Влияние неферментативного посттрансляционного дезамидирования на активность белков препарата иммунной лактосыворотки

УДК 574.96:612,11/12±616.15

ВЛИЯНИЕ НЕФЕРМЕНТАТИВНОГО ПОСТТРАНСЛЯЦИОННОГО ДЕЗАМИДИРОВАНИЯ НА АКТИВНОСТЬ БЕЛКОВ ПРЕПАРАТА ИММУННОЙ ЛАКТОСЫВОРОТКИ

© 2004 г. М.Ю. Бибов, Б.Ф. Вачаев, И.А. Сорокина, А.И. Лукаш, А.А. Синичкин, Э.А. Яговкин

We have investigated processes of posttranslational nonenzymatic deamidation in proteins of immune whey against Salmonella during one- and two-week incubation at different temperatures (4 °, 20 ° and 35 °C). A reliable decrease of easily hydrolyzed amide group level in proteins of investigated preparates which depended on temperature and time of incubation was shown. As a result of posttranslational modifications in immune whey proteins we have observed changes in its electrophoretic properties as well as increasing of heterogeneity of the preparates. Distribution Indexes of middle weight molecules were 0,65, 1,1 and 1,14 after one-week incubation at 4°, 20° and 35°C, respectively and were half as much again by two weeks. Changes in fluorescence spectra of whey protein molecules occurred under influence of deamidation of asparagines residues were observed. We have found out that lactoperoxidase activity of investigated preparates was decreased depending on temperature and time of incubation. The 7 day incubation of preparates at 35 °C has led to the total loss of lactoperoxidase activity. It was shown that specific antibody level was not changing during the incubation. It is suggested that nonenzymatic asparagines depended autofragmentation of some whey proteins could take place during its aging.

Введение

В процессе функционирования в организме белковые молекулы претерпевают ряд изменений, обусловленных химической модификацией их аминокислотных остатков. Среди огромного количества различных посттрансляционных модификаций (ПТМ) особое место занимают процессы неферментативного дезамидирования остатков аспарагина (Asn) и глутамина (Gln). Предполагают, что встроенные в поли-пептидную цепь остатки Asn и Gln действуют как «молекулярные часы», определяющие продолжительность функционирования белковой молекулы [1, 2]. В отличие от других посттрансляционных модификаций, являющихся либо результатом ферментативной реакции, либо воздействия тех или иных внешних факторов, дезамидирование - гидролитическая реакция, требующая для образования продукта только наличия воды [3]. Оба продукта этой гидролитической реакции представляют собой природные аминокислоты аспартат (Asp) и глутамат (Glu). Скорость неферментативного дезамидирования зависит от последовательности аминокислот, пространственной организации каждого из белков [1], а также от свойств раствора, окружающего амиды. Так, гидролиз амидов значительно ускоряется при повышении температуры и ионной силы раствора [2]. Ранее нами было показано спонтанное отщепление амидных групп в белках (альбумине, у-глобулине, РНК-азе, лизоциме, лакто-феррине и др.)[4, 5] в условиях, моделирующих физиологические (0,85 % NaCl, pH 7,0, 37 °C). Процессы неферментативного дезамидирования и связанная с ним автофрагментация задействованы в процессах старения и деградации белковых молекул [6]. Изменение степени амидированности влечет за собой определенные локальные нарушения структурных и физико-химических характеристик белков и является причиной возникновения новых модифицированных белков с «дефектными» биологическими функциями [7]. Следствие этих изменений - снижение специфической и неспецифической биологической активности белковых молекул.

Цель настоящей работы - изучение влияния процессов неферментативного посттрансляционного дезамидирования остатков Абп на некоторые физикохимические и биологические свойства нелиофилизи-рованных препаратов белков иммунной лактосыворотки, полученных методом ультрафильтрации в тангенциальном потоке, против сальмонелл. Препарат представляет собой комплексную иммунобиологическую систему, обладающую протекторными антимикробными свойствами, и включает в себя иммуноглобулины трех классов (^в, ^М, ^А), а также факторы неспецифической антимикробной резистентности (лактопероксидаза (ЛПО), ксантиноксидаза, суперок-сиддисмутаза, лактоферрин, лактоферрицин) [8]. До настоящего времени для получения иммунобиологических препаратов на основе молока и молозива традиционно применяли технологию, использующую метод Кона [9]. Однако в последние годы исследователей все больше стала привлекать возможность применения для получения препаратов сывороточных белков мембранных технологий, в основу которых положен процесс тангенциальной ультрафильтрации. В зарубежной литературе имеются сведения об использовании процесса ультрафильтрации для получения ряда белковых и пептидных препаратов [10], тогда как в отечественной производственной практике он до сих пор не нашел широкого применения. Мембранные технологии позволят избежать использования спиртового осаждения в процессе получения препаратов и как следствие необходимость их лиофили-зации. Это, в свою очередь, снизит вероятность повреждения белков лактосыворотки и создаст более благоприятные условия для работы факторов неспецифической резистентности, таких как ЛПО. В связи с этим представляется актуальным исследование степени устойчивости нелиофилизированного комплекса белков лактосыворотки и его способности к проявлению биологической активности.

Материалы и методы

Материалом для получения белков лактосыворотки служило свежее иммунное молозиво, хранившееся

при 20 °С, из которого методом створаживания получали лактосыворотку [9].

Препарат белков лактосыворотки, специфический против сальмонелл, получали из иммунной лактосыворотки методом мембранной ультрафильтрации в тангенциальном потоке [11]. Белковые препараты в физиологическом растворе, содержащем 5 % белка, 0,8 5 % NaCl, (рН 7,0±0,5), после стерилизации с использованием бактериальных фильтров 0,22 мкм (Schleicher Schull, Deutschland) и теста на отсутствие протеолитической активности (способности к расщеплению желатины) для моделирования условий ускоренного старения инкубировали при 4, 20, и 35 °С в течение 7 и 14 дней.

По истечении срока инкубации в препаратах определяли количество легкогидролизуемых амидных групп (ЛАГ), которые освобождают аммиак за 15 мин гидролиза в 1 н. H2SO4 при 100 °С [12] . Концентрацию свободного аммиака после гидролиза амидных групп определяли флуориметрическим методом на спектрофотометре «Флюорат-02» (Люмэкс, Россия) (^возб = 413 нм, Хэмис = 476 нм) [13] и выражали в мкМ азота аммиака на 1 г белка, содержание которого определяли методом Лоури [14]. По содержанию амидов легкогидролизуемой фракции в первом приближении можно судить о количестве Asn в белках препарата [4]. Об интенсивности фрагментации белков лактосыворотки судили по приросту уровня молекул средней массы (МСМ) [15] и анализу электрофореграмм, полученному с помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по Леммли [16], используя гели с концентрацией акриламида 7,5 и 15 % соответственно. Количественную обработку данных электрофоретического исследования осуществляли с помощью программы QuantyScan (Biosoft. USA). Величину электрофоретической подвижности (Rm) рассчитывали как отношение расстояния, пройденного белковой фракцией, к расстоянию, пройденному маркерным красителем (бромфеноловый синий) [17]. Уровень содержания МСМ выражали индексом распределения (ИР), который рассчитывали как отношение А280/А254, определяемое в супернатанте после осаждения белка 30 % трихлоруксусной кислоты (ТХУ).

Регистрацию спектров собственной флуоресценции белков лактосыворотки вели на спектрофлуори-метре «Флюорат-02» в диапазоне длин волн от 210 до 650 нм при Хвозб = 275 и 285 нм, которые соответствуют максимумам поглощения ароматических остатков тирозина (Tyr) и триптофана (Trp), и при Хвозб = 280 нм, где располагается область перекрывания поглощения остатков Tyr и Trp [18].

Биологическую активность белков препаратов лактосыворотки определяли по изменению титра специфических антител в реакции пассивной гемагглю-тинации (РПГА) с сальмонеллезными эритроцитар-ными О-диагностикумами из условнопатогенных бактерий (Salmonella B и Salmonella D) [19] и активности ЛПО, которую определяли спектрофотометрическим методом [20].

Все цифры, представленные в работе, являются средними величинами 8 - 10 повторных операций.

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью 1 - критерия Стьюдента [21].

Результаты и обсуждение

Данные, представленные на рис.1, количественно отражают динамику изменений во фракции ЛАГ белков препарата лактосыворотки против сальмонелл в ходе 7 и 14 сут инкубации в условиях, моделирующих физиологические, при различных температурных режимах (4, 20 и 35 °С). Содержание фракции ЛАГ в белках исходного исследуемого препарата (контроль) составило 855±2,01 мкМ амидного азота на 1 г белка. При «старении» препарата иммунной лактосыворотки происходит спонтанное дезамидирование, которое сопровождается снижением количества ЛАГ в среднем на 52 % к 7 сут инкубации при исследуемых температурных показателях. Дальнейшее увеличение срока инкубации белков препарата лактосыворотки до 14 сут привело к усилению процесса потери амидных групп. При этом прослеживается влияние температурного фактора на скорость неферментативного дезамидирования. Если уровень ЛАГ после двухнедельной инкубации исследуемого препарата при 4 °С составил 327 ± 1,5 мкМ азота аммиака на 1 г белка, что на 62 % ниже контрольных значений, то при 20 и 35 °С количество амидов уменьшилось до 266, ± 0,9 и 142 ± 2,2 мкМ соответственно (рис.1). Следует подчеркнуть, что изучаемое снижение амидированности происходило за счет фракции ЛАГ, представленной в основном Абп [4], что согласуется с литературными данными о преимущественном дезамидировании Абп и косвенно свидетельствует о неферментативности процесса [3, 6]. Известно, что Абп является эффективным нуклеофилом и внутримолекулярным катализатором трансацилирования (гидролиза) [6], и именно его дезамидирование «запускает» механизм спонтанного протеолиза (аспарагинзависимая автофрагментация) и лежит в основе селективности процесса. Результатом автофрагментации белковых структур является образование и накопление низкомолекулярных соединений, в том числе МСМ [22]. Мы исследовали характер изменения содержания МСМ в препаратах иммунной лактосыворотки в зависимости от температуры и времени инкубации в условиях, моделирующих физиологические (рис.1). Полученные данные свидетельствуют об увеличении ИР МСМ как продуктов спонтанной деструкции белков исследуемого препарата в процессе его дезамидирования; к 7 сут инкубации в физиологическом растворе ИР МСМ возрос на 63, 175 и 185 % (температурный режим 4, 20 и 35 °С) по отношению к контрольным значениям, а через 14 сут - в 2,5 раза при низкотемпературном режиме экспозиции и в 4,1 раза при температурах инкубации 20 и 35 °С. Полученные результаты согласуются с литературными данными о том, что скорость неферментативного дезамидирования имеет температурную зависимость и затрагивает как отдельные функциональные группы, так и общую конформацию белковой молекулы [3, 6], способствуя ее «разрыхлению» и образованию одиночных разрывов ковалентного полипептидного остова [4]. В пользу этого свидетельствует увеличение степени гетерогенности

препарата белков комплексной иммунобиологической системы, представленной на рис.2. Электрофоретический анализ в 7,5 % ПААГ белков исходного препарата лактосыворотки показал наличие фракций иммуноглобулинов, а- и р-лактоглобулинов, лактоальбуминов, лактопреальбуминов с величинами Яш 0,31;

0,71; 0,58; 0,86; и 0,95 соответственно.

350

300

250

200

150

100

50

-50 --Ч

-100

-150

мс м МО и

мем

ЛАГ

1 1

* Я ^ ЛПО ЛАГ 1

4 °С ЛПО 20 °С ЛПО 35 °С

7 сут

14 сут

держания молекул иммуноглобулиновой фракции после двухнедельной инкубации препарата лактосыворотки при 20 и 35 °С не наблюдалось. Последний факт, вероятно, связан с распадом молекул иммуноглобулинов на более легкие Бе- и РаЪ-фрагменты и косвенно отражает чувствительность этих белков к температурным воздействиям во временном ходе инкубации. Общий прирост степени гетерогенности исследуемого препарата после 14 сут инкубации при 20 и 35 °С численно сопоставим с изменением количества амидных групп фракции ЛАГ и уровнем МСМ и, очевидно, может быть связан со статистически недостоверным распадом других составляющих комплексной иммунобиологической системы (рис.2).

Рис. 1. Динамика изменений содержания фракции легкогидролизуемых амидных групп, МСМ и лактопероксидазной активности белков препарата иммунной лактосыворотки в ходе инкубации при 4, 20 и 35° С в течение 7 и 14 сут в условиях, моделирующих физиологическое старение (0,85 % №01, рН 7,0). * - достоверные различия по отношению к контролю,

Р < 0,05

Электрофоретическое разделение белков исследуемого препарата, подвергнутых одно- и двухнедельному модельному «старению» при различных температурных режимах, обнаруживает наличие дополнительных 7 низкомолекулярных фракций, которые, по-видимому, образуются за счет спонтанной деградации иммуноглобулиновых и р-лактоглобули-новых составляющих лактосыворотки (рис.2, фракции 1 и 2). Установлено, что после инкубации в течение 7 сут при 4, 20 и 35 °С содержание р-лактоглобулинов снизилось на 49, 66 и 69 % соответственно и оставалось неизменным при увеличении срока эксперимента. Очевидно, процесс модификации электрофоретических свойств р-лактоглобулиновой фракции исследуемого препарата иммунной лактосыворотки, инициированный спонтанным дезамидированием и аспа-рагинзависимой автофрагментацией, завершается к 7 сут «старения». В отношении иммуноглобулиновой фракции отмечен сходный характер возрастных изменений электрофоретической подвижности. Если после 7 сут инкубации при 4, 20 и 35 °С отмечено падение концентрации иммуноглобулинов на 34, 59 и 69 % соответственно, то увеличение времени инкубации до 14 сут привело к усилению процесса спонтанной деградации исследуемой фракции до 61 % только при низкотемпературном воздействии. Появление новых зон при электрофорезе и дальнейшее снижение со-

Рис. 2. Электрофоретический анализ в 7,5 % ПААГ препарата лактосыворотки против сальмонелл в ходе инкубации при 4, 20 и 35 °С в течение 7 и 14 сут в условиях, моделирующих физиологическое старение (0,85 % ЫаС1, рН 7,0):

1 - иммуноглобулины; 2 - Р-лактоглобулины; 3 - а-лактоглобулины; 4 - лактопостальбумины; 5 - лактоальбумины; 6 - лактопреальбумины;

I, II, III - исходные препараты трех серий; IV, V, VI - инкубация в течение 7 сут при 4, 20 и 35 °С соответственно; VII, VIII, IX - инкубация в течение 14 сут при 4, 20 и 35 °С соответственно

Снижение содержания ЛАГ и фрагментация в белках препарата лактосыворотки также согласуется с данными об интенсивности и характере флуоресценции, поскольку процесс неферментативного дезамидирования оказывает существенное влияние на конфор-мационную структуру и внутримолекулярную динамику белковых цепей (рис.3). Сравнительно-возрастное исследование пространственной организации белков препарата иммунной лактосыворотки показало различие в конформационном состоянии остатков Туг и Тгр и температурную независимость процесса конформа-ционных изменений. Установлено изменение соотношения интенсивности флуоресценции, регистрируемой при различных длинах волн возбуждения. Так, в исходном препарате максимальная интенсивность флуоресценции, наблюдаемой при = 285 нм, отличалась от интенсивности флуоресценции при Хвозб = 280 и 275 нм на 6 и 17 % соответственно. Уже после 7 сут инкубации препарата при 4, 20 и 35 °С отмечался прирост интенсивности флуоресценции, возбуждаемой при Хвозб = = 285 относительно 280 и 275 нм на 31 %, что свидетельствовало об увеличении вклада остатков Тгр в

общую интенсивность собственной флуоресценции. Аналогичная тенденция сохранялась и при двухнедельной инкубации препарата. Данный факт позволил нам сделать предположение о конформационных перестройках, происходящих в белковых молекулах в ходе старения и приводящих к увеличению степени экспонированности остатков Тгр на поверхности белковой глобулы [18]. Однако наблюдаемые возрастные различия (рис.3) конформационных переходов белков препарата лактосыворотки не носят температурозависимый характер и свидетельствуют о низкой термолабильности «старых» белков.

275 нм 280 нм 285нм

70

Рис. 3. Динамика изменений собственной флуоресценции в белках иммунной лактосыворотки в процессе инкубации при 4, 20 и 35 °С в течение 7 и 14 сут в условиях, моделирующих физиологическое старение (0,85 % ЫаС1, рН 7,0) Р < 0,05

Дезамидирование, ЛБп-зависимая фрагментация и конформационные изменения приводили к снижению биологической активности исследуемого препарата (рис.1). Инкубация белков лактосыворотки при 4 и 20 °С уже в течение 7 сут приводила к снижению активности лактопероксидазы на 50 и 89 % по сравнению с исходными препаратами. Недельная инкубация препаратов белков лактосыворотки при 35 °С приводила к полной потере лактопероксидазной активности. Увеличение срока инкубации белков препаратов лактосыворотки в течение 14 сут при 4 и 20 °С характеризовалось снижением активности лактопероксида-зы на 75 и 95 % соответственно. Исследование иммунных свойств белков препарата лактосыворотки в зависимости от температуры и времени инкубации не обнаружило заметного падения специфической активности иммуноглобулинов, что свидетельствует о высокой степени устойчивости их антигенсвязываю-щих детерминант, предопределенной особенностями первичной структуры функционально важных доменов, а также несущественной ролью остатков Абп и в1п в связывании данного антигена.

Сочетание достаточно устойчивой специфической активности в РПГА с данными электрофоретического

исследования, указывающими на снижение содержания иммуноглобулиновой фракции в ходе инкубации препаратов, косвенно подтверждает сделанное нами ранее предположение о фрагментации молекул иммуноглобулина с образованием Fab- и Fc-фрагментов.

Таким образом, полученные нами результаты указывают на достаточно высокую степень стабильности иммуноглобулинов в жидких препаратах белков лактосыворотки, а также их сродства к антигену. В то же время следует отметить высокую степень уязвимости лактопероксидазы, являющейся одним из основных компонентов системы неспецифической антимикробной резистентности молока, к действию временного и температурного фактора. В связи с этим поиск путей стабилизации и повышения активности лактоперок-сидазы в препаратах белков лактосыворотки и в препаратах лактоглобулинов с целью увеличения их неспецифических протекторных свойств может рассматриваться как актуальное направление дальнейших исследований.

Литература

1. Robinson A., Robinson R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1991. Vol. 15. № 88(20). P.8880-8884.

2. Robinson N. E., Robinson A. B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2001. Vol. 30. № 98 (3). Р. 944-949.

3. Wright H. // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 1991. Vol. 26. №1. P.1 - 52.

4. Пушкина Н.В. // Укр. биохим. журн. 1988. Т. 60. № 4. С.9 -13.

5. Belizy S. et al. //Biochemistry (Moscow). 2001. Vol. 66. № 5. Р. 576 - 580.

6. Олехнович Л.П. и др. // Докл. АН СССР. 1985. Т. 281. № 1. С. 217 - 220.

7. Пушкина Н.В. // Укр. биохим. журн. 1979. Т. 51. № 6. С.680-683.

8. Cecile Bos et al. // J. of American College of Nutrition. 2000. Vol. 19. № 90002. Р. 191-205.

9. Ермолов В.И. Иммуноглобулины и другие препараты крови. Л., 1976. С.132-136.

10. Kim L. et al. // Biotechnol. Appl. Biochem. 2000. Vol. 32. P. 161 - 166.

11. Николаева Т.А. и др. // Острые кишечные инфекции. 1987. Вып. 4. С.67-70.

12. Гершенович З.С., Кричевская А.А. // Биохимия. 1960. Т. 25. № 2. С. 310-317.

13. Sugawara K., Oyama F. Fluorogenic // J. Biochem. 1981. № 5. Р.771-774.

14. Lowry O.H. et al. // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. №1. P.265.

15. Бобров В.М., Шишкин Ш.А. // Вестник оториноларингологии. 1999. № 1. С. 33-34.

16. Laemmli U.K. // Nature. 1970. Vol. 227. № 5259. P. 680-685.

17. Маурер Ф. Диск - электрофорез. М., 1977.

18. Vekshin N.L. Photonics of Biopolymers. М., 1999.

19. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. СПб., 1998.

20. Альперович Д.В., Кеселман Э.В. // Тез. докл. Все-союз. конф. «Методы получения, анализа и применения ферментов». Рига, 1990. С.114.

21. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1973.

22. Лукаш А.И. и др. // Бюл. гипербар. биол. мед. 1994. Т. 2. С.85

7 июля 2003 г.

Ростовский государственный университет, Ростовский НИИ микробиологии и паразитологии