СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ПРЕЗЕНТАЦИИ АНТИГЕНА ETEC CS6 НА КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ И ПРОДУКТЫ, ПОЛУЧАЕМЫЕ НА ЕГО ОСНОВЕ
METHOD TO INCREASE ETEC CS6 ANTIGEN PRESENTATION ON CELLULAR SURFACE AND PRODUCTS OBTAINED BASED THEREON

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способам, которые могут быть использованы для получения антигена ETEC CS6, в частности, для получения вакцин, а также к клеткам и вакцинам, которые могут быть получены таким способом.
Уровень техники, предшествующий изобретению
Поверхностный антиген 6 Coli (CS6) представляет собой один из наиболее распространенных нефимбриальных факторов колонизации (CF) энтеротоксигенных бактерий Escherichia coli (ETEC), которые представляют собой наиболее частую причину диареи у младенцев и детей в развивающихся странах и у путешествующих в эти регионы.
Вследствие того, что иммунная защита от ETEC в основном опосредована местной продукцией антител IgA в кишечнике, то значительные усилия сосредоточены на получении пероральной вакцины на основе CF. Были получены кандидатные вакцины против ETEC, индуцирующие иммунный ответ против CF, например, в форме комбинированной CF-ETEC+CTB пероральной вакцины, которая содержала пять инактивированных штаммов ETEC, экспрессирующих несколько наиболее часто встречающихся CF, т.е. CFA/I, CS1, CS2, CS3, CS4 и CS5, совместно с B-субъединицей рекомбинантного холерного токсина (CTB, которая является высоко гомологичной с B-субъединицей ETEC LT) (Levine M.M., Giron J.A., Noriega F. Fimbrial vaccines. In: P. Klemm editor. Fimbriae: adhesion, biogenics, genetics and vaccines, CRC Press, Boca Raton, Fla. 1994, p. 255-70; Svennerholm A.M., Tobias J., Vaccines against enterotoxigenic Escherichia coli, Expert. Rev. Vaccines, 2008, 7:795-804).
В предыдущих работах описано получение штаммов E.coli кандидатной вакцины, экспрессирующих иммуногенные количества фимбриальных антигенов CF, таких как CFA/I и CS2, которые сохраняются после обработки формалином. Однако до настоящего времени попытки получить E. coli, экспрессирующую иммуногенные количества CS6, и сохранить иммунологическую активность белка CS6 в инактивированной цельноклеточной вакцине являлись неудачными.
В настоящем описании описана конструкция рекомбинантного нетоксикогенного штамма E. coli с не являющимся антибиотиком селективным маркером thyA, который экспрессирует большие количества антигена CS6 на поверхности бактерий, и для которого продемонстрировано, что инактивация фенолом бактерий не нарушает антигенных свойств CS6. В противоположность этому, неожиданно выявлено, что обработка фенолом значительно повышает количество антигена, презентируемого на клеточной поверхности. Это повышение является очень важным, поскольку количество клеток, которые можно вводить в пероральную цельноклеточную вакцину, является основным ограничивающим фактором при разработке вакцин, вследствие того, что слишком большие количества бактерий, вводимые перорально, оказывают неблагоприятные реакции, такие как рвота, в частности у новорожденных индивидуумов. Путем повышения количества антигена, презентируемого клеткой, можно повышать количество антигена(ов) в вакцине без увеличения общего количества клеток в вакцине.
Пероральная иммунизация мышей такими инактивированными фенолом бактериями E.coli, сверхэкспрессирующими CS6, индуцировала сильные ответы антител IgA в фекалиях и кишечнике и IgG+IgM в сыворотке против CS6, что превосходит ответ, индуцируемый эталонным штаммом ETEC, естественным образом экспрессирующим CS6 и ранее используемым в качестве вакцинного штамма. Данные свидетельствуют о том, что этот описанный инактивированный фенолом нетоксикогенный и сверхэкспрессирующий CS6 штамм E. coli представляет собой пригодный компонент в пероральной вакцине против ETEC.
Определения
В контексте настоящего описания указанные ниже термины имеют следующие ниже значения.
Сокращенное обозначение ETEC относится к энтеротоксигенным бактериям Escherichia coli.
Термин антиген CS6 означает поверхностный антиген Coli 6, один из наиболее распространенных нефимбриальных факторов колонизации бактерий ETEC. Термин антиген ETEC CS6 используют синонимично.
Термин инактивированная цельноклеточная вакцина относится к вакцине, содержащей целые (интактные), но инактивированные (не живые) бактерии.
Термин не являющийся антибиотиком селективный маркер относится к генетическим селективным маркерам для отбора плазмид, для которых не требуется использования антибиотиков в процессе отбора. Примеры включают комплементацию thyA (тимидилатсинтазы).
Краткое описание чертежей
Фиг.1: Конструкция pJT-CS6-thyA для экспрессии CS6. Сначала конструировали плазмиду pJT-CFA/I-ThyA (A), а затем заменяли оперон CFA/I на полный амплифицированный оперон CS6, получая pJT-CS6-thyA (B).
9
Фиг.2: Поверхностная экспрессия CS6 у рекомбинантного штамма C600-CS6 и эталонного штамма CS6. E11881/23 анализировали посредством дот-блот анализа (A) и конкурентного ELISA (B). Оба штамма культивировали в жидкой среде CFA, рекомбинантный штамм индуцировали IPTG, оба промывали и тестировали в серийных разведениях при исходной плотности 10 бактерий/мл. **P<0,01 по t-критерию Стьюдента, двустороннему.
Фиг.3: Титры ELISA IgG+IgM в сыворотке и IgA против CS6 в фекальных и кишечных экстрактах после пероральной иммунизации мышей C57 BI/6 одинаковыми количествами инактивированных фенолом бактерий C600-CS6 и бактерий E11881/23 (n=5 мышей/группа). Титры представлены в виде среднего геометрического (GM)+стандартная ошибка (SE) для мышей в каждой группе, для фекальных и кишечных экстрактов уровни усредняют до общих уровней IgA в экстрактах. Контроли обозначают уровни антител у мышей до иммунизации. **P<0,01, ***P<0,001 по t-критерию Стьюдента, двустороннему.
Сущность изобретения
В первом аспекте раскрыт способ повышения презентации антигена CS6 ETEC на клеточной поверхности, включающий стадию контактирования клеток, экспрессирующих указанный антиген с водным раствором, содержащим 0,6-2,2 % фенола по массе, таким образом, что презентация указанного антигена повышается по меньшей мере на 100%, предпочтительно по меньшей мере на 200%, более предпочтительно по меньшей мере на 300%.
Предпочтительно продолжительность стадии контактирования составляет от 1 до 72 ч. Более предпочтительно продолжительность стадии контактирования составляет от 1,5 до 42 ч.
Предпочтительно температура во время стадии контактирования составляет от 18 до 42°C, более предпочтительно от 18 до 38°C, даже более предпочтительно 18-22°C или 36-38°C.
Предпочтительно концентрация фенола составляет 0,8-2,0 % по массе, более предпочтительно 1,0-2,0 % по массе.
Предпочтительно клетки включают клетки Escherichia coli. Предпочтительно антиген является рекомбинантно сверхэкспрессированным клетками.
Предпочтительно способ по первому аспекту дополнительно включает стадию сравнения презентации антигена клетками с презентацией антигена CS6 необработанными, но иным образом сравнимыми клетками, посредством конкурентного ELISA или дот-блот анализа, предпочтительно конкурентного ELISA.
7
Во втором аспекте раскрыт способ получения инактивированной цельноклеточной вакцины для иммунизации против экспрессирующих CS6 ETEC, включающий способ по любому из предшествующих пунктов, где концентрация фенола, температура контактирования и время контактирования выбирают таким образом, что по меньшей мере происходит инактивация клеток в 10 раз наряду с повышением презентации антигена CS6.
Предпочтительно в способе по второму аспекту концентрация фенола составляет 0,6-2,0 % по массе, время контактирования составляет 6-72 ч, и температура контактирования составляет 18-22°C. Более предпочтительно концентрация фенола составляет 0,75-0,85 % по массе, время контактирования составляет 40±2 ч, и температура контактирования составляет 20±1°C.
В третьем аспекте раскрыта клетка, получаемая способом в соответствии с первым или вторым аспектами.
В четвертом аспекте раскрыта вакцина для иммунизации против экспрессирующих CS6 ETEC, содержащая клетки по третьему аспекту.
Подробное описание
Способ повышения презентации антигена CS6
В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу повышения презентации антигена CS6 ETEC на клеточной поверхности, отличающемуся тем, что он включает стадию контактирования клетки или клеток, экспрессирующих указанный антиген с водным раствором, содержащим 0,6-2,2 % фенола по массе, при подходящей температуре и в течение подходящего периода времени, таким образом, что презентация указанного антигена повышается по меньшей мере на 20%. Под по меньшей мере повышением на 20% презентации антигена подразумевают, что количество антигена, презентируемого на клеточной поверхности и детектируемого подходящими способами (см. ниже для более подробного описания), по меньшей мере удваивается по сравнению с клетками, которые не подвергали воздействию способом, но которые являются сравнимыми иным образом. Предпочтительно повышение презентации антигена составляет по меньшей мере 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%, более предпочтительно по меньшей мере 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250% или 300%. Наиболее предпочтительно повышение составляет по меньшей мере 100%.
2
4
2
4
Водный раствор может, например, представлять собой забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) с добавлением фенола, но многие другие водные буферы являются подходящими. Предпочтительно pH буферов составляет 5-9, более предпочтительно 6-8, наиболее предпочтительно от 6,5 до 7,5. Концентрация солей буфера, предпочтительно составляет 50-200 мМ, более предпочтительно 100-150 мМ и наиболее предпочтительно приблизительно 137 мМ. Подходящий буфер PBS может представлять собой такой, как указано ниже: 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г NaHPO, 0,24 г KHPO, в 1 литре, pH 7,4.
Для переменных концентрации фенола, температуры и времени продемонстрирована определенная степень взаимозависимости. Если повышают температуру, то требуется более низкая концентрация фенола и/или более короткое время для получения повышенной презентации (и наоборот). Если увеличивают время обработки, более низкую концентрацию фенола и/или более низкую температуру можно использовать (и наоборот). С помощью руководства из указаний в настоящем описании специалист может применять общепринятое экспериментирование без существенной необходимости адаптировать комбинации концентрации фенола, времени и температуры к существующим потребностям.
Подходящая продолжительность обработки может составлять от 0,1 до 240 ч или от 1 до 240 ч. Предпочтительно время обработки может составлять от 1 до 72 ч. Более предпочтительно время обработки может составлять от 1,5 до 42,0 ч. Наиболее предпочтительно время обработки составляет 2,0-40,0 ч.
Подходящая температура обработки находится в диапазоне 1-45°C или 4-45°C. Предпочтительно температура может составлять от 18 до 42°C. С практической точки зрения может быть предпочтительно проводить способ при температуре окружающей среды (комнатной) для устранения необходимости специализированного оборудования для поддержания температуры. Таким образом, один из предпочтительных диапазонов температуры составляет 18-25°C, даже более предпочтительно 18-22°C, наиболее предпочтительно приблизительно 20°C. Также предпочтительным может являться проведение способа при повышенной температуре для сокращения продолжительности процесса и/или уменьшения необходимой концентрации фенола. Таким образом, другой предпочтительный диапазон температур составляет 35-42°C, даже более предпочтительно 36-38°C, наиболее предпочтительно приблизительно 37°C.
Концентрация фенола может предпочтительно находиться в диапазоне от 0,7 до 2,0% по массе, более предпочтительно 0,75-2,0% по массе, еще более предпочтительно 0,8-2,0% по массе, еще более предпочтительно 0,85-2,0% по массе, даже более предпочтительно 0,9-2,0% по массе и наиболее предпочтительно 1,0-2,0% по массе. В одном из предпочтительных вариантов осуществления концентрация фенола составляет 0,6-2,0% по массе, время контактирования составляет 6-72 ч, и температура контактирования составляет 18-22°C. В другом предпочтительном варианте осуществления концентрация фенола составляет 0,6-2,0 % по массе, время контактирования составляет 2-4 ч, и температура контактирования составляет 36-38°C.
Клетки в указанном выше способе могут представлять собой клетки Escherichia coli. Это может являться предпочтительным с практической точки зрения, т.к. E. coli легко культивировать и проводить над ними генетические манипуляции в лаборатории. Кроме того, основной целью способа является предоставление вакцин против ETEC, в соответствии с этим предпочтительным может являться использование E. coli хозяина для антигена для обеспечения более естественных условий для презентируемого антигена. Предпочтительно клетки представляют собой нетоксикогенные клетки E. coli. Однако следует понимать, что способ также можно применять для других экспрессирующих CS6 клеток.
12
8
12
9
10
Концентрация клеток не является критической в разумных пределах. Подходящей считают любую концентрация до 10 клеток/мл. Практический предпочтительный диапазон концентрации клеток может составлять 10-10 клеток/мл. Наиболее предпочтительный диапазон составляет от 10 до 2·10 клеток/мл.
Продукцию антигена CS6 ETEC можно рекомбинантно индуцировать в клетке посредством генетической инженерии (см. пример 1). Это облегчает получение высоких уровней антигена на клетку, является эффективным в отношении минимизации числа клеток, необходимых для дозы вакцины, приводя к минимизации неблагоприятных воздействий. Однако способ также можно использовать для клеток, которые нативно (т.е. без какой-либо генетической инженерии) экспрессируют антиген CS6. Однако предпочтительно клетки по способу являются нетоксикогенными клетками-хозяевами E. coli, которые экспрессируют антиген CS6 в результате трансформации экспрессирующей CS6 плазмидой. Предпочтительно плазмида содержит не являющийся антибиотиком селективный маркер, т.е. селективный маркер, для которого не требуется использование антибиотиков для его функционирования. Наиболее предпочтительно клетки-хозяева являются ауксотрофными по тимидину, и сверхэкспрессирующая CS6 плазмида несет фактор комплементации тимидилатсинтазу (ThyA), таким образом, отбор можно проводить с использованием среды, не содержащей тимидин. Предпочтительно сверхэкспрессией CS6 управляет tac-промотор или аналогичный сильный индуцибельный промотор, хорошо известный в данной области.
В отношении измерения повышенной презентации антигена CS6 в результате способа по изобретению пригодные способы описаны в настоящем описании, а также известны из литературы. Предпочтительно определение проводят анализом конкурентного ELISA, как описано в настоящем описании (см. пример 2 и ассоциированные вещества и способы), или дот-блот анализом, также описываемым в настоящем описании (см. пример 2). Предпочтительно способ по первому аспекту включает дополнительные стадии анализа количества презентации антигена CS6 клетками (например, указанными выше способами) и сравнение презентируемого количества с количеством антигена CS6, презентируемого клетками, которые не подвергали обработке водным раствором, содержащим фенол, но которые являются сопоставимыми иным образом. Соответственно часть клеток отделяют и хранят до стадии контактирования, чтобы они служили по существу контрольным образцом.
Способ получения вакцины
7
8
9
10
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу получения инактивированной цельноклеточной вакцины для иммунизации против экспрессирующих CS6 ETEC, включающему способ по первому аспекту, где концентрацию фенола, температуру контактирования и время контактирования выбирают таким образом, чтобы происходила по меньшей мере в 10 раз инактивация клеток наряду с повышением презентации антигена CS6. Предпочтительно степень инактивации составляет по меньшей мере 10, более предпочтительно 10, еще более предпочтительно 10 и наиболее предпочтительно не существует жизнеспособных клеток, содержащихся после обработки. Инактивацию клеток можно определять любыми общепринятыми способами, хорошо известными в данной области. Подходящий способ описан в настоящем описании в разделе, озаглавленном «Вещества и способы».
Использование фенола для инактивации клеток, а также повышения презентации антигена может являться эффективным вследствие того, что это уменьшает число стадий способа получения вакцины. Инактивация фенолом также решает проблему, возникающую в результате способности антигена CS6 разрушаться обычно предпочтительным способом инактивации, обработкой формалином (см. пример 2).
Предпочтительно в способе по второму аспекту концентрация фенола составляет 0,6-2,0 % по массе, время контактирования составляет 6-72 ч, и температура контактирования составляет 18-22°C. Альтернативный предпочтительный набор условий является таким, где концентрация фенола составляет 0,6-2,0 % по массе, время контактирования составляет 2-4 ч, и температура контактирования составляет 36-38°C. Еще один другой предпочтительный набор условий является таким, где концентрация фенола составляет 1,1-1,3 % по массе, время контактирования составляет 16±3 ч, и температура контактирования составляет 20±2°C. Еще один другой предпочтительный набор условий является таким, где концентрация фенола составляет 1,1-1,3 % по массе, время контактирования составляет 40±8 ч, и температура контактирования составляет 20±2°C. Дополнительный предпочтительный набор условий является таким, где концентрация фенола составляет 1,4-1,6 % по массе, время контактирования составляет 6±2 ч, и температура контактирования составляет 20±2°C. Еще один дополнительный предпочтительный набор условий является таким, где концентрация фенола составляет 0,75-0,85 % по массе, время контактирования составляет 40±2 ч, и температура контактирования составляет 20±1°C.
Клетки и вакцины, получаемые способом по изобретению
Третий аспект относится к клетке, получаемой способом по первому или второму аспектам.
Обработка фенолом приводит к заметному изменению структуры клеточной стенки и/или антигена таким образом, что больше антигена становится более доступным для детекции (как in vitro, например, антителами, и in vivo иммунной системой). Другими словами, бактериальная клетка, обрабатываемая таким образом, приобретает новую структуру в результате проведения способа по первому или второму аспектам, хотя невозможно описать изменение структуры структурными терминами.
Четвертый аспект относится к вакцине для иммунизации против экспрессирующих CS6 ETEC, содержащей клетки в соответствии с третьим аспектом.
Примеры
Для подробного описания экспериментальных способов, относящихся к примерам, читателю следует обратиться к разделу «Вещества и способы».
Пример 1: Экспрессия CS6 в E. coli C600-CS6
Фрагмент ДНК, содержащий структурные гены (cssA, cssB, cssC, cssD) для CS6, получаемый из штамма дикого типа ETEC с поверхностной экспрессией CS6, амплифицировали ПЦР и клонировали в конструкцию, экспрессирующую вектор pJT-CS6-ThyA, как проиллюстрировано на фиг.1A и 1B. Затем эту плазмиду электропорировали в зависящий от тимина, нетоксикогенный штамм E. coli C600-ΔthyA и индуцировали поверхностную экспрессию CS6 добавлением IPTG к среде для выращивания, как показано в анализе дот-иммуноблоттинга (фиг.2A).
Не наблюдали экспрессии CS6 при отсутствии индуктора (данные не показаны). При анализе экспрессии CS6 рекомбинантным штаммом C600-CS6 анализом дот-блот авторы обнаружили, что этот штамм экспрессировал CS6 по меньшей мере на уровнях больших в 8 раз по сравнению с эталонным штаммом E11881/23 CS6, который ранее использовали в качестве вакцинного штамма CS4+CS6 в вакцине CF-CTB-ETEC (фиг.2A). Аналогичным образом, также при конкретном определении поверхностной экспрессии CS6 анализом конкурентного ELISA, выявляли приблизительно в 10 раз большее количество CS6 у рекомбинантного штамма по сравнению с эталонным штаммом (фиг.2B).
Пример 2: Инактивация бактерий без нарушения свойств антигена CS6
Для инактивации экспрессирующих CS6 бактерий при сохранении свойств антигена CS6 на их поверхности сравнивали действия формальдегида и фенола. Предварительные исследования продемонстрировали, что обработка бактерий 0,3% или 0,6% формальдегидом наряду с безопасной инактивацией бактерий приводила к полной потере детектируемого антигена CS6 (данные не показаны). В противоположность этому, обработка бактерий 0,5% фенолом не только инактивировала тестируемые бактерии, а также сохраняла антиген CS6 (данные не показаны); с другой стороны, самая низкая тестируемая концентрация фенола 0,25% не приводила к полной инактивации бактерий. Эти результаты свидетельствовали о том, что обработка фенолом может являться пригодной для инактивации бактерий при сохранении антигена CS6. Для разработки оптимального способа инактивации тестировали, таким образом, различные концентрации фенола для инактивации рекомбинантного штамма C600-CS6 и для сравнения с другим сверхэкспрессирующим CS6 штаммом (TOP10-CS6-Amp). Как видно в таблице 2, в обоих штаммах, тестируемых с 0,5%, 0,8%, 1% и 1,6%, но не с 0,25%, фенол инактивировал бактерии, а также сохранял поверхностный CS6, как тестировали конкурентным ELISA. Максимальный уровень CS6 выявляли, когда бактерии инактивировали 0,8% фенолом, обработка которым фактически воспроизводимо повышала предполагаемые количества антигена CS6 поверхности по сравнению с необрабатываемыми бактериями (таблица 2). На основании этих результатов использовали, таким образом, фенол в концентрации 0,8% для инактивации C600-CS6 и эталонного штамма E11881/23, в результате чего получали инактивированные бактерии с количествами CS6 в 6 раз больше у рекомбинантного штамма, по сравнению с эталонным штаммом, как тестировали конкурентным ELISA. Затем эти инактивированные бактерии использовали для пероральных иммунизаций мышей.
Таблица 2Уровни поверхностного CS6 и отсутствие роста штаммов C600-CS6 и top10-CS6-Amp после инактивации различными концентрациями фенола
CS6 (мкг/10<sup>9</sup> бактерии)<sup>a</sup>
Рост<sup>b</sup>
Фенол
C600-CS6
top10-CS6-Amp
C600-CS6
top10-CS6-Amp
0
0,61±0,038
0,39±0,054
+
+
0,25%
0,55±0,037
0,30±0,06
+
+
0,5%
0,53±0,046
0,77±0,084
-
-
0,8%
2,03±0,23
2,36±0,206
-
-
1,0%
1,92±10,18
1,87±0,13
-
-
1,6%
1,15±10,11
0,89±0,082
-
-
<sup>a</sup> Уровни поверхностного CS6 измеряли конкурентным ELISA, как описано в веществах и способах, среднее значение±SE четырех определений.
<sup>b</sup> После инактивации фенолом обрабатываемые бактерии тестировали на стерильность (т.е. отсутствие роста), как описано в веществах и способах; - означает отсутствие роста и + означает рост.
Пример 3: Иммуногенность инактивированных фенолом C600-CS6 у мышей
В первом тесте иммуногенности рекомбинантного штамма C600-CS6 авторы иммунизировали группы мышей Balb/C и C57 Bl/6 одинаковым количеством инактивированных фенолом бактерий и сравнивали ответы антител против CS6 в сыворотке, как измерено ELISA. Хотя значительные ответы против CS6 индуцировались у обоих типов мышей, ответы антител у мышей C57 Bl/6 являлись по существу выше, чем у мышей Balb/C (данные не показаны). Таким образом, авторы использовали C57 Bl/6 мышей для дальнейших исследований пероральной иммунизации, в которых сравнивали иммуногенность перорально вводимого препарата инактивированной фенолом вакцины на основе C600-CS6 и эталонного штамма E11881/23. Результаты свидетельствовали о том, что все иммунизированные мыши отвечали продукцией антител IgG+IgM против CS6 в сыворотке, и что титры антител против CS6 в среднем являлись более чем в 60 раз выше у мышей, иммунизированных бактериями C600-CS6, по сравнению с титрами у мышей, иммунизированных эталонным штаммом E11881/23 (фиг.3). Также анализировали ответы антитела IgA против CS6 в фекальных и кишечных экстрактах (фиг.3). В обоих случаях рекомбинантный штамм C600-CS6 значительно индуцировал, в среднем в 75 раз выше, уровни ответа антител IgA против CS6 в фекальных и кишечных экстрактах по сравнению с уровнями у мышей, иммунизированных соответствующим эталонным штаммом, последний штамм индуцировал только незначительно более высокие уровни антител IgA против CS6 в слизистой оболочке по сравнению с уровнями антител у неиммунизированных контрольных мышей.
Пример 4: Оптимизация обработки фенолом, повышающей презентацию антигена CS6 при 20°C
10
Штамм C600-CS6 культивировали в течение ночи (16-18 ч) в ротационном шейкере (150 об/мин) при 37°C. Аликвоты ночной культуры разбавляли 1/100 и получаемую культуру инкубировали в течение 2 ч, как указано ниже, к которой добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ для индукции экспрессии CS6. Затем культуру дополнительно инкубировали в аналогичных условиях дополнительно в течение 6 ч. Затем собирали бактерии, промывали дважды PBS (для устранения возможности содержания каких-либо остатков из среды) и ресуспендировали в PBS в плотности OD600=16 (соответствующей приблизительно 2×10 бактерий/мл).
Индуцированную с подведенной OD бактериальную культуру разливали в 8 колб по 250 мл, каждая колба содержала 25 мл бактериальной культуры. В момент времени ноль (т.е. необработанные бактерии) часть отбирали для подсчета жизнеспособных бактерий. В колбы добавляли двадцать пять (25) мл фенола в конечной концентрации (% по массе) 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,5 или 2,0 с последующей инкубацией всех колб в течение 1 ч, 2 ч, 6 ч, 16 ч и 40 ч при комнатной температуре при 80 об/мин. После каждого момента времени из каждой колбы отбирали 1 мл каждой бактериальной суспензии (с фенолом) в пробирку Эппендорфа. Собирали бактерии, тщательно промывали дважды PBS (для устранения возможности содержания каких-либо остатков фенола) и ресуспендировали с 1 мл PBS. Суспензии хранили при 4°C и использовали для конкурентного ELISA. Результаты приведены в таблице 3.
Таблица 3Уровни поверхностного CS6 в штамме C600-CS6 после инактивации различными концентрациями фенола для различных моментов времени при 20°C
CS6 (мкг/10<sup>9</sup> бактерий)<sup>a</sup>
Времена инкубации
Фенол
0 ч
6 ч
16 ч
40 ч
0
0,3
0,6%
0,17
0,28
0,73
0,8%
0,28
0,77
0,89
1,0%
1,1
0,93
1,06
1,2%
1,67
2,2
1,36
1,5%
2,75
1,71
1,14
2,0%
1,57
0,91
0,37
<sup>a</sup> Уровни поверхностного CS6 измеряли конкурентным ELISA, как описано в веществах и способах. Значения представляют собой среднее двух определений.
Пример 5: Обработка фенолом, повышающая презентацию антигена CS6 и одновременно инактивирующая бактерии, в промышленном масштабе
9
В ферментер 500 литров вносили штамм E. coli, сверхэкспрессирующий антиген CS6 (ETEX 24). После индукции экспрессии посредством IPTG проводили ферментацию в течение 8 ч. Бактерии собирали и отмывали ультрафильтрат 500 кДа, и в заключении разливали в концентрации 20×10 бактерии/мл. Добавляли фенол до конечной концентрации 0,8% (мас./об.) и хранили суспензию при 20°C в течение 40 ч при постоянном перемешивании. Суспензию отмывали на ультрафильтрационной мембране 500 кДа в фосфатно-солевом буфере и хранили при 4°C.
Во время процедуры инактивации образцы отбирали перед инактивацией, через 1, 2, 18 и 40 ч после инактивации для тестирования их жизнеспособности. В кратком изложении, отобранные образцы промывали центрифугированием и ресуспендировали в исходном объеме в PBS, после чего разбавляли в PBS и высевали на агаре с фактором колонизации (агар CFA). Планшеты инкубировали при 37°C и проводили подсчет на следующие сутки.
Конкурентный ELISA для определения количества антигена CS6 проводили на свежем материале до инактивации и промывали инактивированный материал.
Ясно видно, что эффективную инактивацию клеток и повышенную презентацию антигена CS6 можно получать одновременно в масштабе промышленного производства (таблица 4).
Таблица 4Зависимость от времени для инактивации при 20°C
Время инактивации (часы)
0
1
2
18
40
Всего CS6 (мкг/10<sup>9</sup> клеток)
2,51
не опр.
не опр.
не опр.
5,36
Связанного CS6 (log/10<sup>9</sup> клеток)
1,01
не опр.
не опр.
не опр.
2,90
Жизнеспособных клеток (КОЕ/мл)
1,64×10<sup>10</sup>
1,5×10<sup>5</sup>
1,2×10<sup>3</sup>
0
0
Не опр.=не определено
Вещества и способы
Бактериальные штаммы и культура. Бактериальные штаммы, используемые в этом исследовании, перечислены в таблице 1. Нетоксикогенный штамм E. coli C600-ΔthyA, который является ауксотрофным по тимину (N.I.A. Carlin and M. Lebens, неопубликовано), использовали для конструкции штамма C600-CS6 для кандидатной вакцины. Штамм E11881/23 ETEC, который ранее использовали в качестве экспрессирующего CS4+CS6 штамма в вакцине CF-ETEC+CTB, использовали в качестве эталонного штамма. Для экспрессии CS6 бактерии выращивали в среде CFA (Evans DG, Evans D.J. Jr., Clegg S., Pauley J.A., Purification and characterization of the CFA/I antigen of enterotoxigenic Escherichia coli. Infect. Immun., 1979; 25:738-48) с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) при необходимости.
Таблица 1Список штаммов, плазмид и праймеров, используемых в этом исследовании
Штаммы, плазмида и праймеры
Соответствующие характеристики
Ссылка/источник
Штаммы
ETEC GB35
CS6<sup>+</sup>, LT<sup>+</sup>,
Nicklasson et al., Microb Pathog., 2008, 44:246-54.
E. coli E11881/23
CS4<sup>+</sup> CS6<sup>+</sup>, LT<sup>-</sup>, ST<sup>-</sup>
Tobias et al., Vaccine, 2008, 26:5373-80
top10-CS6-Amp
top10, экспрессирующий CS6, Amp<sup>r</sup>
N.I.A. Carlin and M. Lebens
E. coli C600-ΔthyA
Ауксотрофный по тимину, Kan<sup>r</sup>
Это исследование
C600-CFA/I
C600-ΔthyA/pJT-CFA/I-ThyA
Это исследование
C600-CS6
C600-ΔthyA/pJT-CS6-ThyA
Плазмида:
pJT-CFA/I-Cm
9041 п.н.
Tobias et al., Vaccine, 2010, 28:6977-84.
pNC-4
5086 п.н.; thyA
N.I.A. Carlin
pJT-CFA/I-ThyA
8879 п.н.; thyA
Это исследование
pJT-CS6-ThyA
7973 п.н., thyA
Это исследование
Праймеры:
P1
5'-CGGTCTCCCTAGGCCTCCTTACCTATGGTGATC (SEQ ID NO:1)
P2
5'-CGGTCTCCTCGAGCGACTCTAGACCTAACCG (SEQ ID NO:2)
P3
5'-CGGTCTCGAATTCTAATGGTGTTATATGAAGAAAACAATTG (SEQ ID NO:3)
P4
5'-CGGTCTCAAGCTTAACATTGTTTATTTACAACAGATAATTGTTTG (SEQ ID NO:4)
Конструкция экспрессирующего вектора pJT-CS6-ThyA. Для конструкции рекомбинантного штамма C600-CS6 сначала получали плазмиду pJT-CFA/I-ThyA. Плазмида pJT-CFA/I-Cm (Tobias J., Holmgren J., Heilman M., Nygren E., Lebens M., Svennerholm A-M. Over-expression of major colonization factors of enterotoxigenic Escherichia coli, alone or together, on non-toxigenic E. coli bacteria. Vaccine 2010, 28:6977-84) расщепляли с использованием XhoI и AvrII для удаления гена устойчивости к хлорамфениколу (cat). Затем использовали плазмиду pNC-4 (N.I.A. Carlin, неопубликовано) в ПЦР реакции для амплификации гена thyA (из Vibrio cholerae). Прямой праймер P1 (SEQ ID NO:1) являлся гомологичным последовательности, начинающейся 98 п.н. перед thyA, и содержал участки рестрикции для Eco31I и AvrII, и обратный праймер P2 (SEQ ID NO:2) являлся гомологичным последовательности, заканчивающейся 75 п.н. ниже thyA, и содержал участки рестрикции для Eco31I и XhoI на 5'-конце (таблица 1). Условия ПЦР являлись следующими: 95°C в течение 5 минут, 31 цикл 94°C в течение 15 секунд, 58°C в течение 30 секунд и 72°C в течение 50 секунд, с конечной элонгацией 7 минут при 72°C. Затем получаемый фрагмент 1065 п.н., содержащий thyA, подвергали экстракции из геля и расщепляли XhoI и AvrII. Лигирование амплифицированного и расщепленного thyA с расщепленным pJT-CFA/I-Cm приводило к получению pJT-CFA/I-ThyA (фиг.1A). Эту плазмиду затем электропорировали в E. coli C600-ΔthyA и выделяли рекомбинантный штамм (C600-ΔthyA/pJT-CFA/I-ThyA).
Затем конструировали плазмиду pJT-CS6-ThyA в две стадии (фиг.1B). Сначала расщепляли плазмиду pJT-CFA/I-ThyA EcoRI и Hind III. Использовали ПЦР для амплификации оперона CS6 из экспрессирующего CS6 штамма GB35 ETEC (Nicklasson M., Sjoling A., Lebens M., Tobias J., Janzon A., Brive L., Svennerholm A-M., Mutations in the periplasmic chaperone leading to loss of surface expression of the colonization factor CS6 in enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) clinical isolates. Microb. Pathog., 2008, 44:246-54). Амплификацию проводили с использованием прямого и обратного праймеров P3 (SEQ ID NO:3) и P4 (SEQ ID NO:4), соответственно (таблица 1) и системы Expand High Fidelity PCR (Roche Diagnostics GmbH). P3 является гомологичным последовательности, начинающейся 13 п.н. перед cssA, и содержит участки рестрикции для EcoRI и Eco31I, тогда как P4, который является гомологичным последовательности, заканчивающей 2 п.н. ниже cssD, содержит участки рестрикции для HindIII и Eco31I на 5'-конце (фиг.1B). Условия ПЦР являются такими, как описано ранее (Tobias J., Lebens M., Kallgard S., Nicklasson M., Svennerholm A-M., R Role of different genes in the CS6 operon for surface expression of enterotoxigenic Escherichia coli colonization factor CS6. Vaccine, 2008, 26:5373-80). Затем амплифицированный оперон CS6 4135 п.н. расщепляли Eco31I с получением фрагмента, фланкированного EcoRI и HindIII, который лигировали с расщепленным pJT-CFA/I-ThyA с получением плазмиды pJT-CS6-ThyA 7973 п.н. Конструируемую плазмиду pJT-CS6-ThyA электропорировали в штамм C600-ΔthyA. Для выявления наличия оперона CS6 получаемые колонии подвергали скринингу посредством ПЦР с использованием праймеров P3 и P4. Положительные клоны анализировали в дальнейшем рестрикционным анализом выделяемых плазмид, а также посредством способности расти в среде CFA, подтверждая их независимость от тимина. Один такой клон выбирали в качестве штамма положительного по CS6 и независимого от тимина и конструировали C600-CS6 (т.е. C600-ΔthyA/pJT-CS6-ThyA).
9
Экспрессия CS6. Экспрессирующие CS6 штаммы культивировали в среде CFA в течение ночи (16-18 ч) в ротационном шейкере (150 об/мин) при 37°C. Аликвоты ночных культур разбавляли 1/100 средой CFA и получаемые культуры инкубировали в течение 2 ч, как указано выше. К культуре рекомбинантного штамма добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ для индукции экспрессии CS6, а затем дополнительно инкубировали при аналогичных условиях еще в течение 6 ч. Затем собирали бактерии и ресуспендировали в PBS в плотности OD600=0,8 (соответствующей приблизительно 10 бактерий/мл).
Количественное определение CS6 рекомбинантного штамма. Специфическое моноклональное антитело (MAb 2a:14) против CS6 (Helander A., Grewal H.M., Gaastra W., Svennerholm A-M., Detection and characterization of the coli surface antigen 6 of enterotoxigenic Escherichia coli strains by using monoclonal antibodies. J. Clin. Microbiol., 1997, 35:867-72) использовали для количественного определения уровня экспрессии CS6 рекомбинантным C600-CS6 и эталонным штаммом E11881/23 ETEC способам дот-блот анализа и конкурентного ELISA, как описано (Tobias J., Holmgren J., Heilman M., Nygren E., Lebens M., Svennerholm A-M. Over-expression of major colonization factors of enterotoxigenic Escherichia coli, alone or together, on non-toxigenic E. coli bacteria. Vaccine, 2010, 28:6977-84 и Tobias J., Lebens M., Bolin I., Wiklund G., Svennerholm A-M., Construction of non-toxic Escherichia coli and Vibrio cholerae strains expressing high and immunogenic levels of enterotoxigenic E. coli colonization factor I fimbriae. Vaccine, 2008, 26:743-52).
10
Получение инактивированных бактерий. Тестировали и сравнивали формальдегид и фенол для инактивации экспрессирующих CS6 штаммов. Формальдегид в конечных концентрациях 0,3% (масс./об., 0,1 M) или 0,6% (0,2 M) и фенол в конечных концентрациях 0,25%-1,6% (масс./об., 0,026-0,17 M) добавляли к бактериальным культурам в плотности 10 бактерий/мл в PBS. Суспензии инкубировали в течение 2 ч при 37°C при перемешивании при 60 об/мин, а затем хранили при 4°C в течение 3 суток без перемешивания. Затем бактериальные суспензии центрифугировали, промывали и ресуспендировали в аналогичном объеме PBS и хранили при 4°C до использования. В обоих способах инактивации 0,1 мл каждой суспензии растирали на кровяном агаре и инкубировали при 37°C в течение одной недели для проверки отсутствия роста. Пред использованием для пероральной иммунизации проверяли уровень CS6 в инактивированных бактериях конкурентным ELISA.
8
Иммунизации мышей и получение образцов. Группы самок мышей Balb/C и C57 Bl/6 (Charles River, в возрасте 6-8 недель, 5 мышей/группа) использовали для пероральных (внутрижелудочных) иммунизаций. Всем мышам вводили две дозы 3×10 инактивированных фенолом бактерий (инактивированных с использованием 0,8% концентрации фенола) штамма C600-CS6 или эталонного штамма совместно с CT 7,5 мкг через двое суток в 0,3 мл 3% растворе бикарбоната натрия внутрижелудочно через детский катетер для питания (первая стадия иммунизации) с последующими через две недели двумя идентичными иммунизациями через двое суток на второй стадии иммунизации. Отбор проб крови проводили до первой иммунизации и через две недели после последней иммунизации, во время которых также собирали фекальные комочки (FP) и получали экстракты, как описано ранее (Nygren E., Holmgren J., Attridge S.R. Murine antibody responses following systemic or mucosal immunization with viable or inactivated Vibrio cholerae. Vaccine, 2008, 26:6784-90). Кроме того, в последующие моменты времени, когда мышей умерщвляли, их перфузировали раствором гепарина-PBS для удаления крови из ткани, и собирали ткани тонкого кишечника и экстрагировали 2% (масс./об.) раствором сапонина-PBS (способ Perfext), как описано ранее Villavedra M., Carol H., Hjulstrom M., Holmgren J., Czerkinsky C. "PERFEXT": a direct method for quantitative assessment of cytokine production in vivo at the local level. Res. Immunol., 1997, 148:257-66).
ELISA. Титры антител IgG+IgM и IgA против CS6 определяли в сыворотке, фекальных экстрактах и экстрактах кишечника ELISA, как описано ранее (Rudin A., Svennerholm A-M. Colonization factor antigens (CFAs) of enterotoxigenic Escherichia coli can prime and boost immune responses against heterologous CFAs. Microb. Pathog., 1994, 16:131-9). Для применения в ELISA в качестве покрывающего антигена (в конечной концентрации 0,7 мкг/мл) CS6 выделяли из ранее описанного сверхэкспрессирующего CS6 штамма TOP10 (Tobias J., Lebens M., Kallgard S., Nicklasson M., Svennerholm A-M. Vaccine, 2008, 26:5373-80) поочередным осаждением сульфатом аммония и гель-фильтрацией. Сыворотку от индивидуальных мышей тестировали с использованием планшетов со слабым связыванием для микротитрования (Greiner) и изначально разбавляли образцы 1/100 с последующими серийными трехкратными разбавлениями. Экстракты фекальных комочков и экстракты ткани тонкого кишечника тестировали в планшетах для микротитрования с высоким связыванием (Greiner) в 3-кратных серийных разбавлениях от начального разбавления 1/3. Титры антител рассчитывали как обратные величины разбавлений образца, которые обеспечивали оптическую плотность A450 на 0,4 выше фоновой величины. В образцах фекальных и кишечных экстрактах также измеряли общий IgA ELISA, как описано (Nygren E., Holmgren J., Attridge S.R. Vaccine, 2008, 26:6784-90) и выражали значение антиген-специфического антитела IgA в виде единиц титра IgA на мкг общего IgA.
Статистический анализ. Все эксперименты ELISA проводили по меньшей мере дважды на различных выборках. Статистические анализы проводили с использованием t-критерия Стьюдента и P<0,05 (двустороннее) считали значимым отличием.