СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ИОНИЗИРОВАННОГО КАЛЬЦИЯ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
METHOD FOR DETERMINING FUNCTIONAL ACTIVITY OF IONISED CALCIUM IN HUMAN BLOOD SERUM

Изобретение относится к лабораторной диагностике, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано для определения функциональной активности ионизированного кальция в сыворотке крови человека.
Проблема оценки состояния иммунной системы организма человека остается в настоящее время актуальной в связи с тем, что многие соматические заболевания характеризуются иммунодефицитом и соответствующая иммунокорригирующая терапия позволит более рационально и эффективно проводить терапию этих состояний.
Известен способ определения нарушений иммунного статуса организма человека путем проведения лизиса эритроцитов барана 0,8% сывороткой крови человека с использованием эндогенных гетерофильных антител при (37,0±0,5)°C в течение 30 мин с последующим выявлением степени лизиса эритроцитов по соответствующей формуле, а также титра гетерофильных антител. Определение нарушений иммунного статуса проводят сопоставлением коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител с уровнем содержания циркулирующих иммунных комплексов [1].
Недостатком этого способа является длительность, трудоемкость, недостаточная точность в связи с тем, что не отражается участие компонента C1q комплемента, связывающего циркулирующие иммунные комплексы.
Известен также экспресс-способ определения нарушений иммунного статуса организма человека путем проведения лизиса эритроцитов барана 25% сывороткой крови человека с использованием эндогенных гетерофильных антител в присутствии 0,29 M NaCl в буферном растворе. При наличии ингибирования лизиса эритроцитов менее 35% оценивают повышенную реакцию иммунной системы организма человека, 35-70% нормальную, более 70% - пониженную [2].
Недостатком этого экспресс-способа является недостаточная точность, связанная с тем, что используется нефизиологическая концентрация 0,29 M NaCl в гемолитической системе в качестве «нагрузки».
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности способа за счет исследования функциональной активности системы комплемента человека в условиях искусственного дефицита ионов кальция, сокращение длительности процедуры исследования, упрощение, удешевление.
Указанный результат достигается тем, что лизис эритроцитов барана проводят 10% сывороткой крови человека с использованием эндогенных гетерофильных антител при температуре 37,0±0,5°C в присутствии 0,55 мМ этиленгликольтетрауксусной кислоты (ЭГТУК) в буферном растворе в течение 10 мин, определяют степень ингибирования лизиса эритроцитов, при наличии ингибирования активности комплемента менее 30% оценивают повышенную функциональную активность ионизированного кальция в организме человека, от 31% до 70% - нормальную, более 71% - пониженную.
8
2+
2
2
Способ осуществляют следующим образом. Проводят забор крови, приготовление сыворотки, проведение гемолитического теста и расчет степени ингибирования лизиса. Гемолитический тест проводят с использованием стандартизованных эритроцитов барана (1,5×10 кл/мл) (ЭБ) в вероналовом солевом буфере (ВСБ), содержащем 0,55 мМ MgCl, 0,15 М CaCl (ВСБ) и 0,5 мМ ЭГТУК. Время проведения экспресс-способа 10 мин.
Пример 1. Определение оптимальной концентрации ЭГТУК для 50% ингибирования гемолитической активности системы комплемента сыворотки крови человека.
8
2+
2+
2
405
К 100 мкл суспензии ЭБ с концентрацией 1,5×10 кл/мл добавляют 20 мкл пулированной сыворотки крови человека от 10 здоровых доноров и 5-50 мкл 10 мМ ЭГТУК в ВСБ (концентрации ЭГТУК в пробах от 0,25 мМ до 0,75 мМ) и в общем объеме 200 мкл, доведенном буфером ВСБ, инкубируют 10 мин при 37°C. Одновременно ставят контроль на спонтанный (100 мкл ЭБ + 100 мкл ВСБ) и полный лизис ЭБ (100 мкл ЭБ + 100 мкл HO). После инкубации в течение 10 мин останавливают реакцию гемолиза добавлением 1,3 мл холодного 0,15 М раствора NaCl, центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин и определяют степень гемолиза по величине A супернатанта. Степень лизиса эритроцитов (Y) определяют по формуле
Y(%)=[(X-R)/(H-R)]×100,
405
где H, R и X - величины оптической плотности A супернатанта в гемолитических системах при полном лизисе, в контроле спонтанного лизиса E и в опытной пробе соответственно.
Степень ингибирования (СИ) определяют как разность показателей лизиса в контрольных и в опытных пробах, содержащих возрастающие концентрации ЭГТУК, по формуле
СИ(%)=(100-Y),
где 100 - степень лизиса в контрольной пробе, Y - степень лизиса в опытных пробах. Полученные данные приведены ниже (таблица 1).
2
2
Как видно из данных, представленных в таблице 1, гемолиз эритроцитов барана 10% сывороткой человека ингибируется дозозависимо от концентрации ЭГТУК. 50% ингибирование активности классического пути комплемента пулированной сыворотки крови наблюдается в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК. Ингибирование классического пути активации комплемента ЭГТУК обусловлено избирательным связыванием ионизированного кальция, который участвует в формировании и функционировании C1 компонента. При связывании ионов кальция происходит диссоциация C1r и C1s от субкомпонента C1q, связанного с иммунными комплексами. В данном случае иммунный комплекс представляет собой эритроциты барана, сенсибилизированные гетерофильными антителами человека.
Пример 2. Определение ингибирования гемолиза эритроцитов барана индивидуальной сывороткой человека в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК.
Исследования проведены аналогично выше описанным условиям только при постоянной концентрации ЭГТУК, равной 0,55 мМоль/л в гемолитической системе. Вместо пулированной сыворотки крови человека использовали индивидуальные сыворотки доноров (контрольная группа). Полученные результаты представлены ниже в таблице 2.
Как видно из данных, представленных в таблице 2, ингибирование лизиса эритроцитов барана сывороткой крови человека (контрольная группа) в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК в гемолитической системе наблюдалось на уровне 35-70%. Ингибирование комплемента 0,55 мМ ЭГТУК на уровне 31-70% у здоровых доноров контрольной группы нами принято за показатель, который характеризует оптимальную функциональную активность ионизированного кальция в сыворотке крови человека.
Пример 3. Определение ингибирования гемолиза в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК в сыворотках крови неврологических больных. Разработанным способом были тестированы сыворотки крови 84 неврологических больных с инструментально подтвержденным атеросклерозом каротидных артерий. Результаты представлены в таблице 3.
Как видно из данных, представленных в таблице 3, только у 18 (21%) из 84 обследованных больных степень ингибирования гемолиза эритроцитов 10% сывороткой крови человека в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК была в пределах референтных величин. В 50 пробах крови (60%) степень ингибирования комплемента была достоверно выше, чем у здоровых людей, и свидетельствовало о низкой функциональной активности ионизированного кальция. В 16 (19%) пробах крови неврологических больных СИ была меньше 30% и свидетельствовала о высокой функциональной активности ионизированного кальция.
2+
Таким образом, из 84 обследованных проб в 66 (79%) сыворотках крови больных с атеросклерозом каротидных артерий наблюдаются сдвиги как в сторону повышения, так и в сторону снижения функциональной активности Ca.
Пример 4. Определение ионизированного и общего кальция в сыворотке крови неврологических больных.
Содержание общего кальция определяли с использованием коммерческого набора кальций (ЗАО «ЭКОлаб») в группе больных с повышенной и пониженной функциональной активностью кальция. Ионизированный кальций в сыворотке 84 неврологических больных измеряли с использованием ион-селективного электрода на автоматическом биохимическом анализаторе («Конелаб», Финляндия). Полученные результаты представлены в таблице 4.
2+
2+
Как видно из данных, представленных в таблице 4, содержание общего и ионизированного Ca практически не отличается между двумя группами с повышенной и пониженной функциональной активностью Ca.
2+
2
2
Таким образом, низкая и высокая функциональная активность Ca в гемолитическом тесте не связана с концентрацией данного катиона в сыворотке крови. Тест с использованием ЭГТУК выявляет аффинность связывания ионов кальция в пентамолекулярном комплексе, C1q(C1rC1s), C1 компонента системы комплемента. Функционирование данного ферментного комплекса находится под контролем C1-ингибитора, который необратимо связывается с димерным комплексом C1r-C1s и вызывает диссоциацию C1 компонента системы комплемента. От эффективности активации C1 комплекса зависит опсонизация иммунных комплексов активированным компонентом C3b и последующая их солюбилизация и элиминация.
2+
Пример 5. Исследование гемолитической активности системы комплемента и эффекторной, комплемент активирующей функции гетерофильных антител в сыворотках крови неврологических больных с высокой и низкой функциональной активностью Ca.
2+
В группах с повышенной и пониженной функциональной активностью ионизированного Ca проведены исследования комплемент активирующей функции гетерофильных антител, как описано в работе [3], и реактивность системы комплемента в условиях «нагрузки» в виде 0,288% NaCl в гемолитической системе, как описано в работе [4]. Полученные результаты представлены в таблицах 5 и 6.
ЭФГА
ЭФГА
Как видно из данных, представленных в таблице 5, повышенная функциональная активность в 100% совпадает с повышенной комплемент активирующей функцией гетерофильных антител (КАФГА) и в 91% -  с повышенной реактивностью системы комплемента. Высокий титр гетерофильных антител в сыворотке крови наблюдается у 64% тестированных пробах и соответственно низкий коэффициент эффекторной, комплемент активирующей функции гетерофильных антител у 8 больных (73%). Только в одной сыворотке выявлен К на уровне референтных величин (5,3±0,2 ЕД), в двух сыворотках К в 4 раза выше.
ЭФГА
ЭФГА
Как видно из данных, представленных в таблице 6, КАФГА только в 5 сыворотках больных (36%) была в пределах референтных значений (лизиса на уровне 30-70%), в 2 сыворотках (14%) повышенной и в 7 (50%) - пониженной. Причем титр гетерофильных антител во всех 14 исследованных сыворотках с пониженной функциональной активностью ионизированного кальция была в пределах нормы (от (1:4) до 1:32). Расчетный коэффициент эффекторной функции гетерофильных антител (К) в этой группе только у одного больного находился в референтной области (5,3±0,2 ЕД). У 8 больных (57%) К был низкий, а у 5 (36%) - высокий. Реактивность системы комплемента у троих больных (21%) в пределах нормы, у 11 (79%) данный показатель был пониженный.
ЭФГА
Таким образом, способ определения функциональной активности ионизированного кальция является более чувствительным тестом оценки иммунного статуса, чем определение К и РСК.
Предлагаемый способ имеет преимущества по сравнению с известными, заключающиеся в повышении точности диагностики нарушений иммунного статуса, упрощении, сокращении длительности процедуры исследования до 10 мин, удешевлении, возможности использования в рутинных исследованиях. Реализация изобретения позволит контролировать эффективность проводимого лечения и выявлять доклинические состояния вторичных иммунодефицитов, аутоиммунных и опухолевых процессов.
Литература
1. Шойбонов Б.Б., Хайбулин В.Р., Сониев В.М., Онтобоев А.Н., Зинченко А.А., Алешкин В.А. Способ определения нарушения иммунного статуса // Патент РФ №2247381 от 27.02.2005.
2. Шойбонов Б.Б., Хайбулин В.Р., Панченко Л.Ф., Зинченко А.А. Кубатиев А.А. Экспресс-способ определения нарушения иммунного статуса организма человека // Патент РФ №2422831 от 27.06.2011 г. Бюл. №18.
ЭФГА
3. Шойбонов Б.Б. и др. Хайбулин В.Р., Баронец В.Ю., Осипов А.В., Панченко Л.Ф. Коэффициент эффекторной функции антител (К) - новый показатель состояния гуморального иммунитета // Патогенез. - 2011. - Т.9, №1. - С.43-49.
4. Панченко Л.Ф., Шойбонов Б.Б., Тахаров И.Г., Зинченко А.А. Способ оценки состояния иммунной системы организма человека // Патент РФ №2314529 от 10.01.2008 г.
Таблица 1
Ингибирование лизиса эритроцитов барана 10% пулированной сывороткой крови человека раствором ЭГТУК
ЭГТУК в гемсистеме, мМоль/л
0,35
0,45
0,55
0,65
0,7
0,75
0
СИ, %
16
32
50
71
82
92
0
Таблица 2
Показатели степени ингибирования (СИ) лизиса эритроцитов барана сывороткой крови человека в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК
№ сыворотки
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
СИ,%
42
51
70
46
58
44
62
31
66
54
Таблица 3
Показатели степени ингибирования (СИ) лизиса эритроцитов барана сывороткой крови неврологических больных в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК
Количество обследованных, n
Степень ингибирования гемолиза, %
<30
31-70
>71
сыворотка крови больных
84
16
18
50
M±m
15±12
58±9
92±8
Таблица 4
Содержание общего и ионизированного кальция в сыворотке крови неврологических больных
Сыворотки 84 больных
Сыворотки с высокой функциональной активностью Ca<sup>2+</sup> (17 проб)
Сыворотки с низкой функциональной активностью Ca<sup>2+</sup> (18 проб)
Ионизированный Ca<sup>2+</sup>, мМоль/л
1,24±0,075 (N=1,15-1,27)
1,21±0,05
1,24±0,09
Общий Ca<sup>2+</sup>, мМоль/л
2,22±0,12 (N=2,15-2,5)
2,20±0,09
2,23±0,14
Таблица 5
Сравнительные данные показателей в сыворотках с повышенной функциональной активностью ионизированного Ca<sup>2+</sup> (ФАИ Ca<sup>2+</sup>), комплемент активирующей функции гетерофильных антител (КАФГА), титра ГА, коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител (К<sub>ЭФГА</sub>) и реактивности системы комплемента (РСК) в сыворотках крови 11 больных с атеросклерозом каротидных артерий
№ сыв.
ФАИ Ca<sup>2+</sup>, % инг.
КАФГА, % лизиса
Титр ГА 1: …
К<sub>ЭФГА</sub>, ЕД
РСК, % инг.
4
12
78
64
1,2
20
23
5
90
512
0,2
1
36
7
91
512
0,2
0
38
4
81
64
1,3
2
42
2
90
4
22,5
0
43
12
77
16
4,8
16
45
2
78
64
1,2
8
66
17
86
64
1,3
24
70
17
85
4
21,3
60
73
2
87
64
1,4
0
74
25
84
32
2,6
16
M±m
9,5±7,7
84±5
1:(127±192)
5,3±8,3
13±18
Таблица 6
Сравнительные данные в сыворотках с пониженной функциональной активностью ионизированного Ca<sup>2+</sup> (ФАИ Ca<sup>2+</sup>), комплемент активирующей функции гетерофильных антител (КАФГА), титра ГА, коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител (К<sub>ЭФГА</sub>) и реактивности системы комплемента (РСК) в сыворотках крови 14 больных с атеросклерозом каротидных артерий
№ сыв.
ФАИ Ca<sup>2+</sup>, % инг.
КАФГА, % лизиса
Титр ГА 1: …
К<sub>ЭФГА</sub>, Ед
РСК, % инг.
3
90
51
16
3,2
48
6
97
29
4
7,3
97
8
100
7
8
0,9
100
9
100
71
4
17,8
51
10
100
47
8
5,9
86
11
100
79
8
9,9
37
12
100
23
8
2,9
100
13
100
58
4
14,5
90
14
100
28
4
7,0
98
15
100
6
4
1,5
99
17
100
61
32
1,9
92
18
100
59
32
1,8
72
20
100
5
8
0,6
100
22
97
27
16
1,8
90
M±m
99±3
39±25
11±10
5,5±5,3
83±22