ФЕРМЕНТЫ ЛАКТАЗЫ С УЛУЧШЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ

1. Пептид, проявляющий повышенную ферментативную активность бета-галактозидазы по сравнению с пептидом SEQ ID NO: 35, где:
(а) активность бета-галактозидазы определяют путем инкубации 13 мкл раствора, содержащего известное количество очищенного фермента лактазы, и 37 мкл раствора, содержащего 140 мМ лактозы, при рН 6,7 и 37°С в течение 10 мин, завершения реакции с лактазой путем нагревания, определения количества образовавшейся глюкозы путем инкубации продукта реакции при 30°С в течение 40 мин с 80 мкл раствора, содержащего глюкозооксидазу (0,6 г/л), диаммониевую соль 2,2'-азино-бис(3-этилбензолтиазолин-6-сульфокислоты) (1,0 г/л ABTS) и пероксидазу хрена (0,02 г/л), и определения оптической плотности при 610 нм с помощью флуоресцентного фотометра;
(б) повышение ферментативной активности бета-галактозидазы по сравнению с пептидом SEQ ID NO: 35 составляет по меньшей мере 20%.
2. Пептид по п. 1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 22, 33, 14, 13, 19, 7, 9, 11, 26 и 27, 30 и 1, или имеющий идентичность аминокислотной последовательности более 85% с любой из этих последовательностей.
3. Пептид, проявляющий ферментативную активность бета-галактозидазы, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, или его обладающие ферментативной активностью фрагменты, или аминокислотная последовательность любого из них, имеющая не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 аминокислотных замен, добавлений или делеций.
4. Димерный пептид, проявляющий ферментативную активность бета-галактозидазы, который состоит из двух пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2 и 3; 5 и 6; 20 и 21; 23 и 24; 26 и 27; или 28 и 29, или его обладающие ферментативной активностью фрагменты, или аминокислотная последовательность любого из них, имеющая не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 аминокислотных замен, добавлений или делеций.
5. Применение пептида или димерного пептида, проявляющего ферментативную активность бета-галактозидазы, по любому из пп. 1-4 для получения молочного продукта с пониженным содержанием лактозы.
6. Способ снижения содержания лактозы в композиции, содержащей лактозу, такой как молочный продукт, включая субстрат на молочной основе, включающий стадию приведения указанной композиции в контакт с пептидом или димерным пептидом, проявляющим ферментативную активность бета-галактозидазы, по любому из пп. 1-4; или с клеткой-хозяином, экспрессирующей любой из указанных пептида или димерного пептида, при рН в диапазоне 3-10 и при температуре в диапазоне 0-140°С.
7. Способ получения молочного продукта, включающий стадии
а) обеспечения содержащего лактозу субстрата на молочной основе;
б) добавления пептида или димерного пептида, проявляющего ферментативную активность бета-галактозидазы, по любому из пп. 1-4 к указанному содержащему лактозу субстрату на молочной основе; и
в) обработки указанного субстрата на молочной основе указанным пептидом или димерным пептидом, проявляющим активность бета-галактозидазы.
8. Способ по п. 7, где стадию (в) осуществляют при рН в диапазоне 3-10, например, в диапазоне 3-9, например, в диапазоне 3-8, например, в диапазоне 3-7, например, в диапазоне 3-6, например, в диапазоне 3-5, например, в диапазоне 3-4, например, в диапазоне 4-10, например, в диапазоне 4-9, например, в диапазоне 4-8, например, в диапазоне 4-7, например, в диапазоне 4-6, например, в диапазоне 4-5, например, в диапазоне 5-10, например, в диапазоне 5-9, например, в диапазоне 5-8, например, в диапазоне 5-7, например, в диапазоне 5-6, например, в диапазоне 6-10, например, в диапазоне 6-9, например, в диапазоне 6-8, например, в диапазоне 6-7.
9. Способ по любому одному из пп. 7 или 8, где стадию (в) или часть стадии (в) осуществляют при температуре не более чем примерно 25°С, например, не более чем примерно 20°С, например, не более чем примерно 18°С, например, не более чем примерно 16°С, например, не более чем примерно 14°С, например, не более чем примерно 12°С, например, не более чем примерно 10°С, например, не более чем примерно 8°С, например, не более чем примерно 7°С, например, не более чем примерно 6°С, например, не более чем примерно 5°С, например, не более чем примерно 4°С, например, не более чем примерно 3°С, например, не более чем примерно 2°С.
10. Способ по любому из пп. 7-9, где стадию (в) или часть стадии (в) осуществляют при температуре по меньшей мере примерно 25°С, например, по меньшей мере примерно 30°С, например, по меньшей мере примерно 35°С, например, по меньшей мере примерно 40°С, например, по меньшей мере примерно 45°С, например, по меньшей мере примерно 50°С, например, по меньшей мере примерно 55°С, например, по меньшей мере примерно 60°С, например, по меньшей мере примерно 65°С, например, по меньшей мере примерно 70°С, например, по меньшей мере примерно 75°С, например, по меньшей мере примерно 80°С, например, по меньшей мере примерно 85°С, например, по меньшей мере примерно 90°С, например, по меньшей мере примерно 95°С, например, по меньшей мере примерно 100°С, например, по меньшей мере примерно 110°С, например, по меньшей мере примерно 120°С, например, по меньшей мере примерно 130°С, например, по меньшей мере примерно 135°С, например, по меньшей мере примерно 140°С.
11. Способ по любому из пп. 6-10, где:
(а) пептид, проявляющий ферментативную активность бета-галактозидазы, имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 22, 33, 14, 7, 26, 27, 30 и 1, или имеет идентичность аминокислотной последовательности более 85% с любой из этих последовательностей; и
(б) пептид проявляет повышенную ферментативную активность бета-галактозидазы по сравнению с пептидом SEQ ID NO: 35, где:
(1) активность бета-галактозидазы определяют путем инкубации 13 мкл раствора, содержащего известное количество очищенного фермента лактазы, и 37 мкл раствора, содержащего 140 мМ лактозы, при рН 6,7 и 37°С в течение 10 мин, завершения реакции с лактазой путем нагревания, определения количества образовавшейся глюкозы путем инкубации продукта реакции при 30°С в течение 40 мин с 80 мкл раствора, содержащего глюкозооксидазу (0,6 г/л), диаммониевую соль 2,2'-азино-бис(3-этилбензолтиазолин-6-сульфокислоты) (1,0 г/л ABTS) и пероксидазу хрена (0,02 г/л), и определения оптической плотности при 610 нм с помощью спектрофотометра;
(2) повышение ферментативной активности бета-галактозидазы по сравнению с пептидом SEQ ID NO: 35 составляет по меньшей мере 20%; и
(в) стадию приведения композиции, содержащей лактозу, в контакт с пептидом или димерным пептидом, проявляющим ферментативную активность бета-галактозидазы, выполняют при температуре от 50°С до 140°С.
12. Способ по любому из пп. 6-11, посредством которого концентрацию лактозы в композиции, содержащей лактозу, или в субстрате на молочной основе снижают до менее 0,2%, предпочтительно до менее 0,1%.
13. Способ по любому из пп. 6-12, где концентрацию менее 0,2% лактозы в композиции, содержащей лактозу, или субстрате на молочной основе получают в течение периода от 3 до 30 минут, предпочтительно от 4 до 20 минут, наиболее предпочтительно от 4 до 10 минут после добавления пептида, проявляющего ферментативную активность бета-галактозидазы.
14. Способ по любому из пп. 6-13, где пептид, проявляющий активность бета-галактозидазы, добавляют к композиции, содержащей лактозу, так чтобы получить смесь, содержащую концентрацию лактазы от 0,001 до 0,2 мг/мл, предпочтительно концентрацию лактазы от 0,002 до 0,04 мг/мл.
15. Способ по любому из пп. 6-14, где стадию приведения композиции, содержащей лактозу, в контакт с пептидом или димерным пептидом, проявляющим ферментативную активность бета-галактозидазы, проводят при температуре от 50°С до 140°С в течение периода времени от 4 до 20 минут, и где продукт на молочной основе затем охлаждают и хранят до дальнейшего использования при температуре от 1°С до комнатной температуры, предпочтительно от 1°С до 6°С.