СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ У ПОЛОВОЗРЕЛЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ КРЫС
METHOD OF MODELING NEURODEGENERATIVE DISEASES IN ADULT LABORATORY RODENTS

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии и фармакологии, и предназначено для моделирования нейродегенеративных процессов на лабораторных животных.
Известен способ моделирования нейродегенерации путем окклюзии средних мозговых артерий (аналог) (Tamura A, Graham DI, McCulloch J, Teasdale GM., 1981; Lopez MS, Vemuganti R., 2018), при котором окклюзия приводит к гибели части нейронов в результате инсульта, развитию глиальных реакций и рубцов, длительному состоянию неврологического дефицита. Недостатками этого способа являются: дороговизна оборудования для окклюзии сосудов, малая эффективность модели - достижение результата возможно только у 30-40% животных (остальные гибнут во время операции).
Известна модель нейродегенерации (энцефаломиелита) у мышей путем введения основного белка миелина (аналог) (Sun D.M. et al., 2001;  B.A. et al., 2004), при которой повреждается часть нейронов, формируются специфические очаги, наблюдается диффузный нейродистрофический процесс. К недостаткам этого способа можно отнести: высокую стоимость препаратов для провокации нейродегенерации, малая эффективность модели: нейродегенеративные изменения исчезают через 2-3 недели, распределение очагов поражения непредсказуемо.
Наиболее близким аналогом к предлагаемому способу (прототипом) является способ моделирования деафферентации путем введения раствора капсаицина подкожно новорожденным крысятам (Levine JD, 1990; Mione МС, 1992). В этом способе описаны изменения в клетках чувствительных ганглиев и в миелоархитектонике периферических нервов. Введение раствора капсаицина на 3-5 сутки жизни крысы позволяет избирательно разрушить часть чувствительных нейронов.
Недостатком способа является избирательность и ограниченность использования, т.к., во-первых, дегенеративные изменения исчезают через 30-40 суток из-за компенсаторных возможностей растущего организма или медленного всасывания препарата при подкожном введении; а, во-вторых, моделируемое избирательное повреждение не имеет аналогичного нейродегенеративного заболевания у человека.
Целью предлагаемого способа моделирования нейродегенеративного заболевания у половозрелых лабораторных крыс является повышение эффективности и надежности за счет длительности сохранения вызываемых нейродегенеративных изменений.
Поставленная цель достигается тем, что раствор капсаицина вводят под наркозом внутрибрюшинно, в суммарной дозе от 100 до 110 мг капсаицина на 1 кг массы животного, за три раза: в 1-е и 2-е сутки по 25-35 мг/кг, а на 3-й сутки - 40-45 мг/кг.
Новизна предлагаемого технического решения заключается в том, что раствор капсаицина вводят под наркозом, внутрибрюшинно, в суммарной дозе от 100 до 110 мг капсаицина на 1 кг массы животного, за три раза: в 1-е и 2-е сутки по 25-35 мг/кг, а на 3-й сутки - 40-45 мг/кг.
Технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого нами способа, не выявлены, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого способа критерию «изобретательский уровень».
Предлагаемый способ моделирования нейродегенеративного заболевания у половозрелых лабораторных крыс осуществляют следующим образом:
В 1-ый день лабораторной половозрелой белой крысе массой под наркозом (эфирным ингаляционным или внутримышечным) вводят внутрибрюшинно раствор, содержащий капсаицин в дозе 25-35 мг на кг массы. На 2-ой день повторно под наркозом внутрибрюшинно вводят раствор капсаицина в той же дозе: 25-35 мг/кг. На 3-ий день дозировку капсаицина повышают до 40-45 мг/кг и также вводят его раствор внутрибрюшинно под наркозом.
Исследование было выполнено на 30 белых крысах самцах линии Вистар массой 220-250 г, возраст 90-120 суток. Крыс разделяли на 3 группы: в первой группе (10 животных) материал забирали на 30 сутки после введения капсаицина, во второй группе (10 животных) материал забирали на 60 сутки, в третьей группе (10 животных) материал забирали на 90 сутки. Проводили гистологическое исследование на парафиновых срезах стандартных участков лобной и теменной долей, а также островка и гиппокампа, окрашенных тионином по Нисслю.
Через 30 суток в лобной, в теменной доле и в островке мозга крыс первой группы отмечаются очаги выраженного глиоза, нейроны в разных фазах дистрофии от обратимых изменений: вакуолизация цитоплазмы, гипохроматоз, перинуклеарное сгущение тигроида, до необратимых: гиперхромные безъядерные клетки, клетки-тени. Вовлечения в процесс оболочек не отмечается. Эти изменения характерны для хронического нейродегенеративного процесса.
Через 60 суток во всех исследованных зонах изменения сохраняются: в лобной доле, в теменной доле и в меньшей степени в островке есть признаки глиоза, разной степени дистрофии нейронов, от обратимых до необратимых.
Через 90 суток дистрофические изменения нейронов и глиоз наблюдались в коре лобной и теменной долей, в коре островка изменения отмечены лишь у 4 из 10 крыс экспериментальной группы (см. табл. 1).
Предлагаемый способ моделирования нейродегенеративного заболевания у половозрелых лабораторных крыс иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Лабораторной белой крысе, линии Вистар, массой 250 г, в возрасте 92 суток, под эфирным ингаляционным наркозом внутрибрюшинно вводили раствор капсаицина: в первые и вторые сутки - по 30 мг капсаицина на кг массы крысы. Затем, на третьи сутки - 40 мг/кг. Таким образом, суммарная доза капсаицина составила 100 мг/кг.
Через 30 суток для подтверждения наличия нейродегенеративного процесса под наркозом проводили интракардиальную перфузию физраствором и 4% нейтральным формалином, забирали полушария конечного мозга, фиксировали в 4% формалине 5 дней, заливали в парафин. Изготавливали срезы полушарий толщиной 7 мкм, депарафинировали, окрашивали тионином, заключали в бальзам. Полученные препараты микроскопировали. При патогистологической оценке в разных отделах полушария выявлялись группы нейронов вакуолизацией цитоплазмы, гипохромией, смещением ядер, безъядерные гиперхромные, клетки-тени (погибшие нейроны), вокруг них определялась глиальная реакция - скопление ядер микроглии. Очаги гибнущих клеток распределялись диффузно, наиболее выраженные изменения отмечались в коре лобной и теменной долей, наименее выраженные - в коре островка. При количественной оценке процент клеток с необратимыми изменениями составил в коре лобной доли 4% и с обратимыми изменениями - 16%, в коре теменной доли 8% и 15%, в коре островка - 7% и 7% соответственно. Описанные изменения характерны для нейродегенеративного процесса.
Пример 2
Лабораторной белой крысе линии Вистар массой 280 г, возраст 100 суток, под внутримышечным наркозом (тиопентал 0,1 мг/кг) вводили внутрибрюшинно в первые сутки 25 мг/кг капсаицина в 1,0 мл раствора (8 мл физ. раствора, 1 мл твин 80 и 1 мл 96 этилового спирта), на вторые сутки под наркозом 35 мг/кг, на третьи сутки под наркозом вводили 40 мг/кг. Суммарная доза 100 мг/кг
Через 60 суток под наркозом проводили интракардиальную перфузию физраствором и 4% нейтральным формалином, забирали полушария конечного мозга, фиксировали в 4% формалине 5 дней, заливали в парафин. Изготавливали срезы полушарий толщиной 7 мкм, депарафинировали, окрашивали тионином, заключали в бальзам. Полученные препараты микроскопировали.
При патогистологической оценке в разных отделах полушария выявлялись группы нейронов вакуолизацией цитоплазмы, гипохромией, смещением ядер, безъядерные гиперхромные, клетки-тени (погибшие нейроны), вокруг них определялась глиальная реакция - скопление ядер микроглии. Очаги гибнущих клеток распределялись диффузно, наиболее выраженные изменения отмечались в коре лобной и теменной долей, наименее выраженные - в коре островка. При количественной оценке процент клеток с необратимыми изменениями составил в коре лобной доли 1% и с обратимыми изменениями - 11%, в коре теменной доли 4% и 14%, в коре островка - 2% и 7% соответственно. Описанные изменения являются нейродистрофическими.
Предлагаемый способ моделирования нейродегенеративного заболевания у половозрелых лабораторных крыс осуществлен в межкафедральной гистохимической лаборатории ФГБОУ ВО ЯГМУ Минздрава России