Оценкагенетической изменчивости лиственницы сибирской с использованием микросателлитного анализа

ЛЕСНАЯ СЕЛЕКЦИЯ, ГЕНЕТИКА И БИОТЕХНОЛОГИЯ

ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКрОСАТЕЛЛИТНОГО АНАЛИЗА

Н.В. ОРЕШКОВА, н. с. лаборатории лесной генетики и селекции Института леса им.

В.Н. Сукачева СО РАН,

М.М. БЕЛОКОНЬ, с. н. с. лаборатории популяционной генетики им. Ю.П. Алтухова Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, канд. биол. наук,

Лиственница сибирская (Larix sibirica Ledeb.) является одним из наиболее распространенных представителей рода Larix (Mill) и важнейшим компонентом бореаль-ных лесов северного полушария. Насаждения лиственницы сибирской занимают около 14 % территорий лиственничных лесов России. С севера на юг ее ареал простирается от южного побережья Белого моря до юга Сибири и Монголии, с запада на восток от Онежской губы до Забайкалья. Основные ее массивы приурочены к континентальным горным районам Южной Сибири. Такое широкое распространение лиственницы обусловлено ее высокой экологической пластичностью. В пределах ареала распространения лиственница сибирская формирует большое количество различных типов лесных насаждений. Только в горных районах Южной Сибири выделено 172 типа лиственничных лесов.

Данный вид имеет огромное биосферное и экологическое значение. Лиственничные экосистемы играют большую водоохранную и почвозащитную роль в горных районах Сибири, предотвращают нарушение хрупкого баланса природных процессов в системе «ат-мосфера-почва-мерзлая литосфера» в районах Крайнего Севера, а также выступают в качестве форпостов лесной растительности у ее северного (в лесотундре) и южного (в степи) пределов. Нельзя не отметить народнохозяйственное значение вида. Ценная и прочная древесина находит разнообразное применение в машиностроении, судостроении, изготовлении шпал, строительных элементов, в целлюлозно-бумажной, текстильной и лакокрасочной промышленностях и др.

В настоящее время лиственница сибирская является наиболее изученным видом

oreshkova@ksc.krasn.ru; belokon@vigg.ru

с точки зрения ее морфологической изменчивости, однако ее генетическое разнообразие изучено крайне слабо.

Ранее исследования генетического разнообразия вида проводили главным образом на уровне продуктов генов, используя метод изоферментного анализа [1]. Однако анализ изоферментов (изоэнзимов) позволяет исследовать полиморфизм только белок-ко-дирующих последовательностей, которых у высших эукариот всего около 1-2 % от общей части генома. Очевидно, что от внимания ускользает основная часть генома, а полученные показатели генетической изменчивости существенно занижены и не отражают реальной картины. Используемый рестрикционный анализ ДНК митохондриальных и хло-ропластных генов также имеет ограничения, главным образом по числу доступных высокополиморфных локусов, а непосредственное прямое секвенирование последовательностей генома имеет высокую стоимость.

В связи с этим в настоящее время для исследования генетического полиморфизма хвойных начали использовать наиболее информативную и сравнительно недорогую группу ДНК-маркеров, к которым относятся микросателлиты. Микросателлитные локусы - фрагменты ДНК, с повторяющимися короткими (2-10 нуклеотидов) последовательностями, называемыми мотивами. Высокий уровень полиморфизма микросателлитов, относительно равномерное их распределение в геноме и широкая представленность сделала их чрезвычайно популярными и широко используемыми в современных популяционногенетических исследованиях.

Поэтому целью нашей работы явилось получение качественно новой информации

118

ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 1/2012

ЛЕСНАЯ СЕЛЕКЦИЯ, ГЕНЕТИКА И БИОТЕХНОЛОГИЯ

Таблица 1

Географическое расположение и характеристика исследованных популяций лиственницы сибирской

Популя- ция Числен- ность Район расположения Географические координаты Бонитет, возраст (лет) Высота над у.м., м

Черга 32 Шебалинский район Республики Алтай, окр. с. Черга 51°29’с.ш. 85°32’в.д. II-III 100-150 Предгорье 600-650

Кукуя 33 Шебалинский район Республики Алтай, окр. автодор. на Кукуйском перевале 51°27’с.ш. 85°15’в.д. III-IV 250-300 Горный склон 930-1200

Таблица 2

Характеристика микросателлитных локусов, отобранных для анализа генетической изменчивости

Локус Мотив teC отжига Число аллелей Размер фрагмента Источник литературы

bcLK056 (AG)20 Touchdown 63-53°С 12 174-200 Isoda, Watanabe, 2006

bcLK066 (TG)i2 6 155-172 Isoda, Watanabe, 2006

bcLK189 (AG)i7AT(AG)6 20 162-196 Isoda, Watanabe, 2006

bcLK194 (AG)17 9 116-136 Isoda, Watanabe, 2006

bcLK224 (AG)17 5 152-168 Isoda, Watanabe, 2006

bcLK225 (GA)20 18 180-213 Isoda, Watanabe, 2006

bcLK232 (AG)19 5 142-178 Isoda, Watanabe, 2006

bcLK260 (TG)14(AG)9 7 115-126 Isoda, Watanabe, 2006

bcLK235 (TC)9(AC)2AG(AC)14 58°С 19 177-220 Isoda, Watanabe, 2006

UBCLXtet 1-22 (TATC)9(TA)12 6 175-250 Chen et al., 2009

UAKLly6 (GT)17 20 214-264 Khasa et al., 2000 Khasa et al., 2006

при оценке генетической изменчивости лиственницы сибирской с использованием метода микросателлитного анализа.

Объекты и методы исследований

В качестве объектов исследования взяты выборки из двух популяций лиственницы сибирской, произрастающие на территории Республики Алтай. Названия популяций, их местоположение и краткие лесоводственные характеристики представлены в табл. 1.

Для выделения ДНК использовали хвою. Выделения проводили по стандартному протоколу для растительных тканей с применением цетилтриметиламмониумбромида (CTAB) [4]. Выделенную ДНК использовали для проведения ПЦР с одиннадцатью парами праймеров для микросателлитных последовательностей, разработанных для лиственницы японской (L. kaempferi Sarg.) - группа bcLK [5], лиственниц альпийской (L. lyallii Pari.) и западной (L. occidentalisNutt.) группы

- UAKLY [6, 7] и UBCLX (Chen et al.,2009). Для проведения ПЦР использовали готовые реакционные смеси производства ООО «Лаборатория Изоген».

В результате тестирования 25 пар праймеров для микросателлитных локусов для последующего анализа были отобраны 11. Характеристики микросателлитных последовательностей и условия ПЦР-амплифи-кации приведены в табл. 2.

Электрофоретическое разделение полученных в результате амплификации фрагментов проводили в 6 % полиакриламидном геле с использованием Трис-ЕБТА-боратно-го электродного буфера. Гели окрашивали в растворе бромистого этидия и визуализировали с помощью системы гель-документации «Kodak». Молекулярный вес фрагментов определяли путем сопоставления со стандартными маркерами в программе Photo-Capt. Обработку полученных данных производили в программе GenAlEx 6.2 [9].

ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 1/2012

119

inn 11

ЛЕСНАЯ СЕЛЕКЦИЯ, ГЕНЕТИКА И БИОТЕХНОЛОГИЯ

Результаты исследований и их обсуждение

Все исследованные локусы оказались полиморфными. Самыми высокополиморфными в обеих выборках были локусы bcLK189 и UAKLly6, у которых наблюдалось 20 аллельных вариантов. Высокую изменчивость продемонстрировали также локусы bcLK235, bcLK225 и bcLK056, в изученных популяциях у них идентифицированы от 12 до 19 аллелей. Относительно низкая изменчивость характерна для локусов bcLK232, bcLK224, bcLK066 и UBCLXtet1-22. В них выявлено от пяти до шести аллельных вариантов (табл. 2).

Пример электрофореграммы, представляющей изменчивость микросателлитного локуса и кодирующих его аллелей, представлен на рисунке.

В результате проведенных исследований выявили, что алтайские популяции лиственницы характеризовались достаточно высоким аллельным разнообразием и уровнем наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности (табл. 3).

Среднее число аллелей на локус в популяциях составило от трех до восемнадцати (табл. 3). Уникальные аллели встречались 2,8 на локус в выборке Черга и 2,3 на локус в выборке Кукуя. Однако практически во всех случаях их частота не превышала 0,1. Суммарные частоты уникальных аллелей по отдельным

локусам не превысили 0,34 на локус в выборке. По данным изоферментного анализа показано, что уникальные аллели составляют около 37 % от общего числа аллелей, выявляемых в популяциях лиственницы сибирской [2].

Наблюдается слабая тенденция к увеличению всех основных показателей генетического полиморфизма в предгорной популяции Черга (табл.1 и табл.3). Например, средние значения наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности для популяции Черга составили 0,412 и 0,676 против 0,409 и 0,660 для горной популяции Кукуя (табл. 3).

Полученные нами значения показателей генетического полиморфизма находятся в пределах значений аналогичных показателей, рассчитанных для других представителей рода Larix [5, 7, 8].

В обеих выборках наблюдается дефицит гетерозигот по большинству локусов (bcLK232, bcLK056, bcLK224, bcLK225, bcLK189, bcLK260, bcLK194, UAKLly6). В локусах bcLK235 и UBCLXtet1-22 дефицит гетерозигот наблюдался только в популяции Черга, а в популяции Кукуя индекс фиксации был близок к равновесному. Исследования, выполненные на других видах лиственниц, также выявили дефицит гетерозигот у японской лиственницы в восьми из девятнадцати микросателлитных локусах [5] и в шести из

Рисунок. Электрофореграмма микросателлитного локуса bcLK225 у лиственницы сибирской; 168, 170, 180, 190, 194, 204, 208 - обозначение аллелей по длине амплифицируемого фрагмента ДНК

120

ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 1/2012

ЛЕСНАЯ СЕЛЕКЦИЯ, ГЕНЕТИКА И БИОТЕХНОЛОГИЯ

Таблица 3

Показатели генетической изменчивости лиственницы сибирской, рассчитанные по результатам микросателлитного анализа

Локус Na Ne Ho He F

Черга

bcLK232 4 2,190 0,375 0,543 0,310

bcLK056 9 6,095 0,719 0,836 0,140

bcLK224 5 2,513 0,406 0,602 0,325

bcLK225 15 11,011 0,125 0,909 0,863

bcLK066 4 1,294 0,188 0,227 0,174

bcLK189 18 11,315 0,406 0,912 0,554

bcLK260 5 4,240 0,688 0,764 0,100

bcLK194 9 5,120 0,375 0,805 0,534

bcLK235 14 7,907 0,688 0,874 0,213

UBCLXtet 1-22 4 1,173 0,094 0,147 0,364

UAKLly6 15 5,596 0,469 0,821 0,429

В среднем для популяции 9,273±1,607 5,314±1,079 0,412±0,066 0,676±0,081 0,364±0,067

Кукуя

bcLK232 3 1,832 0,182 0,454 0,600

bcLK056 11 5,967 0,485 0,832 0,418

bcLK224 4 2,149 0,281 0,535 0,474

bcLK225 12 6,958 0,758 0,856 0,115

bcLK066 5 1,474 0,273 0,321 0,151

bcLK189 15 9,037 0,333 0,889 0,625

bcLK260 7 4,033 0,333 0,752 0,557

bcLK194 8 4,894 0,485 0,796 0,391

bcLK235 15 7,309 0,939 0,863 -0,088

UBCLXtet 1-22 3 1,070 0,067 0,065 -0,026

UAKLly6 13 9,553 0,364 0,895 0,594

8,727 4,934 0,409 0,660 0,346

В среднем для популяции ±1,408 ±0,925 ±0,076 ±0,084 ±0,079

В среднем для обеих 9,000 5,124 0,410 0,668 0,355

популяции ±1,044 ±0,695 ±0,049 ±0,057 ±0,051

Примечание: NA - среднее число аллелей на локус, NT - эффективное число аллелей на локус, HO - наблюдаемая гетерозиготность, НЕ - ожидаемая гетерозиготность, F - индекс фиксации.

Таблица 4

Значения показателей F-статистик райта

Локусы FIS Fit FsT

bcLK232 0,442 0,445 0,006

bcLK056 0,279 0,297 0,026

bcLK224 0,395 0,397 0,003

bcLK225 0,500 0,515 0,029

bcLK066 0,161 0,167 0,008

bcLK189 0,589 0,597 0,020

bcLK260 0,327 0,330 0,005

bcLK194 0,463 0,473 0,020

bcLK235 0,063 0,076 0,014

UBCLXtet_1-22 0,245 0,254 0,012

UAKLly6 0,515 0,531 0,033

Среднее 0,362±0,049 0,371±0,049 0,016±0,003

ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 1/2012

121

ЛЕСНАЯ СЕЛЕКЦИЯ, ГЕНЕТИКА И БИОТЕХНОЛОГИЯ

девяти полиморфных локусов лиственницы западной [8]. Наличие дефицита гетерозигот может свидетельствовать о присутствии в выборке нуль-аллелей, или же быть вызванным инбридингом и близкородственными скрещиваниями. В нашем исследовании, включавшем 65 проанализированных особей, по перечисленным локусам нуль-аллели не были выявлены. По данным изоферментного анализа в популяциях лиственницы сибирской соотношение наблюдаемой и ожидаемой гетерози-готности близко к равновесному [2, 3].

Исследование популяционной структуры с помощью F - статистик Райта [10] показало, что каждое дерево в изученных популяциях лиственницы сибирской обнаруживает 36 %-й дефицит гетерозиготных генотипов (FIS = 0,362) (табл. 4).

Около 1,6 % всей наблюдаемой изменчивости приходится на межпопуляционную (F ). Внутри популяций сосредоточено 98,4 % всего генетического разнообразия. Максимально популяции дифференцированы по локусам bcLK056, bcLK225 и UAKLly6. По изоферментным локусам была отмечена более высокая степень генетической дифференциации популяций - у лиственницы сибирской FST = 0,038 [2], лиственниц Гмелина FST = 0,019 и Каяндера FT = 0,152 [1]. Однако стоит отметить, что эти исследования охватывали не только близкие географически, но и удаленные друг от друга популяции.

Генетическая дистанция между изученными нами популяциями лиственницы сибирской составила 0,016, что выше величин, определяемых с помощью изоферментного анализа [2,3].

Анализ ядерных микросателлитных маркеров выявляет значительную часть изменчивости, не обнаруживаемой при анализе изоферментов, широко используемых в популяционно-генетических исследованиях древесных растений. Полученные данные свидетельствуют о генетическом своеобразии отдельных популяций лиственницы сибирской. Дальнейшие исследования позволят подробно оценить уровни изменчивости в большем числе популяций, определить степень дифференциации более удаленных друг от друга локальностей.

Полученные результаты могут быть также применены для изучения межвидовой гибридизации лиственниц Сибири.

Работа проводилась в рамках проекта РФФИ 10-04-90819-моб_ст, при поддержке программ РАН «Биологическое разнообразие» (подпрограмма «Генофонды и генетическое разнообразие»), «Биологические ресурсы России: Оценка состояния и фундаментальные основы мониторинга» и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (направление 1.1, Госконтракты 02.740.11.0281, 14.740.11.0164).

Библиографический список

1. Абаимов, А.П. Биоразнообразие лиственниц Азиатской России / А.П. Абаимов, И.Ю. Адрианова, Е.В. Артюкова и др. - Новосибирск: Академ. изд. «ГЕО», 2010. - 160 с.

2. Орешкова, Н.В. Генетическая дифференциация лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) в Средней Сибири / Н.В. Орешкова // Хвойные бореаль-ной зоны. - 2010. - XXVII. - № 1-2. - С. 147-153.

3. Орешкова, Н.В. Генетические особенности и морфологическая изменчивость лиственницы сибирской в Алтайско-Саянской горной области / Н.В. Орешкова // Вестник КрасГАУ - 2010. - № 10. - С. 59-64.

4. Devey M. Е., Bell J. C., Smith D. N., Neale D. B., Moran G. F. A genetic linkage map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD, and microsatellite markers // Theor. Appl. Genet. 1996. V 92. № 6. P. 673-679.

5. Isoda K., Watanabe A. Isolation and characterization of microsatellite loci from Larix kaempferi // Molecular Ecology. - 2006. - V.6, I.3 - P. 664-666.

6. Khasa D.P., Newton C.H., Rahman M.H., Jaquish B., Dancik B.P. Isolation, characterization, and inheritance of microsatellite loci in alpine larch and western larch // Genome. - 2000. - №43 (3) - P. 439-448.

7. Khasa D.P., Jaramillo-Correa J.P., Jaquish B., Bousquet J. Contrasting microsatellite variationbetween subalpine and western larch, two closely related species with different distribution patterns // Molecular Ecology.

- 2006. - V15, I.13 - P. 3907-3918.

8. Chen C., Liewlaksaneeyanawin C., Funda T., Kenawy A., Newton C.H., El-Kassaby Y.A. Development and characterization of microsatellite loci in western larch (Larix occidentalis Nutt.) // Molecular Ecology Resources - 2009. - V9, I.3 - P. 843-845.

9. Peakall R., Smouse P.E. GenAIEx V6: Genetic Analysis in Excel. Population Genetic Software for Teaching and Research // Molecular Ecology Notes.

- 2006. - V.6 (1) - P.288-295.

10. Wright S. The interpretation of population structure by F-statistics with special regard to systems of mating // Evolution. - 1965. - Vol. 19. - P. 355--420.

122

ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 1/2012