ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ N-АЦЕТИЛНЕЙРАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ

1. Не встречающийся в природе микроорганизм, способный продуцировать ацетилнейраминовую кислоту (Neu5Ac), отличающийся тем, что у указанного не встречающегося в природе микроорганизма имеется путь синтеза сиаловой кислоты, включающий по меньшей мере один гетерологичный фермент, причем в микроорганизме блокирован природный катаболический путь сиаловой кислоты, блокирована по меньшей мере одна система фосфоенолпируват: сахар-фосфотрансфераза для импорта сахарида, который не используется в качестве источника углерода в процессе ферментативного продуцирования Neu5Ac, и при этом микроорганизм может использовать источник экзогенного углерода, присутствующий в ферментативном бульоне, в качестве единственного источника углерода, не используя систему фосфоенолпируват : сахар-фосфотрансфераза для доступа к указанному источнику экзогенного углерода.
2. Не встречающийся в природе микроорганизм по п. 1, в котором путь биосинтеза сиаловой кислоты включает следующие ферменты: глутамин-фруктозо-6-фосфатаминотрансферазу, глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазу, N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу, синтазу N-ацетилнейраминовой кислоты и сахар-фосфатазу суперсемейства HAD-подобных фосфатаз.
3. Не встречающийся в природе микроорганизм по п. 1 или 2, в котором по меньшей мере один из ферментов пути биосинтеза сиаловой кислоты представляет собой гетерологичный фермент.
4. Не встречающийся в природе микроорганизм по любому из пп. 1-3, в котором блокирован природный катаболический путь сиаловой кислоты.
5. Не встречающийся в природе микроорганизм по любому из пп. 1-4, в котором один или более генов, кодирующих фермент, который участвует в катаболическом пути сиаловой кислоты, удален из генома не встречающегося в природе микроорганизма, в котором нарушена экспрессия одного или более генов, кодирующих фермент, который участвует в катаболическом пути сиаловой кислоты, или в котором изменена нуклеотидная последовательность области, кодирующей белок, по меньшей мере одного гена, кодирующего фермент, который участвует в катаболическом пути сиаловой кислоты, в результате чего полипептид, кодируемый измененной нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок, не обладает ферментативной активностью фермента, кодируемого неизмененной нуклеотидной последовательностью.
6. Не встречающийся в природе микроорганизм по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанный не встречающийся в природе микроорганизм генетически модифицирован, для делеции одного или более генов, выбранных из группы генов, кодирующих N-ацетилманнозаминкиназу, N-ацетилманнозамин-6-фосфатэпимеразу, альдолазу N-ацетилнейраминовой кислоты и пермеазу сиаловой кислоты, в котором нарушена экспрессия одного или более указанных генов или в котором изменена нуклеотидная последовательность области, кодирующей белок, по меньшей мере одного из указанных генов, в результате чего полипептид, кодируемый указанной измененной нуклеотидной последовательностью, не обладает ферментативной активностью фермента, кодируемого неизмененной нуклеотидной последовательностью.
7. Не встречающийся в природе микроорганизм по любому из пп. 1-6, в котором устранены активности одного или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из N-ацетилглюкозамин-6-фосфатдезацетилазы и N-ацетилглюкозамин-6-фосфатдезаминазы.
8. Не встречающийся в природе микроорганизм по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что указанный не встречающийся в природе микроорганизм генетически модифицирован, для устранения активности N-ацетилглюкозамин-6-фосфатдезацетилазы и/или N-ацетилглюкозамин-6-фосфатдезаминазы за счет делеции одного или обоих генов, кодирующих указанные ферменты, за счет нарушения экспрессии одного или обоих указанных генов или за счет мутации в кодирующей белок области одного или обоих генов, в результате чего полипептид, кодируемый каждой из измененных нуклеотидных последовательностей, не обладает ферментативной активностью фермента, кодируемого неизмененной нуклеотидной последовательностью.
9. Не встречающийся в природе микроорганизм по любому из пп. 1-8, в котором блокирована по меньшей мере одна фосфоенолпируват (РЕР)-зависимая система фосфотрансферазы - переносчик сахара для импорта углевода.
+
+
10. Не встречающийся в природе микроорганизм по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что указанный не встречающийся в природе микроорганизм включает симпортер сахарида/Н, предпочтительно симпортер сахарида/Н, выбранный из группы, состоящей из симпортера сахарозы-протона, симпортера лактозы-протона и симпортера глюкозы-протона.
11. Не встречающийся в природе микроорганизм по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что указанный не встречающийся в природе микроорганизм обладает улучшенным биосинтезом PEP по сравнению с микроорганизмом дикого типа, предпочтительно в результате сверхэкспрессии РЕР-синтазы.
12. Не встречающийся в природе микроорганизм по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что не встречающийся в природе микроорганизм не содержит одного или более, выбранных из группы, состоящей из функциональной РЕР-карбоксилазы, функциональной глутаматсинтазы, функционального WzxC-белка, функциональной трансферазы UDP-глюкозы:ундекапренилфосфат-глюкозо-1-фосфата, функциональной β-галактозидпермеазы, функциональной β-галактозидазы, функционального YjhC-белка, функциональной фукозоизомеразы, функциональной фукулокиназы и функциональной N-ацетилглутаминаминоацилазы.
13. Не встречающийся в природе микроорганизм по любому из пп. 1-12, отличающийся улучшенным синтезом глутамина по сравнению с микроорганизмом дикого типа, предпочтительно в результате сверхэкспрессии глутаминсинтазы.
14. Применение не встречающегося в природе микроорганизма по любому из пп. 1-13 для получения Neu5Ac.
15. Способ получения Neu5Ac посредством ферментации с использованием не встречающегося в природе микроорганизма, способного продуцировать Neu5Ac, где способ включает следующие этапы:
a) предоставление не встречающегося в природе микроорганизма по любому из пп. 1-13;
b) культивирование не встречающегося в природе микроорганизма в ферментативном бульоне в условиях, пермиссивных для продуцирования Neu5Ac не встречающимся в природе микроорганизмом; и
c) необязательно выделение Neu5Ac из ферментативного бульона.
16. Способ по п. 15, в котором ферментативный бульон содержит источник углерода для роста не встречающегося в природе микроорганизма, при этом указанный источник углерода предпочтительно выбран из группы, состоящей из глюкозы, ксилозы, сахарозы, фруктозы, лактозы, глицерина, синтез-газа и их комбинаций.
17. Применение Neu5Ac, полученной способом по п. 15 или 16, для изготовления питательной композиции.
18. Питательная композиция, содержащая Neu5Ac, полученную способом по п. 15 или 16.
19. Питательная композиция по п. 18, где указанная композиция также содержит по меньшей мере один олигосахарид грудного молока (НМО), предпочтительно по меньшей мере один нейтральный НМО и/или по меньшей мере один сиалилированный НМО.
20. Питательная композиция по п. 18 или  19, где указанная питательная композиция также содержит пробиотический микроорганизм.
21. Питательная композиция по любому из пп. 18-20, где указанная питательная композиция представляет собой композицию, выбранную из группы, состоящей из лекарственных препаратов, детских питательных смесей и пищевых добавок.
22. Питательная композиция по любому из пп. 18-21, где указанная питательная композиция находится в жидкой форме, предпочтительно в форме концентрата или готовой для питья форме, или в твердой форме, предпочтительно в виде порошка, гранул, хлопьев или крупинок.
23. Детская питательная смесь, содержащая Neu5Ac, полученную способом по любому из пп. 15, 16.