Способ очистки фибриногена, продукт фибриногена и средство для очистки или производства продукта фибриногена
METHOD FOR CLEANING FIBRINOGEN, FIBRINOGEN PRODUCT AND MEANS FOR CLEANING OR PRODUCING FIBRINOGEN PRODUCT

Настоящее изобретение относится к способу очистки фибриногена из источника, содержащего фибриноген, к продукту фибриногена, получаемому в соответствии со способом по изобретению, а также к анионообменной смоле, выбираемой из группы, состоящей из материала-подложки, включающей каркас гидроксилированного полимера с привитыми третичными или четвертичными аминогруппами для очистки или производства продукта фибриногена.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Фибриноген, также известный как фактор свертывания I, играет ключевую роль в гемостазе и заживлении ран. Это гликопротеин, синтезируемый в печени, с приблизительной молекулярной массой 340000 Да, состоит из двух димеров, каждый из которых состоит из трех пар неидентичных полипептидных цепей, называемых Αα, Ββ и γ, сшитых дисульфидными мостиками. Он циркулирует в кровотоке в концентрации приблизительно 1,5-4,0 мг/мл. При повреждении кровеносных сосудов тромбоциты крови активируются и образуется тромб. Фибриноген вовлечен в первичный гемостаз, способствуя сшивке активированных тромбоцитов.
Параллельно начинается активация каскада свертывания. В конечной точке фибриноген преобразуется в фибрин посредством протеолитического высвобождения тромбином фибринопептида A и - более медленно - фибринопептида B. Растворимые мономеры фибрина объединяются в двухцепочечные закрученные фибриллы. Впоследствии указанные фибриллы располагаются горизонтально, образуя более толстые волокна. Такие волокна затем сшиваются посредством FXIIIa в фибриновую сеть, которая стабилизирует тромбоцитарный тромб посредством взаимодействий фибрина с активированными тромбоцитами, давая стабильный сгусток.
ЗАБОЛЕВАНИЯ И ДЕФЕКТЫ
Врожденная афибриногенемия является редким нарушением, характеризующимся повышенной кровоточивостью, такие пациенты страдают от неадекватного свертывания крови из-за отсутствия или дисфункции фибриногена. Такое медицинское состояние может приводить к эпизодам спонтанных кровотечений или к избыточным кровотечениям при минимальных травмах или вмешательствах.
Приобретенный дефицит фибриногена гораздо более распространен, чем врожденная афибриногенемия и может быть индуцирован гемодилюцией или другими событиями, такими как кровопотеря во время операции, травма, диссеминированное сосудистое свертывание (ДВС) или сепсис.
Дефицит фибриногена можно корректировать до нормального уровня фибриногена около 1,5-4 г/л посредством заместительной терапии внутривенными инфузиями свежезамороженной плазмы или криопреципитата. Однако такое лечение сопряжено с риском внесения пациенту патогенных микроорганизмов, например, вирусов или прионов, и вследствие этого с развитием дополнительных заболеваний. Следовательно, для поддержания фибриногена на физиологическом уровне безопасным образом желательно внутривенно применять композиции фибриногена с инактивированными вирусами.
Поскольку существует фибриноген в препаратах, называемых фибриновый клей, фибриногеновый адгезив, тканевый клей и подобные указанные препараты предназначены для местного применения в виде порошков, паст, пен или в комбинациях с изделиями, такими как пластыри для ран, их не используют для внутривенного применения из-за того, что их консистенция и состав при введении немедленно вызывают развитие тромботических событий. Такие препараты дополнительно содержат тромбин, соли кальция и относительно большие количества фактора коагуляции XIII. Примерами указанных препаратов являются US-A1-2008/003272, WO-A-95/22316 или US-A1-2008/181878.
Способы продукции фибриногена известны из EP-A1-1240200, который относится к методу очистки фибриногена из раствора, содержащего фибриноген, включающему нанесение раствора, содержащего фибриноген, на ионообменную матрицу в условиях, таких что фибриноген связывается с матрицей, промывку ионообменной матрицы буферным раствором, включающим, по меньшей мере, одну ко-аминокислоту, элюцию фибриногена из матрицы буфером, состоящим из 10 мM Tris, 10 мM цитрата, 45 мM сахарозы и NaCl в концентрации 200 мM до 1,0 M, и необязательно восстановление фибриногена из элюата.
EP-A1-0771324 относится к процессу получения концентрата фибриногена без вирусов, который получают посредством воздействия на растворенную фракцию плазмы, содержащую фибриноген, химической обработки для инактивации вирусов, т.е. обработки S/D или растворитель/детергент, осаждения полученной вирус-инактивированной фракции в растворе, содержащем аминокислоту, при кислом pH для получения надосадочной жидкости, фильтрации надосадочной жидкости для получения очищенного концентрата фибриногена и восстановления полученного концентрата фибриногена. Восстановленный концентрат фибриногена подвергают ультрафиолетовому облучению для второй инактивации вирусов. Продукт стабилизируют и лофилизируют перед третьей стадией инактивации вирусов.
В EP-A1-1519944 описано применение матрицы афинной хроматографии с иммобилизованными ионами металлов в условиях, когда фибриноген и плазминоген связываются с матрицей, и имеет место селективная элюция отдельно фибриногена и 93% плазминогена из матрицы.
В EP-A1-0555135 описан способ получения внутривенно применимого фибриногена посредством очистки раствора фибриногена при помощи анионообменного геля на основе сшитой агарозы, включающего группы четвертичного амина. Считают, что образующийся фибриноген не содержит фактора VIIIc.
EP-A1-1457497 относится к способу удаления вирусов из растворов фибриногена, который характеризуется стабилизацией и замораживанием раствора и последующим его оттаиванием. Отделение нерастворенных веществ происходит перед разведением белка, и за этим следует нанофильтрация полученного раствора с использованием фильтров с размером отверстий менее чем 35 нм.
В US-A1-2006/0009376 также описан метод получения фибриногена с последующим повторным растворением и осаждением фибриногена для удаления фактора XIII.
WO-A2-2009/155626 относится к способу очистки фибриногена посредством растворения криопреципитата или фракции Кона I в растворе EDTA при диапазоне температур 3°C-5°C, с последующим фракционированным осаждением в диапазоне температур 2°C-4°C и растворением последнего преципитата в растворе EDTA. Инактивация вирусов реагентами S/D и нанофильтрация для улучшения безопасности в отношении патогенов происходит в присутствии EDTA. Ингибирование остаточных количеств протеаз в полученном концентрате осуществляется путем добавления AT-III, кофактора гепарина-II и ингибитора C1-эстеразы.
В US-B2-7919592 описан метод удаления вирусов из растворов фибриногена путем добавления разобщающих субстанций, выбираемых из аргинина, гуанидина, цитруллина и мочевины, их солей или производных, и последующей фильтрации через нанофильтры с различными размерами отверстий.
Goheen, S. C. et al. сообщают в Journal of Chromatography A. 816 (1998) 89-96, о ВЭЖХ ионообменной хроматографии белков плазмы альбумина, фибриногена и иммуноглобулина (G) на непористых материалах колонки, содержащих функциональные группы или четвертичного амина или сульфопропила.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей изобретения является обеспечение концентрата фибриногена, производимого с предусмотренным устранением патогенов и/или стадиями инактивации в процессе получения с целью преодоления нежелательных реакций или развития заболеваний, связанных с патогенами. Указанные патогены выбирают из групп бактерий, вирусов и прионов, например, прионовый белок Скрейпи (PrPsc).
Нанофильтрация представляет собой метод, в принципе известный для удаления вирусов из белков, проходящих через нанофильтр, но отделение вирусов от фибриногена посредством нанофильтрации осложняется тем, что фибриноген является достаточно крупным и липким белком, быстро приводя к закупорке отверстий фильтра и к окончательной потере продукта. Одним подходом для преодоления указанной проблемы является добавление разобщающих веществ для улучшения фильтруемости, как указано в US-B2-7919592, хотя нанофильтрация разведенного раствора фибриногена, полученного в соответствии со способом международной заявки WO-A1-2012/038410, выявила сравнимую фильтруемость без добавления разобщающих веществ. Разобщающими веществами по изобретению являются вещества, описанные в US-B2-7919592, включенном в виде ссылки, и обозначаемые как аргинин, гуанидин, цитруллин и мочевина, их соли и производные.
Следующим предметом настоящей заявки является обеспечение процесса производства концентрата на промышленном уровне, т.е. несколько сотен-тысяч литров исходного материала, такого как кровь или плазма крови, хотя продукция в небольших масштабах, т.е. от нескольких 1/10 литра до нескольких литров, также возможна.
Указанные и дополнительные задачи осуществляются посредством процессов по пп.1-18, продукта, как заявлено в пп.19-24, получаемого процессом по изобретению, и применения по п.25.
На фиг.1 изображен SDS-Page (электрофорез в полиакриламидном геле) в невосстанавливающих условиях, тогда как на фиг.2 изображен SDS-Page тех же образцов в восстанавливающих условиях.
В соответствии с настоящим изобретением неожиданно наблюдали, что осаждение промежуточной пасты фибриногена в присутствии одного или более хелатообразующих агентов с последующей экстракцией фибриногена из промежуточного продукта обеспечивает раствор фибриногена с лучшей фильтруемостью, чем раствор, получаемый по способу WO-A1-2012/038410.
Неожиданно дополнительно обнаружили, что разовое добавление предпочтительно небольшого количества, по меньшей мере, одного хелатообразующего агента перед осаждением, приводящее к общей концентрации хелатообразующего агента около 3-10 мM, достаточно для настоящего изобретения для обеспечения и превосходного выхода и фильтруемости, даже с нанофильтрами, обеспечивающими удержание частиц <35 нм. Остаточные количества хелатообразующих агентов могут быть удалены ниже, обеспечивая конечный продукт, т.е. концентрат фибриногена, который не содержит хелатообразующих агентов с пределом определения, который меньше 0,08 пг/мл для EDTA. Продукт, не содержащий хелатообразующих агентов, является предпочтительным, так как, например, EDTA является известным антикоагулянтом. Следовательно, присутствие EDTA в существенных количествах уменьшает эффекты продукта фибриногена.
Следовательно, все буферы, используемые после осаждения, например, буферы для уравновешивания, промывки и элюции, используемые для хроматографии, или буферы, используемые во время концентрирования посредством ультра/диафильтрации, не должны содержать Ca2+-хелатообразующих агентов, которые определяют ниже. Остаточные количества, в конечном счете, присутствующих хелатообразующих агентов удаляют из раствора, содержащего фибриноген, посредством ультра/диафильтрации. Такое удаление преимущественно осуществляют посредством ультра/диафильтрации в конце процесса, в частности, во время концентрирования или рецептирования, если это необходимо. Системное применение продукта фибриногена, не содержащего хелатообразующего агента, посредством внутривенного пути допускает лечение врожденной афибриногенемии и приобретенных дефицитов фибриногена. Применение такого стандартизованного концентрата фибриногена позволяет быстрое лечение в неотложных ситуациях, без занимающего время оттаивания свежезамороженной плазмы и со сниженной объемной нагрузкой и с надежными свойствами коагуляции из-за по существу постоянного состава. Повышенная концентрация фактора коагуляции XIII, по сравнению с продуктами, описанными в WO-A1-2012/038410, также сохраняет местное применение в ранах или использование в качестве тканевого клея.
Также неожиданно было обнаружено, что добавление ингибиторов протеаз на любой стадии процесса по изобретению было необязательным, когда промежуточная паста фибриногена осаждалась в присутствии одного или более хелатообразующих агентов. Применение ингибиторов протеазы, таких как ингибиторы C1-протеазы, ингибиторы трипсина, ингибиторы тромбина, антитромбин-III (AT-III), кофактор гепарина-II, апротинин, пепстатин, лейпептин и, в частности, эпсилон-аминокапроновая кислота (ε-ACA) во избежание разрушения фибриногена известно из литературы предшествующей области техники. Концентрат фибриногена по настоящему изобретению не проявляет ни измеримой протеолитической активности, ни измеримой концентрации AT-III.
В общем способ по изобретению для очистки или производства фибриногена из источников, содержащих фибриноген, включает стадии:
- получения обогащенного фибриногеном преципитата путем добавления хелатообразующего агента перед добавлением, по меньшей мере, одного осаждающего средства к источнику, содержащему фибриноген;
- выделения преципитата, обогащенного фибриногеном, например, посредством центрифугирования указанного преципитата;
- экстракции фибриногена из преципитата, обогащенного фибриногеном, в водной среде без хелатообразующего агента и, таким образом, получения раствора, содержащего фибриноген, необязательно с последующей фильтрацией и/или ультра/диафильтрацией;
- обработки раствора, содержащего фибриноген, хроматографией на стационарной фазе, имеющей сильные анионообменные группы, путем контакта указанного раствора с указанной фазой в условиях, когда фибриноген связывается с указанной фазой;
- последующей элюции фибриногена из стационарной фазы посредством водного раствора, имеющего более высокую ионную силу, чем ионная сила вышеуказанной стадии, дающей фракцию, обогащенную фибриногеном, которую собирают;
- необязательно последующие стадии разведения и/или концентрирования фракции, обогащенной фибриногеном;
- и необязательно заполнения фракции, обогащенной фибриногеном, в подходящие флаконы при отсутствии добавления ингибиторов протеаз.
В одном варианте осуществления процесса производства по изобретению источник, содержащий фибриноген, выбирают из группы, состоящей из плазмы крови, фракций плазмы, таких как фракция I, или криопреципитат, культур клеток, продуцирующих фибриноген, и/или надосадочной жидкости указанных культур клеток. Если криопреципитат не используется как исходный материал, промежуточный продукт, содержащий фибриноген, в качестве исходного материала получают хорошо известными методами, как описанные Cohn, Kistler-Nitschmann, и их модификациями.
Для получения фармацевтически применимого продукта предпочтительно, чтобы источник, содержащий фибриноген, подвергали, по меньшей мере, одному процессу инактивации вирусов например, процессу обработки растворителем/детергентом, как описано в EP-A1-0131740, включенном в виде ссылки.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения инактивацию вирусов проводят перед получением преципитата, обогащенного фибриногеном. Однако также возможно проводить инактивацию вируса на другой стадии.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения удаление веществ, инактивирующих вирусы, проводят посредством экстракции масла и/или хроматографии с сильными анионообменниками. Другим методом удаления вирусов является нанофильтрация из-за низкого содержания полимеров, после экстракции фибриногена нанофильтрация может быть проведена также с фильтрами <35 нм без добавления разобщающих веществ.
Типичный осаждающий агент для применения в процессе производства по изобретению выбирают из группы, состоящей из аминокислот, таких как глицин, полиэтиленгликоля или высоких концентраций солей, где соль содержит одновалентные ионы металлов, в частности, выбираемые из щелочных металлов или аммония.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения экстракцию фибриногена из преципитата, обогащенного фибриногеном, проводят с помощью буфера, имеющего pH 7,5-8,5, в течение 10-120 минут.
В соответствии с дополнительным вариантом осуществления изобретения стационарная фаза содержит третичные или четвертичные аминогруппы.
Стадии хроматографии в процессе производства по изобретению могут, в частности, быть проведены в колонке. Обычно форма хранения заполненной фракции, обогащенной фибриногеном, является жидкой, замороженной, предпочтительно при <-15°C, наиболее предпочтительно ниже -30°C, или в виде лиофилизата.
Способ по изобретению в подробностях включает стадии
a) растворения криопреципитата, растворенного при около нейтральном уровне pH,
b) адсорбции раствора с помощью Al(OH)3 и удаления полученного геля,
c) инактивации вирусов в полученном растворе стадии b) посредством обработки растворителем/детергентом (S/D), экстракции реагентов S/D растительным маслом и контакт водной фазы со смолой TMAE,
d) добавления, по меньшей мере, одного хелатообразующего агента для получения концентрации хелатообразующего агента, например, 3 мM-100 мM в полученной водной фазе стадии c),
e) осаждения фибриногена из водной фазы, содержащей хелатообразующий агент, стадии d), путем добавления глицина до достижения конечной концентрации около 1M глицина, и разделения полученной пасты фибриногена,
f) экстракции фибриногена из пасты фибриногена посредством буфера 20 мM TRIS при pH около 8,0, фильтрации и,
g) загрузки фильтрованного раствора со стадии f) на анионообменную смолу, включающую триметиламиногруппы, привитые на основу гидроксилированного метакрилового полимера посредством линкерных групп, и отмывки слабо связанных веществ с помощью промывочного буфера с проводимостью около 12,0 мС/см,
h) элюцию фибриногена с помощью элюирующего буфера, содержащего около 1,5 г/л цитрата натрия, около 7,0 г/л хлорида натрия и около 10,0 г/л глицина, в частности с pH, доведенным до около 7,0 и проводимостью 13,1-15 мСм/см,
i) фильтрации через, по меньшей мере, один нанофильтр
j) концентрирования, рецептирования, заполнения стерильной фильтрацией и, необязательно, лиофилизации.
Объектом настоящего изобретения также является фракция, обогащенная фибриногеном, получаемая в соответствии с процессом производства по изобретению.
Концентрат фибриногена заполняют в конечные контейнеры после стерильной фильтрации и их можно хранить в жидкой, замороженной или лиофилизированной форме. Подходящими контейнерами являются стеклянные флаконы или бутыли или пластиковые пакеты, в конечном счете, включающие мембрану, допускающую лиофилизацию, тогда как пакет тщательно герметизирован для жидкостей.
Фибриноген, полученный в соответствии с указанным процессом, характеризуется очень низким количеством примесей, что определяет происхождение продукта и позволяет длительно лечить нуждающихся людей. FXIII предпочтителен в содержащейся концентрации, так как он поддерживает стабилизацию образующегося фибрина, тогда как перегрузки этой трансглютаминазы избегают.
Термины "включающий", "включать" или "включает" также могут быть заменены признаками "состоящий", "состоять" или "состоит" без изменения описания изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Хотя в принципе все источники, содержащие фибриноген, могут быть использованы в соответствии с изобретением, криопреципитат является предпочтительным источником и далее криопреципитат служит типичным источником фибриногена в дополнительном описании процесса производства по изобретению.
Обычно криопреципитат восстанавливают или растворяют в подходящих буферных условиях, в частности, при около нейтральном pH (6,9-7,0 например, в растворе буфера, содержащего Na-цитрат и NaCl), подвергают адсорбции, в частности, с помощью Al(OH)3, и полученный гель удаляют, например, центрифугированием. Затем надосадочную жидкость инактивируют от вирусов, например, посредством обработки растворителем/детергентом (S/D). Указанный метод хорошо известен специалисту в области техники и оригинально описан в EP-A1-131740. S/D соединения, такие как Triton (0-[4-(1, 1,3,3-тетраметилбутил)фенокси]полиэтоксиэтанол) и TnBP (три-н-бутилфосфат), в частности, удаляют экстракцией касторовым маслом. Для дополнительной очистки водная фаза может быть подвергнута процессу хроматографии. Обычно она может быть проведена посредством контакта водной фазы с сильным анионообменным гелем, триметиламиноэтилом (TMAE), привитым на матриксный материал, таким как Fractogel EMD-TMAE. Хороших результатов достигают, если хроматографию проводят с буферами, имеющими значение pH 6,9-7,1 и осмолярность 570-610 мосмоль/л. В таких условиях фибриноген не связывается со стационарной фазой и, следовательно, обнаруживается в промывке или надосадочной жидкости, последней, если проводят процесс хроматографии партии.
Раствор несвязанного фибриногена, содержащий обычно около 40 г/л (турбидометрический метод Клаусса) доводят до pH =7,0-8,0, в частности до pH = 7,3-7,5 с помощью буфера, содержащего по меньшей мере один хелатообразующий агент. Подходящими хелатообразующими агентами являются Ca2+-хелатообразующие агенты, в частности 1,2-бис(o-амино)этан-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетрауксусная кислота (BAPTA), диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA), этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), этиленгликольтетрауксусная кислота (EGTA) и нитрилотриуксусная кислота (NTA) в концентрациях от 3 мM до 100 мM, в частности от 5 мM до 50 мM, еще точнее - от 5 мM до 20 мM. После этого подходящее осаждающее средство, например глицин, добавляют для завершения в концентрации 0,8-1,2 M, в частности 0,9-1,1 M, полученный раствор можно перемешивать в течение 60-120 мин для осаждения фибриногена. Осаждение может быть проведено в диапазоне температур +4,1°C-+40°C, пока исключается криопреципитация, в частности в диапазоне от +5°C до 37°C, точнее от 5,1°C до 30°C, еще точнее - при 10°-20°C. Преципитат, содержащий фибриноген, затем может быть разделен посредством центрифугирования, и полученную промежуточную пасту фибриногена можно хранить при <-60°C, предпочтительно при -100°C-65°C, в течение, по меньшей мере, 6 месяцев, если промежуточную пасту фибриногена не обрабатывают сразу же, но срок хранения от 1 дня до 6 месяцев является предпочтительным. Уже одно осаждение, например, с глицином, обеспечивает пасту фибриногена, достаточно чистую для последующей обработки.
Затем фибриноген экстрагируют из полученного таким образом промежуточного продукта при помощи 10-30 мM трис(гидроксиметил)аминометанового (Tris буфера) буфера без хелатообразующих агентов при значении pH от 7,5 до 8,5, в частности 15-25 мM Tris буфер с pH 7,5-8,5. Экстракция занимает 10-120 минут, в частности 15-90 минут, еще предпочтительнее 20-60 минут при перемешивании. Полученную суспензию затем можно фильтровать и подвергать ультра/диафильтрации, например, против 5-кратного объема суспензии того же или другого буфера.
Полученный раствор, содержащий фибриноген, затем нагружают на анионообменный гель, предпочтительно выбираемый из группы третичных или четвертичных аминогрупп в качестве лигандов, привитых на матрицу. Указанные функциональные группы выбирают из хорошо известных диэтиламиноэтил (DEAE) или, в случае сильного анионообменного геля, из групп, таких как триметиламино, триметиламиноэтил (TMAE) и других групп, тогда как материал носитель может состоять из целлюлозы, агарозы, диоксида кремния, полимерного или керамического материала. Хорошие результаты, в частности в снижении фибронектина и витронектина, могут быть достигнуты с триметиламиногруппами, привитыми на гидроксилированный метакриловый полимер посредством линкерной группы, такой как GigaCap Q-650M. Очень неожиданно, что химически сходный Marco-Prep High Q, метакриловый полимер, состоящий из диэтиленгликольдиметакрилата/глицидилметакрилата также с триметиламино лигандами, но не имеющий гидроксильной функциональной группы в полимерном каркасе, оказался менее эффективным в снижении двух указанных белков. Эффективное снижение липкого фибронектина является существенным преимуществом для необязательных фильтраций, таких как ультра/диафильтрация или нанофильтрация, так как период жизни фильтров повышается из-за сниженного закупоривания. Если процесс включает нанофильтрацию, предпочтительно проводить процесс с разведенным раствором, в частности с каскадом нанофильтров. Хроматографический гель или смола, в частности, заранее уравновешены тем же буфером, который используют для ресуспендирования промежуточной пасты фибриногена перед нанесением раствора фибриногена. Слабо связанные вещества отмывают уравновешивающим буфером с последующим промывочным буфером (1,5 г/л цитрата натрия, 6,0 г/л хлорида натрия, доведенного до pH 6,8-7,2, предпочтительно 6,9-7,1, и обладающим проводимостью 11,0-13,0 мСм/см при комнатной температуре 20-25°C).
Затем фибриноген можно элюировать из хроматографической колонки с помощью элюирующего буфера, содержащего 1,5 г/л цитрата натрия и 10,0 г/л глицина, в частности, доведенного до того же диапазона pH, что и промывочный буфер, например, посредством HСl и/или NaOH, и доведенного с помощью около 7,0 г/л NaCl до проводимости 13,1-15 мС/см при комнатной температуре 20°C-25°C. Приблизительно 74% фибриногена, нанесенного на колонку, восстанавливается в элюате, тогда как фибронектин почти полностью удаляется из элюата, содержащего фибриноген. Преимущественно, проводят фильтрацию, в частности нанофильтрацию.
Такой фильтрованный раствор фибриногена может дополнительно быть концентрирован посредством ультра/диафильтрации до около 20-26 г/л и стерильно фильтрован с мембранами с номинальным размером отверстий ≤0,2 мкм. Специалисты в области техники знают, что также достижимы другие концентрации, такие как 1-19,9 г/л или 26,01-30 г/л или даже выше. Концентрат фибриногена по настоящему изобретению также может быть рецептирован с добавками, такими как стабилизаторы, известные специалисту, такие как углеводы, например, сахароза, трегалоза, аминокислоты, например, глицин, гистидин, аланин, аргинин и детергенты, например, поли-оксиэтилен-(20)-сорбит-моноолеат (TWEEN 80). Такой стерильно фильтрованный объем хранят при -60°C или ниже, в частности при -65°C-80°C, перед второй стерильной фильтрацией и заполнением в конечные контейнеры и необязательно лиофилизацией, или непосредственным заполнением в конечные контейнеры и необязательной лиофилизацией без второй стерильной фильтрации.
Нет необходимости добавлять дополнительные буферы, стабилизаторы, ингибиторы протеаз, как AT-III, кофактор гепарина-II и ингибитор C1-эстеразы, или другие соединения, как фактор коагуляции XIII (F XIII). Фактор коагуляции XIII присутствует в концентрате с активностью ≥0,05 МЕ на мг фибриногена (метод Клаусса), в частности с активностью 0,05-0,30 МЕ/мг. Концентрат фибриногена по настоящему изобретению дополнительно характеризуется низким содержанием соединений с более высокой молекулярной массой, чем фибриноген (HMW), определяемым как % общей площади по хроматографии, исключительной по размерам, при 280 нм. Концентрат фибриногена по настоящему изобретению содержит менее чем 11% HMW, в частности 2-10%, когда концентрация хелатообразующего агента составляет, по меньшей мере, 3 ммоль/л. Применение хелатообразующих агентов в концентрациях, по меньшей мере, 5 ммоль/л снижает содержание HMW до 2-6%. Некоторое количество альбумина также может присутствовать в концентрации около 16 нг на мг фибриногена. Антитромбин-III (AT-III) и протеолитическая активность не определяются, т.е. концентрация AT-III менее чем 0,2 МЕ/мл и протеолитическая активность менее чем 2 ЕД на литр (<2 ЕД/л), что соответствует менее чем 0,01 МЕ AT-III на мг фибриногена и менее чем 0,1 мЕД протеолитической активности на мг фибриногена, при измерении в растворе конечного продукта, содержащего фибриноген в концентрации 20 мг/мл. Изобретение далее проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.
Пример I:
Криопреципитат, полученный из плазмы известными методами, восстанавливали или растворяли при около нейтральном pH, подвергали адсорбции с помощью Al(OH)3 и полученный гель удаляли центрифугированием. Надосадочную жидкость затем инактивировали от вирусов посредством обработки растворителем/детергентом (S/D). S/D соединения в соответствии с EP-A1-0131740 экстрагировали растительным маслом, и водная фаза контактировала с Fractogel EMD-TMAE. Использовали хроматографические условия (значение pH 6,9-7,1 и осмолярность 570-610 мосмоль/л), в которых фибриноген не связывается с гелем и, следовательно, обнаруживается в проточной или надосадочной жидкости.
Раствор несвязанного фибриногена смешивали с EDTA до достижения концентрации EDTA 10 мM и раствор фибриногена, содержащий EDTA, перемешивали при около 15°C в течение около 60 минут после добавления глицина (1 моль/л конечная концентрация и pH 7,4) для осаждения фибриногена. Преципитат, содержащий фибриноген, затем разделяли центрифугированием, получая промежуточную пасту фибриногена.
Фибриноген экстрагировали путем перемешивания в течение около 30 минут из полученного таким образом промежуточного продукта при помощи буфера 20 мM Tris (pH около 8,0), в отсутствие хелатообразующего агента, и полученную суспензию затем фильтровали и подвергали ультра/диафильтрации.
Полученный раствор, содержащий фибриноген, затем нагружали на GigaCap Q-650M и хроматографический гель или смолу предварительно уравновешивали с помощью того же буфера Tris, который использовали для ресуспендирования перед нанесением раствора фибриногена. Слабо связанные вещества отмывали уравновешивающим буфером с последующей промывкой промывочным буфером (1,5 г/л цитрата натрия, 6,0 г/л хлорида натрия, доведенный до около pH 7,0 и проводимостью около 12,0 мСм/см). Затем фибриноген элюировали из хроматографической колонки с помощью элюирующего буфера (1,5 г/л цитрата натрия и 10,0 г/л глицина, приведенный к такому же pH, как промывочный буфер и доведенный с помощью около 7,0 г/л NaCl до проводимости 13,1-15 мСм/см). Нанофильтрацию проводили путем последовательного пропускания раствора фибриногена через нанофильтры с уменьшающимся размером отверстий от 75 нм до <35 нм.
Полученный раствор фибриногена концентрировали, рецептировали и стерильно фильтровали. Такую стерильно фильтрованную партию хранили в течение 5 дней при -80°C перед второй стерильной фильтрацией и заполняли в конечные контейнеры. Одну часть конечных контейнеров лиофилизировали, тогда как другую часть держали в виде жидкой композиции. Не наблюдали определяемых количеств хелатообразующих агентов в лиофилизированном продукте или жидком концентрате.
Восстановление лиофилизатов осуществляли путем добавления воды для инъекций (WFI) до концентрации перед лиофилизацией.
Примеры II-XII проводили таким же образом, как пример I, но они включали вариации типа и концентрации хелатообразующих агентов, а также вариации времени экстракции. Поскольку параметры, такие как содержание белка, содержание антигена фибриногена или содержание фибринопептида A существенно не подвергались влиянию таких вариаций при нормализации относительно 1 мг фибриногена, наблюдали, что содержание соединений с более высокой молекулярной массой, чем фибриноген (HMW), определяемое посредством хроматографии, исключительной по размерам, превосходило 10%, когда концентрация хелатообразуюшего агента составляла менее чем 3 ммоль/л. Пример XIII получали в соответствии со способом WO-A1-2012/038410, т.е. без присутствия какого-либо хелатообразующего агента во время очистки. Результаты таких вариаций суммированы в таблице 1.
Таблица 1
Пример
Вещество
Ммоль/л
HMW %
II
EDTA
1
18
III
EDTA
3
10
IV
EDTA
5
4
V
EDTA
20
4
VI
EDTA
50
4
XIII
-
0
20
XI
EGTA
1
13
XII
BAPTA
1
22
IX
EGTA
5
3
X
BAPTA
5
6
I
EDTA
10
3
VII
EGTA
10
2
VIII
BAPTA
10
4
Серию экспериментов проводили для определения подходящего диапазона времени экстракции как компромисс между выходом и чистотой экстрагируемого промежуточного продукта фибриногена. Подходящий диапазон времени экстракции определяли как составляющий между 10 и 120 минутами, поскольку меньшее время экстракции обеспечивало очень чистый промежуточный продукт за счет выхода фибриногена, тогда как во время экстракции, превосходящей 120 минут, некоторые примеси начинали повторно растворяться без достоверного повышения выхода фибриногена.
Сравнение с WO-A1-2012/038410.
Различия между настоящим изобретением и WO-A1-2012/038410 представлено добавлением хелатообразующего агента перед осаждением фибриногена посредством подходящего осаждающего агента, такого как глицин, и заменой следующей стадии ресуспендирования в WO-A1-2012/038410 экстракцией. Указанная модификация приводила к неожиданному увеличению активности фактора коагуляции XIII в конечном продукте по настоящему изобретению, т.е. до 0,30 МЕ/мг фибриногена (концентрация фибриногена 20-25 мг/мл; определяемая методом Клаусса), а также к повышенному выходу.
На фиг.1 изображен SDS-Page в невосстанавливающих условиях, выявивший соединения с более низкой молекулярной массой в типичных продуктах, полученных в соответствии с процессом по настоящему изобретению (строки 6-11 также показаны как "+"), по сравнению с продуктом патентной публикации WO-A1-2012/038410 (строки 2-5, также показанные как "-"). Полоса белка, ближайшая к 250 кДа, представляет собой фибриноген, тогда полоса выше фибриногена, представляет собой соединения с более высокой молекулярной массой. Полоса белка, расположенная приблизительно 50 кДа, представляет собой альбумин. Полоса 1 отражает маркеры молекулярной массы.
На фиг.2 изображен SDS-Page в восстанавливающих условиях. Тестируемые продукты были такими же, как на фиг.1 и в том же порядке, и их последовательно показывают таким же образом, как на фиг.1, т.е. для продуктов, полученных процессами в соответствии с настоящим изобретением, тогда как "-" показывает продукты, полученные процессом в соответствии с WO-A1-2012/038410. Основные полосы, расположенные приблизительно 50-70 кДа, представляют собой α-, β- и γ-цепи фибриногена. Полоса белка на около 100 кДа представляет собой димер γ-цепи фибриногена. Неотчетливая полоса на около 30 кДа обусловлена фрагментами фибриногена. Полоса 1 отражает маркеры молекулярной массы.
Сравнение с WO-A2-2009/155626
Различия между продуктами по настоящему изобретению и продуктами, расположенными в WO-A2-2009/155626, исследовали посредством анализа продуктов, полученных способами WO-A2-2009/155626, в частности, посредством комбинации описанных примеров 1 и 6, которые давали нанофильтрованный и лиофилизированный продукт. Наблюдали, что продукт WO-A2-2009/155626 содержал 1% соединений с более высокой молекулярной массой, чем фибриноген, определяемые хроматографией исключительной по размеру, и активность фактора коагуляции XIII около 0,41 МЕ/мг фибриногена.