Способ спектроскопического исследования тканевых метаболитов и устройство для его осуществления
METHOD FOR SPECTROSCOPIC STUDY OF TISSUE METABOLITES AND DEVICE FOR ITS IMPLEMENTATION

Изобретение относится к исследованию метаболома и анализу характерных метаболитов при определенных заболеваниях ЛОР-органов с помощью молекулярной спектроскопии высокого разрешения и может быть использовано в практической медицине.
Изобретение направлено на создание способа для выявления и анализа тканевых метаболитов и высокочувствительного и быстродействующего прибора для его осуществления, позволяющих проводить спектроскопический анализ паров и продуктов разложения тканей ЛОР-органов с целью выявления метаболитов патологических процессов.
Наиболее известным и распространенным способом исследования метаболома и анализа метаболитов заболеваний является газовая хроматография, сопряженная с масс-спектрометрией. При этом проводится исследование выдыхаемого воздуха на наличие метаболитов, характерных для определенного заболевания. Наибольшее количество патентов связано с определением в выдыхаемом воздухе метаболитов онкологических заболеваний.
Так, в патенте US 9638695 ((Noninvasive detection of lung cancer using exhaled breath» (публ. 02.05.2017 г., МПК G01N 1/40, G01N 33/574, G01N 33/543, G01N 33/64, G01N 33/497) предлагается неинвазивный способ детектирования или скрининга рака легкого. В предложенном способе оценивают количество одного или несколько карбонил-содержащих летучих органических соединений (ЛОС), которые являются маркерами рака легкого в выдыхаемом воздухе. Способ включает забор выдыхаемого воздуха, образование продуктов присоединения карбонил-содержащих ЛОС с химически активными соединениями, количественное определение наличия продуктов присоединения карбонил-содержащих ЛОС для дальнейшего сравнения содержания каждого из продуктов присоединения с содержанием их в образце здорового человека. Для анализа используется газовая хроматография, сопряженная с масс-спектрометрией. Выявляют одно или несколько веществ в количествах, превышающих их содержание в образце здорового человека, что используют для скрининга рака легкого.
В патенте US 9551712 «Volatile organic compounds as diagnostics markers for various types of сапсег» (публ. 24.01.2017 г., МПК G01N 33/497, G01N 33/574, G01N 30/00, H01J 49/26) предлагаются способы диагностики, прогнозирования и контроля различных видов рака путем выявления наборов маркеров (летучих органических соединений) в выдыхаемом воздухе, определения их содержания и сравнения с контрольным образцом. Для исследований используется метод газовой хроматографии, сопряженный с масс-спектрометрией.
К недостаткам указанных способов можно отнести то, что при сложных составах смесей идентификация газов бывает сильно затруднена.
В патенте США US 8174394 «System for noninvasive determination of analytes in tissue» (публ. 08.05.2012 г., МПК G08B 13/14, A61B 5/1455) описана система ИК-спектроскопии, предназначенная для неинвазивного определения уровня содержания этанола и продуктов его переработки в коже человека. Устройство включает в себя различные подсистемы обнаружения веществ маркеров в ткани: обработки полученных сигналов, калибровки системы, а также базы данных спектров веществ-маркеров для сравнения с получаемыми результатами. К недостаткам описанного устройства можно отнести низкую селективность и ограниченную разрешающую способность.
Множество патентных документов посвящено исследованию патологических процессов и заболеваний ЛОР-органов: US 10695080 «Devices, systems and methods for diagnosing and treating sinusitis and other disorders of the ears, nose and/or throat» (публ. 30.06.2020 г., МПК A61M 25/10, A61M 31/00); US 10725040 «Proteomics based diagnostic detection method for chronic sinusitis» (публ. 28.07.2020 г., МПК G01N 33/53, A61K 39/00, A61B 10/00, C12Q 1/04, A61K 39/07, G01N 33/569); US 10660923 «Sinusitis diagnostics and treatment)) (публ. 26.05.2020 г., МПК A61K 35/747, C12Q 1/689, C12Q 1/06, A61K 35/744, A61K 9/00); US 9625451 «Method for diagnosing chronic sinusitis» (публ. 18.04.2017 г., МПК G01N 33/53, G01N 33/68); US 7659080 «Detecting a bacterial process in chronic rhinosinusitis» (публ. 09.02.2010 г., МПК C12N 9/66, G01N 33/00); US 6551791 «Rapid diagnostic method for distinguishing allergies and infections and nasal secretion collection unit» (публ. 22.04.2003 г., МПК C12Q 1/44, G01N 33/569, G01N 33/68, C12Q 001/44). Большое значение в них уделяется микробиоте синусов, процессам, происходящим в полости носа с фиксированным выделением одного метаболита, например оксида азота, без анализа тканевых метаболитов, полученных непоредственно из очага восспаления. Работ по исследованию тканевых метаболитов при патологии ЛОР-органов на настоящий момент не проводилось.
Наиболее близкими является способ и устройство для его осуществления, описанные в патенте RU 2084874 «Способ микроволновой спектроскопии и спектрометр для его осуществления» (публ. 20.07.1997 г., МПК G01N 22/00). По данному способу воздействуют на исследуемый образец микроволновым излучением, принимают и детектируют микроволновое излучение. Затем про детектированный сигнал усиливают, преобразуют в цифровую форму и проводят компьютерную обработку полученных результатов. Недостатком способа-прототипа является невозможность непосредственного исследования негазообразных образцов, которыми чаще всего и являются образцы, полученные из ЛОР-органов. В прототипе требуется предварительная обработка тканей и размещение их паров в измерительной ячейке. Кроме того, вид представления конечной информации не позволяет выявить тканевые метаболиты -маркеры патологического процесса.
Описанный в патенте RU 2084874 микроволновой спектрометр содержит последовательно размещенные источник микроволнового излучения, ячейку с исследуемым образцом, детектор, блок обработки сигнала, а также блок управления частотой источника микроволнового излучения. Недостатками устройства-прототипа является отсутствие блока пробоподготовки, в результате чего невозможно исследовать негазообразные образцы тканей ЛОР-органов. К тому же, блок обработки сигнала не позволяет распознать тканевые метаболиты, являющиеся маркерами патологического процесса, и построить метаболический профиль.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа и устройства спектроскопического исследования для проведения спектроскопического анализа, позволяющих изучать в том числе и негазообразные образцы тканей за счет предварительной пробоподготовки исследуемого образца тканей ЛОР-органов и обеспечивающих выявление тканевых метаболитов - маркеров патологического процесса с построением метаболического профиля.
Технический результат в части способа в предлагаемом изобретении достигается за счет того, что разработанный способ спектроскопического исследования, так же, как и способ-прототип, включает в себя воздействие на исследуемый образец, размещенный в измерительной ячейке, микроволновым излучением, прием и детектирование микроволнового излучения, измерение спектров поглощения исследуемого образца, компьютерную обработку полученных результатов. Новым в разработанном способе спектроскопического исследования является то, что перед размещением исследуемого образца в измерительной ячейке выполняют пробоподготовку, включающую в себя обезвоживание исследуемого образца, после чего производят нагрев исследуемого образца и напуск паров и продуктов его термического разложения в измерительную ячейку. К тому же в процессе компьютерной обработки выявляют тканевые метаболиты и строят метаболический профиль.
В частном случае реализации разработанного способа для воздействия на исследуемый образец используют излучение с длиной волны от сантиметрового до субмиллиметрового диапазонов.
Технический результат в части устройства в предлагаемом изобретении достигается за счет того, что разработанное устройство для спектроскопического исследования, так же, как и устройство-прототип содержит последовательно размещенные источник микроволнового излучения, измерительную ячейку с исследуемым образцом, детектор, блок обработки сигнала, а также блок управления частотой, подключенный к источнику микроволнового излучения. Новым в разработанном устройстве является то, что к измерительной ячейке подключен через систему напуска блок пробоподготовки, при этом блок пробоподготовки и измерительная ячейка подключены к вакуумирующему блоку, а блок обработки сигнала дополнительно снабжен программным обеспечением, позволяющим выявить тканевые метаболиты, являющиеся маркерами патологического процесса, и построить метаболический профиль.
На фиг. 1 представлена блок схема предлагаемого устройства для спектроскопического исследования.
На фиг. 2 представлены диаграммы, показывающие соотношение количества линий поглощения в спектрах мукоида из решетчатых пазух при муковисцидозе, ретенционной кисты основной пазухи, чистых колоний золотистого стафилококка.
На фиг. 3 изображены графические зависимости для конкретных маркеров, характеризующих мукоид из решетчатых пазух при муковисцидозе, ретенционную кисту основной пазухи и чистые колонии золотистого стафилококка.
На фиг. 4 представлены диаграммы, показывающие соотношение количества линий поглощения в спектрах мукоида из бронхов, мукоида из решетчатых пазух, полипа верхнечелюстной пазухи.
На фиг. 5 изображены графические зависимости для конкретных маркеров, характеризующих мукоид из бронхов, мукоид из решетчатых пазух, полип верхнечелюстной пазухи.
На фиг. 6 представлены диаграммы, показывающие соотношение количества линий поглощения в спектрах мукоида из бронхов, мукоида из решетчатых пазух, чистых колоний синегнойной палочки.
На фиг. 7 изображены графические зависимости для конкретных маркеров, характеризующих мукоид из бронхов, мукоид из решетчатых пазух, чистые колонии синегнойной палочки.
На фиг. 1 представлена схема устройства для спектроскопического исследования. В разработанном устройстве к выходу источника 1 микроволнового излучения подключена измерительная ячейка 2. Один выход блока пробоподготовки 3 через систему напуска 4 подключен к ячейке 2, а другой к вакуумирующему блоку 5. При этом измерительная ячейка 2 соединена с вакуумирующим блоком 5. Выход измерительной ячейки 2 соединен с детектором 6, выходы которого соединены с блоком управления частотой 7 и блоком обработки сигнала 8. Блок управления частотой 7 подключен к источнику 1 микроволнового излучения.
Разработанный способ спектроскопического исследования с помощью заявляемого устройства реализуют следующим образом.
Вначале происходит забор исследуемого материала. В ходе проводимой операции с использованием микроскопии, ларингоскопии, эндоскопии в носу, носоглотке проводят удаление патологического содержимого при соответствующей ЛОР-патологии. Часть материала отдают для морфологического исследования с целью однозначной гистологической верификации, другую часть материала (2,5-3 мг) используют для спектроскопического исследования. Далее происходит консервация исследуемого образца. Биологическую ткань помещают в стерильную емкость, заполненную 5 мл дистиллированной воды.
-4
-2
По разработанному способу исследуемый образец размещают в блоке пробоподготовки 3. В ходе пробоподготовки осуществляют процедуру обезвоживания для исключения влияния паров воды на спектр поглощения исследуемого образца. Блок пробоподготовки 3 представляет собой вакуумируемый объем, внутри которого размещается резервуар, закрытый от вакуума, куда наливается жидкий азот. Таким образом, в вакуумируемом объеме есть поверхность, имеющая температуру кипения жидкого азота. При прохождении паров воды вдоль холодной стенки они намораживаются на эту холодную поверхность и тем самым удаляются из образца. Измерительную ячейку 2 предварительно вакуумируют до остаточного давления 10 мбар. Затем производят нагрев исследуемого образца, его пары и продукты термического разложения через систему напуска 4 попадают в измерительную ячейку 2, которая соединена с вакуумирующим блоком 5 (например, с насосом). После напуска паров и продуктов термического разложения образца в измерительную ячейку 2 уровень давления в ней составляет 10 мбар. Источник 1 воздействует на исследуемый образец, размещенный в измерительной ячейке 2, микроволновым излучением. В качестве заменяемого источника 1 микроволнового излучения могут быть использованы полупроводниковые генераторы сантиметрового и миллиметрового диапазонов длин волн, сопряженные с умножителями частоты. Затем микроволновое излучение принимают и детектируют с помощью детектора 6. В качестве детектора 6 могут быть использованы диоды с барьером Шоттки, детекторы и смесители на основе полупроводниковых гетероструктур. В результате получают спектры поглощения паров и продуктов термического разложения исследуемого образца ткани. Полученные результаты в блоке обработки сигнала 8, который дополнительно снабжен программным обеспечением, подвергают компьютерной обработке. После регистрации характерных линий поглощения всех веществ, присутствующих в исследуемом образце, записывают файл с набором всех центральных частот линий поглощения и соответствующими им экспериментально измеренными коэффициентами поглощения. Записанный файл загружают во встроенную в устройство программу для идентификации тканевых метаболитов, присутствующих в исследуемом образце. Идентификацию осуществляют путем сравнения полученного в образце набора центральных частот и коэффициентов поглощения с данными каталогов спектров поглощения химических соединений. При этом осуществляют отбор всех обнаруженных линий поглощения, соответствующих каждому конкретному веществу. После этого выявляют характерные тканевые метаболиты, которые могут быть специфичны для конкретной патологии ЛОР-органов и строят графическую интерпретацию (фиг. 3, фиг. 5, фиг. 7) полученных экспериментальных результатов по выявлению тканевых метаболитов ЛОР-органов для создания метаболического профиля и использования его в практической медицине.
Важным применением способа спектроскопического исследования и устройства для его осуществления является выявление маркеров, характерных для конкретной патологии. В этом случае сравнивают образцы различных патологий, для каждого образца составляют список центральных частот всех зарегистрированных линий поглощения веществ. В процессе последовательного сравнения их между собой выбирают совпадающие частоты в спектрах различных образцов. Количество совпадающих частот указывает на схожесть или различие состава паров и продуктов термического разложения тканей ЛОР-органов. По результатам этого сравнения строят диаграммы, указывающие на совпадающие центральные частоты линий поглощения в спектрах различных образцов (фиг. 2, фиг. 4, фиг. 6). Затем для каждого исследуемого образца подсчитывают количество линий поглощения каждого идентифицированного в спектре вещества. Существует прямая зависимость между коэффициентом поглощения и концентрацией вещества в смеси. По количеству линий поглощения оценивают содержание каждого вещества в смеси: чем большее количество линий, в том числе малоинтенсивных, регистрируют в спектре, тем выше концентрация вещества в образце. Затем на основе полученных данных строят их графическую интерпретацию и сравнивают количество линий поглощения конкретных веществ, а, следовательно, и их концентрации для разных образцов. Построенные графические интерпретации позволяют выявлять характерные для каждой патологии маркеры, этиологию и патогенетические закономерности развития заболевания.
Предложенное техническое решение было испытано на конкретных примерах для выявления тканевых метаболитов определенных заболеваний ЛОР-органов. Исследовано 20 образцов тканей при различной патологии. Ниже приведены примеры следующих гистологически и клинически верифицированных диагнозов: Хронический экссудативный средний отит; Хронический эпитимпано-антральный средний отит, осложненный холестеатомой; Папилломатоз гортани; Кавернозная гемангиома полости носа; Хронический сфеноидальный полипозный синусит; Хронический кистозно-полипозный гемисинусит; Хронический верхнечелюстной синусит; Муковисцидоз, смешанная форма с кистозно-полипозным поражением околоносовых синусов.
В качестве примера применения разработанного способа спектроскопического исследования и устройства для его осуществления приведены диаграммы и графические зависимости с указанием конкретных маркеров, характеризующих патологии ЛОР-органов и возбудителей заболеваний.
На фиг. 2 представлены диаграммы, показывающие соотношение количества линий поглощения в спектрах мукоида из решетчатых пазух при муковисцидозе, ретенционной кисты основной пазухи, чистых колоний золотистого стафилококка.
Для диаграммы на фиг. 2а: столбец «А» - количество всех зарегистрированных линий поглощения в спектре мукоида из решетчатых пазух - 259, из них столбец «АБ» -количество линий, совпадающих с линиями спектра ретенционной кисты основной пазухи - 35, столбец «АВ» - количество линий, совпадающих с линиями спектра чистых колоний золотистого стафилококка - 57.
Для диаграммы на фиг. 2б: столбец «Б» - количество всех зарегистрированных линий поглощения в спектре ретенционной кисты основной пазухи - 74, из них столбец «АБ» - количество линий, совпадающих с линиями спектра мукоида из решетчатых пазух - 35, столбец «БВ» - количество линий, совпадающих с линиями спектра чистых колоний золотистого стафилококка - 45.
Для диаграммы на фиг. 2в: столбец «В» - количество всех зарегистрированных линий поглощения в спектре чистых колоний золотистого стафилококка - 214, из них столбец «АВ» - количество линий, совпадающих с линиями спектра мукоида из решетчатых пазух - 57, столбец «БВ» - количество линий, совпадающих с линиями спектра ретенционной кисты основной пазухи - 45.
На фиг. 3 изображены графические зависимости для конкретных маркеров, характеризующих мукоид из решетчатых пазух при муковисцидозе (линия I), ретенционную кисту основной пазухи (линия II) и чистые колонии золотистого стафилококка (линия III). В качестве веществ-маркеров в данном случае выбраны: ацетон, гидроксиацетон, дигидроксиацетон, пероксиазотная кислота, акриловая кислота, метанол, пропандиол, фенол, ацетальдегид, пропаналь, бензальдегид, бутиронитрил, пентаннитрил, метилбутиронитрил, аланин, азол, фуран, метилмеркаптан, метилмеркаптан с изотопом серы, поскольку количество линий поглощений этих веществ в спектрах образцов максимально по сравнению с остальными идентифицированными веществами.
На фиг. 4 представлены диаграммы, показывающие соотношение количества линий поглощения в спектрах мукоида из бронхов, мукоида из решетчатых пазух, полипа верхнечелюстной пазухи. Данные исследуемые образцы были получены у больного с муковисцидозом.
Для диаграммы на фиг. 4а: столбец «Г» - количество всех зарегистрированных линий поглощения в спектре мукоида из бронхов - 221, из них столбец «АГ» -количество линий, совпадающих с линиями спектра мукоида из решетчатых пазух - 46, столбец «ГД» - количество линий, совпадающих с линиями спектра поглощения полипа верхнечелюстной пазухи - 7.
Для диаграммы на фиг. 4б: столбец «А» - количество всех зарегистрированных линий поглощения в спектре мукоида из решетчатых пазух - 259, из них столбец «АГ» -количество линий, совпадающих с линиями спектра мукоида бронхов - 46, столбец «АД»
- количество линий спектра, совпадающих с линиями поглощения в спектре полипа верхнечелюстной пазухи - 4.
Для диаграммы на фиг. 4в: столбец «Д» - количество всех зарегистрированных линий поглощения в спектре полипа верхнечелюстной пазухи - 104, из них столбец «ГД»
- количество линий, совпадающих с линиями спектра мукоида бронхов - 7, столбец «АД»,
- количество линий, совпадающих с линиями спектра мукоида из решетчатых пазух - 4.
На фиг. 5 изображены графические зависимости для конкретных маркеров, характеризующих мукоид из бронхов (линия IV), мукоид из решетчатых пазух (линия I), полип верхнечелюстной пазухи (линия V). В качестве веществ-маркеров в данном случае выбраны: ацетон, пропандиол, фенол, ацетальдегид, бензальдегид, акрилальдегид, бутиронитрил, метилбутиронитрил, аминопропионитрил, аланин, метилкарбамат, этиленгликоль, дикетен, пиридин, поскольку количество линий поглощений этих веществ в спектрах образцов максимально по сравнению с остальными идентифицированными веществами.
На фиг. 6 представлены диаграммы, показывающие соотношение количества линий поглощения в спектрах мукоида из бронхов, мукоида из решетчатых пазух, чистых колоний синегнойной палочки. Данные исследуемые образцы были получены у больного с муковисцидозом.
Для диаграммы на фиг.6а: столбец «Г» - количество всех зарегистрированных линий поглощения в спектре мукоида из бронхов - 221, из них столбец «АГ» -количество линий поглощения, совпадающих с линиями спектра мукоида из решетчатых пазух - 70, столбец «ГЕ» - количество линий в спектре поглощения, совпадающих с линиями спектра чистых колоний синегнойной палочки - 46.
Для диаграммы на фиг.6б: столбец «А» - количество всех зарегистрированных линий поглощения в спектре мукоида из решетчатых пазух - 259, из них столбец «АГ» -количество линий, совпадающих с линиями спектра мукоида бронхов - 70, столбец «АЕ» - количество линий, совпадающих с линиями в спектре чистых колоний синегнойной палочки - 34.
Для диаграммы на фиг.6в: столбец «Е» - количество всех зарегистрированных линий поглощения в спектре чистых колоний синегнойной палочки - 76, из них столбец «ГЕ» - количество линий, совпадающих с линиями спектра мукоида бронхов - 47, столбец «АЕ» - количество линий, совпадающих с линиями в спектре мукоида из решетчатых пазух - 34.
На фиг. 7 изображены графические зависимости для конкретных маркеров, характеризующих мукоид из бронхов (линия IV), мукоид из решетчатых пазух (линия I), чистые колонии синегнойной палочки (линия VI). В качестве веществ-маркеров в данном случае выбраны: ацетон, гидроксиацетон, дигидроксиацетон, акриловая кислота, пропанол, пропандиол, ацетальдегид, бензальдегид, глицеральдегид, акрилальдегид, бутиронитрил, бензонитрил, метилбутиронитрил, акрилонитрил, аминопропионитрил, аланин, метилкарбамат, этиленгликоль, пиридин, поскольку количество линий поглощений этих веществ в спектрах образцов максимально по сравнению с остальными идентифицированными веществами.
Графические зависимости для одного и того же заболевания, приведенные на фиг. 3, фиг. 5, фиг. 7, выглядят по-разному, так как представляют собой выборку по определенным маркерам из всего метаболического профиля, полученного для этого заболевания. Выбор маркеров обусловлен количеством совпадений линий поглощения по сравнению со всеми идентифицированными веществами.
Из вышеописанных фиг. 2, фиг. 4, фиг. 6 видно, что для каждой конкретной патологии ЛОР-органов и возможных возбудителей этих заболеваний характерен свой набор линий спектра, что позволяет делать вывод о характерных тканевых метаболитах, специфичных для каждого заболевания с учетом причины его возникновения.
При анализе описанных выше диаграмм с учетом спектров поглощения и выявления характерных маркеров можно сделать однозначный вывод, что патобиота при муковисцидозе является ключевой мишенью для терапии процесса (фиг. 2, фиг. 3, фиг. 6, фиг. 7), а при хроническом верхнечелюстном синусите, осложненном ретенционной кистой, или полипе метаболиты отличаются и заставляют в большей мере ориентироваться на аллергический или скорее инфекционно-аллергический аспект воспаления (фиг. 2, фиг. 3, фиг. 4, фиг. 5). При анализе спектров поглощения образцов выявлены вещества с максимальным количеством линий поглощения. При оценке определяются характерные маркеры, идентичные при заболевании и инфекционном агенте как возможном этиологическом факторе развития болезни. При анализе метаболитов других нозологических единиц: хронического верхнечелюстного синусита, осложненного ретенционной кистой, и полипа, количественные характеристики спектров поглощения отличаются и не могут свидетельствовать об инфекционном агенте (патобиоте) как основной причине развития заболевания.
Разработанный способ спектроскопического исследования и устройство для его реализации позволяют обнаружить тканевые метаболиты, что в практической деятельности позволяет выявить патогенетические закономерности развития заболевания и оптимизировать выводы о роли бактериальной флоры в развитии патологии ЛОР-органов. В ряде случаев при анализе тканевых метаболитов при системных заболеваниях, в частности при муковисцидозе, разработанные способ и устройство позволяют выявить прогностические критерии для понимания вероятности рецидивов заболевания.
При анализе образцов опухолей выявление тканевых метаболитов и сравнение их с международной базой данных общего пользования HumanMetabolomeDatabase (HMDB) также позволяет составить представление о стадии заболевания и применимости вариантов терапии.
Таким образом, разработанные способ спектроскопического исследования тканевых метаболитов и устройство для его осуществления благодаря блоку пробоподготовки, в котором выполняют обезвоживание и нагрев исследуемого образца, позволяют изучать, в том числе и негазообразные образцы тканей ЛОР-органов. Кроме того, в процессе компьютерной обработки за счет дополнительного программного обеспечения выявляют тканевые метаболиты и строят метаболический профиль. В свою очередь, определение совокупности метаболитов, характерной для определенного заболевания, и построение соответствующего метаболического профиля позволяют, во-первых, поставить диагноз, во-вторых, оценить стадию заболевания, в-третьих, выяснить чем оно вызвано, то есть природу заболевания (воспаление, аллергия или другая причина), и, исходя из этих знаний, спрогнозировать лечение выявленного заболевания.