ВЫЗЫВАЮЩИЕ ПЕРЕКРЕСТНЫЙ ИММУНИТЕТ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЫ
VACCINES AGAINST SALMONELLA CAUSING CROSS-IMMUNITY

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к перекрестному иммунитету против сероваров серогруппы C2-3 Salmonella enterica с сероварами серогруппы C1 Salmonella enterica, обеспечивая получение вакцин, которые содержат серовар только из одной из этих двух различных серогрупп, для защиты от серогруппы Salmonella enterica.
Предшествующий уровень техники
Salmonella представляют собой основной патоген домашней птицы, и его наличие в стаях домашней птицы является основной проблемой здравоохранения. Случаи пищевого отравления, вызываемого Salmonella, остаются широко распространенными во всем мире и уступают только Campylobacter, как наиболее распространенной причине пищевого отравления, вызываемого бактериями. Не удивительно, что продукты птицеводства являются первичным источником инфекций Salmonella у людей, где перенос этого патогена происходит от кур-несушек к яйцам или от тушек бройлеров к мясопродуктам. Salmonella Enteritidis (SE) является особенно важным при пищевых отравлениях, связанных с яйцами, вследствие способности некоторых штаммов колонизировать репродуктивные ткани кур, что может проводить к присутствию живой Salmonella в яйцах и/или на скорлупе яиц.
Загрязнение Salmonella можно контролировать до некоторой степени путем использования эффективных мер биозащиты, продуктов конкурентного исключения и способов дезинфекции. Эти меры используют в сочетании с вакцинацией для обеспечения оптимальной защиты против заражения стаи домашней птицы, где вакцинация является эффективным средством для уменьшения загрязнения яиц SE. Фактически, вследствие введения вакцин в программы борьбы с Salmonella в 1990 гг. их применение стало широко распространенным во многих частях мира.
Инактивированные вакцины NOBILIS SALENVAC и SALENVAC T, которые были введены сначала, практически полностью были заменены на рынке производителей яиц живыми вакцинами, вследствие обеспечиваемой ранней защиты и сниженной стоимости, в частности трудозатрат, т.к. введение можно проводить с питьевой водой. Таким образом, в сегменте производства яиц птицеводства вакцинация живой вакциной против Salmonella в течение первой недели жизни стала стандартной практикой в Соединенном Королевстве и становится все более распространенной во всем Европейском союзе. Несмотря на то, что для обеспечения защиты кур повторная вакцинация необходимой является на всем протяжении жизни стаи, многие производители придерживаются программы первичной живой вакцинации с дозой или курсом инактивированной вакцины. Основой этой последней процедуры является то, что было продемонстрировано, что антитела, присутствующие в желтке яиц, откладываемых курами, которых вакцинировали инактивированной вакциной, снижают рост Salmonella по сравнению с яйцами от невакцинированных кур или кур, вакцинированных живой вакциной. Инактивированные вакцины также остаются общепринятой практикой в мясном птицеводстве, т.к. они обеспечивают пассивную защиту суточным цыплятам против Salmonella путем переноса антител через яйцо [Inoue et al., Avian Diseases, 52:567-571 (2008)].
Salmonella spp. представляет собой род грамотрицательных бактерий, который разделяют на два вида S. enterica и S. bongori. S. enterica содержит 6 основных серогрупп (A, B, C1, C2-3, D и E), которые классифицировали в соответствии с их липополисахаридной структурой. По существу все представленные на рынке вакцины претендуют на защиту против Salmonellae серогрупп B (например, серовар S. Typhimurium) и D (например, серовар S. Enteritidis), и, таким образом, они конкретно направлены на устранение этих сероваров. Фактически, до недавнего времени эти серогруппы являлись не только наиболее распространенными, но также наиболее важными с точки зрения зоонозов. Однако, несмотря на то, что S. Enteritidis и S. Typhimurium все еще остаются наиболее распространенными сероварами, вовлеченными в заболевание человека в Европе, по-видимому, их распространенность в зараженных продуктах кур уменьшается, тогда как распространенность Salmonellae серогрупп C1 (которая включает, например, S. Infantis, S. Mbandaka и S. Virchow) и C2-3 (которая включает, например, S. Hadar, S. Newport и S. Kentucky) значительно увеличилась. В частности, было продемонстрировано, что вакцина, которая содержит серовары S. Typhimurium (серогруппа B) и S. Enteritidis (серогруппа D), обеспечивает перекрестный иммунитет против других сероваров серогруппы B, т.е. S. Heidelberg и S. Agona, но не удалось продемонстрировать какую-либо эффективность против контрольного заражения S. Hadar (серогруппа C2-3), что свидетельствует о необходимости дополнительных антигенов в вакцинах для обеспечения необходимой защиты.
В последнее время было опубликовано, что инактивированная трехвалентная вакцина, содержащая S. Enteritidis (серогруппа D), S. Typhimurium (серогруппа B) и S. Infantis (серогруппа C1), является эффективной против контрольного заражения S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Infantis или S. Heidelberg (серогруппа B) [Deguchi et al., Avian Disease, 53:281-286 (2009)]. Кроме того, также было опубликовано, что другая инактивированная трехвалентная вакцина, содержащая S. Typhimurium (серогруппа B), S. Mbandaka (серогруппа C1) и S. Orion (серогруппа E) защищает против нескольких сероваров серогрупп B и C1, хотя результаты с сероварами серогруппы E являлись неубедительными [Pavic et al., Avian Pathology, 39 (1):31-39 (2010)].
O-антиген является основным липополисахаридным компонентом клеточной поверхности всех грамотрицательных бактерий. Каждая из серогрупп S. enterica экспрессирует различимые O-антигены, и, таким образом, O-антиген можно использовать для их классификации [Nori and Thong, African Journal of Microbiology Research, 4(9) 871-876 (2010)]. В соответствии с этим, когда проводили твердофазный иммуноферментный анализ, наблюдали от небольшой перекресной реакции до ее отсутствия между шестью различными серогруппами S. enterica, (ELISA) [Smith et al., J. Vet. Diagn. Invest., 7:481-487 (1995)].
O-антиген кодируется многими генами в кластере гена rfb генома S. enterica, и не удивительно, что существуют существенные различия в кластерах гена rfb у 6 основных серогрупп S. enterica [Lee et al., J. Gen. Microbiol., 138:1843-1855 (1992); Nori and Thong, African Journal of Microbiology Research, 4(9) 871-876 (2010)]. Более конкретно, было продемонстрировано, что кластер гена rfb серогруппы C1 обладает только ограниченным сходством с кластером rfb серогрупп A, B, C2-3, D или E [Lee et al., J. Gen. Microbiol., 138:1843-1855 (1992)]. Кроме того, моноклональное антитело, индуцированное против нагретого экстрагированного спиртом-ацетоном серовара серогруппы C2-3 (S. Newport), взаимодействовало с не содержащими белков липополисахаридами из других сероваров серогруппы C2-3, но не с не содержащими белков липополисахаридами из любой другой серогруппы. Кроме того, способность реагировать с таким моноклональным антителом ингибировали предварительной инкубацией соответствующего антигена из серогруппы C2-3 с поликлональными антителами кролика против серогруппы C2-C3, но не предварительной инкубацией этого антигена с поликлональными антисыворотки, получаемыми из антигена серогруппы C1 или любого другого тестируемого антигена серогруппы Salmonella [Duffey et al., J. Clin. Microbiol., 30(12):3050-3057 (1992)].
Несмотря на то, что вакцины против конкретной серогруппы Salmonella являлись коммерчески доступными в течение нескольких десятилетий, сохраняется необходимость предоставления вакцин против Salmonella, которые могут защищать от серогрупп C1 и C2-3, а также от серогрупп B и D Salmonella.
Цитирование любой ссылки в настоящем описании не следует истолковывать как допущение, что такая ссылка является доступной как "известный уровень техники" по отношению к настоящей заявке.
Сущность изобретения
Для устранения недостатков существующих в настоящее время вакцин против Salmonella один из аспектов настоящего изобретения относится к серовару серогруппы C1 Salmonella enterica для применения для защиты домашней птицы против нарушения, вызываемого инфекцией серогруппы C2-3 Salmonella enterica или инфекцией серогруппы C2-3 Salmonella enterica и серогруппы C1 Salmonella enterica. Аналогично, настоящее изобретение относится к применению серовара серогруппы C1 Salmonella enterica в получении вакцины для введения домашней птице для защиты от нарушения, вызываемого инфекцией серогруппы C2-3 Salmonella enterica или инфекцией серогруппы C2-3 Salmonella enterica и серогруппы C1 Salmonella enterica. В частных вариантах осуществления вакцина против Salmonella enterica C1 предназначена для введения цыплятам.
В частном варианте осуществления серовар серогруппы C1 Salmonella enterica представляет собой S. Livingstone. В другом варианте осуществления серовар серогруппы C1 Salmonella enterica представляет собой S. Mbandaka. В еще одном варианте осуществления серовар серогруппы C1 Salmonella enterica представляет собой S. Montevideo. В еще одном другом варианте осуществления серовар серогруппы C1 Salmonella enterica представляет собой S. Ohio. В еще одном варианте осуществления серовар серогруппы C1 Salmonella enterica представляет собой S. Thompson. В еще одном варианте осуществления серовар серогруппы C1 Salmonella enterica представляет собой S. Virchow. В частном варианте осуществления серовар серогруппы C1 Salmonella enterica представляет собой S. Infantis.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к серовару серогруппы C2-3 Salmonella enterica для применения для защиты домашней птицы от нарушения, вызываемого инфекцией серогруппы C1 Salmonella enterica или инфекцией серогруппа C2-3 Salmonella enterica и серогруппы C1 Salmonella enterica. Аналогично, настоящее изобретение относится к применению серовара серогруппы C2-3 Salmonella enterica в получении вакцины для введения домашней птице для защиты от нарушения, вызываемого инфекцией серогруппы C1 Salmonella enterica или инфекцией Salmonella enterica серогруппа C2-3 и Salmonella enterica серогруппа C1. В частных вариантах осуществления вакцина Salmonella enterica C2-C3 предназначена для введения цыплятам.
В частном варианте осуществления серовар серогруппы C2-3 Salmonella enterica представляет собой S. Blockley. В другом варианте осуществления серовар серогруппы C2-3 Salmonella enterica представляет собой S. Bovismorbificans. В еще одном варианте осуществления серовар серогруппы C2-3 Salmonella enterica представляет собой S. Kentucky. В еще одном варианте осуществления серовар серогруппы C2-3 Salmonella enterica представляет собой S. Kottbus. В еще одном варианте осуществления серовар серогруппы C2-3 Salmonella enterica представляет собой S. Muenchen. В еще одном варианте осуществления серовар серогруппы C2-3 Salmonella enterica представляет собой S. Newport. В частном варианте осуществления серовар серогруппы C2-3 Salmonella enterica представляет собой S. Hadar.
Настоящее изобретение также относится к серовару серогруппы C1 Salmonella enterica или серовару серогруппы C2-3 Salmonella enterica в комбинации с сероваром серогруппы B Salmonella enterica для дополнительной защиты домашней птицы от нарушения, вызываемого инфекцией серогруппы B Salmonella enterica. Аналогично, настоящее изобретение дополнительно относится к применению серовара серогруппы C2-3 Salmonella enterica или серовару серогруппы C1 Salmonella enterica в получении вакцины по настоящему изобретению, которое дополнительно включает применение серовара серогруппы B Salmonella enterica. В частном варианте осуществления серовар серогруппы B Salmonella enterica представляет собой S. Typhimurium. В других вариантах осуществления Salmonella enterica серовар серогруппы B может представлять собой S. Agama, S. Agona, S. Derby, S. Heidelberg, S. Indiana, S. Saintpaul, S. Sarajane или S. Monophasic Typhimurium.
Настоящее изобретение также относится к серовару серогруппы C1 Salmonella enterica или серовару серогруппы C2-3 Salmonella enterica в комбинации с сероваром серогруппы D Salmonella enterica для дополнительной защиты домашней птицы от нарушения, вызываемого инфекций серогруппы D Salmonella enterica. Аналогично, настоящее изобретение дополнительно относится к применению серовара серогруппы C2-3 Salmonella enterica или серовару серогруппы C1 Salmonella enterica в получении вакцины по настоящему изобретению, которое также включает применение серовара серогруппы D Salmonella enterica. В частном варианте осуществления серовар серогруппы D Salmonella enterica представляет собой Salmonella Enteritidis. В другом таком варианте осуществления серовар серогруппы D Salmonella enterica представляет собой S. Pullorum/Gallinarum.
Настоящее изобретение также относится к серовару серогруппы C1 Salmonella enterica или серовару серогруппы C2-3 Salmonella enterica в комбинации с сероваром серогруппы B Salmonella enterica и сероваром серогруппы D Salmonella enterica для дополнительной защиты домашней птицы от нарушения, вызываемого инфекцией серогруппы B Salmonella enterica и серогруппы D Salmonella enterica. Аналогично, настоящее изобретение также относится к применению серовара серогруппы C2-3 Salmonella enterica или серовару серогруппы C1 Salmonella enterica в получении вакцины по настоящему изобретению, которое дополнительно включает применение серовара серогруппы B Salmonella enterica и серовара серогруппы D Salmonella enterica. В частном варианте осуществления такого типа настоящее изобретение относится к применению сероваров Enteritidis, Typhimurium и Infantis Salmonella enterica, включая применение для получения вакцины, для защиты домашней птицы от нарушения, вызываемого инфекцией серогрупп C1, C2-C3, B и D Salmonella enterica. В другом таком варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению сероваров Enteritidis, Typhimurium и Hadar Salmonella enterica, включая применение для получения вакцины, для защиты домашней птицы от нарушения, вызываемого инфекцией серогруппами C1, C2-C3, B и D Salmonella enterica.
Настоящее изобретение также относится к применению серовара серогруппы C2-3 Salmonella enterica или серовара серогруппы C1 Salmonella enterica по настоящему изобретению, включая применение для получения вакцины, которое дополнительно включает применение Salmonella enterica серовара серогруппы G (например, S. Durham, S. Kedougou, S. Mishmarhaemek или S. Poona), серовара серогруппы E1 Salmonella enterica (например, S. Anatum, S. Binza, S. Orion или S. Thomasville) или серовара серогруппы E4 Salmonella enterica (например, S. Senftenberg).
Все серовары Salmonella enterica, используемые по настоящему изобретению, включая серовары в получении вакцин, можно выращивать в среде с ограниченным содержанием железа, что приводит к ограниченному содержанию железа в клетках. В некоторых вариантах осуществления серовары Salmonella enterica являются инактивированными. В частном варианте осуществления настоящего изобретения серовары Salmonella enterica и/или соответствующая получаемая вакцина представляет собой жидкую суспензию убитых формалином клеток сероваров Enteritidis, Typhimurium и Infantis Salmonella enterica с ограниченным содержанием железа. В другом варианте осуществления настоящего изобретения серовары Salmonella enterica и/или соответствующая получаемая вакцина представляет собой жидкую суспензию убитых формалином клеток сероваров Enteritidis, Typhimurium и Hadar Salmonella enterica с ограниченным содержанием железа. В некоторых вариантах осуществления серовары Salmonella enterica являются живыми. В частных вариантах осуществления живые серовары Salmonella enterica являются аттенуированными.
Настоящее изобретение также относится к сероварам Salmonella enterica и/или соответствующему получению вакцин, содержащих убитые формалином клетки сероваров Enteritidis, Typhimurium и Infantis или Hadar Salmonella enterica с ограниченным содержанием железа, которое дополнительно включает применение ринотрахеита птиц, одного или более штаммов вируса инфекционного бронхита, вируса болезни Ньюкасла и вируса инфекционного бурсита. В альтернативных вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к сероварам Salmonella enterica и/или соответствующему получению вакцин, содержащих убитые формалином клетки сероваров Enteritidis, Typhimurium и даже Infantis или Hadar Salmonella enterica с ограниченным содержанием железа, которое дополнительно включает применение ринотрахеита птиц, одного или более штаммов вируса инфекционного бронхита, вируса болезни Ньюкасла и вируса инфекционного бурсита (болезнь Гамборо) и инактивированного реовируса. В других вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к серовару Salmonella enterica и/или соответствующему получению вакцин, содержащих убитые формалином клетки сероваров Enteritidis, Typhimurium и даже Infantis или Hadar Salmonella enterica с ограниченным содержание железа, которое дополнительно включает применение инактивированного реовируса, одного или более штаммов вируса инфекционного бронхита, вируса инфекционного бурсита (болезнь Гамборо) и альфа-анатоксина C. perfringens.
Все серовары Salmonella enterica по настоящему изобретению и/или соответствующих вакцин, получаемых с применением серогрупп Salmonella enterica, можно вводить однократно или посредством первой (например, первичной) вакцинации, за которой следует вторая (бустер) и/или дополнительные бустер-вакцинации. Как указано выше, инактивированные серовары Salmonella enterica по настоящему изобретению и/или соответствующую вакцину, получаемую с применением инактивированных серогрупп Salmonella enterica, также можно вводить последовательно с проводимой ранее вакцинацией живой Salmonella enterica индивидуума, являющегося домашней птицей.
Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут более понятны посредством ссылки на следующие ниже фигуры и "подробное описание".
Краткое описание чертежей
10
На фигурах 1A-1C сравнивают эффективность трехвалентных и/или четырехвалентных вакцин на основе сероваров и контроля в отношении числа суток после контрольного заражения S. Hadar. Данные представлены в виде отдельных точек для каждой птицы. Эффективность выражают в виде logКОЕ/г серовара контрольного заражения, который выделяли посредством клоакальных мазков. На фигурах 1A и 1B сравнивают эффективность двух трехвалентных вакцин (SE/ST/SI и SE/ST/SH) и четырехвалентной вакцины (Quad 1, SE/ST/SH/SI) относительно контроля.
На фигуре 1A (исследование 1 контрольное заражение Hadar: клоакальный мазок индивидуальной птицы) представлены данные, получаемые в исследовании 1 на сутки 3 (●) и сутки 5 (♦) после контрольного заражения, при этом
На фигуре 1B (исследование 2 Hadar: клоакальные мазки индивидуальных птиц) представлены данные, получаемые в исследовании 2 на сутки 3 (●), 5 () и 7 (♦) после контрольного заражения.
На фигуре 1C (исследование 3: бактериовыделение у индивидуальной птицы в зависимости от времени. Контрольное заражение Hadar) представлены данные, получаемые на сутки 3 (●), 5 () и 7 (♦) после исследования 3, в котором сравнивают эффективность трех различных четырехвалентных (SE/ST/SH/SI) составов относительно контроля.
В таблице 1 ниже приведено содержание каждой из тестируемых вакцин. На фигурах 1A-1C представлены средние значения ().
На фигурах 2A-2B представлен процент позитивных птиц по результатам прямого культивирования, как определяют посредством посмертных изолятов из органов, получаемых на сутки 7 после контрольного заражения S. Hadar.
На фигуре 2A (исследование 1 Hadar: соотношение птиц, позитивных по результатам прямого культивирования (сутки 7)) продемонстрированы результаты исследования 1, как представлено на фигуре 1A, в которых сравнивают посмертные образцы из слепой кишки, печени и селезенки.
На фигуре 2B (исследование 2 Hadar: соотношение птиц, позитивных по результатам прямого культивирования (сутки 7)) продемонстрированы результаты исследования 2, как представлено на фигуре 1B, в которых сравнивают посмертные образцы из слепой кишки, печени и селезенки.
В таблице 1 ниже приведено содержание каждой из тестируемых вакцин.
На фигурах 3A-3C представлен процент птиц, позитивных по результатам прямого культивирования, как определяют посредством посмертных изолятов из органов, получаемых на сутки 7 и/или сутки 14 после контрольного заражения S. Infantis. В исследованиях 1 и 2 сравнивают две трехвалентные вакцины (SE/ST/SI и SE/ST/SH) и одну чертырехвалентную вакцину (четверка 1, как определено ниже) в сравнении с контролем.
На фигуре 3A (исследование 1 Infantis: соотношение прямых позитивных образцов, сутки 7) продемонстрировано сравнение посмертных образцов слепой кишки на сутки 7 для исследования 1.
На фигуре 3B (исследование 1 Infantis: соотношение прямых позитивных образцов селезенки, сутки 14) продемонстрировано сравнение посмертных образцов селезенки на сутки 14 для исследования 1.
На фигуре 3C (исследование 2 Infantis: соотношение прямых позитивных образцов, сутки 7) продемонстрировано сравнение посмертных образцов печени и селезенки на сутки 7 для исследования 2. В таблице 1 ниже приведено содержание каждой из тестируемых вакцин. Корреляция содержания вакцины и штриховка столбчатой диаграммы являются такими, как приведено на указанных выше фигурах 2A-2B.
На фигуре 4 представлены результаты бактериовыделения из примера 3 бактерии контрольного заражения S. Hadar в виде среднего Log10 КОЕ/г, которые получали из клоакальных образцов прямым культивированием в каждый момент времени отбора проб для обеих тестируемых групп.
На фигуре 5 представлены результаты распространения из примера 3 в виде процента всех позитивных образцов селезенки (прямым и обогатительным культивированием) для обеих тестируемых групп на сутки 10 и 14 после контрольного заражения.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение раскрывает, что несмотря на описанные ранее значительные различия антигенов в сероварах Salmonel из групп C1 и C2-3, как указано выше, величина перекрестного иммунитета между этими двумя различными серогруппами является достаточной для обеспечения возможности того, что вакцина, содержащая серовар из серогруппы, защищает от сероваров из обеих серогрупп. Более конкретно, было продемонстрировано, что защитная способность антигенов, получаемых из сероваров серогрупп C2-3 или C1, обеспечивает защиту от контрольного заражения S. Hadar (C2/3) и S. Infantis (C1).
Таким образом, настоящее изобретение демонстрирует данные, которые свидетельствуют о том, трехвалентная вакцина против Salmonella, содержащая серовары Salmonella из серогрупп B, D, и кроме того C2-3 или C1, обеспечивают достаточную защиту от серогрупп B и D, а также C2-3 и C1. Преимущество такой трехвалентной вакцины в сравнении с чертырехвалентной вакциной включает минимизацию стоимости продукции и сведение к минимуму вероятности взаимного влияния одного антигена на другой.
В одном из аспектов настоящего изобретения серовары Salmonella enterica выращивают в среде с ограниченным содержанием железа. Введение хелатора железа в среду для выращивания сероваров Salmonella индуцирует активацию в бактериях их собственных механизмов связывания железа, что приводит к физиологически более близкому росту in vivo по сравнению с общепринято выращиваемыми организмами. Такой способ выращивания Salmonella с ограниченным содержанием железа приводит к продукции антител к антигенам, наблюдаемым во время заражения и колонизации в поле и, таким образом, обеспечивает более эффективный иммунный ответ.
В частном варианте осуществления трехвалентная вакцина по настоящему изобретению может быть предназначена для уменьшения инфекции S. Enteritidis, Typhimurium, Hadar и Infantis или выделения, или горизонтального переноса, или инвазии внутренних органов во время выращивания и яйцекладки для кур, используемых для получения яиц, например, несушек. В другом частном варианте осуществления трехвалентная вакцина по настоящему изобретению может быть предназначена для уменьшения инфекции S. Enteritidis, Typhimurium, Hadar и Infantis или выделения, или горизонтального переноса, инвазии внутренних органов во время первой недели жизни потомства посредством пассивного переноса для применения у домашних птиц, используемых для разведения домашней птицы для мяса, например, у бройлеров и/или ростеров.
Использование терминов в единственном числе для удобства в описании не предназначено для такого ограничения каким-либо образом. Таким образом, например, ссылка на "серовар" включает ссылку на один или несколько таких сероваров, если не указано иначе. Использование терминов во множественном числе также не предназначено для ограничения, если не указано иначе.
9
9
Термин "примерно" используют взаимозаменяемо с термином "приблизительно", и он означает, что значение находится в диапазоне пятидесяти процентов от указанного значения, например, доза, содержащая "приблизительно" 2×10 клеток/мл, может содержать от 1 до 3×10 клеток/мл.
Как используют в настоящем описании, "вакцина" представляет собой композицию, которая является подходящей для применения у животного (включая, в некоторых вариантах осуществления людей, при этом для других вариантов осуществления, в частности, включая применение не у людей), которая после введения животному, например, курице, индуцирует иммунный ответ, достаточный сильный для того, чтобы минимально способствовать защите от клинического заболевания, возникающего в результате инфекции микроорганизмом дикого типа, например, достаточно сильный для облегчения профилактики клинического заболевания и/или профилактики, улучшения состояния или излечения клинического заболевания. Если конкретно не указано иначе, использование термина вакцина включает поливалентные вакцины. Таким образом, проиллюстрированная ниже трехвалентная вакцина содержит убитые формалином клетки сероваров Enteritidis, Typhimurium и Infantis Salmonella enterica с ограниченным содержание железа.
Как используют в настоящем описании, "поливалентная вакцина" представляет собой вакцину, которая содержит два или более различных антигенов. В частном варианте осуществления такого типа поливалентная вакцина стимулирует иммунную систему реципиента против двух или более различных патогенов.
Как используют в настоящем описании, термины "защищать", "защита", "обеспечивать защиту", "обеспечивающий защиту" и "способствовать защите" не предусматривают полную защиту от какого-либо признака инфекции. Например, "способствует защите" может означать, что защита является настолько достаточной, что после контрольного заражения симптомы исходной инфекции являются по меньшей мере уменьшенными, и/или что одна или более лежащих в основе клеточных, физиологических или биохимических причин или механизмов, вызывающих симптомы, являются уменьшенными и/или исключаются. Следует понимать, что "уменьшенный", как используют в этом контексте, подразумевает относительно состояния инфекции, включая молекулярное состояние инфекции, а не только физиологическое состояние инфекции.
Как используют в настоящем описании, термин "терапевтически эффективное количество" представляет собой количество данного антигена, например, убитого изолята Salmonella, которое является достаточным для обеспечения защиты и/или способствования защите от патогена, где антиген, вводимый для защиты, в случае, когда предоставлен и/или когда предназначен для однократного введения, предоставляют как первичное введение с одним или более последующими вторичными введениями.
Как используют в настоящем описании, "эффективная" вакцина содержит терапевтически эффективное количество данного антигена.
Как используют в настоящем описании, термин "фармацевтически приемлемый" используют в качестве прилагательного для обозначения, что определяемое существительное является подходящим для применения в фармацевтическом продукте. В случае, когда его используют, например, для описания эксципиента в фармацевтической вакцине, оно характеризует эксципиент как являющийся совместимым с другими ингредиентами композиции и не являющийся неблагоприятно вредным для предполагаемого реципиента.
Термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или носителю, с которым вводят соединение. Фармацевтически приемлемые носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и/или масла, включая жидкости на основе нефти, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. В качестве носителей можно применять воду или водный раствор физиологического раствора и водные растворы декстрозы и глицерина, в частности для инъецируемых растворов.
Как используют в настоящем описании, "адъювант" представляет собой вещество, которое способно оказывать благоприятное действие или усиливать каскад иммунологических событий, в конечном итоге приводя к лучшему иммунному ответу, например, неспецифическому системному ответу на введение антигена. Адъювант, как правило, не подразумевает возникновение иммунного ответа, но оказывает благоприятное действие или усиливает такой ответ.
Как используют в настоящем описании, "системное введение" представляет собой введение в кровеносную систему организма (включая сердечно-сосудистую и лимфатическую систему), таким образом влияющее на организм в целом, а не на конкретный участок, такой как желудочно-кишечный тракт (например, при пероральном или ректальном введении) и дыхательная система (например, при интраназальном введении). Системное введение можно проводить, например, введением в мышечную ткань (внутримышечно), в кожу (интрадермально, трансдермально или на кожу), ниже кожи (подкожно), ниже слизистой (подслизисто), в вены (внутривенно) и т.д.
"Парентеральное введение" включает подкожные инъекции, подслизистые инъекции, внутривенные инъекции, внутримышечные инъекции, интрадермальные инъекции и инфузию.
Как используют в настоящем описании термин "домашняя птица" может включать куриц, индюков, уток, гусей, перепела и фазанов.
Вакцины
9
Настоящее изобретение относится к вакцинам, которые содержат представителя серогруппа C1 Salmonella enterica или серогруппы C2-3 Salmonella enterica, которые обеспечивают достаточную защиту от сероваров из обеих серогрупп. В частном варианте осуществления настоящего изобретения вакцина представляет собой жидкую суспензию убитых (например, формалином или тепловой инактивацией) клеток сероваров Enteritidis, Typhimurium и Infantis Salmonella enterica с ограниченным содержание железа. В более частном варианте осуществления убитые серовары Salmonella enterica являются убитыми формалином. В одном из таких вариантах осуществления конечная концентрация каждого антигена составляет приблизительно 2×10 клеток/мл. В другом варианте осуществления вакцина содержит адъювант на основе гидроксида алюминия приблизительно 25% об./об. В родственном варианте осуществления вакцину вводят внутримышечно. В другом родственном варианте осуществления вакцину вводят домашней птице (например, курицам) при минимальном возрасте шести недель.
Настоящее изобретение дополнительно относится к применению серовара серогруппы C2-3 Salmonella enterica или серовару серогруппы C1 Salmonella enterica и необязательно серовару серогруппы B Salmonella enterica и/или серовару серогруппы D Salmonella enterica в получении вакцины по настоящему изобретению, которое дополнительно включает применение одного или более штаммов ринотрахеита птиц, вируса инфекционного бронхита, вируса болезни Ньюкасла, инфекционного брусита (болезни Гамборо), вируса синдрома снижения яйценоскости, реовируса и антигена Clostridial perfringens (C. perfringens). В частных вариантах осуществления антиген C. perfringens представляет собой альфа-анатоксин C. perfringens [см. WO2006/113722, US 2006/0233825 A1, таким образом, содержание которых полностью включено посредством ссылки]. В других таких вариантах осуществления антиген C. perfringens представляет собой рекомбинантный аттенуированный организм C. perfringens [см. US 7732187 B2, таким образом, содержание которого полностью включено посредством ссылки]. В других вариантах осуществления антиген C. perfringens представляет собой по существу нетоксичный мутеин альфа-токсина C. perfringens [см. US 7972604 B2, таким образом, содержание которого полностью включено посредством ссылки].
Настоящее изобретение также относится к применению серовара серогруппы C2-3 Salmonella enterica или серовара серогруппы C1 Salmonella enterica в получении вакцины по настоящему изобретению, которое дополнительно включает применение одного или более штаммов ринотрахеита птиц, вируса инфекционного бронхита, вируса болезни Ньюкасла и вируса синдрома снижения яйценоскости. В частности, такие вакцины могут быть направлены на несущих яйца кур (например, несушек).
В альтернативных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению серовара серогруппы C2-3 Salmonella enterica или серовара серогруппы C1 Salmonella enterica в получении вакцины по настоящему изобретению, которое дополнительно включает применение ринотрахеита птиц, одного или нескольких штаммов вируса инфекционного бронхита, вируса болезни Ньюкасла и вируса инфекционного бурсита (болезни Гамборо) и инактивированного реовируса. В альтернативных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению серовара серогруппы C2-3 Salmonella enterica или серовара серогруппы C1 Salmonella enterica в получении вакцины по настоящему изобретению, которое дополнительно включает применение инактивированного реовируса, одного или нескольких штаммов вируса инфекционного бронхита, вируса инфекционного бурсита (болезни Гамборо) и антигена C. perfringens, например, альфа-анатоксина C. perfringens. Такие вакцины могут быть направлены, в частности, на домашних птиц, используемых в производстве мяса (например, бройлеров и ростеров).
Настоящее изобретение дополнительно относится к получению вакцин, содержащих убитые формалином клетки сероваров Enteritidis, Typhimurium и даже Infantis или Hadar Salmonella enterica с ограниченным содержание железа, которое, кроме того, включает применение ринотрахеита птиц, одного или нескольких штаммов вируса инфекционного бронхита, вируса болезни Ньюкасла, инфекционного брусита (болезни Гамборо), вируса синдрома снижения яйценоскости, реовируса и антигена Clostridial perfringens.
Вакцины и иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут, но не обязательно, содержать физиологически совместимые буферы и физиологический раствор и т.п., а также фармацевтически приемлемые адъюванты. В определенных вариантах настоящего изобретения вакцины и/или иммуногенные композиции по настоящему изобретению хранят замороженными, и, таким образом, они содержат криоконсервант, такой как диметилсульфоксид (DMSO), для сохранения замороженных инфицированных клеток.
Также предусмотрено, что для хранения вакцину можно высушивать сублимацией (лиофилизировать) или иным образом уменьшать жидкий объем, а затем восстанавливать в жидком разбавителе до или в момент введения. Такое восстановление можно получать с использованием, например, воды степени чистоты для использования в вакцине. В определенных вариантах осуществления лиофилизированная часть поливалентной вакцины может содержать один или более антигенов, и разбавитель может содержать один или более антигенов.
В частных вариантах осуществления вакцина по настоящему изобретению (или ее часть) может находиться в лиофилизированной форме, например, в виде таблеток и/или сфер, которые получают способом, описанным в WO 2010/125084, таким образом полностью включенном посредством ссылки. В частности, ссылку можно привести на примеры на стр.15, строка 28 на стр.27, строка 9 WO 2010/125084, в которых описан способ получения таких быстро распадающихся таблеток/сфер. Такие лиофилизированные формы можно легко растворять в разбавителе для обеспечения системного введения вакцины.
Введение вакцины
Вакцины и/или иммуногенные композиции по настоящему изобретению можно вводить любыми общепринятыми способами, например, системным введением, включая парентеральное введение, такое как, без ограничения, внутримышечное или подкожное введение, внутривенная инъекция, интрадермальная инъекция, in ovo или их сочетания. Вакцины по настоящему изобретению также можно вводить введением в слизистую, таким как интраназальное, внутритрахеальное, ректальное и/или глазное введение. Альтернативно, вакцины можно вводить посредством трансдермального пластыря, скарификации или местного введения. Предусматривают, что вакцину по настоящему изобретению также можно вводить пероральным введением, в том числе посредством питьевой воды и/или пищи реципиента.
Вакцины (включая поливалентные вакцины) по настоящему изобретению также можно вводить в виде части комбинированного лечения, например, терапии, которая в дополнение к самой вакцине включает введение одного или более дополнительных активных средств, видов терапии и т.д. В этом случае следует понимать, что количество вакцины, которое составляет "терапевтически эффективное" количество, может быть больше или меньше количества вакцины, которое составляет "терапевтически эффективное" количество, если вакцину было необходимо вводить отдельно. Другие виды терапии могут включать известные в данной области виды терапии, такие как, например, анальгетики, жаропонижающие лекарственные средства, отхаркивающие средства, противовоспалительные лекарственные средства, антигистаминные средства и/или введение жидкостей.
Уровень иммуногенности можно определять экспериментально способом титрования дозы контрольного заражения, как правило, известным в данной области. Такие способы, как правило, включают вакцинацию ряда являющихся животными индивидуумов вакциной в различных дозах, а затем контрольное заражение являющихся животным индивидуумов соответствующим вирулентным сероваром Salmonella enterica для определения минимальной защитной дозы.
Доза/интервал введения
В частных вариантах осуществления две дозы 0,5 мл вакцины по настоящему изобретению вводят с интервалом по меньшей мере четыре недели. В частных вариантах осуществления минимальный возраст первой вакцинации составляет 6 недель, и вторую дозу следует вводить по меньшей мере от 3 до 4 недели перед яйцекладкой.
Другие факторы, влияющие на предпочтительный режим дозирования, могут включать, например, возраст, массу, пол, корм, активность, размер легких и состояние индивидуума; путь введения; эффективность, безопасность и профили продолжительности иммунитета конкретной используемой вакцины; используют ли систему доставки и вводят ли вакцину в качестве лекарственного средства и/или комбинации вакцин. Таким образом, фактически применяемая доза может изменяться для конкретных животных, и, таким образом, может отклоняться от характерных доз, приведенных выше. Определение таких подборов дозы общепринятыми способами, как правило, находится в компетенции специалистов в области разработки вакцин. Предусматривают, что вакцину можно вводить реципиенту вакцины один раз или, альтернативно, два или более раз в сутки, неделю, месяцы, или годы. В некоторых вариантах осуществления вакцину вводят по меньшей мере два раза. В некоторых таких вариантах осуществления, например, вакцину вводят дважды, где вторую дозу (например, бустер) вводят по меньшей мере через 2 недели после первой дозы. В частных вариантах осуществления вакцину вводят дважды, где вторую дозу вводят не более 8 недель после первой дозы. В других вариантах осуществления вторую дозу вводят от 1 недели до 2 лет после первой дозы, от 1,5 недель до 8 недель после первой дозы или от 2 до 4 недель после первой дозы. В других вариантах осуществления вторую дозу вводят приблизительно через 3 недели после первой дозы.
В указанных выше вариантах осуществления первая и последующие дозы могут изменяться, например, по количеству и/или форме. Однако, как правило, дозы являются одинаковыми по количеству и форме. В случае, когда вводят только однократную дозу, количество вакцины только в этой дозе, как правило, составляет терапевтически эффективное количество вакцины. Однако, когда вводят более одной дозы, количества вакцины в этих совместных дозах могут составлять терапевтически эффективное количество. Кроме того, вакцину можно вводить первично, а затем можно вводить вторичную дозу через 2-12 недель, как указано выше. Однако последующие введения вакцины можно проводить на годичной (1 год) или двухгодичной (2 года) основе, независимо от того, вводили или не вводили вторичную дозу.
Настоящее изобретение может быть более понятно со ссылкой на следующие ниже неограничивающие примеры, которые предоставлены в виде иллюстрирующих изобретение. Следующие ниже примеры предоставлены для более полной иллюстрации вариантов осуществления изобретения. Однако их не следует интерпретировать каким-либо образом как ограничивающие общий объем изобретения.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Сравнение вакцин, содержащих различные серовары Salmonella
Получали вакцины, содержащие инактивированные серовары Salmonella Enteritidis (S. Enteritidis, SE) и Salmonella Typhimurium (S. Typhimurium, ST) (следует отметить: серовары S. Enteritidis и S. Typhimurium являлись такими как серовары в SALENVAC T) отдельно или в комбинации с инактивированными сероварами Salmonella Hadar (S. Hadar, SH) и/или Salmonella Infantis (S. Infantis, SI). Все серовары выращивали в среде с ограниченным содержанием железа и инактивировали формалином перед использованием. Составы вакцин, используемых в исследовании, приведены в таблице 1.
Таблица 1Вакцинные композиции
Вакцина
S. Enteritidis клетки/мл
S. Typhimurium клетки/мл
S. Infantis клетки/мл
S. Hadar клетки/мл
Гидроксид алюминия
SE/ST
2×10<sup>9</sup>
2×10<sup>9</sup>
25%
SE/ST/SI
2×10<sup>9</sup>
2×10<sup>9</sup>
2×10<sup>9</sup>
25%
SE/ST/SH
2×10<sup>9</sup>
2×10<sup>9</sup>
2×10<sup>9</sup>
25%
Четверка 1
2×10<sup>9</sup>
2×10<sup>9</sup>
2×10<sup>9</sup>
2×10<sup>9</sup>
40%
Четверка 2
2×10<sup>9</sup>
2×10<sup>9</sup>
2×10<sup>9</sup>
2×10<sup>9</sup>
25%
Четверка 3
1×10<sup>9</sup>
1×10<sup>9</sup>
1×10<sup>9</sup>
1×10<sup>9</sup>
25%
9
Чертырехвалентная вакцина 1 SE/ST/SH/SI (четверка 1) содержала дополнительные количества адъюванта, т.к. предшествующие исследования с аналогичными вакцинами, содержащими большое число клеток, подтверждали, что 25% содержание гидроксида алюминия может являться неподходящим для вакцины, содержащей в целом 8×10 клеток/мл. Чертырехвалентная вакцина 2 SE/ST/SH/SI (четверка 2) содержала 25% адъюванта для исследования гипотезы о концентрации адъюванта, и чертырехвалентная вакцина SE/ST/SH/SI 3 (четверка 3) содержала половину дозы всех антигенов, что обеспечивало вакцину, которая содержала такую же общую концентрацию клеток как в коммерчески доступной SALENVAC T (SE/ST).
10
В двух исследованиях (исследование 1 и исследование 2) сравнивали эффективность двух индивидуальных трехвалентных вакцин (SE/ST/SI и SE/ST/SH) с четверкой 1 и вводили контроль. В третьем исследовании (исследование 3) сравнивали три четырехвалентных состава против контрольного заражения S. Infantis или S. Hadar и вводили соответствующие контроли. Эффективность вакцин тестировали с использованием породы несушек кур от коммерческого поставщика. Птицам проводили две внутримышечные вакцинации с интервалом три недели, и проводили контрольное заражение через три недели введением пероральной дозы приблизительно 10 КОЕ S. Hadar или S. Infantis.
Образцы обрабатывали, как указано ниже: взвешенный образец гомогенизировали в стерильной забуференной пептонной воде (BPW). Давали отстояться комкам, и серийно разводили аликвоту супернатанта в стерильной BPW. Аликвоты супернатанта и разведения использовали для инокуляции селективных для Salmonella агаровых планшетов. Вторую аликвоту супернатанта использовали для инокуляции бутылки бульона Раппапорта-Вассилиадиса, который представляет собой селективную среду для Salmonella [см. Rappaport et al., J. Clin. Pathol, 9:261-266 (1956); Vassiliadis et al., J. Appl. Bacteriol., 44:233-239 (1978)]. Бульоны и планшеты инкубировали при подходящей температуре. Планшеты анализировали на Salmonella и подсчитывали любые колонии. Это обеспечивает прямое выделение, которое можно выражать в виде подсчетов на грамм образца или в виде прямого позитивного. В случае, когда не наблюдают Salmonella в планшетах, относящихся к образцу, соответствующий бульон Раппапорта-Вассилиадиса инокулируют на селективном для Salmonella планшете и инкубируют. Затем, когда наблюдают Salmonella, результат регистрируют как обогащенное позитивное, при этом в случае, когда наблюдают Salmonella, результат является отрицательными. Различия между группами можно наблюдать как различия в количестве выделяемой Salmonella, количестве прямых позитивных или общего числа позитивных (прямых плюс обогащенных).
Исследования демонстрировали, что эти серовары и S. Infantis, а также другие штаммы и серовары группы C1, не образовывали достаточно колоний для получения профиля бактериовыделения, который соответственно демонстрирует уменьшенное бактериовыделение у вакцинированных птиц. Кроме того, использование такой высокой дозы контрольного заражения может подавлять уровень получаемой защиты, таким образом препятствуя воспроизводимой демонстрации эффективности, в частности, в отношении бактериовыделения.
Эффективность вакцинации определяли сравнением бактериовыделения серовара контрольного заражения в клоакальных мазках. Результаты бактериовыделения выражают в виде сравнений числа выделяемых организмов, как определяют прямым культивированием, и числа позитивных клоакальных мазков в группе. Кроме того, защиту против инвазии печени и селезенки определяли при посмертном анализе. Результаты посмертных изолятов из органов выражают в виде процента позитивных птиц в каждой группе посредством прямого культивирования или после обогащения (см. таблицу 2).
Контрольное заражение S. Infantis в этих исследованиях не являлось сильным. Даже с используемой высокой дозой контрольного заражения бактериовыделение являлось слишком низким у контрольных птиц для того, чтобы получать убедительные результаты, однако в исследовании 3 наблюдали, что бактериовыделение увеличивалось на сутки 7 во всех группах, т.е. не наблюдали уменьшения у вакцинированных птиц. Полагают, что используемые высокие дозы контрольного заражения могут превосходить уровень защиты, получаемый после вакцинации. Аналогичные результаты были опубликованы другими группами с использованием моделей контрольного заражения S. Infantis. Видимые отличия эффективности различных тестируемых составов, вероятно, обусловлены вариабельностью контрольного заражения, получаемого в индивидуальных исследованиях.
Таблица 2Обобщение результатов исследований контрольного заражения
Контрольное заражение
S. Hadar
S. Infantis
Вакцина
Бактерио-выделение
Слепая кишка
Печень
Селезенка
Бактерио-выделение
Слепая кишка
Печень
Селезенка
SE/ST/SI (исследование 1)
⎫
X
⎫
X
NR
⎫/X
NR
X
SE/ST/SI (исследование 2)
⎫
⎫/X
NR
⎫/X
NR
NR
⎫
X
SE/ST/SH (исследование 1)
⎫
X
⎫
⎫
NR
⎫/X
NR
X
SE/ST/SH (исследование 2)
⎫
X
NR
⎫
NR
NR
X
X
Четверка 1 (исследование 1)
⎫
X
X
⎫
NR
⎫
NR
⎫
Четверка 1 (исследование 2)
⎫/X
X
NR
⎫
NR
NR
X
X
Четверка 1 (исследование 3)
⎫
X
NR
⎫
NR*
X
⎫/X
X
Четверка 2 (исследование 3)
⎫
X
NR
⎫
NR*
X
⎫
X
Четверка 3 (исследование 3)
⎫
X
NR
⎫
NR*
X
⎫
X
⎫ - защита, продемонстрированная уменьшением подсчета или количества позитивных проб.X - означает отсутствие наблюдаемой защиты, например, отсутствие уменьшения подсчета или количества позитивных проб.NR - Отсутствие результата. Подсчет или число позитивных проб в контроле являлось недостаточным.NR* - аналогичный паттерн бактериовыделения во всех группах, см. ниже.⎫/X - неоднозначный результат.
Результаты
10
Результаты для изолятов из клоакальных мазков представлены на фигурах 1A-1C в виде индивидуальных точек для каждой птицы и означают log КОЕ/г серовара контрольного заражения. Средний подсчет в каждой группе показан соединенным сплошной линией для ясности. Результаты посмертных изолятов образцов на фигурах 2A-2B и фигуры 3A-3C выражены в виде процента образцов, которые являлись позитивными для изолятов контрольного заражения. В исследовании 1 образцы получали посмертно от некоторых птиц в каждой группе на сутки 7 и оставшуюся часть на сутки 14 после контрольного заражения.
Эффективность против бактериовыделения после контрольного заражения S. Hadar
10
Исследование 1: на фигуре 1A представлен период от 3 суток до 5 суток после контрольного заражения S. Hadar, где бактериовыделение у контрольных птиц сохранялось приблизительно на уровне 3 log, и на сутки 5 все птицы являлись позитивными по результатам прямого культивирования. Для всех вакцинированных групп SE/ST/SI, SE/ST/SH и четверки 1 (см. таблицу 1 выше), включая трехвалентную вакцину, формулируемую с S. Infantis (SE/ST/SI), среднее бактериовыделение уменьшалось в течение определенного периода времени, и увеличивалось число птиц, негативных по результатам прямого культивирования. Гомологичная вакцина (SE/ST/SH) характеризуется резким спадом, тогда как четырехвалентная вакцина (четверка 1) характеризовалась наибольшим числом негативных птиц.
10
Исследование 2: исследование 2 являлось повторением указанного выше исследования 1 за исключением того, что, как изображено на фигуре 1B, включали данные на сутки 7 после контрольного заражения S. Hadar. Как можно видеть на фигуре 1B, среднее бактериовыделение вновь составляло приблизительно 3 log, но наблюдали ряд птиц в контрольной группе, которые подвергались контрольному заражению, как определяли прямым культивированием, и, таким образом, среднее бактериовыделение вакцинированных групп в некоторых случаях являлось выше, чем в контрольной группе. Однако, эффект вакцинации подтверждают быстрым снижением среднего бактериовыделения (где подсчет составляет по меньшей мере в 10 раз ниже, чем в контрольной группе на сутки 7) и увеличивающимся числом негативных птиц в каждой из групп трехвалентной вакцины. Четырехвалентная вакцина, четверка 1, не действовала в исследовании 2 так же, как она действовала в исследовании 1.
Исследование 3: как представлено на фигуре 1C, для всех трех групп четырехвалентных вакцин, например, четверка 1, четверка 2 и четверка 3 (см. указанную выше таблицу 1), подсчет являлся приблизительно в 1 раз ниже, чем в контрольной группе на сутки 7. Это включало группу, вакцинированную четверкой 3, которая представляла собой состав, содержащий 50% дозы антигена. Для двух групп, вакцинированных вакцинами, содержащими 25% адъюванта, например, четверкой 2 и четверкой 3, также выявляли более низкий подсчет на сутки 3 и сутки 5, чем для группы, вакцинированной вакциной, содержащей 40% адъювант, например, четверки 1.
Посмертные изоляты после контрольного заражения S. Hadar
В исследовании 1 на сутки 7 содержимое слепой кишки большей части птиц во всех группах являлось позитивным (см. фигуру 2A). В печени каждая трехвалентная вакцина снижала инвазию до степени, при которой ни один из образцов не являлся прямым позитивным. По-видимому, уменьшение доли образцов селезенки, которые являлись прямо позитивными, демонстрирует специфический в отношении серовара эффект, где только для трехвалентной вакцины, содержащей клетки S. Hadar, и четырехвалентной вакцины демонстрировали уменьшение. Наблюдали несколько позитивных образцов из любых образцов печени или селезенки, получаемых на сутки 14 после контрольного заражения.
Результаты исследования 2 демонстрируют, что группа трехвалентной вакцины SE/ST/SI характеризовалась сниженными числами позитивных образцов содержимого слепой кишки по сравнению с другими группами (см. фигуру 2B). Характер изолятов из селезенки являлся аналогичным исследованию 1, хотя соотношение положительных контролей являлась больше, и для всех вакцин демонстрировали уменьшение доли позитивных образцов. Наблюдали лишь несколько позитивных образцов из печени контрольных птиц в этом исследовании для достоверного анализа.
В исследовании 3, несмотря на то, что образцы содержимого слепой кишки от всех птиц являлись позитивными, несколько образцов печени являлись позитивными (от 5 до 15 контролей по сравнению с 1 или 2 из 12 вакцинированных птиц). Для каждой вакцины демонстрировали уровень защиты от колонизации селезенки с использованием вакцин, содержащих 25% адъюванта, с наиболее низкими соотношениями позитивных образцов, как представлено в таблице 3 ниже.
Таблица 3Процент позитивных образцов селезенки
Доза вакцины/адъювант
Полная/40%
Полная/25%
Половина/25%
Контроль
Процент позитивных образцов
58
33*
31*
87
*Достоверно отличающийся от контролей p=<0,05.
Эффективность против бактериовыделения после контрольного заражения S. Infantis
В исследованиях 1 и 2 не наблюдали явного свидетельства того, что S. Infantis колонизировала слепую кишку у контрольных птиц. Через семь суток после контрольного заражения не наблюдали птиц, позитивных по результатам прямого культивирования. В исследовании 3 различия средних подсчетов в группах на каждые сутки являлись ниже, хотя для четырехвалентных вакцин 1 и 2 выявляли меньше птиц, позитивных по прямому культивированию на сутки 3 после контрольного заражения по сравнению с контролями и четверкой 3, см. таблицу 4 ниже. Подсчеты в каждой группе заметно увеличивались с 5 суток по 7 сутки, что указывает на то, что доза контрольного заражения является достаточно высокой, чтобы нарушать защиту.
Таблица 4Процент прямо позитивных птиц на сутки 3 после контрольного заражения
Доза вакцины/адъювант
Полная/40%
Полная/25%
Половина/25%
Контроль
Процент позитивных образцов
8,3
0
33
42,8
Посмертные изоляты после контрольного заражения S. Infantis
В исследовании 1 на сутки 7 после контрольного заражения S. Infantis наблюдали меньше позитивных образцов содержимого слепой кишки в любой из вакцинированных групп по сравнению с контролями, но соотношения позитивных образцов печени и селезенки из контролей являлись очень низкими для проведения значимого анализа (см. фигуру 3A). Данные образца селезенки на 14 сутки после контрольного заражения демонстрировали уменьшение соотношения позитивных образцов из группы четырехвалентной вакцины (четверка 1) по сравнению с контролями (см. фигуру 3B).
В исследовании 2 на сутки 7 наблюдали очень мало позитивных образцов из слепой кишки для достоверного анализа. Не наблюдали уменьшения соотношения позитивных образцов селезенки с использованием любого из составов (см. фигуру 3C). Однако наблюдали соответствующую защиту от инвазии печени, т.к. наблюдали меньше прямо позитивных образцов из групп трехвалентной SE/ST/SI и четырехвалентной вакцины (четверка 1, см. фигуру 3C).
Таблица 5Процент позитивных образцов печени при вскрытии
Доза вакцины/адъювант
Полная/40%
Полная/25%
Половина/25%
Контроль
Процент позитивных образцов
58
36
40
71
В исследовании 3 при посмертном исследовании на сутки 7 не наблюдали защитного эффекта в отношении уменьшений соотношения позитивных образцов слепой кишки или селезенки для любого из составов. Однако для каждой вакцины демонстрировали уровень защиты от инвазии печени с использованием вакцин, содержащих 25% адъюванта (четверка 2 и четверка 3), с наименьшими соотношениями позитивных образцов, как представлено в таблице 5 выше.
ПРИМЕР 2
Пассивная защита у бройлерных цыплят, у которых проводили контрольное заражение S. Hadar или S. Infantis в возрасте 4 суток
Родительских птиц вакцинировали комбинированной вакциной S. Enteritidis + S. Typhimurium + S. Infantis (SE/ST/SI) с 25% Rehydrogel™ или, альтернативно, оставляли невакцинированными в качестве контролей. Для тестирования пассивной защиты от этих двух различных сероваров проводили контрольное заражение S. Hadar или S. Infantis бройлерных цыплят в возрасте четырех суток, которые вылуплялись из яиц вакцинированных или невакцинированных кур.
2
3
Выделение заражающих сероваров из исследуемых птиц являлось высоким. Не наблюдали различий между вакцинированными и контрольными группами в отношении бактериовыделения контрольного заражения посредством мониторинга клоакальных мазков или в содержимом слепой кишки после смерти. Однако наблюдали меньше позитивных птиц в вакцинированных группах по сравнению с контрольными группами, когда рассматривали инвазию печени и селезенки. Было выявлено, что это наиболее соответствует получению образцов на 10 сутки после контрольного заражения и, когда использовали заражение 10 КОЕ S. Hadar или 10 КОЕ S. Infantis. Для обеих групп заражения S. Hadar и S. Infantis демонстрировали очень сходные результаты защиты от инвазии органов, несмотря на тот факт, что родительское стадо получало вакцину, которая содержала S. Infantis, но не S. Hadar. Эти результаты соответствуют результатам указанного выше примера 1, и, таким образом, они предоставляют убедительное доказательство перекрестного иммунитета между этими двумя различными подгруппами Salmonella enterica.
Экспериментальные способы
Яйца от родительских стад, которые вакцинировали комбинированной вакциной S. Enteritidis, S. Typhimurium и S. Infantis (SE/ST/SI) или, альтернативно, не вакцинировали, хранили, выводили и содержали в инкубаторе раздельно для обеспечения того, чтобы можно было идентифицировать происхождение выведенных цыплят. В возрасте одни сутки цыплят распределяли на четыре группы по 15 от вакцинированных птиц и четыре от невакцинированных птиц, где каждую группу содержали раздельно. Проводили контрольное заражение птиц в возрасте 4 суток соответствующим штаммом Salmonella и дозой в соответствии с распределением группы (см. таблицу 6 ниже).
Таблица 6Экспериментальный протокол контрольного заражения для пассивной защиты
Группа
Птицы (кол-во)
Вакцинация
Штамм контрольного заражения
Доза (в 0,5 мл)
1
15
SE/ST/SI
S. Hadar
10<sup>2</sup> КОЕ
2
15
Контроль
S. Hadar
3
15
SE/ST/SI
S. Hadar
10<sup>4</sup> КОЕ
4
15
Контроль
S. Hadar
5
15
SE/ST/SI
S. Infantis
10<sup>3</sup> КОЕ
6
15
Контроль
S. Infantis
7
15
SE/ST/SI
S. Infantis
10<sup>5</sup> КОЕ
8
15
Контроль
S. Infantis
За течением инфекции наблюдали посредством анализа клоакальных мазков птиц на сутки 3, 5, 7 и 10 после контрольного заражения. Наличие организмов контрольного заражения в содержимом клоаки и слепой кишки и распространение в образцы печени и селезенки определяли посмертным анализом половины птиц в каждой группе на 7 сутки после контрольного заражения и оставшейся части на 10 сутки после контрольного заражения.
Результаты
После контрольного заражения S. Hadar: не наблюдали уменьшения бактериовыделения или различия изолятов слепой кишки от вакцинированных птиц по сравнению с контролями с использованием дозы контрольного заражения.
4
2
На сутки 7 и 10 после контрольного заражения на более высоком уровне контрольного заражения (10 КОЕ/доза) наблюдали заметное уменьшение изолятов из печени и селезенки на сутки 7 и сутки 10, и для более низкого уровня контрольного заражения (10 КОЕ/доза) наблюдали уменьшение по сравнению с вакцинированными птицами для контролей для печени и селезенки на сутки 10 после контрольного заражения. Доля позитивных птиц отражает выделяемые количества в вакцинированных группах, содержащих меньше позитивных образцов на сутки 7 и сутки 10 после контрольного заражения более низкой дозой. Для низкой дозы контрольного заражения демонстрировали только защитный эффект вакцинация на сутки 10 после контрольного заражения. Однако это представляло собой наибольшее различие между вакцинированными и контрольными птицами и отражало увеличивающееся соотношение положительных контрольных птиц в сравнении с уменьшающимся соотношением позитивных птиц вакцинированной группы. Результаты приведены в таблице в виде общего процента птиц, позитивных после контрольного заражения S. Hadar в таблице 7 ниже.
Таблица 7Общий процент позитивных птиц после контрольного заражения S. Hadar (прямое и обогащенное культивирование на сутки 7 и 10)
% общих позитивных образцов, сутки 7
Группа
Вакцинация
Штамм контрольного заражения
Слепая кишка
Печень
Селезенка
1
SE/ST/SI
10<sup>2</sup> S. Hadar
100%
38%
25%
2
Контроль
10<sup>2</sup> S. Hadar
100%
0%
0%
3
SE/ST/SI
10<sup>4</sup> S. Hadar
100%
25%
50%
4
Контроль
10<sup>4</sup> S. Hadar
100%
63%
75%
% общих позитивных образцов, сутки 10
1
SE/ST/SI
10<sup>2</sup> S. Hadar
100%
17%
33%
2
Контроль
10<sup>2</sup> S. Hadar
100%
71%
71%
3
SE/ST/SI
10<sup>4</sup> S. Hadar
100%
14%
57%
4
Контроль
10<sup>4</sup> S. Hadar
100%
57%
86%
3
5
После контрольного заражения S. Infantis: первоначально для контрольного заражения S. Infantis при 10 КОЕ демонстрировали уменьшение бактериовыделения в вакцинированной группе на сутки 3, однако это различие между группами уменьшалось на более поздних сутках получения образцов. Для более высокого уровня дозы контрольного заражения (10 КОЕ/доза) не демонстрировали уменьшения бактериовыделения для вакцинированных групп во все моменты времени. Практически все образцы слепой кишки являлись позитивными.
Изоляты S. Infantis из печени и селезенки приводили к меньшему числу позитивных образцов от вакцинированных групп по сравнению с контрольными группами на сутки 7 после контрольного заражения более высокой дозой контрольного заражения, при этом для обоих уровней контрольного заражения демонстрировали защитный эффект вакцинация на сутки 10 (см. таблицу 8 ниже). С более низкой дозой контрольного заражения наблюдали уменьшающееся соотношение позитивных птиц с 7 по 10 сутки по сравнению с увеличивающимся соотношением положительных контрольных птиц.
Таблица 8Общий процент позитивных птиц после контрольного заражения S. Infantis (прямое и обогащенное культивирование)
% общих позитивных образцов, сутки 7
Группа
Вакцинация
Штамм контрольного заражения
Слепая кишка
Печень
Селезенка
5
SE/ST/SI
10<sup>3</sup> S. Infantis
100%
50%
75%
6
Control
10<sup>3</sup> S. Infantis
100%
38%
25%
7
SE/ST/SI
10<sup>5</sup> S. Infantis
100%
50%
50%
8
Контроль
10<sup>5</sup> S. Infantis
100%
88%
88%
% общих позитивных образцов, сутки 10
5
SE/ST/SI
10<sup>3</sup> S. Infantis
100%
14%
43%
6
Контроль
10<sup>3</sup> S. Infantis
100%
71%
86%
7
SE/ST/SI
10<sup>5</sup> S. Infantis
100%
29%
57%
8
Контроль
10<sup>5</sup> S. Infantis
86%
57%
71%
Выводы
2
Для получавших вакцину групп при обоих уровнях контрольного заражения S. Hadar не демонстрировали уменьшений бактериовыделения в клоаке (числа выделившихся бактерий и числа позитивных образцов) или образцов содержимого слепой кишки по сравнению с контролями. Однако для групп, получавших вакцину, при обоих уровнях контрольного заражения демонстрировали уменьшения колонизации органа с максимальными различиями, наблюдаемыми при более низком уровне контрольного заражения (10 КОЕ) на сутки 10 после контрольного заражения. Таким образом, наблюдали подтверждение перекрестного иммунитета против контрольного заражения S. Hadar у цыплят, которых пассивно иммунизировали против S. Infantis, что выражалось в уменьшении колонизации органов.
Для получающих вакцину групп при обоих уровнях контрольного заражения Salmonella Infantis демонстрировали небольшое уменьшение бактериовыделения в клоаки или образцов содержимого слепой кишки по сравнению с контролями. Уменьшение инвазии органов наблюдали в получавших вакцину группах, для которых демонстрировали меньше позитивных образцов органов по сравнению с контролями с аналогичным паттерном, как наблюдают для контрольного заражения S. Hadar.
ПРИМЕР 3
Тестирование эффективности трехвалентной вакцины против контрольного заражения S. Hadar у несушек в возрасте 14 недель
Краткое описание
Цыплят типа несушки SPF происхождения в возрасте шести недель иммунизировали трехвалентной вакциной, содержащей равные количества убитых формалином клеток S. Enteritidis, S. Typhimurium и S. Infantis, которые выращивали в условиях с ограниченным содержанием железа. Вторую дозу вакцины вводили в возрасте 10 недель. Через четыре недели после второй вакцинации птиц и невакцинированную когорту подвергали контрольному заражению S. Hadar пероральным путем, и наблюдали за бактериовыделением штамма контрольного заражения посредством анализа клоакальных мазков. Распространение бактерий контрольного заражения во внутренние органы определяли путем посмертного анализа птиц на 10 и 14 сутки после контрольного заражения.
Наблюдали значительно меньше организмов контрольного заражения, выделяемых из вакцинированной группы, когда уровень бактериовыделения индивидуальной птицы сравнивали с контрольной группой (p=0,001). Соотношение позитивных образцов селезенки от контрольных птиц являлось значительно выше по сравнению с вакцинированной группой (p=0,01). В этом исследовании не наблюдали выделение организма контрольного заражения из культуры печени.
Для трехвалентной вакцины, тестируемой в этом исследовании, демонстрировали эффективность против контрольного заражения S. Hadar, которая заключалась в том, что:
- число серовара Hadar S. enterica в свежих образцах фекалий вакцинированных цыплят после контрольного заражения на различные сутки получения проб являлось ниже у вакцинированных птиц по сравнению с контрольными птицами в каждый момент времени получения образцов; когда сравнивали общее бактериовыделение в течение определенного периода времени, число организмов, выделяемых вакцинированными птицами, являлось значительно ниже по сравнению с контрольными птицами.
- демонстрировали значительное уменьшение общего числа позитивных образцов селезенки у вакцинированных птиц при сравнении с контролями.
Схема эксперимента
Птиц-несушек SPF происхождения выращивали как одну группу в обычном помещении для кур в течение нескольких недель для развития одинаковой нормальной флоры кишечника до фазы контрольного заражения исследования. 55 птиц вакцинировали в возрасте 6 недель 0,5 мл вакцины, вводимой внутримышечно в грудь. Через четыре недели вводили вторую дозу тем же путем. 52 птицы оставались невакцинированными в качестве контрольной группы. Перед введением контрольного заражения птиц переносили в виварии с защитой для их содержания в отдельных группах в загонах с полом.
Птиц подвергали пероральной контрольной инфекции в возрасте приблизительно 14 недель контрольным заражением S. Hadar. За сутки до контрольного заражения у птиц изымали корм, а затем после контрольного заражения возвращали обратно. За течением инфекции наблюдали посредством анализа клоакальных мазков одних и тех же 30 птиц из каждой группы на 3, 5, 7, 10 и 14 сутки после контрольного заражения. Наличие бактерии контрольного заражения в образцах печени и селезенки определяли анализом образцов, получаемых посмертно от птиц, не выбранных для получения клоакальных образцов, на сутки 10 после контрольного заражения или для оставшихся птиц на сутки 14 после контрольного заражения. Исследуемые группы являлись такими, как представлено в таблице 9.
Таблица 9Исследуемые группы
Группа
Число птиц
Вакцина
Целевая доза контрольного заражения в 20 мл
1
55
Партия 29
10<sup>8</sup> КОЕ/птица
2
52
Отсутствует
9
Вакцина. Вакцина содержала 1,5×10 клеток убитых формалином клеток каждого из S. Typhimurium, S. Enteritidis и S. Infantis с ограниченным содержанием железа и адъювант гидроксид алюминия. Перед использованием для вакцины проводили тест на стерильность и аналитические тесты.
8
Контрольное заражение. Каждую птицу подвергали контрольному заражению 3,8×10 КОЕ S. Hadar, штамм PT16, свежеприготовленный из ночной культуры при 37°C в микроаэрофильной среде.
Культуры концентрировали в 10 раз центрифугированием и проверяли на жизнеспособность и чистоту высеванием на кровяной агар. Контрольное заражение вводили в виде 20 мл пероральной дозы на птицу.
Животные. SPF несушки породы белый леггорн смешанного пола в возрасте 6 недель на момент первой вакцинации.
Способы и процедуры
Тестирование образцов окружающей среды. Образцы подстилки тестировали на наличие Salmonella во время вакцинация и контрольного заражения посредством сбора образцов фекального вещества по меньшей мере из пяти различных мест с пола загона в стерильный контейнер. Фекальное вещество суспендировали в забуференной пептонной воде с отношением фекалий к среде 1:10 масс./об. и инкубировали при 37°C до 24 часов. 100 мкл образца культуры из бульона инокулировали в 10 мл объемах бульона Раппапорта-Вассилиадиса (RV) и инкубировали до 72 часов при 42°C. Петлю для посева из каждой культуры бульона RV инокулировали в селективные среды для Salmonella Brilliance™ (Oxoid) и инкубировали до 24 часов при 37°C. Наличие любой Salmonella демонстрировали по наличию розовато-лиловых колоний. Любые предполагаемые колонии подтверждали серологической идентификацией. Выделение Salmonella из окружающей среды делало недействительным исследование.
Серология. Образцы крови отбирали из лучевой вены каждой исследуемой птицы до контрольного заражения. Образцы сыворотка тестировали на присутствие антител против S. Typhimurium, S. Enteritidis и S. Infantis с использованием ELISA, проводимого в лаборатории исследования. Анализ включал инкубацию разведений тестируемой и эталонной сывороток на микротитровальных планшетах, предварительно покрытых жгутиками, получаемыми из клеток Salmonella релевантного серовара. После промывания связанные антитела детектировали с использованием конъюгированного с пероксидазой антитела против IgY курицы с последующей инкубацией с субстратом. Проявление цвета блокировали кислотой, и регистрировали оптические плотности при 450 нм. Уровни антител рассчитывали относительно эталонной сыворотки для каждого серовара.
Изоляты Salmonella
Клоакальные мазки и посмертные образцы печени и селезенки анализировали на наличие бактерии контрольного заражения, как описано в примере 1.
Данные анализа. Число Salmonella, выделяемых на грамм фекалий из клоакальных мазков, рассчитывали из изолятов из прямых культур. Также регистрировали число позитивных образцов из каждой группы после обогащения.
Рассчитывали геометрические средние бактериовыделения, общее число позитивных образцов и общее бактериовыделение для птицы. Общее бактериовыделение для каждой птицы в группах в течение периода продолжительности исследования рассчитывали с использованием оценки "площадь под кривой", и сравнивали две группы с использованием двухвыборочного t-критерия.
Сравнивали соотношения птиц с позитивными образцами селезенки (прямым и обогащенным культивированием) с использованием таблиц сопряженности (анализ на основе критерия хи-квадрат с поправкой на непрерывность по Йетсу), где это применимо. Результаты для образцов печени не включали, т.к. не обнаруживали, что образцы печени являлись позитивными на Salmonella.
Результаты
10
Бактериовыделение штамма контрольного заражения Salmonella Hadar - результаты клоакальных мазков: Рассчитывали величины геометрического среднего Salmonella, выделяемой в каждый момент времени из клоакальных мазков после контрольного заражения. Рассчитывали log подсчета на грамм содержимого слепой кишки и рассчитывали среднее для каждой группы в каждый момент времени (см. фигуру 4 и таблицу 10).
В каждый момент времени до 14 суток после контрольного заражения наблюдали более высокие уровни среднего выделения из контрольной группы по сравнению с вакцинированной группой. На сутки 14 после контрольного заражения количества, выделяемые обеими группами, являлись одинаковыми. Рассчитывали общее бактериовыделение в течение определенного периода времени для каждой птицы, и было продемонстрировано, что оно является статистически значимым отличием вакцинированной группы (1) от контрольной группы (2) (p=0,001) при сравнении t-критерием.
Таблица 10Сравнение log10 КОЕ/г геометрического среднего, выделяемого из вакцинированных и контрольных птиц в течение определенного периода времени
Log10 КОЕ/г среднего значения
Сутки после контрольного заражения
Вакцинированные птицы (группа 1)
Контроли (группа 2)
Сутки 3
3,09
4,97
Сутки 5
3,00
4,13
Сутки 7
2,00
2,65
Сутки 10
1,38
1,96
Сутки 14
1,10
1,31
Посмертное выделение S. Hadar: В каждый момент времени наблюдали больше позитивных образцов от невакцинированных птиц как в результате прямого культивирования, так и в общем по сравнению с образцами из вакцинированной группы.
На 10 сутки после контрольного заражения всего 9 из 25 (36%) образцов селезенки из вакцинированной группы являлись позитивными, 7 из них прямыми по сравнению с 16 из 22 (73%) из контрольной группы, из которых 11 являлись прямыми.
На 14 сутки после контрольного заражения всего 8 из 30 (27%) образцов из вакцинированной группы являлись позитивными, 4 из них прямыми по сравнению с 14 из 30 (47%) культур из контрольной группы, из которых 11 являлись прямыми (см. фигуру 2 и таблицу 11).
Таблица 11Число позитивных образов селезенки (прямое и обогащенное культивирование)
Селезенка, сутки 10 после контрольного заражения
Позитивные
Негативные
Всего
Группа 1 - вакцинированные птицы
9
16
25
Группа 2 - контроли
16
6
22
Селезенка, сутки 14 после контрольного заражения
Позитивные
Негативные
Всего
Группа 1 - вакцинированные птицы
8
22
30
Группа 3 - контроли
14
16
30
Не наблюдали выделения организма контрольного заражения посредством прямого или обогащенного культивирования из образцов печени, получаемых на 10 и 14 сутки после контрольного заражения.
См. фигуру 5 для процента общих позитивных образцов селезенки (прямое и обогащенное культивирование) из групп 1 и 2 на сутки 10 и 14 после контрольного заражения.
Число птиц, от которых получали посмертный позитивный образец, обобщено в таблице 12.
Таблица 12Краткое описание общего числа позитивных птиц после смерти (прямое и обогащенное культивирование)
Позитивные
Негативные
Общее число птиц, у которых получали образцы
Группа 1 - вакцинированные птицы
17
28
55
Группа 2 - контроли
30
22
52
Значение критерия хи-квадрат (поправка Йейтса)=6,736 (p=<0,01)
Выводы
Целью этого исследования являлась демонстрация эффективности трехвалентной вакцины Salmonella против гетерологичной инфекции контрольного заражения S. Hadar.
Убедительно демонстрировали эффективность вакцины в отношении уменьшения бактериовыделения, т.к. наблюдали значительно меньшее число организмов контрольного заражения, выделяемых в фекалии, в вакцинированной группе по сравнению с контрольной группой в течение периода продолжительности исследования (p=0,001); начиная от 100-кратно более низкого уровня бактериовыделения.
Также демонстрировали впечатляющую эффективность против распространения во внутренние органы, т.к. наблюдали значительно меньшее число птиц из вакцинированной группы, от которых получали посмертные позитивные образцы по сравнению с контролями (p<0,01); фактически уровни распространения эффективно уменьшались наполовину.
Таким образом, трехвалентная вакцина, тестируемая в настоящем исследовании, приводила к значительному уменьшению числа S. Enterica в образцах свежих фекалий от вакцинированных куриц по сравнению с контролями, которые сохранялись на более низких уровнях до конца тестирования. Кроме того, число образцов, позитивных в отношении Salmonella, из печени или селезенки являлась значительно меньше у вакцинированных птиц, чем у контролей.