Иммуногистохимическое исследование молекулярных основ онкологических заболеваний человека

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ОСНОВ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА

И.И. Бабиченко

Кафедра патологической анатомии Российский университет дружбы народов Ул. Миклухо-Маклая, 8, 117198 Москва, Россия

В статье изложены результаты научных исследований сотрудников кафедры патологической анатомии медицинского факультета РУДН. Показано, что современная молекулярная диагностика опухолевого роста с использованием иммуногистохимического метода позволяет решать проблемы гистогенетической дифференцировки опухолей, оценить чувствительность анапластических клеток к стероидной противоопухолевой терапии и, таким образом, является необходимым компонентом современной практической онкоморфологии.

Классическая диагностика опухолей основана на гистологической оценке степени выраженности тканевого и клеточного атипизма. Учитывая уникальность генетических изменений в опухолевых клетках, патолог нередко сталкивается с трудностями в идентификации тканевой принадлежности опухоли и степени ее анаплазии. Подобные проблемы можно с успехом решать современными иммуногистохимиче-скими методиками, поскольку большинство опухолей, несмотря на клеточный и тканевой атипизм, способны экспрессировать белки, специфичные для данного вида ткани.

Важным направлением молекулярной диагностики опухолей является определение чувствительности опухолей к гормональным воздействиям в организме. Этот вид исследований актуален при изучении эстрогеновых рецепторов в опухолях женской половой сферы и андрогеновых в опухолях предстательной железы. Выявление рецепторов к гормонам позволяет оценить степень анапластических процессов в опухолевых клетках.

Апоптоз как уникальный генетически запрограммированный клеточный механизм привлекает ученых онкологов прежде всего тем, что с его патологией может быть связан неограниченный опухолевый рост. В настоящее время известно большое количество факторов, препятствующих развитию апоптоза (ВСЬ-2, В(Х-Х) и способствующих его развитию (Р53, ВАХ). Выявление подобных факторов, как правило, не позволяет оценить гистогенетическую принадлежность опухолевых клеток, но с достаточной определенностью свидетельствует о степени их анапластических изменений.

С целью практического применения основ молекулярной диагностики опухолевого роста на кафедре проводились исследования гормонально-зависимых новообразований различной локализации. В работе И.И. Фроловой [7-9] было проведено комплексное иммуногистохимическое исследование экспрессии эстрогеновых рецепторов, факторов апоптоза Р53 и ВСЬ2, пролиферативной активности (с по-

мощью Кл-67), а также выявление вирусных антигенов ВПЧ16 и ВПЧ18 типов в клетках многослойного плоского эпителия шейки матки при предраковых изменениях эктоцервикса. Подобные виды изменений эпителиальных клеток шейки матки часто выявляются на фоне системной гинекологической патологии, характеризующейся гиперэстрогенемией и сопровождаются, как правило, активной пролиферацией эстрогензависимых клеток базального и парабазального слоев эктоцервикса, что может служить основой для внедрения вирусов папилломы человека.

Было показано, что по мере нарастания неопластических процессов в эпителии шейки матки от ЦИН I до ЦИН III экспрессия продуктов гена р53 и количество клеток с положительной ядерной реакцией на Кл-67 увеличивается, а экспрессия ВСЬ-2 и количество эстрогеновых рецепторов уменьшается. При ЦИН III практически все неопластические клетки эпителия были лишены рецепторов к эстрогенам. Таким образом, при неопластической трансформации клеток эктоцервикса их чувствительность к эстрогенам снижается, тем не менее, гиперэстрогению можно рассматривать как один из факторов, способствующих формированию опухолевых поражений шейки матки.

Подобные исследования в неизмененном эндометрии женщин, а также при ги-перпластических и неопластических процессах были проведены в работах М.Х. Ашхаб [1; 5] и В.А. Ковязина [4]. При анализе экспрессии рецепторов к стероидным гормонам в эпителии желез в каждую из семи стадий менструального цикла женщин был подтвержден циклический характер экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону в ядрах эпителиальных клеток. Показано, что биологическое действие стероидных гормонов на эндометрий определяется уровнем рецепторов к эстрогенам и прогестерону в клетках желез: высокая чувствительность эпителия желез к эстрогенам в течение фазы пролиферации стимулирует развитие секреторного аппарата клетки для его дальнейшей функции в фазе секреции, в свою очередь увеличение чувствительности железистого эпителия к прогестерону в секреторную фазу цикла тормозит пролиферацию тканей, вызванную эстрадиолом, и способствует развитию секреторной активности эндометрия.

Проведенные исследования рецепторов к стероидным гормонам при гиперплазии и аденокарциноме эндометрия выявили два типа экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону. Первый тип характеризовался равномерным и высоким уровнем экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону в эпителии всех желез. Подобная картина была свойственна для простой гиперплазии эндометрия (ПГЭ) и напоминала распределение стероидных рецепторов в неизмененном пролиферативном эндометрии (НПЭ). Второй тип экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону был выявлен на препаратах с атипической гиперплазией эндометрия (АГЭ) и высоко дифференцированной аденокарциноме (ВАК) и характеризовался мозаичной картиной окрашивания ядерных рецепторов. Средняя интенсивность иммуногистохимической реакции при данных видах патологии сильно варьирована.

Сопоставление полученных результатов при изучении неизмененного и неопластического эндометрия показало, что при неизмененном пролиферативном эндометрии и при простой гиперплазии более 90% клеток желез содержат рецепторы к стероидным гормонам, при неопластической трансформации наблюдается увеличение числа атипичных железистых клеток с низким содержанием рецепторов к эстрогенам и прогестерону.

Таким образом, на пути неопластической трансформации клетки эндометрия также, как и эктоцервикса, утрачивают способность к восприятию стероидных гор-

монов. В анапластических тканях эндометрия наблюдается увеличение числа желез, содержащих атипические клетки без рецепторов к эстрогенам и прогестерону.

При гиперпластических и неопластических процессах эндометрия проводилось изучение и факторов, препятствующих (ВСЬ-2) и способствующих (ВАХ, Р53) развитию апоптоза клеток. Положительная иммуногистохимическая реакция с антителами к белку ВСЬ-2 отмечалась во всех случаях с ПГЭ, в 85% АГЭ и 56% ВАК. Средняя интенсивность иммуногистохимического окрашивания белков ВСЬ-2 была наиболее высокой при ПГЭ и НПЭ.

Экспрессия белка ВАХ наблюдалась в 22% случаев ПГЭ, 92% АГЭ и 88% ВАК. Интенсивность экспрессии белка ВАХ была слабой или отсутствовала в ПГЭ и возрастала в анапластическом эндометрии при АГЭ.

В случаях НПЭ и ПГЭ мутантные белки Р53 выявлены не были. В свою очередь, в 23% случаев АГЭ и в 100% образцов ВАК выявлялась экспрессия продуктов мутантного гена р53.

Поскольку экспрессия фактора Р53 при атипической гиперплазии эндометрия наблюдается редко, можно сделать предположение, что мутация гена Р53 является достаточно поздним этапом в злокачественной трансформации эндометрия. Учитывая достоверные различия между атипической гиперплазией и высокодифференцированной аденокарциномой эндометрия по экспрессии белка Р53, данный признак может быть использован как дополнительный дифференциально-диагностический критерий.

Особенности дифференцировки эпителиальных клеток предстательной железы человека в процессе онкогенеза были изучены С.З. Раад, Л.В. Гундоровой [2; 3] и Р.В. Савковым [6]. В работах проведено иммуногистохимическое исследование экспрессии антигенов андрогеновых рецепторов и факторов, связанных с апопто-зом в эпителиальных клетках предстательной железы человека с различной степенью анаплазии. Установлено, что подобный подход к изучению онкологических заболеваний предстательной железы человека позволяет четко дифференцировать такие заболевания как доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ), простатическая интраэпителиальная неоплазия и аденокарцинома (АК). Доброкачественные процессы в секреторном эпителии простаты характеризуются наличием рецепторов к андрогенам в ядрах и отсутствием экспрессии ВСЬ-2 в цитоплазме клеток. Для злокачественных новообразований характерно снижение количества рецепторов к андрогенам и усиление экспрессии ВСЬ-2 и ВАХ в цитоплазме и Р53 в ядрах клеток.

В работе Р.В. Савкова [6] получены результаты иммуногистохимических исследований рецепторов к андрогенам в биопсийном материале от пациентов с различным клиническим течением ДГПЖ и АК.

В результате проведенных исследований было выявлено, что у пациентов без прогрессирования ДГПЖ отмечается интенсивное окрашивание 70-90% ядер железистых клеток на андрогеновые рецепторы. В случае прогрессирования количество окрашенных ядер уменьшалось и составляло — 20-40%.

При исследовании пациентов с АК простаты в случае отсутствия резкого прогрессирования заболевания средние показатели окрашивания ядер эпителиальных клеток составляли 40-70%. В случаях прогрессирования АК среднее количество окрашенных ядер соответствовало 15-30%.

Полученные данные свидетельствуют о том, что сравнительное иммуногистохимическое исследование рецепторов к андрогеновым гормонам при ДГПЖ и АК предстательной железы человека позволяет оценить индивидуальные изменения в

экспрессии андрогеновых рецепторов у пациентов с различным клиническим течением заболевания и прогнозировать эффективность антиандрогеновой терапии.

Полученные данные свидетельствуют о том, что по мере нарастания клеточного атипизма в эпителии эктоцервикса, эндометрия и предстательной железы человека уменьшается число клеток, экспрессирующих рецепторы к стероидным гормонам. Это проявляется в возрастающей автономности опухолевых клеток и снижении их чувствительности к гормональным влияниям. Кроме того, соотношение количества клеток, обладающих рецепторами и без них, имеет прогностическое значение для определения эффективности антиандрогеновой или антиэстрогеновой терапии.

При исследовании факторов, связанных с процессами апоптоза, было показано, что экспрессия факторов, препятствующих развитию апоптоза BCL-2, в норме осуществляется в стволовых клетках базального эпителиального слоя желез и не встречается в клетках секреторного эпителия. В свою очередь фактор ВАХ экспрессируется в клетках при запуске механизмов апоптоза. Наши данные по изучению опухолей различной локализации свидетельствуют о том, что в анапластических клетках происходит одновременная экспрессия как факторов препятствующих, так и способствующих развитию апоптоза. Подобные утверждения находят свое объяснение благодаря исследованиям С. Magi-Galluzzi и соавт. [10], которыми показано, что некоторые онкогены влияют на митогенактивирующие протеин киназы (МАР), осуществляющие проведение как пролиферативных, так и апоптозных сигналов к клеточному ядру. Модулирование подобных киназных путей МАР способно нарушить баланс между клеточной пролиферацией и смертью, и привести к торможению механизмов апоптоза. Эти данные, с одной стороны, свидетельствует о том, что рост злокачественных новообразований происходит за счет блокировки про-апоптозных факторов их антагонистами, а также позволяет провести дифференциальную диагностику между злокачественными и доброкачественными опухолями в тех случаях, когда у патолога возникают сомнения относительно степени анапластических изменений в клетках.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ашхаб М.Х., Владимирцева А.Л., Шелястина Н.Н., Бабиченко И.И. Иммуно-гистохимические иследования экспрессии рецепторов стероидных гормонов в эндометрии женщин в ходе нормального менструального цикла // Вестник РУДН, серия Медицина. — 2002. — № 1. — С. 54-59.

2. Гундорова Л.В., Бабиченко И.И. Экспрессия антиапоптозного белка BCL-2 в эпителиальных клетках предстательной железы человека с различной степени не-оплазии // Вестник РУДН, серия Медицина. — 2002. — № 4. — С. 93-95.

3.Гундорова Л.В., Шелястина Н.Н., Бабиченко И.И. Корреляция между Gleason score и андроген-рецепторами при раках предстательной железы // Вестник РУДН, серия Медицина. — 2002. — № 4. — С. 96-98.

4. Ковязин В.А., Костанян И.А., Драницына С.М., Бабиченко И.И. Иммуноги-стохимическое исследование экспрессии факторов апоптоза в железистых клетках нормального пролиферативного, гиперпластического и неопластического эндометрия // Вестник РУДН, серия Медицина. — 2005. — Т. 29. — № 1. — С. 65-70.

5. Лысенко О.Н., Ашхаб М.Х., Стрижова Н.В., Бабиченко И.И. Иммуногисто-химические исследования экспрессии рецепторов к стероидным гормонам при ги-перпластических процессах в эндометрии // Архив патологии. — 2004. — Т. 66. — №2, —С. 7-10.

6. Савков Р.В., Бабиченко И.И. Иммуногистохимические исследования рецепторов к андрогеновым гормонам в опухолях предстательной железы человека // Вестник РУДН, серия Медицина. — 2004. — № 3. — С. 105-106.

7. Фролова И.И., Бабиченко И.И. Клинико-морфологические исследования дис-кератозов и предрака шейки матки // Вопросы гинекологии, акушерства и перина-тологии. — 2003. — Т. 2. — № 3. — С. 19-24.

8. Фролова И.И, Бабиченко ИИ, Местергази Г.М. Цервикальные интраэпите-лиальные неоплазии и дискератозы шейки матки. — М.: Издательский дом «Династия», 2004. — 88 с.

9. Фролова ИИ, Местергази Г.М., Радзинский В.Е., Шелястина Н.Н., Бабиченко И.И. Иммуногистохимические исследования дискератоза и неопластических изменений экзоцервикса при системной гинекологической патологии // Архив патологии. •— 2002. — Т. 64. — № 6. — С. 23-26.

10. Magi-Galluzzi С., Montironi R., Cangi M.G., Wishnow К., Loda М. Mitogen-activated protein kinase and apoptosis in PIN // Virchows Arch. — 1998. — V. 432. — N5, —P. 407-413.

IMMUNOHISTOCHEMICAL INVESTIGATION OF MOLECULAR BASIS OF HUMANE ONCOLOGICAL DISEASES

I.I. Babichenko

Department of Pathological Anatomy Peoples’ Friendship University of Russia Mik.lukho-Mak.laya St., 8, 117198 Moscow, Russia

Complex imunohistochemical investigation of ectocervix, endometrium and prostate tumors allows to value receptors to steroid hormones, as well as various expression of proteins that regulate apoptosis, and to indicate the beginning of the neoplastic changes in epithelial cells.

Due to neoplastic epithelial transformation in ectocervix, the number of cells with Ki-67, P53 in nuclei is increased, while BCL-2 and ERs expression is decreased. Neoplastic epithelial cells at CIN III loused the receptors to estrogens. The results of immunohistochemical researches in endometrium have shown, that the factor P53 in compared with BCL-2 and BAX, may be helpful in differentiating of atypical hyperplasia from well-differentiated adenocarcinoma.

The similar approach to study of oncologic diseases of prostate allows to differentiate legibly such diseases as a benign prostatic hypertrophy, prostate intraepithelial neoplasia and adenocarcinoma. The benign processes in secretory epithelial cells are characterized by presence of receptors to androgens in the cells nuclei and absence of BCL-2 in cells cytoplasm. Malignant cells loused the receptors to androgens and intensifying expression of BCL-2 in cytoplasm. The positive reaction on androgen receptors was marked in researches of BPH and adenocarcinoma samples in patients without progression. The average quantity of the stained nucleuses was authentically reduced in cases with progression.

Keywords: Immunohistochemistry, ectocervix, endometrium, prostate, steroid hormones receptors.