Влияние оксида азота и динитрозильных комплексов железа на активность антиоксидантных ферментов в крови in vitro

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ВЛИЯНИЕ ОКСИДА АЗОТА И ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА НА АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ В КРОВИ IN VITRO

Н.В. Диденко, А.Г. Соловьева, К.Л. Беляева

ФГБОУ ВО «Приволжский исследовательский медицинский университет» Минздрава России, Нижний Новгород

Abstract

In the article the effect of different concentrations of nitric oxide and dinitrosyl iron complexes (DNICs) on specific activity of antioxidant enzymes of blood in vitro was considered. It was shown that the maximum increase in the specific activity of superoxide dismutase, catalase, glutathione reductase occurred using a concentration of NO - 100 ppm compared to lower concentrations of nitric oxide (20, 50, 75 ppm). The activity of superoxide dismutase (SOD), catalase and glutathione reductase (GR) increased when deposited form NO (DNIC) added to the donor blood in vitro in the ratio of 1:100 and 1:50. The activity of enzymes of the antioxidant system, especially SOD, decreased when adding DNA in a ratio of 1: 25.

Key words: nitric oxide, dinitrosyl iron complexes, superoxide dismutase, catalase, glutathione reductase

В статье рассмотрено влияние различных концентраций оксида азота и динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) на удельную активность антиоксидантных ферментов донорской крови в условиях in vitro. В результате эксперимента показано, что при воздействии на донорскую кровь экзогенного NO в виде газового потока максимальное увеличение удельной активности таких антиоксидантных ферментов как супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионредуктаза происходит при использовании концентрации NO - 100 ppm по сравнению с меньшими концентрациями оксида азота (20, 50, 75 ррm). При введении в образцы донорской крови в условиях in vitro депонированной формы NO в виде комплексов ДНКЖ также отмечено повышение активности супероксиддисмутазы (СОД), каталазы и глутатионредуктазы (ГР) в соотношениях 1:100 и 1:50. При добавлении ДНКЖ в соотношении 1:25 наблюдался спад активности ферментов антиоксидантной системы, особенно проявившийся в снижении удельной активности СОД.

Ключевые слова: оксид азота, динитрозильные комплексы железа, супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионредуктаза

Молекулы-метаболиты являются фундаментальной основой функционирования сложных биологических систем, поэтому чрезвычайно большой интерес представляет возможность управления их реакционной способностью, что может быть использовано для регуляции процессов метаболизма [5]. Оксид азота (N0) — уникальный по своей природе и механизмам действия как первичный так и вторичный мессенджер, вовлеченный во множество биохимических и физиологических процессов

[3].

В настоящее время известно о полифункциональности действия N0, носящее порой противоположный характер. Условия, при которых защитное действие N0 переходит в повреждающее, недостаточно ясны [5]. Исходя из этого не ясно, какие количества N0 благоприятны для организма, а какие следует считать увеличенными. Однако при любом подходе к решению проблемы регуляции N0 необходимо иметь в виду, что N0 - универсальный медиатор метаболизма и резкое изменение его генерации может привести к нарушению функциональной активности многих биосистем [2]. Будучи свободным радикалом, N0 имеет короткую продолжительность жизни -около 6—10 с. Поэтому ученые все чаще обращаются к природным формам связывания N0 - динитрозильным комплексам железа (ДНКЖ). Известно, что ДНКЖ представляют собой стабильные комплексы, обладающие собственной метаболической активностью и способны выступать в качестве «ловушки» свободных радикалов [1].

Цель работы - изучить влияние различных концентраций оксида азота и динитрозильных комплексов железа на удельную активность антиоксидантных ферментов донорской крови в условиях т уйго.

Материал и методы исследования

Эксперимент был проведен на консервированной крови от пациентов-доноров (п=35). Генерацию оксида азота производили с помощью специализированного аппарата, разработанного в РФЯЦ (Саров). Был выполнен барботаж образцов крови (5мл) газовой смесью в течение 2 минут. В качестве действующих концентраций использованы 20, 50, 75 и 100 ррт N0.

Синтез ДНКЖ осуществляли по методике А.Ф. Ванина с соавт. [1]. Концентрация водного раствора ДНКЖ, взятого в эксперимент, составляла 5 ммоль/л (определялась спектрофотометрически по известным молекулярным экстинкциям при длинах волн 310 и 360 нм). В пробирки, содержащие по 5 мл консервированной крови, добавляли свежеполученный водный раствор ДНКЖ в соотношении 1:150, 1:100, 1:50 и 1:25.

Активность СОД измеряли по ингибированию образования продукта аутоокисления адреналина [7]. Активность каталазы оценивали спектрофотометрическим методом, основанным на определении скорости разложения перекиси водорода каталазой исследуемого образца с образованием воды и кислорода [6]. Активность ГР исследовали методом,

основанным на изменении абсорбции раствора при образовании окисленной формы НАД+ [6]. Результаты исследований подвергали статистической обработке с использованием ^критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение Известно, что сама молекула NO обладает антиоксидантными свойствами, что оказывается эффективным способом ограничения активации свободнорадикального окисления [10].

В результате эксперимента показан рост удельной активности СОД донорской крови при воздействии на неё газового потока, содержащего NO во всех выбранных концентрациях. При этом удельная активность энзима находилась в прямой зависимости от повышения концентрации NO. С ростом исследуемых концентраций NO в газовом потоке от 20 до 100 ppm удельная активность СОД возросла в 1,05 раза (р=0,075), в 1,09 раза (р=0,031), в 1,1 раза (р=0,028) и в 1,25 раза (р=0,034) соответственно по сравнению с контролем (табл. 1).

Таблица 1. Удельная активность супероксидисмутазы, каталазы, глутатионредуктазы в донорской крови при воздействии на нее оксида азота __в условиях in vitro__

Условия эксперимента Активность СОД, усл.ед./мин*мг b Активность каталазы, усл.ед./мин*мг b Активность ГР, нмоль/мин*мг b

Контроль 245,83±10,13 0,0261±0,0016 106,41±6,76

20 ррm NO 258,11±12,65 0,0317±0,0022* 129,09±11,29*

50 ррm NO 268,06±10,98* 0,0391±0,0029* 121,96±8,06*

75 ррm NO 271,24±13,77* 0,0284±0,0018 122,01±8,75*

100 ррm NO 307,05±19,64* 0,0318±0,0021* 178,75±18,63*

Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с контролем

Такая динамика изменений функционального состояния фермента может быть объяснена способностью NO регулировать антиоксидантную активность самих энзимов и экспрессию кодирующих их генов [8]. Удельная активность каталазы в донорской крови, обработанной газовой смесью, содержащей 20 ррm NO, возросла статистически значимо по сравнению с контролем в 1,21 раза (р=0,028). Наиболее существенное увеличение удельной активности каталазы отмечено при концентрации NO 50 ppm (в 1,5 раза по сравнению с контролем; р=0,03)4. Воздействие газового потока, содержащего NO в концентрации 75 ppm, не вызвало статистически значимого увеличения удельной активности каталазы. При воздействии на донорскую кровь газового потока NO 100 ppm удельная активность каталазы статистически значимо возросла в 1,22 раза (р=0,031) по сравнению с контролем.

Также установлено увеличение удельной активности ГР при концентрации N0 20 ppm в 1,21 раза (р=0,023), при концентрации N0 50 ррm - в 1,14 раза (р=0,037), при концентрации N0 75 ppm - в 1,15раза (р=0,029) по сравнению с контролем. Максимальное увеличение удельной активности ГР ( в 1,67 раза по сравнению с контролем; р=0,041) наблюдалось при концентрации N0 100 ppm.

Таким образом, показано, что газовый поток, содержащий N0 в концентрации 100 ppm, увеличивает удельную активность в донорской крови всех исследуемых антиоксидантных ферментов по сравнению с влиянием на энзимы N0 в меньших концентрациях (20, 50, 75 ррm).

Однако в организме основная часть пула N0 присутствует в связанной форме, формируя квазистабильные нетоксичные комплексы, что способно существенно уменьшать неблагоприятное действие экзогенного введения N0. Исследование таких комплексов, содержащих N0 в депонированной форме, представляет собой актуальную научную проблему, так как они способны мигрировать и накапливаться в разных областях организма, что является одним из факторов избирательности их действия, а также данные комплексы являются природными формами связывания N0, что дает возможность их применения в качестве эффективных и безопасных лекарственных препаратов - доноров N0, обладающих гипотензивным и антиоксидантным действием [9].

Исследование влияния ДНКЖ на активность ферментов антиоксиданой системы показало, что добавление к донорской крови малых количеств водного раствора ДНКЖ (в соотношении 1:150 и 1:100) увеличивает удельную активность С0Д в 1,22 раза (р=0,034) ив 1,24 раза (р=0,036) соответственно по сравнению с контролем (табл. 2).

Таблица 2. Удельная активность супероксидисмутазы, каталазы, глутатионредуктазы в донорской крови при добавлении в нее ДНКЖ в __условиях in vitro__

Условия Активность СОД, Активность Активность ГР,

эксперимента усл.ед./мин*мг b каталазы, усл.ед./мин*мг b нмоль/мин*мг b

Контроль 219,73±19,56 0,0328±0,0012 74,39±3,26

1:150 267,65±22,03* 0,0304±0,0008* 117,48±8,15*

1:100 271,54±25,47* 0,0343±0,0016 138,34±10,48*

1:50 224,63±22,01 0,0358±0,0017* 145,15±17,64*

1:25 172,59±16,28* 0,0301±0,0008* 121,47±9,85*

Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с контролем

Известно, что ДНКЖ обладают метаболической активностью и проявляют собственные антиоксидантные свойства. 0днако в зависимости от

концентрации ДНКЖ может происходить конкурентная реакция NO с O2 , продуктом которой является пероксинитрит, что проявляется отсутствием антиоксидантного действия [4].

Отмечено, что добавление ДНКЖ в донорскую кровь в соотношении 1:50 привело к увеличению удельной активности каталазы в 1,09 раза (р=0,011) соответственно по сравнению с контролем.

Кроме того, показано повышение удельной активности ГР при добавлении ДНКЖ в донорскую кровь во всех представленных соотношениях. Так, добавление ДНКЖ в соотношении 1:150; 1:100; 1:50; 1:25 увеличивало активность фермента в 1,58 раза (р=0,032), в 1,86 раза (р=0,034), в 1,95 раза (р=0,037) и в 1,63 раза (р=0,033) соответственно по сравнению с контролем.

В ходе проведенного исследования выявлен дозозависимый эффект воздействия динитрозильных комплексов железа на активность супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионредуктазы донорской крови в условиях in vitro.

Таким образом, следует отметить, что концентрация NO является главным фактором, обуславливающим его биологический эффект. При низких концентрациях оксида азота в основном преобладают проадаптивные эффекты, направленные на поддержание гомеостаза организма. При высоких концентрациях, преобладающими становятся непрямые эффекты, обусловленные образованием и последующим действием высокореакционноспособного соединения-пероксинитрита. Это согласуется с результатами наших предшествующих исследований [4].

Заключение

В результате эксперимента показано, что при воздействии на донорскую кровь экзогенного NO в виде газового потока максимальное увеличение удельной активности таких антиоксидантных ферментов как супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионредуктаза происходит при использовании концентрации NO - 100 ppm по сравнению с меньшими концентрациями оксида азота (20, 50, 75 ррm). При добавлении к донорской крови в условиях in vitro депонированной формы NO в виде комплексов ДНКЖ в соотношениях 1:100 и 1:50 также отмечено повышение активности СОД, каталазы и ГР. При добавлении ДНКЖ в соотношении 1:25 наблюдался спад активности ферментов антиоксидантной системы, особенно проявившийся в снижении удельной активности СОД.

Список литературы

1. Ванин А.Ф., Адамян Л.В., Бургова Е.Н., Ткачев Н.А. Физико-химическое обоснование лечебного действия на эндометриоз динитрозильных комплексов железа с тиолсодержащими лигандами // Биофизика. 2014. Т. 59, №4. С. 766-776.

2. Зарипова Р.И. Изменение содержания оксида азота в тканях крыс при гипокинезии различной длительности: дисс. ... канд. биол. наук. Казань: К(П)ФУ, 2012. 131 с.

3. Камилов Ф.Х. Оксид азота при терапии больных псориазом с использованием препаратов из экстракта травы люцерны посевной / Камилов Ф. Х., Бурханова Н. Р., Капулер О. М., Фахретдинова Х. С. // Клинические исследования. Т.18. № 6. С.38-43.

4. Мартусевич А.К. Анализ влияния оксида азота на физико-химические параметры крови in vitro / Мартусевич А.К., Соловьева А.Г., Перетягин С.П., Диденко Н.В. // Врач-аспирант. 2013. Т.57, №2.1. С.218-222.

5. Паршина С.С. Биологические эффекты оксида азота в развитии кардиоваскулярной патологии как основа применения терагерцовой терапии / Паршина С.С., Афанасьева Т.Н., Тупикин В.Д. // Бюллетень медицинских интернет-конференций.2012. Т.2. №6. С.446-452.

6. Сибгатуллина Г.В., Хаертдинова Л.Р., Гумерова Е.А. Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений: учебно-методическое пособие, Казань: Казанский (Приволжский) Федеральный Университет, 2011. 61 с.

7. Сирота Т.В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопросы медицинской химии. 1999. Т. 45, №3. С. 109-116.

8. Степуро Т.Л. Роль оксида азота в регуляции сродства гемоглобина к кислороду при стрессе / Степуро Т.Л., Зинчук В.В. // Фундаментальные и прикладные проблемы стресса: мат. III Междунар. науч.-практ. конф., Витебск, 16-17 апреля 2013 г. Витебск : ВГУ имени П.М. Машерова, 2013. С. 89-91.

9.Тимошин А.А., Лакомкин В.Л., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Фармакокинетика и распределение динитрозильных комплексов железа в тканях органов крыс // Биофизика. 2012. Т.57, № 2. С. 331-337.

10. Sharma S.K., Kim H, Roqler P.J., Karlin K.D. Isocyanide or nitrosyl complexation to hemes with varying axial base ligand donors: synthesis and characterization // Journal of biological inorganic chemistry. 2016. Vol. 21. P. 729743.