                 460
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
465                 470                 475                 480
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
485                 490                 495
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
500                 505                 510
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
515                 520                 525
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu
530                 535                 540
Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
545                 550                 555                 560
Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu
565                 570                 575
Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val
580                 585                 590
Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr
595                 600                 605
Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu
610                 615                 620
Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His
625                 630                 635                 640
Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln
645                 650                 655
Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala
660                 665                 670
Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe
675                 680                 685
Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn
690                 695                 700
Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro
705                 710                 715                 720
Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu
725                 730                 735
Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln
740                 745                 750
Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val
755                 760                 765
Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His
770                 775                 780
Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg
785                 790                 795                 800
Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg
805                 810                 815
Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu
820                 825                 830
Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His
835                 840                 845
Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala
850                 855                 860
Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln
865                 870                 875                 880
Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg
885
<210> 2
<211> 22
<212> ПТР
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 2
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1               5                   10                  15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 3
<211> 112
<212> ПТР
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 3
Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu
1               5                   10                  15
Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met
20                  25                  30
Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu
35                  40                  45
Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg
50                  55                  60
Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys
85                  90                  95
Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn
100                 105                 110
<210> 4
<211> 229
<212> ПТР
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 4
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1               5                   10                  15
Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20                  25                  30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35                  40                  45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50                  55                  60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85                  90                  95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100                 105                 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115                 120                 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130                 135                 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165                 170                 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180                 185                 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195                 200                 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210                 215                 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 5
<211> 22
<212> ПТР
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 5
Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile
1               5                   10                  15
Gly Leu Gly Ile Phe Phe
20
<210> 6
<211> 42
<212> ПТР
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 6
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1               5                   10                  15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20                  25                  30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35                  40
<210> 7
<211> 112
<212> ПТР
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 7
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1               5                   10                  15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20                  25                  30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35                  40                  45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50                  55                  60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65                  70                  75                  80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85                  90                  95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100                 105                 110
<210> 8
<211> 24
<212> ПТР
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 8
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1               5                   10                  15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 9
<211> 323
<212> ПТР
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 9
Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met
1               5                   10                  15
Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp
20                  25                  30
Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln
35                  40                  45
Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu
50                  55                  60
Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile
65                  70                  75                  80
Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu
85                  90                  95
Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr
100                 105                 110
Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp
115                 120                 125
Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro
130                 135                 140
Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala
145                 150                 155                 160
Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro
165                 170                 175
Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro
180                 185                 190
Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser
195                 200                 205
Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser
210                 215                 220
Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp
225                 230                 235                 240
Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala
245                 250                 255
Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu
260                 265                 270
Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly
275                 280                 285
Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu
290                 295                 300
Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg
305                 310                 315                 320
Arg Lys Arg
<210> 10
<211> 867
<212> ПТР
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 10
Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu
1               5                   10                  15
Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met
20                  25                  30
Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu
35                  40                  45
Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg
50                  55                  60
Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys
85                  90                  95
Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn
100                 105                 110
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
115                 120                 125
Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
130                 135                 140
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
145                 150                 155                 160
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
165                 170                 175
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser
180                 185                 190
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
195                 200                 205
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
210                 215                 220
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
225                 230                 235                 240
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
245                 250                 255
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
260                 265                 270
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
275                 280                 285
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
290                 295                 300
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
305                 310                 315                 320
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
325                 330                 335
Leu Ser Leu Gly Lys Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly
340                 345                 350
Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Lys Arg Gly Arg Lys
355                 360                 365
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
370                 375                 380
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
385                 390                 395                 400
Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
405                 410                 415
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
420                 425                 430
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
435                 440                 445
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
450                 455                 460
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
465                 470                 475                 480
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
485                 490                 495
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
500                 505                 510
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg
515                 520                 525
Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
530                 535                 540
Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met
545                 550                 555                 560
Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp
565                 570                 575
Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln
580                 585                 590
Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu
595                 600                 605
Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile
610                 615                 620
Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu
625                 630                 635                 640
Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr
645                 650                 655
Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp
660                 665                 670
Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro
675                 680                 685
Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala
690                 695                 700
Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro
705                 710                 715                 720
Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro
725                 730                 735
Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser
740                 745                 750
Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser
755                 760                 765
Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp
770                 775                 780
Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala
785                 790                 795                 800
Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu
805                 810                 815
Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly
820                 825                 830
Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu
835                 840                 845
Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg
850                 855                 860
Arg Lys Arg
865
<210> 11
<211> 405
<212> ПТР
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 11
Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu
1               5                   10                  15
Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met
20                  25                  30
Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu
35                  40                  45
Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg
50                  55                  60
Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys
85                  90                  95
Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn
100                 105                 110
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
115                 120                 125
Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
130                 135                 140
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
145                 150                 155                 160
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
165                 170                 175
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser
180                 185                 190
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
195                 200                 205
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
210                 215                 220
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
225                 230                 235                 240
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
245                 250                 255
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
260                 265                 270
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
275                 280                 285
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
290                 295                 300
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
305                 310                 315                 320
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
325                 330                 335
Leu Ser Leu Gly Lys Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly
340                 345                 350
Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Lys Arg Gly Arg Lys
355                 360                 365
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
370                 375                 380
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
385                 390                 395                 400
Gly Gly Cys Glu Leu
405
<210> 12
<211> 7754
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид
<400> 12
gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc       60
tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg      120
taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg      180
aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt      240
gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg      300
actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga      360
attagatcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa      420
acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga      480
aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc      540
agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat      600
agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa      660
gaaaaaagca cagcaagcag cagctgacac aggacacagc aatcaggtca gccaaaatta      720
ccctatagtg cagaacatcc aggggcaaat ggtacatcag gccatatcac ctagaacttt      780
aaatgcatgg gtaaaagtag tagaagagaa ggctttcagc ccagaagtga tacccatgtt      840
ttcagcatta tcagaaggag ccaccccaca agatttaaac accatgctaa acacagtggg      900
gggacatcaa gcagccatgc aaatgttaaa agagaccatc aatgaggaag ctgcaggcaa      960
agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt     1020
tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca     1080
gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc     1140
aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg     1200
ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac     1260
tcatttgcac cactgctgtg ccttggatct acaaatggca gtattcatcc acaattttaa     1320
aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca taatagcaac     1380
agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa attcaaaatt ttcgggttta     1440
ttacagggac agcagagatc cagtttgggg atcaattgca tgaagaatct gcttagggtt     1500
aggcgttttg cgctgcttcg cgaggatctg cgatcgctcc ggtgcccgtc agtgggcaga     1560
gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gaaccggtgc     1620
ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt     1680
tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg     1740
caacgggttt gccgccagaa cacagctgaa gcttcgaggg gctcgcatct ctccttcacg     1800
cgcccgccgc cctacctgag gccgccatcc acgccggttg agtcgcgttc tgccgcctcc     1860
cgcctgtggt gcctcctgaa ctgcgtccgc cgtctaggta agtttaaagc tcaggtcgag     1920
accgggcctt tgtccggcgc tcccttggag cctacctaga ctcagccggc tctccacgct     1980
ttgcctgacc ctgcttgctc aactctacgt ctttgtttcg ttttctgttc tgcgccgtta     2040
cagatccaag ctgtgaccgg cgcctacggc tagcgccgcc accatgctgc tgctggtgac     2100
cagcctgctg ctgtgcgagc tgccccaccc cgcctttctg ctgatccctg gccccgtgcc     2160
ccctagcacc gccctgcgct acctgatcga ggaactggtg aacatcaccc agaaccagaa     2220
agcccccctg tgcaacggca gcatggtgtg gagcatcaac ctgaccgccg gcatgtactg     2280
tgccgccctg gaaagcctga tcaacgtgag cggctgcagc gccatcgaga aaacccagcg     2340
gatgctgtcc ggcttctgcc cccacaaggt gtccgccgga cagttcagca gcctgcacgt     2400
gcgggacacc aagatcgagg tggcccagtt cgtgaaggac ctgctgctgc acctgaagaa     2460
gctgttccgg gagggccggt tcaactacaa gaccaccccc cctgtgctgg acagcgacgg     2520
cagcttcttc ctgtacagca ggctgaccgt ggacaagagc cggtggcagg aaggcaacgt     2580
ctttagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agagcctgtc     2640
cctgagcctg ggcaagcggg tgaagttcag ccggtccgcc gacgcccctg cctaccagca     2700
gggccagaac cagctgtaca acgagctgaa cctgggcagg cgggaggaat acgacgtgct     2760
ggacaagcgg agaggccggg accctgagat gggcggcaag cctcggcgga agaaccccca     2820
ggaaggcctg tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg     2880
catgaagggc gagcggaggc ggggcaaggg ccacgacggc ctgtatcagg gcctgtccac     2940
cgccaccaag gatacctacg acgccctgca catgcaggcc ctgcccccaa ggtctagacc     3000
cgggctgcag gaattcgata tcaagcttat cgataatcaa cctctggatt acaaaatttg     3060
tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc     3120
tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta     3180
taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt     3240
ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca     3300
gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc     3360
ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt     3420
gtcggggaaa tcatcgtcct ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg     3480
cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg     3540
cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat     3600
ctccctttgg gccgcctccc cgcatcgata ccgtcgacta gccgtacctt taagaccaat     3660
gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg     3720
gctaattcac tcccaaagaa gacaagatct gctttttgcc tgtactgggt ctctctggtt     3780
agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca     3840
ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa     3900
ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagaa ttcgatatca     3960
agcttatcga taccgtcgac ctcgaggggg ggcccggtac ccaattcgcc ctatagtgag     4020
tcgtattaca attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt     4080
acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag     4140
gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gaaattgtaa     4200
gcgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc     4260
aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga     4320
gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag     4380
ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt     4440
ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta     4500
gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag     4560
cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg     4620
cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa     4680
cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac     4740
cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg     4800
tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc     4860
tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg     4920
atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga     4980
gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc     5040
aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag     5100
aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga     5160
gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg     5220
cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga     5280
atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt     5340
tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact     5400
ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt     5460
ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg     5520
ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta     5580
tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac     5640
tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta     5700
aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt     5760
tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt     5820
tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt     5880
gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc     5940
agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg     6000
tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg     6060
ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt     6120
cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac     6180
tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg     6240
acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg     6300
gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat     6360
ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt     6420
tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg     6480
attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa     6540
cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc     6600
ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga     6660
aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg     6720
ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc     6780
acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctcga aattaaccct cactaaaggg     6840
aacaaaagct ggagctccac cgcggtggcg gcctcgaggt cgagatccgg tcgaccagca     6900
accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat     6960
tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc     7020
tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag     7080
cttcgacggt atcgattggc tcatgtccaa cattaccgcc atgttgacat tgattattga     7140
ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc     7200
gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat     7260
tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc     7320
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc     7380
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt     7440
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta     7500
ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg     7560
gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac     7620
gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg     7680
tacggaattc ggagtggcga gccctcagat cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt     7740
actgggtctc tctg                                                       7754
<210> 13
<211> 8732
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид
<400> 13
gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc       60
tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg      120
taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg      180
aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt      240
gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg      300
actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga      360
attagatcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa      420
acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga      480
aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc      540
agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat      600
agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa      660
gaaaaaagca cagcaagcag cagctgacac aggacacagc aatcaggtca gccaaaatta      720
ccctatagtg cagaacatcc aggggcaaat ggtacatcag gccatatcac ctagaacttt      780
aaatgcatgg gtaaaagtag tagaagagaa ggctttcagc ccagaagtga tacccatgtt      840
ttcagcatta tcagaaggag ccaccccaca agatttaaac accatgctaa acacagtggg      900
gggacatcaa gcagccatgc aaatgttaaa agagaccatc aatgaggaag ctgcaggcaa      960
agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt     1020
tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca     1080
gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc     1140
aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg     1200
ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac     1260
tcatttgcac cactgctgtg ccttggatct acaaatggca gtattcatcc acaattttaa     1320
aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca taatagcaac     1380
agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa attcaaaatt ttcgggttta     1440
ttacagggac agcagagatc cagtttgggg atcaattgca tgaagaatct gcttagggtt     1500
aggcgttttg cgctgcttcg cgaggatctg cgatcgctcc ggtgcccgtc agtgggcaga     1560
gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gaaccggtgc     1620
ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt     1680
tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg     1740
caacgggttt gccgccagaa cacagctgaa gcttcgaggg gctcgcatct ctccttcacg     1800
cgcccgccgc cctacctgag gccgccatcc acgccggttg agtcgcgttc tgccgcctcc     1860
cgcctgtggt gcctcctgaa ctgcgtccgc cgtctaggta agtttaaagc tcaggtcgag     1920
accgggcctt tgtccggcgc tcccttggag cctacctaga ctcagccggc tctccacgct     1980
ttgcctgacc ctgcttgctc aactctacgt ctttgtttcg ttttctgttc tgcgccgtta     2040
cagatccaag ctgtgaccgg cgcctacggc tagcgccgcc accatgctgc tgctggtgac     2100
cagcctgctg ctgtgcgagc tgccccaccc cgcctttctg ctgatccccg acatccagat     2160
gacccagacc acctccagcc tgagcgccag cctgggcgac cgggtgacca tcagctgccg     2220
ggccagccag gacatcagca agtacctgaa ctggtatcag cagaagcccg acggcaccgt     2280
caagctgctg atctaccaca ccagccggct gcacagcggc gtgcccagcc ggtttagcgg     2340
cagcggctcc ggcaccgact acagcctgac catctccaac ctggaacagg aagatatcgc     2400
cacctacttt tgccagcagg gcaacacact gccctacacc tttggcggcg gaacaaagct     2460
ggaaatcacc ggcagcacct ccggcagcgg caagcctggc agcggcgagg gcagcaccaa     2520
gggcgaggtg aagctgcagg aaagcggccc tggcctggtg gcccccagcc agagcctgag     2580
cgtgacctgc accgtgagcg gcgtgagcct gcccgactac ggcgtgagct ggatccggca     2640
gccccccagg aagggcctgg aatggctggg cgtgatctgg ggcagcgaga ccacctacta     2700
caacagcgcc ctgaagagcc ggctgaccat catcaaggac aacagcaaga gccaggtgtt     2760
cctgaagatg aacagcctgc agaccgacga caccgccatc tactactgcg ccaagcacta     2820
ctactacggc ggcagctacg ccatggacta ctggggccag ggcaccagcg tgaccgtgag     2880
cagcgagagc aagtacggcc ctccctgccc cccttgccct gcccccgagt tcctgggcgg     2940
acccagcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc     3000
cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagat cccgaggtcc agttcaattg     3060
gtacgtggac ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag cccagggaag agcagttcaa     3120
cagcacctac cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa     3180
agaatacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc agcatcgaga aaaccatcag     3240
caaggccaag ggccagcctc gggagcccca ggtgtacacc ctgccccctt cccaggaaga     3300
gatgaccaag aatcaggtgt ccctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat     3360
cgccgtggag tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt     3420
gctggacagc gacggcagct tcttcctgta cagcaggctg accgtggaca agagccggtg     3480
gcaggaaggc aacgtcttta gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac     3540
ccagaagagc ctgtccctga gcctgggcaa gatggccctg atcgtgctgg gcggcgtggc     3600
cgggctgctg ctgttcatcg gcctgggcat ctttttccgg gtgaagttca gccggtccgc     3660
cgacgcccct gcctaccagc agggccagaa ccagctgtac aacgagctga acctgggcag     3720
gcgggaggaa tacgacgtgc tggacaagcg gagaggccgg gaccctgaga tgggcggcaa     3780
gcccaggcgg aagaaccctc aggaaggcct gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc     3840
cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggcgg aggggcaagg gccacgacgg     3900
cctgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa ggatacctac gacgccctgc acatgcaggc     3960
cctgcccccc aggtgacccg ggctgcagga attcgatatc aagcttatcg ataatcaacc     4020
tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac     4080
gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt     4140
cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt     4200
tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg     4260
cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac     4320
ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac     4380
tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt     4440
tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc     4500
ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg     4560
ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg catcgatacc gtcgactagc     4620
cgtaccttta agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga     4680
aaagggggga ctggaagggc taattcactc ccaaagaaga caagatctgc tttttgcctg     4740
tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa     4800
cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct     4860
gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc     4920
tagcagaatt cgatatcaag cttatcgata ccgtcgacct cgaggggggg cccggtaccc     4980
aattcgccct atagtgagtc gtattacaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac     5040
tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc     5100
tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat     5160
ggcgaatgga aattgtaagc gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa     5220
tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat     5280
agaccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg     5340
tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac     5400
catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta     5460
aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag     5520
ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg     5580
taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcaggt ggcacttttc     5640
ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc     5700
cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga     5760
gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt     5820
ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag     5880
tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag     5940
aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta     6000
ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg     6060
agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca     6120
gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag     6180
gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc     6240
gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg     6300
tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc     6360
ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg     6420
cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg     6480
gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga     6540
cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac     6600
tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa     6660
aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca     6720
aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag     6780
gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac     6840
cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa     6900
ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc     6960
accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag     7020
tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac     7080
cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc     7140
gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc     7200
ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca     7260
cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc     7320
tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg     7380
ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct     7440
ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata     7500
ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc     7560
gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg     7620
acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca     7680
ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg     7740
tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagctcgaaa     7800
ttaaccctca ctaaagggaa caaaagctgg agctccaccg cggtggcggc ctcgaggtcg     7860
agatccggtc gaccagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact     7920
ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag     7980
gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc     8040
ctaggctttt gcaaaaagct tcgacggtat cgattggctc atgtccaaca ttaccgccat     8100
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata     8160
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc     8220
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag     8280
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac     8340
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg     8400
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg     8460
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat     8520
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt     8580
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc     8640
aaatgggcgg taggcgtgta cggaattcgg agtggcgagc cctcagatcc tgcatataag     8700
cagctgcttt ttgcctgtac tgggtctctc tg                                   8732
30
<---