АГОНИСТЫ РЕЦЕПТОРА МЕЛАНОКОРТИНА-4
MELANOCORTIN-4 RECEPTOR AGONISTS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[1] Настоящее изобретение относится к соединению, проявляющему превосходную агонистическую активность в отношении рецепторов меланокортина. Более конкретно, настоящее изобретение относится к соединению следующей формулы 1, фармацевтической композиции, содержащей соединение в качестве активного ингредиента, и его применению, и соединение настоящего изобретения проявляет превосходную агонистическую активность в отношении рецепторов мелакортина-4 и может быть особенно полезным для предотвращения или лечения ожирения, диабета, воспалений и эректильной дисфункции:
[2] [Формула 1]
[3]
[4]
2
5
[5] где R1 представляет собой C-C алкил.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[6] Белок лептина представляет собой гормон, секретируемый жировыми клетками тела (адипоцитами), и количество его секреции увеличивается по мере увеличения содержания жира в организме. Белок лептина регулирует функции различных нейропептидов, продуцируемых в гипоталамусе, тем самым регулируя аппетит, содержание жира в организме и различные функции in vivo, включая энергетический метаболизм (Schwartz, et al., Nature 404, 661-671 (2000)). Сигнальная трансдукция аппетита и контроля веса с помощью лептинового белка осуществляется посредством регуляции многих нижестоящих факторов, наиболее характерными из которых являются меланокортин, агути-родственный пептид (AgRP) и гормон нейропептид Y (NPY).
[7] Когда концентрация лептина в крови увеличивается в результате чрезмерного потребления калорий in vivo, секреция белкового гормона проопиомеланокортина (POMC) в гипофизе увеличивается, а продукция AgRP и NPY снижается. Альфа-MSH (гормон, стимулирующий меланоциты), который представляет собой небольшой пептидный гормон, вырабатывается нейронами POMC, и этот гормон является агонистом рецептора меланокортина-4 (MC4R) вторичных нейронов и в конечном итоге вызывает снижение аппетита. С другой стороны, когда концентрация лептина снижается из-за дефицита калорий, увеличивается экспрессия AgRP, который является антагонистом MC4R, а также увеличивается экспрессия NPY, что в конечном итоге усиливает аппетит. То есть, в зависимости от изменений лептина, гормон альфа-MSH и гормон AgRP участвуют в регуляции аппетита, являясь агонистом и антагонистом MC4R.
[8] Гормон альфа-MSH вызывает различные физиологические реакции, связываясь с 3 подтипами MCR в дополнение к MC4R. К настоящему времени идентифицировано пять подтипов MCR. Среди подтипов известно, что MC1R в основном экспрессируется в клетках кожи и участвует в пигментации меланина, MC2R в основном экспрессируется в надпочечниках и участвует в производстве глюкокортикоидного гормона, и только ACTH (адренокортикотропный гормон), полученный из POMC, является его лигандом. MC3R и MC4R, которые в основном экспрессируются в центральной нервной системе, участвуют в регуляции аппетита, энергетического метаболизма и эффективности накопления жира в организме, а MC5R, который экспрессируется в различных тканях, как известно, регулирует экзокринную функцию (Wikberg, et al., Pharm Res 42 (5) 393-420 (2000)). В частности, активация рецептора MC4R имеет эффект эффективного снижения массы тела, вызывая снижение аппетита и повышение энергетического метаболизма, и таким образом доказано, что она является основным направлением действия при разработке лекарств от ожирения (Обзор: Wikberg, Eur. J. Pharmacol 375, 295-310 (1999)); Wikberg, et al., Pharm Res 42 (5) 393-420 (2000); Douglas et al., Eur J Pharm 450, 93-109 (2002); и OʼRahilly et al., Nature Med 10, 351-352 (2004)).
[9] Роль MC4R в контроле аппетита и веса была в первую очередь продемонстрирована в эксперименте на животной модели аномальной экспрессии белка агути (мышь агути). В случае мышей агути обнаружено, что белок агути экспрессируется в высоких концентрациях в центральной нервной системе и действует как антагонист MC4R в гипоталамусе из-за генетических мутаций, вызывая, таким образом, ожирение (Yen, TT et al., FASEB J. 8, 479-488 (1994); и Lu D., et al. Nature 371, 799-802 (1994)). В последующих результатах исследований было замечено, что AgRP (родственный агути пептид), подобный фактическому белку агути, экспрессировался в гипоталамическом нерве, и также известно, что AgRP участвует в регуляции аппетита в качестве антагонистов против MC4R (Shutter, et al., Genes Dev., 11, 593-602 (1997); и Ollman, et al. Science 278, 135-138 (1997)).
[10] Церебральное введение животному альфа-MSH, который является агонистом MC4R in vivo, демонстрирует эффект снижения аппетита, и если вводят SHU9119 (пептид) или HS014 (пептид), которые являются антагонистами MC4R, то снова наблюдается эффект повышения аппетита (Kask et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 245, 90-93 (1998)). Кроме того, в тесте на животных с использованием меланотана II (MTII, Ac-Nle-c[Asp-His-DPhe-Arg-Trp-Lys]-NH2) и HP228, который является агонистом, аналогичным ему, после церебрального, внутрибрюшинного или подкожного введения была подтверждена эффективность подавления аппетита, потери веса и повышения энергетического метаболизма и тому подобное. (Thiele T. E., et al. Am J Physiol 274 (1 Pt 2), R248-54 (1998); Lee M. D., et al. FASEB J 12, A552 (1998); Murphy B., et al. J Appl Physiol 89, 273-82 (2000)). Напротив, когда животному вводится репрезентативный SHU9119, наблюдается значительное и устойчивое потребление корма и увеличение веса, что дает фармакологические доказательства того, что агонисты MCR могут использоваться для лечения ожирения. Эффект снижения аппетита, который, очевидно, проявляется при введении MTII, не проявляется у мышей MC4R KO (нокаутные), и этот экспериментальный результат еще раз доказывает, что эффект снижения аппетита в основном достигается за счет активации MC4R (Marsh, et al., Nat Genet 21, 119-122 (1999)).
[11] В лечении ожирения, разработанном до настоящего времени, преобладают подавители аппетита, которые действуют на центральную нервную систему, и большинство подавителей являются лекарствами, которые модулируют действие нейромедиаторов. Их примеры включают норадреналиновые агенты (фентермин и мазиндол) и флуоксетин и сибутрамин, которые являются серотонинергическими агентами. Однако модулятор нейротрансмиттера оказывает широкий спектр эффектов на различные физиологические действия помимо подавления аппетита многочисленными рецепторами подтипа. Следовательно, модуляторы не обладают селективностью для каждого подтипа и имеют большой недостаток, заключающийся в том, что при длительном применении возникают различные побочные эффекты.
[12] С другой стороны, меланокортины являются нейропептидами, а не нейротрансмиттерами, и, учитывая, что все другие функции, кроме энергетического метаболизма, нормальны у мышей KO с геном MC4R, преимущество агонистов меланокортина в качестве точки действия состоит в том, что можно вызвать только потерю веса за счет подавления аппетита, не влияя на другие физиологические функции. В частности, рецептор представляет собой рецептор, связанный с G-белком (GPCR), который относится к наиболее успешной категории среди новых точек действия лекарственных средств, разработанных к настоящему времени, и в значительной степени отличается от точек действия в родственной области техники тем, что относительно легко можно обеспечить селективность по рецепторам подтипа.
[13] В международных публикациях №№ WO 2008/007930 и WO 2010/056022 описаны соединения-агонисты рецептора меланокортина как примеры использования рецептора меланокортина в качестве точки действия.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА
[14] Целью настоящего изобретения является разработка нового соединения, представленного формулой 1, которое обладает превосходной селективной агонистической активностью в отношении рецепторов меланокортина, в частности, рецепторов меланокортина-4 (MC4R), или его фармацевтически приемлемой соли или изомера.
[15] Другой целью настоящего изобретения является разработкаспособа получения соединения, представленного формулой 1.
[16] Еще одной целью настоящего изобретения является разработка агонистической фармацевтической композиции рецептора меланокортина, содержащей соединение, представленное формулой 1, или его фармацевтически приемлемую соль или изомер в качестве активного ингредиента.
[17] Еще одной целью настоящего изобретения является предложение применения соединения, представленного формулой 1, или его фармацевтически приемлемой соли или изомера для профилактики или лечения ожирения, диабета, воспаления и эректильной дисфункции.
[18] Еще одним объектом настоящего изобретения является способ предотвращения или лечения ожирения, диабета, воспаления и эректильной дисфункции, включающий введение соединения, представленного формулой 1, или его фармацевтически приемлемой соли или изомера нуждающемуся субъекту. из них.
[19]
РЕШЕНИЕ ЗАДАЧИ
[20] Для достижения вышеуказанной цели в настоящем изобретении предложено соединение следующей формулы 1 или его фармацевтически приемлемая соль или изомер:
[21] [Формула 1]
[22]
[23]
2
5
[24] где R1 представляет собой C-C алкил.
[25]
[26] Соединение формулы 1 по настоящему изобретению может образовывать фармацевтически приемлемую соль.
[27] Кроме того, поскольку соединения в соответствии с настоящим изобретением могут иметь асимметричный углеродный центр и асимметричную ось или асимметричную плоскость, соединения могут существовать в виде цис- или транс-изомеров, R- или S-изомеров, рацематов, смесей диастереомеров и отдельных диастереомеров, и все эти изомеры и смеси включены в объем настоящего изобретения.
[28] В настоящем описании, если не указано иное, соединение формулы 1 используется в смысле включения всего соединения формулы 1, его фармацевтически приемлемых солей и изомеров.
[29]
2
4
2
4
трет
[30] В одном варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением, R1 в формуле 1 представляет собой C-C алкил. В другом варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением R1 в формуле 1 представляет собой линейный или разветвленный C-C алкил, например, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил или -бутил.
2
3
2
3
[31] В другом варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением R1 в формуле 1 представляет собой C или C алкил. В другом варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением R1 в формуле 1 представляет собой линейный или разветвленный C или C алкил, например этил, н-пропил или изопропил.
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
[32] В другом варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением соединение формулы 1 представляет собой -((3,5)-1-((3,4)-1-(-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)--((1,4)-4-метилциклогексил)изобутирамид следующей формулы 2:
[33] [Формула 2]
[34]
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
[35] В другом варианте осуществления настоящего изобретения соединение формулы 1 представляет собой -((3,5)-1-((3,4)-1-(-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)--((1,4)-4-метилциклогексил)пропионамид следующей формулы 3:
[36] [Формула 3]
[37]
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
[38] В другом варианте осуществления настоящего изобретения, соединение формулы 1 представляет собой -((3,5)-1-((3,4)-1-(-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)--((1,4)-4-метилциклогексил)пиваламид следующей формулы 4:
[39] [Формула 4]
[40]
[41]
[42] В другом варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением примеры фармацевтически приемлемой соли включают кислотно-аддитивные соли, образованные неорганической кислотой, такой как хлористоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, бромистоводородная кислота и йодистоводородная кислота; органической карбоновой кислотой, такой как винная кислота, муравьиная кислота, лимонная кислота, уксусная кислота, трихлоруксусная кислота, трифторуксусная кислота, глюконовая кислота, бензойная кислота, молочная кислота, фумаровая кислота и малеиновая кислота; сульфоновой кислотой, такой как метансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота и нафталинсульфоновая кислота, но ими не ограничиваются.
[43] В другом варианте осуществления изобретения соединение представляет собой фармацевтическую соль соединения формулы 1, где R1 представляет собой этил и соль является солью неорганической кислоты, такой как хлористоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, бромистоводородная кислота и йодистоводородная кислота; органической карбоновой кислоты, такой как винная кислота, муравьиная кислота, лимонная кислота, уксусная кислота, трихлоруксусная кислота, трифторуксусная кислота, глюконовая кислота, бензойная кислота, молочная кислота, фумаровая кислота и малеиновая кислота; и сульфоновой кислоты, такой как метансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота и нафталинсульфоновая кислота.
[44] В другом варианте осуществления изобретения соединение представляет собой фармацевтическую соль соединения формулы 1, где R1 представляет собой н-пропил и соль является солью неорганической кислоты, такой как хлористоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, бромистоводородная кислота и йодистоводородная кислота; органической карбоновой кислоты, такой как винная кислота, муравьиная кислота, лимонная кислота, уксусная кислота, трихлоруксусная кислота, трифторуксусная кислота, глюконовая кислота, бензойная кислота, молочная кислота, фумаровая кислота и малеиновая кислота; и сульфоновой кислоты, такой как метансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота и нафталинсульфоновая кислота.
[45] В другом варианте осуществления изобретения соединение представляет собой фармацевтическую соль соединения формулы 1, где R1 представляет собой изопропил и соль является солью неорганической кислоты, такой как хлористоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, бромистоводородная кислота и йодистоводородная кислота; органической карбоновой кислоты, такой как винная кислота, муравьиная кислота, лимонная кислота, уксусная кислота, трихлоруксусная кислота, трифторуксусная кислота, глюконовая кислота, бензойная кислота, молочная кислота, фумаровая кислота и малеиновая кислота; и сульфоновой кислоты, такой как метансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота и нафталинсульфоновая кислота.
[46] В другом варианте осуществления изобретения соединение представляет собой фармацевтическую соль соединения формулы 1, где R1 представляет собой н-бутил и соль является солью неорганической кислоты, такой как хлористоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, бромистоводородная кислота и йодистоводородная кислота; органической карбоновой кислоты, такой как винная кислота, муравьиная кислота, лимонная кислота, уксусная кислота, трихлоруксусная кислота, трифторуксусная кислота, глюконовая кислота, бензойная кислота, молочная кислота, фумаровая кислота и малеиновая кислота; и сульфоновой кислоты, такой как метансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота и нафталинсульфоновая кислота.
[47] В другом варианте осуществления изобретения соединение представляет собой фармацевтическую соль соединения формулы 1, где R1 представляет собой изобутил и соль является солью неорганической кислоты, такой как хлористоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, бромистоводородная кислота и йодистоводородная кислота; органической карбоновой кислоты, такой как винная кислота, муравьиная кислота, лимонная кислота, уксусная кислота, трихлоруксусная кислота, трифторуксусная кислота, глюконовая кислота, бензойная кислота, молочная кислота, фумаровая кислота и малеиновая кислота; и сульфоновой кислоты, такой как метансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота и нафталинсульфоновая кислота.
[48] В другом варианте осуществления изобретения соединение представляет собой фармацевтическую соль соединения формулы 1, где R1 представляет собой втор-бутил и соль является солью неорганической кислоты, такой как хлористоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, бромистоводородная кислота и йодистоводородная кислота; органической карбоновой кислоты, такой как винная кислота, муравьиная кислота, лимонная кислота, уксусная кислота, трихлоруксусная кислота, трифторуксусная кислота, глюконовая кислота, бензойная кислота, молочная кислота, фумаровая кислота и малеиновая кислота; и сульфоновой кислоты, такой как метансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота и нафталинсульфоновая кислота.
трет
[49] В другом варианте осуществления изобретения соединение представляет собой фармацевтическую соль соединения формулы 1, где R1 представляет собой -бутил и соль является солью неорганической кислоты, такой как хлористоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, бромистоводородная кислота и йодистоводородная кислота; органической карбоновой кислоты, такой как винная кислота, муравьиная кислота, лимонная кислота, уксусная кислота, трихлоруксусная кислота, трифторуксусная кислота, глюконовая кислота, бензойная кислота, молочная кислота, фумаровая кислота и малеиновая кислота; и сульфоновой кислоты, такой как метансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота и нафталинсульфоновая кислота.
[50] В другом варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением фармацевтически приемлемая соль представляет собой гидрохлорид.
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
[51] В другом варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением соединение формулы 1 представляет собой гидрохлорид-((3,5)-1-((3,4)-1-(-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)--((1,4)-4-метилциклогексил)изобутирамида следующей формулы 5:
[52] [Формула 5]
[53]
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
[54] В другом варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением соединение формулы 1 представляет собой гидрохлорид-((3,5)-1-((3,4)-1-(-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)--((1,4)-4-метилциклогексил)пропионамида следующей формулы 6:
[55] [Формула 6]
[56]
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
[57] В другом варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением соединение формулы 1 представляет собой гидрохлорид-((3,5)-1-((3,4)-1-(-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)--((1,4)-4-метилциклогексил)пиваламида следующей формулы 7:
[58] [Формула 7]
[59]
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
[60] В другом варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением гидрохлорид-((3,5)-1-((3,4)-1-(-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)--((1,4)-4-метилциклогексил)изобутирамида вышеуказанной формулы 5, гидрохлорид -((3,5)-1-((3,4)-1-(-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)--((1,4)-4-метилциклогексил)пропионамида вышеуказанной формулы 6 и гидрохлорид-((3,5)-1-((3,4)-1-(-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)--((1,4)-4-метилциклогексил)пиваламида вышеуказанной формулы 7 может быть получен в соответствии со следующей реакционной схемой 1.
[61] [Реакционная схема 1]
[62]
[63]
[64] На реакционной схеме 1
1
5
[65] R2 представляет собой C-C алкил;
3
8
1
5
[66] R3 представляет собой C-C циклоалкил, незамещенный или замещенный 1 или 2 C-C алкилами; и
[67] R4 и R5, каждый, независимо, представляют собой водород или галоген.
[68]
[69] Соединение формулы 1 по настоящему изобретению проявляет превосходную агонистическую активность в отношении рецепторов меланокортина, в частности, рецепторов меланокортина-4 (MC4R), и, таким образом, в настоящем изобретении предложена также фармацевтическая композиция агонистов рецепторов меланокортина, содержащая соединение формулы 1 или его фармацевтически приемлемую соль или изомер в качестве активного ингредиента вместе с фармацевтически приемлемым носителем. В частности, композиция по настоящему изобретению проявляет превосходный эффект в предотвращении или лечении ожирения, диабета, воспаления и эректильной дисфункции, но этим не ограничивается.
[70] В настоящем описании термин «носитель» относится к соединению, которое облегчает внедрение соединения в клетки или ткани.
[71] При введении соединения по настоящему изобретению в клинических целях общая суточная доза, которую следует вводить хозяину в виде разовой дозы или отдельными дозами, предпочтительно, находится в диапазоне от 0,01 до 10 мг на 1 кг веса тела, но конкретный уровень дозы для отдельных пациентов может варьироваться в зависимости от конкретного соединения, которое будет использоваться, веса, пола, состояния здоровья и питания пациента, времени введения, метода введения и скорости выведения лекарственного средства, лекарственной смеси, а от также тяжести заболевания.
[72] Соединение по настоящему изобретению можно вводить любым путем в зависимости от цели. Например, соединение по настоящему изобретению можно вводить путем инъекции или перорально.
[73] Составы для инъекций могут быть получены с использованием подходящего диспергирующего агента, смачивающего агента или суспендирующего агента в соответствии с известными методами.
[74] Примеры твердых лекарственных форм для перорального введения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы, и твердые лекарственные формы могут быть получены путем смешивания активного соединения формулы 1 по настоящему изобретению с одним или несколькими носителями, такими как инертные разбавители, лубриканты, разрыхлители и связующие.
[75]
ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[76] Соединение формулы 1 по настоящему изобретению проявляет превосходную агонистическую активность в отношении рецепторов меланокортина, в частности, рецепторов меланокортина-4 (MC4R), и, таким образом, может быть эффективно использовано для профилактики или лечения ожирения, диабета, воспалений и эректильной дисфункции.
[77] Соединение формулы 1 по настоящему изобретению оказывает целевое действие на рецептор меланокортина-4, не влияет на тревогу и депрессию, проявляя при этом эффекты потери веса и снижения питания, и его можно вводить без побочных эффектов на ингибирование гена специфических калиевых каналов сердца человека (hERG), или на проблемы безопасности, такие как мутагенез. Кроме того, соединение формулы 1 по настоящему изобретению можно вводить безопасно, поскольку отсутствует цитотоксичность и токсичность для печени.
[78]
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[79] Далее настоящее изобретение описано более подробно с помощью препаративных примеров и примеров. Однако эти примеры являются только иллюстративными, и объем настоящего изобретения ими не ограничивается.
[80]
Препаративный пример 1
: Получение гидрохлорида метил (2
,4
)-4-(
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)изобутирамидо)-пирролидин-2-карбоксилата
S
S
N
S
R
[81]
[82]
[83]
[84] Указанное в заголовке соединение получали посредством следующих стадий A, B, C, D и E.
[85]
Стадия A: Получение 1-(
-бутил) 2-метил (2
,4
)-4-азидопирролидин-1,2-дикарбоксилата
трет
S
S
[86]
трет
S
R
N, N
[87] 1-(-Бутил) 2-метил (2,4)-4-((метилсульфонил)окси)пирролидин-1,2-дикарбоксилат (48,5 г, 150 ммоль) растворяли в ʼ-диметилформамиде (250 мл) в атмосфере азота и добавляли азид натрия (19,5 г, 300 мл). После перемешивания при температуре 80°C в течение 16 часов растворитель реакции концентрировали при пониженном давлении, добавляли воду и два раза экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали водным раствором хлорида натрия и водой, сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением сырого продукта (39,59 г, 98%), который использовали на следующей стадии без очистки.
[88] MS [M+H]=271 (M+1)
1
3
[89] H ЯМР (400 МГц, CDOD) δ 4,43-4,37 (м, 1H), 4,35-4,27 (шир., 1H), 3,77 (с, 1,8H), 3,76 (с, 1,2H), 3,73-3,66 (м, 1H), 3,44-3,38 (м, 1H), 2,63-2,49 (м, 1H), 2,19-2,11 (м, 1H), 1,50 (с, 4,5H), 1,44 (с, 4,5H)
[90]
Стадия B: Получение 1-(
-бутил) 2-метил (2
,4
)-4-аминопирролидин-1,2-дикарбоксилата
трет
S
S
[91]
трет
S
S
[92] 1-(-Бутил) 2-метил (2,4)-4-азидопирролидин-1,2-дикарбоксилат (24,59 г, 91,0 ммоль), полученный на стадии A, растворяли в тетрагидрофуране (180 мл) и затем при температуре 0°C медленно добавляли 1M раствор триметилфосфин тетрагидро (109,2 мл, 109,2 ммоль). После перемешивания при той же температуре в течение одного часа, смесь перемешивали при комнатной температуре в течение трех часов. После концентрирования растворителя реакции при пониженном давлении добавляли дихлорметан (100 мл) и воду (150 мл) и перемешивали в течение около 30 минут. После разделения слоев и экстрагирования один раз дихлорметаном органический слой сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением сырого продукта (20,62 г, 93%), который использовали на следующей стадии без очистки.
[3] MS [M+H]=245 (M+1)
1
3
[94] H ЯМР (400 МГц, CDOD) δ 4,27 (м, 1H), 3,77 (с, 1,8H), 3,76 (с, 1,2H), 3,75-3,67 (м, 1H), 3,50-3,42 (м, 1H), 3,22-3,17 (м, 1H), 2,58-2,47 (м, 1H), 1,82-1,71 (м, 1H), 1,48 (с, 4,5H), 1,42 (с, 4,5H)
[95]
Стадия C: Получение 1-(
-бутил) 2-метил (2
,4
)-4-(((1
,4
)-4-метилциклогексил)амино)пирролидин-1,2-дикарбоксилата
трет
S
S
S
R
[96]
трет
S
S
[97] 1-(-Бутил) 2-метил (2,4)-4-аминопирролидин-1,2-дикарбоксилат (20,62 г, 84,4 ммоль), полученный на стадии B, растворяли в дихлорэтане (150 мл) и добавляли 4-метилциклогексанон (9,5 мл, 101,3 ммоль). При температуре 0°C добавляли триацетоксиборгидрид натрия (26,8 г, 126,6 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Растворитель реакции концентрировали при пониженном давлении, добавляли воду и два раза экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали водным раствором хлорида натрия, сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и очищали колоночной хроматографией с получением указанного в заголовке соединения (22,9 г, 80%).
[98] MS [M+H]=341 (M+1)
1
3
[99] H ЯМР (400 МГц, CDOD) δ 4,26 (м, 1H), 3,76 (с, 1,8H), 3,75 (с, 1,2H), 3,78-3,71 (м, 1H), 3,49-3,40 (м, 1H), 3,22-3,16 (м, 1H), 2,69-2,60 (шир., 1H), 2,58-2,46 (м, 1H), 1,87-1,77 (м, 1H), 1,73-1,63 (м, 1H), 1,62-1,35 (м, 8H), 1,48 (с, 4,5H), 1,42 (с, 4,5H), 0,96 (д, 3H)
[100]
Стадия D: Получение 1-(
-бутил) 2-метил (2
,4
)-4-(
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)изобутирамидо)пирролидин-1,2-дикарбоксилата
трет
S
S
N
S
R
[101]
трет
S
S
S
R
[102] 1-(-Бутил) 2-метил (2,4)-4-(((1,4)-4-метилциклогексил)амино)пирролидин-1,2-дикарбоксилат (37,29 г, 109,5 ммоль), полученный на стадии C, растворяли в дихлорметане (500 мл), при температуре 0°C добавляли триэтиламин (61,1 мл, 438,1 ммоль) и медленно добавляли изобутирилхлорид (11,7 мл, 219 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 16 часов растворитель реакции концентрировали при пониженном давлении, добавляли водный раствор гидрокарбоната натрия и два раза экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали водным раствором хлорида натрия и водой, сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и очищали колоночной хроматографией с получением указанного в заголовке соединения (38,79 г, 86%).
[103] MS [M+H]=411 (M+1)
1
3
[104] H ЯМР (400 МГц, CDOD) δ 4,27 (м, 1H), 3,76 (с, 1,8H), 3,75 (с, 1,2H), 3,78-3,72 (м, 1H), 3,50-3,41 (м, 1H), 3,33-3,14 (м, 1H), 2,69-2,60 (м, 2H), 2,57-2,43 (м, 1H), 1,87-1,79 (м, 1H), 1,70-1,61 (м, 1H), 1,60-1,32 (м, 8H), 1,47 (с, 4,5H), 1,41 (с, 4,5H), 1,10 (дд, 6H), 0,99 (д, 3H)
[105]
Стадия E: Получение гидрохлорида метил (2
,4
)-4-(
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)изобутирамидо)пирролидин-2-карбоксилата
S
S
N
S
R
[106]
трет
S
S
N
S
R
[107] 1-(-Бутил) 2-метил (2,4)-4-(-((1,4)-4-метилциклогексил)изобутирамидо)пирролидин-1,2-дикарбоксилат (34,0 г, 82,8 ммоль), полученный на стадии D, растворяли в дихлорметане (200 мл) и при температуре 0°C добавляли 4н раствор хлористоводородной кислоты в 1,4-диоксане (82,8 мл, 331,3 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 6 часов растворитель реакции концентрировали при пониженном давлении с получением сырого продукта (28,7 г, 99%), который использовали на следующей стадии без очистки.
[108] MS [M+H]=311 (M+1)
[109]
Препаративный пример 2
: Получение (3
,4
)-1-(
-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбоновой кислоты
S
R
трет
[110]
[111]
[112]
[113] Указанное в заголовке соединение получали способом, описанным в международной публикации № WO 2004/092126.
[114] MS [M+H]=282 (M+1)
1
3
[115] H ЯМР (400 МГц, CDOD) δ 7,43-7,33 (м, 4H), 3,90-3,69 (м, 3H), 3,59 (дд, J=11,2, 10,0 Гц, 1H), 3,29 (дд, J=11,2, 11,2 Гц, 1H), 3,18-3,09 (м, 1H), 1,44 (с, 9H)
[116]
Препаративный пример 3
: Получение гидрохлорида метил (2
,4
)-4-(
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)пропионамидо)-пирролидин-2-карбоксилата
S
S
N
S
R
[117]
[118]
[119]
[120] Указанное в заголовке соединение получали посредством стадий A и B.
Стадия A: Получение 1-(
-бутил) 2-метил (2
,4
)-4-(
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)пропионамидо)пирролидин-1,2-дикарбоксилата
трет
S
S
N
S
R
[121]
[123]
[124]
трет
S
S
S
R
[125] Указанное в заголовке соединение (0,98 г, 84%) получали таким же образом, как на стадии D в препаративном примере 1, с использованием 1-(-бутил) 2-метил (2,4)-4-(((1,4)-4-метилциклогексил)амино)пирролидин-1,2-дикарбоксилата (1,0 г, 2,9 ммоль), полученного на стадии C препаративного примера 1, и пропионилхлорида (0,33 г, 3,5 ммоль).
[126] MS [M+Na]=419,5 (M+23)
1
3
[127] H ЯМР (400 МГц, CDOD) δ 4,33 (м, 1H), 4,00-3,80 (м, 2H), 3,75 (м, 3H), 3,58 (м, 1H), 3,47 (м, 1H), 2,85-2,68 (м, 1H), 2,38 (кв, 2H), 2,31 (м, 1H), 1,93 (м, 1H), 1,80 (м, 2H), 1,72-1,55 (м, 4H), 1,45 (м, 2H), 1,45-1,41 (м, 9H), 1,07 (м, 6H)
[128]
Стадия B: Получение гидрохлорида метил (2
,4
)-4-(
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)пропионамидо)пирролидин-2-карбоксилата
S
S
N
S
R
[129]
[130]
[131]
трет
S
S
N
S
R
[132] Указанное в заголовке соединение (0,76 г, 93%) получали таким же образом, как на стадии E препаративного примера 1, с использованием 1-(-бутил) 2-метил (2,4)-4-(-((1,4)-4-метилциклогексил)пропионамидо)пирролидин-1,2-дикарбоксилата (0,98 г, 2,4 ммоль), полученного на стадии A.
[133] MS [M+H]=297,4 (M+1)
1
6
[134] H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d) δ 9,95 (шир. с, 1H), 8,63 (шир. с, 1H), 4,38 (м, 1H), 4,21 (м, 1H), 3,77 (с, 3H), 3,53 (м, 1H), 3,40 (м, 2H), 2,53 (м, 1H), 2,37 (кв, 2H), 2,24 (м, 1H), 1,88 (м, 1H), 1,68-1,55 (м, 4H), 1,52 (м, 2H), 1,40 (м, 2H), 0,97 (м, 6H)
[135]
Препаративный пример 4
: Получение гидрохлорида метил (2
,4
)-4-(
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)пиваламидо)пирролидин-2-карбоксилата
S
S
N
S
R
[136]
[137]
[138]
[139] Указанное в заголовке соединение получали посредством стадий A и B.
[140]
Стадия A: Получение 1-(
-бутил) 2-метил (2
,4
)-4-(
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)пиваламидо)пирролидин-1,2-дикарбоксилата
трет
S
S
N
S
R
[141]
[142]
[143]
[144] Указанное в заголовке соединение получали способом, описанным в международной публикации № WO 2008/007930.
[145] MS [M+Na]=447,5 (M+23)
1
3
[146] H ЯМР (400 МГц, CDOD) δ 4,34 (м, 1H), 3,90-3,75 (м, 2H), 3,73 (м, 3H), 3,45 (м, 2H), 2,75-2,60 (м, 1H), 2,30 (м, 1H), 1,95 (м, 1H), 1,85 (м, 2H), 1,66 (м, 4H), 1,50 (м, 2H), 1,45-1,41 (м, 9H), 1,25-1,20 (м, 9H), 1,05 (д, 3H)
[147]
Стадия B: Получение гидрохлорида метил (2
,4
)-4-(
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)пиваламидо)пирролидин-2-карбоксилата
S
S
N
S
R
[148]
[149]
[150]
трет
S
S
N
S
R
[151] Указанное в заголовке соединение (0,68 г, 99%) получали таким же образом, как на стадии E препаративного примера 1, с использованием 1-(-бутил) 2-метил (2,4)-4-(-((1,4)-4-метилциклогексил)пиваламидо)пирролидин-1,2-дикарбоксилат а(0,80 г, 1,88 ммоль), полученного на стадии A.
[152] MS [M+H]=325,4 (M+1)
1
6
[153] H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d) δ 10,24 (шир. с, 1H), 8,60 (шир. с, 1H), 4,41 (м, 1H), 4,22 (м, 1H), 3,77 (м, 3H), 3,40-3,28 (м, 3H), 2,55 (м, 1H), 2,20 (м, 1H), 1,87 (м, 1H), 1,70-1,50 (м, 6H), 1,40 (м, 2H), 1,21-1,10 (м, 9H), 1,00 (м, 3H)
[154]
Пример 1:
Получение гидрохлорида
-((3
,5
)-1-((3
,4
)-1-(
-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)-
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)изобутирамида
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
[155]
[156]
[157]
[158] Указанное в заголовке соединение получали посредством стадий A, B, C и D.
[159]
Стадия A: Получение метил (2
,4
)-1-((3
,4
)-1-(
-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-4-(
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)изобутирамидо)пирролидин-2-карбоксилата
S
S
S
R
трет
N
S
R
[160]
S
S
N
S
R
S
R
трет
N, N
N, N
[161] Гидрохлорид метил (2,4)-4-(-((1,4)-4-метилциклогексил)изобутирамидо)пирролидин-2-карбоксилата (28,7 г, 82,73 ммоль), полученный в препаративном примере 1, (3,4)-1-(-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбоновую кислоту (24,5 г, 86,87 ммоль), полученную в препаративном примере 2, гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (22,2 г, 115,83 ммоль) и гидрат 1-гидроксибензотриазола (15,7 г, 115,83 ммоль) растворяли в ʼ-диметилформамиде (400 мл), и медленно добавлялиʼ-диизопропилэтиламин (72,0 мл, 413,66 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 16 часов растворитель реакции концентрировали при пониженном давлении, затем добавляли 0,5н водный раствор гидроксида натрия и два раза экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали два раза водным раствором хлорида натрия и водой, сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и очищали колоночной хроматографией с получением указанного в заголовке соединения (41,19 г, 87%).
[162] MS [M+H]=575 (M+1)
[163]
Стадия B: Получение (2
,4
)-1-((3
,4
)-1-(
-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-4-(
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)изобутирамидо)пирролидин-2-карбоновой кислоты
S
S
S
R
трет
N
S
R
[164]
S
S
S
R
трет
N
S
R
[165] Метил (2,4)-1-((3,4)-1-(-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-4-(-((1,4)-4-метилциклогексил)изобутирамидо)пирролидин-2-карбоксилат (39,4 г, 68,62 ммоль), полученный на стадии A, растворяли в метаноле (450 мл) и добавляли 6н водный раствор гидроксида натрия (57,2 мл, 343,09 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 16 часов и доведения pH до примерно 5 с помощью 6н водного раствора соляной кислоты реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. Концентрат растворяли в дихлорметане, а затем нерастворимое твердое вещество фильтровали через бумажный фильтр. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением сырого продукта (38,4 г, 99%), который использовали на следующей стадии без очистки.
[166] MS [M+H]=561 (M+1)
[167]
Стадия C: Получение
-((3
,5
)-1-((3
,4
)-1-(
-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)-
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)изобутирамида
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
[168]
S
S
S
R
трет
N
S
R
N, Nʼ
N, Nʼ
[169] (2,4)-1-((3,4)-1-(-Бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-4-(-((1,4)-4-метилциклогексил)изобутирамидо)пирролидин-2-карбоновую кислоту (38,4 г, 68,60 ммоль), полученную на стадии B, гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (18,4 г, 96,04 ммоль) и гидрат 1-гидроксибензотриазола (13,0 г, 96,04 ммоль) растворяли в -диметилформамиде (200 мл) и медленно и последовательно добавляли морфолин (5,9 мл, 68,80 ммоль) и -диизопропилэтиламин (59,7 мл, 343,02 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 16 часов реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении, добавляли 0,5н водный раствор гидроксида натрия и два раза экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали два раза водным раствором хлорида натрия и водой, сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и очищали колоночной хроматографией с получением указанного в заголовке соединения (37,05 г, 86%).
[170] MS [M+H]=630 (M+1)
[171]
Стадия D: Получение гидрохлорида
-((3
,5
)-1-((3
,4
)-1-(
-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)-
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)изобутирамида
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
[172]
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
[173] -((3,5)-1-((3,4)-1-(-Бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)--((1,4)-4-метилциклогексил)изобутирамид (5,0 г, 7,95 ммоль), полученный на стадии C, растворяли в этилацетате (50 мл) и медленно добавляли 2н раствор хлористоводородной кислоты в этилацетате (3,97 мл, 15,89 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 30 минут растворитель реакции концентрировали при пониженном давлении. Образовавшийся сырой твердый продукт очищали растиранием, используя гексан и диэтиловый эфир, с получением указанного в заголовке соединения (5,23 г, 99%).
[174] MS [M+H]=630 (M+1)
1
3
[175] H ЯМР (500 МГц, CDOD) δ 7,49-7,44 (м, 4H), 4,83 (м, 1H), 4,23-4,20 (м, 1H), 3,95-3,91 (м, 2H), 3,79-3,47 (м, 14H), 3,03-3,00 (м, 1H), 2,86-2,82 (м, 1H), 2,73-2,67 (м, 1H), 2,20-2,14 (м, 1H), 1,97 (м, 1H), 1,80-1,62 (м, 5H), 1,50 (с, 9H), 1,44-1,27 (м, 3H), 1,06-1,04 (м, 9H)
[176]
Пример 2: Получение гидрохлорида
-((3
,5
)-1-((3
,4
)-1-(
-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)-
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)пропионамида
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
[177]
[178]
[179]
[180] Указанное в заголовке соединение получали посредством стадий A, B, C и D.
[181]
Стадия A: Получение метил (2
,4
)-1-((3
,4
)-1-(
-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-4-(
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)пропионамидо)пирролидин-2-карбоксилата
S
S
S
R
трет
N
S
R
[182]
[183]
[184]
S
S
N
S
R
S
R
трет
[185] Указанное в заголовке соединение (0,45 г, 35%) получали таким же образом, как на стадии A примера 1, с использованием метил (2,4)-4-(-((1,4)-4-метилциклогексил)пропионамидо)пирролидин-2-карбоксилата гидрохлорида (0,76 г, 2,28 ммоль), полученного в препаративном примере 3, и (3,4)-1-(-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбоновой кислоты (0,64 г, 2,28 ммоль), полученной в препаративном примере 2.
[186] MS [M+H]=560,4 (M+1)
1
3
[187] H ЯМР (400 МГц, CDOD) δ 7,39-7,30 (м, 4H), 4,45 (м, 1H), 4,04 (м, 1H), 3,71 (с, 3H), 3,65-3,35 (м, 6H), 3,13 (м, 2H), 2,99 (м, 1H), 2,71 (м, 1H), 2,34 (кв, 2H), 2,20 (м, 1H), 1,92 (м, 1H), 1,75-1,55 (м, 6H), 1,42 (м, 2H), 1,22 (м, 9H), 1,03 (м, 6H)
[188]
Стадия B: Получение (2
,4
)-1-((3
,4
)-1-(
-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-4-(
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)пропионамидо)пирролидин-2-карбоновой кислоты
S
S
S
R
трет
N
S
R
[189]
[190]
[191]
S
S
S
R
трет
N
S
R
[192] Указанное в заголовке соединение (0,44 г, 99%) получали таким же образом, как на стадии B примера 1, с использованием метил (2,4)-1-((3,4)-1-(-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-4-(-((1,4)-4-метилциклогексил)пропионамидо)пирролидин-2-карбоксилат (0,45 г, 0,80 ммоль), полученного на стадии A.
[193] MS [M+H]=546,4 (M+1)
[194]
Стадия C: Получение
-((3
,5
)-1-((3
,4
)-1-(
-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)-
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)пропионамида
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
[195]
[196]
S
S
S
R
трет
N
S
R
[197] Указанное в заголовке соединение (0,28 г, 53%) получали таким же образом, как на стадии C примера 1, с использованием (2,4)-1-((3,4)-1-(-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-4-(-((1,4)-4-метилциклогексил)пропионамидо)пирролидин-2-карбоновой кислоты (0,44 г, 0,80 ммоль), полученной на стадии B.
[198] MS [M+H]=615,5 (M+1)
1
3
[199] H ЯМР (400 МГц, CDOD) δ 7,36 (м, 4H), 4,79 (м, 1H), 4,18 (м, 1H), 3,80-3,40 (м, 15H), 3,20 (м, 1H), 3,03 (м, 1H), 2,70 (м, 1H), 2,33 (кв, 2H), 2,15 (м, 1H), 1,93 (м, 1H), 1,71-1,56 (м, 6H), 1,40-1,20 (м, 11H), 1,00 (м, 6H)
[200]
Стадия D: Получение гидрохлорида
-((3
,5
)-1-((3
,4
)-1-(
-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)-
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)пропионамида
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
[201]
[2021]
[203]
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
[204] Указанное в заголовке соединение (0,08 г, 94%) получали таким же образом, как на стадии D примера 1, с использованием -((3,5)-1-((3,4)-1-(-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)--((1,4)-4-метилциклогексил)пропионамида (0,08 г, 0,13 ммоль), полученного на стадии C.
[205] MS [M+H]=615,5 (M+1)
1
3
[206] H ЯМР (400 МГц, CDOD) δ 7,43 (м, 4H), 4,82 (t, 1H), 4,20 (м, 1H), 4,06-3,40 (м, 15H), 2,97 (м, 1H), 2,69 (м, 1H), 2,33 (м, 2H), 2,15 (м, 1H), 1,93 (м, 1H), 1,80-1,53 (м, 5H), 1,47 (с, 9H), 1,50-1,25 (м, 4H), 1,01 (м, 6H)
[207]
Пример 3:
Получение гидрохлорида
-((3
,5
)-1-((3
,4
)-1-(
-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)-
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)пиваламида
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
[208]
[209]
[210]
[211] Указанное в заголовке соединение получали посредством стадий A, B, C и D.
[212]
Стадия A: Получение метил (2
,4
)-1-((3
,4
)-1-(
-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-4-(
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)пиваламидо)пирролидин-2-карбоксилата
S
S
S
R
трет
N
S
R
[213]
[214]
[215]
S
S
N
S
R
S
R
трет
[216] Указанное в заголовке соединение (0,70 г, 66%) получали таким же образом, как на стадии A примера 1, с использованием гидрохлорида метил (2,4)-4-(-((1,4)-4-метилциклогексил)пиваламидо)пирролидин-2-карбоксилата (0,65 г, 1,8 ммоль), полученного в препаративном примере 4, и (3,4)-1-(-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбоновой кислоты (0,50 г, 1,8 ммоль), полученной в препаративном примере 2.
[217] MS [M+H]=588,5 (M+1)
1
3
[218] H ЯМР (400 МГц, CDOD) δ 7,40-7,30 (м, 4H), 4,49 (м, 1H), 4,00-3,50 (м, 4H), 3,71 (с, 3H), 3,40 (м, 3H), 3,20-3,05 (м, 2H), 3,00 (м, 1H), 2,70 (м, 1H), 2,27 (м, 1H), 1,90 (м, 1H), 1,73-1,60 (м, 6H), 1,60-1,35 (м, 2H), 1,25-1,17 (м, 18H), 1,01 (м, 3H)
[219]
Стадия B: Получение (2
,4
)-1-((3
,4
)-1-(
-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-4-(
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)пиваламидо)пирролидин-2-карбоновой кислоты
S
S
S
R
трет
N
S
R
[220]
[221]
[222]
S
S
S
R
трет
N
S
R
[223] Указанное в заголовке соединение (0,10 г, 99%) получали таким же образом, как на стадии B примера 1, с использованием метил (2,4)-1-((3,4)-1-(-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-4-(-((1,4)-4-метилциклогексил)пиваламидо)пирролидин-2-карбоксилата (0,10 г, 0,18 ммоль), полученного на стадии A.
[224] MS [M+H]=574,4 (M+1)
[225]
Стадия C: Получение
-((3
,5
)-1-((3
,4
)-1-(
-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)-
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)пиваламида
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
[226]
[227]
S
S
S
R
трет
N
S
R
[228] Указанное в заголовке соединение (0,020 г, 17%) получали таким же образом, как на стадии C примера 1, с использованием (2,4)-1-((3,4)-1-(-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-4-(-((1,4)-4-метилциклогексил)пиваламидо)пирролидин-2-карбоновой кислоты (0,10 г, 0,18 ммоль), полученной на стадии B.
[229] MS [M+H]=643,5 (M+1)
1
3
[230] H ЯМР (400 МГц, CDOD) δ 7,40-7,30 (м, 4H), 4,79 (м, 1H), 4,17 (м, 1H), 3,80-3,40 (м, 15H), 3,10 (м, 1H), 2,96 (м, 1H), 2,71 (м, 1H), 2,15 (м, 1H), 1,90 (м, 1H), 1,80-1,35 (м, 8H), 1,21-1,15 (м, 18H), 1,02 (м, 3H)
[231]
Стадия D: Получение гидрохлорида
-((3
,5
)-1-((3
,4
)-1-(
-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)-
-((1
,4
)-4-метилциклогексил)пиваламида
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
[232]
[233]
[234]
N
S
S
S
R
трет
N
S
R
[235] Указанное в заголовке соединение (0,29 г, 83%) получали таким же образом, как на стадии D примера 1, с использованием -((3,5)-1-((3,4)-1-(-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)--((1,4)-4-метилциклогексил)пиваламида (0,33 г, 0,51 ммоль), полученного на стадии C.
[236] MS [M+H]=643,5 (M+1)
1
3
[237] H ЯМР (400 МГц, CDOD) δ 7,41 (м, 4H), 4,80 (м, 1H), 4,13 (м, 1H), 3,90 (м, 2H), 3,80-3,40 (м, 13H), 2,94 (м, 1H), 2,63 (м, 1H), 2,11 (м, 1H), 1,93 (м, 1H), 1,75 (м, 2H), 1,60 (м, 4H), 1,46 (с, 9H), 1,15 (с, 9H), 1,45-1,30 (м, 3H), 1,01 (м, 3H)
[238]
Сравнительный пример 1
: Получение гидрохлорида
-((3
,5
)-1-((3
,4
)-1-(
-бутил)-4-(2,4-дифторфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)-
-(4,4-диметилциклогексил)ацетамида (A95)
N
S
S
S
R
трет
N
[239]
[240]
[241]
[242] Соединение A95, описанное в международной публикации № WO 2008/007930, было получено тем же способом, который там описан.
[243]
Сравнительный пример 2
: Получение гидрохлорида
-((3
,5
)-1-((3
,4
)-1-(
-бутил)-4-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбонил)-5-(морфолин-4-карбонил)пирролидин-3-ил)-
-(4,4-диметилциклогексил)ацетамида (A96)
N
S
S
S
R
трет
N
[244]
[2450]
[246]
[247] Соединение A96, описанное в международной публикации № WO 2008/007930, было получено тем же способом, который там описан.
[248]
Экспериментальный пример 1: Анализ люциферазы
[249]
2
2
[250] Для оценки агонистической способности против MC4R (рецептор меланокортина-4) была создана линия клеток, которая постоянно экспрессирует ген люциферазы (CRE-LUC) под контролем MC4R и CRE (элемент ответа цАМФ). После получения вектора экспрессии клеток млекопитающих (pCDNA3 (Neo)) (Invitrogen), содержащего ген MC4R, клеточные линии эмбриональной почки человека (HEK) трансформировали с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) вместе с вектором (pCRE-Luc) (Stratagen), экспрессирующим ген люциферазы (CRE-LUC) под контролем элемента ответа цАМФ (CRE). Трансформированные клеточные линии (HEK MC4R-Luc) инкубировали в инкубаторе при температуре 37°C в присутствии 5% CO в течение 24 часов с использованием модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM), содержащей 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (GIBCO/BRL). Клеточные линии инкубировали в течение четырех дней в присутствии модифицированной по Дульбекко среды Игла (DMEM), содержащей 10 мл селективной среды (10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (GIBCO/BRL), 100 единиц мл пенициллина (GIBCO/BRL), 100 ед/мл стрептомицина (GIBCO/BRL), 800 мкг/мл генетицина (G418) (GIBCO/BRL)). Процесс удаления клеток, убитых селективной средой, путем замены среды на 10 мл новой селективной среды повторяли трижды, каждые 4 дня. Отдельные колонии, образованные окончательно отобранными и размноженными клонами, переносили под микроскопом в 24-луночный планшет для культивирования клеток, содержащий 1 мл селективной среды на лунку, и инкубировали в течение 4 дней. Форсколин (SIGMA) обрабатывали до конечной концентрации 10 мкМ, а затем инкубировали в течение пяти часов в инкубаторе при температуре 37°C в присутствии 5% CO. Каждую лунку обрабатывали 50 мкл люциферазного реагента Bright-Glo (Promega) и оставляли при комнатной температуре на 15 минут, а затем измеряли люминесценцию каждой лунки с помощью люминометра (Victor). Клоны, демонстрирующие люминесценцию в 100 или более раз превышающую исходное значение при обработке форсколином, отбирали и использовали для измерения агонистической способности MC4R каждого соединения.
4
2
2
0,5
50
[251] Клетки HEK MC4R-Luc добавляли в каждую лунку 96-луночного люминометрического планшета для культивирования клеток (Costar) до размера 2,5×10 клеток в 100 мкл культуральной среды, а затем инкубировали в инкубаторе при температуре 37°C в присутствии 6% CO в течение 18 часов. Агонист MCR, разбавленный на каждой стадии концентрирования с использованием вышеуказанной культуральной среды, обрабатывали так, чтобы конечная концентрация ДМСО не превышала 1%, а затем инкубировали в течение пяти часов в инкубаторе при температуре 37°C в присутствии 6% CO. Каждую лунку обрабатывали 50 мкл люциферазного реагента Bright-Glo (Promega) и оставляли при комнатной температуре на пять минут, а затем измеряли люминесценцию каждой лунки с помощью люминометра (Victor). Количество люминесценции, индуцированной агонистом, разбавленным на каждой стадии концентрирования, преобразовывали в относительное значение в % по отношению к количеству, проявляемому при обработке 10 мкМ NDP-α-MSH. EC MSH выражается как концентрация, которая вызывает 50% максимального количества люминесценции, которое может быть индуцировано NDP-α-MSH, а EC выражается как концентрация, которая вызывает 50% максимального количества люминесценции, которое может быть индуцировано каждым агонистом. Измерения проводились с использованием статистического программного обеспечения (Prizm).
50
[252] В таблице 1 показаны результаты измерения агонистической способности MC4R каждого соединения, полученные в вышеуказанных экспериментах, в единицах EC (нМ).
[253] [Таблица 1]
[254]
Анализ люциферазы, EC<sub>50</sub> (нМ)
Соединение
MC4R
Пример 1
0,562
Пример 2
1,073
Пример 3
0,675
Сравнительный пример 1 (A95)
17,45
Сравнительный пример 2 (A96)
5,479
[255]
[256] Как показано в таблице 1, было подтверждено, что среди хорошо известных рецепторов меланокортина in vivo в отношении рецептора меланокортина-4 (MC4R), участвующего в энергетическом метаболизме и контроле веса in vivo, соединения примеров обладают более высокой агонистической способностью к MC4R, чем соединения сравнительных примеров (A95 и A96).
[257]
Экспериментальный пример 2: Анализ цАМФ
[258]
[259] Рецептор меланокортина представляет собой тип рецептора, сопряженного с G-белком (GPCR), и основная роль G-белка заключается в активации вторичных преобразователей для регулирования клеточных ответов на многие физиологические стимулы посредством трансдукции сигнала. MC4R представляет собой Gs-связанный рецептор, и известно, что, если MC4R взаимодействует с агонистом, аденилатциклаза (AC) активируется, увеличивая концентрацию циклического AMP (cAMP), который является одним из вторичных преобразователей в клетках. Следовательно, можно оценить активность рецепторов меланокортина путем измерения генерации сигналов цАМФ.
2
[260] После того, как были установлены линии клеток, связанных с цАМФ Hunter Gs (линия клеток CHO-K1), в которых каждый из MC1R, MC3R, MC4R и MC5R был сверхэкспрессирован, чтобы можно было измерить повышение уровня цАМФ в клетках из-за реакции агонистов, клетки инокулировали в каждую лунку планшета для культивирования лейкоцитов и инкубировали в течение 24 часов в инкубаторе при температуре 37°C в присутствии 5% CO. После инкубации среду удаляли и добавляли 15 мкл реагента 2:1 HBBS/10 мМ HEPES:cAMP XS+Ab. После добавления 5 мкл образца, разбавленного в 4 раза буфером, концентрацию носителя устанавливали равной 1% и добавляли соединение-агонист MC4R, разбавленное на каждой стадии концентрации, с последующим взаимодействием при температуре 37°C в течение 30 минут. Активность (%) каждого соединения-агониста выражается как 100%×(среднее значение RLU образца-среднее значение RLU контроля носителя)/(среднее значение RLU максимального контроля-среднее значение RLU контроля носителя), и значение было проанализировано с помощью пакета анализа данных (ChemInnovation, CA).
50
[261] В таблице 2 показаны результаты измерения агонистической способности рецепторов меланокортина соединений, полученных в вышеуказанных экспериментах, в значениях EC (нМ).
[262] [Таблица 2]
[263]
<b>Анализ цАМФ, EC</b><sub><b>50</b></sub><b> (нМ)</b>
<b>Соединение</b>
<b>MC4R</b>
Пример 1
36,5
Пример 2
50,3
Пример 3
22,7
Сравнительный пример 1 (A95)
335,3
Сравнительный пример 2 (A96)
150,0
[264] Как показано в Таблице 2, было подтверждено, что среди хорошо известных рецепторов меланокортина in vivo в отношении рецептора меланокортина-4 (MC4R), участвующего в энергетическом метаболизме и контроле веса in vivo, соединения примеров обладают более высокой способностью к агонистам рецепторов, чем соединения сравнительных примеров (A95 и A96).
[265]
Экспериментальный пример 3: Анализ β-аррестина
[266]
[267] Рецептор меланокортина представляет собой тип рецептора, сопряженного с G-белком (GPCR), и регулирует различные физиологические реакции путем трансдукции сигналов от многих нейротрансмиттеров. Когда GPCR фосфорилируется, β-аррестин связывается с фосфорилированной частью рецептора и играет важную роль в активации различных сигнальных путей в клетках посредством взаимодействия с другими белками. Известно, что когда рецептор меланокортина взаимодействует с агонистом, β-аррестин мобилизуется и участвует в опосредованном β-аррестином сигнальном пути. Следовательно, активность рецептора меланокортина можно оценить путем измерения β-аррестина.
2
[268] Была создана клеточная линия β-аррестина Pathhunter eXpress (линия клеток U2OS), в которой вместе экспрессировались β-аррестин, меченный Prolink (PK), MC1R, MC3R, MC4R, MC5R и ферментный акцептор (EA). Когда часть MCR-PK этой клеточной линии активируется, β-аррестин-EA мобилизуется, и акцептор фермента (EA) и Prolink (PK), которые являются фрагментами фермента β-галактозидазы, взаимодействуют. Активированный фермент гидролизует субстрат за счет активности β-галактозидазы, чтобы произвести хемилюминесцентный сигнал, так что активность может быть измерена. После инкубации линии клеток-аррестина Pathhunter eXpress (линия клеток U2OS) клетки инокулировали в каждую лунку планшета для культивирования клеток и инкубировали в течение 48 часов в инкубаторе при температуре 37°C в присутствии 5% CO. После инкубации добавляли 5 мкл образца, разведенного в 5 раз буфером, концентрацию носителя устанавливали равной 1% и добавляли соединение-агонист MC4R, разбавленное на каждой стадии концентрации, с последующим взаимодействием при температуре 37°C в течение 90 минут. Активность (%) каждого соединения-агониста выражается как 100%×(среднее значение RLU образца-среднее значение RLU контроля носителя)/(среднее максимальное значение контрольного лиганда-среднее значение RLU контроля носителя), и значение было проанализированы пакетом анализа данных CBIS (ChemInnovation, CA).-
50
[269] В таблице 3 показаны результаты измерения активности рецептора меланокортина каждого соединения, полученные в вышеуказанных экспериментах, в значениях EC (нМ).
[270] [Таблица 3]
[271]
<b>Анализ β-аррестина, EC</b><sub><b>50</b></sub><b> (нМ)</b>
<b>Соединение</b>
<b>MC4R</b>
Пример 1
4,6
Пример 2
8,7
Пример 3
3,3
Сравнительный пример 1 (A95)
176,4
Сравнительный пример 2 (A96)
44,3
[272]
[273] Как показано в таблице 3, было подтверждено, что среди хорошо известных рецепторов меланокортина in vivo в отношении рецептора меланокортина-4 (MC4R), участвующего в энергетическом метаболизме и контроле веса in vivo, соединения примеров обладают более высокой способностью к агонистам рецепторов, чем соединения сравнительных примеров (A95 и A96).
[274]
Экспериментальный пример 4: Сродство связывания
[275]
[276] Известно пять подтипов рецептора меланокортина (MCR) in vivo, и известно, что MC4R, который относится к подтипу 4, участвует в энергетическом метаболизме и контроле веса. Поскольку другие подтипы MCR участвуют в регуляции различных функций in vivo, таких как пигментация кожи, энергетический гомеостаз и экзокринные функции, обеспечение селективности в отношении MC4R соединений-агонистов MC4R очень важно для предотвращения возможных побочных эффектов в будущем. Поэтому были измерены рецепторные способности агонистов MC4R для каждого подтипа MCR.
125
125
125
125
125
125
125
50
[277] После того, как были созданы клеточная линия CHO-K1, экспрессирующая человеческий рекомбинантный MC1R, и клеточные линии HEK-293, экспрессирующие MC3R, MC4R и MC5R, из каждой клеточной линии собирали мембраны. В 96-луночном планшете для культивирования клеток 3 мкг MC1R-мембраны и 0,04 нМ I-NDP-α-MSH на лунку взаимодействовали при температуре 37°C в течение двух часов. 3 мкг мембраны MC3R и MC5R и 0,035 нМ I-NDP-α-MSH взаимодействовали при температуре 37°C в течение двух часов. 3 мкг мембраны MC3R и MC5R и 0,035 нМ I-NDP-α-MSH подвергали взаимодействию при температуре 37°C в течение одного часа, и 3,12 мкг мембраны MC4R и 0,02 нМ I-NDP-α-MSH подвергали взаимодействию при температуре 37°C в течение двух часов. В это время в каждую лунку добавляли 25 мМ адсорбционного буфера HEPES-KOH (pH 7,0), содержащего агонист MCR, разведенный на каждой стадии концентрации, и подвергали взаимодействию. Прореагировавший раствор переносили на фильтр и промывали адсорбционным буфером, а затем измеряли радиоактивность. Значение, исключая количество неспецифического связывания в присутствии 1 мкМ (MC1R) и 3 мкМ (MC3R, MC4R, MC5R) NDP-α-MSH от каждого общего количества связывания, использовали в качестве количеств специфического связывания I-NDP-α-МСГ. Измеряли степень, в которой специфическое связывание I-NDP-α-MSH ингибировалось агонистом, разбавленным при каждой ступенчатой концентрации. IC выражали как концентрацию каждого агониста, которая ингибировала специфическое связывание 50% I-NDP-α-MSH.
[278] В таблице 4 представлены результаты измерения связывания рецепторов меланокортина соединений, полученных в вышеуказанном эксперименте, в значениях Ki (нМ).
[279] [Таблица 4]
[280]
<b>Сродство связывания, Ki (нМ)</b>
<b>Соединение</b>
<b>MC4R</b>
Пример 1
65
Пример 2
110
Пример 3
24
Сравнительный пример 1 (A95)
1400
Сравнительный пример 2 (A96)
360
[281]
[282] Как показано в Таблице 4, было подтверждено, что среди хорошо известных рецепторов меланокортина in vivo в отношении рецептора меланокортина-4 (MC4R), участвующего в энергетическом метаболизме и контроле веса in vivo, соединения примеров обладают более высокой способностью связываться с рецепторами, чем соединения сравнительных примеров (A95 и A96).
[283]
Экспериментальный пример 5: Фармакокинетика и метаболизм лекарственного средства
[284]
Экспериментальный пример 5-1: Фармакокинетический профиль
[285]
[286] Для исследования фармакокинетических (PK) свойств соединения примера 1 и соединений сравнительных примеров был проведен следующий эксперимент.
[287] Для проведения PK-теста для соединения примера 1 и соединений сравнительных примеров (A95 и A96) были приготовлены мыши C57BL6 в возрасте около 7 недель, по 12 особей были распределены по каждому введенному веществу, разделены на группы и голодали для перорального приема. В день введения раствор лекарственного средства готовили с концентрацией 1 мг/мл с использованием дистиллированной воды (DW) в качестве носителя и вводили перорально из расчета 1 мл на кг массы тела каждой особи, а конечная доза составляла 10 мг/кг. Через 1, 3, 8 и 24 часа после введения у каждого из 3 особей в каждой группе собирали цельную кровь путем забора крови из сердца, а затем помещали в пробирку с гепарином для предотвращения коагуляции. После этого головной мозг каждой особи собирали и помещали в пробирку для EP, измеряли массу ткани и хранили при заморозке при температуре -20°C.
[288] В день анализа в каждую тканевую пробирку добавляли DDW в 4 раза превышающий объем массы ткани и гомогенизировали, и сохраненную плазму размораживали при комнатной температуре. Как и в случае с плазмой брали 50 мкл гомогената ткани и переносили в отдельную пробирку, и затем в каждую пробирку с плазменным и тканевым гомогенатом добавляли 200 мкл ацетонитрила (AN), что в 4 раза больше общего объема образца для проведения депротеинизации. В этом случае AN включил внутренний стандарт. Для построения калибровочной кривой был приготовлен раствор AN (с внутренним стандартом) с известными концентрациями 0,1, 0,5, 5, 50 и 500 нг/мл, и была проведена депротеинизация в 4-кратном объеме, как указано выше, в пустой плазме каждой из плазмы и мозга. Таким образом, были подготовлены окончательные калибровочные кривые от 0,4 до 2000 нг/мл для плазмы и 1, 5, 50, 500 и 5000 нг/мл для мозга. После того, как 0,5 мкл супернатанта, полученного после депротеинизации, было введено в ЖХ-МС/МС, площади пиков соединений примера и сравнительных примеров (A95 и A96) были скорректированы с площадями пиков IS, чтобы получить пиковую реакцию на каждом точку отбора пробы и выполнить преобразование концентрации по калибровочной кривой.
max
inf
1/2
[289] Фармакокинетические параметры (C, AUC, t и тому подобное) рассчитывали методом некомпартментного анализа с использованием WinNonlin 8.1 для значений концентрации в крови во времени для каждой группы введения.
[290] Фармакокинетические характеристики каждого соединения сравнивали путем сравнения воздействия, изменений периода полужизни и тому подобное для каждой группы введения лекарственного средства, и полученные значения показаны в таблицах 5 и 6. Кроме того, значения результатов в соответствии с соотношением воздействия на мозг и воздействия крови показано в таблице 7.
[291] [Таблица 5]
[292]
<b>Параметры</b>
<b>Плазма</b>
<b>Пример 1</b>
<b>Сравнительный пример 1 (A95)</b>
<b>Сравнительный пример 2 (A96)</b>
C<sub>max</sub> (нг/мл)
232,3
205,0
337,1
AUC<sub>inf </sub>(нг·час/мл)
2067,0
564,6
1654,5
t<sub>1/2</sub> (час)
3,9
2,7
2,6
[293] [Таблица 6]
[294]
<b>Параметры</b>
<b>Мозг</b>
<b>Пример 1</b>
<b>Сравнительный пример 1 (A95)</b>
<b>Сравнительный пример 2 (A96)</b>
C<sub>max</sub> (нг/мл)
49,1
20
27,1
AUC<sub>inf </sub>(нг·час/мл)
1495,3
222,1
529,6
t<sub>1/2</sub> (час)
19,0
6,0
8,0
[295] [Таблица 7]
[296]
<b>Соотношение AUC мозга и плазы</b>
Параметры
<b>Пример 1</b>
<b>Сравнительный пример 1 (A95)</b>
<b>Сравнительный пример 2 (A96)</b>
Среднее соотношение
Значение
0,72
0,39
0,32
[297]
[298] На основании приведенных выше результатов, воздействие каждого соединения было подтверждено во всем организме и в головном мозге в порядке следования соединения примера 1, соединения сравнительного примера 2 (A96) и соединения сравнительного примера 1 (A95). Время полужизни потери в головном мозге в течение периода наблюдения выше, чем значение, наблюдаемое в крови, и предполагается, что это означает эффективное сохранение ряда веществ в месте проявления эффективности. Кроме того, было подтверждено, что, когда каждое соединение вводилось в одной и той же дозе, соединение примера имело наилучшее абсолютное воздействие и стабильность в головном мозге. Кроме того, было подтверждено, что соотношение воздействия на мозг и воздействия на кровь соединения примера 1 также было самым превосходным по сравнению с соединениями сравнительных примеров (A95 и A96).
[299] В дополнение к этим результатам, когда in vitro активность каждого соединения и стойкость лекарственного средства были всесторонне рассмотрены, наилучшую эффективность можно было ожидать от соединения из примера 1 по сравнению с соединениями из сравнительных примеров, когда была введена та же доза. Чтобы достичь эффективности определенного уровня, можно вводить более низкую дозу, и, соответственно, ожидается, что это сведет к минимуму побочные эффекты, возникающие в результате системного воздействия.
[300]
Экспериментальный пример 5-2: Ингибирование CY (%)
[301]
[302] Чтобы подтвердить лекарственное взаимодействие с изоферментом CYP (цитохром P450), был проведен следующий эксперимент.
[303] Для измерения и сравнения ингибирующей способности соединения примера 1 и соединения сравнительного примера 2 (A96) были приготовлены рекомбинантные ферменты CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 и 3A4. Следующая таблица 8 относится к использованию зондового субстрата, положительного контроля, изофермента и условий измерения в отношении измерения ингибирующей способности каждого вещества.
[304] [Таблица 8]
[305]
<b>Изофермент CYP</b>
<b>1A2</b>
<b>2C9</b>
<b>2C19</b>
<b>2D6</b>
<b>3A4</b>
<b>Маркерный субстрат</b>
ER
FCA
BMC
MMC
7BQ
<b>(конечные концентрации)</b>
0,5 мкМ в 1% ацетонитриле
50 мкМ в 1% ацетонитриле
10 мкМ в 1%ДМСО
10 мкМ в 1%метаноле
25 мкМ в 1% ацетонитриле
<b>Положительный контроль</b>
Фурафиллин
Тиениловая кислота
Тиклопидин
Пароксетин
Тролеандомицин
<b>Положительная конечная концентрация (мг/мл)</b>
0,01
0,1
0,0014
0,008
0,1
<b>Длина волны (нМ): возбуждение/эмиссия</b>
530/590
409/508
409/460
409/485
409/530
[306]
[307] Инкубирование проводили в 96-луночном планшете (Costar, 3792-черный, с круглым дном), буферная система, используемая для метаболизма, представляла собой 50 мМ калий-фосфатный буфер и pH 7,4, а конечный объем реакции составлял 250 мкл. Конечные концентрации соединения примера 1, соединения сравнительного примера 2 (A96) и положительного контроля в общем буфере составляли 10 мкМ (2% метанол (об./об.)), и каждая включала отрицательный контроль (только метанол, 2% (об./об.)). Буфер, содержащий экспериментальное соединение, смешивали с таким же объемом раствора для приготовления изофермента CYP так, чтобы конечная концентрация составляла 10 мкМ, с последующим предварительным нагреванием в течение 10 минут в флюоресцентном считывающем устройстве для планшетов при температуре 37°C. В каждую лунку добавляли раствор NRS (система регенерации NADPH: 0,22 мМ β-NADP, 2,8 мМ глюкозо-6-фосфат и 0,6 единиц/мл глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы) с последующей предварительной инкубацией в течение 30 минут. После этого реакцию инициировали добавлением субстрата в лунку, подвергнутую предварительной инкубации, и контролировали с интервалом в одну минуту при длине волны измерения для каждого субстрата в течение 30 минут. Измеренные значения, полученные для положительного контроля и соединения примера 1, сравнивали с интенсивностью флуоресценции отрицательного контроля (без ингибирования или соединения) для подтверждения ингибирующей способности каждого соединения против изофермента. Ингибирующая способность (%) против каждого изофермента, когда каждое соединение обрабатывали в концентрации 10 мкМ, показана в таблице 9. Ингибирующая активность (%) была выражена на основании следующих критериев: A=<50%, B=>50%.
[308] Обрабатывающая концентрация соединения 10 мкМ была очень высокой, и представляет собой консервативный критерий для оценки ингибирующей способности на основе такой обрабатывающей концентрации и выбора лекарства со степенью ингибирования ниже 50% в качестве кандидата. Можно считать, что это наименее вероятно, что выбранный препарат-кандидат в этом случае ингибирует изофермент CYP.
[309] [Таблица 9]
[310]
<b>Ингибирование CYP (%) при 10 мкМ</b>
Изофермент CYP
1A2
2C9
2C19
2D6
3A4
Пример 1
A
A
A
A
A
Сравнительный пример 2 (A96)
A
B
A
A
A
[311]
[312] Из приведенных выше результатов при обработке в той же концентрации было подтверждено, что ингибирующая способность соединения примера 1 против основного изофермента CYP была ниже или аналогична таковой у соединения (A96) сравнительного примера 2. Существует опасение, что соединение (A96) сравнительного примера 2 взаимодействует с лекарственными средствами из-за очень высокой ингибирующей способности против CYP2C9. Известно, что CYP2C9 участвует в метаболизме примерно 10% всех коммерчески доступных лекарств и играет важную роль в потере эффективности лекарств с узким терапевтическим окном. Кроме того, CYP2C9 очень важен как в исследовательских, так и в клинических аспектах, поскольку сообщалось о полиморфизме, зависящем от каждой особи. Об этом также можно узнать из того факта, что CYP2C9 представлен в списке основных изоферментов, ингибирующий эффект которых следует проверять во время разработки лекарственного средства в руководстве FDA по взаимодействию лекарств с лекарственными средствами (DDI).
[313] На основании этого было определено, что при введении соединения примера 1 лекарственное взаимодействие, вызванное ингибированием CYP, ниже, чем у соединения сравнения (A96).
[314]
Экспериментальный пример 6: Фармакология
[315]
[316] Фармакологический эффект агониста рецептора меланокортина-4 соединения по настоящему изобретению оценивали на следующей модели ожирения.
[317]
Экспериментальный пример 6-1: Модель ожирения у мышей, индуцированного диетой с высоким содержанием жиров
[318]
[319] Эффект агонистов рецептора меланокортина-4 на ожирение оценивали с использованием модели ожирения у мышей, индуцированного диетой с высоким содержанием жиров.
[320] Пятинедельным самцам мышей C57BL/6Ntaconic давали диету с содержанием жира 60 ккал % (D12492, Research Diet.) в течение 15 недель, чтобы вызвать ожирение. Соединение примера 1, соединения сравнительных примеров (A95 и A96) и сибутрамин в качестве положительного контроля готовили в дистиллированной воде и вводили перорально 19-недельным мышам с моделями ожирения, индуцированного диетой с высоким содержанием жиров, один раз в день с 1 по 16 день. С 1 по 16 день измеряли массу тела один раз в день, потребление пищи измеряли пять раз в неделю и потребление питьевой воды измеряли два раза в неделю. Уровень глюкозы в крови и гликированный гемоглобин измеряли на 15-й день, и всех животных умерщвляли на 17-й день. Кровь собирали через брюшную полую вену, удаляли и взвешивали печень и эпидидимальную жировую ткань. Собранную кровь помещали в пробирку с гепарином и центрифугировали для отделения плазмы, а затем выполняли биохимический анализ плазмы.
[321] В таблице 10 показана разница в скорости изменения веса носителя, измеренную на 12-й день для каждой дозы каждого соединения.
[322] [Таблица 10]
[323]
День 12
<b>10 мг/кг</b>
<b>30 мг/кг</b>
Пример 1
-9,4%*
-15,1%**
Сравнительный пример 1
-4,8%
-4,0%
Сравнительный пример 2
-0,2%
-7,1%
Сибутрамин
-6,8%
NT (не исследовали)
[324] (Различие в скорости изменения веса по сравнению с носителем)
[325] Значимая различие в массе тела между контрольной группой носителя и группой, получавшей соединение: *p<0,05, **p<0,01 (среднее±SEM, t-критерий Стьюдента, непарный, двусторонний)
[326]
[327] На этих моделях ожирения у мышей, в частности, когда вводили только соединение примера 1, была показана значительная потеря веса. Когда соединение примера 1 вводили в дозах 10 мг/кг и 30 мг/кг, было вызвано -9,4% и -15,1% ингибирования увеличения веса по сравнению с контрольным носителем, когда вводили растворитель, соответственно, и был продемонстрирован статистически значимый эффект потери веса по сравнению с соединениями сравнительных примеров (A95 и A96).
[328] Это вызвано превосходной агонистической способностью MC4R in vitro, превосходным абсолютным воздействием на мозг и стабильностью, а также превосходным коэффициентом воздействия на мозг по сравнению с воздействием на кровь соединения из примера 1 по сравнению с соединениями из сравнительных примеров, и считается, что значительная разница может проявляться даже при низких дозах.
[329] Кроме того, соединение примера 1 показало превосходные результаты, равные или более высокие с точки зрения эффективности, по сравнению с сибутрамином (Reductil), который является средством для лечения ожирения в родственной области, и, таким образом, ожидается, что оно будет проявлять значительную лекарственную эффективность. в реальном клиническом применении.