Определение параметров молекулярно-массового распределения декстранов методом диффузионноупорядоченной спектроскопии ЯМР

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 615.076+615.273

Определение параметров молекулярно-массового распределения декстранов методом диффузионноупорядоченной спектроскопии ЯМР

С.В. Моисеев, Н.Е. Кузьмина, В.И. Крылов, В.А. Яшкир, В.А. Меркулов

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 127051, Москва, Россия

Резюме: Показана возможность применения метода диффузионно-упорядоченной спектроскопии ЯМР для изучения молекулярно-массового распределения декстранов. Предложены уравнения степенной регрессии для количественной оценки средневесовой (Mw), среднечисловой (M„) молекулярных масс, молекулярной массы в максимуме пика (Mp) декстранов на основе двух параметров самодиффузии макромолекул полимера как единого целого — среднего коэффициента самодиффузии (Д) и коэффициента самодиффузии в максимуме пика (Д). Определение Mw, M„, Mp на основе данных Д приводит к лучшим результатам, чем на основе Д. Значения индексов полидисперсности, определенные методом DOSY, не зависят от выбора диффузионного параметра (Д или Д).

Ключевые слова: диффузионно-упорядоченная спектроскопия ЯМР; параметры молекулярно-массового распределения полимеров; средний коэффициент самодиффузии; коэффициент самодиффузии в максимуме пика; декстраны.

THE DETERMINATION OF MOLECULAR WEIGHT DISTRIBUTION PARAMETERS OF DEXTRANS WITH THE DIFFUSION-ORDERED NMR SPECTROSCOPY TECHNIQUE S.V. Moiseev, N.E. Kuzmina, V.I. Krylov, V.A. Yashkir, V.A. Merkulov

Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, 127051, Moscow, Russia

Abstract: The article describes the using of diffusion-ordered NMR spectroscopy technique for the investigation of dextrans molecular weight distribution. The power regressions equations has been derived for quantitation of the weight-average molecular weight Mw, number-average molecular weight Mn and molecular weight at the peak maximum Mp using two self-diffusions parameters of dextrans macromolecules as a whole - the average self-diffusion coefficient (Ds) and the self-diffusion coefficient at the peak maximum (Dp). It is shown that the determination of Mw, Mn, Mp, based on the data Dp, gives better results, than the one, based on the data Ds. Polydispersity index values, determined by DOSY, do not depend on the choice of the diflusion parameter (Ds or Dp).

Key words: diffusion-ordered NMR spectroscopy; weight-average molecular weight; number-average molecular weight; molecular weight at the peak maximum; average self-diffusion coefficient; self-diffusion coefficient at the peak maximum; dextrans.

Декстраны — микробные полисахариды, которые продуцируются разными видами бактерий семейства стрептококковых 8&ер1ососсасеае. На протяжении последних 40 лет их широко используют в биотехнологии и фармацевтике, причем область применения декстранов в этих отраслях промышленности определяется средней молекулярной массой (ММ) биополимера. Так, декстран с ММ 70 кДа применяют для внутривенного введения как плазмозамещающий раствор при шоке, обширных ожогах и больших потерях крови [1]. Декстран с ММ 40 кДа используют для улучшения кровотока в капиллярах, снятия сосудистого спазма, для искусственной экстракорпоральной перфузии органов и др. Показана эффективность этой молекулярной фракции декстранов как адъювантов, переносчиков инсулина и витамина В12 в препаратах пролонгированного действия [1]. Низкомолекулярные формы декстрана с ММ 5—8 кДа интересны для разработки пробиотиков или микроэле-ментозных препаратов, нормализующих у животных обмен веществ, рост и развитие, а также устойчивость к заболеваниям [1]. На основе декстрана с ММ 1 кДа производят медицинские препараты, способные пре-

дотвращать случаи тяжелых анафилактических реакций при трансфузии декстрановых кровезаменителей с более высокой ММ [2].

Химическая модификация декстранов позволяет получать сефадексы — молекулярные сита, используемые при разделении смесей высокомолекулярных веществ, определении молекулярной массы глобулярных белков и ферментов, обессоливании и концентрировании биополимеров и др. Размеры пор в сефадексах зависят от ММ используемого дек-страна [3].

Декстран является полидисперсным полимером, состоящим из остатков а-О-глюкопиранозы. Макромолекулы декстрана представляют собой разветвленные цепи, линейная часть которых содержит главным образом а(1^6) связи и небольшое количество а(1^3) связей. В некоторых редко встречающихся декстра-нах обнаружены чередующиеся а(Н6) и а(Н3) связи (рис. 1). Разветвления в макромолекуле декстрана образуются с помощью а(Н2), а(Н3) или а(Н4) связей (рис. 1) [4—7]. Боковые ветви молекулы состоят обычно из одного или двух остатков глюкозы, реже встречаются более длинные боковые цепи.

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

§ сР

а-

Рис. 1. Фрагмент молекулярной структуры декстранов

Полидисперсный полимер представляет собой набор макромолекул различной длины и разной массы, который описывают молекулярно-массовым распределением (ММР). Значением ММР определяются физико-химические свойства, метаболизм и экскреция декстранов. Поэтому определение ММР является обязательной задачей фармакопейного анализа качества лекарственных субстанций декстранов.

Основными параметрами ММР полимеров являются средняя молекулярная масса (ММ) и индекс полидисперсности. В зависимости от способа усреднения различают средневесовую молекулярную массу (М„, получают усреднением по массе макромолекул в полимере) и среднечисловую молекулярную массу (Мп, получают усреднением по числу макромолекул в полимере). Величина Мж чувствительна к высокомолекулярным фракциям, а Мп — к низкомолекулярным фракциям полидисперсных полимеров. Поэтому для характеристики средней ММ полимеров часто используют молекулярную массу в максимуме хроматографического пика (Мр), которая для узкодисперсных образцов равна Мр = (М„ х Мп)0 5 [8а]. Отношение Мж/ Мп определяет индекс полидисперсности полимера, позволяющий оценить разброс макромолекул по молекулярным массам. Кроме того, с помощью индекса полидисперсности можно определить число единиц ветвления в разветвленной макромолекуле полимера [8].

В настоящее время наиболее надежным методом определения средних ММ и индекса полидисперсности полимеров является метод мультидетекторной

гель-проникающей хроматографии (ГПХ) [9]. ГПХ с детектором по светорассеянию и концентрационным детектором с вискозиметром позволяет определять молекулярные массы независимо от какого-либо вида калибровки колонок. В последнее десятилетие получил развитие новый перспективный метод определения средней ММ полимеров — метод диффузионно-упорядоченной спектроскопии ЯМР (Diffusion Ordered Spectroscopy, DOSY), позволяющий измерить самодиффузию различных молекулярных объектов (молекул, макромолекул, молекулярных комплексов, супрамолекулярных систем) под действием градиента магнитного поля [10]. Метод DOSY основан на регистрации потери фазовой когерентности ядерных спинов за счет трансляционных перемещений молекул в таком поле [11, 12]. Диффузную информацию используют для количественной оценки размера макромолекул полимера и, соответственно, его молекулярной массы [4, 13—18]. Преимуществом метода DOSYявляется получение наряду с диффузной также спектральной информации (значения химических сдвигов, мультиплетность сигналов), что позволяет в рамках одного эксперимента решить целый спектр задач фармакопейного анализа качества лекарственных субстанций декстранов.

Метод DOSY является косвенным методом определения ММ полимеров. Он предусматривает эмпирическую калибровку корреляционной зависимости коэффициента самодиффузии D (количественной характеристики диффузных процессов) от параметра ММР в ряду объектов, близких по природе к исследуемой системе, и последующую экстраполяцию полученной зависимости в область D изучаемого объекта, чтобы оценить для него искомый параметр. Вид корреляционного уравнения и его значимость будут зависеть от используемого параметра ММР.

При выводе корреляционного уравнения очень важна проблема корректной интерпретации экспериментальных величин DOSY эксперимента, поскольку определение значения D полимера как единого целого — нетривиальная задача, даже если все инструментальные источники ошибок учтены, и значения D скорректированы. Основная трудность связана с тем, что не все ядра полимерной макромолекулы характеризуются одним значением D.

Цель работы — сравнить различные способы определения значения D макромолекул декстрана как единого целого и определить функциональные взаимозависимости между D и основными параметрами его ММР.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объектов исследования использовали стандартные образцы декстранов производства компании «Pharmacosmos» (Дания). Параметры ММР представлены в табл. 1. Регистрацию спектров Н и Н-DOSY проводили на ЯМР спектрометре Agilent DD2 NMR System 600 с 5-мм инверсным мультиядер-

Таблица 1

ЗНАЧЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ ММР ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ ДЕКСТРАНОВ

Образец М,,кДа Мп,кДа Образец |^Мр,кДа| Mw, кДа Мп,кДа I

Dextran1 1,08 1,27 1,01 Dextran80 66,70 80,9 55,5

Dextran5 4,44 5,22 3,26 Dextran150 123,60 147,6 100,3

Dextran12 9,89 11,6 8,11 Dextran270 196,30 273,0 164,2

Dextran25 21,40 23,8 18,3 Dextran410 276,50 409,8 236,3

Dextran50 43,50 48,6 35,6 Dextran670 401,30 667,8 332,8

ным датчиком, оснащенным градиентной катушкой, при температуре 300 К. Анализируемые образцы в количестве 5 мг растворяли в 0,5 мл D2O (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.). Полученные растворы разбавляли D2O в 10 раз до концентрации 1 мг/мл и переносили в ЯМР-ампулы Shigemi со стеклянным плунжером для минимизации эффектов конвекции и неоднородности импульсов градиента магнитного поля. Для измерения коэффициентов самодиффузии использовали последовательность DBPPSTE (DOSY Bipolar Pulse Pair Stimulated Echo). Кривые диффузионного затухания получали при последовательном 15-шаговом линейном увеличении амплитуды импульса градиента магнитного поля в интервале от 1,82 до 53 Гс/см при фиксированных значениях времени диффузии А (285 мс), длительности градиентного импульса б (2,0 мс) и времени релаксации d1 (5 с). Математическую обработку результатов осуществляли методом DISCRETE (Discrete Sum of Exponential Decays) [19], в рамках которого каждую кривую диффузионного затухания представляли суммой двух экспоненциальных составляющих. Вывод корреляционных уравнений и расчет статистических параметров (коэффициентов детерминации, ^-критериев Фишера, t-критериев Стьюдента) проводили с использованием программного обеспечения MS Excel 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Под самодиффузией понимают пространственное перемещение молекул в термодинамически равновесной материальной среде за счет хаотического теплового движения [20]. Самодиффузию характеризуют коэффициентом самодиффузии D, который численно равен среднеквадратичному смещению молекулы за время диффузии td. Информацию о величине D молекулярной системы в рамках метода DOSY получают из анализа диффузионного затухания — зависимости амплитуды сигнала спинового эха от параметров градиента магнитного поля, которая описывается функцией Стейскала-Таннера [21]:

I(6,A)=I„exp[-DY2g262(A-6/3)],

где I и I0 — амплитуда сигнала спинового эха в присутствии и отсутствии импульса градиента магнитного поля, А — время диффузии (мс), б — длительность градиентного импульса (мс), y — гиромагнитное отношение для данного ядра (Гц-Тл-1), g — величина градиента магнитного поля (Тл-м-1).

Зависимость величины Б от размера молекулярных объектов описывает уравнение Стокса-Энштей-на [22]:

D=kT/6пnR-t^

где k — постоянная Больцмана (Дж-К1), Т — абсолютная температура (К), п — вязкость раствора (Н-с-м2), — гидродинамический радиус (м).

Растворы полимеров, как правило, характеризуются несколькими значениями D, даже в случае узкодисперсного ММР, когда образец представляет собой набор близких по длине и массе макромолекул. Одна из причин данного явления — наличие в исследуемой системе ряда состояний, соответствующих минимумам на поверхности потенциальной энергии (например, различных конформаций или ассоциатов с растворителем), и химический обмен между ними (переход спина или группы спинов между несколькими состояниями). В случае медленного химического обмена каждый набор сигналов, соответствующий различным состояниям, будет характеризоваться своим значением D. Другая причина экспериментально наблюдаемого разброса значений D ядер макромолекулы полимера — различная локальная подвижность сегментов полимерной цепи, которая не зависит от молекулярной массы полимера, но является специфической для каждой конкретной системы «полимер — растворитель» и зависит от температуры измерения. В рамках метода ЯМР системы спинов ядер, характеризующихся единственными значениями исследуемого параметра ^, времени релаксации Т или Т2 и т.д.) принято выделять в фазы [20]. Определяемые таким образом фазы не имеют ничего общего с термодинамическими фазами состояния вещества. Следовательно, растворы полимеров, которые характеризуются набором значений D, являются полифаз-ными системами. Трансляционную подвижность по-лифазной полимерной макромолекулы как единого целого часто анализируют с помощью среднего коэффициента самодиффузии Щ), который определяют по формуле [20, 22]:

Ds =2^1 D^,

где р1 — относительная доля (населенность) резонирующих ядер в образце, характеризующихся значением Di.

На практике величины р1 можно определять путем интегрирования пиков на диаграмме распределения D. Например, на рис. 2 представлена диаграмма рас-

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

пределения Б образца БехШп1, значение Д которого (2,517* 10-10 м2/с) получено усреднением четырех величин Д. В своих предыдущих работах [23—25] мы предложили для характеристики самодиффузии макромолекулы полимера как единого целого использовать величину Б в максимальном пике на диаграмме распределения Б в образце полимера (Бр). Например, для образца Бех&ап1 Бр=2,510-10—10 м2/с (рис. 2). В табл. 2 представлены значения Д и Бр для декстра-нов с различной средней ММ, которые получены нами при использовании параметров Б08У эксперимента, обеспечивающих высокое разрешение по величине Б разветвленных полисахаридов (декстранов и ГЭК) [24, 25]. Как следует из табл. 2, в большинстве случаев Б>Бр.

Мы исследовали степенные зависимости параметров ММР декстранов (М*, Мп и Мр) от диффузионных характеристик (Бр и Б3), разбив весь массив исследуемых образцов декстранов на обучающую (Бех/гап1, 5, 12, 25, 50, 150, 270, 670) и контрольную (БехКап80, БехШп410) выборки. Полученные уравнения степенной регрессии представлены в табл. 3, графическое отображение этих зависимостей — на рис. 3 и 4. Как следует из таблицы 3, обе количественные характеристики процессов самодиффузии (Бр и Д) с высокой точностью коррелируют со всеми параметрами ММР: значения коэффициентов детерминации (Я2), которые являются индикатором степени подгонки модели к исходным данным, во всех случаях близки к 1. Максимальные значения Я2 имеют уравнения 1—111. Следовательно, параметры ММР декстранов лучше всего коррелируют с Бр. Следует отметить, что вывод регрессионных уравнений был проведен для ограниченной по

объему совокупности (12 наблюдений), то есть полученные параметры уравнений регрессии и коэффициенты детерминации могут быть искажены действием случайных факторов. Для оценки значимости отдельных коэффициентов регрессий и уравнений регрессии в целом были рассчитаны значения /-критерия Стью-дента (/) для каждого коэффициента и /-критерии Фишера (¥) для каждого уравнения (табл. 3). Расчет / и ¥ осуществляли, используя линейные регрессионные уравнения, полученные логарифмическим преобразованием соответствующих степенных зависимостей. Графические изображения линейных зависимостей ^ ММ=а-^ Б + Ь (табл. 3) приведены на рис. 5 и 6. Фактические значения ¥ и / для каждого коэффициента (1а, Ш) сравнивали с табличными (максимальными значениями критериев под влиянием случайных факторов) при текущих степенях свободы и заданном уровне значимости (0.05). Как следует из данных табл. 3, фактические значения ¥, /а, /ь по модулю значительно превосходят табличные значения, что свидетельствует о статистической значимости моделей и надежности полученных уравнений регрессии. Следует отметить, что выбор количественной характеристики процесса самодиффузии макромолекул декстранов как единого целого (Бр или Д) не оказывает существенного влияния на значения статистических параметров точности и значимости регрессионных моделей зависимости параметров ММР от Б.

Полученные уравнения степенной регрессии параметров ММР от Б (1—У1, табл. 3) были использованы для расчета значений М*, Мр, Мп и М№/Мп образцов декстранов, вошедших в контрольную выборку (табл. 4). Погрешность расчета (б) оценивали относительно экспериментальных значений параметров ММР, определенных методом ГПХ с детектором по светорассеянию и концентрационным детектором с вискозиметром. Как следует из данных табл. 4, в целом наблюдается хорошее соответствие между всеми анализируемыми параметрами ММР декстранов, определенными методом ГПХ (см. табл. 1) и рассчитанными с использованием предложенных регрессионных уравнений в рамках метода Б0SY. Независимо от способа определения значения Б декстранов (Б3 или Бр), соответствие расчетных параметров ММР экспериментальным значениям увеличивается в ряду М№<Мп~Мр. Средняя погрешность в определении Мр дек-странов методом Б0SY лежит в пределах погрешности опре-

2.84 2.76 2.68 2.60 2.52 2.44 2.36 2.28 2.20 2.12 2.04 1.96 1.88 1.80 О

Рис. 2. Диаграмма распределения коэффициентов самодиффузии образца декстрана БехШп1

Таблица 2

ЗНАЧЕНИЯ ДИФФУЗИОННЫХ ПАРАМЕТРОВ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ ДЕКСТРАНОВ

Образец V 10 10 м2/с р ' Д/10 10 м2/с Образец V 10 10 м2/с р Д10 10 м2/с

Бех1гап1 2,510 2,517 Бей;гап80 0,367 0,372

Бех1гап5 1,379 1,375 БехИапШ 0,296 0,337

Бех1гап12 0,924 0,914 Бех1гап270 0,223 0,225

ВехИап25 0,637 0,628 ВехИап410 0,207 0,216

ВехИап50 0,466 0,477 Бех1гап670 0,168 0,186

Таблица 3

РЕГРЕССИОННЫЕ УРАВНЕНИЯ ЗАВИСИМОСТИ ПАРАМЕТРОВ ММР ОТ ДИФФУЗИОННЫХ

ПАРАМЕТРОВ ДЕКСТРАНОВ

№ п/п Уравнение ММ=« Vх

Уравнение ^(ММ)=« \%(Ц)+Ь

Я2 Г *(а) т

I М = 9,7412 Б 226 1я М = - 2,2603 1я Б - 21,615 0,997 2183 -46,72 -43,57

п Мр = 8,3038 Бр - 2,164 1я М = - 2,1637 1я Б - 20,718 ° р ’ р 0,999 8608 -92,78 -86,64

ш Мп = 6,9291 Бр - 2151 1я Мп = - 2,151 1я Бр - 20,669 0,999 11205 -105,85 -99,20

IV Mw= 9,9832 Б8 - 234 1Я Mw = - 2,3401 1я Б8 - 22,402 0,993 844 -29,05 -27,16

V Мр = 8,4984 Д - 2,241 1я Мр = - 2,2407 1я Б8 - 21,478 0,996 1332 -36,50 -34,17

VI М = 7,0909 Б - 2227 п ’ 8 1Я М = - 2,2274 1я Б - 21,424  п ’ ° 8 ’ 0,996 1356 -36,83 -34,59

-Рибл=5,987

г(а)тбл=г(Ь)табл=2,447

Таблица 4

РАСЧЕТНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ ММР ОБРАЗЦОВ ДЕКСТРАНОВ КОНТРОЛЬНОЙ ВЫБОРКИ

Декстран V Расчетные параметры ММР (Х0С8¥) 6 *, %

М , w, кДа М , кДа М , кДа М /М W/ п М„, кДа Мр, кДа Мп, кДа М /М w/ п

Бех1гап80 Б р 93,86 72,67 59,85 1,57 16,01 8,95 7,84 7,53

Б Б 100,97 76,64 64,13 1,57 24,81 14,90 15,56 7,53

Бех1гап410 Б р 342,39 250,91 205,13 1,67 16,45 9,26 13,19 3,43

Б Б 360,29 256,75 215,22 1,67 12,08 7,14 8,92 3,43

среднее значение Б р 16,23 9,11 10,52 5,48

Б Б 18,45 11,02 12,24 5,48

*5 —|(ХгПХ-^ГЮ8у)/^ТПх|'100%

деления ММ методом ГПХ (5—10%) [26]. Сравнение средних значений относительных погрешностей позволяет сделать следующий вывод: определение Мп, Мр и М„ на основе данных Бр приводит к лучшим результатам, чем на основе данных Д. Значения индексов полидисперсности, полученные с использованием обоих диффузионных характеристик, совпадают, и средняя относительная погрешность определения М,,/Мп не превышает 10%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе регрессионного анализа сделан вывод о возможности применения метода Б08У для оценки основных параметров ММР (М„, Мп и Мр, индекса полидисперсности) декстранов. Наиболее точно диффузионные параметры коррелируют с молекулярной массой декстранов в максимуме хроматографического пика (Мр). Таким образом, при определении параметров ММР и индекса полидисперсности декстранов методом Б08У можно ограничиться данными Бр.

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Рис. 3. Графическая зависимость средних молекулярных масс декстранов от Dp

Рис. 4. Графическая зависимость средних молекулярных масс декстранов от Ds

Рис. 5. Линейная зависимость lg MM от lg Dp для декстранов

Рис. 6. Линейная зависимость lg MM от lg Ds для декстранов

ЛИТЕРАТУРА

REFERENCES

1. Гоготов ИН. Полисахариды: свойства, получение и практическое использование. В кн.: Тезисы докладов Международной научнопрактической конференции «Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества». Минск-Нароч. 25-28 мая 2005. С. 54-55.

2. Донецкий ИА, Персанова ЛВ, Акимов ДА, Суханов ЮС, Бодина ЗК, Новохатский АС, Хлябич ГН. Способ получения декстрана. Патент Российской Федерации, № 2093577; 2002.

3. Жуков АФ, Колосова ИФ, Кузнецов ВВ. Аналитическая химия. Физические и физико-химические методы анализа. М.: Химия; 2001.

4. Maina NH. Structure and macromolecular properties of Weissella confusa and Leuconostoc citreum dextrans with a potential application in sourdough. PhD [dissertation]. Helsinki: University of Helsinki; 2012.

5. Кнунянц ИЛ, ред. Химическая энциклопедия. Т. 2. М: Большая российская энциклопедия; 1990.

6. Monsan P, Bozonnet S, Albenne C, Joucla G, Willemot R, Remaund-Simeon M. Homopolysaccharides from lactic acid bacteria. Int Dairy J 2001; 11: 675-685.

7. Sarwat F., Qader S.A., Aman A., Nuzhat A. N. Production and Characterization of a Unique Dextran from an Indigenous Leuconostoc mesenteroides CMG713. Int J Biol Sci 2008; 4(6): 379-386.

8. Нефедов ПП, Лавренко ПН. Транспортные методы в аналитической химии полимеров. Л.: Химия; 1979.

9. Striegel AM. Multiple detection in size-exclusion chromatography of macromolecules. Analytical Chem 2005; 77(5): 104А-113А.

10. Morris KF, Johnson Jr. CS. Resolution of discrete and continuous molecular size distributions by means of diffusion-ordered 2D NMR spectroscopy. J Am Chem Soc 1993; 115(10): 4291-4299.

1. Gogotov IN. Polysaccharides: properties, production and practical use. In: Abstracts of the International scientific-practical conference «Prospects and problems of biotechnology in the Common Economic Space of the Commonwealth». Minsk-Naroch. 2005, May 25-28. P. 54-55 (in Russian).

2. Donetsky IA, Persanova LV, Akimov DA, Suhanov YuS, Bodina ZK, Novo-hatsky AS, Hlyabich GN. A method of producing of dextran. Patent of the Russian Federation, № 2093577; 2002 (in Russian).

3. Zhukov AF, Kolosova IF, Kuznetsov VV. Analytical chemistry. Physical and chemical methods of analysis. Moscow: Himiya; 2001 (in Russian).

4. Maina NH. Structure and macromolecular properties of Weissella confusa and Leuconostoc citreum dextrans with a potential application in sourdough. PhD [dissertation]. Helsinki: University of Helsinki; 2012.

5. Knunyants IL, ed. Chemical encyclopedia. V. 2. Moscow: Bolshaya rossiys-kaya entsiklopedia; 1990 (in Russian).

6. Monsan P, Bozonnet S, Albenne C, Joucla G, Willemot R, Remaund-Simeon M. Homopolysaccharides from lactic acid bacteria. Int Dairy J 2001; 11: 675-685.

7. Sarwat F., Qader S.A., Aman A., Nuzhat A. N. Production and Characterization of a Unique Dextran from an Indigenous Leuconostoc mesenteroides CMG713. Int J Biol Sci 2008; 4(6): 379-386.

8. Nefedov PP, Lavrenko PN. Transportation methods in analytical chemistry of polymers. Leningrad: Himiya; 1979 (in Russian).

9. Striegel AM. Multiple detection in size-exclusion chromatography of macromolecules. Analytical Chem 2005; 77(5): 104A-113A.

10. Morris KF, Johnson Jr. CS. Resolution of discrete and continuous molecular size distributions by means of diffusion-ordered 2D NMR spectroscopy. J Am Chem Soc 1993; 115(10): 4291-4299.

11. Price WS. Pulsed-field gradient nuclear magnetic resonance as a tool for

11. Price WS. Pulsed-field gradient nuclear magnetic resonance as a tool for studying translational diffusion: Part 1. Basic theory. Concept Magn Reson 1997; 9(5): 299-336.

12. Price WS. Pulsed-field gradient nuclear magnetic resonance as a tool for studying translational diffusion: Part 2. Experimental aspects. Concept Magn Reson 1998; 10(4): 197-237.

13. Li W, Chung H, Daeffler C, Johnson JA, Grubbs RH. Application of 1H DOSY for Facile Measurement of Polymer Molecular Weights. Macromolecules 2012; 45(24): 9595-9603.

14. Mazarin M, Viel S, Allard-Breton B, Thevand A, Charles L. Use of Pulsed Gradient Spin-Echo NMR as a Tool in MALDI Method Development for Polymer Molecular Weight Determination. Anal Chem 2006; 78(8): 2758-64.

15. Viel S, Capitani D, Mannina L, Segre A. Diffusion ordered NMR spectroscopy: A versatile tool for the molecular weight determination of uncharged polysaccharides. Biomacromolecules 2003; 4(6): 1843-7.

16. Tomati U, Belardinelli M, Galli E, Iori V, Capitani D, Mannina L, Viel S, Seg-re A. NMR characterization of the polysaccharidic fraction from Lentinula edodes grown on olive mill waste waters. Carbohyd Res 2004; 339(6): 1129-34.

17. Politi M, Groves P, Chavez MI, Canada FJ, Jimenez-Barbero J. Useful applications of DOSY experiments for the study of mushroom polysaccharides. Carbohydr Res 2006; 341(1): 84-9.

18. Suarez ER, Syvitski R, Kralovec JA, Noseda MD, Barrow CJ, Ewart HS, Lums-den MD, Grindley TB. Immunostimulatory Polysaccharides from Chlorella pyrenoidosa. Biomacromolecules 2006; 7(8): 2368-76.

19. Provencher SW. An eigenfunction expansion method for the analysis of exponential decay curves. J Chem Phys 1976; 64(7): 2772-7.

20. Маклаков АИ, Скирда ВД, Фаткуллин НФ. Самодиффузия в растворах и расплавах. Казань: Издательство Казанского университета; 1987.

21. Stejscal JE, Tanner EO. Spin diffusion measurements: spin echoes in the presence of a time-dependent field gradient. J Chem Phys 1965; 42(1): 288-90.

22. Харламов СВ, Латыпов ШК. Современная диффузионно-упорядоченная спектроскопия ЯМР в химии супрамолекулярных систем: возможности и ограничения. Успехи химии 2010; 79(8): 699-719.

23. Кузьмина НЕ, Моисеев СВ, Крылов ВИ, Яшкир ВА, Меркулов ВА. Возможности применения метода диффузно-упорядоченной спектроскопии ЯМР для количественной оценки средней молекулярной массы полулланов. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения 2013; 4: 8-11.

24. Кузьмина НЕ, Моисеев СВ, Крылов ВИ, Яшкир ВА, Меркулов ВА. Журнал аналитической химии 2014; 69. В печати.

25. Кузьмина НЕ, Моисеев СВ, Крылов ВИ, Яшкир ВА, Меркулов ВА. Журнал аналитической химии 2014; 69. В печати.

26. Благодатских ИВ. Жидкостная хроматография полимеров. Методическое пособие. М.: Научно-образовательный центр по физике и химии полимеров ИНЭОС РАН; 2010.

ОБ АВТОРАХ:_____________________________________________________________

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Российская Федерация, 127051, Москва, Петровский бульвар, 8.

Моисеев Сергей Владимирович. Эксперт 1-й категории лаборатории нанолекарств, препаратов для клеточной и генотерапии, канд. хим. наук. Кузьмина Наталия Евгеньевна. Ведущий эксперт лаборатории нанолекарств, препаратов для клеточной и генотерапии, д-р хим. наук.

Крылов Владимир Игоревич. Ведущий инженер лаборатории нанолекарств, препаратов для клеточной и генотерапии.

Яшкир Вадим Анатольевич. Начальник лаборатории нанолекарств, препаратов для клеточной и генотерапии, канд. хим. наук.

Меркулов Вадим Анатольевич. Первый заместитель генерального директора, д-р мед. наук.

studying translational diffusion: Part 1. Basic theory. Concept Magn Reson 1997; 9(5): 299-336.

12. Price WS. Pulsed-field gradient nuclear magnetic resonance as a tool for studying translational diffusion: Part 2. Experimental aspects. Concept Magn Reson 1998; 10(4): 197-237.

13. Li W, Chung H, Daeffler C, Johnson JA, Grubbs RH. Application of 1H DOSY for Facile Measurement of Polymer Molecular Weights. Macromolecules 2012; 45(24): 9595-9603.

14. Mazarin M, Viel S, Allard-Breton B, Thevand A, Charles L. Use of Pulsed Gradient Spin-Echo NMR as a Tool in MALDI Method Development for Polymer Molecular Weight Determination. Anal Chem 2006; 78(8): 2758-64.

15. Viel S, Capitani D, Mannina L, Segre A. Diffusion ordered NMR spectroscopy: A versatile tool for the molecular weight determination of uncharged polysaccharides. Biomacromolecules 2003; 4(6): 1843-7.

16. Tomati U, Belardinelli M, Galli E, Iori V, Capitani D, Mannina L, Viel S, Segre A. NMR characterization of the polysaccharidic fraction from Lentinula edodes grown on olive mill waste waters. Carbohyd Res 2004; 339(6): 1129-34.

17. Politi M, Groves P, Chavez MI, Canada FJ, Jimenez-Barbero J. Useful applications of DOSY experiments for the study of mushroom polysaccharides. Carbohydr Res 2006; 341(1): 84-9.

18. Suarez ER, Syvitski R, Kralovec JA, Noseda MD, Barrow CJ, Ewart HS, Lums-den MD, Grindley TB. Immunostimulatory Polysaccharides from Chlorella pyrenoidosa. Biomacromolecules 2006; 7(8): 2368-76.

19. Provencher SW. An eigenfunction expansion method for the analysis of exponential decay curves. J Chem Phys 1976; 64(7): 2772-7.

20. Maklakov AI, Skirda VD, Fatkullin NF. Self-diffusion in solutions and melts. Kazan: Izdatelstvo Kazanskogo universiteta; 1987 (in Russian).

21. Stejscal JE, Tanner EO. Spin diffusion measurements: spin echoes in the presence of a time-dependent field gradient. J Chem Phys 1965; 42(1): 288-90.

22. Harlamov SV, Latypov SK. Modern diffusion-ordered NMR spectroscopy in chemistry of supramolecular systems: possibilities and limitations. Uspehi himii 2010; 79(8): 699-719 (in Russian).

23. Kuzmina NE, Moiseev SV, Krylov VI, Yashkir VA, Merkulov VA. The possibility of using diffusion-ordered NMR spectroscopy for quantitative analysis of pullulan average molecular weight. Vedomosti Nauchnogo tsentra ekspertizy sredstv meditsinskogo primeneniya 2013; 4: 8-11 (in Russian).

24. Kuzmina NE, Moiseev SV, Krylov VI, Yashkir VA, Merkulov VA. Zhurnal anal-iticheskoy himii 2014; 69 (in Russian).

25. Kuzmina NE, Moiseev SV, Krylov VI, Yashkir VA, Merkulov VA. Zhurnal anal-iticheskoy himii 2014; 69 (in Russian).

26. Blagodatskih IV. Благодатских ИВ. Liquid chromatography of polymers. Toolkit. Moscow: Nauchno-obrazovatelny tsentr po fizike i himii polim-erov INEOS RAN; 2010 (in Russian).

AUTHORS:________________________________________________________________

Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, 8 Petrovsky Boulevard, Moscow, 127051, Russian Federation.

Moiseev SV. 1st category expert of Laboratory of nanomedicines, medicines for cell therapy and genotherapy. Candidate of Chemical Sciences.

Kuzmina NE. Leading expert of Laboratory of nanomedicines, medicines for cell therapy and genotherapy. Doctor of Chemical Sciences.

Krylov VI. Leading engineer of Laboratory of nanomedicines, medicines for cell therapy and genotherapy.

Yashkir VA. Head of Laboratory of nanomedicines, medicines for cell therapy and genotherapy. Candidate of Chemical Sciences.

Merkulov VA. First Deputy Director General. Doctor of Medical Sciences.

АДРЕС ДЛЯ ПЕРЕПИСКИ:

Моисеев Сергей Владимирович; MoiseevSV@expmed.ru

Статья поступила 04.04.2014 г. Принята к печати 14.05.2014 г.

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ