СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ РЕГЕНЕРАЦИИ НЕРВА
METHOD FOR STIMULATING NEUROTISATION

Изобретение относится к медицине, преимущественная область его использования - нейрохирургия и травматология.
Травматические повреждения нервов достаточно часто встречаются в клинической практике. В тяжелых случаях травма вызывает полный анатомический разрыв с формированием дефекта между центральным и периферическим отрезками нерва. Существующие хирургические, терапевтические и физиотерапевтические методы лечения недостаточно эффективны и зачастую приводят к утрате функции денервированного органа, полному параличу всех мышц, иннервируемых поврежденным нервом, нарушению чувствительности. На сегодняшний день одним из наиболее эффективных методов замещения дефекта является аутонервная пластика с использованием фрагмента другого, функционально менее значимого нерва. В качестве альтернативного подхода активно разрабатываются кондуиты нерва, состоящие из трубки на основе биосовместимых и биорастворимых материалов, и содержимого в виде гидрогелевой среды [см. Челышев Ю.А. Экспериментальное обоснование применения кондуитов нерва / Ю.А.Челышев, А.А.Богов // Неврологический вестник (журнал им. В.М.Бехтерева). - 2008. - Т.40. - №4. - С.101-109]. Перспективы этого подхода связывают с возможностью введения в кондуит нерва стимуляторов нейрорегенерации. Этими свойствами в разной степени обладают факторы роста, нейротрофические факторы, гормоны и ряд веществ различной химической природы. Однако возникающие при использовании этих веществ значительные побочные эффекты не позволяют их применять в клинической практике. Перспективным стимулятором нейрорегенерации нерва представляется аминокислота L-аргинин. Ранее было высказано предположение о том, что L-аргинин участвует в модификации белков в дегенерирующей после повреждения нервной ткани, что должно поддерживать регенерацию периферического нерва [см. Cestaro В. Effects of arginine, S-adenosylmethionine and polyamines on nerve regeneration. / B.Cestaro // Acta Neurol. Scand. Suppl. - 1994. - Vol.154. - P.32-41]. В пользу этой гипотезы свидетельствуют два обстоятельства: во-первых, NO во многих тканях и клеточных системах поддерживает процесс регенерации; во-вторых, естественным субстратом для синтеза NO в организме служит L-аргинин. На генетически дефектных (нокаутных) по нейрональной NO-синтазе мышах показано, что при перерезке седалищного нерва происходит задержка регенерации, замедление восстановления чувствительной и двигательной функции конечности, а также более выраженный посттравматический апоптоз чувствительных нейронов [см. Keilhoff G. Nitric oxide synthase, an essential factor in peripheral nerve regeneration / G.Keilhoff, H.Fansa, G.Wolf // Cell. Mol. Biol. (Noisy-le-grand). - 2003. - Vol.49. - №6. - P.885-897]. Однако в работе Zochodne et al. (1997) был зарегистрирован противоположный эффект, когда угнетение образования NO путем прямого ингибирования NO-синтазы с помощью метилового эфира N(omega)-нитро-L-аргинина(L-NAME), наоборот, стимулировало регенерацию периферического нерва. Это указывает на актуальность детального исследования роли системы NO в регенерации нерва и, в частности, возможности влияния субстрата синтеза NO L-аргинина на ее компоненты.
Основанием для применения L-аргинина в качестве стимулятора регенерации нерва послужили также данные исследований, которыми показано, что при травме спинного мозга L-аргинин или его аналоги сдерживают развитие дегенерации и оказывают цитопротекторное действие, снижая вероятность вступления в апоптоз нейронов и олигодендроцитов [см. Lee Y.B. Role of tumor necrosis factor-alpha in neuronal and glial apoptosis after spinal cord injury / Y.B.Lee, T.Y.Yune, S.Y.Baik et al. // Exp.Neurol. - 2000. - Vol.166. - №1. - P.190-195; Yüceer N. The early protective effects of L-arginine and Ng-nitro-L-arginine methyl ester after experimental acute spinal cord injury. A light and electron microscopic study / N.Yüceer. A.Attar, M.F.Sargon et al. // J. Clin. Neurosci. - 2000. - Vol.7. - №3. - P.238-243].
Известен способ преодоления разрыва нерва с помощью гидрогелевой среды на основе карбоксиметилцеллюлозы [см. Adanali G. Effects of hyaluronic acid-carboxymethylcellulose membrane on extraneural adhesion formation and peripheral nerve regeneration / G.Adanali, M.Verdi, A.Tuncel, B.Erdogan, E.Kargi // J.Reconstr. Microsurg. - 2003. - Vol.19. - №1. - P.29-36]. В этой работе разрыв нерва был укутан мембраной из смеси гиалуроновой кислоты и карбоксиметилцеллюлозы, что к 3 месяцу после операции сдерживало образование рубца нерва и увеличивало количество регенерирующих нервных волокон.
Известен способ лечения повреждений периферических нервов, включающий введение в нерв нейропротекторов, стимуляторов метаболизма и васкуляризации ткани [патент РФ №2005123569/14, МПК A61K 35/64, опубл. 2006; заявка на изоблетение РФ №2008101251/14, МПК A61K 35/14, опубл. 2009).
Применение ингибитора нейрональной (nNO-синтазы) и эндотелиальной (eNO-синтазы) синтазы оксида азота - метилового эфира N(omega)-нитро-L-аргинина(L-NAME), приводящее к снижению содержания NO, вызывает значительное уменьшение количества выживающих после травмы нейронов [см. Yonehara N. Involvement of nitric oxide in re-innvervation of rat molar tooth pulp following transection of the inferior alveolar nerve / N.Yonehara, M.Takemura, Y.Shigenaga // Brain Res. - 1997. - Vol.757. - №1. - P.31-36].
Наиболее близким техническим решением, взятым в качестве прототипа, является способ поддержания посттравматического выживания нейронов при травме периферического нерва [см. Yonehara N. Involvement of nitric oxide in re-innvervation of rat molar tooth pulp following transection of the inferior alveolar nerve / N.Yonehara, M.Takemura, Y.Shigenaga // Brain Res. - 1997. - Vol.757. - №1. - P.31-36], в котором на модели перерезки нижнего альвеолярного нерва было показано, что интраперитонеальное введение L-аргинина в дозе 300 мг/кг один раз в день в течение 4 суток приводит к незначительному увеличению количества выживающих нейронов тройничного узла. Это нейропротекторное действие L-аргинина является необходимым условием для регенерации нервных волокон и восстановления функции периферического нерва.
В исследовании, рассматриваемом в качестве прототипа:
- осуществлено интраперитонеальное (системное) введение L-аргинина, что не позволяет создать достаточную концентрацию вещества локально в области повреждения нерва, где располагаются ключевые клетки, поддерживающие регенерацию нервных волокон и которые могут быть главными мишенями L-аргинина в процессе посттравматической регенерации периферического нерва;
- вследствие системного введения L-аргинина не представляется возможным детально проанализировать механизмы возможного прямого влияния на нейральные структуры в области повреждения;
- не установлено, оказывает ли L-аргипин стимулирующее влияние на регенерацию нерва в условиях нарушения его целостности на значительном протяжении, т.е. в условиях образования диастаза;
- не получены данные об эффективности доставки L-аргинина в составе имплантируемого кондуита нерва, который применяют для преодоления протяженных посттравматических дефектов нерва;
- показано, что системное введение L-аргинина приводит к незначительному увеличению количества выживающих нейронов тройничного узла, что является достаточным предрасполагающим фактором для регенераторного роста нервных волокон, однако прямые данные по прорастанию нервных волокон в периферический отрезок нерва и центрального отрезка не получены.
Исследований прямого влияния на нейрорегенерацию L-аргинина, доставляемого локально в область повреждения нерва, в доступных заявителю источниках информации не выявлено.
Целью заявленного способа является стимулирование посттравматической регенерации нерва, что позволит обеспечить достижение новых технических результатов, а именно: улучшить результаты посттравматической регенерации периферического нерва в виде более полного восстановления двигательной и чувствительной функций, контролируемых данным нервом, преодолевать более протяженные разрывы нерва, сократить сроки пребывания больных с травмой периферического нерва в стационаре и повысить качество жизни больных данного контингента.
Указанный технический результат достигается способом стимулирования регенерации периферического нерва млекопитающего, отличающийся тем, что в депонирующую среду на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, которая заполняет силиконовую трубку, вводят L-аргинин, а созданный кондуит имплантируют в протяженный разрыв периферического нерва; концентрация натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, образующей гидрогелевую депонирующую среду в составе кондуита нерва, составляет 8%, а конечная концентрация L-аргинина в составе депонирующей среды на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы составляет 0,6%. Введение L-аргинина в депонирующую среду, находящуюся в просвете кондуита, проводят в стерильных условиях операционной непосредственно перед процедурой имплантации кондуита ex tempore.
Заявленный способ характеризуется следующей последовательностью этапов:
1) создание кондуита нерва, стенка которого представлена фрагментом биосовместимой силиконовой трубки, а содержимое трубки состоит из гидрогелевой среды на основе 8% натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы;
2) введение в гидрогелевую среду на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, которая находится в просвете силиконовой трубки, L-аргинина до конечной концентрации 0,6%;
3) имплантация сформированного кондуита в разрыв нерва и фиксация его концов эпиневральными швами.
Заявляемый способ иллюстрируется графическими изображениями.
Фиг.1. Функциональный индекс седалищного нерва. (*) - Р<0,05 при сравнении показателей в группе с L-аргинином и в контрольных группах (только с натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы (NaКМЦ) без L-аргинина и пустой трубкой). По оси Х - сроки после операции в сутках. По оси Y - значения функционального индекса седалищного нерва.
Фиг.2. Влияние введения L-аргинина в депонирующую среду на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (NaКМЦ) в составе кондуита нерва, используемого для преодоления разрыва седалищного нерва крысы длиной 5 мм, на общее количество нейронов и численность их отдельных популяций в спинальном ганглии L5 на ипсилатеральной стороне к 30 суткам после операции. Белые области - количество нейронов малого диаметра. Серые области - количество нейронов среднего диаметра. Черные области - количество нейронов большого диаметра. Левый столбик соответствует количеству нейронов у интактных животных. Второй столбик слева соответствует количеству нейронов в опытной группе с введением в депонирующую среду на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (NaКМЦ) L-аргинина. Два столбика справа показывают количество нейронов в обеих контрольных группах сравнения.
Примеры конкретного выполнения способа
Эксперименты проведены на белых беспородных крысах-самцах весом 150-200 г в соответствии с требованиями локального этического комитета при ГОУ ВПО «Казанский государственным медицинский университет». Животных содержали в пластмассовых клетках при температуре 18-20°С со свободным доступом к воде и пище.
Хирургические манипуляции проводили под уретановым наркозом (600 мг/кг, внутрибрюшинно). Наркотизированному животному в левом седалищном нерве на уровне середины бедра иссекали фрагмент нерва и формировали разрыв (диастаз) длиной 5 мм. Силиконовой трубкой (А-М Systems Inc.) длиной 7 мм и внутренним диаметром 2,2 мм соединяли центральный и периферический концы нерва при помощи четырех эпиневральных швов мононитью 8.0 с атравматической иглой.
Животным опытной группы (12 крыс) в разрыв нерва имплантировали трубку, в которую непосредственно перед операцией ex tempore вводили L-аргинин (Sigma) до конечной концентрации 0,6% в объеме гидрогелевой депонирующей среды на основе 8% натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (Pierre Fabre), которая заполняла просвет трубки кондуита нерва и формировала столбик гелевой массы длиной 5 мм. Выбор концентрации натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы основан на наших данных об оптимальной скорости гелеобразования и плотности этого искусственного заменителя матрикса ткани в потенциальном пространстве роста нервных волокон [см. Masgutov R. Stimulation of the rat's sciatic nerve regeneration by local treatment with xymedon / R.Masgutov, I.Raginov, G.Fomina, M.Kozlova, Y.Chelyshev // Cell. Mol. Neurobiol. - 2006. - Vol.26. - P.1411-1419]. Выбор дозы дейстсвующего вещества L-аргинина был основан на данных, полученных при его системном локальном подведении непосредственно в область повреждения нерва [см. Yonehara N. Involvement of nitric oxide in re-innvervation of rat molar tooth pulp following transection of the inferior alveolar nerve / N.Yonehara, M.Takemura, Y.Shigenaga // Brain Res. - 1997. - Vol.757. - №1. - P.31-36], а также пиримидинового стимулятора регенерации ксимедона, эффект которого был изучен нами ранее на той же экспериментальной модели - седалищном нерве крысы [см. Рагинов И.С. Влияние лекарственных препаратов ксимедон и ноотропил на регенерацию периферического нерва / И.С.Рагинов, А.Ю.Вафин, Р.X.Хафизьянова, Ю.А.Челышев // Российские морфологические ведомости. - 1997. - Т.1. - №6. - С.120-125].
Животным первой контрольной группы (10 крыс) имплантировали трубку с гидрогелевой средой на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, но без L-аргинина.
Животным второй контрольной группы (10 крыс) имплантировали пустую трубку без гидрогелевой среды и L-аргинина.
2
2
2
Об эффективности регенерации судили по функциональным тестам: тест восстановления двигательной функции задних конечностей (функциональный индекс седалищного нерва) [см. Bain J.R. Functional evolution of complete sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat / J.R.Bain, S.E.Mackinon, D.A.Hunter // Plast. Reconstr. Surg. - 1989. - Vol.83. - P.129-138; Inserra M.M. Functional indices for sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the mouse / M.M.Inserra et al. // Microsurgery. - 1998. - Vol.18. - №2. - P.119-124] и тест восстановления чувствительности кожи конечности (pinch-тест) [см. Bajrovic F. Long-term effects of deprivation of cell support in the distal stump on peripheral nerve regeneration / F.Bajrovic, M.Bresjanac, J.Sketelj // Neurosci. Res. - 1994. - Vol.39. - P.23-30]. Функциональные тесты проводили на 7, 11, 14, 18, 21, 25 и 28 сутки после операции. Для оценки посттравматического восстановления на 30 сутки после операции производили забор материала. Для этого под уретановым наркозом (600 мг/кг) после ламинэктомии выделяли спинальные ганглии L5 на стороне операции, фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали и заключали в парафин по стандартной методике. Одновременно забирали 5 мм фрагмент периферического отрезка нерва дистальнее места травмы, фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида и 2% растворе четырехокиси осмия и заливали в эпон. Парафиновые срезы спинальных ганглиев толщиной 7 мкм использовали для подсчета количества выживающих нейронов. Оценивали количество малых (<30 мкм), средних (30-50 мкм) и больших (>50 мкм) нейронов с видимыми ядрышками [см. Henken D. Exspression of bb-preprotachykinin mRNA and tachykinins in rat dorsal root ganglion cells following peripheral or central axotomy / D.Henken, W.Battisti, M.Chesselet // Neuroscience. - 1990. - Vol.39. - №3. - Р.733-742]. Полутонкие срезы седалищного нерва, окрашенные толуидиновым синим, использовали для подсчета количества регенерирующих миелиновых волокон. Достоверность различий между группами оценивали методом Стьюдента.
1. Тестирование двигательной функции при помощи оценки функционального индекса седалищного нерва
Наибольшие значения функционального индекса седалищного нерва на всех сроках наблюдений зарегистрированы в случае введения в трубку гидрогелевой среды на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы с L-аргинином (Фиг.1).
Показатель восстановления двигательной функции нерва в случае использования L-аргинина динамично возрастает, начиная с 11 суток после операции, и к 28 суткам превышает показатель теста в группе с пустой трубкой на 46% (Р<0,05) и на 43% (Р<0,05) по сравнению с первой контрольной группой с введением только натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы. В условиях применения кондуита нерва, заполненного гидрогелевым матриксом на основе 8% натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, не оказывает стимулирующего влияния на восстановление двигательной функции.
2. Тестирование чувствительности кожи задних конечностей
Статистическая обработка результатов восстановления чувствительности кожи конечности показала отсутствие различий между группами с NaКМЦ и пустой трубкой, тогда как наличие L-аргинина в депонирующей среде улучшает показатели теста к 28 суткам на 32% (Р<0,05) по сравнению с пустой трубкой и на 46% (Р<0,05) по сравнению с NaКМЦ.
3. Количество чувствительных нейронов в спинальном ганглии L5 на стороне операции
Общее количество нейронов у животных с имплантацией трубки, содержащей гидрогелевую среду на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы и L-аргинин (опытная группа), на 60% (Р<0,05) превышает соответствующий показатель у животных с имплантируемой пустой трубкой (вторая контрольная группа) и на 59% (Р<0,05) превышает этот показатель у животных с имплантацией трубки, содержащей только гидрогелевую среду на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы без L-аргинина (первая контрольная группа) (Фиг.2). Различий по этому показателю при сравнении обеих контрольных групп зарегистрировано не было. При этом количество нейронов большого диаметра в опытной группе с L-аргинином возрастает на 32% (Р<0,05) при сравнении с аналогичным показателем у животных второй контрольной группы (пустая трубка) и на 36% (Р<0,05) при сравнении с этим же показателем у животных первой контрольной группы (натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы без L-аргинина).
В группе с L-аргинином количество средних нейронов увеличивается на 55% (Р<0,05) по сравнению со второй контрольной группой (пустая трубка) и на 61% (Р<0,05) при сравнении с первой контрольной группой (только натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы). Количество малых нейронов при введении в кондуит L-аргинина увеличивается на 84% (Р<0,05) по сравнению со второй контрольной группой (пустая трубка) и на 73% (Р<0,05) по сравнению с первой контрольной группой (натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы без L-аргинина).
4. Количество миелиновых волокон в периферическом отрезке нерва
К 30-м суткам эксперимента количество миелиновых волокон в случае использования L-аргинина увеличивается на 24% (Р<0,05) по сравнению со второй контрольной группой (пустая трубка) и на 13% (Р<0,05) по сравнению с первой контрольной группой (натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы без L-аргинина).
Использование заявленного способа стимулирования посттравматической регенерации нерва путем введения L-аргинина в имплантируемый кондуит позволяет:
- улучшить результаты посттравматической регенерации периферического нерва в виде более полного восстановления двигательной и чувствительной функций, контролируемых данным нервом;
- преодолевать более протяженные разрывы нерва;
- применять данную композицию в виде гидрогелевого матрикса на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы как носителя активного стимулятора нейрорегенерации L-аргинина при использовании с целью посттравматической пластики нерва кондуитов на основе других биосовместимых и биорастворимых материалов;
- сократить сроки пребывания больных с травмой периферического нерва в стационаре и повысить качество жизни больных данного контингента. Достигнутый результат по заявленному решению состоит в повышении эффективности посттравматической регенерации периферического нерва в виде более полного восстановления двигательной и чувствительной функций, контролируемых данным периферическим нервом.
Заявителем впервые:
- реализован способ доставки стимулятора нейрорегенерации при помощи гидрогелевого носителя на основе биосовместимого материала натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы;
- применен способ доставки аминокислоты L-аргинина в область травматического повреждения нерва при помощи гидрогелевого носителя на основе биосовместимого материала натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы;
- показано стимулирующее влияние локальной доставки аминокислоты L-аргинина в область травматического повреждения нерва на его регенерацию.