Способ ускоренного выращивания посадочного материала древесных растений сем. Betulaceae на основе клонирования in vitro
METHOD FOR ACCELERATED CULTIVATION OF PLANTING MATERIAL OF WOODY PLANTS OF BETULACEAE FAMILY BASED ON IN VITRO CLONING

Изобретение относится к лесной биотехнологии, а именно к селекции, семеноводству, выращиванию посадочного материала, воспроизводству экономически ценных видов и форм лесных древесных растений, а также созданию культур плантационного типа в лесном хозяйстве.
2
Известен способ массового получения посадочного материала разных видов березы на основе культуры in vitro, по которому размножение и укоренение побегов исходных генотипов выполняют в соответствии с основными методиками клонального микроразмножения. Акклиматизацию растений и дальнейшее их выращивание осуществляют в кассетах, включающих мини-ячейки объемом 20 мл, использование которых обеспечивает высокую густоту посадки (667 и 900 шт/м). Перенос растений из культуры in vitro в теплицу производят в середине мая. Для полива используют капиллярные маты. Высота посадочного материала к концу вегетационного периода составляет около 15 см (Лебедев В.Г., Азарова А.Б., Аркаев М.С., Невский С.А., Шестибратов К.А. Эффективная технология массового получения посадочного материала различных видов березы на основе культуры in vitro II Биотехнология. 2017. Т. 33. №2. С. 76-88).
3
2
2
2
Однако в указанном способе для выращивания посадочного материала используют пластиковые кассеты марки Plantek и ВСС SideSlit размером 400x400 мм, где объем отдельной ячейки равняется 49 и 21 см. Это, с одной стороны, обеспечивает одновременное размещение большого количества растений (соответственно 667 и 900 шт/м) на небольшой площади, а с другой, после посадки вследствие малого объема в кассетах происходит высокая конкуренция между растениями в надземной части за свет, а в подземной - за питательные вещества и воду. В результате растения развиваются неравномерно, часть из них отстает в росте и со временем погибает. Кроме того, при плотном размещении растений возрастает вероятность прорастания корневой системы в соседние ячеи, что в дальнейшем препятствует извлечению растений из кассет без повреждения и отрицательно сказывается на их дальнейшей приживаемости и сохранности. При начальном размещении растений в одной кассете по 667 и 900 шт/м к осени их количество, согласно данным авторов, уменьшается в три раза и составляет 210-350 шт/м соответственно. При использовании предложенного способа можно сохранить только 1/3 (и менее) растений от первоначально полученных путем клонирования. Для посадки в грунт рекомендуют растения высотой около 15 см. Такая весьма небольшая высота обусловлена, вероятно, низкой эффективностью капиллярных матов, использованных для полива, которые не могут обеспечить уровень влажности воздуха, необходимый для роста и развития растений при их переносе из условий in vitro (стерильные) в условия ex vitro (нестерильные). Предложенный цикл выращивания посадочного материала нельзя считать завершенным, поскольку при высоте равной 15 см растения не способны успешно конкурировать с активно вегетирующей травяной растительностью за питательные вещества и свет после посадки на постоянное место.
Использование данного способа является малоэффективным вследствие значительных потерь количества растений, полученных в результате клонального микроразмножения, а также из-за необходимости продолжения работ по «доращиванию» посадочного материала в течение еще не менее чем одного вегетационного сезона. Все это увеличивает трудоемкость и продолжительность процесса, и соответственно он становится более дорогостоящим.
Наиболее близким по сущности является способ получения посадочного материала ценных видов, включающий размножение и укоренение побегов исходных генотипов в условиях клонального микроразмножения in vitro. Для выращивания посадочного материала отбирают микрорастения с хорошо развитой корневой системой высотой от 3 до 5 см. Испытаны два способа адаптации растений к нестерильным условиям среды (ех vitro): один (поэтапный) - с предварительным размещением в условиях лаборатории, а другой (прямой) - непосредственно в условиях теплицы. Процент адаптированных растений при поэтапной посадке в условия теплицы был ниже от 70 до 92%, чем при прямой от 75 до 98%. В обоих случаях, в течение 2-3 суток проводят акклиматизацию микрорастений в условиях климатической камеры, путем их размещения на агаризованной среде в открытых культуральных сосудах с добавлением 1-1,3 мл дистиллированной нестерильной воды. Посадку осуществляют в мае-июне в теплицу без туманообразующей установки. Повышенную влажность 80-90%, необходимую для растений, обеспечивают за счет использования дополнительной минитеплицы, что одновременно способствует удешевлению данного способа. Через 10-14 дней укрытие снимают, постепенно переходят на более редкий полив. К концу вегетационного периода высота растений составляет от 6,5 до 12,2 см, а приживаемость - от 70 до 98% в зависимости от генотипа (Машкина О.С., Табацкая Т.М., Внукова Н.И. Технология долгосрочного хранения в культуре in vitro ценных генотипов березы и выращивание на ее основе посадочного материала //Биотехнология. 2019. Т. 34. №3. С 57-67).
На этапе адаптации к нестерильным условиям среды данный способ не обеспечивает оптимальные условия для роста и развития растений, поскольку в пластиковые контейнеры объемом 1 л их размещают не индивидуально, а по 10 штук в каждый. Для микрорастений, высаженных непосредственно в теплицу, используют технологию открытой, а не закрытой корневой системы. В результате в обоих случаях корневая система травмируется при дальнейшей пересадке на постоянное место. Недостатком способа также являются их небольшие размеры - от 6,5 до 12,2 см, достигаемые растениями в течение первого вегетационного периода, что влечет за собой необходимость их доращивания в течение следующего года. Использование посадки с открытой корневой системой усложняет процесс выращивания, увеличивает его продолжительность и трудозатраты и отрицательно влияет в дальнейшем на приживаемость растений вследствие возможного повреждения корневой системы при их пересадке. Поэтому полный цикл данного способа получения посадочного материала также является малоэффективным, дорогостоящим, продолжительным от 2-х лет и более и, кроме того, не обеспечивающим производство посадочного материала необходимого высокого качества.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа ускоренного выращивания посадочного материала трудноразмножаемых экономически ценных и декоративных древесных растений семейства Betulaceae, позволяющего получать одновременно большое количество высококачественных растений, сохраняющих уникальные признаки исходных генотипов.
Техническим результатом изобретения является получение крупномерного посадочного материала высотой от 50 см до 1 ми выше в зависимости от генотипа клона в течение одного вегетационного периода с наименьшими трудовыми, временными и материальными затратами.
Заявленный технический результат достигается тем, что в способе выращивания посадочного материала древесных растений сем. Betulaceae на основе клонирования in vitro, включающем индукцию, элонгацию и укоренение микропобегов на агаризованной питательной среде in vitro, перенос их в условия ex vitro для роста и развития, согласно изобретению, индукцию микропобегов и их укоренение непосредственно в культуре тканей проводят в зимний период, а перенос полученных растений в условия ex vitro для выращивания крупномерного посадочного материала осуществляют с наступлением весеннего периода путем их индивидуального размещения с закрытой корневой системой в микропарнике в нестерильном субстрате при влажности воздуха 80-90% и последующего повторного перемещения растений с увеличением объема нестерильного субстрата.
Актуальность заявляемого способа обусловлена тем, что среди представителей рода Betula встречаются редкие, находящиеся на грани исчезновения растения, которые требуют принятия срочных мер для их сохранения и размножения. Данный способ позволяет обеспечить высокую сохранность посадочного материала не только в период его выращивания, но и после размещения его на постоянное место.
Апробация способа проводилась на территории Республики Карелия в течение 5-ти лет в период с 2015 по 2020 гг. Полученные растения высаживали на опытных участках и в последующем использовали для озеленения в городских посадках.
Способ осуществляется следующим образом:
Способ получения посадочного материала сем. Betulaceae, включающим укоренение микропобегов на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга in vitro и последующую их адаптацию к нестерильным условиям лаборатории, согласно заявляемого изобретения, проводят индивидуально, а именно с закрытой корневой системой (ЗКС).
Для укоренения используют сегменты побегов, состоящие из стебля длиной 2,5-3,5 см, имеющего 2-3 листовые пластинки.
Укоренение осуществляют с использованием уменьшенной вдвое минеральной основы по Мурасиге-Скуга с добавлением ауксина, в виде индолил-3-масляной кислоты, в зимний период, начиная с января и по март месяц включительно (Патент РФ №2627194, опубл. 2017 г «Способ клонального микроразмножения растений сем. Betu-laceae»).
Культивирование проводят в стеклянных сосудах объемом 125 мл и диаметром -55 мл или в пробирках диаметром 16 мм при температуре воздуха 24-26°С, 16-часовом фотопериоде и искусственном освещении, соответствующем 4500 лк. Через 3-4 недели, укорененные in vitro растения (рисунок А), используя стандартные минипарники размером 44×22×6,5 см, индивидуально переносят в условия ex vitro и выдерживают в лабораторных условиях в течение 1-2 месяцев с февраля по март месяц (рисунок Б). Приживаемость растений на данном этапе составляет 85% и выше, средняя высота - около 16 см (данные представлены в таблице).
В дальнейшем окрепшие растения также индивидуально переносят в цилиндры большего объема 0,5-1,0 л и выдерживают в лабораторных условиях еще около 2 месяцев в весенний период с апреля по май месяц. К началу текущего вегетационного периода, а именно май-начало июня, высота растений достигает 30-40 см (таблица), после чего их переносят в условия теплицы, где выращивают до середины августа.
В последующем их переносят из теплицы на открытый воздух для акклиматизации и одревеснения побегов (как правило, в середине августа месяца) (рисунок В), где их оставляют на весь зимний период.
Высота растений к концу вегетационного периода составляет от 50 см до 80 см, максимальное значение 1,0 метр, это зависит от биологических особенностей клонов, включая их жизненную форму (таблица). При этом приживаемость растений не снижается и составляет 98% и выше. Данный положительный эффект обусловлен, тем, что приживаемость относится не к мелким растениям 6-12 см, а к более крупным - от 50 см до 1 м, такие растения характеризуются значительно большей биомассой и к этому времени у них происходит дифференциация по жизненной форме. При посадке на постоянное место крупномерный посадочный материал способен успешно конкурировать с активно вегетирующей травяной растительностью за питательные вещества и свет, что значительно снижает риск гибели посадочного материала.
Использование минипарников и осуществление полива воздушно-капельным путем позволяет сохранить уровень влажности воздуха на уровне 80-90% и выше, который необходим растениям, полученным путем клонирования in vitro. Технология выращивания посадочного материала с ЗКС является оптимальной для роста и развития растений, поскольку при ее применении корневая система саженцев не повреждается, обеспечивая в дальнейшем их высокую приживаемость и сохранность.
Повышение эффективности способа достигается за счет более ранних сроков начала выращивания посадочного материала, а также повышения жизнеспособности микрорастений при их адаптации к нестерильным условиям среды, удешевления и снижения трудозатрат процесса получения микропобегов в культуре тканей независимо от сезона и выращивания высококачественного посадочного материала, гарантированно соответствующего исходным генотипам.
Данный способ позволяет выращивать качественный посадочный материал с закрытой корневой системой не менее двух раз в год: в зимне-весенний период и при необходимости - традиционно в весенний, что снижает сезонную зависимость работ при массовом выращивании посадочного материала.
Таким образом: важным преимуществом заявляемого способа, по сравнению с известными, является возможность получать одновременно массовое количество высококачественного крупномерного посадочного материала при размножении и воспроизводстве хозяйственно ценных и декоративных представителей семейства Betulaceae при экономии времени и снижении трудовых и материальных затрат, что позволяет широко использовать его в практике лесного хозяйства для массового выращивания редких и трудноразмножаемых вегетативно древесных пород с сохранением их уникальных свойств и признаков, а также в научных целях.