СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ, ОБРАЗУЮЩИХ БИОПЛЕНКУ, В БУМАЖНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
METHOD FOR DETECTION OF MICROORGANISMS FORMING BIOFILM IN PAPER INDUSTRY

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способу определения наличия микроорганизмов, образующих биопленку, при производстве бумаги или картона для определения необходимости использования агента, противодействующего образованию биопленки в производственном процессе. Кроме того, предусмотрен набор для осуществления данного способа.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В процессах производства бумаги и картона присутствуют теплые технические воды (например, с температурой 45-60°С), которые содержат много биоразлагаемых питательных веществ и имеют благоприятный pH (например, pH 4-9), за счет чего обеспечивается хорошая среда для размножения микроорганизмов. Для микробов, присутствующих в производственном процессе, характерен рост с образованием биопленки, т.е. с прикреплением к поверхности, и свободный, т.е. планктонный, рост. Ряд проблем в бумажной промышленности вызван биопленками, то есть слоями слизи, которые образуются на поверхностях производственного оборудования и могут отрываться от поверхностей. Отложения микроорганизмов на поверхностях машин и свободные биопленки/агломераты могут быть причиной серьезных нарушений технологического процесса: снижения потока воды; блокирования фильтров, сеток и т.п.; снижения качества конечного продукта, например из-за появления отверстий или цветных пятен в конечном продукте; или разрыва всего бумажного полотна. Биопленки трудно удалить с поверхностей производственного оборудования, и часто для этого нужно использовать очень сильнодействующие химические вещества.
Для борьбы с размножением микробов в технические воды добавляли, например, биоциды. Планктонные микробы эффективно подавляются биоцидами; однако использование биоцидов не решает всех проблем, связанных с присутствием биопленки в машинах для изготовления бумаги и картона. Для этого существует несколько причин, например то, что в процессе изготовления бумаги размножаются очень разнообразные микробы, и в настоящее время уже известно, что бактерии, размножающиеся в биопленке, обычно более устойчивы к биоцидам, чем планктонные микробы.
Один из авторов настоящего изобретения, М.Колари, недавно исследовал биопленкообразующие микробы (т.е. микроорганизмы, образующие биопленку) в производстве бумаги и картона («Механизмы фиксации и свойства бактериальных биопленок на неживых поверхностях», Диссертации Биоцентра Viiki Хельсинкского университете 12/2003, диссертация на соискание ученой степени д-ра философии, Хельсинкский университет, Финляндия). В этом исследовании были выявлены микроорганизмы, образующие биопленку, и исследованы их взаимодействия.
Соответственно, было обнаружено, что в технологических процессах присутствуют различные типы микроорганизмов: первичные биопленкообразующие микроорганизмы, которые способны к адгезии с чистыми поверхностями, и вторичные биопленкообразующие микроорганизмы, которые затем связываются с первичными биопленками. Первичные биопленкообразующие микроорганизмы, по-видимому, являются предпосылкой к успешной колонизации поверхности некоторыми другими микробами, встречающимися в машинах для изготовления бумаги и картона. Например, Deinococcus geothermalis является микроорганизмом, образующим первичную биопленку, а штаммы нескольких видов Bacillus связываются с первичными биопленками, образованными этой бактерией. М.Колари и соавторы в Журнале Промышленной Микробиологии и биотехнологии (Kolari, М. et al. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2003) 30, p.225-238) описали еще несколько видов первичных биопленкообразующих бактерий. С учетом новейших неопубликованных данных соответствующими первичными образующими биопленку микроорганизмами, известными к настоящему времени, являются: виды Deinococcus geothermalis; род Meiothermus, например виды M. silvanus или M. ruber, род Azospirillum; род Burkholderia, например В. multivorans или B. cepacia; род Porphyrobacter, например Р. cryptus; род "Rubellimicrobium"; и род Thermomonas, например Т. haemolytica или Т. hydrothermalis. Первичные микроорганизмы, образующие биопленку, обычно являются умеренно термофильными микроорганизмами, у некоторых температура максимального роста достигает 67°С, тогда как большинство штаммов обнаруживает наиболее быстрый рост при температурах от 45 до 55°С. Однако в этой работе не обсуждалось, как преодолеть проблемы, связанные с биопленками, в бумажной промышленности.
Как указано выше, в контексте образования слизи в машинах для изготовления бумаги и картона, очевидно, что микробы, образующие биопленку, являются наиболее вредными микробами, а предотвращение их развития улучшит функционирование производственного оборудования и вследствие этого производительность производственного процесса. С этой целью автор настоящей заявки в недавно поданных заявках на патент FI 20021986 и FI 20021987 описал новый тип агентов, противодействующих образованию биопленки, которые имеют растительное происхождение и могут быть использованы для предотвращения образования биопленки и/или для удаления уже образовавшейся биопленки в процессах производства бумаги или картона.
Для эффективного использования биоцидов или упомянутых антибиопленочных средств необходим эффективный способ определения (мониторинга) наличия микроорганизмов. В бумажной промышленности типичным способом определения микробного роста является культивирование пробы технологической воды в лаборатории. Однако такие способы культивирования требуют много времени и сложны, то есть они занимают несколько дней и требуют, среди прочего, использования различных культуральных сред для выделения и идентификации различных типов микробов, содержащихся в пробе. Кроме того, известно, что размножение микробов в лаборатории зависит от культуральной среды, поэтому часть микробов, присутствующих в пробе, часто не может размножаться в лабораторных условиях. Кроме того, мониторинг обычно сфокусирован на свободно плавающих микробах. Эффективные способы определения воздействия агентов, противодействующих образованию биопленки, на микроорганизмы, образующие биопленку, отсутствуют. Поэтому биоциды, например, обычно используют для неселективного ингибирования всех микробов, присутствующих в процессе, из-за чего часто требуются большие количества биоцидов.
2
В заявке FI 95597 автора настоящего изобретения описано устройство, которое можно использовать в лаборатории или в процессе производства бумаги для получения биопленки на его поверхностях. Биопленку получают из чистых культур дрожжей или посредством помещения устройства в технологическую воду. Микробный рост анализируют посредством подсчета числа дрожжевых клеток на см с использованием традиционного способа посева на чашках Петри. Как уже отмечалось, способ посева на чашках Петри требует большого времени как для идентификации вредных микробов, так и для скрининга, например, подходящего биоцида. Кроме того, часть микробов, содержащихся в биопленке, не может размножаться в культуральной среде.
В патентах US 6,326,190 и US 6,410,256 описан способ, в котором бактериальная биопленка образуется на поверхности множества выступов, имеющихся в устройстве, и определяется чувствительность биопленки к антибактериальным средствам. Однако в указанных способах биопленку получали с помощью традиционной, требующей большого времени техники, то есть с использованием чистых культур, которые культивируют в лаборатории, в специальном лабораторном устройстве.
Соответственно, в бумажной промышленности существует потребность в более эффективных способах мониторинга образования бактериальной слизи.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей настоящего изобретения является обеспечение нового способа обнаружения микроорганизмов, который включал бы эффективные и быстрые средства для мониторинга микробиологического состояния в процессе производства бумаги или картона.
Следующей задачей настоящего изобретения является обеспечение способа обнаружения, который можно было бы использовать для селективного мониторинга микробов, образующих биопленку, которые оказывают вредные воздействия в процессе производства бумаги, и который можно было бы использовать для скрининга наиболее активных агентов, противодействующих образованию биопленок, образующихся в условиях конкретного производственного процесса.
Следующей задачей настоящего изобретения является обеспечение набора средств, который очень хорошо подходил бы для осуществления способа обнаружения согласно настоящему изобретению на производственном участке.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На чертеже представлена одна из предпочтительных форм осуществления устройства для отбора проб и устройства для обработки/культивирования бактерий согласно настоящему изобретению, использованная в примере.
СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы изобретения обнаружили, что биопленка может формироваться in situ в процессе изготовления бумаги и картона на поверхности устройства для отбора проб и что образовавшуюся биопленку можно проанализировать, если это желательно, прямо на указанной поверхности на присутствие и количество вредных образующих биопленку микроорганизмов, более конкретно - первичных микроорганизмов, образующих биопленку. Таким образом, в настоящем изобретении биопленку, образовавшуюся in situ, не нужно удалять с поверхности устройства для отбора проб.
Кроме того, авторы изобретения разработали способ обнаружения присутствия микробов в биопленке, образовавшейся на поверхности устройства для отбора проб. Этот способ является более быстрым, чем использующиеся в настоящее время способы, основанные на культивировании микробов, и который можно использовать для обнаружения фактических биопленкообразователей на конкретном производственном участке и для выбора наиболее эффективного агента, противодействующего образованию биопленки, и эффективной концентрации этого агента для борьбы с существующей биопленкой на этом производственном участке.
Разработанный способ можно использовать для текущего контроля за потребностью в агенте, противодействующем образованию биопленки, в процессе производства бумаги или картона, то есть для контроля за тем, требуется ли этот агент, необходимо ли добавить дополнительное количество этого агента и/или какое эффективное/оптимальное количество агента необходимо добавить.
Отличительные признаки настоящего изобретения определены в формуле изобретения, приведенной ниже.
Соответственно, изобретение предусматривает способ обнаружения микробного роста в процессе производства бумаги или картона для определения потребности в агенте, противодействующем образованию биопленки, в этом процессе. Способ включает в себя следующие стадии:
(а) помещения устройства для отбора проб в технологическую линию на определенный период времени, например на период от 3 часов до 7 дней, предпочтительно от 12 часов до 3 дней, для обеспечения возможности образования микроорганизмами биопленки in situ в технологическом процессе на поверхности устройства для отбора проб,
(б) факультативной обработки образовавшейся биопленки, предпочтительно - поверхности устройства для отбора проб с находящейся на ней биопленкой, раствором испытываемого агента, противодействующего образованию биопленки, в течение определенного периода времени, например от 10 минут до 4 часов, предпочтительно в течение 1-2 часов, при температуре в диапазоне от температуры окружающей среды до 65°С, например при 35-65°С, предпочтительно при 40-60°С, более предпочтительно при температуре, имеющейся в месте отбора проб в технологической линии, например при 40-60°С,
в) обеспечения контакта биопленки, предпочтительно поверхности устройства для отбора проб с находящейся на ней биопленкой, с жидкой культуральной средой, находящейся в углублении устройства для культивирования микроорганизмов, в течение определенного периода времени, например в течение 8-48 часов, предпочтительно 8-24 часов, более предпочтительно в течение 16-20 часов, при температуре в диапазоне от температуры окружающей среды до 65°С, например при 35-65°С, предпочтительно при 40-60°С, более предпочтительно при температуре, имеющейся в месте отбора проб в технологической линии, например при 40-60°С,
г) удаления культуральной среды и (в том случае, если биопленка сохранилась на поверхности устройства для отбора проб) устройства для отбора проб из углубления устройства и качественного и/или количественного определения присутствия или отсутствия биопленки на стенках углубления.
Что касается используемых терминов, то в контексте настоящего изобретения термины «процесс изготовления бумаги или картона» и «технологическая линия» охватывают технологические линии влажных производственных процессов обработки сырьевых материалов в бумажной промышленности, процесса варки целлюлозы, процесса сушки целлюлозной пульпы, фактического процесса изготовления бумаги и картона и оборудование этих технологических линий, включая машины для изготовления бумаги и картона. Машины для изготовления бумаги и картона следует понимать, как машины, включающие влажную часть с сеточной секцией и сушильной секцией.
Устройство для отбора проб можно поместить в любое место в технологических линиях, включая влажную часть машин для изготовления бумаги и картона и сухую часть технологических линий. Кроме того, средой, воздействующей на устройство для отбора проб, может быть любая технологическая среда, включая технологические воды, суспензии целлюлозы, циркуляционные и сточные воды, сырьевые материалы, реагенты, промежуточные продукты и т.д. Устройство может быть погружено в потоки жидкости или помещено в зону, куда попадают брызги из технологической линии.
Кроме того, устройство для отбора проб может содержать приспособления для фиксации его, например, на поверхности оборудования для производства бумаги, например в резервуаре с технологической водой в машине для производства бумаги. Альтернативно места отбора проб в технологической линии могут быть оборудованы монтажными средствами, в которых устройство для отбора проб может быть зафиксировано на период образования биопленки на его поверхности. Время, необходимое для формирования биопленки на поверхности устройства в ходе процесса, зависит от участка технологической линии и от типа процесса, и оно может быть соответственно выбрано специалистом в данной области техники. Например, если устройство находится в сеточной секции нейтральной машины для производства бумаги, время экспозиции (воздействия) составляет 12-48 часов в зависимости от чистоты машины, то есть времени, прошедшего от последней остановки и промывки.
После удаления устройства для отбора проб из процесса поверхность, которая была экспонирована для образования биопленки, можно, по выбору, сполоснуть или промыть для удаления рыхлого материала.
В предпочтительной форме осуществления изобретения образовавшуюся биопленку подвергают факультативной стадии обработки (б) и стадии культивирования (в), пока она находится на месте, то есть прикреплена к поверхности устройства для отбора проб.
Предпочтительно способ включает стадию обработки (б) одним или несколькими испытываемыми агентами, противодействующими образованию биопленки, с целью выбора наиболее эффективного агента в наиболее эффективной концентрации.
Стадию обработки (б) предпочтительно осуществляют посредством погружения поверхности устройства для отбора проб с находящейся на нем биопленкой в раствор, который содержит испытываемый агент, противодействующий образованию биопленки. Обработку можно провести в устройстве для проведения обработки, которое имеет углубление, заполненное раствором, содержащим испытываемый агент, противодействующий образованию биопленки. Испытываемый агент растворяют в растворе, который предпочтительно является жидкой культуральной средой, стерилизованной водой и/или технологической водой. Обработку предпочтительно производят посредством встряхивания устройства для обработки в стандартном встряхивателе, например с частотой в диапазоне 150-250 об/мин, в течение периода времени и при температуре, которые определены выше. После стадии обработки поверхность соответствующим образом промывают, например, стерильной водой. Предпочтительно предусматривается также образец для сравнения, который получают в том же месте, где была взята первая проба, и который обрабатывают тем же раствором, но без испытываемых агентов, противодействующих образованию биопленки.
В данном способе предпочтительно одно или несколько испытываемых агентов, противодействующих образованию биопленки, которые испытывают в различных концентрациях для определения их эффективности в отношении микробов, образующих биопленку, присутствующих в контролируемом процессе, и для определения концентрации агента, пригодной/оптимальной для использования на данном технологическом участке. В случае испытания нескольких агентов, противодействующих образованию биопленки/концентраций можно использовать несколько устройств для отбора проб, которые помещают на одном и том же участке технологической линии, причем каждое устройство предназначено для одного агента в одной концентрации. Более предпочтительно устройство для отбора проб имеет несколько отдельных поверхностей, причем каждую отдельную поверхность можно обработать на стадии (б) одним агентом, противодействующим образованию биопленки, в одной концентрации и культивировать отдельно на стадии (в). Кроме того, в характерном случае, на стадии (б) одно или несколько устройств или одну, или несколько поверхностей оставляют необработанными испытываемым агентом в качестве контрольных образцов, то есть образцов, обработанных чистым раствором. Стадия обработки (б) согласно настоящему изобретению обеспечивает надежную информацию об эффективности испытываемых агентов, противодействующих образованию биопленки, в отношении вредных биопленок, образующихся в ходе производственного процесса, поскольку испытание сфокусировано на истинных образующих биопленку микробах в процессе их размножения в биопленке, то есть на предварительно выращенной биопленке.
После факультативной стадии обработки (б) и перед стадией культивирования (в) обработанные биопленки можно сполоснуть или промыть. Культивирование факультативно обработанных биопленок производят в устройстве для культивирования, имеющем углубление, которое заполнено жидкой культуральной средой, предпочтительно посредством погружения указанной поверхности устройства для отбора проб с находящейся на ней факультативно обработанной пленкой в указанный раствор. Время и температура, используемые на стадии культивирования, являются, например, такими, как определено выше. В предпочтительной форме осуществления изобретения стадию культивирования осуществляют посредством встряхивания, например в стандартном встряхивателе, например с частотой 150-260 об/мин, поскольку было показано, что встряхивание очень полезно для образования биопленки. Встряхиватель может быть оборудован нагревателями для обеспечения желаемой температуры. Стадию (в) используют для образования на стенках устройства биопленки, которую можно затем окрасить на следующей стадии (г) для качественного и/или количественного обнаружения присутствия или отсутствия микробов, образующих биопленку, в месте отбора пробы в технологической линии. Предпочтительно способ включает в себя стадию обработки (б), поскольку эта стадия позволяет определить количество образующих биопленку микробов, которые выживают после стадии обработки агентом, противодействующим образованию биопленки.
Соответственно, после стадии культивирования культуральную среду и (в том случае, если биопленку обрабатывали на месте, то есть на поверхности устройства для отбора проб, в ходе факультативной стадии (б) и следующей стадии (в)) устройство для отбора проб удаляют из углубления устройства для культивирования микробов на стадии (г), углубление факультативно промывают, предпочтительно стерильной водой, для удаления рыхлого материала, окрашивают образующие биопленку микроорганизмы, связанные со стенками углубления, и присутствие и/или интенсивность окрашивания в углублении определяют качественно, например визуально, или количественно, например спектрофотометрически, способами, известными в данной области техники. Подходящими красителями являются любые стандартные красители, пригодные для окрашивания биопленок, например:
- общие красители для выявления биомассы, такие как кристаллвиолет или сафранин,
- красители для определения числа клеток, такие как акридиновый оранжевый, этидия бромид, DAPI, SYTO16 или другие красители для выявления нуклеиновых кислот,
- красители для определения жизнеспособности микробных клеток, такие как LIVE/DEAD™, CTC или различные тетразолиевые соединения,
- функционально специфичные флуоресцентные красители, такие как флуоресцирующие субстраты ферментов для выявления активности в отношении расщепления крахмала, хитиназной активности, эстеразной активности, активности в отношении гидролиза сложных эфиров липидов или фосфатазной активности.
В предпочтительной форме осуществления способа согласно настоящему изобретению устройство для отбора проб содержит несколько удлиненных выступов, опирающихся на опору, т.е. соединенных с ней, при этом, если устройство помещено в технологический процесс, биопленка одинаково образуется на всех поверхностях выступов. Материалом для этих выступов может быть, например, нержавеющая сталь, пластмассы, например полистирол, или керамика. Более предпочтительным материалом является нержавеющая сталь. В указанной форме осуществления изобретения устройство для факультативной обработки также оборудовано несколькими углублениями для растворов, содержащих одно или несколько испытываемых агентов, противодействующих образованию биопленки в одной или нескольких концентрациях, причем каждое углубление содержит один испытываемый агент в одной концентрации, и для раствора, не содержащего испытываемого агента (для контроля), так что выступы устройства для отбора проб можно погрузить в углубления (один выступ - в одно углубление) после удаления устройства для отбора проб из места отбора проб в технологической линии. В указанной форме осуществления изобретения устройство для культивирования микроорганизмов также содержит несколько углублений, содержащих культуральную среду, так что выступы устройства для отбора проб, факультативно обработанные на стадии (б), можно погрузить в раствор, содержащийся в углублениях устройства для культивирования микроорганизмов, причем один выступ попадает в одно углубление.
Биопленки, образовавшейся на поверхности выступов, неожиданно оказалось достаточно для осуществления способа согласно настоящему изобретению, и такое устройство имеет дополнительное преимущество, состоящее в том, что не требуется удаления биопленки с выступов, что упрощает и ускоряет процесс определения. Основным преимуществом данной простой в использовании формы осуществления изобретения является то, что одновременно можно исследовать несколько различных агентов, противодействующих образованию биопленки на нескольких сходных биопленках, предварительно выращенных в реальных условиях производственного процесса.
Кроме того, согласно настоящему изобретению можно исследовать влияние агентов, противодействующих образованию биопленки на реальные образующие биопленку микробы, присутствующие в месте отбора проб из технологической линии, в состоянии реального размножения с образованием биопленки, за счет чего могут быть получены более достоверные результаты относительно эффективности испытываемых агентов.
Предпочтительное устройство для отбора проб может быть любой системой, в которой удлиненные выступы зафиксированы одним концом на опоре, предпочтительно - на плоской опоре. Размер устройства для отбора проб не ограничен, и он может быть различным в зависимости от выбранного места отбора проб в производственном процессе и системы анализа. В следующей предпочтительной форме осуществления изобретения устройство для отбора проб содержит несколько штырей или штифтов, расположенных рядами и зафиксированных с одного конца на опорной пластине, а устройство для обработки во время факультативной стадии (б) и устройство для культивирования микроорганизмов на стадии (в) являются планшетами, снабженными несколькими лунками, расположенными рядами и приспособленными для приема одного выступающего штыря или штифта в одну лунку, так что каждый штырь/штифт устройства для отбора проб расположен в одной лунке планшета для обработки или планшета устройства для культивирования микробов. Предпочтительно, устройства для отбора проб являются крышками, оборудованными рядами штырей/штифтов, прочно на них укрепленными, так что эти крышки можно использовать, например, совместно с коммерчески доступными многолуночными планшетами, такими как 6-, 12- или 24-луночные планшеты, предпочтительно - 12-луночные планшеты, такие как 12-луночные полистироловые планшеты, в качестве устройства для обработки (б) и устройства для культивирования микроорганизмов (в). Естественно, что желательно выбрать такое количество лунок и рядов лунок на планшетах для обработки и культивирования микроорганизмов, которое соответствует количеству штырей/штифтов и их рядов на крышке, чтобы, когда крышка будет надета на многолуночный планшет, каждый штырь/штифт находился в одной лунке планшета. Таким образом, во время стадий обработки и культивирования один конец штырей/штифтов погружен в жидкую среду, содержащуюся в лунках планшета, тогда как второй конец зафиксирован на крышке.
Было обнаружено, что устройство для отбора проб, например крышка со штырями/штифтами, очень удобно для получения биопленок in situ в процессе производства бумаги или картона. Также было обнаружено, что для устройства для отбора проб согласно настоящему изобретению, находящегося в производственной линии, не требуется покрытие/оболочка, поскольку можно разместить устройство так, что его выступы будут экспонированы процессу, то есть выступы будут находиться в прямом контакте с условиями производственного процесса, например с потоками или брызгами технологических вод.
Развитие биопленки из первичных образующих биопленку микробов на устройстве для отбора проб можно обнаружить уже через 12-48 часов. Эффективность агентов, противодействующих образованию биопленки, в отношении предварительно выращенных биопленок можно исследовать уже через 18 часов. Поэтому способ согласно настоящему изобретению обеспечивает возможность быстрого реагирования на любые изменения в росте биопленки в ходе производственного процесса и на любые проблемные ситуации, уже возникшие из-за указанных организмов в способах согласно современному уровню техники.
Соответственно в одной из предпочтительных форм осуществления изобретения осуществляется непрерывный мониторинг в одной или нескольких точках производственного процесса, при этом необходимость принятия мер, например, необходимость добавления агента, противодействующего образованию биопленки, или добавления дополнительного количества агента, тип и эффективное количество такого агента, может быть определена без ненужных задержек, очевидных при использовании способов согласно современному уровню техники. По этим же причинам можно оптимизировать добавление агентов, противодействующих образованию биопленки, и предсказать, а значит, и предотвратить серьезные нарушения производственного процесса.
По выбору выступы на устройстве для отбора проб можно использовать в качестве исходной точки для выделения первичных микроорганизмов, образующих биопленку. По выбору можно также окрасить выступы устройства для отбора проб и количественно оценить развитие биопленки во время экспозиции условиям производственного процесса.
Изобретение также предусматривает набор для определения наличия микроорганизмов, образующих биопленку, в процессе производства бумаги или картона и для определения потребности в агенте, противодействующем образованию биопленки в ходе процесса и, факультативно, для выбора наиболее эффективного агента. Набор содержит, по меньшей мере, комбинацию из:
(i) устройства для отбора проб, содержащего несколько удлиненных выступов, соединенных с опорой, для обеспечения возможности образования микроорганизмами биопленки in situ в процессе на поверхности пробоотборника,
(ii) факультативно - устройства для обработки, содержащего планшет, оборудованный несколькими углублениями, приспособленными для помещения одного выступа устройства для отбора проб в одно углубление планшета,
(iii) устройства для культивирования микроорганизмов, содержащего планшет, оборудованный несколькими углублениями, приспособленными для помещения одного выступа устройства для отбора проб в одно углубление планшета,
(iv) встряхивателя для встряхивания устройства для обработки и/или устройства для культивирования микроорганизмов,
(v) факультативно - детектора для выявления присутствия или отсутствия окрашенных микробов, связанных с поверхностью углублений устройства для культивирования микроорганизмов, и
(vi) реагентов, включающих
(а) один или несколько испытываемых агентов, противодействующих образованию биопленки, подходящих для использования в бумажной промышленности, предпочтительно в одном или нескольких разведениях,
(б) жидкую культуральную среду,
(в) краситель, и
(г) факультативно, промывочный раствор, например стерильную воду.
Предпочтительно набор содержит: (i) пробоотборник, который представляет собой крышку, оборудованную несколькими рядами штырей или штифтов, одним концом закрепленных на крышке, (ii) устройство для обработки и (iii) устройство для культивирования микроорганизмов, которые оба являются многолуночными планшетами, снабженными несколькими рядами лунок, причем штыри/штифты устройства для отбора проб попадают в лунки планшетов для обработки или культивирования микроорганизмов (один штырь - в одну лунку), когда крышку для отбора проб помещают на планшет для обработки или культивирования микроорганизмов. Такие устройства описаны выше.
Кроме того, в одной из форм осуществления: (ii) лунки планшета для обработки предварительно заполнены растворами одного или нескольких агентов, противодействующих образованию биопленки в одной или нескольких концентрациях в жидкой культуральной среде или стерилизованной воде (по одному испытываемому агенту в каждой лунке), при этом, по меньшей мере, одна лунка предварительно заполнена только культуральной средой или стерилизованной водой (контрольная лунка) и (iii) лунки планшета для культивирования микроорганизмов предварительно заполнены жидкой культуральной средой, при этом лунки герметично закрыты съемной крышкой, например фольгой.
Термин «агент, противодействующий образованию биопленки» при использовании в контексте настоящего изобретения обозначает любое средство, которое ингибирует размножение микроорганизмов или предотвращает его. Предпочтительным агентом, противодействующим образованию биопленки, является средство, подходящее для ингибирования роста и образования биопленки биопленкообразующими микроорганизмами, встречающимися в бумажной промышленности, и более предпочтительно ингибирование роста первичных биопленкообразующих микроорганизмов, встречающихся в бумажной промышленности, например Deinococcus geothermalis и/или других первичных биопленкообразующих микроорганизмов, указанных выше. Примеры агентов, противодействующих образованию биопленки, включают коммерчески доступные биоцидные химикаты, такие как 2,2-дибромо-3-нитрилопропионамид (DBNPA) и метилендитиоцианат (МВТ), а также агенты, противодействующие образованию биопленки, растительного происхождения, чистые соединения и экстракты, например перечисленные в заявках на патенты FI 20021986 и FI 20021987, указанных выше, предпочтительно фенольные соединения, например октилгаллат и лаурилгаллат, бетулин и флавонолы, например пентагидроксифлавон и тригидроксифлавон. Термин «испытываемый агент, противодействующий образованию биопленки» при использовании в контексте настоящего изобретения означает один агент, например соединение, смесь двух или нескольких агентов, например любую комбинацию соединений для совместного испытания и использования, или экстракт, например растительный экстракт. Испытываемый агент, противодействующий образованию биопленки, предпочтительно растворяют в водном растворе, как описано выше.
Культуральная среда представляет собой раствор, и она может быть выбрана, например, из коммерчески доступных водных культуральных сред, подходящих для микробов, особенно для биопленкообразующих микроорганизмов, встречающихся в бумажной промышленности, таких как R2-бульон (который можно приобрести, например, в компании Difco), или из стерилизованных технологических вод из машин для изготовления бумаги или картона, предпочтительно содержащих добавленные в них питательные вещества.
Часть реагентов может быть расфасована в контейнеры, содержащие несколько доз, например во флаконы, или в контейнеры, содержащие одну дозу, или они могут быть заранее залиты в углубления устройств, как описано выше.
Подходящие красители для включения в набор включают любые стандартные красители, пригодные для окрашивания биопленок, например красители, перечисленные выше. Также может быть предусмотрен реагент, например этанол, для растворения красителей, находящихся в углублениях, если набор предназначен для количественного определения.
Набор также может включать в себя, например, встряхиватель, пригодный для встряхивания планшетов для обработки и/или культивирования, этот встряхиватель предпочтительно может быть оборудован нагревательной системой для инкубации планшетов, например во время стадии обработки и/или культивирования. Также в набор может быть включен детектор, например устройство для считывания с многолуночных планшетов для измерений оптической плотности или флуоресценции. Тип детектора зависит от способа окрашивания, использованного для окрашивания микробов биопленки. Также в набор могут быть включены пипетки.
ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данном эксперименте пример осуществления устройства для отбора проб согласно настоящему изобретению использован для иллюстрации способа согласно настоящему изобретению, предназначенного для определения воздействия нескольких агентов, противодействующих образованию биопленки, в отношении инактивации биопленок, образующихся в машине для изготовления бумаги.
В этом примере устройство для отбора проб содержит 12 штифтов из нержавеющей стали, закрепленных одним концом на крышке из нержавеющей стали. Крышка со штифтами изображена на чертеже вместе с планшетом для обработки, содержащим 12 лунок, приспособленных для помещения в них штифтов в том случае, когда крышка надета на планшет. Крышка была сконструирована так, чтобы она соответствовала коммерчески доступным 12-луночным планшетам из полистирола.
Три крышки для отбора проб погрузили в бункер с прозрачным фильтратом машины для изготовления нейтральной тонкой бумаги и оставили их висеть погруженными в фильтрат при температуре технологической воды, равной 52°С, в течение 68 часов. Затем крышки вынули, промыли один раз стерилизованной водопроводной водой и надели каждую крышку на 12-луночный планшет для обработки, так что штифты с биопленками, образовавшимися in situ в технологическом процессе на поверхности этих штифтов, оказались погруженными в раствор для обработки, находившийся внутри лунок (один штифт - одна лунка), тогда как с другого конца их удерживала крышка.
Каждая лунка планшета для обработки содержала 3,5 мл стерилизованной водопроводной воды (контрольные пробы) или 3,5 мл стерилизованной водопроводной воды и агента, противодействующего образованию биопленки, в концентрации от 1 до 50 промилле (активное вещество). Был использован максимальный объем лунок, так что почти вся длина штифтов подвергалась воздействию агентов (растворов для обработки). Испытываемыми агентами, противодействующими образованию биопленки, были BCDMH (бром-хлор-5,5-диметилгидантоин), смесь 5-хлоро-2-метил-4-изотиазолин-3-она и 2-метил-4-изотиазолин-3-она, THPS (тетракис(гидроксиметил)фосфония сульфат), DBNPA (2,2-дибромо-2-цианоацетамид), глутаровый альдегид, МВТ (метилен-ди(тиоцианат)), BNPD (бромо-2-нитропропан-1,3-диол); все эти вещества являются коммерчески доступными.
Стадия антибиопленочной обработки была проведена посредством инкубации планшетов с находящимися на них крышками при 52°С в течение 2 часов. После стадии обработки крышки снимали с планшетов и промывали три раза стерилизованной водопроводной водой, после чего их помещали на 12-луночные планшеты для культивирования микроорганизмов, которые были аналогичны планшетам, использованным для обработки, но лунки содержали по 2,5 мл стерильного R2-бульона (Difco). Планшеты для культивирования (планшет + крышка со штифтами, погруженными в лунки) встряхивали с частотой 250 об/мин при 52°С в течение 17 часов.
В заключение штифты и культуральную среду удаляли из лунок, лунки промывали один раз водопроводной водой, а микробы, связанные со стенками лунок, окрашивали сафранином. Объем биопленки, образованной микробами, выжившими после стадии обработки агентами, противодействующими образованию биопленки, оценивали визуально.
Соответственно в данном эксперименте DBNPA, BCDMH, THPS и глутаровый альдегид убивали микроорганизмы или удаляли биопленку с поверхности штифтов, так что во время стадии культивирования не образовывалось новой биопленки. Тем не менее после обработки биопленки, находящейся на поверхности штифтов, смесью изотиазолонов, МВТ или BNPD обработанная биопленка все еще была способна образовывать новую биопленку на поверхности ячеек устройства для культивирования во время стадии культивирования. Предотвращения повторного образования новой биопленки на стадии культивирования при минимальной концентрации агента, противодействующего образованию биопленки, удалось добиться при концентрации DBNPA, равной 5 промилле.