Методические подходы к разработке показателя «Бактериальные эндотоксины» в фармацевтических субстанциях

О.В. Шаповалова, Н.П. Неугодова, Г.В. Долгова, Г.А. Сапожникова

МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К РАЗРАБОТКЕ ПОКАЗАТЕЛЯ «БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОКСИНЫ» В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ СУБСТАНЦИЯХ

О.В. Шаповалова, Н.П. Неугодова, Г.В. Долгова, Г.А. Сапожникова

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России, Москва

Резюме: Приведенные методические рекомендации будут полезны при расчете норм предельного содержания бактериальных эндотоксинов, разработке и оформлении раздела «Бактериальные эндотоксины» для нормативных документов на фармацевтические субстанции.

Ключевые слова: бактериальные эндотоксины, гель-тромб тест, фармацевтические субстанции, метронидазол.

METHODOLOGICAL APPROACHES TO THE ELABORATION OF «BACTERIAL ENDOTOXINS» INDEX IN THE PHARMACEUTICAL SUBSTANCES

O.V. Shapovalova, N.P. Neugodova, G.V. Dolgova, GA. Sapozhnikova

Abstract: The present guidelines will be helpful in calculating endotoxin limits, elaboration and design of the section «Bacterial endotoxins» for normative documents on pharmaceutical substances.

Key words: bacterial endotoxins, gel-clot test, pharmaceutical substances, metronidazole.

Внедрение ЛАЛ-теста в России с 2000 г. позволило осуществлять контроль за пирогенны-ми примесями in vitro практически для всех субстанций, используемых в производстве инъекционных препаратов, в том числе и для тех, качество которых невозможно проверить в испытании на пирогенность in vivo, в т. ч. в силу их фармакологического действия (миорелаксанты, снотворные, средства для наркоза и т.д.) или физико-химических свойств (плохая растворимость в воде и т.д.). Субстанции, используемые для этой цели, должны содержать нормированное количество эндотоксинов, т.к. стерилизация готовой лекарственной формы не мо-

Шаповалова Ольга Владимировна, эксперт 1 категории лаборатории фармакологии Испытательного центра экспертизы качества лекарственных средств Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России»; chemicolya@gmail. com.

Неугодова Наталия Петровна, к.б.н., начальник лаборатории фармакологии Испытательного центра экспертизы качества лекарственных средств Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России»; pharmacologia@inbox.ru.

Долгова Галина Владимировна, кбн, ведущий эксперт лаборатории фармакологии; pharmacologia@inbox.ru. Сапожникова Галина Алексеевна, эксперт 1 категории лаборатории фармакологии; pharmacologia@inbox.ru.

жет гарантировать их инактивацию или удаление. С момента утверждения ОФС 42-0002-00 «Бактериальные эндотоксины» число субстанций, контролируемых по этому показателю, быстро увеличивалось [1]. По нашим данным, к концу 2011 г. оно составило более 700 наименований.

В настоящей статье предложены методические приемы, используемые при разработке раздела «Бактериальные эндотоксины» для нормативных документов на фармацевтические субстанции. Раздел «Бактериальные эндотоксины» в нормативной документации на субстанцию должен включать: норму предельного содержания бактериальных эндотоксинов (БЭ), ссылку на ГФ XII, ч. 1, с. 128 [2, 3]. В качестве растворителя используется вода для ЛАЛ-теста. Кроме этого, желательно указать концентрацию исходного раствора субстанции, а в случае необходимости - процедуру растворения. Так, для субстанций мало- или практически нерастворимых в воде следует привести соответствующий растворитель, концентрацию исходного раствора, необходимые процедуры пробоподго-товки, например предварительное измельчение, нагревание, интенсивное перемешивание, а также рабочее разведение испытуемого раствора.

Норма предельного содержания БЭ для каждой фармацевтической субстанции рассчитывается по формуле, приведенной в ОФС, с учетом рекомендаций дозирования готовой лекарственной формы, изготавливаемой из этой субстанции:

Предельное содержание _ к бактериальных эндотоксинов м ,

где:

К - пороговая пирогенная доза, которая составляет 5 единиц эндотоксина (ЕЭ) на 1 кг массы тела в течение одного часа для препарата, вводимого пациенту любым парентеральным путем, кроме интратекального. При интратекаль-ном пути введения К = 0,2 ЕЭ/кг [2];

М - максимальная терапевтическая доза препарата, вводимая пациенту в течение одного часа (в мг на 1 кг массы тела).

Для расчета уровня предельного содержания БЭ проводится анализ информации о режимах дозирования лекарственной формы, изготовляемой из субстанции. За основу принимаются указания инструкций по медицинскому применению препаратов, приведенные в Государственном реестре лекарственных средств [4]. Полученные расчетные величины необходимо сравнить с нормами содержания БЭ на аналогичные лекарственные сред-

ства в ведущих фармакопеях мира (Европейская фармакопея, фармакопеи США, Великобритании и Японии), а также в нормативных документах на лекарственные средства, зарегистрированных в Российской Федерации [5-8].

В отдельных случаях возможно использовать пересчет с тест-доз, применяемых для кроликов в испытании на пирогенность, при этом за величину К принимают 5 ЕЭ на 1 кг массы животного [9].

По результатам сравнительного анализа выбирают наименьшее значение нормы предельного содержания БЭ как наиболее надежное для контроля качества субстанции и обеспечивающее безопасность применения изготавливаемого препарата (табл. 1). Расчеты, проведенные с учетом международных требований к количеству БЭ, безопасному для парентерального введения человеку (не более 350 ЕЭ/ч), показали, что величину предельного содержания БЭ следует выбирать из двух значений:

1) 0,35 ЕЭ на 1 мг метронидазола для препарата, который применяют как противомикробное средство;

2) 0,035 ЕЭ на 1 мг метронидазола для препарата, предназначенного для использования в качестве радиосенсибилизирующего средства.

После теоретического выбора величины оптимального содержания БЭ (наиболее «жесткого» уровня) проводят серию экспериментов, подтверждающих возможность использования на практике данного уровня. Экспериментальная работа включает следующие стадии.

I. Выбор образцов испытуемой субстанции для анализа

Исследования проводят на образцах субстанции не менее 3 серий, с различными сроками годности, что позволяет оценить качество субстанции в процессе ее хранения.

II. Подготовка исходного раствора испытуемой субстанции, растворимой в воде

Наиболее целесообразно величину концентрации исходного раствора субстанции выбирать равной концентрации готовой лекарственной формы, если это раствор для инъекций или инфузий. Возможно использование концентрации, удобной для дальнейших разведений (например, в диапазоне от 1 до 10 мг/мл) с учетом растворимости испытуемой субстанции.

При приготовлении раствора следует учитывать конкретное содержание влаги и активного вещества в данном образце. Подобная информация имеется в паспорте качества на субстанцию или определяется в процессе лабораторной экспертизы.

Исходный раствор готовят на воде для ЛАЛ-теста или, в случае использования большого количества растворителя (более 10 мл), на воде для инъекций (при условии, что содержание БЭ в ней менее 0,03 ЕЭ/мл).

Например, для анализа субстанции метронидазола готовили исходные растворы образцов с концентрацией 5 мг/мл, что соответствует содержанию действующего вещества в лекарственной форме. Субстанцию растворяли в воде для ЛАЛ-теста при нагревании до 37 °С и непрерывном интенсивном перемешивании в течение 5 минут.

III. Выбор разведения исходного раствора, в котором испытуемая субстанция не оказывает мешающего влияния на ЛАЛ-реакцию

Для этого на основании рассчитанной нормы предельного содержания БЭ в испытуемой субстанции, концентрации исходного раствора и чувствительности используемого ЛАЛ-реактива (X) проводят расчет максимально допустимого разведения (МДР) по формуле [2]:

С

~ X

где

С - установленная концентрация активного вещества в исходном растворе,

X - чувствительность используемого ЛАЛ-реактива.

Например, для субстанции метронидазола:

Таблица 1. Уровни содержания бактериальных эндотоксинов в субстанции метронидазол в зависимости от рекомендуемых режимов применения его лекарственной формы

Нормативная документация Высшая разовая доза Назначение Уровень содержания бактериальных эндотоксинов в препарате

Международная норма содержания БЭ - не более 350 ЕЭ/доза или 5 ЕЭ/кг/ч

«Государственный реестр лекарственных средств» [4] 1DDD мг Внутривенно,для взрослых 0,35 ЕЭ/мг

7,5 мг/кг Внутривенно, для детей 0,66 ЕЭ/мг

1D DDD мг в объеме 2 л с концентрацией 5 мг/мл В качестве радиосенсибилизирующего средства 0,07 ЕЭ/мг - если объем введения равен 1 л в час или 0,035 ЕЭ/мг, если объем введения равен 2 л в час

USP 31 metronidazole Injection» [5] - - 0,35 USP EU per mg of metronidazole

ВР 2009 metronidazole Intravenous Infusion» [6] - - 3,5 IU per ml Solution A (5 mg per ml) -0.7 IU per mg of metronidazole

_ 5 мг/мл х 0,35 ЕЭ/мг _ для субстанции, используемой в изготовлении

МДР _ о,03 ЕЭ/МЛ противомикробного средства,

_ 5 мг/мл х 0,035 ЕЭ/мг _ ^ для субстанции, используемой в изготовлении

0,03 ЕЭ/мЛ ’ радиосенсибилизирующего средства.

На следующем этапе экспериментально проверяют соответствие истинного содержания БЭ в испытуемых образцах расчетному значению, проводя качественный анализ в 1/2 МДР Затем проводят испытания исходного раствора каждого из образцов субстанции в соответствии с требованиями ГФ XII, ч. 1, ст. 134 («Количественный анализ», метод В) [3]. С помощью ЛАЛ-теста анализируют разведения исходного раствора с шагом 1:2 или 1:10 (в зависимости от величины МДР) вплоть до 1/2 МДР или МДР. В соответствии со схемой, указанной ГФ XII, ч. 1, с. 135 (табл. 27.4) готовят ряд разведений исследуемой субстанции на воде для ЛАЛ-теста и параллельно, ряд таких же разведений на растворе КСЭ, в каждом из которых конечная концентрация КСЭ составляет 2 X.

По результатам, полученным в экспериментах, устанавливают допустимую величину разведения исходного рас-

твора субстанции, которое можно будет использовать в качестве рабочего для проведения рутинных анализов производственных серий. В выбранном разведении исходный раствор не должен содержать БЭ и обладать ингибирующим действием, т.е. мешать образованию геля. Рабочее разведение должно быть как минимум в 2 раза меньше МДР, то есть равным МДР/2.

Например, установлено, что в испытуемой субстанции не были обнаружены БЭ, а также не отмечено ингибирующее действие ни в одном из исследованных разведений (табл. 2).

Таким образом, для субстанции метро-нидазола можно выбрать в качестве рабочего разведения исходный раствор с концентрацией 5 мг/мл. Величина рН (6,7-7,0) этого разведения находится в оптимальном диапазоне для проведения ЛАЛ-теста.

После проведения процедуры валидации данное разведение может быть

49

рекомендовано в качестве «рабочего» для рутинного контроля качества фармацевтической субстанции по показателю «Бактериальные эндотоксины». Необходимо отметить, что указанная концентрация метронидазола (5 мг/ мл) является концентрацией лекарственной формы - раствора для ин-фузий. Валидация исходного раствора субстанции должна подтвердить ее пригодность для приготовления лекарственных форм как для применения в лечебных целях, так и в качестве радиосенсибилизирующего средства.

IV. Валидация «рабочего разведения» субстанции

Все образцы субстанции испытывают в выбранном рабочем разведении в соответствии с требованиями раздела «Мешающие факторы» в ГФ XII, ч. 1, с. 132 по схеме, приведенной в таблице 27.2 [2]. Для этого готовят исходные растворы с заданной концентрацией, которые разводят водой для ЛАЛ-те-ста до «рабочего разведения». Далее в эти разведения добавляют КСЭ для того, чтобы получить испытуемые пробы с концентрациями эндотоксина: 2Х, X, 0,5Х, 0,25Х. Параллельно готовят аналогичные разведения КСЭ на воде для ЛАЛ-теста. Сравнительное испытание в ЛАЛ-тесте проводят при условии одновременной инкубации всех приготовленных рядов разведений раствора КСЭ как на воде для ЛАЛ-теста, так и на растворах исследуемой субстанций.

Если в результате данного опыта испытуемая субстанция в выбранном разведении не оказывает мешающего действия (ингибирующего или потенцирующего) на реакцию гелеобразо-вания, то оно считается валидирован-ным и может быть рекомендовано для использования в рутинном контроле (табл. 3).

Как видно из таблицы 3, чувствительность ЛАЛ-реактива, определенная с КСЭ в разведении на воде для ЛАЛ-теста, не отличалась от чувствительности ЛАЛ-реактива, определенной с КСЭ в разведении на растворе субстанции. Это означает, что раствор субстанции метронидазола в концентрации 5 мг/мл не только не инги-

Таблица 2. Определение содержания бактериальных эндотоксинов в ряду последовательных разведений исходного раствора образца субстанции метронидазола

Субстанция метронидазола Повторность № Фактор разведения исходного раствора субстанции метронидазола 5 мг/мл Контроли

1 2 4 8 16 Положительный Отрицательный

Исходный раствор 1 - - - - -

2 - - - - -

Положительный контроль исходного раствора 1 + + + + +

2 + + + + + + + - -

Таблица 3. Подтверждение возможности применения ЛАЛ-теста для определения содержания бактериальных эндотоксинов в образце субстанции метронидазола

Повторность № Разведения КСЭ Концентрация эндотоксина в конечной точке реакции Среднее геометрическое значение концентрации эндотоксина Отрицательные контроли

2% % О 5 ГЧ О

на воде для ЛАЛ-теста а 1— и е 1- о; л го о со Раствор субстанции

1 + + - - 0,03 ЕЭ/мл 0,021 ЕЭ/мл

2 + + + - 0,015 ЕЭ/мл

на растворе субстанции с концентрацией 5 мг/мл

1 + + - - 0,03 ЕЭ/мл 0,021 ЕЭ/мл

2 + + - - 0,03 ЕЭ/мл

3 + + + - 0,015 ЕЭ/мл - - - -

4 + + + - 0,015 ЕЭ/мл

бировал реакцию гелеобразования, но и не потенцировал ее.

Eсли получены подобные результаты, то на их основании можно рекомендовать установленную норму и «рабочее разведение» исходного раствора субстанции, гарантирующее необходимое качество по показателю «Бактериальные эндотоксины».

Исходный раствор субстанции метронидазола с концентрацией 5 мг/ мл можно анализировать с помощью гель-тромб теста без разведения. Таким образом, содержание БЭ будет составлять 0,006 EЭ на 1 мг метронидазола и соответствовать обеим установленным нормам.

Если в испытании будет получен положительный результат (образование геля) для исходного раствора субстанции, то необходимо повторное проведение теста в МДР/2 и МДР, рассчитанном с учетом нормы содержания БЭ - 0,035 ЕЭ/мг метронидазола, предусмотренной для субстанции, которая используется для производства лекарственных форм радиосенсибилизирующего применения. Данная норма предъявляет более жесткие требования к качеству субстанции.

В том случае, если в субстанции будет обнаружено содержание БЭ, превышающее значение нормы 0,035 ЕЭ/ мг, но находящееся в пределах нормы

0,35 ЕЭ/мг, такая субстанция пригодна для производства готовой лекарственной формы, однако она не может быть использована для применения в качестве радиосенсибилизирующего средства.

V. Оформление раздела

«Бактериальные эндотоксины»

В разделе указывают норму предельного содержания БЭ, ссылку на ГФ XII, рекомендуют концентрацию исходного раствора субстанции, в случае необходимости указывают величину рабочего разведения, приводят описание процедуры коррекции рН или же другие особенности пробоподготовки субстанции. Если имеются особые указания по использованию субстанции, то они должны быть отражены в примечании к спецификации и в разделе. Например, «Испытание проводят для субстанции, предназначенной для изготовления инъекционных лекарственных форм».

Таблица S. Оформление разделов ФСП «Бактериальные эндотоксины» для субстанции метронидазола

Спецификация Нормы

Показатели Методы

Бактериальные эндотоксины ГФ XII, ч. 1, с. 128 Предельное содержание не более 0,35 ЕЭ на 1 мг субстанции. Не более 0,035 ЕЭ на 1 мг субстанции для приготовления радиосенсибилизирующего препарата

*Бактериальные эндотоксины. Предельное содержание не более 0,35 ЕЭ на 1 мг метронидазола. В случае приготовления препарата для радиосенсибилизации предельное содержание не более 0,035 ЕЭ на 1 мг метронидазола (ОФС 4I-006I-07). Для проведения анализа готовят раствор субстанции с концентрацией 5 мг метронидазола в 1 мл при нагревании до 37 °С.

Примечание. Показатель выполняют для субстанции, используемой для изготовления инъекционных лекарственных форм

Литература

1. Долгова Г.В., Неугодова Н.П., Шаповалова О.В., Са-пожникова Г.А., Аладышева Ж.И. «Определение бактериальных эндотоксинов в фармацевтических субстанциях, используемых для изготовления инфузионных растворов»//Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2006. № 2. С. 67-74.

2. Государственная Фармакопея Российской Федерации XII, часть 1, С. 128 (ОФС 42-0062-07).

3. Методические рекомендации «Правила составления, изложения и оформления стандартов качества на фармацевтические субстанции». Москва. 2009.

4. Государственный реестр лекарственных средств (по состоянию на 1 апреля 2012 г. grls.rosminzdrav.ru).

5. United States Pharmacopoeia, 31-th Ed. (USP 31).

6. European Pharmacopoeia 7-th Ed.

7. British Pharmacopoeia 9-th Ed.

8. Японии фармакопея 15-th Ed

9. Pearson F.C. « Pyrogens», N.Y. 1985.