Роль полиморфизма генов в формировании бронхолегочной дисплазии у новорожденных детей

© ПАНЧЕНКО А.С. - 2014 УДК 616-053.31, 616.24

РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ В ФОРМИРОВАНИИ БРОНХОЛЕГОЧНОЙ ДИСПЛАЗИИ

У НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ

Александра Сергеевна Панченко

Резюме. Бронхолёгочная дисплазия в настоящее время является одной из ведущих причин заболеваемости в группе недоношенных детей. Нами обследована группа недоношенных детей (144 ребенка) с клиникой бронхолёгочной дисплазии и группа сравнения недоношенные дети (100 человек) без данной патологии. В группах недоношенных детей исследовалась частота встречаемости полиморфных вариантов генов MnSOD (С60Т), EPHX1 (Tyr113His), NOS3 (Т786С) с целью уточнения их вклада в формирование бронхолёгочной дисплазии. В результате анализа прогностическими дополнительными предикторами развития бронхолёгочной дисплазии являются определение полиморфизма генов антиоксидантных ферментов (мито-хондриальная супероксиддисмутаза, микросомальная эпоксигидролаза) и фермента эндотелиальной дисфункции (синтаза оксида азота).

Ключевые слова: новорожденный, бронхолёгочная дисплазия, генетика.

THE ROLE OF POLYMORPHISMS OF GENES IN THE FORMATION OF BRONCHOPULMONARY DISEASES IN NEWBORNS

A.S. Panchenko

Summary. Nowadays bronchopulmory displosia is one of the main aetiology in newborns. We examined a group of children (144 children) with bronchopulmonary dysplasia and comparison group of preterm infants without this pathology. We analyzed the frequency of polymorphic variants of genes MnSOD (S60T), EPHX1 (Tyr113His), NOS3 (T786S) in preterm infants to clarify their contribution to the formation of BPD. The result of analysis has shown that additional prognostic predictors of bronchopulmonary dysplasia are the definition of gene polymorphisms of antioxidant enzymes (superoxide dismutase mitochondrial, microsomal epoxygenase) and the enzyme endothelial dysfunction (nitric oxide synthase).

Key words: newborn, bronchopulmonary dysplasia, genetics.

В настоящее время исследование генетических маркеров, отвечающих за наследственную предрасположенность к мультифакториальным заболеваниям, является одной из важнейших задач предиктивной медицины и медицинской науки в целом.

Расшифровка этиопатогенетических механизмов формирования бронхолёгочной дисплазии (БЛД) позволила разработать методы лечения и профилактики. Одна из проблем БЛД - недооценка факторов риска формирования данной патологии [1,2]. Различные варианты генетического полиморфизма затрагивают практически все звенья патогенеза БДЛ: систему сурфактанта, внутриклеточного матрикса, ферментов перекисного окисления липидов, фактора роста фибробластов, цитокинов, ксенобиотиков и ферментов антиоксидантной системы [5,7,8,9,10,11,12]. В последнее время был проведен ряд исследований по выявлению генов-кандидатов при бронхолегочной дисплазии. Одним из перспективных направлений является определение однонуклео-тидных замен в генах антиоксидантных ферментов. У пациентов группы риска по развитию БЛД статистически значимо чаще регистрировались минорные аллели 129Т GCLC и 60Т 80Э2 [3,4]. Полиморфизм генов антиоксидантных ферментов имеет патогенетическое значение в формировании БЛД. В основе поражения различных органов и систем большую роль играют циркуляторные нарушения, в этой связи особый интерес представляет выявление предрасположенности к нарушениям в системе регуляции сосудистого тонуса. К эндотелиальным факторам дилятации относится оксид азота (N0). Кроме того, N0 угнетает пролиферацию клеток в гладкомышечном слое сосудов, ингибирует агрегацию тромбоцитов и адгезию нейтрофилов к эндотелию сосудов, также способен вызвать повреждение клеток, в частности эндотелия, путем генерации свободных радикалов [6]. Установлено, что к уменьшению концентрации N0 в кровяном русле предрасполагает вариант 786С гена еN0S.

Таким образом, исследование генетических маркеров, отвечающих за наследственную предрасположенность к брон-холегочным заболеваниям у детей грудного возраста, является одной из важнейших задач детской пульмонологии. В связи с этим, изучение полиморфизма генов МШ0Э, N0S3, ЕРНХ у недоношенных детей является актуальным и имеет патогенетическое значение в формировании БЛД.

Материалы и методы

В исследование включены недоношенные дети, находившиеся на лечении в отделении раннего возраста Краевой клинической больнице г. Читы. Основную группу составили недоношенные дети в возрасте от 1 до 3 месяцев с диагнозом БЛД (n=144, мальчиков 93, девочек 51), со сроком гестации 26-32 недели (30,0±3,0), массой тела при рождении от 834 до 1642 г (1475±539).

Критерии исключения: дети с пороками развития брон-холегочной системы и синдромом Вильсона-Микити, наличие тяжелой сопутствующей патологии в стадии декомпенсации, гемодинамически значимых врожденных пороков сердца, диафрагмальной грыжи и хромосомных аномалий.

Группу сравнения составили 100 недоношенных детей (53 мальчика и 47 девочки), не сформировавшие БЛД, с диагнозами: неонатальная пневмония (54,4%), анемия недоношенного (82,3%), перинатальное поражение ЦНС (81%), травма шейного отдела позвоночника (44,1%). Сравниваемые группы не имели статистических различий по гестационному возрасту, среднему возрасту и массе тела при рождении (р>0,05).

Исследуемым материалом для анализа являлся букаль-ный эпителий. Выделение ДНК осуществлялось при помощи наборов реагента «ДНК-экспресс-кровь» (НПФ «Литех», Россия, Москва). Исследование полиморфизма генов (MnSOD C60T, еNOS Т786С, EPHX 1 Tyr 113 His) проводилось методом ПЦР с аллель специфичными праймерами(НПФ «Литех», Россия, Москва).

Исследование было одобрено этическим комитетом ЧГМА. Родители всех детей были проинформированы о дизайне, методах обследования и дали письменное согласие на участие.

Распределение генотипов проверяли на соответствие закону Харди-Вайнберга, для сравнения распределений частот генотипов и аллелей между исследуемыми группами использовали критерий х2.Об ассоциации аллелей или генотипов с предрасположенностью к изучаемой патологии судили по величине относительного риска заболевания (ОР) и отношения шансов события (ОШ). Значения уровня p<0,05 рассматривались как статистически значимые. Статистическая обработка данных проводилась с использованием программного пакета Statistica 6.0.

Результаты и обсуждение

Нами исследовалась частота встречаемости полиморфных вариантов генов Мп80Э (С60Т), ЕРНХ1 (Туг113Ш8), N083 (Т786С) у недоношенных детей для уточнения их вклада в формирование БЛД. В ходе исследования обнаружены все искомые мутации в гомо- и гетерозиготном состоянии с частотным подчинением закону Харби-Вайнберга.

Частоты генотипов изучаемых полиморфизмов генов 2 MnSOD

Таблица 1

Полиморфизм Генотип ЧВ генотипа Р ОР ОШ ДИ

Основная группа, n=34 Группа сравнения, n=32

MnSOD 60 60 С/С 28 (82) 32 (100) 0,01 0,86 - -0,95-0,10

60 С/Т 4* (12) 0 0,04 0 0 0

60 Т/Т 2 (6) 0 0,16 0 0 0

EPHX 1 113 113 Tyr/Tyr 18* (53) 8 (25) 0,02 2,17 3,37 0,19-3,88

113 Tyr/ His 10 (29) 23* (72) 0,0005 0,40 0,16 -3,96-0,89

113 His/ His 6* (18) 1 (3) 0,05 5,64 6,64 0,89-10,3

NOS3 786 786 Т/Т 3 (9) 3 (9) 0,93 0,94 0,93 -4,31-3,98

786 Т/С 15(44) 22* (69) 0,04 0,64 0,35 -2,41-0,00

789С/С 16*(47) 7 (22) 0,03 2,15 3,17 0,05-4,10

Примечания: ОР - отношение между группами, ОШ - отношение между группами, *р - статистически значимая разница между группами при помощи х2 (р<0,05), ДИ - доверительный интервал, ЧВ - частота встречаемости.

При замене определенной позиции в изучаемых анти-оксидантных ферментах и фермента эндотелиальной дисфункции изменяется генотип. Так в результате полиморфизма в Т786С в гене N083 получены генотипы Т/С и С/С, ассоциированы со снижением активности эндотелиальной синтазы оксида азота. Наличие однонуклеотидных замен в генах антиоксидантных ферментов митохондриальной су-пероксиддисмутазы 2 Мп80Э (С60Т) и микросомальной эпоксигидролазы ЕРНХ 1 (ТугПЗШз) приводило к риску повышения активных форм кислорода и выделению большого количества свободных радикалов, которые повреждают легочную ткань (табл. 1).

У пациентов, не сформировавших хроническое заболевание легких (группа сравнения), отмечался нормальный генотип 60 С/С Мп80Б (р=0,01, 0Р=0,82) в 100% случаях. У детей с клиникой БЛД данный вариант генотипа также наблюдался с преобладанием у 28(82%) детей. Мутация гена Т/Т Мп80Б встречалась у 2 (6%) детей в группе, страдающих бронхолегочной дисплазией БЛД (р=0,16), также отмечался гетерозиготный генотип в данной группе детей в 12% случаев (4 ребенка) (р=0,04). Частота доминантной аллеи С в ферменте Мп80Э статистически значимо преобладала в группе детей без хронической патологии лёгких (р=0,004). Частота встречаемости минорного аллеля Т фермента 60 С/С Мп80Э встречалась только в группе недоношенных детей с БЛД (р=0,004).

В дальнейшем при оценке фермента микросомальной эпоксигидролазы в исследуемых группах недоношенных де-

тей отмечено, что преобладал нормальный генотип Tyr/Tyr в группе детей, сформировавших БЛД, в 53% случаях (18 детей) (р=0,02, ОР=2,17, ОШ=3,37). Встречаемость полиморфного генотипа (His/His) в данном ферменте была у детей с БЛД (р=0,05, ОР=5,64, ОШ=6,64), при этом гетерозиготный генотип 113 Tyr/His EPHX в 72% случаях отмечался в группе детей без БЛД (р=0,0005, 0Р=0,40, 0Ш=0,16). Частота встречаемости аллелей Tyr гена 113 EPHX не имела отличий в сравниваемых группа (р=0,42), как, впрочем, и аллелей His (р=0,42).

При анализе полиморфизма эндотелиальной синтазы оксида азота было выявлено, что в группе детей, страдающих БЛД, встречаемость однонуклеотидной замены в гене С/С была в 2,2 раза чаще, чем у группы сравнения. У 16 (47%) детей отмечалась данная мутация (р=0,03, ОР=2,15, ОШ=3,17), против 7 (22%) случаев в группе сравнения.

У 22 (69%) недоношенных детей без сформировавшейся БЛД был диагностирован гетерозиготный генотип Т/С 786 NOS3 (р=0,04, 0Р=0,64, 0Ш=0,35). Нормальный генотип у недоношенных обеих групп исследования отмечался в равной степени (у 3 (9%) детей с БЛД и 3 (9%) младенцев в сравниваемой группе (р=0,93)). Частота встречаемости аллелей Т и С в гене NOS3 в исследуемых группах не имела статистической разницы (р=0,12), в группе детей с бронхолегочной дисплазией чаще встречался аллель С (ОР=1,22, ОШ=1,74).

В результате анализа представленного полиморфизма генов антиоксидантных ферментов отмечено, что дети с полиморфными генотипами His/His в гене микросомальной эпоксигидролазы (р=0,05) и С/С в гене NOS3 (р=0,03), так же гетерозиготный вариант С/Т фермента MnSOD 60 (р=0,04) встречались у детей с БЛД, в сравнении с детьми без мутации. Возможно, это сочеталось со снижением защиты от оксидативного стресса, что способствовало формированию БЛД у части пациентов этой группы.

Таблица 3

Свободный член и коэффициенты регрессии

Шаг Показатель Оценка 95% ДИ Р Х2Вальда р-Вальда

1 В0 0,53 -0,004; 1,8 0,05 3,85 0,04

2 MnSOD -60 Т -26,52 -358587; 358533,8 0,99 0,0000 0,99

3 NOS3- 786 С -2,61 -3,94; -1,28 0,0001 15,15 0,0000

4 EPHX-113 His 2,59 1,21; 3,96 0,0002 13,84 0,0001

Частоты аллелей изучаемых полиморфизмов генов MnSOD, EPHX 1 Tyr 113 His Т 786 С в гене NOS3 у недоношенных детей

Полиморфизм Аллель ЧВ аллеля р ОР ОШ ДИ

Основная группа, n=34 Группа сравнения, n=32

MnSOD 60 С/Т 60 С 60 (88) 64* (100) 0,004 0,88 0 -0,50- 0,14

60 Т 8* (12) 0 0,004 0 0 0

EPHX1 113 Tyr/His 113 Tyr 46 (68) 39 (61) 0,42 1,11 1,32 -0,41- 0,97

113 His 22 (32) 25 (39) 0,42 0,82 0,74 -1,76- 0,73

NOS3 786 Т/С 786 Т 21 (31) 28 (44) 0,12 0,70 0,57 -2,17-0,27

786 С 47 (69) 36 (56) 0,12 1,22 1,74 1,01- 1,34

Примечание: В0 - свободный член, при наличии аллелей MnSOD-60 Т, EPHX-113 His, NOS3-786 С принят равным 1.

Данные молекулярно-генетического исследования недоношенных детей продемонстрировали вклад различных генотипов в развитие бронхолегочной дисплазии. Для оценки степени влияния (определения независимых факторов прогноза) изученных генотипов на формирование бронхолегоч-ной дисплазии была проведена бинарная логистическая регрессия, оценивалось влияние аллелей полиморфизма генов MnSOD (С60 Т), EPHX 1 (Tyr 113 His), Таблица 2 NOS3 (Т786 С).

Результатом бинарной логистической регрессии явилась оценка коэффициентов математической модели, итоговое уравнение вероятности развития БЛД:

Примечание: ОР - отношение между группами, ОШ - отношение между группами, *р - статистически значимая разница между группами при помощи х2 (р<0,05), ДИ - доверительный мов. интервал, ЧВ - частота встречаемости.

где е - математическая константа равна 2,72, Ь0 - свободный член, Ь1 -наиболее информативные анализируемые признаки, х - принимает значение 1 при наличии указанных полиморфиз-

При построении итогового уравне-

ния бинарной логистической регрессии х2=36,08 при уровне значимости р<0,001, что свидетельствует о значимости данной математической модели. Предсказательная ценность - 70%. Свободный член и коэффициенты регрессии в многофакторной модели прогнозирования развития БЛД представлены в таблице 3.

Итоговое уравнение вероятности развития бронхолёгоч-ной дисплазии у недоношенных детей приняло вид:

Р

1

1 + e

-

Использование бинарной логистической регрессии позволило определить наиболее тесно связанные аллели с развитием бронхолегочной дисплазии у недоношенных детей. Прогностическими факторами риска развития БЛД явились полиморфизмы гена EPHX-113 His, NOS3-786 С.

Таким образом, перспективным направлением исследования по выявлению генов кандидатов при БЛД является определение однонуклеотидных замен в генах антиоксидантных ферментов и можно предположить, что полиморфизм генов имеет патогенетическое значение в формировании БЛД и является одним из предикторов развития заболевания.

ЛИТЕРАТУРА

1. Беляева И.А., Давыдова И.В. Роль генетических факторов в формировании бронхолегочной дисплазии у детей // Вопросы диагностики в педиатрии. - 2012. - Т. 4. №5. - С.5-9.

2. Овсянников Д.Ю., КузьменкоЛ.Г., Дегтярева Е.А. Возможности высокоразрешающей компьютерной томографии в диагностике бронхолегочной дисплазии у детей первых двух лет жизни // Педиатрия. - 2010. -Т. 89. №1. - С.56-60.

3. Павленова Е.Б. Анализ полиморфизма генов ферментов антиоксидантной системы у недоношенных новорожденных из группы риска по формированию бронхолегочной дисплазии // Вопросы диагностики в педиатрии. - 2011. - Т. 3. №5. - С.14-19.

4. Павленова Е.Б., Геппе Н.А. Полиморфизм генов анти-оксидантных ферментов и формирование бронхолегочной дисплазии у недоношенных детей // Доктор.ру. - 2012. - №9.

- С.14-20.

5. Хамидуллина Л.И. Генетические маркеры предрасположенности к развитию дыхательных нарушений у новорожденных // Вопросы диагностики в педиатрии. - 2012. - Т. 4. №5. - С.26-30.

6. Хышиктуев Б.С. Некоторые итоги изучения обмена и пероксидации липидов: фундаментальные и прикладные аспекты // Забайкальский медицинский вестник. - 2004. -№4. - С.19-22.

7. Floros J., Veletza S.V., Kotikalapudi P. Dinucleotide repeats in the human surfactant protein - B gene and respiratory distress syndrome // Biochem. J. - 1995. - Vol. 305. - P.583-590.

8. Haataja R., Ramet M., Marttila R., Haliman M. Surfactant protein A and B genetic variants in respiratory distress syndrome in singietons and twins // Am. J. Respir. Crit. Care Med.- 2003. -Vol. 168. - Р.1216-1222.

9. Halliman M., Haataja R. Genetic influences and neonatal lung disease // Semin Neonatal. - 2003. - Vol. 8. №1. - P. 19-27.

10. Marttila R., Haataja R., Ramet M., Pokela M.L. Surfactant protein a gene locus and respiratory distress syndrome in Finnish premature twin pairs // Ann. Med. - 2003. - Vol. 5. №35. - Р.344-352.

11. Haataja R., Ramet M., Marttila R., Haliman M. Surfactant protein A and B genetic variants in respiratory distress syndrome in singietons and twins // Am. J. Respir. Crit Care Med. - 2003. -Vol. 168. - P.1216-1222.

12. Wu T., Hu Y., Chen C. Passive smoking, metabolic gene polymorphisms, and infant birth weight in a prospective cohort study of chinese women // Am. J. Epidemiol. - 2007. - Vol. 166.

- P.313-322.

REFERENCES

1. Belyaev I.A., Davydova I.V. The role of genetic factors in the formation of bronchopulmonary dysplasia among children // Voprosy diagnostiki v pediatrii. - 2012. - Vol. 4. №5. - P.5-9.

2. Ovsyannikov D. U., Kuzmenko L.G., Degtyareva D.E. The possibility of high-resolution computed tomography in the diagnosis of bronchopulmonary dysplasia among children during the first two years of the life // Pediatriya. - 2010. - Vol. 89. №1. -P.56-60.

3. Pavlenova E.B. Analysis of gene polymorphisms of antioxidant enzymes among preterm infants of the risk group of bronchopulmonary dysplasia formation // Voprosy diagnostiki of pediatrii. - 2011. - Vol. 3.№5. - P.14-19.

4. Pavlenova E.B., Geppe N.A. Gene polymorphism of antioxidant enzymes and the formation of bronchopulmonary dysplasia among premature infants // Doktor.ru. - 2012. - №9. -P.14-20.

5. Khamidullina L.I. Genetic markers of predisposition of the development of respiratory disorders among newborn children // Voprosy diagnostiki v pediatrii. - 2012. - Vol.4. №5. - P.26-30.

6. Khyshiktuyev B.S. Some results of the study of metabolism and lipid peroxidation: fundamental and applied aspects // Zabajkal'skij meditsinskij vestnik. - 2004. - №4. - P.19-22.

7. Floros J., Veletza S.V., Kotikalapudi P. Dinucleotide repeats in the human surfactant protein - B gene and respiratory distress syndrome // Biochem. J. - 1995. - Vol. 305. - P.583-590.

8. Haataja R., Ramet M., Marttila R., Haliman M. Surfactant protein A and B genetic variants in respiratory distress syndrome in singietons and twins // Am. J. Respir. Crit. Care Med.- 2003. -Vol. 168. - P.1216-1222.

9. Halliman M., Haataja R. Genetic influences and neonatal lung disease // Semin Neonatal. - 2003. - Vol. 8. №1. - P.19-27.

10. Marttila R., Haataja R., Ramet M., Pokela M.L. Surfactant protein a gene locus and respiratory distress syndrome in Finnish premature twin pairs // Ann. Med. - 2003. - Vol. 5. №35. - P.344-352.

11. Haataja R., Ramet M., Marttila R., Haliman M. Surfactant protein A and B genetic variants in respiratory distress syndrome in singietons and twins // Am. J. Respir. Crit Care Med. - 2003. -Vol. 168. - P.1216-1222.

12. Wu T., Hu Y., Chen C. Passive smoking, metabolic gene polymorphisms, and infant birth weight in a prospective cohort study of chinese women // Am. J. Epidemiol. - 2007. - Vol. 166. - P.313-322.

Информация об авторе:

Панченко Александра Сергеевна - к.м.н., доцент, заведующий кафедрой пропедевтики детских болезней,

e-mail: sashawomen@mail.ru

Information About the Authors:

Panchenko Alexandra S. - Ph.D., MD, Associate Professor, Head of the Department of Childhood Illness propedeutics,

e-mail: sashawomen@mail.ru