РЕКОМБИНАНТНЫЕ ОДНОДОМЕННЫЕ АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧЕСКИ СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛОК F4/80, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ЭТОГО БЕЛКА
RECOMBINANT SINGLE-DOMAIN ANTIBODIES SPECIFICALLY BINDING F4/80 PROTEIN, METHOD FOR PRODUCTION THEREOF AND USE FOR DETECTION OF SAID PROTEIN

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области молекулярной иммунологии, биотехнологии и медицины, а именно к получению рекомбинантных однодоменных наноантител (VHH), избирательно связывающих белок F4/80.
Уровень техники
Поверхностный клеточный гликопротеин F4/80 (мышиный гомолог человеческого EMR1) был идентифицирован в моноцитах, большинстве тканевых макрофагов, миелоидных дендритных клетках и эозинофилах мышей. Он принадлежит к семейству рецепторов EGF-TM7, которые закреплены в клеточной мембране с помощью 7 трансмембранных доменов, а также включают в себя большие внеклеточные участки, содержащие вариабельное количество NH2 терминальных EGF доменов [Hamann, J. et al., EMR1, the human homolog of F4/80, is an eosinophil-specific receptor. Eur J Immunol; 2007. P. 2797-2802. - EMR1, человеческий гомолог F4/80, эозинофил-специфического рецептора.]. Ген F4/80 находится в 17-й хромосоме и кодирует полипептид из 931 аминокислоты, который впоследствии процессируется, образуя зрелый белок из 904 аминокислот [McKnight, A.J. and Gordon, S. The EGF-TM7 family: unusual structures at the leukocyte surface. J Leukoc Biol; 1998. P. 271-280. - TEGF-TM7 Семейство белков TEGF-TM7: необычные структуры на поверхности лейкоцитов.].
Белок F4/80 привлекает особое внимание, в первую очередь, как мышиный макрофагальный маркер, конститутивно экспрессируемый в период эмбрионального развития и в течение взрослой жизни. Изучение белка F4/80 имело ключевое значение для характеристики системы мононуклеарных фагоцитов мышей и для обнаружения макрофагов в многочисленных исследованиях in vivo. Исследования последних лет продемонстрировали роль F4/80 в индукции толерантности [Lin, H.H. et al., The macrophage F4/80 receptor is required for the induction of antigen-specific efferent regulatory Τ cells in peripheral tolerance. J Exp Med; 2005. P. 1615-1625. - Рецептор макрофагов F4/80 необходим для индукции антиген-специфических эфферентных регуляторных Т-клеток в периферической толерантности.].
Имеются многочисленные данные, свидетельствующие о том, что белок EMR1, человеческий гомолог мышиного F4/80, является важным диагностическим маркером и мишенью для разработки новых терапевтических препаратов [Legrand, F. Et al., Eosinophil surface receptor EMR1: a novel therapeutic target for eosinophilic disorders. J Allergy Clin Immunol. 2014. P. 1439-1447. - Поверхностный рецептор эозинофилов EMR1: новая терапевтическая мишень для лечения заболеваний характеризующихся нарушением функции эозинофилов.]. Этот факт обосновывает актуальность и целесообразность исследований в этом направлении, в том числе, посредством разработки функциональных анализов на мышиных моделях.
В последние годы все большее внимание при создании новых диагностических и терапевтических препаратов для выявления и лечения многих болезней уделяется препаратам на основе антител, как правило, моноклональных классических антител. Антитело способно специфически связывать определенный антиген/белок, как свободный или находящийся в комплексе с другими молекулами, так и белок, оверэкспрессированный и локализующийся на поверхности клетки определенного типа. Такое связывание может блокировать важный биологический процесс, каскад, а также стимулировать иммунную систему пациента атаковать клетки, с которыми связалось антитело. Антитело может быть также средством специфической доставки других терапевтических молекул, субстанций или радиоизотопов. Наконец, возможно использование би- и поли-функциональных и многокомпонентных конструкций на основе получаемых антител или их производных.
В качестве ближайшего аналога технического решения, составляющего основу настоящего изобретения, можно привести следующий пример.
Патент US 20130064826 А1 "Anti-emr1 antibodies" - «Анти-emr1 антитела» от 14.03.2013.
В данном патенте заявлено получение моноклональных антител к определенному пептидному участку белка EMR1 (человеческий гомолог мышиного F4/80), а также использование этих антител для диагностики и для лечения EMR1-зависимых заболеваний человека.
Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по составу действующего вещества и способу его использования, выбрано авторами настоящего изобретения за прототип.
Недостатками прототипа являются:
- Относительно дорогостоящее производство антител, сложность поддержания и хранения продуцента, очень высокие требования к качеству используемых реактивов и условий культивирования.
- Относительно большой размер получаемых антител, что влечет за собой пониженную проницаемость тканей.
- Структурные особенности накладывают ограничение на узнавание некоторых «скрытых» эпитопов, находящихся, например, в углублениях, щелях малого размера в структуре белков.
- Ограниченность и относительная трудоемкость генно-инженерных манипуляций, адаптаций для конкретных задач, сложность создания многовалентных и многофункциональных производных заявленных антител.
Таким образом, в уровне техники существует потребность в разработке новых антител (антиген-узнающих молекул), лишенных указанных выше недостатков и специфически узнающих белок EMR1 и соответствующий ему гомолог мыши F4/80 (для функциональных анализов на мышиных моделях).
Задачей настоящего изобретения является создание новых антител, способных эффективно связывать гомолог белка EMR1 у мыши, известный как белок F4/80, получение этих антител, производство и хранение которых должно быть экономичным. Новые антитела должны быть эффективны и относительно просты; их размер должен быть в несколько раз меньше, чем у классических антител.
Техническая задача решается за счет того, что получены однодоменные наноантитела, специфически связывающие белок F4/80 мыши. При этом способ получения однодоменных наноантител к белку F4/80, включает в себя иммунизацию двугорбого верблюда (Camelus bactrianus) аффинноочищенным белком F4/80 мыши, получение библиотеки последовательностей, кодирующих наноантитела, системы селекции специфических наноантител с использованием фагового дисплея, продукцию наноантител в прокариотической системе экспрессии и очистку. А способ детекции белка F4/80 на поверхности клетки осуществляется с помощью использования наноантител.
В основе настоящего изобретения находятся не классические бивалентные антитела, которые рассматриваются в качестве прототипа, а малые однодоменные наноантитела, которые имеют ряд преимуществ, что позволяет предполагать большой потенциал их будущего использования в различных исследованиях и при создании новых биотехнологических устройств, а также в клинических целях для диагностики и лечения заболеваний. Поскольку наноантитела (молекулярная масса около 12-15 кДа) на порядок меньше по размеру традиционных классических антител, они приобретают ряд новых положительных качеств, имеющих практическую значимость. Наноантитела могут обладать новыми структурными особенностями, в принципе позволяющими им узнавать некоторые «скрытые» для обычных антител эпитопы.
Раскрытие изобретения
Способ получения однодоменных наноантител, связывающих антигенные эпитопы белка F4/80, включает следующие принципиальные этапы:
1) индукция образования специфических антител в результате иммунизации представителя семейства Верблюдовых (в частности, двугорбого верблюда) аффинноочищенным белком F4/80 мыши;
2) клонирование последовательностей антиген-узнающих доменов (наноантител) особых одноцепочечных антител, синтезирующихся в лимфоцитах иммунизированного животного, в фагмидном векторе (использующимся в последующей процедуре фагового дисплея), получение специфически обогащенной библиотеки последовательностей, кодирующих наноантитела;
3) селекция методом фагового дисплея (функционального отбора фаговых частиц, несущих на поверхности экспрессируемое наноантитело, а внутри - ДНК, кодирующую это наноантитело) клонов наноантител, связывающихся с заданным антигеном, белком F4/80, из полученной библиотеки наноантител;
4) проведение переклонирования и генно-инженерных модификаций кодирующих последовательностей отобранных наноантител с целью их эффективной наработки в бактериальной системе экспрессии и последующей эффективной очистки (в качестве продуцента действующего вещества используются бактерии E.coli).
В качестве антигена для иммунизации использовали специально синтезированную для этой цели внеклеточную часть белка F4/80 (номер в базе данных EXPASY Q61549). Рекомбинантный мышиный белок F4/80 был экспрессирован в клетках яичника китайского хомяка
Алгоритм получения рекомбинантного белка F4/80 включал в себя следующие этапы.
Клонирование ДНК
Внеклеточная часть F4/80 Ν- и С- терминально связанная с аффинной меткой была оптимизирована по составу кодонов для экспрессии белка в эукариотической системе. Полученная последовательность была синтезирована в GenScript (США) и субклонирована в вектор pOptiVec (Invitrogen). Плазмидную ДНК для трансфекции очищали с использованием набора Qiagen Plasmid Maxi kit, расщепляли с Sail и затем очищали с QIAquick DNA extraction kit. Линеаризованный вектор был использован для трансфекции клеток DG44 (Invitrogen), как описано ниже.
Клеточная культура DG44 и трансфекция
2
Клеточную культуру DG44 культивировали в колбах Эрленмейера в среде CD-DG44 (Gibco) с добавлением 8 мМ Glutamax-1 и гипоксантина и тимидина (HT) добавки в шейкере при 125 оборотах качалки в минуту, в увлажненном инкубаторе с 8% CO при 37°С. Перед трансфекцией клетки собирали центрифугированием и ресуспендировали в среде CHO-S SFMII (Invitrogen). Трансфекция была выполнена с PeiProTM (Polyplus Transfections) при плотности 4 млн. клеток в 1 мл (4M). Через шесть часов после трансфекции были добавлены три объема среды OptiCHO (Invitrogen) с HT добавкой после чего и клетки культивировали в течение еще 48 часов. Далее, среду заменяли на CD OptiCHO без HT; культуру выращивали в течение 4 недель, до достижения ею устойчивой жизнеспособности более 95%.
Получение стабильного клеточного пула
Полученные на предыдущем этапе клеточные пулы подвергали амплификации генов в присутствии 500 нМ метотрексата (Sigma). В процессе этого этапа селекции не наблюдалось видимых изменений в жизнеспособности клеток.
Полученная популяция клеток была использована для продукции белка, как описано ниже.
Продукция белка
Для продукции рекомбинантного белка клетки культивировали в среде CD OptiCHO medium, содержащей 20% Cell Boost5 (Hyclone). Клеточная культура была собрана через 6 дней при плотности клеток 8-9 млн. на мл. Клетки отделяли центрифугированием, супернатант фильтровали через фильтр 0.45 мкм и использовали для очистки белка.
Очистка белка
Кондиционированную среду наносили на колонку, содержащую CL-4B сефарозу с прикрепленными антителами. Затем носитель последовательно промывали 20 мМ Трис мМ 150 мМ NaCl, рН 7,5 (буфер А), 20 мМ Трис, 700 мМ NaCl, рН 7,5 (буфер В) и 5 мМ Трис, 150 мМ NaCl, рН 7,5 (буфер С). Связанный белок элюировали 0,1 M глицин рН 2,5, элюат сразу же нейтрализовали трис-буфером. Элюированный белок F4/80 хранили в аликвотах при -70°С. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически, при поглощении при 280 нм, против буфера элюции. Качество препарата проверяли с помощью денатурирующего электрофореза в ПААГ (ФИГ. 2).
Способ получения однодоменных наноантител описан в примерах 1 и 2. Возможность использования полученных наноантител для детекции белка F4/80 и их функциональные характеристики показаны в примерах 3-5.
Наноантитела (молекулярная масса около 12-15 кДа) на порядок меньше по размеру традиционных антител и являются полнофункциональными антиген-узнающими единицами, обладающими рядом новых положительных качеств практической значимости. Наноантитело представляет собой однодоменный белок, который хорошо растворим и обладает повышенной стабильностью (в широком диапазоне температур и рН). Это позволяет избегать проблем с растворимостью и правильным сворачиванием молекул антител при продукции прокариотическими клетками и ведет к существенному снижению затрат на их производство по сравнению с традиционными способами получения терапевтических моноклональных антител в эукариотических системах экспрессии. Существенно облегчается также процедура сохранения и транспортировки антител по сравнению с заметно менее стабильными традиционными антителами. Наноантитела позволяют легко проводить генно-инженерные манипуляции с целью последующей продукции биспецифических наноантител или химер, в состав которых помимо наноантитела входит другой белок с желаемыми свойствами.
В иллюстративных целях авторами настоящего изобретения делается акцент на продукции антител с использованием бактерии E.coli, однако очевидно, что существуют и другие варианты систем реализации настоящего изобретения, прямо не заявленные в настоящем документе. Например, в качестве эукариотического продуцента могут быть использованы дрожжевые культуры или любые другие системы, очевидные в данной области техники.
Выбор путей реализации с целью получения наноантител с заявляемыми свойствами из прокариотической системы экспрессии в соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения обусловлен следующими факторами:
1) Высокий экспрессионный выход, экономичность наработки в больших количествах, обеспечивающийся экспрессией наноантител в периплазму бактерий E.coli (в количестве 1-10 мг из 1 литра культуры).
2) Простота всевозможных генно-инженерных манипуляций, адаптаций для конкретных задач, возможность создания многовалентных и многофункциональных производных.
3) Высокая экономическая рентабельность производства.
Авторы настоящего изобретения исходят из того, что первичные, исходно получаемые последовательности однодоменных наноантител могут быть затем адаптированы или «форматированы» различным образом для последующего практического использования.
Так, однодоменные наноантитела могут быть исходными модулями (блоками) более сложных многомодульных препаратов. Возможно объединение в одном мультивалентном производном двух, трех и более моновалентных первичных однодоменных наноантител. Эти объединяемые в одну конструкцию однодоменные наноантитела могут связываться как с одним и тем же эпитопом антигена-мишени, так и с его разными эпитопами, или даже с различными антигенами-мишенями. Возможно также комбинированное объединение в одну конструкцию однодоменных наноантител и других молекул или лекарств с получением многофункциональных препаратов; мультимеризация с помощью введения дополнительных аминокислотных последовательностей, взаимодействующих белковых доменов, таких как лейциновые зипперы или последовательностей небольших белков, образующих стабильные комплексы. Для модулирования свойств препарата однодоменного наноантитела, например, увеличения времени жизни или совершенствования способа очистки, в состав конечного соединения могут быть введены дополнительные аминокислотные последовательности. Очевидно, что такие модификации и прочие варианты антител, лежащих в основе настоящего изобретения, подпадают под объем настоящего изобретения, поскольку являются структурными и функциональными вариантами однодоменных наноантител. Таким образом, авторы настоящего изобретения понимают под термином "однодоменные наноантитела" как первичные, исходно получаемые, "минимальные" аминокислотные последовательности однодоменных наноантител, так и их модификации, полученные в результате упомянутых адаптаций или «форматирования» и их варианты. Термин «вариант антитела» для целей настоящего изобретения означает полипептид, который содержит изменения в аминокислотной последовательности, а именно делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, при условии, что при этом сохраняется необходимый уровень активности белка, например, как минимум 10% от активности исходного однодоменного наноантитела. Ряд изменений в варианте белка зависит от положения или от типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Количество изменений может составлять, например, от 1 до 30, более предпочтительно, от 1 до 15, и наиболее предпочтительно, от 1 до 5 изменений в последовательности исходного однодоменного наноантитела. Эти изменения могут иметь место в областях полипептида, которые не являются критичными для его функции. Это становится возможным благодаря тому, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг с другом, и поэтому третичная структура или активность белка не нарушаются при таком изменении. Поэтому в качестве варианта белка может выступать белок, который характеризуется гомологией не менее 70%, предпочтительно, не менее 80%, более предпочтительно, не менее 90%, и наиболее предпочтительно, не менее 95% по отношению к аминокислотной последовательности исходного однодоменного наноантитела при условии сохранения активности полипептида. Гомология между аминокислотными последовательностями может быть установлена с использованием хорошо известных методов, например с помощью выравнивания последовательностей в компьютерной программе BLAST 2.0, которая вычисляет три параметра: счет, идентичность и сходство.
Полипептиды однодоменных наноантител согласно настоящему изобретению могут кодироваться большим множеством молекул нуклеиновых кислот, что является результатом хорошо известного в данной области техники явления вырожденности генетического кода. Суть феномена состоит в том, что любая аминокислота (за исключением триптофана и метионина), входящая в состав природных пептидов, может кодироваться более, чем одним триплетным нуклеотидным кодоном. Любая из этих вырожденных кодирующих молекул нуклеиновых кислот может входить в состав кассет, экспрессирующих антитела заявленные в соответствии с настоящим изобретением и подпадающих под объем настоящего изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Аминокислотные последовательности девяти отобранных однодоменных антител (наноантител), способных специфически связывать белок F4/80. В указанных последовательностях выделены и подчеркнуты гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3 (соответственно, слева направо, от N- к С-концу).
Фиг. 2. Результаты анализа белка F4/80 методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле.
Фиг. 3. Очищенные форматированные однодоменные антитела (одАТ), специфически узнающие белок F4/80, фракционированные в 14% SDS-полиакриламидном геле.
Фиг. 4. Результаты иммуноферментного анализа узнавания рекомбинантного белка F4/80, иммобилизованного в лунках иммунологической плашки, отобранными девятью однодоменными форматированными антителами (обозначены в нижней части рисунка под номером от 1 до 9). Контрольные лунки не содержали антиген, но далее были блокированы и процессированы параллельно с экспериментальными ячейками (с антигеном). Ось ординат соответствует данным поглощения в экспериментальных ячейках при длине волны 405 нм. Представлены усредненные результаты трех повторов данного анализа (с указанными диапозонами разброса полученных значений).
Фиг. 5. Анализ связывания девяти однодоменных форматированных наноантител (обозначены под номерами от 1 до 9) к F4/80 с поверхностью макрофагов методом проточной цитофлуориметрии.
Фиг. 6. Измерение константы связывания и диссоциации однодоменных антител против F4/80 с рекомбинантным белком F4/80 методом поверхностного-плазмонного резонанса.
На рисунке показаны сенсограммы, полученные в результате 5 взаимодействий для каждого из антител. Результаты анализировались с помощью ProteOn Manager Software (Bio-Rad) с использованием модели Ленгмюра. Для эксперимента использовались препараты биотинилированных однодоменных антител против F4/80, которые были иммобилизованы на NLC-чипе в концентрации 5 нМ. Антитела наносились при скорости 30 мкл/мин в объеме 150 мкл в вертикальной ориентации. Уровень иммобилизации антител составил 600-800 RU. После промывки 1М раствором хлорида натрия (100 мкл/мин, объем 50 мкл) ориентация была изменена на горизонтальную. Затем была проведена промывка фосфатно-солевым буфером, содержащим 0.005% Tween (100 мкл/мин, объем 10 мкл, диссоциация 3600 с) после чего установилась базовая линия. Затем также в горизонтальной ориентации был нанесен препарат рекомбинантных антител против белка F4/80 в фосфатно-солевом буфере в двукратно убывающих концентрациях 200 - 12.5 нМ.
Примеры осуществления настоящего изобретения
Пример 1
Получение библиотеки вариабельных доменов одноцепочечных антител
Иммунизация
Для генерирования однодоменных наноантител, специфически узнающих белок F4/80, была проведена 5-кратная подкожная иммунизация двугорбого верблюда (Camelus bactrianus). В качестве антигена для иммунизации использовали специально синтезированный для этой цели рекомбинантный белок F4/80, который был экспрессирован в эукариотической системе.
Препарат рекомбинантного белка F4/80 разделили на 6 равных частей по 0,5 мг (первые 5 частей - для 5 последовательных инъекций, а также оставили аликвоту для последующих этапов селекции и анализа заданных наноантител). Все аликвоты замораживали для хранения при -70°С. Перед проведением каждого этапа иммунизации одну из хранящихся при -70°С аликвот препарата размораживали и непосредственно перед инъекцией смешивали в равных пропорциях с адъювантом LQ (фирмы Gerbu, Heidelberg, Германия).
Перед 1-й иммунизацией от верблюда отбирали кровь для получения преиммунной сыворотки, которая впоследствии использовалась в качестве негативного контроля. Пятикратную иммунизацию проводили путем подкожных инъекций рекомбинантного белка F4/80, смешанного в равных пропорциях с адъювантом. Вторую иммунизацию проводили через 4 недели после первой, а последующие 3 с интервалом 10 дней. Отбор крови проводили через 5 дней после последней инъекции.
Для предотвращения свертывания взятой крови добавляли 50 мл стандартного фосфатно-солевого раствора (PBS), содержащего гепарин (50 ед./мл) и ЭДТА(2 мМ).
Кровь разводили в 2 раза раствором PBS, содержащим 1 мМ ЭДТА. 35 мл разбавленного раствора крови наслаивали на ступеньку специальной среды (Histopaque-1077, Sigma) с плотностью 1,077 г/мл объемом 15 мл и проводили центрифугирование в течение 20 мин при 800×g. Мононуклеарные клетки (лимфоциты и моноциты) отбирали из интерфазной зоны плазма/Histopaque, после чего промывали раствором PBS, содержащим 1 мМ ЭДТА.
Суммарную РНК из В-лимфоцитов выделяли с помощью реагента TRIzol (Invitrogen). Затем, на колонке с олиго(dT)-целлюлозой из тотальной РНК очищали поли(А)-содержащую РНК. Концентрацию РНК определяли с помощью биофотометра (Eppendorf) и проверяли качество выделенной РНК с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле с формальдегидом.
Реакцию обратной транскрипции проводили по стандартному протоколу [Sambrook et al., 1989] с использованием обратной транскриптазы HM-MuLV и праймера onnro(dT)15 в качестве затравки.
Продукты обратной транскрипции использовали в качестве матрицы в двухступенчатой полимеразной цепной реакции и полученные продукты амплификации клонировали по сайтам Ncol(Pstl) и Notl в плазмидный вектор pHEN4, как описано ранее [Hamers-Casterman С, Atarhouch Τ, Muyldermans S, et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature, 1993; 363: 446-448. - Существующие в природе антитела без легких цепей. Nguyen V.K., Desmyter Α., Muyldermans S. 2001. Functional heavy-chain antibodies in camelidae. Adv. Immunol. 79, 261-296. - Функциональные антитела, состоящие только из тяжелых цепей, у Верблюдовых.
Saerens D., Kinne J., Bosmans Ε., Wernery U., Muyldermans S., Conrath K. 2004. Single domain antibodies derived from dromedary lymph node and peripheral blood lymphocytes sensing conformational variants of prostate-specific antigen. J. Biol. Chem. 279, 51965-51972. - Однодоменные антитела, ведущие свое происхождение из лимфатического узла или лимфоцитов периферической крови верблюда, распознают конформационные варианты простата-специфического антигена.
Rothbauer U., Zolghadr K., Tillib S., Nowak D., Schermelleh L., Gahl Α., Backmann N., Conrath K., Muyldermans S., Cardoso M.C., Leonhardt L. 2006. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods. 3, 887-889. - Таргетирование и наблюдение антигенов в живых клетках с помощью флуоресцентных нанотел.].
Пример 2
Селекция однодоменных наноантител, специфически узнающих F4/80.
Селекцию однодоменных наноантител проводили методом фагового дисплея с использованием рекомбинантного белка F4/80, иммобилизованного на дне лунок 96-луночного ИФА-планшета. Использовали полистироловые иммунологические плашки с высокой сорбцией MICROLON 600 (Greiner Bio-One). Для блокировки использовали 1% БСА (Sigma-Aldrich, США) и/или 1% обезжиренное молоко (Bio-Rad, США) в PBS. Процедуру селекции и последующей амплификации отбираемых фаговых частиц повторяли последовательно три раза. Все манипуляции проводили, как описано в публикациях [Тиллиб С.В., Иванова Т.И., Васильев Л.А. 2010. Фингерпринтный анализ селекции «наноантител» методом фагового дисплея с использованием двух вариантов фагов-помощников. Acta Naturae 2010; 2 (3): 100-108. Hamers-Casterman С. et al. Nature. 363, 446-448. Nguyen V.K. et al. Adv. Immunol. 2001; 79: 261-296. Saerens D. et al. J Biol Chem. 2004; 279: 51965-51972. Rothbauer U. et al. Nature Methods 2006; 3: 887-889. (Подробное описание последних четырех ссылок было уже приведено выше)]. Последовательности клонов отобранных наноантител группировали по схожести их фингерпринтов, получаемых при электрофоретическом разделении продуктов гидролиза амплифицированных последовательностей однодоменных наноантител параллельно тремя частощепящими рестрикционными эндонуклеазами (Hinfl, Mspl, Rsal). Были определены последовательности кДНК однодоменных наноантител к F4/80. Из них были выведены соответствующие аминокислотные последовательности 9 клонов наноантител к F4/80 (SEQ ID ΝΟ: 1-9) (ФИГ.1).
Продукция наноантител
Последовательности кДНК девяти отобранных клонов наноантител переклонировали в экспрессионный модифицированный плазмидный вектор pHEN6 [Conrath KЕ, Lauwereys M, Galieni M, Matagne A, Frere JM, Kinne J, Wyns L, Muyldermans S. Betalactamase inhibitors derived from single-domain antibody fragments elicited in the Camelidae. Antimicrob Agents Chemother. 2001; 45:2807- 2812. - Ингибиторы бета-лактамазы, ведущие свое происхождение из однодоменных фрагментов антител Верблюдовых.], позволяющий присоединение к С-концу однодоменного нано-антитела (His)6-эпитопа. Благодаря наличию на N-конце экспрессируемой последовательности сигнального пептида (peIB) нарабатываемый рекомбинантный белок (однодоменное наноантитело) накапливается в периплазме бактерий, что позволяет эффективно его выделять методом осмотического шока, не разрушая собственно бактериальные клетки. Продукцию однодоменных наноантител проводили в Е.coli (штамм BL21). Экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ индолил-бета-D-галактопиранозида и клетки инкубировали при интенсивном перемешивании в течение 7 часов при 37°С или в течение ночи при 29°С. Однодоменное наноантитело выделяли из периплазматического экстракта с использованием аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе с использованием системы для очистки QIAExpressionist (QIAGEN, США).
На ФИГ. 3 представлена электорофореграмма полиакриламидного геля с наработанными и очищенными однодоменными антителами (одАТ), специфически узнающими белок F4/80.
Структура девяти однодоменных наноантител к F4/80 показана на ФИГ. 1. В указанных последовательностях выделены и подчеркнуты гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3 (соответственно, слева направо, от N- к С-концу).
Пример 3
Детекция рекомбинантного белка F4/80 с помощью отобранных клонов наноантител
Полученный в результате описанной процедуры периплазматический экстракт, содержащий мини-антитело с НА-тагом, использовали для оценки специфичности и эффективности связывания соответствующего мини-антитела с препаратом рекомбинантного белка-антигена с помощью метода иммунофлуоресцентного анализа.
В ячейки стандартной 96-луночной иммунологической плашки (из полистирола, Microlon 600 hi-binding, фирмы Greiner bio-one) наносили в объеме 50 мкл разбавленный (в PBS) до концентрации примерно 2 мкг/мл рекомбинантный белок F4/80. Иммобилизацию проводили в течение ночи при +4°С. Затем ячейки отмывали (в PBS) от несвязавшегося антигена и блокировали лунки раствором 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS в течение 2 часов при комнатной температуре. Ячейки отмывали в PBS и PBS с 0.05% Твеен-20, после чего добавляли проверяемые однодоменные форматированные антитела, содержащие НА-таг на С-конце, в количестве примерно 500 нг в 50 мкл PBS, содержащим 0,1% БСА. После инкубации (при перемешивании) в течение 2 часов при комнатной температуре ячейки вновь отмывали, как описано выше, и затем инкубировали с разведенными в 2000 раз (в PBS с 0.1% БСА) вторичными антителами цыпленка к НА-тагу, конъюгированными с пероксидазой хрена (CHGT-45P-Z, ICL, Inc., USA). Инкубацию проводили в течение 1 часа при комнатной температуре. После тщательной отмывки проводили детекцию активности фермента пероксидазы хрена, используя в качестве хромогенного субстрата ABTS (2,2′-азино-бис 3-этилбензотиазолин-6-сульфонат). Оптическую плотность измеряли при длине волны 405 нм с помощью планшетного флюориметра. Контрольные лунки не содержали антиген, но далее были блокированы и процессированы параллельно с экспериментальными ячейками (с антигеном).
На ФИГ. 4 представлены результаты иммуноферментного анализа, из которых следует, что все изучаемые клоны однодоменных наноантител специфически связываются с рекомбинантным белком F4/80. Величина столбцов на рисунке соответствует относительным величинам поглощения при длине волны 405 нм, количественно отражающим эффективность связывания наноантитела с F4/80.
Пример 4
Исследование способности наноантител связываться с F4/80 на поверхности макрофагов с помощью проточной цитофлуориметрии
Способность клонов однодоменных наноантител связываться с поверхностью макрофагов за счет специфического взаимодействия с F4/80 была проверена с помощью проточной цитофлуориметрии. Первичные культуры костномозговых макрофагов выделяли из бедренных и берцовых костей мышей линии C57BL/6. Макрофаги культивировали в течение семи дней в чашках Петри в среде для культивирования макрофагов (50% среды DMEM (содержащей 2 мМL-глутамин, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина), 30% кондиционной среды, полученной из супернатантаклеточной линии L929 и 20% лошадиной сыворотки) при 37°С и 5% С02, затем клетки пересаживались на 96-луночные планшеты в количестве 100 тыс. клеток на лунку и окрашивались. Отобранные клоны однодоменных наноантител к F4/80 были конъюгированы с биотином. Клетки окрашивали антителами, специфичными к макрофагальному маркеру CD11b, конъюгированными с флуоресцентным маркером, а также отобранными биотинилированными клонами однодоменных наноантител к F4/80. Затем клетки инкубировали со стрептавидином, конъюгированным с флуоресцентным маркером. После окрашивания клетки фиксировали 4% раствором параформальдегида.
Полученные образцы анализировались на проточных цитофлуориметрах Gallios™ (Beckman Coulter Inc.) и FACSCanto II (BDBiosciences). Результаты обрабатывались с помощью программы FlowJo (Treestar Inc.).
На ФИГ. 5 представлены результаты проточной цитофлуориметрии, из которых следует, что полученные клоны однодоменных наноантител к F4/80 способны связываться с поверхностью макрофагов. Представленные данные демонстрируют, что способность связываться с поверхностью макрофагов у отобранных клонов однодоменных наноантител к F4/80 неоднородна. Среди девяти клонов можно выделить несколько, показывающих хорошее связывание с F4/80 (VHH1, 2, 3, 8, 9), и клоны, практически или совсем не связывающиеся с поверхностью макрофагов (VHH4, 5, 6, 7).
Таким образом, для дальнейших исследований были отобраны наиболее перспективные клоны однодоменных антител (VHH 1, 2, 3, 8, 9), которые могут быть использованы, как потенциальные фрагменты для последующего конструирования биспецифических антител.
Пример 5
Измерение константы связывания и диссоциации однодоменных антител против F4/80 с рекомбинантным белком F4/80 методом поверхностного-плазмонного резонанса.
Для анализа были взяты наиболее перспективные
Измерения кинетики связывания: скорости ассоциации, скорости диссоциации и константы диссоциации однодоменных антител с рекомбинантным белком F4/80 проводились с помощью прибора поверхностного плазмонного резонанса Proteon XPR36 (Bio-Rad). Измерения проводились при 20°С в качестве буфера использовался фосфатно-солевой буфер рН 7.4, 0.005% Tween 20.
Для этого препараты биотинилированных однодоменных антител против F4/80 в фосфатно-солевом буфере (рН=8.0) были иммобилизованы на NLC-чипе (на этом чипе поверх слоя золота, в котором происходит эффект поверхностного плазмонного резонанса нанесен слой полимера альгиновой кислоты, к которому ковалентно присоединены молекулы нейтравидина (neutravidin) - рекомбинантного аналога биотина с нейтральным зарядом) в концентрации 5 нМ. Антитела наносились при скорости 30 мкл/мин в объеме 150 мкл в вертикальной ориентации. Уровень иммобилизации антител составил 600-800 RU. После промывки 1М раствором хлорида натрия (100 мкл/мин, объем 50 мкл) ориентация была изменена на горизонтальную. Затем была проведена промывка фосфатно-солевым буфером, содержащим 0.005% Tween (100 мкл/мин, объем 10 мкл, диссоциация 3600 с) после чего установилась базовая линия. Затем также в горизонтальной ориентации был нанесен препарат рекомбинантных антител против белка F4/80 в фосфатно-солевом буфере в двукратно убывающих концентрациях 200 - 12.5 нМ.
Сенсограммы, полученные в результате 5 взаимодействий для каждого из антител, анализировались с помощью ProteOn Manager Software (Bio-Rad) с использованием модели Ленгмюра.
На ФИГ. 6 представлены кривые взаимодействия (сенсограммы) рекомбинантного F4/80 с сенсорными чипами, на которых были иммобилизованы однодоменные антитела против F4/80.
Приведенные примеры с иллюстрациями доказывают выполнение поставленной данным изобретением задачи. Созданы новые особые однодоменные наноантитела, способные эффективно связывать белок F4/80. Эти новые особые наноантитела обладают следующими преимуществами по отношению к прототипу (моноклональные антитела к определенному пептидному участку белка EMR1 (человеческий гомолог мышиного F4/80)): их получение, производство и хранение более экономично, эффективно и относительно просто; их получение включает стадию иммунизации и аффинного дозревания in vivo, что обычно способствует более высокой аффинности и существенному повышению эффективности селекции заданных наноантител, они хорошо растворимы, обладают новыми структурными особенностями, позволяющими им потенциально узнавать некоторые «скрытые» для обычных антител эпитопы. Таким образом, задача поставленная в данном изобретении решена.