ТЕРМОФИЛЬНЫЙ ПЛАНКТОННЫЙ ШТАММ CHLORELLA SOROKINIANA - ПРОДУЦЕНТ ПИЩЕВОЙ БИОМАССЫ
THERMOPHYLIC PLANKTON STRAIN CHLORELLA SOROKINIANA - PRODUCT FOOD BIOMASS

Область применения
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый термофильный планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella sorokiniana, предназначенный для получения пищевой биомассы, использующейся как продукт питания в виде напитка, концентрата и пасты.
Уровень техники
Известны термофильные штаммы одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris, предназначенные для получения биомассы. К ним относится штамм ЛАРГ-3. Температурный оптимум роста этого штамма 38°С. Из промышленной культуры ЛАРГ-3 на среде Тамийя методом многоступенчатого отбора получен штамм ЛАРГ-3М. Температура культивирования Ларг-3М составляет 35-38°С (а.с. SU 644140) [1].
Штамм Chlorella vulgaris Beyer 62/56 был получен из исходного штамма №62 методом последовательных термоимпульсов в проточных условиях культивирования. Оптимальная температура для роста 30-41°С, максимальная - 43°С (а.с. SU 237779) [2].
Штамм Chlorella vulgaris А был получен из штамма хлореллы №174 из коллекции ИОГен. Исходный штамм подвергали действию высокой температуры в условиях короткого светового дня. Достигнута оптимальная температура культивирования 35-38°С. Световой период укорочен до 9 часов, и одновременно увеличено количество автоспор до 16-32 (а.с. SU 553958) [3].
Штамм Chlorella vulgaris Beijer ИФР N С-66 отселектирован из штамма ЛАРГ-3 действием высокой температуры (46°С), культивируется при температуре 36°С (а.с. SU 1530637) [4].
Штамм Chlorella vulgaris ВКПМ N А-29 получен методом мутационной селекции с использованием нитрозометилмочевины из дикого штамма 132. Оптимальная температура культивирования 42°С (патент RU 2005777) [5].
Известен термофильный штамм Chlorella vulgaris Buzovna. Срок культивирования штамма составляет 5-10 суток. Для культивирования используется среда Тамийя. В зависимости от условий культивирования деление клеток на 2-32. Культура синхронная. Оптимальная температура культивирования 30-35°С.Перемешивание суспензии осуществляется механически или барботированием воздухом. Культивирование ведется на солнечном свету (патент AZ 017614) [6].
Все приведенные штаммы относятся к категории термофильных, но среди них нет планктонных штаммов. Недостатками этих штаммов являются: длительный период культивирования (от 3 до 6 дней), необходимость барботирования культуры газовоздушной смесью и постоянного перемешивания суспензии, что усложняет биотехнологию культивирования; получаемая биомасса предназначена для использования как корм в животноводстве.
4
3
Известен штамм Chlorella sorokiniana Shihira et Krauss (прототип). Клетки шаровидные или эллипсоидные от 3×2 до 4,5×3,5 мкм, на среде с глюкозой от 4,5 до 5,5 мкм. Хлоропласт мелкий, чашевидный, зеленый. Пе-риноид есть. Аммоний и нитрат утилизируются одинаково. Гидролизат казеина в качестве источника азота лучше поддерживает рост, чем NHNO. Максимальная скорость роста при температуре 39°С - 9,2 удвоений в день (So-rokin С.et al., 1953, 330-331) [7].
Типовая культура - штамм К.А. Сорокина №7-11-05 - хранится в коллекции Мэриленда, США (Андреева В. М., 1975. Стр. 69) [8].
Раскрытие изобретения
Цель данного изобретения состоит в создании нового термофильного планктонного штамма хлореллы для получения пищевой продукции, различающейся по содержанию биомассы, для дифференцированного использования в виде напитка, концентрата и пасты.
Техническим результатом настоящего изобретения является выведение термофильного планктонного штамма, обладающего тонкой оболочкой и способного активно продуцировать биомассу в синхронном режиме культивирования на комплексной питательной среде с включением в ее состав минеральных и органических компонентов, позволяющих в дифференцированном режиме получать разноуровневую по биомассе продукцию за четырехчасовой период культивирования в режиме одной световой фазы, за которую хлорелла проходит полный жизненный цикл с образованием 8-32 автоспор.
Описание изобретения
Исходным для селекции Chlorella sorokiniana FAT, депонированным во Всероссийской Коллекции Промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Al-26, был штамм Chlorella vulgaris Al-24, который культивировался на питательных средах в дифференцированном режиме и с соблюдением температурного режима в 36°С.
В результате селекции был отобран штамм, наделенный тонкой оболочкой, способный интенсивно наращивать биомассу в синхронном режиме культивирования, расти на дифференцированных питательных средах, использовать солнечный свет или освещение лампами при укороченном световом периоде, составляющем 4 часа, за которые культура проходит полный цикл развития и поддерживает монокультуру в процессе производства.
Морфологические признаки. Молодые клетки эллипсоидной формы, размером 1,5-2,0 мкм. Взрослые клетки шаровидные, 5-6 мкм в диаметре. Клетки с уже сформированными автоспорами, но еще находящиеся в материнской оболочке 7-8 мкм в диаметре. Хлоропласт плотно прилегает к оболочке, по форме широкопоясковидный незамкнутый и выстилает  поверхности клетки, у молодых клеток корытовидный. Пиреноид окружен крахмальной оберткой, состоящей из двух полусфер. Размножение происходит автоспорами. Споры одинакового размера. Число спор 8-32. Чаще всего спор 8-16, редко 32. Число спор бывает только четное. Деление клеток - синхронное. Клетки как молодые, так и взрослые темно-зеленого цвета.
На агаризированной минеральной среде при температуре 36°С на шестой день образуются выпуклые гладкие блестящие колонии с ровными краями. Диаметр колоний 1-2 мм, окрашены молодые и взрослые клетки в темно-зеленый цвет.
Физиологические признаки. В лабораторных и в производственных условиях растет на минерально-органической питательной среде.
Питательная среда (1) на один литр водопроводной воды при соотношении химических реактивов и органических компонентов следующего состава:
- Минеральный:
1. Нитрат аммония, ГОСТ 2-2013
0,2 г;
2. Моноаммонийфосфат, ГОСТ 18918-85, 15% раствор
0,1 мл;
3. Хлорид железа (III), ГОСТ 4147-74, 1% раствор
0,15 мл;
4. Кобальт азотнокислый, ГОСТ 4528-78, 0,01% раствор
0,5 мл;
5. Медь сернокислая, ГОСТ 4165-78, 0,01% раствор
0,5 мл;
6. Магний сернокислый, ГОСТ 4523-77
0,2 г;
7. Калий сернокислый, ГОСТ 4145-74, 12% раствор
0,5 мл;
- Органический:
1. Настой голозерного овса на фугате зерновом (рН 3-5)
10-30 мл.
Для приготовления настоя органического компонента питательной среды используют зерно голозерного овса и фугат в соотношении 1:2 по объему. Настаивают в течение одних суток при температуре 36°С. По истечении срока жидкую часть отцеживают через сетчатый фильтр и замеряют рН, который должен быть 3-5. Раствор углекислого газа в количестве 10-30 мл/л вводится в культуральную среду.
Штамм автотрофный. Штамм устойчиво развивается при естественном и при искусственном освещении. При солнечном освещении или освещении лампами температура суспензии хлореллы должна быть 36°С.
Режим освещения как при солнечном свете, так и лампами составляет 4 часа. Развитие штамма не зависит от сезона года.
Штамм относится к категории термофильных. Оптимальная температура культивирования в дневное и ночное время 36°С.
Все известные термофильные штаммы хлореллы относятся к высокопродуктивным, хотя среди них нет планктонных штаммов. Исследование по влиянию температуры на продукцию планктонного штамма Chlorella vulgaris ИФР №С-111 проводилось для определения урожайности при разных величинах температуры культуры. Зависимость концентрации клеток от температуры шла по возрастающей от 15 до 36°С.Дальнейшее повышение температуры приводило к снижению численности клеток, т.е. граница для планктонного штамма была установлена в 36°С (Мещерякова Ю.В. и др., 2012. Стр. 34) [9].
Предлагаемый термофильный планктонный штамм Chlorella sorokiniana FAT так же лучшие результаты показал при 36°С. При этом в процессе культивирования должна строго выдерживаться установленная температура. Например, при снижении температуры до 35°С срок культивирования увеличивается до 6 часов, а при повышении до 37°С культура не набирает плотность.
Антагонистические свойства штамма проявляются при наборе культурой оптической плотности 0,85 D (440), при этом наступает лизис прочей альгофлоры, гибель бактерий, грибов и дрожжей, а так же он обладает устойчивостью к фагам.
Стойкого цикла развития у штамма нет. Деление клеток происходит в любое время суток. Он строго соблюдает условия монокультуры.
Культуральные свойства. Штамм относится к категории пресноводных и обладает планктонными свойствами, т.е. находится во взвешенном состоянии и свободно парит в водной толще, а также равномерно распределятся в культуральной среде.
В состоянии покоя для естественного осаждения клеток требуется один-два месяца. Осевшие клетки можно вывести из покоя путем удаления надосадочной жидкости, добавления питательной среды и в течение суток выдержав на рассеянном свету.
Клетки в культуре погибают при динамических ударах, например, при длительной перевозке в цистернах, а также при механическом перемешивании культуры или при использовании для культивирования лабораторных качалок. При промышленном выращивании в установках штамм требователен к соблюдению биотехнологии и составу питательной среды.
Биотехнологические свойства. Для культивирования штамма применяется установка (патент RU 2540011), которая позволяет использовать не только искусственное, но и солнечное освещение. Установка обеспечивает процесс производства суспензии хлореллы в автоматическом режиме, при этом температурный режим выдерживается 36°С. Оптимальные условия выращивания хлореллы, которые создаются в установке, позволяют за 4 часа получить нормативную оптическую плотность суспензии в пределах 1,8-2,0 D (440). Культивирование штамма ведется с соблюдением требований санитарии, однако создание условий стерильности не требуется. Штамм растет как в помещении, так и под открытым небом.
Для каждого пищевого продукта должна быть своя питательная среда по минеральному и органическому составу, т.е. питательная среда должна быть дифференцированной, и это особенно касается пищевой хлореллы, когда реактивы в питательной среде не должны оставаться недоиспользованными. Для получения напитка используется питательная среда (1) и исходный посевной материал культуры термофильный планктонный штамм Chlorella sorokiniana А1-26 с оптической плотностью 1,4-1,8 D (440) в соотношении по 50% каждого. Для освещения культуры используют солнечный свет в дневное время или лампы ДРИ-250 в ночное время, при этом температура суспензии весь период культивирования должна быть 36°С. В процессе культивирования выделяются световой и темновой периоды, которые состоят из одной световой и одной темновой фазы, при этом каждый световой период составляет 4 часа, а темновой период - 2 часа. Таким образом, за сутки можно получить продукцию четыре раза.
Клетки штамма чувствительны к механическому перемешиванию культуры в установках с электрическими насосами, а также при барботировании воздухом или углекислым газом, в результате чего нарушается микробиоценоз, что приводит к снижению урожайности, а в последующем гибели культуры. Не допускается соприкосновение суспензии с металлическими предметами, которые могут быть в установке; трубопроводы должны иметь пищевую сертификацию.
Пример 1
В емкость установки (патент РФ 2540011) вводят питательную среду (1) и маточную культуру термофильного планктонного штамма Chlorella sorokiniana FAT ВКПМ Al-26 с оптической плотностью 1,4-1,8 D (440) в соотношении 1:1. В дневное время выдерживают на солнце четыре часа. В ночное время освещают лампами ДРИ-250. В процессе культивирования температуру в аквариумах выдерживается в автоматическом режиме на уровне 36°С. Постоянная температура суспензии, равная 36°С поддерживается автоматическим включением и выключением встроенного нагревательного элемента по команде блока термостабилизации прибора. По окончании четырехчасового светового периода культуру сливают и используют как напиток. За четырехчасовой период культивирования биомасса составит 1,0 г/л сухого веса. Для каждого последующего этапа культивирования необходимо пройти тем-новую фазу в течение двух часов.
Пример 2
В емкость установки (патент РФ 2540011) на один литр водопроводной воды вводят питательную среду (2) следующего состава:
- Минеральный:
1. Нитрат аммония, ГОСТ 2-2013
0,6 г;
2. Моноаммонийфосфат, ГОСТ 18918-85, 15% раствор
0,3 мл;
3. Хлорид железа (III), ГОСТ 4147-74, 1% раствор
0,15 мл;
4. Кобальт азотнокислый, ГОСТ 4528-78, 0,01% раствор
0,5 мл;
5. Медь сернокислая, ГОСТ 4165-78, 0,01% раствор
0,5 мл;
6. Магний сернокислый, ГОСТ 4523-77
0,2 г;
7. Калий сернокислый, ГОСТ 4145-74, 12% раствор
0,5 мл;
- Органический:
1. Настой голозерного овса на фугате зерновом (рН 3-5)
30-50 мл.
Культивирование осуществляется по примеру 1. По окончании четырехчасового светового периода культуру сливают и используют как концентрат. За этот период культивирования биомасса составит 3,0 г/л сухого веса.
Пример 3
В емкость установки (патент РФ 2540011) на один литр водопроводной воды вводят питательную среду (3) следующего состава:
- Минеральный:
1. Нитрат аммония, ГОСТ 2-2013
1,0 г;
2. Моноаммонийфосфат, ГОСТ 18918-85, 15% раствор
0,5 мл;
3. Хлорид железа (III), ГОСТ 4147-74, 1% раствор
0,15мл;
4. Кобальт азотнокислый, ГОСТ 4528-78, 0,01% раствор
0,5 мл;
5. Медь сернокислая, ГОСТ 4165-78, 0,01% раствор
0,5 мл;
6. Магний сернокислый, ГОСТ 4523-77
0,2 г;
7. Калий сернокислый, ГОСТ 4145-74, 12% раствор
0,5 мл;
- Органический:
1. Настой голозерного овса на фугате зерновом (рН 3-5)
50-80 мл.
Культивирование осуществляют по примеру 1. По окончании четырехчасового периода культуру сливают, центрифугируют и используют как пасту. За этот период культивирования биомасса составит 5 г/л сухого веса.
Следующие материалы иллюстрируют достижение цели. Получена пищевая биомасса с использованием термофильного планктонного штамма Chlorella sorokiniana FAT ВКПМ Al-26 на дифференцированных минерально-органических питательных средах с использованием установки по патенту 2540011, позволившей получить продукты питания в виде напитка, концентрата и пасты, биомасса которых за одни сутки составила от 4,0 до 20,0 грамм сухого веса, что значительно превышает показатели известных термофильных штаммов.
Таким образом, предлагаемый штамм является более продуктивным, используется как пищевая биомасса в виде напитка, концентрата и пасты.
Источники информации
1. А.с. СССР 644140 от 24 января 1977, кл. C12N 1/00. Штамм Chlorella vulgaris ЛАРГ-3М - продуцент биомассы. Альбицкая О.Н. и др. 07.10.1981. Бюл.№37.
2. А.с. СССР 237779 от 24 июля 1967, кл. 6а, 14. МПК C12k. Рубинчик Л.И. и др. 20.02.1969. Бюл. №9.
3. А.с. СССР 553958 от 4 декабря 1974, кл. А01Н 13/00. Овсянникова М.Н. и др. 15.07.1977. Бюл. №14.
4. А.с. СССР 1530637 от 18 сентября 1987. кл. C12N 1/12. Штамм водоросли Chlorella vulgaris - продуцент зеленой биомассы. Семененко В.Е. и др. 23.12.1989. Бюл. №47.
5. Патент RU 2005777 от 14 июня 1991, кл. МПК C12N 1/12. Термофильный штамм водоросли Chlorella vulgaris для получения биомассы. Овсянникова М.Н. и др. Конвенционный приоритет: 14.06.1991 SU 91 4945146.
6. Патент AZ 017614 от 12 августа 2009, кл. C12N 1/12. Термофильный штамм водоросли Chlorella vulgaris Buzovna для получения биомассы и способ получения биомассы данного штамма. Абдулрагимбеков Ю.М. и др. 08.12.2009. Евразийское патентное ведомство.
7. Sorokin С.et al. A higt temperature strain of Chlorella. Science 117. - 1953. - C. 330-331.
8. Андреева В.M. Род Chlorella. Морфология, систематика, принцип классификации. Л.: «Наука», Ленингр. отд., 1975. - 110 с.
9. Мещерякова Ю.В., Нагорнов С.А. Культивирование микроводоросли хлорелла с целью получения биотоплива. Вопросы современной науки и практики. Университет им. В. И. Вернадского. Специальный выпуск (43). 2012. - С. 33-36.