ЛЕЧЕНИЕ ИНСУЛЬТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПЛАЦЕНТАРНЫХ КЛЕТОК
STROKE TREATMENT WITH APPLICATION OF ISOLATED PLACENTAL CELLS

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной патентной заявкой США № 61/090565, поданной 20 августа 2008 г., которая включена в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте.
1. ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
В настоящем документе предоставлены способы применения изолированных плацентарных клеток, например, плацентарных мультипотентных клеток, популяций таких изолированных плацентарных клеток и/или композиций, включающих клетки, в лечении индивидуума, имеющего гипоксическое повреждение или нарушение кровотока в мозге или вокруг него, например, симптом или дефект, например, неврологический дефицит, который может быть отнесен к нарушению кровотока в мозге или вокруг него.
2. ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Инсульт, также известный под названиями "мозговая атака", острое нарушение мозгового кровообращения (CVA) или острый ишемический цереброваскулярный синдром, представляет собой потерю функции(й) мозга, обычно быстро развивающуюся, что является результатом нарушения в кровеносных сосудах, снабжающих кровью мозг или ствол мозга. Нарушение может быть ишемическим (отсутствие крови), обусловленным, например, тромбозом или эмболией или может быть следствием кровотечения. В соответствии с формулировкой Всемирной Организации Здравоохранения, инсульт представляет собой "неврологический дефицит цереброваскулярного происхождения, который сохраняется свыше 24 часов или прерывается смертью в течение 24 часов". Сохранение симптомов свыше 24 часов отделяет инсульт от Транзиторной Ишемической Атаки (ТИА), при которой симптомы сохраняются менее чем 24 часа.
В настоящее время лечение ишемического инсульта типично включает антитромбоцитарный препарат, такой как аспирин, клопидогрель, дипиридамол или антикоагулянтный препарат, такой как варфарин для уменьшения или снижения закупорки, являющейся причиной ишемии. Дополнительно, насколько возможно, приводят к норме уровень сахара крови и пациенту с инсультом предоставляются адекватная кислородная поддержка и внутривенное введение жидкостей. Лечение геморрагического инсульта, как правило, включает в себя одно или более из: введение лекарственного препарата, снижающего артериальное давление, введение обезболивающего препарата, иного чем нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат (NSAID), введение блокатора кальциевых каналов (например, Нимодипина), и, если показано, хирургическое вмешательство для восстановления разрывов сосудов, ответственных за кровотечение.
Однако такое лечение стремится только уменьшить происходящее неврологическое повреждение и ничего не делает для восстановления потерянной функции. Многочисленные неклеточные нейропротекторные средства тестировались на эффективность при лечении инсульта и были неудовлетворительными, включая антагонисты рецептора N-метил-D-аспартат, налмефен, лубелузол, клометиазол, блокаторы кальциевых каналов (включающие антагонисты a-амино-3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-пропионовой кислоты, агонисты серотонина (например, репинотан) и модуляторы трансмембранных калиевых каналов), тирилазад, антитело против-ICAM-I, антилейкоцитарное антитело человека (Hu23F2G), антитромбоцитарное антитело (например, абциксимаб), цитиколин (экзогенная форма цитидин-5'-дифосфохолина) и основной фактор роста фибробластов.
Эффективное лечение инсульта отсутствует. Таким образом, имеется необходимость в терапии, которая не только уменьшает неврологическое повреждение, возникающее в тех или иных условиях, но улучшает функцию нервной системы и прогноз.
3. СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
См
Предоставленными здесь, в одном аспекте, являются способы применения изолированных плацентарных клеток, популяций изолированных плацентарных клеток, популяций клеток, включающих изолированные плацентарные стволовые клетки и композиций, включающих изолированные плацентарные клетки при лечении индивидуума, имеющего нарушение кровотока в центральной нервной системе (ЦНС) индивидуума или вокруг нее, например, мозге или спинном мозге. Способы включают в себя, например, лечение симптома или неврологического дефицита у индивидуума, которые могут быть отнесены к нарушению кровотока в мозге индивидуума или вокруг мозга, такие как гипоксическое повреждение, аноксическое повреждение, инсульт (например, ишемический или геморрагический инсульт), неинсультное кровотечение или ТИА. Как рассматривается здесь, лечение симптома или неврологического дефицита у индивидуума, которые могут быть отнесены к нарушению кровотока в мозге индивидуума или вокруг мозга, включает лечение симптомов или неврологических дефицитов, которые могут быть отнесены к реперфузионному повреждению, которое может сопутствовать такому нарушению кровотока в мозге индивидуума или вокруг мозга. Успешное лечение ишемического инсульта, например, аноксического повреждения или гипоксического повреждения, продемонстрировано здесь на общепринятой модели инсульта на животных. . пример 1 и пример 2.
В одном аспекте, здесь предоставлен способ лечения индивидуума, имеющего нарушение кровотока в мозге индивидуума или вокруг мозга, например, имеющего симптом или неврологический дефицит, которые могут быть отнесены к нарушению кровотока в мозге индивидуума или вокруг мозга или в центральной нервной системе (ЦНС), включающий в себя введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества изолированных, адгезивных к пластику культуры ткани человеческих плацентарных клеток, где указанные изолированные плацентарные клетки имеют характеристики мультипотентных клеток или стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления, нарушение кровотока приводит в результате к аноксическому повреждению или гипоксическому повреждению мозга индивидуума или его ЦНС.
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
-
-
В некоторых вариантах осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой изолированные плацентарные стволовые клетки. В некоторых других вариантах осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой изолированные плацентарные мультипотентные клетки. В конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD34, CD10 и CD105, как обнаружено посредством проточной цитометрии. В более конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки представляют собой плацентарные стволовые клетки. В еще одном более конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки представляют собой мультипотентные плацентарные клетки. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки имеют возможность дифференцировать в клетки остеогенного фенотипа или клетки хондрогенного фенотипа. В еще одном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки имеют возможность дифференцировать в клетки нейронального фенотипа. В более конкретном варианте осуществления, изолированные CD34-, CD10, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD200. В еще одном более конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD90 или CD45, как обнаружено посредством проточной цитометрии. В еще одном более конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD90 или CD45, как обнаружено посредством проточной цитометрии. В более конкретном варианте осуществления, CD34, CD10, CD105, CD200 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD90 или CD45, как обнаружено посредством проточной цитометрии. В еще одном более конкретном варианте осуществления, CD34, CD10, CD105, CD200 клетки представляют собой дополнительно CD90 и CD45, как обнаружено посредством проточной цитометрии. В еще одном более конкретном варианте осуществления, CD34, CD10, CD105, CD200, CD90, CD45 клетки представляют собой дополнительно CD80 и CD86, как обнаружено посредством проточной цитометрии.
-
+
+
+
-
+
+
-
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
низкий
-
+
-
+
"
"
+
-
-
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
низкий
-
+
-
+
-
-
+
-
-
+
-
+
+
В более конкретном варианте осуществления, CD34, CD10, CD105 клетки представляют собой дополнительно одни или более из CD29, CD38, CD44, CD54, CD80, CD86, SH3 или SH4. В еще одном более конкретном варианте осуществления, клетки представляют собой дополнительно CD44. В еще одном конкретном варианте осуществления, CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно одни или более из CD13, CD29, CD33, CD38, CD44, CD45, CD54, CD62E, CD62L, CD62P, SH3 (CD73), SH4 (CD73), CD80, CD86, CD90, SH2 (CD105), CD 106/VCAM, CDl17, CD144/VE-кадхерин, CD184/CXCR4, CD200, CDl33, OCT-4, SSEA3, SSEA4, ABC-p, KDR (VEGFR2), HLA-A,B,C, HLA-DP,DQ,DR, HLA-G и Лиганд Программированной Смерти-1 (PDLl) или любое их сочетание. В более конкретном варианте осуществления, CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD13, CD29, CD33, CD38, CD44, CD45, CD54/ICAM, CD62E, CD62L, CD62P, SH3 (CD73), SH4 (CD73), CD80, CD86, CD90, SH2 (CD105), CD106/VCAM, CDl17, CD144/VE-кадхерин, CD184/CXCR4, CD200, CD133, OCT-4, SSEA3, SSEA4, ABC-p, KDR (VEGFR2), HLA-A,B,C, HLA-DP,DQ,DR, HLA-G, и Лиганд Программированной Смерти-1 (PDLl).
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
В других вариантах осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD200 и HLA-G; CD73, CD105, и CD200; CD200 и OCT-4; CD73, CDl05 и HLA-G; CD73 и CD105 и облегчают образование одного или более эмбриоид-подобных телец в популяции плацентарных клеток, содержащей указанные изолированные плацентарные клетки, когда указанную популяцию культивируют при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобного тельца; или OCT-4 и облегчают образование одного или более эмбриоид-подобных телец в популяции плацентарных клеток, содержащей изолированные плацентарные клетки, когда указанную популяцию культивируют при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобных телец; или любое их сочетание. В других вариантах осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD34, CD10, CD105, и дополнительно представляют собой CD200 и HLA-G; CD73, CD105, и CD200; CD200 и OCT-4; CD73, CD105 и HLA-G; CD73 и CD105 и облегчают образование одного или более эмбриоид-подобных телец в популяции плацентарных клеток, содержащей указанные изолированные плацентарные клетки, когда указанную популяцию культивируют при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобного тельца; или OCT-4 и облегчают образование одного или более эмбриоид-подобного тельца в популяции плацентарных клеток, содержащей изолированные плацентарные клетки, когда указанную популяцию культивируют при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобных телец; или любое их сочетание.
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
В конкретном варианте осуществления, указанные CD200, HLA-G плацентарные клетки представляют собой CD34, CD38, CD45, CD73 и CD105. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD73, CD105, и CD200 плацентарные клетки представляют собой CD34, CD38, CD45 и HLA-G. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные CD200, OCT-4 стволовые клетки представляют собой CD34, CD38, CD45, CD73, CD105 и HLA-G. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD73, CD105 и HLA-G плацентарные клетки представляют собой CD34, CD45, OCT-4 и CD200. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD73 и CD105 плацентарные клетки представляют собой OCT-4, CD34, CD38 и CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные клетки представляют собой CD73, CD105, CD200, CD34, CD38, и CD45.
+
+
-
-
+
~
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
-
-
+
-
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
-
-
-
+
+
-
+
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
В определенных вариантах осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой одни или более из CD10, CD29, CD34, CD38, CD44, CD45, CD54, CD90, SH2, SH3, SH4, SSEA3, SSEA4, OCT-4, MHC-I или ABC-p, где ABC-p представляет собой плацента-специфический ABC белок-переносчик (также известный как белок резистентности к раку молочной железы (BCRP) и как белок резистентности к митоксантрону (MXR)). В конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD10, CD29, CD34, CD38, CD44, CD45, CD54, CD90, SH2, SH3, SH4, SSEA3, SSEA4 и OCT-4. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD10, CD29, CD34, CD38, CD45, CD54, SH2, SH3, и SH4. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD10, CD29, CD34, CD38, CD45, CD54, SH2, SH3, SH4 и OCT-4. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD10, CD29, CD34, CD38, CD44, CD45, CD54, CD90, HLA-I, SH2, SH3, SH4. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой OCT-4 и ABC-p. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой SH2, SH3, SH4 и OCT-4. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой OCT-4, CD34, SSEA3, и SSEA4. В конкретном варианте осуществления, указанные OCT-4, CD34, SSEA3, и SSEA4 клетки представляют собой дополнительно CD10, CD29, CD34, CD44, CD45, CD54, CD90, SH2, SH3, и SH4. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой OCT-4 и CD34, и либо SH3 или SH4. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD34 и либо CD10, CD29, CD44, CD54, CD90 или OCT-4. В некоторых вариантах осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD10, CD34, CD105 и CD200.
+
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
низкий
-
низкий
низкий
-
низкий
низкий
-
-
+
+
+
В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые в способах лечения, описанных здесь, представляют собой один или более из CD10, CD29, CD44, CD45, CD54/ICANT, CD62-E, CD62-L, CD62-P, CD80, CD86, CD103, CD104, CD105, CD 106/VCAM, CD144/VE-кадхерин, CD184/CXCR4, β2-микроглобулин, HLA-I, HLA-II, HLA-G, и/или PDLl. В конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой, по меньшей мере, CD29 и CD54. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой, по меньшей мере, CD44 и CD106. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой, по меньшей мере, CD29.
-9
-4
"9
"4
В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки экспрессируют один или более генов на заметно более высоком уровне, чем эквивалентное количество полученных из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток, где указанные один или более генов представляют собой один или более из ACTG2, ADARBl, AMIGО2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAМ1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, ILl8, KRTl8, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAKl, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTNl, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, и ZC3H12A, и где указанные полученные из костного мозга мезенхимальные стволовые клетки проходят количество пассажей в культуре, эквивалентное числу пассажей указанных изолированных плацентарных клеток. В более конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки экспрессируют указанные один или более генов, когда их культивируют в течение приблизительно от 3 до приблизительно 35 удвоений популяции в среде, содержащей 60% DMEM-LG (например, от Gibco) и 40% MCDB-201 (например, от Sigma); 2% зародышевой бычьей сыворотки (например, от Hyclone Labs.); Ix инсулин-трансферрин-селен (ITS); Ix линолевая кислота-альбумин бычьей сыворотки (LA-BSA); 10M дексаметазон (например, от Sigma); 10M аскорбиновая кислота 2-фосфат (например, от Sigma); эпидермальный фактор роста 10 нг/мл (например, от R&D Systems); и тромбоцитарный фактор роста (PDGF-BB) 10 нг/мл (например, от R&D Systems). В более конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки экспрессируют указанные один или более генов при культивировании в течение от приблизительно 3 до приблизительно 35 удвоений популяции в среде, содержащей 60% DMEM-LG (например, от Gibco) и 40% MCDB-201 (например, от Sigma); 2% зародышевой бычьей сыворотки (например, от Hyclone Labs.); Ix инсулин-трансферрин-селен (ITS); Ix линолевая кислота-альбумин бычей сыворотки (LA-BSA); 10 M дексаметазон (например, от Sigma); 10 M аскорбиновая кислота 2-фосфат (Sigma); эпидермальный фактор роста 10 нг/мл (например, от R&D Systems); и тромбоцитарный фактор роста (PDGF-BB) 10 нг/мл (например, от R&D Systems).
В еще одном конкретном варианте осуществления способа лечения, указанные плацентарные стволовые клетки экспрессируют нейротрофические факторы роста глиальных клеток (GDNF), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), фактор роста гепатоцитов (HGF), плацентарный фактор роста (PGF) и фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF).
В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки представляют собой содержащиеся в пределах популяции клетки, по меньшей мере, 50% клеток из которых представляют собой указанные изолированные плацентарные клетки. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки представляют собой содержащиеся в пределах популяции клетки, по меньшей мере, 70% клеток из которых представляют собой указанные изолированные плацентарные клетки. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки представляют собой содержащиеся в пределах популяции клетки, по меньшей мере, 80% клеток из которых представляют собой указанные изолированные плацентарные клетки. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки представляют собой содержащиеся в пределах популяции клетки, по меньшей мере, 90% клеток из которых представляют собой указанные изолированные плацентарные клетки. В некоторых других вариантах осуществления, плацентарные клетки в указанной популяции клеток по существу не содержат клеток, имеющих материнский генотип; например, по меньшей мере, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% плацентарных клеток в указанной популяции имеют фетальный генотип, т.е. являются зародышевыми по происхождению. В некоторых других вариантах осуществления, популяция клеток, содержащая указанные плацентарные клетки, по существу не содержит клеток, имеющих материнский генотип; например, по меньшей мере, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток в указанной популяции имеют генотип плода, т.е. являются зародышевыми по происхождению.
В некоторых вариантах осуществления, какие-либо из плацентарных клеток, например, плацентарные стволовые клетки или мультипотентные плацентарные клетки, описанные здесь, являются аутологичными для реципиента, например, индивидуума, который имеет инсульт или имеет симптом инсульта. В некоторых других вариантах осуществления, какие-либо из плацентарных клеток, например, плацентарные стволовые клетки или мультипотентные плацентарные клетки, описанные здесь, являются гетерологичными для реципиента, например, индивидуума, который имеет инсульт или имеет симптом инсульта.
В еще одном конкретном варианте осуществления способа лечения, указанные изолированные плацентарные клетки являются криоконсервированными перед указанным введением. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки получают из банка плацентарных стволовых клеток.
В любом из приведенных выше вариантов осуществления изолированных плацентарных клеток, изолированные плацентарные клетки, в целом, не дифференцируют во время культивирования в среде для роста, т.е., среде, составленной для инициации пролиферации, например, во время пролиферации в среде для роста. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки не требуют питательного слоя для пролиферации. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки не дифференцируют в культуре в результате культивирования в отсутствие клеток питательного слоя.
В еще одном более конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки получают посредством перфузии послеродовой плаценты, которая была дренирована от крови и подвергнута перфузии для удаления остаточной крови; дренирована от крови, но не подвергнута перфузии для удаления остаточной крови; или, ни дренирована от крови, ни подвергнута перфузии для удаления остаточной крови. В еще одном более конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки получают посредством физического и/или ферментативного разрушения плацентарной ткани.
Маркеры клеточной поверхности, молекулярные и генетические маркеры плацентарных клеток, применимые в способах предоставленных здесь, описаны подробно в Разделе 5.4.2, ниже.
В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное нарушение кровотока представляет собой инсульт. В более конкретном варианте осуществления, указанный инсульт представляет собой ишемический инсульт. В еще одном более конкретном варианте осуществления, указанный инсульт представляет собой геморрагический инсульт, например, внутричерепное кровоизлияние в мозг или спонтанное субарахноидальное кровоизлияние. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное нарушение представляет собой гематому. В более конкретных вариантах осуществления, гематома представляет собой дуральную гематому, субдуральную гематому или субарахноидальную гематому. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанная гематома вызывается воздействием внешнего усилия на череп в результате, например, травмы головы. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное нарушение представляет собой преходящее ишемическое нарушение (TIA), например, возвратное TIA. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное нарушение представляет собой вазоспазм, например, вазоспазм, следующий за геморрагическим инсультом.
В еще одном конкретном варианте осуществления способа, указанное терапевтически эффективное количество представляет собой количество изолированных плацентарных клеток, которое приводит к устранению, обнаруживаемому улучшению, уменьшению тяжести или замедлению развития одного или более симптомов или неврологических дефицитов, присущих для нарушения кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС, проявленных указанным индивидуумом, например, аноксического повреждения или гипоксического повреждения. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные терапевтически эффективное количество изолированных плацентарных клеток вводят указанному индивидууму профилактически, например, для снижения или устранения неврологического повреждения, вызываемого вторым или последующим нарушением кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС после указанного нарушения кровотока.
В конкретных вариантах осуществления, указанные симптомы или неврологические дефициты включают гемиплегию (паралич одной стороны тела); гемипарез (слабость одной стороны тела); слабость лицевых мышц; нечувствительность; снижение чувствительности; измененные обоняние, вкус, слух или зрение; опущение века (птоз); слабость глазных мышц; сниженный рвотный рефлекс; сниженную способность к глотанию; сниженную реакцию зрачка на свет; сниженную чувствительность лица; нарушение равновесия; нистагм; измененную частоту дыхания; измененную частоту сердечных сокращений; слабость грудинно-ключично-сосцевидной мышцы со сниженной возможностью или невозможностью поворота головы в одну сторону; слабость в языке; афазию (невозможность разговора или понимания языка); апраксию (измененные произвольные движения); дефекты поля зрения; дефицит памяти; геминеглект или полупространственное пренебрежение (дефицит внимания к пространству со стороны поля зрения напротив повреждения); дезорганизацию мышления; спутанность; развитие гиперсексуальных жестов; анозогнозию (настойчивое отрицание имеющегося дефицита); затрудненность ходьбы; измененную координацию движений; головокружение; неустойчивость; потерю сознания; головную боль; и/или рвоту.
В еще одном конкретном варианте осуществления способов лечения, описанных выше, указанные изолированные плацентарные клетки вводят посредством болюсной инъекции. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки вводят посредством внутривенной инфузии. В конкретном варианте осуществления, указанная внутривенная инфузия представляет собой внутривенную инфузию в течение от приблизительно от 1 до приблизительно 8 часов. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки вводят интракраниально. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки вводят интраперитонеально. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки вводят интраартериально. В более конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки вводят в область ишемии. В еще одном более конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки вводят в область, периферическую к ишемии. В еще одном конкретном варианте осуществления способа лечения, указанные изолированные плацентарные клетки вводят внутримышечно, внутрикожно, подкожно или внутриглазным методом.
В еще одном варианте осуществления способов лечения, описанных выше, указанные изолированные плацентарные клетки вводят посредством хирургической имплантации указанному индивидууму композиции материала, содержащей указанные изолированные плацентарные клетки. В более конкретном варианте осуществления, указанная композиция материала представляет собой матрицу или каркас. В еще одном более конкретном варианте осуществления, указанные матрица или каркас представляют гидрогель. В еще одном более конкретном варианте осуществления, указанные матрица или каркас представляют собой подвергнутую децеллюляризации ткань. В еще одном более конкретном варианте осуществления, указанные матрица или каркас представляют собой синтетическую биодеградируемую композицию. В еще одном более конкретном варианте осуществления, указанные матрица или каркас представляют собой пену.
4
5
5
6
6
7
7
8
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
7
7
7
7
7
7
6
7
6
В еще одном конкретном варианте осуществления способов лечения, описанных выше, указанные изолированные плацентарные клетки вводят однократно указанному индивидууму. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки вводят указанному индивидууму в два или более раздельных введений. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение в интервале между приблизительно 1×10 и 1×10 изолированных плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, на килограмм указанного индивидуума. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение в интервале между приблизительно 1×10 и 1×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение в интервале между приблизительно 1×10 и 1×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение в интервале между приблизительно 1×10 и 1×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума. В других конкретных вариантах осуществления, указанное введение включает в себя введение в интервале между приблизительно 1×10 и приблизительно 2×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума; между приблизительно 2×10 и приблизительно 3×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума; между приблизительно 3×10 и приблизительно 4×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума; между приблизительно 4×10 и приблизительно 5×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума; между приблизительно 5×10 и приблизительно 6×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума; между приблизительно 6×10 и приблизительно 7×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума; между приблизительно 7×10 и приблизительно 8×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума; между приблизительно 8×10 и приблизительно 9×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума; или между приблизительно 9×10 и приблизительно 1×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение в интервале между приблизительно 1×10 и приблизительно 2×10 изолированных плацентарных клетки на килограмм указанного индивидуума указанному индивидууму. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение в интервале между приблизительно 1,3×10 и приблизительно 1,5×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума указанному индивидууму. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение вплоть до приблизительно 3×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума указанному индивидууму. В конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение в интервале между приблизительно 5×10 и приблизительно 2×10 изолированных плацентарных клеток указанному индивидууму. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение приблизительно 150×10 изолированных плацентарных клеток в приблизительно 20 миллилитрах раствора указанному индивидууму.
6
7
В конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение в интервале между приблизительно 5×10 и приблизительно 2×10 изолированных плацентарных клеток указанному индивидууму, где указанные клетки содержатся в растворе, содержащем 10% декстран, например, декстран-40, 5% человеческий сывороточный альбумин, и необязательно иммуносупрессант.
7
9
8
9
7
8
7
В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение в интервале между приблизительно 5×10 и 3×10 изолированных плацентарных клеток внутривенно. В более конкретных вариантах осуществления, указанное введение включает в себя введение приблизительно 9×10 изолированных плацентарных клеток или приблизительно 1,8×10 изолированных плацентарных клеток внутривенно. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение в интервале между приблизительно 5×10 и 1×10 изолированных плацентарных клеток интракраниально. В более конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение приблизительно 9×10 изолированных плацентарных клеток интракраниально.
В еще одном конкретном варианте осуществления, способы лечения, описанные выше, включают в себя введение второго терапевтического средства указанному индивидууму. В более конкретном варианте осуществления, указанное второе терапевтическое средство представляет собой нейропротекторное средство. В более конкретном варианте осуществления, указанное второе терапевтическое средство представляет собой NXY-059 (дисульфонильное производное фенилбутилнитрона: N-оксид динатрия 4-((трет-бутиламино)-метил)бензол-l,3-дисульфонат или динатрия 4-((оксидо-трет-бутил-азаниумилиден)метил)бензол-l,3-дисульфонат; также известный как дисуфентон). В еще одном более конкретном варианте осуществления, второе терапевтическое средство представляет собой тромболитическое средство. В более конкретном варианте осуществления, указанное тромболитическое средство представляет собой тканевой активатор плазминогена (tPA). В вариантах осуществления, в которых нарушение кровотока в мозге или вокруг него представляет собой кровоизлияние, второе терапевтическое средство может представлять собой антигипертензивное средство, например, бета-адреноблокатор или диуретическое лекарственное средство, сочетание диуретического лекарственного средства и калийсберегающего диуретика, сочетание бета-адреноблокатора и диуретического лекарственного средства, сочетание ингибитора ангиотензин-конвертирующего фермента (ACE) и диуретика, антагониста ангиотензина-II и диуретического лекарственного средства и/или блокатора кальциевых каналов и ингибитора ACE. В еще одном более конкретном варианте осуществления, второе терапевтическое средство представляет собой блокатор кальциевых каналов, антагонист глутамата, агонист гамма-аминомасляной кислоты (GABA), антиоксидант или уловитель свободных радикалов.
В еще одном конкретном варианте осуществления способа лечения, указанные изолированные плацентарные клетки вводят указанному индивидууму в пределах 21-30, например, 21 дней развития одного или более симптомов нарушения кровотока в мозге или вокруг него у указанного индивидуума, например, в пределах 21-30, например, 21 дней развития симптомов инсульта, аноксического повреждения или гипоксического повреждения. В еще одном конкретном варианте осуществления способа лечения, указанные изолированные плацентарные клетки вводят указанному индивидууму в пределах 14 дней развития одного или более симптомов нарушения кровотока в мозге или вокруг него у указанного индивидуума. В еще одном конкретном варианте осуществления способа лечения, указанные изолированные плацентарные клетки вводят указанному индивидууму в пределах 7 дней развития одного или более симптомов нарушения кровотока в мозге или вокруг него у указанного индивидуума. В еще одном конкретном варианте осуществления способа лечения, указанные изолированные плацентарные клетки вводят указанному индивидууму в пределах 48 часов развития одного или более симптомов нарушения кровотока в мозге или вокруг него у указанного индивидуума. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки вводят указанному индивидууму в пределах 24 часов развития одного или более симптомов нарушения кровотока в мозге или вокруг него у указанного индивидуума. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки вводят указанному индивидууму в пределах 12 часов развития одного или более симптомов нарушения кровотока в мозге или вокруг него у указанного индивидуума. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки вводят указанному индивидууму в пределах 3 часов развития одного или более симптомов нарушения кровотока в мозге или вокруг него у указанного индивидуума.
3.1 ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Как используют в данном документе, термин "приблизительно", когда он относится к установленному числовому значению, указывает значение в пределах плюс или минус 20% от установленного числового значения.
Как используют в данном документе, термин "аноксическое повреждение" относится к повреждению, например, неврологическому повреждению или симптому, вызванным полным недостатком снабжения кислородом в области мозга или ЦНС.
Как используют в данном документе, термин "гипоксическое повреждение" относится к повреждению, например, неврологическому повреждению или симптому, вызванным частичным недостатком снабжения кислородом в области мозга или ЦНС.
+
+
Как используют в данном документе, термин "SH2" относится к антителу, которое связывает эпитоп на клеточном маркере CD105. Таким образом, клетки, которые обозначаются как SH2, представляют собой CD105.
+
+
+
Как используют в данном документе, термины "SH3" и SH4" относятся к антителам, которые связывают эпитопы на клеточном маркере CD73. Таким образом, клетки, которые обозначаются как SH3 и/или SH4, представляют CD73.
Плацента имеет генотип плода, внутри которого она развивается, но также находится в тесном физическом контакте с материнскими тканями во время беременности. Как таковой, как используют в данном документе, термин "зародышевый генотип" означает генотип плода, например, генотип плода, ассоциированного с плацентой, из которой получают конкретные изолированные плацентарные клетки, как описано здесь, в противоположность с генотипом матери, которая вынашивала плод. Как используют в данном документе, термин "материнский генотип" означает генотип матери, которая вынашивала плод, например, плод, ассоциированный с плацентой, из которой получают конкретные изолированные плацентарные клетки, как описано здесь.
Как используют в данном документе, термин "изолированная клетка", например, "изолированная стволовая клетка", означает клетку, которая по существу отделяется от других, различных клеток ткани, например, плаценты, из которой получают стволовые клетки. Клетка является "изолированной", если, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или, по меньшей мере, 99% клеток, например, нестволовых клеток, с которыми стволовая клетка естественно ассоциирована или стволовые клетки, проявляющие различный профиль маркеров, удаляют из стволовых клеток, например, во время сбора и/или культивирования стволовых клеток.
Как используют в данном документе, "мультипотентные", когда термин относится к клеткам, означает, что клетки обладают способностью к дифференциации в некоторые, но необязательно все типы клеток организма или в клетки, имеющие характеристики некоторых, но не всех типов клеток организма. В некоторых вариантах осуществления, например, изолированные плацентарные клетки, которые обладают способностью к дифференциации в клетки, имеющие характеристики нейрогенных, хондрогенных и/или остеогенных клеток, представляет собой мультипотентные клетки.
Как используют в данном документе, термин "популяция изолированных клеток" означает популяцию клеток, которые по существу отделены от других клеток ткани, например, плаценты, из которой получают популяцию клеток.
in vitro
in vivo
Как применяется в данном документе, термин “плацентарная стволовая клетка” относится к стволовой клетке или клетке-предшественнику, которую выделяют из плаценты млекопитающих, независимо от морфологии, маркеров поверхности клетки или количества пассажей после первичной культуры. Термин “плацентарная стволовая клетка”, как применяется в данном документе, однако не относится к, и плацентарная стволовая клетка не является, однако, трофобластом, ангиобластом, гемангиобластом, эмбриональной зародышевой клеткой, эмбриональной стволовой клеткой, клеткой, полученной из внутренней клеточной массы бластоцистов, или клеткой полученной из полового гребня позднего эмбриона, например, эмбриональной зародышевой клеткой. Клетку считают “стволовой клеткой”, если клетка проявляет, характеристики стволовой клетки, например, маркер или профиль экспрессии генов, связанные с одним или более типами стволовых клеток; способность к репликации в культуре по меньшей мере 10-40 раз, способность к дифференциации в клетки, проявляющие характеристики одного или более из трех зародышевых слоев. Термины “плацентарная стволовая клетка” и “полученная из плаценты стволовая клетка” могут использоваться взаимозаменяемо. Если здесь не указано иначе, термин "плацентарные" включает пуповину. Изолированные плацентарные клетки, раскрытые здесь, в некоторых вариантах осуществления, дифференцируют  в условиях дифференциации, дифференцируют  или имеют место обе ситуации.
+
-
+
+
Как применяется в данном документе, клетка является “положительной” для конкретного маркера, когда этот маркер является обнаруживаемым свыше уровня фона. Например, плацентарная клетка является положительной, например, для CD73, так как CD73 является обнаруживаемой на плацентарных клетках в количестве заметно большем, чем фон (в сравнении, например, с изотипным контролем). Клетка также является положительной для маркера, когда этот маркер можно применять для различения клетки, по меньшей мере, от одного другого типа клеток или его можно применять для селекции или выделения клетки в случае присутствия или экспрессии посредством клетки. В контексте, например, обнаружения, опосредованного антителом, "положительная," как указание того, что присутствует конкретный маркер клеточной поверхности, означает, что маркер является обнаруживаемым с использованием антитела, например, флуоресцентно-меченого антитела, специфичным для этого маркера; "положительная" также относится к клетке, проявляющей маркер в количестве, которое производит сигнал, например, в цитометре, который заметно выше фона. Например, клетка является "CD200", когда клетку обнаруживаемо метят антителом, специфичным к CD200, и сигнал от антитела является заметно более высоким, чем сигнал от контроля (например, фона или изотипного контроля). Напротив, "отрицательная" в таком же контексте означает, что маркер клеточной поверхности не является обнаруживаемым с использованием антитела, специфичного для этого маркера, по сравнению с контрольной средой с контролем (например, фоном или изотипным контролем). Например, клетка является "CD34", когда клетку не метят воспроизводимо для обнаружения антителом, специфичным к CD34 в большей степени, чем контроль (например, фон или изотипный контроль). Маркеры, не обнаруженные или не обнаруживаемые с использованием антител, определяются как положительные или отрицательные сходным образом с использованием соответствующего контроля. Например, клетка или популяция клеток могут определяться как OCT-4, если количество OCT-4 РНК, обнаруженное в РНК клеток или популяции клеток является заметно более высоким, чем фон, как определяют, например, посредством способа обнаружения РНК такого как ПЦР в режиме реального времени, слот-блоттинг и т.д. Если здесь не указано иначе, кластер дифференциации ("CD") маркеров обнаруживают с использованием антител. В некоторых вариантах осуществления, определяют присутствие OCT-4, и клетка является "OCT-4", если OCT-4 является обнаруживаемым с использованием ПЦР в режиме реального времени.
Как используют в данном документе, "лечение" охватывает лечение, излечение, улучшение, уменьшение тяжести или снижение в течение протекания заболевания, расстройства или состояния или его любого параметра или симптома.
4. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
5
ФИГ. 1: Результаты теста на качание поднятого тела. Вертикальная ось: процент уклона активности качания. Горизонтальная ось: День, в который оценивают активность качания. Базовая линия представляет собой процент уклона активности качания перед индуцированной ишемией. Процент уклона активности качания также оценивали на День 2 после инфаркта перед тем, как изолированные плацентарные клетки вводили интракраниально, и повторно на дни 7 и 14 после инфаркта. Жизнеспособные 400K: 4×10 жизнеспособных изолированных плацентарных клеток.
Нежизнеспособные: нежизнеспособные плацентарные стволовые клетки. CsA: циклоспорин A.
ФИГ. 2: Результаты теста Бедерсона. Вертикальная ось: Среднее значение балльной оценки неврологического дефицита.
5
Горизонтальная ось: день, в который оценивают неврологический дефицит. Базовая линия представляет собой неврологический дефицит перед индуцированной ишемией; 0 указывает на отсутствие дефицита. Среднюю неврологическую активность также оценивали на День 2 после инфаркта во время введения изолированных плацентарных клеток и повторно на дни 7 и 14 после инфаркта. Жизнеспособные 400K: 4×10 жизнеспособных изолированных плацентарных клеток. Нежизнеспособные: нежизнеспособные плацентарные стволовые клетки. CsA: циклоспорин A.
ФИГ. 3: Результаты теста на качание поднятого тела. Вертикальная ось: процент уклона активности качания. Горизонтальная ось: День, в который оценивают активность качания. Базовая линия представляет собой процент уклона активности качания перед индуцированной ишемией. Процент уклона активности качания также оценивали на День 2 после инфаркта перед тем, как изолированные плацентарные клетки вводили внутривенно, и повторно на дни 7 и 14 после инфаркта.
5
6
6
6
Нежизнеспособные: нежизнеспособные плацентарные стволовые клетки. Введено: 4×10, 1×10, 4×10 или 8×10 жизнеспособных изолированных плацентарных клеток (пояснение).
5
6
6
6
ФИГ. 4: Результаты теста Бедерсона. Вертикальная ось: Среднее значение балльной оценки неврологического дефицита. Горизонтальная ось: день, в который оценивают неврологический дефицит. Базовая линия представляет собой неврологический дефицит перед индуцированной ишемией; 0 указывает на отсутствие дефицита. Среднюю неврологическую активность также оценивали на День 2 после инфаркта во время внутривенного введения изолированных плацентарных клеток и повторно на дни 7 и 14 после инфаркта. Нежизнеспособные: нежизнеспособные плацентарные стволовые клетки. Введено: 4×10, 1×10, 4×10 или 8×10 жизнеспособных изолированных плацентарных клеток (пояснение).
6
6
6
ФИГ. 5: Результаты модифицированного теста на нейрональную тяжесть с балльной оценкой. Y-ось: баллы (см. таблица 1 для метода балльной оценки). X-ось: Дни после операции по обтурации средней мозговой артерии (MCAO). PDA: Плацентарные стволовые клетки; FBC-Контроль: фибробласты контроль; Декстран, контрол без клеток; 1PDA, 1×10 клеток; 4PDA, 4×10 клеток; 8PDA, 8×10 клеток. Rx: Введение клеток или декстрана.
6
6
6
ФИГ. 6: Результаты соматосенсорного теста на адгезивное удаление. Y-ось: Число секунд для удаления адгезивного тестируемого изделия. X-ось: Дни после операции по обтурации средней мозговой артерии. PDA: Плацентарные стволовые клетки; FBC-Контроль: фибробласты контроль; Декстран, контроль без клеток; IPDA, 1×10 клеток; 4PDA, 4×10 клеток; 8PDA, 8×10 клеток. Rx: Введение клеток или декстрана.
6
6
ФИГ. 7: Результаты зашагового теста. Y-ось: Процент зашагиваний из 100 шагов, на металлической решетке. X-ось: Число дней после обработки (Rx), когда проводили зашаговый тест. *: Существенное (p<0,05) улучшение в зашаговом тесте для животных, получающих 4×10 плацентарных стволовых клеток (PDA-4M) по сравнению с контрольной средой. #: Существенное (p<0,05) улучшение в зашаговом тесте для животных, получивших 4×10 плацентарных стволовых клеток (PDA-4M) по сравнению с фибробластным контролем.
6
3
6
6
ФИГ. 8: Измерение ангиогенеза через 56 дней после обработки обтурации средней мозговой артерии. Обработка плацентарными стволовыми клетками существенно увеличивает пролиферацию эндотелиальных клеток, и сосудистую плотность и сосудистый перметр в ишемической граничной зоне(IBZ). N=10/группа. ФИГ. 8 A: Окрашивание антителами против-BrdU обнаруженное в парафинизированных срезах мозга. Y-ось: Процент BrdU-положительных эндотелиальных клеток (EC) на границе с ишемическим повреждением; X-ось: экспериментальные условия (MCAo-Dex: Обтурация средней мозговой артерии-декстран (начальное условие перед обработкой); Клетки-контроля: введение фибробластов; PDA-4M: введение 4×10 плацентарных стволовых клеток). #: существенное (p<0,05) увеличение пролиферации эндотелиальных клеток в PDA-4M условиях по сравнению с фибробластным контролем. *: Существенное (p<0,05) увеличение пролиферации эндотелиальных клеток в PDA-4M условиях по сравнению с декстрановым (среда) контролем. ФИГ. 8B: Сосудистая плотность в ишемической пограничной зоне после обработки плацентарными стволовыми клетками. Y-ось: число сосудов на мм; X-ось: экспериментальные условия (MCAo-Dex: Обтурация средней мозговой артерии-декстран (начальное условия перед обработкой); Клетки-контроля: введение фибробластов; PDA-4M: введение 4×10 плацентарных стволовых клеток). #: существенное (p<0,05) увеличение сосудистой плотности в PDA-4M условиях по сравнению с фибробластным контролем. *: Существенное (p<0,05) увеличение сосудистой плотности в PDA-4M условиях по сравнению с декстрановым (среда) контролем. ФИГ. 8C: Увеличение сосудистого периметра вокруг ишемической пограничной зоны. Y-ось: Длина сосудистого периметра в миллиметрах; X-ось: экспериментальные условия (MCAo-Dex: Обтурация средней мозговой артерии-декстран (начальное условия перед обработкой); Клетки-контроля: введение фибробластов; PDA-4M: введение 4×10 плацентарных стволовых клеток). #: существенное (p<0,05) увеличение длины сосудистого периметра в PDA-4M условиях по сравнению с фибробластным контролем. *: Существенное (p<0,05) увеличение длины сосудистого периметра в PDA-4M условиях по сравнению с декстрановым (среда) контролем.
6
ФИГ. 9: Обработка плацентарными стволовыми клетками существенно увеличивает экспрессию Синаптофизина в ишемической границе ишемического мозга. N=10/группа. Y-ось: % обследованная область в парафинизированном срезе мозга, в котором обнаруживают синаптофизин; X-ось: экспериментальные условия. MCAo: Экспрессия Синаптофизина на время обтурации средней мозговой артерии; Клеточный-контроль: введение фибробластов; PDA-4M: введение 4×10 плацентарных стволовых клеток). *: Существенное увеличение области экспрессии синаптофизина в PDA-4M по сравнению с фибробластным клеточным контролем.
5. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
5.1ЛЕЧЕНИЕ НАРУШЕНИЙ КРОВОТОКА В МОЗГЕ И ВОКРУГ МОЗГА
В данной заявке предоставлены способы лечения индивидуума, имеющего нарушение кровотока в мозге или вокруг мозга индивидуума, например, лечения одного или более симптомов или неврологического дефицита, присущих нарушению кровотока в мозге или вокруг мозга индивидуума, включающие в себя введение индивидууму терапевтически эффективного количества изолированных адгезивных к пластику тканевой культуры человеческих плацентарных клеток, где указанные изолированные плацентарные клетки имеют характеристики мультипотентных клеток или стволовых клеток, и, где указанные изолированные плацентарные клетки представляют собой мезенхимальные клетки, полученные не из костного мозга, полученные из жировой ткани мезенхимальные стволовые клетки или мезенхимальные клетки, полученные из крови пуповины, плацентарной крови или периферической крови. В некоторых вариантах осуществления, повреждение представляет собой гипоксическое повреждение или аноксическое повреждение. В некоторых вариантах осуществления, предоставленных здесь, указанное терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к устранению, обнаруживаемому улучшению, уменьшению тяжести или замедлению развития одного или более симптомов или неврологического дефицита, присущих нарушению кровотока в мозге индивидуума или вокруг него, проявляемых указанным индивидуумом.
В конкретном варианте осуществления, один или более симптомов или неврологических дефицитов, например, симптом инсульта, гипоксического повреждения или аноксического повреждения являются присущими, по меньшей мере, частично или полностью, реперфузионному повреждению после нарушения кровотока. Как используют в данном документе, "реперфузионное повреждение" относится к повреждению ткани, вызываемому, когда прерванное кровоснабжение возвращается в ткань после периода ишемии. Отсутствие переносимого кровью кислорода и питания во время ишемии создает состояние, при котором восстановление циркуляции приводит к воспалению и окислительному повреждению через индукцию окислительного стресса в большей степени, чем к восстановлению нормальной функции.
Как используют в данном документе, термин "нарушение кровотока в мозге или вокруг него" в контексте лечения такого нарушения, охватывает лечение одного или более симптомов проявляемых индивидуумом, имеющим нарушение, и лечение неврологических дефицитов у индивидуума, которые являются присущими нарушению, например, один или более симптомов инсульта, гипоксического повреждения или аноксического повреждения. В некоторых вариантах осуществления, один или более симптомов представляют собой один или более симптомов, присущих первично или полностью самой ишемии. В некоторых других вариантах осуществления, один или более симптомов представляют собой один или более симптомов, присущих первично или полностью реперфузионному повреждению, например, ассоциированному с ишемией.
5.2 ИНСУЛЬТ
Нарушение кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС, излечиваемое посредством способов, предоставленных здесь, может представлять собой любое нарушение кровотока, которое вызывает один или более обнаруживаемых симптомов или неврологических дефицитов у пораженного индивидуума (см. ниже). В некоторых вариантах осуществления, нарушение кровотока представляет собой инсульт, например, ишемический инсульт или геморрагический инсульт, например, внутричерепное кровоизлияние в мозг. В некоторых других вариантах осуществления, нарушение кровотока представляет собой кровоизлияние вне мозга, например, дуральную гематому, субдуральную гематому или субарахноидальную гематому. В некоторых других вариантах осуществления, нарушение кровотока является преходящим, например, транзиторная ишемическая атака (TIA). В некоторых других вариантах осуществления, нарушение кровотока представляет собой вазоспазм. В конкретном варианте осуществления, нарушение кровотока в мозге происходит в головном мозге. В более конкретных вариантах осуществления, нарушение происходит в теменной доле, лобной доле, височной доле или затылочной доле головного мозга. В еще одном конкретном варианте осуществления, нарушение происходит в мозжечке. В еще одном конкретном варианте осуществления, нарушение происходит в стволе головного мозга или позвоночнике. В некоторых вариантах осуществления, нарушение вызывает гипоксическое повреждение или аноксическое повреждение.
В одном варианте осуществления, здесь предоставлен способ лечения индивидуума, страдающего от гипоксического повреждения или аноксического повреждения, например, апоплектического удара (например, жертвы инсульта), включающий в себя введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества изолированных адгезивных к пластику тканевой культуры плацентарных клеток, как описано здесь, например, в Разделе 5.4.2, ниже. В конкретном варианте осуществления, указанное терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к устранению, обнаруживаемому улучшению, уменьшению тяжести или замедлению развития одного или более симптомов инсульта, проявляемых указанным индивидуумом. Изолированные плацентарные клетки, например, множество или изолированная популяция изолированных плацентарных клеток, могут представлять собой любые из изолированных плацентарных клеток, описанных здесь где либо еще, например, в Разделе 5.4.2, ниже.
Инсульт, излечимый в соответствии со способами, предоставленными здесь, может представлять собой инсульт, характерный для любой причины. В конкретном варианте осуществления, инсульт представляет собой ишемический инсульт. В более конкретных вариантах осуществления, ишемический инсульт представляет собой тромботический инсульт или эмболический инсульт. В еще одном конкретном варианте осуществления, инсульт происходит вследствие системной гипоперфузии, т.е., снижения кровотока во всех частях организма; или происходит вследствие венозного тромбоза. В других конкретных вариантах осуществления, ишемический инсульт вызывается фибрилляцией сердца, например, фибрилляцией предсердий; пароксизмальной фибрилляцией предсердий; ревматическим заболеванием; заболеванием митрального или аортального клапанов; искусственными клапанами сердца; сердечным тромбом предсердия или желудочка; синдромом слабости синусового узла; продолжительным трепетанием предсердий; инфарктом миокарда; застарелым инфарктом миокарда наряду со снижением фракции выброса до менее, чем 28 процентов; симптомaтической застойной сердечной недостаточностью наряду со снижением фракции выброса до менее, чем 30 процентов; кардиомиопатией; эндокардитом, например, эндокардитом Либмана-Сакса, марантическим эндокардитом или инфекционным эндокардитом; папиллярной фиброэластомой; миксомой левого предсердия; операцией шунтирования коронарной артерии; кальцификацией кольца митрального клапана; открытым овальным отверстием; аневризмой межпредсердной перегородки, аневризмой левого желудочка без тромба, изолированным "дымком" левого предсердия при эхокардиографии без митрального стеноза или фибрилляции предсердий; и/или комплексной атеромой в восходящей аорте или проксимальной части дуги аорты.
В еще одном конкретном варианте осуществления, инсульт представляет собой геморрагический инсульт. В более конкретных вариантах осуществления, геморрагический инсульт вызывается интра-аксиальным кровоизлиянием (истечение крови внутри мозга). В еще одном более конкретном варианте осуществления, указанный геморрагический инсульт вызывается экстра-аксиальным кровоизлиянием (кровь внутри черепа, но вне мозга). В более конкретных вариантах осуществления, инсульт вызывается кровоизлиянием в паренхиму мозга, внутрижелудочковым кровоизлиянием (кровь в желудочковой системе), эпидуральной гематомой (кровотечение между твердой мозговой оболочкой и черепом), субдуральной гематомой (кровотечением в субдуральном пространстве) или субарахноидальным кровоизлиянием (между паутинной оболочкой и мягкой мозговой оболочкой). Большинство синдромов геморрагического инсульта имеют специфические симптомы (например, головная боль, предшествующая травма головы). В других более конкретных вариантах осуществления, геморрагический инсульт вызывается или ассоциирован с гипертензией, травмой, расстройствами кровотечения, амилоидной ангиопатией, приемом запрещенных наркотических средств (например, амфетаминов или кокаина) или мальформацией сосудистой системы.
В еще одном варианте осуществления, здесь предоставлен способ лечения индивидуума, имеющего нарушение кровотока в мозге индивидуума или вокруг него или ЦНС, например, лечения одного или более симптомов или неврологического дефицита, присущих для нарушения кровотока в мозге индивидуума или вокруг него или ЦНС, включающий в себя введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества изолированных плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток или плацентарных мультипотентных клеток, где указанное нарушение кровотока возникает от немедленной причины, отличной от инсульта, например, закрытой травмы головы или гематомы, не относящейся к воздействию. В конкретном варианте осуществления, указанное терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к устранению, обнаруживаемому улучшению, уменьшению тяжести или замедлению развития одного или более симптомов нарушения, проявляемых указанным индивидуумом. Как и в случае инсульта, изолированные плацентарные клетки могут представлять собой любые из плацентарных клеток, например, плацентарные стволовые клетки или плацентарные мультипотентные клетки, описанные где-либо еще здесь, например, в Разделе 5.4.2, ниже.
Как отмечено выше, в некоторых вариантах осуществления, способ лечения, предоставленный здесь, приводит к устранению, обнаруживаемому улучшению, уменьшению тяжести или замедлению развития одного или более симптомов нарушения кровотока в или вокруг мозга или ЦНС или неврологического дефицита, присущих нарушению кровотока в мозге или вокруг него или ЦНС, например, инсульта, гематомы, например, вызванными гипоксическим повреждением или аноксическим повреждением. В конкретных вариантах осуществления, указанные симптомы или неврологические дефициты включают гемиплегию (паралич одной стороны тела); гемипарез (слабость одной стороны тела); слабость лицевых мышц; нечувствительность; снижение чувствительности; измененные обоняние, вкус, слух или зрение; опущение века (птоз); слабость глазных мышц; сниженный рвотный рефлекс; сниженную способность к глотанию; сниженную реакции зрачка на свет; сниженную чувствительность лица; нарушение равновесия; нистагм; измененную частоту дыхания; измененную частоту сердечных сокращений; слабость грудинно-ключично-сосцевидной мышцы со сниженной возможностью или невозможностью поворота головы в одну сторону; слабость в языке; афазию (невозможность разговора или понимания языка); апраксию (измененные произвольные движения); дефекты поля зрения; дефицит памяти; геминеглект или полупространственное пренебрежение (дефицит внимания к пространству со стороны поля зрения напротив повреждения; дезорганизацию мышления; спутанность; развитие гиперсексуальных движений; анозогнозию (настойчивое отрицание имеющегося дефицита); затрудненность ходьбы; измененную координацию движений; головокружение; неустойчивость; потерю сознания; головную боль; и/или рвоту.
Степень тяжести нарушения кровотока в мозге или вокруг него или ЦНС, например, тяжесть инсульта или симптомов инсульта и/или неврологических дефицитов, присущих инсульту, может оцениваться с использованием одной или более общепринятых шкал оценки неврологической функции.
Например, в одном варианте осуществления, здесь предоставлен способ лечения индивидуума, который имеет нарушение кровотока в мозге индивидуума или вокруг него или ЦНС, например, индивидуума, который имеет симптом или неврологический дефицит, присущие нарушению кровотока в мозге индивидуума или вокруг него, например, гипоксическое повреждение или аноксическое повреждение, включающий в себя введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества изолированных человеческих адгезивных плацентарных клеток, где терапевтически эффективное количество указанных клеток представляет собой количество плацентарных клеток, достаточное, чтобы привести к обнаруживаемому или обнаруживаемому и долговременному улучшению неврологической функции индивидуума при оценке посредством одной или более из Modified Rankin Scale, NIH Insult Scale, Canadian Neurological Scale (ЦНС), Glasgow Coma Scale (GCS), Hempispheric Insult Scale, Hunt & Hess Scale, Mathew Insult Scale, Mini-Mental State Examination (MMSE), Orgogozo Insult Scale, Oxfordshire Community Insult Project Classification (Bamford), Scandinavian Insult Scale, Japan Coma Scale (JCS), Barthel Index и/или Japan Insult Scale (JSS). В конкретных вариантах осуществления, улучшение обнаруживается в пределах 1, 2, 3, 4, 5 или 6 дней или в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 или 12 недель после первоначальной оценки и после одного или более введений изолированных плацентарных клеток. В других конкретных вариантах осуществления, указанную первоначальную оценку осуществляют в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часов или в пределах 1, 2, 3, 4 или 5 дней после развития одного или более симптомов инсульта. В других вариантах осуществления, улучшение, если оно есть, является продолжительным, например, в течение, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев или 1, 2, 3, 4, 5 или более лет.
5.3 ВВЕДЕНИЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПЛАЦЕНТАРНЫХ КЛЕТОК
Изолированные плацентарные клетки, применяемые в способах лечения, предоставленных здесь, могут вводиться индивидууму, проявляющему один или более симптомов или неврологические дефициты, вызванные посредством нарушения кровотока в мозге или вокруг него или ЦНС или присущие индивидууму, посредством любого медицински-приемлемого способа или пути. В одном варианте осуществления, терапевтически эффективное количество изолированных плацентарных клеток вводят индивидууму интракраниально, например, в ишемический или геморрагический участок в пораженном мозге или ЦНС индивидуума. Для интракраниального введения, местоположение инсульта (например, пораженная область) может быть визуализировано, например, посредством КТ-сканирования, магнитно-резонансной томографии (MRI) (например, Tl-, T2-, диффузионно- и/или перфузионно- взвешенные МРТ), позитронной эмиссионной томографии с кобальтом-55 или сходной технологии. В еще одном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки вводят индивидууму внутривенно или внутриартериально. В других вариантах осуществления, терапевтически эффективное количество изолированных плацентарных клеток вводят индивидууму внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрикожно, подкожно, внутрь глаза или парентерально. Изолированные плацентарные клетки могут вводиться посредством болюсной инъекции или посредством внутривенной инфузии. В конкретном варианте осуществления, указанная внутривенная инфузия представляет собой внутривенную инфузию в течение от приблизительно 1 до приблизительно 8 часов. В некоторых вариантах осуществления, изолированные плацентарные клетки вводят индивидууму посредством сочетания путей, например, интракраниально и посредством внутривенной инфузии.
Терапевтически эффективное количество изолированных плацентарных клеток может изменяться в соответствии с возрастом и/или размером индивидуума и приблизительным объемом ишемической области. Приблизительные объем и расположение ишемической области оценивают, например, по серийным изображениям, полученным при сканировании посредством магнитно-резонансной или компьютерной томографии (КT).
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
11
7
9
7
8
8
9
8
8
8
8
7
8
7
Количество изолированных плацентарных клеток, введенных, например, в разовой дозе, может представлять собой приблизительно или, по меньшей мере, или более чем, например, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или 5×10 изолированных плацентарных клеток на введение. В конкретных вариантах осуществления, индивидууму, страдающему от нарушения кровотока в мозге или вокруг него или ЦНС, например, индивидууму, страдающему от инсульта, аноксического повреждения или гипоксического повреждения, могут вводиться от приблизительно 5×10 до приблизительно 3×10 изолированных плацентарных клеток внутривенно. В более конкретных вариантах осуществления, индивидууму, страдающему от нарушения кровотока в мозге или вокруг него или ЦНС, например, индивидууму, страдающему от инсульта, гипоксического повреждения или аноксического повреждения, могут вводиться приблизительно 9×10 изолированных плацентарных клеток, приблизительно 3,6×10 изолированных плацентарных клеток, приблизительно 9×10 изолированных плацентарных клеток или приблизительно 1,8×10 изолированных плацентарных клеток внутривенно. В еще одном конкретном варианте осуществления, индивидууму вводят одну дозу из приблизительно 2×10 изолированных плацентарных клеток внутривенно. В еще одном конкретном варианте осуществления, индивидууму вводят одну дозу из приблизительно 8×10 изолированных плацентарных клеток внутривенно. В еще одном конкретном варианте осуществления, индивидууму вводят две дозы, каждая из которых содержит приблизительно 2×10 изолированных плацентарных клеток, внутривенно. В еще одном конкретном варианте осуществления, индивидууму вводят две дозы, каждая из которых содержит приблизительно 8×10 изолированных плацентарных клеток, внутривенно. В других более конкретных вариантах осуществления, индивидууму, страдающему от нарушения кровотока в мозге или вокруг него или ЦНС, например, индивидууму страдающему от инсульта, гипоксического повреждения или аноксического повреждения, могут вводиться между приблизительно 5×10 и 1×10 изолированных плацентарных клеток интракраниально. В более конкретном варианте осуществления, указанному индивидууму вводят приблизительно 9×10 изолированных плацентарных клеток интракраниально.
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
11
Индивидууму, страдающему от нарушения кровотока в или вокруг мозга или вокруг него или ЦНС, симптомов нарушения, и/или неврологического дефицита, присущего нарушению, могут вводиться изолированные плацентарные клетки однократно или более, чем однократно, например, два или более раз в ходе лечения. Изолированные плацентарные клетки могут вводиться в подходящем объеме для интракраниального введения, например, в приблизительно 100 мкл, 200 мкл, 300 мкл, 400 мкл, 500 мкл, 600 мкл, 700 мкл, 800 мкл, 900 мкл, 1000 мкл, 1,5 мл, 2 мл, 2,5 мл, 3 мл, 3,5 мл, 4 мл, 4,5 мл, 5 мл, 5,5 мл, 6,0 мл, 6,5 мл, 7 мл, 7,5 мл, 8 мл, 8,5 мл, 9 мл, 9,5 мл, 10 мл, 11 мл, 12 мл, 13 мл, 14 мл, 15 мл, 16 мл, 17 мл, 18 мл, 19 мл, 20 мл, 21 мл, 22 мл, 23 мл, 24 мл, 25 мл, 26 мл, 27 мл, 28 мл, 29 мл или приблизительно 30 мл фармацевтически приемлемого раствора. Для внутривенного введения, множество изолированных плацентарных клеток (например, приблизительно 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или 5×10) изолированных плацентарных клеток могут быть доставлены в, например, приблизительно или не более чем 100 мл, 150 мл, 200 мл, 250 мл, 300 мл, 350 мл, 400 мл, 450 мл, 500 мл, 550 мл, 600 мл, 650 мл, 700 мл, 750 мл, 800 мл, 850 мл, 900 мл, 950 мл, 1000 мл, 1,1 л, 1,2 л, 1,3 л, 1,4 л или 1,5 л, например, посредством внутривенной инфузии.
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
7
7
7
7
7
7
7
6
6
7
6
7
9
9
7
7
В других вариантах осуществления, указанному индивидууму вводят между приблизительно 1×10 и приблизительно 2×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм индивидуума (например, индивидуума, имеющего один или более симптомов или неврологических дефицитов, вызванные нарушением кровотока в мозге или вокруг него или ЦНС или реперфузионным повреждением); между приблизительно 2×10 и приблизительно 3×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума; между приблизительно 3×10 и приблизительно 4×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума; между приблизительно 4×10 и приблизительно 5×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума; между приблизительно 5×10 и приблизительно 6×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума; между приблизительно 6×10 и приблизительно 7×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума; между приблизительно 7×10 и приблизительно 8×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума; между приблизительно 8×10 и приблизительно 9×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума; или между приблизительно 9×10 и приблизительно 1×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение в интервале между приблизительно 1×10 и приблизительно 2×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума указанному индивидууму. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение в интервале между приблизительно 1,3×10 и приблизительно 1,5×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума указанному индивидууму. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение вплоть до приблизительно 3×10 изолированных плацентарных клеток на килограмм указанного индивидуума указанному индивидууму. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение приблизительно 15×10 изолированных плацентарных клеток в приблизительно 20 миллилитрах раствора указанному индивидууму. В предпочтительном варианте осуществления, введение изолированных плацентарных клеток включает в себя введение не более, чем 7,5×10 изолированных плацентарных клеток на кг реципиента, в не более, чем приблизительно 1 литре раствора. В конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение в интервале между приблизительно 5×10 и приблизительно 2×10 изолированных плацентарных клеток указанному индивидууму, например, интракраниально. В конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение в интервале между приблизительно 5×10 и приблизительно 3×10 изолированных плацентарных клеток на кг указанному индивидууму, где указанные клетки содержатся в растворе, содержащем 10% декстран, 5% человеческий сывороточный альбумин, и необязательно иммуносупрессант, например, циклоспорин A, например, интракраниально. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение в интервале между приблизительно 1×10 и приблизительно 3×10 плацентарных мультипотентных клеток указанному индивидууму, где указанные клетки содержатся в растворе, содержащем 10% декстран, 5% человеческий сывороточный альбумин, и необязательно иммуносупрессант, например, циклоспорин A. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение приблизительно от 15×10 до приблизительно 25×10 изолированных плацентарных клеток в приблизительно 20 миллилитрах раствора указанному индивидууму. В любых из приведенных выше вариантов осуществления, изолированные плацентарные клетки могут вводиться внутривенно или интраартериально, например, в виде болюса или через капельницу. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанное введение включает в себя введение приблизительно 200 миллионов клеток в приблизительно 20 миллилитрах раствора указанному индивидууму.
Изолированные плацентарные клетки могут быть инфузированы в течение любого медицински приемлемого периода времени. В различных вариантах осуществления, например, количества изолированных плацентарных клеток, описанные выше, могут вводиться, например, инфузироваться, например, внутривенно или внутриартериально, в течение курса из приблизительно или не более чем 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или 55 минут или в течение курса из приблизительно или не более, чем, 1 часа или 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5 или 6 часов.
Изолированные плацентарные клетки могут вводиться индивидууму, имеющему нарушения кровотока в мозге или вокруг него или ЦНС в любое время после развития одного или более симптомов или неврологических дефицитов, например, гипоксического повреждения или аноксического повреждения, присущих нарушению у индивидуума. В различных вариантах осуществления, изолированные плацентарные клетки вводят в пределах первых 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 дней развития первого симптома или неврологического дефицита, проявляемого индивидуумом; Предпочтительно изолированные плацентарные клетки вводят в пределах первых 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 21, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 часов развития первых обнаруживаемых симптома или неврологического дефицита у индивидуума или в пределах первого часа развития первого обнаруживаемого симптома или неврологического дефицита у индивидуума.
В других вариантах осуществления, изолированные плацентарные клетки вводят профилактически, например, перед проявлением или обнаружением одного или более симптомов указанного нарушения кровотока в мозге или вокруг него или ЦНС, симптома инсульта, проявлений гипоксического повреждения или аноксического повреждения.
Лечение индивидуума, имеющего нарушение кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС индивидуума, включающее в себя введение изолированных плацентарных клеток индивидууму, может дополнительно включать в себя введение индивидууму одного или более второго терапевтического средства. Такие вторые терапевтические средства могут вводиться перед введением изолированных плацентарных клеток, во время введения изолированных плацентарных клеток или после введения изолированных плацентарных клеток. Указанные вторые терапевтические средства могут вводиться несколько, больше или равное количество раз по мере того, как вводят изолированные плацентарные клетки.
Второе терапевтическое средство может представлять собой любой агент, который обладает терапевтическим благоприятным воздействием на индивидуума, имеющего нарушение кровотока в мозге или вокруг него или ЦНС. В одном варианте осуществления, терапевтическое средство представляет собой агент, например, лекарственный препарат, который применяют для лечения инсульта, гипоксического повреждения или аноксического повреждения. В конкретном варианте осуществления, второе терапевтическое средство представляет собой нейропротекторное средство. В конкретном варианте осуществления, нейропротекторное средство представляет собой дисуфентон натрия (NXY-059; дисульфонильное производное фенилбутилнитрона), структура которого показана ниже:
В еще одном варианте осуществления, в котором индивидуум страдает от геморрагического инсульта, второе терапевтическое средство представляет собой терапевтическое средство, которое снижает кровяное давление у указанного индивидуума. В еще одном варианте осуществления, второе терапевтическое средство представляет собой тромболитическое средство. В конкретном варианте осуществления, тромболитическое средство представляет собой тканевой активатор плазминогена (tPA). tPA может представлять собой полученный из природного источника или рекомбинантный. В более конкретном варианте осуществления, tPA вводят в пределах первых трех часов после развития одного или более симптомов или неврологических дефицитов у индивидуума. В еще одном более конкретном варианте осуществления, tPA вводят после первых трех часов после развития одного или более симптомов инсульта у жертвы инсульта. В некоторых вариантах осуществления, применение тромболитического средства имеет противопоказания, например, когда жертва инсульта имеет травму головы или, когда инсульт вызван травмой головы. В еще одном конкретном варианте осуществления, второе терапевтическое средство представляет собой антикоагулянт или антитромбоцитарное средство. В вариантах осуществления, в которых нарушение кровотока в мозге или вокруг него или ЦНС представляет собой кровоизлияние, второе терапевтическое средство может представлять собой антигипертензивное средство, например, бета-адреноблокатор или диуретическое лекарственное средство, сочетание диуретического лекарственного средства и калийсберегающего диуретика, сочетание бета-адреноблокатора и диуретического лекарственного средства, сочетание ингибитора ангиотензин-конвертирующего фермента (ACE) и диуретика, антагониста ангиотензина-II и диуретического лекарственного средства, и/или блокатора кальциевых каналов и ингибитора ACE. В еще одном варианте осуществления, второе терапевтическое средство вводят, чтобы снизить внутричерепное давление. В более конкретном варианте осуществления, второе терапевтическое средство представляет собой диуретик.
В вариантах осуществления, в которых введенные изолированные плацентарные клетки не являются аутологичными для индивидуума, имеющего нарушение кровотока в мозге или вокруг него или ЦНС, второе терапевтическое средство может представлять собой иммуносупрессорный агент. Иммуносупрессорные агенты хорошо известны в данной области и включают, например, против рецепторов T клеток антитела (моноклональные или поликлональные или фрагменты антител или их производные, например, Muromonab-CD3), антитела против рецептора IL-2 (например, Базиликсимаб (SIMULECT) или даклизумаб (ZENAP AX)), азатиоприн, кортикостероиды, циклоспорин, такролимус, мофетил микофенолята, стролимус, ингибиторы кальциневрина и т.п. В конкретном варианте осуществления, иммуносупрессорный агентпредставляет собой нейтрализующие антитела для воспалительного белка макрофагов (MIP)-1α или MIP-1β. Предпочтительно, антитела против MIP-lα или MIP- lβ вводят в количестве, достаточном, чтобы вызвать обнаруживаемое снижение количества MIP-1α и/или MIP-1β у указанного индивидуума, например, во время введения.
5.4 ИЗОЛИРОВАННЫЕ ПЛАЦЕНТАРНЫЕ КЛЕТКИ И ПОПУЛЯЦИИ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПЛАЦЕНТАРНЫХ КЛЕТОК
Изолированные плацентарные клетки, применимые для лечения индивидуумов, имеющих нарушение кровотока в мозге или вокруг него или ЦНС, включая симптомы и неврологические дефициты присущие для него, представляют собой клетки, получаемые из плаценты или ее части, которые обладают адгезией к субстрату культуры ткани и имеют характеристики мультипотентных клеток или стволовых клеток, но не являются трофобластами. В некоторых вариантах осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые в раскрытых здесь способах, обладают способностью к дифференциации в неплацентарные клеточные типы. Изолированные плацентарные клетки, применимые в раскрытых здесь способах, могут представлять собой либо зародышевые или материнские по происхождению (то есть, могут иметь генотип либо плода или матери, соответственно). Предпочтительно, изолированные плацентарные клетки и популяции изолированных плацентарных клеток представляют собой зародышевые по происхождению. Как используют в данном документе, фраза "зародышевые по происхождению" или "нематеринские по происхождению" указывает, что изолированные плацентарные клетки или популяции изолированных плацентарных клеток получают из пуповины или плацентарных структур, ассоциированных с плодом, т.е., тех, которые имеют генотип зародыша. Как используют в данном документе, фраза "материнские по происхождению" указывает на то, что клетки или популяции клеток получают из плацентарных структур, ассоциированных с матерью, например, тех, которые имеют материнский генотип. Изолированные плацентарные клетки или популяции клеток, содержащие изолированные плацентарные клетки, могут содержать изолированные плацентарные клетки, которые являются исключительно зародышевыми или материнскими по происхождению или могут содержать смешанную популяцию изолированных плацентарных клеток как зародышевого, так и материнского происхождения. Изолированные плацентарные клетки, и популяции клеток, содержащие изолированные плацентарные клетки, могут быть идентифицированы и выбраны по морфологии, маркеру и характеристикам культуры, обсуждаемых ниже. В некоторых вариантах осуществления, любые из плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток или плацентарных мультипотентных клеток, описанных здесь, являются аутологическими для пациента, например, индивидуума, у которого был инсульт или который имеет симптом инсульта. В некоторых других вариантах осуществления, любые из плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток или плацентарных мультипотентных клеток, описанных здесь, являются гетерологическими для реципиента, например, индивидуума, у которого был инсульт или который имеет симптом инсульта.
5.4.1 ФИЗИЧЕСКИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Изолированные плацентарные клетки, описанные здесь, когда их культивируют в первичных культурах или в культуре клеток, прилипают к субстрату культуры ткани, например, поверхности контейнера культуры ткани (например, пластику культуры ткани) или к поверхности культуры ткани, покрытой внеклеточным матриксом или лигандами, такими как ламинин, коллаген (например, природный или денатурированный), желатин, фибронектин, орнитин, витронектин, и внеклеточный мембранный белок (например, MATRIGEL (BD Discovery Labware, Bedford, Mass.)). Изолированные плацентарные клетки в культуре предполагают, в целом, фибробластоидный, звездообразный внешний вид, причем ряд цитоплазматических отростков вытягивается от центральной клеточной основы. Клетки, однако, морфологически отличаются от фибробластов, культивированных в таких же условиях, так как изолированные плацентарные клетки, как правило, имеют большее количество подобных отростков, чем фибробласты. Морфологически ОРАС также отличаются от гематопоэтических стволовых клеток, которые, как правило, предполагают более круглую или крупногалечную морфологию в культуре.
-9
-4
В некоторых вариантах осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые, в раскрытых здесь способах лечения, при культивировании в среде для роста (выращивания), развивают эмбриоид-подобные тельца. Эмбриоид-подобные тельца представляют собой несообщающиеся сгустки клеток, которые могут расти на верхней части адгезивного слоя пролиферирующих изолированных плацентарных клеток. Термин "эмбриоид-подобные" применяют, поскольку сгустки клеток напоминают эмбриоидные тельца, сгустки клетки которых растут из культур эмбриональных стволовых клеток. Среда для роста, в которой эмбриоид-подобные тельца могут развиваться в пролиферирующей культуре изолированных плацентарных клеток, включает среду, содержащую, например, DMEM-LG (например, от Gibco); 2% зародышевой телячей сыворотки (например, от Hyclone Labs.); 1x инсулин-трансферрин-селен (ITS); 1x линолевая кислота-альбумин бычьей сыворотки (LA-BSA); 10 M дексаметазона (например, от Sigma); 10M аскорбиновой кислоты 2-фосфат (например, от Sigma); эпидермальный фактор роста 10 нг/мл (например, от R&D Systems); и тромбоцитарный фактор роста (PDGF-BB) 10 нг/мл (например, от R&D Systems).
5.4.2 КЛЕТОЧНАЯ ПОВЕРХНОСТЬ, МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ
Изолированные плацентарные клетки, например, мультипотентные клетки или стволовые клетки, и популяции изолированных плацентарных клеток, применимые в раскрытых здесь способах лечения, представляют собой адгезивные к пластику культуры ткани человеческие плацентарные клетки, которые имеют характеристики мультипотентных клеток или стволовых клеток, и экспрессируют множество маркеров, которые могут применяться для идентификации и/или выделения клеток или популяций клеток, которые содержат стволовые клетки. Изолированные плацентарные клетки, и популяции плацентарных клеток, описанные здесь (то есть две или более изолированные плацентарные клетки) включают плацентарные клетки и содержащие плацентарные клетки популяции клеток, получаемые непосредственно из плаценты или любой ее части (например, амниона, хориона, плацентарных котиледонов, и т.п.). Популяции изолированных плацентарных клеток, также включают популяции (то есть две или более) изолированные плацентарные клетки в культуре, и популяцию в контейнере, например, мешке. Изолированные плацентарные клетки, описанные здесь, не являются полученными из костного мозга мезенхимальными клетками, полученными из жировой ткани мезенхимальными стволовыми клетками или мезенхимальными клетками, полученными из пуповинной крови, плацентарной крови или периферической крови.
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
+
-
+
+
-
+
-
+
+
-
+
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
-
+
-
+
+
+
-
+
-
+
+
+
-
-
В некоторых вариантах осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой изолированные плацентарные стволовые клетки. В некоторых других вариантах осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой изолированные плацентарные мультипотентные клетки. В одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD34, CD10 и CD105 как обнаружено посредством проточной цитометрии. В конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки представляют собой плацентарные стволовые клетки. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки представляют собой мультипотентные плацентарные клетки. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки имеют возможность дифференцировать в клетки нейронального фенотипа, клетки остеогенного фенотипа, и/или клетки хондрогенного фенотипа. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD200. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD45 или CD90. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD45 и CD90, как обнаружено посредством проточной цитометрии. В более конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CDl05, CD200 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD90 или CD45, как обнаружено посредством проточной цитометрии. В еще одном более конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105, CD200 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD90 и CD45, как обнаружено посредством проточной цитометрии, т.е., клетки представляют собой CD34, CD10, CD45, CD90, CD105 и CD200. В более конкретном варианте осуществления, указанные CD34, CD10, CD45, CD90, CD105, CD200 клетки представляют собой дополнительно CD80 и CD86.
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
-
-
-
-
+
+
В конкретном варианте осуществления, любые из CD34, CD10, CD105 клеток, описанных выше, представляют собой дополнительно одни или более из CD29, CD38, CD44, CD54, SH3 или SH4. В еще одном более конкретном варианте осуществления, клетки представляют собой дополнительно CD44. В еще одном конкретном варианте осуществления любые из изолированных CD34, CD10, CD105 плацентарных клеток, представленных выше, клетки представляют собой дополнительно один или более из CDl17, CD133, KDR (VEGFR2), HLA-A,B,C, HLA-DP,DQ,DRT или Лиганд Программированной Смерти-1 (PDLl) или любое их сочетание.
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
низкий
-
+
-
+
-
-
+
-
-
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
низкий
-
+
-
+
-
-
+
-
"
+
-
+
+
-
-
+
В еще одном варианте осуществления, CD34, CD10, CD105 клетки представляют собой дополнительно одни или более из CD13, CD29, CD33, CD38, CD44, CD45, CD54, CD62E, CD62L, CD62P, SH3 (CD73), SH4 (CD73), CD80, CD86, CD90, SH2 (CD105), CD106/VCAM, CDl17, CD144/VE-кадхерин, CD184/CXCR4, CD200, CD133, OCT-4, SSEA3, SSEA4, ABC-p, KDR (VEGFR2), HLA-A,B,C, HLA-DP,DQ,DR, HLA-G или Лиганд Программированной Смерти-1 (PDLl) или любое их сочетание. В другом варианте осуществления, CD34, CD10, CD105 клетки представляют собой дополнительно CD13, CD29, CD33, CD38, CD44, CD45, CD54/ICAM, CD62E, CD62L, CD62P, SH3 (CD73), SH4 (CD73), CD80, CD86, CD90, SH2 (CD105), CD106/VCAM, CDl17, CD144/VE-кадхерин, CD184/CXCR4, CD200, CD133, OCT-4, SSEA3, SSEA4, ABC-p, KDR (VEGFR2), HLA-A,B,C, HLA-DP,DQ,DR, HLA-G, и Лиганд Программированной Смерти-1 (PDLl). В некоторых вариантах осуществления, клетки представляют собой одни или более из SSEA3, SSEA4 или ABC-p. Изолированные плацентарные клетки могут также экспрессируют HLA-ABC (MHC-1). Эти маркеры могут применяться, в любом сочетании, для идентификации изолированных плацентарных клеток, например, изолированных плацентарных стволовых клеток или изолированных мультипотентных клеток и для различения изолированных плацентарных клеток от других клеточных типов. Вследствие того, что изолированные плацентарные клетки могут экспрессировать CD73 и CD105, они могут иметь характеристики, подобные характеристикам мезенхимальных стволовых клеток. Отсутствие экспрессии CD34, CD38 и/или CD45, например, позволяет идентифицировать изолированные плацентарные клетки как негемопоэтические стволовые клетки.
+
+
-
+
+
-
-
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
низкий
-
+
-
+
-
-
+
-
-
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
ннизкий
-
+
-
+
-
-
+
-
-
+
-
+
+
Также в данном документе предоставлены популяции изолированных плацентарных клеток или популяции клеток, например, популяции плацентарных клеток, содержащие, например, клетки, обогащенные изолированными плацентарными клетками, которые являются применимыми в способах лечения, раскрытых здесь. Предпочтительные популяции клеток содержащие изолированные плацентарные клетки, где популяции клеток применяют в раскрытых здесь способах лечения, содержат, например, по меньшей мере, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% изолированных CD10, CD105 и CD34 плацентарных клеток; то есть, по меньшей мере, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% клеток в указанной популяции представляют собой изолированные CD10, CD105 и CD34 плацентарные клетки. В конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD200. В более конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105, CD200 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD90 или CD45, как обнаружено посредством проточной цитометрии. В еще одном более конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105, CD200 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD90 и CD45, как обнаружено посредством проточной цитометрии. В более конкретном варианте осуществления, любые из изолированных CD34, CD10, CD105 плацентарных клеток, описанных выше, представляют собой дополнительно одни или более из CD29, CD38, CD44, CD54, SH3 или SH4. В еще одном более конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки или изолированные CD34, CD10, CD105, CD200 плацентарные клетки, представляют собой дополнительно CD44. В конкретном варианте осуществления любые из популяции клеток содержат изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки, указанные выше, изолированные плацентарные клетки представляют собой дополнительно одни или более из CD13, CD29, CD33, CD38, CD44, CD45, CD54, CD62E, CD62L, CD62P, SH3 (CD73), SH4 (CD73), CD80, CD86, CD90, SH2 (CD105), CD106/VCAM, CDl17, CD144/VE-кадхерин, CD184/CXCR4, CD200, CDl33, OCT-4, SSEA3, SSEA4, ABC-p, KDR (VEGFR2), HLA-A,B,C, HLA-DP,DQ,DR, HLA-G или Лиганд Программированной Смерти-1 (PDLl) или любое их сочетание. В более конкретном варианте осуществления, CD34, CD10, CD105 клетки представляют собой дополнительно CD13, CD29, CD33, CD38, CD44, CD45, CD54/ICAM, CD62E, CD62L, CD62P, SH3 (CD73), SH4 (CD73), CD80, CD86, CD90, SH2 (CD105), CD106/VCAM, CDl17, CD144/VΕ-кадхерин, CD184/CXCR4, CD200, CD133, OCT- 4, SSEA3, SSEA4, ABC-p, KDR (VEGFR2), HLA-A,B,C, HLA-DP,DQ,DR, HLA-G, и Лиганд Программированной Смерти-1 (PDLl).
+
+
-
-
+
-
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
+
-
-
-
+
-
+
+
+
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
-
-
+
-
+
+
+
-
+
+
-
-
+
+
В некоторых вариантах осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые в способах лечения, описанных здесь, представляют собой изолированные плацентарные клетки, которые являются одними или более или всеми из CD10, CD29, CD34, CD38, CD44, CD45, CD54, CD90, SH2, SH3, SH4, SSEA3, SSEA4, OCT-4, и ABC-p, где указанные изолированные плацентарные клетки получают посредством физического и/или ферментативного разрушения плацентарной ткани. В конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой OCT-4 и ABC-p. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой OCT-4 и CD34, где указанные изолированные плацентарные клетки имеют, по меньшей мере, одну из следующих характеристик: CD10, CD29, CD44, CD45, CD54, CD90, SH3, SH4, SSEA3, и SSEA4. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой OCT-4, CD34, CD10, CD29, CD44, CD45, CD54, CD90, SH3, SH4, SSEA3, и SSEA4. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой OCT-4, CD34, SSEA3, и SSEA4. В более конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой OCT-4 и CD34, и являются либо SH2 или SH3. В более конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой OCT-4, CD34, SH2, и SH3. В еще одном более конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой OCT-4, CD34, SSEA3, и SSEA4, и представляют собой либо SH2 или SH3. В еще одном более конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой OCT-4 и CD34, и либо SH2 или SH3, и являются, по меньшей мере, одними из CD10, CD29, CD44, CD45, CD54, CD90, SSEA3 или SSEA4. В еще одном более конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой OCT-4, CD34, CD10, CD29, CD44, CD45, CD54, CD90, SSEA3, и SSEA4, и либо SH2 или SH3.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
+
+
+
-
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
-
-
В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые в раскрытых здесь способах лечения, представляют собой SH2, SH3, SH4 и OCT-4. В более конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, CD34, CD45, SSEA3 или SSEA4. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой SH2, SH3, SH4, SSEA3 и SSEA4. В более конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой SH2, SH3, SH4, SSEA3 и SSEA4, CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, OCT-4, CD34 или CD45.
+
+
-
+
-
+
+
+
+
+
+
-
-
В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые в раскрытых здесь способах, представляют собой CD10, CD29, CD34, CD44, CD45, CD54, CD90, SH2, SH3, и SH4; где указанные изолированные плацентарные клетки представляют собой дополнительно одни или более из OCT-4, SSEA3 или SSEA4.
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
В некоторых вариантах осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые в раскрытых здесь способах лечения, например, лечения нарушения кровотока в мозге или вокруг него или ЦНС, лечения инсульта, представляют собой CD200 или HLA-G. В конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD200 и HLA-G. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD73 и CD105. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38 или CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38 и CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные стволовы клетки представляют собой CD34, CD38, CD45, CD73 и CDl05. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD200 или HLA-G плацентарные клетки облегчают образование эмбриоид-подобных телец в популяции плацентарных клеток, содержащей изолированные плацентарные клетки, при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобных телец. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки выделяют из плацентарных клеток, которые не являются стволовыми или мультипотентными клетками. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки выделяют из плацентарных стволовых клеток, которые не проявляют этих маркеров.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
-
-
-
+
+
+
+
В еще одном варианте осуществления, популяция клеток, применимая в способах лечения, описанных здесь, представляет собой популяцию клеток, содержащую, например, то есть обогащенную CD200, HLA-G стволовыми клетками. В конкретном варианте осуществления, указанная популяция представляет собой популяцию плацентарных клеток. В различных вариантах осуществления, по меньшей мере, приблизительно 10%, по меньшей мере, приблизительно 20%, по меньшей мере, приблизительно 30%, по меньшей мере, приблизительно 40%, по меньшей мере, приблизительно 50% или по меньшей мере, приблизительно 60% клеток в указанной клеточной популяции представляют собой изолированные CD200, HLA-G плацентарные клетки. Предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 70% клеток в указанной клеточной популяции представляют собой изолированные CD200, HLA-G плацентарные клетки, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 90%, 95% или 99% указанных клеток представляют собой изолированные CD200, HLA-G плацентарные клетки. В конкретном варианте осуществления популяции клеток, указанные изолированные CD200, HLA-G плацентарные клетки представляют собой также CD73 и CDl05. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD200, HLA-G плацентарные клетки представляют собой также CD34, CD38 или CD45. В более конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD200, HLA-G плацентарные клетки представляют собой также CD34, CD38, CD45, CD73 и CD105. В еще одном варианте осуществления, указанная популяция клеток вырабатывает одно или более эмбриоид-подобных телец, когда ее культивируют при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобных телец. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанную популяцию клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не являются стволовыми клетками. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD200, HLA-G плацентарные клетки выделяют из плацентарных клеток, которые не проявляют этих маркеров.
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые в способах лечения, описанных здесь, представляют собой CD73, CD105, и CD200. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой HLA-G. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD34, CD38 или CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD34, CD38 и CD45. В более конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD34, CD38, CD45, и HLA-G. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные CD73, CD105, и CD200 плацентарные клетки способствуют образованию одного или более эмбриоид-подобных телец в популяции плацентарных клеток, содержащей изолированные плацентарные клетки, когда популяцию культивируют при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобных телец. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки выделяют из плацентарных клеток, которые не являются изолированными плацентарными клетками. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки выделяют из плацентарных клеток, которые не проявляют этих маркеров.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
В еще одном варианте осуществления, популяция клеток, применимая в способах лечения, описанных здесь, представляет собой популяцию клеток, содержащую, например, то есть обогащенную изолированными CD73, CD105, CD200 плацентарными клетками. В различных вариантах осуществления, по меньшей мере, приблизительно 10%, по меньшей мере, приблизительно 20%, по меньшей мере, приблизительно 30%, по меньшей мере, приблизительно 40%, по меньшей мере, приблизительно 50% или, по меньшей мере, приблизительно 60% клеток в указанной клеточной популяции представляют собой изолированные CD73, CD105, CD200 плацентарные клетки. В еще одном варианте осуществления, по меньшей мере, приблизительно 70% указанных клеток в указанной популяции клеток представляют собой изолированные CD73, CD105, CD200 плацентарные клетки. В еще одном варианте осуществления, по меньшей мере, приблизительно 90%, 95% или 99% клеток в указанной популяции клеток представляют собой изолированные CD73, CD105, CD200 плацентарные клетки. В конкретном варианте осуществления указанных популяций, изолированные плацентарные клетки представляют собой HLA-G. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38 или CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38 и CD45. В более конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38, CD45, и HLA-G. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанная популяция клеток вырабатывает одно или более эмбриоид-подобных телец, когда ее культивируют при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобных телец. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанную популяцию плацентарных клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не являются стволовыми клетками. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанную популяцию плацентарных стволовых клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не проявляют этих характеристик.
+
+
-
-
+
-
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
-
-
+
-
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
-
-
-
+
+
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
В некоторых других вариантах осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой одни или более из CD10, CD29, CD34, CD38, CD44, CD45, CD54, CD90, SH2, SH3, SH4, SSEA3, SSEA4, OCT-4, HLA-G или ABC-p. В конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD10, CD29, CD34, CD38, CD44, CD45, CD54, CD90, SH2, SH3, SH4, SSEA3, SSEA4, и OCT-4. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD10, CD29, CD34, CD38, CD45, CD54, SH2, SH3, и SH4. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD10, CD29, CD34, CD38, CD45, CD54, SH2, SH3, SH4 и OCT-4. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD10, CD29, CD34, CD38, CD44, CD45, CD54, CD90, HLA-G, SH2, SH3, SH4. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой OCT-4 и ABC-p. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой SH2, SH3, SH4 и OCT-4. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой OCT-4, CD34, SSEA3, и SSEA4. В конкретном варианте осуществления, указанные изолированные OCT-4, CD34, SSEA3, и SSEA4 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD10, CD29, CD34, CD44, CD45, CD54, CD90, SH2, SH3, и SH4. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой OCT- 4 и CD34, и либо SH3 или SH4. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD34 и либо CD10, CD29, CD44, CD54, CD90 или OCT-4.
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
-
-
-
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые в способах лечения, описанных здесь, представляют собой CD200 и OCT-4. В конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD73 и CD105. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки представляют собой HLA-G. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD200, OCT-4 плацентарные клетки представляют собой CD34, CD38 или CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD200, OCT-4 плацентарные клетки представляют собой CD34, CD38 и CD45. В более конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD200, OCT-4 плацентарные клетки представляют собой CD34, CD38, CD45, CD73, CD105 и HLA-G. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные CD200, OCT-4 плацентарные клетки облегчают выработку одного или более эмбриоид-подобных телец посредством популяции плацентарных клеток, которая содержит изолированные клетки, когда популяцию культивируют при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобных телец. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD200, OCT-4 плацентарные клетки выделяют из плацентарных клеток, которые не являются стволовыми клетками. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD200, OCT-4 плацентарные клетки выделяют из плацентарных клеток, которые не проявляют этих характеристик.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
В еще одном варианте осуществления, клеточная популяция, применимая в способах лечения, описанных здесь, представляет собой популяцию клеток, содержащую, например, т.е. обогащенную CD200, OCT-4 плацентарными клетками. В различных вариантах осуществления, по меньшей мере, приблизительно 10%, по меньшей мере, приблизительно 20%, по меньшей мере, приблизительно 30%, по меньшей мере, приблизительно 40%, по меньшей мере, приблизительно 50% или по меньшей мере, приблизительно 60% клеток в указанной популяции клеток представляют собой изолированные CD200, OCT-4 плацентарные клетки. В еще одном варианте осуществления, по меньшей мере, приблизительно 70% указанных клеток представляют собой указанные изолированные CD200, OCT-4 плацентарные клетки. В еще одном варианте осуществления, по меньшей мере, приблизительно 80%, 90%, 95% или 99% клеток в указанной популяции клеток представляют собой указанные изолированные CD200, OCT-4 плацентарные клетки. В конкретном варианте осуществления изолированных популяций, указанные изолированные CD200, OCT-4 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD73 и CD105. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD200, OCT-4 плацентарные клетки представляют собой дополнительно HLA-G. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD200, OCT-4 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38 и CD45. В более конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD200, OCT-4 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38, CD45, CD73, CD105 и HLA-G. В еще одном конкретном варианте осуществления, клеточная популяция вырабатывает одно или более эмбриоид-подобных телец, когда ее культивируют при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобных телец. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанную популяцию клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не являются изолированными CD200, OCT-4 плацентарными клетками. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанную популяцию клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не проявляют этих маркеров.
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые в способах лечения, описанных здесь, представляют собой CD73, CD105 и HLA-G. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные CD73, CDl05 и HLA-G плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38 или CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные CD73, CD10S, HLA-G плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38 и CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные CD73, CDl05, HLA-G плацентарные клетки представляют собой дополнительно OCT-4. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные CD73, CD105, HLA-G плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD200. В более конкретном варианте осуществления, изолированные CD73, CD105, HLA-G плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38, CD45, OCT-4 и CD200. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные CD73, CD105, HLA-G плацентарные клетки облегчают образование эмбриоид-подобных телец в популяции плацентарных клеток, содержащей указанные клетки, когда популяцию культивируют при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобных телец. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD73, CD105, HLA-G плацентарные клетки выделяют из плацентарных клеток, которые не являются изолированными CD73, CD105, HLA-G плацентарными клетками. В ещеодном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD73, CD105, HLA-G плацентарные клетки выделяют из плацентарных клеток, которые не проявляют этих маркеров.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
В еще одном варианте осуществления, популяция клеток, применимая в способах лечения, описанных здесь, представляет собой популяцию клеток, содержащую, например, то есть обогащенную изолированными CD73, CD105 и HLA-G плацентарными клетками. В различных вариантах осуществления, по меньшей мере, приблизительно 10%, по меньшей мере, приблизительно 20%, по меньшей мере, приблизительно 30%, по меньшей мере, приблизительно 40%, по меньшей мере, приблизительно 50% или по меньшей мере, приблизительно 60% клеток в указанной популяции клеток представляют собой изолированные CD73, CD105, HLA-G плацентарные клетки. В еще одном варианте осуществления, по меньшей мере, приблизительно 70% клеток в указанной популяции клеток представляют собой изолированные CD73, CD105, HLA-G плацентарные клетки. В еще одном варианте осуществления, по меньшей мере, приблизительно 90%, 95% или 99% клеток в указанной популяции клеток представляют собой изолированные CD73, CD105, HLA-G плацентарные клетки. В конкретном варианте осуществления указанной выше популяции, указанные изолированные CD73, CD105, HLA-G плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38 или CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD73, CD105, HLA-G плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38 и CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD73, CD105, HLA-G плацентарные клетки представляют собой дополнительно OCT-4. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD73, CD105, HLA-G плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD200. В более конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD73, CD105, HLA-G плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38, CD45, OCT-4 и CD200. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанную популяцию клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не являются CD73, CD105, HLA-G плацентарными клетками. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанную популяцию клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не проявляют этих маркеров.
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые в способах лечения, описанных здесь, представляют собой CD73 и CD105 и облегчают образование одного или более эмбриоид-подобных телец в популяции изолированных плацентарных клеток, содержащей указанные CD73, CDl05 клетки, когда указанную популяцию культивируют при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобных телец. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD73, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38 или CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD73, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38 и CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD73, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно OCT-4. В более конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD73, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно OCT-4, CD34, CD38 и CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD73, CD105 плацентарные клетки выделяют из плацентарных клеток, которые не являются указанными клетками. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD73, CD105 плацентарные клетки выделяют из плацентарных клеток, которые не проявляют этих характеристик.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
В еще одном варианте осуществления, популяция клеток, применимая в способах лечения, описанных здесь, представляет собой популяцию клеток, содержащую, например, то есть обогащенную изолированными плацентарными клетками, которые являются CD73, CD105 и облегчают образование одного или более эмбриоид-подобных телец в популяции изолированных плацентарных клеток, содержащей указанные клетки, когда указанную популяцию культивируют при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобных телец. В различных вариантах осуществления, по меньшей мере, приблизительно 10%, по меньшей мере, приблизительно 20%, по меньшей мере, приблизительно 30%, по меньшей мере, приблизительно 40%, по меньшей мере, приблизительно 50% или, по меньшей мере, приблизительно 60% клеток в указанной популяции клеток представляют собой указанные изолированные CD73, CD105 плацентарные клетки. В еще одном варианте осуществления, по меньшей мере, приблизительно 70% клеток в указанной популяции клеток представляют собой указанные изолированные CD73, CD105 плацентарные клетки. В еще одном варианте осуществления, по меньшей мере, приблизительно 90%, 95% или 99% клеток в указанной популяции клеток представляют собой указанные изолированные CD73, CD105 плацентарные клетки. В конкретном варианте осуществления указанной выше популяции, указанные изолированные CD73, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38 или CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD73, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38 и CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD73, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно OCT-4. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD73, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD200. В более конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD73, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38, CD45, OCT-4 и CD200. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанную популяцию клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не являются указанными изолированными CD73, CD105 плацентарными клетками. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанную популяцию клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не проявляют этих маркеров.
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые в способах лечения, описанных здесь, представляют собой OCT-4 и облегчают образование одного или более эмбриоид-подобных телец в популяции изолированных плацентарных клеток, содержащей указанные клетки, когда ее культивируют при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобных телец. В конкретном варианте осуществления, указанные изолированные OCT-4 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD73 и CD105. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные OCT-4 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38 или CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные OCT-4 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD200. В более конкретном варианте осуществления, указанные изолированные OCT-4 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD73, CDl05, CD200, CD34, CD38, и CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные OCT-4 плацентарные клетки выделяют из плацентарных клеток, которые не являются OCT-4 плацентарными клетками. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные OCT-4 плацентарные клетки выделяют из плацентарных клеток, которые не проявляют этих характеристик.
+
+
+
+
+
-
-
-
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
В еще одном варианте осуществления, популяция клеток, применимая в способах лечения, описанных здесь, представляет собой популяцию клеток, содержащую, например, то есть обогащенную изолированными плацентарными клетками, которые являются OCT-4 и облегчают образование одного или более эмбриоид-подобных телец в популяции изолированных плацентарных клеток, содержащей указанные клетки, когда указанную популяцию культивируют при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобных телец. В различных вариантах осуществления, по меньшей мере, приблизительно 10%, по меньшей мере, приблизительно 20%, по меньшей мере, приблизительно 30%, по меньшей мере, приблизительно 40%, по меньшей мере, приблизительно 50% или, по меньшей мере, приблизительно 60% клеток в указанной популяции клеток представляют собой указанные изолированные OCT-4 плацентарные клетки. В еще одном варианте осуществления, по меньшей мере, приблизительно 70% клеток в указанной популяции клеток представляют собой указанные изолированные OCT-4 плацентарные клетки. В еще одном варианте осуществления, по меньшей мере, приблизительно 80%, 90%, 95% или 99% клеток в указанной популяции клеток представляют собой указанные изолированные OCT-4 плацентарные клетки. В конкретном варианте осуществления указанных выше популяций, указанные изолированные OCT-4 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38 или CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные OCT-4 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD34, CD38 и CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные OCT-4 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD73 и CD105. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные OCT-4 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD200. В более конкретном варианте осуществления, указанные изолированные OCT-4 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD73, CD105, CD200, CD34, CD38, и CD45. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанную популяцию клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не являются указанными клетками. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанную популяцию клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не проявляют этих маркеров.
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые в способах лечения, описанных здесь представляют собой изолированные HLA-A,B,C, CD45, CD133 и CD34 плацентарные клетки. В еще одном варианте осуществления, клеточная популяция, применимая для лечения нарушение кровотока в мозге или вокруг мозга или в ЦНС представляет собой популяцию клеток, содержащую изолированные плацентарные клетки, где, по меньшей мере, приблизительно 70%, по меньшей мере, приблизительно 80%, по меньшей мере, приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 95% или, по меньшей мере, приблизительно 99% клеток в указанной изолированной популяции клеток представляют собой изолированные HLA-A,B,C, CD45, CD133 и CD34 плацентарные клетки. В конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки или популяцию изолированных плацентарных клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не являются HLA-A,B,C, CD45, CDl33 и CD34 плацентарными клетками. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки представляют собой нематеринские по происхождению. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанная изолированная популяция плацентарных клеток по существу не содержит материнских компонентов; например, по меньшей мере, приблизительно 40%, 45%, 5-0%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанных клеток в указанной изолированной популяции плацентарных клеток представляют собой нематеринские по происхождению.
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые в способах лечения, описанных здесь, представляют собой изолированные CD10, CD13, CD33, CD45, CDl17 и CD133 плацентарные клетки. В еще одном варианте осуществления, клеточная популяция, применимая для лечения нарушение кровотока в мозге или вокруг мозга или в ЦНС, представляет собой популяцию клеток, содержащую изолированные плацентарные клетки, где, по меньшей мере, приблизительно 70%, по меньшей мере, приблизительно 80%, по меньшей мере, приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 95% или, по меньшей мере, приблизительно 99% клеток в указанной популяции клеток представляют собой изолированные CD10, CD13, CD33, CD45, CDl17 и CD133 плацентарные клетки. В конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки или популяцию изолированных плацентарных клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не являются указанными изолированными плацентарными клетками. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные CD10, CD13, CD33, CD45, CDl17 и CD133 плацентарные клетки являются нематеринскими по происхождению, т.е., имеют зародышевый генотип. В еще одном конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанных клеток в указанной изолированной популяции плацентарных клеток, являются нематеринскими по происхождению. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки или популяцию изолированных плацентарных клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не проявляют этих характеристик.
-
-
+
-
-
-
-
+
-
-
В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые в способах лечения, описанных здесь, представляют собой изолированные CD10, CD33, CD44, CD45, и CDl17 плацентарные клетки. В еще одном варианте осуществления, клеточная популяция, применимая для лечения нарушение кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС, представляет собой популяцию клеток, содержащую, например, обогащенную изолированными плацентарными клетками, где, по меньшей мере, приблизительно 70%, по меньшей мере, приблизительно 80%, по меньшей мере, приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 95% или, по меньшей мере, приблизительно 99% клеток в указанной популяции клеток представляют собой изолированные CD10, CD33, CD44, CD45 и CDl17 плацентарные клетки. В конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки или популяцию изолированных плацентарных клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не являются указанными клетками. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки являются нематеринскими по происхождению. В еще одном конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанных клеток в указанной популяции клеток являются нематеринскими по происхождению. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки или популяция изолированных плацентарных клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не проявляют этих маркеров.
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые в способах лечения, описанных здесь, представляют собой изолированные CD10, CDl3, CD33, CD45 и CDl17 плацентарные клетки. В еще одном варианте осуществления, клеточная популяция, применимая для лечения нарушение кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС, представляет собой популяцию клеток, содержащую, например, обогащенную изолированными CD10, CD13, CD33, CD45 и CDl17 плацентарными клетками, где, по меньшей мере, приблизительно 70%, по меньшей мере, приблизительно 80%, по меньшей мере, приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 95% или по меньшей мере, приблизительно 99% клеток в указанной популяции представляют собой CD10, CD13, CD33, CD45 и CDl17 плацентарные клетки. В конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки или популяцию изолированных плацентарных клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не являются указанными клетками. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки представляют собой нематеринские по происхождению. В еще одном конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанных клеток в указанной популяции клеток являются нематеринскими по происхождению. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки или популяцию изолированных плацентарных клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не проявляют этих характеристик.
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые в способах лечения, описанных здесь, представляют собой HLA A,B,C, CD45, CD34 и CD 133, и представляют собой дополнительно CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 и/или HLA-G, и/или отрицательные для CDl17. В еще одном варианте осуществления, клеточная популяция, применимая для лечения нарушение кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС, представляет собой популяцию клеток, содержащую изолированные плацентарные клетки, где, по меньшей мере, приблизительно 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или приблизительно 99% клеток в указанной популяции представляют собой изолированные плацентарные клетки, которые являются HLA A,B,C, CD45, CD34, CD 133 и которые представляют собой дополнительно положительные для CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 и/или HLA-G, и/или отрицательные для CDl17. В конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки или популяцию изолированных плацентарных клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не являются указанными клетками. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки представляют собой нематеринские по происхождению. В еще одном конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанных клеток в указанной клеточной популяции являются нематеринскими по происхождению. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки или популяцию изолированных плацентарных клеток выделяют из плацентарных клеток, которые не проявляют этих маркеров.
+
+
-
+
-
+
+
+
-
+
+
+
-
+
-
-
-
-
-
-
-
+
+
низкий
-
низкий
низкий
-
низкий
низкий
+
+
+
+
+
В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые в способах лечения, описанных здесь, представляют собой изолированные плацентарные клетки, которые являются CD200 и CD10, как определяют посредством связывания антител, и CDl17, как определяют посредством как связывания антител, так и ПЦР в режиме реального времени. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые для лечения нарушение кровотока в мозге или вокруг него, или ЦНС представляют собой изолированные плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки или плацентарные мультипотентные клетки, которые являются CD10, CD29, CD54, CD200, HLA-G, HLA класса T и β-2-микроглобулин. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые для лечения нарушение кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС представляют собой плацентарные клетки, где экспрессия, по меньшей мере, одного клеточного маркера составляет, по меньшей мере, в два раза выше, чем для мезенхимальных стволовых клеток (например, полученных из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток). В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки представляют собой нематеринские по происхождению. В еще одном конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанных клеток в указанной клеточной популяции являются нематеринскими по происхождению. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые в способах лечения, описанных здесь, представляют собой изолированные плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки или плацентарные мультипотентные клетки, которые являются одним или более из CD10, CD29, CD44, CD45, CD54/ICAM, CD62E, CD62L, CD62P, CD80, CD86, CD103, CD104, CD105, CD106/VCAM, CD144/VE- кадхерин, CD184/CXCR4, β2-микроглобулин, MHC-I, MHC-II, HLA-G и/или PDL1. В конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой, по меньшей мере CD29 и CD54. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой, по меньшей мере CD44 и CD106. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой по меньшей мере CD29.
+
+
+
-
+
-
-
-
-
-
-
-
+
+
низкий
-
низкий
низкий
-
низкий
низкий
+
+
+
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
низкий
-
низкий
низкий
-
низкий
низкий
В еще одном варианте осуществления, популяция клеток, применимая в способах лечения, описанных здесь, содержит изолированные плацентарные клетки, и, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток в указанной популяции клеток представляют собой изолированные плацентарные клетки, которые являются одними или более из CD10, CD29, CD44, CD45, CD54/ICAM, CD62-E, CD62-L, CD62-P, CD80, CD86 , CD103, CD104, CD105, CD 106/VCAM, CD144/VE-кадхерин, CD184/CXCR4, β2-микроглобулин, HLA-I, HLA-II, HLA-G, и/или PDLl. В более конкретном варианте осуществления, по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток в указанной клеточной популяции представляют собой CD10, CD29, CD44, CD45, CD54/ICAM, CD62E, CD62-L, CD62-P, CD80, CD86, CD103, CD104, CD105, CD106/VCAM, CD144/VE-кадхерин, CD184/CXCR4, β2-микроглобулин, MHC-I, MHC-II, HLA-G и PDLl.
+
+
-
-
+
-
+
+
+
+
+
-
-
+
+
В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, применимые для лечения нарушения кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС, представляют собой изолированные плацентарные клетки, которые являются одними или более или всеми из CD10, CD29, CD34, CD38, CD44, CD45, CD54, CD90, SH2, SH3, SH4, SSEA3, SSEA4, OCT-4 и ABC-p, где ABC-p представляет собой плацента-специфический ABC белок-переносчик (также известный как белок резистенции к раку молочной железы (BCRP) и как белок, резистентный к митоксантрону (MXR)), где указанные изолированные плацентарные клетки получают посредством перфузии плаценты млекопитающих, например, человеческой, которые была дренирована от пуповинной крови и перфузирована для удаления остаточной крови.
-9
-4
Профилирование генов подтверждает, какие изолированные плацентарные клетки и популяции изолированных плацентарных клеток, являются отличительными от других клеток, например, мезенхимальных стволовых клеток, например, полученных из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток. Изолированные плацентарные клетки, описанные здесь, могут отличаться от, например, мезенхимальных стволовых клеток на основании экспрессии одного или более генов, экспрессия которых является существенно более высокой в изолированных плацентарных клетках или в некоторых изолированных пуповинных стволовых клетках, в сравнении с полученными из костного мозга мезенхимальными стволовыми клетками. В частности, изолированные плацентарные клетки, применимые в способах лечения, предоставленных здесь, могут отличаться от мезенхимальных стволовых клеток на основании экспрессии одного или более генов, экспрессия которых является существенно более высокой (то есть, по меньшей мере в два раза более высокой) в изолированных плацентарных клетках, чем в эквивалентном количестве полученных из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток, где один или более генов представляют собой ACTG2, ADARBl, AMIGО2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAМ1 IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAKl, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTNl, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, ZC3H12A или сочетание любых из вышеуказанных, когда клетки выращивают в эквивалентных условиях. См., например, опубликованную патентную заявку США № 2007/0275362, раскрытие которой включено здесь посредством ссылки во всей его полноте. В более конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки экспрессируют указанные один или более генов при культивировании в течение от приблизительно 3 до приблизительно 35 удвоений популяции в среде, содержащей DMEM-LG (например, от Gibco); 2% зародышевой телячьей сыворотки {например, от Hyclone Labs.); 1x инсулин-трансферрин-селен (ITS); 1x линолевая кислота-альбумин бычьей сыворотки (LA- BSA); 10 M дексаметазона {например, от Sigma); 10 M аскорбиновой кислоты 2-фосфат {например, от Sigma); эпидермальный фактор роста 10 нг/мл {например, от R&D Systems); и тромбоцитарный фактор роста (PDGF-BB) 10 нг/мл (например, от R&D Systems). В конкретном варианте осуществления, геном, специфичным для изолированных плацентарных клеток или изолированных клеток пуповины является CD200.
Специфические последовательности для этих генов можно обнаружить в GenBank под инвентарными номерами NM_001615 (ACTG2), BC065545 (ADARBl), (NM_181847 (AMIGО2), AY358590 (ARTS-1), BC074884 (B4GALT6), BC008396 (BCHE), BC020196 (C11orf9), BC031103 (CD200), NM_001845 (COL4A1), NM_001846 (COL4A2), BC052289 (CPA4), BC094758 (DMD), AF293359 (DSC3), NM_001943 (DSG2), AF338241 (ELOVL2), AY336105 (F2RL1), NMJ_018215 (FLJ10781), AY416799 (GATA6), BC075798 (GPRl 26), NM_016235 (GPRC5B), AF340038 (ICAМ1), BC000844 (IER3), BC066339 (IGFBP7), BC013142 (IL1A), BT019749 (IL6), BC007461 (IL18), (BC072017) KRT18, BC075839 (KRT8), BC060825 (LIPG), BC065240 (LRAP), BC010444 (MATN2), BC011908 (MEST), BC068455 (NFE2L3), NM_014840 (NUAK1), AB006755 (PCDH7), NM_014476 (PDLIM3), BC126199 (PKP-2), BC090862 (RTNl), BC002538 (SERPINB9), BC023312 (ST3GAL6), BC001201 (ST6GALNAC5), BC126160 или BC065328 (SLC12A8), BC025697 (TCF21), BC096235 (TGFB2), BC005046 (VTN), и BC005001 (ZC3H12A) по состоянию на Март 2008.
В более конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки экспрессируют каждый из ACTG2, ADARBl, AMIGО2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAМ1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, и ZC3H12A на заметно более высоком уровне, чем эквивалентное количество полученных из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток, когда клетки выращивают в эквивалентных условиях.
Экспрессию вышеуказанных генов можно оценить посредством стандартных методов. Например, зонды, основанные на последовательности гена(ов) могут быть индивидуально выбраны и сконструированы посредством стандартных методов. Экспрессию генов можно оценить, например, на микрочипе, содержащем зонды к одному или более из генов, например, чипе Affymetrix GENECHIP Human Genome U133A 2,0 или Affymetrix GENECHIP Human Genome U133 Plus 2,0 (Santa Clara, California). Экспрессию этих генов можно оценить даже, если последовательность для конкретного инвентарного номера GenBank отсутствует, поскольку зонды, специфичные для пропущенной последовательности, могут легко генерироваться с использованием хорошо известных стандартных методов.
Уровень экспрессии этих генов может применяться для подтверждения идентичности популяции изолированных плацентарных клеток, для идентификации популяции клеток, как содержащей, по меньшей мере, множество изолированных плацентарных клеток или т.п. Популяции изолированных плацентарных клеток, идентичность которых подтверждена, могут представлять собой клональные, например, популяции изолированных плацентарных клеток распространенные из единственной изолированной плацентарной клетки или смешанную популяцию стволовых клеток, например, популяцию клеток, содержащую исключительно изолированные плацентарные клетки, которые являются распространенными из множества изолированных плацентарных клеток или популяцию клеток, содержащую изолированные плацентарные клетки, как описано здесь, и, по меньшей мере один другой тип клеток.
Уровень экспрессии этих генов может применяться для выбора популяции изолированных плацентарных клеток. Например, популяция клеток, например, клонально-распространенных клеток, может быть выбрана, если экспрессия одного или более из генов, перечисленных выше, является существенно более высокой в образце из популяции клеток, чем в эквивалентной мезенхимальных стволовых клеток. Такая селекция может представлять собой популяцию из множества популяций изолированных плацентарных клеток, из множества популяций клеток, идентичность которых неизвестна и т.д.
Изолированные плацентарные клетки могут быть выбраны на основании уровня экспрессии одного или более таких генов, по сравнению с контрольной средой с уровнем экспрессии в указанных одном или более генах в, например, контрольных мезенхимальных стволовых клетках. Например, уровень экспрессии в указанных одном или более генах в эквивалентном количестве полученных из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток. В одном варианте осуществления, уровень экспрессии указанных одного или более генов в образце, содержащем эквивалентное количество мезенхимальных стволовых клеток применяют как контроль. В еще одном варианте осуществления, контролем, для изолированных плацентарных клеток, тестируемых при определенных условиях, является числовое значение, представляющее уровень экспрессии указанных одного или более генов в мезенхимальных стволовых клетках при указанных условиях.
-9
-4
Изолированные плацентарные клетки, описанные здесь, проявляют указанные выше характеристики (например, сочетания маркеров поверхности клеток и/или профили экспрессии генов) в первичной культуре или во время пролиферации в среде, содержащей, например, DMEM-LG (Gibco), 2% зародышевой телячьей сыворотки (FCS) (Hyclone Laboratories), 1x инсулин-трансферрин-селен (ITS), 1x линоленовая кислота - альбумин бычьей сыворотки (LA-BSA), 10 M дексаметазона (Sigma), 10M аскорбиновой кислоты 2-фосфат (Sigma), эпидермальный фактор роста (EGF) 10нг/мл (R&D Systems), тромбоцитарный фактор роста (PDGF-BB) l0 нг/мл (R&D Systems), и 100 Ед. пенициллина/1000 Ед. стрептомицина.
В еще одном конкретном варианте осуществления указанных изолированных плацентарных клеток или популяций клеток, содержащих изолированные плацентарные клетки, указанные клетки или популяцию распространяют, например, пересевают, по меньшей мере, приблизительно или не более, чем, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 раз или подвергают пролиферации в течение, по меньшей мере, приблизительно или не более, чем, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 или 40 удвоений популяции. В еще одном конкретном варианте осуществления изолированных плацентарных клеток или популяции клеток, содержащей изолированные плацентарные клетки, которые раскрыты здесь, указанные изолированные плацентарные клетки являются зародышевыми по происхождению (то есть имеют зародышевый генотип).
В некоторых вариантах осуществления изолированных плацентарных клеток, указанные изолированные плацентарные клетки не дифференцируют во время культивирования в среде для роста, т.е., среде, составленной для инициации пролифераци, например, во время пролиферации в среде для роста. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки не требуют питающего слоя для пролиферации. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки не дифференцируют в культуре при отсутствии питательного слоя, исключительно, вследствие отсутствия слоя подпитывающих клеток.
В еще одном варианте осуществления, клетки, применимые для лечения нарушение кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС, представляют собой изолированные плацентарные клетки, где множество указанных изолированных плацентарных клеток является положительным для альдегиддегидрогеназы (ALDH), как оценивают посредством анализа активности альдегиддегидрогеназы. Такие анализы являются известными в данной области (см., например, Bostian и Betts, Biochem. J., 173, 787, (1978)). В конкретном варианте осуществления, в указанном анализе ALDH используют ALDEFLUOR (Aldagen, Inc., Ashland, Oregon) в качестве маркера активности альдегиддегидрогеназы. В конкретном варианте осуществления, указанное множество находится между приблизительно 3% и приблизительно 25% клеток в указанной популяции клеток. В еще одном варианте осуществления, здесь предоставлена популяция изолированных пуповинных клеток, например, мультипотентных изолированных пуповинных клеток, где множество указанных изолированных пуповинных клеток являются положительными для альдегиддегидрогеназы, как оценивают посредством анализа активности альдегиддегидрогеназы, в котором применяют ALDEFLUOR в качестве индикатора активности альдегиддегидрогеназы. В конкретном варианте осуществления, указанное множество находится между приблизительно 3% и приблизительно 25% клеток в указанной популяции клеток. В еще одном варианте осуществления, указанные популяции изолированных плацентарных клеток или изолированных клеток пуповины показывают, по меньшей мере, трехкратную или, по меньшей мере, пятикратную, более высокую ALDH активность, чем популяция полученных из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток, имеющих приблизительно такое же число клеток и культивируемых при таких же условиях.
В некоторых вариантах осуществления в любых из популяций клеток, содержащих изолированные плацентарные клетки, описанных здесь, плацентарные клетки в указанных популяциях клеток по существу не содержат клеток, имеющих материнский генотип; например, по меньшей мере, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% плацентарных клеток в указанной популяции имеют зародышевый генотип. В некоторых других вариантах осуществления в любых из популяций клеток, содержащих изолированные плацентарные клетки, описанных здесь, популяции клеток, содержащие указанные плацентарные клетки, по существу не содержат клеток, имеющих материнский генотип; например, по меньшей мере, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток в указанной популяции имеют зародышевый генотип.
В конкретном варианте осуществления любые из указанных выше изолированных плацентарных клеток или популяции клеток изолированных плацентарных клеток, кариотип клеток или по меньшей мере, приблизительно 95% или приблизительно 99% клеток в указанной популяции, являются нормальными. В еще одном конкретном варианте осуществления, любые из указанных выше плацентарных клеток или популяции клеток, клеток, или клеток в популяции клеток, являются нематеринскими по происхождению.
Изолированные плацентарные клетки или популяции изолированных плацентарных клеток, несущие любые из указанных выше сочетаний маркеров, могут сочетаться при любом соотношении. Любые две или более из указанных выше популяций изолированных плацентарных клеток, могут сочетаться для образования популяции изолированных плацентарных клеток. Например, популяция изолированных плацентарных клеток может содержать первую популяцию изолированных плацентарных клеток, определяемую одним из сочетаний маркеров, описанных выше, и вторую популяцию изолированных плацентарных клеток, определяемую посредством других сочетаний маркеров, описанных выше, где указанные клетки первой и второй популяции сочетают при соотношении, равном приблизительно 1:99, 2:98, 3:97, 4:96, 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2 или приблизительно 99:1, подобным образом, любые три, четыре, пять или более из вышеописанных изолированных плацентарных клеток или популяций изолированных плацентарных клеток популяции могут быть объединены.
Изолированные плацентарные клетки, применимые для лечения нарушение кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС, могут быть получены, например, посредством разрушения плацентарной ткани, с ферментативным расщеплением или без него (см. Раздел 5.5.3) или перфузии (см. Раздел 5.5.4). Например, популяции изолированных плацентарных клеток могут быть получены в соответствии со способом, включающим в себя перфузию плаценты млекопитающих, которая была дренирована от пуповинной крови и перфузирована для удаления остаточной крови; перфузию указанной плаценты перфузионным раствором; и сбор указанного перфузионного раствора, где указанный перфузионный раствор после перфузии содержит популяцию плацентарных клеток, которая содержит изолированные плацентарные клетки; и отделения множества указанных изолированных плацентарных клеток из указанной популяции клеток. В конкретном варианте осуществления, перфузионный раствор пропускают через пупочную вену и пупочные артерии и собирают после его истечения из плаценты. В еще одном конкретном варианте осуществления, перфузионный раствор пропускают через пупочную вену и собирают из пупочных артерий или пропускают через пупочные артерии и собирают из пупочной вены.
В различных вариантах осуществления, изолированные плацентарные клетки, содержащиеся внутри популяции клеток, полученной от перфузии плаценты, составляют, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или, по меньшей мере 99,5% от указанной популяции плацентарных клеток. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, собранные посредством перфузии, содержат зародышевые и материнские клетки. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки, собранные посредством перфузии, представляют собой, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или, по меньшей мере, 99,5% зародышевых клеток.
В еще одном конкретном варианте осуществления, здесь предоставлена композиция, содержащая популяцию изолированных плацентарных клеток, как описано здесь, собранную посредством перфузии, где указанная композиция содержит, по меньшей мере, часть перфузионного раствора, использованного для сбора изолированных плацентарных клеток.
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
Изолированные популяции изолированных плацентарных клеток, описанные здесь, могут быть получены посредством расщепления плацентарной ткани тканеразрушающим ферментом для получения популяции плацентарных клеток, содержащей клетки, и отделения или отделения по существу, множества плацентарных клеток от оставшейся части указанных плацентарных клеток. Вся плацента или любая ее часть могут быть расщеплены для получения изолированных плацентарных клеток, описанных здесь. В конкретных вариантах осуществления, например, указанная плацентарная ткань может представлять собой целую плаценту, амниотическую мембрану, хорион, сочетание амниона и хориона или сочетание любых из перечисленных выше. В другом конкретном варианте осуществления, разрушающий ткани фермент представляет собой трипсин или коллагеназу. В различных вариантах осуществления, изолированные плацентарные клетки, содержащиеся в пределах популяции клеток, полученной из расщепленной плаценты, представляют собой, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или, по меньшей мере, 99,5% от указанной популяции плацентарных клеток. Изолированные популяции плацентарных клеток, описанные выше, и популяции изолированных плацентарных клеток, в целом, могут содержать приблизительно, по меньшей мере, или не более, чем, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или более изолированных плацентарных клеток. Популяции изолированных плацентарных клеток, применимые в способах лечения, описанных здесь, содержат, по меньшей мере, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% жизнеспособных изолированных плацентарных клеток, как определяют, например, посредством эксклюзии трипанового синего.
5.4.3 РОСТ В КУЛЬТУРЕ
Рост изолированных плацентарных клеток, описанный здесь в Разделе 5.4.2, как для любой клетки млекопитающих, зависит от части конкретной среды, выбранной для роста. При оптимальных условиях, изолированные плацентарные клетки обычно удваиваются по количеству в течение приблизительно 1 дня. Во время культивирования, изолированные плацентарные клетки, описанные здесь, прилипают к субстрату в культуре, например, поверхности контейнера для культуры ткани (например, пластику чашки для культуры ткани, фибронектин-покрытому пластику, и т.п.) и образуют монослой.
Популяции плацентарных клеток, которые содержат изолированные плацентарные клетки, описанные здесь, когда их культивируют в соответствующих условиях, могут образовывать эмбриоид-подобные тельца, которые являются трехмерными кластерами клеток, растущими в верхней части слоя адгезивных клеток. Клетки в пределах эмбриоид-подобных телец экспрессируют маркеры, ассоциированные с очень ранними стволовыми клетками, например, OCT-4, Nanog, SSEA3 и SSEA4. Клетки в пределах эмбриоид-подобных телец обычно не являются адгезивными к субстрату культуры, как изолированные плацентарные клетки, описанные здесь, но остаются прикрепленными к адгезивным клеткам во время культивирования. Клетки эмбриоид-подобного тельца являются зависимыми от адгезивных изолированных плацентарных клеток по жизнеспособности, так как эмбриоид-подобные тельца не образуются в отсутствии адгезивных изолированных плацентарных клеток. Адгезивные изолированные плацентарные клетки, таким образом, облегчают рост одного или более эмбриоид-подобных телец в популяции плацентарных клеток, которая содержит адгезивные изолированные плацентарные клетки. Не желая быть связанными с теорией, авторы полагают, что клетки эмбриоид-подобных телец растут на адгезивных изолированных плацентарных клетках, как эмбриональные стволовые клетки растут на подпитывающем слое клеток.
5.5 СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПЛАЦЕНТАРНЫХ КЛЕТОК
5.5.1 КОМПОЗИЦИЯ СБОРА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Далее здесь предоставлены способы сбора и выделения плацентарных клеток, например, изолированных плацентарных клеток, описанных в Разделе 5.4.2, выше. В общем случае, такие клетки получают из плаценты млекопитающих с использованием физиологически-приемлемого раствора, например, композиции сбора клеток. Примерная композиция клеточного сбора описана подробно в родственной публикации патентной заявки США № 2007/0190042, озаглавленной "Улучшенная среда для сбора плацентарных стволовых клеток и консервации органов", раскрытие которой включено здесь посредством ссылки во всей его полноте.
Композиция клеточного сбора может содержать любой физиологически-приемлемый раствор, пригодный для сбора и/или культивирования клеток, например, изолированных плацентарных клеток, описанных здесь, например, физиологический раствор (например, забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор, Кребса, модифицированный раствор Кребса, раствор Игла, 0,9% NaCl и т.д.), культуральная среда (например, DMEM, H.DMEM, и т.д.) и т.п.
Композиция клеточного сбора может содержать один или более компонентов, которые имеют тенденцию к консервации изолированных плацентарных клеток, что означает предотвращение изолированных плацентарных клеток от высыхания или задержку смерти изолированных плацентарных клеток, снижение числа изолированных плацентарных клеток в популяции клеток, которые умирают или т.п., от времени сбора до времени культивирования. Такие компоненты могут представлять собой, например, ингибитор апоптоза (например, ингибитор каспазы или ингибитор JNK); вазодилататор (например, сульфат магния, антигипертензивное средство, натрийуретический пептид предсердия (ANP), адренокортикотропин, кортикотропин-высвобождающий гормон, нитропруссид натрия, гидралазин, трифосфат аденозина, аденозин, индометацин или сульфат магния, ингибитор фосфодиэстеразы и т.д.); ингибитор некроза (например, 2-(lH-индол-3-ил)-3-пентиламиномалеимид, дитиокарбамат пирролидина или клоназепам); ингибитор TNF-α; и/или кислород-переносящий перфторуглерод (например, перфтороктилбромид, перфтордецилбромид, и т.д.).
Clostridium histolyticum
Композиция клеточного сбора может содержать один или более ферментов для деградации ткани, например, металлопротеазу, серинпротеазу, нейтральную протеазу, РНКазу или ДНКазу или т.п. Такие ферменты включают, но не ограничены ими, коллагеназы (например, коллагеназу I, II, III или IV, коллагеназу из  и т.д.); диспазу, термолизин, эластазу, трипсин, ЛИБЕРАЗУ, гиалуронидазу и т.п.
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus
Композиция клеточного сбора может содержать бактерицидно или бактериостатически эффективное количество антибиотика. В некоторых неограничивающих вариантах осуществления, антибиотик представляет собой макролид (например, тобрамицин), цефалоспорин (например, цефалексин, цефрадин, цефуроксим, цефпрозил, цефаклор, цефиксим или цефадроксил, кларитромицин, эритромицин, пенициллин (например, пенициллин V) или хинолон (например, офлоксацин, ципрофлоксацин или норфлоксацин), тетрациклин, стрептомицин и т.д. В конкретном варианте осуществления, антибиотик является активным против Грам (+) и/или Грам (-) бактерий, например,  и т.п. В одном варианте осуществления, антибиотик представялет собой гентамицин, например, приблизительно от 0,005% до приблизительно 0,01% (м/о) в культуральной среде.
Композиция клеточного сбора может также содержать одно или более из следующих соединений: аденозин (приблизительно от 1 мМ до приблизительно 50 мМ); D-глюкозу (приблизительно от 20 мМ до приблизительно 100 мМ); ионы магния (приблизительно от 1 мМ до приблизительно 50 мМ); макромолекулы с молекулярной массой свыше 20000 Дальтонов, в одном варианте осуществления, присутствуют в количестве, достаточном, чтобы поддерживать эндотелиальную целостность и клеточную жизнеспособность (например, синтетический или природный коллоид, полисахарид, такой как декстран, или полиэтиленгликоль присутствуют при приблизительно от 25 г/л до приблизительно 100 г/л или приблизительно от 40 г/л до приблизительно 60 г/л); антиоксидант (например, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, глутатион, витамин C или витамин Е присутствуют при от приблизительно 25 мкМ до приблизительно 100 мкМ); восстанавливающий агент (например, N-ацетилцистеин присутствует при приблизительно от 0,1 мМ до приблизительно 5 мM); агент, который препятствует вхождению кальция в клетки (например, верапамил присутствует при приблизительно от 2 мкМ до приблизительно 25 мкМ); нитроглицерин (например, от приблизительно 0,05 г/л до приблизительно 0,2 г/л); антикоагулянт, в одном варианте осуществления, присутствует в количестве, достаточном, чтобы помочь предотвратить свертывание остаточной крови (например, гепарин или гирудин присутствуют при концентрации приблизительно от 1000 единиц/л до приблизительно 100000 единиц/л); или амилоридсодержащее соединение (например, амилорид, этилизопропиламилорид, гексаметиленамилорид, диметиламилорид или изобутиламилорид присутствуют при приблизительно от 1,0 мкМ до приблизительно 5 мкМ).
5.5.2 СБОР И ОПЕРАЦИИ С ПЛАЦЕНТОЙ
В общем случае, человеческую плаценту извлекают вскоре после ее удаления после рождения. В предпочтительном варианте осуществления, плаценту извлекают из пациента после информированного согласия и после того как получена полная история болезни пациента и ассоциирована с плацентой. Предпочтительно, историю болезни продолжают после выписки. Такая история болезни может применяться для координации последующего использования плаценты или изолированных плацентарных клеток, собранных из нее. Например, изолированные человеческие плацентарные клетки могут применяться, в свете истории болезни для персонализированного медицинского обслуживания ребенка, ассоциированного с плацентой, или родителей, потомков тех же родителей или других родственников ребенка.
Перед извлечением изолированных плацентарных клеток, кровь пуповины и плацентарную кровь предпочтительно удаляют. В некоторых вариантах осуществления, после доставки, кровь пуповины в плаценте извлекают. Плацента может быть подвергнута общепринятому процессу для извлечения крови пуповины. Обычно применяют иглу или канюлю, чтобы под действием силы тяжести обескровить плаценту (см., например, Anderson, Патент США № 5372581; Hessel et al, Патент США № 5415665). Иглу или канюлю обычно помещают в пупочную вену, и плацента может быть подвергнута осторожному массажу, чтобы способствовать дренированию пуповинной крови из плаценты. Такое извлечение пуповинной крови может осуществляться промышленно, например, LifeBank USA, Cedar Knolls, NJ. Предпочтительно, плаценту дренируют под действием силы тяжести без дополнительных операций, так, чтобы минимизировать разрушение тканей во время извлечение пуповинной крови.
Обычно, плаценту транспортируют из родового зала или родильной комнаты в другое расположение, например, лабораторию для извлечения пуповинной крови и сбора стволовых клеток посредством, например, перфузии или диссоциации тканей. Плаценту предпочтительно транспортируют в стерильном, термоизолированном транспортном устройстве (поддерживая температуру плаценты между 20-28°C), например, помещая плаценту, с пережатой проксимальной пуповиной, в стерильный пластиковый мешок с застежкой типа молния, которую затем помещают в изолированный контейнер. В еще одном варианте осуществления, плаценту транспортируют в наборе для сбора пуповинной крови по существу, как описано в рассматриваемом патенте США № 7147626, раскрытие которого включено здесь посредством ссылки. Предпочтительно, плаценту доставляют в лабораторию от четырех до двадцати четырех часов после родов. В некоторых вариантах осуществления, проксимальную пуповину пережимают, предпочтительно, в пределах 4-5 см (сантиметров) от ввода в плацентарный диск перед извлечением пуповинной крови. В других вариантах осуществления, проксимальную пуповину пережимают после извлечения пуповинной крови, но перед дальнейшей обработкой плаценты.
Плацента перед сбором клеток может храниться в стерильных условиях и при либо комнатной температуре или при температуре, равной от 5°C до 25°C. Плацента может храниться в течение периода от четырех до двадцати четырех часов, вплоть до сорока восьми часов или более сорока восьми часов, перед перфузированием плаценты для удаления остаточной пуповинной крови. В одном варианте осуществления, плаценту собирают от между приблизительно нуля часов до приблизительно двух часов после удаления. Плаценту предпочтительно хранят в растворе антикоагулянта при температуре, равной от 5°C до 25°C. Пригодные антикоагулянтные растворы являются хорошо известными в данной области. Например, может применяться раствор гепарина или варфарина натрия. В предпочтительном варианте осуществления, антикоагулянтный раствор содержит раствор гепарина (например, 1% м/м в 1:1000 растворе). Обескровленную плаценту предпочтительно хранят в течение не более, чем 36 часов перед сбором плацентарных клеток.
Плацента млекопитающих или ее часть, однажды собранная и полученная, в целом, как указано выше, может быть обработана любым образом, известным в данной области, например, может быть подвергнута перфузии или разрушена, например, обработана одним или более тканеразрущающими ферментами, для получения изолированных плацентарных клеток.
5.5.3 ФИЗИЧЕСКОЕ РАЗРУШЕНИЕ И ФЕРМЕНТАТИВНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ ПЛАЦЕНТАРНОЙ ТКАНИ
В одном варианте осуществления, стволовые клетки собирают из плаценты млекопитающих посредством физического разрушения части всего органа. Например, плацента или ее часть, могут быть, например, раздавлены, разрезаны, раскрошены, раздроблены, разрублены, размягчены или т.п. Ткань может затем культивироваться для получения популяции изолированных плацентарных клеток. Обычно, плацентарную ткань разрушают, используя, например, культуральную среду, физиологический раствор или композицию сбора стволовых клеток (см. Раздел 5.5.1 и ниже).
Плацента может быть рассечена на компоненты перед физическим разрушением и/или ферментативным расщеплением и извлечением стволовых клеток. Изолированные плацентарные клетки могут быть получены из всех или части амниотической мембраны, хориона, пуповины, плацентарных котиледонов или любого их сочетания, включая цельную плаценту. Предпочтительно, изолированные плацентарные клетки получают из плацентарной ткани, содержащей амнион и хорион. Типично, изолированные плацентарные клетки могут быть получены посредством разрушения небольшого блока плацентарной ткани, например, блока плацентарной ткани, который составляет приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или приблизительно 1000 кубических миллиметров в объеме. Может применяться любой способ физического разрушения, при условии, что способ разрушения оставляет множество, более предпочтительно большинство, и более предпочтительно, по меньшей мере, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток в указанном органе жизнеспособными, как определяется, например, эксклюзией трипанового синего.
Изолированные адгезивные плацентарные клетки могут в общем случае быть собраны из плаценты или ее части, в любое время в пределах приблизительно первых трех дней после удаления, но предпочтительно между приблизительно 8 часами и приблизительно 18 часами после удаления.
В конкретном варианте осуществления, разрушенную ткань культивируют в среде для культуры ткани, пригодной для пролиферации изолированных плацентарных клеток (см., например, Раздел 5.6, ниже, описывающий культуру плацентарных стволовых клеток).
В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки собирают посредством физического разрушения плацентарной ткани, где физическое разрушение включает ферментативное расщепление (гидролиз), который может завершаться посредством применения одного или более тканерасщепляющих ферментов. Плацента или ее часть могут также быть физически разрушены и расщеплены одним или более ферментами, и полученный в результате материал затем погружают или замешивают в композицию сбора клеток.
Предпочтительная композиция сбора клеток содержит один или более тканеразрушающий фермент(ы). Ферменты, которые могут применяться для разрушения ткани плаценты, включают папаин, дезоксирибонуклеазы, сериновые протеазы, такие как трипсин, химотрипсин, коллагеназа, диспаза или эластаза. Сериновые протеазы могут ингибироваться альфа-2-микроглобулином и, следовательно, среда, применяемая для обработки, обычно не содержит сыворотки. ЭДТА и ДНКаза обычно применяют в методиках ферментной обработки для увеличения эффективности извлечения клеток. Гидролизат после обработки предпочтительно разбавляют так, чтобы избежать улавливания клеток внутрь вязкой среды. Может применяться любая комбинация ферментов для обработки тканей. Типовые концентрации для обработки с использованием трипсина включают, от 0,1% до приблизительно 2% трипсина, например, приблизительно 0,25% трипсина. Протеазы могут применяться в сочетании, что означает, две или более протеаз в одной и той же реакции обработки или могут применяться последовательно, чтобы высвободить плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки и плацентарные мультипотентные клетки. Например, в одном варианте осуществления, плаценту или ее часть, обрабатывают первоначально соответствующим количеством коллагеназы I при приблизительно от 1 до приблизительно 2 мг/мл в течение, например, 30 минут, с последующей обработкой трипсином, при концентрации приблизительно 0,25%, в течение, например, 10 минут, при 37°C. Сериновые протеазы предпочтительно используют последовательно после применения других ферментов.
В еще одном варианте осуществления, ткань может дополнительно быть разрушена посредством добавления хелатообразователя, например, этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (ЭГTA) или этилендиамин тетрауксусной кислоты (ЭДТА) к композиции сбора стволовых клеток, содержащей стволовые клетки, или к раствору, в котором ткань разрушается и/или расщепляется перед выделением стволовых клеток с композицией сбора стволовых клеток.
После расщепления гидролизат промывают, например, три раза культуральной средой, и промытые клетки засевают в колбы для культивирования. Клетки затем выделяют посредством дифференциальной адгезии и характеризуют на предмет, например, жизнеспособности, маркеров поверхности клеток, дифференциации и т.п.
Следует учитывать, что, когда целая плацента или часть плаценты содержит как зародышевые, так и материнские клетки (например, когда часть плаценты содержит хорион или котиледоны), изолированные плацентарные клетки могут содержать смесь плацентарных клеток, полученных как из зародышевых, так и материнских источников. Когда часть плаценты, которая не содержит или содержит очень малое количество материнских клеток, (например, амнион), плацентарные клетки, изолированные из них, будут содержать, почти исключительно, зародышевые плацентарные клетки (то есть, плацентарные клетки, имеющие генотип плода).
Плацентарные клетки, например, плацентарные клетки, описанные в Разделе 5.4.2, выше, могут быть выделены из разрушенной плацентарной ткани посредством дифференциальной трипсинизации (см. Раздел 5.5.5, ниже) с последующим содержанием в культуре в одном или более новых контейнеров культуры в свежей среде для пролиферации, необязательно с последующей второй стадией дифференциальной трипсинизации.
5.5.4 ПЛАЦЕНТАРНАЯ ПЕРФУЗИЯ
Плацентарные клетки, например, плацентарные клетки, описанные в Разделе 5.4.2, выше, могут также быть получены посредством перфузии плаценты млекопитающих. Способы перфузии плаценты млекопитающих для получения плацентарных клеток раскрыты, например, в Hariri, патенты США №№ 7045148 и 7255729, в опубликованных патентных заявках США №№ 2007/0275362 и 2007/0190042, раскрытие каждой из которых включено здесь посредством ссылки во всей полноте.

Плацентарные клетки могут быть собраны посредством перфузии, например, через плацентарную сосудистую сеть, используя, например, композицию сбора клеток в качестве перфузионного раствора. В одном варианте осуществления, плаценту млекопитающих подвергают перфузии посредством пропускания перфузионного раствора через каждую или обе из пупочной артерии и пупочной вены. Поток перфузионного раствора через плаценту может завершаться с использованием, например, гравитационного течения в плаценту. Предпочтительно, перфузионный раствор принудительно прокачивают через плаценту, используя насос, например, перистальтический насос. Пупочная вена может быть, например, катетеризована с помощью канюли, например, TEFLON или пластиковой канюли, которая соединена с устройством стерильного соединения, таким как стерильные трубки. Устройство стерильного соединения соединено с перфузионным сборником.
При подготовке для перфузии, плаценту предпочтительно располагают (например, подвешивают) таким образом, что пупочная артерия и пупочная вена расположены в самой высшей точке плаценты. Плацента может быть подвергнута перфузии посредствомпассажа (пропускания) перфузионной текучей среды через плацентарную сосудистую сеть и окружающие ткани. Плацента может также быть подвергнута перфузии посредством пропускания перфузионной текучей среды через пупочную вену и сбора из пупочных артерий или пропускания перфузионной текучей среды через пупочные артерии и сбора из пупочной вены.
В одном варианте осуществления, например, пупочную артерию и пупочную вену соединяют одновременно, например, с пипеткой, которая соединена через гибкое соединение с резервуаром для перфузионного раствора. Перфузионный раствор пропускают через пупочную вену и артерию. Перфузионный раствор вытекает из и/или проходит через стенки кровеносных сосудов в окружающие ткани плаценты, и собирают в пригодный открытый сосуд с поверхности плаценты, который был присоединен к матке матери во время беременности. Перфузионный раствор может также вводиться через отверстие пуповины и может быть обеспечен его поток или перколяция из отверстий в стенке плаценты, которые обращены в сторону стенки матки матери. Плацентарные клетки, которые собирают посредством этого способа, который может именоваться способом "пэннинга", представляют собой обычно смесь зародышевых и материнских клеток.
В еще одном варианте осуществления, перфузионный раствор пропускают через пупочные вены и собирают из пупочной артерии или пропускают через пупочные артерии и собирают из пупочных вен. Плацентарные клетки, собранные посредством этого способа, который может называться способ "замкнутого контура", обычно являются почти исключительно зародышевыми.
Следует учитывать, что перфузия с использованием способа пэннинга, посредством которого перфузат собирают после его истечения из материнской стороны плаценты, приводит к смеси зародышевых и материнских клеток. В результате, клетки, собранные посредством этого способа, могут содержать смешанную популяцию плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток или плацентарных мультипотентных клеток, как зародышевого, так и материнского происхождения. Напротив, перфузия исключительно через плацентарную сосудистую сеть в способе замкнутого контура, в котором перфузионная текучая среда проходит через один или два плацентарных сосуда, и собирается исключительно через оставшиеся сосуд(ы), приводит к сбору популяции плацентарных клеток почти исключительно зародышевого происхождения.
Способ перфузии с замкнутым контуром может, в одном варианте осуществления, быть осуществлен следующим образом. Post-partum плаценту получают в пределах приблизительно 48 часов после родов. Пуповину пережимают и обрезают выше зажима. Пуповину можно отбросить или обработать для извлечения, например, стволовых клеток пуповины и/или обработать мембрану пуповины для получения биоматериала. Амниотическая мембрана может быть удержана во время перфузии или может быть отделена от хориона, например, с использованием blunt рассечения с помощью пальцев. Если амниотическую мембрану отделяют от хориона перед перфузией, она может быть, например, отброшена или обработана, например, для получения стволовых клеток посредством ферментативного расщепления или для получения, например, биоматериала амниотической мембраны, например, биоматериала, описанного в Опубликованной патентной заявке США № 2004/0048796, раскрытие которой включено здесь посредством ссылки во всей полноте. После очистки плаценты от всех видимых кровяных сгустков и остаточной крови, например, используя стерильную gauze, сосуды пуповины экспонируют, например, посредством частичного среза мембраны пуповины, чтобы экспонировать поперечное сечение пуповины. Сосуды идентифицируют и открывают, например, продвигая закрытый хирургический зажим через отрезанный конец каждого сосуда. Устройство, например, пластиковые трубки, соединенные с перфузионным устройством или перистальтическим насосом, затем вводят в каждую из плацентарных артерий. Насос может представлять собой любой насос, пригодный для этой цели, например, перистальтический насос. Пластиковую трубку, соединенную со стерильным резервуаром для сбора, например мешком для крови, таким как сборный мешок объемом 250 мл, затем вводят в плацентарную вену. Альтернативно, трубку, соединенную с насосом, вводят в плацентарную вену, и трубки к резервуару(ам) для сбора вводят в одну или обе плацентарные артерии. Плаценту затем подвергают перфузии объемом перфузионного раствора, например, приблизительно 750 мл перфузионного раствора. Клетки в перфузате затем собирают, например, посредством центрифугирования. В некоторых вариантах осуществления, плаценту подвергают перфузии перфузионным раствором, например, 100-300 мл перфузионного раствора, для удаления остаточной крови перед перфузией для сбора плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток и/или плацентарных мультипотентных клеток. В еще одном варианте осуществления, плаценту не подвергают перфузии перфузионным раствором для удаления остаточной крови перед перфузией для сбора плацентарных клеток.
В одном варианте осуществления проксимальную пуповину пережимают во время перфузии, и более предпочтительно, пережимают в пределах 4-5 см (сантиметров) от входа пуповины в плацентарный диск.
Первый сбор перфузионной текучей среды из плаценты млекопитающих во время процесса обескровливания обычно окрашен остаточными красными кровяными клетками крови пуповины и/или плацентарной крови. Перфузионная текучая среда становится более бесцветной, по мере того, как протекает перфузия, и остаточная кровяные клетки пуповины вымываются из плаценты. В целом, от 30 до 100 мл (миллилитров) перфузионной текучей среды являются достаточными для начального обескровливания плаценты, но более или менее перфузионной текучей среды может использоваться в зависимости от наблюдаемых результатов.
Объем перфузионной жидкости, применяемой для выделения плацентарных клеток может изменяться в зависимости от количества клеток, подлежащих сбору, размера плаценты, числа сборов, которые нужно проделать из единичной плаценты и т.д. В различных вариантах осуществления, объем перфузионной жидкости может составлять от 50 мл до 5000 мл, 50 мл до 4000 мл, 50 мл до 3000 мл, 100 мл до 2000 мл, 250 мл до 2000 мл, 500 мл до 2000 мл или 750 мл до 2000 мл. Типично, плаценту подвергают перфузии с 700-800 мл перфузионной жидкости с последующим обескровливанием.
Плацента может подвергаться перфузии множество раз в течение курса из нескольких часов часов или нескольких дней. Когда плаценту подвергают перфузии множество раз, ее можно поддерживать или культивировать при асептических условиях в контейнере или другом пригодном сосуде, и проводить перфузию с композицией клеточного сбора или стандартным перфузионным раствором (например, нормальным физиологическим раствором, таким как забуференный фосфатом физиологический раствор("PBS")) с антикоагулянтом (например, гепарином, варфарином натрия, кумарином, бисгидроксикумарином) или без него, с антимикробным агентом (например, β-меркаптоэтанолом (0,1 мM) или без него; антибиотиками, такими как стрептомицин (например, при 40-100 мкг/мл), пенициллин (например, at 40 Ед/мл), амфотерицином B (например, при 0,5 мкг/мл). В одном варианте осуществления, изолированную плаценту поддерживают или культивируют в течение периода времени без сбора перфузата, так, чтобы плацента поддерживалась или культивировалась в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 часов или 2 или 3 или более дней перед перфузией и сбором перфузата. Плацента, подвергающаяся перфузии может поддерживаться в течение одного или более дополнительных раз, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или более часов, и подвергаться перфузии второй раз с использованием, например, 700-800 мл перфузионной текучей среды. Плацента может подвергаться перфузии 1, 2, 3, 4, 5 или более раз, например, однократно каждые 1, 2, 3, 4, 5 или 6 часов. В предпочтительном варианте осуществления, перфузию плаценты и сбор перфузионного раствора, например, композиции клеточного сбора, повторяют, пока число извлеченных клеток, имеющих ядро не упадет ниже 100 клеток/мл. Перфузаты в различные моменты времени могут быть индивидуально обработаны для извлечения зависимых от времени популяций клеток, например, стволовых клеток. Перфузаты от различных моментов времени могут также быть объединены. В предпочтительном варианте осуществления, плацентарные клетки собирают во время или несколько раз между приблизительно 8 часами и приблизительно 18 часами после удаления.
Перфузия предпочтительно приводит к сбору существенно большего количества плацентарных клеток, чем количество, получаемое из плаценты млекопитающих, не подвергаемой перфузии с применением указанного раствора, и не обработанных другим образом для получения плацентарных клеток (например, посредством разрушения тканей, например, ферментативного расщепления). В этом контексте, "существенно большее" означает, по меньшей мере, на 10% больше. Перфузия дает на выходе существенно больше плацентарных клеток, чем, например, число плацентарных клеток, выделяемых из культуральной среды, в которой плацента или ее часть культивировались.
Плацентарные клетки могут быть выделены из плаценты посредством перфузии с помощью раствора, содержащего одну или более протеаз или других тканеразрушающих ферментов. В конкретном варианте осуществления, плаценту или ее часть (например, амниотическая мембрана, амнион и хорион, плацентарные долька или котиледон, пуповина или сочетание любых из приведенных выше) доводят до 25-37°C, и инкубируют с одним или более тканеразрушающими ферментами в 200 мл культуральной среды в течение 30 минут. Клетки из перфузат собирают, доводят до 4°C, и промывают холодной ингибиторной смесью, содержащей 5 мМ ЭДТА, 2 мМ дитиотреитола и 2 мМ бета-меркаптоэтанола. Плацентарные клетки промывают через несколько минут холодной (например, 4°C) композицией сбора стволовых клеток.
5.5.5
ВЫДЕЛЕНИЕ, СОРТИРОВКА И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ ПЛАЦЕНТАРНЫХ КЛЕТОК
Изолированные плацентарные клетки, например, клетки, описанные в Разделе 5.4.2, выше, полученные либо посредством перфузии или физического разрушения, например, посредством ферментативного расщепления, могут первоначально быть очищены (т.е., быть изолированы от) других клеток посредством градиентного центрифугирования Фиколла. Такое центрифугирование может следовать любому стандартному протоколу для скорости цетрифугирования и т.д. В одном варианте осуществления, например, клетки, собранные из плаценты, извлекают из перфузата посредством центрифугирования при 5000×g в течение 15 минут при комнатной температуре, которое отделяет клетки от, например, загрязняющих остатков и тромбоцитов. В еще одном варианте осуществления, плацентарный перфузат концентрируют до приблизительно 200 мл, осторожно выстилают слоем над Фиколл, и центрифугируют при приблизительно 1100×g в течение 20 минут при t 22°C и межфазный слой клеток с низкой плотностью собирают для дальнейшей обработки.
Осадки клеток могут быть ресуспендированы в свежей композиции сбора стволовых клеток или среде, пригодной для поддержания клеток, например, поддержания стволовых клеток, например, среде IMDM, не содержащей сыворотки, содержащей 2 Ед/мл гепарина и 2 мМ ЭДТА (GibcoBRL, NY). Полная фракция моноядерных клеток может быть выделена, например, с использованием Lymphoprep (Nycomed Pharma, Осло, Норвегия) в соответствии с рекомендованной методикой производителя.
6
2
Плацентарные клетки, полученные посредством перфузии или расщепления могут, например, быть дополнительно или первоначально изолированы посредством дифференциальной трипсинизации с использованием, например, раствора 0,05% трипсина с 0,2% ЭДТА (Sigma, St. Louis MO). Дифференциальная трипсинизация является возможной, поскольку изолированные плацентарные клетки, которые представляют собой культуру ткани, адгезивную к пластику, обычно, отсоединяются от пластиковых поверхностей в пределах приблизительно пяти минут, в то время как для других адгезивных популяций обычно требуется более, чем 20-30 минут инкубации. Отсоединенные плацентарные клетки могут быть собраны после трипсинизации и нейтрализации трипсина, с использованием, например, Раствора для Нейтрализации Трипсина (TNS, Cambrex). В одном варианте осуществления выделения адгезивных клеток, аликвоты, составляющие, например, приблизительно 5-10×10 клеток помещают в каждую из нескольких колб T-75, предпочтительно колб Т75, покрытых фибронектином. В таком варианте осуществления, клетки могут культивироваться вместе с промышленно доступной Средой для Роста Мезенхимальных Стволовых Клеток (MSCGM) (Cambrex), и помещаться в инкубатор для культуры ткани (37°C, 5% CO). Через 10-15 дней, неадгезивные клетки удаляют из колб посредством промывки с помощью PBS. PBS затем заменяют на MSCGM. Колбы предпочтительно обследуют ежедневно на предмет наличия различных типов адгезивных клеток и, в частности, для идентификации и распространения кластеров фибробластоидных клеток.
+
+
Число и тип клеток, собранных из плаценты млекопитающих могут регистрироваться, например, посредством измерения изменений морфологии и маркеров поверхности клеток с использованием стандартных методов обнаружения клеток, таких как проточная цитометрия, сортировка клеток, иммуноцитохимия (например, окрашивание с помощью антител, специфичных к ткани или клеточным маркерам) сортировка клеток, активируемая флуоресценцией (FACS), сортировка клеток, активируемая магнитным полем (MACS), посредством обследования морфологии клеток с использованием световой или конфокальной микроскопии и/или посредством измерения изменений в генной экспрессии с использованием методов, хорошо известных в данной области, таких как ПЦР и профилирование генной экспрессии. Эти методы могут применяться, также для идентификации клеток, которые являются положительными для одного или более конкретных маркеров. Например, с использованием антител к CD34, можно определить, с использованием методов, приведенных выше, содержит ли клетка обнаруживаемое количество CD34; если так, клетка является CD34. Аналогично, если клетка продуцирует достаточно OCT-4 РНК, обнаруживаемых посредством RT-ПЦР или значительно больше OCT-4 РНК, чем взрослая клетка, клетка является OCT-4. Антитела к маркерам поверхности клеток (например, CD маркеры, такие как CD34) и последовательность генов, специфичных для стволовых клеток, такая как OCT-4, являются хорошо известными в данной области.
Плацентарные клетки, особенно, клетки, которые были изолированы посредством разделения по Фиколл, дифференциальной адгезии или сочетания обоих методов, могут быть отсортированы с использованием сортировки клеток, активированной флуоресценцией (FACS). Сортировка клеток, активированная флуоресценцией (FACS), представляет собой хорошо известный способ разделения частиц, включая клетки, основанный на флуоресцентных свойствах частиц (Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165). Лазерное возбуждение флуоресцентных фрагментов в индивидуальных частицах приводит к повлению небольшого электрического заряда, позволяющего проводить электромагнитное разделение положительных и отрицательных частиц из смеси. В одном варианте осуществления, специфичные антитела к маркерам клеточной поверхности или лиганды метят различимыми флуоресцентными метками. Клетки обрабатывают через сортировщик клеток, позволяющий проводить разделение клеток на основании их способности связываться с применяемыми антителами. Частицы, отсортированные FACS могут быть непосредственно осаждены в индивидуальных лунках 96-луночных или 384-луночных планшетов для облегчения разделения и клонирования.
-
+
+
-
+
+
+
+
-
-
-
В одной схеме сортирования, клетки из плаценты, например, сортируют на основе экспрессии одного или более из маркеров CD34, CD38, CD44, CD45, CD73, CD105, OCT-4 и/или HLA-G. Это может завершаться в связи с методиками для выбора таких клеток на основании их адгезивных свойств в культуре. Например, выбор культуры ткани по адгезии к пластику может завершаться перед или после сортировки на основе экспрессии маркера. В одном варианте осуществления, например, клетки сортируют сначала на основании их экспрессии CD34; CD34 удерживаются, и CD34- клетки, которые представляют собой дополнительно CD200HLA-G отделяют от других CD34 клеток. В еще одном варианте осуществления, клетки из плаценты сортируют на основании их экспрессии маркеров CD200 и/или HLA-G; например, клетки, проявляющие оба этих маркера, выделяют для дальнейшего применения. Клетки, которые экспрессируют, например, CD200 и/или HLA-G могут, в конкретном варианте осуществления, дополнительно могут сортироваться на основании их экспрессии CD73 и/или CD105 или эпитопов, распознаваемых антителами SH2, SH3 или SH4 или отсутствия экспрессии CD34, CD38 или CD45. Например, в еще одном варианте осуществления, плацентарные клетки сортируют посредством экспрессии или ее отсутствия CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38 и CD45, и плацентарные клетки, которые представляют собой CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38 и CD45 выделяют из других плацентарных клеток для дальнейшего применения.
В конкретных вариантах осуществления любых из приведенных выше вариантах осуществления сортированных плацентарных клеток, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% клеток в клеточной популяции, оставшиеся после сортировки представляют собой указанные изолированные плацентарные клетки. Плацентарные клетки могут сортироваться посредством одного или более из любых маркеров, описанных в Разделе 5.4.2, выше.
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
В конкретном варианте осуществления, плацентарные клетки, которые являются (1) адгезивными к пластику для культур тканей и (2) CD10, CD34 и CD105,сортируют от (т.е., изолируют из) других плацентарных клеток. В еще одном конкретном варианте осуществления, плацентарные клетки, которые являются (1) адгезивными к пластику для культур тканей и (2) CD10, CD34, CD105 и CD200 сортируют от (т.е., изолируют из) других плацентарных клеток. В еще одном конкретном варианте осуществления, плацентарные клетки, которые являются (1) адгезивными к пластику для культур тканей и (2) CD10, CD34-, CD45-, CD90, CD105 и CD200, сортируют от (т.е., изолируют из) других плацентарных клеток.
Что касается опосредованного антителами обнаружения и сортировки плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток или плацентарных мультипотентных клеток, любые антитела, специфичные для конкретного маркера, могут применяться в сочетании с любым флуорофором или другой метки, пригодной для обнаружения и сортировки клеток (например, сортировки клеток, активированной флуоресценцией). Сочетания антитело/флуорофор для конкретных маркеров включают, но не ограничены ими, конъюгированные с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) моноклональные антитела против HLA-G (доступные от Serotec, Raleigh, North Carolina), CD10 (доступные от BD Immunocytometry Systems, San Jose, California), CD44 (доступные от BD Biosciences Pharmingen, San Jose, California), и CD 105 (доступные от R&D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota); конъюгированные с фикоэритрином (PE) моноклональные антитела против CD44, CD200, CDl 17 и CD 13 (BD Biosciences Pharmingen); конъюгированные с фикоэритрином-Cy7 (PE Cy7) моноклональные антитела против CD33 и CD10 (BD Biosciences Pharmingen); стрептавидин, конъюгированный с аллофикоцианином (APC) и моноклональными антителами против CD38 (BD Biosciences Pharmingen); и Биотинилированный CD90 (BD Biosciences Pharmingen). Другие антитела, которые могут применяться, включают, но не ограничены ими, CD133-APC (Miltenyi), KDR-Biotin (CD309, Abeam), CytokeratinK-Fitc (Sigma или Dako), HLA ABC- Fitc (BD), HLA DR,DQ,DP-PE (BD), β-2-микроглобулин-PE (BD), CD80-PE (BD) и CD86-APC (BD).
Другие сочетания антитело/метка, которые могут применяться включают, но не ограничены ими, CD45-PerCP (перидинхлорофилл белок); CD44-PE; CD19-PE; CD10-F (флуоресцеин); HLA-G-F и 7-амино-актиномицин-D (7-AAD); HLA-ABC-F; и т.п.
Изолированные плацентарные клетки, предоставленные здесь могут быть проанализированы на CD1l7 или CD133 с использованием, например, стрептавидина, конъюгированного с фикоэритрином-Cy5 (PE Cy5) и моноклональных антител против CDl 17 или CD 133, конъюгированных с биотином; однако при использовании этой ситемы, клетки могут проявляться как положительные для CDl17 или CDl33, соответственно, вследствие относительно низкого фона.
Изолированные плацентарные клетки могут быть мечены антителом к единственному маркеру и обнаружены и/сортированы. Плацентарные клетки могут также одновременно быть помечены множеством антител к различным маркерам.
В еще одном варианте осуществления, для разделения клеток могут применяться магнитные шарики. Клетки могут быть сортированы с использованием метода сортирования клеток с активацией магнитным полем (MACS), способа разделения частиц на основании их способности связываться с магнитными шариками (0,5-100 мкм в диаметре). Разнообразные применимые модификации могут осуществляться на магнитных микросферах, включая ковалентное присоединение антитела, которое специфически распознает конкретную молекулу поверхности клетки или гаптен. Шарики затем смешивают с клетками для обеспечения связывания. Клетки затем пропускают через магнитное поле для выделения клеток, имеющих специфический маркер поверхности клетки. В одном варианте осуществления, эти клетки могут затем выделяться и повторно смешиваться с магнитными шариками, связанными с антителом против дополнительных маркеров поверхности клеток. Клетки снова пропускают через магнитное поле, выделяя клетки, которые связались с двумя антителами. Такие клетки могут затем быть разделены в отдельные чашки, такие как микротитровальные чашки для выделения клонов.
+
Изолированные плацентарные клетки могут также быть характеризованы и/или отсортированы на основании клеточной морфологии и характеристик роста. Например, изолированные плацентарные клетки могут быть характеризованы, как имеющие и/или быть выбраны на основании, например, появления фибробластоидов в культуре. Изолированные плацентарные клетки могут также быть характеризованы как имеющие и/или быть выбраны на основании их способности к образованию эмбриоид-подобных телец. В одном варианте осуществления, например, плацентарные клетки, которые являются фибробластоидными по форме, экспрессируют CD73 и CD105, и продуцируют одно или более эмбриоид-подобных телец в культуре, отделяют от других плацентарных клеток. В еще одном варианте осуществления, OCT-4 плацентарные клетки, которые продуцируют одно или более эмбриоид-подобных телец в культуре отделяют от других плацентарных клеток.
В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки могут быть идентифицированы и характеризованы по данным анализа на колониеобразующие единицы. Анализы на колониеобразующие единицы являются общеизвестными в данной области, такие как среда MESEN CULT™ (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver British Columbia).
Изолированные плацентарные клетки могут подвергаться оценке на жизнеспособность, потенциал пролиферации и продолжительность жизни с использованием стандартных методов, известных в данной области, таких как эксклюзионный анализ с трипановым синим, анализ на захват диацетата флуоресцеина, анализ на захват пропидиййодида (для оценки жизнеспособности); и анализ на поглощение тимидина, анализ на пролиферацию MTT клеток (для оценки пролиферации). Продолжительность жизни может быть определена посредством способов, хорошо известных в данной области, таких как посредством определения максимального числа удвоений популяции в распространенной культуре.
Изолированные плацентарные клетки, например, изолированные плацентарные клетки, описанные в Разделе 5.4.2, выше, могут быть также отделены от других плацентарных клеток с использованием других методов, известных в данной области, например, селективного роста желательных клеток (положительная селекция), селективного разрушения нежелательных клеток (отрицательная селекция); разделения, основанного на дифференциальной способности клеток к агглютинации в смешанной популяция как, например, с соевым агглютинином; методик замораживания-оттаивания; фильтрации; общепринятого и зонального цетрифугирования; центрифужной элютриации (противоточного цетрифугирования); разделения под действием силы тяжести; противоточного распределения; электрофореза; и т.п.
5.6 КУЛЬТУРА ИЗОЛИРОВАННЫХ ПЛАЦЕНТАРНЫХ КЛЕТОК
5.6.1 КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СРЕДА
Изолированные плацентарные клетки или популяции изолированных плацентарных клеток или клетки или плацентарные ткани, из которых вырастают плацентарные стволовые клетки, могут применяться для инициации или посева культур клеток. Клетки в общем случае переносят в стерильные сосуды для культуры ткани, либо непокрытые или покрытые внеклеточным матриксом или лигандами, такими как ламинин, коллаген (например, нативный или денатурированный), желатин, фибронектин, орнитин, витронектин и белок внеклеточной мембраны (например, MATRIGEL (BD Discovery Labware, Bedford, Mass.)).
Изолированные плацентарные клетки могут культивироваться в любой среде и при любых условиях, признанных в области как приемлемых для культуры клеток, например, стволовых клеток. Предпочтительно, культуральная среда содержит сыворотку. Изолированные плацентарные клетки могут культивироваться в, например, DMEM-LG (незаменимой модифицированной среде Дульбекко, с низкой глюкозой)/MCDB 201 (базальная среда фибробластов цыплят), содержащей ITS (инсулин-трансферрин-селен), LA+BSA (линолевая кислота-альбумин бычьей сыворотки), дексаметазон L-аскорбиновая кислота, PDGF, EGF, IGF-I, и пенициллин/стрептомицин; DMEM-HG (высокая глюкоза), содержащей 10% зародышевую бычью сыворотку (FBS); DMEM-HG, содержащей 15% FBS; IMDM (модифицированной Исковым среде Дульбекко), содержащей 10% FBS, 10% лошадиной сывороти и гидрокортизон; M199, содержащей от 1% до 20% FBS, EGF и гепарин; α-MEM (минимальной незаменимой среде), содержащей 10% FBS, GLUTAMAX™ и гентамицин; DMEM, содержащей 10% FBS, GLUTAMAX™ и гентамицин и т.д.
Другие среды, которые могут применяться для культивирования плацентарных клеток, включают DMEM (с высокой или низкой глюкозой), базальную среду Игла, Fl0 среду Хама (Fl0), F-12 среду Хама (F12), модифицированную Исковым среду Дульбекко, среду для роста мезенхимальных стволовых Клеток (MSCGM), L-15 среду Лейбовица, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, улучшенную DMEM (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma), и CELL-GRO FREE.
Культуральная среда может быть дополнена одним или более компонентами, включающими, например, сыворотку (например, зародышевую бычью сыворотку (FBS), предпочтительно приблизительно 2-15% (о/о); кобылью (лошадиную) сыворотку (ES); человеческую сыворотку (HS)); бета-меркаптоэтанол (BME), предпочтительно приблизительно 0,001% (о/о); один или более факторов роста, например, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), эпидермальный фактор роста (EGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), инсулиноподобный фактор роста - 1 (IGF-1), фактор ингибирующий лейкемию (LIF), фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) и эритропоэтин (EPO); аминокислоты, включая L-валин; и один или более антибиотиков и/или антимикотических средств для контроля микробной контаминации, такие как, например, пенициллин G, стрептомицина сульфат, амфотерицин B, гентамицин и нистатин, либо по отдельности или в сочетании.
4
Изолированные плацентарные клетки могут культивироваться в стандартных условиях для культуры ткани, например, в чашках для культуры ткани или многолуночных планшетах. Изолированные плацентарные клетки могут также культивироваться с использованием способа висящей капли. В этом способе изолированные плацентарные клетки суспендируют при приблизительно 1×10 клеток на мл в приблизительно 5 мл среды, и одну или более капель среды помещают на внутренней поверхности крышки контейнера для культуры ткани, например, 100 мл чашки Петри. Капли могут представлять собой, например, единичные капли или множество капель из, например, многоканального пипетирующего устройства. Крышку осторожно переворачивают и помещают на верхушке дна чашки, которая содержит объем жидкости, например, стерильного PBS, достаточный для поддержания содержания влаги в атмосфере чашки и стволовые клетки культивируют.
В одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки культивируют в присутствии соединения, которое действует для поддержания недифференцированного фенотипа в изолированных плацентарных клетках. В конкретном варианте осуществления, соединение представляет собой замещенный 3,4-дигидропиридимол [4,5-d]пиримидин. В более конкретном варианте осуществления, соединение представляет собой соединение, имеющее следующую химическую структуру:
Соединение может контактировать с изолированными плацентарными клетками или популяцией изолированных плацентарных клеток, при концентрации, например, между от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 10 мкМ.
5.6.2 РАСПРОСТРАНЕНИЕ И ПРОЛИФЕРАЦИЯ ПЛАЦЕНТАРНЫХ КЛЕТОК
in vivo
in vitro
Однократно изолированная плацентарная клетка или популяция изолированных плацентарных клеток (например, плацентарная клетка или популяция плацентарных клеток, отделенные от, по меньшей мере, 50% плацентарных клеток, с которыми стволовая клетка или популяция стволовых клеток в норме ассоциированы ), клетка или популяция клеток могут быть подвергнуты пролиферации и распространению . Например, популяция изолированных плацентарных клеток может культивироваться в контейнерах для культуры ткани, например, чашках, колбах, многолуночных планшетах или т.п., в течение достаточного времени для пролиферации клеток до 70-90% слияния, то есть до тех пор, пока клетки и их потомство не займет 70-90% площади поверхности культивирования контейнера для культуры ткани.
2
2
2
2
2
Изолированные плацентарные клетки могут быть высеяны в сосудах для культур при плотности, которая обеспечивают рост клеток. Например, клетки могут быть высеяны при низкой плотности (например, приблизительно от 1000 до приблизительно 5000 клеток/см) до высокой плотности (например, приблизительно 50000 или более клеток/см). В предпочтительном варианте осуществления, клетки культивируют в присутствии приблизительно от 0 до приблизительно 5 процентов по объему CO в воздухе. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, клетки культивируют при приблизительно от 2 до приблизительно 25 процентов O в воздухе, предпочтительно приблизительно от 5 до приблизительно 20 процентов O в воздухе. Клетки предпочтительно культивируют при приблизительно 25°C до приблизительно 40°C, Предпочтительно 37°C. Клетки предпочтительно культивируют в инкубаторе. Культуральная среда может быть статической или возбуждаемой, например, с использованием биореактора. Плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки или плацентарные мультипотентные клетки, предпочтительно выращивают в условиях низкого окислительного стресса (например, с добавлением глутатиона, аскорбиновой кислоты, каталазы, токоферола, N-ацетилцистеина или т.п.).
2
Как только получают слияние менее, чем 100%, например, от 70% до 90%, клетки могут быть подвергнуты пассажу. Например, клетки могут быть ферментативно обработаны, например, трипсинизированы, с использованием методов, хорошо известных в области, для отделения их от поверхности культуры ткани. После удаления клеток посредством пипетирования и подсчета клеток, приблизительно 10000-100000 клеток/см подвергаются пассажу (пересевают) в новый контейнер для культуры, содержащий свежую культуральную среду. Типично, новая среда представляет собой тот же тип среды, из которой были удалены изолированные плацентарные клетки. Изолированные плацентарные клетки могут быть пересеяны приблизительно, по меньшей мере, или не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 или 20 раз или более.
5.6.3 ПОПУЛЯЦИИ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПЛАЦЕНТАРНЫХ КЛЕТОК
Также здесь предоставлены популяции изолированных плацентарных клеток, например, изолированные плацентарные клетки, описанные в Разделе 5.4.2, выше, применимые для лечения нарушения кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС. Популяции изолированных плацентарных клеток могут быть выделены непосредственно из одной или более плацент; то есть клеточная популяция может представлять собой популяцию плацентарных клеток, содержащую изолированные плацентарные клетки, где изолированные плацентарные клетки получают из или содержат внутри перфузата, или получают из или содержат внутри, разрушенной плацентарной ткани, например, ферментативном гидролизате плацентарной ткани (то есть сборе клеток, полученных посредством ферментативного расщепления плаценты или ее части). Изолированные плацентарные клетки, описанные здесь, могут также культивироваться и распространяться для получения популяции изолированных плацентарных клеток. Популяции плацентарных клеток, содержащие изолированные плацентарные клетки, могут также культивироваться и распространяться для получения популяций плацентарных клеток.
Популяции плацентарных клеток, применимые в способах лечения, предоставленных здесь, содержат изолированные плацентарные клетки, например, изолированные плацентарные клетки как описано здесь в Разделе 5.4.2. В различных вариантах осуществления, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% клеток в плацентарной клеточной популяции представляют собой изолированные плацентарные клетки. Это означает, что популяция изолированных плацентарных клеток может содержать, например, так много как 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% клеток, которые не являются изолированными плацентарными клетками.
Популяции изолированных плацентарных клеток, применимые для лечения нарушение кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС, могут быть получены посредством, например, селекции изолированных плацентарных клеток, полученных либо в результате ферментативного расщепления или перфузии, которые экспрессируют конкретные маркеры и/или проявляют конкретные характеристики культуры или морфологические характеристики. В одном варианте осуществления, например, клеточную популяцию получают посредством селекции плацентарных клеток, которые (a) прилипают к субстрату и (b) экспрессируют CD200 и HLA-G; и отделения указанных клеток от других клеток для образования популяции клеток. В еще одном варианте осуществления, клеточную популяцию получают посредством селекции плацентарных клеток, которые экспрессируют CD200 и HLA-G, и отделения указанных клеток от других клеток для образования популяции клеток. В еще одном варианте осуществления, клеточную популяцию получают посредством селекции плацентарных клеток, которые (a) прилипают к субстрату, и (b) экспрессируют CD73, CDl05, и CD200; и отделения указанных клеток от других клеток для образования популяции клеток. В еще одном варианте осуществления, клеточную популяцию получают посредством идентификации плацентарных клеток, которые экспрессируют CD73, CD105, и CD200, и отделения указанных клеток от других клеток для образования популяции клеток. В еще одном варианте осуществления, клеточную популяцию получают посредством селекции плацентарных клеток, которые (a) прилипают к субстрату и (b) экспрессируют CD200 и OCT-4; и отделения указанных клеток от других клеток для образования популяции клеток. В еще одном варианте осуществления, клеточную популяцию получают посредством селекции плацентарных клеток, которые экспрессируют CD200 и OCT-4, и отделения указанных клеток от других клеток для образования популяции клеток. В еще одном варианте осуществления, клеточную популяцию получают посредством селекции плацентарных клеток, которые (a) прилипают к субстрату, (b) экспрессируют CD73 и CD105, и (c) способствуют образованию одного или более эмбриоид-подобных телец в популяции плацентарных клеток, содержащей указанные стволовые клетки, когда указанную популяцию культивируют в условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобного тельца; и отделения указанных клеток от других клеток для образования популяции клеток. В еще одном варианте осуществления, клеточную популяцию получают посредством селекции плацентарных клеток, которые экспрессируют CD73 и CD105, и способствуют образованию одного или более эмбриоид-подобных телец в популяции плацентарных клеток, содержащей указанные стволовые клетки, когда указанную популяцию культивируют в условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобного тельца, и отделения указанных клеток от других клеток для образования популяции клеток. В еще одном варианте осуществления, клеточную популяцию получают посредством селекции плацентарных клеток, которые (a) прилипают к субстрату, и (b) экспрессируют CD73, CD105 и HLA-G; и отделения указанных клеток от других клеток для образования популяции клеток. В еще одном варианте осуществления, клеточную популяцию получают посредством селекции плацентарных клеток, которые экспрессируют CD73, CD105 и HLA-G, и отделения указанных клеток от других клеток для образования популяции клеток. В еще одном варианте осуществления, способ получения клеточной популяции включает в себя селекцию плацентарных клеток, которые (a) прилипают к субстрату, (b) экспрессируют OCT-4, и (c) способствуют образованию одного или более эмбриоид-подобных телец в популяции плацентарных клеток, содержащей указанные стволовые клетки, когда указанную популяцию культивируют в условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобного тельца; и отделения указанных клеток от других клеток для образования популяции клеток. В еще одном варианте осуществления, клеточную популяцию получают посредством селекции плацентарных клеток, которые экспрессируют OCT-4, и способствуют образованию одного или более эмбриоид-подобных телец в популяции плацентарных клеток, содержащей указанные стволовые клетки, когда указанную популяцию культивируют в условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобного тельца, и отделения указанных клеток от других клеток для образования популяции клеток.
В еще одном варианте осуществления, клеточную популяцию получают посредством селекции плацентарных клеток, которые (a) прилипают к субстрату, и (b) экспрессируют CD10 и CD105, и не экспрессируют CD34; и отделения указанных клеток от других клеток для образования популяции клеток. В еще одном варианте осуществления, клеточную популяцию получают посредством селекции плацентарных клеток, которые экспрессируют CD10 и CD105, и не экспрессируют CD34, и отделения указанных клеток от других клеток для образования популяции клеток. В еще одном варианте осуществления, клеточную популяцию получают посредством селекции плацентарных клеток, которые (a) прилипают к субстрату, и (b) экспрессируют CD10, CD105, и CD200, и не экспрессируют CD34; и отделения указанных клеток от других клеток для образования популяции клеток. В еще одном варианте осуществления, клеточную популяцию получают посредством селекции плацентарных клеток, которые экспрессируют CD10, CD105, и CD200, и не экспрессируют CD34, и отделения указанных клеток от других клеток для образования популяции клеток. В еще одном более конкретном варианте осуществления, клеточную популяцию получают посредством селекции плацентарных клеток, которые (a) прилипают к субстрату, и (b) экспрессируют CD10, CD90, CD105 и CD200, и не экспрессируют CD34 и CD45; и отделения указанных клеток от других клеток для образования популяции клеток. В еще одном более конкретном варианте осуществления, клеточную популяцию получают посредством селекции плацентарных клеток, которые экспрессируют CD10, CD90, CD 105 и CD200, и не экспрессируют CD34 и CD45, и отделения указанных клеток от других клеток для образования популяции клеток.
Такие клеточные популяции или их сочетания могут применяться для лечения нарушения кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС, например, симптома нарушения или неврологического дефицита присущих для такого нарушения.
В любом из приведенных выше вариантов осуществления, селекция изолированных клеточных популяций может дополнительно включать в себя селекцию плацентарных клеток, которые экспрессируют ABC-p (плацента-специфичный ABC транспортерный белок; см., например, Allikmets et al., Cancer Res. 58(23):5337-9 (1998)). Способ может также включать в себя селекцию клеток, проявляющих, по меньшей мере, одну характеристику, специфичную для, например, мезенхимальных стволовых клеток, например, экспрессию CD44, экспрессию CD90 или экспрессию сочетания из перечисленных выше.
В приведенных выше вариантах осуществления, субстрат может представлять собой любую поверхность, на которой культивирование и/или селекция клеток, например, изолированных плацентарных клеток, могут завершаться. Типично, субстрат является пластиком, например, чашкой для культуры ткани или многолуночным планшетом из пластика. Пластик для культуры ткани может быть покрыт биомолекулами, например, ламинином или фибронектином.
Клетки, например, изолированные плацентарные клетки, могут быть отобраны для плацентарной клеточной популяции посредством любых средств, известных в области селекции клеток. Например, клетки могут быть отобраны с использованием антитела или антител к одному или более маркерам поверхности клеток, например, в проточной цитометрии или FACS. Селекция может завершаться с использованием антител в сочетании с магнитными шариками. Антитела, которые являются специфичными для некоторых маркеров, специфичных для стволовых клеток, являются известными в данной области. Например, антитела к OCT-4 (Abeam, Cambridge, MA), CD200 (Abeam), HLA-G (Abeam), CD73 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), CD 105 (Abeam; BioDesign International, Saco, ME) и т.д. Антитела к другим маркерам также являются доступными на рынке, например, CD34, CD38 и CD45 доступны от, например, StemCell Technologies или BioDesign International.
Популяции изолированных плацентарных клеток могут содержать плацентарные клетки, которые не являются стволовыми клетками, или клетки, которые не являются плацентарными клетками.
Популяции изолированных плацентарных клеток, предоставленные здесь, могут быть объединены с одной или более популяциями нестволовых клеток или неплацентарных клеток. Например, популяция изолированных плацентарных клеток может быть объединена с кровью {например, плацентарной кровью или пуповинной кровью), стволовыми клетками, полученными из крови, {например, стволовыми клетками, полученными из плацентарной крови или пуповинной крови), пуповинными стволовыми клетками, популяциями, полученными из крови клеток с ядрами, полученными из костного мозга мезенхимальными клетками, полученными из костной ткани популяциями стволовых клеток, неочищенным костным мозгом, взрослыми (соматическими) стволовыми клетками, популяциями стволовых клеток, содержащихся в ткани, культивированными стволовыми клетками, популяциями полностью дифференцированных клеток (например, хондроцитов, фибробластов, амниотических клеток, остеобластов, мышечных клеток, клеток сердца, и т.д.) и т.п. В конкретном варианте осуществления, популяция клеток, применимая для лечения нарушение кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС, содержит изолированные плацентарные клетки и изолированные клетки пуповины. Клетки в популяции изолированных плацентарных клеток могут быть объединены с множество клеток еще одного типа при соотношениях, равных приблизительно 100000000:1, 50000000:1, 20000000:1, 10000000:1, 5000000:1, 2000000:1, 1000000:1, 500000:1, 200000:1, 100000:1, 50000:1, 20000:1, 10000:1, 5000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1000; 1:2000; 1:5000; 1:10000; 1:20000; 1:50000; 1:100000; 1:500000; 1:1000000; 1:2000000; 1:5000000; 1:10000000; 1:20000000; 1:50000000; или приблизительно 1:100000000, по сравнению с контрольной средой с общими числами клеток с ядрами в каждой популяции. Клетки в популяции изолированных плацентарных клеток, также могут быть объединены с множеством клеток множества клеточных типов.
+
+
В одном варианте осуществления, изолированную популяцию плацентарных клеток объединяют с множеством гемопоэтических стволовых клеток. Такие гемопоэтические стволовые клетки могут, например, содержаться в необработанной плацентарной, пуповинной крови или периферической крови; в полностью ядерных клетках из плацентарной крови, пуповинной крови или периферической крови; в изолированной популяции CD34 клеток из плацентарной крови, пуповинной крови или периферической крови; в необработанном костном мозге; полностью ядерных клетках из костного мозга; в изолированной популяции CD34 клеток из костного мозга или т.п.
5.7 ПРОИЗВОДСТВО БАНКА ПЛАЦЕНТАРНЫХ КЛЕТОК
Изолированные клетки из послеродовых плацент, например, изолированные плацентарные клетки, описанные в Разделе 5.4.2, выше, могут культивироваться рядом различных путей для получения набора лотов, например, где лот представляет собой набор индивидуально-вводимых доз изолированных плацентарных клеток. Такие лоты могут, например, быть получены из клеток плацентарных перфузатов или из клеток, расщепленных ферментами плацентарных тканей. Наборы лотов плацентарных клеток, полученные из множества плацент, могут помещаться в банк изолированных плацентарных клеток для, например, долговременного хранения. В целом, адгезивные к пластику плацентарные клетки культуры ткани получают из первоначального плацентарного материала для образования посевной культуры, которая распространяется в контролируемых условиях для образования популяции клеток из приблизительно эквивалентного числа удвоений. Лоты предпочтительно получают из ткани единственной плаценты, но могут быть получены из ткани множества плацент.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
2
3
4
2
В одном варианте осуществления, лоты плацентарных клеток получают следующим образом. Плацентарную ткань сперва разрушают, например, посредством измельчения, расщепляют подходящим ферментом, например, трипсином или коллагеназой (см. Раздел 5.5.3, выше). Плацентарная ткань предпочтительно содержит, например, цельный амнион, цельный хорион или оба, из единственной плаценты, но может содержать только часть либо амниона или хориона. Расщепленную ткань культивируют, например, в течение приблизительно 1-3 недель, Предпочтительно приблизительно в течение 2 недель. После удаления неадгезивных клеток, колонии с высокой плотностью этой формы собирают, например, посредством трипсинизации. Эти клетки собирают и ресуспендируют в удобном объеме культуральной среды, и затем применяют для посева распространяемых культур. Распространяемые культуры могут представлять собой любое расположение раздельных устройств для клеточных культур, например, Cell Factory от NUNC™. Клетки могут подразделяться для любой степени, чтобы засевать распространяемые культуры с, например, 1×10, 2×10, 3×10, 4×10, 5×10, 6×10, 7×10, 8×10, 9×10, 1×10, 1×10, 2×10, 3×10, 4×10, 5×10, 6×10, 7×10, 8×10, 9×10 или 10×10 клеток/см. Предпочтительно, от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 клеток/см применяют для засева каждой распространяемой культуры. Количество распространяемых культур может быть больше или меньше по числу в зависимости от конкретных плацент(ы), из которых получают клетки.
5
2
Распространяемые культуры выращивают до тех пор, пока плотность клеток в культуре не достигнет определенного значения, например, приблизительно 1×10 клеток/см. Клетки могут либо быть собраны и криоконсервированы в этой точке или пересеяны в новые распространяемые культуры, как описано выше. Клетки могут пересеваться, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 раз перед применением. Регистрация кумулятивного числа удвоений популяции предпочтительно поддерживают во время распространения культур(ы). Клетки из культуры могут распространяться на протяжении 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 или 40 удвоений или вплоть до 60 удвоений. Предпочтительно, однако, чтобы число удвоений популяции, перед разделением популяции клеток на индивидуальные дозы, составляло от приблизительно 15 до приблизительно 30. Клетки могут культивироваться непрерывно на протяжении всего процесса распространения или могут быть заморожены в одной или более точек во время распространения.
6
10
Клетки для применения в индивидуальных дозах могут быть заморожены, например, криоконсервированы для более позднего применения. Индивидуальные дозы могут содержать, например, приблизительно от 1 миллиона до приблизительно 50 миллионов клеток на мл, и могут содержать между приблизительно 10 и приблизительно 10 клеток в целом.
В одном варианте осуществления, следовательно, банк плацентарных клеток может быть создан посредством способа, включающего в себя: распространение плацентарных клеток первичной культуры из человеческой послеродовой плаценты для первого множества удвоений популяции; криконсервацию указанных плацентарных клеток для образования Master Cell Bank; распространение множества плацентарных клеток из Master Cell Bank для второго множества удвоений популяции; криоконсервацию указанных плацентарных клеток для образования Working Cell Bank; распространение множества плацентарных клеток из Working Cell Bank для третьего множества удвоений популяции; и криоконсервацию указанных плацентарных клеток в индивидуальных дозах, где указанные индивидуальные дозы сообща составляют банк плацентарных клеток. Необязательно, множество плацентарных клеток из указанного третьего множества удвоений популяции может распространяться для четвертого множества удвоений популяции и криоконсервировано в индивидуальных дозах, где указанные индивидуальные дозы сообща составляют банк плацентарных стволовых клеток.
+
+
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные плацентарные клетки первичной культуры содержат плацентарные клетки из плацентарного перфузата. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные плацентарные клетки первичной культуры содержат плацентарные клетки из расщепленной плацентарной ткани. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные плацентарные клетки первичной культуры содержат плацентарные клетки из плацентарного перфузата и из расщепленной плацентарной ткани. В еще одном конкретном варианте осуществления, все из указанных плацентарных клеток в указанной первичной культуре плацентарных клеток взяты из одной и той же плаценты. В еще одном конкретном варианте осуществления, способ дополнительно включает в себя стадии селекции CD200 или HLA-G плацентарных клеток из указанного множества указанных плацентарных клеток из указанного Working Cell Bank для образования индивидуальных доз. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные индивидуальные дозы содержат от приблизительно 10 до приблизительно 10 плацентарных клеток. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные индивидуальные дозы содержат от приблизительно 10 до приблизительно 10 плацентарных клеток. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные индивидуальные дозы содержат от приблизительно 10 до приблизительно 10 плацентарных клеток. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные индивидуальные дозы содержат от приблизительно 10 до приблизительно 10 плацентарных клеток. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные индивидуальные дозы содержат от приблизительно 10 до приблизительно 10 плацентарных клеток. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные индивидуальные дозы содержат от приблизительно 10 до приблизительно 10 плацентарных клеток.
В предпочтительном варианте осуществления, донор, из которого получают плаценту (например, мать) тестируется на, по меньшей мере, один патоген. Если тесты являются положительными на тестируемый патоген, полный лот из плаценты отбрасывается. Такое тестирование может осуществляться в любое время в процессе получения лотов плацентарных клеток, например, во время распространения культуры. Патогены, присутствие которых тестируется, могут включать, без ограничения, гепатит A, гепатит B, гепатит C, гепатит D, гепатит E, вирус иммунодефицита человека (типы I и II), цитомегаловирус, герпесвирус, и т.п.
5.8 КОНСЕРВАЦИЯ ПЛАЦЕНТАРНЫХ КЛЕТОК
Изолированные плацентарные клетки, например, изолированные плацентарные клетки, описанные в Разделе 5.4.2, выше, могут подвергаться консервации, то есть помещаться в условия, которые обеспечивают долговременное хранение или условия, при которых происходит ингибирование смерти клеток посредством, например, апоптоза или некроза.
Плацентарные клетки могут подвергаться консервации с использованием, например, композиции, содержащей ингибитор апоптоза, ингибитор некроза и/или кислород-переносящий перфторуглерод, как описано в родственной публикации патентной заявки США № 2007/0190042, раскрытие которой включено здесь посредством ссылки во всей его полноте. В одном варианте осуществления, способ консервации популяции клеток, применимый для лечения нарушения кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС, включает в себя контактирование указанной популяции клеток с композицией сбора клеток, содержащей ингибитор апоптоза и кислород-переносящий перфторуглерод, где указанный ингибитор апоптоза присутствует в количестве и в течение времени, достаточных для снижения или предотвращения апоптоза в популяции клеток, по сравнению с контрольной средой с популяцией клеток, не контактировавшей с ингибитором апоптоза. В конкретном варианте осуществления, указанный ингибитор апоптоза представляет собой ингибитор каспазы. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанный ингибитор апоптоза представляет собой ингибитор JNK. В более конкретном варианте осуществления, указанный ингибитор JNK не модулирует дифференциацию или пролиферацию указанных клеток. В еще одном варианте осуществления, указанная композиция сбора клеток содержит указанный ингибитор апоптоза и указанный кислород-переносящий перфторуглерод в раздельных фазах. В еще одном варианте осуществления, указанная композиция сбора клеток содержит указанный ингибитор апоптоза и указанный кислород-переносящий перфторуглерод в эмульсии. В еще одном варианте осуществления, композиция клеточного сбора дополнительно содержит эмульгатор, например, лецитин. В еще одном варианте осуществления, указанный ингибитор апоптоза и указанный перфторуглерод находятся между приблизительно 0°C и приблизительно 25°C во время контактирования клеток. В еще одном более конкретном варианте осуществления, указанный ингибитор апоптоза и указанный перфторуглерод находятся между приблизительно 2°C и 10°C или между приблизительно 2°C и приблизительно 5°C, во время контактирования клеток. В еще одном более конкретном варианте осуществления, указанное контактирования осуществляют во время транспорта указанной популяции клеток. В еще одном более конкретном варианте осуществления, указанное контактирование осуществляют во время замораживания и оттаивания указанной популяции клеток.
Популяции плацентарных клеток могут подвергаться консервации, например, посредством способа, включающего в себя контактирование указанной популяции клеток с ингибитором апоптоза и соединения для консервации органа, где указанный ингибитор апоптоза присутствует в количество и в течение времени, достаточных для снижения или предотвращения апоптоза в популяции клеток, по сравнению с контрольной средой с популяцией клеток, не контактировавшей с ингибитором апоптоза. В конкретном варианте осуществления, соединение для консервации органа представляет собой UW раствор (описанный в Патенте США № 4798824; также известный как ViaSpan; см. также Southard et al., Transplantation 49(2):251-257 (1990)) или раствор, описанный в Stern et al., Патент США № 5552267. В еще одном варианте осуществления, указанное соединение для консервации органа представляет собой гидроксиэтилкрахмал, лактобионовую кислоту, раффинозу или их сочетание. В еще одном варианте осуществления, композиция клеточного сбора дополнительно содержит кислород-переносящий перфторуглерод, либо в двух фазах или в виде эмульсии.
В еще одном варианте осуществления способа, плацентарные клетки контактируют с композицией сбора клеток, содержащей ингибитор апоптоза и кислород-переносящий перфторуглерод, соединение для консервации органа или их сочетание, во время перфузии. В еще одном варианте осуществления, указанные клетки контактируют во время процесса разрушения ткани, например, ферментативного расщепления. В еще одном варианте осуществления, плацентарные клетки контактируют с указанным соединением сбора клеток после сбора посредством перфузии или после сбора посредством разрушения ткани, например, ферментативного расщепления.
Обычно, во время сбора плацентарных клеток, обогащения и выделения, предпочтительным является минимизировать или исключить стресс клеток вследствие гипоксии и механического стресса. В еще одном варианте осуществления способа, следовательно, клетки или популяцию клеток, подвергают воздействию гипоксического состояния во время сбора, обогащения или выделения в течение менее шести часов в процессе указанной консервации, где гипоксическое состояние представляет собой концентрацию кислорода, которая составляет меньше, чем нормальная концентрация кислорода в крови. В более конкретном варианте осуществления, указанную популяцию клеток подвергают воздействию указанного гипоксического состояния в течение менее, чем двух часов во время указанной консервации. В еще одном более конкретном варианте осуществления, указанную популяцию клеток подвергают воздействию указанного гипоксического состояния в течение менее, чем одного часа или менее, чем тридцати минут или не подвергают воздействию гипоксического состояния, во время сбора, обогащения или выделения. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанную популяцию клеток не подвергают воздействию сдвигового стресса во время сбора, обогащения или выделения.
Плацентарные клетки может быть криоконсервированы, например, в среде для криоконсервации в небольших контейнерах, например, ампулах. Пригодная среда для криоконсервации содержит, но не ограничена ими, культуральную среду, включающую, например, среду для роста или среду для замораживания клеток, например, промышленно доступную среду для замораживания клеток, например, C2695, C2639 или C6039 (Sigma). Среда для криоконсервации предпочтительно содержит ДМСО (диметилсульфоксид), при концентрации приблизительно от 2% до приблизительно 15% (о/о), например, приблизительно 10% (о/о). Среда для криоконсервации может содержать дополнительные агенты, например, метилцеллюлозу и/или глицерин. Плацентарные клетки предпочтительно охлаждают при приблизительно 1°C/мин во время криоконсервации. Предпочтительная температура криоконсервации составляет от приблизительно -80°C до приблизительно -180°C, предпочтительно от приблизительно -125°C до приблизительно -140°C. Криоконсервированные клетки могут быть перенесены в жидкий азот перед оттаиванием для применения. В некоторых вариантах осуществления, например, как только ампулы достигают приблизительно -90°C, их переносят в область хранения с жидким азотом. Криоконсервация может также быть проведена с использованием морозильной камеры с контролируемой скоростью. Криоконсервированные клетки предпочтительно оттаивают при температуре, равной приблизительно 25°C до приблизительно 40°C, предпочтительно при температуре, равной приблизительно 37°C.
5.9 КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ИЗОЛИРОВАННЫЕ ПЛАЦЕНТАРНЫЕ КЛЕТКИ
Плацентарные клетки, описанные здесь, например, в Разделе 5.4.2, могут быть объединены с любым физиологически-приемлемым или медицински-приемлемым соединением, композицией или устройством для применения при лечении нарушения кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС. Композиции, применимые в способах лечения, предоставленных здесь, могут содержать любые одну или более из плацентарных клеток, описанных здесь (см. раздел 5.4.2, выше). В некоторых вариантах осуществления, композиция представляет собой фармацевтически-приемлемую композицию, например, композицию, содержащую плацентарные клетки в фармацевтически приемлемом носителе. См. раздел 5.9.2, ниже.
В некоторых вариантах осуществления, композиция, содержащая изолированные плацентарные клетки дополнительно содержит матрикс, например, бесклеточный матрикс или синтетический матрикс. В более конкретном варианте осуществления, указанный матрикс представляет собой трехмерный каркас. В еще одном более конкретном варианте осуществления, указанный матрикс содержит коллаген, желатин, ламинин, фибронектин, пектин, орнитин или витронектин. В еще одном более конкретном варианте осуществления, матрикс представляет собой амниотическую мембрану или биоматериал, полученный из амниотической мембраны. В еще одном более конкретном варианте осуществления, указанный матрикс содержит внеклеточный мембранный белок. В еще одном более конкретном варианте осуществления, указанный матрикс содержит синтетическое соединение. В еще одном более конкретном варианте осуществления, указанный матрикс содержит биоактивное соединение. В еще одном более конкретном варианте осуществления, указанное биоактивное соединение представляет собой фактор роста, цитокин, антитело или органическую молекулу, менее 5000 Дальтонов.
В еще одном варианте осуществления, композиция, применимая в способах лечения, предоставленных здесь, содержит среду, кондиционированную посредством любых из вышеуказанных плацентарных клеток или любых из вышеуказанных популяций плацентарных клеток.
5.9.1 КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫЕ ИЗОЛИРОВАННЫЕ ПЛАЦЕНТАРНЫЕ КЛЕТКИ
Популяции изолированных плацентарных клеток, применимые для лечения нарушения кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС могут подвергаться консервации, например, криоконсервирования для более позднего применения. Способы криоконсервации клеток, таких как стволовые клетки, являются хорошо известными в данной области. Популяции изолированных плацентарных клеток могут быть получены в форме, которая является легко вводимой индивидууму, например, популяции изолированных плацентарных клеток, которая содержится внутри контейнера, пригодного для медицинского применения. Такой контейнер может представлять собой, например, шприц, стерильный пластиковый мешок, колбу, банку или другой контейнер, из которого популяция изолированных плацентарных клеток может легко распределяться. Например, контейнер может представлять собой мешок для крови или другой пластик, медицински-приемлемый мешок, пригодный для внутривенного введения жидкости реципиенту. Контейнер предпочтительно является контейнером, который обеспечивает криоконсервацию объединенной популяции клеток.
Криоконсервированная популяция изолированных плацентарных клеток может содержать изолированные плацентарные клетки, полученные от единственного донора или от множества доноров. Популяция изолированных плацентарных клеток может быть полностью HLA-совпадающей с предназначенным реципиентом или частично или полностью HLA-несовпадающей.
Таким образом, в одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки могут применяться для лечения нарушения кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС в виде композиции, содержащей адгезивную к пластику плацентарную клеточную популяцию культуры ткани в контейнере. В конкретном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки являются криоконсервированными. В еще одном конкретном варианте осуществления, контейнер представляет собой мешок, колбу или банку. В более конкретном варианте осуществления, указанный мешок представляет собой стерильный пластиковый мешок. В более конкретном варианте осуществления, указанный мешок является пригодным для, обеспечивает или облегчает внутривенное введение указанной популяции изолированных плацентарных клеток, например, посредством внутривенной инфузии. Мешок может содержать множественные просветы или подразделения, которые являются взаимосвязанными, для обеспечения смешивания изолированных плацентарных клеток и одного или более других растворов, например, лекарственного средства, перед или во время введения. В еще одном конкретном варианте осуществления композиция содержит одно или несколько соединений, которые облегчают криоконсервацию объединенной популяции клеток. В еще одном конкретном варианте осуществления указанная популяция изолированных плацентарных клеток содержится в физиологически-приемлемом водном растворе. В более конкретном варианте осуществления, указанный физиологически-приемлемый водный раствор представляет собой 0,9% раствор NaCl. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанная популяция изолированных плацентарных клеток содержит плацентарные клетки, которые являются HLA-совпадающей с реципиентом указанной популяции клеток. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанная объединенная популяция клеток содержит плацентарные клетки, которые являются, по меньшей мере, частично HLA-несовпадающими с реципиентом указанной популяции клеток. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные изолированные плацентарные клетки получают от множества доноров.
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
-
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
низкий
-
+
-
+
-
-
+
-
-
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
низкий
-
+
-
+
-
-
+
-
-
+
-
+
+
В некоторых вариантах осуществления, изолированные плацентарные клетки в контейнере представляют собой изолированные CD10, CD34-, CD105 плацентарные клетки, где указанные клетки были криоконсервированы и содержатся внутри контейнера. В конкретном варианте осуществления, указанные CD10, CD34, CD105 плацентарные клетки представляют собой также CD200. В более конкретном варианте осуществления, указанные CD10, CD34, CDl05, CD200 плацентарные клетки представляют собой также CD45 или CD90. В более конкретном варианте осуществления, указанные CD10, CD34-, CDl05, CD200 плацентарные клетки представляют собой также CD45 и CD90. В еще одном конкретном варианте осуществления, CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно один или более из CDl3, CD29, CD33, CD38, CD44, CD45, CD54, CD62E, CD62L, CD62P, SH3 (CD73), SH4 (CD73), CD80, CD86, CD90, SH2 (CD105), CD106/VCAM, CDl17, CD144/VE-кадхерин, CD184/CXCR4, CD200, CD133, OCT-4, SSEA3, SSEA4, ABC-р, KDR (VEGFR2), HLA-A,B,C, HLA-DP,DQ,DR, HLA-G или Лиганд Программированной Смерти-1 (PDLl) или любое их сочетание. В более конкретном варианте осуществления, CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD13, CD29, CD33, CD38, CD44, CD45, CD54/ICAМ, CD62E, CD62L, CD62P, SH3 (CD73), SH4 (CD73), CD80, CD86, CD90, SH2 (CD105), CD106/VCAM, CDl17, CD144/VE-кадхерин, CD184/CXCR4, CD200, CDl33, OCT-4, SSEA3, SSEA4, ABC-p, KDR (VEGFR2), HLA-A,B,C, HLA-DP,DQ,DR, HLA-G, и Лиганд Программированной Смерти-1 (PDLl).
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
В некоторых других вариантах осуществления, вышеуказанные изолированные плацентарные клетки представляют собой изолированные CD200, HLA-G плацентарные клетки, где указанные клетки были криоконсервированы и содержатся внутри контейнера. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD73, CD105, CD200 клетки, которые были криоконсервированы и содержатся внутри контейнера. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD200, OCT-4 стволовые клетки, которые были криоконсервированы и содержатся внутри контейнера. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD73, CD105 клетки, которые были криоконсервированы и содержатся внутри контейнера, и, где указанные изолированные плацентарные клетки способствуют образованию одного или более эмбриоид-подобных телец, когда их культивируют с популяцией плацентарных клеток при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобных телец. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой CD73, CD105, HLA-G клетки, которые были криоконсервированы и содержатся внутри контейнера. В еще одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки представляют собой OCT-4 плацентарные клетки, которые были криоконсервированы и содержатся внутри контейнера, и, где указанные клетки способствуют образованию одного или более эмбриоид-подобных телец, когда их культивируют с популяцией плацентарных клеток при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобных телец.
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
-
-
-
+
+
+
-
+
+
-
-
+
+
+
-
+
+
-
-
-
-
+
-
+
В еще одном конкретном варианте осуществления, вышеуказанные изолированные плацентарные клетки представляют собой плацентарные стволовые клетки или плацентарные мультипотентные клетки, которые являются CD34, CD10 и CD105, как обнаружено посредством проточной цитометрии. В более конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки представляют собой плацентарные стволовые клетки. В еще одном более конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки представляют собой мультипотентные плацентарные клетки. В еще одном конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки имеют возможность дифференцировать в клетки неврального фенотипа, клетки остеогенного фенотипа или клетки хондрогенного фенотипа. В более конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD200. В еще одном более конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CD105 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD90 или CD45, как обнаружено посредством проточной цитометрии. В еще одном более конкретном варианте осуществления, изолированные CD34, CD10, CDl05 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD90 или CD45, как обнаружено посредством проточной цитометрии. В более конкретном варианте осуществления, CD34, CD10, CD105, CD200 плацентарные клетки представляют собой дополнительно CD90 или CD45, как обнаружено посредством проточной цитометрии. В еще одном более конкретном варианте осуществления, CD34, CD10, CD105, CD200 клетки представляют собой дополнительно CD90 и CD45, как обнаружено посредством проточной цитометрии. В еще одном более конкретном варианте осуществления, CD34, CD10, CD105, CD200, CD90, CD45 клетки представляют собой дополнительно CD80 и CD86, как обнаружено посредством проточной цитометрии. В еще одном более конкретном варианте осуществления, CD34, CD10, CD105 клетки представляют собой дополнительно один или более из CD29, CD38, CD44, CD54, CD80, CD86, SH3 или SH4. В еще одном более конкретном варианте осуществления, клетки представляют собой дополнительно CD44. В конкретном варианте осуществления любые из изолированных CD34, CD10, CD105 плацентарных клеток выше, клетки представляют собой дополнительно один или более из CDl17, CDl33, KDR (VEGFR2), HLA-A,B,C, HLA- DP,DQ,DR и/или PDLl.
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
В конкретном варианте осуществления любых из приведенных выше криоконсервированных изолированных плацентарных клеток, указанный контейнер представляет собой мешок. В различных конкретных вариантах осуществления, указанный контейнер содержит приблизительно, по меньшей мере, или, по большей мере, 1×10 указанных изолированных плацентарных клеток, 5×10 указанных изолированных плацентарных клеток, 1×10 указанных изолированных плацентарных клеток, 5×10 указанных изолированных плацентарных клеток, 1×10 указанных изолированных плацентарных клеток, 5×10 указанных изолированных плацентарных клеток, 1×10 указанных изолированных плацентарных клеток, 5×10 указанных изолированных плацентарных клеток, 1×10 указанных изолированных плацентарных клеток или 1×10 указанных изолированных плацентарных клеток. В других конкретных вариантах осуществления любых из приведенных выше криоконсервированных популяций, указанные изолированные плацентарные клетки пересевали приблизительно, по меньшей мере, или не более, чем 5 раз, не более, чем 10 раз, не более, чем 15 раз или не более, чем 20 раз. В еще одном конкретном варианте осуществления любых из приведенных выше криоконсервированных изолированных плацентарных клеток, указанные изолированные плацентарные клетки распространяли внутри указанного контейнера.
5.9.2 ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ
in vivo
in vivo
Популяции изолированных плацентарных клеток или популяции клеток, содержащие изолированные плацентарные клетки, могут быть составлены в фармацевтические композиции, для применения , например, в способах лечения, предоставленных здесь. Такие фармацевтические композиции содержат популяцию изолированных плацентарных клеток или популяцию клеток, содержащую изолированные плацентарные клетки, в фармацевтически приемлемом носителе, например, физиологического растворе или другом принятом физиологически приемлемом растворе для введения . Фармацевтические композиции, содержащие изолированные плацентарные клетки, описанные здесь, могут содержать любую или любое сочетание из популяций изолированных плацентарных клеток или изолированные плацентарные клетки, описанных здесь где-либо еще. Фармацевтические композиции могут содержать зародышевые, материнские или как зародышевые, так и материнские изолированные плацентарные клетки. Фармацевтические композиции, предоставленные здесь, могут дополнительно содержать изолированные плацентарные клетки, полученные из единственных индивидуума или плаценты или от множества индивидуумов или плацент.
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
Фармацевтические композиции, предоставленные здесь, могут содержать любое количество изолированных плацентарных клеток. Например, разовая единица дозы изолированных плацентарных клеток может содержать, в различных вариантах осуществления, приблизительно, по меньшей мере, или не более, чем 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×l0 или более изолированных плацентарных клеток.
Фармацевтические композиции, предоставленные здесь, содержат популяции клеток, которые содержат 50% жизнеспособных клеток или более (то есть, по меньшей мере, 50% клеток в популяции являются функциональными или живыми). Предпочтительно, по меньшей мере, 60% клеток в популяции являются жизнеспособными. Более предпочтительно, по меньшей мере, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% клеток в популяции в фармацевтической композиции являются жизнеспособными.
Фармацевтические композиции, предоставленные здесь, могут содержать одно или несколько соединений, которые, например, облегчают приживление трансплантата (например, антитела против рецепторов T-клеток, иммуносупрессант или т.п.); стабилизаторы такие как альбумин, декстран 40, желатин, гидроксиэтилкрахмал, плазмалит и т.п.
6
7
При составлении в виде раствора для инъекций в одном варианте осуществления, фармацевтическая композиция содержит приблизительно от 1% до 1,5% HSA и приблизительно 2,5% декстрана. В предпочтительном варианте осуществления, фармацевтическая композиция содержит от приблизительно 5×10 клеток на миллилитр до приблизительно 2×10 клеток на миллилитр в растворе, содержащем 5% HSA и 10% декстран, необязательно содержащем иммуносупрессант, например, циклоспорин, при, например, 10 мг/кг.
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
В других вариантах осуществления, фармацевтическая композиция, например, раствор, содержит множество клеток, например, изолированные плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки или плацентарные мультипотентные клетки, где указанная фармацевтическая композиция содержит между приблизительно от 1,0±0,3×10 клеток на миллилитр до приблизительно 5,0±1,5×10 клеток на миллилитр. В других вариантах осуществления, фармацевтическая композиция содержит от приблизительно 1,5×10 клеток на миллилитр до приблизительно 3,75×10 клеток на миллилитр. В других вариантах осуществления, фармацевтическая композиция содержит от приблизительно 1×10 клеток/мл до приблизительно 50×10 клеток/мл, от приблизительно 1×10 клеток/мл до приблизительно 40×10 клеток/мл, от приблизительно 1×10 клеток/мл до приблизительно 30×10 клеток/мл, от приблизительно 1×10 клеток/мл до приблизительно 20×10 клеток/мл, от приблизительно 1×10 клеток/мл до приблизительно 15×10 клеток/мл или от приблизительно 1×10 клеток/мл до приблизительно 10×10 клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция не содержит видимых скоплений клеток (т.е., не содержит макроскопления клеток) или по существу никаких видимых сгустков. Как используют в данном документе, "макроскопления клеток" означает аггрегацию клеток, видимую без увеличения, например, видимую невооруженным взглядом, и, в целом, относится к агрегации клеток крупнее, чем приблизительно 150 микронов. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция содержит приблизительно 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5% 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5% или 10% декстрана, например, декстрана-40. В конкретном варианте осуществления, указанная композиция содержит приблизительно от 7,5% до приблизительно 9% декстрана-40. В конкретном варианте осуществления, указанная композиция содержит приблизительно 5,5% декстрана-40. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция содержит от приблизительно 1% до приблизительно 15% человеческого сывороточного альбумина (HSA). В конкретных вариантах осуществления, фармацевтическая композиция содержит приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% или 15% HSA. В конкретном варианте осуществления, указанные клетки были криоконсервированы и оттаяны. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные клетки фильтровали через фильтр от 70 мкм до 100 мкм. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанная композиция не содержит видимых скоплений клеток. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанная композиция содержит менее, чем приблизительно 200 скоплений клеток на 10 клеток, где указанные скопления клеток являются видимыми только под микроскопом, например, оптическим микроскопом. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанная композиция содержит менее, чем приблизительно 150 скоплений клеток на 10 клеток, где указанные скопления клеток являются видимыми только под микроскопом, например, оптическим микроскопом. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанная композиция содержит менее, чем приблизительно 100 скоплений клеток на 10 клеток, где указанные скопления клеток являются видимыми только под микроскопом, например, оптическим микроскопом.
6
В конкретном варианте осуществления, фармацевтическая композиция содержит приблизительно 1,0±0,3×10 клеток на миллилитр, приблизительно 5,5% декстрана-40 (м/о), приблизительно 10% HSA (м/о) и приблизительно 5% ДМСО (о/о).
6
6
6
6
6
6
6
В других вариантах осуществления, фармацевтическая композиция содержит множество клеток, например, множество изолированных плацентарных клеток в растворе, содержащем 10% декстрана-40, где фармацевтическая композиция содержит от приблизительно 1,0±0,3×10 клеток на миллилитр до приблизительно 5,0±1,5×10 клеток на миллилитр, и, где указанная композиция не содержит скоплений клеток, видимых невооруженных глазом (т.е., не содержит макроскоплений клеток). В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция содержит от приблизительно 1,5×10 клеток на миллилитр до приблизительно 3,75×10 клеток на миллилитр. В конкретном варианте осуществления, указанные клетки были криоконсервированы и оттаяны. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанные клетки отфильтровывали через фильтр от 70 мкм до 100 мкм. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанная композиция содержит менее, чем приблизительно 200 микроскоплений клеток (то есть скоплений клеток, видимых только с увеличением) на 10 клеток. В еще одном конкретном варианте осуществления, фармацевтическая композиция содержит менее, чем приблизительно 150 микроскопления клеток на 10 клеток. В еще одном конкретном варианте осуществления, фармацевтическая композиция содержит менее, чем приблизительно 100 микроскоплений клеток на 10 клеток. В еще одном конкретном варианте осуществления, фармацевтическая композиция содержит менее, чем 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% или 2% ДМСО или менее, чем 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2% или 0,1% ДМСО.
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Дополнительно здесь предоставлены композиции, содержащие клетки, где указанные композиции получают посредством одного из способов, раскрытых здесь. Например, в одном варианте осуществления, фармацевтическая композиция содержит клетки, где фармацевтическую композицию получают посредством способа, включающего в себя фильтрование раствора, содержащего плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки или плацентарные мультипотентные клетки, с образованием отфильтрованного содержащего клетки раствора; разбавление отфильтрованного раствора, содержащего клетки, первым раствором до приблизительно от 1 до 50×10, от 1 до 40×10, от 1 до 30×10, от 1 до 20×10, от 1 до 15×10 или от 1 до 10×10 клеток на миллилитр, например, перед криоконсервацией; и разбавление полученного в результате отфильтрованного раствора, содержащего клетки, вторым раствором, содержащим декстран, но не содержащим человеческий сывороточный альбумин (HSA) для получения указанной композиции. В некоторых вариантах осуществления, указанное разбавление составляет не более, чем приблизительно 15×10 клеток на миллилитр. В некоторых вариантах осуществления, указанное разбавление составляет не более, чем приблизительно 10±3×10 клеток на миллилитр. В некоторых вариантах осуществления, указанное разбавление составляет не более, чем приблизительно 7,5×10 клеток на миллилитр. В других определенных вариантах осуществления, если отфильтрованный раствор, содержащий клетки, перед разбавлением содержит менее чем приблизительно 15×10 клеток на миллилитр, то фильтрация является необязательной. В других некоторых вариантах осуществления, если отфильтрованный раствор, содержащий клетки, перед разбавлением содержит менее, чем приблизительно 10±3×10 клеток на миллилитр, то фильтрация является необязательной. В других некоторых вариантах осуществления, если отфильтрованный раствор, содержащий клетки, перед разбавлением содержит менее, чем приблизительно 7,5×10 клеток на миллилитр, то фильтрация является необязательной.
6
6
6
6
В конкретном варианте осуществления, клетки криоконсервировали между указанным разбавлением раствором первого разбавления и указанным разбавлением раствором второго разбавления. В еще одном конкретном варианте осуществления, раствор первого разбавления содержит декстран и HSA. Декстран в растворе первого разбавления или растворе второго разбавления может представлять собой декстран с любой молекулярной массой, например, декстран, имеющий молекулярную массу от приблизительно 10 кДа до приблизительно 150 кДа. В некоторых вариантах осуществления, указанный декстран в указанном растворе первого разбавления или указанном втором растворе составляет приблизительно 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5% 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5% или 10% декстрана. В еще одном конкретном варианте осуществления, декстран в указанном растворе первого разбавления или указанном растворе второго разбавления представляет собой декстран-40. В еще одном конкретном варианте осуществления, декстран в указанном растворе первого разбавления и указанном растворе второго разбавления представляет собой декстран-40. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанный декстран-40 в указанном растворе первого разбавления составляет 5,0% декстрана-40. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанный декстран-40 в указанном растворе первого разбавления представляет собой 5,5% декстран-40. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанный декстран-40 в указанном растворе второго разбавления представляет собой 10% декстран-40. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанный HSA в указанном растворе, содержащем HSA, составляет от 1 до 15% HSA. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанный HSA в указанном растворе, содержащем HSA, составляет приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% или 15% HSA. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанный HSA в указанном растворе, содержащем HSA, составляет 10% HSA. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанный раствор первого разбавления содержит HSA. В более конкретном варианте осуществления, указанный HSA в указанном растворе первого разбавления представляет собой 10% HSA. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанный раствор первого разбавления содержит криопротектор. В более конкретном варианте осуществления, указанный криопротектор представляет собой ДМСО. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанный декстран-40 в указанном растворе второго разбавления представляет собой приблизительно 10% декстран-40. В еще одном конкретном варианте осуществления, указанная композиция, содержащая клетки, содержит приблизительно от 7,5% до приблизительно 9% декстрана. В еще одном конкретном варианте осуществления, фармацевтическая композиция содержит от приблизительно 1,0±0,3×10 клеток на миллилитр до приблизительно 5,0±1,5×10 клеток на миллилитр. В еще одном конкретном варианте осуществления, фармацевтическая композиция содержит от приблизительно 1,5×10 клеток на миллилитр до приблизительно 3,75×10 клеток на миллилитр.
6
6
6
6
6
6
6
6
6
В еще одном варианте осуществления, фармацевтическую композицию получают посредством способа, включающего в себя (a) фильтрование раствора, содержащего клетки, содержащие плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки или плацентарные мультипотентные клетки, перед криоконсервациией для получения отфильтрованного раствора, содержащего клетки; (b) криоконсервацию клеток в фильтрованном растворе, содержащем клетки, при приблизительно от 1 до 50×10, от 1 до 40×10, от 1 до 30×10, от 1 до 20×10, от 1 до 15×10 или от 1 до 10×10 клеток на миллилитр; (c) оттаивание клеток; и (d) разбавление фильтрованного раствора, содержащего клетки, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:11 (о/о) раствором декстрана-40. В некоторых вариантах осуществления, если количество клеток составляет менее, чем приблизительно 10±3×10 клеток на миллилитр перед стадией (a), то фильтрация является необязательной. В более конкретном варианте осуществления, клетки на стадии (b) криоконсервировали при приблизительно 10±3×10 клеток на миллилитр. В более конкретном варианте осуществления, клетки на стадии (b) криоконсервировали в растворе, содержащем приблизительно от 5% до приблизительно 10% декстрана-40 и HSA. В некоторых вариантах осуществления, указанное разбавление на стадии (b) составляет не более, чем приблизительно 15×10 клеток на миллилитр.
6
6
6
6
6
6
6
6
6
В еще одном варианте осуществления, фармацевтическую композицию получают посредством способа, включающего в себя: (a) суспендирование плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток или плацентарных мультипотентных клеток в 5,5% растворе декстрана-40, который содержит 10% HSA для образования раствора, содержащего клетки; (b) фильтрацию раствора, содержащего клетки, через фильтр 70 мкм; (c) разбавление раствора, содержащего клетки, раствором, содержащим 5,5% декстрана-40, 10% HSA и 5% ДМСО до приблизительно от 1 до 50×10, от 1 до 40×10, от 1 до 30×10, от 1 до 20×10, от 1 до 15×10 или от 1 до 10×10 клеток на миллилитр; (d) криоконсервацию клеток; (e) оттаивание клеток; и (f) разбавление раствора, содержащего клетки, от 1:1 до 1:11 (о/о) 10% декстраном-40. В некоторых вариантах осуществления, указанное разбавление на стадии (c) составляет не более чем приблизительно 15×10 клеток на миллилитр. В некоторых вариантах осуществления, указанное разбавление на стадии (c) составляет не более, чем приблизительно 10±3×10 клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления, указанное разбавление на стадии (c) составляет не более, чем приблизительно 7,5×10 клеток/мл.
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
В еще одном варианте осуществления, композицию содержащую клетки, получают посредством способа, включающего в себя: (a) центрифугирование множества клеток для сбора клеток; (b) ресуспендирование клеток в 5,5% декстране-40; (c) центрифугирование клеток для сбора клеток; (d) ресуспендирование клеток в растворе 5,5% декстрана-40, который содержит 10% HSA; (e) фильтрацию клеток через фильтр 70 мкм; (f) разбавление клеток в 5,5% декстране-40, 10% HSA и 5% ДМСО до приблизительно от 1 до 50×10, от 1 до 40×10, от 1 до 30×10, от 1 до 20×10, от 1 до 15×10 или от 1 до 10×10 клеток на миллилитр; (g) криоконсервацию клеток; (h) оттаивание клеток; и (i) разбавление клеток от 1:1 до 1:11 (о/о) 10% декстраном-40. В некоторых вариантах осуществления, указанное разбавление на стадии (f) составляет не более, чем приблизительно 15×10 клеток на миллилитр. В некоторых вариантах осуществления, указанное разбавление на стадии (f) составляет не более, чем приблизительно 10±3×10 клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления, указанное разбавление на стадии (f) составляет не более, чем приблизительно 7,5×10 клеток/мл. В других некоторых вариантах осуществления, если количество клеток составляет менее, чем приблизительно 10±3×10 клеток на миллилитр, то фильтрация является необязательной.
Композиции, например, фармацевтические композиции, содержащие изолированные плацентарные клетки, описанные здесь, могут содержать любые изолированные плацентарные клетки, описанные здесь.
Могут применяться другие готовые формы для инъекций, пригодные для введения клеточных продуктов.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
-
+
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
+
-
+
В одном варианте осуществления, фармацевтическая композиция содержит изолированные плацентарные клетки, которые являются по существу или полностью, нематеринскими по происхождению, то есть имеют зародышевый генотип; например, по меньшей мере, приблизительно 90%, 95%, 98%, 99% или приблизительно 100% являются нематеринскими по происхождению. Например, в одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит популяцию изолированных плацентарных клеток, которые представляют собой CD200 и HLA-G; CD73, CD105 и CD200; CD200 и OCT-4; CD73, CD105 и HLA-G; CD73 и CD105 и способствуют образованию одного или более эмбриоид-подобных телец в популяции плацентарных клеток, содержащей указанные популяции изолированных плацентарных клеток, когда указанную популяцию плацентарных клеток культивируют при условиях, которые обеспечивают образовании эмбриоид-подобного тельца; или OCT-4 и способствуют образованию одного или более эмбриоид-подобных телец в популяции плацентарных клеток, содержащей указанную популяцию изолированных плацентарных клеток, когда указанную популяцию плацентарных клеток культивируют при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобного тельца; или сочетание приведенных выше, где, по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 95% или 99% указанных изолированных плацентарных клеток являются нематеринскими по происхождению. В еще одном варианте осуществления, фармацевтическая композиция содержит популяцию изолированных плацентарных клеток, которые представляют собой CD10, CD105 и CD34; CD10, CD105, CD200 и CD34; CD10, CD105, CD200, CD34 и, по меньшей мере, одни из CD90 или CD45; CD10, CD90, CD105, CD200, CD34 и CD45; CD10, CD90, CD105, CD200, CD34 и CD45; CD200 и HLA-G; CD73, CD105 и CD200; CD200 и OCT-4; CD73, CD105 и HLA-G; CD73 и CD105 и способствуют образованию одного или более эмбриоид-подобных телец в популяции плацентарных клеток, содержащей указанные изолированные плацентарные клетки, когда указанную популяцию плацентарных клеток культивируют при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобного тельца; OCT-4 и способствуют образованию одного или более эмбриоид-подобных телец в популяции плацентарных клеток, содержащей указанные изолированные плацентарные клетки, когда указанную популяцию плацентарных клеток культивируют при условиях, которые обеспечивают образование эмбриоид-подобного тельца; или один или более из CDl17, CD133, KDR, CD80, CD86, HLA-A,B,C, HLA-DP,DQ,DR и/или PDLl; или сочетание из приведенных выше, где, по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 95% или 99% указанных изолированных плацентарных клеток являются нематеринскими по происхождению. В конкретном варианте осуществления, фармацевтическая композиция дополнительно содержит стволовые клетки, которые не являются полученными из плаценты.
Изолированные плацентарные клетки в композициях, например, фармацевтических композициях, предоставленных здесь, могут содержать плацентарные клетки, полученные от единичного донора или от множественных доноров. Изолированные плацентарные клетки могут представлять собой полностью HLA-соответствующие для предназначенного реципиента или частично или полностью HLA-несовпадающие.
5.9.3 МАТРИЦЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИЗОЛИРОВАННЫЕ ПЛАЦЕНТАРНЫЕ КЛЕТКИ
Дополнительно здесь предоставлены композиции, содержащие матрицы, гидрогели, каркасы и т.п., которые содержат плацентарные стволовые клетки или популяцию изолированных плацентарных клеток. Такие композиции могут применяться вместо клеток или в дополнение к клеткам в жидкой суспензии для лечения нарушения кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС.
2
Изолированные плацентарные клетки, описанные здесь, могут представлять собой клетки, высеянные на природном матриксе, например, плацентарном биоматериале, таком как материал амниотической мембраны. Такой материал амниотической мембраны может представлять собой, например, амниотическую мембрану, вырезанную непосредственно из плаценты млекопитающих; фиксированную или подвергнутую нагреву амниотическую мембрану, по существу сухую (т.е., <20% HO) амниотическую мембрану, мембрану хориона, по существу сухую мембрану хориона, по существу сухие амниотическую мембрану и мембрану хориона, и т.п. Предпочтительные плацентарные биоматериалы, на которых высевают изолированные плацентарные клетки, описаны в Hariri, публикации патентной заявки США № 2004/0048796, раскрытие которой включено здесь посредством ссылки во всей полноте.
Изолированные плацентарные клетки, описанные здесь, могут быть суспендировны в растворе гидрогеля, пригодном, например, для инъекции. Пригодные гидрогели для такой композиции включают самосборные пептиды, такие как RAD 16. В одном варианте осуществления, раствор гидрогеля, содержащий клетки, может позволить отверждаться, например, в форме, для образования матрикса, имеющего клетки, диспергированные в нем для имплантации. Изолированные плацентарные клетки в таком матриксе могут также культивироваться таким образом, что клетки митотически распространяются перед имплантацией. Гидрогель представляет собой, например, органический полимер (природный или синтетический), который сшивают посредством ковалентных, ионных или водородных связей для создания трехмерной структуры с открытой пространственной решеткой, котрая улавливает молекулы воды для образования геля. Гидрогель-образующие материалы включают полисахариды, такие как альгинат и его соли, пептиды, полифосфазины и полиакрилаты, которые сшиты через ионные связи, или блок полимеры, такие как блок-сополимеры полиэтиленоксида и полипропиленгликоля, которые сшиты посредством температуры или pH, соответственно. В некоторых вариантах осуществления, гидрогель или матрикс является биодеградируемым.
В некоторых вариантах осуществления, готовая лекарственная форма содержит in situ полимеризуемый гель (см., например, публикацию патентной заявки США 2002/0022676, раскрытие которой включено здесь посредством ссылки во всей его полноте; Anseth et аl., J. Контрол Release, 78(1- 3): 199-209 (2002); Wang et al, Biomaterials, 24(22):3969-80 (2003).
В некоторых вариантах осуществления полимеры являются, по меньшей мере, частично растворимыми в водных растворах, таких как вода, забуференные солевые растворы или водные спиртовые растворы, которые имеют заряженные боковые группы, или их моновалентная ионная соль. Примеры полимеров, имеющих боковые кислотные группы, которые взаимодействуют с катионами представляют собой поли(фосфазены), поли(акриловые кислоты), поли(метакриловые кислоты), coполимеры акриловой кислоты и метакриловой кислоты, поли(винилацетат) и сульфонированные полимеры, такие как сульфонированный полистирол. Coполимеры, имеющие кислотные боковые группы, образованные посредством реакции акриловой или метакриловой кислоты и мономеров винилового эфира или полимеров, могут также применяться. Примеры кислотных групп представляют собой группы карбоновой кислоты, группы сульфоновой кислоты, галогенированные (предпочтительно, фторированные) спиртовые группы, фенольные OH группы и кислотные OH группы.
in vivo
Изолированные плацентарные клетки, описанные здесь, или их со-культуры могут быть высеяны на трехмерном остове или каркасе и имплантированы . Такой каркас может быть имплантирован в сочетании с любыми одним или более факторов роста, клетками, лекарствами или другими компонентами, которые, например, стимулируют образование ткани.
Примеры каркасов, которые могут применяться, включают нетканые покрытия, пористые пены или самособирающиеся пептиды. Нетканые покрытия могут быть образованы с использованием волокон, содержащих синтетический абсорбируемый coполимер гликолевой и молочной кислот (например, PGA/PLA) (VICRYL, Ethicon, Inc., Somerville, N.J.). Также в качестве каркасов можно применять пены, состоящие, например, из сополимера поли(ε-капролактона) и полигликолевой кислоты (PCL/PGA), образованные посредством процессов, таких как сублимационная сушка или лиофилизация (см., например, патент США № 6355699).
В еще одном варианте осуществления изолированные плацентарные клетки могут высеваться в фетр или контактировать с ним, который может, например, состоять из мультифиламентных нитей, изготовленных из биоабсорбируемого материала, такого как PGA, PLA, PCL сополимеры или смеси или гиалуроновой кислоты.
Изолированные плацентарные клетки, предоставленные в данном документе, можно в еще одном варианте осуществления высевать на вспененные каркасы, которые могут быть композитными структурами. Подобные вспененные каркасы можно формовать в пригодной форме, такие как форма части конкретной структуры на теле, которую следует восстановить, заменить или нарастить. В некоторых вариантах осуществления каркас обрабатывают, например, 0,1М уксусной кислотой с последующей инкубацией в полилизине, PBS и/или коллагене до инокуляции ОРАС для усиления клеточного прикрепления. Внешние поверхности матрикса можно модифицировать для улучшения прикрепления или роста клеток и дифференциации ткани, так как посредством покрытия плазмой матрикса или добавления одного или более белков (например, коллагенов, эластичных волокон, ретикулярных волокон), гликопротеинов, гликозаминогликанов (например, сульфат гепарина, хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматан сульфат, кератин сульфат и т.д.), клетчатый матрикс и/или другие материалы, такие как, но не ограничиваясь ими, желатин, альгинаты, агар, агароза и растительные смолы и т.п.
В некоторых вариантах осуществления каркас включает в себя материалы, которые приводят его в не тромбогенное состояние, или каркас обрабатывают подобным материалом. Эти обработки и материалы могут также стимулировать и поддерживать рост эндотелия, миграцию и отложение внеклеточного матрикса. Примеры этих материалов и обработок включают, но не ограничиваются ими, природные материалы, такие как основные мембранные белки, такие как ламинин и коллаген типа IV, синтетические материалы, такие как EPTFE, и сегментированные силиконы полиуретанмочевины, такие как PURSPAN™ (The Polymer Technology Группа., Inc., Berkley, Calif.). Каркас может также включать в себя противотромботические агенты, такие как гепарин; каркасы также можно обработать для изменения поверхностного заряда (например, покрытие плазмой) перед высеванием с изолированными плацентарными клетками.
6
6
В одном варианте осуществления, изолированные плацентарные клетки засевают на пригодный каркас или обеспечивают их контакт с ним при приблизительно от 0,5×10 до приблизительно 8×10 клеток/мл.
5.10 ИММОРТАЛИЗОВАННЫЕ ЛИНИИ ПЛАЦЕНТАРНЫХ КЛЕТОК
Плацентарные клетки млекопитающих можно условно иммортализовать посредством трансфекции любым подходящим вектором, содержащим стимулирующий рост ген, то есть ген, кодирующий белок, который при подходящих условиях стимулирует рост трансфицированной клетки так, чтобы выработка и/или активность стимулирующего рост белка была регулируемой внешним фактором. В предпочтительном варианте осуществления стимулирующий рост ген представляет собой онкоген, такой как, но не ограничивается ими, v-myc, N-myc, c-myc, р53, антиген SV40 с высоким Т, антиген полиомы с высоким Т, аденовирус Е1а или белок Е7 папиломавируса человека.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Eschrichia coli
CMV*-1
Внешнее регулирование стимулирующего рост белка можно достичь посредством помещения стимулирующего рост гена под контроль регулируемого извне промотора, например, промотора, активность которого можно контролировать, например, посредством модификации температуры трансфицированных клеток или композиции среды в контакте с клетками. В одном варианте осуществления можно использовать систему экспрессии контролируемого тетрациклином (тет) гена (см. Gossen et al., 89:5547-5551, 1992; Hoshimary et al.,  93:1518-1523, 1996). В отсутствие тет, контролируемый тет трансактиватор (tTA) внутри этого вектора сильно активирует транскрипцию от ph, минимальный промотор из человеческого цитомегаловируса, комбинированного с последовательностями тет оператора. tTA представляет собой объединенный белок репрессора (tetR) тет устойчивого производного от транспозона оперона  и кислотного домена VP16 вируса герпес симплекс. Низкая не токсичная концентрация тет (например, 0,01-1,0 мкг/мл) почти полностью аннулирует трансактивацию посредством tTA.
R
R
В одном варианте осуществления вектор дополнительно включает в себя ген, кодирующий выбираемый маркер, например, белок, который предоставляет лекарственную устойчивость. Бактериальный ген, устойчивый к неомицину (neo) представляет собой один подобный маркер, который можно использовать, как описано в данном документе. Клетки, несущие neo, можно выбирать из известных специалистам в данной области техники, таких как добавление к среде для выращивания, например, 100-200 мг/мл G418.
in
vitro
Трансфекции можно достичь посредством любого из множества способов, известных специалистам в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, ретровирусную инфекцию. Как правило, клеточную культуру можно трансфицировать посредством инкубации со смесью кондиционированной среды, собранной из линии производителя клеток для вектора и DMEM/F12, содержащего N2 дополнения. Например, плацентарную клеточную культуру, полученную, как описано выше, можно инфицировать, например, через пять дней  посредством инкубации в течение приблизительно 20 часов в одном объеме кондиционированной среды и двух объемах DMEM/F12, содержащей N2 дополнения. Трансфицированные клетки, несущие селектируемый маркер, затем можно отбирать, как описано выше.
После трансфекции культуры пересевают на поверхность, которая обеспечивает пролиферацию, например, дает возможность, по меньшей мере, 30% клеток удваиваться за период в 24 часа. Предпочтительно субстрат представляет собой субстрат полиорнитина/ламинина, состоящий из пластика тканевой культуры, покрытого полиорнитином (10 мкг/мл) и/или ламинином (10 мкг/мл), субстрат полилизина/ламинина или поверхность, покрытая фибронектином. Затем культуры подпитывают каждые 3-4 дня средой для выращивания, которая может или не может дополняться одним или более усиливающими пролиферацию факторами. Усиливающие пролиферацию факторы можно добавлять к среде для выращивания, когда культуры составляют менее чем 50% слияния.
Условно иммортализованные плацентарные клеточные линии можно пересевать с применением стандартных технологий, таких как посредством трипсинизации, когда происходит 80-95% слияние. Вплоть до приблизительно двенадцатого пассажа в некоторых вариантах осуществления выгодно поддерживать селекцию (например, посредством добавления G418 для клеток, содержащих устойчивый к неомицину ген). Клетки можно также заморозить в жидком азоте для долговременного хранения.
Клоновые линии клеток можно выделить из условно иммортализованной человеческой плацентарной линии клеток, полученной, как описано выше. Как правило, подобные клоновые линии клеток можно выделить с применением стандартных технологий, таких как посредством ограниченного разбавления или применения клонзапирающего кольца, и распространить. Клоновые линии клеток, как правило, можно подпитывать и пересевать, как описано выше.
Условно иммортализованные линии человеческих плацентарных клеток, которые могут быть, но не обязательно, клоновыми, можно, как правило, индуцировать для дифференциации посредством подавления выработки и/или активности стимулирующего рост белка в условиях культуры, которые облегчают дифференциацию. Например, если ген, кодирующий стимулирующий рост белок, находится под контролем регулируемого извне промотора, условия, например, температура или состав среды, можно модифицировать для сдерживания транскрипции стимулирующего рост гена. Для системы экспрессии контролирующего тетрациклин гена, обсужденной выше, дифференциацию можно достичь посредством добавления тетрациклина для подавления транскрипции стимулирующего рост гена. Как правило, 1 мкг/мл тетрациклина в течение 4-5 дней достаточно для инициации дифференциации. Для стимуляции дополнительной дифференциации в питательную среду можно включать дополнительные агенты.
5.11 НАБОРЫ
+
-
+
+
-
+
+
В еще одном аспекте, здесь предоставлены наборы, пригодные для лечения индивидуума, у которого было нарушение кровотока в ЦНС или вокруг нее, например, индивидуума, который перенес инсульт, содержащие, в контейнере, отделенном от оставшегося содержимого набора, адгезивные к пластику культуры ткани мультипотентные плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки или плацентарные мультипотентные клетки и изолированные их популяции, например, клетки, описанные в Разделе 5.4.2, выше и инструкции по применению. Предпочтительно, плацентарные стволовые клетки предоставлены в фармацевтически приемлемом растворе, например, растворе, пригодном для интракраниального введения или растворе, пригодном для внутривенного введения. В некоторых вариантах осуществления, плацентарные стволовые клетки или плацентарные мультипотентные клетки представляют собой любые из CD10, CD34, CD105 плацентарных клеток, описанных здесь, например, CD10, CD34, CD105, CD200 плацентарные клетки.
В определенных вариантах осуществления наборы содержат один или более компонентов, которые облегчают доставку плацентарных клеток индивидууму. Например, в определенных вариантах осуществления набор содержит компоненты, которые облегчают интракраниальную доставку плацентарных клеток индивидууму. В таких вариантах осуществления, набор может содержать, например, шприцы и иглы, пригодные для доставки клеток индивидууму; радиоактивные или нерадиоактивные соединения, которые позволяют проводить визуализацию пораженной ткани ЦНС (например, кобальт-55) и т.п. В таких вариантах осуществления плацентарные клетки могут содержаться в наборе в мешке или в одном или более пузырьках. В определенных других вариантах осуществления, набор содержит компоненты, которые облегчают внутривенную или внутриартериальную доставку плацентарных клеток индивидууму. В таких вариантах осуществления, плацентарные клетки могут содержаться, например, внутри бутыли или мешка (например, мешка для крови или сходного мешка, способного вместить до приблизительно 1,5 л раствора, содержащего клетки), и набор дополнительно содержит трубки и иглы, пригодные для доставки клеток индивидууму.
Дополнительно, набор может содержать одно или более соединений, которые уменьшают боль или воспаление у индивидуума (например, анальгетик, стероидное или нестероидное противовоспалительное соединение или т.п.). Набор может также содержать антибактериальное или антивирусное соединение (например, один или более антибиотиков), соединение для снижения тревоги у индивидуума (например, алапрозолам), соединение, которое снижает иммунный ответ у индивидуума (например, циклоспорин А), антигистаминное средство (дифенгидрамин, лоратадин, деслоратадин, кветапин, фексофенадин, цетиризин, прометазин, хлорфенирамин, левоцетиризин, циметидин, фамотидин, ранитидин, низатидин, роксатидин, лафутидин или т.п).
Дополнительно, набор может содержать изделия одноразового использования, например, стерильные салфетки, одноразовые бумажные изделия, перчатки или т.п., которые облегчают доставку препарата индивидууму, или которые снижают вероятность инфекции у индивидуума в результате введения плацентарных клеток.
6. ПРИМЕРЫ
6.1 ПРИМЕР 1: ЛЕЧЕНИЕ ИНСУЛЬТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПЛАЦЕНТАРНЫХ КЛЕТОК, ВВЕДЕННЫХ ИНТРАКРАНИАЛЬНО
Этот пример демонстрирует эффективность введения изолированных плацентарных клеток, введенных для лечения симптомов, ассоциированных с нарушением кровотока в мозге или вокруг него или ЦНС.
-
+
+
+
CD34, CD10, CD105, CD200 адгезивные к пластику культуры ткани плацентарные клетки получали посредством ферментативного расщепления, используя коллагеназу I при от приблизительно 1 до приблизительно 2 мг/мл, в течение, например 30 минут, с последующим расщеплением трипсином при концентрации приблизительно 0,25% в течение 10 минут при 37°С. Крысы Sprague-Dawley использовались как модель инсульта. Крысы являются установленной животной моделью, на которой исследуют эффекты инсульта и эффекты различных терапий на симптомы инсульта. См., например, Chen et al., “A Model of Focal Ischemic Stroke in the Rat: Reproducible Extensive Cortical Infarction” Stroke 17(4):738-743 (1986). На условие использовали 10 животных.
Операция на МСА для вызывания инсульта: Все хирургические процедуры проводили в асептических условиях. Животных анестезировали эквитезином (300 мг/кг, внутрибрюшинно) и проверяли на болевые рефлексы. Операцию по обтурации МСА проводили на животных под глубокой анестезией. Метод сшивания МСА лигатурой включает в себя введение нити через сонную артерию, чтобы достичь точки разветвления МСА, блокируя, таким образом, кровоток из общей сонной артерии, а также из круга Виллиса. Правая общая сонная артерия была установлена и изолирована через вентральный срединный шейный надрез. Размер лигатуры составлял 4-0, и она была изготовлена из стерильной, неабсорбирующей лигатуры (Ethicon, Inc., Somerville, NJ), с диаметром кончика лигатуры, суженным до калибра 24-26, с использованием каучукового цемента. Приблизительно 15-17 мм нити вводили из точки разветвления внешней и внутренней сонных артерий для блокирования МСА. Правая МСА была обтурирована в течение одного часа. На основании опубликованных исследований, одночасовая обтурация МСА приводила к максимальному инфаркту. См. Borlongan et al., Neurorep. 9(16):3615-3621 (1998); Borlongan et al., Pharmacol. Biochem. Behav. 52(1):225-229 (1995); Borlongan et al., Physiol. Behav. 58(5):909-917 (1995). Для поддержания температуры тела в пределах нормы применяли нагревающую подстилку и ректальный термометр. Для определения успешной обтурации и реперфузии применяли лазерную допплерографию. Лазерный зонд Допплера помещали у дистального конца МСА для измерения мозгового кровотока до, во время и после обтурации.
5
5
5
Адгезивные плацентарные клетки вводили посредством интракраниальной инъекции (приблизительно 400000 клеток в 5 микролитрах) непосредственно в участок ишемии на 2-ой день после ишемии. Крысам вводили среду (10% декстран и 5% человеческий сывороточный альбумин) по отдельности, 4×10 жизнеспособных клеток, 4×10 жизнеспособных клеток в сочетании с 10 мг/кг циклоспорина А или 4×10 жизнеспособных клеток и циклоспорин А.
В дни 7 и 14 после ишемии, животных обследовали на предмет моторной асимметрии, индуцированной инсультом. Моторную асимметрию оценивали, применяя тест на качание поднятого тела (EBST) или тест Бедерсона. См. Borlongan & Sanberg, J. Neurosci 15(7): 5372-5378 (1995). В тесте EBST животное поднимали посредством удерживания за его хвост, и регистрировали частоту и направление движения качания. Крыс помещали в коробку из Плексигласса и давали возможность освоиться в течение приблизительно 2 минут. Крыс удерживали на расстоянии приблизительно 1 дюйма от основания хвоста, таким образом, что нос крысы находился приблизительно на расстоянии 1 дюйма от поверхности. Крыс удерживали вдоль вертикальной оси или в нейтральном положении, определяемом, как не более чем 10° качание головы вправо или влево. Качание регистрировали вне зависимости от того двигала ли крыса головой от вертикальной оси вправо или влево; правые качания или левые качания подсчитывали, когда голова животного двигалась на 10° или более от вертикальной оси вправо или влево, соответственно. Когда крыса повторяла дважды свои попытки в определенную сторону, регистрировали только единственное качание. После единственного качания животное помещали назад в коробку из Плексигласса и давали ему возможность свободно двигаться в течение 30 секунд перед повторным тестированием. Эти стадии повторяли 20 раз для каждого животного (10 животных на условие).
Подсчитывали общее число качаний, а также число качаний вправо или влево. Поведение качания считали отклоненным, когда число качаний равнялось или превышало 70%. Результаты анализировали с использованием двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA), и апостериорные тесты по полученным результатам проводили, используя тест Tukey HSD (на достоверно значимое различие).
Индуцированное плацентарными клетками восстановление неврологических дефицитов у крыс также оценивали, применяя Неврологический Тест Бедерсона, в котором измеряют сенсомоторные задания. См. Bederson et al., Stroke 17:472-6 (1986); Altumbabic, Stroke 29:1917-22 (1998).
В тесте Бедерсона получали неврологическую балльную оценку для каждой крысы, используя 4 теста, которые включают (а) наблюдение спонтанного ипсилатерального кругового движения, по шкале от 0 (отсутствие кругового движения) до 3 (непрерывное круговое движение); (b) контралатерального сокращения задних конечностей, которое позволяет измерить способность животного к возмещению задней конечности после ее латерального смещения на 2-3 см, по балльной шкале от 0 (немедленное возмещение) до 3 (возмещение через минуты или без возмещения); (с) способности к хождению по лучу, по шкале от 0 для крысы, которая легко пересекает луч шириной 2,4 см, длиной 80 см, до 3 для крысы, неспособной оставаться на луче в течение 10 секунд; и (d) билатерального захвата передней лапкой, который позволяет измерить способность удерживаться на стальном стержне диаметром 2 мм, по шкале от 0 для крысы с нормальным поведением захвата передней лапкой до 3 для крысы, неспособной осуществлять захват передними лапками. Балльные оценки от всех 4 тестов, проводимых в течение периода, равного приблизительно 15 минутам в дни оценки 7 и 14, добавляли с получением балльной оценки неврологического дефицита от 0 до 12, причем более низкие баллы указывали на более неврологически нормальных крыс.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В день 0, непосредственно перед индукцией ишемии, все животные проявляли приблизительно нормальное (неотклоненное) поведение качания (ФИГ. 1, Базовая линия). В день 2 после ишемии, день введения плацентарных клеток, все животные проявляли почти 100% индуцированное ишемией отклонение в поведении качания (ФИГ. 1), как и ожидалось. В дни 7 и 14 животные, получающие жизнеспособные плацентарные клетки, показали существенное улучшение, демонстрирующее приблизительно 65% и 60% отлонение при качании, соответственно (ФИГ. 1, День 7 и День 14). Животные, получающие нежизнеспособные плацентарные клетки и циклоспорин А, или среду по отдельности, не показали статистически значимого улучшения.
Крысы, прошедшие оценку в День 0, перед индукцией ишемии, были все неврологически нормальными, и им была присвоена балльная оценка дефицита, равная 0 (ФИГ. 2, Базовая линия) в тесте Бедерсона. На второй день после индукции ишемии, день введения изолированных плацентарных клеток, крысы, получающие только среду, показали сводную среднюю балльную оценку, равную приблизительно 2,5 (ФИГ. 2, День 2). В дни 7 и 14, крысы, получающие плацентарные клетки, показали статистически значимое улучшение в балльной оценке неврологического дефицита, улучшающейся от балльной оценки, равной приблизительно 2,5, до балльной оценки, равной приблизительно 1,7 и 1,1, соответственно. Как и в случае EBST, крысы, получающие только среду, или нежизнеспособные плацентарные клетки и циклоспорин А, не показали статистически значимого улучшения балльной оценки неврологического дефицита.
5
В заключение, с помощью двух тестов на неврологический дефицит было продемонстрировано, что введение 4×10 человеческих плацентарных клеток через два дня после индукции ишемии на принятой животной модели ишемии, существенно улучшает неврологическую функцию у модельных животных. Введение циклоспорина А для подавления любой иммунной реакции хозяина на плацентарные клетки, по-видимому, не является необходимым для неврологического улучшения от действия плацентарных клеток.
6.2 ПРИМЕР 2: ЛЕЧЕНИЕ ИНСУЛЬТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПЛАЦЕНТАРНЫХ КЛЕТОК, ВВЕДЕННЫХ ВНУТРИВЕННО
Этот пример демонстрирует эффективность введения изолированных плацентарных клеток, введенных внутривенно, при лечении симптомов, ассоциированных с нарушением кровотока в мозге или вокруг него или в ЦНС, например, гипоксического повреждения или аноксического повреждения. Например, результаты, представленные здесь, указывают на то, что внутривенное введение плацентарных клеток инициирует дозозависимое поведенческое восстановление как в моторных, так и в неврологических тестах на животных, которым вводили жизнеспособные человеческие плацентарные клетки, по сравнению с животными, получающими нежизнеспособные человеческие плацентарные клетки.
-
+
+
+
5
6
6
6
Изолированные CD34, CD10, CD105, CD200 адгезивные к пластику культуры ткани плацентарные клетки получали посредством ферментативного расщепления, как описано где-либо еще в данном документе. Крыс Sprague-Dawley применяли в качестве модели инсульта, и обтурацию средней артерии осуществляли, как описано в примере 1, выше. На день 2 после обтурации, крысам вводили 4×10, 1×10, 4×10 или 8×10 плацентарных клеток в приблизительно 5 мкл среды (10% декстран и 5% сывороточный альбумин человека) или нежизнеспособные клетки в среде в качестве контроля. Крыс оценивали на день 0 перед операцией, и в дни 2, 14, 28, 56 и 84 после операции посредством Теста на Качание Поднятого Тела (EBST), как описано в примере 1, выше. Проводили модифицированный тест Бедерсона, в котором каждую крысу оценивали по (1) сокращению передних конечностей, которое позволяет измерить способность животного к компенсации передней конечности после ее латерального смещения на 2-3 см, по балльной шкале от 0 (немедленное возмещение) до 3 (возмещение через несколько секунд или без возмещения); (2) способности к хождению по лучу, по шкале от 0 для крысы, которая легко пересекает луч шириной 2,4 см, длиной 80 см, до 3 для крысы, неспособной оставаться на луче в течение 10 секунд; и (3) билатеральному захвату передней лапкой, который позволяет измерить способность удерживаться на стальном стержне диаметром 2 мм, по шкале от 0 для крысы с нормальным поведением захвата передней лапкой до 3 для крысы, неспособной осуществлять захват передними лапками. Балльные оценки от всех 3 тестов, проводимых в течение периода, равного приблизительно 15 минутам, в день оценки, добавляли с получением средней балльной оценки неврологического дефицита (максимально возможная оценка 9 пунктов, разделенная на 3 теста = 3). Результаты EBST и теста Бедерсона оценивали посредством двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) в тесте Tukey HSD, как описано в примере 1, выше.
Крыс умерщвляли в день 84 для вскрытия и оценки приживления и дифференциации плацентарных клеток. Вкратце, криостатированные срезы ткани толщиной 20 мкм исследовали при 40Х увеличении и подвергали цифровой обработке, используя компьютерную программу Image Tools на базе ПК. Срезы мозга кодировали слепым методом. Срезы тканей обрабатывали, используя стандартный АВС метод. Индексы приживления и дифференциации для определения выживания трансплантированных стволовых клеток, полученных из человеческой плаценты, оценивали, используя человеческое специфическое антитело HuNu, которое не имеет перекрестного взаимодействия с маркерами поверхности клеток грызунов или другими белками грызунов. Для определения экспрессии нейронального фенотипа в клеточных трансплантатах, применяли иммуногистохимический маркер МАР2. Дополнительные срезы мозга обрабатывали для GFAP и О4, чтобы отобразить глиальную и олигодендроглиальную фенотипичную экспрессию трансплантированных клеток.
Внутривенная трансплантация клеток, полученных из человеческой плаценты, не требовала иммуносуппрессии.
Все животные, включенные в данное исследование, проявляли нормальное поведение на базовой линии, и достигали критериев успешной индукции церебральной ишемии на день 2 после инсульта перед трансплантацией. Начиная с самой ранней временной отметки тестирования после трансплантации, на день 7 после инсульта, поведенческие тесты показали дозозависимое значительное улучшение как локомоторных, так и неврологических функций у животных, перенесших инсульт, которые получили жизнеспособные клетки, полученные из плаценты человека, по сравнению с животными, перенесшими инсульт, которые получали нежизнеспособные клетки, полученные из плаценты человека. В течение времени вплоть до 84 дней после инсульта, наблюдали увеличивающуюся тенденцию в дальнейшем улучшении при выполнении обоих заданий у животных, перенесших инсульт, которые получили жизнеспособные клетки, полученные из человеческой плаценты. У любого из животных, подвергнутых трансплантации, отсутствовало обнаруживаемое обострение индуцированных инсультом поведенческих дефицитов, включая животных, получавших нежизнеспособные клетки. Во время периода созревания трансплантата, наблюдали общую тенденцию спонтанного поведенческого восстановления у животных, получавших нежизнеспособные клетки, но опосредованное трансплантатом функциональное улучшение не достигало статистической значимости по сравнению с предтрансплантационной операцией (т.е. на день 2 после инсульта).
Животные, перенесшие инсульт, которые получили высокую дозу, равную 8 миллионам жизнеспособных клеток, выраженно проявляли наиболее устойчивое улучшение при выполнении как локомоторного, так и неврологического задания, как и в раннем посттрансплантационном периоде. Однако, с течением времени животные, перенесшие инсульт, которые получали низкие дозы жизнеспособных клеток, также проявляли выраженное усиление поведенческих дефицитов, которое, в целом, является сравнимым с высокой дозой в 8 миллионов жизнеспособных клеток.
6
6
5
6
Крысы, которых оценивали в День 0, перед индукцией ишемии, все являлись неврологически нормальными, и им была присвоена балльная оценка дефицита, равная 0 (ФИГ. 3, Базовая линия). В день 2 после ишемии, день введения плацентарных стволовых клеток, все животные проявляли почти 100% индуцированное ишемией отклонение в поведении качания (ФИГ. 3), как и ожидалось. Животные, получившие жизнеспособные изолированные плацентарные клетки, показали существенное, дозозависимое улучшение в EBST для каждого из Дней 7, 14, 28, 56 и 84, по сравнению с контролем, и дополнительно показали существенное улучшение (р<0,01) между дозами, за исключением 4×10 по сравнению с 8×10 изолированных плацентарных клеток для всех дней и 4×10 по сравнению с 1×10 изолированных плацентарных клеток в День 7 (р<0,0454). См. ФИГ. 3. Животные, получившие нежизнеспособные изолированные плацентарные клетки, не показали статистически значимого улучшения по сравнению с контролями.
5
6
6
6
5
6
5
6
Для теста Бедерсона, крысы, подвергаемые оценке в день 0, перед индукцией ишемии, все являлись неврологически нормальными, и им была присвоена балльная оценка дефицита, равная 0 (ФИГ. 4, Базовая линия). В день 2 после ишемии, день введения плацентарных стволовых клеток, крысы, получившие только нежизнеспособные клетки, показали суммарную среднюю балльную оценку дефицита, равную приблизительно 2,5-3,0 (ФИГ. 2, День 2). В дни 7, 14, 28, 56 и 84 крысы, получившие изолированные плацентарные клетки, показали статистически значимое улучшение балльной оценки неврологическог дефицита по сравнению с крысами, получавшими нежизнеспособные клетки (р<0,01 в каждом случае). Улучшение было дополнительно существенно (р<0,01) дозозависимым в День 7 (4×10 по сравнению с 8×10 и 1×10 по сравнению с 8×10), и Дни 14 и 28 (4×10 по сравнению с 4×10 и 4×10 по сравнению с 8×10), соответственно. Как и для EBST, крысы, получившие только среду и нежизнеспособные изолированные плацентарные клетки, и циклоспорин А, не показали статистически существенного улучшения в балльной оценке неврологического дефицита.
Таким образом, внутривенное введение изолированных плацентарных клеток инициирует дозозависимое поведенческое восстановление при выполнении как моторных, так и неврологических тестов. Функциональное улучшение было очевидным уже на 7 день после введения, с усилением тенденции лучшего восстановления в течение посттрансплантационного периода 3 месяцев. Ни у одной из отдельных крыс не наблюдали выраженных неблагоприятных побочных эффектов.
Таким образом, результаты, представленные здесь, демонстрируют безопасность и эффективность внутривенного введения изолированных плацентарных клеток для лечения симптомов, ассоциированных с нарушениями мозгового кровотока в мозге или вокруг него. Например, ни одно из животных, подвергшихся трансплантации, не показало какого-либо обострения индуцированных инсультом поведенческих аномалий. По сравнению с животными, получившими нежизнеспособные клетки, полученные из человеческой плаценты, животные, которые получили жизнеспособные клетки, проявили существенное улучшение индуцированных инсультом поведенческих дефицитов и значительную мобилизацию клеток хозяина в ишемической пенумбре. Кроме того, у любого из животных, прошедших трансплантацию, не было обнаружено опухолей или образования эктопических тканей.
6.3 ПРИМЕР 3: ЛЕЧЕНИЕ ИНСУЛЬТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЛАЦЕНТАРНЫХ КЛЕТОК ЧЕРЕЗ ВНУТРИВЕННЫЙ ПУТЬ - ОЦЕНКА ПОСРЕДСТВОМ ДРУГИХ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ ТЕСТОВ
Этот пример демонстрирует эффективность лечения инсульта с использованием плацентарных стволовых клеток, как оценивают посредством неврологических тестов, отличных от теста на качание поднятого тела и теста Бедерсона.
6.3.1 НЕВРОЛОГИЧЕСКИЕ ТЕСТЫ
2
2
Операцию обтурации средней мозговой артерии осуществляли на крысах Wistar следующим образом. Cамцов крыс Wistar (270-300 г, 2-3 см) подвергали 2 ч обтурации средней мозговой артерии (MCAo), индуцированной внесением хирургического найлонового жгута во внутреннюю сонную артерию (ICA) для блокировки начала MCA. Вкратце, крыс анестезировали 2% изофлураном в полураскрытом состоянии для предварительной анестезии, и самопроизвольно респирировали 1,5% изофлураном в смеси 2:1 NO:O, используя маску, соединенную и регулируемую с помощью модифицированного парового ингалятора FLUOTEC 3 Vaporizer (Fraser Harlake, Orchard Park, New York). Ректальную температуру поддерживали при 37°C в течение всей хирургической процедуры, используя регулируемую водонагревательную систему с обратной связью (подушка рециркуляции и K модуль, и регистрировали через внутриректальную термопару типа T). Разрез длиной 1 см был сделан в центре шеи, и правая общая сонная артерия (CCA), внешняя сонная артерия (ECA) и внутренняя сонная артерия (ICA) были исследованы под микроскопом (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY). CCA и ICA были временно пережаты с использованием микрохирургических зажимов (Codman & Shurtleff, Inc., Randolf, MA). Лигатуру из найлона 4-0 с концом, закругленным посредством нагрева рядом с пламенем, вводили в ECA через небольшой прокол. Микрохирургические скобки удаляли. Длину найлоновой лигатуры, определенную в соответствии с массой животного, осторожно выдвигали из ECA в просвет ICA до тех пор, пока лигатура не блокировала начало MCA. Найлоновый жгут удерживали внутри ICA в течение 2 часов (ч), и разрез на шее закрывали. Животных переносили в их клетки для пробуждения. Через 2 ч MCAo, животных реанестезировали изофлураном, и восстановление кровотока осуществляли удалением жгута до тех пор, пока кончик не освобождал просвет ECA. Надрез затем закрывали.
+
-
+
+
6
6
6
Адгезивные CD10, CD34, CD105, CD200 адгезивные к пластику тканевой культуры плацентарные клетки вводили посредством внутривенного пути (инъекция в хвостовую вену). Животные, подвергнутые MCAo, были статистически распределены в одну из пяти групп: (1) человеческие кожные фибробласты в качестве клеточного контроля, (2) контроль с декстраном, с дозой плацентарных клеток, равной (3) 1×10, (4) 4×10 и (5) 8×10 клеток, вводимых через 1 день после MCAo. Поведенческие тесты (тест на прилипание, зашаговый тест и mNSS) проводили через 1 день после MCAo перед исследованием на лечение (базовая линия), и в дни 7, 14, 21, 28, 42 и 56 после MCAo. Дозозависимые эффекты плацентарных клеток на функциональное восстановление измеряли от трех поведенческих тестов, описанных ниже.
Балльная оценка модифицированной неврологической тяжести (mNSS таблица 1): нанесена на шкалу от 0 до 18 (нормальная оценка 0; оценка максимального дефицита 18, таблица 1). Оценку в один балл присваивают при неспособности выполнять тест или отсутствии тестируемого рефлекса; таким образом, чем выше балльная оценка, тем тяжелее повреждение.
<b>Таблица 1</b>
Критерии балльной оценки модифицированной неврологической тяжести
<b>Моторный тест</b>
<b>Максимальные баллы</b>
Поднятие крысы за хвост:1 Сгибание передней конечности1 Сгибание задней конечности1 Голова сдвигается более, чем на 10° по отношению к вертикальной оси в пределах 30 секунд
3
Ходьба по полу0 Нормальная ходьба1 Неспособность к хождению по прямой2 Круговое движение по направлению паретической стороны3 Падение в паретическую сторону
3
Сенсорные тесты:1 Тест на размещение (визуальный и тактильный тест)1 Проприоцептивный тест (глубокое ощущение, толкание лапкой края стола для стимуляции мышц конечностей)
2
Тесты на удержание баланса на луче0 Балансирует в устойчивой позиции1 Захватывает сторону луча2 Придерживается луча, и одна конечность выпадает из луча3 Придерживается луча, и две конечности выпадают из луча или качается на луче (>60 сек)4 Пытается балансировать на луче, но выпадает (>40 сек)5 Пытается балансировать на луче, но выпадает (>20 сек)6 Выпадение: Нет попыток балансировать или повиснуть на луче (<20 сек)
6
Рефлексы и аномальные движения:1 Рефлекс ушной раковины (потряхивание головой при касании слухового прохода)1 Роговичный рефлекс (мигание глазом при лёгком касании роговицы ватой)1 Рефлекс Моро (моторный ответ на кратковременный шум от хлопка руками)1 Судороги, миоклония, миодистония
4
Максимальные баллы:
18
2
2
Соматосенсорный тест на удаление адгезива: Все животные были ознакомлены с окружением тестирования. В первоначальном тесте два небольших кусочка липких с обратной стороны бумажных обрывков (равного размера, 113,1 мм для теста в пределах одного месяца; 56,6 мм для теста через один месяц) использовали в качестве двусторонних тактильных стимулов, занимающих дистально-радиальную область запястья каждой передней конечности. Крыс затем возвращали в их клетки. Время для удаления каждого стимула с передних конечностей регистрировали для 5 попыток в день.
Зашаговый тест: Животных поместили на поднятый решетчатый пол (45 см на 30 см), 2,5 см выше уровня твердого основания пола, с диаметром отверстий 2,5 см х 2,5 см. Животные пытаются двигаться на решетке, причем их лапы размещены на проволочном каркасе. Когда животные неточно помещают лапу, передняя конечность проваливается через одно из отверстий в решетке. Когда лапа западала или сползала между проволоками, регистрировали зашаг (заступ). Всего было подсчитано 100 шагов (движение каждой передней конечности), и регистрировали общее число заступов для левой передней конечности, и определяли процентное соотношение зашагов левой лапы от общего числа шагов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
6
Балльная оценка модифицированной неврологической тяжести (mNSS): Группа животных, обработанная 4,0 x 10 клеток, показала улучшение балльной оценки mNSS по сравнению с контрольной средой на дни 7-56 (p<0,05) (ФИГ. 5).
6
6
Соматосенсорный тест на удаление адгезива: Группа животных, обработанная 4,0 x 10 клеток, показала улучшение (p<0,05) в соматосенсорном тесте по удалению адгезива по сравнению с контрольной средой или клеточным контролем на день 14 после обработки и улучшение было продолжительным на протяжении периода исследования (ФИГ. 6). Дополнительно, животные, обработанные 8,0×10 клеток, показали улучшение (p<0,05) на дни 42 и 56 после обработки.
6
Зашаговый тест: Группа животных, обработанных 4,0×10 клеток, демонстрировала улучшение по сравнению с контрольной средой или клеточным контролем на день 7 после обработки, и улучшение было постоянным на протяжении периода исследования (ФИГ. 7).
6
На основании проведенных выше исследований, определяли, что лечение инсульта дозо-зависимо улучшает функциональный результат после инсульта у крыс по сравнению с фибробласт-контролем и декстран-контролем. Определено, что оптимальная доза, используемая в данном исследовании для обработки крыс плацентарными стволовыми клетками, составляет 4×10.
6.3.2 ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ И СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ
Для оценки того, способствует ли введение плацентарных стволовых клеток неоваскуляризации, 5-бром-2-дезоксиуридин (BrdU; 50 мг/кг в физиологическом растворе с 0,007 N NaOH, Sigma, St, Louis MO)) вводили инъекционно экспериментальным животным, начиная с 24ч после MCAo и ежедневно в течение 14 дней. Экспериментальных животных умерщвляли, получали срезы ткани мозга из окклюдированной области и окрашивали с BrdU. Экспериментальных животных реанестезировали кетамином (80 мг/кг) и ксилазином (13 мг/кг и.п. инъекция) и глубину анестезии регистрировали посредством рефлекса на защемление лапки. После анестезии, 2 мл крови отбирали из сердца. Сыворотку получали и хранили при -20°C. Затем животных подвергали пункции сердца с перфузией физиологическим раствором (приблизительно 200 мл для крыс) и затем перфузии 4% параформальдегидом (приблизительно 50 мл для крыс) с использованием насоса Simon Varistaltic Pump.
6
Мозг вырезали и фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 48ч-72ч, с последующим погружением в парафин для иммуноокрашивания. С использованием матрикса для мозга крыс (Activational Systems Inc., Warren, MI), каждый передний мозг был нарезан на коронарные блоки толщиной 2 мм, с получением всего 7 блоков на животное. Срезы мозга, полученные для оптимальной (4×10 клеток) обработки плацентарными стволовыми клетками, Декстран MCAo-контрольную и FBC-контрольную группы применяли для иммуноокрашивания. Стандартный парафиновый блок был получен из центра повреждения (брегма -1 мм до +1 мм). Ряды из срезов толщиной 6 мкм были вырезаны из блока. Три коронарных среза мозга применяли для каждого иммуногистохимического окрашивания. Проводили иммуноокрашивание антителами против BrdU, маркером пролиферирующих клеток (1:100, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), фактором фон Виллебранда (vWF, 1:400; Dako, Carpenteria, CA), дублекортином (DCX, маркер мигрирующих нейробластов) (C-18, козьи поликлональные IgG антитела, 1:200 разбавление, Santa Cruz) и синаптофизином (Boehringer Mannheim Biochemica Моноклональные антитела, клон SY 38, 1:40). BrdU иммуноокрашенные срезы оцифровывали с использованием 40X объектива (Olympus BX40) посредством компьютерной системы анализа изображений MCID (Imaging Research, St. Catharines, Canada). BrdU положительные клетки в пределах всего 10 увеличенных тонкостенных сосудов, расположенных в пограничной области к ишемическому повреждению, были подсчитаны в каждом срезе.
Для полуколичественной оценки иммунореактивности синаптофизина, иммуноокрашенный коронарный срез и восемь полей обзора из ишемической пенумбры (кора и полосатое тело) в каждой секции оцифровывали под 20x объективом. Измеряли положительную область. Данные представляли в виде процентного содержания положительной области.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
6
6
Было обнаружено, что введение 4×10 плацентарных стволовых клеток существенно увеличивает ангиогенез, как было измерено посредством увеличения пролиферации эндотелиальных клеток и сосудистой плотности в ишемическом мозге по сравнению с контрольной средой с FBC-контролем и Декстран-контролем (Фигура 8). Кроме того, введение 4×10 плацентарных стволовых клеток существенно увеличивает синаптическую пластичность, как измерено посредством увеличенной экспрессии синаптофизина в ишемическом мозге по сравнению с контрольной средой с FBC-контролем.
6.4 ПРИМЕР 4: ЛЕЧЕНИЕ ИНСУЛЬТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ ПЛАЦЕНТАРНЫХ КЛЕТОК
7
-
+
+
+
Индивидуум, 62 года, с проявлением гемиплегии на левой стороне; мышечной слабости с левой стороны лица; и онемения и снижения чувствительности с левой стороны тела. Симптомы развивались в течение двух часов перед презентацией. Был поставлен диагноз инсульт. Индивидууму, в пределах полного часа после диагноза, вводят 100-200 миллилитров мультипотентных, адгезивных к пластику культуры ткани плацентарных клеток, при концентрации приблизительно 1×10 клеток на миллилитр. Анализ введенных мультипотентных плацентарных клеткок показал, что они представляют собой ≥90% CD34, CD10, CD105 и CD200. Состояние индивидуума оценивают через 12 часов, 24 часов, 48 часов, 4 дня и 7 дней после введения и отмечают видимое улучшение мышечной силы или онемения с левой стороны. Необязательно проводят второе введение.
6.5 ПРИМЕР 5: ГОТОВАЯ ФОРМА ПЛАЦЕНТАРНЫХ КЛЕТОК ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНСУЛЬТА, ГИПОКСИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ИЛИ АНОКСИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ
-
+
+
+
6
9
Мультипотентные CD34, CD10, CD105 и CD200 плацентарные клетки отфильтровывали для удаления сгустков и приводили к 10±3×10 клеток на миллилитр в растворе, содержащем 5,5% (м/о) декстрана-40, 10% (м/о) сывороточного альбумина человека и 5% (о/о) диметилсульфоксида (ДМСО) в воде. Общее количество клеток в готовой лекарственной форме составляет приблизительно 4-7 × 10 клеток.
Клетки, полученные в виде готовой формы, таким образом, распределяют на аликвоты по 20 мл в контейнеры для замораживания объемом 50 мл и замораживают. Разделенные на аликвоты клетки разбавляют для применения с 10% декстраном-40 в хлориде натрия в инфузионном мешке объемом 1000 мл.
ЭКВИВАЛЕНТЫ:
Композиции и способы, раскрытые здесь, не ограничиваются по охвату конкретными вариантами осуществления, описанными здесь. Несомненно, разнообразные модификации композиций и способов в дополнение к описанным станут очевидными для квалифицированных специалистов в области из приведенного выше описания и сопроводительных фигур. Подразумевают, что такие модификации попадают в пределы охвата прилагаемой формулы изобретения.
В данном описании цитируются различные публикации, патенты и патентные заявки, раскрытие каждой из которых включено посредством ссылки во всей его полноте.