РЕВАСКУЛЯРИЗАЦИЯ ИШЕМИЧЕСКОЙ ТКАНИ СЕТЧАТКИ И СПОСОБ ЕЕ СКРИНИНГА
REVASCULARISATION OF ISCHEMIC RETINAL TISSUE AND SCREENING TECHNIQUE

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
По данной заявке испрашивается приоритет согласно предварительной заявке на патент США No. 60/655732, поданной 24 февраля 2005г., которая включена в настоящий документ посредством ссылки.
ЗАЯВЛЕНИЕ ИНТЕРЕСА ПРАВИТЕЛЬСТВА
Часть работы, описанной в данном документе, была поддержана грантом № EY11254 и грантом № EY14174 от National Institutes of Health. Правительство США обладает определенными правами на данное изобретение.
ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к лечению неоваскулярных заболеваний сетчатки. Конкретнее настоящее изобретение относится к способам стимулирования реваскуляризации сетчатки путем введения пациенту фрагмента ангиостатического белка и к способам скрининга, позволяющим выявить терапевтические средства для лечения сосудистых заболеваний сетчатки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Сосудистые заболевания сетчатки, включая диабетическую ретинопатию, экссудативную возрастную дегенерацию желтого пятна (ARMD), ретинопатию недоношенных (ROP) и окклюзию сосудов, являются основными причинами ухудшения зрения и слепоты. Эта группа заболеваний находится в центре интенсивного изучения, направленного на то, чтобы определить новые методики лечения, которые помогут предотвратить или модифицировать патологическую неоваскуляризацию глаза. Например, ARMD поражено 12-15 миллионов американцев старше 65 лет, у 10-15% больных наступает потеря зрения в результате прямого влияния неоваскуляризации сосудистой оболочки глаза (субретинальной неоваскуляризации). Ведущей причиной потери зрения для американцев моложе 65 лет является диабет; 16 миллионов людей в США больны диабетом, и 40 000 ежегодно страдают от глазных осложнений данного заболевания, которые часто служат результатом неоваскуляризации сетчатки. Хотя лазерная фотокоагуляция эффективно предотвращает тяжелую потерю зрения в подгруппах высокого риска среди больных диабетом, общая 10-летняя заболеваемость ретинопатией по существу не меняется. У пациентов с неоваскуляризацией сосудистой оболочки глаза, вызванной ARMD или воспалительными заболеваниями, такими как гистоплазмоз глаз, фотокоагуляция, за немногими исключениями, неэффективна в предотвращении потери зрения. Хотя недавно разработанная неразрушающая фотодинамическая терапия обещает временно снизить индивидуальную потерю зрения у больных с ранее не поддававшейся лечению неоваскуляризацией сосудистой оболочки глаза, зрение улучшается или стабилизируется только у 61,4% пациентов, получающих лечение каждые 3-4 месяца, по сравнению с 45,9% в группе плацебо.
Возрастная дегенерация желтого пятна и диабетическая ретинопатия - ведущие причины потери зрения в промышленно развитых странах, и потеря зрения при них происходит в результате патологической неоваскуляризации сетчатки. Поскольку сетчатка состоит из ясно очерченных слоев нейронных, глиальных и сосудистых элементов, относительно мелкие нарушения, такие как наблюдающиеся при пролиферации сосудов или отеке, могут привести к существенному снижению зрения. Наследственные дегенерации сетчатки, такие как пигментный ретинит (RP), тоже связаны с сосудистыми расстройствами, такими как сужение артериол и атрофия сосудистой. Хотя достигнуты существенные успехи в идентификации факторов, которые стимулируют и ингибируют ангиогенез, способов специфического лечения сосудистых заболеваний глаза в настоящее время не существует.
Retinitis Pigmentosa,
et al.
Science
et al.
EMBOJ.
rds
rds
et al.
Nat. Genet.
rds
et al.
J. Virol
et al.
Nat. Genet.
Наследственные дегенерации сетчатки поражают 1 из 3500 людей и характеризуются прогрессирующим ухудшением сумеречного зрения, выпадением части поля зрения, атрофией зрительного нерва, сужением артериол, нарушением проницаемости сосудов и снижением центрального зрения, часто прогрессирующим до полной слепоты (Heckenlively, J. R., editor, 1988; Philadelphia: JB Lippincott Co.). Молекулярный генетический анализ этих заболеваний выявил мутации более чем в 110 различных генах, ответственных за заболевание относительно небольшого процента больных (Humphries 1992, 256:804-808; Farrar 2002, 21:857-864). Многие из этих мутаций связаны с ферментными и структурными компонентами механизма превращения света, включая родопсин, фосфодиэстеразу цГМФ, периферин и RPE65. Несмотря на эти наблюдения, все еще нет эффективного лечения, замедляющего или обращающего вспять прогрессирование этих дегенеративных заболеваний сетчатки. Недавние успехи генотерапии привели к успешному обратному развитию фенотипов (Ali 2000, 25:306-310) и (Takahashi 1999, 73:7812-7816) у мышей и фенотипа RPE65 у собак (Acland 2001, 28:92-95), когда трансген дикого типа доставлялся в зрительные рецепторы или пигментный эпителий сетчатки (RPE) животных со специфичной мутацией.
Ангиогенез - это процесс, посредством которого формируются новые кровеносные сосуды. В ответ на специфичные химические сигналы от существующего сосуда отрастают капилляры, размер которых в конечном счете увеличивается в зависимости от потребности организма. Первоначально эндотелиальные клетки, которые выстилают кровеносные сосуды, размножаются в направлении, ортогональном к существующему сосуду, образуя вырост, не имеющий полости. Затем в соседних эндотелиальных клетках образуются большие вакуоли, и клетки перестраивают так, что вакуоли выстраиваются «конец в конец» и в конечном счете сливаются с образованием полости нового капилляра (формированием трубки).
Ангиогенез стимулируется рядом условий, таких как ответ на рану, и сопровождает рост фактически всех тканей в организмах позвоночных, таких как млекопитающие. Ангиогенез также участвует в определенных патологических состояниях, таких как диабетическая ретинопатия и определенные злокачественные опухоли. Для роста опухолей, например, требуется рост кровеносных сосудов, обеспечивающих доставку кислорода и питательных веществ к ткани растущей опухоли.
Если вмешаться в химические сигналы, которые стимулируют процесс ангиогенеза, ангиогенез можно остановить или ингибировать. Например, ангиогенные эндотелиальные клетки вырабатывают протеазы, переваривающие базальную мембрану, которая окружает кровеносные сосуды, таким образом очищая путь для нового капилляра. Ингибирование действия или образования этих протеаз может препятствовать формированию нового сосуда. Аналогично эндотелиальные клетки пролиферируют в ответ на химические сигналы. Особенно важные сигналы пролиферации включают семейства белков фактора роста эндотелия (VEGF) и фактора роста фибробластов (FGF). Доказано, что VEGF участвует в васкуляризации определенных опухолей. Вмешательство в эти процессы передачи сигналов пролиферации также может ингибировать ангиогенез.
В ангиогенезе участвуют несколько факторов. Молекулы и кислого, и щелочного фактора роста фибробластов служат митогенами для эндотелиальных клеток и других типов клеток. Высокоселективным митогеном для эндотелиальных клеток сосудов служит фактор роста эндотелия (VEGF).
У здорового взрослого ангиогенез жестко регулируется и ограничен заживлением ран, беременностью и циклическими изменениями матки. Ангиогенез запускает специфичные ангиогенные молекулы, такие как щелочной и кислый фактор роста фибробластов (FGF), VEGF, ангиогенин, трансформирующий фактор роста (TGF), фактор некроза опухолей α (ФНО-α) и тромбоцитарный фактор роста (PDGF). Ангиогенез может подавляться ингибирующими молекулами, такими как интерферон-α, тромбоспондин-1, ангиостатин и эндостатин. Именно баланс этих природных стимуляторов и ингибиторов управляет капиллярной сосудистой сетью, обычно находящейся в состоянии покоя. Если этот баланс расстроен, как при определенных патологических состояниях, стимулируется пролиферация, миграция и в конечном счете дифференцировка эндотелиальных клеток капилляров.
Ангиогенез играет центральную роль в ряде заболеваний, включая рак и неоваскуляризацию глаза. Также показано, что постоянный рост и метастазирование ряда опухолей зависят от врастания новых кровеносных сосудов хозяина в опухоль в ответ на ангиогенные факторы, выделяемые опухолью. Пролиферация новых кровеносных сосудов в ответ на ряд стимулов служит основным проявлением большинства глазных болезней и вызывает слепоту, в том числе при пролиферативной диабетической ретинопатии, ARMD, неоваскулярной глаукоме, интерстициальном кератите и ретинопатии недоношенных. При этих заболеваниях повреждение ткани может стимулировать высвобождение ангиогенных факторов, приводящих к пролиферации капилляров. VEGF играет доминирующую роль в неоваскуляризации радужной оболочки и неоваскулярных ретинопатиях. Хотя в сообщениях ясно показана корреляция между внутриглазными уровнями VEGF и ишемической ретинопатической неоваскуляризацией глаза, FGF, вероятно, тоже играет роль. Известно, что щелочной и кислый FGF присутствуют в нормальной сетчатке взрослого, хотя их определимые уровни не всегда коррелируют с неоваскуляризацией. В значительной степени это может объясняться тем, что FGF очень прочно связан с заряженными компонентами внеклеточного матрикса и малодоступен в свободно диффундирующей форме, которую можно обнаружить при стандартных исследованиях внутриглазных жидкостей.
ν
3
ν
3
ν
5
ν
3
ν
5
ν
ν
3
ν
5
ν
3
ν
3
ν
5
В общем конечном пути ангиогенной реакции участвует опосредованный интегринами информационный обмен между пролиферирующей эндотелиальной клеткой сосуда и внеклеточным матриксом. Этот класс рецепторов адгезии, названных интегринами, экспрессируется в виде гетеродимеров, имеющих α- и β-субъединицу, на всех клетках. Один такой интегрин, αβ, является самым разносторонним членом этого семейства и позволяет эндотелиальным клеткам взаимодействовать с самыми разнообразными компонентами внеклеточного матрикса. Пептидные антагонисты и антитела-антагонисты этого интегрина ингибируют ангиогенез путем селективной стимуляции апоптоза пролиферирующих сосудистых эндотелиальных клеток. Существуют два зависимых от цитокинов пути ангиогенеза, которые можно охарактеризовать по их зависимости от различных интегринов клеток сосудов, αβ и αβ. Конкретнее, ангиогенез, индуцируемый щелочным FGF, и ангиогенез, индуцируемый VEGF, зависят от интегринов αβ и αβ соответственно, поскольку антитела-антагонисты каждого интегрина селективно блокируют один из этих путей ангиогенеза в модели роговицы кролика и модели хориоаллантоисной мембраны (CAM). Пептидные антагонисты, которые блокируют все α-интегрины, ингибируют ангиогенез, стимулируемый FGF и VEGF. Хотя в норме кровеносные сосуды глаза человека не экспрессируют ни один интегрин, αβ и αβ интегрины селективно экспрессируются на кровеносных сосудах в тканях пациентов с активным неоваскулярным глазным заболеванием. Хотя только αβ последовательно определяется в ткани пациентов с ARMD, оба интегрина, αβ и αβ, присутствуют в тканях пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией. Системно введенные пептидные антагонисты интегринов блокируют образование новых кровеносных сосудов на мышиной модели образования и развития сосудов сетчатки.
Тестирование потенциальных средств для лечения неоваскулярных заболеваний сетчатки намного упростилось благодаря созданию моделей ретинопатии, вызванной кислородом (OIR), использующих нескольких видов животных, включая котят, щенков породы бигль, крыс и мышей. У каждой из этих моделей воздействие на новорожденных животных гипероксии (или чередования гипероксии и гипоксии) вызывает регресс или задержку развития сосудов сетчатки, за чем следует патологический ангиогенез после возвращения к нормальному уровню кислорода. Эти модели отражают события, которые происходят при ретинопатии недоношенных (ROP) - состоянии, в развитии которого участвует патологическая неоваскуляризация и которое может поражать недоношенных детей.
За последнее десятилетие мышиная модель OIR стала самой распространенной моделью для изучения патологического ангиогенеза, связанного с ретинопатиями, вызванными кислородом. Характер сосудистых расстройств в этой модели слегка отличается от наблюдаемого при ROP; у мыши вслед за воздействием гипероксии аваскулярным становится центральный, задний участок сетчатки, в то время как у детей аваскулярной становится периферия. Тем не менее это общепринятая модель для изучения механизмов заболевания и потенциального лечения ретинопатии, вызванной гипоксией, и изменения сосудов на этой модели очень последовательны, воспроизводимы и измеримы. В последние годы применение этой модели распространилось на общее исследование ишемических васкулопатий и связанных с ними антиангиогенных вмешательств, и теперь она широко используется как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях.
Исторически распространенный метод количественного определения пролиферативного неоваскулярного ответа на мышиной модели OIR основан на подсчете количества клеток, связанных с новообразованными сосудами, отходящими от сетчатки в стекловидное тело («ядер, залегающих перед внутренней пограничной мембраной (ILM)»). Количество клеток подсчитывают на сагиттальных поперечных срезах, обычно в областях вблизи диска зрительного нерва (но не включая сам диск). Метод очень трудоемок, отнимает много времени и сопряжен с некоторыми трудностями, включая потребность дифференцировать клетки патологических сосудов от клеток гиалоидных сосудов в стекловидном теле. Поскольку, в целом, исследуется только каждый 30-й последовательный срез, значительная часть ткани не оценивается количественно, что потенциально вводит ошибки, связанные с выбором срезов. Кроме того, поскольку глаз целиком подвергается разделению на срезы, это препятствует оценке того же самого глаза на другой важный параметр данной модели, а именно протяженность облитерации сосудов и скорость реваскуляризации сетчатки, которая происходит одновременно с патологическим формированием новообразованных сосудов. Этот параметр лучше всего оценивается на препаратах цельной сетчатки.
Соответственно, сохраняется потребность в усовершенствованных способах лечения неоваскулярных заболеваний сетчатки и в том, чтобы оценить терапевтическую эффективность такого лечения на цельной сетчатке. Способы по настоящему изобретению удовлетворяют этим потребностям.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу лечения, способствующему физиологической реваскуляризации ишемической ткани сетчатки. Способ предусматривает введение млекопитающему, страдающему от ишемии сетчатки, терапевтически эффективного количества ангиостатического фрагмента триптофанил-тРНК синтетазы (TrpRS), посредством чего одновременно ингибируется патологическая неоваскуляризация сетчатки и стимулируется благоприятная физиологическая реваскуляризация поврежденных областей сетчатки. В предпочтительном варианте осуществления ангиостатический фрагмент TrpRS представляет собой фрагмент T2. Предпочтительно млекопитающее является пациентом - человеком, страдающим от ишемии сетчатки.
Способ лечения по настоящему изобретению применим для лечения ишемических и неоваскулярных заболеваний глаза, ишемических ретинопатий, включая такие как диабетическая ретинопатия, ретинопатия недоношенных и тому подобные.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу скрининга для выявления и оценки терапевтической эффективности потенциальных терапевтических средств для лечения неоваскулярных заболеваний сетчатки. Способ предусматривает воздействие на новорожденную мышь, предпочтительно в возрасте около 7 дней, гипероксии на время, достаточное, чтобы вызвать измеримый регресс сосудистой сети сетчатки, предпочтительно приблизительно 5 дней, и последующее возвращение мышей к нормоксии. После возвращения к нормоксии в глаз мыши вводится потенциальное терапевтическое средство. Из подвергшегося лечению глаза изымают сетчатку целиком, предпочтительно спустя приблизительно 5 дней после возвращения к нормоксии. По существу цельную сетчатку также изымают из контрольного глаза той же самой мыши или мыши того же самого возраста, подвергнутой воздействию того же уровня гипероксии в течение того же времени. В контрольный глаз вместо потенциального терапевтического средства предпочтительно вводят буферный или физиологический раствор. Кровеносные сосуды подвергшейся лечению и контрольной сетчаток окрашивают для облегчения идентификации и визуализации. Получают микрографические изображения по существу всей окрашенной сетчатки, чтобы визуализировать площадь облитерации сосудов, вызванной гипероксией, и площадь преретинальных новообразованных сосудов, которые формируются после возвращения к нормоксии. Микрографические изображения затем анализируют, чтобы оценить площадь облитерации сосудов, вызванной гипероксическими условиями, и оценить распространенность патологической неоваскуляризации, которая возникает после возвращения к нормоксии. Эффективность потенциального терапевтического средства оценивают путем сравнении области облитерации сосудов в глазах, подвергшихся лечению, и контрольных глазах и путем сравнения площади преретинальных новообразованных сосудов в глазах, подвергшихся лечению, и контрольных глазах. Показателем распространенности патологической неоваскуляризации служит площадь сетчатки с преретинальными новообразованными сосудами в леченых глазах по сравнению с контрольными глазами. Уменьшение площади преретинальных новообразованных сосудов указывает на ангиостатическую активность, то есть на то, что средство ингибирует патологическую неоваскуляризацию. Реваскуляризацию оценивают, сравнивая площадь облитерации сосудов в леченых и контрольных глазах. Сокращение площади облитерации сосудов в леченых глазах по сравнению с контрольными указывает на то, что терапевтическое средство вызывает благоприятную физиологическую реваскуляризацию поврежденных сетчаток.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 изображены микрофотографические монтажи окрашенных цельных сетчаток новорожденных мышей, иллюстрирующие нормальное развитие сосудистой сети в глазу мыши после рождения, с 9-дневного (P9) до 22-дневного (P22) возраста. Панели A, Β и C иллюстрируют сосудистую сеть в P9, Ρ18 и P22 соответственно, визуализированную путем окрашивании перфузией FITC-декстрана. Панели D, Ε и F иллюстрируют сосудистую сеть в дни P9, Р18 и P22 соответственно, визуализированную путем окрашивания лектином GS.
На фиг. 2 изображены микрофотографические монтажи и графики, иллюстрирующие развитие сосудистой сети сетчатки у новорожденных мышей, подвергнутых воздействию гипероксии в период с P7 по Ρ12. Панели A, B и C являются микрофотографиями, показывающими области облитерации сосудов. Панель D (верхний график) является графиком площади сетчатки в зависимости от возраста. Панель D (нижний график) является графиком площади облитерации сосудов в зависимости от возраста. Панель Ε является графиком рассеяния, показывающим корреляцию площади сетчатки левого глаза с площадью сетчатки правого глаза. Панель F является графиком рассеяния, показывающим корреляцию площади облитерированных сосудов левого глаза с площадью облитерированных сосудов правого глаза. Панель G - это гистограмма, показывающая малую изменчивость от наблюдателя к наблюдателю измеренной площади облитерации сосудов для 6 различных сетчаток, выделенных в различных возрастах, измеренных 4 различными наблюдателями согласно способу скрининга по изобретению.
На фиг. 3 изображены микрофотографии и графики, иллюстрирующие развитие преретинальных новообразованных сосудов у новорожденных мышей, подвергнутых воздействию гипероксии в период с P7 по Ρ12. Панели A-F представляют собой микрофотографии, из которых панель A показывает преретинальные новообразованные сосуды (яркие участки). На панели Β показано изображение с панели А с новообразованными сосудами, окрашенными красным. На панели С показано, что области новообразованных сосудов перфузируются только частично - пучки сосудов, связанные с основной сосудистой сетью, окрашены зеленым. На панели D показано, что окрашенные изолектином GS преимущественно CD31-положительные (зеленый цвет), что указывает на их сосудистое происхождение. Панель Ε показывает, что среди CD31-положительных новообразованных сосудов присутствуют некоторые клетки макрофагального (зеленого) происхождения. Панель G - это график, показывающий новообразование сосудов как функцию возраста. Панель Η показывает корреляцию площади новообразованного сосуда правого глаза и левого глаза. Панель I - гистограмма, иллюстрирующая низкую вариабельность от наблюдателя к наблюдателю определения площади новообразованных сосудов согласно способу скрининга по изобретению. Панель J показывает корреляцию между площадью пучка, который измерен способом скрининга по изобретению, по сравнению с известным из уровня техники трудоемким способом поперечных срезов для измерения пре-ILM ядер.
На фиг. 4 изображены микрофотографии и графики, иллюстрирующие количественное определение площади облитерации сосудов и площади преретинальных новообразованных сосудов у новорожденных мышей, подвергнутых воздействию гипероксии в период с P7 по Ρ12, согласно способу скрининга по изобретению. Панель A (верхнее правое изображение): показывает площадь облитерации сосудов в контрольном глазу мыши, подвергнутой воздействию к гипероксии согласно способу скрининга по изобретению; (верхнее среднее изображение) показывает площадь новообразованных сосудов (красные) в контрольном глазу мыши; (верхнее левое изображение) поперечный разрез контрольной сетчатки, показывающий пре-ILM ядра (стрелки). Панель B (правое нижнее изображение): показывает площадь облитерации сосудов в глазу мыши, подвергнутой воздействию гипероксии и подвергшейся лечению ингибитором iNOS согласно способу скрининга по изобретению; (нижнее среднее изображение) показывает площадь новообразованных сосудов (красные) в глазу мыши, подвергнутом лечению; (нижнее левое изображение) представляет собой поперечный разрез леченой сетчатки, показывающий пре-ILM ядра (стрелки). Панель B (левый график): сравнивает площадь облитерации сосудов в контрольном глазу против глаза, подвергнутого лечению iNOS; (средний график) сравнивает площадь новообразованных сосудов для контрольного глаза против глаза, подвергнутого лечению iNOS; (правый график) сравнивает количество пре-ILM ядер для контрольного глаза против глаза, подвергнутого лечению iNOS.
На фиг. 5 изображены микрофотографии и графики, иллюстрирующие количественное определение благоприятного влияния ангиостатического фрагмента TrpRS на облитерацию сосудов и формирование пучков сосудов у новорожденных мышей, подвергнутых воздействию гипероксии в период с P7 по Ρ12 согласно способу скрининга по изобретению. Панель A является графиком, сравнивающим площадь новообразованных сосудов для глаз, подвергнутых лечению различными дозами T2-TrpRS, по сравнению с глазами, подвергнутыми лечению схожими дозами полноразмерного TrpRS в способе скрининга по изобретению. Панель Β является графиком, сравнивающим площадь облитерации сосудов для глаз, подвергнутых лечению различными дозами T2-TrpRS, по сравнению с глазами, подвергнутыми лечению сходными дозами полноразмерного TrpRS, в способе скрининга по изобретению. Панели C и D иллюстрируют снижение площади облитерации сосудов в глазах, леченных T2-TrpRS (C), против контрольных глаз, в которых вводили буфер PBS (D). Панель Ε иллюстрирует ускоренную реваскуляризацию, вызванную T2-TrpRS (верхнее изображение), по сравнению с контрольным глазом (нижнее изображение). Панель F иллюстрирует, что аптамер VEGF вызывает задержку реваскуляризации областей с облитерированными сосудами. Панель G и Η - это графики, сравнивающие активность T2-TrpRS и аптамера VEGF в способе скрининга по настоящему изобретению.
Фиг. 6 иллюстрирует последовательность аминокислотных остатков T2-TrpRS (SEQ ID NO: 1) и мутантного T2-TrpRS-GD (SEQ ID NO: 2).
Фиг. 7 иллюстрирует последовательность аминокислотных остатков мини-TrpRS (SEQ ID NO: 3).
Фиг. 8 иллюстрирует последовательность аминокислотных остатков T1-TrpRS (SEQ ID NO: 4).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Способ стимулирования благоприятной физиологической реваскуляризации ишемической ткани сетчатки предусматривает введение млекопитающему, страдающему от ишемии сетчатки, терапевтически эффективного количества ангиостатического фрагмента триптофанил-тРНК синтетазы (TrpRS), посредством чего одновременно ингибируется патологическая неоваскуляризация и стимулируется физиологическая реваскуляризация поврежденных областей сетчатки. Предпочтительно фрагмент TrpRS вводится в глаз с помощью инъекции в стекловидное тело.
Предпочтительные ангиостатические фрагменты TrpRS включают фрагмент T2 (T2-TrpRS; SEQ ID NO: 1, фиг. 6), мутантный T2-TrpRS (T2-TrpRS-GD; SEQ ID NO: 2, фиг. 6), укороченный TrpRS, известный как мини-TrpRS (SEQ ID NO: 3, фиг. 7) и T1-TrpRS (SEQ ID NO: 4, фиг. 8). Последовательность аминокислотных остатков T2-TrpRS-GD (SEQ ID NO: 2) отличается от SEQ ID NO: 1 заменами двух аминокислотных остатков (то есть S121G и Y122D). Более предпочтительно ангиостатический фрагмент TrpRS является фрагментом T2.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу скрининга для оценки терапевтической эффективности предполагаемых терапевтических средств для лечения неоваскулярных заболеваний сетчатки. В способе используется мышиная модель ретинопатии, вызванной кислородом, чтобы моделировать состояние ретинопатического заболевания в глазу мыши. Способ предусматривает воздействие на новорожденных мышей (предпочтительно в возрасте приблизительно 7 дней) гипероксии (например, атмосферы 75%-ной кислородной) на время, достаточное, чтобы вызвать измеримый регресс сосудистой сети сетчатки, предпочтительно приблизительно 5 дней, и последующее возвращение мышей к нормоксии (то есть к нормальному воздуху). После возвращения к нормоксии в глаз каждой мыши затем вводится потенциальное терапевтическое средство. Предпочтительно, чтобы в один глаз отдельной мыши вводилось терапевтическое средство, в то время как в другой глаз вводилось плацебо, такое как физиологический раствор или буферный раствор, в качестве контроля. Альтернативно некоторые мыши могут быть использованы в качестве контрольных, в то время как других лечат потенциальным терапевтическим средством. Сетчатки от леченых и контрольных мышей изымают целиком, предпочтительно спустя приблизительно 5 дней после возвращения к нормоксии, и кровеносные сосуды сетчаток окрашивают для облегчения идентификации.
Получают микрографические изображения по существу целых окрашенных сетчаток и анализируют, чтобы оценить площадь облитерации сосудов, вызванной гипероксическими условиями, и оценить распространенность патологической неоваскуляризации, которая развивается по возвращении к нормоксии. Эффективность потенциального терапевтического средства оценивают путем сравнения области облитерации сосудов в леченых глазах против контрольных глаз и/или путем сравнения площади преретинальных новообразованных сосудов в леченых глазах против контрольных глаз.
Предпочтительный способ скрининга для выявления и оценки терапевтической эффективности потенциальных терапевтических средств для лечения неоваскулярных заболеваний сетчатки предусматривает воздействие на новорожденную мышь гипероксии на время, достаточное, чтобы вызвать измеримый регресс сосудистой сети сетчатки и возвращение мышей к нормоксии. Затем в глаз мыши вводится раствор предлагаемого терапевтического средства. После периода длительностью до приблизительно 5 дней мышь подвергают эвтаназии, и из глаза, в который было введено предлагаемое терапевтическое средство, изымают сетчатку по существу целиком. Сосудистую сеть сетчатки окрашивают и получают микрографическое изображение по существу всей окрашенной сетчатки, чтобы визуализировать сосудистую сеть сетчатки. По изображению определено по меньшей мере одно из (a) площади облитерации сосудов, видимой в окрашенной сетчатке, и (b) площади преретинальных новообразованных сосудов в окрашенной сетчатке. Впоследствии делают сравнение по меньшей мере одного из (i) области облитерации сосудов, заметной в окрашенной сетчатке, по сравнению с областью облитерации сосудов, заметной в окрашенной сетчатке, от контрольного глаза мыши, подвергнутого воздействию тех же условий гипероксии, но в который предполагаемое терапевтическое средство не вводилось, и (b) площади преретинальных новообразованных сосудов в окрашенной сетчатке по сравнению с площадью преретинальных сосудов в окрашенной сетчатке из контрольного глаза мыши, подвергнутого воздействию тех же условий гипероксии, но в который предполагаемое терапевтическое средство не вводилось.
Предпочтительный способ скрининга для выявления и оценки терапевтической эффективности потенциальных терапевтических средств для лечения неоваскулярных заболеваний сетчатки предусматривает:
воздействие на 7-дневную мышь атмосферы, содержащей приблизительно 75% кислорода, в течение приблизительно 5 дней (гипероксические условия);
возвращение мышей в атмосферу обычного воздуха (нормоксия);
введение потенциального терапевтического средства в глаз мыши после возвращения к обычному воздуху;
эвтаназию мыши и удаление из глаза, в который было введено предлагаемое терапевтическое средство, сетчатки по существу целиком;
окрашивание сосудистой сети сетчатки глаза, в который было введено предлагаемое терапевтическое средство;
получение по меньшей мере одного микрографического изображения окрашенной сетчатки по существу целиком, чтобы визуализировать ее сосудистую сеть;
определение площади облитерации сосудов, заметной в окрашенной сетчатке, и площади преретинальных новообразованных сосудов в окрашенной сетчатке по меньшей мере на одном изображении;
сравнение площади облитерации сосудов, заметной в окрашенной сетчатке, с площадью облитерации сосудов, заметной в окрашенной сетчатке контрольного глаза мыши, подвергнутого воздействию тех же самых гипероксических условий, причем в контрольный глаз предлагаемое терапевтическое средство не вводилось, и
сравнение площади преретинальных новообразованных сосудов в окрашенной сетчатке с площадью преретинальных сосудистых пучков, заметной в окрашенной сетчатке контрольного глаза мыши, подвергнутого воздействию тех же самых гипероксических условий, причем в контрольный глаз предлагаемое терапевтическое средство не вводилось.
Показателем протяженности патологической неоваскуляризации служит площадь сетчатки с преретинальными новообразованными сосудами в леченых глазах относительно контрольных глаз, видимых на микрографическом изображении. Уменьшение площади преретинальных новообразованных сосудов указывает на ангиостатическую активность, то есть на то, что средство ингибирует патологическую неоваскуляризацию. Оценку реваскуляризации выполняют путем сравнения площади облитерации сосудов в сетчатках леченых глаз против контрольных глаз. Снижение площади облитерации сосудов в сетчатках леченых глаз по сравнению с контрольными указывает на то, что терапевтическое средство вызывает благоприятную физиологическую реваскуляризацию поврежденных сетчаток.
Remington's Pharmaceutical Sciences,
Терапевтические композиции, содержащие ангиостатический фрагмент TrpRS, могут содержать фармакологически подходящие, фармацевтически приемлемые носители, экспициенты и растворители. В целом, эти носители включают водные или спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и буферизованные среды, такие как забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Парентеральные растворители могут включить раствор хлорида натрия, раствор глюкозы Рингера, раствор глюкозы и хлорида натрия, раствор Рингера с лактатом или нелетучие масла. Кроме того, внутривенные растворители могут включать растворы для восполнения жидкости и питательных веществ и растворы для восполнения электролитов, такие как основанные на растворе глюкозы Рингера. Также могут присутствовать экспициенты, такие как консерванты и другие добавки, например антимикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие средства и инертные газы. Подходящие средства, облегчающие приготовление лекарственной формы, носители, другие наполнители и способы приготовления фармацевтических композиций раскрыты в 14th Ed., Mack Publishing Co., 1970, в частности в части VIII, «Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture», страницы 1461-1762, соответствующие раскрытия которого включены в данный документ посредством ссылки.
Терапевтические композиции могут быть упакованы в соответственно стерилизованные пузырьки или флаконы, содержащие много доз или одну дозу. После заполнения композицией по изобретению контейнеры предпочтительно герметизируются. Предпочтительно композиции упаковывают в контейнер с приложенной к нему этикеткой, причем на этикетке указаны лекарственные средства, присутствующие в композиции, и этикетка несет уведомление в форме, предписанной правительственным учреждением, таким как Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США, отражая одобрение композиции согласно соответствующим законам, информацию о дозе и тому подобное. Этикетка предпочтительно содержит информацию о композиции, которая полезна для работника здравоохранения, вводящего композицию пациенту. Упаковка также предпочтительно содержит печатные информационные материалы, касающиеся введения композиции, инструкций, показаний и любых необходимых предупреждений.
Модель ретинопатии, вызванной кислородом (OIR)
et al. Invest. Opthalmol. Vis. Sci.,
Вся работа с животными соответствовала строгим рекомендациям протокола по гуманному обращению и использованию животных в исследовании. OIR вызывали согласно протоколу, описанному Smith 1994; 35:101-111. Семидневных мышат вместе с матерями перемещали из комнатного воздуха в гипероксическую среду, содержащую приблизительно 75% кислорода, на 5 дней, после чего возвращали в комнатный воздух (нормоксия). Воздействие гипероксических условий выполняли, помещая клетки с животными в модифицированный кувез. Кислород циркулировал в кувезе (чтобы управлять потоком, использовали наркозный аппарат для животных), и его концентрацию контролировали и поддерживали на уровне 74-75%, используя одобренный FDA газоанализатор для кислорода (AX-300, Teledyne Analytical Instruments, Калифорния, США). Во время 5 дней гипероксии животных осматривали по меньшей мере три раза в день. В течение эксперимента пища и вода были доступны для матерей без ограничений. Через 5 дней, то есть на 12-й день после родов (P12), клетки возвращали в комнатный воздух.
Получение препарата цельной сетчатки и иммуногистохимия
После того как мыши были подвергнуты эвтаназии, энуклеированные глаза фиксировали в 4% растворе параформальдегида в PBS в течение приблизительно 10 минут и сетчатки рассекали с помощью кругового разреза позади лимба, примерно у корня радужной оболочки, затем переднюю часть глаза удаляли. Хрусталик и стекловидное тело иссекали и сетчатку отделяли от склеры и сосудистой оболочки, оставляя сетчатку в конфигции глазного бокала. На сетчатке делали радиальные ослабляющие разрезы, что позволяло сделать ее плоской, и любые остатки стекловидного тела или гиалоидной мембраны тщательно удаляли с уплощенной сетчатки.
6
Griffonia simplicifolia
Для ангиографии с FITC-декстраном животных анестезировали интраперитонеальными инъекциями кетамина HCl (Ketalar, Parke Davis, Великобритания, 100 мг/кг) в комбинации с релаксирующим средством ксилазином (2 мг/кг). Приблизительно 300 мкл высокомолекулярного (2×10 Да) FITC-декстрана (концентрация 50 мг/мл, Sigma, С-Louis, MO) вводили в левый желудочек и позволяли циркулировать в течение приблизительно двух минут прежде, чем умертвить животное и энуклеировать глаза. Для окрашивания изолектином G4 сетчатки постфиксировали в 4% параформальдегиде в течение приблизительно 45 минут и инкубировали при комнатной температуре в течение ночи с изолектином GS-IB4, полученнным из (изолектин GS), который был конъюгирован Alexa Fluor 594 (Molecular Probes, разведение 1:150 в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS)), чтобы предоставить "изолектин GS-594". Вслед за 4-5 промывками PBS в течение 2-часов сетчатки монтировали как цельные препараты на предметных стеклах с SLOW FADE (Molecular Probes) для последующего получения изображения.
Поскольку изолектин GS окрашивает не только сосудистые эндотелиальные клетки, также и активировали мышиные макрофаги, поликлональные антитела, специфичные для эндотелиального маркера CD31 (BD Biosciences-Pharmingen, разведение 1:100 в 10%-ной фетальной телячьей сыворотке (FBS)/10% буфер NGS), и антитела против маркера макрофагов F4/80 (1:150) использовались в субпопуляции сетчаток, чтобы дополнительно характеризовать изолектин GS-положительные клетки. Сетчатки блокировали 20% FBS, 20% NGS в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре и инкубировали с первичным антителом и изолектином GS-594 в течение ночи. После промывки PBS наносили конъюгированные с Alexa 488 вторичные антитела (Invitrogen Corporation) на 2 часа, промывали и сетчатки монтировали, как описано выше.
Получение изображений и количественная оценка
Микрографические изображения получали, используя 4-кратный объектив с разрешением датчика 512×512 пикселей. Особые усилия прикладывали, чтобы сфокусировать объектив непосредственно над внутренней пограничной мембраной сетчатки, используя конфокальную микроскопию (BioRad), с тем чтобы лежащие над мембраной новообразованные сосуды стали более заметными, чем лежащее под ними поверхностное сосудистое сплетение, что делало последующее количественное определение количества площади новообразованных сосудов более легким. В большинстве случаев от каждой сетчатки получали четыре перекрывавшихся изображения (каждое представляло один квадрант сетчатки). Используя Adobe PHOTOSHOP 6.0, затем создавали монтажи, используя ориентиры сетчатки, такие как диск зрительного нерва и крупные сосуды, чтобы выровнять изображения. Эти монтажи позволяли визуализировать и количественно оценить всю сетчатку. В нескольких случаях, в которые и облитерированные участки и все участки неоваскуляризации были расположены ближе к центру сетчатки, получили одно 4-кратное изображение, центрированное на диске зрительного нерва. Хотя периферия сетчатки не попадала в такие изображения полностью, соответствующие OIR-вызванные изменения в этих случаях были полностью видимы. Каждое индивидуальное изображение конвертировали в размер 2×2 дюйма с разрешением 300 пикселей на дюйм перед созданием монтажа и количественным определением площади облитерации и новообразованных сосудов.

2
2

После того как были получены изображения и созданы монтажи сетчатки, облитерацию сосудов и патологические неоваскулярные образования оценивались количественно людьми в слепом протоколе, для профилактики смещения, и подлинные сетчатки визуализировались под микроскопом всякий раз, когда требовалось помочь определить фактические площади облитерации и новообразованных сосудов на изображениях. Чтобы измерить площади облитерации сосудов, использовали инструмент Adobe PHOTOSHOP, инструмент выбора областей произвольной формы. Границы аваскулярных областей очерчивали и вычисляли общую площадь облитерации в пикселях. Измерение площади новообразованных сосудов тоже выполняли в конфигции цельной смонтированной сетчатки, и это измерение было основано на более высокой интенсивности окрашивания изолектином этих областей, их характерном внешнем виде и изображениях, полученных при фокусировке выше внутренней пограничной мембраны сетчатки. Новообразованные сосуды специфично выбирали вручную, используя инструмент «волшебная палочка» в программе Adobe PHOTOSHOP. Затем определяли общую площадь в пикселях. Как только площади были измерены в пикселях, был применен коэффициент пересчета, который для параметров в экспериментах был вычислен как 27,8 мкм на пиксель и были получены абсолютные площади (в мкм). Этот коэффициент пересчета был вычислен на основе получения изображения (4-кратный объектив) и параметров сборки монтажа, таких как размер (2×2 дюйма) и разрешение (300 пикселей на дюйм) после импортирования и создания монтажа в программном обеспечении Adobe PHOTOSHOP.
Поперечные срезы сетчатки и подсчет пре-ILM ядер
.
В подгруппе из шести глаз после определения количества в конфигции монтажа целиком сетчатки были удалены с предметных стекол и обработаны для получения поперечных срезов и подсчета пре-ILM ядер. После дополнительной фиксации в 4% PFA сетчатки были залиты в парафин и из них были получены последовательные срезы. Было выполнено стандартное окрашивание гематоксилином и эозином, и все ядра, находящиеся на витреальной стороне ILM, были пересчитаны. Было вычислено среднее количество ядер на срез. В дополнительной группе глаз, обработанных ингибитором iNOS (описанным ниже), целые глаза были залиты в парафин, из них приготовлены поперечные срезы, окрашены гематоксилином и эозином, и выборка поперечных срезов была посчитана, как ранее описал Smith at al Был определен зрительный нерв и 2-4 среза с каждой сторны от него, с шагом 30-90 мкм, были посчитаны на неоваскуляризацию.
Инъекция ангиостатических соединений
Если лечение предусматривало одну инъекцию, инъекции в стекловидное тело делали в Р12 (по возвращению к нормоксии), если лечение предусматривало две инъекции, их делали в Р13 и Р16. В каждом случае 0,5 мкл подходящего раствора (PBS - контроль, PBS, содержащий отдельное терапевтическое средство, или PBS, содержащий комбинацию терапевтических средств) вводили, используя шприц Гамильтона, снабженный иглой 33 G. Инъекции делали между экватором и лимбом роговиды. Во время инъекции местоположение иглы визуализировалось с помощью препаровальной лупы, чтобы убедиться в том, что игла находится в стекловидном теле, и таким образом, минимизировалась возможность повреждения сетчатки или хрусталика. После инъекции веки были помещены на место, чтобы закрыть щель.
Результаты
Нормальный процесс послеродового развития сосудов сетчатки у мыши хорошо описан и включает центростремительный рост поверхностных сосудов, появляющихся из диска зрительного нерва при рождении и достигающих отдаленной периферии сетчатки приблизительно 9-11 дней спустя. К концу первой недели после рождения от этой поверхностной сети вглубь начинают отходить короткие сосуды, образующие глубокую сосудистую сеть, которая обычно достигает полного развития примерно к Р11-12. Затем формируется заключительный, промежуточной слой (IL) сосудов. Процесс сопровождается волнами перестройки и удаления лишнего и в основном заканчивается примерно к P21-23. У новорожденных мышей C57B16/J контакт с высокими уровнями кислорода значительно изменяет эту четкую последовательность событий. Вслед за контактом с 75%-ным кислородом между P7 и Ρ12 обширные площади сосудистой сети в центре сетчатки регрессируют (облитерация сосудов), оставляя только основной сосуд и практически отсутствие капиллярной сети. Это видно на обоих перфузированных декстраном (фиг. 1, панель A) и окрашенных изолектином (фиг. 1, панель D) цельных препаратах глаза на день P9. Изолектинположительные макрофаги также присутствовали внутри участка облитерации сосудов (фиг. 1, панель D, а также фиг. 2, панель C). На периферии сетчатки все еще наблюдаются признаки сосудистой сети, состоящеей главным образом из поверхностных сосудов (фиг. 2, панель C). После возвращения к нормоксии в Ρ12 относительное состояние ишемии в плохо васкуляризованной сетчатке побуждает к возобновлению роста поверхностных сосудов от периферии внутрь, что сопровождается прорастанием сосудов внутри сетчатки с образованием глубокого сосудистого слоя, а также патологическим разрастанием на поверхности контакта между сетчаткой и стекловидным телом (преретинальные сосудистые пучки). Примерно к Ρ18 площади облитерации сосудов становятся меньше, простираясь вокруг диска зрительного нерва и вдоль основных артерий сетчатки (фиг. 1, панели Β и E), и преретинальные пучки хорошо заметны как ярко окрашенные, лектинположительные области (фиг. 1, панель E, фиг. 3, панель A). Важно отметить, что после перфузии сосудов сетчатки флуоресцентным красителем (в данном случае декстраном FITC) участки облитерации сосудов становятся четко очерченными, но пучки выявить нелегко (сравните фиг. 1, панель Β с панелью E). Примерно к P22-23 сетчатка обычно в значительной степени реваскуляризируется (фиг. 1, панель C и панель F), и новообразованные сосуды главным образом рассасываются, хотя может пройти еще несколько дней прежде, чем сетчатка примет полностью нормальный вид.
Пример 1. Количественное определение количества площади облитерации сосудов и скорости реваскуляризации сетчатки
Чтобы количественно определить облитерацию сосудов и скорость реваскуляризации сетчатки, с помощью флуоресцентной микроскопии при низком увеличении были получены изображения инъецированных декстраном или окрашенных изолектином препаратов цельных сетчаток. Чтобы создать монтаж сетчатки (фиг. 2, панель A), использовали четыре перекрывающихся изображения и измеряли площадь облитерации (желтая), а также общую площадь сетчатки (синяя линия), используя легко доступные компьютерные программы обработки изображения (фиг. 2, панель B). Поскольку в этих препаратах граница между сосудистой и бессосудистой сетчаткой обычно была очень четкой, вариабельность результатов у разных исследователей была очень низкой (фиг. 2, панель G). Были приняты меры, чтобы не включать в анализ участки, в которых присутствовали артефакты, вызванные препарированием или монтажом препарата. Изменения общей площади сетчатки в зависимости от времени показаны на верхней панели фиг.2, панель D. Очевидно, что во время гипероксии рост сетчатки продолжается, и общая площадь сетчатки между P8 и Р13 увеличивается приблизительно на 20%. Позже скорость изменений снижается. Динамика облитерации сосудов и реваскуляризации (фиг. 2, панель D, нижний график) показывает, что после контакта с гипероксией в день P7 облитерация происходит весьма быстро и занимает приблизительно 30-35% общей площади сетчатки между P8-P12. После возвращения к нормоксии реваскуляризация происходит более медленно, с обширной неоваскуляризацией, начинающейся приблизительно в день Ρ16, через четыре дня после возвращения к нормоксии. Процесс происходит совершенно симметрично, что доказывается высокой корреляцией в парных глазах (то есть глазах одного и того же животного) общей площади сетчатки (фиг. 2, панели E) и особенно распространенностью облитерации сосудов (фиг. 2, панель F). Предпочтительно в практическом осуществлении способов по настоящему изобретению в качестве контрольных использовать парные глаза.
Пример 2. Количественное определение распространенности патологической неоваскуляризации

Между днями P15 и P22, и особенно начиная с P17-P19, в мышиной модели OIR происходит патологический рост сосудов на поверхности контакта между сетчаткой и стекловидным телом. Эти преретинальные сосудистые пучки особенно заметны на границе между периферической васкуляризованной и центральной облитерированной зоной сетчатки. Эти имеющие неправильное направление сосудистые элементы были количественно определены классическим методом в окрашенных гематоксилином и эозином, заключенных в парафин поперечных срезах путем подсчета ядер клеток, выступающих с витреальной стороны внутренней пограничной мембраны (ILM). Однако эти участки отчетливо выделяются в окрашенных изолектином цельных препаратах в виде скоплений клеток, лежащих над поверхностной сосудистой сетью (фиг. 1, панель E, фиг. 3, панель A). Площадь этих областей, сильно окрашивающихся изолектином, можно легко измерить, используя любой инструмент для определения пороговой интенсивности (имеется в ряде коммерческих программ для анализа изображений) или программное обеспечение Adobe PHOTOSHOP, чтобы вручную выделить площади формирования преретинальных сосудов (фиг. 3, панель B, неоваскулярные площади помечены красным). Конфокальная микроскопия помогает прояснить локализацию этих клеток, а также их отношение к подлежащим кровеносным сосудам сетчатки (фиг. 3, панель C). Обратите внимание, что эти области пролиферации перфузируются только частично, что видно по зеленым пятнам внутривенно введенного декстрана-FITC, находящимся внутри их (фиг. 3, панель C). Этот ограниченный уровень перфузии мешает использованию ангиографии с декстраном-FITC для адекватной визуализации и количественного определения сосудистых пучков. Специфичные для клетки маркеры показывают, что большинство изолектинположительных клеток внутри сосудистых пучков экспрессирует эндотелиальный маркер CD31, что подтверждает их сосудистую идентичность (фиг. 3, панель D). Интересно, что в скоплениях также присутствуют клетки макрофагального происхождения, что доказывается иммунным окрашиванием F4/80 (фиг. 3, панель E).
Распространенность и динамика патологической васкуляризации показаны на фиг.3, панель G. Между днями P16-P20 приблизительно 12-16% общей площади сетчатки покрыты новообразованными сосудами, их количество достигает максимума в P17. Важно отметить, что непрерывная и быстрая перестройка этих пучков происходит между P15-P22. В результате реваскуляризации сетчатки, которая протекает одновременно с перестройкой, перестроенные участки также рассасываются. Относительно крупные, выдающиеся группы клеток, наблюдаемые ранее (фиг. 3, панель A-E), сокращаются до рядов изолектинположительных клеток, которые, как правило, сопровождают сосуды сетчатки (фиг. 3, панель F) и в конечном счете исчезают между P22-P25 (фиг. 1, панель F).
Хотя корреляция между парными глазами, с точки зрения формирования сосудистых пучков, не так сильна, как корреляция, касающаяся облитерации сосудов, этот процесс, тем не менее, в значительной степени симметричен (фиг. 3, панель H). И в этом случае вариабельность результатов у разных исследователей была низкой независимо от изучаемого момента времени и распространенности явного формирования сосудистых пучков (фиг. 3, панель I), что свидетельствует об относительной последовательности и ясности способа количественного определения по настоящему изобретению. Наконец, чтобы исследовать, коррелируют ли площадь неоваскуляризации, измеренные в препаратах цельных сетчаток, с пре-ILM (то есть преретинальными) ядрами, подсчитанными на поперечных срезах, ряд ранее подвергшихся количественному исследованию цельных сетчаток был залит в парафин, из них были приготовлены поперечные срезы и во всех срезах были подсчитаны пре-ILM ядра. Фиг. 2, панель J, показывает соотношения площади сосудистых пучков и количества ядер в каждом из 6 различных глаз, нормализованных по среднему каждого параметра. Очевидно, что эти два способа количественного определения, как правило, согласуются (то есть глаз с большей площадью пучка имеет тенденцию также иметь более высокое количество ядер и наоборот). У протокола количественного определения по настоящему способу есть преимущество перед способом подсчета ядер на поперечных срезах, заключающееся в том, что сетчатка сразу изучается целиком.
Пример 3. Антиангиогенный эффект ингибитора iNOS
Полезность методики количественного определения по настоящему изобретению подверглась дальнейшей оценке и была сравнена с известным способом подсчета пре-ILM ядер путем исследования влияния нового антиангиогенного средства, ингибитора iNOS, на реваскуляризацию сетчатки и ангиостаз. Ингибитор (или физиологический раствор - контроль) доставляли в глаза мышей в дни P12-P17 путем ежедневных интраперитонеальных инъекций, и в P17 глаза были энуклеированы и подверглись количественному изучению одним из этих двух методов. На фиг.4, панель А, показаны препараты цельных сетчаток на предметном стекле и поперечный срез сетчаток в Р17, взятых от контрольных мышей (верхний ряд) и мышей, леченных ингибитором iNOS (нижний ряд). Участки облитерации сосудов очерчены на левых панелях (синие линии), участки новообразованных сосудов отмечены (красный) на тех же самых цельных препаратах, приведенных на центральных панелях, и примеры пре-ILM ядер приведены на поперечных срезах справа (стрелки). Инъекция ингибитора iNOS уменьшала площадь облитерации сосудов примерно на 28% по сравнению с контрольными животными (фиг. 4, панель B, левые прямоугольники на гистограмме). Площадь новообразованных сосудов, определенная количественно по цельным препаратам, снизилась примерно на 30% (центральные прямоугольники), что схоже с величиной эффекта, наблюдавшегося при подсчете пре-ILM ядер на поперечных срезах (то есть приблизительно на 36%, правый нижний график).
Пример 4. T2-TrpRS мощно ингибирует формирование новообразованных сосудов на модели OIR
2
T2-TrpRS - это протеолитический фрагмент триптофан-тРНК синтетазы (TrpRS), который продемонстрировал мощный ангиостатический потенциал на нескольких моделях ангиогенеза, включая мышиную модель Matrigel и модель ангиогенеза сетчатки новорожденной мыши. Способ по настоящему изобретению использовали, чтобы проверить активность T2-TrpRS против патологической неоваскуляризации на мышиной модели OIR. Используя представленный метод количественного определения, также оценивали влияние инъекции T2-TrpRS на реваскуляризацию поверхностного сплетения сетчатки после облитерации сосудов, вызванной кислородом. При инъекции в стекловидное тело в день Ρ12, сразу после того, как мыши были возвращены из состояния гипероксии (75% О) к нормоксии, T2-TrpRS дозозависимо и заметно сократил площадь формирования новообразованных сосудов к Р17 (фиг. 5). Триптофан-тРНК синтетаза полной длины (FL-TrpRS) также продемонстрировала некоторую активность в самой высокой дозе, но наблюдаемые уровни ингибирования были значительно более низкими по сравнению с эквивалентными инъекциями T2-TrpRS. Поскольку ранее было обнаружено, что FL-TrpRS не имеет ангиостатической активности в других моделях ангиогенеза, возможно, что наблюдаемая активность явилась результатом естественного расщепления FL-TrpRS до продукта, подобного T2-TrpRS после инъекции in vivo.
Также определяли количественно площадь облитерации в контрольных и леченных T2-TrpRS сетчатках, чтобы проанализировать влияния на физиологическую реваскуляризацию сетчатки после вызванной кислородом облитерации (фиг. 5, панель B). Хотя T2-TrpRS мощно ингибировал формирование новообразованных сосудов, реваскуляризация нормальных поверхностных и глубоких сосудистых сплетений сетчатки не была ингибирована. Фактически сетчатки после инъекций T2-TrpRS, даже в низких дозах, последовательно показывали значительное усиление реваскуляризации. В сетчатках после инъекций T2-TrpRS облитерированные участки ко дню P17 последовательно сокращались приблизительно на 40% по сравнению с облитерированными участками контрольных сетчаток на P17, в которые инъецировали PBS (фиг. 5, панель B). Облитерированные участки на момент инъекции (P12) были примерно равны (данные не приведены). Таким образом, существенное и неожиданное снижение площади облитерации ко дню Р17 свидетельствует о новой активности T2-TrpRS, стимулирующей физиологическую реваскуляризацию при одновременном ингибировании патологической неоваскуляризации. После инъекции 1,25 мг/глаз T2-TrpRS сосудистая морфология сетчатки выглядела почти нормальной, особенно по сравнению с нормальными или контрольными сетчатками OIR (фиг. 5, панели C-E). Даже на P22, если новообразованные сосуды регрессировали естественным путем и сетчатка зажила, новообразованные сосуды в контрольных сетчатках OIR выглядели несомненно патологическими по сравнению с изъятыми в день P17 сетчатками, в которые был инъецирован T2-TrpRS (фиг. 5, панель E). Сетчатки, в которые был инъецирован FL-TrpRS, тоже демонстрировали существенное усиление процесса реваскуляризации, но только при более высоких дозах.
165
не
Активность T2-TrpRS в модели OIR непосредственно сравнивали с активностью аптамера VEGF, который имеет доказанные свойства антагониста активности VEGF и который продемонстрировал мощное ингибирование вызванного OIR формирования новообразованных сосудов. Обе ангиостатических молекулы были мощными ингибиторами формирования новообразованных сосудов. Глаза, в которые был инъецирован T2-TrpRS, 1,25 мг/глаза, показали небольшое, но значимое снижение площади новообразованных сосудов по сравнению с сетчатками, обработанными аптамером VEGF. Таким образом, даже после инъекции молярных концентраций в 10 раз ниже, чем концентрации аптамера, T2-TrpRS продемонстрировал высококонкурентную ингибиторную активность, направленную против формирования новообразованных сосудов в модели OIR. В отличие от T2-TrpRS аптамер VEGF увеличивал реваскуляризацию поверхностного сплетения. Фактически, хотя аптамер VEGF не препятствовал осуществлению физиологической реваскуляризации, реваскуляризация последовательно замедлялась по сравнению с сетчатками, в которые были инъецирован контрольный растворитель PBS (фиг. 5, панель F-G). Эта задержка процесса реваскуляризации в глазах, леченных аптамером VEGF, становилась еще более явной в день Р19 после двух отдельных инъекций более низких доз (фиг. 5, панель H).
Обсуждение
Принятый в настоящее время способ количественного определения патологической неоваскуляризации на модели OIR основан на подсчете лежащих на мембране ядер в окрашенных гематоксилином и эозином, залитых в парафин гистологических поперечных срезах глаза. Этот способ очень трудоемок, отнимает много времени, дает весьма непостоянные результаты, зависящие от наблюдателя, а также препятствует точному количественному определению пределов облитерации сосудов в том же самом глазу, поскольку не позволяет получить препараты цельной сетчатки. Хотя ранее сообщалось об анализе бессосудистых областей с использованием препаратов всей сетчатки, по нашим сведениям, способ по настоящему изобретению - первый способ скрининга, который может использоваться, чтобы количественно определить абсолютные площади формирования новообразованных сосудов и облитерации при анализе одного и того же глаза. В представленном методе используются обычные методы иссечения тканей и методы окраски, а также легкодоступные компьютерные программы, что позволяет им легко овладеть и дает низкую вариабельность результатов у разных исследователей. Кроме того, к преимуществам данного метода относится снижение количества ошибок, связанных с выбором проб для исследования, поскольку количественному исследованию подвергаются сетчатки целиком, а не ограниченное число срезов. Дифференцировка витреальных ядер, связанных с гиалоидной системой, от ядер, связаных с новообразованными сосудами, также может быть трудной в методах поперечных срезов, известных из уровня техники, особенно в модели OIR, в которой сохраняется гиалоидная система. В настоящем методе гиалоидные сосуды, как правило, удаляются во время препарирования, и любые их остатки легко идентифицируются и не включаются в анализ.
Представленный способ скрининга использовался, чтобы оценить ангиостатическую активность T2-TrpRS на модели патологического ангиогенеза OIR. На модели OIR наблюдалось сильное, дозозависимое ангиостатическое влияние T2-TrpRS на патологическую неоваскуляризацию. Инъекция приблизительно 1,25 мкг/глаз T2-TrpRS привела почти к полному ингибированию формирования новообразованных сосудов. Эти наблюдаемые эффекты были сопоставимы, если не превосходили эффектов аптамера VEGF - еще одного мощного ингибитора патологической неоваскуляризации на модели OIR. Долгосрочное влияние на OIR-связанную неоваскуляризацию было оценено путем анализа неоваскуляризации сетчатки на Ρ19, после двух инъекций более низких доз ингибиторов. T2-TrpRS ингибировал патологическую неоваскуляризацию и снижал формирование пучка более чем на 75% по сравнению с 55%-ным снижением после лечения аптамером VEGF (0,5 мг/глаз/инъекция, 53,9 пикомоль).
Удивительно, но T2-TrpRS также усиливал полезный физиологический процесс реваскуляризации после ретинопатии, вызванной кислородом. Хотя площади облитерации были эквивалентны во время инъекции, облитерированные площади в сетчатках, леченных T2-TrpRS, последовательно уменьшились наполовину по сравнению с контрольными сетчатками. Соответственно, лечение T2-TrpRS приводит к удивительно более быстрому и более полному заживлению сетчатки, и полученная в результате сосудистая сеть анатомически более близко напоминает нормальную сосудистую сеть сетчатки.
Можно осуществить многочисленные изменения и модификации вариантов осуществления, описанных выше, не отступая от сущности и объема новых признаков изобретения. Не предполагается никаких ограничений по отношению к конкретным вариантам осуществления, проиллюстрированных в данном документе.