99m
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВЯЗЫВАНИЯ РАДИОФАРМПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЦИПРОФЛОКСАЦИНА, МЕЧЕННОГО Tc C БАКТЕРИЯМИ
99m
METHOD FOR DETECTING Tc-CIPROFLOXACIN RADIOPHARMACEUTICAL FIXATION TO BACTERIA

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и может применяться для доклинического испытания радиофармпрепаратов.
99m
99m
Известен способ определения связывания радиофармпрепарата на основе ципрофлоксацина, меченного Tc с Escherichia coli [1], заключающийся в инкубировании культуры Escherichia coli с 0,37 МБк/мл ципрофлоксацина, меченного Tc, и концентрацией ципрофлоксацина в готовом радиофармпрепарате 4 мг/мл, с последующим центрифугированием радиоактивной бактериальной суспензии в течение 10 мин при 2000 g, двукратной отмывкой меченых бактерий 0,9% NaCl и радиометрией бактериального осадка, надосадка и центрифужной пробирки.
Данный способ является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа.
Его недостатком является длительность выполнения процедуры (60 мин) и контакта исследователя с бактериями вследствие двукратной отмывки бактериальной суспензии и трехкратного ее центрифугирования, а также потеря радиоактивной бактериальной суспензии в наконечниках пипеток при выполнении отмывки.
Цель изобретения - сокращение сроков и повышение безопасности процедуры.
99m
99m
99m
99m
4
Поставленная цель достигается техническим решением, представляющим собой способ определения связывания радиофармпрепарата на основе ципрофлоксацина, меченного Tc с бактериями, заключающийся в следующем. В стерильный флакон вливают по 1 мл бактериальной культуры, затем добавляют по 0,37 МБк/мл ципрофлоксацина, меченного Tc (концентрация ципрофлоксацина в готовом радиофармпрепарате 4 мг/мл) и предварительно отфильтрованного фильтром-насадкой для шприцов с диаметром пор 100 нм. Полученную суспензию инкубируют в термостате при 37°C в течение сроков, выбранных исследователями. По истечении сроков инкубации радиоактивную бактериальную суспензию забирают в стерильный шприц и пропускают через антибактериальный фильтр-насадку для шприцов с диаметром пор 200 нм, затем фильтр промывают 10 мл 0,9% раствором NaCl и измеряют радиоактивность осадка в фильтре и во флаконе с отмывочным раствором на радиометре. В качестве контроля используют фильтры, через которые пропускают 1 мл 0,37 МБк/мл ципрофлоксацина, меченного Tc и NaTcO без предварительной инкубации с культурами бактерий.
99m
99m
99m
4
Новым в предлагаемом способе является использование для сепарации радиоактивных бактерий и раствора несвязанного ципрофлоксацина, меченного Tc, антибактериальных фильтр-насадок для шприцов с диаметром пор 200 нм, а также использование контрольной фильтрации растворов ципрофлоксацина, меченного Tc и NaTcO без предварительной инкубации с культурами бактерий.
Новые признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства. Идентичной совокупности признаков в известных технических решениях не обнаружено.
Предлагаемый способ может быть использован при выполнении доклинических испытаний новых радиофармпрепаратов, а также в научно-исследовательских работах.
Исходя из вышеизложенного предлагаемое изобретение соответствует условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень» и «Промышленная применимость».
Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных рисунков.
Диагностика воспалительных процессов бактериальной этиологии остается одной из наиболее актуальных проблем современной медицины. Широкая распространенность такой патологии и связанные с ней высокая степень инвалидизации и летальности требует разработки новых методов диагностики. Решением этой проблемы может служить использование радионуклидных методов исследования, которые во многих случаях позволяют оценить патофизиологические изменения в поврежденных органах и тканях с помощью гамма-сцинтиграфии. В последние годы была предпринята попытка синтезировать радиофармпрепараты (РФП), связывающиеся непосредственно с возбудителем и, таким образом, позволяющие селективно визуализировать очаги бактериального воспаления. В качестве таких индикаторов могут быть использованы меченные радиоактивными изотопами антибактериальные лекарственные средства (ЛС), при этом антибиотик выполняет функцию транспорта и фиксации радионуклида в патологическом очаге.
Ципрофлоксацин - антибиотик фторхинолонового ряда - обладает химической структурой, позволяющей проводить его радиоизотопное мечение технецием-99m. Кроме того, указанное ЛС необратимо связывается с ферментами бактерий и аккумулируется в очагах скопления микроорганизмов. Эти свойства дают основание рассматривать ципрофлоксациц, меченный технецием-99m, в качестве перспективного РФП для диагностики бактериального воспаления. В рамках доклинических исследований указанного РФП обязательным является исследование его способности селективно связываться бактериями, присутствующими в патологическом очаге.
Новые существенные признаки позволяют сократить время исследования и повысить безопасность выполняемой процедуры.
Способ осуществляется следующим образом.
99m
99m
99m
4
В стерильный флакон вливают по 1 мл бактериальной культуры, затем добавляют по 0,37 МБк/мл ципрофлоксацина, меченного Tc (концентрация ципрофлоксацина в готовом радиофармпрепарате 4 мг/мл) и предварительно отфильтрованного фильтром-насадкой для шприцов с диаметром пор 100 нм. Полученную суспензию инкубируют в термостате при 37°C в течение сроков, выбранных исследователями. По истечении сроков инкубации радиоактивную суспензию живой или инактивированной бактериальной культуры забирают в стерильный шприц и пропускают через антибактериальный фильтр-насадку для шприцов с диаметром пор 200 нм, затем фильтр промывают 10 мл 0,9% раствором NaCl и измеряют радиоактивность осадка в фильтре и во флаконе с промывочным раствором на радиометре. В качестве контроля используют фильтры, через которые пропускают 1 мл 0,37 МБк/мл ципрофлоксацина, меченного Tc и NaTcO без предварительной инкубации с культурами бактерий.
Пример 1
99m
В ходе доклинических испытаний определяли долю связывания ципрофлоксацина, меченного Tc со Staphylococcus aureus, в 3-х сериях опытов следующим образом.
99m
99m
99m
99m
99m
4
4
В стерильные флаконы (общее количество 18 шт. на 1 опыт) вливали по 1 мл живой бактериальной культуры (6 флаконов), инактивированной культуры (6 флаконов) и ципрофлоксацин-резистентной культуры S. aureus (6 флаконов). Затем в 3 флакона, содержащих каждую из исследуемых культур, добавляли по 1 мл (0,37 МБк) Tc-ципрофлоксацина, предварительно отфильтрованного фильтром-насадкой для шприцов Minisart  (Sartorius Stedim biotech) с диаметром пор 100 нм. Полученную суспензию инкубировали в термостате при 37°C в течение 15, 30 и 60 мин. Для того чтобы определить возможность взаимодействия свободного Tc с микроорганизмами, аналогичным образом проводили инкубацию оставшейся части культур Staphylococcus aureus с натрия пертехнетатом (NaTcO). По истечении сроков инкубации каждый вид суспензии забирали в стерильный шприц и пропускали через антибактериальный фильтр-насадку для шприцов Minisart  (Sartorius Stedim biotech) с диаметром пор 200 им, затем фильтр промывали 10 мл 0,9% раствором NaCl и измеряли радиоактивность осадка в фильтре и во флаконе с промывочным раствором на радиометре. В качестве контроля использовали фильтры, через которые пропускали 1 мл (20 МБк) Tc-ципрофлоксацина и NaTcO без предварительной инкубации с культурами S. aureus.
99m
99m
Результаты инкубации культур Staphylococcus aureus с ципрофлоксацином, меченным Tc, представлены на рис.1. Так, через 15 мин после смешивания бактерий с РФП меченный Tc антибиотик в большем количестве накапливался в суспензии инактивированных, чем в живых и резистентных бактериях. Известно, что ципрофлоксацин обладает бактерицидным действием не только на активно делящиеся, но и на покоящиеся клетки [2]. Накопление РФП в убитой культуре стафилококка можно объяснить увеличением проницаемости поврежденной нагреванием клеточной стенки микроорганизмов, что облегчает попадание антибиотика в бактериальную клетку.
99m
В то же время из рис.1 следует, что с течением времени происходило вымывание РФП из инактивированной культуры и увеличение степени его аккумуляции в живых образцах. К 60 мин инкубации количество Tc-ципрофлоксацина, связавшегося с бактериями, становилось одинаковым во всех опытах. Эти данные свидетельствуют об обратимом взаимодействии меченного изотопной меткой антибиотика с убитыми бактериями и о необратимом его связывании с живыми культурами.
Предлагаемый способ апробирован в 3 сериях экспериментов и позволяет сократить время исследования, а также уменьшить затраты на его проведение.
Используемая литература
1. K. Alexander, Wm. Tod Drost, J.S. Mattoon, et al. Binding of ciprofloxacin labelled with technetium Tc 99m versus 99m Tc-pertechnetate to a live and killed equine isolate of Escherichia coli // The Canadian Journal of Veterinary Research 2005. V 69. P.272-277.
2. Сидоренко С.В. Роль хинолонов в антибактериальной терапии. Механизм действия, устойчивость микроорганизмов, фармакокинетика и переносимость // Клин. фармакология и терапия. 2003. Т.11. №2. С.46-51.