СПОСОБ БИОДЕСТРУКЦИИ ДЕГИДРОАБИЕТИНОВОЙ КИСЛОТЫ
METHOD FOR BIODESTRUCTION OF DEHYDROABIETIIC ACID

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, в частности касается биодеградации токсичных органических соединений с помощью микроорганизмов.
50
Дегидроабиетиновая кислота - трициклический дитерпеноид, продуцируемый хвойными растениями Pinaceae, - является токсичным (LD 0,5-6,3 мг/л) компонентом сточных вод целлюлозно-бумажной промышленности [Peng G., Roberts J. Solubility and toxicity of resin acids. Water Research. 2000. V. 34. №10. P. 2779-2785; Kamaya Y., Tokita N., Suzuki K. Effects of dehydroabietic acid and abietic acid on survival, reproduction, and growth of the crustacean Daphnia magna. Ecotoxicology and Environment Safety. 2005. V. 61. P. 83-88]. Накопление дегидроабиетиновой кислоты в сточных водах в высокой (500-1000 мг/л) концентрации [Liss S.N., Bicho Р.А., Saddler J.N. Microbiology and biodegradation of resin acids in pulp mill effluents: a minireview. Canadian Journal of Microbiology. 1997. V. 75. P. 599-611] и последующее ее выделение в окружающую среду оказывает крайне негативное воздействие на водную фауну, способствуя нарушению экологического баланса. Способность к естественной биоаккумуляции обеспечивает широкое распространение токсиканта, что позволяет обнаружить дегидроабиетиновую кислоту не только в стоках целлюлозно-бумажных комбинатов, но и в морской/речной воде [Volkman J.K., Holdsworth D.G., Richardson D.E. Determination of resin acids by gas chromatography and high-performance liquid chromatography in paper mill effluent, river waters and sediments from the upper Derwent Estuary, Tasmania. Journal of Chromatography A. 1993. V. 643. P. 209-219], в морских отложениях и почве [Pérez-de-Mora A., Madejón E., Cabrera F., Buegger F., Fuβ R., Pritsch K., Schloter M. Long-term impact of acid resin waste deposits on soil quality of forest areas I. Contaminants and abiotic properties. Science of the Total Environment. 2008. V. 406. P. 88-98.], в живых организмах [Hernándes V., Silva M., Gavilán J., Jiménez B., Barra R., Becerra J. Resin acids in bile samples from fish inhabiting marine waters affected by pulp mill effluents. The Journal of the Chilean Chemical Society. 2008. V. 53. P. 1718-1721]. В связи с этим интерес представляет поиск и разработка способов эффективной утилизации дегидроабиетиновой кислоты на стадии детоксикации стоков целлюлозно-бумажных комбинатов.
Биотехнологии, которые основаны на естественных процессах разложения загрязнителей нативными микроорганизмами и протекают при физиологических температурах, нормальном давлении и без использования агрессивных химикатов, являются перспективным подходом для утилизации токсичных соединений. Известно, что значительная часть микроорганизмов, способных разлагать дегидроабиетиновую кислоту, представлена мицелиальными грибами [Choudhary M.I., Atif М., Ali Shah S.A., Sultan S., Erum S., Khan S.N., Atta-Ur-Rahman. Biotransformation of dehydroabietic acid with microbial cell cultures and α-Glucosidase inhibitory activity of resulting metabolites. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 2014. V. 6. P. 375-378; Van Веек T.A., Claassen F.W., Dorado J., Godejohann M., Sierra-Alvarez R., Wijnberg J.B.P.A. Fungal biotransformation products of dehydroabietic acid. Journal of Natural Products. 2007. V. 70. P. 154-159] и грамотрицательными бактериями (представители родов Pseudomonas [Biellmann J.F., Branlant G Gero-Robert M., Poiret M. Degradation bacterienne de l'acide dehydroabietique par un Pseudomonas et une Alcaligenes. Tetrahedron Letters. 1973. V. 29. P. 1227-1236; Bicho P.A., Martin V., Saddler J.N. Growth, Induction, and Substrate Specificity of Dehydroabietic Acid-Degrading Bacteria Isolated from a Kraft Mill Effluent Enrichment. Applied and Environment Microbiology. 1995. V. 61. P. 3245-3250], Sphingomonas [Mohn W.W., Yu Z, Moore E.R.B., Muttray A.F. Lessons learned from Sphingomonas species that degradeabietane triterpenoids. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 1999. V. 23. P. 374-379], Zoogloea [Mohn W.W. Bacteria obtained from a sequencing batch reactor that are capable of growth on dehydroabietic acid. Applied and Environment Microbiology. 1995. V. 61. P. 2145-2150], Flavobacterium [Biellmann J.F., Branlant G., Gero-Robert M., Poiret M. Degradation bacterienne de l'acide dehydroabietique Flavobacterium resinovorum. Tetrahedron. 1973. V. 29. P. 1227-1236]).
Следует отметить, что, несмотря на достаточно большое разнообразие биодеструкторов, максимальная эффективность процесса биодеградации экополлютанта зарегистрирована при использовании дегидроабиетиновой кислоты в концентрации не более 300 мг/л. Кроме того, ферментные системы грибов обычно катализируют реакцию гидроксилирования дегидроабиетиновой кислоты и не способны осуществить полную деструкцию токсиканта, что может привести к образованию производных дегидроабиетиновой кислоты с аналогичной или большей токсичностью. В связи с этим актуален поиск новых биодеструкторов, способных эффективно утилизировать более высокие (500-1000 мг/л) концентрации ДАК.
В процессах самоочищения природных экосистем важную роль играют актинобактерии рода Rhodococcus - устойчивые обитатели загрязненных почв, водоемов, активных илов, сточных вод, обладающие высокой активностью оксидоредуктаз, а также широким спектром адаптивных возможностей в отношении различных токсичных соединений и высоким потенциалом для биоремедиации загрязненных объектов [Ivshina I.B., Kuyukina M.S., Krivoruchko A.V. Hydrocarbon-oxidizing bacteria and their potential in eco-biotechnology and bioremediation. In: I. Kurtboke (Ed.), Microbial Resources: From Functional Existence in Nature to Industrial Applications, Academic Press, Cambridge. 2017. pp. 121-148]. Авторами настоящего изобретения ранее была показана возможность утилизации дегидроабиетиновой кислоты с использованием родококков [Cheremnykh K.М., Luchnikova N.A., Grishko V.V., Ivshina I.B. Bioconversion of ecotoxic dehydroabietic acid using Rhodococcus actinobacteria. Journal of Hazardous Materials. 2018. V. 346 P. 103-112].
Наиболее близким к заявляемому способу является способ биодеструкции дегидроабиетиновой кислоты с использованием растущих клеток Rhodococcus rhodochrous ВКПМ АС-2065 (ИЭГМ 107) [Черемных К.М., Лучникова Н.А., Гришко В.В., Ившина И.Б. Способ биодеструкции дегидроабиетиновой кислоты с использованием штамма Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 107 (Патент РФ 2656145, C12N 1/20, C02F 3/34, опубл. 31.05.2018)]. В приведенном изобретении максимальная нагрузка дегидроабиетиновой кислоты не превышала 750 мг/л, при этом процесс протекал в н-гексадекансодержащей среде в течение 7-11 суток.
Недостатками данного способа являются большая продолжительность процесса и невозможность достижения высоких качественных показателей процесса в условиях н-гексадекансодержащей среды.
Цель настоящего изобретения - оптимизация процесса биодеструкции дегидроабиетиновой кислоты (ДАК) с использованием нерастущих клеток штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ АС-2065 (ИЭГМ 107).
Под термином "нерастущие клетки" имеются в виду клетки стационарной фазы роста, отмытые от источников питания и перенесенные в буферный раствор [Mutafova В., Fernandes P., Mutafov S., Berkov S., Pavlov A. Microbial Transformations of Plant Secondary Metabolites. Bioprocessing of Plant In Vitro Systems. Reference Series in Phytochemistry 2016. P. 1-41; Grishko V.V., Tarasova E.V., Ivshina I.B. Biotransformation of betulin to betulone by growing and resting cells of the actinobacterium Rhodococcus rhodochrous IEGM 66. Process Biochemistry. 2013. V. 48. P. 1640-1644].
Техническим результатом заявляемого изобретения является сокращение продолжительности процесса биодеструкции дегидроабиетиновой кислоты и повышение эффективности ее биодеструкции.
600
Данный технический результат достигается посредством реализации способа биодеструкции дегидроабиетиновой кислоты, который предусматривает взаимодействие дегидроабиетиновой кислоты с нерастущими клетками R. rhodochrous ВКПМ АС-2065 в определенных условиях. Используют клетки стационарной фазы роста, отмытые от источника питания в фосфатно-солевом буфере рН 6,0-9,0 в виде клеточной суспензии с плотностью ОП 1,5-3,0.
Применение заявленного способа обеспечивает полную биодеструкцию от 500 до 1000 мг/л дегидроабиетиновой кислоты в течение периода от 3 до 8 суток. При этом биокатализатор может быть использован многократно, что позволяет увеличить суммарную нагрузку токсиканта.
В способе используется культура R. rhodochrous ИЭГМ 107 из Региональной специализированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, номер 285 во Всемирной федерации коллекции культур, www.iegmcol.ru; реестровый номер УНУ www.ckp-rf.ru/usu/73559). Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ АС-2065.
Изобретение осуществляется следующим образом.
600
Бактерии выращивают в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл, в которые вносят 100 мл среды LB («Sigma», США). Культивирование проводят в условиях постоянного перемешивания (160 об/мин) и при температуре 28°С в течение 48 часов. В стационарной фазе роста бактериальные клетки осаждают центрифугированием 3000 об/мин в течение 10 мин и трижды отмывают эквивалентным объемом фосфатно-щелочного буферного раствора (рН 7,0). Отмытые клетки ресуспендируют в 50 мл фосфатного-щелочного буфера (рН 6,0; 7,0; 8,0; 9,0) и доводят оптическую плотность (ОП) до значений 1,5, 2,0, 2,5 3,0, которую определяют с помощью спектрофотометра Lambda EZ201 (Perkin-Elmer, США) при длине волны 600 нм и кварцевых кювет объемом 2 мл.
Дегидроабиетиновую кислоту (например, 99,1% чистоты от «Mosinter Group Limited», Китай) добавляют в концентрации 500, 750, 1000 мг/л в виде раствора в этаноле (1:10). В качестве контроля используют (1) стерильный раствор дегидроабиетиновой кислоты в фосфатно-щелочном буфере (для оценки абиотической деградации); (2) бактериальную суспензию в фосфатно-щелочном буфере без дегидроабиетиновой кислоты (биотический контроль). Продолжительность процесса биодеструкции дегидроабиетиновой кислоты составляет от 3 до 8 суток. Клеточные суспензии сохраняют активность до 3 циклов биодеструкции токсиканта во всем диапазоне (500-1000 мг/л) концентраций, что позволяет увеличить суммарную нагрузку дегидроабиетиновой кислоты до 1500-3000 мг/л.
3
2
4
Для обнаружения остаточной дегидроабиетиновой кислоты и ее возможных метаболитов среду ферментации подкисляют 10%-ным водным раствором HCl и трижды экстрагируют эквивалентным объемом этилацетата. Объединенные экстракты последовательно промывают 1%-ным водным раствором NaHCO и дистиллированной водой (до рН 7,0). Полученный этилацетатный экстракт обезвоживают NaSO. Растворитель удаляют с помощью роторного испарителя Laborota 4000 (Heidolph, Германия). Образование метаболитов контролируют методом тонкослойной хроматографии на пластинах с силикагелем (Merck, Германия). Образцы экстрактов для анализа методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) предварительно обрабатывают триметилсилилдиазометаном. Качественный анализ полученных экстрактов осуществляют методом ГХ-МС на хроматографе Agilent 6890N/5975B (Agilent Technologies, США), оборудованном капиллярной колонкой HP-5ms (30 м × 0,25 мм, 0,25 мкм), в режиме ионизации электронным ударом (70 эВ). В качестве газа-носителя используют гелий (1 мл/мин). Количественный анализ дегидроабиетиновой кислоты осуществляют методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием хроматографа LC Prominence 20AD (Shimadzu, Япония), оборудованного хроматографической колонкой Supelcosil™ LC-18 (150×4,5 мм, 5 мкм) и диоидно-матричным детектором SPD-M20A. В качестве элюента используют 70% водный раствор ацетонитрила.
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1.
600
Биодеструкцию дегидроабиетиновой кислоты проводят с использованием суспензии нерастущих клеток R. rhodochrous ВКПМ АС-2065 с ОП 1,5 в 50 мл фосфатного буфера (рН 7,0) при постоянном перемешивании (160 об/мин) и 28°С. Дегидроабиетиновую кислоту (500 мг/л) вносят в виде раствора в этаноле (1:10). Количество остаточной дегидроабиетиновой кислоты контролируют методами ГХ-МС и ВЭЖХ. Полная биодеструкция дегидроабиетиновой кислоты в концентрации 500 мг/л регистрируется через 7 сут после внесения кислоты (Фиг. 1).
Пример 2.
600
Способ осуществляется по примеру 1, но используют суспензию нерастущих клеток R. rhodochrous ВКПМ АС-2065 с ОП 2,0. Полная биодеструкция дегидроабиетиновой кислоты в концентрации 500 мг/л регистрируется через 6 сут после внесения кислоты (Фиг. 1).
Пример 3.
600
Способ осуществляется по примеру 1, но используют суспензию нерастущих клеток R. rhodochrous ВКПМ АС-2065 с ОП 2.5. Полная биодеструкция дегидроабиетиновой кислоты в концентрации 500 мг/л регистрируется через 5 сут, после внесения кислоты (Фиг. 1).
Пример 4.
600
Способ осуществляется по примеру 1, но используют суспензию нерастущих клеток R. rhodochrous ВКПМ АС-2065 с ОП 3,0. Полная биодеструкция дегидроабиетиновой кислоты в концентрации 500 мг/л регистрируется через 6 сут, после внесения кислоты (Фиг. 1).
Пример 5.
Способ осуществляется по примеру 3, но используют фосфатный буфер рН 6,0. Полная биодеструкция дегидроабиетиновой кислоты (500 мг/л) регистрируется через 6 сут, после внесения кислоты (Фиг. 2).
Пример 6.
Способ осуществляется по примеру 3, но используют фосфатный буфер рН 8,0. Полная биодеструкция дегидроабиетиновой кислоты (500 мг/л) регистрируется через 3 сут, после внесения кислоты (Фиг. 2).
Пример 7.
Способ осуществляется по примеру 3, но используют фосфатный буфер рН 9,0. Полная биодеструкция дегидроабиетиновой кислоты (500 мг/л) регистрируется через 5 сут, после внесения кислоты (Фиг. 2).
Пример 8.
Способ осуществляется по примеру 6, но дегидроабиетиновую кислоту вносят в концентрации 750 мг/л. Полная биодеструкция дегидроабиетиновой кислоты (750 мг/л) регистрируется через 8 сут, после внесения кислоты (Фиг. 3).
Пример 9.
Способ осуществляется по примеру 6, но дегидроабиетиновую кислоту вносят в концентрации 1000 мг/л. Полная биодеструкция дегидроабиетиновой кислоты регистрируется через 8 сут, после внесения кислоты (Фиг. 3).
Пример 10.
Способ осуществляется по примеру 6, но дополнительно дегидроабиетиновую кислоту вносят порциями по 500 мг/л через 4 и через 7 сут. Биодеструкция дегидроабиетиновой кислоты осуществляется на протяжении 12 сут (3 цикла). Суммарная нагрузка дегидроабиетиновой кислоты составляет 1500 мг/л (Фиг. 4).
Пример 11.
Способ осуществляется по примеру 8, но дополнительно дегидроабиетиновую кислоту вносят порциями по 750 мг/л через 8 и через 16 сут. Биодеструкция дегидроабиетиновой кислоты осуществляется на протяжении 24 сут (3 цикла). Суммарная нагрузка дегидроабиетиновой кислоты составляет 2250 мг/л (Фиг. 4).
Пример 12.
Способ осуществляется по примеру 9, но дополнительно дегидроабиетиновую кислоту вносят порциями по 1000 мг/л через 8 и через 17 сут. Биодеструкция дегидроабиетиновой кислоты осуществляется на протяжении 25 сут (3 цикла). Суммарная нагрузка дегидроабиетиновой кислоты составляет 3000 мг/л (Фиг. 4).
Изобретение поясняется нижеследующими графическими материалами, на которых изображены:
600
на Фиг. 1 - влияние ОП 1,5  2,0 (), 2,5 () или 3,0 () суспензии нерастущих клеток R. rhodochrous ВКПМ АС-2065 на биодеструкцию дегидроабиетиновой кислоты (500 мг/л). Используют фосфатно-щелочной буфер с рН 7,0.
600
на Фиг. 2 - влияние значений рН 6,0  7,0 (), 8,0 () и 9,0 () фосфатно-щелочного буфера на биодеструкцию дегидроабиетиновой кислоты (500 мг/л). Используют суспензию нерастущих клеток R. rhodochrous ВКПМ АС-2065 с ОП 2,5.
600
на Фиг. 3 - динамика биодеградации 500  750 () и 1000 () мг/л дегидроабиетиновой кислоты нерастущими клетками R. rhodochrous ВКПМ АС-2065. Используют суспензию клеток с ОП 2,5 в фосфатно-щелочном буфере рН 8,0.
600
на Фиг. 4 - многократное использование суспензий нерастущих клеток R. rhodochrous ВКПМ АС-2065 в процессе биодеструкции 500  750 (Δ)и 1000  мг/л дегидроабиетиновой кислоты. Используют суспензии нерастущих клеток с ОП 2,5 в фосфатно-щелочном буфере рН 8,0. Стрелками показано внесение дегидроабиетиновой кислоты.