СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ВОЗБУЖДЕНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ПРИ ПОМОЩИ ДЛИННОПРОБЕЖНЫХ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОЛН НА ОДНОМЕРНОМ ФОТОННОМ КРИСТАЛЛЕ
METHOD AND DEVICE FOR EXCITATING FLUORESCENCE BY LONG-RANGE SURFACE WAVES ON SINGLE-PHOTON CRYSTAL

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к оптической промышленности, к области систем засветки образца на флуоресцентных микроскопах и может быть использовано для проведения лабораторных исследований и медико-биологических анализов.
Уровень техники
На протяжении последних лет во всем мире отмечается значительный рост количества коммерчески доступных устройств для реализации различных методик в флуоресцентной микроскопии [1]. Одной из проблем широкопольной флуоресцентной микроскопии, на решение которой нацелены данные устройства, является наличие паразитного фонового сигнала от объектов, находящихся вне плоскости фокуса объектива, ухудшающего контраст получаемых микроскопических изображений.
В связи с этим ставится вопрос о создании систем засветки, позволяющих возбуждать флуоресценцию только в тонком слое объема образца. Кроме увеличения контраста получаемых изображений, несомненным преимуществом таких систем перед классическими системами объемной засветки является возможность изучать приповерхностные процессы и адсорбцию [2].
Ближайшим аналогом изобретения является метод флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (ФМПВО) [3]. В этом методе для возбуждения флуоресценции образца используют затухающую электромагнитную волну, которая локализована на границе раздела двух сред, имеющих различные показатели преломления. Для возбуждения флуоресценции по методике ФМПВО свет на образец заводят под углом, большим или равным критическому, из среды, показатель преломления которой больше показателя преломления образца. Глубина проникновения поля в образец зависит от длины волны света, угла засветки и показателей преломления сред. На практике в качестве описанной выше границы раздела наиболее часто используют границу между образцом и стеклом. Существуют две основные схемы реализации метода ФМПВО: призменный метод и метод с высокоапертурным иммерсионным объективом.
Основными недостатками метода ФМПВО являются необходимость постоянной юстировки оптической системы для достижения оптимального угла засветки и необходимость использовать дорогостоящий высокоапертурный иммерсионный объектив при реализации соответствующей схемы.
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является разработка способа и устройства засветки образца, которое не требует постоянной юстировки (перед каждым использованием прибора), не содержит дорогостоящих компонент и позволяет возбуждать флуоресценцию только в тонком слое объема образца за счет локализации там электромагнитного излучения источника засветки.
Технический результат, сформулированный в цели изобретения, достигается за счет использования для возбуждения флуоресценции образца длиннопробежных поверхностных волн оптического диапазона, распространяющихся вдоль границы раздела между средой, в которой находится образец (жидкостью или воздухом), и твердой поверхностью одномерного фотонного кристалла. При этом структуру фотонного кристалла выбирают таким образом, чтобы поверхностные волны, которые могут возбуждаться на данной границе раздела, имели длину волны, подходящую для эффективного возбуждения флуоресценции образца.
Раскрытие изобретения
Основным элементом, который позволяет предложенному способу и устройству достигать требуемого технического результата, является одномерный фотонный кристалл (далее ОФК) - многослойная структура с периодически меняющимися показателями преломления слоев. Как показано в работе [4], варьируя количество, толщину и показатели преломления слоев, а также показатель преломления внешней среды, можно создать необходимые условия для существования на поверхности ОФК одной или нескольких мод длиннопробежных поверхностных электромагнитных волн оптического диапазона. Длина пробега таких волн вдоль границы раздела между твердой поверхностью ОФК и жидкой или газообразной внешней средой может достигать нескольких сот микрометров. Кроме того, изменяя указанные выше параметры ОФК, можно также варьировать глубину проникновения электромагнитного поля поверхностной волны в объем внешней среды.
Данные уникальные свойства ОФК позволяют использовать длиннопробежные поверхностные волны для возбуждения флуоресценции образцов только в тонком приповерхностном слое на одной или нескольких длинах волн. За счет большой длины пробега такие волны равномерно возбуждают флуоресценцию на площадях, сопоставимых с размерами полей микроскопных объективов среднего и высокого увеличения. При этом, как уже отмечалось ранее, параметры ОФК выбирают таким образом, чтобы данные длины волн попадали в спектр поглощения флуорофора, находящегося в образце, и эффективно возбуждали его флуоресценцию. Кроме того, возможность изменять глубину проникновения поверхностной волны во внешнюю среду позволяет возбуждать флуоресценцию объектов различного размера, а также локализованных на различных расстояниях от поверхности ОФК.
Преимущества такого способа заключаются в том, что он позволяет получать микроскопические изображения, обладающие более высоким контрастом и разрешением, по сравнению с изображениями, полученными при использовании стандартных методик засветки параллельным пучком через объектив, реализованными в большинстве коммерчески доступных эпифлуоресцентных микроскопов.
Пример реализации изобретения
Для демонстрации возможностей заявленного способа, а также для иллюстрации других признаков, заявленных в техническом результате изобретения, мы собрали прототип устройства для возбуждения флуоресценции при помощи длиннопробежных поверхностных волн и провели несколько модельных экспериментов. Следует отметить, что конкретная конструкция данного устройства может принимать различные модификации в зависимости от требуемых длин волн, метода создания ОФК, производителя оптических компонент и конструкции флуоресцентного микроскопа, на который предполагается устанавливать данную систему засветки образца. Однако данные вариации не меняют сущность изобретения и не выходят за пределы объема изобретения, определенного в формуле изобретения.
На фигуре 1 приведена схема заявленного устройства. На фигуре 1 присутствуют следующие условные обозначения: 1 - лазер, 2 - поляризатор, 3 - расширитель пучка с регулировкой схождения, 4 - призма, 5 - цилиндрическая линза, 6 - иммерсионное масло, 7 - проточная микрофлюидная ячейка, 8 - объектив микроскопа, 9 - объекты, адсорбированные на стенку микрофлюидной ячейки, противоположенную поверхности ОФК, 10 - объекты, адсорбированные на поверхность ОФК, 11 - ОФК, 12 - ПЗС камера, кроме того, толстыми стрелками показан ход оптических лучей. Данная установка была собрана на предметном столике инвертированного микроскопа, при реализации на микроскопах прямого типа схема принципиально не изменяется.
2
2
5
2
Центральным элементом данной системы засветки, как уже отмечалось выше, является ОФК. Основной конструктивной особенностью и отличительным признаком ОФК, необходимым для реализации заявленного способа, является то, что поверхностные моды, возбуждаемые на границе раздела между его поверхностью и внешней средой, должны иметь длину волны, подходящую для возбуждения флуоресценции образца. Таким образом, количество и толщину слоев ОФК рассчитывают, опираясь на спектральные характеристики флуорофора образца, и на значения показателя преломления среды, в которой находится образец. При этом применяют численные методы на основе описанного в литературе метода импедансов [4], либо на основе матричного метода [5]. Из данных работ следует, что структура ОФК может быть рассчитана для возбуждения на ней одной или нескольких поверхностных мод, с любой требуемой длинной волны из диапазона от ближнего ультрафиолета до ближнего инфракрасного. В нашей демонстрации в качестве модельных объектов для микроскопических исследований (фигура 1, обозначение 9, 10) мы использовали флуоресцентно меченные полимерные микрочастицы диаметром ~6 мкм, имеющие широкий спектр поглощения с максимумом в районе 640 нм и максимумом эмиссии в районе 710 нм. Для возбуждения флуоресценции этих объектов был изготовлен подходящий ОФК при помощи метода магнетронного напыления диэлектрических покрытий. Данный ОФК состоял из полированной основы из стекла марки БК-7 толщиной 1,5 мм, 3 слоев SiO толщиной 183,5 нм и TaO толщиной 111,5 нм и завершающего слоя SiO толщиной 346,2 нм. На поверхности данной многослойной структуры могут распространяться моды с длинами волн в окрестности 659 нм при условии, что показатель преломления внешней среды близок к 1,33 - т.е. в том случае, если внешняя среда является водой при комнатной температуре. Видно, что данная длина волны не совпадает с максимумом поглощения флуоресцентного красителя в используемых нами полимерных микрочастицах, однако она находится внутри спектральной области, обеспечивающей эффективное возбуждение данного флуоресцентного красителя.
Для выполнения условий дисперсии и ввода излучения с волновым вектором, необходимым для возбуждения поверхностной волны, ОФК присоединили к одной из граней призмы (фигура 1, обозначение 4) с подходящим показателем преломления при помощи иммерсионного масла (фигура 1, обозначение 6), показатель преломления которого также согласован с материалом основы ОФК. Вместо иммерсионного масла для присоединения ОФК к призме могут также использоваться различные оптически клеи или гели, при этом основным отличительным признаком таких соединений является согласование показателей преломления. Система возбуждения поверхностной волны состоит из источника лазерного излучения, расширителя пучка с регулировкой схождения и цилиндрической линзы (фигура 1, обозначения 1, 3, 5 соответственно). В качестве источника нами использовался полупроводниковый лазер с длиной волны 660,7 нм, которая подходит как для возбуждения поверхностных волн на используемом нами ОФК, так и для возбуждения флуоресценции красителя в полимерных микрочастицах. Отличительной особенностью такой системы засветки, необходимой для реализации заявленного изобретения, является фокусировка излучения источника в линию на поверхности одномерного фотонного кристалла при помощи расширителя пучка с регулировкой схождения и цилиндрической линзы. Такая один раз сфокусированная и настроенная под нужный диапазон углов схема позволяет избавиться от постоянной юстировки, необходимой при засветке параллельным пучком, которая реализуется в системе ФМПВО. Так происходит, потому что цилиндрическая линза собирает на поверхности ОФК сразу целый набор углов засветки, при этом, если диапазон углов выбран верно, в данном наборе всегда найдется угол, под которым возбуждается поверхностная волна, несмотря на то, что точное значение угла возбуждения постоянно меняется во времени. Такие изменения неизбежно происходят в течение эксперимента за счет флуктуаций показателя преломления и изменений свойств поверхности ОФК за счет адсорбции частиц. При этом остальные углы отражаются от границы раздела и выходят из призмы, не создавая паразитной засветки. Для уменьшения ширины фокусной перетяжки цилиндрическую линзу также закрепили на призме при помощи иммерсионного масла. Следует пояснить, что возбуждение флуоресценции в тонком слое при помощи длиннопробежной поверхностной волны следует наблюдать в стороне от описанной выше перетяжки фокуса цилиндрической линзы.
Для дополнительной детекции поверхностной длиннопробежной волны в нашем демонстрационном эксперименте мы добавили к заявленной системе поляризатор (фигура 1, обозначение 2) и ПЗС камеру для детектирования излучения, отраженного от границы раздела и вышедшего из призмы (фигура 1, обозначение 12). Эти компоненты не являются необходимыми для реализации заявленного изобретения и служат только для иллюстрации принципов работы данного устройства. Кроме того, используемый нами ОФК обладает тем свойством, что на нем возбуждаются поверхностные волны только при условии, что инициирующее излучение имеет ТЕ поляризацию. Таким образом, вращая поляризацию засветки, можно «включать» и «выключать» поверхностную волну, не отключая лазерного источника. Поляризационная селективность ОФК также не является необходимым условием реализации данного изобретения.
На поверхности ОФК была собрана проточная микрофлюидная ячейка (фигура 1, обозначение 7). Высота ячейки составила 50 мкм. Нижней стенкой ячейки, противоположенной ОФК, являлось покровное стекло толщиной 0,17 мм, сквозь которое и происходила съемка процессов в ячейке. Отметим, что конкретная конструкция микрофлюидной ячейки не важна для реализации заявленного изобретения, кроме того, с данным устройством засветки возможно проводить эксперименты в открытом объеме образца, если используется объектив с водной иммерсией.
На фигуре 2А представлено микроскопическое флуоресцентное изображение поверхности ОФК, наблюдаемые через объектив с десятикратным увеличением и стандартную для эпифлуоресцентного микроскопа систему оптических фильтров, записанное на ПЗС камеру микроскопа. Фокус микроскопа настроен на объекты с условным обозначением 10 на фигуре 1, при этом засветка обладает поляризацией ТМ, то есть поверхностная волна отсутствует. При этом фактически реализован метод ФМПВО и наблюдается сильная неоднородность засветки вокруг фокусной перетяжки цилиндрической линзы. На фигуре 2Б представлено угловое распределение отраженного излучения такой засветки, вышедшего из призмы, которое представляет собой гауссов профиль. Теперь поляризатор повернули на 90°, и засветка стала обладать ТЕ поляризацией. На фигуре 3А приведено флуоресцентное изображение с того же поля зрения и с той же плоскости фокуса, что и на фигуре 2А, однако, теперь видно, что поверхностная волна распространяется влево от линии фокусировки, возбуждая на своем пути флуоресценцию микрочастиц. На фигуре ЗБ представлено угловое распределение отраженного излучения при засветке с поляризацией ТЕ, на котором хорошо видно падение интенсивности при углах, на которых происходит возбуждение поверхностной волны. Кроме того, в отраженном свете также наблюдается интерференционный эффект, характерный для длиннопробежных волн (см. соответствующие обозначения на фигуре 3Б).
Далее мы провели сравнение заявленного способа со стандартным методом засветки образца параллельным пучком через объектив, реализованным в большинстве эпифлуоресцентных микроскопов. Для этого мы сместили плоскость фокуса микроскопа на поверхность нижней стенки микрофлюидной ячейки, то есть на объекты с условным обозначением 9 на фигуре 1. На фигуре 4А представлено флуоресцентное изображение, полученное при таком положении фокуса и при возбуждении флуоресценции по стандартной методике. На данном изображении четко видны объекты, адсорбированные на нижней стенке ячейки, и размыто объекты, адсорбированные на ОФК (обозначены стрелками на фигуре 4А). На фигуре 4Б плоскость фокуса и поле зрения сохранены относительно фигуры 4А, однако, данное флуоресцентное изображение получено при возбуждении флуоресценции с помощью поверхностной волны. Объекты, адсорбированные на нижней стенке ячейки, теперь не видны, что свидетельствует о том, что поверхностная волна не возбудила их флуоресценцию. Данное наблюдение является следствием малой глубины проникновения поля поверхностной волны во внешнюю среду. Вернув теперь плоскость фокуса на поверхность ОФК (т.е. на объекты с условным обозначением 10 на фигуре 1), мы записали флуоресцентное изображение с возбуждением по стандартной методике с того же поля зрения, что и изображение на рисунке 3А (см. фигуру 5). При сравнении изображений на фигурах 3А и 5 видно, что при возбуждении поверхностной волной интенсивность паразитного сигнала от частиц, адсорбированных на нижней стенке микрофлюидной ячейки (т.е. от объектов с условным обозначением 9 на фигуре 1), намного слабее, чем при возбуждении по стандартной методике (объекты обозначены стрелками на рисунке 5).
Таким образом, проиллюстрированы все пункты заявленного технического результата данного изобретения.
Перечень поясняющих рисунков и схем.
Фигура 1. Схема установки для возбуждения флуоресценции при помощи длиннопробежных поверхностных волн на ОФК.
Фигура 2. А: Микроскопические флуоресцентные изображение поверхности ОФК при засветке через призму с поляризацией ТМ. Поверхностная волна отсутствует.
Б: Картина углового распределения отраженного света при засветке через призму с поляризацией ТМ. Поверхностная волна отсутствует.
Фигура 3. А: Микроскопическое флуоресцентное изображение поверхности ОФК при засветке через призму с поляризацией ТЕ. Наблюдается поверхностная длиннопробежная волна.
Б: Картина углового распределения отраженного света при засветке через призму с поляризацией ТЕ. Наличие провала интенсивности в отраженном свете и наличие характерного эффекта интерференции подтверждает наличие поверхностной длиннопробежной волны.
Фигура 4. А: Микроскопическое флуоресцентное изображение поверхности стенки микрофлюидной ячейки, противоположной ОФК при засветке по стандартной методике эпифлуоресцентной микроскопии.
Б: Микроскопическое флуоресцентное изображение поверхности стенки микрофлюидной ячейки, противоположной ОФК при засветке через призму с поляризацией ТЕ.
Фигура 5. Микроскопическое флуоресцентное изображение поверхности ОФК при засветке по стандартной методике эпифлуоресцентной микроскопии.
Литература
[1] J.W. Lichtman, J.A. Conchello, Fluorescence microscopy. Nature Methods, 2005, 2, 910-919.
[2] A.N. Asanov, W.W. Wilson, P.B. Oldham. Regenerable Biosensor Platform: A Total Internal Reflection Fluorescence Cell with Electrochemical Control. Anal. Chem. 1998, 70,1156-1163.
[3] G. Kennedy, D.M. Warshaw. An adjustable total internal reflectance microscopy (tirfm) illuminator apparatus, WO 2012051383 A2, PCT/US2011/056089.
[4] V.N. Konopsky. Plasmon-polariton waves in nanofilms on one-dimensional photonic crystal surfaces. New Journal of Physics, 2010, 12 (9), 093006.
[5] P. Yeh, A. Yariv, C.S. Hong, Electromagnetic propagation in periodic stratified media. J. Opt. Soc. Am. 1977, 67, 423-38.