СПОСОБЫ АМПЛИФИКАЦИИ, СИСТЕМЫ И СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ НА ОСНОВЕ ЭФФЕКТОРНОЙ СИСТЕМЫ CRISPR

1. Способ амплификации и/или обнаружения целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающий
(а) объединение образца, содержащего целевую двухцепочечную нуклеиновую кислоту, с реакционной смесью для амплификации, причем реакционная смесь для амплификации включает:
(i) систему CRISPR для амплификации, где система CRISPR для амплификации содержит первый и второй комплекс CRISPR/Cas, где первый комплекс CRISPR/Cas содержит первый фермент CRISPR/Cas и первую направляющую молекулу, которая направляет первый комплекс CRISPR/Cas к первой цепи целевой нуклеиновой кислоты, и второй комплекс CRISPR/Cas, содержащий второй фермент CRISPR/Cas и вторую направляющую молекулу, которая направляет второй комплекс CRISPR/Cas ко второй цепи целевой нуклеиновой кислоты;
(ii) геликазу;
(iii) пару праймеров, содержащую первый и второй праймеры, где первый праймер содержит часть, которая комплементарна первой цепи целевой нуклеиновой кислоты, а второй праймер содержит часть, которая комплементарна второй цепи целевой нуклеиновой кислоты; и
(iv) полимеразу;
(б) амплификацию целевой нуклеиновой кислоты путем раскрытия R-петель целевой нуклеиновой кислоты с использованием первого и второго комплексов CRISPR/Cas, разматывания первой и второй цепи целевой нуклеиновой кислоты с использованием геликазы, отжига и удлинения цепей с использованием пары праймеров и полимеразы; и
(в) дальнейшую амплификацию целевой нуклеиновой кислоты путем повторного раскрытия, раскручивания, отжига и удлинения в изотермических условиях; и
(г) необязательно, обнаружение амплифицированной целевой нуклеиновой кислоты.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фермент CRISPR/Cas представляет собой мертвый фермент CRISPR/Cas, выбранный из группы, состоящей из мертвого Cas9, мертвого Cas12a, мертвого Cas12b и мертвого Cas12c.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что мертвый фермент CRISPR/Cas представляет собой мертвый белок Cas9, который содержит мутацию в домене HNH и RuvC.
4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что мертвый фермент CRISPR/Cas представляет собой мертвый белок Cas9, который содержит мутацию соответствующую D10A и N863A в SpCas9, или D10A и Н840А в SpCas9.
5. Способ по п. 3 или 4, отличающийся тем, что мертвый фермент CRISPR/Cas представляет собой мертвый белок Cas9, полученный от вида бактерий, выбранных из группы, состоящей из Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus thermophilus, S. mutans, S. agalactiae, S. equisimilis, S. sanguinis, S. pneumonia; C. jejuni, C. coli; N. salsuginis, N. tergarcus; S. auricularis, S. carnosus; N. meningitides, N. gonorrhoeae; L. monocytogenes, L. ivanovii; C. botulinum, C. difficile, C. tetani, C. sordellii, Francisella tularensis 1, Prevotella albensis, Lachnospiraceae bacterium MC2017 1, Butyrivibrio proteoclasticus, Peregrinibacteria bacterium GW2011__GWA2_33_10, Parcubacteria bacterium GW2011_GWC2_44_17, Smithella sp. SCADC, Acidaminococcus sp. BV3L6, Lachnospiraceae bacterium MA2020, Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens, Moraxella bovoculi 237, Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium ND2006, Porphyromonas crevioricanis 3, Prevotella disiens и Porphyromonas macacae.
6. Способ по п. 2, отличающийся тем, что мертвый фермент CRISPR/Cas представляет собой мертвый белок Cas12.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что мертвый белок Cas12 содержит мутацию в домене RuvC.
8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что мертвый фермент Cas12 представляет собой мертвый Cas12a, Cas12b, Cas12c.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что мертвый Cas12a содержит мутацию, соответствующую D908A или Е993А в AsCpf1.
10. Способ по п. 6 или 7, отличающийся тем, что мертвый белок Cas12 получен от вида бактерий, выбранных из группы, состоящей из Francisella tularemia, Prevotella albensis, Lachnospiraceae bacterium, Butyrivibrio proteoclasticus, Peregrinibacteria bacterium, Parcubacteria bacterium, Smithella sp., Acidaminococcus sp., Lachnospiraceae bacterium, Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens, Moraxella bovoculi, Leptospira inadai, Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens and Porphyromonas macacae, Succinivibrio dextrinosolvens, Prevotella disiens, Flavobacterium branchiophilum, Helcococcus kunzii, Eubacterium sp., Microgenomates (Roizmanbacteria) bacterium, Flavobacterium sp., Prevotella brevis, Moraxella caprae, Bacteroidetes oral, Porphyromonas cansulci, Synergistes jonesii, Prevotella bryantii, Anaerovibrio sp., Butyrivibrio flbrisolvens, Candidatus Methanomethylophilus, Butyrivibrio sp., Oribacterium sp., Pseudobutyrivibrio ruminis и Proteocatella sphenisci.
11. Способ по п. 6, отличающийся тем, что мертвый Cas12 представляет собой мертвый белок Cas12b, который содержит мутацию в домене Nuc.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что мертвый Cas12b содержит мутацию, соответствующую D570A, Е848А, или D977A в АасС2с1.
13. Способ по п. 11 или 12, отличающийся тем, что мертвый белок Cas12b получен от вида бактерий, выбранных из группы, состоящей из Alicyclobacillus acidoterrestris, Alicyclobacillus contaminans, Alicyclobacillus macrosporangiidus, Bacillus hisashii, Candidatus Lindowbacteria, Desulfovibrio inopinatus, Desulfonatronum thiodismutans, Elusimicrobia bacterium RLFOXYA12, Omnitrophica WOR_2 bacterium RIFCSPHIGH02, Opitutaceae bacterium TAV5, Phycisphaerae bacterium ST-NAGAB-D1, Planctomycetes bacterium RBG_13_46_10, Spirochaetes bacterium GWB1_27_13, Verrucomicrobiaceae bacterium UBA2429, Tuberibacillus calidus, Bacillus thermoamylovorans, Brevibacillus sp. CF112, Bacillus sp. NSP2.1, Desulfatirhabdium butyrativorans, Alicyclobacillus herbarius, Citrobacter freundii, Brevibacillus agri (например, BAB-2500), и Methylobacterium nodulans.
14. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что первый мертвый фермент CRISPR/Cas и второй мертвый фермент CRISPR/Cas являются одинаковыми.
15. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что первый мертвый фермент CRISPR/Cas и второй мертвый фермент CRISPR/Cas являются разными.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что мертвый фермент CRISPR/Cas представляет собой dCas9, dCas12a, dCas12b, dCas12c или dCasl4.
17. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что полимеразу выбирают из группы, состоящей из ДНК полимеразы Bst 2.0, ДНК полимеразы Bst 2.0 WarmStart, ДНК полимеразы Bst 3.0, полноразмерной ДНК полимеразы Bst, большого фрагмента ДНК полимеразы Bst, большого фрагмента ДНК полимеразы Bsu, ДНК полимеразы рЫ29, ДНК полимераза Т7, полимеразы Gst, полимеразы Taq, фрагмента Кленова ДНК полимеразы I Е. coli, ДНК полимеразы KlenTaq, ДНК полимеразы Pol III, ДНК полимеразы Т5 и ДНК полимеразы Секвеназа.
18. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что геликазу выбирают из группы, состоящей из геликазы UvrD, геликазы CRISPR-Cas3, геликазы I Е. coli, геликазы II Е. coli, геликазы III Е. coli, геликазы IV Е. coli, геликазы Rep, геликазы DnaB, геликазы PriA, геликазы Per А, геликазы Т4 Gp41, геликазы Т4 Dda, большого Т антигена SV40, дрожжевой геликазы RAD, геликазы RecD, геликазы RecQ, термостабильной геликазы Т. tengcongensis UvrD, термостабильной геликазы Т. thermophilus UvrD, термостабильной геликазы Т. aquaticus DnaB, геликазы Dda, геликазы вируса папилломы Е1, геликазы простейших МСМ, геликазы эукариотов МСМ и геликазы Gp4T7.
19. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что амплификацию целевой нуклеиновой кислоты проводят при около 37-65°С.
20. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что амплификацию целевой нуклеиновой кислоты проводят при около 50-59°С.
21. Способ по любому из пп. 1-18, отличающийся тем, что амплификацию целевой нуклеиновой кислоты проводят при около 60-72°С.
22. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что амплификацию целевой нуклеиновой кислоты проводят при комнатной температуре.
23. Способ по п. 1, выполняемый при мезофильных изотермических условиях.
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что полимераза представляет собой мезофильную полимеразу.
25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что мезофильная полимераза представляет собой полимеразу Sau LF.
26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что амплификацию целевой нуклеиновой кислоты проводят при около 37°С.
27. Способ по п. 23, отличающийся тем, что геликаза представляет собой геликазу UvrD Е. Coli, необязательно с двумя иди более заменами D на А, например, в D403 и D404.
28. Способ по п. 23, отличающийся тем, что геликаза представляет собой геликазу pcrA (UvrD)-THna, содержащую одну или более мутаций, соответствующих D409Ah D410A.
29. Способ по п. 23, отличающийся тем, что геликаза представляет собой Tte-UvrDD409A/D410A.
30. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что последовательность целевой нуклеиновой кислоты имеет длину около 20-30, около 30-40, около 40-50 или около 50-100 нуклеотидов.
31. Способ по любому из пп. 1-23, отличающийся тем, что последовательность целевой нуклеиновой кислоты имеет длину около 100-200, около 100-500 или около 100-1000 нуклеотидов.
32. Способ по любому из пп. 1-23, отличающийся тем, что последовательность целевой нуклеиновой кислоты имеет длину около 1000-2000, около 2000-3000, около 3000-4000 или около 4000-5000 нуклеотидов.
33. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что первый или второй праймер содержит промотор РНК полимеразы.
34. Способ по любому из предшествующих пунктов, включающий одну или более добавок, выбранных из краудинг-агента, кофактора, белка, связывающего одноцепочечную ДНК, и/или вспомогательных белков.
35. Способ по п. 34, отличающийся тем, что краудинг-агент представляет собой полиэтиленгликоль.
36. Способ по п. 34, отличающийся тем, что кофактор представляет собой АТФ.
37. Способ по п. 34, отличающийся тем, что белок, связывающий одноцепочечную ДНК, выбирают из Т4 gp32 или термофильного SSB (ET-SSB).
38. Способ по п. 34, отличающийся тем, что вспомогательный белок представляет собой dCpf1 и/или рекомбиназу UvsX.
39. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий обнаружение амплифицированной нуклеиновой кислоты с помощь способа выбранного из группы, состоящей из гель-электрофореза, обнаружения интеркалирующего красителя, ПЦР, ПЦР в реальном времени, флуоресценции, резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), масс-спектрометрии, иммунохроматографического анализа, колориметрических анализов и системы обнаружения на основе CRISPR.
40. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что амплифицированная целевая нуклеиновая кислота выявляется системой на основе CRISPR Cas13, системой на основе CRISPR Cas12 или их комбинацией.
41. Способ по п. 40, отличающийся тем, что амплифицированная целевая нуклеиновая кислота выявляется системой на основе CRISPR Cas-13, содержащей фермент LwaCas13.
42. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что целевая нуклеиновая кислота выявляется с аттомолярной чувствительностью.
43. Способ по любому из пп. 1-29, отличающийся тем, что целевая нуклеиновая кислота выявляется с фемтомолярной чувствительностью.
44. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что целевую нуклеиновую кислоту выбирают из группы, состоящей из геномной ДНК, митохондриальной ДНК, вирусной ДНК, плазмидной ДНК, свободно-циркулирующей ДНК, ДНК окружающей среды, синтетической двухцепочечной ДНК и РНК.
45. Способ по п. 44, отличающийся тем, что целевая нуклеиновая кислота представляет собой РНК и где РНК обратно транскрибируется в кДНК перед амплификацией.
46. Способ по п. 45, отличающийся тем, что амплификация представляет собой рекомбиназную полимеразную амплификацию (RPA).
47. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что реакцию проводят менее чем за около 2 часа, менее чем за около 90 минут, менее чем за около 60 минут, менее чем за около 30 минут или менее чем за около 15 минут.
48. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что образец представляет собой биологический образец или образец окружающей среды.
49. Способ по п. 48, отличающийся тем, что биологический образец представляет собой кровь, плазму, сыворотку, мочу, стул, мокроту, слизистую, лимфатическую жидкость, синовиальную жидкость, желчь, асцит, плевральный выпот, серому, слюну, спинномозговую жидкость, образец водянистого или стекловидного тела или любые выделения организма, транссудат, экссудат или жидкость, полученную из сустава, или мазок с кожи или поверхности слизистой оболочки.
50. Способ по п. 49, отличающийся тем, что образец представляет собой кровь, плазму или сыворотку, полученную от пациента-человека.
51. Способ по п. 48, отличающийся тем, что образец представляет собой образец растения.
52. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что образец представляет собой неочищенный образец.
53. Способ по любому из пп. 1-52, отличающийся тем, что образец представляет собой очищенный образец.
54. Способ амплификации и/или обнаружения целевой одноцепочечной нуклеиновой кислоты, включающий
(а) превращение одноцепочечной нуклеиновой кислоты в образце в целевую двухцепочечную нуклеиновую кислоту; и
(б) выполнение стадий по п. 1.
55. Способ по п. 54, отличающийся тем, что целевая одноцепочечная нуклеиновая кислота представляет собой молекулу РНК.
56. Способ по п. 55, отличающийся тем, что молекула РНК превращается в двухцепочечную нуклеиновую кислоту посредством стадии обратной транскрипции и амплификации.
57. Способ по любому из пп. 54-56, отличающийся тем, что целевую одноцепочечную нуклеиновую кислоту выбирают из группы, состоящей из одноцепочечной вирусной ДНК, вирусной РНК, информационной РНК, рибосомальной РНК, транспортной РНК, микроРНК, короткой интерферирующей РНК, низкомолекулярной ядерной РНК, синтетической РНК, синтетической одноцепочечной ДНК, длинной некодирующей РНК, пре-микроРНК, вирусной дцРНК и невирусной дцРНК.
58. Способ по п. 1, дополнительно содержащий праймер-амплификатор, который включает часть, содержащуюся в первом праймере пары праймеров; и содержащий стадии, на которых первый праймер из пары праймеров опосредует первую стадию амплификации, а праймер-амплификатор вместе со вторым праймером из пары праймеров опосредует последующие стадии амплификации.
59. Способ по п. 58, отличающийся тем, что праймер-амплификатор и первый праймер пары праймеров каждый содержит последовательность промотора Т7.
60. Способ по п. 58, отличающийся тем, что праймер-амплифиактор имеет длину от около 23 до около 35 нуклеотидов.
61. Система для амплификации и/или обнаружения целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты в образце, содержащая
а) систему CRISPR для амплификации, где система CRISPR для амплификации содержит первый и второй комплекс CRISPR/Cas, где первый комплекс CRISPR/Cas содержит первый фермент CRISPR/Cas и первую направляющую молекулу, которая направляет первый комплекс CRISPR/Cas к первой цепи целевой нуклеиновой кислоты, и второй комплекс CRISPR/Cas, содержащий второй фермент CRISPR/Cas и вторую направляющую молекулу, которая направляет второй комплекс CRISPR/Cas ко второй цепи целевой нуклеиновой кислоты;
б) геликазу;
в) пару праймеров, содержащую первый и второй праймеры, где первый праймер содержит часть, которая комплементарна первой цепи целевой нуклеиновой кислоты, а второй праймер содержит часть, которая комплементарна второй цепи целевой нуклеиновой кислоты;
г) полимеразу; и необязательно;
д) систему обнаружения для выявления амплификации целевой нуклеиновой кислоты.
62. Система по п. 61, отличающаяся тем, что фермент CRISPR/Cas представляет собой мертвый фермент CRISPR/Cas, выбранный из мертвого фермента Cas9 или мертвого фермента Cas12.
63. Система по п. 62, отличающаяся тем, что мертвый фермент Cas12 представляет собой мертвый фермент Cas12a, Cas12b или Cas12c.
64. Система по п. 61, отличающаяся тем, что фермент CRISPR/Cas представляет собой фермент Cas9 или Cas12.
65. Система по п. 64, отличающаяся тем, что фермент Cas12 представляет собой фермент Cas12a, Cas12b или Cas12c.
66. Система по любому из пп. 61-65, отличающаяся тем, что полимеразу выбирают из группы, состоящей из ДНК полимеразы Bst 2.0, ДНК полимеразы Bst 2.0 WarmStart, ДНК полимеразы Bst 3.0, полноразмерной ДНК полимеразы Bst, большого фрагмента ДНК полимеразы Bst, большого фрагмента ДНК полимеразы Bsu, ДНК полимеразы рЫ29, ДНК полимераза Т7, полимеразы Gst, полимеразы Taq, фрагмента Кленова ДНК полимеразы I Е. coli, ДНК полимеразы KlenTaq, ДНК полимеразы Pol III, ДНК полимеразы Т5, и ДНК полимеразы Секвеназа, и ДНК полимеразы Sau LF.
67. Система по любому из пп. 61-66, отличающаяся тем, что геликазу выбирают из группы, состоящей из геликазы UvrD, геликазы CRISPR-Cas3, геликазы Rep, геликазы PcrA, геликазы I Е. coli, геликазы II Е. coli, геликазы III Е. coli, геликазы IV Е. coli, геликазы Rep, геликазы DnaB, геликазы PriA, геликазы PcrA, геликазы Т4 Gp41, геликазы Т4 Dda, большого Т антигена SV40, дрожжевой геликазы RAD, геликазы RecD, геликазы RecQ, термостабильной геликазы Т. tengcongensis UvrD, термостабильной геликазы Т. thermophilus UvrD, термостабильной геликазы Т. aquaticus DnaB, геликазы Dda, геликазы вируса папилломы Е1, геликазы простейших МСМ, геликазы эукариотов МСМ и геликазы Gp4 Т7.
68. Система по п. 67, отличающаяся тем, что геликаза представляет собой Tte-UvrDD409A/D410A.
69. Система по любому из пп. 61-68, отличающаяся тем, что фермент CRISPR/Cas, геликаза и полимераза работают при одинаковой температуре, в некоторых случаях, около 37°С.
70. Система для амплификации и/или обнаружения целевой одноцепочечной нуклеиновой кислоты в образце, содержащая
а) реагенты для превращения целевой одноцепочечной нуклеиновой кислоты в двухцепочечную нуклеиновую кислоту;
б) компоненты по п. 61.
71. Система по любому из пп. 61-70, отличающаяся тем, что система обнаружения включает систему CRISPR, содержащую эффекторный белок Cas12 или Cas13 и направляющую РНК, предназначенную для связывания с соответствующей целевой молекулой; и маскирующий конструкт.
72. Система по п. 71, отличающаяся тем, что система обнаружения содержит Cas13 фермент LwaCas13.
73. Система по п. 61, дополнительно содержащая дополнительный праймер-амплификатор, имеющий последовательность промотора, идентичную первому праймеру из пары праймеров.
74. Набор для амплификации и/или обнаружения целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты в образце, содержащий компоненты по любому из пп. 61-69, и набор инструкций по применению.
75. Набор по п. 74, дополнительно содержащий реагенты для очистки двухцепочечной нуклеиновой кислоты в образце.
76. Набор для амплификации и/или обнаружения целевой одноцепочечной нуклеиновой кислоты в образце, содержащий компоненты по п. 72, и набор инструкций по применению.
77. Набор по п. 76, дополнительно содержащий реагенты для очистки одноцепочечной нуклеиновой кислоты в образце.
78. Система по п. 66, отличающаяся тем, что геликаза представляет собой Tte-UvrDD409A/D410A.
79. Система по п. 66, отличающаяся тем, что геликаза содержит одну или более А замен в D в ферменте.
80. Система по п. 66, дополнительно содержащая одну или более добавок, выбранных из краудинг-агента, кофактора, белка, связывающего одноцепочечную ДНК, и/или вспомогательных белков.
81. Система по п. 80, отличающаяся тем, что краудинг-агент представляет собой полиэтиленгликоль с молекулярной массой 20 К, необязательно в количестве от около 2,5% до около 6,5%.
82. Система по п. 80, отличающаяся тем, что кофактор представляет собой АТФ, необязательно в количестве от 0,75 до около 5 мМ.
83. Система по п. 80, отличающаяся тем, что белок, связывающий одноцепочечную ДНК, выбран из Т4 gp32 или термофильного SSB (ET-SSB).
84. Система по п. 80, отличающаяся тем, что вспомогательный пептид представляет собой dCpf1 и/или рекомбиназу UvsX.
85. Система по п. 76, содержащая мезофильную ДНК полимеразу, в частности полимеразу Sau LF.
86. Способ по п. 1 или система по п. 61, отличающийся тем, что геликаза представляет собой геликазу PcrA из Thermoanaerobacter ethanolicus с мутациями D403A/D404A, геликазу PcrA из Bacillus sp.FJAT-27231 с мутациями D407A/D408A, геликазу PcrA из Bacillus megaterium с мутациями D415A/D416A, геликазу PcrA из Bacillus simplex с мутациями D407A/D408A или геликазу PcrA из Paeniclostridium sordellii с мутациями D402A/D403A.