Способ оценки состояния дисбиоза ротоглотки у детей
METHOD FOR ASSESSING THE OROPHARYNGEAL DYSBIOSIS IN CHILDREN

Изобретение относится к медицине и может найти применение в оценке состояния дисбиоза ротоглотки и этиологии респираторной инфекции на разных этапах течения заболевания у детей возрастного интервала от 4 месяцев до 14 лет.
Микробиоценоз ротоглотки является экстракорпоральным органом, для которого характерна защитная функция в отношении патогенных микроорганизмов и вирусов. Инфекционные агенты микробной, вирусной и грибковой природы передаются воздушно-капельным, воздушно-пылевым, контактно-бытовым путем или с пищей на слизистую оболочку. Далее через дыхательный или пищевой тракт патогены попадают в организм. Способность индигенной микрофлоры в кооперации с макроорганизмом защищать экосистему слизистых оболочек открытых полостей от патогенных микроорганизмов и вирусов является физиологическим феноменом -колонизационной резистентностью [1, 2]. Микроорганизмы нормальной (индигенной) микрофлоры респираторного тракта регулируют защитные иммунные реакции за счет поддержания N и В-клеточных иммунных реакций, функции и миграции дендритных клеток [3]. Противовирусный ответ формируется за счет стимуляции толл-подобных рецепторов [4].
Увеличение интенсивности обсемененности ротоглотки просветной микрофлорой, нетипичной для данного биотопа, приводит к нарушению защитной функции микробиоценоза [5, 6, 7]. Данное состояние биотопа характеризуется как дисбиоз и выражается в увеличении интенсивности бактериальной колонизации условно-патогенной микрофлорой. Дисбиоз ротоглотки традиционно определяется при помощи бактериологического анализа мазка с задней стенки глотки и миндалин [8]. Бактериологический анализ может определить не более 1% всех микроорганизмов преимущественно просветной микрофлоры, так как большинство микроорганизмов являются трудно культивируемыми. Интерпретация результатов бактериологического анализа не имеет решающих правил, которые можно трактовать однозначно. Для оценки степени микробиологических нарушений микробиоценоза ротоглотки используется метод экспертной оценки, в котором присутствует субъективное мнение врача-бактериолога [9].
Из-за анатомически обусловленной разнородности ротовая полость представляет собой сложный микробиологический локус [1]. Микрофлора, колонизирующая слизистые оболочки и миндалины, поверхности зубов и десневые карманы, значительно отличается [2]. В настоящее время получена информация о более 300 родов бактерий, выделенных из слюны и зубных бляшек [1, 10]. Ротовая жидкость осуществляет взаимосвязь между всеми биотопами полости и является своеобразным буфером, который осуществляет внутреннюю регуляцию.
Биологический объект можно рассматривать как единую систему, проявляющую реакцию на эндогенные и экзогенные факторы воздействия. В связи с большим количеством факторов и многоуровневой системой взаимодействия всех компонентов объекта получаемый ответ, в виде изменений в геноме, протеоме и метаболоме, очень сложный. Множество одновременно происходящих процессов накладываются друг на друга, и получается нечеткий ответ. Для обработки таких данных применяются методы многомерной статистики и математического моделирования [9].
Использование концентраций короткоцепочечных жирных кислот для интегральной оценки состояния микробиоценоза актуально, так как включает в себя информацию о функциональной активности микроорганизмов из всех экологических ниш ротоглотки как аэробной, так и анаэробной части микрофлоры, а применение проекционных методов многомерной статистики позволяет выявить пациентов с дисбиозом ротоглотки как группу риска для респираторных инфекций [10].
К проекционным методам многомерной статистики относится линейный дискриминантный анализ (ЛДА), который можно использовать для интегральной оценки функциональной активности микробиоценоза ротоглотки [11].
Наиболее распространенным методом оценки дисбиоза полости рта является бактериологический анализ мазков с задней стенки глотки и миндалин [12, 13]. Данный метод является достоверным и адекватным, но не учитывает трудно культивируемые микроорганизмы, микроорганизмы других локусов ротовой полости, а также фактор функциональной активности микробиоценоза.
Известен метод экспресс-диагностики дисбактериоза полости рта по специфичности газовыделений различных микроорганизмов. Метод осуществляется сравнением соотношений интегральных оценок поглощения газовыделений мазка с миндалин и выдыхаемого воздуха в различных диапазонах. Данный метод является высокотехнологичным, быстрым и воспроизводимым, но имеющим ограничение по чувствительности, так как в опытную группу входили пациенты с существенным дисбалансом микрофлоры ротоглотки, связанным с массивной антибиотико- и химиотерапией онкологических заболеваний [14].
Известен способ определения дисбиоза по антилизоцимной активности микроорганизмов [15]. Увеличение антилизоцимной активности для просветной микрофлоры увеличивает возможность персистенции этих микроорганизмов за счет инактивации лизоцима макроорганизма антилизоцимным фактором - термостабильным белком. Появление плазмидного профиля ДНК, кодирующего антилизоцимную активность у микроорганизмов, является маркером персистенции бактерий и дисбиоза. Данный метод является точным и адекватным, но рассматривает дисбиоз только по фактору персистенции условно-патогенных микроорганизмов и снижению антилизоцимной активности индигенных бифидобактерий [16].
Известен способ определения дисбиоза по изменению родового (видового) состава ассоциации микроорганизмов в биосубстратах [17]. Методом газовой хроматографии масс-спектрометрии определяются концентрации жирных кислот, гидроксикислот, альдегидов и других химических компонентов микробных клеток. Наличие и количество отдельных микроорганизмов определяют по концентрациям малых молекул - биомаркерам данных микроорганизмов. Дисбиоз определяется по отклонению количества микроорганизмов от референсных значений. В одном анализе определяется более 70 основных микроорганизмов и вирусов с высокой чувствительностью. К недостаткам данного метода можно отнести низкую специфичность и отсутствие информации о функциональной активности микробиоценоза [18].
Известен газохроматографический способ оценки дисбиотических состояний ротоглотки у детей по концентрациям короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) в ротовой жидкости [19]. Дисбиоз ротоглотки определяется при сравнении концентраций короткоцепочечных жирных кислот с концентрациями этих кислот в группе условно-здоровых детей.
Этот способ определения дисбиоза ротоглотки является прототипом предлагаемого способа.
Технической проблемой, решаемой изобретением, является разработка быстрого и достоверного способа оценки состояния дисбиоза ротоглотки у детей путем идентификации специфического соотношения концентраций короткоцепочечных жирных кислот в слюне.
Задача решена таким образом, что оценка состояния дисбиоза ротоглотки осуществляется с помощью математической модели, полученной каноническим линейным дискриминантным анализом, анализом сопряженности с прямой пошаговой процедурой включения показателей относительных концентраций уксусной, пропионовой, изомасляной, масляной и капроновых кислот в слюне. При этом используются относительные концентрации КЖК в слюне (концентрации, приведенных к сумме определяемых кислот) для математического моделирования, чтобы избежать влияния ротовой жидкости на значения определяемых концентраций.
Технический результат предлагаемого способа оценки дисбиоза ротоглотки заключается в том, что он позволяет учесть изменения во всех локусах биотопа ротоглотки, учесть изменения анаэробной части микробиоценоза, избежать субъективности, связанной с экспертной оценкой, является быстрым, безопасным, неинвазивным, простым в использовании и достаточно легко воспроизводимым.
Сущность изобретения заключается в том, что методом газожидкостной хроматографии определяют концентрации низкомолекулярных короткоцепочечных жирных кислот в слюне пациентов. Полученные результаты умножают на коэффициенты классификационных уравнений и суммируют с учетом знаков коэффициентов. Затем по величине полученных значений определяют наличие дисбиоза ротоглотки или его отсутствие.
Указанная цель достигается определением концентраций короткоцепочечных жирных кислот в слюне газохроматографическим методом и формированием результатов по классификационным уравнениям дискриминантного анализа.
Определение концентрации КЖК в слюне проводят газожидкостной хроматографией, методом прямого ввода в испаритель хроматографа супернатанта водного раствора слюны в 0,1N соляной кислоте (рН 1,9-2,1).
Способ осуществляют следующим образом.
Для определения КЖК используют супернатант пробы слюны. Получение его проходит по следующей схеме:
Пробоподготовка.
1. В одноразовой пластиковой пробирке взвешивают 2-3 грамма слюны на аналитических весах с точностью до 3-го знака.
2. К пробе приливают 1 мл 40% хлорной кислоты и 1 мл стандартного вещества (диметилмасляная кислота). Гомогенизируют смесь путем энергичного встряхивания в закрытой пробирке.
3. Пробирку с гомогенной смесью центрифугируют 10 минут при 6000 об./мин.
4. Полученный супернатант был прозрачным и имел кислую реакцию (рН 1,9-2,1).
Хроматографирование.
Для хроматографирования используют газо-жидкостной хроматограф Кристалл 5000.2 с капиллярной колонкой ZB-FFAP (Zebron) диаметр - 0,32 мм, длина - 30 м, толщина слоя неподвижной фазы - 0,50 мкм и детектором пламенно-ионизационного типа. Газ - носитель азот. Температурный режим термостата колонки - изотерма 155°С. Температура испарителя и детектора - 250°С. Скорость газа носителя - 60 см/сек при давлении газа носителя 136 кПа. Деление потока газа носителя - 1:35.
Пробу - супернатант отбирают из пластиковой пробирки хроматографическим шприцом 1 мкл и вводят в испаритель хроматографа. Пики концентраций короткоцепочечных жирных кислот определяют по времени удержания. Времена удержания определяют на основании разделения стандартного образца - смеси монокарбоновых кислот гомологического ряда от уксусной до капроновой кислоты.
Времена удержания:
Уксусная кислота, мин
1,36
Пропионовая кислота, мин
1,59
Изомасляная кислота, мин
1,69
Масляная кислота, мин
1,94
Изовалериановая кислота, мин
2,16
Стандартное вещество
(α,α-диметилмасляная кислота), мин
2,39
Валериановая кислота, мин
2,6
Изокапроновая кислота, мин
3,16
Капроновая кислота, мин
3,6
Обработка хроматограмм.
Расчет пиков проводят с помощью компьютерной программы прибора путем анализа последовательности пиков, их границ и высот. Площади пиков определяются как площади треугольников с основанием равным ширине пика и высотой равной высоте пика. Исходя из площади пика стандарта (α,α-диметилмасляной кислоты) с известной концентрацией и по соотношениям площадей анализируемых пиков, рассчитывают концентрацию каждого компонента смеси КЖК. В формуле расчета используют также коэффициенты горения, которые являются коэффициентами перевода молярной концентрации в весовую. Концентрации отдельных компонентов рассчитывают по формуле:
где
i
ст.
C, С- концентрации стандарта и компонента,
i
ст
S, S - площади пиков,
i
K - переводной коэффициент.
Определение диагностических коэффициентов.
Расчет диагностических коэффициентов проводят по формулам классификационных уравнений линейного дискриминантного анализа:
1
F=12210,91*C2+11890,28*C3+13156,14*iC4+12226,24*C4+42514,51*C6-6025,33
2
F=12015,23*C2+11738,47*C3+12952,92*iC4+12062,53*C4+41838,19*C6-5846,01,
где
1
F - диагностический коэффициент, при максимальном значении которого устанавливается дисбиоз ротоглотки;
2
F - диагностический коэффициент, при максимальном значении которого не устанавливается дисбиоз ротоглотки;
С2 - относительная концентрация уксусной кислоты;
С3 - относительная концентрация пропионовой кислоты;
iC4 - относительная концентрация изомасляной кислоты;
С4 - относительная концентрация масляной кислоты;
С6 - относительная концентрация капроновой кислоты.
Изобретение иллюстрируют следующими примерами.
Пример 1. Пациент А. Возраст 10 лет, больной ангиной стрептококковой этиологии.
Анализ концентраций короткоцепочечных жирных кислот в слюне показал следующие концентрации (ммоль/г): уксусная - 61,852 ммоль/г; пропионовая - 23,72 ммоль/г; изомасляная - 1,54 ммоль/г; масляная - 1,12 ммоль/г; изовалериановая - 0,79 ммоль/г; валериановая - 0,080 ммоль/г; изокапроновая - 0,083 ммоль/г; капроновая 0,051 ммоль/г. Суммарная молярная концентрация короткоцепочечных жирных кислот - 89,23 ммоль/г. Из полученных концентраций рассчитали относительные концентрации: уксусной - 0,693 ед.; пропионовой - 0,266 ед.; изомасляной - 0,017 ед.; масляной - 0,013 ед.; капроновой кислот - 0,001 ед. Для расчета значений диагностических коэффициентов полученные значения относительных концентраций короткоцепочечных жирных кислот были умножены на коэффициенты классификационных уравнений дискриминантного анализа и сложены с учетом знака.
1
2
F=12210,91*0,693+11890,28*0,266+13156,14*0,017+12226,24*0,013+42514,51*0,001-6025,33=6003,56 F=12015,23*0,693+11738,47*0,266+12952,92*0,017+12062,53*0,013+41838,19*0,001-5846,01=6000,95
3
7
6
Полученные значения диагностических коэффициентов сравнили между собой. Максимальное значение - 6003,56, что соответствует дисбиозу ротоглотки пациента. Проведенный микробиологический анализ интенсивности бактериальной колонизации миндалин и задней стенки глотки подтвердил снижение количества Neisseriaceae flava 5⋅10 КОЕ/г, и присутствие Streptococcus pyogenes в титре 1⋅10 КОЕ/г, Staphylococcus aureus в титре 7⋅10 КОЕ/г.Таким образом бактериологический метод подтвердил наличие дисбиоза ротоглотки.
Вариант 2. Пациент С. Возраст 14 лет, проходил профилактическое обследование микробиоценоза ротоглотки.
Анализ концентраций короткоцепочечных жирных кислот в слюне показал следующие концентрации (ммоль/г): уксусная - 39,041 ммоль/г; пропионовая - 21,62 ммоль/г; изомасляная - 1,21 ммоль/г; масляная - 2,21 ммоль/г; изовалериановая - 0,62 ммоль/г; валериановая - 0,119 ммоль/г; изокапроновая - 0,0172 ммоль/г; капроновая 0,0272 ммоль/г. Суммарная молярная концентрация короткоцепочечных жирных кислот - 64,86 ммоль/г. Из полученных концентраций рассчитали относительные концентрации: уксусной - 0,602 ед.; пропионовой - 0,333 ед.; изомасляной - 0,019 ед.; масляной - 0,034 ед.; капроновой кислот - 0,0001 ед. Для расчета значений диагностических коэффициентов полученные значения относительных концентраций короткоцепочечных жирных кислот были домножены на коэффициенты классификационных уравнений дискриминантного анализа и сложены с учетом знака.
1
2
F=12210,91*0,602+11890,28*0,333+13156,14*0,019+12226,24*0,034+42514,51*0,0001-6025,33=5967,436 F=12015,23*0,602+11738,47*0,333+12952,92*0,019+12062,53*0,034+41838,19*0,0001-5846,01=5968,726
6
4
Полученные значения диагностических коэффициентов сравнили между собой. Максимальное значение 5968,726, что соответствует отсутствию дисбиоза ротоглотки пациента. Проведенный микробиологический анализ интенсивности бактериальной колонизации миндалин и задней стенки глотки подтвердил отсутствие дисбиоза и наличие типичного для ротоглотки микробного пейзажа по количественному и качественному составу микроорганизмов: Streptococcus agalactiae в титре 1⋅10 КОЕ/г, Neisseriaceae flava 5⋅10 КОЕ/г. Таким образом бактериологический метод подтвердил отсутствие дисбиоза ротоглотки.
Метод оценки дисбиоза ротоглотки был апробирован у детей возрастного интервала от 4 месяцев до 14 лет на базе консультативно-диагностического центра при Московской НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора в 2018-2019 г. Было обследовано 683 пациента амбулаторного приема, полученные результаты подтверждались методом бактериологического анализа микробиоценоза ротоглотки. Чувствительность метода составила 100%, специфичность 95,12%.
Литература:
1. Алешкин, В.А., Микробиоценозы и здоровье человека: руководство для врачей / под редакцией В.А. Алешкина, С.С.Афанасьев, А.В. Караулова - М.: Издательство Династия, 2015 - 548 с.
2. Медведева, Е.А. Метаболическая активность микрофлоры ротоглотки у детей с бронхитом и внебольничной пневмонией / Е.А. Медведева, Е.Р. Мескина // Альманах клинической медицины. - 2015. №42. - С.72-78.
3. Aliprantis А.О., Yang R.B., Mark M.R., Suggett S., Devaux B. et al. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. // Science 1999.- Vol.285. - P. 9-736.
4. Janeway Jr C.A., Medzhitov R. Innate immune recognition. // Annu Rev. Immunol. - 2002, - №20. - P. 197-216.
5. Алешкин, В.А. Микробиоценозы открытых полостей и муконазальный иммунитет / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, Е.А. Воропаева // Эффективная фармакотерапия. Аллергология и иммунология. - 2013. - Том 27 №2. - С. 6-11.
6. Гаврилова, О.А. Микробный пейзаж полости рта у здоровых подростков и больных хроническим гастродуоденитом. / О.А. Гаврилова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2008. - №6. - С.59-63.
7. Феклисова, Л.В. Клинико-лабораторная характеристика воспалительных изменений ротоглотки при острой респираторной патологии: пособие для врачей / Л.В. Феклисова, Е.Е. Целипанова / М.: ГБУЗ МО МОНИКИ, 2010. -24 с.
8. Зверев, В.В. Микроэкология и гуморальный иммунитет слизистых открытых полостей человека в норме и при патологических состояниях. Учебное пособие для системы послевузовского профессионального образования врачей / В.В. Зверев, Ю.В. Несвижский, Е.А. Воропаева, С.С.Афанасьев, В.А. Алешкин, А.В. Караулов, Х.М. Галимзянов, О.В. Макаров, Е.А. Богданова, О.В. Рубальский, М.С.Афанасьев, Н.С. Матвеевская, Д.С. Афанасьев, Т.Н. Савченко, В.А. Метельская, Е.Е. Рубальская, Е.О. Рубальский. - Астрахань - Москва: АГМА, 2011. - 80 с.
9. Затевалов A.M. Оценка степени микробиологических нарушений микрофлоры ротоглотки и кишечника с помощью методов математического моделирования / Селькова Е.П., Афанасьев С.С., Алешкин А.В., Миронов А.Ю., Гусарова М.П., Гудова Н.В. // Клиническая лабораторная диагностика. 2016. Т. 61. №2. С. 117-121.
10. Затевалов A.M. Возрастная динамика продукции короткоцепочечных жирных кислот микробиотой ротоглотки у пациентов, не имеющих заболеваний респираторного тракта и ротовой полости / Селькова Е.П., Гудова Н.В., Оганесян А.С. // Альманах клинической медицины. 2018. Т. 46. №8. С. 784-791.
11. Боровиков, В.П. STATISTICA: Статистический анализ и обработка данных в среде Windows / В.П. Боровиков, И.П. Боровиков. - М.: Филинъ, 1997. - 608 с. - ISBN 589568033-Х.
12. "Приложение 1" к Приказу №535 МЗ СССР от 22 апреля 1985 г.
13. Беюл Е.А., Куваева И.Б. Дисбактериоз кишечника и его клиническое значение. Клиническая медицина. 1986 (11): 37-44.
14. Патент РФ №2433400 МПК G01N 33/48 СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ДИСБАКТЕРИОЗА ПОЛОСТИ РТА.
15. Патент РФ №2126051 МПК C12Q 1/02 Способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов.
16. Сидорова О.И., Иванова Е.В., Перунова Н.Б. Антилизоцимная активность и биопленкообразование бифидобактерий при стрессорном воздействии // Вестник ОГУ. 2014. №13 (174). С.С. 100-3.
17. Патент РФ №2086642 МПК C12N 1/00, 1/20, C12Q 1/04 СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РОДОВОГО (ВИДОВОГО) СОСТАВА АССОЦИАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ.
18. Помазанов В.В. Микроэкологический статус и его определение // Сборник материалов научно-практической конференции с международным участием «Перспективы внедрения инновационных технологий в медицине и фармации. Орехово-Зуево. 2019. Т. 1. С.С. 166-183.
19. Патент РФ №2473902 МПК C1 G01N 33/487 Газохроматографический способ оценки дисбиотических состояний ротоглотки у детей.