КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ В СТАБИЛЬНОМ СОСТОЯНИИ ОДНОЦЕПОЧЕЧНУЮ МОЛЕКУЛУ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, КОТОРАЯ ПОДАВЛЯЕТ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА TGF-β1
COMPOSITION, IN STABLE CONDITION, SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID MOLECULE WHICH SUPPRESSES EXPRESSION OF GENE TGF-Β1

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, ингибирующую экспрессию гена TGF-β1, которая представляет собой новую композицию, в частности, фармацевтическую композицию, отличающуюся повышенной стабильностью молекулы нуклеиновой кислоты.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Легочный фиброз представляет собой заболевание, при котором в строме легкого развивается фиброз, вызванный травмой и коллапсом легочных альвеол. Во многих случаях причина остается неизвестной. Когда причина не установлена, легочный фиброз обычно называют идиопатическим легочным фиброзом (ИЛФ). По мере прогрессирования фиброза легкие затвердевают и способность к кислородному обмену снижается. В настоящее время не существует радикального лечения этого заболевания и лечение по существу является симптоматическим.
Известно, что TGF-β является цитокином, регулирующим пролиферацию и дифференциацию клеток, и, как считают, он также играет важную роль в фиброидном изменении печени или легких. Таким образом, он привлекает внимание в качестве мишени при лечении легочного фиброза.
Применение нуклеиновых кислот в медицине считают технологией нового поколения в области разработки лекарственных средств, поскольку она отличается легкостью производства низкомолекулярных фармацевтических препаратов, а также эффективностью и безопасностью, характерными для использования лекарственных средств на основе антител. Однако прогресс в разработке фармацевтических препаратов достигается не так быстро, как ожидалось, из-за препятствий, которые создает нестабильность молекул нуклеиновой кислоты в организме, побочных эффектов вследствие стимуляции врожденного иммунного ответа, отсутствия разработанных эффективных систем доставки лекарств (СДЛ) и тому подобного.
В случае респираторных заболеваний, легочный фиброз является обоснованно выбранным заболеванием для применения терапии нуклеиновыми кислотами из-за возможности топического введения лекарственных средств в легкие. Для решения проблем с молекулами нуклеиновой кислоты, таких как стабильность в организме и индукция врожденного иммунного ответа, были разработаны одноцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты, на концах которых двухцепочечные нуклеиновые кислоты киРНК или микроРНК связаны при помощи различных линкеров (например, патентные документы 1-5). Hamasaki с соавторами сообщали о значительном ослаблении симптомов при интратрахеальном введении одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей следующую структуру с содержанием ингибирующей экспрессию TGF-β1 последовательности (далее в тексте настоящего документа называемой «PK-0051»), мышам в животной модели легочного фиброза и острого повреждения легких (не патентный документ 1).
UAUGCUGUGUGUACUCUGC
5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUUC-P-G-3' (SEQ ID NO: 1)
(Подчеркиванием выделена ингибирующая экспрессию TGF-β1 последовательность. P означает линкер, являющийся производным пролина, который имеет следующую формулу (I)).
Список документов
Патентные документы
патентный документ 1: WO 2012/017919
патентный документ 2: WO 2013/103146
патентный документ 3: WO 2012/005368
патентный документ 4: WO 2012/077446
патентный документ 5: WO 2013/133393
Не патентный документ
не патентный документ 1: PLoS One, 2012, 7(8): e42655.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Проблемы, решаемые с помощью изобретения
Как правило, поскольку нуклеиновые кислоты подвержены распаду в растворах и являются нестабильными, с ними очень сложно проводить манипуляции при температуре окружающей среды. Вследствие этого, принято хранить их в лиофилизированном состоянии, либо добавлять 50% этанол в буфер Tris-ЭДТА (TE) и хранить при температуре -20°C без замораживания. Учитывая данные обстоятельства, существует потребность в разработке стабильного, легкого в обращении препарата нуклеиновой кислоты, способного обеспечивать стабильность присутствующей нуклеиновой кислоты в качестве активного ингредиента при температуре окружающей среды.
Таким образом, целью настоящего изобретения является предложение композиции, в частности, фармацевтической композиции, содержащей в стабильном состоянии одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты (PK-0051), достоверно имеющую лечебный эффект при легочном фиброзе или остром повреждении легких, в виде раствора при температуре окружающей среды, а также способа ее получения.
Средства для решения проблем
Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования в попытке решить вышеупомянутые проблемы и неожиданно обнаружили, что молекула PK-0051 может стабильно храниться в течение долгого срока, если растворять PK-0051 в буфере и контролировать, чтобы значение pH раствора PK-0051 находилось в пределах конкретного диапазона, в результате чего было создано настоящее изобретение.
Таким образом, настоящее изобретение включает следующее.
[1] Композиция, содержащая одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, состоящую из нуклеотидной последовательности 5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3' (SEQ ID NO: 1)
(в последовательности P означает линкер, являющийся производным пролина, который имеет следующую формулу (I))
,
и буфер, которая имеет следующие характерные признаки:
(a) находится в форме раствора при температуре окружающей среды; и
(b) содержание молекулы нуклеиновой кислоты после хранения при 25°C, относительной влажности 60% в течение 4 недель составляет не менее 80% относительно содержания в момент начала хранения.
[2] Композиция по п. [1], отличающаяся тем, что содержание молекулы нуклеиновой кислоты после хранения при 40°C, относительной влажности 75% в течение 4 недель составляет не менее 80% относительно содержания в момент начала хранения.
[3] Композиция по п. [1] или [2], отличающаяся тем, что содержание молекулы нуклеиновой кислоты после хранения при 60°C в течение 4 недель составляет не менее 60% относительно содержания в момент начала хранения.
[4] Композиция по п. [1], отличающаяся тем, что содержание молекулы нуклеиновой кислоты, подвергнутой общей световой экспозиции 1,2 миллиона люкс⋅час, составляет не менее 80% относительно содержания в момент начала хранения.
[5] Композиция по любому из пунктов [1] - [4], отличающаяся тем, что буфер поддерживает pH композиции на уровне не менее 4,0 и не более 9,0.
[6] Композиция по любому из пунктов [1] - [4], отличающаяся тем, что буфер поддерживает pH композиции на уровне не менее 4,4 и не более 7,4.
[7] Композиция по любому из пунктов [1] - [4], отличающаяся тем, что буфер поддерживает pH композиции на уровне не менее 4,6 и не более 7,0.
[8] Композиция по любому из пунктов [1] - [4], отличающаяся тем, что буфер поддерживает pH композиции на уровне не менее 5,5 и не более 6,5.
[9] Композиция по любому из пунктов [1] - [8], отличающаяся тем, что буфер содержит одно или более буферных средств, выбранных из гидрофосфата натрия, дигидрофосфата натрия, гидрофосфата динатрия, хлорида натрия, гидрохлорида аргинина, цитрата натрия, цитрата тринатрия дигидрата, L-глутамата мононатрия, ацетата натрия, карбоната натрия, гидрокарбоната натрия, лактата натрия, фосфата монокалия, гидроксида натрия, меглумина, глицина, лимонной кислоты и уксусной кислоты.
[10] Композиция по любому из пунктов [1] - [9], отличающаяся тем, что буфер содержит лимонную кислоту и/или фосфорную кислоту.
[11] Композиция по любому из пунктов [1] - [10], дополнительно содержащая изотоническое средство.
[12] Композиция по п. [11], отличающаяся тем, что изотоническое средство представляет собой одно или более средств, выбранных из D-сорбита, хлорида натрия, глицерина, D-маннита, хлорида калия, лактита и сахарозы.
[13] Композиция по любому из пунктов [1] - [12], предназначенная для профилактики или лечения легочного фиброза или острого повреждения легких.
[14] Способ получения композиции по любому из пунктов [1] - [13], включающий растворение вышеуказанной молекулы нуклеиновой кислоты в буфере, поддерживающем pH композиции на уровне не менее 4,6 и не более 7,0, и хранение раствора при температуре окружающей среды.
[15] Способ получения композиции по любому из пунктов [1] - [13], включающий растворение вышеуказанной молекулы нуклеиновой кислоты в буфере, поддерживающем pH композиции на уровне не менее 5,5 и не более 6,5, и хранение раствора при температуре окружающей среды.
[16] Способ по п. [14] или [15], отличающийся тем, что буфер содержит лимонную кислоту и/или фосфорную кислоту.
[17] Способ по любому из пунктов [14] - [16], отличающийся тем, что композиция предназначена для профилактики или лечения легочного фиброза или острого повреждения легких.
[18] Способ стабилизации молекулы нуклеиновой кислоты в композиции, включающий растворение молекулы нуклеиновой кислоты в буфере, поддерживающем pH композиции на уровне не менее 4,6 и не более 7,0, и хранение раствора при температуре окружающей среды.
[19] Способ стабилизации молекулы нуклеиновой кислоты в композиции, включающий растворение молекулы нуклеиновой кислоты в буфере, поддерживающем pH композиции на уровне не менее 5,5 и не более 6,5, и хранение раствора при температуре окружающей среды.
[20] Способ по п. [18] или [19], отличающийся тем, что буфер содержит лимонную кислоту и/или фосфорную кислоту.
[21] Способ по любому из пунктов [18] - [20], отличающийся тем, что раствор представляет собой композицию для профилактики или лечения легочного фиброза или острого повреждения легких.
ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с настоящим изобретением может быть предложена новая и легкая в обращении фармацевтическая композиция, отличающаяся повышенной стабильностью одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты в качестве активного ингредиента и не требующая повторного растворения при использовании.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фиг. 1 приведены результаты теста на стабильность при 25°C раствора PK-0051, полученного с использованием буфера при каждом значении pH.
На Фиг. 2 приведены результаты теста на стабильность при 40°C раствора PK-0051, полученного с использованием буфера при каждом значении pH.
На Фиг. 3 приведены результаты теста на стабильность при 60°C раствора PK-0051, полученного с использованием буфера при каждом значении pH.
На Фиг. 4 приведены результаты теста на стабильность при 60°C раствора PK-0051, полученного с использованием 0,05 M цитратного буфера (pH 4,0-7,5).
На Фиг. 5 приведены результаты теста на стабильность при 60°C раствора PK-0051, полученного с использованием 0,1 M цитратного буфера (pH 4,0-7,8).
На Фиг. 6 приведены результаты теста на стабильность при 60°C раствора PK-0051, полученного с использованием 0,05 M фосфатного буфера (pH 4,0-7,9).
На Фиг. 7 приведены результаты теста на стабильность при 60°C раствора PK-0051, полученного с использованием смеси 0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 4,0-7,8).
На Фиг. 8 приведены результаты теста на стабильность при 60°C раствора PK-0051, полученного с использованием смеси 0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 4,0-7,8).
На Фиг. 9 приведены результаты теста на стабильность при 60°C раствора PK-0051, полученного с использованием смеси 0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 4,0-7,8).
На Фиг. 10 приведены результаты теста на стабильность при 40°C раствора PK-0051, полученного с использованием цитратного буфера в каждой концентрации.
На Фиг. 11 приведены результаты теста на стабильность при 60°C раствора PK-0051, полученного с использованием цитратного буфера в каждой концентрации.
На Фиг. 12 приведены результаты теста на стабильность раствора PK-0051 с концентрацией 1 мг/мл (pH 6,5).
На Фиг. 13 приведены результаты теста на стабильность раствора PK-0051 с концентрацией 10 мг/мл (pH 6,5).
На Фиг. 14 приведены результаты теста на стабильность раствора PK-0051 с концентрацией 1 мг/мл (pH 6,0).
На Фиг. 15 показано относительное количество чTGF-β1 в легочной ткани в каждой из групп введения PK-0051.
На Фиг. 16 показано количество гидроксипролина в легочной ткани в каждой из групп введения PK-0051.
На Фиг. 17 приведены результаты теста на стабильность при 60°C раствора PK-0051 с концентрацией 10, 20, 40 и 80 мг/мл (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)).
На Фиг. 18 приведены результаты теста на фотостабильность раствора PK-0051 с концентрацией 1 мг/мл (0,05 M цитратный буфер (pH 5,5)). Для измерений использовали метод ионообменной ВЭЖХ.
На Фиг. 19 приведены результаты теста на фотостабильность раствора PK-0051 с концентрацией 1 мг/мл (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)). Для измерений использовали метод ионообменной ВЭЖХ.
На Фиг. 20 приведены результаты теста на фотостабильность раствора PK-0051 с концентрацией 1 мг/мл (0,05 M цитратный буфер (pH 6,5)). Для измерений использовали метод ионообменной ВЭЖХ.
На Фиг. 21 приведены результаты теста на фотостабильность раствора PK-0051 с концентрацией 1 мг/мл (0,05 M цитратный буфер (pH 5,5)). Для измерений использовали метод обращенно-фазовой ВЭЖХ.
На Фиг. 22 приведены результаты теста на фотостабильность раствора PK-0051 с концентрацией 1 мг/мл (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)). Для измерений использовали метод обращенно-фазовой ВЭЖХ.
На Фиг. 23 приведены результаты теста на фотостабильность раствора PK-0051 с концентрацией 1 мг/мл (0,05 M цитратный буфер (pH 6,5)). Для измерений использовали метод обращенно-фазовой ВЭЖХ.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к содержащей молекулу нуклеиновой кислоты композиции, в которой может стабильно сохраняться одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты PK-0051, содержащая нуклеотидную последовательность, ингибирующую экспрессию гена TGF-β1, в форме раствора при температуре окружающей среды (далее в настоящем документе также называемой «композиция по настоящему изобретению»). Используемый в настоящем документе термин «температура окружающей среды» означает диапазон температур 15-30°C, и термин «стабильное сохранение» означает, что не менее 80% молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в момент начала хранения (после изготовления композиции), сохраняется без распада в течение (1) не менее 4 недель, предпочтительно (2) не менее 24 недель (примерно 6 месяцев), более предпочтительно (3) не менее 200 недель (примерно 3,7 лет). Такую стабильность при хранении в каждом случае можно подтверждать или предсказывать на основании результатов следующего теста на стабильность.
(1) Содержание молекулы нуклеиновой кислоты в композиции после хранения при 25°C, относительной влажности 60% в течение 4 недель составляет не менее 80% относительно содержания в момент начала хранения.
(2) Содержание молекулы нуклеиновой кислоты в композиции после хранения при 40°C, относительной влажности 75% в течение 4 недель составляет не менее 80% относительно содержания в момент начала хранения.
(3) Содержание молекулы нуклеиновой кислоты в композиции после хранения при 60°C в течение 4 недель составляет не менее 60%, предпочтительно не менее 70%, более предпочтительно не менее 80% относительно содержания в момент начала хранения. Альтернативно, содержание молекулы нуклеиновой кислоты в композиции после выдерживания при 105°C в течение 15 мин или при 121°C в течение 15 мин составляет не менее 60%, предпочтительно не менее 70%, более предпочтительно не менее 80% относительно содержания в момент начала хранения.
Композиция по настоящему изобретению может стабильно сохраняться в условиях высокой температуры. Кроме того, она может стабильно сохраняться даже при замораживании-размораживании.
Кроме того, термин «стабильно сохраняемая», предпочтительно, включает понятие «стабильно сохраняемая на свету». Термин «стабильно сохраняемая на свету» означает, что не менее 80% молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в момент начала хранения (после изготовления композиции), сохраняется без распада даже в условиях общей световой экспозиции 1,2 миллиона люкс⋅час. Такую стабильность при хранении можно подтверждать или предсказывать на основании того факта, что содержание молекулы нуклеиновой кислоты в композиции после хранения под флуоресцентной лампой дневного света (освещенность 1580 люкс) с лампой D65 в качестве источника света в течение 4 недель составляет не менее 80% относительно содержания в момент начала хранения.
В настоящем документе содержание молекулы нуклеиновой кислоты в композиции определяют с использованием раствора (100%), полученного путем растворения молекулы нуклеиновой кислоты в том же количестве, что и в тестируемом образце, в воде для инъекций, и растворов, полученных путем смешивания указанного раствора и воды для инъекций в соотношениях 9:1, 8:2, 7:3 и 6:4 (90%, 80%, 70% и 60%, соответственно), в качестве образцов для построения калибровочной кривой, нанося 10 мкл каждого из образцов для построения калибровочной кривой на колонку для ВЭЖХ для измерения площади пиков, строя график на основании измеренных значений соответствующих образцов для построения калибровочной кривой, с теоретическими значениями содержания (%) на горизонтальной оси (X) и значениями площади пика на вертикальной оси (Y), получая линию регрессии (Y=aX+b) (калибровочную кривую) методом наименьших квадратов и сопоставляя значение площади пика для тестируемого образца, измеренное методом ВЭЖХ в тех же условиях, с калибровочной кривой для определения теоретического содержания (%). Условия для измерений вышеуказанным методом ВЭЖХ являются следующими.
Обращенно-фазовая ВЭЖХ
Измерительный прибор: система для ВЭЖХ LC-10A SHIMAZU (ОФ-ВЭЖХ) производства Shimadzu Corporation
Детектор: спектрофотометр для измерения поглощения в ультрафиолетовой области (измерение при длине волны: 254 нм) (производства Shimadzu Corporation)
Колонка: X-Bridge OST C18 (2,5 мкм, 4,6×50 мм) (производства Japan Waters)
Температура колонки: 40°C
Подвижная фаза A: 50 мМ ТЭАА (pH 7,0), 0,5% ацетонитрила
Подвижная фаза B: 100% ацетонитрила
Подача подвижной фазы: соотношение при смешивании подвижной фазы A и подвижной фазы B изменяли следующим образом для контроля градиента концентрации.
Таблица 1
Время (мин) после впрыска
Подвижная фаза A (об%)
Подвижная фаза B (об%)
0→12
100→60
0→40
поток: 1,0 мл/мин
Ионообменная ВЭЖХ
Измерительный прибор: система для ВЭЖХ LC-20A SHIMAZU (АО-ВЭЖХ) производства Shimadzu Corporation
Детектор: спектрофотометр для измерения поглощения в ультрафиолетовой области (измерение при длине волны: 260 нм)
Колонка: DNAPac PA-100 (4×250 мм)
Температура колонки: 80°C
Подвижная фаза A: 25 мМ трис-HCl (pH 8,0), 8 M мочевина, 10% ацетонитрила
Подвижная фаза B: подвижная фаза A, 700 мМ перхлорат натрия моногидрат
Подача подвижной фазы: соотношение при смешивании подвижной фазы A и подвижной фазы B изменяли следующим образом для контроля градиента концентрации.
Таблица 2
Время (мин) после впрыска
Подвижная фаза A (об%)
Подвижная фаза B (об%)
0→20
90→60
10→40
поток: 1,0 мл/мин
1. Молекула нуклеиновой кислоты
Молекула нуклеиновой кислоты, содержащаяся в композиции по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, имеет следующую нуклеотидную последовательность.
UAUGCUGUGUGUACUCUGC
5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUUC-P-G-3' (SEQ ID NO: 1)
(в последовательности P означает линкер, являющийся производным пролина, который имеет следующую формулу (I)).
В вышеприведенной нуклеотидной последовательности подчеркнутая последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность, комплементарную мРНК TGF-β1 человека, и является последовательностью, ингибирующей экспрессию TGF-β1, которая связывается с мРНК, оказывая действие РНК-интерференции.
Молекула нуклеиновой кислоты, содержащаяся в композиции по настоящему изобретению, может быть получена методом, известным как таковой. Например, она может быть получена методом, описанным в WO 2013/133393, PLoS One, 2012, 7(8): e42655.
Хотя содержание молекулы нуклеиновой кислоты в композиции по настоящему изобретению не имеет конкретных ограничений, в случае, когда композиция представляет собой фармацевтическую композицию, оно, как правило, составляет 0,0001-60 масс%, предпочтительно 0,001-15 масс%, более предпочтительно 0,01-1 масс%, в расчете на массу всей фармацевтической композиции.
2. Буфер
Композиция по настоящему изобретению содержит буфер. В настоящем изобретении буфер представляет собой раствор (в частности, водный раствор), оказывающий буферное действие и имеющий в составе буферное средство. В настоящем изобретении буферное средство представляет собой стабилизатор pH водного раствора, и можно выбирать средство, которое обычно используют в области производства лекарственных средств.
В настоящем изобретении распад молекулы нуклеиновой кислоты в композиции может быть предотвращен с помощью буфера.
В качестве буфера, используемого по настоящему изобретению, может быть упомянут буфер, который поддерживает pH композиции на уровне не менее 4,0 и не более 9,0. Буфер, который поддерживает pH композиции на уровне не менее 4,4 и не более 7,4, является предпочтительным, буфер, который поддерживает pH композиции на уровне не менее 4,6 и не более 7,0, является более предпочтительным и буфер, который поддерживает pH композиции на уровне не менее 5,5 и не более 6,5, является еще более предпочтительным.
В качестве буферного средства, используемого по настоящему изобретению, в частности, можно упомянуть одно или более буферных средств, выбранных из аскорбиновой кислоты, L-аспартата магния, сульфита натрия, L-аргинина, гидрохлорида L-аргинина, бензойной кислоты, бензоата натрия, эпсилон-аминокапроновой кислоты, хлорида аммония, хлорида калия, хлорида натрия, хлорида глюкозамина, гидрохлорида триэтаноламина, разбавленной соляной кислоты, лимонной кислоты, безводной лимонной кислоты, безводного цитрата натрия, гидрата лимонной кислоты, цитрата натрия гидрата, цитрата натрия дигидрата, цитрата натрия, цитрата динатрия, цитрата тринатрия, цитрата тринатрия дигидрата, цитрата калия, глицилглицина, глицина, глюконо-σ-лактона, глюконовой кислоты, глюконата кальция гидрата, L-глутаминовой кислоты, L-глутамата мононатрия, креатинина, хлорбутанола, гидрофосфата динатрия, дигидрофосфата натрия, янтарной кислоты, сукцината динатрия гексагидрата, уксусной кислоты, ацетата аммония, ацетата калия, ацетата натрия гидрата, диизопропаноламина, диэтаноламина, виннокаменной кислоты, L-тартрата натрия, гидроксида калия, гидроксида натрия, таурина, карбоната натрия, карбоната натрия гидрата, гидрокарбоната натрия, триизопропаноламина, триэтаноламина, трометамола, диоксида углерода, молочной кислоты, лактата кальция гидрата, раствора лактата натрия, L-гистидина, 4-(2-гидроксиэтила), ледяной уксусной кислоты, глюкозы, фумарата мононатрия, пропионата натрия, хлорида бензалкония, растворителя из смешанных ароматических углеводородов, бората аммония, малеиновой кислоты, безводного ацетата натрия, безводного карбоната натрия, гидрофосфата динатрия ангидрата, фосфата тринатрия ангидрата, дигидрофосфата натрия ангидрата, метафосфата натрия, метансульфоновой кислоты, серной кислоты, сульфата алюминия-калия гидрата, фосфорной кислоты, моногидрофосфата натрия гептагидрата, фосфата тринатрия, двухосновного фосфата натрия гидрата, гидрофосфата динатрия гидрата, дигидрофосфата натрия гидрата, дигидрофосфата калия, дигидрофосфата натрия, дигидрофосфата натрия моногидрата. Из них, в качестве буферного средства предпочтительно использовать буфер, содержащий лимонную кислоту или ее соль, или ее гидрат, либо фосфорную кислоту или ее соль, или ее гидрат.
Таким образом, в качестве буфера, используемого для композиции по настоящему изобретению, предпочтительно использовать буфер, содержащий лимонную кислоту и/или фосфорную кислоту.
В настоящем изобретении буфер предпочтительно содержит кислоту, указанную среди перечисленных выше буферных средств, и ее соль, либо соли кислот двух или более видов, указанных среди перечисленных выше буферных средств. Более предпочтительно использовать буфер, содержащий лимонную кислоту и ее соль (например, лимонную кислоту и цитрат натрия, лимонную кислоту и цитрат тринатрия, и тому подобное), буфер, содержащий фосфорную кислоту и ее соль (например, фосфорную кислоту и дигидрофосфат натрия, и тому подобное), а также буфер, содержащий фосфаты двух видов (например, гидрофосфат динатрия и дигидрофосфат натрия). Особенно предпочтительными являются/является буфер, содержащий лимонную кислоту и ее соль, и/или буфер, содержащий фосфаты двух видов.
Количество буфера, используемого для композиции по настоящему изобретению, может быть любым при условии, что он способен поддерживать желательный диапазон pH. Например, количество можно соответствующим образом определять, чтобы содержание буферного средства в композиции попадало в следующий диапазон. То есть, содержание буферного средства в композиции по настоящему изобретению как правило, составляет 0,0001-40 масс%, предпочтительно 0,0005-20 масс%, более предпочтительно 0,001-10 масс%, в расчете на массу всей композиции.
3. Другие добавки
Композиция по настоящему изобретению также может содержать растворитель. Примеры растворителя включают фармацевтически приемлемые органические растворители (например, этанол, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, глицерин и так далее), воду, воду для инъекций, физиологический солевой раствор, раствор глюкозы и тому подобное. Растворители одного или более видов можно использовать в сочетании.
В настоящем изобретении молекулу нуклеиновой кислоты предпочтительно растворяют заранее в растворителе и смешивают с буфером, поскольку молекула нуклеиновой кислоты может быть растворена за короткое время. В качестве растворителя предпочтительно использовать воду. В настоящей спецификации, если не указано иначе, выражение «молекулу нуклеиновой кислоты растворяют в буфере» означает не только то, что молекулу нуклеиновой кислоты в сухом виде непосредственно растворяют в буфере, но также и то, что, как упомянуто выше, молекулу нуклеиновой кислоты сначала растворяют в растворителе, таком как вода и тому подобное, и полученный раствор смешивают с буфером.
В настоящем изобретении содержание растворителя, как правило, составляет не менее 0,0001 масс% и не более 100 масс%, предпочтительно не менее 0,001 масс% и не более 100 масс%, более предпочтительно не менее 0,005 масс% и не более 100 масс%, в виде общего количества в расчете на массу всей композиции.
Композиция по настоящему изобретению, необязательно, дополнительно содержит изотоническое средство. Примеры изотонического средства включают глюкозу, D-сорбит, хлорид натрия, глицерин, D-маннит, хлорид калия, лактит, сахарозу, глюкозу и тому подобное. Предпочтительными изотоническими средствами являются D-сорбит, хлорид натрия, глицерин, D-маннит, хлорид калия, лактит и сахароза, и более предпочтительными являются хлорид натрия, хлорид калия и сахароза. Изотонические средства одного или более видов можно использовать в сочетании.
Если используют изотоническое средство, коэффициент осмотического давления композиции по настоящему изобретению (отношение осмолярности композиции по настоящему изобретению к осмолярности, создаваемой физиологическим солевым раствором) предпочтительно составляет 0,6-1,4, более предпочтительно 0,8-1,2, еще более предпочтительно 1,0.
Если композиция по настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, композицию можно формулировать, например, в виде ингаляционной жидкости, инъекции, жидкости и тому подобного, известным методом и вводить парентеральным путем введения (например, трансназальным введением, внутривенным введением, инстилляцией, внутримышечным введением, подкожным введением и так далее). Кроме того, ее можно вводить перорально в соответствующей лекарственной форме (например, капсуле и так далее). Предпочтительным способом введения является ингаляция капельных частиц с использованием небулайзера.
Если фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой инъекцию, ее также можно получать в виде препарата липосом, инкапсулирующих молекулу нуклеиновой кислоты, путем растворения молекулы нуклеиновой кислоты в буфере и создания контакта полученного раствора с молекулами - компонентами липидной мембраны. Препарат липосом можно, предпочтительно, использовать в качестве инъекции для системного введения, например, внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции и тому подобного.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемую добавку, когда это необходимо, в дополнение к вышеуказанным компонентам. Если фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой инъекцию, примеры добавки включают изотоническое средство (например, глюкозу, D-сорбит, хлорид натрия, глицерин, D-маннит, хлорид калия, лактит, сахарозу, глюкозу и так далее), смягчающее средство (например, бензиловый спирт и так далее), консервант (например, метилбензоат, параоксибензоаты, хлорбутанол, бензиловый спирт и так далее) и тому подобное. Предпочтительными добавками являются метилбензоат, D-сорбит, хлорид натрия, глицерин, D-маннит, хлорид калия, лактит и сахароза. Более предпочтительными добавками являются хлорид натрия, хлорид калия и сахароза.
Если фармацевтическая композиция по настоящему изобретению сформулирована в виде ингаляционного средства, например, раствор, полученный путем растворения молекулы нуклеиновой кислоты в растворителе, таком как вода и тому подобное, смешивают с водным раствором, в который добавлено буферное средство (например, лимонная кислота и ее соль, фосфорная кислота и ее соль), смесь фильтруют для удаления бактерий и полученный раствор лекарственного средства помещают в герметично закрытый контейнер, такой как флакон, ампула и тому подобное, для получения ингаляционного средства. Например, молекулу нуклеиновой кислоты смешивают с водным раствором, содержащим воду и буферное средство (например, лимонную кислоту и ее соль, фосфорную кислоту и ее соль), растворяют с помощью обработки ультразвуком и тому подобного, фильтруют для удаления бактерий, и полученный раствор лекарственного средства помещают в герметично закрытый контейнер, такой как флакон, ампула и тому подобное, для получения ингаляционного средства. Хотя используемый герметично закрытый контейнер, как правило, представляет собой контейнер из прозрачного боросиликатного стекла, также можно использовать контейнер, в котором контактирующая с жидкостью часть внутренней поверхности стекла обладает свойством кварцевой поверхности.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению полезна для лечения или профилактики заболеваний, отличающихся аномальным усилением экспрессии TGF-β1, в частности, легочного фиброза и острого повреждения легких, поскольку она содержит в качестве активного ингредиента молекулу нуклеиновой кислоты, способную ингибировать экспрессию TGF-β1. В настоящем изобретении термин «лечение» означает ослабление заболевания и улучшение прогноза, а термин «профилактика» означает предотвращение начала и отсрочку начала заболевания.
Доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению также варьируется в зависимости от приемлемости лекарственного средства для субъекта, пути введения, степени тяжести заболевания и тому подобного. Например, если ее вводят в качестве лекарственного средства от легочного фиброза в виде ингаляционной жидкости взрослому человеку, доза молекулы нуклеиновой кислоты в качестве активного ингредиента составляет от примерно 0,001 до примерно 20 мг/кг массы тела, предпочтительно от примерно 0,005 до примерно 5 мг/кг массы тела, более предпочтительно от примерно 0,01 до примерно 1 мг/кг массы тела, при этом ее можно вводить одной или несколькими порциями в сутки.
Настоящее изобретение также относится к способу стабилизации молекулы нуклеиновой кислоты в композиции, который включает добавление буфера к молекуле нуклеиновой кислоты, или способу получения стабильной композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты. В качестве буфера, используемого в данном способе, можно упомянуть те, которые аналогичны вышеуказанным примерам буферов для композиции по настоящему изобретению, и аналогичный буфер является предпочтительным.
Количество добавляемого буфера в способе стабилизации/получения по настоящему изобретению может быть любым при условии, что pH может поддерживаться в нужном диапазоне. Например, количество буферного средства можно соответствующим образом определять, чтобы оно попадало в следующий диапазон. То есть, добавляемое количество буферного средства в способе стабилизации/получения по настоящему изобретению, как правило, составляет 0,0001-40 масс%, предпочтительно 0,0005-20 масс%, более предпочтительно 0,001-10 масс%, в расчете на массу всей композиции, получаемой данным способом.
Далее настоящее изобретение объяснено более подробно с помощью примеров, которые не следует истолковывать, как ограничивающие.
ПРИМЕРЫ
Пример получения 1 (синтез одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты)
Одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты PK-0051, содержащую последовательность, ингибирующую экспрессию TGF-β1, синтезировали на синтезаторе нуклеиновых кислот (торговое название: ABI Expedite (зарегистрированная торговая марка) 8909 Nucleic Acid Synthesis System, Applied Biosystems) фосфорамидитным методом. Для вышеуказанного синтеза фосфорамидиты РНК (2'-O-TBDMSi, торговое название, Samchully Pharm. Co., Ltd.) использовали в качестве РНК амидитов (далее в настоящем документе так же). У вышеуказанного амидита снимали защиту общепринятым методом. Синтезированную РНК очищали методом ВЭЖХ. Каждую РНК после очистки лиофилизировали.
В качестве области линкера использовали L-пролиндиамидамидит. Подчеркиванием выделена последовательность, ингибирующая экспрессию гена TGF-β1 человека.
UAUGCUGUGUGUACUCUGC
5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUUC-P-G-3' (SEQ ID NO: 1)
(P означает линкер, являющийся производным пролина, который имеет следующую формулу (I)).
Пример 1 (Оценка влияния pH на стабильность при разной температуре хранения)
Оценивали термальную стабильность PK-0051-содержащей композиции прототипа ингаляционного препарата нуклеиновой кислоты.
1. Получение тестируемой композиции
Тестируемую композицию 1 готовили следующим образом.
97,0 мл 0,04 M соляной кислоты, 50 мл 0,04 M хлорида калия и 53 мл воды для инъекций смешивали, получая 0,04 M буфер соляная кислота-хлорид калия (pH 1,0). Используя буфер, готовили раствор PK-0051 с концентрацией 0,1 мг/мл.
Тестируемую композицию 2 готовили следующим образом.
10 мл 0,04 M фосфорной кислоты, 10 мл 0,04 M борной кислоты и 10 мл 0,04 M уксусной кислоты смешивали, и значение pH смеси доводили до 2,0 2Н NaOH, получая 0,04 M буфер Бриттона-Робинсона. Используя буфер, готовили раствор PK-0051 с концентрацией 0,1 мг/мл.
Тестируемые композиции 3-12 готовили способом, аналогичным способу приготовления тестируемой композиции 2, за исключением того, что значение pH доводили до каждого нужного значения pH с помощью 2Н NaOH.
тестируемая композиция 1: PK-0051 (0,04 M буфер соляная кислота-хлорид калия (pH 1,5)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 2: PK-0051 (0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 2,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 3: PK-0051 (0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 3,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 4: PK-0051 (0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 4,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 5: PK-0051 (0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 5,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 6: PK-0051 (0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 6,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 7: PK-0051 (0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 7,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 8: PK-0051 (0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 8,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 9: PK-0051 (0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 9,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 10: PK-0051 (0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 10,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 11: PK-0051 (0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 11,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 12: PK-0051 (0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 12,0)), (0,1 мг/мл).
2. Метод оценки
Тестируемые композиции 1-12, соответственно, разливали в четыре 5-мл стеклянных флакона, в каждый по 1 мл композиции, и по одному флакону с соответствующими композициями хранили в камерах для теста на стабильность (производства ESPEC CORP.) при 4°C, 25°C/60%RH, 40°C/75%RH и 60°C. Из каждой из тестируемых композиций отбирали по 50 мкл и проводили измерения методом ВЭЖХ каждую неделю в течение 4 недель. Рассчитывали содержание PK-0051 и оценивали стабильность на основании уменьшения содержания (%) относительно содержания в момент начала хранения. Метод расчета содержания и метод измерения описаны ниже.
Содержание PK-0051 в тестируемой композиции определяли с использованием раствора (100%), полученного путем растворения PK-0051 в том же количестве, что и в тестируемой композиции, в воде для инъекций, и растворов, полученных путем смешивания указанного раствора и воды для инъекций в соотношениях 9:1, 8:2, 7:3 и 6:4 (90%, 80%, 70% и 60%, соответственно), в качестве образцов для построения калибровочной кривой, нанося 10 мкл каждого из образцов для построения калибровочной кривой на колонку для ВЭЖХ для измерения площади пиков, строя график на основании измеренных значений соответствующих образцов для построения калибровочной кривой, с теоретическими значениями содержания (%) на горизонтальной оси (X) и значениями площади пика на вертикальной оси (Y), получая линию регрессии (Y=aX+b) (калибровочную кривую) методом наименьших квадратов и сопоставляя значение площади пика для тестируемой композиции, измеренное методом ВЭЖХ в тех же условиях, с калибровочной кривой для определения теоретического содержания (%).
Метод измерения
Измерения образцов для построения калибровочной кривой (60% - 100%) и тестируемых композиций проводили в следующих условиях:
Детектор: спектрофотометр для измерения поглощения в ультрафиолетовой области (измерение при длине волны: 254 нм)
Колонка: X-Bridge OST C18 (2,5 мкм, 4,6×50 мм)
Температура колонки: 40°C
Подвижная фаза A: 50 мМ ТЭАА (pH 7,0), 0,5% ацетонитрила
Подвижная фаза B: 100% ацетонитрила
Подача подвижной фазы: соотношение при смешивании подвижной фазы A и подвижной фазы B изменяли следующим образом для контроля градиента концентрации (Таблица 3).
Таблица 3
Время (мин) после впрыска
Подвижная фаза A (об%)
Подвижная фаза B (об%)
0→12
100→60
0→40
поток: 1,0 мл/мин
3. Результаты
Результаты представлены на Фиг. 1 - Фиг. 3. Заметное уменьшение содержания отсутствовало в диапазоне pH 5-7 в самых жестких условиях хранения в течение 4 недель при 60°C.
Как правило, нуклеиновая кислота легко подвержена влиянию температуры, и считается, что ее хранение при температуре окружающей среды или выше в течение долгого времени невозможно. Результаты показали, что одноцепочечную нуклеиновую кислоту можно хранить в течение долгого срока даже при температуре окружающей среды или выше, контролируя значение pH раствора.
Пример 2 (Оценка стабильности при разных значениях pH в случае использования цитратного буфера и/или фосфатного буфера)
Оценивали различные буферы PK-0051-содержащих композиций прототипа ингаляционного препарата нуклеиновой кислоты и стабильность при каждом значении pH.
1. Тестируемая композиция
Тестируемые композиции 13-48 готовили следующим образом.
0,1 M водный раствор цитрата натрия и 0,1 M водный раствор лимонной кислоты смешивали, получая 0,1 M цитратный буфер, имеющий значение pH, которое в каждом случае доводили до pH 4,0-7,5. Раствор PK-0051 с концентрацией 2,35 мг/мл (2,13 мл), приготовленный с водой для инъекций, воду для инъекций (0,37 мл) и 0,1 M цитратный буфер (2,5 мл) с каждым значением pH смешивали, получая 5 мл каждой из тестируемых композиций 13-48 с концентрацией 1 мг/мл.
Тестируемые композиции 49-68 готовили следующим образом.
0,1 M водный раствор цитрата натрия и 0,1 M водный раствор лимонной кислоты смешивали, получая 0,1 M цитратный буфер, имеющий значение pH, которое в каждом случае доводили до pH 4,0-7,8. Раствор PK-0051 с концентрацией 5,8 мг/мл (0,086 мл), приготовленный с водой для инъекций, и 0,1 M цитратный буфер (4,914 мл) с каждым значением pH смешивали, получая 5 мл каждой из тестируемых композиций 49-68 с концентрацией 0,1 мг/мл.
Тестируемые композиции 69-108 готовили следующим образом.
0,1 M водный раствор дигидрофосфата натрия и 0,1 M раствор гидрофосфата динатрия смешивали, получая 0,1 M фосфатный буфер, имеющий значение pH, которое в каждом случае доводили до pH 4,0-7,9. Раствор PK-0051 с концентрацией 1,2 мг/мл (0,495 мл), приготовленный с водой для инъекций, воду для инъекций (2,505 мл) и 0,1 M фосфатный буфер (3,000 мл) с каждым значением pH смешивали, получая 6 мл каждой из тестируемых композиций 69-108 с концентрацией 0,1 мг/мл.
Тестируемые композиции 109-168 готовили следующим образом.
0,1 M водный раствор цитрата натрия и 0,1 M водный раствор лимонной кислоты смешивали, получая 0,1 M цитратный буфер, имеющий значение pH, которое в каждом случае доводили до pH 4,0-7,8. Аналогично, 0,1 M водный раствор дигидрофосфата натрия и 0,1 M раствор гидрофосфата динатрия смешивали, получая 0,1 M фосфатный буфер, имеющий значение pH, которое в каждом случае доводили до pH 4,0-7,8. 0,1 M цитратный буфер и 0,1 M фосфатный буфер, имеющие одинаковые значения pH, смешивали в соотношении 8:2 (4 мл:1 мл), 5:5 (3 мл:3 мл) и 2:8 (1 мл:4 мл), получая 0,1 M цитрат-фосфатный буфер (8:2), 0,1 M цитрат-фосфатный буфер (5:5) и 0,1 M цитрат-фосфатный буфер (2:8), с каждым значением pH 4,0-7,8.
Раствор PK-0051 с концентрацией 5,8 мг/мл (0,1 мл), приготовленный с водой для инъекций, воду для инъекций (2,9 мл) и 0,1 M цитрат-фосфатный буфер (8:2) (3,0 мл) с каждым значением pH смешивали, получая 6 мл каждой из тестируемых композиций 109-128 с концентрацией 0,1 мг/мл. Тестируемые композиции 129-148 получали способом, аналогичным способу получения тестируемых композиций 109-128, за исключением того, что использовали 0,1 M цитрат-фосфатный буфер (5:5) (3,0 мл) вместо 0,1 M цитрат-фосфатного буфера (8:2) (3,0 мл) с каждым значением pH. Тестируемые композиции 149-168 получали способом, аналогичным способу получения тестируемых композиций 109-128, за исключением того, что использовали 0,1 M цитрат-фосфатный буфер (2:8) (3,0 мл) вместо 0,1 M цитрат-фосфатного буфера (8:2) (3,0 мл) с каждым значением pH.
1-1. 0,05 M цитратный буфер (pH 4,0-7,5)
тестируемая композиция 13: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 4,0)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 14: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 4,1)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 15: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 4,2)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 16: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 4,3)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 17: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 4,4)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 18: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 4,5)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 19: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 4,6)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 20: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 4,7)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 21: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 4,8)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 22: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 4,9)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 23: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 5,0)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 24: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 5,1)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 25: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 5,2)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 26: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 5,3)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 27: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 5,4)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 28: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 5,5)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 29: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 5,6)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 30: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 5,7)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 31: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 5,8)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 32: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 5,9)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 33: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 34: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,1)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 35: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,2)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 36: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,3)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 37: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,4)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 38: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,5)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 39: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,6)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 40: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,7)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 41: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,8)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 42: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,9)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 43: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 7,0)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 44: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 7,1)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 45: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 7,2)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 46: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 7,3)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 47: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 7,4)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 48: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 7,5)), (1 мг/мл)
1-2. 0,1 M цитратный буфер (pH 4,0-7,8)
тестируемая композиция 49: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 4,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 50: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 4,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 51: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 4,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 52: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 4,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 53: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 4,8)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 54: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 5,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 55: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 5,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 56: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 5,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 57: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 5,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 58: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 5,8)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 59: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 6,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 60: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 6,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 61: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 6,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 62: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 6,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 63: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 6,8)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 64: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 7,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 65: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 7,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 66: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 7,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 67: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 7,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 68: PK-0051 (0,1 M цитратный буфер (pH 7,8)), (0,1 мг/мл)
1-3. 0,05 M фосфатный буфер (pH 4,0-7,9)
тестируемая композиция 69: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 4,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 70: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 4,1)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 71: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 4,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 72: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 4,3)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 73: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 4,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 74: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 4,5)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 75: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 4,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 76: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 4,7)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 77: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 4,8)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 78: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 4,9)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 79: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 5,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 80: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 5,1)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 81: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 5,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 82: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 5,3)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 83: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 5,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 84: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 5,5)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 85: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 5,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 86: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 5,7)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 87: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 5,8)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 88: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 5,9)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 89: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 6,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 90: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 6,1)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 91: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 6,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 92: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 6,3)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 93: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 6,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 94: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 6,5)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 95: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 6,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 96: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 6,7)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 97: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 6,8)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 98: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 6,9)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 99: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 7,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 100: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 7,1)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 101: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 7,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 102: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 7,3)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 103: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 7,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 104: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 7,5)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 105: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 7,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 106: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 7,7)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 107: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 7,8)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 108: PK-0051 (0,05 M фосфатный буфер (pH 7,9)), (0,1 мг/мл)
1-4. 0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 4,0-7,8)
тестируемая композиция 109: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 4,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 110: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 4,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 111: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 4,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 112: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 4,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 113: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 4,8)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 114: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 5,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 115: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 5,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 116: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 5,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 117: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 5,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 118: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 5,8)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 119: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 6,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 120: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 6,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 121: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 6,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 122: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 6,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 123: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 6,8)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 124: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 7,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 125: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 7,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 126: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 7,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 127: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 7,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 128: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (8:2) (pH 7,8)), (0,1 мг/мл)
1-5. 0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 4,0-7,8)
тестируемая композиция 129: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 4,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 130: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 4,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 131: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 4,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 132: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 4,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 133: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 4,8)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 134: PK-005 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 5,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 135: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 5,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 136: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 5,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 137: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 5,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 138: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 5,8)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 139: PK-005 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 6,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 140: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 6,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 141: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 6,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 142: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 6,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 143: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 6,8)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 144: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 7,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 145: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 7,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 146: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 7,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 147: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 7,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 148: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (5:5) (pH 7,8)), (0,1 мг/мл)
1-6. 0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 4,0-7,8)
тестируемая композиция 149: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 4,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 150: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 4,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 151: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 4,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 152: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 4,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 153: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 4,8)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 154: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 5,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 155: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 5,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 156: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 5,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 157: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 5,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 158: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 5,8)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 159: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 6,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 160: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 6,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 161: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 6,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 162: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 6,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 163: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 6,8)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 164: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 7,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 165: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 7,2)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 166: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 7,4)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 167: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 7,6)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 168: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер:0,05 M фосфатный буфер (2:8) (pH 7,8)), (0,1 мг/мл)
2. Метод оценки
Тестируемые композиции 13-168, соответственно, разливали в пять 5-мл стеклянных флаконов, в каждый по 1 мл композиции, и хранили в камерах для теста на стабильность (производства ESPEC CORP.) при 60°C. Измерения для тестируемых композиций проводили методом ВЭЖХ в неделю 4. Рассчитывали содержание PK-0051 и оценивали стабильность на основании уменьшения содержания (%) относительно содержания в момент начала хранения. Метод измерения и метод расчета содержания были аналогичны тем, которые использовали в примере 1.
3. Результаты
Результаты приведены на Фиг. 4 - Фиг. 9. Независимо от используемого буфера содержание составляло не менее 80% в диапазоне значений pH от примерно 4,6 до примерно pH 7,4 через 4 недели хранения при 60°C.
Пример 3 (Оценка стабильности в цитратном буфере и его концентрации)
Оценивали термальную стабильность PK-0051-содержащей композиции прототипа ингаляционного препарата нуклеиновой кислоты.
1. Тестируемая композиция
Тестируемую композицию 169 готовили следующим образом.
0,1 M водный раствор цитрата натрия и 0,1 M водный раствор лимонной кислоты смешивали, получая 0,1 M цитратный буфер с pH 6,8. Раствор PK-0051 с концентрацией 20 мг/мл (0,1 мл), приготовленный с водой для инъекций, воду для инъекций (9,9 мл) и 0,1 M цитратный буфер (10 мл) с pH 6,8 смешивали, получая 20 мл тестируемой композиции 169 с концентрацией 0,1 мг/мл.
Тестируемую композицию 170 готовили следующим образом.
0,1 M водный раствор цитрата натрия и 0,1 M водный раствор лимонной кислоты смешивали, получая 0,1 M цитратный буфер с pH 6,8. Его разбавляли в 10 раз, получая 0,01 M цитратный буфер с pH 6,8. Раствор PK-0051 с концентрацией 14,2 мг/мл (0,0704 мл), приготовленный с водой для инъекций, воду для инъекций (4,9296 мл) и 0,01 M цитратный буфер (5 мл) с pH 6,8 смешивали, получая 10 мл тестируемой композиции 170 с концентрацией 0,1 мг/мл.
тестируемая композиция 169: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,8)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 170: PK-0051 (0,005 M цитратный буфер (pH 6,8)), (0,1 мг/мл)
2. Метод оценки
Тестируемые композиции 169 и 170, соответственно, разливали в девять 5-мл стеклянных флаконов, в каждый по 1 мл композиции, и по четыре флакона с соответствующими композициями хранили в камерах для теста на стабильность при 40°C/75%RH и 60°C, и по одному флакону с соответствующими композициями хранили при 4°C. Измерения для тестируемых композиций проводили методом ВЭЖХ каждую неделю в течение 4 недель. Рассчитывали содержание PK-0051 и оценивали стабильность на основании уменьшения содержания (%) относительно содержания в момент начала хранения. Метод измерения и метод расчета содержания были аналогичны тем, которые использовали в примере 1.
3. Результаты
Результаты приведены на Фиг. 10 и Фиг. 11. Результаты показали, что заметное изменение содержания отсутствовало в цитратном буфере с концентрациями 0,005 M и 0,05 M даже в случае хранения при 60°C в течение 4 недель. На основании этих результатов можно сделать вывод, что эффект на стабильность нуклеиновой кислоты может сохраняться за счет контроля концентрации цитратного буфера, даже при увеличении концентрации одноцепочечной нуклеиновой кислоты.
Пример 4 (Оценка стабильности PK-0051-содержащей композиции (pH 6,5))
Готовили PK-0051-содержащие композиции с концентрациями 10 мг/мл и 1 мг/мл (pH 6,5) и оценивали их стабильность.
1. Тестируемая композиция
PK-0051-содержащую композицию с концентрацией 10 мг/мл (pH 6,5) готовили следующим образом.
Гидрат лимонной кислоты (21,0 г) растворяли в воде для инъекций (1 л), получая 0,1 M раствор лимонной кислоты. Аналогично, цитрат тринатрия дигидрат (29,4 г) растворяли в воде для инъекций (1 л), получая 0,1 M раствор цитрата натрия. 0,1 M раствор лимонной кислоты добавляли к 0,1 M раствору цитрата натрия для доведения значения pH до 6,5, получая 0,1 M цитратный буфер (pH 6,5). PK-0051 (10 г), синтезированную, как описано в примере получения 1, растворяли в воде для инъекций (500 мл). В раствор добавляли 0,1 M цитратный буфер (pH 6,5) (500 мл) и смесь перемешивали. Композицию пропускали через 0,22-мкм фильтр из поливинилиденфторида (ПВДФ), получая PK-0051-содержащую композицию с концентрацией 10 мг/мл (pH 6,5).
PK-0051-содержащую композицию с концентрацией 1 мг/мл (pH 6,5) готовили способом, аналогичным способу, описанному выше, за исключением того, что количество PK-0051 было изменено на 1,0 г.
Используя PK-0051-содержащие композиции с концентрациями 10 мг/мл и 1 мг/мл (pH 6,5) в качестве тестируемых композиций 171 и 172, оценивали стабильность.
тестируемая композиция 171: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,5)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 172: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,5)), (10 мг/мл)
2. Метод оценки
Тестируемые композиции 171 и 172, соответственно, разливали в девять 5-мл стеклянных флаконов, в каждый по 1 мл композиции, и по четыре флакона с соответствующими композициями хранили в камерах для теста на стабильность при 25°C/60%RH, 40°C/75%RH и 60°C, и по одному флакону с соответствующими композициями хранили при 4°C. Измерения для тестируемых композиций проводили методом ВЭЖХ каждую неделю в течение 4 недель. Рассчитывали содержание PK-0051 и оценивали стабильность на основании уменьшения содержания (%) относительно содержания в момент начала хранения. Метод измерения был аналогичен тому, который описан в примере 1.
Содержание PK-0051 в тестируемой композиции определяли с использованием раствора (100%), полученного путем растворения PK-0051 в воде для инъекций до концентрации 1 мг/мл, и растворов, полученных путем смешивания указанного раствора и воды для инъекций в соотношениях 9:1, 8:2, 7:3 и 6:4 (90%, 80%, 70% и 60%, соответственно), в качестве образцов для построения калибровочной кривой, нанося 10 мкл каждого из образцов для построения калибровочной кривой на колонку для ВЭЖХ для измерения площади пиков, строя график на основании измеренных значений соответствующих образцов для построения калибровочной кривой, с теоретическими значениями содержания (%) на горизонтальной оси (X) и значениями площади пика на вертикальной оси (Y), получая линию регрессии (Y=aX+b) (калибровочную кривую) методом наименьших квадратов и сопоставляя значение площади пика для тестируемой композиции, измеренное методом ВЭЖХ в тех же условиях, с калибровочной кривой для определения теоретического содержания (%). Содержание PK-0051 в тестируемой композиции 172 определяли способом, аналогичным тому, который описан выше, за исключением того, для ВЭЖХ использовали 1 мкл.
3. Результаты
Результаты приведены на Фиг. 12 и Фиг. 13. Результаты показали, что заметное изменение содержания отсутствовало даже в случае хранения при 60°C в течение 4 недель. Полученные результаты продемонстрировали, что PK-0051-содержащие композиции с концентрациями 1 мг/мл и 10 мг/мл (pH 6,5) имеют высокую стабильность.
Пример 5 (Оценка стабильности PK-0051-содержащей композиции (pH 6,0))
Готовили PK-0051-содержащую композицию с концентрацией 1 мг/мл (pH 6,0) и оценивали стабильность.
1. Тестируемая композиция
Гидрат лимонной кислоты (21,014 г) растворяли в воде для инъекций (1 л), получая 0,1 M раствор лимонной кислоты. Аналогично, цитрат тринатрия дигидрат (29,41 г) растворяли в воде для инъекций (1 л), получая 0,1 M раствор цитрата натрия. 0,1 M раствор лимонной кислоты добавляли к 0,1 M раствору цитрата натрия для доведения значения pH до 6,0, получая 0,1 M цитратный буфер (pH 6,0). PK-0051 (347 мг), синтезированную, как описано в примере получения 1, растворяли в воде для инъекций (5 мл). В данный раствор (0,144 мл) добавляли воду для инъекций (4,856 мл) и 0,1 M цитратный буфер (pH 6,0) (5 мл), и смесь перемешивали. Композицию пропускали через 0,22-мкм фильтр из поливинилиденфторида (ПВДФ), получая PK-0051-содержащую композицию с концентрацией 1 мг/мл (pH 6,0).
Используя PK-0051-содержащую композицию с концентрацией 1 мг/мл (pH 6,0) в качестве тестируемой композиции 173, оценивали стабильность.
тестируемая композиция 173: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)), (1 мг/мл)
2. Метод оценки
Тестируемую композицию 173 разливали в пять 5-мл стеклянных флаконов, в каждый по 1 мл композиции, один флакон хранили при 4°C и четыре флакона хранили в камерах для теста на стабильность при 60°C. Измерения для тестируемой композиции проводили методом ВЭЖХ каждую неделю в течение 4 недель. Рассчитывали содержание PK-0051 и оценивали стабильность на основании уменьшения содержания (%) относительно содержания в момент начала хранения. Метод измерения и метод расчета содержания были аналогичны тем, которые использовали в примере 1.
3. Результаты
Результаты приведены на Фиг. 14. Результаты показали, что заметное изменение содержания отсутствовало даже в случае хранения при 60°C в течение 4 недель. Полученные результаты продемонстрировали, что PK-0051-содержащая композиция с концентрацией 1 мг/мл (pH 6,0) имеет высокую стабильность.
Пример 6 (Ингибирующий эффект на легочный фиброз в мышиной модели спонтанного легочного фиброза)
С использованием мышиной модели спонтанного легочного фиброза (трансгенная мышь с TGF-β1 человека, описанная в Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2012, 46(3), 397-406 и PLoS One, 2012, 7(8): e42655, далее в настоящем документе называемая TG мышь), подтверждали ингибирующий эффект композиции по настоящему изобретению на легочный фиброз. Вышеуказанный эффект подтверждали, используя количество гидроксипролина в легочной ткани в качестве показателя в соответствии с методом, описанным в PLoS One, 2012 (ссылка приведена выше).
1. Тестируемая композиция
PK-0051-содержащую композицию с концентрацией 10 мг/мл (pH 6,5), полученную в примере 4, разбавляли 0,05 M цитратным буфером (pH 6,5) и использовали в качестве тестируемой композиции. Разбавление выполняли, исходя из массы тела TG мышей в день введения тестируемой композиции.
2. Разделение животных на группы и введение тестируемой композиции
С использованием прибора Micro CT (R_mCT2, производства Rigaku Corporation) оценивали фиброз в легких TG мышей, и мышей разделяли на группы таким образом, чтобы степень легочного фиброза и масса тела животных в момент разделения на группы были эквивалентными среди соответствующих групп.
Описание соответствующих групп введения приведено далее. В каждой группе введения использовали 11 самцов мышей. Под анестезией изофлураном вводили тестируемую композицию в общей сложности 4 раза в трахею TG мышей с использованием микрораспылителя (MSA-250-M: производства PENNCENTURY).
- группа введения 1
0,05 M цитратный буфер (pH 6,5) вводили TG мышам один раз/неделю.
- группа введения 2
тестируемую композицию вводили TG мышам в дозе 5 мг/кг массы тела один раз/две недели.
- группа введения 3
тестируемую композицию вводили TG мышам в дозе 5 мг/кг массы тела один раз/неделю.
3. Сбор образцов легочной ткани
Для анестезии TG мышам внутрибрюшинно вводили пентобарбитал (1,22 мг/150 мкл/мышь - 1,62 мг/200 мкл/мышь), собирали образцы крови, парные легкие выделяли и замораживали для получения гомогенизированных образцов.
4. Количественное определение чTGF-β1 в легочной ткани
Парные легкие гомогенизировали в клеточном дезинтеграторе с гранулами (MS-100, производства TOMY SEIKO CO., LTD.) и получали супернатант центрифугированием. Уровень чTGF-β1 в супернатанте определяли с использованием набора для определения TGF-β1 человека методом ELISA (производства BD).
5. Количественное определение гидроксипролина в легочной ткани
Парные легкие после гомогенизации сушили, инкубируя при 110°C в течение ночи, и вновь тонко измельчали при помощи клеточного дезинтегратора с гранулами. К измельченным парным легким добавляли 6Н HCl (1 мл) и смесь инкубировали в вытяжном шкафу при 110°C в течение ночи. Затем смесь инкубировали в вытяжном шкафу при 110°C в течение ночи. В смесь добавляли 2 мл PBS, инкубировали при 60°C в течение 1 часа и пропускали через фильтр, получая образец для измерения количества гидроксипролина. Количество гидроксипролина определяли методом, описанным в PLoS One. 2012; 7(8): e42655.
6. Результаты
Результаты приведены на Фиг. 15 и Фиг. 16. На Фиг. 15 приведен график, показывающий уровень TGF-β1 у животных в каждой группе введения, при этом на вертикальной оси указан уровень TGF-β1 в легочной ткани. На Фиг. 16 приведен график, показывающий количество гидроксипролина у животных в каждой группе введения, при этом на вертикальной оси указано количество гидроксипролина в легочной ткани. У TG мышей в группе 3 введения раствора молекулы нуклеиновой кислоты (0,1 мг/кг) уровень TGF-β1 и количество гидроксипролина в легочной ткани были значительно снижены по сравнению с TG мышами в группе 1 введения 0,05 M цитратного буфера (pH 6,5).
in vivo
Полученные результаты показали, что PK-0051, представляющая собой молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, ингибирует экспрессию целевого TGF-β1 также  и ингибирует легочный фиброз.
Пример 7 (Оценка стабильности PK-0051-содержащих композиций с концентрациями 10, 20, 40 и 80 мг/мл (pH 6,0))
Готовили PK-0051-содержащие композиции с концентрациями 10, 20, 40 и 80 мг/мл (pH 6,0) и оценивали их стабильность.
1. Тестируемая композиция
Тестируемую композицию 174 готовили следующим образом. Гидрат лимонной кислоты (105,07 г) растворяли в воде для инъекций (1 л), получая 0,5 M раствор лимонной кислоты. Аналогично, цитрат тринатрия дигидрат (147,05 г) растворяли в воде для инъекций (1 л), получая 0,5 M раствор цитрата натрия. 0,5 M раствор лимонной кислоты добавляли к 0,5 M раствору цитрата натрия для доведения значения pH до 6,0, получая 0,5 M цитратный буфер (pH 6,0). PK-0051 (840 мг) растворяли в воде для инъекций (8 мл) и использовали в качестве маточного раствора. 4,02 мл воды для инъекций и 0,5 мл 0,5 M цитратного буфера (pH 6,0) добавляли к 0,48 мл маточного раствора, смесь перемешивали и пропускали через 0,22-мкм фильтр из поливинилиденфторида (ПВДФ).
Тестируемую композицию 175 готовили способом, аналогичным способу, используемому для приготовления тестируемой композиции 174, за исключением того, что 3,55 мл воды для инъекций и 0,5 мл 0,5 M цитратного буфера (pH 6,0) добавляли и смешивали с 0,95 мл маточного раствора.
Тестируемую композицию 176 готовили способом, аналогичным способу, используемому для приготовления тестируемой композиции 174, за исключением того, что 2,6 мл воды для инъекций и 0,5 мл 0,5 M цитратного буфера (pH 6,0) добавляли и смешивали с 1,9 мл маточного раствора.
Тестируемую композицию 177 готовили способом, аналогичным способу, используемому для приготовления тестируемой композиции 174, за исключением того, что 0,69 мл воды для инъекций и 0,5 мл 0,5 M цитратного буфера (pH 6,0) добавляли и смешивали с 3,81 мл маточного раствора.
тестируемая композиция 174: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)), (10 мг/мл)
тестируемая композиция 175: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)), (20 мг/мл)
тестируемая композиция 176: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)), (40 мг/мл)
тестируемая композиция 177: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)), (80 мг/мл)
2. Метод оценки
Тестируемые композиции 174-177, соответственно, разливали в четыре 5-мл стеклянных флакона, в каждый по 1 мл композиции, и хранили в камерах для теста на стабильность при 60°C. Тестируемые композиции доставали каждую неделю и разбавляли в 10 раз. Проводили измерения методом ВЭЖХ, используя 10 мкл тестируемой композиции 174, 5 мкл тестируемой композиции 175, 3 мкл тестируемой композиции 176 и 2 мкл тестируемой композиции 177. Измерения проводили до недели 4. Рассчитывали содержание PK-0051 и оценивали стабильность на основании уменьшения содержания (%) относительно содержания в момент начала хранения. Метод расчета содержания и метод измерения описаны ниже.
Используя раствор (100%), полученный путем разведения в 10 раз тестируемой композиции 174, хранящейся отдельно при 4°C, и растворов, полученных путем смешивания указанного раствора и воды для инъекций в соотношениях 9:1, 8:2, 7:3 и 6:4 (90%, 80%, 70% и 60%, соответственно), в качестве образцов для построения калибровочной кривой, 10 мкл каждого из образцов для построения калибровочной кривой наносили на колонку для ВЭЖХ для измерения площади пиков. Линию регрессии (Y=aX+b) (калибровочную кривую) получали методом наименьших квадратов, строя график на основании измеренных значений соответствующих образцов для построения калибровочной кривой, с теоретическими значениями содержания (%) на горизонтальной оси (X) и значениями площади пика на вертикальной оси (Y). Значение площади пика для тестируемой композиции 174, измеренное методом ВЭЖХ в тех же условиях, сопоставляли с калибровочной кривой для определения теоретического содержания (%). Содержание для тестируемой композиции 175 определяли способом, аналогичным вышеописанному способу, за исключением того, что для ВЭЖХ использовали каждый образец для построения калибровочной кривой (5 мкл), полученный с использованием тестируемой композиции 175. Содержание для тестируемой композиции 176 определяли способом, аналогичным вышеописанному способу, за исключением того, что для ВЭЖХ использовали каждый образец для построения калибровочной кривой (3 мкл), полученный с использованием тестируемой композиции 176. Содержание для тестируемой композиции 177 определяли способом, аналогичным вышеописанному способу, за исключением того, что для ВЭЖХ использовали каждый образец для построения калибровочной кривой (2 мкл), полученный с использованием тестируемой композиции 177.
Метод измерения
Измерения образцов для построения калибровочной кривой (60% - 100%) и соответствующих тестируемых композиций проводили в следующих условиях:
Ионообменная ВЭЖХ
Измерительный прибор: система для ВЭЖХ LC-20A SHIMAZU (АО-ВЭЖХ) производства Shimadzu Corporation
Детектор: спектрофотометр для измерения поглощения в ультрафиолетовой области (измерение при длине волны: 260 нм)
Колонка: DNAPac PA-100 (4×250 мм)
Температура колонки: 80°C
Подвижная фаза A: 25 мМ трис-HCl (pH 8,0), 8 M мочевина, 10% ацетонитрила
Подвижная фаза B: подвижная фаза A, 700 мМ перхлорат натрия моногидрат
Подача подвижной фазы: соотношение при смешивании подвижной фазы A и подвижной фазы B изменяли следующим образом для контроля градиента концентрации (Таблица 4).
Таблица 4
Время (мин) после впрыска
Подвижная фаза A (об%)
Подвижная фаза B (об%)
0→20
90→60
10→40
поток: 1,0 мл/мин
3. Результаты
Результаты приведены в Таблице 5 и на Фиг. 17. После хранения при 60°C в течение 4 недель содержание PK-0051 составляло примерно 97%, когда концентрация PK-0051 составляла 10 мг/мл, примерно 95%, когда концентрация составляла 20 мг/мл, примерно 91%, когда концентрация составляла 40 мг/мл, и примерно 85%, когда концентрация составляла 80 мг/мл. Полученные результаты показали, что уменьшение содержания относительно содержания в момент начала хранения возрастает при возрастании концентрации. Напротив, когда концентрация PK-0051 составляла 10 мг/мл или 20 мг/мл, уменьшение содержания относительно содержания в момент начала хранения было менее 10%. Кроме того, даже при концентрации PK-0051 80 мг/мл, в случае которой содержание после хранения было самым низким, уменьшение содержания составляло примерно 15%. Таким образом, было показано, что PK-0051 имеет высокую стабильность даже в самых жестких условиях хранения в течение 4 недель при 60°C.
Таблица 5
Период хранения (недели)
Содержание (%)PK-0051
10 мг/мл
20 мг/мл
40 мг/мл
80 мг/мл
0
100,20
100,05
99,67
98,50
1
98,42
99,39
99,34
101,43
2
99,41
99,20
98,38
94,01
3
97,63
97,79
95,81
91,48
4
96,63
94,95
91,35
84,94
Пример 8 (Оценка стабильности (фотостабильности) PK-0051-содержащей композиции с концентрацией 1 мг/мл (pH 5,5, 6,0 и 6,5))
Стабильность PK-0051 вод воздействием света оценивали с использованием прозрачных стеклянных флаконов и флаконов из темного стекла, в каждом из которых находилась PK-0051-содержащая композиция, и которые были дополнительно упакованы в бумажные коробки.
1. Тестируемая композиция
Тестируемую композицию 178 готовили следующим образом. Гидрат лимонной кислоты (21,014 г) растворяли в воде для инъекций (1 л), получая 0,1 M раствор лимонной кислоты. Аналогично, цитрат тринатрия дигидрат (29,41 г) растворяли в воде для инъекций (1 л), получая 0,1 M раствор цитрата натрия. 0,1 M раствор лимонной кислоты добавляли к 0,1 M раствору цитрата натрия для доведения значения pH до 5,5, получая 0,1 M цитратный буфер (pH 5,5). PK-0051 (210 мг) растворяли в воде для инъекций (10 мл) и использовали в качестве маточного раствора. 9,5 мл воды для инъекций и 10,5 мл 0,1 M цитратного буфера (pH 5,5) добавляли к 1 мл маточного раствора, смесь перемешивали и пропускали через 0,22-мкм фильтр из поливинилиденфторида (ПВДФ).
Тестируемую композицию 179 готовили способом, аналогичным способу, используемому для приготовления тестируемой композиции 178, за исключением того, что 0,1 M раствор лимонной кислоты добавляли к 0,1 M раствору цитрата натрия для доведения значения pH до 6,0, получая 0,1 M цитратный буфер (pH 6,0), и 9,5 мл воды для инъекций и 10,5 мл 0,1 M цитратного буфера (pH 6,0) добавляли и смешивали с 1 мл маточного раствора.
Тестируемую композицию 180 готовили способом, аналогичным способу, используемому для приготовления тестируемой композиции 178, за исключением того, что 0,1 M раствор лимонной кислоты добавляли к 0,1 M раствору цитрата натрия для доведения значения pH до 6,5, получая 0,1 M цитратный буфер (pH 6,5), и 9,5 мл воды для инъекций и 10,5 мл 0,1 M цитратного буфера (pH 6,5) добавляли и смешивали с 1 мл маточного раствора.
тестируемая композиция 178: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 5,5)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 179: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)), (1 мг/мл)
тестируемая композиция 180: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,5)), (1 мг/мл)
2. Метод оценки
Тестируемые композиции 178-180, соответственно, разливали в десять 5-мл прозрачных стеклянных флаконов и десять 5-мл флаконов из темного стекла (прозрачные емкости и непрозрачные емкости). Кроме того, прозрачные емкости и непрозрачные емкости, аналогично содержащие тестируемые композиции 178-180, упаковывали в бумажные коробки (вторичную упаковку для прозрачных емкостей и вторичную упаковку для непрозрачных емкостей). Их хранили в камерах для теста на стабильность при 25°C/60%RH под флуоресцентной лампой дневного света (освещенность 1580 люкс) с лампой D65 в качестве источника света до того момента, когда общая световая экспозиция достигала 1,2 миллиона люкс⋅час (период хранения 32 дня, общая световая экспозиция 1213743 люкс⋅час). Когда общая световая экспозиция достигала 0,3 миллиона люкс⋅час, 0,6 миллиона люкс⋅час, 0,9 миллиона люкс⋅час и 1,2 миллиона люкс⋅час, тестируемые композиции доставали и использовали по 10 мкл из них для измерений методом обращенно-фазовой ВЭЖХ и ионообменной ВЭЖХ. Рассчитывали содержание PK-0051 и оценивали стабильность на основании уменьшения содержания (%) относительно содержания в момент начала хранения. Метод расчета содержания и метод измерения описаны ниже.
Тестируемую композицию 178 (100%), полученную, как описано выше (прозрачные емкости, непрозрачные емкости, вторичная упаковка для прозрачных емкостей и вторичная упаковка для непрозрачных емкостей), и хранящуюся в темном месте при 4°C, и воду для инъекций смешивали в соотношениях 9:1, 8:2, 7:3 и 6:4, и растворы (90%, 80%, 70% и 60%) использовали в качестве образцов для построения калибровочной кривой. Каждый образец для построения калибровочной кривой (10 мкл) наносили на колонку для обращенно-фазовой ВЭЖХ и ионообменной ВЭЖХ, и измеряли площадь пика. Линию регрессии (Y=aX+b) (калибровочную кривую) получали методом наименьших квадратов, строя график на основании измеренных значений каждого образца для построения калибровочной кривой, с теоретическими значениями содержания (%) на горизонтальной оси (X) и значениями площади пика на вертикальной оси (Y). Значение площади пика для тестируемой композиции 178, измеренное методом обращенно-фазовой ВЭЖХ и ионообменной ВЭЖХ в тех же условиях, сопоставляли с калибровочной кривой для определения теоретического содержания (%). Содержание для тестируемых композиций 179 и 180 определяли способом, аналогичным описанному выше способу.
Метод измерения
Измерения образцов для построения калибровочной кривой (60% - 100%) и каждой из тестируемых композиций проводили в следующих условиях. Измерения методом ионообменной ВЭЖХ проводили способом, аналогичным способу примера 7.
Обращенно-фазовая ВЭЖХ
Измерительный прибор: система для ВЭЖХ LC-10A SHIMAZU (ОФ-ВЭЖХ) производства Shimadzu Corporation
Детектор: спектрофотометр для измерения поглощения в ультрафиолетовой области (измерение при длине волны: 260 нм)
Колонка: X-Bridge OST C18 (2,5 мкм, 4,6×50 мм)
Температура колонки: 40°C
Подвижная фаза A: 50 мМ ТЭАА (pH 7,0), 0,5% ацетонитрила
Подвижная фаза B: 100% ацетонитрила
Подача подвижной фазы: соотношение при смешивании подвижной фазы A и подвижной фазы B изменяли следующим образом для контроля градиента концентрации (Таблица 6).
Таблица 6
Время (мин) после впрыска
Подвижная фаза A (об%)
Подвижная фаза B (об%)
0→12
100→60
0→40
поток: 1,0 мл/мин
3. Результаты
Результаты приведены в Таблицах 7-9 и на Фиг. 18-23. Из полученных результатов стало очевидно, что тестируемые композиции демонстрировали отсутствие заметных изменений содержания при определении методом обращенно-фазовой ВЭЖХ или ионообменной ВЭЖХ и являются стабильными под воздействием света. На основании данных результатов можно сделать вывод, что композиция по настоящему изобретению не теряет качества препарата под воздействием света, даже находясь в условиях освещенности, составляющей 1,2 миллиона люкс⋅час, на протяжении периода времени от производства до использования, и с ней можно обращаться так же, как и с не подвергнутыми воздействию света препаратами. Кроме того, считается, что вместо флаконов из темного стекла могут быть использованы более дешевые флаконы из прозрачного стекла.
Таблица 7
Тест на фотостабильность PK-0051 в 0,05 M цитратном буфере (pH 5,5)
Образец
Люкс⋅час
Содержание (%)PK-0051
Ионообменная ВЭЖХ
Обращенно-фазовая ВЭЖХ
Прозрачная емкостьтемное место при 4°C
0
101,55
99,13
Прозрачная емкость0,05 M цитратный буфер (pH 5,5)
30
101,10
100,95
60
100,85
99,50
90
100,28
96,83
120
99,73
98,70
Прозрачная емкость с вторичной упаковкой0,05 M цитратный буфер (pH 5,5)
30
102,32
99,92
60
102,30
100,77
90
101,86
99,13
120
102,76
99,68
Непрозрачная емкость0,05 M цитратный буфер (pH 5,5)
30
101,99
100,38
60
101,79
100,26
90
101,61
100,03
120
102,23
100,60
Непрозрачная емкость с вторичной упаковкой0,05 M цитратный буфер (pH 5,5)
30
101,79
100,35
60
101,87
100,52
90
102,43
99,70
120
102,20
99,12
Таблица 8
Тест на фотостабильность PK-0051 в 0,05 M цитратном буфере (pH 6,0)
Образец
Люкс⋅час
Содержание (%)PK-0051
Ионообменная ВЭЖХ
Обращенно-фазовая ВЭЖХ
Прозрачная емкостьтемное место при 4°C
0
102,83
98,35
Прозрачная емкость0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)
30
102,24
98,83
60
101,65
97,75
90
100,57
98,09
120
102,62
97,93
Прозрачная емкость с вторичной упаковкой0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)
30
102,41
98,21
60
102,35
99,07
90
103,23
98,07
120
103,00
99,18
Непрозрачная емкость0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)
30
102,46
98,44
60
102,17
98,60
90
102,94
97,98
120
104,15
99,33
Непрозрачная емкость с вторичной упаковкой0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)
30
103,70
98,52
60
102,12
98,68
90
103,16
98,83
120
104,11
98,65
Таблица 9
Тест на фотостабильность PK-0051 в 0,05 M цитратном буфере (pH 6,5)
Образец
Люкс⋅час
Содержание (%)PK-0051
Ионообменная ВЭЖХ
Обращенно-фазовая ВЭЖХ
Прозрачная емкостьтемное место при 4°C
0
102,41
98,20
Прозрачная емкость0,05 M цитратный буфер (pH 6,5)
30
102,57
98,53
60
102,12
98,77
90
103,14
97,82
120
101,23
98,71
Прозрачная емкость с вторичной упаковкой0,05 M цитратный буфер (pH 6,5)
30
102,15
98,26
60
101,71
98,92
90
102,85
98,00
120
102,54
98,20
Непрозрачная емкость0,05 M цитратный буфер (pH 6,5)
30
101,83
99,63
60
103,21
98,62
90
103,97
99,12
120
102,73
98,74
Непрозрачная емкость с вторичной упаковкой0,05 M цитратный буфер (pH 6,5)
30
103,23
98,33
60
103,04
98,36
90
102,43
98,85
120
101,85
98,37
Пример 9 (Оценка стабильности PK-0051-содержащей композиции с коэффициентом осмотического давления, скорректированным изотоническим средством)
С использованием различных изотонических средств (NaCl, KCl, глицерин, D-маннит, лактит, D-сорбит и сахароза) коэффициент осмотического давления PK-0051-содержащей композиции доводили до 1±0,1 и оценивали стабильность.
1. Тестируемая композиция
Тестируемую композицию 181 готовили следующим образом. Гидрат лимонной кислоты (105,07 г) растворяли в воде для инъекций (1 л), получая 0,5 M раствор лимонной кислоты. Аналогично, цитрат тринатрия дигидрат (147,05 г) растворяли в воде для инъекций (1 л), получая 0,5 M раствор цитрата натрия. 0,5 M раствор лимонной кислоты добавляли к 0,5 M раствору цитрата натрия для доведения значения pH до 6,0, получая 0,5 M цитратный буфер (pH 6,0). 1 г NaCl растворяли в 10 мл воды для инъекций, получая 10% раствор. PK-0051 (210 мг) растворяли в воде для инъекций (140 мл) и использовали в качестве маточного раствора. 0,68 мл 10% раствора NaCl, 11,82 мл воды для инъекций и 1,5 мл 0,5 M цитратного буфера (pH 6,0) добавляли к 1 мл маточного раствора, смесь перемешивали и пропускали через 0,22-мкм фильтр из поливинилиденфторида (ПВДФ).
Тестируемую композицию 182 готовили способом, аналогичным способу, используемому для приготовления тестируемой композиции 181, за исключением того, что KCl использовали вместо NaCl, и 0,85 мл 10% раствора KCl, 11,65 мл воды для инъекций и 1,5 мл 0,5 M цитратного буфера (pH 6,0) добавляли и смешивали с 1 мл маточного раствора.
Тестируемую композицию 183 готовили способом, аналогичным способу, используемому для приготовления тестируемой композиции 181, за исключением того, что глицерин использовали вместо NaCl, и 1,8 мл 10% раствора глицерина, 10,7 мл воды для инъекций и 1,5 мл 0,5 M цитратного буфера (pH 6,0) добавляли и смешивали с 1 мл маточного раствора.
Тестируемую композицию 184 готовили способом, аналогичным способу, используемому для приготовления тестируемой композиции 181, за исключением того, что D-маннит использовали вместо NaCl, и 3,75 мл 10% раствора D-маннита, 8,75 мл воды для инъекций и 1,5 мл 0,5 M цитратного буфера (pH 6,0) добавляли и смешивали с 1 мл маточного раствора.
Тестируемую композицию 185 готовили способом, аналогичным способу, используемому для приготовления тестируемой композиции 181, за исключением того, что лактит использовали вместо NaCl, и 7,05 мл 10% раствора лактита, 5,45 мл воды для инъекций и 1,5 мл 0,5 M цитратного буфера (pH 6,0) добавляли и смешивали с 1 мл маточного раствора.
Тестируемую композицию 186 готовили способом, аналогичным способу, используемому для приготовления тестируемой композиции 181, за исключением того, что D-сорбит использовали вместо NaCl, и 3,75 мл 10% раствора D-сорбита, 8,75 мл воды для инъекций и 1,5 мл 0,5 M цитратного буфера (pH 6,0) добавляли и смешивали с 1 мл маточного раствора.
Тестируемую композицию 187 готовили способом, аналогичным способу, используемому для приготовления тестируемой композиции 181, за исключением того, что сахарозу использовали вместо NaCl, и 7 мл 10% раствора сахарозы, 5,5 мл воды для инъекций и 1,5 мл 0,5 M цитратного буфера (pH 6,0) добавляли и смешивали с 1 мл маточного раствора.
Тестируемую композицию 188 готовили способом, аналогичным способу, используемому для приготовления тестируемой композиции 181, за исключением того, что 12,5 мл воды для инъекций и 1,5 мл 0,5 M цитратного буфера (pH 6,0) добавляли и смешивали с 1 мл маточного раствора.
Тестируемую композицию 189 готовили способом, аналогичным способу, используемому для приготовления тестируемой композиции 181, за исключением того, что 12,65 мл воды для инъекций и 1,35 мл 10% раствора NaCl добавляли и смешивали с 1 мл маточного раствора.
тестируемая композиция 181: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)/NaCl (коэффициент осмотического давления 1)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 182: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)/KCl (коэффициент осмотического давления 1)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 183: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)/глицерин (коэффициент осмотического давления 1)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 184: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)/D-маннит (коэффициент осмотического давления 1)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 185: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)/лактит (коэффициент осмотического давления 1)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 186: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)/D-сорбит (коэффициент осмотического давления 1)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 187: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)/сахароза (коэффициент осмотического давления 1)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 188: PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)), (0,1 мг/мл)
тестируемая композиция 189: PK-0051 (NaCl (коэффициент осмотического давления 1)), (0,1 мг/мл)
2. Метод оценки
Тестируемые композиции 181-189, соответственно, разливали в четырнадцать 5-мл стеклянных флакона, в каждый по 1 мл композиции, и хранили в камерах для теста на стабильность при 25°C/60%RH, 40°C/75%RH и 60°C. Через одну и две недели проводили измерения для каждой из тестируемых композиций (30 мкл) методом обращенно-фазовой ВЭЖХ и ионообменной ВЭЖХ.
Тестируемые композиции 181-189 подвергали ускоренному испытанию стабильности в условиях (105°C и 121°C в течение 5 мин и 15 мин), соответствующих хранению при 60°C в течение 4 недель. Тестируемые композиции 181-189, соответственно, подвергали обработке в автоклаве в условиях четырех видов: 105°C в течение 5 мин, 105°C в течение 15 мин, 121°C в течение 5 мин и 121°C в течение 15 мин, и по 30 мкл использовали для измерений методом обращенно-фазовой ВЭЖХ и ионообменной ВЭЖХ.
После измерений методом ВЭЖХ рассчитывали содержание PK-0051 и оценивали стабильность на основании уменьшения содержания (%) относительно содержания в момент начала хранения. Метод расчета содержания и метод измерения описаны ниже.
Растворы (90%, 80%, 70% и 60%), полученные путем смешивания тестируемой композиции 188 (100%) и воды для инъекций в соотношении 9:1, 8:2, 7:3 и 6:4, соответственно, использовали в качестве образцов для построения калибровочной кривой, 30 мкл каждого из образцов для построения калибровочной кривой наносили на ВЭЖХ для измерения площади пиков, строили график на основании измеренных значений соответствующих образцов для построения калибровочной кривой, с теоретическими значениями содержания (%) на горизонтальной оси (X) и значениями площади пика на вертикальной оси (Y), линию регрессии (Y=aX+b) (калибровочную кривую) получали методом наименьших квадратов и сопоставляли значение площади пика для тестируемой композиции, измеренное методом ВЭЖХ в тех же условиях, что и образцы для построения калибровочной кривой, с калибровочной кривой, определяя теоретическое содержание (%).
Метод измерения
Измерения образцов для построения калибровочной кривой (60% - 100%) и тестируемых композиций проводили в следующих условиях. Измерение методом ионообменной ВЭЖХ проводили методом измерения, аналогичным тому, который описан в примере 7. Измерение методом обращенно-фазовой ВЭЖХ проводили методом измерения, аналогичным тому, который описан в примере 8, за исключением того, что 50 мМ ТЭАА (pH 7,3) использовали в качестве подвижной фазы A и измерения проводили при длине волны 254 нм.
3. Результаты
Результаты приведены в Таблицах 10-18. Тестируемые композиции 181-188 продемонстрировали отсутствие заметного уменьшения содержания PK-0051 после хранения при 25°C, 40°C или 60°C в течение 2 недель. В тестируемых композициях 181-188 было отмечено уменьшение в пределах примерно 15% содержания PK-0051 после обработки в автоклаве (105°C и 121°C в течение 5 мин и 15 мин), таким образом, композиции показали высокую стабильность. С другой стороны, тестируемая композиция 189 продемонстрировала отсутствие заметного уменьшения содержания PK-0051 после хранения при 25°C, 40°C или 60°C в течение 2 недель; однако было обнаружено значительное уменьшение содержания PK-0051 после обработки в автоклаве (121°C в течение 5 мин и 15 мин) (уменьшение примерно 24% в случае 121°C в течение 5 мин, уменьшение примерно 41% в случае 121°C в течение 15 мин). Полученные результаты также показали, что стабильность уменьшается вследствие воздействия NaCl в отсутствие 0,05 M цитратного буфера (pH 6,0). Приведенные выше результаты продемонстрировали, что изотоническое средство не приводит к уменьшению стабильности PK-0051 в 0,05 M цитратном буфере (pH 6,0).
Таблица 10
Термальная стабильность PK-0051 в 0,05 M цитратном буфере (pH 6,0)/NaCl (коэффициент осмотического давления 1)
Образец
Температура хранения или температура обработки в автоклаве
Период хранения
Содержание (%) PK-0051
обращенно-фазовая ВЭЖХ
ионообменная ВЭЖХ
Тестируемая композиция 181PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)/NaCl (коэффициент осмотического давления 1)), (0,1 мг/мл)
25°C
Начало хранения
101,70
103,70
1 неделя
102,08
101,15
2 недели
102,73
101,45
40°C
Начало хранения
101,70
103,70
1 неделя
102,37
101,19
2 недели
101,32
101,02
60°C
Начало хранения
101,70
103,70
1 неделя
102,36
100,99
2 недели
101,39
98,83
автоклав105°C
Начало хранения
101,70
103,70
5 мин
99,43
101,67
15 мин
98,06
97,32
автоклав121°C
Начало хранения
101,70
103,70
5 мин
95,16
96,58
15 мин
90,00
86,90
Таблица 11
Термальная стабильность PK-0051 в 0,05 M цитратном буфере (pH 6,0)/KCl (коэффициент осмотического давления 1)
Образец
Температура хранения или температура обработки в автоклаве
Период хранения
Содержание (%) PK-0051
обращенно-фазовая ВЭЖХ
ионообменная ВЭЖХ
Тестируемая композиция 182PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)/KCl (коэффициент осмотического давления 1)), (0,1 мг/мл)
25°C
Начало хранения
101,05
102,22
1 неделя
101,41
98,79
2 недели
102,24
100,44
40°C
Начало хранения
101,05
102,22
1 неделя
101,70
100,47
2 недели
102,07
99,52
60°C
Начало хранения
101,05
102,22
1 неделя
101,46
100,02
2 недели
100,94
98,44
автоклав105°C
Начало хранения
101,05
102,22
5 мин
99,65
99,94
15 мин
97,27
96,70
автоклав121°C
Начало хранения
101,05
102,22
5 мин
95,44
95,16
15 мин
88,63
85,79
Таблица 12
Термальная стабильность PK-0051 в 0,05 M цитратном буфере (pH 6,0)/глицерин (коэффициент осмотического давления 1)
Образец
Температура хранения или температура обработки в автоклаве
Период хранения
Содержание (%) PK-0051
обращенно-фазовая ВЭЖХ
ионообменная ВЭЖХ
Тестируемая композиция 183PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)/глицерин (коэффициент осмотического давления 1)), (0,1 мг/мл)
25°C
Начало хранения
101,27
102,24
1 неделя
101,73
101,23
2 недели
102,55
97,82
40°C
Начало хранения
101,27
102,24
1 неделя
101,52
101,35
2 недели
102,98
102,18
60°C
Начало хранения
101,27
102,24
1 неделя
102,09
99,25
2 недели
100,87
99,72
автоклав105°C
Начало хранения
101,27
102,24
5 мин
100,22
100,87
15 мин
98,78
97,78
автоклав121°C
Начало хранения
101,27
102,24
5 мин
95,17
95,77
15 мин
91,04
86,41
Таблица 13
Термальная стабильность PK-0051 в 0,05 M цитратном буфере (pH 6,0)/D-маннит (коэффициент осмотического давления 1)
Образец
Температура хранения или температура обработки в автоклаве
Период хранения
Содержание (%) PK-0051
обращенно-фазовая ВЭЖХ
ионообменная ВЭЖХ
Тестируемая композиция 184PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)/D-маннит (коэффициент осмотического давления 1)), (0,1 мг/мл)
25°C
Начало хранения
101,86
102,32
1 неделя
102,42
101,18
2 недели
102,59
98,52
40°C
Начало хранения
101,86
102,32
1 неделя
102,40
101,57
2 недели
102,85
100,76
60°C
Начало хранения
101,86
102,32
1 неделя
102,00
101,13
2 недели
101,20
100,12
автоклав105°C
Начало хранения
101,86
102,32
5 мин
100,35
100,79
15 мин
98,86
97,25
автоклав121°C
Начало хранения
101,86
102,32
5 мин
95,58
95,85
15 мин
90,14
86,95
Таблица 14
Термальная стабильность PK-0051 в 0,05 M цитратном буфере (pH 6,0)/лактит (коэффициент осмотического давления 1)
Образец
Температура хранения или температура обработки в автоклаве
Период хранения
Содержание (%) PK-0051
обращенно-фазовая ВЭЖХ
ионообменная ВЭЖХ
Тестируемая композиция 185PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)/лактит (коэффициент осмотического давления 1)), (0,1 мг/мл)
25°C
Начало хранения
102,18
102,70
1 неделя
102,37
101,06
2 недели
101,12
102,50
40°C
Начало хранения
102,18
102,70
1 неделя
103,15
101,60
2 недели
101,84
101,04
60°C
Начало хранения
102,18
102,70
1 неделя
102,63
101,45
2 недели
101,62
100,04
автоклав105°C
Начало хранения
102,18
102,70
5 мин
100,15
100,79
15 мин
99,01
98,17
автоклав121°C
Начало хранения
102,18
102,70
5 мин
95,54
96,00
15 мин
90,80
87,74
Таблица 15
Термальная стабильность PK-0051 в 0,05 M цитратном буфере (pH 6,0)/D-сорбит (коэффициент осмотического давления 1)
Образец
Температура хранения или температура обработки в автоклаве
Период хранения
Содержание (%) PK-0051
обращенно-фазовая ВЭЖХ
ионообменная ВЭЖХ
Тестируемая композиция 186PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)/D-сорбит (коэффициент осмотического давления 1)), (0,1 мг/мл)
25°C
Начало хранения
101,42
102,53
1 неделя
101,93
100,91
2 недели
102,21
99,73
40°C
Начало хранения
101,42
102,53
1 неделя
102,16
101,24
2 недели
101,99
102,88
60°C
Начало хранения
101,42
102,53
1 неделя
102,01
100,98
2 недели
100,04
99,18
автоклав105°C
Начало хранения
101,42
102,53
5 мин
99,66
100,91
15 мин
98,05
96,94
автоклав121°C
Начало хранения
101,42
102,53
5 мин
95,35
94,84
15 мин
90,10
85,32
Таблица 16
Термальная стабильность PK-0051 в 0,05 M цитратном буфере (pH 6,0)/сахароза (коэффициент осмотического давления 1)
Образец
Температура хранения или температура обработки в автоклаве
Период хранения
Содержание (%) PK-0051
обращенно-фазовая ВЭЖХ
ионообменная ВЭЖХ
Тестируемая композиция 187PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)/сахароза (коэффициент осмотического давления 1)), (0,1 мг/мл)
25°C
Начало хранения
102,10
103,37
1 неделя
102,49
101,67
2 недели
101,15
102,00
40°C
Начало хранения
102,10
103,37
1 неделя
102,60
99,59
2 недели
102,90
101,39
60°C
Начало хранения
102,10
103,37
1 неделя
102,56
103,63
2 недели
101,52
101,59
автоклав105°C
Начало хранения
102,10
103,37
5 мин
100,44
101,87
15 мин
99,24
96,84
автоклав121°C
Начало хранения
102,10
103,37
5 мин
95,52
95,98
15 мин
90,15
87,35
Таблица 17
Термальная стабильность PK-0051 в 0,05 M цитратном буфере (pH 6,0)
Образец
Температура хранения или температура обработки в автоклаве
Период хранения
Содержание (%) PK-0051
обращенно-фазовая ВЭЖХ
ионообменная ВЭЖХ
Тестируемая композиция 188PK-0051 (0,05 M цитратный буфер (pH 6,0)), (0,1 мг/мл)
25°C
Начало хранения
101,72
100,97
1 неделя
102,32
101,09
2 недели
102,98
103,16
40°C
Начало хранения
101,72
103,27
1 неделя
102,37
101,54
2 недели
102,67
101,55
60°C
Начало хранения
101,72
103,27
1 неделя
102,45
103,33
2 недели
102,07
101,72
автоклав105°C
Начало хранения
101,72
103,27
5 мин
100,51
100,92
15 мин
99,04
97,67
автоклав121°C
Начало хранения
101,72
103,27
5 мин
95,83
98,21
15 мин
89,65
87,45
Таблица 18
Термальная стабильность PK-0051 в NaCl (коэффициент осмотического давления 1)
Образец
Температура хранения или температура обработки в автоклаве
Период хранения
Содержание (%) PK-0051
обращенно-фазовая ВЭЖХ
ионообменная ВЭЖХ
Тестируемая композиция 189PK-0051(NaCl (коэффициент осмотического давления 1)), (0,1 мг/мл)
25°C
Начало хранения
101,19
102,38
1 неделя
101,13
100,86
2 недели
101,98
101,07
40°C
Начало хранения
101,19
102,38
1 неделя
101,71
101,30
2 недели
101,89
100,17
60°C
Начало хранения
101,19
102,38
1 неделя
99,57
100,41
2 недели
95,09
91,67
автоклав105°C
Начало хранения
101,19
102,38
5 мин
95,59
96,12
15 мин
93,82
94,94
автоклав121°C
Начало хранения
101,19
102,38
5 мин
78,25
75,92
15 мин
62,71
58,85
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
В соответствии с настоящим изобретением, одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты PK-0051, способную ингибировать экспрессию TGF-β1, можно стабильно хранить в растворенном состоянии при температуре окружающей среды в течение длительного срока. Таким образом, настоящее изобретение чрезвычайно полезно тем, что оно позволяет иметь фармацевтический препарат на основе нуклеиновой кислоты, который удобно хранить и транспортировать, который не нуждается в повторном растворении для использования и чрезвычайно прост в обращении.
Данная заявка основана на патентной заявке № 2015-215207, поданной в Японии (дата подачи: 30 октября 2015 г.), полное содержание которой включено в настоящий документ.