СПОСОБ ОЦЕНКИ НЕОАДЪЮВАНТНОЙ ХИМИОТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С ГИПЕРЭКСПРЕССИЕЙ HER2/NEU
METHOD FOR EVALUATING NEOADJUVANT CHEMOTHERAPY IN BREAST CANCER PATIENTS WITH HER2/NEU OVEREXPRESSION

Изобретение относится к области медицины, онкологии, конкретно к способам оценки неоадъювантной терапии рака молочной железы с гиперэкспрессией HER2/neu.
Одной из наиболее изученных молекулярных мишеней является рецептор эпидермального роста 2 типа (HER2/neu), экспрессия которого выявляется на поверхности опухолевых клеток при раке легкого, яичников, желудка, простаты и пр. [Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G., et al. Human breast cancer: correlation of relapse a survival with amplification of the Her-2/neu oncogenes. Science. 1987; 235: 177-182]. При этом наиболее часто высокая его экспрессия обнаруживается у больных раком молочной железы (РМЖ), частота встречаемости при котором составляет до 20% и ассоциируется как правило с неблагоприятным прогнозом и агрессивным течением. Главным клиническим значением гиперэкспрессии рецептора HER2/neu является необходимость назначения таргетной терапии с препаратами трастузумаб, пертузумаб, трастузумаб эмтанзин, лапатиниб, применение которой существенно улучшает показатели выживаемости у данной категории пациентов. Как правило, химиотерапия у больных раком молочной железы проводится в неоадъювантном режиме (неоадъювантная химиотерапия - НАХТ).
Основными методами лучевой диагностики рака молочной железы, применяемыми для оценки динамики НАХТ, являются рентгеновская маммография, ультразвуковое исследование и компьютерная томография. Однако информативность указанных методов в известной степени ограничена. Так, например, чувствительность маммографии значительно ограничена у пациентов, имеющих рентгенологически плотную ткань молочной железы, наличие в анамнезе хирургических вмешательств, у носителей мутаций генов BRCA1/2 [Yaghjyan L et al. 2013]. Главным недостатком ультразвукового метода исследования является субъективный фактор, проявляющийся зависимостью от оператора и характристик используемого УЗ-аппарата [Е.А. Eisenhauera et al. 2009, NCCN 2017]. Недостатком компьютерной томографии в оценке динамики НАХТ является субъективный фактор при оценке полученных результатов, а также сложность в визуализации опухолей менее 2 см.
В последние годы все большую популярность получают таргетные радионуклидные методы диагностики злокачественных заболеваний, обладающие высокой специфичностью к различным молекулярным мишеням и позволяющие визуализировать опухолевые очаги различных размеров (как основной опухолевый узел, визуализировать опухолевые очаги различных размеров (как основной опухолевый узел, так и метастатические очаги) [Чернов В.И., Брагина О.Д., Синилкин И.Г. и соавт. Радиоиммунотерапия: современное состояние проблемы // Вопросы онкологии. 2016. Т. 62. №1. С. 24-26]. В настоящее время для этих целей в качестве «нацеливающего» модуля изучается новый класс таргентных молекул, получивший название «альтернативные каркасные белки» или «скаффолды», обладающие оптимальными характеристиками для переноса различных радиоизотопов к целевым мишеням [Plückthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015; 55: 489-511].
Одними из представителей рекомбинантных адресных молекул являются дарпины (DARPin, Design Ankyrin Repeat Protein), которые являются повторами белка анкирина, состоящего из повторяющихся доменов длиной 33 а.о. и обладающего стабильной структурой из β-поворота и двух ά-спиралей. Обычно белки представлены 4-6 модулями с суммарной молекулярной массой от 14 до 21 кДа (молекулярная масса каждого 3,5 кДа) [Hanenberg М., McAfoose J., Kulic L. Amyloid-β peptide-specific DARPins as a novel class of potential therapeutics for Alzheimer disease. J Biol Chem. 2014; 26: 27080-27089]. Основными преимуществами данных молекул являются небольшой размер, стабильная структура, высокая специфичность и аффинность к антигену, а также значительно более низкая стоимость производства, обусловленная их экспрессией в бактериальных средах [Kramer L., Renko М., Završnik J., et.al Non-invasive in vivo imaging of tumour-associated cathepsin В by a highly selective inhibitory DARPin. Theranostics. 2017; 8: 2806-2821].
1/2
99m
Наиболее часто используют способы с применением радионуклидов для проведения диагностических исследований как на территории Российской Федерации, так и в мире, остается короткоживущий (T=6,02 ч) технеций-99м (Tc), препараты которого изготавливаются в виде стандартных наборов реагентов (лиофилизатов) к генератору технеция-99м [Лыков А.В. Сублимационная сушка // В кн.: Теория сушки. - М., Энергия. - 1968. - С.334 - 362].
99m
99m
Наиболее близким к предлагаемому является «Способ оценки динамики неоадъювантной системной терапии рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu» Братиной О.Д. и соавт (Патент на изобретение 2737996 С1, 07.12.2020. Заявка №2020118845 от 08.06.2020.) с использованием молекул DARPin9_29, меченных технецием-99m («Tc-DARPin9_29»). Основным недостатком данной методики является неоптимальные молекулярные характеристики протеина DARPin9_29, что приводит с низкому соотношению опухоль/фон и лимфатический узел/фон, а также характеризуется высоким накоплением в печень «Tc-DARPin9_29». Последний факт имеет особое невозможности оценки их изменений на фоне химио/таргетного лечения у данной категории пациентов.
Новый технический результат - расширение области применения, повышение точности, информативности и доступности способа.
99m
+
99m
4-
3
2
3
Для достижения нового технического результата в способе оценки неоадъювантной терапии рака молочной железы с гиперэкспрессией HER2/neu, включающем внутривенное введение радиофармпрепарата (РФП) и проведение сцинтиграфического исследования, пациенткам внутривенно вводят радиофармацевтический препарат на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3, который готовят непосредственно перед введением, для этого в асептических условиях согласно разработанному авторами лабораторному регламенту: в набор «CRS Isolink» (Center for Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Швейцария) для приготовления трикарбонильного технеция [Tc(СО)(HO)] добавляют 1000 мкл (2-4 ГБк) элюата TcO и инкубируют в течение 30 минут при температуре 100°С, после инкубации 400 мкл трикарбонильного технеция добавляют к 3000 мкг DARPinG3 и инкубируют при температуре 60°С в течение 60 минут, затем выполняют очистку полученного соединения от белковых примесей и несвязавшихся с технецием молекул DARPinG3 с использованием очистительных колонок Sephadex G-25 М (GE Healthcare, Швеция), полученный после очищения препарат с активностью 200-500 МБк, разбавляют в 10 мл стерильного 0,9% раствора NaCl, забирают через стерилизующий фильтр и медленно вводят пациенту в дозе 3000 мкг, через 4 часа после введения пациенту выполняют однофотонную эмиссионную компьютерную томографию органов грудной клетки и верхнего этажа органов брюшной полости на двухдетекторной гамма-камере, исследование выполняют перед началом лечения и затем после проведения 2, 4 и 6 курсов системного лечения, на каждом этапе оценивают накопление препарата в проекции молочных желез, регионарных лимфатических узлов и отдаленных органов и тканей, а также показатели опухоль/фон во всех имеющихся опухолевых очагах и при уменьшении последнего показателя определяют положительную динамику терапии.
99m
+
99m
4-
3
2
3
Способ осуществляют следующим образом, радиофармацевтический препарат готовят непосредственно перед введением в асептических условиях: в набор «CRS Isolink» (Center for Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Швейцария) для приготовления трикарбонильного технеция [Tc(СО)(HO)] добавляют 1000 мкл (2-4 ГБк) элюата TcO и инкубируют в течение 30 минут при температуре 100°С. После инкубации 400 мкл трикарбонильного технеция добавляют к 3000 мкг DARPinG3 и инкубируют при температуре 60°С в течение 60 минут. В дальнейшем выполняется инкубируют при температуре 60°С в течение 60 минут. В дальнейшем выполняется очистка полученного соединения от белковых примесей и несвязавшихся с технецием молекул DARPinG3 с использованием очистительных колонок Sephadex G-25 М (GE Healthcare, Швеция). Радиохимические выход и чистоту определяют с помощью тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ). Анализ хроматограмм проводят с использованием хроматографа Hitachi Chromaster HPLC systems с радиоактивным детектором. Полученный после очищения препарат в дозе 200-500 МБК разбавляют в 10 мл стерильного 0,9% раствора NaCl, забирают через стерилизующий фильтр и медленно вводят пациенту. Через 4 часа после введения пациенту выполняют однофотонную эмиссионную компьютерную томографию органов грудной клетки и верхнего этажа органов брюшной полости на двухдетекторной гамма-камере до начала системного лечения, а также после 2, 4 и 6 курсов неоадъювантной системной терапии. На каждом этапе оценивают накопление препарата в проекции молочных желез, регионарных лимфатических узлов и отдаленных органов и тканей, а также показатели опухоль/фон во всех имеющихся опухолевых очагах. Уменьшение показателя последнего свидетельствует о положительной динамике терапии.
4
0-3
0-1
99m
Способ основан на анализе результатов клинических исследований, для подтверждения эффективности которых в выявлении злокачественных опухолей молочных желез с гиперэкспрессией HER2/neu и оценки динамики неоадъювантного системного лечения было проведено изучение особенностей накопления радиофармацевтического препарата на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3. С этой целью была сформирована группа из 7 больных с верифицированным диагнозом рака молочной железы TNM с гиперэкспрессией HER2/neu. Всем пациентам внутривенно вводили радиофармацевтический препарат «Tc-DARPinG3» в дозировке 3000 мкг (200-500 МБк) до начала лечения, после 2, 4 и 6 курсов неоадъювантного лечения.
Всем пациенткам выполнялись гистологическое и иммуногистохимическое исследование биопсийного материала первичной опухоли с определением статуса HER2/neu по стандартным методикам. При значении HER2/neu 2+ проводился FISH анализ.
99m
+
99m
4-
3
2
3
Радиофармацевтический препарат готовили непосредственно перед введением согласно разработанному авторами лабораторному регламенту: в набор «CRS Isolink» (Center for Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Швейцария) для приготовления трикарбонильного технеция [Tc(СО)(HO)] добавляли 1000 мкл (2-4 ГБк) элюата TcO и инкубировали в течение 30 минут при температуре 100°С. После инкубации 400 мкл трикарбонильного технеция добавляли к 1000, 2000 и 3000 мкг DARPinG3 и инкубировали при температуре 60°С в течение 60 минут [Bragina О., Chernov V., Schulga A., Konovalova Е., Garbukov Е., Vorobyeva A. et al. Phase I trial of 99mTc-(HE)3-G3, a DARPin-based probe for imaging of HER2 expression in breast cancer. Journal of Nuclear Medicine. 2021 - August 12, 2021, jnumed.l21.262542;DOI: https://doi.org/10.2967/jnumed.121.262542]. В дальнейшем выполнялась очистка полученного соединения от белковых примесей и несвязавшихся с технецием молекул DARPinG3 с использованием очистительных колонок Sephadex G-25 М (GE Healthcare, Швеция). Радиохимические выход и чистоту определяли с помощью тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ). Анализ хроматограмм проводили с использованием хроматографа Hitachi Chromaster HPLC systems с радиоактивным детектором. Полученный после очищения препарат в дозе 200-500 МБк разбавляли в 10 мл стерильного 0,9% раствора NaCl, забирали через стерилизующий фильтр и медленно вводили пациенту.
Через 4 часа после введения препарата пациентам выполняли однофотонную эмиссионную компьютерную томографию органов грудной клетки и верхнего этажа органов брюшной полости на двухдетекторной гамма-камере Е.САМ фирмы SIEMENS. Полученные при исследовании изображения (сцинтиграммы) подвергали постпроцессинговой обработке с использованием фирменного пакета программ E.Soft (SIEMENS, Германия). На каждом этапе оценивали накопление препарата в проекции молочных желез, регионарных лимфатических узлов и отдаленных органов и тканей, а также показатели опухоль/фон во всех имеющихся опухолевых очагах. Уменьшение последнего показателя свидетельствовало о положительной динамике терапии.
Клинический пример 1.
Пациентка А., 43 лет: Ds.: Рак правой молочной железы IIA стадия (T2N1M0), метастатическое поражение аксиллярных лимфатических узлов. Гистологическое и иммуногистохимическое исследование: Инвазивная карцинома неспецифического типа 2 степени злокачественности. РЭ+, РП+, HER2/neu 3+.
99m
По данным однофотонной эмиссионной компьютерной томографии органов грудной клетки с препаратом «Tc-DARPinG3» в дозировке 3000 мкг сцинтиграфической картине отчетливо визуализировались опухолевое поражение в правой молочной железе и аксиллярных лимфатических узлах (фиг. 1).
99m
После двух курсов неоадьювантной химио/таргетной терапии по данным повторного исследования с препаратом «Tc-DARPinG3» опухолевые узлы в проекции молочной железы и аксиллярных лимфатических узлов выявлены не были, что было сопоставимо с результатами стандартных диагностических методик (фиг. 2).
Таким образом, предлагаемый способ оценки динамики неоадьювантной химиотерапии рака молочной железы с гиперэкспрессией HER2/neu с применением радиофармацевтического препарата на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3 в дозе 3000 мкг и проведением ОФЭКТ ОГК и верхнего этажа брюшной полости, позволяет отчетливо оценивать динамику химио/таргетного лечения у больных раком молочной железы с гиперэкспрессией HER2/neu, что позволит повысить диагностическую эффективность, информативность и доступность радионуклидной диагностики рака молочных желез с гиперэкспрессией HER2/neu.