РАСТЕНИЯ КАПУСТЫ BRASSICA OLERACEA, УСТОЙЧИВЫЕ К ЗАБОЛЕВАНИЮ КИЛОЙ
BRASSICA OLERACEA PLANTS RESISTANT TO CLUB ROOT DISEASE

Настоящее изобретение относится к растениям, устойчивым к болезням, прежде всего к растениям Brassica oleracea, устойчивым к заболеванию килой.
Кила представляет собой широко распространенное заболевание, которое является серьезной проблемой во многих зонах возделывания представителей р.Brassica (см., например, обзор Dixon, Grower April 29, 1999, cc.28-29). Возбудителем болезни является одноклеточный организм Plasmodiophora brassicae. Симптомы болезни включают неправильное формирование листьев с выраженным разбуханием (кила), что, в конце концов, приводит к гниению. Болезнь приводит также к карликовости из-за замедленного роста и к увяданию листьев при стрессе, вызванном недостатком воды. Применение химических средств защиты растений для борьбы с болезнью является неэффективным. Таким образом, для защиты культуры от болезни важной является высокоэффективная генетическая устойчивость.
Род капустных (Brassica) включает несколько представляющих коммерческий интерес видов, таких как В.rара (капуста китайская, пак-хой, турнепс (или репа огородная)), В.napus (предназначенная для получения масла капуста, брюква), В.juncea (горчица), В.nigra (горчица черная) и В.oleracea (цветная капуста, брокколи, капуста огородная, брюссельская капуста, савойская капуста, капуста кормовая (огородная, браунколь, кольраби и другие)). Хотя подвиды видов, относящихся к роду Brassica, как правило, обладают половой совместимостью, половая совместимость не всегда имеет место в случае различных видов рода Brassica. Например, В.rара и В.oleracea имеют разное число хромосом (10 хромосом и 9 хромосом соответственно) и поэтому не обладают половой совместимостью. Это в очень значительной степени затрудняет перенос признака от одного вида рода Brassica к другому.
Для представителей рода Brassica описано несколько видов, которые можно использовать для переноса признака устойчивости к киле (см., например, Bradshaw и др., Ann. Appl. Biol. 130, 1997, cc.337-348; Gowers, Euphytica 31, 1982, сс.971-976). В некоторых случаях устойчивость является моногенной, в некоторых случаях полигенной, в некоторых случаях доминантной, в некоторых случаях рецессивной. Моногенная доминантная устойчивость обнаружена у В.rара и В.napus, например, моногенная доминантная устойчивость обнаружена у китайской капусты В.rара (Yoshikawa, Japan Agricultural Research Quarterly, т.17, №.1, 1983, сс.6-11). Установлено, что F1-гибриды китайской капусты, обладающие такой устойчивостью, хорошо защищены от килы, хотя небольшое число штаммов (“рас”) возбудителя килы могут подавлять эту устойчивость. Вероятно, такие расы превалируют в Азии, а не Европе.
В противоположность этому, у тех представителей рода Brassica, как В.oleracea, которые можно рассматривать в качестве источников признака устойчивости, известны только случаи полигенной рецессивной устойчивости (см., например, Voorrips, Euphytica 83, 1995, сс.139-146). Доказано, что такие представители В.oleracea, которые можно рассматривать в качестве источников признака устойчивости, не только не обладают достаточным уровнем устойчивости к киле, но этот признак также очень трудно переносить от одних имеющих коммерческое значение линий В.oleracea к другим. Это очень сильно затрудняет и удлиняет селекцию по признаку устойчивости.
Таким образом, существует настоятельная потребность в получении растений В.oleracea, обладающих повышенной устойчивостью к киле, которую легко отбирать и переносить в имеющие коммерческое значение линии В.oleracea.
Таким образом, проблемой, на решение которого направлено настоящее изобретение, является неудовлетворительная устойчивость к заболеванию килой у представителей В.oleracea. Для повышения устойчивости к болезни у В.oleracea в настоящем изобретении предложен перенос моногенного доминантного признака устойчивости к киле от капусты китайской (В.rара) к брокколи В.oleracea и затем к другим подвидам В.oleracea, таким как капуста огородная белокочанная, цветная капуста и брюссельская капуста. Для преодоления половой несовместимости между В.rара и В.oleracea признак устойчивости к киле переносили с помощью межвидовой гибридизации с использованием метода “спасения” эмбриона с последующими повторными возвратными скрещиваниями и оценками поражения заболеванием всех поколений бэккроссов. Полученные растения В.oleracea характеризовались высоким уровнем устойчивости к киле. Эта устойчивость являлась стабильной, поддавалась переносу в другие поколения и переносу в чувствительные или обладающие недостаточным уровнем устойчивости растения В.oleracea.
Таким образом, в настоящем изобретении описаны устойчивые к киле растения В.oleracea, включая семена и материалы указанных растений и их потомство, где устойчивость к киле является моногенной и доминантной. В настоящем изобретении описаны также способы получения устойчивых к киле растений В.oleracea, способы переноса устойчивости к киле в чувствительные или обладающие недостаточным уровнем устойчивости растения В.oleracea. В настоящем изобретении описаны также молекулярные маркеры, связанные с генетическим фактором, обусловливающим устойчивость к киле.
Важное преимущество настоящего изобретения по сравнению с существующими методами придания устойчивости к киле у В.oleracea состоит в том, что устойчивость, предлагаемую в настоящем изобретении, легко переносить из одних растений В.oleracea в другие и в представляющие коммерческий интерес сорта. Устойчивые растения из-за того, что они не поражаются заболеванием, дают более высокие урожаи. Кроме того, при выращивании растений В.oleracea, предлагаемых в настоящем изобретении, требуется применение существенно меньших количеств химических средств защиты растений от килы или химические средства защиты растений не требуются вообще.
Таким образом, в настоящем изобретении предложено:
Растение В.oleracea, устойчивое к заболеванию килой, более конкретно к заболеванию килой, которое вызывается патогеном Plasmodiophora brassicae. В конкретном варианте осуществления изобретения устойчивость к заболеванию килой является моногенной и доминантной. Предпочтительно поражение растения В.oleracea соответствует баллу 2 или менее при оценке вызываемого болезнью поражения по 1-9-бальной шкале, предпочтительно согласно методу, описанному в примере 2. Предпочтительно поражение растения В.oleracea соответствует баллу 1 при оценке вызываемого болезнью поражения по 1-9-бальной шкале, предпочтительно согласно методу, описанному в примере 2. Предпочтительно, поражение растения В.oleracea соответствует баллу 1 или менее при оценке вызываемого болезнью поражения по 0-5-бальной шкале, предпочтительно согласно методу, описанному в примере 2. Предпочтительно поражение растения В.oleracea соответствует баллу 0 при оценке вызываемого болезнью поражения по 1-5-бальной шкале, предпочтительно согласно методу, описанному в примере 2. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения растение В.oleracea обладает устойчивостью к заражению через корневые волоски. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения растение В.oleracea представляет собой брокколи, белокочанную капусту, цветную капусту, брюссельскую капусту, капусту кормовую (браунколь), капусту савойскую или капусту краснокочанную. В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения растение В.oleracea является гомозиготным или гетерозиготным по признаку устойчивости к киле. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения устойчивость к киле генетически сцепливают с молекулярным маркером. Предпочтительно молекулярный маркер можно получать с помощью ПЦР-амплификации. Предпочтительно генетический фактор, обусловливающий устойчивость, находится на расстоянии 10 сМ (сантиморганид) от молекулярного маркера, предпочтительно на расстоянии менее 6 сМ, более предпочтительно менее 5 сМ, еще более предпочтительно менее 3 сМ, наиболее предпочтительно менее 1,5 сМ. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения генетический фактор устойчивости к киле сцеплен с молекулярным маркером, который можно получать с помощью ПЦР-амплификации с использованием праймера O 20 (SEQ ID NО:1) или праймера Y 13 (SEQ ID NО:2). В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения устойчивость можно получать из устойчивого к киле растения В.rара, предпочтительно из F1-гибрида капусты китайской “Parkin”. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения устойчивость к киле, предлагаемую в настоящем изобретении, можно получать из линии CFL 667, депонированной в NCIMB под регистрационным номером NCIMB 41134. В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения устойчивость выводят или получают из линии CFL 667 или из потомка или предка линии CFL 667, который несут указанный признак устойчивости. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения растение является инбредным или гибридным. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения растение является дигаплоидным. И в еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения растение обладает цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС). В следующем предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения растение В.oleracea имеет локус, обусловливающий устойчивость к киле. Предпочтительно локус находится на расстоянии 10 сантиморганид (сМ) от молекулярного маркера, который можно получать с помощью ПЦР-амплификации с использованием праймера O 20 (SEQ ID NО:1) или праймера Y 13 (SEQ ID NО:2), предпочтительно 6 сМ, более предпочтительно 5 сМ, еще более предпочтительно 3 сМ, наиболее предпочтительно на расстоянии 1,5 сМ от указанного молекулярного маркера. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения обусловливающий устойчивость локус соответствует локусу, который присутствует в линии CFL 667, депонированной в NCIMB под регистрационным номером NCIMB 41134, и предпочтительно косегрегируется с локусом, обусловливающим устойчивость, который присутствует в линии CFL 667. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения локус, обусловливающий устойчивость к киле, можно получать из линии CFL 667, депонированной в NCIMB под регистрационным номером NCIMB 41134, или из потомка или предка линии CFL 667, который несет этот признак устойчивости. В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения обусловливающий устойчивость локус выводят или получают из линии CFL 667 или из потомка или предка линии CFL 667, который несет признак устойчивости.
Кроме того, в настоящем изобретении предложены:
- семенной материал описанного выше растения, включая его потомство, где семенной материал или потомство обладает устойчивостью, предлагаемой в настоящем изобретении;
- плод описанного выше растения; часть описанного выше растения, включая пыльцу, семяпочку и эмбрион указанного растения.
В настоящем изобретении предложено также:
Растение В.oleracea, которое обладает устойчивостью к заболеванию килой, причем, когда растение является гомозиготным по признаку устойчивости, и это растение, гомозиготное по признаку устойчивости, скрещивают с растением-тестером”, которое является гомозиготным по моногенному и доминантному признаку устойчивости к заболеванию килой, то поколение растений первой генерации, полученное в результате этого скрещивания, расщепляется в соотношении 1:0 по признаку устойчивости к заболеванию килой. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, когда это поколение растений первой генерации являются самоопыляемым, то образовавшееся поколение растений второй генерации расщепляется в соотношении 1:0 по признаку устойчивости к заболеванию килой. В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение-“тестер” представляет собой растение, которое выведено из линии CFL 667, депонированной в NCIMB под регистрационным номером NCIMB 41134, и которое несет моногенный и доминантный признак устойчивости к киле, присущий указанной линии CFL 667 или потомку или предку линии CFL 667, которые несут моногенный и доминантный признак устойчивости к киле, присущий линии CFL 667. В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение-“тестер” выводят из растения линии CFL 667 или растения-потомка линии CFL 667 путем клеточного слияния. В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения растение-“тестер” обладает мужской фертильностью.
Растение В.oleracea, которое обладает устойчивостью к заболеванию килой, причем, когда растение является гетерозиготным по фактору устойчивости, и это растение, гетерозиготное по признаку устойчивости, скрещивают с растением-“тестером”, которое является гетерозиготным по моногенному и доминантному признаку устойчивости к заболеванию килой, то поколение первой генерации, полученное в результате этого скрещивания, расщепляется в соотношении 3:1 по признаку устойчивости к заболеванию килой. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, когда эти растения из поколения первой генерации дополнительно скрещивают с указанным растением, гетерозиготным по признаку устойчивости, то образовавшееся поколение второй генерации расщепляется в соотношении 5:1 по признаку устойчивости к заболеванию килой. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения растение-“тестер” представляет собой растение линии CFL 667, депонированной в NCIMB под регистрационным номером NCIMB 41134, или потомок или предок линии CFL 667, которые обладают моногенным и доминантным признаком устойчивости к киле, присущей линии CFL 667, или растение, которое выведено из линии CFL 667, депонированной в NCIMB под регистрационным номером NCIMB 41134, и которое обладает моногенным и доминантным признаком устойчивости к киле, присущей линии CFL 667. В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения оценка потомства индивидуальных растений позволяет установить, что полученное поколение второй генерации расщепляется в соотношении 3:1, 1:0 или 1:1 по признаку устойчивости в зависимости от генетического статуса индивидуальных растений из поколения первой генерации (гетерозиготные, гомозиготные по признаку устойчивости или гомозиготные по признаку чувствительности соответственно).
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения признак устойчивости к киле является моногенным, предпочтительно моногенным и доминантным. В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение В.oleracea является гомозиготным по признаку устойчивости. В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения растение В.oleracea является гетерозиготным по признаку устойчивости.
В настоящем изобретении предложены также:
- семенной материал описанного выше растения, включая его потомство, где семенной материал или потомство обладает устойчивостью, предлагаемой в настоящем изобретении;
- плод описанного выше растения; часть описанного выше растения, включая пыльцу, семяпочку и эмбрион указанного растения.
В настоящем изобретении предложено также:
Применение моногенного и доминантного признака устойчивости к киле, предлагаемой в настоящем изобретении, для придания устойчивости к этому заболеванию растению В.oleracea. Предпочтительно признак устойчивости можно получать из растения В.rара, предпочтительно из F1-гибрида капусты китайской “Parkin”.
В настоящем изобретении предложен также:
Способ получения растения В.oleracea, несущего моногенный и доминантный признак устойчивости к киле, заключающийся в том, что а) получают растение В.rара, устойчивое к киле; б) скрещивают указанное растение В.rара с растением В.oleracea, в) “спасают” эмбрионы, полученные в результате скрещивания, указанного на стадии б); г) регенерируют растение из эмбриона, полученного на стадии в); д) отбирают растение, полученное на стадии г), которое обладает устойчивостью к киле; е) осуществляют возвратное скрещивание растения, полученного на стадии д), с растением В.oleracea. В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ дополнительно предусматривает интрогрессию признака устойчивости в элитные инбредные растения В.oleracea. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения способ предусматривает также скрещивание указанного инбредного растения с другим инбредным растением В.oleracea для получения гибрида.
В настоящем изобретении предложено также:
Растение В.oleracea, в том числе гибридное растение, которое можно получать с помощью описанного выше способа.
В настоящем изобретении предложен также:
Способ переноса моногенного и доминантного признака устойчивости к киле в растение В.oleracea, чувствительное или обладающее недостаточным уровнем устойчивости к заболеванию, который заключается в том, что: а) получают растение В.oleracea, несущее моногенный и доминантный признак устойчивости к киле; б) скрещивают полученное на стадии а) растение В.oleracea с растением В.oleracea, чувствительным или обладающим недостаточным уровнем устойчивости к киле; в) отбирают растение, полученное на стадии б), которое обладает устойчивостью к киле. В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ дополнительно предусматривает возвратное скрещивание устойчивого растения с растением В.oleracea, которое является чувствительным или обладает недостаточным уровнем устойчивости к киле. В предпочтительном варианте осуществления изобретения поражение растения В.oleracea, чувствительного или обладающего недостаточным уровнем устойчивости к заболеванию, соответствует баллу 4 или более, предпочтительно баллу 3 или более, при оценке вызываемого болезнью поражения по 1-9-бальной шкале, или баллу 3 или более, предпочтительно баллу 2 или более, при оценке вызываемого болезнью поражения по 0-5-бальной шкале.
В настоящем изобретении предложены также:
ДНК-фрагмент, амплифицированный из генома растений рода Brassica, где этот ДНК-фрагмент состоит примерно из 400 пар оснований и представлен в SEQ ID NO:1.
ДНК-фрагмент, амплифицированный из генома растений рода Brassica, где этот ДНК-фрагмент состоит примерно из 640 пар оснований и представлен в SEQ ID NО:2.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения описанный выше ДНК-фрагмент является индикатором присутствия доминантного и моногенного признака устойчивости к киле у растения рода Brassica.
Применение описанного выше ДНК-фрагмента для идентификации растения рода Brassica, устойчивого к киле.
Применение праймера O 20 (SEQ ID NО:1) для обнаружения ДНК-фрагмента длиной примерно 400 пар в геноме растения рода Brassica.
Применение праймера Y 13 (SEQ ID NO:) для обнаружения ДНК-фрагмента длиной примерно 640 пар в геноме растения рода Brassica.
Применение праймера O 20 или Y 13 для обнаружения растения рода Brassica, устойчивого к киле.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение рода Brassica представляет собой В.oleracea.
Набор для обнаружения моногенного и доминантного признака устойчивости к киле у растения В.oleracea, который содержит олигонуклеотид, представленный в SEQ ID NО:1 или SEQ ID NО:2.
В настоящем изобретении предложен также:
Способ переноса моногенного и доминантного признака устойчивости к киле в растение В.oleracea, которое является чувствительным или обладает недостаточным уровнем устойчивости к заболеванию, заключающийся в том, что а) получают растение В. oleracea, несущее моногенный и доминантный признак устойчивости к киле; б) скрещивают растение В.oleracea, полученное на стадии а), с растением В.oleracea, чувствительным или обладающим недостаточным уровнем устойчивости к киле; в) отбирают растение, несущее ДНК-фрагмент, который можно получать с помощью ПЦР-амплификации и который косегрегируется с признаком устойчивости. Предпочтительно ДНК-фрагмент можно получать с помощью ПЦР-амплификации с использованием праймера О 20 (SEQ ID NО:1) или праймера Y 13 (SEQ ID NО:2). Предпочтительно растение, полученное на стадии в), обладает устойчивостью к киле. В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ дополнительно предусматривает возвратное скрещивание устойчивого растения с растением В.oleracea, которое является чувствительным или обладает недостаточным уровнем устойчивости к киле.
В настоящем изобретении предложен также:
Способ выявления растения В.oleracea, устойчивого к киле, заключающийся в том, что а) получают образец из растения В.oleracea; б) выявляют в указанном образце ДНК-фрагмент, который можно получать с помощью ПЦР-амплификации с использованием праймера O 20 (SEQ ID NО:1) или праймера Y 13 (SEQ ID NО:2), где рассматриваемое растение В.oleracea на стадии б) обладает устойчивостью к киле.
В настоящем изобретении предложен также:
Способ отбора устойчивого к киле растения В.oleracea из популяции растений В.oleracea, заключающийся в том, что: а) получают популяцию растений В.oleracea; б) получают образец из растения, входящего в эту популяцию; в) выявляют в этом образце ДНК-фрагмент, который можно получать с помощью ПЦР-амплификации с использованием праймера О 20 (SEQ ID NО:1) или праймера Y 13 (SEQ ID NО:2), где рассматриваемое на б) стадии растение В.oleracea обладает устойчивостью к киле.
Определения
Признак: характеристика или фенотип, например, устойчивость к болезни. Признак может наследоваться как доминантный или рецессивный или может быть моногенным или полигенным. Например, признак может представлять собой устойчивость к болезни, такой как кила.
Устойчивость: характеристика или фенотип растения, при которых отсутствуют симптомы болезни или присутствуют незначительные симптомы болезни. Таким образом, устойчивость предпочтительно представляет собой способность растения снижать развитие патогена (см., например, Robinson R.A., Review Applied Mycology, 48, 1969, сс.593-606).
Моногенный: определяется одним локусом.
Полигенный: определяется более чем одним локусом.
Доминантный: определяет фенотип, когда присутствует в гетерозиготном или гомозиготном состоянии.
Рецессивный: проявляется только тогда, когда присутствует в гомозиготном состоянии.
Локус: область хромосомы, которая несет один или несколько генетических факторов, например один или несколько генов, определяющих признак, такой как устойчивость к болезням.
Генетическое сцепление: тенденция хромосомных областей наследоваться совместно в результате их локализации на одной и той же хромосоме. Оценивается по проценту рекомбинаций между локусами (сантиморганида, сМ).
Изогенные: растения, которые являются генетически идентичными за исключением того, что они могут отличаться присутствием или отсутствием гетерологичной последовательности ДНК.
Осуществляемый с помощью маркера отбор: относится к процессу отбора требуемого признака или требуемых признаков в растении или растениях путем выявления одной или нескольких нуклеиновых кислот из растения, где нуклеиновая кислота связана с требуемым признаком.
Дигаплоидный: дубликация гаплоидного (одна хромосома) статуса генома (например, с использованием культуры пыльника или культуры микроспор) с образованием полностью гомозиготного растения.
Растение-“тестер”: растение, применяемое для генетического изучения признака в тестируемом растении. Как правило, подлежащее тестированию растение скрещивают с растением-“тестером” и оценивают соотношение расщепления признака в потомстве, полученном в результате скрещивания.
В настоящем изобретении описаны растения В.oleracea, устойчивые к заболеванию килой, более конкретно к заболеванию килой, возбудителем которого является патоген Plasmodiophora brassicae. В частности, в настоящем изобретении описаны растения В.oleracea, которые несут моногенный доминантный признак устойчивости к заболеванию. Генетический фактор устойчивости обеспечивает повышенный уровень устойчивости к заболеванию по сравнению с известными уровнями устойчивости растений В.oleracea и его легко переносить из одного растения В.oleracea в другое.
Виды и подвиды рода Brassica описаны, например, у Р.Н.Williams (Screening Crucifers for multiple disease resistance, Workshop 1981, Un. Wisconsin-Madison) и их генетический анализ дополнительно проведен и описан у Song KM и др., TAG 75, 1988, cc.784-794; TAG 76, 1988, cc. 593-600 и TAG 79, 1990, сс.497-506 (серия из трех статей).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения растения В.oleracea, которые применяют согласно настоящему изобретению, представляют собой, например:
Brassica oleracea L. (капустные культуры)
- сорт acephala DC. (капуста кормовая, капуста листовая, браунколь)
- сорт albiflora Sun [В.alboglabra] (капуста китайская)
- сорт alboglabra [В.alboglabra] (капуста китайская)
- сорт botrytis L. (капуста цветная)
- сорт. capitata L. (капуста огородная кочанная)
- сорт chinensis Prain (сорт “Prain” капусты китайской)
- сорт fimbriata Mill. (капуста огородная)
- сорт fruticosa Metz. (капуста кормовая тысячеголовая)
- сорт gemmifera DC. (брюссельская капуста)
- сорт gongylodes L. (кольраби)
- сорт italica Plenck. (брокколи, спаржевая капуста)
- сорт sabauda L. (савойская капуста)
- сорт sabellica (капуста кормовая)
- сорт tronchuda L.H.Bailey (капуста тронхуда, описанный L.H.Bailey)
- сорт costata (португальская капуста)
- сорт medullosa (капуста коровья)
- сорт pamifolia (капуста джерсейная)
- сорт ramosa (капуста тысячеголовая)
- сорт selensia (капуста кормовая)
Предпочтительными растениями В.oleracea согласно настоящему изобретению являются белокочанная капуста, цветная капуста, брюссельская капуста и брокколи.
Согласно настоящему изобретению моногенный доминантный признак устойчивости к киле переносили из китайской капусты (В.rара) в брокколи (В.oleracea). Для межвидовой гибридизации использовали брокколи (В.oleracea сорт italica) в качестве материнского растения и В.rара в качестве отцовского растения. Инбредные линии брокколи выбирали в качестве материнского растения для предупреждения присутствия клеточных органелл различного происхождения в конечных продуктах скрещивания. Применяемое для межвидового скрещивания отцовское растение представляло собой устойчивый к киле F1-гибрид китайской капусты, полученный из Японии, который поступает в продажу под названием “Parkin” (фирма Takii Seeds, Япония). После каждого скрещивания или возвратного скрещивания подсчитывали число хромосом полученных растений для оценки уровня полиплодии растений и успеха с точки зрения получения хромосомного набора, характерного для В.oleracea. Подсчет хромосом осуществляли с использованием метода, описанного у Chiang и др., Euphytica 28, 1979, cc.41-45. Для проточной цитометрии использовали устройство типа Partec CA II (фирма Partech, Великобритания).
F1-гибриды, представляющие собой результат скрещивания, получали методом “спасения” эмбриона. Метод “спасения” эмбриона требуется применять из-за того, что В.rара и В.oleracea имеют различное число хромосом и поэтому не обладают половой совместимостью. Метод “спасения” эмбриона позволяет решить проблемы, связанные с разрушением эндосперма. Использовали метод “спасения” эмбриона, описанный у Harbert и др.. (Euphytica 18, 1969, с.425-429). Стерилизованные 10-12-дневные семяпочки после опыления разрезали пополам и интродуцировали в культуральную среду при постоянном перемешивании. Культуральная среда представляла собой среду Уайта, дополненную 8% сахарозы и 400 част./млн казеинового гидролизата. Эмбрионы отмывали от семяпочек и выращивали в жидкой среде.
Устойчивые к киле F1-растения скрещивали с растениями брокколи (т.е. осуществляли возвратное скрещивание). Описанный выше метод “спасения” эмбриона также требовался для получения растений после первого возвратного скрещивания (т.е. ВС1-растений).
Вновь осуществляли возвратное скрещивание устойчивых к киле ВС1-растений с растениями брокколи, при этом с помощью обычного набора семян было получено три ВС2-растения, которые обладали устойчивостью к киле. Эти растения вновь подвергали возвратному скрещиванию с растениями брокколи, и растения, полученные после четвертого возвратного скрещивания (т.е. ВС4-растения), применяли в качестве источника признака устойчивости для других культурных сортов В.oleracea.
Подробный экспериментальный протокол, позволяющий переносить признак устойчивости в В.oleracea, описан в примере 1. Оценка поражения заболеванием, которую применяли для выявления наличия устойчивости, описана в примере 2. Результаты полевых опытов, демонстрирующие устойчивость к киле, представлены в примере 3.
Репрезентативная линия В.oleracea, которая несет моногенный доминантный признак устойчивости к киле, предлагаемая в настоящем изобретении, т.е. линия CFL 667, была депонирована в NCIMB, Абердин, АВ 21 RY, Шотландия, Великобритания под регистрационным номером NCIMB 41134 28 июня 2002 г. Растения линии CFL 667 обладают цитоплазматической мужской стерильностью и являются гетерозиготными по признаку устойчивости.
Таким образом, согласно настоящему изобретению устойчивость к киле можно получать с использованием линии CFL 667, депонированной в NCIMB под регистрационным номером NCIMB 41134.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения растение В.oleracea, устойчивое к киле, определяют как растение, поражение которого соответствует баллу 0 или 1 при использовании 0-5-балльной шкалы, которая описана в примере 2, или растение, поражение которого соответствует баллу 1 или 2 при использовании 1-9-балльной шкалы, которая описана в примере 2.
Признак устойчивости к киле переносили в другие сорта В.oleracea, прежде всего в белокочанную капусту, цветную капусту и брюссельскую капусту, с использованием стандартных методов отбора, хорошо известных в области селекции представителей рода Brassica. Признак устойчивости также интрогрессировали в элитные линии В.oleracea. Интрогрессию признака устойчивости в элитную линию осуществляли, например, путем рекуррентной селекции (повторяющийся отбор), например, путем возвратного скрещивания. В этом случае элитную линию (рекуррентный родитель) сначала скрещивали с инбредным донором (нерекуррентный родитель), который несет признак устойчивости. Потомство этого скрещивания затем вновь скрещивали с рекуррентным родителем и отбирали полученное потомство по признаку устойчивости к киле. После получения трех, предпочтительно четырех, более предпочтительно пяти или более поколений, полученных в результате возвратного скрещивания с рекуррентным родителем, и отбора по признаку устойчивости к киле, потомство являлось гетерозиготоным по локусу, обусловливающему устойчивость, но напоминало рекуррентного родителя по большинству или почти по всем другим генам (см., например, Poehlman и Sleper, Breeding Field Crops, 4-е изд., 1995, сс.172-175; Fehr, Principles of Cultivar Development, том 1: Theory and Technique, cc.360-376, публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки). После каждого скрещивания осуществляли отбор по признаку устойчивости к киле. Таким образом, предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является способ переноса доминантного и моногенного признака устойчивости к киле в растение В.oleracea, которое является чувствительным или обладает недостаточным уровнем устойчивости к болезни, заключающийся в том, что скрещивают первое растение В.oleracea со вторым растением В.oleracea, где первое растение несет доминантный и моногенный признак устойчивости к киле, отбирают полученное в результате скрещивания растение, которое обладает устойчивостью к киле. Поражение заболеванием растения В.oleracea, которое является чувствительным или обладает недостаточным уровнем устойчивости к болезни, например, соответствует баллу 4 или выше, предпочтительно 3 или выше при оценке болезни по 1-9-балльной шкале, или баллу 3 или выше, предпочтительно 2 и выше при оценке болезни по 0-5-балльной шкале. Способ предусматривает также возвратное скрещивание отобранного с помощью вышеизложенного способа растения со вторым растением В.oleracea, до тех пор пока признак устойчивости не будет перенесен во второе растение В.oleracea.
Признак устойчивости к киле предпочтительно переносят в имеющие коммерческое значение линии В.oleracea. Такие линии представляют собой, например, инбредные линии. В другом варианте имеющие коммерческое значение линии представляют собой гибриды, которые получают скрещиванием двух инбредных линий. В этом случае генетический фактор, обусловливающий устойчивость к киле, может присутствовать в одном из инбредных родителей или в обоих родителях. Таким образом, предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является инбредная или гибридная линия В.oleracea, которая несет моногенный доминантный признак устойчивости к киле, включая семена и материал указанной инбредной или гибридной линии и ее потомство. Предпочтительно генетический фактор устойчивости может иметь происхождение из В.гара, предпочтительно из F1-гибрида китайской капусты “Parkin”. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения признак устойчивости к киле, предлагаемой в настоящем изобретении, присущ линии CFL 667, депонированной в NCIMB под регистрационным номером NCIMB 41134.
Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения устойчивое к киле растение В.oleracea, предлагаемое в настоящем изобретении, обладает мужской стерильностью. Мужская стерильность является важной для дающего семена гибрида В.oleracea, поскольку обычные цветки являются самоопыляющимися. Линии с мужской стерильностью не продуцируют жизнеспособную пыльцу и не способны к самоопылению. Путем элиминации пыльцы одного из родительских сортов, применяемых для скрещивания, агроном-селекционер гарантированно должен получать гибридный семенной материал однородного качества. Наиболее предпочтительной системой мужской стерильности является цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС). Примером такой ЦМС у представителей рода Brassica является описанная Ogura ЦМС, которая первоначально обнаружена в растениях редьки (см., например, Ogura, Mem. Fac. Agric. Kagoshima Univ. 6, 1968, сс.39-78; Makaroff, Journal of Biol. Chem. 264, 1989, cc.11706-11713; US 5254802). Таким образом, в настоящем изобретении описано обладающее мужской стерильностью, прежде всего ЦМС, растение В.oleracea, которое несет моногенный доминантный признак устойчивости к киле, включая семена и материал таких растений и их потомство. Предпочтительно генетический фактор устойчивости может иметь происхождение из В.rара, предпочтительно из F1-гибрида китайской капусты “Parkin”. Предпочтительно ЦМС получают из описанного у Ogura генома.
Мужскую фертильность растений с мужской стерильностью можно восстанавливать с помощью хорошо известных в данной области методов. Мужскую фертильность растений с ЦМС, в частности растений В.oleracea с ЦМС, предпочтительно восстанавливают путем слияния клеток. Для этой цели ЦМС-растение сливают с клетками растения с мужской фертильностью, заменяя ядро фертильного растения ядром стерильного растения в фертильном цитоплазматическом окружении, и восстанавливают фертильность. Методы слияния клеток хорошо известны в данной области, например описаны у Sigareva и Earle, Theor. Appl. Genet. 94, 1997, сс.213-320. С помощью таких методов регенерируют растения, обладающие мужской фертильностью, и дают им самоопыляться или скрещиваться с другим растением.
Признаки, в частности признаки, которые имеют фенотипическое проявление, такие как устойчивость к болезни, можно затем оценивать генетически путем скрещиваний и определения расщепления признака в потомстве, полученном в результате скрещивания. Этот подход позволяет, например, определять является ли признак доминантным или рецессивным. Это позволяет также оценивать находятся ли генетические факторы, обусловливающие эти признаки, в одном и том же локусе (например, в одном(их) и том(ех) же гене(ах) или в различных генах, в одном(их) и том(ех) же аллеле(ях) или в различных аллелях) или в различных сцепленных или несцепленных локусах.
Например, когда гомозиготное по признаку растение скрещивают с растением-“тестером”, гомозиготным по доминантному признаку, которое имеет такой же фенотип, то потомство, полученное в результате скрещивания, не должно расщепляться по фенотипу признака (соотношение 1:0). Это соотношение 1:0 получают, когда генетические факторы, обусловливающие признак, находятся в одном и том же локусе или в различных локусах. Когда происходит самоопыление растений из поколения первой генерации, полученного в результате описанного выше скрещивания, то соотношение 1:0 является характерным для доминантных признаков, обусловленных генетическими факторами, которые находятся в одном и том же локусе у тестируемого растения и у растения-“тестера”. В противоположность этому, соотношение 15:1 является характерным для доминантных признаков, обусловленных генетическими факторами, которые находятся в различных несцепленных локусах у тестируемого растения и растения-“тестера”. Если генетические факторы находятся в различных, но генетически сцепленных локусах, то соотношение находится между указанными соотношениями 1:0 и 15:1.
В другом примере, когда тестируемое растение, которое является гетерозиготным по доминантному признаку, скрещивают с растением-“тестером”, которое также является гетерозиготным по доминантному признаку, имеющему такой же фенотип, то полученное в результате скрещивания потомство расщепляется в соотношении 3:1 по фенотипу устойчивости. Это соотношение 3:1 является характерным для случая, когда генетические факторы, обусловливающие признак, находятся в одном и том же локусе или в различных локусах. Когда полученные в результате описанного выше скрещивания растения из поколения первой генерации скрещивают с растениями “тестерной” линии или вновь с подлежащим тестированию растением, гетерозиготным по признаку, то соотношение 3:1 является характерным для доминантных признаков, основой которых являются генетические факторы, расположенные в одном и том же локусе, а соотношение 23:9 является характерным для доминантных признаков, основой которых являются генетические факторы, расположенные в различных несцепленных локусах. Если два генетических фактора находятся в двух различных, но генетически сцепленных локусах, то соотношение обычно находится между указанными двумя соотношениями.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения поколение второй генерации отдельных растений анализируют индивидуально. В этом случае для генетических факторов, расположенных в одном и том же локусе, 50% растений из поколения второй генерации вновь расщепляется в соотношении 3:1, 25% в соотношении 1:0 и 25% в соотношении 1:1 при скрещивании с гетерозиготным растением. При наличии несцепленного генетического фактора в тестируемом растении в поколении второй генерации 50% растений расщепляется в соотношении 3:1, 25% в соотношении 7:1 и 25% в соотношении 1:1 (в поколении второй генерации нет растений с зафиксированной устойчивостью).
Если признак представляет собой устойчивость к болезни и тестируемая болезнь вызывает гибель чувствительных растений или препятствует цветению чувствительных растений, то в поколении второй генерации могут быть различные соотношения расщепления из-за гибели или отсутствия потомства у чувствительных растений из поколения первой генерации. Например, в этом случае вместо указанных выше соотношений 3:1 и 23:9, получают соотношения 5:1 и 19:5 соответственно. При оценке поражения заболеванием отдельных растений 2/3 поколения второй генерации расщепляется в соотношении 3:1, а 1/3 в соотношении 1:0 по генетическим факторам, которые расположены в одном и том же локусе, и 2/3 расщепляется в соотношении 3:1 и 1/3 в соотношении 7:1 по генетическим факторам, которые расположены в различных локусах.
Применяют также другие стратегии скрещивания, например, с использованием других комбинаций гомозиготных или гетерозиготных растений или растений, которые не несут признак. Затем оценивают расщепление признака в потомстве. Эти стратегии скрещивания и соответствующие им соотношения расщепления хорошо известны специалисту в данной области, которому очевидны также пути получения и применения соответствующих растений-“тестеров” и интерпретация полученных в результате таких скрещиваний соотношений расщепления. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, проиллюстрированные выше схемы скрещивания применяют для создания устойчивости к заболеванию килой в контексте настоящего описания. Таким образом, другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является растение В.oleracea, гомозиготное или гетерозиготное по признаку устойчивости к киле, причем, когда признак устойчивости к киле является гомозиготным у тестируемого растения и это растение скрещивают с растением-“тестером”, гомозиготным по признаку устойчивости к киле, то в полученном в результате этого скрещивания поколении растений первой генерации расщепление признака устойчивости к киле происходит в соотношении 1:0. Применяемое для такого скрещивания растение-“тестер” представляет собой, например, растение, которое получено из линии CFL 667, депонированной в NCIMB под регистрационным номером NCIMB 41134 и которое несет признак устойчивости, предлагаемой в настоящем изобретении. В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение-“тестер” получают из растения линии CFL 667 или из потомства растения линии CFL 667 путем слияния клеток. Другие растения с мужской фертильностью, которые несут признак устойчивости, предлагаемой в настоящем изобретении, можно использовать также в качестве растения-“тестера”. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, когда растениям из поколения первой генерации дают самоопыляться, то полученное поколение второй генерации расщепляется в соотношении 1:0 по признаку устойчивости. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, когда растениям из поколения первой генерации дают самоопыляться, то полученное поколение второй генерации расщепляется в соотношении 15:1 по признаку устойчивости. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения поколение второй генерации, полученное в результате самоопыления, расщепляется в соотношении от 1:0 до 15:1. Таким образом, на основе соотношения расщепления можно определять локализованы ли генетические факторы устойчивости тестируемого растения и растений-“тестеров” в одном и том же локусе или в различных сцепленных или несцепленных локусах.
Другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является растение В.oleracea, гомозиготное или гетерозиготное по признаку устойчивости к киле, причем, когда признак устойчивости к киле является гетерозиготным у тестируемого растения и это тестируемое растение скрещивают с растением-“тестером”, гетерозиготным по признаку устойчивости к киле, то полученное в результате этого скрещивания поколение первой генерации расщепляется в соотношении 3:1 по признаку устойчивости к киле. Растение-“тестер” для такого скрещивания представляет собой, например, растение линии CFL 667, депонированной в NCIMB под регистрационным номером NCIMB 41134, или растение-потомок линии CFL 667, несущее признак устойчивости, предлагаемой в настоящем изобретении. В качестве растения-“тестера” можно применять также любое другое растение, несущее признак устойчивости, предлагаемой в настоящем изобретении. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, когда растения из поколения первой генерации дополнительно скрещивают с тестируемыми растениями, гетерозиготными по признаку устойчивости, то ожидается, что расщепление по признаку устойчивости поколения второй генерации должно происходить в соотношении 3:1. Однако в связи с тем, что чувствительные растения, как правило, не выживают в опытах по оценке устойчивости к заболеванию килой или в таких опытах у них не происходит цветение, то поколение второй генерации расщепляется в соотношении 5:1. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, когда растения из поколения первой генерации дополнительно скрещивают с растениями “тестерной” линии, то ожидается, что расщепление полученного поколения второй генерации по признаку устойчивости должно происходить в соотношении 23:9, но обычно расщепление происходит в соотношении 19:5. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения расщепление поколения второй генерации происходит в соотношении от 5:1 до 19:5. При индивидуальной оценке поражения заболеванием потомства отдельных растений были обнаружены указанные выше соотношения. Таким образом, на основе соотношения расщепления можно определять локализованы ли генетические факторы устойчивости тестируемого растения и растений-“тестеров” в одном и том же локусе или в различных сцепленных или несцепленных локусах.
Еще одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения являются молекулярные маркеры, сцепленные с генетическим фактором, обусловливающим моногенный доминантный признак устойчивости к киле. Такие молекулярные маркеры позволяют дифференцировать на молекулярном уровне устойчивые и чувствительные растения, и таким образом выявляют моногенный и доминантный признак устойчивости в растениях рода Brassica, предпочтительно в растениях В.oleracea. Основой для создания молекулярных маркеров является генетический полиморфизм между устойчивыми и чувствительными растениями, и они локализованы в обусловливающем устойчивость локусе или в непосредственной близости от него. Молекулярные маркеры применяют, например, для отбора и получения устойчивых растений, для выявления наличия признака устойчивости при отборе или для контроля присутствия признака устойчивости в поступающей в продажу партии семян.
Таким образом, предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения являются способы картирования генетического фактора устойчивости к киле в растениях рода Brassica, предпочтительно в растениях В.oleracea, способы выявления присутствия признака устойчивости в растении рода Brassica, предпочтительно растении В.oleracea, и способы переноса признака устойчивости в чувствительное или обладающее недостаточным уровнем устойчивости растение рода Brassica, предпочтительно растение В.oleracea. Например, указанные способы применяют для отбора новых устойчивых растений или линий или для контроля качества партии семян. Представленные в описании молекулярные маркеры позволяют ускорять внедрение устойчивых линий на рынок и улучшать качество контроля поступающих в продажу партий семян. Вследствие этого можно не осуществлять оценку поражения болезнью и заменять ее применением молекулярного маркера.
Молекулярные маркеры и способы, предлагаемые в настоящем изобретении, являются особенно ценными на различных стадиях получения коммерческого сорта, таких как программы отбора и процесс получения семян. Например, настоящее изобретение применяют для интрогрессии признака устойчивости в растение В.oleraceat, например, в элитную инбредную линию. Отбор по признаку устойчивости к киле осуществляют путем оценки семян или растений, полученных после каждого скрещивания с молекулярными маркерами. Таким образом, предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения являются способы переноса доминантного и моногенного признака устойчивости к киле в растение В.oleracea, которое является чувствительным или обладает недостаточным уровнем устойчивости к болезни, заключающиеся в том, что: скрещивают первое растение, устойчивое к болезни, со вторым растением, чувствительным или обладающим недостаточным уровнем устойчивости, собирают семена, полученные в результате скрещивания, получают образец семенного материала или выращенное из него растение, определяют в этом образце наличие молекулярного маркера, предлагаемого в настоящем изобретении, присутствие указанного молекулярного маркера свидетельствует об устойчивости к болезни в этом семенном материале или растении, отбирают растение, позитивное в отношении присутствия указанного маркера, причем это растение предпочтительно обладает устойчивостью к болезни. Предпочтительно затем осуществляют возвратное скрещивание устойчивого растения с чувствительным или обладающим недостаточным уровнем устойчивости растением.
Молекулярные маркеры, предлагаемые в настоящем изобретении, удобно применять также для получения стабильных гомогенных инбредных линий или культиваров (которые также иногда называют сортами), при этом конкретная линия самоопыляется до достижения удовлетворительной чистоты и гомогенности линии. Настоящее изобретение можно применять также для промышленного производства семян конкретной линии или культивара. И в этом случае после каждого скрещивания предлагаемый в изобретении способ применяют для оценки семян, полученных в результате скрещивания, и отбирают только устойчивые растения. Таким образом, предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения являются способы получения устойчивых к киле семян или растений, заключающиеся в том, что: скрещивают устойчивое растение с самим собой, собирают семена, образовавшиеся в результате скрещивания, получают образец семенного материала или выращенное из него растение, определяют в этом образце наличие молекулярного маркера, предлагаемого в настоящем изобретении, присутствие указанного молекулярного маркера свидетельствует об устойчивости к болезни в этом семенном материале или растении.
Настоящее изобретение применяют также для получение гибридного семенного материала. В этом случае настоящее изобретение применяют для гарантии того, что все гибридные семена, которые проросли и выросли в полевых условиях, обладают устойчивостью к болезни. Предпочтительно молекулярные маркеры, предлагаемые в настоящем изобретении, применяют также для гарантии качества и для гарантии того, что устойчивость к болезни присутствует в гибридных семенах. Таким образом, предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения являются способы получения семян, заключающиеся в том, что: скрещивают первое растение и второе растение, где одно из растений обладает устойчивостью к киле, собирают семена, образовавшиеся в результате скрещивания, получают образец семенного материала или выращенное из него растение, определяют в этом образце наличие молекулярного маркера, предлагаемого в настоящем изобретении, присутствие указанного молекулярного маркера свидетельствует о наличии признака устойчивости к болезни в этом семенном материале или растении. Таким образом, настоящее изобретение позволяет существенно совершенствовать промышленные процессы селекции и получения семян.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулярный маркер, предлагаемый в настоящем изобретении, расположен на расстоянии 10 сантиморганид (сМ) от локуса, обусловливающего устойчивость к киле, предпочтительно 6 сМ, более предпочтительно 5 сМ, еще более предпочтительно 3 сМ, наиболее предпочтительно на расстоянии 1,5 сМ от локуса, обусловливающего устойчивость к киле, и в результате этого обладает высокой способностью к косегрегации с признаком устойчивости.
В контексте настоящего описания предпочтительные полиморфизмы включают, например, повторы одной последовательности (SSR, см, например, Неагпе и др., Trends Genet 8, 1992, сс.288-294), полиморфизмы одного нуклеотида (SNP, Botstein В и др., Am J Hum Genet 32, 1980, сс.314-331) и любые другие типы перегруппировок ДНК, такие как делеции, амплификации, кроссоверы.
В контексте настоящего описания для получения молекулярных маркеров, сцепленных с генетическим фактором, обусловливающим устойчивость, можно применять методы выявления полиморфизмов, которые хорошо известны в данной области. Предпочтительными являются методы, основанные на ПЦР-амплификации, например на SSR-технологии и RAPD-технологии (Williams и др., Nucl Acids Res 18, 1990, сс.6531-6535). В целом, предпочтительные олигонуклеотиды, применяемые для ПЦР, состоят из 8-50 нуклеотидов, более предпочтительно 10-30 нуклеотидов. Полученные с помощью ПЦР-амплификации ДНК-фрагменты, которые содержат сайт, включающий полиморфизм, предлагаемый в настоящем изобретении, предпочтительно состоят примерно из 100-3000, более предпочтительно примерно из 200-2000, еще более предпочтительно примерно из 300-1000 нуклеотидов. Другие методы скрининга или выявления полиморфизмов, которые можно применять согласно настоящему изобретению, включают прямое секвенирование нуклеиновых кислот, анализ одноцепочечных полиморфизмов, лигазную цепную реакцию, ферментативное расщепление и Саузерн-гибридизацию.
Альтернативные методы представляют собой несколько методов, предназначенных для обнаружения расщепленных амплифицированных полиморфных последовательностей (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences; CAPS-методы; Konieczny и др., The Plant Journal 4(2), 1993, сс.403-410) и для обнаружения полиморфизмов одного нуклеотида (SNP) с помощью метода, предназначенного для обнаружения расщепленных амплифицированных модифицированных полиморфных последовательностей (Cleaved Amplified Modified Polymorphic Sequences, обозначен как CAMPS-метод), также известного как dCAPS-метод (Neff и др., Plant J. 14, 1998, сс.387-392; Michaels и Amasino, Plant J 14, 1998, сс.381-385). Согласно CAPS-методу нуклеиновую кислоту, содержащую полиморфный сайт рестрикции, амплифицируют с использованием праймеров, фланкирующих сайт рестрикции. Образовавшийся ПЦР-продукт расщепляют рестриктазой, соответствующей полиморфному сайту рестрикции, и расщепленные продукты анализируют с помощью гель-электрофореза.
Саузернгибридизация также представляет собой эффективный метод выявления различий в последовательностях, в частности на основе полиморфизмов длин рестрикционных фрагментов (RFLP; restriction fragment length polymorphisms) (Botstein В и др., Am J Hum Genet 32, 1980, сс.314-331).
Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения являются молекулярные маркеры, прочно сцепленные с генетическим фактором, обусловливающем устойчивость к киле, которые получают с помощью RAPD-метода (см. пример 4 настоящего описания).
Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах, не ограничивающих его объем.
Все процитированные в настоящем описании публикации полностью включены в него в качестве ссылок.
Примеры
Пример 1: Перенос признака устойчивости в В.oleracea
F1
Осуществляли несколько сотен скрещиваний устойчивого к киле F1-гибрида сорта “Parkin” китайской капусты с брокколи (В.oleracea). “Спасали” эмбрионы, полученные в результате этих скрещиваний (Harbert и др., Euphytica 18, 1969, сс.425-429). Из четырех эмбрионов развились растения, два из которых оказались устойчивыми к болезни. Геном этих двух устойчивых растений включал 19 хромосом. По фенотипу растения оказались гибридом китайской капуста и брокколи.
ВС1
Для получения ВС1-растений также осуществляли “спасение” эмбрионов. Инбредную линию брокколи использовали в качестве родителя при возвратном скрещивании. Для получения следующих генераций в качестве родителя при возвратном скрещивании также использовали линии брокколи. Только одно из указанных выше двух растений поколения F1 оказалось респондером и из 5 эмбрионов развились растения. Четыре из них оказались устойчивыми к киле.
По фенотипу ВС1-растения оказались ближе к применяемым в качестве родителя при возвратном скрещивании растениям брокколи.
Поскольку распределение хромосом генома В.rара в ВС1-растениях является произвольным, растения содержали 18 хромосом В.oleracea и 0-10 хромосом В.rара.
В результате были получены растения с 18-28 хромосомами.
ВС2
ВС2-растения получали путем заложения семян ВС1-растений. Установлено, что девять растений, которые были получены в результате заложения семян одного растения, обозначенного как растение В, из указанных выше ВС1-растений обладали устойчивостью к киле. У них определяли количество хромосом и с помощью проточного цитометра оценивали отклонение содержания ДНК от основного уровня. В дальнейшей программе исследований использовали три растения, а именно В23, В27 и В28.
ВС3 и ВС4
ВС3- и ВС4-растения также получали путем заложения семян. В растение B 27. которое уже в ВС2-поколении было диплоидным, оказался включен доминантный ген, обусловливающий устойчивость и к киле. В полученных путем возвратного скрещивания поколениях ВС3 и ВС4 обнаружено ожидаемое расщепление 1:1.
Как было установлено при анализе следующих поколений, ген, обусловливающий устойчивость, был также интрогрессирован в растения В23 и B28.
Полевой опыт
Предварительный полевой опыт осуществляли с использованием устойчивых растений, отобранных после оценки проростков, которые были получены из одного из ВС3-растений, обозначенного как В27. Растения высаживали в поле с высоким уровнем заражения на испытательной базе фирмы-заявителя в Клеве, Германия. Все растения оказались здоровыми и у них не обнаружено никаких симптомов при выкапывании после созревания.
Перенос признака устойчивости в других представителей В.oleraceas
Устойчивое растение В27 использовали в качестве источника признака устойчивости к киле для осуществления программы по возвратному скрещиванию с брокколи, цветной капустой, капустой огородной и брюссельской капустой, получая устойчивые сорта, которые представлены, в частности, в примере 3.
Пример 2: Оценка симптомов заболевания
6
Проростки пересаживали через одну неделю после посева в блок бумажных или пластмассовых горшочков, содержащих смесь песка и торфяной почвы в соотношении 2:1, значение рН<6. Через один день после пересадки в горшочки инъецировали 1 мл раствора, содержащего 1×10 цист/мл. Раствор представлял собой смесь источников килы, которые имели ECD-коды 16/3/30, 16/23/30, 16/3/14 и 16/7/30 (Buczacki и др., Trans. Вr. Mycol. Soc.65, 1975, сс.295-303). Первые две недели почву увлажняли, после этого срока почва могла слегка подсыхать. Температуру при инкубации в теплице поддерживали на уровне 18-20°С. Через 4-5 недель после пересадки корни полностью отмывали и оценивали симптомы заболевания.
В другом варианте семена непосредственно высаживали в ящики с блоками бумажных или пластмассовых горшочков в смесь песка и торфяной почвы (2:1 EGO, pH 5-6,1 семя на 1 горшочек из блока). Как правило, для каждой линии оценивали по 20-30 растений. Примерно через 7-10 дней после посева растения инокулировали, вторую инокуляцию осуществляли через 2-5 дней после первой инокуляции. Если предполагалось, что семена могут плохо прорастать, то посев осуществляли в черные ящики в грядки и растения пересаживали через 7-10 дней в ящики с блоками горшочков. Температуру инкубации поддерживали на уровне 20-22°С.
7
Стандартный инокулят представлял собой изолят 9 (агрессивный изолят, выделенный из зараженного поля в Германии). Инокулят получали из зараженных корней, которые хранили в замороженном состоянии при -20°С в пластиковых мешочках. Корни перемешивали в миксере (1 часть корней, 5 частей воды) в течение примерно 2 мин. Небольшие частицы затем фильтровали с использованием сырной салфетки и подсчитывали количество цист (круглые, слабо окрашенные (слегка голубоватые)). Один мл раствора, содержащего 0,5-1×10 цист/мл вносили с помощью пипетки Эппендорфа на стебель/основание корня растения. Инокулят требовалось регулярно встряхивать для гомогенного перемешивания присутствующих в суспензии цист.
В зависимости от масштаба опыта требовалось включение в него достаточного количества контрольных растений. Чувствительными контрольными растениями являлись, например: сорт White Rock (цветная капуста), сорт Maximus или другие F1-гибриды (брюссельская капуста), сорт Marathon (белокочанная капуста). В качестве устойчивых контрольных растений в опыт можно включать сорта Parkin или Storkin (китайская капуста). Можно также использовать сорт Hopkin (чувствительный сорт китайской капусты), так как в нем, если инокулят является эффективным, признаки заболевания проявляются на ранних стадиях.
Растения должны были находиться в достаточно влажном состоянии на протяжении всего опыта. Требовалось регулярное внесение удобрений, однако растения не должны были расти слишком быстро. Температуру поддерживали на уровне 22-20°С (день/ночь), продолжительность дня 16 ч.
Через 4 недели (лето) - 6 недель (зима) после инокуляции растения можно вынимать из почвы, промывать и оценивать симптомы заболевания.
Для оценки симптомов заболевания можно использовать, например, следующую балльную шкалу:
0 - отсутствие кил, здоровая корневая система;
1 - 1-2 небольших килы на боковых корнях, иногда корни приобретают коричневатую окраску;
2 - несколько небольших кил на боковых корнях, иногда главные корни слегка утолщаются;
3 - большая часть главных корней утолщена;
4 - главные корни значительно утолщены и сращены с килообразными боковыми корнями, иногда еще присутствуют здоровые корни;
5 - один комок корней, отсутствуют здоровые корни.
Растения, поражение которых соответствует баллу 0 при проведении опыта вне теплицы (иногда баллу 1 в зависимости от жесткости условий испытания в теплице и генетических особенностей), затем переносили в зараженное килой поле (например, поле De Wit в Энкхузене). Как правило, растения, взятые из теплицы, в полевых условиях оказывались сильно инфицированными, и это было хорошо заметно (задержка роста). Однако количество таких растений было очень невелико.
Для оценки симптомов заболевания можно использовать, например, другую балльную шкалу:
1 - отсутствие заметного галлообразования на корнях;
2 - один галл на боковых корнях;
3 - несколько небольших галлов на боковых корнях (растение является здоровым);
4 - слабое галлообразование на главном корне, несколько небольших галлов;
5 - заметное (умеренное) галлообразование на главном корме, много небольших или несколько крупных галлов на боковых корнях;
6 - выраженное галлообразование на главном корне, много крупных галлов на боковых корнях;
7 - выраженное галлообразование, остается несколько здоровых корней;
8 - выраженное галлообразование, присутствует незначительное количество здоровых корней;
9 - выраженное галлообразование, здоровые корни отсутствуют.
Пример 3: Результаты полевых опытов
Таблица 1
Полевой опыт проводили в Верриби, провинция Виктория, Австралия. Растения были посажены в январе 2002 г. в зараженную возбудителями килы почву. Оценка, проведенная через 6 недель после посадки (таблица 1), уже позволила выявить устойчивость к киле гибридов цветной капусты, предлагаемых в настоящем изобретении (F308 и F311), в сравнении с чувствительными сортами (White Rock и Triumphant) и чувствительным сортом (Triumphant), который обрабатывали различными количествами фунгицида (ширлан), а также при добавлении извести (повышение значения рН приводит к уменьшению поражения килой, см., например, Dixon и Page, Acta Horticulturae, 459, 1998, cc.343-349). Для оценки опыта использовали указанную выше 1-9-балльную шкалу.
Режим обработки
Галлообразование по 0-9-балльной шкале
1.Негашеная известь (2,5 т/га)
4,11
2. Ширлан (3 л/га)
2,33
3. Ширлан (3 л/га) + негашеная известь (2,5 т/га)
2,22
4. Ширлан (2 л/га)
3,00
5. Контроль - сорт Triumphant
5,06
6.F308
1,00
7.F311
1,00
8. сорт White Rock
5,11
Таблица 2
Представлены результаты, полученные в опыте с использованием молодых растений цветной капусты и изолятов, взятых из трех различных областей Австралии (Кора Лин (Cora Lyn), Верриби (Werribee) и Трентам (Trentham)). Инокуляцию изолятами осуществляли с помощью метода, аналогичного описанному выше. Сорт White Rock представлял собой чувствительный контроль, а Е70 - устойчивый гибридный сорт цветной капусты, предлагаемый в настоящем изобретении. Для оценки опыта использовали указанную выше 1-9-балльную шкалу.
Усредненные результаты
Кора Лин
Верриби
Трентам
White Rock
8,2
8,7
3,9
Е70
1
1
1
Таблица 3
Представлены результаты, полученные в течение 2 лет в разных областях Европы на полях с естественным заражением килой. Применяемые линии D249, D506, Е245, Е246 представляли собой устойчивые гибриды цветной капусты, предлагаемые в настоящем изобретении, White Rock представлял собой чувствительный сорт цветной капусты, SPR666 и А876 представляли собой устойчивые гибриды В.sprouts, предлагаемые в настоящем изобретении, Romulus и Maximus представляли собой чувствительные сорта B.sprouts, F1182, F1187 представляли собой устойчивые гибриды белокочанной капусты, предлагаемые в настоящем изобретении, и Marathon представлял собой чувствительный сорт белокочанной капусты. Оценку (di05) осуществляли в конце вегетативного периода по 0-5-балльной шкале (см. выше).
Популяция
Тип
Область
Год
di05
D249
Цветная капуста
Ганновер
2000
0,0
D506
Цветная капуста
Ганновер
2000
0,0
White Rock
Цветная капуста
Ганновер
2000
1,8
D249
Цветная капуста
Халсал-Великобритания
2000
0,0
White Rock
Цветная капуста
Халсал-Великобритания
2000
4,3
SPR666
В.sprouts
Халсал-Великобритания
2000
0,0
Romulus
В.sprouts
Халсал-Великобритания
2000
4,5
SPR666
В.sprouts
Роеслар-Бельгия
2001
0,0
Romulus
В.sprouts
Роеслар-Бельгия
2001
3,3
A876
В.sprouts
Халсал-Великобритания
2001
0,0
Maximus
В.sprouts
Халсал-Великобритания
2001
4,5
E245
Цветная капуста
Халсал-Великобритания
2001
0,0
White Rock
Цветная капуста
Халсал-Великобритания
2001
4,6
F1187
Белокочанная капуста
Халсал-Великобритания
2001
0,0
Marathon
Белокочанная капуста
Халсал-Великобритания
2001
3,5
E246
Цветная капуста
Ганновер
2001
0,5
White Rock
Цветная капуста
Ганновер
2001
1,9
F1182
Белокочанная капуста
Ганновер
2001
0,0
Marathon
Белокочанная капуста
Ганновер
2001
3,6
Пример 4: Молекулярные маркеры
Сцепленные с обусловливающим устойчивость генетическим фактором RAPD-маркеры оценивали с использованием двух популяций белокочанной капусты (D1544 и D1545). С помощью двух молекулярных маркеров, полученных с использованием праймеров O 20 и Y 13 соответственно, получали продукты ПЦР-амплификации, прочно сцепленные с генетическим фактором, обусловливающим устойчивость к киле. Результаты, полученные как с использованием O 20, так и Y 13, коррелировали на 94,6% (53 случая из 56) с результатом опыта по оценке поражения заболеванием (устойчивость или чувствительность) в популяции D1544, что свидетельствует о расстоянии на карте сцепления, соответствующем 5,4 сМ. Для популяции D1555 при использовании O 20 корреляция с результатами опыта по оценке поражения заболеванием составила 100%, а при использовании Y 13 - 95,7% (45 случаев из 47), что позволяет предположить прочное сцепление (0 сМ) между O 20 и генетическим фактором, обусловливающим устойчивость, и сцепление, соответствующее 4,3 сМ, между Y 13 и генетическим фактором, обусловливающим устойчивость. При оценке RAPD-маркеров в диплоидной популяции белокочанной капусты, состоящей из 140 растений, при использовании о20 обнаружена 100%-ная (0 сМ), а при использовании Y 13 98,6%-ная (1,4 сМ) корреляция с результатами опыта по оценке поражения заболеванием.
При использовании праймера O 20 (5'-АСА САС GCT G-3') получали специфический фрагмент длиной примерно 400 пар оснований.
При использовании праймера Y 13 (5'-GGG TCT CGG Т-3') получали специфический фрагмент длиной примерно 640 пар оснований.
Условия амплификации описаны ниже. После проведения ПЦР 25 мкл ДНК анализировали в 1,8%-ном агарозном геле.
ДНК
мкл (разбавленная ДНК из стандартного минипрепа)
Праймер (10 мкМ)
1,0 мкл
дНТФ (2,5 мМ)
2,0 мкл
10-кратный буфер Platinium Taq
2,5 мкл (200мМ Трис-НСl рН 8,4, 500 мМ КСl, не содержащий MgCl<sub>2</sub>)
MgCl<sub>2</sub> (50 мМ)
0,75 мкл
Platinium Taq (BRL/life)
0,2 мкл (5 ед./мкл)
Стерильная вода
мкл (в зависимости от количества применяемой ДНК) конечный объем 25 мкл
Программа ПЦР
3 мин 94°С
Уровень 0:00 94°С
0,10
1 цикл, ПЦР цикл (Perkin Elmer 9600)
Уровень 0:00 36°С
0,30
Уровень 0:45 72°С
1,05
3 мин 94°С
Уровень 0:00 94°С
0,10
40 циклов, ПЦР цикл (Perkin Elmer 9600)
Уровень 0:00 36°С
0,30
Уровень 0:45 72°С
1,05
5 мин 72°С