СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАЗВИТИЯ СТЕНОЗИРОВАНИЯ СТЕНТОВ, ПОКРЫТЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫМ ПРЕПАРАТОМ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR DEVELOPING STRICTURE FORMATION IN DRUG-COATED STENTS

Изобретение относится к медицине, в частности к кардиологии, и может применяться для диагностики развития рестеноза стентов, покрытых лекарственным препаратом.
Возникновение рестеноза - сужения просвета сосуда в ранее стентированном сегменте (внутри стента и на 5 мм дистальнее или проксимальнее стента), уменьшающего просвет сосуда более чем на 50% по диаметру - развивается в среднем через 6-9 месяцев после установки стента и представляет собой результат избыточного клеточного ответа на повреждение стенки сосуда [1]. Внедрение в клиническую практику стентов с лекарственным покрытием позволило значительно снизить частоту возникновения рестенозов [2, 3], тем не менее она может достигать 6-8% [4, 5]. Определению распространенности, механизму развития, способам лечения и профилактики рестеноза посвящены многие исследования [6, 7]. В настоящее время актуальным вопросом остается выявление факторов, увеличивающих риск возникновения рестеноза, наиболее изучены из них - диаметр сосуда, сахарный диабет, кальцинированная бляшка, множественное стентирование [8, 9, 10]. Однако в литературе также рассматриваются воспалительные и клеточные факторы.
В ряде случаев стенты, покрытые лекарственным препаратом, могут индуцировать локальное воспаление и даже приводить к поздним тромбозам вследствие развития реакции гиперчувствительности [6]. В литературе рассматриваются различные маркеры, являющиеся показателями возможного развития рестеноза стента, такие как С-реактивный белок, фибриноген, BNP (мозговой натрий-уретический пептид), а также уровни циркулирующих в крови лейкоцитов и стромальных клеток предшественников. Повышение уровня С-реактивного белка ассоциировано с возникновением позднего тромбоза стента, а не с развитием рестеноза, по данным метаанализа, проведенного в 2009 г., в который вошли 2651 больных. Уровень фибриногена, также как и определение количества лейкоцитов не являются специфическими, т.е. характерными только для рестеноза показателями [11]. Повышение уровня BNP также может быть независимым предиктором возникновения рестеноза [12], но в то же время повышенный уровень данного показателя может быть связан с сердечной недостаточностью, гипертрофией левого желудочка, миокардитом и др. заболеваниями. В этом случае достаточно сложно интерпретировать результаты как связанные именно с возникновением рестеноза, а не с каким-либо из перечисленных заболеваний.
Иммуногистологические исследования показывают, что после установки стентов с лекарственным покрытием в тканях, полученных из зон рестеноза, выявляются клетки гематогенного происхождения, такие как нейтрофилы и макрофаги, Т- и В-лимфоциты [13]. В более ранних исследованиях было показано, что уровень стромальных клеток-предшественников выше у пациентов после установки стентов, чем у здоровых лиц, но сохранялся одинаково высоким и не различался в группах с рестенозом и без него, таким образом можно говорить лишь об ответе на проводимое эндоваскулярное вмешательство [14].
Предлагаемые выше показатели невозможно рассматривать в качестве предикторов развития стенозирования стентов, покрытых лекарственным препаратом, вследствие чрезвычайно низкой чувствительности и специфичности, что и вызвало необходимость поиска новых способов прогнозирования рестеноза стентов, покрытых лекарственным препаратом.
Прототипом настоящего изобретения является способ прогнозирования рестеноза при использовании стентов с лекарственным покрытием путем определения количества полиморфно-ядерных эозинофилов в крови пациентов. Анализ проводится по результатам измерения, полученного на двух различных приборах: автоматическом гематологическом анализаторе (Cell-Dyn 3500В) и на проточном цитофлуориметре (FACS Calibur). Определение количества эозинофилов в крови выполняется следующим способом: с помощью автоматического гематологического анализатора Cell-Dyn 3500B определяется общее количество лейкоцитов в исследуемой пробе крови, в той же пробе крови с помощью проточного цитофлуориметра FACS Calibur по параметрам светорассеяния клеток, связыванию клеток с CD45 (кластер дифференцировки 45, общий лейкоцитарный антиген) и активной автофлуоресценции определяется процентное содержание CD45-положительных гранулоцитов с высоким уровнем автофлуоресценции (автофлуоресценция+/CD45+). По данным этих двух измерений вычисляется концентрация эозинофильных гранулоцитов в крови. Автофлуоресценция неокрашенных лейкоцитов характерна для полиморфно-ядерных эозинофилов и связана с флуоресцентным свечением их цитоплазматических гранул и может быть использована для выявления эозинофилов методами проточной цитофлуометрии [15, 16]. По результатам ранее проведенного исследования, в которое вошли 37 пациентов, чувствительность определения количества полиморфно-ядерных эозинофилов в крови пациентов, составила 82%, что и определило возможность использования данного показателя в качестве предиктора развития рестеноза. Однако повышение уровня эозинофилов не является специфическим показателем (специфичность 50%) в связи с тем, что оно может возникнуть и в ответ на введение контрастного вещества, а также при наличии у данной группы пациентов сопутствующей патологии, такой как легочные и кожные заболевания, поливалентная аллергия, паразитарная инвазия.
Задача настоящего изобретения состоит в выявлении нового предиктора развития рестеноза, доступного для широкого использования, с определенной чувствительностью, специфичностью и изученной воспроизводимостью результатов. Данная задача решается определением в крови белка, секретируемого эозинофилами (эозинофильного катионного белка). Однако исходя из того, что белков, секретируемых эозинофилами, четыре (наряду с эозинофильным катионным белком существуют также большой катионный белок, эозинофильный нейротоксин, эозинофильная пероксидаза), в качестве предикторов развития рестеноза также можно предположить их использование.
Определение в крови эозинофильного катионного белка согласно изобретению осуществляется следующим образом:
1. кровь для исследования берется из локтевой вены пациентов утром натощак после 12-часового голодания и стабилизируется ЭДТА;
2. образцы крови центрифугируются, и супернатант отбирается в отдельные пробирки и хранится при -38°C;
3. уровни катионного белка эозинофилов в крови определяются иммуноферментным методом на автоматическом хемилюминесцентном анализаторе Immulite-1000 (DPC-Siemens, США). Для эозинофильного катионного белка диапазон регистрируемых значений составляет 0,5-200 нг/мл с коэффициентом вариации не более 4%.
Пациентам, которым выполнялось стентирование стентами с лекарственным препаратом, в крови по стандартизованной методике определяется уровень эозинофильного катионного белка. При значении данного показателя выше 11 нг\мл можно говорить о развитии рестеноза стента. В случае если уровень данного показателя был ниже 11 нг/мл - об отсутствии рестеноза стента.
Разработка нового способа прогнозирования рестеноза проводилась в два этапа на основе сопоставления полученных данных с результатами одномоментно проводимой коронароангиографии («золотой стандарт»).
На первом этапе была сформирована группа из больных ИБС (мужчин и женщин в возрасте 35-60 лет), которым в течение первого года после эндоваскулярной реваскуляризации миокарда с помощью стентов, покрытых рапамицином, проведено повторное коронарографическое обследование (КАГ) (не включались пациенты с нестабильной стенокардией, инфарктом миокарда в пределах 2 месяцев, повторной ангиопластикой в связи с возникновением рестеноза, застойной сердечной недостаточностью, количеством эозинофилов в крови >700 клеток/мкл). У всех пациентов определяли в крови уровень эозинофильного катионного белка, иммуноглобулина Е (IgE) и высокочувствительного С-реактивного белка (вч-СРБ).
На втором этапе проводили сопоставление полученных результатов с данными проведенной КАГ.
Всего обследовано 40 пациентов с ИБС: возникновение рестеноза было выявлено у 17 пациентов (8 жен., 9 муж.), у 23 больных рестеноз отсутствовал (13 жен., 10 муж.), а также 20 лиц без ИБС (8 жен., 12 муж.) - группа контроля.
Всем обследованным кровь для исследования брали из локтевой вены утром натощак после 12-часового голодания. Образцы крови центрифугировали. Супернатант отбирали в отдельные пробирки и хранили при -38°C. Уровни катионного белка эозинофилов и иммуноглобулина Е в плазме крови определяли иммуноферментным методом на автоматическом хемилюминесцентном анализаторе Immulite-1000 (DPC-Siemens, США). Для эозинофильного катионного белка диапазон регистрируемых значений составлял 0,5-200 нг/мл с коэффициентом вариации не более 4%. Уровень С-реактивного белка в плазме крови определяли высокочувствительным нефелометрическим методом на автоматическом лазерном нефелометре BN-proSpec (Dade-Behring, Германия). В последующем проводилось сопоставление полученных данных отдельно в группах с рестенозом и без с результатами проведенной КАГ («золотой стандарт»).
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием статистической программы Statistica 6,0. Для проверки статистических гипотез о виде распределения использовали W-тест Шапиро-Уилка. Непараметрические критерии, в том числе точный критерий Фишера или U-критерий Манна-Уитни, были использованы для сравнения двух групп результатов, и критерий ANOVA по Краскелу-Уоллису - для сравнения множественных групп.
Выявлено, что уровень эозинофильного катионного белка в плазме крови пациентов с рестенозом составил в среднем 17,7 нг/мл (11,2-24,0), что было достоверно выше, чем у пациентов без рестеноза, где он был равен 9,0 нг/мл (6,4-12,9). Уровень иммуноглобулина IgE в плазме крови у пациентов с рестенозом не отличался от уровня IgE в плазме крови у пациентов без рестеноза и здоровых лиц и составил соответственно 58.8 мг/мл (42.1-164.0), 52,9 мг/мл (12,8-76,1) и 32,0 мг/мл (21,2-80.8). Уровень высокочувствительного С-реактивного белка в крови у пациентов с ИБС был достоверно выше, чем у здоровых лиц, и составлял соответственно 1,76 мг/мл (0,61-2,82) против 0,36 мг/мл (0,1-0,75). В группах больных ИБС с рестенозом и без рестеноза уровень вч-СРБ был равен 2,38 мг/мл (0,30-4,08) и 1.63 мг/мл (0,61-2,47) соответственно. Уровень вч-СРБ в обоих случаях был достоверно выше, чем у здоровых лиц, без значимых различий между группами.
По уровню эозинофильного катионного белка в плазме крови пациенты, подвергшиеся коронарному стентированию, были разделены на две группы - больные с уровнем эозинофильного катионного белка в крови ниже медианы распределения (<11 нг/мл) и пациенты с уровнем эозинофильного катионного белка в плазме крови выше медианы распределения (>11 нг/мл). В группе больных с уровнем эозинофильного катионного белка крови ниже уровня медианы распределения рестенозы возникли у 4 (17%) пациентов, в то время как в группе пациентов с уровнем эозинофильного катионного белка в плазме крови >11 нг/мл рестеноз выявлен у 13 пациентов (63%, p=0.019). Подъем уровня эозинофильного катионного белка при рестенозе не связан с развитием IgE-зависимых аллергических реакций, а также не коррелирует с интенсивностью воспалительных процессов.
Разработанный новый способ прогнозирования рестеноза стентов, покрытых лекарственным препаратом, был клинически апробирован в условиях НИИ Кардиологии им А.Л. Мясникова на автоматическом хемилюминесцентном анализаторе Immulite-1000 (DPC-Siemens, США). Потенциально открывается новая возможность обследования пациентов - по уровню этого уникального катионного белка в крови можно количественно определять активацию эозинофилов и оценивать риск опасного развития рестеноза стентов с лекарственным покрытием.
Преимуществами предлагаемого нового способа в сравнении с прототипом являются:
1. большая чувствительность и специфичность нового способа прогнозирования рестеноза стента, покрытого лекарственным препаратом, а именно 88% и 92% соответственно, по сравнению с прототипом 82% и 50%;
2. показана хорошая воспроизводимость результатов нового способа, коэффициент вариации составил не хуже 4%.
Источники информации