Исследование физико-химических свойств фермента глутатионпероксидазы типа i и его комплексов с полиэлектролитами как перспективных агентов для лечения заболеваний центральной нервной системы

УДК 577.152.193

ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТА ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ ТИПА I И ЕГО КОМПЛЕКСОВ С ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМИ КАК ПЕРСПЕКТИВНЫХ АГЕНТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ И.С. Панина, Л.Ю. Филатова, А.В. Кабанов, Н.Л. Клячко

Проведено исследование кинетики термоинактивации глутатионпероксидазы типа I -фермента, играющего ключевую роль в системе антиоксидантной защиты организма. Показано, что при температуре 37°С олигомерная глутатионпероксидаза инактивируется по мономолекулярному механизму. Предложен эффективный способ стабилизации фермента при помощи полиэлектролитов разной природы.

Ключевые слова: активные формы кислорода, глутатионпероксидаза, полиэлектролит, кинетика инактивации, стабилизация.

Окислительные процессы, протекающие в организме с участием активных форм кислорода (АФК), привлекают в последние годы все возрастающий интерес ученых. АФК - это высоко реакционно-способные химические частицы, такие как содержащие кислород свободные радикалы (О2-*, НО2*, НО*, NO*, ROO*) и молекулы, способные легко продуцировать свободные радикалы (H2O2, ROOH, ROOR). АФК повреждают многие биомолекулы за счет неспецифического окисления и инициирования цепных реакций. Избыточная активация реакций свободнорадикаль-ного окисления встречается при самых различных заболеваниях (атеросклероз, болезни Паркинсона и Альцгеймера, диабет, катаракта, онкологические заболевания, преждевременное старение) [1].

В защите от АФК в организме участвуют ферментные системы и низкомолекулярные соединения. Низкомолекулярные антиоксиданты окисляются активными формами кислорода, но они не предотвращают образование АФК, а лишь борются с негативными последствиями [2].

Более эффективной является ферментативная система антиоксидантной защиты организма. Супер-ок-сиддисмутаза, каталаза и глутатионпероксидаза - важнейшие антиоксидантные ферменты, необходимые для нормальной жизнедеятельности организмов млекопитающих [3-7]. Глутатионпероксидаза катализирует процесс разложения пероксида водорода и органических перекисей с одновременным окислением глутатиона, что и придает этому ферменту первооче-

редное значение в антиоксидатной защите организма [8, 9].

В связи с этим актуальной становится разработка методик получения высокоэффективных и стабильных антиоксидантных препаратов на основе глутатионеперокисдазы для лечения и профилактики заболеваний центральной нервной системы и других опасных поражений организма. Цель настоящей работы - разработка методик получения стабильных препаратов на основе фермента глутатионпероксидазы I.

Материалы и методы

Материалы. Для измерения активности глутати-онпероксидазы использовали препарат фермента из эритроцитов быка (лиофилизированный порошок, активность 713 ед./мг белка), глутатионредуктазу (ГР) из пекарских дрожжей (суспензия в 3,6 М (NH4)2SO4 (pH 7,0), содержащая 0,1 мМ дитиотрейтола), восстановленный глутатион ("SH) и никотинамид аденин динуклеотид фосфат (НАДФН), все фирмы «Sigma», перекись водорода фирмы «Chemapol». Для приготовления буферного растовора, в котором проводили измерение активности, использовали этилендиамин-тетрауксусную кислоту (ЭДТА), дигидрофосфат калия, гидроксид калия фирмы «Sigma-Aldrich», соляную кислоту фирмы «Реахим».

В качестве добавок к глутатионпероксидазе выбрали следующие полимеры: блок-сополимер поли-этиленгликоля с полилизином (молекулярная масса

9,9 кДа, 30 первичных аминогрупп, ПЛ-ПЭГ) и блок-сополимер полиэтиленгликоля с полиэтиленимином (молекулярная масса 12,6 кДа, 48 первичных аминогрупп, ПЭИ-ПЭГ) фирмы «Alamanda Polymers» (США); полиакриловые кислоты (молекулярной массой 5,1 и 240 кДа, ПАК) фирмы «Aldrich».

Реактивы, используемые для проведения электрофореза: акриламид и Н,Н'-метилен-бисакриламид фирмы «Диа М» (Россия); тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) и персульфат аммония фирмы «Helicon» (Россия); Трис, глицин, додецилсульфат натрия и бриллиантовый синий фирмы «Sigma».

Методы

Измерение активности глутатионпероксидазы. Активность препарата глутатионпероксидазы определяли спектрофотометрически по убыли поглощения окисленной формы никотинамид аденин дину-клеотид фосфата при длине волны 340 нм по методу [10].

В кварцевую кювету вносили 1 мл калий-фосфатного буфера (0,5 М KH2PO4 с pH 7,0, содержащий 0,5 мМ ЭДТА), 10 мкл 0,0084 М НАДФН, 10 мкл 0,15 М Г-SH, 3 мкл глутатионредуктазы (2,2 мг/мл), 1,5 мкл 0,136 М H2O2. Реакцию инициировали добавлением 5-8 мкл раствора глутатионпероксидазы (0,3 и 1 мг/мл) и регистрировали изменение оптической плотности при длине волны X = 340 нм и 37°С.

Измерение точной концентрации исходных растворов перекиси водорода проводили спектрофо-тометрически при длине волны 240 нм (коэффициент молярной экстинкции е240 принимали равным 46,3 М-1см-1). Полученные результаты обсчитывали методом линейной регрессии с помощью программы Microsoft Excel.

Исследование стабильности глутатионпе-роксидазы при 37°С проводили спектрофотометри-ческим методом, путем отбора аликвот через фиксированные промежутки времени с последующим измерением активности в стандартных условиях.

Нативный электрофорез препаратов глутатионпероксидазы проводили по методике Bio-Rad [11].

Получение препаратов глутатионпероксидазы, содержащих полиэлектролиты и блок-сополимеры. Полиэлектролиты (блок-сополимер полилизина и по-лиэтиленгликоля, блок-сополимер полиэтеленимина и полиэтиленгликоля, полиакриловые кислоты) растворяли в 0,02 М калий-фосфатном буфере (КФБ) с рН 7,0.

К растворам фермента (0,6 и 2,0 мг/мл) в этом же буфере, добавляли равные объемы растворов полиэлектролитов в 1-, 10- и 100-кратном молярном из-

бытке. Полученные растворы оставляли на разные промежутки времени (1, 12 ч или 1 сут) при температуре 4°С для образования комплексов.

Исследование активности и стабильности препаратов глутатионпероксидазы с полиэлектролитами и блок-сополимерами. Активность и стабильность препаратов глутатионпероксидазы с полиэлектролитами и блок-сополимерами определяли спекторофотометрически, по описанным выше методикам, сравнивая полученные значения со значениями для фермента без добавок.

Исследование образцов глутатионпероксидазы методом динамического рассеяния света. За изменением размера частиц глутатионпероксидазы в процессе инкубации при 37°С следили при помощи анализатора размеров частиц «Zetasizer Nano». Для этого растворы фермента (концентрацией 0,3 и 1,0 мг/мл) в калий-фосфатном буфере (0,02 М КН2РО4, рН 7,0) пропускали через фильтры «Millipore» с диаметром пор

0.22 мкм с последующим термостатированием при 37°С и измерением размеров частиц через определенные промежутки времени. Аналогичным образом проводили измерение размеров частиц глутатионперокси-дазы в смесях с полимерами.

Результаты и их обсуждение

Нестабильность ферментов при повышенных температурах - один из факторов, препятствующих применению этих активных биокатализаторов. Среди множества факторов, влияющих на активность и стабильность ферментов, можно выделить такие, как специфические свойства самого фермента, рН среды и состав буферного раствора, температура и давление, присутствие активаторов или ингибиторов (в том числе и катионов некоторых металлов). Рассмотрим более подробно влияние некоторых из перечисленных факторов на стабильность глутатионпероксидазы типа I.

Глутатионпероксидаза представляет собой тетрамер, состоящий из четырех нековалентно связанных идентичных субъединиц [12, 13]. Мономер представляет собой полипептидную цепь, состоящую из 178 аминокислотных остатков и содержащую остаток селеноци-стеина, который принимает участие в катализе [12]. Из литературных данных известно, что значение рН, оптимальное для функционирования глутатионпероксидазы

1, равно 7,0 [8]. Именно при этом значении рН были исследованы кинетические закономерности инактивации фермента, которые в литературе не описаны.

Кривые инактивации глутатионпероксидазы в полулогарифмических координатах приведены на рис. 1,

Время, ч

Рис. 1. Термоинактивация глутатионпероксида-зы при концентрации фермента, мг/мл: 1 - 0,3;

2 - 1

из которого видно, что инактивация фермента протекает по первому порядку с константой инактивации, равной 0,027±0,002 ч-1.

Для более детального понимания процесса инактивации глутатионпероксидазы растворы фермента с разной степенью инактивации были исследованы физико-химическими методами нативного электрофореза и динамического рассеяния света, а также добавлением низкомолекулярного агента. Методом нативного электрофореза показано, что молекулярная масса фермента в процессе инактивации не изменяется. Величина эффективного гидродинамического радиуса неинактивированной глутатионпероксидазы при концентрации фермента 0,3 и 1,0 мг/мл составляет величину порядка 4 нм, в процессе инактивации при 37°С существенного изменения размеров частиц не происходит. Таким образом, исходя из вышеприведенных данных, можно сделать вывод о том, что процессы агрегации/диссоциации не являются причиной инактивации глутатионпероксидазы.

В литературе [14] показано, что взаимодействие между 8ес35 и Су891 приводит к необратимой инактивации фермента. Для проверки данной гипотезы растворы фермента инкубировали в присутствии ДТТ при 37°С и рН 7,0. Добавление в раствор глута-тионпероксидазы ДТТ до конечной концентрации 10 мМ с последующим инкубированием при комнатной температуре в течение 10 мин не вызывает изменения активности фермента в пределах погрешности эксперимента. Однако через 1 сут инкубирования при 37°С остаточная активность фермента в присутствии ДТТ равна нулю, в то время как фермент без

ДТТ сохраняет порядка 50% активности. Следовательно, образование мостика -8-8е- может являться одной из возможных причин инактивации глутати-онпероксидазы.

Таким образом, возможными причинами инактивации глутатионпероксидазы в физиологических условиях являются конформационные изменения молекулы фермента и окисление селеноцистеина активного центра, соответствующие кинетике первого порядка.

Известно, что добавление полиэлектролитов является хорошим способом подавления как окисления ответственных за катализ групп, так и информационных изменений белковых глобул.

В качестве полиэлектролитов были использованы полиакриловые кислоты массой 5,1 и 240 кДа, блок-сополимер полилизина и полиэтиленгликоля массой 9,9 кДа и блок-сополимер полиэтиленимина и поли-этиленгликоля массой 12,6 кДа, содержащий 48 первичных аминогрупп на одну молекулу.

Известно, что на поверхностях белковых глобул имеются положительно и отрицательно заряженные участки, с которыми и могут взаимодействовать молекулы положительно и отрицательно заряженных полимеров. Количественной мерой процесса инактивации глутатионпероксидазы в присутствии полиэлектролитов было принято значение константы инактивации, которое сравнивали с соответствующими величинами для индивидуального фермента при прочих равных условиях.

Установлено, что в присутствии 1-, 10- и 100-кратных избытков указанных выше полимеров инактивация фермента протекает по первому порядку. Величины констант инактивации первого порядка индивидуальной глутатионпероксидазы и фермента в присутствии полиэлектролитов приведены в таблице, где показано, что значения констант инактивации при молярном соотношении ПЛ-ПЭГ: фермент, равном 1:1 и молярных соотношениях ПЭИ-ПЭГ: фермент в интервале 1:1-1:10 фактически эквивалентны величине этого параметра для индивидуальной глутатионпероксидазы. Значения констант инактивации существенно возрастают с увеличением мольных соотношений ПЛ-ПЭГ:фермент до 10:1-100:1, а ПЭИ-ПЭГ:фермент до 100:1.

Отрицательно заряженные группы аспарагино-вой и глутаминовой кислот молекулы фермента и отрицательно заряженные группы фрагментов полилизина и полиэтиленимина молекул блок-сополимеров взаимно притягиваются, что приводит

Количественные параметры инактивации глутатионпероксидазы в присутствии полимеров при 37°С и рН 7,0

Полиэлектролит Полиэлектролит: фермент, моль/моль Коэффициент инактивации, ч-1

1 0,021±0,006

ПЭИ-ПЭГ (12,6 кДа) 10 0,052±0,016

100 0,053±0,015

1 0,023±0,003

ПЛ-ПЭГ (9,9 кДа) 10 0,025±0,002

100 0,037±0,005

1 0,022±0,002

ПАК (5,1 кДа) 10 0,022±0,001

100 0,021±0,001

ПАК (240 кДа) 1 0,027±0,001

10 0,079±0,001

Фермент 0 0,027±0,002

ПЭИ-ПЭГ: фермент от 1:1 до 10:1 не наблюдается потери ферментом активности, при молярном соотношении 100:1 глутатионпероксидаза сохраняет около 60% своей первоначальной активности.

Что касается влияния полиакриловых кислот на активность глутатионпероксидазы, то при мольных соотношениях ПАК51 кда:фермент от 1:1 до 100:1 глутатионпероксидаза сохраняет 80-100% началь-

к образованию фермент-полиэлектролитных комплексов. Незаряженные фрагменты полиэтиленгли-коля покрывают образующиеся частицы и нивелируют токсическое действие фрагментов полилизина и полиэтиленимина. По-видимому, именно катион-ные фрагменты блок-сополимеров оказывают денатурирующее действие на фермент, что проявляется в возрастании значений констант инактивации при высоких мольных соотношениях полимер/фермент.

Отрицательно заряженная полиакриловая кислота массой 5,1 кДа в отличие от положительно заряженных блок-сополимеров оказывает стабилизирующее действие на глутатионпероксидазу: наблюдается снижение значения константы инактивации первого порядка с 0,027 ч 1 до приблизительно 0,022 ч-1. Величина констатны инактивации фермента в присутствии полиакриловой кислоты понижается приблизительно на 20% и не зависит от мольного соотношения полимер: фермент в диапазоне от 1:1 до 100:1. В присутствии полиакриловой кислоты существенно более высокой молекулярной массы (240 кДа) происходит дестабилизация фермента, что проявляется в увеличении среднего значения кон-статны инактивации первого порядка в 3 раза.

На начальную активность глутатионпероксидазы блок-сополимер полилизина и полиэтиленгликоля практически не влияет при мольных соотношениях полимера и фермента, не превышающих 100:1 (рис. 2). При увеличении молярного соотношения

Рис. 2. Влияние блок сополимеров ПЛ-ПЭГ и ПЭИ-ПЭГ на активность фермента при рН 7,0 и 37°С

Рис. 3. Влияние полиакриловых кислот на активность фермента при рН 7,0 и 37°С

ной активности. При увеличении мольного соотношения ПАК240 фермент от 1:1 до 50:1 происходит снижение активности глутатионпероксидазы от 80 до 5% от начальной активности фермента (рис. 3).

Методом динамического светорассеяния показано, что значение эффективного гидродинамичесого радиуса (Rh) для молекулы глутатионпероксидазы составляет величину порядка 4 нм, для полиэлектролитов величина Rh эквивалентна 2-4 нм. В условиях, когда наблюдается стабилизационный эффект (при взаимодействии ГП с полиакриловыми кислотами), происходит укрупнение частиц до значения эффективного гидродинамического радиуса порядка 50 нм, что свидетельствует о возможном достижении стабилизационного эффекта за счет комплексообразования.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Sies H., Helmut M. // Exper. phys. 1997. 82. P. 291.

2. Скулачев В.П. // Сорос. Образов. Жур. 1996. 3. C. 4.

3. Mills G. // Arch. of Biochem. Biophys. 1960. 86. P. 1.

4. Nagababu E., Chrest F., Rifkind J. // Biochim. Biophys. Acta. 2003. 25. C. 1.

5. Rotruck J., Pope A. // Science. 1973. 179. P. 588.

6. Flohe R. // Free Rad. Biol. Med. 1999. 27. P. 951.

7. Arthur J. // CMLS Cell. Mol. Life Sci. 2000. 57. P. 1825.

8. Оковитый С.В. // ФАРМинд.-практ. 2003. 5. C. 85.

9. Muller F., Lustgarten M., Jang Y. // Free Radic. Biol. Med. 2007. 43. P. 477.

Таким образом, выдвинуто предположение, что инактивация глутатионпероксидазы при 37°С протекает за счет окисления селеноцистеина и конформа-ционных изменений в молекуле.

Исследовано влияние на стабильность глутати-онпероксидазы полимеров катионной и анионной природы (блок-сополимеров полилизина и поли-этиленгликоля а также полиэтиленимина и поли-этиленгликоля, полиакриловых кислот с разной молекулярной массой (5,1 и 240 кДа). Обнаружен стабилизационный эффект полиакриловой кислоты массой 5,1 кДа.

Подобраны условия, при которых полиакриловая кислота оказывает максимальное стабилизирующее действие (без потери активности) на глутатионпе-роксидазу за счет формирования комплексов.

10. Koller L., South P., Exon J., Whitbeck G. II Can. J. Comp. Med. 1984. 48. P. 431.

11. Ячейка для электрофореза Mini-PROTEAN Tetra. Инструкция по эксплуатации», C. 14.

12. Miwa S., Nakashima K., Ariyoshi E. II J. Haem. l. 1975. 29. P. 157.

13. Toppo S., Flohe L., Ursini F. II Biochem. et biophys. Acta. 2009. 1790. P. 1486.

14. Asahi M., Fujii J., Takao Т. II J. Biol. Chem. 1997. 272. P. 19152.

Поступила в редакцию 30.01.13

INVESTIGATION OF PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF BOTH GLUTATHIONE EROXIDASE I AND ITS COMPLEXES WITH POLYELECTROLYTES AS PROMISING AGENTS FOR THE TREATMENT OF CENTRAL NERVOUS SYSTEM DISEASES

I.S. Panina, L.Y. Filatova, A.V. Kabanov, N.L. Klyachko

A study of kinetics of thermal inactivation of glutathione peroxidase I was carried out. Glutathione peroxidase is an enzyme that plays a key role in the antioxidant protection system of the body. It was shown that oligomeric glutathione peroxidase I is inactivated by monomolecular mechanism (37°C, pH 7.0, the enzyme concentrations of 0.3 and 1 mg/ml). An effective way to stabilize the enzyme by polyelectrolytes of different nature was proposed.

Key words: active forms of oxygen, glutathione peroxidase I, polyelectrolyte, kinetic of inactivation, stabilization.

Сведения об авторах: Панина Ирина Сергеевна - студентка кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ (irinaspanina@gmail.com); Филатова Любовь Юрьевна - науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (luboff.filatova@gmail. com); Кабанов Александр Викторович - зав. лабораторией кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ; директор Центра нанотехнологий и доставки лекарств Университета Северной Каролины (США), докт. хим. наук (skabanov@me.com); Клячко Наталья Львовна - профессор кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, докт. хим. наук (nlklyachko@gmail.com).