СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРИМОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ИНТЕРФЕРОНА БЕЗ ДЕНАТУРИРОВАНИЯ

1. Способ получения рекомбинантного белка интерферона I типа, причем упомянутый способ включает:
экспрессию рекомбинантного белка интерферона культивированием клетки-хозяина Pseudomonas или E.coli, содержащей экспрессионную конструкцию, причем упомянутая экспрессионная конструкция содержит нуклеиновую кислоту, содержащую кодирующую последовательность для интерферона I типа, которая была оптимизирована для экспрессии в клетке-хозяине;
лизис культиворованной клетки-хозяина;
получение нерастворимой фракции и растворимой фракции из лизированной клетки-хозяина;
экстрагирование нерастворимой фракции подверганием ее неденатурирующим условиям экстракции, причем упомянутые неденатурирующие условия экстракции включают цвиттерионный детергент или октилглюкопиранозид; и
получение осадка экстракта и супернатанта экстракта из экстрагированной нерастворимой фракции;
причем рекомбинантный белок в супернатанте экстракта присутствует в растворимой форме, активной форме или их комбинации, без необходимости осуществления дополнительной стадии его ренатурации или рефолдинга.
2. Способ по п.1, в котором кодирующая последовательность для интерферона I типа является функционально связанной с производным промотора lac, причем культивирование включает:
600
выращивание клетки-хозяина при температуре от около 25°C до около 33°C и при значении рН от около 5,7 до около 6,5, до значения OD, равного от около 80 до около 160, и
индукцию клетки-хозяина IPTG в концентрации, равной от около 0,08 мМ до около 0,4 мМ.
3. Способ по п.1, в котором цвиттерионный детергент представляет собой Zwittergent 3-08, Zwittergent 3-10, Zwittergent 3-12, Zwittergent 3-14 или CHAPS.
4. Способ по п.3, в котором неденатурирующие условия экстракции включают от около 0,5% до около 2% Zwittergent 3-14.
5. Способ по п.1, в котором неденатурирующие условия экстракции дополнительно включают хаотропный агент и космотропную соль.
4
2
4
6. Способ по п.5, в котором хаотропный агент представляет собой мочевину или гидрохлорид гуанидина, и в котором космотропная соль представляет собой NaCl, KCl или (NH)SO.
7. Способ по п.1, в котором неденатурирующие условия экстракции включают: от около 0,5 до около 2% Zwittergent 3-14; от около 0 до около 2М мочевины; от около 0 до около 2М NaCl, и в котором значения рН составляют от около 6,5 до около 8,5.
8. Способ по п.7, в котором неденатурирующие условия экстракции включают: около 1% Zwittergent 3-14; около 2М мочевины; около 2М NaCl; и в котором значение рН составляет около 8,2.
9. Способ по п.1, в котором неденатурирующие условия экстракции дополнительно включают от около 1% до около 40% масс./об. твердых веществ.
10. Способ по п.9, в котором неденатурирующие условия экстракции дополнительно включают около 5% масс./об. твердых веществ.
11. Способ по п.1, в котором рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-β, интерферон-α, интерферон-κ или интерферон-ω.
12. Способ по п.11, в котором рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-β, и в котором упомянутый интерферон-β выбирают из группы, состоящей из: человеческого интерферона-β 1b и человеческого интерферона-β 1b C17S, или в котором рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-α, и в котором интерферон-α выбирают из группы, состоящей из: человеческого интерферона-α 2а и человеческого интерферона-α 2b.
13. Способ по п.1, дополнительно включающий измерение количества рекомбинантного белка интерферона I типа в образце нерастворимой фракции, причем упомянутый образец нерастворимой фракции получен до экстрагирования нерастворимой фракции, и измерение количества рекомбинантного белка интерферона I типа в образце супернатанта экстракта, причем упомянутый образец супернатанта экстракта получен после экстрагирования нерастворимой фракции, причем количество рекомбинантного белка интерферона, обнаруженное в образце супернатанта экстракта, полученном после экстрагирования нерастворимой фракции, составляет от около 10% до около 95% количества рекомбинантного белка интерферона, измеренного в образце нерастворимой фракции, полученном до экстрагирования нерастворимой фракции.
14. Способ по п.1, дополнительно включающий измерение активности рекомбинантного белка интерферона I типа в образце супернатанта экстракта, причем упомянутый образец супернатанта экстракта получен после экстрагирования нерастворимой фракции, в котором определяется, что от около 40% до около 100% рекомбинантного белка, присутствующего в образце супернатанта экстракта, полученном после экстрагирования нерастворимой фракции, является активным, или в котором от около 75% до около 100% рекомбинантного белка, присутствующего в образце супернатанте экстракта, полученном после экстрагирования нерастворимой фракции, является активным при сравнении с колчеством активного белка интерферона в стандартном образце, содержащем то же самое количество рекомбинантного белка интерферона, что и образец супернатанта экстракта, полученный после экстрагирования нерастворимой фракции.
15. Способ по п.1, в котором рекомбинантный белок представляет собой интерферон-β, и в котором количество активного рекомбинантного белка определяется аффинной хроматографией на колонке с Blue Sepharose, анализом связывания с рецептором, анализом противовирусной активности или анализом цитопатического эффекта.
16. Способ по п.1, в котором рекомбинантный белок интерферон I типа в супернатанте экстракта присутствует в концентрации, составляющей от около 0,3 г/л до около 10 г/л.
17. Способ по п.1, в котором клетка-хозяин представляет собой штамм с делецией Lon протеазы и протеазы hslUV.
18. Способ по п.1, в котором интерферон I типа экспрессируется в цитоплазме клетки-хозяина.
19. Способ по п.12, в котором интерферон I типа представляет собой человеческий интерферон-β 1b или человеческий интерферон-β 1b C17S, и в котором человеческий интерферон-β 1b или человеческий интерферон-β 1b C17S экспрессируется в цитоплазме клетки-хозяина.