Метаболические особенности изолированной перфузируемой печени крысы при гипоксии

физико-химическая Биология physical-chemical biol ogy

DOI: 10.12731/wsd-2016-9-33-46 УДК 57.085.2

метаболические особенности

изолированной перфузируемой печени

крысы при гипоксии Пахомова В.Г., Шадрин К.В., Рупенко А.П., Крюкова О.В.

В работе исследована функциональная активность изолированной печени крыс при моделировании состояния нормобарической гипоксии in vivo и in vitro. Определение физиологических и биохимических параметров, характеризующих жизнеспособность изолированной печени крыс, показало, что изменения метаболизма изолированной перфузируемой печени при реакции на недостаток кислорода проявляется в одни и те же сроки вне зависимости от способа экспериментального моделирования гипоксического состояния.

Ключевые слова: нормобарическая гипоксия; перфузия изолированных органов; метаболизм; печень.

peculiar properties of isolated perfused

rat liver metabolism at hypoxic state

Pakhomova V.G., Shadrin K.V., RupenkoA.P., Kryukova O.V.

In the artificial homeostasis conditions using the model of the isolated perfused organ the metabolic features of rat liver at hypoxic state were researched. The results showed that under oxygen deficiency the metabolic changes in the

isolated perfused liver appear for the different methods of experimental simulation of the hypoxic condition simultaneously.

Keywords: normobaric hypoxia; isolated organs perfusion; metabolism; liver.

Один из наиболее адекватных методов для исследования функциональной активности изолированных органов является управляемая перфузия. Сложность структурой организации целостного организма делает анализ биологических процессов в отдельных органах, и их контроль затрудненным, в то время как более простые системы (клеточные и тканевые культуры) не позволяют адекватно оценить реальной ситуации in situ. Кроме того, возможность контролировать протекающие процессы в условиях органной культуры шире, чем в условиях клеточных и тканевых культур, поскольку при этом сохраняется структура нативного органа и органный кровоток посредством микроциркуляции и диффузионных потоков [1]. Создания искусственного гомеостаза изолированного органа путем управляемой перфузии позволяет рассматривать и сравнивать биохимические и физиологические реакции органа вне регуляторных влияний организма, что является актуальным для оценки жизнеспособности органа и подготовке его к трансплантации, в процессе которой орган находится в состоянии гипоксии [2-5].

Цель работы - выявить особенности органной реакции изолированной перфузируемой печени на экспериментально создаваемую нормоба-рическую гипоксию методом перфузии изолированных органов.

Методика исследования

Состояние нормобарической гипоксии моделировали на крысах-самцах Wistar (200-250 г) двумя способами. Первый способ in vitro, заключался в снижении оксигенации перфузионной среды (14% кислорода в среде), т.е. непосредственно во время перфузии исследуемый орган оказывался в состоянии гипоксии. Во втором случае гипоксическое состояние моделировали in vivo, помещая интактных крыс на 40 мин в метабо-

лическую камеру, в которую подавали газовую смесь из 14% кислорода, 86% азота.

Животные были разделены на 3 группы. Группа 1 (контрольная) -перфузия изолированной печени интактных животных средой с содержанием кислорода 95%. Группа 2 - перфузия изолированной печени ин-тактных животных средой с содержанием кислорода 14%. Группа 3 - перфузия изолированной печени животных, после моделирования состояния гипоксии, средой с содержанием кислорода 95%.

Перфузию печени крыс осуществляли с использованием уникальной научной установки «Комплекс оборудования для управляемого культивирования изолированных органов». Печень перфузировали через портальную вену, в качестве перфузионнной среды использовали раствор Кребса-Рингер с добавлением лактата (1,7 мМ), хлорида аммония (5 мМ) и аспарагиновой кислоты (0,2 мМ). Перфузию проводили на при постоянной скорости потока среды 2,5мл/(мин*г) [6, 7].

В процессе эксперимента определяли давление (прямым монометрическим методом), которое в случае постоянной скорости среды отражает сопротивление сосудов печени. Измерение содержания кислорода, углекислого газа, проводили на ABL 800 Flex (Дания). Концентрацию мочевины в оттекающей от органа перфузионной среде определяли с использованием набора Мочевина-Витал (Vital, Россия).

В последующем рассчитывали скорости выделения печенью кислорода, углекислого газа и мочевины по артерио-венозной разнице.

Манипуляции с животными проводились в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными отраженными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей».

Данные, представленные в работе, подвергали статистической обработке с определением средней арифметической и ее ошибки. Достоверность различий между средними величинами оценивали согласно критерию Фишера.

Результаты исследования и обсуждение

Функции печени многочисленны и сложны, следовательно, при культивировании изолированной печени необходимо учитывать различные аспекты физиологии изолированного органа [8]. Одним из физиологических параметров, характеризующих реакцию печени на недостаток кислорода является давление в сосудах изолированной перфузируемой печени крыс (рисунок 1 а, б).

Время, мин

Рис. 1. Изменение перфузионного давления и удельной скорости потребления кислорода и выделения углекислого газа изолированной перфузируемой печенью крысы после моделирования гипоксии in vivo

При моделировании органной гипоксии наблюдали спазм сосудов изолированной печени на протяжении всего эксперимента. При гипоксии органа, моделированной in vivo, нарушение микроциркуляции наблюдается только в первые минуты перфузии, что может быть связано с действием прекапиллярных сфинктеров. Известно, что у прекапиллярных сфинктеров тонус и диаметр изменяются за счет местных тканевых гормонов тучных клеток и базофилов при их дегрануляции, что составляет минуты.

При развитии гипоксического состояния кислородное обеспечение органов зависит от ряда параметров, в том числе от газового состава крови, от диффузионных расстояний для кислорода, способности к утилизации кислорода и др. [9-11]. Следует отметить, что в группе, где орган непосредственно испытывает гипоксию на протяжении всей перфузии, наблюдается стабильное, но сниженное относительно контроля потребление кислорода органом. Значение содержания кислорода в оттекающем перфузате в течение всего времени прохождения перфузионной жидкости через орган не опускались ниже 80 мм рт. ст. (против 300 мм рт. ст. во втекающем перфузате). Таким образом, орган потребляет не весь присутствующий в среде кислород, несмотря на искусственное снижение его концентрации в перфузионной среде. Полученные нами данные согласуются с результатами работ других авторов [9, 10].

Рассматривая изменения метаболизма изолированного органа при ги-поксическом воздействии, можно заметить, что происходит увеличение выхода углекислого газа в перфузионную среду (рисунок 2). При этом максимальные уровни выхода углекислого газа в группах, где моделировали гипоксическое состояние печени, приблизительно одинаковы по величине, однако увеличение содержания углекислого газа в оттекающем от изолированной печени перфузате происходит на 40 минут раньше в группе животных, которых предварительно содержали в метаболической камере с низким содержанием кислорода.

При гипоксии в кровоток попадают недоокисленные продукты обмена, которые нейтрализуются бикарбонатной буферной системой, что в итоге приводит к накоплению СО2. Известно, что при гипоксии наблюда-

ется увеличение скорости выделения СО2 в сочетании с повышением дыхательного коэффициента, что свидетельствует о том, что при гипоксии происходит активация анаэробных процессов в организме [12].

Рис. 2. Удельная скорость выделения углекислого газа и мочевины изолированной перфузируемой печенью крысы после моделирования гипоксии in vivo (а) и при гипоксии in vitro(6).

При оценке данных рисунка 2 можно видеть, что количество произведенного углекислого газа напрямую связано с количеством синтезированной мочевины. Синтез мочевины так же может усиливаться посредством

недоокисленных продуктов обмена, накапливающихся при недостатке кислорода в среде. При гипоксии происходит экстренная мобилизация защитных сил организма в результате перераспределения ресурсов между пластическими и энергетическими процессами в клетках. Ряд авторов предполагает, что активность цикла мочевины в гепатоцитах можно рассматривать как существенный параметр при культивирования изолированной печени, который, вносит существенный вклад в устойчивый рост осмоляльности среды [4, 5, 13].

Вероятно, при низком содержании кислорода в перфузионной среде, при усилении процесса анаэробного распада глюкозы в клетках увеличивается уровень восстановительных коферментов, необходимых для адекватного протекания химических превращений [14-19]. Следовательно, клетки начинают использовать аминокислоты в качестве метаболического топлива, при этом активируются реакции окислительного деза-минирования и высвобождение аммиака, приводя в итоге к увеличению перфузионной среде содержание мочевины.

Таким образом, общая ответная реакция организма на острую кислородную недостаточность характеризуется активацией срочных регуля-торных компенсаторных механизмов. В клетке включаются каскадные механизмы внутриклеточной сигнализации ответственные формирование адаптивных признаков. Наблюдаемые в работе процессы, происходящие в изолированной печени свидетельствуют о наличие метаболической автономии органа, состоящей в каскаде биохимических реакции в клетках печени, функционирующей как in vivo, так и в условиях искусственного гомеостаза, поддерживаемого перфузионной системой. Сходные процессы наблюдали и на уровне организма в ходе оценки комплемент-зависимой реакции в постгипоксическом периоде, достигающей наибольшей выраженности через 60 мин после начала гипоксии [20].

Список литературы

1. Нефедов В.П., Самойлов В.А., Гареев Р.А., Ким Т.Д. Управление функциональной активностью органов при перфузии. Новосибирск: Наука. 1982.

2. Schon MR., Kollman O., Wolf S., Scherem H., Matthes M., Akkoc N., Schnoy N.C., Neuhaus P. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion // Annals of surgery. 2001. Vol. 233, №1, рр. 114-123.

3. Tolboom H., Milwid J.M., Izamis M.-L., Uygun K., Berthiaume F., Yarmush M.L. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ishemic rat liver // Transplant Proc. 2008. Vol. 40, No 5, рр. 1306-1309.

4. Op den Dries S., Karimian N., Sutton M.E., Westerkamp A.C., Nijsten M.W., Gouw A.S. Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers // Am. J. Transplant. 2013. Vol.13, рр. 1327-1335.

5. Totsuka E., Dodson F., Urakami A., Moras N., Ishii T., Lee M.C. Influence of high donor serum sodium levels on early postoperative graft function in human liver transplantation: effect of correction of donor hypernatremia // Liver Transpl. Surg. 1999. Vol.5, рр. 421-428.

6. Рупенко А.П., Круглик О.В., Моргулис И.И. Функциональная активность изолированной перфузируемой печени крыс зависит от состава среды // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 2008. Vol.146(7). С. 117-120.

7. Шадрин К.В., Пахомова В.Г., Рупенко А.П., Моргулис И.И. Влияние условий и подготовки проведения эксперимента на показатели функционирования изолированной перфузируемой печени крысы // Вестник КрасГАУ. 2013.Vol.3. С. 96-102.

8. Заика С.Н., Котельников В.Н. Особенности гемодинамики печени при длительном течении витамин В 12-дефицитной анемии // В мире научных открытий. 2014. №2.1 (50). С. 657-699.

9. Балыкин М.В., Каркобатов Х.Д. Системные и органные механизмы кислородного обеспечения организма в условиях высокогорья // Рос. физиол. журн. им. И.М Сеченова. 2012. Vol.98(1). С. 127-136.

10. Kuwahira I., Heisler N., Piiper J., Gonzalez N.C. Effect of chronic hypoxia on hemodynamics, organ blood flow and O2 supply in rats // Respiration Physiology. 1993. Vol.92(2), рр. 227-238.

11. Shumacker R.T., Sugget A.J., Wagner P.D., West J.B. Role of hemoglobin Pso in O2 transport during normoxic and hypoxic exercise in dog // J.Appl. Physiol. 1985. Vol.59(3), рр. 749-757.

12. Гришин О.В., Басалаева С.В., Устюжанинова Н.В., Уманцева Н.Д., Гла-дырь С.Н. Реакции внешнего дыхания и интенсивность энергетического обмена у неадаптированных к гипоксии людей в условиях нарастающей гипоксии // Бюлл. физиологии и патологии дыхания. 2014. Vol.51.

C. 8-14.

13. Reiling J., Lockwood D.S.R., Simpson A.H., Campbell C.M., Bridle K., Sant-rampurwala N., Britton L.J., Crawford D.H.G., Dejong C.H.C., Fawcett J. Production During Normothermic Machine Perfusion: Price of Success? // Liver transplantation. 2015. Vol. 21(5), рр. 702-703

14. Инжеваткин Е.В., Савченко А.А. Метаболические изменения в печени мышей при асцитной карциноме Эрлиха // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 2014. Vol.157(6). С. 757-761.

15. Инжеваткин Е.В., Савченко А.А., Альбрант А.И., Нефедов В.П. Исследование метаболических изменений печени крыс в динамике восстановительного периода гипертермического воздействия // Вопросы медицинской химии. 2000. Vol.46(2). С. 135-139.

16. Лукьянова Л.Д. Современные проблемы адаптации к гипоксии. Сигнальные механизмы и их роль в системной регуляции // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2011. Vol.1. С. 3-19.

17. Лукьянова Л.Д., Дудченко А.М. Параметры аденилатного пула как предикторы нарушений энергетического обмена в гепатоцитах при гипоксии // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 2003. Vol.136(7). С. 41-44.

18. Лукьянова Л.Д., Козлов Л.В., Бичучер А.М., Кирова Ю.И., Германова Э.Л. Срочная реакция системы комплемента неустойчивых к гипоксии крыс на гипоксические воздействия // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 2010. Vol.150(12). С. 626-630.

19. Макаренко А.Н., Карандеева Ю.К. Адаптация к гипоксии как защитный механизм при патологических состояниях // Вестник проблем биологии и медицины. 2013. Vol.2(100). С. 27-29.

20. Fondevila C., Hessheimer A.J., Maathuis M.H., Munoz J., Taura P., Calatayud

D. Superior preservation of DCD livers with continuous normothermic perfusion // Annals of Surgery. 2011. Vol. 254, рр. 1000-1007.

Reference

1. Nefedov V.P., Samoylov V.A., Gareev R.A., Kim T.D. Upravlenie funktsion-al'noy aktivnost'yu organov pri perfuzii [Managing the functional activity of organs in perfusion]. Novosibirsk: Nauka. 1982.

2. Schon M.R., Kollman O., Wolf S., Scherem H., Matthes M., Akkoc N., Schnoy N.C., Neuhaus P. Liver transplantation after organ preservation with normother-mic extracorporeal perfusion. Annals of surgery. 2001. Vol.233, №1, pp. 114-123.

3. Tolboom H., Milwid J.M., Izamis M.-L., Uygun K., Berthiaume F., Yarmush M.L. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ishemic rat liver. Transplant Proc. 2008. Vol. 40, No 5, pp. 1306-1309.

4. Op den Dries S., Karimian N., Sutton M.E., Westerkamp A.C., Nijsten M.W., Gouw A.S. Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers. Am. J. Transplant. 2013. Vol.13, pp. 1327-1335.

5. Totsuka E., Dodson F., Urakami A., Moras N., Ishii T., Lee M.C. Influence of high donor serum sodium levels on early postoperative graft function in human liver transplantation: effect of correction of donor hypernatremia. Liver Trans-pl. Surg. 1999. Vol.5, pp. 421-428.

6. Rupenko A.P., Kruglik O.V., Morgulis I.I. Funktsional'naya aktivnost' izoliro-vannoy perfuziruemoy pecheni krys zavisit ot sostava sredy [The functional activity of the isolated perfused rat liver depends on the medium composition]. Byull. eksperim. biologii i meditsiny [Bulletin of Experimental Biology and Medicine]. 2008. Vol.146(7), pp. 117-120.

7. Shadrin K.V., Pakhomova V.G., Rupenko A.P., Morgulis I.I. Vliyanie usloviy i podgotovki provedeniya eksperimenta na pokazateli funktsionirovaniya izolirovannoy perfuziruemoy pecheni krysy [Influence of preparation conditions and the experiment on the functioning of the performance of an isolated perfused rat liver]. Vestnik KrasGAU [Bulletin of the Krasnoyarsk State Agrarian University]. 2013.Vol.3, pp. 96-102.

8. Zaika S.N., Kotel'nikov V.N. Osobennosti gemodinamiki pecheni pri dlitel'nom techenii vitamin V 12-defitsitnoy anemii [Features hemodynamics liver with prolonged duration of vitamin B 12 deficiency anemia]. Vmire nauchnykh otkrytiy [In the world of scientific discoveries]. 2014. №2.1(50), pp. 657-699.

9. Balykin M.V., Karkobatov Kh.D. Sistemnye i organnye mekhanizmy kislo-rodnogo obespecheniya organizma v usloviyakh vysokogor'ya [System organ and mechanisms to ensure the body's oxygen at high altitudes]. Ros. fiziol. zhurn. im. I.M Sechenova [Russian Journal of Physiology them. I.M. Sechen-ov]. 2012. Vol.98(1), pp. 127-136.

10. Kuwahira I., Heisler N., Piiper J., Gonzalez N.C. Effect of chronic hypoxia on hemodynamics, organ blood flow and O2 supply in rats. Respiration Physiology. 1993. Vol.92(2), pp. 227-238.

11. Shumacker R.T., Sugget A.J., Wagner P.D., West J.B. Role of hemoglobin Pso in O2 transport during normoxic and hypoxic exercise in dog. J.Appl. Physiol. 1985. Vol.59(3), pp. 749-757.

12. Grishin O.V., Basalaeva S.V., Ustyuzhaninova N.V., Umantseva N.D., Gladyr' S.N. Reaktsii vneshnego dykhaniya i intensivnost' energeticheskogo obmena u neadaptirovannykh k gipoksii lyudey v usloviyakh narastayushchey gipoksii [Reactions of external respiration and the intensity of energy metabolism in people not adapted to hypoxia under conditions of increasing hypoxia]. Byull. fiziologii i patologii dykhaniya [Bulletin of the physiology and pathology of respiration]. 2014. Vol.51, pp. 8-14.

13. Reiling J., Lockwood D.S.R., Simpson A.H., Campbell C.M., Bridle K., San-trampurwala N., Britton L.J., Crawford D.H.G., Dejong C.H.C., Fawcett J. Production During Normothermic Machine Perfusion: Price of Success? Liver transplantation. 2015. Vol. 21(5), pp. 702-703.

14. Inzhevatkin E.V., Savchenko A.A. Metabolicheskie izmeneniya v pecheni my-shey pri astsitnoy kartsinome Erlikha [Metabolic changes in the liver of mice with Ehrlich ascites carcinoma]. Byull. eksperim. biologii i meditsiny [Bulletin of Experimental Biology and Medicine]. 2014. Vol.157(6), pp. 757-761.

15. Inzhevatkin E.V., Savchenko A.A., Al'brant A.I., Nefedov V.P. Issledovanie metabolicheskikh izmeneniy pecheni krys v dinamike vosstanovitel'nogo peri-oda gipertermicheskogo vozdeystviya [The study of metabolic changes in the liver of rats in the dynamics of the recovery period hyperthermic effects]. Vo-prosy meditsinskoy khimii [Problems of medical chemistry]. 2000. Vol.46(2), pp. 135-139.

16. Luk'yanova L.D. Sovremennye problemy adaptatsii k gipoksii. Signal'nye me-khanizmy i ikh rol' v sistemnoy regulyatsii [Modern problems of adaptation to hypoxia. Signaling pathways and their role in the system of regulation]. Pato-logicheskayafiziologiya i eksperimental'naya terapiya [Pathological physiology and experimental therapy]. 2011. Vol.1, рр. 3-19.

17. Luk'yanova L.D., Dudchenko A.M. Parametry adenilatnogo pula kak predik-tory narusheniy energeticheskogo obmena v gepatotsitakh pri gipoksii [Ad-enylate pool parameters as predictors of disorders of energy metabolism in hepatocytes during hypoxia]. Byull. eksperim. biologii i meditsiny [Bulletin of Experimental Biology and Medicine]. 2003. Vol.136(7), рр. 41-44.

18. Luk'yanova L.D., Kozlov L. V., Bichucher A.M., Kirova Yu.I., Germanova E.L. Srochnaya reaktsiya sistemy komplementa neustoychivykh k gipoksii krys na gipoksicheskie vozdeystviya [Emergency response systems complement unstable to hypoxia rats hypoxic exposure]. Byull. eksperim. biologii i meditsiny [Bulletin of Experimental Biology and Medicine]. 2010. Vol.150(12), рр. 626-630.

19. Makarenko A.N., Karande eva Yu.K. Adaptatsiya k gipoksii kak zashchitnyy mekhanizm pri patologicheskikh sostoyaniyakh [Adaptation to hypoxia as a defense mechanism in pathological conditions]. Vestnikproblem biologii imeditsiny [Bulletin of the problems of biology and medicine]. 2013. Vol.2(100), рр. 27-29.

20. Fondevila C., Hessheimer A.J., Maathuis M.H., Munoz J., Taura P., Calatayud D. Superior preservation of DCD livers with continuous normothermic perfusion. Annals of Surgery. 2011. Vol. 254, рр. 1000-1007.

ДАННЫЕ ОБ АВТОРАХ

Пахомова Вера Геннадьевна, инженер-исследователь

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение

«Федеральный исследовательский центр «Красноярский научный

центр Сибирского отделения Российской академии наук»

ул. Академгородок, 50, г. Красноярск, Красноярский край, 660036,

Российская Федерация

vgpakhomova@mail.ru

Шадрин Константин Викторович, младший научный сотрудник

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение

«Федеральный исследовательский центр «Красноярский научный

центр Сибирского отделения Российской академии наук»

ул. Академгородок, 50, г. Красноярск, Красноярский край, 660036,

Российская Федерация

kvsh_buffon@mail.ru

Рупенко Александр Петрович, младший научный сотрудник

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение

«Федеральный исследовательский центр «Красноярский научный

центр Сибирского отделения Российской академии наук»

ул. Академгородок, 50, г. Красноярск, Красноярский край, 660036,

Российская Федерация

olikru@yandex.ru

Крюкова Ольга Витальевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение

«Федеральный исследовательский центр «Красноярский научный

центр Сибирского отделения Российской академии наук»

ул. Академгородок, 50, г. Красноярск, Красноярский край, 660036,

Российская Федерация

marta913@mail.ru

DATA ABOUT THE AUTHORS Pakhomova Vera Gennad'evna, Research Worker

Federal Research Center «Krasnoyarsk scientific center» 50, Akademgorodok, Krasnoyarsk, 660036, Russian Federation vgpakhomova@mail.ru SPIN-code: 4611-9571

Shadrin Konstantin Viktorovich, Research Assistant

Federal Research Center «Krasnoyarsk scientific center»

50, Akademgorodok, Krasnoyarsk, 660036, Russian Federation

kvsh_buffon@mail.ru

Rupenko Aleksandr Petrovich, Research Assistant

Federal Research Center «Krasnoyarsk scientific center»

50, Akademgorodok, Krasnoyarsk, 660036, Russian Federation

olikru@yandex.ru

Kruykova Olga Vital'evna, Candidate of Biological Science, Research Scientist

Federal Research Center «Krasnoyarsk scientific center» 50, Akademgorodok, Krasnoyarsk, 660036, Russian Federation marta913@mail.ru SPIN-code: 5882-0170