Бронхиальная астма и хроническая обструктивная болезнь легких. Клинико-генетические аспекты диагностики

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

© ЧЕРКАШИНА И.И., НИКУЛИНА С.Ю., ВОЕВОДА М.И., МАКСИМОВ В.Н., ЛОГВИНЕНКО Н.И.

БРОНХИАЛЬНАЯ АСТМА И ХРОНИЧЕСКАЯ ОБСТРУКТИВНАЯ БОЛЕЗНЬ ЛЕГКИХ.

КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ДИАГНОСТИКИ И.И.Черкашина, С.Ю.Никулина, М.И.Воевода, В.Н.Максимов, Н.И.

Логвиненко.

Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, ректор - д.м.н., проф. И.П. Артюхов; кафедра внутренних болезней №1, зав. - д.м.н., проф. В. А. Шульман; НИИ терапии СО РАМН г.

Новосибирск, директор - член-корр. РАМН М.И. Воевода.

Резюме. Проведено исследование полиморфизма гена ТИР-а у 89 пациентов БА и 74 пациентов ХОБЛ с целью оценки вклада данного гена -кандидата в предрасположенность к развитию этих заболеваний. Контрольную группу составили 258 индивидуума, не имеющие бронхолегочной патологии. Методом полимеразной цепной реакции изучен -308 О/А полиморфизм гена ТИР-а. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии у больных БА связи полиморфизма гена ТИР-а в позиции 308 с предрасположенностью к заболеванию. Выявлена ассоциация между аллелем А гена ТИР-а и ХОБЛ. Полученные данные позволяют сделать предположение, что аллель А полиморфизма гена ТИР-а может являться генетическим предиктором ХОБЛ.

Ключевые слова: бронхиальная астма, хроническая обструктивная болезнь легких, ген, фактор некроза опухоли - альфа.

Черкашина Ирина Ивановна - к.м.н. каф. внутренних болезней № 1; тел. 8 (391) 2642980.

Никулина Светлана Юрьевна - д.м.н., проф. каф. внутренних болезней №1 КрасГМУ, проректор по учебной работе КрасГМУ; тел. 8(391)2640979.

Шульман Владимир Абрамович - д.м.н., проф. зав. каф. внутренних болезней № 1 КрасГМУ; тел. 8(391)2640979.

Бронхиальная астма (БА) и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) - два хронических заболевания респираторной системы, наиболее распространенные среди населения [1,2,3].

Как БА, так и ХОБЛ - представляют собой хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей. Однако при БА воспалительный процесс, в основном, имеет аллергический характер, а при ХОБЛ - это «абнормальный» воспалительный ответ на факторы экологической агрессии [2]. Основные пункты дифференциальной диагностики БА и ХОБЛ хорошо известны [8]. Они основаны на клинике, функциональных и лабораторных данных. И все же часто возникают трудности в дифференциальной диагностике, кроме того, возможно и сочетание двух болезней у одного человека. Считается, что в настоящее время нет ни одного информативного диагностического маркера, надежно дифференцирующего БА и ХОБЛ, поэтому их поиск продолжается.

Всестороннее изучение БА и ХОБЛ показало значительную роль в развитии этих заболеваний генетических факторов [11,12].

Исследования гена фактора некроза опухоли - альфа (ЮТ-а) в качестве гена-кандидата различных мультифакториальных заболеваний активно проводятся учеными многих стран [6]. ТКБ-а - провоспалительный цитокин, относящийся к семейству факторов некроза опухолей. Основным считается его роль в развитии острого воспалительного процесса. ТКБ-а стимулирует хемотаксис нейтрофилов в очаг воспаления [5]. ТКБ-а участвует и в хронизации процесса за счет повышения адгезии макрофагов и опосредованно через фактор активации тромбоцитов и индукции синтеза оксида азота (N0).

Ген ТКБ картирован на 6 хромосоме. Описано более 30 аллельных вариантов гена [9]. В промоторной области этого гена обнаружен полиморфизм с заменой гуанина в позиции (-308) на аденин. Несмотря на множество описанных полиморфизмов гена, ТКБ-а лишь замена в позиции О- 308 А влияет на изменение транскрипции и продукции ТКБ-а.

В 2002 году обнаружена ассоциация -308А аллеля с повышенным риском развития БА [14]. Показано, что риск развития БА при наличии аллеля А полиморфизма 0-308А гена Т№-а увеличивается более чем в 2 раза [4]. При БА аллель А ассоциирована с повышенной продукцией ТКБ-а. При БА ТКБ-а индуцирует развитие ранней фазы аллергического ответа в виде острого воспаления, проявляющегося бронхоспазмом, отеком слизистой оболочки и гиперсекрецией слизи. ТКБ-а вовлекается также в развитие структурных изменений бронхов. Он способен вызывать митогенный ответ фибробластов и/или гладкой мускулатуры бронхов, а также рост соединительной ткани.

В развитии ХОБЛ доказана существенная роль ТКБ-а, который является мощным фактором адгезии и хемотаксиса нейтрофилов. Известно, что высокие концентрации ТКБ-а в мокроте, БАЛЖ и в сыворотке крови больных ХОБЛ свидетельствуют об участии данного цитокина в местном и в системном воспалении при ХОБЛ [10]. При ХОБЛ уровень провоспалительного цитокина ТКБ-а детерминирован одноименным геном ТКБ (полиморфизм 3080/А) [7]. Считают, что наличие редкого генотипа АА гена ТОТА не связано с предрасположенностью к развитию ХОБЛ [15]. По данным В.П. Пузырева с соавт. [7], полиморфизм -308А гена ТОТ играет значимую роль в формировании ХОБЛ у русских.

Все это дало основание считать, что изучение полиморфизма генов ТКБ - а у больных БА и ХОБЛ поможет решить вопросы выявления генетических предикторов развития болезней.

Цель исследования: изучение ассоциации полиморфизма -308 О/А в промоторной области гена Т№-а с развитием БА и ХОБЛ.

Материалы и методы

Обследовано 89 чел с БА, из них 65 женщин (73%) и 24 мужчин (27%), в возрасте от 16 до 72 лет, средний возраст - 45,65±0,12 и 74 чел с ХОБЛ, из них 65 мужчин (87,8%) и 9 женщин (12,2%), в возрасте от 40 до 77 лет, средний возраст составил 66,81±0,71 лет .

Набор пациентов БА и ХОБЛ производился за период их стационарного лечения в пульмонологическом отделении МУЗ ГКБ №20.

Диагноз БА устанавливался в соответствии с Глобальной стратегией лечения и профилактики БА (GINA 2002 и 2006) [1] на основании жалоб на приступы затрудненного дыхания или приступообразный кашель, купирующиеся ингаляцией - агонистов, наличия обратимой бронхиальной обструкции, подтвержденной объективными методами обследования (суточный разброс ПСВ>20%, прирост ОФВ1>15%).

Среди наблюдавшихся больных диагностированы следующие формы БА (в соответствии с МКБ - 10): аллергическая - у 60 чел (67,4 %), неаллергическая - у 17 (19,1%) и смешанная - у 12 (13,5%). По степени тяжести БА у 27 больных (30,3%) была легкой интермиттирующей, у 12 (13,5 %) - легкой персистирующей, у 34 (38,2%) - среднетяжелой и у 16 пациентов (18,0%) - тяжелой. Среди обследованных с легким обострением БА было 12 (13,5%), среднетяжелым - 49 (55,0%), тяжелым - 8 (9,0%) и не было обострения у 20 (22,5%) человек. Средний стаж болезни составил 12,3±6,1 лет.

Диагноз ХОБЛ устанавливался в соответствии с рекомендациями программы «GOLD»[2]. Подавляющее большинство составили больные с тяжелой и крайне тяжелой стадией заболевания: стадия I диагностирована у 4 пациентов (5,4%), стадия II диагностирована у 20 пациентов (27%), стадия III -у 27 (36,5%), стадия IV - у 23 (31,1%).

Комплексное обследование включало: клиническое динамическое

наблюдение; изучение клинических анализов крови, мокроты;

рентгенологическое исследование органов грудной клетки и придаточных

пазух носа (по клиническим показаниям); оценку параметров функции внешнего дыхания с помощью компьютерной спирографии.

При оценке полиморфизма гена TNF-a у больных БА и ХОБЛ в качестве контроля использовали выборку лиц без аллергических и хронических заболеваний легких, проживающих в Новосибирске (n=258, средний возраст 32,7±7,36). Молекулярно - генетические исследования проведены на базе НИИ терапии СО РАМН, Новосибирск. Для проведения молекулярногенетического анализа были взяты образцы венозной крови в количестве 5 -10 мл. Выделение ДНК проводили стандартным методом с фенол -хлороформной экстракцией. Генотипирование осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе [13].

Статистическая обработка материала проводилась с использованием пакета прикладных программ "SPSS-13 " и Exsel 2002. Различия в распределении частот аллелей и генотипов гена TNF-a между группами оценивали посредством критерия х и точного критерия Фишера (двусторонние варианты оценки). Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты и обсуждение Согласно вариациям полиморфизма гена TNF-a в позиции -308 больные БА, ХОБЛ и лица контрольной группы разделены на 3 группы по генотипам TNF-a -308: G/G, G/A и A/A. Распределение генотипов по полиморфным вариантам гена TNF-a у здоровых лиц в исследованной популяции соответствовало ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга.

При изучении распределения генотипов полиморфного локуса -308 G^A гена TNF-a достоверных различий между контрольной группой и выборкой пациентов с БА не получено (p>0,05). При анализе полиморфизма гена TNF-a обнаружено, что имеется тенденция к увеличению доли носителей «мутантного» гомозиготного генотипа А/А среди лиц с БА, по сравнению контролем (4,5% и 1,9%), но различие не достигает уровня статистической достоверности (P=0,357). Частота более редкого аллеля А составила 12,4%

среди больных БА и 11,4% в группе контроля. Достоверных отличий по частоте аллеля между группами не выявлено (P= 0,740). Распределение генотипов и аллелей в гене TNF у больных БА отличается от наблюдаемого у больных БА в других исследованиях [4,14]. В 2002 году обнаружена ассоциация -30SA аллеля с повышенным риском развития бронхиальной астмы [14]. Т.Э. Иващенко с соавт. [4] отметили достоверное увеличение частоты -30SA аллеля в группе больных атопической БА (9%) по сравнению с популяционной выборкой (4%). По их данным, риск развития БА при наличии аллеля А полиморфизма G-30SA гена TNF-a увеличивался более чем в 2 раза. [4 ]. В нашем исследовании подтвердить эту ассоциацию не удалось.

Таблица 1

Частоты генотипов и аллелей -G30SA полиморфизма гена фактора некроза опухоли TNF-a в исследуемых группах

Нами получены различия в распространенности генотипов между контрольной группой и пациентами ХОБЛ (табл.1). Доля носителей «мутантного» гомозиготного генотипа А/А среди лиц с ХОБЛ значительно выше, по сравнению контролем (S,1% и 1,9%) и различие достигало уровня статистической достоверности (P=0,003).

Таблица 2

Частоты генотипов и аллелей -G30SA полиморфизма гена фактора некроза опухоли TNF-a в группах больных ХОБЛ и БА

Анализ частот встречаемости аллелей позволил также выявить преобладание носителей аллеля А среди пациентов ХОБЛ в сравнении со здоровыми лицами (P=0,001).

При исследовании распространенности генотипов и аллелей полиморфизма -G30SA гена фактора некроза опухоли TNF-a в группах больных БА и ХОБЛ

также обнаружены значимые различия (табл.2). Частота аллеля А в группе больных ХОБЛ почти в 2 раза выше, чем в группе с БА (12,4% и 23,0%).

Таким образом, у больных БА не выявлено связи полиморфизма гена TNF-a в позиции -308 с предрасположенностью к заболеванию. При анализе распределения частот аллелей и генотипов среди лиц с БА и группой контроля статистически значимых различий между группами не выявлено. Однако не исключен вклад данного полиморфизма в предрасположенность к БА, что подтверждается результатами исследований, проведенных на других популяциях. Выявлена ассоциация между аллелем А TNF-a в позиции 308 и ХОБЛ. Полученные данные позволяют сделать предположение, что аллель А полиморфизма гена TNF-a может являться генетическим предиктором ХОБЛ.

BRONCHIAL ASTHMA AND CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE. CLINICAL AND GENETIC ASPECTS OF DIAGNOSTICS I.I. Cherkashina, S.Yu Niculina, N.I. Logvinenko, V.N. Maksimov, M.I. Voevoda Krasnoyarsk State Medical University named after prof. Voino-Yasenetsky

Abstract. To estimate the role of candidate gene in the disease development we studied the polymorphism of TNF-a gene in 89 patients with bronchial asthma (BA) and in 74 patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Two hundred fifty eight persons without bronchial and lung pathology were in the control group. We studied 308 G/A polymorphism of TNF-a gene by polymerase chain reaction. The data indicate that there is no relation among gene TNF-a polymorphism in position 308 and disease predisposition in patients with BA. The association among the allele A of TNF-a gene and COPD is revealed. It is possible to suggest that allele A of TNF-a polymorphism may be genetic predictor of COPD.

Key words: bronchial asthma, chronic obstructive pulmonary disease, gene, tumor necrosis factor - a.

Литература

1. Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной

астмы (GINA) / Пер. с англ. - М.: Атмосфера, 2006. - 104 с.

2. Глобальная стратегия диагностики, лечения и профилактики

хронической обструктивной болезни легких(COLD). Пересмотр 2007г. / Пер. с англ. Под ред. А.Г.Чучалина. М.: Атмосфера, 2008. - 99 с.

3. Демко И. В. Бронхиальная астма: вопросы диагностики, лечения,

социально-экономические аспекты. - Красноярск: Издательство

КрасГМА, 2006. - 217 с.

4. Иващенко Т.Э., Останкова Ю.А., Баранов В.С. Анализ

полиморфизма гена фактора некроза опухоли - a у больных с атопической бронхиальной астмой // Медицинская генетика. - 2005. - Т. 4, №5. - С. 195.

5. Корытина Г.Ф., Целоусова О. С., Ахмадишина Л.З. и др. Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов медиаторов воспаления (IL1B, TNFA, LTA, IL8, IL6, IL1RN, IL10, TGFb, TLR4, DBP) с развитием хронических заболеваний респираторной системы у детей // Медицинская генетика. - 2008. - Т.2. - С. 17-25.

6. Пузырев В. П. Наследственность и болезни легких: учебное пособие. Томск. - 2007. - 79 с.

7. Сеитова Г.Н. Анализ взаимосвязи генов-кандидатов хронической обструктивной болезни легких с клиническими проявлениями болезни у татар и русских западной Сибири: автореф. ... канд. мед. наук. - Томск,

2004. - 23 с.

8. Шмелев Е.И. Различия в диагностике и лечении бронхиальной

астмы и хронической обструктивной болезни легких // Consilium medicum.

- 2002. - Т. 4, № 9. - С. 492-497.

9. Bouwmeester T., Bauch A., Ruffner H. et al. A physical and functional map of the human TNF-alpha/NF-kappa-B signal transduction pathway // Nature Cell Biol. - 2004. - Vol.6. - P. 97-105.

10. Chung K.F. Cytokines in chronic obstructive pulmonary disease // Eur. Respir. J. - 2001. - Vol. 34. - P. 50-59.

11. Holloway J.W., Jongepier, B. Beghe et al. The genetics of asthma. The European respiratory Monograph, Asthma, Chapter 2. - 2003. - Vol. 8, № 23. - P.26-57.

12. Stoller JK, Aboussouan LS. Alpha1-antitrypsin deficiency // Lancet. -

2005. - Vol. 365, № 9478. - P. 2225-2236.

13. Warzocha K., Ribeiro P., Jacques Bienvenu, et al. Genetic polymorphisms in the Tumor Necrosis Factor Locus Influence Non-Hodgkin’s Lymphoma Outcome // Blood. - 1998. - Vol. 91, № 10. - P. 3574-3581.

14. Witte J. S. Palmer L. J., O'Connor, R. D. et al. Relation between tumour necrosis factor polymorphism TNF-alpha-308 and risk of asthma // Europ. J. Hum. Genet. - 2002. - Vol.10. - P. 82-85.

15. Wong W., Kossodo S., Kochevar I. Influence of cytokines on matrix metalloproteinases produced by fibroblasts cultured in monolayer and collagen gels // J. Formos. Med. Assoc. - 2001. - Vol.100, № 6. - P. 377-382.