Влияние тромбодефенсинов на чувствительность микроорганизмов к антагонистически активным веществам лактобацилл

Влияние тромбодефенсинов на чувствительность микроорганизмов к антагонистически активным веществам лактобацилл

М.В. Сычёва, к.б.н., Л.Ф. Галиуллина, аспирантка,

О.Л. Карташова, дб.н, профессор, Оренбургский ГАУ

В последние годы отмечаются значительные темпы роста бактериальных инфекций. Расширение спектра возбудителей, многообразие их свойств, рост антибиотикорезистентных штаммов диктуют необходимость поиска новых подходов к лечению бактериальных инфекций [1]. Важным арсеналом совершенствования терапевтических подходов является разработка нового поколения препаратов на основе антимикробных пептидов, среди которых на сегодняшний день особое внимание уделяется низкомолекулярным катионным белкам из тромбоцитов, или тромбо-дефенсинам (ТД) [7]. Результаты исследований последних лет свидетельствуют о способности ТД изменять персистентные характеристики микроорганизмов, влиять на биоплёнкообра-зование [2, 3]. Установлен противомикробный эффект тромбоцитарного катионного белка (ТКБ). Необходимо отметить, что немаловажным является вопрос о влиянии тромбодефенсинов на чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистически активным веществам представителей нормальной микрофлоры.

Как известно, одним из представителей резидентной микрофлоры, характеризующихся высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, являются бактерии рода Lactobacillus. Лактобациллы обладают высокой биологической и функциональной активностью, что определяет их широкое использование в производстве пробиотиков [4]. Изучение влияния тромбоцитарного катионного белка на чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистически активным веществам микроорганизмов — представителям нормофлоры, на наш взгляд, позволит по-новому подойти к решению вопроса лечения инфекционных заболеваний и коррекции дисбиозов.

Вышеизложенное предопределило цель настоящего исследования — изучить влияние антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных на чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистически активным веществам лактобацилл.

Материалы и методы. Кислоторастворимые белки тромбоцитов крупного рогатого скота, лошади и кур получали методом кислотной экстрак-

ции. Содержание белка в кислотных экстрактах определяли по методу М.М. Брэдфорда (1976) с использованием красителя Coomassie Brilliant Blue G-250 (SIGMA, Германия) [8]. В опыт подобрали антагонистически активные штаммы рода Lactobacillus (L 364 и L 370), выделенные из репродуктивного тракта, и клоны условнопатогенных микроорганизмов (Staphylococcus aureus, Candida albicans). Суточные культуры условно-патогенных микроорганизмов соинку-бировали с тромбодефенсинами в минимальной подавляющей концентрации (МПК) и 1/4 МПК, установленных нами ранее, в течение одного часа при 37 °С. Чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистически активным веществам лактобацилл определяли с помощью чашечного метода (принципа отсроченного антагонизма) [5]. Степень чувствительности к антагонистическим факторам лактобацилл условно-патогенных микроорганизмов выражали с помощью коэффициента, который рассчитывали как отношение диаметра зоны задержки роста условно-патогенного микроорганизма к диаметру зоны роста культуры лактобацилл.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента [6].

Результаты исследований. В результате проведённых исследований было установлено, что антимикробные пептиды из тромбоцитов сельскохозяйственных животных усиливали чувствительность S. aureus и C. albicans к антагонистически активным веществам бактерий рода Lactobacillus.

Максимальное увеличение чувствительности клонов S. aureus к антагонистическим факторам штамма L 370 отмечено после соинкубирования с тромбодефенсинами крупного рогатого скота в МПК, при этом коэффициент антагонистической активности увеличился в 3,3 раза (15,2+6,51 против 4,6+1,43 в контроле; рис.).

Коэффициенты антагонистической активности для штамма L 364 в отношении S. aureus после соинкубирования с тромбодефенсинами крупного рогатого скота в МПК и 1/4 МПК составили, соответственно, 4,8+1,02 и 8,4 +2,31 против 3,72 + 0,58 в контроле, а для штамма L 370 в 1/4 МПК - 7,6+3,8 против 4,6+1,43 в контроле. При воздействии другими препаратами тромбоцитарного катионного белка на S. aureus также регистрировали выраженное изменение признака. Так, у клонов S. aureus при соинку-бировании с ТКБ птицы в 1/4 МПК отмечено

= s ^

Ш

e-i E

ra

т

н

а

t u • X ф :

« т

J S , S I- . -0-“ і

6-1 і rn о

контроль

куры

контроль

Рис.

лошадь КРС

L 364

Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на чувствительность S. aureus к антагонистически активным веществам лактобацилл

мпк

лошадь

L 37G

мпк

КРС

мпк

куры

Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на чувствительность C. albicans к антагонистически активным веществам лактобацилл

Коэффициент антагонистической активности лактобацилл

Тромбодефенсины Контроль L 364 L370

5,5±1,20 6,6±1,53

Лошадь МПК 1/4 МПК 8,4±170 11,7±2,04* 7,8±1,40 12,7±2,22*

Крупный рогатый скот МПК 1/4 МПК 7,5±1,19 12,1±1,65** 5,4±0,63 8,6±1,20

Куры МПК 1/4 МПК 12,8±1,27** 14,0±2,76* 14,9±1,74** 9,8±2,84

Примечание: * — достоверность различий коэффициента антагонистической активности в контроле и после со-инкубирования с кислотным экстрактом тромбоцитов (р<0,05); ** — р<0,01.

увеличение чувствительности к антагонистически активным веществам L 370 в 1,9 раза, а при соинкубировании с кислотным экстрактом из тромбоцитов лошади в той же концентрации изучаемый показатель увеличивался в 2,6 раза. Также у клонов S. aureus было установлено значительное изменение чувствительности к антагонистическим факторам L 364 при соинкубировании с ТКБ птицы в МПК, с увеличением коэффициента антагонистической активности в 2,2 раза. Изменения значений чувствительности клонов S. aureus к антагонистически активным веществам лактобацилл были в пределах ошибки средней арифметической, а поэтому различия между величинами оказались недостоверными.

Следует отметить, что тромбодефенсины крупного рогатого скота по сравнению с антимикробными пептидами из тромбоцитов лошади и кур в наибольшей степени увеличивали чувствительность клонов S. aureus к антагонистически активным веществам лактобацилл.

При изучении влияния тромбодефенсинов лошади в МПК на чувствительность С. albicans к антагонистически активным веществам лактобацилл было установлено увеличение изучаемого показателя в среднем на 35,45% (табл.).

В меньшей степени изменялась чувствительность С. albicans к антагонистически активным веществам лактобацилл под действием кислотного экстракта из тромбоцитов крупного

рогатого скота. В среднем изучаемый показатель увеличивался на 18,2% после соинкубирования с тромбодефенсинами в МПК. Более существенное изменение рассматриваемого параметра было отмечено при соинкубировании С. albicans с ТД в 1/4 МПК. Коэффициент антагонистической активности для Lactobacillus 364 составил 12,1+1,65 против 5,5+1,20 в контроле (р<0,01), для Lactobacillus 370 — 8,6+1,20 против 6,6+1,35 в контроле.

Максимальное изменение признака наблюдали при воздействии на микроорганизмы тромбо-дефенсинами кур. Так, под влиянием ТКБ кур в МПК отмечалось увеличение коэффициента антагонистической активности лактобацилл L 364 и L 370 в отношении С. albicans в 2,3 раза. Разница значений по сравнению с контролем в обоих случаях достоверна (р<0,01). Коэффициент антагонистической активности L 364 и L 370 в отношении С. albicans после соинкубирования с кислотным экстрактом из тромбоцитов птицы в 1/4 МПК возрастал по сравнению с контролем в 2,5 (р<0,05) и 1,5 раза соответственно.

Заключение. Таким образом, тромбодефенси-ны сельскохозяйственных животных оказывают стимулирующее влияние на чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистически активным веществам бактерий рода Lactobacillus. Максимальный стимулирующий эффект отмечен в отношении чувствительности S. aureus к антагонистическим факторам лакто-

бацилл L 364 под воздействием тромбоцитарного катионного белка крупного рогатого скота. Однако наиболее выраженным стимулирующим действием на чувствительность С. albicans к факторам межмикробного взаимодействия лактобацилл обладает кислотный экстракт из тромбоцитов птицы.

Известно, что большинство антимикробных пептидов эндогенного происхождения, в том числе и тромбодефенсины, являются мембраноактивными агентами [9]. Полученные нами данные позволяют предположить, что соинкуби-рование с ТД приводит к изменению структуры и функции цитоплазматических мембран, что способствует проникновению в микробную клетку антибиотических веществ, обусловливающих антагонистическую активность лактобацилл в отношении условно-патогенных микроорганизмов.

Литература

1. Яковлев В.П., Яковлев С.В. Рациональная антимикробная фармакотерапия. М.: Мир, 2008. 1001 с.

2. Сычёва М.В., Шейда Е.В., Карташова O.JI. и др. Влияние антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных на способность микроорганизмов к образованию биоплёнок // Известия КрасГАУ. 2011. № 1. С, 130-132.

3. Сычёва М.В., Шейда Е.В., Карташова O.JI. Влияние тромбодефенсинов некоторых видов животных на анти-лактоферриновую активность микроорганизмов // Учёные записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. Казань. 2010. С. 256—259.

4. Тюрин М.В., Шендеров Б.А., Рахимова Н.Г. К механизму антагонистической активности лактобацилл // Журнал микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. 1989. № 5. С. 3-7.

5. КудлайД.Г.,ЛиходедВ.Г. Бактериоциногения. М.: Медицина, 1966. 203 с.

6. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. 288 с.

7. Tang Y.Q. Antimicrobial peptides from human platelets / Q.Y. Tang, M.R. Yeaman, M.E. Selsted // Infection and Immunity. 2002. Vol. 70. № 12. P. 6524-6533.

8. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochev. 1976. Vol. 72. P. 248-254.

9. Matsuzaki K. Molecular basis for membrane selectivity of an antimicrobial peptide, magainin 2 / K. Matsuzaki, K. Sugishita, N. Fujii // Biochemistry. 1995. Vol. 34. No 10. P. 3423-3429.