Способ выделения эндотелия микрососудов мозга крысы
METHOD FOR ISOLATING THE ENDOTHELIUM OF RAT BRAIN MICROVESSELS

Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии, и может быть использовано для выделения и культивирования эндотелия микрососудов мозга.
Эндотелий - активный эндокринный орган, самый большой в организме, диффузно рассеянный вместе с сосудами по всем тканям. Эндотелий, по классическому определению гистологов, - однослойный пласт специализированных клеток, выстилающих изнутри все сердечно-сосудистое дерево, весом около 1,8 кг. Один триллион клеток со сложнейшими биохимическими функциями, включающий системы синтеза белков и низкомолекулярных веществ, рецепторы, ионные каналы [Каде А.Х., Занин С.А., Губарева Е.А., Туровая А.Ю., Богданова Ю.А., Апсалямова C.O., Мерзлякова С.Н. Физиологические функции сосудистого эндотелия // Фундаментальные исследования. - 2011. - №11-3. - С. 611-617].
Сосудистый эндотелий, находясь на границе между кровью и другими тканями организма, выполняет свои основные функции за счет биологически активных веществ: регуляция параметров гемодинамики, тромборезистентность и участие в процессах гемостаза, участие в воспалении и ангиогенезе. Причем при нарушении функции или структуры эндотелия резко меняется спектр выделяемых им биологически активных веществ. Эндотелий начинает секретировать агреганты, коагулянты, вазоконстрикторы, причем часть из них (ренин-ангиотензиновая система) оказывает влияние на всю сердечно-сосудистую систему. При неблагоприятных условиях (гипоксия, нарушения обмена веществ, атеросклероз и т.п.) эндотелий становится инициатором (или модулятором) многих патологических процессов в организме.
Эндотелиоциты синтезируют субстанции, важные для контроля свертывания крови, регуляции сосудистого тонуса, артериального давления, фильтрационной функции почек, сократительной активности сердца, метаболического обеспечения мозга. Эндотелий способен реагировать на механическое воздействие протекающей крови, величину давления крови в просвете сосуда и степень напряжения мышечного слоя сосуда. Клетки эндотелия чувствительны к химическим воздействиям, которые могут приводить к повышенной агрегации и адгезии циркулирующих клеток крови, развитию тромбоза, оседанию липидных конгломератов.
Гетерогенность популяции клеток эндотелия в организме человека определяет особенности функционирования сосудов в разных тканях и органах. Приобретение эндотелиального фенотипа, специфичного для различных тканей, осуществляется на этапах развития эндотелиальных прогениторных клеток путем сложных процессов, определяющих их дифференцировку и миграцию, причем эти процессы достаточно пластичны и могут изменяться под действием внешних факторов. Эндотелиоциты, которые входят в состав нейроваскулярной единицы (НВЕ) головного мозга, составляющей основу структуры гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), в процессе эволюции приобрели свойства, позволяющие эффективно регулировать взаимодействие между кровотоком и центральной нервной системой (ЦНС) (Кувачева Н.В., Салмина А.Б., Комлева Ю.К., Малиновская Н.А., Моргун А.В., Пожиленкова Е.А., Замай Г.С., Лузина Н.А., Петрова М.М. Проницаемость гематоэнцефалического барьера в норме, при нарушении развития головного мозга и нейродегенерации. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова, 2013; 113(4): 80-85). Причем эта барьерная функция не всегда ассоциировалась с клетками эндотелиальной природы: изначально ГЭБ формировался из глиальных клеток. Примечательно, что последовательность событий совершенно иная в онтогенезе - ГЭБ формируется в процессе эмбриогенеза из клеток эндотелия и перицитов, и эти события предшествуют включению астроцитов в состав нейроваскулярной единицы. Свойства, определившие преимущества эндотелиоцитов перед клетками глии в контексте регуляции избирательной проницаемости ГЭБ, связаны с возможностью формирования компактного нефенестрированного монослоя, с наличием так называемых тесных контактов, экспрессией большого числа высокоспециализированных транспортных молекул и белков клеточной адгезии, с низким уровнем трансцитоза (Ronaldson Р.Т., Davis Т.Р. Blood-brain barrier integrity and glial support: mechanisms that can be targeted for novel therapeutic approaches in stroke. Curr Pharm Des 2012; 18(25): 3624-3644). Отсутствие фенестр определяет низкий уровень экспрессии гликопротеина МЕСА-32 (PVLAP) в эндотелии микрососудов головного мозга. Кроме того, эндотелий в составе нейроваскулярной единицы головного мозга является объектом регуляции со стороны других клеток НВЕ - перицитов, астроцитов и нейронов, а также молекул внеклеточного матрикса. Понимание клеточно-молекулярных механизмов барьерогенеза при развитии головного мозга, восстановлении его после повреждения обеспечит новые возможности фармакотерапии заболеваний центральной нервной системы, обусловленных эндотелиальной дисфункцией (Салмина А.Б., Моргун А.В., Кувачева Н.В., Пожиленкова Е.А., Солончук Ю.Р., Таранушенко Т.Е. Эндотелиальные прогениторные клетки в развитии и восстановлении церебрального эндотелия (обзор). Современные технологии в медицине (СТМ J), 2014, том 6, No4, с. 213-222).
Существует несколько протоколов выделения клеток эндотелия, в целом, и клеток церебрального эндотелия, в частности, из организма экспериментальных животных, однако на сегодняшний день в выделении эндотелия микрососудов мозга крысы для последующего изучения эндотелиальной дисфункции in vitro сохраняется ряд проблем, таких как низкий выход, контаминация другими типами клеток и потребность в использовании большого количества животных и дорогостоящего фактора роста. Одна из основных проблем с эндотелием микрососудов головного мозга крысы - получение максимально чистых (свободных от примеси других клеток) первичных культур.
2
4
2
4
2
Известен способ выделения и очистки эндотелиальных клеток капилляров головного мозга крыс на основе пуромицина путем рассечения кортикального слоя 2-недельной крысы Wistar, удаления мозговых оболочек и его измельчения. Рассечение проводят на льду и в физиологическом растворе с фосфатным буфером (NaCl, 137 мМ; KCl, 2,7 мМ; NaHPO, 8 мМ; KHPO, 1,5 мМ). Кортикальный слой гомогенизируют пипеткой на 5 мл и для его переваривания в DMEM в течение 1,5 ч при 37°С добавляют смесь коллагеназа/диспаза (270 Ед коллагеназы/мл, 0,1% диспазы) и ДНКазы (10 Ед/мл). Осадок клеток разделяют центрифугированием в 20% бычьем сывороточном альбумине/DMEM (1000 г, 15 мин) и инкубируют в смеси коллагеназа/диспаза в течение 1 часа при 37°С. Фрагменты капилляров удерживают на нейлоновом фильтре 10 мкм, удаляют из фильтра базальной средой эндотелиальные клетки с добавлением 20% сыворотки, полученной из бычьей плазмы, и антибиотиков (пенициллин, 100 Ед/мл; стрептомицин, 100 мкг/мл), и высевают на чашки Петри диаметром 60 мм, покрытые коллагеном IV типа (5 мкг/см). Затем добавляют либо 4 мкг/мл пуромицина в течение 2 дней, либо 3 мкг/мл пуромицина в течение 3 дней. Затем пуромицин удаляют из культуральной среды и заменяют фактором роста фибробластов (2 нг/мл) и гидрокортизоном (500 нг/мл). Чистоту культуры оценивают с помощью микроскопического исследования (N. Perriere, Р.Н. Demeuse, Е. Garcia, et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. Journal of Neurochemistry, 2005, 93, 279-289). При этом многие клетки проявляют признаки страдания. Также присутствуют некоторые гигантские и многоядерные эндотелиальные клетки и загрязняющие культуру клетки (перициты).
3
Наиболее близким техническим решением к заявленному способу является способ выделения эндотелия микрососудов мозга крысы проводят анестезии и стерилизации мозга, который сначала отделяют от новорожденной 10-дневной крысы и осторожно катают по асептической сухой фильтровальной бумаге для удаления мозговых оболочек и крупных сосудов. Затем левое и правое полушария головного мозга диссоциируют в холодном растворе Хенкса. За исключением серого вещества удаляют ткань головного мозга и видимые крупные сосуды. Серое вещество измельчают на мелкие кусочки размером примерно 1 мм и центрифугируют в конической пробирке на 15 мл при 150×g в течение 3 минут. В слой осадка добавляют 25% БСА, что в 2 раза превышает объем осаждения, и перемешивают 25-30-кратными движениями вверх и вниз пипеткой на 5 мл. Затем гомогенат дополнительно центрифугируют при 600×g в течение 10 минут. Осадок микрососудов, расположенный в нижнем слое, переносят в новую коническую пробирку на 15 мл, а остальные повторно перемешивают и повторно центрифугируют таким же образом еще два или три раза. Все гранулы микрососудов переваривают 0,1% коллагеназой II, в 2 раза превышающем объем агрегатов микрососудов, но не менее 1 мл, в течение 35 минут при 37°С с периодическим перемешиванием. Обработанные ферментом микрососуды ресуспендируют и центрифугируют при 150×g в течение 5 минут. При этом получают агрегаты микрососудов и отдельные эндотелиальные клетки. Затем осуществляют посев на культуральный пластик в ростовой среде. Морфологию клеток и статус роста наблюдают с помощью фазово-контрастного микроскопа (Yang Liu, Qiang Xue, Qing Tanga et al. A simple method for isolating and culturing the rat brain microvascular endothelial cells. Microvascular Research 90 (2013) 199-205). Однако данный способ не обеспечивает полноценное отделение эндотелиальных микрососудов от других клеток нейроваскулярной единицы (нейроны, перициты, глия), что снижает выход эндотелиальных клеток.
Технический результат заявленного способа заключается в расширении арсенала технических средств для выделения эндотелия микрососудов мозга крысы с лучшим отделением микрососудов от клеток нейрональной и глиальной природы и более высоком выходе эндотелиальных клеток.
Технический результат достигается тем, что выделение эндотелия микрососудов мозга крысы проводят путем следующих операций: извлечения мозга крысы, удаления мозговых оболочек и крупных сосудов, диссекции коры головного мозга в холодном растворе Хенкса и ее измельчение, диссоциации ткани пипетированием количеством 25-30 раз, осаждение центрифугированием для отделения микрососудов от нейрональной ткани, переваривание в 0,1% растворе коллагеназы II при 37°С, осаждение и удаление фермента с последующим посевом на культуральный пластик в ростовой среде, при этом используют мозг крысы возрастом от 14 до 20 дней, измельчают кору мозга на кусочки размером 5-7 мм, добавляют 3 миллилитра раствора Хенкса, а диссоциацию ткани осуществляют вначале пипетированием 25-30 раз пастеровской пипеткой с широким отверстием - 1,5-2 мм, после чего проводят осаждение центрифугированием, удаляют надосадок, добавляют еще 3 миллилитра раствора Хенкса и вновь пипетируют 25-30 раз пастеровской пипеткой с тонким просветом - 0,5-0,7 мм, затем центрифугируют в течение 5 минут при 1000 об/мин, удаляют надосадок и добавляют холодный 4-8°С 25% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) на натрий-фосфатный буферный раствор (PBS), вновь центрифугируют в течение 10 минут при 2000 об/мин, далее надосадок пипетируют еще 25-30 раз и центрифугируют в течение 10 минут при 2000 об/мин, отбирают часть диссоциированной ткани над BSA вместе с раствором альбумина, к осадку приливают 3-4 миллилитра раствора Хенкса и центрифугируют осадок в течение 5 минут при 1000 об/мин, удаляют надосадок, добавляют к осадку 2 мл 0,1% раствора коллагеназы на PBS и вновь пипетируют, далее пробирку с тканью помещают в роллерную установку при 37°С на 40 минут, затем после инкубации в пробирку приливают 5 миллилитров раствора Хенкса для остановки процесса переваривания, центрифугируют в течение 5 минут при 1000 об/мин, удаляют супернатант, ресуспендируют клеточную массу в ростовой среде и засевают на культуральный пластик, покрытый субстратом.
Способ осуществляют следующим образом.
Для работы используют кору мозга крыс линии Wistar возрастом от 14 до 20 дней. Это связано с тем, что у крысы данного возраста уже сформировалась обширная сосудистая сеть и можно получить больше материала от одного животного, кроме того, эти эндотелиоциты имеют высокий пролиферативный потенциал, что соответствует активным процессам ангиогенеза и барьерогенеза в развивающемся головном мозге.
Животных наркотизируют этиловым эфиром и погружают в 70-ти процентный этиловый спирт. Стерильно извлекают мозг, перекатыванием на стерильной фильтровальной бумаге удаляют оболочки и крупные сосуды и помещают мозг в холодный раствор (4-8°С) Хенкса. Под лупой снимают оставшиеся оболочки и отделяют от коры больших полушарий другие структуры мозга. Кору промывают 2-3 раза холодным раствором Хенкса, затем измельчают лезвием скальпеля и переносят в центрифужную пробирку. Дополнительно добавляют 3 миллилитра раствора Хенкса и проводят диссоциацию ткани пипетированием 25-30 раз пастеровской пипеткой с широким просветом (1,5-2 мм). После чего проводят осаждение центрифугированием измельченной ткани в течение 5 минут при 1000 об/мин, удаляют надосадок, добавляют еще 3 миллилитра раствора Хенкса и вновь пипетируют 25-30 раз пастеровской пипеткой с тонким просветом - 0,5-0,7 мм, центрифугируют в течение 5 минут при 1000 об/мин и удалают надосадок. Далее к осадку добавляют холодный (4-8°С) 25% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) на натрий-фосфатный буферный раствор (PBS) (объем должен быть на 2 мл больше, чем объем осадка) и центрифугируют в течение 10 минут при 2000 об/мин. Осадок разделяется по плотности: более тяжелые структуры (микрососуды с эритроцитами опускаются на дно пробирки, а нервные клетки, содержащие много липидов в мембране, поднимаются над раствором BSA). Надосадок пипетируют еще 25-30 раз и центрифугируют в течение 10 минут при 2000 об/мин. Удаляют часть диссоциированной ткани над BSA вместе с раствором альбумина, к осадку приливают 3-4 миллилитра раствора Хенкса и центрифугируют осадок в течение 5 минут при 1000 об/мин. Удаляют надосадок, добавляют к осадку 2 мл 0,1% раствора коллагеназы II на PBS и вновь пипетируют. Далее пробирку с тканью помещают в роллерную установку при 37°С на 40 минут. Затем после инкубации в пробирку приливают 5 миллилитров раствора Хенкса для остановки процесса переваривания, центрифугируют в течение 5 минут при 1000 об/мин, удаляют супернатант, ресуспендируют клеточную массу в ростовой среде и засевают на культуральный пластик, покрытый субстратом.
На первых этапах работы растворы должны быть холодными (4-8°С), для того, чтобы замедлить обменные процессы в тканях. В этом случае живых клеток сохранится больше. Промывание коры после переноса из емкости, в которой ее отсекали от остальной части мозга, необходимо для удаления остатков ненужных тканей, волокон, погибших клеток. При измельчении скальпелем кусочки ткани не должны оставаться очень маленькими, как для получения других первичных нейрональных культур клеток. Сосуды должны оставаться протяженными. Это нужно для того, чтобы при расслоении по плотности, больше тяжелых плотных структур опускалось на дно пробирки. Мелкие кусочки сосудов с большей долей вероятности будут флотировать, и, в конечном итоге, будут удалены. Так же для того, чтобы не разрывать сосуды, измельчать ткань мозга нужно постепенно и более бережными, чем лезвие, средствами. Для этого и используются пастеровские пипетки с просветом разного диаметра: чем больше кусочки ткани, там шире просвет пипетки (1,5-2 мм в диаметре), по мере гомогенизации коры мозга, просвет пипетки становится меньше (0,5-0,7 мм в диаметре). Дополнительно ткань промывают, чтобы убрать погибшие клетки, детрит; для этого суспензию центрифугируют и удаляют супернатант.
Примеры выполнения способа.
Количество использованных в работе животных: 20.
Пять животных использовали для повторения и отработки оригинальной методики из статьи Yang Liu 2013 года (см. ссылка выше).
Для отработки заявленной модифицированной методики выделения эндотелия микрососудов мозга использовано 20 крыс. При этом животных наркотизировали этиловым эфиром и погружали в 70-ти процентный этиловый спирт. Стерильно извлекали мозг, перекатыванием на стерильной фильтровальной бумаге удаляли оболочки и помещали мозг в холодный раствор (4-8°С) Хенкса. Под лупой снимали оставшиеся оболочки и отделяли от коры больших полушарий другие структуры мозга. Кору промывали 2-3 раза холодным раствором Хенкса, затем измельчали лезвием скальпеля и переносили в центрифужную пробирку. Дополнительно добавляли 3 миллилитра раствора Хенкса и пипетировали 25-30 раз пастеровской пипеткой с широким просветом (размер просвета 1,5-2 мм). Центрифугировали измельченную ткань 5 минут при 1000 об/мин, удаляли супернатант, снова добавляли 3 мл раствора Хенкса и пипетировали 25-30 раз пастеровской пипеткой с широким просветом (размер просвета 1,5-2 мм), центрифугировали и удаляли надосадок. Добавляли еще 3 миллилитра раствора Хенкса и пипетировали 25-30 раз пастеровской пипеткой с тонким просветом (размер просвета 0,5-0,7 мм), центрифугировали 5 минут при 1000 об/мин, удаляли надосадок и добавляли холодный (4-8°С) 25% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) на PBS (объем должен быть на 2 мл больше, чем объем осадка), центрифугировали 10 минут при 2000 об/мин. Осадок разделялся по плотности: более тяжелые структуры (микрососуды с эритроцитами опускались на дно пробирки, а нервные клетки, содержащие много липидов в мембране, поднимались над раствором BSA). Надосадок пипетировали еще 25-30 раз и центрифугировали 10 минут на 2000 об/мин. Полностью отбирали часть диссоциированной ткани над BSA вместе с раствором альбумина, к осадку приливали 3-4 миллилитра раствора Хенкса и ресуспендировали осадок, центрифугировали 5 минут на 1000 об/мин. Надосадок удаляли полностью, добавляли 2 мл 0,1% раствор коллагеназы II на PBS и умеренно пипетировали. Пробирку с тканью помещали в роллерную установку при 37°С на 40 минут. После инкубации в пробирку приливали 5 миллилитров раствора Хенкса для остановки процесса переваривания. Центрифугировали 5 минут на 1000 об/мин, удаляли супернатант, ресуспендировали клеточную массу в ростовой среде и засевали на культуральный пластик, покрытый матригелем.
Используемая ростовая среда для культуры:
Ростовая среда на 100 мл:
1. DMEM/F-12 Gibco
76 мл
2. Телячья эмбриональная сыворотка 20%
20 мл
3. GlutaMAX Gibco×100
1 мл
4. Глюкоза 40%
750 мкл
5. Гидрокортизон 1,4 мМ
100 мкл
6. Пируват натрия 11 мг/мл
1 мл
7. Антибиотик (Пеницилин-5000 ед/мл:
трептомицин-5000 мкг/мл)
1 мл.
При этом были выявлены следующие преимущества заявленной методики выделения эндотелия микрососудов мозга крысы в сравнении с прототипом.
Таким образом, дополнительные этапы позволяют лучше отделить микрососуды от клеток нейрональной природы, поэтому при расслоении ткани в бычьем сывороточном альбумине обеспечивается более высокий выход клеток эндотелиоцитов. К тому же, при длительном пипетировании и центрифугировании погибает большая часть глии, поэтому нет необходимости в дополнительных приемах ингибирования роста сопутствующих культур, например, в химическом подавлении роста астроцитов.
Результаты выделения клеток эндотелия из головного мозга крыс представлены на фиг.1 А, Б, В и на фиг.2 А, Б, В. На указанных фото представлены первичные культуры церебральных эндотелиоцитов коры головного мозга крыс при иммуноцитохимическом окрашивании клеток: зеленый - виментин (эндотелиоциты- фото Б), красный - GFAP (зрелые астроциты - фото В). На фотографиях клетки разного типа помечены стрелками: белые стрелки - эндотелиоциты, серые стрелки с хвостиком - астроциты.
На фиг.1 А, Б, В представлена первичная культура церебральных эндотелиоцитов коры головного мозга крысы, полученная по оригинальной методике выделения Yang Liu 2013 год (прототип). (А - фотография первичной культуры эндотелия микрососудов коры мозга крысы с примесью астроцитов, Б - эндотелиоциты, В - астроциты над монослоем эндотелия). Визуализация культуры первого пассажа (после выделения в течение в среднем 5-7 дней образовывался монослой субпассажа на поверхности субстрата, который пересевали) после суток культивирования in vitro.
Культура клеток зафиксирована параформальдегидом, а затем клетки разных типов (эндотелиоциты и астроциты) были маркированы антителами (эндотелий - виментин, астроглия - GFAP). На фотографии А показан общий план с клетками разных типов, на фотографии Б показаны эндотелиоциты, образующие плотный монослой, на фотографии В - астроциты, находящиеся над монослоем эндотелия. Как видно из данных фото первичной культуры церебральных эндотелиоцитов коры головного мозга крысы, выделенной по оригинальной методике (фиг. 1 фото А, Б и В) в культуре клеток присутствует примерно равное количество эндотелиоцитов и астроцитов.
На фиг. 2 представлено фото препарата крысы первичная культура церебральных эндотелиоцитов коры головного мозга крысы, полученная по заявляемой модифицированной методике выделения (А - фотография первичной культуры эндотелия микрососудов коры мозга крысы с примесью астроцитов, Б - эндотелиоциты, В - астроциты. Визуализация культуры первого после суток культивирования in vitro.
Культура гомогенная, в ней практически отсутствуют астроциты, клетки эндотелия хорошо сохранены и составляют большую часть присутствующих в культуре клеток.
Таким образом, выделение эндотелия микрососудов мозга крысы по заявленной методике осуществлено с лучшим отделением микрососудов от клеток нейрональной и глиальной природы и более высоким выходом эндотелиальных клеток.