Способ и устройство для выделения внеклеточных везикул из биологических жидкостей с помощью каскадной ультрафильтрации
METHOD AND DEVICE FOR RECOVERING EXTRACELLULAR VESICLES FROM BIOLOGICAL FLUIDS BY MEANS OF CASCADE ULTRAFILTRATION

Область техники
Изобретение относится к биологии и медицине, в частности, к методу и устройству для выделения и очистки внеклеточных везикул из биологических жидкостей животных и человека, а также к использованию очищенных внеклеточных везикул для различных диагностических и терапевтических целей.
Уровень техники
Extracell Vesicles,
Внеклеточные везикулы, такие как экзосомы (диаметром 40-150 нанометров (нм)), простасомы (диаметром 40-500 нм), микровезикулы (диаметром 100-1000 нм) и апоптотические тела (диаметром 800-5000 нм)  представляют собой мембранные сфероиды, выделяемые в межклеточное пространство клетками различных тканей и органов в норме и при патологиях. Эти частицы можно обнаружить  практически в любых биологических жидкостях, таких как (культуральная) среда для роста культур клеток, плазма крови, моча, синовиальная жидкость, спинномозговая жидкость, слюна, слеза, семенная жидкость, молоко и др. Эти везикулы содержат определенные специфические наборы молекул, включающие белки, липиды, метаболиты и нуклеиновые кислоты, характерные для материнских клеток. Это делает их своеобразными носителями информации, которой могут обмениваться клетки разных тканей. Экзосомы, микровезикулы и апоптотические тела также значительно различаются по содержанию биологических молекул, таких как рибосомная РНК, микроРНК и белковые маркеры (Crescitelli RJ, et al.,  2013 Sep 12;2). Везикулы образуются с помощью отпочковывания от плазматической мембраны клетки, и поэтому их содержимое заключено в двухслойную фосфолипидную мембрану, содержащую различные микродомены (например, обогащённые холестерином, сфинголипидами и др).
ACS Nano
Повышенный интерес к везикулам вызван тем, что их содержимое может быть использовано для диагностики состояния выделивших их клеток. Возможность их очистки из биологических жидкостей и информативность заключенного в них материала делает их идеальными неинвазивными биомаркерами для множества заболеваний, например, онкологических (Fais S, et al., , 2016, Apr 26;10(4):3886-99). Кроме этого, они также могут быть использованы для специфической доставки терапевтических агентов. Для того, чтобы в полной мере использовать диагностический и терапевтический потенциал экзосом, необходима разработка воспроизводимых специфических и простых в использовании методов очистки экзосом из биологических жидкостей.
Theranostics
BioTechniques
Kidney Int
PLoS ONE
Sci Rep
В литературе описано множество способов выделения везикул,  в частности, экзосом (Pin Li, et al., "Progress in Exosome Isolation Techniques", , 2017, Vol. 7, Issue 3, 789-804). Традиционный метод выделения везикул опирается на ультрацентрифугирование биологической жидкости в таких условиях, как, например, при 100,000 × g в течение нескольких часов для селективного осаждения экзосом из биологических жидкостей (Kosanovic M and Jankovic M, , 2014, 57:143-149), хотя при таком подходе отмечено загрязнение получаемой фракции экзосом клеточным и белковым дебрисом. Экзосомы также выделяют на основе их плавучей плотности в вязких жидкостях, когда образцы с экзосомами наслаивают сверху на градиент сахарозы или другого вещества и подвергают высокоскоростному ультрацентрифугированию (Alvarez ML et al., ., 2012, 82:1024-1032; Gerlach J, et al., , 2013, Sep 19;8(9):e74801). Преимуществом этого метода является повышение чистоты экзосомной фракции, но при этом этот метод трудоемок, длителен, не подходит для анализа большого количества образцов и приводит к потерям значительного количества экзосом (Lane RE, et al., ., 2015, Jan 6;5:7639).
J Physiol
Еще один подход к выделению внеклеточных везикул описан в заявке US 20170198280 A1; он специально предназначен для анализа нуклеиновых кислот, содержащихся в экзосомах, поскольку в нем используются центрифужные колонки с положительно заряженными мембранами, обеспечивающими электростатическое взаимодействие с нуклеиновыми кислотами; кроме того, везикулы подвергаются лизису в процессе элюции. Также были разработаны несколько коммерчески доступных наборов реагентов для очистки экзосом из гетерогенных биологических образцов, таких как Invitrogen Total Exosome Isolation Kit (Life Technologies, USA) и ExoSpin Exosome Purification Kit (Cell Guidance Systems, USA). Эти два набора стимулируют осаждение везикул с помощью добавления полиэтиленгликоля или других подобных веществ, при этом комплексы экзосом с полиэтиленгликолем осаждаются из раствора при низкоскоростном центрифугировании (10 000-20 000 × g). Несмотря на то, что этот метод менее трудозатратный и не использует ультрацентрифугирование, он осаждает не только экзосомы, но также клеточную и белковую фракции (Oosthuyzen W, et al., ., 2013 Dec 1;591(23):5833-42). Наличие примесей белков и других полимеров из биологических жидкостей во фракции экзосом существенно затрудняет последующие диагностические процедуры и понижает их чувствительность. Наконец, другие методы выделения экзосом были также описаны в US 20160333338 A1, RU 2556825, US 20150024949 A1.
Существующие на сегодняшний день на рынке и описанные в литературе подходы к очистке и выделению экзосом из биологических жидкостей не способны адекватно удовлетворить растущую потребность в простых в использовании и надежных методах, применимых в стандартных диагностических лабораториях. Поскольку важность диагностического и терапевтического потенциала экзосом трудно переоценить, существует потребность в новых улучшенных способах выделения интактных экзосом из биологических жидкостей для последующего анализа или модифицирования для терапевтических приложений. Данное изобретение обладает рядом свойств, необходимых для решения поставленной задачи, и способно найти применение в рутинной диагностической практике.
Сущность изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание простого и эффективного метода очистки внеклеточных везикул из биологических жидкостей животных, применимого в условиях стандартной диагностической лаборатории, то есть без использования дорогостоящих инструментов, таких как ультрацентрифуга.
Решение указанной задачи заключается в использовании двухраундовой фильтрации биологической жидкости через фильтры, мембрана которых практически не связывает биологические полимеры, в том числе содержащиеся на поверхностях везикул. В этом случае эффективность очистки определяется размером везикул и не зависит от их клеточного происхождения или наличия определенных эпитопов на поверхности. Подобранные параметры фильтрации позволяют освободить фракцию везикул как от большинства мажорных белков, присутствующих в биологических жидкостях, так и от крупных микрокомплексов размером более 500 нм, включающих клетки, клеточные фрагменты, апоптотические тела и др.
В некоторых вариантах изобретения указанная задача решается с помощью способа выделения внеклеточных везикул из образца биологической жидкости субъекта, включающего по меньшей мере следующие действия: (а) получают образец биологической жидкости; (б) пропускают этот образец биологической жидкости по меньшей мере один раз через первый мембранный фильтр, содержащий мембрану, которая практически не связывает биологические полимеры и имеет размеры пор в диапазоне от 400-600 нм; (в) прошедший через первый фильтр раствор из стадии (б) пропускают по меньшей мере один раз через второй мембранный фильтр, содержащий мембрану, которая практически не связывает биологические полимеры и имеет размеры пор в диапазоне  70-200 нм; (г) промывают материал, находящийся на поверхности второго фильтра; (д) собирают материал, не прошедший через второй фильтр, с поверхности второго фильтра, при этом указанный материал состоит преимущественно из внеклеточных везикул. В некоторых вариантах изобретения мембрана фильтра, которая практически не связывает биологические полимеры, изготовлена из: ацетата целлюлозы, регенерированной целлюлозы, полиэфирсульфона или арамида. В предпочтительных вариантах изобретения второй мембранный фильтр имеет размеры пор в диапазоне от 70 до 105 нм.
В некоторых вариантах изобретения сбор материала, не прошедшего через второй фильтр, производят обратным потоком промывочного буфера.
В некоторых вариантах изобретения указанная задача решается способом выделения внеклеточных везикул, отличающимся тем, что пропускание материала через первый или второй мембранный фильтр осуществляют по меньшей мере два раза.
В предпочтительных вариантах изобретения способ выделения внеклеточных везикул характеризуется тем, что для увеличения скорости прохождения биологической жидкости через первый или второй мембранный фильтр используют центрифугирование или вакуумное фильтрование. В некоторых вариантах изобретения центрифугирование или вакуумное фильтрование для увеличения скорости фильтрования используется в любой комбинации, а именно: вакуум для первого фильтра и вакуум для второго фильтра; вакуум для первого фильтра и центрифуга для второго фильтра; центрифуга для первого фильтра и вакуум для второго фильтра; центрифуга для первого фильтра и центрифуга для второго фильтра.
in vitro
В некоторых вариантах изобретения способ выделения везикул характеризуется тем, что исходной биологической жидкостью, из которой выделяются везикулы, является любая другая биологическая жидкость, выбранная из следующего списка: плазма или сыворотка крови, моча, синовиальная жидкость, спинномозговая жидкость, слюна, слеза, семенная жидкость, молоко и прочие. Также, этот способ применим для выделения везикул из культуральной среды, используемой для роста клеток . В предпочтительных вариантах изобретения биологической жидкостью, из которой выделяются внеклеточные везикулы, является моча.
В некоторых вариантах изобретения с целью повышения полноты выделения мелкой фракции экзосом пропускание материала через второй мембранный фильтр происходит методом двухсторонней ультрафильтрации. Данный метод предполагает проведение фильтрации любым из описанных способов, после чего смыв собранного материала производится обратным потоком промывочного буфера. Это производится с целью более полного выделения самой мелкой фракции экзосом, которая может проникать в подповерхностный слой фильтра.
В предпочтительных вариантах изобретения описываемые способы выделения внеклеточных везикул могут быть использованы в процессе диагностики, прогнозирования развития или определения риска развития заболевания у субъекта. В некоторых вариантах изобретения медицинские показания для применения указанного способа выделения везикул выбирают из заболеваний органов и тканей мочеполовой системы или онкологических заболеваний, например, злокачественных   заболеваний кроветворной системы, предстательной железы, мочевого пузыря, почки или других органов и тканей.
В некоторых вариантах фильтрация может быть последовательной, когда проба пропускается через первый фильтр, а потом через второй, иначе проба может пропускаться через двойной фильтр одновременно.
В некоторых вариантах первая, вторая или обе ступени фильтрации ускоряются за счет вакуумной фильтрации.
В некоторых вариантах первая, вторая или обе ступени фильтрации ускоряются за счет центрифугирования 3-6 000 g.
Последовательная ультрафильтрация может представлять собой любую комбинацию вакуумной и центрифужной ультрафильтрации: вакуум- вакуум, вакуум-центрифуга, центрифуга-вакуум, центрифуга- центрифуга.
В некоторых вариантах изобретения вышеуказанная задача решается с помощью устройства для реализации вышеописанных способов выделения внеклеточных везикул из образца биологической жидкости субъекта, которое включает первый мембранный фильтр, содержащий мембрану с размерами пор в диапазоне от 400 до 600 нм, соединенный со вторым мембранным фильтром, содержащим мембрану с размерами пор в диапазоне от 70 до 200 нм, при этом мембраны указанных фильтров изготовлены из материалов, которые практически не связывают биологические полимеры, а само устройство выполнено с возможностью фильтрации образца биологической жидкости через оба указанных фильтра. В некоторых вариантах изобретения вышеуказанная задача решается с помощью устройства, имеющего специальную конструкцию, соответствующую реализации каждого из вышеуказанных способов. Например, реализация одностадийной двойной ультрафильтрации может быть вакуумной или центрифужной. В конструкции для реализации вакуумной одностадийной двойной ультрафильтрации предпочтительно используется вакуумная система ультрафильтрации, конструктивно близкая к стандартным, но с воронкой цилиндрической формы, обеспечивающей плотную посадку вставляемого в воронку внутреннего цилиндра, в дно которого вмонтирован первый фильтр с размерами пор 400-500 нм, а ниже его оказывается второй фильтр 70-200 нм.  В случае двойной ультрафильтрации, осуществляемой с помощью центрифугирования, предпочтительно используется двойная вставка в центрифужную пробирку, имеющая конструкцию «цилиндр-в-цилиндре». В дно внутреннего цилиндра, в который вносится обрабатываемая жидкость, герметически вставлена первая мембрана с размерами пор 400-600 нм., а в дно внешнего цилиндра герметически вставлена вторая мембрана с размерами пор 70-200 нм.
В некоторых случаях, когда исходная проба содержит большое количество крупных частиц и полимеров, забивающих первый фильтр, процедура фильтрации может быть произведена после предварительного центрифугирования при 15 000 g.
В некоторых случаях после предварительного центрифугирования при 15 000 g. удается получить столь чистый материал, что его можно непосредственно фильтровать через второй фильтр 70-200 нм.
Для ультрафильтрации преимущественно используются хорошо смачиваемые фильтры с нулевым или пренебрежимо малым зарядом (очень слабо или полностью не связывающиеся с биологическими полимерами, такими как ДНК, РНК, белки, липиды, полисахариды и пр.). Примерами материалов мембран для таких фильтров являются ацетат целлюлозы, регенерированная целлюлоза или полиэфирсульфон. Также это может быть любой другой фильтр с подходящим размером пор, изготовленный ( по крайней мере одна фильтрующая сторона) из неионизирующихся при условиях выделения материалов, не связывающих полимеры, присутствующие в биологических пробах.
Допускается использование в качестве второго фильтра мембраны на подложке или фильтра с модифицированным верхним слоем, обладающим нужными свойствами.
При осуществлении изобретения достигается следующий технический результат: разработан новый эффективный способ очистки целых, неповрежденных, не загрязненных посторонними белками внеклеточных везикул размером от 40 до 400 нм, применимый для выделения из широкого спектра биологических жидкостей животных и человека, таких, как плазма крови, моча, синовиальная жидкость, спинномозговая жидкость, слюна, слеза, семенная жидкость, молоко и другие. Описанный способ позволяет эффективно очищать внеклеточные везикулы из биологических жидкостей животных и человека в условиях стандартной диагностической лаборатории, то есть без использования дорогостоящих инструментов, таких как ультрацентрифуга. Описанный способ демонстрирует большую быстроту, простоту и более высокую степень очистки при сопоставимом количестве выделяемых везикул по сравнению с другими методами очистки везикул, не использующими ультрацентрифугирование.
Краткое описание рисунков
Фиг. 1. Система ультрафильтрации в варианте двойного одновременного фильтрования под воздействием вакуума. 1.1- Двойной мембранный патрон для вакуумной ультрафильтрации. 1.2 вариант устройства для лабораторной ультрафильтрации, особенностью которого является цилиндрическая воронка, герметически вмещающая в себя мембранный патрон.
Фиг. 2. Система ультрафильтрации в варианте двойного одновременного фильтрования в центрифуге. 2.1- Двойной мембранный патрон для ультрафильтрации в центрифуге. 2.2 – центрифужная пробирка
Фиг. 3. Унифицированный модуль для вакуумной ультрафильтрации в центрифужную пробирку. 3.1 - Мембранный патрон для вакуумной фильтрации в центрифужную пробирку. 3.2 - центрифужная пробирка. Патрон и пробирку соединяет вакуумный модуль.
Фиг. 4. Унифицированный модуль для двухсторонней ультрафильтрации в варианте вакуум – центрифуга (4.3.а) или вакуум-вакуум (4.3.б). 4.1 - Мембранный патрон для двусторонней ультрафильтрации. 4.2. - переворот мембранного патрона.
Фиг. 5.а Фотография поверхности фильтра с везикулами, полученная с помощью электронного микроскопа. Размер между насечками составляет 1.0 мкм.
Фиг.5.б фотография очищенного препарата везикул, полученная с помощью электронного микроскопа. Длина масштабной полоски составляет 1.0 мкм.
Фиг. 6. Пример распределения наночастиц в образце экзосом, выделенных из мочи методом осаждения ПЭГ, как описано в тексте. Анализ проведён на приборе Zetasizer NanoZS при 25 °С. Стрелкой указаны загрязнения препарата белками мочи, которые наблюдаются в пределах размеров от 1 до 10 нм. Экзосомы распределяются в пределах размеров 40-200 нм (область показана скобкой). Размер частиц указан на оси Х (в нм).
Фиг. 7. Анализ экзосом на приборе Zetasizer NanoZS выделенных методом «высаливания». А- распределение наночастиц в образце согласно размеру (ось Х в нм) и интенсивности светового рассеивания (ось Y). Загрязнение белками мочи, детектируемое присутствием сигнала в пределах 0.8 до 10 нм, показано стрелкой. Распределение экзосом по размеру указано скобкой. Б- анализ того же препарата экзосом, показывающий относительное число (ось Y) частиц, определяемых как загрязнение белками (в пределах 0.8 до 10 нм, ось Х) и относительное число экзосом (область экзосом показана скобкой).
Фиг. 8. Вариант осуществления способа выделения экзосом, реализующего сбор и промывку экзосом при помощи вакуумной ультрафильтрации.
А – на подложку воронки помещают фильтр, на котором осаждаются экзосомы. Воронку помещают в колбу для сбора отфильтрованной жидкости и подключают к вакуумному насосу. Б - Система для одновременного выделения экзосом из четырёх образцов.
Фиг. 9. Анализ экзосом на приборе Zetasizer NanoZS, выделенных способом фильтрации с использованием фильтров с размерами пор 0.05 мкм. Стрелками показано загрязнение препарата экзосом белками мочи, сорбированных на фильтре. А - распределение наночастиц в образце согласно размеру в нм (ось Х) и интенсивности светового рассеивания (ось Y). Распределение экзосом по размеру частиц показано скобкой. Б - анализ того же препарата экзосом, показывающий относительное число (ось Y) частиц, определяемых как загрязнение белками (в пределах от 1 до 10 нм, ось Х) и относительное число экзосом (область экзосом показана скобкой).
Фиг. 10. Анализ экзосом на приборе Zetasizer NanoZS, выделенных заявляемым способом фильтрации с использованием фильтров с размерами пор 0.1 мкм. Стрелками показано отсутствие детектируемого при использовании других методов загрязнения препаратов экзосом белками мочи, которые определяются в пределах размеров от 1 до 10 нм. А - распределение наночастиц в образце согласно размеру в нм (ось Х) и интенсивности светового рассеивания (ось Y). Распределение экзосом по размеру частиц показано скобкой. Б - анализ того же препарата экзосом, показывающий относительное число частиц (ось Y), определяемых как загрязнение белками (в пределах от 1 до 10 нм, ось Х) и относительное количество экзосом (область экзосом показана скобкой).
Фиг. 11. Фотография очищенных экзосом, полученная в виде стоп-кадра из видеофрагмента, записываемого прибором NANOSIGHT NS300.
Фиг. 12. Кривая распределения размера внеклеточных везикул, выделенных из мочи (усреднение по 5 пробам), полученная на NANOSIGHT NS300.
Фиг.13. Анализ экзосом на приборе Zetasizer NanoZS, выделенных заявляемым способом фильтрации из культуральной жидкости клеток эпителия рака простаты LnCaP с использованием фильтров с размерами пор 0.1 мкм. Стрелкой показано отсутствие детектируемого при использовании других методов загрязнения препаратов экзосом белками культуральной жидкости, которые определяются в пределах размеров от 1 до 10 нм. По оси Х показано распределение наночастиц в образце согласно размеру в нм, а по оси Y - интенсивность светового рассеивания. Распределение экзосом по размеру частиц показано скобкой.
Фиг.14. Анализ экзосом на приборе Zetasizer NanoZS, выделенных заявляемым способом фильтрации из плазмы крови человека с использованием фильтров с размерами пор 0.1 мкм. Стрелкой показано отсутствие детектируемого при использовании других методов загрязнения препаратов экзосом белками плазмы крови, которые определяются в пределах размеров от 1 до 10 нм. По оси Х показано распределение наночастиц в образце согласно размеру в нм, а по оси Y - интенсивность светового рассеивания. Распределение экзосом по размеру частиц показано скобкой.
Подробное раскрытие изобретения
В описании данного изобретения термины «включает», «включающий» и «включает в себя» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
The Prostate
Термин «внеклеточные везикулы» охватывает все мембранные везикулы, высвобождаемые из клеток, в то время как термины «экзосомы», «простасомы», «микровезикулы», «апоптотические тела» и «микросомы» используются для конкретных популяций внеклеточных везикул. Экзосомы, являющиеся наиболее изученными из внеклеточных везикул, представляют собой небольшие мембранные везикулы (40-150 нм) внутриклеточного происхождения, которые высвобождаются путем слияния внутриклеточных мультивезикулярных тел с клеточной мембраной. Экзосомы, выделяемые простатой (называемые как "простасомы"; описаны, например, в Ronquist G, et al., , 2012 Wiley Periodicals, p.1-10), могут достигать диаметра 500 нм. Другим широко распространенным типом внеклеточных везикул являются микровезикулы, которые, как предполагается, имеют типичный диаметр 100-1000 нм и высвобождаются почкованием клеточной плазматической мембраны. Клетки, подвергающиеся апоптозу, образуют нерегулярные почки плазматической мембраны; при разрушении клетки образуются мембранные везикулы, называемые апоптотическими телами, с размерами 800-5000 нм. Микросомами обозначают небольшие везикулы диаметром 80-120 нм, образованные из фрагментов мембраны эндоплазматического ретикулума в процессе ультрацентрифугирования гомогенизатов клеток.
Под материалом мембраны фильтров, который практически не связывает биологические полимеры, понимается хорошо смачиваемый водой материал с нулевым или пренебрежимо малым зарядом, образуемым в процессе смачивания, что обеспечивает отсутствие возникновения электростатических, диполь-дипольных, гидрофобных, ван-дер-ваальсовых и других взаимодействий при контакте материала мембраны с биологическими полимерами, такими как ДНК, РНК, белки, липиды, полисахариды и пр. Примерами материалов мембраны для таких фильтров являются ацетат целлюлозы, регенерированная целлюлоза, полиэфирсульфон и некоторые другие.
Под вакуумным фильтрованием следует понимать способ фильтрования (фильтрации) жидкостей, при котором для перемещения фильтруемой жидкости сквозь фильтрующий элемент используется разница между атмосферным давлением снаружи приёмника фильтрата и искусственно уменьшенным давлением (вакуумом) внутри него.
Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Разработка принципа очистки экзосом из биологических жидкостей.
Ввиду значительного диагностического и терапевтического потенциала экзосом процедура их очистки должна быть простой и надежной и приводить к выделению фракции экзосомальных частиц размером 0.04-0.5 микрометров (мкм) из биологических жидкостей, свободной от белков и других биологических полимеров. Биологические жидкости представляют собой сложную смесь, в которой содержатся частицы как крупнее, так и мельче необходимого диапазона; в них содержатся полимеры, например, белки, разных молекулярных весов, которые могут образовывать агрегаты при взаимодействии между собой. Такие комплексы могут образовывать хлопья или желеобразный осадок. Молекулы полимеров и их агрегаты перекрывают весь спектр фильтрации. Низкомолекулярная фракция проходит все ступени фильтрации, а наиболее крупные образования препятствуют ультрафильтрации, забивая фильтры или образуя на фильтрующей поверхности желеобразный слой. Решение поставленной задачи представляется в виде фильтрационной системы, которая должна не просто задерживать частицы, большие по размеру, чем 40 нм, а еще и дополнительно позволять отделить образования, больше 400 нм, и вместе с тем дополнительно обеспечивать отделение основной массы растворимых белков.
Из уровня техники известны различные фильтры, имеющие ряд различающихся свойств, сильно отражающихся на их применимости для решения конкретной задачи. Важнейшим отличием фильтров является химическая природа материала, из которого изготовлен фильтр. Материал фильтра определяет ряд важнейших параметров:
1) смачиваемость (гидрофильность – гидрофобность) мембраны сильно влияет на процесс протекания жидкости. При малых размерах пор фильтр обязательно должен быть сделан из смачиваемого материала, иначе поверхностное натяжение сможет просто удерживать слой жидкости на поверхности, препятствуя ее проникновению в толщу фильтра. В случае биологических образцов имеется в виду смачиваемость водой, называемая гидрофильностью.
2) ионизация материала при попадании в воду; при этом может образоваться заряд поверхности фильтра. Этот заряд может привести к эффекту удержания на ней молекул и/или частиц, имеющих противоположенный заряд. При значительном заряде мембраны эффект связывания может быть практически необратим. При меньших зарядах связывание обратимо и молекулы и/или частицы можно отделить обратно. Однако даже при малых зарядах мембраны происходит ее взаимодействие с различными биологическими молекулами и частицами, которые сами бывают заряжены.
В настоящее время нет точных данных о характере и постоянстве заряда экзосом, поэтому для очистки экзосом представляется необходимым использовать хорошо смачиваемый фильтр с нулевым или пренебрежимо малым зарядом (очень слабо или полностью не связывающийся с биологическими полимерами: ДНК, РНК, белки, липиды, полисахариды и пр.). Примерами материалов мембраны для таких фильтров являются ацетат целлюлозы, регенерированная целлюлоза, полиэфирсульфон и некоторые другие. Также для осуществления изобретения может быть использован любой другой фильтр с подходящим размером пор, изготовленный (или, по крайней мере одна фильтрующая сторона изготовлена) из неионизирующегося при условиях выделения материала, не связывающегося с полимерами, присутствующими в биологических пробах.
3) Еще одной важной характеристикой фильтров является средний размер пор и распределение размеров пор. Здесь возникают дополнительные сложности, поскольку мелкопористые фильтры чаще всего используются для разделения полимеров и хорошо охарактеризованы по параметрам взаимодействия с ними. Наиболее распространенной характеристикой фильтра является минимальный молекулярный вес задерживаемого полимера в MWCO (molecular-weight cutoff). Тем не менее, молекула крахмала и молекула белка по-разному будут вести себя на одном и том же фильтре, даже если у обеих одинаковый молекулярный вес. Производители не скрывают, что параметр MWCO является приблизительным и корреляция между ним и средним размером пор существует, но для фильтров, изготовленных из разных материалов и по разным технологиям может отличаться значительно.
Более того, в обсуждаемом диапазоне размеров частиц (0.04-0.5 мкм) и, соответственно, фильтров, имеющих близкие по размерам поры, проявляется эффект существования на гидрофильной поверхности слоя связанной воды. Этот слой имеет минимальную толщину около 5 нм, и может доходить до 30 нм. Таким образом эффективный размер пропускания фильтра может быть значительно меньше среднего размера пор. Исходя из этого, например, на фильтре 0.1 мкм в соответствующих условиях возможно задержать везикулы диаметром 0.05 мкм.
Таким образом, для эффективной очистки экзосом из биологических жидкостей необходимо: (1) отделить частицы, хлопья и другие образования размером более 0.4-0.5 мкм и желеобразные продукты взаимодействия растворенных полимеров (чаще всего белков) между собой; (2) выделить из пробы максимальное количество оставшихся частиц, размером более (0.04-0.5 мкм) мкм, при этом желательно удержать выделенную массу интактных везикул на поверхности фильтра для их дальнейшего использования; (3) использовать слабозаряженные или незаряженные смачиваемые фильтры, не связывающие, или минимально связывающие, биологические макромолекулы, что позволит (a) фильтровать большие объемы проб из-за того, что такой фильтр не покрывается связавшимися с ним полимерами и дольше сохраняет фильтрующую способность, и (б) избавиться от растворенных макромолекул, промывая массу выделенных частиц чистым буфером.
Таким образом, для осуществления изобретения по указанному способу, необходимо получить образец исходной биологической жидкости, из которого выделяются везикулы. Образцом может являться любая биологическая жидкость человека, например,  плазма крови, моча, синовиальная жидкость, спинномозговая жидкость, слюна, слеза, семенная жидкость, молоко, сок простаты и другие, а также культуральная среда, используемая для роста клеток. Для осуществления изобретения могут быть использованы стандартные методы получения образцов биологических жидкостей, известные среднему специалисту. Далее этот образец необходимо пропустить по меньшей мере один раз через первый мембранный фильтр, содержащий мембрану, которая практически не связывает биологические полимеры и имеет размеры пор в диапазоне от 400 до 600 нм. Далее прошедший через первый фильтр раствор необходимо пропустить по меньшей мере один раз через второй мембранный фильтр, содержащий мембрану, которая практически не связывает биологические полимеры и имеет размеры пор в диапазоне от 70 до 200 нм. Далее необходимо собрать материал, не прошедший через второй фильтр, с поверхности второго фильтра.
В настоящем изобретении используется последовательная ультрафильтрация биологической жидкости через два или более гидрофильных, не связывающихся с биологическими полимерами фильтра. Такая система может быть реализована универсальным способом в виде комплекта фильтровальных устройств, в которых проба проходит последовательную обработку, причем фильтры подобраны таким образом, что
1. первый со средним диаметром пор 0.45-0.5 мкм обеспечивает удержание крупных частиц и агрегатов/ хлопьев макромолекул, пропуская микрочастицы, размером менее 450 нм и растворенные в жидкости молекулы, включая полимеры;
2. второй, со средним диаметром пор 0.1-0.15 мкм обеспечивает удержание микрочастиц размером более 40 нм, пропуская растворенные в жидкости молекулы меньшего размера.
В некоторых вариантах осуществления размеры пор первого фильтра составляют 0.4 мкм, 0.45 мкм, 0.5 мкм, 0.55 мкм или 0.6 мкм. В некоторых вариантах осуществления размеры пор второго фильтра составляют 0.1 мкм, 0.15 мкм или 0.2 мкм.
При осуществлении заявленного способа в качестве побудителя потока жидкости через фильтр может использоваться как вакуум, так и центрифугирование. Конструкция фильтрационного узла может быть может быть реализована в виде цилиндра- вкладыша, образуя двойной мембранный патрон, а побудителем потока может быть пониженное давления воздуха на выходе из фильтрационной системы (вакуумная ультрафильтрация, см. Фиг. 1).
Альтернативно пара цилиндров -вкладышей может помещаться в центрифужную пробирку (Фиг. 2), а побудителем потока может быть низкоскоростное центрифугирование (центробежная ультрафильтрация).
При осуществлении способа есть возможность использовать фильтровальные диски, или, в предпочтительном варианте, конструкция фильтрационного узла может быть реализована в виде цилиндра- вкладыша, аналогичного показанным на Фиг. 1 и Фиг. 2.
При необходимости может быть произведена последовательная фильтрация в вариантах вакуум – вакуум, вакуум – центрифуга, центрифуга – вакуум или центрифуга – центрифуга. Унифицированный модуль для вакуумной ультрафильтрации в центрифужную пробирку показан на Фиг. 3. Унифицированный модуль для двухсторонней ультрафильтрации в варианте вакуум-вакуум или вакуум – центрифуга показан на Фиг. 4.
В предпочтительных вариантах изобретения использовались гидрофильные, слабозаряженные, не связывающиеся с биологическими полимерами ультрафильтры, сделанные из смеси ацетатов целлюлозы, имеющие пористость до 85%. Дефекты в структуре, а также функциональные группы придают ацетату целлюлозы незначительные ионообменные свойства, не приводящие к связыванию биополимеров. На Фиг. 5.а показана электронная фотография поверхности фильтра с экзосомами на ней. На Фиг. 5.б показана электронная фотография очищенного препарата везикул (экзосом).
В некоторых вариантах фильтрация может быть последовательной, когда проба пропускается через первый фильтр (см. Фиг. 3), а потом через второй, иначе проба может пропускаться через два фильтра одновременно (см. Фиг. 1. Двойная вакуумная ультрафильтрация и Фиг. 2. Двойная ультрафильтрация в центрифужной пробирке).
В некоторых вариантах первая, вторая или обе ступени фильтрации ускоряются за счет вакуумной фильтрации.
В некоторых вариантах первая, вторая или обе ступени фильтрации ускоряются за счет центрифугирования 3-5 000 об/мин.
В некоторых случаях, когда исходная проба содержит большое количество крупных частиц и полимеров, забивающих первый фильтр, процедура фильтрации может быть произведена после предварительного центрифугирования при 10 000 об/мин.
В некоторых случаях после предварительного центрифугирования при 10 000 об/мин. удается получить столь чистый материал, что его можно непосредственно фильтровать через второй фильтр с размерами пор 70-200 нм.
В некоторых случаях, обычно при интересе исследователя к фракции экзосом более мелкого размера, с целью повышения полноты их выделения, на втором мембранном фильтре производят двухстороннюю ультрафильтрацию. Данный метод предполагает проведение фильтрации любым из описанных способов, после чего сбор собранного материала производится путем смыва обратным потоком промывочного буфера, например, так как показано на Фиг. 4, где на первом этапе производится прямое фильтрование, через патрон 4.1, после чего фильтр переворачивается (4.2) и смыв производится центрифугированием (4.3.а) или фильтрацией (4.3.в). Это производится с целью более полного выделения самой мелкой фракции экзосом, которая может проникать в подповерхностный слой фильтра.
Допускается использование в качестве второго фильтра мембраны на подложке или фильтра с модифицированным верхним слоем, обладающим нужными свойствами.
Примеры использования изобретения в сравнении с другими методами очистки экзосом из биологических жидкостей
.
Theranostics
Для клинического и диагностического применения экзосом необходимо наличие метода их очистки из биологических жидкостей без использования ультрацентрифуги в виду ее отсутствия в клинических лабораториях. Поэтому в качестве возможных подходов можно использовать (Pin Li, et al., "Progress in Exosome Isolation Techniques", , 2017, Vol. 7, Issue 3, 789-804) ультрафильтрацию, концентрирование материала при помощи мембранных концентраторов и осаждение экзосом из больших объёмов биоматериала посредством полиэтиленгликоля. Ультрафильтрация может осуществляться при пропускании биоматериала через насадки на шприцы (фильтр-шприцы) которые содержат мембраны с различным размером пор. Использование концентраторов предполагает центрифугирование материала через мембраны при низких скоростях (2 000 -4 000 об/мин). Осаждение экзосом полиэтиленгликолем из биологических жидкостей также предполагает низкоскоростное центрифугирование.  В этом случае возможно использование обычных центрифуг, которыми оснащены стандартные клинические лаборатории.
Авторами были проведены эксперименты по сравнению эффективности выделения экзосом различными опубликованными методами в сравнении с заявляемым методом. Эксперименты проводились с мужской мочой, полученной от анонимных доноров. Внеклеточные везикулы, находящиеся в моче, содержат фракцию простасом и могут иметь размер до 500 нм.
Процесс сбора и хранения образцов разрабатывался таким образом, чтобы позволять производить накопление биоматериала в необходимых для проведения анализа количествах без потери активности исследуемых белков. Решение было сделано после проведения сравнительного анализа образцов свежей (незамороженной) мочи и мочи после замораживания-оттаивания, полученной от одного и того же индивидуума. Как показал опыт, наиболее удобный для медицинской практики протокол предполагает замораживание образцов при температуре -15- -20 °С. Образцы не рекомендуется держать при комнатной температуре более 3 часов чтобы исключить размножение бактерий, присутствующих в моче, и деградацию белков.
Для сбора мочи были использованы стерильные контейнеры, применяемые в стандартной клинической практике. Также могут быть использованы центрифужные пробирки объемом 50 миллилитров (мл), как, например, «Пробирка центрифужная 50 мл, CELLSTAR, коническая, стерильная», или альтернативные бренды.  Стерильность контейнеров и пробирок необходима для обеспечения повторяемости процедуры анализа. При использовании нестерильных пробирок существует риск размножения бактерий и влияние на результаты исследования.
В предпочтительном варианте изобретения процедура подготовки образца включала в себя следующие стадии: (a.1.) полученная от пациента моча подвергалась центрифугированию при низких скоростях (2 000-3 000 об/мин) в течение 15 мин; (a.2.) супернатант мочи помещали в стерильные центрифужные пробирки объёмом 50 мл и замораживали. После размораживания была отмечена необходимость нагревания образца мочи до комнатной температуры с постоянным перемешиванием (встряхиванием) пробирки. Оттаявшие, но не прогретые образцы, содержат мажорный белок мочи - уромодулин в нерастворимой форме. Использование таких образцов приводит к засорению фильтров агрегатами уромодулина и других белков, что снижает интенсивность протока жидкости через фильтр; (a.3.) после разморозки пробы инкубировались 2-3 часа при комнатной температуре; (a.4.) образцы мочи подвергались центрифугированию при скорости 5- 10 000g в течение 20-30 мин; (a.5.) 5-20 мл супернатанта использовали для дальнейших исследований.
Качество выделения экзосом оценивали с использованием стандартного метода вестерн блоттинга (Western Blot) с использованием по крайней мере двух экзосом-специфических антител (антитела против CD63 и CD9). Это позволяло точно идентифицировать наличие экзосом, а дополнительная прокраска мембраны красителем Ponceau Red позволяла достаточно точно определять соотношение целевого материала и загрязнений.
Для сравнения были опробованы  методы выделения экзосом: ультрацентрифугирование; осаждение полиэтиленгликолем; комбинация ультрацентрифугирования и осаждения полиэтиленгликолем при различных концентрациях полиэтиленгликоля; последовательная фильтрация образцов мочи посредством шприца с насадками фильтров с размерами пор 0.45 мкм, 0.22 мкм и 0.02 мкм; фильтрование образцов мочи через поликарбонатные фильтры с размером пор 0.01 мкм при помощи вакуумного насоса; выделение экзосом посредством белковых концентраторов с мембранами 100 000 и 50 000 Дальтон.
При осуществлении метода ультрацентрифугирования 35 мл мочи подвергались центрифугированию 10 000 g для удаления обломков клеток, а затем супернатант переносился в центрифужные пробирки Beckman и ультрацентрифугирование проводили при скорости 100 000 g в течение разного периода времени. Были испробованы разные временные параметры – ультрацентрифугирование в течение 3х часов (стандартные условия), 5-и часов и 12-16 часов. При использовании стандартных условий ультрацентрифугирования выход экзосом был слишком мал, при увеличении времени ультрацентрифугирования в некоторых пробах наблюдалась загрязнение осаждённых экзосом белками мочи, что приводило к возникновению неспецифических ложно-позитивных сигналов при использовании антител при проведении вестерн-блоттинга. В итоге метод ультрацентрифугирования показал нестабильные результаты – отсутствие или низкую концентрацию экзосом в отдельных пробах или значительное загрязнение проб белками мочи в других.
Полиэтиленгликоль (ПЭГ) применяется в коммерческих наборах для выделения экзосом из мочи и плазмы крови (например, набор ExoQuick-TC компании Invitrogen, USA). Для проверки эффективности этого подхода различные количества ПЭГ были добавлены к 7 мл мочи до получения конечных концентраций ПЭГ в моче – 5%, 10% и 20%, затем пробы инкубировались на льду 12-16 часов с последующим центрифугированием 10 000 g в течении одного часа. Затем полученный осадок промывали физиологическим раствором, лизировали и анализировали методом вестерн-блоттинга для определения эксосомальных белков. Было показано, что данный метод увеличивает количество осаждённого материала по сравнению с методом ультрацентрифугирования, но, как правило, эти образцы содержат также и белки мочи. Эти загрязнения значительно затрудняют анализ белков методом вестерн-блоттинга.
J. Vis. Exp
Также нами был использован метод осаждения экзосом из мочи, включающий предобработку образцов дитиотреитолом (ДТТ) с последующей обработкой ПЭГ и центрифугированием (Kanchi Ravi, R., et al., ., 2015, (95), e51158). Хотя эта модификация метода осаждения ПЭГ увеличивала количество экзосом в осадке, проблема загрязнения образцов мажорными белками мочи оставалась, что приводило к увеличению неспецифического фона при анализе белков методом вестерн блоттинга.
При комбинации методов ультрацентрифугирования и осаждения полиэтиленгликолем использовалось 15 мл мочи и различные концентрации ПЭГ (3%, 5%, 10%) с целью уменьшить загрязнение проб экзосом белками мочи, вследствие использования ПЭГ. Затем пробы подвергались ультрацентрифугированию 25 000 g или 100 000 g в течение 1 часа.  Затем полученный осадок промывали физиологическим раствором, лизировали и анализировали методом вестерн-блоттинга для определения экзосомальных белков. Показано, что эти условия выделения не приводят к улучшению результата и не решают проблемы загрязнения образцов белками мочи, которые со-осаждаются с экзосомами.
При выделении экзосом посредством шприца с насадками фильтров с размерами пор 0.45 мкм, 0.22 мкм и 0.02 мкм (фильтры фирмы Anatop, USA) было использовано 5-7 мл образца. Затем экзосомы, сорбирующиеся на фильтре 0.02 мкм, были промыты стерильным физиологическим раствором и лизированы. Лизаты анализировались методом вестерн-блоттинга для определения эксосомальных белков. Показано, что образцы экзосом полученные этим методом из мочи пациентов не содержат загрязнений белками мочи и являются приемлемым материалом для анализа экспрессии экзосомальных белков.
При фильтровании образцов мочи через поликарбонатные фильтры (polycarbonate (PCTE) membrane filters) с размером пор 0.01 мкм (STERLITECH) использовалось 15 мл мочи, предварительно профильтрованной через фильтры с размерами пор 0.45 мкм и 0.22 мкм. Образец помещался в воронку, содержащую фильтры с размером пор 0.01 мкм, и фильтрование осуществлялось посредством вакуумного насоса, присоединённого к воронке. После промывки фильтров физиологическим раствором экзосомы, задержанные на фильтре с размером пор 0.01 мкм, были лизированы и проанализированы методом вестерн-блоттинга для определения эксосомальных белков. Показано, что полученные таким способом образцы не содержат значительных загрязнений белками мочи, но количество экзосом было значительно ниже, чем полученное методом фильтрации мочи посредством шприца с насадками фильтров с размерами пор 0.45 мкм, 0.22 мкм или 0.02 мкм.
Для выделения экзосом посредством белковых концентраторов с мембранами 100 000 и 50 000 Дальтон (Sartorius) использовали 15 мл мочи, предварительно центрифугированной при скорости 10 000 g или профильтрованной через фильтры с размерами пор 0.45 мкм и 0.22 мкм. Концентрирование образцов осуществлялось согласно протоколу, рекомендованному для данного типа концентраторов с использованием низкоскоростного центрифугирования (3000-4000 об/мин). После центрифугирования мочи сорбированные на мембране концентратора экзосомы промывали двумя объёмами (по 15 мл каждый) физиологического раствора и лизировали в малом (200-400 мкл) объеме лизирующего буфера, содержащего детергенты и ингибиторы протеаз. Результаты анализа белков методом вестерн-блоттинга показали, что данный метод является неприемлемым для выделения экзосом вследствие загрязнения образцов мажорными белками мочи (такими как уромодулин, иммуноглобулины и др.), которые в нативной форме имеют размер более 100 кДа и, поэтому, не фильтруются через мембраны концентраторов, соосаждаясь вместе с экзосомами. Кроме того, было практически невозможно обеспечить полную элюцию экзосом с мембран концентраторов, несмотря на использование различных лизирующих буферов, содержащих достаточно сильные детергенты (NP-40, SDS) и различный температурный режим лизиса (25 °С - 90 °С).
Таким образом, можно констатировать, что метод фильтрации образцов мочи посредством шприца с насадкой 3-х фильтров является наиболее оптимальным для выделения экзосом из образцов мочи в клинических условиях, хотя и нуждается в дополнительной доработке. Так, при применении фильтров нельзя использовать больше 5 -7 мл мочи для продавливания образца через шприц вследствие забивания пор на последнем фильтре с размером пор 0.02 мкм, что ведёт к дополнительным затратам физических усилий и времени.
,
J Immunol Methods
Frontiers in Immunology
Еще одним подходом для выделения экзосом является метод «высаливания»которыйпредполагает осаждение экзосом 0.1 М ацетатом натрия при рН 4.75 (Brownlee Z, et al., , 2014 May; 407: 120–126).  1 М раствор ацетата натрия, рН 4.75, был добавлен к 15 мл мочи, предварительно центрифугированных  при скорости 10 000 g или профильтрованных через фильтры с размерами пор 0.45 мкм или 0.22 мкм для удаления клеточного дебриса, до конечной концентрации ацетата натрия в растворе равной 0.1 М. Затем образцы инкубировали на льду 30-60 мин, после чего нагревали до 37 °С в течение 5 мин и центрифугировали при скорости 5 000 g в течение 10 мин (также было опробовано центрифугирование с увеличением времени до 30 мин или 60 мин). Для отмывания экзосом от загрязнения белками мочи осадки ресуспензировали в 0.1 М растворе ацетата натрия рН 4.75, и повторяли процедуру центрифугирования. Затем осажденные экзосомы резуспендировали в 200-400 мкл фосфатного буфера и анализировали методами вестерн блоттинга и анализа распределения наночастиц на приборе Zetasizer Nano ZS (результаты см. ниже). Анализ показал, что метод «высаливания» не обеспечивает количества экзосом, достаточного для проведения иммунно-ферментного анализа (ИФА) с использованием множественных белковых факторов. Увеличение объёмов образцов мочи до 30-50 мл не решало эту проблему. Данные авторов согласуются с результатами, полученными в работе (Matías Sáenz-Cuesta, et al., , February 2015, Volume 6, pp.1-12), где было показано, что метод «высаливания», по сравнению с другими методами выделения экзосом, даёт достаточно материала для изучения экзосомальных РНК, но, по сравнению с другими методами, обеспечивает меньший выход экзосом-специфических белков.
Еще одним описанным способом является выделение экзосом посредством связывания с частицами карбида кремния (SiC). Как описано в патентной заявке US 20160333338, «неожиданно было показано, что карбид кремния может быть использован для селективного выделения экзосом из биологических жидкостей». Протокол выделения экзосом из мочи, описанный в US 20160333338, является простым, не требующим высоких скоростей центрифугирования, и при воспроизводимости результатов мог бы быть рекомендован для использования в рутинной клинической практике. Авторами были проведены сравнительные эксперименты согласно методике, описанной в US 20160333338. Суспензия порошка карбида кремния была приготовлена добавлением 6.25 грамм порошка (G/S 2500) к 10 мл фосфатного буфера (рН 7). 15 мл мочи подвергались низкоскоростному центрифугирования (1000-3000 об/мин) для удаления клеточного дебриса и в 5 мл супернатанта было добавлено 400 мкл суспензии SiC. После этого рН смеси доводили до рН 8.5 и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Образцы центрифугировали на скорости 2000 об/мин, удаляли супернатант и элюировали экзосомы с частиц кремния инкубацией в 400 мкл фосфатного буфера рН 6. Анализ экзосом посредством вестерн-блоттинга и анализатора наночастиц Zetasizer Nano ZS, в сравнении с другими использованных авторами методиками, показал относительно малое количество экзосом, выделенных с использованием SiC, а также контаминацию препаратов экзосом растворимыми белками мочи, причём уровень загрязнения варьировал от образца к образцу. Интересно отметить, что изменение рН смеси до 8.5 без добавления SiC приводило к помутнению образцов, что, возможно, связано с преципитацией мажорных белков мочи вследствие изменения их изоэлектрической точки. При последующем центрифугировании и анализе осадков было показано наличие в них экзосом, что, по-видимому, связано с механическим захватом везикул осаждающимися белками. Поскольку заявленный в US 20160333338 способ взаимодействия экзосом с частицами SiC не содержит описания возможного механизма процесса избирательного связывания везикул с частицами кремния, мы предполагаем, что в описанных условиях при изменении рН мочи происходит осаждение группы белков, в процессе которого и осаждаются экзосомы.
Theranostics
Таким образом, ни один из проанализированных авторами методов не привёл к результату, приемлемому для применения в стандартной клинической практике. Несмотря на существование коммерческих наборов для выделения экзосом из биологических жидкостей, поиск дешёвого и нетрудоёмкого метода, доступного для стандартных клинических лабораторий, интенсивно продолжается (Li Pin, et al., , 2017; 7(3): 789–804).
Для прямого сравнения заявляемого метода выделения экзосом с наиболее популярными конкурентными методами, а также для анализа качества и количества экзосом, выделенных из образцов мочи, авторами был использован метод динамического рассеивания света (Dynamic light scattering или DLS). Прибор Zetasizer NanoZS (Malvern Instruments, UK) позволяет измерять динамическое рассеивание света (ДРС) на наночастицах и, таким образом, подсчитывать количество находящихся в растворе частиц в пределах размеров от 1-го нанометра до 3-х мкм. Анализ препаратов экзосом посредством Zetasizer NanoZS позволяет определить размер частиц, выявить контаминацию образца соосаждёнными белками мочи и оценить относительное количество экзосом в образце.
На Фиг. 6 показан типичный результат анализа препарата, полученного посредством осаждения экзосом с использованием ПЭГ (представляет собой аналог метода, используемого в коммерческих наборах для выделения экзосом ExoQuick-TC reagent, Invitrogen). Анализ методом ДРС показал значительную загрязненность полученной фракции экзосом белками мочи, что проявляется в появлении частиц размером от 1 до 10 нм. Аналогичные результаты были получены при использовании методов с применением концентраторов 50 и 100 кДа (когда экзосомы собирались в фосфатном буфере без использования лизиса) и методом ультрацентрифугирования. Последний метод показал меньшую, чем ПЭГ, контаминацию белками мочи, но и значительно меньшую концентрацию экзосом.
DLS анализ экзосом, выделенных методом «высаливания», также показал загрязнение препаратов экзосом белками мочи и распределение наночастиц в пределах размеров 40-800 нм (Фиг. 7). Присутствие крупных (более чем 200 нм) частиц может быть объяснено агрегацией экзосом в процессе высаливания. Как видно из Фиг. 7Б, количество белков, соосаждённых с экзосомами в процессе «высаливания», является значительным по отношению к числу чистых экзосом.
Процедура ультрафильтрации образцов по настоящему изобретению может проводиться на стандартной (Фиг. 8) вакуумной системе (может обеспечиваться вакуумным или водоструйным насосом). После полного прохождения мочи через второй фильтр его промывали 15 мл фосфатно-буферного раствора следующим образом: убедившись, что вся жидкость прошла через фильтр, но не допуская его переосушки, в воронку добавляли 15 мл буфера и дожидались, чтобы буфер прошел через фильтр. Промывку повторяли еще 1 раз. Для обеспечения оптимальной отмывки после последнего фильтрования необходимо убедиться, что вся жидкость в воронке прошла через фильтр. После завершения фильтрации вакуумный насос требуется отключить и собрать находящиеся на фильтре экзосомы, для чего добавляется 400 мкл фосфатного буфера с последующим пипетированием 5-8 раз. Суспензию экзосом можно перенести в пробирку типа Эппендорф и использовать в анализе или хранить при -20 °С.
При оптимизации условий очистки экзосом с помощью ультрафильтрации авторами
были использованы фильтры, изготовленные на основе смеси ацетилцеллюлозы с различным размером пор: первый фильтр 0.45-0.5 мкм, второй фильтр 0.05 мкм, 0.1 мкм или 0.15 мкм. Для оценки эффективности разработанного метода выделения экзосом, образцы экзосом, полученные ультрафильтрацией через мембранные фильтры, были проанализированы на приборе Zetasizer NanoZS. Экзосомы, выделенные на фильтрах с размером пор 0.05 мкм, содержали белки мочи, детектируемые в пределах размеров 1-10 нм (Фиг. 9). В то же время препараты экзосом, полученные фильтрацией мочи через фильтры 0.1 или 0.15 мкм, были свободны от загрязнения и показали распределение наночастиц в пределах размеров, характерных для экзосом мочи (Фиг. 10). Следует отметить, что препараты экзосом, выделенные из клинических образцов мочи с использованием фильтров с размером пор 0.15 мкм, также не содержали загрязнений белками мочи.
9
9
9
9
Для того, чтобы оценить относительное количество экзосом, выделяемых заявляемым методом ультрафильтрации, прибор Zetasizer NanoZS был калиброван с использованием известного числа наночастиц с размером 60 нм. Показано, что значение 370 kcps (derived count rate) соответствует 5х10 частиц в 1 мл. Сравнение препаратов экзосом, выделенных из двадцати различных образцов мочи показало, что разработанный метод в среднем позволяет получить 1.62-2.1 х 10 экзосом в 1 мл, хотя были отмечены вариации между образцами в количестве экзосом (минимальное – 0.48 х10 экзосом/мл, максимальное – 10 х 10экзосом/мл). Эти значения сравнимы с количеством экзосом, получаемых из 15 мл мочи коммерческими наборами ExoQuick-TC reagent (Invitrogen) и больше чем количество экзосом выделяемых посредством Total Exosome Isolation Reagent (Life Technologies) и ультрацентрифугированием.
Окончательная верификация качества выделяемых внеклеточных везикул и их статистические характеристики были получены на приборе NANOSIGHT NS300 (фотография внеклеточных везикул показана на Фиг. 11 и усредненное распределение частиц из 5 образцов - на Фиг. 12). Пики размеров (диаметров) очищенных внеклеточных везикул приходятся на примерно 160 нм и 230 нм.
Разработанный способ выделения экзосом верифицировали с использованием других биологических жидкостей млекопитающих (например, плазмы крови), а также питательной среды (культуральной жидкости), в которой выращивали клетки млекопитающих. На Фиг.13 представлена кривая анализа экзосом на приборе Zetasizer NanoZS, выделенных заявляемым способом фильтрации из культуральной жидкости клеток эпителия рака простаты LnCaP с использованием фильтров с размерами пор 0.1 мкм. На Фиг.14 представлена кривая анализа экзосом на приборе Zetasizer NanoZS, выделенных заявляемым способом фильтрации из плазмы крови человека с использованием фильтров с размерами пор 0.1 мкм. В связи с высоким содержанием биологического материала в плазме при осуществлении заявляемого способа образец плазмы объемом 2 мл перед фильтрацией подвергали предварительной обработке, а именно разводили в 15 раз стерильным фосфатным буфером до конечного объема в 30 мл. Аналогично препаратам экзосом, выделенных из клинических образцов мочи с использованием фильтров с размером пор 0.1 мкм, полученные препараты экзосом, выделенные из плазмы, показали распределение наночастиц в пределах размеров, характерных для экзосом, и, соответственно, также не содержали загрязнений белками плазмы (Фиг.14).
Таким образом, важными достоинствами настоящего изобретения являются отсутствие загрязнения выделенных внеклеточных везикул или экзосом белками, присутствующими в обрабатываемой биологической жидкости, а также простота и нетрудоёмкость самого способа очистки. Описанный способ позволяет эффективно очищать внеклеточные везикулы из биологических жидкостей в условиях стандартной диагностической лаборатории, то есть без использования дорогостоящих инструментов, таких как ультрацентрифуга. Этот способ может быть успешно применён для выделения экзосом из широкого спектра биологических жидкостей животных и человека, а также из кондиционированной среды культур клеток. Помимо применения заявляемого способа очистки для диагностических целей (медицинские показания для применения указанного способа охватывают по меньшей мере заболевания органов и тканей мочеполовой системы, а также онкологические заболевания), данный способ очистки пригоден для терапевтических целей, когда очищенные везикулы используются как средство доставки лекарственного средства в клетки организма. Основанием для этого является то, что при осуществлении данного способа очистки образуются интактные везикулы, пригодные для дальнейших манипуляций.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.