60
ГОМО- И ГЕТЕРО-ПОЛИАМИНОКИСЛОТНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ФУЛЛЕРЕНА C, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ НА ИХ ОСНОВЕ
60
HOMO- AND HETERO-POLYAMINO ACID FULLERENE C DERIVATIVES, METHOD FOR PREPARING THEM AND BASED PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS

60
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине, а именно к новым гомо- и гетеро-полиаминокислотным производным фуллерена С формулы (I), а также к способу их получения и созданию фармацевтических композиций на их основе.
2
m
2
k
2
где n=2-5, х=3, L=-(CH) или -CO(CH)CH(NH)-, при m=2-5, где k=1-2.
Применение производных фуллерена в медицине основано на липофильных свойствах фуллеренового ядра, позволяющих фуллереновым производным проникать через клеточные мембраны, и способности фуллерена с высоким квантовым выходом генерировать синглетный кислород, расщепляющий ДНК. Эти свойства обеспечивают функциональным производным фуллерена проявление цитотоксических, антивирусных и других свойств (Bedrov D., Smith G.D., Davande H., "Passive transport of fullerenes through a lipid membrane." J. Phys. Chem., B, 2008, v.112., p.2078-84, Qiao R., Roberts A.E., "Translocation of fullerene and its derivatives across a lipid bilayer", Nano Lett., 2007, v.7, p.614-9. Nelsen G.D., и др., "In vivo biology and toxicology of fullerenes and their derivatives". Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology, 2008, v.103, p.197-208, Pat. US 6204391, 2005, "Water soluble fullerenes with antiviral activity").
Основной проблемой, затрудняющей биологические исследования производных фуллеренов и создания лечебных препаратов на их основе, является нерастворимость фуллеренов в воде, что затрудняет их прямое введение в организм человека. Одним из возможных вариантов преодоления этих трудностей является введение молекул фуллерена в солюбилизирующие матрицы. Известны способы получения водорастворимых форм фуллерена за счет образования аддукта с поливинилпирролидоном (Kiselev O.I. et al. // Mol. Materials. 1998. V.11. P.121; Piotrovsky L.B. et al. // Ibidem. 2000. V.13. P.41). Показана его эффективность против вируса гриппа А- и В-типа.
Известен также способ получения фуллеренов, включающий смешивание предварительно растворенных в органическом растворителе фуллеренов с полимерной матрицей в хлороформе, выпаривание смеси под вакуумом до полного удаления растворителей, растворение полученного комплекса в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4-7,6) с последующей обработкой продукта ультразвуком (RU №2162819, 02.10.01). При этом в качестве водорастворимой полимерной матрицы используют мембранные кефалины. Продукты, полученные в результате таких модификаций, являются нестабильными композициями с ограниченными возможностями хранения.
Перспективным методом получения водорастворимых фуллереновых композиций является химическая модификация сферы фуллерена введением гидрофильных солюбилизирующих лигандов. В международной заявке WO 2005/070827 представлена серия аминокислотных производных фуллерена, полученных по реакции циклоприсоединения аминокислотных фрагментов к фуллерену, и продуктов их внедрения в биологически-активные органические субстраты. Представленные в данном техническом решении методы синтеза многостадийны и нетехнологичны. Полученные соединения имеют низкую растворимость в воде.
В настоящее время получен большой ряд функционализированных фуллеренов, содержащих гидрофильные фрагменты как в боковой цепи присоединенных к фуллерену лигандов (детергентный тип комплексов), так и сферический тип производных, когда имеются полярные группы, распределенные по фуллереновой сфере (такой тип включает фуллеренолы, аминоаддукты).
Наиболее перспективными для использования являются аминокислотные производные фуллерена.
Аналогами настоящего изобретения являются соединения и способы их получения, описанные в международной заявке WO 2009/00203, а также патенте РФ №2236852.
m
2m
4
8
В международной заявке WO 2009/00203 описаны полифункциональные аминокислотные производные фуллерена формулы , где R=Н, моно- или дигидроксиалкил, галоидалкил, моно- или динитроксиалкил, малеинимид; N-Z представляет собой фрагмент α, β, γ, ω-аминокислоты общей формулы -NH-CH-COOM или CHN-COOM, где m=2-5, а М представляет собой нитроксиалкильную группу, алкильную группу или соль щелочного металла, или дипептид. Данные соединения получены по реакции эквимолярного присоединения аминокислот к фуллерену с последующим замещением активного водорода органическим биологически активным лигадом с образованием соединений типа. Полученные соединения, обладают ингибирующей активностью в отношении метастазов опухоли, усиливают антилейкемическую активность циклофосфамида, и могут быть пригодны в качестве доноров монооксида азота или в качестве вазодилататоров быстрого действия для антигипертинезивной терапии.
Основным недостатком соединений по данной заявке является то, что они являются продуктами ковалентного присоединения, содержат малое количество полярных групп и имеют низкую растворимость в воде.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является средство для ингибирования репродукции оболочечных вирусов и способ его получения (патент РФ №2236852). В результате взаимодействия фуллерена с солью аминокислоты в среде органического растворителя в присутствии полиалкиленоксида получены фуллеренполикарбоновые анионы общей формулы
60
n
2
m
n
-
CH[NH(СН)C(O)O],
60
2
m
-
где С - фуллереновое ядро, NH(CH)C(O)O - аминокарбоновый анион; m равно целому числу от 1 до 5, п равно целому числу от 2 до 12.
Для получения этих соединений к раствору фуллерена в о-дихлорбензоле (толуоле или любом другом органическом растворителе) вносят аминокислоту в виде соли (калиевой или натриевой), затем добавляют солюбилизатор. Порядок внесения в реакционную среду аминокислоты и солюбилизатора не важен, можно вносить их в виде комплекса, предварительно смешав. В качестве солюбилизатора используют различные полиалкиленоксиды: полиэтиленгликоли мол. массы от 150 до 400, и выше 400 (например, ПЭГ-1500), а также диметиловый эфир полиэтиленгликоля мол. массы 500. Для увеличения скорости реакции добавляют любой сильный восстановитель (щелочные металлы).
Соотношение фуллерена и аминокислоты увеличено более чем в 50 раз. Превращение в желаемую фармацевтически приемлемую соль, особенно натриевую или калиевую, выполнялось путем обработки кислоты подходящим основанием или путем добавления соли слабой летучей кислоты. В частности, не растворимая в воде фуллеренполикарбоновая кислота превращается в более предпочтительные фармацевтически приемлемые соли, такие как натриевая соль, которые растворимы в воде. Добавление соли слабой летучей кислоты происходит путем обработки раствора солью щелочного металла и слабой летучей кислоты. При концентрировании раствора путем выпаривания или лиофилизации слабая кислота удаляется, а фуллеренполикарбоновые кислоты выделяются в виде их солей щелочных металлов. Целевой продукт по данному изобретению характеризуется постоянством состава, содержание в целевом продукте основного вещества составляет всего 87,8%. В описании отсутствуют технологические регламенты, связанные с определением оптимальных количеств исходных соединений, соотношений количеств используемых растворителей и, особенно, описания методов выделения искомых соединений.
Основными недостатками фуллеренаминокислотных производных, полученных представленным в патенте методом получения является то, что данным способом получают смесь фуллеренкарбоксилатных анионов, как солевых, так и кислотных форм. Получить индивидуальное соединение способом, описанным в патенте, не представляется возможным. Также фуллерен-полиаминокислоты, полученные запатентованным способом, в кислотной форме практически нерастворимы в воде. Получить стабильную фармацевтическую композицию с фуллеренполикарбоновыми анионами не удалось, т.к. в процессе хранения соединения выпадают в осадок.
Применение в синтезе большого избытка калиевой или натриевой солей аминокислот и больших избытков растворителей приводит к возникновению экологических проблем, связанных с утилизацией отходов производства, а также к удорожанию процесса производства. Использование щелочных металлов для увеличения скорости реакции является технологически невозможным при использовании хлорированных ароматических растворителей.
Однако представленные в патенте уникальные биохимические свойства препаратов на основе соединений фуллерена с аминокислотными фрагментами ставят задачу получения новых производных фуллерена, разработки высокотехнологичного способа их промышленного получения, отличающегося простотой и эффективностью процесса, чистотой, экологичностью и доступностью исходных реагентов.
Для решения данной задачи предлагается группа изобретений, объединенных единым изобретательским замыслом, а именно: гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена, способ получения производных фуллерена и фармацевтические композиции, включающие гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена в качестве действующего вещества. Варьируя соотношение реагентов и условия проведения процесса, по заявляемому способу можно получать различные производные фуллерена.
Указанная задача решается гомо- и гетеро-полиаминокислотными производными фуллерена общей формулы (II):
В случае, когда m=n получают гомо-полиаминокислотные производные фуллерена, при m≠n - гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена.
Указанная задача решается способом получения гомо- и гетеро-полиаминокислотные производных фуллерена, образующихся при взаимодействии фуллерена с 10-кратным мольным избытком безводных калиевых солей аминокислот в среде органического ароматического растворителя при добавлении к полученной суспензии межфазного катализатора при перемешивании и нагревании до температуры не выше 60°С до полного обесцвечивания раствора и формирования твердого осадка, который затем выделяют, растворяют в воде, после чего осуществляют обработку водных растворов калиевых солей фуллеренполиаминокислот 1Н раствором органических или минеральных кислот с последующим добавлением растворов аминокислот в полярных растворителях. В способе используют свежеприготовленные безводные калиевые соли аминокислот в мелкодисперсном состоянии, а выделение твердого осадка калиевых солей фуллеренполиаминокислот осуществляют фильтрованием, промывкой этиловым спиртом и высушиванием. В процессе экспериментов было выявлено, что фуллеренполиаминокислоты указанного состава могут быть получены только при использовании свежеприготовленных безводных калиевых солей аминокислот. В качестве межфазного катализатора используют метиловые эфиры полиэтиленоксидов молекулярной массы 200, 400, 500.
Указанная задача решается также созданием фармацевтических композиций, содержащих в качестве активного вещества гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена формулы (II), обладающих активностью против вируса герпеса, вируса гепатита С, вирусов гриппа различной природы, ВИЧ, а также противоопухолевой и противопсориатической активностью. Фармацевтические композиции могут быть выполнены в форме таблеток, капсул, мазей, эмульсий, суппозиториев, растворов, спреев.
Фармацевтические композиции по предложенному техническому решению содержат соединение общей формулы (II) в количестве, эффективном для достижения желаемого результата, и могут быть введены в виде стандартных лекарственных форм (например, в твердой, полутвердой или жидкой формах), содержащих соединения предложенного технического решения в качестве активного ингредиента в смеси с носителем или наполнителем, пригодным для внутримышечного, внутривенного, перорального, сублингвального, ингаляционного, местного, назального, ректального и вагинального введения. Активный ингредиент может быть включен в композицию вместе с обычно используемыми нетоксичными фармацевтически приемлемыми носителями, пригодными для изготовления растворов, таблеток, пилюль, капсул, драже, суппозиториев, эмульсий, суспензий, мазей, гелей и любых других лекарственных форм.
Конкретный уровень дозировок и частота приема лекарства для каждого конкретного пациента будет зависеть от большого числа факторов, включая активность конкретного производного фуллерена, метаболическую стабильность и длительность действия, скорость выделения, возраст пациента, вес тела, общее состояние здоровья, пол, лекарственные комбинации, а также тяжесть заболевания у индивида, подвергаемого лечению.
Для орального применения в виде суспензий композиции готовят согласно методам, широко известным в области приготовления фармацевтических рецептур, и они могут содержать микрокристаллическую целлюлозу или ее производные для обеспечения массы, альгиновую кислоту или альгинат натрия в качестве суспендирующего агента, метилцеллюлозу в качестве усилителя вязкости и подслащивающие агенты и/или отдушки, известные в этой области. В форме таблеток такие композиции могут содержать микрокристаллическую целлюлозу, кальций фосфат, крахмал, стеарат магния и лактозу и/или другие эксципиенты, связующие вещества, расширители, дезинтеграторы, разбавители и смазывающие вещества, известные в данной области.
При применении в виде назальных аэрозолей или путем ингаляции такие композиции готовят методами, хорошо известными в области фармацевтических рецептур, и они могут выпускаться в виде растворов на физиологическом растворе, с использованием бензойной кислоты или других подходящих консервантов, промоторов адсорбции для усиления биоприменимости, и/или других солюбилизирующих или диспергирующих агентов, известных в данной области.
Растворы или суспензии для инъекций могут формироваться согласно известным методам, с использованием нетоксичных, парентерально применимых разбавителей или растворителей, таких как маннит, 1,3-бутандиол, вода, раствор Рингера или изотонический раствор хлористого натрия или подходящих диспергирующих или смачивающих и суспендирующих агентов, таких как стерильные, мягкие, устойчивые масла, включая синтетические моно- или диглицериды, или жирные кислоты, включая олеиновую кислоту.
При ректальном или вагинальном применении в виде свечей такие композиции могут готовиться путем смешивания лекарства с таким нераздражающим эксципиентом, как масло какао, синтетические глицеридные сложные эфиры или полиэтиленгликоли, которые являются твердыми веществами при обычных температурах, но сжижаются и/или растворяются в полости тела с выделением лекарства.
При местном применении в виде мазей, гелей, кремов, линиментов и т.д. такие композиции могут готовиться путем смешивания активных ингредиентов с приемлемой мазевой основой.
В качестве мазевой основы могут быть использованы жировые, углеводородные или гидрофильные основы, например вазелин, вазелиновое масло, парафин, воск, ланолин, полиэтиленгликоль и др.
В качестве основы для гелей могут быть использованы метилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, оксипропилцеллюлоза, полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид, карбопол, поливинилпирролидон, поливиниловый спирт и т.д.
2
m
2
k
2
60
Технический результат изобретения состоит в том, что получены новые гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена формулы:  где n=2-5, х=3, L=-(СН), где m=1-5, либо -CO(CH)CH(NH)-, где k=1-2, характеризующиеся тем, что соединения содержат ковалентно-связанные аминокислотные группы и полярные ионные формы аминокислот, разработан новый промышленный способ получения аминокислотных производных фуллерена С с различным соотношением компонентов с использованием реакции нуклеофильного присоединения к фуллерену аминокислоты с образованием продуктов полиприсоединения. Предложены фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного вещества гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена формулы (II), обладающие активностью против вируса герпеса, вируса гепатита С, вирусов гриппа различной природы, ВИЧ, а также противоопухолевой и противопсориатической активностью. Фармацевтические композиции выполнены в форме таблеток, капсул, мазей, суппозиториев, растворов, спреев.
Соединения обладают новыми свойствами:
- растворимостью в смеси диметилсульфоксид - вода (1:100, 1:200);
- высокой биодоступностью;
- высокой эффективностью воздействия на инфицированные клетки;
- низкой токсичностью.
2
2
m
2
k
2
Заявляемый способ позволяет получить различные гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена в зависимости от соотношения реагентов и условий проведения процесса. Способ основан на использовании в стадии синтеза оптимальных соотношений исходных реагентов (1:10), минимальных количеств органического растворителя и межфазного катализатора, с последующем выделением заявляемых композиций с использованием концентрированных растворов органических и минеральных кислот, с последующим введением аминокислот ряда NHLCOOH, где L=-(СН), либо -CO(CH)CH(NH), что приводит к количественному получению фуллеренаминокислотных композиций определенного состава и возможности применения заявляемого способа для их промышленного синтеза, отличающегося эффективностью и экологичностью.
Заявляемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение фуллеренполиаминокапроновой кислоты формулы
60
К раствору 7,2 г (0,01 моля) фуллерена С в 400 мл о-дихлорбензола добавляют 17 г (0,1 моля) свежеполученной тонкоизмельченной безводной калийной соли ε-аминокапроновой кислоты. К полученной суспензии при перемешивании и нагревании не выше 80°С прибавляют в течение 2-х часов смесь о-дихлобензола и метилового эфира полиэтиленгликоля 400 в соотношении 2,5:1. Реакционную смесь перемешивают при температуре не выше 60°С в течение 2-3 часов до полного обесцвечивания раствора и формирования твердого осадка. Затем смесь фильтруют, осадок на фильтре промывают несколькими порциями этилового спирта и высушивают в вакууме при температуре не выше 60°С. Выделенную калиевую соль фуллеренаминокислоты растворяют в 2 л дистиллированной воды. В раствор медленно при перемешивании добавляют 1Н раствор соляной кислоты до рН 5,1. Смесь отстаивают до полного высаживания продукта. Затем водный слой декантируют. К осадку, представляющему собой тонкую взвесь твердого продукта в воде, медленно при перемешивании добавляют раствор аминокапроновой кислоты в смеси диметилсульфоксида с водой (1:10). Смесь перемешивают до полного растворения. Затем растворители удаляют отгонкой в вакууме. Твердый остаток высушивают при температуре не выше 60°С в вакуумном сушильном шкафу.
3
2
2
Выход целевого продукта количественный по отношению к исходному фуллерену. Соединение представляет собой темно-коричневое твердое вещество, растворимое в смеси диметилсульфоксид: вода - 1:200, ограниченно растворимое в смесях CHCN:HO - 1:1 и ДМФА - НО.
Термогравиметрический анализ продукта показывает наличие в комплексе 3 молей слабосвязанной аминокапроновой кислоты, отщепляющейся с разложением при температуре 200°С. Термическое разложение фуллеренполиаминокислоты проходит при температуре 345°С с выделением фуллерена и продуктов его окисления. Количество твердого остатка после разложения соединения, представляющего собой по данным дифракционного анализа незамещенный фуллерен, соответствует соотношению С60:аминокислотный фрагмент как 1:6.
Кислотный гидролиз соединения 0,1 молярным раствором HCl приводит к выделению гидрохлорида аминокапроновой кислоты в количестве 3 молей на моль исходного вещества.
Адсорбция соединения на поверхности силикагеля приводит к расщеплению ионных связей и выделению свободной аминокапроновой кислоты. Последующим фотометрическим анализом продуктов реакции аминокапроновой кислоты с нингидрином определено количество ионносвязанных аминокислотных групп. Их количество соответствует составу заявляемых соединений.
Электронный спектр поглощения продукта не содержит полос поглощения свободного фуллерена.
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
60
ИК-спектр продукта содержит полосы поглощения, характерные для N-замещенных аминокислот: группа -СООН - 1704 см, 1658 см, группы  - 3100, 2550, 2000 см, -N-H-валентные колебания 3300 см, N-H-деформационные 1552 см, полосы поглощения С-NH-R - 1104 см, 930 см, 830 см.
96
75
6
12
Элементный анализ продукта показывает следующие соотношения элементов: %С=76,84; %Н=4,80; %N=5,15, для брутто-формулы CHNO (молекулярная масса 1503) рассчитано: %С=76,49, %Н=4,90, %N=5,57.
Пример 2. Получение N-фуллерен-γ-аминомасляной кислоты с β-аланином формулы:
60
К раствору 7,2 г (0,01 моля) фуллерена С в 400 мл о-дихлорбензола добавляют 14 г (0,1 моля) свежеполученной безводной калиевой соли γ-аминомасляной кислоты. К полученной суспензии при перемешивании и нагревании не выше 60°С прибавляют в течение 2-х часов смесь о-дихлобензола и метилового эфира полиэтиленгликоля 400 в соотношении 3:1. Реакционную смесь перемешивают при температуре не выше 60°С в течение 2-3 часов до полного обесцвечивания раствора и формирования твердого осадка. Затем смесь фильтруют, осадок на фильтре промывают несколькими порциями этилового спирта и высушивают в вакууме при температуре не выше 60°С. Выделенный продукт растворяют в дистиллированной воде. В раствор медленно при перемешивании добавляют 1Н раствор соляной кислоты до рН 5,1. Смесь отстаивают до полного высаживания продукта. Затем водный слой декантируют. К осадку, представляющему собой тонкую взвесь твердого продукта в воде, медленно при перемешивании добавляют спиртовой раствор 2,7 г (0,03 моля) β-аланина. Смесь перемешивают в течение 2 часов до полного растворения осадка. После удаления растворителя выделено 12 г продукта.
3
2
2
Соединение представляет собой темно-коричневое твердое вещество, растворимое в смеси диметилсульфоксид:вода - 1:200, ограниченно растворимое в смесях CHCN:HO - 1:1 и ДМФА - HO.
60:
Термогравиметрический анализ продукта показывает наличие в комплексе 3 молей слабосвязанного β-аланина, отщепляющегося при температуре 210°С. Термическое разложение всего комплекса проходит при температуре 335°С с выделением фуллерена в количестве соответствующем соотношению С аминокислотные фрагменты как 1:6.
Кислотный гидролиз полученного соединения 0,01 молярным раствором HCl приводит к образованию гидрохлорида β-аланина в количестве 3 молей на моль исходного вещества.
Спектры продукта в растворах в диметилсульфоксиде и в 0,1 Н водном растворе NaOH содержат полосы поглощения в области 217, 260, 335 нм, характерные для производных фуллерена и не содержат полос поглощения свободного фуллерена.
-
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
60
ИК-спектр соединения содержит полосы поглощения, характерные для N-замещенных аминокислот и катионных форм аминокислот: группы -СООН 1717 см, 1710 см, 1658 см, группы  3100, 2550, 2000 см, N-H-валентные колебания 3400 см, N-H-валентные колебания - 3400 см, N-H-деформационные - 1552 см, полосы поглощения С-NH-R - 1104 см, 930 см, 830 см.
81
48
6
12
Элементный анализ продукта показывает следующие соотношения элементов: %С=75,24; %Н=3,80; %N=6,25, для брутто-формулы CHNO (молекулярная масса 1296) рассчитано: %С=75,00, %Н=3,70, %N=6,48.
Пример 3. Получение N-фуллерен-ε-аминокапроновой кислоты с глутамином формулы:
Процесс проводят так же, как в примере 1. Только на стадии обработки осадка после осаждения кислой формы фуллерен-аминокапроновой кислоты добавляют раствор 4,5 г глутамина в смеси диметилсульфоксид - вода. Растворители удаляют отгонкой в вакууме.
93
69
9
15
Элементный анализ твердого продукта показывает следующие соотношения элементов: %С=71,34; %H=4,80; %N=8,25, для брутто-формулы CHNO (молекулярная масса 1551) рассчитано: %С=71,95, %Н=4,50, %N=8,12.
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
60
60
ИК-спектр соединения содержит полосы поглощения, характерные для N-замещенных аминокислот и катионных форм аминокислот: группы -СООН - 1714 см, 1707 см, -С=O(NH-С) 1658 см, группы  3000, 2550, 2000 см, N-H-валентные колебания 3400 см, N-H-деформационные 1552 см, полосы поглощения С-NH-R - 1104 см, 930 см, 830 см.
Кислотный гидролиз соединения приводит к выделению глутамин гидрохлорида в количестве 3 молей на моль исходного вещества.
Была изучена противовирусная активность соединений в отношении ВИЧ, ВПГ, вируса гриппа, а также противоопухолевая активность. В приведенных ниже примерах препарат, полученный способом, описанным в примере 1, назван по тексту препарат №1 (фуллеренполиаминокапроновая кислота).
Пример 4. Исследование активности препарата фуллеренполиаминокапроновой кислоты в отношении вируса иммунодефицита человека.
Исследования проводились в лаборатории вирусов иммунодефицита с испытательным Центром по экспертной оценке противовирусных и дезинфекционных средств (ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН).
50
2
К клеткам добавляли исследуемый препарат и инфицировали вирусом в дозе 0,01 ТЦИД/клетка. Инкубировали культуры клеток при 37°С в атмосфере с 5% CO и 98% влажности 4-5 дней. Учет результатов проводили окрашиванием клеток с помощью красителя и световой микроскопии: исследование цитопатического эффекта вируса (ЦПД) и вирусиндуцируемого синци-тийобразования (синцитий - конгломерат нескольких клеток с общей клеточной оболочкой, образовавшейся в результате слияния их мембран).
Степень цитодеструкции оценивали под микроскопом по общепринятой четырехкрестовой системе знаками + или - соответственно количеству погибших клеток в каждой из четырех лунок, соответствующих одному исследуемому показателю.
ая
++++ - 100% гибель клеток в четырех лунках, использованных в опыте на одно разведение
ая
+++ - 75% гибель клеток в каждой из четырех лунок,
ая
++ - 50% гибель клеток в каждой из четырех лунок,
ая
+ - 25% гибель клеток в каждой из четырех лунок,
+- - начало дегенерации,
- - отсутствие цитодеструкции.
Результаты исследования представлены в таблицах 1-2.
50
Полученные данные (таблица 1, 2) показали, что исследованные препараты фуллеренполиаминокапроновой кислоты обладали противовирусной активностью в отношении вируса иммунодефицита человека типа 1. ЭК (50%-эффективная концентрация) препарата 0,9 мкг/мл. Препарат в концентрациях 0,5-10 мкг/мл не обладал цитотоксическим действием на клетки.
Пример 5. Исследование противогерпетической активности препарата фуллеренполиаминокапроновой кислоты в экспериментах in vitro. Исследование выполнялось ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, г.Москва.
В процессе исследования были изучены цитотоксическая и противогерпетическая активность препарата в клеточных культурах Vero.
2
50
50
В исследовании были использованы: перевиваемая культура клеток почки обезьян (VERO), полученная из коллекции культур тканей Института вирусологии им. И.Д.Ивановского РАМН; вирус герпеса простого (Herpes simplex virus), тип 1, штамм Л, размноженный в клетках Vero. Клетки инфицировали вирусом в дозе 100 ТЦИД/0,2 мл и 1000 ТЦИД/0,2 мл.
Для исследования представлен образец субстанции в виде порошка темного цвета.
Препарат первоначально растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) в соотношении 1:20, а затем готовили рабочие концентрации на среде ИГЛА MEM. Оценку активности испытанных образцов проводили по степени защиты клеток от вирусиндуцированного цитотоксического действия ВПГ микроскопическим методом и методом МТТ по оптической плотности.
Результаты исследования. Исследована токсичность веществ в использованных концентрациях, а также растворителя (1,5 мл ДМСО в 50 мл воды).
2
Препарат в конечных концентрациях от 50 до 1000 мкг/мл добавляли к монослою клеточной культуры VERO и инкубировали в атмосфере 5,0% CO при 37°С в течение 24-48 часов. Монослой клеток окрашивали 0,4% раствором трипанового синего и исследовали под микроскопом.
Образец в концентрации до 100 мкг/мл не оказывал токсического действия на культуру клеток VERO, при концентрации 200 мкг/мл появляются признаки токсического действия - отмечается гибель 25% клеток. Концентрации в 500 мкг/мл и более уже токсичны для Vero клеток (табл.3).
50
50
Исследование защитных свойств образца проводили при одной схеме введения - за час до инфицирования, и при двух дозах вируса - 100 ТЦИД и 1000 ТЦИД.
Результаты представлены в таблицах 3-7.
50
Проведенные исследования показали, что введение за 60 минут образца препарата до инфицирования клеточной культуры вирусом герпеса простого в дозе 100 ТЦИД полностью защищает клетки от цитодеструктивного действия вируса при всех испытанных концентрациях - от 5,0 мкг/мл и выше (см. табл.4 и 5).
50
При увеличении инфицирующей дозы вируса герпеса до 1000 ТЦИД/0,2 мл (см. табл.6 и 7), образец препарата обеспечивает полную защиту чувствительной культуры клеток от цитодеструктивного действия вируса при данной схеме испытания (инфицирование клеток вирусом через 60 минут после внесения препарата в культуральную среду).
Пример 6. Изучение активности фуллеренполиаминокапроновой кислоты (препарат №1) в отношении вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl.
Исследования проводились в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, г.Москва. В задачу исследований входило изучение противовирусной активности этих препаратов в культуре клеток MDCK в отношении вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl.
Препарат разводили в ДМСО (5 мг субстанции + 0,5 мл ДМСО) с последующим добавлением 4,5 мл среды для культур клеток MEM, получая, таким образом, сток в концентрации 1,0 мг/мл. В последующем проводили разведения стоков средой MEM до рабочих концентраций 6,5 мкг/мл - 12,5-25,0-50,0-100 мкг/мл.
Определение противовирусной активности веществ проводили по снижению репродукции вируса гриппа в культуре клеток MDCK, выявляемой ИФА.
50
2
50
С этой целью клетки МДСК выращивали в 96-луночных планшетах до полного монослоя, отмывали от ростовой среды и вносили вещества в двукратной концентрации в 100 мкл среды MEM. Инфицирование вирусом в рабочей дозе 100-1000 ТЦИД проводили в двух режимах: через 2 часа после внесения веществ и одномоментно. Планшеты инкубировали в термостате с CO в течение 24 часов при 37°С. После инкубации среду удаляли и клетки фиксировали 80% ацетоном в PBS в течение 15 минут, хорошо высушивали и осуществляли постановку ИФА, проводя последовательно адсорбцию специфических реагентов - моноклональных антител, конъюгата и субстрата (ортофенилендиамин). Реакцию учитывали по оптической плотности при 492 нМ на спектрофотометре фирмы «Биоком». Каждое разведения вируса исследовали в 3-х повторах, для которых вычисляли среднее значение оптической плотности (ОП). Процент ингибирования определяли, как отношение между разницей ОП опыта и ОП клеточного контроля, разделенное на разницу ОП вирусного контроля и ОП клеточного контроля, умноженное на 100%. На основании полученных данных определены значения минимальной концентрации вещества, вызывающей 50,0% ингибирование вирусной репродукции (МИК).
Оценку подавления репродукции вируса гриппа A(H1N1) проводили в 3-х опытах при разной множественности заражения. Результаты представлены в табл.8 (протоколы 3 опытов) и табл.9 (средние значения полученных результатов 3 опытов).
Как видно из таблицы 9, четко прослеживается зависимость степени репродукции и концентрации препарата: с повышением концентрации - снижается репродукция вируса. Кроме того, значительных отличий в показателях при разных режимах инфицирования (через 2 часа после внесения препарата или одномоментно) не отмечено.
Таким образом, полученные результаты изучения активности разных разведении препарата в отношении вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl выявили высокую активность подавления его репродукции в культуре клеток MDCK. При этом режимы внесения препаратов за 2 часа до инфицирования или одновременно с инфицированием не влияли на их активность в культуре клеток MDCK.
Пример 7. Изучение противовирусной активности фуллеренполиа-минокапроновой кислоты (препарат №1) на модели гриппозной пневмонии мышей.
Исследования выполнялись в центре химии лекарственных средств (ЦХЛС-ВНИХФИ), г.Москва.
В работе использовали препарат в виде темно-коричневого кристаллического порошка. Для перорального применения готовили необходимые дозы препарата, растворяя навески в 1% растворе крахмала, сваренного на воде. Для внутрибришинного и внутримышечного применения навески препарата растворяли в 1,5% растворе ДМСО.
В работе был использован вирус гриппа А/Аичи/2/69 (H3N2), адаптированный к мышам. Данный вирус широко используется для определения эффективности противовирусных препаратов на модели гриппозной пневмонии мышей и был получен из музея вирусных штаммов и клеточных культур ГУ НИИ вирусологии РАМН. Для подготовки инфицирующего материала мышей заражали интраназально аллантоисным вирусом, после проявления признаков болезни их забивали и в стерильных условиях получали гомогенат легочной ткани. Далее этот гомогенат использовали для заражения 10-дневных куриных эмбрионов, из которых получали аллантоисный вирус и после титрования на его мышах использовали для инфицирования животных.
Белых беспородных мышей (самки) массой 12-14 г получали из питомника «Андреевка» (Московская обл.) и содержали на стандартном рационе в регламентированных условиях вивария.
50
50
Предварительно взвешенные мыши (самки нелинейные, средний вес 12-14 г) инфицировались интраназально под легким эфирным наркозом вирусом гриппа А/Аичи/2/69 (H3N2) (10ЛД в 100 мкл). В предварительном опыте было проведено определение ЛД путем титрования аллантоисного вируса на таких же мышах, которые затем использовались в основном опыте. Была использована следующая схема лечения исследуемым препаратом: за 24 часа до инфицирования, за 1 час до инфицирования, через 24 часа и далее 1 раз в день через 24 часа в течение 5 дней. Для перорального введения использовали одноразовый инсулиновый шприц со специальной иглой (лаваж), каждую дозу вводили в объеме 100 мкл. Для внутрибрюшинного и внутримышечного лечения также каждую дозу вводили в объеме 100 мкл. Группа вирусного контроля представляла собой 10 мышей, инфицированных вирусом, но не леченных препаратами. Также в опыте было две группы по 10 неинфицированных мышей, которым вводили внутрибрюшинно и внутримышечно по 100 мкл 1,5% ДМСО, который использовался в качестве растворителя препаратов. В остальных группах также изначально было по 10 животных. За леченными и контрольными животными велось ежедневное наблюдение, в первые 5 дней после инфицирования мыши взвешивались каждый день, далее - через день. Химиотерапевтическую активность препарата на модели гриппозной пневмонии мышей оценивали по трем критериям: показатель защиты от смертельной вирусной инфекции, увеличение средней продолжительности жизни и уменьшение снижение веса в группах животных, леченных препаратом по сравнению с контрольной группой.
Лечение фуллеренаминокапроновой кислотой было эффективно, уменьшая смертность мышей от гриппозной пневмонии и потерю их веса и увеличивая среднюю продолжительность жизни по сравнению с вирусным контролем. Эффективность данного лечения зависела от дозы препарата и способа лечения. Результаты представлены в таблицах 10-11.
Наиболее эффективным по всем трем параметрам (показатель защиты от смертности, средняя продолжительность жизни и потеря веса) было лечение фуллеренполиаминокапроновой кислотой внутримышечно, которое в дозах 100 и 200 мг/кг/день предотвращало гибель 60-70% зараженных животных и потерю их веса, а также увеличивало продолжительность их жизни почти в 2 раза. Внутрибрюшинное лечение фуллеренполиаминокапроновой кислотой было эффективно только в дозах 50 и 100 мг/кг/день. Гибель животных, значительное снижение средней продолжительности жизни и веса мышей при внутрибрюшинном лечении их фуллеренполиаминокапроновой кислотой в дозе 200 мг/кг/день дают основание полагать, что данная доза при этом способе введения является токсичной для инфицированных мышей.
Пример 8. Изучение противоопухолевого действия фуллеренполиаминокапроновой кислоты (препарат №1) при перевиваемых опухолях лейкоза L 1210, аденокарциномы молочной железы Са-755 и карциномы Льюиса.
Исследования выполнялись в Институте токсикологии, г.Санкт-Петербург, 2006 г. в соответствии с «Методическими указаниями по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ» («Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», Минздрав РФ, Ремедиум. М., 2000 г., с.319-325).
Штаммы опухолевых клеток лейкемии L1210, аденокарциномы молочной железы Са-755, а также штамм опухолевых клеток карциномы Льюиса (3LL) получены из НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова МЗ РФ (г.Санкт-Петербург).
В исследовании использованы следующие тест- системы:
Мыши линии DBA/2 с перевитыми клетками лейкемии L1210. Возраст мышей 6-8 недель, масса 19-25 г.
Мыши самцы линии С 57 BL/6j с перевитыми клетками Са-755. Возраст мышей 6-8 недель, масса 19-25 г.
Мыши самцы линии С 57 BL/6j с перевитыми клетками 3LL. Возраст мышей 6-8 недель, масса 18-24 г.
Оценка противоопухолевого действия проводилась на основании:
- оценки накопления асцита по регистрации прибавки веса животных;
- оценки продолжительности жизни животных;
3
- оценки опухолевого роста. Проводили измерение большего размера опухоли (длина) и перпендикулярного ему меньшего размера (ширина). Рассчитывали объем опухоли и торможение опухолевого роста рассчитывали по формуле. Оценочным критерием являлся день достижения каждой индивидуальной опухолью объема 500 мм.
Результаты влияния препарата на развитие лейкемии L1210 представлены в таблице 12.
В таблице 13 приведена средняя продолжительность жизни животных с перевиваемыми опухолями лейкемии L1210 и контрольной группы, а также данные увеличения продолжительности жизни по сравнению с контрольной группой в %.
Как видно из таблицы 13 средняя продолжительность жизни мышей контрольной группы с перевитыми опухолевыми клетками лейкемии L1210 составила 6,0±0,21 дней. Введение препарата достоверно увеличило продолжительность жизни мышей до 10,7±0,37 дней и 10,60±0,37 дней, процент увеличения продолжительности жизни по сравнению с контролем составил 78,33% и 76,67% для доз препарата 100 мг/кг и 200 мг/кг соответственно, однако различия между опытными группами оказались статистически недостоверными.
В процессе эксперимента проводилось ежедневное взвешивание животных с целью оценки накопления асцита и изучения сравниваемых препаратов на данный процесс.
Результаты оценки прибавки веса представлены в таблице 14.
Как видно из таблицы 14, препарат достоверно уменьшал накопление асцита у мышей с перевитыми опухолями лейкемии L1210. Прибавка веса тела у мышей, получавших исследуемый препарат, была достоверно меньше, чем в контрольной группе, причем у животных, получавших исследуемый препарат в дозе 250 мг/кг, средняя прибавка веса была достоверно ниже (в 1,5 раза) по сравнению с таковым показателем у животных, получавших препарат в дозе 100 мг/кг.
Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что препарат проявляет выраженное противоопухолевое действие и тормозит рост опухолевых клеток лейкемии L1210 у мышей, что проявилось в достоверном увеличении продолжительности жизни (78,33% и 76,67%) для доз 100 и 250 мг/кг и достоверном торможении накопления асцита экспериментальных животных (78-43%). Признаков интоксикации на фоне введения исследуемого препарата не зарегистрировано. Анализ полученных данных выявил достоверные различия между дозой препарата 100 мг/кг и дозой 250 мг/кг - увеличение дозы препарата приводит к достоверному уменьшению накопления асцита у экспериментальных животных.
По другим показателям контраст (отличие средних для групп, получавших разные дозы исследуемого препарата) был на уровне ошибок, вызванных естественным разбросом данных.
Результаты влияния препарата на развитие аденокарциномы молочной железы Са-755 представлены в таблице 15.
В таблице 16 приведена средняя продолжительность жизни животных с перевиваемыми опухолями аденокарциномы молочной железы Са-755 и контрольной группы, а также данные увеличения продолжительности жизни по сравнению с контрольной группой в %.
Как видно из таблицы 16 средняя продолжительность жизни мышей контрольной группы с перевитыми опухолевыми клетками опухолями аденокарциномы молочной железы Са-755 составила 37,9±0,74 дней. Введение препарата достоверно увеличило продолжительность жизни мышей до 71,9±2,58 дней и 73,4±0,92 дней, процент увеличения продолжительности жизни по сравнению с контролем составил 89,71% и 93,67% для доз препарата 100 мг/кг и 200 мг/кг соответственно, однако различия между опытными группами оказались статистически недостоверными.
Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что препарат проявляет выраженное противоопухолевое действие и тормозит рост опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы Са-755 у мышей, что проявилось в достоверном увеличении продолжительности жизни (89,71% и 93,67%) для доз 100 и 250 мг/кг. Признаков интоксикации на фоне введения исследуемого препарата не зарегистрировано.
Проведена оценка влияния препарата на средние величины объема опухолей карциномы Льюиса в различные дни после перевивки. В контрольной группе опухоли развились у 21 из 26 мышей (80,8%), первые опухоли были зарегистрированы на 7 день после перевивки и регистрировались до 40 дня. Первые опухоли в группе с воздействием препарата в дозе 100 мг/кг были зарегистрированы на 7 день после перевивки и регистрировались до 60 дня; в группе с воздействием препарата в дозе 250 мг/кг были зарегистрированы на 8 день после перевивки и регистрировались до 60 дня. Препарат оказывал выраженный противоопухолевый эффект на развитие карциномы легких Льюиса; процент торможения в группе препарата - 100 мг/кг по сравнению с контрольной группой на 10-17 дни достоверно составлял 71,77% и 58,5%, в группе препарата - 250 мг/кг по сравнению с контрольной группой на 10-17 дни - 84,37% и 54,2% соответственно.
3
В таблице 17 представлено влияние препарата на рост карциномы Льюиса, анализировались сроки достижения опухолью размера 500 мм; в контрольной группе данный показатель колебался от 12 до 20 дней, а в экспериментальных группах - от 17 до 28 дней. Как видно из данной таблицы, препарат достоверно увеличивал этот показатель на 22-27% по сравнению с контролем.
Гибель мышей контрольной группы наступала в результате прогрессирования опухолевого роста основного очага, а также вследствие обширного метастатического поражения легких. Индивидуальная продолжительность жизни мышей в контрольной группе колебалась от 28 до 39 дней, в группах с препаратом от 51 до 60 дней. В таблице 18 представлено влияние препарата на среднюю продолжительность жизни мышей после перевивки опухоли. Как видно из таблицы 18 препарат достоверно увеличивал среднюю продолжительность жизни примерно на 70% по сравнению с контрольной группой, разница между опытными группами статистически недостоверна.
Индивидуальные вес легких и количество метастазов в легких у мышей контрольной группы и опытных групп с воздействием сравниваемых препаратов представлены в таблице 19.
Как видно из таблицы 19 препарат достоверно уменьшал вес легких и количество метастазов в легких в 1,5-2 раза. Разница между опытными группами статистически недостоверна.
Таблица 1
Исследование цитотоксичности препарата на модели лимфобластоидных клеток человека
Условия опыта, концентрация, мкг/мл
Жизнеспособность клеток, %
Количество клеток ×10<sup>3</sup>/мл
Контроль клеток
98
800
Препарат №1
0,5
95
833
1,0
94
833
5,0
98
799
10,0
94
767
100
95
600
Таблица 2
Исследование противовирусной активности препарата на модели клеток человека, инфицированных ВИЧ-1
Условия опыта
Концентрация, мкг/мл
Жизнеспособность клеток, %
Кол-во клеток ×10<sup>3</sup>/мл
ЦПЭ/синцитии (+)
Контроль клеток
0
98
800
0
Контроль вируса
0
20
66
4,0
Препарат №1
0,5
18
33
4,0
1,0
26
495
4,0
5,0
98
633
0
10
98
600
0
Таблица 3
Изучение цитотоксического действия образца фуллеренполиаминокапроновой кислоты на культуру клеток Vero
Концентрация вещества, мкг/мл
Цитотоксическое действие на клетки, %
50
0,0
100
0,0
200
25,0
500
100,0
1000
100,0
Примечание: ДМСО в концентрации, применяемой для растворения, не оказывает цитотоксического действия на клетки
Таблица 4
Противогерпетическая активность образца фуллеренполиаминокапроновой кислоты в культуре клеток Vero при инфицирующей дозе вируса герпеса - 100 ТЦИД<sub>50</sub>/0,2 мл
Концентрация вещества, мкг/мл
Защита клеток от цитопатического действия вируса герпеса, %
5,0
81,25±12,5
10,0
100±0,0
50,0
100±0,0
100,0
100±0,0
Примечание: клетки инфицировали через час после введения образцов.
Таблица 5
Защитное действие препарата от цитодеструктивного действия вируса герпеса, тип 1 при инфицирующей дозе вируса 100 ТЦИД<sub>50</sub>
Концентрация препарата, мкг/мл
Препарат №1
Оптическая плотность
Отличия от контроля достоверны при р
0
0,403±0,02
5,0
1,110±0,08
<0,01
10,0
1,015±0,07
<0,01
50,0
1,153±0,06
<0,01
100,0
1,79±0,05
<0,01
Контроль клеток
1,133±0,07
<0,01
Таблица 6
Противогерпетическая активность образца фуллеренполиаминокапроновой кислоты в культуре клеток Vero при инфицирующей дозе вируса герпеса - 1000 ТЦИД<sub>50</sub>/0,2 мл
Концентрация вещества, мкг/мл
Защита клеток от цитопатического действия вируса герпеса, %
5,0
100±0,0
10,0
100±0,0
50,0
100±0,0
100,0
100±0,0
Примечание: клетки инфицировали через час после введения образцов
Таблица 7
Защитное действие препарата от цитопатического действия вируса герпеса, тип 1 при инфицирующей дозе вируса 1000 ТЦИД<sub>50</sub>
Концентрация препарата, мкг/мл
Оптическая плотность
Отличия от контроля достоверны при Р
0
0,796±0,06
5,0
1,027±0,04
<0,01
10,0
1,021±0,04
<0,01
50,0
1,033±0,03
<0,01
100,0
1,083±0,01
<0,01
Контроль клеток
1,133±0,07
Таблица 8
Результаты изучения активности препарата №1 в отношении вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl
Концентра-ции препаратов (мкг/мл)
Внесение препарата
Снижение (%) репродукции вируса гриппа в культуре клеток MDCK по отношению к контролю в присутствии серий препарата №1
6,25
за 2 часа до инфицирования
27,0-28,0-0
одномоментно с инфицированием
18,0-0-0
12,5
за 2 часа до инфицирования
47,0-74,0-9,5
одномоментно с инфицированием
39,0-13,0-0
25,0
за 2 часа до инфицирования
41,0-79,0-12
одномоментно с инфицированием
40,0-0
50,0
за 2 часа до инфицирования
28,0-72,0-31,0
одномоментно с инфицированием
33,0-10,0
100,0
за 2 часа до инфицирования
4,0-0-20,0
одномоментно с инфицированием
29,0-28,0
Различия в показателях 2-х опытов зависели от множественности заражения вирусом культуры клеток MDCK.
Таблица 9
Результаты изучения активности препаратов в отношении вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl, средние показатели
Концентра-ции препаратов (мкг/мл)
Внесение препарата
Снижение (%) репродукции вируса гриппа в культуре клеток MDCK по отношению к контролю в присутствии серий препарата №1
6,25
за 2 часа до инфицирования
18,0
одномоментно с инфицированием
6,0
12,5
за 2 часа до инфицирования
44,0
одномоментно с инфицированием
26
25,0
за 2 часа до инфицирования
44,0
одномоментно с инфицированием
20,0
50,0
за 2 часа до инфицирования
44,0
одномоментно с инфицированием
22,0
100,0
за 2 часа до инфицирования
8
одномоментно с инфицированием
29,0
Таблица 12
Влияние препарата на продолжительность жизни мышей с перевиваемой опухолью лейкемии L1210
Название
№ животного и его продолжительность жизни в днях
группы
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Контроль
6
7
7
6
6
5
6
6
5
6
Препарат №1 100 мг/кг
9
11
13
11
12
10
11
10
10
10
Препарат №1 250 мг/кг
10
10
10
9
10
11
13
10
11
12
Таблица 13
Влияние препарата на среднюю продолжительность жизни животных с перевиваемой опухолью лейкемии L1210
Название группы
СПЖ в днях, М±ь
УПЖ, %
Контроль
6,0±0,21
Препарат №1, 100 мг/кг
10,7±0,37*
78,33
Препарат №1, 250 мг/кг
10,6010,37*
76,67
Примечание: * - достоверные отличия от контроля (при р<0,05)
Таблица 14
Влияние препарата на развитие асцита у мышей с перевиваемой опухолью лейкемии L 1210
День
Контрольная группа
Препарат 100 мг/кг
Препарат 250 мг/кг
Средняя прибавка веса, М±m
Средняя прибавка веса, М±m
% торможения по сравнению с контролем
Средняя прибавка веса, M±m
% торможения по сравнению с контролем
1
0,4±0,2
0,3±0,2
0,3±0,1
2
0,9±0,3
0,8±0,4
0,5±0,3
3
5,0±0,8
2,5±0,5
50,0%*
1,1±0,4
78,0%*
4
11,4±1,1
4,2±1,0
63,2%*
2,8±0,9
75,4%*
5
16,3±2,0
8,4±1,2
48,5%*
4,7±1,2
71,2%*
6
21,2±2,1
12,1±2,1
42,9%*
8,4±1,6
60,4%*
7
26,3±1,7
14,2±2,2
46,0%*
10,0±1,3
62,0%*
Примечание: * - достоверные отличия от контроля (при р<0,05)
Таблица 15
Влияние препарата на продолжительность жизни мышей с перевиваемой опухолью лейкемии СА-755
Название группы
N животного и его продолжительность жизни в днях
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Контроль
36
39
41
34
35
40
39
38
40
37
Препарат №1, 100 мг/кг
79
81
73
82
80
66
63
60
67
68
Препарат №1, 250 мг/кг
77
72
70
78
76
71
73
70
72
75
Таблица 16
Влияние препарата на среднюю продолжительность жизни животных с перевиваемой опухолью аденокарциномы молочной железы Са-755
Название группы
СПЖ в днях, М±m
УПЖ, %
Контроль
37,9±0,74
Препарат №1, 100 мг/кг
71,9±2,58*
89,71
Препарат №1, 250 мг/кг
73,40±0,92*
93,67
Примечание: * - достоверные отличия от контроля (при р<0,05)
Таблица 17
Влияние препарата на размеры карциномы Льюиса (достижение V=500 мм<sup>3</sup>)
День достижения опухолью объема 500 мм<sup>3</sup>
Группа
М±m
% увеличения, статистическая значимость
Контроль
16,7±0,65
Препарат №1, 100 мг/кг
21,3±1,21
27,3% *
Препарат №1, 250 мг/кг
20,5±1,20
22,9%*
Примечание: * - достоверные отличия от контроля (при р<0,05)
Таблица 18
Влияние препарата на продолжительность жизни мышей после перевивки карциномы Льюиса
Продолжительность жизни
Группа
М±m
% увеличения Статистическая значимость
Контроль
32,81±0,86
Препарат 100 мг/кг
55,92±0,98
70,42%*
Препарат 250 мг/кг
56,38±0,68
71,85%*
Примечание: * - достоверные отличия от контроля (при р<0,05)
Таблица 19
Влияние препарата на метастазирование карциномы Льюиса у мышей
Группа № (число животных)
Вес легких, мг М±m
Количество метастазов в легких, M±m
Количество крупных (≥3 мм) метастазов в легких, M±m
Контроль (n=21)
1486,7±64,08
70,5±5,50
13,4±2,05
Препарат №1, 100 мг/кг (n=12)
491,9±63,72*
53,5±11,23*
5,8±1,91*
Препарат №1, 250 мг/кг (n=13)
505,4±68,82*
55,8±11,60*
5,7±1,54*
Примечание: * - достоверные отличия от контроля (при р<0,05)