УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА С ПРИМЕНЕНИЕМ БИОЧИПА

Полезная модель относится к области медицины, а также может быть использована в области биологии и ветеринарии и предназначена для проведения исследований с помощью биочипов клеток (или иных биологических объектов, имеющих микроскопические размеры).
Известно устройство, представляющее собой проточную камеру, предназначенную для инкубации биочипа с клеточной суспензией и выполнения его отмывки, содержащая приводящую и отводящую трубки, а также корпус, в котором находится капилляр, одну из стенок которого образует биочип (см. А.В.Шишкин, И.И.Шмырев, С.А.Кузнецова, Н.Г.Овчинина, А.А.Бутылин, Ф.И.Атауллаханов, А.И.Воробьев «Иммунологические биочипы для исследования эритроцитов человека», журнал «Биологические мембраны». - 2008.- №4 - С.267-276), взятое в качестве аналога.
Недостатком данного устройства является высокая трудоемкость выполнения подготовительных этапов проведения анализа с помощью биочипа, включающих обработку биочипа раствором вещества, блокирующего сайты неспецифического связывания подложки и последующее проведение отмывки биочипа раствором детергента. Соответствующими растворами требуется последовательно заполнять весь контур устройства (капилляр и проточные трубки), что ведет к значительному их расходу. При этом необходимо следить за герметичностью системы и избегать попадания в контур пузырей воздуха, что также повышает трудоемкость. Кроме того, недостатком является не совсем удачное крепление биочипа в устройстве, требующее выполнения точных манипуляций при закреплении в нем биочипа и его последующем извлечении. Это повышает риск повреждения биочипа. Конструкция проточной камеры допускает дополнительное введение в ее капилляр небольших объемов растворов реагентов. Но при этом в контакт с данными растворами приводится вся поверхность биочипа. Это приводит к достаточно высокому их расходу. Отсутствует возможность одновременного приведения в контакт с разными растворами отдельных участков поверхности биочипа.
Известно приспособление для инкубации и отмывки биочипа, предназначенного для определения поверхностных антигенов клеток, используемое для инкубации биочипа с клеточной суспензией, выполнения его отмывки, а также для обработки биочипа различными жидкостями при проведении дополнительных исследований связавшихся с ним клеток, взятое в качестве прототипа и представляющее собой емкость (например, чашку Петри), на дне которой закреплен биочип. (См., например, А.В.Шишкин, И.И.Шмырев, С.А.Кузнецова, Н.Г.Овчинина, А.А.Бутылин, Ф.И.Атауллаханов, А.И.Воробьев «Иммунологические биочипы для параллельного определения поверхностных антигенов и морфологического исследования клеток», Биологические мембраны, 2008, том 25, №4, с 277-284).
Недостатком данного приспособления является невозможность регулировки скорости потока отмывающей жидкости. Это приводит к тому, что при отмывке биочипа от не специфически связавшихся клеток может происходить отрыв тех клеток, которые связались с биочипом специфически, но с недостаточной прочностью. В результате снижается чувствительность анализа и воспроизводимость результатов. Кроме того, закрепление биочипа и его извлечение требуют выполнения точных манипуляций. Это создает риск повреждения биочипа. Недостатком также является невозможность одновременного приведения отдельных участков поверхности биочипа в контакт с разными растворами без их смешивания.
Задачей заявленной полезной модели является снижение трудоемкости проведения анализа, повышение воспроизводимости результатов и расширение функциональных возможностей устройства.
Поставленная задача решается за счет того, что согласно полезной модели устройство для проведения анализа с применением биочипа, содержащее емкость для размещения биочипа, снабжено платформой, запирающим приспособлением, герметично устанавливаемой съемной крышкой, каналами для подведения и отведения жидкости.
Емкость для размещения биочипа выполнена съемной и оснащена запирающим приспособлением.
Платформа снабжена отсеком, в котором герметично крепится съемная емкость для размещения биочипа.
Емкость для размещения биочипа имеет съемное герметично устанавливаемое дно.
Дно емкости для размещения биочипа имеет клейкое покрытие.
Устройство оснащено съемным приспособлением, герметично устанавливаемым на поверхность биочипа, и разделяющим емкость, в которой размещен биочип, на несколько емкостей меньшего объема, дно каждой из которых образовано участком поверхности биочипа.
Устройство снабжено емкостью для отмывочной жидкости.
Устройство снабжено емкостью для сбора отработанной жидкости.
Устройство оснащено приспособлением для измерения давления жидкости.
Устройство снабжено приспособлением для улавливания пузырей воздуха.
Устройство снабжено приспособлением, прижимающим съемную крышку.
Устройство снабжено приспособлением для дополнительного введения жидкости в емкость, в которой размещен биочип.
Устройство снабжено дренажной трубкой.
Форма и размеры горизонтального сечения емкости для размещения биочипа соответствуют форме и размерам биочипа.
Использование заявленной полезной модели позволяет снизить трудоемкость проведения анализа и уменьшить расход используемых растворов. Становится возможным выполнение отдельных этапов анализа с заполнением емкости растворами и их удалением наименее трудоемким путем (без регулирования скорости потока жидкости) точно также, как при работе с кюветой. Другие этапы проведения анализа могут быть выполнены с подачей потока жидкости с точно задаваемой скоростью, как при работе с проточной камерой. За счет этого трудоемкость проведения анализа снижается по сравнению с использованием устройства, взятого за аналог, при сохранении такой же чувствительности и воспроизводимости результатов. В тоже время, при использовании заявленного устройства чувствительность и воспроизводимость значительно повышаются по сравнению с использованием приспособления, взятого за прототип.
Выполнение емкости для размещения биочипа съемной повышает удобство использования устройства. В случае необходимости съемная емкость при закрытых запирающих приспособлениях (кранах) может использоваться отдельно в качестве инкубационно-отмывочной кюветы. Это повышает универсальность использования устройства.
Выполнение дна емкости (нижней стенки емкости) съемным облегчает извлечение из нее биочипа. Наличие клейкого покрытия на дне емкости упрощает процесс крепления биочипа, а также обеспечивает герметичность соединения биочипа с его поверхностью.
Наличие приспособления для измерения давления жидкости позволяет определять разницу между атмосферным давлением и давлением жидкости в контуре устройства. Эти данные необходимы для оценки (расчета) скорости движения жидкости.
Наличие приспособления, прижимающего съемную крышку, обеспечивает надежную герметизацию устройства.
Соответствие формы и размеров горизонтального сечения полости емкости форме и размерам биочипа обеспечивают наиболее экономное расходование исследуемой клеточной суспензии, поскольку все клетки при проведении инкубации оседают на поверхность биочипа.
Наличие дренажной трубки, оснащенной запирающим приспособлением, дает возможность слива жидкости из емкости без удаления жидкости из расположенных выше отделов устройства. Кроме того, дренажная трубка может быть использована для введения в контур устройства небольших объемов жидкости, а также для удаления пузырей воздуха.
Наличие приспособления для улавливания пузырей воздуха предотвращает их проникновение в закрытую емкость при проведении отмывки биочипа.
Платформа обеспечивает удобное расположение устройства на предметном столике микроскопа. Кроме того, в ней расположены основные части устройства
Наличие съемного приспособления, герметично устанавливаемого на поверхность биочипа и разделяющего емкость (в которой размещается биочип) на несколько емкостей меньшего объема, дно каждой из которых образовано участками поверхности биочипа, дает возможность одновременного приведения в контакт разных участков поверхности биочипа с растворами разных реагентов без их смешивания друг с другом. Это позволяет сократить расход растворов дорогостоящих реагентов при проведении дополнительных исследований связавшихся с биочипом клеток (например, сократить расход меченных антител при определении коэкспрессии антигенов).
Полезная модель поясняется чертежом, где:
на фиг.1 представлен общий вид устройства в продольном разрезе;
на фиг.2 представлен вид устройства сверху;
на фиг.3 представлено сечение АА на фиг.2;
на фиг.4 представлен биочип 1-го типа;
на фиг.5 представлен биочип 2-го типа.
Устройство содержит корпус (платформу) 1 (фиг.1) в котором располагаются приводящий канал 2, отводящий канал 3, запирающее приспособление (кран) 4 и отсек 5 для размещения съемной кюветы 6, в которой расположен биочип 7. Герметичность крепления кюветы 6 в отсеке 5 обеспечивает герметизирующие покрытие 8. Съемная кювета 6 имеет корпус 9, выполненный в виде рамы, к которой крепится съемное дно 10. Герметизацию крепления дна 10 к корпусу 9 кюветы 6 обеспечивает герметизирующие покрытие (на чертеже не показано). Кроме того, герметизация крепления дна емкости к корпусу 9 кюветы 6 обеспечивается полосой прозрачного скотча (на чертеже не показана), которая наклеивается на нижнюю стенку кюветы 6. Дно 10 выполнено из прозрачного материала и имеет клейкое прозрачное покрытие (на чертеже не показано), обеспечивающее крепление биочипа 7. При креплении дна 10 к корпусу 9 кюветы 6 образуется емкость 11 для размещения биочипа. Каналы 2 и 3, емкость 11, а также приводящая и отводящая трубки (26 и 27) образуют контур устройства. Контур устройства имеет форму, обеспечивающую ламинарное течение жидкости. Корпус (платформа) 1 выполнен из прозрачного материала. Это позволяет определять наличие пузырей воздуха в контуре устройства при его заполнении жидкостью.
В корпусе 9 съемной кюветы 6 размещены запирающие приспособления (краны) 12 и 13. При этом сечение их отверстий 14 и соответствуют сечению приводящего и отводящего каналов 2 и 3. В кранах 12 и 13 также выполнены дополнительные отверстия 15, сообщающиеся с отверстием 14. В торцах кранов 12 и 13 размещены эластичные пробки 16 (фиг.2) через которые с помощью шприца возможно введение небольших объемов жидкости в контур устройства (игла шприца проводится через пробку 16). Устройство снабжено отсеком 17, предназначенным для удаления пузырей воздуха из его контура, заполняемого жидкостью. Устройство снабжено дополнительной трубкой 18 открывающейся в его контур. Трубка 18 снабжена запирающим приспособлением (краном или зажимом), которое на чертеже не показано.
Кювета 6 (фиг.3) снабжена съемной крышкой 19. Крышка 19 состоит из металлической рамки и прозрачной пластины 20. Герметизацию соединения крышки 19 и корпуса 9 кюветы 6, обеспечивает герметизирующее покрытие 21.
Устройство снабжено подвижной рамой 22, прижимающей крышку 19 к корпусу 9 кюветы 6, установленной в отсеке 5. Прижимающая рама 22 подвижно закреплена в пазах 23 корпуса (платформы) 1. В корпусе 1 в проекции расположения биочипа 7 выполнено отверстие 24, предназначенное для прохождения света.
Форма и размеры горизонтального сечения емкости 11 соответствуют форме и размерам биочипа 7.
Приводящий канал 2 (фиг.1 и 2) и отводящий канал 3 с помощью патрубков 25 соединяются с приводящей и отводящей трубками 26 и 27. Приводящая трубка 26 соединяется с емкостью в которой находится отмывающая жидкость (на чертеже не показана). Отводящая трубка 27 соединяется со сливной емкостью, предназначенной для сбора отработанной отмывающей жидкости (на чертеже не показана).
Для работы устройства уровень отмывочной жидкости, находящейся в емкости (не показанной на чертеже), соединенной с приводящей трубкой 26, должен находиться выше уровня поверхности биочипа 7. Сливную емкость (также не показанную на чертеже), соединенную с отводящей трубкой 27, располагают при этом ниже уровня биочипа. Внешнее отверстие отводящего канала 3 (фиг.1) расположено ниже уровня поверхности биочипа 7, а внешнее отверстие приводящего канала 2 расположено выше уровня биочипа 7.
Емкость для размещения отмывающей жидкости и сливная емкость крепятся на внешних штативах, но возможны и другие варианты их установки. Устройство во время проведения контролируемой отмывки биочипа размещают на предметном столике микроскопа.
Емкость для отмывающей жидкости (на чертеже не показана) снабжена шкалой (на чертеже не показана) указывающей высоту расположения уровня жидкости над поверхностью биочипа 7. Также возможно исполнение устройства дополнительно оснащенного вертикальной водомерной трубкой со шкалой (на чертеже не показана), или иным приспособлением, позволяющим оценить давление жидкости в контуре.
Возможен вариант использования устройства, когда отмывающая жидкость поступает в контур устройства не самотеком, а подается с заданной скоростью за счет работы насоса (на чертеже не показан), с которым соединяется приводящая трубка 26 (если насос работает в режиме нагнетания жидкости) или отводящая трубка 27 (если насос работает в режиме всасывания жидкости). В этом случае высота расположения уровня жидкости во внешней емкости значения не имеет.
Биочип 7 (фиг.4, 5) представляет собой подложку 28, на которой расположена рабочая область 29, содержащая тестовые участки 30, в которых иммобилизованы молекулы антител, специфичных к поверхностным антигенам клеток (или иных микрообъектов биологического происхождения), либо молекулы иных веществ, способных связываться с молекулами, находящимися на поверхности исследуемых клеток (или иных микрообъектов биологического происхождения). Тестовые участки 30 отделены друг от друга фоновыми участками 31, не содержащими данных молекул. Рабочая область 29 ограничена краями 32 подложки 28. Устройство позволяет проводить исследование с помощью биочипов 7 с различным типом расположения тестовых участков.
Биочип 1-го типа (фиг.4) имеет тестовые участки 30, выполненные в виде упорядочение расположенных пятен округлой или иной формы, которые не пересекают рабочую область 29 биочипа 7 в каком-либо направлении.
На биочипе 2-го типа (фиг.5) тестовые участки 30 выполнены в виде параллельных полос пересекающих рабочую область 29
Для возможности проведения некоторых дополнительных исследований связавшихся клеток при работе с биочипами 2-го типа устройство оснащено приспособлением 33 (фиг.3), позволяющим разделять емкость 11 на несколько емкостей (каналов) 34, имеющих меньшие размеры. При этом дно каждой из емкостей 34 образовано участком поверхности биочипа 7. Приспособление 33 представляет собой пластину 35, имеющую выступы 36, снабженные герметизирующим покрытием (на чертеже не обозначено). Приспособление 33 размещаю таким образом, что емкости 34 располагаются параллельно продольной оси контура устройства, но перпендикулярно тестовым участкам 30 биочипа 2-го типа. (Биочип 2-го типа устанавливают в емкости 11 таким образом, что его тестовые участки 30 располагаются поперек продольной оси контура устройства). При этом емкости (каналы) 34 сообщаются с остальными элементами контура устройства при открытых кранах 12 и 13. Для заполнения емкостей 34 растворами реагентов в пластине 35 выполнены отверстия 37 (фиг.1), в каждое из которых может быть введена игла шприца Гамильтона или наконечник микропипетки, либо иного подобного приспособления.
Для доступа к отверстиям, выполненным в торцах кранов 12 (фиг.2) и 13 и закрытых эластичными пробками 16 в корпусе 1 в их проекции выполнены отверстия 38 и 39. Поворот кранов 12 и 13 осуществляют с помощью отвертки или специального ключа. Для этого на их противоположных торцах выполнены выемки 40. Для доступа к ним в корпусе 1 выполнены отверстия 41 и 42.
Устройство используют следующим образом.
Биочип 7 закрепляют в съемной кювете 6, прижимая его к дну 10 снабженному прозрачным клейким покрытием. Запирающие приспособления (краны) 12 и 13 при этом закрывают. Осуществляют заполнение емкости 11 необходимыми жидкостями, с которыми выполняют инкубацию биочипа 7. После завершения обработки биочипа 7 использованный раствор сливают, а емкость 11 заполняют следующим раствором. Последовательность проведения обработки биочипа 7, предназначенного для определения поверхностных антигенов клеток, может быть следующей: 1) обработка биочипа 7 белковым раствором (например, раствором бычьего сывороточного альбумина), блокирующим сайты неспецифического связывания подложки 28; 2) обработка биочипа 7 раствором детергента для устранения не связавшихся с подложкой 28 молекул белка; 3) промывка биочипа 7 буферным раствором для устранения следов детергента. При проведении данных манипуляций кювету 6 устанавливают на шейкере.
К патрубкам 25 устройства крепят приводящую трубку 26 и отводящую трубку 27, которые соединены соответственно с емкостью заполненной отмывающей жидкостью (на чертеже не показана) и сливной емкостью (на чертеже не показана). Устанавливают съемную кювету 6 в отсеке 5 устройства. Устанавливают крышку 19 и фиксируют ее с помощью подвижной прижимающей рамы 22. Открывают краны 4, 12, 13 при этом жидкость заполняет контур устройства (приводящий канал 2, отводящий канал 3, емкость 11). После этого кран 12 закрывают. Воздух из контура устройства устраняют с помощью шприца, который соединяют с трубкой 18. Оставшийся воздух скапливается в отсеке 17 и может быть удален с помощью шприца, игла которого вводится через находящееся в его верхней части отверстие закрытое, эластичной пробкой.
Открывают кран 13. Устройство наклоняют таким образом, чтобы закрытый кран 12 находился внизу. С помощью шприца иглу, которого вводят через отверстие в торце крана, закрытое эластичной пробкой 16, вводят необходимый объем клеточной суспензии, которая попадает в емкость 11 через отверстие 15. Закрывают кран 13. Возможны и другие варианты выполнения манипуляций при заполнении емкости 11 клеточной суспензией.
Устанавливают устройство на предметном столике микроскопа. Осуществляют инкубацию биочипа 7 с исследуемой суспензией клеток в течение необходимого времени. После этого открывают краны 4, 13 и 12 и пропускают поток отмывающей жидкости, который смывает клетки, не связавшиеся в области тестовых участков 30 с иммобилизованными антителами. Затем оценивают качество проведения отмывки, проводя микроскопическое исследование биочипа 7. (перед этим кран 12 закрывают). Связавшиеся клетки должны оставаться только в области определенных тестовых участков 30 и отсутствовать в области фоновых участков 31. Если не специфически связавшиеся с подложкой 28 клетки из фоновых участков 31 оказываются устранены не полностью, увеличивают скорость потока отмывающей жидкости. Для этого увеличивают высоту расположения уровня отмывающей жидкости, например, поднимая емкость в которой она находится, или при использовании насоса, увеличивают скорость прохождения жидкости через контур устройства.
После завершения отмывки биочипа может быть выполнена его инкубация с раствором, повышающим прочность связывания с подложкой оставшихся клеток. Соответствующая жидкость может быть введена в емкость 11, например, через трубку 18 при открытых кранах 12 и 13 и закрытом кране 4. После завершения инкубации вновь пропускают отмывающую жидкость из емкости (краны 12, 13 и 4 при этом открыты).
После этого закрывают кран 4, открывают краны 12 и 13 и впускают в контур воздух через трубку 18. При этом жидкость стекает из емкости 11 и происходит ее заполнение воздухом. Затем отодвигают прижимающую раму 22 и снимают крышку 19. Съемная кювета 6 может быть вынута из отсека 5. После этого при необходимости может быть выполнена фиксация и окрашивание биочипа. При этом соответствующие жидкости вносят в емкость 11 (краны 12 и 13 должны быть закрыты). Затем съемное дно 10 может быть извлечено вместе с биочипом 7. Биочип 7 отделяют от дна 10 и подвергают дальнейшим исследованиям.
При работе с биочипами 2-го типа могут быть выполнены исследования связавшихся клеток, требующие приведения некоторых растворов в контакт с определенными участками поверхности биочипа. Например, проведение определения многих вариантов коэкспрессии антигенов на связанных клетках путем обработки участков поверхности биочипа растворами флуоресцентно-меченных антител. Для этого после удаления отмывающей жидкости из емкости 11 и снятия крышки 19 на поверхность биочипа устанавливают приспособление 33. При этом образуются каналы 34, которые располагаются вдоль продольной оси контура устройства, но перпендикулярно тестовым участкам 30 биочипа 2-го типа (выполненным в виде полос). Каждый из каналов 34 пересекает все тестовые участки 30 такого биочипа. Каналы 34 заполняют необходимыми растворами через отверстия 37 с помощью автоматической пипетки, шприца Гамильтона или иного подобного устройства. Устанавливают крышку 19 и фиксируют ее с помощью прижимающей рамы 22. Осуществляют инкубацию в течение необходимого времени, после чего выполняют отмывку биочиа, пропуская с небольшой скоростью поток жидкости через каналы 34. Для этого открывают краны 12, 13 и 4. После завершения отмывки съемную кювету 6 извлекают и проводят исследование биочипа 7 с помощью люминесцентного микроскопа. При необходимости биочип 7 может быть извлечен из съемной кюветы 6. При проведении других видов дополнительных исследований клеток, характер и последовательность выполняемых манипуляций могут быть иными.