КАТИОННЫЙ ЛИПИД
CATIONIC LIPID

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Настоящее изобретение относится к новому катионному липиду.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
in vivo
[0002] Нуклеиновые кислоты, такие как векторы экспрессии и антисмысловые олигонуклеотиды siRNA (малая интерферирующая РНК), miRNA (микро-РНК) и shRNA (короткая шпилечная РНК или малая шпилечная РНК) индуцируют специфический в отношении последовательности сайленсинг генов  и известны как олигонуклеотидные терапевтические средства.
[0003] Среди олигонуклеотидных терапевтических средств особое внимание уделяют siRNA. siRNA представляют собой двухнитевые РНК, состоящие из 19-23 пар оснований, и индуцируют специфический в отношении последовательности сайленсинг генов под названием РНК-интерференция (RNAi).
[0004] siRNA являются химически стабильными, однако при применениях siRNA в терапевтических целях возникают такие проблемы, как их подверженность к расщеплению РНКазой (рибонуклеазой) в плазме и низкая вероятность их самостоятельного прохождения через клеточную мембрану (например, см. патентный литературный источник 1).
[0005] С целью решить вышеуказанные проблемы обнаружили, что путем инкапсулирования siRNA внутри тонкодисперсной частицы, содержащей катионный липид, заключенная в полость siRNA защищается от разложения в плазме крови и может проникать через липофильную клеточную мембрану (например, см. патентный литературный источник 1).
[0006] В патентных литературных источниках 2-5 раскрываются катионные липиды, которые применяют для доставки олигонуклеотидных терапевтических средств, таких как siRNA, и которые характеризуются улучшенной биоразлагаемостью.
[0007] Тонкодисперсные частицы, содержащие катионные липиды, характеризуются проблемой со стабильностью, которая заключается в том, что частицы склонны к агрегации во время хранения, и известен способ предупреждения агрегации путем добавления модифицированных полиэтиленгликолем липидов (PEG-липидов) к тонкодисперсным частицам. Более того, в патентном литературном источнике 6 раскрывается способ предупреждения агрегации и повышения эффективности доставки нуклеиновых кислот путем придания определенной конфигурации тонкодисперсным частицам, которые содержат конкретный PEG-липид, представляющий собой PEG-DPG, и препарат, который содержит тонкодисперсные частицы и деионизированный растворитель.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПАТЕНТНЫЕ ЛИТЕРАТУРНЫЕ ИСТОЧНИКИ
[0008]
Патентный литературный источник 1: WO 2010/144740
Патентный литературный источник 2: WO 2011/153493
Патентный литературный источник 3: WO 2013/086354
Патентный литературный источник 4: WO 2013/158579
Патентный литературный источник 5: WO 2015/095346
Патентный литературный источник 6: WO 2014/089239
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА
[0009] Однако, несмотря на последние достижения, до сих пор остается потребность в катионном липиде, который можно применять для доставки нуклеиновых кислот в цитоплазму.
РЕШЕНИЕ ЗАДАЧИ
[0010] Настоящее изобретение относится к пунктам [1]-[15], представленным ниже.
[0011] [1] Соединение, представленное формулой (1a) ниже, или его фармацевтически приемлемая соль:
1
2
1
2
1
где L и L независимо представляют собой алкиленовую группу, содержащую от 3 до 10 атомов углерода; R и R независимо представляют собой алкильную группу, содержащую от 4 до 22 атомов углерода, или алкенильную группу, содержащую от 4 до 22 атомов углерода; X представляет собой одинарную связь или -CO-O-; и кольцо P представлено любой из формул (P-1) -(P-5) ниже:
3
где R представляет собой алкильную группу, содержащую от 1 до 3 атомов углерода.
[2] Соединение согласно пункту [1], представленное формулой (1) ниже, или его фармацевтически приемлемая соль:
1
2
1
2
1
где L и L независимо представляют собой алкиленовую группу, содержащую от 3 до 10 атомов углерода; R и R независимо представляют собой алкильную группу, содержащую от 4 до 22 атомов углерода, или алкенильную группу, содержащую от 4 до 22 атомов углерода; и X представляет собой одинарную связь или -CO-O-.
[0012] [3] Соединение согласно пункту [1] или пункту [2], выбранное из группы, состоящей из соединений, представленных формулами (A1)-(A22) ниже, или его фармацевтически приемлемая соль.
[0013] [3a] Соединение согласно пункту [3], выбранное из группы, состоящей из соединений, представленных формулами (A1), (A2), (A3), (A4), (A5), (A9), (A12), (A15), (A16), (A17), (A19), (A20) и (A22) выше, или его фармацевтически приемлемая соль.
[3b] Соединение согласно пункту [3], выбранное из группы, состоящей из соединений, представленных формулами (A1), (A2), (A3), (A4), (A5), (A9), (A12), (A15) и (A20) выше, или его фармацевтически приемлемая соль.
[3c] Соединение согласно пункту [3], выбранное из группы, состоящей из соединений, представленных формулами (A1)-(A5) выше, или его фармацевтически приемлемая соль.
[3d] Соединение согласно пункту [3], выбранное из группы, состоящей из соединений, представленных формулами (A6)-(A8) выше, или его фармацевтически приемлемая соль.
[0014] [4] Соединение согласно любому из пунктов [1]-[3], представленное формулой (A1) ниже, или его фармацевтически приемлемая соль.
[0015] [5] Соединение согласно любому из пунктов [1]-[3], представленное формулой (A2) ниже, или его фармацевтически приемлемая соль.
[0016] [6] Соединение согласно любому из пунктов [1]-[3], представленное формулой (A3) ниже, или его фармацевтически приемлемая соль.
[0017] [7] Соединение согласно любому из пунктов [1]-[3], представленное формулой (A4) ниже, или его фармацевтически приемлемая соль.
[0018] [8] Соединение согласно любому из пунктов [1]-[3], представленное формулой (A5) ниже, или его фармацевтически приемлемая соль.
[0019] [9] Соединение согласно любому из пунктов [1]-[3], представленное формулой (A9) ниже, или его фармацевтически приемлемая соль.
[0020] [10] Соединение согласно любому из пунктов [1]-[3], представленное формулой (A12) ниже, или его фармацевтически приемлемая соль.
[0021] [11] Соединение согласно любому из пунктов [1]-[3], представленное формулой (A15) ниже, или его фармацевтически приемлемая соль.
[0022] [12] Соединение согласно любому из пунктов [1]-[3], представленное формулой (A20) ниже, или его фармацевтически приемлемая соль.
[0023] [13] Липидный комплекс, содержащий: (I) соединение согласно любому из пунктов [1]-[12] или его фармацевтически приемлемую соль и (II) по меньшей мере один липид, выбранный из группы, состоящей из нейтрального липида, модифицированного полиэтиленгликолем липида и стерина.
[0024] [14] Композиция, содержащая: (I) соединение согласно любому из пунктов [1]-[12] или его фармацевтически приемлемую соль, (II) по меньшей мере один липид, выбранный из группы, состоящей из нейтрального липида, модифицированного полиэтиленгликолем липида и стерина, и (III) нуклеиновую кислоту.
[0025] [15] Способ получения композиции, который включает: стадию смешивания содержащего полярный органический растворитель водного раствора, содержащего (I) соединение согласно любому из пунктов [1]-[12] или его фармацевтически приемлемую соль и (II) по меньшей мере один липид, выбранный из группы, состоящей из нейтрального липида, модифицированного полиэтиленгликолем липида и стерина, с водным раствором, содержащим (III) нуклеиновую кислоту, с получением смешанного раствора; и стадию уменьшения процентного содержания полярного органического растворителя в смешанном растворе.
ЭФФЕКТ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0026] Катионный липид по настоящему изобретению оказывает один или несколько эффектов, указанных ниже:
(1) катионный липид по настоящему изобретению обеспечивает эффективное высвобождение нуклеиновых кислот в цитоплазму;
(2) катионный липид по настоящему изобретению может предупреждать увеличение диаметра частиц липидного комплекса при хранении в течение определенного периода времени.
Следовательно, катионный липид по настоящему изобретению можно использовать в качестве липида, применяемого для доставки нуклеиновой кислоты в цитоплазму.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0027]
[Фигура 1] На фигуре 1 представлен график, иллюстрирующий результат тестового примера 1.
[Фигура 2] На фигуре 2 представлен график, иллюстрирующий результат тестового примера 2.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0028] Настоящее изобретение подробно описано далее в данном документе посредством рассмотрения вариантов осуществления и примеров. Однако настоящее изобретение не ограничивается описанными ниже вариантами осуществления и примерами и может быть произвольно модифицировано и задействовано в работу в пределах объема, который не отклоняется от идеи настоящего изобретения. Все документы и публикации, приведенные в описании настоящего изобретения, во всей своей полноте включены в данный документ посредством ссылки независимо от их назначения.
[0029] (Катионный липид)
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет собой соединение, представленное формулой (1a) ниже, или его фармацевтически приемлемую соль и может применяться в качестве катионного липида. Катионный липид может представлять собой гидрат соли или сольват соли.
В формуле (1a) кольцо P представлено любой из формул (P-1)-(P-5) ниже.
3
В формулах (P-1)-(P-5) выше R представляет собой алкильную группу, содержащую от 1 до 3 атомов углерода.
[0030] В одном варианте осуществления кольцо P представлено любой из формулы (P-1), формул (P-2), (P-4) и (P-5).
В одном варианте осуществления кольцо P представлено формулой (P-1).
[0031] В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет собой соединение, представленное формулой (1) ниже, или его фармацевтически приемлемую соль и может применяться в качестве катионного липида. Катионный липид может представлять собой гидрат соли или сольват соли.
[0032]
1
2
1
2
1
[0033] В формуле (1a) и формуле (1) L и L независимо представляют собой алкиленовую группу, содержащую от 3 до 10 атомов углерода; R и R независимо представляют собой алкильную группу, содержащую от 4 до 22 атомов углерода, или алкенильную группу, содержащую от 4 до 22 атомов углерода; и X представляет собой одинарную связь или -CO-O-.
[0034] Применяемый в данном документе «алкил» означает линейную, циклическую или разветвленную насыщенную алифатическую углеводородную группу, содержащую указанное число атомов углерода.
Применяемый в данном документе «алкенил» означает линейную или разветвленную углеводородную группу, содержащую указанное число атомов углерода и по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь. Его примеры включают моноены, диены, триены и тетраены; однако данный термин ими не ограничивается.
Применяемый в данном документе «алкилен» означает линейную, циклическую или разветвленную двухвалентную насыщенную алифатическую углеводородную группу, содержащую указанное число атомов углерода.
Применяемый в данном документе «галоген» означает F, Cl, Br или I.
1
2
1
2
1
[0035] Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой соединение, представленное формулой (1a) или формулой (1) выше, где L и L независимо представляют собой алкиленовую группу, содержащую от 3 до 10 атомов углерода (например, от 5 до 10 атомов углерода или от 3 до 8 атомов углерода); R и R независимо представляют собой алкильную группу, содержащую от 4 до 18 атомов углерода, или алкенильную группу, содержащую от 4 до 18 атомов углерода; и X представляет собой одинарную связь или -CO-O-, или его фармацевтически приемлемую соль и может применяться в качестве катионного липида. Катионный липид может представлять собой гидрат соли или сольват соли.
1
2
1
2
1
[0036] Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой соединение, представленное формулой (1a) или формулой (1) выше, где L и L независимо представляют собой линейную алкиленовую группу, содержащую от 3 до 10 атомов углерода (например, от 5 до 10 атомов углерода или от 3 до 8 атомов углерода); R и R независимо представляют собой линейную или разветвленную алкильную группу, содержащую от 4 до 18 атомов углерода, или линейную алкенильную группу, содержащую от 4 до 18 атомов углерода; и X представляет собой -CO-O-, или его фармацевтически приемлемую соль и может применяться в качестве катионного липида. Катионный липид может представлять собой гидрат соли или сольват соли.
Следовательно, один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой соединение, представленное формулой (1b) ниже, или его фармацевтически приемлемую соль.
1
2
В формуле (1b) R и R независимо представляют собой алкильную группу, содержащую от 4 до 22 атомов углерода, или алкенильную группу, содержащую от 4 до 22 атомов углерода, предпочтительно линейную или разветвленную алкильную группу, содержащую от 4 до 18 атомов углерода, или линейную алкенильную группу, содержащую от 4 до 18 атомов углерода; и n1 и n2 независимо равняются целому числу от 3 до 10 (например, от 5 до 10 или от 3 до 8).
1
1
2
1
2
[0037] В одном варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение представляет собой соединение формулы (1a) или формулы (1) выше, где X представляет собой -CO-O-; L является таким же, как L; и R является таким же, как R, или его фармацевтически приемлемую соль и может применяться в качестве катионного липида. Катионный липид может представлять собой гидрат соли или сольват соли.
1
2
1
2
1
2
2
[0038] В одном варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение представляет собой соединение формулы (1a) или формулы (1) выше, где L и L независимо представляют собой линейную алкиленовую группу, содержащую от 5 до 10 атомов углерода; R представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, содержащую от 4 до 18 атомов углерода, или линейную алкенильную группу, содержащую от 4 до 18 атомов углерода; R представляет собой линейную алкильную группу, содержащую от 4 до 18 атомов углерода; и X представляет собой одинарную связь, или его фармацевтически приемлемую соль. В представленном варианте осуществления общее число атомов углерода L и R составляет предпочтительно от 9 до 12. Соединение в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может применяться в качестве катионного липида. Катионный липид может представлять собой гидрат соли или сольват соли.
Следовательно, один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой соединение, представленное формулой (1c) ниже, или его фармацевтически приемлемую соль.
1
В формуле (1c) R представляет собой алкильную группу, содержащую от 4 до 22 атомов углерода, или алкенильную группу, содержащую от 4 до 22 атомов углерода, предпочтительно линейную или разветвленную алкильную группу, содержащую от 4 до 18 атомов углерода, или линейную алкенильную группу, содержащую от 4 до 18 атомов углерода; n1 равняется целому числу от 3 до 10 (например, от 5 до 10 или от 3 до 8); и n2 равняется целому числу от 8 до 25, предпочтительно от 8 до 11.
[0039] Ниже по тексту приведены примеры соединения согласно варианту осуществления.
[0040] Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой соединение, представленное любой из формул (A1)-(A22) выше, или его фармацевтически приемлемую соль и может применяться в качестве катионного липида. Катионный липид может представлять собой гидрат соли или сольват соли.
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой соединение, представленное любой из формул (A1)-(A5) и (A9)-(A22) выше, или его фармацевтически приемлемую соль и может применяться в качестве катионного липида. Катионный липид может представлять собой гидрат соли или сольват соли.
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой соединение, представленное любой из формул (A1), (A2), (A3), (A4), (A5), (A9), (A12), (A15), (A16), (A17), (A19), (A20) и (A22) выше, или его фармацевтически приемлемую соль и может применяться в качестве катионного липида. Катионный липид может представлять собой гидрат соли или сольват соли.
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой соединение, представленное любой из формул (A1), (A2), (A3), (A4), (A5), (A9), (A12), (A15) и (A20) выше, или его фармацевтически приемлемую соль и может применяться в качестве катионного липида. Катионный липид может представлять собой гидрат соли или сольват соли.
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой соединение, представленное любой из формул (A1), (A2), (A3), (A4) и (A5) выше, или его фармацевтически приемлемую соль и может применяться в качестве катионного липида. Катионный липид может представлять собой гидрат соли или сольват соли.
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой соединение, представленное любой из формул (A6), (A7) и (A8) выше, или его фармацевтически приемлемую соль и может применяться в качестве катионного липида. Катионный липид может представлять собой гидрат соли или сольват соли.
[0041] Применяемый в данном документе «катионный липид» представляет собой амфифильную молекулу, обладающую липофильным участком, содержащим одну или несколько углеводородных групп, и гидрофильным участком, содержащим полярную группу, которая подвергается протонированию при физиологическом уровне pH. А именно, катионный липид по настоящему изобретению может протонироваться с образованием катиона. Например, соединение, представленное формулой (1) выше, охватывает соединение (катион), представленное формулой (1)' ниже, в котором ион водорода координируется с неподеленной парой электронов при атоме азота пиперидинового кольца.
Анион, который может быть включен в катионный липид в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения путем образования пары с катионом, конкретно не ограничен, поскольку анион является фармацевтически приемлемым. Его примеры включают неорганические ионы, такие как хлорид-ион, йодид-ион, нитрат-ион, сульфат-ион и фосфат-ион; ионы органической кислоты, такие как ацетат-ион, оксалат-ион, малеат-ион, фумарат-ион, цитрат-ион, бензоат-ион и метансульфонат-ион, и т.п.
Катионный липид по настоящему изобретению может иметь стереоизомер, такой как геометрический изомер и оптический изомер, или таутомер. Катионный липид по настоящему изобретению охватывает все возможные изомеры, в том числе вышеприведенные, и их смеси.
[0042] (Способ получения катионного липида)
Ниже описывается способ получения катионного липида по настоящему изобретению. Варианты осуществления схемы синтеза катионного липида представлены на формулах (10) и (11) ниже. Все соединения, описанные в настоящем документе, охватываются настоящим изобретением как соединения. Соединение по настоящему изобретению можно синтезировать согласно по меньшей мере одному способу, проиллюстрированному на представленных ниже схемах.
[0043]
1
1
2
1
2
2
1
2
На формуле L и R соответственно являются такими, как определено выше; и R представляет собой -L-X-R (где L, X и R соответственно являются такими, как определено выше) в формуле (1).
1
[0044] Катионный липид формулы (1) (соединение, где X представляет собой одинарную связь) можно синтезировать, например, согласно схеме 1, проиллюстрированной на формуле (10) выше.
(Стадия 1-1: эстерификация)
1
1
Сначала спирт (a1) и галогенированную алкилкарбоновую кислоту X-L-COOH (X представляет собой атом галогена, и L определен выше) (предпочтительно бромированную алкилкарбоновую кислоту) подвергают реакции в присутствии конденсирующего средства с получением галогенированного сложного эфира (a2). Примеры конденсирующего средства включают 1-[3-(диметиламино)пропил]-3-этилкарбодиимида (EDC) гидрохлорид, N,N'-дициклогексилкарбодиимид (DCC) и т.п. Необязательно может быть добавлено основание. Примеры основания включают NMM, TEA, DIPEA, DMAP, пиридин, пиколин, лутидин и т.п. Примеры растворителя включают тетрагидрофуран (THF), метиленхлорид, хлороформ, бензол, гексан, этилацетат и т.п.
(Стадия 1-2: введение алкильной цепи)
После этого галогенированный сложный эфир (a2) и ди-трет-бутилмалонат подвергают реакции в присутствии основания. В ходе реакции атом водорода активного метилена в малоновом сложном диэфире отщепляется с введением алкильной цепи сложного эфира с получением таким образом соединения (a3). Примеры основания включают NaH. Примеры растворителя включают простые эфиры, такие как диоксан, тетрагидрофуран, циклопентил-метиловый простой эфир и 1,2-диметоксиэтан.
(Стадия 1-3: введение алкильной цепи)
После этого соединение (a3) и алкилгалогенид (предпочтительно йодид) подвергают реакции в присутствии основания с введением алкильной цепи с получением таким образом соединения (a4). Основание и растворитель могут быть подобными таковым на стадии 1-2 выше.
(Стадия 1-4: удаление защиты)
После этого из соединения (a4) удаляют защитную трет-бутиловую группу при условиях кислотного гидролиза с получением соединения (a5). Примеры кислоты, применяемой для удаления защиты, включают трифторуксусную кислоту (TFA), хлористоводородную кислоту и т.п. Примеры растворителя включают метиленхлорид и т.п.
(Стадия 1-5: декарбонизация)
После этого получают карбоновую кислоту (a6) путем декарбонизации соединения (a5). Реакцию декарбонизации можно проводить, например, путем нагревания в растворителе. Примеры растворителя включают ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол и ксилол.
(Стадия 1-6: стадия восстановления)
3
Карбоксильную группу соединения (a6) восстанавливают до гидроксильной группы в присутствии восстановителя с получением соединения (a7). Примеры восстановителя включают борановые комплексы, такие как борановый комплекс (BH)-тетрагидрофуран и боран-диметилсульфидный комплекс. Примеры растворителя включают простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, тетрагидрофуран и диоксан; галогенированные углеводороды, такие как хлороформ, метиленхлорид и дихлорэтан; углеводороды, такие как гексан, бензол и толуол; и смешанные растворители на их основе.
(Стадия 1-7: эстерификация)
2
1
2
Полученный спирт (a7) и 1-метилпиперидин-4-карбоновую кислоту или ее производное (галогеноводороды и т.п.) подвергают реакции в присутствии конденсирующего средства и основания с получением конечного продукта, представляющего собой соединение (a8) (R=L-X-R) (соединение, соответствующее катионному липиду формулы (1)). Применяемые конденсирующее средство и основание могут быть подобными таковым на стадии 1-1.
1
[0045] Если синтезируют соединение, где X представляет собой -CO-O-, то соединение, карбоксильная группа которого защищена согласно стадии 2-1, описанной ниже, может быть получено на стадии 1-3 схемы 1 выше, причем соединение можно подвергать реакции с соединением (a3), и наконец, могут быть проведены удаление защиты и эстерификация.
[0046]
1
1
2
1
2
2
1
2
На формуле L и R соответственно являются такими, как определено выше; R представляет собой -L-X-R (L, X и R соответственно являются такими, как определено выше) в формуле (1).
1
На схеме 2 выше проиллюстрирован другой способ синтезирования катионного липида формулы (1) (соединения, где X представляет собой одинарную связь), применяемый специалистом в данной области техники.
(Стадия 2-1: эстерификация)
Сначала бензиловый спирт и галогенированную алкилкарбоновую кислоту конденсируют с получением галогенированного сложного эфира (b1). Условия эстерификации являются такими же, как на стадии 1-1.
(Стадия 2-2: введение алкильной цепи)
После этого, подобно стадии 1-2, галогенированный сложный эфир (b1) и ди-трет-бутилмалонат подвергают реакции в присутствии основания с получением соединения (b2).
(Стадия 2-3: введение алкильной цепи)
После этого, подобно стадии 1-3, соединение (b2) и алкилгалогенид подвергают реакции в присутствии основания с получением соединения (b3).
(Стадия 2-4: удаление защиты)
После этого, подобно стадии 1-4, из соединения (b3) удаляют защитную трет-бутоксикарбонильную группу при условиях кислотного гидролиза с получением соединения (b4).
(Стадия 2-5: декарбонизация)
После этого, подобно стадии 1-5, получают карбоновую кислоту (b5).
(Стадия 2-6: стадия восстановления)
После этого, подобно стадии 1-6, продукт предыдущей стадии восстанавливают в присутствии восстановителя с получением соединения (b6).
(Стадия 2-7: эстерификация)
Полученное соединение (b6) и 1-метилпиперидин-4-карбоновую кислоту или ее производное (галогеноводород и т.п.) подвергают эстерификации в присутствии конденсирующего средства и основания с получением соединения (b7).
(Стадия 2-8: удаление защиты)
После этого при восстановительных условиях удаляют защитную бензильную группу с получением соединения (b8). Удаление защиты можно проводить, например, путем реакции каталитического гидрирования в присутствии металлического катализатора, такого как палладий на угле.
(Стадия 2-9: эстерификация)
1
2
1
2
После этого соединение (b8) можно подвергать реакции со спиртом (ROH) с получением соединения (b9) (R=L-X-R) (соединения, соответствующего катионному липиду формулы (1)).
1
[0047] Если синтезируют соединение, где X представляет собой -CO-O-, то соединение, карбоксильная группа которого защищена согласно стадии 2-1, можно подвергать реакции с соединением (b2) на стадии 2-3 вышеприведенной схемы 2, и на стадии 2-8 с продукта можно удалять защиту.
[0048] Соединение формулы (1a) выше также можно синтезировать согласно схеме 1 или 2 выше. В частности, если кольцо P характеризуется структурой формулы (P-1), (P-4) или (P-5), то карбоновая кислота, соответствующая структуре формулы (P-1), (P-4) или (P-5), может применяться для реакции эстерификации, например, на стадии 1-7 или стадии 2-7, вместо 1-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты. Если кольцо P характеризуется структурой формулы (P-2) или (P-3), то соединение, представленное формулой (1a), можно получать путем проведения вместо стадии 1-7 реакции соединения a7, полученного на стадии 1-6, реагента для карбонилирования (например, сложного эфира хлорформиата, такого как 4-нитрофенилхлорформиат) и N-алкилпиперазина или N-алкилгомопиперазина (соединения, характеризующегося структурой формулы (P-2) или (P-3)) в присутствии основания (см. пример A-8 ниже).
[0049] В синтезе соединения по настоящему изобретению, если получение исходных материалов не описано конкретно, соединения являются известными или могут быть получены согласно аналогичным способам, которые являются общеизвестными в данной области техники или описаны в примерах ниже. Специалисту в данной области техники понятно, что вышеприведенные схемы являются всего лишь типичными способами получения соединения по настоящему изобретению, и могут применяться другие общеизвестные способы.
[0050] При получении соединения по настоящему изобретению введение защиты для функциональной группы молекулы может быть необходимым и/или желательным. Это можно осуществлять с помощью традиционной защитной группы, которая общеизвестной для специалиста в данной области техники. Защитную группу можно удалять согласно общеизвестному способу в данной области техники на любой последующей подходящей стадии. Защитные группы (такие как трет-бутильная защитная группа и бензильная защитная группа), указанные на вышеприведенных схемах, могут быть заменены другими защитными группами, которые являются общеизвестными специалисту в данной области техники.
[0051] (Липидный комплекс)
Настоящее изобретение предусматривает липидный комплекс, содержащий (I) катионный липид, описанный выше, и (II) по меньшей мере один липид, выбранный из группы, состоящей из нейтрального липида, модифицированного полиэтиленгликолем липида и стерина. Липидный комплекс согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения содержит (I) катионный липид, описанный выше, (II) по меньшей мере один липид, выбранный из группы, состоящей из нейтрального липида, модифицированного полиэтиленгликолем липида и стерина, и (III) нуклеиновую кислоту. Таким образом, липидный комплекс по настоящему изобретению может содержать нуклеиновую кислоту или не содержать ее. Липидный комплекс в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения обеспечивает эффективное высвобождение нуклеиновой кислоты в цитоплазму. В липидном комплексе в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения предотвращается увеличение диаметра частиц после хранения в течение определенного периода времени (например, 1 месяц или 3 месяца), и он может проявлять превосходную физическую стабильность.
Примеры формы комплекса, образованного из липида, включающего катионный липид, и нуклеиновой кислоты, включают комплекс нуклеиновой кислоты и мембраны (обратная мицелла), образованной из липидного монослоя (одномолекулярный слой), комплекс нуклеиновой кислоты и липосомы, комплекс нуклеиновой кислоты и мицеллы и т.п. В липидном комплексе согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения нуклеиновую кислоту инкапсулируют внутри тонкодисперсной частицы, образованной с помощью липида, включающего катионный липид.
[0052] Липидный комплекс в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения содержит, исходя из общего содержания липидов в липидном комплексе, катионный липид в количестве, например, от 10% до 100% мольных долей, например, от 20% до 90% мольных долей, например, от 40% до 80% мольных долей. Применяемый катионный липид можно применять сам по себе или в виде смеси двух или более из них.
[0053] Примеры нуклеиновой кислоты включают вектор экспрессии siRNA, miRNA, shRNA, антисмысловой олигонуклеотид, mRNA, рибозим и т.п. В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота может представлять собой siRNA, miRNA или mRNA.
[0054] Липидный комплекс в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения содержит, относительно общего веса липидного комплекса, нуклеиновую кислоту в количестве, например, от 0,01% до 50% по весу, например, от 0,1% до 30% по весу, например, от 1% до 10% по весу.
[0055] Липидный комплекс в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения содержит в качестве липидных компонентов (I) катионный липид и (II) по меньшей мере один липид, выбранный из группы, состоящей из нейтрального липида, модифицированного полиэтиленгликолем липида и стерина. Липидный комплекс в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения содержит, относительно общего веса липидного комплекса, липидные компоненты в количестве, например, от 50% до 100% по весу, например, от 70% до 99,99% по весу, например, от 90% до 99% по весу.
[0056] «Нейтральный липид» означает липид, который находится в незаряженной форме или в виде нейтрального амфотерного иона при физиологическом уровне pH. Примеры нейтрального липида включают диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (POPC), яичный фосфатидилхолин (EPC), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диарахидоилфосфатидилхолин (DAPC), дибегеноилфосфатидилхолин (DBPC), дилигноцероилфосфатидилхолин (DLPC), диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), сфингомиелин, церамид, диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), фосфатидилэтаноламин (POPE), диолеоилфосфатидилэтаноламин-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (DOPE-mal) и т.п. Нейтральный липид можно применять сам по себе или в виде смеси двух или более из них.
[0057] Липидный комплекс в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может содержать, исходя из общего содержания липидов в липидном комплексе, нейтральный липид в количестве, например, от 0% до 50% мольных долей, например, от 0% до 40% мольных долей, например, от 0% до 30% мольных долей.
[0058] Примеры модифицированного полиэтиленгликолем липида включают PEG2000-DMG (PEG2000-димиристилглицерин), PEG2000-DPG (PEG2000-дипальмитоилглицерин), PEG2000-DSG (PEG2000-дистеароилглицерин), PEG5000-DMG (PEG5000-димиристилглицерин), PEG5000-DPG (PEG5000-дипальмитоилглицерин), PEG5000-DSG (PEG5000-дистеароилглицерин), PEG-cDMA (N-[(метоксиполи(этиленгликоль)2000)карбамил]-1,2-димиристилоксилпропил-3-амин), PEG-C-DOMG (R-3-[(ω-метоксиполи(этиленгликоль)2000)карбамоил]-1,2-димиристилоксилпропил-3-амин), полиэтиленгликоль (PEG)-диацилглицерин (DAG), PEG-диалкилоксипропил (DAA), PEG-фосфолипид, PEG-церамид (Cer) и т.п.
[0059] Примеры PEG-диалкилоксипропила включают PEG-дилаурилоксипропил, PEG-димиристилоксипропил, PEG-дипальмитилоксипропил, PEG-дистеарилоксипропил и т.п. Модифицированный полиэтиленгликолем липид можно применять сам по себе или в виде смеси двух или более из них.
[0060] Липидный комплекс в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может содержать, исходя из общего содержания липидов в липидном комплексе, модифицированный полиэтиленгликолем липид в количестве, например, от 0% до 30% мольных долей, например, от 0% до 20% мольных долей, например, от 0% до 10% мольных долей.
[0061] Стерин представляет собой спирт, характеризующийся стероидным каркасом. Примеры стерина включают холестерин, дигидрохолестерин, ланостерин, β-ситостерин, кампестерин, стигмастерин, брассикастерин, эргостерин, фукостерин, 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтил)карбамоил]холестерин (DC-Chol) и т.п. Стерин можно применять сам по себе или в виде смеси двух или более из них.
[0062] Липидный комплекс в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может содержать, исходя из общего содержания липидов в липидном комплексе, стерин в количестве, например, от 0% до 90% мольных долей, например, от 10% до 80% мольных долей, например, от 20% до 50% мольных долей.
[0063] Липидные компоненты в липидном комплексе в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения можно объединять без какого-либо ограничения, и примеры комбинации включают комбинацию вышеописанных катионного липида, нейтрального липида и стерина, комбинацию вышеописанных катионного липида, нейтрального липида, модифицированного полиэтиленгликолем липида и стерина и т.п.
[0064] (Композиция)
В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрена композиция, содержащая (I) катионный липид, (II) по меньшей мере один липид, выбранный из группы, состоящей из вышеописанного нейтрального липида, модифицированного полиэтиленгликолем липида и стерина, и (III) нуклеиновую кислоту. Композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения обеспечивает эффективное высвобождение нуклеиновой кислоты в цитоплазму. Композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может содержать вышеописанный липидный комплекс, фармацевтически приемлемую среду и необязательно другие добавки. Ниже в данном документе описаны фармацевтически приемлемая среда и другие добавки.
[0065] Композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения содержит, исходя из общего содержания липидов в композиции, катионный липид в количестве, например, от 10% до 100% мольных долей, например, от 20% до 90% мольных долей, например, от 40% до 70% мольных долей. Катионный липид можно применять сам по себе или в виде смеси двух или более из них.
[0066] Примеры нуклеиновой кислоты включают описанные выше. Композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения содержит, относительно общего веса композиции, нуклеиновую кислоту в количестве, например, от 0,01% до 50% по весу, например, от 0,1% до 30% по весу, например, от 1% до 10% по весу.
[0067] Композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения содержит в качестве липидных компонентов (I) вышеописанный катионный липид и (II) по меньшей мере один липид, выбранный из группы, состоящей из нейтрального липида, модифицированного полиэтиленгликолем липида и стерина.
[0068] Примеры нейтрального липида включают описанные выше. Композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может содержать, исходя из общего содержания липидов в композиции, нейтральный липид в количестве, например, от 0% до 50% мольных долей, например, от 0% до 40% мольных долей, например, от 0% до 30% мольных долей.
[0069] Примеры модифицированного полиэтиленгликолем липида включает описанные выше. Композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может содержать, исходя из общего содержания липидов в композиции, модифицированный полиэтиленгликолем липид в количестве, например, от 0% до 30% мольных долей, например, от 0% до 20% мольных долей, например, от 0% до 10% мольных долей.
[0070] Примеры стерина включают описанные выше. Композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может содержать, исходя из общего содержания липидов в композиции, стерин в количестве, например, от 0% до 90% мольных долей, например, от 10% до 80% мольных долей, например, от 20% до 50% мольных долей.
[0071] Липидные компоненты в композиции в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения можно объединять без какого-либо ограничения, и их примеры включают комбинацию вышеописанных катионного липида, нейтрального липида и стерина, комбинацию вышеописанных катионного липида, нейтрального липида, модифицированного полиэтиленгликолем липида и стерина и т.п.
[0072] Композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может содержать в качестве других добавок сахариды, такие как сахароза, глюкоза, сорбит и лактоза; аминокислоты, такие как глутамин, глутаминовая кислота, глутамат натрия и гистидин; соли кислот, таких как лимонная кислота, фосфорная кислота, уксусная кислота, молочная кислота, угольная кислота и винная кислота, и т.п.
[0073] Композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может быть составлена в виде фармацевтической композиции. Примеры лекарственной формы фармацевтической композиции включают инъекционный препарат.
[0074] Композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может находиться, например, в порошкообразном состоянии, которого достигают посредством удаления растворителя с помощью сублимации или т.п., или в жидком состоянии. Композиция согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения представляет собой порошкообразную композицию, содержащую липидный комплекс согласно вышеописанному варианту осуществления. Порошкообразную композицию можно получать из композиции в жидком состоянии (дисперсии) посредством удаления растворителя путем, например, фильтрования или центрифугирования, или получать с помощью сублимации дисперсии. Если композиция находится в порошкообразном состоянии, то композицию можно суспендировать или растворять в фармацевтически приемлемой среде перед ее применением в качестве инъекционного препарата. Композиция согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения представляет собой жидкую композицию, содержащую липидный комплекс согласно вышеописанному варианту осуществления и фармацевтически приемлемую среду. Если композиция находится в жидком состоянии, то композицию можно применять непосредственно или в качестве инъекционного препарата после растворения композиции в фармацевтически приемлемой среде.
[0075] Примеры фармацевтически приемлемой среды включают стерильную воду; солевой раствор; изотонические растворы, содержащие вспомогательное вещество, такое как глюкоза, D-сорбит, D-манноза, D-маннит и хлорид натрия; буферы, такие как фосфатный буфер, цитратный буфер и ацетатный буфер; и т.п. Композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может дополнительно содержать добавки, в том числе вспомогательное вещество для растворения, такое как спирты, в том числе этанол, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль, стабилизирующее вещество, антиоксидант, антисептик, среду-носитель, которую обычно применяют при получении лекарственных средств, наполнитель, наполнитель, связывающее средство, смачивающее средство, разрыхлитель, смазывающее вещество, поверхностно-активное вещество, диспергирующее средство, консервант, ароматизирующее средство, успокаивающее средство и т.п.
[0076] Композицию можно вводить пациенту с помощью парентеральных путей введения, таких как внутриартериальная инъекция, внутривенная инъекция и подкожная инъекция. Доза композиции может варьировать в зависимости от субъекта, которому следует осуществить введение, целевого органа, симптома или режима введения. В отношении субъекта, которому вводят композицию, ограничения не устанавливаются, и композицию можно применять в отношении различных животных. В частности, композицию можно вводить млекопитающему, предпочтительно человеку, и экспериментальному животному в клинических исследованиях, при скрининге и в лабораторных экспериментах.
[0077] Композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения образует липидный комплекс, содержащий нуклеиновую кислоту, инкапсулированную внутри тонкодисперсных частиц, образованных из липидов, в том числе катионного липида. «Средний диаметр частиц» липидного комплекса может быть рассчитан, исходя из любого из среднего значения объема, среднего значения количественного показателя и Z-среднего значения. В композиции в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения липидный комплекс может характеризоваться средним диаметром частиц (Z-средним значением), составляющим, например, от 10 до 1000 нм, например, от 30 до 500 нм, например, от 30 до 200 нм.
Композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения предпочтительно является такой, что диаметр частиц липидного комплекса практически не увеличивается в течение периода хранения по сравнению с диаметром частиц перед хранением. Например, предпочтительным является, если средний диаметр частиц (Z-среднее значение) после хранения при 4°C в течение 3 месяцев увеличивается предпочтительно в 1,3 раза или меньше, более предпочтительно в 1,2 раза или меньше и, в частности, предпочтительно в 1,1 раза или меньше по сравнению с диаметром частиц перед хранением.
[0078] С точки зрения подавления неспецифичной адсорбции и иммунной реакции композиция в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения предпочтительно практически не имеет поверхностного заряда в среде с pH, составляющим приблизительно 7,4, например, в крови. С точки зрения улучшения эффективности слияния с эндосомальной мембраной во время включения в клетки при эндоцитозе, предпочтительным является, если композиция является положительно заряженной в среде с низким pH (например, от 3,5 до 7,0).
[0079] (Способ получения композиции)
В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрен способ получения композиции, при этом способ включает: стадию (a) смешивания содержащего полярный органический растворитель водного раствора, содержащего (I) вышеописанный катионный липид, (II) по меньшей мере один липид, выбранный из группы, состоящей из нейтрального липида, модифицированного полиэтиленгликолем липида и стерина, с водным раствором, содержащим (III) нуклеиновую кислоту, с получением смешанного раствора; и стадию (b) уменьшения процентного содержания полярного органического растворителя в смешанном растворе. Способ получения согласно варианту осуществления настоящего изобретения позволяет получать композицию, которая обеспечивает эффективное высвобождение нуклеиновой кислоты в цитоплазму.
[0080] Липидный комплекс, содержащий нуклеиновые кислоты, инкапсулированные внутри тонкодисперсных частиц, образованных из липидов, может быть образован за счет электростатического взаимодействия между водорастворимыми нуклеиновыми кислотами и катионным липидом и гидрофобного взаимодействия между липидами. Например, путем уменьшения процентного содержания полярного органического растворителя в смешанном растворе можно изменять растворимость липидных компонентов, в том числе (I) вышеописанного катионного липида и (II) по меньшей мере одного липида, выбранного из группы, состоящей из нейтрального липида, модифицированного полиэтиленгликолем липида и стерина, в содержащем полярный органический растворитель водном растворе с образованием таким образом липидного комплекса. Примеры полярного органического растворителя включают спирты, такие как этанол.
[0081] Сначала на стадии (a) смешивают содержащий полярный органический растворитель водный раствор, содержащий растворенные в нем (I) катионный липид и (II) по меньшей мере один липид, выбранный из группы, состоящей из нейтрального липида, модифицированного полиэтиленгликолем липида и стерина, и водный раствор, содержащий (III) нуклеиновую кислоту, с получением смешанного раствора. Концентрация полярного органического растворителя в содержащем полярный органический растворитель водном растворе конкретно не ограничена, поскольку липидные молекулы можно солюбилизировать даже после смешивания с водным раствором нуклеиновой кислоты. Например, концентрация полярного органического растворителя в содержащем полярный органический растворитель водном растворе на стадии (a) может составлять от 0% до 60% по весу.
[0082] После этого на стадии (b) к смешанному раствору добавляют воду или что-либо подобное для уменьшения процентного содержания полярного органического растворителя. В результате может быть образован липидный комплекс. Для эффективного образования липидного комплекса предпочтительным является, если процентное содержание полярного органического растворителя быстро уменьшается. Например, концентрация полярного органического растворителя в конечном содержащем полярный органический растворитель водном растворе на стадии (b) может составлять от 0% до 5% по весу.
[0083] В качестве альтернативы, смешанный раствор, полученный на стадии (a), можно подвергать диализу для удаления полярного органического растворителя и замены растворителя фармацевтически приемлемой средой. Поскольку процентное содержание полярного органического растворителя в растворе понижается в течение диализа, то в результате может быть образован липидный комплекс.
[0084] Согласно способу получения композиции в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может быть получен липидный комплекс, содержащий нуклеиновую кислоту, эффективно инкапсулированную в тонкодисперсных частицах. Липидный комплекс может обладать превосходной физической стабильностью. Например, после хранения в течение определенного периода времени (например, 1 месяц или 3 месяца) увеличение диаметра частиц может быть подавлено.
in vivo
in vitro
[0085] Если нуклеиновая кислота, инкапсулированная в композиции, представляет собой олигонуклеотидное терапевтическое средство, то композицию можно применять в качестве фармацевтической композиции. Например, композицию по настоящему изобретению можно применять в терапии (такой как генная терапия) для введения необходимой нуклеиновой кислоты в целевую цитоплазму (такую как цитоплазма, обуславливающая заболевание)  или . Таким образом, в настоящем изобретении согласно одному варианту осуществления предусмотрен способ терапии (в частности, способ генной терапии) различных заболеваний путем применения фармацевтической композиции, содержащей липидный комплекс. Субъект, которому следует осуществить введение, способ и условие введения являются такими же, как и описанные выше.
[0086] В настоящем изобретении согласно одному варианту осуществления может предусматриваться набор для доставки олигонуклеотидного терапевтического средства, содержащий вышеуказанный анионный липид. Набор можно также предпочтительно применять в терапии (такой как генная терапия) различных клеток-мишеней. В наборе в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения состояние, в котором хранят анионный липид, конкретно не ограничено и может представлять собой любое состояние, такое как в виде раствора или порошка, принимая во внимание стабильность (стабильность при хранении), удобство применения и т.п. Набор в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может содержать, дополнительно к вышеуказанному анионному липиду, например, различные нуклеиновые кислоты, различные среды (фармацевтически приемлемые среды, буферы), инструкцию (инструкцию по применению) и т.п. Набор в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения применяется для получения композиции или липидного комплекса, содержащих необходимую нуклеиновую кислоту, подлежащую введению в клетки-мишени, и липиды, в том числе вышеуказанный анионный липид. Полученную композицию или липидный комплекс можно эффективно применять для доставки нуклеиновой кислоты в клетки-мишени. Кроме того, в настоящем изобретении согласно одному варианту осуществления может предусматриваться набор для доставки олигонуклеотидного терапевтического средства, в том числе фармацевтическая композиция, содержащая анионный липид. Набор в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения может содержать, дополнительно к фармацевтической композиции, например, различные среды (фармацевтически приемлемые среды), инструкцию (инструкцию по применению) и т.п.
ПРИМЕРЫ
[0087] Настоящее изобретение более конкретно описано ниже в данном документе посредством примеров, примеров получения и тестовых примеров. Однако настоящее изобретение не ограничивается примерами. В примерах и примерах получения номенклатуру соединений получали с помощью программного обеспечения (торговое название "ChemDraw Ultra ver.12.0", изготовлена PerkinElmer Co., Ltd.).
Все исходные материалы, реагенты, кислоты, основания, обезвоживающие средства, растворители и катализаторы, которые применяются для синтеза соединений по настоящему изобретению, являются коммерчески доступными или могут быть получены согласно способам органического синтеза, которые хорошо известны специалисту в данной области техники. Кроме того, соединения по настоящему изобретению могут быть получены, как показано в примерах ниже по тексту, согласно способам органического синтеза, которые хорошо известны специалисту в данной области техники.
[0088] Сокращения, применяемые в примерах, являются общепринятыми и общеизвестными специалисту в данной области техники. Некоторые сокращения приведены ниже.
DIPEA: N,N-диизопропилэтиламин
DMAP: 4-(диметиламино)пиридин
DMF: N,N-диметилформамид
EDC: 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид
н-: нормальный
трет-: третичный
EtOAc: этилацетат
TFA: трифторуксусная кислота
THF: тетрагидрофуран
1
H-ЯМР: спектрометрия на основе протонного ядерного магнитного резонанса
[0089] В примерах и примерах получения ниже «комнатная температура» означает, как правило, температуру от приблизительно 10°C до приблизительно 35°C. % означает процент по весу, если не указано иное.
[0090] Химические сдвиги в спектрометрии на основе протонного ядерного магнитного резонанса регистрируются в единицах измерения δ (ppm) относительно тетраметилсилана. Сокращения в распределениях являются такими, как указано ниже:
s: синглет, d: дублет, t: триплет, q: квартет, quin: квинтет, m: мультиплет, br: широкий.
Для проведения хроматографии применяли Parallel Prep, изготовленный YAMAZEN Corporation {колонка: изготовлена YAMAZEN Corporation, колонка Hi-FlashTM (силикагель), размер: S (16×60 мм), M (20×75 мм), L (26×100 мм), 2L (26×150 мм)}, или систему автоматизированной флэш-очистки IsoleraTM, изготовленную Biotage {колонка: SNAP, картридж KP-Sil (10 г, 25 г, 50 г, 100 г, 340 г)}.
[0091] A. Синтез катионного липида
[Пример получения 1]
Синтез 2-бутилоктил-9-бромнонаноата
[0092] Растворяли 9-бромнонановую кислоту (1,1 г, 4,7 ммоль), DIPEA (0,91 мл, 5,3 ммоль) и DMAP (76 мг, 0,63 ммоль) в метиленхлориде (13 мл) и при охлаждении льдом добавляли EDC (1,0 г, 5,3 ммоль). Добавляли 2-бутил-1-октанол (0,58 г, 3,1 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. В реакционную смесь добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (н-гептан/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (1,2 г, 2,96 ммоль).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,82-0,95 (m, 6H), 1,17-1,49 (m, 24H), 1,52-1,70 (m, 3H), 1,75-1,93 (m, 2H), 2,23-2,36 (m, 2H), 3,34-3,47 (m, 2H), 3,91-4,02 (m, 2H).
[0093] [Пример получения 2]
Синтез бензил-9-бромнонаноата
[0094] Растворяли бензиловый спирт (0,50 мл, 4,84 ммоль), 9-бромнонановую кислоту (1,38 г, 5,80 ммоль) и DMAP (59 мг, 0,48 ммоль) в метиленхлориде (9,6 мл) и при охлаждении льдом добавляли EDC (1,16 г, 6,05 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. В реакционную смесь добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и экстрагировали диэтиловым эфиром. Органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (н-гептан/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (1,49 г, 4,55 ммоль).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 1,22-1,48 (m, 8H), 1,58-1,71 (m, 2H), 1,78-1,90 (m, 2H), 2,30-2,40 (m, 2H), 3,35-3,44 (m, 2H), 5,12 (s, 2H), 7,26-7,45 (m, 5H).
[0095] [Пример получения 3]
Синтез бензил-8-бромоктаноата
[0096] Согласно способу в примере получения 2 указанное в заголовке соединение (4,8 г, 15,3 ммоль) получали из бензилового спирта (1,85 мл, 17,9 ммоль), 8-бромоктановой кислоты (4,0 г, 17,9 ммоль), EDC (3,78 г, 19,7 ммоль), DMAP (0,22 г, 1,79 ммоль) и метиленхлорида (36 мл).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 1,22-1,48 (m, 6H), 1,58-1,71 (m, 2H), 1,78-1,90 (m, 2H), 2,30-2,38 (m, 2H), 3,33-3,45 (m, 2H), 5,12 (s, 2H), 7,28-7,44 (m, 5H).
[0097] [Пример получения 4]
Синтез 8-пентилтридекан-1-ола
[0098] (1) Синтез (6-карбоксигексил)трифенилфосфония бромида
Суспендировали 7-бромгептановую кислоту (2,0 г, 9,57 ммоль) и трифенилфосфин (2,5 г, 9,57 ммоль) в ацетонитриле (20 мл) и повергали перегонке с обратным холодильником при нагревании в течение 18 часов. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (4,1 г, 8,66 ммоль).
1
H-ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ (ppm): 1,22-1,59 (m, 8H), 2,12-2,25 (m, 2H), 3,47-3,62 (m, 2H), 7,19-7,28 (m, 2H), 7,34-7,44 (m, 2H), 7,71-7,85 (m, 10H), 7,85-7,94 (m, 3H), 11,97 (br s, 1H).
[0099] (2) Синтез 8-пентил-7-тридеценовой кислоты
Растворяли соединение (4,65 г, 9,87 ммоль), полученное в примере получения 4-(1), в THF (15 мл) и добавляли раствор бис(триметилсилил)амида натрия/THF (1 М, 19,7 мл, 19,7 ммоль) при комнатной температуре в атмосфере азота. Реакционный раствор нагревали до 45°C и затем перемешивали в течение 30 минут. Добавляли по каплям раствор ундекан-6-она (1,7 мл, 8,22 ммоль) в THF (5 мл) с последующей перегонкой с обратным холодильником с помощью нагревания. Реакционную смесь перемешивали в течение 22 часов и затем осторожно добавляли хлористоводородную кислоту (2 М) до достижения pH 2. После добавления воды (100 мл) и экстрагирования диэтиловым эфиром органический слой высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (этилацетат/циклогексан) с получением смеси 1:1 (1,36 г) указанного в заголовке соединения и ундекан-6-она.
1
H-ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ (ppm): 0,80-0,89 (m, 6H), 1,16-1,38 (m, 18H), 1,43-1,53 (m, 2H), 1,89-1,99 (m, 4H), 2,17 (t, J=7,43 Гц, 2H), 5,07 (t, J=6,90 Гц, 1H), 11,83 (br s, 1H).
[0100] (3) Синтез 8-пентилтридециловой кислоты
Суспендировали соединение (1,36 г), полученное в примере получения 4-(2), и 10% палладий на угле (0,06 г, 0,060 ммоль) в этаноле (5 мл) и суспензию перемешивали в течение 18 часов в атмосфере водорода при комнатной температуре и при нормальном давлении. Реакционную смесь фильтровали через целит и промывали этанолом. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (0,60 г, 2,18 ммоль).
1
H-ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ (ppm): 0,85 (t, J=7,1 Гц, 6H), 1,14-1,32 (m, 25H), 1,42-1,52 (m, 2H), 2,18 (t, J=7,43 Гц, 2H).
[0101] (4) Синтез 8-пентилтридекан-1-ола
В раствор алюмогидрида лития/THF (2,4 М, 1,3 мл, 3,15 ммоль) в атмосфере азота добавляли по каплям раствор соединения (1,36 г), полученного в примере получения 4-(3), в THF (5 мл) при охлаждении льдом. После перемешивания при комнатной температуре в течение 2 часов добавляли по каплям хлористоводородную кислоту (1 М, 8 мл) и смесь перемешивали в течение 1 часа. Органический слой экстрагировали диэтиловым эфиром и затем последовательно промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (этилацетат/циклогексан) с получением указанного в заголовке соединения (0,28 г, 1,02 ммоль).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,88 (t, J=7,24 Гц, 6H), 1,13-1,41 (m, 28H), 1,54-1,60 (m, 2H), 3,59-3,68 (m, 2H).
[0102] [Пример получения 5]
Синтез 4-нонилтридекан-1-ола
[0103] (1) Синтез (3-бромпропокси)(трет-бутил)диметилсилана
Растворяли 3-бром-1-пропанол (6,5 мл, 71,9 ммоль) в метиленхлориде (250 мл), добавляли имидазол (7,84 г, 115,0 ммоль) при комнатной температуре и полностью растворяли. Добавляли трет-бутилдиметилсилилхлорид (13,0 г, 86,3 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. Реакционный раствор фильтровали и затем концентрировали при пониженном давлении. К остатку добавляли диэтиловый эфир (300 мл), последовательно промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (циклогексан) с получением указанного в заголовке соединения (16,2 г, 64,0 ммоль).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,08 (s, 6H), 0,91 (s, 9H), 2,05 (quin, J=6,05 Гц, 2H), 3,53 (t, J=6,42 Гц, 2H), 3,75 (t, J=5,69 Гц, 2H).
[0104] (2) Синтез {3-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]пропил}трифенилфосфония бромида
Согласно способу в примере получения 4-(1) указанное в заголовке соединение (21,2 г, 41,1 ммоль) получали из соединения (16,2 г, 63,9 ммоль), полученного в примере получения 5-(1), трифенилфосфина (16,8 г, 63,9 ммоль) и ацетонитрила (125 мл).
1
H-ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ (ppm): 0,01 (s, 6H), 0,84 (s, 9H), 1,65-1,75 (m, 2H), 3,48-3,57 (m, 2H), 3,69 (t, J=6,14 Гц, 2H), 7,73-7,84 (m, 12H), 7,87-7,93 (m, 3H).
[0105] (3) Синтез трет-бутилдиметил-[(4-нонил-3-тридецен-1-ил)окси]силана
Растворяли соединение (4,38 г, 8,50 ммоль), полученное в примере получения 5-(2), в THF (15 мл) и добавляли в атмосфере азота раствор бис(триметилсилил)амида натрия/THF (1 М, 8,5 мл, 8,5 ммоль) при комнатной температуре. Реакционный раствор нагревали до 45°C и затем перемешивали в течение 30 минут. Добавляли по каплям раствор нонадекан-10-она (2,0 г, 7,08 ммоль) в THF (10 мл) и подвергали перегонке с обратным холодильником при нагревании в течение 21 часа. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, затем в нее добавляли диэтиловый эфир, последовательно промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия и органический слой высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (циклогексан) с получением указанного в заголовке соединения (1,16 г).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,07 (s, 6H), 0,90 (m, 15H), 1,21-1,41 (m, 28H), 1,92-2,04 (m, 4H), 2,24 (q, J=7,34 Гц, 2H), 3,58 (t, J=7,24 Гц, 2H), 5,09 (t, J=7,15 Гц, 1H).
[0106] (4) Синтез 4-нонилтридекан-1-ола
Суспендировали соединение (1,16 г, 2,64 ммоль), полученное в примере получения 5-(3), и 10% палладий на угле (0,28 г, 0,26 ммоль) в этилацетате (10 мл) и уксусной кислоте (0,15 мл, 2,64 ммоль) и суспензию перемешивали в атмосфере водорода при комнатной температуре в течение 18 часов. Реакционную смесь фильтровали через целит и промывали этанолом и затем фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (этилацетат/циклогексан) с получением указанного в заголовке соединения (0,35 г, 1,08 ммоль).
1
H-ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ (ppm): 0,80-0,90 (m, 6H), 1,13-1,30 (m, 35H), 1,32-1,39 (m, 2H), 3,32-3,38 (m, 2H), 4,30 (t, J=5,23 Гц, 1H).
[0107] [Пример получения 6]
Синтез 4-гептилундекан-1-ола
[0108] (1) Синтез трет-бутил-[(4-гептил-3-ундецен-1-ил)окси]диметилсилана
Согласно способу в примере получения 5-(3) указанное в заголовке соединение (0,83 г, 2,17 ммоль) получали из {3-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]пропил}трифенилфосфония бромида (3,0 г, 5,83 ммоль), THF (10 мл), раствора бис(триметилсилил)амида натрия/THF (1 М, 5,8 мл, 5,8 ммоль) и пентадекан-8-она (1,1 г, 4,86 ммоль).
1
3
H-ЯМР (600 Гц, CDCl) δ (ppm): 0,07 (s, 6H), 0,84-0,95 (m, 15H), 0,89 (s, 1H), 1,21-1,41 (m, 20H), 1,92-2,05 (m, 4H), 2,24 (q, J=7,34 Гц, 2H), 3,58 (t, J=7,24 Гц, 2H), 5,09 (t, J=7,24 Гц, 1H).
[0109] (2) Синтез 4-гептилундекан-1-ола
Согласно способу в примере получения 5-(4) указанное в заголовке соединение (0,42 г, 1,56 ммоль) получали из соединения (0,83 г, 2,17 ммоль), полученного в примере получения 6-(1), с применением 10% палладия на угле (0,23 г, 0,22 ммоль), этилацетата (10 мл) и уксусной кислоты (0,25 мл, 4,35 ммоль).
1
H-ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ (ppm): 0,82-0,89 (m, 6H), 1,14-1,31 (m, 27H), 1,33-1,39 (m, 2H), 3,32-3,38 (m, 2H), 4,30 (t, J=5,14 Гц, 1H).
[0110] [Пример получения 7]
Синтез 4-пентилнонан-1-ола
[0111] (1) Синтез трет-бутилдиметилсилил-[(4-пентил-3-нонен-1-ил)окси]силана
Согласно способу в примере получения 5-(3) указанное в заголовке соединение (1,16 г) получали из{3-[(трет-бутилдиметилсилил)окси]пропил}трифенилфосфония бромида (5,0 г, 9,72 ммоль), THF (4 мл), раствора бис(триметилсилил)амида натрия /THF (1 М, 9,7 мл, 9,7 ммоль) и ундекан-6-она (1,7 мл, 8,10 ммоль).
1
3
H-ЯМР (600 Гц, CDCl) δ (ppm): 0,07 (s, 6H), 0,90 (m, 15H), 1,19-1,43 (m, 13H), 1,92-2,05 (m, 4H), 2,21-2,29 (m, 2H), 3,58 (t, J=7,24 Гц, 2H), 5,10 (t, J=7,15 Гц, 1H).
[0112] (2) Синтез 4-пентилнонан-1-ола
Согласно способу в примере получения 5-(4) указанное в заголовке соединение (0,22 г, 1,02 ммоль) получали из соединения (1,12 г, 3,43 ммоль), полученного в примере получения 7-(1), с применением 10% палладия на угле (0,37 г, 0,34 ммоль), этилацетата (15 мл) и уксусной кислоты (0,39 мл, 6,86 ммоль).
1
H-ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ (ppm): 0,87-0,93 (m, 6H), 1,18-1,36 (m, 19H), 1,37-1,45 (m, 2H), 3,36-3,42 (m, 2H), 4,35 (t, J=5,23 Гц, 1H).
[0113] [Пример получения 8]
Синтез бензил-4-бромбутаноата
Растворяли бензиловый спирт (2,84 мл, 27,3 ммоль), 4-бромбутановую кислоту (5,01 г, 30,0 ммоль) и DMAP (0,33 г, 2,73 ммоль) в метиленхлориде (50 мл), добавляли EDC (6,5 г, 34,1 ммоль) при охлаждении льдом и перемешивали при комнатной температуре в течение 2,5 часа. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и затем растворяли в диэтиловом эфире. Раствор последовательно промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия, водой и 10% водным раствором лимонной кислоты и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (6,41 г, 24,9 ммоль).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 2,20 (quin, J=6,83 Гц, 2H), 2,56 (t, J=7,15 Гц, 2H), 3,46 (t, J=6,51 Гц, 2H), 5,13 (s, 2H), 7,28-7,42 (m, 5H).
[0114] [Пример получения 9]
Синтез бензил-6-бромгексаноата
Согласно способу в примере получения 8 указанное в заголовке соединение (5,43 г, 19,0 ммоль) получали из бензилового спирта (1,93 мл, 18,5 ммоль), 6-бромгексановой кислоты (4,33 г, 22,2 ммоль), DMAP (0,23 г, 1,85 ммоль), EDC (4,43 г, 23,1 ммоль) и метиленхлорида (35 мл).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 1,44-1,51 (m, 2H), 1,64-1,72 (m, 2H), 1,83-1,90 (m, 2H), 2,38 (t, J=7,43 Гц, 2H), 3,39 (t, J=6,69 Гц, 2H), 5,12 (s, 2H), 7,30-7,40 (m, 5H).
[0115] [Пример получения 10]
Синтез (1R,5S,6r)-3-метил-3-азабицикло[3.1.0]гексан-6-карбоновой кислоты гидрохлорида
[0116] (1) Синтез (1R,5S,6r)-этил-3-метил-3-азабицикло[3.1.0]гексан-6-карбоксилата
Растворяли (1R,5S,6r)-этил-3-азабицикло[3.1.0]гексан-6-карбоксилат (CAS 174456-77-0) (0,89 г, 5,74 ммоль) в THF (20 мл), куда последовательно добавляли уксусную кислоту (0,49 мл, 8,6 ммоль) и раствор формальдегида (11,7 мл, 161,5 моль) при комнатной температуре, и смесь перемешивали в течение 30 минут. Добавляли три(ацетокси)борогидрид натрия (2,43 г, 11,5 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, затем добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и экстрагировали метиленхлоридом. Смесь высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (метиленхлорид/метанол) с получением указанного в заголовке соединения (0,70 г, 4,14 ммоль).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 1,25 (t, J=7,2 Гц, 3H), 1,94 (br s, 2H), 2,01 (br s, 1H), 2,29 (s, 3H), 2,35 (d, J=9,2 Гц, 2H), 3,05 (d, J=9,2 Гц, 2H), 4,09 (q, J=7,2 Гц, 2H).
[0117] (2) Синтез (1R,5S,6r)-3-метил-3-азабицикло[3.1.0]гексан-6-карбоновой кислоты гидрохлорида
Концентрированную хлористоводородную кислоту (10 мл) добавляли к соединению (0,60 г, 3,55 ммоль), полученному в примере получения 10-(1), и перемешивали при 70°C в течение 12 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (0,52 г, 3,05 ммоль).
1
H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ (ppm): 2,14 (br s, 2H), 2,25 (br s, 1H), 2,74 (br s, 3H), 3,25-3,37 (m, 2H), 3,56-3,67 (m, 2H), 10,91 (br s, 1H), 12,49 (br s, 1H).
[0118] [Пример получения 11]
Синтез (1R,5S,6s)-3-метил-3-азабицикло[3.1.0]гексан-6-карбоновой кислоты гидрохлорида
[0119] (1) Синтез (1R,5S,6s)-этил-3-метил-3-азабицикло[3.1.0]гексан-6-карбоксилата
Согласно способу в примере получения 10-(1), указанное в заголовке соединение (2,5 г, 14,8 ммоль) получали из (1R,5S,6s)-этил-3-азабицикло[3.1.0]гексан-6-карбоксилата (CAS 1144099-54-6) (2,5 г, 16,1 ммоль), уксусной кислоты (1,4 мл, 24,2 ммоль), раствора формальдегида (10,0 мл, 134,3 ммоль), три(ацетокси)борогидрида натрия (6,8 г, 32,2 ммоль) и THF (50 мл).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 1,23 (t, J=7,1 Гц, 3H), 1,48-1,68 (m, 3H), 2,22 (s, 3H), 2,33 (br d, J=8,8 Гц, 2H), 3,02 (d, J=8,8 Гц, 2H), 4,10 (q, J=7,1 Гц, 2H).
[0120] (2) Синтез (1R,5S,6s)-3-метил-3-азабицикло[3.1.0]гексан-6-карбоновой кислоты гидрохлорида
Согласно способу в примере получения 10-(2) указанное в заголовке соединение (350 мг, 1,97 ммоль) получали из соединения (500 мг, 2,96 ммоль), полученного в примере получения 10-(2), и концентрированной хлористоводородной кислоты (10 мл).
1
H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ (ppm): 1,88-1,94 (m, 0,45H), 1,94-2,00 (m, 0,55H), 2,35-2,45 (m, 2H), 2,68 (br s, 1,65H), 2,67 (br s, 1,35H), 3,08-3,18 (m, 1,1H), 3,45-3,57 (m, 0,9H), 3,73-3,88 (m, 2H), 9,16 (br s, 1H), 11,52 (br s, 1H).
[0121] (Синтез катионного липида (1))
[Пример A-1]
2-{9-[(2-бутилоктил)окси]-9-оксононил}додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат (катионный липид 1)
[0122] (1) Синтез 1,1-ди-трет-бутил-9-(2-бутилоктил)нонан-1,1,9-трикарбоксилата
Суспендировали 60% гидрид натрия (59 мг, 1,48 ммоль) в 1,4-диоксане (6,5 мл), куда постепенно добавляли при комнатной температуре ди-трет-бутилмалонат (0,30 мл, 1,35 ммоль), и смесь перемешивали в течение 20 минут. К соединению (573 мг, 1,41 ммоль), полученному в примере получения 1, добавляли 1,4-диоксан (1 мл) и смесь перемешивали при 70°C в течение 3 часов и при 95°C в течение 15 часов. Реакционную смесь охлаждали на бане с ледяной водой, добавляли насыщенный водный раствор хлорида аммония и экстрагировали н-гептаном. Органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (н-гептан/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (490 мг, 0,91 ммоль).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,80-0,98 (m, 6H), 1,18-1,38 (m, 24H), 1,39-1,54 (m, 2H), 1,46 (s, 18H), 1,55-1,69 (m, 3H), 1,71-1,87 (m, 2H), 2,24-2,35 (m, 2H), 3,06-3,15 (m, 1H), 3,91-4,02 (m, 2H).
[0123] (2) Синтез 9,9-ди-трет-бутил-1-(2-бутилоктил)нонадекан-1,9,9-трикарбоксилата
Растворяли соединение (490 мг, 0,91 ммоль), полученное в примере A-1-(1), в 1,4-диоксане (4 мл), куда добавляли 60% гидрид натрия (47 мг, 1,18 ммоль) при охлаждении водой, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут. Добавляли 1-йододекан (0,39 мл, 1,81 ммоль) и смесь перемешивали при 80°C в течение 15 часов. Реакционную смесь охлаждали на бане с ледяной водой, добавляли насыщенный водный раствор хлорида аммония и экстрагировали н-гептаном. Органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (н-гептан/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (450 мг, 0,66 ммоль).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,80-0,96 (m, 9H), 1,05-1,36 (m, 40H), 1,39-1,49 (m, 2H), 1,44 (s, 18H), 1,53-1,68 (m, 3H), 1,70-1,82 (m, 4H), 2,23-2,34 (m, 2H), 3,92-4,01 (m, 2H).
[0124] (3) Синтез 2-{9-[(2-бутилоктил)окси]-9-оксононил}додекановой кислоты
Растворяли соединение (450 мг, 0,66 ммоль), полученное в примере A-1-(2), в метиленхлориде (2 мл), куда добавляли TFA (1 мл) при охлаждении льдом, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часа. К реакционной смеси добавляли толуол и растворитель отгоняли при пониженном давлении. Добавление и перегонку толуола повторяли дважды до осушения реакционной среды с получением, таким образом, неочищенного продукта, представляющего собой 2-{9-[(2-бутилоктил)окси]-9-оксононил}-2-децилмалоновую кислоту. Полученный неочищенный продукт растворяли в ксилоле (5 мл) и раствор перемешивали при 150°C в течение 8 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (н-гептан/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (240 мг, 0,46 ммоль).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,80-0,97 (m, 9H), 1,16-1,70 (m, 49H), 2,22-2,41 (m, 3H), 3,92-4,02 (m, 2H).
[0125] (4) Синтез 2-бутилоктил-10-(гидроксиметил)эйкозаноата
Соединение (240 мг, 0,46 ммоль), полученное в примере A-1-(3), растворяли в THF (4 мл), куда добавляли по каплям 0,92 М комплекс боран-THF (0,75 мл, 0,69 ммоль) при -15°C, и смесь перемешивали при 0°C в течение 2 часов. Добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут и экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (н-гептан/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (197 мг, 0,39 ммоль).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,80-0,98 (m, 9H), 1,10-1,39 (m, 46H), 1,39-1,50 (m, 1H), 1,54-1,69 (m, 4H), 2,23-2,36 (m, 2H), 3,48-3,59 (m, 2H), 3,92-4,02 (m, 2H).
[0126] (5) Синтез 2-{9-[(2-бутилоктил)окси]-9-оксононил}додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилата
Растворяли соединение (38 мг, 0,074 ммоль), полученное в примере A-1-(4), DIPEA (0,054 мл, 0,31 ммоль), 1-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты гидрохлорид (27 мг, 0,15 ммоль) и DMAP (1,8 мг, 0,015 ммоль) в метиленхлориде (0,8 мл), куда добавляли EDC (31 мг, 0,16 ммоль) при охлаждении льдом, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 часов. В реакционную смесь добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и экстрагировали хлороформом. Органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (н-гептан/этилацетат/метанол) с получением указанного в заголовке соединения (38 мг, 0,060 ммоль).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,77-0,97 (m, 9H), 1,13-1,41 (m, 46H), 1,50-1,69 (m, 4H), 1,69-1,85 (m, 2H), 1,85-2,09 (m, 4H), 2,18-2,35 (m, 3H), 2,27 (s, 3H), 2,72-2,88 (m, 2H), 3,90-4,03 (m, 4H).
[0127] (Синтез катионного липида (2))
[Пример A-2]
2-{9-оксо-9-[(3-пентилоктил)окси]нонил}додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат (катионный липид 2)
[0128] (1) Синтез 9-бензил-1,1-ди-трет-бутилнонан-1,1,9-трикарбоксилата
Суспендировали 60% гидрид натрия (83 мг, 2,07 ммоль) в 1,4-диоксане (9,4 мл), куда постепенно добавляли при комнатной температуре ди-трет-бутилмалонат (0,42 мл, 1,88 ммоль), и смесь перемешивали в течение 10 минут. Добавляли соединение (650 мг, 1,99 ммоль), полученное в примере получения 2, и смесь перемешивали при 95°C в течение 13 часов. Реакционную смесь охлаждали на бане с ледяной водой, добавляли насыщенный водный раствор хлорида аммония и экстрагировали н-гептаном. Органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (н-гептан/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (536 мг, 1,16 ммоль).
[0129] (2) Синтез 1-бензил-9,9-ди-трет-бутилнонадекан-1,9,9-трикарбоксилата
Согласно способу в примере A-1-(2) указанное в заголовке соединение (470 мг, 0,78 ммоль) получали из соединения (590 мг, 1,28 ммоль), полученного в примере A-2-(1), 1-йододекана (0,54 мл, 2,55 ммоль), 65% гидрида натрия (71 мг, 1,91 ммоль) и 1,4-диоксана (5 мл).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,83-0,93 (m, 3H), 1,05-1,36 (m, 26H), 1,44 (s, 18H), 1,57-1,68 (m, 2H), 1,71-1,82 (m, 4H), 2,29-2,39 (m, 2H), 5,11 (s, 2H), 7,28-7,42 (m, 5H).
[0130] (3) Синтез 2-[9-(бензилокси)-9-оксононил]додекановой кислоты
Согласно способу в примере A-1-(3) указанное в заголовке соединение (286 мг, 0,64 ммоль) получали из соединения (470 мг, 0,78 ммоль), полученного в примере A-2-(2), метиленхлорида (2 мл), TFA (1 мл) и ксилола (2 мл).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,81-0,95 (m, 3H), 1,18-1,37 (m, 26H), 1,39-1,52 (m, 2H), 1,54-1,69 (m, 4H), 2,28-2,41 (m, 3H), 5,11 (s, 2H), 7,28-7,40 (m, 5H).
[0131] (4) Синтез бензил-10-(гидроксиметил)эйкозаноата
Согласно способу в примере A-1-(4) указанное в заголовке соединение (223 мг, 0,52 ммоль) получали из соединения (285 мг, 0,64 ммоль), полученного в примере A-2-(3), 0,92 М комплекса боран-THF (1,0 мл, 0,96 ммоль) и THF (3,2 мл).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,81-0,95 (m, 3H), 1,12-1,38 (m, 31H), 1,39-1,50 (m, 1H), 1,58-1,72 (m, 2H), 2,23-2,36 (m, 2H), 3,48-3,59 (m, 2H), 5,11 (s, 2H), 7,28-7,41 (m, 5H).
[0132] (5) Синтез 2-[9-(бензилокси)-9-оксононил]додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилата
Согласно способу в примере A-1-(5) указанное в заголовке соединение (128 мг, 0,23 ммоль) получали из соединения (114 мг, 0,26 ммоль), полученного в примере A-2-(4), 1-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты гидрохлорида (95 мг, 0,53 ммоль), EDC (111 мг, 0,58 ммоль), DIPEA (0,090 мл, 0,53 ммоль), DMAP (6,4 мг, 0,053 ммоль) и метиленхлорида (1,3 мл).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,81-0,96 (m, 3H), 1,15-1,41 (m, 31H), 1,52-1,70 (m, 2H), 1,70-1,84 (m, 2H), 1,85-2,06 (m, 4H), 2,18-2,40 (m, 3H), 2,27 (s, 3H), 2,73-2,89 (m, 2H), 3,92-4,03 (m, 2H), 5,12 (s, 2H), 7,28-7,44 (m, 5H).
[0133] (6) Синтез 10-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}эйкозановой кислоты
Растворяли соединение (127 мг, 0,23 ммоль), полученное в примере A-2-(5), в этилацетате (2 мл), куда добавляли при комнатной температуре 10% палладий на угле (24 мг, содержащий 50% воды), и смесь перемешивали в атмосфере водорода при нормальном давлении в течение 3 часов. Реакционный раствор фильтровали и промывали этилацетатом. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (хлороформ/метанол) с получением указанного в заголовке соединения (94 мг, 0,20 ммоль).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,81-0,95 (m, 3H), 1,12-1,44 (m, 31H), 1,53-1,71 (m, 2H), 1,74-1,95 (m, 2H), 1,97-2,10 (m, 2H), 2,11-2,37 (m, 5H), 2,40 (s, 3H), 3,11-3,28 (m, 2H), 3,79-3,92 (m, 1H), 4,14-4,25 (m, 1H).
[0134] (7) Синтез 2-{9-оксо-9-[(3-пентилоктил)окси]нонил}додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилата
Согласно способу в примере получения 2 указанное в заголовке соединение (103 мг, 0,16 ммоль) получали из соединения (93 мг, 0,20 ммоль), полученного в примере A-2-(6), 3-пентилоктан-1-ола (CAS 1443519-63-8) (60 мг, 0,30 ммоль), EDC (42 мг, 0,22 ммоль), DMAP (4,9 мг, 0,040 ммоль) и метиленхлорида (1,5 мл).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,82-0,95 (m, 9H), 1,14-1,46 (m, 46H), 1,50-1,68 (m, 6H), 1,70-1,84 (m, 2H), 1,85-2,06 (m, 4H), 2,19-2,33 (m, 3H), 2,27 (s, 3H), 2,74-2,87 (m, 2H), 3,93-4,02 (m, 2H), 4,03-4,14 (m, 2H).
[0135] (Синтез катионного липида (3))
[Пример A-3]
2-нонил-11-оксо-11-[(3-пентилоктил)окси]ундецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат (катионный липид 3)
[0136] (1) Синтез 1-бензил-9,9-ди-трет-бутилоктадекан-1,9,9-трикарбоксилата
Растворяли соединение (536 мг, 1,16 ммоль), полученное в примере A-2-(1), в THF (6 мл), куда добавляли 60% гидрид натрия (58 мг, 1,45 ммоль) при охлаждении водой, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут. Добавляли 1-йоднонан (0,23 мл, 1,16 ммоль) и смесь перемешивали при 80°C в течение 20 часов. Реакционную смесь охлаждали на бане с ледяной водой, добавляли насыщенный водный раствор хлорида аммония и экстрагировали н-гептаном. Органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (н-гептан/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (340 мг, 0,577 ммоль).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,82-0,92 (m, 3H), 1,03-1,36 (m, 24H), 1,44 (s, 18H), 1,57-1,68 (m, 2H), 1,71-1,81 (m, 4H), 2,28-2,40 (m, 2H), 5,11 (s, 2H), 7,28-7,41 (m, 5H).
[0137] (2) Синтез 11-(бензилокси)-2-нонил-11-оксоундекановой кислоты
Согласно способу в примере A-1-(3) указанное в заголовке соединение (96 мг, 0,22 ммоль) получали из соединения (340 мг, 0,58 ммоль), полученного в примере A-3-(1), метиленхлорида (2 мл), TFA (1 мл) и ксилола (2 мл).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,80-0,95 (m, 3H), 1,12-1,74 (m, 30H), 2,28-2,41 (m, 3H), 5,11 (s, 2H), 7,28-7,40 (m, 5H).
[0138] (3) Синтез бензил-10-(гидроксиметил)нонадеканоата
Согласно способу в примере A-1-(4) указанное в заголовке соединение (80 мг, 0,19 ммоль) получали из соединения (96 мг, 0,22 ммоль), полученного в примере A-3-(2), 0,92 М комплекса боран-THF (0,36 мл, 0,33 ммоль) и THF (1,1 мл).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,81-0,94 (m, 3H), 1,09-1,38 (m, 29H), 1,38-1,50 (m, 1H), 1,58-1,71 (m, 2H), 2,30-2,40 (m, 2H), 3,48-3,58 (m, 2H), 5,11 (s, 2H), 7,29-7,42 (m, 5H).
[0139] (4) Синтез 11-(бензилокси)-2-нонил-11-оксоундецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилата
Согласно способу в примере A-1-(5) указанное в заголовке соединение (97 мг, 0,18 ммоль) получали из соединения (80 мг, 0,19 ммоль), полученного в примере A-3-(3), 1-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты гидрохлорида (69 мг, 0,38 ммоль), EDC (81 мг, 0,42 ммоль), DIPEA (0,066 мл, 0,38 ммоль), DMAP (4,7 мг, 0,038 ммоль) и метиленхлорида (1,0 мл).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,83-0,94 (m, 3H), 1,15-1,39 (m, 29H), 1,52-1,70 (m, 2H), 1,70-1,85 (m, 2H), 1,85-2,07 (m, 4H), 2,19-2,40 (m, 3H), 2,27 (s, 3H), 2,73-2,88 (m, 2H), 3,94-4,02 (m, 2H), 5,12 (s, 2H), 7,28-7,43 (m, 5H).
[0140] (5) Синтез 10-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}нонадекановой кислоты
Согласно способу в примере A-2-(6) соединение (96 мг, 0,18 ммоль), полученное в примере A-3-(4), растворяли в этилацетате (2 мл), куда добавляли при комнатной температуре 10% палладий на угле (19 мг, содержащий 50% воды) и смесь перемешивали в атмосфере водорода при нормальном давлении в течение 3 часов. Реакционный раствор фильтровали и промывали этилацетатом. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (хлороформ/метанол) с получением указанного в заголовке соединения (74 мг, 0,163 ммоль).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,81-0,95 (m, 3H), 1,12-1,44 (m, 29H), 1,53-1,71 (m, 2H), 1,74-1,94 (m, 2H), 1,98-2,08 (m, 2H), 2,08-2,38 (m, 5H), 2,39 (s, 3H), 3,10-3,30 (m, 2H), 3,80-3,91 (m, 1H), 4,14-4,25 (m, 1H).
[0141] (6) Синтез 2-нонил-11-оксо-11-[(3-пентилоктил)окси]ундецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилата
Согласно способу в примере получения 2 указанное в заголовке соединение (81 мг, 0,13 ммоль) получали из соединения (74 мг, 0,16 ммоль), полученного в примере A-3-(5), 3-пентилоктан-1-ола (CAS 1443519-63-8) (49 мг, 0,25 ммоль), EDC (38 мг, 0,20 ммоль), DMAP (4,0 мг, 0,033 ммоль) и метиленхлорида (1,2 мл).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,81-0,95 (m, 9H), 1,15-1,47 (m, 44H), 1,50-1,68 (m, 6H), 1,70-1,84 (m, 2H), 1,84-2,06 (m, 4H), 2,18-2,33 (m, 3H), 2,27 (s, 3H), 2,73-2,87 (m, 2H), 3,94-4,01 (m, 2H), 4,04-4,12 (m, 2H).
[0142] (Синтез катионного липида (4))
[Пример A-4]
бис(3-пентилоктил)-9-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}гептадекандиоат (катионный липид 4)
[0143] (1) Синтез 8-бензил-1,1-ди-трет-бутилоктан-1,1,8-трикарбоксилата
Суспендировали 60% гидрид натрия (59 мг, 1,48 ммоль) в DMF (5,4 мл), куда постепенно добавляли ди-трет-бутилмалонат (0,30 мл, 1,35 ммоль) при охлаждении льдом, и смесь перемешивали при 0°C в течение 5 минут, а затем в течение 20 минут после того, как убрали баню. При охлаждении льдом добавляли йодид натрия (61 мг, 0,40 ммоль) и соединение (443 мг, 1,41 ммоль), полученное в примере получения 3, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 часов. Реакционную смесь охлаждали на бане с ледяной водой, добавляли воду и экстрагировали диэтиловым эфиром. Органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (н-гептан/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (456 мг, 1,02 ммоль).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 1,23-1,36 (m, 8H), 1,45 (s, 18H), 1,58-1,69 (m, 2H), 1,72-1,84 (m, 2H), 2,30-2,40 (m, 2H), 3,05-3,15 (m, 1H), 5,11 (s, 2H), 7,28-7,41 (m, 5H).
[0144] (2) Синтез 1,15-дибензил-8,8-ди-трет-бутилпентадекан-1,8,8,15-тетракарбоксилата
Согласно способу в примере A-4-(1) указанное в заголовке соединение (380 мг, 0,56 ммоль) получали из соединения (456 мг, 1,02 ммоль), полученного в примере A-4-(1), соединения (478 мг, 1,53 ммоль), полученного в примере получения 3, йодида натрия (46 мг, 0,31 ммоль), 60% гидрида натрия (49 мг, 1,22 ммоль) и DMF (3,3 мл).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 1,03-1,17 (m, 4H), 1,23-1,36 (m, 12H), 1,43 (s, 18H), 1,56-1,68 (m, 4H), 1,70-1,80 (m, 4H), 2,29-2,38 (m, 4H), 5,11 (s, 4H), 7,27-7,41 (m, 10H).
[0145] (3) Синтез 10-(бензилокси)-2-[8-(бензилокси)-8-оксооктил]-10-оксодекановой кислоты
Согласно способу в примере A-1-(3) указанное в заголовке соединение (234 мг, 0,45 ммоль) получали из соединения (380 мг, 0,56 ммоль), полученного в примере A-4-(2), метиленхлорида (2 мл), TFA (1 мл) и ксилола (2 мл).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 1,18-1,37 (m, 16H), 1,38-1,71 (m, 8H), 2,26-2,41 (m, 5H), 5,11 (s, 4H), 7,28-7,43 (m, 10H).
[0146] (4) Синтез дибензил-9-(гидроксиметил)гептадекандиоата
Согласно способу в примере A-1-(4) указанное в заголовке соединение (188 мг, 0,37 ммоль) получали из соединения (234 мг, 0,45 ммоль), полученного в примере A-4-(3), 0,92 М комплекса боран-THF (0,73 мл, 0,67 ммоль) и THF (1,8 мл).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 1,12-1,51 (m, 22H), 1,56-1,72 (m, 4H), 2,29-2,41 (m, 4H), 3,47-3,58 (m, 2H), 5,11 (s, 4H), 7,28-7,44 (m, 10H).
[0147] (5) Синтез дибензил-9-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}гептадекандиоата
Согласно способу в примере A-1-(5) указанное в заголовке соединение (217 мг, 0,34 ммоль) получали из соединения (188 мг, 0,37 ммоль), полученного в примере A-4-(4), 1-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты гидрохлорида (132 мг, 0,74 ммоль), EDC (155 мг, 0,81 ммоль), DIPEA (0,126 мл, 0,74 ммоль), DMAP (9,0 мг, 0,074 ммоль) и метиленхлорида (1,9 мл).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 1,16-1,38 (m, 21H), 1,53-1,69 (m, 4H), 1,70-1,84 (m, 2H), 1,85-2,04 (m, 4H), 2,19-2,40 (m, 5H), 2,26 (s, 3H), 2,74-2,86 (m, 2H), 3,92-4,01 (m, 2H), 5,11 (s, 4H), 7,28-7,41 (m, 10H).
[0148] (6) Синтез бис(3-пентилоктил)-9-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}гептадекандиоата
Растворяли соединение (217 мг, 0,34 ммоль), полученное в примере A-4-(5), в THF (4 мл) и метаноле (2 мл), куда добавляли при комнатной температуре 10% палладий на угле (19 мг, содержащий 50% воды), и смесь перемешивали в атмосфере водорода при нормальном давлении в течение 2 часов. Реакционную систему заполняли азотом и реакционный раствор фильтровали и промывали метанолом. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта, представляющего собой 9-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}гептадекандикарбоновую кислоту (160 мг).
Согласно способу в примере получения 2 указанное в заголовке соединение (34 мг, 0,041 ммоль) получали из полученного неочищенного продукта (40 мг), 3-пентилоктан-1-ола (CAS 1443519-63-8) (44 мг, 0,22 ммоль), EDC (37 мг, 0,19 ммоль), DMAP (2,1 мг, 0,018 ммоль) и THF (1 мл).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,83-0,94 (m, 12H), 1,14-1,48 (m, 53H), 1,51-1,67 (m, 10H), 1,70-1,84 (m, 2H), 1,85-2,07 (m, 4H), 2,18-2,34 (m, 5H), 2,27 (s, 3H), 2,74-2,88 (m, 2H), 3,93-4,01 (m, 2H), 4,03-4,12 (m, 4H).
[0149] (Синтез катионного липида (5))
[Пример A-5]
ди[(Z)-2-нонен-1-ил]-9-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}гептадекандиоат (катионный липид 5)
[0150] Согласно способу в примере получения 2 указанное в заголовке соединение (76 мг, 0,11 ммоль) получали из неочищенного продукта (60 мг), представляющего собой 9-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}гептадекандикарбоновую кислоту, полученную в примере A-4-(6), цис-2-нонен-1-ола (0,066 мл, 0,40 ммоль), EDC (56 мг, 0,29 ммоль), DMAP (3,2 мг, 0,026 ммоль) и THF (1,3 мл).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,81-0,96 (m, 6H), 1,15-1,44 (m, 35H), 1,52-1,68 (m, 6H), 1,70-1,84 (m, 2H), 1,85-2,05 (m, 4H), 2,05-2,15 (m, 4H), 2,21-2,35 (m, 5H), 2,27 (s, 3H), 2,74-2,88 (m, 2H), 3,93-4,01 (m, 2H), 4,57-4,67 (m, 4H), 5,47-5,58 (m, 2H), 5,59-5,70 (m, 2H).
[0151] (Синтез катионного липида (6))
[Пример A-6]
(1R,5S,6r)-2-{9-[(2-бутилоктил)окси]-9-оксононил}додецил-3-метил-3-азабицикло[3.1.0]гексан-6-карбоксилат (катионный липид 6)
[0152] Согласно способу в примере A-1-(5) указанное в заголовке соединение (40 мг, 0,063 ммоль) получали из соединения (40 мг, 0,078 ммоль), полученного в примере A-1-(4), соединения (28 мг, 0,16 ммоль), полученного в примере получения 10-(2), EDC (33 мг, 0,17 ммоль), DIPEA (0,027 мл, 0,16 ммоль), DMAP (1,9 мг, 0,016 ммоль) и метиленхлорида (1,0 мл).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,80-1,00 (m, 9H), 1,16-1,40 (m, 46H), 1,52-1,70 (m, 4H), 1,89-1,97 (m, 2H), 1,98-2,06 (m, 1H), 2,23-2,42 (m, 4H), 2,30 (s, 3H), 3,00-3,12 (m, 2H), 3,87-4,03 (m, 4H).
[0153] (Синтез катионного липида (7))
[Пример A-7]
(1R,5S,6s)-2-{9-[(2-бутилоктил)окси]-9-оксононил}додецил-3-метил-3-азабицикло[3.1.0]гексан-6-карбоксилат (катионный липид 7)
[0154] Согласно способу в примере A-1-(5) указанное в заголовке соединение (38 мг, 0,060 ммоль) получали из соединения (40 мг, 0,078 ммоль), полученного в примере A-1-(4), соединения (27,8 мг, 0,16 ммоль), полученного в примере получения 11-(2), EDC (33 мг, 0,17 ммоль), DIPEA (0,027 мл, 0,157 ммоль), DMAP (1,9 мг, 0,016 ммоль) и метиленхлорида (1,0 мл).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,81-0,97 (m, 9H), 1,15-1,40 (m, 46H), 1,46-1,70 (m, 7H), 2,21 (s, 3H), 2,24-2,38 (m, 4H), 2,96-3,07 (m, 2H), 3,85-4,02 (m, 4H).
[0155] (Синтез катионного липида (8))
[Пример A-8]
2-{9-[(2-бутилоктил)окси]-9-оксононил}додецил-4-метилпиперазин-1-карбоксилат (катионный липид 8)
[0156] Соединение (11 мг, 0,022 ммоль), полученное в примере A-1-(4), и пиридин (0,0043 мл, 0,054 ммоль) растворяли в метиленхлориде (0,8 мл), куда добавляли 4-нитрофенилхлорформиат (12 мг, 0,060 ммоль) при охлаждении льдом, и смесь перемешивали при такой же температуре в течение 10 минут и при комнатной температуре в течение 1,5 часа. В реакционный раствор добавляли 1-метилпиперазин (0,010 мл, 0,090 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. В реакционную смесь добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (н-гептан/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (11 мг, 0,017 ммоль).
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,80-0,98 (m, 9H), 1,16-1,42 (m, 46H), 1,52-1,77 (m, 4H), 2,23-2,44 (m, 6H), 2,30 (s, 3H), 3,42-3,57 (m, 4H), 3,90-4,04 (m, 4H).
[0157] (Синтез катионного липида (9))
[Пример A-9]
2-[9-(гексилокси)-9-оксононил]додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат (катионный липид 9)
Согласно способу в примере получения 2 указанное в заголовке соединение (102 мг, 0,19 ммоль) получали из соединения (100 мг, 0,21 ммоль), полученного в примере A-2-(6), гексан-1-ола (32 мкл, 0,26 ммоль), EDC (49 мг, 0,26 ммоль), DMAP (5,0 мг, 0,050 ммоль) и метиленхлорида (5,0 мл).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,85-0,92 (m, 6H), 1,19-1,39 (m, 37H), 1,57-1,66 (m, 5H), 1,73-1,84 (m, 2H), 1,87-1,94 (m, 2H), 1,96-2,07 (m, 2H), 2,22-2,32 (m, 6H), 2,73-2,87 (m, 2H), 3,98 (d, J=5,50 Гц, 2H), 4,06 (t, J=6,79 Гц, 2H).
[0158] (Синтез катионного липида (10))
[Пример A-10]
2-[9-(октилокси)-9-оксононил]додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат (катионный липид 10)
Согласно способу в примере получения 2 указанное в заголовке соединение (109 мг, 0,19 ммоль) получали из соединения (200 мг, 0,42 ммоль), полученного в примере A-2-(6), октан-1-ола (67 мг, 0,51 ммоль), EDC (98 мг, 0,51 ммоль), DMAP (10 мг, 0,09 ммоль) и метиленхлорида (10 мл).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,91 (t, J=6,97 Гц, 6H), 1,23-1,40 (m, 40H), 1,60-1,68 (m, 5H), 1,76-1,85 (m, 2H), 1,89-1,95 (m, 2H), 1,97-2,06 (m, 2H), 2,25-2,33 (m, 6H), 2,78-2,86 (m, 2H), 4,00 (d, J=5,69 Гц, 2H), 4,08 (t, J=6,79 Гц, 2H).
[0159] (Синтез катионного липида (11))
[Пример A-11]
2-[9-(децилокси)-9-оксононил]додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат (катионный липид 11)
Согласно способу в примере получения 2 указанное в заголовке соединение (153 мг, 0,25 ммоль) получали из соединения (200 мг, 0,42 ммоль), полученного в примере A-2-(6), декан-1-ола (100 мкл, 0,51 ммоль), EDC (98 мг, 0,51 ммоль), DMAP (10 мг, 0,09 ммоль) и метиленхлорида (10 мл).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,91 (t, J=7,06 Гц, 6H), 1,17-1,42 (m, 44H), 1,60-1,68 (m, 5H), 1,75-1,86 (m, 2H), 1,88-1,96 (m, 2H), 1,97-2,07 (m, 2H), 2,24-2,35 (m, 6H), 2,78-2,87 (m, 2H), 4,00 (d, J=5,50 Гц, 2H), 4,08 (t, J=6,79 Гц, 2H).
[0160] (Синтез катионного липида (12))
[Пример A-12]
2-{9-оксо-9-[(4-пентилнонил)окси]нонил}додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат (катионный липид 12)
Согласно способу в примере получения 2 указанное в заголовке соединение (212 мг, 0,32 ммоль) получали из соединения (200 мг, 0,42 ммоль), полученного в примере A-2-(6), соединения (115 мг, 0,60 ммоль), полученного в примере получения 7-(2), EDC (98 мг, 0,51 ммоль), DMAP (10 мг, 0,09 ммоль) и метиленхлорида (10 мл).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,85-0,92 (m, 9H), 1,16-1,34 (m, 49H), 1,51-1,66 (m, 5H), 1,73-1,84 (m, 2H), 1,86-1,94 (m, 2H), 1,95-2,05 (m, 2H), 2,23-2,31 (m, 6H), 2,75-2,85 (m, 2H), 3,98 (d, J=5,50 Гц, 2H), 4,04 (t, J=6,79 Гц, 2H).
[0161] (Синтез катионного липида (13))
[Пример A-13]
2-(4-оксо-4-(тридецилокси)бутил)додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат (катионный липид 13)
[0162] (1) Синтез 4-бензил-1,1-ди-трет-бутилбутан-1,1,4-трикарбоксилата
Суспендировали 60% гидрид натрия (1,05 г, 26,2 ммоль) в THF (50 мл), куда добавляли по каплям ди-трет-бутилмалонат (5,86 мл, 26,2 ммоль) при охлаждении льдом, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут. При охлаждении льдом добавляли йодид натрия (0,37 г, 2,49 ммоль), затем добавляли по каплям соединение (6,41 г, 24,9 ммоль), полученное в примере получения 8, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Реакционную смесь разбавляли диэтиловым эфиром и промывали водой и затем водный слой экстрагировали диэтиловым эфиром. Органические слои объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (9,88 г, 25,2 ммоль).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 1,42-1,49 (m, 18H), 1,65-1,72 (m, 2H), 1,80-1,87 (m, 2H), 2,39 (t, J=7,52 Гц, 2H), 3,13 (t, J=7,52 Гц, 1H), 5,11 (s, 2H), 7,29-7,40 (m, 5H).
[0163] (2) Синтез 1-бензил-4,4-ди-трет-бутилтетрадекан-1,4,4-трикарбоксилата
Растворяли соединение (9,88 г, 25,2 ммоль), полученное в примере A-13-(1), в THF (100 мл), куда добавляли 60% гидрид натрия (1,51 г, 37,8 ммоль) при охлаждении водой, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Постепенно добавляли 1-йододекан (10,7 мл, 50,4 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. В реакционную смесь добавляли насыщенный водный раствор хлорида аммония и экстрагировали н-пентаном. Органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (н-гептан/диэтиловый эфир) с получением указанного в заголовке соединения (4,31 г, 8,09 ммоль).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,85-0,91 (m, 3H), 1,07-1,17 (m, 2H), 1,21-1,33 (m, 16H), 1,44 (s, 18H), 1,49-1,54 (m, 2H), 1,74-1,84 (m, 4H), 2,36 (t, J=7,34 Гц, 2H), 5,11 (s, 2H), 7,28-7,38 (m, 5H).
[0164] (3) Синтез 2-[4-(бензилокси)-4-оксобутил]додекановой кислоты
Растворяли соединение (4,31 г, 8,09 ммоль), полученное в примере A-13-(2), в метиленхлориде (20 мл), куда добавляли по каплям TFA (10 мл) при охлаждении льдом, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с последующим добавлением толуола и проведением азеотропной перегонки дважды. Полученный неочищенный продукт растворяли в ксилоле (25 мл) и подвергали перегонке с обратным холодильником при нагревании в течение 8 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (циклогексан/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (2,74 г, 7,28 ммоль).
1
H-ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ (ppm): 0,82-0,89 (m, 3H), 1,17-1,31 (m, 16H), 1,32-1,42 (m, 3H), 1,43-1,57 (m, 4H), 2,16-2,22 (m, 1H), 2,32-2,38 (m, 2H), 5,08 (s, 2H), 7,29-7,40 (m, 5H), 12,06 (br s, 1H).
[0165] (4) Синтез бензил-5-(гидроксиметил)пентадеканоата
Растворяли соединение (2,74 г, 7,28 ммоль), полученное в примере A-13-(3), в THF (30 мл), куда добавляли по каплям комплекс боран-THF (1 М, 16,9 мл, 16,9 ммоль) при -78°C. Смесь перемешивали при 0°C в течение 8 часов и затем при 15°C в течение 22 часов. В смесь добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и экстрагировали диэтиловым эфиром. Органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (циклогексан/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (2,30 г, 6,34 ммоль).
1
H-ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ (ppm): 0,85 (t, J=6,88 Гц, 3H), 1,08-1,37 (m, 18H), 1,49-1,58 (m, 2H), 2,27-2,36 (m, 2H), 3,21-3,29 (m, 2H), 4,28 (t, J=5,14 Гц, 1H), 5,01-5,12 (m, 2H), 7,30-7,40 (m, 5H).
[0166] (5) Синтез 2-(4-(бензилокси)-4-оксобутил)додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилата
Растворяли соединение (2,30 г, 6,34 ммоль), полученное в примере A-13-(4), DIPEA (2,2 мл, 12,7 ммоль), 1-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты гидрохлорид (2,28 г, 12,7 ммоль) и DMAP (0,16 г, 1,27 ммоль) в метиленхлориде (30 мл), куда добавляли EDC (2,68 г, 13,9 ммоль) при охлаждении льдом, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и растворяли в диэтиловом эфире. Раствор серийно промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и водой и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (2,97 г, 6,09 ммоль).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,88 (t, J=7,06 Гц, 3H), 1,17-1,38 (m, 21H), 1,60-1,70 (m, 3H), 1,77-1,87 (m, 2H), 1,89-1,99 (m, 2H), 2,23-2,38 (m, 6H), 2,74-2,91 (m, 2H), 3,94-4,02 (m, 2H), 5,09-5,13 (m, 2H), 7,30-7,41 (m, 5H).
[0167] (6) Синтез 5-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}пентадекановой кислоты
Растворяли соединение (2,97 г, 6,09 ммоль), полученное в примере A-13-(5), в этилацетате (35 мл), куда добавляли 10% палладий на угле (0,65 г, 0,61 ммоль, содержащий 50% воды) при комнатной температуре, и смесь перемешивали в атмосфере водорода при нормальном давлении в течение 3 часов. Реакционный раствор фильтровали и промывали этилацетатом. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (2,31 г, 5,81 ммоль).
1
H-ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ (ppm): 0,85 (t, J=6,88 Гц, 3H), 1,21-1,32 (m, 20H), 1,44-1,66 (m, 5H), 1,75-1,83 (m, 2H), 1,95-1,98 (m, 1H), 1,99-2,06 (m, 1H), 2,13-2,23 (m, 5H), 2,23-2,30 (m, 1H), 2,64-2,77 (m, 2H), 3,88-3,97 (m, 2H).
[0168] (7) Синтез 2-(4-оксо-4-(тридецилокси)бутил)додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилата
Растворяли соединение (200 мг, 0,50 ммоль), полученное в примере A-13-(6), тридекан-1-ол (121 мг, 0,60 ммоль) и DMAP (12 мг, 0,10 ммоль) в метиленхлориде (5 мл), куда добавляли EDC (116 мг, 0,60 ммоль) при комнатной температуре, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Реакционную смесь очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (метанол/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (170 мг, 0,29 ммоль).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,88 (t, J=6,7 Гц, 6H), 1,26 (br s, 41H), 1,57-1,69 (m, 6H), 1,73-1,82 (m, 2H), 1,90 (br dd, J=13,5, 3,03 Гц, 2H), 1,94-2,04 (m, 2H), 2,22-2,34 (m, 6H), 2,67-2,90 (br d, J=9,8 Гц, 2H), 3,95-4,02 (m, 2H), 4,03-4,08 (t, J=6,8 Гц, 2H).
[0169] (Синтез катионного липида (14))
[Пример A-14]
2-(4-оксо-4-((8-пентилтридецил)окси)бутил)додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат (катионный липид 14)
Согласно способу в примере A-13-(7) указанное в заголовке соединение (133 мг, 0,21 ммоль) получали из соединения (120 мг, 0,30 ммоль), полученного в примере A-13-(6), соединения (90 мг, 0,33 ммоль), полученного в примере получения 4-(4), EDC (64 мг, 0,33 ммоль), DMAP (4,0 мг, 0,033 ммоль) и метиленхлорида (1,5 мл).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDOD) δ (ppm): 0,87-0,97 (m, 9H), 1,18-1,45 (m, 47H), 1,60-1,73 (m, 5H), 1,73-1,83 (m, 2H), 1,88-1,99 (m, 2H), 2,06-2,19 (m, 2H), 2,23-2,43 (m, 6H), 2,77-2,89 (m, 2H), 3,99-4,15 (m, 4H).
[0170] (Синтез катионного липида (15))
[Пример A-15]
2-{4-[(4-нонилтридецил)окси]-4-оксобутил}додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат (катионный липид 15)
Согласно способу в примере A-13-(7) указанное в заголовке соединение (106 мг, 0,15 ммоль) получали из соединения (110 мг, 0,28 ммоль), полученного в примере A-13-(6), соединения (99 мг, 0,30 ммоль), полученного в примере получения 5-(4), EDC (58 мг, 0,30 ммоль), DMAP (4,0 мг, 0,033 ммоль) и метиленхлорида (1,3 мл).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDOD) δ (ppm): 0,85-0,99 (m, 9H), 1,15-1,44 (m, 55H), 1,56-1,84 (m, 7H), 1,94 (m, J=13,2 Гц, 2H), 2,06-2,19 (m, 2H), 2,23-2,44 (m, 6H), 2,76-2,90 (m, 2H), 3,96-4,14 (m, 4H).
[0171] (Синтез катионного липида (16))
[Пример A-16]
диоктил-9-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}гептадекандиоат (катионный липид 16)
[0172] (1) Синтез 9-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}гептадекандикарбоновой кислоты
Растворяли соединение (0,80 г, 1,25 ммоль), полученное в примере A-4-(5), в этаноле (5 мл), куда добавляли 10% палладий на угле (0,13 г, 0,13 ммоль, содержащий 50% воды) при комнатной температуре, и смесь перемешивали в атмосфере водорода при нормальном давлении в течение 18 часов. Реакционный раствор фильтровали через целит и промывали этанолом. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (0,58 г, 1,26 ммоль).
1
H-ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ (ppm): 1,17-1,30 (m, 20H), 1,43-1,52 (m, 4H), 1,52-1,62 (m, 3H), 1,77-1,82 (m, 2H), 1,92-2,03 (m, 2H), 2,12-2,22 (m, 7H), 2,23-2,33 (m, 1H), 2,66-2,75 (m, 2H), 3,93 (d, J=5,50 Гц, 2H).
[0173] (2) Синтез диоктил-9-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}гептадекандиоата
Растворяли соединение (100 мг, 0,22 ммоль), полученное в примере A-16-(1), октан-1-ол (83 мкл, 0,53 ммоль) и DMAP (11 мг, 0,09 ммоль) в метиленхлориде (5 мл), куда добавляли EDC (101 мг, 0,53 ммоль) при комнатной температуре, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и затем очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (метанол/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (101 мг, 0,15 ммоль).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,83-0,92 (m, 6H), 1,21-1,39 (m, 40H), 1,55-1,66 (m, 9H), 1,72-1,83 (m, 2H), 1,85-1,95 (m, 2H), 1,95-2,06 (m, 2H), 2,22-2,33 (m, 8H), 2,75-2,87 (m, 2H), 3,97 (d, J=5,69 Гц, 2H), 4,05 (t, J=6,69 Гц, 4H).
[0174] (Синтез катионного липида (17))
[Пример A-17]
бис(4-пентилнонил)-9-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}гептадекандиоат (катионный липид 17)
Согласно способу в примере A-16-(2) указанное в заголовке соединение (0,23 г, 0,27 ммоль) получали из соединения (0,20 г, 0,44 ммоль), полученного в примере A-16-(1), соединения (0,23 г, 1,05 ммоль), полученного в примере получения 7-(2), EDC (0,20 г, 1,05 ммоль), DMAP (11 мг, 0,09 ммоль) и метиленхлорида (5 мл).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,88 (t, J=7,24 Гц, 12H), 1,17-1,35 (m, 58H), 1,58-1,65 (m, 9H), 1,73-1,83 (m, 2H), 1,87-1,93 (m, 2H), 1,95-2,04 (m, 2H), 2,23-2,32 (m, 8H), 2,75-2,86 (m, 2H), 3,97 (d, J=5,50 Гц, 2H), 4,04 (t, J=6,79 Гц, 4H).
[0175] (Синтез катионного липида (18))
[Пример A-18]
ди-тридецил-5-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}нонандиоат (катионный липид 18)
[0176] (1) Синтез 1,7-дибензил-4,4-ди-трет-бутилгептан-1,4,4,7-тетракарбоксилата
Растворяли соединение (3,84 г, 9,78 ммоль), полученное в примере A-13-(1), в THF (30 мл), куда добавляли 60% гидрид натрия (0,43 г, 10,8 ммоль) при охлаждении водой, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Добавляли раствор бензил-4-бромбутаноата (3,02 г, 11,7 ммоль) в THF (10 мл) и подвергали перегонке с обратным холодильником при нагревании в течение 18 часов. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры и разбавляли диэтиловым эфиром. Органический слой последовательно промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (этилацетат/циклогексан) с получением указанного в заголовке соединения (1,88 г, 3,31 ммоль).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 1,43 (s, 18H), 1,47-1,54 (m, 4H), 1,78-1,85 (m, 4H), 2,36 (t, J=7,34 Гц, 4H), 5,10 (s, 4H), 7,27-7,40 (m, 10H).
[0177] (2) Синтез 6-(бензилокси)-2-[4-(бензилокси)-4-оксобутил]-6-оксогексановой кислоты
Согласно способу в примере A-13-(3) указанное в заголовке соединение (1,01 г, 2,45 ммоль) получали из соединения (1,88 г, 3,31 ммоль), полученного в примере A-18-(1), TFA (4 мл), метиленхлорида (8 мл) и ксилола (10 мл).
1
H-ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ (ppm): 1,31-1,58 (m, 8H), 2,19-2,25 (m, 1H), 2,33-2,37 (m, 4H), 5,05-5,11 (m, 4H), 7,27-7,40 (m, 10H), 12,14 (br s, 1H).
[0178] (3) Синтез дибензил-5-(гидроксиметил)нонандиоата
Растворяли соединение (1,01 г, 2,45 ммоль), полученное в примере A-18-(2), в THF (10 мл), куда добавляли по каплям комплекс боран-THF (1 М, 4,9 мл, 4,9 ммоль) при -78°C. Смесь перемешивали при 0°C в течение 16 часов, добавляли насыщенный водный раствор хлорида аммония и экстрагировали диэтиловым эфиром. Органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (циклогексан/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (0,59 г, 1,47 ммоль).
1
H-ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ (ppm): 1,09-1,37 (m, 6H), 1,48-1,56 (m, 4H), 2,32 (t, J=7,34 Гц, 4H), 3,26 (t, J=5,23 Гц, 2H), 4,32 (t, J=5,14 Гц, 1H), 5,08 (s, 4H), 7,28-7,41 (m, 10H).
[0179] (4) Синтез дибензил-5-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}нонандиоата
Согласно способу в примере A-13-(5) указанное в заголовке соединение (0,62 г, 1,19 ммоль) получали из соединения (0,58 г, 1,47 ммоль), полученного в примере A-18-(3), DIPEA (0,51 мл, 2,95 ммоль), 1-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты гидрохлорида (0,52 г, 2,95 ммоль), DMAP (36 мг, 0,30 ммоль), EDC (0,62 г, 3,24 ммоль) и метиленхлорида (7 мл).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 1,27-1,38 (m, 4H), 1,59-1,69 (m, 5H), 1,70-1,81 (m, 2H), 1,85-1,92 (m, 2H), 1,92-2,02 (m, 2H), 2,26 (s, 4H), 2,33 (t, J=7,34 Гц, 4H), 2,74-2,83 (m, 2H), 3,97 (d, J=5,69 Гц, 2H), 5,11 (s, 4H), 7,28-7,39 (m, 10H).
[0180] (5) Синтез 5-[{(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси}метил]нонандикарбоновой кислоты
Согласно способу в примере A-16-(1) указанное в заголовке соединение (0,41 г, 1,19 ммоль) получали из соединения (0,62 г, 1,19 ммоль), полученного в примере A-18-(4), с применением 10% палладия на угле (62 мг, 0,06 ммоль, содержащий 50% воды) и этанола (2 мл).
1
H-ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ (ppm): 1,20-1,31 (m, 4H), 1,44-1,66 (m, 7H), 1,72-1,81 (m, 4H), 1,88-1,97 (m, 2H), 2,13 (s, 3H), 2,16-2,22 (m, 4H), 2,22-2,30 (m, 1H), 2,64-2,71 (m, 2H), 3,93 (d, J=5,32 Гц, 2H).
[0181] (6) Синтез ди-тридецил-5-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}нонандиоата
Согласно способу в примере A-13-(7) указанное в заголовке соединение (107 мг, 0,15 ммоль) получали из соединения (135 мг, 0,39 ммоль), полученного в примере A-18-(5), тридекан-1-ола (189 мг, 0,94 ммоль), DMAP (9 мг, 0,08 ммоль), EDC (166 мг, 0,87 ммоль) и метиленхлорида (5 мл).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,88 (t, J=7,06 Гц, 6H), 1,20-1,41 (m, 45H), 1,58-1,71 (m, 9H), 1,71-1,82 (m, 2H), 1,86-1,94 (m, 2H), 1,95-2,04 (m,2H), 2,23-2,30 (m, 8H), 2,77-2,83 (m, 2H), 4,00 (d, J=5,5 Гц, 2H), 4,05 (t, J=6,88 Гц, 4H).
[0182] (Синтез катионного липида (19))
[Пример A-19]
бис(8-пентилтридецил)-5-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}нонандиоат (катионный липид 19)
Согласно способу в примере A-13-(7) указанное в заголовке соединение (79 мг, 0,09 ммоль) получали из соединения (80 мг, 0,23 ммоль), полученного в примере A-18-(5), соединения (151 мг, 0,56 ммоль), полученного в примере получения 4-(4), DMAP (6 мг, 0,05 ммоль), EDC (98 мг, 0,51 ммоль) и метиленхлорида (5 мл).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,88 (t, J=7,24 Гц, 12H), 1,15-1,40 (m, 60H), 1,59-1,71 (m, 10H), 1,72-1,82 (m, 2H), 1,86-1,94 (m, 2H), 1,94-2,04 (m, 2H), 2,23-2,32 (m, 8H), 2,77-2,85 (m, 2H), 4,00 (d, J=5,5 Гц, 2H), 4,05 (t, J=6,88 Гц, 4H).
[0183] (Синтез катионного липида (20))
[Пример A-20]
бис(4-нонилтридецил)-5-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}нонандиоат (катионный липид 20)
Согласно способу в примере A-13-(7) указанное в заголовке соединение (46 мг, 0,05 ммоль) получали из соединения (80 мг, 0,23 ммоль), полученного в примере A-18-(5), соединения (198 мг, 0,61 ммоль), полученного в примере получения 5-(4), DMAP (6 мг, 0,05 ммоль), EDC (98 мг, 0,51 ммоль) и метиленхлорида (5 мл).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,88 (t, J=6,97 Гц, 12H), 1,17-1,41 (m, 77H), 1,57-1,72 (m, 9H), 1,72-1,81 (m, 2H), 1,85-1,94 (m, 2H), 1,94-2,03 (m, 2H), 2,23-2,31 (m, 8H), 2,80 (m, J=10,50 Гц, 2H), 4,00 (d, J=5,50 Гц, 2H), 4,03 (t, J=6,88 Гц, 4H).
[0184] (Синтез катионного липида (21))
[Пример A-21]
диундецил-7-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}тридекандиоат (катионный липид 21)
[0185] (1) Синтез 6-бензил-1,1-ди-трет-бутилгексан-1,1,6-трикарбоксилата
Суспендировали 60% гидрид натрия (0,80 г, 20,0 ммоль) в THF (35 мл), куда добавляли по каплям ди-трет-бутилмалонат (4,48 мл, 20,0 ммоль) при охлаждении льдом, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. При охлаждении льдом добавляли йодид натрия (0,29 г, 1,90 ммоль) и затем добавляли по каплям раствор соединения (5,43 г, 19,0 ммоль), полученного в примере получения 9, в THF (10 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Реакционную смесь экстрагировали диэтиловым эфиром и промывали водой и водный слой разбавляли диэтиловым эфиром. Органические слои объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (циклогексан/этилацетат) с получением указанного в заголовке соединения (6,01 г, 14,3 ммоль).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 1,27-1,38 (m, 4H), 1,45 (s, 18H), 1,62-1,68 (m, 2H), 1,73-1,82 (m, 2H), 2,35 (t, J=7,52 Гц, 2H), 3,09 (t, J=7,61 Гц, 1H), 5,11 (s, 2H), 7,29-7,40 (m, 5H).
[0186] (2) Синтез 1,11-дибензил-6,6-ди-трет-бутилундекан-1,6,6,11-тетракарбоксилата
Согласно способу в примере A-18-(1) указанное в заголовке соединение (5,18 г, 8,29 ммоль) получали из соединения (4,0 г, 9,51 ммоль), полученного в примере A-21-(1), 60% гидрида натрия (0,42 г, 10,5 ммоль), соединения (3,25 г, 11,4 ммоль), полученного в примере получения 9, и THF (30 мл).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 1,09-1,19 (m, 4H), 1,28-1,36 (m, 5H), 1,43 (s, 18H), 1,60-1,69 (m, 4H), 1,72-1,80 (m, 4H), 2,34 (t, J=7,52 Гц, 4H), 5,05-5,15 (m, 4H), 7,28-7,41 (m, 9H).
[0187] (3) Синтез 8-(бензилокси)-2-[6-(бензилокси)-6-оксогексил]-8-оксооктановой кислоты
Согласно способу в примере A-13-(3) указанное в заголовке соединение (2,49 г, 5,31 ммоль) получали из соединения (5,18 г, 8,29 ммоль), полученного в примере A-21-(2), TFA (10 мл), метиленхлорида (20 мл) и ксилола (25 мл).
1
H-ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ (ppm): 1,15-1,57 (m, 16H), 2,11-2,20 (m, 1H), 2,33 (t, J=7,34 Гц, 4H), 5,08 (s, 4H), 7,23-7,43 (m, 10H), 12,01 (br s, 1H).
[0188] (4) Синтез дибензил-7-(гидроксиметил)тридекандиоата
Согласно способу в примере A-18-(3) указанное в заголовке соединение (1,95 г, 4,29 ммоль) получали из соединения (2,49 г, 5,31 ммоль), полученного в примере A-21-(3), комплекса боран-THF (1 М, 13,2 мл, 13,2 ммоль) и THF (20 мл).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 1,11-1,36 (m, 13H), 1,39-1,46 (m, 1H), 1,60-1,70 (m, 4H), 2,35 (t, J=7,52 Гц, 4H), 3,51 (d, J=5,32 Гц, 2H), 5,11 (s, 4H), 7,29-7,40 (m, 10H).
[0189] (5) Синтез дибензил-7-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}тридекандиоата
Согласно способу в примере A-13-(5) указанное в заголовке соединение (2,97 г, 6,09 ммоль) получали из соединения (1,95 г, 4,29 ммоль), полученного в примере A-21-(4), DIPEA (1,5 мл, 8,58 ммоль), 1-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты гидрохлорида (1,54 г, 8,58 ммоль), DMAP (0,11 г, 0,86 ммоль), EDC (1,81 г, 9,44 ммоль) и метиленхлорида (20 мл).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 1,22-1,35 (m, 12H), 1,61-1,68 (m, 4H), 1,70-1,84 (m, 3H), 1,85-1,93 (m, 2H), 1,95-2,06 (m, 2H), 2,21-2,30 (m, 4H), 2,35 (t, J=7,52 Гц, 4H), 2,74-2,85 (m, 2H), 3,96 (d, J=5,50 Гц, 2H), 5,11 (s, 4H), 7,29-7,39 (m, 10H).
[0190] (6) Синтез 7-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}тридекандикарбоновой кислоты
Согласно способу в примере A-16-(1) указанное в заголовке соединение (1,34 г, 3,35 ммоль) получали из соединения (2,28 г, 3,93 ммоль), полученного в примере A-21-(5), с применением 10% палладия на угле (0,42 г, 0,39 ммоль, содержащий 50% воды) и этанола (20 мл).
1
H-ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ (ppm): 1,19-1,30 (m, 12H), 1,44-1,53 (m, 4H), 1,53-1,63 (m, 3H), 1,72-1,81 (m, 2H), 1,90-1,98 (m, 2H), 2,14 (s, 3H), 2,18 (t, J=7,43 Гц, 4H), 2,23-2,31 (m, 1H), 2,64-2,73 (m, 2H), 3,93 (d, J=5,50 Гц, 2H).
[0191] (7) Синтез диундецил-7-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}тридекандиоата
Растворяли соединение (200 мг, 0,50 ммоль), полученное в примере A-21-(6), ундекан-1-ол (83 мкл, 1,20 ммоль) и DMAP (24 мг, 0,20 ммоль) в метиленхлориде (10 мл), куда добавляли EDC (230 мг, 1,20 ммоль) при комнатной температуре, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. В смесь добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и экстрагировали метиленхлоридом и затем органический слой концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (этилацетат/циклогексан/метанол) с получением указанного в заголовке соединения (220 мг, 0,32 ммоль).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,88 (t, J=7,06 Гц, 6H), 1,19-1,39 (m, 44H), 1,57-1,68 (m, 9H) 1,71-1,86 (m, 2H), 1,84-1,95 (m, 2H), 1,95-2,06 (m, 2H), 2,21-2,34 (m, 8H), 2,75-2,87 (m, 2H), 3,97 (d, J=5,69 Гц, 2H), 4,05 (t, J=6,79 Гц, 4H).
[0192] (Синтез катионного липида (22))
[Пример A-22]
бис(4-гептилундецил)-7-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}тридекандиоат (катионный липид 22)
Согласно способу в примере A-16-(2) указанное в заголовке соединение (88 мг, 0,10 ммоль) получали из соединения (200 мг, 0,25 ммоль) полученного в примере A-21-(6), соединения (160 мг, 0,60 ммоль), полученного в примере получения 6-(2), DMAP (12 мг, 0,10 ммоль), EDC (120 мг, 0,60 ммоль) и метиленхлорида (5 мл).
1
3
H-ЯМР (600 МГц, CDCl) δ (ppm): 0,88 (t, J=6,97 Гц, 12H), 1,11-1,36 (m, 66H), 1,49-1,67 (m, 9H), 1,71-1,84 (m, 2H), 1,84-1,95 (m, 2H), 1,95-2,05 (m, 2H), 2,21-2,33 (m, 8H), 2,74-2,88 (m, 2H), 3,97 (d, J=5,50 Гц, 2H), 4,04 (t, J=6,88 Гц, 4H).
[0193] Синтезированные катионные липиды 1-22 представлены в таблице A ниже.
[Таблица A-1]
Таблица A: синтезированные катионные липиды 1-22
Структура
Катионный липид 1:2-{9-[(2-бутилоктил)окси]-9-оксононил}-додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат
<img file="00000094.jpg" he="40" wi="85" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Катионный липид 2:2-{9-оксо-9-[(3-пентилоктил)окси]нонил}-додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат
<img file="00000095.jpg" he="38" wi="88" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Катионный липид 3:2-нонил-11-оксо-11-[(3-пентилоктил)-окси]ундецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат
<img file="00000096.jpg" he="42" wi="85" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Катионный липид 4:бис(3-пентилоктил)-9-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)-окси]метил}гептадекандиоат
<img file="00000097.jpg" he="50" wi="89" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Катионный липид 5:ди[(Z)-2-нонен-1-ил]-9-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)-окси]метил}гептадекандиоат
<img file="00000098.jpg" he="44" wi="89" img-content="undefined" img-format="jpg" />
[Таблица A-2]
Катионный липид 6:(1R,5S,6r)-2-{9-[(2-бутилоктил)окси]-9-оксононил}додецил-3-метил-3-азабицикло[3.1.0]-гексан-6-карбоксилат
<img file="00000099.jpg" he="45" wi="97" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Катионный липид 7:(1R,5S,6s)-2-{9-[(2-бутилоктил)окси]-9-оксононил}додецил-3-метил-3-азабицикло[3.1.0]-гексан-6-карбоксилат
<img file="00000100.jpg" he="44" wi="97" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Катионный липид 8:2-{9-[(2-бутилоктил)окси]-9-оксононил}-додецил-4-метилпиперазин-1-карбоксилат
<img file="00000101.jpg" he="39" wi="92" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Катионный липид 9:2-[9-(гексилокси)-9-оксононил]додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат
<img file="00000102.jpg" he="43" wi="79" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Катионный липид 10:2-[9-(октилокси)-9-оксононил]додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат
<img file="00000103.jpg" he="44" wi="88" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Катионный липид 11:2-[9-(децилокси)-9-оксононил]додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат
<img file="00000104.jpg" he="43" wi="94" img-content="undefined" img-format="jpg" />
[Таблица A-3]
Катионный липид 12:2-{9-оксо-9-[(4-пентилнонил)окси]-нонил}додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат
<img file="00000105.jpg" he="42" wi="91" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Катионный липид 13:2-(4-оксо-4-(тридецилокси)бутил)додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат
<img file="00000106.jpg" he="56" wi="121" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Катионный липид 14:2-(4-оксо-4-((8-пентилтридецил)окси)-бутил)додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат
<img file="00000107.jpg" he="43" wi="95" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Катионный липид 15:2-{4-[(4-нонилтридецил)окси]-4-оксобутил}додецил-1-метилпиперидин-4-карбоксилат
<img file="00000108.jpg" he="59" wi="122" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Катионный липид 16:диоктил-9-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}-гептадекандиоат
<img file="00000109.jpg" he="63" wi="121" img-content="undefined" img-format="jpg" />
[Таблица A-4]
Катионный липид 17:бис(4-пентилнонил)-9-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}-гептадекандиоат
<img file="00000110.jpg" he="68" wi="119" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Катионный липид 18:дитридецил-5-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}нонандиоат
<img file="00000111.jpg" he="62" wi="122" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Катионный липид 19:бис(8-пентилтридецил)-5-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}нонандиоат
<img file="00000112.jpg" he="70" wi="120" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Катионный липид 20:бис(4-нонилтридецил)-5-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}нонандиоат
<img file="00000113.jpg" he="70" wi="123" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Катионный липид 21:диундецил-7-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)окси]метил}тридекандиоат
<img file="00000114.jpg" he="62" wi="121" img-content="undefined" img-format="jpg" />
[Таблица A-5]
Катионный липид 22:бис(4-гептилундецил)-7-{[(1-метилпиперидин-4-карбонил)-окси]метил}тридекандиоат
<img file="00000115.jpg" he="69" wi="120" img-content="undefined" img-format="jpg" />
[0194] B. Получение и анализ композиций
(Получение композиций (1))
[Пример B-1]
Композицию получали с помощью катионного липида 1 из примера A-1. В качестве нуклеиновой кислоты применяли отожженную siRNA (GeneDesign Inc., далее в данном документе также называется «siRNA фактора VII»), которая подавляет экспрессию гена фактора VII (фактора свертывания крови VII) и состоит из смысловой цепи, характеризующейся последовательностью оснований: 5'-GGAfUfCAfUfCfUfCAAGfUfCfUfUAfCT*T-3' (T: ДНК, fU, fC= 2'-фтор-РНК, *= фосфотиоатная связь) (SEQ ID NO: 1), и антисмысловой цепи, характеризующейся последовательностью оснований: 5'-GfUAAGAfCfUfUGAGAfUGAfUfCfCT*T-3' (T: ДНК, fU, fC= 2'-фтор-РНК, *= фосфотиоатная связь) (SEQ ID NO: 2).
[0195] Растворяли siRNA фактора VII в 25 мМ ацетата натрия (pH 4,0) при 80 мкг/мл с получением разбавленного раствора siRNA. Растворяли катионный липид 1, DSPC (Nippon Fine Chemical Co., Ltd.), холестерин (Nippon Fine Chemical Co., Ltd.), MPEG2000-DMG (NOF Corporation) в этаноле при соотношении 60/8,5/30/1,5 (молярное соотношение) так, что общая концентрация липидов составляла 7,2 мМ, и затем получали липидный раствор. Подавали разбавленный раствор siRNA и липидный раствор и смешивали при значениях расхода 3 мл/мин. и 1 мл/мин. соответственно с получением водного раствора липидного комплекса. Полученный водный раствор липидного комплекса подвергали диализу с применением диализной мембраны (торговое название «Float-A-Lyzer G2», SPECTRUM, Inc., 50K MWCO) с заменой внешнего раствора на фосфатный буфер (PBS, pH 7,4). После диализа проводили концентрирование и стерилизацию фильтрованием с получением, таким образом, жидкой композиции из примера B-1.
[0196] [Пример B-2]
Композицию из примера B-2 получали таким же образом, как и в примере B-1, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 2 из примера A-2 вместо катионного липида 1.
[0197] [Пример B-3]
Композицию из примера B-3 получали таким же образом, как и в примере B-1, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 3 из примера A-3 вместо катионного липида 1.
[0198] [Пример B-4]
Композицию из примера B-4 получали таким же образом, как и в примере B-1, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 4 из примера A-4 вместо катионного липида 1.
[0199] [Пример B-5]
Композицию из примера B-5 получали таким же образом, как и в примере B-1, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 5 из примера A-5 вместо катионного липида 1.
[0200] [Пример B-6]
Композицию из примера B-6 получали таким же образом, как и в примере B-1, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 6 из примера A-6 вместо катионного липида 1.
[0201] [Пример B-7]
Композицию из примера B-7 получали таким же образом, как и в примере B-1, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 7 из примера A-7 вместо катионного липида 1.
[0202] [Пример B-8]
Композицию из примера B-8 получали таким же образом, как и в примере B-1, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 8 из примера A-8 вместо катионного липида 1.
[0203] [Сравнительный пример B-1]
Композицию из сравнительного примера B-1 получали таким же способом, как и в примере B-1, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли ди((Z)-нон-2-ен-1-ил)-9-((4-(диметиламино)бутаноил)окси)гептадекандиоат (далее в данном документе также называемый "ALN-319"), представленный формулой (12) ниже, раскрытый в патентном литературном источнике 2, и который синтезировали в соответствии со способом, раскрытым в патентном литературном источнике 2, вместо катионного липида 1.
[0204]
[0205] (Анализ композиций (1))
В композициях из примеров от примера B-1 до примера B-8 и из сравнительного примера B-1 измеряли степень инкапсуляции siRNA в липидные комплексы.
[0206] В частности, концентрацию siRNA (A), измеренную с помощью РНК-реагента Quant-iT RiboGreen (Invitrogen) после разбавления композиции водой, не содержащей РНКазы, принимали за концентрацию siRNA, присутствующей во внешнем растворе липидного комплекса. Концентрацию siRNA (B), измеренную после разбавления композиции с помощью 1% Triton X-100, принимали за общую концентрацию siRNA в композиции. После этого рассчитывали степень инкапсуляции нуклеиновой кислоты согласно формуле (F1) ниже.
Степень инкапсуляции (%)=100-(A/B)×100 (F1)
[0207] Средний диаметр частиц в липидных комплексах измеряли с применением анализатора диаметра частиц (торговое название «Zetasizer Nano ZS», изготовлен Malvern Panalytical Ltd.).
[0208] В таблице 1 приведены степень инкапсуляции siRNA, средний диаметр частиц (Z-среднее значение) и индекс полидисперсности липидных комплексов.
[0209]
[Таблица 1]
Таблица 1
Композиция
Катионный липид
Степень инкапсуляции (%)
Средний диаметр частиц (нм)
Индекс полидисперсности
Пример B-1
1
98
87
0,11
Пример B-2
2
98
78
0,09
Пример B-3
3
98
77
0,10
Пример B-4
4
99
86
0,11
Пример B-5
5
96
76
0,14
Пример B-6
6
91
69
0,17
Пример B-7
7
96
69
0,14
Пример B-8
8
97
69
0,14
Сравнительный пример B-1
ALN-319
98
84
0,11
Установлено, что композиции из примеров от примера B-1 до примера B-8 проявляют высокие значения степени инкапсуляции siRNA, эквивалентные таковой для композиции из сравнительного примера B-1.
[0210] (Получение композиций (2))
[Пример B-9]
Композицию получали с помощью катионного липида 1 из примера A-1. В качестве нуклеиновой кислоты применяли mRNA люциферазы светлячка (FLuc) (TriLink Biotechnologies, далее в данном документе также называется «mRNA FLuc»).
[0211] mRNA FLuc растворяли в 50 мМ ацетате натрия (pH 4,0) при 27 мкг/мл с получением разбавленного раствора mRNA. Растворяли катионный липид 1, DSPC (Nippon Fine Chemical Co., Ltd.), холестерин (NNippon Fine Chemical Co., Ltd.), MPEG2000-DMG (NOF Corporation) в этаноле при соотношении 60/8,5/30/1,5 (молярное соотношение) тка, что общая концентрация липидов составляла 2,4 мМ, и получали липидный раствор. Подавали разбавленный раствор mRNA и липидный раствор и смешивали при значениях расхода 3 мл/мин. и 1 мл/мин. соответственно с получением водного раствора липидного комплекса. Полученный водный раствор липидного комплекса подвергали диализу с применением диализной мембраны (торговое название «Float-A-Lyzer G2», SPECTRUM, Inc., 50K MWCO) с заменой внешнего раствора на фосфатный буфер (PBS, pH 7,4). После диализа проводили концентрирование и стерилизацию фильтрованием с получением, таким образом, композиции из примера B-9.
[0212] [Пример B-10]
Композицию из примера B-10 получали таким же образом, как и в примере B-9, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 2 из примера A-2 вместо катионного липида 1.
[0213] [Сравнительный пример B-2]
Композицию из сравнительного примера B-2 получали таким же образом, как и в примере B-9, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли ALN-319, описанный выше, вместо катионного липида 1.
[0214] (Анализ композиций (2))
Так же, как и в анализе композиций (1), степень инкапсуляции mRNA в липидных комплексах и средний диаметр частиц в липидных комплексах измеряли для композиций из примера B-9, примера B-10 и сравнительного примера B-2. В таблице 2 приведены степень инкапсуляции mRNA и средний диаметр частиц (Z-среднее значение) в липидных комплексах.
[0215]
[Таблица 2]
Таблица 2
Композиция
Катионный липид
Степень инкапсуляции (%)
Средний диаметр частиц (нм)
Индекс полидисперсности
Пример B-9
1
94
104
0,06
Пример B-10
2
92
110
<0,01
Сравнительный пример B-2
ALN-319
95
125
0,04
Установлено, что композиции из примера B-9 и примера B-10 проявляют высокие значения степени инкапсуляции mRNA, эквивалентные таковой для композиции из сравнительного примера B-2.
[0216] (Получение композиций (3))
[Пример B-11]
Композицию получали с помощью катионного липида 2 из примера A-2. Композицию из примера B-11 получали таким же образом, как и в примере B-9, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 2 вместо катионного липида 1 и в качестве нуклеиновой кислоты применяли mRNA эритропоэтина человека (hEPO) (TriLink Biotechnologies, далее в данном документе также называется «mRNA EPO») вместо mRNA FLuc.
[0217] [Сравнительный пример B-3]
Композицию из сравнительного примера B-3 получали таким же образом, как и в примере B-11, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли ALN-319, описанный выше, вместо катионного липида 2.
[0218] (Анализ композиций (3))
Так же, как и в анализе композиций (1), степень инкапсуляции mRNA в липидных комплексах и средний диаметр частиц в липидных комплексах измеряли для композиций из примера B-11 и сравнительного примера B-3. В таблице 3 приведены степень инкапсуляции mRNA и средний диаметр частиц (Z-среднее значение) в липидных комплексах.
[0219]
[Таблица 3]
Таблица 3
Композиция
Катионный липид
Степень инкапсуляции (%)
Средний диаметр частиц (нм)
Индекс полидисперсности
Пример B-11
2
98
109
0,06
Сравнительный пример B-3
ALN-319
92
127
0,06
Установлено, что композиция из примера B-11 проявляет высокую степень инкапсуляции mRNA, эквивалентную таковой для композиции из сравнительного примера B-3.
[0220] (Получение композиций (4))
[Пример B-12]
Так же, как и при получении композиций (1), получали композицию из примера B-12, содержащую siRNA фактора VII, с применением катионного липида 1 из примера A-1.
[0221] [Пример B-13]
Композицию из примера B-13 получали таким же образом, как и в примере B-12, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 2 из примера A-2 вместо катионного липида 1.
[0222] [Сравнительный пример B-4]
Композицию из сравнительного примера B-4 получали таким же образом, как и в примере B-12, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли ALN-319, описанный выше, вместо катионного липида 1.
[0223] (Анализ композиций (4))
Так же, как и в анализе композиций (1), средний диаметр частиц (средний диаметр частиц перед хранением) в липидных комплексах измеряли для композиций из примера B-12, примера B-13 и сравнительного примера B-4. Далее композиции хранили в герметически закрытых пробирках при 4°C в течение 3 месяцев и измеряли средний диаметр частиц (средний диаметр частиц после хранения) в липидных комплексах. В таблице 4 приведено изменение среднего диаметра частиц (Z-среднее значение) в липидных комплексах. В таблице изменение (%) среднего диаметра частиц рассчитывали как средний диаметр частиц после хранения/средний диаметр частиц перед хранением × 100.
[0224]
[Таблица 4]
Таблица 4
Композиция
Катионный липид
Средний диаметр частиц перед хранением (нм)
Средний диаметр частиц после хранения (нм)
Изменение среднего диаметра частиц (%)
Пример B-12
1
91
96
105
Пример B-13
2
90
92
102
Сравнительный пример B-4
ALN-319
76
115
151
[0225] Было продемонстрировано, что композиции из примера B-12 и примера B-13 характеризовались показателями среднего диаметра частиц, которые практически не изменялись после хранения в течение 3 месяцев, и были физически более стабильными, чем композиция из сравнительного примера B-4.
[0226] (Получение композиций (5))
[Пример B-14]
Так же, как и при получении композиций (1), получали композицию из примера B-14, содержащую siRNA фактора VII, с применением катионного липида 9 из примера A-9.
[0227] [Пример B-15]
Композицию из примера B-15 получали таким же образом, как и в примере B-14, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 10 из примера A-10 вместо катионного липида 9.
[0228] [Пример B-16]
Композицию из примера B-16 получали таким же образом, как и в примере B-14, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 11 из примера A-11 вместо катионного липида 9.
[0229] [Пример B-17]
Композицию из примера B-17 получали таким же образом, как и в примере B-14, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 12 из примера A-12 вместо катионного липида 9.
[0230] [Пример B-18]
Композицию из примера B-18 получали таким же образом, как и в примере B-14, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 13 из примера A-13 вместо катионного липида 9.
[0231] [Пример B-19]
Композицию из примера B-19 получали таким же образом, как и в примере B-14, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 14 из примера A-14 вместо катионного липида 9.
[0232] [Пример B-20]
Композицию из примера B-20 получали таким же образом, как и в примере B-14, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 15 из примера A-15 вместо катионного липида 9.
[0233] [Пример B-21]
Композицию из примера B-21 получали таким же образом, как и в примере B-14, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 2 из примера A-2 вместо катионного липида 9.
[0234] (Анализ композиций (5))
Так же, как и в анализе композиций (1), степень инкапсуляции siRNA в липидных комплексах и средний диаметр частиц в липидных комплексах измеряли для композиций из примеров от примера B-14 до примера B-21. В таблице 5 приведены степень инкапсуляции siRNA, средний диаметр частиц (Z-среднее значение) и индекс полидисперсности липидных комплексов.
[0235]
[Таблица 5]
Таблица 5
Композиция
Катионный липид
Степень инкапсуляции (%)
Средний диаметр частиц (нм)
Индекс полидисперсности
Пример B-14
9
80
84
0,11
Пример B-15
10
94
78
0,14
Пример B-16
11
96
71
0,06
Пример B-17
12
98
78
0,16
Пример B-18
13
99
77
0,12
Пример B-19
14
99
73
0,05
Пример B-20
15
99
74
0,06
Пример B-21
2
99
87
0,16
[0236] (Получение композиций (6))
[Пример B-22]
Так же, как и при получении композиций (1), получали композицию из примера B-22, содержащую siRNA фактора VII, с применением катионного липида 16 из примера A-16.
[0237] [Пример B-23]
Композицию из примера B-23 получали таким же образом, как и в примере B-22, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 17 из примера A-17 вместо катионного липида 16.
[0238] [Пример B-24]
Композицию из примера B-24 получали таким же образом, как и в примере B-22, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 18 из примера A-18 вместо катионного липида 16.
[0239] [Пример B-25]
Композицию из примера B-25 получали таким же образом, как и в примере B-22, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 19 из примера A-19 вместо катионного липида 16.
[0240] [Пример B-26]
Композицию из примера B-26 получали таким же образом, как и в примере B-22, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 20 из примера A-20 вместо катионного липида 16.
[0241] [Пример B-27]
Композицию из примера B-27 получали таким же образом, как и в примере B-22, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 21 из примера A-21 вместо катионного липида 16.
[0242] [Пример B-28]
Композицию из примера B-28 получали таким же образом, как и в примере B-22, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 22 из примера A-22 вместо катионного липида 16.
[0243] [Пример B-29]
Композицию из примера B-29 получали таким же образом, как и в примере B-22, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 2 из примера A-2 вместо катионного липида 16.
(Анализ композиций (6))
Так же, как и в анализе композиций (1), степень инкапсуляции siRNA в липидных комплексах и средний диаметр частиц в липидных комплексах измеряли для композиций из примеров от примера B-22 до примера B-29. В таблице 6 приведены степень инкапсуляции siRNA, средний диаметр частиц (Z-среднее значение) и индекс полидисперсности липидных комплексов.
[0244]
[Таблица 6]
Таблица 6
Композиция
Катионный липид
Степень инкапсуляции (%)
Средний диаметр частиц (нм)
Индекс полидисперсности
Пример B-22
16
72
87
0,12
Пример B-23
17
97
80
0,08
Пример B-24
18
97
90
0,13
Пример B-25
19
97
78
0,18
Пример B-26
20
97
91
0,11
Пример B-27
21
96
90
0,13
Пример B-28
22
97
82
0,14
Пример B-29
2
99
87
0,16
[0245] (Получение композиций (7))
[Пример B-30]
Так же, как и при получении композиций (1), получали композицию из примера B-30, содержащую siRNA фактора VII, с применением катионного липида 1 из примера A-1.
[0246] [Пример B-31]
Композицию из примера B-31 получали таким же образом, как и в примере B-30, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 2 из примера A-2 вместо катионного липида 1.
[0247] [Пример B-32]
Композицию из примера B-32 получали таким же образом, как и в примере B-30, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 3 из примера A-3 вместо катионного липида 1.
[0248] [Пример B-33]
Композицию из примера B-33 получали таким же образом, как и в примере B-30, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли катионный липид 4 из примера A-4 вместо катионного липида 1.
[0249] [Сравнительный пример B-5]
Композицию из сравнительного примера B-5 получали таким же образом, как и в примере B-30, за исключением того, что в качестве катионного липида применяли ALN-319, описанный выше, вместо катионного липида 1.
[0250] (Анализ композиций (7))
Так же, как и в анализе композиций (1), средний диаметр частиц (средний диаметр частиц перед хранением) в липидных комплексах измеряли для композиций из примеров от примера B-30 до примера B-33 и сравнительного примера B-5. Далее композиции хранили в герметически закрытых пробирках при 4°C и измеряли средний диаметр частиц (средний диаметр частиц после хранения) в липидных комплексах через 3 месяца и 6 месяцев. В таблице 7 приведено изменение среднего диаметра частиц (Z-среднее значение) в липидных комплексах. В таблице изменение (%) среднего диаметра частиц рассчитывали как средний диаметр частиц после хранения (через 6 месяцев)/средний диаметр частиц перед хранением × 100.
[0251]
[Таблица 7]
Таблица 7
Композиция
Катионный липид
Перед хранением
Через 3 месяца
Через 6 месяцев
Изменение среднего диаметра частиц (%)
Средний диаметр частиц (нм)
Индекс полидисперсности
Средний диаметр частиц (нм)
Индекс полидисперсности
Средний диаметр частиц (нм)
Индекс полидисперсности
Пример B-30
1
87
0,11
88
0,09
91
0,12
105
Пример B-31
2
78
0,09
80
0,12
85
0,14
109
Пример B-32
3
77
0,10
79
0,12
83
0,12
108
Пример B-33
4
86
0,11
85
0,11
87
0,08
101
Сравнительный пример B-5
ALN-319
84
0,11
102
0,10
117
0,09
139
[0252] Было продемонстрировано, что композиции из примеров от примера B-30 до примера B-33 характеризовались показателями среднего диаметра частиц, которые практически не изменялись после хранения в течение 6 месяцев, и были физически более стабильными, чем композиция из сравнительного примера B-5.
[0253] (Получение композиций (8))
[Пример B-34]
Композицию получали с помощью катионного липида 2 из примера A-2. В качестве нуклеиновой кислоты применяли mRNA EPO.
[0254] Растворяли mRNA EPO в 10 мМ цитрате натрия (pH 4,0) при 80 мкг/мл с получением разбавленного раствора mRNA. Растворяли катионный липид 2, DOPE (NOF Corporation), холестерин (Nippon Fine Chemical Co., Ltd.), MPEG2000-DMG (NOF Corporation) в этаноле при соотношении 60/5,0/33,5/1,5 (молярное соотношение) так, что общая концентрация липидов составляла 2,25 мМ, и затем получали липидный раствор. Подавали разбавленный раствор mRNA и липидный раствор и смешивали при значениях расхода 3 мл/мин. и 1 мл/мин. соответственно с получением водного раствора липидного комплекса. Полученный водный раствор липидного комплекса подвергали диализу с применением диализной мембраны (торговое название «Float-A-Lyzer G2», SPECTRUM, Inc., 50K MWCO) с заменой внешнего раствора на фосфатный буфер (PBS, pH 7,4). После диализа проводили концентрирование и стерилизацию фильтрованием с получением, таким образом, композиции из примера B-34.
[0255] [Пример B-35]
Композицию из примера B-35 получали таким же образом, как получали композиции (1), за исключением того, что в качестве нуклеиновой кислоты применяли siRNA люциферазы вместо siRNA фактора VII и в качестве катионного липида применяли катионный липид 2 из примера A-2 вместо катионного липида 1. siRNA люциферазы представляла собой отожженную siRNA (GeneDesign Inc.), которая состояла из смысловой цепи, характеризующейся последовательностью оснований: 5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAT*T-3' (T: ДНК, *= фосфотиоатная связь) (SEQ ID NO: 3), и антисмысловой цепи, характеризующейся последовательностью оснований: 5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGT*T-3' (T: ДНК, *= фосфотиоатная связь) (SEQ ID NO: 4).
[0256] (Анализ композиций (8))
Так же, как и в анализе композиций (1), степень инкапсуляции mRNA или siRNA в липидных комплексах и средний диаметр частиц в липидных комплексах измеряли для композиций из примера B-34 и примера B-35. В таблице 8 приведены степень инкапсуляции mRNA или siRNA и средний диаметр частиц (Z-среднее значение) в липидных комплексах.
[0257]
[Таблица 8]
Таблица 8
Композиция
Нуклеиновая кислота
Степень инкапсуляции (%)
Средний диаметр частиц (нм)
Индекс полидисперсности
Пример B-34
mRNA EPO
98
105
0,06
Пример B-35
siRNA люциферазы
99
66
0,06
Установлено, что композиции из примера B-34 и примера B-35 проявляют высокие значения степени инкапсуляции нуклеиновой кислоты. Данный результат указывает на то, что композиции из примеров можно применять для доставки нуклеиновых кислот, независимо от типа нуклеиновых кислот.
[0258] C. Тестовые примеры
[Тестовый пример 1]
Композиции из примеров от примера B-1 до примера B-3 и сравнительного примера B-1 разбавляли с помощью PBS так, что концентрация siRNA фактора VII, инкапсулированной в липидных комплексах, составляла 1 мкг/мл или 5 мкг/мл. Композиции вводили мышам ICR (возраст 5 недель, самки, средний вес: 25 г, n=3) через хвостовую вену в дозировке 10 мл/кг и отбирали образцы крови и печени под анестезией через 24 часа после введения. Плазму отделяли от крови путем центрифугирования и измеряли концентрацию белка фактора VII в плазме с применением коммерчески доступного набора (торговое название «BIOPHEN FVII», HYPHEN BioMed). В качестве отрицательного контроля проводили такую же обработку в группе, особям которой вводили PBS.
[0259] Если принять концентрацию белка фактора VII в группе, особям которой вводили PBS, за 100%, то значения концентрации белка фактора VII в группах, особям которых вводили композиции, рассчитывали как относительное значение. Результаты приведены на фиг. 1 и в таблице 9.
[0260]
[Таблица 9]
Таблица 9
Доза siRNA (мг/кг)
Композиция
Катионный липид
Концентрация белка фактора VII (относительное значение)
0,01
Пример B-1
1
50%
Пример B-2
2
46%
Пример B-3
3
44%
Сравнительный пример B-1
ALN-319
63%
0,05
Пример B-1
1
13%
Пример B-2
2
12%
Пример B-3
3
11%
Сравнительный пример B-1
ALN-319
21%
Установлено, что композиции из примеров от примера B-1 до примера B-3 оказывают больший ингибирующий эффект на экспрессию белка фактора VII, чем композиция из сравнительного примера B-1. Этот результат указывает на то, что композиции из примеров обеспечивают эффективное высвобождение нуклеиновых кислот в цитоплазму.
[0261] [Тестовый пример 2]
Так же, как и в тестовом примере 1, композиции из примера B-4 и сравнительного примера B-1 вводили мышам ICR (возраст 5 недель, самки, средний вес: 25 г, n=3) и рассчитывали относительное значение концентрации белка фактора VII в плазме через 24 часа после введения. Результаты приведены на фиг. 2 и в таблице 10.
[0262]
[Таблица 10]
Таблица 10
Доза siRNA (мг/кг)
Композиция
Катионный липид
Концентрация белка фактора VII (относительное значение)
0,01
Пример B-4
4
68%
Сравнительный пример B-1
ALN-319
77%
0,05
Пример B-4
4
18%
Сравнительный пример B-1
ALN-319
24%
Установлено, что композиция из примера B-4 оказывает более сильный ингибирующий эффект на экспрессию белка фактора VII, чем композиция из сравнительного примера B-1. Этот результат указывает на то, что композиции из примеров обеспечивают эффективное высвобождение нуклеиновых кислот в цитоплазму.
[0263] [Тестовый пример 3]
Так же, как и в тестовом примере 1, композицию из примера B-5 вводили мышам ICR (возраст 5 недель, самки, средний вес: 25 г, n=3) и рассчитывали относительное значение концентрации белка фактора VII в плазме через 24 часа после введения. Результаты приведены в таблице 11.
[0264]
[Таблица 11]
Таблица 11
Доза siRNA (мг/кг)
Композиция
Катионный липид
Концентрация белка фактора VII (относительное значение)
0,01
Пример B-5
5
77%
0,05
Пример B-5
5
14%
Установлено, что композиция из примера B-5 оказывает сильный ингибирующий эффект на экспрессию белка фактора VII. Этот результат указывает на то, что композиции из примеров обеспечивают эффективное высвобождение нуклеиновых кислот в цитоплазму.
[0265] [Тестовый пример 4]
Композиции из примера B-11 и сравнительного примера B-3 разбавляли с помощью PBS так, что концентрация mRNA hEPO, инкапсулированной в липидных комплексах, составляла 1 мкг/мл или 3 мкг/мл. Композиции вводили мышам ICR (возраст 5 недель, самки, средний вес: 25 г, n=3) через хвостовую вену в дозировке 10 мл/кг и отбирали образцы крови под анестезией через 24 часа после введения. Плазму отделяли от крови путем центрифугирования и измеряли концентрацию белка hEPO в плазме с применением коммерчески доступного набора (торговое название «Human Erythropoietin Quantikine IVD ELISA Kit», R&D Systems). В качестве отрицательного контроля проводили такую же обработку в группе, мышам которой не производили введение (без обработки), и в группе, мышам которой вводили PBS. Результаты приведены в таблице 12.
[0266]
[Таблица 12]
Таблица 12
Доза mRNA (мг/кг)
Композиция
Катионный липид
Концентрация белка hEPO (пг/мл)
Без обработки
Не определена
Введение PBS
Не определена
0,01
Пример B-11
2
29,7
0,03
Пример B-11
2
234,1
Сравнительный пример B-3
ALN-319
165,4
Установлено, что композиция из примера B-11 оказывает более сильный эффект на экспрессию белка hEPO, чем композиция из сравнительного примера B-3. Этот результат указывает на то, что композиции из примеров обеспечивают эффективное высвобождение нуклеиновых кислот в цитоплазму.
[0267] [Тестовый пример 5]
Композиции из примеров от примера B-14 до примера B-21 разбавляли с помощью PBS так, что концентрация siRNA фактора VII, инкапсулированной в липидных комплексах, составляла 3 мкг/мл или 30 мкг/мл. Композиции вводили мышам ICR (возраст 5 недель, самки, средний вес: 25 г, n=3) через хвостовую вену в дозировке 10 мл/кг и отбирали образцы крови и печени под анестезией через 24 часа после введения. Плазму отделяли от крови путем центрифугирования и измеряли концентрацию белка фактора VII в плазме с применением коммерчески доступного набора (торговое название «BIOPHEN FVII», HYPHEN BioMed). В качестве отрицательного контроля проводили такую же обработку в группе, особям которой вводили PBS.
[0268] Если принять концентрацию белка фактора VII в группе, особям которой вводили PBS, за 100%, то концентрации белка фактора VII в группах, особям которых вводили композиции, рассчитывали как относительное значение. Результаты приведены в таблице 13.
[0269]
[Таблица 13]
Таблица 13
Доза siRNA (мг/кг)
Композиция
Катионный липид
Концентрация белка фактора VII (относительное значение)
0,03
Пример B-14
9
38%
Пример B-15
10
69%
Пример B-16
11
71%
Пример B-17
12
52%
Пример B-18
13
93%
Пример B-19
14
88%
Пример B-20
15
44%
Пример B-21
2
45%
0,3
Пример B-14
9
7%
Пример B-15
10
15%
Пример B-16
11
19%
Пример B-17
12
3%
Пример B-18
13
93%
Пример B-19
14
57%
Пример B-20
15
2%
Пример B-21
2
2%
[0270] [Тестовый пример 6]
Так же, как и в тестовом примере 5, композиции из примеров от примера B-22 до примера B-29 вводили мышам ICR (возраст 5 недель, самки, средний вес: 25 г, n=3) и рассчитывали относительное значение концентрации белка фактора VII в плазме через 24 часа после введения. Результаты приведены в таблице 14.
[0271]
[Таблица 14]
Таблица 14
Доза siRNA (мг/кг)
Композиция
Катионный липид
Концентрация белка фактора VII (относительное значение)
0,03
Пример B-22
16
45%
Пример B-23
17
51%
Пример B-24
18
101%
Пример B-25
19
53%
Пример B-26
20
18%
Пример B-27
21
62%
Пример B-28
22
59%
Пример B-29
2
20%
0,3
Пример B-22
16
6%
Пример B-23
17
4%
Пример B-24
18
83%
Пример B-25
19
4%
Пример B-26
20
<1%
Пример B-27
21
23%
Пример B-28
22
<1%
Пример B-29
2
1%
[0272] [Тестовый пример 7]
Композицию из примера B-34 с инкапсулированной mRNA EPO разбавляли с помощью PBS так, что концентрация РНК, инкапсулированной в липидный комплекс, составляла 30 мкг/мл. Композиции вводили мышам BALB/c (самки, n=4) через хвостовую вену в дозировке 10 мл/кг и отбирали образцы крови под анестезией через 1 день и 4 дня после введения. Плазму отделяли от крови путем центрифугирования и измеряли концентрацию белка hEPO в плазме с применением коммерчески доступного набора (торговое название «Human Erythropoietin Quantikine IVD ELISA Kit», R&D Systems). Также измеряли количество ретикулоцитов. В качестве отрицательных контролей проводили такую же обработку в группе, мышам которой не производили введение (без обработки), и в группе, мышам которой вводили композицию из примера B-35 с инкапсулированной siRNA люциферазы. Результаты приведены в таблице 15.
[0273]
[Таблица 15]
Таблица 15
Введенный образец
Композиция
Доза нуклеиновой кислоты (мг/кг)
День(дни) после введения
Концентрация hEPO (пг/мл)(Ср. знач. ± S.D.)
Количество ретикуло-цитов (10<sup>9</sup>/л)(Ср. знач. ± S.D.)
Без обработки
-
-
-
Не определена
435 ± 57
siRNA Luc
Пример B-35
0,30
1 день
Не определена
404 ± 74
mRNA EPO
Пример B-34
0,30
1 день
3175 ± 379
310 ± 25
siRNA Luc
Пример B-35
0,30
4 дня
Не определена
330 ± 101
mRNA EPO
Пример B-34
0,30
4 дня
Не определена
615 ± 60
[0274] В группе без обработки и в группе, мышам которой вводили siRNA Luc, hEPO не определяли, а в группе, мышам которой вводили mRNA EPO, определяли hEPO через 1 день после введения. Также было установлено, что вследствие воздействия выработанного EPO количество ретикулоцитов увеличилось через 4 дня после введения. Этот результат указывает на то, что композиции из примеров обеспечивают эффективное высвобождение нуклеиновых кислот в цитоплазму.
[0275] Согласно вышеприведенным результатам, в случае применения катионного липида по настоящему изобретению является возможным эффективное высвобождение нуклеиновых кислот в цитоплазму. Кроме того, в случае применения катионного липида по настоящему изобретению является возможным подавление увеличения диаметра частиц в липидных комплексах после хранения в течение определенного периода времени.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
[0276] Согласно настоящему изобретению можно получить катионный липид, который может обеспечивать эффективное высвобождение нуклеиновых кислот в цитоплазму.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  EISAI R & D MANAGEMENT Co., Ltd.
<120>  Катионный липид
<130>  G1579
<160>  4
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  №1 смысловая
<220>
<221>  Другое_отличие
<222>  (1)..(19)
<223>  РНК
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (4)..(4)
<223>  n означает 2'-фторуридин
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (5)..(5)
<223>  n означает 2'-фторцитидин
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (7)..(7)
<223>  n означает 2'-фторуридин
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (8)..(8)
<223>  n означает 2'-фторцитидин
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (9)..(9)
<223>  n означает 2'-фторуридин
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (10)..(10)
<223>  n означает 2'-фторцитидин
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (14)..(14)
<223>  n означает 2'-фторуридин
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (15)..(15)
<223>  n означает 2'-фторцитидин
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (16)..(16)
<223>  n означает 2'-фторуридин
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (17)..(17)
<223>  n означает 2'-фторуридин
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (19)..(19)
<223>  n означает 2'-фторцитидин
<220>
<221>  Другое_отличие
<222>  (20)..(21)
<223>  ДНК
<220>
<221>  Другое_связывание
<222>  (20)..(21)
<223>  Фосфотиоатное связывание
<400>  1
ggannannnn aagnnnnant t                                                21
<210>  2
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  №1 антисмысловая
<220>
<221>  Другое_отличие
<222>  (1)..(19)
<223>  РНК
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (2)..(2)
<223>  n означает 2'-фторуридин
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (7)..(7)
<223>  n означает 2'-фторцитидин
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (8)..(8)
<223>  n означает 2'-фторуридин
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (9)..(9)
<223>  n означает 2'-фторуридин
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (14)..(14)
<223>  n означает 2'-фторуридин
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (17)..(17)
<223>  n означает 2'-фторуридин
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (18)..(18)
<223>  n означает 2'-фторцитидин
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (19)..(19)
<223>  n означает 2'-фторцитидин
<220>
<221>  Другое_отличие
<222>  (20)..(21)
<223>  ДНК
<220>
<221>  Другое_связывание
<222>  (20)..(21)
<223>  Фосфотиоатное связывание
<400>  2
gnaagannng agangannnt t                                                21
<210>  3
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  №2 смысловая
<220>
<221>  Другое_отличие
<222>  (1)..(19)
<223>  РНК
<220>
<221>  Другое_отличие
<222>  (20)..(21)
<223>  ДНК
<220>
<221>  Другое_связывание
<222>  (20)..(21)
<223>  Фосфотиоатное связывание
<400>  3
cuuacgcuga guacuucgat t                                                21
<210>  4
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  №2 антисмысловая
<220>
<221>  Другое_отличие
<222>  (1)..(19)
<223>  РНК
<220>
<221>  Другое_отличие
<222>  (20)..(21)
<223>  ДНК
<220>
<221>  Другое_связывание
<222>  (20)..(21)
<223>  Фосфотиоатное связывание
<400>  4
ucgaaguacu cagcguaagt t                                                21
<---