СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА
METHOD OF PRODUCING TULAREMIC MICROBE BIOMASS

Изобретение относится к области промышленной микробиологии, а именно к способам получения биомассы туляремийного микроба, и может быть использовано для получения антигенных компонентов для создания диагностических препаратов против возбудителя туляремии.
Известно, что возбудитель туляремии требователен к составу питательных сред. Для его выращивания обычно используют среды на основе естественных субстратов: яичного желтка, крови, печени, мозга и пр. [Олсуфьев Н.Г. Дунаева Т.Н., 1970]. При этом часто для стимулирования роста используются витаминно-минеральные добавки, содержащие, в частности, пантотенат кальция, тиамин, цистеин, ионы магния.
Известен способ выращивания туляремийного микроба на кровяном рыбно-дрожжевом-глюкозо-цистиновом агаре. Однако на свежей среде приживаются только единичные бактерии, посеянные в виде взвеси в физиологическом растворе. Кроме того, кровяной агар должен быть приготовлен не более чем за 2-3 суток до посева, так как при длительном хранении ростовые качества среды снижаются.
Известен способ получения биомассы туляремийного микроба для приготовления диагностических препаратов, живой вакцины, антигенов и других продуктов на плотных агаровых средах без добавления крови, ее компонентов или желтка [Сомов П.В., 1939; Дрожевкина М.С., 1945]. Однако для получения большого выхода биомассы требуется большая посевная доза.
Известны способы выращивания туляремийного микроба на полужидких средах глубинным методом в условиях аэрации непрерывным пропусканием через толщу среды мелкораспыленного воздуха [Колядицкая Л.С., Шмурыгина А.А., 1957] или непрерывным встряхиванием [Татомир Л.Г., 1963]. В состав сред входят гидролизаты свежей рыбы, печени или мяса, гидролизат желатина, желатин, хлористый натрий, глюкоза, цистин при рН среды 7,2-7,3.
К недостаткам способов культивирования возбудителя туляремии на плотных и полужидких средах следует отнести неравномерное распределение микроорганизмов и питательной среды по объему сосуда, в связи с чем выращиваемая культура гетерогенна в физиологическом и техническом отношении, кроме того, невозможно получить антигены, выделяемые в окружающую среду в процессе жизнедеятельности, а также после гибели клеток. Избежать описанных недостатков позволяет применение жидких питательных сред, использование которых даже без перемешивания позволяет увеличить выход биомассы, в том числе и за счет использования больших емкостей для культивирования (бутыли, ферментеры) [Баснакьян И.А., 1992].
Известен способ выращивания туляремийного микроба с использованием многокомпонентной, синтетической жидкой питательной среды [Майский В.Г. и др., 1984]. К недостаткам данного способа можно отнести низкий выход биомассы и длительность культивирования возбудителя туляремии до 5 суток, высокую стоимость компонентов среды, что не позволяет использовать его для биотехнологических целей.
Известен способ культивирования возбудителя туляремии [патент RU 2361916, 20.07.2007] в статических условиях в течение 120 ч при температуре 37°С в жидкой двухфазной среде, при этом посев возбудителя осуществляют на границе раздела фаз, где создаются оптимальные условия для размножения микроорганизмов. Однако такой способ культивирования трудоемкий, дорогостоящий и не пригоден для выращивания культуры в промышленных целях.
Известен способ глубинного культивирования клеток вакцинного штамма туляремийного микроба в течение 16-18 ч при 37°С в ферментере (12 л) в жидкой среде, содержащей сернокислый гидролизат рыбокостной муки с добавлением солей, витаминов, цистина и глюкозы [В.С.Хлебников, И.Р.Головлев и Д.П.Кулевацкий, 1991]. В способе не раскрыт количественный состав среды и методика культивирования. В описанном способе культуральную жидкость после извлечения клеток (не использовали) автоклавировали и сливали в канализацию.
Описанные выше способы пригодны для выращивания биомассы возбудителя туляремии в лабораторных условиях и не применялись для масштабированного культивирования.
Накопленные данные о синтезе антигенных структур возбудителя туляремии свидетельствуют о существенной роли компонентного состава питательных сред и условий культивирования в формировании и количественном накоплении отдельных поверхностных структур клетки, обладающих протективной активностью.
Задачей изобретения является создание оптимальной технологии глубинного культивирования туляремийного микроба для получения (в промышленных масштабах) биомассы, пригодной для выделения протективных антигенных компонентов не только из клеток, но и из культуральной жидкости.
Технический результат изобретения заключается в получении биомассы, пригодной для получения профилактических препаратов и диагностически значимых антигенов, и в снижении количества отходов и объема сточных вод.
Дополнительный технический результат заключается в экономии посевного материала.
Задача решается путем глубинного культивирования предварительно подготовленного посевного материала (туляремийного микроба) в ферментере на жидкой среде при рН 6,8-7,0, температуре 37°С в течение 16-20 ч. Для повышения эффективности процесса культивирования и увеличения жизнеспособности биомассы используют подкормку раствором глюкозы с витаминами В1 и В3 (тиамин хлоридом и пантотенатом кальция). Внесение подкормки осуществляется на стадии посева и в экспоненциальной фазе развития микробной популяции, прекращается при переходе в стационарную фазу.
Подготовку посевного материала осуществляют на чашках с FT-агаром с последующим пересевом в матрацы с бифазной средой. В качестве плотной среды используют FT-aгap, содержащий сернокислый гидролизат рыбокостной муки 17,0 г/л, стимулятор роста гемофильных организмов 5,0 г/л, экстракт пекарских дрожжей 2,3 г/л, магния сульфат 0,5 г/л, натрия сульфит 0,7 г/л, L-цистеин 0,5 г/л, агар 10,0 г/л, а в качестве жидкой - модифицированную среду, содержащую панкреатический гидролизат рыбокостной муки 17,0 г/л, стимулятор роста гемофильных организмов 5,0 г/л, экстракт пекарских дрожжей 2,3 г/л, магния сульфат 0,5 г/л, натрия сульфит 0,7 г/л, L-цистеин 0,5 г/л. Культивирование туляремийного микроба бифазным способом значительно увеличивает выход биомассы (до 60%) по сравнению с культивированием на плотных и жидких средах.
Кроме того, при выращивании биомассы заявляемым способом в случае необходимости возможно дополнительно в экспоненциальной фазе роста вводить последовательные операции отъемно-доливного способа выращивания, который предусматривает удаление 50% биомассы при достижении культурой максимальной концентрации в данных условиях и добавлении 50% свежей питательной среды. Введение в технологический процесс выращивания туляремийного микроба дополнительных операций позволяет при однократной подготовке посевного материала увеличить выход биомассы, что сокращает временные затраты на предварительных этапах, уменьшает риск контаминации, дает возможность получить максимальное количество биомассы с однотипными свойствами и автоматизировать процесс выращивания.
Жидкую питательную среду готовят следующим образом: 17,0 г/л панкреатического гидролизата рыбокостной муки, 5,0 г/л стимулятора роста гемофильных организмов и 2,3 г/л экстракта пекарских дрожжей растворяют в дистиллированной воде при постоянном перемешивании. Отдельно в малых объемах дистиллированной воды растворяют 0,5 г/л сульфата магния, 0,7 г/л сульфита натрия и 0,5 г/л L-цистеина.
Затем все растворы объединяют и доводят объем до 1 л дистиллированной водой. рН питательной среды доводят до 7,0 раствором дигидрофосфата калия 0,4 моль. Готовый бульон в бутылях с монтажом стерилизуют автоклавированием при 12 °С 15 мин. Для приготовления глюкозо-витаминной добавки (ГВД) 6 г глюкозы, 0,08 г тиамин-хлорида и 0,08 г пантотената кальция растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Готовый раствор стерилизуют автоклавированием при 110°С 30 мин. Для создания селективных условий в среду перед внесением культуры туляремийного микроба возможно добавление пенициллина в конечной концентрации 50 мкг/мл.
Полученная биомасса туляремийного микроба обладает морфологическими (форма и размер клеток) и культуральными (форма колонии) свойствами, характерными для возбудителя туляремии.
Для последующего выделения антигенных компонентов биомассу туляремийного микроба, полученную заявляемым способом (пример 1), разделяют на клеточную массу и культуральную жидкость.
Выделение антигенов из клеточной массы подтверждено примером 2.
Культуральная жидкость после извлечения клеточной массы содержит достаточное количество сырья и также пригодна для получения антигенов, что подтверждено примером 3. Таким образом, культуральная жидкость - потенциальный отход производства, полученная при реализации заявляемого способа, используется в качестве источника сырья для получения антигенов.
Пример 1
Способ осуществляют следующим образом.
Для подготовки посевного материала культуру F.tularensis 15 НИИЭГ I генерации, выращенную на чашке с FT-агаром в течение 48 ч при температуре 37°С, петлей пересевают в пробирки со скошенным FT-агаром. После инкубирования при температуре 37°С в течение 48 ч в пробирки вносят по 2-3 мл охлажденного 0,86% раствора NaCl и смывают культуру с поверхности FT-агара. Смыв (II генерация) стерильно добавляют во флаконы, содержащие по 50 мл скошенного FT-aгapa. Флаконы помещают в термостат при температуре 37 °С на 48 ч. По истечении двух суток культуру III генерации стерильно смывают с поверхности FT-агара 5 мл охлажденного 0,86% раствора хлористого натрия и засевают на матрацы с бифазной средой. Бифазную среду готовят следующим образом: в матрацы со скошенным FT-агаром (коммерческим) - плотная фаза наслаивают жидкую среду - жидкая фаза в соотношении агар - жидкая среда 10:1. В качестве жидкой среды используют вышеописанную модифицированную среду. В конкретном исполнении использовано FT-агара (коммерческого) в количестве 300 мл, а жидкой среды - 30 мл. После инкубирования при температуре 37°С в течение 48 ч культуру смывают с поверхности агара в стерильный флакон (IV генерация). Объем посевного материала стерильно доводят до 100 мл 0,86% раствором хлористого натрия. Посевная доза культуры в итоге должна быть не менее 1 млрд м.к./мл. После внесения посевного материала в ферментер закачивают глюкозо-витаминную добавку (из расчета 2 мл добавки на 100 мл среды). При необходимости возможно добавление антибиотика в качестве ингибитора роста посторонней микрофлоры (пенициллин, конечная концентрация 50 мкг/мл).
Культуру выращивают 16-20 ч на модифицированной жидкой среде (7,0±0,2). В начале экспоненциальной фазы в качестве источника глюкозы добавляют глюкозо-витаминную подкормку (из расчета 2 мл добавки на 100 мл среды), что приводит к увеличению концентрации биомассы через 4 часа на 50%. Концентрация полученной биомассы согласно заявляемому способу при посевной дозе не менее 1 млрд м.к./мл составляет 18 млрд м.к./мл.
В случае необходимости получения биомассы туляремийного микроба в больших количествах при однократной подготовке посевного материала дополнительно вводят операции отъемно-доливного способа выращивания, в соответствии с которым через 8 часов от начала выращивания при концентрации 11 млрд м.к./мл 50% культуры в ферментере заменяют равным количеством свежей среды с глюкозо-витаминной добавкой и пенициллином. Процедуру повторяют каждые 4 часа (всего 5 раз). В результате после каждого разбавления концентрация культуры достигает первоначальных значений или превышает его.
Пример 2
Выделение антигенов из клеток туляремийного микроба, выращенных согласно заявляемому способу.
Отделение клеточной массы от культуральной жидкости осуществляют центрифугированием с охлаждением при 9000 об/мин в течение 20 мин. С поверхности клеток антигены получают гидродинамическим смывом с последующим поэтапным осаждением с постепенным понижением рН (от 7,0 до 4,3) для освобождения от балластных веществ. На последнем этапе переосаждение повторяют 2-3 раза для окончательной очистки препарата. Выход антигена составляет 25,0±1,0 мг по белку из 100 мл клеточной массы. Выделенные из клеток антигены отличаются высокой иммуногенностыо для белых мышей: синтез антител и положительный аллергический ответ в реакции лейкоцитолиза к 21 суткам иммуногенеза свидетельствуют о формировании напряженного иммунитета; и защищают животных от последующего заражения возбудителем туляремии. Препараты антигенов не обладают токсичностью (in vivo) и пирогенностью (in vitro) (концентрация эндотоксина менее 0,5 ЕЭ/мл). В РДП была выявлена высокая иммунохимическая активность и идентичность образцов антигенов, полученных с использованием глубинного культивирования, как с поверхности клеток, так и из жидкой фазы.
Пример 3
Выделение антигенов из культуральной жидкости, полученной при выращивании согласно заявляемому способу туляремийного микроба.
Культуральную жидкость освобождают от клеточной массы центрифугированием при 9000 об/мин в течение 20 мин или на сепараторе АСГ 3М при том же режиме. Для уменьшения объема рН доводят до 4,2, осадок отделяют центрифугированием, суспендируют в дистиллированной воде и доводят рН до 7,0 1 моль раствором NaOH, а затем проводят поэтапное осаждение с постепенным понижением рН (от 7,0 до 4,3) для освобождения от балластных веществ. На последнем этапе переосаждение повторяли 2-3 раза для окончательной очистки препарата. Выход антигена составляет 22,0±1,0 мг по белку из 4 л культуральной жидкости. Выделенные из культуральной жидкости антигены обладают иммунохимической активностью и иммуногенными свойствами, обладают протективностью в отношении летальных доз вакцинного штамма на модели белых мышей. Таким образом, культуральная жидкость после извлечения из нее клеток не утилизируется, а используется для выделения антигенных компонентов, что способствует снижению отхода производства.
В таблице представлены сравнительные данные о свойствах антигенов, выделенных из культуральной жидкости и клеток, полученных при выращивании туляремийного микроба согласно заявляемому способу.
Полученная заявляемым способом биомасса туляремийного микроба пригодна для последующего выделения антигенных компонентов как из клеток, так и из культуральной жидкости, полученной после осаждения клеток на сепараторе.
Таким образом, заявляемый способ позволяет для производственных целей получать целевой продукт. В заявляемом способе отработаны условия глубинного культивирования туляремийного микроба в ферментере с использованием жидкой питательной среды со стимуляторами роста. Используемая жидкая среда дает возможность получать антигенные компоненты из клеток и из культуральной жидкости. Заявляемый способ позволяет в случае необходимости использовать отъемно-доливной метод выращивания с удалением 50% биомассы при достижении культурой максимальной концентрации в данных условиях и добавлением 50% свежей питательной среды. Разработанный способ получения биомассы позволяет проводить множество циклов процесса и наиболее экономически эффективен при выращивании возбудителя туляремии для производственных целей, т.к. дает возможность получать антигенные компоненты как из клеток, так и из культуральной жидкости.