Усовершенствование питательных сред с использованием пантолизата

ucts on phagocytosis of Staphylococcus aureus by milk leucocytes. Am. J. Vet. Res. Vol. 44 (3). P. 385-388.

6. Nickerson S.C., Paape, M.J., Harmon R.J., Ziv G. (1986). Mammary leukocyte response to drug therapy. J. Dairy Sci. Vol. 69 (6). P. 1733-1742.

7. Griesbeck-Zilch B., Meyer H.H., Kuhn C.H., Schwerin M., Wellnitz O. (2008). Staphylococcus aureus and Escherichia coli cause deviating expression profiles of cytokines and lactoferrin messenger ribo-nucleic acid in mammary epithelial cells. J. Dairy Sci. Vol. 91 (6). P. 2215-2224.

8. Wellnitz O., Arnold E.T., Bruckmaier R.M. (2011). Lipopolysaccharide and lipoteichoic acid induce different immune responses in the bovine mammary gland. J. Dairy Sci. Vol. 94 (11). P. 5405-5412.

9. Walt D.R. (2013). Optical methods for single molecule detection and analysis. Analytical Chem. Vol. 85 (3). P. 1258-1263

+

10. van Dorland H.A., Richter S., Morel I., et al. (2009). Variation in hepatic regulation of metabolism during the dry period and in early lactation in dairy cows. J. Dairy Sci. Vol. 92 (5). P. 1924-1940.

11. Radkowski, M. (2006). The effect of polyphosphates on streptococci isolated from mastitis cases. Pol. J. Vet. Sci. Vol. 9 (2). P. 135-138.

12. Rukovodstvo po eksperimentalnomu (dok-linicheskomu) izucheniyu novykh farma-kologicheskikh veshchestv / pod obshch. red. chlena-korespondenta RAMN, professora R.U. Khabrieva. -2-izd., pererab. i dop. - M.: OAO «Izdatelstvo «Med-itsina», 2005. - 832 s.

13. Malanin L.P., Morozov A.P., Selivanova A.S. Metodicheskie ukazaniya po opredeleniyu toksi-cheskikh svoystv preparatov, primenyaemykh v vet-erinarii i zhivotnovodstve: veterinarnye preparaty: spravochnik. - M.: Agropromizdat, 1988. -

S. 239-289. +

УДК 619:616.98.9 Ю.Н. Романцева

Yu.N. Romantseva

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПАНТОЛИЗАТА

IMPROVEMENT OF CULTURE MEDIA BY USING PANTOLIZAT PRODUCT

-V-

Ключевые слова: питательная среда, пантоли-зат, шрот, микроорганизмы, информативность, мясо-пептонный бульон, мясопептонный агар.

Питательные среды без преувеличения считаются одними из главных составляющих в микробиологических исследованиях. Современная микробиология без питательных сред существовать не может, а их качество во многом определяет информативность, точность микробиологического анализа. При подборе питательной среды следует учитывать ее полноценность, то есть обоснованный и сбалансированный набор различных питательных соединений, необходимых микроорганизму для построения растущей клетки. Для нормального роста и развития микроорганизмов в питательной среде должны присутствовать все элементы, из которых формируется клетка. Изыскание высокоэффективных питательных сред на дешевой белоксодержащей основе из отходов различных производств является актуальной задачей. В связи с этим необходима разработка экономически обос-

нованных эффективных питательных сред, исключающих использование в качестве сырья дорогостоящего мяса, обладающих повышенной информативностью при уменьшении сроков культивирования микроорганизмов при первичном посеве. Биохимический состав пантового шрота вполне отвечает требованиям, предъявляемым к сырью для производства жидкой основы питательных сред. При проведении контроля модифицированных питательных сред использовали штаммы микроорганизмов: St. aureus, St. epidermidis, Str. pneumoniae, E. coli, Enterobacter aerogenes, изолированных от маралов. По проведенным микробиологическим исследованиям новые среды на основе пантолизата, полученного из пантового шрота, превосходят общепризнанные МПА и МПБ. Сокращается время появления первичного роста на 1-7 ч, увеличивается накопление бакмассы, а также не требуется добавления сыворотки крови, необходимой для культивирования стрептококков. Все вышеизложенное позволяет использовать эту среду для первичного посева биоматериала.

Keywords: culture medium, Pantolizat (hydrolysate of velvet antler), extraction cake, microorganisms, information value, beef-extract broth, beef-extract agar.

Quite literally, culture media are considered to be one of the primary components of microbiological research. The modern microbiology cannot exist without culture media, and their quality largely determines the information value and accuracy of microbiological analysis. When selecting a culture medium, its full value should be taken into account, i.e., it should be a substantial and well-balanced set of various nutritional compounds that a microorganism requires to build up a growing cell. To ensure a normal growth and development of microorganisms, a culture medium must have all of the elements from which a cell is formed. Finding highly-efficient culture media on a cheap protein base obtained from by-products of various industries is a topical issue. In this regard, the development of economically feasible effective culture media that does not use expensive meat as the base

material will have an increased information value and allow for a decreased cultivation period at the primary isolation stage. The biochemical composition of the velvet antler cake quite corresponds to the requirements for the raw material intended for the production of the culture medium liquid base. The following microbial strains: St. aureus, St. epidermidis, Str. pneumoniae, E. coli, Enterobacter aerogenes isolated from marals were used for the control of modified culture media. According to the conducted microbiological research, the new media based on the hydrolysate of velvet antler obtained from velvet antler cake outperforms the generally acknowledged beef-extract broth and beef-extract agar. The time before the primary growth decreases by 1-7 hours, the accumulation of the bacterial mass increases, and no blood serum needs to be added in order to cultivate streptococci. In view of the above, this medium can be used for the primary inoculation of biological material.

Романцева Юлия Николаевна, к.в.н., вед. н.с., лаб. болезней животных, отдел «ВНИИПО», Федеральный Алтайский научный центр агробиотехнологий, г. Барнаул. E-mail: wniipo@rambler.ru.

Введение

Задачи, стоящие перед ветеринарными врачами по снижению уровня инфекционных болезней, тесно связаны с бактериологической диагностикой, которая в значительной степени зависит от качества и ассортимента питательных сред [1].

Питательные среды без преувеличения считаются одними из основных составляющих в микробиологических исследованиях. Современная микробиология без питательных сред существовать не может, а их качество во многом определяет информативность, точность микробиологического анализа. Число питательных сред, включенных в ряд руководств (с учетом модификаций), превышает 5000 прописей, причем эта цифра вряд ли может считаться полной [2].

Проблема изыскания высокоэффективных питательных сред на дешевой белоксодержащей основе из отходов различных производств в настоящее время является актуальной [3, 4].

В связи с этим разработка экономически обоснованных эффективных питательных сред, исключающих использование в качестве сырья дорогостоящего мяса, обладающих повышенной информативностью и при уменьшении сроков

Romantseva Yuliya Nikolayevna, Cand. Vet. Sci., Leading Staff Scientist, Lab. of Animal Diseases, Federal Altai Scientific Center of Agro-Biotechnologies, Barnaul. E-mail: wniipo@rambler.ru.

V/-

культивирования микроорганизмов при первичном посеве, является актуальной.

Исходя из вышеизложенного, целью исследований явилась модификация общепринятых питательных сред.

Для решения поставленной цели предусматривались следующие задачи:

- определить оптимальный способ изготовления питательных сред на основе пантолизата;

- изучить информативность полученных питательных сред.

Объекты и методы: пантолизат, информативность модифицированных питательных сред, микробиологические методы исследований.

Экспериментальная часть: изучение оптимальных способов изготовления модифицированных питательных сред с исследованием их информативности.

Материалы и методы

При проведении контроля разрабатываемых питательных сред использовали штаммы микроорганизмов: St. aureus, St. epidermidis, Str. pneumoniae, E. coli, Enterobacter aerogenes, изолированных от маралов.

Для сравнения новых питательных сред использовали общепринятые среды - мясопептон-ный бульон (МПБ) и мясопептонный агар (МПА). Новую питательную среду для выращивания микроорганизмов готовили следующим образом: 200 г пантового шрота смешивали с 1 л дистиллированной воды, смесь помещали в экстрактор и экстрагировали при 98°С под давлением 1,5 атм. в течение 3 ч. Содержимое емкости фильтровали через ватно-марлевый фильтр с последующей стерилизацией при 120°С в течение 40 мин. После стерилизации экстракт (пантолизат) фильтровали вторично. Для приготовления 500,0 г среды брали 487,5 г пантолизата и смешивали с 5,0 г пептона, 2,5 г натрия хлорида (жидкая питательная среда) и 5,0 г агар-агара (для приготовления плотной среды), доводили рН до 7,6, после этого среду кипятили в течение 30 мин., отстаивали, фильтровали, фасовали в пробирки и стерилизовали при 1 атм. в течение 30 мин.

Для посева определенного количества микробных клеток в жидкую или плотную питательную среду использовали бактериальный стандарт мутности (ОСО 42-28-85-04) ГИСК им. Л.А. Тара-севича на 10 ед.

При этом учитывали в жидких средах: рост микроорганизмов с помутнением среды, придонный рост, поверхностный рост, на плотных средах, соответственно, размер, форму, цвет, рельеф и структуру колоний.

Показатель роста определяли во время инкубации посевов, фиксируя дату и час видимого роста культур.

Биохимические свойства выделенных культур изучали согласно регламентированным методикам [5, 6].

Результаты исследований

В процессе приготовления пантокрина, в который переходит лишь 3-4% сухого вещества измельченного панта, значительная часть биологически активных веществ остается в пантовом шроте [7]. Исследования биохимического состава пантового шрота приведены в таблице 1.

Согласно данным, приведенных в таблице 1, пантовый шрот богат макро- и микроэлементами, липидами и аминокислотами.

В свою очередь, это позволяет использовать его как основу для питательных сред, таких как мясопептонный бульон и мясопептонный агар.

Таблица 1

Биохимический состав пантового шрота

Наименование показателя Ед. измерения, мг/кг Наименование показателя Ед. измерения, мг/кг

Железо 124 Незаменимые аминокислоты 161848

Кадмий Менее 0,003

Калий 1200

Кальций 205000

Кобальт Менее 0,1

Кремний 26,3

Магний 5500 Заменимые аминокислоты 125833

Марганец 1,29

Медь 0,56

Мышьяк Менее 0,005

Натрий 4300 Белок 287681

Никель 0,036

Свинец Менее 0,007

Селен 1,11 Липиды 13300

Фосфор 121000

Цинк 59,2

Питательные среды на основе пантолизата были испытаны на штаммах микроорганизмов: St. aureus, St. epidermidis, Str. pneumoniae, E. coli, Enterobacter aerogenes. В таблицах 2, 3 приведены сравнительные данные роста микроорганизмов на питательных средах: мясопептонном бульоне и питательных сред, приготовленных на основе пантолизата, полученного в режимах:

- соотношение шрот:сырье 1:5, экстракция в течение 3 ч при 1,5 атм. и 98-990С;

- соотношение 1:4, время 4 ч, 1,5 атм., 98-990С.

Для изучения влияния питательных сред на

основе пантолизата, полученного из пантового шрота, на изменчивость микроорганизмов проведено определение их биохимических свойств.

St. aureus - в мазках, окрашенных по Граму, обнаружены клетки сферические диаметром 0,51,5 мкм, одиночные, в парах и в группах неправильной формы, грамположительные, неподвижные, не спорообразующие. В заявленной жидкой питательной среде отмечен рост с равномерным стабильным помутнением среды, сформировал компактный легкосуспензируемый осадок. На плотных питательных средах образует круглые, выпуклые, гладкие, блестящие, непрозрачные колонии. На данной среде с добавлением крови образует зону а-гемолиза. Каротиноидный пигмент колоний, растёт в анаэробных и аэробных условиях, на агаре с 10-15% NaCl, при температу-

Сравнительная характеристика роста

ре 15 и 45°С. Образует молочную кислоту. Образует кислоту (в аэробных условиях) из сахарозы, мальтозы, маннита, маннозы, трегалозы, лактозы, галактозы, фруктозы, туранозы, рибозы. Образует дезоксирибонуклеазу, аргининдигидрола-зу, гиалуронидазу, коагулазу, оксидазоотрицате-лен, восстанавливает нитрат, положительная реакция на щелочную фосфатазу, обладает уре-азной активностью.

St. epidermidis - в окрашенных мазках обнаружены сферические клетки, диаметром 0,5-1,5 мкм, одиночные, в парах и в группах неправильной формы, грамположительные, неподвижные, не спорообразующие. В жидкой питательной среде растёт с помутнением и последующим просветлением среды, формирует слизистый осадок. На агаровой среде колонии округлые, гладкие, выпуклые, блестящие, непрозрачные, 3-6 мм в диаметре. Цвет колоний серый. Растёт в анаэробных и аэробных условиях, на агаре с концентрацией №С1 10%, при температуре культивирования 45°С. Образует кислоту (в аэробных условиях) из сахарозы, мальтозы, маннозы, лактозы, галактозы, фруктозы, рибозы, туранозы. Образует ацето-ин, восстанавливает нитрат, положительная реакция на щелочную фосфатазу, образует арги-ниндигидролазу, обладает уреазной активностью. Биопроба отрицательная.

Таблица 2

кроорганизмов на питательных средах

Вид микроорганизма и показатели роста Питательные среды на основе

мясной воды

1. St. aureus, St. epidermidis Время появления роста 12 ч 9 ч 11 ч

2. Str. рпеитотае Время появления роста Роста нет 15 ч 21 ч

3. E. coli, Enterobacter aerogenes Время появления роста 11 ч 4 ч 9 ч

Таблица 3

Сравнительная характеристика роста микроорганизмов на питательных средах

Питательные среды на основе

Вид микроорганизма и характер роста мясной воды

1. St. aureus,

St. epidermidis 12 ч 9 ч 9 ч

Время появления роста 35, 80 70, 130 47, 115

Количество колоний

2. Str. pneumon^e Время появления роста роста нет 15 ч 100 15 ч 26

Количество колоний

3. E. coli,

Enterobacter aerogenes 12-14 ч 9-10 ч 12 ч

Время появления роста 20; 40 17, 54 15, 46

Количество колоний

Str. pneumoniae - в окрашенных мазках из суточных агаровых культур обнаружены сферические клетки диаметром 0,5-2,0 мкм, неподвижные, не спорообразующие, грамположительные, кап-сулообразующие. В жидкой питательной среде растёт с равномерным помутнением и образованием осадка. Колонии на твердой питательной среде мелкие, круглые, полупрозрачные, плоские, с приподнятым центром и краями. На данной среде с добавлением крови образует зону а-ге-молиза. Растёт на воздухе, с 5%-ным СО2. Роста нет при культивировании при температуре 10, 45°С; при рН 9,6; растет на средах с концентрацией NaCl 6,5%; 40% - желчи; 0,25% - оптоцина. Гидролизует аргинин, эскулин, не гидролизует геппурат. Образует кислоту из инулина, лактозы, раффинозы, трегалозы. Отрицательная реакция Фогеса-Проскауэра. Биопроба положительная.

Escherichia coli - в мазках, окрашенных по Граму, обнаружены прямые палочки 1,1-1,5х2,0-6,0 мкм, одиночные или в парах, грамотрицатель-ные, подвижные. В жидкой питательной среде растёт диффузно с помутнением среды. На твердой питательной среде образует гладкие, выпуклые, блестящие с ровными краями колонии, хорошо суспензируемые в растворе хлорида натрия. Оксидазоотрицателен, образует индол, реакция с метиленовым красным положительная,

реакция Фогеса-Проскауэра - отрицательная. Не растёт на среде Симмонса. Сероводород не образует. Мочевину не гидролизовал. Образует ли-зиндекарбоксилазу, образует кислоту из глюкозы, арабинозы, глицерола, дульцита, ксилозы, мальтозы, маннита, маннозы, мелибиозы, рамнозы, сорбита, трегалозы. Использует ацетат, восстанавливает нитрат, каталазоположителен. Биопроба отрицательная.

Enterobacter aerogenes - в мазках, окрашенных по Граму, обнаружены прямые палочки, 0,6-1,0x1,2-3,0 мкм, грамотрицательные, подвижные. В жидкой питательной среде растёт диффузно с помутнением среды с выпадением осадка. На твердой питательной среде образует гладкие, выпуклые, блестящие с ровными краями колонии. Оксидазоотрицателен, индол и сероводород не образует, реакция с метиленовым красным отрицательная, реакция Фогеса-Проскауэра - положительная. Растёт на среде Симмонса. Растёт в присутствии KCN. Использует малонат. Образует кислоту и газ из глюкозы, кислоту из адонитола, арабинозы, глицерола, мио-инозитола, ксилозы, лактозы, мальтозы, маннита, маннозы, мелибио-зы, рамнозы, рафинозы, салицина, сахарозы, сорбита, трегалозы, целлобиозы. Гидролизует эскулин, не гидролизует мочевину. По лизинде-карбоксилазе и орнитиндекарбоксилазе положи-

телен, использует ацетат, восстанавливает нитрат, каталазоположителен. Биопроба отрицательная.

Из вышеизложенных результатов следует, что при использовании пантолизата, полученного из пантового шрота, для приготовления питательных сред повышается их информативность при культивировании E. coli, Enterobacter aerogenes, St. aureus, St. epidermidis, а культивировании Str. pneumoniаe нет необходимости в добавлении 20%-ной сыворотки крови лошади, без добавления которой этот микроорганизм не растет на общепринятых средах МПБ и МПА.

Заключение

Новые среды на основе пантолизата, полученного в процессе переработки пантового шрота, превосходят общепризнанные МПА и МПБ по своей информативности. Сокращается время появления первичного роста на 1-7 ч, увеличивается накопление бакмассы, а также не требуется добавления сыворотки крови, необходимой для культивирования стрептококков, что позволяет использовать эту среду в микробиологических исследованиях.

Библиографический список

1. Егорова И.Ю., Никитченко Д.В, Чернышева А.Н., Рысцова Е.О. Микробиологические питательные среды нового формата в ветеринарно-санитарной оценке продуктов питания и сырья животного происхождения // Вестник РУДН. -2017. - № 1. - С. 76-85.

2. Поляк М.С. Питательные среды для медицинской микробиологии В.И. Сухаревич, М.Э. Су-харевич. - СПб., 2002. - С. 4.

3. Султанов З.З. Разработка и усовершенствование технологий получения микробиологических питательных основ и сред: автореф. дис. ... докт. биол. наук. - Махачкала, 2008. - С. 7.

4. Bridson E.Y., Brecker A. Design and formulation of microbial culture media. In: Norris J.R., Rib-

bons D.W., editors. Methods in microbiology. London and New York: Academic Press; 1970. p. 968-974.

5. Скородумов Д.И., Сидоров М.А., Костен-ко Т.С. Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных. - М.: ИзографЪ, 2005. - С. 94-106.

6. Cowan, S.T., Steel, K.J. Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria, 2nd edn. Revised by S.T. Cowan. Cambridge, UK: Cambridge University Press. 1974. P. 238.

7. Луницын В.Г., Борисов Н.П. Пантовое оленеводство России: монография. - Барнаул, 2012. - 1000 с.

References

1. Yegorova I.Yu., Nikitchenko D.V., Chernyshe-va A.N., Rystsova Ye.O. Mikrobiologicheskie pitate-lnye sredy novogo formata v veterinarno-sanitarnoy otsenke produktov pitaniya i syrya zhivotnogo pro-iskhozhdeniya // Vestnik RUDN. - 2017. - No. 1. -S. 76-85.

2. Polyak M.S., Sukharevich V.I., Sukhare-vich M.E. Pitatelnye sredy dlya meditsinskoy mikrobi-ologii. - SPb., 2002. - S. 4.

3. Sultanov Z.Z. Razrabotka i usovershenstvo-vanie tekhnologiy polucheniya mikrobiologicheskikh pitatelnykh osnov i sred: avtoref. dis. ... dokt. biol. nauk. - Makhachkala, 2008. - S. 7.

4. Bridson E.Y., Brecker A. Design and formulation of microbial culture media. In: Norris J.R., Ribbons D.W., editors. Methods in microbiology. London and New York: Academic Press; 1970. p. 968-974.

5. Skorodumov D.I., Subbotin V.V., Sidorov M.A., Kostenko T.S. Mikrobiologicheskaya diagnostika bak-terialnykh bolezney zhivotnykh. - M.: Izograf, 2005. -S. 94-106.

6. Cowan, S.T., Steel, K.J. Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria, 2nd edn. Revised by S.T. Cowan. Cambridge, UK: Cambridge University Press. 1974. P. 238.

7. Lunitsyn V.G., Borisov N.P. Pantovoe olenevodstvo Rossii: monografiya. - Barnaul, 2012. -1000 s.

+ + +