КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ ПОЛИПЕПТИДА α-АМИЛАЗЫ ИЗ BACILLUS, ВИД 195, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
COMPOSITIONS BASED ON α-AMYLASE POLYPEPTIDE FROM BACILLUS, TYPE 195, AND USE THEREOF

Область техники, к которой относится изобретение
Bacillus
В настоящем изобретении описываются композиции и способы использования α-амилазных ферментов, полученных из  sp. 195.
Предпосылки создания изобретения
Крахмал представляет собой смесь амилозы (15-30 вес. %) и амилопектина (70-85 вес. %). Амилоза состоит из линейных цепей α-1,4-связанных глюкозных единиц с молекулярным весом (М.в.) от примерно 60000 до примерно 800000. Амилопектин представляет собой разветвленный полимер, содержащий α-1,6 точки ветвления через каждые 24-30 глюкозных единиц; его М.в. может достигать 100 миллионов.
Сахара из крахмала, в виде концентрированных сиропов декстрозы, в настоящее время получают в процессе ферментативного катализа, который включает: (1) ожижение (или снижение вязкости) твердого крахмала с α-амилазой до получения декстринов со средней степенью полимеризации 7-10 и (2) осахаривание полученного ожиженного крахмала (т.е. гидролизата крахмала) амилоглюкозидазой (также называемой глюкоамилазой или ГА). Полученный сироп характеризуется высоким содержанием глюкозы. Большую часть получаемого в коммерческих масштабах глюкозного сиропа далее подвергают ферментативной изомеризации до смеси декстрозы/фруктозы, известной как изосироп.
Bacilli.
Как известно, α-амилазы (ЕС 3.2.1.1) гидролизуют крахмал, гликоген и родственные полисахариды путем расщепления внутренних α-1,4-глюкозидных связей в случайном порядке. Этот фермент имеет множество важнейших направлений его применения, в частности, в сахарной, пивоваренной, спиртовой и текстильной промышленностях. При этом α-амилазы выделяют из большого числа бактерий, грибов, растений и животных, используемых в качестве источника. Наиболее важные α-амилазы, в контексте их в промышленного применения, включают те α-амилазы, которые выделяют из видов
В течение многих лет α-амилазные ферменты использовали для различных целей, включая ожижение крахмала, расшлихтовку нитей, модификацию крахмала в бумажной и целлюлозно-бумажной промышленности и в пивоварении. Эти ферменты могут также использоваться в средствах для мытья посуды и для стирки для удаления крахмалистых окрашенных веществ.
Bacillus
Bacillus
of Bacillus
Biochem J.
Streptomyces lividans,
Bacillus
Bacillus
Одна из α-амилаз , которая была подвергнута секвенированию, представляет собой фермент из sp. 195 (ВАА). Этот фермент состоит из двух доменов: каталитического домена, аналогичного таковым в α-амилазах животных, и домена, который содержит два крахмалсвязывающих мотива (см. J. Sumitani et al., "New type of starch-binding domain: the direct repeat motif in the C-terminal region sp. 195 a-amylase contributes to starch binding and raw starch degrading," 350: 477-484 (2000)). В указанной работе Сумитани с соавт. (Sumitani et al., (2000)) были обнаружены три активных формы генных продуктов в культуральном супернатанте из где в указанной культуре генный продукт sp. 195 экспрессировался в гетерологическом варианте. Три указанных продукта представляют собой форму размером 69 кДа, форму размером 60 кДа и форму размером 50 кДа. Форма размером 69 кДа, во всей видимости, представляет собой полноразмерный зрелый белок с молекулярным весом, эквивалентным его расчетному значению, вычисленному на основе нуклеотидной последовательности гена полной длины. Форма размером 60 кДа, по всей видимости, соответствует природному ферменту из sp. 195 и, предположительно, может быть получена при протеолитическом процессинге, осуществляемом на участке между двумя крахмалсвязывающими мотивами, на С-конце. Эта форма характеризуется сниженной активностью применительно к связыванию и деградации необработанного крахмала в сравнении с формой 69 кДа. Тогда как форма размером 50 кДа вообще не способна связывать или разлагать нерастворимые крахмалы.
Амилазы использовались при обработке текстильных материалов, в препаратах для стирки и чистки, в композициях для расшлихтовки волокон, в хлебопечении, при ожижении и обработке крахмала. Таким образом, имеется насущная потребность в идентификации α-амилаз, которые можно было бы получать в рамках более легкого процесса со сниженной стоимостью с целью достижения рентабельности их производства, снижения стоимости доставки от производственных помещений и с достижением большей активности продуктов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Bacillus
Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к α-амилазе из sp. 195, которая может быть получена в больших количествах и с меньшей стоимостью в ответ на потребности промышленного производства. Указанные варианты могут использоваться во множестве композиций и способов, где используется α-амилаза.
Bacillus licheniformis
Один из объектов настоящего изобретения относится к нуклеиновой кислоте, в одном из альтернативных подходов, к оптимизированной нуклеиновой кислоте, показанной на фиг. 2 (SEQ ID NO: 2). Другой аспект настоящего изобретения относится к гену α-амилазы, оперативно связанному с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальный пептид α-амилазы из или его усеченный, процессированный полипептид.
В еще одном аспекте, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует усеченную форму полипептида, показанного на фиг. 4, где указанное усечение, или процессинг, может быть осуществлен по любому остатку после аминокислоты 491 (например, по аминокислоте 492, 494, 504, 509, после любого крахмалсвязывающего домена и т.п.).
Другой аспект настоящего изобретения относится к полноразмерному полипептиду, показанному на фиг. 4, или к любому усеченному по карбоксиконцу продукту, где указанное усечение локализовано после остатка 491.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к вектору, оперативно связанному с нуклеиновой кислотой, кодирующей указанные полипептиды.
(
B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus. B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. thuringiensis, Streptomyces lividans, S. murinus
Escherichia coli).
Еще один аспект настоящего изобретения относится к выделенной клетке-хозяину, содержащей любую из указанных нуклеиновых кислот или векторов, включающих указанные нуклеиновые кислоты. Выделенная клетка-хозяин может представлять собой прокариотическую или эукариотическую клетку. Выделенная клетка-хозяин может представлять собой бактериальную клетку например,или
Другой аспект относится к детергентной добавке, включающей полипептид согласно настоящему описанию, где указанная детергентная добавка необязательно имеет вид нераспыляемого гранулята, микрогранулята, стабилизированной жидкости, геля или защищенного фермента. Указанный полипептид в детергентной добавке может представлять собой усеченный полипептид согласно приведенному выше описанию. Детергентная добавка может содержать от примерно 0,02 мг до примерно 200 мг полипептида на грамм детергентной добавки. Указанная детергентная добавка может дополнительно включать фермент, выбранный из группы, состоящей из протеазы, липазы, пероксидазы, оксидазы, аминолитического фермента, целлюлазы, полиэстеразы и любого их сочетания.
Другой аспект относится к детергентной композиции, включающей любую из описанных выше детергентных добавок. Детергентная композиция может необязательно включать один или несколько из указанных ингредиентов: поверхностно-активное вещество, отбеливающее систему или отбеливатель, детергентный наполнитель, полимер, стабилизатор, кондиционер для ткани, пенообразователь, супрессор образования мыльной пены, антикоррозийный агент, краситель, отдушку, средство для суспендирования загрязняющего материала, ингибитор потускнения, оптический осветлитель или бактерицидное вещество. Детергентная композиция может включать или включать вдобавок дополнительный фермент, где указанный фермент представляет собой протеазу, липазу, пероксидазу, оксидазу, амилолитический фермент, целлюлазу, полиэстеразу или любое их сочетание.
Другой аспект относится к детергентной композиции для ручного или автоматизированного мытья посуды, включающей полипептид согласно настоящему описанию.
Еще один аспект относится к способу мытья посуды, где указанный способ включает применение детергента для ручного или автоматизированного мытья посуды согласно настоящему описанию для мытья одной или нескольких единиц, при необходимости. Указанный способ мытья посуды включает добавление детергента для мытья посуды в таком количестве, что промывная жидкость содержит полипептид согласно настоящему описанию, в количестве от примерно 0,01 м.д. до примерно 4 м.д.
Другой аспект относится к детергентной композиции для стирки белья, включающей детергентную добавку согласно настоящему описанию. Еще один аспект относится к способу чистки ткани, включающему промывку загрязненной ткани в растворе детергентной композиции согласно настоящему изобретению. Рассматриваемый способ также относится к полипептиду согласно настоящему описанию, где указанный полипептид применяется в растворе в количестве от примерно 0,01 до примерно 2 м.д. в растворе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг. 1 А-В
Bacilus
. Нуклеотидная кодирующая последовательность для α-амилазы из  sp. 195 (номер доступа АВ006823). Нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид amy195, подчеркнута. STOP-кодон выделен жирным шрифтом. SEQ ID NO:1.
Фиг. 2
Bacilus
B. licheniformis
. Нуклеотидная кодирующая последовательность для α-амилазы из  sp. 195, после оптимизации кодонов. Нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелый белок amyl95, находится после нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнальный пептид для α-амилазы из  (LAT) (SEQ ID NO: 2). Нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид LAT, подчеркнута. Стоп-кодон выделен жирным шрифтом. Оптимизация аминокислотных кодонов проведена с использованием системы GeneArt (GeneArt GmbH, Germany).
Фиг. 3
. Полипептидная последовательность Amy195 (SEQ ID NO: 3). Сигнальная последовательность охватывает остатки 1-46 (подчеркнуты). Зрелый белок Amy195 начинается от остатка 47. Кодоны, кодирующие выделенные жирным шрифтом и подчеркиванием остатки, замещены стоп-кодоном с целью получения генетически процессированных форм. Таким образом, Y511, K521 и V526, где используется нумерация согласно фиг. 3, представляют собой последние аминокислотные остатки в генетически процессированных формах.
Фиг. 4
B. licheniformis.
. Аминокислотная последовательность Amy195 показана в виде гетерологичного белка слияния с сигнальной последовательностью LAT (SEQ ID NO: 4). Прописными буквами в карбоксиконцевой части показаны крахмалсвязывающие домены, принадлежащие к семейству CBD-25. Прописными буквами (остатки 1-29) на аминоконце обозначены сигнальные последовательности амилазы, полученные из Заглавные буквы обозначают каталитический домен фермента, включающий субдомены, А, В и С, которые, предположительно, будут охватывать остатки, примерно на участках 30-105 и 208-300 для субдомена А; примерно остатки 106-207 для субдомена В; и примерно остатки 301-492 для субдомена С. Val492 представляет собой последний аминокислотный остаток в протеолитически усеченной форме (используется нумерация, приведенная на фиг. 4). Следует отметить, что субдомен А прерывается в показанной линейной последовательности полипептида.
Фиг. 5
Bacillus
B. subtilis
. Схематическое изображение связи нуклеиновой кислоты, кодирующей α-амилазу изsp. 195, с нуклеиновой кислотой, кодирующей сигнальную последовательность LAT и терминирующую последовательность LAT в векторе pHPLT. Указанные плазмиды pHPLT известны в данной области (см., например, патенты США No. 5871550 и 6562612, а также публикации патента США 20060014265). Вектор pHPLT встраивают с достижением генной экспрессии amy195 в девяти штаммах с делетированной протеазой (см. US20050202535A1).
Фиг. 6
. Показаны результаты теста на функционирование фермента Amy195 в качестве функции рН и концентрации белка. Исследованная фракция показана в виде е-пула на фиг. 10. Тест проводят в 96-ячеечном планшете. В каждую ячейку помещают образцы ткани в одну четверть дюйма (0,00635 м), загрязненные окрашенным рисовым крахмалом (Testfabrics Inc., CS28-окрашенный рисовый крахмал). Буфер: 25 мМ HEPES, pH 8,0 или 25 мM CAPS, pH 10,3 добавляют к каждой ячейке. Планшет подвергают предварительной инкубации при 40°C. Реакцию начинают добавлением фермента Amy195 до конечной концентрации от 0 м.д. до 2 м.д. Планшет инкубируют при температуре 40°C в течение 10 минут при встряхивании со скоростью 750 об/мин в аппарате Эппендорф/Термомикс. После инкубации супернатантную жидкость переносят в новый 96-ячеечный планшет и измеряют поглощение при длине волны 488 н.м. в устройстве для анализа планшетов Molecular Devices, модель Spectra Max 190. На основе полученных данных строят график с использованием пакета прикладных программ GRAFIT, программное обеспечение Erithicus. Для построения графика используют изотермический алгоритм Лангмуира, который имеет ту же форму, что и алгоритм Михаэлиса-Ментен, доступный в составе программного обеспечения. Каждый экспрессируемый белок Amy195 содержит сигнальный пептид из LAT, но удаляется в процессе секреции и не присутствует в зрелом белке Amy195.
Фиг. 7
. Тест на функционирование всех протеолитических фрагментов, показанных на фиг. 10. Проводят указанный тест и результаты изображают в виде графика, как было описано в примере 3, в соответствии с условиями, приведенными для фиг. 6, при pH 8. Приведенные данные показывают, что все фракции функционируют так же или даже лучше, чем OxAm (Genencor International, Inc.).
Фиг. 8
. Проводят электрофорез в ДСН-полиакриламидном геле и выявляют экспрессию кинетически процессированных молекул Amy195. При процессинге выявляются C-концевые остатки 494, 504 и 509, согласно системе нумерации, приведенной на фиг. 4. Экспрессию в культурах проводят в соответствии с описанием, приведенным в примере 2, и концентрацию оценивают с использованием OxAm в качестве стандарта плотности.
Фиг. 9
. Функционирование в данном варианте применения генетически процессированных форм амилазы Amy195. Тесты на функционирование проводят с использованием культурального супернатанта, который не подвергался дальнейшей очистке. Процедуры тестирования и построения графика на основе полученных данных описаны в примере 3 согласно условиям, описанным для фиг. 6, при рН 8,0. Приведенные данные показывают, что процессированные молекулы функционируют лучше, чем OxAm.
Фиг. 10.
2
Анализ фракций из β-циклодекстриновой колонки, которая содержит протеолитические фрагменты Amy195. Фракции обозначены символами "wl" ("промывка 1", элюированная из колонки с использованием 25 мM бис-трис-пропана, pH 8,5, 2 мM CaCl); "w2" ("промывка 2", элюированная дополнительной аликвотой того же буфера); и "e-пул" (фракции, элюированные 50 мM β-циклодекстрином в том же буфере и при нанесении на гель трех разных концентраций). Матрицу для β-циклодекстриновой колонки синтезируют в лабораторных условиях по стандартному протоколу из β-циклодекстрина (Sigma Aldrich Cat. No. c4767) и с использованием эпоксиактивированной Сефарозы-6B (GE Healthcare, N.J. Cat. No. 17-0480-01).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Bacillus
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим α-амилазу из sp. 195, и к способам их использования. Описываются также вариации способов получения α-амилазы и ее гетерологичных форм посредством модификации полипептидной последовательности зрелой α-амилазы.
Bacillus
2+
Загрязнения одежды и посуды в значительной мере варьирует по составу и, в этой связи, также по их способности к удалению. Относительно небольшое число амилаз, имеющихся в настоящее время на рынке, может использоваться и для чистки одежды, и для мытья посуды. Полученная из sp. 195 α-амилаза не демонстрирует высокой идентичности относительно какой-либо из бактериальных амилаз, применяемых в настоящее время. Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к использованию белка дикого типа в качестве скелета для идентификации его вариантов, где указанный белок обладает лучшими характеристиками с целью его применения в композициях для мытья посуды и стирки, достигаемых, например, за счет снижения зависимости от Ca, улучшения стабильности LAS, улучшения диапазона pH, улучшения температурного диапазона, повышения удельной активности и т.п.
Определения и сокращения
1.
Согласно приведенному в настоящем тексте подробному описанию изобретения могут использоваться следующие сокращения и определения. Следует иметь в виду, что в тексте всего описания формы единственного числа включают также их множественные варианты, если из контекста явно не следует иное. Так, например, ссылка на фермент включает множество таких ферментов, а ссылка на дозировку включает ссылку на одну или несколько дозировок и их эквиваленты, известные специалистам в данной области и т.п.
Если особо не указано иное, все технические и научные термины в контексте настоящего описания имеют значения, общепринятые и известные специалистам в данной области. Ниже приведены следующие термины.
Сокращения
1.1
Приведенные ниже сокращения имеют указанное значение, если из приведенного описания обсуждения не следует иное.
AE
этоксилат спирта
AEO
этоксилат спирта
AEOS
этоксисульфат спирта
ASAE
этоксисульфат спирта
Amy 195
α-амилаза из <i>Bacillus </i>sp. 195
AOS
α-олефинсульфонат
AS
Алкилсульфат
CBD-25
семейство белков с углеводсвязывающим доменом 25
кДНК
Комплементарная ДНК
КМЦ (CMC)
карбоксиметилцеллюлоза
ДНК
дезоксирибонуклеиновая кислота
DTMPA
диэтилентриаминпентауксусная кислота
EC
Комитет по номенклатуре ферментов
ЭДТА (EDTA)
этилендиаминтетрауксусная кислота
EMPA
Eidgenoessische Matenalprufungs- und Forschungs Anstalt (Федеральная лаборатория Швейцарии по тестированию и оценке материалов)
EO
этиленоксид (полимерный фрагмент)
F&HC
средства по уходу за тканями и для других хозяйственных нуждцелей
ГА (GA)
глюкоамилаза
IPTG
изопропил-β-D-тиогалактозид
кДа
килодальтон
LAS
линейный алкилбензолсульфонат
LAT
относится к амилазе <i>B.lichemformis (</i>например, сигнальная или, терминирующая последовательность амилазы из <i>B.lichemformis</i>)
MW
молекулярный вес
MWU
Модифицированные единицы Вольгемута; 1,6×l0<sup>-5</sup> мг/MWU= единица активности
NOBS
нонаноилоксибензолсульфонат
NTA
нитрилуксусная кислота
OxAm
Purastar HPAM 5000L (Genencor International, Inc.)
PEG
Полиэтиленгликоль
pI
изоэлектрическая точка
ПВА (PVA)
поли(виниловый спирт)
ПВП (PVP)
поли(винилпирролидон)
РНК
рибонуклеиновая кислота
SAS
алкансульфонат
ДСН-ПААГ
электрофорез в полиакриламидном геле-додецилсульфате натрия
sp.
вид
TAED
тетраацетилендиамин
w/v
вес/объем
w/w
вес/вес
Определения
1.2
Bacillus
В
licheniformis
B. subtilis.
Термины «амилаза» или «амилолитический фермент» в контексте настоящего описания включают любую амилазу, из таких как глюкоамилазы, α-амилазы, β-амилазы, α-амилазаsp. дикого типа, например, такую как α-амилаза из . и Термин «амилаза» обозначает фермент, который в числе других свойств способен катализировать разложение крахмала. Амилаза представляет собой гидролазу, которая расщепляет α-D-(1→4) O-гликозидные связи в крахмале. В основном, α-амилазы (EC 3.2.1.1; α-D-(1→4)-глюкан-глюкангидролазы) определяются как эндоферменты, расщепляющие α-D-(1→4) O-гликозидные связи в молекуле крахмала в случайном порядке. Тогда как экзоферменты амилолитического действия, такие как β-амилазы (EC 3.2.1.2; α-D-(1→4)-глюкан-мальтогидролазы) и некоторые специфичные для определенного продукта амилазы типа мальтогенной α-амилазы (EC 3.2.1.133), расщепляют молекулу крахмала с невосстановленного конца субстрата. β-амилазы, α-глюкозидазы (EC 3.2.1.20; α-D-глюкозид-глюкогидролазы), глюкоамилазы (EC 3.2.1.3; α-D-(1→4)-глюкан-глюкогидролазы) и специфичные для определенного продукта амилазы могут продуцировать мальтоолигосахариды конкретной длины из крахмала.
Bacillus
B. licheniformis
Bacillus
3
3
Термины «вариант амилазы», «вариант α-амилазы», «вариантный полипептид α-амилазы» и «вариант фермента» в контексте настоящего описания обозначают белок α-амилазы изsp. 195, который был модифицирован, например, путем использования сигнальной последовательности из другой α-амилаз и который содержит оптимизированную последовательность. В контексте настоящего описания термины «исходные ферменты», «исходная последовательность», «исходный полипептид дикого типа», «α-амилазный белок дикого типа» и «исходные полипептиды» обозначают ферменты и полипептиды, из которых были получены вариантные формы полипептидов α-амилазы. Исходный фермент может представлять собой фермент дикого типа или α-амилазу, которая была ранее сконструирована по рекомбинантной технологии. Таким образом, α-амилазный полипептид может представлять собой рекомбинантный сконструированный фермент. Вариант α-амилазы может также представлять собой белок слияния, содержащий гетерологичный полипептид α-амилазы. Так, например, белок α-амилазы может включать сигнальный пептид из α-амилазы  (LAT), соединенный со зрелым белком другой α-амилазой из. Термин «вариант» может использоваться взаимозаменяемо с термином «мутант». Варианты включают полипептиды, а также нуклеиновые кислоты. Варианты включают вставки; указанные варианты могут также включать дополнительные замещения, вставки, трансверсии, усечения и/или инверсии в одном или нескольких положениях. Варианты могут включать последовательности, которые являются комплементарными к последовательностям, которые способны гибридизироваться с нуклеотидными последовательностями согласно настоящему описанию. Например, вариантная последовательность комплементарна к последовательностям, способным гибридизироваться в жестких условиях (т.е. в условиях, включающих 50°C и промывку с использованием 0,2 × SSC {I × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na цитрат, pH 7,0}) с нуклеотидными последовательностями согласно настоящему описанию. Термин «вариант» может также включать последовательности, которые комплементарны к последовательностям, способным гибридизироваться в очень жестких условиях (т.е. при температуре 65°C и при промывке в 0,1 × SSC {I × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na цитрат, pH 7,0}) с нуклеотидными последовательностями согласно настоящему описанию.
Bacillus
Термины «α-амилаза sp. 195», «α-амилаза Amy 195» или «Amy 195» в контексте настоящего описания обозначают нуклеиновую кислоту (фиг. 1), кодирующую белок согласно фиг. 3, или синтетическую последовательность нуклеиновой кислоты согласно фиг. 2, которая также кодирует белок согласно фиг. 4. Она может включать любую усеченную форму (например, усеченную после остатка 492 в природном, рекомбинантном или синтетическом варианте, фермента форму фермента без сигнальной последовательности или форму фермента с гетерологичной сигнальной последовательностью и усеченной по карбоксиконцу). Кроме того, указанные термины могут охватывать любую производную последовательность согласно фиг. 3 и соответствующую ей последовательность ДНК, содержащую аминокислотные замещения, делеции, вставки или расширения аминокислот по N- или C-концу, которые не встречаются в природе.
Термин «выделенная» относится к последовательности, которая, по меньшей мере, в значительной части свободна, по меньшей мере, от одного другого компонента, с которым данная последовательность ассоциирована и встречается в природе.
Термин «очищенный» обозначает материал, который находится в относительно чистом состоянии, т.е., по меньшей мере, в состоянии 90% чистоты или который характеризуется, по меньшей мере, примерно 95% чистоты или, по меньшей мере, примерно 98% чистоты.
1/2
Термин «термостабильный» в контексте настоящего описания обозначает способность фермента сохранять активность после воздействия повышенных температур. Термостабильность фермента, такого как α-амилаза, определяется по его периоду полужизни. Период полужизни (t) представляет собой время в минутах, часах или днях, в течение которого теряется половина ферментативной активности в определенных условиях. Значение периода полужизни вычисляется при измерении остаточной активности α-амилазы.
Выражение «диапазон рН» относится к способности фермента демонстрировать каталитическую активность в условиях, варьирующих от кислых до основных, с охватом 5 или более единиц рН.
В контексте настоящего описания термин «рН-стабильный» относится к способности фермента сохранять активность в широком диапазоне значений рН.
В контексте настоящего описания термин «аминокислотная последовательность» используется как синоним термина «полипептид» и/или термина «белок». В некоторых случаях термин «аминокислотная последовательность» используется как синоним термина «пептид». В некоторых случаях термин «аминокислотная последовательность» используется как синоним термина «фермент».
В контексте настоящего описания термин «нуклеотидная последовательность» или «последовательность нуклеиновой кислоты» относится к олигонуклеотидной последовательности или полинуклеотидной последовательности и к их варианту, гомологам, фрагментам и производным (таким как их часть). Указанная нуклеотидная последовательность может быть геномной, синтетической или рекомбинантной и может быть как двуцепочечной, так и одноцепочечной, представляя смысловую или антисмысловую цепь. В контексте настоящего описания термин «нуклеотидная последовательность» включает геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК и РНК.
Термин «гомолог» в контексте настоящего описания обозначает структуру, обладающую определенной степенью идентичности с целевыми аминокислотными последовательностями и с целевыми нуклеотидными последовательностями. Гомологичная последовательность включает аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 75%, 80%, 85% или 90% идентична или, по меньшей мере, на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична целевой последовательности. В типичном случае, гомологи включают те же активные сайты, что и целевая аминокислотная последовательность.
В контексте настоящего описания термин «гибридизация» обозначает способ, посредством которого одна цепь нуклеиновой кислоты соединяется с комплементарной цепью в ходе спаривания оснований, а также способ амплификации, проводимый в рамках полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР). Вариантная форма нуклеиновой кислоты для α-амилазы может существовать в виде одноцепочечной или двуцепочечной ДНК или РНК, гетеродуплекса РНК/ДНК или сополимера РНК/ДНК.
В контексте настоящего описания, термин «сополимер» относится к одноцепочечной нуклеиновой кислоте, которая включает и рибонуклеотиды, и дезоксирибонуклеотиды. Нуклеиновая кислота для α-амилазы может даже быть оптимизирована по кодонам для дополнительного усиления экспрессии.
in vitro,
Pichia, Streptomyces,
Trichoderma reesei
Hansenula.
В контексте настоящего описания, термин «синтетический» определяет условия, при которых была достигнута продукция путем химического или энзиматического синтеза. Этот термин включает, без ограничения, вариантные формы нуклеиновых кислот для α-амилазы, которые получают при оптимизации использования кодонов в организмах-хозяевах, таких как, без ограничения, и
В контексте настоящего описания, термин «трансформированная клетка» включает клетки, которые были генетически изменены за счет использования технологии рекомбинантных ДНК. Трансформацию в типичном случае проводят при встраивании одной или нескольких нуклеотидных последовательностей в клетку. Встроенная нуклеотидная последовательность может представлять собой гетерологичную нуклеотидную последовательность (т.е. последовательность, которая не является природной для клетки, подлежащей трансформации, такая как последовательность, кодирующая белок слияния).
В контексте настоящего описания, термин «оперативно связанный» обозначает тот факт, что описываемые компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать заданным способом. Регуляторную последовательность, оперативно связанную с кодирующей последовательностью, подвергают лигированию таким образом, чтобы экспрессия кодирующей последовательности достигалась в условиях, совместимых с контрольными последовательностями.
В контексте настоящего описания, термин «биологически активный» относится к последовательности, имеющей аналогичные структурные свойства (но необязательно в той же самой степени) и/или аналогичную регуляторную функцию (но необязательно в той же степени), и/или аналогичную биохимическую функцию (но необязательно в той же степени), что и природная последовательность.
Нуклеиновые кислоты и кодируемые ими полипептиды
2.
Bacillus
(см.
Последовательность нуклеиновой кислоты из sp. 195 может быть оперативно связана с различными промоторами и регуляторами в векторе и экспрессироваться в различных клетках-хозяинах. Последовательность нуклеиновой кислоты, включающая 2103 остатка, описана и депонирована в GenBank с номером доступа No. AB006823 фиг. 1A-B). Полипептидная последовательность, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты из 2103 остатков, описана и депонирована в GenBank с номером доступа BAA22082.1 и включает 700 аминокислот в длину (фиг. 3). Первые 46 аминокислот формируют сигнальный пептид. Расщепление осуществляется после остатка 46 (Ala46).
B.subtilis
B. subtilis
При экспрессии в клетках образуются три протеолитически процессированных формы белка, выявляемые при анализе в геле. Все указанные формы имеют одинаковый аминоконец, но отличаются по своему карбоксиконцу. Форма размером 49,5 кДа заканчивается остатком Val492 (последовательность, приведенная на фиг. 4), т.e. в ней протеолитическое расщепление происходит после остатка 492. Две других более длинных формы, размером 69 кДа и 60 кДа, соответственно, содержат один и два крахмалсвязывающих домена, как описано в работе Сумитани с соавт. (Sumitani et al., (2000)). Генетически усеченные по С-концу формы получают с использованием продуктов, содержащих на С-конце остатки Tyr494, Lys504 и Val509. Все указанные продукты с усечением, полученным по рекомбинатной технологии, экспрессируются на высоком уровне в девяти штаммах с делетированной протеазой (см. US20050202535A1) под контролем LAT промотора и сигнальной последовательности, как показано на фиг. 8.
Белки слияния и рекомбинантные белки
2.1
Bacillus
Один аспект настоящего изобретения относится к белкам слияния, где используются сигнальные последовательности амилаз из других микроорганизмов, таких как дрожжи или другая бактерия, присоединенные к зрелому белку из sp. 195. А именно: первые 46 аминокислот, формируют сигнальную последовательность согласно фиг. 3, которая может быть удалена и заменена сигнальной последовательностью из другого микроорганизма или вариантом сигнальной последовательности из другого микроорганизма. Так, например, LAT последовательность (подчеркнутая и приведенная прописными буквами) может быть замещена по первым 46 аминокислотам, как показано на фиг. 4.
В. subtilis
B. subtilis,
B. subtilis
B. subtilis.
Streptomyces
Streptomyces
Другие примеры включают, без ограничения, сигнальную последовательность для α-амилазы из (amyE) для экспрессии в aprE промотор из и сигнальные последовательности, также подходящие для экспрессии в Кроме того, в настоящем изобретении рассматривается возможность тестирования экспрессии в sp. при использовании промоторов из и сигнальные последовательности из CelA.
Способ продукции и очистки белков
3.
Baallus,
Способы продукции и очистки белков, которые секретируются в культуральную среду из известны в данной области, как и известны подходящие клетки-хозяева для продукции α-амилаз. Репрезентативные методы для продукции α-амилаз описаны ниже.
Материалы и методы для продукции
-амилаз
3.1 α
Последовательность ДНК, кодирующая α-амилазу Amy195 или ее вариант, полученная по приведенным в настоящем описании способам или согласно любому из альтернативных способов, известных в данной области, может быть экспрессирована с образованием энзиматической формы, при использовании вектора экспрессии, который в типичном случае включает контрольные последовательности, кодирующие соответствующий промотор, оператор, сайт связывания рибосомы, сигнальную последовательность инициации трансляции и необязательно ген-репрессор или различные гены-активаторы.
Bacillus
Bacillus
Biosс. Biotechnol. Biochem
Streptomyces lividans
oi Bacillus
Biochem. J.
Так, например, sp. 195 может культивироваться при температуре 30°C, как описано в работе Кавагучи с соавт. (Kawaguchi et al., "Purification и some properties of a Haim-sensitive α-амилаз from newly isolated sp. 195," 56: 1792-1796 (1992)). Альтернативно, ген, кодирующий α-амилазу, оперативно связанную с вектором, может быть трансфицирован в другой организм, такой как TK-24, с последующим культивированием в подходящих условиях, как описано в литературе (J. Sumitani et al., "New type of starch-binding domain: the direct repeat motif in the C-terminal region sp. 195 α-амилаз contributes to starch binding и raw starch degrading," 350: 477-484 (2000)).
Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий последовательность ДНК, которая кодирует α-амилазу Amy195 или ее вариант, может представлять собой любой вектор, который может быть в удобном варианте подвергнут процедурам на основе рекомбинантных ДНК, и выбор такого вектора в основном зависит от клетки-хозяина, в которую он должен вводиться. Так, указанный вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т.е. вектор, который существует в виде внехромосомной единицы, репликация которого не зависит от репликации хромосомы, т.е. это может быть плазмида, бактериофаг или внехромосомный элемент, мини-хромосома или искусственная хромосома. Альтернативно, указанный вектор может представлять собой такой вектор, который при его введении в изолированную хозяйскую клетку интегрируется в геном клетки-хозяина и реплицируется вместе с одной или несколькими хромосомами, в которые он интегрирован. Интегрированный ген может также быть амплифицирован с образованием множественных копий гена в хромосоме за счет использования амплифицируемой конструкции, созданной при отборе на антибиотиках или при использовании другого фактора селективного давления, такого как обязательный регуляторный ген, или за счет комплементации по типу доза-эффект применительно к обязательному гена конкретного метаболического пути.
E. coli,
Streptomyces coelicolor
Bacillus licheniformis
Bacillus stearothermophilus,
Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus subtilis
.
Aspergillus oryzae
Rhizomucor miehei
Aspergillus niger
у из A. niger
A. niger
Rhizomucor miehei
A. oryzae
A. oryzae
A. nidulans
E. coli,
Saccharomyces cerevisiae
Pichia pastor
Trichoderma reesei
В векторе последовательность ДНК должна быть оперативно связана с подходящей промоторной последовательностью. Указанный промотор может представлять собой любую последовательность ДНК, которая демонстрирует транскрипционную активность в выбранной клетке-хозяине и может быть получена из генов, кодирующих белки, гомологичные или гетерологичные, в клетке-хозяине. Репрезентативные промоторы для осуществления транскрипции последовательности ДНК, кодирующей α-амилазу Amy 195 или ее вариант, в особенности, бактериальной хозяйской клетке, представляют собой промотор lac-оперона из промоторы гена агаразы dagA или сelA из, промоторы гена α-амилазы из  (amyL), промоторы гена мальтогенной амилазы (amyM) из промоторы α-амилазы (amyQ) из , промоторы генов xylA и xylB из и т.пДля транскрипции в грибном организме-хозяине в качестве примеров подходящих промоторов можно указать промоторы, полученные из генов, кодирующих, соответственно, амилазу из TAKA, аспарагиновую протеиназу из , нейтральную α-амилазу из , кислотостабильную α-амилаз, глюкоамилазу из , липазу из , щелочную протеазу из , триозофосфатизомеразу из  или ацетамидазу из . В том случае, когда ген, кодирующий вариантный полипептид α-амилазы, экспрессируется в клетках бактерий, таких как может быть выбран соответствующий промотор, например, промотор из бактериофага, включающий T7 промотор и промотор фага ламбда. Примеры подходящих промоторов для экспрессии в дрожжах включают, без ограничения, промоторы Gal 1 и Gal 10 из и промоторы из AOX1 или AOX2. Для экспрессии в клетках может быть использован промотор CBHII (целлобиогидролазы II).
Вектор экспрессии может также включать подходящие терминатор транскрипции, а в случае эукариот последовательности полиаденилирования, оперативно связанные с последовательностью ДНК, кодирующей α-амилазу Amy 195 или ее варианты. Последовательности терминации и полиаденилирования могут быть соответствующим образом выбраны из тех же источников, что и промотор.
Указанный вектор может также включать последовательность ДНК, позволяющую вектору реплицироваться в клетке-хозяине. Примерами таких последовательностей являются ориджины репликации плазмид pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 и pIJ702.
dal
B. subtilis
B.
licheniformis,
Aspergillus
amdS, argB, niaD
xxsC,
Указанный вектор также может включать селектируемый маркер, т.е. ген, продукт которого восполняет дефект, имеющийся в выделенной клетке-хозяине, такой как гены из или или ген, который придает антибиотикорезистентность, такой как, например, ген, придающий резистентность к ампицилину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину. Кроме того, указанный вектор может включать маркеры селекции для , такие как и маркер, определяющий резистентность к гигромицину, или селекция может сопровождаться сопутствующей трансформацией, известной в данной области. См., например, заявку на Международный патент PCT WO 91/17243.
Хотя внутриклеточная экспрессия или твердофазная ферментация могут быть полезны в ряде отношений, например, в тех случаях, когда в качестве хозяйских клеток используют некоторые бактерии или грибы, один из аспектов изобретения относится к экспрессии α-амилазы Amy 195 или ее вариантов в культуральной среде. В основном, α-амилаза включает сигнальную последовательность на аминоконце, что позволяет ей достичь ее секреции в культуральную среду. При желании, сигнальный пептид может быть замещен другой последовательностью за счет, например, замены последовательности ДНК, кодирующей соответствующий сигнальный полипептид. Сигнальные последовательности α-амилаз в типичном случае характеризуются наличием трех доменов, N-концевого домена, H-домена и C-концевого домена, где длина в типичном случае варьирует от 18 до 35 остатков, но они могут быть и длиннее, как это видно на примере сигнальной последовательности Amy 195.
Указанный вектор экспрессии в типичном случае включает компоненты вектора клонирования, такие как, например, элемент, который позволяет автономную репликацию вектора в выбранном организме-хозяине, и один или несколько фенотипически детектируемых маркеров для целей селекции. Такой вектор экспрессии в норме включает контрольные нуклеотидные последовательности, такие как промотор, оператор, сайт связывания рибосомы, сигнальная последовательность инициации трансляции и, необязательно, ген-репрессор и один или несколько генов-активаторов. Дополнительно, вектор экспрессии может включать последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая способна воздействовать на вариант α-амилазы в органелле хозяйской клетки, такой как пероксисома или конкретный компартмент хозяйской клетки. Такая воздействующая последовательность включает, без ограничения, последовательность SKL. Для экспрессии под управлением контрольных последовательностей последовательность нуклеиновой кислоты варианта α-амилаза оперативно связывается с контрольными последовательностями соответствующим способом, применительно к экспрессии. Часть репрезентативного вектора изображена на фиг. 5.
nd
rd
Процедуры, используемые для лигирования конструкции ДНК, кодирующей вариант α-амилазы, промотор, терминатор и другие элементы, соответственно, и для целей их встраивания в соответствующие векторы, содержащие информацию, необходимую для репликации, известны специалистам в данной области (см., например, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2 ed., Cold Spring Harbor, 1989, и 3 ed., 2001).
Изолированная клетка, содержащая либо конструкцию ДНК, либо вектор экспрессии, может быть с успехом использована в качестве клетки-хозяина в процедуре рекомбинантной продукции α-амилазы Amy 195 или ее варианта. Указанная клетка может быть трансформирована конструкцией ДНК, кодирующей фермент, путем интеграции конструкции ДНК (в виде одной или нескольких копий) в хозяйскую хромосому. Указанная интеграция в основном рассматривается как некоторое преимущество, поскольку в этом случае последовательность ДНК, с большей вероятностью, будет стабильно поддерживаться в клетке. Интеграция конструкций ДНК в хозяйскую хромосому может быть осуществлена по традиционным методам, например, путем гомологичной или гетерологичной рекомбинации. Альтернативно, указанная клетка может быть трансформирована описанным выше вектором экспрессии в условиях использования различных типов клеток-хозяев.
Bacillaceae,
Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium
Bacillus thuringiensis;
Streptomyces
Streptomyces murinus;
Lactococcus
Lactococcus lactis; Lactobacillus
Lactobacillus reuteri; Leuconostoc
Pediococcus
Streptococcus
Enterobacteriaceae
E. coli,
Pseudomonadaceae
Примеры подходящих бактериальных организмов-хозяев включают Грамположительные бактерии, такие как виды включающие и виды , такие как виды молочнокислых бактерий, включающих spp., такие как spp., включая spp.; spp. и spp. Альтернативно, штаммы для использования в качестве организма-хозяина могут быть выбраны из Грамотрицательных бактерий, принадлежащих к , включая или принадлежащие к .
Pichia
Hansenula
Kluyveromyces, Yarrowinia, Schizosaccharomyces
Saccharomyces,
Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces
S. pombe
Pichia pastoris
Hansenula
Aspergillus,
, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Aspergillus awamori
Aspergillus nidulans.
Fusarium
, Fusarium oxysporum,
Rhizomucor
Rhizomucor miehei
Thermomyces
Mucor
Trichoderma reesei
Aspergillus
Подходящий дрожжевой организм-хозяин может быть выбран из релевантного в биотехнологическом отношении вида дрожжей, который включает, без ограничения, такие виды дрожжей, как sp., sp. или  или вид, принадлежащий к  включающий или вид, принадлежащий к , такой как, например, . Штамм метилотрофных видов дрожжей также может использоваться в качестве организма-хозяина. Альтернативно, организм-хозяин может относиться к . Подходящие организмы-хозяева из числа нитевидных грибов включают виды напримерили Альтернативно, в качестве организма-хозяина могут использоваться штаммы вида , напримерили вида , такие как . Другие подходящие штаммы включают штаммы видов и . Дополнительно, в качестве организма-хозяина может использоваться . Подходящая процедура для трансформации клеток-хозяеввключает, без ограничения, процедуру, описанную в EP 238023.
Согласно еще одному аспекту, в настоящем изобретении предлагается способ получения α-амилазы Amy 195 или ее варианта, включающий культивирование хозяйской клетки, описанной выше, в условиях, подходящих для продукции фермента и восстановления фермента из клеток и/или культуральной среды.
Среда, используемая для культивирования клеток, может представлять собой любую стандартную среду, подходящую для выращивания рассматриваемой хозяйской клетки и достижения экспрессии α-амилазы Amy 195 или ее варианта. Подходящие среды и компоненты сред доступны от коммерческих источников или могут быть получены в соответствии с известными процедурами (например, описанными в каталогах Американской Коллекции типовых культур (American Type Culture Collection)).
Согласно еще одному аспекту, фермент, секретированный из хозяйских клеток, используют в препарате, созданном на основе полного бульона. Согласно способам настоящего изобретения, получение отработанного ферментационного бульона от рекомбинантного микроорганизма может быть достигнуто с использованием любого способа культивации, известного в данной области, который приводит к экспрессии α-амилазы. В этой связи, ферментацию стоит понимать как способ, включающий культивирование в качалочных колбах, низко- или крупномасштабную ферментацию (включая непрерывную ферментацию, периодическую ферментацию, периодическую ферментацию с подпиткой или твердофазную ферментацию) в лабораторных или промышленных ферментерах, осуществляемых в подходящей среде и в условиях, позволяющих экспрессировать или выделить амилазу. Термин «отработанный полный ферментационный бульон» в контексте настоящего описания определяется как нефракционированное содержимое ферментационного материала, который включает культуральную среду, внеклеточные белки (например, ферменты) и клеточную биомассу. Следует понимать, что термин «отработанный полный ферментационный бульон» также охватывает клеточную биомассу, которая была лизирована или подвергнута пермеабилизации с использованием способов, известных в данной области.
Фермент, секретированный из клеток-хозяев, может быть восстановлен из культуральной среды с использованием известных процедур, которые включают отделение клеток от среды с помощью центрифугирования или фильтрования и осаждение протеиноподобных компонентов среды с использованием соли, такой как сульфат аммония, с последующим использованием процедур хроматографии, таких как ионообменная хроматография, аффинная хроматография и т.п.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к полинуклеотиду в векторе, который оперативно соединен с контрольной последовательностью и который способен обеспечивать экспрессию кодирующей последовательности в клетке-хозяине, который является вектором экспрессии. При этом контрольные последовательности могут быть модифицированы, например, путем дополнительного добавления регуляторных элементов транскрипции, с тем чтобы сделать уровень транскрипции под управлением контрольной последовательности более отзывчивым к модуляторам транскрипции. Указанные контрольные последовательности могут, в частности, включать промоторы.
in vitro,
Клетки-хозяева могут культивироваться в подходящих условиях, которые позволяют экспрессию α-амилазы Amy 195 или ее варианта. Экспрессия ферментов может быть конститутивной, так что они могут продуцироваться на постоянной основе, или индуцируемой, где указанная экспрессия требует стимула для инициации. В случае индуцируемой экспрессии продукция белка может быть инициирована в том случае, когда требуется, например, добавление индуцирующего вещества в культуральную среду, например, дексаметазона или IPTG или Сефарозы. Полипептиды могут быть также получены в рекомбинантном виде в бесклеточной системе например, в системе, включающей ретикулоциты кролика TnT™ (Promega).
В случае α-амилазы Amy 195 или ее варианта экспрессирующий их организм-хозяин может также культивироваться в соответствующей для данного организма-хозяина среде, в аэробных условиях. Встряхивание или сочетание методов перемешивания или аэрации в этом случае могут быть полезными, при этом продукция осуществляется при соответствующей для данного организма-хозяина температуре, например, в диапазоне температур от примерно 25°C до примерно 75°C (например, при температуре 30°C- 45°C), в зависимости от потребностей организма-хозяина и от условий, связанных с продукцией желательного варианта α-амилазы. Культивирование может осуществляться в течение от примерно 12 до примерно 100 часов или больше (и включая любой временной промежуток, в часах, например, от 24 до 72 часов). В типичном случае культуральный бульон имеет рН от примерно 5,5 до примерно 8,0 и также определяется условиями культивирования, необходимыми для данного организма-хозяина применительно к продукции варианта α-амилазы.
Материалы и методы, применяемые для очистки белка
3.2
Методы ферментации, отделения и концентрирования хорошо известны в данной области и могут использоваться стандартные методики для получения концентрированной α-амилазы Amy 195 или ее варианта в растворе.
После ферментации получают ферментационный бульон, микробные клетки и различные суспендированные твердые вещества, включая остаточные материалы ферментации, удаляют с использованием стандартных методик разделения, получая раствор с амилазой. В основном, используют фильтрование, центрифугирование, микрофильтрацию, вакуумное фильтрование во вращающемся барабане, ультрафильтрацию, центрифугирование с последующей процедурой ультрафильтрации, экстракцию или хроматографию или т.п.
Желательно провести концентрирование раствора, содержащего α-амилазу Amy 195 или ее вариант, с тем чтобы оптимизировать процесс восстановления. Использование неконцентрированных растворов требует увеличения времени инкубации для сбора очищенного осадка фермента.
Раствор, содержащий фермент, концентрируют в рамках стандартных методов концентрирования до получения желательного уровня фермента. Концентрирование раствора, содержащего фермент, может быть достигнуто в рамках любой описанной ниже методики. Репрезентативные способы очистки включают, без ограничения, вакуумное фильтрование во вращающемся барабане и/или ультрафильтрацию.
Раствор, содержащий фермент, концентрируют до получения концентрированного раствора фермента, так чтобы ферментативная активность указанной концентрированной α-амилазой Amy 195 или ее варианта в содержащем их растворе составляла, по меньшей мере, примерно 4 г/л (в частности, по меньшей мере, примерно 4,8 г/л или, по меньшей мере, 5,6 г/л или еще выше). В некоторых вариантах очистки указанные концентрации могут быть повышены даже до примерно 25 г/л.
Термин «осаждающий агент» в контексте очистки обозначает соединение, которое эффективно действует в направлении осаждения α-амилазы Amy 195 или ее варианта из концентрированного раствора фермента в твердой форме, независимо от природы, т.е. кристаллической, аморфной или их смеси.
Осаждение может быть осуществлено с использованием, например, осаждающего агента на основе галогенида металла. Осаждающие агенты на основе галогенида металла включают, без ограничения, хлориды щелочного металла, бромиды щелочного металла и смеси двух или нескольких указанных галогенидов металлов. Репрезентативные галогениды металлов включают хлорид натрия, хлорид калия, бромид натрия, бромид калия и смеси двух или более указанных галогенидов металлов. Такой осаждающий агент на основе галогенида металлов, как хлорид натрия, может также использоваться в качестве консерванта.
Осаждающий агент на основе галогенида металла используется в количестве, которое эффективно для осаждения α-амилазы Amy 195 или ее варианта. Выбор наименьшего эффективного количества и оптимального количества галогенида металла, которое является эффективным для того, чтобы вызвать осаждение фермента, а также условий осаждения с целью достижения максимального восстановления, включающих время инкубации, величину рН, температуру и концентрацию фермента, могут быть легко определены специалистом после проведения стандартных процедур тестирования.
В основном, по меньшей мере, от примерно 5% (вес/объем) до примерно 25% (вес/объем) галогенида металла добавляют к концентрированному раствору фермента и обычно в концентрации, равной, по меньшей мере, 8% (вес/объем). В основном, добавляют не более чем 25% (вес/объем) галогенида металла к раствору концентрированного фермента и обычно не более чем примерно 20% (вес/объем). Оптимальная концентрация осаждающего агента на основе галогенида металла будет зависеть, в числе других факторов, от природы конкретного варианта α-амилазы Amy 195 и от его концентрации в концентрированном растворе фермента.
Другим альтернативным способом осаждения фермента является использование органических соединений. Репрезентативные органические соединения, используемые в качестве осаждающих агентов, включают: 4-гидроксибензойную кислоту, соли щелочного металла и 4-гидроксибензойной кислоты, сложные алкильные эфиры 4-гидроксибензойной кислоты и смеси двух или более таких органических соединений. Добавление указанных органических осаждающих агентов может проводиться до, одновременно или после добавления осаждающего агента на основе галогенида металла, при этом может практиковаться добавление обоих осаждающих агентов на основе органического соединения и галогенида металла, последовательно или одновременно.
Более подробное описание указанных методик приведено, например, в патенте США No. 5281526. В основном, органические осаждающие агенты выбирают из группы, состоящей из солей щелочного металла и 4-гидроксибензойной кислоты, таких как натриевая или калиевая соли, линейных или разветвленных сложных алкильных эфиров 4-гидроксибензойной кислоты, где алкильная группа содержит от 1 до 12 атомов углерода, а также смесей двух или более указанных органических соединений. Органические осаждающие агенты могут представлять собой, например, линейные или разветвленные сложные алкильные эфиры 4-гидроксибензойной кислоты, где указанная алкильная группа содержит от 1 до 10 атомов углерода, а также могут представлять собой смеси двух или более таких органических соединений. Репрезентативные органические соединения включают линейные алкильные эфиры 4-гидроксибензойной кислоты, где указанная алкильная группа содержит от 1 до 6 атомов углерода, а также могут представлять собой смеси двух или более таких органических соединений. Могут также использоваться сложные метиловые эфиры 4-гидроксибензойной кислоты, сложные пропиловые эфиры 4-гидроксибензойной кислоты, сложный бутиловый эфир 4-гидроксибензойной кислоты, сложный этиловый эфир 4-гидроксибензойной кислоты и смеси двух или более указанных органических соединений. Дополнительные органические соединения включают, без ограничения, сложный метиловый эфир 4-гидроксибензойной кислоты (называемый метил-парабен), сложный пропиловый эфир 4-гидроксибензойной кислоты (называемый пропил-парабен), где оба указанных соединения являются консервантами для амилазы.
Добавление органического осаждающего агента характеризуется преимуществом, определяемым высокой гибкостью условий осаждения, применительно к величине рН, температуре, концентрации α-амилазы Amy 195 или ее варианта, концентрации осаждающего агента и времени инкубации.
Осаждающий агент на основе органической кислоты используют в количестве, которое эффективно для повышения эффективности осаждения фермента, которое проводят с использованием осаждающего агента на основе галогенида металла. Выбор наименьшего эффективного количества и оптимального количества осаждающего агента на основе органического соединения, а также условий осаждения для достижения максимального восстановления, включая длительность инкубации, величину рН, температуру, концентрацию фермента, может выполнить специалист в данной области с учетом данного описания, после проведения стандартных процедур тестирования.
В основном, добавляют, по меньшей мере, примерно 0,01% (вес/объем) осаждающего агента на основе органического соединения в концентрированный раствор варианта фермента и обычно, по меньшей мере, добавляют примерно 0,02% (вес/объем). В основном, добавляют не более чем примерно 0,3% (вес/объем) осаждающего агента на основе органического соединения к концентрированному раствору варианта фермента, и обычно не больше чем примерно 0,2% (вес/объем).
Концентрированный раствор фермента, содержащий осаждающий агент на основе галогенида металла, а также осаждающий агент на основе органического соединения, может быть откорректирован по рН, который будет, несомненно, зависеть от природы фермента, подлежащего очистке. В основном, величину рН корректируют до уровня, примерно близкого к изоэлектрической точке амилазы. Величину рН корректируют до достижения рН в диапазоне от примерно 2,5 единиц рН ниже изоэлектрической точки (pI) до примерно 2,5 единиц рН выше изоэлектрической точки.
Время инкубации, необходимое для получения осадка очищенного фермента, зависит от природы конкретного фермента, концентрации фермента и конкретных используемых одного или нескольких осаждающих агентов и их концентраций. В основном, время, эффективное для осаждения фермента, составляет от примерно 1 до примерно 30 часов; и обычно не превышает примерно 25 часов. При наличии осаждающего агента на основе органического соединения длительность инкубации снижается до периода менее чем примерно 10 часов, и в большинстве случаев составляет даже примерно 6 часов.
В основном, температура в ходе инкубации составляет от примерно 4°C до примерно 50°C. В основном, указанный способ осуществляют при температуре от примерно 10°C до примерно 45°C (например, в диапазоне температур от примерно 20°C до примерно 40°C). Оптимальная температура для индукции осаждения варьирует в соответствии с условиями, в которых находится раствор, и от природы используемого фермента или одного или нескольких осаждающих агентов.
Полное восстановление осадка очищенного фермента и эффективность, с которой проводится этот процесс, повышаются при перемешивании раствора, включающего фермент, при добавлении галогенида металла и при добавлении органического соединения. Стадия перемешивания проводится в процессе добавления галогенида металла и органического соединения, а также в течение всего последующего периода инкубации. Подходящие способы перемешивания включают механическое перемешивание или встряхивание, энергичную аэрацию или любую другую аналогичную процедуру.
По завершению инкубации очищенный фермент отделяют от диссоциированного пигмента и других примесей и собирают с использованием стандартной процедуры разделения, такой как фильтрация, центрифугирование, микрофильтрация, вакуумное фильтрование во вращающемся барабане, ультрафильтрация, фильтрация под давлением, кросс-мембранная микрофильтрация, мембранная микрофильтрация в поперечном потоке или т.п. Дальнейшая очистка осадка очищенного фермента может быть достигнута при промывке данного осадка водой. Так, например, осадок очищенного фермента промывают водой, содержащей осаждающий агент на основе галогенида металла, или водой, содержащей галогенид металла и органическое соединение в качестве осаждающих агентов.
В ходе ферментации α-амилаза Amy 195 или ее вариант накапливается в культуральном бульоне. Для выделения и очистки желательного варианта α-амилазы культуральный бульон центрифугируют или фильтруют с целью удаления клеток, а полученную бесклеточную жидкость используют для очистки фермента. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный бесклеточный бульон обессоливают с использованием сульфата аммония, примерно до 70% насыщения; затем фракцию осадка, полученного с использованием соли, взятой до 70% насыщения, растворяют в буфере и наносят на колонку, такую как колонка с Сефадексом G-100, и далее элюируют для восстановления фракции активного фермента. Для дальнейшей очистки может быть использована стандартная процедура, такая как ионообменная хроматография.
Очищенные ферменты используются для стирки и чистки. Так, например, они могут использоваться в качестве детергентов в стиральных порошках и для удаления пятен. Они далее могут быть введены в состав готового продукта, имеющего вид либо жидкости (раствор, взвесь), либо твердого вещества (гранулярная порошковая форма).
of Bacillus
Biochem. J.
Streptomyces lividans
of Bacillus
Biochem. J.
4
2
4
2
2
2
4
2
4
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
Более конкретным примером очистки является способ, описанный в работе Сумитани с соавт. (J. Sumitani et al., "New type of starch-binding domain: the direct repeat motif in the C-terminal region sp. 195 α-amylase contributes to starch binding и raw starch degrading," 350:477-484 (2000)), и ниже этот способ приводится в сокращенном виде. Фермент, полученный из 4 литров культурального супернатанта от TK24, обрабатывают (NH)SО при 80% насыщении. Осадок восстанавливают центрифугированием при 10000 x g (20 минут при температуре 4°C) и перерастворяют в 20 мМ Трис/HCl буфере (pH 7,0), содержащем 5 мМ CaCl. Солюбилизированный осадок далее подвергают диализу против того же буфера. Диализованный образец наносят на колонку Sephacryl S-200, которая была ранее уравновешена с использованием 20 мМ Трис/HCl буфера (pH 7,0), 5 мМ CaCl, и проводят линейную элюцию со скоростью в течение 7 см/час тем же буфером. Фракции, получаемые при элюции с колонки, собирают и оценивают их активность в тесте на ферментативную активность и при использовании электрофореза в ДСН-ПААГ. Далее белок подвергают очистке следующим образом. Колонку Toyopearl HW55 (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA; Cat. No. 19812) уравновешивают 20 мМ Tрис/HCl буфером (pH 7,0), содержащим 5 мМ CaCl и 1,5 M (NH)SO. Фермент элюируют в линейном градиенте от 1,5 до 0 M (NH)SО в 20 мМ Трис/HCl буфере, pH 7,0, содержащем 5 мМ CaCl. Активные фракции собирают и фермент осаждают (NH)SO при 80% насыщении. Осадок отбирают, перерастворяют и диализируют по указанной выше процедуре. Диализованный образец наносят на колонку Mono Q HR5/5 (Amersham Pharmacia; Cat. No. 17-5167-01), которая была предварительно уравновешена 20 мМ Трис/HCl буфером (pH 7,0), содержащим 5 мМ CaCl, со скоростью течения 60 мл/час. Активные фракции собирают и добавляют к 1,5 M раствору (NH)S0. Фракцию активного фермента подвергают повторной хроматографии на колонке Toyopearl HW55, как было описано ранее, с получением гомогенного фермента, по результатам оценки путем электрофореза в ДСН-ПААГ (см. J. Sumitani et al., "New type of starch-binding domain: the direct repeat motif in the C-terminal region sp. 195 α-amylase contributes to starch binding и raw starch degrading," 350: 477-484 (2000)), где приводится общее описание и обсуждение данного метода и его вариаций.
Для восстановления в крупномасштабных процессах, указанный фермент может быть частично очищен, как было описано в общих чертах выше, путем удаления клеток за счет флокуляции полимерами. Альтернативно, фермент может быть очищен микрофильтрацией с последующим концентрированием ультрафильтрацией с использованием доступных мембран и соответствующего оборудования. Однако в некоторых вариантах применения фермент необязательно должен быть очищен, и в этом случае полный культуральный бульон может быть подвергнут лизированию и далее использован без дополнительной обработки. Далее фермент может быть обработан с получением, например, гранул.
Композиции для очистки
4.
α-амилаза Amy195 и один или несколько ее вариантов обладают ценными свойствами, позволяющими применять их во множестве промышленных процессов. Указанные ферменты могут использоваться в качестве компонента в детергентных композициях для стирки, мытья посуды и чистки твердых поверхностей. Они также могут быть введены в состав композиции как часть детергентной добавки, как часть детергентной композиции, как часть композиции, предназначенной для автоматического или ручного мытья посуды, и т.п. α-амилаза Amy195 и один и или несколько ее вариантов могут включаться в указанные средства в концентрации, которая стандартно используется в детергентах. Согласно настоящему изобретению, в рассматриваемые детергентные композиции α-амилаза может добавляться в количестве, соответствующем 0,00001 - 1 мг (при расчете на чистый ферментный белок) α-амилазы на литр жидкости для стирки/мытья посуды. Репрезентативные композиции приведены ниже.
Детергентная композиция для стирки
4.1
J. Biol. Chem.
J. Chromatography A
Соответственно, α-амилаза Amyl95 или ее вариант может в типичном случае представлять собой компонент детергентной композиции в виде только одного фермента или в сочетании с другими ферментами, включающими другие амилолитические ферменты. В качестве таковой она может вводиться в состав детергентной композиции в форме обеспыленного гранулята, в форме стабилизированной жидкости или защищенного фермента. Обеспыленные грануляты могут быть получены, например, по процедуре, описанной в патентах США NoNo. 4106991 и 4661452, и могут необязательно содержать покрытие, нанесенное согласно известным в данной области методам. Примеры воскообразных покрывающих материалов включают поли(этиленоксидные) продукты (полиэтиленгликоль, ПЭГ) со средним молекулярным весом от 1000 до 20000; этоксилированные нонилфенолы, содержащие от 16 до 50 этиленоксидных единиц, этоксилированные жирные спирты, где входящий в их состав спирт содержит от 12 до 20 атомов углерода, и которые содержат от 15 до 80 этиленоксидных единиц; жирные спирты; жирные кислоты; и моно- и ди- и триглицериды жирных кислот. Примеры пленкообразующих покрывающих материалов, подходящих для применения в методах нанесения с использованием псевдоожиженного слоя, приведены, например, в патенте GB no. 1483591. Жидкие ферментные композиции могут быть стабилизированы, например, за счет добавления полиола, такого как пропиленгликоль, сахар или сахарный спирт, молочная кислота или борная кислота, согласно установленным методам. Другие стабилизаторы ферментов также известны в данной области. Защищенные ферменты могут быть получены согласно методу, описанному, например, в EP 238216. Полиолы давно уже известны как стабилизаторы белков, а также как средства, улучшающие растворимость белков (см, например, J. K. Kaushik et al., "Why is trehalose an exceptional protein stabilizer?" 278: 26458-65 (2003) и содержащиеся в работе ссылки, а также Monica Conti et al., "Capillary isoelectric focusing: the problem of protein solubility," 757: 237-245 (1997)).
Детергентная композиция может быть представлена в любой используемой форме, например, в виде порошков, гранул, паст или жидкости. Жидкий детергент может быть водным, который в типичном случае содержит примерно до 70% воды и от 0% до примерно 30% органического растворителя. Указанная композиция также может быть представлена в виде компактного геля, содержащего всего примерно 30% воды.
Детергентная композиция включает в свой состав один или несколько поверхностно-активных веществ, каждое из которых может быть анионным, неионным, катионным или цвиттерионным. Детергент обычно содержит от 0% до примерно 50% анионного поверхностно-активного вещества, такого как линейный алкилбензолсульфонат (LAS); α-олефинсульфонат (AOS); алкилсульфат (сульфат жирного спирта) (AS); этоксисульфат спирта (AEOS или AES); вторичные алкансульфонаты (SAS); сложные метиловые эфиры α-сульфо-жирной кислоты; алкил- или алкенил-янтарная кислота; или мыло. Указанная композиция может также содержать от 0% до примерно 40% неионного поверхностно-активного вещества, такого как этоксилат спирта (AEO или AE), этоксилаты карбоксилированного спирта, этоксилат нонилфенола, алкилполигликозид, алкилдиметиламиноксид, моноэтаноламид этоксилированной жирной кислоты, моноэтаноламид жирной кислоты или амид полигидроксиалкилированной жирной кислоты (как описано, например в WO 92/06154).
Дополнительно, детергентная композиция может включать один или несколько других ферментов, таких как липаза, другой амилолитический фермент, кутиназа, протеаза, целлюлаза, пероксидаза и/или лакказа, в любом сочетании.
Указанный детергент может содержать от примерно 1% до примерно 65% детергентного наполнителя или комплексообразующего агента, такого как цеолит, дифосфат, трифосфат, фосфонат, цитрат, нитрилтриуксусная кислота (NTA), этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTMPA), алкил- или алкенил-янтарная кислота, растворимые силикаты или слоистые силикаты (например, SKS-6 от Hoechst). Указанный детергент также может быть представлен в форме без наполнителя, например, по существу в форме, свободной от детергентного наполнителя. При этом ферменты могут использоваться в составе любой композиции, совместимой с условиями поддержания стабильности фермента. Указанные ферменты в основном могут быть защищены от действия вредных для них компонентов за счет использования известных форм инкапсулирования, например, путем гранулирования или секвестрации в гидрогелях. Ферменты и, в частности, α-амилазы, такие как молекулы amy195, содержащие или не содержащие крахмалсвязывающие доменты, могут использоваться в различных композициях, включая композиции, используемые для стирки и для мытья посуды, в композициях, используемых для чистки поверхности, а также в композициях, используемых для получения этанола из крахмала или биомассы.
Детергент может включать один или несколько полимеров. Соответствующие примеры включают карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ), поли(винилпирролидон) (ПВП), полиэтиленгликоль (ПЭГ), поли(виниловый спирт) (ПВА), поликарбоксилаты, такие как полиакрилаты, сополимеры малеиновой /акриловой кислоты и сополимеры луарилметакрилата/акриловой кислоты.
2
2
Указанный детергент может содержать отбеливающую систему, которая, в свою очередь, может включать источник HO, такой как перборат или перкарбонат, который может быть объединен с активатором отбеливания, образующим надкислоту, такой как тетраацетилэтилендиамин (TAЭД) или нонаноилоксибензолсульфонат (НОБС). Альтернативно, отбеливающая система может включать пероксикислоты (например, пероксикислоты амидного, имидного или сульфонного типа). Отбеливающая система может также представлять собой отбеливающую систему ферментативного типа, например, на основе пергидролазы, такую как система, описанная в Международной заявке PCT WO 2005/056783.
Ферменты в рассматриваемой детергентной композиции могут быть стабилизированы за счет использования стандартных стабилизирующих агентов, например, полиола, такого как пропиленгликоль или глицерин; сахара или сахарного спирта; молочной кислоты, борной кислоты или производного борной кислоты, такого как, например, сложный эфир ароматического соединения бората; и указанная композиция может быть изготовлена в соответствии с процедурой, описанной, например, в WO 92/19709 и WO 92/19708.
Указанный детергент также может содержать другие стандартные для детергента ингредиенты, такие как тканевые кондиционеры, включающие глины, усилители пенообразования, супрессоры образования мыльной пены, антикоррозийные средства, вещества, используемые для суспендирования загрязняющих частиц, средства, препятствующие повторному отложению загрязняющих частиц, красители, бактерицидные вещества, ингибиторы потускнения, оптические отбеливатели или отдушки.
Величина pH (измеряемая в водном растворе используемой концентрации) обычно имеет нейтральное или щелочное значение, например, pH от примерно 7,0 до примерно 11,0.
Конкретные формы детергентных композиций, включающих α-амилазу Amy195 или ее варианты, могут быть изготовлены с образованием композиций следующего вида:
12-18
16-18
14-15
2
3
2
2
4
2
4
6
5
3
7
6
8
7
3
2
1) Детергентная композиция, изготовленная в виде гранулята, обладающего объемной плотностью, равной, по меньшей мере, 600 г/л, которая включает линейный алкилбензолсульфонат (рассчитанный по кислоте), в количестве от примерно 7% до примерно 12%; этоксисульфат спирта (например, С спирт, 1-2 этиленоксидных единицы (ЕО)) или алкилсульфат (например, С), в количестве от примерно 1% до примерно 4%; этоксилат спирта (например, C спирт, 7 EO), в количестве от примерно 5% до примерно 9%; карбонат натрия (т.е. NaCO), в количестве от примерно 14% до примерно 20%; растворимый силикат (например, NaО , 2SiО), в количестве от примерно 2% до примерно 6%; цеолит (например, NaAlSiО), в количестве от примерно 15% до примерно 22%; сульфат натрия (т.е. NaSO), в количестве от примерно 0% до примерно 6%; цитрат натрия/лимонная кислота (например, CHNaО/CHO), в количестве от 0% до примерно 15%; перборат натрия (например, NaBОHО), в количестве от примерно 11% до примерно 18%; TAЭД, в количестве от примерно 2% до примерно 6%; карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ), в количестве от 0% до примерно 2%; полимеры (например, сополимер малеиновой/акриловой кислоты, ПВП, ПЭГ), 0-3%; ферменты (рассчитанные по чистому ферменту), 0,0001-0,1% по белку; и минорные ингредиенты (например, супрессоры образования мыльной пены, отдушки, оптический осветлитель, фотоотбеливатель) 0-5%.
12-18
16-18
14-15
2
3
2
2
4
2
4
6
5
3
7
6
8
7
2) Детергентная композиция, изготовленная в виде гранулята, обладающего объемной плотностью, равной, по меньшей мере, 600 г/л, которая включает линейный алкилбензолсульфонат (рассчитанный по кислоте), в количестве от примерно 6% до примерно 11%; этоксисульфат спирта (например, С спирт, 1-2 ЕО) или алкилсульфат (например, С), в количестве от примерно 1% до примерно 3%; этоксилат спирта (например, C спирт, 7 EO), в количестве от примерно 5% до примерно 9%; карбонат натрия (т.е. NaCО), в количестве от примерно 15% до примерно 21%; растворимый силикат (например, NaО, 2SiО), в количестве от примерно 1% до примерно 4%; цеолит (например, NaAlSiО), в количестве от примерно 24% до примерно 34%; сульфат натрия (т.е. NaSО), в количестве от примерно 4% до примерно 10%; цитрат натрия/лимонная кислота (например, CHNaО/CHO), в количестве от 0% до примерно 15%; карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ), в количестве от 0% до примерно 2%; полимеры (например, сополимер малеиновой/акриловой кислоты, ПВП, ПЭГ), 1-6%; ферменты (рассчитанные по белку чистого фермента), 0,0001-0,1%; минорные ингредиенты (например, супрессоры образования мыльной пены, отдушки) 0-5%.
12-15
16-22
2
3
2
2
4
2
4
3
2
3) Детергентная композиция, изготовленная в виде гранулята, обладающего объемной плотностью, равной, по меньшей мере, 600 г/л, которая включает линейный алкилбензолсульфонат (рассчитанный по кислоте), в количестве от примерно 5% до примерно 9%; этоксилат спирта (например, С спирт, 7 ЕО), в количестве от примерно 7% до примерно 14%; мыло, такое как жирная кислота (например, C жирная кислота), в количестве от примерно 1% до примерно 3%; карбонат натрия (т.е. NaCО), в количестве от примерно 10% до примерно 17%; растворимый силикат (например, NaО, 2SiО), в количестве от примерно 3% до примерно 9%; цеолит (в виде, NaAlSiО), в количестве от примерно 23% до примерно 33%; сульфат натрия (т.е. NaSО), в количестве от 0% до примерно 4%; перборат натрия (например, NaBОHO), в количестве от примерно 8% до примерно 16%; TAЭД, в количестве от примерно 2% до примерно 8%; фосфонат (например, EDTMPA), в количестве от 0% до примерно 1%; карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ), в количестве от 0% до примерно 2%; полимеры (например, сополимер малеиновой/акриловой кислоты, ПВП, ПЭГ), 0-3%; ферменты (рассчитанные по белку чистого фермента), 0,0001-0,1%; минорные ингредиенты (например, супрессоры образования мыльной пены, отдушка, оптический осветлитель) 0-5%.
12-15
2
3
2
2
4
2
4
,
4) Детергентная композиция, изготовленная в виде гранулята, обладающего объемной плотностью, равной, по меньшей мере, 600 г/л, которая включает линейный алкилбензолсульфонат (рассчитанный по кислоте), в количестве от примерно 8% до примерно 12%; этоксилат спирта (например, С спирт, 7 ЕО), в количестве от примерно 10% до примерно 25%; карбонат натрия (т.е. NaCО), в количестве от примерно 14% до примерно 22%; растворимый силикат (например, NaО, 2SiО), в количестве от примерно 1% до примерно 5%; цеолит (например, NaAlSiО), в количестве от примерно 25% до примерно 35%; сульфат натрия (напримерNaSO), в количестве от 0% до примерно 10%; карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ), в количестве от 0% до примерно 2%; полимеры (например, сополимер малеиновой/акриловой кислоты, ПВП, ПЭГ), 1-3%; ферменты (рассчитанные по белку чистого фермента), 0,0001-0,1%; и минорные ингредиенты (например, супрессоры образования мыльной пены, отдушка) 0-5%.
12-15
12-15
12-14
4
7
5) Водная жидкая детергентная композиция, включающая линейный алкилбензолсульфонат (рассчитанный по кислоте), в количестве от примерно 15% до примерно 21%; этоксилат спирта (например, С спирт, 7 ЕО или С спирт, 5 ЕО), в количестве от примерно 12% до примерно 18%; мыло, такое как жирная кислота (например, олеиновая кислота), в количестве от примерно 3% до примерно 13%; алкенил-янтарную кислоту (С), в количестве от 0% до примерно 13%; аминоэтанол, в количестве от примерно 8% до примерно 18%; лимонную кислоту, в количестве от примерно 2% до примерно 8%; фосфонат, в количестве от 0% до примерно 3%; полимеры (например, ПВП, ПЭГ), в количестве от 0% до примерно 3%; борат (например, ВО), в количестве от 0% до примерно 2%; этанол, в количестве от 0% до примерно 3%; пропиленгликоль, в количестве от примерно 8% до примерно 14; ферменты (рассчитанные по белку чистого фермента), 0,0001-0,1%; и минорные ингредиенты (например, средства, способствующие диспергированию, супрессоры образования мыльной пены, отдушка, оптический осветлитель) 0-5%.
12-15
12-15
4
4
7
6) Водная жидкая структурированная детергентная композиция, включающая линейный алкилбензолсульфонат (рассчитанный по кислоте), в количестве от примерно 15% до примерно 21%; этоксилат спирта (например, С спирт, 7 ЕО или С спирт, 5 ЕО), 3-9%; мыло, такое как жирная кислота (например, олеиновая кислота), в количестве от примерно 3% до примерно 10%; цеолит цеолит (в виде NaAlSiО), в количестве от примерно 14% до примерно 22%; цитрат калия, в количестве от примерно 9% до примерно 18%; борат (например, ВО), в количестве от 0% до примерно 2%; карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ), в количестве от 0% до примерно 2%; полимеры (например, ПЭГ, ПВП), в количестве от 0% до примерно 3%; связанные полимеры, такие как, например, сополимер лурилметакрилата/акриловой кислоты (в молярном соотношении 25:1, М.в.-3800), в количестве от 0% до примерно 3%, глицерин, в количестве от 0% до примерно 5%; ферменты (рассчитанные по белку чистого фермента), 0,0001-0,1%; и минорные ингредиенты (например, диспергирующие вещества, супрессоры образования мыльной пены, отдушка, оптические осветлители), 0-5%.
2
3
2
2
4
2
4
3
2
,
7) Детергентная композиция, изготовленная в виде гранулята, обладающего объемной плотностью, равной, по меньшей мере, 600 г/л, которая включает сульфат жирного спирта, в количестве от примерно 5% до примерно 10%; моноэтаноламид этоксилированной жирной кислоты, в количестве от примерно 3% до примерно 9%; мыло, такое как жирная кислота, 0-3%; карбонат натрия (например, NaCО), в количестве от примерно 5% до примерно 10%; растворимый силикат (например, NaО, 2SiО), в количестве от примерно 1% до примерно 4%; цеолит (например, NaAlSiО), в количестве от примерно 20% до примерно 40%; сульфат натрия (напримерNaSО), в количестве от примерно 2% до примерно 8%; перборат натрия (например, NaBОHO), в количестве от примерно 12% до примерно 18%; TAЭД, в количестве от примерно 2% до примерно 7%; полимеры (например, сополимер малеиновой/акриловой кислоты, ПЭГ), в количестве от примерно 1% до примерно 5%; ферменты (рассчитанные по белку чистого фермента), 0,0001-0,1%; и минорные ингредиенты (например, оптический осветлитель, супрессоры образования мыльной пены, отдушка), 0-5%.
2
3
2
2
4
2
4
6
5
3
7
,
8) Детергентная композиция, изготовленная в виде гранулята, включающая линейный алкилбензолсульфонат (рассчитанный по кислоте), в количестве от примерно 8% до примерно 14%; моноэтаноламид этоксилированной жирной кислоты, в количестве от примерно 5% до примерно 11%; мыло, такое как жирная кислота, в количестве от 0% до примерно 3%; карбонат натрия (например, NaCО), в количестве от примерно 4% до примерно 10%; растворимый силикат (например, NaО, 2SiО), в количестве от примерно 1% до примерно 4%; цеолит (например, NaAlSiО), в количестве от примерно 30% до примерно 50%; сульфат натрия (напримерNaSO), в количестве от примерно 3% до примерно 11%; цитрат натрия (например, CHNaО), в количестве от примерно 5% до примерно 12%; полимеры (например, ПВП, сополимер малеиновой/акриловой кислоты, ПЭГ), в количестве от примерно 1% до примерно 5%; ферменты (рассчитанные по белку чистому ферменту), 0,0001-0,1%; и минорные ингредиенты (например, супрессоры образования мыльной пены, отдушка), 0-5%.
2
3
4
2
4
6
5
3
7
3
2
,
9) Детергентная композиция, изготовленная в виде гранулята, которая включает линейный алкилбензолсульфонат (рассчитанный по кислоте), в количестве от примерно 6% до примерно 12%; неионное поверхностно-активное вещество, в количестве от примерно 1% до примерно 4%; мыло, такое как жирная кислота, в количестве от примерно 2% до примерно 6%; карбонат натрия (например, NaCО), в количестве от примерно 14% до примерно 22%; цеолит (например, NaAlSiО), в количестве от примерно 18% до примерно 32%; сульфат натрия (напримерNaSO), в количестве от примерно 5% до примерно 20%; цитрат натрия (например, CHNaО), в количестве от примерно 3% до примерно 8%; перборат натрия (например, NaBОHО), в количестве от примерно 4% до примерно 9%; активатор отбеливания (например, НОБС или TAЭД), в количестве от примерно 1% до примерно 5%; карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ), в количестве от 0% до примерно 2%; полимеры (например, поликарбоксилат или ПЭГ), в количестве от примерно 1% до примерно 5%; ферменты (рассчитанные по белку чистого фермента), 0,0001-0,1%; и минорные ингредиенты (например, оптический осветлитель, отдушка), 0-5%.
12-15
12-15
12-15
4
7
10) Водная жидкая детергентная композиция, включающая линейный алкилбензолсульфонат (рассчитанный по кислоте), в количестве от примерно 15% до примерно 23%; этоксисульфат спирта (например, С спирт, 2-3 ЕО), в количестве от примерно 8% до примерно 15%; этоксилат спирта (например, С спирт, 7 ЕО или С спирт, 5 ЕО), в количестве от примерно 3% до примерно 9%; мыло, такое как жирная кислота (например, лауриновая кислота), в количестве от 0% до примерно 3%; аминоэтанол, в количестве от примерно 1% до примерно 5%; цитрат натрия, в количестве от примерно 5% до примерно 10%; гидротропное вещество (например, толуолсульфонат натрия), в количестве от примерно 2% до примерно 6%; борат (например, ВО), в количестве от 0% до примерно 2%; карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ), в количестве от 0% до примерно 1%; этанол, в количестве от примерно 1% до примерно 3%; пропиленгликоль, в количестве от примерно 2% до примерно 5%; ферменты (рассчитанные по белку чистого фермента), 0,0001-0,1%; и минорные ингредиенты (например, полимеры, средства, способствующие диспергированию, отдушка, оптические осветлители), 0-5%.
12-15
12-15
4
7
11) Водная жидкая детергентная композиция, включающая линейный алкилбензолсульфонат (рассчитанный по кислоте), в количестве от примерно 20% до примерно 32%; этоксилат спирта (например, например, С спирт, 7 ЕО или С спирт, 5 ЕО), 6-12%; аминоэтанол, в количестве от примерно 2% до примерно 6%; лимонную кислоту, в количестве от примерно 8% до примерно 14%; борат (например, ВО), в количестве от примерно 1% до примерно 3%; полимер (например, сополимер малеиновой/акриловой кислоты, связанный полимер, такой как, например, сополимер луарилметакриловой/акриловой кислота, связанный полимер, такой как, например, сополимер лаурилметакрилата/акриловой кислоты), в количестве от 0% до примерно 3%; глицерин, в количестве от примерно 3% до примерно 8%; ферменты (рассчитанные по белку чистого фермента), 0,0001-0,1%; и минорные ингредиенты (например, гидротропные вещества, диспергирующие вещества, отдушка, оптические осветлители), 0-5%.
2
3
2
2
2
4
4
3
2
,
12) Детергентная композиция, изготовленная в виде гранулята, обладающего объемной плотностью, равной, по меньшей мере, 600 г/л, которая включает анионное поверхностно-активное вещество (линейный алкилбензолсульфонат, алкилсульфат, α-олефинсульфонат, сложные метиловые эфиры α-сульфожирной кислоты, алкансульфонаты, мыло), в количестве от примерно 25% до примерно 40%; неионное поверхностно-активное вещество (например, этоксилат спирта), в количестве от примерно 1% до примерно 10%; карбонат натрия (например, NaCO), в количестве от примерно 8% до примерно 25%; растворимые силикаты (например, NaO, 2SiO), в количестве от примерно 5% до примерно 15%; сульфат натрия (напримерNaSО), в количестве от 0% до примерно 5%; цеолит (NaAlSiО), в количестве от примерно 15% до примерно 28%; перборат натрия (например, NaBО4HО), в количестве от 0% до примерно 20%; активатор отбеливания (TAЭД или НОБС), в количестве от 0% до примерно 5%; ферменты (рассчитанные по белку чистого фермента), 0,0001-0,1%; и минорные ингредиенты (например, отдушка, оптические осветлители), 0-3%.
12
18
13) Детергентные композиции, соответствующие композициям 1)-12), приведенным выше, где линейный алкилбензолсульфонат, полностью или частично, замещен (С-С) алкилсульфатом.
12
18
4
2
3
2
2
14) Детергентная композиция, изготовленная в виде гранулята, обладающего объемной плотностью, равной, по меньшей мере, 600 г/л, которая включает (С-С) алкилсульфат, в количестве от примерно 9% до примерно 15%; этоксилат спирта, в количестве от примерно 3% до примерно 6%; амид полигидроксиалкилжирной кислоты, в количестве от примерно 1% до примерно 5%; цеолит (например, NaAlSiО), в количестве от примерно 10% до примерно 20%; слоистый дисиликат (например, SK56 от компании Hoechst), в количестве от примерно 10% до примерно 20%; карбонат натрия (например, NaCО), в количестве от примерно 3% до примерно 12%; растворимый силикат (например, NaO, 2SiO), в количестве от 0% до примерно 6%; цитрат натрия, в количестве от примерно 4% до примерно 8%; перкарбонат натрия, в количестве от примерно 13% до примерно 22%; TAЭД, в количестве от примерно 3% до примерно 8%; полимеры (например, поликарбоксилаты и ПВП), в количестве от 0% до примерно 5%; ферменты (рассчитанные по белку чистого фермента), 0,0001-0,1%; и минорные ингредиенты (например, оптический осветлитель, фотоотбеливатель, отдушка, супрессоры образования мыльной пены), 0-5%.
12
18
2
3
2
2
15) Детергентная композиция, изготовленная в виде гранулята, обладающего объемной плотностью, равной, по меньшей мере, 600 г/л, которая включает (С-С) алкилсульфат, в количестве от примерно 4% до примерно 8%; этоксилат спирта, в количестве от примерно 11% до примерно 15%; мыло, в количестве от примерно 1% до примерно 4%; цеолит МАР или цеолит А, в количестве от примерно 35% до примерно 45%; карбонат натрия (в виде NaCО), в количестве от примерно 2% до примерно 8%; растворимый силикат (например, NaO, 2SiO), в количестве от 0% до примерно 4%; перкарбонат натрия, в количестве от примерно 13% до примерно 22%; TAЭД, 1-8%; карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ), в количестве от 0% до примерно 3%; полимеры (например, поликарбоксилаты и ПВП), в количестве от 0% до примерно 3%; ферменты (рассчитанные по белку чистого фермента), 0,0001-0,1%; и минорные ингредиенты (например, оптический осветлитель, фосфонат, отдушка), 0-3%.
16) Детергентные композиции, описанные выше в пунктах 1)-15), которые содержат стабилизированную или инкапсулированную надкислоту либо в качестве дополнительного компонента, либо в качестве заместителя для уже определенных выше отбеливающих систем.
17) Детергентные композиции, описанные выше в пунктах 1), 3), 7), 9) и 12), где указанный перборат замещен перкарбонатом.
Nature
18) Детергентные композиции, описанные выше в пунктах 1), 3), 7), 9), 12), 14) и 15), которые дополнительно содержат марганцевый катализатор. Указанный марганцевый катализатор представляет собой, например, одно из соединений, описанных в руководстве по марганцевым катализаторам ("Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching," 369:637-639(1994)).
19) Детергентная композиция, изготовленная в виде неводной детергентной жидкости, включающей жидкое неионное поверхностно-активное вещество, такое как, например, линейный алкоксилированный первичный спирт, наполнительную систему (например, фосфат), один или несколько ферментов и щелочное вещество. Указанный детергент может также включать анионное поверхностно-активное вещество и/или систему отбеливания.
α-амилаза Amy 195 или ее вариант может быть введена в состав композиции в концентрациях, которые обычно используют в детергентах. Согласно настоящему изобретению, указанный фермент может быть добавлен в детергентную композицию в количестве, соответствующем 0,00001-1,0 мг (рассчитанный по белку чистого фермента) α-амилазы Amy 195 или ее варианта, в расчете на литр чистящей жидкости.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения, другие ферменты, такие как 2,6-β-D-фруктангидролаза, могут быть включены в детергентные композиции, содержащие α-амилазу Amy 195 или ее вариант, с целью использования для удаления/очистки биопленки, присутствующей в хозяйственных и/или промышленных текстильных изделиях /для стирки.
Указанная детергентная композиция может также быть изготовлена, например, в виде детергентной композиции, пригодной для ручной или машинной (автоматизированной) стирки, включая композицию добавки для стирки, подходящей для предварительной обработки ткани с пятнами, и композицию с добавленным смягчителем для промывки ткани, или может быть изготовлена в виде детергентной композиции для использования при чистке твердых поверхностей в домашних условиях, или может быть изготовлена в виде, подходящем для ручной или автоматизированной мойки посуды.
В конкретном аспекте настоящего изобретения, указанная детергентная композиция может включать 2,6-β-D-фруктангидролазу, в дополнение к α-амилазе Amy 195 или ее варианту, а также один или несколько других подходящих для чистки ферментов, таких как протеаза, липаза, кутиназа, карбогидраза, целлюлаза, пектиназа, маннаназа, арабиназа, галактаназа, другой амилолитический фермент, ксиланаза, оксидаза, лакказа и/или пероксидаза и/или их сочетания.
В основном свойства одного или нескольких выбранных ферментов должны быть совместимы с выбранным для работы детергентом (например, по оптимальному значению рН, совместимости с другими ферментными и неферментными ингредиентами и т.п.), и указанные один или несколько ферментов должны присутствовать в эффективных количествах.
Bacillus
Fusarium
Протеазы: подходящие протеазы включают соответствующие ферменты животного, растительного или микробного происхождения. При этом включаются также химически модифицированные или генетически сконструированные белковые мутантные формы, а также процессированные в естественных условиях белки. Указанная протеаза может представлять собой сериновую протеазу или металлопротеазу, такую как щелочная микробная протеаза, трипсинподобную протеазу или химотрипсинподобную протеазу. Примеры щелочных протеаз включают субтилизины, в особенности, те субтилизины, которые получают из , например, субтилизин Novo, субтилизин Carlsberg, субтилизин 309, субтилизин 147 и субтилизин 168 (см., например, WO 89/06279). Примеры трипсинподобных протеаз включают трипсин (например, трипсин свиного или бычьего происхождения) и протеазы из (см., например, WO 89/06270 и WO 94/25583). Примеры подходящих для использования протеаз также включают, без ограничения, варианты, описанные в WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 и WO 98/34946. Коммерчески доступные протеазные ферменты включают, без ограничения: Alcalase, Savinase, Primase™, Duralase™, Esperase и Kannase™ (Novo Nordisk A/S); Maxatase, Maxacal™, Maxapem™, Properase, Purafect, Purafect OxP™, FN2™ и FN3™(Genencor International, Inc.).
Humicola
Thermomyces)
H. lanuginosa (T. lanuginosus)
H. insolens
Pseudomonas
P. alcaligenes
P. pseudoalcaligenes;
P. cepacia
P. stutzeri
P. fluorescens,
Pseudomonas
P. wisconsmensis (see e g,
Bacillus
B. subtilis;
Biochemica et Biophysica Acta,
B. stearothermophilus
В. pumilus
Липазы: подходящие липазы включают липазы бактериального или грибного происхождения. Химически модифицированные, протеолитически модифицированные или генетически сконструированные белковые лиганды также включаются в настоящее изобретение. Примеры подходящих для использования липаз включают, без ограничения, липазы из (синоним , например, (см., например, EP 258068 и EP 305216), из (см., например, WO 96/13580); липазу из (например, из или см., например, EP 218272), (см., например, EP 331376), (см., например, GB 1372034), штамм sp. SD 705 (см., например, WO 95/06720 и WO 96/27002), WO 96/12012); липазу из (например, из  см., например, Dartois et al. 1131: 253-360 (1993)), (см., например, JP 64/744992) или (см., например, WO 91/16422). Дополнительные варианты липаз, подходящие для использования в композициях согласно настоящему изобретению, включают липазы, описанные, например, в следующих патентах: WO 92/05249, WO 94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, EP 407225 и EP 260105. Некоторые коммерчески доступные липазные ферменты включают Lipolase и Lipolase Ultra™ (Novo Nordisk A/S).
Полиэстераза: в состав композиции могут быть введены подходящие полиэстеразы, такие как соответствующие ферменты, описанные в WO 01/34899 и WO 01/14629.
Амилазы: указанные композиции могут быть объединены с другими амилазами, такими как усовершенствованная α-амилаза непроизводственного характера. Указанные амилазы могут включать коммерчески доступные амилазы, такие как, без ограничения, Duramyl, Termamyl, Fungamyl и BAN™ (Novo Nordisk A/S); Rapidase и Purastar (от компании Genencor International, Inc.).
Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium,
Humicola insolens, Myceliophthora thermophila
Fusarium oxysporum
Целлюлазы: целлюлазы также могут быть добавлены к данным композициям. Подходящие целлюлазы включают соответствующие ферменты бактериального или грибного происхождения. Настоящее изобретение охватывает также химически модифицированные или генетически сконструированные мутантные формы белка. Подходящие целлюлазы включают целлюлазы из родов например, грибные целлюлазы, полученные из и , как это описано, например, в патентах США NoNo. 4435307; 5648263; 5691178; 5776757; и в патенте WO 89/09259. Репрезентативные целлюлазы, которые могут рассматриваться для применения, включают целлюлазы, которые могут использоваться для ухода за цветными тканями. Примеры таких целлюлаз включают целлюлазы, описанные, например, в EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397 и WO 98/08940. Другие примеры включают варианты целлюлазы, такие как целлюлазы, описанные в WO 94/07998; WO 98/12307; WO 95/24471; PCT/DK98/00299; EP 531315; в патентах США NoNo. 5457046; 5686593 и 5763254. Коммерчески доступные целлюлазы включают Celluzyme и Carezyme (Novo Nordisk A/S); Clazinase и Puradax HA (Genencor International, Inc.); и KAC-500(B)™ (Kao Corporation).
Coprinus,
C.
Cinereus,
Пероксидазы/оксидазы: подходящие пероксидазы/оксидазы, рассматриваемые в контексте использования в настоящей композиции, включают соответствующие ферменты растительного, бактериального или грибного происхождения. В настоящем изобретении рассматривается использование химически модифицированных или генетически сконструированных мутантных форм белка. Примеры подходящих для использования пероксидаз включают пероксидазы из например, из и их варианты, такие как описанные в WO 93/24618, WO 95/10602 и WO 98/15257. Коммерчески доступные пероксидазы включают, например, Guardzyme™ (Novo Nordisk A/S).
Один или несколько ферментов детергентного действия могут быть включены в детергентную композицию путем внесения отдельных добавок, содержащих один или несколько ферментов, или при внесении объединенной добавки, содержащей все указанные ферменты. Детергентная добавка, например, отдельная добавка или объединенная добавка, может быть изготовлена, например, в виде гранулята, жидкости, взвеси и т.п. Репрезентативная детергентная композиция добавки включает, без ограничения, грануляты, в частности, обеспыленные грануляты, жидкости, в частности, стабилизированные жидкости, или взвеси.
Обеспыленные грануляты могут быть получены, например, по процедуре, описанной в патентах США NoNo. 4106991 и 4661452, и могут необязательно содержать покрытие, нанесенное согласно известному в данной области методу. Примеры восковых покрывающих материалов включают поли(этиленоксидные) продукты (например, полиэтиленгликоль, ПЭГ) со средней молекулярной массой от 1000 до 20000; этоксилированные нонилфенолы, содержащие от 16 до 50 эитиленоксидных единиц; этоксилированные жирные спирты, где спирт содержит от 12 до 20 атомов углерода и где содержится от 15 до 80 этиленоксидных единиц; жирные спирты; жирные кислоты; и моно- и ди- и триглицериды жирных кислот. Примеры пленкообразующих покрывающих материалов, подходящих для нанесения по методике псевдоожиженного слоя, приведены, например, в GB 1483591. Жидкие ферментные препараты могут быть, например, стабилизированы за счет добавления полиола, такого как пропиленгликоль, сахар или сахарный спирт, молочная кислота или борная кислота согласно установленным методикам. Защищенные ферменты могут быть получены по способу, описанному в EP 238216.
Детергентная композиция может быть представлена в любой подходящей форме, например, в виде бруска, таблетки, порошка, гранулы, пасты или жидкости. Жидкий детергент может быть водным, в типичном случае содержащим примерно до 70% воды и от 0% до примерно 30% органического растворителя. Могут также рассматриваться компактные гелевые детергенты, содержащие примерно 30% или менее воды. Детергентная композиция может необязательно включать одно или несколько поверхностно-активных веществ, которые могут быть неионными, включая полуполярные, и/или анионными, и/или катионными, и/или цвиттерионными. Указанные поверхностно-активные вещества могут быть представлены в широком диапазоне концентраций, от примерно 0,1 вес.% до примерно 60 вес.%.
Указанный детергент, при его включении в состав описываемой композиции, содержит в типичном случае от примерно 1% до примерно 40% анионного поверхностно-активного вещества, такого как линейный алкилбензолсульфонат, α-олефинсульфонат, алкилсульфат (сульфат жирного спирта), этоксисульфат спирта, вторичный алкансульфонат, сложный метиловый эфир α-сульфожирной кислоты, алкил- или алкенил-янтарная кислота или мыло.
Указанный детергент, при его включении в состав описываемой композиции, обычно содержит от примерно 0,2% до примерно 40% неионного поверхностно-активного вещества, такого как этоксилат спирта, этоксилат нонилфенола, алкилполигликозид, алкилдиметиламиноксид, моноэтаноламид этоксилированной жирной кислоты, моноэтаноламид жирной кислоты, амид полигидроксиалкилжирной кислоты или N-ацил-N-алкильное производное глюкозамина («глюкамиды»).
Указанный детергент может содержать от 0% до примерно 65% детергентного наполнителя или комплексообразующего агента, такого как цеолит, дифосфат, трифосфат, фосфонат, карбонат, цитрат, нитрилуксусная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота, алкил- или алкенил-янтарная кислота, растворимые силикаты или слоистые силикаты (например, SKS-6 от Hoechst).
Указанный детергент включает один или несколько полимеров. Репрезентативные полимеры включают карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ), поли(винилпирролидон) (ПВП), поли(этиленгликоль) (ПЭГ), поли(виниловый спирт) (ПВА), поли(винилпиридин-N-оксид), поли(винилимидазол), поликарбоксилаты, например, полиакрилаты, сополимеры малеиновой/акриловой кислоты и сополимеры лаурилметакрилата/акриловой кислоты.
Один или несколько ферментов, входящих в состав детергентной композиции, могут быть стабилизированы с использованием стандартных стабилизирующих агентов, таких как, например, полиол (например, пропиленгликоль или глицерин), сахар или сахарный спирт, молочная кислота, борная кислота или производное борной кислоты (например, сложный эфир ароматического бората) или фенильное производное бороновой кислоты (например, 4-формилфенилбороновая кислота). Указанная композиция может быть изготовлена по процедуре, описанной в WO 92/19709 и WO 92/19708.
Согласно настоящему изобретению в применяемые детергентные композиции, один или несколько ферментов, в частности, варианты ферментов, могут быть добавлены в количестве, соответствующем от примерно 0,01 до примерно 100 мг фермента по белку, в расчете на литр промывной жидкости (в частности, от примерно 0,05 до примерно 5,0 мг фермента по белку на литр промывной жидкости и от 0,1 до примерно 1,0 мг фермента по белку на литр промывной жидкости).
Композиции для чистки
4.2
В составе детергентных препаратов, α-амилаза Amy 195 и/или ее вариант обычно используют в виде жидкой композиции, содержащей пропиленгликоль. Указанный фермент подвергают солюбилизации, например в пропиленгликоле, путем смешивания в 25 объемн.% в растворе пропиленгликоля, содержащем 10% хлорида кальция.
α-амилаза Amy 195 и/или ее вариант согласно настоящему описанию может быть изготовлена в виде детергентных композиций, подходящих для их использования при мытье посуды или в составе чистящих композициях для других вариантов применения. Они могут быть представлены в виде порошков, гелей или жидкостей. Указанные композиции могут включать один фермент или его сочетание с другими амилолитическими ферментами и/или с другими используемыми для очистки ферментами или активирующими отбеливание ферментами, а также с другими компонентами, которые обычно используются в композициях для чистки.
Таким образом, детергентная композиция для мытья посуды может включать поверхностно-активное вещество. Указанное поверхностно-активное вещество может быть анионным, неионным, катионным, амфотерным или представлять собой смесь указанных типов. Такой детергент может содержать от 0 вес.% до примерно 90 вес.% неионного поверхностно-активного вещества, такого как этоксилированные/пропоксилированные линейноцепочечные спирты с низкой способностью к пенообразованию или вовсе не образующие пену.
Детергентная композиция может содержать детергентный наполнитель в виде солей неорганического и/или органического типа. Указанные детергентные наполнители могут быть подразделены на фосфорсодержащие и не содержащие фосфор типы. Такая детергентная композиция обычно содержит от примерно 1% до примерно 90% детергентного наполнителя. Примеры фосфорсодержащих неорганических щелочных детергентных наполнителей, в случае их присутствия в композиции, включают водорастворимые соли, в особенности, пирофосфаты, ортофосфаты и полифосфаты щелочного металла. Пример фосфорсодержащего органического щелочного детергентного наполнителя, в случае его присутствия в композиции, включает водорастворимые соли фосфонатов. Примеры не содержащих фосфор неорганических наполнителей, в случае их наличия в композиции, включают водорастворимые карбонаты, бораты и силикаты щелочного металла, а также различные типы нерастворимых в воде кристаллических или аморфных алюминосиликатов, наиболее известными представителями которых являются цеолиты.
Примеры подходящих органических наполнителей включают щелочной металл, аммоний и замещенный аммоний; цитраты; сукцинаты; малонаты; сульфонаты жирной кислоты; карбоксиметоксисукцинаты; полиацетаты аммония; карбоксилаты; поликарбоксилаты; аминополикарбоксилаты; полиацетилкарбоксилаты и полигидроксисульфонаты.
Другие подходящие органические наполнители включают высокомолекулярные полимеры и сополимеры, которые, по известным данным, обладают свойствами наполнителя, например, подходящие полиакриловая кислота, полималеиновая кислота и сополимеры полиакриловой/полималеиновой кислоты, а также их соли.
Указанная чистящая композиция может содержать отбеливающие агенты хлорного/бромного типа или кислородного типа. Примеры неорганических отбеливателей хлорного/бромного типа включают гипохлорид лития, натрия или кальция и гипобромит этих металлов, а также хлорированный фосфат тринатрия. Примеры органических отбеливателей хлорного/бромного типа включают гетероциклические N-бром- и N-хлор-имиды, такие как трихлоризоциануровая, трибромизоциануровая дибромизоциануровая и дихлоризоциануровая кислоты и их соли с солюбилизируемыми в воде катионами, такими как калий и натрий. Приемлемы также соединения гидантоина.
Композиция для чистки может содержать кислородные отбеливатели, например, в форме неорганической персоли, необязательно при наличии предшественника такого отбеливающего вещества, или в форме пероксикислотного соединения. Типичным примером подходящих перекисных отбеливателей являются пербораты щелочного металла, как тетрагидраты, так и моногидраты, перкарбонаты, персиликаты и перфосфаты щелочного металла. Репрезентативными активаторными материалами являются ТАЭД и триацетат глицерина. Ферментные системы активации отбеливания также могут присутствовать в композиции, например, такие как перборат или перкарбонат, триацетат глицерина и пергидролаза (см., например, WO 2005/056783).
Композиция для чистки может быть подвергнута стабилизации с использованием стандартных стабилизирующих средств, подходящих для одного или нескольких используемых ферментов, например, полиола, такого как, например, пропиленгликоль, сахар или сахарный спирт, молочная кислота, борная кислота или производное борной кислоты (например, сложный эфир ароматического бората).
Композиция для чистки может также содержать другие стандартные детергентные ингредиенты, например, дефлоккулятор, фильтровальный материал, средства, снижающие пенообразование, антикоррозийные агенты, средства для суспендирования грязевых частиц, секвестранты, средства, препятствующие повторному осаждению грязевых частиц, дегидратирующие средства, красители, бактерицидные вещества, флуоресцирующие вещества, загустители и отдушки.
Ниже настоящее изобретение будет описано со ссылкой на детальные варианты его осуществления, хотя следует понимать, что в настоящее описание могут быть введены различные модификации.
Способы оценки детергентных композиций
4.3
Существует множество тестов для оценки чистящих свойств α-амилазы. Ниже приводится описание примеров такого тестирования чистящей способности рассматриваемых агентов, которые включают следующее.
Термин «образец» представляет собой кусочек материала, такого как ткань, который содержит нанесенное на нее пятно. Указанный материал может представлять собой ткань, выполненную из хлопка, полиэфира или из смеси натуральных и синтетических волокон. Такой образец также может быть бумагой, такой как фильтровальная бумага или нитроцеллюлоза, или кусочком твердого материала, такого как керамика, металл или стекло. Для случая амилаз, указанное пятно имеет крахмальную основу, но может также включать кровь, молоко, красящее вещество, загрязнение травой, чаем, вином, шпинатом, подливкой, шоколадным изделием, сыром, глиной, пигментом, маслом или смесью указанных соединений.
600
Термин «уменьшенный образец» представляет собой срез образца, который был получен с помощью штамповочного устройства с одним отверстием или который был получен с помощью стандартного производственного штамповочного устройства с 96 отверстиями, где характер такого штампа с множеством отверстий соответствует 96-ячеечным микротитрационным планшетам, или указанный срез образца был получен из основного образца каким-либо другим способом. Рассматриваемый образец может представлять собой образец ткани, бумаги, металла или другого подходящего материала. Указанный «уменьшенный образец» может содержать пятно, нанесенное до или после его помещения в ячейку 24-, 48- или 96-ячеечного микротитрационного планшета. Указанный уменьшенный образец может также быть получен при нанесении пятна на небольшой кусочек материала. Так, например, такой уменьшенный образец может представлять собой кусочек ткани с нанесенным пятном диаметром 5/8" или 0,25" (0,015875 м или 0,00635 м). Стандартный производственный штамп разрабатывается таким образом, чтобы он мог доставлять 96 образцов одновременно ко всем ячейкам 96-ячеечного планшета. Указанное устройство позволяет доставлять больше чем один образец на ячейку путем простого нанесения на один и тот же 96-ячеечный планшет несколько раз. Штамповочные устройства с множеством отверстий могут рассматриваться для одновременной доставки образцов в планшет любого формата, включая, без ограничения, 24-ячеечный, 48-ячеечный и 96-ячеечный планшеты. В рамках другого возможного способа, загрязненная исследуемая платформа может представлять собой шарики, выполненные из любого металла, пластика, стекла, керамики или любого другого подходящего материала, который покрывают загрязняющим субстратом. Один или несколько покрытых таким материалом шариков помещают в ячейки 96-, 48- или 24-ячеечных планшета или в планшеты более крупного формата, содержащие подходящий буфер и фермент. В этом случае супернатант исследуют на наличие высвобожденного загрязняющего материала, либо при прямом измерении абсорбции, либо после проведения вторичной реакции окрашивания. Анализ высвободившегося загрязняющего материала может также проводиться в рамках масс-спектрального анализа. Другой тест в рамках микроскрининга может проводиться при доставке и соответствующей установке образца, например, хлопчатобумажной ткани, окрашенной индиго-красителем, в ячейку многоячеечного планшета, с добавлением частиц, таких как песок или более крупные частицы, такие как, например, гранат, отобранный до частиц 6-8 или 9 размера, с последующим встряхиванием планшета, так чтобы вызвать шлифовку образцов добавленными частицами. Указанный тест нашел применение для оценки целлюлаз с целью их применения для промывки камней. Эффективность фермента может быть оценена либо по развитию окрашивания (например, по высвобождению краски индиго, которая растворена в диметилсульфоксиде, и последующему измерению поглощения при длине Анм) в реакционном буфере, либо путем измерения коэффициента отражения шлифованного образца.
В том случае, когда, например, необработанные образцы типа КМЧ (BMI) (кровь/молоко/чернила) промывают в детергенте без отбеливателя, большая часть чернил высвобождается даже без добавления протеазы. Добавление протеазы ведет к небольшому повышению высвобождения чернил, количественная оценка которого может быть затруднена на фоне имеющегося материала. Настоящее изобретение относится к протоколу обработки, который позволяет контролировать степень фиксации красящего пятна. В результате становится возможным получать образцы, которые, например, высвобождают варьирующее количество красящего вещества при промывке в отсутствии исследуемого фермента. Использование фиксированных образцов ведет к резкому увеличению соотношения сигнал/шум в тестах с промывкой. Кроме того, при варьировании степени фиксации можно создавать окрашенные пятна, которые дают оптимальные результаты в различных условиях чистки.
Textile Research Journal
Образцы, содержащие пятна с известной «прочностью» на материалах разного типа, доступны в коммерческом варианте (EMPA, St. Gallen, Switzerland; wfk-Testgewebe GmbH, Krefeld Germany; или Center for Test Materials, Vlaardingen, The Netherlands) и/или могут быть получены практикующим специалистом в данной области (Morris and Prato, 52(4): 280286 (1982)). Другие исследуемые образцы включают, не ограничиваясь одним или несколькими пятнами типа КМЧ (BMI), т.е. из крови/молока/чернил на хлопчатобумажной ткани, окрашенную шпинатом хлопчатобумажную ткань или окрашенную травой хлопчатобумажную ткань, а также хлопчатобумажную ткань, окрашенную шоколадом/молоком/сажей.
Пятна типа КМЧ могут быть нанесены на хлопок при добавлении 0,0003%-0,3% перекиси водорода. Другие комбинации включают загрязнение травой или шпинатом, нанесенное вместе с 0,001%-1% глютаральдегидом, желатином и кумасси-красителем, в сочетании с 0,001%-1% глютаральдегидом, или шоколадом, молоком и сажей, вместе с 0,001%-1% глютаральдегидом.
Указанный образец может также подвергаться перемешиванию в ходе инкубации с ферментом и/или детергентной композицией. Результаты промывки зависят от ориентации образцов в ячейках (горизонтальной или вертикальной), в особенности, в случае 96-ячеечного планшета. Это указывает на то, что смешивание в ходе инкубации было недостаточным. Хотя имеется множество способов гарантировать достаточное перемешивание в процессе инкубации, может быть сконструирован держатель, в котором микротитрационный планшет закрепляется между двумя планшетами из алюминия в виде «сэндвича». Это может быть выполнено достаточно просто, например, путем помещения адгезивной пленки на ячейки планшета и затем укладывания двух алюминиевых пластин на 96-ячеечный планшет с использованием любого типа подходящих коммерчески доступных зажимов. И далее такая конструкция может быть внесена в коммерчески доступный встряхиватель на период инкубации. Установка работы встряхивателя на скорость примерно 400 об/мин приводит к очень эффективному перемешиванию, при том, что такого рода держатель эффективно препятствует подтеканию жидкости или загрязнению соседних ячеек.
Anal. Biochem.
Тринитробензолсульфоновая кислота (ТНБК) (TNBS) может использоваться для количественного определения концентрации аминогрупп в промывной жидкости. Такое определение является мерой оценки количества белка, удаленного из образца (см., например, Cayot and Tainturier, 249: 184-200 (1997)). Однако, если детергент или ферментный образец ведет к образованию необычно малых пептидных фрагментов (например, как результат наличия пептидаз в образце), то может быть получен более выраженный сигнал ТНБК, т.е. больший «шум».
Другой способ оценки качества промывки пятен из крови/молока/чернил или пятен другого характера основан на высвобождении красящего вещества. Протеолиз белка в исследуемых образцах ведет к высвобождению частиц красящего вещества, которое может быть оценено количественно путем измерения поглощения промывной жидкости. Поглощение может быть определено при использовании для измерения любой длины волны в диапазоне от 350 до 800 нм. Указанное поглощение измеряют при длине волны 410 нм или 620 нм. Промывная жидкость также может быть подвергнута анализу для определения качества удаления пятен, содержащих траву, шпинат, желатин или кумасси-краситель. Подходящие условия для оценки таких пятен включают, в случае шпината или другой травы, измерение при длине волны 670 нм, а в случае желатина или кумасси-красителя, при длине волны 620 нм. Так, например, отбирают аликвоту промывной жидкости (в типичном случае, например, по 100-150 мкл из ячеек 96-ячеечного планшета) и помещают в кювету или ячейки многоячеечного микропланшета. Затем эту аликвоту помещают в спектрофотометр и определяют поглощение при соответствующей длине волны.
Указанная система может также использоваться для оценки эффективности действия композиции с введенным ферментом и/или детергентной композицией при мытье посуды, например, с использованием пятен крови/молока/чернил на подходящем субстрате, таком как образец ткани, пластика или керамики.
В одном аспекте пятно типа КМЧ фиксируют на хлопчатобумажной ткани, при добавлении 0,3% перекиси водорода к образцу КМЧ/хлопок на 30 минут при температуре 25°C, или при добавлении 0,03% перекиси водорода к образцу КМЧ/хлопок на 30 минут при температуре 60°C. Более мелкие образцы размером 0,25" (0,00635 м) вырезают из образца КМЧ/хлопка и помещают в ячейки 96-ячеечного микротитрационного планшета. В каждую ячейку вносят известную смесь детергентной композиции и фермента, такого как вариантный белок. После заклеивания верха микротитрационного планшета адгезивной пленки, указанный микротитрационный планшет зажимают между двумя алюминиевыми пластинами и подвергают перемешиванию на угловом встряхивателе со скоростью примерно 250 об/мин в течение 10-60 минут. По истечении этого периода времени супернатанты переносят в ячейки нового микротитрационного планшета и измеряют поглощение красящего вещества при длине волны 620 нм. Аналогичным образом, указанная процедура может использоваться для тестирования пятен шпината или пятен травы, нанесенных на хлопчатобумажную ткань, при добавлении 0,01% глютаральдегида к образцу шпината/хлопка или к образцу травы/хлопка на 30 минут при температуре 25°C. Та же процедура может быть проведена с образцами, содержащими пятна шоколада, молока и/или сажи.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
В. subtilis
Экспрессия в
B. subtilis
Hy
Конструкцию, изображенную на фиг. 5, подвергают трансформации в 9 штаммов  с делетированной протеазой (degU32, oppA, ΔspoII3501, amyE::xylRPxylAcomK- ermC, ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpr, Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybfJ, ΔnprB) (см. US20050202535A1). Культуру данного штамма растят в указанной ниже среде (которая содержит в расчете на один литр): 10 г Soytone, 75 г глюкозы, 7,2 г мочевины, 40 мМ MOPS, 4 мМ трицина, 3 мМ двухосновного фосфата калия, 21,4 мМ KOH, 50 мМ NaCl, 276 мкМ сульфата калия, 528 мкМ хлорида магния, 50 мкM дигидрата цитрата тринатрия, 100 мкМ дигидрата хлорида кальция, 14 мкМ гептагидрата сульфата железа, 5,9 мкМ дигидрата сульфата марганца, 5,7 мкМ моногидрата сульфата цинка, 2,9 мкМ дигидрата хлорида меди, 4,2 мкМ гексагидрата кобальта, 4,5 мкМ дигидрата молибдата натрия. Для получения объема 1л все компоненты, за исключением Soytone, перемешивают в 500 мл, подвергают стерильному фильтрованию и добавляют к равной части 2 х Soytone, который был предварительно простерилизован автоклавированием. Микроэлементы и цитрат могут быть получены из концентрированных растворов 100X или 1000X. Буферы, гидроксид калия, хлорид натрия, сульфат калия и хлорид магния, а также микроэлементы могут быть получены из 10Х концентрированных растворов. После перемешивания всех компонентов рН смеси доводят до значения 7,3. Перед использованием указанной среды добавляют 20 мМ хлорида кальция.
Указанная культура экспрессирует фермент в виде различных процессированных форм. Явно зрелая форма (без сигнальной последовательности) наблюдается в области маркера размером 69 кДа, при проведении электрофореза в 10% геле ДСН-ПААГ. Присутствуют также две более коротких формы.
2
Активность α-амилазы Amy195 фракционируют, проводя обработку культурального бульона аффинной смолой на основе β-циклодекстрин-сефарозы, далее указанную смолу собирают и промывают 25 мМ бис-трис-пропановым буфером (рН 8,5), содержащим 2 мМ хлорида кальция (СаCl), с последующей элюцией промытой смолы тем же буфером с добавкой 50 мМ β-циклодекстрина. В результате обработки культурального бульона β-циклодекстриновой смолой из бульона частично удаляется вид молекул размером 60 кДа (примерно до 50%) и полностью удаляется вид молекул размером 69 кДа. Промывка смолы буфером дает практически чистый белок размером 60 кДа; элюция буфером, содержащим β-циклодекстрин, дает белок размером 69 кДа, при наличии примеси, примерно 25%, белка размером 60 кДа. Указанный компонент оценивают при проведении электрофореза в ДСН-ПААГ, где результаты данного анализа проиллюстрированы на фиг. 10. Содержание фермента во фракциях оценивают гельденситометрией при использовании препарата OxAm амилазы (Genencor International, Inc.), который выполняет функцию стандартного белка. N-концевой анализ самой темной полосы на линии, маркированной "wl" на фиг. 10, дает последовательность «AAPGPKDATA» (SEQ ID NO: 5). Масс-спектральный анализ в сочетании с определением N-концевой последовательности позволяет идентифицировать белок, который имеет последовательность, показанную в верхней части на фиг. 4 (т.е. без сигнальной последовательности и С-концевого расширения, отражающего крахмалсвязывающие мотивы). Проведенные анализы показывают, что данный молекулярный фрагмент состоит из доменов α-амилазы А, В и С.
ПРИМЕР 2
Экспрессия каталитического домена в генетически процессированной форме Amу195
Bacillus subtilis
Hy
2
Ген Amy 195 подвергают процессированию в трех разных сайтах, с тем чтобы проанализировать экспрессию усеченных форм, а также для целей тестирования эффективности промывки. Указанное усечение/процессирование проводят согласно стандартным методикам, известным специалистам в данной области, по аминокислотным остаткам с номерами 494, 504 и 509, где используемая нумерация полипептидов соответствует последовательности, показанной на фиг. 4. Указанные плазмиды, содержащие процессированные гены, подвергают трансформации в девять штаммов с делетированной протеазой (degU32, oppA, ΔspoII3501, amyE::xylRPxylAcomK- ermC, ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpr, Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybfJ, ΔnprB). Далее клетки культивируют в колбах с перегородкой объемом 250 мл, содержащих 50 мл обогащенной среды, с добавкой 10 или 30 мМ СаCl, в течение 64 часов при температуре 37°C и при встряхивании со скоростью 250 об/мин. Культуральные супернатанты анализируют, проводя электрофорез в ДСН-ПААГ, и содержание амилазы оценивают по методу гельденситометрии.
Было показано, что экспрессия амилазы на основе процессированных генов примерно в 2 раза выше, чем экспрессия того же домена в полноразмерном гене дикого типа. Эти результаты, проиллюстрированные на фиг. 8, показывают, что процессированный ген обладает лучшими характеристиками для экспрессии белка.
ПРИМЕР 3
Тест на очистку
Все фракции, выявленные в геле, далее анализируют в формате 96-ячеечного теста с использованием образца рисового крахмала, прокрашенного оранжевым красителем CS28. Данный тест проводят в 25 мМ HEPES (pH 8,0), а также 25 мМ CAPS (pH 10,3) буферах.
Чистящие характеристики всех видов Amy195, выделенных в рамках примера 1, тестируют в условиях имитации стирки, используя для оценки концентрацию амилазы в качестве функции. Результаты по фракции «e-пул» для фиг. 10 приведены на фиг. 6. Эффективность чистки определяют по количеству красителя, высвободившегося в супернатантную жидкость, при проведении измерений на спектрофотометре при длине волны 488 нм. Дополнительная информация по процедуре данного теста приведена в патенте США No. 7122334. Данный фермент чрезвычайно эффективен в условиях тестирования при рН 8,0, однако демонстрирует также удивительные свойства по удалению пятен при pH 10,3. Все основные белковые полосы на каждой из белковых линий в геле (фиг. 10) демонстрируют наличие очистки, и наилучшие результаты были получены в полосе на «wl». Все чистящие активности показаны на фиг. 7 в условиях тестирования при pH 8,0. Процессированная форма, которая заканчивается аминокислотным остатком 492, согласно фиг. 4, демонстрирует лучшие свойства (см. фиг. 7, «•»), чем форма, сохраняющая один крахмалсвязывающий домен (см. фиг. 7, «»). Результаты данного теста показывают, что α-амилаза Amy 195 обладает высокой эффективностью по удалению пятен из текстильных образцов.
ПРИМЕР 4
Характеристика продукта, полученного на основе генетически процессированного гена
Продукты генетически процессированного гена, полученные по приведенной выше процедуре примера 2, тестируют для оценки эффективности промывки таким же образом, как это было описано применительно к протеолитическим ферментам в рамках примера 3, выше. Образцы риса CS28 инкубируют с набором концентраций каталитического фрагмента Amy195. Эффективность промывки оценивают по высвободившейся в супернатант краске, проводя измерения при длине волны 488 нм. Все три фрагмента генетически процессированного гена демонстрируют хорошие характеристики по результатам промывки, как это проиллюстрировано на фиг. 9.
Указанный тест для оценки образца может быть модифицирован несколькими способами применительно к разным целям. Указанный 96-ячеечный тест хорошо подходит в качестве крупномасштабного теста на эффективность очистки при измерении поглощения супернатанта после инкубации фермента с образцами, тогда как, например, 24-ячеечный планшет с образцами, внесенными в ячейки, может быть использован для промывки более крупных образцов, в случае которых в качестве меры оценки может быть использован коэффициент отражения, определяемый по известной в данной области процедуре. Результаты обоих измерений, определения поглощения супернатанта и определения коэффициента отражения образца демонстрируют практически идеальную корреляцию.
2
Корреляция коэффициента отражения промытого образца с поглощением супенатанта была высокой; коэффициент детерминации r имеет значение 0,99. Данный тест может быть, в принципе, масштабирован до 384-ячеечного планшета. Указанный тест может проводиться с любым загрязненным образцом и, кроме CS28 образца, могут также тестироваться CS26, CS27 и CS29 образцы (например, кукурузный крахмал, картофельный крахмал и крахмал из тапиоки соответственно; Testfabrics, Inc., West Pittiston, PA) для демонстрации эффективности определения, проведенного согласно процедуре примера 3. Данный тест может также использоваться для оценки детергентных композиций и проводиться при разных температурах и разных значениях рН. Указанные тесты были взяты и соответствующим образом адаптированы из патента США No. 7122334.
Все приведенные в описании ссылки включены в настоящую заявку полностью, применительно ко всем заявленным целям.