ОПТИМИЗИРОВАННЫЕ ГЕНЫ И ЭКСПРЕССИОННЫЕ КАССЕТЫ МИНИ-ДИСТРОФИНА, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

1. Полинуклеотид, кодирующий белок мини-дистрофин, где полинуклеотид содержит:
(a) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей;
(b) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2 или нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 90% идентична ей; или
(c) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3 или нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 90% идентична ей.
2. Полинуклеотид по п. 1, где белок мини-дистрофин, кодируемый полинуклеотидом, состоит в основном из N-конца, актин-связывающего домена (ABD), шарнира H1, стержней R1 и R2, шарнира H3, стержней R22, R23 и R24, шарнира H4, CR домена и части CT домена мышечного белка дистрофина человека дикого типа.
3. Полинуклеотид по п. 1, где белок мини-дистрофин, кодируемый полинуклеотидом, состоит в основном из N-конца, ABD, шарнира H1, стержней R1 и R2, стержней R22, R23 и R24, шарнира H4, CR домена и части CT домена мышечного белка дистрофина человека дикого типа.
4. Полинуклеотид по любому из пп. 1-3, где белок мини-дистрофин не содержит последние три аминокислотных остатка на C-конце мышечного белка дистрофина человека дикого типа.
5. Полинуклеотид по любому из пп. 1-4, кодирующий белок мини-дистрофин, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 90% идентична ей.
6. Полинуклеотид по любому из пп. 1-4, кодирующий белок мини-дистрофин, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 90% идентична ей.
7. Полинуклеотид по любому из пп. 1-6, функционально связанный с промотором.
8. Полинуклеотид по п. 7, где промотор представляет собой специфический для мышц промотор.
9. Полинуклеотид по п. 7 или 8, где промотор представляет собой промотор креатинкиназы.
10. Полинуклеотид по п. 9, где промотор содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:4.
11. Полинуклеотид по п. 9, где промотор содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5.
12. Полинуклеотид по любому из пп. 1-11, функционально связанный с элементом полиаденилирования.
13. Полинуклеотид по п. 12, где элемент полиаденилирования содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:6.
14. Полинуклеотид по любому из пп. 1-13, где полинуклеотид является частью генной экспрессионной кассеты, содержащей промотор и элемент полиаденилирования.
15. Полинуклеотид по п. 14, где генная экспрессионная кассета содержит любую нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 9-12 или нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 90% идентична ей.
16. Вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пп. 1-15.
17. Вектор по п. 16, который представляет собой вирусный вектор.
18. Вектор по п. 17, который представляет собой аденоассоциированный вирусный (AAV) вектор.
19. Вектор по п. 18, который представляет собой AAV9 вектор.
20. Трансформированная клетка, содержащая полинуклеотид по любому из пп. 1-15 и/или вектор по любому из пп. 16-19.
21. Трансгенное животное, содержащее полинуклеотид по любому из пп. 1-15, вектор по любому из пп. 16-19 и/или трансформированную клетку по п. 20.
22. Белок мини-дистрофин, состоящий в основном из N-конца, ABD, шарнира H1, стержней R1 и R2, шарнира H3, стержней R22, R23 и R24, шарнира H4, CR домена и части CT домена мышечного белка дистрофина человека дикого типа,
где белок мини-дистрофин не содержит последние три аминокислотных остатка на C-конце мышечного белка дистрофина человека дикого типа.
23. Белок мини-дистрофин по п. 22, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 90% идентична ей.
24. Белок мини-дистрофин, состоящий в основном из N-конца, ABD, шарнира H1, стержней R1, R2, R22, R23 и R24, шарнира H4, CR домена и части CT домена мышечного белка дистрофина человека дикого типа.
25. Белок мини-дистрофин по п. 24, который не содержит последние три аминокислотных остатка на C-конце мышечного белка дистрофина человека дикого типа.
26. Белок мини-дистрофин по п. 24 или 25, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 90% идентична ей.
27. Способ получения белка мини-дистрофина в клетке, включающий приведение клетки в контакт с полинуклеотидом по любому из пп. 1-15 или вектором по любому из пп. 16-19, что приводит к продукции мини-дистрофина в клетке.
28. Способ получения белка мини-дистрофина в организме индивида, включающий доставку в организм индивида полинуклеотида по любому из пп. 1-15, вектора по любому из пп. 16-19 и/или трансформированной клетки по п. 20, что приводит к продукции белка мини-дистрофина в организме индивида.
29. Способ лечения мышечной дистрофии у индивида, который нуждается в этом, включающий доставку в организм индивида терапевтически эффективного количества полинуклеотида по любому из пп. 1-15, вектора по любому из пп. 16-19 и/или трансформированной клетки по п. 20, что приводит к лечению мышечной дистрофии у индивида.
30. Способ по п. 29, где мышечная дистрофия представляет собой мышечную дистрофию Дюшенна или мышечную дистрофию Беккера.
31. Рекомбинантная AAV частица, содержащая AAV капсид и векторный геном для экспрессии человеческого белка мини-дистрофина.
32. Рекомбинантная AAV частица по п. 31, отличающаяся тем, что AAV капсид получен из AAV9.
33. Рекомбинантная AAV частица по любому из пп. 31-32, отличающаяся тем, что указанный векторный геном содержит кодон-оптимизированную для экспрессии у человека последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный человеческий белок мини-дистрофин.
34. Рекомбинантная AAV частица по любому из пп. 31-33, где белок мини-дистрофин человека содержит следующие субдомены из полноразмерного человеческого белка дистрофина в направлении от амино-конца к карбокси-концу: N-концевой актин-связывающий домен, H1, R1, R2, H3, R22, R23, R24, H4, цистеин-богатый домен и часть карбокси-концевого домена, не содержащего последние 3 аминокислоты в человеческом мышечном дистрофине дикого типа.
35. Рекомбинантная AAV частица по любому из пп. 31-34, где N-концевой актин-связывающий домен состоит из аминокислотных остатков 1-240 SEQ ID NO:25; H1 состоит из аминокислотных остатков 253-327 SEQ ID NO:25; R1 состоит из аминокислотных остатков 337-447 SEQ ID NO:25; R2 состоит из аминокислотных остатков 448-556 SEQ ID NO:25; H3 состоит из аминокислотных остатков 2424-2470 SEQ ID NO:25; R22 состоит из аминокислотных остатков 2687-2802 SEQ ID NO:25; R23 состоит из аминокислотных остатков 2803-2931 SEQ ID NO:25; R24 состоит из аминокислотных остатков 2932-3040 SEQ ID NO:25; H4 состоит из аминокислотных остатков 3041-3112 SEQ ID NO:25; CR домен состоит из аминокислотных остатков 3113-3299 в SEQ ID NO:25; и часть CT домена состоит из аминокислотных остатков 3300-3408 SEQ ID NO:25.
36. Рекомбинантная AAV частица по любому из пп. 31-35, где белок мини-дистрофин человека содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7.
37. Рекомбинантная AAV частица по любому из пп. 33-36, в которой указанная кодон-оптимизированная для экспрессии у человека нуклеиновая кислота, кодирующая указанный белок мини-дистрофин человека, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1.
38. Рекомбинантная AAV частица по любому из пп. 31-37, в которой указанный векторный геном также содержит 5' AAV инвертированный концевой повтор (ITR) и 3' AAV ITR, фланкирующие указанную кодон-оптимизированную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный белок мини-дистрофин человека.
39. Рекомбинантная AAV частица по п. 38, в которой указанные AAV ITR представляют собой AAV2 ITR.
40. Рекомбинантная AAV частица по любому из пп. 33-39, в которой указанный векторный геном также содержит специфический для мышц транскрипционный регуляторный элемент, функционально связанный с указанной кодон-оптимизированной для экспрессии у человека последовательностью нуклеиновой кислоты.
41. Рекомбинантная AAV частица по п. 40, в которой указанный специфический для мышц транскрипционный регуляторный элемент расположен между 5' AAV2 ITR и кодон-оптимизированной для экспрессии у человека нуклеиновой кислотой, кодирующей белок мини-дистрофин человека.
42. Рекомбинантная AAV частица по любому из пп. 40-41, в которой указанный специфический для мышц транскрипционный регуляторный элемент получен из гена креатинкиназы человека или мыши.
43. Рекомбинантная AAV частица по любому из пп. 40-42, в которой указанный специфический для мышц транскрипционный регуляторный элемент содержит энхансер и промотор.
44. Рекомбинантная AAV частица по любому из пп. 40-43, в которой указанный специфический для мышц транскрипционный регуляторный элемент содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:16.
45. Рекомбинантная AAV частица по любому из пп. 38-44, в которой указанный векторный геном также содержит последовательность терминации транскрипции между 5'-концом кодон-оптимизированной нуклеиновой кислоты, кодирующей белок мини-дистрофин человека, и 3' ITR.
46. Рекомбинантная AAV частица по п. 45, в которой указанная последовательность терминации транскрипции содержит последовательность сигнала полиаденилирования.
47. Рекомбинантная AAV частица по любому из пп. 31-46, в которой указанный векторный геном содержит, в направлении от 5' к 3'-концу: первый AAV2 ITR, специфический для мышц транскрипционный регуляторный элемент, функционально связанный с кодон-оптимизированной для человека нуклеиновой кислотой, кодирующей человеческий белок мини-дистрофин, последовательность терминации транскрипции и второй AAV2 ITR.
48. Рекомбинантная AAV частица по п. 47, в которой указанный специфический для мышц транскрипционный регуляторный элемент содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:16.
49. Рекомбинантная AAV частица по любому из пп. 47-48, в которой указанная кодон-оптимизированная для человека последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную ей.
50. Рекомбинантная AAV частица по любому из пп. 47-49, в которой указанная последовательность терминации транскрипции содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:17.
51. Рекомбинантная AAV частица по любому из пп. 31-50, в которой указанный векторный геном содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:18 или ее обратный комплемент.
52. Рекомбинантная AAV частица по любому из пп. 31-50, в которой указанный векторный геном состоит в основном из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:18 или ее обратного комплемента.
53. Рекомбинантная AAV частица по любому из пп. 31-50, в которой указанный векторный геном состоит из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:18 или ее обратного комплемента.
54. Рекомбинантная AAV частица, содержащая AAV9 капсид и векторный геном, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:18 или ее обратный комплемент.
55. Рекомбинантная AAV частица, содержащая AAV9 капсид и векторный геном, состоящий в основном из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:18 или ее обратного комплемента.
56. Рекомбинантная AAV частица, содержащая AAV9 капсид и векторный геном, состоящий из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:18 или ее обратного комплемента.
57. Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантную AAV частицу по любому из пп. 31-56 и фармацевтически приемлемый носитель.
58. Способ лечения дистрофинопатии, включающий введение индивиду, который нуждается в этом, терапевтически эффективного количества композиции по п. 57.
59. Способ по п. 58, где указанная дистрофинопатия представляет собой мышечную дистрофию Дюшенна (DMD), мышечную дистрофию Беккера (BMD) или DMD-ассоциированную дилатационную кардиомиопатию.
60. Способ по п. 58 или п. 59, где указанный индивид является мужчиной или женщиной.
61. Способ по любому из пп. 58-60, где указанный индивид является ходячим, когда впервые получает лечение.
62. Способ по любому из пп. 58-61, где указанный индивид находится в возрасте 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 лет, когда впервые получает лечение.
12
12
12
12
12
12
12
12
12
13
13
13
13
13
13
13
13
13
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
63. Способ по любому из пп. 58-62, где дозу AAV частиц выбирают из группы, состоящей из: 1×10 вг/кг, 2×10 вг/кг, 3×10 вг/кг, 4×10 вг/кг, 5×10 вг/кг, 6×10 вг/кг, 7×10 вг/кг, 8×10 вг/кг, 9×10 вг/кг, 1×10 вг/кг, 2×10 вг/кг, 3×10 вг/кг, 4×10 вг/кг, 5×10 вг/кг, 6×10 вг/кг, 7×10 вг/кг, 8×10 вг/кг, 9×10 вг/кг, 1×10 вг/кг, 1,5×10 вг/кг, 2×10 вг/кг, 2,5×10 вг/кг, 3×10 вг/кг, 3,5×10 вг/кг, 4×10 вг/кг, 4,5×10 вг/кг, 5×10 вг/кг, 5,5×10 вг/кг, 6×10 вг/кг, 6,5×10 вг/кг, 7×10 вг/кг, 7,5×10 вг/кг, 8×10 вг/кг, 8,5×10 вг/кг и 9×10 вг/кг.
64. Способ по любому из пп. 58-63, которые являются эффективными для снижения средних уровней ALT, AST или LDH в крови у индивида до значений, примерно в 7, 6, 5, 4, 3 или 2 раза превышающих уровни ALT, AST или LDH в крови у здоровых контролей.
65. Способ по любому из пп. 58-64, которые являются эффективными для снижения среднего уровня общей CK в крови у индивида до значений, примерно в 50, 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 раза превышающих средний уровень общей CK в крови у здоровых контролей.
66. Способ по любому из пп. 58-63, которые являются эффективными для увеличения средней дистанции 6-минутной ходьбы (6MWD) у индивидов на по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 метров, в сравнении со средним показателем 6MWD у не получавших лечение контролей.
67. Способ по п. 66, где 6MWD у индивида определяют через 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 или 36 месяцев после введения вектора.
68. Способ по любому из пп. 58-63, которые являются эффективными для уменьшения среднего времени, необходимого индивиду для выполнения теста подъема на 4 ступени, на по меньшей мере 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3,0, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8 или 4,0 секунды, в сравнении с со средним временем у не получавших лечение контролей.
69. Способ по п. 68, где время, необходимое индивиду для подъема на 4 ступени, определяют через 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 или 36 месяцев после введения вектора.
70. Способ по любому из пп. 58-63, которые являются эффективными для уменьшения среднего количества индивидов, потерявших способность к самостоятельному передвижению, на по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% или 65% в сравнении со средним количеством не получавших лечение контролей, которые потеряли способность к самостоятельному передвижению.
71. Способ по п. 70, где способность к самостоятельному передвижению у индивидов определяют через 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 или 36 месяцев после введения вектора.
72. Способ по любому из пп. 58-63, которые являются эффективными для уменьшения среднего количества жировой фракции в нижних конечностях у индивида на по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% или 75% в сравнении с средним количеством жировой фракции в нижних конечностях у не получавших лечение контролей.
73. Способ по п. 72, где количество жировой фракции в нижних конечностях у индивида определяют через 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 или 36 месяцев после введения вектора.
74. Способ по любому из пп. 58-63, которые являются эффективными для индукции в по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90% скелетных мышечных волокон у индивида экспрессии указанного белка мини-дистрофина.
75. Способ по п. 74, где экспрессию белка мини-дистрофина в мышечных волокнах у индивида определяют через 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 или 36 месяцев после введения вектора.
76. Способ по любому из пп. 74-75, где скелетные мышечные волокна находятся в полученном при биопсии образце из двуглавой, дельтовидной или четырехглавой мышцы указанного индивида.
77. Способ по любому из пп. 58-76, которые вызывают клеточный иммунный ответ против указанного белка мини-дистрофина или мышечное воспаление у не более, чем примерно 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% индивидов.
78. Способ по п. 77, где наличие клеточного иммунного ответа против белка мини-дистрофина или мышечного воспаления определяют через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36 месяцев после введения вектора.
79. Способ по любому из пп. 58-78, где композицию вводят в сочетании с по меньшей мере вторым средством, эффективным для лечения дистрофинопатии.
80. Способ по п. 79, где указанное второе средство выбирают из группы, состоящей из антисмыслового олигонуклеотида, вызывающего пропуск экзона гена DMD, антитела против миостатина, средства, стимулирующего сквозное прохождение рибосомы через нонсенс-мутации, средства, подавляющего преждевременное образование стоп-кодонов, анаболического стероида или кортикостероида.
81. Применение рекомбинантной AAV (rAAV) частицы по любому из пп. 31-56 или применение композиции по п. 57 для получения лекарственного средства для лечения индивида, страдающего дистрофинопатией.
82. Применение rAAV частицы по любому из пп. 31-56 или композиции по п. 57 для лечения индивида, страдающего дистрофинопатией.
83. Применение по любому из п. 81 или п. 82, где указанная дистрофинопатия представляет собой мышечную дистрофию Дюшенна (DMD), мышечную дистрофию Беккера (BMD) или DMD-ассоциированную дилатационную кардиомиопатию.
84. Применение по любому из пп. 81-83, где указанный индивид является мужчиной или женщиной.
85. Применение по любому из пп. 81-84, где указанный индивид является ходячим, когда впервые получает лечение.
86. Применение по любому из пп. 81-85, где указанный индивид находится в возрасте 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 лет, когда впервые получает лечение.
12
12
12
12
12
12
12
12
12
13
13
13
13
13
13
13
13
13
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
87. Применение по любому из пп. 81-86, где дозу AAV частиц выбирают из группы, состоящей из: 1×10 вг/кг, 2×10 вг/кг, 3×10 вг/кг, 4×10 вг/кг, 5×10 вг/кг, 6×10 вг/кг, 7×10 вг/кг, 8×10 вг/кг, 9×10 вг/кг, 1×10 вг/кг, 2×10 вг/кг, 3×10 вг/кг, 4×10 вг/кг, 5×10 вг/кг, 6×10 вг/кг, 7×10 вг/кг, 8×10 вг/кг, 9×10 вг/кг, 1×10 вг/кг, 1,5×10 вг/кг, 2×10 вг/кг, 2,5×10 вг/кг, 3×10 вг/кг, 3,5×10 вг/кг, 4×10 вг/кг, 4,5×10 вг/кг, 5×10 вг/кг, 5,5×10 вг/кг, 6×10 вг/кг, 6,5×10 вг/кг, 7×10 вг/кг, 7,5×10 вг/кг, 8×10 вг/кг, 8,5×10 вг/кг и 9×10 вг/кг.
88. Применение по любому из пп. 81-87, которые являются эффективными для снижения средних уровней ALT, AST или LDH в крови у индивида до значений, примерно в 7, 6, 5, 4, 3 или 2 раза превышающих уровни ALT, AST или LDH в крови у здоровых контролей.
89. Применение по любому из пп. 81-88, которые являются эффективными для снижения среднего уровня общей CK в крови у индивида до значений, примерно в 50, 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 раза превышающих средний уровень общей CK в крови у здоровых контролей.
90. Применение по любому из пп. 81-87, которые являются эффективными для увеличения средней дистанции 6-минутной ходьбы (6MWD) у индивидов на по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 метров, в сравнении со средним показателем 6MWD у не получавших лечение контролей.
91. Применение по любому из пп. 81-87, которые являются эффективными для уменьшения среднего времени, необходимого индивиду для выполнения теста подъема на 4 ступени, на по меньшей мере 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3,0, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8 или 4,0 секунды, в сравнении с со средним временем у не получавших лечение контролей.
92. Применение по любому из пп. 81-87, которые являются эффективными для уменьшения среднего количества индивидов, потерявших способность к самостоятельному передвижению, на по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% или 65% в сравнении со средним количеством не получавших лечение контролей, которые потеряли способность к самостоятельному передвижению.
93. Применение по любому из пп. 81-87, которые являются эффективными для уменьшения среднего количества жировой фракции в нижних конечностях у индивида на по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% или 75% в сравнении с средним количеством жировой фракции в нижних конечностях у не получавших лечение контролей.
94. Применение по любому из пп. 81-87, которые являются эффективными для индукции в по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90% скелетных мышечных волокон у индивида экспрессии указанного белка мини-дистрофина.
95. Применение по п. 94, где скелетные мышечные волокна находятся в полученном при биопсии образце из двуглавой, дельтовидной или четырехглавой мышцы указанного индивида.
96. Применение по любому из пп. 81-95, которые вызывают клеточный иммунный ответ против указанного белка мини-дистрофина или мышечное воспаление у не более, чем примерно 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% индивидов.
97. Применение по любому из пп. 81-96, где композицию вводят в сочетании с по меньшей мере вторым средством, эффективным для лечения дистрофинопатии.
98. Применение по п. 97, где указанное второе средство выбирают из группы, состоящей из антисмыслового олигонуклеотида, вызывающего пропуск экзона гена DMD, антитела против миостатина, средства, стимулирующего сквозное прохождение рибосомы через нонсенс-мутации, средства, подавляющего преждевременное образование стоп-кодонов, анаболического стероида или кортикостероида.
99. Способ увеличения мышечной массы или силы, включающий введение индивиду, который нуждается в этом, количества композиции по п. 57, достаточного для увеличения мышечной массы или силы у индивида.
100. Способ предотвращения потери мышечной массы или силы, включающий введение индивиду, который нуждается в этом, количества композиции по п. 57, достаточного для предотвращения потери мышечной массы или силы у индивида.
101. Способ предотвращения дистрофинопатии, включающий введение индивиду, который нуждается в этом, профилактически эффективного количества композиции по п. 57.
102. Способ получения AAV частицы по пп. 31-56, включающий:
введение в клетку-продуцент полинуклеотида, содержащего AAV векторный геном, полинуклеотида, содержащего ген rep AAV, полинуклеотида, содержащего ген cap AAV, и полинуклеотида, содержащего один или более вирусных хелперных генов,
инкубацию указанной клетки; и
очистку AAV частиц, полученных в ней.
103. Способ по п. 102, где указанный векторный геном содержится в первой плазмиде и указанные гены rep, cap и вирусные хелперные гены содержатся в одной или двух дополнительных плазмидах.
104. Способ получения AAV частицы по пп. 31-56, включающий:
введение в клетку-продуцент полинуклеотида, содержащего AAV векторный геном, полинуклеотида, содержащего ген rep AAV, и полинуклеотида, содержащего ген cap AAV,
инкубацию указанной клетки; и
очистку AAV частиц, полученных в ней,
где указанная клетка-продуцент содержит и экспрессирует эндогенные вирусные хелперные гены.
105. Способ по п. 104, где указанный векторный геном содержится в первой плазмиде и указанные гены rep и cap содержатся в одной или двух дополнительных плазмидах.
106. Способ по любому из пп. 102-105, где указанный этап введения выполняют методом трансфекции.
107. Способ по любому из пп. 102-106, где указанная клетка-продуцент представляет собой клетку HEK293.
108. Способы по любому из пп. 102-107, где указанный ген cap представляет собой ген cap AAV9.
109. AAV частица, полученная способом по любому из пп. 102-108.