Сравнение влияния интрамиокардиальной аутотрансплантации различных клеток костного мозга на репарацию миокарда кроликов после инфаркта

ИМИ!

Оригинальные исследования

ЕЕ^ЕШ

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сравнение влияния интрамиокардиальной аутотрансплантации различных клеток костного мозга на репарацию миокарда кроликов после инфаркта

АА. Матюков1, Н.В. Цупкина2, Т.Д. Власов1, В.В. Гриценко1, В.В. Давыденко1,

АН. Ялфимов1, Г.П. Пи наев2

1 Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова 2Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Comparison of effects of bone marrow different cells intramyocardial autotransplantation on reparation of rabbit myocardium after infarction

A.A. Matyukov1, N.V. Tsupklna3. T.D. Vlasov1. V.V. Gritsenko1, V.V. Davydenko1. A.N. Yalflmov1. G.P. Plnaev3 1 Pavlov State Medical University of Saint-Petersburg institute of Cytology RAS, Saint-Petersburg

В работе представлены результаты исследования по сравнительной оценке влияния интрамиокардиальной аутотрансплантации мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга и ядросодержащих клеток костного мозга на репарацию миокарда после инфаркта. Эксперименты проведены на кроликах породы Шиншилла. Инфаркт миокарда моделировался путем лигирования передней нисходящей ветви левой коронарной артерии. Оценку результатов проводили по площади рубцовой ткани и индексу делегации левого желудочка через 12 месяцев после трансплантации клеток. Для определения размера инфаркта миокарда использовали методику окрашивания 1,3.5-трифенилтетразолием хлоридом. Были сформированы три группы животных. Животным 1 -й группы [контроль, п=13)в пораженную зону инъекционным способом вводилась ростовая среда а-МЕМ, животным 2-й группы [п=14] вводилась культура мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга [2x1013}, животным 3-й группы [п=14] - ядросодержащие клетки костного мозга [2x1013}. В работе показано, что трансплантация мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга приводит к уменьшению площади рубца и дилатации левого желудочка по сравнению с контрольной группой. После трансплантации ядросодержащих клеток костного мозга отмечается расширение зоны некроза, увеличение площади рубца и выраженная дилатация всех камер сердца.

Ключевые слова: инфаркт миокарда, мультипотентные мезенхимные стромальные клетки, ядросодержащие клетки, костный мозг, дилатация левого желудочка.

Введение

Сердечно сосудистые заболевания продолжают зани мать ведущее место среди причин инвалидности и смер тности населения в экономически развитых странах [1]. Высокий уровень летальности во многом определяется осо бенностями регенерации миокарда. В организме взрослых млекопитающих гибель и замещение дифференцированных клеток происходит по разному. Эти процессы могут осуще ствляться либо путем деления дифференцированных кле ток с образованием потомков идентичного гено и фенотипа (гепатоциты), либо путем замещения погибших дифферен цированных клеток потомками недифференцированных ранних предшественников (клетки крови) [2]. У человека на поздних стадиях онтогенеза кардиомиоциты утрачивают

The article represents the results of comparative estimation of effects of Intramyocardial autotransplantation of bone marrow pluripotent mesenchymal stromal cells and nucleated cell on reparation of myocardium after Infarction. Rabbits of the Chinchilla species were used In the experiments. Myocardial Infarction was modeled by ligating the anterior descending branch of the left coronary artery. The results were assessed by a scar tissue area and the Index of left ventricle dilatation In 12 months after cells transplantation. To evaluate an extend of myocardial Infarction the cells were stained with 1. 3.5. triphenlltetrasole chloride. There were three groups of animals. Into the affected* zone of the 1st group animals [control, n=13] a-MEM medium was Injected; to the animals of the 2nd group [n=14} the culture of pluripotent mesenchymal stromal cells of bone marrow was Introduced [2x10B], the 3-rd group animals [n=14] were given bone marrow nucleated cells [2x1 O’3}. It has been shown that transplantation of pluripotent mesenchymal stromal cells of bone marrow reduces a scar area and left ventricle dilatation as compared with the control. Bone marrow nucleated cells having been transplanted, the necrosis extends, scar area Increases, every cardiac chamber substantially dilates.

Key words: myocardial infarction, pluripotent mesenchymal stromal cells, nucleated cells, bone marrow, dilatation of left ventricle.

способность к регенерации. В результате этого погибшие в ходе инфаркта кардиомиоциты замещаются соединитель ной тканью, что, в конечном итоге, приводит к нарушению функции сердца [3].

Новый терапевтический подход для предотвращения раз вития сердечной недостаточности основан на использовании живых клеток, подвергнутых обработке или модификации вне организма. Среди методов клеточной трансплантации наи большую популярность получила аутотрансплантация мультипотентных мезенхимных стромальных клеток кост ного мозга и ядросодержащих клеток костного мозга [4]. Растущее число экспериментальных работ демонстрирует положительный эффект трансплантации этих клеток на ре генерацию поврежденного миокарда [5].

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, hl< 1, 2007

И I II II

m

Оригинальные исследования

Цель работы

Сравнить влияние аутотрансплантации мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) костного мозга и ядросодержащих клеток (ЯСК) костного мозга на репара цию миокарда кроликов после инфаркта.

Материалы и методы

Эксперименты проведены на кроликах самцах породы Шиншилла массой 2,7 3,0 кг. Возраст животных к началу эксперимента составлял 3 4 месяца.

1. Получение мультипотентных мезенхимных

стромальных клеток и ядросодержащих клеток

костного мозга

В работе использовали культуру ММСК и ЯСК, получен ных из аспирата костного мозга.

Аспират костного мозга получали путем пункции крыла под вздошной кости после премедикации (дроперидол 0,5 мг/кг, ксилазин 14 мг/кг) под местным обезболиванием 0,5% ра створом новокаина. Аспират в количестве 10 мл помещали в пробирку, содержащую антикоагулянт CPDS (citrate phosphate dextrose solution). Полученный костный мозг фракционировали с помощью центрифугирования [1600д, 20 мин) в градиенте плотности Перколла (63%). Образовав шееся интерфазное кольцо с ЯСК костного мозга промывали в растворе Хенкса без Са2^ и Мда^и осаждали центрифугиро ванием. Осадок суспендировали в среде а МЕМ и исполь зовали либо для дальнейшего культивирования, либо для трансплантации без культивирования.

Жизнеспособность ЯСК костного мозга определяли в камере Горяева с помощью окраски трипановым синим.

а

сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия) и гентамицина сульфата (50 мкг/мл) в С02 инкубаторе при 5 % концентрации углекислого газа. Смену среды произво дили через каждые трое суток. После первой смены среды в нее добавляли аскорбиновую кислоту (50 мкг/мл). Клетки, достигшие субконфлюэнтного состояния, пересевали при помощи раствора трипсина и ЭДТА (Gibco, США).

Характеристику клеточных культур проводили путем ок рашивания стандартной смесью реактивов BCIP NBT (Sigma, США) на щелочную фосфатазу (ЩФ) для иденти фикации клеток остеогенной дифференцировки и Суданом III (BDH Chemicals Ltd. Англия) для идентификации клеток адипоцитарной дифференцировки.

2. Моделирование инфаркта миокарда

Для моделирования инфаркта миокарда кроликам после премедикации (дроперидол 0,5 мг/кг, метацин 0,8 мг/кг) и эндотрахеальной интубации в условиях искусственной венти ляции легких под управляемым наркозом (кетамин 32 мг/кг, ксилазин 14 мг/кг, дитилин 3 мг/кг) в четвертом межребе рье слева выполнялась торакотомия. Затем осуществлялась перикардиотомия и перевязка передней нисходящей ветви левой коронарной артерии на расстоянии 1,0 см от верхушки сердца (рис. 1). Сразу после коронароокклюзии в зону пред полагаемого инфаркта интрамиокардиально с помощью ин сулинового шприца вводили клетки или эквивалентное коли чество ростовой среды (рис. 2). Рану послойно ушивали, пневмоторакс ликвидировали путем активной аспирации воз духа из плевральной полости. Интраоперационная летальность составила 10%, послеоперационная менее 2%.

3. Окрашивание клеток

Окрашивание клеточных культур и ЯСК костного мозга

проводили с помощью флуорохрома Hoechst

в концентрации 1 мкг/мл. Для обнаружения меченых кле

ток часть животных в каждой экспериментальной группе выводили из эксперимента через 20 суток, данный срок был обусловлен длительностью функционирования метки. Идентификацию окрашенных клеток осуществляли после ферментативной обработки миокарда смесью трипсин кол лагеназы (Sigma, США). Меченые клетки выявляли с помощью флуоресцентного микроскопа «Axioscop» (Zeiss, Германия).

4, Определение размера экспериментального

инфаркта миокарда и дилатации левого желудочка

Для определения размера инфаркта миокарда в экспе рименте использовали методику окрашивания 1,3,5 трифе нилтетразолием хлоридом (TTC), позволяющую на макро скопическом уровне отграничить необратимо поврежденную ткань миокарда от ткани, сохранившей жизнеспособность. У животных сразу после эвтаназии (через 12 месяцев пос ле трансплантации клеток) извлекали сердце, промывали физиологическим раствором и разрезали в поперечном на правлении с помощью специального устройства на 3 сег мента одинаковой толщины (рис. 3), плегический раствор не использовали, так как сердце во всех группах эксперимента подвергалось равнозначной контракции. Затем срезы по мещали в 1% раствор TTC (ICN, США), окрашивающий жизнеспособный миокард с сохраненной активностью НАД зависимых ферментов в ярко красный (кирпичный) цвет, и инкубировали в течение 15 минут при температуре 37°С и pH 7,4. Окрашенные срезы миокарда фотографи ровали с базальной поверхности цифровой камерой Olimpus 2020. Общую площадь рубца вычисляли по трем срезам и представляли в процентном отношении от площади среза.

Дилатацию левого желудочка рассчитывали как отноше ние площади просвета к площади миокарда.

Все эксперименты на животных выполнены в соответ ствии с требованиями этического комитета СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Результаты исследования

В результате культивирования клеток, выделенных из аспирата костного мозга, была получена культура ММСК. После окрашивания ММСК смесью реактивов BCIP NBT и Суданом III окрашенных положительно клеток выявлено не было, что свидетельствовало об отсутствии спонтанной ос теогенной и адипоцитарной дифференцировки.

Для изучения механизмов влияния трансплантирован ных клеток на репарацию ишемизированного миокарда, необходимо было определить местонахождение введенных клеток. Детекция флуоресцентно окрашенных клеток в ми окарде кроликов показала их присутствие в зоне ишемичес кого повреждения.

Все животные были разделены на 3 группы. Животным 1 й группы (контроль, п=13) в пораженную зону инъек ционным способом вводилась ростовая среда а МЕМ, животным 2 й группы (п=14) вводилась культура ММСК (2x106), животным 3 й группы (п=14) - ЯСК костного мозга (2x106).

Макроскопическое исследование нативных сердец кро ликов контрольной группы (без лечения) показало значи тельное увеличение размеров сердца и наличие выражен ной аневризмы левого желудочка по сравнению со здоровым сердцем (неоперированные животные). В сердцах кроликов, которым выполнялась трансплантация ММСК, на передней стенке левого желудочка выявлялись рубцовые изменения, размеры сердца были незначительно увеличены. В группе животных, которым осуществляли трансплантацию ЯСК, размеры сердца значительно превышали размеры здоро вого сердца, а левый желудочек был аневризматически из менен (рис. 4).

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007

І І І І І

І І І

Оригинальные исследования

Рис.

Лигирование передней нисходящей ветви левой коронарной артерии

Норма

Контроль

Трансплантация мультипотентных мезенхимных стромальных клеток

Трансплантация ядросодержащих клеток костного мозга

Рис, 4, Сердце здорового [неоперированного) и опытных кроликов через 12 месяцев после эксперимента:

А - аневризма, Р - рубец, ЛЖ - левый желудочек

Рис. 2. Введение клеток в ишемизированную зону миокарда левого желудочка

Рис. 3. Разделение сердца на сегменты

Норма

Контроль

Трансплантация мультипотентных мезенхимных стромальных клеток

Трансплантация ядросодержащих клеток костного мозга

Рис. 5. Срезы сердец кроликов контрольной и опытных групп: ЛЖ - левый желудочек, ПЖ - правый желудочек. Стрелками обозначен рубец.

Окраска 1,3,5-трифенилтетразолием хлоридом

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 1, 2007

I I I I I I

I I I

Оригинальные исследования

Результаты определения площади рубца после окраши вания срезов сердца кролика TTC показали, что в конт рольной группе площадь рубца составила 20,2±1,9%. В опытных группах максимальные изменения были выявле ны в группе животных, которым выполнялась трансплантация ЯСК костного мозга: общая площадь рубца составила 35,8±1,6%. Положительные изменения были отмечены после трансплантации культуры ММСК - площадь рубцовой ткани в этих сердцах соответствовала 6,0±2,6% (рис. 5, 6).

Результаты определения индекса дилатации левого желудочка показали, что в группе животных, которым инт рамиокардиально трансплантировали ЯСК костного мозга, этот показатель в 2 раза превышал значения контрольной группы (0,34±0,03 и 0,1 ¿±0,02). Индекс дилатации ле вого желудочка сердец кроликов, перенесших трансплан тацию ММСК, был в 2 раза меньше по сравнению с конт рольной группой и составил 0,11±0,02 (рис. 7).

группы животных

Примечание: р<0,001 в сравнении с контрольной группой

Рис. Б. Площадь рубца в контрольной группе, после трансплантации ММСК (группа 2} и ЯСК костного мозга (группа 3}

группы животных

Примечание: р<0,001 в сравнении с контрольной группой

Рис. 7. Индекс дилатации левого желудочка в контрольной группе, после трансплантации ММСК (группа 2} и ЯСК костного мозга (группа 3}

Обсуждение результате

Представленные результаты показывают, что интрамио кардиальная трансплантация ММСК костного мозга приводит к положительным изменениям в поврежденном миокарде, что проявляется в уменьшении площади рубца и дилатации ле вого желудочка по сравнению с контрольной группой. D. Orlic et al. (2001) показали, что недифференцированные ММСК обладают тропностью к поврежденным тканям и при транс плантации в зону альтерации активно участвуют в репара тивных процессах (6). Эти же авторы продемонстрировали способность ММСК дифференцироваться в кардиомиоци ты. ММСК вырабатывают некоторые гемопоэтические и негемопоэтические ростовые факторы, интерлейкины и хе мокины, а также экспрессируют рецепторы некоторых ци токинов и ростовых факторов. In vitro показано, что ММСК продуцируют цитокины: IL (interleukin) 1 a, IL 1 ß, IL 6, IL 11, IL 12, IL 14, IL 15, рецепторы для IL 1 a, IL 1 ß, IL 1, IL 3, a

Многие из этих цитокинов продуцируются конститутивно, а другие - только после стимуляции. Р. Azarnous et al. (2005) продемонстрировали способность ММСК после трансплан

a

(hypoxia inducible factor 1 alpha), который оказывает цитоп ротективное действие и ингибирует апоптоз [9]. Кроме того, ММСК могут продуцировать факторы SDF 1 (stromal cell derived factor 1), SCF (stem cell factor), G CSF (granulocyte colony stimulating factor), способные дополнительно вызывать мобилизацию и хоуминг ММСК костного мозга в ишемизиро ванный миокард и пролиферацию трансплантированных ММСК (10). SCF также обладает мощным антиапоптотичес ким действием, усиливает хоуминг предшественников эндо телиоцитов из костного мозга и стимулирует пролиферацию миофибробластов (11]. Кроме того, ММСК участвуют в

процессах неоангиогенеза за счет секреции ангиогенных факторов, таких как VEGF (vascular endothelial growth factor), bFGF (basic fibroblast growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), TGF ß (transforming growth factor beta), ангиопоэ тин 1, и экспрессии на своей поверхности рецепторов для VEGF (VEGFR2), фибронектина, ламинина, молекул адгезии ICAM 1 (intercellular adhesion molecule 1), ICAM 2 (intercellular adhesion molecule 2), VCAM 1 (vascular cell adhesion molecule 1) [12]. Вырабатываемые ММСК ангиоген ные факторы способны мобилизовать прогениторные эндо телиальные клетки из костного мозга, стимулировать проли ферацию эндотелиоцитов сосудов поврежденного миокарда и вызывать дифференцировку трансплантированных в ми окард ММСК в эндотелиоциты, гладкие миоциты, перициты, фибробласты, которые затем становятся компонентами со судистой стенки (13).

Таким образом, выявленное нами положительное влия ние ММСК на репарацию поврежденного миокарда можно объяснить как прямым (дифференцировка ММСК в кардио миоциты, эндотелиоциты и другие клетки), так и опосредован ным (секреция цитокинов, стимулирующих неоангиогенез, ингибирующих апоптоз и т.д.) действием.

Трансплантация ЯСК костного мозга, наоборот, приво дит к ухудшению течения инфаркта миокарда, сопровожда ется усилением фиброза и увеличением дилатации левого желудочка с формированием выраженной аневризмы. Как известно, инфаркт миокарда сопровождается острой вое палительной реакцией, в ходе которой происходит последо вательная смена спектра синтезируемых цитокинов и кле точных популяций, в конечном итоге, приводящая к заживлению и формированию рубца (14). Введенные инт рамиокардиально в зону ишемии ЯСК костного мозга, по видимому, изменяют течение воспаления. ЯСК костного

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007

А

ИМИ!

Оригинальные исследования

мозга представляют собой гетерогенную популяцию и со держат ММСК, прогениторные эндотелиальные клетки, ге мопоэтические стволовые клетки, нейтрофилы, моноциты, лимфоциты и другие клетки крови, способные секретировать множество различных цитокинов [15]. Попадая искусствен но в ишемизированный миокард, ЯСК качественно и количе ственно изменяют воспалительную реакцию. Транспланти рованные клетки, по видимому, начинают секретировать протеолитические ферменты и хемоаттрактанты (IL 8, monocyte chemoattractant protein 1, macrophage inflammatory protein 1 alpha, 1 beta), которые дополнительно привлекают из крови в зону альтерации гранулоциты, усили вая тем самым воспалительную реакцию [16]. Высвобожда емые протеолитические ферменты лизируют межклеточные коллагеновые сшивки и активируют матриксные металлопро теиназы. В результате каскада ферментативных реакций про исходит деградации внеклеточного матрикса и расширение зоны инфаркта. В условиях повреждения кардиомиоциты на чинают вырабатывать тканевые ингибиторы металлопроте иназ [17, 18]. Однако, видимо количества синтезируемых ингибиторов недостаточно для подавления активности обра зующихся металлопротеиназ.

Еще один механизм влияния ЯСК костного мозга на те чение воспаления, по видимому, связан с прогениторными эндотелиальными клетками. ЯСК в больших количествах секретируют ангиогенные факторы: VEGF, bFGF, TGF р, PDGF (platelet derived growth factor) и другие. Эти факторы сти мулируют пролиферацию эндотелиоцитов сосудов повреж денного миокарда и трансплантированных прогениторных эндотелиальных клеток [19]. В результате этого трансплан тированные и вновь образованные эндотелиоциты начина ют синтезировать ангиотензин II, эндотелии 1 и другие факторы, которые усиливают интерстициальный и перивас кулярный фиброз [20].

Выводы

Таким образом, в ходе проведенного исследования нами было показано, что интрамиокардиальная трансплантация ММСК костного мозга приводит к выраженному положи тельному влиянию на репарацию ишемизированного мио карда. Трансплантация ЯСК костного мозга в острейшую фазу инфаркта миокарда не сопровождается положитель ными морфологическим изменениям, а, наоборот, ухудшает течение репаративных процессов.

Литература:

1. Государственный доклад о состоянии здоровья населения Российской Федерации в 2001 году. Здравоохранение Российской Федерации. 2000; 2: 7 22.

2. Малайцев В.В., Богданова И.М., Сухих Г.Т. Современные представления

о биологии стволовой клетки. Архив патологии. 2002; 4: 7 11.

3. Репин B.C., Сухих Г.Т. Медицинская клеточная биология. М. 1998.

4. Smits A.M., van Vliet P., Hassink R.J. et al. The rale of stem cells in cardiac regeneration. J. Cell Mol. Med. 2005; 9(1 ): 25 36.

5. Itescu S., Schuster M.D., Kocher AA. New directions in strategies using cell therapy for heart disease. J. Mol. Med. 2003; 81 (5): 288 96.

6. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S. et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 2001; 410: 701 5.

7. Tang Y.L., Zhao Q., Qin X. et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann. Thorac. Surg. 2005; 80(1 ): 229 36.

8. Vandervelde S., Luyn M.J., Tio R.A. et al. Signaling factors in stem cell mediated repair of infarcted myocardium. Mol. Cell. Cardiol. 2005; 39(2): 363 76.

9. Azarnoush K., Maurel A., Sebbah L. et al. Enhancement of the functional benefits of skeletal myoblast transplantation by means of coadministration of hypoxia inducible factor 1 alpha. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2005; 130(1 ): 173 9.

10. Archundia A., Aceves J.L., Lopez Hernandez M. et al. Direct cardiac injection of G CSF mobilized bone marrow stem cells improves ventricular function in old myocardial infarction. Life Sci. 2005; 78(3): 279 83.

11. Heissing B., Hattori K., Dias S. et al. Recruitment of stem cell and progenitor cells from bone marrow niche requirens MMP 9 release of kit ligand. Cell 2002; 109: 625 37.

1 2. Matsumoto R., Qmura T., Yoshiyama M. et al. Vascular endothelial growth factor expressing mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of acute myocardial infarction. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2005; 25(6): 1168 73.

13. Yoon J., Min B.G., Kim Y.H. Differentiation, engraftment and functional effects of pre treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 2005; 60(3): 277 84.

14. Михайлов B.B. Основы патологической физиологии. М. 2001.

1 5. Shintani S., Murohara Т., Ikeda H. et al. Augmentation of postnatal neovascularization with autologous bone marrow transplantation. Circ. 2001; 103: 897 5.

16. Frangogiannis N.G., Entman M.L. Chemokines in myocardial ischemia. Trends Cardiovasc. Med. 2005; 15(5): 163 9.

17. Dobaczewski М., Bujak М., Zymek P. et al. Extracellular matrix remodeling in canine and mouse myocardial infarcts. Cell Tissue Res. 2006; 324(3): 475 88.

1 8. Ren G., Dewald 0., Frangogiannis N.G. Inflammatory mechanisms in myocardial infarction. Curr. Drug. Targets Inflamm. Allergy. 2003; 2(3): 242 56.

19. Tang Y.L. Autologous mesenchymal stem cells for post ischemic myocardial repair. Methods Mol. Med. 2005; 112: 183 92.

20. Tarakura N., Watanabe T., Suenobu S. et al. A Role for hematopoietic stem cells in promoting angiogenesis. Circ. 1999; 53(11): 452 68.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007

А

I I I I I

I I I

Оригинальные исследования

И.В. Потапов

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии стволовых клеток

ГУ НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава, Москва

В настоящее время накоплен значительный (более чем 10 летний) опыт экспериментальных исследований, по священных трансплантации клеток различных фенотипов в поврежденный миокард (клеточной кардиомиопластике). За рубежом такие работы появлялись регулярно с 1995 года, в России с 2000 г. Первые исследования описывали применение фетальных и неонатальных кардиомиоцитов, фибробластов, а затем ЭСК и их производных. Несмотря на обнадеживающие результаты первых нескольких лет, стало очевидно, что фетальные клетки и ЭСК в перспективе не могут стать общепринятым средством в кардиологической практике, прежде всего, по этическим причинам и невоз можности обеспечить должную степень безопасности био трансплантата. Фокус исследований постепенно смещался к использованию «взрослых клеток», в основном это были миосателлитоциты скелетной мускулатуры. Очередной всплеск интереса к клеточной кардиомиопластике случился после успехов в изучении стволовых и прогениторных клет ках взрослых индивидов, в частности костного мозга. Были подробно описаны мезенхиальные (стромальные) стволо вые клетки, эндотелиальные прогениторные клетки и их «инкубатор» костный мозг, был описан феномен слия ния, было показано участие клеток костного мозга в ревас куляризации миокарда и его постинфарктном ремоделиро вании. Множество работ по клеточной кардиомиопластике появляется и по настоящее время, в них раскрываются все новые и новые аспекты сложных механизмов клеточной миграции, дифференцировки, переживания, регенерации, ангиогенеза.

В настоящее время наиболее подходящим источником клеток для трансплантации в сердце является костный мозг. Этому есть причины: относительная простота его получения и процессинга, наличие в костномозговой взвеси значительного количества стволовых и прогениторных клеток различного фе нотипа, возможность аутогенного применения, отсутствие эти ческих проблем при его использовании. Неудивительно, что к настоящему времени накоплен не только большой экспе риментальный, но и клинический материал по применению клеток костного мозга в кардиологии. Однако до сих пор нет ответа на один из главных вопросов: какие клетки костного мозга эффективнее. В этом аспекте можно условно разде лить исследователей на 2 лагеря. Первый (больший) склоня ется к необходимости минимальных манипуляций с костным мозгом, ставя во главу угла безопасность таких методик. В результате применяется мононуклеарная фракция костного мозга, содержащая в основном клетки лимфоидного ростка. Во втором лагере находятся сторонники другого подхода, при котором необходимо целенаправленно работать с клеточным материалом, улучшая его свойства методами иммуномагнит ного сортанга или культивирования. В результате становится возможным применять стандартизованные по составу кле точные препараты, в которых процент клеток предше ственников (С034*. С0133^, ММСК) значительно выше, нежели в мононуклеарной фракции.

Результаты экспериментальных исследований показа ли эффективность обоих подходов. Однако везде есть «под водные камни». Например, показано, что мононуклеарная

фракция может вести к кальцификации миокарда (Yoon Y.S. et al., 2004), а культивированные в течение длительного времени ММСК при определенных условиях могут вызы вать опухоли (Tolar J. et al., 2007). Результаты клиничес ких исследований также неоднозначны. Например, после интракоронарной трансплантации мононуклеарной фрак ции клеток костного мозга показан как положительный эффект (Perin Е.С. et al., 2003), так и его отсутствие (Lunde K. et al., 2006), а также кратковременный эффект (Meyer G.P. et al., 2006). Результаты клинического применения однородных по составу клеточных препаратов пока немно гочисленны, и они описывают безопасность (Stamm C. et al., 2003) и эффективность (Assmus В. et al., 2006).

Вследствие существования различных методик экспери ментальных работ и разнородных по дизайну клинических ис следований провести сравнительный анализ эффективное ти того или иного клеточного препарата не представляется возможным. Именно поэтому большое значение приобрета ют исследования, подобные статье А.А. Матюкова и соавт. В работе показана не только эффективность ММСК, но и отрицательное действие ядросодержащих клеток костно го мозга. Очевидно, применение ядросодержащих клеток поддерживает воспалительные процессы и усиливает вто ричную волну некроза миокарда, тогда как ММСК вызыва ет значительную перестройку процессов постинфарктного ремоделирования, что в результате приводит к значимому уменьшению размеров рубцовой ткани. Такой значитель ный регресс после моделирования инфаркта миокарда удалось показать, пожалуй, только в одной работе, прове денной на мышах, в результате применения G CSF (Orlic D. et al., 2001).

Однако, следует заметить, что в статье А.А. Матюкова и соавт. морфометрические исследования проведены не со всем корректно. Известно, что вскоре после извлечения из грудной клетки миокард контрагирует (и это видно на рис. 5). Поэтому истинного отношения площади здорового миокар да к площади рубца (который сокращаться не может) полу чить такой методикой нельзя. Кроме того, авторы оценивали дилатацию миокарда также морфометрическим методом, который в данном случае не может полностью охарактери зовать функциональное состояние левого желудочка. Диас толический объем левого желудочка и соответственно его дилатация определяются многими факторами, например, растяжимостью миокарда, преднагрузкой, и, таким образом, является понятием функциональным. Для оценки таких па раметров как фракция выброса, размеры камер сердца, давление в левом желудочке и других показателей функции миокарда традиционно применяют ультразвуковой метод или перфузию изолированных сердец по Langendorf или Neely.

Несмотря на небольшое несоответствие применяемых морфометрических методов задачам исследования, разни ца в двух экспериментальных группах видна невооружен ным глазом. Таким образом, данная статья дарит новую пищу для размышлений клиницистам, которые уже несколь ко лет пытаются выяснить вопрос о приемлемости интра миокардиальной трансплантации нефракционированных свежевыделенных клеток костного мозга.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007