Противоопухолевая композиция доксорубицина с ингибитором АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток
ANTITUMOR COMPOSITION OF DOXORUBICIN WITH ATP INHIBITOR-DEPENDENT REVERSE CELL TRANSPORTER

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и может быть использовано для увеличения эффективности противоопухолевой химиотерапии путем преодоления множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток под воздействием нового структурного класса ингибиторов АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток (АВС-транспортеров, от англ. ATP-binding cassette transporters). Изобретение может быть использовано в области биологии, фармакологии, фармацевтики и медицины для существенного усиления эффективности действия противоопухолевых препаратов, в том числе широко используемого в химиотерапии злокачественных опухолей антибиотика антрациклинового ряда доксорубицина.
Одной из важнейших проблем современной химиотерапии злокачественных образований является множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток – врожденная или приобретенная невосприимчивость клеток к противоопухолевым лекарственным препаратам, различающимся по механизму действия и структуре. Одним из основных механизмов лекарственной устойчивости является обратный захват и выброс проникающих в клетку молекул ксенобиотиков АТФ-зависимыми насосами семейства АВС-транспортеров [1]. В семейство АВС-транспортеров входят гликопротеин P-gp (P-glycoprotein), белки множественной лекарственной устойчивости семейства MRP (multidrug resistance-associated protein) и белок устойчивости рака молочной железы BCRP (breast cancer resistance protein). Активность указанных АВС-транспортеров, экспрессия которых существенно возрастает при малигнизации клетки (переходе от нормальной клетки к злокачественной), приводит к значительному снижению эффективности противоопухолевой химиотерапии. Подобные эффекты экспериментально показаны и исследованы на примере большинства лекарственных средств для химиотерапии опухолей [2], в том числе таргетных. Ингибиторы АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток обладают очень широкой субстратной специфичностью, осуществляя обратный захват и выброс из клетки очень многих противоопухолевых препаратов, например: 5-фторурацил, актиномицин D, бисантрен, хлорамбуцил, колхицин, цисплатин, цитарабин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, гефитиниб, иринотекан, метотрексат, митомицин С, митоксантрон, паклитаксел, тамоксифен, тенипозид, топотекан, винбластин, винкристин и др. [3]. Для всех указанных препаратов показан эффект существенного снижения их эффективности, обусловленного активностью ингибиторов АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток. Весьма остро стоит эта проблема и для широко применяемого препарата антрациклинового ряда доксорубицина.
Таким образом, комбинированное применение противоопухолевого препарата с эффективным и безопасным ингибитором АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток является перспективным подходом к увеличению эффективности действия широкого ряда противоопухолевых лекарственных средств. Создание подобных препаратов позволит значительно уменьшить терапевтическую дозу активных веществ, и, как следствие, их побочные эффекты, и тем самым совершить качественный прорыв в фармакологии и медицине.
Из исследованного уровня техники известен широкий ряд соединений, в том числе разрешенных к применению лекарственных препаратов, способных ингибировать АВС-транспортеры. Так, была проведена масштабная исследовательская работа по созданию ингибиторов АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток в качестве препаратов, увеличивающих чувствительность раковых клеток к действию противоопухолевых препаратов [3]. В частности, в качестве ингибиторов P-gp проявили активность и исследовались для комбинированной противоопухолевой химиотерапии аторвастатин, амлодипин, циклоспорин А, дисульфирам, нифедипин, верапамил, препараты GF120918, LY475776, LY335979, MS-209, OC144-093, pluronic L61, PSC-833, R101933, S9788, VX-710, XR-9576, V-104. В качестве ингибиторов MRP2 исследовались азитромицин, циклоспорин А, фуросемид, глибенкламид, пробенецид, МК-571. В качестве ингибиторов BCRP исследовались циклоспорин А, дипиридамол, элакридар, фумитреморгин С, новобиоцин, ортатаксел, резерпин, ритонавир, тариквидар, GF120918, VX-710, XR-9576.
Известны многочисленные попытки преодоления множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток к доксорубицину путем его комбинированного применения с ингибиторами обратных транспортеров. Так, комбинированное использование ингибиторов АТФ-зависимых обратных транспортеров первого поколения, таких, как циклоспорин А и верапамил, с антрациклиновыми препаратами привело к выраженным токсическим эффектам без усиления эффективности [4, 5]. Попытка инкапсуляции циклоспорина А в мицеллы с целью снижения токсических эффектов также не привела к усилению эффективности доксорубицина [6]. Ингибиторы второго поколения, такие как PSC-833 и VX-710, были разработаны для увеличения ингибирующей активности и снижения токсических эффектов ингибиторов первого поколения. Было показано, что аналог циклоспорина А РSC-833 способен повышать чувствительность опухолевых клеток SK-MES-1/DX1000 к действию доксорубицина, но его использование сопровождалось серьезными нежелательными фармакотоксическими эффектами у пациентов [7, 8]. Также не привело к существенным положительным эффектам применение VX-710 с доксорубицином [9], при этом появились экспериментальные свидетельства того, что VX-710 действует по более сложным механизмам, связанным не только с ингибированием АВС-транспортеров [10]. Было показано, что ингибиторы второго поколения зачастую способны усиливать токсические эффекты противоопухолевых препаратов путем изменения профиля их фармакокинетики и биораспределения [11]. Еще более эффективными ингибиторами обратного транспорта на in vitro моделях стали препараты третьего поколения, такие как GF120918, LY335979, R101933 и XR9576, однако и их применение с химиотерапевтическими препаратами также не привело к существенным клиническим результатам [12]. Предпринимались попытки усиления противоопухолевой эффективности доксорубицина путем комбинирования с природными биологически активными добавками, ингибирующими P-gp [13].
В целом, как для доксорубицина, так и для других противоопухолевых препаратов, до настоящего времени описанная стратегия не привела к существенным клиническим результатам. Современное состояние исследований в этой области характеризуется локальными успехами на уровне in vitro, однако переход к in vivo, а тем более клиническим исследованиям, как правило, не приносит желаемого эффекта, в основном, в силу нежелательных побочных эффектов противоопухолевых комбинаций или недостаточной широты и эффективности действия ингибиторов АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток.
Таким образом, упомянутые выше аналоги заявленного технического решения  являются комбинациями доксорубицина и других противоопухолевых препаратов с ингибиторами АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток. При этом все из указанных выше препаратов характеризуются общими недостатками, заключающимися, в основном, в нежелательных побочных эффектах противоопухолевых комбинаций или недостаточной широте и эффективности действия ингибиторов АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток.
Для детального выявления указанных недостатков заявителем представлено описание одного из указанных выше аналогов, взятого в качестве прототипа по заявке на  изобретение [7], сущностью которого является разработка ингибиторов АВС-транспортера P-гликопротеина на основе аналогов циклоспорина, в частности, соединения PSC-833. Было показано, что аналог циклоспорина А PCS833 способен увеличивать чувствительность опухолевых клеток SK-MES-1/DX1000 к действию доксорубицина [7]. Однако использование PSC-833 у пациентов с острой миелоидной лейкемией, хотя и привело к некоторому усилению противоопухолевого эффекта, но сопровождалось серьезными нежелательными фармакотоксическими эффектами, что не позволяет использовать его в клинике [8].
Основываясь на изложенном, является очевидным, что для полноценной реализации перспектив данного подхода требуются более активные и безопасные ингибиторы АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток, обладающие оптимальным фармакокинетическим и фармакотоксическим профилем, способные синергетически взаимодействовать с действующим противоопухолевым препаратом.
В патенте РФ №2641304 [19] описан новый ингибитор АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток, относящийся к группе хиральных конъюгатов (оптически активных гибридных молекул) олигоэфирполиольной природы (далее по тексту - ОЭП-ингибитор), представляющий собой смесь полиоксипропиленгексола формулы 4
,
где n=2-6, преимущественно n=4,
и полиоксипропиленгликоля формулы  5
,
где m=5-9, преимущественно m=7.
Ингибитор представляет собой коньюгат полиоксипропиленгликоля с молекулярной массой от 300 до 500 Дa и полиоксипропиленгексола с молекулярной массой от 1000 до 1500 Дa в эквимольном соотношении, с гидроксильным числом в пределах 215-240 мг КОН/г.
ОЭП-ингибитор по  патенту РФ №2641304 значительно увеличивает поглощение лекарственных средств живыми клетками и тканями, характеризуется высокой безопасностью и эффективностью:
- обладает низкой цитотоксичностью в отношении культур клеток человека по сравнению с большинством описанных в литературе ингибиторов АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток;
- не влияет на микровязкость цитоплазматических мембран опухолевых клеток линии MCF-7 и клеток MCF-7/RES с приобретенной лекарственной устойчивостью;
- не проникает через цитоплазматическую мембрану внутрь опухолевых клеток MCF-7;
- в диапазоне концентраций 8.7-870 мкг/мл вызывает специфическое ингибирование P-gp-опосредованного обратного транспорта доксорубицина, увеличивая его концентрации в акцепторных лунках в 1.9-3.8 раз соответственно;
- элиминирует активную гликозилированную изоформу 190 кДа  ABCB1, вызывая при этом накопление в клетках неактивной высокоманнозной изоформы 175 кДа транспортера;
- ингибирует АТФ-азную активность изолированных мембран клеток Sf9 с гиперэкспрессией Р-гликопротеина человека;
- не изменяет внутриклеточный уровень АТФ;
- при введении внутрижелудочно по степени токсичности относится к нетоксичным веществам, при внутривенном введении – к малотоксичным веществам.
Целью технического решения является получение композиции противоопухолевого препарата доксорубицина и ОЭП-ингибитора, которая обеспечивает повышение эффективности действия доксорубицина, в том числе для преодоления множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток, повышение безопасности химиотерапии опухолей, снижение токсических реакций и создание эффективных лекарственных форм для химиотерапии онкобольных с множественной лекарственной устойчивостью.
Техническим результатом заявленного технического решения является создание эффективной противоопухолевой композиции доксорубицина с представителем нового класса ОЭП-ингибитора, на который выдан патент РФ №2641304, позволяющая  существенно увеличить эффективность и безопасность действия противоопухолевого препарата доксорубицина.
Сущностью заявленного технического решения является противоопухолевая композиция, представляющая собой водный раствор доксорубицина и ингибитора АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток в массовом соотношении 1:15, где ингибитор АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток представляет собой смесь полиоксипропиленгексола формулы 4
,
где n=2-6,
и полиоксипропиленгликоля формулы  5
,
где m=5-9,
имеющий гидроксильное число 215-240 мг КОН/г, соединение 4 имеет молекулярную массу от 1000 до 1500 Да, соединение 5 имеет молекулярную массу от 300 до 500 Да, мольное соотношение соединений 4 и 5 составляет 0,9-1,1.
Объектом исследования во всех представленных ниже примерах являются ОЭП-ингибитор, противоопухолевый антибиотик доксорубицин и композиция доксорубицина с ОЭП-ингибитором. Для выполнения исследований было получено разрешение Этического комитета ГУАЗ Республиканского Клинического онкологического диспансера Министерства здравоохранения Республики Татарстан (Протокол заседания от 22.09.2014).
Поставленная цель и заявленный технический результат достигается посредством создания принципиально новой, неизвестной из исследованного уровня техники композиции: на основе ингибитора АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток олигоэфирполиольной природы и известного как такового противоопухолевого цитостатического препарата доксорубицина.
Противоопухолевый цитостатический препарат доксорубицин применяется для лечения широкого ряда злокачественных опухолей, включая: рак молочной железы, рак легкого (мелкоклеточный), мезотелиома, рак пищевода, рак желудка, первичный гепатоцеллюлярный рак, инсулинома, карциноид, рак головы и шеи, рак щитовидной железы, злокачественная тимома, рак яичников, герминогенные опухоли яичка, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря (лечение и профилактика рецидивов после оперативного вмешательства), рак эндометрия, рак шейки матки, саркома матки, саркома Юинга, рабдомиосаркома, нейробластома, опухоль Вильмса, остеогенная саркома, саркома мягких тканей, саркома Капоши, острый лимфобластный лейкоз, острый миелобластный лейкоз, хронический лимфолейкоз, болезнь Ходжкина и неходжкинские лимфомы, множественная миелома (https://medi.ru/instrukciya/doksorubitsin-ebeve-rastvor_11206/).
Ограничением для терапевтического использования доксорубицина является его высокая токсичность в отношении активно делящихся нормальных клеток организма. Эффективным способом ее снижения считается использование доксорубицина не в свободной форме, а в составе лекарственных композиций или в связанном с транспортными системами (переносчиками) виде.
Указанный выше технический результат в целом достигается заявителем тем, что комбинацию доксорубицина с ОЭП-ингибитором в виде инъекционного раствора готовят следующим способом:
- готовят концентрат ОЭП-ингибитора путем растворения ОЭП в воде для инъекций;
- приготовленный раствор концентрата тщательно перемешивают и фильтруют  через мембранные фильтры с диаметром пор 0.2 мкм;
- готовят раствор доксорубицина в воде для инъекций согласно инструкции по применению;
- к полученному концентрату ОЭП-ингибитора добавляют  раствор  доксорубицина и  все тщательно перемешивают, в результате получают заявленную композицию.
Поставленная цель достигается тем, что заявителем разработана противоопухолевая фармацевтическая композиция для увеличения эффективности действия противоопухолевого лекарственного средства, включающая ОЭП-ингибитор (ингибитор АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток), доксорубицин и воду.
Фармацевтическая композиция в соответствии с заявленным техническим решением позволяет существенно увеличить эффективность и безопасность действия противоопухолевого препарата доксорубицина.
В результате создания и исследования различных вариантов композиций заявителем установлено, что заявленный  технический результат достигается при условии, что заявленная фармацевтическая композиция содержит  от 1.1 до 1.6 масс.% (в пересчете на 100 мас.% фармацевтической композиции лекарственной формы) ОЭП-ингибитора, от 0.082 до 0.100 масс.%  доксорубицина, остальное до 100 масс.%  - вода. Это может быть вода для инъекций или физиологический раствор.
Согласно заявленному техническому решению, предлагаемая противоопухолевая композиция доксорубицина с ОЭП-ингибитором, наиболее предпочтительно содержит 1.36 масс.% (в пересчете на 100 мас.% фармацевтической композиции лекарственной формы) ОЭП-ингибитора, а также от 0.091 масс.%  доксорубицина.
Оптимальная  форма содержит в своем составе доксорубицин и ОЭП-ингибитор в соотношении по массе 1:15. Соотношение 1:15 продиктовано максимально возможной концентрацией, которая не вызывает гибели животных. Данное соотношение рассчитано из результатов оценки влияния ОЭП-ингибитора на трансэпителиальный транспорт доксорубицина через плазматическую мембрану клеток CaCo-2 (см. патент РФ №2641304, пример 12), где изучалась активность in vitro ОЭП-ингибитора при различных концентрациях от 0.087 до 870 мкг/мл, при одинаковом содержании доксорубицина (1 мкМ или 0.58 мкг/мл). В изобретении по патенту  РФ №2641304 показано, что ОЭП-ингибитор ингибирует обратный транспорт доксорубицина, увеличивая его в концентрации 8.7 мкг/мл почти в 2 раза. Данное соотношение концентраций доксорубицина 0.58 мкг/мл и ОЭП-ингибитор 8,7 мкг/мл соответствует отношению 1:15, является оптимальным для исследованных в известном изобретении клеток in vitro, т.к. когда опыты проводятся «в пробирке» вне живого организма.
При этом в целом возможно сделать предварительный вывод о том, что при соотношении доксорубицин-ОЭП-ингибитор  5:50 мг/кг (1:10) эффективность композиции при использовании явно снижается, а при соотношении 5:100 мг/кг (1:20) может наступить  эмболия сосудов у животных,  что может привести к их смерти, причем в известном изобретении действие композиции изучалось in vitro, т.е. вне живого организма, а действие на живом организме не было предметом изобретения, т.е. не изучалось.
Анализ литературных данных, проведённый заявителем [20], свидетельствует, что терапевтическая доза доксорубицина на моделях ксенографтов на мышах составляет 5 мг/кг. Выбранное  заявителем соотношение доксорубицин-ОЭП-ингибитор = 5:75 мг/кг (1:15) связано с  максимально возможной концентрацией ОЭП-ингибитора, которое не приводит к образованию эмболии (закупорке кровяного русла).
Более детально процесс создания заявленной композиции достигается следующим образом.
Противоопухолевую композицию готовят растворением  в воде для инъекций или в физиологическом растворе.
3
3
3
В мерную колбу  вместимостью 10 см  с помощью дозатора  заливают  воду для инъекций  в объеме 5.0-5.5 см. Колбу помещают на магнитную мешалку. При перемешивании загружают фармацевтическую субстанцию ОЭП в количестве 1.50 г и перемешивают в течение 5-10 минут. Затем доводят объем раствора в колбе до метки  водой для инъекций. Получают 10 см раствора концентрата  ОЭП-ингибитора с концентрацией 150 мг/мл. Приготовленный раствор концентрата тщательно перемешивают и фильтруют через лабораторные мембранные фильтры с диаметром пор 0.2 мкм.
К 5 мл полученного концентрата ОЭП-ингибитора добавляют  50 мг доксорубицина, растворенного в 50 мл воды для инъекций, и тщательно перемешивают. Получают 55 мл композиции с массовым соотношением доксорубицина и ОЭП-ингибитора  равным 1:15. Конечный объем доводят до необходимого в зависимости от показаний и разработанного протокола введения.
Заявленное техническое решение проиллюстрировано Фиг.1 – Фиг. 16:
50
50
На Фиг.1 в Таблице 1 приведены  концентрации соединений полумаксимального ингибирования роста для условно-нормальных (СС, мкМ) и опухолевых клеток человека (IС, мкМ). Средние значения ± стандартное отклонение.
На Фиг.2 в Таблице 2 – приведена схема исследования эффективности заявленного технического решения на модели ксенографтов рака молочной железы человека на трёх экспериментальных группах мышей - контрольной, с применением заявленного технического решения и доксирубицином.
На Фиг.3 в Таблице 3 – приведены средние размеры опухолей и значения торможения роста опухолей (ТРО) в группах после первого (день 8) и второго (день 12) внутривенного введения исследуемых препаратов.
На Фиг.4 в Таблице 4 – приведены параметры ингибирующей активности исследуемых препаратов.
На Фиг.5 в Таблице 5 – приведено количество животных в экспериментальных группах в эксперименте по исследованию эффективности заявленного технического решения на модели ксенотрансплантированной миксофибросаркомы на кроликах.
На Фиг.6 – приведены размеры опухолей у животных на момент начала лечения.
На Фиг. 7 (7А, 7Б, 7В) – приведена динамика роста рака молочной железы в модели ксенографтов (среднее ± ст. ошибка).
На Фиг.8 –  приведен размер опухолей молочной железы в модели ксенографтов в дни 8 и 12 (среднее ± ст. ошибка). На день 12 в группе композиция Доксорубицин - ОЭП-ингибитор 5/75 осталось одно животное.
На Фиг. 9 – приведены экспоненциальные кривые роста опухолей рака молочной железы в модели ксенографтов (среднее ± ст. ошибка).
На Фиг. 10 – приведено изменение размеров ксенотрансплантированной миксофибросаркомы под влиянием химиопрепаратов.
На Фиг. 11 – приведена фотография миксофибросаркомы в передней камере глаза кролика на 2 сутки после ксенотрансплантации.
На Фиг. 12 – приведена фотография глаза кролика на 30 сутки после ксенотрансплантации миксофибросаркомы на фоне действия композиции доксорубицина с ОЭП-ингибитором. Опухоль не визуализируется.
На Фиг. 13 – приведена микрофотография миксофибросаркомы на 30 сутки инкубации в передней камере глаза. Контрольная группа. Осадок красного цвета соответствует позитивной иммуногистохимической реакции с антителами против виментина – показано стрелками.
На Фиг. 14 – приведена микрофотография миксофибросаркомы на 30 сутки инкубации в передней камере глаза на фоне введения доксорубицина. Стрелкой показана виментин-позитивная (опухолевая) клетка.
На Фиг. 15 – приведена микрофотография миксофибросаркомы на 30 сутки инкубации в передней камере глаза на фоне введения композиции доксорубицина и олигоэфирполиола.
На Фиг. 16 – приведен сравнительный анализ соотношения виментин-позитивных (опухолевых) клеток в ксенотрансплантатах контрольной и опытных групп животных  на 30 сутки после операции.
Обозначения и сокращения
in vitro – технология выполнения экспериментов в лабораторных условиях, когда опыты проводятся вне живого организма;
АТСС – (от англ. American Type Culture Collection) – Американская коллекция клеточных культур;
50
IC – концентрация полумаксимального ингибирования роста опухолевых клеток;
50
CC – концентрация полумаксимального ингибирования роста условно-нормальных клеток;
мкМ – микромоль на литр;
ДМСО – диметилсульфоксид;
mQ – вода очищенная;
МТТ – 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид;
HSF – условно нормальные фибробласты кожи человека;
MCF-7 -аденокарцинома молочной железы человека, ATCC;
MCF-7/Vin – аденокарцинома молочной железы человека, резистентная к винбластину и доксорубицину;
CaCo-2 – колоректальная аденокарцинома человека, ATCC;
DOX - доксорубицина гидрохлорид
HCT-15 – колоректальная аденокарцинома человека, NCI-60;
HCT-116 – колоректальная карцинома человека, NCI-60;
OVCAR-4 – аденокарцинома яичников человека, NCI-60;
PC-3 – аденокарцинома простаты человека, NCI-60;
A-498 – карцинома почки человека, NCI-60;
NCI-H322M – немелкоклеточная карцинома легкого человека,
NCI-60;
M-14 – меланома кожи человека, NCI-60;
SNB-19 – глиобластома человека, NCI-60;
SF-539 – глиосаркома человека, NCI-60.
Докс   –  доксорубицин.
Материалы и реагенты
L-глутамин, питательные среды б-МЕМ, питательная среда DМЕМ, пенициллин-стрептомицин (кат. № A065), раствор Хенкса, раствор трипсина-ЭДТА, раствор Версена, пируват натрия приобретены в компании ПанЭко (Россия). MTT 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид) – от компании Promega. Доксорубицина гидрохлорид (DOX) – от компаний Sigma-Аldrich (США) и ОАО «Фармстандарт»; раствор Хенкса, аккутаза – от компании Gibco; таблетки 17в-эстрадиол, 3.0 мм, 1.7 мг, 60 days release – от компании Innovative Research. FBS, фетальная бычья сыворотка, – от компании HyClone. Эмбриональная телячья сыворотка – от компании РАА; краситель трипановый синий – от компании Диа-М (Россия); Матригель – от компании BD (кат. № 356235).
Ниже заявителем приведены примеры практического осуществления заявленного технического решения.
Пример 1.
Изучение цитотоксической активности заявленной композиции in vitro
50
50
Целью эксперимента явилось экспериментальное изучение цитотоксической активности ОЭП-ингибитора, доксорубицина (Докс) и композиции доксорубицина и ОЭП-ингибитора in vitro в отношении опухолевых клеточных линий MCF-7, MCF-7/Vin, HSF, CaCo-2, HCT-15, HCT-116, OVCAR-4, PC-3, A-498, NCI-H322M, M-14, SNB-19, SF-539 и условно-нормальных клеточных линий первичных фибробластов, выделенных из кожи человека. Исследования включали в себя построение кривой доза-эффект и определения концентрации полумаксимального ингибирования роста опухолевых клеток (IC) и условно-нормальных клеток (СС).
Цитотоксичность ОЭП-ингибитора, доксорубицина и комбинации доксорубицина и ОЭП-ингибитора на культурах клеток оценивали с использованием пролиферативного MTT-теста, суть которого заключается в следующем. МТТ желтого цвета под действием митохондриальных сукцинат-дегидрогеназ клеток превращается в формазан, имеющий фиолетовую окраску. При лизисе клеток кристаллы формазана легко переходят в раствор таких органических растворителей, как изопропанол, тритон или ДМСО. По данным оптической плотности раствора формазана (500-600 нм) определяли активность митохондриальных редуктаз, и, соответственно, жизнеспособность клеток (MTT Cell Proliferation Assay. Instruction Guide. American Type Culture Collection [Электронный ресурс]. 2011).
-4
-4
-4
Перед началом эксперимента готовили стоковые растворы исследуемых соединений в мерных колбах объемом 5 мл в воде [качества mQ] для инъекций. Концентрация стоковых растворов ОЭП-ингибитора составляла 100 мг/мл; доксорубицина – 10М; композиции доксорубицина и ОЭП-ингибитора: 10М DOX + 200 мкг/мл ОЭП-ингибитора (композиция 1) и 10М DOX + 100 мкг/мл ОЭП-ингибитора (композиция 2).
Стоковые растворы соединений фильтровали с использованием шприцевых фильтров 0.22 мкм с PTFE (тефлон) мембраной. При приготовлении композиции доксорубицина с ОЭП-ингибитором сначала готовили раствор ОЭП-ингибитора в воде для инъекций, затем добавляли полученный раствор в необходимом объеме к навеске доксорубицина.
2
Клетки культивировали в среде б-MEM с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина в атмосфере 5%-го СО при 37 °С до образования монослоя. Для получения клеточной суспензии монослой клеток трипсинизировали с последующей инактивацией трипсина добавлением среды б-MEM с сывороткой. Подсчёт клеток производили в камере Нэйбауэра методом исключения трипанового синего. Клетки пересевали 2 раза в неделю в отношении 1:6 [14].
2
Для осуществления трехдневного теста в лунки 96-ти луночного планшета вносили 1000 клеток в 90 микролитрах культуральной среды. Перед внесением в планшет клетки тщательно суспензировали. Клеточную суспензию вносили в лунки планшета с помощью многоканального дозатора и стерильных наконечников. Далее планшеты с клетками инкубировали 24 часа в СО-инкубаторе для адгезии клеток к субстрату. С использованием многоканального дозатора и стерильных наконечников в лунки планшета с клетками вносили аликвоты приготовленных растворов исследуемых соединений в объеме 10 микролитров в каждую лунку.
2
Исследование проводили в трипликатах. В контрольные лунки планшета вместо анализируемых соединений вносили аналогичные объемы воды mQ. После внесения исследуемых веществ клетки культивировали в СО инкубаторе в стандартных условиях в течение 72 часов.
На третий день культивирования конфлюентность клеток в контрольных лунках составляла 70-90% поверхности дна.
По истечении времени инкубации, культуральную среду с исследуемыми веществами удаляли из планшета с помощью вакуумного аспиратора.
2
В ванночке для многоканального дозатора готовили смесь: 9 мл культуральной среды + 1 мл MTT-реагента (5 мг/мл в растворе Хэнкса) на один 96-ти луночный планшет. Приготовленную реакционную смесь вносили в объеме 100 мкл в каждую лунку планшета и инкубировали в СО инкубаторе 3.5 часа [15]. По истечении времени инкубации культуральную среду с МТТ-реагентом удаляли вакуумным аспиратором, в каждую лунку планшета вносили 100 мкл ДМСО и инкубировали 5-10 минут. Появившееся фиолетовое окрашивание детектировали на планшетном ридере Tecan при 555 нм (референтная длина волны – 650 нм).
50
Результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения OriginPro 8. Рассчитывали процент жизнеспособных клеток в каждой опытной лунке относительно лунок положительного контроля, жизнеспособность которых принимали за 100%. Далее строили графики зависимости жизнеспособности клеток, выражаемые в процентах, относительно десятичного логарифма концентраций добавленных соединений. Полученную кривую подвергали анализу “Fit Sigmoidal – DoseResp” в программном обеспечении OriginPro 8, находили логарифм концентрации в точке 50% жизнеспособности клеток. Рассчитывали концентрацию полумаксимального ингибирования роста клеток (IС). Результаты исследований описанных выше представлены на Фиг.1 в Таблице 1.
50
Для большей части исследованных клеток IC ОЭП-ингибитора превышает 1.5 мг/мл, что свидетельствует о его полной безопасности.
Определенную специфичность ОЭП-ингибитор проявляет к клеткам глиобластомы SNB-19 и глиосаркомы SF-539 – 0.46±0.12 мг/мл и 0.30±0.04 мг/мл соответственно, что свидетельствует о его некотором, хотя и незначительном, потенциальном эффекте по отношению к соответствующим опухолям. При этом композиция ОЭП-ингибитора с доксорубицином увеличивает цитотоксичность доксорубицина для опухолевых клеток в 1.1-6.6 раз, а для клеток CaCo-2 в 246 раз при постоянной концентрации в питательной среде в 100 мкг/мл.
При увеличении в композиции постоянной концентрации ОЭП-ингибитора в питательной среде до 200 мкг/мл наблюдается увеличение цитотоксичности доксорубицина в исследованных клетках в 1.5-54 раза, для CaCo-2 в 307 раз.
Цитотоксичность же доксорубицина для условно-нормальных фибробластов кожи человека не изменяется.
Результаты описанного эксперимента свидетельствуют о том, что в композиции ОЭП-ингибитор существенно, в некоторых случаях более чем в 300 раз, увеличивает чувствительность опухолевых клеток к цитотоксическому действию доксорубицина. В то же самое время ОЭП-ингибитор не увеличивает чувствительность нормальных клеток к доксорубицину. Тем самым обеспечивается существенно повышенная селективность действия композиции доксорубицина и ОЭП-ингибитора по сравнению с доксорубицином. Полученный результат является неочевидным для специалиста и на практике означает значительное повышение эффективности и безопасности заявленной композиции.
Пример 2. Изучение эффективности заявленной композиции на модели ксенографтов рака молочной железы человека на грызунах
Исследование противоопухолевой активности заявленной композиции проводили на модели ксенографтов рака молочной железы человека. Модель формировали на основе клеток линии MCF7/Vnb, которые были предварительно инкубированы в течение 90 дней в присутствии винбластина и доксорубицина для развития множественной лекарственной устойчивости (см. Фиг.2, Таблица 2).
Клетки рака молочной железы человека линии MCF7/Vinb размораживали в среде и культивировали в Т175 флаконах для прикрепленных культур. По мере достижения 100% конфлюентности клетки пересевали в среднем один раз в 3-4 дня. При откреплении удаляли культуральную жидкость, промывали в фосфатно-солевом буфере и добавляли раствор аккутазы. Инкубировали 5 минут при 37 °С, добавляли среду и суспендировали. Далее рассевали на Т175 флаконы.
Исследование было проведено на самках мышей линии SCID Beige. Поставщик животных Charles River GmbH, средний возраст мышей 6-8 недель. Выбор животных основан на том, что иммунодефицитные мыши являются удобной моделью для изучения противоопухолевой активности лекарственных средств. Отсутствие иммунитета позволяет перевивать им раковые клетки человека, что увеличивает прогностическую достоверность активности исследуемых веществ.
Поскольку данная модель (ксенографтов рака молочной железы человека) является гормон-чувствительной, мышам имплантировали капсулы с постепенным высвобождением 17в-эстрадиола [16, 17]. Перед началом эксперимента проводили отработку модели – оценивали динамику роста опухолей в присутствии разных доз 17в-эстрадиола, время появления и вариабельность размера опухолей после имплантации. Наиболее равномерно опухоли появились и росли при имплантации 17в-эстрадиола в дозе 1.7 мг/мышь и клеток MCF7/Vinb в дозе 2 млн клеток/мышь. Эти условия были выбраны в качестве модели для тестирования противоопухолевой активности заявленного технического решения на втором этапе исследования.
В ходе основного эксперимента исследовали эффективность композиции доксорубицина и ОЭП-ингибитора на полученной модели ксенографтов. Путь введения соответствует клиническому (внутривенно). Растворы для введения препаратов готовили, используя в качестве растворителя физиологический раствор.
При приготовлении композиции доксорубицина с ОЭП-ингибитором сначала готовили раствор ОЭП-ингибитора в физиологическом растворе, затем добавляли полученный раствор в необходимом объеме к навеске доксорубицина. Растворы инкубировали при комнатной температуре на вортексе 20 мин. После инкубации вещества полностью растворялись, осадок не выпадал.
Сначала готовили концентрированный раствор композиции доксорубицин – ОЭП-ингибитор для введения максимальной дозы, затем часть его разбавляли физиологическим раствором для получения более разбавленных растворов для введения меньших доз. Объем введения составлял 10 мл/кг.
После окончания периода адаптации животным подкожно имплантированы капсулы 17в-эстрадиола, и через 2 недели – клетки MCF7/Vinb в Матригеле (1:1, 200 мкл на мышь).
В день имплантации мышам клетки MCF7/Vinb открепили, промыли средой и суспендировали в физрастворе. Была приготовлена суспензия клеток с концентрацией 20 млн/мл. Клетки охладили во льду. Предварительно охлажденной пипеткой добавили объем Матригеля, равный объему суспензии клеток и плавно перемешали их. Таким образом, конечная концентрация клеток составила 10 млн/мл.
Суспензию клеток вводили мышам подкожно вдоль позвоночника (в районе правой лопатки) в объеме 0.2 мл (2 млн клеток) на мышь. Перед имплантацией клеток соответствующий участок кожи мышей выбривали и обрабатывали дезинфицирующим раствором АХД-2000.
3
После формирования опухолей, животных разделили на 7 экспериментальных групп, по 6-7 животных в каждой. Средний размер опухолей в группах составил ~250 мм.
Лечение животных исследуемыми препаратами начали на следующий день после рандомизации (рандомизация - это процесс случайного распределения участников эксперимента по группам или порядка предъявления им экспериментальных условий) по группам. Препараты вводили внутривенно 2 раза, один раз в 5 дней. Контрольной группе животных вводили растворитель в эквивалентном объеме. Дозы и группы животных указаны на Фиг.2 в Таблице 2.
Измерение подкожно имплантированных опухолей проводили 2 раза в неделю. Объем опухоли определяли по формуле:
2
3
р/6 x L x W=mm,
где L - соответствует наибольшему диаметру опухоли, W – наименьшему. Измерения проводили с помощью штангенциркуля.
Противоопухолевую активность исследуемых препаратов определяли по замедлению роста опухоли относительно опухолей в контрольной группе, получающей растворитель. Для этого рассчитывали значения торможения роста опухоли (ТРО):
ТРО=(С-Т) х100/С, %
где С – средний размер опухоли в контрольной группе, получавшей растворитель,          Т – размер опухоли в экспериментальной группе.
Также оценивали ингибирующий эффект препаратов по логарифму погибших клеток. Для этого оценивали среднее время удвоения в контрольной и экспериментальных группах. Логарифм числа погибших клеток оценивали по формуле:
Lg(n)=(Tk-To)/3.32Td,
где (Tk-To) – время задержки роста опухоли в опытной группе; Td – время удвоения размеров опухоли в контроле; 3.32 – число удвоений, необходимое для увеличения Lgn не менее чем в 2-4 раза.
3
2
Также следили за здоровьем и поведением животных, фиксировали число летальных исходов. Осмотр животных проводили в момент введения соединений, и далее дважды в день (утром и вечером) для регистрации смертности и общего состояния. Измерение веса животных проводили 2 раза в неделю. Согласно правилам гуманного обращения с животными, при достижении объема опухоли >2000 мм у 50% животных в группе, эвтаназировали всю группу. По окончании эксперимента все оставшиеся в живых животные были подвержены эвтаназии ингаляцией CO.
Анализ данных проводили с помощью программ Microsoft Office Excel 2007 и GraphPad Prizm 5.
На Фиг. 6 приведены размеры опухолей животных в экспериментальных группах до начала лечения. Модель характеризуется большой гетерогенностью по объему опухолей. На момент рандомизации средний размер опухолей между группами не отличался.
Исследуемые препараты вводили 2 раза в ходе исследования, один раз в 5 дней. После введения животные, получавшие доксорубицин в дозах 1 мг/кг и 5 мг/кг, а также комбинацию доксорубицин/ОЭП-ингибитор с эквивалентной дозой доксорубицина, проявляли дозозависимое снижение двигательной активности, наблюдалась сгорбленная поза, снижение потребления пищи. Разницы между состоянием животных, получавших доксорубицин и комбинацию доксорубицин/ОЭП-ингибитор с эквивалентной дозой доксорубицина, не обнаружено.
На Фиг. 7 приведены кривые роста опухолей в контрольной и экспериментальных группах. В связи с большим количеством групп, для облегчения восприятия результатов, рисунок разбит на 3 части (А-В)  в соответствии с дозами доксорубицина.
На Фиг. 8 показаны средние размеры опухолей в группах в дни 8 и 12.
Анализ Фиг.3 показал, что доксорубицин в дозах 0.5 и 1 мг/кг практически не влияет на рост опухолей молочной железы с множественной лекарственной устойчивостью, тогда как добавление ОЭП-ингибитора приводит к заметному увеличению его противоопухолевой активности на 30% в сравнении со свободной формой доксорубицина и на 43% и 30% относительно контрольной группы,  соответственно.
Максимальную эффективность комбинация доксорубицин/ОЭП-ингибитор показала в дозе 5/75 мг/кг.
На основе полученных размеров опухолей были рассчитаны значения торможения роста опухолей (ТРО) (Фиг.3, Таблица 3) и логарифм погибших клеток (Фиг. 4, Таблица 4). Анализ таблиц показал, что доксорубцин в дозах 0.5 и 1 мг/кг не оказывает влияния на рост ксенографтов молочной железы с приобретенной лекарственной устойчивостью. В дозе 5 мг/кг доксорубицин вызывает замедление роста опухоли.
Добавление доксорубицина к ОЭП-ингибитору в соотношении 1:15 вызывает заметное усиление противоопухолевого действия доксорубицина – комбинации доксорубицин/ОЭП-ингибитор в дозах 0.5/7.5 и 1/15 мг/кг оказали противоопухолевый эффект, сравнимый таковым доксорубицина в дозе 5 мг/кг. При этом необходимо отметить практически полное отсутствие гибели животных в группах с композицией доксорубицина с ОЭП-ингибитором 0.5/7.5 и 1/15 мг/кг (пало 1 животное в обеих группах), тогда как в группе доксорубицин 5 мг/кг погибло 50 % животных.
Наибольшего противоопухолевого эффекта удалось достичь при применении композиции доксорубицин/ОЭП-ингибитор в дозе 5/75 мг/кг – на 8-й день исследования средний размер опухоли в группе был статистически достоверно ниже группы контроля, значение ТРО ~64% (см. Фиг.3, Таблица 3).
На 12-й день исследования в  группе осталось только одно животное, что не позволяет говорить о статистической достоверности результатов на этом сроке; однако нужно отметить, что значение ТРО сохранилось на том же уровне, что и на день 8. Время удвоения клеток увеличилось в 1.5 раза по сравнению с контролем, логарифм погибших клеток – более чем в 5 раз (см. Фиг. 4 Таблица 4).
Таким образом, проведенный эксперимент, описанный в Примере 2, продемонстрировал, что добавление ОЭП-ингибитора к доксорубицину заметно усиливает противоопухолевое действия доксорубицина – комбинация доксорубицин/ОЭП-ингибитор в дозах 0.5/7.5 и 1/15 мг/кг оказала противоопухолевый эффект, сравнимый с таковым доксорубицина в дозе 5 мг/кг, при этом токсичность комбинации была значительно ниже
Таким образом, по мнению заявителя, следует подчеркнуть, что эффективность комбинации доксорубицин/ОЭП была продемонстрирована в эксперименте с агрессивным типом опухоли с фенотипом множественной лекарственной устойчивости, полученной в ходе инкубации клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 с известными противоопухолевыми препаратами винбластином и доксорубицином в течение 90 дней.  Подобные опухоли являются крайне трудными для лечения, и поэтому описанные выше результаты являются чрезвычайно обнадеживающими и очевидными для специалиста в данной области техники.
Пример 3. Изучение эффективности заявленной композиции на модели ксенографтов на кроликах.
В данном эксперименте исследовали влияние заявленной композиции на рост опухоли на модели ксенотрансплантации опухолей человека в переднюю камеру глаза кроликов, эффективность которой подробно описана в патенте РФ на изобретение №2638285 [18].
В ходе эксперимента осуществляли ксенотрансплантацию опухоли миксофибросаркомы человека в переднюю камеру глаза кроликов, затем оценивали изменение размеров трансплантированной опухоли в передней камере глаза кролика на фоне введения доксорубицина и ОЭП-ингибитора. Для этой оценки ксенотрансплантаты опухоли в передней камере глаза кроликов характеризовались морфологически; кроме того, проводилось морфометрическое исследование изменения количества виментин-позитивных (опухолевых) клеток в саркоме на 30 сутки после ксенотрансплантации.
В эксперименте использовали 36 кроликов обоих полов весом 2800-3500 г. Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и корму. Была исследована реакция ксенотрансплантированной миксофибросаркомы на вводимые фармакологические препараты. Животные были поделены на 4 группы по 9 кроликов в каждой группе (Фиг.5, Таблица 5).
Начиная со следующего дня после операции, всем животным начинали делать инъекции.
Кроликам контрольных групп вводили физиологический раствор в объёме 1 мл/кг.
Кроликам опытных групп внутрибрюшинно вводили раствор доксорубицина в возрастающей концентрации для исключения осложнений заживления травмированной роговицы. Первые две инъекции – 1 мг/кг, следующие две – 2 мг/кг и далее – 3 мг/кг.
В группе композиция  доксорубицин/ОЭП-ингибитор дополнительно вводили 1 мл раствора 0.8% ОЭП-ингибитора на один килограмм массы кролика.
Растворы исходных компонентов готовили на воде для инъекций.
У всех животных через сутки фотографировали трансплантированные фрагменты опухоли для оценки их изменений, а затем осуществляли подсчёт площади опухоли. Статистическую обработку осуществляли с использованием критерия Стьюдента.
После трансплантации размеры опухолей во всех группах начали возрастать.
В контрольной группе (без лечения) размер опухоли к 30 суткам увеличился на 39±4.2% (Р<0.05).
К 12 суткам после трансплантации в группе, получавшей доксорубицин, увеличение размера опухоли составило 48±4.7% (Р<0.05). После этого срока размеры опухоли достоверно не изменялись.
В группе животных, получавшей ОЭП-ингибитор,  размеры опухоли увеличились к 30 суткам на 9±1.6% (Р>0.05).
В группе животных, получавших композицию доксорубицина/ОЭП-ингибитора, ксенотрансплантированная опухоль не изменяла размер до 12 суток, но в дальнейшем стала уменьшаться и к 30 суткам сократилась по сравнению с исходным размером в среднем в 2.5 раза (Р<0.05) (Фиг. 10).
Морфологическое исследование во всех группах показало врастание опухоли в область травмы роговицы, отсутствие кровеносных сосудов и очаги некроза (Фиг. 11 и 12).
Через 30 суток после операции у животных были выделены трансплантаты и фиксированы в 10% формалине. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином или проводили иммуногистохимическое выявление виментин-позитивных (опухолевых) клеток.
Для выявления экспрессии виментина (разведение 1:100), маркера фиброзно-соединительной ткани, использовали непрямой иммунопероксидазный метод и моноклональные кроличьи (мышиные) антитела, применяя набор LSAB-kit (DAKO, Дания). Виментин экспрессируется клетками опухолей соединительной ткани (саркомы), а учитывая, что в эксперименте были использованы антитела, связывающиеся только с человеческими антигенами, то виментин служит для выявления ксенотрансплантированных опухолевых клеток. Иммуногистохимический анализ проводился на срезах толщиной 4 мкм. Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали, после чего помещали в раствор фосфатного буфера (рН 7.4). Затем блокировали эндогенную пероксидазную активность, поместив срезы на 40 минут в 1% раствор перекиси водорода. Отмывали в фосфатном буфере в 2 смены по 3-5 минут.
Удаляли лишнюю жидкость вокруг срезов и раскапывали на срезы каждой из групп соответствующие данной группе антитела к виментину. Инкубировали во влажной прохладной камере 12 часов. Отмывали в фосфатном буфере в 2 смены по 3-5 минут. Раскапывали вторичные антитела, конъюгированные с биотином. Инкубировали 40 мин. Промывали в 2 сменах фосфатного буфера. Удаляли излишки жидкости вокруг срезов и раскапывали стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена. Инкубировали 40 минут. Промывали в 2 сменах фосфатного буфера. Удаляли лишнюю жидкость вокруг срезов. Визуализацию иммуногистохимических реакций осуществляли раствором, содержащим аминоэтилкорбазол и перекись водорода в ацетатном буфере (рН 6.4). В результате взаимодействия перекиси водорода с пероксидазой хрена выделяется атомарный кислород, который, окисляя аминоэтилкорбазол, переводит его в нерастворимое состояние. Таким образом, осадок красного цвета (аминоэтилкорбазола) свидетельствует об экспрессии в срезах виментина. Заключали срезы в глицерин-желатину. Виментин-позитивные клетки (опухолевые) подсчитывали в 3 различных полях зрения и получали среднее значение. Статистическую обработку осуществляли с использованием критерия Стьюдента.
На срезах ксенотрансплантатов позитивная иммуногистохимическая реакция с антителами против виментина  определяется в цитоплазме клеток. Учитывая, что используемые антитела реагируют только с антигенами человека, то выявленные виментин-позитивные клетки являются трансплантированными опухолевыми клетками.
На фоне введения доксорубицина к 30 суткам после ксенотрансплантации количество виментин-позитивных клеток снижается более чем в 6 раз (Фиг. 13 и 14).
К этому сроку при введении композиции доксорубицина/ОЭП-ингибитора в большинстве гистологических препаратов виментин-позитивные клетки не определяются, а в оставшихся имеются только единичные (Фиг. 15 и 16).
В рамках описанного исследования было установлено, что на заключительном этапе химиотерапии доксорубицином (30 сутки) размеры ксенотрансплантированной миксофибросаркомы не отличаются от контроля, но при этом количество опухолевых клеток уменьшается на 84% по сравнению с контролем.
Композиция доксорубицина и ОЭП-ингибитора приводит к уменьшению размеров опухоли в 3.3 раза по сравнению с контролем. При этом, согласно результатам иммуногистохимических исследований, лишь в некоторых образцах присутствуют единичные опухолевые клетки.
Таким образом, в описанном эксперименте композиция доксорубицина и ОЭП-ингибитора существенно превосходит по своему противоопухолевому эффекту на ксенотрансплантированной опухоли в передней камере глаза кролика доксорубицин, применяемый отдельно.
Достигнутый результат является неочевидным для специалиста и основан на синергетическом взаимодействии противоопухолевого препарата и ОЭП-ингибитора.
Таким образом, результаты экспериментов, описанных в Примерах 1-3, позволяют сделать логическое умозаключение о том, что заявителем достигнуты поставленные цели и заявленный технический результат, а именно – создана эффективная противоопухолеваяй композиция доксорубицина с представителем нового класса ОЭП-ингибитора (полученного заявителем по патенту РФ №2641304), позволяющая существенно увеличить эффективность и безопасность действия противоопухолевого препарата доксорубицина.
Полученная композиция противоопухолевого препарата доксорубицина и ОЭП-ингибитора обеспечивает реализацию поставленных целей, а именно - достигнуто:
- повышение эффективности действия доксорубицина, в том числе для преодоления множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Комбинация доксорубицин/ОЭП-ингибитор в дозах 0.5/7.5 и 1/15 мг/кг оказала противоопухолевый эффект, сравнимый с таковым доксорубицина в дозе 5 мг/ кг (см. Фиг.3, Таблица 3). ТРО на 12 день исследования составило 42.7%, 26.5% и 35.7% соответственно и логарифм погибших клеток в этот период составил 0.224 во всех трех случаях (см. Фиг.4, Таблица 4). При этом в группах со свободной формой доксорубицина в дозах 0,5 мг/кг и 1 мг/кг ТРО составило 11.4% и 1.1%, а логарифм погибших клеток 0.075 и 0.037 соответственно;
- повышение безопасности химиотерапии опухолей. Необходимо отметить практически полное отсутствие гибели животных в группах доксорубицин/ОЭП-ингибитор 0.5/7.5 и 1/15 мг/кг (пало 1 животное в обеих группах), тогда как в группе доксорубицин 5 мг/кг погибло 50 % животных. Гибель: контроль – 0/7, докс 0.5 – 0/6, докс 1 – 0/7, докс 5 – 3/6, ОЭП+докс 0.5 - 1/7, ОЭП+докс 1 – 1/6, ОЭП+докс 5 -  5/6.
- устранение токсических реакций клеток и тем самым обеспечение создания базиса для создания  эффективных лекарственных форм для химиотерапии больных с множественной лекарственной устойчивостью.
Заявленное техническое решение, основанное на применении композиции доксорубицина и нового ОЭП-ингибитора, позволяет решать спектр задач в химиотерапии злокачественных опухолей, которые ранее не могли быть решены при помощи доксорубицина, взятого отдельно, или других существующих на момент подачи заявки средств химиотерапии, в силу чего заявленное техническое решение обеспечивает возможность разрешения практически не разрешимых до даты подачи настоящей заявки проблем, а именно - обеспечена возможность повышения эффективности лечения раковых клеток in vitro в 1,5 – 54 раза для 10 опухолевых линий, для CaCo-2 в 307 раз, in vivo комбинация доксорубицин/ОЭП-ингибитор – в 5-10 раз в сравнении со свободной формой доксорубицина, этом токсичность комбинации была значительно ниже. Этот факт доказывает наличие изобретательского уровня.
Наиболее важной характеристикой заявленного решения является то, что предлагаемая композиция позволяют существенно увеличить эффективность и безопасность действия противоопухолевого препарата доксорубицин, причем даже в отношении наиболее агрессивных видов злокачественных опухолей, обладающих множественной лекарственной устойчивостью. При этом, вероятно, следует обратить внимание на то, что основываясь на заявленном техническом решении, представляется возможным проводить различного рода модификации и/или изменения на базе заявленного решения, не выходя за объём патентных притязаний.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного уровня техники не выявлены технические решения, обладающие заявленной совокупностью отличительных признаков, обеспечивающих достижение заявленных результатов.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, так как не является очевидным для специалиста в данной области науки и техники.
Заявленное техническое решение удовлетворяет критерию «промышленная применимость», так как может быть многократно повторено и использовано для создания химиотерапевтических препаратов и воспроизведено в производственных условиях с использованием стандартного оборудования и известных технологических процессов.
Список использованных источников
1. Choi, Y.H. ABC transporters in multidrug resistance and pharmacokinetics, and strategies for drug development / Y.H. Choi, A.M. Yu // Curr. Pharm. Des. 20 (2014) 793–807.
2. Tiwari, A.K. Revisiting the ABCs of multidrug resistance in cancer chemotherapy,/ A.K. Tiwari, K. Sodani, C.L. Dai, C.R. Ashby Jr., Z.S. Chen // Curr. Pharm. Biotechnol. 12 (2011) 570–594.
3. Chen, Z. Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding cassette (ABC) family in multidrug resistance: A review of the past decade / Z. Chen, T. Shi, L. Zhang, P. Zhu, M. Deng, C. Huang, T. Hu et al. // Cancer Letters 370 (2016) 153–164.
4. Daenen, S. Addition of cyclosporin A to the combination of mitoxantrone and etoposide to overcome resistance to chemotherapy in refractory or relapsing acute myeloid leukaemia: a randomised phase II trial from HOVON, the Dutch-Belgian Haemato-Oncology Working Group for adults / S. Daenen, B. van der Holt, G.E. Verhoef, B. Lowenberg, P.W. Wijermans, P.C. Huijgens, et al. // Leuk. Res. 28 (2004) 1057–1067.
5. List, A.F. Benefit of cyclosporine modulation of drug resistance in patients with poor-risk acute myeloid leukemia: a Southwest Oncology Group study / A.F. List, K.J. Kopecky, C.L. Willman, D.R. Head, D.L. Persons, M.L. Slovak, et al. //Blood 98 (2001) 3212–3220.
6. Binkhathlan, Z. Encapsulation of P-glycoprotein inhibitors by polymeric micelles can reduce their pharmacokinetic interactions with doxorubicin / Z. Binkhathlan, A. Shayeganpour, D.R. Brocks, A. Lavasanifar  // Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (2012) 142–148.
7. Lehne, G., Dzieglewska, H.E. Use of P-glycoprotein (Pgp) inhibitors in the treatment of cancer. WO 1999017757.
8. Kolitz, J.E. Dose escalation studies of cytarabine, daunorubicin, and etoposide with and without multidrug resistance modulation with PSC-833 in untreated adults with acute myeloid leukemia younger than 60 years: final induction results of Cancer and Leukemia Group B Study 9621 / J.E. Kolitz, S.L. George, R.K. Dodge, D.D. Hurd, B.L. Powell, S.L. Allen, et al. //J. Clin. Oncol. 22 (2004) 4290–4301.
9. Bramwell, V.H. Safety and efficacy of the multidrug-resistance inhibitor biricodar (VX-710) with concurrent doxorubicin in patients with anthracycline-resistant advanced soft tissue sarcoma / V.H. Bramwell, D. Morris, D.S. Ernst, I. Hings, M. Blackstein, P.M. Venner, et al. // Clin. Cancer Res. 8 (2002) 383–393.
10. Gandhi, L. A phase II study of the safety and efficacy of the multidrug resistance inhibitor VX-710 combined with doxorubicin and vincristine in patients with recurrent small cell lung cancer / L. Gandhi, M.W. Harding, M. Neubauer, C.J. Langer, M. Moore, H.J. Ross, et al. // Cancer 109 (2007) 924–932.
11. Kolitz, J.E. P-glycoprotein inhibition using valspodar (PSC-833) does not improve outcomes for patients younger than age 60 years with newly diagnosed acute myeloid leukemia: Cancer and Leukemia Group B study 19808 / J.E. Kolitz, S.L. George, G. Marcucci, R. Vij, B.L. Powell, S.L. Allen, et al. // Blood 116 (2010) 1413–1421.
12. Cripe, L.D. Zosuquidar, a novel modulator of P-glycoprotein, does not improve the outcome of older patients with newly diagnosed acute myeloid leukemia: a randomized, placebo-controlled trial of the Eastern Cooperative Oncology Group 3999 / L.D. Cripe, H. Uno, E.M. Paietta, M.R. Litzow, R.P. Ketterling, J.M. Bennett, et al. // Blood 116 (2010) 4077–4085.
13. Khan, M. Enhancing Activity of Anticancer Drugs in Multidrug Resistant Tumors by Modulating P-Glycoprotein through Dietary Nutraceuticals / M. Khan, A. Maryam, T. Mehmood, Y. Zhang, T. Ma. // Asian Pac J Cancer Prev, 16 (16), 6831-6839.
14. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications / R.I. Freshney, editor, 6th Edition. - Wiley-Liss, Inc., 2010.
15. Cory, A.H. Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture / A.H. Cory, T.C. Owen, J.A. Barltrop, J.G. Cory // Cancer communications. 3 (1991) 207-212.
16. Bertazzoli, C. Experimental systemic toxicology of 4'-epidoxorubicin, a new, less cardiotoxic anthracycline antitumor agent / Bertazzoli C, Rovero C, Ballerini L, Lux B, Balconi F, Antongiovanni V, Magrini U. // Toxicol Appl Pharmacol. 79 (1985) 412-422.
17. Kratz, F. Acute and repeat-dose toxicity studies of the (6-maleimidocaproyl)hydrazone derivative of doxorubicin (DOXO-EMCH), an albumin-binding prodrug of the anticancer agent doxorubicin / Kratz F, Ehling G, Kauffmann HM, Unger C. // Hum Exp Toxicol. 26 (2007) 19-35.
51
18. Способ оценки эффективности воздействия химиотерапевтических препаратов ксенотрансплантатной модели in vivo : пат. 2638285  Рос. Федерация: МПК G09B 23/28 / И.С. Рагинов, Ю.Г. Штырлин,  М.В. Бурмистров и др.; патентообладатель федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ). – 2016134112, заявл.  19.08.2016  опубл. 12.12.2017,  Бюл. № 2.
51
19. Ингибитор АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток и способ его получения: пат. 2641304 Рос. Федерация: МПК C07C 43/11, A61K 31/08, C07C 41/03 / Ю.Г. Штырлин,  А.Г. Иксанова,  Ю.В. Бадеев, К.В. Балакин; патентообладатель федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ). – 2016143074, заявл.  02.11.2016  опубл. 17.01.2018,  Бюл. № 2.
20. а) Giuliani, F. C. Therapeutic response of human tumor xenografts in athymic mice to
Doxorubicin / F. C.,Giuliani, K. A. Zirvi, N. O. Kaplan// Cancer Res. 41 (1981) 325-335;
b) Bagalkot, V.  A combined chemoimmunotherapy approach using a plasmid - Doxorubicin complex/ V. Bagalkot, In-Hyun Lee, Mi K. Yu, E. Lee, et al // Molec. Pharm. 6 (2009) 1019-1028;
c) McCarthy, M. In vivo anticancer synergy mechanism of doxorubicin and verapamil
combination treatment is impaired in BALB/c mice with metastatic
breast cancer/   M. McCarthy, G/ Auda, S.Agrawal, et al //Exp Mol Pathol 97 (2014) 6-15;
d) Bao, L. Increased Expression of P-Glycoprotein Is Associated with Doxorubicin Chemoresistance in the Metastatic 4T1 Breast Cancer Model/L.Bao, A. Haque, K. Jackson, et al// AJP178 (2011) 838-852;
е)  Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств, Часть 1, под ред. Миронова А.Н.// М., 2012, с.1610.