Механизмы изменения реологических свойств крови у лиц с патологией церебрального сосудистого русла под влиянием пентоксифиллина

УДК 612.1+612.014

А. В. Муравьёв, С. В. Булаева, А. В. Замышляев

Механизмы изменения реологических свойств крови у лиц с патологией церебрального сосудистого русла под влиянием пентоксифиллина

Исследование выполнено при поддержке гранта РФФИ №12-04-00550-а и в рамках ведомственной целевой программы Минобрнауки, № 01201276739

Имеются многочисленные свидетельства того, что вязкость цельной крови и плазмы повышены при сосудистых расстройствах. Это снижение текучести крови и ее транспортных возможностей, как правило, обусловлено выраженной агрегацией эритроцитов и существенно повышенной ригидностью клеток. В данном исследовании реологические параметры крови были исследованы у лиц с нарушением сосудистого русла головного мозга (церебральный атеросклероз) до и после четырехнедельного курса применения реокорректора - пентоксифиллина (400 мг х 3 раза в день). Параллельно исследовали прямой микрореологический эффект этого препарата. Было показано, что существенный вклад в снижение цельной крови после периода терапии, наряду с вязкостью плазмы, оказывает более высокая деформируемость эритроцитов и их сниженная агрегируемость. В исследовании in vitro было продемонстрировано, что при инкубации эритроцитов с ингибиторами активности фосфодиэстераз, существенно и благоприятно изменяются микрореологические свойства эритроцитов.

Ключевые слова: вязкость крови, деформируемость эритроцитов, агрегация, пентоксифиллин, фосфодиэстеразы, церебральный атеросклероз.

A. V. Muravyov, S. V. Bulaeva, A. V. Zamyshlayev

Rheological properties change of patients with cerebrovascular disease after pentoxifylline therapy

There are many evidences that the whole blood and plasma viscosity are increased under vascular disorders. The blood viscosity rise and the blood transport capacity reduction under vascular diseases may be due to the red blood cell (RBC) aggregation increase and their deformability lowering. To correct RBC microrheological disturbances drugs with well-known rheological efficiency can be used. In the present study the rheological parameters were investigated in patients with the cerebrovascular disease after 4 weeks of the pentoxifylline therapy together with in vitro direct pentoxifylline (0.02 mg/ml) effect on RBC microrheology assessment. There were found similar rheological changes of RBC deformability and RBCA as after therapy as in vitro pentoxifylline treatment of cells. It was shown that the drugs can inhibit the cellular phosphodiesterase activity resulted in RBCD rise and their aggregation lowering. Therefore, red blood cell microrheology control mechanisms may be associated with the phosphodiesterase activity inhibition.

Keywords: blood viscosity, cerebrovascular disease, red blood cells deformability and aggregation, phosphodiesterase, pentoxifylline.

Введение

В последние годы получены убедительные данные об участии повышенной вязкости крови в процессе системных нарушений микроциркуляции у лиц с цереброваскулярными заболеваниями [1, 3, 14]. Известно, что прирост вязкости цельной крови и снижение ее транспортного потенциала, наблюдаемые при сосудистых расстройствах, происходят из-за микрореологических нарушений [2-6]. Применяемые при лечении заболеваний лекарственные препараты могут оказывать прямое влияние на реологические свойства крови и в первую очередь на микрореологию эритроцитов [7, 8, 9]. Однако при оценке только курсового применения лекарственного препарата трудно с уверенностью сказать о его прямом воздействии на деформацию и агрегацию эритроцитов и, следовательно, на текучесть цельной крови [12, 13].

© Муравьев А. В., Булаева С. В., Замышляев А. В., 2013

Для этого протокол исследования необходимо дополнить оценкой прямого влияния используемого препарата для коррекции реологических нарушений у больных в опытах in vitro [12] . Таким образом, целью данной работы было проведение анализа изменений макро- и микрореологических показателей крови лиц с церебральным атеросклерозом (ЦА) в условиях лекарственной терапии тренталом (пентоксифиллином) и in vitro исследование изменений агрегации и деформируемости эритроцитов под действием этого лекарственного препарата.

Материал и методы исследования

Дизайн исследования

Изучение реологических свойств крови лиц с ЦА проводили в несколько этапов. На первом этапе регистрировали макро- и микрореологические параметры крови у пациентов с верифици-

рованным диагнозом церебральный атеросклероз (возраст - от 50 до 68, п=31) до и после курса лечения больных с включением в схему пен-токсифиллина (Трентал, 8апой-Ауепй8, 1200 мг/день, в течение четырех недель).

На втором этапе для проведения исследования прямых эффектов трентала на микрореологию эритроцитов лиц с церебральным атеросклерозом клетки инкубировали с данным препаратом (0,02 мг/мл) в течение 15 мин при 37 С. В качестве контроля в этой серии исследовали суспензии эритроцитов в изотоническом растворе без добавления препарата.

Методы исследования

В комплекс измерений макрореологических свойств крови включали регистрацию вязкости цельной крови при высоких (ВК1) и при низких скоростях сдвига (ВК2), плазмы (ВП), гематокрита (Нс^). Измерение вязкости проводили на полуавтоматическом капиллярном вискозиметре при напряжениях сдвига от 0,196 Нм2 до 1,96 Н-м"2 при комнатной температуре (20,0±1,0 С). Гемато-крит цельной крови и приготовленных суспензий эритроцитов определяли с помощью специальной центрифуги СМ-70 (Латвия). Для исследования микрореологических свойств эритроцитов из цельной крови клетки получали центрифугированием (10 мин, при 2750 об/мин). После этого эритроциты отмывали три раза в изотоническом растворе хлорида натрия (№С1) с добавлением 5 мМ глюкозы. Затем суспензию отмытых эритроцитов делили на две аликвоты и после периода инкубации, как описано выше, проводили регистрацию агрегации и деформируемости клеток.

Деформируемость эритроцитов (ДЭ) исследовали двумя методами:

1) Регистрировали вязкость суспензий эритроцитов [11] в изотоническом растворе №С1 с Ие1=40 % на капиллярном вискозиметре при напряжении сдвига 1,96 Нм-2 (ВС). Вязкость суспензионной среды была постоянной и составила 1,10 мПа-с. Коэффициент вариации при измерении вязкости не превышал 1,0 %.

2) Определяли индекс удлинения эритроцитов (ИУЭ), используя метод проточной микрокамеры. Для этого микрокамеру заполняли суспензией эритроцитов (0,5 %) в изотоническом растворе №С1, содержащем 5,0 мМ глюкозы и 0,1 % альбумина, и помещали на предметный столик микроскопа. Затем в камеру подавали давление, которое создавало в ней величину напряжения сдвига (г = 0,78 Нм2), что приводило к деформационному вытягиванию клеток по направлению потока.

Изображение вытянутых эритроцитов, прикрепленных одной точкой к поверхности микроканала, с микроскопа передавалось через USB порт в компьютер, используя цифровой окуляр (модель DCM 500). После «захвата» и записи изображения его обрабатывали с помощью компьютерной программы, где определяли длину и ширину деформированных клеток (около 100) и рассчитывали индекс удлинения как показатель деформации:

ИУЭ = (L-W)/(L+W), где L - длина деформированной клетки, W - ее ширина.

Агрегацию эритроцитов регистрировали агре-гометром (Myrenne M1) и методом оптической микроскопии с последующим компьютерным анализом изображения.

Регистрация биохимических показателей крови Концентрацию гемоглобина крови (Hb; гемо-глобинцианидным методом), общего белка плазмы (биуретовым методом), триглицеридов (энзи-матическим колориметрическим методом), глюкозы (глюкозооксидазным методом), альбумина (по реакции с бромкрезоловым зеленым) в плазме определяли на биохимическом фотометре Микролаб-540, используя реагенты фирм «Ви-тал-Европа» и «Агат».

Статистическую обработку полученных цифровых материалов проводили, используя табличный редактор Microsoft Excel и программу «Statistica» (версия 6.0).

Результаты исследования и их обсуждение Применение в течение четырех недель трента-ла в терапии больных церебральным атеросклерозом сопровождалось неоднозначными изменениями гемореологических параметров. Было найдено, что вязкость цельной крови при высоких напряжениях сдвига у 45 % пациентов (рис. 1) снижалась в среднем на 12 % (p<0,05), тогда как у 48 % наблюдалось ее достоверное повышение на 17 %. При низких напряжениях сдвига вязкость крови в результате лечения снижалась у 68 % лиц (рис. 2) с ЦА на 34 % (p<0,05), а у 26 % выявлен ее статистически значимый прирост на сходную величину.

7%

45%

26% ¿г;;;

6%

[Снижение п Повышение а Отсутствие изменений

Косвенным свидетельством этого могут выступать выявленные нами корреляционные взаимосвязи между ВК1 и ВП, а также ВК2 и ВП. В результате лечения было найдено статистически значимое снижение уровня холестерина в плазме на 12 % (рис.3). Также наблюдалась тенденция к снижению концентрации в плазме триг-лицеридов и глюкозы.

пСнижение 1=1 Повышение  Отсутствие изменений

Рис. 1. Изменение вязкости цельной крови у лиц с церебральным атеросклерозом при высоких напряжениях сдвига под влиянием лечения тренталом

В основе более выраженного позитивного изменения в результате лечения низкосдвиговой вязкости крови могло лежать достоверное повышение на 7 % деформируемости эритроцитов, о чем свидетельствует наличие корреляции (г=0,430; р<0,05), выявленной между ВК2 и ВС.

Снижение вязкости плазмы на 16 % (р<0,05), которое наблюдалось у 42 % пациентов под влиянием лекарственной терапии, также могло вносить определенный вклад в уменьшение вязкости цельной крови, как при высоких, так и при низких напряжениях сдвига.

0х

<и «

И

<и И <и

120 -, 105 -90 -75 -60 45 Н 30 15 0

До лечения

После лечения

Рис. 3. Изменение концентрации холестерина в плазме у лиц с церебральным атеросклерозом после четырехнедельной коррекции пентоксифиллином

Показатель гемоглобина в крови, а также уровень общего белка и альбуминов в плазме после у лиц с ЦА были сопоставимы с теми, что наблюдались до лечения. Что касается агрегации эритроцитов, то после курса лечения тренталом у 52 % пациентов наблюдалось ее достоверное снижение в среднем на 45 %. Вместе с тем, более чем у трети лиц, наоборот - ее заметное увеличение агрегации (р<0,05). Важно отметить тот факт, что снижение агрегации после лечения, как правило, наблюдалось у пациентов с исходно высокой агрегацией, в то время как у лиц с изначально низкими величинами агрегации в результате четырехнедельной терапии тренталом агрегация существенно возрастала. Этим можно объяснять столь разнонаправленные изменения агрегации, наблюдаемые после курса лечения больных тренталом.

*

Рис. 2. Изменение вязкости цельной крови у лиц с церебральным атеросклерозом при низких напряжениях сдвига под влиянием лечения тренталом

А

Б

Рис. 4. Изменение интегрального индекса агрегации эритроцитов

Важно иметь в виду, что при инкубации с пен-токсифиллином эритроцитов пациентов с исходно высокой агрегацией, было найдено ее достоверное снижение на сходную, как после лечения, величину, около 50 % (р<0,05). Тогда как у лиц с исходно низкой агрегацией этот препарат in vitro, также как четырех недельная терапия им, существенно (на 90 %; p<0,05) повысил агрегацию эритроцитов.

Изменения деформируемости эритроцитов лиц с ЦА после инкубации эритроцитов с пен-токсифиллином in vitro также во многом совпа-

дали с изменениями этой микрореологической характеристики у данных пациентов, которые наблюдались в результате лекарственной терапии. Так после инкубации эритроцитов с пентоксифиллином был найден статистически значимый прирост ИУЭ, который составил в среднем 8 %. Снижение вязкости суспензии эритроцитов под влиянием пентоксифиллина наблюдалось у 52 % пациентов, а после лечения этим препаратом - у 55 % (рис. 5).

0,6 0,5

£

«0,4

s '

S0,3 s

Г)

s0,2 0,1

0

52%

38%

10%

снижение повышение без изменений

Рис. 5. Изменение вязкости суспензии эритроцитов пациентов с церебральным атеросклерозом при прямом воздействии на них трентала

В качестве внутриклеточной молекулярной мишени для пентоксифиллина вероятно служат ферменты фосфодиэстеразы [10, 11]. При их ин-гибировании повышается уровень циклического АМФ в клетках, запускающего каскад внутриклеточных реакций, который вероятно приводит к повышению деформируемости эритроцитов [12]. Позитивные изменения деформируемости

эритроцитов, полученные в результате действия пентоксифиллина могли быть связаны именно с ингибированием данных ферментов, поскольку в предварительных опытах при использовании селективных ингибиторов фосфодиэстераз (ФДЭ) наблюдались сходные изменения пластичности клеток. Так в частности ингибитор фосфодиэсте-разы 1 в эритроцитах - винпоцетин, способство-

вал достоверному приросту деформируемости эритроцитов на 8 %, тогда как ингибитор ФДЭ 4 -ролипрам повышал ДЭ в среднем на 15 % (p<0,05). При применении классического ингибитора активности ФДЭ - изобутилметилксантина (ИБМК) отмечалось достоверное повышение пластичности эритроцитов на 19 % (p<0,01).

Таким образом, в результате исследования получены неоднозначные изменения вязкости цельной крови и плазмы у лиц с церебральным атеросклерозом после четырехнедельной терапии пен-токсифиллином. Изменения микрореологических свойств эритроцитов у лиц с церебральным атеросклерозом в результате лечения пентоксифилли-ном в подавляющем большинстве случаев совпадали с изменениями микрореологии клеток у данных пациентов, полученными после инкубации эритроцитов с этим препаратом in vitro.

Заключение

При in vitro исследовании прямых эффектов лекарственного препарата пентоксифиллина (0,02 мг/мл) на микрореологию эритроцитов лиц с церебральным атеросклерозом были найдены сходные изменения свойств клеток с теми, что наблюдались в результате лечения данных больных.

При исходно высокой агрегации отмечалось достоверное снижение интегрального индекса агрегации, в то время как у лиц с изначально низкой агрегацией, после терапии наблюдался ее существенный прирост.

Эффект позитивного изменения деформируемости эритроцитов, как в результате лечения, так и в результате применения трентала in vitro может быть связан с ингибированием активности фосфодиэстераз в клетках.

Библиографический список

1. Маймистова, А. А. Сравнительный анализ изменений гемореологического профиля мужчин и женщин с нарушениями церебрального кровообращения [Текст] / А. А. Маймистова, А. В. Муравьёв, С. В. Булаева, Е. Л. Волкова // Ярославский педагогический вестник. Том III. (Физико-математические и естественные науки). - 2010. - № 4. - С. 67-72.

2. Муравьёв, А. В. Изменение реологического профиля у больных диабетом 1 и 2 типа при лечении Тренталом [Текст] / А. В. Муравьёв, А. В. Замышляев, Ф. А. Чучканов, И. А. Тихомирова, С. В. Булаева, А. А. Маймистова // Клиническая фармакология и тер. - 2009. - 18. - №2. - С. 87-92.

3. Ройтман, Е. В., Гемореологические эффекты различных плазмозамещающих препаратов [Текст] / Е. В. Ройтман, И. И. Дементьева, Ю. А. Морозов // Мат. Междунар. Конф. «Гемореология и микроциркуляция. - Ярославль, - 2003. - С. 77.

4. Bolokadze N., Lobjanidze I., Momtselidze. Blood rheological properties and lipid peroxidation in cerebral and systemic circulation of neurocritical patients // Clin. Hemorheol. and Microcirc. - 2004. - Vol. 30, N 2. - P. 99-105.

5. Delamaire M., Durand F., Pinel J.F., Goff M.C., Chauvel P., Beauplet A. Importance of erythrocyte aggregation phenomena in cerebrovascular accidents. // Clin. Hem-orheol. and Microcirc. - 1995. - Vol. 15, N 3. - P. 430.

6. Endres S., Semmler J., Eisenbut T., Sinba B. The role of cyclic adenosine 3',5'-monophosphate in suppression of tumor necrosis factor-a synthesis: effect of pentoxifylline // Leukocytes and Endothelial Interactions. Prous Science. Barselona. -1995. - P. 59-69.

7. Forconi S., Turchetti V., Matteis C., Leoncini F., Picciolini F., Trabalzini L., Postorino G., Altavilla R. Be-

havior of blood viscosity, intraerythrocytic calcium, total erythrocytic morphology in ischaemic diseases // Clin. Hemorheol. and Microcirc. - 1995. - Vol. 15, N 3. - P. 68.

8. Koenig W., Ernst E. The possible role of hemorhe-ology in atherothrombogenesis // Atherosclerosis. - 1992.

- Vol. 94, N 2-3. - P. 93-107.

9. Koscielny J., Jung E.M., Mrowietz C., Kiesewetter H., Latza R. Blood fluidity, fibrinogen, and cardiovascular risk factors of occlusive arterial disease: results of the Aachen study // Clin. Hemorheol. and Microcirc. - 2004. - Vol. 31, N 3. - P. 185-195.

10. Muravyov A.V., Meiselman J.H., Yakusevich V.V. Zamishlayev A.V. Effects of antihypertensive therapy on hemorheological profiles in female hypertensive patients with initially low or high whole blood viscosity // Clin. Hemorheol. and Microcirc. - 2002. - Vol. 26. - P. 125-135.

11. Muravyov A.V., Yakusevich V.V., Kabanov A.V., Petrochenko A.S. The effect of diuretics on red blood cell microrheological parameters in female hypertensive patients // Clin. Hemorheol. and Microcirc. - 2005. - Vol. 33.

- N 2. - P. 121.

12. Muravyov A. V. Yakusevich V. V., Maimisto-va A. A., Chuchkanov F. A., Bulaeva S. V. Hemorheolog-ical efficiency of drugs, targeting on intracellular phos-phodiesterase activity: in vitro study // Clin. Hemorheol. and Microcirc. - 2007. - Vol. 36, N 4. - P. 327-334.

13. Solerte S.B., Fioravanti M., Cerutti N. Retrospective analysis of long-term hemorheologic effects of pent-oxifylline in diabetic patients with angiopathic complications // Acta Diabetol. - 1997. - Vol. 34. - P. 67-74.

14. Velcheva I., Antonova N., Titianova E., Damianov P., Dimitrov N., Dimitrova V. Hemorheological disturbances in cerebrovascular diseases // Clin. Hemorheol. and Microcirc. - 2008. - Vol. 39, N 1-4. - P. 391-396.

Bibliograficheskij spisok

1. Majmistova, A. A. Sravnitel'nyj analiz izmenenij gemoreologicheskogo profilja muzhchin i zhenshhin s narushenijami cerebral'nogo krovoobrashhenija [Tekst] / A. A. Majmistova, A. V. Murav'jov, S. V. Bulaeva,

E. L. Volkova // Jaroslavskij pedagogicheskij vestnik. Tom III. (Fiziko-matematicheskie i estestvennye nauki). -2010. - № 4. - S. 67-72.

2. Murav'jov, A. V. Izmenenie reologicheskogo profilja u bol'nyh diabetom 1 i 2 tipa pri lechenii Trentalom [Tekst] / A. V. Murav'jov, A. V. Zamyshljaev,

F. A. Chuchkanov, I. A. Tihomirova, S. V. Bulaeva, A. A. Majmistova // Klinicheskaja farmakologija i ter. - 2009. -18. - №2. - S. 87-92.

3. Rojtman, E. V., Gemoreologicheskie jeffekty razlichnyh plazmozameshhajushhih preparatov [Tekst] / E. V. Rojtman, I. I. Dement'eva, Ju. A. Morozov // Mat. Mezhdunar. Konf. «Gemoreologija i mikrocirkuljacija. -Jaroslavl', - 2003. - S. 77.

4. Bolokadze N., Lobjanidze I., Momtselidze. Blood rheological properties and lipid peroxidation in cerebral and systemic circulation of neurocritical patients // Clin. Hem-orheol. and Microcirc. - 2004. - Vol. 30, N 2. - P. 99-105.

5. Delamaire M., Durand F., Pinel J.F., Goff M.C., Chauvel P., Beauplet A. Importance of erythrocyte aggregation phenomena in cerebrovascular accidents. // Clin. Hemorheol. and Microcirc. - 1995. - Vol. 15, N 3. - P. 430.

6. Endres S., Semmler J., Eisenbut T., Sinba B. The role of cyclic adenosine 3',5'-monophosphate in suppression of tumor necrosis factor-a synthesis: effect of pent-oxifylline // Leukocytes and Endothelial Interactions. Prous Science. Barselona. -1995. - P. 59-69.

7. Forconi S., Turchetti V., Matteis C., Leoncini F., Picciolini F., Trabalzini L., Postorino G., Altavilla R. Behavior of blood viscosity, intraerythrocytic calcium, total

erythrocytic morphology in ischaemic diseases // Clin. Hemorheol. and Microcirc. - 1995. - Vol. 15, N 3. - P. 68.

8. Koenig W., Ernst E. The possible role of hemorhe-ology in atherothrombogenesis // Atherosclerosis. - 1992.

- Vol. 94, N 2-3. - P. 93-107.

9. Koscielny J., Jung E.M., Mrowietz C., Kiesewetter H., Latza R. Blood fluidity, fibrinogen, and cardiovascular risk factors of occlusive arterial disease: results of the Aachen study // Clin. Hemorheol. and Microcirc. - 2004. - Vol. 31, N 3. - P. 185-195.

10. Muravyov A.V., Meiselman J.H., Yakusevich V.V. Zamishlayev A.V. Effects of antihypertensive thera-py on hemorheological profiles in female hypertensive patients with initially low or high whole blood viscosity // Clin. Hemorheol. and Microcirc. - 2002. - Vol. 26. - P. 125-135.

11. Muravyov A.V., Yakusevich V.V., Kabanov A.V., Petrochenko A.S. The effect of diuretics on red blood cell microrheological parameters in female hyper-tensive patients // Clin. Hemorheol. and Microcirc. - 2005. - Vol. 33.

- N 2. - P. 121.

12. Muravyov A. V. Yakusevich V. V., Maimisto-va A. A., Chuchkanov F. A., Bulaeva S. V. Hemorheolog-ical efficiency of drugs, targeting on intracellular phosphodiesterase activity: in vitro study // Clin. Hemorheol. and Microcirc. - 2007. - Vol. 36, N 4. - P. 327-334.

13. Solerte S.B., Fioravanti M., Cerutti N. Retrospective analysis of long-term hemorheologic effects of pent-oxifylline in diabetic patients with angiopathic complications // Acta Diabetol. - 1997. - Vol. 34. - P. 67-74.

14. Velcheva I., Antonova N., Titianova E., Damian-ov P., Dimitrov N., Dimitrova V. Hemorheological disturbances in cerebrovascular diseases // Clin. Hem-orheol. and Microcirc. - 2008. - Vol. 39, N 1-4. - P. 391-396.