ОПТИМИЗИРОВАННЫЕ КОМПОЗИЦИИ АНТИТЕЛ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ГЛАЗ
OPTIMIZED ANTIBODY COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF EYE DISEASES

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
В данной заявке содержится перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и полностью включен в данный документ посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 22 марта 2018 года, называется 50474-1600WO3_Sequence_Listing_3.22.18_ST25 и имеет размер 57671 байт.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение в целом относится к конъюгатам антител, антителам, сконструированным введением цистеина (cysteine engineered), их композициям (например, фармацевтическим композициям), и способам их применения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Ангиогенез представляет собой строго регулируемый процесс, посредством которого из ранее существовавших кровеносных сосудов образуются новые кровеносные сосуды. Хотя ангиогенез имеет важное значение в процессе развития для обеспечения адекватной циркуляции крови, многие нарушения связаны с патологическим ангиогенезом, такими как заболевания глаз (например, возрастная макулярная дегенерация, ВМД) и клеточные пролиферативные заболевания (например, рак). Фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС - VEGF - vascular endothelial growth factor) является клинически апробированным стимулирующим фактором ангиогенеза, и нейтрализация ФРЭС (например, с использованием блокирующего анти-ФРЭС антитела), может быть использована для лечения нарушений, связанных с патологическим ангиогенезом.
Современные подходы к лечению заболеваний глаз, связанных с патологическим ангиогенезом (например, ВМД (AMD) (например, влажная ВМД), диабетическим макулярным отеком (ДМО), диабетической ретинопатией (ДР) и окклюзией вены сетчатки (ОВС)), как правило, включают инъекции в стекловидное тело антагонистов ФРЭС (например, анти-ФРЭС Fab ранибизумаба). Поскольку место действия анти-ФРЭС Fab-фрагментов находится на задней стенке глаза на сетчатке, а также потому, что Fab-фрагменты могут иметь относительно короткое время пребывания в глазе, максимальную пользу для пациента от анти-ФРЭС Fab-фрагментов, как правило, получают путем относительно частого введения доз (например, каждые четыре недели, Q4W) путем инъекции в стекловидное тело. Пролонгированная доставка анти-ФРЭС антител или фрагментов антител (например, Fab-фрагментов) при заболеваниях глаз может быть желательна по меньшей мере, частично, чтобы уменьшить частоту введение доз, что может улучшить удобство пациента и соблюдение режима лечения.
В данном случае сохраняется потребность в композициях антител для пролонгированной доставки для лечения заболеваний глаз (например, ВМД (например, влажной ВМД), диабетического макулярного отека (ДМО), диабетической ретинопатии (ДР) и окклюзии вены сетчатки (ОВС)).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение обеспечивает конъюгаты антител, которые содержат монодисперсные полимеры (например, монодисперсные полимеры гиалуроновой кислоты (ГК)), ковалентно связанные с антителами (например, анти-ФРЭС антителами), антитела, сконструированные введением цистеина, которые могут быть использованы, например, при получении конъюгатов антител, композиций, которые содержат конъюгаты антител (например, фармацевтические композиции), а также способы их получения и применения, например, применения в терапевтических целях.
В одном аспекте данное изобретение относится к конъюгату антитела, содержащему (i) антитело, и (ii) полимер гиалуроновой кислоты (ГК), ковалентно присоединенный к антителу, причем полимер ГК имеет индекс полидисперсности (PDI - polydispersity index) 1,1 или ниже. В некоторых вариантах осуществления полимер ГК имеет PDI от 1,0 до 1,1. В некоторых вариантах осуществления полимер ГК имеет PDI от 1,0 до около 1,05. В некоторых вариантах осуществления полимер ГК имеет PDI от около 1,0001 до около 1,05. В некоторых вариантах осуществления полимер ГК имеет PDI около 1,001. В некоторых вариантах осуществления полимер ГК имеет молекулярную массу около 1 мегадальтона (МДа) или ниже. В некоторых вариантах осуществления полимер ГК имеет молекулярную массу в диапазоне от около 25 кДа и около 500 кДа. В некоторых вариантах осуществления полимер ГК имеет молекулярную массу в диапазоне от около 100 кДа и около 250 кДа. В некоторых вариантах осуществления полимер ГК имеет молекулярную массу в диапазоне от около 150 кДа и около 200 кДа. В некоторых вариантах осуществления полимер НА представляет собой линейный полимер ГК. В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела имеет гидродинамический радиус в пределах от около 10 нм до около 60 нм. В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела имеет гидродинамический радиус в пределах от около 25 нм до около 35 нм. В некоторых вариантах осуществления гидродинамический радиус составляет от около 20 нм до около 30 нм.
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту конъюгат антитела имеет период полувыведения из глаза, который увеличивается по сравнению с эталонным антителом, которое не присоединено ковалентно к полимеру ГК. В некоторых вариантах осуществления период полувыведения из глаза увеличивается по меньшей мере в около 2 раза по отношению к эталонному антителу. В некоторых вариантах осуществления период полувыведения из глаза увеличивается по меньшей мере в около 4 раза по отношению к эталонному антителу. В некоторых вариантах осуществления период полувыведения из глаза представляет собой период выведения из стекловидного тела. В некоторых вариантах осуществления эталонное антитело идентично антителу конъюгата антитела.
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту, антитело специфически связывается с биологической молекулой, выбранной из группы, состоящей из фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС); ИЛ-1β; ИЛ-6; ИЛ-6R; ИЛ-13; ИЛ-13R; ТцФР (тромбоцитарного фактора роста); ангиопоэтина; ангиопоэтина-2; Tie2; S1P; интегринов αvβ3, αvβ5 и α5β1; бетацеллюлина; апелина/APJ; эритропоэтина; фактора D комплемента; ФНО-α; HTRA1; рецептора ФРЭС; ST-2-рецептора; и белка, генетически связанного с риском ВМД. В некоторых вариантах осуществления рецептор ФРЭС представляет собой ФРЭСР1, ФРЭСР2, ФРЭСР3, mbФРЭСР или sФРЭСР. В некоторых вариантах осуществления белок, генетически связанный с риском ВМД, выбирают из группы, состоящей из компонентов пути комплемента С2, фактора В, фактора Н, CFHR3, C3b, С5, С5а, и С3а; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; ИЛ-8; CX3CR1; TLR3; TLR4; СЕТР; LIPC, COL10A1; и TNFRSF10A.
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
5
6
7
8
1
1
1
1
1
2
1
2
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту антитело специфически связывается с ФРЭС. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит следующие шесть гипервариабельных областей (HVR): (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GXTPXGGXXXYXDSVXX (SEQ ID NO: 2), где X представляет собой Ile или His, Х представляет собой Ala или Arg, Х представляет собой Tyr или Lys, Х представляет собой Thr или Glu, Х представляет собой Arg, Tyr, Gln, или Glu, Х представляет собой Ala или Glu, Х представляет собой Lys или Glu, и Х представляет собой Gly или Glu; (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQXVSTAVA (SEQ ID NO: 4), где X представляет собой Asp или Arg; (е) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность XASFLYS (SEQ ID NO: 5), где X представляет собой Ser или Met; и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность XQGYGXPFT (SEQ ID NO: 6), где X представляет собой Gln, Asn, или Thr и Х представляет собой Ala, Asn, Gln, или Arg. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит следующие шесть HVR: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7), GITPAGGYEYYADSVKG (SEQ ID NO: 21), или GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10) или QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23).
В некоторых вариантах осуществления антитело содержит следующие шесть HVR: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7); (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно содержит следующие каркасные области (FR) вариабельного домена тяжелой цепи (VH): (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14); (с) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16). В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно содержит FR вариабельного домена легкой цепи (VL): (а) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (с) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20).
В некоторых вариантах осуществления антитело содержит следующие шесть HVR: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (е) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23). В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно содержит следующие FR домена VL: (а) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (c) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 24); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20).
В некоторых вариантах осуществления антитело содержит следующие шесть HVR: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (е) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно содержит следующие FR домена VL: (а) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17), DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 25), или DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18) или WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27); (c) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19) или GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 28); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно содержит следующие FR домена VH: (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29) или EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 52); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (c) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32).
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11, 40 или 42; (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12, 41, или 46; или (с) домен VH как в (а) и домен VL как в b). В некоторых вариантах осуществления домен VH дополнительно содержит следующие FR: (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность VWRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14) или VWRQEPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 39); (c) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16). В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления домен VH дополнительно содержит следующие FR: (a) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17) или DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIDC (SEQ ID NO: 45); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (c) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19), GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYC (SEQ ID NO: 44), или GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC (SEQ ID NO: 54); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20) или FGQGTKVEVK (SEQ ID NO: 55). В некоторых вариантах осуществления домен VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и (b) VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41.
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 33 или 51; (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12, 34, 35, 36, 37, или 38; или (с) домен VH как в (а) и домен VL как в (b). В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно содержит следующие FR: (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29) или EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 52); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (c) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно содержит следующие FR: (а) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17), DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 25), или DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18) или WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27); (c) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19), GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 24), или GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 28); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). В некоторых вариантах осуществления домен VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления домен VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления домен VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36. В некоторых вариантах осуществления домен VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37. В некоторых вариантах осуществления домен VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления домен VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38.
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38.
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36.
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37.
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38.
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37.
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту антитело содержит (а) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48 и (b) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50.
В некоторых вариантах осуществления по предшествующему аспекту антитело содержит (а) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49 и (b) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50.
В некоторых вариантах осуществления любого из предшествующих аспектов антитело способно ингибировать связывание ФРЭС с рецептором ФРЭС. В некоторых вариантах осуществления рецептор ФРЭС представляет собой рецептор-1 ФРЭС (Flt-1). В некоторых вариантах осуществления рецептор ФРЭС представляет собой рецептор-2 ФРЭС (KDR).
В некоторых вариантах осуществления любого из предшествующих аспектов антитело связывает человеческий ФРЭС (hФРЭС) с Kd около 2 нМ или ниже. В некоторых вариантах осуществления антитело связывает hФРЭС с Kd от около 75 пМ до около 2 нМ. В некоторых вариантах осуществления антитело связывает hФРЭС с Kd от около 75 пМ до около 600 пМ. В некоторых вариантах осуществления антитело связывает hФРЭС с Kd от около 75 пМ до около 500 пМ. В некоторых вариантах осуществления антитело связывает hФРЭС с Kd около 80 пМ. В некоторых вариантах осуществления антитело связывает hФРЭС с Kd около 60 пМ.
В некоторых вариантах осуществления любого из предшествующих аспектов, антитело имеет температуру плавления (Tm) более чем около 83,5°С. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет Tm от около 85°С до около 91°С. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет Tm около 89°С.
В некоторых вариантах осуществления любого из предшествующих аспектов антитело имеет изоэлектрическую точку (pl) ниже чем 8. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет pi от около 5 до около 7. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет pl от около 5 до около 6.
В некоторых вариантах осуществления любого из предшествующих аспектов антитело является моноклональным, человеческим, гуманизированным или химерным.
2
В некоторых вариантах осуществления любого из предшествующих аспектов антитело представляет собой фрагмент антитела, который связывает ФРЭС. В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела выбирают из группы, состоящей из фрагментов Fab, Fab-C, Fab'-SH, Fv, scFv, и (Fab'). В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела представляет собой Fab.
В некоторых вариантах осуществления любого из предшествующих аспектов антитело представляет собой моноспецифическое антитело. В других вариантах осуществления любого из предшествующих аспектов антитело представляет собой мультиспецифическое антитело. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело представляет собой биспецифическое антитело. В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело связывает ФРЭС и вторую биологическую молекулу, выбранную из группы, состоящей из интерлейкина 1β (ИЛ-1β); интерлейкина-6 (ИЛ-6); рецептора интерлейкина-6 (ИЛ-6R); интерлейкина-13 (ИЛ-13); рецептора ИЛ-13 (ИЛ-13R); ТцФР (тромбоцитарного фактора роста); ангиопоэтина; ангиопоэтина-2; Tie2; S1P; интегринов αvβ3, αvβ5, и α5β1; бетацеллюлина; апелина/APJ; эритропоэтина; фактора D комплемента; ФНО-α; HtrA1; рецептора ФРЭС; ST-2-рецептора; и белка, генетически связанного с риском возрастной макулярной дистрофии (ВМД). В некоторых вариантах осуществления рецептор ФРЭС представляет собой ФРЭСР1, ФРЭСР2, ФРЭСР3, связанный с мембраной рецептор ФРЭС (mbФРЭСР), или растворимый рецептор ФРЭС (sФРЭСР). В некоторых вариантах осуществления белок, генетически связанный с риском ВМД, выбирают из группы, состоящей из компонентов пути комплемента С2, фактора В, фактора Н, CFHR3, C3b, С5, С5а, и С3а; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; интерлейкина-8 (ИЛ-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; СЕТР; LIPC, COL10A1; и TNFRSF10A.
В некоторых вариантах осуществления любого из предшествующих аспектов антитело представляет собой антитело, сконструированное введением цистеина. В некоторых вариантах осуществления антитело, сконструированное введением цистеина, содержит цистеиновую мутацию в тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из НС-А118С, НС-А140С, и HC-L174C (нумерация EU), или цистеиновая мутация в легкой цепи, выбранной из группы, состоящей из LC-K149C и LC-V205C (нумерация Кабата). В некоторых вариантах осуществления цистеиновая мутация в тяжелой цепи представляет собой НС-А118С (нумерация EU). В некоторых вариантах осуществления цистеиновая мутация в тяжелой цепи представляет собой НС-А140С (нумерация EU). В некоторых вариантах осуществления цистеиновая мутация в тяжелой цепи представляет собой НС-L174C (нумерация EU). В некоторых вариантах осуществления цистеиновая мутация в легкой цепи представляет собой LC-K149C (нумерация Кабата). В некоторых вариантах осуществления цистеиновая мутация в легкой цепи представляет собой LC-V205C (нумерация Кабата). В некоторых вариантах осуществления полимер ГК ковалентно присоединен к антителу при цистеиновой мутации.
В другом аспекте любой из предшествующих конъюгатов антител может быть использован в качестве лекарственного средства.
В другом аспекте любой из предшествующих конъюгатов антител может быть использован в изготовлении лекарственного средства для лечения заболевания глаз у субъекта.
В другом аспекте любой из предшествующих конъюгатов антител может быть использован для снижения или ингибирования ангиогенеза у субъекта, имеющего заболевание глаз.
В другом аспекте любой из предшествующих конъюгатов антител может быть использован для лечения заболевания глаз у субъекта.
В некоторых вариантах осуществления любого из предшествующих аспектов заболевание глаз выбирают из группы, состоящей из возрастной макулярной дегенерации (ВМД), макулодистрофии, макулярного отека, диабетического макулярного отека (ДМО) (в том числе фокального ДМО вне центральной зоны и диффузного ДМО с вовлечением центральной зоны сетчатки), ретинопатии, диабетической ретинопатии (ДР) (в том числе пролиферативной ДР (ПДР), непролиферативной ДР (НПДР), и высокогорной ДР), других связанных с ишемией ретинопатии, ретинопатии недоношенных (РН), окклюзии вен сетчатки (ОВС) (в том числе формы окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС) и ветви центральной вены сетчатки (ОВВС)), ХНВ (в том числе миопической ХНВ), неоваскуляризации роговицы, болезни, связанной с неоваскуляризацией роговицы, неоваскуляризации сетчатки, болезни, связанной с неоваскуляризацией сетчатки/хориоидальной неоваскуляризацией, патологической миопией, болезни Гиппеля - Линдау, гистоплазмоза глаз, семейной экссудативной витреоретинопатии (СЭВРП), болезни Коутса, болезни Норри, синдрома остеопороза-псевдоглиомы (OPPG), субконъюнктивального кровоизлияния, рубеоза, неоваскулярных заболеваний глаз, неоваскулярной глаукомы, пигментного ретинита (ПР), гипертонической ретинопатии, ретинальной ангиоматозной пролиферации, макулярной телеангиэктазии, неоваскуляризации радужки, внутриглазной неоваскуляризации, дегенерации сетчатки, кистозного макулярного отека (КМО), васкулита, отека диска зрительного нерва, ретинита, конъюнктивита (в том числе инфекционного и неинфекционного (например, аллергического) конъюнктивита), врожденного амавроза Лебера, увеита (в том числе инфекционного и неинфекционного увеита), хориоидита, гистоплазмоза глаз, блефарита, синдрома сухого глаза, травматического повреждения глаза, и синдрома Шегрена. В некоторых вариантах осуществления заболевание глаз представляет собой ВМД, ДМО, ДР или ОВС. В некоторых вариантах заболевание глаз представляет собой ВМД. В некоторых вариантах осуществления ВМД представляет собой влажную ВМД. В некоторых вариантах осуществления заболевание глаз представляет собой ДМО.
2
В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей любой из конъюгатов антител, описанных в данном документе, фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель, или разбавитель. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит второй агент, при этом второй агент выбирают из группы, состоящей из антитела, антиангиогенного агента, цитокина, антагониста цитокина, кортикостероида, анальгетика, и соединения, которое связывается со второй биологической молекулой. В некоторых вариантах осуществления антиангиогенный агент представляет собой антагонист ФРЭС. В некоторых вариантах осуществления антагонист ФРЭС представляет собой анти-ФРЭС антитело, антитело против рецептора ФРЭС, слитый белок растворимого рецептора ФРЭС, аптамер, анти-ФРЭС DARPin, или ингибитор тирозинкиназы ФРЭСР (рецептор ФРЭС). В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС антитело представляет собой ранибизумаб (LUCENTIS), RTH-258, или биспецифическое анти-ФРЭС антитело. В некоторых вариантах осуществления биспецифическое анти-ФРЭС антитело представляет собой анти-ФРЭС/анти-Ang2 антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС/анти-Ang2 антитело представляет собой RG-7716. В некоторых вариантах осуществления слитый белок растворимого рецептора ФРЭС представляет собой афлиберцепт (EYLEA). В некоторых вариантах осуществления аптамер представляет собой пегаптаниб (MACUGEN). В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС DARPin представляет собой абиципар пегол. В некоторых вариантах осуществления ингибитор тирозинкиназы ФРЭСР выбирают из группы, состоящей из 4-(4-бромо-2-фторанилино)-6-метокси-7-(1-метилпиперидин-4-илметокси)хиназолина (ZD6474), 4-(4-фтор-2-метилиндол-5-илокси)-6-метокси-7-(3-пирролидин-1-илпропокси)хиназолина (AZD2171), ваталаниба (РТК787), семаксаминиба (SU5416), и SUTENT (сунитиниба). В некоторых вариантах осуществления вторую биологическую молекулу выбирают из группы, состоящей из ИЛ-1β; ИЛ-6; ИЛ-6R; ИЛ-13; ИЛ-13R; ТцФР; ангиопоэтина; ангиопоэтина-2; Tie2; S1P; интегринов αvβ3, αvβ5 и α5β1; бетацеллюлина; апелина/APJ; эритропоэтина; фактора D комплемента; ФНО-α; HTRA1; рецептора ФРЭС; ST-2-рецептора; и белка, генетически связанного с риском ВМД. В некоторых вариантах осуществления рецептор ФРЭС представляет собой ФРЭСР1, ФРЭСР2, ФРЭСР3, mdФРЭСР или sФРЭСР. В некоторых вариантах осуществления белок, генетически связанный с риском ВМД, выбирают из группы, состоящей из компонентов пути комплемента С2, фактора В, фактора Н, CFHR3, C3b, С5, С5а, и С3а; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; ИЛ-8; CX3CR1; TLR3; TLR4; СЕТР; LIPC, COL10A1; и TNFRSF10A. В некоторых вариантах осуществления соединение, которое связывает вторую биологическую молекулу, представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела выбирают из группы, состоящей из фрагментов Fab, Fab-C, Fab'-SH, Fv, scFv, и (Fab'). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела представляет собой Fab.
В другом аспекте любая из предшествующих фармацевтических композиций может быть использована в качестве лекарственного средства.
В другом аспекте любая из предшествующих фармацевтических композиций может быть использована в изготовлении лекарственного средства для лечения заболевания глаз у субъекта.
В другом аспекте любая из предшествующих фармацевтических композиций может быть использована для снижения или ингибирования ангиогенеза у субъекта, имеющего заболевание глаз.
В другом аспекте любая из предшествующих фармацевтических композиций может быть использована для лечения заболевания глаз у субъекта.
В некоторых вариантах осуществления любого из предшествующих аспектов заболевание глаз выбирают из группы, состоящей из возрастной макулярной дегенерации (ВМД), макулодистрофии, макулярного отека, диабетического макулярного отека (ДМО) (в том числе фокального ДМО вне центральной зоны и диффузного ДМО с вовлечением центральной зоны сетчатки), ретинопатии, диабетической ретинопатии (ДР) (в том числе пролиферативной ДР (ПДР), непролиферативной ДР (НПДР), и высокогорной ДР), других связанных с ишемией ретинопатии, ретинопатии недоношенных (РН), окклюзии вен сетчатки (ОВС) (в том числе формы окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС) и ветви центральной вены сетчатки (ОВВС)), ХНВ (в том числе миопической ХНВ), неоваскуляризации роговицы, болезни, связанной с неоваскуляризацией роговицы, неоваскуляризации сетчатки, болезни, связанной с неоваскуляризацией сетчатки/хориоидальной неоваскуляризацией, патологической миопией, болезни Гиппеля - Линдау, гистоплазмоза глаз, семейной экссудативной витреоретинопатии (СЭВРП), болезни Коутса, болезни Норри, синдрома остеопороза-псевдоглиомы (OPPG), субконъюнктивального кровоизлияния, рубеоза, неоваскулярных заболеваний глаз, неоваскулярной глаукомы, пигментного ретинита (ПР), гипертонической ретинопатии, ретинальной ангиоматозной пролиферации, макулярной телеангиэктазии, неоваскуляризации радужки, внутриглазной неоваскуляризации, дегенерации сетчатки, кистозного макулярного отека (КМО), васкулита, отека диска зрительного нерва, ретинита, конъюнктивита (в том числе инфекционного и неинфекционного (например, аллергического) конъюнктивита), врожденного амавроза Лебера, увеита (в том числе инфекционного и неинфекционного увеита), хориоидита, гистоплазмоза глаз, блефарита, синдрома сухого глаза, травматического повреждения глаза, и синдрома Шегрена. В некоторых вариантах осуществления заболевание глаз представляет собой ВМД, ДМО, ДР или ОВС. В некоторых вариантах заболевание глаз представляет собой ВМД. В некоторых вариантах осуществления ВМД представляет собой влажную ВМД. В некоторых вариантах осуществления заболевание глаз представляет собой ДМО.
В другом аспекте изобретение относится к способу снижения или ингибирования ангиогенеза у субъекта, имеющего заболевание глаз, включающему введение субъекту эффективного количества любого из конъюгатов антител, описанных в данном документе, или любой из фармацевтических композиций, описанных в данном документе, тем самым уменьшая или ингибируя ангиогенезу субъекта.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения заболевания глаз, включающему введение эффективного количества любого из конъюгатов антител, описанных в данном документе, или любой из фармацевтических композиций, описанных в данном документе субъекту, нуждающемуся в таком лечении.
В некоторых вариантах осуществления любого из предшествующих аспектов заболевание глаз выбирают из группы, состоящей из возрастной макулярной дегенерации (ВМД), макулодистрофии, макулярного отека, диабетического макулярного отека (ДМО) (в том числе фокального ДМО вне центральной зоны и диффузного ДМО с вовлечением центральной зоны сетчатки), ретинопатии, диабетической ретинопатии (ДР) (в том числе пролиферативной ДР (ПДР), непролиферативной ДР (НПДР), и высокогорной ДР), других связанных с ишемией ретинопатии, ретинопатии недоношенных (РН), окклюзии вен сетчатки (ОВС) (в том числе формы окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС) и ветви центральной вены сетчатки (ОВВС)), ХНВ (в том числе миопической ХНВ), неоваскуляризации роговицы, болезни, связанной с неоваскуляризацией роговицы, неоваскуляризации сетчатки, болезни, связанной с неоваскуляризацией сетчатки/хориоидальной неоваскуляризацией, патологической миопией, болезни Гиппеля - Линдау, гистоплазмоза глаз, семейной экссудативной витреоретинопатии (СЭВРП), болезни Коутса, болезни Норри, синдрома остеопороза-псевдоглиомы (OPPG), субконъюнктивального кровоизлияния, рубеоза, неоваскулярных заболеваний глаз, неоваскулярной глаукомы, пигментного ретинита (ПР), гипертонической ретинопатии, ретинальной ангиоматозной пролиферации, макулярной телеангиэктазии, неоваскуляризации радужки, внутриглазной неоваскуляризации, дегенерации сетчатки, кистозного макулярного отека (КМО), васкулита, отека диска зрительного нерва, ретинита, конъюнктивита (в том числе инфекционного и неинфекционного (например, аллергического) конъюнктивита), врожденного амавроза Лебера, увеита (в том числе инфекционного и неинфекционного увеита), хориоидита, гистоплазмоза глаз, блефарита, синдрома сухого глаза, травматического повреждения глаза, и синдрома Шегрена. В некоторых вариантах осуществления заболевание глаз представляет собой ВМД, ДМО, ДР или ОВС. В некоторых вариантах заболевание глаз представляет собой ВМД. В некоторых вариантах осуществления ВМД представляет собой влажную ВМД. В некоторых вариантах осуществления заболевание глаз представляет собой ДМО.
2
В некоторых вариантах осуществления любого из предшествующих аспектов, способ дополнительно включает введение субъекту эффективного количества второго агента, причем второй агент выбирают из группы, состоящей из антитела, антиангиогенного агента, цитокина, антагониста цитокина, кортикостероида, анальгетика, и соединения, которое связывается со второй биологической молекулой. В некоторых вариантах осуществления антиангиогенный агент представляет собой антагонист ФРЭС. В некоторых вариантах осуществления антагонист ФРЭС представляет собой анти-ФРЭС антитело, антитело против рецептора ФРЭС, слитый белок растворимого рецептора ФРЭС, аптамер, анти-ФРЭС DARPin, или ингибитор тирозинкиназы ФРЭСР (рецептор ФРЭС). В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС антитело представляет собой ранибизумаб (LUCENTIS), RTH-258, или биспецифическое анти-ФРЭС антитело. В некоторых вариантах осуществления биспецифическое анти-ФРЭС антитело представляет собой анти-ФРЭС/анти-Ang2 антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС/анти-Ang2 антитело представляет собой RG-7716. В некоторых вариантах осуществления слитый белок растворимого рецептора ФРЭС представляет собой афлиберцепт (EYLEA). В некоторых вариантах осуществления аптамер представляет собой пегаптаниб (MACUGEN). В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС DARPin представляет собой абиципар пегол. В некоторых вариантах осуществления ингибитор тирозинкиназы ФРЭСР выбирают из группы, состоящей из 4-(4-бромо-2-фторанилино)-6-метокси-7-(1-метилпиперидин-4-илметокси)хиназолина (ZD6474), 4-(4-фтор-2-метилиндол-5-илокси)-6-метокси-7-(3-пирролидин-1-илпропокси)хиназолина (AZD2171), ваталаниба (РТК787), семаксаминиба (SU5416), и SUTENT (сунитиниба). В некоторых вариантах осуществления вторую биологическую молекулу выбирают из группы, состоящей из ИЛ-1β; ИЛ-6; ИЛ-6R; ИЛ-13; ИЛ-13R; ТцФР; ангиопоэтина; ангиопоэтина-2; Tie2; S1P; интегринов αvβ3, αvβ5 и α5β1; бетацеллюлина; апелина/APJ; эритропоэтина; фактора D комплемента; ФНО-α; HTRA1; рецептора ФРЭС; ST-2-рецептора; и белка, генетически связанного с риском ВМД. В некоторых вариантах осуществления рецептор ФРЭС представляет собой ФРЭСР1, ФРЭСР2, ФРЭСР3, mbФРЭСР или sФРЭСР. В некоторых вариантах осуществления белок, генетически связанный с риском ВМД, выбирают из группы, состоящей из компонентов пути комплемента С2, фактора В, фактора Н, CFHR3, C3b, С5, С5а, и С3а; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; ИЛ-8; CX3CR1; TLR3; TLR4; СЕТР; LIPC, COL10A1; и TNFRSF10A. В некоторых вариантах осуществления соединение, которое связывает вторую биологическую молекулу, представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела выбирают из группы, состоящей из фрагментов Fab, Fab-C, Fab'-SH, Fv, scFv, и (Fab').
В некоторых вариантах осуществления любого из предшествующих аспектов конъюгат антитела или фармацевтическую композицию вводят интравитреально, через глаз, интраокулярно, в околосклеральную область, в субтеноновое пространство, в супрахориоидальное пространство, местно, внутривенно, внутримышечного, интрадермально, чрескожно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутриочагово, интракраниально, внутрисуставно, внутрь простаты, внутриплеврально, интратрахеально, интратекально, интраназально, внутривагинально, ректально, местно, внутриопухолево, перитонеально, интравентрикулярно, подкожно, субконъюнктивально, интравезикулярно, мукозально, интраперикардиально, внутрипуповинно, интраорбитально, перорально, местно, трансдермально, путем ингаляции, путем инъекции, в виде глазных капель, путем имплантации, путем инфузии, путем длительной инфузии, путем локализованной перфузии непосредственно через клетки-мишени, при помощи катетера, при помощи лаважа, в кремах или в липидных композициях. В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела или фармацевтическую композицию вводят в стекловидное тело, через глаз, интраокулярно, в околосклеральную область, в субтеноновое пространство, в супрахориоидальное пространство, или местно. В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела или фармацевтическую композицию вводят путем инъекции в стекловидное тело. В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела или фармацевтическую композицию вводят местно в виде глазных капель или мази. В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела или фармацевтическую композицию вводят с помощью имплантируемого устройства доставки.
В некоторых вариантах осуществления любого из предшествующих аспектов субъект представляет собой человек.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1А представлен график, демонстрирующий распределение совокупности молекулярных масс (в понятиях молярной массы) в репрезентативной выборке 200 кДа ГК.
На Фиг. 1В представлен график, демонстрирующий распределение совокупности числа малеимидов на цепи ГК массой 200 кДа в результате моделирования стохастической модификации по методу Монте-Карло для каждой кислотной группы, имеющей 5% вероятность модификации.
На Фиг. 1С представлен график, демонстрирующий полидисперсность 40 кДа, 200 кДа и 600 кДа полимеров ГК. В Таблице ниже графика продемонстрирована среднечисленная молекулярная масса (Mn), среднемассовая молекулярная масса (Mw), индекс полидисперсности (PDI), и диапазон молекулярной массы (MW) (в терминах Mw) для указанных образцов.
На Фиг. 2 представлена серия графиков, демонстрирующих, что конъюгаты TK-G6.31.AARR имеют различия в физической стабильности при физиологически соответствующих условиях стресса, как оценивали с помощью гель-эксклюзионной хроматографии (ЭХ) с подключенным рефрактометрическим детектором (RI) и детектором многоуглового лазерного светорассеяния (MALS) (SEC-RI-MALS). Серии меток относятся к молекулярной массе остова ГК (40 кДа («40K»); 200 кДа («200K») и 600 кДа («600K») и уровню загрузки Fab.
На Фиг. 3 представлена серия графиков, демонстрирующих изменения в профилях удерживания ЭХ с течением времени для TK40K-G6.31.AARR-4,7% (левая панель), TK200K-G6.31.AARR-4,7% (центральная панель), и ГК600К-G6.31.AARR-2.1% (правая панель), демонстрируя, что время удерживания ЭХ сдвигается на более позднее время (меньше гидродинамического размера), со степенью этого сдвига в зависимости от молекулярной массы остова ГК.
На Фиг. 4 представлена серия графиков, демонстрирующих данные SEC-RI-MALS на графике как кумулятивную массовую долю для TK40K-G6.31.AARR-4,7% (левая панель), TK200K-G6.31.AARR-4,7% (центральная панель), и ГК600К-G6.31.AARR-2,1% (правая панель).
На Фиг. 5 представлен график, демонстрирующий результаты SEC-RI-MALS характеристики коммерческой полидисперсной ГК (черный) и монодисперсной ГК (серый), демонстрирующие различие в массовых распределениях между двумя способами производства. В таблице на правой панели приведены значения Mn, Mw, и PDI, определяемые этим анализом.
На Фиг. 6 представлен график, демонстрирующий результаты SEC-RI-MALS характеристики коммерческой полидисперсной TK200K-G6.31.AARR (черный) и монодисперсной TK150K-G6.31.AARR (серый), демонстрирующие различие в массовых распределениях. В таблице на правой панели приведены значения Mn, Mw, и PDI, определяемые этим анализом.
На Фиг. 7 представлено схематическое изображение, демонстрирующее, что стандартные молекулы формата Fab-C разрабатываются так, чтобы содержать свободный цистеиновый остаток пригодный для конъюгации посредством увеличения стандартной последовательности шарнирного пептида Fab с первым или вторым дисульфидным цистеином шарнирной области. Для того, чтобы минимизировать или предотвратить скремблирование между межцепочечным дисульфидом и этим свободным остатком цистеина, цистеин вместо этого может быть мутирован на поверхности Fab в месте, пространственно отделенном от межцепочечного дисульфида (называемый в данном документе как «тио-Fab»).
На Фиг. 8А-8С представлен ряд схематических изображений, демонстрирующих, что гибкость и пространственная близость последовательности шарнира может привести к перестройке в трех возможных дисульфидных состояниях оставляя три различных остатка цистеина, доступными для конъюгации. На Фиг. 8А показана предполагаемая конфигурация, в которой цистеин шарнирной последовательности уменьшается и доступен для конъюгации. На Фиг. 8В показан вариант циклизированной тяжелой цепи (НС), в котором цистеин шарнирной области образует дисульфидную связь с остатком цистеина НС, который обычно является частью межцепочечной дисульфидной связи, в результате чего цистеин в легкой цепи (LC) межцепочечной дисульфидной связи доступен для конъюгации. На Фиг. 8С показан вариант LC, в котором цистеин шарнира образует дисульфидную связь с цистеином LC, который обычно образует часть межцепочечной дисульфидной связи, в результате чего цистеин в НС межцепочечной дисульфидной связи доступен для конъюгации.
На Фиг. 9 показана серия графиков, демонстрирующих результаты серии экспериментов по малеимидному кэппированию и ограниченному Lys-C расщеплению, выполненных на G6.31.AARR.Fab-C и проанализированных с помощью обращенно-фазовой сверхэффективной жидкостной хроматографии/времяпролетной (RP-UPLC-TOF) масс-спектрометрии. Числа над пиками являются суммарным количеством ионов для этого пика и являются мерой площади пика.
На Фиг. 10А и 10В представлена серия графиков, демонстрирующих результаты ограниченного расщепления Lys-C (Фиг. 10А) и гиалуронидазой (ГКаза) (Фиг. 10В) конъюгата TK-G6.31.AARR, что подтверждает наличие конъюгированных вариантов, аассоциированных с конъюгацией посредством обоих цистеинов, нормально захваченных межцепочечной дисульфидной связью.
На Фиг. 11 представлена серия графиков, демонстрирующих, что конъюгация тио-Fab G6.31.AARR с ГК200К-малеимидом протекала нормально по сравнению с G6.31.AARR.Fab-C, хотя степень превращения Fab в конъюгат была ниже для образцов тио-Fab.
На Фиг. 12 представлен график, демонстрирующий деконъюгацию модели полимера полиэтиленгликоль (ПЭГ)-малеимид из G6.31.AARR различных форматов в ФСБ + 2 мМ окисленного глутатиона (GSSG) при 37°С, оценивали с помощью RP-UPLC-TOF.
На Фиг. 13А показана схема нумерации по Кабату для легкой цепи 4D5.
На Фиг. 13В показана схема последовательной нумерации (левый столбец), начиная на N-конце по сравнению со схемой нумерации по Кабату (средний столбец) и схемой нумерации EU (правый столбец) для антитела 4D5.
На Фиг. 14 представлен график, демонстрирующий, что конъюгаты ГК-G6.31.AARR, полученные из монодисперсных ГК, демонстрируют улучшенную физическую стабильность при физиологическом стрессе на четвертой неделе по сравнению с конъюгатами TK-G6.31.AARR аналогичного размера, полученными из полидисперсной ГК. В таблице на правой панели продемонстрирована Mw (кДа) на 0-ю, 2-ю, и 4-ю недели.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Термин "около", используемый в данном документе, относится к обычному диапазону погрешностей для соответствующего значения и хорошо известный специалисту в данной области техники. В данном документе применение «около» по отношению к величине или параметру включает (и описывает) варианты осуществления, которые относятся непосредственно к этой величине или параметру, по существу.
В контексте данного документа "акцепторная каркасная область человека" представляет собой каркасную область, которая содержит аминокислотную последовательность каркасной области вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркасной области вариабельного домена тяжелой цепи (VH), которая получена из каркасной области иммуноглобулина человека или консенсусной каркасной области человека, как определено ниже. Акцепторная каркасная область человека, "полученная из" каркасной области иммуноглобулина человека или консенсусной каркасной области человека, может содержать такую же самую аминокислотную последовательность, как и указанная, или может содержать изменения в аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления количество аминокислотных изменений составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, или 2 или менее. В некоторых вариантах осуществления последовательность акцепторной человеческой каркасной области VL идентична последовательности каркасной области VL иммуноглобулина человека или последовательности консенсусной каркасной области человека.
Термин «аффинность» относится к силе суммарных общих нековалентных взаимодействий между одиночным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнера по связыванию (например, антигена). Если не указано иное, используемый в данном документе термин "аффинность связывания" относится к действительной аффинности связывания, которая отражает взаимодействие в соотношении 1:1 между членами связывающей пары (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y, как правило, можно представить в виде константы диссоциации (Kd). Аффинность можно измерить с помощью общепринятых в данной области техники способов, в том числе тех, которые описаны в данном документе. Конкретные иллюстративные и типичные варианты осуществления изобретения, относящиеся к измерению аффинности связывания, описаны далее.
Антитело с «созревшей аффинностью» относится к антителу с одним или более изменениями в одной или более гипервариабельных областях (HVR) и/или каркасных областях (FR) по сравнению с исходным антителом, которое не содержит таких изменений, при этом указанные изменения приводят к улучшению аффинности антитела в отношении антигена.
111
121
145
165
189
206
165
109
165
Термин «фактор роста эндотелия сосудов» или «ФРЭС» относится к белку фактора роста эндотелия сосудов-А, примером которого является SEQ ID NO: 47 (см. также Swiss Prot, номер доступа Р15692, Gene ID (NCBI): 7422). Термин «ФРЭС» включает белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, а также его гомологи и изоформы. Термин «ФРЭС» также охватывает известные изоформы, например, сплайсированные изоформы, ФРЭС, например, ФРЭС, ФРЭС, ФРЭС, ФРЭС, ФРЭС, и ФРЭС, вместе с его природными аллельными и процессированными формами, включая фактор роста эндотелиальных клеток человека, состоящий из 110 аминокислот, образуемых расщеплением плазмином ФРЭС, как описано в Ferrara Mol. Biol. Cell, 21:687 (2010), Leung et al., Science, 246:1306 (1989), и Houck et al., Mol. Endocrin., 5:1806 (1991). Термин «ФРЭС» также относится к ФРЭС видов, не являющихся человеком, например, мыши, крысы или примата. Иногда ФРЭС из конкретного вида обозначают такими терминами, как hФРЭС для человеческого ФРЭС, mФРЭС для мышиного ФРЭС и т.п. Термин «ФРЭС» также используемый для обозначения укороченных форм полипептида, содержащих аминокислоты от 8 до 109 или от 1 до 109 из 165 аминокислот от фактора роста сосудистых эндотелиальных клеток человека. Ссылка на любые такие формы ФРЭС может быть идентифицирована в данной заявке, например, с помощью «ФРЭС», «ФРЭС (8-109)», «ФРЭС (1-109)» или «ФРЭС». Положения аминокислот для "усеченного" нативного ФРЭС пронумерованы так же, как указано в нативной последовательности ФРЭС. Например, положение аминокислоты 17 (метионина) в усеченном нативном ФРЭС представляет собой также положение 17 (метионин) в нативном ФРЭС. Усеченный нативный ФРЭС имеет аффинность связывания для рецепторов KDR и Flt-1, сравнимую с нативным ФРЭС. Термин «вариант ФРЭС», используемый в данном документе, относится к полипептиду ФРЭС, который содержит одну или более аминокислотных мутаций в нативной последовательности ФРЭС. Необязательно, одна или более аминокислотных мутаций содержит аминокислотную замену (замены). В контексте сокращенного обозначения вариантов ФРЭС, описанных в данном документе, отмечается, что числа относятся к положению аминокислотного остатка аминокислотной последовательности предполагаемого нативного ФРЭС (указана в Leung et al., ранее и Houck et al., ранее). Если не указано иное, термин «ФРЭС», используемый в данном документе, обозначает ФРЭС-А.
-8
-8
-13
-9
-13
Термины "анти-ФРЭС антитело", и "антитело, которое связывается с ФРЭС," и "антитело, которое специфически связывает ФРЭС" относятся к антителу, которое способно связывать ФРЭС с достаточной аффиностью, чтобы антитело можно было применять в качестве диагностического и/или терапевтического агента для нацеливания на ФРЭС. В одном варианте осуществления степень связывания анти-ФРЭС антитела с неродственным белком, не являющимся ФРЭС, составляет менее чем около 10% от связывания антитела с ФРЭС, как измерено, например, с помощью радиоиммунологического анализа (РИА). В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ФРЭС, имеет константу диссоциации (Kd) ≤ 1 мкМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 0,01 нМ, или ≤ 0,001 нМ (например, 10 М или менее, например, от 10 М до 10 М, например, от 10 М до 10 М). В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС антитело связывается с эпитопом ФРЭС, который является консервативным среди ФРЭС из различных видов.
Термин «антитело» применяется в данном документе в самом широком смысле и включает различные структуры антител, включая, но не ограничиваясь этим, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, до тех пор, пока они демонстрируют необходимую антигенсвязывающую активность.
2
2
«Фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывает антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают, но не ограничиваются ими, v, Fab, Fab', Fab-C, Fab'-SH, F(ab'); диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. В некоторых случаях примеры фрагментов антитела включают, но не ограничиваются ими, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab'); диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
2
2
При расщеплении антител папаином образуются два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемые «Fab»-фрагментами, и остаточный «Fc»-фрагмент, название которого отражает его способность к легкой кристаллизации. Fab-фрагмент состоит из целой легкой (L) цепи вместе с доменом вариабельного области тяжелой (Н) цепи (VH) и первым константным доменом из одной тяжелой цепи (СН1). Обработка антитела пепсином позволяет выделить одиночный большой F(ab')-фрагмент, который приблизительно соответствует двум Fab-фрагментам с бивалентной антигенсвязывающей активностью, соединенным дисульфидной связью, и сохраняющий способность к перекрестному сшиванию антигена. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов тем, что имеют несколько дополнительных остатков на карбоксильном конце домена СН1, включая один или более цистеинов из шарнирного области антитела. Молекулы Fab-C представляют собой молекулы Fab, которые экспрессируются таким образом, что последовательность усекается при первом цистеине шарнирной области, что приводит к Fab со свободным цистеином непосредственно при экспрессии (см., например, Shatz et al. Mol, Pharmaceutics 2016; PubMed identifier (PMID) 27244474). Например, молекула Fab-C может иметь свободный цистеин в положении Cys227 тяжелой цепи. В других случаях молекула Fab-C может иметь свободный цистеин в положении Cys229 тяжелой цепи. В данном документе Fab'-SH представляет собой обозначение Fab', в котором цистеиновый(е) остаток(и) константных доменов несет свободную тиольную группу. F(ab')-фрагменты антител первоначально получали как пары Fab'-фрагментов, которые соединены между собой цистеинами шарнирной области. Также известны другие химические соединения фрагментов антитела.
В данном документе термин «область Fc» употребляется для обозначения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Данный термин включает нативные последовательности областей Fc и варианты областей Fc. В одном варианте осуществления область Fc яжелой цепи человеческого IgG находится в пределах от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако, область Fc может содержать или не содержать С-концевой лизин (Lys447). Если не указано иное, нумерация аминокислотных остатков области Fc или константной области соответствует системе нумерации EU, также называемой индексом EU, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
«Fv» состоит из димера одного домена вариабельного области тяжелой цепи и одного домена вариабельной области легкой цепи, жестко связанных посредством нековалентных связей. При фолдинге этих двух доменов наружу выступают шесть гипервариабельных петель (по 3 петли на каждой Н- и L-цепи), аминокислотные остатки которых участвуют в связывании антигена и придают антителу специфичность по отношению к связыванию антигена. В то же время даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три HVR, специфичные к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя часто с более низкой аффинностью, чем целый сайт связывания.
«Одноцепочечные Fv», также имеющие аббревиатуру «sFv» или «scFv», представляют собой фрагменты антител, которые содержат домены антител VH и VL, связанные в одну полипептидную цепь. Предпочтительно, полипептид sFv также содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, позволяющий sFv образовывать структуру, необходимую для связывания с антигеном. Для обзора sFv, см. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
Термин "диатела" относится к небольшим фрагментам антител, полученным путем конструирования sFv-фрагментов (см. предыдущий абзац) с короткими линкерами (около 5-10 остатков) между доменами VH и VL, благодаря чему достигается межцепочечное, а не внутрицепочечное сопряжение V-доменов, приводящее к образованию бивалентного фрагмента, т.е. фрагмента, несущего два антигенсвязывающих сайта. Биспецифические антитела представляют собой гетеродимеры двух «кроссоверных» sFv-фрагментов, в которых VH -и VL-домены двух антител представлены на разных полипептидных цепях. Диатела более подробно описаны, например, в ЕР 404097; WO 93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
"Блокирующее" антитело или "антагонистическое" антитело представляет собой антитело, которое ингибирует или снижает биологическую активность антигена, который оно связывает. Некоторые блокирующие антитела или антагонистические антитела в значительной степени или полностью ингибируют биологическую активность антигена.
«Антитело, которое связывается с тем же эпитопом» в качестве эталонного антитела относится к антителу, которое блокирует связывание эталонного антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50% или более, и, наоборот, эталонное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50% или более. В данном документе предлагается иллюстративный конкурентный анализ.
Термин «химерное» антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи получена из конкретного источника или вида, в то время как остаток тяжелой и/или легкой цепи получен из другого источника или вида.
1
3
4
1
2
«Класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, содержащейся в его тяжелой цепи. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно подразделены на подклассы (изотипы), например, IgG, IgG2, IgG, IgG, IgA, и IgA. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ, и μ, соответственно.
«Антитело, сконструированное введением цистеина», или «вариант антитела, сконструированного введением цистеина», представляет собой антитело, в котором один или более остатков антитела, замещены остатками цистеина. В некоторых случаях, антитела, сконструированные введением цистеина, могут быть отнесены к антителам THIOMAB™ или антителам тио-Fab. Тиольная(ые) группа(ы) из антител, сконструированных введением цистеина, может быть конъюгирована с другими компонентами, например, полимерами (например, полимерами ГК, в том числе монодисперсными полимерами ГК). В конкретных вариантах осуществления замещенные остатки расположены в доступных участках антитела. Таким образом, в результате замены таких остатков на цистеин, группы, реакционноспособные к тиолу, располагаются в доступных участках антитела и могут быть использованы для конъюгации антитела с другими компонентами, такими как полимеры (например, полимеры ГК). Так, например, антитело, сконструированное введением цистеина, может представлять собой антитело с одной мутацией нецистеинового нативного остатка на цистеин в легкой цепи (например, LC-G64C, LC-I106C, LC-R108C, LC-R142C, или LC-K149C согласно нумерации по Кабату) или в тяжелой цепи (например, HC-D101C, НС-V184C, или НС-Т205С согласно нумерации по Кабату, или НС-Т114С, НС-А140С, HC-L174C, HC-L179C, НС-Т187С, НС-Т209С, HC-V262C, HC-G371C, HC-Y373C, НС-Е382С, HC-S424C, HC-N434C, и HC-Q438C согласно нумерации EU (например, НС-А136С согласно нумерации по Кабату представляет собой НС-А140С согласно нумерации EU)) (см. Фиг. 13А и 13В). В особых случаях антитело, сконструированное введением цистеина, может содержать цистеиновую мутацию в тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из НС-А118С, НС-А140С, и НС-L174C (нумерация EU), или цистеиновая мутация в легкой цепи, выбранной из группы, состоящей из LC-V205C и LC-K149C (нумерация по Кабату). В некоторых случаях антитело, сконструированное введением цистеина, имеет одну цистеиновую мутацию или в тяжелой или в легкой цепи, так что каждое полноразмерное антитело (т.е. антитело с двумя тяжелыми цепями и двумя легкими цепями) имеет два сконструированных остатка цистеина, и каждый Fab-фрагмент имеет один модифицированный остаток цистеина. В других случаях, антитело, сконструированное введением цистеина, имеет более одной цистеиновой мутации (например, 2, 3, 4 или 5 цистеиновых мутаций).
«Свободная аминокислота цистеин» относится к остатку аминокислоты цистеина, который введен при конструировании в исходное антитело, имеет тиоловую функциональную группу (-SH), и не является спаренным в качестве внутримолекулярного или межмолекулярного дисульфидного мостика.
Термин «значение реакционной способности тиола» представляет собой количественную характеристику реакционной способности свободных цистеиновых аминокислот. Значение реакционной способности тиола представляет собой процент свободной аминокислоты цистеина в антителе, сконструированном введением цистеина, вступающей в реакцию с реакционноспособным по отношению к тиолу реагентом, и преобразованный до максимального значения 1. Например, свободная аминокислота цистеин в антителе, сконструированном введением цистеина, которая вступает в реакцию со 100% выходом с реакционноспособным по отношению к тиолу реагентом, таким как биотин-малеимидный реагент, с формированием меченного биотином антитела, имеет значение реакционной способности тиола, равное 1,0. Другая аминокислота цистеин, введенная при конструировании в такое же или другое исходное антитело, которая вступает в реакцию с 90% выходом с реакционноспособным по отношению к тиолу реагентом, имеет значение реакционной способности тиола 0,9. Другая аминокислота цистеин, введенная при конструировании в такое же или другое исходное антитело, которая вступает в реакцию с 80% выходом с реакционной способности по отношению к тиолу реагентом, имеет значение реакционной способности тиола 0,8. Другая аминокислота цистеин, введенная при конструировании в такое же или другое исходное антитело, которая вступает в реакцию с 70% выходом с реакционноспособным по отношению к тиолу реагентом, имеет значение реакционной способности тиола 0,7. Другая аминокислота цистеин, введенная при конструировании в такое же или другое исходное антитело, которая вступает в реакцию с 60% выходом с реакционноспособным по отношению к тиолу реагентом, имеет значение реакционной способности тиола 0,6. Другая аминокислота цистеин, введенная при конструировании в такое же или другое исходное антитело, которая вступает в реакцию с 50% выходом с реакционноспособным по отношению к тиолу реагентом, имеет значение реакционной способности тиола 0,5. Другая аминокислота цистеин, введенная при конструировании в такое же или другое исходное антитело, которая вступает в реакцию с 40% выходом с реакционноспособным по отношению к тиолу реагентом, имеет значение реакционной способности тиола 0,4. Другая аминокислота цистеин, введенная при конструировании в такое же или другое исходное антитело, которая вступает в реакцию с 30% выходом с реакционноспособным по отношению к тиолу реагентом, имеет значение реакционной способности тиола 0,3. Другая аминокислота цистеин, введенная при конструировании в такое же или другое исходное антитело, которая вступает в реакцию с 20% выходом с реакционноспособным по отношению к тиолу реагентом, имеет значение реакционной способности тиола 0,2. Другая аминокислота цистеин, введенная при конструировании в такое же или другое исходное антитело, которая вступает в реакцию с 10% выходом с реакционноспособным по отношению к тиолу реагентом, имеет значение реакционной способности тиола 0,1. Другая аминокислота цистеин, введенная при конструировании в такое же или другое исходное антитело, которая совсем не вступает в реакцию с реакционноспособным по отношению к тиолу реагентом, имеет значение реакционной способности тиола 0. Определение значения реакционной способности тиола конкретного цистеина можно проводить при помощи анализа ИФА (например, анализа PHESELECTOR, как описано в данном документе), масс-спектроскопии, жидкостной хроматографии, радиоавтографии или других количественных аналитических тестов.
«Исходное антитело» представляет собой антитело, содержащее аминокислотную последовательность, в которой один или более аминокислотных остатков заменяют на один или более остатков цистеина. Исходное антитело может содержать нативную последовательность или последовательность дикого типа. Исходное антитело может иметь предсуществующие модификации аминокислотной последовательности (такие как добавления, делеции и/или замены) по сравнению с другими природными формами, формами дикого типа или модифицированными формами антитела. Исходное антитело может быть нацелено против целевого антигена, представляющего интерес, например, биологически важного полипептида, таких как ФРЭС. Любое из описанных в данном документе антител (например, анти-ФРЭС антитело) может быть исходным антителом.
«Эффекторные функции» относятся к тем видам биологической активности, присущей области Fc антитела, которые изменяются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ); связывание с рецептором Fc; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ); фагоцитоз; снижение экспрессии клеточных поверхностных рецепторов (например, В-клеточного рецептора) и В-клеточную активацию.
«Каркас», или «каркасная область», или «FR» относится к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков гипервариабельной области (HVR). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех доменов FR: FR1, FR2, FR3 и FR4.
Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «полное антитело» взаимозаменяемо употребляются в данном документе для обозначения антитела, имеющего структуру, в значительной степени сходную со структурой нативного антитела, или содержащего тяжелые цепи, которые содержат область Fc, согласно определению в данном документе.
«Человеческим антителом» является антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, которая соответствует последовательности антитела, вырабатываемого организмом человека или клеткой человека, или полученного из источника нечеловеческого происхождения, в котором используется набор человеческих антител или других человеческих кодирующих антитело последовательностей. Из этого определения антитела человека, в частности, исключено гуманизированное антитело, содержащее антигенсвязывающие остатки нечеловеческого происхождения.
"Консенсусная каркасная область человека" представляет собой каркасную область, которая содержит наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки при выборе последовательностей каркасной области VL или VH иммуноглобулина человека. Как правило, последовательности VL или VH иммуноглобулина человека выбирают из последовательностей подгруппы вариабельных доменов. Как правило, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу по классификации Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. В одном варианте осуществления для VL подгруппа представляет собой подгруппу каппа I, согласно Kabat et al., выше, В одном варианте осуществления для VH подгруппа представляет собой подгруппу III, согласно Kabat et al., выше.
«Гуманизированные» формы нечеловеческих (например, грызуна) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого антитела. В большинстве случаев, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки гипервариабельной области реципиента заменены остатками гипервариабельной области нечеловеческих видов (донорское антитело), такого как мышь, крыса, кролик или примат, отличный от человека, имеющего требуемую специфичность, аффинность и активность антитела. В некоторых случаях, остатки FR человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими нечеловеческими остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, не встречающиеся в реципиентном антителе или донорском антителе. Эти модификации проведены для дополнительного усовершенствования характеристик антител. В общем, гуманизированное антитело будет содержать практически все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или практически все гипервариабельные петли соответствуют таким областям иммуноглобулина нечеловеческого происхождения, а все или практически все FR соответствуют таким областям последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также необязательно будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, из человеческого иммуноглобулина. Для получения более подробной информации см. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
Термин «вариабельный» относится к тому факту, что среди антител некоторые сегменты вариабельных доменов сильно различаются по последовательностям. Вариабельный или «V»-домен опосредует антигенное связывание и определяет специфичность конкретного антитела к своему конкретному антигену. В то же время, вариабельность неравномерно распределена на протяжении вариабельного домена. На самом деле, V-области состоят из относительно инвариантных фрагментов, называемых каркасными областями (FR), из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими областями с чрезвычайной вариабельностью, называемыми «гипервариабельными областями», которые составляют в длину 9-12 аминокислот. Термин "гипервариабельная область" или "HVR", если используется в данном документе, относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывания антигена. Гипервариабельная область, как правило, содержит аминокислотные остатки из числа, например, приблизительно около остатков 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в VL, и приблизительно около остатков 26-35 (Н1), 49-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в VH (в одном из вариантов осуществления, Н1 состоит из приблизительно около 31-35 остатков); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или этих остатков из «гипервариабельной петли» (например, 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) остатки в VL, и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2), и 96-101 (Н3) - в VH; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987). Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, преимущественно принимающих конфигурацию бета-листа, соединенных тремя гипервариабельными областями, которые образуют петли, соединяющие структуру бета-листа, а в некоторых случаях - образующие часть структуры бета-листа. Гипервариабельные области каждой цепи объединены друг с другом в непосредственной близости при помощи FR и, вместе с гипервариабельными областями другой цепи, участвуют в образовании антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Соответственно, последовательности HVR и FR, как правило, располагаются в следующем порядке в VH (или VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. Константные домены не вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном, однако проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности (АЗКЦ).
Термин "нумерация аминокислотных остатков в вариабельном домене по Кабату" или "нумерация положения аминокислоты по Кабату" и их вариации относится к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи, при компиляции антител по Kabat et al., ранее. При использовании этой системы нумерации, фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше или больше аминокислот, что соответствует укорочению или вставкам в FR или HVR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать единичную аминокислотную вставку (остаток 52а согласно Кабату) после остатка 52 в Н2 и вставленные аминокислотные остатки (например, остатки 82а, 82b и 82с и т.д. согласно Кабату) после FR аминокислотного остатка 82 тяжелой цепи. Нумерация остатков по Кабату может быть определена для данного антитела путем выравнивания гомологичных областей последовательности антитела со "стандартной" пронумерованной последовательностью по Кабату.
Система нумерации по Кабату, как правило, используется при рассмотрении аминокислотного остатка вариабельного домена (приблизительно аминокислотные остатки 1-107 легкой цепи и аминокислотные остатки 1-113 тяжелой цепи) (например, см. Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), который включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме). "Система нумерации EU" или "индекс EU", как правило, используется при рассмотрении аминокислотного остатка в константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, индекс EU, представленный в Kabat et al., ранее). «Индекс EU по Кабату" относится к нумерации аминокислотных остатков антитела человека UgG1 EU. Если не указано иначе, ссылки на номера остатков в вариабельном домене антител означают нумерацию остатков по системе нумерации по Кабату. Если не указано иное, ссылки на номера остатков в константной области антител означает нумерацию остатков по системе нумерации EU, также называемой индексом EU, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
Если не указано иное, остатки HVR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки FR) нумеруются в данном документе в соответствии с Kabat et al., выше.
Термин «выделенное антитело», когда используется для описания различных антител, описанных в данном документе, относится к антителу, которое идентифицировано и отделено и/или выделено из клетки или культуры клеток, в которой оно экспрессировано. Загрязняющие компоненты окружающей природной среды представляют собой вещества, которые как правило могут мешать диагностическому или терапевтическому применению полипептида, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В некоторых вариантах осуществления антитело является очищенным до более чем 95% или 99% чистоты, определяемой, например, посредством электрофореза (например, ДСН-ПААГ-электрофореза, изоэлектрического фокусирования (ИЭФ), капиллярного электрофореза) или методом хроматографии (например, ионообменной или обращенно-фазовой ВЭЖХ). Для обзора способов оценки чистоты антител, см., например, Flatman et al., J, Chromatogr, В 848:79-87 (2007). В предпочтительных вариантах осуществления антитело будет очищено (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков на N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности путем использования секвенатора с вращающейся чашкой или (2) до гомогенности, полученной методом ДСН-ПААГ электрофореза в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях, используя окрашивание красителем Кумасси синим или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает антитела, полученные in situ внутри рекомбинантных клеток, поскольку по меньшей мере один компонент из полипептидного природного окружения будет отсутствовать. В то же время, выделенный полипептид обычно будет получен с использованием по меньшей мере одной стадии очистки.
Используемый в данном документе термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции в значительной степени гомогенных антител, т.е., отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связывают один эпитоп за исключением возможных вариантных антител, например, содержащих мутации природного происхождения или возникших во время получения препарата моноклональных антител, при этом такие варианты в общем случае присутствуют в незначительном количестве. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно содержат различные антитела против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело из препарата моноклонального антитела направлено против одной детерминанты антигена. Таким образом, определение "моноклональный" указывает на характеристику антитела, полученного по существу из однородной популяции антител, и не должно быть истолковано как необходимость получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для использования согласно данному изобретению можно получить с помощью различных способов, включая, без ограничений, метод гибридомы, методы рекомбинантных ДНК, методы фагового дисплея и способы с использованием трансгенных животных, полностью или частично содержащих локусы человеческого иммуноглобулина, причем такие способы и другие иллюстративные способы получения моноклональных антител описаны в данном документе.
Термин «мультиспецифическое антитело» используется в самом широком смысле и конкретно охватывает антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), причем единица VH-VL обладает полиэпитопной специфичностью (т.е. способна связываться с двумя разными эпитопами на одной биологической молекуле или каждым эпитопом на разных биологических молекулах). Такие мультиспецифические антитела включают, но не ограничиваются, полноразмерные антитела, антитела, обладающие двумя или более доменами VL и VH, фрагментами антител, такими как Fab, Fab', Fab-C. Fv, dsFv, scFv, диатела, биспецифические диатела и триатела, фрагменты антитела, которые ковалентно или нековалентно связаны. «Полиэпитопная специфичность» предполагает способность специфически связываться с двумя или более разными эпитопами на одной и той же или отличающейся мишени(ях). «Двойная специфичность» или «биспецифичность» относится к способности специфически связываться с двумя разными эпитопами на одной и той же или отличающейся мишени(ях). Однако, в отличие от биспецифических антител, антитела с двойной специфичностью имеют два антигенсвязывающих плеча, которые идентичны в аминокислотной последовательности и каждое Fab-плечо способно распознавать два антигена. Двойная специфичность позволяет антителам взаимодействовать с высокой аффинностью с двумя разными антигенами как одна молекула Fab или IgG. В соответствии с одним из вариантов осуществления мультиспецифичное антитело в виде IgG1 связываются с каждым эпитопом с аффинностью от 5 мкМ до 0,001 пМ, от 3 мкМ до 0,001 пМ, от 1 мкМ до 0,001 пМ, от 0,5 мкМ до 0,001 пМ или от 0,1 мкМ до 0,001 пМ. Термин «моноспецифический» относится к способности связывать только один эпитоп.
Термин «нативные антитела» относится к природным молекулам иммуноглобулинов, имеющим разные структуры. Например, нативные антитела IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой около 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, соединенных дисульфидными связями. В направлении от N- к С-концу каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), также называемую вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которым следуют три константных домена (СН1, СН2 и СН3). Аналогичным образом в направлении от N- к С-концу каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), которая также называется вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которым следует константный домен легкой цепи (CL). В зависимости от аминокислотной последовательности своего константного домена легкую цепь антитела можно отнести к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ).
-4
-5
-6
-7
-8
-3
-10
-11
-12
-4
-6
-6
-10
-7
-9
Применительно к связыванию антитела с молекулой-мишенью, термин «специфическое связывание» или «специфически связываться с» или является «специфическим к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретной полипептидной мишени означает связывание, которое измеряемо отличается от неспецифического взаимодействия. Специфическое связывание может быть измерено, например, при помощи определения связывания молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы. Например, специфическое связывание может определяться конкуренцией с контрольной молекулой, которая сходна с мишенью, к примеру, при избытке немеченой мишени. В этом случае специфическое связывание демонстрирует может ли связывание меченой мишени с зондом полностью ингибироваться избытком немеченой мишени. Термин «специфическое связывание» или «специфически связывается с» или является «специфическим к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретной полипептидной мишени, как используется в данном документе, может быть проиллюстрирован, например, при помощи молекулы, имеющей Kd для мишени 10М или ниже, альтернативно 10М или ниже, альтернативно 10 М или ниже, альтернативно 10 М или ниже, альтернативно 10 М или ниже, альтернативно 10 М или ниже, альтернативно 10 М или ниже, альтернативно 10 М или ниже, альтернативно 10 М или ниже, или Kd в диапазоне от 10 М до 10 М, или от 10 М до 10 М, или от 10 М до 10 М. Как будет понятно специалисту в данной области техники, значения аффинности и Kd связаны обратной зависимостью. Высокая аффинность для антигена измеряется низким значением Kd. В одном варианте осуществления изобретения термин «специфическое связывание» относится к связыванию, при котором молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде без значительного связывания с любым другим полипептидом или полипептидным эпитопом.
Выражение «нуклеиновая кислота, кодирующая анти-ФРЭС антитело» относится к одной или более молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), включая молекулы нуклеиновых(ой) кислот(ы) в одном векторе или отдельных векторах и молекулы нуклеиновых(ой) кислот(ы), присутствующие в одной или более местах в клетке-хозяине.
Термин «вектор» в контексте данного документа относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной обеспечивать репродукцию другой нуклеиновой кислоты, связанной с ней. Термин включает вектор как самореплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, который включен в геном клетки-хозяина, в которую он был введен. Некоторые векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в данном документе называют «векторами экспрессии».
Термины «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются как взаимозаменяемые и относятся к клеткам, в которые введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первично трансформированные клетки и полученное от них потомство вне зависимости от числа пассажей. Потомство может не быть полностью идентичным исходной клетке по содержанию нуклеиновых кислот, и может содержать мутации. В данный документ включено мутантное потомство, которое обладает такой же функцией или биологической активностью, которая является предметом исследований или отбора в изначально трансформированной клетке.
«Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей» относительно эталонной полипептидной последовательности определяется как процентная доля аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые являются идентичными с аминокислотными остатками в эталонной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и внесения, в случае необходимости, промежутков для достижения максимальной идентичности последовательностей, но без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотных последовательностей может осуществляться различными способами, которые известны специалистам в данной области техники, например, с использованием общедоступных компьютерных программ, таких как программные обеспечения BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить параметры, подходящие для выравнивания последовательностей, в том числе любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания сравниваемых последовательностей по всей длине. Однако для целей данного изобретения значения % идентичности аминокислотных последовательностей генерируются с использованием компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для выравнивания последовательностей ALIGN-2 была разработана Genentech, Inc., а исходная программа была подана вместе с документацией пользователя в Бюро регистрации авторских прав США, Вашингтон, округ Колумбия, 20559, где она зарегистрирована под номером регистрации авторского права США TXU510087. Программа ALIGN-2 находится в свободном доступе в Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, штат Калифорния, или ее можно скомпилировать из исходного кода. Для применения в операционной системе UNIX, включающей цифровую версию UNIX V4.0D, программу ALIGN-2 нужно скомпилировать. Все параметры сравнения последовательностей устанавливаются программой ALIGN-2 и остаются неизменными.
В тех случаях, когда для сравнения аминокислотных последовательностей используется ALIGN-2, % идентичности аминокислотной последовательности данной аминокислотной последовательности А к, с, или по отношению к данной аминокислотной последовательности В (что в альтернативном варианте может быть сформулировано как данная аминокислотная последовательность А, которая имеет или содержит определенный % идентичности аминокислотной последовательности к, с или по отношению к данной аминокислотной последовательности В) рассчитывают следующим образом: 100 умножить на соотношение X/Y, где X представляет собой число аминокислотных остатков, оцененных программой выравнивания последовательностей ALIGN-2 как идентичные совпадения при программном выравнивании А и В, и где Y представляет общее количество аминокислотных остатков в В. Следует понимать, что там, где длина аминокислотной последовательности А не равняется длине аминокислотной последовательности В, % идентичности аминокислотной последовательности А к В не будет равен % идентичности аминокислотной последовательности В к А. Если специально не указано иное, все значения % идентичности аминокислотных последовательностей, которые используется в данном документе, получают, как описано в предыдущем абзаце с использованием компьютерной программы ALIGN-2.
Используемый в данном документе термин «введение» означают способ введения субъекту дозы соединения (например, антитела (например, анти-ФРЭС антитела, сконструированного введением цистеина), или конъюгата антитела (например, монодисперсного конъюгата ГК) по данному изобретению) или композиции (например, фармацевтической композиции, например, фармацевтической композиции, содержащей антитело или конъюгат антитела согласно изобретению). Композиции, применяемые в описанных в данном документе способах, можно вводить, например, интравитреально (например, путем инъекции в стекловидное тело), в виде глазных капель, внутримышечно, внутривенно, интрадермально, чрескожно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутриочагово, интракраниально, внутрисуставно, внутрь простаты, внутриплеврально, интратрахеально, интратекально, интраназально, внутривагинально, ректально, местно, внутриопухолево, перитонеально, подкожно, субконъюнктивально, интравезикулярно, мукозально, интраперикардиально, внутрипуповинно, интраокулярно, интраорбитально, перорально, местно, трансдермально, путем ингаляции, путем инъекции, путем имплантации, путем инфузии, путем длительной инфузии, путем локализованной перфузии непосредственно через клетки-мишени, при помощи катетера, при помощи лаважа, в кремах или в липидных композициях. Композиции, используемые в способах, описанных в данном документе, можно также вводить системно или локально. Способ введения может изменяться в зависимости от различных факторов (например, соединения или композиции для введения, степени тяжести патологического состояния, заболевания или нарушения, подлежащего лечению).
«Ангиогенез» относится к процессу, посредством которого из ранее существовавших кровеносных сосудов образуются новые кровеносные сосуды. Ангиогенез отличается от васкулогенеза, который представляет собой образование эндотелиальных клеток de novo из мезодермальных клеток-предшественников. Заболевания, связанные с патологическим ангиогенезом можно лечить с помощью композиций и способов согласно изобретению. Примеры нарушений, связанных с патологическим ангиогенезом, включают, но не ограничиваются ими, болезни глаз (неограничивающие болезни глаз включают, например, ретинопатии, включая пролиферативную диабетическую ретинопатию, хориоидальную неоваскуляризацию (ХНВ), возрастную макулярную дегенерацию (ВМД), диабетическую и другие ретинопатии, связанные с ишемией, диабетический макулярный отек (ДМО), патологическую миопию, болезнь Гиппеля-Линдау, гистоплазмоз глаза, окклюзию вен сетчатки (в том числе формы окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС) и ветви центральной вены сетчатки (ОВВС)), неоваскуляризацию роговицы, неоваскуляризацию сетчатки, ретинопатию недоношенных (РН), семейную экссудативную витреоретинопатию (СЭВРП), болезнь Коутса, болезнь Норри, синдром остеопороза-псевдоглиомы (OPPG), субконъюнктивальное кровоизлияние, рубеоз, неоваскулярное заболевание глаз, неоваскулярную глаукому, гипертоническую ретинопатию). Дополнительные заболевания глаз описаны ниже.
Термин «заболевание глаз», используемые в данном документе, включает любое заболевание глаз (также называемое в данном документе взаимозаменяемо как «патологическое состояние глаз»), связанное с патологическим ангиогенезом. Заболевание глаз может характеризоваться измененной или нерегулируемой пролиферацией и/или инвазией новых кровеносных сосудов в структуры глазных тканей, такие как сетчатка или роговица. Неограничивающие болезни глаз включают, например, ВМД (например, влажную форму ВМД, сухую форму ВМД, ВМД в промежуточной стадии, ВМД на поздней стадии, и географическую атрофию сетчатки (ГА)), макулярную дегенерацию, макулярный отек, ДМО (например, фокальный ДМО вне центральной зоны и диффузный ДМО с вовлечением центральной зоны сетчатки), ретинопатию, диабетическую ретинопатию (ДР) (например, пролиферативную ДР (ПДР), непролиферативную ДР (НПДР), и высокогорную ДР), другие ретинопатии, связанные с ишемией, РН, окклюзию вен сетчатки (ОВС) (например, формы окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС) и ветви центральной вены сетчатки (ОВВС))), ХНВ (например, миопическую ХНВ), неоваскуляризацию роговицы, болезни, связанные с неоваскуляризацией роговицы, неоваскуляризацию сетчатки, болезни, связанные с неоваскуляризацией сетчатки/хориоидальной неоваскуляризацией, патологическую миопию, болезнь Гиппеля - Линдау, гистоплазмоз глаз, СЭВРП, болезнь Коутса, болезнь Норри, OPPG, субконъюнктивальное кровоизлияние, рубеоз, неоваскулярное заболевание глаз, неоваскулярную глаукомы пигментный ретинит (ПР), гипертоническую ретинопатию, ретинальную ангиоматозную пролиферацию, макулярную телеангиэктазию, неоваскуляризацию радужки, внутриглазную неоваскуляризацию, дегенерацию сетчатки, кистозный макулярный отек (КМО), васкулит, отек диска зрительного нерва, ретинит, конъюнктивит (например, инфекционный и неинфекционный (например, аллергический) конъюнктивит), врожденный амавроз Лебера (также известный как амавроз Лебера или ВАЛ), увеит (в том числе инфекционный и неинфекционный увеит), хориоидит (например, мультифокальной хориоидит), гистоплазмоз глаз, блефарит, синдром сухого глаза, травматическое повреждение глаз, синдром Шегрена, и другие болезни глаз, причем заболевание или нарушение связано с неоваскуляризацией, транссудацией и/или отеком сетчатки. Дополнительные иллюстративные болезни глаз включают болезни, связанные с рубеозом (неоваскуляризацией угла передней камеры), и болезни, вызванные аномальной пролиферацией фиброваскулярной или фиброзной ткани, в том числе всех форм пролиферативной витреоретинопатии.
Примеры заболеваний, связанных с неоваскуляризацией роговицы, включают, но не ограничиваются ими, эпидемический кератоконъюнктивит, дефицит витамина А, синдром перенашивания контактных линз, атопический кератит, верхний лимбальный кератит, птеригиум, сухой кератит, синдром Шегрена, розовые угри, фликтенулезный конъюнктивит, сифилис, инфекции, вызванные Mycobacteria, липидную дегенерацию, химические ожоги, бактериальную язву, грибковую язву, инфекции, вызванные простым герпесом, опоясывающий лишай, протозойные инфекции, саркому Капоши, язву Мурена, краевую дегенерацию Терьена, краевой кератолиз, ревматоидный артрит, системную красную волчанку, полиартрит, травму, саркоидоз Вегенера, склерит, синдром Стивенса-Джонсона, радиальную кератотомию при рубцующем пемфигоиде и отторжение трансплантата роговицы.
Примеры заболеваний, связанных с неоваскуляризацией сетчатки/хориоидальной неоваскуляризацией, включают, но не ограничиваются ими, диабетическую ретинопатию, макулярную дегенерацию, серповидно-клеточную анемию, саркоидоз, сифилис, эластическую псевдоксантому, болезнь Педжета, окклюзии вены, окклюзию артерии, атеросклероз сонных артерий, хронический увеит/витреит, микобактериальные инфекции, болезнь Лайма, системную красную волчанку, ретинопатия недоношенных, пигментный ретинит, отек сетчатки (включая макулярный отек), заболевания Илза, болезнь Бехчета, инфекцию, вызывающую ретинит или хориоидит (например, мультифокальный хориоидит), синдром предполагаемого гистоплазмоза глаз, болезнь Беста (врожденную дегенерацию желтого пятна), близорукость, врожденные ямки в диске зрительного нерва, болезнь Штаргардта, парспланит, отслоение сетчатки (например, хроническое отслоение сетчатки), синдромы повышенной вязкости крови, токсоплазмоз, травмы, и постлазерные осложнения.
«Ангиогенный фактор или агент» представляет собой фактор роста, который стимулирует развитие кровеносных сосудов, например, стимулирует ангиогенез, рост эндотелиальных клеток, стабильность кровеносных сосудов и/или васкулогенез и т.д. Например, ангиогенные факторы, включает, но не ограничиваясь этим, например, ФРЭС и члены семейства ФРЭС, PIGF (плацентарный фактор роста), семейства ТцФР, семейства факторов роста фибробластов (ФРФ), лиганды TIE (ангиопоэтины), эфрины, Del-1, факторы роста фибробластов: кислотный (кФРФ) и основной (оФРФ), фоллистатин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), фактор роста гепатоцитов (ФРГ)/рассеивающий фактор (РФ), интерлейкин-8 (ИЛ-8), лептин, мидкин, фактор роста плаценты, тромбоцитарный фактор роста эндотелиальных клеток (PD-ECGF), тромбоцитарный фактор роста, особенно PDGF-BB или PDGFR-бета, плейотропин (ПТН), програнулин, пролиферин, трансформирующий фактор роста-альфа (ТФР-альфа), трансформирующий фактор роста-бета (ТФР-бета), фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-альфа), фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС)/фактор сосудистой проницаемости (VPF) и т.д. Они также включают факторы, ускоряющие заживление ран, такие как гормон роста, инсулиноподобный фактор роста I (ИФР-1), VIGF, эпидермальный фактор роста (ЭФР), CTGF (фактор роста соединительной ткани) и члены его семейства, а также ТФР-альфа и ТФР-бета. См., например, Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (например, в Таблице 1 перечислены известные ангиогенные факторы); и Sato, Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003).
«Антиангиогенный агент» или «ингибитор ангиогенеза» относится к веществу с малой молекулярной массой, полинуклеотиду, полипептиду, выделенному белку, рекомбинантному белку, антителу, или конъюгатам или их слитым белкам, которые ингибируют ангиогенез, васкулогенез или нежелательную проницаемость сосудов либо непосредственно или опосредованно. Следует понимать, что антиангиогенный агент включает такие агенты, которые связывают и блокируют ангиогенную активность ангиогенного фактора или его рецептора. Например, антиангиогенный агент представляет собой антитело или другой антагонист ангиогенного агента, как определено выше, например, антагонисты ФРЭС (например, антитело к ФРЭС-А или к рецептору ФРЭС-А (например, к рецептору KDR или рецептору Flt-1)), антагонисты ТцФР (например, анти-ТцФР ингибиторы, такие как GLEEVEC™ (иматиниба мезилат)). Антиангиогенные агенты также включает нативные ингибиторы ангиогенеза, например, ангиостатин, эндостатин и т.д. См., например, Klagsbrun and D'Amore, Annu, Rev, Physiol., 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (например, в Таблице 3 перечислены антиангиогенные терапии при злокачественной меланоме); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (например, в Таблице 2 перечислены известные антиангиогенные факторы); и, Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) (например, в Таблице 1 перечислены антиангиогенные агенты, используемые в клинических испытаниях).
121
165
Термин «антагонист ФРЭС», используемый в данном документе, относится к молекуле, способной связываться с ФРЭС, снижая уровни экспрессии ФРЭС или нейтрализуя, блокируя, ингибируя, подавляя, уменьшая или препятствуя биологической активности ФРЭС, включая, без ограничений, связывание ФРЭС с одним или более рецепторами ФРЭС, сигналинг ФРЭС и ФРЭС-опосредованный ангиогенез и выживание или пролиферацию эндотелиальных клеток. Например, молекула, которая способна нейтрализовать, блокировать, ингибировать, подавлять, уменьшать или препятствовать биологической активности ФРЭС, может проявлять свои эффекты путем связывания с одним или более рецепторами ФРЭС (ФРЭСР) (например, ФРЭСР1, ФРЭСР2, ФРЭСР3, мембраносвязанным рецептором ФРЭС (mbФРЭСР) или растворимым рецептором ФРЭС (эФРЭСР)). В качестве антагонистов ФРЭС, используемых в способах согласно данному изобретению, можно назвать полипептиды, которые специфически связываются с ФРЭС, анти-ФРЭС антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, молекулы рецепторов и их производные, которые специфически связываются с ФРЭС, тем самым предотвращая его связывание с одним или более рецепторами, слитыми белками (например, ФРЭС-Trap (Regeneron)), и ФРЭС--гелонин (Peregrine). Антагонисты ФРЭС, также включают антагонистические модификации полипептидов ФРЭС, антисмысловые нуклеотидные олигомеры, комплементарные по меньшей мере одному фрагменту молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид ФРЭС; малые РНК, комплементарные по меньшей мере одному фрагменту молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид ФРЭС; рибозимы, которые нацелены на ФРЭС; пептитела (peptibodies) к ФРЭС; и аптамеры ФРЭС. Антагонисты ФРЭС также включают полипептиды, которые связываются с ФРЭСР, анти-ФРЭСР антитела и их антигенсвязывающие фрагменты и производные, которые связываются  с ФРЭСР, таким образом, что блокируют, ингибируют, подавляют, уменьшают или препятствуют биологической активности ФРЭС (например, сигналингу ФРЭС), слитые белки. Антагонисты ФРЭС, также включают непептидные малые молекулы, которые связываются с ФРЭС или ФРЭСР, и способны блокировать, ингибировать, подавлять, уменьшать или препятствовать биологической активности ФРЭС. Таким образом, термин "активность ФРЭС", в частности, включает ФРЭС-опосредованную биологическую активность ФРЭС. В некоторых вариантах осуществления антагонист ФРЭС уменьшает или ингибирует по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более уровень экспрессии или биологической активности ФРЭС. В некоторых вариантах осуществления ФРЭС ингибируется ФРЭС-специфическим антагонистом, который представляет собой ФРЭС (8-109), ФРЭС (1-109) или ФРЭС-.
Используемые в данном документе антагонисты ФРЭС могут включать, но не ограничиваются ими, анти-ФРЭСР2 антитела и родственные молекулы (например, рамуцирумаб, танибирумаб, афлиберцепт), анти-ФРЭСР1 антитела и родственные молекулы (например, икрукумаб, афлиберцепт (ФРЭС Trap-Eye; EYLEA), и зив-афлиберцепт (ФРЭС Trap; ZALTRAP)), биспецифические антитела к ФРЭС (например, МР-0250, вануцизумаб (ФРЭС-ANG2), и биспецифические антитела, описанные в US 2001/0236388), биспецифические антитела, которые включают комбинации двух анти-ФРЭС, анти-ФРЭСР1, и анти-ФРЭСР2 плечи, анти-ФРЭС антитела (например, бевацизумаб, севацизумаб и ранибизумаб), и непептидные низкомолекулярные антагонисты ФРЭС (например, пазопаниб, акситиниб, вандетаниб, стиварга, кабозаниниб, ленватиниб, ниндеданиб, орантиниб, телатиниб, довитиниг, седираниб, мотосаниб, сульфатиниб, апатиниб, форатиниб, фамитиниб, и тивозаниб). Дополнительные антагонисты ФРЭС описаны ниже.
«Эффективное количество» агента, например, фармацевтического препарата, относится к количеству, эффективному в дозах и в течение требуемых периодов времени, для достижения требуемого терапевтического или профилактического результата.
«Индивидуум» или «субъект» представляет собой млекопитающее. Млекопитающие включают, но не ограничиваются этими, одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак, лошадей), приматов (например, людей и приматов, не являющихся человеком, таких, как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В некоторых вариантах осуществления индивидуум или субъект является человеком. «Субъект» может быть «пациентом».
"Нарушение" представляет собой любое патологическое состояние, которые поддается лечению при помощи антител. Так, например, млекопитающие, которые страдают от или нуждаются в профилактике против аномального ангиогенеза (чрезмерного, неподходящего или неконтролируемого ангиогенеза). Данный термин охватывает хронические и острые нарушения или заболевания, включая те патологические состояния, которые увеличивают предрасположенность млекопитающего к рассматриваемому нарушению. В данном документе неограничивающие примеры нарушений, подлежащих лечению, включают нарушения, связанные с патологическим ангиогенезом (например, болезни глаз).
Термин «листок-вкладыш в упаковке» используется для обозначения инструкций, которые обычно вкладывают в коммерческие упаковки терапевтических продуктов для продажи, содержащие информацию о показаниях, использовании, дозах, приеме, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях, которые касаются использования таких терапевтических продуктов.
Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от активного ингредиента, который является нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничиваются ими, буфер, вспомогательное вещество, стабилизатор или консервант.
Термин «фармацевтический состав» относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы обеспечить биологическую активность активного ингредиента (например, конъюгата антитело), содержащийся в ней, чтобы быть эффективным, и который не содержит каких-либо дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет вводиться состав.
В данном документе термин «лечение» (и его грамматические варианты, например, «лечить») относится к клиническому вмешательству при попытке изменить естественное течение заболевания у индивидуума, подвергаемого лечению, и может осуществляться для профилактики или в процессе клинического проявления патологии. Желаемые эффекты лечения включают, без ограничения, предотвращение возникновения или рецидива заболевания, частичное снятие симптомов, уменьшение каких-либо прямых или косвенных патологических последствий заболевания, снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или временное облегчение болезненного состояния, и ремиссию или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты антитела согласно изобретению или другие композиции, которые содержат конъюгат антитела согласно изобретению, (например, фармацевтический препарат) используются для задержки развития заболевания или замедления прогрессирования заболевания.
«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена, по меньшей мере от одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно связана в природном источнике нуклеиновой кислоты. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от формы или состояния, в котором она находится в природе. Поэтому выделенные молекулы нуклеиновой кислоты отличаются от молекулы нуклеиновой кислоты, находящейся в природных клетках. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно экспрессируют антитело, где, например, молекула нуклеиновой кислоты присутствуют в области хромосомы, отличающейся от ее положения в природных клетках.
Выражение «контрольные последовательности» относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Контрольные последовательности, которые подходят для прокариот, например, включают промотор, необязательно последовательность оператора и сайт связывания рибосом. Известно, что в эукариотических клетках используются промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.
Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», когда она помещена в функциональную зависимость от другой последовательности нуклеиновой кислоты. К примеру, ДНК предпоследовательности или секреторного лидера является функционально связанной с ДНК полипептида, если она экспрессируется как белок-предшественник, принимающий участие в секреции этого полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию этой последовательности, или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы облегчать прохождение трансляции. В целом, «функционально связанный» означает, что последовательности ДНК, будучи связанными, являются непрерывными и, в случае наличия секреторного лидера, непрерывными и в фазе считывания. Тем не менее, энхансеры не должны быть непрерывными. Связывание сопровождается лигированием по подходящим сайтам рестрикции. Если таких сайтов нет, то в соответствии с подходящей методикой используются синтетические олигонуклеотидные адапторы или линкеры.
Как используется в данном документе, выражения «клетка», «линия клеток» и «культура клеток» используется взаимозаменяемо, и все такие обозначения включают потомство. Таким образом, слова «трансформанты» и «трансформированные клетки» включают первичную клетку субъекта и культуры, полученные из нее, без учета числа пассажей. Следует также понимать, что все потомство может не быть полностью идентичным по содержанию ДНК вследствие преднамеренных или случайных мутаций. Включено мутантное потомство, которое обладает такой же функцией или биологической активностью, которая является предметом исследований в изначально трансформированной клетке. Из контекста будет ясно где включаются различные обозначения.
«Вариант» или «мутант» из исходного или эталонного полипептида (например, эталонное антитело или его вариабельный домен(ы)/HVR) представляет собой полипептид, который (1) имеет аминокислотную последовательность, отличную от исходного или эталонного полипептида и (2) был получен из исходного или эталонного полипептида посредством или естественного или искусственного (сделанного человеком) мутагенеза. Такие варианты включают, например, делеции из, и/или инсерции в, и/или замены остатков в аминокислотной последовательности представляющего интереса полипептида, которые называются в данном документе как «изменения аминокислотных остатков». Таким образом, вариант HVR относится к HVR, содержащей последовательность варианта по отношению к исходной или эталонной полипептидной последовательности (например, как у исходного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента). Изменение аминокислотного остатка, в данном контексте, относится к аминокислоте, отличной от аминокислоты в соответствующем положении в исходной или эталонной последовательности полипептида (например, как у эталонного антитела или его фрагмента). Любая комбинация делеции, вставки и замены может быть сделана, чтобы достигнуть конечного варианта или мутантного конструкта, при условии, что конечный конструкт обладает желаемыми функциональными характеристиками. Изменения аминокислот также могут изменять посттрансляционные процессы полипептида, такие как изменение числа или положения сайтов гликозилирования.
Последовательность «дикого типа (ДТ)», или «эталонная» последовательность, или последовательность из белка/полипептида «дикого типа», или «эталонного» белка/полипептида, такие как HVR или вариабельный домен эталонного антитела, могут представлять собой эталонную последовательность из которой путем введения мутация получают вариантные полипептиды. В общем, последовательность «дикого типа» для данного белка представляет собой последовательность, которая является наиболее распространенной в природе. Подобным образом, последовательность гена «дикого типа» представляет собой последовательность для этого гена, который наиболее часто встречается в природе. Мутации могут быть введены в ген «дикого типа» (и, таким образом, он кодирует белок) или путем естественных процессов или посредством технических средств. Продуктами таких процессов являются «вариантные» или «мутантные» формы исходного белка или гена «дикого типа».
Термин «изоэлектрическая точка (pl)» означает, рН, при которой молекула (например, белок, такой как антитело) не несет никакого чистого электрического заряда, также называемого в данной области как "рН(I)" или "IEP.
Как используется в данном документе термин «конъюгат антитела» представляет собой антитело, ковалентно присоединенное к одному или более полимерам. Любой подходящий полимер может быть конъюгирован с антителом, например, гидрофильный полимер (например, гиалуроновая кислота (ГК) или полиэтиленгликоль (ПЭГ)) или гидрофобный полимер (например, полилактид-когликолид (PLGA)). В конкретных вариантах осуществления полимер представляет собой ГК (также называемую в данном документе как «конъюгаты ГК»).
Как используется в данном документе термин «полимер» означает молекулу, которая содержит повторяющиеся структурные единицы (т.е. мономеры), соединенные химическими связями линейным, кольцевым, разветвленным, поперечно-сшитым или дендримерным образом, или их комбинацией. Полимер может быть синтетическими или природными, или их комбинацией. Следует понимать, что термин «полимер» включает сополимеры, которые представляют собой полимеры, которые содержат два или более различных мономеров. Полимер также может представлять собой гомополимер, который представляет собой полимер, который содержит только один тип мономера.
M
w
n
w
n
Термин «индекс полидисперсности (PDI)» относится к измерению широты молекулярно-массового распределения полимера. PDI также упоминается в данной области техники как «индекс дисперсности», «показатель полидисперсности», или «степень дисперсности (D)». PDI образца полимера может быть рассчитан с использованием уравнения (I): D=M/M, где M представляет собой средневесовую молекулярную массу и M представляет собой среднечисленную молекулярную массу. Если не указано иное, PDI рассчитывается в соответствии с уравнением (I).
Образец полимера можно считать «монодисперсным» (также известный в данной области техники как однородный) или «полидисперсным» (также известный в данной области техники, как неоднородный). Как использовано в данном описании, термин «монодисперсный» по отношению к образцу полимера ГК или конъюгата ГК означает, что образец полимера ГК или конъюгат ГК образца имеет PDI менее чем или равный около 1,1, например, около 1,001, около 1,02, около 1,03, около 1,04, около 1,05, около 1,06, около 1,07, около 1,08, около 1,09, или около 1,1. Например, образец монодисперсного полимера ГК или конъюгата ГК может иметь PDI от 1,0 до около 1,1 (например, от 1 до около 1,1, от 1 до около 1,09, от 1 до около 1,08, от 1 до около 1,07, от 1 до около 1,06, от 1 до около 1,05, от 1 до около 1,04, от 1 до около 1,03, от 1 до около 1,02, от 1 до около 1,01, от 1 до около 1,005, от около 1,001 до около 1,1, от около 1,001 до около 1,1, от около 1,001 до около 1,09, от около 1,001 до около 1,08, от около 1,001 до около 1,07, от около 1,001 до около 1,06, от около 1,001 до около 1,05, от около 1,001 до около 1,04, от около 1,001 до около 1,03, от около 1,001 до около 1,02, от около 1,001 до около 1,01, от около 1,001 до около 1,005, от около 1,001 до около 1,004, от около 1,001 до около 1,003, от около 1,001 до около 1,002, от около 1,0001 до около 1,1, от около 1,0001 до около 1,09, от около 1,0001 до около 1,08, от около 1,0001 до около 1,07, от около 1,0001 до около 1,06, от около 1,0001 до около 1,05, от около 1,0001 до около 1,04, от около 1,0001 до около 1,03, от около 1,0001 до около 1,02, от около 1,0001 до около 1,01, от около 1,0001 до около 1,005, от около 1,0001 до около 1,004, от около 1,0001 до около 1,003, от около 1,0001 до около 1,002, или от около 1,0001 до около 1,005).
В противоположность этому, термин «полидисперсный» означает, что образец полимера ГК или конъюгата ГК имеет PDI более чем 1,1, например, около 1,3, около 1,4, около 1,5, около 1,6, около 1,7, около 1,8 или выше. Например, в некоторых вариантах осуществления, полидисперсной образец полимера ГК или конъюгата ГК имеет PDI в диапазоне от около 1,3 до около 2, от около 1,4 до около 2, от около 1,5 до около 2, от около 1,6 до около 2, от около 1,7 до около 2, от около 1,8 до около 2, или от около 1,9 до около 2.
Термины «гиалуроновая кислота», «гиалуронан» и «ГК», которые используются в данном документе взаимозаменяемо, относятся к полимерному гликозаминогликану (ГАГ), который содержит повторяющиеся дисахаридные единицы N-ацетилглюкозамина и глюкуроновой кислоты. ГК представляет собой анионный, несульфатированные ГАГ, которые можно найти, например, во внеклеточном матриксе (например, в стекловидном теле глаза), соединительной ткани, эпителиальной и нервной ткани.
2
2
n
Термин «полиэтиленгликоль» или «ПЭГ», используемый в данном описании, относится к полиэфирному соединению, которое также известно как полиэтиленоксид (ПЭО) или полиоксиэтилен (ПОЭ), в зависимости от его молекулярной массы. ПЭГ может иметь структуру Н-(O-СН-СН)-ОН, где n представляет собой любое подходящее целое число,. ПЭГ может представлять собой разветвленный ПЭГ, звездообразный ПЭГ, или гребнеобразный ПЭГ. ПЭГ может представлять собой, например, тетрамер ПЭГ, гексамер ПЭГ, или октамер ПЭГ.
Термин «клиренс», используемый в данном документе, относится к объему вещества (например, анти-ФРЭС антитела, конъюгата антитела, слитого белка (например, Fab-слитого белка), или полимерного препарата), который выводится из компартмента (например, глаза (например, стекловидного тела)) в единицу времени.
Термин «период полужизни» относится ко времени, необходимому для уменьшения наполовину концентрации вещества (например, анти-ФРЭС антитела, конъюгата антитела, слитого белка (например, Fab-слитого белка), или полимерного препарата), in vivo (например, в глазу (например, стекловидном теле)) или in vitro.
II. КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ
Изобретение обеспечивает конъюгаты антител, которые включают полимеры (например, монодисперсные полимеры ГК), ковалентно связанные с антителами (например, анти-ФРЭС антителами, включая анти-ФРЭС антитело, описанное в данном документе), антитела, сконструированные введением цистеина, которые могут быть использованы, например, при получении конъюгатов антител, композиций, которые содержат конъюгаты антител (например, фармацевтические композиции), а также к способам их получения и применения, например, для применения в терапевтических целях (например, для лечения заболеваний глаз).
А. Иллюстративные антитела для применения в конъюгатах согласно изобретению
Изобретение обеспечивает конъюгаты антител, которые включают антитела (например, анти-ФРЭС антитела), ковалентно связанные с полимерами (например, монодисперсными полимерами). Могут быть использованы любые подходящие антитела (например, анти-ФРЭС антитела). Например, антитетело может специфически связываться с антигеном, выбранным из группы, состоящей из ФРЭС; интерлейкина-1 бета (ИЛ-1β); интерлейкина-6 (ИЛ-6); рецептора интерлейкина-6 (ИЛ-6Р); интерлейкина-13 (ИЛ-13); рецептора ИЛ-13 (ИЛ-13R); ТцФР (например, PDGF-BB); ангиопоэтина; ангиопоэтина-2 (Ang2); Tie2; S1P; интегринов αvβ3, αvβ5, и α5β1; бетацеллюлина; апелина/APJ; эритропоэтина; фактора D комплемента; ФНО-α; HtrA1; рецептора ФРЭС (например, ФРЭСР1, ФРЭСР2, ФРЭСР3, мембраносвязанного рецептора ФРЭС (mbФРЭСР), или растворимого рецептора ФРЭС (эФРЭСР)); ST-2-рецептора; и белка, генетически связанного с риском возрастной макулярной дегенерации (ВМД) (например, компонентов пути комплемента С2, фактора В, фактора Н, CFHR3, C3b, С5, С5а, и С3а; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; интерлейкина-8 (ИЛ-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; СЕТР; LIPC; COL10A1; и TNFRSF10A). Такие антитела могут быть полезны, например, для уменьшения ангиогенеза и/или для лечения или замедления прогрессирования нарушения, связанного с патологическим ангиогенезом (например, болезней глаз). Иллюстративные, неограничивающие анти-ФРЭС антитела, которые могут быть использованы в конъюгатах антител согласно изобретению, описаны ниже.
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
5
6
7
8
1
1
1
1
1
2
1
2
В некоторых случаях анти-ФРЭС антитело может содержать по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GXTPXGGXXXYXDSVXX (SEQ ID NO: 2), где X представляет собой IIe или His, Х представляет собой Ala или Arg, Х представляет собой Tyr или Lys, Х представляет собой Thr или Glu, X представляет собой Arg, Tyr, GIn, или Glu, Х представляет собой Ala или Glu, X представляет собой Lys или Glu, и Х представляет собой Gly или Glu; (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQX-VSTAVA (SEQ ID NO: 4), где Х представляет собой Asp или Arg; (е) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность XASFLYS (SEQ ID NO: 5), где X представляет собой Ser или Met; и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность XQGYGXPFT (SEQ ID NO: 6), где X представляет собой GIn, Asn, или Thr и Х представляет собой Ala, Asn, Gin, или Arg, или комбинацию одной или более из указанных выше HVR и одного или более ее вариантов, имеющих по меньшей мере около 80% идентичность последовательности (например, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичность) с любой из SEQ ID NO: 1-6.
Например, анти-ФРЭС антитело может содержать по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из: (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7), GITPAGGYEYYADSVKG (SEQ ID NO: 21), или GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10) или QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23), или комбинации одной или более из указанных выше HVR и одного или более их вариантов, имеющих по меньшей мере около 80% идентичность последовательности (например, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность) с любой из SEQ ID NO: 1, 3, 7-10, или 21 -23.
Например, в некоторых случаях анти-ФРЭС антитело может содержать по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из: (а) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7); (с) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10), или комбинации одной или более из указанных выше HVR и одного или более их вариантов, имеющих по меньшей мере около 80% идентичность последовательности (например, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность) с любой из SEQ ID NO: 1, 3, или 7-10. В конкретном примере, в некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело содержит следующие шесть HVR: (а) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7); (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (е) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10).
В некоторых случаях любое из предшествующих антител анти-ФРЭС может содержать одну, две, три, или четыре из следующих каркасных областей вариабельного домена тяжелой цепи (FR): (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14); (с) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16).
В некоторых случаях любое из предшествующих антител анти-ФРЭС может содержать одну, две, три, или четыре из следующих каркасных областей вариабельного домена легкой цепи (FR): (a) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (с) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20).
Например, в некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело содержит следующие шесть HVR: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7); (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). В некоторых случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена тяжелой цепи: (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14); (с) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16). В дополнительных случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена легкой цепи: (a) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (с) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
Например, в некоторых случаях анти-ФРЭС антитело может содержать по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из: (а) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23), или комбинации одной или более из указанных выше HVR и одного или более их вариантов, имеющих по меньшей мере около 80% идентичность последовательности (например, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность) с любой из SEQ ID NO: 1, 3, 8, 9, 22, или 23. В конкретном примере, в некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело содержит следующие шесть HVR: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23).
В некоторых случаях любое из предшествующих антител анти-ФРЭС может содержать одну, две, три, или четыре из следующих каркасных областей вариабельного домена тяжелой цепи (FR): (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29) или EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 52); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (c) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32).
В некоторых случаях любое из предшествующих антител анти-ФРЭС может содержать одну, две, три, или четыре из следующих каркасных областей вариабельного домена легкой цепи (FR): (a) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (с) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 24); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20).
Например, в некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело содержит следующие шесть HVR: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23). В некоторых случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена тяжелой цепи: (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (с) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). В дополнительных случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена легкой цепи: (a) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (с) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 24); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38.
В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело содержит следующие шесть HVR: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGNPFT (SEQ ID NO: 23). В некоторых случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена тяжелой цепи: (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 52); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (с) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). В дополнительных случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена легкой цепи: (a) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (с) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 24); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38.
Например, в некоторых случаях анти-ФРЭС антитело может содержать по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из: (а) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10), или комбинации одной или более из указанных выше HVR и одного или более их вариантов, имеющих по меньшей мере около 80% идентичность последовательности (например, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность) с любой из SEQ ID NO: 1, 3, 8-10, или 22. В конкретном примере, в некоторых случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие шесть HVR: (а) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10).
В некоторых случаях любое из предшествующих антител анти-ФРЭС может содержать одну, две, три, или четыре из следующих каркасных областей вариабельного домена тяжелой цепи (FR): (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29) или EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 52); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (c) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32).
В некоторых случаях любое из предшествующих антител анти-ФРЭС может содержать одну, две, три, или четыре из следующих каркасных областей вариабельного домена легкой цепи (FR): (a) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17), DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 25), или DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18) или WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27); (c) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19) или GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 28); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20).
Например, в некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело содержит следующие шесть HVR: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). В некоторых случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена тяжелой цепи: (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (c) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). В дополнительных случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена легкой цепи: (a) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 25); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (с) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
Например, в других случаях, анти-ФРЭС антитело содержит следующие шесть HVR: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). В некоторых случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена тяжелой цепи: (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (с) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). В дополнительных случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена легкой цепи: (a) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27); (с) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 28); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20).
В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
Например, в других случаях, анти-ФРЭС антитело содержит следующие шесть HVR: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). В некоторых случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена тяжелой цепи: (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 52); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (с) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). В дополнительных случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена легкой цепи: (a) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27); (с) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 28); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
Например, в еще других случаях, анти-ФРЭС антитело содержит следующие шесть HVR: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). В некоторых случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена тяжелой цепи: (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (с) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). В дополнительных случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена легкой цепи: (a) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 25); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27); (с) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36.
Например, в еще дополнительных случаях, анти-ФРЭС антитело содержит следующие шесть HVR: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). В некоторых случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена тяжелой цепи: (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (с) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). В дополнительных случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена легкой цепи: (a) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (с) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37.
В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело содержит следующие шесть HVR: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). В некоторых случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена тяжелой цепи: (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 52); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (с) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). В дополнительных случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена легкой цепи: (a) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (c) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37.
Например, в других случаях, анти-ФРЭС антитело содержит следующие шесть HVR: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). В некоторых случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена тяжелой цепи: (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (c) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). В дополнительных случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена легкой цепи: (a) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (с) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело содержит следующие шесть HVR: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYEYYADSVEG (SEQ ID NO: 22); (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). В некоторых случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена тяжелой цепи: (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 52); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30); (с) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32). В дополнительных случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие FR вариабельного домена легкой цепи: (a) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (с) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
В некоторых случаях анти-ФРЭС антитело содержит (а) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с (например, по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность), или последовательность любой из SEQ ID NO: 11, 40 или 42; (b) вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с (например, по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичности последовательностей), или последовательность любой из SEQ ID NO: 12, 41, или 46; или (с) домен VH как в (а) и домен VL как в (b). Например, в некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41. В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46.
В некоторых случаях любые из предшествующих антител анти-ФРЭС может содержать одну, две, три, или четыре из следующих каркасных областей вариабельного домена тяжелой цепи (FR): (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14) или WVRQEPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 39); (с) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16).
В некоторых случаях любое из предшествующих антител анти-ФРЭС может содержать одну, две, три, или четыре из следующих каркасных областей вариабельного домена легкой цепи (FR): (a) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17) или DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIDC (SEQ ID NO: 45); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (c) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19), GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYC (SEQ ID NO: 44), или GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC (SEQ ID NO: 54); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20) или FGQGTKVEVK (SEQ ID NO: 55).
В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 59).
В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 59).
В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, и домен VL, содержащий  аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 59).
В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 59).
В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 59).
В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 60).
В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 60).
В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 60).
В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 60).
В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 60). Например, в некоторых случаях анти-ФРЭС антитело может содержать (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности (например, по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичность последовательности) с, или последовательность, SEQ ID NO: 11; (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности (например, по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичность последовательности) с, или последовательность, SEQ ID NO: 11; или (с) домен VH как в (а) и домен VL как в (b). В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело может содержать (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7); (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). В некоторых случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие каркасные области тяжелой цепи: (a) FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14); (с) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16). В некоторых случаях анти-ФРЭС антитело содержит следующие каркасные области легкой цепи: (a) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (с) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). В некоторых случаях анти-ФРЭС антитело содержит связывающий домен, содержащий (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых случаях иллюстративное анти-ФРЭС представляет собой N94A.F83A.N82aR.Y58R (также называется как G6.31 AARR или G6.31.AARR).
В некоторых случаях анти-ФРЭС антитело может содержать (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности (например, по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичность последовательности) с, или последовательность, SEQ ID NO: 33 или 51; (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с (например, по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичности последовательностей), или последовательность любой из SEQ ID NO: 12, 34, 35, 36, 37, или 38; или (с) домен VH как в (а) и домен VL как в (b). Например, в некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34. В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35. В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36. В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37. В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38. В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38. В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35. В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37. В некоторых случаях антитело содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
В некоторых случаях любое из предшествующих антител анти-ФРЭС может содержать одну, две, три, или четыре из следующих каркасных областей вариабельного домена тяжелой цепи (FR): FR-H1, содержащую аминокислотную последовательность EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 29) или EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS (SEQ ID NO: 52); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQEPGEGLEWVA (SEQ ID NO: 30) или WVRQEPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 39); (с) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 31); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGELVTVSS (SEQ ID NO: 32).
В некоторых случаях любое из предшествующих анти-ФРЭС антител может содержать одну, две, три, или четыре из следующих каркасных областей вариабельного домена легкой цепи (FR): (a) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17), DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 25), или DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC (SEQ ID NO: 26); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18) или WYQQKPGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 27); (с) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19), GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 24), или GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 28); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20).
В некоторых случаях изобретение обеспечивает антитело, содержащее (а) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48 и/или (b) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой G6.31 AARR, экспрессируемое в формате Fab.
В некоторых случаях изобретение обеспечивает антитело, содержащее (а) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49 и/или (b) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой вариант версии G6.31 AARR, который лишен реактивности к антителу против IgG человека.
В дополнительном аспекте антитело (например, анти-ФРЭС антитело) в соответствии с любым из вышеописанных вариантов осуществления, может включать любой из признаков, по отдельности или в комбинации, как описано в разделах 1-8 ниже:
1. Аффинность антитела
-8
-13
-9
-13
В некоторых вариантах осуществления антитело, предложенное в данном документе, имеет константу диссоциации (Kd) ≤ 1 мкМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 0,01 нМ, или ≤ 0,001 нМ (например, 10-8 М или менее, например, от 10М до 10 М, например, от 10 М до 10 М). Например, в некоторых случаях антитело, предложенное в данном документе, связывает антиген (например, человеческий ФРЭС (hФРЭС)) с Kd около 10 нМ или ниже. В некоторых случаях антитело, предложенное в данном документе, связывает антиген (например, hФРЭС) с Kd около 5 нМ или ниже. В некоторых случаях антитело, предложенное в данном документе, связывает антиген (например, человеческий ФРЭС (hФРЭС)) с Kd около 2 нМ или ниже. Например, в некоторых случаях антитело связывает антиген (например, hФРЭС) с Kd от около 25 пМ до около 2 нМ (например, около 25 пМ, около 50 пМ, около 75 пМ, около 100 пМ, около 125 пМ, около 150 пМ, около 175 пМ, около 200 пМ, около 225 пМ, около 250 пМ, около 275 пМ, около 300 пМ, около 325 пМ, около 350 пМ, около 375 пМ, около 400 пМ, около 425 пМ, около 450 пМ, около 475 пМ, около 500 пМ, около 525 пМ, около 550 пМ, около 575 пМ, около 600 пМ, около 625 пМ, около 650 пМ, около 675 пМ, около 700 пМ, около 725 пМ, около 750 пМ, около 775 пМ, около 800 пМ, около 825 пМ, около 850 пМ, около 875 пМ, около 900 пМ, около 925 пМ, около 950 пМ, около 975 пМ, около 1 нМ, около 1,1 нМ, около 1,2 нМ, около 1,3 нМ, около 1,4 нМ, около 1,5 нМ, около 1,6 нМ, около 1,7 нМ, около 1,8 нМ, около 1,9 нМ, или около 2 нМ). В некоторых случаях антитело связывает антиген (например, hФРЭС) с Kd от около 75 пМ до около 600 пМ (например, около 75 пМ, около 100 пМ, около 125 пМ, около 150 пМ, около 175 пМ, около 200 пМ, около 225 пМ, около 250 пМ, около 275 пМ, около 300 пМ, около 325 пМ, около 350 пМ, около 375 пМ, около 400 пМ, около 425 пМ, около 450 пМ, около 475 пМ, около 500 пМ, около 525 пМ, около 550 пМ, около 575 пМ, около 600 пМ). В некоторых случаях антитело связывает антиген (например, hФРЭС) с Kd от около 75 пМ до около 500 пМ. В некоторых случаях антитело связывает антиген (например, hФРЭС) с Kd от около 75 пМ до около 400 пМ. В некоторых случаях антитело связывает антиген (например, hФРЭС) с Kd от около 75 пМ до около 300 пМ. В некоторых случаях антитело связывает антиген (например, hФРЭС) с Kd от около 75 пМ до около 200 пМ. В некоторых случаях антитело связывает антиген (например, hФРЭС) с Kd от около 75 пМ до около 150 пМ. В некоторых случаях антитело связывает антиген (например, hФРЭС) с Kd от около 75 пМ до около 125 пМ. В некоторых случаях антитело связывает антиген (например, hФРЭС) с Kd от около 75 пМ до около 100 пМ. В некоторых случаях антитело связывает антиген (например, hФРЭС) с Kd около 80 пМ. В некоторых случаях антитело связывает антиген (например, hФРЭС) с Kd около 60 пМ. В некоторых случаях антитело связывает антиген (например, hФРЭС) с Kd около 40 пМ.
125
125
В одном варианте осуществления Kd измеряют с помощью анализа связывания антигена, меченного радиоактивным изотопом (РИА). В одном варианте осуществления РИА выполняли с использованием версии Fab представляющего интерес антитела и его антигена. Например, аффинность связывания Fab в растворе в отношении антигена измеряют, уравновешивая Fab минимальной концентрацией (I)-меченного антигена в присутствии ряда титров немеченого антигена, затем иммобилизуя связанный антиген на покрытом анти-Fab антителом планшете (см., например, Chen et al., J. Moi. В/о/. 293:865-881(1999)). Чтобы определить условия анализа, многолуночные планшеты MICROTITER (Thermo Scientific) покрывали в течение ночи захватывающим антителом против Fab (Cappel Labs) в концентрации 5 мкг/мл в 50 мкМ растворе карбоната натрия (рН 9,6), а затем блокировали 2% (мас./об.) раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) в течение от двух до пяти часов при комнатной температуре (около 23°С). В неадсорбентном планшете (Nunc №269620) смешивали 100 пМ или 26 пМ [I]-антигена с серийными разведениями целевого Fab (например, в соответствии с оценкой анти-ФРЭС антитела, Fab-12, в Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Затем представляющий интерес Fab инкубировали в течение ночи; однако инкубацию можно продолжать в течение более длительного периода (например, около 65 часов), чтобы обеспечить достижение равновесия. Затем смесь переносили на планшет для захвата и инкубировали при комнатной температуре (например, в течение часа). Затем раствор удаляют и планшет промывают восемь раз 0,1% раствором полисорбата 20 (TWEEN-20) в ФСБ. После высыхания планшетов добавляли 150 мкл/лунку сцинтиллятора (MICROSCINT-20™; Packard), а планшеты считывали на счетчике гамма-излучения TOPCOUNT™ (Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого Fab, обеспечивавшие связывание, меньшее или равное 20% от максимального, отбирали для использования в конкурентном анализе связывания.
on
off
off
on
6
-1
-1
В соответствии с другим вариантом осуществления Kd измеряют методом поверхностного плазменного резонанса BIACORE. Например, анализ с использованием BIACORE-2000 или BIACORE-3000 (BIAcore, Inc., Пискатауэй, Нью-Джерси) выполняли при 25°C с чипами СМ5 с иммобилизованным антигеном при 10 единицах ответа (ЕО). В одном варианте осуществления биосенсорные чипы на основе карбоксиметилированного декстрана (СМ5, BIACORE, Inc.) активируются N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид гидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями изготовителя. Антиген разводят 10 мкМ ацетата натрия, рН 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед инжекцией при скорости потока 5 мкл/минута для достижения приблизительно 10 единиц ответа (ЕО) связанного белка. После введения антигена вводили 1 М раствор этаноламина для блокирования непрореагировавших групп. Для измерений кинетики двукратные серии разведении Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) вводили в PBS с 0,05% полисорбат 20 (TWEEN-20™) сурфактантом (PBST) при 25°С при расходе приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (k) и диссоциации (k) рассчитывали как простые однозначные модели связывания Лангмюра (BIACORE Evaluation Software version 3.2) путем одновременной подгонки сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) рассчитывали, как отношение k/k. См., например, Chen et al., J. Mol. В/о/. 293:865-881 (1999). Если скорость превышает 10 М с из вышеописанного способа поверхностного плазмонного резонанса, то скорости прямой реакции могут быть определены с помощью метода затухания флуоресценции, который измеряет повышение или понижение интенсивности флуоресцентного излучения (возбуждение = 295 нм; излучение = 340 нм, 16 нм полоса пропускания) при температуре 25°С 20 нМ антитела против антигена (Fab-форма) в ФСБ, при рН 7,2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена, что измеряется спектрометром, таким как спектрофотометр с устройством остановки потока (Aviv Instruments) или спектрометр SLM-AMINCO™ 8000 серии (ThermoSpectronic) с перемешивающей кюветой.
2. Стабильность антитела
m
agg
В некоторых случаях, антитело, используемое в конъюгатах антител согласно изобретению или их композициях, имеет повышенную стабильность, например, по сравнению с анти-ФРЭС антитела, например, G6.31 (см., например, патент США. №7758859 и публикацию международной заявки №WO 2005/012359, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте). Стабильность антитела может быть определена с использованием любого способа, известного в данной области техники, например, дифференциальной сканирующуей флуориметрии (DSF), циркулярного дихроизма (CD), собственной флуоресценции белка, дифференциальной сканирующей калориметрии, спектроскопии, светорассеяния (например, динамического светорассеяния (DLS) и статического светорассеяния (SLS), хроматографии взаимодействующих молекул (SIC). Анти-ФРЭС антитело может иметь, например, улучшенную температуру плавления (T), температуру агрегации (T), или другие показатели стабильности по сравнению с анти-ФРЭС антителом, например, G6.31.
m
m
m
m
m
m
В некоторых вариантах осуществления антитело, предложенное в данном документе, имеет T, которая больше или равна около 80°С (например, около 81°С, около 82°С, около 83°С, около 84°С, около 85°С, около 86°С, около 87°С, около 88°С, около 89°С, около 90°С, около 91°С, около 92°С или около 93°С). Например, в некоторых случаях анти-ФРЭС антитело имеет Т, которое больше или равно приблизительно 83,5°С (например, около 83,5°С, около 84°С, около 85°С, около 86°С, около 87°С, около 88°С, около 89°С, около 90°С, около 91°С, около 92°С или около 93°С). В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело имеет T примерно 82°С до примерно 92°С (например, около 82°С, около 83°С, около 84°С, около 85°С, около 86°С, около 87°С, около 88°С, около 89°С, около 90°С, около 91°С, или от примерно 92°С). В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело имеет T около 82°С. В некоторых случаях любой из предыдущих значений T анти-ФРЭС антитела определяется с использованием DSF. В некоторых вариантах осуществления значение T анти-ФРЭС антитела определяют, как описано, например, в Примере 1 международной патентной заявки PCT/US2016/053454, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
3. Фрагменты антител
2
2
В определенных вариантах осуществления антитело, предложенное в данном документе, представляет собой фрагмент антитела. Фрагменты антител включают, без ограничений, фрагменты Fab, Fab', Fab-C, Fab'-SH, F(ab'), Fv, и scFv и другие фрагменты, описанные ниже. Обзор некоторых фрагментов антител см. в Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003). Для обзора фрагментов scFv см., например, , in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); см. также WO 93/16185; патенты США №№5571894 и 5587458. Обсуждение фрагментов Fab и F(ab'), содержащих остатки эпитопа связывания рецептора реутилизации и имеющих увеличенное in vivo время полужизни, смотрите в патенте США №5869046.
Диатела представляют собой фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые могут быть двухвалентными или биспецифическими. См., например, ЕР 404097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Триатела и тетратела также описаны в Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003).
Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, которые содержат весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи, или весь или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело (Domantis, Inc., Уолтем, Массачусетс; см., например., патент США №6248516 В1).
Фрагменты антител могут быть получены различными способами, включая, без ограничений, протеолитическое расщепление интактного антитела, а также получение при помощи рекомбинантных клеток-хозяев (например, E. coli или фага), как описано в данном документе.
4. Химерные и гуманизированные антитела
В определенных вариантах осуществления антитело, предложенное в данном документе, представляет собой химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в патенте США №4816567 и в статье Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984). В одном примере химерное антитело содержит нечеловеческую вариабельную область (например, вариабельный домен, полученный от антитела мыши, крысы, хомяка, кролика или отличного от человека примата, например, обезьяны) и константный домен человека. В дополнительном примере, химерное антитело представляет собой антитело с "переключенным классом", у которого класс или подкласс был изменен по сравнению с исходным антителом. Термин «химерные антитела» включает антигенсвязывающие фрагменты таких антител.
В определенных вариантах осуществления химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Как правило, антитело нечеловеческого происхождения гуманизируют с целью снижения иммуногенности для человека, сохраняя при этом специфичность и аффинность исходного антитела нечеловеческого происхождения. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или более вариабельных доменов, в которых HVR, например, CDR (или их фрагменты) получают из нечеловеческого антитела, и FR (или их фрагменты) получают из последовательностей антитела человека. В некоторых случаях гуманизированное антитело также содержит по меньшей мере фрагмент константной области человека. В некоторых вариантах осуществления некоторые FR остатки гуманизированного антитела заменены соответствующими остатками из антитела нечеловеческого происхождения (например, антитела, из которого получены остатки HVR), например, для восстановления или улучшения специфичности антитела или аффинности.
Гуманизированные антитела и способы их получения рассмотрены, например, в Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), и дополнительно описаны, например, в Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); патентах США №5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (где описано прививание определяющей специфичность области (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (где описано "изменение поверхности"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (где описана "перетасовка FR"); и Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) и Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (где описан подход "направленного отбора" к перетасовке FR).
Человеческие каркасные области, которые могут быть использованы для гуманизации, включают, но не ограничиваются этими, каркасные области, выбранные с использованием способа «наилучшего соответствия» (см., например, Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993)); каркасные области, полученные из консенсусной последовательности антител человека конкретной подгруппы вариабельных областей легкой или тяжелой цепи (см., например, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); and Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)); зрелые (содержащие соматические мутации) каркасные области человека или эмбриональные каркасные области человека (см., например, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); и каркасные области, полученные в результате скрининга библиотек FR (см., например, Васа et al. J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) и Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
5. Человеческие антитела
В определенных вариантах осуществления предложенное в данном документе антитело представляет собой человеческое антитело. Человеческие антитела могут быть получены с использованием различных способов, известных в данной области техники. Человеческие антитела описаны в общих чертах у van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
Человеческие антитела можно получить путем введения иммуногена трансгенному животному, модифицированному с целью продукции интактных человеческих антител или интактных антител с человеческими вариабельными областями в ответ на антигенную стимуляцию. Такие животные, как правило, содержат все или часть локусов иммуноглобулина человека, которые замещают эндогенные локусы иммуноглобулина или которые находятся во внехромосомном пространстве или случайным образом интегрированы в хромосомы животного. Как правило, у таких трансгенных мышей инактивированы эндогенные локусы иммуноглобулинов. Обзор способов получения антител человека из трансгенных животных см. в Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Также см., например, патенты США №№6075181 и 6150584, описывающие технологию XENOMOUSE™; патент США №5770429, описывающий технологию HUMAB; патент США №7041870, описывающий технологию K-М MOUSE, и публикацию патентной заявки США № US 2007/0061900, описывающую технологию VELOCIMOUSE). Человеческие вариабельные области из интактных антител, образованных такими животными, могут дополнительно модифицироваться, например, путем объединения с разными человеческими консервативными областями.
Человеческие антитела также можно получать при помощи способов на основе гибридом. Были описаны клеточные линии человеческой миеломы и мышино-человеческой гетеромиеломы для получения человеческих моноклональных антител. (См, например, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeuret al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); и Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Антитела человека, полученные с использованием технологии человеческой B-клеточной гибридомы, описаны в Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Дополнительные способы включают способы, описанные, например, в патенте США №7189826 (описывающая продукцию моноклональных антител IgM человека из гибридомных клеточных линий) и в статье Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (описывающей гибридомы типа человек-человек). Технология с использованием человеческих гибридом (технология Trioma) также описана в Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) and Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).
Человеческие антитела также можно получать путем выделения последовательностей вариабельного домена клона Fv из библиотек фагового дисплея человеческого происхождения. Такие последовательности вариабельного домена можно затем объединять с требуемым константным доменом человека. Методики отбора человеческих антител из библиотек антител описаны ниже.
6. Антитела, полученные из библиотек
Антитела согласно изобретению могут быть выделены путем скрининга комбинаторных библиотек антител с необходимой активностью или свойствами. Например, в данной области техники известно множество способов получения библиотек фагового дисплея и скрининга таких библиотек в отношении антител, обладающих необходимыми связывающими характеристиками. Такие способы рассмотрены, например, в публикации Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001), и дополнительно описаны, например, в статьях McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597, (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mot. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); и Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).
В некоторых методах фагового дисплея репертуары генов VH и VL отдельно клонируют при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) и повторно комбинируют случайным образом в фаговых библиотеках, которые затем можно подвергнуть скринингу на антигенсвязывающий фаг, как описано в Winter et al. Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Фаг, как правило, представляет фрагменты антител, как одноцепочечные фрагменты Fv (scFv), так и фрагменты Fab. Библиотеки из иммунизированных источников позволяют получить антитела с высокой аффинностью к иммуногену без необходимости конструирования гибридом. В качестве альтернативы, можно клонировать наивный репертуар (например, от человека) для получения единого источника антител к широкому спектру чужеродных антигенов и аутоантигенов без иммунизации, как описано в статье Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Наконец, наивные библиотеки можно также получить путем синтеза, клонируя сегменты V-генов стволовых клеток, не подвергавшиеся реаранжировке, и используя ПЦР-праймеры, содержащие случайные последовательности, для кодирования гипервариабельной области CDR3 и осуществления реаранжировки in vitro, как описано в статье Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Патентные публикации, в которых описаны фаговые библиотеки антител человека, включают, например: патент США №5750373, и публикации патентов США №№2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, и 2009/0002360.
Антитела или фрагменты антител могут быть получены из фаговых библиотек, как описано в международной патентной заявке PCT/US2016/053454.
Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек человеческих антител, считаются в данном документе человеческими антителами или фрагментами человеческих антител.
7. Мультиспецифические антитела
В некоторых вариантах осуществления антитело, предложенное в данном документе, представляет собой мультиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело. Мультиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые имеют специфичности связывания в отношении по меньшей мере двух различных сайтов. В некоторых вариантах осуществления одна из специфичностей связывания для ФРЭС и другие для любого другого антигена (например, второй биологической молекулы, например, интерлейкина-1 бета (ИЛ-1β); интерлейкина-6 (ИЛ-6); рецептора интерлейкина-6 (ИЛ-GR); интерлейкина-13 (ИЛ-13); рецептора ИЛ-13 (ИЛ-13R); ТцФР (например, PDGF-BB); ангиопоэтина; ангиопоэтина-2 (Ang2); Tie2; S1P; интегринов αvβ3, αvβ5, и α5β1; бетацеллюлина; апелина/APJ; эритропоэтина; фактора D комплемента; ФНО-α; HtrA1; рецептора ФРЭС (например, ФРЭСР1, ФРЭСР2, ФРЭСР3, мембраносвязанного рецептора ФРЭС (mbФРЭСР), или растворимого рецептора ФРЭС (sФРЭСР)); ST-2-рецептора; и белков, генетически связанных с риском возрастной макулярной дегенерации (ВМД), таких как компоненты пути комплемента С2, фактор В, фактор Н, CFHR3, C3b, С5, С5а, и С3а; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; интерлейкин-8 (ИЛ-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; СЕТР; LIPC; COL10A1; и TNFRSF10A). Соответственно, биспецифические антитела могут иметь специфичность связывания в отношении ФРЭС и ИЛ-1β; ФРЭС и ИЛ-6; ФРЭС и ИЛ-6Р; ФРЭС и ИЛ-13; ФРЭС и ИЛ-13R; ФРЭС и ТцФР (например, PDGF-BB); ФРЭС и ангиопоэтина; ФРЭС и Ang2; ФРЭС и Tie2; ФРЭС и S1P; ФРЭС и интегрина αvβ3; ФРЭС и интегрина αvβ5; ФРЭС и интегрина α5β1; ФРЭС и бетацеллюлина; ФРЭС и апелина/APJ; ФРЭС и эритропоэтина; ФРЭС и фактора D комплемента; ФРЭС и ФНО-α; ФРЭС и HtrA1; ФРЭС и рецептора ФРЭС (например, ФРЭСР1, ФРЭСР2, ФРЭСР3, mbФРЭСР, или sФРЭСР); ФРЭС и ST-2-рецептора; ФРЭС и С2; ФРЭС и фактора В; ФРЭС и фактора Н; ФРЭС и CFHR3; ФРЭС и C3b; ФРЭС и С5; ФРЭС и С5а; ФРЭС и С3а; ФРЭС и ARMS2; ФРЭС и TIMP3; ФРЭС и HLA; ФРЭС и ИЛ-8; ФРЭС и CX3CR1; ФРЭС и TLR3; ФРЭС и TLR4; ФРЭС и СЕТР; ФРЭС и LIPC; ФРЭС и COL10A1; или ФРЭС и TNFRSF10A. В некоторых вариантах осуществления биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами ФРЭС. Биспецифические антитела также могут применяться для перемещения цитотоксических агентов в клетки, которые экспрессируют ФРЭС. Биспецифические антитела могут быть получены как полноразмерные антитела или как фрагменты антител (например, фрагменты Fab, Fab', или Fab-C).
В некоторых случаях, биспецифическое антитело представляет собой биспецифическое анти-ФРЭС/анти-ангиопоетин 2 (Ang2) антитело, раскрытое в заявке на патент США № US 2014/0017244, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Например, анти-ФРЭС/анти-Ang2 биспецифическое антитело может содержать первый связывающий домен, который связывает ФРЭС (например, любое из анти-ФРЭС антител, описанных в данном документе), и второй связывающий домен, который связывает ANG2, который содержит (a) HVR -Н1, содержащий аминокислотную последовательность GYYMH (SEQ ID NO: 62); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WINPNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 63); (с) HVR-Н3, содержащую аминокислотную последовательность SPNPYYYDSSGYYYPGAFDI (SEQ ID NO: 64); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность GGNNIGSKSVH (SEQ ID NO: 65); (e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность DDSDRPS (SEQ ID: 66); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QVWDSSSDHWV (SEQ ID NO: 67), или комбинации одной или более из указанных выше HVR и одного или более их вариантов, имеющих по меньшей мере около 80% идентичность последовательности (например, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность) с любой из SEQ ID NO: 62-67.
В некоторых случаях, анти-ФРЭС/анти-Ang2 биспецифическое антитело может содержать первый связывающий домен, который связывает ФРЭС (например, любое из антител анти-ФРЭС, описанных в настоящем документе), и второй связывающий домен, который связывает Ang2, и содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности (например, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичность последовательности) с, или последовательность, SEQ ID NO: 68, (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% (например, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичность последовательности) с, или последовательность, SEQ ID NO: 69; или (с) домен VH как в (а) и домен VL как в (b). В некоторых случаях анти-ФРЭС/анти-Ang2 биспецифическое антитело может содержать первый связывающий домен, который связывает ФРЭС (например, любое из антител анти-ФРЭС, описанных в данном документе), и второй связывающий домен, который специфически связываться с Ang2, в котором второй связывающий домен представляет собой любой антитело-связывающий домен, описанный в публикации международной патентной заявки № WO 2010/069532, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме, или его вариант.
В других случаях анти-ФРЭС/анти-Ang2 биспецифическое антитело представляет собой любое анти-ФРЭС/анти-Ang2 биспецифическое антитело, описанное в публикации международной патентной заявки № WO 2016/073157.
В некоторых случаях биспецифические антитело представляет собой биспецифическое анти-ФРЭС/анти-ИЛ-6 антитело. В некоторых случаях анти-ФРЭС/анти-ИЛ-6 антитело может содержать первый связывающий домен, который связывает ФРЭС (например, любое из анти-ФРЭС антитела, описанные в данном документе), и второй связывающий домен, который связывает ИЛ-6. Второй связывающий домен может представлять собой связывающий домен любого анти-ИЛ-6 антитела, известного в данной области техники, например, EBI-031 (Eleven Biotherapeutics; см., например, WO 2016/073890, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме), силтуксимаб (SYLVANT), олокизумаб, клазакизумаб, сирукумаб, елсилимомаб, герилимзумаб, OPR-003, MEDI-5117, PF-04236921, или его вариант.
В некоторых случаях биспецифические антитело представляет собой биспецифическое анти-ФРЭС/анти-ИЛ-6R антитело. В некоторых случаях анти-ФРЭС/анти-ИЛ-6R антитело может содержать первый связывающий домен, который связывает ФРЭС (например, любое из анти-ФРЭС антитела, описанные в данном документе), и второй связывающий домен, который связывает ИЛ-6R. Второй связывающий домен может представлять собой любой связывающий домен анти-ИЛ-6R антитела, известный в данной области техники, например, тоцилизумаб (ACTEMRA) (см., например, WO 1992/019579, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме), сарилумаб, вобарилизумаб (ALX-0061), SA-237, или его вариант.
Методики получения мультиспецифических антител включают, но не ограничиваются ими, рекомбинантную коэкспрессию двух пар тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулинов, имеющих разную специфичность (см. Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, и Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), и метод конструирования «выступ-во-впадину» (см., например, в патенте США №5731168). Мультиспецифические антитела также могут быть получены путем конструирования с использованием эффекта электростатического взаимодействия для получения молекул Fc-гетеродимерных антител (WO 2009/089004 А1); путем перекрестного связывания двух или более антител или фрагментов (см., например, патент США №4676980, и Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); с использованием лейциновых застежек для создания биспецифических антител (см., например, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); с использованием технологии «диател» для получения фрагментов биспецифических антител (см., например, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); и с использованием одноцепочечных Fv (sFv) димеров (см., например, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); и получения триспецифических антител, как описано, например, в Tutt et al., J. immunoi. 147:60 (1991).
Сконструированные антитела с тремя или более функциональными антигенсвязывающими сайтами, включая «антитела-осьминоги», также включены в данный документ (см., например, US 2006/0025576A1).
В данном документе антитело или фрагмент также включает "FAb двойного действия" или "DAF", который содержит сайт связывания антигена, который связывается с ФРЭС а также другим, отличающимся антигеном (см., например, US 2008/0069820).
8. Варианты антител
В некоторых вариантах осуществления рассматриваются варианты аминокислотных последовательностей (например, варианты антител, включающие одно или более изменений аминокислотных остатков) антител, представленных в данном документе. Например, может быть желательно улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотных последовательностей антитела можно получить путем внесения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или вставки и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Для получения конечного конструкта можно выполнить любые комбинации делеции, инсерций и замен, при условии, что конечный конструкт обладает требуемыми характеристиками, например, связыванием антигена.
а) Варианты замен, вставок и делеций
В некоторых вариантах осуществления варианты антител предусмотрены одна или более аминокислотных замен. Сайты, представляющие интерес для мутагенеза с заменами, включают HVR и FR. Консервативные замены показаны в Таблице 1 под заголовком «предпочтительные замены». Более существенные изменения представлены в Таблице 1 под заголовком «иллюстративные замены», и как дополнительно описано ниже со ссылкой на классы аминокислотных боковых цепей. Аминокислотные замены можно вносить в представляющее интерес антитело, и проводить скрининг полученных продуктов в отношении необходимой активности, например, сохранения/улучшения связывания антигена, снижения иммуногенности или улучшения АЗКЦ или КЗЦ.
Аминокислоты можно поделить на группы в соответствии с общими свойствами боковых цепей:
(1) гидрофобные: Норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтрально гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) кислотные: Asp, Glu;
(4) основные: His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Неконсервативные замены приводят к замене члена одного из этих классов на член другого класса.
Один тип заменяемого варианта включает замену одного или более остатков гипервариабельной области, и/или остатков FR исходного антитела (например, гуманизированное или человеческое антитело). Как правило, полученный вариант(ы), выбранный для дальнейшего изучения, будет иметь модификации (например, улучшения) определенных биологических свойств (например, повышенную аффинность, повышенную стабильность, повышенную экспрессию, измененную pI, и/или пониженную иммуногенность) по сравнению с исходным антителом, и/или будет иметь по существу сохраненные определенные биологические свойства исходного антитела. Иллюстративным замещающим вариантом является антитело с созревшей аффинностью, которое традиционно можно получить, например, применяя методы созревания на основе фагового дисплея, такие как те, что описаны в данном документе. Вкратце один или более аминокислотных остатков HVR подвергают мутации и вариантные антитела экспонируют на поверхности фага и проводят скрининг в отношении конкретного вида биологической активности (например, аффинности связывания).
Изменения (например, замещения) могут быть сделаны в HVR, например, для улучшения аффинности антитела. Такие изменения могут быть произведены в «горячих точках» HVR, т.е. остатках, кодируемых кодонами, которые подвергаются мутации с высокой частотой во время процесса соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol, 207:179-196 (2008)), и/или остатках, которые контактируют с антигеном, с тестированием полученного варианта VH или VL на аффинность связывания. Созревание аффинности путем конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек было описано, например, в Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). В некоторых вариантах осуществления аффинного созревания, многообразие вводится в вариабельные гены, выбранные для созревания любым из множества способов (например, ПЦР пониженной точности, перестановкой цепи или олигонуклеотид-направленным мутагенезом). Затем создают вторичную библиотеку. Затем проводят скрининг библиотеки для идентификации любых вариантов антител с требуемой аффинностью. Другой способ для внесения разнообразия включает подходы, направленные на HVR, в которых несколько аминокислотных остатков HVR (4-6 аминокислотных остатков подряд) являются рандомизированными. Остатки HVR, вовлеченные в связывание антигена, могут быть специфически идентифицированы, например, с использованием аланин-сканирующего мутагенеза или моделирования. Мишенями, в частности, являются CDR-H3 и CDR-L3.
В некоторых вариантах осуществления замены, вставки или делеции могут совершаться внутри одной или более HVR при условии, что такие изменения существенно не снижают способность антитела связывать антиген. Например, в HVR можно проводить консервативные замены (например, консервативные замены, предложенные в данном документе), которые существенно не снижают аффинность связывания. Такие изменения могут быть, например, за пределами остатков, контактирующих с антигеном, в HVR. В некоторых вариантах осуществления в вариантах последовательностей VH и VL, приведенных ранее, каждый HVR или не изменен, или содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.
В некоторых вариантах осуществления замены, вставки или делеции могут совершаться внутри одной или более FR при условии, что такие изменения существенно не снижают способность антитела связывать антиген. Такие изменения могут, например, улучшить аффинность и/или стабильность антитела (например, как оценено при помощи повышенной температуры плавления).
Удобный способ выявления остатков или областей антитела, которые могут быть мишенями для мутагенеза, называется «аланин-сканирующим мутагенезом», описанным в Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. В данном способе аминокислотный остаток или группу целевых аминокислотных остатков (например, заряженные аминокислотные остатки, такие как Arg, Asp, His, Lys и Glu) идентифицируют и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином) для определения влияния на взаимодействие антитела с антигеном. Дополнительные замены могут быть внесены в те расположения аминокислот, которые проявляли функциональную чувствительность к исходным заменам. В альтернативном или дополнительном варианте используют кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и расположенные рядом остатки можно использовать в качестве мишеней или удалять из кандидатов для замены. Варианты могут быть скринированы для определения наличия в них желаемых свойств.
Аминокислотные вставки включают амино- и/или карбокси-концевые слияния с диапазоном длины от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки одного или более аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым остатком метионила. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают слияние с N- или С-концом антитела с ферментом (например, для терапии ADEPT) или полипептидом, который увеличивает время полужизни в сыворотке крови.
b) Варианты аликозилирования
В некоторых вариантах осуществления антитело, предложенное в данном документе, изменено с целью увеличения или уменьшения степени гликозилирования антитела. Добавление или удаление сайтов гликозилирования в антителе легко осуществить путем изменения аминокислотной последовательности, приводящего к созданию или удалению одного или более сайтов гликозилирования.
Если антитело содержит область Fc можно изменять присоединенный к ней углевод. Нативные антитела, вырабатываемые клетками млекопитающих, как правило, содержат разветвленный, биантеннальный олигосахарид, который в общем случае присоединен посредством N-связи к Asn297 домена СН2 области Fc. См., например, Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997). Олигосахарид может содержать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетил глюкоза мин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стволе» биантеннальной олигосахаридной структуры. В некоторых вариантах осуществления можно выполнить модификации олигосахарида в антителе согласно изобретению с целью создания вариантов антител с определенными улучшенными свойствами.
В одном варианте осуществления предложены варианты антител, в которых углеводная структура, присоединенная (или непосредственно, или опосредованно) к области Fc, имеет сниженное содержание фукозы. Например, количество фукозы в таком антителе может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Количество фукозы определяют, рассчитывая среднее количество фукозы в сахарной цепи Asn297 относительно общего количества гликоструктур, присоединенных к Asn297 (например, комплексных, гибридных или содержащих большое количество маннозы структур), согласно данным масс-спектрометрии MALDI-TOF, как описано, например, в WO 2008/077546. Asn297 относится к остатку аспарагина, расположенному в положении 297 в области Fc (согласно нумерации EU остатков области Fc); при этом Asn297 также может быть расположен на около ±3 аминокислот выше или ниже положения 297, т.е. между положениями 294 и 300, вследствие незначительных вариаций последовательностей в антителах. Такие фукозилированные варианты могут обладать улучшенной функцией АЗКЦ. См., например, патенты США №№ US 2003/0157108; US 2004/0093621. Примеры публикаций, связанных с «дефукозилированными» или «фукозодефицитными» вариантами антитела включают: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; W02005/053742; W02002/031140; Okazaki et al, J. Mol. В/о/. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Примеры линий клеток, способных вырабатывать дефукозилированные антитела, включают клетки СНО Lec13 с дефицитом фукозилирования белка (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); заявка на патент США № US 2003/0157108 А1, Presta, L, и WO 2004/056312 А1, Adams et al., особенно в Примере 11), и нокаутные линии клеток, такие как нокаутные клетки СНО по гену альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8, (см., например, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); и WO 2003/085107).
Кроме того, предлагаются варианты антител с олигосахаридами, разделенными пополам, например, в которых биантенный олигосахарид, присоединенный к области Fc антитела, разделен пополам с помощью GlcNAc. Такие варианты антител могут обладать сниженным уровнем фукозилирования и/или улучшенной функцией АЗКЦ. Примеры таких вариантов антител описаны, например, в заявке WO 2003/011878; в патенте США №6602684; и US 2005/0123546 (Umana et al.). Кроме того, предлагаются варианты антител, содержащие по меньшей мере один остаток галактозы в составе олигосахарида, присоединенного к области Fc. Такие варианты антител могут обладать улучшенной функцией КЗЦ. Такие варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087; WO 1998/58964; и WO 1999/22764 (Raju, S.).
с) Варианты области Fc
В определенных вариантах осуществления в область Fc антитела, предложенного в данном документе, могут быть введены одна или более аминокислотных модификаций, тем самым обеспечивая создание варианта области Fc. Вариант области Fc может содержать последовательность человеческой области Fc (например, человеческой области Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), содержащую аминокислотное изменение (например, замену) в одном или более аминокислотных положениях. В определенных вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает вариант антитела, который обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его подходящим кандидатом для практических применений, в которых важное значение имеет период полужизни антитела in vivo, хотя отдельные эффекторные функции (такие как комплемент и АЗКЦ) не являются необходимыми или являются вредными. Цитотоксические анализы могут быть проведены in vitro и/или in vivo для подтверждения восстановления/ослабления активности КЗЦ и/или АЗКЦ. Например, чтобы убедиться в отсутствии связывания антитела с FcγR (и, следовательно, отсутствии активности АЗКЦ) при сохранении способности связывания с FcRn, можно выполнить анализы связывания с Fc-рецептором (FcR). Первичные клетки для опосредования АЗКЦ, NK клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гемо поэтических клетках суммирована в таблице 3 на странице 464 в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991).
Неограничивающие примеры анализов in vitro для оценки активности АЗКЦ представляющей интерес молекулы, описаны в патенте США №5500362 (см., например, Hellstrom et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) и Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); патент США. №5821337; и Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). В альтернативном варианте могут быть использованы нерадиоактивные методы анализа (см., например, ACTI™ нерадиоактивный анализ цитотоксичности для проточной цитометрии (CellTechnology, Inc. Маунтин-Вью, Калифорния; и CytoTox 96 нерадиоактивный анализ цитотоксичности (Promega, Мадисон, Висконсин). Эффекторные клетки, пригодные для такого анализа, включают мононуклеары периферической крови (МКПК) и натуральные клетки-киллеры (NK). В альтернативном или дополнительном варианте активность АЗКЦ представляющей интерес молекулы можно оценить in vivo, например, на животной модели, как раскрыто в Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Также можно проводить анализ связывания C1q, чтобы подтвердить, что антитело неспособно связывать C1q и, следовательно, у него отсутствует активность КЗЦ. См., например, анализ связывания C1q и С3с методом ИФА в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента может быть выполнен анализ КЗЦ (см., например, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg et al., Blood 101:1045-1052 (2003); и Cragg et al., Blood 103:2738-2743 (2004)). Определение связывания с FcRn и in vivo клиренса/времени полужизни также может быть выполнено с использованием способов, известных в данной области техники (см., например, Petkova et al., Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).
Антитела со сниженной эффекторной функцией включают те, которые содержат замены одного или более из остатков 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 области Fc (патенты США №6737056). Такие мутанты Fc включают мутантов Fc с заменами в двух или более аминокислотных положениях 265, 269, 270, 297 и 327, в том числе так называемые мутанты Fc "DANA" с заменой остатков 265 и 297 на аланин (патент США 7332581).
Описаны некоторые модификации антитела с улучшенным или уменьшенным связыванием с FcR. (См., например, патент США №6737056;
Международную патентную заявку WO 2004/056312 и публикацию Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)).
В некоторых вариантах осуществления вариант антитела содержит область Fc с одной или более аминокислотными заменами, которые улучшают АЗКЦ, например, с заменами в положениях 298, 333 и/или 334 области Fc (нумерация остатков по системе EU).
В некоторых вариантах осуществления изменения сделаны в Fc области, что привело к изменению (то есть или к улучшению, или к ухудшению) связывания C1q и/или комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ), например, как описано в патенте США №6194551, WO 99/51642, и Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184(2000).
Антитела с увеличенным временем полужизни и улучшенным связыванием с неонатальным рецептором Fc (FcRn), который отвечает за перенос материнских IgG к плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kirn et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), описаны в US 2005/0014934 A1 (Hinton et al.). Данные антитела содержат область Fc с одной или более заменами в ней, которые улучшают связывание области Fc с FcRn. Такие варианты Fc включают варианты с заменами одного или более остатков области Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, замену аминокислотного остатка 434 в области Fc (патент США №7371826). См. также публикацию Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); патент США №5648260; патент США №5624821; и международную патентную заявку WO 94/29351 в отношении других примеров вариантов Fc области.
d) Варианты антител, сконструированные введением цисте и на
Изобретение обеспечивает антитела, сконструированные введением цистеина, в которых одну или более аминокислот антитела дикого типа или исходного антитела (например, анти-ФРЭС антитела, включая любые анти-ФРЭС антитела, описанные в данном документе) заменяют (т.е., «замещают» или «подвергают мутации») аминокислотой цистеином (то есть, «сконструированным цистеином»). Любые формы антитела могут быть сконструированы таким образом, т.е. мутированы. Так, например, исходное моноклональное антитело может быть сконструировано, чтобы образовать «антитело THIOMAB™». Одним из примеров антитела THIOMAB™ представляет собой фрагмент антитела (т.е. Fab), который имеет сконструированный цистеин. Это антитело Fab THIOMAB ™ может упоминаться как «тио-Fab». Следует отметить, что мутация одного сайта дает единственный сконструированный остаток цистеина в тио-Fab, в то время как мутация одного сайта дает два сконструированных остатка цистеина в антителе THIOMAB™, из-за димерной природы антитела IgG.
Мутанты со сконструированными остатками цистеина (Cys) могут быть оценены на реакционную способность вновь введенных тиольных групп сконструированного цистеина. Значение реакционной способности тиола является относительным, численным значением в диапазоне от 0 до 1,0 и может быть измерено для любого антитела, сконструированного введением цистеина. Значения реакционной способности тиола антител, сконструированных введением цистеина, согласно изобретению, находятся в диапазоне от 0,0 до 1,0. Как правило, значения реакционной способности тиола антител, сконструированных введением цистеина, согласно изобретению, находятся в диапазоне от 0,1 до 1,0. В определенных вариантах осуществления значения реакционной способности тиола согласно изобретению находятся в диапазоне от 0,0 до 0,1, от 0,1 до 0,5, от 0,1 до 0,6, от 0,1 до 0,7, от 0,1 до 0,8, от 0,1 до 0,9, или от 0,1 до 1,0. В определенных вариантах осуществления значения реакционной способности тиола согласно изобретению находятся в диапазоне от 0,2 до 1,0, от 0,3 до 1,0, от 0,4 до 1,0, от 0,5 до 1,0, от 0,6 до 1,0, от 0,7 до 1,0, или от 0,8 до 1,0. В определенных вариантах осуществления значения реакционной способности тиола антител, сконструированных введением цистеина, согласно изобретению находятся в диапазоне от 0,6 до 1,0. В определенных вариантах осуществления значения реакционной способности тиола антител, сконструированных введением цистеина, согласно изобретению находятся в диапазоне от 0,7 до 1,0. В определенных вариантах осуществления значения реакционной способности тиола антител, сконструированных введением цистеина, согласно изобретению находятся в диапазоне от 0,8 до 10. В определенных вариантах осуществления значения реакционной способности тиола антител, сконструированных введением цистеина, согласно изобретению находятся в диапазоне от 0,5 до 0,8. В определенных вариантах осуществления значения реакционной способности тиола антител, сконструированных введением цистеина, согласно изобретению находятся в диапазоне от 0,5 до 0,9. В некоторых вариантах осуществления значения реакционной способности тиола антител, сконструированных введением цистеина, согласно изобретению находятся в диапазоне от 0,5 до 0,7. В определенных вариантах осуществления значения реакционной способности тиола антител, сконструированных введением цистеина, согласно изобретению, находятся в диапазоне от 0,5 до 1,0.
Способы конструирования, выбора и получения по изобретению делают возможным получение антител, сконструированных введением цистеина, которые являются реакционноспособными с электрофильной функциональностью. Кроме того, эти способы делают возможным получение соединений конъюгатов антител, таких как, например, конъюгаты антитело-полимер с полимерными фрагментами, конъюгированными в заданных, сконструированных, селективных сайтах. Реакционноспособные цистеиновые остатки на поверхности антитела делают возможным специфичное конъюгирование полимера с помощью тиольной реакционноспособной группы, такой как малеимид или галогенацетил. Нуклеофильная реакционноспособность тиольной функциональной группы остатка Cys к малеимидной группе примерно в 1000 раз выше по сравнению с любой другой аминокислотной функциональной группой в белке, такой как аминогруппа остатков лизина или М-концевая аминогруппа. Тиол-специфическая функциональная группа в иодацетильном и малеимидном реагентах может реагировать с аминогруппами, но требуется более высокий рН (>9,0) и более длительное время реакции (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London).
Антитело, сконструированное введением цистеина, согласно изобретению предпочтительно сохраняет антигенсвязывающую способность их аналогов исходного антитела дикого типа. Таким образом, антитела, сконструированные введением цистеина, способны предпочтительно специфично связываться с антигенами. Иллюстративные, неограничивающие антигены включают ФРЭС; ИЛ-1β; ИЛ-6; ИЛ-6R; ИЛ-13; ИЛ-13R; ТцФР (например, PDGF-BB); ангиопоэтин; ангиопоэтин 2 (Ang2); Tie2; S1P; интегрины αvβ3, αvβ5, и α5β1; бетацеллюлин; апелин/APJ; эритропоэтин; фактор D комплемента; ФНО-α; HtrA1; рецептор ФРЭС (например, ФРЭСР1, ФРЭСР2, ФРЭСР3, mbФРЭСР, или sФPЭCP); ST-2-рецептор; и белок, генетически связанный с риском ВМД (например, компоненты пути комплемента С2, фактор В, фактор Н, CFHR3, C3b, С5, С5а, и С3а; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; ИЛ-8; CX3CR1; TLR3; TLR4; СЕТР; LIPC; COL10А1; и TNFRSF10А).
Любое из описанных в данном документе антител (например, любое из анти-ФРЭС антител, описанных выше), может представлять собой исходное антитело, используемое для создания антитела, сконструированное введением цистеина. Иллюстративные способы, описанные в данном документе, могут быть применены в целом для идентификации и получения антител путем применения этапов конструирования и скрининга, описанных в данном документе.
Антитела, сконструированные введением цистеина, согласно изобретению могут быть сайт-специфически и эффективно соединены с реакционноспособным к тиолу реагентом. Реакционноспособный к тиолу реагент может быть, например, агентом, изменяющим клиренс, таким как полимер (например, полимер ГК или различными изомерами полиэтиленгликоля), пептидом, который связывается с третьим компонентом, или другим углеводлм или липофильным агентом, многофункциональным линкерным реагентом, меченым реагентом захвата, т.е. аффинности (например биотин-линкерным реагентом), меткой детекции (например, флуорофорным реагентом), твердофазным иммобилизирующим реагентом (например, SEPHAROSE™, полистиролом или стеклом) или промежуточным соединением лекарственное средство-линкер. Одним примером реакционноспособного к тиолу реагента является N-этил-малеимид (NEM). В иллюстративном варианте осуществления реакция антитела THIOMAB™ с биотин-линкерным реагентом обеспечивает биотилинированное антитело THIOMAB™, посредством чего могут быть выявлены и измерены наличие и реакционноспособность сконструированного остатка цистеина. Реакция антитела THIOMAB™ с многофункциональным линкерным реагентом обеспечивает антитело THIOMAB™ с функционализированным линкером, который далее может реагировать с полимером, реагентом фрагмента лекарственного средства или другой меткой. Реакция антитела THIOMAB™ с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер обеспечивает конъюгат лекарственного средства с антителом THIOMAB™. В некоторых вариантах осуществления антитело THIOMAB™ представляет собой тио-Fab.
Антитело, сконструированное введением цистеина, может быть конъюгировано с реакционноспособными к тиолу агентами, в которых реакционноспособная группа представляет собой, например, малеимид, иодацетамид, пиридилдисульфид или другой реакционноспособный к тиолу партнер по конъюгированию (см., например, Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671). Партнер может представлять собой цитотоксический агент (например, токсин, такой как доксорубицин или коклюшный токсин), флуорофоры, такие как флуоресцентный краситель, подобные флуоресцеину или родамину, хелатирующий агент для металлов, использующихся в диагностической визуализации или радиотерапии, пептидиловая или непептидиловая метка или метка детекции, или агент, изменяющий клиренс, такой как полимер (например, полимер ГК или различные изомеры полиэтиленгликоля), пептид, который связывается с третьим компонентом, или другой углевод или липофильный агент.
Анализ PHESELECTOR (ИФА фага для отбора реакционноспособных тиолов) делает возможным определение групп реакционноспособных цистеиновых групп в антителах в фаговом формате ИФА. См. патент США №7521541 и публикацию патента США №20110301334, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. В частности, анализ PHESESLECTOR включает процесс нанесения покрытия представляющего интерес белка (например, антитела) на поверхности, с последующим инкубированием с фаговыми частицами, а затем с вторичным антителом, меченным пероксидазой хрена (HRP), с определением оптической плотности. Можно провести скрининг мутантных белков, экспонируемых фагом, быстрым, надежным, высокопроизводительным методом. Библиотеки антител, сконструированных введением цистеина, могут быть созданы и подвергнуты отбору по связывающей активности, используя тот же подход, что и для идентификации соответствующего включения реакционноспосбных сайтов свободного Суз из случайных белково-фаговых библиотек антител или других белков. Эта методика включает реагирование цистеина мутантных белков, экспонируемых фагом, с аффинным реагентом или репортерной группой, которая также является реакционноспособной ктиольной группе.
10
В определенных вариантах осуществления анализ PHESELECTOR включает следующие стадии: (1) бычий сывороточный альбумин (БСА), часть или весь целевой белок (например, ФРЭС), и стрептавидин (100 мкл 2 мкг/мл) пот отдельности наносили на 96-луночные планшеты MAXISORB; (2) после блокирования 0,5% твином-20 (в ФСБ), биотинилированное и небиотинилированное антитело THIOMAB™-фаг (2×10 фаговых частиц), инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре; (3) инкубация с фагом с последующей инкубацией с вторичным антителом, меченным HRP, (антитело к белку оболочки фага М13, белку pVIII); (4) стандартные реакции HRP проводят и измеряют поглощение при 450 нм; (5) реакционную способность тиола измеряют путем расчета отношения между ОП450 для стрептавидина/ОП450 для целевого белка (например, ФРЭС), таким образом, что значение реакционной способности тиола 1 указывает на полное биотинилирование тиола цистеина.
ДНК, кодирующую антитело, сконструированное введением цистеина, легко выделяют и сиквенируют с использованием общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Клетки гибридомы служат в качестве источника такой ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в векторы экспрессии, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки E.coli, обезьяньи клетки COS, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки НЕK293Т, или другие клетки-хозяева млекопитающих, например, клетки миеломы (патент США №5807715; US 2005/0048572; US 2004/0229310), которые иным способом не продуцируют белок антитела, для достижения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. В большинстве случаев полученные антитела, сконструированные введением цистеина, сходны с антителами дикого типа.
После конструирования и выбора антитела, сконструированные введением цистеина, например, антитела THIOMAB™, с высокой реакционной способностью непарных остатков Cys, могут быть получены посредством: (i) экспрессии в бактериальной, например E. coli, системе или системе культуры клеток млекопитающего (WO 01/00245), например, в клетках яичника китайского хомячка (СНО) или клетки НЕK293 (например, клетки НЕK293Т); и (ii) очистки с использованием общих технологий очистки белков (например, Lowman et al (1991) J. Biol. Chem. 266(17):10982-10988). В конкретных вариантах осуществления антитела THIOMAB™ экспрессируются в системе экспрессии клеток млекопитающих. В конкретных вариантах осуществления система экспрессии клеток млекопитающих представляет собой клетки НЕK293Т.
Структурные положения сконструированных остатков Cys тяжелой и легкой цепей пронумерованы в соответствии с системой последовательной нумерации. Эта система последовательной нумерации согласована с системой нумерации по Кабату (Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) для антитела 4D5 на Фиг. 13А и 13В. При использовании системы нумерации по Кабату, фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее или дополнительное количество аминокислот, что связано с укорочением или вставками в FR или CDR вариабельного домена. Вариантные сайты легкой цепи и вариантные сайты тяжелой цепи, сконструированных введением цистеина, определяют по схемам последовательной нумерации и нумерации по Кабату на Фиг. 13А и 13В.
Реакционная способность тиола также может быть обобщена на определенные домены антитела, такие как константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелой цепи, СН1, СН2 и СН3. Цистеиновые замены, приводящие к значениям реакционной способности тиола, равным 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, и 0,95, и выше, могут быть сделаны в константных доменах тяжелой цепи α, δ, ε, γ, и μ интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, соответственно, включая подклассы IgG: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, и IgA2.
Антитела, сконструированные могут быть получены, как описано, например, в патенте США №7521541 или международной патентной публикации № WO 2006/034488, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. В некоторых вариантах осуществления вариант антитела, сконструированного введением цистеина, представляет собой вариант антитела, сконструированного введением цистеина, описанный в патенте США №7521541 или международной патентной публикации № WO 2006/034488. В некоторых случаях вариант антитела, сконструированного введением цистеина, представляет собой вариант антитела, сконструированного введением цистеина, описанный в публикации международной патентной заявки № WO 2011/156328 или в патенте США №9000130, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. В некоторых вариантах осуществления вариант антитела, сконструированного введением цистеина, представляет собой вариант антитела, сконструированного введением цистеина, описанный в публикации международной патентной заявки № WO 2016/040856, которая включена в данный документ посреством ссылки в полном объеме, например, в Таблицах 1-4 в WO 2016/040856.
Например, в определенных вариантах осуществления цистеиновую мутацию выбирают из группы, состоящей из НС-1195С, HC-S420C, HC-Y432C и LC-G64C (в соответствии с нумерацией по Кабату). В определенных вариантах осуществления цистеиновую мутацию выбирают из группы, состоящей из HC-Y432C и LC-G64C (в соответствии с нумерацией по Кабату). В определенных вариантах осуществления цистеиновая мутация представляет собой мутацию тяжелой цепи и выбирается из группы, состоящей из Y33C, G162C, V184C, I195С, S420C, Y432C и Q434C (в соответствии с нумерацией по Кабату). В определенных вариантах осуществления цистеиновая мутация представляет собой мутацию тяжелой цепи и выбирается из группы, состоящей из R19C, Е46С, Т57С, Y59C, А60С, M100cC, W103C, G162C, I195С, V258C, S420C, Н425С, и N430C (в соответствии с нумерацией по Кабату). В определенных вариантах осуществления цистеиновая мутация представляет собой мутацию тяжелой цепи и выбирается из группы, состоящей из Y33C, G162C, V184C и I195С (в соответствии с нумерацией по Кабату). В определенных вариантах осуществления цистеиновая мутация представляет собой мутацию тяжелой цепи и выбирается из группы, состоящей из R19C, Е46С, Y59C, А60С, М100сС, W103C, V258C, Н425С, и N430C (в соответствии с нумерацией по Кабату).
В определенных вариантах осуществления цистеиновая мутация представляет собой мутацию легкой цепи и выбирается из группы, состоящей из Y55C, G64C, Т85С, Т180С, и N430C (в соответствии с нумерацией по Кабату). В определенных вариантах осуществления цистеиновая мутация представляет собой мутацию легкой цепи и выбирается из группы, состоящей из Т31С, S52C, G64C, R66C, А193С, и N430C (в соответствии с нумерацией по Кабату). В определенных вариантах осуществления цистеиновая мутация представляет собой мутацию легкой цепи и выбирается из группы, состоящей из G64C, Т85С, Т180С, и N430C (в соответствии с нумерацией по Кабату). В определенных вариантах осуществления цистеиновая мутация представляет собой мутацию легкой цепи и выбирается из группы, состоящей из S52C, G64C, R66C, А193С, и N430C (в соответствии с нумерацией по Кабату). В конкретных вариантах осуществления цистеиновую мутацию в легкой цепи выбирают из группы цистеиновых мутаций, состоящей из LC-I106C, LC-R108C, LC-R142C, и LC-K149C (в соответствии с нумерацией по Кабату) (см. Фиг. 13А; Таблица 2). В конкретном варианте осуществления цистеиновая мутация в легкой цепи представляет собой LC-K149C (в соответствии с нумерацией по Кабату) (см. Фиг. 13А). В конкретном варианте осуществления цистеиновая мутация в легкой цепи представляет собой LC-V205C (в соответствии с нумерацией по Кабату).
В конкретных вариантах осуществления цистеиновую мутацию в тяжелой цепи выбирают из группы цистеиновых мутаций, состоящей из НС-Т114С, НС-А140С, HC-L174C, HC-L179C, НС-Т187С, НС-Т209С, HC-V262C, HC-G371C, НС-Y373C, НС-Е382С, HC-S424C, HC-N434C, и HC-Q438C (в соответствии с нумерацией EU) (см. Фиг. 13 В; Таблица 3). В конкретном варианте осуществления цистеиновая мутация в тяжелой цепи представляет собой НС-А143С в соответствии с нумерацией по Кабату (т.е. НС-А140С в соответствии с нумерацией EU) (см. Фиг. 13В; Таблица 3). В конкретном варианте осуществления цистеиновая мутация в тяжелой цепи представляет собой НС-А174С в соответствии с нумерацией EU (см. Фиг. 13В;. Таблица 3). В конкретном варианте осуществления, цистеиновая мутация в тяжелой цепи представляет собой НС-А118С согласно нумерации EU (т.е. НС-А114С в соответствии с нумерацией по Кабату).
В конкретном варианте осуществления любое антитело, сконструированное введением цистеина, как описано в данном документе, имеет одну из следующих цистеиновых мутаций: LC-K149C в соответствии с нумерацией по Кабату и НС-А140С в соответствии с нумерацией EU (см. Таблицы 2 и 3 и Фиг. 13А и 13В).
В некоторых вариантах осуществления цистеином можно заменить один или более из следующих остатков: V205 (нумерация по Кабату) в легкой цепи, АН 8 (нумерация EU) в тяжелой цепи и S400 (нумерация EU) в области Fc тяжелой цепи.
В некоторых вариантах осуществления антитело, сконструированное введением цистеина, может содержать одну или более цистеиновых мутаций тяжелой цепи, выбранной из группы, состоящей из V2C, L4C, V5C, L11C, R19C, F27C, I29C, Т32С, Y33C, Q39C, А40С, K43С, L45C, Е46С, Т53С, G55C, Т57С, R58C, Y59C, А60С, Т68С, N76C, Y79C, Q81 С, W95C, G96C, D101 С, W103С, Т116С, K117С, Т135С, N155C, А158С, G162C, G174C, L175C, Т183С, V184C, 1195С, N199C, S203C, F239C, М248С, Е254С, V258C, N272C, V278C, L305C, Т331С, S333C, R340C, Q343C, K356С, Е384С, S399C, K410С, Q414C, G416C, N417С, Y432C, Т433С, K435С, S438C, L439C, M100cС, и N82aC (в соответствии с нумерацией по Кабату). См. также Таблицу 3 международной патентной заявки WO 2016/040856.
В некоторых вариантах осуществления антитело, сконструированное введением цистеина, может содержать одну или более цистеиновых мутаций легкой цепи, выбранной из группы, состоящей из S12С, S14C, G16C, R18C, Т22С, R24C, Q27C, Т31С, А32С, Q38C, K39С, G41C, K42С, Р44С, Y49C, S50C, S52C, F53C, L54C, Y55C, S63C, G64C, R66C, D70C, Т72С, Т74С, S76C, Q79C, Т85С, Н91С, Y92C, Р95С, Т97С, F98C, K103С, Е105С, K107С, Р119С, K126С, Т129С, S131C, Q147C, W148C, А153С, Q155C, S156C, S159C, Q160C, S162C, Q166C, Т172С, Т180С, V191C, А193С, Е195С, V205C, Т206С, и N210С (в соответствии с нумерацией по Кабату). См. также Таблицу 4 международной патентной заявки WO 2016/040856.
В некоторых вариантах осуществление антитело, сконструированное введением цистеина, может содержать одну или более цистеиновых мутаций, выбранных из группы, состоящей из НС-I195С, HC-S420C, HC-Y432C и LC-G64C (в соответствии с нумерацией по Кабату). См. также Таблицу 5 международной патентной заявки WO 2016/040856.
В некоторых вариантах осуществления антитело, сконструированное введением цистеина, содержит цистеиновые мутации легкой цепи, выбранные из группы сайтов, состоящих из LC-T22C, LC-K39C, LC-Y49C, LC-Y55C, LC-T85C, LC-Т97С, LC-I106C, LC-R108C, LC-R142C, LC-K149C, и LC-V205C (в соответствии с нумерацией по Кабату).
Антитело, сконструированное введением цистеина, может содержать любое подходящее количество сконструированных остатков цистеина, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более сконструированных остатков цистеина. В некоторых вариантах осуществления антитело, сконструированное введением цистеина, может содержать 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, или 1-10 сконструированных остатков цистеина. В некоторых вариантах осуществления антитело, сконструированное введением цистеина, может содержать 1 сконструированный остаток цистеина. В некоторых вариантах осуществления антитело, сконструированное введением цистеина, может содержать 2 сконструированных остатка цистеина. В некоторых вариантах осуществления антитело, сконструированное введением цистеина, может содержать 3 сконструированных остатка цистеина.
В любом из предыдущих вариантов осуществления антитело, сконструированное введением цистеина, может содержать сконструированный цистеин в эквивалентном положении, как любую из цистеиновых мутаций, описанных выше. Например, если антитело содержит нативный серин в положении 118 (нумерация EU), серин может быть заменен на цистеин с образованием мутации S118C.
Например, изобретение обеспечивает анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина, содержащее цистеиновую мутацию в тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из НС-А118С, НС-А140С и НС-L174C (нумерации EU), или цистеиновую мутацию в легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из LC-V205C и LC-K149C (нумерация по Кабату), причем анти-ФРЭС антитело представляет собой любое анти-ФРЭС антитело, описанное в данном документе, например, любое анти-ФРЭС антитело, описанное в Таблицах 8-10. В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС антитело представляет собой N94A.F83A.N82aR.Y58R (G6.31 AARR). В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС антитело представляет собой G6.31 ДТ. В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС антитело представляет собой LC-N94A. В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС антитело представляет собой LC-N94A.LC-F83A. В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС антитело представляет собой LC-N94A.LC-F83A. В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС антитело представляет собой НС-А40Е.НС-Т57Е (G6.31 ААЕЕ). В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС антитело представляет собой HCcombo. В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС антитело представляет собой HCLC2. В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС антитело представляет собой HCLC4. В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС антитело представляет собой HCLC5. В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС антитело представляет собой HCLC3. В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС антитело представляет собой HCLC1. В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС антитело представляет собой R19HCcombo. В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС антитело представляет собой R19HCLC2. В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС антитело представляет собой R19HCLC4. В некоторых вариантах осуществления анти-ФРЭС антитело представляет собой R19HCLC5.
В конкретном примере изобретение обеспечивает анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина, содержащее цистеиновую мутацию в тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из НС-А118С, НС-А140С и НС-L174C (нумерация EU), или цистеиновую мутацию в легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из LC-V205C и LC-K149C (нумерация по Кабату), причем указанное антитело содержит следующие шесть HVR: (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность DYWIH (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность GITPAGGYTRYADSVKG (SEQ ID NO: 7); (с) HVR-Н3, содержащую аминокислотную последовательность FVFFLPYAMDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 8); (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SASFLYS (SEQ ID NO: 9); и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGYGAPFT (SEQ ID NO: 10). В некоторых случаях анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина, содержит следующие FR вариабельного домена тяжелой цепи: (a) FR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS (SEQ ID NO: 13); (b) FR-H2, содержащую аминокислотную последовательность WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 14); (с) FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 15); и (d) FR-H4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16). В дополнительных случаях анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина, содержит следующие FR вариабельного домена легкой цепи: (a) FR-L1, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) FR-L2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 18); (с) FR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC (SEQ ID NO: 19); и (d) FR-L4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина, содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и (b) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых случаях исходное антитело представляет собой G6.31 AARR. В некоторых вариантах осуществления цистеиновая мутация представляет собой НС-А118С. В других вариантах осуществления цистеиновая мутация представляет собой НС-А140С. В других вариантах осуществления цистеиновая мутация представляет собой HC-L174C (нумерация EU). В других вариантах осуществления цистеиновая мутация представляет собой LC-V205C (нумерация по Кабату). В других вариантах осуществления цистеиновая мутация представляет собой LC-K149C (нумерация по Кабату).
В некоторых случаях изобретение обеспечивает антитело, содержащее (а) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90 и/или (b) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 89.
В некоторых случаях изобретение обеспечивает антитело, содержащее (а) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92 и/или (b) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91.
В некоторых случаях изобретение обеспечивает антитело, содержащее (а) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94 и/или (b) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93.
е) Производные антител
В определенных вариантах осуществления антитело, предложенное в данном документе, может быть дополнительно модифицировано для включения дополнительных небелковых компонентов, которые известны в данной области техники и общедоступны. Фрагменты, пригодные для получения производных антитела, включают, без ограничений, водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают, без ограничений, полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо статистические сополимеры), декстран или поли(n-винилпирролидон) полиэтиленгликоль, гомополимеры пропропиленгликоля, сополимеры оксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Пропиональдегид полиэтиленгликоля может иметь преимущество при производстве вследствие его стабильности в воде. Указанный полимер может обладать любой молекулярной массой и быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к антителу, может изменяться и, в случае присоединения более одного полимера, они могут представлять собой одинаковые или разные молекулы. В целом, количество и/или тип полимеров, используемых для дериватизации, можно определить с учетом факторов, включающих, без ограничений, конкретные свойства или функции антитела, подлежащие улучшению, независимо оттого, будет ли производное антитела использоваться в терапии при определенных условиях и тому подобное. Дополнительные конъюгаты антител описаны в данном документе, например, в разделе G ниже и в Примерах 1 и 2.
В другом варианте осуществления изобретения предложены конъюгаты антитела и небелкового компонента, которые можно избирательно нагревать путем облучения. В одном варианте осуществления изобретения небелковый компонент представляет собой углеродную нанотрубку (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Излучение может иметь любую длину волны и включает, без ограничений, длины волн, которые не наносят вред обычным клеткам, но которые нагревают небелковый компонент до температуры, при которой клетки, расположенные близко к антитело-небелковому компоненту, погибают.
f) Варианты изоэлектрической точки
Изобретение относится к вариантам антител с измененными изоэлектрическими точками. Например, изобретение относится к вариантам антител со сниженной изоэлектрической точкой (pI), например, по сравнению с анти-ФРЭС антитела, например, G6.31. В некоторых случаях, поверхностный заряд уменьшается при физиологическом рН. В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело имеет pI, равную или меньшую, чем около 8 (например, около 8, около 7, около 6, около 5, или около 4). В некоторых случаях антитело имеет pI от около 4 до около 8 (например, около 4, около 5, около 6, около 7, или около 8). В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело имеет pI от около 5 до около 7 (например, около 5, около 6, или около 7). В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело имеет pI от около 5 до около 6 (например, около 5,1, около 5,2, около 5,3, около 5,4, около 5,5, около 5,6, около 5,7, около 5,8, около 5,9, или около 6).
2
Антитела согласно изобретению могут быть сконструированы так, чтобы иметь сниженную pI, например, путем замены аминокислотных остатков дикого типа в заданном положении аминокислотой, имеющей более низкую pI. pI аминокислоты может быть определена на основе значений рКа амина (-NH), карбоновой кислоты (-СООН), и боковой цепи аминокислоты, которые известны в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления экспонированные на поверхности аминокислотные остатки могут быть замещены для уменьшения pI антитела. В одном варианте осуществления экспонированные на поверхности аминокислотные остатки могут быть замещены глутаматом (Е). В одном варианте осуществления экспонированные на поверхности аминокислотные остатки могут быть замещены аспартатом (D).
В. Рекомбинантные способы и композиции
Любое из антител (например, анти-ФРЭС антител, в том числе анти-ФРЭС антител, сконструированных введением цистеина), описанных в данном документе, может быть получено с использованием рекомбинантных способов и композиций, например, как описано в патенте США №4816567. В одном варианте осуществления предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая анти-ФРЭС антитело, описанное в данном документе. Такая нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую VL, и/или аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела (например, легкую и/или тяжелую цепи антитела). В дополнительном варианте осуществления предложены один или более векторов (например, векторов экспрессии), содержащих такие нуклеиновые кислоты. В дополнительном варианте осуществления предложена клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту. В одном таком варианте осуществления клетка-хозяин содержит (например, трансформирована): (1) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела; или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела. В одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например, клетку яичника китайского хомячка (СНО) или лимфоидную клетку (например, клетку Y0, NS0, Sp20). В одном варианте осуществления предложен способ получения анти-ФРЭС антитела, причем способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующей антитело, как указано выше, в условиях, подходящих для экспрессии антитела, и, в некоторых случаях, выделение антитела из клетки-хозяина (или из среды для культивирования клетки-хозяина).
Для рекомбинантной продукции антитела (например, анти-ФРЭС-антитело, в том числе анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина), нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, например, как описано ранее, выделяют и встраивают в один или более векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такая нуклеиновая кислота может быть легко выделена и сиквенирована с использованием общепринятых способов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, которые кодируют тяжелые и легкие цепи антитела).
Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела, включают прокариотические или эукариотические клетки, описанные в данном документе. Например, антитела можно получать в бактериях, в особенности, если гликозилирование и эффекторная функция Fc не являются необходимыми. Для экспрессии фрагментов антител и полипептидов в бактериях, см., например, патенты США №№5648237, 5789199, и 5840523. См. также Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), стр. 245-254, в которой описана экспрессия фрагментов антител в Е. coli. После экспрессии антитело может быть выделено из пасты бактериальных клеток в растворимой фракции и может быть дополнительно очищено.
В дополнение к прокариотам, подходящие для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела, хозяева представляют собой эукариотические микроорганизмы, такие как мицелиальные грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей с «гуманизированными» путями гликозилирования, которые приводят к получению антитела с частичным или полностью человеческим профилем гликозилирования. См. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), и Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного антитела также получены из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Были идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы, которые можно использовать в сочетании с клетками насекомых, особенно для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.
Культуры клеток растений также могут быть использованы в качестве хозяев. См., например, патенты США №№5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описывающие технологию PLANTIBODIES™ для производства антител в трансгенных растениях).
-
Клетки позвоночных могут также использоваться в качестве хозяев. Например, могут быть подходящими клеточные линии млекопитающих, которые приспособлены для роста в суспензии. Другими примерами подходящих клеточных линий клеток млекопитающих являются линия CV1 почки обезьяны, трансформированная при помощи SV40 (COS-7); линия эмбриональных клеток почки человека (293 или клетки 293, как описано, например, в Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клетки почки новорожденного хомячка (ВНК); клетки Сертоли мыши (клетки ТМ4, описанные, например, в Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK, клетки печени крысы линии Buffalo (BRL 3А), клетки легких человека (W138), клетки печени человека (Hep G2), клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562), клетки TRI, как описано, например, в Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); клетки MRC 5 и клетки FS4. Другие подходящие линии клеток млекопитающих включают клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая клетки DHFR СНО (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); и миеломные клеточные линии, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Для обзора некоторых линий клеток-хозяев млекопитающих, подходящих для продуцирования антител, см., например, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).
С. Анализы
Антитела (например, анти-ФРЭС антитела, описанные в данном документе, в том числе анти-ФРЭС антитела, сконструированные введением цистеина), а также конъюгаты антител (например, конъюгаты антител, которые содержат анти-ФРЭС антитела (например, любое анти-ФРЭС антитело, представленное в данном документе)), могут быть идентифицированы, подвергнуты скринингу, или охарактеризованы по их физико-химическим свойствам и/или биологической активности с помощью различных анализов, известных в данной области техники.
1. Анализы связывания и другие анализы
В одном аспекте, антитело (например, анти-ФРЭС антитело, в том числе анти-ФРЭС антитела, сконструированного введением цистеина), или конъюгат такого антитела, исследуют на антигенсвязывающую активность, например, с помощью известных методов, таких как ИФА, вестерн-блоттинг, и т.д.
В другом аспекте, конкурентные анализы могут быть использованы для идентификации антитела, которое конкурирует с антителом, как описано в данном документе, или конъюгата такого антитела, за связывание с антигеном (например, ФРЭС). В некоторых вариантах осуществления такое конкурирующее антитело связывается с одним и тем же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), который связывается с антителом, как описано в данном документе. Подробное описание типовых способов картирования эпитопа, с которым связывается антитело, представлено в Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," в Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
В иллюстративном конкурентном анализе иммобилизованный ФРЭС инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с ФРЭС, и второе немеченое антитело, которое исследуют в отношении его способности конкурировать с первым антителом за связывание с ФРЭС. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный ФРЭС инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не второе немеченое антитело. После инкубации в условиях, обеспечивающих связывание первого антитела с ФРЭС, удаляют избыток несвязанного антитела и измеряют количество метки, связанной с иммобилизованным ФРЭС. Если количество метки, связанной с иммобилизованным ФРЭС, существенно снижается в исследуемом образце относительно контрольного образца, то это указывает на то, что второе антитело конкурирует с первым антителом для связывания с ФРЭС. Аналогичные анализы могут быть проведены для других антигенов. См. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
2. Анализы активности
В одном аспекте представлены анализы для идентификации антител (например, анти-ФРЭС антител, включая анти-ФРЭС антитела, сконструированные введением цистеина) или конъюгатов таких антител, имеющих биологическую активность. Биологическая активность может включать, например, связывание с антигеном (например, ФРЭС (например, ФРЭС в кровотоке)), или его пептидным фрагментом, или in vivo, in vitro, или ex vivo. В некоторых вариантах осуществления биологическая активность может включать блокирование или нейтрализацию антигена. Например, в некоторых вариантах осуществления биологическая активность может включать блокирование или нейтрализацию ФРЭС или предотвращение связывания ФРЭС с лигандом, например, рецептором, таким как KDR или Flt-1. Также предложены антитела или конъюгаты таких антител, обладающие такой биологической активностью in vivo и/или in vitro. В некоторых вариантах осуществления антитело согласно изобретению, или конъюгаты таких антител, тестировали на такую биологическую активность.
3. Анализы стабильности
В одном аспекте предложены анализы для определения стабильности (например, термостабильности) антитела (например, анти-ФРЭС, включая анти-ФРЭС антитело, сконструированное антитело) или конъюгата такого антитела. Например, стабильность антитела или конъюгата такого антитела может быть определена с использованием любого способа, известного в данной области техники, например, дифференциальной сканирующуей флуориметрии (DSF), циркулярного дихроизма (CD), собственной флуоресценции белка, дифференциальной сканирующей калориметрии, спектроскопии, светорассеяния (например, динамического светорассеяния (DLS) и статического светорассеяния (SLS), хроматографии взаимодействующих молекул (SIC). Стабильность антитела или конъюгата такого антитела может быть определена, как описано в данном документе, например, с использованием DSF, как описано, например, в Примерах 1 и 2 международной патентной заявки № PCT/US 2016/053454. В некоторых случаях стабильность конъюгата антитела может быть определена с помощью гель-эксклюзионной хроматографии с встроенными рефрактометрическим детектором и детектором многоуглового лазерного светорассеяния (SEC-RI-MALS), например, как описано в Примере 1.
D. Фармацевтические составы
Фармацевтические составы антитела (например, анти-ФРЭС антитела, включая анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина) или конъюгата такого антитела, представленные в данном документе, получают путем смешивания такого антитела или конъюгата антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с одним или более необязательными фармацевтически приемлемыми носителями Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители являются в общем случае нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и включают, но не ограничиваются этим, буферные вещества, например, фосфат, цитрат и другие органические соли; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (например, хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензэтония; фенол; бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, например, метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и m-крезол); низкомолекулярные (содержащие менее 10 остатков) полипептиды; белки, например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, например, поливинилпирролидон; аминокислоты, например, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, например, ЭДТА; сахара, например, сахарозу, маннит, трегалозу или сорбит; солеобразующие противоионы, например, натрия; металлсодержащие комплексы (например, комплексы Zn-белок) и/или неионогенные сурфактанты, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Примеры фармацевтически приемлемых носителей в данном документе дополнительно включают средства, обеспечивающие внутритканевое распределение лекарственных средств, таких как растворимые нейтрально-активные гликобелки, содержащие гиалуронидазу (sHASEGP), например, растворимые гликобелки РН-20 человека, содержащие гиалуронидазу, такие как rHuPH20 (HYLENEX, Baxter International, Inc.). Некоторые примеры sHASEGP и способы применения, в том числе rHuPH20, описаны в публикациях патентов США №№2005/0260186 и 2006/0104968. В одном аспекте sHASEGP объединяют с одним или более дополнительными глюкозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.
Иллюстративные лиофилизированные составы антител описаны в патенте США №6267958. Водные составы антител включают те, которые описаны в патенте США №6171586 и WO 2006/044908, последние составы содержат гистидин-ацетатный буфер.
Лекарственная форма, описанная в данном документе, также может содержать более одного активного соединения, требуемого при конкретном показании подлежащем лечению, предпочтительно с дополняющими видами активности, которые не оказывают негативного влияния друг на друга. Например, может существовать потребность в обеспечении иммуносупрессивного агента. Такие молекулы присутствуют в надлежащей комбинации в количествах, которые эффективны для использования по назначению.
Активные ингредиенты можно помещать в микрокапсулы, полученные, например, методом коацервации или межфазной полимеризации, например, в микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулы из поли(метилметакрилата), соответственно; в коллоидные системы для доставки лекарственных препаратов (например, в липосомы, микросферы альбумина, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Составы, предназначенные для введения in vivo, обычно являются стерильными. Стерильность может быть легко достигнута, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.
В определенных вариантах осуществления фармацевтический состав содержит одно или более дополнительных соединений. В определенных вариантах осуществления дополнительное соединение связывается со второй биологической молекулой, выбранной из группы, состоящей из: ИЛ-1β; ИЛ-6; ИЛ-6R; ИЛ-13; ИЛ-13R; ТцФР; ангиопоэтина; ангиопоэтина 2; Tie2; S1P; интегринов αvβ3, αvβ5, и α5β1; бетацеллюлина; апелина/APJ; эритропоэтина; фактора D комплемента; ФНО-α; HtrA1; рецептора ФРЭС; ST-2-рецептора; и белков, генетически связанных с риском возрастной макулярной дегенерации (ВМД), таких как компоненты пути комплемента С2, фактор В, фактор Н, CFHR3, C3b, С5, С5а, и С3а; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; ИЛ-8; CX3CR1; TLR3; TLR4; СЕТР; LIPC; COL10A1; и TNFRSF10A. В некоторых вариантах осуществления дополнительное соединение представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Например, в некоторых случаях дополнительное соединение представляет собой биспецифическое антитело (например, анти-ФРЭС/анти-Ang2 биспецифическое антитело, такое как RG-7716 или любое анти-ФРЭС/анти-Ang2 биспецифическое антитело, раскрытое в WO 2010/069532 или WO 2016/073157.
В другом примере в некоторых случаях дополнительное соединение представляет собой анти-ИЛ-6 антитело, например EBI-031 (Eleven Biotereutics; См., например, WO 2016/073890), силтуксимаб (SYLVANT), олокизумаб, клазакизумаб, сирукумаб, эльсилимомаб, герилимзумаб, OPR-003, MEDI-5117, PF-04236921, или его вариант.
В еще одном примере в некоторых случаях дополнительное соединение представляет собой анти-ИЛ-6R антитело, например тоцилизумаб (ACTEMRA) (см., например, WO 1992/019579), сарилумаб, вобарилизумаб (ALX-0061), SA-237, или его вариант.
Е. Терапевтические способы и композиции
Любые антитела (например, анти-ФРЭС, включая анти-ФРЭС антитела, сконструированные введением цистеина) или их конъюгаты (например, конъюгаты монодисперсной ГК), представленные в данном документе, могут быть использованы в терапевтических способах.
В одном аспекте предлагается анти-ФРЭС антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина) для применения в качестве лекарственного средства. В другом аспекте предлагается конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) для применения в качестве лекарственного средства. В других аспектах изобретение обеспечивает анти-ФРЭС антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина) для применения при лечении нарушения, связанного с патологическим ангиогенезом. В других аспектах изобретение обеспечивает анти-ФРЭС антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина) для применения при лечении нарушения, связанного с патологическим ангиогенезом. В некоторых вариантах осуществления нарушение, связанное с патологическим ангиогенезом, представляет собой заболевание глаз. В некоторых случаях заболевание глаз представляет собой ВМД (например, влажную форму ВМД, сухую форму ВМД, ВМД в промежуточной стадии, ВМД на поздней стадии, или географическую атрофию сетчатки (ГА)), макулярную дегенерацию, макулярный отек, ДМО (например, фокальный ДМО вне центральной зоны или диффузный ДМО с вовлечением центральной зоны сетчатки), ретинопатию, диабетическую ретинопатию (ДР) (например, пролиферативную ДР (ПДР), непролиферативную ДР (НПДР), или высокогорную ДР), другие ретинопатии, связанные с ишемией, РН, окклюзию вен сетчатки (ОВС) (например, формы окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС) и ветви центральной вены сетчатки (ОВВС))), ХНВ (например, миопическую ХНВ), неоваскуляризацию роговицы, болезни, связанные с неоваскуляризацией роговицы, неоваскуляризацию сетчатки, болезни, связанные с неоваскуляризацией сетчатки/хориоидальной неоваскуляризацией, патологическую миопию, болезнь Гиппеля-Линдау, гистоплазмоз глаз, СЭВРП, болезнь Коутса, болезнь Норри, OPPG, субконъюнктивальное кровоизлияние, рубеоз, неоваскулярное заболевание глаз, неоваскулярную глаукомы пигментный ретинит (ПР), гипертоническую ретинопатию, ретинальную ангиоматозную пролиферацию, макулярную телеангиэктазию, неоваскуляризацию радужки, внутриглазную неоваскуляризацию, дегенерацию сетчатки, кистозный макулярный отек (КМО), васкулит, отек диска зрительного нерва, ретинит, конъюнктивит (например, инфекционный и неинфекционный (например, аллергический) конъюнктивит), врожденный амавроз Лебера, увеит (в том числе инфекционный и неинфекционный увеит), хориоидит (например, мультифокальной хориоидит), гистоплазмоз глаз, блефарит, синдром сухого глаза, травматическое повреждение глаз, синдром Шегрена.
В другом аспекте предлагается анти-ФРЭС антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина) для применения в способе лечения. В другом аспекте предлагается конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) для применения в способе лечения. В некоторых случаях изобретение обеспечивает анти-ФРЭС антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина) для применения в способе лечения субъекта, имеющего нарушение, связанное с патологическим ангиогенезом, включающем введение индивидууму эффективного количества анти-ФРЭС антитела. Изобретение также относится к конъюгату антитела (например, конъюгату монодисперсной ГК) для применения в способе лечения субъекта, имеющего нарушение, связанное с патологическим ангиогенезом, включающем введение индивидууму эффективного количества конъюгата антитела. В некоторых случаях нарушение, связанное с патологическим ангиогенезом, представляет собой заболевание глаз. В некоторых случаях заболевание глаз представляет собой ВМД (например, влажную форму ВМД, сухую форму ВМД, ВМД в промежуточной стадии, ВМД на поздней стадии, или географическую атрофию сетчатки (ГА)), макулярную дегенерацию, макулярный отек, ДМО (например, фокальный ДМО вне центральной зоны или диффузный ДМО с вовлечением центральной зоны сетчатки), ретинопатию, диабетическую ретинопатию (ДР) (например, пролиферативную ДР (ПДР), непролиферативную ДР (НПДР), или высокогорную ДР), другие ретинопатии, связанные с ишемией, РН, окклюзию вен сетчатки (ОВС) (например, формы окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС) и ветви центральной вены сетчатки (ОВВС))), ХНВ (например, миопическую ХНВ), неоваскуляризацию роговицы, болезни, связанные с неоваскуляризацией роговицы, неоваскуляризацию сетчатки, болезни, связанные с неоваскуляризацией сетчатки/хориоидальной неоваскуляризацией, патологическую миопию, болезнь Гиппеля-Линдау, гистоплазмоз глаз, СЭВРП, болезнь Коутса, болезнь Норри, OPPG, субконъюнктивальное кровоизлияние, рубеоз, неоваскулярное заболевание глаз, неоваскулярную глаукомы пигментный ретинит (ПР), гипертоническую ретинопатию, ретинальную ангиоматозную пролиферацию, макулярную телеангиэктазию, неоваскуляризацию радужки, внутриглазную неоваскуляризацию, дегенерацию сетчатки, кистозный макулярный отек (КМО), васкулит, отек диска зрительного нерва, ретинит, конъюнктивит (например, инфекционный и неинфекционный (например, аллергический) конъюнктивит), врожденный амавроз Лебера, увеит (в том числе инфекционный и неинфекционный увеит), хориоидит (например, мультифокальной хориоидит), гистоплазмоз глаз, блефарит, синдром сухого глаза, травматическое повреждение глаз, синдром Шегрена.
В некоторых случаях изобретение обеспечивает анти-ФРЭС антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина) для применения в снижении или ингибировании ангиогенеза у субъекта. В другом аспекте предлагается конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) для применения в снижении или ингибировании ангиогенеза у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретение обеспечивает анти-ФРЭС антитело (например, анти-ФРЭС антитело) для применения в способе снижения или ингибирования ангиогенеза у субъекта, включающем введение индивидууму эффективного анти-ФРЭС антитела для снижения или ингибирования ангиогенеза. Изобретение также обеспечивает конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) для применения в способе снижения или ингибирования ангиогенеза у субъекта, включающем введение индивидууму эффективного количества конъюгата антитела. "Субъект" согласно любому из вышеуказанных применений может представлять собой человек.
Изобретение относится к применению анти-ФРЭС антитела (например, анти-ФРЭС антитела, сконструированного введением цистеина) при изготовлении или получении лекарственного средства. Изобретение также относится к применению конъюгата антитела (например, конъюгата монодисперсной ГК) при изготовлении или получении лекарственного средства. Например, в одном примере лекарственное средство предназначено для лечения нарушения, связанного с патологическим ангиогенезом. В дополнительном примере лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения нарушения, связанного с патологическим ангиогенезом, включающем введение субъекту, имеющему нарушение, связанное с патологическим ангиогенезом, эффективного количества лекарственного средства. В некоторых случаях нарушение, связанное с патологическим ангиогенезом, представляет собой заболевание глаз. В некоторых случаях заболевание глаз представляет собой ВМД (например, влажную форму ВМД, сухую форму ВМД, ВМД в промежуточной стадии, ВМД на поздней стадии, или географическую атрофию сетчатки (ГА)), макулярную дегенерацию, макулярный отек, ДМО (например, фокальный ДМО вне центральной зоны или диффузный ДМО с вовлечением центральной зоны сетчатки), ретинопатию, диабетическую ретинопатию (ДР) (например, пролиферативную ДР (ПДР), непролиферативную ДР (НПДР), или высокогорную ДР), другие ретинопатии, связанные с ишемией, РН, окклюзию вен сетчатки (ОВС) (например, формы окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС) и ветви центральной вены сетчатки (ОВВС))), ХНВ (например, миопическую ХНВ), неоваскуляризацию роговицы, болезни, связанные с неоваскуляризацией роговицы, неоваскуляризацию сетчатки, болезни, связанные с неоваскуляризацией сетчатки/хориоидальной неоваскуляризацией, патологическую миопию, болезнь Гиппеля-Линдау, гистоплазмоз глаз, СЭВРП, болезнь Коутса, болезнь Норри, OPPG, субконъюнктивальное кровоизлияние, рубеоз, неоваскулярное заболевание глаз, неоваскулярную глаукомы пигментный ретинит (ПР), гипертоническую ретинопатию, ретинальную ангиоматозную пролиферацию, макулярную телеангиэктазию, неоваскуляризацию радужки, внутриглазную неоваскуляризацию, дегенерацию сетчатки, кистозный макулярный отек (КМО), васкулит, отек диска зрительного нерва, ретинит, конъюнктивит (например, инфекционный и неинфекционный (например, аллергический) конъюнктивит), врожденный амавроз Лебера, увеит (в том числе инфекционный и неинфекционный увеит), хориоидит (например, мультифокальной хориоидит), гистоплазмоз глаз, блефарит, синдром сухого глаза, травматическое повреждение глаз, синдром Шегрена. В другом примере лекарственное средство предназначено для снижения или ингибирования ангиогенеза у субъекта. В дополнительном примере лекарственное средство предназначено для применения в способе снижения или ингибирования ангиогенеза у субъекта, включающем введение субъекту количества, эффективного для снижения или ингибирования ангиогенеза. В любом из предшествующих применений лекарственных средств способ может включать введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, как описано ниже.
Изобретение обеспечивает способ лечения нарушения, связанного с патологическим ангиогенезом. В одном варианте осуществления способ включает введение индивидууму, имеющему нарушение, связанное с патологическим ангиогенезом, эффективного количества анти-ФРЭС антитела (например, анти-ФРЭС антитела, сконструированного введением цистеина). В другом примере способ включает введение индивидууму, имеющему нарушение, связанное с патологическим ангиогенезом, эффективного количества конъюгата антитела (например, конъюгата монодисперсной ГК). В некоторых случаях нарушение, связанное с патологическим ангиогенезом, представляет собой заболевание глаз. В некоторых случаях заболевание глаз представляет собой ВМД (например, влажную форму ВМД, сухую форму ВМД, ВМД в промежуточной стадии, ВМД на поздней стадии, или географическую атрофию сетчатки (ГА)), макулярную дегенерацию, макулярный отек, ДМО (например, фокальный ДМО вне центральной зоны или диффузный ДМО с вовлечением центральной зоны сетчатки), ретинопатию, диабетическую ретинопатию (ДР) (например, пролиферативную ДР (ПДР), непролиферативную ДР (НПДР), или высокогорную ДР), другие ретинопатии, связанные с ишемией, РН, окклюзию вен сетчатки (ОВС) (например, формы окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС) и ветви центральной вены сетчатки (ОВВС))), ХНВ (например, миопическую ХНВ), неоваскуляризацию роговицы, болезни, связанные с неоваскуляризацией роговицы, неоваскуляризацию сетчатки, болезни, связанные с неоваскуляризацией сетчатки/хориоидальной неоваскуляризацией, патологическую миопию, болезнь Гиппеля-Линдау, гистоплазмоз глаз, СЭВРП, болезнь Коутса, болезнь Норри, OPPG, субконъюнктивальное кровоизлияние, рубеоз, неоваскулярное заболевание глаз, неоваскулярную глаукомы пигментный ретинит (ПР), гипертоническую ретинопатию, ретинальную ангиоматозную пролиферацию, макулярную телеангиэктазию, неоваскуляризацию радужки, внутриглазную неоваскуляризацию, дегенерацию сетчатки, кистозный макулярный отек (КМО), васкулит, отек диска зрительного нерва, ретинит, конъюнктивит (например, инфекционный и неинфекционный (например, аллергический) конъюнктивит), врожденный амавроз Лебера, увеит (в том числе инфекционный и неинфекционный увеит), хориоидит (например, мультифокальной хориоидит), гистоплазмоз глаз, блефарит, синдром сухого глаза, травматическое повреждение глаз, синдром Шегрена. В дополнительных случаях способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, как описано ниже. "Субъект" согласно любому из вышеуказанных способов может представлять собой человека.
Предполагается, что антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина) или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК), согласно данному изобретению, можно использовать для лечения млекопитающего. В одном варианте осуществления антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина) или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) вводят млекопитающему, не являющемуся человеком, например, в целях получения, например, доклинических данных. Подлежащие лечению иллюстративные млекопитающие, не являющиеся человеком, включают приматов, не являющихся человеком, собак, кошек, грызунов (например, мышей и крыс) и других млекопитающих, для которых проводят доклинические исследования. Такие млекопитающие могут представлять собой стандартные животные модели для заболевания, подлежащего лечению антителом, или могут быть использованы для изучения токсичности или фармакокинетики представляющего интерес антитела. В каждом из этих вариантов осуществления у млекопитающего могут быть проведены исследования с повышением дозы. Антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина) или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) можно вводить грызуну-хозяину, например, в модели солидной опухоли. Антитело или конъюгат антитела можно вводить хозяину (например, грызуну, например, кролику) для глазных фармакокинетических исследований, например, путем интравитреального введения (например, интравитреальной инъекции) или с помощью имплантируемого устройства доставки.
В дополнительном аспекте изобретение обеспечивает фармацевтические составы, содержащие любое из антител (например, анти-ФРЭС антител, сконструированных введением цистеина) или конъюгатов антител (например, конъюгатов монодисперсной ГК), представленных в данном документе, например, для применения в любом из вышеуказанных терапевтических способов. В одном варианте осуществления фармацевтический состав содержит любое из антител (например, анти-ФРЭС антител, сконструированных введением цистеина) или конъюгатов антител (например, конъюгатов монодисперсной ГК), представленных в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления фармацевтический состав содержит любое из антител (например, анти-ФРЭС антител, сконструированных введением цистеина) или конъюгатов антител (например, конъюгатов монодисперсной ГК), представленных в данном документе, и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент, например, как описано ниже. В определенных вариантах осуществления фармацевтический состав содержит одно или более дополнительных соединений. В определенных вариантах осуществления дополнительное соединение связывается со второй биологической молекулой, выбранной из группы, состоящей из: ИЛ-1β; ИЛ-6; ИЛ-6R; ИЛ-13; ИЛ-13R; ТцФР; ангиопоэтина; Ang2; Tie2; S1P; интегринов αvβ3, αvβ5, и α5β1; бетацеллюлина; апелина/APJ; эритропоэтина; фактора D комплемента; ФНО-α; HtrA1; рецептора ФРЭС; ST-2-рецептора; и белков, генетически связанных с риском возрастной макулярной дегенерации (ВМД), таких как компоненты пути комплемента С2, фактор В, фактор Н, CFHR3, C3b, С5, С5а, и С3а; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; интерлейкина-8 (ИЛ-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; СЕТР; LIPC, COL10A1; и TNFRSF10A. В некоторых вариантах осуществления дополнительное соединение представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Например, в некоторых случаях дополнительное соединение представляет собой биспецифическое антитело (например, анти-ФРЭС/анти-Ang2 биспецифическое антитело, такое как RG-7716 или любое анти-ФРЭС/анти-Ang2 биспецифическое антитело, раскрытое в WO 2010/069532 или WO 2016/073157, или его вариант. В другом примере в некоторых случаях дополнительное соединение представляет собой анти-ИЛ-6 антитело, например EBI-031 (Eleven Biotereutics; См., например, WO 2016/073890), силтуксимаб (SYLVANT), олокизумаб, клазакизумаб, сирукумаб, эльсилимомаб, герилимзумаб, OPR-003, MEDI-5117, PF-04236921, или его вариант. В еще одном примере в некоторых случаях дополнительное соединение представляет собой анти-ИЛ-6R антитело, например тоцилизумаб (ACTEMRA) (см., например, WO 1992/019579), сарилумаб, вобарилизумаб (ALX-0061), SA-237, или его вариант.
Антитела (например, анти-ФРЭС антитела, сконструированные введением цистеина) или конъюгаты антител (например, конъюгаты монодисперсной ГК) могут быть использованы или отдельно, или в комбинации с другими агентами в терапии. Например, антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина) или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) можно вводить совместно с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим агентом. В некоторых вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент представляет собой другое антитело, антиангиогенный агент, иммуносупрессивный агент, цитокин, антагонист цитокина, кортикостероид, противорвотное средство, противораковую вакцину, анальгетик или их комбинации.
Например, в некоторых вариантах осуществления любой из предшествующих способов дополнительно включает введение одного или более дополнительных соединений. В некоторых вариантах осуществления антитело (например, анти-ФРЭС антитело) или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) вводят одновременно с дополнительным соединением (соединениями). В некоторых вариантах осуществления антитело или конъюгат антитела вводят до или после дополнительного соединения (соединений). В определенных вариантах осуществления дополнительное соединение связывается со второй биологической молекулой, выбранной из группы, состоящей из: ИЛ-1β; ИЛ-6; ИЛ-6R; ИЛ-13; ИЛ-13R; ТцФР; ангиопоэтина; Ang2; Tie2; S1P; интегринов αvβ3, αvβ5, и α5β1; бетацеллюлина; апелина/APJ; эритропоэтина; фактора D комплемента; ФНО-α; HtrA1; рецептора ФРЭС; ST-2-рецептора; и белков, генетически связанных с риском ВМД, таких как компоненты пути комплемента С2, фактор В, фактор Н, CFHR3, C3b, С5, С5а, и С3а; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; интерлейкина-8 (ИЛ-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; СЕТР; LIPC; COL10A1; и TNFRSF10A. В некоторых вариантах осуществления дополнительное соединение представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
В некоторых вариантах осуществления в соответствии с (применительно к) любым из описанных выше вариантов осуществления заболевание глаз представляет собой интраокулярное неоваскулярное заболевание, выбранное из группы, состоящей из пролиферативных ретинопатии, хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ), возрастной макулярной дегенерации (ВМД), диабетической и других связанных с ишемией ретинопатии, диабетического макулярного отека, патологической миопии, болезни Гиппеля-Линдау, гистоплазмоза глаза, окклюзии вены сетчатки (ОВС), включая ОЦВС и ОВВС, неоваскуляризации роговицы, неоваскуляризации сетчатки и ретинопатии недоношенных (РН). Например, в некоторых случаях дополнительное соединение представляет собой биспецифическое антитело (например, анти-ФРЭС/анти-Ang2 биспецифическое антитело, такое как RG-7716 или любое анти-ФРЭС/анти-Ang2 биспецифическое антитело, раскрытое в WO 2010/069532 или WO 2016/073157, или его вариант. В другом примере в некоторых случаях дополнительное соединение представляет собой анти-ИЛ-6 антитело, например EBI-031 (Eleven Biotereutics; См., например, WO 2016/073890), силтуксимаб (SYLVANT), олокизумаб, клазакизумаб, сирукумаб, эльсилимомаб, герилимзумаб, OPR-003, MEDI-5117, PF-04236921, или его вариант. В еще одном примере в некоторых случаях дополнительное соединение представляет собой анти-ИЛ-6R антитело, например тоцилизумаб (ACTEMRA) (см., например, WO 1992/019579), сарилумаб, вобарилизумаб (ALX-0061), SA-237, или его вариант.
В некоторых случаях антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина) или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) согласно изобретению можно вводить в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим агентом для лечения заболевания глаз, например, заболевания глаз, описанного в данном документе (например, ВМД (например, влажная ВМД), ДМО, ДР или ОВС). Иллюстративные дополнительные терапевтические агенты для комбинированной терапии для лечения заболеваний глаз включают, без ограничения, антиангиогенные агенты, такие как антагонисты ФРЭС, включая, например, анти-ФРЭС антитела (например, анти-ФРЭС Fab LUCENTIS (ранибизумаб)), слитые белки растворимого рецептора (например, рекомбинантный слитый белок растворимого рецептора EYLEA (афлиберцепт, также известный как VEGF Trap Eye; Regeneron/Aventis)), аптамеры (например, анти-ФРЭС пегилированный аптамер MACUGEN (пегаптаниб натрия; NeXstar Pharmaceuticals/OSI Pharmaceuticals)), и ингибиторы тирозинкиназы ФРЭСР (например, 4-(4-бромо-2-фторанилино)-6-метокси-7-(1-метилпиперидин-4-илметокси)хиназолин (ZD6474), 4-(4-фтор-2-метилиндол-5-илокси)-6-метокси-7-(3-пирролидин-1-илпропокси)хиназолин (AZD2171), ваталаниб (PTK787), семаксаминиб (SU5416; SUGEN), и SUTENT (сунитиниб)); триптофанил-тРНК-синтетаза (TrpRS); скваламин; RETAANE (анекортав ацетат для депо-суспензии; Alcon, Inc.); пролекарство комбретастатина А4, (СА4Р); MIFEPREX (мифепристон-ru486); субтеноновый триамцинолона ацетонид; интравитреальный кристаллический триамцинолона ацетонид; ингибиторы матриксной металлопротеиназы (например, приномостат (AG3340; Pfizer)); флуоцинолона ацетонид (включая интраокулярный имплантат флуоцинолона; Bausch & Lomb/Control Delivery Systems); линомид; игибиторы функции интегрина β3; ангиостатина, а также их комбинации. Эти и другие терапевтические агенты, которые могут быть введены в комбинации с конъюгатом антитела согласно изобретению, описаны, например, в заявке на патент США № US 2014/0017244, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Другие примеры дополнительных терапевтических агентов, которые могут быть использованы в комбинации с антителом (например, анти-ФРЭС антителом, сконструированным введением цистеина) или конъюгатом антитела (например, монодисперсным конъюгатом ГК) согласно изобретению для лечения заболевания глаз (например, ВМД, ДМО, ДР или ОВС), включают, но не ограничиваются ими, VISUDYNE (вертепорфин; активируемый светом препарат, который, как правило, используется в комбинации с фотодинамической терапией с нетепловым лазером), PKC412, эндовион (NS 3728; NeuroSearch A/S), нейротрофические факторы (например глиальный нейротрофический фактор (GDNF) и цилиарный нейротрофический фактор (CNTF)), дилтиазем, дорзоламид, PHOTOTROP, 9-цис-ретиналь, глазные лекарственные средства (например, иодид фосфолина, эхотиофат или ингибиторы карбоангидразы), неовастат (АЕ-941; AEterna Laboratories, Inc.), Sirna-027 (AGF-745; Sima Therapeutics, Inc.), нейротрофины (включая, только в качестве примера, NT-4/5, Genentech), Cand5 (Acuity Pharmaceuticals), INS-37217 (Inspire Pharmaceuticals), антагонисты интегрина (включая антагонисты интегрина от Jerini AG и Abbott Laboratories), EG-3306 (Ark Therapeutics Ltd.), BDM-E (BioDiem Ltd.), талидомид (используемый, например, EntreMed, Inc.), кардиотрофин-1 (Genentech), 2-метоксиэстрадиол (Allergan/Oculex), DL-8234 (Toray Industries), NTC-200 (Neurotech), тетратиомолибдат (Мичиганский университет), LYN-002 (Lynkeus Biotech), соединение из микроводорослей (Aquasearch/Albany, Mera Pharmaceuticals), D-9120 (Celltech Group plc), ATX-S10 (Hamamatsu Photonics), TGF-beta 2 (Genzyme/Celtrix), ингибиторы тирозинкиназы (например, от Allergan, SUGEN, или Pfizer), NX-278-L (NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences), Opt-24 (OPTIS France SA), нейропротекторы ганглиев клеток сетчатки (Cogent Neurosciences), производные N-нитропиразола (Texas А&М University System), KP-102 (Krenitsky Pharmaceuticals), циклоспорин А, терапевтические агенты, используемые в фотодинамической терапии (например, VISUDYNE; рецепторнаправленную PDT, Bristol-Myers Squibb, Co.; порфимер натрия для инъекции совместно с PDT; вертепорфин, QLТ Inc.; ростапорфин с PDT, Miravent Medical Technologies; талапорфин натрия с PDT, Nippon Petroleum; и мотексафин лютеция, Pharmacyclics, Inc.), антисмысловые олигонуклеотиды (включая только в качестве примера, продукты, протестированные Novagali Pharma SA и ISIS-13650, Isis Pharmaceuticals), и их комбинации.
Антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина) или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) по изобретению можно применять в комбинации с терапией или хирургической процедурой для лечения заболевания глаз (например, ВМД, ДМО, ДР, ии ОВС), включая, например, лазерную фотокоагуляцию (например, панретинальную фотокоагуляцию (PRP)), обработку друз лазером, хирургию макулярных разрывов сетчатки, хирургическую транслокацию макулы, имплантируемые миниатюрные телескопы, ангиографию Phi-движения (также известную как микролазерная терапия и или ангиография фидерных сосудов), бомбардировку протонным пучком, микростимулирующую терапию, хирургию по поводу отслоения сетчатки и операцию на стекловидном теле, перацию вдавливания сферы, операцию в субмакулярной области, транспупиллярную термотерапию, терапию фотосистемы I, применение РНК-интерференции (РНКи), экстракорпоральный реоферез (известный также как мембранная дифференциальная фильтрация и реотерапия), имплантацию микрочипов, терапию стволовыми клетками, генную заместительную терапию, генную терапию на основе рибозимов (включая генную терапию с использованием элемента ответа на гипоксию, Oxford Biomedica; Lentipak, Genetix; и генная терапия PDEF, GenVec), трансплантацию фоторецепторных/ретинальных клеток (включая трансплантируемые эпителиальные клетки сетчатки, Diacrin, Inc.; трансплантат ретинальных клеток, Cell Genesys, Inc.), акупунктуру, и их комбинации.
В некоторых случаях антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина) или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) согласно изобретению можно вводить в комбинации с антиангиогенным агентом для лечения заболевания глаз (например, ВМД, ДМО, ДР или ОВС). Любой подходящий антиангиогенный агент может быть использован в комбинации с антителом (например, анти-ФРЭС антителом, сконструированным введением цистеина) или конъюгатом антитела согласно изобретению, в том числе, но не ограничиваясь ими, те, которые перечислены в Carmeliet et al. Nature 407:249-257, 2000. В некоторых вариантах осуществления антиангиогенный агент представляет собой антагонист ФРЭС, включая, но не ограничиваясь ими, анти-ФРЭС антитело (например, анти-ФРЭС Fab LUCENTIS (ранибизумаб), RTH-258 (раньше ESBA-1008, фрагмент анти-ФРЭС одноцепочечного антитела; Novartis), или биспецифическое анти-ФРЭС антитело (например, биспецифическое анти-ФРЭС/анти-ангиопоетин 2 антитело, такое как RG-7716; Roche)), рекомбинантный слитый белок растворимого рецептора (например, EYLEA (афлиберцепт)), вариант ФРЭС, фрагмент растворимого ФРЭСР, аптамер, способный блокировать ФРЭС (например, пагептаниб) или ФРЭСР, нейтрализующее анти-ФРЭСР антитело, низкомолекулярный ингибитор тирозинкиназ ФРЭСР, анти-ФРЭС DARPin (например, абиципар пегол), малые интерферирующие РНК, которые ингибирует экспрессию ФРЭС или ФРЭСР, ингибитор тирозинкиназы ФРЭСР (например, 4-(4-бромо-2-фторанилино)-6-метокси-7-(1-метилпиперидин-4-илметокси)хиназолин (ZD6474), 4-(4-фтор-2-метилиндол-5-илокси)-6-метокси-7-(3-пирролидин-1-илпропокси)хиназолин (AZD2171), ваталаниб (PTK787), семаксаминиб (SU5416; SUGEN), и SUTENT (сунитиниб)), и их комбинации. В некоторых случаях биспецифическое анти-ФРЭС антитело связывается со второй биологической молекулой, включая, но не ограничиваясь ими, ИЛ-1β; ИЛ-6; ИЛ-6R; ТцФР (например, PDGF-BB); ангиопоэтин; ангиопоэтин 2; Tie2; S1P; интегрины αvβ3, αvβ5, и α5β1; бетацеллюлин; апелин/APJ; эритропоэтин; фактор D комплемента; ФНО-α; HtrA1; рецептор ФРЭС (например, ФРЭСР1, ФРЭСР2, ФРЭСР3, mbФРЭСР, или sФРЭСР); ST-2-рецептор; и белки, генетически связанные с риском возрастной макулярной дегенерации (ВМД), такие как компоненты пути комплемента С2, фактор В, фактор Н, CFHR3, C3b, С5, С5а, и С3а; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; ИЛ-8; CX3CR1; TLR3; TLR4; СЕТР; LIPC; COL10A1; и TNFRSF10A. Например, в некоторых случаях дополнительное соединение представляет собой биспецифическое антитело (например, анти-ФРЭС/анти-Ang2 биспецифическое антитело, такое как RG-7716 или любое анти-ФРЭС/анти-Ang2 биспецифическое антитело, раскрытое в WO 2010/069532 или WO 2016/073157, или его вариант.
Другие подходящие антиангиогенные агенты, которые могут быть введены в комбинации с антителом (например, анти-ФРЭС антителом, сконструированным введением цистеина) или конъюгатом антитела (например, монодисперсным конъюгатом ГК) согласно изобретению для лечения заболевания глаз (например, ВМД, ДМО, ДР или ОВС), включают кортикостероиды, ангиостатические стероиды, анекортава ацетат, ангиостатин, эндостатин, ингибиторы тирозинкиназы, ингибиторы матриксной металлопротеиназы (ММР), белок-3, связывающий инсулиноподобный фактор роста, (IGFBP3), антагонисты фактора стромальных клеток (SDF-1) (например, анти-SDF-1 антитела), фактор пигментного эпителия (PEDF), гамма-секретаза, дельта-подобный лиганд-4, антагонисты интегрина, антагонисты фактора, индуцируемого гипоксией, (HIF)-1α, антагонисты протеинкиназы CK2, агенты, которые ингибируют стволовые клетки (например, эндотелиальные клетки-предшественники), находящиеся в месте неоваскуляризации, (например, антитело против сосудистого эндотелиального кадгерина (CD-144) и/или анти-SDF-1 антитело), и их комбинации.
В другом примере, в некоторых случаях, антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина) или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) согласно данному изобретению может быть введен в комбинации с агентом, который обладает активностью против неоваскуляризации для лечения заболевания глаза (например, ВМД, ДМО, ДР или ОВС), таким как противовоспалительное лекарственное средство, ингибитор мишени рапамицина в клетках млекопитающих (mTOR) (например, рапамицин, AFINITOR (эверолимус), и TORISEL (темсиролимус)), циклоспорин, антагонист фактора некроза опухоли (ФНО) (например, анти-ФНО-α антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, инфликсимаб, адалимумаб, цертолизумаб пегол и голимумаб) или слитый белок растворимого рецептора (например, этанерцепт)), антикомплементный агент, нестероидное противовоспалительное средство (НПВС), или их комбинации.
В качестве еще одного примера, в некоторых случаях, антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина) или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) согласно изобретению может быть введено в комбинации с агентом, который является нейропротекторным и потенциально может уменьшить прогрессирование сухой формы ВМД во влажную форму ВМД, таким как класс препаратов, называемых «нейростероидами», которые включают такие препараты, как дегидроэпиандростерон (ДЭА) (торговые наименования: PRASTERA™ и FIDELIN), дегидроэпиандростерон-сульфат, и прегненолон-сульфат.
Любой подходящий терапевтический агент против ВМД может быть введен в качестве дополнительного терапевтического агента в комбинации с антителом (например, анти-ФРЭС антителом, сконструированным введением цистеина) или конъюгатом антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) согласно изобретению для лечения заболевания глаз (например, ВМД, ДМО, ДР или ОВС), включая, но не ограничиваясь этим, антагонист ФРЭС, например, анти-ФРЭС антитело (например, LUCENTIS (ранибизумаб), RTH-258 (ранее называвшийся ESBA-1008, фрагмент анти-ФРЭС одноцепочечного антитела; Novartis), или биспецифическое анти-ФРЭС антитело (например, анти-ФРЭС/анти-ангиопоэтин 2 биспецифическое антитело, такое как RG-7716; Roche)), слитый белок растворимого рецептора ФРЭС (например, EYLEA (афлиберцепт)), анти-ФРЭС DARPin (например, абиципар пегол; Molecular Partners AG/Allergan), или анти-ФРЭС аптамер (например, MACUGEN (пегаптаниб натрия)); антагонист тромбоцитарного фактора роста (ТцФР), например, анти-ТцФР антитело, анти-PDGFR антитело (например, REGN2176-3), анти-PDGF-BB пегилированный аптамер (например, FOVISTA; Ophthotech/Novartis), слитый белок растворимого рецептора PDGFR, или двойной антогнист ТцФР/ФРЭС (например, низкомолекулярный ингибитор (например, DE-120 (Santen) или Х-82 (TyrogeneX)) или биспецифическое анти-ТцФР/анти-ФРЭС антитело)); VISUDYNE (вертепорфин) в комбинации с фотодинамической терапией; антиоксидант; антагонист системы комплемента, например, антагонист фактора комплемента С5 (например, низкомолекулярный ингибитор (например, ARC-1905; Opthotech) или анти-С5 антитело (например, LFG-316; Novartis), антагонист пропердина (например, антитело против пропердина, например, CLG-561; Alcon), или антагонист фактора комплемента D (например, антитело против фактора комплемента D, например, лампализумаб; Roche)); модификатор цикла превращений родопсина (например, эмиксустата гидрохлорид); скваламин (например, OHR-102; Ohr Pharmaceutical); витаминные и минеральные добавки (например, те, которые описаны в исследовании 1 (AREDS1; цинк и/или антиоксиданты) и исследовании 2 возрастных заболеваний глаз (AREDS2; цинк, антиоксиданты, лютеин, зеаксантин, и/или омега-3 жирные кислоты)); клеточную терапию, например, NT-501 (Renexus); РН-05206388 (Pfizer), трансплантацию клеток huCNS-SC (StemCells), CNTO-2476 (Janssen), OpRegen (Cell Cure Neurosciences), или трансплантацию клеток MA09-hRPE (Ocata Therapeutics); антагонист тканевого фактора (например, hl-con1; Iconic Therapeutics); агонист альфа-адренергических рецепторов (например, бримонидина тартрат); пептидную вакцину (например, S-646240; Shionogi); антагонист бета-амилоида (например, моноклонольное антитело против бета-амилоида, например, GSK-933776); антагонист S1P (например, анти-S1P-антитело, например, iSONEP™; Lpath Inc); антагонист ROBO4 (например, анти-ROBO4 антитело, например, DS-7080a; Daiichi Sankyo); лентивирусный вектор, экспрессирующий эндостатин и ангиостатин (например, RetinoStat); и любые их комбинации. В некоторых случаях, терапевтические агенты против ВМД (в том числе любой из предшествующих терапевтических агентов против ВМД) могут быть совместно составлены. Например, анти-PDGFR антитело REGN2176-3 может быть совместно составлено с афлиберцептом (EYLEA). В некоторых случаях такой совместный препарат можно вводить в комбинации с антителом согласно изобретению. В некоторых случаях заболевание глаз представляет собой ВМД (например, влажную ВМД).
Антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина), или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) согласно изобретению можно вводить в комбинации с LUCENTIS (ранибизумабом) для лечения заболевания глаз (например, ВМД, ДМО, ДР или ОВС). LUCENTIS (ранибизумаб) может быть введен, например, в дозе 0,3 мг/глаз или 0,5 мг/глаз путем интравитреальной инъекции, например, каждый месяц. В некоторых случаях заболевание глаз представляет собой ВМД (например, влажную ВМД).
Антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина), или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) согласно изобретению можно вводить в комбинации с EYLEA (афлиберцептом) для лечения заболевания глаз (например, ВМД, ДМО, ДР или ОВС). EYLEA (афлиберцепт) может быть введен, например, в дозе 2 мг/глаз путем интравитреальной инъекции, например, каждые четыре недели (Q4W), или Q4W в течение первых трех месяцев, с последующими инъекциями один раз в два месяца в виде поддерживающей дозы. В некоторых случаях заболевание глаз представляет собой ВМД (например, влажную ВМД).
Антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина), или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) согласно изобретению можно вводить в комбинации с MACUGEN (пегаптанибом натрия) для лечения заболевания глаз (например, ВМД, ДМО, ДР или ОВС). MACUGEN (пегаптаниб натрия) можно вводить, например, в дозе 0,3 мг/глаз путем интравитреальной инъекции каждые шесть недель. В некоторых случаях заболевание глаз представляет собой ВМД (например, влажную ВМД).
2
Антитело (анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина), или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) согласно изобретению можно вводить в комбинации с VISUDYNE (вертепорфином) в комбинации с фотодинамической терапией для лечения заболевания глаз (например, ВМД, ДМО, ДР или ОВС). VISUDYNE может быть введен, например, путем внутривенной инфузии в любой подходящей дозе (например, 6 мг/м площади поверхности тела) и могут быть введены один раз каждые три месяца (например, в течение 10 минут инфузии). В некоторых случаях заболевание глаз представляет собой ВМД (например, влажную ВМД).
Антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина), или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) согласно изобретению можно вводить в комбинации с антагонистом ТцФР для лечения заболевания глаз (например, ВМД, ДМО, ДР или ОВС). Иллюстративные антагонисты ТцФР, которые могут быть использованы в комбинации с антителом согласно изобретению включают анти-ТцФР антитело, анти-PDGFR антитело, низкомолекулярный ингибитор (например, скваламин), анти-PDGF-B пегилированный аптамер, такой как FOVISTA (Е10030; Ophthotech/Novartis), или двойной антагонист ТцФР/ФРЭС (например, низкомолекулярный ингибитор (например, DE-120 (Santen) или Х-82 (TyrogeneX)) или биспецифическое анти-ТцФР/анти-ФРЭС антитело). Например, FOVISTA можно вводить в качестве вспомогательной терапии с антителом согласно изобретению. FOVISTA можно вводить в любой подходящей дозе, например, от 0,1 мг/глаз до 2,5 мг/глаз, например, 0,3 мг/глаз или 1,5 мг/глаз, например, путем интравитреальной инъекции, например, каждые четыре недели (Q4W). OHR-102 (офтальмологический раствор скваламина лактата, 0,2%) можно вводить с помощью глазных капель, например, два раза в сутки. OHR-102 может быть введен в комбинации с антагонистами ФРЭС, такими как LUCENTIS или EYLEA. В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела согласно изобретению можно вводить в комбинации с OHR-102, LUCENTIS, и/или EYLEA. В некоторых случаях заболевание глаз представляет собой ВМД (например, влажную ВМД).
Антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина), или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) согласно изобретению можно вводить в комбинации с RTH-258 для лечения заболевания глаз (например, ВМД, ДМО, ДР или ОВС). РУТ-258 может быть введен, например, путем интравитреальной инъекции или глазной инфузией. Для интравитреальной инъекции, RTH-258 может быть введен в любой подходящей дозе (например, 3 мг/глаз или 6 мг/глаз), например, один раз каждые четыре недели (Q4W) в течение первых трех месяцев, в виде нагрузочной дозы, с последующей инъекцией каждые 12 недель (Q12W) или каждые восемь недель (Q8W) в виде поддерживающей дозы. В некоторых случаях заболевание глаз представляет собой ВМД (например, влажную ВМД).
Антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина), или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) согласно изобретению можно вводить в комбинации с абиципаром пегола для лечения заболевания глаз (например, ВМД, ДМО, ДР или ОВС). Абиципар пегол можно вводить, например, путем интравитеральной инъекции. Абиципар пегол можно вводить в любой подходящей дозе (например, 1 мг/глаз, 2 мг/глаз, 3 мг/глаз, 4 мг/глаз, или 4,2 мг/глаз), например, один раз каждые четыре недели (Q4W) в течение первых трех месяцев, в виде нагрузочной дозы, с последующей инъекцией каждые 12 недель (Q12W) или каждые восемь недель (Q8W) в виде поддерживающей дозы. В некоторых случаях заболевание глаз представляет собой ВМД (например, влажную ВМД).
Любые подходящий терапевтический агент против ДМО и/или ДР можно вводить в комбинации с антителом (например, анти-ФРЭС антителом, сконструированным введением цистеина), конъюгатом антитела (например, конъюгатом монодисперсной ГК) согласно изобретению для лечения заболевания глаз (например, ВМД, ДМО, ДР или ОВС), включая, но не ограничиваясь ими, антагонист ФРЭС (например, LUCENTIS или EYLEA), кортикостероид (например, кортикостероидный имплантат (например, OZURDEX (интравитреальный имплантат дексаметазона) или ILUVIEN (интравитреальный имплантат флуоцинолона ацетонид)) или кортикостероид, составленный для введения путем интравитреальной инъекции (например, триамцинолона ацетонид)), или их комбинации. В некоторых случаях заболевание глаз представляет собой ДМО и/или ДР.
Антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина), или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) согласно изобретению можно вводить в комбинации с LUCENTIS (ранибизумабом) для лечения заболевания ДМО и/или ДР (например, НПДР или ПДР). LUCENTIS (ранибизумаб) может быть введен, например, в дозе 0,3 мг/глаз или 0,5 мг/глаз путем интравитреальной инъекции, например, каждые четыре недели (Q4W).
Антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина), или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) согласно изобретению можно вводить в комбинации с EYLEA (афлиберцептом) для лечения ДМО и/или ДР (например, НПДР или ПДР). EYLEA (афлиберцепт) могут быть введены, например, в дозе 2 мг/глаз путем интравитреальной инъекции, например, каждые четыре недели (Q4W), или Q4W в течение первых пяти месяцев, с последующими инъекциями один раз каждые восемь недель (Q8W) в виде поддерживающей дозы.
Антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина), или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) согласно изобретению можно вводить в комбинации с OZURDEX (интравитреальным имплантатом дексаметазона) для лечения ДМО и/или ДР. OZURDEX можно вводить в виде интравитреального имплантата с 0,7 мг дексаметазона, который можно вводить каждые шесть месяцев.
Антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина), или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) согласно изобретению можно вводить в комбинации с ILUVIEN (интравитреальным имплантатом дексаметазона) для лечения ДМО и/или ДР. OZURDEX можно вводить в виде интравитреального имплантата с 0,19 мг фторцинолона ацетонида, который может высвобождаться со скоростью 0,25 мкг/сутки до около 36 месяцев.
В некоторых случаях схема лечения TAO/PRN («лечить и наблюдать»/по мере необходимости) или схема лечения ТАЕ (лечение с удлинением интервалов между введениями доз препарата) может быть использована для введения терапевтического агента против ВМД (например, ранибизумаба или афлиберцепта) в комбинации с антителом (например, анти-ФРЭС антителом, сконструированным введением цистеина) или конъюгатом антитела (например, конъюгатом монодисперсной ГК) согласно изобретению. Для схемы TAO/PRN, после первоначальных интравитреальных инъекций каждые четыре недели (Q4W) (как правило, в течение около 3 месяцев), субъекта наблюдали ежемесячно или раз в месяц (или даже через более длительные интервалы) с инъекциями, вводимыми в случае возникновения признаков активности заболевания (например, снижения остроты зрения или жидкости, оцененной с помощью оптической когерентной томографии (ОКТ)). Для схемы ТАЕ субъект может получать лечение каждые четыре недели (Q4W), с последующим удлинением интервала лечения при фиксированном числе недель (например, 2-х недель) для каждого последующего визита до максимального интервала (например, каждые 6 недель, каждые 8 недель, каждые 10 недель, или каждые 12 недель). Глаз(а) можно наблюдать и обрабатывать при каждом визите, даже если нет никаких признаков активности заболевания. Если макула становится влажной (например, по ОКТ), интервал для инъекций может быть сокращен (например, -2 недель) до тех пор, пока макула снова не станет сухой. В некоторых случаях заболевание глаз представляет собой ВМД (например, влажную ВМД).
Такие комбинированные терапии, указанные ранее, охватывают комбинированное введение (в котором два или более терапевтических агента включены в одну и ту же или отдельные композиции), а также раздельное введение, и в этом случае, введение антитела или конъюгата антитела согласно изобретению может происходить до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического агента или агентов. В одном варианте осуществления введение антитела или конъюгата антитела, и введение дополнительного терапевтического агента происходит каждые около один, два, три, четыре или пять месяцев, или каждые около одна, две или три недели, или каждые около одни, двое, трое, четверо, пять или шесть суток.
Антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина), или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) согласно изобретению (и любой дополнительный терапевтический агент) для профилактики или лечения заболевания или патологического состояния глаз могут быть введены любым подходящим способом, включая, но не ограничиваясь этим, например, окулярной, интраокулярной, и/или интравитреальной инъекцией, и/или инъекцией в околосклеральную область, и/или инъекций в субтеноновое пространство, и/или инъекцией в супрахориоидальное пространство, и/или местного применения в виде глазных капель и/или мази. Такие антитела или конъюгаты антител могут быть доставлены с помощью различных способов, например, интравитреально в виде устройства, и/или депо, которое обеспечивает медленное высвобождение соединения в стекловидное тело, включая и те способы, которые описаны в ссылках, таких как Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006). В одном примере устройство может быть в виде мини-насоса, и/или матрицы, и/или системы пассивной диффузии, и/или инкапсулированных клеток, которые высвобождают соединения в течение длительного периода времени (Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006). Дополнительные подходы, которые могут быть использованы, описаны в разделе G ниже.
Композиции для окулярного, интраокулярного или интравитреального введения могут быть получены при помощи способов и с использованием вспомогательных веществ, известных в данной области техники. Важной особенностью для эффективного лечения является правильное проникновение через глаз. В отличие от заболеваний передней части глаза, куда лекарственные средства могут быть доставлены местно, заболевание сетчатки, как правило, имеет преимущество из-за более сайт-специфического подхода. Глазные капли и мазь редко проникает в задную часть глаза, а гематоофтальмический барьер препятствует проникновению системно вводимых лекарственных средств в глазную ткань. Соответственно, предпочтительный метод для доставки лекарственных средств для лечения заболеваний сетчатки, таких как ВМД и ХНВ, представляет собой, как правило, прямую интравитреальную инъекцию. Интравитреальные инъекции обычно повторяют с интервалами, которые зависят от состояния пациента, а также свойств и периода полувыведения доставленного лекарственного средства. Дополнительные подходы, которые могут быть использованы, описаны в разделе G ниже.
Количество антитела или конъюгата антитела, которое будет эффективным в лечении конкретного заболевания или патологического состояния глаз, будет зависеть от природы заболевания или патологического состояния, и может быть определено стандартными клиническими методами. Там, где это возможно, желательно определить кривую доза-эффект фармацевтических композиций согласно изобретению сначала in vitro, а затем в пригодных животных модельных системах перед тестированием в организме человека.
Дополнительные подходящие способы введения включают парентеральное, внутрилегочное и интраназальное и, если необходимо для местной терапии, внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное и подкожное введение. Введение дозы можно проводить любым удобным способом, например, путем инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, частично в зависимости от того, является ли введение кратковременным или постоянным. В данном документе рассматриваются различные схемы дозирования, включая, без ограничений, одноразовое или многоразовые введения через временные промежутки, в виде одноразовой дозы введения и импульсной инфузии. В некоторых случаях конъюгат антитела согласно изобретению может быть введен внутривенно, внутримышечного, интрадермально, чрескожно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутриочагово, интракраниально, внутрисуставно, внутрь простаты, внутриплеврально, интратрахеально, интратекально, интраназально, внутривагинально, ректально, местно, внутриопухолево, перитонеально, интравентрикулярно, подкожно, субконъюнктивально, интравезикулярно, мукозально, интраперикардиально, внутрипуповинно, интраорбитально, перорально, местно, трансдермально, путем ингаляции, путем инъекции, путем имплантации, путем инфузии, путем длительной инфузии, путем локализованной перфузии непосредственно через клетки-мишени, при помощи катетера, при помощи лаважа, в кремах или в липидных композициях.
Для профилактики или лечения заболевания подходящая доза антитела (например, анти-ФРЭС антитела, сконструированного введением цистеина) или конъюгата антитела (например, конъюгата монодисперсной ГК) согласно изобретению (используемого самостоятельно или в комбинации с одним или более другими дополнительными терапевтическими средствами) будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, тяжести и течения заболевания, того, вводится ли антитело с профилактической или терапевтической целью, предыдущей терапии, истории болезни пациента, чувствительности к антителу и предписания лечащего врача. Антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина) или конъюгат антитела (например, конъюгат монодисперсной ГК) подходящим образом вводят пациенту за один раз или в течение курса лечения. В зависимости от типа и степени тяжести заболевания, от около 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,6 мг/кг, 0,8 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг или 10 мг/кг) антитела или конъюгата антитела может представлять собой первоначальную предполагаемую дозировку для введения пациенту, например, с помощью одного или более отдельных введений, или путем непрерывной инфузии. В некоторых вариантах осуществления используемое количество антитела или конъюгата антитела составляет от около 0,01 мг/кг до около 45 мг/кг, от около 0,01 мг/кг до около 40 мг/кг, от около 0,01 мг/кг до около 35 мг/кг, от около 0,01 мг/кг до около 30 мг/кг, от около 0,01 мг/кг до около 25 мг/кг, от около 0,01 мг/кг до около 20 мг/кг, от около 0,01 мг/кг до около 15 мг/кг, от около 0,01 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 0,01 мг/кг до около 5 мг/кг, или от около 0,01 мг/кг до около 1 мг/кг. Для получения конъюгатов антител, подбор дозы может быть основан на массе компонента антитела в конъюгате. Одна типичная суточная доза может находится в диапазоне от около 1 мкг/ кг до 100 мг/ кг или более в зависимости от вышеуказанных факторов. В случае повторных введений в течение нескольких суток или более, в зависимости от состояния, лечение, как правило, проводят до достижения желаемой степени подавления симптомов заболевания.
В некоторых вариантах осуществления способы могут дополнительно включать дополнительную терапию. Дополнительная терапия может представлять собой лучевую терапию, хирургию, химиотерапию, генную терапию, ДНК-терапию, вирусную терапию, РНК-терапию, иммунотерапию, трансплантацию костного мозга, нанотерапию, терапию моноклональными антителами или комбинацию вышеперечисленного. Дополнительная терапия может быть в виде адъювантной или неоадъювантной терапии. В некоторых вариантах осуществления дополнительная терапия представляет собой введение низкомолекулярного ферментативного ингибитора или антиметастатического агента. В некоторых вариантах осуществления дополнительная терапия представляет собой введение агентов, ограничивающих побочные эффекты, (например, агенты, предназначенные для уменьшения возникновения и/или степени тяжести побочных эффектов лечения, такие как агенты против тошноты и т.д.). В некоторых вариантах осуществления дополнительная терапия представляет собой лучевую терапию. В некоторых вариантах осуществления дополнительная терапия представляет собой хирургическую операцию. В некоторых вариантах осуществления дополнительная терапия представляет собой комбинацию лучевой терапии и хирургической операции. В некоторых вариантах осуществления дополнительная терапия представляет собой гамма-облучение. В некоторых вариантах осуществления дополнительная терапия может представлять собой отдельное введение одного или более из описанных выше терапевтических агентов.
Следует понимать, что любой из вышеуказанных составов или любой из терапевтических способов могут быть осуществлены с использованием иммуноконъюгата согласно изобретению вместо или в дополнение к анти-ФРЭС антителу.
Следует понимать, что любой из вышеуказанных составов или любой из терапевтических способов могут быть осуществлены с использованием конъюгата антитела согласно изобретению (например, любого, описанного в данном документе, например, в разделе G ниже).
F. Промышленные изделия
В другом аспекте изобретения предложено промышленное изделие, содержащее материалы, применяемые для лечения и/или профилактики вышеописанных нарушений. Промышленное изделие содержит контейнер и этикетку или листок-вкладыш в упаковке, нанесенный на или связанный с контейнером. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы, пакеты для растворов для внутривенного введения и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, одну или в комбинации с другой композицией, эффективной в лечении, профилактике и/или диагностировании патологического состояния, и может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет для растворов для внутривенного введения или флакон с пробкой, прокалываемой с помощью иглы для подкожных инъекций). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой композицию антител (например, антитело (например, анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина) или конъюгат такого антитела) согласно изобретению. На этикетке или листке-вкладыше в упаковке указано то, что композиция используется для выбранного патологического состояния. Кроме того, промышленное изделие может содержать (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, при этом композиция содержит антитело или композицию таких антител согласно изобретению; и (b) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, при этом композиция содержит дополнительный цитотоксический или другой терапевтический агент. Промышленное изделие в данном варианте осуществления изобретения может дополнительно содержать листок-вкладыш в упаковке с указанием того, что композиция(и) может быть использована для лечения конкретного патологического состояния. В альтернативном или дополнительном варианте изделие может дополнительно содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (БВДИ), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Дополнительно могут быть включены другие вещества, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, включая другие буферы, растворители, фильтры, иглы и шприцы.
Понятно, что любое из указанных выше промышленных изделий может содержать любое из антител или конъюгаты таких антител, описанные в данном документе, и/или какие-либо дополнительные терапевтические агенты.
G. Подходы к доставке глазных лекарственных средств пролонгированного действия
Изобретение обеспечивает композиции для лечения заболеваний глаз, которые могут быть использованы для доставки антител пролонгированного действия (например, анти-ФРЭС антитела (включая любое анти-ФРЭС антитело, описанное в данном документе, такой как G6.31 AARR)) в глаз. Например, изобретение обеспечивает конъюгаты антител (например, конъюгаты монодисперсной ГК), которые содержат анти-ФРЭС антитело, описанное в данном документе, (например, конъюгаты Fab, Fab-C, или антитела, сконструированного введением цистеина, (например, тио-Fab)). Изобретение также относится к устройствам, которые могут быть использованы для окулярного введения антитела или конъюгата антитела, описанного в данном документе. Кроме того, изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, которые содержат антитела или конъюгаты антител, описанные в данном документе. Эти композиции могут быть использованы в любом из терапевтических способов, описанных в данном документе, например, способы лечения заболевания глаз (например, ВМД (например, влажной ВМД), ДМО, ДР (например, НПДР или ПДР), или ОВС (например, ОЦВС или ОВВС)).
1. Конъюгаты антитела
Изобретение обеспечивает конъюгаты антитела, которые содержат антитело (например, анти-ФРЭС антитело) и монодисперсный полимер, ковалентно присоединенный к антителу. Антитело (например, анти-ФРЭС антитело) может быть ковалентно присоединено к монодисперсному полимеру необратимым или обратимым образом. Любой подходящий монодисперсный полимер может быть использован, в том числе те, которые описаны в данном документе, или другие, известные в данной области техники.
Изобретение обеспечивает конъюгат антитела, который содержит антитело и монодисперсный полимер (например, монодисперсный полимер ГК), ковалентно присоединенный к антителу. Полимер может иметь индекс полидисперсности (PDI), равный около 1,1 или ниже. Следует понимать, что значение PDI может относиться к значению PDI полимера, используемого для получения конъюгата антитела. Например, в некоторых вариантах осуществления полимер имеет PDI от 1,0 до около 1,1 (например, от 1 до около 1,1, от 1 до около 1,09, от 1 до около от 1 до около 1,07, от 1 до около 1,06, от 1 до около 1,05, от 1 до около 1,04, от 1 до около 1,03, от 1 до около 1,02, от 1 до около 1,01, от 1 до около 1,005, от около 1,001 до около 1,1, от около 1,001 до около 1,1, от около 1,001 до около от около 1,001 до около 1,08, от около 1,001 до около 1,07, от около 1,001 до около 1,06, от около 1,001 до около 1,05, от около 1,001 до около 1,04, от около 1,001 до около 1,03, от около 1,001 до около 1,02, от около 1,001 до около 1,01, от около 1,001 до около 1,005, от около 1,001 до около 1,004, от около 1,001 до около 1,003, от около 1,001 до около 1,002, от около 1,0001 до около 1,1, от около 1,0001 до около 1,09, от около 1,0001 до около 1,08, от около 1,0001 до около 1,07, от около 1,0001 до около 1,06, от около 1,0001 до около 1,05, от около 1,0001 до около 1,04, от около 1,0001 до около 1,03, от около 1,0001 до около 1,02, от около 1,0001 до около 1,01, от около 1,0001 до около 1,005, от около 1,0001 до около 1,004, от около 1,0001 до около 1,003, от около 1,0001 до около 1,002, или от около 1,0001 до около 1,005).
Например, в некоторых вариантах осуществления монодисперсный полимер (например, монодисперсный полимер ГК) имеет PDI, равный 1,001, около 1,0001, около 1,00001, около 1,000001, около 1,0000001, или ниже. В некоторых вариантах осуществление монодисперсный полимер (например, монодисперсный полимер ГК) имеет PDI, равный 1,0, около 1,001, около 1,002, около 1,003, около 1,004, около 1,005, около 1,006, около 1,007, около 1,008, около 1,009, около 1,01, около 1,011, около 1,012, около 1,013, около 1,014, около 1,015, около 1,016, около 1,017, около 1,018, около 1,019, около 1,02, около 1,021, около 1,022, около 1,023, около 1,024, около 1,025, около 1,026, около 1,027, около 1,028, около 1,029, около 1,03, около 1,031, около 1,032, около 1,033, около 1,034, около 1,035, около 1,036, около 1,037, около 1,038, около 1,039, около 1,04, около 1,041, около 1,042, около 1,043, около 1,044, около 1,045, около 1,046, около 1,047, около 1,048, около 1,049, около 1,05, около 1,051, около 1,052, около 1,053, около 1,054, около 1,055, около 1,056, около 1,057, около 1,058, около 1,059, около 1,06, около 1,061, около 1,062, около 1,063, около 1,064, около 1,065, около 1,066, около 1,067, около 1,068, около 1,069, около 1,07, около 1,071, около 1,072, около 1,073, около 1,074, около 1,075, около 1,076, около 1,077, около 1,078, около 1,079, около 1,08, около 1,081, около 1,082, около 1,083, около 1,084, около 1,085, около 1,086, около 1,087, около 1,088, около 1,089, около 1,09, около 1,091, около 1,092, около 1,093, около 1,094, около 1,095, около 1,096, около 1,097, около 1,098, около 1,099, или около 1,1. В некоторых вариантах осуществления полимер (например, полимер ГК) имеет PDI около 1,001.
Монодисперсный полимер может представлять собой гидрофильный полимер или гидрофобный полимер. Следует понимать, что гидрофильный полимер может представлять собой растворимый в воде полимер. Любой подходящий гидрофильный полимер может быть использован, например, гидрофильный полимер описан в публикации международной патентной заявки № WO 2011/066417. и/или Pelegri-O'Day et al. J. Am. Chem. Soc. 136:14323-14332, 2014, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. Иллюстративные неограничивающие гидрофильные полимеры, которые могут быть использованы, включают гиалуроновую кислоту, (ГК), полиэтиленгликоль (ПЭГ; также известный как поли(этиленгликоль)) (например, линейный ПЭГ, разветвленный ПЭГ, гребнеобразный ПЭГ, и дендритный ПЭГ), поли[этиленоксид)-ко-(метилен-этиленоксид)], поли(поли(этиленгликоль) метиловый эфир метакрилат) (pPEGMA), агарозу, альгинат, каррагинаны, карбоксиметилцеллюлозу, целлюлозу, производные целлюлозы, хитозан, хондроитинсульфат, коллаген, дерматансульфат, декстран, сульфат декстрана, фибрин, фибриноген, фибронектин, фукоидан, желатин, гликозаминогликаны (GAG), гликополимер, гепарин, гепарин сульфат, высоко разветвленный полисахарид (например, дендример галактозы), кератансульфат, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС), поли(N-(2-гидроксипропил)метакриламид) (рНРМА), пектины, производные пектина, пентозан полисульфат, крахмал, гидроксилэтилкрахмалы (HES), стирол, витронектин, поли(акриловую кислоту), поли(метакриловую кислоту), поли(акриламид), поли(акриловую кислоту), поли(амины), поли(аминокислоты), поли(карбоксибетаин) (РСВ), полиэлектролиты, поли(глутаминовую кислоту) (PGA), поли(глицерин) (PG) (например, линейные, среднефункциональный, гиперразветвленный, или линейный гиперразветвленный PG), поли(малеиновую кислоту), поли(2-оксазолин) (POZ), поли(2-этил-2-оксазолин, полисиаловую кислоту (PSA), полистирол, производные полистирола (например, заряженные производные полистирола), поли(стиролсульфонат-ко-РЕСМА), поливинилпирролидон (PVP), поли(N-акрилоилморфолин) (pNAcM), и их сополимеры. В некоторых случаях полимер представляет собой гидрофобный полимер, например, полилактид ко-гликолид (PLGA), полилактид (PLA), и полигликолидом (PGA). Полимер может быть биоразлагаемым и/или биологически совместимым. В конкретных вариантах осуществления полимер представляет собой ГК.
4
4
В качестве примера, монодисперсный полимер (например, полимер ГК) может содержать любое подходящее количество мономеров, например, от 2 до около 1×10 мономеров (например, около 10, около 50, около 100, около 200, около 300, около 400, около 500, около 600, около 700, около 800, около 900, около 1000, около 2000, около 3000, около 4000, около 5000, около 6000, около 7000, около 8000, около 9000 или около 1×10 мономеров), или больше. Например, полимер (например, полимер ГК) может содержать от около 50 до около 250 мономеров, от около 50 до около 500 мономеров, от около 50 до около 1000 мономеров, от около 50 до около 2000 мономеров, от около 50 до около 3000 мономеров, от около 50 до около 4000 мономеров, от около 50 до около 5000 мономеров, от около 50 до около 6000 мономеров, от около 50 до около 7000 мономеров, от около 50 до около 8000 мономеров, от около 50 до около 9000 мономеров, от около 50 до около 10000 мономеров, от около 100 до около 250 мономеров, от около 100 до около 500 мономеров, от около 100 до около 1000 мономеров, от около 100 до около 2000 мономеров, от около 100 до около 3000 мономеров, от около 100 до около 4000 мономеров, от около 100 до около 5000 мономеров, от около 100 до около 6000 мономеров, от около 100 до около 7000 мономеров, от около 100 до около 8000 мономеров, от около 100 до около 9000 мономеров, от около 100 до около 10000 мономеров, от около 250 до около 500 мономеров, от около 250 до около 1000 мономеров, от около 250 до около 2000 мономеров, от около 250 до около 3000 мономеров, от около 250 до около 4000 мономеров, от около 250 до около 5000 мономеров, от около 250 до около 6000 мономеров, от около 250 до около 7000 мономеров, от около 250 до около 8000 мономеров, от около 250 до около 9000 мономеров, от около 250 до около 10000 мономеров, от около 500 до около 1000 мономеров, от около 500 до около 2000 мономеров, от около 500 до около 3000 мономеров, от около 500 до около 4000 мономеров, от около 500 до около 5000 мономеров, от около 500 до около 6000 мономеров, от около 500 до около 7000 мономеров, от около 500 до около 8000 мономеров, от около 500 до около 9000 мономеров, или от около 500 до около 10000 мономеров. В некоторых случаях полимер (например, полимер ГК) может содержать около 500 мономеров.
Изобретение обеспечивает конъюгат антитела, который содержит антитело (например, анти-ФРЭС антитело, такое как G6.31 AARR) ковалентно присоединенное к монодисперсному полимеру ГК. Такие конъюгаты антител иногда упоминаются в данном документе как «монодисперсные конъюгаты ГК». Монодисперсный полимер ГК может иметь индекс полидисперсности (PDI), равный около 1,1 или ниже. Например, в некоторых вариантах осуществления монодисперсный полимер ГК имеет PDI от 1,0 до около 1,1 (например, от 1 до около 1,1, от 1 до около 1,09, от 1 до около 1,08, от 1 до около 1,07, от 1 до около 1,06, от 1 до около 1,05, от 1 до около 1,04, от 1 до около 1,03, от 1 до около 1,02, от 1 до около 1,01, от 1 до около 1,005, от около 1,001 до около 1,1, от около 1,001 до около 1,1, от около 1,001 до около 1,09, от около 1,001 до около 1,08, от около 1,001 до около 1,07, от около 1,001 до около 1,06, от около 1,001 до около 1,05, от около 1,001 до около 1,04, от около 1,001 до около 1,03, от около 1,001 до около 1,02, от около 1,001 до около 1,01, от около 1,001 до около 1,005, от около 1,001 до около 1,004, от около 1,001 до около 1,003, от около 1,001 до около 1,002, от около 1,0001 до около 1,1, от около 1,0001 до около 1,09, от около 1,0001 до около 1.08, от около 1,0001 до около 1,07, от около 1,0001 до около 1,06, от около 1,0001 до около 1,05, от около 1,0001 до около 1,04, от около 1,0001 до около 1,03, от около 1,0001 до около 1,02, от около 1,0001 до около 1,01, от около 1,0001 до около 1,005, от около 1,0001 до около 1,004, от около 1,0001 до около 1,003, от около 1,0001 до около 1,002, или от около 1,0001 до около 1,005).
Например, в некоторых вариантах осуществления монодисперсный полимер ГК имеет PDI, равный 1,001, около 1,0001, около 1,00001, около 1,000001, около 1,0000001, или ниже. В некоторых вариантах осуществление монодисперсный полимер ГК имеет PDI, равный 1,0, около 1,001, около 1,002, около 1,003, около 1,004, около 1,005, около 1,006, около 1,007, около 1,008, около 1.009, около 1,01, около 1,011, около 1,012, около 1,013, около 1,014, около 1,015, около 1,016, около 1,017, около 1,018, около 1,019, около 1,02, около 1,021, около 1,022, около 1,023, около 1,024, около 1,025, около 1,026, около 1,027, около 1,028, около 1,029, около 1,03, около 1,031, около 1,032, около 1,033, около 1,034, около 1,035, около 1,036, около 1,037, около 1,038, около 1,039, около 1,04, около 1,041, около 1,042, около 1,043, около 1,044, около 1,045, около 1,046, около 1,047, около 1,048, около 1,049, около 1,05, около 1,051, около 1,052, около 1,053, около 1,054, около 1,055, около 1,056, около 1,057, около 1,058, около 1,059, около 1,06, около 1,061, около 1,062, около 1,063, около 1,064, около 1,065, около 1,066, около 1,067, около 1,068, около 1,069, около 1,07, около 1,071, около 1,072, около 1,073, около 1,074, около 1,075, около 1,076, около 1,077, около 1,078, около 1,079, около 1,08, около 1,081, около 1,082, около 1,083, около 1,084, около 1,085, около 1,086, около 1,087, около 1,088, около 1,089, около 1,09, около 1,091, около 1,092, около 1,093, около 1,094, около 1,095, около 1,096, около 1,097, около 1,098, около 1,099, или около 1,1. В некоторых вариантах осуществления монодисперсный полимер ГК имеет PDI около 1,001.
В некоторых случаях монодисперсный полимер ГК имеет молекулярную массу около 2,5 мегадальтон (МДа) или ниже (например, около 2,5 МДа или ниже, около 2,4 МДа или ниже, около 2,3 МДа или ниже, около 2,2. МДа или ниже, около 2,1 МДа или ниже, около 2,0 МДа или ниже, около 1,9 МДа или ниже, около 1,8 МДа или ниже, около 1,7 МДа или ниже, около 1,6 МДа или ниже, около 1,5 МДа или ниже, около 1,4 МДа или ниже, около 1,3 МДа или ниже, около 1,2 МДа или ниже, около 1,1 МДа или ниже, около 1,0 МДа или ниже, около 900 кДа или ниже, около 800 кДа или ниже, около 700 кДа или ниже, около 600 кДа или ниже, около 500 кДа или ниже, около 400 кДа или ниже, около 300 кДа или ниже, около 200 кДа или ниже, или около 100 кДа или ниже). В некоторых случаях полимер ГК имеет молекулярную массу около 1 МДа или ниже (например, около 1,0 МДа или ниже, около 900 кДа или ниже, около 800 кДа или ниже, около 700 кДа или ниже, около 600 кДа или ниже, около 500 кДа или ниже, около 400 кДа или ниже, около 300 кДа или ниже, около 200 кДа или ниже, около 100 кДа или ниже). В некоторых случаях полимер ГК имеет молекулярную массу от около 25 кДа до около 2,5 МДа (например, от около 25 кДа до около 2,5 МДа, от около 25 кДа до около 2 МДа, от около 25 кДа до около 1,5 МДа, от около 25 кДа и около 1 МДа, от около 25 кДа и приблизительно 900 кДа, от около 25 кДа и приблизительно 800 кДа, от около 25 кДа до около 700 кДа, от около 25 кДа до около 600 кДа, от около 25 кДа до около 500 кДа, от около 100 кДа до около 2,5 МДа, от около 100 кДа до около 2 МДа, от около 100 кДа до около 1,5 МДа, от около 100 кДа до около 1 МДа, от около 100 кДа до около 900 кДа, от около 100 кДа до около 800 кДа, от около 100 кДа до около 700 кДа, от около 100 кДа до около 600 кДа, от около 100 кДа до около 500 кДа, от около 250 кДа до около 2,5 МДа, от около 250 кДа до около 2 МДа, от около 250 кДа до около 1,5 МДа, от около 250 кДа до около 1 МДа, от около 250 кДа до около 900 кДа, от около 250 кДа до около 800 кДа, от около 250 кДа до около 700 кДа, от около 250 кДа до около 600 кДа, от около 250 кДа до около 500 кДа, от около 500 кДа до около 2,5 МДа, от около 500 кДа до около 2 МДа, от около 500 кДа до около 1,5 МДа, от около 500 кДа до около 1 МДа, от около 500 кДа до около 900 кДа, от около 500 кДа до около 800 кДа, от около 500 кДа до около 700 кДа, от около 500 кДа до около 600 кДа, от около 1 МДа до около 2,5 МДа, от около 1 МДа до около 2 МДа, от около 1 МДа до около 1,5 МДа, от около 1 МДа до около 1,25 МДа, от около 1,25 МДа до около 2,5 МДа, от около 1,25 МДа до около 2 МДа, от около 1,25 МДа до около 1,5 МДа, от около 1,5 МДа до около 2,5 МДа, от около 1,5 МДа до около 2 МДа, от около 1,5 МДа до около 1,75 МДа, от около 1,75 МДа до около 2,5 МДа).
В некоторых случаях монодисперсный полимер ГК имеет молекулярную массу от около 25 кДа до около 500 кДа (например, от около 25 кДа до около 500 кДа, от около 25 кДа до около 450 кДа, от около 25 кДа до около 400 кДа, от около 25 кДа до около 350 кДа, от около 25 кДа до около 300 кДа, от около 25 кДа до около 300 кДа, от около 25 кДа до около 250 кДа, от около 25 кДа до около 200 кДа, от около 25 кДа до около 150 кДа, от около 25 кДа до около 100 кДа, от около 25 кДа до около 50 кДа, от около 40 кДа до около 500 кДа, от около 40 кДа до около 450 кДа, от около 40 кДа до около 400 кДа, от около 40 кДа до около 350 кДа, от около 40 кДа до около 300 кДа, от около 40 кДа до около 300 кДа, от около 40 кДа до около 250 кДа, от около 40 кДа до около 200 кДа, от около 40 кДа до около 150 кДа, от около 40 кДа до около 100 кДа, от около 40 кДа до около 50 кДа, от около 50 кДа до около 500 кДа, от около 50 кДа до около 450 кДа, от около 50 кДа до около 400 кДа, от около 50 кДа до около 350 кДа, от около 50 кДа до около 300 кДа, от около 50 кДа до около 300 кДа, от около 50 кДа до около 250 кДа, от около 50 кДа до около 200 кДа, от около 50 кДа до около 150 кДа, от около 50 кДа до около 100 кДа, от около 50 кДа до около 75 кДа, от около 100 кДа до около 500 кДа, от около 100 кДа до около 450 кДа, от около 100 кДа до около 400 кДа, от около 100 кДа до около 350 кДа, от около 100 кДа до около 300 кДа, от около 100 кДа до около 300 кДа, от около 100 кДа до около 250 кДа, от около 100 кДа до около 200 кДа, от около 100 кДа до около 150 кДа, от около 150 кДа до около 500 кДа, от около 150 кДа до около 450 кДа, от около 150 кДа до около 400 кДа, от около 150 кДа до около 350 кДа, от около 150 кДа до около 30 0 кДа, от около 150 кДа до около 300 кДа, от около 150 кДа до около 250 кДа, от около 150 кДа до около 200 кДа, от около 175 кДа до около 500 кДа, от около 175 кДа до около 450 кДа, от около 175 кДа до около 400 кДа, от около 175 кДа до около 350 кДа, от около 175 кДа до около 300 кДа, от около 175 кДа до около 300 кДа, от около 175- 200 до около 250 кДа, от около 175 кДа до около 225 кДа, от около 200 кДа до около 500 кДа, от около 200 кДа до около 450 кДа, от около 200 кДа до около 400 кДа, от около 200 кДа до около 350 кДа, от около 200 кДа до около 300 кДа, от около 200 кДа до около 300 кДа, от около 200 кДа до около 250 кДа, или от около 200 кДа до около 225 кДа).
В некоторых случаях монодисперсный полимер ГК имеет молекулярную массу от около 100 кДа до около 250 кДа (например, около 100 кДа, около 110 кДа, около 120 кДа, около 130 кДа, около 140 кДа, около 150 кДа, около 160 кДа, около 170 кДа, около 180 кДа, около 190 кДа, около 200 кДа, около 210 кДа, около 220 кДа, около 230 кДа, около 240 кДа, или около 250 кДа). В конкретных случаях полимер ГК имеет молекулярную массу около 200 кДа.
Любая из предшествующих молекулярных масс может представлять собой средневесовую молекулярную массу (также известной как среднемассовая молекулярная масса).
В некоторых случаях любой из предшествующих монодисперсных полимеров ГК является линейным, т.е., не перекрестно-сшитым.
В других случаях изобретение обеспечивает конъюгат антитела, который содержит антитело (например, анти-ФРЭС антитело, такое как G6.31 AARR) ковалентно присоединенное к монодисперсному полимеру ГК. Такие конъюгаты антител в данном документе иногда называют как «конъюгаты ПЭГ». Может быть использован любой подходящий монодисперсный полимер ПЭГ. Следует понимать, что монодисперсные полимеры ПЭГ могут иметь разные значения PDI по сравнению с монодисперсными полимерами ГК. Так, например, коммерчески доступные полимеры ПЭГ могут иметь PDI ниже 1,1; таким образом, монодисперсный полимер ПЭГ будет определяться другим диапазоном значений PDI по сравнению с монодисперсным полимером ГК. Например, монодисперсный полимер ПЭГ может иметь PDI от около 1 до около 1,02 (например, PDI, равный 1, около 1,001, около 1,002, около 1,003, около 1,004, около 1,005, около 1,006, около 1,007, около 1,008, около 1,009, около 1,01, около 1,011, около 1,012, около 1,013, около 1,014, около 1,015, около 1,016, около 1,017, около 1,018, около 1,019, или около 1,02). ПЭГ может представлять собой разветвленный ПЭГ, звездообразный ПЭГ, или гребнеобразный ПЭГ. Полимер ПЭГ может представлять собой, например, тетрамер ПЭГ, гексамер ПЭГ, или октамер ПЭГ. В некоторых случаях, конъюгат антитела содержит анти-ФРЭС антитело (например, анти-ФРЭС антитело, описанное в данном документе, такое как G6.31 AARR), ковалентно присоединенное к дендримеру ПЭГ. Полимеры ПЭГ являются коммерчески доступными, например, от JenKem Technology, Quanta BioDesign, NOF America Corporation и других производителей.
В некоторых случаях монодисперсный полимер ПЭГ имеет молекулярную массу от около 1 кДа до около 500 кДа (например, от около 1 кДа до около 500 кДа от около 1 кДа до около 450 кДа, от около 1 кДа до около 400 кДа, от около 1 кДа до около 350 кДа, от около 1 кДа до около 300 кДа, от около 1 кДа до около 300 кДа, от около 1 кДа до около 250 кДа, от около 1 кДа до около 200 кДа, от около 1 кДа до около 150 кДа, от около 1 кДа до около 100 кДа, от около 1 кДа до около 50 кДа, от около 10 кДа до около 500 кДа, от около 10 кДа до около 450 кДа, от около 10 кДа до около 400 кДа, от около 10 кДа до около 350 кДа, от около 10 кДа до около 300 кДа, от около 10 кДа до около 300 кДа, от около 10 кДа до около 250 кДа, от около 10 кДа до около 200 кДа, от около 10 кДа до около 150 кДа, от около 10 кДа до около 100 кДа, от около 10 кДа до около 50 кДа, от около 20 кДа до около 500 кДа, от около 20 кДа до около 450 кДа, от около 20 кДа до около 400 кДа, от около 20 кДа до около 350 кДа, от около 20 кДа до около 300 кДа, от около 20 кДа до около 300 кДа, от около 20 кДа до около 250 кДа, от около 20 кДа до около 200 кДа, от около 20 кДа до около 150 кДа, от около 20 кДа до около 100 кДа, от около 20 кДа до около 75 кДа, от около 30 кДа до около 500 кДа, от около 30 кДа до около 450 кДа, от около 30 кДа до около 400 кДа, от около 30 кДа до около 350 кДа, от около 30 кДа до около 300 кДа, от около 30 кДа до около 300 кДа, от около 30 кДа до около 250 кДа, от около 30 кДа до около 200 кДа, от около 30 кДа до около 150 кДа, от около 40 кДа до около 500 кДа, от около 40 кДа до около 450 кДа, от около 40 кДа до около 400 кДа, от около 40 кДа до около 350 кДа, от около 40 кДа до около 300 кДа, от около 40 кДа до около 300 кДа, от около 40 кДа до около 250 кДа, от около 40 кДа до около 200 кДа, от около 50 кДа до около 500 кДа, от около 50 кДа до около 450 кДа, от около 50 кДа до около 400 кДа, от около 50 кДа до около 350 кДа, от около 50 кДа до около 300 кДа, от около 50 кДа до около 300 кДа, от 50-200 кДа до около 250 кДа, или от около 50 кДа до около 225 кДа).
В некоторых случаях монодисперсный полимер ПЭГ имеет молекулярную массу от около 5 кДа до около 250 кДа (например, около 1 кДа, около 5 кДа, около 10 кДа, около 15 кДа, около 20 кДа, около 25 кДа, около 30 кДа, около 35 кДа, около 40 кДа, около 50 кДа, около 60 кДа, около 70 кДа, около 80 кДа, около 90 кДа, 100 кДа, около 110 кДа, около 120 кДа, около 130 кДа, около 140 кДа, около 150 кДа, около 160 кДа, около 170 кДа, около 180 кДа, около 190 кДа, около 200 кДа, около 210 кДа, около 220 кДа, около 230 кДа, около 240 кДа, или около 250 кДа). В конкретных случаях полимер ПЭГ имеет молекулярную массу около 20 кДа. В других случаях полимер ГК имеет молекулярную массу около 40 кДа.
Любая из предшествующих молекулярных масс может представлять собой средневесовую молекулярную массу (также известной как среднемассовая молекулярная масса).
В некоторых случаях монодисперсный полимер ПЭГ представляет собой тетрамер ПЭГ. Тетрамеры ПЭГ являются коммерчески доступными, например, от OF America SUNBRIGHT РТЕ-400МА, РТЕ-200МА, РТЕ-100МА, и JenKem Technology USA 4-плечевой ПЭГ-малеимид (кат. №.4ARM-MAL). В некоторых случаях, тетрамер ПЭГ имеет ядро пентаэритрита. Например, в некоторых случаях, тетрамер ПЭГ включает структуру формулы (I), где n является независимо друг от друга любым подходящим целым числом:
Формула I:
В другом примере, в некоторых случаях монодисперсный полимер ПЭГ представляет собой гексамер ПЭГ. Гексамеры ПЭГ являются коммерчески доступными, например, от JenKem Technology USA 6-плечевой ПЭГ-амин (кат. №6ARM(DP)-NH2HCl), или гексамеры ПЭГ от Quanta BioDesign. В некоторых случаях гексамеры ПЭГ содержат ядро дипентаэритрита.
В некоторых случаях монодисперсный полимер ПЭГ представляет собой октамер ПЭГ. Октамеры ПЭГ являются коммерчески доступными, например, от серий NOF America SUNBRIGHT HGEO или от JenKem Technology USA 8-плечевой ПЭГ-малеимид (кат. №8ARM(TP)-MAL). В некоторых случаях октамер ПЭГ может содержать ядро три пентаэритрита. Например, в некоторых случаях, октамер ПЭГ включает структуру формулы (I), где n является независимо друг от друга любым подходящим целым числом:
Формула II:
В еще одном примере, в некоторых случаях, октамер ПЭГ содержит ядро трипентаэритрита.
rd
Следует понимать, что любой подходящий подход к конъюгации, в том числе те, которые описаны в данном документе, и другие, известные в данной области техники, могут быть использованы для конъюгации анти-ФРЭС антитела согласно изобретению с монодисперсным полимером. Например, монодисперсный полимер может быть конъюгирован с любой подходящей функциональной группой белка, в том числе первичной аминогруппой, карбоксильной группой, сульфгидрильной группой, или карбонильной группой. Любая подходящая химически реактивная группа может быть использована для нацеливания на функциональную группу белка, например, карбодиимид (например, EDC), NHS сложный эфир, сложный имидоэфир, пентафторфениловый эфир, гидроксиметил фосфин, малеимид, галогенацетил (например, бромацетил или иодацетил), пиридилдисульфид, тиосульфонат, винилсульфон, гидразин, алкоксиамин, диазирин, арил азид, изоцианат, или другие, известные в данной области техники. См., например, Hermanson, Bioconjugate Techniques, 3 Edition, 2013. В конкретных вариантах осуществления ГК (например, монодисперсную ГК) модифицируют с использованием малеимидных групп (ГК-малеимид), и второе, антитело, которое содержит свободный тиол на цистеине (например, Fab-C или цистеиновый вариант (например, THIOMAB™ или тио-Fab)) приводят в контакт с ГК-малеимидом с образованием ковалентных ГК-Fab конъюгатов, например, как описано в Примере 1.
Любой из предшествующих конъюгатов антител может иметь гидродинамический радиус от около 5 нм до около 200 нм (например, около 5 нм, около 10 нм, около 20 нм, около 30 нм, около 40 нм, около 50 нм, около 60 нм, около 70 нм, около 80 нм, около 90 нм, около 100 нм, около 110 нм, около 120 нм, около 130 нм, около 140 нм, около 150 нм, около 160 нм, около 170 нм, около 180 нм, около 190 нм или около 200 нм). В некоторых случаях конъюгат антитела имеет гидродинамический радиус от около 5 нм до около 150 нм (например, около 5 нм, около 10 нм, около 20 нм, около 30 нм, около 40 нм, около 50 нм, около 60 нм, около 70 нм, около 80 нм, около 90 нм, около 100 нм, около 110 нм, около 120 нм, около 130 нм, около 140 нм или 150 нм). В некоторых случаях, конъюгат антитела имеет гидродинамический радиус от около 5 нм до около 100 нм (например, около 5 нм, около 10 нм, около 20 нм, около 30 нм, около 40 нм, около 50 нм, около 60 нм, около 70 нм, около 80 нм, около 90 нм или около 100 нм). В некоторых случаях конъюгат антитела имеет гидродинамический радиус от около 5 нм до около 60 нм (например, около 5 нм, около 10 нм, около 20 нм, около 30 нм, около 40 нм, около 50 нм, или около 60 нм). В некоторых случаях, конъюгат антитела имеет гидродинамический радиус от около 25 нм до около 35 нм (например, около 25 нм, около 26 нм, около 27 нм, около 28 нм, около 29 нм, около 30 нм, около 31 нм, около 32 нм, около 33 нм, около 34 нм или около 35 нм). В некоторых случаях гидродинамический радиус составляет около 28 нм.
В некоторых случаях конъюгат антитела имеет гидродинамический радиус от около 10 нм до около 200 нм, от около 10 нм до около 180 нм, от около 10 нм до около 160 нм, от около 10 нм до около 140 нм, от около 10 нм до около 120 нм, от около 10 нм до около 100 нм, от около 10 нм до около 80 нм, от около 10 нм до около 60 нм, от около 10 нм до около 50 нм, от около 10 нм до около 40 нм, от около 10 нм до около 30 нм, от около 20 нм до около 200 нм, от около 20 нм до около 180 нм, от около 20 нм до около 160 нм, от около 20 нм до около 140 нм, от около 20 нм до около 120 нм, от около 20 нм до около 100 нм, от около 20 нм до около 80 нм, от около 20 нм до около 60 нм, от около 20 нм до около 50 нм, от около 20 нм до около 40 нм, от около 20 нм до около 30 нм, от около 30 нм до около 200 нм, от около 30 нм до около 180 нм, от около 30 нм до около 160 нм, от около 30 нм до около 140 нм, от около 30 нм до около 120 нм, от около 30 нм до около 100 нм, от около 30 нм до около 80 нм, от около 30 нм до около 60 нм, от около 30 нм до около 50 нм, от около 30 нм до около 40 нм, от около 40 нм до около 200 нм, от около 40 нм до около 180 нм, от около 40 нм до около 160 нм, от около 40 нм до около 140 нм, от около 40 нм до около 120 нм, от около 40 нм до около 100 нм, от около 40 нм до около 80 нм, от около 40 нм до около 60 нм, от около 40 нм до около 50 нм, от около 50 нм до около 200 нм, от около 50 нм до около 180 нм, от около 50 нм до около 160 нм, от около 50 нм до около 140 нм, от около 50 нм до около 120 нм, от около 50 нм до около 100 нм, от около 50 нм до около 80 нм, от около 50 нм до около 60 нм, от около 60 нм до около 200 нм, от около 60 нм до около 180 нм, от около 60 нм до около 160 нм, от около 60 нм до около 140 нм, от около 60 нм до около 120 нм, от около 60 нм до около 100 нм, или от около 60 нм до около 80 нм.
2
В любом из предыдущих конъюгат антител, антитело может представлять собой фрагмент антитела, которое связывается с ФРЭС, например, фрагмент анти-ФРЭС антитела, описанного в данном документе, которое связывается с ФРЭС. В некоторых случаях, анти-ФРЭС антитело представляет собой анти-ФРЭС антитело, сконструированное введением цистеина, как описано в данном документе (см., например, Раздел 1(8)(d) выше). В некоторых случаях фрагмент антитела выбирают из группы, состоящей из фрагментов Fab, Fab', Fab-C, Fab'-SH, Fv, scFv, и (Fab'). В особых случаях, фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab', или Fab-C. В некоторых случаях фрагмент антитела представляет собой Fab-C.
Любой из предшествующих конъюгатов антител может иметь период полувыведения из глаза, который увеличивается по сравнению с эталонным антителом, которое не присоединено ковалентно к полимеру (например, гидрофильному полимеру). В некоторых случаях период полувыведения из глаза увеличивается по меньшей мере в около 2 раза (например, в около 2 раза, около 3 раза, около 4 раза, около 5 раз, около 6 раз, около 7 раз, около 8 раз, около 9 раз, около 10 раз, около 12 раз, около 14 раз, около 16 раз, около 18 раз, около 20 раз или более) по отношению к исходному антителу. В некоторых случаях период полувыведения из глаза увеличивается по меньшей мере в около 4 раза по отношению к эталонному антителу. В некоторых случаях период полувыведения из глаза представляет собой период выведения из стекловидного тела. В некоторых случаях эталонное антитело является идентичным антителу конъюгата антитела. В некоторых случаях эталонное антитело является неидентичным антителу конъюгата антитела.
Любой из предшествующих конъюгатов антител может иметь клиренс, который снижается по сравнению с эталонным антителом, которое не присоединено ковалентно к полимеру (например, гидрофильному полимеру). В некоторых случаях клиренс снижается по меньшей мере в около 2 раза (например, в около 2 раза, около 3 раза, около 4 раза, около 5 раз, около 6 раз, около 7 раз, около 8 раз, около 9 раз, около 10 раз, около 12 раз, около 14 раз, около 16 раз, около 18 раз, около 20 раз или более) по отношению к исходному антителу. В некоторых случаях клиренс снижается по меньшей мере в около 4 раза по отношению к эталонному антителу. В некоторых случаях клиренс представляет собой клиренс из стекловидного тела. В некоторых случаях эталонное антитело является идентичным антителу конъюгата антитела. В некоторых случаях эталонное антитело является неидентичным антителу конъюгата антитела.
В некоторых случаях, период времени между двумя интраокулярными инъекциями (например, интравитреальными инъекциями) любого из предшествующих конъюгатов антител (например, конъюгатов ГК) составляет по меньшей мере 1 месяц, например, по меньшей мере 1 месяц, по меньшей мере 5 недель, по меньшей 6 недель, по меньшей мере 7 недель, по меньшей мере 8 недель, по меньшей мере 9 недель, по меньшей мере 10 недель, по меньшей мере 11 недель, по меньшей мере 12 недель, по меньшей мере 13 недель, по меньшей мере 14 недель, по меньшей мере 15 недель, по меньшей мере 16 недель, по меньшей мере 20 недель, по меньшей мере 24 недели, по меньшей мере 28 недель, по меньшей мере 32 недели, по меньшей мере 36 недель, по меньшей мере 40 недель, по меньшей мере 44 недели, по меньшей мере 48 недель, по меньшей мере 52 недели или более. В некоторых случаях максимальный период между двумя интраокулярными инъекциями составляет не более чем четыре года, например, не более чем три года, не более чем два года, или не более одного года. Конъюгат антитела можно вводить, например, каждые два-двенадцать месяцев, например, каждые четыре-десять месяцев. В некоторых случаях конъюгат антитела вводят каждые шесть месяцев.
Данное изобретение также обеспечивает композиции (например, фармацевтические композиции), которые содержат любые из конъюгатов антител, описанных выше. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит одно или более дополнительных соединений. В определенных вариантах осуществления дополнительное соединение связывается со второй биологической молекулой, выбранной из группы, состоящей из: ИЛ-1β; ИЛ-6; ИЛ-6R; ТцФР; ангиопоэтина; ангиопоэтина 2; Tie2; S1P; интегринов αvβ3, αvβ5, и α5β1; бетацеллюлина; апелина/APJ; эритропоэтина; фактора D комплемента; ФНО-α; HtrA1; рецептора ФРЭС; ST-2-рецептора; и белков, генетически связанных с риском возрастной макулярной дегенерации (ВМД), таких как компоненты пути комплемента С2, фактор В, фактор Н, CFHR3, C3b, С5, С5а, и С3а; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; интерлейкина-8 (ИЛ-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; СЕТР; LIPC; COL10A1; и TNFRSF10A. В некоторых вариантах осуществления дополнительное соединение представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.Например, в некоторых случаях дополнительное соединение представляет собой биспецифическое антитело (например, анти-ФРЭС/анти-Ang2 биспецифическое антитело, такое как RG-7716 или любое анти-ФРЭС/анти-Ang2 биспецифическое антитело, раскрытое в WO 2010/069532 или WO 2016/073157, или его вариант. В другом примере в некоторых случаях дополнительное соединение представляет собой анти-ИЛ-6 антитело, например EBI-031 (Eleven Biotereutics; См., например, WO 2016/073890), силтуксимаб (SYLVANT), олокизумаб, клазакизумаб, сирукумаб, эльсилимомаб, герилимзумаб, OPR-003, MEDI-5117, PF-04236921, или его вариант. В еще одном примере в некоторых случаях дополнительное соединение представляет собой анти-ИЛ-eR антитело, например тоцилизумаб (ACTEMRA) (см., например, WO 1992/019579), сарилумаб, вобарилизумаб (ALX-0061), SA-237, или его вариант.
Кроме того, изобретение обеспечивает композиции (например, фармацевтические композиции), которые содержат любой из конъюгатов антител, описанных выше, и дополнительный антагонист ФРЭС.
2. Устройства
Любое из антител (например, анти-ФРЭС антител, сконструированных введением цистеина) или конъюгатов антител (например, конъюгатов монодисперсной ГК), описанных в данном документе, может быть введено в глаз с помощью имплантируемого устройства доставки. Имплантируемое устройство доставки представляет собой имплантируемое, многоразовое устройство, которое может высвобождать терапевтический агент (например, конъюгат анти-ФРЭС антитела) в течение нескольких месяцев (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более месяцев). Иллюстративные имплантируемые устройства доставки, которые могут быть использованы, включают такие от ForSight Labs, LLC и/или ForSight VISION4, например, как описано в публикациях международных патентных заявок №№ WO 2010/088548, WO 2015/085234, WO 2013/116061, WO 2012/019176, WO 2013/040247, WO 2012/019047 и, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.
Например, изобретение обеспечивает имплантируемое устройство доставки, которое включает резервуары, содержащие любое из антител или конъюгатов антител, описанных в данном документе. Имплантируемое устройство доставки может дополнительно содержать проксимальную область, трубчатый корпус, соединенный с проксимальной областью в сообщении по текучей среде с резервуаром, и одну или более точек в сообщении по текучей среде с резервуаром и выполненное с возможностью высвобождения композиции в глаз. Трубчатый корпус может иметь наружный диаметр, выполненный с возможностью быть вставленным через разрез или отверстие в глазе, равном около 0,5 мм или меньше. Устройство может иметь размер от около 1 мм до около 15 мм в длину (например, около 1 мм, около 2 мм, около 4 мм, около 5 мм, около 6 мм, около 7 мм, около 9 мм, около 11 мм, около 13 мм, или около 15 мм в длину). Резервуар может иметь любой подходящий объем. В некоторых случаях, резервуар имеет объем от около 1 мкл до около 100 мкл (например, около 1 мкл, около 5 мкл, около 10 мкл, около 20 мкл, около 50 мкл, около 75 мкл или около 100 мкл). Устройство или его составные части могут быть изготовлены из любого подходящего материала, например, полиимида.
В некоторых случаях, имплантируемое устройство доставки содержит резервуар, содержащий любое из антител или конъюгатов антител, описанных в данном документе, и одно или более дополнительных соединений. В определенных вариантах осуществления дополнительное соединение связывается со второй биологической молекулой, выбранной из группы, состоящей из ИЛ-1β; ИЛ-6; ИЛ-6R; ТцФР; ангиопоэтина; ангиопоэтина 2; Tie2; S1P; интегринов αvβ3, αvβ5, и α5β1; бетацеллюлина; апелина/APJ; эритропоэтина; фактора D комплемента; ФНО-α; HtrA1; рецептора ФРЭС; ST-2-рецептора; и белков, генетически связанных с риском ВМД, таких как компоненты пути комплемента С2, фактор В, фактор Н, CFHR3, C3b, С5, С5а, и C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; интерлейкина (ИЛ-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; СЕТР; LIPC; COL10A1; и TNFRSF10A. В некоторых вариантах осуществления дополнительное соединение представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Например, в некоторых случаях дополнительное соединение представляет собой биспецифическое антитело (например, анти-ФРЭС/анти-Ang2 биспецифическое антитело, такое как RG-7716 или любое анти-ФРЭС/анти-Ang2 биспецифическое антитело, раскрытое в WO 2010/069532 или WO 2016/073157, или его вариант. В другом примере в некоторых случаях дополнительное соединение представляет собой анти-ИЛ-6 антитело, например EBI-031 (Eleven Biotereutics; См., например, WO 2016/073890), силтуксимаб (SYLVANT), олокизумаб, клазакизумаб, сирукумаб, эльсилимомаб, герилимзумаб, OPR-003, MEDI-5117, PF-04236921, или его вариант. В еще одном примере в некоторых случаях дополнительное соединение представляет собой анти-ИЛ-6R антитело, например тоцилизумаб (ACTEMRA) (см., например, WO 1992/019579), сарилумаб, вобарилизумаб (ALX-0061), SA-237, или его вариант.
В некоторых случаях, имплантируемое устройства доставки содержит любое из антител или конъюгатов антител, описанных в данном документе, и дополнительный антагонист ФРЭС.
III. ПРИМЕРЫ
Ниже приведены примеры способов и композиций согласно данному изобретению. Следует понимать, что, учитывая общее описание, представленное выше, можно осуществить различные другие варианты осуществления данного изобретения.
Пример 1: Конъюгаты линейная гиалуроновая кислота (ГК) - антитело, полученные из монодисперсной ГК для улучшения стабильности
Конъюгирование Fab с биополимером гиалуроновой кислоты (ГК) может значительно улучшить время удерживания Fab в глазу, например, путем замедления диффузии Fab и, таким образом, клиренса из стекловидного тела. Для получения конъюгата ГК-Fab использовали двухстадийный способ: сначала, коммерческую ГК модифицировали с малеимиднными группами (ГК-малеимид), а затем, Fab-C (Fab со свободным тиолом на цистеине), подвергали взаимодействию с ГК-малеимидом с образованием ковалентных конъюгатов ГК-Fab.
Когда их производят с помощью типичных средств, конъюгаты ГК-белок могут иметь два ортогональных компонента изменчивости. Первый источник изменчивости представляет собой полидисперсность, которая обеспечивалась полидисперсностью каркаса ГК (Фиг. 1А). Второй источник представляет собой гетерогенность, которая обеспечивалась различиями в числе молекул Fab, присоединенных к данной цепи ГК. Этот второй источник изменчивости диктуется стохастической природой малеимидной модификации цепей ГК на первой стадии процесса конъюгации ГК. На Фиг. 1В представлены результаты моделирования методом Монте-Карло, в котором каждой кислотной группе из 200 кДа цепи ГК была дана 5% вероятность быть подвергнутой взаимодействию с малеимид-содержащим линкером, повторяющийся на 1000 независимых цепей ГК. Полученные результаты свидетельствуют о том, что, хотя среднее ожидаемое количество малеимидов на цепь ГК при моделировании составляло 24,7, абсолютный диапазон составлял от 11 до 42.
Может быть желательно поддерживать физическую и коллоидную стабильность конъюгатов антител (например, конъюгатов антител, которые содержат линейную ГК и анти-ФРЭС антитело G6.31AARR; упоминаемых в данном документе как конъюгаты ГК-антитело G6.31.AARR) в водной фазе и стекловидном теле. Основываясь частично на моделированиях, описанных выше, считается, что молекулярная масса каркаса ГК и уровень загрузки Fab может быть важными параметрами для физической стабильности. Уровень загрузки Fab относится к среднему количеству молекулы антитела (например, G6.31.AARR) присоединенному к каждой цепи ГК, и выражается в терминах процентов кислотных групп на каркасе ГК, которые ковалентно модифицированных с помощью фрагмента Fab (каждый повторяющийся фрагмент ГК содержит одну изменяемую группу кислот на сахариде глюкуроновой кислоты). В то время как другие параметры могут внести свой вклад в стабильности конъюгации (например, специфические свойства Fab включая суммарный заряд, распределение поверхностного заряда, гидрофобность), они, как правило, неконтролируемые в пределах этой конкретной молекулы.
Для того, чтобы оценить влияние MW ГК и уровня нзагрузки Fab на физическую стабильность ГК-G6.31.AARR, были получены конъюгаты с тремя различными ГК, начиная с MW (приблизительно 40 кДа, 200 кДа и 600 кДа) и различным уровнем загрузки Fab, испытанные в физиологических условиях и контролированные в отношении физической стабильности в течение нескольких месяцев, чтобы имитировать биологическое воздействие.
(А) Материалы и методы
(i) Материалы
H
В данном исследовании использовали гиалуронат натрия (ГК, Lifecore Biomedical, Часка, штат Миннесота) с тремя различными молекулярными массами. Их свойства, оцененные с помощью эксклюзионной хроматографии с включенным индексом преломления и детекторами многоуглового лазерного светорассеяния (SEC-RI-MALS), обобщены в Таблице 4. Mn обозначает среднечисловую молекулярную массу; Mw обозначает средневесовую молекулярную массу; PDI обозначает индекс полидисперсности; a R указывает на гидродинамический радиус. В Таблице 5 приведены данные для Mn, Mw, и PDI различных полидисперсных образцов ГК по сравнению с монодисперсным образцом, определенные при помощи SEC-RI-MALS. Данные из Таблиц 4 и 5 из двух разных партий ГК200K, который имели различные полидисперсности.
(ii) Синтез малеимид-функционализированной ГК (ГК-мал)
ГК модифицировали малеимидными группами с использованием водной реакции со связующим реагентом 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолинхлорид (DMTMM) и линкером N-(2-аминоэтил)малеимидтрифторацетатной солью (АЕМ). ГК растворяли в 100 мМ 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) (рН 5,5) при 2,5 мг/мл и к этому раствору добавляли DMTMM и АЕМ при перемешивании. Количества добавляемых DMTMM и АЕМ различались и были выбраны для различных целевых уровней функционализации малеимида в диапазоне от 2 до 10%. Реакционную смесь нагревали до 70°С на протяжении 2 часов.
Избыток АЕТ и DMTMM удаляли из реакционной смеси с помощью процедуры обессоливания. Обессоливающую колонку HIPREP™ 26/10 монтировали на систему очистки ™ (GE Life Sciences) и уравновешивали 10 мМ ацетата натрия (рН 4,0) 150 мМ NaCl. Реакционную смесь впрыскивали в чистом виде в колонку, а пик ГК-мал собирали в соответствии с оптической плотностью при 302 нм и концентрировали до более чем 5 мг/мл с использованием центробежного устройства ультрафильтрации. Концентрация малеимида в ГК-мал исходного раствора измеряли по оптической плотности при 302 нм с помощью УФ-видимого спектрофотометра, и молярное отношение групп малеимида на цепь ГК оценивали с помощью эксклюзионной хроматографии с разными углами рассеяния света (SEC-MALS).
(iii) Конъюгация Fab-C с ГК-мал
Раствор Fab-C доводили по рН до 6,5 с помощью 1 М фосфата (рН 6,5) до конечной концентрации фосфата, равной 50 мМ, а этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), добавляли до конечной концентрации, равной 2,5 мМ. Раствор Fab-C перемешивали и добавляли к нему ГК-мал, разведенный в реакционном буфере, состоящем из 10 мМ фосфата (рН 6,5), 150 мМ NaCl, и 2,5 мМ ЭДТА. Стехиометрия была установлена на уровне 1,2 молей Fab-C на моль малеимида в конечной реакции, а объем был установлен, чтобы получить конечную концентрацию белка, равную 1 мг/мл. Реакцию конъюгации проводили при комнатной температуре и перемешивании. Через 3 часа, добавляли меркаптоэтанол в отношении 2 моля на моль малеимида для связывания непрореагировавших групп малеимида. Через 30 минут реакционную смесь разбавляли 10 мМ фосфата (рН 6,5) до менее чем 50 мМ NaCl.
Очистку проводили с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC), чтобы отделить свободный Fab-C и димер Fab от конъюгата. Колонку HILOAD 26/600 SUPERDEX 200 пг (GE Healthcare) уравновешивали 10 мМ HisHCl (рН 5,5), 150 мМ NaCl, а реакционную смесь впрыскивали в чистом виде. Пики, связанные с конъюгатом, димером Fab и мономером Fab элюировали отдельно, а пик конъюгата собирали.
(iv) Анализ конъюгатов ГК-Fab посредством SEC-RI-MALS
280
280
Содержание Fab, свободное от остатков, общую молярную массу конъюгата и массовую долю белка оценивали с помощью SEC-RI-MALS-QELS (комбинация эксклюзионной хроматографии (SEC), показателя преломления (RI) многоракурсного рассеивания света (MALS) и квазиупругого рассеивания света (QELS)) на ВЭЖХ Agilent 1200 с подключением детектора рефракционного индекса (RI) Wyatt OPTILAB T-rEX™ и детектора многоракурсного рассеивания света (MALS) Wyatt HELEOS™-II. Для SEC последовательно запускали две колонки: ACCLAIM™ 7,8×150 мм размер поры 1000 А с последующим ACCLAIM™ 7,8×150 мм размер поры 300 А с фосфатным буферным солевым раствором (PBS) (рН 7,4) в качестве подвижного буфера. Контроль на основе бычьего сывороточного альбумина (БСА) использовали для нормализации детекторов MALS и коррекции полосы уширения между детекторами. Содержание свободного Fab измеряли путем интегрирования пиков УФ А, соответствующих Fab и конъюгату ГК-Fab. Молярная масса конъюгата была взята в качестве средневесовой молекулярной массы (Mw) пика конъюгата. Массовую долю белка рассчитывали с использованием белкового анализа конъюгата с использованием индекса дифференциального преломления (dRI) и сигналов УФ А.
(v) Физиологический стресс и анализ конъюгата ГК-G6.31.AARR
280
450
Очищенные конъюгаты растворяли в буфере ФСБ с добавлением 2 мМ азида натрия и 0,01% полисорбата 20 (PBSTN). Конечные концентрации составляли приблизительно 5 мг/мл на основе Fab. Образцы герметично закрывали и инкубировали при 37°С. Это условие служит в качестве заменителя стекловидного тела (имитируя рН, температуру и ионной силы стекловидного тела). Концентрация 5 мг/мл представляет собой «стрессовую» для оценки концентрации осадков в стекловидном теле (2 мг дозе в 4 мл человеческого стекловидного тела эквивалентно 0,5 мг/мл Fab). Через определенные промежутки времени, образцы отбирали, разбавляли до 1 мг/мл в 10 мМ HisHCl (рН 5,5) с 0,01% полисорбата 20 и 10% (мас./об.) трегалозы и анализировали на концентрации растворимого белка (А), мутность (А), время удерживания SEC, и молекулярную массу (Mn и Mw посредством SEC-RI-MALS как указано выше).
(В) Результаты
(i) Характеристика материалов
В Таблице 6 приведены результаты характеристики SEC-RI-MALS для девяти конъюгатов, используемых в данном исследовании. Конъюгаты различаются как по MW каркаса ГК (40 кДа, 200 кДа или 600 кДа), так и по уровню загрузки Fab. Названия образцов приведены в качестве MW каркасов (кДА) с дальнейшим указанием уровня загрузки Fab (%).
Полидисперсность конъюгатов ГК-G6.31.AARR экспериментально оценивали с использованием SEC-RI-MALS (Фиг. 1С). Индекс полидисперсности составлял 1,58, 1,78 и 1,41 для конъюгатов ГК40K, ГК200K и ГК600K, соответственно.
(ii) Стабильность конъюгата при физиологическом стрессе В условиях физиологического стресса, некоторые конъюгаты ГК-G6.31.AARR продемонстрировали значительные физические изменения в течение длительного инкубации в PBSTN. Это изменение наиболее ясно свидетельствуют о сдвигах в средней молекулярной массе (Mw - средневесовая молекулярная масса) с течением времени, как это показано на Фиг. 2. В то время как Mw некоторых образцов не изменялись в течение 12-недельного исследования, те, у которых у которых наблюдалось, все показали снижение Mw с течением времени. Степень снижения Mw зависит как от молекулярной массы каркаса ГК, так и уровня загрузки Fab. В общем, было обнаружено, что преципитация происходит в образцах, в которых молекулярная масса ГК и загрузка Fab были выше.
Для того, чтобы понять этот сдвиг Mw, был выполнен анализ профилей удерживания SEC инкубированных конъюгатов ГК-G6.31.AARR. Время удерживания SEC смещалось в более позднее время при продленной инкубации, что свидетельствует о том, что среднее количество конъюгата становилось все меньше постепенно с течением времени (Фиг. 3). Поскольку время удерживания SEC определяют исключительно по молекулярной массе каркаса ГК (а не по загрузке Fab), это наблюдение показало, что либо: (а) вся популяция конъюгатов становится меньше с течением времени, или (b) субпопуляцию с более высокой молекулярной массой осаждали из раствора, что приводит к видимому смещению к более мелким конъюгатам. Эти данные также приведены в Таблице 7, в которой показана разница между временем удерживания в начале исследования (Т0) и на 12 неделе.
Эти изменения, измеренные с помощью SEC и MALS проводили параллельно с визуальными наблюдениями, что образцы с более высокой молекулярной массой каркаса ГК и более высокой загрузкой Fab содержали видимый осадок на более поздних временных точках. Это наблюдение поддерживает последнее объяснение наблюдаемого сдвига в профилях удерживания SEC, то есть, что более высокие субпопуляции молекулярной массы ГК преципитировались и приводили к смещению средней популяции, оставшейся в растворе.
Далее в поддержку этой гипотезы проводили повторный анализ данных SEC-RI-MALS, исследуя распределение конъюгата ГК-G6.31.AARR по отношению к молекулярной массе, как показано на Фиг. 4. Для образца каркаса ГК40K (левая панель) общее распределение молекул конъюгата по отношению к молекулярной массе заметно не изменилось при длительном воздействии на физиологические условия. Для образца каркаса ГК600K (справа) наблюдали непрерывный сдвиг всех фракций популяции к меньшим молекулярным массам, что указывает на широкую популяцию молекул конъюгатов, которые преципитировались из раствора. Для образца каркаса ГК200K (центральная панель) сдвиг во фракциях популяции происходил главным образом в молекулах конъюгатов с более высокой молекулярной массой. Это указывает на то, что в образце каркаса ГК200K была смешанная популяция относительно стабильных и нестабильных молекул конъюгата. Со временем, молекулы конъюгата с высокой молекулярной массой (относительно нестабильные) преципитируют из раствора, оставляя только относительно стабильную субпопуляцию оставшуюся в растворе.
(iii) Монодисперсные конъюгаты ГК
Основываясь на понимании того, что в полидисперсной популяции ГК200K-G6.31.AARR, только субпопуляция с более высокой MW являются движущей силой физической нестабильности и преципитации, мы предположили, что переключение с полидисперсного каркаса ГК на монодисперсный каркас ГК может привести к более стабильному конъюгату антитела.
Стандартную коммерчески доступную ГК получают путем многостадийного способа, в котором: (а) ГК синтезируется посредством бактериальной ферментации, обеспечивая ГК с чрезвычайно высокой MW (MW 1-4 МДа), (b) ГК очищают из культуры клеток и (с) ГК химически расщепляют контролируемым образом обеспечивая случайный разрыв молекул ГК. Эта заключительная стадия способа имеет решающее значение для получения ГК с более низкой молекулярной массой, которая бы в противном случае не представлялась возможной только при ферментации. Тем не менее, случайный процесс деградации разрезки также приводит к широкому (т.е. полидисперсному) распределению молекулярных масс ГК.
4
4
ГК также можно синтезировать в промышленном масштабе с помощью синхронизированного химио-ферментативного процесса (см. Jing et al. J, Biol, Chem. 279:42345-42349, 2004; Jing et al. Anal. Blochem. 355:183-188, 2006 и патент США №8088604, которые включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме). В этом способе, очищенный фермент гиалуронансинтазы добавляют к смеси мелких олигосахаридов ГК (обычно тетрамеру ГК, ГК) и сахаридам дифосфата уридина (UDP) UDP-глюкуроновой кислоты и UDP-N-ацетилглюкозамину. Фермент гиалуронансинтазы увеличивает фрагменты олигосахаридов, используя доступный сахар переменным образом, что приводит к синхронной полимеризации ГК. Молекулярная масса полученного полимера ГК может быть изменена отношением субстрата ГК (например, ГК) к сахарам в исходной реакции. Результатом этого процесса является высоко монодисперсные полимеры ГК.
Для сравнения, характеристики SEC-RI-MALS полидисперсных и монодисперсных коммерческих ГК подобного размера были сопоставлены на Фиг. 5. Наиболее заметным является различие в индексе полидисперсности, который составлял 1,779 для полидисперсной ГК200К и 1,001 для монодисперсной ГК150K. Считается, что этот нижний уровень полидисперсности для монодисперсной ГК обеспечит несколько ключевых преимуществ с точки зрения конъюгатов ГК-белок: (а) упрощение аналитической характеристики, поскольку устранение полидисперсности ГК оставляет различия в уровнях загрузки белка в качестве единственного источника гетерогенности в образце; (b) устранение низких и более высоких значений молекулярной массы каркасов ГК в общей популяции, которая может устранить гетерогенность, и наблюдаемые осадки при более высокой молекулярной массе каркасов ГК в пределах субпопуляции конъюгатов ГК-G6.31.AARR и (с) потенциальное уменьшение вязкости сформированного конъюгата ГК-антитело.
В контексте использования полидисперсных и монодисперсных исходных материалов ГК для приготовления конъюгатов G6.31.AARR, наблюдалась та же разница в полидисперсности: полидисперсные ГК200K-G6.31.AARR имели индекс полидисперсности, равный 1,228, в то время как монодисперсные ГК150K-G6.31.AARR имели индекс полидисперсности, равный 1,003 (Фиг. 6). Ожидается, что эта монодисперсность позволит улучшить стабильность конъюгатов ГК-G6.31.AARR из-за отсутствия более высокой субпопуляции молекулярной массы каркаса ГК, которая предположительно несет ответственность за нестабильности и преципитацию, наблюдаемые при физиологическом стрессе полидисперсных конъюгатов ГК-G6.31.AARR.
Пример 2: Оптимизированная загрузка Fab и сайты со сконструированным цистеином для конъюгатов антитело линейная ГК
Ковалентное конъюгирование моноклональных антител (мкАт) или фрагментов антител (Fab) к полимерному каркасу может осуществляться посредством широкого спектра химических веществ, начиная от химии амина (прямого амидирования через остатки лизина, доступных для растворителя) и до химио-ферментативных спряжений с использованием субстрат-распознающих ферментов, таких как трансглутаминазы. В последнее время, химическая конъюгация с тиол-малеимидом обрела значительный интерес, поскольку она обеспечивает несколько ключевых преимуществ по сравнению с другими подходами: (а) она является сайт-селективной, реагирующей только на восстановленные, доступные для растворителя остатки цистеина, (b) она является чрезвычайно быстрой реакцией, (с) малеимид-содержащие линкеры легко доступны и, как правило, легко доступны синтетически, (d) остатки цистеина, как правило, могут быть легко включены в структуру белка, а также (е) конъюгация тиол-малеимидом может быть выполнена вблизи нейтрального рН в водных условиях.
Для того, чтобы создать Fab, который поддается малеимидной конъюгации, использовали одну стратегию для получения Fab-C, в которой последовательность тяжелой цепи продлевали за счет шарнирного пептида с первой или второй позиции дисульфид цистеина шарнира и усеченный на этом остатке цистеина (Фиг. 7). На практике этот подход потенциально может ввести ряд осложнений, которые влияют на конъюгацию с полимерным каркасом. Первичное следствие пространственной близости этого свободного остатка цистеина к межцепочечной дисульфидной связи является перестановка тиола, при которой эти три близлежащих остатки цистеина могут образовывать три возможные дисульфидных конфигурации. Эти три возможные дисульфидные конфигурации показаны графически на Фиг. 8А-8С. В каждой конфигурации восстанавливается различный остаток цистеина, что делает его потенциальным местом сопряжения с малеимид-содержащим каркасом полимера. Следствием этого является гетерогенность в месте прикрепления между Fab и каркасом ГК, которая может иметь последствия с точки зрения качества продукта, стабильности Fab или безопасности конъюгированного материала.
Мы предположили, что перемещение в свободном цистеиновый остатке от гибкой, пространственно проксимальной последовательности шарнира к дальнейшему расположению на поверхности Fab может уменьшить или устранить эти варианты конъюгации. Этот подход аналогичен по своей природе тому, который использует моноклональных антител THIOMAB™ со сконструированным цистеином, в которых поверхностные остатках подвергают мутации в цистеины для последующей конъюгации. В формате Fab, мы называем Fab, содержащие поверхностно-мутированный цистеин как «ThioFab».
Белково-полимерные конъюгаты, полученные с использованием химии тиол-малеимида могут также страдать от деконъюгации белка из полимерного каркаса посредством обратной реакции присоединения Михаэля. Это может привести к медленному высвобождению свободного белка из основной цепи полимера рН- и температуро-зависимым образом. Такое поведение также зависят от локальной химической окружающей среды вокруг остатка цистеина и структуры малеимид-содержащего линкера (например, наличие электроноакцепторных групп или аминов). Основываясь на результатах по чувствительности обратной реакции Михаэля различных мест цистеина в разработке THIOMAB™ (см. Shen et al. Nat, Biotechnol, 30:184-189, 2012), мы также предсказали, что перемещение свободного цистеина от шарнирного пептида к месту поверхности приведет к снижению скорости высвобождения свободного Fab из полимерного каркаса в обратной реакции Михаэля. Мы также исследовали скорость деконъюгации в обратной реакции Михаэля модельного полимера полиэтилен гликоль (ПЭГ)-малеимид на молекулах формата Fab-C и ThioFab в физиологических условиях.
(А) Материалы и методы
(i) Материалы
Фермент Lys-C был приобретен у Promega (Каталог №V1671, Мэдисон, Висконсин), фермент гиалуронидаза (рекомбинантный человеческий РН20, также упоминается как TKase) был приобретен у Halozyme (Сан-Диего, Калифорния), N-этилмалеимид (NEM) был приобретен у Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Определенный метоксиполиэтиленгликоль малеимид (d-mPEG4-Mal, партия №10745) приобретали у Quanta Biodesign (Плейн Сити, штат Огайо).
(ii) Ограниченное Lys-C расщепление G6.31.AARR.Fab-C
Ограниченное расщепление при помощи Lys-C проводили на образцах G6.31.AARR.Fab-C. По сравнению с более традиционным Lys-C расщеплением белка, «ограниченное» Lys-C расщепление выполняется с уменьшенным количеством фермента Lys-C и при неденатурирующих условиях. Это приводит к селективному расщеплению части шарнирного пептида молекулы G6.31.AARR.Fab-C (KTHTC (SEQ ID NO: 61)), который расщепляется после остатка лизина. При различных условиях тестировали четыре образца G6.31.AARR.Fab-C: (a) +NEM, -расщепление, (b) +NEM +расщепление, (с) -NEM, +расщепление, и (d) -NEM, -расщепление.
Для каждого образца, до 500 мкг Fab-C в 500 мкл 10 мМ гистидин-ацетата +150 мМ хлорида натрия добавляли 50 мкл 1 М Трис +10 мМ NEM (рН 5,5) (рН 7,5); NEM не добавляли для образцов -NEM. Образцы инкубировали в течение 30 мин при 37°С для связывания любых свободных тиолов. Фермент Lys-C затем добавляли к образцам +Lys-C при массовом соотношении 1:500 Lys-C: Fab-C. Образцы инкубировали в течение 30 мин при 37°С После гидролиза образцы были заморожены для остановки реакции и анализировались с помощью RP-UPLC-TOF.
(iii) Ограниченное Lys-C расщепление ГК200K-G6.31.AARR
К 500 мкг (на белковой основе) ГК200K-G6.31.AARR в 500 мкл 10 мМ гистидина-ацетата +150 мМ буфера хлорида натрия (рН 5,5), добавляли 50 мкл 1 М Трис (рН 7,5). Фермент Lys-C добавляли в массовом соотношении 1:500 Lys-C: Fab-C. Образцы инкубировали в течение ночи при 37°С. После гидролиза образцы были заморожены для остановки реакции и анализировались с помощью RP-UPLC-TOF.
(iv) Расщепление ГК200K-G6.31.AARR при помощи гиалуронидазы
500 мкг (на белковой основе) ГК200K-G6.31.AARR разводили в 500 мкл 10 мМ гистидина-ацетата +150 мМ хлорида натрия (рН 5,5). Гиалуронидазу добавляли в количестве 10 единиц (Ед) на 1 мкг ГК в конъюгата. Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 4 ч. После гидролиза образцы были заморожены для остановки реакции, и анализировались с помощью RP-UPLC-TOF.
(v) Деконъюгация в обратной реакции Михаэля модельных конъюгатов G6.31.AARR-PEG
Для G6.31. AARR. Fab-C, G6.31.AARR.A140C, G6.31.AARR.L174C и G6.31.AARR.K149C заменяли буфер на 10 мМ фосфата (рН 6,5), 150 мМ NaCl, 2,5 мМ ЭДТА в концентрации от 0,2 до 0,5 мг/мл, и добавляли d-mPEG4-Mal в 20-кратном молярном избытке. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч с последующей очисткой с помощью обессоливания на колонках PD-10 (GE Healthcare, Питтсбург, штат Пенсильвания) в ФСБ (рН 7,4). Конъюгаты затем концентрировали до 1 мг/мл с помощью центробежной ультрафильтрации и с добавкой окисленного глутатиона (GSSG) до конечной концентрации 2 мМ. Конструкты инкубировали при 37°С и периодически отбирали образцы для анализа с помощью RP-UPLC-TOF.
(vi) Анализ методом обращенно-фазовой сверхэффективной жидкостной хроматографии/ времяпролетной (RP- UPLC-TOF) масс-спектрометрии (MS)
Интактные массы образцов были получены с помощью анализа методом жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ЖХ/МС) с использованием времяпролетного (TOF) масс-спектрометра с ионизацией электрораспылением (ESI) Agilent 6230 с системой сверхэффективной жидкостной хроматографии (UPLC) Agilent 1290. Приблизительно 2,5 мкг белка вводили на образец и обессоливали с помощью сверхэффективной жидкостной хроматографии с обратной фазой (RP-UPLC) для прямого онлайн МС-анализа. Полученные спектры подвергали деконволюции до состояния нулевого заряда, используя рабочую станцию с программным обеспечением для качественного анализа MassHunter Workstation/Qualitative Analysis (Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, Калифорния).
(В) Результаты
(iii) Дисульфидный статус в G6.31.AARR.Fab-C
Для подтверждения наличия трех дисульфидных состояний, приведенных на Фиг. 8А-8С, существующих в G6.31.AARR. Fab-C, и сохраняющихся в динамическом термодинамическом равновесии, мы провели серию экспериментов с использованием малеимидного кэппирования с использованием NEM и ограниченных Lys-C расщеплений, чтобы исследовать как мгновенный статус трех цистеиновых остатков, так и их способность динамически перегруппировываться.
В первом эксперименте, G6.31.AARR.Fab-C кэппировали с использованием NEM (фиксируя дисульфидный статус за счет устранения любых свободных тиолов), а затем подвергали ограниченному Lys-C расщеплению, расщепляя последовательность шарнирного пептида тяжелой цепи до предполагаемого свободного остатка цистеина (Фиг. 9, вторая хроматограмма). После денатурирующего анализа на RP-UPLC-TOF наблюдали виды, связанные стремя дисульфидными состояниями, представленными на Фиг. 8А-8С: (а) неповрежденный Fab-минус шарнирный пептид (имеющий отношение к Фиг. 8А); (b) легкую цепь плюс NEM и циклизированную тяжелую цепь (имеющий отношение к Фиг. 8В); и (с) легкую цепь плюс шарнирный пептид и тяжелую цепь минус шарнирный пептид плюс NEM (имеющий отношение к Фиг. 8С). Данный эксперимент продемонстрировал, что G6.31.AARR.Fab-C не существует в однородном состоянии, но содержит три различных вида с различными дисульфидными конфигурациями и, следовательно, реакционноспособными остатками цистеина.
Во втором эксперименте, G6.31.AARR.Fab-C было подвергнут ограниченному Lys-C расщеплению без NEM кэппирования, оставляя цистеинам возможность динамически перегруппировываться (Фиг. 9, третья хроматограмма). В данном эксперименте, почти все белки, проанализированные при помощи RP-UPLC-TOF, были в одном и том же состоянии: Fab минус шарнирный пептид. Принимая во внимание результаты первого эксперимента, этот второй набор данных указывает на то, что три свободных цистеина динамически перегруппировались и в относительно ускоренном масштабе времени (30 мин продолжительность эксперимента). После расщепления шарнирного пептида при помощи Lys-C, три возможных дисульфидных состояния динамически «скремблируются» между тремя остатками цистеина. Если в какой-то момент времени образуется правильный межцепочечный дисульфид, последовательность шарнирного пептида оставляют для высвобождения в раствор, поскольку она была предварительно расщеплена при помощи Lys-C. В результате этого процесса перегруппировки образец движется к полностью правильно сформированному межцепочечному дисульфиду.
Эти два эксперимента подтвердили, что G6.31.AARR.Fab-C может существовать в трех различных состояниях в отношении трех проксимальных остатков цистеина, и что их относительное содержание определяется динамическим термодинамическим равновесием. Это последнее обстоятельство имеет важное значение, поскольку оно указывает на то, что ни одна стадия дополнительной обработки не может полностью устранить две неправильные дисульфидные конфигурации, так как с учетом любого короткого периода времени три цистеина повторно скремблируются, чтобы образовать три варианта, наблюдаемые в первом эксперименте.
(ii) Варианты конъюгации в конъюгатах ГК-G6.31.AARR.Fab-C
В то время как эти три дисульфидные варианты присутствуют в G6.31.AARR.Fab-C, осталось продемонстрировать, что они также существуют как варианты в конъюгатах ГК-G6.31.AARR. Для того, чтобы выяснить точное местоположение конъюгации отдельных молекул G6.31.AARR.Fab-C с ГК-малеимидом, мы использовали две процедуры ферментативного расщепления. Первое, ограниченным Lys-C расщеплением G6.31.AARR расщепляли при шарнирном пептиде, предшествующем предполагаемому свободному остатку цистеина тяжелой цепи. В правильно конъюгированных молекулах G6.31.AARR, эта обработка должно освободить свободный интактный G6.31.AARR в раствор. Однако анализ расщепленных образцов при помощи RP-UPLC-TOF в денатурирующих условиях определил дополнительные виды в растворе: свободная легкая цепь плюс расщепленный шарнирный пептид (Фиг. 10А). Присутствие данного вида подтверждает, что популяцию G6.31.AARR.Fab-C конъюгировали с ГК через цистеин тяжелой цепи, обычно занимаемый межцепочечным дисульфидом, предположительно происходящим из дисульфидного варианта, изображенного на Фиг. 8С.
Вторая процедура ферментативного расщепления сохраняла все сопряжения нетронутыми, но полностью расщепила каркас ГК с помощью гиалуронидазы (ГКаза). Это позволило не только анализировать свободные молекулы в растворе, но и конъюгированные белки с ковалентно связанными малыми олигосахаридами ГК. Этот метод позволял непосредственно наблюдать конъюгированные виды на индивидуальном уровне. В этом эксперименте наблюдали молекулы G6.31.AARR правильно конъюгированные с ГК через предполагаемый концевой цистеин тяжелой цепи; однако, были также найдены прямые доказательства конъюгации через дисульфидный вариант, изображенный на Фиг. 8 В. Это предложение было поддержано двумя наблюдениями: (а) наличием свободных молекул циклизованной тяжелой цепи в растворе; и (b) наличием олигосахаридов ГК с ковалентно связанным малеимидным линкером плюс легкой цепи (Фиг. 10В). Присутствие данных видов подтверждает, что популяцию G6.31.AARR.Fab-C конъюгировала с ГК через цистеин легкой цепи, обычно занимаемый межцепочечным дисульфидом, предположительно происходящим из дисульфидного варианта, изображенного на Фиг. 8В.
Эти два эксперимента с расщеплением подтвердили, что дисульфидная перегруппировка действительно приводит к изменениям в месте присоединения G6.31.AARR.Fab-C и ГК-малеимида. Это наблюдение, как ожидается, применимо к любому малеимид-содержащему каркасу полимера, используемому для конъюгации, и любому Fab-C, содержащего эту конфигурацию из трех остатков цистеина в непосредственной близости.
(iii) Конструирование Fab, содержащего свободный цистеин, для более однородной конъюгации
Данные, описанные выше, демонстрируют, что три варианта конъюгации существует при присоединении молекулы Fab-C к малеимид-содержащему каркасу полимера. Эта неоднородность конъюгации обусловлена наличием трех различных дисульфидных конфигураций в термодинамическом равновесии, причем каждая конфигурация оставляет доступный для конъюгации остаток цистеина, отличающийся от других. То, что эти три дисульфидные конфигурации возможны, скорее всего, зависит от нескольких факторов, в том числе близости предполагаемого свободного цистеинового остатка шарнира к межцепочечному дисульфиду и гибкости последовательности шарнирного пептида, к которому присоединен свободный цистеин.
Для того чтобы избежать скремблирования (scrambling) свободного цистеина с межцепочечным дисульфидом, мы предусмотрели перемещение свободного цистеина дальше от межцепочечного дисульфида. Таким образом, мы урезали шарнирную последовательность, как это типично для стандартной молекулы Fab-формата и заменили остатки поверхности Fab на остатки цистеина. Эти сайты были выбраны таким образом, чтобы они были достаточно далеко от HVR так, чтобы не оказывать негативное воздействие на связывания антигена, и чтобы были достаточно далеко от межцепочечного дисульфида, чтобы предотвратить скремблирование.
Для начального скринингового исследования на основе предыдущих отчетов от разработки THIOMAB™ было выбрано три сайта, отвечающих этим критериям: LC-K149 (нумерация EU), НС-А140 (нумерациия EU) и HC-L174 (нумерация EU). Каждый сайт был заменен на остаток цистеина и шарнирный пептид был закончен непосредственно перед первым дисульфидным цистеином шарнирной области (т.е. KТНТ; SEQ ID NO: 87).
Для того, чтобы подтвердить, что эти цистеиновые сайты все еще реакционноспособны по отношению к ГК-малеимиду, мы провели пилотные сопряжения связей в стандартных условиях (10 мМ фосфат (рН 6,5), 150 мМ NaCl и 2,5 мМ ЭДТА) и оценивали продукты по данным SEC-RI-MALS после того, как инкубировали в течение ночи. Сопряжение протекало нормально с генерацией конъюгатов ГК-G6.31.AARR при правильном времени удерживания по сравнению с контролем реакции конъюгации G6.31.AARR.Fab-C (Фиг. 11). Единственное существенное отличие, отмеченное для образцов тио-Fab, заключалось в более низкой степени превращения Fab в конъюгат. Это, вероятно, вызвано сравнительно низкой рН реакции конъюгации (рН 6,5), что может быть лучше подходит для рKа цистеина шарнира по сравнению с таким сконструированных остатков цистеина тио-Fab. Ожидается, что увеличение рН реакции конъюгации повысит выход сопряжений тио-Fab.
(iv) Чувствительность обратной реакции присоединения Михаэля форматов Fab-C и muo-Fab
G6.31.AARR в форматах Fab-C и тио-Fab конъюгировали с модельными конструктами ПЭГ-малеимида и инкубировали в ФСБ при 37°С с GSSG, чтобы действовать в качестве ловушки для свободных тиолов (т.е., предотвращение обратной реакции присоединения Михаэля выделившегося свободного тиола с ПЭГ-малеимидом), а затем периодический анализ с помощью RP-UPLC-TOF. В конструктах Fab-C-ПЭГ наблюдали значительную деконъюгацию в обратной реакции Михаэля в течение первых семи суток, что приводит к потере 9,8% интактного конъюгата (Фиг. 12). Конъюгаты тио-Fab продемонстрировали различные уровни улучшения по сравнению Fab-C с вариантом А140С, демонстрирующим почти полное отсутствие деконъюгации до 14 суток, вариант L174C, демонстрирующий 5,9% деконъюгации, и вариант K149С, демонстрирующий 7,1% деконъюгации за то же время. Эти данные указывают на то, что варианты цистеиновой мутации могут быть защитными против деконъюгации белка, опосредованной обратной реакцией Михаэля, и может обеспечить значительное преимущество по сравнению с форматом Fab-C в сохранении интактных конъюгатов белок-полимер.
Пример 3: Иллюстративные анти-ФРЭС антитела для применения в конъюгатах антител согласно изобретению
Любое из анти-ФРЭС антител, описанных в данном документе, может быть использовано для получения конъюгатов антител, как описано в Примерах 1 и 2. Например, любое анти-ФРЭС антитело, описанное в международной патентной заявке № PCT/US2016/053454, может быть использовано. В Таблице 8 описаны иллюстративные анти-ФРЭС антитела, которые могут быть использованы, а также аминокислотные последовательности из доменов VH и VL для каждого антитела. В Таблице 9 описаны аминокислотные последовательности HVR VL для анти-ФРЭС антител, описанных в Таблице 8. В Таблице 10 описаны аминокислотные последовательности HVR VH для анти-ФРЭС антител, описанных в Таблице 8. В конкретных вариантах осуществления используется анти-ФРЭС антитело G6.31 AARR (также называемое в данном документе «G6.31.AARR»).
Верхняя шарнирная область тяжелой цепи Fab любых из антител, перечисленных выше, например, G6.31 AARR, может быть мутирована для удаления реакционной способности к аутоантителам против шарнира IgG1, о которой сообщалось в литературе. См, например, Brezski et al., J. Immunol. 181:3183-3192, 2008 и Brezski et al., mAbs 2:3, 212-220, 2010. Таким образом, С-концевая аминокислота тяжелой цепи G6.31 AARR может быть или Т (версия дикого типа (ДТ)) или L (вариант версии, который лишен реактивности к Fab против IgG человека). Полноразмерная аминокислотная последовательность тяжелой цепи G6.31 AARR дикого типа представляет собой SEQ ID NO: 48. Полноразмерная аминокислотная последовательность тяжелой цепи варианта версии, который лишен реактивности к Fab против IgG человека, представляет собой SEQ ID NO: 49. Полноразмерная аминокислотная последовательность легкой цепи как для G6.31 AARR, так и варианта версии, который лишен реактивности к Fab против IgG человека, представляет собой SEQ ID NO: 50.
Аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи варианта антитела, сконструированного введением цистеина, G6.31.AARR.LC-K149C приведены ниже (LC-C149 выделена полужирным шрифтом и подчеркнута).
Легкая цепь (LC):
Тяжелая цепь (НС):
Аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи варианта антитела, сконструированного введением цистеина, G6.31AARR.HC-A140C приведены ниже (НС-С140 выделена жирным шрифтом и подчеркиванием).
LC:
НС:
Аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи варианта антитела, сконструированного введением цистеина, G6.31AARR.HC-L174C приведены ниже (НС-С174 выделена жирным шрифтом и подчеркиванием).
LC:
НС:
Пример 4: Конъюгаты ГК-G6.31.AARR, полученные из монодисперсных ГК, демонстрируют улучшенные физическую стабильность при физиологическом стрессе по сравнению с конъюгатами ГК-G6.31.AARR, полученными из полидисперсной ГК
(А) Материалы и методы
Монодисперсную ГК синтезировали при помощи химио-ферментативного процесса с использованием гиалуронансинтазы Pasteurella multocida (PmHAS), полученной от Hyalose (Оклахома-Сити, Оклахома). Все остальные химические вещества и реагенты были от Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури).
h
Монодисперсную ГК (моноГК, Mw 137 кДа, r 21,2 нм), модифицировали с N-(2-аминоэтилмалеимидом), как описано выше, чтобы она содержала 4,0% малеимидных групп.G6.31.AARR.Fab-C затем конъюгируют с каркасом моноГК-малеимидом, как описано выше, и очищали с помощью SEC на колонке HILOAD SUPERDEX 200 пг с ФСБ, рН 7,4 подвижного буфера. Конъюгированные фракции объединяли и подтверждали при помощи SEC-RI-MALS.
280
450
Очищенный моноГК-G6.31.AARR концентрировали при помощи ультрафильтрации до 5 мг/мл (на основе Fab) в ФСБ, с добавлением азида натрия и полисорбата 20 (PS20) до конечной концентрации 2 мМ и 0,01%, соответственно, и инкубировали при 37°С. В определенные моменты времени отбирали образцы и разбавляли до 1 мг/мл в буфере, содержащем 10 мМ His-HCl (рН 5,5), 150 мМ NaCl, 10% (вес/объем) трегалозы и 0,01% полисорбата 20, а затем анализировали на концентрацию растворимого белка (А), мутность (А), время удерживания SEC и молекулярную массу (Mn и Mw по данным SEC-RI-MALS).
(В) Результаты
Конъюгаты ГК-G6.31.AARR, полученные с использованием монодисперсной ГК продемонстрировали значительно улучшенную физическую стабильность до четырех недель по сравнению с конъюгатом ГК-G6.31.AARR, полученным с полидисперсной ГК подобного размера при том же уровне загрузки Fab (Фиг. 14). Молекулярная масса (Mw) моноГК-G6.31.AARR незначительно снизилась с недели до 2 недели и 4 недели, но эта потеря могла быть полностью объяснена потерей свободного Fab вследствие деконъюгации в обратной реакции Михаэля, как это обычно наблюдается для конъюгированных с тиол-малеимидом белков. Также не было заметного сдвига во времени удерживания SEC для моноГК-G6.31.AARR, что указывало на то, что физический размер конъюгата не изменялся стечением времени.
Эти результаты ясно подтверждают гипотезу о том, что в популяции конъюгатов ГК-G6.31.AARR, полученных из исходного вещества полидисперсных ГК, субпопуляция на основе ГК с высокой молекулярной массой отвечает за физическую нестабильность, наблюдаемую после физиологического стресса. Удаление этой субпопуляция путем гомогенизации исходного вещества ГК (то есть, исходя из монодисперсной ГК) приводит к более стабильной молекуле конъюгата, которая является менее склонной к осаждению в условиях физиологического стресса. Эти данные дополнительно поддерживают использование конъюгатов ГК-G6.31.AARR, полученных из вещества монодисперсной ГК, в качестве терапевтических агентов для применения in vivo.
Хотя вышеизложенное изобретение в целях однозначности понимания было описано с некоторыми подробностями в качестве иллюстрации и примеров, описание и примеры не следует воспринимать как ограничивающие объем изобретения. Содержание всех патентов и научной литературы, упоминаемых в данном документе, в явной форме и в полном объеме включено посредством ссылки.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Genentech, Inc.
F. Hoffmann-La Roche AG
<120>  ОПТИМИЗИРОВАННЫЕ КОМПОЗИЦИИ АНТИТЕЛ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ ГЛАЗ
<130>  50474-160WO3
<150>  US 62/475163
<151>  2017-03-22
<160>  94
<170>  PatentIn версии 3.5
<210>  1
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  1
Asp Tyr Trp Ile His
1               5
<210>  2
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa представляет собой Ile или His
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa представляет собой Ala или Arg
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa представляет собой Tyr или Lys
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa представляет собой Thr или Glu
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa представляет собой Arg, Tyr, Gln, или Glu
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой Ala или Glu
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (16)..(16)
<223>  Xaa представляет собой Lys или Glu
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (17)..(17)
<223>  Xaa представляет собой Gly или Glu
<400>  2
Gly Xaa Thr Pro Xaa Gly Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Asp Ser Val Xaa
1               5                   10                  15
Xaa
<210>  3
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  3
Phe Val Phe Phe Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>  4
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa представляет собой Asp или Arg
<400>  4
Arg Ala Ser Gln Xaa Val Ser Thr Ala Val Ala
1               5                   10
<210>  5
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой Ser или Met
<400>  5
Xaa Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1               5
<210>  6
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой Gln, Asn, или Thr
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой Ala, Asn, Gln, или Arg
<400>  6
Xaa Gln Gly Tyr Gly Xaa Pro Phe Thr
1               5
<210>  7
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  7
Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  8
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  8
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1               5                   10
<210>  9
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  9
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1               5
<210>  10
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  10
Gln Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Phe Thr
1               5
<210>  11
<211>  120
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Arg Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Phe Val Phe Phe Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  12
<211>  107
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  13
<211>  30
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser
20                  25                  30
<210>  14
<211>  14
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  14
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1               5                   10
<210>  15
<211>  32
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  15
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Arg Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  16
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  16
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  17
<211>  23
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210>  18
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  18
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  19
<211>  32
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  19
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  20
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  20
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  21
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  21
Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  22
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  22
Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Gly
<210>  23
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  23
Gln Gln Gly Tyr Gly Asn Pro Phe Thr
1               5
<210>  24
<211>  32
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  24
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  25
<211>  23
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Glu Val Thr Ile Thr Cys
20
<210>  26
<211>  23
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Glu Val Thr Ile Thr Cys
20
<210>  27
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  27
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  28
<211>  32
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  28
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Glu Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  29
<211>  30
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  29
Glu Glu Gln Leu Val Glu Glu Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Glu Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Glu Ile Ser
20                  25                  30
<210>  30
<211>  14
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  30
Trp Val Arg Gln Glu Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val Ala
1               5                   10
<210>  31
<211>  32
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  31
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Glu Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Glu Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  32
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  32
Trp Gly Gln Gly Glu Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  33
<211>  120
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  33
Glu Glu Gln Leu Val Glu Glu Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Glu Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Glu Ile Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Glu Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Glu Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Glu Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Phe Val Phe Phe Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Glu Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  34
<211>  107
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Glu Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  35
<211>  107
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Glu Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Glu Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  36
<211>  107
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Glu Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  37
<211>  107
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Glu Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  38
<211>  107
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Asn Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  39
<211>  14
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  39
Trp Val Arg Gln Glu Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1               5                   10
<210>  40
<211>  120
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Glu Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Phe Val Phe Phe Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  41
<211>  107
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  42
<211>  120
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Phe Val Phe Phe Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  43
<211>  227
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Phe Val Phe Phe Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His
225
<210>  44
<211>  32
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  44
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  45
<211>  23
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Asp Cys
20
<210>  46
<211>  107
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Asp Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  47
<211>  232
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  47
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20                  25                  30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35                  40                  45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
50                  55                  60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65                  70                  75                  80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
85                  90                  95
Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
100                 105                 110
Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
115                 120                 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val
130                 135                 140
Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp
165                 170                 175
Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys
180                 185                 190
His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn
195                 200                 205
Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr
210                 215                 220
Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
225                 230
<210>  48
<211>  228
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Arg Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Phe Val Phe Phe Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr
225
<210>  49
<211>  228
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Arg Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Phe Val Phe Phe Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Leu
225
<210>  50
<211>  214
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  51
<211>  120
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  51
Glu Glu Gln Leu Val Glu Glu Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Glu Ile Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Glu Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Glu Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Glu Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Phe Val Phe Phe Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Glu Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  52
<211>  30
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  52
Glu Glu Gln Leu Val Glu Glu Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Glu Ile Ser
20                  25                  30
<210>  53
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  53
Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  54
<211>  32
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  54
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  55
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  55
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys
1               5                   10
<210>  56
<211>  34
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  56
catcagatgg cgggaagatg aagacagatg gtgc                                   34
<210>  57
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  57
gccatccaga tgacccagtc tcc                                               23
<210>  58
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  58
ggctgcacca tctgtcttc                                                    19
<210>  59
<211>  107
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Asn Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  60
<211>  107
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  61
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  61
Lys Thr His Thr Cys
1               5
<210>  62
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  62
Gly Tyr Tyr Met His
1               5
<210>  63
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  63
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  64
<211>  20
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  64
Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Pro Gly
1               5                   10                  15
Ala Phe Asp Ile
20
<210>  65
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  65
Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His
1               5                   10
<210>  66
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  66
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser
1               5
<210>  67
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  67
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Trp Val
1               5                   10
<210>  68
<211>  129
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  68
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr
100                 105                 110
Pro Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  69
<211>  110
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  69
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35                  40                  45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85                  90                  95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100                 105                 110
<210>  70
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  70
Gly Thr Lys Val Glu Cys Lys Arg Thr Val Ala
1               5                   10
<210>  71
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  71
Lys Val Glu Ile Lys Cys Thr Val Ala Ala Pro
1               5                   10
<210>  72
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  72
Asn Asn Phe Tyr Pro Cys Glu Ala Lys Val Gln
1               5                   10
<210>  73
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  73
Ala Lys Val Gln Trp Cys Val Asp Asn Ala Leu
1               5                   10
<210>  74
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  74
Gln Gly Thr Leu Val Cys Val Ser Ser Ala Ser
1               5                   10
<210>  75
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  75
Thr Ser Gly Gly Thr Cys Ala Leu Gly Cys Leu
1               5                   10
<210>  76
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  76
Thr Phe Pro Ala Val Cys Gln Ser Ser Gly Leu
1               5                   10
<210>  77
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  77
Leu Gln Ser Ser Gly Cys Tyr Ser Leu Ser Ser
1               5                   10
<210>  78
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  78
Leu Ser Ser Val Val Cys Val Pro Ser Ser Ser
1               5                   10
<210>  79
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  79
His Lys Pro Ser Asn Cys Lys Val Asp Lys Lys
1               5                   10
<210>  80
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  80
Pro Glu Val Thr Cys Cys Val Val Asp Val Ser
1               5                   10
<210>  81
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  81
Thr Cys Leu Val Lys Cys Phe Tyr Pro Ser Asp
1               5                   10
<210>  82
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  82
Leu Val Lys Gly Phe Cys Pro Ser Asp Ile Ala
1               5                   10
<210>  83
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  83
Ile Ala Val Glu Trp Cys Ser Asn Gly Gln Pro
1               5                   10
<210>  84
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  84
Gln Gly Asn Val Phe Cys Cys Ser Val Met His
1               5                   10
<210>  85
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  85
His Glu Ala Leu His Cys His Tyr Thr Gln Lys
1               5                   10
<210>  86
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  86
His Asn His Tyr Thr Cys Lys Ser Leu Ser Leu
1               5                   10
<210>  87
<211>  4
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  87
Lys Thr His Thr
1
<210>  88
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  88
Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys
1               5
<210>  89
<211>  214
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  89
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Cys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  90
<211>  228
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  90
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Arg Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Phe Val Phe Phe Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr
225
<210>  91
<211>  214
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  91
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  92
<211>  228
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  92
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Arg Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Phe Val Phe Phe Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Cys Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr
225
<210>  93
<211>  214
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  93
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  94
<211>  228
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический конструкт
<400>  94
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Arg Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Phe Val Phe Phe Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Cys Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr
225
<---