НОВЫЕ ПЕПТИДЫ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
NOVEL PEPTIDES AND METHODS FOR PRODUCTION THEREOF

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к областям биологических наук и питания, кормов или фармацевтической индустрии. В частности, изобретение относится к новым пептидам, белкам, ворсинчатым структурам, полинуклеотидам, а также векторам, клеткам-хозяевам, продуктам и фармацевтическим композициям, содержащим полинуклеотиды, пептиды, белки или ворсинчатые структуры. Изобретение также относится к кластерам генов и антителам. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам получения пептидов, белков или ворсинчатых структур или получения продуктов, содержащих пептиды, белки или ворсинчатые структуры. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам лечения, а также применениям и способам скрининга бактериальных штаммов для снижения или подавления адгезии патогенных бактерий, стимуляции адгезии бактериальных клеток к слизи и/или эпителию и/или для модуляции иммунного ответа у индивидуума. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам выявления пробиотических бактериальных штаммов или патогенных штаммов для идентификации и/или ингибирования.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
E. coli
Neisseria
Pseudomonas
E. coli
Инвазивная адгезия к тканям хозяина бактериальных патогенных микроорганизмов часто облегчается удлиненными волосовидными белковыми нитями, называемыми ворсинками или фимбриями, которые выступают наружу от клеточной поверхности микроорганизма. У грамотрицательных патогенных бактерий роль ворсинок в качестве средств колонизации в патогенезе является общепризнанной и общий механизм сборки ворсинок за пятьдесят лет исследований точно определен. Наиболее структурно охарактеризованными ворсинками грамотрицательных бактерий являются форма I типа, выявляемая, например, у энтеропатогенных , и форма IV типа, выявляемая, например, у видов  и , а также in . Как правило, ворсинки грамотрицательных бактерий являются длинными (от 1 до 4 мкм в длину) и тонкими (от 5 до 8 нм в диаметре), а также демонстрируют структурные свойства гибкости и прочности. Эти ворсинки в основном состоят из ряда нековалентно связанных нескольких белковых субъединиц, сборка которых зависит от специфических белков-шаперонов, но не зависит ни от какой ферментативной активности. Часто на верху ворсинок расположен белок с адгезивными свойствами. В основном полагают, что промежуточная протяженность белковых субъединиц от поверхности микроорганизма обеспечивает беспрепятственный контакт между адгезивным белком на верху и соответствующими рецепторными участками клетки-хозяина, которые потенциально представлены компонентами внеклеточного матрикса (ECM) или конкретными углеводными группами гликопротеинов и гликолипидов (Scott J.R. and Zähner D, 2006, Mol. Microbiol. 62, 320-330; Telford, J.L. et al., 2006, Nat. Rev. Microbiol. 4, 509-519).
Corynebacterium renale
Streptococcus pyogenes
Streptococcus agalactiae
Streptococcus pneumoniae
Присутствие ворсинкообразных структур у грамположительных бактерий фактически впервые наблюдали в поздние 1960 годы при электронной микроскопии  (Yanagawa, R. et al., 1968, Jpn. J. Vet. Res. 16, 31-37), и в последующие годы ворсинки выявлены у нескольких других грамположительных бактериальных видов, включая самое недавнее открытие ворсинок у трех основных вызывающих заболевания у людей стрептококковых патогенных микроорганизмов, т.е. ,  и  (Telford, J.L. et al., 2006, Nat. Rev. Microbiol. 4, 509-519). Наиболее подробные характеристические исследования ворсинок грамположительных микроорганизмов проводили на коринебактериальных, стрептококковых и бациллярных патогенных микроорганизмах.
in vivo
Corynebacterium diphtheriae
C. diphtheriae
spaA
spaB
spaC
В отличие от грамотрицательных бактерий ворсинки у грамположительных бактерий являются более тонкими в диаметре (от 2 до 3 нм) и более трудно визуально различимы, что также дает возможность предположить, почему у многих видов грамположительных бактерий наличие этих ворсинок могло остаться невыявленным (Kang, H.J. et al., 2007, Science 318, 1625-1628). В настоящее время наиболее полное описание процесса сборки ворсинок, которое также в основном характерно для всех ворсинок грамположительных микроорганизмов, сделано при характеристических исследованиях  биогенеза у  (Ton-That, H. and Schneewind, O. 2004, Trends Microbiol. 12, 228-234). Структурно прототипические ворсинки выглядят как полимеры, состоящие из ковалентно связанных поперечными связями белковых субъединиц (называемых пилинами), которые также ковалентно прикреплены ну основе пептидогликанового компонента клеточной стенки, где оба вида этих ковалентных связей ферментативно зависят от катализа различными мембраносвязанными транспептидазами семейства сортаз, т.е. специфичными к пилинам и конститутивными сортазами, соответственно (Mandlik, A. et al., 2008, Trends Microbiol. 16, 33-40). Ворсинка грамположительной бактерии, как правило, состоит из трех пилиновых субъединиц, и в случае  белки (или кодирующие их гены) называются SpaA () (опосредованная сортазой сборка пилина) для основной пилиновой субъединицы, которая целиком формирует ствол или каркас ворсинки, SpaB () для дополнительной второстепенной пилиновой субъединицы и SpaC () для другой второстепенной пилиновой субъединицы с адгезивными свойствами, располагающейся на верху ворсинки (фиг.1). Гены, кодирующие эти три пилиновые субъединицы расположены в пределах одних и тех же локусов в виде кластера генов пилинов, наряду по меньшей мере с одним геном, кодирующим специфичную к пилинам сортазу в непосредственной близости. Также гены в пределах пилинового кластера на обоих концах часто фланкированы мобильными генетическими элементами, позволяющими сделать предположение о происхождении посредством горизонтального переноса генов. Транскрипция всех этих генов происходит в одинаковом направление и свидетельствует о регуляторном контроле оперона (Scott J.R. and Zähner D, 2006, Mol. Microbiol. 62, 320-330).
Пересмотренная модель общего процесса сборки ворсинок грамположительных бактерий, который зависит от нескольких различных консервативных мотивов и доменов в первичной последовательности каждой пилиновой субъединицы включает четыре основные стадии (Mandlik, A. et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 14147-14152; Telford, J.L. et al., 2006, Nat. Rev. Microbiol. 4, 509-519) (фиг.1). На первой стадии через мембрану бактериальных клеток посредством зависимого от Sec пути секретируются пилиновые белки, каждый из которых содержит N-концевой сигнальный пептид, а затем они удерживаются в мембране клетки вследствие наличия C-концевого трансмембранного домена, состоящего из гидрофобной области приблизительно из 20 остатков и положительно заряженного хвоста.
На второй стадии процесса сборки для зависимого от сортазы расщепления прикрепленных к клеточной мембране пилиновых белков становится доступным сигнал сортировки клеточной стенки (CWSS), предпочтительно мотив LPXTG, который также непосредственно предшествует трансмембранному домену. Специфичная к пилинам сортаза расщепляет этот мотив из пяти остатков между остатками треонина (T) и глицина (G) и формирует промежуточное соединение ацил-фермент, включающее ковалентную тиоэфирную связь между карбоксильной группой остатка треонина и цистеинилтиолом, находящимся в каталитическом кармане сортазы.
Третья стадия представляет собой полимеризацию пилиновых субъединиц посредством образования изопептидных связей и включает расщепление тиоэфирной связи и высвобождение сортазы из пилиновой субъединицы посредством нуклеофильной атаки ε-аминогруппы боковой цепи остатка лизина (K), консервативной в пилиновом мотиве (WXXXVXVYPKN) второй пилиновой субъединицы. Полагают, что формируется амидная связь между C-концевым карбоксилом треонинового остатка в первой пилиновой субъединице и боковой цепью аминогруппы лизина пилинового мотива из второй пилиновой субъединицы, все еще связанной в виде ковалентного тиоэфира с другой специфичной к пилинам сортазой (Budzik, J.M. et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 10215-10220). В этой модели сборки ворсинок растущая полимерная структура снабжается дополнительными пилиновыми субъединицами у основания ворсинки и общая длина регулируется количеством доступных пилиновых субъединиц, ассоциированных со специфичными к пилинам сортазами. Так как пилиновый мотив является характеристическим признаком основной (SpaA) и дополнительных второстепенных (SpaB) пилиновых субъединиц, но отсутствует в первичной последовательности второстепенных пилиновых субъединиц (SpaC), демонстрирующих адгезивные свойства, вероятно, эта пилиновая субъединица расположена на верху ствола ворсинки и является первой пилиновой субъединицей для инициации полимеризации ворсинки.
Четвертой стадией процесса сборки является прикрепление полимеризованной ворсинки к клеточной стенке. На этой стадии дополнительная второстепенная пилиновая субъединица (SpaB) сигнализирует о прекращении полимеризации ворсинки, но только тогда, когда находится в ассоциации с конститутивной сортазой, ген которой кодируется где-либо в другом месте генома. На этой финальной стадии растущая полимерная структура из основных пилиновых субъединиц (SpaA) переносится из тиоэфирной связи со специфичной к пилинам сортазой с формированием амидной связи с боковой цепью лизина в пилиновом мотиве второстепенной пилиновой субъединицы SpaB, которая связана в виде промежуточного соединения ацил-фермент с конститутивной сортазой. Затем нуклеофильная атака аминогруппой пентапептида пептидогликанового предшественника липида II позволяет конститутивной сортазе катализировать прикрепление полимера связанной с пилином SpaB ворсинки к клеточной стенке. Третьим и менее охарактеризованным консервативным мотивом первичной последовательности (YXLXETXAPXGY), найденным между мотивом LPXTG и пилиновым мотивом в пилиновых субъединицах многих грамположительных бактерий, является E-бокс.
Streptococcus agalactiae
S. aureus
Streptococcus pyogenes
К настоящему времени определение трехмерных (3-D) структур посредством рентгеноструктурной кристаллографии позволило получить понимание структурных особенностей сборки и функции только для двух белков пилиновых субъединиц грамположительных бактерий. Krishnan et al. (2007, Structure 15:893-903) установили кристаллическую структуру для второстепенного пилина GBS52  и выявили наличие IgG-подобных доменных укладок, обладающих структурным сходством с коллаген-связывающим белком Cna , что также указывает на то, как эта второстепенная пилиновая субъединица может способствовать адгезии ворсинки к конкретной ткани хозяина. Кристаллическая структура основного пилина Spy0128 , установленная Kang et al. (2007, Science 318, 1625-1628), продемонстрировала, как спонтанно образующиеся внутримолекулярные изопептидные связи между боковыми цепями лизина и остатками аспарагина в пилиновой субъединице могут также дополнять катализируемые сортазами межмолекулярные изопептидные связи для поддержания общей прочности и стабильности ворсинок.
Lactobacillus rhamnosus
.
Большинство пробиотических микроорганизмов являются представителями грамположительных лактобацилл и бифидобактерий, и существует длительная традиция их использования в ферментируемых пищевых продуктах и молочных продуктах (Goldin, B.R. and Gorbach, S.L. 2008, Clin. Infect. Dis. 46, S96-S100; Ljungh, A. and Wadstrom, T. 2006, Curr. Issues Intest. Microbiol. 7, 73-89; Salminen, S. et al., 1998, Br. J. Nutr. 80, S147-S171). Ворсинчатые структуры пробиотических лактобацилл или гены, кодирующие эти ворсинчатые структуры, в литературе не описаны. У  никогда не было показано наличия ворсинкообразных структур или полинуклеотидов
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является предоставление новых полипептидов ворсинок, а также кодирующих их полинуклеотидов. Кроме того, целью изобретения является предоставление новых ворсинчатых структур. Кроме того, целью изобретения является предоставление новых способов, применений и продуктов, связанных с указанными выше пептидами, полипептидами, белками, ворсинчатыми структурами и полинуклеотидами.
Настоящее изобретение относится к пептидам, содержащим последовательность, где последовательность по меньшей мере на 94% идентична с SEQ ID NO:1 (GG00441), где последовательность по меньшей мере на 94% идентична с SEQ ID NO:2 (GG00442), где последовательность по меньшей мере на 84% идентична с SEQ ID NO:3 (GG00443), где последовательность по меньшей мере на 91% идентична с SEQ ID NO:4 (GG00444), где последовательность по меньшей мере на 83% идентична с SEQ ID NO:5 (GG02369), где последовательность по меньшей мере на 94% идентична с SEQ ID NO:6 (GG02370), где последовательность по меньшей мере на 93% идентична с SEQ ID NO:7 (GG02371) или где последовательность по меньшей мере на 93% идентична с SEQ ID NO:8 (GG02372), или к их фрагментам или вариантам.
Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим пептидную последовательность, где последовательность по меньшей мере на 94% идентична с SEQ ID NO:1 (GG00441), где последовательность по меньшей мере на 94% идентична с SEQ ID NO:2 (GG00442), где последовательность по меньшей мере на 84% идентична с SEQ ID NO:3 (GG00443), где последовательность по меньшей мере на 91% идентична с SEQ ID NO:4 (GG00444), где последовательность по меньшей мере на 83% идентична с SEQ ID NO:5 (GG02369), где последовательность по меньшей мере на 94% идентична с SEQ ID NO:6 (GG02370), где последовательность по меньшей мере на 93% идентична с SEQ ID NO:7 (GG02371) или где последовательность по меньшей мере на 93% идентична с SEQ ID NO:8 (GG02372), или с их фрагментами или вариантами.
Настоящее изобретение также относится к ворсинчатой структуре, содержащей по меньшей мере один из пептидов по изобретению, продукту, содержащему по меньшей мере один пептид или одну ворсинчатую структуру по изобретению, и к фармацевтической или пищевой композиции, содержащей по меньшей мере один пептид или одну ворсинчатую структуру по изобретению.
Кроме того, настоящее изобретение относится к продукту, содержащему по меньшей мере один пептид или одну ворсинчатую структуру по изобретению, для применения в качестве лекарственного средства или для профилактики или лечения диареи, артериальной гипертензии, сосудистых заболеваний, аллергий, злокачественной опухоли, атопических заболеваний, вирусных заболеваний, инфекционных заболеваний, инфекций мочевыводящих путей, респираторных инфекций, зубного кариеса, синдрома раздраженного кишечника (IBS), воспалительного заболевания кишечника (IBD), воспаления слизистой, нарушений проницаемости кишечника, ожирения, метаболического синдрома, окислительного стресса или боли в животе.
Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию по меньшей мере одного пептида или одной ворсинчатой структуры по изобретению в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики диареи, артериальной гипертензии, сосудистых заболеваний, аллергий, злокачественной опухоли, атопических заболеваний, вирусных заболеваний, инфекционных заболеваний, инфекций мочевыводящих путей, респираторных инфекций, зубного кариеса, IBS, IBD, воспаления слизистой, нарушений проницаемости кишечника, ожирения, метаболического синдрома, окислительного стресса или боли в животе.
Кроме того, настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному пептиду или к одной ворсинчатой структуре по изобретению для лечения или профилактики диареи, артериальной гипертензии, сосудистых заболеваний, аллергий, злокачественной опухоли, атопических заболеваний, вирусных заболеваний, инфекционных заболеваний, инфекций мочевыводящих путей, респираторных инфекций, зубного кариеса, IBS, IBD, воспаления слизистой, нарушений проницаемости кишечника, ожирения, метаболического синдрома, окислительного стресса или боли в животе.
Кроме того, настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность любого из SEQ ID NO:9-16, или к его вырожденной последовательности, или кодирующему пептид по изобретению, к вектору, содержащему полинуклеотид по изобретению, к клетке-хозяину, содержащей полинуклеотид или пептид по изобретению, и к кластеру генов, содержащему по меньшей мере один полинуклеотид по изобретению.
Также настоящее изобретение относится к антителу/антителам к пептидам по изобретению или их функциональным доменам.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения или профилактики диареи, артериальной гипертензии, сосудистых заболеваний, аллергий, злокачественной опухоли, атопических заболеваний, вирусных заболеваний, инфекционных заболеваний, инфекций мочевыводящих путей, респираторных инфекций, зубного кариеса, IBS, IBD, воспаления слизистой, нарушений проницаемости кишечника, ожирения, метаболического синдрома, окислительного стресса или боли в животе, включающему введение индивидууму по меньшей мере одного пептида или одной ворсинчатой структуры по изобретению.
Настоящее изобретение относится к способу скрининга бактериальных штаммов, содержащих по меньшей мере один полинуклеотид по изобретению или его фрагмент, где способ включает:
i) получение из бактериальных штаммов ДНК или РНК;
ii) гибридизацию праймеров или зондов, специфичных к полинуклеотиду по изобретению или его фрагменту, с ДНК или РНК из стадии i) и, необязательно, амплификацию полинуклеотида или его фрагмента;
iii) детекцию по меньшей мере одного полинуклеотида или его фрагмента, гомологичных полинуклеотиду по изобретению или его фрагменту.
Настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного полинуклеотида по изобретению или его фрагмента или по меньшей мере одного антитела по изобретению для скрининга бактериальных штаммов.
Настоящее изобретение относится к способу скрининга бактериальных штаммов, содержащих по меньшей мере один пептид или одну ворсинчатую структуру по изобретению, с применением по меньшей мере одного антитела по изобретению, где способ включает:
i) получение белков бактериальных штаммов;
ii) детекцию по меньшей мере одного полипептида, одной ворсинчатой структуры или их фрагмента с применением антитела/антител.
Настоящее изобретение относится к способу снижения или подавления адгезии патогенных бактерий к желудочно-кишечному тракту, к эпителию или к слизи индивидуума, где способ включает введение индивидууму по меньшей мере одного пептида и/или одной ворсинчатой структуры по изобретению.
Настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного пептида и/или одной ворсинчатой структуры по изобретению для снижения или подавления адгезии патогенных бактерий к желудочно-кишечному тракту, к эпителию или к слизи индивидуума.
Настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному пептиду или к одной ворсинчатой структуре по изобретению для снижения или подавления адгезии патогенных бактерий к желудочно-кишечному тракту, к эпителию или к слизи индивидуума.
Настоящее изобретение относится к способу стимуляции адгезии бактериальной клетки или адгезии любого другого средства к слизи или эпителию, где способ включает:
i) получение по меньшей мере одного пептида или одной ворсинчатой структуры по изобретению или их фрагмента;
ii) экспозицию пептида, ворсинчатой структуры и/или их фрагмента на бактериальной клетке или на любом другом средстве;
iii) приведение бактериальной клетки или любого другого средства в контакт со слизью или эпителием.
Настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного пептида или одной ворсинчатой структуры по изобретению для стимуляции адгезии бактериальных клеток или адгезии любого другого средства к слизи или эпителию.
Настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному пептиду или одной ворсинчатой структуре по изобретению для стимуляции адгезии бактериальных клеток или адгезии любого другого средства к слизи или эпителию.
Настоящее изобретение относится к способу модификации иммунного ответа у индивидуума, где способы включают:
i) получение по меньшей мере одного пептида или одной ворсинчатой структуры по изобретению или их фрагмента;
ii) экспозицию пептида, ворсинчатой структуры и/или их фрагмента на клетке-хозяине;
iii) необязательно приведение клетки-хозяина в контакт со слизью или другой клеткой-хозяином.
Настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного пептида или одной ворсинчатой структуры по изобретению для модификации иммунного ответа.
Настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному пептиду или одной ворсинчатой структуре по изобретению для модификации иммунного ответа.
Настоящее изобретение относится к способу получения продукта по изобретению, где способ включает стадию получения для продукта по меньшей мере одного пептида или одной ворсинчатой структуры по изобретению.
Настоящее изобретение также относится к способу получения по меньшей мере одного пептида или одной ворсинчатой структуры по изобретению, где способ включает следующие стадии:
i) получение по меньшей мере одного полинуклеотида по изобретению;
ii) трансформация клетки-хозяина полинуклеотидом(ами);
iii) культивирование клетки-хозяина из стадии ii) с получением пептида(ов) или ворсинчатой структуры;
iv) необязательно выделение пептида(ов) или ворсинчатой структуры.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения по меньшей мере одного пептида или одной ворсинчатой структуры по изобретению, где способ включает следующие стадии:
i) разрушение клетки, продуцирующей или содержащей по меньшей мере один пептид или одну ворсинчатую структуру по изобретению;
ii) необязательно, выделение пептида(ов) или ворсинчатой структуры.
Также настоящее изобретение относится к способу получения по меньшей мере одного пептида по изобретению, где способ включает следующие стадии:
i) получение аминокислот;
ii) производство по меньшей мере одного пептида по изобретению из аминокислот из стадии i) с синтезом по меньшей мере одного пептида.
Настоящее изобретение относится к способу детекции потенциальных пробиотических бактериальных штаммов с применением биоинформатических подходов, где способ включает следующие стадии:
i) получение последовательности по меньшей мере одного пептида, полинуклеотида или их фрагментов;
ii) сравнение последовательности из стадии i) с последовательностями из коллекций последовательностей;
iii) детекция последовательностей с биологически подобными фрагментами с последовательностями из стадии i) или высокоидентичными с последовательностью из стадии i).
Настоящее изобретение также относится к способу детекции патогенных штаммов, против которых эффективны пептиды или ворсинчатые структуры по изобретению, с применением биоинформатических подходов, где способ включает:
i) получение последовательности по меньшей мере одного пептида, полинуклеотида или их фрагментов;
ii) сравнение последовательности из стадии i) с последовательностями из коллекций последовательностей;
iii) детекцию последовательностей с биологически подобными фрагментами с последовательностью из стадии I) или высокоидентичными с последовательностью из стадии i).
Пептиды, ворсинчатые структуры и полинуклеотиды по изобретению предоставляют средства для дальнейших разработок в пищевой, кормовой, косметической и фармацевтической индустрии. Настоящее изобретение обеспечивает быстрые и эффективные способы скрининга и надежный и точный качественный или количественный анализ множества бактериальных штаммов. Таким образом, способы и средства по изобретению обеспечивают выявление новых пробиотических бактериальных штаммов, а также открытие новых продуктов (включая ингредиенты, добавки и продукты питания), лекарственных средств и терапевтических способов. Кроме того, благодаря настоящему изобретению становятся доступными более эффективные и специфические способы лечения.
Существует постоянная очевидная необходимость предоставления потребителям новых продуктов с четко выраженным действием на здоровье и получаемым в форме, позволяющей их использование самих по себе или в виде части другого продукта, такого как фармацевтический, или пищевой, или кормовой продукт. По настоящему изобретению продукты также применимы в виде капсул, пилюль или таблеток, которые обеспечивают использование в виде удобной части или добавки, например, для повседневной диеты или лечения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1a и 1b демонстрируют модели сборки и ковалентного прикрепления ворсинок к клеточной стенке у грамположительных Corynebacteria.
Lactobacillus rhamnosus
На фиг.2 представлены кластеры ворсинок GG  (LGG), включающие гены, кодирующие специфичные к пилинам сортазы, основной белок ствола ворсинки, второстепенный белок ствола ворсинки и кэпирующие белки ворсинки. CWSS означает сигнал формирования клеточной стенки, т.е. консервативный мотив, найденный у множества грамположительных бактерий. Пилиновый мотив и E-бокс также означают консервативные мотивы, найденные у множества грамположительных бактерий.
На фиг.3 представлены примеры поликлональных антител, связывающихся с пептидами GG00442, GG00443, GG00444, GG02370, GG02371 и GG02372 ворсинчатой структуры LGG.
На фиг.4 представлена фазово-контрастная фотография на атомно-силовом микроскопе выступающих ворсинчатых структур LGG.
in vitro
На фиг.5a и 5b представлено связывание рекомбинантных меченых гистидином белков LGG, т.е. пилиновых белков SpaA, SpaB, SpaC, SpaD и SpaF, со слизью кишечника человека . В качестве источника слизи на полистироловом планшете для микротитрования использовали удаленную ткань кишечника человека. Связанные белки детектировали посредством твердофазного иммуноферментного анализа.
L. rhamnosus
На фиг.6a и 6b представлен вестерн-блоттинг фракций клеточной стенки LGG, а в качестве отрицательного контроля LC705  (LC705), выращенных в среде mTSB или в среде MRS + 0,6% бычья желчь с использованием специфичных к пилиновым белкам SpaA и SpaC поликлональных антител соответственно. Фиг.6a демонстрирует наличие у LGG содержащих SpaA ворсинок и мономеров SpaA, а фиг.6b демонстрирует наличие у LGG содержащих SpaC ворсинок и мономеров SpaC. Дорожка 1: рекомбинантный пилиновый белок SpaA/SpaC; дорожка 2: LGG, выращенный в mTSB; дорожка 3: LGG, выращенный в MRS + 0,6% бычья желчь; дорожка 4: LC705, выращенный в mTSB, дорожка 5: LC705, выращенный в MRS + 0,6% бычья желчь. Используемое антитело указано вверху каждого рисунка. На фиг.6b на панели A: дорожки 1-5 подвергали воздействию в течение 1 секунды; Panel B: дорожки 2-5 раздельно подвергали воздействию в течение 60 секунд. Положения стандартов молекулярных масс указаны слева в виде килодальтон. HMW означает высокомолекулярный лестничный маркер. Фиг.6c демонстрирует наличие содержащих SpaB ворсинок и мономеров SpaB в вестерн-блоттинге фракций клеточной стенки у LGG. Дорожка 1: маркер молекулярной массы; дорожка 2: LGG, выращенный в MRS. Детекцию проводили со специфичными к пилиновому белку SpaB поликлональными антителами, конъюгатом IgG козы к антителам кролика и AP (BioRad) и красителем BCIP/NBT.
Lactobacillus rhamnosus
Lactobacillus rhamnosus
Lactobacillus casei
На фиг.7a-c представлены результаты скрининга посредством ПЦР новых пробиотических штаммов с ворсинчатыми структурами. Фиг.7a-c демонстрируют продукты амплификации GG , LC705 и ATCC 334 соответственно. Дорожки 1: маркер молекулярной массы; дорожки 2: продукт амплификации с праймерами для SpaF; дорожки 3: продукт амплификации с праймерами для SpaE; дорожки 4: продукт амплификации с праймерами для SpaD; дорожки 5: продукт амплификации с праймерами для SpaC; дорожки 6: продукт амплификации с праймерами для SpaB; дорожки 7: продукт амплификации с праймерами для SpaA.
spaC
spaB
spaA
L. casei
L. rhamnosus
L. rhamnosus
spaC
Lactobacillus rhamnosus
spaB
Lactobacillus rhamnosus
spaA
Lactobacillus rhamnosus
Hind
Hae
Lactobacillus casei
Hind
Lactobacillus rhamnosus
Hind
Lactobacillus rhamnosus
Hind
На фиг.8a-d представлены сигналы при гибридизации по Саузерну, означающие наличие ,  или  в ATCC 334, LC705 и GG. На фиг.8a представлены расщепленные геномные ДНК, разделенные посредством электрофореза в агарозном геле, а на фиг.8b, 8c и 8d представлена гибридизация по Саузерну тех же ДНК с использованием в качестве зонда меченных DIG продукта амплификации ПЦР гена  GG длиной 801 п.н., продукта амплификации ПЦР гена  GG длиной 612 п.н. или продукта амплификации ПЦР гена  GG длиной 780 п.н. соответственно. Дорожка 1: маркер молекулярной массы I смесь III-φX174 III; дорожка 2: меченый DIG маркер молекулярной массы II (Roche); дорожка 3: ATCC 334, расщепленный III; дорожка 4: LC705, расщепленный III; дорожка 5: GG, расщепленный III; дорожка 6: -; дорожка 7: немеченый зонд.
6
Lactobacillus rhamnosus
Lactobacillus rhamnosus
На фиг.9 представлены уровни TNF-α при стимуляции макрофагов 2×10 КОЭ/мл живого GG или приблизительно 30 пмоль/мл очищенных меченных меткой His белков SpaA, SpaB и SpaC GG.
Enterococcus faecium
Lactobacillus rhamnosus
E. faecium
На фиг.10 представлено вытеснение патогенной бактерии  из слизи кишечника человека GG или пилиновыми белками SpaC, SpaB и SpaA. Адгезия (%) представлена как среднее ± S.D. пяти параллельных экспериментов. * относится к значимо сниженной адгезии  (P<0,05).
На фиг.11a и 11b представлены нуклеотидные последовательности, кодирующие опероны ворсинок, представленные на фиг.2. На фиг.11a представлен оперон, кодирующий гены GG00441-GG00444 (жирным). Предполагаемые консервативные элементы последовательность -35 (подчеркиванием), последовательность -10 (двойным подчеркиванием), участок связывания рибосомы (подчеркнутым курсивом) и терминатор ро (подчеркнутым точками). На фиг.11b представлен оперон, кодирующий гены GG02369-GG02372 (жирным). Предполагаемые консервативные элементы последовательность -35 (подчеркиванием), последовательность -10 (двойным подчеркиванием), участок связывания рибосомы (подчеркнутым курсивом) и терминатор ро (подчеркнутым точками).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Молочнокислые бактерии используют в пищевой индустрии в течение долгого времени и в настоящее время их применяют в различных пищевых продуктах, таких как молочные продукты. Например, известно, что лактобациллы и бифидобактерии обладают пробиотическим действием, но способы, которыми пробиотические бактерии воздействуют на здоровье, понятны не полностью. Таким образом, дополнительные исследования пробиотиков являются оправданными.
Lactobacillus rhamnosus.
Настоящее изобретение основано на открытии того, что грамположительные бактерии также содержат ворсинчатые структуры. Кроме того, изобретение основано на открытии новых пептидов ворсинок и ворсинчатых структур у грамположительных бактерий, в частности у лактобацилл, более конкретно у
Пептиды ворсинчатой структуры
В основном ворсинки грамположительных бактерий тянутся от наружной мембраны бактерий, как правило, составляя 1-4 мкм в длину и 2-8 нм в диаметре и находясь в малых количествах. Полагают, что ворсинки способствуют адгезии бактерий к поверхностям-мишеням. Фактически, как применяют в настоящем документе, выражение "ворсинчатая структура" относится к удлиненной волосковой или волосовидной белковой нити, содержащей несколько белковых субъединиц (предпочтительно более одной субъединицы). Сборка этих белков может зависеть от специфических белков, т.е. от сортаз. Белок с адгезивными свойства, как правило, расположен на верху ворсинки. Также адгезивными могут являться другие белки гетеромерной ворсинчатой структуры. Как применяют в настоящем документе, выражение "часть ворсинчатой структуры" относится к любому компоненту ворсинки, предпочтительно любому белку, или любому фрагменту, или любому варианту ворсинки. В предпочтительном варианте осуществления изобретения ворсинчатая структура расположена на поверхности микроорганизма или начинается от него.
Как применяют в настоящем документе, выражение "пептид" относится к любому пептиду, такому как дипептид, полипептид, белок и/или пилиновый белок.
В конкретном варианте осуществления изобретения характеристическими признаками пилина являются основная (SpaA), дополнительная второстепенная (SpaB) и кэпирующая (SpaC) пилиновые субъединицы.
Специфичные к пилину сортазы действуют, перенося в растущей полимерной структуре пилина SpaA на SpaC (фиг.1). В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид, содержащий последовательность, где последовательность по меньшей мере на 94% идентична с SEQ ID NO:1 (GG00441), или последовательность, где последовательность по меньшей мере на 83% идентична с SEQ ID NO:5 (GG002369), представляет собой специфичную к пилину сортазу (фиг.2, также для обзора нуклеотидных последовательностей, кодирующих опероны ворсинок, представленные на фиг.2, см. фиг.11).
Вероятно, SpaA формирует каркас ворсинчатой структуры. Длина различных ворсинчатых структур зависит от количества SpaA в каркасе (фиг.1). В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид, содержащий последовательность, где последовательность по меньшей мере на 94% идентична с SEQ ID NO:2 (GG00442), или последовательность, где последовательность по меньшей мере на 94% идентична с SEQ ID NO:6 (GG002370), представляет собой основной белок ствола ворсинки, т.е. основную пилиновую субъединицу (фиг.2, также для обзора нуклеотидных последовательностей, кодирующих опероны ворсинок, представленные на фиг.2, см. фиг.11). GG00442 и GG02370 содержат участок распознавания сортазы, таким образом являясь субстратами сортаз.
Вероятно, SpaB добавляется к ворсинчатой структуре на самой поздней стадии (конечная стадия) формирования ворсинки, и он формирует связь ворсинки с клеточной стенкой (фиг.1). В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид, содержащий последовательность, где последовательность по меньшей мере на 84% идентична с SEQ ID NO:3 (GG00443), или последовательность, где последовательность по меньшей мере на 93% идентична с SEQ ID NO:7 (GG002371), представляет собой второстепенный белок ствола ворсинки (фиг.2, также для обзора нуклеотидных последовательностей, кодирующих опероны ворсинок, представленные на фиг.2, см. фиг.11). GG00443 и GG002371 содержат участок распознавания сортазы, таким образом являясь субстратами сортаз.
Вероятно, SpaC расположен на верху ствола ворсинки и является первой пилиновой субъединицей для инициации полимеризация ворсинок (фиг.1). В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид, содержащий последовательность, где последовательность по меньшей мере на 91% идентична с SEQ ID NO:4 (GG00444), или последовательность, где последовательность по меньшей мере на 93% идентична с SEQ ID NO:8 (GG002372), представляет собой связывающий белок ворсинки (фиг.2, также для обзора нуклеотидных последовательностей, кодирующих опероны ворсинок, представленные на фиг.2, см. фиг.11). Белок GG00444 содержит домен фактора фон Виллебранда (vWF), а GG00444 и GG02372 содержат участки распознавания сортазы, таким образом являясь субстратами сортаз.
В конкретном варианте осуществления изобретения пептид или полипептид по изобретению содержит последовательность, по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,8, 99,9 или 100% идентичную с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или с их фрагментами или вариантами.
По конкретному варианту осуществления изобретения пептид по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,8, 99,9 или 100% идентичен с любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или с их фрагментами или вариантами.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения пептид имеет последовательность, представленную в любой из последовательностей SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их фрагментах или вариантах.
Идентичность любой последовательности или ее фрагментов, сравниваемой с последовательностью по настоящему изобретению, относится к идентичности любой последовательности, сравниваемой с целой последовательностью по настоящему изобретению. Идентичность последовательностей можно определять, например, с применением BLAST (Basic Local Alignment Search Tools, средства поиска основного локального выравнивания) или FASTA (FAST-All). При поисках параметры установок "штрафы за пропуск" и "матрица", как правило, выбирают по умолчанию.
Как применяют в настоящем документе, фрагмент или вариант пептида относится к любой части или варианту пептида, который может обладать биологической функцией. Вариант относится к пептиду с небольшими изменениями в последовательности пептид, например небольшие делеции, мутации или вставки. Как применяют в настоящем документе, "функциональный фрагмент или вариант пептида" относится, например, к фрагменту или варианту, способному формировать изопептидные связи между различными пилиновыми субъединицами (например, транспептидазная активность специфичной к пилину сортазы), являясь субстратом сортаз (например, функция SpaA, SpaB, SpaC, SpaD, SpaE и SpaF) или связываясь с клеточной стенкой (например, функция SpaC и SpaF) или с другими белками или фрагментами (например, функция SpaC). Также "функциональный фрагмент или вариант пептида" могут относиться к любому фрагменту или варианту, содержащему биологический домен.
В настоящее время домены в полипептидах, как правило, определяют как пространственно обособленные структуры, которые потенциально могут сворачиваться и функционировать отдельно (Ponting C. P. and Russell R. R. 2002, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31:45-71).
На основе анализа полипептидной последовательности, например, SEQ ID NO:4 с использованием средства из общедоступной базы данных доменов PFAM (Finn, R. D. et al., 2009, Nucleic Acids Res. Nov 17 [электронная публикация пред печатью]), полипептидная последовательность SEQ ID NO:4 в этом исследовании была охарактеризована как содержащая три домена со значимым значением E, меньшим или равным 0,1.
Streptococcus agalactiae
Аминокислоты SEQ ID NO:4 от 137 до 271 формируют первый домен (PF00092 - домен фактора фон Виллебранда типа A), который также найден во многих белках, опосредующих и вовлеченных в белок-белковые взаимодействия (Colombatti, A. et al., 1993, Matrix. 13:297-306; Whittaker C. A. and Hynes R. O. 2002, Mol. Biol. Cell. 13:3369-87; Konto-Ghiorghi, Y et al., 2009, PLoS Pathog. 5:e1000422). Белки, содержащие домен фактора фон Виллебранда типа A, часто функционируют в мультибелковых комплексах, и установлено, что они участвуют в многочисленных биологических явлениях у эукариот, включая мембранный транспорт, протеасому, транскрипцию, репарацию ДНК, клеточную адгезию, миграцию, хоуминг, формообразование и передачу сигнала (Colombatti, A. et al., Matrix. 13:297-306). Совсем недавно показано, что домен фактора фон Виллебранда типа A пилина патогенного штамма  NEM316 необходим для функции адгезии этого белка к эпителиальным клеткам человека (Konto-Ghiorghi, Y. et al., 2009, PLoS Pathog. 5:e1000422).
Staphylococcus aureus
Аминокислоты от 617 до 691 формируют второй домен (PF05738 - домен белка Cna типа B), а аминокислоты от 749 до 821 формируют третий домен (PF05738 - домен белка Cna типа B) SEQ ID NO:4. Установлено, что домен белка Cna типа B играет важную роль в связывающем коллаген поверхностном белке . Однако эта область не опосредует связывание коллагена, а вместо этого служит в качестве "ствола", который отодвигает другие области белка от поверхности бактерии и, таким образом, способствует адгезии бактерии к коллагену (Deivanayagam, C. C. et al., 2000, Structure. 8:67-78). Недавно для этого домена белка Cna типа B предложено другое свойство, так как замечено, что он содержит образующие изопептидную связь остатки, которые, как показано, являются важными для сборки ворсинок и для связи различных субъединиц пилина вместе (Kang, H. J. et al., 2007, Science 318, 1625-1628). Процент идентичности последовательности фрагмента можно измерять с использованием средств и установок, как проводят для целого полипептида.
Любую полипептидную последовательность по изобретению можно анализировать подобно SEQ ID NO:4, как описано выше. Домены белка Cna типа B найдены в SEQ ID NO:2 (аминокислоты 73-155 и 193-295), в SEQ ID NO:3 (аминокислоты 72-164), в SEQ ID NO:6 (аминокислоты 374-470 и 69-168), в SEQ ID NO:7 (аминокислоты 238-328) и в SEQ ID NO:8 (аминокислоты 743-805 и 839-906).
На основе современных знаний, полипептиды с достаточно высоким процентом идентичности обладают сходными пространственными структурами и, вероятно, вовлечены в сходные, хотя и необязательно идентичные, функции. Процент идентичности на уровне последовательностей для функциональной и структурной эквивалентности является функцией длины выравнивания (Sander C. and Schneider R. 1991, Proteins. 9:56-68). Например, полипептиды по меньшей мере с 50 аминокислотами обладают хорошим структурным сходством, когда их процент идентичности на уровне последовательностей превышает 35%. Таким образом, из современных знаний следует, что полипептидные последовательности с процентом идентичности последовательностей более 35% и длиной более 50 аминокислот могут быть вовлечены в сходную функцию, имеют сходную пространственную структуру и их выявляют с использованием такого же основанного на антителах способа скрининга.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид с SEQ ID NO:2-4 или 6-8 представляет собой часть ворсинчатой структуры. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения ворсинчатая структура по изобретению содержит по меньшей мере один из пептидов по изобретению, более предпочтительно по меньшей мере два или по меньшей мере три пептида по изобретению. Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления изобретения ворсинчатая структура содержит пептиды GG00442 (SEQ ID NO:2), GG00443 (SEQ ID NO:3) и GG00444 (SEQ ID NO:4) и/или пептиды GG02370 (SEQ ID NO:6), GG02371 (SEQ ID NO:7) и GG02372 (SEQ ID NO:8).
Грамположительные и пробиотические бактерии
Пептиды или ворсинчатые структуры по изобретению могут происходить из любых бактерий, таких как грамположительные или грамотрицательные бактерии. Однако в предпочтительном варианте осуществления изобретения пептиды или ворсинчатые структуры происходят из грамположительных бактерий. Грамположительные бактерии, которые могут содержать пептиды или ворсинчатые структуры по изобретению, включают в качестве неограничивающих примеров лактобациллы, лактококки, бифидобактерии, пропионовокислые бактерии, лейконосток, стрептококки, коринебактерии, актиномицеты и микобактерии.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид или ворсинчатая структура происходят из пробиотических бактерий, таких как пробиотические лактобациллы, лактококки, бифидобактерии, энтерококки, пропионовокислые бактерии, лейконосток и стрептококки, или дрожжей. Пробиотики представляют собой живые микроорганизмы, предпочтительно непатогенные микроорганизмы, которые при введении человеку или животному в адекватных количествах поддерживают хорошее самочувствие хозяина (Fuller, R. 1989, J. Appl. Microbiol. 66:365-378). При потреблении в адекватных количествах в качестве пищи или пищевой добавки пробиотики приводят к существенной пользе для здоровья хозяина.
Заявления о полезности для здоровья пробиотиков у людей или животных включают возможное профилактику и лечение многих болезней. Улучшающее здоровье действие пробиотиков включает, например, балансировку и поддержание кишечной флоры, стимуляцию иммунной системы и противораковое действие. Полезное действие пробиотиков в кишечнике человека основано на нескольких независимых факторах, имеющих в основе живые бактериальные клетки, их клеточные структуры и продукты метаболизма.
Бактерию можно обозначить как пробиотическую, если она в основном удовлетворяет следующим требованиям (Lee, Y-K and Salminen, S. 1995 Trend Food Sci. Technol., 6:241-245): она остается жизнеспособной в жестких условиях, преобладающих в желудочно-кишечном тракте (низкий pH в желудке, кислоты пищеварительной системы и т.д.); прикрепляется к стенкам кишечника; колонизирует ЖКТ; осуществляет метаболизм в кишечнике; технологически применима (выносит обработку); демонстрирует клинически протестированное и опубликованное влияние на здоровье и безопасна для потребления.
Bacteroides
Bifidobacterium
Coprococcus
Peptostreptococcus, Eubacterium
Ruminococcus.
Lactobacillus
Streptococcus
Fusobacterium
Veillonella
Propionibacterium
Enterobacteriaceae
Между различными частями желудочно-кишечного тракта существуют огромные различия в содержании микроорганизмов, приблизительно 95% всех бактерий кишечника находятся в толстой кишке. Рассчитано, что кроме транзиторных микроорганизмов в толстой кишке хорошо растут более 400 видов бактерий. Доминирующими видами являются следующие: , , ,  и  Количество видов , , , ,  и  является немного меньшим. Некоторые из видов являются полезными микроорганизмами, тогда как другие даже могут быть вредными (Tannock, G.W. 1998, Int. Dairy J. 8:527-533). Изменения в составе кишечной флоры или внезапное снижение ее количества (вследствие тяжелой диареи, лечения антибиотиками и т.д.) увеличивает инфекционность потенциально патогенных видов, что может иметь серьезные последствия (вспышку аллергии, заболевания кишечника, злокачественная опухоль).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид или ворсинчатая структура связывается с желудочно-кишечным трактом (ЖКТ), наиболее предпочтительно с эпителием желудочно-кишечного тракта. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид или ворсинчатая структура связывается со слизью. Слизь представляет собой скользкий секреторный продукт, вязкий коллоид, из продуцирующих слизь клеток. Слизь защищает эпителиальные клетки, например, в ЖКТ. В дополнение к антисептическим ферментам и иммуноглобулинам слизь также содержит муцины и неорганические соли. Как применяют в настоящем документе, желудочно-кишечный тракт относится к трубке от ротовой полости до ануса, участвующей в переваривании пищи. ЖКТ включает ротовую полость, пищевод, желудок, двенадцатиперстную кишку, тощую кишку, подвздошную кишку, тонкую кишку, толстую кишку (ободочную кишку), слепую кишку, прямую кишку и анус.
L. rhamnosus
L. johnsonii
L. casei
Bifidobacterium lactis
Lactobacillus rhamnosus
Lactobacillus rhamnosus
Наиболее хорошо подтвержденные документальными доказательствами пробиотики включают GG, LA1, Shirota и Bb12. Кроме того, в литературе в данной области описан ряд других пробиотиков. В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид или ворсинчатая структура происходит из , наиболее предпочтительно из штамма GG (LGG, LGG), который является непатогенным грамположительным изолятом, происходящим из USA (US4839281 A). Штамм LGG выделен из экскрементов человека, он способен хорошо расти при pH 3 и выживает даже при меньших значениях pH, а также при высоком содержании желчных кислот. Штамм демонстрирует прекрасную адгезию к слизи и эпителиальным клеткам и колонизирует ЖКТ. Выход молочной кислоты из глюкозы является хорошим: когда его растят в бульоне MRS, штамм продуцирует 1,5-2% молочной кислоты. Штамм не ферментирует лактозу, и, таким образом, он не продуцирует молочную кислоту из лактозы. Штамм ферментирует следующие углеводы: D-арабинозу, рибозу, галактозу, D-глюкозу, D-фруктозе, D-маннозу, рамнозу, дульцит, инозит, маннит, сорбит, N-ацетилглюкозамин, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, целлобиозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, мелицитозу, гентибиозу, D-тагатозу, L-фукозу и глюконат. Штамм хорошо растет при 15-45°C, оптимальной температурой является 3-37°C. LGG депонирован с полномочиями хранилища American Type Culture Collection под инвентарным номером ATCC 53103.
Гены ворсинок
Гены, кодирующие пилиновые белки ворсинчатой структуры в геноме LGG, кластеризованы в одних и тех же локусах. В общей сложности в геноме LGG биоинформатическими способами найдены два различных кластера генов, кодирующие пептиды ворсинок (фиг.2, также для обзора нуклеотидных последовательностей, кодирующих опероны ворсинок, представленные на фиг.2, см. фиг.11).
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения полинуклеотид содержит последовательность любых из SEQ ID NO:9-16, или их вырожденной последовательности, или их фрагмента, или он кодирует пептид по изобретению или его фрагмент. Полинуклеотид, обладающий вырожденной последовательностью, представленной любым из SEQ ID NO:9-16, означает, что он содержит один или несколько измененных нуклеотидов, но все еще кодирует те же аминокислоты. Как применяют в настоящем документе, "полинуклеотид" представляет собой последовательность нуклеотидов, такую как последовательность ДНК или РНК, и может представлять собой одно- или двухцепочечную полинуклеиновую кислоту. Термин полинуклеотид включает геномную ДНК, кДНК и мРНК. Также полинуклеотид может представлять собой выделенную ДНК.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения кластер генов содержит по меньшей мере один полинуклеотид по изобретению. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения кластер генов содержит по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре полинуклеотида по изобретению. Наиболее предпочтительно кластер генов содержит полинуклеотиды, представленные в SEQ ID NO:9-12 или SEQ ID NO:13-16. Как применяют в настоящем документе, "кластер генов" относится к группе по меньшей мере из двух генов, которые кодируют пептиды/белки, необходимые для совместного действия (согласованного действия), например здесь для ворсинчатой структуры. Гены одного кластера, как правило, сгруппированы вместе в одном генетическом локусе.
По конкретному варианту осуществления изобретения полинуклеотид по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,8, 99,9 или 100% идентичен любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO:9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 или их фрагментам.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения полинуклеотид содержит последовательность, представленную в любой из последовательностей SEQ ID NO:9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16.
Продукты и фармацевтические композиции
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения продукт содержит по меньшей мере один пептид или одну ворсинчатую структуру по изобретению. Продукт также может содержать по меньшей мере два или по меньшей мере три пептида по изобретению. В одном предпочтительном варианте осуществления продукт содержит по меньшей мере один фрагмент пептида по изобретению. Продукты по изобретению в качестве неограничивающих примеров можно выбирать из группы, состоящей из пищевых продуктов, корма для животных, продуктов питания, пищевых добавок, ингредиентов пищи, диетических продуктов питания, фармацевтических препаратов и косметических средств. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения продукт представляет собой пищевой или кормовой продукт. В другом варианте осуществления изобретения продукт представляет собой функциональный пищевой продукт, т.е. пищевой продукт, обладающий любыми улучшающими здоровье и/или предотвращающими или лечащими заболевание свойствами. Предпочтительно пищевой продукт по изобретению выбран из группы, состоящей из молочных продуктов, хлебобулочных изделий, шоколада и кондитерских изделий, кондитерских изделий из сахара и жевательных кондитерских изделий, хлебопродуктов, сухих завтраков, ягодных или фруктовых продуктов и питья/напитков. Молочные продукты в качестве неограничивающих примеров включают молоко, простоквашу, йогурты и другие ферментированные молочные продукты, такие как сыры и масло, порошковое молоко, детское питание, питание для младенцев, питание для детей ясельного возраста, детская смесь, соки и супы. В дополнение к пептидам или ворсинчатым структурам по изобретению продукт также может содержать другие составляющие, пробиотики и т.д.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения продукт представляет собой фармацевтическую композицию. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере один пептид или одну ворсинчатую структуру по изобретению, а в другом варианте осуществления по меньшей мере два или по меньшей мере три пептида по изобретению. Фармацевтические композиции можно использовать, например, в твердой, полутвердой или жидкой форме, такой как в форме таблеток, пилюль, капсул, растворов, эмульсий, суспензий, вагинальных гелей и мазей, вагинальных суппозиториев и т.п. Предпочтительно композиция предназначена для перорального введения или для применения в кишечнике.
В дополнение по меньшей мере к одному пептиду или одной ворсинчатой структуре по изобретению фармацевтическая композиция может содержать пребиотики, фармацевтически приемлемый носитель(и) (например, воду, глюкозу или лактозу), вспомогательное вещество(а), эксципиент(ы), вспомогательный эксципиент(ы), антисептик(и), стабилизатор(ы), загуститель(и) или краситель(и), отдушку(и), связывающее средство(а), наполнитель(и), смазку(и), суспендирующее средство(а), подсластитель(и), ароматизатор(ы), желатинизирующее средство(а), антиоксидант(ы), консервант(ы), буфер(ы), регулятор(ы) pH, увлажнитель(и) или компоненты, в норме присутствующие в соответствующих продуктах.
Продукт или фармацевтическая композиция по изобретению содержит пептид или ворсинчатую структуру в количестве, достаточном для получения желаемого эффекта. Другие ингредиенты, а также другие конкретные компоненты продуктов или фармацевтических композиций получают коммерчески или получают общепринятыми способами, известными в данной области.
Продукты или фармацевтические композиции можно производить любыми общепринятыми способами, известными в данной области. Получение пептида или ворсинчатой структуры в продукте означает, что пептид или ворсинчатую структуру можно, например, добавлять в любые продукты или смешивать с любыми средствами. Пептид или ворсинчатую структуру также можно получать в продукте, например, посредством экспрессии в соответствующих условиях. Пептид или ворсинчатую структуру можно добавлять или смешивать согласованно с получением или позднее, при завершающей обработке конечного продукта. В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид или ворсинчатую структуру по изобретению добавляют в продукт.
Способы получения
Пептид или ворсинчатую структуру по изобретению можно получать, например, синтетическими способами, например пептидным синтезом или посредством рекомбинантной продукции генетически модифицированным организмом. В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид или ворсинчатая структура являются рекомбинантными. Как применяют в настоящем документе, "рекомбинантный" генетический материал относится к материалу, который, как правило, представляет собой комбинацию одного или нескольких генетических материалов, например цепей ДНК различного происхождения, и его получают посредством комбинации или вставки последовательностей. Рекомбинантное получение позволяет добиваться специфических и/или особых характеристик гена или продукта гена или, например, экспрессии гена (например, сверх- или сниженной экспрессии). Например, полинуклеотид по изобретению можно помещать под контроль любых эндогенных или экзогенных регуляторов, таких как промоторы. Рекомбинантный белок получают с рекомбинантной ДНК.
По меньшей мере один представляющий интерес полинуклеотид можно выделять из клетки или получать синтетически. Этот нуклеотид можно трансформировать в клетку-хозяина. Подходящая клетка-хозяин для получения любого пептида по изобретению может представлять собой любую эукариотическую клетку или микроорганизм, предпочтительно бактерии, наиболее предпочтительно - молочнокислые бактерии, такие как лактобациллы, лактококки, бифидобактерии, энтерококки, лейконосток и стрептококки или пропионовокислые бактерии или дрожжи.
Как применяют в настоящем документе, "трансформация" относится к генетическому изменению клетки посредством чужеродного генетического материала, предпочтительно ДНК, приводящему к экспрессии этого генетического материала. Чужеродный генетический материал можно вводить сам по себе или как встроенный в любой другой генетический материал, такой как векторы, плазмиды и т.д. Для трансформации клетки-хозяина полинуклеотидом по изобретению можно использовать любой способ генетической инженерии или любые способы молекулярного клонирования. Существуют различные способы введения чужеродного материала в эукариотическую клетку. В качестве носителей для трансформации используют такие материалы, как полимеры (например, DEAE-декстран или полиэтиленимин), липосомы и наночастицы (например, золотые). Генетический материал также можно вводить в клетки с применением в качестве носителей вирусов или векторов. Другие способы введения чужеродного материала в клетку включают в качестве неограничивающих примеров нуклеофекцию, электропорацию, конъюгацию, трансфекцию, сонопорацию, тепловой шок и магнитофекцию. В данной области хорошо известно применение различных реагентов для трансфекции, таких как фосфат кальция или липофектамин. Предпочтительным способом введение чужеродного материала в бактериальную клетку является электропорация.
Пептид или ворсинчатую структуру по изобретению также можно получать посредством клеток, экспрессирующих пептиды или ворсинчатые структуры в природе.
После продукции природными клетками или трансформированными клетками-хозяевами пептида по изобретению в подходящих условиях пептид можно, например, очищать от клеток или секретируемую форму пептида можно выделять, например, из среды для культивирования. Для очистки пептида клетки можно разрушать, например, посредством ультразвукового облучения, радиации, нагревания, лизиса, механического перемешивания (разделения), ферментативных способов, "клеточной бомбы" или химических средств (гипотонический шок, детергенты и растворители) или их смесей. Пептид или ворсинчатую структуру можно получать из растущих или метаболически активных, т.е. живых и/или лиофилизированных, или неживых, например убитых нагреванием, облученных или лизированных организмов. Пептид или ворсинчатую структуру можно получать из погибшей клетки или живой клетки.
Пептид или ворсинчатая структура могут продуцироваться в одной клетке, а затем экспонироваться на этой же клетке, или пептид или ворсинчатая структура могут продуцироваться в клетке, отличной от той, на которой они экспонированы.
Для получения антител к пептидам по изобретению можно использовать любые известные способы, такие как иммунизация. Антитела можно получать к любым эпитопам или функциональным доменам пептидов, и они могут быть моноклональными или поликлональными. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитела являются поликлональными (фиг.3). Как применяют в настоящем документе, "функциональный домен пептида" относится к любой части пептида, которая обладает биологической функцией.
Способы лечения
Бактерии, большая группа одноклеточных микроорганизмов, вызывают различные заболевания эукариот, таких как люди, животные и растения. Однако только в течение последних лет интерес среди исследований вызвало присутствие ворсинок на поверхности важных патогенных микроорганизмов. Так как ЖКТ и его микрофлора влияют на самочувствие индивидуумов, полезные свойства ворсинок бактерий делают возможным новые способы лечения. Пептиды, ворсинчатые структуры или полинуклеотиды по изобретению можно использовать в способе лечения или профилактики заболеваний, вызываемых микроорганизмами, такими как бактерии или вирусы, или вызываемых другой причиной, такой как несбалансированное питание, напряженный образ жизни или генетическая предрасположенность. Заболевания или недомогания, которые можно предотвращать или лечить пептидами, ворсинчатыми структурами, полинуклеотидами или фармацевтическими препаратами по изобретению, в качестве неограничивающих примеров включают диарею, такую как диарея путешественников, артериальную гипертензию, сосудистые заболевания, аллергию, атопические заболевания, инфекции мочевыводящих путей, респираторные инфекции, зубной кариес, синдром раздраженного кишечника, воспалительное заболевание кишечника, а также устранение небольшого дискомфорта в кишечнике и улучшение/поддержания общего самочувствия индивидуума. Композиция по изобретению также пригодна для профилактики и лечения желудочно-кишечных нарушений и заболеваний и для поддержания общего состояние здоровья. Нарушения или заболевания предпочтительно выбраны из группы, состоящей из воспаления слизистой, нарушений проницаемости кишечника, IBD, IBS и других желудочно-кишечных нарушений. В особом варианте осуществления изобретения пептиды или ворсинчатые структуры используют в качестве вакцин (иммунный ответ).
Escherichia coli
Способ снижения или подавления адгезии патогенных бактерий к ЖКТ индивидуума приводит к предотвращению или облегчению симптомов, вызываемых патогенным микроорганизмом. Патогенный микроорганизм вытесняется из эпителия или с поверхности ЖКТ вследствие конкуренции с пептидом или ворсинчатой структурой по изобретению. В примере 11 заявки описан анализ конкуренции с заменой вредных патогенных бактерий белками ворсинок LGG. Предпочтительные патогенные микроорганизмы для вытеснения в качестве неограничивающих примеров включают , сальмонеллу, бациллы, бактероиды, листерию, стафилококки, энтерококки, клостридии и стрептококки. Как применяют в настоящем документе, "патогенные бактерии" относятся к любым бактериям, вызывающим любое заболевание или любой неблагоприятный эффект. Как применяют в настоящем документе, "адгезия" относится к скреплению по меньшей мере двух молекул или структур друг с другом посредством химических или физических связей/сил или без них. Известны различные типы адгезии, такие как механическая адгезия, химическая адгезия, дисперсионная адгезия, электростатическая адгезия и диффузная адгезия. Адгезия может являться обратимым и необратимым событием, но в биохимической системе адгезия, как правило, обратима.
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
и  представляют собой кишечные бактерии, которые являются развивающимися нозокомиальными патогенными микроорганизмами, включая устойчивые к ванкомицину энтерококки (VRE), которые высокоустойчивы к важному клиническому антибиотику vancomyciny (de Regt, M.J. et al., 2008, J. Antimicrob. Chemother. 62(6):1401-1406). Эти виды входят в основные три нозокомиальных бактериальных патогенных микроорганизма, вызывающие у госпитализированных пациентов инфекции кровотока, хирургических ран и мочевыводящих путей (Richards, M.J. et al., 2000, Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 21:510-515). Энтерококки могут вызывать широкое множество заболеваний: инфекции мочевыводящих путей, бактериемию, сепсис, эндокардит, инфекции ран и тканей, внутрибрюшные и тазовые инфекции (Kayser, F.H. et al., 2003, Int. J. Food. Microbiol. 88(2-3):255-262) и инфекции хирургических ран, особенно в присутствии имплантированных устройств (Baldassarri L. et al., 2005, Int. J. Artif. Organs 28 (11):1101-1109), а также вызывают менингит (Pintado V. et al., 2003, Medicine (Baltimore). 82(5):346-64), хронический апикальный периодонтит (Hancock H.H et al., 2001. Oral Surg. Oral Med. Oral pathol. 91:579-586) и периапикальные очаги повреждения (Sunde P.T. et al., 2002, J. Endod 28:304-310).
E. faecium
E. faecium
Lactobacillus rhamnosus
Lactobacillus rhamnosus
Lactobacillus rhamnosus
E. faecium
E. faecium
Недавно описано, что изоляты  содержат расположенные на поверхности ворсинки и, что примечательно, подавляющее большинство (71%) внутригоспитальных и значительная часть (43%) негоспитальных штаммов  содержит гены ворсинок (Hendricks A.P. et al., 2008, Microbiology 154:3212-3223). В двойном слепом исследовании с контролем плацебо описано, что потребление GG эффективно прекращает инфекцию энтерококками у положительных по VRE пациентов (Manley K.J. et al., 2007 Med. J. Aust. 186(9):454-457). Подтверждение конкуренции между содержащим ворсинки GG и VRE на молекулярном уровне основано на исследованиях связывания, которые продемонстрировали, что  обладает в 20-130 раз более высоким связыванием со слизью желудочно-кишечного тракта человека, чем устойчивая к ванкомицину  (Pultz N.J. et al., 2006 Curr. Microbiol. 52(3):221-224). Неожиданно в анализе связывания по настоящему изобретению очищенные меченные меткой His белки LGG SpaA, SpaB и SpaC ингибируют связывание патогенных микроорганизмов, например, устойчивой к ванкомицину  со слизью.
Способ снижения или подавления адгезии патогенных бактерий к желудочно-кишечному тракту, к эпителию или к слизи индивидуума может включать следующие стадии: i) получение по меньшей мере одного пептида по изобретению или его фрагмента или одной ворсинчатой структуры; ii) экспонирование пептида, фрагмента и/или ворсинчатой структуры на клетке или слизи.
in vivo
ex vivo
in vitro
В дополнение к снижению адгезии вредных или патогенных бактерий настоящее изобретение также предоставляет возможность стимулировать адгезию полезных клеток или других средств, таких как фермент(ы), рекомбинантные клетки, микрокапсула, нанокапсула или лекарственное средство(а), к ЖКТ. Способ стимуляции адгезии бактериальной клетки к слизи и к ЖКТ или применения пептида или ворсинчатой структуры по изобретению для стимуляции адгезии бактериальной клетки к слизи желудочно-кишечного тракта относится к неожиданной способности новых пептидов или ворсинчатых структур к адгезии к ЖКТ ,  или . Пептид ворсинки или ворсинчатая структура действуют как средство связи клетки или любого другого средства, такого как лекарственные средства, фермент(ы), микроорганизм(ы), рекомбинантные клетки, микрокапсулы или нанокапсулы с ЖКТ.
ex vivo
in vitro
Способ модификации иммунного ответа у индивидуума и использования пептидов или ворсинчатой структуры для модификации иммунного ответа основан на неожиданном открытии того, что пептиды или ворсинчатая структура по изобретению вызывают изменения иммунного ответа. Иммунный ответ относится к ответу на антиген в организме, в системе  или  или к ответу на другой модулятор. Этот ответ может быть опосредован лимфоцитами и/или распознаванием антигенов специфическими антителами. Одной из целей иммунного ответа является разрушение антигена, который, как правило, является антигеном чужеродного происхождения, или его нейтрализация. Как применяют в настоящем документе, "модификация" относится к любому изменению иммунного ответа, такому как увеличение или снижение. Изменения иммунного ответа можно контролировать посредством любого подходящего медицинского, физиологического или биологического теста, включая в качестве неограничивающих примеров тесты, основанные на детекции активации сигнальных путей, а также на детекции уровня транскрипции или трансляции маркерных генов или количества белков, например, антител или рецепторов. В настоящее время одного маркера, пригодного для определения иммунного ответа в клетке или организме, не существует. Однако предпочтительные маркеры включают в качестве неограничивающих примеров фактор некроза опухоли альфа (TNFαα). Другие возможные маркеры представляют собой IL-1α, IL-6, IL-18, IFN-γ, IL-4, TGFβ, IL-I Ra и IL-18BP. В предпочтительном варианте осуществления изобретения маркер(ы) выбран(ы) из группы, состоящей из TNF-α, цитокинов Th1, IL-10 и IL-12.
TNF-α представляет собой воспалительный цитокин (Bertazza L and Mocellin S. 2008, Front. Biosci. 13:2736-43), активирующий иммунную систему и инициирующий воспалительный ответ для противодействия инфекции. TNF-α, наряду с IL-6 и INF-γ, также опосредует системное действие воспаления, такое как лихорадка и синтез белков острой фазы. Продукция соответствующих количеств TNF-α, а также других провоспалительных цитокинов важна в ответе для разрешения от инфекции. Однако несоответствующие или избыточные количества провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α, связаны с патофизиологическими состояниями, такими как ревматоидный артрит, спондилоартрит, увеит, псориаз и воспалительное заболевание кишечника. TNF-α, наряду с IFN-γ, также представляют собой один из цитокинов Th1-типа, и, таким образом, он активирует макрофаги и ингибирует B-клетки и таким образом стимулирует иммунитет Th1-типа. TNF-α также вовлечен в активацию тучных клеток, таким образом принимая участие в аллергических реакциях. Ответ Th1-типа вызывает клеточный иммунитет. Ответ Th1-типа координирует ответ хозяина на внутриклеточные патогенные микроорганизмы и играет центральную роль в активации фагоцитов и в стимуляции уничтожения микроорганизмов, которое важно при различных инфекциях, таких как респираторные инфекции и инфекции желудочно-кишечного тракта, такие как диарея. Ответ Th1-типа также важен в балансе иммунного ответа при аллергии - при аллергии иммунный ответ смещен в направлении ответа Th2-типа, приводя к гиперчувствительности, а средства, стимулирующие иммунный ответ Th1-типа, могут сбалансировать ситуацию.
in vitro
ex vivo
in vivo
in vitro
ex vivo
in vivo
Изменения иммунного ответа можно проверять посредством тестов ,  или  в любом биологическом образце или у любого индивидуума. Свойства пробиотических штаммов можно исследовать в клеточных культурах () с использованием, например, мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), моноцитов, макрофагов и дендритных клеток человека. Примеры экспериментов  включают определение фагоцитоза нейтрофилов и моноцитов, окислительного взрыва, т.е. образования супероксида нейтрофилами и моноцитами, активности NK-клеток, пролиферации лимфоцитов и продукции цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови, моноцитами или лимфоцитами. Эксперименты  в качестве неограничивающих примеров включают определение ответа на вакцины (например, специфичные к вакцине антитела или специфичные к вакцине синтезирующие антитела клетки), гиперчувствительности замедленного типа и ответа на аттенуированные патогенные микроорганизмы.
В качестве альтернативы пробиотическому действию, пептиды или ворсинчатые структуры по изобретению могут осуществлять в клетке или у субъекта другое действие. Это другое действие также может происходить отдельно или в дополнение к пробиотическому действию. Пробиотическое действие может представлять собой комбинацию другого иммуномодулятора(ов) и пептидов или ворсинчатых структур.
По настоящему изобретению индивидуумом для лечения или профилактики может являться любой эукариотический организм, предпочтительно человек или животное, особенно комнатные животные и продуктивные животные. Животного можно выбирать из группы, состоящей из продуктивных животных и комнатных животных, таких как коровы, лошади, свиньи, козы, овцы, домашняя птица, собаки, кошки, кролики, пресмыкающиеся и змеи.
Способы скрининга
Любой полинуклеотид по изобретению или любой его фрагмент можно использовать для скрининга бактериальных штаммов со сходными ворсинчатыми структурами. В способе скрининга бактериальных штаммов по меньшей мере один полинуклеотид или его фрагменты, кодирующие пептиды ворсинок или их фрагменты можно определять, например, основанными на ПЦР способами, такими как общепринятые ПЦР и секвенирование или мини-секвенирование; способы гибридизации, такие как саузерн- или нозерн-гибридизация; любые биоинформатические способы с использованием различных программ и параметров; и любые основанные на антителах способы с применением антител к пептидам по изобретению, проточной цитометрии, иммунопреципитации, коиммунопреципитации, иммуногистохимии, иммунофлуоресцентного способа, способов ELISA и ELIS-POT. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения новые бактериальные штаммы с ворсинчатыми структурами подвергают скринингу ПЦР с использованием праймеров, сконструированных на основе генов ворсинок LGG. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения новые бактериальные штаммы с ворсинчатыми структурами подвергают гибридизации по Саузерну с использованием в качестве зондов продуктов амплификации генов LGG по изобретению.
В способах скрининга гомологичных полинуклеотиду по изобретению последовательностей или фрагментов предпочтительными являются жесткие условия гибридизации для праймеров или зондов. Как применяют в настоящем документе, "гомологичная последовательность" или "последовательность с высокой идентичностью" относится к последовательности, которая может являться идентичной, но которая не должна быть идентичной другой последовательности. Однако последовательности являются сходными и обладают высоким % идентичности.
"Биологически подобные фрагменты" относятся к сходным последовательностям или последовательностям с процентом идентичности более 35% и длиной более 50 аминокислот.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения новые бактериальные штаммы и метапопуляции с ворсинчатыми структурами подвергают скринингу посредством компьютерных подходов на основе существующих или вновь создаваемых списков или баз данных последовательностей.
Образец для скрининга можно получать из любого организма или любого материала, и он может представлять собой, например, бактериальную культуру, образец ткани, образец крови (образец сыворотки или плазмы), образец пищи или образец из окружающей среды. В предпочтительном варианте осуществления изобретения бактериальный штамм для скрининга является потенциальным пробиотическим бактериальным штаммом.
С применением способов скрининга по изобретению возможно детектировать штаммы, родственные с патогенными бактериальными штаммами или бактериальными штаммами, содержащими известные патогенные компоненты. Такие штаммы могут содержать последовательности с функциональностью, соответствующей фрагментам последовательностей по настоящему изобретению, таким как SEQ ID NO:4 (GG00444), и с идентичностью последовательностей по меньшей мере от 35 до 100%, или содержать полинуклеотид по настоящему изобретению, такой как полинуклеотид, содержащий SEQ ID NO:12 или его вырожденную форму, или кодирующий пептид по настоящему изобретению.
in vivo
in vitro
in silico
ex vivo
По настоящему изобретению скрининг можно проводить в условиях , ,  или .
Настоящее изобретение проиллюстрировано приведенными ниже примерами, которые никоим образом не предназначены для ограничения.
Пример 1. Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантных пилиновых белков LGG
Eco
Sac
Xho
Eco
Sac
Xho
E. coli
E. coli
2
4
2
4
2
4
280
2+
Кодирующие последовательности SpaA (GG00442), SpaB (GG00443), SpaC (GG00444), SpaD (GG02370), SpaE (GG02371) и SpaF (GG02372), исключая область, кодирующую N-концевой сигнальный пептид и C-концевой сигнал формирования клеточной стенки (CWSS), амплифицировали посредством ПЦР с геномной ДНК LGG с использованием пар олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих 5'- и 3'-концы, один - содержащий участок RI (участок I для GG02372), а другой - с участком I (см. Таблицу 1). Амплифицированные фрагменты ПЦР расщепляли рестрикционными эндонуклеазами RI (или I для GG02372) и I, затем лигировали в соответствующие участки в регулируемый T7 экспрессирующий вектор pET28b+, и полученные рекомбинантные плазмиды (pKTH5319 для GG00442, pKTH5320 для GG00443, pKTH5321 для GG00444, pKTH5324 для GG02370, pKTH5379 для GG02371 и pKTH5341 для GG02372) выращивали в штамме  BL21 (DE3) pLysS с экспрессией внутриклеточных белков, меченных на C-конце гексагистидином. При всех манипуляциях с ДНК использовали общепризнанные способы с использованием стандартных протоколов. Для получения белка  выращивали при 37°C до середины фазы логарифмического роста в среде Лурия-Бертани, дополненной 50 мкг/мл канамицином, экспрессию белка индуцировали в течение три часов посредством 1 мМ IPTG, клетки собирали посредством центрифугирования и клеточный осадок ресуспендировали в лизирующем буфере [50 мМ NaHPO (pH 8,0), 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол]. Клетки разрушали посредством ультразвукового облучения, очищали посредством центрифугирования и бесклеточные лизаты пропускали через 0,45 мкм фильтр. Затем меченные гексагистидином пилиновые белки очищали посредством Ni-хелатирующей аффинной хроматографии. В кратком изложении, каждый из бесклеточных лизатов наносили на колонку с Ni-NTA агарозой (Qiagen), промывали промывочным буфером [50 мМ NaHPO (pH 8,0), 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол] и белки элюировали с колонки элюирующим буфером [50 мМ NaHPO (pH 8,0), 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол]. Колоночные фракции, содержащие очищенные белки, объединяли, буфер заменяли на 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0) для белков SpaA (GG00442), SpaC (GG00444), SpaD (GG02370), SpaE (GG02371) и SpaF (GG02372) и 50 мМ ацетат натрия (pH 5,1) для белка SpaB (GG00443) с использованием колонки для высаливания BioRad EconoPac 10 DG и концентрировали с использованием 30 кДа фильтра Microsep (Pall Life Sciences). Чистоту рекомбинантных пилиновых белков контролировали посредством SDS-PAGE, а концентрации белков определяли посредством измерений A.
Пример 2. Получение специфичных к рекомбинантным пилиновым белкам LGG поликлональных антител
Поликлональные антитела кролика, специфичные к пилиновым белкам SpaA (GG00442), SpaB (GG00443), SpaC (GG00444), SpaD (GG02370), SpaE (GG02371) и SpaF (GG02372), получали в соответствии с протоколом иммунизации, описанном Johnston B.A. et al. (1991, Laboratory of Animal Science 41:15-21). В кратком изложении, сначала проводили подкожную (п/к) инъекцию (1 мл) смеси 1:1400 мкг очищенного рекомбинантного пилинового белка в полном адъювант Фрейнда с последующими тремя заходами повторных инъекций (п/к) смесей 1:1200 мкг белка в неполном адъюванте Фрейнда с трехнедельными интервалами. В завершение проводили сбор крови через две недели после последней повторной инъекции. С применением стандартных протоколов проводили получение антисывороток из крови.
Пример 3. Прогнозирование кодирующих белки последовательностей биоинформатическими способами
Прогнозирование кодирующих белки последовательностей проводили с использованием Glimmer3 (Delcher A.L. et al., 2007, Bioinformatics. 23:673-679) и анализа полногеномных последовательностей LGG. Glimmer3 использовали с применением сценария итерационного режима (g3-iterated.csh) со следующими модификации в параметрах по умолчанию: минимальная длина гена (150 п.н.) и максимальное перекрытие (50 п.н.). Начальные участки исходных прогнозов выравнивали с использованием BLAST (Altschul S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402) и поиска предполагаемых участков связывания рибосом. Прогнозы Glimmer3 для GG00441, GG00442, GG00443, GG00444, GG02369, GG02370 и GG02371 принимали как есть, тогда как прогноз для GG02372 вручную исправляли до стартовых 21 п.н. ниже по последовательности. Ро-зависимые стоп-участки прогнозировали с использованием Tran-sTermHP (Kingsford C.L. et al., 2007, Genome Biol. 8:R22.), показавшей, что GG00441, GG00442, GG00443 и GG00444; GG02369, GG02370, GG02371 и GG02372 транскрибируются в виде одного транскрипта и, таким образом, формируют собственные опероны.
Аннотации получали, конвертируя спрогнозированные кодирующие белки последовательности в последовательности белков и проводя поиск гомологии в базе данных опубликованных последовательностей (Wheeler D.L. et al., 2008, Nucleic Acids Res. 36: D13-21). Аннотации принимали только у тех последовательностей, у которых локальное выравнивание с запросом приводило к идентичности аминокислот ≥35% и покрывало ≥80% последовательности объекта. На основе этого поиска GG00441 и GG02369 были аннотированы как ферменты-сортазы; GG00444 как белок, содержащий домен фактора фон Виллебранда; GG02370 и GG02371 как консервативный гипотетический белок и GG02372 как белок наружной мембраны. Для GG00442 и GG00443 аннотаций не получили.
Дополнительные аннотации и информацию о последовательностях получали посредством объединенной информации InterPro и анализов COG (Mulder N.J. et al., 2007, Nucleic Acids Res. 35:D224-D228; Tatusov R.L. et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28:33-36) и проводя анализы конкретных доменов. Поиск конкретных доменов проводили с использованием средства Hmmsearch пакета Hmmer и с использованием моделей, ассоциированных с сортазой доменов, получаемых из общедоступных баз данных PFAM и TIGRFAM (Finn R.D. et al., 2008, Nucleic Acids Res. 36:D281-288; Haft D.H. et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31:371-373). Для поиска участков распознавания сортаз использовали следующие модели: TIGR01167, TIGR03063, TIGR03065, TIGR03068 и PF00746, а для поиска сортаз использовали следующие модели: TIGR01076, TIGR03064, PF04203 и PF07170. Проводили поиск на основе моделей fs и Is из моделей PFAM и полноразмерных моделей из моделей TIGR. Использовали оба типа поиска, поиск последовательностей и доменов. Совпадения с показателями выше, чем записанное достоверное отсечение, установленное базой данных, рассматривали как значимые. В случаях когда модель последовательности была значимой, принимали каждый удачный результат поиска домена. Эти поиски показали, что GG00441 и GG02369 являются ферментами-сортазами и что GG00442, GG00443, GG02370 и GG02372 содержат участок распознавания сортазы, таким образом, вероятно, являясь их субстратами. Участки распознавания сортаз также искали с применением поисков с регулярными выражениями (с шаблонами LPXTG и LVNTG (Ton-That H. et al., 2004, Mol. Microbiol. 53:251-261), где X означает любую аминокислоту), выявившими следующие совпадения: GG00442 и GG00443, GG00444, GG02370, GG02371 и GG02372. E-боксы искали с использованием в качестве регулярного выражения YXXXETXXPX(G/N)X, которое получали из исходного шаблона YXLXETXAPXGY (Ton-That, H et al., 2004, Mol. Microbiol. 53:251-261). Поиск E-бокс выявил совпадения на GG00442, GG00443, GG00444, GG02370 и GG02372, подтверждая вероятность того, что эти последовательности являются субстратами сортазы. Присутствие возможных секреторных сигнальных последовательностей тестировали с использованием средства SignalP3 с использованием способов скрытой марковской модели и нейронных сетей. Во всех случаях оба способа позволили получить прогноз, что пептидные последовательности GG00441, GG00442, GG00443, GG02370, GG02371 и GG02372 содержали сигнальную последовательность, подходящую для секреции.
Пример 4. Биоинформатический скрининг по общедоступным базам данных
Пептидные последовательности, их фрагменты, их варианты, полинуклеотидные последовательности, их фрагменты или их варианты по настоящему изобретению можно использовать для проведения компьютерного поиска по общедоступным и частным коллекциям последовательностей и, таким образом, для определения бактериальных штаммов, содержащих сходные пептидные последовательности, полинуклеотидные последовательности или ворсинчатые структуры. Другим предпочтительным применением способов биоинформатического скрининга является отбор бактериальных групп с большим представительством пептидных последовательностей, полинуклеотидных последовательностей или ворсинчатых структур. Биоинформатический поиск представляет собой приемлемый способ определения штаммов с последовательностями, которые находятся в публичных коллекциях последовательностей, но которые никогда не были аннотированы или проверены экспертом.
Биоинформатический поиск проводят с использованием таких алгоритмов, как BLAST (Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402) или FASTA (Pearson, W.R. 1990, Methods Enzymol. 183:63-98) (предпочтительно используют параметры по умолчанию). Алгоритмы BLAST и FASTA применяют для сравнения выбранных последовательностей с набором других последовательностей и для получения сведений о статистически значимых соответствиях. Пептидные последовательности, полинуклеотидные последовательности или ворсинчатые структуры искали на основе, например, следующих общедоступных коллекций последовательностей, предлагаемых National Center for Biotechnology Information (NCBI): невырожденные белковые последовательности, образцы из окружающей среды, полногеномное секвенирование по методу "дробовика" и обзор геномных последовательностей; или предпочтительно на основе частной коллекции последовательностей полученной, например, с использованием высокопроизводительных способов секвенирования.
Для скрининга на значимые соответствия пептидов, проводя стандартный поиск Blast по коллекции невырожденных белковых последовательностей NCBI, используют пептидные последовательности SEQ ID NO:1-8 или их фрагменты. Когда найдено значимое соответствие пептида, бактерию, кодирующую этот представляющий интерес пептид, классифицируют как предполагаемый пробиотический штамм или как предполагаемый патогенный микроорганизм, против которого эффективен пептид.
Пример 5. Атомно-силовая микроскопия, демонстрирующая ворсинки LGG
Штамм LGG выращивали на планшете с агаром MRS (LabM) при 37°C в течение 20 часов в анаэробных условиях. Бактериальные клетки разбавляли стерильной водой, фиксировали на предметном стекле из слюды и высушивали на воздухе. Топографические и фазово-контрастные изображения бактерий получали на микроскопе Nanoscope Ilia Multimode AFM (атомно-силовой микроскоп, Digital Instruments, Santa Barbara) и J-сканнере (фиг.4).
Пример 6. Связывание рекомбинантных белков LGG со слизью кишечника человека по оценкам неколичественного анализа ELISA
in vitro.
Связывание рекомбинантных меченных гексагистидином пилиновых белков SpaA, SpaB, SpaC, SpaD, SpaF со слизью кишечника человека оценивали  В качестве источника слизи использовали удаленную ткань кишечника человека. Использование удаленной ткани кишечника человека одобрено объединенным этическим комитетом University of Turku и Turku University Central Hospital (оба из Turku, Finland), а от пациентов получали письменное информированное согласие. Слизь выделяли из здоровой части ткани, полученной у пациентов, подвергнутых хирургической операции на толстой кишке, например, вследствие колоректального рака. Обработку ткани кишечника и выделение слизи проводили, как описано ранее (Vesterlund, S. et al 2005; Res. Microbiol. 156(2):238-244; J. Microbiol. Methods 2005, 60(2):225-233). Слизь пассивно иммобилизовали на полистироловом планшете для микротитрования (Maxisorp, Nunc, Denmark) посредством инкубации в течение ночи при 4°C. Лунки три раза промывали фосфатно-солевым буфером (PBS; pH 7,2) и блокировали 0,5% (масс./об.) бычьим сывороточным альбумином (Sigma A7030) в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Блокирующий раствор удаляли и добавляли 0,5 или 0,05 нмоль меченных гексагистидином пилиновых белков в BSA-PBS с последующим 1 часом инкубации при 37°C. После инкубации и отмывок связанные белки детектировали посредством твердофазного иммуноферментного анализа. Пилиновые белки детектировали посредством антител мыши Tetra-His (Qiagen, 34670) и конъюгата Fab IgG козы, специфичных к антителам мыши, со щелочной фосфатазой (Sigma, A1293) в качестве вторичных антител. Для первичных и вторичных антител использовали разведения 1:2000 и 1:5000 (об./об.) соответственно. Добавляли субстрат динатриевую соль 4-нитрофенилфосфата (pNPP, Sigma, A7030) в диэтаноламиновом буфере с MgCl (Reagena, 170057, Finland) в концентрации 2 мг/мл и развитие окраски измеряли через 1 час при 405 нм. Результаты представляют собой среднее ± стандартное отклонение трех параллельных измерений (фиг.5a-b).
Пример 7. Выделение ассоциированных с клеточной стенкой белков ворсинок и вестерн-блоттинг
600
Свежие 10 час культуры клеток LGG и LC705 (отрицательный контроль) в MRS (LabM) инокулировали (1%) в среду mTSB (15 г/л среды TSB, BD Biosciences), обогащенную 20 г/л бактопептоном (Difco), или в среду MRS, дополненную 0,6% бычьей желчью (Sigma), и культивировали при 37°C. Рост контролировали, измеряя оптическую плотность (OD), и клетки в фазе стационарного роста собирали посредством центрифугирования.
9
2
2
Фракционирование бактериальных клеток проводили, по существу, как описано в другом источнике (Evall-Jääskeläinen, S. et al., 2003, Appl Environ Microbiol. 69:2230-2236). В кратком изложении, бактерии (10 КОЭ) однократно промывали PBS и гомогенизировали посредством трехкратного перемалывания в течение двух минут со стеклянными гранулами в клеточном измельчителе (Buhler Vibrogen-Zellmuhle). Бактериальные гомогенаты ресуспендировали в 500 мкл PBS и пять минут центрифугировали при 1000 g. Для сбора клеточных стенок супернатант центрифугировали при 16000 g в течение 30 минут при +4°C. Полученные осадки ресуспендировали в 50 мкл 50 мМ Tris-Cl (pH 8,0), дополненных 5 мМ MgCl, 5 мМ CaCl, 10 мг/мл лизоцимом и 42 ед./мл мутанолизином. Ресуспендированные осадки клеточных стенок инкубировали 3 часа при 37°C с выделением ассоциированных с клеточной стенкой полипептидов.
Ферментативно обработанные фракции клеточных стенок запускали на геле с градиентом 4-15% (Bio-Rad) и переносили на мембрану из PVDF Immobilon-P (Millipore). Мембрану подвергали анализу вестерн-блоттингом с применением набора ECL Advance™ Western Blotting Detection Kit (Amersham) по инструкциям производителя. Первичные поликлональные антитела, специфичные к пилиновым белкам SpaA и SpaC (см. пример 2) разбавляли 1:25000, а вторичное антитело в виде конъюгата IgG козы к антителам кролика (H+L) с HRP (Bio-Rad) разбавляли 1:100000. Пилиновый белок SpaB детектировали с использованием специфичных к пилиновому белку SpaB первичных поликлональных антител, конъюгата IgG козы к антителам кролика с AP (Bio Rad) и красителя BCIP/NBT.
Ворсинки у грамположительных бактерий состоят из пилиновых субъединиц, ковалентно связанных друг с другом. Мономерные пилиновые субъединицы добавляются к растущим ворсинкам одна за одной под действием сортаз, и, как следствие, в каждый конкретный момент времени каждая отдельная клетка несет на своей поверхности ворсинки различной длины (Scott J.R. and Zahner D. 2006, Mol. Microbiol. 62:320-330). Таким образом, классическим способом продемонстрировать наличие ворсинок является подвергание обработанной мутанолизин/лизоцимом фракции клеточной стенки анализу вестерн-блоттингом: если ворсинки присутствуют, на блоте будут детектировать высокомолекулярный лестничный маркер (HMW) и во многих случаях также будут наблюдать пилиновые мономеры (Scott, J.R. and Zahner, D. 2006, Mol. Microbiol. 62:320-330). Присутствие содержащих SpaA, Spa B и SpaC ворсинок у LGG очевидно на основании фиг.6a, 6b и 6c, так как в экстрактах клеточной стенки LGG с использованием специфичных к SpaA, SpaB и SpaC антител можно идентифицировать мономерные пилиновые субъединицы SpaA, Spa B и SpaC и HMW, тогда как в клетках LC705 молекулы SpaA, SpaB и SpaC отсутствуют. Время экспозиции, необходимое для записи хемилюминесцентного сигнала блота SpaC составляло 60 секунд, тогда как для блота SpaA достаточным являлось время экспозиции 1 секунда, что означает присутствие SpaA в ворсинках в больших количествах, чем SpaC. Это различие в относительных количествах может означать, что SpaA является формирующей ствол пилиновой субъединицей, тогда как SpaC может служить в качестве верхушечного адгезина ворсинки. Также примечательно, что ворсинки найдены в клетках LGG, растущих в среде, дополненной желчью, что означает, что ворсинки могут экспрессироваться в желудочно-кишечном тракте человека.
Пример 8. Скрининг новых пробиотических штаммов с ворсинчатыми структурами посредством ПЦР
2
Лактобациллы выращивали в анаэробных условиях в бульоне MRS при +37°C в течение 10 часов. Геномную ДНК выделяли, как указано ниже. 1 мл культуры центрифугируют при 14000 g в течение 2 мин. Собранные клетки ресуспендировали в 480 мкл 50 мМ ЭДТА, 100 мкл 50 мг/мл лизоцима (Amresco, Solon, OH, USA) и добавляли 20 мкл 50 ед./мкл мутанолизина (Sigma) и смесь инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Смесь центрифугировали в течение 2 мин при 14000 g, супернатант удаляли и бактериальный осадок экстрагировали с применением набора Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega) по инструкциям производителя. Очищенную ДНК суспендировали в 200 мкл буфера Tris-ЭДТА (TE). Приблизительно 200 нг геномной ДНК использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР. ПЦР проводили с использованием полимеразы Dynazyme (Finnzymes, Espoo, Finland) и олигонуклеотидных праймеров, на основе последовательностей генов GG00442, GG00443, GG00444 и GG02370, GG02371, GG02372, представленных в таблице 2. Реакцию ПЦР проводили на устройстве PCT-200 apparatus (MJ Research, Waltham, MA, USA), и реакционная смесь содержала 10 мМ Tris-HCl, 1,5 мМ MgCl, 50 мМ KCl и 0,1% Triton-X 100 (pH 8,8). Праймеры использовали в концентрации 1 мкМ, а дезоксинуклеотиды - 200 мкМ. Исходную денатурацию проводили при 94°C в течение 2 минут. Перв цикл составлял по 1 минуте каждой из 95°C, 65°C и 72°C, следующие пять циклов представляли собой по 1 минуте каждой из 95°C, 60°C и 72°C, а последние 25 циклов представляли собой по 1 минуте каждой из 95°C, 55°C и 72°C. Для остановки цикла смесь поддерживали при 72°C в течение 5 мин и при 4°C в течение 15 мин. Полосы амплифицированной ДНК разделяли посредством электрофореза в 0,7% агарозном геле (см. фиг.7a-c).
Lactobacillus casei
Во всех штаммах  LGG, LC705 и ATCC 334 наблюдали ворсинчатые структуры по изобретению (см. фиг.7a-c).
L. rhamnosus
Примеры праймеров для амплификации генов ворсинок представлены в таблице 2, но не ограничены ими. Размеры амплифицированных продуктов ПЦР с использованием ДНК GG в качестве матрицы и праймеров из таблицы 2 составляли 780 п.н., 612 п.н. и 801 п.н. для SpaA, SpaB, SpaC соответственно, а для SpaD, SpaE и SpaF - 688 п.н., 705 п.н. и 799 п.н.
Пример 9. Скрининг новых пробиотиков, содержащих гены ворсинок, посредством гибридизации по Саузерну
Hind
Новые пробиотические штаммы с ворсинчатыми структурами подвергали скринингу посредством гибридизации по Саузерну с использованием в качестве зондов продуктов амплификации LGG из примера 8. Условия гибридизации устанавливали в жесткие, позволяя гибридизацию зондов только с идентичными последовательностями, или в условия с низкой жесткостью, позволяя некоторую степень различия последовательностей. Продукты амплификации ПЦР SpaA, B, C, D, E и F очищали в легкоплавкой агарозе NuSieve (FMC Byproducts, Rockland, ME, USA) и метили посредством системы DIG (Roche Diagnostics). Тотальную ДНК бактериальных штаммов расщепляли III и полученные фрагменты разделяли в 0,7% агарозном геле. Фрагменты ДНК в агарозе переносили на нейлоновые мембраны и гибридизовали в соответствии со стандартной процедурой системы DIG. Жесткую гибридизацию проводили при 68°C, два раза отмывали в 2× SSC - 0,1% SDS при комнатной температуре и дважды в 0,1× SSC-0,1% SDS в течение 15 минут при 68°C. Гибридизацию с меньшей жесткостью проводили при 60°C, а последние две отмывки проводили в 0,5× SSC-0,1% SDS при 50°C в течение 15 минут. Гибридизацию детектировали посредством конъюгированных с щелочной фосфатазой антител и цветной реакции NBT/BCIP (система DIG, Roche).
spaC
spaB
spaA
Lactobacillus rhamnosus
На фиг.8 представлены расщепленные геномные ДНК, разделенные электрофорезом в агарозном геле (фиг.8a), и гибридизация тех же ДНК по Саузерну с использованием в качестве зондов меченных DIG продуктов амплификации ПЦР генов  (801 п.н.),  (612 п.н.) или  (780 п.н.) GG (фиг.8b-8d). Реакцию ПЦР проводили с использованием праймеров SpaC, SpaB или SpaA, приведенных в таблице 2. Гибридизацию проводили при +68°C.
spaC
spaB
spaA
L. casei
L. rhamnosus
L. rhamnosus
Сигналы гибридизации указывали на наличие ,  и  у ATCC 334 (дорожка 3) и GG (дорожка 5), но не у LC705 (дорожка 4).
Пример 10. Иммуномодуляция посредством очищенных белков ворсинок LGG
Streptococcus pyogenes
Из крови здоровых добровольцев выделяли макрофаги человека (фракция лейкоцитарного слоя), как документально описано ранее (Miettinen, M. et al., 2000, J. Immunol. 164:3733-3740; Miettinen, M. et al., 2008, J. Leuk. Biol. 84:1092-1100). По существу, это проводили с использованием свежесобранного богатого лейкоцитами слоя от 4 здоровых доноров крови (представленных Finnish Red Cross Blood Transfusion Service, Helsinki Fl) и с выделением мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) посредством центрифугирования в градиенте фиколл-пака (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala SE). Моноциты очищали из PBMC посредством адгезии на шестилуночные пластиковые планшеты (Falcon Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ, US) и культивировали в течение 7 суток в бессывороточной среде для макрофагов (Gibco Invitrogen, Grand Island NY, US) в присутствии 10 нг/мл рекомбинантного GM-CSF человека (rh GM-CSF) (Leucomax, Schering-Plough, Innishannon, IRL) с получением макрофагов. Макрофаги инкубировали в концентрации приблизительно 4 миллиона клеток на лунку в 6-луночном планшете для микротитрования и стимулировали эквивалентным количеством живых бактерий (LGG и T1M1 ) или приблизительно 3, 100, 3000 или 10000 и т.д., фмоль очищенных меченных меткой His белков LGG SpaA и SpaC. После инкубации в течение 6 час и 24 часов определяли изменение количеств иммунных маркеров, или активацию сигнальных путей, или экспрессию рецепторов, как описано ранее (Miettinen, M. et al., 1996, Infec. Immunol. 64:5403-5405; Miettinen, M. et al., 2000, J. Immunol. 164:3733-3740; Miettinen, M. et al., 2008, J. Leuk. Biol. 84:1092-1100).
6
На фиг.9 представлены уровни TNF-α при стимуляции макрофагов живыми бактериями LGG (2×10 КОЭ/мл) или очищенными меченными меткой His белками LGG SpaA, SpaB и SpaC (приблизительно 30 пмоль/мл). При стимуляции SpaA и SpaC уровни TNF-α возрастали.
S. pyogenes
Как правило, клетки пробиотического LGG и патогенного T1M1  демонстрируют иммуномодулирующую активность и индуцируют у PBMC или макрофагов специфический Th1-подобный ответ (Miettinen, M. et al., 2000, J. Immunol. 164: 3733-3740; Veckman, V. et al., 2003, J. Leuk. Biol. 74:395-402). Примечательно, что очищенные белки ворсинок LGG также индуцируют ответ у макрофагов, демонстрируя их функциональность для иммуномодуляции. Кроме того, эти эксперименты демонстрируют, что белки ворсинок LGG дают сигнал клеткам-хозяевам человека.
Пример 11. Анализ конкуренции с использованием белков ворсинок LGG
Обработку ткани кишечника и выделение слизи проводили, как описано в примере 6.
Enterococcus faecium
E. faecium
-1
-1
-1
600
Анализ конкуренции проводили в соответствии с Vesterlund, S. et al., 2006 (Microbiology 152(6): 1819-1826). Слизь (Sigma) в концентрации 0,5 мг/мл пассивно иммобилизовали на полистироловом планшете для микротитрования (Maxisorp, Nunc, Denmark) посредством инкубации в течение ночи при 4°C. Лунки два раза промывали фосфатно-солевым буфером (PBS; pH 7,2).  культивировали в бульоне с сердечно-мозговым экстрактом, а LGG в бульоне MRS в анаэробных условиях в течение ночи при 37°C. В культуру  для метаболического радиоактивного мечения бактерий добавляли 10 мкл мл [5'-3H]тимидина (16,7 Ки ммоль; 618 ГБк ммоль). Бактериальные клетки собирали посредством центрифугирования и дважды промывали буфером PBS. OD бактериальных суспензий доводили PBS до 0,25.
E. faecium
Клеточную суспензию  с доведенной концентрацией добавляли в лунки в объеме 100 мкл, в каждом эксперименте использовали пять параллельных лунок. Бактериям позволяли прикрепляться в течение 1 часа при 37°C и лунки два раза промывали 200 мкл PBS для удаления неприкрепившихся бактерий. Добавляли 100 мкл клеточной суспензии LGG с доведенной концентрацией или 0,5 нмоль белка SpaC в 100 мкл буфера PBS, а затем проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°C. Лунки два раза промывали 200 мкл PBS и бактерии, связанные со слизью, выделяли и лизировали 1% SDS - 0,1 M NaOH посредством инкубации при 60°C в течение 1 часа с последующим измерением радиоактивности посредством жидкостной сцинтилляции. Степень адгезии (%) бактерий рассчитывали, сравнивая количество прикрепившихся бактерий с количеством добавленных бактерий. Для определения значимости различий между контролем и образцами (P<0,05) применяли парный t-критерий Стьюдента.
E. faecium
На фиг.10 показано, что LGG и пилиновые белки SpaA, SpaB и SpaC LGG вытесняли прикрепившуюся патогенную бактерию () из слизи кишечника человека.