Влияние кратковременной глюкозной депривации на функционирование нейронной сети первичной культуры гиппокампа на мультиэлектродной матрице

ВЛИЯНИЕ кратковременной глюко;

ДЕПРИВАЦИИ на функционирование

нейронной сети первичной культуры

ГИППОКАМПА НА МУЛЬТИЭЛЕКТРОДНОЙ МАТР1

УДК 576/.577:616.8.001.6 Поступила 14.12.2010 г.

М.В. Ведунова, к.б.н., старший научный сотрудник ЦНИЛ НИИ ПФМ1;

СА Коротченко, аспирант2;

А.Н. Балашова, студентка2;

A.О. Исакова, студентка1;

Л.Г. Хаспеков, д.м.н., зав. лабораторией3;

B.Б. Казанцев, д.ф.-м.н., зав. лабораторией4;

И.В. Мухина, д.б.н., профессор, зав. кафедрой нормальной физиологии им. Н.Ю. Беленкова, зав. ЦНИЛ НИИ ПФМ1

Жижегородская государственная медицинская академия, Н. Новгород;

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского —

Национальный исследовательский университет, Н. Новгород;

3Научный центр неврологии РАМН, Москва;

4Институт прикладной физики РАН, Н. Новгород

Изучено влияние кратковременной глюкозной депривации на функционирование нейронной сети первичной культуры гиппокампа, развивающейся в течение 32 дней на мультиэлектродной матрице MED64 (ф. Alpha MED Sciences, Япония), в раннем и отдаленном периодах после депривации. Показано, что кратковременная глюкозная депривация (20 мин) повышает биоэлектрическую активность нейронной сети первичной культуры гиппокампа, запуская при этом каскад метаболических реакций, приводящих в дальнейшем к гибели части функционально активных нейронов. В отдаленном периоде происходит упрощение функциональной структуры нейронной сети при сохранении узловых управляющих единиц. Кратковременная глюкозная депривация создает эффект метаболического прекондиционирования, который в отдаленном периоде препятствует необратимым морфофункциональным повреждениям нейронной сети во время более длительной глюкозной депривации.

Ключевые слова: гиппокамп, диссоциированная культура, глюкозная депривация, прекондиционирование, мультиэлектродная матрица.

English

The effect of a short-term glucose deprivation on neuron net functioning of hippocampus primary culture on a multi-electrode matrix

M.V. Vedunova, PhD, Senior Research Worker, SRI cSRL of the APM1; s.A. Korotchenko, Postgraduate2;

A.N. Balashova, Student2;

A.O. Isakova, Student1;

L.G. Khaspekov, D.Med.Sc., Head of the Laboratory3;

Для контактов: Ведунова Мария Валерьевна, тел. раб. 8(831)465-46-43, тел. моб. +7 915-937-55-55; e-mail: MVedunova@yandex.ru.

V.B. Kazantsev, D.Phys.-Math.Sc., Head of the Laboratory 4;

I.V. Mukhina, D.Bio.Sc., Professor, Head of the N.Y. Belenkov Normal Physiology Department, Head of SRI cSRL of the APM1

1Nizhny Novgorod State Medical Academy, N. Novgorod;

2 N.I. Lobachevsky Nizhny Novgorod State University — National Research University, N. Novgorod;

3Scientific Neurology centre of RAMS, Moscow;

Institute of Applied Physics of the RAS, N. Novgorod

There has been studied the effect of a short-term glucose deprivation on neuron net functioning of hippocampus primary culture developing within 32 days on a multi-electrode matrix MED64 (Alpha MED Sciences company, Japan) in an early and remote periods after deprivation. A short-term glucose deprivation (20 min) has been shown to result in the increase of electrobiological activity of neuron net of hippocampus primary culture, with the cascade of metabolic reactions being activated leading to the death of functional neuron thereafter. In a remote period the simplification of a functional structure of neuron net occurs, with node control units being preserved. A short-term glucose deprivation creates an effect of metabolic preconditioning that in a remote period prevents a neuron net from permanent morphofunctional damages during the longer glucose deprivation.

Key words: hippocampus, dissociated culture, glucose deprivation,

Изучение механизмов нейропротекции к повреждающим факторам ишемии/реперфузии является важной проблемой не только современной неврологии, но и нейробиологии в целом. Среди различных методов нейропротекции выделяют фармакологические методы и прекондиционирование.

Прекондиционирование является эффективным способом повышения резистентности клеток к ишемичес-кому/реперфузионному повреждению. Данный феномен был описан впервые в 1986 г. А. Schurr с соавт. для ткани мозга [1], С.Е. Murry с соавт. — для ткани сердца [2]. Для прекондиционирования, эффект которого сохранялся в течение 2—3 дней, использовался кратковременный период аноксии. Механизм прекондиционирования остается неясным до сих пор, хотя литературные данные свидетельствуют о вовлечении в него мембраносвязанных рецепторов, внутриклеточных киназ, ионных каналов, в частности митохондриального КАТР-канала, стресс-белков, свободных радикалов кислорода и различных форм NO-синтетазы [3—5].

Последние исследования показали, что не только ишемическое, но и химическое/метаболическое пре-кондиционирование может являться защитным фактором и повышать толерантность тканей к повреждениям при ишемии/реперфузии [6, 7]. Так, кратковременная глюкозная депривация (ГД) — 3, 6 и 9 ч — может выступать в качестве прекондиционирования и защищать клетки коры головного мозга от повреждающих факторов, действующих во время длительной ишемии головного мозга, таких как гипоксия, перекисное окисление липидов, дефицит энергетических субстратов [8]. В числе возможных протекторных механизмов следует отметить сохранение уровня митохондриального мембранного потенциала, уменьшение продукции свободных радикалов при одновременном повышении содержания глютатиона, снижение концентрации внутриклеточного кальция. В результате метаболического прекондиционирования выживаемость нейронов коры в течение суток при воздействии в последующем кис-лородно-глюкозной депривации, глутаматной токсичности или оксидативного стресса увеличивается по сравнению с контролем (33%) почти в три раза (81%).

preconditioning, multi-electrode matrix.

Несмотря на известные положительные результаты метаболического прекондиционирования в короткие сроки наблюдения (до трех дней), последствия ГД в отдаленном периоде не выяснены.

Цель исследования — изучение влияния кратковременной глюкозной депривации на функционирование нейронной сети первичной культуры гиппокампа в раннем и отдаленном периодах после воздействия.

Материалы и методы. Использованы первичные культуры клеток гиппокампа, полученные от 18-дневных эмбрионов белых беспородных мышей линии СВА. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, данным в Приказе Минздрава России №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации» и были согласованы с Этическим комитетом при НижГМА. Диссоциирование клеток достигалось путем обработки ткани гиппокампа 0,25% трипсином. Клетки ресуспендирова-ли в нейробазальной среде Neurobasal™ (ф. Invitrogen, США) в комплексе с биоактивной добавкой В27 (ф. Invitrogen, США), глутамином (ф. Invitrogen, США), эмбриональной телячьей сывороткой (ф. ПанЭко, Москва) и культивировали, согласно разработанному протоколу [9], на мультиэлектродной матрице системы MED64 (ф. Alpha Med Sciences, Япония) в течение 32 дней in vitro (DIV). Предварительно матрицу стерилизовали УФ-облучением и обрабатывали полиэтиленимином, служившим опорным субстратом для культивируемых клеток. Исходная плотность культуры на матрице составляла 2000 кл./мм2. Жизнеспособность культур поддерживалась в СО2-инкубаторе при температуре 35,5оС, в газовой смеси, содержащей 95% воздуха и 5% СО2. Для количественной обработки и анализа полученных данных использовался набор программного обеспечения Conductor™ (ф. Alpha Med Sciences, Япония), а также пакет прикладных программ matlab.

Метаболические показатели (содержание глюкозы, лактата, общего белка) определялись в культуральной среде с помощью диагностических наборов Vital Diagnostic, содержание окислительно-модифицированных белков исследовалось по методу Е.Е. Дубининой [10].

Кратковременную ГД (20 мин) проводили на 12-й день культивирования путем полной замены культуральной среды на раствор Рингера без глюкозы. Для поддержания осмолярности раствора использовали сахарозу. После окончания ГД раствор Рингера замещали на культуральную питательную среду с глюкозой. Контролем служили культуры, в которых среду заменяли на раствор Рингера, содержащий глюкозу.

Параметры, характеризующие ответную реакцию первичной культуры гиппокампа на ГД, регистрировали через 30 и 60 мин, на 1-е и 6-е сутки после ГД. На 6-е сутки проводили повторную, более длительную (в течение 120 мин) ГД с дальнейшим восстановлением исходного состава культуральной среды и регистрацией функциональной активности в течение последующих 16 сут.

Результаты исследования статистически обрабатывали с помощью пакета прикладных программ Місго-

soft Exel и Biostat. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение. Установлено, что кратковременная ГД вызывает усиление биоэлектрической активности нейронов (рис. 1). Паттерн спонтанной активности, регистрируемый мультиэлектродной матрицей, изменялся за счет увеличения количества сетевых пачек в минуту и сокращения их длительности. Количество спайков в пачке оставалось неизменным. После ГД в сети сохранялся высокий уровень активности, обусловленный главным образом повышением количества спайков в пачке. Через 3 сут высокий уровень активности также сохранялся, количество сетевых, более продолжительных пачек было больше, чем в контроле, хотя число спайков в пачке не отличалось от исходного (рис. 2).

Таким образом, 20-минутное снижение доставки глюкозы как энергетического субстрата оказывало

о о -

CD О X *

150

о с

^ О с

450

ш

v.Li-.i_______с .і—U j

СО

О

I—

*

CD

5

Q.

CD

t .

: ! : 1Г В: : і a it г s Т“! г пнтгт і гг

Т 11 S Г : : ; Г ! ІП ї. ! 1» » . *! .» 1.1 1 « f.l !

til и-У" I I II 11 ' t ftll !V І4.гггиг* гя:і!?-Т

\ \ " Г! !**!! 1:M !І ПТІі!тТЇ ТП7

- и 1 N4 Ш.і—

г ! : ?=?! 1 І Jf:?t : Г rrt!»?Vtirr*5Pff P^PTJ

‘Hi Ш\ і « H:»і * %v4JMr«uributci

50 100 150 200 250 300

Время, с

а

ИВЕ

It:»! :• wurr-'vili 4гл.-.л

200 400

600 800 1000 1200 Время, с

б

50 100 150 200 250 300

Время, с

100 200 300 400

г Время, с

в

Рис. 1. Растровые диаграммы спонтанной активности нейронной сети первичной культуры гиппокампа (нижние графики) и количество спайков за 50 мс (верхние графики), 12 DIV: а — до ГД; б — через 20 мин ГД;

Рис. 2. Динамика изменения спонтанной электрической активности первичной культуры гиппокампа при воздействии кратковременной ГД (20 мин): а — количество сетевых пачек импульсов в минуту; б — количество внеклеточных потенциалов (спайков) в сетевой пачке; в — продолжительность пачек; г — длительность межпачечного интервала. Здесь «После ГД» — через 30 мин после окончания ГД, «72 ч» — через 72 ч после окончания ГД. * — статистическая значимость различий с контролем, р<0,05

возбуждающее действие на нейронную сеть, изменяя паттерн ее активности.

Современные представления о работе клеток головного мозга основываются на том, что недостаток глюкозы приводит к нарушению процессов передачи и получения сигналов сразу после истощения запасов внутриклеточного АТФ. Считается, что запасов гликогена как внутреннего источника глюкозы, которые составляют примерно 1% от общего пула гликогена, хватает лишь на 5—7 мин активной работы мозга. Однако нами не зафиксировано снижения биоэлектрической активности на протяжении 20 мин полной ГД. Повышенная активность и изменение паттерна сетевой пачки обусловлены, вероятно, усиленным высвобождением возбуждающего нейротрансмиттера глутамата из пресина-птических терминалей пирамидных нейронов в составе сети первичной культуры гиппокампа. Усиление высвобождения глутамата может происходить вследствие стимуляции экзоцитоза повышенной концентрацией внутриклеточного кальция [Са2+] в пресинаптических терминалях в результате выброса из внутриклеточных депо, в частности из митохондрий. Известно, что ГД приводит к падению мембранного потенциала митохондрий за счет ингибирования КАТФ-каналов и, как следствие, к снижению аккумулирующей способности митохондрий и усилению выброса Са2+ в цитоплазму [11]. Сохранение повышенной биоэлектрической активности

в течение 3 сут после ГД свидетельствовало, вероятно, о продолжающейся гиперактивации глутаматных рецепторов. Известно, что данный механизм может являться критическим фактором развития эксайтотоксичности, опосредуемой повышением уровня внутриклеточного кальция и запуском каскада патологических реакций, приводящих к гибели нейронов [12].

О запуске этого каскада свидетельствовали изменения уровней лактата и окислительно-модифицированных белков (см. таблицу) в культуральной среде. Так, в 1-е сутки после ГД выделение лактата в среду снижалось по сравнению с контролем в 2 раза на фоне незначительного повышения потребления глюкозы клетками, что могло быть обусловлено продолжающимся субстратным дефицитом и нарушением сбалансированного пути обмена субстратами между астроцитами и нейронами [13].

При исследовании окислительной модификации белков обнаружено достоверное увеличение количества 2,4-динитрофинилгидрозонов, регистрируемых на длинах волн 363 и 370 нм, что говорит об активации процессов свободно-радикального окисления белков вследствие окислительного стресса, развивающегося после 20-минутной ГД. Обнаружена обратная корреляционная зависимость между количеством продуктов окислительной модификации белков и концентрацией лактата в среде культивирования (г=-0,589). Таким образом,

Концентрация глюкозы, лактата и содержание продуктов окислительной модификации белков через сутки после 20-минутной ГД

Серии Продукты окислительной модификации белков, усл. ед. Концентрация лактата, ммоль/л Концентрация глюкозы, ммоль/л

А,=363нм Х=370 нм

Контроль 92,58±28,15 152,74±38,43 12,50±1,36 19,50±1,01

ГД 290,38±45,32* 299,96±52,28* 5,46±0,34* 16,50±1,34*

* — различия с контролем статистически значимы, р<0,05.

рис. 3. Динамика изменения спонтанной активности первичной культуры гиппокампа в условиях долговременной ГД (120 мин): а — среднее количество пачек импульсов в минуту; б — среднее количество спайков в пачке; в — средняя продолжительность пачек; г — длительность межпачечного интервала. «После ГД» — через 30 мин после окончания ГД. * — статистическая значимость различий с исходным уровнем, р<0,05

процесс восстановления метаболической активности клеток после ГД обратно пропорционален количеству белков, подверженных окислительной деструкции.

Активация свободно-радикального окисления в условиях достаточного поступления кислорода может быть следствием как нарушения процессов дыхания в митохондриях, так и чрезмерного накопления свободного кальция в цитоплазме нейронов и глии [14]. Процесс субстратного голодания в условиях адекватного кислородного снабжения связан, как правило, с нарушением окислительного фосфорилирования и истощением запасов НАДН+ и НАДФН+, которые являются необходимыми коферментами для работы ферментных (в том числе антиоксидантных) систем.

Через 6 сут основные биоэлектрические показатели активности нейронной сети оставались в пределах исходных значений, за исключением длительности сетевых пачек. Более длительные пачки можно объяснить усложнением паттерна активности в связи с показанной ранее продолжающейся дифференцировкой нейронов и синаптических межнейронных связей в сети в процессе культивирования [9].

Повторная, более длительная (120 мин) ГД через 6 сут выявила практически те же закономерности изменения пачечной активности, что и 20-минутная ГД (рис. 3).

Количество сетевых пачек в минуту повышалось последовательно до 80-й минуты ГД в 6 раз при укоро-

чении длительности пачек. Однако количество импульсов в пачке снижалось, тогда как изменения данного показателя при первом эпизоде кратковременной ГД отсутствовали.

К 120-й минуте ГД количество пачек, их длительность и число спайков в пачке возвращались к исходным значениям. Замена раствора на питательную среду, так же, как и при кратковременной ГД, вызывала повышение числа спайков в сетевой пачке.

Таким образом, более длительная повторная ГД обеспечивала усиление биоэлектрической активности нейронной сети со сходной динамикой параметров сетевой активности во время первого кратковременного воздействия ГД, что свидетельствовало, вероятно, о сохранении основных структурно-функциональных единиц сети нейронов после эпизодов дефицита глюкозы.

Для доказательства данного предположения были изучены корреляционные связи между импульсами в сетевой пачке, отражающие функциональные взаимосвязи между нейронами в сети, с использованием нового метода анализа многоканальных импульсных последовательностей, генерируемых нейросетями с априорно неизвестной топологией связей. Метод основан на построении направленного корреляционного графа, описывающего повторяющиеся пространственновременные импульсные последовательности (рис. 4). Вершинами графа являются элементы сети (нейроны), задействованные в генерации наблюдаемого паттерна активности. Ребра графа отображают активные меж-элементные связи с определенной временной задержкой, априорно неизвестной и детектируемой по пикам локальной кросс-корреляционной функции. Наличие статистически достоверных связей определяется по

рис. 4. Графическое отображение корреляционной взаимосвязи нейронов в сети гиппокампа: а — контроль; б — после кратковременной ГД; в — через 72 ч после кратковременной ГД; г — после долговременной ГД

возможности существования для каждого из событий сигнала-источника на определенной задержке. Пороговое значение этой возможности рассчитывается как вероятность случайных совпадений из анализа суррогатных данных. Корреляционные графы позволяют определить характерные особенности функциональной архитектуры исследуемых сетей, включая: 1) ключевые элементы, «распределители» (англ. hubs) активности; 2) замкнутые циклы передачи возбуждения в сети и 3) характерные временныю масштабы пространственновременны 1х паттернов активности.

Изучение внутренней структуры пачки спайков в общем паттерне активности нейронной сети с помощью метода корреляционных графов выявило значительное упрощение структуры взаимосвязей между клетками при сохранении основных центральных нейронов-распределителей, которые поддерживали общесетевую функциональную морфологию сети.

Вероятно, наиболее слабые звенья нейронной сети при недостатке доступных субстратов окисления в условиях ГД элиминировали, в то время как наиболее устойчивые к стрессу нейроны продолжали активно функционировать и поддерживать структуру сети за счет пластических перестроек.

Морфологическое исследование культур клеток гиппокампа показало, что на 3—6-е сутки после и кратковременной, и долговременной ГД количество погибших нейронов возрастает. В контроле число таких клеток составило 0,7% от их общего числа, в то время как в культурах, подвергнутых кратковременной ГД, — 4%. Увеличение количества погибших клеток после долговременной ГД, по сравнению с кратковременной, статистически не значимо (р>0,05) и составляет в среднем 6% от общего числа клеток.

Заключение. Кратковременная глюкозная депривация повышает биоэлектрическую активность нейронной сети первичной культуры гиппокампа, запуская при этом каскад метаболических реакций, приводящих в дальнейшем к гибели части функционально активных нейронов. Патологические реакции в нейронной сети развиваются на протяжении 6 сут после глюкозной депривации и приводят к упрощению ее функциональной структуры при сохранении узловых управляющих единиц.

Методами корреляционного анализа показано, что глюкозная депривация вызывает снижение количества функциональных взаимосвязей между нейронами, что может быть причиной нарушения когнитивных функций мозга in vivo при изменении метаболизма глюкозы в условиях ее недостаточной доставки к клеткам. Кратковременная глюкозная депривация нейронной сети создает эффект метаболического прекондициони-рования, которое в отдаленном периоде препятствует необратимым морфофункциональным повреждениям нейронов во время более длительной глюкозной депривации.

Работа поддержана грантами РФФИ (09 09-04-12304-офи-м, 09-04-97090-офи-м, 08-04-1

офи) и аналитической ведомственной целевой программой Министерства образования и науки РФ 2.1.1/6223.

Литература

1. Schurr A, Reid K.H., Tseng M.T., West C, Rigor B.M. Adaptation of adult brain tissue to anoxia and hypoxia in vitro. Brain Res 1986; 374: 244—248.

2. Murry C.E., Jennings R.B., Reimer K.A. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell in jury in ischemic myocardium. Circulation 1986; 74: 1124—1136.

3. Bolli R. The late phase of preconditioning. Circ Res 2000; 87: 972—983.

4. Busija D.W., Lacza Z., Rajapakse N., Shimizu K., Kis B., Bari F., Domoki F., Horiguchi T. Targeting mitochondrial ATP-sensitive potassium channels — a novel approach to neuroprotection. Brain Res Rev 2004; 46: 282—294.

5. Hausenloy D., Wynne A, Duchen M., Yellon D. Transient mitochondrial permeability transition pore opening mediates pre-conditioning-induced protection. Circulation 2004; 109: 1714—1717.

6. Horiguchi T., Kis B., Rajapakse N., Shimizu K., Busija D.W. Opening of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels is a trigger of 3-nitropropionicacid-induced tolerance to transient focal cerebral ischemia in rats. Stroke 2003; 34: 1015—1020.

7. Kis B., Rajapakse N.C., Snipes J.A., Nagy K., Horiguchi T., Busija D.W. Diazoxide induces delayed pre-conditioning in cultured rat cortical neurons. J Neurochem 2003; 87: 969—980.

8. Gaspar T., Kis B., Snipes J.A., Lenzser G., Mayanagi K., Bari F., Busija D.W. Transient glucose and aminoacid deprivation induces delayed preconditioning in cultured rat cortical neurons. J Neurochem 2006; 98: 555—565.

9. Мухина И.В., Казанцев В.Б., Хаспеков Л.Г., Захаров Ю.Н., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Коротчен-ко С.А., Корягина Е.А. Мультиэлектродные матрицы — новые возможности в исследовании пластичности нейрональной сети. Соврем технол мед 2009; 1: 8—15.

10. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О. Ходов Д.А., Поро-тов И.Г. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения. Вопросы медицинской химии 1995; 41(1): 24—26.

11. Kahlert S., Zundorf G., Reiser G. Glutamate-mediated influx of extracellular Ca2+ is coupled with reactive oxygen species generation in cultured hippocampal neurons but not in astrocytes. J Neurosci Res 2005; 79: 262—271.

12. Stelmashook E.V., Lozier E.R., Goryacheva E.S., Mer-genthaler P., Novikova S.V., Zorov D.B., Isaev N. Glutamine-mediated protection from neuronal cell deat depends on mitochondrial activity. Neurosci Letters 201 ( 482(2): 151—1

13. Simpson A, Carruthers A, Vannucci S. Supply and demand in cerebral energy metabolism: the role of nutrient transporters Cereb Blood Flow Meta 2007; 27(11): 1766—1791.

-long Z., Xin H., Zhu Y.Z. Neuroprotective effects of on ischemia/reperfusion-induced mitochondrial nctions in rat cerebral cortex. Biol Pharm Bull 2010; ): 1958—1964.

ттшшшш Влияние кратковременной глюкозной депривации на функционирование нейронной сети ...

СТМ J 2011 - 2 13