СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА НАРУШЕНИЙ ФЕРТИЛЬНОСТИ У МУЖЧИН С ОЖИРЕНИЕМ
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF DISTURBED FERTILITY IN MALES SUFFERING OBESITY

Изобретение относится к медицине, а именно к урологии, и может быть использовано для прогнозирования нарушения фертильности мужчин с ожирением.
Известен способ определения фертильности мужчин (RU 2052202 C1, Посисеева и др., 10.01.1996). В спермальной жидкости исследуют содержание термостабильного альфа-1-гликопротеина и при уровне последнего выше 16 мкг/мл диагностируют сниженную фертильность спермы. Описан также способ диагностики ранних нарушений репродуктивной функции у мужчин (RU 2413949 C1, Тарасова и др., 10.03.2011). В сыворотке крови методом иммуноферментного анализа определяют концентрации цитокинов IL-8, IL-10 и IL-1RA, затем вычисляют диагностический индекс DI. При DI более 0 диагностируют ранние нарушения репродуктивной функции у мужчин, а при DI менее 0 делают заключение об отсутствии лабораторных признаков нарушений мужской репродуктивной функции. Однако указанные способы не предполагают выявления группы риска развития бесплодия у мужчин с ожирением.
В изобретении (RU 2342660 C2, Семенов, 27.12.2008) описан способ прогнозирования нарушений фертильности у мужчин. Путем проточной цитометрии спермы исследуют соотношение лимфоцитов с фенотипом CD25+ и CD95+. При его значениях менее 0,71 и более 1,20 прогноз фертильности признается неблагоприятным. Однако и этот способ не позволяет выявить группу риска развития бесплодия среди мужчин с ожирением.
Наиболее близким к патентуемому, является способ прогнозирования нарушения фертильности спермы у мужчин в виде астенозооспермии, в котором исследуют периферическую кровь посредством анализа генов (RU 2314530 C1, Фетисова и др., 10.01.2008 - прототип). На выделенной из лимфоцитов ДНК амплифицируют фрагменты генов глутатион-S-трансфераз M1 и Р1. При выявлении одного из генотипов GSTM1 0/0, GSTP1 В/В, GSTP1 В/С и GSTP1 С/С прогнозируют риск развития астенозооспермии. Однако указанный способ дает возможность определить только нарушение подвижности сперматозоидов и не касается морфологии и концентрации.
Вместе с тем известно, что бесплодие развивается не у всех мужчин с ожирением. Одним из возможных факторов, который может объяснить гормональные изменения у мужчин с ожирением, а также различия во влиянии ожирения на конкретного индивидуума, является полиморфизм гена ароматазы, который ответственен за превращение тестостерона в эстрадиол в различных тканях организма, в том числе и жировой ткани (см. обзор литературы в ст. Гамидова С.И и др. в ж. Проблемы репродукции, 2010, N 6, с.79-88). Показано существование полиморфизмов гена ароматазы CYP19A1, который локализуется в хромосоме 15q21.2. Доказано, что у мужчин с большей частотой повторов ТТТА концентрация эстрадиола в сыворотке крови была значительно выше и зависела от веса. Кроме того, показано, что только мужчины с большей частотой повторов ТТТА в гене ароматазы CYP19A1 имеют шанс снижения уровня эстрадиола после похудения (Hammoud A et al. An aromatase polymorphism modulates the relationship between weight and estradiol levels in obese men. Fertil steril; 2009; 10: 37).
M.R. Sowers и соавт. (Sowers M.R. et al. Aromatase gene (CYP 19) polymorphisms and endogenous androgene concentrations in a multiracial/multiethnic, multisite study of women at midlife. Am J Med. 2006 Sep; 119 (9 Suppl 1): S 23-30)) изучали связь полиморфизма гена ароматазы с концентрацией андрогенов у женщин среднего возраста. Проанализированы пять однонуклеотидных полиморфизмов гена ароматазы CYP19A1 (rs2414096, rs936306, rs2446405, rs1008805, rs749292). Три из пяти полиморфизмов были связаны с изменениями концентрации андрогенов. Однако прямая корреляция связи полиморфизмов указанного гена с фертильностью у мужчин с ожирением в литературе не описана.
Задачей настоящего изобретения является поиск критериев прогнозирования риска нарушений фертильности у мужчин с ожирением, в чем и состоит технический результат изобретения.
Патентуемый способ прогнозирования риска нарушений фертильности у мужчин с ожирением включает отбор венозной крови, проведение аллель-специфичной полимеразной цепной реакции с использованием флуоресцентно-меченного олигонуклеотидного зонда и анализа кривой плавления, определение генотипов полиморфизмов rs2414096 и rs749292 гена ароматазы CYP19A, выявление аллеля А полиморфизмов rs2414096 и rs749292, при наличии которого прогнозируют риск нарушения фертильности у мужчин с ожирением.
Для определения роли полиморфизмов гена ароматазы CYP19A1 в развитии бесплодия у мужчин с ожирением было обследовано 85 мужчин с ожирением, которым производилось генетическое исследование. Описание полиморфизмов гена ароматазы CYP19A1 приведено в табл.1.
Таблица 1
Полиморфизмы гена ароматазы CYP19A1
Полиморфизм
Замена
Позиция в хромосоме
Локализация в гене
rs2414096
A>G
15q21.1: 51529779
Интрон
rs749292
A>G
15q21.1: 51558731
Интрон
rs936306
C>Т
15q21.1: 51579598
3'UTR
2
2
Обследованные мужчины с ожирением были разделены на две группы. В основную группу (группа 1) были включены 50 мужчин с ИМТ более 30 кг/м и идиопатической патозооспермией; в контрольную группу (группа 2) были включены 35 фертильных пациентов с ИМТ более 30 кг/м.
Сравнительный анализ пациентов двух групп не выявил статистически достоверных различий в антропометрических показателях, наличии или отсутствии вредных привычек.
Данные, представленные в табл.2, обосновывают наличие связи бесплодия у мужчин с ожирением и присутствием аллеля А полиморфизма rs2414096. У мужчин с ожирением и бесплодием почти в 2 раза чаще, чем у фертильных мужчин, выявляется носительство гомозиготного генотипа АА. Встречаемость аллеля А у бесплодных мужчин составила 60% по сравнению с 42,9% в контрольной группе (p=0,027). Риск развития бесплодия (OR) у мужчин с ожирением при наличии у них аллеля А в геторо- или гомозиготной форме составил 2,0 (95% ДИ: 1,1-3,7).
Таблица 2
Частота полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1
Генотип
Фертильные
Бесплодные
количество
%
количество
%
АА
7
20,00
19
38,00
AG
16
45,70
22
44,00
GG
12
34,30
9
18,00
Частота аллелей
А
30
42,90
60
60,00*
G
40
57,10
40
40,00
Примечание: * - достоверность различия p=0,027.
Аналогичная ассоциация была обнаружена также и для полиморфизма rs749292. У бесплодных мужчин с ожирением гомозиготный генотип АА встречался в 1,7 раз чаще, чем у мужчин контрольной группы (38,0% и 22,9%, соответственно). Риск развития бесплодия при наличии аллеля А полиморфизма rs749292 составил 1,92 (95% ДИ: 1,04-3,55). Данные о частоте полиморфизма rs749292 в группах представлены в табл.3.
Таблица 3
Частота полиморфизма rs749292 гена ароматазы CYP19A1
Генотип
Фертильные
Бесплодные
количество
%
количество
%
АА
8
22,9
19
38
AG
14
40
21
42
GG
13
31,1
10
20
Частота аллелей
А
30
42,9
59
59,0*
G
40
57,1
41
41,0
Примечание: * - достоверность различия p=0,038.
Частота аллелей С и Т полиморфизма rs936306 у бесплодных и фертильных мужчин с ожирением была практически одинаковой: 81,4 и 18,6% у фертильных пациентов и 83,0 и 17,3% у пациентов с идиопатическим бесплодием. Данные о частоте полиморфизма rs936306 в группах представлены в табл.4.
Таблица 4
Частота полиморфизма rs936306 в группах
Генотип
Фертильные
Бесплодные
количество
%
количество
%
СС
23
65,7
35
70
СТ
11
31,4
13
26
ТТ
1
2,9
2
4
Частота аллелей
С
57
81,4
83
83,0
Т
13
18,6
17
17,0
После определения частоты встречаемости полиморфизмов гена ароматазы и их связи с развитием бесплодия у мужчин с ожирением нами проведено сравнение показателей спермограммы и уровня гормонов у пациентов основной группы в зависимости от генотипа полиморфизма гена ароматазы rs2414096 и rs749292, т.е. тех полиморфизмов, для которых была выявлена связь с развитием бесплодия у мужчин с ожирением.
При обследовании пациенты с полиморфизмом rs749292 гена ароматазы CYP19A1 были разделены нами в зависимости от генотипа: генотип АА (19 мужчин), генотип AG (21 мужчина) и генотип GG (10 мужчин).
При математической обработке данных у пациентов с генотипом АА уровни ЛГ, ФСГ и тестостерона были достоверно ниже, чем аналогичные показатели гормонов у пациентов с генотипами AG и GG. Средний уровень эстрадиола оказался выше у пациентов с генотипом АА (p<0,05). Вышеописанные данные представлены в табл.5.
Таблица 5
Уровни гормонов в зависимости от генотипа полиморфизма rs749292 гена ароматазы CYP19A1
Гормон
Генотип АА (N=19)
Генотип AG (N=21)
Генотип GG (N=10)
ЛГ, мЕд/мл
2,8±0,2*
4,0±0,3
4,9±0,5
ФСГ, мЕд/мл
3,1±0,3*
6,1±0,5
6,0±0,7
ТТГ, мЕд/л
2,4±0,2
2,0±0,2
1,9±0,3
Тироксин, нмоль/л
96,1±4,8
103,8±4,3
93,8±6,8
Эстрадиол, пмоль/л
134,9±3,7*
97,2±4,4
86,8±5,2
Прогестерон, нмоль/л
1,4±0,1
1,3±0,1
1,2±0,2
Пролактин, мЕд/л
253,4±25,9
244,7±21,9
222,6±26,5
Тестостерон, нмоль/л
11,1±0,7*
17,2±0,9
20,1±1,0
Кортизол, нмоль/л
305,6±28,2
352,0±30,0
388,5±37,3
Лептин, нг/мл
13,6±1,3
12,6±1,0
10,5±1,2
Примечание: * - p<0,05 при сравнении показателей гормонов у пациентов в зависимости от генотипа полиморфизма rs749292 гена ароматазы CYP19A1.
При анализе особенностей показателей спермограммы у мужчин с ожирением и идиопатической патозооспермией в зависимости от генотипа полиморфизма rs749292 гена ароматазы CYP19A1 были обнаружены следующие особенности. Все три группы были сопоставимы по объему эякулята и подвижности сперматозоидов (p>0,05). В то же время, концентрация сперматозоидов у мужчин с генотипом АА была достоверно ниже, чем у мужчин с генотипом GG, а показатели концентрации сперматозоидов у мужчин с генотипом AG являлись промежуточными. Аналогичная ситуация была отмечена при анализе количества нормальных форм сперматозоидов - 14,1±1,3% и 20,8±2,5% соответственно (p<0,05) (см. табл.6).
Таблица 6
Показатели спермограммы в зависимости от генотипа полиморфизма гена ароматазы rs749292
Показатели спермограммы
Генотип АА (N=19)
Генотип AG (N=21)
Генотип GG (N=10)
Объем эякулята, мл
3,2±0,2
2,9±0,2
2,6±0,2
Концентрация сперматозоидов, млн/мл
34,8±7,9
42,3±8,3
46,8±9,1*
Подвижность категория А, %
11,2±1,1
12,7±1,2
13,5±1,5
Подвижность категория А+В, %
26,7±2,0
30,1±2,1
31,5±3,2
Морфология, %
14,1±1,3
18,3±2,1
20,8±2,5*
Примечание: * - p<0,05 при сравнении генотипов АА и GG полиморфизма rs749292 гена ароматазы CYP19A1.
При оценке гормонального профиля у мужчин с идиопатической патозооспермией и ожирением, в зависимости от генотипа полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1, получены результаты, которые представлены в табл.7.
Таблица 7
Уровни гормонов в зависимости от генотипа полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1
Гормон
Генотип АА (N=19)
Генотип AG (N=22)
Генотип GG (N=9)
ЛГ, мЕд/мл
2,5±0,2*
4,3±0,2
4,7±0,6
ФСГ, мЕд/мл
2,5±0,2*
6,4±0,4
6,1±0,8
ТТГ, мЕд/л
2,3±0,2
2,2±0,2
1,8±0,3
Тироксин, нмоль/л
98,9±4,8
99,6±4,4
96,9±7,0
Эстрадиол, пмоль/л
137,9±2,8*
96,9±3,7
84,8±6,4
Прогестерон, нмоль/л
1,4±0,1
1,4±0,1
1,2±0,2
Пролактин, мЕд/л
255,4±27,5
242,4±20,5
223,3±27,3
Тестостерон, нмоль/л
11,2±0,8*
17,0±0,9
20,1±1,3
Кортизол, нмоль/л
318,5±30,0
342,8±27,3
386,7±42,9
Лептин, нг/мл
14,5±1,3
11,4±0,9
11,7±1,3
Примечание: * - p<0,05 при сравнении генотипов АА с генотипами AG и GG полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1
При математической обработке данных у пациентов с генотипом АА уровни ЛГ, ФСГ и тестостерона были достоверно ниже, чем аналогичные показатели гормонов у пациентов с генотипами AG и GG. Средний уровень эстрадиола оказался выше у пациентов с генотипом АА (р<0,05).
Данные спермиологического исследования при анализе влияния генотипа полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1 представлены в табл.8.
Таблица 8
Показатели спермограммы в зависимости от генотипа полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1
Показатели спермограммы
Генотип АА (N=19)
Генотип AG (N=22)
Генотип GG (N=9)
Объем эякулята, мл
3,2±0,2
2,8±0,2
2,8±0,3
Концентрация сперматозоидов, млн/мл
38,3±6,7
42,9±8,4
52,5±12,6*
Подвижность сперматозоидов (категория А), %
11,0±1,0
12,1±1,5
14,3±1,1
Подвижность сперматозоидов (категория А+В), %
25,0±1,9
27,1±2,3
33,3±2,2*
Морфология, %
13,0±1,2
18,0±1,2
23,2±4,2 **
Примечание: * - p<0,05 при сравнении генотипов АА и GG полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1;
** - p<0,05 при сравнении генотипа АА с генотипами AG и GG полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1.
У пациентов с генотипом АА этих полиморфизмов уровни ЛГ, ФСГ и тестостерона достоверно выше, чем у мужчин с генотипами AG и GG. Одновременно с этим, у мужчин с генотипом АА отмечаются более высокие показатели эстрадиола.
При оценке показателей спермограммы у пациентов с гомозиготной формой полиморфизмов гена ароматазы rs2414096 и rs749292 отмечается снижение концентрации сперматозоидов и количества сперматозоидов с активной подвижностью (категория А и А+В) в эякуляте. Кроме этого, у пациентов с генотипом АА полиморфизма гена ароматазы rs2414096 достоверно ниже содержание в эякуляте количества сперматозоидов с нормальным строением (морфология).
При наличии генотипа АА полиморфизмов rs2414096 и rs749292 гена ароматазы CYP19A1 происходит более активная ароматизация тестостерона в эстрадиол, что приводит к относительному снижению концентрации тестостерона и соответствующему повышению уровня эстрадиола, что в свою очередь приводит к снижению ФСГ и ЛГ, при этом замыкается порочный круг, так как снижение концентрации ЛГ уменьшает выработку тестостерона клетками Лейдига. Эти гормональные сдвиги и приводят к снижению сперматогенеза, особенности изменения которого описаны выше.
Таким образом, представленные экспериментальные данные доказывают достижение технического результата: выявлена связь бесплодия у мужчин с ожирением с присутствием аллеля А полиморфизмов rs749292 и rs2414096, которая может использоваться в качестве прогностического критерия риска нарушений фертильности у мужчин с ожирением.