СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОПОЛИМЕРОВ МИКРОБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ОБРАЗОВАННЫХ МОНОМЕРАМИ 3-ГИДРОКСИМАСЛЯНОЙ И 4-ГИДРОКСИМАСЛЯНОЙ КИСЛОТ
METHOD OF PRODUCING MICROBIAL COPOLYMERS FORMED BY MONOMERS OF 3-HYDROXYBUTYRIC ACID AND 4-HYDROXYBUTYRIC ACID ACIDS

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения природными штаммами биоразрушаемого сополимерного материала, образованного мономерами 3-гидроксимаслянной и 4-гидроксимасляной кислот [П(3ГБ/4ГБ)], обладающего свойствами эластомеров и относящегося к полигидроксиалканоатам (ПГА). ПГА перспективны для различных сфер применения: в медицине (хирургические элементы, имплантаты, матриксы функционирующих клеток), в фармакологии (для создания долговременных лекарственных систем с контролируемым выходом препаратов, предметов гигиены и санитарии), в качестве разрушаемого.
Сополимер 3-гидроксибутирата и 4-гидроксибутирата является одним из наиболее перспективных представителей семейства природных разрушаемых полимеров полигидроксиалканоатов, синтезируемых микроорганизмами. В качестве продуцентов этого сополимера используют рекомбинантные и природные штаммы; для их синтеза питательная среда содержит основной источник углеродного субстрата и углеродные субстраты-предшественники, необходимые для синтеза мономеров 4-гидроксибутирата, применение которых, как правило, ингибирует рост бактерий и общий выход сополимера в целом. В зависимости от физиолого-биохимических особенностей штамма продуцента и условий культивирования выходы сополимера и соотношение в нем мономеров 3-гидроксибутирата (3 ГБ) и 4-гидроксибутирата (4ГБ) различно.
Достижение высоких выходов технологичных сополимеров П(3ГБ/4ГБ) с высоким содержанием мономеров 4ГБ - сложная технологическая задача.
В патентной литературе описаны способы получения сополимеров П(3ГБ/4ГБ) рекомбинантными штаммами.
Известен способ синтеза П(3ГБ/4ГБ) рекомбинантным штаммом E. Coli MBX769, несущим плазмиду Pfsl6, что обеспечило экспрессию Clostridiumkluyveri 4-гидроксибутирил-КоА-трансферазы, которые культивировали в 250 колбах при 37°C в 100 мл среды, содержащей 100 мкг/мл ампициллина натрия. После 16 ч культивирования клетки центрифугировали, затем ресуспендировали в 100 мл среды, содержащей 5 г/л 4-гидроксибутирата натрия, 2 г/л глюкозы. Клетки инкубировали в этой среде в течение 3 дней с перемешиванием при 200 оборотах в минуту при 32°C. Содержание сополимера в клетках максимально составило до 52,6%, содержание в нем мономеров 4ГБ 36,6 мол. % [Патент WO 1999061624 A2; 1999].
Известен способ синтеза сополимера П(3ГБ/4ГБ) рекомбинантным штаммом Е. coli с плазмидой pJM9238, несущей ген ПГА-синтезы из Ralstoniaeutropha и плазмидой pCKS, несущей ген сукцинатного метаболического пути из Clostridiumkluyveri. При культивировании данного продуцента содержание сополимера составляет 46%, при этом содержание мономеров 4ГБ в сополимере низкое (1,5 мол. %) при крайне низком урожае биомассы бактерий (0,52 г/л). Используя штамм E.coli CT101 с трансформированными плазмидами pJM9238 и pCKS, удалось увеличить содержание мономера 4ГБ до 5 мол. % [US патент 006117658 А, опубл. 12.09.2000].
Известен способ синтеза П(3ГБ/4ГБ) в культуре рекомбинантного штамма Escherichiacoli JM109SG, обеспечивающий содержание 4ГБ в сополимере до 22,61 мол. %. При этом выход биомассы и содержание сополимера составили 9,70 г/л и 65% соответственно [US патент 2012/0214213 A1, опубл. Aug. 23, 2012].
Известен способ синтеза сополимера П(ЗГБ/4ГБ) рекомбинантным штаммом Escherichiacoli с геном ПГА-синтезы из R. eutropha. В качестве субстрата-предшественника в среду добавляют натриевую соль 4-гидроксимасляной кислоты. Содержание мономеров 4ГБ детектировано ЯМ, оно составило в сополимере 20 мол. % [US патент, опубл. 2010/0093043 A1, Apr. 15,2010].
Недостатками данных способов являются низкое содержание в сополимерах П(3Г/4ГБ) мономеров 4ГБ; недостаточно высокие общие выходы сополимера, а также то, что в качестве продуцентов сополимеров используют генетически модифицированные штаммы, которые требуют для роста специализированных дорогостоящих сред, а также характеризуются нестабильностью в процессе культивирования, что может сопровождаться снижением или утратой способности синтезировать данные сополимеры.
Известны способы синтеза сополимеров П(3ГБ/4ГБ) природными штаммами.
Известен способ синтеза сополимеров 3ГБ/4ГБ природным штаммом Cupriavidus necator DSM 545 при использовании в качестве основного источника углерода глицериновых отходов производства биодизеля, в качестве субстрата-предшественника гамма-бутиролактона. Манипулируя концентрацией растворенного кислорода и временем выращивания содержание в сополимере мономеров 4ГБ варьируют от 11,4 до 21,5 мол. % (J. Cavalheiro, R. Raposo, М. deAlmeida, et al. Effect of cultivation parameters on the production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-4-hydroxybutyrate-3 -hydroxyvalerate) by Cupriavidusnecator using waste glycerol. Bioresource Technology 111 (2012) 391-397).
Известны способы синтеза сополимеров П(ЗГБ/4ГБ) с различным содержанием мономеров 4ГБ в зависимости от параметров культивирования природным штаммом Cupriavidussp.USMAA1020. Максимальное содержание в сополимере мономеров 4ГБ (39 мол. %) получено при низких общих выходах сополимера (37%) и урожае биомассы клеток. При одновременном добавлении в среду нескольких субстратов-предшественников (y-бутиролактон и 1,6-гександиол) удалось увеличить содержание мономеров 4ГБ до 70 мол. %, однако из-за значительного ингибирования роста бактерий субстратами-предшественниками значительно снижается общий выход биомассы клеток и сополимера, а также происходит резкое (на порядок) снижение молекулярной массы сополимера (от 369,3 до 34,0 кДа), что делает его непригодным для переработки в изделия (К.-Н. Huong, A. YahyaandA. Amirul.Pronounced synergistic influence of mixed substrate cultivation on single step copolymer P(3HB-co-4HB) biosynthesis with a wide range of 4HB monomer composition. J. ChemTechnolBiotechnol89, 1023-1029, 2014).
Известен способ синтеза сополимеров П(3ГБ/4ГБ) природным штаммом Ralstonia eutropha КСТС 2662 с использованием в качестве основного источника углерода соевого масла и субстрата-предшественника гамма-бутиролактона. Содержание мономеров 4ГБ в сополимере крайне низкое (чуть более 2 мол. %). При увеличение концентрации гамма-бутиролактона в среде содержание мономеров 4ГБ в сополимере возросло до 9,4 мол. %, однако выход биомассы клеток и сополимера снизились (D. ParkandB. Kim.Production of poly(3-hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) by Ralstoniaeutropha from soybean oil. New Biotechnology 2011, 28, 719-24).
Недостатки вышеперечисленных способов получения сополимеров П(3ГБ/4ГБ) на основе природных штаммов заключаются в высокой чувствительности к субстратам-предшественникам, необходимым для синтеза мономеров 4ГБ, что сопровождается ингибированием бактерий и невысоким содержанием мономеров 4ГБ в сополимере. Попытки повышения содержания 4ГБ в сополимере за счет увеличения концентрации в ростовой среде субстратов-предшественников, если и приводило к повышению содержания мономеров 4ГБ, то, как правило, сопровождалось снижением продуктивности процесса, - падению конечной концентрации биомассы клеток, общих выходах сополимера, снижению его молекулярной массы.
Известен способ получения полигидроксиалканоатов, заключающийся в культивировании природного штамма-продуцента Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646, обладающего повышенной устойчивостью к углеродным субстратам-предшественникам и способностью синтезировать сополимерные полимеры, содержащие в своем составе, помимо мономеров 3-гидроксибутирата, другие мономеры (3-гидроксивалерата, 3-гидроксигексаноата и 4-гидроксибутирата). Штамм выращивают в условиях аэрации и перемешивания при лимите азота на жидкой солевой среде, содержащей основной С-субстрат и субстрат-предшественник [Патент РФ №2439143, МПК C12P 7/62, опубл. 10.01.2012 г]. С помощью этого штамма разработаны способы синтеза сополимерных двух- и трехкомпонентных ПГА, образованных мономерами 3-гидроксибутирата, 4-гидрокисбутирата, 3-гидрокисвалерата, 3-гидроксигексаноата.
Недостатки данного способа заключаются в невысоком содержании мономеров 4-гидроксибутирата в сополимере П(3ГБ/4ГБ), максимально 28,5 мол. %; снижении средневесовой молекулярной массы у ряда образцов сополимеров, а также в использовании в качестве основного углеродного ростового субстрата cахаров или масляной кислоты, на стоимость которых приходится до 45-50% от всех затрат. Стоимость глюкозы 90-100 руб./кг, фруктозы 120-150 руб./кг, масляной кислоты 1500-2758 руб./кг. Замена гетеротрофных субстратов (сахаров, масляной кислоты) автотрофными субстратами - смесь газов: CO2+O2+H2 или синтез-газ удлиняет время культивирования и существенно усложняет техническое оформление процесса и технологию в связи с тем, что эти субстраты взрывоопасны.
Наиболее близким к заявляемому является способ получения сополимеров П(3ГБ/4ГБ) при выращивание природного штамма Ralstonia eutropha А-04. Штамм способен для роста и синтеза гомополимера 3-гидкроксибутирата усваивать сахара (глюкозу, фруктозу) и масляную кислоту; для синтеза П(3ГБ/4ГБ) - в качестве предшественников-мономеров 4ГБ использовать гамма-масляную кислоту, гамма-бутиролактон, 1,4 бутандиол. Для синтеза П(3ГБ/4ГБ) на стадии получения посевного материала используют богатую ростовую среду, содержащую, помимо минеральных элементов и источника азота (сульфата аммония), 10 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л полипептона, 5 г/л мясного экстракта. При выращивании штамма в течение 96 ч на среде с фруктозой (20 г/л) и различными субстратами-предшественниками при лимитировании роста бактерий по азоту самое высокое содержание мономеров 4ГБ составило 52 мол. % при низком общем выходе сополимера (20%) на среде с гамма-масляной кислотой. При использовании гамма-бутиролактона и 1,4 бутандиола содержание мономеров 4ГБ было ниже (12-20 мол. %), общий выход сополимера 43-47%. При оптимизации процесса за счет варьирования соотношения в ростовой среде гамма-масляной кислоты и сульфата аммония углерод/азот (C/N) удалось повысить содержание в сополимере мономеров 4ГБ до 70 мол. %, но при этом произошло снижение общего выхода сополимера до 30% (S. Chanprateep, Y. Katakura, S. Visetkoop, et al. Characterization of new isolated Ralstonia eutropha strain A-04 and kinetic study of biodegradable copolyester poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) production. J Ind Microbiol Biotechnol (2008). - Vol.35. - P. 1205-1215).
Недостаток способа - невысокое содержание мономеров 4ГБ в сополимере при низком общем выходе сополимера П(3ГБ/4ГБ), а также длительность процесса выращивания бактерий и использование на стадии получения посевного материала сложной и дорогостоящей ростовой среды. Попытки повышения содержания 4ГБ в сополимере за счет увеличения изменения соотношения (C/N) и повышения концентрации в ростовой среде субстрата-предшественника приводит к падению конечной концентрации биомассы клеток и общих выходов сополимера.
Задача изобретения - разработка способа получения биоразрушаемых сополимеров 3-гидроксимаслянной и 4-гидроксимасляной кислот с низкой степенью кристалличности, повышенной эластичностью с высоким общим выходом сополимера и высоким содержанием мономеров 4ГБ в сополимере с использованием природных штаммов.
Техническим результатом изобретения является разработка способа получения сополимеров 3-гидроксимаслянной и 4-гидроксимасляной кислот с низкой степенью кристалличности, повышенной эластичностью, высоким содержанием мономера 4ГБ в сополимере, высоким выходом сополимера и устойчивой средневесовой молекулярной массой с использованием природных штаммов
Способ позволяет расширить сырьевую базу, снизить затраты на получение сополимера П(3ГБ/4ГБ) путем осуществления способа на более доступном и дешевом сырье по сравнению с сахарами или масляной кислотой.
Указанный технический результат достигается тем, что способ получения сополимеров П(3ГБ/4ГБ) микробного происхождения, способных к деструкции, реализуется с использованием природных штаммов Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 или Ralstonia eutropha ВКПМ В8562 на ростовой среде, содержащей в качестве основного источника углерода олеиновую кислоту в сочетании с глицерином или олеиновую кислоту в сочетании с подсолнечным маслом, или глицерин в сочетании с подсолнечным маслом, при избытке углеродного субстрата на минеральной среде при одновременном лимитировании роста бактерий по азоту и сере, максимизирующих аккумуляцию в бактериях полимеров, в качестве субстрата-предшественника используют 1,4-бутандиол в сочетании с хлормасляной кислотой. Введение субстрата-предшественника не ингибирует роста бактерий, для этого 1,4 бутандиол и хлормасляную кислоту вносят однократно, или дважды, или трижды, при концентрации в культуре 1,4 бутандиола от 1, до 2,8 г/л и хлормасляной кислоты от 1,5 до 2,0 г/л при общем времени культивирования от 45 до 50 ч.
Природный штамм Ralstonia eutropha ВКПМ В8562 ранее использовался  как продуцент высококристалличного гомополимера 3-гидроксимасляной кислоты (ПЗГБ) (Волова Т.Г. с соавт. Физиолого-биохимические свойства и способность к синтезу полиоксиалканоатов у глюкозоусваивающего штамма водородных бактерий Ralstonia eutropha В8562. // Микробиология. - 2005, - том 74, №6, - С. 788-794). В качестве продуцента сополимеров 3ГБ/4ГБ его применение не известно.
Использование в качестве основного источника углерода в ростовой среде олеиновой кислоты в сочетании с глицерином или олеиновой кислоты в сочетании с подсолнечным маслом, или глицерина в сочетании с подсолнечным маслом, а в качестве субстрата-предшественника 1,4-бутандиола в сочетании с хлормасляной кислотой, в концентрации, не ингибирующий роста бактерий, при одновременном лимитировании роста бактерий по азоту и сере как фактора, стимулирующего синтез сополимера, обеспечивает высокое содержание мономера 4ГБ (выше 50 мол. %), высокий выход сополимера (не менее 80% от веса сухого вещества клеток) без снижения средневесовой молекулярной массы.
Высокое содержание мономера 4ГБ в сополимере П(3ГБ/4ГБ) обеспечивает получение образцов сополимера с сниженной степенью кристалличности (ниже 30%) при повышении эластичности, показателем которой служит удлинение при разрыве, которое измеряется с применением разрывной машины, что обеспечивает получение прочных и эластичных изделий.
Сущность изобретения поясняется чертежами.
1
На фиг. 1 представлена структурная формула и Н-ЯМР спектр сополимера 3-гидрокисмасляной и 4-гидроксимасляной кислот П(3ГБ/4ГБ).
На фиг. 2 представлена ионная хроматограмма сополимера П(3ГБ/4ГБ) с временами удерживания: метил-3-гидроксибутират (3ГБ) - 9,113; метил-4-гидроксибутират (4ГБ) - 11,251.
На фиг. 3 представлены масс-спектры мономера 3ГБ, образующего сополимер П(3ГБ/4ГБ).
На фиг. 4 представлены масс-спектры мономера 4ГБ, образующего сополимер П(3ГБ/4ГБ).
На фиг. 5 представлены фото (а) и РЭМ снимки (б) сополимера П(3ГБ/4ГБ) в виде наливных пленок.
На фиг. 6. представлены фото (а) и РЭМ снимки (б) сополимера П(3ГБ/4ГБ) в виде мембраны, образованной неориентированными ультратонкими волокнами.
На фиг. 7. представлены фото (а) и РЭМ снимки (б) сополимера П(3ГБ/4ГБ) в виде мембраны, образованной ориентированными ультратонкими волокнами.
Сущность изобретения заключается в следующем: синтез сополимеров [П(3ГБ/4ГБ)], образованных мономерами 3-гидроксибутирата и 4-гидроксибутирата, осуществляют на опытном биотехнологическом производстве полимеров в Сибирском федеральном университете (Акт готовности производства от 17.11.2014 ФБУ «Государственный региональный центр стандартизации, метрологии и испытаний в Красноярском крае») в соответствии с Техническими условиями ТУ 9390-00902067876-2015. Культуру штамма Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 или Ralstonia eutropha ВКПМ В8562 выращивают в периодическом режиме на первом этапе на среде Шлегеля с использованием в качестве основного ростового субстрата сочетания олеиновой кислоты и глицерина или сочетания олеиновой кислоты с подсолнечным маслом, или сочетания глицерина с подсолнечным маслом, при избытке углеродного субстрата на минеральной среде с одновременным лимитированным содержанием азота и серы, максимизирующими аккумуляцию сополимера.
2
2
4
2
Лимитирование роста бактерий по азоту и сере осуществляют дозированной подачей растворов этих элементов в культуру бактерий раздельными потоками. На первом этапе процесса культивирования бактерий растворы источника азота [CO(NH)] и источника серы (MgSO·HO) подают в культуру в заданной концентрации, составляющей 50% от физиологической потребности бактерий исследуемых штаммов в этих элементах, обеспечивающей концентрацию азота и серы в культуре соответственно 0,5 и 0,1 г/л, с помощью перистальтического насоса-дозатора Ismatec Flowmaster FMT300 «IDEX Health & Science SA» (Швейцария). Текущие концентрации азота и серы в культуре на заданном уровне могут быть обеспечены варьированием концентраций этих элементов в подаваемых растворах в широких пределах (от единиц до десятков г/л), а также изменением скорости дозирования подаваемых в культуру растворов этих элементов (от единиц до десятков мл/час). Для подачи субстратов в культуру бактерии выращивают в колбах, имеющих отростки. Для образования мономеров 4ГБ и синтеза сополимеров П(3ГБ/4ГБ) в состав среды вносят дополнительный углеродный субстрат-предшественник при одновременной подаче в культуру бактерий двумя потоками 1,4 бутандиола и хлормасляной кислоты в концентрации, не ингибирующей рост используемых штаммов. На втором этапе культивирование штамма продуцента процесс продолжают в среде, не содержащей азота и серы, путем прекращения подачи этих элементов в культуру выключением насоса-дозатора при избытке основного углеродного субстрата.
В зависимости от дозы подаваемого субстрата-предшественника и последующего после добавки времени культивирования штамма синтезируется сополимер П(3ГБ/4ГБ) с высокими выходами, не менее 80% от сухого вещества клетки, с высоким содержанием мономеров 4ГБ, от 53 до 87 мол. %. без изменения молекулярного веса образцов по мере увеличения содержания мономеров 4ГБ.
1
3
Концентрацию сополимера П(3ГБ/4ГБ) в клеточной биомассе и состав мономеров в нем определяют после предварительного метанолиза проб на "AgilentTechnologies" 7890А (США). Н-ЯМР спектры растворов полимеров в CDCl снимали с использованием ЯМР-спектрометра AvanceIII 600 "Bruker" (Германия). Выделение полимера из биомассы клеток проводят дихлорметаном. Полученный экстракт после его концентрирования на роторном испарителе RotavaporR-210 (Швейцария) осаждают изопропанолом. Для получения высокоочищенных образцов процедуру перерастворения и осаждения сополимера проводят несколько раз. Полученный сополимер высушивают при комнатной температуре в боксе-ламинаре и анализируют физико-химические характеристики. Молекулярную массу и молекулярно-массовое распределение образцов исследовали с использованием гельпроникающей хроматографии (хроматограф "AgilentTechnologies" 1260 Infinity, США) относительно полистироловых стандартов ("Fluka", Швейцария, Германия). Рентгеноструктурный анализ и определение степени кристалличности образцов выполнены на рентгеноспектрометре D8 ADVANCE фирмы «Bruker» (Германия) (графитовый монохроматор на отраженном пучке). Для определения температурных характеристик сополимера проводили комплексный термический анализ образцов с использованием синхронного термоанализатора STA 449 Jupiter фирмы NETZCSH (Германия), сочетающего одновременное измерение изменений массы (термогравиметрия) и тепловых потоков (дифференциальная сканирующая калориметрия).
Получение сополимеров 3ГБ/4ГБ с использованием природных штаммов Cupriavidus eutrophus В-10646 или Ralstonia eutropha ВКПМ В8562 и их свойства иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1.
2
4
2
2
4
4
2
3
6
5
7
2
2
2
3
3
2
2
4
2
2
2
4
2
4
2
2
2
2
4
2
в
Музейную культуру штамма-продуцента Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646, хранящуюся на агаризованной среде в при 5°C, суспендируют в жидкой солевой среде, содержащей (г/л): олеиновую кислоту - 10 г/л, NaHPO·HO - 9.1, KHPO - 1.5; MgSO·HO - 0.2, FeCHO·7HO - 0.25, CO(NH) - 1.0. Стандартный раствор микроэлементов по Хоагланду из расчета 3 мл на 1 л питательной среды, который содержит: НВО - 0.228, СоСе·6НО - 0.030, CuSO·5HO - 0.008, МnСе·4НO - 0.008, ZnSO·7H O - 0.176, NaMoO·2HO - 0.050, NiCe - 0.008 (г/л) и раствор железа лимоннокислого 5/г/л из расчета 5 мл раствора на 1 л среды. Культивирование штамма-продуцента проводят в периодическом режиме в стеклянных колбах объемом 1 л при коэффициенте заполнения 0,5 с использованием термостатируемого шейкера-инкубатора «Incubator ShakerInnova серии 44» «New Brunswick Scientific)) (США). Культивирование проводят в течение 15-18 ч при 30°С и pH 7.0. Полученную культуру используют в качестве инокулята для последующего выращивания бактерий в режиме синтеза полимеров в периодической двустадийной культуре, используя ростовую среду, описанную выше, но не содержащую источников азота и серы. Растворы источника азота (CO(NH)) и серы (MgSO·HO) подаются в культуру в заданной концентрации. Для выращивания бактерий используют колбы объемом 1-2 л, оборудованные отростками, через которые в культуру осуществляют подачу необходимых субстратов. На первом этапе синтез полимеров стимулируется лимитирующей концентрацией азота и серы (50% от физиологической потребности культуры в концентрации 0,5 и 0,1 г/л соответственно), растворы которых подают в культуру раздельными потоками с помощью перистальтического насоса-дозатора; источником углерода служат олеиновая кислота и глицерин, которые одновременно раздельными потоками подают в культуру при текущей концентрации каждого, не ниже 5 г/л. На втором этапе процесс проводят в среде, не содержащей азота и серы (подачу этих элементов в культуру прекращают выключением насоса-дозатора) при избытке основного углеродного субстрата. Коэффициент заполнения стеклянных колб объемом 1-2 л составляет от 0,3 до 0,5. Выращивание бактерий проводят при 30°C и pH 7.0 при текущих концентрациях олеиновой кислоты и глицерина не ниже 5 г/л для каждого и лимитирующих рост бактерий концентрациях азота и  серы соответственно 0,5 и 0,1 г/л. На первом этапе процесса через 15 ч от начала культивирования с помощью насосов дозаторов в культуру подают одновременно субстраты-предшественники: 1,4-бутандиол до концентрации в культуре 2,0 г/л и хлормасляную кислоту до концентрации 1,5 г/л; культивирование бактерий продолжают еще 10 ч. Общее время культивирования на первом этапе составляет 25 ч. После отключения подачи азота и серы в культуру культивирование продолжают 20 ч при подаче в культуру олеиновой кислоты и глицерина. Культивирования штамма-продуцента составляет 45 ч при общем выходе полимера 87% (к весу сухого вещества клетки). Это сопоставимо с показателями при использовании сахаров (фруктоза или глюкоза). Состав сополимера: 3-гидроксибутират - 47,0; 4-гидроксибутират - 53,0 мол. %. Физико-химические свойства сополимера П(3ГБ/4ГБ) представлены в таблице 1. Степень кристалличности образца составила 26%; температура плавления и термической деградации 171 и 298°C; средневесовая молекулярная масса (М) 790 кДа.
Пример 2.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, при аналогичных концентрациях основного источника углерода, концентраций азота и серы. При этом концентрация вносимого субстрата-предшественника 1,4-бутандиола выше - 2,8 г/л, хлормасляной кислоты - аналогично Примеру 1. Время культивирования штамма после подачи субстратов предшественников 12 ч; общее время культивирования 47 ч. Выход сополимера достиг 90%. Состав сополимера: 3-гидроксибутират - 38,0; 4-гидроксибутират - 62,0 мол. %. Степень кристалличности образца составила 25%; средневесовая молекулярная масса 820 кДа; температура плавления и термической деградации - без существенных изменений (таблица 1).
Пример 3.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, в качестве основного источника углерода используют олеиновую кислоту и подсолнечное масло при концентрациях не ниже 5 г/л для каждого. Субстраты-предшественники: 1,4-бутандиол и хлормасляную кислоту вносят в культуру дважды с интервалом 5 ч при текущей концентрации после добавки в культуре каждого по 2,0 г/л. Общее время культивирования 45 ч. Выход сополимера 86%; состав мономеров: 3-гидроксибутират - 23,2; 4-гидроксибутират - 76,8 мол. %. Степень кристалличности образца сополимера 20%, средневесовая молекулярная масса 810 кДа; температура плавления и термической деградации - без существенных изменений.
Пример 4.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 3, в качестве основного источника углерода используют глицерин и подсолнечное масло при концентрациях не ниже 5 г/л для каждого. Субстраты-предшественники вносят в культуру три раза в концентрации для каждого по 1,5 г/л с интервалом 5 ч. Время культивирования штамма после подачи субстратов предшественников составляет 15 ч; общее время культивировании 50 ч. Выход сополимера 89%; состав мономеров: 3-гидроксибутират - 13,0; 4-гидроксибутират - 87,0 мол. %. Степень кристалличности 16%; средневесовая молекулярная масса 798 к Да; температура плавления и термической деградации - без существенных изменений (таблица 1).
Пример 5.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 2, в качестве продуцента используют природный штамм Ralstonia eutropha ВКПМ В8562; состав и концентрации основного ростового субстрата и субстратов предшественников, время культивирования штамма - аналогичные. Выход сополимера достиг 89%. Состав сополимера: 3-гидроксибутират - 40,0; 4-гидроксибутират - 60,0 мол. %. Степень кристалличности образца составила 24%; средневесовая молекулярная масса 843 кДа; температура плавления и термической деградации 170 и 284°C (таблица 1).
Пример 6.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 3, в качестве продуцента используют природный штамм Ralstonia eutropha ВКПМ В8562; состав и концентрации основного ростового субстрата и субстратов предшественников, время культивирования штамма - аналогично примеру 3. Выход сополимера 90%; состав мономеров: 3-гидроксибутират - 22,0; 4-гидроксибутират - 78,0 мол. %. Степень кристалличности образца сополимера 12%, средневесовая молекулярная масса 808 кДа; температура плавления и термической деградации, без существенных изменений (таблица 1).
Пример 7.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 4, в качестве продуцента используют природный штамм Ralstonia eutropha ВКПМ В8562; состав и концентрации основного ростового субстрата и субстратов предшественников, время культивирования штамма - аналогично примеру 4. Выход сополимера 87%; состав мономеров: 3-гидроксибутират - 13,2; 4-гидроксибутират - 86,8 мол. %. Степень кристалличности 8%; средневесовая молекулярная масса 790 кДа; температура плавления и термической деградации - без существенных изменений (таблица 1).
Для регистрации физико-механических характеристик сополимеров П(3ГБ/4ГБ) с различным содержанием мономеров 4ГБ получены полимерные изделия: а) в виде гладких пленок методом полива разогретого  до 35°C 1,5% раствора сополимера в дихлорметане на обезжиренную поверхность предварительно нагретых до такой же температуры чашек Петри, которые выдерживали в боксе-ламинаре в течение 2-х суток, далее досушивали в диссикаторе «Labconco» (США) до полного испарения растворителя, и б) мембран, образованных ориентированными или неориентированными ультратонкими волокнами методом электростатического формования растворов П(3ГБ/4ГБ) в дихлорметане на автоматизированной установке Nanon 01А (МЕСС Inc., Япония).
Микроструктуру полимерных изделий анализировали растровой электронной микроскопией с использованием микроскопа JEM-100C с растровой приставкой EM-ASID-4, Япония) и ТМ-3000 (Hitachi НТ Corporation, Япония) при напряжении 5 кВ. Предварительно на образцы напыляют золото (10 мА, 40 сек) с помощью установки вакуумного напыления Emitech K575X (Великобритания). Физико-механические свойства образцов изучали с использованием универсальной испытательной машины Instron 5565, 5KN (Instron, Великобритания) при комнатной температуре. Базовая (начальная) длина образцов - от 20,0 до 50,0 мм; скорость растяжения 3 мм/мин. Измеряли абсолютную и относительную разрывную нагрузку, модуль Юнга, относительное разрывное удлинение.
Соотношение мономеров существенно влияло на физико-механические свойства изделий, - с увеличением содержания мономеров 4ГБ в сополимере П(3ГБ/4ГБ) возрастала эластичность образцов и механическая прочность. Физико-механические свойства образца сополимера, с содержанием 4ГБ, равным 53 мол. %, следующие: для пленки удлинение при разрыве, напряжение при разрыве и модуль Юнга составили 102,0%, 17,90 и 74,08 МПа и соответственно 121,43%, 16,90 и 93,76 МПа для неориентированной мембраны и 140,37%, 20,26 и 101,06 МПа для ориентированной мембраны - (таблица 2). При увеличение содержания мономеров 4ГБ до 62 мол. % напряжение при разрыве и модуль Юнга у пленки и мембран незначительно возросли; удлинение при разрыве  увеличилось у пленки до 250,38%; до 274,32% у неориентированной и 298,60% у ориентированной мембраны. При содержании мономеров 4ГБ 76,8 мол. % удлинение при разрыве возросло у пленки и неориентированной и ориентированной мембран соответственно до 298,22; 368,95; 490,32%. При максимально полученном содержании мономеров 4ГБ в сополимере удлинение при разрыве составило 498,43; 508;43; 660;16% соответственно для пленки, неориентированной и ориентированной мембран.
В таблице 1 приведены состав и физико-химические свойства сополимеров, полученных по примерам 1-7.
Физико-механические свойства сополимеров П(3ГБ/4ГБ) с различным соотношением мономеров 3ГБ и 4ГБ приведены в таблице 2.
Использование природного штамма Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 или природного штамма Ralstoniae utropha ВКПМ В8562 в качестве продуцента; азота и серы как фактора, стимулирующего синтез сополимеров, в качестве основного ростового субстрата олеиновой кислоты в сочетании с глицерином, или подсолнечного масла в сочетании с олеиновой кислотой, или подсолнечного масля в сочетание с глицерином и в качестве субстратов-предшественников 1,4 бутандиола в сочетании с хлормасляной кислотой при варьирования концентрации последних без лимитирования роста бактерий обеспечивает синтез сополимеров П(3ГБ/4ГБ) с высокими выходами (86-90%) с различным соотношением мономеров и с повышенным содержанием мономеров 4ГБ (свыше 50 мол. %, максимально до 87 мол. %), характеризующихся стабильными показателями молекулярной массы и термических характеристик, сниженной степенью кристалличности и повышенными механической прочностью и эластичностью.
Получение сополимеров П(3ГБ/4ГБ) с повышенным содержанием 4ГБ обеспечивает получение более технологичных эластичных изделий, расширение сырьевой базы и снижение затрат на получение сополимера с высоким выходом со стабильными значениями молекулярной массы.