Идентификация распространенных в Беларуси бактериофагов лактококков

ИДЕНТИФИКАЦИЯ РАСПРОСТРАНЕННЫХ В БЕЛАРУСИ БАКТЕРИОФАГОВ ЛАКТОКОККОВ

А.П. Райский

В работе представлены результаты идентификации с помощью мультиплекс-ПЦР-анализа и трансмиссионной электронной микроскопии коллекционных бактериофагов, выделенных из молочнокислых продуктов, произведенных на молочных комбинатах, расположенных в различных регионах Республики Беларусь.

Введение

Вирусы бактерий рода ЬаМососст представляют собой весьма обширную и достаточно хорошо изученную группу вирулентных и умеренных фагов. Эти микроорганизмы вызывают постоянный интерес исследователей, прежде всего, из-за экономических издержек, которые несут предприятия молочной промышленности в результате развития фаговой инфекции. Поскольку в производстве ферментированных молочных продуктов чаще других используют молочнокислые бактерии Ьас^сосст lactis, то и фаги, вирулентные по отношению к данным бактериям, распространены на молочных комбинатах наиболее широко. По оценкам зарубежных авторов, до двух третей всех процессов ферментации осуществляется молочнокислыми бактериями Ьа^ососст 1ас-tis [1], и именно лактофаги являются причиной большинства неудачных технологических процессов в производстве кисломолочных продуктов как в Республике Беларусь, так и в странах ближнего и дальнего зарубежья [2].

В настоящее время выделены и охарактеризованы сотни фагов лактококков. Они классифицированы в десять видов по результатам ДНК-ДНК гибридизации, согласно особенностям морфологии вирионов, выявленных с помощью электронной микроскопии, а также по данным сравнительного анализа геномов. Однако на молочных комбинатах чаще всего встречаются только лактофаги трех видов: с2, 936 и Р335. Представители этих трех видов принадлежат к семейству Siphoviridae (имеют двухцепочечную ДНК и длинный несокращающийся хвост) отряда Caudovirales.

Во Франции, Германии, Новой Зеландии и Канаде, согласно литературным данным, доминирующими являются лактофаги вида 936 [1]. Представителей вида с2 наиболее часто обнаруживали на территории России, а представителей вида Р335 выявляли в течение последних 20 лет в США, Дании и Новой Зеландии [3].

В данной работе представлены результаты идентификации лактофагов, широко распространенных на молочных комбинатах Республики Беларусь.

Объекты и методы исследования.

В работе использовали вирулентные лактофаги, выделенные из кисломолочных продуктов производства различных предприятий Республики Беларусь. Фаги титровали на чувствительных тест-культурах Lactococcus lactis из коллекции кафедры биотехнологии и биоэкологии БГТУ.

Получение фаголизатов с высоким титром осуществляли в жидкой среде М17 в присутствии 0,5% глюкозы и 5 мМ СаС12.

Микроскопические исследования проводили с помощью трансмиссионного электронного микроскопа марки 1БМ-300. Пробы готовили следующим образом. Фаги концентрировали центрифугированием при 36600 g в течение 40 мин при 4°С. Отмывали в 1 мл 0,1М растворе ацетата аммония. Повторно центрифугировали и ресуспендировали в 15 мкл ацетата аммония. На пленки-подложки наносили 10 мкл суспензии фагов. Через

1 мин удаляли с пленки фаговую суспензию и наносили 10 мкл 2%-го раствора фосфор-но-вольфрамовой кислоты. Выдерживали 1 мин, удаляли раствор и высушивали.

ПЦР-анализ фаговых лизатов осуществляли в объеме 50 мл, содержащем 1 цмоль/л каждого из трех пар праймеров, специфичных по отношению к фагам групп с2, 936 и Р335; 1,25 U Taq-полимеразы ДНК («Fermentas», Литва), Taq-буфер 1х и 1 мкл лизата (Т=108 БОЕ/мл). В качестве контроля вместо лизата в рабочую смесь вносили 1 мкл стерильной среды М17. Амплификацию осуществляли в термоциклере «Терцик» при следующих режимах: 3 мин при 94°C, 35 циклов по 30 с при 94°C, 1 мин при 50°С и 1 мин при 72°С, последний шаг - 7 мин при 72°С. ПЦР-продукты разделяли с использованием 1,5% агарозного геля в ТАЕ буфере, окрашивали бромистым этидием и визуализировали в УФ (Х=280 нм).

Результаты и обсуждение

Одним из основных критериев идентификации бактериофагов лактококков является морфология их вирионов. С помощью трансмиссионной электронной микроскопии (TEM) исследованы вирионы 23 бактериофагов, вирулентных по отношению к бактериям Lactococcus lactis. В результате среди исследуемой выборки выделены три группы фагов, представители которых различаются по морфологии вирионов. На рис. 1 приведены фотографии трех типичных по морфологии фагов, а в табл. 1 - распределение всей коллекции по видам.

V шШ* 0

а б в

Рис. 1. Электронные микрофотографии лактофагов: а - БИМ БУ-27

В некоторых случаях на основании одних только морфологических признаков не удается идентифицировать лактофаги [4]. Labrie и Moineau [5] предложили для этих целей использовать еще один критерий - различия в размерах продуктов амплификации уникальных нуклеотидных последовательностей при ПЦР-анализе со специфическими олигонуклеотидами.

В данной работе для детекции уникальных последовательностей ДНК коллекционных фагов использовали метод мультиплексной ПИР Праймерами служили следующие последовательности:

• для фагов вида с2 5' CAATCGAAGCAGGTGTAAAAGTTCGAGAAC 3', 5' GCTTTATCCATTTGTAGGTATGCTTCTGC 3';

• для фагов вида 936 5' ATCAGTTGGCTCAATGGAAGACCAAGCGG 3', 5' GTTGCTTCTGCTGTTGGTGTCAAATGAGGA 3';

• для фагов группы Р335: 5' GAAGCTAGGCGAATCAGTAAACTTGCTAG 3', 5' CGGCTATCTCGTCAATTGTTCCGGTTGC 3'.

Отжиг олигонуклеотидных праймеров с ДНК фагов вида с2 должен приводить к появлению ампликона размером 444 п.н., вида 936 - 318 п.н., вида Р335 - 196 п.н.

ДНК всех коллекционных фагов исследовали в ходе ПЦР-анализа с указанными праймерами. Результаты одного из подобных экспериментов приведены на рис. 2.

Фаги Принадлежность к виду согласно данным:

ТЕМ ПЦР

БИМ БУ-25 c2 c2

БИМ БУ-26 c2 c2

БИМ БУ-27 936 936

Е04 c2 c2

БИМ БУ-28 c2 c2

БИМ БУ-29 c2 c2

БИМ БУ-30 936 936

БИМ БУ-31 936 c2

БИМ БУ-32 P034 c2

БИМ БУ-33 c2 c2

Е11 936 936

Е12 c2 c2

БИМ БУ-34 c2 c2

Е14 c2 c2

Е15 P034 -

БИМ БУ-35 c2 c2

БИМ БУ-36 c2 c2

Е18 c2 c2

БИМ БУ-37 P034 -

БИМ БУ-38 c2 c2

БИМ БУ-39 c2 c2

БИМ БУ-40 c2 c2

БИМ БУ-41 P034 -

Таблица 1. Результаты видовой идентификации лактофагов

1 23 4 5 6 7 8 910 11 12

Рис. 2. Продукты ПЦР-анализа ДНК коллекционных лактофагов. 1, 12 - маркер, 2 - БИМ БУ-29, 3 - БИМ БУ-37, 4 - БИМ БУ-41, 5 - E14, 6 - E18, 7 - БИМ БУ-27, 8 - БИМ БУ-31, 9 - БИМ БУ-33, 10 - БИМ БУ-38, 11 - контроль

Оказалось, что среди 23 изолятов 17 относятся к виду с2 и 3 изолята - к виду 936. Для трех фагов ампликоны не были выявлены. Также не было обнаружено ампликонов размером 196 п.н., типичных для фагов вида Р335.

Однако ПЦР-анализ ДНК бактерий Ь. 1аей5 позволил обнаружить характерные ампликоны размером 196 п.н. для трех из 30 исследованных штаммов. Результаты одного из экспериментов представлены на рис. 3. Это может свидетельствовать о присутствии профагов вида Р335 в ДНК исследованных заквасочных бактерий.

Рис. 3. Продукты ПЦР-анализа ДНК коллекционных штаммов бактерий L. ¡actis. 1, 12 - 100 b маркер, 2 - контроль (не содержит образца ДНК), 3 - 180, 4 - 400/6, 5 - 110/1, 6 - 313/1, 7 - 402/1, 8 - 415, 9 - 411, 10 - 111/2, 11 - 404/2

Для индукции профагов из лизогенных бактерий L. lactis использовали полупроводниковые фотокатализаторы на основе TiO2, на поверхности частиц которых при воздействии УФ (Х=365 нм) образуются радикальные формы кислорода (OH, O2", O2H) и пероксид водорода. Эти активные формы кислорода, которые генерируются под действием фотоэлектронов и фотодырок, взаимодействуют с различными клеточными структурами. В частности, они могут нарушать целостность мембран, инактиви-ровать молекулы белков и нуклеиновых кислот и, таким образом, обеспечить индукцию профагов к литическому циклу.

В табл. 2 отражены результаты эксперимента по выявлению среди коллекционных лактококков лизогенных бактерий при воздействии УФ-облучения (Х=365 нм) в присутствии фотокатализатора (TiO2). Длительность облучения составляла 2 мин. Контролем служили аналогичным образом обработанные суспензии, где вместо двуокиси титана присутствовало балластное вещество (SiO2).

Культура Исходная концентрация клеток, КОЕ/мл Концентрация клеток (КОЕ/мл) после УФ-облучения (Х=365 нм) Концентрация фаговых частиц в облученных суспензиях (БОЕ/мл) в присутствии

TiO2 SiO2

L. lactis 411 1,2-109 4,3-108 2,3-102 0

L. lactis 415 1,4-109 6,7-108 1,1-102 0

Таблица 2. Концентрация клеток и индукция профагов после действия УФ-облучения (А=365 нм) в присутствии фотокатализатора ТЮ2

Полученные данные свидетельствуют о наличии полноценных фагов в составе геномов молочнокислых бактерий.

Для 18-ти коллекционных лактофагов результаты идентификации по данным морфологических исследований совпали с данными идентификации с помощью ПЦР-анализа. Для двух фагов (БИМ БУ-31 и БИМ БУ-32) результаты идентификации по двум использованным критериям носят противоречивый характер (табл. 1). Данное обстоятельство может являться следствием высокой вариабельности признаков лактофа-гов. Подобные фаги, сочетающие свойства представителей двух видов, описаны в литературе [4].

Сопоставление данных по морфологии вирионов и размерам ампликонов уникальных последовательностей ДНК позволяет констатировать, что состав группы лактофагов, наиболее широко представленных в кисломолочных продуктах производства Республики Беларусь, имеет свои особенности: в нем очевидно преобладание фагов с удлиненной головкой (с2) и достаточно высоко относительное содержание фагов с короткими отростками (Р034). Согласно литературным данным [1, 6], фаголизис на производстве в большинстве случаев вызывают фаги с изометрической головкой, принадлежащие к виду 936 - они составляют обычно до половины всех изолятов; четверть изолятов относится к виду с2, а оставшаяся четверть - к гетерогенному виду Р335, чьи представители характеризуются маленькой изометрической головкой и могут быть как вирулентными, так и умеренными; фаги семейства Podoviridae обусловливают фаголи-зис редко.

Заключение

С привлечением мультиплексного ПЦР-анализа и трансмиссионной электронной микроскопии осуществлена идентификация бактериофагов лактококков, выделенных на территории Республики Беларусь. На основании полученных данных 74% изученных фаговых изолятов отнесены к группе с2, 13% - к группе 936. В ходе амплификации ДНК трех фагов не выявлено специфических фрагментов. Исследование морфологии вирио-нов позволило отнести их к группе фагов р034. Умеренные бактериофаги группы Р335 выявлены в ДНК 10% проанализированных заквасочных штаммов.

Литература

1. Brussow H. Phages of dairy bacteria // Annu. Rev. Microbiol. - 2001. - Уо1. 55 - P. 283303.

2. Szczepanska A.K., Hejnowicz M.S., Kolakowski P., Bardowski J. Biodiversity of Lacto-coccus lactis bacteriophages in Polish dairy environment // Acta Biochimica Polonica. -2007. - Vo1. 54. - P. 151-158.

3. Jarvis A.W., Fitzgerald G.F., Mata M., Mercenier A., Neve H., Powell I.B., Ronda C., Saxelin M., Teuber M. Species and type phages of lactococcal bacteriophages // Intervi-rology, - 1991. - Vo1.32. - P. 2-9.

4. Fortier L., Bransi A., Moineau S. Genome sequence and global gene expression of Q54, a new phage species linking the 936 and c2 phage species of Lactococcus lactis // Journal of Bacteriology. - 2000. - Vo1. 188. № 17. - P. 6101-6114.

5. Labrie S., Moineau S. Multiplex PCR for detection and identification of lactococcal bacteriophages // Applied and Environmental Microbiology. - 2000. - Vo1. 66. № 3. - P. 987994.

6. Deveau H., Labrie S.J., Chopin M.C., Moineau S. Biodiversity and classification of lactococcal phages // Applied and Environmental Microbiology. - 2006. - Vol. 72. - P. 43384346.