СПОСОБ ОЦЕНКИ МЕТАСТАТИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ СИГНАЛЬНОГО ЛИМФАТИЧЕСКОГО УЗЛА ПРИ РАННИХ ФОРМАХ ПЛОСКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ПОЛОСТИ РТА
METHOD FOR ASSESSING METASTATIC INVOLVEMENT OF SIGNALLING LYMPH NODE IN EARLY FORMS OF SQUAMOUS CELL CARCINOMA OF ORAL CAVITY

Изобретение относится к медицине, а именно, к способам патоморфологической оценки метастатического поражения, и может быть использовано для оценки метастатического поражения сигнального лимфатического узла при ранних формах плоскоклеточного рака полости рта.
Оценка метастатического поражения сигнального лимфатического узла при раннем плоскоклеточном раке полости рта позволяет оценить общую и безрецидивную выживаемость пациентов и необходимость выполнения радикальной шейной лимфодиссекции.
Известен способ оценки метастатического поражения сигнального лимфатического узла при ранних формах плоскоклеточного рака полости рта при помощи световой микроскопии с использованием стандартной окраски гематоксилином и эозином путем визуальной оценки в процентах врачом-патологоанатомом (Denoth S, Broglie MA, Haerle SK, Huber GF, Haile SR, Soltermann A, Jochum W, Stoeckli SJ. Histopathological mapping of metastatic tumor cells in sentinel lymph nodes of oral and oropharyngeal squamous cell carcinomas. Head Neck. 2015 Oct; 37(10): 1477-82.). С целью уточнения гистогенеза опухоли, а также определения прогностических и предиктивных биомаркеров в сигнальном лимфатическом узле используется иммуногистохимический метод анализа.
Недостатком визуальной оценки иммуногистохимических маркеров в сигнальном лимфатическом узле является ее субъективность и низкая воспроизводимость количественных показателей между патологоанатомами.
Известен способ оценки метастатического поражения сигнального лимфатического узла при ранних формах плоскоклеточного рака полости рта, который заключается в исследовании лимфатического узла с использованием серийно-ступенчатых срезов, и применении иммуногистохимического исследования с панцитокератином (АЕ1/АЕ2) с последующей оценкой наличия метастатического поражения патологоанатомом методами световой микроскопии (Протокол исследования сигнального лимфатического узла в многоцентровом рандомизированном исследовании SENT - (Schilling С, Stoeckli SJ, Haerle SK et al. Sentinel European Node Trial (SENT): 3-year results of sentinel node biopsy in oral cancer. Eur J Cancer. 2015 Dec;51(18):2777-84. doi: 10.1016/j.ejca.2015.08.023. Epub 2015 Nov 18).). Этот способ является наиболее близким аналогом.
Недостатками данного способа является отсутствие количественной оценки иммуногистохимического исследования, а также его низкая воспроизводимость.
Техническим результатом изобретения является возможность количественной оценки биомаркеров Ki67 и CD49, повышающей диагностическую точность способа, повышение воспроизводимости способа.
Указанный технический результат достигается в способе оценки метастатического поражения сигнального лимфатического узла при ранних формах плоскоклеточного рака полости рта, включающем выполнение серийно-ступенчатых срезов сигнального лимфатического узла с последующим иммуногистохимическим исследованием, в котором срезы толщиной 5 микрометров окрашивают с использованием гематоксилина и эозина, проводят иммуногистохимическое исследование с применением антител к белкам Ki-67 и CD49, полученные окрашенные микропрепараты сканируют в цифровое изображение высокого разрешения, проводят цифровой анализ изображений с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом, оценивают индекс Ki-67 как количество позитивно-окрашенных ядер на 1 квадратный миллиметр ткани лимфатического узла, индекс CD49 - количество позитивно-окрашенных мембран опухолевых клеток на 1 квадратный миллиметр ткани лимфатического узла, клеточную плотность опухолевой ткани - количество опухолевых клеток на 1 квадратный миллиметр ткани лимфатического узла и наличие количественных показателей больше нуля оценивают как наличие метастатического поражения сигнального лимфатического узла.
Цифровое сканирование окрашенных микропрепаратов в высоком разрешении при помощи специализированного программно-аппаратного комплекса (QuPath (Bankhead, P. et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Scientific Reports (2017). https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5) позволяет произвести объективную оценку метастатического поражения сигнального лимфатического узла при ранних формах плоскоклеточного рака полости рта, повышает воспроизводимость оценки иммуногистохимических биомаркеров Ki-67 и CD49, позволяет оценить количественно клеточную плотность опухолевой ткани.
Цифровая количественная оценка иммуногистохимических маркеров Ki67 и CD 49 в сигнальном лимфатическом узле может быть использована как прогностический и предиктивный показатель.
Изобретательский уровень способа заключается в иммуногистохимической оценке сигнального лимфатического узла при помощи маркеров ki-67 и CD49 и их количественной цифровой оценки.
Заявляемый способ применяется только для исследования сигнального лимфатического узла, который не содержит метастазов по данным ультразвукового исследования, магнитно-резонансной томографии.
При исследовании врачом-патоморфологом существует вероятность пропуска метастаза ввиду его малых размером и низкой клеточной плотности при использовании световой микроскопии.
При количественном анализе цифровой показатель выше О свидетельствует о наличии метастаза в сигнальном лимфатическом узле.
Способ иллюстрируется фигурой, где изображен микропрепарат сигнального лимфатического узла. Окраска Ki-67. Увеличение 50. Цифровое изображение с количественным анализом; 1 - клетки плоскоклеточного рака; 2 - стромальные элементы; 3 - ткань лимфоузла; 4 - различные артефакты либо отсутствие ткани на стекле, не учитывается при анализе. Опухолевая ткань - 50,64%. Иммунные клетки - 29,46%. Клетки стромы - 28,3%. Артефакты - 1,7%.
Способ осуществляют, например, следующим образом.
Сигнальный лимфатический узел фиксируют в течение 24 часов в 10% нейтральном растворе формалина с последующим приготовлением парафинового блока и выполнением серийно-ступенчатых срезов в количестве 6 штук с толщиной среза 5 микрометров и окрашиванием с использованием гематоксилина и эозина, а также панели иммуногистохимических маркеров - антител к белкам Ki-67 и CD49 по общепринятой методике (Birner Р, Ritzi М, Musahl С, KnippersR, Gerdes J, Voigtlander T, et al. Immunohistochemical detection of cell growth fraction in formalin-fixed and paraffin-embedded murine tissue. Am J Pathol 2001; 158:1991-6.) с использованием стейнера, микротома и сканера 3DHistech.
Полученные окрашенные микропрепараты сканируют в цифровое изображение высокого разрешения при помощи специализированного программно-аппаратного комплекса (QuPath (Bankhead, P. etal. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Scientific Reports (2017). https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5). Цифровые изображения высокого разрешения подвергают цифровому анализу изображений с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом (QuPath (Bankhead, P. et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. ScientificReports (2017). https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5), позволяющего получить количественное содержание иммуногистохимических маркеров (Ki-67, CD49) с оценкой клеточной плотности опухолевой ткани.
Сущность способа подтверждается клиническим примером.
Пациент Г. 58 лет с клиническим диагнозом рак правой боковой поверхности языка cT2N0M0. Морфологическая верификация: высокодифференцированный ороговевающий плоскоклеточный рак. Для клинического стадирования опухоли языка использовались следующие методы исследования: ультразвуковое исследование лимфатических узлов шеи, магнитно-резонансная томография мягких тканей и лимфатических узлов, компьютерная томография органов грудной полости, брюшной полости и малого таза с внутривенным контрастированием.
С целью изучения лимфооттока от первичной опухоли языка пациенту выполнена однофотонная-эмиссионная томография, совмещенная с компьютерной томографией с целью визуализации и картирования сигнальных лимфатических узлов. По данным исследования отмечается накопление радиофармпрепарата в лимфатических узлах IIa-IIb-IIIсправа.
Интраоперационно при помощи гамма-зонда выполнена детекция сигнальных лимфатических узлов, накапливающих радиофармпрепарат и их хирургическое удаление с последующим патоморфологическим исследованием и количественным цифровым анализом микропрепаратов по предложенной методике (фиг.). Средняя плотность опухолевых клеток составила 190 на 1 кв. мм - 190 окрашенных Ki67 позитивно.
Всего обследовано 20 пациентов с клинически негативными лимфатическими узлами. У 4 из них отмечена положительная окраска на Ki67 и CD49, данные представлены в табл.
Использование заявляемого способа патоморфологического исследования с цифровым количественным анализом изображения позволяет получить данные оценки метастатического поражения сигнального лимфатического узла, обладающие большей воспроизводимостью, что позволяет повысить точность диагностики как в клинической практике, так и при проведении научных исследований.