Особенности люминол- и люцигенин-зависимой хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов у больных хроническим риносинуситом

Медицинская иммунология 2010, Т. 12, № 4-5, стр. 437-440 © 2010, СПб РО РААКИ

Краткие сообщения

ОСОБЕННОСТИ ЛЮМИНОЛ-И ЛЮЦИГЕНИН-ЗАВИСИМОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ РИНОСИНУСИТОМ

Коленчукова О.А.1, Савченко А.А.2, Смирнова С.В.1

1 Лаборатория молекулярно-клеточной физиологии и патологии НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН, г. Красноярск

2 Институт фундаментальной биологии и биотехнологии Сибирского Федерального Университета, г. Красноярск

Резюме. Проведено исследование особенностей функциональной активности нейтрофильных гра-нулоцитов при люминол- или люцигенин-зависимой хемилюминесценции у больных хроническим риносинуситом. Обнаружено увеличение скорости образования активных форм кислорода (АФК) как при спонтанной, так и при зимозан-индуцированной хемилюминесцентной реакции, где в качестве активатора участвует люминол и определяется суммарная функциональная активность нейтрофилов. В тоже время в хемилюминесцентном процессе, активатором которой является люцигенин, отвечающий за образование супероксидного анион-радикала обнаружена замедленная реакция образования АФК как при спонтанном, так и при зимозан-индуцированом ответе. Можно утверждать, что при исследуемом патологическом процессе реакция формирования активных радикалов кислорода в нейтрофильных гранулоцитах идет в большей степени по миелопероксидазному пути.

Ключевые слова: нейтрофильные гранулоциты, люминол, люцигенин, активные формы кислорода, риносинусит.

Kolenchukova O.A., Savchenko A.A., Smirnova S.V.

FEATURES OF LUMINOL- AND LUCIGENIN-INDUCED CHEMILUMINESCENCE

of neutrophilic granulocytes in patients with chronic rhinosinusitis

abstract. Studies of functional activity of neutrophilic granulocytes from patients with chronic rhinosinusitis was performed using luminol- or lucigenin-dependent chemiluminescence. We have revealed increased production of reactive oxygen species

Keywords: neutrophilic granulocytes, luminol, lucigenin, reactive oxygen species, rhinosinusitis.

Адрес для переписки:

Коленчукова Оксана Александровна ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН 660022, Красноярск, ул. Партизана Железняка, 3Г. Тел.: (391) 228-06-83.

Факс: (391) 228-06-83.

E-mail: kalina-chyikova@mail.ru; aasavchenko@yandex.ru

Введение

Одним из первых этапов при взаимодействии организма с чужеродным объектом являются реакции так называемого «неспецифического иммунитета», в частности «дыхательный взрыв». Под этим термином понимают резкое увеличение потребления

437

Коленчукова О.А. и др.

Медицинская Иммунология

кислорода за счет преобразования его в активные формы кислорода клетками-фагоцитами [2, 4].

Фагоцитоз является одной из главных систем защиты организма от чужеродных агентов и играет важную роль при гнойно-воспалительных заболеваниях, особенно при бактериальной инфекции [1, 6]. Несомненным преимуществом является применение в хемилюминесцентной реакции зимозана в качестве неспецифического индуктора дыхательного взрыва, который представляет собой вещество бактериальной природы (полисахарид, получаемый из культуры Saccharomyces cerevisiae) [1, 10].

Выделение активных форм кислорода (АФК) направлено на уничтожение чужеродных объектов, при этом, недостаточное образование АФК может свидетельствовать о слабости защитных сил организма [2, 5]. Таким образом, способность нейтрофильных гранулоцитов образовывать достаточное количество АФК может служить прогностическим признаком для оценки дальнейшего хода воспалительного процесса, а ответ на стандартный стимул может характеризовать активность защитных сил организма [3, 7, 9].

Существуют различные способы оценки образования АФК. Одним из наиболее чувствительных является хемилюминесцентный метод, особенно после открытия активаторов хемилюминесценции (ХЛ), из которых наиболее широко используются люминол и люцигенин. Известно, что существует химическая специфичность активаторов: люминол вступает в реакцию с АФК образуемыми различными ферментами, а люцигенин — только с супероксидным анион-радикалом [2, 8].

Таким образом, целью данного исследования явилась оценка люминол- и люцигенин-зависимой хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов у больных хроническим риносину-ситом.

Материалы и методы

Под наблюдением находились 70 больных с обострением хронического верхнечелюстного риносинусита (ХРС) в возрасте от 18 до 45 лет. Контрольную группу составили 100 практически здоровых людей аналогичного возрастного диапазона.

Функциональную активность нейтрофиль-ных гранулоцитов оценивали с помощью хемилюминесцентного метода по методу De Sole P. et al. (1983). Из венозной крови обследуемого пациента выделяли нейтрофильные гранулоци-ты. Для этого к 5 мл крови с гепарином добавляли 1 мл полиглюкина и инкубировали в тече-

ние 30 мин при 37 °С для ускорения осаждения эритроцитов. Надосадочную жидкость наслаивали на двойной градиент плотности фиколл-верографин (р = 1,077 для выделения популяции лимфоцитов; р = 1,199 для выделения популяции нейтрофильных гранулоцитов) и центрифугировали при 400 g в течение 45 минут. При контроле морфологического состава лейкоцитарных взвесей определяют чистоту выхода нейтрофиль-ных гранулоцитов, которая составляла 97%. Полученную суспензию нейтрофильных грануло-цитов дважды отмывали в растворе Хенкса без фенолового красного по 10 мин при 400 g. Супернатант сливали, оставшиеся нейтрофильные гранулоциты разводили в 1 мл раствора Хенкса и получали взвесь. Подсчитывали количество нейтрофильных гранулоцитов в камере Горяева. Для хемилюминесцентного анализа использовали 2 x 106 клеток. Измеряли величину спонтанной хемилюминесценции (СХЛ) нейтрофилов, которая характеризует базальный уровень активации этих клеток. Для определения резервных возможностей активации нейтрофилов осуществляли стимуляцию кислородного метаболизма посредством добавления к ним опсонизированного зимозана. Опсонизированнй зимозан готовили следующим образом: сливную свежую гепари-незированную кровь полученную от 40 здоровых доноров, имеющих IV группу крови и (-) резус фактор, центрифугировали в течение 5 мин при 500 g, забирали плазму в отдельную пробирку. Затем к 60 мг зимозана добавляли 7 мл плазмы и 7 мл раствора Хенкса, тщательно суспензировали, инкубировали в течение 60 мин в термостате при 37 °С, встряхивая через каждые 5 мин. Затем отмывали центрифугированием по 5 мин при 400g 3 раза, отбирая надосадочную жидкость. К отмытой надосадочной жидкости добавляли 30 мл раствора Хенкса и отбирали необходимое количество опсонизированного зимозана для хемилюминесцентной реакции.

В качестве усилителей люминесценции использовали люминол и люцигенин. Люминол-усиленная хемилюминесценция регистрировала весь пул АФК и отражала суммарную активность миелопероксидазы и NADPH-оксидазы и др., а люцигенин-усиленная хемилюминесценция измеряла образование супероксидного анионрадикала (^О2_) и оценивала активность NADPH-оксидазы.

Оценка спонтанной и индуцированной хемилюминесценции осуществлялась в течение 90 минут на 36-канальном хемилюминесцентном анализаторе «CL3604» (Россия). Определяли сле-

438

2010, Т. 12, № 4-5 Особенности нейтрофильных гранулоцитов у больных хроническим риносинуситом

ТАБЛИЦА 1. ПОКАЗАТЕЛИ ЛЮМИНОЛ-ЭАВИСИМОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ риносинусИТОм

Показатели Контроль n = 100 ХРС n = 70 Р

Хемилюминесценция спонтанная

Tmax,

Imax, (о.е. х 103) 13,1 (3,1; 14,9) 27,7 (6,9;38,4) р < 0,001

S1 (о.е. х 103) 513,8 (110; 565,5) 2839,4 (194; 4730) р < 0,001

Хемилюминесценция, индуц ированная зимозаном

Tmax

Imax (о.е. х 103) 24,8 (6,2; 26,5) 42,2 (12,5; 68,9) р < 0,001

S2 (о.е. х 103) 652,3 (171; 971) 4292,8 (469; 4560) р < 0,001

ИА 2

дующие характеристики: время выхода на максимум (Tmax), максимальное значение интенсивности (Imax), площадь кривой (S2). Усиление ХЛ, индуцированной зимозаном, оценивали отношением площади индуцированной ХЛ к площади спонтанной ХЛ и определяли как индекс активации (ИА). Регистрация результатов и управление хемилюминесцентным анализатором осуществлялась через компьютер.

Результаты и обсуждение

Изучение параметров хемилюминесценции у больных ХРС выявило увеличение скорости максимального образования АФК как при спонтанной, так и при зимозан-индуцированной хемилюминесцентной реакции, где в качестве активатора участвует люминол и регистрируется весь пул АФК и отражается суммарная активность ферментов синтезирующих АФК относительно группы контроля. Так, происходит увеличение интенсивности и площади под кривой при спонтанном и зимозан-индуцированном хемилюминесцентном процессе относительно лиц контрольной группы (табл. 1).

Таким образом, на фоне базовой повышенной функциональной активности дополнительная стимуляция «респираторного взрыва» нейтрофилов опсонизированным зимозаном приводит к соответствующему увеличению продукции АФК нейтрофильными гранулоцитами крови, что отражает повышенные резервные метаболические возможности данной клеточной популяции больных ХРС.

Изучение параметров спонтанной и зимозан-индуцированной люцигенин-зависимой хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов крови позволило обнаружить у больных ХРС статистически значимое замедление реакции образования АФК, по сравнению с аналогичными параметрами здоровых людей (табл. 2). Так при спонтанной и зимозан-индуцированной ХЛ происходит снижение времени выхода на пик. Что свидетельствует о снижении скорости образования супероксидного анион радикала (О2-) и таким образом низкой активности NADPH-оксидазы.

При сравнительном анализе люминол-и люцигенин-зависимой хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов крови у больных ХРС и лиц контрольной группы обнаружено, что интенсивность люминол-зависимой реакции зна-

таблица 2. показатели люцигЕнин-зАвисимой хемилюминесценции нейтрофилов крови у больных хроническим риносинуситом

Показатели Контроль n = 100 ХРС n = 70 Р

Хемилюминесценция спонтанная

Tmax, (сек.) 2781,6 (2010;3791) 1804 (1006,5;2537) р < 0,001

Imax,

S1,

Хемилюминесценция, индуцированная зимозаном

Tmax, (сек.) 2227,5 (1651;2722) 1797 (1272;2244) р < 0,05

Imax,

S2,

ИА 3,2

439

Коленчукова О.А. и др.

Медицинская Иммунология

чительно выше люцигенин-зависимого хемилюминесцентного процесса. Можно утверждать, что при хроническом риносинусите основную функцию формирования активных радикалов кислорода в нейтрофильных гранулоцитах берет на себя миело-пероксидаза. Известно, что формирование супероксидных радикалов связано с мембранной NADPH-оксидазой. Источником NADPH в нейтрофильных гранулоцитах является преимущественно гексозо-монофосфатный путь окисления углеводов. Кроме того, значительную роль в формирования активных радикалов кислорода в нейтрофилах играет миело-пероксидазный путь. Люминол-усиленная ХЛ формируется в основном системе миелопероксидазы и отражает суммарную активность кислородных и других радикалов, люцигенин окисляется и люми-несцирует под влиянием преимущественно супероксидного аниона [4, 10]. Необходимо заметить что, миелопероксидазный путь формирования активных радикалов кислорода у нейтрофилов существенно превалирует над другими механизмами, отсюда и выявляется наибольший уровень люминол-зависимой хемилюминесцентной активности клеток.

Заключение

В результате исследования функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов у больных ХРС хемилюминесцентным методом, в котором в качестве активатора участвует лю-минол выявлено увеличение интенсивности образования АФК как при спонтанной хемилюминесцентной реакции, так и в нагрузочных тестах относительно группы контроля. В случае, где активатором хемилюминесцентного процесса служит люцигенин и определяется активность только NADPH-оксидазы, обнаружено снижение интенсивности хемилюминесцентной реакции в спонтанных и зимозан индуцированных тестах. Таким образом, можно с уверенностью отметить, что при хроническом риносинусите формирование свободных форм кислорода в нейтрофиль-ных гранулоцитах идет в большей степени по ми-елопероксидазному пути.

Список литературы

1. Грачева Т.А., Бондарев В.П., Дармов И.В., Нестеров Г.Н. Способ диагностики специфической сенсибилизации организма человека к бактериальным антигенам по показателям хемилюминесцентного свечения нейтрофилов // Иммунология. - 2007. - № 5. - С. 297-299.

2. Грачева Т.А. Совершенствование хемилюминесцентного метода исследования функциональной активности фагоцитирующих клеток // Клиническая лабораторная диагностика. -2008. - № 2. - С. 54-55.

3. Попов Н.Н., Огнивенко Е.В., Романова Е.А. Особенности функционирования системы фагоцитарных клеток больных верхнечелюстным синуситом, страдающим сахарным диабетом // Медицинская иммунология. - 2008. - Т. 10. -№ 2-3. - С. 145-150.

4. Рудой Б.А., Грачева ТА., Рассанов В.П., Медведев Н.П. Использование метода регистрации хемилюминесценции нейтрофилов для оценки сенсибилизации лабораторных животных, иммунизированных бруцеллезной вакциной // Иммунология. - 2005. - № 3. - С. 191-193.

5. Тарасов А.А., Каманин Е.И., Крюков А.И., Страчунский Л.С. Острый бактериальный рино-синусит: современные подходы к диагностике и антимикробной терапии в амбулаторных условиях // Вестник оториноларингологии. - 2003. -№ 2. - С. 46-54.

6. Тюрин-Кузьмин А.Ю. Ячейка для хемилюминесцентного анализа взаимодействия клеток крови с макроскопической твердой поверхностью // Клиническая лабораторная диагностика. - 2007. - № 6. - С. 36-39.

7. Саидов М.З., Джамалудинов Ю.А., Даудов Х.Ш., Нажмудинов И.И. Изучение состояния макрофагального звена местного иммунитета у часто болеющих детей с патологией ЛОР-органов // Иммунология. - 2007. - № 5. - С. 303-307.

8. Швыдченко И.Н., Нестерова И.В., Синельникова Е.Ю. Цитосекретирующая функция нейтрофильных гранулоцитов // Иммунология. - 2005. - № 1. - С. 31-34.

9. Prestwich R.J., Errington F., Hatfield Р, Roodman D.G. The immune system - is it relevant to са^ег development, progression and treatment? // Clin. Oncol. (R. Coil. Radiol.). - 2008. - Vol. 20. -Р. 101-112.

10. Schins R.RF., Вот RJ.A., Van Schooten F. J Neutropihis and respiratory tract DNA damage and mutagenesis: а review // Mutagenesis. - 2006. -Vol. 21. - Р. 225-236.

11. Stewart XJ., Greeneltch К.М, Lutsiak М.Е., Abrams S. I. Immu^^^l responses саn hаvе both рш- and аntitumоr еffects: трИсаТош for immunotherapy // Expert. Rev. Мо1. Med. - 2007. -W. 9. - Р 1-20.

12. Viola А., Bronte V Metabolic mechanisms оf cancer-induced inhibition of immune responses // Semin. Саnсеr Biol. - 2007. - W. 17. - Р 309-316.

13. Yamashita S., Suzuki А., Yanagita Т., Ueta Е., Osaki T Ana1ysis оf neutrophil proteins оf patients with Behcet's disease Ьу two-dimensiona1 gel electrophoresis // Biol. Рhаrm. Bull. - 2000. -Vol. 23. - Р 519-522.

поступила в редакцию 08.02.2010 отправлена на доработку 15.02.2010 принята к печати 02.03.2010

440