СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАННЕГО РАЗВИТИЯ ПРОФЕССИОНАЛЬНЫХ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ДЕРМАТОЗОВ
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF DEVELOPING EARLY OCCUPATIONAL ALLERGIC DERMATOSES

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии на организм факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия.
Известен способ прогнозирования риска развития профессиональных аллергических дерматозов, включающий забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфизного варианта A4889G цитохрома Р-450 1А1 (см. Лазарашвили Н.А., Роль системы «оксиданты-антиоксиданты» и генетического биохимического полиморфизма в патогенезе профессиональных аллергических дерматозов. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, М., 2006 г., с.48-87).
Однако данный способ имеет невысокую скорость проведения обследования пациентов ввиду сложности и трудоемкости используемых лабораторных технологий, являющихся вредными для медицинского персонала, проводящего их. Это затрудняет прогнозирование риска развития профессиональных аллергических дерматозов, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени.
Задачей настоящего изобретения является усовершенствование способа прогнозирования риска раннего развития (до 5 лет работы с вредными производственными факторами) профессиональных аллергических дерматозов при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени.
Техническим результатом изобретения является повышение воспроизводимости и скорости проведения прогнозирования риска профессиональных аллергических дерматозов при воздействии на организм факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия.
Указанная задача достигается тем, что в известном способе прогнозирования риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов, включающем забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфизного варианта A4889G цитохрома Р-450 1А1, при проведении полимеразной цепной реакции используют специфические праймеры
С1А1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT T
C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA,
а после проведения полимеразной цепной реакции проводят реакцию пиросеквенирования в режиме реального времени с использованием специфического праймера C1A1-S ACC TCC Cag Cgg gCA A и детекцию нуклеотидной последовательности с помощью хемилюминисцентного сигнала, далее проводят сравнение полученной нуклеотидной последовательности в положении 4889 с референсными последовательностями, при выявлении на полученной пирограмме отсутствия замены аденина на гуанин и при воздействии на организм вредного производственного фактора раздражающего и сенсибилизирующего действия прогнозируют риск раннего развития профессиональных аллергических дерматозов менее 40%, при выявлении на полученной пирограмме гетерозиготного варианта Сур1А1*2С, обусловленного заменой аденина на гуанин в нуклеотидной последовательности в положении 4889, и при воздействии на организм вредного производственного фактора раздражающего и сенсибилизирующего действия прогнозируют 40-80% риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов.
Проведенные исследования по патентным и научно-техническим информационным источникам показали, что предлагаемый способ неизвестен и не следует явным образом из изученного уровня техники, т.е. соответствует критериям "новизна" и "изобретательский уровень".
Предлагаемый способ может быть применен в клинических, биохимических, молекулярно-генетических лабораториях, укомплектованных широко используемым оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью.
Следовательно, заявленный способ является доступным и практически применимым.
Таким образом, предложена совокупность приемов, позволяющих обеспечить повышение воспроизводимости и скорости проведения прогнозирования риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов, что, в свою очередь, позволяет повысить достоверность прогнозирования риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии на организм вредных производственных факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени.
Предлагаемый способ основан на исследовании комплекса диагностических тестов.
В таблице 1 представлена последовательность использованных праймеров (см. в конце описания).
Предлагаемый способ пояснен на чертеже.
На фиг.1 изображен принцип действия прибора для пиросеквенирования. На фиг.2 изображена принципиальная схема предлагаемого способа при выявлении гетерозиготного варианта Сур1А1*2С в нуклеотидной последовательности. На фиг.3 изображен световой сигнал, регистрируемый при ферментопосредованном превращении высвобождающегося пирофосфата. На фиг.4 изображена пирограмма с вариантом гомозиготного генотипа по определяемому аллельному варианту, не имеющему замены аденина на гуанин в положении 4889 (А/А) в нуклеотидной последовательности - соответствует норме (пример 1). На фиг.5 изображена пирограмма с вариантом гетерозиготного генотипа по определяемому аллельному варианту, имеющему замены аденина на гуанин в положении 4889 (A/G) (пример 2).
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
У пациента осуществляют забор венозной крови. Кровь исследуют заявленным образом: из 100 мкл цельной крови выделяют ДНК-сорбент однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В"(ТУ 9398-071-01897593-2008) в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.
Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовят серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляют 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для осуществления полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами.
Объем полимерной цепной реакции 25 мкл, при этом используют реагенты производства ЦНИИ Эпидемиологии: «ПЦР-смесь-2-blue», смесь десоксинуклеотидтрифосфатов «dNTPs (Т)», «Воск для ПЦР», «Минеральное масло для ПЦР». Для амплификации исследуемого генетического локуса используют специфические олигонуклеотидные праймеры C1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT Т и C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA (последовательность используемых праймеров представлена в таблице 1). Количество праймеров C1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT Т и C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA в полимеразной цепной реакции 10 пмоль.
Реакцию амплификации проводят по следующей программе.
При использовании амплификатора «Терцик» (фирма ДНК-Технология), когда температура достигнет 95°C (режим паузы), пробирки ставят в ячейки амплификатора и выдерживают их при температуре 95°C - 5 мин. Далее пробирки выдерживают 45 циклов: при 95°C - 10 с, при 65°C - 10 с, при 72°C - 10 с, а в конце при 72°C - 2 мин.
При использовании амплификаторов «Gradient Palm Cycler» («MAXYGEN»), «GeneAmp PCR System 2700», «PalmCycler», когда температура достигнет 95°C (режим паузы) ставят пробирки в ячейки амплификатора и продолжают программу при температуре 95°C - 5 мин. Далее 45 циклов выдерживают пробирки 45 циклов: при 95°C - 15 с, при 65°C - 15 с, при 72°C - 20 с, а в конце при 95°C - 2 мин.
После проведения амплификации осуществляют пробоподготовку образцов для секвенирования. После амплификации ПЦР-фрагмент связывают с частицами сефарозы, покрытыми стрептавидином за счет образования комплекса биотин-стрептавидин. Далее его очищают от свободных компонентов реакционной смеси с помощью серии отмывок и проводят стадию щелочной денатурации. В результате остается амплифицированный одноцепочечный ПЦР-фрагмент, который используют в качестве матрицы в реакции секвенирующего синтеза.
На одноцепочечный ПЦР-ампликлон, выступающий в качестве матрицы, гибридизуют секвенирующий праймер C1A1-S АСС ТСС Cag Cgg gCA А в концентрации 0,3 пМ, разведенный в буфере для отжига.
После полимеразной цепной реакции проводят реакцию пиросеквенирования в режиме реального времени с использованием специфического праймера C1A1-S АСС TCC Cag Cgg gCA А и детекцию нуклеотидной последовательности с помощью хемилюминисцентного сигнала.
С помощью прибора пиросеквенатора, например «PyroMark Q96 MD» или «PyroMark Q24» (Германия), проводят пиросеквенирование (фиг.1).
На данной стадии в ходе секвенирования комплементарной к матричному фрагменту цепи высвобожденный пирофосфат проходит серию ферментативных превращений, в результате чего регистрируют хемилюминесцентный сигнал (фиг.3). Проводят инкубацию исследуемого иммобилизированного фрагмента ДНК в присутствии четырех ферментов (сульфурилазы, люциферазы, апиразы, Taq-полимеразы) и субстратов (аденозин-5-фосфосульфата (APS) и люцеферина) для преобразования высвобожденного пирофосфата в хемилюминисцентный сигнал.
Реакция пиросеквенирования включает следующие стадии:
- Добавляют один из четырех дезоксинуклеотид-3-фосфатов (dNTP) в реакционную смесь. В том случае, если добавленный нуклеотид комплементарен матричной цепи ДНК, происходит встраивание в растущую цепь, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Каждый акт включения нуклеотида в цепь ДНК сопровождается высвобождением пирофосфата (PPi) в эквимолярном количестве.
- Фермент сульфурилаза катализирует процесс образования молекулы АТФ-аденозин 3 фосфат из высвобожденного пирофосфата и присутствующего в реакционной смеси аденозин-5-фосфосульфата (APS).
- Созданная молекула АТФ-аденозин 3 фосфат (АТР) запускает процесс превращения люциферина в оксилюциферин, катализируемого ферментом люциферазой, в результате чего генерируется хемилюминесцентный сигнал, величина которого пропорциональна количеству АТР.
- Хемилюминисцентный сигнал регистрируют CCD-камерой, он отображается в виде пика на пирограмме. В течение всей реакции фермент апираза деградирует невстроившиеся нуклеотиды и избыток АТР таким образом, что новый нуклеотид добавляется в цепь ДНК только при полной деградации невстроившихся дезоксинуклеотид-3-фосфатов. Последовательное добавление dNTP обеспечивает появление пиков на пирограмме, составляющих нуклеотидную последовательность исследуемого генетического локуса (фиг.3).
Далее проводят сравнение полученной нуклеотидной последовательности с референсными последовательностями и по полученной пирограмме определяют, какой вариант мутации имеет место в нуклеотидной последовательности.
При выявлении на полученной пирограмме отсутствия замены аденина на гуанин и при воздействии на организм вредного производственного фактора раздражающего и сенсибилизирующего действия прогнозируют риск раннего развития профессиональных аллергических дерматозов менее 40%, при выявлении на полученной пирограмме гетерозиготного варианта Сур1А1*2С, обусловленного заменой аденина на гуанин в нуклеотидной последовательности в положении 4889, и при воздействии на организм вредного производственного фактора раздражающего и сенсибилизирующего действия прогнозируют 40-80% риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов.
Пример 1. Больная М., 53 года
При анализе анамнеза и профессионального маршрута пациентки было выявлено, что больная М. работала с 1992 г. по настоящее время полировщиком оптических деталей в контакте с канифолью. Считает себя больной профессиональным аллергическим дерматозом с 2005 г., когда впервые появились высыпания на ладонных поверхностях, распространившиеся на тыльные поверхности и сопровождаемые зудом. В 2006 г. появились высыпания на коже нижних конечностей. Больная обращалась к дерматологу по месту жительства, но получала лечение с временным эффектом. В выходные дни, во время отпуска отмечает улучшение.
По данным биохимических исследований: незначительное (на верхней границе референсных значений) повышение содержания продуктов перекисного окисления липидов (диеновых конъюгатов, кетодиенов и карбонилов) в сыворотке крови и угнетение антиоксидантной защиты - незначительное снижение (на нижней границе референсных значений) тиолдисульфидного соотношения.
Кровь исследовали согласно предлагаемому способу.
Из 100 мкл цельной крови выделили суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ 9398-071-01897593-2008) в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.
Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) приготовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляли 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для полимеразной цепной реакции. Объем полимерной цепной реакции 25 мкл, использованы реагенты производства ЦНИИ Эпидемиологии: «ПЦР-смесь-2-blue», смесь десоксинуклеотидтрифосфатов «dNTPs (Т)», «Воск для ПЦР», «Минеральное масло для ПЦР». Для амплификации исследуемого генетического локуса использовали специфические олигонуклеотидные праймеры C1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT Т и C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA, один из которых мечен биотином. Количество праймеров C1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT Т и С1А1 - R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA в полимеразной цепной реакции - 10 пмоль
Реакцию амплификации проводили с использованием амплификатора «Терцик» (фирма ДНК-технология). При его нагреве до температуры 95°C (режим паузы) пробирки поставили в ячейки амплификатора и выдержали их при температуре 95°C - 5 мин. Далее пробирки выдерживали 45 циклов: при 95°C - 10 с, при 65°C - 10 с, при 72°C - 10 с, а в конце при 72°C - 2 мин.
После проведения амплификации осуществили пробоподготовку образцов для секвенирования. Для пиросеквенирования использовали приборы и станцию для пробоподготовки фирмы «Qiagen», Германия.
Далее проведен отжиг секвенирующего праймера. Полученные пробы подвергли пиросеквенированию на приборе «PyroMark Q96 MD» (Германия).
При анализе результатов выявлен гомозиготный вариант A4889G, не имеющий замены аденина на гуанин в положении 4889 - вариант генотипа соответствующий нормальной активности цитохрома Р-450 1А1.
Вывод: у больной М. выявлен гомозиготный вариант Сур1А1*2С полиморфизма A4889G, не имеющий замену аденина на гуанин, свидетельствующий о нормальной активности фермента. Раннего развития профессионального аллергодерматоза при воздействии на организм вредных производственных факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия не наблюдается, заболевание развилось через 13 лет после начала работы с факторами раздражающего и сенсибилизирующего действия.
Пример 2. Больная В., 58 лет
При анализе анамнеза и профессионального маршрута пациента, было выявлено, что больная В. в течение 21 года работала на Московском заводе АЗЛК слесарем-сборщиком, в контакте с металлами-аллергенами: хромом, никелем, кобальтом и бензином. Через год после начала работы был поставлен диагноз: Профессиональная экзема верхних конечностей. При обследовании в НИИ МТ РАМН диагноз был подтвержден и уточнен: Профессиональная экзема верхних конечностей.
По данным биохимических исследований: повышение содержания продуктов перекисного окисления липидов (диеновых конъюгатов, кетодиенов и карбонилов) в сыворотке крови и угнетение антиоксидантной защиты - снижение тиолдисульфидного соотношения.
Кровь исследовали согласно предлагаемому способу.
Из 100 мкл цельной крови выделяли суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ 9398-071-01897593-2008) в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.
Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) приготовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавили 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для полимеразной цепной реакции. Объем полимерной цепной реакции 25 мкл, использованы реагенты производства ЦНИИ Эпидемиологии: «ПЦР-смесь-2-blue», смесь десоксинуклеотидтрифосфатов «dNTPs (Т)», «Воск для ПЦР», «Минеральное масло для ПЦР». Для амплификации исследуемого генетического локуса использовали специфические олигонуклеотидные праймеры «C1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT Т» и «C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA», один из которых мечен биотином. Количество праймеров «C1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT Т» и «C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA» в полимеразной цепной реакции - 10 пмоль.
Реакцию амплификации проводили с использованием амплификатора «Терцик» (фирма ДНК-технология). При его нагреве до температуры 95°C (режим паузы) пробирки поставили в ячейки амплификатора и выдержали их при температуре 95°C - 5 мин. Далее выдерживали пробирки 45 циклов: при 95°C - 10 с, при 65°C - 10 с, при 72°C - 10 с, а в конце при 72°C - 2 мин.
После проведения амплификации осуществляли пробоподготовку образцов для секвенирования. Для пиросеквенирования использовали приборы и станцию для пробоподготовки фирмы «Qiagen», Германия.
Проводили отжиг секвенирующего праймера, далее пробы подвергли пиросеквенированию на приборе «PyroMark Q96 MD».
При анализе результатов был выявлен гетерозиготный вариант Сур1А1*2С полиморфизма A4889G, имеющий замену аденина на гуанин.
Вывод: у больной В. был выявлен гетерозиготный вариант Сур1А1*2С полиморфизма A4889G, имеющий замену аденина на гуанин, свидетельствующий о повышенной активности фермента. Следовательно, имеет место повышенное образование промежуточных токсичных метаболитов. Это и явилось причиной раннего развития профессионального аллергического дерматоза через год после начала работы с вредными производственными факторами раздражающего и сенсибилизирующего действия.
Предлагаемый способ прогнозирования риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов позволяет повысить точность полученных результатов за счет снижения до минимума ошибки при интерпретации результатов путем устранения «человеческого фактора» и скорость проведения анализа на 25% по сравнению с прототипом за счет применения метода пиросеквенирования, использование которого позволяет в единицу времени проводить большее количество анализов, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда, за короткие (сжатые) сроки времени.
Предложенный способ прогнозирования риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов может быть применен в клинических, биохимических, молекулярно-генетических лабораториях, укомплектованных оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью.