АНТИМИКРОБНОЕ СОЕДИНЕНИЕ НА ОСНОВЕ ЭРИТРОЗИНА ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
ANTIMICROBIAL ERYTHROSINE-BASED COMPOUND FOR PHOTODYNAMIC THERAPY AND USE THEREOF

Настоящее изобретение относится к области фотодинамической терапии, в частности к применению фотодинамической терапии для селективного разрушения бактерий у человека и животных.
Фотодинамическая терапия (ФДТ) хорошо известна и используется для борьбы с различными заболеваниями, ассоциированными с гиперпролиферирующей тканью, такими как рак и различные кожные состояния. ФДТ также используется в качестве способа антимикробного лечения. Однако имеется множество серьезных проблем, связанных с антимикробной ФДТ. Первая проблема определяется сложностью нахождения фотоактивных веществ, которые могут эффективно использоваться как против грамположительных, так и против грамотрицательных бактерий. Грамотрицательные бактерии представляют собой еще более сложную проблему, связанную, прежде всего, с двухслойной структурой их наружной мембраны.
Основное различие между грамположительными и грамотрицательными бактериями связано с их клеточными стенками, как проиллюстрировано на фиг.1 и 2. Как показано на фиг.1, грамположительные бактерии обладают толстой пептидогликановой клеточной стенкой 101, состоящей из множества отдельных пептидогликановых слоев 103 (например, из 20-40 слоев), окружающих клеточную мембрану 105. И наоборот, как показано на фиг.2, грамотрицательные клетки имеют лишь тонкий слой пептидогликана 201, окружающий клеточную мембрану 203, которая, в свою очередь, окружена дополнительной наружной мембраной 205. Этот дополнительный слой позволяет дифференцировать грамотрицательные и грамположительные бактерии с использованием метода окрашивания по Граму. В связи с наличием наружной мембраны у грамотрицательных бактерий, краситель кристаллический йод-фиолетовый не может достичь пептидогликанового слоя клеточной стенки и задерживается в грамотрицательных бактериях после окрашивания по Граму, в отличие от ситуации, имеющей место в грамположительных бактериях. Наружная мембрана преимущественно отвечает за ингибирование проникновения многих веществ в грамотрицательные бактерии и является причиной тех трудностей, которые возникают при поиске фотосенсибилизаторов, которые будут эффективны против обоих типов бактерий.
Другая проблема состоит в трудности подбора подходящего фоточувствительного соединения, которое сохраняет, по меньшей мере, некоторую активность в присутствии сложных сред, таких как сыворотка крови, кровь или слюна. Большинство фоточувствительных соединений (фотосенсибилизаторов), которые демонстрируют хорошую активность против суспензий клеток в бедных средах, таких как забуференный фосфатом физиологический раствор, практически не имеют эффекта в присутствии сыворотки крови, крови или слюны. Это происходит в связи с тем, что компоненты таких сложных сред (например, белки, клетки крови) конкурируют с бактериями по аффинности к соединениям, используемым в ФДТ. Еще одна проблема связана с риском разрушения природных микроорганизмов, которые присутствуют в организме и являются благоприятными или необходимыми для осуществления некоторых функций организма. Применение антимикробной ФДТ связано с риском разрушения полезной микрофлоры вместе с вредными бактериями, которые подлежат удалению.
Эритрозин В представляет собой красный краситель, который поглощает в диапазоне сине-зеленого цвета с длиной волны 450-600 нм. Его используют в качестве биологического красителя в таких процессах, как микрофотография. Например, эритрозин В широко используется в качестве контрастного красителя при использовании различных красителей для ядер как растительных, так и животных тканей, или в качестве контрастного красителя при исследовании бактериальных клеток.
Эритрозин и эритрозин В могут использоваться в качестве красителя в стоматологи, поскольку они позволяют визуально выявить наличие и расположение кариесных бляшек на зубах. Эритрозин используют для удаления бактерий с биологических поверхностей, а также в качестве средства для антибактериального лечения.
В патенте США No.4581227 также раскрывается использование эритрозина или других веществ для удаления микроорганизмов, прикрепленных к биологическим поверхностям, например к желудку и кишечнику, зубам и поверхности ран у свиней, крупного рогатого скота и домашней птицы. Данный метод используют не с целью уничтожения бактерии, но, скорее, для удаления или для предотвращения прилипания бактерий к биологической поверхности.
Эритрозин и родственные красители используются для периодонтальной обработки, при которой выявляются и удаляются микробы, а также обрабатываются полости в зубах, вокруг зубов и десен. В патенте США No.6337357 описаны антимикробные композиции, используемые для выявления кариеса, которые включают воду, смешиваемый с водой растворитель или их сочетание, краситель, способный окрашивать пораженные кариесом части зуба, и антимикробный агент. Такая система способна выявлять полости и стерилизовать их. Могут использоваться красители, такой как эритрозин, который входит в число подходящих красителей, растворимых в растворителе или растворителях и способствующих визуальному определению наличия и расположения полости. В контексте указанного изобретения эритрозин используют только как окрашивающее вещество и не рассматривают его применение в качестве антимикробного средства.
Эритрозин В представляет собой известный фотосенсибилизатор, используемый как для медицинской, так и немедицинской обработки. Немедицинская обработка включает инсектицидную обработку и обработку поверхностей в промышленном производстве, тогда как медицинская обработка включает антимикробную обработку в рамках ФДТ зубов и других биологических поверхностей, а также ФДТ тканей, пораженных раком и другими заболеваниями.
В заявке на патент No.2002/0173832 А1 описано лечение по методу ФДТ неоваскуляризации глаза, возникшей в результате возрастной макулярной дегенерации. Эритрозин и эритрозин В приведены в числе многих других фотосенсибилизаторов, которые могут использоваться в рамках указанного способа.
В патенте США No.6609014 описано применение ФДТ для ингибирования рестеноза кровеносных сосудов, вызванного гиперплазией интимы. В число многих фотосенсибилизаторов, заявленных в качестве средств, полезных в данном способе лечения, входят эритрозин и эритрозин В.
В заявке на патент США No.2002/0022032 А1 описано применение фотосенсибилизаторов в сочетании с иммунологическими адъювантами для уничтожения метастазных опухолевых клеток. Фотосенсибилизаторы, заявленные в качестве средств для применения в рамках указанного способа, включают ксантиновые красители, такие как эритрозин и эритрозин В.
В патенте США No.4647578 раскрываются водорастворимые инсектицидные композиции на основе ряда ксантиновых красителей, не содержащих кислот, таких как эритрозин В, для борьбы со зрелыми насекомыми и личинками насекомых. Насекомые или их личинки потребляют соединения, содержащиеся в указанных композициях, и это в итоге приводит к гибели зрелых насекомых или личинок при экспозиции видимым светом.
В патенте США No.5798112 описано применение фотоактивных красителей, таких как эритрозин В, в фототоксичной инсектицидной композиции. Композиция содержит выбранные фотоактивные красители, приманку и адъювант.Соединение потребляется желательными насекомыми, в результате чего адъювант взаимодействует с фотоактивным красителем и мембранами насекомого, изменяя токсичность композиции, которая в этом случае уничтожает насекомых после экспозиции солнечным светом в течение определенного периода времени. В патенте США No.6506791 раскрывается способ лечения протозойных инфекций у рыб.
Фотоактивный краситель, включающий эритрозин В, вводят в водную среду с инфицированной рыбой, так чтобы концентрация фотоактивных красителей была достаточной для уничтожения некоторых или всех бактерий.
В патенте ЕС No.652709 В1 раскрывается способ уничтожения бактерий на биопленках за счет применения некоторых фотосенсибилизаторов, включающих эритрозин В, на поверхностях с последующей фотодинамической инактивацией бактерий. Указанный способ предназначен для применения на твердых бытовых и промышленных поверхностях, таких как стекло, пластики и керамические изделия. В указанном патенте не раскрывается применение на биологических поверхностях.
Способ фототермического разрушения бактерий в ротовой полости описан в патенте США No.6290496. Композицию, содержащую краситель, предпочтительно эритрозин В, наносят на зубы для селективного окрашивания бактерий ротовой полости. Облучение, отфильтрованное таким образом, чтобы исключить длину волны, которая в существенной мере поглощается гемоглобином, используется для селективного повышения температуры окрашенных бактерий и разрушения бактерий путем коагуляции. Указанный метод не раскрывает способ селективного разрушения тольковредных бактерий, когда не затрагивается природная микрофлора.
Фотосенсибилизаторы и способы проведения ФДТ с использованием галогенсодержащих ксантинов или их производных описаны в патенте США No.2001/0022970 A1 и предназначены для лечения патологических состояний в различных тканях тела, включая кожу и систему кровообращения. Заболевания, такие как рак и микробные инфекции, могут быть подвергнуты лечению описываемыми в указанном патенте композициями и способами. Соединения, такие как бенгал-роз (bengal rose) и эритрозин В, описаны в качестве возможных фотосенсибилизаторов. Указанный способ включает интракорпоральное введение, такое как внутривенная инъекция и чрескожная доставка. Фотосенсибилизатор может быть включен в состав геля (пар.46). Указанное изобретение применимо к заболеваниям полости рта, при этом применение может быть непосредственно или опосредованно осуществляться через воздействие на ткани, включающие рот и десны, или по существу прилегающие к ним участки, для лечения заболеваний, таких как болезни десен и другие периодонтальные заболевания, включая гингивит (пар.69). Лекарственное средство может применяться для воздействия на микробные инфекции человека и животных, которые могут доставляться в инфицированные ткани или в области, по существу близкие к ним (пар.97). Примеры бактерий включают стрептококки (пар.98).
Это изобретение в основном описывает применение фотосенсибилизаторов, таких как эритрозин В, при проведении лечения в рамках ФДТ и не описывает их применение в рамках перорального или антибактериального лечения, а также не описывает способ или композицию, которые позволят ограничивать действие фотосенсибилизаторов в определенной области или в области, близкой к биопленке, такой как гелевая композиция, для целей направленного нанесения на зубы, десны и/или язык. Кроме того, указанное изобретение не раскрывает способ или композицию для селективного разрушения вредных бактерий в условиях сохранения природной микрофлоры неповрежденной. И, наконец, указанное изобретение не раскрывает способ или композицию, которые снижают вредное воздействие комплексных сред, таких как кровь, сыворотка крови и слюна.
Приведенные выше способы и/или композиции ФДТ имеют тот недостаток, что они действуют недифференцированно и могут повредить нормальную микрофлору в различных зонах организма, таких как ротовая полость. Данная микрофлора выполняет необходимые функции и, в этой связи, любые антибактериальные способы/композиции должны предусматривать щадящее воздействие на такую природную микрофлору. Однако состояние разработок в данной области техники не позволяет решить эту проблему.
Имеется потребность в способе проведения антимикробной ФДТ и в соединении, которое будет эффективно в присутствии комплексных сред, таких как слюна. Этот метод должен эффективно работать при использовании его как против грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, и должен быть достаточно мощным для эффективного уничтожения грамположительных бактерий в специальных областях его приложения. Кроме того, указанные способ и соединение должны быть эффективными против патогенных бактерий, но оставлять незатронутыми необходимые бактерии. Настоящее изобретение относится к данной потребности.
Объектом настоящего изобретения является предоставление способа эффективной и селективного разрушения вредных микробов, в особенности бактерий, у человека и животных.
Другой целью настоящего изобретения является предоставление антибактериального способа, который может быть контролируемым и селективно активируемым электромагнитным облучением.
Еще одним объектом настоящего изобретения является предоставление способа, который будет эффективен для разрушения грамположительных бактерий.
Еще одним объектом настоящего изобретения является предоставление антибактериального способа и композиции, которые будут эффективны в присутствии сложных сред, таких как слюна.
В общих чертах, настоящее изобретение относится к способу разрушения микробов, в особенности бактерий, в организме с использованием композиций, содержащих эритрозин В, в сочетании с электромагнитным облучением. В предпочтительном способе композицию, включающую эритрозин В, вводят в подлежащую лечению область. По истечении достаточного периода времени применяют облучение данной области волнами соответствующей длины для активации эритрозина В и фотодинамической реакцией разрушить бактерии. Предпочтительное облучение включает свет с длиной волны примерно 530 нм. Эритрозин В включают в гель, действие которого направлено на ограничение фотодинамического воздействия в области, прилежащей к биопленке, позволяя, таким образом, подвергаться воздействию только нежелательным бактериям, оставляя природную микрофлору незатронутой. Данный способ эффективен для разрушения по меньшей мере грамположительных бактерий и, в частности, он эффективен в тех зонах, где присутствуют также сложные среды, такие как слюна.
Указанные выше и другие объекты, особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из прилагаемого описания в сочетании с прилагаемыми рисунками.
Фиг.1 - поперечный разрез клеточной стенки, клеток грамположительных бактерий.
Фиг.2 - поперечный разрез клеточной оболочки клеток грамотрицательных бактерий.
Фиг.3 - график, показывающий фотодинамическую инактивацию Streptococcus mutans DSM6178 гелем, содержащим эритрозин В.
Фиг.4 - график, показывающий выживание Streptococcus spec. после фотодинамической инактивации гелем, содержащим эритрозин В.
В связи с имеющимися на достигнутом уровне техники трудностями, которые относятся к способам и соединениям, в особенности для того, чтобы избежать неблагоприятного воздействия комплексных сред, таких как сыворотка крови, кровь или слюна, и не допустить разрушения природной микрофлоры, желательно найти соединение, которое позволит преодолеть указанные недостатки. Было обнаружено, что эритрозин В является эффективным фотосенсибилизирующим веществом, действующим против грамположительных бактерий в слюне. Данный эффект весьма интересен для некоторых специальных областей применения, например для эффективного уничтожения клеток Streptococcus spec. в ротовой полости с целью предупреждения кариеса ротовой полости. Другим выявленным преимуществом является тот факт, что наличие сложных компонентов в среде (например, в слюне) не нейтрализует эффективность эритрозина В для целевых бактерий, как это часто происходит в случае других фотосенсибилизаторов. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением эритрозин В может входить в качестве составной части в курс эффективного антибактериального лечения. Антибактериальная композиция для ФДТ, включающая эритрозин В, также является частью настоящего изобретения. В предпочтительном варианте антибактериальное лечение включает три основных стадии. Первая стадия связана с введением композиции с эритрозином В в систему, содержащую бактерии. Вторая стадия направлена на обеспечение достаточного периода времени для того, чтобы эритрозин В проник в бактериальные клетки области, подлежащей лечению, или, по меньшей мере, связался с компонентами оболочек их клеток. И последняя стадия включает применение облучения волнами соответствующей длины для инициации фотодинамического механизма через активацию эритрозина В, что вызывает образование реакционноспособных видов кислорода и свободных радикалов, ведущих к разрушению бактерий.
Предпочтительно длительность «времени экспозиции» или периода времени между нанесением композиции с эритрозином В и облучением, которая является достаточной для того, чтобы фотосенсибилизатор распределился по биофильтру или по поверхности, варьирует и может меняться в зависимости от ряда факторов, таких как тип бактерий, подлежащих лечению, область тела, подлежащая лечению, и способ введения композиции с эритрозином В, соответственно. Обычно в случае местного применения данный период времени составляет по меньшей мере 5 минут. Для лечения внутренних бактериальных инфекций композиция может быть инъецирована в кровоток для системного воздействия или может быть инъецирована местно, если инфекция ограничена конкретной зоной. В случае инфекций, поражающих кожу или прилегающие зоны, композиция может иметь вид раствора, крема, геля или лосьона для местного применения.
В предпочтительном варианте композиция по настоящему изобретению включает эритрозин В, входящий в состав геля. Нанесение геля с эритрозином В имеет преимущества, определяемые тем, что композиция может быть селективно нанесена с последующим прилипанием к поверхности, на которой присутствует бляшка, так что только бактерии, локализованные на биопленке или кариесной зоне, поражаются при последующем облучении. Это важно, поскольку имеется множество микроорганизмов в организме или на поверхности тела, которые важны для протекания биологических процессов. Существенно, что такое антибактериальное лечение позволяет избежать уничтожения природной полезной микрофлоры. В композиции по настоящему изобретению эритрозин В ограничен и сконцентрирован в области возле геля. После нанесения геля на биопленки эритрозин В диффундируют из гелевой матрицы в бляшку, непосредственно окрашивая целевые бактерии. Только бактерии, находящиеся в бляшке, окрашиваются в достаточной мере (эритрозин В берется в достаточно высокой концентрации), что позволяет применить впоследствии освещение, которое стимулирует существенный фотодинамический эффект. Таким образом, значительное количество эритрозина В не может перемещаться к областям, локализованным вдали от зоны нанесения на биопленку. Так что область активации оказывается ограниченной только зонами, ближайшими к биопленке, и в этой связи, в непосредственной близости от локализации вредных бактерий.
Примером лечения по настоящему изобретению является профилактическое нанесение геля с эритрозином В на зубы и/или тыльную часть языка для разрушения вредных бактерий для предупреждения развития кариеса. Альтернативно, гель может наноситься на ткань, уже пораженную кариесом или заболеванием, для уничтожения имеющихся там бактерий. Гель наносят на зубы или другие поверхности, такие как десны, и активируют соответствующим облучением для уничтожения бактерий вблизи биопленки. В предпочтительном варианте биопленки по настоящему изобретению преимущественно включают биопленки, помещенные на зубы и/или тыльную часть языка, где осаждаются вредные бактерии, ведущие к развитию зубного кариеса. Поскольку вдали от места нанесения гелевой композиции эритрозин В не присутствует в значительных концентрациях, другая микрофлора в ротовой полости не поражается.
Имеется множество материалов, которые могут использоваться согласно настоящему изобретению для создания гелевой композиции. Все такие материалы должны быть нетоксичными и должны иметь разрешение для внутреннего или перорального применения. Гелевые компоненты должны солюбилизировать эритрозин В. Для этого может использоваться множество гелей на целлюлозной основе, таких как гидроксиэтилцеллюлоза. Иллюстративный вариант геля по настоящему изобретению включает эритрозин В, гидроксиэтилцеллюлозу, пропиленгликоль, воду и необязательно отдушку или ароматизирующее соединение.
По истечении заданного периода времени применяют облучение места, подлежащего лечению, для активации эритрозина В и разрушения бактерий. Предпочтительная длина волны активирующего облучения составляет от 500 нм до 580 нм и еще более предпочтительно примерно 530 нм. Облучение может представлять собой некогерентное облучение, такое как облучение от лампы, или когерентное лазерное облучение. В случае лечения поверхностных или подповерхностных зон для облучения конкретных инфекционных областей может эффективно использоваться лампа, тогда как в случае инфицированных зон, расположенных глубже в организме, для доставки лазерного излучения к таким внутренним областям предпочтителен оптический волоконный аппарат, включающий одно или более оптических волокон, которые могут также содержать диффузоры или другие устройства, необходимые для облучения конкретной инфицированной области. Предпочтительным лазерным источником является диодный лазер с помпой с длиной волны 532 нм.
Настоящее изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами, которые не являются ограничивающими.
Пример 1
Фотодинамическая активация суспензий бактериальных клеток Streptococcus mukans эритрозином В
Используемый в данном исследовании организм представляет собой Streptococcus mutans DSM 6178 (ATCC 35668). Грамположительные бактерии Streptococcus spec. при совместном воздействии вызывают развитие кариеса ротовой полости.
Клетки Streptococcus mutans выращивают в аэробных условиях в течение ночи при температуре 37°С в соевом бульоне, обработанном трипсином (Merck KGaA Darmstadt, Germany). Клетки собирают центрифугированием и ресуспензируют в стерильном забуференном фосфатом физиологическом растворе (FBS) с добавкой 10% стерильной отфильтрованной природной слюны. Конечное значение ОП (оптическая плотность) при длине волны 600 нм в кювете с длиной прохода луча 1 см во всех случаях составляет 0,05. Вносят примерно 0,5 мл геля на основе гидроксиэтилцеллюлозы с эритрозином В (1 мМ, 2 мМ, 3 мМ и 8 мМ эритрозина В) на дно пробирки. На гель наслаивают 0,5 мл бактериальной суспензии и подвергают экспозиции в течение 1, 3 или 5 минут, соответственно, при слабом встряхивании при комнатной температуре. После экспозиции вносят 250 мкл суспензии в новую пробирку, пробирку подвергают центрифугированию, супернатант удаляют и клеточный остаток суспензируют в 250 мкл FBS + 10% природной слюны (стерильная, отфильтрованная). Аликвоты бактериальных суспензий по 200 мкл вносят в лунки стерильных черных 96-луночных планшетов с прозрачным дном (Costar 3603, Corning Inc., USA) и подвергают экспозиции светом от лазера Ceralas G2 (biolitec AG, Germany), длина волны 532 нм, мощность 0,05 Вт, время облучения 30 секунд от оптического волокна на дне планшета. Плотность мощности потока в такой системе составляет примерно
2
2
0,1 Вт/см (при измерении с использованием Optometer Р-9710, Gigahertz-Optik GmbH, Puchheim, Germany). Для данного времени освещения достигаемый суммарный поток энергии составляет примерно 3 Дж/см.
Контрольные образцы для оценки темновой токсичности
не подвергают экспозиции лазерным светом.
После освещения образцы отбирают из лунок планшета, разбавляют обработанным трипсином соевым бульоном и высевают с помощью спирального коллектора для планшета Eddy Jet (iul Instruments, Barcelona, Spain) на планшеты с соевым агаром, обработанным трипсином. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) подсчитывают после адекватной инкубации с использованием счетчика колоний Countermat Flash (iul Instruments, Barcelona, Spain).
Результаты экспериментов показаны на фиг.3.
ФДТ с использованием геля, содержащего эритрозин В, демонстрирует очень хороший эффект с точки зрения уничтожения бактерий. Антибактериальный эффект зависит от времени экспозиции и концентрации эритрозина В. Не отмечается темновой токсичности.
Пример 2
Фотодинамическое снижение уровня Streptococcus spec. в ротовой полости волонтеров
2
25 волонтеров распределяют по 5 группам. Всем волонтерам при легком массировании наносят на зубы примерно по 2 мл геля, содержащего эритрозин В. Ротовую полость после экспозиции в течение 2 минут промывают водой и зубы обрабатывают светом от лазера Ceralas G2 с длиной волны 532 нм (biolitec AG, Germany) с использованием светового аппликатора через оптическое волокно. Время облучения составляет примерно 3 минуты. Плотность мощности светового потока в четырех группах волонтеров, проходивших испытание, составляет примерно 0,05, 0,1, 0,3 и 0,5 Вт/см соответственно. Контрольную группу волонтеров не облучают. Все виды обработки проводят перед нормальной утренней чисткой зубов, которая может привести к удалению бактерий из ротовой полости. Перед первой обработкой и после каждой обработки отбирают образцы слюны пробирками Salivette (Sarstedt Ag & Co., Numbrecht, Germany), затем слюну берут из пробирок Salivette и помещают на планшет с помощью спирального коллектора для планшетов Eddy Jet (iul Instruments, Barcelona, Spain) на агар TYCSB (селективная среда для Streptococcus spec.) в планшетах. Подсчитывают количество колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) после проведения адекватной инкубации в анаэробных установках (Don Whitney Scientific Lim., Shipley, England) с использованием счетчика колоний Countermat Flash (iul Instruments, Barcelona, Spain). В случае Streptococcus spec. количество бактерий в слюне соответствует количеству бактерий в зубной бляшке.
Результаты экспериментов показаны на фиг.4.
2
2
Наилучший эффект с точки зрения уничтожения бактерий в ходе указанного лечения был получен при освещении потоком с плотностью мощности 0,3 и 0,5 Вт/см. Снижение числа бактерий в сравнении с контрольной группой отмечается также в группе, которую освещали потоком с плотностью мощности 0,1 и 0,05 Вт/см.
Несмотря на то, что предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения описаны со ссылкой на прилагаемые рисунки, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается указанными точными вариантами и что специалисты в данной области могут ввести в него различные изменения и модификации без отступления от существа и объема настоящего изобретения, определяемых в прилагаемой формуле изобретения.