СИНТЕЗ ДНК

1. Бесклеточный процесс синтеза ДНК, включающий контактирование матрицы ДНК по меньшей мере с одной полимеразой в присутствии нуклеотидов с образованием реакционной смеси при условиях, способствующих амплификации указанной матрицы путем замещения реплицированных цепей посредством репликации другой цепи с замещением цепей, при этом дополнительные нуклеотиды добавляются в реакционную смесь контролируемым образом.
2. Процесс по п. 1, согласно которому указанная реакционная смесь дополнительно содержит один или более праймеров.
3. Бесклеточный процесс синтеза ДНК, включающий контактирование матрицы ДНК, по меньшей мере, с одной полимеразой в присутствии нуклеотидов и, по меньшей мере, одного праймера с образованием реакционной смеси при условиях, способствующих амплификации указанной матрицы путем замещения реплицированных цепей посредством репликации другой цепи с замещением цепей, при этом дополнительные нуклеотиды добавляются в реакционную смесь контролируемым образом.
4. Бесклеточный процесс синтеза ДНК по любому из пп. 1-3, согласно которому реакционная смесь дополнительно содержит один или более катионов металлов, причем дополнительные катионы металлов добавляются в реакционную смесь контролируемым образом.
5. Процесс по п. 4, согласно которому указанные дополнительные нуклеотиды и дополнительные катионы металлов добавляются в реакционную смесь раздельно.
6. Процесс по любому из пп. 1-5, согласно которому указанная матрица ДНК является кольцевой, и амплификация указанной матрицы ДНК представляет собой амплификацию по типу катящегося кольца.
7. Процесс по любому предшествующему пункту, в котором указанная матрица ДНК является замкнутой линейной ДНК, и в котором предпочтительно указанную матрицу ДНК инкубируют в денатурирующих условиях с образованием замкнутой кольцевой одноцепочечной ДНК.
8. Процесс по любому из предшествующих пунктов, согласно которому указанная матрица ДНК содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень для процессирующего фермента, предпочтительно последовательность-мишень для рекомбиназы или последовательность-мишень для протеломеразы.
9. Процесс по п. 8, согласно которому процессирующий фермент добавляют в реакционную смесь контролируемым образом.
10. Процесс по любому из предшествующих пунктов, согласно которому указанные дополнительные нуклеотиды доставляются в реакционную смесь в виде некоторого количества аликвот.
11. Процесс по любому из предшествующих пунктов, согласно которому указанные дополнительные нуклеотиды доставляют в виде аликвот через равные промежутки времени на всем протяжении процесса, необязательно по меньшей мере каждые 30 минут.
12. Процесс по п. 4, согласно которому указанные дополнительные ионы металлов доставляют в виде аликвот через равные промежутки времени на всем протяжении процесса, необязательно по меньшей мере каждые 30 минут.
13. Процесс по п. 11 или 12, согласно которому, по меньшей мере, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аликвот добавляют в реакционную смесь.
14. Процесс по любому из пп. 10-13, согласно которому указанные аликвоты подают из внешнего источника с использованием насоса или доставляют в реакционную смесь с помощью осмотического насоса.
15. Процесс по любому из предшествующих пунктов, согласно которому указанные нуклеотиды или дополнительные нуклеотиды включают биологически неактивные нуклеотиды и предпочтительно доставляются в реакционную смесь посредством активации.
16. Процесс по любому из предшествующих пунктов, согласно которому указанные дополнительные нуклеотиды доставляют в ответ на сигнал, имеющий отношение к концентрации ДНК в реакционной смеси, в котором предпочтительно концентрацию ДНК в реакционной смеси контролируют путем измерения разницы в давлении реакционной смеси или ее части, что может необязательно генерировать сигнал.
17. Процесс по п. 16, согласно которому сигнал, показывающий концентрацию ДНК, формируют путем измерения разницы давлений, созданных насосом поршневого типа, который извлекает и возвращает часть реакционной смеси, необязательно с помощью датчика давления.
18. Процесс по любому из предшествующих пунктов, согласно которому указанный процесс осуществляют в устройстве для синтеза, при этом указанное устройство включает:
реакционный сосуд, имеющий по меньшей мере первый порт и второй порт;
регулятор температуры для контролирования температуры реакционного сосуда;
множество резервуаров для хранения компонентов реакции;
множество каналов, при этом каждый из множества каналов соединяет первый порт реакционного сосуда с соответствующим одним из множества резервуаров;
по меньшей мере один датчик давления, находящийся в непосредственной близости к первому порту или второму порту реакционного сосуда;
устройства доставки для осуществления выборочной подачи контролируемых количеств компонентов реакции, хранящихся в резервуарах, в реакционный сосуд;
перемешивающие устройства для выборочного извлечения некоторого количества содержимого из реакционного сосуда через его второй порт и выборочного возвращения содержимого реакционного сосуда в реакционный сосуд через его второй порт; и
контролирующие устройства для контролирования устройств доставки и перемешивающих устройств,
при этом датчик давления обнаруживает изменение в давлении снаружи реакционного сосуда и посылает сигнал к контролирующим устройствам, а контролирующие устройства контролируют устройства доставки и/или перемешивающие устройства в ответ на изменение в наблюдаемом давлении.
19. Процесс по п. 18, согласно которому указанные компоненты реакции включают указанные дополнительные нуклеотиды и/или дополнительные ионы металлов.
2+
2+
2+
2+
2+
2+
+
+
+
2+
20. Процесс по п. 4 или 19, согласно которому указанные катионы металлов включают один или более металлов, выбранных из списка, состоящего из магния (Mg), марганца (Mn), кальция (Ca), бериллия (Be), цинка (Zn) и стронция (Sr), лития (Li), натрия (Na) или калия (K), предпочтительно Mg.
21. Процесс по п. 4, или 20, или 21, согласно которому указанный катион металла является двухвалентным катионом, и отношение между указанными катионами двухвалентных металлов и нуклеотидами поддерживается примерно 3:1 в реакционной смеси.
22. Процесс по любому из предшествующих пунктов, согласно которому концентрация нуклеотидов в реакционной смеси сохраняется в пределах от 0.001мМ до 6мМ, необязательно около 3мМ.
23. Процесс по любому из предшествующих пунктов, согласно которому указанные нуклеотиды и/или дополнительные нуклеотиды являются дезоксирибонуклеозид трифосфатами (дНТФ) или их производными или модифицированными вариантами.
24. Процесс по любому из предшествующих пунктов, согласно которому указанные нуклеотиды и/или дополнительные нуклеотиды являются одним или более из числа дезоксиаденозин трифосфата (дАТФ), дезоксигуанозин трифосфата (дГТФ), дезоксицитидин трифосфата (дЦТФ), дезокситимидин трифосфата (дТТФ) и их производных.
2+
2+
2+
2+
+
+
+
2+
2+
25. Процесс по любому из предшествующих пунктов, согласно которому указанные нуклеотиды предоставляются в виде одного или более из числа свободных кислот, их солей или их хелатов, при этом необязательно указанные соли или хелаты включают один или более из следующих ионов металлов: Mg, Be, Ca, Sr, Li, Na, K, Mn или Zn.
26. Процесс по п. 8, согласно которому указанный процессирующий фермент добавляется по сигналу, имеющему отношение к концентрации ДНК в реакционной смеси.