ХРОМОГЕННАЯ СЕЛЕКТИВНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДагХром АГАР ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ И ДРУГИХ КОЛИФОРМНЫХ БАКТЕРИЙ
CHROMOGENIC SELECTIVE CULTURE MEDIUM DagChrom AGAR FOR ISOLATING AND IDENTIFYING ECOLI AND OTHER COLIFORM BACTERIA

Изобретение относится к медицине, а именно к санитарной и клинической микробиологии, и может быть использовано при исследовании различного материала с подозрением на кишечную палочку и другие колиформные бактерии.
Проблема острых кишечных инфекций (ОКИ) чрезвычайно актуальна в современной медицине, о чем свидетельствуют спорадические вспышки тех или иных острых кишечных заболеваний.
Источником заражения ОКИ являются инфицированные объекты внешней среды - питьевая вода, воды открытых водоемов, предметы обихода, пищевые продукты и их компоненты, особенно промышленного изготовления. В связи с тем, что ОКИ являются заболеваниями с фекально-оральным путем передачи инфекции, важное значение для предупреждения заболевания имеет регулярный санитарно - эпидемиологический надзор за объектами внешней среды, включающий в себя микробиологические исследования окружающей среды и пищевых продуктов с целью оценки их безопасности для здоровья человека.
Для предупреждения внутрибольничных инфекций (ВБИ) также проводят регулярные санитарно-микробиологические исследования на обсемененность в лечебно-профилактических учреждениях: смывы с различных объектов стационара, инструментов, пищеблока и т.п.
Согласно действующим Методическим указаниям по проведению санитарно-микробиологического анализа питьевой воды (МУК 4.2.1018-01) и микробиологическому контролю продуктов питания и их компонентов (МУК 4.2.577-96) в исследуемом материале проводят определение бактерий группы кишечной палочки (БГКП), так называемых общих колиформных бактерий, как санитарно - показательных микроорганизмов, к которым в соответствии с принятой международной номенклатурой относят грамотрицательные неспорообразующие палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при температуре (37±1)°С в течение 24-48 ч и являющиеся представителями родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella и Serratia, т.е. учитываются как цитратотрицательные, так и цитратположительные варианты БГКП.Наличие БГКП в исследуемом образце характеризует общее микробное загрязнение. Индикатором свежего фекального загрязнения и косвенным показателем возможного загрязнения патогенными возбудителями кишечных инфекций является непосредственное присутствие в исследуемом материале E.coli - неутилизирующих цитрат, грамотрицательных бесспоровых палочек, способных расти и ферментировать лактозу при температурах выше температуры человека и теплокровных животных (44-44,5)°С.
Известны питательные среды для санитарно-микробиологических исследований объектов внешней среды (1, 2, 3, 4, 5).
К недостаткам указанных сред следует отнести их слабые дифференцирующие свойства из-за сходства биохимических реакций колиформных бактерий (БГКП) по отношению к лактозе, вследствие чего все колонии БГКП идентично окрашиваются. Кроме того, существенным недостатком традиционных сред Эндо и Левина является неспособность их подавлять роение протеев: в случае присутствия в микробной ассоциации роящихся форм протея выделение возбудителя в чистой культуре невозможно, что препятствует дифференциации и идентификации микроорганизмов. По этим причинам для выявления свежего фекального загрязнения требуется обязательная постановка дополнительных идентификационных тестов - температурного, индольного, реакции с метиловым красным, реакции Фогес-Проскауэра, т.е. с ацетилметилкарбинолом и цитратного (ТИМАЦ - тест) (4.5), что удлиняет сроки идентификации выделенных микроорганизмов (не менее 3-х суток) и усложняет сам процесс дифференциации и идентификации. В то же время известно, что при проведении микробиологических исследований важным условием является быстрота получения результатов, что способствует ранней диагностике.
Наиболее близким решением задачи того же назначения по совокупности признаков и достигаемому эффекту является сухая питательная среда фирмы "Fluka" - HiCrome™ ECC Selective Agar, в состав которой входят в г/л дистиллированной воды:
Agar
10.0 g/1
Casein enzymic hydrolisate
3.3 g/l
Chromogenic mixture
0.43 g/l
Disodium hydrogen phosphate
1 g/l
Peptone, special
6.0 g/l
Sodium chloride
2 g/l
Sodium dihydrogen phosphate
1 g/l
Sodium pyruvite
1 g/l
Sorbitol
1 g/l
Tergitol 7
0.15 g/l
Tryptophan
1 g/l
Эта среда обеспечивает в течение 24 ч идентификацию колиформных бактерий, в т.ч. Е.coli, с помощью хромогенных индикаторов (субстратов), входящих в состав среды и позволяющих выявить у обнаруженных микроорганизмов группоспецифический (для колиформ) фермент -β-галактозидазу и видоспецифический (для E.coli) фермент β-глюкуронидазу(6).
Отечественная промышленность аналогичных сред не выпускает.
К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании HiCrome™ ECC Selective Agar-среды, принятой за прототип, является неспособность ее подавить роение протея и сложность в приготовлении, т.к. из-за присутствия в среде термолабильных компонентов требуется щадящая стерилизация путем обработки среды в открытой струе пара.
Цель изобретения - получение отечественной среды аналогичного назначения с улучшенными дифференцирующими свойствами и упрощение процесса ее приготовления. Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что предлагаемая питательная среда для подавления роения протея и исключения необходимости стерилизации ее содержит бриллиантовый зеленый и желчные соли. Для стимуляции роста и усиления проявления ферментативных реакций микроорганизмов среда содержит сухой питательный бульон из каспийской кильки и парааминобензойную кислоту. Для обеспечения поддержания рН в процессе роста микроорганизмов среда содержит фосфат калия однозамещенный. Дифференцирующие свойства обеспечиваются двумя хромогенными индикаторами: 2-нитрофенил β-D-галактопиранозид - хромогенный субстрат для обнаружения наличия β-галактозидазы -группоспецифического фермента колиформных бактерий и 5-бром-4-хлор-3-индол β-D-глюкуронид циклогексиламмонийной соли - хромогенный субстрат для выявления β-глюкуронидазы - видоспецифического фермента E.coli. Для придания плотности среде она содержит агар микробиологический.
Состав предлагаемой среды - ДагХром агар в г/л дистиллированной воды:
сухой питательный бульон из каспийской кильки ФС42-3505-98
- 5,0-10,0
панкреатический гидролизат казеина РП №816-98
- 14,0-16,0
парааминобензойная кислота, фирма «Sigma»
- 0,01-0,015
калий фосфорнокислый однозамещенный, з-д химреактив. г Шостка
- 0,2-0,3
2-нитрофенил β-D-галактопиранозид, фирма «Sigma»
- 0,3-0,4
5-бром-4-хлор-3-индол β-D-глюкуронид
циклогексиламмонийной соли, фирма «Sigma»
- 0,5-0,6
желчные соли №3, фирма «Oxoid»
- 1,5-2,0
бриллиантовый зеленый, з-д химреактив. г Шостка
- 0,0002-0,0003
агар микробиологический, ГОСТ 17206-84
- 14,0-16,0
Сухую селективную питательную среду ДагХром агар получают следующим образом.
Пример 1. В шаровую мельницу-смеситель емкостью 100 литров загружают последовательно 5,0 кг сухого питательного бульона из каспийской кильки, 0,01 кг парааминобензойной кислоты, 0,2 кг калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,0002 кг бриллиантового зеленого и 1,5 кг желчных солей. Люк мельницы закрывают и перемешивают все ингредиенты в течение 20 минут. Затем в мельницу-смеситель вносят последовательно 14 кг агара микробиологического, 14 кг панкреатического гидролизата казеина, 0,3 кг 2-нитрофенил β-D-галактопиранозида и 0,5 кг 5-бром-4-хлор-3-индол β-D-глюкуронида циклогексиламмонийной соли.
Содержимое мельницы-смесителя перемешивают в течение 45-60 мин, после чего получают гомогенную сухую питательную среду.
Для приготовления плотной среды, готовой к употреблению, в 1 л дистиллированной воды растворяют 35,5 г сухой среды, трехкратно кипятят по 1-2 мин при помешивании, не допуская пригорания агара, до появления крупнопузырчатой пены. Среду охлаждают до температуры 45-50°С, после чего разливают в стерильные чашки Петри. После застывания агаровой пластинки чашки со средой подсушивают в термостате при 37°С в течение 50-60 мин с соблюдением правил асептики.
Готовая к употреблению среда прозрачная, светло-соломенного цвета, рН среды 7,4±0,2.
Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что в шаровую мельницу-смеситель последовательно вносят 7,5 кг сухого питательного бульона из каспийской кильки, 0,0125 кг парааминобензойной кислоты, 0,25 кг калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,00025 кг бриллиантового зеленого и 1,75 кг желчных солей. Далее - по примеру 1. Затем в мельницу-смеситель вносят последовательно 15 кг агара микробиологического, 15 кг панкреатического гидролизата казеина, 0,35 кг 2-нитрофенил β-D-галактопиранозида и 0,55 кг 5-бром-4-хлор-3-индол β-D-глюкуронида циклогексиламмонийной соли. Далее - по примеру 1.
Для приготовления плотной среды, готовой к употреблению, в 1 л дистиллированной воды растворяют 40,4 г сухой среды. Далее - по примеру 1.
Пример 3. Отличается от примера 1,2 тем, что в шаровую мельницу-смеситель последовательно вносят 10 кг сухого питательного бульона из каспийской кильки, 0,015 кг парааминобензойной кислоты, 0,3 кг калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,0003 кг бриллиантового зеленого и 2,0 кг желчных солей. Далее - по примеру 1,2. Затем в мельницу-смеситель вносят последовательно 16 кг агара микробиологического, 16 кг панкреатического гидролизата казеина, 0,4 кг 2-нитрофенил β-D-галактопиранозида и 0,6 кг 5-бром-4-хлор-3-индол β-D-глюкуронида циклогексиламмонийной соли. Далее - по примеру 1,2.
Для приготовления плотной среды, готовой к употреблению, в 1 л дистиллированной воды растворяют 45,3 г сухой среды. Далее - по примеру 1, 2.
Через 18-24 ч инкубации посевов (при 37±1°С) на предлагаемой среде колиформные бактерии (БГКП) образуют колонии желтого цвета вследствие расщепления хромогенного индикатора (субстрата) β-D-галактопиранозида группоспецифическим ферментом этих бактерий β-галактозидазой и выделением в среду желтого хромофора. Колонии Е.coli на предлагаемой среде окрашиваются в сине-зеленый цвет, т.к. обладают ферментами β-галактозидазой и β-глюкуронидазой, вследствии чего происходит расщепление обоих хромогенных индикаторов - β-D-галактопиранозида и β-D-глюкуронида, выделяющих в среду хромофоры желтого и синего цвета соответственно. Остальные грамотрицательные микроорганизмы образуют бесцветные колонии, поскольку названные ферменты у них отсутствуют.
В известную среду HiCrome™ ECC Selective Agar, взятую за прототип, дополнительно введен триптофан для подтверждения принадлежности выделенного микроорганизма к E.coli путем постановки индольного теста с помощью реактива Ковача.
В предлагаемую среду ДагХром агар введение триптофана не требуется, т.к. необходимое его количество для постановки индольного теста с реактивом Ковача обеспечивается присутствием в составе среды сухого питательного бульона из каспийской кильки, богатого триптофаном. При этом вследствие оптимальной комбинации используемых в предлагаемой среде хромогенных субстратов изменение окраски колоний E.coli при постановке подтверждающего индольного теста легче учитывается: на предлагаемой среде - от сине-зеленой к ярко-розовой, на известной среде - от фиолетовой к оранжево-красной.
Селективные свойства предлагаемой среды, обеспеченные введением в ее состав желчных солей и бриллиантового зеленого, позволяют не только полностью ингибировать грамположительные микроорганизмы, но и подавить роение протея, а так же исключить пророст споровой микрофлоры, в результате чего стерилизация плотной среды не требуется, что в совокупности улучшает дифференцирующие свойства среды и упрощает процесс приготовления ее к употреблению (посеву).
Указанные преимущества предлагаемой среды в совокупности повышают эффективность диагностики при проведении санитарно-микробиологических и клинических исследований.
Сравнительная характеристика предлагаемой и известной среды представлена в таблице 1.