Оптимизация условий получения диагностических флюоресцирующих моноклональных иммуноглобулинов для идентификации холерных вибрионов О1и О139-серогрупп

© коллектив авторов, 2012

удк 579.843.1.083.34

О. Ф. Кретенчук, Л. П. Алексеева, О. в. маркина, Г. А. Козлова, м. Э. Яговкин, в. Д. Кругликов, И. в. Архангельская

оптимизация условий получения диагностических флюоресцирующих моноклональных иммуноглобулинов для идентификации холерных вибрионов О1- и 0139-серогрупп

ФКУЗ Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Получены видоспецифические флюоресцирующие моноклональные иммуноглобулины для выявления холерных вибрионов О1- и 0139-серогрупп в реакции прямой иммунофлюоресценции. Установлено, что источником моноклональных антител (МКА) для приготовления флюоресцирующих конъюгантов могут быть не только асцитические, но и культуральные жидкости. Подобраны оптимальные условия получения ФИТЦ-МКА, технология изготовления которых может быть воспроизведена в любое время ввиду наличия в криохранилище института гибридом-продуцентов МКА О1 и МКА О139. Результаты испытаний флюоресцирующих препаратов на гомологичных и гетерологичных штаммах показали их строгую специфичность и высокую чувствительность в отношении холерных вибрионов О1- и О139-серогрупп. Новые препараты способствуют существенному повышению эффективности диагностики V. cholerae О1 и 0139.

Ключевые слова: холерные вибрионы, диагностика, моноклональные антитела, флюоресцирующие препараты

O.F. Kretentchuk, L.P. Alekseyeva, O.V. Markina, G.A. Kozlova, M.E. Yagovkin, V.D. Kruglikov, I.V. Arkhangelskaya THE OPTIMIZATION OF CONDITIONS OF DIAGNOSTIC FLUORESCENT MONOCLONAL IMMUNOGLOBULINS PRODUCTION TO IDENTIFY COMMA BACILLUS OF SEROGROUPS O1AND

O139.

The article considers the issue of producing the species-specific fluorescent monoclonal immunoglobulins to detect comma bacillus of serogroups O1 and O139 in the reaction of direct immunofluorescence. It is established that not only ascitic but culture fluid too can be the source of monoclonal antibodies for producing fluorescent conjugates. The optimal conditions are selected to produce the fluorescent monoclonal immunoglobulins-monoclonal antibodies. The corresponding producing technology can be reproduced at any time in view of availability of hybrid-producers of monoclonal antibodies O1 and monoclonal antibodies O139 in the institute cryodepository. The results of testing the fluorescent preparations on homologous and heterologous strains demonstrated their strict specificity and high sensibility regarding comma bacillus of serogroups O1 and O139. The new preparations favor significant increase of effectiveness of diagnostics of V.cholerae O1 and 0139/

Key words: comma bacillus, diagnostics, monoclonal antibody, fluorescent preparation

В настоящее время в соответствии с действующим МУК 4.2.2870-11 по лабораторной диагностике холеры регламентируется использование метода флюоресцирующих антител на всех этапах исследования клинического материала. Однако существующие ныне люминесцирующие сыворотки не отвечают в полной мере современным требованиям, так как имеют ряд недостатков: разнородность и гетерогенность популяций антител, низкие титры специфических иммуноглобулинов, наличие перекрестных реакций [8, 11, 12]. Вопрос повышения чувствительности и специфичности диагностических препаратов может быть решен за счет использования моноклональных антител (МКА), как это было сделано за рубежом [9, 10]. В лаборатории гибридом РостНИПЧИ выведены стабильные гибридные клоны, продуцирующие видоспецифические МКА 01 и МКА 0139. Их свойства детально охарактеризованы, и результаты исследований опубликованы [1, 2]. Гибридные клоны депонированы в специализированной коллекции клеточных культур позвоночных (Санкт-Петербург) под номерами РККК (П) 386 Д и РККК (П) 674 Д. На штаммы культивируемых гибридных клеток, продуцирующих МКА к О-антигену холерных вибрионов О1-серогруппы и к липополисахариду (ЛПС) холерных ви-

Для корреспонденции:

Кретенчук Оксана Федоровна, мл. науч. сотр. группы гибридом Адрес: 344022, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40 Телефон: 240-27-09 E-mail: plague@aaanet.ru

брионов О139-серогруппы, получены патенты. В России отсутствуют зарегистрированные моноклональные препараты для иммунодиагностики холеры, поэтому мы считаем актуальным разработку флюоресцирующих MRA и внедрение их в практическое здравоохранение. В связи с этим цель нашей работы - установление оптимальных условий получения ви-доспецифических флюоресцирующих MКA для выявления холерных вибрионов oí- и О139-серогрупп в реакции прямой иммунофлюоресценции.

Материалы и методы. Штаммы микроорганизмов. В работе использовали штамма V. cholerae oí, 35 штаммов V. cholerae oí39, í6 штаммов V. cholerae не Oí/не 0í39, 5 штаммов V. cholerae ro, 7 штаммов Aeromonas, 4 штамма Brucella sp., 4 штамма Salmonella sp. Все штаммы получены из коллекции музея живых культур РостНИПЧИ. Mазки этих штаммов приготовлены на базе лаборатории микробиология холеры.

Культивирование гибридом in vitro. Гибридомы-про-дуценты видоспецифических MКA к V. cholerae oí (F8Gí2) и V. cholerae Oí39 (3Е4) пассировали многократно в жидких питательных средах RPMI-í640 («sigma», США) и DMEM («sigma», США) c í0-í5% сывороткой плода коровы («Hyclone») в СО2-инкубаторе (Nunre).

Культивирование гибридом in vivo. Для получения асци-тических жидкостей использовали инбредных мышей линии BALB/c массой í6-20 г. Животным вводили внутрибрюшин-но (в/б) пристан («sigma», США) по 0,5 мл и через í0-í4 дней по í0 гибридных клеток.

Выделение иммуноглобулиновой фракции из культураль-ной жидкости (КЖ) гибридом осуществляли путем преципи-

ИММУНОЛОГИЯ

тации сульфатом аммония [5]. К охлажденным супернатан-там медленно, постоянно перемешивая, добавляли насыщенный раствор сульфата аммония до конечной концентрации 50%. Осаждение проводили на магнитной мешалке в течение 2 ч при температуре -4oC, после чего центрифугировали и осадок иммуноглобулинов суспендировали в 0,15 М NaCl. Очистку МКА с помощью каприловой кислоты проводили по методу [13].

Маркировка иммуноглобулинов флюоресцинизотиоциа-нат (ФИТЦ). После выделения и очистки концентрацию иммуноглобулинов доводили до 5-10 мг/мл и прибавляли ФИТЦ в концентрации 0,05 мг на 1 мг белка. Конъюгацию проводили не менее 18 ч в условиях холодильника при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Для освобождения от несвязавшегося флюорохрома меченные ФИТЦ МКА диализовали против 0,15 М Nad

Методика проведения РПИФ. Высушенные и фиксированные мазки бактериальных взвесей обрабатывали раствором флюоресцирующих МКА в рабочем разведении и помещали во влажную камеру. Через 30 мин промывали дважды ФСБ и 1 раз дистиллированной водой, затем подсушивали на воздухе. Учет результатов проводили по четырехкрестовой системе на люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ.

Результаты и обсуждение. Источником МКА, необходимых для получения диагностических препаратов, могут быть как асцитические жидкости (АЖ), так и КЖ. В составе АЖ, как правило, не менее 10 мг/мл специфических иммуноглобулинов, однако они в значительной степени контаминирова-ны другими мышиными белками, и требуется немало усилий для их очистки. Следует учитывать и другой момент - для формирования асцитных опухолей в условиях in vivo необходим как минимум 1 мес с момента праймирования мышей. В то же время пассирование гибридом в условиях in vitro сопровождается накоплением больших объемов КЖ. Несмотря на то что количество МКА в АЖ значительно больше, в данной работе предусмотрена оценка КЖ как источника МКА для конъюгации с ФИТЦ.

В экспериментах использовали видоспецифические ги-бридомы, продуцирующие МКА 01 (F8G12) и МКА О139 (ЗЕ4), которые были подняты из азота и многократно пассированы в культуральной питательной среде. Надосадочную (культуральную) жидкость отделяли центрифугированием, а клеточный осадок (живые гибридомные клетки) вводили в/б мышам линии BALB/c.

При выделении и очистке МКА из КЖ следует иметь в виду высокое содержание в ней сывороточных альбуминов, которые, связываясь с флюорохромом, могут присоединить значительную часть флюоресцентной метки, если их не удалить. В настоящее время описано немало методических приемов выделения иммуноглобулинов из КЖ [3, 6], но выбор метода обусловлен, как правило, следующими критериями: количественным выходом специфических иммуноглобулинов и их активностью в серологических реакциях. Процесс выделения МКА также имеет свои особенности, в частности работу проводят при температуре, близкой к 0oc, не применяют сильнокислых и сильнощелочных растворов. Аффинная хроматография позволяет получить чистые иммуноглобулины, но использование низких значений рН может привести к значительной потере активности некоторых МКА и выпадению их в нерастворимый осадок, поэтому чаще используют нехроматографические методы: 1) высаливание белков насыщенным раствором сульфата аммония с последующим диализом [5]; 2) очистку МКА осаждением балластных белков каприловой кислотой с последующим концентрированием насыщенным раствором сульфата аммония [13].

Для сравнительной оценки эффективности методов выделения иммуноглобулиновой фракции использовали образцы КЖ испытуемых гибридом в объеме не меньше 200 мл. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что при одностадийном осаждении (NH4)2S04 выход МКА составил

15% из КЖ Р8012 (126 мг из 840 мг общего белка) и 10% из КЖ ЗЕ4 (70 мг из 700 мг общего белка). Использование во втором методе с каприловой кислотой аналогичных объемов КЖ привело к значительным потерям белка, так как выход иммуноглобулинов составил 5% из КЖ Р8012 (42 мг) и 3% из КЖ 3Е4 (21 мг). При сравнении данных количественного выхода специфических иммуноглобулинов установили, что быстрая одностадийная очистка преципитацией насыщенным раствором сульфата аммония в большей степени удовлетворяла нашим требованиям.

Активность очищенных иммуноглобулиновых фракций колебалась в иммуноферментном анализе от 1:5000 до 1:40 000 и в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) от 1:4 до 1:80. Основным критерием отбора МКА для конъюгации их с ФИТЦ явилось интенсивное свечение клеток V. Ло1егае О1 и О139 в РНИФ в титре не менее 1:32.

Следующим этапом нашей работы стала отработка оптимальных условий конъюгации специфических иммуноглобулинов с флюоресцентным красителем. Были апробированы различные параметры [4, 7] получения ФИТЦ-МКА, которые представленывтабл. 1. Лучшие результатыобеспечивалвторой методический вариант: концентрация белка не ниже 5 мг/мл, ФИТЦ 0,5 мг на 10 мг белка, 10% КББ, рН реакционной смеси 9 (достигалась предварительным диализом раствора иммуноглобулинов против КББ), конъюгацию проводили в условиях холодильника в течение 18 ч. Следует отметить также, что при получении концентратов МКА из КЖ иммуноглобулины растворяли в 0,15 М №С1, с тем чтобы избежать денатурации и достичь нужной концентрации антител.

По отработанной схеме мы приготовили экспериментальные образцы флюоресцирующих моноклональных препаратов. С целью определения рабочего разведения мазки нескольких штаммов холерных вибрионов обрабатывали конъюгатами в разведениях от 1:4 до 1:32 по общепринятой методике. Установили, что красящий титр ФИТЦ-МКА 01 равняется 1:16, ФИТЦ-МКА 0139 - 1:8. Определили, что чувствительность препаратов ФИТЦ-МКА находится на уровне 105 м.к./мл. Специфическую активность полученных препаратов исследовали на наборе штаммов V. Ло1егае О1 и О139. Результаты представлены в табл. 2. У 40 из 42 штаммов V. Ло1егае О1 при взаимодействии с ФИТЦ-МКА 01 зарегистрировали положительную реакцию, из них 22 светились на 4+ и 18 на 3+. Установили также, что клетки холерных вибрионов О1, имеющие иммунофлюоресценцию не больше 2+, отличались низкой агглютинабельностью, возможно, из-за утраты части О-антигена или нарушения его целостности.

Специфическую активность полученных флюоресцирующих препаратов для выявления холерных вибрионов О139-серогруппы изучали в сравнении с экспериментальной поликлональной О139-люминесцирующей сывороткой

Таблица 1

основные параметры метода получения моноклональных флюоресцирующих препаратов

Параметр конъюгации Способ

1-й 2-й

Концентрация специфических иммуноглобулинов, мг/мл < 5 > 5

Предварительный этап - диализ раствора МКА против 0,05 М КББ, рН 9 Диализ не проводят Диализ проводят

Концентрация КББ в реакционной смеси, % 10 10

Температура реакции, 0С 20-25 4-6

Количество ФИТЦ на 10 мг белка, мг 0,3 0,5

Продолжительность реакции, ч 2 18

Таблица 2

Оценка специфичности ФИТЦ-МКА Ol, ФИТЦ-МКА O139 и поликлональной О139-люминесцирующей сыворотки в РИФ

РИФ

Штамм Количество штаммов ФИТЦ-MRA O1

4+ 3+ 2+ 4+ 3+ 2+ 4+ 3+ 2+

V. cholerae eltor Inaba 1б 10 б -

V. cholerae eltor Ogawa V. cholerae cholerae Inaba 17 5 7 4 9 1 1 Oтрицательная реакция Oтрицательная реакция

V. cholerae cholerae Ogawa 4 1 2 1

V. cholerae 0139 от человека 17 8 7 2 8 9 -

V. cholerae 0139 из воды 18 12 б - 5 11 2

V. cholerae не Ol/не 0139, в том числе V. cholerae O22 1б Oтрицательная реакция 2+/3+

V. cholerae RO 5 Oтрицательная реакция

Aeromonas Brucella sp. 7 4 Oтрицательная реакция Oтрицательная реакция

Salmonella sp. 4

Примечание. РИФ - реакция иммунофлюоресценции; 4+ и 3+ - специфическое свечение; 2+ - сомнительная реакция.

(РосНИПЧИ «Микроб», Саратов), которой мы располагали. Из 35 штаммов V. Cholerae О139 большая часть (20 штаммов) при взаимодействии с ФИТЦ-МКА О139 интенсивно светились на 4+ с четко выраженной морфологией клеток, 13 штаммов на 3+, 2 штамма от человека имели свечение на 2+. С поликлональной сывороткой О139 зарегистрировали положительную реакцию на 3+/4+ в отношении 33 штаммов. Два штамма из числа испытуемых светились на 2+. Из табл. 2 также следует, что ФИТЦ-МКА О139 отличаются высокой специфичностью, так как мы не выявили перекрестных реакций с близкородственными микроорганизмами, в том числе с V. cholerae О22, которые имеют ЛПС, структурно сходный с таковым V. cholerae О139. В отличие от МКА поликлональ-ные флюоресцирующие антитела при взаимодействии с клетками V. cholerae О22 обеспечивали свечение на 2+/3+. Это свидетельствует о том, что в процессе адсорбции сыворотки клетками V. cholerae О22 не удалось полностью избавиться от антител, общих с V. cholerae О139.

Препараты ФИТЦ-МКА О1 и ФИТЦ-МКА О139 лиофи-лизированы и хранятся при 4oC в течение двух лет. Периодическая проверка препаратов в процессе хранения показала, что они сохраняют свою активность на исходном уровне.

Заключение. Таким образом, источником МКА для приготовления флюоресцирующих конъюгатов с рабочим разведением 1:8-1:16 могут быть не только АЖ, но и КЖ. Технология их приготовления может быть воспроизведена в любое время ввиду наличия в криохранилище института гибридом-продуцентов МКА О1 и МКА О139. После установления наиболее оптимальных условий конъюгации МКА с ФИТЦ приготовлены экспериментальные серии флюоресцирующих препаратов, которые испытаны на широком наборе холерных вибрионов О1, О139, близкородственных и гетерологичных штаммах. Результаты испытаний показали высокую специ-

фичность ФИТЦ-МКА, и очевидно, что внедрение их в практическое здравоохранение будет способствовать повышению качества и достоверности серологического анализа на холеру.

ЛИТЕРАТУРА

1. Алексеева Л. П., Бурлакова О. С., Балахнова В. В. // Микробиол. журн. - 1992. - Т. 54, № 6. - С. 50-54.

2. Алексеева Л. П., Сальникова О. И., МазрухоБ. Л. и др. // Биотехнология. - 2002. - № 2. - С. 79-84.

3. Антитела. Методы: Кн. 1 / Под ред. Д. Кэтти: Пер. с англ. - М.: Мир, 1991.

4. Жарникова И. В., Брыкалов А. В., Жарникова Т. В. и др. // Биотехнология. - 2008. - № 3. - С. 90-95.

5. Моноклональные антитела. Гибридомы: новый уровень биологического анализа / Под ред. Р. Г. Кеннета и др.: Пер. с англ. - М.: Медицина, 1983.

6. Петрова Е. Г., Комалева Р. Л., Лахтина О. Е. и др. // Биоорган. химия. - 2009. - Т. 35, № 3. - С. 357-367.

7. ШторцX. Иммунофлюоресценция: Иммунологические методы.

- М.: Медицина, 1987. - С. 128-148.

8. GodfroidF., Taminian D., Danese J. et al. // Infect. Im^n. - 1998. -Vol. 66, N 11. - P. 5485-5493.

9. Gustafsson В., Holme T. // J. Clin. Microbiol. - 1984. - Vol. 20, N 6. - P. 1180-1185.

10. Hasan J. A., Bernstein D., Huq А. et al. // FEMS Microbiol. Lett. -1994. - Vol. 1205, N 1-2. - P. 143-148.

11. Kondo S., Iguchi Т., Haishima Y. et al. // Microbiol. Im^nol. - 1989.

- Vol. 33, N 2. - P. 1045-1052.

12. Landersjo C., Weintraub F., AnsaruzzamanM. et al. // J. Biochem. -1998. - Vol. 251, N 3. - P. 986-990.

13. Steinbuch M., Audran R. // Arch. Biochem. - 1969. - Vol. 227. - P. 680-685.

Поступила 09.12.11