Математическое моделирование динамики сообществ анаэробных микроорганизмов

Математическое моделирование динамики сообществ анаэробных микроорганизмов

УДК 579.6+57.03

МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ДИНАМИКИ СООБЩЕСТВ АНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

© 2009 В.А. Вавилин

Институт водных проблем РАН, Москва; e-mail: vavilin@aqua.laser.ru

Показано, что современный анализ поведения сообществ микроорганизмов, разлагающих органические вещества, включает традиционные измерения химических компонентов, молекулярно-биологические методы и математическое моделирование. Предложено уравнение, описывающее аккумуляцию изотопа в микробной клетке.

Ключевые слова: сообщество анаэробных микроорганизмов, аккумуляция изотопа в микробной клетке, имитационная модель.

ВВЕДЕНИЕ

При отсутствии кислорода в разложении орга-нических веществ участвует целое сообщество микроорганизмов. В ходе этих стадий из сложных молекул образуются жирные кислоты и конечные продукты - метан (CH4) и углекислый газ (CO2. В начале 90-х годов прошлого столетия мы построили имитационную модель “Метан” [1], позволяющую оценить скорость разложения органического вещества в анаэробных условиях. Это была первая в мировой практике обобщенная математическая модель анаэробного процесса, которой могут пользоваться обычные исследователи и инженеры, а не только программисты-профессионалы (www.methane.da.ru). Высокие концентрации продукта или субстрата могут ингибировать каждую реакцию, и в итоге конечный продукт CH4 может и не появиться.

Традиционно [2], для калибровки и верификации математических моделей процессов разложения органических веществ учитывается лишь динамика химических компонентов. Недавно, с развитием молекулярных методов стало возможным идентифицировать и измерять концентрации конкретных видов и групп микроорганизмов, осуществляющих процесс разложения органических веществ. Этому способствовали и соответствующие изотопные измерения. В статье приводится пример использования математического моделирования как метода изучения динамики сообщества мезофильных анаэробных микроорганизмов, разлагающих метанол.

СТЕХИОМЕТРИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

Согласно SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) и FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) анализов [3, 4], микроорганизмы, относящиеся к роду Pseudomonas, выполняют синтрофное окисление метанола вместе с водо-родотрофными метаногенами Methanoculleus sp., превращающих H2/CO2 в CH4. Одновременно осуществляется превращение H2/CO2 в ацетат гомоацетогенными микроорганизмами рода Clostridia. Основной группой ацетикластических метаногенов, превращающих ацетат в метан, являются кокки Methanosarcina sp., образующие колонии.

1. CH3OH + 2H2O ^3Ы2 + H2CO3

2. H2 + 0.25H2CO3 ^0.25CH4 + 0.75H2O

3. H2 + 0.5 H2CO3 ^ 0.25CH3COOH + H2O

4. CH3COOH + H2O ^ CH4 + H2CO

МАТЕМАТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ

Четыре группы микроорганизмов представлены в модели (метанол-окисляющие и гомоацетогенные бактерии, ацетикластические метаногены Methanosarcina sp. и водородотрофные метаногены Methanoculleus sp.). Метанол-окисляющие бактерии рассмотрены как автотрофы, использующие CO2 для роста биомассы. Соответствующие функции Моно с одним или двумя субстратами применяются для описания процессов утилизации субстрата, образования продукта и роста биомассы:

1615

Известия Самарского научного центраРоссийской академии наук. Т 11, № 1(7), 2009

dCH 30H d t

dH 2CO3

Pmbacaut Bbacaut

CH 3OH

KcH 3OHbacaut + CH 3OH

7 , Pmbacaut Bbacaut T7.

dt K,

CH 3OH

+ (1 _ Ysar )Pmsar B 0'25Pmcul Bcul

CH 30H bac aut

CH 3COOH

+ CH 3OH

----0.5p . Bh

iy , r'UT.DlJ ^m hom hom If

r,^ CH 3OH K

H2

H 2CO3

LCH 3C00Hsar

H2

H 2 hom + H 2 KH 2CO3hom + H 2CO 3

H 2CO3

Kh 2 ul + H 2 Kh 2CO3cul + H 2CO3

- 5 И d H 2

m bacaut Bbaccaut

H 2CO3

CH 3OH

Khcabbacut + H2CO3 KchoHbacu + CH3OH

dt

= 3P

mbacaut Bbacaut

CH 3OH

Kch OHbacaut + CH 3OH

P mculBcul

- K (H2CO3 - H2CO3sat) H2 H 2CO3

Kh2cul + H2 Kh2co3d + H2CO3

Pm hom Bhom

H2

H 2CO3

Kh2 hom + H 2 Kh 2CO3hom + H 2CO3

dCH 3COOH d t

dCH 4

0.25Pm hom Bhom

H2

H 2CO3

Kh 2 hom + H 2 Kh 2CO3hom + H 2CO3

Pm sar Bsar

CH 3COOH

Kch 3cooh*t + CH 3OH

dt

Ж = Vol * [0.373 ((1 - Ysar )PmsarBSar

CH 3COOH

Kch 3cooh sar + CH 3OH

+ 2.8(1 - Yu) PmcUA

H2

H 2CO3

cul

Kh2^ + H2 Kh2сазы + H2CO3

dB

dt

dB

bacaut __ .. d

m bacaut baccaut

H 2CO3

CH 3OH

Kh 2CO3bacaut + H 2CO3 Kch OHbacaut + CH 3OH

— k B

dbac aut bac aut

dt

dB

hom __у _ B

hom m hom hom

H2

H 2CO3

Kh2 hom + H 2 Kh 2C03hom + H 2CO3

kd homBhom

dt

_ у n B

sar msar sar

CH 3C00H

Kch 3cooh sar + CH 30H

— k B

dsar sar

dB

dt

cul __у _ B

cul mcul cul

H2

H 2C03

Kh2cul + H2 Kh2co3cul + H2C03

kd culBcul

где CH30H, CH300H, H2C03, H2 - концентрации метанола, ацетата, карбоновой кислоты и водорода; H2C03sat - насыщающая концентрация карбоновой кислоты; B, , „ B, , B , B , -концентрации автотрофных метанол-окисляющих и гомоацетогенных бактерий, ацетикластических метаногенов Methanosarcina sp., и водородот-рофных метаногенов, соответственно; CH4tot -полный объем продуцируемого метана;

Рmbacaut,Рmhom , Рmsar, Рmcul - МаКСИМаЛЬНЫС

удельные скорости утилизации метанола, H2/CO2 и ацетата соответствующей группой микроорга-

НИЗМОВ; Кн 2C0 3hom , KH 2C0 3cul, KH 2C0 3bac aut,

KCH3C00H sar, KH2hom, KH2cul, KCH30Hbacaut -

соответствующие константы полунасыщения; jilm - максимальная скорость роста биомассы метанол-окисляющих бактерий; kdbacaut, kdhom , kdsar, kdu - удельные скорости распада биомассы соответствующих микроорганизмов;

Yhom, Yyn, Ycul - соответствующие экономические коэффициенты роста биомассы; K- коэффициент массообмена для CO2 в жидкой и газовой фазе; Vol - объем жидкой фазы.

При вычислениях учитывалось, что из-за взятия проб жидкости объем ее в реакторе уменьшается. Метан вычислялся в литрах. Для вычисления концентраций в весовых единицах (гг-1) учитывались также молекулярные веса соответствующих химических компонентов (62: CH30H, 32: H2C03, 2: H2, 60: CH3C00H, 113: биомасса). Численные расчеты были проведены с использованием пакета МАТЛАБ. Критерием, отражающим точность модели, является:

а = <

1

LN - K

i J

г L 2 '

А/

1 >

Sm

L j J

1/2

1616

Математическое моделирование динамики сообществ анаэробных микроорганизмов

cm cc

где Sj , Sij - измеряемые и вычисляемые переменные; i, j - порядковые номера переменных и их величин, измеренных в определенное время; L, N - общее число переменных и их измеренных значений; K - общее число коэффициентов модели. Для ускорения минимизации а . осуществ-

лялась визуальная калибровка, когда все переменные и измеренные значения выводились на экран компьютера (CH3OH, CH3COOH, TIC, TOC, CH4, и 13C в ацетате, TIC и биомассе). Основные коэффициенты модели представлены в таблице.

Таблица. Параметры микроорганизмов, участвующих в мезофильном разложении метанола

Микроорганизмы Реакция B0, г л 1 Pm Р mY> сут1 Ks , гл~1 Y, 22 kd > cym 1

Метанол-окисляющие 1 0,01 0,09 0,1(H2CO3) - 0,01

Гомоацетогены 2 0,2 1,6 0,000008(H2) 0,08 0,01

Methanoculleus sp. 3 0,01 1,5 0,000002(H2) 0,05 0,01

Methanosarcina sp. 4 0,0015 0,2 1(CH3COOH) 0,08 0,01

В ходе анаэробного процесса субстрат превращается в продукт и частично переходит в биомассу: Субстрат (S) ^ Продукт (P) + Биомасса (B). Для описания аккумуляции 13C мы предложили следующие уравнение [5]:

dfP _ 1 _ lxPdP

dt P dt P1 dt

dP/dt \di3CP/ dt P | dP/ dt

fP}

df

Bio

1 dl3CB

CB dB dB/ dt I d13CB / dt

dt B dt

13Cp

B2 dt

B

dB/ dt

П

13C

fP =

/Bio

=

B

- доли 13C в продуктах

P " B и биомассе, которые, в свою очередь, зависит от

s l3CS dP

доли 13C в субстрате f = —— ; - скорость

S at

аккумуляции продукта (если P одновременно является и субстратом в других реакциях, утилизация P не учитывается);

dB

~0j - скорость роста биомассы (распад биомассы не учитывается). В случае единственного лимитирующего субстратаL, уравнение (3) мож-но записать в виде

dfB

dt

f (L)fs - f }

PmL

где f (L) к m+ l " Функйия Моно, pm = Ypm

- максимальная удельная скорость роста биомассы. Согласно (4), чем выше доля 13C в субстрате, тем выше и аккумуляция 13C в биомассе. Скорость аккумуляции зависит от удельной скорости роста биомассы, которая, в свою очередь,

зависит от максимальной удельной скорости утилизации субстрата рт и экономического коэффициента Y. Чем выше они, тем больше скорость аккумуляции изотопа.

Уровень насыщения содержания изотопа в клетке не превышает этого уровня в субстрате. Измеряя 13C в отдельной микробной клетке (NanoSIMS: Nano Secondary Ion Mass

Spectrometry - In Situ Hybridization [3]), можно уточнить механизм процесса. Модель дает возможность получать абсолютные концентрации меченой (тяжелой) и немеченой (легкой) биомассы различных микроорганизмов i:

13C B h = B x Bio г heavy г c

13C BiUght = Bi x

Общая динамика системы показана на Рис. 1. Молекулярно-биологические анализы SSCP и FISH, также как и NanoSIMS были учтены при моделировании. В модели предполагалось, что часть органического вещества является биологически не разлагаемой (см. значения TOC, показанные на Рис. 1b). В мезофильных условиях наблюдается двух-стадийный процесс продукции метана. Если на первом этапе метан образуется из H2/H2CO3, то на втором этапе он образуется из ацетата. Скорость лимитирующей реакцией на первом этапе является реакция 1, тогда как реакция 4 лимитирует общую скорость образова-ния метана на втором этапе. Эти реакции осуществлялись медленно растущими метанол-окисляющими бактериями и ацетикластически-ми метаногенами Methanosarcina sp., которым свойственны низкие рт, равные 0,09 сутл и 0,2 сутл соответственно (Табл. 1). С увеличением

1617

Известия Самарского научного центраРоссийской академии наук. Т 11, № 1(7), 2009

Рис. 1. Символы - эксперимент [3], кривые - динамическая модель. TIC и TOC - общая концентрация

неорганического и органического углерода.

концентрации метанол-окисляющих бактерий (Рис. 1h) скорость потребления метанола также увеличивается (Рис. 1a). Согласно реакции 1, в процессе трансформации метанола образуется водород и угольная кислота, которые в дальнейшем превращаются в ацетат (Рис. 1e). Когда весь метанол исчезает (Рис. 1a) концентрации метанол-окисляющих и гомоацетогенных бактерий, также как и концентрация водородотрофных метаногенов начинают уменьшаться вследствие распада биомассы (Рис. 1h и 1i). Этопроисходит одновременно с исчезновением водорода (не показано на рисунке).

Концентрации водорода и метанола являются “быстрой” и “медленной” переменными, соответственно. Водород образуется из метанола метанол-окисляющими бактериями и его уровень

быстро подстраивается под текущую концентрацию метанола. Водородотрофные метаногены и гомоацетогены являются быстро растущими микроорганизмами. Величина /лт равна 1,6d"1 и 1,5d_1 для Methanoculleus sp. и гомоацетогенов, соответственно (Табл. 1). В итоге эти микроорганизмы конкурируют за одинаковые субстраты (в основном водород).

Концентрация ацетата увеличивается до 23-х суток (Рис. 1e). С повышением концентрации ацетокластических метаногенов (Рис. 1h) скорость роста изъятия ацетата увеличивается (Рис. 1e). В этот период происходит и увеличение TIC (Рис. 1d). Процесс распада биомассы ацетокластических метаногенов начинается с 48-х суток (Рис. 1h), когда весь ацетат исчезает (Рис. 1e).

Гистограммы меченой (тяжелой) и немече-

Рис. 2. Гистограммы абсолютных концентраций меченой (тяжелой) и немеченой (легкой) фракций биомассы микроорганизмов, рассмотренных в модели (1).

1618

Математическое моделирование динамики сообществ анаэробных микроорганизмов

ной (легкой) фракций биомасс различных групп микроорганизмов, участвующих в процессе (Рис. 2) показали, что биомасса гомоацетогенных бактерий доминировала. Согласно рис. 1, начальная концентрация их равнялась 0,2 глл. Поскольку в модели коэффициенты полунасыщения по угольной кислоте (0,1 глл) были существенно меньше, чем текущая концентрация TIC (1 глл), то концентрация H2CO3, в отличие от концентрации H2, не лимитировала скорость роста гомоацетогенов и водородотрофных метаногенов. В легкой фракции лишь после 42-х суток биомассы Methanosarcina sp. и гомоацетогенных бактерий стали сравнимыми. В тяжелой фракции вклад Methanosarcina sp. был более значителен. Эти результаты подтверждаются качественными PCR-SSCP анализами [3]. В соответствии с экспериментом, модель показала, что аккумуляция 13C в биомассе Methanosarcina sp. выше чем для метанол-окисляющих бактерий. Модель подтвердила, что метанол-окисляющие бактерии являются автотрофными микроорганизмами, т.е. они растут за счет H2CO3, а не непосредствен -но за счет CH3OH.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вавилин В.А., Васильев В.Б., Рытое С.В. Моделирование деструкции органического вещества сообществом микроорганизмов. - М.: Наука, 1993.

2. Batstone D.J. , Keller J., Angelidaki I., Kalyuzhnyi

S.V., Pavlostathis S.G., Rozzi A., Sanders W.T.M., SiegristH., Vavilin VA. Anaerobic Digestion Model No.1. Scientific and Technical Report No.13. 2002. Cornwall, UK: IWA Publishing. 77p.

3. Li T. Groups Microbiens Fonctionnels Impliques dans

la Methanization de la Cellulose et du Methanol: Diversite, F ounction et Influence de la Temperature. These de Doctorat. Universitte Paris-Sud 11, U.F.R. des Sciences d’Orsay. 2008.

4. Li T., Vavilin VIA., Wu T.-D., Mazeas L., Dabert P, Shu A., Chapeleur O., Grossin-Debatista J., Leblon G., Guerquin-Kern J.-L., Bouchez T. Deciphering functional network of uncultured microbes in complex ecosystems (in preparation).

5. Vavilin VA., Li T, Qu X., Mazeas L, He P.-J., Bouchez T. Modelling solid waste degradation mechanisms: chemical reactions, microbial ecology and isotope 13C fractionation // Proc.: 3rd International Workshop “Hydro-Physico-Mechanics of Landfills“. Braunschweig, Germany, 10-13 March 2009, Session B, 1-10.

DYNAMICS OF ANAEROBIC MICROORGANISMS COMMUNITY: EXPERIENCE

IN MATHEMATICAL MODELING

© 2009 V. A. Vavilin

Water Problems Institute of the Russian Academy of Sciences, Moscow; e-mail: vavilin@aqua.laser.ru

It is shown that a traditional chemical kinetics, the new methods of molecular biology as well as isotopic composition analysis made possible to consider new constraints concerning degradation of organic matter and microbial dynamics.

The equation was developed to describe isotope fractionation in microbial cells.

Key words: anaerobic microbial community, isotope fractionation, simulation model.

1619