N-ЭТИЛПИПЕРАЗИЛАМИД БЕТУЛОНОВОЙ КИСЛОТЫ КАК ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ СРЕДСТВО ТРИТЕРПЕНОВОЙ ПРИРОДЫ
N-ETHYLPIPERAZYLAMIDE OF BETULINIC ACID AS TRITERPENIC ANTITUMOUR AGENT

(I):
Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно к N-этилпиперазиламиду бетулоновой кислоты формулы
которое может быть использовано в медицине в качестве лекарственного средства, обладающего противоопухолевым действием.
Современные схемы лечения различного типа злокачественных опухолей используют хирургические методы в комплексе с высокодозной агрессивной терапией, серьезным недостатком которой является высокая токсичность современных противоопухолевых препаратов в отношении жизненно важных органов и систем организма. Сопутствующие побочные эффекты снижают эффективность, а в ряде случаев, ограничивают применение противоопухолевых средств. Другой проблемой в лечении онкологических заболеваний является проблема остаточного опухолевого клона. Опухолевые клетки, пережившие химиотерапию, обычно проявляют лекарственную устойчивость к широкому кругу препаратов и вызывают рецидив заболевания в более тяжелой форме. В связи с этим актуальной задачей является поиск новых противоопухолевых препаратов, обеспечивающих высокую избирательность и эффективность лечения.
Важным направлением медицинской химии, позволяющим получать новые, эффективные противоопухолевые препараты, является использование синтетических трансформаций растительных метаболитов. Наиболее приемлемым считается исследование растительных метаболитов, о биологической активности которых имеются достоверные сведения и которые являются доступными в настоящее время или станут доступными в ближайшем будущем по мере формирования сырьевой базы. К данному классу соединений относятся тритерпеновые кислоты, широкий спектр биологической активности которых (противовоспалительная, противовирусная, противоопухолевая, иммуностимулирующая и т.д.) приковывает к ним пристальный интерес исследователей.
Задачей изобретения является создание нового эффективного, низкотоксичного лекарственного средства, обладающего противоопухолевым действием и получаемого из доступного растительного сырья.
(1),
Поставленная задача решается новым соединением тритерпеновой природы, а именно, N-этилпиперазиламид бетулоновой кислоты формулы которое может использоваться в качестве противоопухолевого средства.
//
2006, 32, 291-307] [1].
IC
10
-10
Mukherjee R., Kumar V., Srivastava S.K., Agarwal S.K., Burman A.C. // Anti-cancer agents in Medicinal Chemistry, 2006, V.6, P.271-279]
in vitro
B.C
//
2007, 33, 624] [3]
β
//
2004, 399,
274] [4].
50
-6
-9
Из литератрурных источников известно, что производные тритерпенов, в частности, лупанового ряда перспективны как противовирусные и противоопухолевые препараты [Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Толстиков Г.А., Толстиков А.Г., Флехтер О.Б. Биорган. химия, На примере бетулиновой кислоты показана связь структуры и противоопухолевой активности в отношении широкого спектра раковых клеток ( М) [ [2]. Показано, что производные бетулоновой кислоты, содержащие фрагменты со-аминокислот, являются активными индукторами апоптоза в лейкозных клетках и клетках гепатокарциномы  [Шинтяпина А.Б., Шульц Э.Э., Петренко Н.И., Узенкова Н.В., Толстиков Г.А., Пронкина Н.В., Кожевников ., Покровский А.Г. Биорган. химия,. Важной чертой амидов бетулоновой кислоты является то, что амид, например, содержащий фрагмент -аланина, проявляет антиоксидантную активность и обладает способностью снижать органотоксическое действие противоопухолевых препаратов [Сорокина И.В., Толстикова ТТ., Жукова Н.А., Петренко Н.И., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А.Докл. АН,С.Обстоятельством, повышающим привлекательность тритерпенов, является их широкое распространение в природе и, во многих случаях, относительная простота технологии получения из многотоннажного растительного сырья.
(2),
(3) -
Betula [Krasutsky P.A // Nat. prod. rep., 2006, 23,
19-942] [5].
Одним из соединений тритерпеновой природы с ярко выраженными физиологическими свойствами, является бетулоновая кислота формулыкоторая легко получается окислением бетулина формулы широкодоступным сырьем, выделяемым из внешней коры березы семейства  Р.9
-
(3),
(3)
(2),
(2)
(1)
Для достижения поставленной цели мы провели ряд химических модификаций, представленных на схеме Фиг.1. В качестве исходного соединения был взят бетулин полученный экстракцией коры березы бензолом. Бетулин окисляли раствором Физера. Следующим этапом являлось получение хлорангидрида бетулоновой кислотыкоторый далее использовался без выделения. Взаимодействие хлорангидрида бетулоновой кислоты с N-этилпиперазином легко приводит к целевому соединению формулы с противоопухолевой активностью.
DFS (Double Focusing Sector
Thermo Electron Corporation.
Элементный состав полученных веществ определяли из масс-спектров высокого разрешения, записанных на приборе ) фирмы
1
13
13
1
1
1
13
13
1
1
13
1
2,3
AV
400.13 MHz
100.61 MHz
DRX-500 (500.13 MHz
125.76 MHz
Bruker
CDCl
δ
7.24
76.9
J
JMOD
C-
H
COSY,
j
135
C-
H
COLOC, LRJMD,
j
10
3
H
c,h
c,h
Спектры ЯМР Н и С регистрировали на спектрометрах -400 (рабочие частоты для 1Н и для С) и  и  соответственно) фирмы  для растворов веществ в . В качестве внутреннего стандарта использовали сигналы растворителя ( и 8 с м.д). Строение полученных соединений устанавливали на основании анализа спектров ЯМР Н с привлечением спектров двойного резонанса Н-Н, а также анализа спектров ЯМР С с использованием стандартных методик записи спектров в режиме-модуляции (), с внерезонансным и селективным подавлением протонов, двумерных спектров гетероядерной  корреляции на прямых константах спин-спинового взаимодействия (С-Н  Гц) и двумерных и одномерных спектров гетероядерной  корреляции на дальних константах спин-спинового взаимодействия ( Гц).
(1)
Было исследовано влияние заявляемого N-этилпиперазиламида бетулоновой кислоты формулы на жизнеспособность различных опухолевых клеток человека.
(1)
13, U
CCID
(1)
5.8-10.5 µM
(1)
50
В результате было показано, что заявляемое соединение проявляет высокую противоопухолевую активность по отношению ко всем использованным опухолевым клеточным культурам, а именно СЕМ--937, МТ-4. Показано, что значения  для соединения имеют сходный порядок величины для всех опухолевых клеток и лежат в диапазоне. Полученные данные по противоопухолевой активности соединенияпозволяют рассматривать его как перспективный лекарственный агент. Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
1.
β
3).
(344
(1.6
8
1
52
38
°
258-260°C [Hayek // Phytochem. 1989, 28,
22.] [6]
11%.
ПримерПолучение луп-20(29)-ен-3,28-диола (бетулина,Измельченную кору березы г) кипятили в бензоле л) с обратным холодильником ч, далее горячий раствор декантировали. В оставшуюся кору добавляли еще 1 л бензола, кипятили ч, горячий раствор снова декантировали. Выпавший из бензола осадок отфильтровывали, высушивали и получали г бетулина-сырца. После перекристаллизации в изопропаноле получали г бетулина с т.пл. 260-262С (лит. т.пл.Р.). Выход бетулина на исходную кору составил
2.
5).
ПримерПолучение 3-оксо-луп-20(29)-ен-28-овой кислоты (бетулоновой кислоты,
10
(22.6
(3)
165
110
0°
1
(11
(0.11
12
15
3
50
300
300
10%
NaCl
2×150
3×200
10%
NaCl,
MgSO
100
200
5%
50
250
5%
HCl
(2)
H
O
7.2
(69%
(2).
Barthel A., Stark S., Csuk R. // Tetrahedron, 2008, 64,
[6].
2
4
2
Суспензию г ммоля) бетулина в мл ледяной уксусной кислоте и мл ацетона охлаждали при С и в течение ч при перемешивании прибавляли свежеприготовленный раствор Физера г моля) хромового ангидрида в мл ледяной уксусной кислоты и мл НО). Выдерживали при комнатной температуре ч. По окончании реакции добавляли мл метанола, прибавляли мл бензола и мл раствора . Бензольный слой отделяли, а водный экстрагировали мл бензола. Объединенные экстракты промывали мл раствором сушат , осушитель отфильтровывали, бензол отгоняли приблизительно до мл и выливали вмл раствора КОН. Осадок калиевой соли бетулоновой кислоты отфильтровывали и высушивали. Сухую соль растворяли в мл этанола, не растворившуюся часть отфильтровывали, фильтрат выливали в млраствор . Выделившуюся кислоту отфильтровывали, промывали , высушивали. В итоге получали г от теории) бетулоновой кислотыТочка плавления и спектры ЯМР соответствуют литературным [ Р.9225-9229]
3.
N
'
1).
Пример Получение-[3-оксо-луп-20(29)-сио-28-ил]-4-этилпиперазина (N-этилпиперазиламида бетулоновой кислоты,
(2) (1
2.2
50
CH
Cl
(0.5
5.7
4
20
CH
Cl
20
CH
Cl
(2)
4.8
30
CH
Cl
.
18
CH
Cl
100
3×20
H
O
MgSO
,
(1) 0.88
73%
°
m/z: 550.4488
]
. C
H
N
O
550.4493.
(1), δ
J
0.87
), 0.91
), 0.92
), 0.96
), 1.00
), 1.13
, J
7.2), 1.62
). 0.90
H
), 1.12
H
, J
13.3), 1.26
.
, J
11.5, J
2.3
1.47
H
), 1.50
.
(H
, J
11.2, J
11.2
1.68
H
, J
12.5), 1.76-1.88
), 1.93
, J
10.2, J
7.6
2.06
H
, J
13.3, J
, 3.7, J
3.0
2.34
), 2.36
, J
7.2), 2.43
H
, J
15.7, J
9.6, J
7.2
2.87
H
, J
12.8, J
11.2, J
3.4), 2.93
, J
11.2, J
11.2, J
3.4), 3.56
), 4.52
4.66
1.23-1.47
(1), δ
39.49
), 33.96
), 217.91
), 47.13
), 54.90
), 19.47
), 33.57
), 40.43
), 50.05
), 36.76
), 21.50
), 25.50
), 36.77
), 41.75
), 29.58
), 32.26
), 54.32
), 52.44
), 45.44
), 151.12
), 31.14
), 35.73
), 26.43
), 20.83
), 15.81
), 15.73
), 14.41
), 173.16
), 108.9
), 19.50
), 52.87
), 52.08
), 11.74
)
45
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
4
36
58
2
2
3
3
3
3
3
3
8',7'
3
15e,15a
5a,6а
5a,6e
18a,13a
18a,19
12e,12a
22α,22β
22α,21
16e,16a
16e,15a
16e,15a
7',8'
2a,2e
2a,1a
2a,1e
13a,12a
13a,18a
13a,12e
19,18a
19,21α
19,21β
+
1
25
27
26
24
23
8'
30
12a
15e
5а
16a
18a
12e
21α
1
22α
16e
2
3'
5'
7'
2a
13a
19
2'
6'
29
13
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
15
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
3',5'
7'
8'
2',6'
К раствору бетулоновой кислоты г, ммоль) в мл  прибавляли оксалилхлорид мл, ммоль) и две капли ДМФА, раствор выдерживали при перемешивании ч при комнатной температуре. Растворитель упаривали, добавляли мл  и снова упаривали, в конце прибавляли мл . Полученный раствор хлорангидрида бетулоновой кислоты по каплям прибавляли к раствору N-этилпиперазина (0.55 г, ммоль) в мл  Реакционную массу оставляли при комнатной температуре на ч, разбавляли  до мл, промывали мл , сушили осушитель отфильтровывали, растворитель отгоняли. К остатку прибавляли небольшое количество метанола и оставляли до выпадения осадка. Осадок отфильтровывали и перекристаллизовывали из метанола. Масса полученного продукта г (выход на кислоту). Т.пл. 232-234С Найдено,  [М. Вычислено М Спектр ЯМР Н соединения, м.д. (, Гц): с (СН с (СН с (СН с (СН с (СНт (СН уш. с (СН м ( д.м ( дд (Н Гц), М (ддГц), д.м ( м (2Н, Н, Н д.д (Н Гц), д.д.д ( Гц), м (5Н, Н, 2Н, 2Н к (2Н, Н д.д.д ( Гц), д.д.д ( д.д.д (Н уш.с (4Н, 2Н, 2Н м и м (2Н, 2Н). Сигналы остальных протонов наблюдаются в области м.д. (11Н). Спектр ЯМР С соединения, м.д.: т (С т (С с (С с (С д (С т (С т (С с (С д (Сс (С т (С т (С д (С с (С т (С т (С с (С д (С д (С с (С т (С т (С к (С к (С к (С к (С к (С с (С т (С к (С т (С т (С к (С). Сигналы (С сильно уширены и наблюдаются в области м.д.
4.
(1)
Пример Влияние N-этилпиперазиламида бетулоновой кислоты на жизнеспособность опухолевых клеток Т-клеточного лейкоза человека МТ-4
RPMI 1640,
(100
0.1
°
2
Клетки линии МТ-4 (клетки Т-клеточного лейкоза человека) культивировали в среде  содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики ед./мл пенициллина и мг/мл стрептомицина), в атмосфере 5%-ного СО при 37С.
(1)
(100
500
(1)
0.1
100
(2).
(1)
(5
0.5
3
100
570
630
-
-
570
630
Жизнеспособность клеток после инкубации с соединением определяли с помощью МТТ теста, который основан на способности живых клеток превращать соединения на основе тетразола (МТТ) в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты мкл клеток с концентрацией тыс клеток/мл. Затем к клеткам добавляли раствор соединения в ДМСО до конечной концентрации в среде от до мкг/мл. В качестве препарата сравнения использовали бетулоновую кислоту Клетки инкубировали в присутствии соединения еще в течение 3-х суток в тех же условиях. По окончании инкубации, без смены среды, к клеткам добавляли раствор МТТ мг/мл) в фосфатно-солевом буфере до концентрации мг/мл и инкубировали в течение ч в тех же условиях. Среду удаляли, к клеткам добавляли по мкл ДМСО, в котором происходит растворение образовавшихся в клетках кристаллов формазана и измеряли оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре на длинах волн и нм, где А поглощение формазана, а А фон клеток.
100%
Данные представляли в виде количества живых клеток относительно контроля. За принимали количество клеток в контроле, где клетки инкубировали в отсутствие соединения, но в присутствии растворителя ДМСО.
2.
(1)
72
100%
(1).
(2)
На Фиг. приведены данные по жизнеспособности клеток линии МТ-4 после инкубации с соединением в течение ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения В качестве препарата сравнения использована бетулоновая кислота
1,
(1)
10
CCID
-
(1),
50%
CCID
CCID
80
90%
1.
1,
(1)
(2).
(1)
50%
5.8
80%
14,5
,
(2),
80%
50%
8.2
-6
50
80
90
Из данных, приведенных на фиг. видно, что обработка лейкозных клеток МТ-4 соединением вызывает их эффективную гибель уже при концентрации соединения  М. Значения  концентрация соединения при которой наблюдается гибель клеток, а также  и  (концентрации, при которых наблюдается гибель и клеток соответственно) приведены в таблице Из данных, приведенных в таблице видно, что соединениеобладает большим противоопухолевым эффектом по сравнению с описанным ранее соединением Обработка клеток линии МТ-4 соединениемвызывает гибель при концентрации соединения мкМ, а гибель при концентрации мкМ в отличие от соединения сравнения для которого при обработке клеток в используемых концентрациях не достигается гибели клеток, а гибель клеток наблюдается при более высокой концентрациимкМ.
Таблица<i> 1.</i>
Значения <i>CCID</i> N-этилпиперазиламида бетулоновой кислоты<i> (1)</i> для опухолевых линий клеток человека МТ-4
Соединение
<i>CCID</i><sub>50</sub><i>,</i> мкМ
<i>CCID</i><sub>50</sub><i>,</i> мкМ
<i>CCID</i><sub>50</sub><i>,</i> мкМ
N-этилпиперазиламид бетулоновой кислоты
<i>5.8</i>
<i>14.5</i>
<i>30.9</i>
Бетулоновая кислота
<i>8.2</i>
<i>>200</i>
<i>>200</i>
5.
(1)
13
Пример Влияние N-этилпиперазиламида бетулоновой кислоты на жизнеспособность опухолевых клеток Т-клеточного лейкоза человека СЕМ-
13
RPMI 1640,
(100
0.1
CO
°
2
Клетки линии СЕМ- (линия клеток Т-клеточного лейкоза человека), культивировали в среде  содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики ед./мл пенициллина и мг/мл стрептомицина), в атмосфере 5%-ного  при 37С.
(1)
(100
500
(1)
0.1
100
(2).
(1)
(5
0.5
3
100
570
630
-
-
570
630
Жизнеспособность клеток после инкубации с соединением определяли с помощью МТТ теста, который основан на способности живых клеток превращать соединения на основе тетразола (МТТ) в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты мкл клеток с концентрацией тыс клеток/мл. Затем к клеткам добавляли раствор соединения в ДМСО до конечной концентрации в среде от до мкг/мл. В качестве препарата сравнения использовали бетулоновую кислоту Клетки инкубировали в присутствии соединения еще в течение 3-х суток в тех же условиях. По окончании инкубации, без смены среды, к клеткам добавляли раствор МТТ мг/мл) в фосфатно-солевом буфере до концентрации мг/мл и инкубировали в течение ч в тех же условиях. Среду удаляли, к клеткам добавляли по мкл ДМСО, в котором происходит растворение образовавшихся в клетках кристаллов формазана и измеряли оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре на длинах волн и нм, где А поглощение формазана, а А фон клеток.
CCID
4.
CCID
(1),
50%
CCID
CCID
80
90%
2.
13
(1)
50%
10.5
80%
42,7
,
(2),
50%
11.6
80%
200
50
80
90
Подсчет значений  проводили как описано в примере Значения  - концентрация соединения при которой наблюдается гибельклеток, а также  и  (концентрации, при которых наблюдается гибель и клеток соответственно) приведены в таблице Обработка клеток линии СЕМ- соединением вызывает гибель при концентрации соединения мкМ, а гибель при концентрации мкМ в отличие от соединения сравнения для которого гибель клеток наблюдается при сравнимой концентрации мкМ, но гибель клеток не достигаеится даже в максимальной использованной концентрации мкМ.
Таблица<i> 2.</i>
Значения CCID N-этилпиперазиламида бетулоновой кислоты<i> (1)</i> для опухолевых линий клеток человека СЕМ-<i>13</i>
Соединение
<i>CCID</i><sub>50</sub><i>,</i> мкМ
<i>CCID</i><sub>80</sub><i>, </i>мкМ
<i>CCID</i><sub>90</sub><i>, </i>мкМ
N-этилпиперазиламид бетулоновой кислоты
<i>10.5</i>
<i>42.7</i>
<i>147</i>
Бетулоновая кислота
<i>11.6</i>
<i>>200</i>
<i>>200</i>
6.
(1)
U-937.
Пример Влияние N-этилпиперазиламида бетулоновой кислоты на жизнеспособность опухолевых клеток человека
U-937
RPMI 1640,
(100
0.1
°
2
Клетки линии(опухолевая линия моноцитов человека) культивировали в среде  содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики ед./мл пенициллина и мг/мл стрептомицина), в атмосфере 5%-ного СО при 37С.
(1)
(100
400
(1)
0.1
100
(2).
(1)
(5
0.5
3
100
570
630
-
-
570
630
Жизнеспособность клеток после инкубации с соединением определяли с помощью МТТ теста, который основан на способности живых клеток превращать соединения на основе тетразола (МТТ) в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты мкл клеток с концентрацией тыс клеток/мл. Затем к клеткам добавляли раствор соединения в ДМСО до конечной концентрации в среде от до мкг/мл. В качестве препарата сравнения использовали бетулоновую кислоту Клетки инкубировали в присутствии соединения еще в течение 3-х суток в тех же условиях. По окончании инкубации, без смены среды, к клеткам добавляли раствор МТТ мг/мл) в фосфатно-солевом буфере до концентрации мг/мл и инкубировали в течение ч в тех же условиях. Среду удаляли, к клеткам добавляли по мкл ДМСО, в котором происходит растворение образовавшихся в клетках кристаллов формазана и измеряли оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре на длинах волн и нм, где А поглощение формазана, а А фон клеток.
CCID
4.
CCID
-
(1),
50%
CCID
CCID
80
90%
2.
CCID
-
(1),
50%
CCID
CCID
80
90%
3.
U
(1)
50%
6
80%
30.9
,
(2),
50%
18.4
80%
200
(1)
13, U-937)
50
80
90
50
80
90
Подсчет значений  проводили как описано в примере Значения  концентрация соединения при которой наблюдается гибельклеток, а также  и  (концентрации, при которых наблюдается гибель и клеток соответственно) приведены в таблице Значения  концентрация соединения при которой наблюдается гибельклеток, а также  и (концентрации, при которых наблюдается гибель и клеток соответственно) приведены в таблице Обработка клеток линии -937 соединением вызывает гибель при концентрации соединения мкМ, а гибель при концентрации мкМ в отличие от соединения сравнения для которого гибель клеток наблюдается при сравнимой концентрации мкМ, но гибель клеток не достигается даже в максимальной использованной концентрации мкМ. Таким образом, соединение обладает более выраженным противоопухолевым эффектом в отношении исследованных опухолевых клеток (МТ-4, СЕМ- по сравнению с бетулоновой кислотой, для которой ранее было показано наличие выраженной противоопухолевой активности.
Таблица<i> 3.</i>
Значения CCID N-этилпиперазиламида бетулоновой кислоты<i> (1)</i> для опухолевых линий клеток человека<i> U-937</i>
Соединение
<i>CCID</i><sub>50</sub><i>,</i> мкМ
<i>CCID</i><sub>80</sub><i>,</i> мкМ
<i>CCID</i><sub>90</sub>, мкМ
N-этилпиперазиламид бетулоновой кислоты
<i>6.0</i>
<i>30.9</i>
<i>>100</i>
Бетулоновая кислота
<i>18.4</i>
<i>>200</i>
<i>>200</i>
Источники информации
1.
//
2006, 32, 291-307].
Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Толстиков Г.А., Толстиков А.Г., Флехтер О.Б. Биорган. химия,
2. Mukherjee R., Kumar V., Srivastava S.K., Agarwal S.K., Burman A.C. // Anti-cancer agents in Medicinal Chemistry, 2006, V.6, P.271-279.
3.
.
.,
.
.,
.
.,
.
.,
.
.,
.
.,
B.C.,
.
. //
.
, 2007, 33, 624.
Шинтяпина АБШульц ЭЭПетренко НИУзенкова НВТолстиков ГАПронкина НВКожевниковПокровский АГБиорганхимия
4.
2004, 399,
Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова Н.А., Петренко Н.И., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. // Докл. АН, С.274.
5. Krasutsky P.A // Nat. prod. rep., 2006, 23,
.919-942.
Р
6. Hayek // Phytochem. 1989, 28,
Р.22.