Evaluation of the Effect of oxidative stress on roots of red beet ( Beta vulgaris L. )

Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 10 No. 4 2014, pp. 5-12 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2014 by Kolesnikova, Ozolina, Nurminsky, Nesterkina, Sitneva and Lapteva

ORIGINAL ARTICLE

Evaluation of the Effect of Oxidative Stress on Roots of

Red Beet

E.V. Kolesnikova, N.V. Ozolina, V.N. Nurminsky*, I.S. Nesterkina,

L.A. Sitneva, T.I. Lapteva

Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, PO 317, Irkutsk, 664033, Russia

* Tel: +7 9148824647; fax +7 3952510754

*E-Mail: cell@sifibr.irk.ru

Received July 7, 2014

In the present investigation it was studied the effect of oxidative stress on root of red beet. The degree of stress exposure was assessed at various levels: in tissues of roots (conductometric method), on isolated vacuoles (time-lapse video recording), and transport activity of the vacuolar membrane enzyme, namely V-H+-ATPase (fluorescent probe method). The obtained results allow to conclude the negative effects of oxidative stress on different levels of plant organization. There were several effects: a significant increase of outflow of electrolytes from the tissues of roots, a great decrease of half-life time of isolated vacuoles, and a 2 times reduction of transport activity of tonoplast H+-ATPase. Thus, the methods used in this study can be applied to assess the intensity of the impact of oxidative stress on plants.

Key words: enzyme activity, electrolyte outflow, root of red beet, oxidative stress, stability of vacuoles

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

6

Evaluation of the Effect of Oxidative Stress...

ORIGINAL ARTICLE

Оценка Влияния Окислительного Стресса на Корнеплод Столовой Свёклы

Е.В. Колесникова, Н.В. Озолина, В.Н. Нурминский*, И.С. Нестёркина, Л.А. Ситнева, Т.И. Лаптева

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132, Россия

* Tel: +7 9148824647; fax +7 3952510754

*E-Mail: cell@sifibr.irk.ru

Поступила в редакцию 7 Июля 2014 г.

В настоящем исследовании проводилось изучение влияния окислительного стресса на корнеплоды столовой свёклы. Степень стрессового воздействия оценивали в тканях корнеплодов (кондуктометрическим методом), на изолированных вакуолях, (методом цейтраферной видеосъёмки) и по транспортной активности фермента вакуолярной мембраны - Н+-АТФ-азы (методом флуоресцентных зондов). Полученные результаты позволяют сделать вывод о негативном влиянии окислительного стресса на разных уровнях организации растений. Происходило значительное увеличение выхода электролитов из тканей корнеплодов, существенно уменьшалось время полураспада вакуолей, и в 2 раза падала транспортная активность Н+-АТФазы тонопласта. Таким образом, методы, используемые в данном исследовании, могут быть применены для оценки интенсивности воздействия окислительного стресса на растительные объекты.

Key words: активность фермента, выход электролитов, корнеплоды столовой свёклы, окислительный стресс, стабильность вакуолей

Как известно, влияние неблагоприятных факторов внешней среды на растения приводит к нарушению метаболизма и существенному

снижению продуктивности растений. Изучение изменений, которые происходят в ответ на стрессовые воздействия и способы их

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Kolesnikova et al.

7

преодоления является одной из основных задач Н2О2 и 1 мМ FeSO4, после чего инкубировали 30

биологии (Shakirova, 2001). Любые абиотические мин. В контрольном варианте инкубацию

стрессы приводят к окислительному - одному из проводили в дистиллированной воде, а полученные

наиболее неблагоприятных видов стресса для результаты принимали за 100%.

растительной клетки (Menshikova et al., 1993). Для оценки устойчивости ткани корнеплодов к

Существует достаточно большое количество окислительному стрессу использовали

методов, позволяющих оценить величину кондуктометрический метод (Grischenkova,

негативного воздействия, вызванного стрессом, Lukatkin, 2005). Диски ткани корнеплодов

часть из которых была использована в настоящем инкубировали 30 минут в дистиллированной воде и

исследовании. Цель данного исследования в растворе 50 мМ Н2О2. Сразу после окончания

состояла в оценке влияния окислительного стресса стрессового воздействия определяли

на разных уровнях организации растительного проницаемость клеточных мембран по выходу

организма. Для этого была поставлена задача электролитов из тканевых дисков в

провести сравнительную оценку воздействия дистиллированную воду с использованием

окислительного стресса начиная с тканевого кондуктометра (ОК-104, Radelkis) с платиновым

уровня (выход электролитов) и кончая электродом. Затем раствор с растительным

молекулярным (активностью мембраносвязанного материалом доводили до кипения (для разрушения

фермента), используя методы кондуктометрии, мембран) и давали ему остыть до комнатной

цейтраферной видеосъёмки и температуры, после чего объём доводили до

спектрофлуориметрию. исходной величины и по электропроводности

MATERIALS AND METHODS определяли полный выход электролитов. Степень

Объектом исследования служили корнеплоды и выхода электролитов рассчитывали в процентах от

изолированные вакуоли столовой свёклы (Beta полного выхода.

vulgaris L.) сорта Бордо, выращенной на опытном Влияние окислительного стресса на барьерные

участке института. Корнеплоды находились на свойства мембран (стабильность мембран) изучали

стадии покоя, и хранились при +4°С. с использованием экспериментальной установки

Изолированные вакуоли и везикулы вакуолярных собственного изготовления, позволяющей получать

мембран получали с помощью метода (Salyaev et серии компьютерных изображений (цейтраферная

al., 1981). Окислительный стресс создавали видеосъемка, частота кадров 0.1 мин-1 (1 кадр за

реакцией Фентона, приводящей к образованию 10 мин)), отражающих динамику процесса

гидроксильных радикалов. Для этого к тканевым разрушения вакуолей (Nurminsky et al., 2004). С

дискам, в суспензию изолированных вакуолей или помощью компьютерной обработки данных строили

к осадку мембранных везикул добавляли 50 мМ график зависимости количества сохранившихся

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

8

Evaluation of the Effect of Oxidative Stress...

вакуолей (%) от времени и рассчитывали значения функционировании фермента. Транспортная

периода полураспада изолированных вакуолей, в активность измерялась в общепринятых единицах

течение которого разрушаются 50% вакуолей (Т1/2). (%^/мг белка/мин), где AF - тушение

Воздействие окислительного стресса на флуоресценции акридинового оранжевого (Braun

транспортную функцию протонной помпы et al, 1986).

определяли на фракции вакуолярных мембран В работе применяли следующие реактивы

(Salyaev et a/., 1981). Уровень протон- фирмы “Sigma”: 2-^морфолино-этансульфоновую

транслоцирующей активности Н+-АТФазы кислоту (МЭС), аденозинтрифосфат (АТФ,

тонопласта оценивали по изменению рН везикул натриевая соль), Трис, 2-меркаптоэтанол,

тонопласта при помощи флуоресцентного зонда карбонилцианид 3-хлорофенилгидразон (СССР).

акридинового оранжевого. За сдвигами рН Акридиновый оранжевый фирмы “Aldrich”.

следили по изменению интенсивности Остальные реактивы были отечественного

флуоресценции этого зонда при длине волны производства квалификации ХЧ.

возбуждающего и испускаемого света 493 и 540 нм На графиках представлены средние

соответственно. Эксперименты проводили на арифметические значения величин и их

спектрофлуориметре (RF-5301PC, Shimadzu). В стандартные отклонения, которые были получены в

кювету поэтапно вносили 2.5 мл инкубационного пяти независимых экспериментах, подсчитанные с

раствора и 0.05 мл осадка везикул тонопласта. помощью программы Microsoft Excel.

Инкубационный раствор содержал: 20 мМ RESULTS AND DISCUSSION

Трис/МЭС, 50 мМ КО, 280 мМ маннит, 5 мкМ На первом этапе исследований измеряли выход

акридиновый оранжевый, 3 мМ МgCl2, рН 7.3. электролитов из дисков ткани корнеплодов. Этот

Содержание белка определяли по методу параметр позволяет оценить проницаемость

Бредфорд (Bradford, 1976). В среднем на 0.05 мл клеточных мембран и их устойчивость к стрессу.

образца приходилось 20-30 мкг белка. В среду При действии неблагоприятных факторов

инкубации вносили 3 мМ АТФ (Трис). Для повышается утечка электролитов из тканей, что

доказательства специфичности проводимых свидетельствует о нарушении избирательной

исследований во всех экспериментах использовали проницаемости мембран растительной клетки

общепринятый ингибитор Н+-АТФазы - 50 мМ (Prikhodko, 1977). Это может быть связано с

KNO3, который подавлял активность этого изменениями в структуре мембран или в состоянии

фермента, а также протонофор 10 мкМ их липидной составляющей (Bertin et al., 1996).

карбонилцианид 3-хлорофенилгидразон (CCCP), Проведённые эксперименты показали, что при

который полностью предотвращал тушение воздействии окислительного стресса на высечки из

флуоресценции, возникающее при корнеплодов столовой свёклы существенно (более

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Kolesnikova et al.

9

чем в 2 раза) увеличивался выход электролитов пероксидом водорода, нарушалась структура

(Рис. 1), что говорит о значительных нарушениях тонопласта, что приводило к формированию и

структуры мембран, которые произошли в ответ на расширению липидных пор в мембране, и в

это стрессовое воздействие. результате чего, она разрушалась за короткое

Сходные результаты были получены и при время. Возможно, именно с нарушением барьерной

оценке стабильности изолированных вакуолей, функции тонопласта, которая отслеживалась в

которая исследовалась методом цейтраферной этих экспериментах, и связан более высокий выход

видеосъёмки. Результаты показывают, что при электролитов из ткани корнеплодов, как это было

окислительном стрессе период полураспада показано ранее.

вакуолей уменьшался более чем в 2 раза (Рис. 2), Для сравнительной оценки влияния

то есть темпы их разрушения были очень высокими. окислительного стресса на молекулярном уровне

Исходя из того, что стабильность липидного бислоя было проведено изучение изменения транспортной

и клеточной мембраны в целом определяется активности протонной помпы вакуолярной

липидными порами (Antonov et al., 1999), разрыв мембраны - Н+-АТФазы, которая являются одними

тонопласта, прежде всего, является следствием из основных мембранных белков тонопласта и

изменений в липидном матриксе мембраны. обеспечивает поступление в вакуоль большого

Причины нарушения целостности липидного числа метаболитов (Martinoia et al., 2007). На долю

бислоя могут быть различны, например, Н+-АТФазы приходится 15% всех белков

перекисное окисление липидов, гиперактивация тонопласта (Maeshima, 2001). Эксперименты

катаболических ферментов, изменения в липид- показали, что в условиях окислительного стресса

белковых взаимодействиях и др. Эти процессы транспортная активность этого фермента падает

приводят к образованию стрессовых пор, их более чем на 40%, что говорит о существенном

последующему расширению и разрыву мембраны. нарушении метаболических процессов (Рис. 3).

Стрессирование и разрыв мембраны могут быть Можно предположить, что пероксид водорода

также вызваны нарушением водно-осмотического вызывает окисление сульфгидрильных групп

равновесия вакуоли, вследствие разрушения гидрофильного комплекса фермента, вследствие

крупных молекул внутри вакуоли (например, при чего и происходит частичное инактивирование Н+-

гидролизе белков) и повышения осмотической АТФазы (Seidel et al., 2012). Кроме, того на

концентрации внутривакуолярного содержимого, уровень активности протонной помпы могло

что должно привести к поступлению воды в оказать влияние и изменение липидного

вакуоль, увеличению ее объема и фатальному окружения (Los et al., 2007), что приводит к

растяжению мембраны. В наших экспериментах перестройке конформации фермента и тем самым

при окислительном стрессе, вызванном сказывается на активности (Palladina, Simchuk,

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

10

Evaluation of the Effect of Oxidative Stress...

1990).

Проведённые эксперименты показали, что окислительных стресс оказывал значительное негативное влияние на разных уровнях организации растения: заметно нарушались

барьерные свойства мембран растительных клеток, резко падала стабильность изолированных

вакуолей и активность мембранных транспортных систем. Устойчивость к этому виду стресса у корнеплодов столовой свёклы была незначительной. Все использованные в экспериментах методы могут применяться для оценки интенсивности воздействия окислительного стресса на растительные объекты.

Figure 2. Влияние окислительного стресса на период полураспада изолированных вакуолей (Т1/2). Результаты получены методом цейтраферной видеосъемки.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Kolesnikova et al.

11

Figure 3. Транспортная активность Н+-АТФазы тонопласта в присутствии пероксида водорода (50 мМ), % от контроля.

ACKNOWLEDGMENT

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научных проектов № 14-04-31103 мол_а и № 14-04-31080 мол_а.

В работе использовалось оборудование Байкальского аналитического центра (ЦКП) ИНЦ СО РАН.

REFERENCES

Antonov V.F., Anosov A.A., Bogatyreva N.E. et al. (1999) Lipid pores: stability and membrane permeability. 2nd Congress of biophysicists, Moscow, Russia, 23-27 Aug., 1999: abstracts. dokl., V. 2, 476-477.

Bertin P., Bouharmont J., Kinet J. (1996) Somaclonal variation and improvement in chilling tolerance in rice. Changes in chilling-induced electrolyte leakage. Plant Breeding. 115(4): 268-272.

Braun Y., Hassidim M., Lerner H., Reinhold L.

Studies on H+-translocating ATPases in plants of varying resistance to salinity. Plant Physiol., 81: 1050-1056.

Bedford D.P. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of protein utilising the principl of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72: 248-254.

Grischenkova N.N., Lukatkin A.S. (2005) Determination of resistance of plant tissues to abiotic stresses using conductometric method. Povolzhskiy journal of ecology, 1: 3-11.

Los D.A. (2007) Perception of stress signals by biological membranes. In the book: Problems of regulation in biological systems. Biophysical aspects. Ed. Rubin A.B. M-Izhevsk: center "Regulatory and chaotic dynamics”, Institute of computer science, 329-360.

Maeshima M. (2001) Tonoplast transporters: organization and function. Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 52: 469-497.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

12

Evaluation of the Effect of Oxidative Stress...

Martinoia E., Maeshima M., Neuhaus H.E. (2007) Vacuolar transporters and their essential role in plant metabolism. Journal of Experimental Botany, 58(1): 83-102.

Menshikova E.E., Zenkov N.A. (1993) Antioxidants and inhibitors of radical processes. Biology Bulletin Reviews, 113(4): 183-205.

Nurminsky V.N., Korzun, A.M., Rosinov SV, Salyaev R.K. (2004) Computer time-lapse video of fractions of isolated vacuoles. Biomedical chemistry, 50: 180-187.

Palladina T.A., Simchuk E.E. (1990) Effect of sterols on the activity of H+-ATPase of plasma membranes of root cells of maize. Dokl. USSR, 314(4): 1018-1020.

Prikhodko N.V. (1977) Changes in permeability of cell membranes as a general level of nonspecific

mechanisms of plant responses to external influences. Physiology and biochemistry of cultivated plants, 9(3): 301-309.

Salyaev R.K., Kuzevanov V.A., Chaptagaev C.B, Kopytchuk V.N. (1981) Isolation and purification of vacuoles and vacuolar membranes from plant cells. Russian Journal of Plant physiology, 28: 1295-1305.

Seidel T., Scholl S., Krebs M., Rienmuller F., Marten

I. , Hedrich R., Hanitzsch M., Janetzki P., Dietz K.-

J. , Schumacher K. (2012) Regulation of the V-type ATPase by redox modulation. Biochem. J., 448: 243-251.

Shakirova F.M. (2001) Nonspecific resistance of plants to stress factors and its regulation. Ufa: Gelem, 160 p.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014