КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ
COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVEMENT OF PLANT PRODUCTIVITY

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США № 61/866681, поданной 16 августа 2013, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
ПРАВА ПРАВИТЕЛЬСТВА
[0002] Это изобретение было сделано при поддержке правительства по контракту № DE-AC52-06NA25396, предоставленному Министерством энергетики США. Правительство имеет определенные права на изобретение.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0003] Изобретение направлено на композиции и способы для улучшения характеристик роста растения, увеличения эффективности использования растением питательных веществ или улучшения способности растений к преодолению стресса.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] Вследствие увеличения населения во всем мире и продолжающегося уничтожения или разрушения иным образом доступных сельскохозяйственных угодий потребность в более эффективных и устойчивых системах для народнохозяйственного агрономического комплекса приобретает первостепенное значение для человечества. Усовершенствование производства биомассы, урожайность культур, содержание белка, темпы роста растений и т.д. представляют собой основные цели в развитии систем сельского хозяйства, которые могут более эффективно реагировать на экологические и экономические проблемы.
2
3
2
3
3
[0005] Азот считается основным ограничивающим развитие элементом в выращивании и продуктивности растений. Он является ключевым компонентом хлорофилла и аминокислот и встречается в аденозинтрифосфате (АТФ) и нуклеиновых кислотах. Растения получают азот из атмосферы в виде газа N и/или из почвы (например, изудобрения и продуктов разложения органических веществ), но могут использовать данный элемент только в восстановленной форме (например,NH). Преобразованием атмосферного азота (N) в аммиак (NH) является «фиксация азота», осуществляемая с помощью фермента «нитрогеназа» у специализированных групп прокариот, имеющих симбиотические отношения с растениями. Растения могут легко усвоить NH и использовать молекулы в качестве основы для производства ключевых биологических компонентов (например,хлорофилла и аминокислот), которые способствуют росту и продуктивности растений.
3
[0006] К сожалению, фиксация азота является ограничивающей стадией для растений в процессе получения NH, и, как результат, современное сельское хозяйство дополнено промышленно выпускаемыми азотными удобрениями. Такое широкомасштабное использование удобрений привело к экологическим проблемам мирового масштаба, таким как формирование прибрежных мертвых зон (объясняется, прежде всего, стоками в ручьи и океаны), имеющим самые серьезные последствия для морских обитателей.
[0007] В результате этого по-прежнему существует потребность в улучшенных, экономически эффективных и экологически обоснованных композициях и способах улучшения роста растений, производства биомассы, урожайности зерна и т.п.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] Изобретение направлено на способы для увеличения ростовых характеристик растений, увеличения эффективности использования растениями питательных веществ или улучшения способности растений преодолевать стресс, включая применение композиций, содержащих кетосукцинамат, его производные или соли, для растений или материалов для размножения растений. Изобретение также направлено на композиции, содержащие кетосукцинамат или его производное, или его соль; носитель; и, необязательно, соединение, стимулирующее рост растений.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0009] На Фигуре 1 показана диаграмма метаболического усвоения азота в растениях, как принято считать в данной области техники. Усвоение азота и первичный метаболизм (сплошные линии) начинаются с образования глютамина с помощью глютаминсинтетазы (GS), катализирующей соединение глутамата и аммиака. Затем один азот из глютамина передается 2-оксоглутарату для образования глутамата. Аспартат и аспарагин синтезируются из оксалоацетатного углеродного остова и одного азота от глутамата, а другого от глютамина. 2-Оксоглутарамат и кетосукцинамат синтезируются из глютамина и аспарагина, соответственно (штриховые линии).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ВОПЛОЩЕНИЯ
[00010] Настоящее изобретение устраняет или минимизирует существующие экологические и экономические недостатки промышленных добавок азота для сельскохозяйственных культур за счет повышения до максимального уровня способности растений использовать доступный азот, тем самым уменьшая необходимое количество добавок. Настоящее изобретение направлено на способы усовершенствования некоторых аспектов продуктивности растений путем применения композиции, содержащей кетосукцинамат или его соль, к растениям или материалу для размножения растений. Также в способах изобретения могут использоваться производные кетосукцинамата или его соли.
[00011] Кетосукцинамат, также известный в данной области техники как 2-оксосукцинамат, L-оксосукцинамат, альфа-кетосукцинамат, 3-карбамоил-2-оксопропаноат и 4-амино-2,4-диоксобутаноат, имеет следующую структуру:
[00012] Кетосукцинамат также может существовать в виде димера, который также входит в объем изобретения. Ralph A Stephani and Alton Meister 1971 «Structure of the dimeric a-ketanalogue of asparagine» J. Biol Chem. 246:7115-7118. Термин «Производные кетосукцинамата», используемый в настоящем документе, относится к химическим соединениям, которые являются производными от кетосукцинамата в результате химического или физического процесса. Производное может быть структурным и/или функциональным аналогом. К производным кетосукцинамата относятся, например, соединения, представленные в таблице 1.
<b>Таблица 1</b>
Производное кетосукцинамата
Химическая структура
Димерная структура кетосукцинамата
<img file="00000002.jpg" he="46" wi="71" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Кетосукцинамат (4-амино-2,4-диоксобутановая кислота)
<img file="00000003.jpg" he="31" wi="64" img-content="undefined" img-format="jpg" />
(S)-4-оксо-2-азетидинкарбоновая кислота(CAS № 16404-94-7)
<img file="00000004.jpg" he="24" wi="52" img-content="undefined" img-format="jpg" />
(R)- 4-оксо-2-азетидинкарбоновая кислота(CAS № 62860-12-2)
<img file="00000005.jpg" he="23" wi="51" img-content="undefined" img-format="jpg" />
4,8-диоксо-1,5-диазокано-2,6-дикарбоновая кислота
<img file="00000006.jpg" he="46" wi="64" img-content="undefined" img-format="jpg" />
2,6-дигидрокси-4,8-диоксо-1,5-диазокано-2,6-дикарбоновая кислота
<img file="00000007.jpg" he="59" wi="77" img-content="undefined" img-format="jpg" />
См.,
[00013] Кетосукцинамат, а также его производные могут быть приобретены или синтезированы, как описано здесь или средствами, известными специалистам в данной области техники.  например, Meister А., J. Biol. Chem., (1953) 200:571 (1953)-589; Weygand, Freidrich and Heinz-Jurgen Dietrich, 1954: Синтез 1,5-диазациклооктандион-(4,8)-дикарбонзаура-(2,6), Chemische Berichte 87(4): 482-488.
[00014] Композиции изобретения могут быть применены с помощью любого из способов, известных в данной области техники, таких как, например, распыление, орошение, нанесение защитного покрытия, погружение, инъекции или любая их комбинация.
[00015] Способы настоящего изобретения включают в себя улучшение характеристик роста растений, включая применение композиции, содержащей кетосукцинамат или его производные, или его соли, к растениям или материалу для размножения растений. Специалисты в данной области техники понимают, что «характеристики роста» включают, например, биомассу, массу внекорневых тканей, количество клубней при клубнеобразовании, массу клубней при клубнеобразовании, активность клубнеобразования, количество семенных шапок, количество побегов, количество цветков, количество клубней, массу клубней, массу луковиц, содержание масла, количество семян, массу всех семян, среднюю массу семян, скорость появления листьев, корневую массу, общую массу находящихся в почве тканей, урожайность закладываемых на хранение фруктов или орехов, содержание растительного белка и крахмала, темпы накопления биомассы, скорость появления ростков, темпы роста ростков, средний вес плода, всхожесть, энергию прорастания семян или любую их комбинацию. В примерных вариантах воплощения настоящего изобретения способы приведут к увеличению биомассы, массы внекорневых тканей, количества клубней при клубнеобразовании, массы клубней при клубнеобразовании, активности клубнеобразования, количества семенных шапок, количества побегов, количества цветков, количества клубней, массы клубней, массы луковиц, количества семян, общей массы семян, скорости появления листьев, скорости появления побегов, энергии прорастания семян или любой их комбинации. С помощью композиций и способов изобретения ростовые показатели растения будут увеличены по сравнению с ростом растений в отсутствие композиций и способов изобретения.
[00016] Другие варианты воплощения изобретения направлены на способы повышения эффективности использования питательных веществ растениями, включая применение композиции, содержащей кетосукцинамат или его производные, или его соли, к растениям или материалу для размножения растений. Термин «эффективность использования азота (ЭИА)», используемый в настоящем документе, относится к измерению урожайности сельскохозяйственных культур на единицу применяемых азотных удобрений. Для большинства сельскохозяйственных систем более чем 50% и вплоть до 75% азота, вносимого в почву, не используется растениями и теряется, выщелачиваясь в почву или в стоки в поверхностных водах. Таким образом, увеличение ЭИА увеличивает эффективность.
[00017] ЭИА может измеряться способами, известными любому специалисту в данной области техники. Одним из показателей производства сельскохозяйственных культур, связанных с ЭИА, является эффективность использования азотных удобрений. Другим показателем производства сельскохозяйственных культур, связанных с ЭИА, является эффективность использования общего азота. Другие признаки ЭИА включают различные воздействия на урожайность. Например, ЭИА может означать повышение содержания или концентрации белка в листьях, зерне или других тканях или органах растения. ЭИА также может означать повышение содержания или концентрации аминокислот в листьях, зерне или других тканях или органах растения. Также признаком ЭИА является комбинация повышения содержания или концентрации белков и аминокислот в листьях, зерне или других тканях или органах растения.
[00018] В то же время другие варианты воплощения изобретения относятся к способам усовершенствования способности растений к преодолению стресса, включающим нанесение композиции, содержащей кетосукцинамат или его производные, или его соли, на растение или на материал для размножения растений. Термин «стресс», используемый здесь, относится к любому нежелательному внешнему фактору. Например, способы изобретения увеличивают способность растений преодолевать биотический стресс. «Биотическим стрессом» является стресс, возникающий в результате нанесения вреда растениям другими живыми организмами, например, насекомыми, вирусами, грибками, паразитами, сорняками и животными. Способы изобретения также увеличивают способность растений преодолевать абиотический стресс. «Абиотическим стрессом» является стресс, возникающий в результате воздействия абиотических факторов, например, инсоляции, ветра, огня, наводнения и засухи. Способы изобретения также усиливают способность растений преодолевать химический стресс, например, стресс, вызванный воздействием пестицидов, фунгицидов, гербицидов, антибактериальных или антивирусных композиций.
[00019] Растения, которые могут извлечь выгоду из способов, описанных здесь, включают однодольные растения и двудольные растения. Они включают, не ограничиваясь этим, зерновые, бобовые, волокнистые растения, масличные растения, клубненосные растения, крахмалосодержащие растения, травянистые, лианы, фруктовые, овощные, цветущие растения и деревья. Конкретные виды растений, относящиеся к объему притязаний изобретения, включают, например, пшеницу, овес, рис, кукурузу, бобы, сою, ячмень, хлопок, рапс, лен, бобовые, виноград, кофейные бобы, томат, виноград, апельсин, орех, табак, люцерну, картофель, арахис и арабидопсис.
[00020] Композиции изобретения могут быть применены в довсходовый (до прорастания семян или появления всходов над землей) или послевсходовый (после прорастания семян или появления всходов над землей) период развития растений. Композиции изобретения могут применяться непосредственно к растению или части растения, например, листу, корню, листве, поверхности листа, побегу, цветку, клетке растения, ткани растения или к их комбинации. Композиции изобретения также могут применяться к среде выращивания.
[00021] Композиции изобретения также могут применяться к материалу для размножения растений. Например, композиции изобретения могут применяться к семенам, зернам, фруктам, клубням, корневищам, спорам, черенкам, саженцам, меристематическим тканям, клеткам растения, орехам или зародышам.
[00022] Композиции изобретения включают кетосукцинамат или его производные, или его соли и носители, например, те, которые обычно используются в данной области техники. Композиции могут быть в виде водного раствора, неводного раствора, суспензии, геля, пены, пасты, порошка, пыли, твердой фазы или эмульсии. Особенно предпочтительными являются водные препараты.
[00023] Концентрация кетосукцинамата или его производных, или его солей будет концентрацией, необходимой для достижения желаемого эффекта, который может быть выяснен специалистом в данной области техники без ненужных экспериментов. Например, композиции изобретения могут включать кетосукцинамат, или его производные, или его соли в концентрации от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 10 мМ. В предпочтительных вариантах воплощения концентрация составляет от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 10 мМ. В других вариантах воплощения концентрация составляет приблизительно от 0,1 мкМ до приблизительно 2000 мкМ. Еще в других вариантах воплощения концентрация составляет приблизительно от 1 мкМ приблизительно до 250 мкМ.
[00024] В дополнение к кетосукцинамату или его производным, или его солям композиции согласно изобретению могут, необязательно, включать по меньшей мере одно иное соединение, стимулирующее рост растений. Кетосукцинамат или его производные, или его соли могут присутствовать в любом соотношении с другим соединением, стимулирующим рост растений. Например, отношение кетосукцинамата или его производных, или его солей к другому соединению(ям), стимулирующему рост растений, может находиться в диапазоне от 99:1 до 1:99. В других вариантах воплощения отношение составляет 90:10. Еще в других вариантах воплощения отношение составляет 80:20. В еще одном варианте воплощения указанное соотношение составляет 70:30. В дополнительных вариантах воплощения отношение составляет 60:40. Еще в других вариантах воплощения отношение составляет 50:50. В дополнительных вариантах воплощения указанное соотношение составляет 40:60. Еще в других вариантах воплощения отношение составляет 30:70. В других вариантах воплощения отношение составляет 20:80. Согласно еще одному варианту воплощения указанное соотношение составляет 10:90.
per se
См.,
[00025] Указанныедругие соединения для стимулирования роста известны в данной области техники, .В частности, для применения в композициях по изобретению предпочтительные соединения, стимулирующие рост растений, включают, например, (R)-2-гидрокси-5-оксопирролидин-2-карбоновую кислоту, (S) -5-оксопирролидин-2-карбоновую кислоту и их комбинации. например, опубликованную заявку на патент США № 2007/0105719.
(R)-2-гидрокси-5-оксопирролидин-2-карбоновая кислота
(S)-5-оксопирролидин-2-карбоновая кислота
[00026] Композиции согласно данному изобретению также могут дополнительно включать дополнительные компоненты, обычно используемые в данной области техники, например, увлажнители, адъюванты, антиоксиданты, стабилизаторы, макроэлементы для растений и микроэлементы для растений, пестициды, фунгициды, противовирусные, антибактериальные препараты, гербициды и их комбинации.
[00027] Композиции согласно данному изобретению могут также дополнительно включать микроорганизмы, например, азотфиксирующие микроорганизмы или микоризу.
[00028] Композиции согласно данному изобретению могут также дополнительно включать материалы растения для размножения, например, семена, зерна, споры и тому подобное.
[00029] Например, обработка растений, посадочного материала и/или субстратов для выращивания может быть выполнена таким образом, что растение, его части, его материал для размножения и/или субстрат для его выращивания обрабатываются кетосукцинаматом, его производными, или его солями и, необязательно, другим соединением, стимулирующим рост растений. Растение, его посадочный материал и/или субстрат для его выращивания могут обрабатываться один раз или более чем один раз. Например, в режимах обработки, которые включают обработку более чем один раз, временной интервал между процедурами должен быть таким, чтобы мог присутствовать желаемый эффект. Временной интервал может быть продолжительностью: секунда(ы), минута(ы), час(ы), день(дни), неделя(и) и месяц(ы).
[00030] Кроме того, растение, его материал для размножения и/или субстрат для его выращивания можно обрабатывать кетосукцинаматом или его производными, или его солями и другими соединениями, стимулирующими рост растений, в отдельной форме; это возможно для обработки отдельными активными соединениями, выполняемой одновременно или последовательно. В случае последовательных обработок временной интервал между процедурами должен быть таким, чтобы достичь желаемого эффекта. Временной интервал может быть продолжительностью: секунда(ы), минута(ы), час(ы), день(дни), неделя(и) и месяц(ы).
[00031] Для любого сценария обработки, описанного здесь, возможно применение соединений к различным объектам (объектами в настоящем контексте являются растения, материал для размножения и субстрат для выращивания), то есть, например, для обработки семян кетосукцинаматом или его производными, или его солями и применения соединения, стимулирующего рост растений, к растениям, развивающимся из семян, и/или для обработки субстрата для их выращивания вместе с ними. Альтернативно для обработки семян соединением, стимулирующим рост растений, и для применения кетосукцинамата или его производных, или его солей к растениям, развивающимся из семян, и/или для обработки субстрата для их выращивания вместе с ними. Также могут быть осуществлены сочетания двух подходов, описанных выше.
[00032] В другом сценарии обработки семена могут обрабатываться кетосукцинаматом или его производными, или его солями в сочетании с микронутриентами, макронутриентами, другими соединениями, улучшающими характеристики роста растений, пестицидами и/или гербицидами.
[00033] В другом сценарии обработки семена могут обрабатываться перед посевом или же через субстрат для выращивания, в который производится посев, например, во время посева в форме, известной как внесение в борозду. При таком виде применения кетосукцинамат или его производные, или его соли, и/или другие соединения, стимулирующие рост растений, помещаются в борозду, по существу, в то же время, что и семена.
[00034] Также может быть соблюден диапазон соотношений при обработке. Например, отношение соединений кетосукцинамата к соединениям, стимулирующим рост растений, может варьироваться от 99:1 до 1:99 (или 99:1, 98:2, 97:3, 96:4, 95:5, 94:6, 93:7, 92:8, 91:9, 90:10, 89:11, 88:12, 87:13, 86:14, 85:15, 84:16, 83:17, 82:18, 81:19, 80:20, 79:21, 78:22, 77:23, 76:24, 75:25, 74:26, 73:27, 72:28, 71:29, 70:30, 69:31, 68:32, 67:33, 66:34, 65:35, 64:36, 63:37, 62:38, 61:39, 60:40, 59:41, 58:42, 57:43, 56:44, 55:45, 54:46, 53:47, 52:48, 51:49, 50:50, 49:51, 48:52, 47:53, 46:54, 45:55, 44:56, 43:57, 42:58, 41:59, 40:60, 39:61, 38:62, 37:63, 36:64, 35:65, 34:66, 33:67, 32:68, 31:69, 30:70, 29:71, 28:72, 27:73, 26:74, 25:75, 24:76, 23:77, 22:78, 21:79, 20:80, 19:81, 18:82, 17:83, 16:84, 15:85, 14:86, 13:87, 12:88, 11:89, 10:90, 9:91, 8:92, 7:93, 6:94, 5:95, 4:96, 3:97, 2:98 или 1:99). Соотношение может относиться к соотношению молярных концентраций или массовому соотношению.
[00035] Кетосукцинамат или его производные, или его соли, и/или соединения, стимулирующие рост растений, могут быть составлены в виде готовых к использованию препаратов, в суспендированных, эмульгированных или растворенных формах, совместно или по отдельности. Использование форм полностью зависит от намеченных целей.
[00036] Кетосукцинамат или его производные, или его соли, и/или соединение, стимулирующее рост растений, могут быть использованы как таковые в виде их препаративных форм или в формах, приготовленных из них, например, в форме непосредственно распыляемых растворов, пен, порошков, суспензий или дисперсий, а также высоко концентрированных водных, масляных или других суспензий или дисперсий, эмульсий, масляных дисперсий, паст, пыли, сопутствующих порошков или гранул. Применение обычно осуществляется путем распыления, аэрозольного орошения, мелкодисперсного разбрызгивания, разбрасывания или заливки. Используемые формы и способы применения зависят от целевого назначения.
[00037] В зависимости от представления, в котором присутствуют готовые к использованию препараты кетосукцинамата, или его производных, или его солей, и/или соединений, стимулирующих рост растений, они содержат один или более жидких или твердых носителей, необязательно, поверхностно-активные вещества и, необязательно, дополнительные адъюванты, обычно используемые для составов, предназначенных для обработки растений. Композиции для таких составов хорошо известны любому специалисту в данной области техники.
[00038] Например, применяемые водные формы могут быть получены, начиная с концентратов эмульсии, суспензий, паст, смачиваемых порошков или диспергируемых в воде гранул путем добавления воды. Для приготовления эмульсий, паст или масляных дисперсий кетосукцинамат или его производные, или его соли, и/или соединения, стимулирующие рост растений, как таковые или растворенные в масле или растворителях, могут гомогенизироваться в воде с помощью смачивателей, адгезивов, диспергаторов или эмульгаторов. Однако также могут быть получены концентраты, состоящие из кетосукцинамата или его производных, или его солей, и/или соединений, стимулирующих рост растений, смачивателей, адгезивов, диспергаторов или эмульгаторов и, при необходимости, растворителей или масел, и такие концентраты подходят для разбавления водой.
[00039] Концентрации кетосукцинамата или его производных, или его солей, и/или соединений, стимулирующих рост растений, в готовых к использованию препаратах могут изменяться в широких диапазонах. В целом они находятся между 0,0001 и 10%, предпочтительно между 0,01 и 1% (% содержания по массе всего кетосукцинамата или его производных, или его солей, и/или соединений, стимулирующих рост растений, на основе общей массы готовых к использованию препаратов).
[00040] Это позволяет добавлять к кетосукцинамату или его производным, или его солям, и/или соединению, стимулирующему рост растений, масел различных типов, увлажнителей, адъювантов, гербицидов, фунгицидов и инсектицидов, которые являются отличными от кетосукцинамата или его производных, или его солей, и/или соединений, стимулирующих рост растений, используемых в соответствии с настоящим изобретением, нематицидами, другими пестицидами, такими как бактерициды, удобрениями и/или регуляторами роста, при необходимости, только непосредственно перед применением. Они могут быть подмешаны к кетосукцинамату или его производным, или его солям, и/или соединениям, стимулирующим рост растений, используемым в соответствии с изобретением в соотношении от 99:1 до 1:99 (или 99:1, 98:2, 97:3, 96:4, 95:5, 94:6, 93:7, 92:8, 91:9, 90:10, 89:11, 88:12, 87:13, 86:14, 85:15, 84:16, 83:17, 82:18, 81:19, 80:20, 79:21, 78:22, 77:23, 76:24, 75:25, 74:26, 73:27, 72:28, 71:29, 70:30, 69:31, 68:32, 67:33, 66:34, 65:35, 64:36, 63:37, 62:38, 61:39, 60:40, 59:41, 58:42, 57:43, 56:44, 55:45, 54:46, 53:47, 52:48, 51:49, 50:50, 49:51, 48:52, 47:53, 46:54, 45:55, 44:56, 43:57, 42:58, 41:59, 40:60, 39:61, 38:62, 37:63, 36:64, 35:65, 34:66, 33:67, 32:68, 31:69, 30:70, 29:71, 28:72, 27:73, 26:74, 25:75, 24:76, 23:77, 22:78, 21:79, 20:80, 19:81, 18:82, 17:83, 16:84, 15:85, 14:86, 13:87, 12:88, 11:89, 10:90, 9:91, 8:92, 7:93, 6:94, 5:95, 4:96, 3:97, 2:98 или 1:99). Соотношение может относиться к соотношению молярных концентраций или массовому соотношению.
[00041] Это можно добавить к кетосукцинамату или его производным, или его солям, и/или соединению, стимулирующему рост растений, масел различных типов, увлажнителей, адъювантов, гербицидов, фунгицидов и инсектицидов, которые являются отличными от кетосукцинамата или его производных, или его солей, и/или соединений, стимулирующих рост растений, используемых в соответствии с настоящим изобретением, нематицидами, другими пестицидами, такими как бактерициды, удобрениями и/или регуляторами роста. В одном аспекте кетосукцинамат или его производные, или его соли, и/или соединения, стимулирующие рост растений, могут смешиваться с нематицидами, другими пестицидами, такими как бактерициды, удобрениями и/или регуляторами роста до применения композиции к растению или посадочному материалу растения.
[00042] Композиции получают известным способом, например, путем добавления кетосукцинамата или его производных, или его солей, и/или соединения, стимулирующего рост растений, растворителями и/или носителями, если требуется, с помощью поверхностно-активных веществ, т.е. эмульгаторов и диспергаторов. В основном пригодными растворителями/вспомогательными веществами являются: вода, ароматические растворители (например, продукты Solvesso, ксилол), парафины (например, минеральные фракции), спирты (например, метанол, бутанол, пентанол, бензиловый спирт), кетоны (например, циклогексанон, метилгидроксибутилкетон, диацетоновый спирт, мезитила оксид, изофорон), лактоны (например, гамма-бутиролактон), пирролидоны (пирролидон, N-метилпирролидон, N-этилпирролидон, n-октилпирролидон), ацетаты (гликоль диацетат), гликоли, глицерин, диметиламиды жирных кислот, жирные кислоты и сложные эфиры жирных кислот. В принципе, могут также использоваться смеси растворителей.
[00043] Носители, такие как природные минералы (например, каолины, глины, тальк, мел) и синтетические минералы (например, высокодисперсный кремнезем, силикаты); эмульгаторы, такие как неионогенные и анионные эмульгаторы (например, полиоксиэтиленэфиры жирных спиртов, алкилсульфонаты и арилсульфонаты), и диспергаторы, такие как лигнин-сульфитный щелок и метилцеллюлоза.
[00044] Подходящими поверхностно-активными веществами являются щелочные металлы, щелочно-земельные металлы и аммониевые соли лигносульфоновой кислоты, нафталинсульфоновой кислоты, фенолсульфоновой кислоты, дибутилнафталинсульфоновой кислоты, алкиларилсульфонаты, SDS, алкилсульфаты, алкилсульфонаты, сульфаты жирных спиртов, гликолевые эфиры жирных кислот и сульфатированных жирных спиртов, а также конденсаты сульфонированного нафталина и производных нафталина с формальдегидом, конденсаты нафталина или нафталинсульфоновой кислоты с фенолом и формальдегидом, полиоксиэтиленоктилфениловый эфир, этоксилированный изооктилфенол, октилфенол, нонилфенол, алкилфениловые полигликолевые эфиры, трибутилфенилполигликолевый эфир, тристеарилфенилполигликолевый эфир, алкилариловые полиэфирные спирты, конденсаты спиртов и жирных спиртов/окиси этилена, этоксилированное касторовое масло, полиоксиэтиленалкиловые эфиры, этоксилированный полиоксипропилен, лауриловый спирт, ацеталь полигликолевого эфира, сложные эфиры сорбита, лигнин-сульфитные щелоки и метилцеллюлоза.
[00045] Веществами, которые подходят для подготовки непосредственно распыляемых растворов, эмульсий, паст или масляных дисперсий, являются фракции минеральных масел со средней и высокой точкой кипения, например, керосина или солярового масла, а также каменноугольные масла и масла растительного или животного происхождения, алифатические, циклические и ароматические углеводороды, например, толуол, ксилол, парафин, тетрагидронафталин, алкилированные нафталины или их производные, метанол, этанол, пропанол, бутанол, циклогексанол, циклогексанон, окись мезитила, изофорон, сильно полярные растворители, например, диметилсульфоксид, 2-пирролидон, N-метилпирролидон, бутиролактон и вода.
[00046] Порошки, материалы для рассеивания и пылевидные препараты могут быть получены путем смешивания или совместного размола действующих веществ с твердым носителем.
[00047] Гранулы, например, покрытые гранулы, пропитанные гранулы и гомогенные гранулы, могут быть получены путем связывания активных ингредиентов с твердыми носителями. Примерами твердых носителей являются минералы, такие как кремнезем, гели, силикаты, тальк, каолин, аттаглина, известняк, известь, мел, известковая глина, лесс, глина, доломит, диатомит, сульфат кальция, сульфат магния, оксид магния, поверхностные синтетические материалы, удобрения, такие как, например, сульфат аммония, фосфат аммония, нитрат аммония, мочевина и продукты растительного происхождения, такие как мука из зерновых, мука из древесной коры, древесная мука и мука из ореховой скорлупы, целлюлозные порошки и другие твердые носители.
[00048] Составы для обработки семян дополнительно могут включать связующие и/или гелеобразующие агенты и, при необходимости, красители.
[00049] В общем, композиции включают активное вещество в количестве от 0,01 до 95% по массе, предпочтительно от 0,1 до 90% по массе, в частности, от 5 до 50% по массе. Используются активные вещества чистотой от 90% до 100%, предпочтительно от 95% до 100% (в зависимости от спектра ЯМР).
[00050] Для обработки семенного материала в соответствующие композиции будут входить кетосукцинамат или его производные, или его соли, и/или соединение, стимулирующее рост растений, в концентрациях от 0,001% до 80% (или 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0. по массе, предпочтительно от 0,1 до 40% по массе в готовых к применению препаратах.
[00051] Термин «субстрат для выращивания», также упоминаемый как «среда для выращивания», используемый в настоящем документе, относится к любому типу субстрата, в котором растет или будет расти растение, такому как почва (например, в горшке, на ограниченном участке или в поле), вода или искусственные среды и любые дополнительные добавки, связанные с ростом (например, удобрения) или предназначенные для защиты растений (например, пестициды).
[00052] Термин «питательные макронутриенты NPKS» или «макронутриенты», используемый в настоящем документе, относится к питательным веществам, содержащим азот (N), фосфор (P), калий (K) и серу (S).
[00053] К используемым здесь микронутриентам относится любой нутриент, необходимый для роста растений и/или воспроизводства.
2
3
[00054] Термин «азотфиксирующие бактерии», используемый в настоящем документе, относится к бактериям, способным фиксировать или восстанавливать азот (N) из атмосферы с образованием аммиака (NH).
[00055] Термин «эффективность использования азота (ЭИА)», используемый в настоящем документе, относится к величине урожайности сельскохозяйственных культур на единицу применяемых азотных удобрений. ЭИА может измеряться множеством различных способов, известных любому специалисту в данной области техники. Кроме того, ЭИА может быть связана с эффективностью использования азотных удобрений или эффективностью использования общего азота. Это может также включать различные признаки урожайности. Например, она может использоваться для обозначения увеличения концентрации азотистых соединений в растении, например, увеличения содержания или концентрации белка в листьях, зерне или других тканях или органах растения. Для большинства сельскохозяйственных систем более чем 50% и вплоть до 75% азота, вносимого в почву, не используется растениями и теряется, выщелачиваясь в почву или в стоки в поверхностных водах.
[00056] Термин «клубнеобразование», используемый здесь, относится к массе клубеньков, количеству клубеньков и к темпу роста клубеньков.
[00057] Термин «соединение, стимулирующее рост растений», используемый в настоящем документе, относится к соединениям, способным улучшить продуктивность растений или увеличить ростовые показатели растений при обработке растения и/или материала для размножения растения эффективным количеством соединения.
[00058] Термин «продуктивность растения», используемый в настоящем документе, относится к измерению одной или более из следующих характеристик: количества побегов, внекорневой биомассы (массы) и семенных шапок. Улучшение продуктивности растений может наблюдаться при увеличении каких-либо вышеперечисленных характеристик растения. Например, для специалистов в данной области техники считается общепринятым, что увеличение числа побегов сельскохозяйственной культуры увеличивает урожайность семян. Кроме того, увеличение количества или скорости нарастания внекорневой биомассы указывает на размер и темпы роста растений.
[00059] Термин «материал для размножения», используемый здесь, относится к материалу, из которого могут быть выращены полноценные растения. Неограничивающие примеры материала для размножения включают в себя семена, зерно, фрукты, клубни, корневище, споры, черенки, саженцы, меристематическую ткань, отдельные клетки растений и любые формы ткани растений, из которых могут быть выращены полноценные растения.
[00060] Термин «соли», используемый здесь, относится к ионным формам любой из композиций изобретения в комбинации с любым подходящим противоионом. Соли должны быть растворимы или поддаваться суспендированию в композициях изобретения. Например, соли композиций изобретения могут образовываться из анионов описанных соединений с катионами металла, такими как катионы щелочных металлов (литий, натрий, калий, цезий и рубидий), катионов щелочноземельных металлов (магний, кальций стронций, барий и т.п.) и катионов тяжелых металлов (медь, серебро, ртуть, цинк, кадмий, хром, марганец, железо, кобальт, никель, алюминий, олово и свинец). Соли описываемых композиций также могут быть образованы из ониевых катионов, например, аммониевых катионов, сульфониевых катионов, сульфоксониевых катионов и фосфониевых катионов. Соли композиций изобретения также могут быть сформированы из катионов описанных композиций с анионами, например, хлоридами, бромидами и тому подобным.
Bradyrhizobium japonicum
Glycine max
Sinorhizobium meliloti
Medicago sativa
[00061] Термин «симбиотические бактерии», используемый в настоящем документе, относится к азотфиксирующим бактериям, которые вступают в отношения со своими специфическими растениями-хозяевами (бобовыми растениями). Неограничивающие примеры включают симбиоз между  и его хозяином  (соей), между  и его хозяином  (люцерной). В этих отношениях каждый член ассоциации получает выгоду от присутствия другого; растение получает фиксированный азот от бактерий, а бактериальные симбионты получают углеродные скелеты от растения. Эти ассоциации находятся в специализированных корневых структурах, называемых клубеньками, которые начинают формироваться при инициировании взаимоотношений.
[00062] Диапазоны, представленные здесь, понимаются как сокращение для всех значений в пределах диапазона. Например, под диапазоном от 1 до 50 следует понимать такой диапазон, который включает любое число, сочетание чисел или поддиапазон из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 (а также ее участки, если в контексте явно не указано иное). Следует понимать, что любой диапазон концентраций, процентный диапазон, диапазон соотношений или диапазон целочисленных значений включает значение любого целого числа в пределах перечисленного диапазона и, при необходимости, его участков (например, одна десятая и одна сотая целочисленного значения), если не указано иное. Кроме того любой числовой диапазон, приведенный в настоящем документе в связи с любым физическим свойством, таким как полимерные субъединицы, размер или толщина, должен пониматься как включающий любое целое число в перечисленном диапазоне, если не указано иное. Используемый здесь термин «около» или «состоит, по существу, из» обозначает среднее ±20% указанного диапазона, значения или структуры, если не указано иное. Используемые здесь термины «включать» и «содержать» являются открытыми и используются как синонимы. Следует понимать, что термины в единственном числе, используемые в настоящем документе, относятся к «одному или более» из перечисленных компонентов. Использование альтернативы (например, «или») должно пониматься как один, оба или любое сочетание этих альтернатив.
[00063] Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны здесь, могут использоваться на практике или при тестировании настоящего раскрытия, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые здесь, включены путем ссылки во всей их полноте. В случае конфликта настоящее описание, включающая объяснения терминов, будет выступать в качестве контрольного. Кроме того, материалы, способы и примеры носят только иллюстративный характер и не предназначены быть ограничивающими.
[00064] Если не обозначено иное, технические термины используются по всей данной спецификации согласно стандартному их применению, пока не будет указано иное. Определения общих терминов в области молекулярной биологии могут быть найдены в Benjiamin Lewin, Genes V, опубликовано Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9);Kendrew et.al. (eds.), Энциклопедия молекулярной биологии, опубликовано Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); и Robert A. Meyers (ed.), Молекулярная биология и биотехнология: полный настольный справочник, опубликованный VCH Publishers, Inc., 1995 года (ISBN 1-56081-569-8).
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Синтез 4-амино-2,4-диоксобутановой кислоты
Meister A., J. Biol. Chem., (1953) 200:571-589.
[00065] См., например,
Пример 2: Обработка растений пшеницы
[00066] Этот пример показывает, что обработка растений пшеницы только кетосукцинаматом или в сочетании с другим соединением, стимулирующим рост растений, увеличивает биомассу, длину побегов и семенной головки, что, как правило, определяется как улучшение продуктивности растений или увеличение ростовых характеристик растения.
[00067] В контрольной группе и группе, прошедшей обработку, использовались различные сорта яровой пшеницы Glenn. Контрольная группа и каждая из групп, прошедших обработку, состояла из 15 растений.
[00068] В контрольном составе был основной водный раствор, содержащий поверхностно-активное вещество (натрия додецилсульфат, 700 мг/л; SDS) и увлажнитель (глицерин, 2 мл/л) при pH 7 (далее «основной раствор»).
[00069] В составах для обработки содержится основной раствор вместе с кетосукцинаматом (состав для обработки № 1), основной раствор с L-пироглутаматом (состав для обработки № 2) или кетосукцинамат и L-пироглутамат (состав для обработки № 3; соотношение 60:40 L-пироглутамат:кетосукцинамат). Эти составы приводятся в таблице 2 ниже.
<b>Таблица 2</b>
Группа
Концентрация кетосукцинамата
Концентрация L-пироглутамата
Контрольный состав
0 мкМ
0 мкМ
Состав для обработки № 1
100 мкМ
0 мкМ
Состав для обработки № 2
0 мкМ
100 мкМ
Состав для обработки № 3
40 мкМ
60 мкМ
3
4
[00070] Яровую пшеницу посадили в день 1 и выращивали в теплице с естественной длительностью дня. Все растения подкармливали коммерчески доступной полной питательной смесью (Flora Gro Bloom; GenHydro), которая обеспечила поступление NO и NH в качестве источников азота в соотношении 10:1. Каждая группа обрабатывалась ежедневно, начиная с 10-го дня, посредствомвнекорневого орошения их соответствующими составами.
[00071] Приблизительно через 70 дней после посадки в контрольной группе и группе, обработанной составом №1 (только соединением кетосукцинамата) было подсчитано количество побегов. Количество побегов/групп (15 растений) показано в таблице 3, приведенной ниже.
<b>Таблица 3</b>
Группа
Количество побегов в каждой группе из 15 растений
Контрольный состав
127
Состав для обработки № 1
145
[00072] Данные, приведенные в таблице 3, показывают, что обработка растений кетосукцинаматом (состав для обработки №1) привела к увеличению числа побегов по сравнению с количеством побегов в контрольной группе.
[00073] Растения были убраны на 91-й день, и были измерены масса внекорневой ткани (в граммах) и количество семенных шапок/растение. Измерения приведены в таблице 4, расположенной ниже.
<b>Таблица 4</b>
Группа
Масса свежей листовой ткани
Количество семенныхшапок на растение
Контрольный состав
11,0 г
4,3
Состав для обработки № 1
12,6 г
4,6
Состав для обработки № 2
13,3 г
6,3
Состав для обработки № 3
13,2 г
5,3
[00074] Данные, приведенные в таблице 4, показывают, что у растений, обработанных только кетосукцинаматом (состав для обработки №1), только L-пироглутаматом (состав для обработки №2) и L-пироглутаматом:кетосукцинаматом в соотношении 60:40 (состав для обработки №3), увеличился вес внекорневой ткани по сравнению с контрольной группой и увеличилось количество семенных шапок/растение по сравнению с контрольной группой.
Пример 3: Обработка растений сои
[00075] В этом примере показано, что обработка растений сои кетосукцинаматом увеличивала внекорневую биомассу и биомассу клубеньков, что обычно упоминается как улучшение продуктивности растений.
[00076] В контрольной группе и группах, прошедших обработку, использовались разнообразные коммерчески доступные сорта сои. Контрольная группа и каждая из групп, прошедших обработку, состояла из 15 растений. В качестве контрольного состава был основной раствор (см. Пример 2). В составе для обработки содержится основной раствор вместе с кетосукцинаматом (состав для обработки №1). Эти составы приводятся в таблице 5, расположенной ниже.
<b>Таблица 5</b>
Группа
Концентрация кетосукцинамата
Контрольный состав
0 мкМ
Состав для обработки № 1
100 мкМ
2
[00077] Растения сои выращивались в парнике с естественной длиной дня. Субстрат для выращивания включал торфяной мох (влажный), вермикулит для плодоводства (влажный) и песок в равных объемах. Процент почвенной влаги поддерживался на уровне от приблизительно 20% до приблизительно 30% насыщения. Все растения еженедельно подкармливали коммерчески доступной полной питательной смесью (Flora Gro) с KCl вместо азота, и CоCl, добавленным для обеспечения наличия этого микроэлемента. Перед посадкой сои инокулянт NDURE смешивали с субстратом. Каждая группа обрабатывалась ежедневнопосредствомвнекорневого орошения соответствующими композициями, начиная с 10-го дня после посадки/инокуляции.
[00078] Растения были убраны через 91 день после посадки, и были измерены масса внекорневой ткани (в граммах) и масса клубеньков (мг)/растение. Измерения приведены в таблице 6, расположенной ниже.
<b>Таблица 6</b>
Группа
Масса сырой внекорневой ткани
Клубеньков на растение
Контрольный состав
2,1 г
24,8 мг
Состав для обработки № 1
2,6 г
85,6 мг
[00079] Данные, приведенные в таблице 6, показывают, что у растений после обработки только кетосукцинаматом (состав для обработки № 1) возросла масса внекорневой ткани по сравнению с контрольной группой и увеличилась клубеньковая масса/растение по сравнению с контрольной группой.
Пример 4: Обработка растений люцерны
[00080] Этот пример показывает, что обработка растений люцерны только кетосукцинаматом или в сочетании с другим соединением (например, L-пироглутаматом), стимулирующим рост растений, увеличивает биомассу, что, как правило, определяется как улучшение продуктивности растений.
См.
[00081] В контрольной группе и группе, прошедшей обработку, использовались различные сорта ладакхской люцерны. Контрольная группа и каждая из групп, прошедших обработку, состояла из 15 растений. В качестве контрольного состава был основной раствор. пример 2. Состав для обработки содержал основной раствор вместе с кетосукцинаматом (состав для обработки №1), основной раствор с L-пироглутаматом (состав для обработки № 2) или кетосукцинамат и L-пироглутамат (состав для обработки № 3; L-пироглутамат:кетосукцинамат в соотношении 50:50). Эти составы приводятся в таблице 7, расположенной ниже.
<b>Таблица 7</b>
Группа
Концентрация кетосукцинамата
Концентрация L-пироглутамата
Контрольный состав
0 мкМ
0 мкМ
Состав для обработки № 1
100 мкМ
0 мкМ
Состав для обработки № 2
0 мкМ
100 мкМ
Состав для обработки № 3
50 мкМ
50 мкМ
[00082] Растения люцерны выращивались в парнике с естественной длиной дня. Все растения высаживались в безазотную среду (Columbia без азота). Субстрат для выращивания включал торфяной мох (влажный), вермикулит для плодоводства (влажный) и песок в равных объемах. Процент почвенной влаги поддерживался на уровне от приблизительно 20% до приблизительно 30% насыщения. Перед посадкой семян люцерны инокулянт NDURE смешивали с субстратом. Каждая группа обрабатывалась ежедневно, начиная с 10-го дня после посадки, посредством внекорневого орошения соответствующими композициями. Обработка проводилась через день.
[00083] Растения были убраны через 85 дней после посадки, и была измерена масса внекорневой ткани (в граммах). Измерения приведены в таблице 8, расположенной ниже.
<b>Таблица 8</b>
Группа
Масса сырой внекорневой ткани
Контрольный состав
8,6 г
Состав для обработки № 1
9,2 г
Состав для обработки № 2
12,4 г
Состав для обработки № 3
14 г
[00084] Данные в таблице 8 показывают, что у растений, обработанных только кетосукцинаматом (состав для обработки №1), только L-пироглутаматом (состав для обработки №2) и L-пироглутаматом: кетосукцинаматом в соотношении 50:50 (состав для обработки №3), увеличился вес внекорневой ткани по сравнению с контрольной группой.
Пример 5: Измерение содержания растительного белка
[00085] Содержание белка в листьях является признаком эффективности использования азота в растениях, т.е. признаком вероятности того, что растение имеет возможность в полной мере развиваться и завязывать максимальное количество семян и плодов. Это также является признаком питательной ценности растительной ткани. К примеру, внекорневые ткани бобового растения люцерна используются в качестве корма для обогащения белкового состава рациона животных. Содержание белка в листьях будет измеряться в растениях, обработанных согласно изобретению, и сравниваться с необработанными контрольными растениями того же вида, выращенными в тех же условиях и при том же составе и уровне питательных веществ.
[00086] Образцы листьев будут взяты из листьев, находящихся в кроне в таком же положении и на той же стадии развития. Это будут полностью развернутые листья размером по меньшей мере одна треть от максимального размера листа, характерного для вида. Среди растений, предназначенных для взятия образцов, должны быть по меньшей мере одно однодольное растение, такое как пшеница, рис или ячмень, и по меньшей мере одно двудольное растение, такое как соя, люцерна, салат или перец. Содержание белка будет определяться с помощью стандартного определения белка способом Брэдфорда с использованием реагента Брэдфорда согласно инструкциям производителя. Этот реагент основан на количественной связи красителя бриллиантовый синий G и образующегося комплекса краситель-белок с оптической плотностью при 595 нм.
[00087] Растения, которые обрабатываются кетосукцинаматом или его производными, или в сочетании с другими питательными веществами или соединением, стимулирующим рост растений, будут иметь увеличение показателей роста растений (например, повышенное содержание белка) по сравнению с необработанными растениями.
Пример 6: Измерение содержания аминокислот в растениях
[00088] Запасы свободных аминокислот в листьях растений, обработанных согласно изобретению, будут сравниваться с необработанными контрольными растениями того же вида, выращенными в тех же условиях и при том же составе и уровнях питательных веществ. Запасы аминокислот будут отражать общее состояние метаболизма азота у растений.
[00089] Размеры запасов аминокислот будут отражать общую устойчивость обмена веществ растений и обеспечивать понимание потока хотя бы в некоторых путях биосинтеза аминокислот, имеющих важное значение для таких важных свойств как устойчивость к определенным видам гербицидов. В частности, любой агент, который улучшает биосинтез аминокислот, обеспечит определенную степень устойчивости к действию гербицидов, блокирующих биосинтез аминокислот. Устойчивость крайне желательна для урожая, который должен быть защищен от гербицидов, используемых для уменьшения количества сорняков, конкурирующих с урожаем.
[00090] Любой агент, повышающий уровень биосинтеза изолейцина и валина, обеспечит устойчивость при применении гербицидов, блокирующих ацетолактатсинтазу, (например, Osprey). То же самое верно для гербицидов, блокирующих биосинтез таких ароматических аминокислот как глифосат, и любой агент, увеличивающий биосинтез ароматических аминокислот, будет обеспечивать устойчивость против этих гербицидов.
[00091] Любой агент, стимулирующий синтез глютамина, будет обеспечивать устойчивость против гербицидов, содержащих глюфосинат, и гербицида, блокирующего глютаминсинтетазу. Они продаются под названиями BASTA, RELY, FINALE и другими названиями.
[00092] Рост растений, обработанных согласно изобретению и представителями гербицидов, ингибирующих биосинтез аминокислот, будет сравниваться с растениями, обработанными только гербицидом. Кетосукцинамат будет испытываться с использованием стандартных эффективных доз и протокола; гербицид будет использоваться при уровнях в диапазоне от менее чем до его полной рекомендуемой летальной дозы. Исследуемые дозы будут находиться между 10% и 100% рекомендуемой летальной дозы. Рост растений будет охарактеризован с помощью стандартных способов, которые включают окончательную биомассу (или внекорневых частей, или корней, или целого растения) и отслеживание появления листьев, побегов или цветков. Виды растений для исследования представляют однодольные растения (пшеница, рис или ячмень) и двудольные растения (соя, хлопок, перец, салат или другие овощи).
[00093] Ожидается, что рассматриваемые обработанные растения или обработанные семена растений, или обработанные почвы, на которых выращивают растения, согласно изобретению будут способствовать увеличению характеристик роста растений (например, увеличению и/или улучшению биосинтеза аминокислот) по сравнению с необработанными растениями или необработанными семенами, или необработанной почвой.
Пример 7: Всхожесть и развитие всходов
Способ обработки семян
[00094] Желаемая для обработки концентрация кетосукцинамата была добавлена в водный раствор 0,01% Tween 80, а pH был доведен до нейтрального значения с помощью KOH. Семена погружали в раствор для смачивания их и давали высохнуть на воздухе перед посадкой, этот процесс занимает меньше 15 минут.
Всхожесть
[00095] У люцерны (сорт Ladak) через 3 дня после начала прорастания на влажных бумажных полотенцах при 18-24°C (65-75°F) были отмечены следующие проценты всхожести.
Контрольные необработанные семена: 80%;
семена, обработанные 0,1 мМ кетосукцинаматом: 88%;
семена, обработанные 1 мМ кетосукцинаматом: 93%.
В каждом варианте использовалось по меньшей мере 30 семян.
[00096] У сои (сорт Viking) через 22 часа после обработки и начала прорастания на влажных бумажных полотенцах при 24-29.5°C (75-85°F) были отмечены следующие показатели всхожести. Пробили перикарп 2 из 20 контрольных семян, при этом пробили перикарп 9 из 20 семян, обработанных кетосукцинаматом (10 мМ). Через 24 часа после обработки 6 из 20 контрольных семян пробили перикарп, и 12 из 20 семян, обработанных кетосукцинаматом, пробили перикарп.
Прорастание в парнике
Соя (сорт Viking)
Bradyrhizobium japonicum
[00097] Семена были высажены в вермикулит, песок, торфяной мох (1:1:1) в парнике, отслеживалось появление всходов. Влажность при прорастании/росте субстрата поддерживалась на уровне 15-20% насыщения. Внутрилабораторная температура варьировалась в диапазоне 22-29°C (72-82°F).  (коммерческая посевная культура) смешивали с субстратом перед посадкой.
[00098] Через 3 дня после посадки было отмечено следующее появление всходов. Из почвы появились 12 из 20 контрольных семян. Из семян, обработанных кетосукцинаматом (1 мМ), появилось 16 из 20.
Люцерна (сорт Ladak)
Sinorhizobium meliloti
[00099] Семена были высажены в вермикулит, песок, торфяной мох (1:1:2) в парнике, отслеживалось появление всходов. Внутрилабораторная температура варьировалась в диапазоне 22-29°C (72-82°F).  (коммерческая посевная культура) смешивали с субстратом перед посадкой.
[000100] Через 3 дня после посадки было отмечено следующее появление всходов. Контроль составил 58%, обработанные кетосукцинаматом (1 мМ) составили 79%.