Выделение эмбрионального гемоглобина и моделирование иммунохимической тест-системы на него

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ

Выделение эмбрионального гемоглобина и моделирование иммунохимической тест-системы на него

Ю.А.Кривенцев1, Р.А.Бисалиева1, Д.М.Никулина1, А.А.Терентьев2

1Астраханская государственная медицинская академия,

кафедра биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики

(зав. кафедрой - проф. Д.М.Никулина);

2Российский государственный медицинский университет им. Н.И.Пирогова,

кафедра биологической химии, Москва

Разработан новый, оптимальный способ выделения и очистки эмбрионального гемоглобина (HbP), включающий термическую обработку и механическую гомогенизацию эмбриональных тканей (5-9 нед), щелочную денатурацию сульфатом аммония 50% насыщения в присутствии 0,2 М NaOH и ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-сефадексе G-50 в восходящем градиенте ионной силы. Иммунизацией кроликов получены моновалентные антисыворотки на HbP. Сопоставлением их с различными антигенными композитами в РИД и бензидиновым окрашиванием доказана их иммунная специфичность к HbP. Получены моновалентные иммунохимические тест-системы на HbP, в которых тест-антигеном является очищенный препарат HbP в рабочем разведении 1 : 2 или экстракт тканей эмбриона (срок -6-9 нед) в рабочем разведении 1 : 8-1 : 16.

Ключевые слова: эмбриональный гемоглобин, иммунохимия, тест-система

Isolation of the embryonic hemoglobin and modeling of immunochemical anti-HbP test-system

Yu.A.Kriventsev1, R.A.Bisalieva1, D.M.Nikulina1, A.A.Terentyev2

1Astrakhan State Medical University, Department of Biochemistry with the course of Clinical Laboratory Diagnostics (Head of the Department - Prof. D.M.Nikulina);

2N.I.Pirogov Russian State Medical University, Department of Biochemistry, Moscow

The purpose of the investigation was to develop a new optimum method of HbP isolation and purification, and modeling of monovalent anti-HbP immunochemical test-system. An optimum method of isolation and purification of HbP was developed with thermal treatment and mechanical homogenization of embryonic tissues (5-9 weeks), alkaline denaturation with ammonium sulfate 50% saturation in the presence of 0,2 M NaOH and ion-exchange chromatography on DEAE-sephadex G-50 in rising gradient of ion strength. Rabbit immunization permitted to obtain monovalent anti-HbP antisera. Their HbP-immune specificity was evidenced by comparing them with different antigenic mixtures in RID and benzidine staining. Monovalent immunochemical anti-HbP test-systems were obtained in which a purified HbP sample at dilution 1 : 2 or embryonic tissue extract (gestational age is 6-9 weeks) at dilutions 1 : 8-1 : 16 was a test-antigen. Key words: embryonic hemoglobin, immunochemistry, test-system

Эмбриональный гемоглобин (НЬР) до настоящего времени остается недостаточно изученным белком. Информация об экспрессии гена эпсилон-цепей НЬР в онтогенезе и динамике его продукции при патологических

Для корреспонденции:

Кривенцев Юрий Алексеевич, кандидат медицинских наук,

доцент кафедры биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики

Астраханской государственной медицинской академии

Адрес: 414000, Астрахань, ул. Бакинская, 121

Телефон: (8512) 44-7496

Статья поступила 19.02.2009 г., принята к печати 31.03.2010 г.

состояниях практически отсутствует. Такой парадоксально низкий интерес к клиническому изучению этого белка можно объяснить сложностью получения биоматериала, выделения и очистки НЬР, а также устоявшимся мнением об отсутствии у этого белка прикладной ценности, т.к. активность его гена полностью репрессирована как у детей, так и у взрослых [1-5].

Однако недавние исследования доказали важную клинико-диагностическую роль эмбрионального гемоглобина при ряде заболеваний. Ранее нами было показано следующее:

Ю.А.Кривенцев и др. / Вестник РГМУ, 2010, №3, с. 77-79

• эмбриональный гемоглобин регистрируется также при некоторых миелопролиферативных заболеваниях [6], что можно объяснить дерепрессией эпсилон-гена НЬР при ма-лигнизации клеток эритроидного ростка;

• при гипоксии различного генеза в крови больных появляется НЬР [7, 8], что, вероятно, связано с влиянием факторов, сопровождающих гипоксию, на транскриби-руемость определенных структурных генов, то есть кислородное голодание в тканях стимулирует продукцию типов гемоглобина, обладающих большим сродством к кислороду;

• НЬР продуцируется в организме человека с 3-й по 13-ю неделю гестации, причем пик продукции приходится на 5-6-ю недели [9].

Очевидно, что для адекватной регистрации и оценки уровня НЬР в биологических жидкостях необходимо создание иммунохимических тест-систем на данный белок, т.к. иммунохимические методы до сих пор остаются самыми точными и специфичными при определении белков.

Цель данного исследования заключалась в разработке нового, оптимального способа выделения и очистки НЬР и моделировании моновалентной иммунохимической тест-системы на него.

Материалы и методы

Исходным биоматериалом для выделения и очистки НЬР служил абортивный материал разных сроков (отделение неонатологии больницы №5 г. Астрахани). В работе было использовано 108 человеческих эмбрионов, полученных на сроках гестации 5-9 нед в результате клинических абортов. Сбор абортивного материала был документально разрешен администрацией клиники и осуществлялся при согласии пациенток.

Абортивный материал сразу по доставке промывали в проточной воде в течение 30 мин, а затем в 0,9% растворе ЫаС!. Полученную массу подвергали сортировке при участии квалифицированных гистологов.

При разработке способа выделения и очистки НЬР использовали методики механической и термической гомогенизации, щелочного осаждения сульфатом аммония 50% насыщенности в присутствии 0,2 М ЫаОН, ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефадексе 0-50 в восходящем градиенте ионной силы, электрофореза в полиакриламидном геле, центрифугирования.

Для получения моновалентных антисывороток на НЬР использовали иммунизацию взрослых кроликов породы шиншилла массой 3-4 кг. Схема иммунизации: инъекции проводились четырежды с недельным интервалом. Каждая инъекция включала в себя смесь антигенного материала с полным адъювантом Фрейнда: 0,5 мл раствора очищенного НЬР, 1,0 мл адъюванта Фрейнда. Смесь вводилась подкожно в боковую поверхность туловища кролика в 8 точек. Забор крови осуществляли из краевой вены уха на 7-9-й день после последней инъекции.

Для контроля качества полученных антисывороток и моделирования иммунохимических тест-систем использовали иммунодиффузию в агаровом геле по Оухтерлони и «истощение» антисывороток антигенными композитами.

Результаты исследования и их обсуждение

Разработан оптимальный алгоритм выделения и очистки НЬР, включающий следующие этапы:

1. Гомогенизация. Эмбриональные ткани промывали, взвешивали и подвергали гомогенизации механически-термическим способом (см. выше). Экстрагирование цито-зольных белков проводили, добавляя в полученную на предыдущем этапе гомогенную кашицу 0,9% раствор ЫаС! в объемном соотношении 1 : 2. Для избавления от клеточных обломков взвесь центрифугировали при 8000 д в течение 30 мин, после чего осадок отбрасывали.

2. Щелочное осаждение. Поскольку устойчивость эмбрионального гемоглобина несколько ниже, чем у феталь-ного [10], для очистки НЬР нами была модифицирована стандартная методика щелочной денатурации для выделения фетального гемоглобина [11], алгоритм которой приводится ниже.

В 2 мл раствора, содержащего НЬР, добавляли 0,2 мл 1,2 М раствора ЫаОН и через 40 с - 2 мл насыщенного раствора сульфата аммония (до 50% насыщенности). При этих условиях щелочелабильные внутриэритроцитарные белки (в том числе и гемоглобины А1 и А2) денатурируют и седи-ментируют. После центрифугирования при 8000 об/мин в течение 30 мин осадок отделяли. Полученный белковый препарат подвергали обессоливанию путем гель-проникающей хроматографии на колонке с сефадексом 0-25, рабочий буфер - 0,05 М фосфатный буферный раствор, рН 7,4.

3. Ионообменная хроматография. Окончательную очистку НЬР от оставшихся щелочеустойчивых компонентов в полученном на предыдущем этапе препарате проводили путем ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефадексе 0-50.

Полученный на втором этапе препарат предварительно забуферивали диализом в течение ночи против 3 л рабочего буфера (0,01 М трис-хлоридный буфер, рН 8,1). Затем 15-20 мл препарата вносили в колонку и начинали хроматографию. Элюцию проводили в градиенте ионной силы с повышением осмолярности буферного раствора путем ступенчатого добавления хлорида натрия. В данных условиях эксперимента окрашенная фракция НЬР элюиру-ется в диапазоне ионной силы элюэнта от 0,15 до 0,2 моль/л. При необходимости элюированные фракции концентрировали.

Анализ чистоты полученных препаратов осуществляли методом вертикального электрофореза в полиакриламид-ном геле.

Моделирование иммунохимической

тест-системы на HbP

Полученные очищенные препараты эмбрионального гемоглобина использовали, в частности, для получения специфических антисывороток на данный белок иммунизацией кроликов.

Для выявления наличия антител на эмбриональный гемоглобин в полученных антисыворотках проводили имму-нохимическое сопоставление антисыворотки на НЬР с другими антигенными композитами: негемолизированной сывороткой здоровых доноров, сывороткой беременных

Выделение эмбрионального гемоглобина и моделирование иммунохимической тест-системы на него

Рисунок. Контроль специфичности антисыворотки на эмбриональный гемоглобин.

1 - антисыворотка на эмбриональный гемоглобин; 2 - антисыворотка на фетальный гемоглобин; 3 - сыворотка крови кролика без антител к НЬР; 4 - гемолизат пуповинной крови; 5 - очищенный препарат НЬА2 (гемоглобина взрослого А2); 6 - экстракт тканей эмбриона 6-12 нед; Э - очищенный препарат НЬР; Sd - сыворотка крови взрослого донора; Г - гемолизат крови взрослого донора.

Таблица. Характеристика полученных тест-систем на HbP

Шифр Ас Разведение антигена Максимальное Наличие

Максимальное Оптимальное разведение дополнительных

антисыворотки линий

преципитации

As31 (II) 1 : 64 1 : 4-1 : 8 1 : 2 нет

As433(III) 1 : 64 1 : 8-1 : 16 1 : 4 нет

женщин, экстрактом тканей эмбриона, гемолизатом взрослого, гемолизатом пуповинной крови, очищенными препаратами НЬАь НЬА2, HЬF и НЬР (рисунок). При наличии дополнительных линий преципитации проводили дробное истощение антисыворотки соответствующей белковой фракцией.

Для дополнительного контроля специфичности и идентификации тест-системы на НЬР линии преципитации, полученные вышеописанным способом, подвергали специфической окраске на гемоглобин бензидиновым методом [10]. В результате отмечалось положительное окрашивание названных линий, что подтверждало гемоглобиновую природу антигена, использованного для получения антисывороток.

В результате проведенной работы разработаны специфические иммунохимические тест-системы на эмбриональный гемоглобин (таблица), в которых тест-антигеном является очищенный препарат НЬР (полученный вышеописанным способом) в рабочем разведении 1 : 2 или экстракт тканей эмбриона (срок - 6-9 нед) в рабочем разведении от 1 : 8 до 1 : 16. Данная тест-система позволяет проводить количественное определение НЬР методом РИД по Манчини или полуколичественное определение НЬР по Оухтерлони.

Выводы

1. Разработан оптимальный способ выделения и очистки НЬР, включающий гомогенизацию эмбриональных тканей (5-9 нед), щелочную денатурацию сульфатом аммония 50% насыщенности в присутствии 0,2 М ЫаОН и ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-сефадексе й-50 в восходящем градиенте ионной силы.

2. Методом иммунизации кроликов получены моновалентные антисыворотки на НЬР. Их иммунная специфичность к НЬР доказана сопоставлением с различными антигенными композитами в РИД и бензидиновым окрашиванием.

3. Путем иммунодиффузионного тестирования в агаровом геле по Оухтерлони с соответствующими антигенами и подбора эквивалентных разведений смоделированы моновалентные иммунохимические тест-системы на НЬР, в которых тест-антигеном является очищенный препарат НЬР в рабочем разведении 1 : 2 или экстракт тканей эмбриона (срок - 6-9 нед) в рабочем разведении 1 : 8-1 : 16.

Литература

1. Вилкинсон Д. Принципы и методы диагностической энзимологии. -М.: Медицина, 1981. - 624 с.

2. Даштаянц Г.А. - В кн.: Клиническая гематология. - Киев: Здоровье, 1973. -С.45-72.

3. Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. Основы патохимии. - СПб.: Элби-СПб, 2000. - 173 с.

4. Лабораторные методы исследования в клинике / Под ред. проф. В.В.Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - С.108-111.

5. Шевченко В.А., Топорнина Н.А., Стволинская Н.С. Генетика человека: Учебник для студентов высших учебных заведений. - М.: Гуманитарный издательский центр «Владос», 2002. - 203 с.

6. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М. Строение и биологическая роль белков гемо-глобинового профиля / Астраханская государственная медицинская академия. - Астрахань, 2007. - 101 с.

7. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова Л.А. и др. Фетальный и эмбриональный типы гемоглобина в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией // Астраханский мед. журн. - Астрахань, 2007. - №2. - С.132-133.

8. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова Л.А. и др. Определение эмбрионального гемоглобина в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией. - В кн.: Матер. науч.-практ. конф. с международ. участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». -Астрахань-Волгоград-Москва, 2006. - С.72-73.

9. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М. и др. Иммунохимический анализ продукции эмбрионального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека. - В кн.: Матер. науч.-практ. конф. с международ. участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань-Волгоград-Москва, 2006. - С.58-62.

10. Иржак Л.И. Гемоглобины и их свойства. - М.: Наука, 1975. - 240 с.

11. Тодоров Й. Клинические лабораторные исследования в педиатрии. - София: Медицина и физкультура, 1968. - С.278-331.

Информация об авторах:

Бисалиева Рината Альбкалиевна, ассистент кафедры биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики Астраханской государственной медицинской академии Адрес: 414000, Астрахань, ул. Бакинская, 121 Телефон: (8512) 50-0713 Б-таН: гаМуаЫэйтаН.ги

Никулина Дина Максимовна, кандидат медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики Астраханской государственной медицинской академии Адрес: 414000, Астрахань, ул. Бакинская, 121 Телефон: (8512) 39-1067 Б-таИ: dimax@astranet.ru

Терентьев Александр Александрович, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой биологической химии Российского государственного медицинского университета им. Н.И.Пирогова

Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-0588