ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОДИНОЧНЫХ МИШЕНЕЙ

1. Способ визуализации одиночной отдельной единицы мишени в образце, где указанная мишень иммобилизирована, включающий
а) инкубацию образца, содержащего популяцию отдельных единиц мишени с одним или более чем одним связывающим агентом, где
(1) по меньшей мере один из связывающих агентов содержит фермент;
(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с отдельной одиночной единицей мишени,
и формирование одного или более чем одного дискретного одиночного сайта-мишени с фракционной субпопуляцией отдельных одиночных единиц мишени, где каждый одиночный дискретный сайт-мишень представляет собой комплекс из одной отдельной одиночной единицы указанной фракционной субпопуляции и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент;
в) инкубацию образца (а) в водном растворе (i), содержащем
пероксидное соединение в количестве, которое составляет менее 2 мМ,
первый субстрат фермента, связанный с дискретными одиночными сайтами-мишенями (а), и
второй субстрат указанного фермента,
где указанный первый субстрат является водорастворимым богатым электронами соединением, которое
(3) способно образовывать радикалы в реакции с указанным ферментом, и
(4) способно сшивать молекулы указанного второго субстрата в присутствии указанного фермента и пероксидного соединения, образуя нерастворимый в воде полимерный продукт указанного второго субстрата,
и где указанный второй субстрат представляет собой конъюгированную молекулу, содержащую по меньшей мере два соединения, которые способны выступать в качестве субстратов указанных ферментов, и определяемую метку, где определяемая метка выбрана из группы, состоящей из флуоресцентных, люминесцентных, радиоактивных или хромогенных веществ или членов пар специфического связывания,
с образованием, таким образом, дискретных депозитов второго субстрата на дискретных одиночных сайтах-мишенях (а) и визуализацией указанных одиночных сайтов-мишеней (а).
2. Способ по п.1, где один или более чем один связывающий агент является членом пары специфического связывания.
3. Способ по п.1, где сайты-мишени создаются с меньшинством одиночных отдельных единиц мишени, присутствующих в образце.
4. Способ по п.1, где сайты-мишени создаются с большинством одиночных отдельных единиц мишени, присутствующих в образце.
5. Способ по п.1, где фермент является ферментом с оксидоредуктазной активностью.
6. Способ по п.5, где фермент обладает пероксидазной или фенолоксидазной активностью.
7. Способ по п.6, где фермент является пероксидазой хрена, пероксидазой сои или лакказой или функциональным аналогом указанных ферментов.
8. Способ по п.1, где первый субстрат фермента с оксидоредуктазной активностью является соединением, которое содержит структуру формулы (I):
,
где
1
R представляет собой арил или винил,
2
3
4
2
2
R, R и R независимо представляют собой H, N-(X), O-(X), где X представляет собой алкил, винил, арил или H, и где R2, R3 и R4 не одновременно представляют собой H,
где
H представляет собой водород;
O представляет собой кислород.
9. Способ по п.1, где соединение является 3,3'-диаминобензидином или его производным.
10. Способ по п.1, где соединение является феруловой кислотой или ее производным.
11. Способ по п.9, где количество 3,3'-диаминобензидина или его производного составляет менее 1 мМ.
12. Способ по п.1, где конъюгированная молекула содержит по меньшей мере одно соединение в качестве субстрата фермента с оксидоредуктазной активностью, которое определяется формулой (II):
,
где
1
2
R представляет собой -H, -O-X, N(X) или-S-X;
2
2
R представляет собой -H, -O-X, -N(X) или -S-X;
3
2
R представляет собой -H, -OH, -NH или-SH;
4
2
R представляет собой -H, -O-X, -N(X) или -S-X;
5
2
R представляет собой -H, -O-X, N(X) или-S-X;
6
2
R представляет собой -CON(X) или СО-Х,
где
H представляет собой водород;
O представляет собой кислород;
S представляет собой серу;
N представляет собой азот;
X представляет собой Н, алкил или арил.
13. Способ по п.12, где по меньшей мере два соединения определяются формулой (II).
14. Способ по п.13, где по меньшей мере два соединения, определяемые формулой (II), являются одинаковыми соединениями.
15. Способ по п.13, где по меньшей мере два соединения, определяемые формулой (II), являются различными соединениями.
16. Способ по п.12, где соединения выбраны из группы, состоящей из коричной кислоты, феруловой кислоты, кофейной кислоты, аминокоричной кислоты или синапиновой кислоты или их производных.
17. Способ по п.1, где конъюгат содержит по меньшей мере один остаток тирозина в качестве субстрата фермента.
18. Способ по п.1, где конъюгаты каждого из по меньшей мере двух соединений, способных выступать в качестве субстратов фермента, связанных с отдельными сайтами-мишенями, отделены друг от друга в конъюгированной молекуле 30 или менее чем 30 последовательно связанными атомами, а определяемая метка отделена от любого из указанных субстратов 30 или более чем 30 последовательно связанными атомами.
19. Способ по п.18, где по меньшей мере 30 последовательно связанных атомов, отделяющих в конъюгированной молекуле метку от любого субстрата фермента с оксидоредуктазной активностью, включают от 2 до 10 повторов следующей формулы (III)
,
1
2
3
2
2
2
2
2
где R и R выбраны среди NH и O, a R выбран среди метила, этила, пропила, CHOCH и (CHOCH), и где имеется не более трех последовательно повторяющихся этилокси-групп.
20. Способ по п.1, где второй субстрат представляет собой популяцию одинаковых конъюгированных молекул или популяцию различных конъюгированных молекул, где конъюгированные молекулы являются такими, как указано в любом из пп.12-19.
21. Способ по п.1, где способ включает этап (б'), который предшествует этапу (б), где образец инкубировали в водном растворе (ii), который представляет собой водный раствор (i), не содержащий второй субстрат.
22. Способ по п.1, который включает по меньшей мере один этап промывания.
23. Способ по п.1, также включающий этап (в), в котором определяются одиночные сайты-мишени (б).
24. Способ по п.23, где этап (в) включает следующие подэтапы:
в') инкубацию образца (б), содержащего дискретные депозиты второго субстрата на дискретных одиночных сайтах-мишенях (а), со связывающим агентом, способным специфически связываться с определяемой меткой депонированного второго субстрата и формирование комплекса, содержащего одну или более чем одну молекулу депонированного второго субстрата и одну или более чем одну молекулу указанного связывающего агента,
(в'') определение в образце (в') связывающего агента, связанного с дискретными депозитами второго субстрата, тем самым определение одиночных сайтов-мишеней и тем самым определение одиночной единицы мишени, связанной с указанным одиночным сайтом-мишенью.
25. Способ по п.24, где связывающий агент включает фермент.
26. Способ по п.24, где связывающий агент содержит определяемую метку, выбранную среди хромогенных, флуоресцентных, люминесцентных или радиоактивных веществ или членов пары специфического связывания.
27. Способ по п.1, где одиночный дискретный депозит второго субстрата на одиночном сайте-мишени имеет округлую форму и определяется в двумерном поле как визуально различимая точка.
28. Способ по п.27, где отдельная точка является точкой с диаметром, который составляет примерно 0,4 мкм или более.
29. Способ по п.1, где мишень является выбранной биологической или химической молекулой-мишенью, частицей, молекулярным или клеточным комплексом, молекулярной или клеточной структурой, вирусом или микроорганизмом, либо фрагментом указанной молекулы-мишени, частицы, комплекса, структуры, вируса или микроорганизма.
30. Способ по п.29, где мишенью является биологический маркер.
31. Способ по п.1, где отдельная единица мишени выбрана среди отдельной одиночной биологической или химической молекулы, отдельной одиночной частицы, отдельного одиночного молекулярного или клеточного комплекса, отдельной одиночной молекулярной или клеточной структуры, или отдельного одиночного вируса или микроорганизма, или отдельных одиночных фрагментов указанной молекулы, частицы, комплекса, структуры, вируса или микроорганизма.
32. Способ по п.1, где образец представляет собой биологический, химический или экологический образец.
33. Способ по п.1, где образец представляет собой гистологический образец.
34. Способ по п.29, где мишень представляет собой белок или нуклеиновую кислоту или их фрагмент или производное.
35. Способ по п.34, где белок представляет собой клеточный мембранный рецептор или цитоплазматический белок или цитоплазматическую нуклеиновую кислоту.
36. Способ по п.1, включающий один или более чем один этап после любого из определенных этапов.
37. Способ по п.1, в котором по меньшей мере один из этапов автоматизирован, или который дополнительно включает по меньшей мере один автоматизированный этап.
38. Способ определения отдельных одиночных единиц иммобилизированной мишени в образце, где мишень присутствует в образце в широком динамическом диапазоне концентраций, включающий
а) инкубацию образца с одним или более чем одним связывающим агентом, где
(1) по меньшей мере один из связывающих агентов включает фермент;
(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с отдельной одиночной единицей указанной мишени,
и формирование одного или более чем одного дискретного первого сайта-мишени с первой фракционной субпопуляцией отдельных одиночных единиц мишени, где каждый одиночный дискретный первый сайт-мишень содержит комплекс из одной отдельной одиночной единицы указанной первой фракционной субпопуляции отдельных одиночных единиц и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент с оксидоредуктазной активностью;
б) инкубацию образца (а) с первым субстратом фермента, связанным с первыми сайтами-мишенями (а), первой популяцией молекул второго субстрата указанного фермента и пероксидным соединением в соответствии с этапом (б) п.1, с образованием, таким образом, дискретных депозитов молекул второго субстрата первой популяции на первых сайтах-мишенях (а);
в) инкубацию образца (б) с раствором перекиси водорода в количестве, достаточном для гашения остаточной активности, связанной с первыми одиночными сайтами-мишенями (а);
г) инкубацию образца (в) с одним или более чем одним связывающим агентом, где
(1) по меньшей мере один из связывающих агентов содержит фермент;
(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с отдельной единицей указанной мишени,
с образованием, таким образом, одного или более чем одного дискретного второго сайта-мишени со второй фракционной субпопуляцией отдельных одиночных единиц мишени, где каждый одиночный дискретный второй сайт-мишень содержит комплекс из одной отдельной единицы указанной второй фракционной субпопуляции отдельных одиночных единиц и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент;
д) инкубацию образца (г) с первым субстратом фермента, связанным со вторыми одиночными сайтами-мишенями, второй популяцией молекул второго субстрата указанного фермента и пероксидным соединением в соответствии с этапом (б) п.1, с формированием, таким образом, дискретных депозитов молекул второго субстрата второй популяции на вторых сайтах-мишенях (г);
е) определение в образце дискретных депозитов молекул второго субстрата первой популяции на первых сайтах-мишенях как первых визуально различимых точек и определение, таким образом, одной или более чем одной отдельной одиночной единицы первой популяции мишени;
ж) определение в образце дискретных депозитов молекул второго субстрата второй популяции на вторых сайтах-мишенях как вторых визуально различимых точек и определение, таким образом, одной или более чем одной отдельной одиночной единицы второй популяции мишени.
39. Способ по п.38, где связывающие агенты этапа (а) и этапа (г) являются одним и тем же связывающим агентом.
40. Способ по п.38, где связывающие агенты (а) и (г) являются различными связывающими агентами.
41. Способ по п.38, где молекулы второго субстрата первой популяции и молекулы второго субстрата второй популяции являются различными конъюгированными молекулами.
42. Способ по п.38, где молекулы второго субстрата выбраны среди соединений, определенных в любом из пп.12-19, а молекулы первого субстрата выбраны среди соединений, определенных в любом из пп.8-10.
43. Способ по 38, который включает по меньшей мере один дополнительный этап.
44. Способ по п.38, где образцом является гистологический образец.
45. Способ по п.38, включающий один или более чем один этап после любого из определенных этапов.
46. Способ по п.38, в котором по меньшей мере один из этапов автоматизирован, или который дополнительно включает по меньшей мере один автоматизированный этап.
47. Способ визуализации и определения отдельных одиночных единиц по меньшей мере двух различных иммобилизированным мишеней, присутствующих в образце, включающий
а) инкубацию образца с одним или более чем одним связывающим агентом, способным связывать первую мишень, где
(1) по меньшей мере один из связывающих агентов содержит фермент;
(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с отдельной одиночной единицей первой мишени,
с образованием, таким образом, одного или более чем одного дискретного первого одиночного сайта-мишени с отдельными одиночными единицами первой мишени, где каждый одиночный дискретный первый сайт-мишень содержит комплекс одной отдельной одиночной единицы первой мишени и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент;
б) инкубацию образца (а) с первым субстратом фермента, связанным с первыми одиночными сайтами-мишенями, первой популяцией молекул второго субстрата указанного фермента и пероксидным соединением в соответствии с этапом (б) п.1, с образованием, таким образом, дискретных депозитов молекул второго субстрата первой популяции на первых одиночных сайтах-мишенях (а);
в) инкубацию образца (б) с раствором перекиси водорода в количестве, достаточном для гашения остаточной активности фермента, связанной с первыми одиночными сайтами связывания (а);
г) инкубацию образца (в) с одним или более чем одним связывающим агентом, способным связываться со второй мишенью, где
(1) по меньшей мере один из связывающих агентов содержит фермент;
(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с отдельной единицей второй мишени,
с образованием одного или более чем одного дискретного второго одиночного сайта-мишени с отдельными одиночными единицами второй мишени, где каждый одиночный дискретный второй сайт-мишень содержит комплекс одной отдельной единицы второй мишени и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент;
д) инкубацию образца (г) с первым субстратом, связанным со вторыми отдельными сайтами связывания, второй популяцией молекул второго субстрата фермента с оксидоредуктазной активностью и пероксидным соединением в соответствии с этапом (б) п.1, с образованием, таким образом, дискретных депозитов молекул второго субстрата второй популяции на вторых сайтах-мишенях (г);
е) определение в образце дискретных депозитов молекул второго субстрата первой популяции на первых сайтах-мишенях в качестве первых визуально различимых точек, таким образом, определение одной или более чем одной отдельной единицы первой мишени;
ж) определение в образце дискретных депозитов молекул второго субстрата второй популяции на вторых сайтах-мишенях в качестве вторых визуально различимых точек и, таким образом, определение одной или более чем одной отдельной одиночной единицы второй мишени.
48. Способ по п.47, где по меньшей мере две мишени являются различными биологическими молекулами.
49. Способ по п.47, где по меньшей мере две мишени являются различными нуклеиновокислотными последовательностями или различными белками.
50. Способ по п.47, где по меньшей мере одна из мишеней является нуклеиновой кислотой, и по меньшей мере одна другая является белком.
51. Способ по п.47, где молекулы второго субстрата первой популяции и второго субстрата второй популяции являются различными молекулами второго субстрата.
52. Способ по п.47, где молекулы второго субстрата выбраны среди соединений, определенных в любом из пп.12-19, а молекулы первого субстрата выбраны среди соединений, определенных в любом из пп.8-10.
53. Способ по п.47, который включает по меньшей мере один дополнительный этап.
54. Способ по п.47, где образцом является гистологический образец.
55. Способ по п.47, включающий один или более чем один этап, предшествующий любому из определенных этапов.
56. Способ по п.47, включающий один или более чем один этап после любого из определенных этапов.
57. Способ по п.47, в котором по меньшей мере один из этапов автоматизирован, или который дополнительно включает по меньшей мере один автоматизированный этап.
58. Способ количественной оценки иммобилизированной мишени в образце, включающй
г) обработку образца в соответствии со способом по любому из предыдущих пп.;
е) подсчет визуально различимых точек в образце; и
е) количественную оценку мишени в образце.
59. Способ по п.58, где отдельные точки подсчитывают вручную или автоматически.
60. Способ по п.58 или 59, в котором количество мишени оценивается относительным образом как количество мишени на референсный маркер, объем образца или площадь образца.
61. Способ диагностики заболевания у пациента, включающий этап обработки биологического образца, полученного от пациента, в соответствии со способом по любому из пп.1-60.
62. Способ оценки эффективности терапевтического лечения у пациентов, включающий этап обработки биологического образца, полученного от пациента, в соответствии со способом по любому из пп.1-60.
63. Способ прогнозирования риска развития заболевания у пациента или прогнозирования вероятности восстановления или ухудшения заболевания, включающий этап обработки и анализа биологического образца, полученного от пациента, в соответствии с любым из способов пп.1-60.
64. Анализ, включающий этап определения одиночных единиц мишени в соответствии со способом по любому из пп.1-60.