СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
METHOD OF TREATING CANCER

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при комплексном лечении пациентов препаратами цитостатической группы, формирующих двуцепочечные ковалентные сшивки между цепями молекулы ДНК с одновременным лечением препаратом, содержащим аллогенный генетический материал, в частности, для лечения пациентов с онкологическими заболеваниями методами заместительной терапии поврежденных и огомозигоченных аллелей генома фрагментами аллогенной ДНК, когда причиной онкологических заболеваний являются мутации в онкогенах, генах онкосупрессоров и тотальное огомозигочивание аллелей генов клетки, претерпевающей раковое перерождение.
Известен способ лечения, основанный на исправлении точечных мутаций в клетках [US 5795972, 18.08.1998].
Способ отличается относительно низкой эффективностью лечения и ограниченностью применения, поскольку согласно этому способу мутации должны быть точно определены еще до начала лечения.
Ввиду того что ни для одной мутации нет достоверного доказательства того, что именно эта мутация является причиной рака, развитие этого метода требует скрупулезных и длительных исследований по выявлению конкретных мутаций, требующих коррекции, а следовательно, существует необходимость в создании способов лечения, которые могли бы применяться на основе уже имеющихся знаний о причинах рака, не делая акцента на конкретных изменениях генома, приведших к злокачественному перерождению.
Известны также способы лечения, основанные на локальном применении ДНК фрагментов для лечения предраковых состояний в коже пациентов и стимуляции солнечного загара [US 5955059, 21.09.1999, US 5470577, 28.11.1995].
Эти способы также имеют ограниченную применимость, поскольку ни конкретные последовательности, ни источники ДНК в указанных патентах не определены. В них предлагается использовать как природную, так и синтетическую ДНК из «любых подходящих источников», например ДНК лосося длиной от 200 мононуклеотидов и нуклеозидов, включая димеры, что в соответствии с тестами авторов является наиболее эффективным. Однако действие и последствия применения ДНК иной природы на человеческий организм пока не полностью изучены, что предопределяет определенную опасность применения способов.
3
2
2
2
2
2
2
2
2
Одним из близких по своей сущности к предложенному является способ, основанный на использовании цитостатических препаратов, например препарата цисплатины для лечения больных с плоскоклеточным раком кожи туловища, путем использования цисплатины в дозе 100 мг/м (1 день), внутривенно капельно 30 мг/м 1 раз в неделю, или 60-150 мг/м каждые 3-5 недель, или 20 мг/м ежедневно 5 дней с повторением каждые недели, или 50 мг/м в 1-й и 8-й дни каждые 4 недели, препарата митомицин С для лечения больных раком желудка, кишечника, поджелудочной железы, мочевого пузыря, молочной железы, легкого, вульвы, предстательной железы (в составе лекарственных комбинаций), путем использования митомицина С внутривенно в дозе 10 мг/м 1 раз в 3-4 недели (в составе лекарственных комбинаций) или также 2 мг/м с 1-го по 5-й и с 8-го по 12-й дни курса, суммарная доза 50 мг/м, или препарата дактиномицина для лечения больных с хориокарциномой матки, саркомой мягких тканей, злокачественных опухолей яичка, меланомы, лимфосаркомы, нейробластом путем использования дактиномицина внутривенно 350 мкг/м ежедневно в течение 5 дней каждые 3-5 недель или 1-2 раза в неделю в течение 3-5 недель, суммарная доза 3000 мкг [http://www.netoncology.ru].
Действие цитостатических препаратов, таких как псорален, цисплатина, ЦФ, нитроген мустард, мельфолан митомицин С и др., используемых при терапии различных раков, основано на их свойстве образовывать двуцепочечные сшивки в произвольных местах генома.
При терапевтической дозе цитостатика в геноме клеток организма образуются до 2000 межцепочечных сшивок. Репаративная система клетки не в состоянии справиться с таким количеством одновременных повреждений, что приводит к гибели раковой клетки.
Однако этот близкий по своей сущности к предлагаемому обладает относительно низкой эффективностью лечения, обусловленной тем, что раковая клетка гибнет, не изменяя своего ракового статуса, и распространяет в окружающее клетку пространство фрагменты ДНК, несущие онкомутации, которые могут служить источником генометастазирования. При этом одновременно с раковыми гибнут все остальные активно пролиферирующие клетки организма, такие как СКК, клетки эпителиев, клетки волосяных фолликул и т.д., что приводит к крайне негативным и даже летальным последствиям.
Все это снижает эффективность лечения пациентов с онкологическими заболеваниями, причиной которых являются как мутации в онкогенах и генах онкосупрессоров, так же как и тотальное огомозигочивание генов.
Наиболее близким по своей сущности к предлагаемому является способ, основанный на введении в организм пациента препарата цитостатической группы, механизм действия которого основан на формировании межцепочечных сшивок в молекуле ДНК раковых клеток организма, причем дополнительно вводят препарат фрагментированной аллогенной ДНК с фрагментами, имеющими биологически активный размер и составляющими полный геном физиологически и генетически здорового донора, за один час и через час после введения цитостатика и далее каждые два часа до завершения полного репаративного цикла, составляющего 12 ч, причем препарат фрагментированной аллогенной ДНК используют в качестве субстрата для гомологической рекомбинации с однонитчатыми участками ДНК и областями двуцепочечных разрывов молекулы ДНК, возникающими при репарации межцепочечных сшивок, а препарат фрагментированной аллогенной ДНК вводят в количестве, равном или превышающем количество собственно ДНК плазмы крови, но не более максимально допустимого количества, равного 30 мкг/мл крови [RU 2345792 С2, А61К 48/00, А61К 31/675, А61Р 35/00 (2006.01), 10.02.2009].
Недостатком способа является относительно низкая эффективность лечения, поскольку каждый из препаратов цитостатической группы цитостатиков имеет особенности, учет которых позволяет повысить эффективность лечения, что не учитывается в известном способе.
Требуемый результат заключается в повышении эффективности лечения пациентов с онкологическими заболеваниями, что проявляется, в частности, в увеличении продолжительности жизни и в улучшении качества жизни пациентов больных онкологическими заболеваниями.
В более широком плане задачей настоящего изобретения является разработка обоснованного и экспериментально подтвержденного способа совместного воздействия на основные звенья иммунной системы, отвечающие за развитие противоракового адаптивного иммунитета.
Способ основан на введении пониженных доз циклофосфана и последующего введения фрагментированной экзогенной ДНК, что позволяет при введении первого дифференцированно ингибировать жизнеспособность Т цитотоксических (CD4+CD25-CD8+) и Т регуляторных (CD4+CD25+) лимфоцитов, последние из которых создают микроокружение опухоли и препятствуют развитию противоракового адаптивного иммунитета, обусловленного функционированием Т цитотоксических лимфоцитов, и при введении второго активировать созревание дендритных клеток.
Способ позволяет сформировать терапевтический промежуток времени, когда регуляторные Т лимфоциты еще не восстановили свое ингибирующее адаптивный иммунитет количество и функцию, тогда как Т цитотоксические лимфоциты уже достигли своего нормального количества и физиологического состояния и вследствие антигенпрезентирующей активности зрелых дендритных клеток (ДК), индуцированной экзогенной ДНК формируют цитотоксический противораковый иммунитет.
Требуемый результат достигается тем, что по способу лечения, основанном на введении в организм пациента препарата цитостатической группы ЦФ в пониженных дозах, механизм которого основан на дифференцированном угнетении жизнеспособности Т цитотоксических (CD4+CD25-CD8+) и Т регуляторных (CD4+CD25+) лимфоцитов и введении препарата фрагментированной аллогенной двуцепочечной геномной ДНК с фрагментами, имеющими биологически активный размер и составляющими полный геном физиологически и генетически здорового донора через 48 часов после введения цитостатика, циклофосфан вводят в дозах от 20 до 200 мг/кг веса, количество экзогенной фрагментированной ДНК вводят до уровня, чтобы достичь концентрации фрагментированной ДНК в плазме крови пациента 2 мкг/мл.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что ДНК вводят в виде таблеток препарата в количестве 10 мг или 2 таблетки и число приемов такого количества препарата ДНК составляет 6 раз в сутки.
Кроме того, требуемый результат достигается тем, что препарат ДНК вводят после введения цитостатика и на протяжении последующих 30 суток для схемы, когда пациент получил полную курсовую дозу 6-14 г, либо на протяжении следующих 3-5 суток после однократной инъекции и за день до следующей по счету инъекции, продолжая такую прерывистую схему до полного набора терапевтической или поддерживающей дозы цитостатика.
Кроме того, требуемый результат достигается тем, что препарат фрагментированной аллогенной двуцепочечной геномной ДНК используют в качестве индуктора пролиферации предшественников дендритных клеток (моноцитов) организма, а также в качестве активатора созревания и проявления специфических активностей этими зрелыми дендритными клетками организма, формирующими адаптивный противораковый иммунитет у пациентов, больных онкологическими заболеваниями.
В современной литературе отсутствуют указания на предлагаемый способ лечения онкологических пациентов с использованием сочетания воздействия пониженных доз цитостатика ЦФ и препарата фрагментированной двуцепочечной геномной аллогенной ДНК, приводящего к активации противоракового адаптивного иммунитета.
Следовательно, предложение отвечает критериям новизны и изобретательского уровня.
Ниже приводятся теоретические и экспериментальные данные, подтверждающие, что изобретение отвечает критерию практической (промышленной) применимости.
На чертеже представлены:
на фиг.1 - влияние на рост внутримышечных трансплантатов опухоли Эрлиха (среднее ±SEM) предварительного (до прививки) многократного введения мышам фрагментированной ДНК человека согласно схеме, изображенной справа;
на фиг.2 - рост опухоли (среднее ±SEM) у мышей, подвергшихся воздействию ЦФ в сочетании с введением фрагментированной экзогенной ДНК человека согласно 3 схемам, изображенным справа;
на фиг.3 - рост опухоли (среднее ±SEM) у мышей, подвергшихся воздействию ЦФ в сочетании с введением фрагментированной экзогенной ДНК человека согласно схеме 4, изображенной справа;
на фиг.4 - анализ дозы препарата мышиной ДНК, вводимой после ЦФ согласно схеме, изображенной справа, оказывающей тормозящее действие на рост экспериментальных опухолей (среднее ±SEM);
на фиг.5 - оценка влияния экзогенной ДНК, полученной из различных организмов, на рост опухолей (среднее ±SEM) при введении согласно схеме, изображенной справа, на фоне терапии ЦФ;
на фиг.6 - оценка влияния иммунизации при последовательной обработке ЦФ и экзогенной фрагментированной геномной дцДНК согласно схеме, изображенной справа, на рост опухоли мышей (среднее ±SEM);
на фиг.7 - сравнение размеров опухолей Кребс 2 (среднее±SEM), перевитых по схеме 1, и аналогично, но с дополнительной иммунизацией. Иммунизация усиливает эффект торможения роста опухоли;
на фиг.8 - оценка влияния различных предварительных обработок экспериментальных мышей ЦФ и экзогенной ДНК, ассоциированной с протамином и нет, согласно схеме, изображенной справа, на рост опухоли мышей;
на фиг.9 - оценка влияния препарата фрагментированной экзогенной ДНК, вводимого добровольцам в дозе 30 мг в сутки, на изменение количества моноцитов человека (% от общего числа лейкоцитов, среднее ±SEM) в Фазе I клинических испытаний.
Предложенный способ лечения онкологических заболеваний реализуется следующим образом.
Способ лечения онкологических заболеваний основан на введении в организм пациента, подвергшегося воздействию цитостатика, препарата фрагментированной аллогенной двуцепочечной геномной ДНК с фрагментами, имеющими биологически активный размер и составляющими полный геном физиологически и генетически здорового донора через 48 часов после введения цитостатика.
Циклофосфан вводят в дозах от 20 до 200 мг/кг веса.
Препарат ДНК вводят после введения цитостатика и на протяжении последующих 30 суток для схемы, когда пациент получил полную курсовую дозу 6-14 г, либо на протяжении следующих 3-5 суток после однократной инъекции и за день до следующей по счету инъекции, продолжая такую прерывистую схему до полного набора терапевтической или поддерживающей дозы цитостатика.
Вводят такое количество экзогенной фрагментированной ДНК, чтобы достичь концентрации фрагментированной ДНК в плазме крови пациента 2 мкг/мл. Терапевтическую ДНК вводят в виде таблеток препарата в количестве 10 мг или 2 таблетки, и число приемов такого количества препарата ДНК составляет 6 раз в сутки.
Кроме того, препарат фрагментированной аллогенной двуцепочечной геномной ДНК используют в качестве индуктора пролиферации предшественников дендритных клеток (моноцитов) организма, а также в качестве активатора созревания и проявления специфических активностей этими зрелыми дендритными клетками организма, формирующими адаптивный противораковый иммунитет у пациентов, больных онкологическими заболеваниями.
При этом введение пониженных доз циклофосфана и последующее введение фрагментированной экзогенной ДНК позволяет, как это следует из анализа литературы, при введении первого дифференцированно ингибировать жизнеспособность Т цитотоксических (CD4+CD25-CD8+) и Т регуляторных (CD4+CD25+) лимфоцитов, последние из которых создают микроокружение опухоли и препятствуют развитию противоракового адаптивного иммунитета, обусловленного функционированием Т цитотоксических лимфоцитов, и при введении второго активировать созревание дендритных клеток. В результате такой обработки создается терапевтический промежуток времени, когда регуляторные Т лимфоциты еще не восстановили свое ингибирующее адаптивный иммунитет количество и функцию, тогда как Т цитотоксические лимфоциты уже достигли своего нормального количества и физиологического состояния, а вследствие созревания и антигенпрезентирующей и аллостимуляторной активности, индуцированной экзогенной ДНК, зрелые ДК формируют Т-цитотоксический противораковый иммунитет.
Пример реализации способа
В сочетании с цитостатиком ЦФ, используемым для лечения мелкоклеточного рака легкого, рака яичников, рака молочной железы, ретикулосаркомы, лимфосаркомы, хронического лимфолейкоза, острого лимфобластного лейкоза, множественной миеломе, опухоли Вильямса, костной ретикулосаркомы, опухоли Юнга, ангиосаркомы, и вводимым а) по 200 мг (3 мг/кг) ежедневно или 400 мг (6 мг/кг) через день (внутрь, внутривенно или внутримышечно); б) по 1 г (15 мг/кг) 1 раз в 5 дней внутривенно; по 2-3 г (30-45 мг/кг) 1 раз в 2-3 недели внутривенно с курсовой дозой при указанных режимах лечения 6-14 г в качестве основного курса лечения, или вводимым 2 раза в неделю внутривенно (или внутримышечно) в качестве поддерживающей терапии по 0,1-0,2 г препарата, дополнительно вводят препарат фрагментированной аллогенной двуцепочечной геномной ДНК с фрагментами, имеющими биологически активный размер и составляющими полный геном физиологически и генетически здорового донора, через 48 часов после введения цитостатика и на протяжении последующих 30 суток для схемы, когда пациент получил полную курсовую дозу 6-14 г, либо на протяжении следующих 3-5 суток после однократной инъекции и за день до следующей по счету инъекции, продолжая такую прерывистую схему до полного набора терапевтической или поддерживающей дозы цитостатика. Препарат ДНК в виде таблеток водят в количестве 2 мг на литр крови или 2 мкг/мл (10 мг или 2 таблетки), и число приемов такого количества препарата ДНК составляет 6 раз в сутки.
Препарат фрагментированной аллогенной двуцепочечной геномной ДНК в указанных схемах используют в качестве индуктора пролиферации предшественников дендритных клеток (моноцитов) организма, а также в качестве активатора созревания и проявления специфических активностей этими зрелыми дендритными клетками организма, формирующими адаптивный противораковый иммунитет у пациентов, больных онкологическими заболеваниями.
Для подтверждения того, что предложенный способ позволяет достигнуть требуемого результата, приведем его теоретическое и экспериментальное доказательство.
Рассмотрим концепцию сочетания воздействия цитостатика циклофосфана и фрагментированной геномной аллогенной двуцепочечной ДНК.
В литературе описано явление синергичного регрессирующего действия на опухоль цитостатической обработки и последующих инъекций иммуномодулирующих олигонуклеотидов, которое связано с активацией адаптивного иммунитета.
Мы обнаружили, что предварительное введение экзогенной ДНК в организм экспериментальных мышей в сочетании с кросслинкирующим цитостатиком ЦФ также приводит к торможению роста перевиваемых экспериментальных опухолей мыши. Ранее нами было показано, что препарат используемой дцДНК активирует ДК в системе ex vivo, индуцирует их созревание и аллостимуляторную активность. Мы полагаем, что торможение роста экспериментальных опухолей связано с активацией именно этого звена иммунной системы.
В последнее время уделяется большое внимание иммуногенным олигонуклеотидам (ИО), содержащим или CpG «островки» или имеющим фосфоротиоатный остов [1]. Имеется много экспериментальных сведений о том, что эти ДНК обладают способностью индуцировать адаптивный иммунный ответ при их введении в организм. Это свойство ИО широко дискутируется в плане их применения в терапии онкологических заболеваний [2-6].
Основной мишенью для ИО ДНК-стимуляции являются иммунокомпетентные Т-лимфоциты, натуральные киллеры, макрофаги и главное дендритные клетки (ДК). ИО ДНК, как индуктор иммунокомпетентности ДК, в зависимости от условий может формировать как иммунное противораковое, так и супрессивное направление их активности. Обработанные специфическими олигонуклеотидами ДК влияют на направление дифференцировки наивных CD4+CD25- Т-клеток [7, 8]. Экспериментально показано, что иммуногенные свойства ИО ДНК связаны с ее воздействием на TLR9, которые обнаружены в большом количестве у плазматических ДК и макрофагов [9-11]. Toll-like рецепторы (TLR9) относятся к группе паттерн-распознающих рецепторов, инициирующих врожденный и адаптивный иммунитет. Взаимодействие TLR-9 рецепторов ДК со специфическим лигандом - ИО ДНК - является первым и основным шагом в цепи последовательных событий, приводящих к активации способности ДК индуцировать противораковый биологический эффект. Противораковое действие активированных ДК состоит в индукции и усилении синтеза и секреции главных цитокинов, а также в определении дифференцировки Т-лимфоцитов. Если активирован Т8+путь, то ДК эффективно представляют антигены (АГ), в том числе и опухолевые, Т-цитотоксическим лимфоцитам и стимулируют их пролиферацию. Это действие приводит к формированию адаптивного противоракового иммунного ответа.
Недавно было обнаружено явление синергичного регрессирующего действия на опухоль цитостатической обработки и последующих инъекций ИО [4]. При этом эффективность противоракового действия специфических олигонуклеотидов, если они доставлялись в организм опытных животных вслед за обработкой цитостатиком, значительно возрастала. Главным условием проявления эффекта, как уже было сказано, являлось последовательное разбитое во времени введение вначале цитостатика, а затем иммуногена ИО. ИО индукция иммунного ответа синергична с большим количеством различных цитостатиков, используемых в химиотерапии онкологических заболеваний, включая циклофосфамид (ЦФ). Предполагается, что одним из механизмов такого синергизма может быть снижение количества супрессирующих адаптивный иммунитет Т-регуляторных лимфоцитов (Tregs) и задержка их развития по сравнению с CD8+Т лимфоцитами после миелосупрессии, вызванной действием цитостатика. Другое объяснение явления синергизма состоит в том, что обработка цитостатиком изменяет иммуногенность опухолевых АГ в сторону усиления иммунного ответа на них. Ингибирование Tregs-противоопухолевого Т-клеточного ответа, по-видимому, является одним из основных препятствий для противораковой вакцинации и иммунотерапии [4, 12]. Клиническая практика предполагает, что противораковая эффективность ИО-терапии может быть усилена предварительной инактивацией Tregs. Известно, что при цитостатической обработке терапевтическими дозами цитостатиков погибают любые типы лимфоцитов, не зависимо от их свойств. Результаты многих экспериментальных работ свидетельствуют о том, что Tregs могут быть более чувствительными к обработке цитостатиками, чем нормальные Т-клетки [13-20]. Это предполагает, что химиотерапия может селективно в большей степени воздействовать на Tregs, сохраняя жизнеспособность Т-цитотоксических лимфоцитов, которые и определяют высокий противораковый индекс такой терапии [17, 21, 22]. Микроокружение опухоли ассоциировано с активностью Tregs, которые супрессируют иммунное воздействие на опухолевые клетки и защищают опухоль от иммунной регрессии. В этом случае проведенная химиотерапия не только значительно уменьшает количество Tregs, но и элиминирует их защитную функцию [14, 20, 23-25]. «Раздетая» таким образом опухоль становится восприимчивой к действию индуцированного TLR-9-ИО терапией врожденного и адаптивного иммунитета. Фактически при щадящей обработке цитостатиком меняется микроокружение опухоли и вовремя активированные ДК становятся в состоянии представлять опухолевые АГ и сформировать Т-цитотоксический ответ против опухоли, которая до этого «ускользала» от иммунного надзора [4].
Принципиально возможны четыре типа воздействия на раковую клетку, приводящие либо к ее элиминации, либо к реверсивной трансформации: 1 -это изменение генотипа раковой клетки, приводящее к стабилизации пролиферации, при этом раковая клетка не становится здоровой, но перестает неконтролируемо делиться [26]; 2 - химическое воздействие на опухоль (использование цитостатиков - широко используемая терапия) [27, 28]; 3 - использование жесткой радиации (широко используемая терапия); 4 - противораковая активность иммунной системы организма, несущего неопластически перерожденную ткань.
В наших ранних работах было установлено, что не только ИО ДНК при ее использовании в сочетании с цитостатиком обладает тормозящим действием на развитие опухоли. Существует синергизм в регрессирующем действии на опухоль последовательного введения ЦФ и препаратов фрагментированной экзогенной геномной двуцепочечной (дц) ДНК. Сочетание обработки ЦФ и фрагментированной дцДНК вызывало более выраженный противоопухолевый эффект, чем применение одного ЦФ [29, 30]. Как было установлено в нашем недавнем исследовании [неопубликованные данные], фрагментированная экзогенная геномная дцДНК стимулирует созревание ДК и активирует их специфическую активность. Мы предположили, что при указанной терапии в организме создаются такие условия, когда иммунная система активируется, приобретает способность распознавать опухолевые АГ и активно реагировать на них. В проведенных экспериментах были протестированы различные схемы введения ЦФ и препаратов фрагментированной геномной ДНК. Также мы оценили динамику роста перевиваемых опухолей с предварительным введением АГ и без введения. Сочетание инъекций ЦФ с последующей обработкой фрагментированной геномной ДНК свидетельствует о том, что указанная совместная терапия приводит к ярко выраженному противораковому действию на перевиваемую опухоль.
Используемые методики
В экспериментах использовали трехмесячных мышей линии CBA/Lac разводки вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Животных содержали в пластиковых клетках по 10 особей в каждой со свободным доступом к пище и воде.
Подробные схемы введения препаратов мышам в проведенных экспериментах и используемые дозы представлены на чертежах. Во всех экспериментах, кроме первого, мыши получали одну или две с промежутком в одни сутки в/б инъекции ЦФ, суммарно не более 200 мкг/кг веса животного. За этим следовало 1-12-кратное внутрибрюшинное, подкожное или внутривенное введение 1 мкг - 5 мг препарата экзогенной ДНК, человеческой, мышиной, спермы лосося или человеческой, ассоциированной с протамином, на протяжении 1-5 дней. Контрольные группы получали инъекции физиологического раствора. Группы состояли из 6-10 мышей.
6
5
6
Через различные промежутки времени (1 сут - 4 мес) мышам внутримышечно прививали по 10 опухолевых клеток в Экспериментах 1-6 и 10 опухолевых клеток в Эксперименте 7. Использовали опухоль Эрлиха, опухоль Кребс-2 и лимфосаркому. В Эксперименте 6 была проведена предварительная иммунизация опухолевыми АГ - мышам подкожно было введено 20×10 опухолевых клеток, инактивированных многократным замораживанием/оттаиванием.
3
Измеренные с помощью штангенциркуля 3 перпендикулярных диаметра опухоли перемножали и таким образом следили за изменением роста опухоли (см).
Остановимся на угнетении роста экспериментальных опухолей при различных схемах введения ЦФ и экзогенной ДНК.
В настоящей работе мы оценили влияние совместного введения цитостатика ЦФ и препаратов экзогенной фрагментированной дцДНК на рост экспериментальных опухолей мышей. В начальной фазе экспериментов были выбраны принципиальные параметры схем введения ЦФ, экзогенной ДНК и прививки опухоли. При выборе мы руководствовались следующими причинами. В первую очередь нам необходимо было определить активирующее действие экзогенной ДНК на иммунную систему. В этой связи все обработки проводились до прививки опухоли. Кроме того, ранее было установлено, что инъекции экзогенной ДНК в непосредственной близи от момента введения ЦФ (30-60 мин до или после) не оказывают статистически достоверного влияния на торможение роста опухоли [29, 30]. Эффективное замедление развития перевиваемой опухоли обнаруживалось при введении ДНК через больший промежуток времени после инъекции ЦФ (1-5 дней после введения ЦФ). Было также показано, что несколько инъекций экзогенной ДНК на протяжении 1-5 дней после обработки ЦФ действует более эффективно на торможение роста опухолей [29, 30].
Принимая во внимание указанные параметры, мы выбрали общую схему активации иммунной системы экспериментальных животных, включающую инъекцию ЦФ, введение препарата экзогенной ДНК и прививку опухоли через различные промежутки времени.
Рассмотрим влияние на рост опухолей различных схем введения ЦФ и экзогенной фрагментированной дцДНК.
Первоначально мы оценили влияние предварительного (до прививки) многократного введения мышам фрагментированной ДНК человека на рост внутримышечных трансплантатов опухоли Эрлиха (Эксперимент 1). Как следует из фиг.1, достоверного влияния на рост опухоли Эрлиха указанная обработка мышей не оказывает (р>0.05, п=10).
В проведенных далее экспериментах были использованы различные варианты введения ЦФ в сочетании с введением фрагментированной экзогенной ДНК человека и мыши.
На фиг.2 приведены три схемы введения цитостатика и экзогенной ДНК (Эксперимент 2).
Как следует из анализа графика, отражающего влияние экзогенной ДНК на прогрессию перевитой опухоли Кребс 2, наиболее сильное тормозящее действие обнаруживалось при использовании 1-й схемы введения (р<0.001, п=10). В этом случае было проведено 2 инъекции ЦФ в сочетании с инъекциями ДНК через указанные промежутки времени и прививкой опухоли через 3 недели - 1.5 месяца (эксперимент повторен несколько раз) после последней инъекции ДНК. Примечательно, что аналогичная обработка мышей (схема 2), отличающаяся тем, что после прививки опухоли дополнительно были проведены четыре инъекции экзогенной ДНК, полностью отменяет тормозящее действие проведенной терапии в режиме схемы 1 и индуцирует прогрессию графта. Мы полагаем, что ко времени повторных инъекций экзогенной ДНК было восстановлено количество и функции супрессоров иммунитета Tregs. Инъекциями экзогенной ДНК было простимулировано уже это направление адаптивного иммунитета, что и привело к супрессии первоначально активированного иммунного ответа и прогрессии развития опухоли.
Четырехкратное введение препарата экзогенной ДНК в режиме «только после прививки опухоли» (схема 3) оказывает статистически достоверное, но менее выраженное, чем при введении согласно схеме 1, тормозящее действие на рост опухоли Кребс 2 (р<0.05, n=10).
Известно, что в промежутках времени между 18 и 30 часами после введения ЦФ в организме животных начинается и заканчивается фаза репаративного процесса МЦС, возникающих в результате действия цитостатика, когда фрагменты экзогенной ДНК человека, как предполагается, способны масштабно интегрировать в геном экспериментальных мышей. Такая интеграция приводит к летальному исходу большинства экспериментальных животных [31]. Чтобы оценить влияние этого эффекта на синергизм действия двух препаратов, мы провели Эксперимент 3 с использованием другой схемы введения цитостатика и ДНК (схема 4) (фиг.3). Было использовано дробное многократное введение препарата ДНК человека мышам через различные промежутки времени после инъекции ЦФ: в течение 12 часов ежечасно сразу после введения ЦФ и ежечасно в течение 6 часов в промежутках времени 13-18; 19-24; 25-30; 31-36 ч после введения ЦФ.
Таблица 1
Средняя продолжительность жизни мышей в Эксперименте 3. Значения представляют среднее ±SEM (n=6).
Группа
Продолжительность жизни, сут.
контроль
18,7±0,8
1
22,1±1,2
2
18,2±1,4
3
19,0±1,1
4
16,4±0,2
5
24,2±2,0
Обнаружилось, что у первой и пятой групп экспериментальных животных (1-13 и 31-36 ч после введения ЦФ) продолжительность жизни была достоверно выше относительно контрольной группы (р<0.05, n=6) (Таблица 1). Также выявлено, что продолжительность жизни мышей четвертой группы (25-30 ч) была на 12% ниже, чем в контрольной группе (р>0.05, n=6). Мы полагаем, что сокращение продолжительности жизни после проведенных процедур на данном временном отрезке связано с наложением друг на друга последствий двух явлений: первое - масштабной интеграции фрагментов экзогенной ДНК в геном экспериментальных животных и связанной с этим раскоординацией основных жизненных систем организма, приводящей к гибели экспериментальных животных; второе - развития болезни, завершающейся гибелью организма.
Увеличение продолжительности жизни экспериментальных животных в группах 1 и 5 мы связываем с тем, что на первом временном отрезке репаративный процесс еще не начался, а на последнем уже закончился, и, таким образом, интеграции экзогенной ДНК не произошло. При этом становится заметным эффект активации молекулами ДНК ДК и развития адаптивного иммунного ответа на развивающуюся опухоль, что приводит к торможению роста опухоли и статистически достоверному увеличению продолжительности жизни мышей (р<0.05, n=6).
Можно отметить, что указанная схема введения препаратов принципиально не отличается от основной, приведенной в начале раздела. Также результаты этой серии экспериментов свидетельствуют о том, что эффект торможения роста перевитой опухоли при таких схемах введения сохраняется и его эффективность сравнима с результатами, полученными при использовании схемы 1.
В рамках схемы 4 было оценено тормозящее действие экзогенной ДНК при многократном ежечасном и однократном почасовом введении препарата ДНК на протяжении 12 часов после инъекции ЦФ (данные не приводятся). Полученные результаты свидетельствуют о том, что многократное введение препарата ДНК на отрезке времени 0-12 ч после инъекции ЦФ приводит к торможению роста опухоли. И наоборот, однократное в различные часы после инъекции ЦФ на протяжении 1-12 ч введение экзогенной ДНК не обладает тормозящим действием на рост опухоли Кребс 2.
Анализ дозы препарата экзогенной дцДНК (Эксперимент 4, фиг.4) свидетельствует о том, что доза 10-100 мкг/мышь оказывает более сильное тормозящее действие на рост опухоли (р<0.005, n=7), тогда как доза 1 мкг/мышь подавляет рост опухоли, но статистически недостоверно (р>0.05, n=7). В этом эксперименте использовалась аллогенная ДНК мышей линии СВА (Таблица 2).
Таблица 2
Средняя продолжительность жизни мышей в Эксперименте 4. Значения представляют среднее ±SEM (n=7).
Группа
Продолжительность жизни, сут
контроль
18,7±0,8
1
25,0±3,4
2
23,1±2,0
Рассмотрим влияние экзогенной ДНК, полученной из различных организмов, на рост опухолей на фоне терапии ЦФ.
В Эксперименте 5 был проанализирован эффект воздействия экзогенной ДНК на рост экспериментальной опухоли в зависимости от ее видового происхождения. Для оценки была выбрана схема 4 совместного применения цитостатика и терапевтической дцДНК. Полученные результаты демонстрируют тот факт, что ксеногенная ДНК человека в сочетании с инъекцией ЦФ обладает статистически достоверным наиболее сильным тормозящим действием на развитие перевитой опухоли (р<0.005, п=6) по сравнению с аллогенной ДНК мышей СВА (р<0.05, п=6) и дальнородственной ДНК, выделенной из спермы лосося (р<0.05, п=6) (фиг.5).
Рассмотрим эффективность иммунизации при последовательной обработке ЦФ и экзогенной фрагментированной геномной дцДНК.
Выявленный эффект тормозящего действия инъекции ЦФ и экзогенной ДНК на рост опухолей, перевитых через 1-2 месяца после совместной терапии обоими препаратами, мог свидетельствовать о том, что за это время происходит активация специфического звена иммунной системы, индуцирующего адаптивный иммунный ответ в направлении развития Т8+цитотоксических лимфоцитов. Такая гипотеза предполагала, что дополнительная иммунизация иммуногенным гомогенатом клеток опухоли, которая будет перевита иммунизированной мышке после обработки ЦФ и экзогенной ДНК, еще в большей степени усилит эффект торможения роста перевитого графта (Эксперимент 6, фиг.6).
Сравнение размеров опухолей Кребс 2, перевитых по схеме 1 (Эксперимент 2), и аналогично, но с дополнительной иммунизацией в промежутке между последней инъекцией ДНК и прививкой графта (Эксперимент 6), демонстрирует усиление иммунизацией эффекта торможения развивающейся опухоли (фиг.7).
Рассмотрим влияние различных доз и сочетания циклофосфана, протамина и экзогенной ДНК на рост экспериментальной опухоли мыши Кребс-2.
Нами было обнаружено, что гистоноподобный белок протамин защищает фрагменты экзогенной ДНК от действия нуклеаз крови и при этом не влияет на тормозящее рост экспериментальной опухоли действие экзогенной ДНК (Эксперимент 7). Используя сочетание инъекций ЦФ и ДНК человека, защищенной протамином и не ассоциированной с протамином, установлено, что наибольшим тормозящим эффектом на рост опухоли Кребс-2 оказывает доза ЦФ 20 мг/кг и последующее введение экзогенной ДНК человека. Подопытным животным были введены дозы ЦФ 20 и 200 мг/кг, а на 1, 3, 4 и 5 сутки после этого вводился препарат фрагментированной геномной человеческой ДНК, защищенный протамином в соотношении 1:1 в количестве 50 мкг на мышь и незащищенный протамином - 200 мкг на мышь. Через неделю после обработки цитостатиком была привита опухоль. Было обнаружено, что при дозе ЦФ 200 мг/кг происходит стимуляция роста опухоли, независимо от режима иммунизации - ДНК или ДНК в комбинации с протамином. При дозе ЦФ 20 мг/кг наблюдается подавление роста опухоли. Введение экзогенной ДНК, защищенной протамином, давало незначительное замедление роста опухоли. Инъекции чистого препарата ДНК приводили к заметной супрессии роста опухоли - торможение роста опухоли составляло ~73% (фиг.8).
Рассмотрим влияние препарата экзогенной ДНК на изменение количества периферических моноцитов крови у здоровых добровольцев, участвующих в Фазе I клинических испытаний препарата фрагментированной ДНК человека (препарат «Панаген»).
Исследование препарата фрагментированной ДНК человека «Панаген» в Фазе I клинических испытаний показало, что доза препарата 5 мг при приеме 6 раз в сутки стимулирует пролиферацию СКК в направлении моноцитарного ряда лимфоцитов, которые являются предшественниками антигенпрезентирующих макрофагов и дендритных клеток (Таблица 3, фиг.9).
Таблица 3
Изменение количества моноцитов (% от общего лейкоцитов) у 5 добровольцев, принимавших по 30 мг препарата Панаген в сутки
Добровольцы
До введения
Время после начала приема препарата, сут
3
7
10
14
17
21
24
28
30
1
3
8.4
5
5
2
4
6
8
7
7
2
2.9
7.8
8
8
8
5.5
3
2
3
5
3
2.3
13.9
7
9
11
13
15
10
14
-
4
1.3
7
3
1
5
4.5
4
3
5
5
5
2.2
2.65
3.1
7
7
7
7
7
9
11
Среднее
2.3
8.0
5.2
6.0
6.6
7.5
7.0
6.0
7.6
7.0
Рассмотрим феномен торможения роста экспериментальных опухолей при введении в организм цитостатика циклофосфана в сочетании с фрагментированной геномной экзогенной аллогенной двуцепочечной ДНК.
Результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что экзогенная ДНК, введенная в организм экспериментальных мышей в сочетании с кросслинкирующим цитостатиком ЦФ, приводит к торможению роста экспериментальных опухолей мыши. Как следует из результатов нашей недавней работы [неопубликованные данные], проведенной параллельно с обсуждаемой, отмеченное свойство экзогенной ДНК связано с активацией и созреванием ДК и индукцией Т-цитотоксического направления адаптивного иммунитета.
В современной литературе уделено большое внимания экспериментам, направленным на понимание процесса синергичного тормозящего воздействия на развитие опухолей цитостатиков и так называемых иммуномодулирующих ДНК, к которым относятся CpG ДНК с нормальным сахарофофатным остовом и олигонуклеотиды с сахарофосфоротиоатным остовом молекулы. Во всех работах синергичное действие двух препаратов связывают с активацией либо врожденного, но чаще адаптивного иммунного ответа против развивающейся опухолевой ткани. Так в работе [33] было исследовано влияние совместной терапии цитостатика доксорубицина и ИО (CpG) на развитие ксенографта опухоли поджелудочной железы человека в поджелудочной железе экспериментальных атимусных мышей. Известно, что CpG действует как РАМР и стимулирует TLR9 позитивные клетки к выработке и секреции большого количества цитокинов и хемокинов, таких как IL-10, IL-22, γINF, NFa, IL-12. Любые клетки, если они несут TLR9, в состоянии активировать при воздействии индуктора (CpG) врожденный иммунитет. Было обнаружено, что клетки поджелудочной железы синтезируют большое количество TLR9. Как следует из полученных результатов, ИО взаимодействует с TLR9 клеток поджелудочной железы и стимулирует эти клетки к выбросу цитокинов, которые, в свою очередь, стимулируют макрофагов и НК к атаке на клетки опухоли. Проведенная совместная терапия доксорубицином и ИО увеличивает продолжительность жизни экспериментальных мышей в два раза.
В работе [1] были изучены свойство ИО при совместном применении с цитостатиком индуцировать секрецию специфических цитокинов и тем самым влиять на активацию адаптивного иммунитета в направлении пролиферации Т8+ цитотоксических лимфоцитов. Показано, что при совместной терапии происходит выброс IL12, INFγ, что усиливает литическую активность НК и приводит к прямой активации ДК.
В другой работе [24] было исследовано свойства ИО при совместном применении с цитостатиком ЦФ влиять на активацию Т CD8+адаптивного иммунитета. Показано, что ЦФ усиливает адаптивный иммунный ответ синергично с DEX (экзосомы ДК) и ИО и эффективно воздействующий на привитую опухоль. CD8+ и CD4+ ответственны за противораковый эффект при указанной терапии. Установлено, что обработка ЦФ приводит к потере Tregs их супрессорной функции по отношению к Т-цитотоксическому иммунитету.
Известно, что опухоль индуцирует быстрый захват Tregs и это ведет к ингибированию адаптивного иммунитета и, как следствие, ускользанию опухоли от иммунологического надзора [34-36]. В крови наивных мышей количество супрессорных Tregs составляет 1-3% от общей массы CD4+. Блокирование функции или миграции Tregs помогло бы помочь в регрессии опухоли за счет проявившегося иммунитета. Известно, что ЦФ определяет и создает условия для адаптивной иммунотерапии [14, 15, 17, 18, 34, 37, 38]. Применение невысоких доз ЦФ (20 мг/кг) приводит к дифференцированному угнетению различных групп Т-лимфоцитов, и существует промежуток времени, когда соотношение Т8+и Tregs на два порядка отличается в сторону Т-киллеров [23]. Разница в степени угнетения и скорости восстановления Т8+и Tregs лимфоцитов имеет важное для терапии опухолей значение. В это время опухоль становится доступной для ее обнаружения несупрессированной иммунной системой. ДК представляют опухолевые АГ и сохраненные Т8+лимфоциты, не подвергающиеся давлению цитокинов, вырабатываемых Tregs, осуществляют свою киллерную функцию на клетки развивающейся опухоли. Для малых доз ЦФ это время соответствует 7-14 дням после инъекции ЦФ.
2+
Удивительный феномен описан в работе [39, 40] и связан с изменением иммуногенности раковых клеток при воздействии определенных цитостатиков. Проанализировав 20 различных цитостатиков на предмет иммуногенности погибших раковых клеток после цитостатической обработки, авторы обнаружили, что цитостатики антрациклинового ряда (доксорубицин, идарубицин, митоксантрон), а также γ-облучение, приводят к формированию в высшей степени иммуногенного клеточного дебриса. Дальнейший анализ такого явления выявил тот факт, что указанные цитостатики индуцируют экспозицию на внешней части цитоплазматической мембраны раковой клетки калритикулина, находящегося до этого на эндоплазматическоретикулярной люмине. Калретикулин представляет собой Са связанный лектиновый шаперон. При обработке антрациклины индуцируют практически мгновенную экспозицию ретикулярного калретикулина на мембране (через несколько минут после добавления цитостатика). Калретикулин является сигналом (eat me) для фагоцитирующих клеток к поглощению везикул, на мембране которых находится белок. Преапоптотическая экспозиция калретикулина на поверхности погибающей клетки в высокой степени коррелирует с иммуногенностью постклеточного апоптотического материала. Калретикулин делает клетки иммуногенными в результате следующих обстоятельств. Один из главных моментов стимуляции Т-цитотоксического клеточного ответа - это поглощение незрелыми ДК иммуногенного клеточного материала. Далее происходит созревание ДК (которое по нашим данным стимулируется фрагментированной экзогенной геномной дц ДНК), в результате чего процессированные АГ опухоли представляются на поверхности ДК в составе MHCI класса молекул. Калретикулин стимулирует ДК к поглощению клеточного дебриса, что делает его иммуногенным. Блокирование калретикулина приводит к потере дендритными клетками способности опознавать такой клеточный материал, как in vitro, так и in vivo. Однако калретикулин никак не действует на созревание и активацию ДК. Это может сделать экзогенная дц ДНК в тот момент, когда ДК поглотила иммуногенный дебрис.
В проанализированных работах использовалась схема, когда первоначально проводилась прививка опухоли, и после ее стабилизации экспериментальные животные получали ЦФ. Раковым клеткам позволяли погибнуть в течение нескольких дней после воздействия цитостатика [41]. Считается, что в это время ДК поглощали апоптозные тельца погибших раковых клеток или ДНК в другой форме, появляющейся в результате лизиса раковых клеток. Вместе с этим проводилась стимуляция адаптивного иммунного ответа ИО по CD8+Т пути, что приводило к активной презентации раковых АГ и пролиферации вновь обученных лимфоцитов. Были определены некоторые принципиальные для терапии опухоли элементы совместного применения двух препаратов - цитостатика и ИО ДНК.
- Показано, что при указанной совместной терапии торможение роста опухоли связано с активацией врожденного и адаптивного иммунитета [1, 24, 33, 41].
- Определено, что этот эффект определяется воздействием цитостатика, когда нарушается баланс в пользу Т-эффекторных клеток, но не Tregs [23]. Одновременно цитостатик воздействует таким образом, что CD4+CD25+Tregs теряют свою ингибирующую адаптивный противораковый иммунитет функцию [14, 20, 23-25].
- Показано, что в некоторых случаях ИО ДНК воздействует на опухолевые клетки или прямо, или через механизм врожденного иммунитета, не зависимо от активированной адаптивной иммунной системы [33, 42].
- Установлено, что экспозиция калретикулина на поверхности раковых клеток вследствие воздействия антрациклинов приводит к образованию иммуногенного клеточного дебриса, что является важным условием формирования адаптивного противоракового иммунного ответа [39, 40].
В своих экспериментах мы использовали иную схему, в которой первоначально проводилась обработка экспериментальных животных комбинацией цитостатика ЦФ и препарата фрагментированной дцДНК человека. После этого перевивалась экспериментальная опухоль. Мы обнаружили, что при такой схеме применения двух препаратов также происходит заметное торможение роста опухоли при достаточно большом количестве перевиваемых клеток. Как было недавно обнаружено в другой нашей работе [неопубликованные данные], мы определили, что препарат используемой дцДНК активирует ДК в системе ex vivo, индуцирует их созревание и аллостимуляторную активность. Мы полагаем, что торможение роста экспериментальных опухолей связано с активацией именно этого звена иммунной системы.
В проведенной работе мы во всех экспериментах использовали стандартные терапевтические дозы ЦФ (200 мг/кг). Как следует из результатов настоящего исследования, во всех экспериментах проявлялся эффект торможения прогрессии опухоли, который мы связываем с активацией введением экзогенной ДНК ДК и, как следствие, индукцией адаптивного иммунитета. Поскольку указанные дозы ЦФ полностью элиминируют как CD8+Т лимфоциты, так и Tregs, по-видимому, экзогенная ДНК активирует ДК таким образом, что в этих условиях происходит преимущественная индукция Т-цитотоксического адаптивного иммунного ответа, но не супрессивного, связанного с активностью Tregs. Это предполагает, что при терапии опухолей сочетанием цитостатика и экзогенной ДНК можно не уменьшать терапевтические дозы цитостатика в ожидании селективного ингибирования двух типов лимфоцитов, а использовать принятые в практике дозы ЦФ и в определенный момент времени индуцировать адаптивный иммунный ответ введением препарата экзогенной дцДНК.
Как следует из анализа полученных результатов, специфическое воздействие на адаптивное звено иммунной системы экзогенная ДНК оказывает в промежуток времени 1-5 суток после инъекции кросслинкирующего цитостатика ЦФ. Далее идет активация адаптивного иммунитета и развитие деструктивного эффекта, что приводит к торможению роста привитой опухоли. Промежуток времени 1-2 месяца после последней инъекции препарата экзогенной ДНК перед прививкой графта был выбран эмпирически. Возможно, существуют более оптимальные сроки, когда тормозящее развитие, регрессирующее действие на опухоль будет наиболее сильным.
Мы полагаем, что предварительная обработка ЦФ и экзогенной ДНК формирует Т-лимфоцитарный фон, где преобладают Т-эффекторные лимфоциты, и что активация ДК экзогенной ДНК после миелосупрессии, вызванной ЦФ, идет по пути индукции пролиферации именно Т-цитотоксических лимфоцитов, но не Т-супрессорных клеток. Это предполагает следующую схему воздействия. ЦФ полностью элиминирует популяции как CD8+Т клетки, так и Tregs из кровяного русла и в последующем ингибирует супрессорную функцию Tregs [24]. Инъекции экзогенной ДНК воздействуют на ДК так, что в них активируется молекулярные механизмы продукции цитокинов, направляющих развитие адаптивного иммунного ответа по Тх1 пути с преимущественной пролиферацией Т-киллерных лимфоцитов. Этот феномен позволяет, не уменьшая терапевтических узаконенных доз цитостатика ЦФ, тем не менее направлять адаптивный иммунный ответ не в сторону развития супрессоров, а в сторону развития эффекторных клеток. Дополнительная обработка регрессирующей опухоли цитостатиками антрациклинового ряда будет индуцировать выход калретикулина на поверхность раковых клеток. Это будет приводить к многократному усилению иммуногенности опухоли и позволит спасенной и усиленной иммунной системе в виде CD8+Т киллеров активно деструктировать возникшие микрометастазы и сохранившиеся стволовые раковые клетки.
Проведенная Фаза I клинических испытаний препарата фрагментированной ДНК человека демонстрирует факт многократного увеличения количества моноцитов, которые являются предшественниками макрофагов и ДК и представляют собой клетки, формирующие адаптивный иммунный ответ (фиг.9). По всей видимости, далее экзогенная ДНК будет стимулировать созревание амплифицированного пула моноцитов в зрелые дендритные клетки, которые будут формировать развитие адаптивного иммунного противоракового ответа. Сочетание такого воздействия препарата экзогенной ДНК и описанных выше обработок ЦФ и цитостатиками анрациклинового ряда могут составить новую стратегию в лечении онкологических заболеваний.