Высокоэффективная жидкостная хроматография в анализе суппозиторий «Нео-пенотран»

8. Насонов Е.Л., Александрова Е.Н., Амирджанова В.Н. и др. Анти-В-клеточная терапия в ревматологии: фокус на ри-туксимаб / Под ред. Е.Л. Насонова. - М.: ИМА-ПРЕСС, 2012.

- 343 с.

9. Cohen S.B., Emery P., Greenwald M. W., et al. for the REFLEX Trial Group. Rituximab for the rheumatoid arthritis refractory to anti- tumor necrosis factor therapy. Results of multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, phase III trial evaluating primary efficacy and safety at twenty-four weeks // Arthe.Rheum. - 2006. - Vol. 54. - P.2793-2806.

10. Emery P., Fleishmann R., Filipowich-Sosnowska A., et al. for the DANCER study group. The Efficacy and safety of rituximab in patients with active rheumatoid arthritis despite methotrexate treatment. Results of a phase IIb randomized, double-blind, placebo-controlled dose-range trial // Arthr. Rheum. - 2006. -Vol. 54. - P.1390-1400.

11. Salaffi F., De Angelis R., Stancati A., et al. Health-related

quality of life in multiple musculoskeletal conditions: a crosssectional population based epidemiological study. II. The MAPPING study // Clinical Rheumatology. - 2005. - Vol. 23. №6.

- P829-839.

12. Spilker B. Quality of life and pharmacoeconomics in clinical trials Philadelphia. - New York: Lippincott-Raven, 1996.

- 1259 p.

13. Staquet M.J. Quality of life assessment in clinical trials. -Oxford: Oxford University Press, 1998. - 360 p.

14. Symmons D., Tricker K., Roberts C., et al. The British Rheumatoid Outcome Study Group (BROSG) randomised controlled trial to compare the effectiveness and cost-effectiveness of aggressive versus symptomatic therapy in established rheumatoid arthritis // Health Technol. Assess. - 2005. - Vol. 9(34). № III-IV. - P1-78.

15. World Health Organization. The constitution of the World Health Organization // WHO Chronicle. - 1947. - P29.

REFERENCES

1. Amirjanova V.N. Quality of life in patients with rheumatoid arthritis receiving rituximab // Nauchno-prakticheskaya reumatologia. - 2008. - №1S. - P15-20.

2. Vorobyov P.A. Clinical and economic analysis. - Moscow,

2004. - 778 p.

3. Lukina G.V., Sigidin J.A., Kuzikyants K.H., et al. Experience with rituximab in patients with rheumatoid arthritis in clinical practice, according to the Russian Register ARBITER // Russkij medicinskij zurnal. - 2011. - Vol. 19. №25. - P1518-1523.

4. Lukina G.V., Nasonov E.L., Sigidin J.A., et al. First experience with monoclonal antibodies to B-lymphocytes

5. Nasonov E.L. New directions in the treatment of rheumatoid arthritis: focus on Infliximab and Rituximab // Sovremennie problemy reumatologii. - 2007. - Is. 3. - P11-17.

6. Nasonov E.L. Rituximab in the treatment of rheumatic diseases. // Nauchno-prakticheskaya reumatologia. - 2008. -№1S. - P3-10.

7. Nasonov E.L. Difficulties of early diagnosis and treatment of rheumatoid arthritis // Sovremennie problemy reumatologii. -

2005. - Is. 2. - P.3-8.

8. Nasonov E.L., Aleksandrova E.N., Amirjanova V.N., et al. Anti-B-cell therapy in rheumatology: Focus on rituximab / Ed. E.L. Nasonov. - Moscow: IMA-PRESS, 2012. - 343 p.

9. Cohen S.B., Emery P., Greenwald M. W., et al. for the REFLEX Trial Group. Rituximab for the rheumatoid arthritis refractory

to anti- tumor necrosis factor therapy. Results of multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, phase III trial evaluating primary efficacy and safety at twenty-four weeks // Arthe.Rheum. - 2006. - Vol. 54. - P.2793-2806.

10. Emery P., Fleishmann R., Filipowich-Sosnowska A., et al. for the DANCER study group. The Efficacy and safety of rituximab in patients with active rheumatoid arthritis despite methotrexate treatment. Results of a phase IIb randomized, double-blind, placebo-controlled dose-range trial // Arthr. Rheum. - 2006. -Vol. 54. - P.1390-1400.

11. Salaffi F., De Angelis R., Stancati A., et al. Health-related quality of life in multiple musculoskeletal conditions: a crosssectional population based epidemiological study. II. The MAPPING study // Clinical Rheumatology. - 2005. - Vol. 23. №6.

- P829-839.

12. Spilker B. Quality of life and pharmacoeconomics in clinical trials Philadelphia. - New York: Lippincott-Raven, 1996.

- 1259 p.

13. Staquet M.J. Quality of life assessment in clinical trials. -Oxford: Oxford University Press, 1998. - 360 p.

14. Symmons D., Tricker K., Roberts C., et al. The British Rheumatoid Outcome Study Group (BROSG) randomised controlled trial to compare the effectiveness and cost-effectiveness of aggressive versus symptomatic therapy in established rheumatoid arthritis // Health Technol. Assess. - 2005. - Vol. 9(34). № III-IV. - P1-78.

15. World Health Organization. The constitution of the World Health Organization // WHO Chronicle. - 1947. - P29.

Информация об авторах:

Раскина Татьяна Алексеевна - д.м.н., профессор, заведующий кафедрой, 650029, Кемерово, ул. Ворошилова, д. 22а; Королева Марина Валерьевна - аспирант кафедры, тел. (3842) 586841, е-mail: 576078@mail.ru

Information About the Authors:

Tatyana A. Ruskina - Ph.D., Professor, Head of Department, 650029, Kemerovo, Voroshilova st., 22a;

Koroleva Marina V. - graduate student, tel. (3842) 586841, e-mail: 576078@mail.ru

© КУЗНЕЦОВА А.Н., ИЛЛАРИОНОВА Е.А. - 2014 УДК 543.544.943.3.068.7:615.07

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ В АНАЛИЗЕ СУППОЗИТОРИЙ «НЕО-ПЕНОТРАН»

Анастасия Николаевна Кузнецова, Елена Анатольевна Илларионова

Резюме. Предложены оптимальные условия качественного и количественного анализа многокомпонентной лекарственной формы суппозитории «Нео-пенотран» с использованием метода микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Условия анализа: градиентное элюирование в системе перхлорат лития, хлорная кислота и вода - ацетонитрил (МеСЫ) градиент линейный 1000 мкл от 5% до 20%, 2500 мкл от 20% до 100%, 3000 мкл 100% ацетонитрила при скорости потока 150 мкл/мин и температуре 450С.

Ключевые слова: метронидазол, миконазол, суппозитории «Нео-пенатран», метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, градиент, ацетонитрил, лития перхлорат.

mGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY ANALYSIS OF THE SUPPOSITORIES «NEO-PENOTRAN»

A.N. Kuznetsova, E.A. Illarionova

Summary. The optimal conditions for qualitative and quantitative analysis of multicomponent dosage using the high-performance liquid chromatography have been presented. Conditions of analysis: gradient elution system of lithium perchlorate, perchloric acid and water [4 M LiClO4-0, 1 M HClO4] - H2O - acetonitrile (MeCN), the gradient line in 1000 mcl from 5% to 20%, 2500 mcl from 20% to 100%, 3000 mcl 100% acetonitrile at a flow rate of 150 ml / min and a temperature of 45oC.

Key words: Metronidazolum, miconazolum, suppositories «Neo-penotran», high-performance liquid chromatography method, gradient, acetonitrile, lithium perchlorate.

Несмотря на существенные успехи в диагностике и лечении инфекционных заболеваний женских половых органов, эти болезни остаются весьма значимыми в структуре акушерско-гинекологической заболеваемости, а также в смежных дисциплинах - дерматовенерологии и урологии. Рост частоты смешанных влагалищных инфекций и/или возникновение чередующихся инфекций (оппортунистических, суперинфекций и т.п.) побудили исследователей к созданию комбинированных антибактериальных препаратов для местного вагинального применения [2].

Объектом исследования является комбинированный препарат для интравагинального применения суппозитории «Нео-пенотран». Высокая эффективность Нео-Пенотрана обусловлена сочетанием метронидазо-ла (500 мг) с миконазолом (100 мг), препятствующим размножению грибов.

Согласно нормативной документации [3] количественное определение метронидазола и миканозола нитрата в исследуемом лекарственном средстве проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Данная методика требует использования импортного хроматографа Therma Separation Prodacts и не воспроизводится на отечественном хроматографе.

Целью настоящей работы являлось разработка методики анализа суппозиторий «Нео-пенотран» с использованием отечественного микроколоночного жидкостного хроматографа «Милихром А-02» (ЗАО «ЭкоНова», Новосибирск).

Материалы и методы

В работе использовали микроколоночный жидкостный хроматограф «Милихром А-02» (ЗАО «ЭкоНова», Новосибирск) с колонкой (75 х 2 мм), заполненной обращенной фазой ProntoSIL-120-5-C18 AQ («Bischoff Analysentechnik und Gerate GmbH», Германия) с ультрафиолетовым (УФ) детектором; центрифугу «Eppendorf» (13200 об./мин), рН-метр «Анион 4100». В качестве стандартных (контрольных) веществ были использованы фармацевтические субстанции метро-нидазола и миконазола, содержание основного вещества в которых не ниже 98%. Для приготовления элюентов и растворения образцов использовали: ацетонитрил «о.с.ч» (сорт 1) фирмы «Криохром» (Санкт-Петербург); перхлорат лития, хлорная кислота квалификации не ниже «х.ч». Метанол перегоняли перед использованием. Дистиллированную воду дополнительно очищали с помощью системы «Norganic, Millipore Corporation» (США).

При статистической обработке результатов анализа использовали методы Стьюдента и Фишера [1] Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез р=0,05.

Результаты и обсуждение

Для анализа суппозиторий «Нео-пенотран» была выбрана обращенно-фазная ВЭЖХ.

Высокоэффективная жидкостная хромато-

графия широко используется для определения лекарственных веществ и во многих случаях альтернативы этому высокоспецифичному, универсальному, чувствительному методу нет. ВЭЖХ позволяет одновременно определять несколько соединений, отличается достаточной точностью и воспроизводимостью [4]. Однако активное применение ВЭЖХ ограничено из-за отсутствия унифицированных методик анализа. В настоящее время для определения каждого лекарственного средства применяется своя процедура подготовки пробы и своя методика ВЭЖХ-анализа, которые в каждом случае требуют использования определенных колонок с разными сорбентами, разных элюентов и детекторов.

Один из возможных путей решения этой проблемы - разработка максимально унифицированных, экономичных и экспрессных методик подготовки пробы и хроматографических процедур.

Использованный в работе полимерный сорбент ProntoSIL-120-5-C18 Ар («Bischoff Апа^еПеЛтк и^ Gerate GmbH», Германия) не проявляет ионообменных свойств по отношению к азотсодержащим лекарственным веществам, что позволило получить симметричные хроматографические пики определяемых соединений. Подвижная фаза состояла из двух элюентов перхлората лития [4 М LiClO4-0,1 М НС104] - Н20 (5:95), ацетонитрил. Эти элюент4ы обладают в4ысок2ой прозрачностью в коротковолновой области ультрафиолетового (УФ) спектра и не содержат УФ-поглощающие примеси, проявляющиеся в виде «лишних» пиков на хроматограмме. Известно, что присутствие в подвижной фазе кислоты (рН 2,8) и высокое содержание ионов лития улучшает хроматографирование азотсодержащих лекарственных веществ [4].

Таким образом, при анализе исследуемой лекарственной формы предложены следующие условия хроматографического определения: элюент А: 0,2 М LiC104 - 0,005 М НС104 (рН 2,8); элюент Б: ацетонитрил, элю4ирование градиен4 тное с линейным увеличением доли органического компонента 1000 мкл от 5% до

Время, мин

Рис. 1. Хроматограмма раствора готовой лекарственной формы «Нео-пенотран». 1 - пик метронидазола; 2 - пик миконазола нитрата.

Таблица 3

Результаты количественного определения лекарственных веществ в суппозиториях «Нео-пенотран» методом ВЭЖХ

Лекарственные вещества Метрологические характеристики

S2 S S ДХ Е% S r

Метронидазол 499,75 100,55 10,03 3,79 9,29 1,86 0,02

Миконазол 99,4 1,66 1,29 0,49 1,19 1,20 0,01

20%, 2500 мкл от 20% до 100%, 3000 мкл 100% при расходе элюента 150 мкл/мин и температуре 45oC.

Хроматограмма суппозиторий «Нео-пенотран» представлена на рисунке 1.

Из представленной хроматограммы видно, что оба компонента в выбранных условиях разделены полностью.

Для определения подлинности исследуемых лекарственных веществ времена удерживания основных пиков на хроматограмме испытуемого раствора сравнивают с временам удерживания основных пиков на хроматограмме растворов стандартных образцов метронидазола и миконазола. Время удерживания метронидазола составило 4,6 мин., миконазола 15,6 мин.

Таблица 1

Длины волн максимального поглощения и количественного определения определяемых соединений (Растворитель: МеСЫ- 0,2 М LiC104 (pH 2,8)).

Определяемое соединение Л , нм мах Л , нм дет

Метронидазол 198, 230, 320 210, 220, 230, 240

Миконазола нитрат 200, 220 (плечо), 270 210, 220, 230, 240

Длины волн максимального поглощения и количественного определения приведены в таблице 1. В качестве длины волны для количественного определения исследуемых соединений выбрана длина волны 210 нм, близкая к длине волны максимального поглощения ми-коназола.

Таблица 2

Спектральные отношения для метронидазола и миконазола

(Растворитель: MeCN- 0,2 М LiClO4 (pH 2,8)).

Определяемое соединение Спектральное оі R=SA гношение,

220 230 240

Метронидазол 0,775 0,739 0,670

Миконазола нитрат 0,652 0,462 0,030

Спектральные отношения для определяемых соединений, рассчитанные как отношение площадей пиков, зарегистрированных при длинах волн Ах и Х210, приведены в таблице 2.

Выбранные нами длины волн позволяют определять миконазола нитрат на длине волны близкой к длине волны максимального поглощения. Высокая концентрация метронидазола в хроматографируемом растворе позволяет детектировать его не только при длине волны максимального поглощения (320 нм), но и при 210 нм. Дополнительные длины волн используются для расчета спектральных отношений, применение которых для идентификации пиков существенно повышает надежность определения.

Количественное определение метронидазола и ми-коназола проводили, сравнивая площади пиков исследуемых веществ и стандартных образцов. Расчеты выполняли с использованием программного обеспечения “МультиХром - обработка данных”, верс. 1.52j. Результаты количественного определения лекарственных веществ в исследуемой комбинированной лекарственной форме представлены в таблице 3.

Из представленных в таблице 3 данных видно, что относительная ошибка определения по разработанной методике для метронидазола составила 1,9%, для мико-назола - 1,2%.

Таким образом, нами разработана методика качественного и количественного определения индивидуальных веществ в комбинированной лекарственной форме «Нео-пенотран» с использованием отечественного микроколоночного жидкостного хроматографа «Милихром А-02» (ЗАО «ЭкоНова», Новосибирск).

ЛИТЕРАТУРА

1. Государственная Фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа. - 11-е. изд., доп. - М.: Медицина, 1987. - 336 с.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 15 изд., перераб., испр. и доп. - М.: Новая Волна, 2005. - 1200 с.

3. Нормативный документ 42-12126-02. Суппозитории

вагинальные «Нео-Пенотран». - М., 2002. - 9 с.

4. Чмелевская Н.В., Илларионова Е.А. Высокоэффективная жидкостная хроматография в анализе таблеток «Пикамилон» // Сибирский медицинский журнал (Иркутск). - 2013. - Т. 119. №4. - С.69-71.

REFERENCES

1. State Pharmacopoeia ofthe USSR: Vol. 1. Common methods of analysis. - 11th. ed., ext. - Moscow: Meditsina, 1987. - 336 p.

2. Mashkovskii M.D. Drugs. - 15 ed. - Moscow: New Wave,

2005. - 1200 p.

3. Normative document 42-12126-02. Vaginal suppositories

“Neo-Penotran.” - Moscow, 2002. - 9 p.

4. Chmelevskaya N.V., Illarionova E.A. High performance liquid chromatography analysis of the tablets “Picamilon” // Sibirskij Medicinskij Zurnal

Информация об авторах:

Кузнецова Анастасия Николаевна - аспирант кафедры; Илларионова Елена Анатольевна - д.х.н., профессор, заведующий кафедрой, 664003, Иркутск, ул. Красного Восстания, 1, ИГМУ кафедра фармацевтической и токсикологической химии,

тел. (3952) 243447, e-mail: illelena@rambler.ru.

Information About the Authors:

Kuznetsova Anastasia Nicolaievna - graduate student of the department, Illarionova Elena Anatolievna - PhD, professor, 664003, Irkutsk, Krasnogo Vosstaniya st., 1, ISMU, department of pharmaceutical and toxicological chemistry, tel. тел. (3952) 243447,

e-mail: illelena@rambler.ru.