Способ применения маркеров бактериального воспаления для диагностики инфекции мочевыводящих путей у детей первых трех лет жизни
METHOD FOR USING MARKERS OF BACTERIAL INFLAMMATION FOR DIAGNOSING URINARY TRACT INFECTION IN CHILDREN UNDER THREE YEARS OF AGE

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии и нефрологии и может быть использовано в качестве диагностики инфекции мочевыводящих путей (ИМВП) у детей первых трех лет жизни.
Описан способ применения маркеров бактериального воспаления для ранней диагностики ИМВП у детей первых трех лет жизни. Способ включает исследование сыворотки крови детей на содержание бактерицидного белка, повышающего проницаемость мембраны клеток BPI и хемокина эотаксина. Бактерицидный белок, повышающий проницаемость мембран клеток (BPI), представляет собой белок нейтрофильного происхождения, описанный как прототип семейства канальцевых липидсвязывающих белков [1, 2]. BPI обладает различными свойствами, такими как: антибактериальными, противовоспалительными и антиангиогенными [3]. Протеин обладает способностью нейтрализовать эффекты, вызванные липополисахаридной структурой грамм-отрицательных бактерий, а также вызывает повышенную антибактериальную активность против Escherichia coli [4, 5], на долю которой приходится до 90% от всей этиологической структуры уропатогенов, вызывающих ИМВП [6]. Эотаксин относится к хемокинам, которые экспрессируются в желудочно-кишечном тракте и тимусе, участвуют в патогенезе бактериального и аллергического воспаления [7, 8].
Существует «Способ диагностики острого гнойного пиелонефрита и инфекции мочевых путей», основанный на определении уровня С-реактивного белка (СРБ) в сыворотке крови. Согласно исследованию, если в биоматериале больных значение показателя составляет 0,785-2,585 мг/л - авторы методики рекомендуют выставить диагноз ИМВП, а если 5,275-30,000 мг/л - острый гнойный пиелонефрит [9]. Согласно Федеральным клиническим рекомендациям по диагностике ИМВП у детей, критериями пиелонефрита являются: повышение температуры тела более 38°С, наличие интоксикационного и болевого синдромов, лейкоцитоз с нейтрофильным сдвигом формулы влево, повышение скорости оседания эритроцитов (СОЭ), положительный СРБ, положительный прокальцитонин (ПКТ), лейкоцитурия, наличие эхографических изменений (увеличивается объем почек, толщина паренхимы, возможна «слоистость» стенок чашечно-лоханочной системы) [10], поэтому, предложенный способ недостаточно информативен, а диагностика ИМВП должна быть основана на комплексном клинико-лабораторном обследовании пациентов. Также, рекомендуется определять уровень СРБ только при повышении температуры тела более 38°С [10]. Кроме того, согласно литературным данным, повышение уровня СРБ характерно для ряда бактериальных инфекций, что снижает диагностическую ценность предложенного способа [11, 12].
Известен «Способ диагностики активности воспалительного процесса при латентном течении хронического пиелонефрита» предложенный для выявления пациентов с бессимптомным течением воспалительного процесса в почках. Способ заключается в микроскопическом исследовании двух проб: в первую фракцию добавляют 5% раствор глюкозы, во вторую - 5% раствор глюкозы и 10% раствор альбумина. После обработки дегидратированных капель смеси мочи и полученных растворов струями пара, оценивается наличие морфологической структуры бактериурии, клеток гриба рода Candida с продуктами жизнедеятельности микрофлоры и делается заключение об активности воспалительного процесса в почках [13]. Недостатком этого способа является то, что способ ограничен диагностикой латентного хронического пиелонефрита и не предложен для диагностики других форм ИМВП.
Существует «Способ диагностики стадии острого пиелонефрита», основанный на определении с помощью люминесцентной микроскопии в сыворотке крови больных адгезированных на поверхности эритроцитов и бактерий, расположенных внутриэритроцитарно, после чего с помощью специальных расчетов интегрального показателя определяется стадия пиелонефрита [14]. Заявленный способ позволяет спрогнозировать развитие гнойных осложнений заболевания, а также идентифицировать обнаруженные уропатогены. Недостатком предложенной методики является ее дороговизна, необходимость использования специальных ДНК-зондов и расчетов интегрального показателя.
Наиболее близким аналогом к заявляемому способу является изобретение «Молекулярные маркеры для инфекций мочевыводящих путей», основанное на определении концентрации ПКТ в пробах мочи и плазмы у пациентов с ИМВП [15]. Способ позволяет не только диагностировать инфекцию почек, но также оценить степень тяжести и контролировать эффективность лечения при определении маркера в динамике. Также авторы патента предлагают свой диагностический набор, содержащий аликвоты реагентов, необходимые для определения концентрации ПКТ в моче и сыворотке крови. Недостатком заявленного способа является малая выборка исследования (20 человек), а также, тот факт, что в эксперименте участвовали только пациенты отделения реанимации, авторами патента не приводится данных о возможности применения метода среди пациентов нефрологических/урологических отделений и о допустимости использования заявленного набора и методики у детей. В изобретении предлагается определять концентрацию показателя при наличии одного из критериев, таких как: повышенной температуры или гипотермии, лейкоцитоза/лейкопении, боли в пояснице и/или дизурии, признаков синдрома системной воспалительной реакции, лихорадки неизвестной природы, рецидивирующей ИМВП, в то время как в современных рекомендациях по диагностике рекомендуется использовать тесты на ПКТ только при подозрении на уросепсис [10].
Задачей заявленного изобретения является разработка с помощью маркеров бактериального воспаления способа ранней диагностики ИМВП, обеспечивающего эффективную диагностику воспалительного процесса органов мочевой системы (ОМС) у детей первых трех лет жизни.
Сущность способа заключается в определении концентрации в сыворотке крови бактерицидного белка, повышающий проницаемость мембраны клеток BPI и эхемокина эотаксина у детей первых трех лет жизни с подозрением на ИМВП. Если в биоматериале определяют уровень BPI выше - 245 нг/мл и, одновременно, уровень эотаксина выше -1430 нг/мл у пациентов диагностируют ИМВП. Способ обеспечивает раннюю и эффективную диагностику ИМВП у детей первых трех лет жизни, а также позволяет своевременно определить тактику лечения пациентов.
Технический результат от реализации предлагаемого способа заключается в том, что заявленный метод позволяет получить достоверные сведения о диагностике ИМВП у детей грудного и раннего возраста. Технический результат от реализации предлагаемого способа состоит в том, что заявленный метод полностью безопасен для здоровья пациентов, для исследования необходимо небольшое количество биологического материала (0,4 мл сыворотки крови на два маркера), позволяет диагностировать заболевание на ранней стадии и, что немаловажно, может использоваться у детей первых трех лет жизни.
Предложенный способ диагностики является технически простым в исполнении, информативным, его внедрение не требует больших экономических затрат и обеспечивает быстрое подтверждение ИМВП. Заявленное изобретение диагностики ИМВП с помощью бактериальных биомаркеров у детей первых трех лет жизни является новым и в общедоступной литературе не описан.
Технический результат достигается в результате осуществления предлагаемого способа, сущность которого заключается в том, что в сыворотке крови пациентов с подозрением на ИМВП с помощью иммуноферментного автоматического анализатора (ELISA) с использованием реактивов фирмы Hycult Biotech (США), до назначения антибактериальной терапии, определяют уровень бактерицидного белка, повышаемого проницаемость мембраны клеток BPI и хемокина эотаксина. При уровне BPI выше 245 нг/мл и, одновременно, уровень эотаксина выше - 1430 нг/мл, у пациентов регистрируют ИМВП. Заявленные отличительные признаки являются новыми и у детей первых трех лет жизни определение BPI и эотаксина в сыворотке крови ранее не проводилось. В связи с этим, разработка и внедрение в клиническую практику новых маркеров диагностики ИМВП может способствовать своевременной постановке диагноза и назначению патогенетической терапии.
Способ осуществляется следующим образом: забор крови для последующего определения маркеров воспаления проводят только после получения письменного согласия родителя ребенка (опекуна) при поступлении в стационар. Процедуру выполняют однократно, до назначения антибактериальных препаратов. Забор биоматериала производят известным способом из периферической вены в количестве, необходимом для получения 0,4 мл сыворотки крови. Забор крови в контрольной группе производят также один раз, после письменного согласия законных представителей ребенка.
Процедура получения сыворотки крови включает:
- использование стерильной пробирки для отделения сыворотки крови;
- после забора биоматериала, образец сразу охлаждают до 4°С и центрифугируют 15 минут с ускорением 1500 g;
- для анализа используют свежеприготовленную сыворотку в количестве не менее 0,2 мл;
- концентрацию маркеров в крови определяют с помощью твердофазного иммуноферментного анализа ELISA.
Через 4,5 часа для BPI и через 3 часа для эотаксина, оценивают результаты исследования. Полученные значения сравнивают с нормативными показателями. При уровне BPI выше 245 нг/мл и, одновременно, уровень эотаксина выше - 1430 нг/мл, у пациентов регистрируют ИМВП.
Эффективность и работоспособность предложенного способа доказана путем клинико-лабораторного обследования 52 пациентов (основная группа) ГБУЗ «Краевая детская клиническая больница №1» г. Владивостока, которым в результате комплексного обследования поставлен диагноз: ИМВП. В группу контроля включили 20 относительно здоровых детей (контрольная группа), сопоставимых по возрасту и полу, не имеющих в анамнезе на момент исследования заболеваний почек и изменений в анализах мочи. Группы обследованных детей не отличались между собой по возрастному и масса-ростовому показателям (р<0,05).
Всем детям в сыворотке крови определяли уровень бактерицидного белка BPI и эотаксина методом ИФА, результаты исследования представлены в таблице.
Полученные результаты достоверно свидетельствуют в пользу того, что концентрации бактерицидного белка, повышающего проницаемость мембран клеток BPI и эотаксина в сыворотке крови, могут служить в качестве объективных критериев диагностики ИМВП. Это было подтверждено при использовании и других методов статистической оценки, в частности, ROC-анализа (фиг.1).
Для оценки полученных данных на диаграммах, с помощь математических формул, был вычислен показатель площади под ROC - кривыми - AUC (Area Under Curve). Для обеих кривых показатель AUC был более 0,8, что свидетельствует о высокой прогностической силе полученной модели. Таким образом, предлагаемый информативный способ использования предлагаемых бактериальных маркеров обеспечивает эффективную, безопасную и раннюю диагностику ИМВП у детей первых трех лет жизни и позволяет своевременно определить тактику патогенетической терапии.
Примеры
Клинический пример 1. Больная Л., 6 месяцев поступила с жалобами на изменения в анализах мочи в виде лейкоцитурии до 70-80 в п/зрения, выявленные во время планового осмотра перед вакцинацией. Учитывая возраст до года и результаты анализов, пациентку госпитализировали в нефрологическое отделение. Из анамнеза жизни: ребенок от 3 беременности, протекающей на фоне гестационного сахарного диабета, анемии I степени и хронической фетоплацентарной недостаточности. Роды 2 в сроке 38-40 недель, без патологии. Закричала сразу. По шкале Апгар - 8/9 баллов. Вес при рождении - 3530 г, длина тела - 53 см, пуповина отпала на 7 сутки. Вскармливание грудное до настоящего времени. Аллергологический анамнез: пищевая аллергия на гречневую кашу в виде сыпи и зуда. Состоит на диспансерном учете у гинеколога с диагнозом: Синехии малых половых губ. После проведенного комплексного обследования ребенку был выставлен диагноз: ИМВП. У данного ребенка в сыворотке крови определен уровень белка BPI и эотаксина, которые составили 280 нг/мл и 1730 нг/мл соответственно. Согласно изобретению, был подтвержден диагноз ИМВП.
Клинический пример 2. Больная А., 1 год 9 месяцев поступила с жалобами на повышение температуры тела до фебрильных цифр, отеки век, редкое мочеиспускание. Со слов мамы жалобы появились после перенесенной вирусной инфекции. Из анамнеза жизни известно, что ребенок от 1 беременности, протекавших на фоне токсикоза 1 половины беременности, гестоза, угрозы прерывания во втором триместре беременности, 1 родов. С рождения находилась на искусственном вскармливании. Состояла на диспансерном учете у невролога с диагнозом: Перинатальное поражение центральной нервной системы. Генетический анамнез отягощен: мать девочки страдает пиелонефритом. Пациентке было проведено комплексное клинико-лабораторное и инструментальное обследование, а также определение содержания в сыворотке крови уровня BPI и эотаксина по предлагаемому способу. В результате получено следующее значение: BPI - 310 нг/мл, эотаксин - 1920 нг/мл. Согласно изобретению, выставлен диагноз: ИМВП.
Клинический пример 3. Больная X., 3 месяца, поступила с жалобами на повышение температуры тела до 39,40С, снижение аппетита, капризность. Больна в течение 6 дней, когда появились вышеперечисленные жалобы. Из анамнеза заболевания известно, что при профилактическом обследовании в возрасте 1 месяца по данным УЗИ выявлен ВПР МВС: подвздошная дистопия, гипоплазия правой почки. Из анамнеза жизни - ребенок от 1 беременности, протекавшей физиологично. Роды проведены путем кесарева сечения. Аллергологический анамнез не отягощен. Генетический анамнез не отягощен. Состоит на диспансерном учете у гинеколога с диагнозом: Синехии малых половых губ. В результате комплексного обследования пациентке выставлен диагноз: ИМВП. Согласно заявленному способу, определен уровень бактерицидного белка BPI, который составил 320 нг/мл, а также значение эотаксина, которое составило - 2000,2 нг/мл. Согласно изобретению, подтвержден диагноз: ИМВП.
Список использованной литературы:
1.  S, Zeller L, Werner Μ, Toelge Μ, Holzinger J, Entzian C, Schubert T, Waldow F, Gisch N, Hammerschmidt S and Gessner A (Bactericidal/PermeabilityIncreasing Protein Is an Enhancer of Bacterial Lipoprotein Recognition. Front. Immunol. 2018; 9:2768. doi: 10.33 89/fimmu.2018.02768.
2. Balakrishnan A, Marathe SA, Joglekar M, Chakravortty D. Bactericidal/permeability increasing protein: A multifaceted protein with functions beyond LPS neutralization. Innate Immunity. 2013; 19(4):339-347. doi:10.1177/1753425912465098.
3. Li, Kun, Yue Liu, Xiaoyu Xia, Li Wang, Meige Lu, Yanqin Hu, and Chen Xu. Bactericidal/permeability-increasing protein in the reproductive system of male mice may be involved in the sperm-oocyte fusion. Reproduction. 2013; 146 (2): 135-144doi.org/10.1530/REP-13-0127.
4. Philipp H. Reichel, Christine Seemann, Elena Csernok, Jens-M. Schroder, Antje Miiller, Wolfgang L. Gross, Hendrik Schultz. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2003; 10(3):473-475. doi: 10.1128/cdli.10.3.473-475.2003.
5. Wu, Zhengchang Liu, Yanki Dong, W Sun, S.Y. Zhu, Guoqiang Wu, S Bao, Weidong. Identification of BPI protein produced in different expression system and its association with Escherichia coli F18 susceptibility. Genetics and Molecular Research. 2015; 14 (1): 1111-1123. doi: 10.4238/2015. февраль, 6.15.
6. Ни Α.Η., Шуматова Τ.Α., Сергеева Ε.В., Шишацкая С.Η., Быкова О.Г. Региональные особенности возбудителей впервые выявленных внебольничных инфекций мочевыводящих путей у детей грудного и раннего возраста. Доктор. Ру. 2020; 19(3): 24-28.doi:10.31550/1727-2378-2020-19-3-24-28.
7. Виноградова Т.В., Чусляева Α.Α., Варламов Ε.Е., Ружицкая Е.А., Сухоруков В.С, Пампура А.Н. Современная оценка цитокинового статуса детей при атопическом дерматите. Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2014; 59(1):76-81.
8. Teixeira AL, Gama CS, Rocha NP and Teixeira MM. Revisiting the Role of Eotaxin-1/CCL11 in Psychiatric Disorders. Front. Psychiatry. 2018; 9: 241. doi: 10.3389/fpsyt.2018.00241.
9. Патент RU 204134 773A, 29.11.2004 «Способ диагностики острого гнойного пиелонефрита и инфекции мочевых путей».
10. Федеральные клинические рекомендации по оказанию медицинской помощи детям с инфекцией мочевыводящих путей [Электронный ресурс] М.: Союз педиатров России, 2018. http://www.pediatr-russia.ru/sites/default/files/file/kr_imvp2018.pdf (Accessed Apr 20, 2021).
11. Бельков В.В. Прокальцитонин и С-реактивный белок в современной лабораторной диагностике. Клинико-лабораторный консилиум. Научно-практический журнал. 2009; 1 (26):34-48.
12. Рябкова Н.Л., Везикова Н.Н. Эволюция лабораторных маркеров системных бактериальных инфекций. Терапевтический архив. 2017; 89 (11): 105-110. doi: 10.17116/terarkh20178911105-110.
13. Патент RU 2697722 С1, 19.08.2019 «Способ диагностики активности воспалительного процесса при латентном течении хронического пиелонефрита».
14. Патент RU 2716713 С1, 16,03,2020 «Способ диагностики стадии острого пиелонефрита».
15. Патент RU 2611371 С2, 21.02.2017 «Молекулярные маркеры для инфекций мочевыводящих путей».