РАСТВОР ДЛЯ КОНСЕРВИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ВЗВЕСЕЙ
SOLUTION FOR CELL SUSPENSIONS PRESERVATION

Изобретение относится к физиологии, криобиологии и медицине, а именно к созданию раствора для консервирования лейкоцитов.
Из уровня техники известен криоконсервант для лейкоцитов (RU 2301524 С1, 27.06.2007), который содержит в оптимальном соотношении лемнан, глицерин, оксиметилэтилпиридина сукцинат, воду для инъекций и гидроксид натрия. Криоконсервант проявляет выраженное хдадоограждающее свойство при охлаждении лейкоцитов до -10°С.
Известен хладоограждающий раствор для замораживания ядерных клеток крови (RU 2464991 С1, 27.10.2012), содержащий в оптимальном соотношении глицерин, растительный полисахарид - комаруман, трилон Б и воду для инъекций. Раствор позволяет сохранять клетки в течение одних суток при замораживании до -20°С.
Недостатками данных криоконсервантов является то, что они обеспечивают сохранность лейкоцитов на исходном уровне при температурах -10°С и -20°С не более 24 часов. Кроме того, в своих составах криозащитные растворы содержат пектиновые полисахариды лемнан и комаруман, которые были получены путем химического гидролиза в лабораторных условиях и в зависимости от времени сбора сырья отличаются молекулярным весом, качественным и количественным сахаридным составом (Оводова Р.Г. и др. Структурное исследование и физиологическая активность лемнана, пектина из Lemna minor L // Биоорганическая химия. - 2000. - Т. 26, №10. - С. 743-751).
Известен криоконсервант (Сведенцов Е.П. и др. Оценка влияния пектина раувольфии змеиной на функциональные показатели лейкоцитов, консервированных при -80°С // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2011. - №9. - С. 105), содержащий глицерин, трилон Б и пектиновый полисахарид - раувольфиан, выделенный из раувольфии змеиной (Ranvolfia serpentine L). Раствор позволяет сохранить лейкоциты в физиологически полноценном состоянии при -80°С в течение суток. Недостатком является отсутствие оптимального соотношения компонентов раствора и непродолжительное время хранения, кроме того, при -80°С происходит вымораживание в лед большого количества клеточной воды, данный раствор не способен в полной мере стабилизировать процесс кристаллизации.
Наиболее близким является раствор для консервирования клеток (T.V. POLEZHAEVA et al. USE OF PECTIC POLYSACCHARIDES FOR CRYOPRESERVATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / Arch. Biol. Sci., Belgrade, 2014, 66 (3), pages 1025-1033), включающий (по объему) 7% глицерина, 0,2% пектинового полисахарида раувольфиана и 0,1% трилона Б. Недостатками раствора являются достаточно высокое содержание глицерина (в пересчете на массу 8,827 г) и, как следствие, непродолжительное время хранения до 1 сут при субумеренно-низкой температуре -20°С, а также содержание пектинового полисахарида, который был получен из раувольфии змеиной и в зависимости от времени сбора сырья отличается молекулярным весом, качественным и количественным сахаридным составом.
Это связано с тем, что растительная клеточная стенка (источник полисахаридов) является динамичной сложноорганизованной системой, состав которой может изменяться во время роста, дифференциации клеток, под влиянием внешних факторов. Необходима стабилизация условий для получения полисахарида с заданными свойствами.
Техническим результатом настоящего изобретения является понижение температуры и увеличение длительности хранения клеток крови, т.е. создание раствора для консервирования клеточных взвесей при умеренно-низкой температуре (-40°С), который обеспечивает сохранность стабильно высокого процента физиологически активных ядерных клеток крови в течение длительного времени (до 15 сут.).
Решить данную проблему позволяет уменьшение концентрации глицерина в растворе и изменение соотношения основных ингредиентов - пектинового полисахарида и глицерина до оптимальных показателей с 1: 44 (в прототипе) до 1: 35.
А также получение стандартизированных полисахаридов из стенок культивируемых in vitro клеток (Sims I.M., Middleton K., Lane A.G. et al. Characterization of extracellular polysaccharides from suspension cultures of members of the Poaceae // Planta. - 2000. - Vol. 210. - P. 261-268). Клеточные культуры подобно нативным растениям синтезируют аналогичные пектиновые вещества, при этом содержание полисахаридов в культурах клеток может значительно превышать таковое в нативных растениях. В настоящее время культуры растительных клеток являются объектом биотехнологии для получения целевых продуктов. Использование пектиновых полисахаридов из каллусных культур, обладающих криозащитным действием, в составе консервантов является перспективным направлением в криобиологии и медицине.
Технический результат достигается тем, что в предложенный раствор для консервирования клеточных взвесей включены следующие ингредиенты (масс. %): пектиновый полисахарид каллуса раувольфии змеиной - 0,2, глицерин - 7,0, трилон Б - 0,1 и вода для инъекций.
Клеточные культуры имеют ряд преимуществ перед нативными растениями: гомогенность системы, состоящей в основном из клеток с первичными клеточными стенками, независимость от климатических условий, высокая продуктивность по биомассе и полисахаридам, полисахариды стандартизованы по составу и биологической активности, возможность регуляции биосинтеза полисахаридов, сохранение природных популяций растений.
Пектиновый полисахарид каллуса раувольфии змеиной (раувольфиан) обладает как полисахарид (пектин) экзоцеллюлярным криопротекторным действием, что дополняет эндоцеллюлярное хладоограждающее влияние глицерина на клетки и делает комбинированный криоконсервирующий раствор более полноценным, дающим при замораживании лейкоцитов выраженный криобиологический (технический) эффект, а также иммуномодулирующим и противовоспалительным действием (Попов С.В. и др. Химическая характеристика и противовоспалительное действие раувольфиана, пектинового полисахарида каллуса раувольфии змеиной // Биохимия. - 2007. - Т. 72, №7. - С. 955-962) на клетки.
Глицерин высшего сорта - криопротектор эндоцеллюлярного действия (Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус A.M., Калугин Ю.В. Криопротекторы: Киев: Наукова думка, 1978. - с. 5-64) используется в нетоксичной для клеток концентрации, поэтому не требует отмывания перед применением, а антикоагулянт - трилон Б (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) имеет широкое применение в производстве медицинских препаратов и при консервировании.
Криоконсервант имеет рН среды 7,0-7,4, самый благоприятный для клеток крови. Его ингредиенты тропны лейкоцитарным клеткам.
Пример использования средства
Консервирующий раствор, содержащий, масс. %: глицерин - 7,0, пектиновый полисахарид каллуса раувольфии змеиной - 0,2, трилон Б - 0,1, вода для инъекций - остальное и имеющий рН 7,0-7,4, смешивают в соотношении 1:1 с концентратом лейкоцитов в полимерном контейнере «Компопласт». При приготовлении раствора использовали аналитические весы. Конечная концентрация веществ, входящих в состав раствора после смешивания с лейкоконцентратом оказывалась в 2 раза ниже исходной, при этом рН среды не изменялась, оставаясь в пределах 7,0-7,4.
Смесь выдерживают 20 мин при комнатной температуре и помещают в электрический морозильник с температурой -20°С на 15 мин в охлажденную спиртовую (96%) ванну, затем перекладывают для хранения в воздушную среду морозильника при -20°С, или -40°С, или -80°С. Размораживают биообъект в 20-литровой водяной ванне при температуре 37°С.
Затем определяют морфологическую сохранность размороженных лейкоцитарных клеток, их жизнеспособность по витальному красителю - эозину и фагоцитарную активность нейтрофилов в пробе с латексом (по Потаповой С.Г. и соавт. Ж. Проблемы гематологии и переливания крови. - 1977. - №9. - С. 58-59). Расчет выражают в процентах в сравнении с аналогичными показателями клеток до замораживания.
Экспериментальные исследования выполнены на базе лабораторий криофизиологии крови и отдела молекулярной биотехнологии Института физиологии Коми НЦ УрО РАН.
Изучены три варианта использования раствора для консервирования лейкоцитов, отличающихся температурой хранения (таблица 1).
Определены максимальные (показатель жизнеспособности выше 50% от исходного) сроки хранения лейкоцитов с предложенным криоконсервантом при различных отрицательных температурах (табл. 2).
Основным критерием оценки биологической полноценности лейкоцитов, прежде всего нейтрофилов, является определение их фагоцитарной активности. Этот тест, наиболее надежно характеризующий физиологические свойства клеток, замороженных с предложенным криоконсервантом, был лучшим после 15 суток хранения клеток при -40°С.
Готовый раствор криоконсерванта прозрачен, с желтоватым оттенком, без запаха, рН 7,0-7,4, хорошо смешивается во всех соотношениях с лейкоцитным концентратом, не вызывает конгломерацию клеток и обеспечивает функциональную и морфологическую сохранность при положительной температуре до замораживания. Криоконсервант проявляет выраженное хладоограждающее свойство при замораживании лейкоцитов до -40°С.
Таким образом, разработанный раствор для консервирования клеточных взвесей, содержащий пектиновый полисахарид каллуса раувольфии змеиной, с оптимальным соотношением ингредиентов позволил при замораживании лейкоконцентрата до -40°С обеспечить сохранность стабильно высокого процента физиологически активных ядерных клеток крови до 15 суток. Он может быть применен в учреждениях медицинского и биологического профиля.