Способ оценки риска развития рака легкого на фоне хронической обструктивной болезни легких
METHOD FOR ASSESSING THE RISK OF DEVELOPING LUNG CANCER AGAINST THE BACKGROUND OF CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способов оценки риска развития рака легкого на фоне хронической обструктивной болезни легких.
Рак легкого лидирует по показателям смертности в мире, являясь одной из важнейших медицинских и социально-экономических проблем (1). В Российской Федерации рак легкого занимает первое место среди новообразований у мужчин (2). Плоскоклеточный рак легкого (ПКРЛ) доминирует среди всех гистотипов, тесно связан с курением и имеет неблагоприятный прогноз и высокие показатели смертности. Есть многочисленные сведения о патогенетической связи ПКРЛ с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), которая является предраковым заболеванием, с манифестацией предракового изменения - дисплазии плоского эпителия. Но при этом нет патогенетически обоснованных подходов для индивидуализации терапии. Такая неоднородность подтверждает необходимость разделения ХОБЛ на фенотипы и использования методов прецизионной медицины в лечении этого заболевания (3). Наряду с проведением политики отказа от курения, перспективным для снижения заболеваемости ПКРЛ является разработка путей профилактики ХОБЛ и ранней диагностики ПКРЛ (4).
Предопухолевый процесс и патогенез плоскоклеточного рака легкого (ПКРЛ) в целом характеризуются последовательным накоплением молекулярно-генетических изменений и существенным изменением транскриптома и протеома клеток бронхиального эпителия. Изменение статуса метилирования ДНК предшествует генетическим мутациям и, как правило, определяет развитие молекулярных событий при канцерогенезе (5, 6). Признаком злокачественной трансформации, связанным с нарушением правильного профиля метилирования, является как глобальное общее снижение уровня метилирования (гипометилирование повторяющихся последовательностей LINE-1, Alu и др.), так и локальное увеличение уровня метилирования отдельных районов (гиперметилирование промоторных областей генов опухолевой супрессии) (7). При изменениях уровня метилирования может наблюдаться активация или подавление экспрессии генов (8).
Одним из последних достижений молекулярной онкологии является внедрение в практику онкодиагностики нового малоинвазивного метода «жидкой биопсии», который включает исследование образцов крови с целью выявления внеклеточных опухолевых ДНК, отражающих молекулярные изменения, характерные для опухоли (9, 10). В этом плане чрезвычайно актуальным представляется изучение молекулярно-генетических изменений в составе внеклеточных ДНК, которые специфичны для морфологических изменений бронхиального эпителия, и последующая разработка стратегии ранней малоинвазивной диагностики и оценки риска развития рака легкого. Показано, что аберрантно метилированные внеклеточные ДНК характерны для всех типов и стадий развития опухоли, обнаруживаются в крови независимо от нозологии (11, 12).
Schotten с соавторами (2021) проводили определение двух генов SOX2, PTGER4 во внеклеточных ДНК крови у больных РЛ, больных ХОБЛ и больных с доброкачественными заболеваниями легкого с целью оценки диагностической значимости данных метилированных маркеров (13). Однако, определение данных маркеров оказалось информативным только для выявления больных с уже манифестированным злокачественным процессом. В исследованиях Rosa-Alonso с соавторами (2020) предлагается анализ уровня метилирования гена, кодирующего микроРНК-7, в образцах букального эпителия, в качестве маркера развития данного заболевания (14).
Наиболее близким к предлагаемому является способ оценки снижения подвижности предраковых клеток легкого основанный на оценки экспрессии гена CYP1B1 (Патент US 20180010197 опубликован: 23.02.2021. «Gene expression-based biomarker for the detection and monitoring of bronchial premalignant lesions». A1). Способ включает выделение клеток с предопухолевыми изменениями (или их отсутствием) из биопсийсного материала, полученного от обследуемого пациента. Далее проведение оценки уровня экспрессии мРНК, кодирующей белок цитохрома Р450 1В1 (CYP1B1).
Недостатком вышеописанных способов является то, что выявление признаков развития предопухолевых изменений проводится инвазивно путем забора ткани или получения изолированных клеток, при этом определяется только один маркер.
Новый технический результат - повышение точности и информативности при снижении инвазивности способа.
Для достижения нового технического результата в способе оценки риска развития рака легкого на фоне хронической обструктивной болезни легких путем проведения молекулярно-генетического исследования биологического материала пациента, производят забор венозной крови, в которой определяют профиль метилирования ДНК и при выявлено гиперметилирования CpG-сайтов в составе генов RARB, ZNF260 во внеклеточных ДНК, пациентов относят в группу высокого риска развития рака легкого.
Способ осуществляют следующим образом.
1. Получение плазмы крови и выделение внеклеточных ДНК. Образцы венозной крови стабилизируют и фракционируют на плазму и клетки крови в течение 4 часов с момента ее забора. Образцы центрифугируют 20 мин при 400×g, затем переносят плазму в отдельные пробирки и центрифугируют повторно 20 мин при 1200×g. Полученный супернатант аликвотируют и хранят при t -80°С. Непосредственно перед проведением молекулярно-генетического анализа замороженные образцы плазмы крови размораживают и центрифугируют 5 мин при 3000×g для удаления криопреципитата. Полученный супернатант используют для выделения внеклеточных ДНК (внДНК). ВнДНК выделяют с использованием наборов фирмы QIAmp MinElute ccfDNA Kit (Qiagen, США). Далее проводят бисульфитную конверсию ДНК с помощью наборов «EZ DNA Methylation-Direct Kit» (Zymo Research, США).
2. Реакция метил-специфной ПЦР. Каждую реакцию проводят в конечном объеме 20 мкл, содержащем 2 мкл ДНК, 60 мкМ специфического праймера для каждого гена, 1 U ДНК-полимеразы, 10Х ПЦР-буфер и 25 нМ dNTP, 50 нМ MgCl. Условия реакции следующие: при температуре 95°С в течение 30 мин, при температуре 95°С в течение 3 мин, при температуре 95°С в течение 30 сек, при температуре 63 или 55°С (для генов RARB и ZNF260) в течение 10 сек, при температуре 72°С в течение 30 сек, при температуре 72°С в течение 5 мин. Амплификацию осуществляют в приборе Биосан (Россия). Последовательности праймеров представлены в таблице 1.
3. Подготовка ДНК-библиотек.
Далее проводят очистку полученных ампликонов на этапе 2 с помощью магнитных частиц КАРА HyperPure Beads kit (КАРА Biosystems, США). Ампликоны используют для подго товки ДНК-библиотек с помощью наборов КАРА Hyper Prep kit (КАРА Biosystems, США).
4. Таргетное секвенирование и биоинформатический анализ.
Секвенирование полученных библиотек для генов RARB и ZNF260 проводят на приборе MiSeq (Illumina, США). Данные секвенирования обрабатываются с помощью программного обеспечения и математических подходов: фильтрация ридов при помощи программы trimmomaticc порогом 20, выравнивание на hg19 с помощью bwa-meth, удаление дубликатов при помощи MarkDuplicates, определение покрытия CpG сайтов при помощи MethylDackel, дальнейшую обработку данных проводят в среде R с помощью библиотеки methylKit, и при выявлении гиперметилированных форм генов во внеклеточных ДНК крови пациентов относят в группу высокого риска развития рака легких.
Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.
Больной 1. Больной А. Возраст 45 лет, курящий, стадия заболевания на момент обращения - III. Отсутствие доброкачественных и злокачественных заболеваний в анамнезе. При молекулярно-генетическом исследовании венозной крови пациента выявлено гиперметилирование CpG-сайтов в составе генов RARB, ZNF260. В ходе динамического наблюдения пациента (1,5-2 года) был диагностирован рак легкого. Больной 2.
Больной А. Возраст 56 лет, курящий, стадия заболевания на момент обращения - III. Отсутствие доброкачественных и злокачественных заболеваний в анамнезе. При молекулярно-генетическом исследовании венозной крови пациента не выявлено гиперметилирование CpG-сайтов в составе генов RARB, ZNF260. В ходе динамического наблюдения пациента (1,5-2 года не был диагностирован рак легкого).
Предлагаемый способ основан на анализе данных клинико-инструментального обследования, анализе амбулаторных и медицинских карт больных.
Проводят молекулярно-генетическое исследование крови пациента в два этапа: 1.Этап (предварительный) включал работы по поиску и отбору наиболее информативных метилированных маркеров при предопухолевых изменениях в бронхиальном эпителии Исследование проведено посредством полногеномного секвенирования микродиссектированных образцов различных морфологических изменений: базальноклеточная гиперплазия в бронхиальном эпителии, плоскоклеточная метаплазия, дисплазия, а также клетки нормального эпителия бронхов и опухолевые клетки. По результатам биоинформатической обработки данных секвенирования отобраны два маркерных гена RARB и ZNF260, уровень метилирования которых увеличивается (гиперметилирование) при переходе от плоскоклеточной метаплазии в бронхиальном эпителии к дисплазии и далее к опухоли. Так, для гена RARB показано гиперметилирование 5 CpG-сайтов, для гена ZNF260 - 2 CpG-сайтов. Ген RARB - ген онкосупрессор, кодирует рецептор ретиноевой кислоты, ZNF260 - участвует в ДНК-связывании.
2. Второй этап включал выявление отобранных метилированных маркеров (RARB, ZNF260) в составе внеклеточных ДНК крови больных ХОБЛ с помощью технологии «жидкостная биопсия».
Для реализации второго этапа изучали биологический материал от 28 пациентов с диагнозом ХОБЛ. Возраст больных составил 40-70 лет. Стадия заболевания - III-IV с обострениями или в период ремиссии. Проведено стандартное обследование пациентов: рентген, спирография, общий и биохимический анализ крови, ЭКГ. При первичном обращении пациента проводился забор венозной крови у пациента и анализ профиля метилирования во внеклеточных ДНК крови. Кроме того, проводился динамический мониторинг пациентов с целью выявления случаев РЛ. На основе анализа данных по профилю метилирования и данных динамического наблюдения пациентов выделено три кластера. В наиболее крупные кластеры попадают пациенты с выявленными гиперметилированными CpG-сайтами в составе генов RARB, ZNF260 и у которых в ходе динамического наблюдения был диагностирован РЛ) На Фигуре 1 представлены результаты двухлетнего динамического наблюдения пациентов с ХОБЛ и анализа уровня метилирования генов (ZNF260, RARB) в составе внеклеточных ДНК крови. Сплошной линией обозначены пациенты, у которых не выявлен рак легкого, пунктирной линией -больные, у которых выявлен рак легкого.
Таким образом, использование данного способа позволяет достичь нового технического результата, а именно повысить точность оценки риска развития рака легкого,используя венозную кровь пациента и снизить инвазивность исследочвания.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания:
1. Anderson N. М., Simon М. С. ВАСН1 orchestrates lung cancer metastasis //Cell. - 2019. - Т. 178. -№. 2. - С.265-267.
2. Каприн А.Д. Злокачественные новообразования в России в 2020 году (заболеваемость и смертность) / Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, А.О. Шахзадовой. М.: МНИОИ им. П. А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России. - 2021. - 252 с.
3. Caramon G. et al. Molecular links between COPD and lung cancer: new targets for drug discovery? // Expert opinion on therapeutic targets. - 2019. - T. 23. - №. 6. - C. 539-553.
4. Patel В., Priefer R. Impact of chronic obstructive pulmonary disease, lung infection, and/or inhaled corticosteroids use on potential risk of lung cancer //Life Sciences. - 2022. - C. 120374.
5. Edwards J. R. et al. DNA methylation and DNA methyltransferases //Epigenetics & chromatin.-2017.-T. 10.-№. 1. -C. 1-10.
6 Dai X. et al. Methylation multiplicity and its clinical values in cancer //Expert reviews in molecular medicine. - 2021. - T. 23.
7. Ehrlich M. DNA hypermethylation in disease: mechanisms and clinical relevance //Epigenetics.-2019.-T. 14. -№. 12. - C. 1141-1163.
8. Silva C. P., Kamens H. M. Cigarette smoke-induced alterations in blood: A review of research on DNA methylation and gene expression //Experimental and clinical psychopharmacology. -2021.-Т. 29.-Ж l.-C. 116.
9. Thierry A.R., El Messaoudi S., Gahan P.B., Anker P., Stroun M. Origins, structures, and functions of circulating DNA in oncology.
// Cancer Metastasis Rev. - 2016. - Т. 3. - №3. - C. 347-376.
10. Pantel K., Alix-Panabieres C. Liquid biopsy in 2016: Circulating tumour cells and cell-free DNA in gastrointestinal cancer // Nat Rev Gastroenterol Hepatol. - 2017. - T. 14. - №2. - C. 73-74.
11. Feinberg A.P., Koldobskiy M.A., Gondor A. Epigenetic modulators, modifiers and mediators in cancer aetiology and progression // Nat Rev Genet. - 2016. - T. 17. - №5. - C. 284-299.
12. Kerachian M.A.. Azghandi M., Mozaffari-Jovin S., Thierry A.R. Guidelines for pre-analytical conditions for assessing the methylation of circulating cell-free DNA // Clin Epigenet. -2021.-T. 13. -№1.-C. 193.
13. Shorten L., Kaid D., Seweryn M., Yildiz V., Kneuertz P., Eberhardt W., Eisenmann., Welter S., Sisson В., Pietrzak M., Wiesweg M., Ploenes Т., Hager Т., Kai H., Lutz F. DNA methylation of PTGER4 in peripheral blood plasma helps to distinguish between lung cancer, benign pulmonary nodules and chronic obstructive pulmonary disease patients // Eur J Cancer. - 2021. -T. 147. - C. 142-150.
14. Rosas-Alonso R., Galera R., Sanchez-Pascuala J., Casitas R., Burdiel M., Martmez-CeronE., Vera O., Rodriguez-Antolin C, Perm'a O., Castro J., Garcia-Rio F., Ibanez-de-Caceres Hypermethylation of Anti-oncogenic MicroRNA 7 is Increased in Emphysema Patients // Arch Bronconeumol. - 2020. - T. 56. - №8. - C. 506-513.