Разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики краснухи

показателем нарушения клеточных мембран и выхода фермента в кровь.

У обследованных больных с хроническим пиелонефритом единственной почки только в активной стадии достоверно увеличено содержание церулоплазмина, который обладает супероксиддисмутазной активностью. Возможно, это компенсаторная реакция организма. В то же время известно, что це-рулоплазмин при активации свободнорадикального окисления может проявлять прооксидантную активность вместо антиок-сидантной. Коэффициент антиоксидантной защиты у больных с хроническим пиелонефритом единственной почки в активной и латентной стадии воспаления достоверно ниже, чем в контрольной группе (см. табл. 2).

Полученные результаты свидетельствуют об активности процессов ПОЛ и нарушении баланса между про- и антиокси-дантной системами у обследованных больных в обеих фазах заболевания.

Таким образом, проведенное сравнительное исследование позволило установить, что у больных с хроническим пиелонефритом единственной почки нарушены противоинфекци-онные реакции иммунной системы и баланс между про- и антиоксидантной системами как в активной, так и в латентной стадии заболевания. Отмеченные изменения могут иметь значение в генезе ряда ведущих симптомов этого тяжелого заболевания. Полученные результаты, по нашему мнению, свидетельствуют о необходимости проведения комплексного иммунологического и биохимического обследования больных с хроническим пиелонефритом единственной почки, которое может быть использовано для прогноза осложнений (низкая

фагоцитарная и высокая лизосомальная активность) и тяжести состояния больных, а также для проведения целенаправленной терапии с целью коррекции нарушений в иммунной и антиоксидантной системах и оценки эффективности проводимой терапии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Большая энциклопедия медицинской диагностики / Абрамович О. Д., Попович С. Е., Самарцев П. К. и др. - М., 2007. - С. 343.

2. Босин В. Ю, Дерюгина Л. А. // Сов. мед. - 1990. - № 8. - С. 41-51.

3. Винницкий Л. И., Бунятян К. А., Инвияева Е. В. // Аллергол. и иммунол. - 2007. - Т. 8, № 2. - С. 203-205.

4. Калугина Г. В., Клушанцева М. С., Шехаб Л. Ф. Хронический пиелонефрит. - М., 1993.

5. Корецкая И. А., Гева О. Н., Вавилова Т. П. // Клин. лаб. диагн. -2010. - № 9. - С. 60-64.

6. Лабораторные методы исследования / Под ред. В. В. Меньшикова. - М., 1987.

7. Переверзев А. С. Инфекции в урологии. - Харьков, 2006.

8. Румянцев В. Ю., Лопаткин Н. А., Яненко Э. К. // Урология. -2001. - № 4. - С. 6-9.

9. ТерехинаН. А., ПетровичЮ. А. Свободно-радикальное окисление и антиоксидантная система. - Пермь, 1992.

10. Baudoin P., Provost A. P., Molenuar J. C. // Am. J. Kidney Dis. -1993. - Vol. 21, N 6. - P. 603-611.

11. ReeaR. S. // Rev. Med. Microbiol. - 1992. - Vol. 3. - P. 9-14.

12. Roberts J. A., KuackM. B., Martin L. N. // Urol. Res. - 1995. - Vol. 23, N 1. - P. 33-37.

Поступила 22.04.11

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616.916.1-078.33

С. Г. марданлы, Е. А. Амелина, Р. Р. Гафаров

разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики краснухи

Закрытое акционерное общество «ЭКОлаб», Электрогорск московской области

Разработаны две новые иммуноферментные тест-системы для лабораторной диагностики краснухи, в которых использованы натуральный антиген вируса краснухи. Тест-системы по своим характеристикам не уступают известным зарубежным аналогам и могут быть рекомендованы для широкого использования в клинико-диагностических лабораториях учреждений здравоохранения при определении антител классов G, M к вирусу краснухи как для диагностики заболевания, так и для массового серологического изучения иммунного статуса населения и оценки эффективности вакцинации.

Ключевые слова: иммуноферментный анализ, антитела, краснуха

S.GMardanly, Ye.A. Amelina. R.R. Gafarov

THE DEVELOPMENT OF IMMUNE-ENZYME TEST-SYSTEMS TO DIAGNOSE RUBELLA

Two new immune-enzyme test-systems are developed to diagnose rubella using the natural antigen of rubella virus. The test-systems by their characteristics are equal with the known international models and can be recommended for large implementation in clinical diagnostic laboratories of health institutions to detect antibodies classes G, M to rubella virus both for disease diagnosis and mass serologic examination of immune status ofpopulation and evaluation of effectiveness of vaccination.

Key words: immune-enzyme analysis, antibody, rubella

Среди методов серологической диагностики краснухи в настоящее время наиболее отвечает требованиям лабораторной практики иммуноферментный анализ (ИФА). Он достаточно прост, быстровыполним, высокочувствителен и специфичен; возможна автоматизация постановки и документирования результатов анализа.

Для корреспонденции: Амелина Елена Анатольевна, сотр.

Адрес: 142530, Московская обл., Электрогорск, ул. Буденного, 1

Телефон: (49643) 3-17-45

Е-таП:еко1аЬ^еЬ^аг@таП.га

Известно, что антитела класса М (]^М-антитела) к вирусу краснухи появляются в крови уже через 1 нед после инфицирования и сохраняются в течение последующих 1—3 мес. Антитела класса О (^О-антитела) появляются вскоре после появления IgМ-антител и сохраняются, как правило, на всю оставшуюся жизнь [5]. Только в редких случаях их не удается определить через 15—20 лет после перенесенной краснухи. Реинфицирование в таких случаях приводит к их повторному появлению с резким подъемом титров на фоне бессимптомного течения инфекции.

С учетом этих особенностей динамики антителообразова-ния при краснухе ИФА может быть использован как для ранней диагностики первичной краснухи, так и для диагностики

ИММУНОЛОГИЯ

бессимптомно текущей реинфекции. Для ранней диагностики наиболее ценно выявление в крови пациента IgM-антител. Наличие IgG-антител при отсутствии в анамнезе указаний на вакцинацию позволяет однозначно установить факт инфицирования, а динамика их титра позволяет оценить его давность [4]. Кроме того, нарастание титра IgG-антител при отсутствии выраженной симптоматики процесса может быть единственным доказательством наличия реинфекции или развития активного процесса у вакцинированного человека. ИФА очень важен для окончательной диагностики у беременных состояний, сходных по клинической картине с краснухой, либо для оценки последствий контакта их с больными [3].

В связи с этим, очевидно, необходимо изначально проводить скрининг женщин детородного возраста, посещающих центр планирования семьи, и при отсутствии антител к вирусу краснухи рекомендовать вакцинацию для профилактики инфекции. Обследование беременных на наличие антител методом ИФА позволяет в кратчайшие сроки подтвердить или отвергнуть диагноз краснухи и дать обоснованные врачебные рекомендации [2].

Для пренатальной диагностики важное значение имеет обнаружение IgM-антител в крови плода, полученной при кордоцентезе.

При диагностике врожденной краснухи у новорожденных обычно исследуют кровь пуповины и сыворотку новорожденного на наличие IgM-антител. Отсутствие антител в неонатальном периоде исключает диагноз врожденной краснухи. Последующие исследования новорожденных до 1 года включают в себя определение IgM- и IgG-антител. Обнаружение специфических IgG-антител в течение 6 мес после рождения указывает на высокую вероятность врожденной инфекции, так как инфицирование детей в этом возрасте происходит довольно редко.

Необходимо отметить, что ИФА важен также при оценке реактогенных свойств и антигенной активности вакцинных препаратов при иммунизации детей и женщин детородного возраста [1].

Среди иммуноферментных тест-систем для выявления антител к вирусу краснухи наиболее перспективны те, в которых используются натуральные высокоочищенные антигены вируса, поскольку это существенно повышает чувствительность и специфичность анализа.

Целью работы явились разработка и изучение возможностей иммуноферментных тест-систем (на основе натуральных антигенов) для выявления IgM- и IgG-антител к вирусу краснухи: "ИФА-Краснуха-IgM-capture" и "ИФА-Краснуха-IgG".

Материалы и методы. В качестве вирусного антигена использован антиген вируса краснухи, штамм HPV 77 (ATCC), полученный в культуре перевиваемых клеток Vero.

Концентрированный препарат антигена вируса краснухи был очищен высокоскоростным центрифугированием в градиенте сахарозы. Степень чистоты полученного антигена, оцененная в электрофорезе в полиакриламидном геле (по методу Лэммли), составила не менее 90%. Концентрация белка (по методу Брэдфорда) составляла от 0,2 до 0,9 мг/мл. До использования препарат антигена хранился при температуре -70oC.

Инактивацию вирусной массы производили обработкой детергента (0,02% SDS).

В качестве твердой фазы при изготовлении иммуносор-бента были использованы высокосорбционные планшеты Nunc maxisorp (Дания).

Антиген вируса краснухи сорбировали в оптимальной концентрации в карбонатно-бикарбонатном буферном растворе рН 9,6. Блокирование свободных участков иммуно-сорбента производили 1% раствором БСА в трис-буфере (sigma).

При конструировании тест-системы для выявления IgM-антител реализован capture-метод (метод ловушки) ИФА на твердой фазе, для чего в качестве специфического компонента иммуносорбента были использованы антитела к IgM человека. Иммобилизация анти-IgM-антител была выполнена в

концентрации 5 мкг/мл в карбонатно-бикарбонатном буфере рН 9,6 с блокировкой раствором сахарозы в фосфатном буферном растворе рН 7,2 (25 г/л).

Для повышения стабильности и увеличения срока хранения полученных иммуносорбентов их сушили под вакуумом и помещали в пластиковые пакеты, которые запаивали в атмосфере азота.

Для детекции вирусспецифических IgG-антител использовали пероксидазный конъюгат к Fc-фрагменту IgG человека (Jackson). Для детекции вирусспецифических IgM-антител использовали антигенный пероксидазный конъюгат (Bio-Kit, Испания). В качестве хромогена применяли стабилизированный раствор тетраметилбензидина.

Количественную оценку содержания антител в исследуемых образцах проводили на основе международного стандарта ВОЗ (RUBI-1-94). При оценке результатов использовали статистическую программу PARALINE (В. Г. Петухов, ГИСК им. Л. А. Тарасевича).

Образцы сывороток крови здоровых людей, пациентов вакцинированных против краснухи, и больных с другими инфекциями были любезно предоставлены нам ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора; образцы сывороток крови больных краснухой были получены из Центра акушерства и перинатологии.

Результаты и обсуждение. Тест-система «ИФА-Краснуха-IgM-capture" предназначена для качественного определения IgM-антител к вирусу краснухи в сыворотке крови. В ней реализован capture-метод ИФА на твердой фазе. При наличии в образце IgM-антител к вирусу краснухи они связываются с антителами к IgM человека, сорбированными в лунках планшета, т. е. как бы захватываются, фиксируются иммуносорбентом, что облегчает последующее их связывание с антигеном вируса краснухи, меченным перок-сидазой (конъюгат), после добавления его в лунку. Комплекс анти-IgM иммуносорбента + IgM к вирусу краснухи образца + антиген вируса краснухи конъюгата выявляется затем по цветной реакции с субстратом пероксидазы (ТМБ).

Эта тест-система была испытана в сравнении с аналогичными тест-системами Abbott Labs EIA Rubazyme-M и Gull Labs ELISA Rubella IgM на двух сероконверсионных панелях сывороток BBI (№ 55003 и 57001); в обеих панелях было по 20 сывороток, каждому номеру сыворотки соответствовал свой день наблюдения. Результаты испытаний показали практически идентичную дифференциацию "положительных" (ОПсыв/ ОПК 1 и более) и «отрицательных» (ОП /ОПК менее

пор 7 JT ^ Ч сыв пор

1) сывороток в тест-системах «ИФА-Краснуха-IgM-capture" и Abbott Labs EIA Rubazyme-M. Несколько ниже оказалась чувствительность тест-системы Gull Labs ELISA Rubella IgM. Все тест-системы показали практически одинаковую динамику титров IgM-антител.

Тест-система «ИФА-Краснуха-IgG" предназначена не только для выявления, но и для количественного (в МЕ/мл) определения содержания IgG-антител в сыворотке крови.

В отличие от тест-системы "ИФА-Краснуха-IgM-capture" она основана на обычном непрямом методе ИФА. При наличии в исследуемом образце IgG-антител к вирусу краснухи они связываются с антигенами возбудителя, сорбированными в лунках планшета. Образовавшийся комплекс после добавления в лунки конъюгата — антител к иммуноглобулинам человека, меченных пероксидазой, связывается с ними. Наличие комплекса антиген иммуносорбента + IgG-антитело образца + анти-IgG конъюгата выявляется затем по цветной реакции с субстратом пероксидазы (ТМБ).

Тест-система "ИФА-Краснуха-IgG" комплектуется четырьмя калибраторами — положительными контрольными сыворотками с известным содержанием (в МЕ/мл) антител к вирусу краснухи, подтитрованным по международному стандарту содержания антител (NIBSC, London), что позволяет строить калибровочный график зависимости оптической плотности от содержания антител и по нему определять содержание антител в исследуемых образцах.

Эта тест-система была испытана на тех же сероконверси-онных панелях сыворток в сравнении с аналогичными тест-системами — Abbott Labs EIA Rubazyme-G и Gull Labs ELISA RUBELLA IgG.

Тест-системы в этих испытаниях дали практически одинаковую картину как дифференциации сывороток на положительные и отрицательные, так и динамика нарастания концентрации IgG-антител в сыворотках обеих панелей, т. е. их использование для оценки динамики содержания IgG-антител к вирусу краснухи у одного и того же больного было практически равноценно.

Внутренние верификационные испытания тест-системы «ИФА-Краснуха-IgM-capture" были проведены на предприятии ЗАО "ЭКОлаб" на 218 образцах. В качестве тест-системы сравнения была использована тест-система EIA-Rubella IgM (DSL, США). Специфичность на сыворотках (в количестве 218) составила 96%, чувствительность — 98%.

В ГИСК им. Л. А. Тарасевича были приведены государственные испытания диагностической эффективности тест-систем "ИФА-Краснуха-IgM-capture" и "ИФА-Краснуха-IgG" по программе, утвержденной Комитетом МИБП.

Материалом для исследования служили образцы сыворотки крови больных с клинически выраженной краснухой, пациентов, контактных с больными краснухой, больных с другими инфекционными заболеваниями, сопровождающимися сыпью и здоровых людей.

Препараты оценивали по трем показателям: чувствительности, специфичности, воспроизводимости.

Чувствительность оценивали по проценту положительных реакций при исследовании образцов сыворотки больных краснухой и пациентов, вакцинированных против краснухи.

Специфичность оценивали по проценту отрицательных реакций при исследовании сывороток здоровых людей и больных с другими заболеваниями.

Воспроизводимость оценивали по величине коэффициента вариации оптической плотности при исследовании отрицательных, слабоположительных и сильноположительных образцов.

Оценка специфичности и чувствительности тест-системы «ИФА-Краснуха-IgM-capture" была проведена на 190 образцах в сравнении с тест-системой отечественного производства, изготовленной с использованием рекомбинантных белков.

Согласно заключению специалистов ГИСК им. Л. А. Тарасевича, тест-система "ИФА-Краснуха-IgM-capture" в этих испытаниях по чувствительности превосходила набор сравнения, а по специфичности практически не отличалась от нее.

Воспроизводимость результатов, полученных с тест-системой "ИФА-Краснуха-IgM-capture", была высокой; коэффициент вариации не превышал 8%.

Высокая чувствительность и специфичность тест-систем "ИФА-Краснуха-IgM-capture" и "ИФА-Краснуха-IgG" подтверждена также испытаниями, проведенными Экспертной лабораторией ГУЗ "Городской диагностический центр (вирусологический)" Комитета по здравоохранению правительства Санкт-Петербурга, в которых в качестве референсных использовались тест-системы Rubella IgM EIA recomb Rubella IgG EIA recomb фирмы Roche (Швейцария).

Заключение. Результаты испытаний двух новых тест-систем для лабораторной диагностики краснухи — "ИФА-Краснуха-IgM-capture" и "ИФА-Краснуха-IgG" — показали, что по своим характеристикам эти тест-системы не уступают известным зарубежным аналогам, изготовленным с использованием натуральных вирусных антигенов, и могут быть рекомендованы для широкого использования в клинико-диагностических лабораториях учреждений здравоохранения при определении антител классов G, M к вирусу краснухи как для диагностики заболевания, так и для массового серологического изучения иммунного статуса населения и оценки эффективности вакцинации.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бектимиров Т. А. // Вакцинация. — 2004. — № 6. — С. 36.

2. Семенов В. М., Астапов А. А., Дмитраченко Т. М. Краснушная инфекция. — М., 1994.

3. Grangeot-Keros L., Pillot J., Daffos F., Forester F. // J. Infect. Dis. — 1988. — Vol. 158. — P. 138—143.

4. Valoup-Fellous C., Grangeot-KerosL. // Clin. Vac. Immunol. — 2007. — Vol. 14. — P. 644—647.

5. WilsonK. M, Camillo C. D., Doughty L., DaxE. M. // Clin. Vac. Immunol. — 2006. — Vol. 13. — P. 380—386.

Поступила 18.04.11

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012

УДК 616.441-002-092:612.017.1]-078.33

Р. м. Зорина, А. В. Янышева, Т. П. маклакова, Т. Г. Рябичева*, В. Н. Зорина

концентрации некоторых цитоКинов и лактооеррина в крови и супернатантах культур клеток у Больных аутоиммунным тиреоидитом

ГОУ ДПО Новокузнецкий ГИУВ Росздрава, ЗАО «Вектор-Бест»*, Новосибирск

Исследовали сыворотку и супернатанты суточных культур клеток крови больных аутоиммунным тиреоидитом (АИТ) и здоровых женщин на содержание цитокинов (интерферона у, фактора некроза опухоли а, интерлейкинов 6, ip, 10, 17) и лактоферрина с использованием тест системы «Цитокин-Стимул-БЕСТ». Установлено, что у больных АИТ снижен про-лиферативный ответ клеток на митогенную стимуляцию in vitro: уровни фактора некроза опухоли а, интерлейкина 6, лактоферрина и индекс стимуляции фактора некроза опухоли а, интерлейкинов 6, ip, 10 и интерферона у были статистически достоверно ниже в супернатантах митогенстимулированных культур клеток больных АИТ по сравнению с показателями у здоровых обследованных.

Ключевые слова: цитокины, супернатанты, мононуклеары, мтогенная стимуляция, аутоиммунный тиреоидит

R.M. Zorina, A.V. Yanysheva, T.P. Maklakova, T.G. Rybitcheva, V.N. Zorina THE CONCENTRATIONS OF CERTAIN CYTOKINS AND LACTOFERRIN IN BLOOD AND SUPERNATANTS OF CELL CULTURES IN PATIENTS WITH AUTOIMMUNE THYROIDITIS The analysis was applied to .serum and supernatants of day cultures of blood cells ofpatients with autoimmune thyroiditis and healthy women to determine the content of cytokins (IFN-y, TNF-а, IL-ip, IL-6, IL-10, IL-17) and lactoferrin. The test-system "Cytokin-