Изменение механических свойств клеточных стенок при фотоингибировании роста мезокотилей кукурузы

2006_ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА_Сер. 3. Вып. 3

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ УДК 581.1.

Е. И. Шарова, Т. Е. Билова, О. В. Аврутина, О. В. Скобелева

ИЗМЕНЕНИЕ МЕХАНИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК ПРИ ФОТОИНГИБИРОВАНИИ РОСТА МЕЗОКОТИЛЕЙ КУКУРУЗЫ*

Для растений характерен быстрый тип роста клеток - рост растяжением, при котором резкое увеличение объема клеток достигается в результате осмотического поглощения воды в центральную вакуоль. Скорость роста растяжением зависит от того, насколько быстро вода может поглощаться вакуолью. В свою очередь поглощение воды вакуолью зависит от концентрации осмотически активных веществ в вакуоли и клеточной стенке, от гидравлической проводимости плазмалеммы и тонопласта клеток и растяжимости клеточных стенок [5]. Скорость растяжения клеток контролируется фито-гормонами. Она изменяется в ходе онтогенеза растения и при действии внешних факторов.

Известно, что красный свет резко тормозит рост мезокотиля этиолированных проростков кукурузы [10, 15]. Подобный феномен фотоингибирования роста очень удобен для изучения механизма регуляции растяжения клеток и поэтому уже более ста лет привлекает внимание физиологов. В настоящее время детально изучен гормональный механизм фотоингибирования роста мезокотилей. Показано, что скорость растяжения мезокотилей определяется поступлением в них фитогормона ауксина из колеоптиля и листьев проростка, а при освещении этиолированных проростков происходит торможение транспорта ауксина, в результате чего его содержание в мезокотиле снижается [4]. Еще в более ранних работах было замечено, что рост облученных красным светом изолированных мезокотилей не возобновлялся даже после обработки экзогенным ауксином. Однако, если отрезки мезокотилей во время облучения находились в инкубационной среде с ауксином, то эффект фотоингибирования роста мезокотилей светом не наблюдался [7, 15]. Ауксин прямо не влияет ни на один из вышеперечисленных параметров, определяющих скорость осмотического поглощения клеткой воды. Известно, что ауксин вызывает подкисление матрикса клеточных стенок. Растяжимость клеточных стенок увеличивается и вследствие этого возрастает скорость роста [3, 6].

Таким образом, можно предположить, что при облучении красным светом в зоне роста растяжением мезокотиля (10 мм ниже колеоптильного узла) в результате недостаточного снабжения ауксином происходят фотозависимые необратимые изменения одного или нескольких параметров, обеспечивающих поглощение воды клеткой. Сведения в литературе о влиянии облучения красным светом на параметры водного обмена

* Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 05-04-49619). © Е. И. Шарова, Т. Е. Билова, О. В. Аврутина, О. В. Скобелева, 2006

клеток и растяжимость их стенок неполны и противоречивы. Например, отсутствуют данные о действии красного света на осмотический потенциал отделов клетки. В ряде работ показано, что в результате облучения красным светом увеличивается пероксидаз-ная активность и усиливается лигнификация клеточных стенок, а также снижается их растяжимость [5], однако отсутствуют сведения о содержании перекиси водорода. В связи с этим цель нашего исследования: попытка рассмотреть, с позиций осмотической модели растительной клетки, причины торможения растяжения клеток мезокотилей при облучении трехдневных этиолированных проростков красным светом. Задачи работы: определить, как при облучении изменяется осмотический потенциал клеточного сока и апопластного раствора, степень водообеспеченности мезокотилей, механические свойства клеточных стенок, активность пероксидаз и содержание пероксида водорода в клеточных стенках.

Объект и методы исследования. В работе использовали отрезки мезокотилей кукурузы (сорт НАРТ-150). Проростки кукурузы выращивали на водопроводной воде при 27 °С в темном термостате в течение 3 суток. Опытные растения 3 ч облучали красным светом, используя светофильтр КС-2 (длина волны выше 630 нм, 34 Дж/м2-с).

Для определения скорости роста растяжением перед началом опыта на мезокотили проростков тушью наносили метки на расстоянии 1,11 и 21 мм от узла. После окончания воздействия (облучения) измеряли расстояние между метками с помощью линейки как у контрольных, так и у опытных растений. Через 48 ч после облучения также определяли прирост всех органов проростков - корней, мезокотилей и колеоптилей.

Эластические свойства клеточных стенок оценивали по степени изменения длины после замораживания и последующего оттаивания ткани [8]. Ткань теряла тургор и сокращалась настолько, насколько клеточные стенки были эластически растянуты тургором. Степень эластической растянутости определяли двумя способами. После облучения, измерив расстояние между метками на мезокотиле, проростки замораживали при -30 °С. Определение длины между метками повторяли после полного оттаивания проростков. Второй способ отличался тем, что после облучения замораживали 10-миллиметровые отрезки мезокотилей, вырезанные на 1 мм (верхний участок) и на 11 мм (нижний участок) ниже колеоптильного узла проростков. Длину отрезков до и после замораживания/оттаивания измеряли при увеличении в 17 раз, используя «Мик-рофот 5П01».

Для выделения пероксидаз и определения их активностей использовали 10-миллиметровые отрезки верхнего и нижнего участка мезокотилей (см. выше). Сразу после облучения проростков отрезки вырезали из мезокотилей в буферную инкубационную среду (1 ммоль/л КН2Р04, 1 ммоль/л лимонной кислоты, рН 6,0). Отрезки обсушивали и взвешивали. Экстракцию пероксидаз проводили при 0+4 °С следующим образом: гомогенат пяти отрезков мезокотилей в 5 мл буфера центрифугировали 10 мин при 2000 g. Супернатант, содержащий растворимые (в основном вакуолярные) пероксидазы, сливали в пробирки и использовали для анализа. Осадок клеточных стенок отмывали от мембранных компонентов ресуспендированием в новой порции (5мл) буфера, содержащего 0,2 % детергента тритона Х-100 с последующим центрифугированием (10 мин при 2000 g). Надосадочную жидкость сливали в пробирки для анализа, а осадок промытых клеточных стенок ресуспендировали в 5 мл буфера, содержащего 0,3 моль/л NaCl. С помощью 10-минутного центрифугирования (2000 g) в надосадочную жидкость выделяются пероксидазы ионносвязанные с клеточной стенкой (которые были связаны с компонентами клеточной стенкой ионными связями).

В основе метода определения активности пероксидаз лежит способность пероксидазы катализировать окисление гваякола пероксидом водорода с образованием тетрагваякола - соединения, окрашенного в бурокоричневый цвет. Активность растворимых и ионносвязанных с клеточной стенкой пероксидаз определяли по стандартной методике [1] с незначительными модификациями в реакционной среде объемом 3 мл: ацетатный буфер (100 ммоль/л рН 5,0), гваякол (20 ммоль/л), Н202 (4 ммоль/л). Реакцию проводили при комнатной температуре. Перок-

сидазную активность оценивали по скорости образования продукта реакции тетрагваякола (коэффициент экстинкции е470(|Ы= 0,0266 (мкмоль/л)"1 • см-1) на линейном участке реакционной кривой (2-я мин реакции) относили к 1 г сырой массы мезокотилей и выражали в процентах от активности фермента в гомогенате.

Для выделения апопластного раствора после облучения в буферную среду нарезали по 180-200 10-миллиметровых отрезков верхнего и нижнего участка мезокотилей. Апопластный раствор получали методом низкоскоростного центрифугирования [5]. Отрезки центрифугировали на холоде в течение 10 мин при 2000 g. Выжатый из мезокотилей апопластный раствор использовали для определения осмотического потенциала (см. далее).

Для определения пероксида водорода использовали апопластный раствор, в котором уже в процессе центрифугирования ферменты инактивировались. Для этого апопластный раствор из тканей мезокотилей во время центрифугирования отжимали сразу в раствор хлорной кислоты -каплю раствора хлорной кислоты (0,4 моль/л) вносили перед центрифугированием на дно центрифужных пробирок. Объем хлорной кислоты рассчитывали из предполагаемого объема отжимаемого раствора так, чтобы при смешивании сохранялось соотношение 1:1. Во время центрифугирования хлорная кислота не контактировала с тканями мезокотилей.

Фиксированный хлорной кислотой апопластный раствор нейтрализовали КОН (4 н), и наносили (по 0,2-0,3 мл) на колонку (2 мл) с анионообменной смолой Dowex 1x2 (50-100 mesh, хло-ридная форма) для очистки от аскорбиновой кислоты и фенолов. Элюцию проводили бидистил-лированной водой. Элюат собирали порциями по 1 мл. Содержание пероксида водорода определяли в каждом из первых 5 мл элюата методом хемилюминесценции на сцинтилляционном счетчике (Beckman, LC - 100 С) [16]. Реакционная смесь объемом 1 мл содержала люминол (0,05 ммоль/л), феррицианид калия (0,05 ммоль/л), буферный раствор (0,2 моль/л КН2Р04, рН 8,5) и анализируемый раствор. Компоненты смеси смешивали в перечисленной выше последовательности. Измерение хемилюминесценции (импульс/мин) проводили через 30 и 45 с после внесения пробы в реакционную смесь. Для расчета концентрации пероксида водорода использовали калибровочную кривую (зависимость концентрации Н202 (в мкмоль/л) от количества подсчитанных установкой импульсов, имп/мин), построенную с использованием растворов пероксида водорода в диапазоне от 0,45 до 3,0 мкмоль/л.

При изучении осмотического потенциала тканей мезокотилей использовали свежевыжатый апопластный раствор и клеточный сок, отжатый с помощью пресса из замороженных/ оттаявших отрезков мезокотилей и очищенный путем низкоскоростного центрифугирования от волокнистых частиц. Осмотический потенциал определяли с помощью криоосмометра, состоящего из электрической термокамеры ТК1, блока питания и вольтметра универсального В7-21. Калибровочную кривую строили по хлористому натрию, исходя из того, что раствор NaCl (0,2 моль/л) имеет осмотический потенциал -1 МПа.

Результаты исследований и их обсуждение. Кинетика торможения роста ме-зокотиля этиолированных проростков кукурузы при освещении красным светом. Известно, что мезокотиль удлиняется в результате деления клеток в узкой зоне (примерно 1 мм длиной) колеоптильного узла и их последующего растяжения, которое в основном завершается на расстоянии 10 мм от узла [12]. В наших опытах также было показано, что скорость удлинения у верхнего односантиметрового участка мезокотиля многократно выше, чем у нижележащего (рис. 1, А). За 3 ч облучения красным светом удлинение верхнего сегмента было примерно вдвое меньше, чем в темноте. Удлинение медленнорастущего нижнего сегмента также тормозилось при освещении проростков, но в меньшей степени (на 30-40 %).

Если растения после облучения вновь выращивать в темноте, то через двое суток можно заметить, что длина их органов не отличается от длины органов контрольных растений, это свидетельствует о том, что фотоингибирование роста мезокотилей проро-

3 -,

2 -

о

1С

'о

ф

«о

— 1 -

контроль а опыт

-

45

30 -

15 -

Г±1

1 • 1

Г^Ъ

г-й

Верхний сегмент

Нижний сегмент

Колеогпиль Мезокотмль Корень

Рис.1. Влияние облучения красным светом на рост этиолированных проростков кукурузы.

А - прирост верхнего и следующего за ним нижнего 10-миллиметровых сегментов мезокотиля за 3 ч; Б - прирост колеоптилей, мезокотилей и корней за 48 ч.

стков было обратимым (рис. 1, Б). Очевидно, что возобновление роста мезокотилей не связано с возобновлением роста клеток, заторможенного при освещении. Оно обусловлено возобновлением в темноте деления клеток в зоне узла и последующим быстрым растяжением этих новообразованных клеток.

Таким образом, полученные данные показывают, что при освещении красным светом этиолированных проростков кукурузы происходит быстрое и обратимое торможение роста мезокотилей. Эти результаты хорошо соответствуют данным, имеющимся в научной литературе [4, 9].

Влияние красного света на осмотический потенциал клеточного сока и апоп-ластного раствора. Согласно математической модели роста Локхарда причиной торможения растяжения клеток может быть уменьшение осмотического давления, определяемого разностью в концентрации осмотически активных веществ между вакуолью («клеточным соком») и апопластным раствором. Это снижение может достигаться уменьшением концентрации осмотиков в клеточном соке либо ее увеличением в апопластном растворе. Данные, представленные в таблице, показывают, что при облучении красным светом концентрация осмотиков в клеточном соке не только не уменьшилась, а, наоборот, несколько возросла, что могло бы только усилить поглощение воды клеткой и тем самым способствовать ее росту, а не замедлить рост. Концентрация осмотиков в апопластном растворе была значительно ниже, чем в клеточном соке (-0,17 МПа против -0,92 МПа), и не изменялась при облучении проростков.

Причиной торможения роста при повышенной концентрации осмотиков в клеточном соке может быть недостаточное водообеспечение мезокотилей проростков. Степень водообеспеченности растительных тканей обычно оценивают по величине дефицита относительной тургесцентности [11]. Результаты, представленные в таблице, доказывают, что красный свет не влияет на системы водообеспечения тканей мезокотилей.

Влияние облучения красным светом на осмотический потенциал клеточного сока и апопластного раствора и дефицит относительной тургесцентности мезокотилей этиолированных проростков кукурузы

Участок мезокотиля Осмотический потенциал, МПа Дефицит относительной тургесцентности, %

клеточного сока апопласта

Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт

Верхний сегмент -0,92 ± 0,01 -1,01+0,03 -0,18 ±0,01 -0,17 ±0,01 4,5 ± 0,5 4,1 ±0,5

Нижний сегмент -0,82 ± 0,02 -0,85 ± 0,02 -0,18 ±0,01 -0,18 ± 0,01 3,4 ±0,3 3,3 ± 0,6

Примечание. Контроль - этиолированные проростки кукурузы, не подвергавшиеся воздействию красного света, опыт - облученные красным светом (X > 630 нм, 34 Дж/м2-с) в течение 3 ч.

Таким образом, при отсутствии влияния красного света на степень водообеспе-ченности мезокотилей светозависимое возрастание концентрации осмотически активных веществ в клеточном соке не является причиной торможения роста клеток.

Влияние красного света на механические свойства клеточных стенок. Измерения показали, что растущий верхний сегмент мезокотиля эластически растянут в направлении роста на 8,3 %, тогда как медленнорастущий нижний - только на 4,8 % (рис. 2). Эти данные соответствуют господствующим в научной литературе представлениям о том, что растущие клетки сильнее растянуты эластически, чем закончившие рост [8, 13,

10

7,5

х

£ о та о.

к

го

О ф

г ?

о го с; О

2,5

Верхний сегмент

Нижний сегмент

Рис. 2. Влияние облучения красным светом на эластическую растянутость мезокотилей этиолированных проростков кукурузы.

14]. Под действием красного света эластическая растянутость снижалась на 20 %. Эластическая растянутость тургесцентной ткани определяется величиной осмотического давления клеток и эластической растяжимостью клеточных стенок: чем больше осмотическое давление и эластическая растяжимость клеточных стенок, тем более ткань растянута эластически [5]. Так как под действием красного света осмотическое давление не снижается, а увеличивается, то можно утверждать, что светозависимое снижение эластической растянутости ткани всецело связано со снижением эластической растяжимости клеточных стенок, т. е. с их ригидификацией.

Влияние красного света на активность вакуолярных и ионносвязанных с клеточными стенками пероксидаз. Результаты определения суммарной активности пе-роксидаз, последовательно экстрагированных из гомогенизированных мезокотилей слабосолевым буфером, раствором детергента и раствором соли, представлены на рис. 3. Суммарная активность фермента существенно не изменялась ни в базальном направлении, ни под действием красного света (рис. 3, А). Активность легкорастворимых пероксидаз, во фракцию которых после гомогенизации в основном попадают пероксидазы локализованные в вакуолях [5], снижается в базальном направлении у мезокотилей контрольных растений (рис. 3, Б). После облучения красным светом различия активности растворимых пероксидаз между верхним и нижним сегментами мезокотилей сглаживаются.

Наиболее сильной оказалась динамика активности пероксидаз, ионносвязанных с клеточными стенками, которые экстрагировали, промывая осадок клеточных стенок раствором хлористого натрия (0,3 моль/л). Активность этих пероксидаз была у медленнорастущего нижнего сегмента мезокотиля почти вдвое выше, чем у верхнего (рис. 3, В). Под действием красного света активность ионносвязанных пероксидаз клеточных стенок возрастала на 20-25 %.

А

В

50 1

40 -

30 -

20-

10 -

Верхний сегмент

Нижний сегмент

30 -,

20-

10

Верхний Нижний сегмент сегмент

30 -.

20-

10

контроль Ш опыт

Верхний Нижний сегмент сегмент

Рис. 3. Изменение активности пероксидаз мезокотилей этиолированных проростков кукурузы под действием красного света.

А - общая активность; Б - активность легкорастворимых пероксидаз; В - активность пероксидаз ионносвязанных с клеточной стенкой.

Представленные результаты позволяют утверждать, что торможение удлинения в базальном направлении и под действием красного света сопровождалось значительным увеличением активности ионносвязанных пероксидаз клеточных стенок.

Влияние красного света на содержание пероксида водорода в апопласте мезо-котилей кукурузы. В научной литературе сведения о содержании пероксида водорода редки и противоречивы, и, прежде всего, это связано со многими методическими проблемами. Баланс пероксида водорода в апопласте очень динамичен и поддерживается клеткой посредством регуляции сложного комплекса быстро протекающих окислительно-восстановительных реакций. Поэтому для исследования в апопласте микроколичеств пероксида водорода апопластный раствор необходимо фиксировать в момент выделения, для того чтобы инактивировать ферменты, использующие Н202 в качестве своего субстрата.

Редки и противоречивы сведения о том, как соотносятся активности пероксидаз клеточных стенок с содержанием в них пероксида водорода. С одной стороны, перокси-дазы утилизируют пероксид водорода, поэтому повышение их потенциальной активности должно приводить к снижению содержания пероксида водорода в ткани. С другой стороны, пероксидазы клеточных стенок способны вырабатывать пероксид водорода, окисляя NADH в присутствии ионов двухвалентных металлов и фенольных кофакторов [2].

В наших опытах показано значительное снижение содержания пероксида водорода в апопластном растворе мезокотилей как в базальном направлении, так и под действием красного света (рис. 4). Следовательно, можно говорить об обратной корреля-

контроль ш опыт

I

т-- -1

Верхний Нижний

сегмент сегмент

Рис. 4. Влияние облучения красным светом на содержание пероксида водорода в апопластном растворе мезокотилей этиолированных проростков кукурузы.

J3

о о га г

>s о о. .с о

I-§

г

т

cJ

о

ф

S X

го *

CL ф

ч о

о

1 и

0,8

0,6 -

0,4 -

0,2 -

J

ции между изменением активности пероксидаз клеточных стенок и изменением содержания пероксида водорода, и объяснять это явление тем, что пероксидазы утилизируют пероксид водорода, а не вырабатывают его.

Подводя итог обсуждению результатов, следует обратить внимание на изменения, происходящие в тканях мезокотилей контрольных и опытных вариантов в базаль-ном направлении. Это даст возможность исследовать процессы, лежащие в основе быстрого фотоингибирования роста, и сравнить их с процессами, которые сопровождают постепенное замедление роста клеток по мере их дифференцировки. Замедление роста мезокотилей под действием красного света происходило на фоне повышения осмотического давления в клетках, а в базальном направлении - на фоне его уменьшения, однако в обоих случаях изменения осмотического потенциала были невелики. Замедление роста мезокотиля как под действием красного света, так и в базальном направлении сопровождалось значительной ригидификацией клеточных стенок. В обоих случаях в клеточных стенках возрастала активность ионносвязанных пероксидаз, причем наблюдалось соответствие между степенью ригидификации и изменением активности пероксидаз. Была также выявлена обратная зависимость содержания перекиси водорода в апопластном растворе от активности пероксидаз клеточных стенок. Учитывая, что ауксин контролирует растяжение клеток мезокотилей через активацию Н+-АТФазы плазмалеммы и таким образом способствует подкислению апопла-ста, не имеет прямого влияния на растяжимость клеточных стенок, при облучении красным светом тормозится (блокируется) его транспорт в зону роста растяжения мезокотиля, можно предложить следующую схему фотозависимого торможения роста мезокотилей.

У новообразованных в зоне узла клеток постепенно усиливаются катализируемые пероксидазами окислительные процессы в клеточных стенках, которые снижают их растяжимость. Ауксин, поступающий в мезокотиль из колеоптиля, может ускорить растяжение только тех клеток, у которых процесс ригидификации не достиг определенного предела. При освещении проростков красным светом торможение растяжения клеток мезокотиля достигается, во-первых, в результате того, что способные к растяжению клетки не получают ауксин из-за фотоингибирования его транспорта из колеоптиля, и, во-вторых, благодаря ускорению процесса ригидификации, вследствие чего клетки раньше теряют способность реагировать на гормон.

Статья рекомендована проф. С. С. Медведевым. Summary

Sharova Е. I., Bilova Т. Е., Avrutina О. V., Skobeleva О. V. The light-inhibited mesocotyl elongation in maize seedlings accompanied with mechanical cell-wall changes.

The red light-inhibited mesocotyl elongation in maize seedlings is accompanied with decreasing elastic cell wall extensibility, increasing activity of the cell wall-bonding peroxidases and low content of the hydrogen peroxide in the apoplast. These results let us assume that the red light induces the cellwall rigidity by increasing oxidative processes catalyzed by peroxidases in the elongating zone of mesocotyl. The process of cell-wall rigidity is reduced to the reduction of cell wall extensibility and contributes to decreasing elongation growth velocity.

Литература

1. Ктиторова И. Н., Скобелева О. В., Шарова Е. И., Ермаков Е. И. Перекись водорода как возможный посредник в гидравлической проводимости корней пшеницы при солевом стрессе // Физиол. растений. 2002. Т. 49. С. 1-13. 2. Минибаева Ф. В. Активные формы кислорода и ионная проницаемость плазмалеммы в растительных клетках при стрессе: Автореф. докт. дис. СПб., 2005. 36 с. 3. Полевой В. В. Роль ауксина в системах регуляции у растений. Л., 1986. 4. Полевой В. В. Физиология целостности растительного организма // Физиол. растений. 2001. Т. 48. С. 631-643. 5. Шарова Е. И. Клеточная стенка растений. СПб., 2004. 6. Шарова Е. И., Полевой В. В. Изучение взаимосвязи «кислого» и индуцируемого ауксином роста у отрезков колеоптилей кукурузы // Вестн. Ленингр. ун-та. 1985. Сер. биол. Вып. 4. С. 56-63.7. Briggs W. R. Red light, auxin relationships, and the phototrofic responses of corn and oat coleoptiles // Am. J. Bot. 1963. Vol. 50, N. 2. P. 196-207. 8. Edelmann H. G. Wall extensibility during hypocotyls growth: a hypothesis to explain elastic-induced wall loosening // Physiol. Plant. 1995. Vol. 95. P. 296-303. 9. Goodwin R. H. On the inhibition of the first internode of Avena by light // Am. J. Bot. 1941. Vol. 28, N. 4. P. 325-332. 10. lino M. Inhibitory action of red light on the growth of the maize mesocotyl: evaluation of the auxin hypothesis // Planta. 1982. Vol. 156, N. 5. P. 388-395. 11. Kramer P. Water relations in plants. New York, 1983. Vol. 11. 12. Мег C. L., Causton D. R. Analytical studies of the growth of the etiolated seedling of Avena sativa //New Phytol. 1967. Vol. 66, N 4. P. 665-681.13. Peters W. S., Farm M. S., Kopf J. Does growth correlate with turgor-induced elastic strain in stems? A re-evaluation of de Vries' classical experiments // Plant Physiol. 2001. Vol. 125. P. 2173-2179.14. SchopferP., Lappiere C., Nolte T. Light-controlled growth of the maize seedling mesocotyl: mechanical cell-wall changes in the elongating zone and related changes in lignification // Physiol. Plant. 2001. Vol. 111. P. 83-92.15. Vanderhoef L. N.. Briggs W. R. Red light-inhibited mesocotyl elongation in maize seedlings. I. The auxin hypothesis // Plant Physiol. 1978. Vol. 61, N. 4. P. 534-537. 16. Veljovic-Jovanovic S., Noctor G., Foyer С. H. Are leaf hydrogen peroxide concentrations commonly overestimated? The potential influence of artefactual interference by tissue phenolics and ascorbate // Plant Physiol. Biochem. 2002. Vol. 40. P. 501-507.

Статья поступила в редакцию 15 мая 2006 г.