ВАКЦИНА ПРОТИВ ПАСТЕРЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ
ANIMAL'S PASTEURELLOSIS VACCINE

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке средств специфической профилактики и, в частности, для получения вакцины против пастереллеза животных.
Известна вакцина против пастереллеза животных, включающая инактивированную баксуспензию Pasteurella multocida серологических вариантов А, В, D и адъювант (Патент РФ №2162339, «Способ изготовления эмульсионной противопастереллезной вакцины», Бюл. №3, 2001, МКИ А61К 39/102).
Недостатками известной вакцины является низкое качество целевого продукта, выявляемое низкой антигенной активностью при высоком содержании балластных веществ, реактогенностью, обуславливающей сенсибилизацию организма животных.
Известна также вакцина против пастереллеза животных, включающая инактивированную баксуспензию Pasteurella multocida серологических вариантов А, В, D и адъювант, причем в качестве P.multocida серологических вариантов А, В, D используют Pasteurella multocida серологических вариантов А, В, D с активностью растворимых поверхностных антигенов в реакции пассивной гемагглютинации как 1:256-4096, 1:512-8192, 1: 256-4096 соответственно, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Pasteurella multocida серологических вариантов А, В, D,
взятых в массовых соотношениях 1:(0,8-1,2):(0,8-1,2)
45-55
Адъювант
Остальное
Также вакцина против пастереллеза животных в качестве адъюванта содержит эмульгатор 139 и минеральное масло Маркол 52, взятые в массовом соотношении 1:10-12 (патент РФ №2311199, БИ №27, 2007.
Недостатками известной вакцины является низкое качество целевого продукта, выявляемое низкой антигенной активностью при высоком содержании балластных веществ, реактогенностью, обуславливающей сенсибилизацию организма животных.
Задачей заявленного технического решения является повышение качества целевого продукта.
Поставленная задача решается в вакцине против пастереллеза животных, включающей инактивированную баксуспензию Pasteurella multocida серологических вариантов А, В, D и адъювант, тем, что дополнительно содержит инактивированную баксуспензию Pasteurella haemolytica с активностью растворимых поверхностных антигенов в реакции пассивной гемагглютинации 1:32-64, а в качестве адъюванта - адъювант ISA-70VG, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Pasteurella multocida серологических вариантов А, В, D и
Pasteurella haemolytica, взятых в массовых соотношениях
1:(0,8-1,2):(0,8-1,2):(0,8-1,2)
45-55
Адъювант ISA-70VG
Остальное
В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие признаки, аналогичные заявляемым, т.е. предложение соответствует критерию «новизна».
Предложение осуществимо в лабораторных и промышленных условиях, направлено на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».
Впервые предложена вакцина против пастереллеза животных, включающая инактивированную баксуспензию Pasteurella multocida серологических вариантов А, В, D, а также Pasteurella haemolytica при определенном соотношении компонентов, что позволяет получить неочевидный положительный эффект - повышение качества целевого продукта, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Способ иллюстрируется на следующих примерах.
Пример 1.
Для получения вакцины против пастереллеза животных отобраны три производственных штамма Pasteurella multocida /P.multocida/ серологических вариантов А, В, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolitica, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 10±2% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием аминного азота не менее 178-180 мг %. Культивирование проводят при температуре 37°С±1°С в течение 8 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.
Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант-культуральная жидкость, освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемый по уровню титров в РПГА, в частности, данный показатель уровня активности для Р.multocida серовариантов А, В, D и Pasteurella haemolitica через 8 часов культивирования был равен 1:256; 1:512; 1:256; 1:32 соответственно.
Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при 37°С, периодически перемешивая каждые 4 часа.
По окончании инактивации берут по 1 кг бактериальной суспензии каждого штамма (всего 4 кг баксуспензии) и добавляют 4 кг адъюванта ISA-70VG, получая состав 1 при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Р. multocida серологических вариантов А, В, D и Pasteurella haemolytica, взятых в массовых соотношениях 1:1:1:1
50
Адъювант ISA-70VG
Остальное
Пример 2.
Для получения вакцины против пастереллеза животных отобраны три производственных штамма P.multocida серологических вариантов А, В, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 10±2% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием аминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 37°С±1°С в течение 10 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.
Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость, освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в РПГА, в частности, данный показатель уровня активности для Р.multocida серовариантов А, В, D и Pasteurella haemolytica через 10 часов культивирования был равен 1:4096; 1:8192; 1:4096; 1:64 соответственно.
Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,35%-ной концентрации к общему объему в течение 18 часов при 38°С, периодически перемешивая каждые 4 часа.
По окончании инактивации берут 1 кг бактериальной суспензии, полученной смешиванием 1 кг P.multocida сероварианта А, 0,8 кг P.multocida сероварианта В, 0,8 кг P.multocida сероварианта D, 0,8 кг Pasteurella haemolytica и добавляют 4,15 кг адъюванта ISA-70VG, получая состав 2 при следующем соотношении компонентов, мас.%:
P.multocida серологических вариантов А, В, D и Pasteurella
haemolytica, взятых в массовых соотношениях 1:0,8:0,8:0,8
45
Адъювант ISA-70VG
Остальное
Пример 3.
Для получения вакцины против пастереллеза животных отобраны три производственных штамма P.multocida серологических вариантов А, В, D №1231, 681, Т-80, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 10±2% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием аминного азота не менее 178-180 мг %. Культивирование проводят при температуре 37°С±1°С в течение 9 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.
Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость, освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в РПГА, в частности, данный показатель уровня активности для P.multocida серовариантов А, В, D и Pasteurella haemolytica через 9 часов культивирования был равен 1:2048; 1:4096; 1:2048; 1:64 соответственно.
Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,4%-ной концентрации к общему объему в течение 22 часов при 37,5°С, периодически перемешивая каждые 4 часа.
По окончании инактивации берут 1 кг бактериальной суспензии, полученной смешиванием 1 кг P.multocida сероварианта А, 1,2 кг P.multocida сероварианта В, 1,2 кг P.multocida сероварианта D, 1,2 кг Pasteurella haemolytica и добавляют 3,76 кг адъюванта ISA-70VG, получая состав 3 при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Р.multocida серологических вариантов А, В, D и Pasteurella
haemolytica, взятых в массовых соотношениях 1:1,2:1,2:1,2
55
Адъювант ISA-70VG
Остальное
Иммунологическую активность полученных вакцин, согласно примерам 1-3, сравнивали с иммунологической активностью известного технического решения по результатам заражения мышей смертельной дозой смесью вирулентных штаммов P.multocida сероварианта A, P.multocida сероварианта В, P.multocida сероварианта D и Pasteurella haemolytica через 28 дней после двухкратной иммунизации мышей опытной вакциной и известной. Полученные опыты показали, что после заражения мышей смертельной дозой смесью вирулентных штаммов P.multocida сероварианта A, P.multocida сероварианта В, P.multocida сероварианта D и Pasteurella haemolytica через 28 дней после их двухкратной иммунизации в опытных группах в живых сохранилось 50-60% мышей, в то время как в контрольной группе мышей, вакцинированной известной вакциной, пало 100% животных.
Как показали результаты экспериментальных исследований, предлагаемая вакцина против пастереллеза животных позволяет повысить качество целевого продукта путем повышения его активности в 2 раза, а также в 1,5 раза увеличить сроки хранения целевого продукта.