СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ БИОСОВМЕСТИМОСТИ ТРАНСПЛАНТАТОВ КЛАПАНОВ СЕРДЦА И СОСУДОВ
METHOD FOR IMPROVING BIOCOMPATIBILITY OF VALVE AND VASCULAR GRAFTS

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам повышения биосовместимости и подавления кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов путем их специальной обработки до имплантации.
Известно, что после трансплантации клапанов сердца и сосудов имеет место их кальцификация, дегенерация и отторжение, что значительно уменьшает длительность их функционирования. Эти ограничения являются одной из основных причин реопераций у взрослых больных и высокой смертности у пациентов в раннем детском возрасте. В качестве одной из наиболее значимых причин иммунной реакции на трансплантаты и их кальцификации в научной литературе рассматриваются клетки донора. В связи с этим для уменьшения иммунного ответа на трансплантат и для предотвращения его кальцификации предлагаются методы обработки трансплантатов клапанов сердца и сосудов, обеспечивающие разрушение в них клеток донора (децеллуларизация) до имплантации в организм реципиента. Для децеллуларизации трансплантатов клапанов сердца и сосудов используют различные подходы, включая обработку гипотоническим шоком, протеолитическими ферментами, нуклеазами, детергентами (Ann. Thorac. Surg. 2001, v.71 (5 Suppl) p.S428-432; Ann Thorac Cardiovasc Surg 2009; 15: 362-367; J. Heart Valve Disease 2011; v.20, p.341-347; Ann Thorac Surg, 2011; 92: 131-137).
Известен способ обработки коллагенсодержащих тканей, в котором для повышения эффективности регенерации тканей и уменьшения иммунной реакции на трансплантируемую ткань, их обрабатывают до имплантации таким образом, что элиминируют все неколлагеновые компоненты, включая клетки и такие компоненты тканевого матрикса, как эластин, протеогликаны, гликозаминогликаны, используя для этого щелочи, хелатирующие агенты, кислоты и соли (см.: Патент США N 5993844, 30-11-1999). Согласно указанному изобретению, после удаления неколлагеновых компонентов сохраняется структурная организация коллагенового матрикса, его способность к ремоделированию, что предполагает миграцию в него клеток реципиента, ответственных за поддержание нативности ткани. В предложенном способе не используются детергенты и ферменты, которые способны отрицательно влиять на восстановление коллагенового матрикса после его имплантации.
Недостатком способа является то, что предложенная обработка вызывает разрушение/удаление из тканевого матрикса не только клеток, но также ряда протеогликанов, которые играют важную роль в защите ткани от кальцификации. Следует также отметить, что коллаген является существенным компонентом поверхности миофибробластов и гладкомышечных клеток, и поэтому невозможно разрушить клетки, не повреждая коллаген тканевого матрикса. Кроме того, согласно указанному способу удаляются все неколлагеновые белки, и, следовательно, эластин, что также указывает на повреждение тканевого матрикса. Как известно повреждение тканевого матрикса индуцирует иммунный ответ, воспаление, фиброзное перерождение. Таким образом, согласно известным биологическим представлениям, предложенная обработка будет повреждать структуру тканевого матрикса, а это, как известно, усиливает реакцию отторжения трансплантата и, в конечном счете, сокращает срок его функционирования.
Известен способ децеллуларизации трансплантатов клапанов сердца и сосудов, основанный на обработке биоматериалов раствором трипсина (0.25%) и этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (0.02%) при pH 7.4 и температуре 37°С в течение 1 суток с последующей отмывкой от указанных компонентов и обработкой раствором дезоксирибонуклеазы (0.2 мг/мл) и рибоксинуклеазы (0.02 мг/мл) (Eur J Vase Endovasc Surg, 2000, v.19, p.381-386). Такая обработка позволяет разрушать клетки донора и рассматривается как один из основных способов децеллуларизации, обеспечивающей подавления иммунного ответа организма на имплантируемые ткани.
Недостатком этого способа является тот факт, что длительная обработка трипсином вызывает не только разрушение клеток донора, но и повреждение коллагеновых фибрилл, эластина и других белков тканевого матрикса, что вызывает усиление иммунной реакции на трансплантат. Более того, имеются экспериментальные данные, свидетельствующие об усилении кальцификации трансплантатов после обработки таким способом, что ставит под сомнение целесообразность его применения для повышения биосовместимости трансплантируемых материалов для сердечно-сосудистой хирургии.
Наиболее близким, принятым за прототип, является способ обработки тканей аллотранспланататов клапанов сердца, согласно которому для уменьшения иммуногенности, подавления кальциноза, ткани до имплантации обрабатывают в течение 8-20 часов в умеренно щелочном буфере, предпочтительно pH 8.0, затем протеолитическими ингибиторами, для чего используют этилендиаминтетрауксусную кислоту или апротинин, после чего инкубируют в умеренно щелочном буфере, предпочтительно pH 8.0 в растворе неионного детергента, предпочтительно используя раствор додецилсульфата натрия (от 0,03% до 0,1%) или деоксихолата натрия (от 0.5% до 2%) в течение 20-28 ч (преимущественно 24 часа), затем многократно (преимущественно 3 раза) отмывают ткани от детергентов умеренно щелочным раствором (pH 8,0), забуференным Трис и содержащим ингибиторы протеаз, а затем таким же раствором, но без протеаз, после чего ткани инкубируют в растворе дезоксирибонуклеазы (0.005-0.1 мг/мл) и рибонуклеазы (0.0001-0.01 мг/мл), помещают в среду для криоконсервации и замораживают для хранения в жидком азоте (Патент США №7354749 В2, 08-04-2008).
Недостатком способа является то, что раствор додецилсулфата натрия, вызывая лизис клеток, воздействует при этом на белки тканевого матрикса, и согласно известным экспериментальным данным, повышает кальцификацию тканей трансплантатов клапанов сердца и сосудов. Другим недостатком этого способа является применение Трис-забуференного раствора, поскольку Трис способствует прочному связыванию деоксихолата с тканевым матриксом, в результате чего деоксихолат не удается отмыть даже в течение 2-4 недель с ежедневной сменой среды, и такой матрикс остается токсичным для клеток. Еще одним недостатком указанного способа является неоправданно широкий диапазон ЭДТА (1-100 мМ), поскольку в процессе обработки при концентрациях ЭДТА 5 мМ и выше происходит повреждение тканевого матрикса, которое усиливает иммунную реакцию на обработанную таким образом ткань. Причиной этого является хелатирование ионов кальция, которые играют существенную роль как ионные мостики между различными молекулами белков в нативной структуре матрикса. Поэтому, инкубация тканей с ЭДТА в концентрации 10 мМ, заявленной как предпочтительная, продолжающаяся в течение 14 часов будет вызывать нарушение структуры матрикса. Такие недостатки известного способа обработки трансплантируемых тканей неионными детергентами способны вызывать осложнения при их хирургическом применении, на что указывают некоторые данные литературы (Europ. J Cardio-Thorac. Surg. 2012, v.41, p.1320-1325).
Задачей настоящего изобретения является создание способа обработки трансплантатов для сердечно-сосудистой хирургии с применением деоксихолата натрия, который, вызывая гибель клеток донора и освобождая ткань от иммуногенных и кальциноз-индуцирующих липидных компонентов, предотвращает кальциноз в организме реципиента и повышает биосовместимость таких трансплантатов.
Поставленная задача достигается тем, что в известном способе, включающем предварительную инкубацию тканей до имплантации в физиологическом солевом растворе с ЭДТА, с последующей обработкой неионным детергентом деоксихолатом натрия, вызывающим гибель клеток донора, и с последующей отмывкой неионного детергента, согласно предлагаемому изобретению, предварительную инкубацию трансплантатов выполняют в течение 4-6 часов в физиологическом растворе, содержащем 0,5-2 мМ ЭДТА и органический буфер HEPES при pH 7.0, последующую инкубацию с деоксихалатом натрия выполняют в течение 30-48 часов при 37°С, также используя физиологический раствор, содержащий органический буфер HEPES при pH 7.8, а отмывку ткани от деоксихолата выполняют в физиологическом растворе, содержащем хлористый натрий (0,9%), HEPES (pH 7,8) и 15-25% этилового спирта, в течение 8 суток при 37°С с 2-х кратной сменой среды каждые сутки на свежую.
В предпочтительном варианте способа используют 0,5 мМ ЭДТА, 4 часа обработки в растворе ЭДТА, 40 часов обработки деоксихолатом и 20% этилового спирта в отмывочном растворе.
Применение низкой концентрации ЭДТА в растворе для предварительной инкубации, и малое время предварительной инкубации обеспечивают защиту тканевого матрикса от повреждения, связанного с избыточным хелатированием кальция. Применение органического буфера HEPES позволяет избежать прочного связывания деоксихолата в тканевом матриксе, которое возникает при использовании фосфатного буфера и особенно Трис-буфера. В результате такого связывания возникают проблемы с отмывкой деоксихолата из матрикса, что вызывает токсичность такого матрикса для клеток. Увеличение времени обработки деоксихолатом позволяет более эффективно удалять липидные компоненты из матрикса, что необходимо для подавления кальцификации трансплантата и повышает его биосовместимость. Применение этилового спирта в отмывочном растворе и длительная отмывка необходимы для тщательного удаления из матрикса деоксихолата, и соответственно этому для предотвращения токсичности, что в конечном счете ведет к повышению биосовместимости.
Ниже представлены примеры реализации предложенного способа повышения биосовместимости трансплантатов для сердечно-сосудистой хирургии.
Пример 1.
Сравнивали биосовместимость стенок аорты свиньи, обработанных заявляемым способом и способом, принятым за прототип. Для этого на обработанные материалы высевали клетки линии NIH 3Т3 (фибробласты, полученные из эмбриона мыши) и оценивали их жизнеспособность через 1 сутки и 3 суток культивирования. Клетки получены из Всероссийской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН. Фрагменты стенки аорты свиньи, согласно флуоресцентному микроскопическому анализу, содержали до обработки живые гладкомышечные и эндотелиальные клетки. Перед обработкой фрагменты инкубировали при 4°С в течение 2 суток в питательной среде ДМЕ при pH 7,4, с антибиотиками гентамицином (400 мг/л) и флуканазолом (20 мг/л) для обеспечения стерильности. Затем фрагменты делили на две группы. Первую группу обрабатывали способом, взятым за прототип, включая предварительную инкубацию в течение 14 ч в физиологическом растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, 10 мМ ЭДТА, буфер Трис-HCl (50 мМ, pH 8.0), последующую инкубацию в физиологическом растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, 1% деоксихолата натрия, буфер Трис-HCl (20 мМ, pH 8.0), в течение 24 часов, отмывку деоксихолата натрия указанным выше раствором ЭДТА с 3-кратной заменой среды через каждые 6 часов и последующую отмывку таким же раствором без ЭДТА. После этого фрагменты помещали в питательную среду Дальбекко, в которую были добавлены 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, и антибиотик гентамицин (50 мг/л) и антимикотик флуканазол (5 мг/л). Другую партию фрагментов обрабатывали заявленным способом, включая предварительную инкубацию в течение 4 ч в растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, 0,5 мМ ЭДТА, органический буфер HEPES pH 7,0, затем инкубировали фрагменты ткани 40 ч в растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, 1% деоксихолата натрия, органический буфер HEPES pH 7,8, после чего фрагменты отмывали в растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, органический буфер HEPES pH 7,8, 20% этилового спирта в течение 8 суток с 2-кратной сменой среды на свежую каждые сутки, а два раза в течение последующих суток отмывали от этилового спирта в растворе 0,9% хлористого натрия, pH 7.2. После такой многостадийной инкубации фрагменты второй группы помещали в культуральную среду, идентичную той, что использовали для первой группы. Клетки NIH 3T3 выращивали в ростовой среде Дальбекко с 10% сыворотки и с антибиотиком гентамицином 50 мкг/мл и флуконазолом. После достижения монослоя клетки открепляли от культуральных флаконов раствором трипсина и высевали на поверхность фрагментов контрольной (прототип) и опытной (заявляемый способ) групп. Через сутки после посева проводили микроскопический флуоресцентный анализ жизнеспособности клеток по окраске ядерными красителями, один из которых проникает в живые клетки и, связываясь с ДНК, флуоресцирует в сине-зеленой области спектра (Hoechst 33342), а другой связывается с ДНК только в погибших клетках и флуоресцирует красным цветом. Флуоресцентный микроскопический анализ показал, что в опытной группе через 1 сутки и трое суток 97±2% клеток были живыми. В контрольной группе через 1 сутки живыми были 45±3%, а через 3 суток живыми оставались 11%±2% клеток. Это указывает на то, что заявленный способ повышает биосовместимость стенок аорты с живыми клетками.
Пример 2.
Сравнивали биосовместимость стенок легочной артерии свиньи, обработанных заявляемым способом, либо способом, принятым за прототип. Как и в примере 1, на обработанные материалы высевали клетки линии NIH 3T3 и оценивали их жизнеспособность через 1 сутки и 3 суток культивирования. Фрагменты стенок легочной артерии, как и аорты свиньи, согласно флуоресцентному микроскопическому анализу, содержали до обработки живые гладкомышечные и эндотелиальные клетки. Перед обработкой фрагменты инкубировали при 4°С в течение 2 суток в питательной среде ДМЕ при pH 7,4, с антибиотиками гентамицином (400 мг/л) и флуканазолом (20 мг/л) для обеспечения стерильности. Затем фрагменты, как в примере 1, делили на две группы. Первую группу обрабатывали способом, взятым за прототип, включая предварительную инкубацию в течение 14 ч в физиологическом растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, 10 мМ ЭДТА, буфер Трис-HCl (50 мМ, pH 8.0), последующую инкубацию в физиологическом растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, 1% деоксихолата натрия, буфер Трис-HCl (20 мМ, pH 8.0), в течение 24 часов, отмывку деоксихолата натрия указанным выше раствором ЭДТА с 3-кратной заменой среды через каждые 6 часов и последующую отмывку таким же раствором без ЭДТА. После этого фрагменты помещали в питательную среду Дальбекко, в которую были добавлены 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, и антибиотики гентамицин (50 мг/л) и флуканазол (5 мг/л). Другую партию фрагментов обрабатывали заявленным способом, включая предварительную инкубацию в течение 4 ч в растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, 0,5 мМ ЭДТА, органический буфер HEPES pH 7,0, затем инкубировали 40 ч в растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, 1% деоксихолата натрия, органический буфер HEPES pH 7,8, после чего фрагменты отмывали в растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, органический буфер HEPES pH 7,8, 20% этилового спирта в течение 8 суток с 2-кратной сменой среды на свежую каждые сутки, а два раза в течение последующих суток отмывали от этилового спирта раствором 0,9% хлористого натрия, pH 7.2. После инкубации фрагменты второй группы помещали в культуральную среду, идентичную той, что использовали для первой группы. Клетки NIH 3T3, выращенные в ростовой среде Дальбекко с 10% сыворотки и с антибиотиком гентамицином 50 мкг/мл и флуконазолом, открепляли от культуральных флаконов раствором трипсина и высевали на поверхность фрагментов контрольной (прототип) и опытной (заявляемый способ) групп. Через сутки и 3 суток после посева, согласно микроскопическому флуоресцентному анализу, в опытной группе 97±2% клеток, посеянных на поверхность фрагментов, были живыми. В контрольной группе через 1 сутки живыми были 54±4%, а через 3 суток живыми оставались 14%±2% клеток. Таким образом, этот пример также показывает, что заявленный способ повышает биосовместимость стенок легочной артерии для живых клеток.
Пример 3.
Сравнивали биосовместимость стенок аорты свиньи, обработанных заявляемым способом и способом, принятым за прототип, в модели гетеротопической имплантации под кожу крысам. Фрагменты стенки аорты свиньи, согласно флуоресцентному микроскопическому анализу, содержали до обработки живые гладкомышечные и эндотелиальные клетки. Перед обработкой фрагменты инкубировали при 4°С в течение 2 суток в питательной среде ДМЕ при pH 7.4, с антибиотиками гентамицином (400 мг/л) и флуканазолом (20 мг/л). После стерилизации фрагменты делили на две группы. Первую группу обрабатывали способом, взятым за прототип, включая предварительную инкубацию в течение 14 ч в физиологическом растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, 10 мМ ЭДТА, буфер Трис-HCl (50 мМ, pH 8.0), последующую инкубацию в физиологическом растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, 1% деоксихолата натрия, буфер Трис-HCl (20 мМ, pH 8.0), в течение 24 часов, отмывку деоксихолата натрия указанным выше раствором ЭДТА с 3-кратной заменой среды через каждые 6 часов и последующую отмывку таким же раствором без ЭДТА. После обработки фрагменты помещали в питательную среду Дальбекко, в которую были добавлены 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, и антибиотики гентамицин (50 мг/л) и флуканазол (5 мг/л). Другую партию фрагментов обрабатывали заявленным способом, включая предварительную инкубацию в течение 4 ч в растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, 0,5 мМ ЭДТА, органический буфер HEPES pH 7,0, затем инкубировали 40 ч в растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, 1% деоксихолата натрия, органический буфер HEPES pH 7,8, после чего фрагменты отмывали в растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, органический буфер HEPES pH 7,8, 20% этилового спирта в течение 8 суток с 2-кратной сменой среды на свежую каждые сутки, а два раза в течение последующих суток отмывали от этилового спирта раствором 0,9% хлористого натрия, pH 7.2. После такой многостадийной инкубации фрагменты второй группы помещали в культуральную среду, идентичную той, что использовали для первой группы. Третью группу составляли не обработанные фрагменты стенок аорты. Кальциноз трансплантатов изучали методом подкожной имплантации крысам. Для этого фрагменты размещали по одному в камеры из пористой стали (диаметр пор 50 мкМ), и затем имплантировали камеры под кожу крысам линии Wistar под тиопенталовым наркозом. После 1,5 месяцев фрагменты эксплантировали из крыс, и измеряли в них содержание минерализованного кальция методом атомной абсорбционной спектроскопии. Визуальный осмотр показал, что в контрольной группе фрагментов, обработанных способом, используемом в качестве прототипа, наблюдается выраженое разрастание фиброзной капсулы вокруг образцов, что указывает на токсичность и на повышенную иммунную реакцию на материал в сравнении с опытными фрагментами, обработанными заявленным способом. Фрагменты, обработанные предлагаемым способом, и способом, принятым за прототип, не кальцифицировались (0,5±0,5 мг кальция на 1 г сухого веса фрагмента). Не обработанные стенки аорты были существенно минерализованы и содержали 85±7 мг кальция на 1 г сухого веса фрагмента. Таким образом, заявляемый способ полностью подавляет кальцификацию в гетеротопической модели подкожной имплантации крысам, и при этом не вызывает сильной реакции иммунной системы, какая наблюдается для контрольных фрагментов, обработанных способом, принятьм за прототип.
Таким образом, приведенные примеры показывают, что заявляемый способ обеспечивает повышение биосовместимости трансплантатов для сердечно-сосудистой хирургии в сравнении со способом, принятым за прототип.