Очистка и концентрирование реовируса птиц

ем уровня противовирусных антител на 1,25-3,5 log2 и антибактериальных - на 2,5-3,25 log2; у морских свинок динамика противовирусных антител характеризовалась увеличением их уровня в 1,8-2,3 раза, антибактериальных - на 2,4-2,9 log2, что свидетельствует о высокой иммуногенной активности разработанной поливалентной инакти-вированной вирусно-бактериальной вакцины для профилактики заболеваний репродуктивных органов коров и желудочно-кишечного тракта телят и позволяет использовать разработанный биопрепарат для проведения дальнейших исследований в производственных условиях.

ЛИТЕРАТУРА

1. Апатенко, В.М. Смешанные инфекции сельскохозяйственных животных / В.М. Апатенко. - Киев: Урожай, 1990. - 172 с.

2. Бакулов, И. А. Особенности распространения вирусных болезней животных в современных условиях и их профилактирование / И.А. Бакулов, Г.Г. Юрков // Актуальные проблемы ветеринарной вирусологии. - Казань, 1980. - С. 4-5.

3. Борисова, Т.В. Эффективность эроконда при мастите и эндометрите у коров / Т.В. Борисова // Матер. Всерос. науч. и учеб.-метод. конф. по акушерству, гинекологии и биотехн. размножению животных. - Воронеж, 1994. - С. 216.

4. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин [и др.]. - М.: Всерос. науч.-исслед. и технол. ин-т биол. пром-сти, 1998. - 928 с.

5. Григорьева, Т.Е. Лечение и профилактика эндометритов у коров / Т.Е. Григорьева. - М.: Росагропромиздат, 1988. - С. 16-31.

6. Новиков, О.Г. Эпизоотология наиболее распространенных инфекционных болезней крупного рогатого скота, разработка средств и методов их профилактики и лечения: автореф. дис. ... д-ра вет. наук; 16.00.03 / О.Г. Новиков // Всерос. науч.-исслед. вет. ин-т патологии, фармакологии и терапии. - Воронеж, 1994. - 42 с.

7. Феоктистова, Н.А. Биологические особенности бактерий рода Proteus и их роль в патологии животных / Н.А. Феоктистова // Ветеринария с.-х. животных. - 2007. -№ 3. - C. 38-40.

8. Фомин, Ю.В. Случаи абортов у стельных коров, вызванные вирусом инфекционного ринотрахеита / Ю.В. Фомин, Н.В. Фоменко // Тез. докл. Всесоюзной межвузов. науч. конф. по вет. вирусологии. - М., 1973. - С. 44-45.

9. Фукс, П.П. Вирусно-микоплазменная патология генитальных и респираторных органов крупного рогатого скота (этиология, патогенез, диагностика): автореф. дис. ... д-ра вет. наук; 16.00.03 / П.П. Фукс. - Казань, 1990. - 38 с.

10. Чомаев, А.М. Лечение послеродовых эндометритов у коров / А.М. Чомаев // Зоотехния. - 1997. - № 10. - С. 28-29.

УДК 619:578.832.1:636.5

ОЧИСТКА И КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ РЕОВИРУСА ПТИЦ

А.А. ГУЛЯКО, И.В. НАСОНОВ, И.С. РАДЮШ РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского НАН Беларуси» г. Минск, Республика Беларусь, 220003

Введение. Основным средством профилактики инфекционных заболеваний остаются вакцины. В ветеринарной практике в основном

используют живые и инактивированные вакцины. Однако при детальном изучении такие вакцины оказались недостаточно безопасными. В результате анализа данных, касающихся современных технологий изготовления вакцин, установлено, что они содержат ряд балластных веществ - посторонние белки, обломки клеток, на которых культивируется вирус, и т. д. Качество же вакцин во многом определяется степенью очистки вирусных антигенов, что, в свою очередь, определяет снижение частоты нежелательных реакций.

При введении в организм вирусных белков в смеси с другими клеточными белками выработка антител на вирусный белок резко снижается [1]. Еще хуже то, что антитела будут вырабатываться в основном к ним, а не к интересующему нас вирусу [5, 9].

По данным А.А. Смородинцева, очищенный вирус гриппа повышает уровень антител в 4 и более раза [16].

В настоящее время огромное значение придается стандартности вакцин, однако стандатизировать вакцины с неочищенным антигеном сложно [2, 8].

Создание эффективных вакцинных препаратов, обладающих высокой защитной активностью и в то же время не имеющих значительных побочных свойств, является одним из наиболее приоритетных направлений в биотехнологии и вирусологии [18]. На сегодняшний день одним из перспективных и наиболее разрабатываемым напрвлением является создание вакцин из очищенных вирусов. Оно предпочтительнее, чем усовершенствование вакцин на основе живых аттенуирован-ных или инактивированных возбудителей. Это обусловлено тем, что присутствие части белков нежелательно. Количество побочных системных эффектов, которые могут развиваться при использовании вакцин, прямо зависит от количества технологических примесей. Поэтому вакцины нового поколения конструируют из высокоочищенных протективных антигенов вируса, в связи с чем так важна роль этапа очистки вируссодержащей жидкости от балластных белков. Очистка и концентрирование вирусного материала даст возможность достичь снижение дозы и объемов вводимой вакцины и повышения ее эффективности при вакцинопрофилактике. Важность очистки и концентрирования вируссодержащей жидкости при изготовлении вакцин доказывает тот факт, что Food and Drug Administration (FDA) и the European Agency for Evaluation Médicinal Products (EMEA) устанавливают очень высокие требования безопасности и заставляют даже за счет уменьшения эффективности медицинских биопрепаратов осуществлять усовершенствование процессов очистки вирусных вакцин. Ветеринарная практика также постепенно переходит к получению вакцин из очищенной вируссодержащей жидкости [10]. Таким образом, одним из важнейших этапов технологии производства вакцин является этап очистки и концентрирования.

Несмотря на то что ветеринарная практика имеет в своем распоряжении большой набор диагностических препаратов, увели-

329

чение номенклатуры, совершенствование, улучшение качества и их стандартизация для практической ветеринарии по-прежнему остается актуальной. Разработка современных методов анализа, в частности, серологических требует наличия препаративных количеств очищенных вирусных антигенов, необходимых для разработки диагностических тест-систем [6, 13, 15]. Не имея очищенного вирусного антигена невозможно сконструировать тест-системы для ИФА и ПЦР. Ложно-положительные реакции иммуноферментного анализа при серодиагностике ВИЧ-инфекции обусловлены наличием антител к клеточным антигенам, которые присутствуют в результате недостаточной очистки вирусных белков.

Приготовление высокоэффективных специфических сывороток требует наличия максимально очищенных антигенов [16]. Показано, что гипериммунизация кроликов неочищенной вируссодержащей жидкостью не позволяет получить сыворотку крови с высоким титром антител к вирусу гриппа [3, 14].

Необходимым условием при изучении структуры, физико-химических и иммунологических свойств антигенных фракций вирусов и бактерий, детерминант или эпитопов, определяющих специфичность конкретного антигена, и определении их роли в иммунитете является наличие чистого антигена [6]. Решение проблем получения чистых белков в целом будет способствовать развитию фундаментальных исследований их структурно-функциональных особенностей, а белков, обладающих маркерными свойствами, - поиску путей и возможностей решения спектра их практического применения, например, в иммунологии, медицине, ветеринарии и экологии.

Итак, при изготовлении нового поколения вакцин, диагностических систем, гипериммунных сывороток, проведении фундаментальных исследований по изучению биохимических и биофизических свойств вирусов и бактерий необходимо иметь очищенные вирусные и бактериальные антигены. Очистка белка представляет собой серию процессов, предназначенных для изоляции одного типа белка из сложной смеси. Для фракционирования смеси белков на индивидуальные белки применяют разнообразные методы: высаливание, хроматографию, электрофорез, ультрацентрифугирование и др. Для того чтобы выяснить, какой метод очистки вирусного материала лучше, важно проанализировать составляющие процессы методов, их характеристики и сравнить технологические параметры. В настоящее время наиболее распространенными методами очистки антигенов являются хроматография и ультрацентрифугирование. Ранее нами было показано, что метод ультрацентрифугирования может успешно применяться для очистки вируса гриппа, вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней [4, 12, 17].

Цель работы - отработать метод очистки вируса теносиновита птиц.

Материал и методика исследований. В опытах использовался штамм КМИЭВ^118 реовируса птиц. Вирус культивировали на перевиваемой линии клеток почки зеленой мартышки Vero.

330

Вирусом с множественностью заражения 0,1-0,5 ТЦД/кл инфицировали 48-часовую культуру клеток Vero со 100%-ным монослоем, выдерживали при температуре (37,5±0,5) °С в течение часа для контакта вируса с клеткой. В качестве поддерживающей использовали среды DMEM и DMEM-HEPES в соотношении 1:1 с добавлением 2%-ной эмбриональной телячьей сыворотки. Зараженную культуру культивировали при температуре (37,5±0,5) °С.

Сбор материала проводили спустя 40-48 ч при поражении не менее 80 % клеток. Сосуды с вирусом замораживали при температуре - 20 °С. Затем механическим путем удаляли монослой со стекла и размораживали при температуре (20-25) °С. Вируссодержащий материал стерильно собирали в 5-10-литровые бутыли.

Для титрации реовируса использовали монослойную культуру клеток Vero, выращенную в 96-луночных культуральных планшетах с плоским дном в СО2-инкубаторе при температуре (37±0,5) °С.

Десятикратные разведения вируса от 10-1 до 10-8 делали в отдельной стерильной посуде на питательной среде, используемой для культивирования клеток с содержанием 2 % сыворотки.

После исследования под микроскопом культуры клеток подготовленные разведения реовируса переносили в культуральные планшеты по 100 мкл на лунку с культурой клеток. На каждое разведение использовали не менее четырех лунок. Планшеты слегка встряхивали и оставляли при температуре (37±0,5) °С на 1 ч для сорбции вируса клетками. Затем добавляли по 100 мкл поддерживающей питательной среды. Реакцию сопровождали контроли: контроль культуры клеток -лунки с культурой клеток этой же партии, в которую вносили поддерживающую среду без вируса; контроль вируса - лунки с культурой клеток этой же партии, в которую вносили поддерживающую среду и нативный вирус. После этого планшеты помещали в СО2-инкубатор (СО2 5 %).

После 3-7-дневной инкубации при температуре (37±0,5) °С оценку наличия вируса проводили по характерным вирусиндуцированным изменениям клеточной морфологии. Результаты учитывали через 67 суток по появлению характерных цитопатических изменений в зараженной культуре клеток при отсутствии таковых в контроле культуры клеток. Титр вируса рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина и выражали в lg ТЦД50/см3 [11].

Вируссодержащую жидкость, полученную путем культивирования вируса на культуре клеток Vero, осветляли низкоскоростным центрифугированием (2000 об/мин, 30 мин). Затем проводили очистку и концентрацию реовируса в РНПЦ эпидемиологии и микробиологии в лаборатории диагностики ВИЧ и сопутствующих инфекций. Для этого вирус осаждали методом ультрацентрифугирования на центрифуге Becman Culter L-100 XP ротор SW-32TIN при 28000 об/мин 40 мин. Осадок ресуспендировали в PBS-буфере (0,05 М фосфотный буфер с 0,1 М NaCl, pH 7,4). Дальнейшую очистку вируса проводили методом ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте плотности саха-

розы 20 и 60 % при 24000 об/мин 4 ч (центрифуга Вестап Сикег L-100 ХР ротор SW-32TIN). Чистый вирус с сахарозой помещали в диализный мешок. Сахарозу удаляли методом диализа против PBS-буфера (12 ч при 40 оС). Чистоту вирусного препарата определяли с помощью электорофореза в полиакриламидном геле [19] в пластинах размером 150*150 мм, толщина геля составляла 1 мм. Концентрацию белка определяли по модифицированному методу Лоури в присутствии ДСН [20].

Результаты исследований и их обсуждение. После очистки ви-руссодержащей жидкости центрифугированием в ступенчатом градиенте плотности сахарозы (20 и 60 %) при 24 000 об/мин в течении 4 ч в центрифужной пробирке визуально наблюдалось опалесцирующее белковое кольцо и на дне пробирки был осадок. Для анализа был отобран осадок и кольцо.

Учет биологической активности вируса проводили на 6-7-е сутки на основании характерного ЦПД для реовируса:

- появление в цитоплазме пораженных клеток оксифильной зернистости;

- образование гигантских многоядерных клеток - синцитиев;

- появление в монослое «стерильных пятен» (участки без клеток) с последующим полным «сползанием» клеток со стекла и обнаружением свободноплавающих в питательной среде гигантских клеток.

Результаты определения биологической активности реовируса в неочищенной вируссодержащей жидкости, а также после очистки в кольце и осадке представлены в табл. 1.

Таблица 1. Биологическая активность вируса теносиновита до и после очистки методом ультрацентрифугирования

Наименование препарата Биологическая активность, ТЦД50/см3

Вируссодержащая жидкость (до очистки) 6,5

Очищенный «осадок» 7,87

Очищенное «кольцо» 7,25

На основании полученных данных, представленных в табл. 1, установлено, что биологическая активность вируса теносиновита птиц после очистки в осадке увеличилась в 23,4 раза, а в белковом кольце - в 5,6 раза по сравнению с неочищенной вируссодержащей жидкостью.

Результаты определения концентрации белка в вируссодержащей жидкости, в белковом осадке и кольце после очистки представлены в табл. 2.

Таблица 2. Концентрация белка в очищенном реовирусе и вируссодержащей жидкости

Наименование препарата Концентрация белка, мг/мл

Вируссодержащая жидкость (до очистки) 3,9

Очищенный «осадок» 18

Очищенное «кольцо» 4,6

Из табл. 2 видно, что концентрация белка в осадке составила 18 мг/мл, в кольце - 4,6 мг/мл, в вируссодержащей жидкости -3,9 мг/мл. В осадке концентрация белка увеличилась в 4,6 раза, в белковом кольце - в 1,2 раза по сравнению с неочищенной вируссодержащей жидкостью.

Чистоту очистки вируссодержащей жидкости определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле. На рис. 1 представлен электрофоретический анализ очистки вируссодержащей жидкости.

А - белки свидетели (Kit белки «DIAPROT-1» - смесь белков из мышцы сердца мыши и мембран эритроцитов с молекулярным массой 95-12,5 кДа; 1-94 кДа, 2-67 кДа, 3-43 кДа, 4-40 кДа, 5-29 кДа, 6-21 кДа, 7-18 кДа и 8-12,5 кДа).

B - вируссодержащий материал после очистки и концентрирования белкового осадка в градиенте сахарозы.

C - вируссодержащий материал после очистки и концентрирования белкового кольца в градиенте сахарозы.

D - неочищенный вируссодержащий материал с концентрацией белка 0,016 мг на полосу.

E - неочищенный вируссодержащий материал с концентрацией белка 0,012 мг на полосу.

F - неочищенный вируссодержащий материал с концентрацией белка 0,0078 мг на полосу.

Рис. 1. Результаты электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле

В структуре реовируса обнаружено внсемь полипептидов - X1, X2, X3, ц1, ц2, с1, с2 и с3. Еще два полипептида обнаруживается в зараженных клетках - ц0 и с4. Поэтому при анализе белков очищенного реовируса электрофорезом в ПАГ их распределяют на три основных класса: крупные (X 140-155 килодальтон), средние (ц 70-88 килодаль-тон) и мелкие (с 30-40 килодальтон). После обработки реовируса хи-мотрипсином, низкими концентрациями додецилсульфата натрия или температурным шоком происходит увеличение транскриптазной активности, латентной в интактном вирусе. Протеолитическая активность фермента сопровождается удалением белков с1, с3 и ц2 наружного капсида и формированием структур диаметром 50 нм и плотностью 1,43 г/см3. Таким образом, формируется субвирусная структура,

лишенная белков с1, с3, а белок ц2 расщепляется до полипептида с с молекулярной массой 65 килодальтон. Поэтому на электрофореграмме обычно наблюдают белки - (молекулярная масса -155 килодальтон), Х2 и Х3 (140 килодальтон), ц1 (80 килодальтон), с2 (38 килодальтон) и с (65 килодальтон).

Из рис. 1 видно, что после очистки в белковом кольце и осадке наблюдаются белки с молекулярной массой 155, 140, 80, 65 и 38 кило-дальтон, характерные для реовируса. Тогда как вируссодержащая жидкость (на рисунке дорожки D, E и F) содержит очень много дополнительных белков с молекулярным весом 67-87 килодальтон.

Заключение. Очистка вируссодержащей жидкости центрифугированием в ступенчатом градиенте плотности сахарозы (20 и 60 %) при 24000 об/мин в течении 4 ч позволяет получить достаточно чистый от примесных белков вирус теносиновита птиц. После очистки в пробирке с сахарозой наблюдались белковое кольцо и осадок. При этом концентрация белка в осадке увеличилась в 4,6 раза, в белковом кольце - в 1,2 раза по сравнению с неочищенной вируссодержащей жидкостью. Очистка и концентрация вируса теносиновита птиц позволила увеличить биологическую активность вируса. Так, биологическая активность вируса теносиновита птиц в осадке увеличилась в 23,4 раза, а в белковом кольце - в 5,6 раза по сравнению с неочищенной вируссо-держащей жидкостью.

Анализ белкового кольца и осадка методом электрофореза в по-лиакриламидном геле показал, что в них находятся белки с молекулярной массой 155, 140, 80, 65 и 38 килодальтон, характерные для рео-вируса. Тогда как вируссодержащая жидкость содержит очень много дополнительных белков с молекулярной массой 67-87 килодальтон.

ЛИТЕРАТУРА

1. Букринская, А.Г. Вирусология / А.Г. Букринская. - М.: Медицина, 1986. - 336 с.

2. Гринь, С.А. Современные биотехнологические процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов: дис. ... д-ра биол. наук; 03.00.06 / С.А. Гринь. - Кашинцево, 2008. - 310 с.

3. Гуляко, А.А. Влияние очищенного вируса гриппа птиц типа А (штамм H7N1) на антителообразование / А.А. Гуляко, Н.В. Захарик // Современные технологии сельскохозяйственного производства: матер. XIV Междунар. науч.-практ. конф. - Гродно, 2011. - С. 185-187.

4. Гуляко, А.А. Концентрирование и очистка вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней / А.А. Гуляко, М.А. Ананчиков, Н.В. Захарик // Инновационные технологии производства и переработки сельскохозяйственной продукции: материалы Междунар. науч.-практ. конф. - Владикавказ, 2012. - С. 142-143.

5. Ковалев, И.Е. Проблемы иммунологии / И.Е. Ковалев, Р.Г. Азидов // Фармакология и токсикология. - 1986. - Т. 49. - № 1. - С. 5-13.

6. Матвеева, И.Н. Получение антигена респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота для использования в ИФА / И.Н. Матвеева // Ветеринария. -2007. - № 11. - С. 49-51.

7. Матвеева, И.Н. Промышленные технологии изготовления компонентов моно- и комплексных диагностикумов инфекционных заболеваний животных: автореф. дис. ... д-ра биол. наук: 03.00.02 / И.Н. Матвеева; Всерос. науч.-исслед. и технолог. ин-т биол. пром. РАСХН. - Щелково, 2008. - 139 с.

8. Медуницын, Н.В. Основы иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных болезней / Н.В. Медуницын, В.И. Покровский. - М.: Геотар-Медицина, 2005. -512 с.

9. Мертвецов, Н.П. Современные подходы к конструированию молекулярных вакцин / Н.П. Мертвецов, А.Б. Беклемишев, И.М. Савич. - Новосибирск: Наука; Сибир. отд-ние, 1987. - 207 с.

10. Метод концентрирования и очистки птичьего реовируса для молекулярно-биологических исследований / Д.Б. Андрейчук [и др.] // Актуальные проблемы патологии сельскохозяйственных животных: матер. Междунар. науч.-практ. конф. - Минск, 2000. - С. 43-44.

11. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных: справочник /

B.Н. Сюрин [и др.]; под общ. ред. В.Н. Сюрина. - М.: Агропромиздат, 1986. - 351 с.

12. Минчук, Ю.Н. Получение очищенного вируса гриппа для усовершенствования средств специфической профилактики гриппа / Ю.Н. Минчук, А.А. Гуляко, О.Л. Гури-нович // Аграрное производство и охрана природы: матер. Х Междунар. науч.-практ. конф. - Витебск, 2011. - С. 116.

13. Москвичев, О.В. Биологические свойства реовируса типа I и разработка тест-системы ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота: автореф. дис. ... канд. биол. наук; 06.02.02 / О.В. Москвичев; Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности. - Казань, 2012. - 71 с.

14. Получение гипериммунной специфической антисыворотки крови к вирусу гриппа птиц H7N1 / А.А. Гуляко [и др.] // Эпизоотология. Иммунология. Фармакология. Санитария. - 2011. - № 1. - С. 9-12.

15. Матвеева, И. Н. Разработка тест-системы для детекции антител к вирусу диареи крупного рогатого скота в ИФА / И.Н. Матвеева // Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных: матер. Междунар. науч.-произв. конф. -Воронеж, 2006. - С. 327-330.

16. Смородинцев, А.А. Грипп и его профилактика / А.А. Смородинцев // Фармацевтический вестник. - 2007. - № 3 (485). - С. 8-12.

17. Способ очистки вируса гриппа птиц типа А подтипа H5N2 / А.А. Гуляко [и др.] // Матер. XIV Междунар. науч.-практ. конф. - Горки, 2011. - С. 128-133.

18. Gluck, R. Virosomal influenza vaccines: immunogenicity after subcutaneous and intranasal administration. Program and abstracts from Options for the Control of Influenza IV / R. Gluck // Hersonisson, Grete, Greece - 56-2, September 23-28. - 2000. - Р. 75-79.

19. Laemli, M.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / M.K. Laemli // Nature. - 1970. - Vol. 221. - P. 680-685.

20. Peterson, C. I. Determination of total protein with the Folin-Penol-Metod /

C.I. Peterson // Methods in Enzymol. - 1983. - Vol. 91. - P. 95-119.

УДК 619: 618.19-002:636.22/.28

ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОМПЛЕКСА ЗООВЕТЕРИНАРНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ ПРИ КОНТАГИОЗНОМ МАСТИТЕ У КОРОВ

О.Т. ЭКХОРУТОМВЕН, Г.Ф. МЕДВЕДЕВ УО «Белорусская государственная сельскохозяйственная академия» г. Горки, Могилевская обл., Республика Беларусь, 213407

Введение. Основной целью производителей молока и молочных продуктов является получение прибыли. Достигнуть этого можно двумя путями - повышением закупочных цен на продукцию либо снижением всех затрат на ее производство. Последний путь нелегкий и в значитель-