СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ НАЦЕЛЕННЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МОДИФИКАЦИЙ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Способ создания линии эмбриональных стволовых (ЭС) клеток XY не относящегося к человеку млекопитающего, способной к производству фертильной самки XY не относящегося к человеку млекопитающего в поколении F0, включающий:
(a) модификацию ЭС-клетки XY не относящегося к человеку млекопитающего для приобретения модификации, которая снижает уровень и/или активность белка Sry; и
(b) культивирование модифицированной ЭС-клетки XY не относящегося к человеку млекопитающего в условиях, которые позволяют создать линию ЭС-клеток XY не относящегося к человеку млекопитающего, способную производить фертильную самку XY не относящегося к человеку млекопитающего в поколении F0.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий:
(c) введение модифицированной ЭС-клетки XY не относящегося к человеку млекопитающего в эмбрион-хозяина;
(d) вынашивание эмбриона-хозяина; и
(e) получение самки XY F0 не относящегося к человеку млекопитающего, причем после достижения половой зрелости самка XY F0 не относящегося к человеку млекопитающего является фертильной.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором ЭС-клетка XY не относящегося к человеку млекопитающего получена от грызуна.
4. Способ по п. 3, в котором грызун представляет собой мышь или крысу.
5. Способ по п. 4, в котором ЭС-клетка XY не относящегося к человеку млекопитающего представляет собой мышиную ЭС-клетку XY, полученную из линии 129 или из линии C57BL/6.
6. Способ по п. 5, в котором мышиная ЭС-клетка XY содержит Y-хромосому, полученную из линии 129.
7. Способ по п. 5, в котором мышиная ЭС-клетка XY представляет собой мышиную ЭС-клетку VGF1.
8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором сниженные уровень и/или активность белка Sry являются результатом нацеленной генетической модификации в геномном локусе, содержащем ген Sry.
9. Способ по п. 8, в котором генетическая модификация в гене Sry содержит:
(i) инсерцию одного или более нуклеотидов;
(ii) делецию одного или более нуклеотидов;
(iii) замену одного или более нуклеотидов;
(iv) нокаут;
(v) нокин;
(vi) замещение эндогенной нуклеотидной последовательности гомологичной, ортологичной или гетерологичной нуклеотидной последовательностью;
(vii) точечную мутацию;
(viii) инсерцию селективного маркера и/или репортерного гена, функционально связанного с промотором, активным в ЭС-клетке XY не относящегося к человеку млекопитающего; и
(ix) инсерцию репортерного гена, функционально связанного с эндогенным промотором Sry, причем, необязательно, репортерный ген кодирует репортерный белок LacZ.
10. Способ по любому из пп. 1-7, в котором ЭС-клетка XY не относящегося к человеку млекопитающего содержит целевой геномный локус на Y-хромосоме, содержащий сайт распознавания для нуклеазного агента,
причем целевой геномный локус находится в гене Sry, и
при этом этап (а) модификация включает:
(i) введение в ЭС-клетку XY не относящегося к человеку млекопитающего: (А) нуклеазного агента, при этом нуклеазный агент индуцирует одно- или двухцепочечный разрыв на сайте распознавания; и (В) нацеливающего вектора, содержащего полинуклеотидную вставку, фланкированную первым и вторым гомологичными плечами, соответствующими первому и второму целевым сайтам, расположенным достаточно близко к сайту распознавания; и
(ii) идентификацию модифицированной ЭС-клетки XY не относящегося к человеку млекопитающего, содержащей в своем геноме полинуклеотидную вставку, интегрированную в целевой геномный локус.
11. Способ по п. 10, в котором нуклеазный агент представляет собой мРНК, кодирующую нуклеазу.
12. Способ по п. 10, в котором нуклеазный агент представляет собой:
(a) нуклеазу с «цинковыми пальцами» (ZFN);
(b) эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN);
(c) мегануклеазу; или
(d) белок (Cas), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), и гидовую РНК (гРНК).
13. Способ по п. 12, в котором нуклеазный агент представляет собой белок Cas и гРНК, причем белок Cas представляет собой Cas9, и при этом гРНК представляет собой:
(a) РНК CRISPR (крРНК), нацеленную на первый сайт распознавания, при этом сайт распознавания непосредственно фланкирован последовательностью мотива, прилежащего к протоспейсеру (РАМ); и
(b) трансактивирующую РНК CRISPR (тракрРНК).
14. Способ по любому из пп. 1-7, в котором уровень и/или активность белка Sry снижается посредством введения в клетку полинуклеотида, который снижает уровень и/или активность белка Sry, причем полинуклеотид предотвращает трансляцию мРНК Sry, кодирует полипептид, ингибирующий транскрипцию или трансляцию гена Sry, или кодирует полипептид, ингибирующий активность белка Sry.
15. Способ по любому из пп. 1-7, в котором модифицированная ЭС-клетка XY не относящегося к человеку млекопитающего содержит условный аллель Sry, который снижает активность и/или уровень белка Sry.
16. Способ по любому из пп. 1-15, в котором этап культивирования включает культивирование модифицированной ЭС-клетки XY не относящегося к человеку млекопитающего в среде, содержащей основную среду и добавки, приемлемые для сохранения в культуре модифицированной ЭС-клетки XY не относящегося к человеку млекопитающего, причем среда представляет собой среду с низкой осмоляльностью, демонстрирующую осмоляльность от около 200 мОсм/кг до менее чем около 329 мОсм/кг.
17. Способ по п. 16, в котором среда с низкой осмоляльностью демонстрирует одну или более из следующих характеристик:
(i) проводимость от около 11 мСм/см до около 13 мСм/см;
(ii) концентрация соли щелочного металла и галида от около 50 мМ до около 110 мМ;
(iii) концентрация соли угольной кислоты от около 17 мМ до около 30 мМ; и
(iv) общая концентрация соли галида щелочного металла и соли угольной кислоты от около 85 мМ до около 130 мМ.
18. Способ по любому из пп. 1-17, в котором после введения модифицированной ЭС-клетки XY не относящегося к человеку млекопитающего в эмбрион-хозяина и последующего вынашивания эмбриона-хозяина по меньшей мере 80% не относящихся к человеку млекопитающих F0 представляют собой самок XY, которые после достижения половой зрелости являются фертильными.
19. Способ по п. 2, в котором самка XY F0 не относящегося к человеку млекопитающего представляет собой мышь и является фертильной при скрещивании с мышью дикого типа.
20. Способ по п. 19, в котором мышь дикого типа представляет собой мышь C57BL/6.
21. Культура in vitro, содержащая линию ЭС-клеток XY не относящегося к человеку млекопитающего по любому из пп. 1-20.
22. Способ производства не относящегося к человеку трансгенного млекопитающего, гомозиготного по целевой генетической мутации в поколении F1, включающий:
(a) скрещивание фертильной самки XY F0 не относящегося к человеку млекопитающего, имеющей сниженные уровень и/или активность белка Sry, с когортным клональным сиблингом, полученным из того же ЭС-клеточного клона, самцом XY F0 не относящегося к человеку млекопитающего, причем каждый из фертильной самки XY F0 не относящегося к человеку млекопитающего и самца XY F0 не относящегося к человеку млекопитающего является гетерозиготным по генетической мутации; и
(b) получение потомства не относящегося к человеку млекопитающего F1, которое является гомозиготным по генетической модификации.
23. Способ модификации целевого геномного локуса на Y-хромосоме в клетке, включающий:
(a) обеспечение клетки, содержащей целевой геномный локус на Y-хромосоме, причем целевой геномный локус содержит сайт распознавания для нуклеазного агента;
(b) введение в клетку нацеливающего вектора, содержащего полинуклеотидную вставку, фланкированную первым и вторым гомологичными плечами, соответствующими первому и второму целевым сайтам; и
(c) идентификацию по меньшей мере одной клетки, содержащей в своем геноме полинуклеотидную вставку, интегрированную в целевой геномный локус.
24. Способ по п. 23, в котором этап (b) дополнительно включает введение в клетку нуклеазного агента, причем нуклеазный агент индуцирует одно- или двухцепочечный разрыв на сайте распознавания, при этом первый и второй целевые сайты расположены в достаточной близости к сайту распознавания.
25. Способ по п. 23 или 24, в котором суммарная длина первого гомологичного плеча и второго гомологичного плеча составляет по меньшей мере 4 т. п. н., но менее чем 150 т. п. н.
26. Способ по п. 23 или 24, в котором суммарная длина первого гомологичного плеча и второго гомологичного плеча составляет по меньшей мере 10 т. п. н.
27. Способ по п. 23 или 24, в котором длина первого гомологичного плеча и/или второго гомологичного плеча составляет по меньшей мере 400 п. н., но менее чем 1000 п. н.
28. Способ по п. 27, в котором длина первого гомологичного плеча и/или второго гомологичного плеча составляет от около 700 п. н. до около 800 п. н.
29. Способ по любому из пп. 23-28, в котором клетка представляет собой клетку млекопитающего.
30. Способ по п. 29, в котором клетка млекопитающего представляет собой не относящуюся к человеку клетку.
31. Способ по п. 30, в котором клетка млекопитающего получена от грызуна.
32. Способ по п. 31, в котором грызун представляет собой крысу, мышь или хомяка.
33. Способ по любому из пп. 23-28, в котором клетка представляет собой плюрипотентную клетку.
34. Способ по п. 33, в котором плюрипотентная клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую (ИПС) клетку или не относящуюся к человеку эмбриональную стволовую (ЭС) клетку.
35. Способ по п. 34, в котором плюрипотентная клетка представляет собой эмбриональную стволовую (ЭС) клетку грызуна, ЭС-клетку мыши или ЭС-клетку крысы.
36. Способ по любому из пп. 23-35, в котором нуклеазный агент представляет собой мРНК, кодирующую нуклеазу.
37. Способ по любому из пп. 23-35, в котором нуклеазный агент представляет собой:
(a) нуклеазу с «цинковыми пальцами» (ZFN);
(b) эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN);
(c) мегануклеазу; или
(d) белок (Cas), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), и гидовую РНК (гРНК).
38. Способ по п. 37, в котором нуклеазный агент представляет собой белок Cas и гРНК, причем белок Cas представляет собой Cas9, и при этом гРНК представляет собой:
(a) РНК CRISPR (крРНК), нацеленную на первый сайт распознавания, при этом сайт распознавания непосредственно фланкирован последовательностью мотива, прилежащего к протоспейсеру (РАМ); и
(b) трансактивирующую РНК CRISPR (тракрРНК).
39. Способ по любому из пп. 23-38, в котором длина полинуклеотидной вставки составляет от около 5 т. п. н. до около 200 т. п. н., от около 200 т. п. н. до около 250 т. п. н., от около 250 т. п. н. до около 300 т. п. н., от около 300 т. п. н. до около 350 т. п. н. или от около 350 т. п. н. до около 400 т. п. н.
40. Способ по любому из пп. 23-39, в котором полинуклеотидная вставка содержит условный аллель, полинуклеотид, кодирующий селективный маркер, нуклеиновую кислоту, фланкированную целевыми последовательностями сайт-специфической рекомбинации, или репортерный ген, функционально связанный с промотором, причем репортерный ген кодирует репортерный белок, который выбирают из группы, состоящей из белков LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, усиленного желтого флуоресцентного белка (EYFP), Emerald, усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP), CyPet, голубого флуоресцентного белка (CFP), Cerulean, Т-Sapphire, люциферазы, щелочной фосфатазы и их комбинации.
41. Способ по любому из пп. 23-40, в котором модификация содержит делецию эндогенной нуклеотидной последовательности, нокаут, нокин, точечную мутацию, перестановку доменов, перестановку экзонов, перестановку интронов, перестановку регуляторных последовательностей, перестановку генов или их комбинацию.
42. Способ по п. 41, в котором модификация содержит делецию эндогенной нуклеотидной последовательности; причем:
(А) делеция находится в диапазоне от около 5 т. п. н. до около 10 т. п. н., от около 10 т. п. н. до около 20 т. п. н., от около 20 т. п. н. до около 40 т. п. н., от около 40 т. п. н. до около 60 т. п. н., от около 60 т. п. н. до около 80 т. п. н., от около 80 т. п. н. до около 100 т. п. н., от около 100 т. п. н. до около 150 т. п. н., или от около 150 т. п. н. до около 200 т. п. н., от около 200 т. п. н. до около 300 т. п. н., от около 300 т. п. н. до около 400 т. п. н., от около 400 т. п. н. до около 500 т. п. н., от около 500 т. п. н. до около 1 млн п. н., от около 1 млн п. н. до около 1,5 млн п. н., от около 1,5 млн п. н. до около 2 млн п. н., от около 2 млн п. н. до около 2,5 млн п. н., или от около 2,5 млн п. н. до около 3 млн п. н.; или
(b) делеция составляет по меньшей мере 500 т. п. н.
43. Способ по любому из пп. 23-42, в котором модификация содержит замещение эндогенной нуклеотидной последовательности экзогенной нуклеотидной последовательностью.
44. Способ по п. 43, в котором модификация содержит замещение эндогенной нуклеотидной последовательности гомологичной или ортологичной нуклеотидной последовательностью.
45. Способ по любому из пп. 23-44, в котором целевой геномный локус на Y-хромосоме представляет собой ген Sry, ген Uty, ген Eif2s3y, ген Ddx3y, ген Ubely, ген Tspy, ген Usp9y, ген Zfy1, ген Zfy2 или область, охватывающую гены Kdm5d, Eif2s3y, Tspy, Uty, Ddx3y и Usp9y.
46. Способ по любому из пп. 23-44, в котором целевой геномный локус на Y-хромосоме содержит ген Sry.