КОМПОЗИЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ПИЩЕВОЙ ДОБАВКИ И СПОСОБ ЕЕ ВВЕДЕНИЯ
COMPOSITION OF BIOLOGICALLY ACTIVE FOOD ADDITIVE AND METHOD OF ITS ADMINISTRATION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к пищевой промышленности, а конкретнее - к пищевым добавкам, способным улучшить или облегчить состояние больных диабетом первого типа.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Диабет 1 типа - аутоиммунное заболевание, характеризующееся иммуноопосредованным разрушением бета (β) - клеток. Генетические и экологические взаимодействия играют важную роль в сбое иммунной системы, вызывая агрессивный адаптивный иммунный ответ против β-клеток. Микробы, обитающие в кишечнике человека, тесно взаимодействуют с иммунной системой слизистой оболочки кишечника. Колонизация кишечной микробиоты и созревание иммунной системы происходят параллельно в первые годы жизни; следовательно, нарушения в микробиоте кишечника могут нарушать функции иммунных клеток и наоборот.
f
f
Нарушения микробиоты кишечника (дисбиоз) часто выявляются у пациентов с СД1, особенно у тех, у кого диагностированы множественные аутоантитела в результате агрессивного и неблагоприятного иммунореагирования. Патогенез T1D включает активацию аутореактивных Т-клеток, что приводит к разрушению β-клеток Т-лимфоцитами CD8+. Становится также очевидным, что кишечные микробы тесно взаимодействуют с Т-клетками. Многочисленные данные о влиянии микробиоты на уровне гормонального ответа позволили сформировать представление о том, что кишечная микробиота является, по сути, «виртуальным эндокринным органом» (см. Clarke G, Stilling RM Kennedy PJ et al. Minireview: Gut microbiota: the neglected endocrine organ. Mol Endocrinol. 2014; 28 (8):1221-1238).
Обнаружено, что устранение дисбактериоза кишечника с использованием специфических пребиотиков связано со снижением аутоиммунного ответа (с уменьшением воспаления) и целостности кишечника (за счет повышенной экспрессии белков с плотным соединением в кишечном эпителии).
Этот эффект обусловлен сложным взаимодействием иммунитета и симбиотической кишечной микрофлоры.
Важность пребиотика заключается в том, что усиливая рост собственных полезных бактерий, он подавляет рост потенциально патогенных бактерий, что обеспечивает благоприятный баланс кишечной микрофлоры, улучшает пищеварение и укрепляет иммунитет, повышают способность бороться с инфекциями и воспалительными процессами.
Хотя точный механизм, лежащий в основе взаимосвязи между кишечной микрофлорой и диабетом первого типа весьма сложен и не до конца ясен, в настоящем изобретении установлено, что пищевая добавка влияет на состав микрофлоры кишечника больных диабетом первого типа и, по видимому, это влияние непосредственно связано с улучшением маркеров диабета первого типа, таких как GDR и уровень гликированного гемоглобина.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задача настоящего изобретения состоит в коррекции микробиоты кишечника, что может приводить к устранению или облегчению состояний, связанных с преобладанием нежелательной микрофлоры. В частности, неоптимальный состав микрофлоры кишечника характерен для больных сахарным диабетом первого типа.
Несмотря на то, что все компоненты предлагаемой композиции хорошо изучены, неожиданно было обнаружено, что одновременное введение в пищу пребиотика, содержащего комбинацию биологически активных компонентов позволяет изменить состав микрофлоры кишечника и улучшить или облегчить состояние больных диабетом. В частности, было обнаружено, что введение в пищу добавки по изобретению больным диабетом 1 типа позволяет снизить количество микроорганизмов вызывающих воспаление (в частности, достигнуть практически полной эрадикации бактерий Clostridium), снизить уровень инсулинорезистентности и повысить чувствительность к инсулину.
Полученные количественные показатели изменения состава кишечной микрофлоры, уровня гликированного гемоглобина и GDR у больных диабетом первого типа при введении композиции по изобретению в течении 21 дня нельзя объяснить аддитивным эффектом каких-либо двух или нескольких компонентов предложенной композиции.
В соответствии с настоящим изобретением предлагается композиция пищевой добавки, содержащая (г):
резистентный крахмал 2-10, инулин 5-10, порошок черного тмина (Nigella Sativa) 1-1,5, порошок черного перца (Piper nigrum L.) 0,1-0,5, порошок белого гриба 35-50, порошок шампиньона (Agaricus) 35-50, порошок куркумы от 0,1 г до 12 г.
Все компоненты предложенной композиции широко применяются в качестве пищевых добавок, и не обладают сколько-нибудь заметной токсичностью в очень широком диапазоне дозировок.
Как видно из приведенного состава основу композиции по изобретению составляет так называемый "устойчивый" или резистентный крахмал.
Резистентный крахмал отличается по своим химическим и физико-химическим свойствам от более известного крахмала, получаемого из термообработанного сырья. В сыром, не прошедшем термическую обработку и очень быстро высушенным в вакуумной среде картофеле практически весь крахмал находится в резистентной форме. Известно, что резистентный крахмал проявляет свойства пребиотика и является пищей для микробиоты кишечника, при этом влияя как на качество и количество самой микробиоты, так и опосредовано на чувствительность к инсулину. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения предпочтительно, когда указанный резистентный крахмал получают из лиофилизированного картофеля, не подвергавшегося термообработке.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения инулин выделен из топинабура, лопуха или цикория.
В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения композицию помещают в саше-пакеты по 100 г для однократного приема 1 раз в день.
В одной из предпочтительных форм осуществления содержание порошка белого гриба в композиции составляет 45 г, а содержание порошка шампиньона (Agaricus) составляет 45 г.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предлагается способ введения пищевой добавки, характеризующийся тем, что индивидууму вводят в пищу, по меньшей мере, 50 г вышеописанной композиции.
В одном из особенно предпочтительных вариантов осуществления способа индивидуум представляет собой индивидуума, имеющего резистентность к инсулину, при этом композицию вводят в количестве 100 г, по меньшей мере, трижды в сутки.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения индивидуум представляет собой индивидуум, перенесший лучевую терапию или химиотерапию, при этом индивидуумам до 14 лет вводят 50 г композиции в сутки, а индивидуумам после 14 лет 100 г композиции в сутки.
В другом предпочтительном варианте осуществления композицию вводят натощак перед сном.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления композицию вводят в виде водной суспензии.
В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения введение композиции осуществляют, по меньшей мере, 21 сутки.
Как будет понятно специалисту в данной области техники после ознакомления с разделом «ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ», было установлено композиция по изобретению влияет на микробиоту кишечника, изменяет количественное содержание типов бактерий, влияющих на здоровье кишечника и другие показатели.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Группа из 60 детей с нарушениями кишечного микробиоценоза и сахарным диабетом 1 типа, в возрасте от 10 до 18 лет была рандомизирована случайным образом на тех, кто получал пищевую добавку по изобретению (NOBELbad) и контроль.
Добавка имела следующий состав, указанный в таблице ниже.
Добавку вводили в виде саше, содержащих по 100 г композиции указанного выше состава 1 раз в день за 1 час до еды. Все дети и подростки были больны диабетом более 3 лет. Мальчиков - 15 (50%), девочек - 15 (50%).
Контрольную группу составили 30 детей с сахарным диабетом 1 типа без диетической коррекции соответствующего пола и возраста.
Все дети и подростки на момент проведения исследования находились в состоянии субкоменсации и декомпенсации, средний уровень гликированного гемоглобина HbA1c составлял 9% (см. таблицу 1.1).
Показатели подопытных групп до введения добавки (эксперимента) приводятся в таблицах 1.1, 2.1, 2.3, 3.1 и 3.2.
В таблице 1.1 приводится уровень HbA1c в группах подопытных до эксперимента; группы подопытных до введения добавки статистически достоверно эквивалентны по рассматриваемому параметру - уровню HbA1c.
В таблице 2.1 приводится уровень Clostridium perfringens (КОЕ/гр) в группах подопытных до эксперимента; группы подопытных до введения добавки статистически достоверно эквивалентны по рассматриваемому параметру - уровню Clostridium perfringens (КОЕ/гр).
В таблице 2.3 приводится уровень Bacteroides (КОЕ/гр) в группах подопытных до эксперимента; группы подопытных до введения добавки статистически достоверно эквивалентны по рассматриваемому параметру - уровню Bacteroides.
В таблицах 3.1 приводятся показатели уровня GDR до и после эксперимента у мальчиков, а в таблице 3.2 - у девочек.
При изучении микробиоценоза кишечника у всех обследованных детей, больных сахарным диабетом I типа выявлены изменения в составе кишечной флоры умеренного характера (дисбиоз 1-й и 2-й степени).
Согласно отраслевому стандарту ОСТ 91500.11.0004-2003, с микробиологической точки зрения, выделяют 3 степени дисбиотического процесса в толстой кишке:
I степень - незначительное снижение количества бифидобактерий и/или лактобактерий на 1-2 порядка, снижение или повышение содержания кишечных палочек, с появлением небольших титров измененных форм (с гемолитическими свойствами или лактозонегативные штаммы);
II степень - наличие одного вида условно-патогенных микроорганизмов в концентрации не выше 105 КОЕ/грамм или ассоциации условно-патогенных бактерий в небольших титрах: Е. coli lac (-), E.coli hem (+), Proteus sp., Clostridium sp., Klebsiella sp., Pseudomonas sp., Enterococcus sp., Acinetobacter sp;
III степень - высокий титр условно-патогенных микроорганизмов как одного вида, так и в ассоциациях.
Мониторинг состава микробиоты подопытных осуществляли с помощью метагеномного секвенирования, которое позволяет отслеживать степень дисбактериоза, в том числе предоставляя количественную оценку уровня присутствия широкого спектра бактериальных патогенов.
До начала введения добавки в пищу в условиях амбулаторного наблюдения проводили секвенирование образцов ДНК, выделенных из кала, полученного от рандомизированной группы детей.
Забор биоматериала производили у всех участников в одинаковое время.
Метагеномный анализ, осуществляли посредством секвенирования вариабельных участков генов 16S рибосомальной РНК.
Полученные, таким образом данные позволили выяснить таксономический состав микробного сообщества.
Проводили исследование 60 образцов фекалий (полученных у всех обследуемых в одно и тоже время*), с последующим секвенированием амплифицированных участков гена 16S рРНК на платформе Miseq (Illumina) по стандартному протоколу.
Метагеномный анализ в формате оценки разнообразия последовательностей гена 16S рРНК в суммарном образце ДНК осуществляли согласно протоколу 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation.
Таксономический состав образцов оценивали путем классификации по базе данных последовательностей гена 16S рРНК Greengenes v. 13.5 с помощью классификатора RDP.
Доминирующими бактериями оказались представители бактериального филума Bacteroicletes и Firmicutes.
При этом до диетического вмешательства отмечен низкий уровень Prevotella, и повышенный Bacteroides, включая незначительный титр условно-патогенных Clostridium (см. таблицы 2.1, 2.3 и 2.5)
Что касается определения показателей инсулинорезистентности в группах подопытных, необходимо отметить следующее. Существует несколько методов измерения инсулинорезистентности, однако не все можно применить для оценки чувствительности тканей к инсулину у лиц с сахарным диабетом 1-го типа. Это тесно связано с абсолютным дефицитом инсулина у данной группы пациентов. Одними из самых распространенных и простых методов является Homeostatic Model Assessment (НОМА) и Quantative Insulin Sensitivity Check Index (QUICKI), который является алгоритмом НОМА. Они разработаны на основе исследований с привлечением больных с сахарным диабетом 2-го типа и сохраненной секрецией инсулина. Похожим образом разработаны такие показатели, как 0GIS (Mari) (oral glucose insulin sensitivity), MCRest (Stumvoll), ISIcomp (Matsuda), SiORAL (Caumo), которые рассчитываются во время перорального глюкозотолерантного теста и являются зарезервированными для оценки чувствительности к инсулину у лиц без сахарного диабета и пациентов с сахарным диабетом 2-го типа. Именно поэтому перечисленные выше индексы не пригодны для оценки инсулинорезистентности у лиц с сахарным диабетом 1-го типа.
Ввиду сложности проведения и возможных осложнений на выборке 10 человек (5 мальчиков и 5 девочек) для оценки инсулинорезистентности проводили классический Кламп-тест (De Fronzo) (см. Ferannini Е. Physiological and metabolic consequences of obesity. Metabolism 1995; 44 (9 Suppl 3): 7-15).
Чувствительность тканей к действию экзогенного инсулина определяли на основе последних 30 минут протокола, оценивая при этом скорость инфузии глюкозы после достижения стабильного уровня гликемии. Она соответствует скорости захвата глюкозы тканями и носит название GDR (glucose disposal rate).
Результаты оценки уровня GDR у мальчиков и девочек до и после введения добавки по изобретению представлены в таблицах 3.1 и 3.2, соответственно.
Введение добавка по изобретению в процессе эксперимента осуществляли в дозе 50 г перед сном в виде суспензии в воде в течение 21 дня.
Показатели подопытных групп после завершения эксперимента приводятся в таблицах 2.2, 2.4, 2.5, 3.1, 3.2.
В таблице 2.2 представлены результаты измерения уровня Clostridium perfringens (КОЕ/гр) после эксперимента; как видно в сравнении с таблицей 2.1, группы очень сильно разделились по измеряемому уровню КОЕ/гр Clostridium perfringens, что с необходимым уровнем статистической достоверности свидетельствует о положительном эффекте введения добавки. Если конкретнее, из полученных результатов следует, что по окончании приема добавки по изобретению титр Clostridium не определялся.
В таблице 2.4 представлены результаты измерения уровня Bacteroides (КОЕ/гр) после эксперимента; как видно в сравнении с табл. 2.3, группы очень сильно разделились по измеряемому уровню параметра КОЕ/гр Bacteroides, что с необходимым уровнем статистической достоверности свидетельствует о положительном результате проведения эксперимента (уровень Bacteroides КОЕ/гр снизился с 80% до 4 0%).
В таблице 2.5 представлены результаты измерения уровня Prevotella (КОЕ/гр) после эксперимента; как видно из приведенных данных, группы очень сильно разделились по измеряемому уровню параметра КОЕ/гр Prevotella, что с необходимым уровнем статистической достоверности свидетельствует о положительном результате проведения эксперимента (уровень Prevotella КОЕ/гр вырос с 10% до 7 0%).
Из сравнения показателей уровня гликированного гемоглобина HbA1c в группах до эксперимента (таблица 1.1) и после эксперимента (таблица 1.2), следует, что средний уровень гликированного гемоглобина после начала введения добавки по изобретению снижался, а на 90-ый день снизился до 6.
Как следует из таблиц 3.1 и 3.2, через 21 день после начала введения добавки, коэффициент GDR в группах улучшился. А именно, до введения добавки средний показатель GDR у мальчиков был 3,5-4,0, у девочек - 4,0-4,5, а после - 7,0 у мальчиков и 7,0 у девочек (GDR больше 7,0±0,5 мг/кг/мин, свидетельствует о чувствительности тканей к действию инсулина; GDR ниже 4,0 мг/кг/мин, указывает на значительную инсулинорезистентность; GDR в интервале 4,0-7,5 мг/кг/мин, считают ранними признаками инсулинорезистентности).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что введение в пищу добавки по изобретению больным диабетом 1 типа позволяет снизить количество микроорганизмов вызывающих воспаление (в частности, достигнуть практически полной эрадикации бактерий Clostridium), снизить уровень инсулинорезистентности и повысить чувствительность к инсулину.