АЛЛЕРГОИДЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ АЛЛЕРГЕНОВ
ALLERGOIDS PREPARED OF ALLERGENS

Настоящее изобретение относится к получению аллергоидов из аллергенов путем химической функционализации с целью снижения риска индуцирования побочных эффектов при применении в качестве противоаллергических вакцин в иммунотерапии аллергических заболеваний.
Аллергические заболевания обусловлены аномальностью иммунной системы и вызваны продукцией определенных антител класса IgE, специфичных к повсеместно распространенным веществам (обозначаемым термином «аллергены»), самим по себе абсолютно безопасным, таким как, главным образом, пыльца, клещи, производные эпителия, токсичное вещество перепончатокрылых насекомых, споры грибов и некоторые продукты. Такие IgE-антитела способны связываться со специфическим рецептором, который находится на мембране, например, мембране тучных клеток слизистых оболочек, т.е. базофилов, и при последующем взаимодействии с аллергенами, на которые они направлены, способны индуцировать высвобождение медиаторов (к числу которых относится гистамин) за счет вышеуказанных клеток, эти медиаторы, в конечном счете, представляют собой истинные провоцирующие факторы аллергической реакции. Симптомы аллергической реакции варьируют от ринита-конъюнктивита до крапивницы, астмы, вплоть до анафилактического шока, этот последний представляет собой осложнение, которое может быть летальным.
Последние расчеты указывают на то, что более чем 20% популяции, проживающей в промышленно развитых странах, страдает от этого типа заболевания, которое, продолжаясь во времени, может определять при отсутствии подходящего лечения усугубление симптомов (например, возникновение астмы после ринита) и повышение чувствительности, которое может распространяться также и на другие аллергены, что еще более отягощает качество жизни индивидуумов, страдающих от него, и заставляет искать более подходящее терапевтическое средство для использования в лечении аналогичного большего комплекса.
Специфическая иммунотерапия, направленная на понижение чувствительности (ITS), в отличие от фармакологической терапии, которая ограничивается воздействием на симптом, который затем вновь появляется в момент прекращения действия лекарственного средства, представляет собой единственную форму этиологического лечения аллергических заболеваний, способную положительно влиять на причины, определяющие так называемый «аллергический марш», путем активации некоторых иммунологических механизмов, которые представляют собой основу клинического эффекта, индуцированного посредством ITS (Clin Exp Allergy. 2008; 38:1074-88. Update on mechanisms of allergen injection immunotherapy. James LK, Durham SR.; Allergy. 2006; 61 Suppl 81:11-4. Immunological mechanisms of sublingual immunotherapy. Akdis CA, Barlan IB, Bahceciler N, Akdis M.).
ITS заключается во введении в увеличивающихся дозах стандартизованных экстрактов (вакцин), полученных, исходя из того вещества, которое вызывает заболевание.
Таким образом, у пациента постепенно индуцируется вид «иммунологической толерантности» к такому веществу, которая опосредуется IgG-антителами, специфичными для аллергена, также называемыми «блокирующими антителами», которые, предотвращая за счет явления конкуренции взаимодействие IgE-антител с аллергеном, на который они направлены, ингибируют запуск аллергической реакции и, следовательно, ингибируют появление симптомов.
Вакцины, использованные для ITS, составлены из более или менее сложной смеси белка, т.е. гликопротеина, компоненты которой, таким образом, направлены против специфических IgE-антител, которые продуцирует индивидуум, страдающий аллергией.
Несмотря на то что терапевтическая эффективность ITS была показана в большом числе клинических исследований, у нее также существует риск развития тяжелых нежелательных реакций (Immunopharmacol Immunotoxicol. 2008; 30:153-61. Local and systemic reactions occurring during immunotherapy: an epidemiological evaluation and a prospective safety-monitoring study. Ventura MT, Giuliano G, Buquicchio R, Accettura F, Carbonara M.; Immunol Allergy Clin North Am. 2007; 27:295-307 Anaphylactic reactions during immunotherapy. Rezvani M, Bernstein DI; Allergy. 2008; 63:374. Anaphylactic shock because of sublingual immunotherapy overdose during third year of maintenance dose. Blazowski L.), которые могут возникнуть после введения вакцины. Такие реакции могут варьировать от описанных местных реакций (аллергических папул, румянца, зуда и т.д.) до системных реакций (вторичного усугубления симптомов, астмы, до анафилактического шока); несмотря на то, что такой риск был в значительной степени снижен за счет применения вакцин с замедленным высвобождением (вакцин замедленного действия) или вакцин, вводимых отличными от инъекционного способами, это, как бы то ни было, ограничило применение ITS в лечении аллергических заболеваний, на сегодняшний день используемой у ограниченного процента от всех пациентов, страдающих аллергией, идентифицированных после подходящего диагностического обследования.
Существенно увеличиваются и пищевые аллергии. С недавних пор, в отличие от того, что утверждалось несколько лет назад, когда существовало лечение этих форм аллергии лишь путем устранения предполагаемого продукта из рациона, в области аллергологии все более и более укрепляется идея того, что для форм пищевой аллергии также подходит специфический способ ITS. Тем не менее, очевидно, что применение нативных аллергенов для лечения форм пищевой аллергии имело бы те же ограничения (риск нежелательных эффектов), что и обнаруженные при ITS респираторных форм аллергии. На самом деле, такие риски могут быть даже отягощены, поскольку от этих форм аллергии часто страдают новорожденные и дети первых лет жизни.
В последние годы большое внимание было уделено разработке вакцин, которые являются более эффективными и обладают более высокой степенью безопасности. В частности, обнаружение способов химической модификации, которые являются более или менее избирательными, но все же нацелены на снижение аллергенного потенциала вакцин, сохраняя насколько возможно их иммуногенный потенциал, то есть способность индуцировать образование IgG-антител, способных распознавать при введении индивидууму также и немодифицированные (нативные) компоненты, которые представляют собой компоненты, воздействию которых подвергается индивидуум, страдающий аллергией, и определять развитие специфических симптомов, подводит к разработке так называемых аллергоидов (J Allergy Clin Immunol. 1985; 76:397-401. Modified forms of allergen immunotherapy. Grammer LC, Shaughnessy MA, Patterson R.; Int Arc hAllergy Appl Immunol. 1971; 41:199-215. Preparation and properties of, allergoids, derived from native pollen allergens by mild formalin treatment. Marsh DG).
Разработка аллергенов, полученных также и из продуктов питания, в виде аллергоида и его применение в иммунотерапии специфических пищевых аллергий могло бы быть фактически решающим в создании у индивидуума, страдающего аллергией, некоторого вида иммунологической толерантности, таким образом, предотвращая у индивидуума возникновение этих реакций, которые могут угрожать его/ее жизни после употребления, не подозревая об этом, даже минимальных количеств аллергена, к которому у него/нее повышена чувствительность.
Степень снижения аллергенного потенциала экстракта, индуцированная химической модификацией, может быть различной в соответствии с типом реагента, который используют для модификации, и/или типом экстракта. Используя в качестве «модифицирующего» реагента цианат калия, получают так называемые карбамилированные производные, которые отличаются сниженной аллергенностью и сохраненной иммуногенностью (Allergy. 1996; 51:8-15. Monomeric chemically modified allergens: immunologic and physicochemical characterization. Mistrello G, Brenna O, Roncarolo D, Zanoni D, Gentili M, Falagiani P.).
Dermatophagoides pteronyssinus
Тем не менее, необходимо отметить, что поскольку экстракты, подвергнутые химической модификации с помощью цианата калия, представляют собой крайне гетерогенные белковые смеси, степень модификации, определяемая количеством аминогрупп, строго связана с типом присутствующего белка, поэтому полученный показатель выражает среднюю величину степени модификации. Фактически может получиться так, что некоторые аллергенные белки несущественно подвергаются воздействию модификации цианатом калия, благодаря чему сохраняют большую часть своей аллергенной активности. На уровне модифицированного экстракта можно было бы не обнаружить выборочное сохранение аллергенной активности компонентом экстракта. Тем не менее, в течение многих лет были разработаны различные техники очистки отдельных аллергенов. Поэтому, рассмотрев процедуру химической модификации на уровне единичных компонентов, на сегодняшний день возможно указать степень замещения, которая может быть получена с помощью цианата калия. В случае, например, аллергена Der p1, одного из основных аллергенов клеща вида , который присутствует в домашней пыли, степень модификации, определенная посредством реакции с 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS), не превышает 50% по сравнению со степенью модификации экстракта, составляющей около 80%.
Цель настоящего изобретения - предоставить препарат для специфической иммунотерапии (ITS), который обладает лучшей переносимостью и в частности дополнительно минимизирует риск возможных нежелательных эффектов, показанных известным уровнем техники в области аллергоидов, без уменьшения при этом эффекта снижения чувствительности, который свойственен традиционному лечению аллергических заболеваний.
Такая цель достигается посредством аллергоидов, у которых остаточная аллергенная активность, сохраняющаяся после модификации цианатом калия или другим реагентом путем реакции карбамилирования или тиокарбамилирования, дополнительно снижается благодаря процедуре второй химической модификации, которая предусматривает применение диальдегида или дикетона, такого как фенилглиоксаль или другие подобные реагенты (глиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион, пара-гидроксифенилглиоксаль и т.д.). Тогда как цианат калия или другой реагент для карбамилирования или тиокарбамилирования специфически взаимодействует с ε-аминогруппами остатков лизина, фенилглиоксаль имеет в качестве специфической мишени гуанидиновую группу аргининовых остатков белков (Blazer AN. Specific chemical modification of proteins. Annu Rev Biochem. 1970; 39:101-30). Затем была определена степень модификации аргининовых остатков, как описано Shah и соавторами (Shah MA, Tayyab S and Ali R. Probing Structure-activity relationship in diamine oxidase reactivities of lysine and arginine residues. Int. Journal of Biol. Macromolecules: 18; 77-81, 1996).
Было отмечено, что химическая модификация аллергенных экстрактов или одиночных белков, осуществленная путем реакции с одним фенилглиоксалем, индуцирует слабое снижение их аллергенной активности. Аналогично, изменение последовательности модификации, фенилглиоксаль и затем цианат калия, не дало обнадеживающих результатов в отношении снижения аллергенного потенциала.
Поэтому специфическая цель настоящего изобретения представлена модифицированными аллергенами, обладающими сниженной аллергенностью по сравнению с соответствующим нативным аллергенным материалом и отличающимися тем, что все или часть первичных аминогрупп лизиновых и аргининовых остатков аллергенных молекул функционализуются, как показано в структуре (I), полагая, что указанные аллергены после модификации соответственно с помощью (i) реакции карбамилирования или тиокарбамилирования и (ii) реакции с диальдегидом или дикеталем имеют следующую структуру (I):
2
в которой R и R независимо выбирают из Н, С1-С5 алкила, фенила, необязательно замещенного в орто-, мета- или пара-положении гидрокси-, С1-С4 алкоксигруппой, галогеном, амино-, алкиламино-, диалкиламино-, меркапто-, С1-С4 алкилмеркаптогруппой;
Х представляет собой O, S или NR3, где R3 представляет собой Н, алкил с 1-6 атомами углерода, фенил или CN;
1
R представляет собой Н, алкил с 1-8 атомами углерода, фенил или арилалкил с атомами углерода в количестве до 8, или гетероциклическое кольцо, содержащее алкил;
prot представляет собой белковый остаток аллергена;
n представляет собой количество функционализированных групп аргинина и находится в диапазоне между 1 и числом групп аргинина, присутствующих в аллергене;
m представляет собой количество функционализированных групп лизина и находится в диапазоне между 1 и числом групп лизина, присутствующих в аллергене.
2
Предпочтительные модифицированные аллергены формулы (I) представляют собой такие аллергены, в которых R представляет собой фенил, необязательно замещенный в орто-, мета- или пара-положении гидрокси-, С1-С4 алкоксигруппой, галогеном, амино-, алкиламино-, диалкиламино-, меркапто-, С1-С4 алкилмеркаптогруппой, и R представляет собой водород.
1
2
Другие предпочтительные модифицированные аллергены представляют собой такие аллергены, в которых Х представляет собой О или S и R представляет собой водород и предпочтительно R и R определены в предыдущем параграфе.
1
2
Особенно предпочтительные модифицированные аллергены представляют собой такие аллергены, у которых R представляет собой фенил, R и R представляют собой водород и Х представляет собой О или S.
Например, схема 1 представляет реакцию лизина с цианатом калия:
Схема 1
Последующая схема 2 представляет пример реакции функционализации с помощью фенилглиоксаля аргининового остатка аллергоида:
Схема 2
Аллергенный материал, подвергаемый способу по изобретению, может быть получен из различных источников, таких как клещи, пыльца, эпителий животных, грибы, белки из продуктов питания (молока, яиц, зерновых продуктов, персика, яблока и т.д.) путем экстракции аллергенных белков с помощью подходящего, обычно водного, растворителя; такой материал также может состоять из белков, очищенных из сырых материалов, перечисленных выше, или в рекомбинантной форме, полученной посредством принятых техник молекулярной биологии.
Функционализация путем реакции карбамилирования или тиокарбамилирования осуществляется посредством обработки цианатом щелочного металла (KCNO или NaCNO) или органическими изоцианатами или тиоцианатами.
2
Производные, в которых Х представляет собой NR3, могут быть получены, исходя из соединений, в которых Х представляет собой S, посредством реакции гуанидилирования с соединением формулы R3-NH в соответствии со способами, которые приняты и известны специалистам в данной области, такими как, например, применение реагента Мукайямы.
Для модификации экстракта с помощью цианата калия (KCNO) подходит, чтобы конечная концентрация соли находилась в диапазоне между 0,1 М и 1,5 М, предпочтительно между 0,4 М и 0,8 М, необязательно поддерживая величину рН между 7 и 11, предпочтительно между 9 и 9,6; температура может находиться в диапазоне между комнатной температурой и 50°С, предпочтительно между 35 и 40°С, в течение суммарного времени проведения реакции между 12 и 36 часами, предпочтительно между 16 и 24 часами. В случае модификации с помощью органических изоцианатов и изотиоцианатов, которые представляют собой более реакционно-способные вещества, реакция должна осуществляться при комнатной температуре или ниже, предпочтительно между 0°С и 5°С, тогда как время проведения реакции должно находиться в диапазоне между 30 минутами и 8 часами, предпочтительно между 2 и 4 часами. Вследствие их плохой растворимости в воде реакция должна осуществляться при наличии совместимого органического растворителя.
В конце реакции модифицированный таким образом экстракт подвергают гель-фильтрации для удаления избытка реагента и уравновешивают подходящим солевым раствором.
2
Степень замещения NH-групп лизинов, которые присутствуют в аллергенных молекулах, составляющих экстракт, или очищенных одиночных аллергенных молекул или в рекомбинантной форме после модификации цианатом калия может быть определена анализом с помощью тринитробензолсульфоновой кислоты (Habeeb, Anal. Bioch. 14, 328, 1966) или анализом исчезновения лизиновых остатков и появления гомоцитруллина с помощью подходящих способов или инструментальных анализов, которые известны специалистам в данной области.
Для модификации с помощью фенилглиоксаля (PGO) к образцам, модифицированным с помощью KCNO, при условиях, описанных ранее, добавляют такое количество 0,1 М раствора бикарбоната натрия, чтобы довести величину рН растворов до 8,0. Концентрация белка образцов, определенная согласно Лоури, находится в диапазоне между 1 и 10 мг/мл (экстракты), т.е. 0,1 и 2,5 мг/мл (очищенные белки) (J. Biol. Chem, 1970:193, 265-275. Protein measurement with Folin Phenol reagent. Lowry, Rosebrough N. J., Farr A.L., Randall R.J.). Затем к вышеупомянутым растворам добавляют PGO, так чтобы получить его молярный избыток в диапазоне между 100 и 1600, предпочтительно между 400 и 800. Для содействия растворению PGO последний предварительно растворили в этиловом спирте при концентрации около 50 мг/мл. Смесь оставляют при слабом перемешивании в течение периода времени между 30 минутами и 8 часами, предпочтительно 4 часа при температуре между 20 и 37°С, предпочтительно 25°С. Затем реакция продолжается диализом или гель-фильтрацией против подходящего буфера полученного таким образом экстракта. После такой же процедуры следует применение других реагентов, модифицирующих аргининовые остатки.
Подобный способ должен быть использован для функционализации с помощью различных диальдегидов или дикетонов.
-1
-1
Степень замещения аргининовых остатков оценивают согласно Shah. Основываясь на вышеупомянутом способе, степень замещения аргининовых групп определяют, принимая во внимание молярный коэффициент экстинкции 11000 М см при 250 нм для комплекса дифенил-аргинин, образование которого является следствием реакции с PGO.
Как правило, средний процент модифицированных первичных аминогрупп должен находиться в диапазоне между 75% и 100%, обычно около 90%; тогда как средний процент замещенных аргининовых остатков должен находиться в диапазоне между 25 и 100%, обычно около 40%.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 представлена оценка аллергенной активности экстракта DP, нативного и после модификации с помощью KCNO или KCNO/фенилглиоксаля;
на фиг.2 показана реактивность IgG в сыворотке мышей, иммунизированных экстрактом DP, модифицированным с помощью KCNO/фенилглиоксаля;
на фиг.3 представлен белковый профиль экстракта DP, нативного, модифицированного с помощью KCNO или KCNO/фенилглиоксаля;
на фиг.4 представлена оценка аллергенной активности аллергена Der p1, нативного и после модификации с помощью KCNO или KCNO/фенилглиоксаля;
на фиг.5 показана реактивность IgG в сыворотке мышей, иммунизированных аллергеном Der p1, модифицированным с помощью KCNO/фенилглиоксаля;
на фиг.6 представлен профиль аллергена Der p1, нативного, модифицированного с помощью KCNO или с помощью KCNO/фенилглиоксаля;
на фиг.7 представлена оценка аллергенной активности овальбумина, нативного и после модификации с помощью KCNO или KCNO/фенилглиоксаля;
на фиг.8 показана реакционная способность IgG в сыворотке мышей, иммунизированных овальбумином, модифицированным с помощью KCNO/фенилглиоксаля;
на фиг.9 представлен профиль овальбумина, нативного, модифицированного с помощью KCNO или с помощью KCNO/фенилглиоксаля;
на фиг.10 представлена оценка аллергенной активности рекомбинантного Pru p3, нативного и после модификации с помощью KCNO или KCNO/фенилглиоксаля;
на фиг.11 показана реакционная способность IgG в сыворотке мышей, иммунизированных рекомбинантным Pru p3, модифицированным с помощью KCNO/фенилглиоксаля;
на фиг.12 представлен профиль рекомбинантного аллергена Pru p3, нативного или после модификации с помощью KCNO или KCNO/фенилглиоксаля.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ РАЗДЕЛ
В соответствии со способами, описанными выше, получают образцы аллергоидов, полученные после реакции с KCNO, или имеющие двойное замещение KCNO/PGO.
После этого «дважды» модифицированные образцы сравнивают с образцами, модифицированными с помощью KCNO, т.е. исходными, с точки зрения аллергенного потенциала посредством EAST-ингибирования, размеров молекул - посредством SDS-PAGE и иммуногенной активности - посредством ELISA.
Настоящее изобретение далее будет описано более подробно с помощью неограничивающего примера в отношении процедуры модификации KCNO/PGO некоторых аллергенов как в виде экстракта, так и одиночных белков, очищенных из своего экстракта, или коммерчески доступных, т.е. полученных в рекомбинантной форме с помощью техник молекулярной биологии. В качестве примера аллергенного экстракта для терапевтического применения был выбран экстракт клещей DP, поскольку из-за их повсеместного распространения они могут вызывать специфическую аллергию во всем мире. В этом смысле экстракт DP может считаться характерным примером этого класса. Тем не менее, процедуру химической модификации также использовали и для одиночных очищенных белков, таких как аллерген, известный как Der p1 (один из основных аллергенов экстракта DP, полученный из того же экстракта подходящим способом очистки), аллергенная активность которого остается большой и после модификации с помощью KCNO, и для очищенных белков, полученных из пищевых продуктов, также вызывающих специфические аллергии, которые могут, к сожалению, приводить к летальному исходу страдающего индивидуума.
липид-переносящий белок,
Поэтому для экспериментов авторов также были приняты во внимание два аллергена из пищевых продуктов: овальбумин (OVA), коммерческий белок, очищенный из яичного белка, последний часто вызывает специфическую аллергию у детей; аллерген, известный как LTP (Pru p3), составляющий основной аллерген экстракта персика (но он присутствует и во многих других продуктах растительного происхождения), и также отвечает даже за тяжелые аллергические реакции. Последний аллерген был получен в рекомбинантной форме посредством применения техник молекулярной биологии. Каждый пример входит в соответствующие экспериментальные испытания.
ПРИМЕР 1
Dermatophagoides pteronissinus
Процедура химической модификации экстракта клещей рода  с помощью KCNO, т.е. последовательной комбинации KCNO/PGO.
Dermatophagoides pteronissinus
2
Экстракт клещей рода (фирмы Greer Labs, Lenoir, NC, USA) был получен после обезжиривания с помощью этилового эфира, объединяя 100 мл буфера PBS (0,015 M фосфатный буфер, 0,135 M NaCl при рН 7,2), содержащего 0,05% азид (PBS-A), с 5 г обезвоженных телец клещей и затем подвергая смесь ультразвуковой обработке в течение 1 минуты (ультразвуковой дезинтегратор модель 450, Branson Ultrasonics, Darbury CT, USA) для разрыва наружного скелета клещей и усиления экстракции аллергенных белков, содержащихся в нем. В заключение, препарат оставляли при перемешивании при 4°С в течение ночи. После центрифугирования при 1400 об/мин в течение 30 мин и удаления нерастворимого осадка супернатант диализовали против дистиллированной НО и высушивали замораживанием.
TM
Высушенный замораживанием экстракт затем переносят в объем 20 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 6,86, чтобы достичь концентрации белка 2,5 мг/мл согласно Лоури. Такой экстракт далее подвергали гель-фильтрации на колонке Sephadex G-25 (фирмы GE Healthcare Uppsala, Sweden), элюируя тем же буфером и собирая исключенный пик. Эту процедуру осуществляют для удаления низкомолекулярных соединений, которые могли бы повлиять на последующую процедуру химической модификации. К 50 мл такого раствора добавляют 1,92 г тетрабората натрия десятиводного и 2,05 г цианата калия. Соли вводили в раствор путем медленного перемешивания и величину рН необязательно доводили до 9,3 с помощью 1 М NaOH. Полученный раствор оставляли при медленном перемешивании в течение 16 часов в термостатической бане при 40°С в запаянном сосуде. В продолжение первых часов наблюдали за величиной рН и необязательно доводили, добавляя 1 М фосфорную кислоту. Полученный таким образом препарат вновь подвергали гель-фильтрации на колонке G-25 для удаления избыточного количества реагента и стерилизовали на мембранах Millipore с размером пор 0,22 микрон. Для последующих анализов использовали его минимальную часть. Полученный процент замещения аминогрупп экстракта, оцененный тестом TNBS, должен быть равен 76%. Оставшуюся часть экстракта, модифицированного с помощью KCNO, подвергали второй процедуре химической модификации с помощью PGO при экспериментальных условиях, описанных ниже.
Экстракт DP, модифицированный с помощью KCNO, т.е. экстракт DP перед модификацией, при концентрации белка 2,0 мг/мл (Лоури) доводят до величины рН 8, добавляя 0,1 М раствор бикарбоната натрия. После этого к образцу, модифицированному с помощью KCNO, добавляют PGO в 800-кратном молярном избытке относительно белков. Для расчета молярного избытка, причем он представляет собой экстракт, а не одиночный белок, все известные последовательности аллергенов экстракта DP были получены из базы данных UniProtKB. Учитывая молекулярную массу каждого известного аллергена, количество аргининовых остатков, исходя из установленной аминокислотной последовательности, и условное количество различных аллергенов, исходя из интенсивности видимых полос после проведения SDS-PAGE экстракта DP, были условно приняты для экстракта DP средняя молекулярная масса 40 кДа и среднее число аргининовых остатков 15. Для содействия растворению PGO последний заранее растворили в этиловом спирте в концентрации 0,3 М. Смесь оставляют при слабом перемешивании в течение 4 часов при 25°С. Затем реакция продолжается диализом или гель-фильтрацией против 20 мМ PBS. Полученная степень замещения аргининовых остатков в рассматриваемом образце должна составить 37%. После чего по возможности образец DP, модифицированный с помощью KCNO/PGO, сравнивали с образцом DP, модифицированным с помощью KCNO, т.е. исходным, с точки зрения аллергенного потенциала посредством EAST-ингибирования, иммуногенной способности - посредством ELISA и размеров молекул - посредством SDS-PAGE.
Оценка аллергенности посредством EAST-ингибирования
С этой целью полистироловые шарики, предварительно обработанные глутаральдегидом, активировали экстрактом DP в пропорции 1 мкг белка на шарик.
Наряду с этим получают пул сыворотки человека, полученной от пациентов, страдающих аллергией на экстракт DP, с записью в истории болезни об аллергии на клещей.
В лунки планшета для проведения ELISA добавляют 30 мкл серийных разведений в PBS-2% BSA (разбавитель) рассматриваемых образцов (нативный экстракт DP, экстракт DP, модифицированный с помощью KCNO, экстракт DP, модифицированный с помощью KCNO/PGO), предварительно доведя до одинаковой концентрации, и 20 мкл пулированной сыворотки; смесь оставляют при перемешивании в течение 2 часов при комнатной температуре. Наряду с этим получают образец положительного контроля, в котором в состав разбавителя входит ингибитор. В конце второго часа в каждую лунку добавляют шарик, активированный DP, и 50 мкл PBS-2% BSA, и планшет оставляют при перемешивании в течение ночи при комнатной температуре. Шарики затем отмывают, и в каждую лунку добавляют 100 мкл раствора античеловеческого IgE-антитела, конъюгированного с пероксидазой, и инкубируют при перемешивании в течение 2 часов. После трех отмывок, добавив 100 мкл реагента ТМВ (фирмы BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) и инкубируя в течение 15 минут при 25°С, наблюдают развитие колориметрической реакции. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл 1М HCl, затем 100 мкл смеси из каждой лунки переносят в новый планшет и оценивают интенсивность появившейся окраски с помощью спектрофотометрического считывания при 450 нм.
50
Детектированные оптические плотности преображают в проценты ингибирования относительно положительного контроля, и строят график, в котором на оси Y отмечают процент ингибирования и на оси Х отмечают логарифм объема образца, использованного в тесте. Исходя из полученных точек, строят прямую линейной регрессии, по которой измеряют величину IC, представляющую объем в микролитрах образца, который требуется для 50% ингибирования связывания IgE с шариком. Такая величина обратно пропорциональна аллергенному потенциалу рассматриваемого образца.
Результаты, представленные на фиг.1, показывают, что модификация с помощью KCNO снижает аллергенную активность в 18 раз, тогда как сочетанная модификация KCNO/PGO обладает синергетическим эффектом, снижая аллергенную активность экстракта DP в 227 раз. Очень вероятно, что такое дополнительное снижение аллергенной активности экстракта DP после модифицикации с помощью KCNO/PGO может быть следствием влияния двойной модификации на аллерген Der p1 (см. пример 2).
Оценка иммуногенности экстракта DP, модифицированного с помощью KCNO/PGO, посредством ELISA сыворотки ранее иммунизированных мышей
а) Протокол иммунизации мышей
Группу мышей, составленную из четырех самок штамма Balb/c (фирмы Charles River), иммунизировали подкожно с помощью 200 мкл эмульсии, состоящей из 100 мкл полного адъюванта Фрейнда и 20 мкг экстракта DP, модифицированного с помощью KCNO/PGO, в 100 мкл физиологического раствора. Другие три ревакцинации осуществляли с двухнедельными интервалами, заменяя полный адъювант неполным. Через семь дней после последней иммунизации осуществляют забор крови из хвоста мышей и образец анализируют с помощью ELISA в отношении антительного ответа на иммуноген, а также способности распознавать нативный белок.
b) Процедура тестирования
Тест осуществляют для проверки, сохраняет ли экстракт DP, модифицированный с помощью KCNO/PGO, иммуногенный потенциал, то есть способность индуцировать у мыши при введении согласно протоколу, указанному ниже, IgG-ответ, направленный также и к нативному, немодифицированному экстракту DP. С этой целью на лунках полистироловых планшетов для проведения анализов ELISA адсорбируют равные количества (0,25 мкг) экстракта DP, нативного или модифицированного с помощью KCNO/PGO, в 50 мМ карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,6, инкубируя при 4°С в течение 16 часов. Лунки затем отмывают раствором для отмывки (60 мМ фосфатный буфер, рН 6,5, содержащий 0,05% Tween 20) и свободные сайты насыщают раствором разбавителя (25% лошадиная сыворотка, 1 мМ EDTA, 0,05% Tween 20, 0,01% тиомерсал в 150 мМ фосфатном буфере, рН 7,4). В каждую лунку добавляют равные аликвоты (100 мкл) 10-кратных серийных разведений пула сыворотки мышей в буфере разбавителя и инкубируют при 25°С в течение 2 часов. После трех отмывок добавляют кроличью сыворотку с антимышиными IgG, конъюгированными с пероксидазой, в разведении 1:2000 в буфере разбавителя, смесь инкубируют при 25°С в течение 1,5 часов. После трех отмывок, добавив 100 мкл реагента ТМВ (фирмы BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) и инкубируя в течение 15 минут при 25°С, наблюдают развитие колориметрической реакции. Реакцию останавливают добавлением 100 мкл 1 N HCl и оценивают посредством спектрофотометрического считывания при 450 нм. Результаты по специфической реакционной способности IgG пулированной сыворотки мышей, иммунизированных экстрактом DP, модифицированным с помощью KCNO/PGO, к белкам как экстракта, использованного для иммунизации, так и немодифицированного (нативного) аналога представлены на фиг.2. Как можно видеть, IgG-антитела, индуцированные обработкой экстрактом DP, модифицированным с помощью KCNO/PGO, способны распознавать также и нативные белки DP (хотя и на более низком уровне, чем модифицированные белки), это указывает на то, что в экстракте DP, модифицированном с помощью KCNO/PGO, сохраняются Т-клеточные эпитопы, аналогичные эпитопам, присутствующим в нативном экстракте DP. Поэтому экстракт, модифицированный с помощью KCNO/PGO, сохраняет способность стимулировать иммунную систему подходящим образом, чтобы продуцировать специфические IgG-антитела, направленные также и против белков нативного экстракта DP.
Это наблюдение важно в отношении людей, поскольку оно означает, что экстракт DP, модифицированный с помощью KCNO/PGO, принимая во внимание дополнительное снижение аллергенной активности, сохраняет потенциальную способность индуцировать IgG-ответ также и против нативных белков DP и поэтому потенциально способен индуцировать клинический эффект, так как продукция специфических IgG-антител является важным элементом в проявлении терапевтической эффективности ITS (Int Arch Allergy Immunol. 2003;132:13-24. Renaissance of the blocking antibody concept in type I allergy., Flicker S, Valenta R).
Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE)

Электрофорез осуществляли, используя акриламидные гели с градиентом 4-12%, расфасованные и используемые согласно указаниям производителя (минигели NuPAGE Novex, Invitrogen, Milan). Эта система для проведения электрофореза с партией с нейтральной величиной рН дает возможность лучшего разрешения полос в интересующем авторов диапазоне молекулярных масс.

Образцы экстракта DP, нативного или модифицированного с помощью KCNO или KCNO/PGO, оценивали с помощью вышеупомянутой техники при восстанавливающих условиях (наличие 5% 2-меркаптоэтанола), загружая в гель одинаковое количество образца (20 мкг). Разделение осуществляют, соединяя прибор с микропроцессорным источником питания для проведения электрофореза 400/1000 и применяя постоянный ток 180 мА в течение около одного часа. В заключение гель окрашивают коллоидным кумасси (набор для окрашивания Colloidal Blue, Novex, Invitrogen). Результаты, которые можно видеть на фиг.3, указывают на наличие большого числа полос как в образце нативного экстракта DP, так и в образце DP, модифицированного с помощью KCNO или KCNO/PGO. Профили SDS-PAGE представляются по существу аналогичными, хотя на самом деле это затруднительно оценить в настолько сложном образце, возможное увеличение размеров молекул индуцировалось реакцией с KCNO/PGO. Тем не менее, из последующих примеров, осуществленных на одиночных белках, очевидно, что модифицикация с помощью KCNO/PGO не приводит к существенному повышению размеров молекул изучаемых белков.
ПРИМЕР 2
Процедура химической модификации очищенного основного аллергена Der p1 с помощью KCNO, т.е. с помощью сочетания KCNO/PGO
а) Стадия очистки аллергена Der p1 из экстракта DP
280
Аллерген Der p1 очищали из экстракта DP посредством аффинной хроматографии, используя специфическое моноклональное антитело (изотипа IgG1, фирмы Lofarma laboratories), ковалентно связанное с подходящей матрицей, такой как CNBr-сефароза (фирмы GE Helthcare, Milan), согласно способу, предложенному производителем. Аллерген Der p1, удержанный в колонке, элюируют с нее, используя буфер, содержащий 5 мМ глицин, 50% этиленгликоль, рН 10,0. Определяли количество очищенного аллергена путем спектрофотометрического считывания при 280 нм, полагая его молярный коэффициент экстинкции (Е) равным 47330, отсюда величина оптической плотности при концентрации 1 мг/мл равна 1,89. В заключение, Der p1 высушивали замораживанием при наличии 1% сахарозы.
Высушенный замораживанием образец Der p1 затем помещают в объем 20 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 6,86, чтобы достичь концентрации белка 0,2 мг/мл. Для модификации с помощью KCNO к 2,5 мл раствора Der p1 добавляют 50,25 мг безводного тетрабората натрия и 101,4 мг цианата калия. Соли вводили в раствор путем медленного перемешивания и величину рН необязательно доводили до 9,3 с помощью 1 М NaOH. Полученный раствор оставляли при медленном перемешивании в течение 16 часов в термостатической бане при 40°С в запаянном сосуде. В течение первых часов наблюдали за величиной рН и необязательно доводили добавлением 1 М фосфорной кислоты. Полученный таким образом препарат повторно подвергали гель-фильтрации на колонке G-25 для удаления избыточного количества реагента и стерилизовали на мембранах Millipore с размером пор 0,22 микрон. Для последующих анализов использовали его минимальную часть. Полученный процент замещения аминогрупп экстракта, оцененный с помощью теста TNBS, должен составить 50%. Оставшееся количество образца, модифицированного с помощью KCNO, подвергали второй процедуре химической модификации с помощью фенилглиоксаля при экспериментальных условиях, описанных ниже.
Образец Der p1, модифицированный с помощью KCNO, при концентрации белка 0,14 мг/мл (Abs 280 нм) доводят до величины рН 8, добавляя 0,1 М раствор бикарбоната натрия. Затем туда добавляют PGO в 800-кратном молярном избытке по белку. Для расчета молярного избытка авторы полагают, что размер молекулы аллергена Der p1 равен 25 кДа согласно базе данных UniProtKB, из которой получают 15 аргининовых остатков. Для содействия растворению PGO последний предварительно растворили в этиловом спирте до концентрации 0,15 М. Смесь оставляют при слабом перемешивании в течение 4 часов при 25°С. Затем реакция продолжается диализом или гель-фильтрацией против 20 мМ PBS. Степень замещения аргининовых остатков должна быть равной 41%. После этого по возможности образец Der p1, модифицированный с помощью KCNO/PGO, сравнивали с образцом, модифицированным с помощью KCNO или PGO, или нативным образцом с точки зрения аллергенного потенциала посредством EAST-ингибирования, иммуногенной способности - посредством ELISA и размеров молекул - посредством SDS-PAGE.
Оценка аллергенности посредством EAST-ингибирования
С этой целью полистироловые шарики, предварительно обработанные глутаральдегидом, активировали аллергеном Der p1 в пропорции 1 мкг белка на шарик.
Наряду с этим получают пул сыворотки человека, полученной от пациентов, страдающих аллергией к экстракту DP, с записью в истории болезни об аллергии на клещей.
В лунки планшета для проведения ELISA добавляют 30 мкл серийных разведений в PBS-2% BSA (разбавитель) рассматриваемых образцов (нативный Der p1, Der p1, модифицированный с помощью KCNO, Der p1, модифицированный с помощью KCNO/PGO), предварительно доведя до одинаковой концентрации, и 20 мкл пулированной сыворотки; смесь оставляют при перемешивании в течение 2 часов при комнатной температуре. Наряду с этим получают образец положительного контроля, в котором в состав разбавителя входит ингибитор. В конце второго часа в каждую лунку добавляют шарик, активированный аллергеном Der p1, и 50 мкл PBS-2% BSA, и планшет оставляют при перемешивании в течение ночи при комнатной температуре. Шарики затем отмывают и в каждую лунку добавляют 100 мкл раствора античеловеческого IgE-антитела, конъюгированного с пероксидазой, и инкубируют при перемешивании в течение 2 часов. После трех отмывок, добавив 100 мкл реагента ТМВ (фирмы BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) и инкубируя в течение 15 минут при 25°С, наблюдают развитие колориметрической реакции. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл 1N HCl, затем 100 мкл смеси из каждой лунки переносят в новый планшет и оценивают интенсивность развившейся окраски с помощью спектрофотометрического считывания при 450 нм.
50
Детектированные оптические плотности преображают в проценты ингибирования относительно положительного контроля и строят график, в котором по оси Y отмечают процент ингибирования и по оси Х отмечают логарифм объема образца, использованного в тесте. Исходя из отмеченных точек, строят прямую линейной регрессии, по которой определяют величину IC, представляющую объем в микролитрах образца, который требуется для 50% ингибирования связывания IgE с шариком. Такая величина обратно пропорциональна аллергенному потенциалу рассматриваемого образца.
Результаты, представленные на фиг.1, указывают на то, что модификация с помощью KCNO снижает аллергенную активность аллергена Der p1 в 16 раз, тогда как модификация с помощью KCNO/PGO обладает синергетическим эффектом, снижая его аллергенную активность в 303 раза.
Оценка иммуногенности Der p1, модифицированного с помощью KCNO/PGO, посредством ELISA сыворотки предварительно иммунизированных мышей
а) Протокол иммунизации мышей
Группу мышей, составленную из четырех самок штамма Balb/c (фирмы Charles River), иммунизируют подкожно с помощью 200 мкл эмульсии, состоящей из 100 мкл полного адъюванта Фрейнда и 20 мкг аллергена Der p1, модифицированного с помощью KCNO/PGO, в 100 мкл физиологического раствора. Другие три ревакцинации осуществляют с двухнедельными интервалами, заменяя полный адъювант неполным. Через семь дней после последней иммунизации осуществляют забор крови и с помощью ELISA измеряют специфический антительный IgG-ответ на иммуноген, а также способность распознавать нативный белок.
b) Процедура тестирования
Тест осуществляют для проверки, сохраняет ли аллерген Der p1, модифицированный с помощью KCNO/PGO, иммуногенный потенциал, то есть способность индуцировать у мыши при введении согласно протоколу, указанному ниже, IgG-ответ, направленный также и против экстракта нативного, немодифицированного Der p1. С этой целью на лунках полистироловых планшетов для анализов ELISA адсорбируют равные количества (0,1 мкг) аллергена Der p1, нативного или модифицированного с помощью KCNO/PGO, в 50 мМ карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,6, инкубируя при 4°С в течение 16 часов. Лунки затем отмывают раствором для отмывки (60 мМ фосфатный буфер, рН 6,5, содержащий 0,05% Tween 20), и свободные сайты насыщают раствором разбавителя (25% лошадиная сыворотка, 1 мМ EDTA, 0,05% Tween 20, 0,01% тиомерсал в 150 мМ фосфатном буфере, рН 7,4). В каждую лунку добавляют равные аликвоты (100 мкл) 10-кратных серийных разведений пула сыворотки мышей в буфере разбавителя и инкубируют при 25°С в течение 2 часов. После трех отмывок добавляют кроличью сыворотку с антимышиными IgG, конъюгированными с пероксидазой, в разведении 1:2000 в буфере разбавителя, смесь инкубируют при 25°С в течение 1,5 часов. После трех отмывок, добавив 100 мкл реагента ТМВ (фирмы BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) и инкубируя в течение 15 минут при 25°С, наблюдают развитие колориметрической реакции. Реакцию останавливают добавлением 100 мкл 1 N HCl и оценивают спектрофотометрическим считыванием при 450 нм. На фиг.5 представлены результаты по специфической реактивности IgG пулированной сыворотки мышей, иммунизированных аллергеном Der p1, модифицированным с помощью KCNO/PGO, как к аллергену, использованному для иммунизации, так и немодифицированному (нативному) аналогу. Как можно видеть, IgG-антитела, индуцированные обработкой Der p1, модифицированным с помощью KCNO/PGO, способны распознавать также и нативные белки Der p1 (хотя и на более низком уровне, чем модифицированные белки), это указывает на то, что в аллергене Der p1, модифицированном с помощью KCNO/PGO, сохранены Т-клеточные эпитопы, которые аналогичны эпитопам, присутствующим в нативном аналоге. Поэтому Der p1, модифицированный с помощью KCNO/PGO, сохраняет способность стимулировать иммунную систему подходящим образом, чтобы продуцировать специфические IgG-антитела, направленные также и против нативного Der p1.
Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE)

Электрофорез осуществляли, используя акриламидные гели с градиентом 4-12%, расфасованные и используемые согласно указаниям производителя (минигели NuPAGE Novex, Invitrogen, Milan). Эта система для проведения электрофореза с партией с нейтральными величинами рН дает возможность лучшего разрешения полос в интересующем авторов диапазоне молекулярных масс.

Образцы аллергена Der p1, нативного или модифицированного с помощью KCNO или KCNO/PGO, оценивали с помощью вышеупомянутой техники при восстанавливающих условиях (наличие 5% 2-меркаптоэтанола), загружая на гель одинаковое количество образца (5 мкг). Разделение осуществляют, соединяя прибор с микропроцессорным источником питания для проведения электрофореза 400/1000 и применяя постоянный ток 180 мА в течение около одного часа. В заключение гель окрашивают коллоидным кумасси (набор для окрашивания Colloidal Blue, Novex, Invitrogen). Результаты, представленные на фиг.6, указывают на то, что не существует различия в профилях рассматриваемых образцов, таким образом, показывая, что размер молекул аллергена Der p1 не изменяется за счет реакций с KCNO/PGO и что он сохраняет свою мономерную форму также и при модификации.
ПРИМЕР 3
Процедура химической модификации основного аллергена овальбумина (OVA) с помощью KCNO, т.е. сочетания KCNO/PGO
Подходящее количество коммерческого аллергена OVA (фирмы Sigma Aldrich, Milan), очищенного из яичного белка, взвешивают и растворяют в одном объеме 20 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 6,86 до достижения концентрации белка 2 мг/мл согласно Лоури. Для модификации с помощью KCNO к 2,5 мл раствора OVA добавляют 50,25 мг тетрабората натрия десятиводного и 101 мг цианата калия. Соли вводили в раствор при медленном перемешивании и величину рН необязательно доводили до 9,3 с помощью 1 М NaOH. Полученный раствор оставляли при медленном перемешивании в течение 16 часов в термостатической бане при 40°С в запаянном сосуде. Во время первых часов наблюдали за величиной рН и необязательно доводили, добавляя 1 М фосфорную кислоту. Полученный таким образом препарат вновь подвергали гель-фильтрации на колонке G-25 для удаления избыточного количества реагента и стерилизовали на мембранах Millipore с размером пор 0,22 микрон. Для последующих анализов использовали его минимальную часть. Полученный процент замещения аминогрупп аллергена, оцененный тестом TNBS, должен быть равен 82%. Оставшийся образец, модифицированный с помощью KCNO, подвергали второй процедуре химической модификации с помощью фенилглиоксаля при экспериментальных условиях, описанных ниже.
Образец OVA, модифицированного с помощью KCNO, при концентрации белка 1,4 мг/мл (по Лоури), доводят до величины рН 8 добавлением 0,1 М бикарбоната натрия. После этого добавляют PGO в 800-кратном молярном избытке по белку. Для расчета молярного избытка авторы полагали, что размер молекулы аллергена OVA составляет 43 кДа согласно базе данных UniProtKB, из которой получают 15 аргининовых остатков. Для облегчения растворения PGO его заранее растворяли в этиловом спирте в концентрации 0,3 М. Смесь оставляют при слабом перемешивании в течение 4 часов при 25°С. Затем реакция продолжается диализом или гель-фильтрацией против 20 мМ PBS. Полученная степень замещения аргининовых остатков образца должна составить 35%. После чего образец OVA, модифицированного с помощью KCNO/PGO, сравнивали по возможности с образцом, модифицированным с помощью KCNO, или нативным, в отношении аллергенного потенциала - посредством EAST-ингибирования, иммуногенной способности - посредством ELISA и размеров молекул посредством SDS-PAGE.
Оценка аллергенности посредством EAST-ингибирования
С этой целью полистироловые шарики, заранее обработанные глутаральдегидом, активировали с помощью OVA в пропорции 1 мкг белка на шарик.
Наряду с этим получают пул сыворотки человека, полученной от пациентов с записью в истории болезни об аллергии на яйца, подтвержденной специфическим серологическим тестом.
В лунки планшета для проведения ELISA добавляют 30 мкл серийных разведений в PBS-2% BSA (разбавитель) рассматриваемых образцов (нативный OVA, OVA, модифицированный с помощью KCNO, OVA, модифицированный с помощью KCNO/PGO), предварительно доведя до одинаковой концентрации, и 20 мкл пулированной сыворотки; смесь оставляют при перемешивании в течение 2 часов при комнатной температуре. Наряду с этим получают образец положительного контроля, в котором в состав разбавителя входит ингибитор. В конце второго часа в каждую лунку добавляют шарик, активированный OVA, и 50 мкл PBS-2% BSA и планшет оставляют при перемешивании в течение ночи при комнатной температуре. Шарики затем отмывают и в каждую лунку добавляют 100 мкл раствора античеловеческого IgE-антитела, конъюгированного с пероксидазой, и инкубируют при перемешивании в течение 2 часов. После трех отмывок, добавив 100 мкл реагента ТМВ (фирмы BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) и инкубируя в течение 15 минут при 25°С, наблюдают развитие колориметрической реакции. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл 1N HCl, затем 100 мкл смеси из каждой лунки переносят в новый планшет и посредством спектрофотометрического считывания при 450 нм оценивают интенсивность развившейся окраски.
50
Определенные оптические плотности преображают в проценты ингибирования относительно положительного контроля и строят график, в котором на оси Y отмечают процент ингибирования и на оси Х отмечают логарифм объема образца, использованного в тесте. Исходя из отмеченных точек, строят прямую линейной регрессии, по которой измеряют величину IC, представляющую объем в микролитрах образца, который необходим для 50% ингибирования связывания IgE с шариком. Такая величина обратно пропорциональна аллергенному потенциалу рассматриваемого образца.
Результаты, представленные на фиг.7, показывают, что модификация с помощью KCNO снижает аллергенную активность OVA в 178 раз, тогда как модификация с помощью KCNO/PGO индуцирует дополнительное снижение аллергенной активности OVA более точно в 1687 раз, показывая также в этом случае, что последовательная комбинация KCNO/PGO обладает синергетическим эффектом.
Оценка иммуногенности
OVA, модифицированного с помощью KCNO/PGO, посредством ELISA сыворотки предварительно иммунизированных мышей
а) Протокол иммунизации мышей
Группу мышей, составленную из четырех самок штамма Balb/c (фирмы Charles River), иммунизируют подкожно с помощью 200 мкл эмульсии, состоящей из 100 мкл полного адъюванта Фрейнда и 20 мкг OVA, модифицированного с помощью KCNO/PGO, в 100 мкл физиологического раствора. Другие три ревакцинации осуществляют с двухнедельными интервалами, заменяя полный адъювант неполным. Через семь дней после последней иммунизации осуществляют забор крови из хвоста мышей и измеряют с помощью ELISA антительный ответ на иммуноген, а также способность распознавать нативный белок.
b) Процедура тестирования
Тест осуществляют для проверки, сохраняет ли аллерген OVA, модифицированный с помощью KCNO/PGO, иммуногенный потенциал, то есть способность индуцировать у мыши при введении согласно протоколу, указанному ниже, IgG-ответ, направленный также и к нативному, немодифицированному OVA. С этой целью на лунках полистироловых планшетов для анализов ELISA адсорбируют равные количества (0,1 мкг) аллергена OVA, нативного или модифицированного с помощью KCNO/PGO, в 50 мМ карбонатном/бикарбонатном буфере, рН 9,6, инкубируя при 4°С в течение 16 часов. Лунки затем отмывают раствором для отмывки (60 мМ фосфатный буфер, рН 6,5, содержащий 0,05% Tween 20) и свободные сайты насыщают раствором разбавителя (25% лошадиная сыворотка, 1 мМ EDTA, 0,05% Tween 20, 0,01% тиомерсал в 150 мМ фосфатном буфере, рН 7,4). В каждую лунку добавляют равные аликвоты (100 мкл) 10-кратных серийных разведений пула сыворотки мышей в буфере разбавителя и инкубируют при 25°С в течение 2 часов. После трех отмывок добавляют кроличью сыворотку с антимышиными IgG, конъюгированными с пероксидазой, в разведении 1:2000 в буфере разбавителя, смесь инкубируют при 25°С в течение 1,5 часов. После трех отмывок, добавив 100 мкл реагента ТМВ (фирмы BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) и инкубируя в течение 15 минут при 25°С, наблюдают развитие колориметрической реакции. Реакцию останавливают добавлением 100 мкл 1 N HCl и оценивают путем спектрофотометрического считывания при 450 нм. Результаты по специфической реактивности IgG пулированной сыворотки мышей, иммунизированных OVA, модифицированным с помощью KCNO/PGO, как на аллерген, использованный для иммунизации, так и на немодифицированный (нативный) аналог представлены на фиг.8. Как необходимо отметить, IgG-антитела, индуцированные обработкой OVA, модифицированным с помощью KCNO/PGO, способны распознавать также и нативные белки OVA (хотя и на более низком уровне, чем модифицированные белки), это указывает на то, что в OVA, модифицированном с помощью KCNO/PGO, сохраняются Т-клеточные эпитопы, которые аналогичны эпитопам, присутствующим в нативном аналоге. Поэтому OVA, модифицированный с помощью KCNO/PGO, сохраняет способность стимуляции иммунной системы подходящим образом, чтобы продуцировать специфические IgG-антитела, направленные также и против нативного OVA.
Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE)

Электрофорез осуществляли, используя акриламидные гели с градиентом 4-12%, расфасованные и используемые согласно указаниям производителя (минигели NuPAGE Novex, Invitrogen, Milan). Эта система для проведения электрофореза с партией с нейтральными величинами рН позволяет лучшее разрешение полос в интересующем авторов диапазоне молекулярных масс.

Образцы нативного OVA или модифицированного с помощью KCNO или KCNO/PGO оценивали с помощью вышеупомянутой техники при восстанавливающих условиях (наличие 5% 2-меркаптоэтанола), загружая на гель одинаковое количество образца (5 мкг). Разделение осуществляют, соединяя прибор с микропроцессорным источником питания для проведения электрофореза 400/1000 и применяя постоянный ток 180 мА в течение около одного часа. В заключение гель окрашивают коллоидным кумасси (набор для окрашивания Colloidal Blue, Novex, Invitrogen). Результаты на фиг.9 указывают на то, что реакция с KCNO/PGO не приводит к существенным изменениям размера молекулы аллергена OVA, который сохраняет свою мономерность и при модификации.
ПРИМЕР 4
Процедура химической модификации основного аллергена персика Pru p3, полученного в рекомбинантной форме, с помощью KCNO или сочетания KCNO/PGO
Стадия получения аллергена rPru p3 в E. coli
кДНК Pru p3 получают амплификацией нуклеотидной последовательности AY792996, содержащейся в клоне PP LEa0029C22F (GenBank, номер доступа BU047210), предлагаемом Институтом геномики Университета Климсона (США). Олигонуклеотиды, использованные в реакции амплификации ПЦР (полимеразная цепная реакция), представляют собой Pru p 3-6Н ЕСО (5' ccg gaa ttc cat atg cat cac cat cac cat cac ata aca tgt ggc caa gtg) и Pru p 3 Bam (5' cgc gga tcc tca ctt cac ggt ggc gc), соответствующие 5'- и 3'-концевым последовательностям транскрипта, соответствующего зрелому белку. Подчеркнутые последовательности представляют собой сайты расщепления рестриктаз EcoRI, NdeI и BamHI, необходимые для клонирования в амплифицирующие и экспрессирующие векторы, последовательность, кодирующая шесть гистидиновых остатков, выделена курсивом. Полученную кДНК после очистки встраивали в экспрессирующий вектор, амплифицировали и проверяли точность последовательности посредством автоматического секвенирования (фирмы M-Medical/MWG-Biotech).
Escherichia coli
2
4
Экспрессия Pru p3 происходит в клетках  BL21 Origami (DE3) (Stratagene), подращенных при 37°С при наличии антибиотиков (Amp в концентрации 100 мкг/мл, Kan в концентрации 15 мкг/мл и Tet в концентрации 12,5 мкг/мл) до плотности, соответствующей OD600=0,6, и индуцируется добавлением в культуральную среду IPTG в концентрации 1 мМ. После подращивания в течение 16 часов при 25°С клетки собирают центрифугированием, ресуспендируют в 50 мМ NaHPO, pH 8 и лизируют обработкой ультразвуком. Растворимые рекомбинантные белки, отделенные центрифугированием от нерастворимого дебриса, очищают аффинной хроматографией на колонке с агарозой NiNTA (фирмы Qiagen, Italy), которая связывает гистидиновые остатки в последовательности, следуя инструкциям производителя.
280
2
Определяют количество очищенного таким образом белка с чистотой выше 98%, как показано профилем SDS-PAGE, путем спектрофотометрического считывания при 280 нм, приняв его молярный коэффициент экстинкции (Е) равным 3480, отсюда оптическая плотность при концентрации 1 мг/мл равна 0,345. В заключение, раствор Pru p3 диализуют против НО и затем высушивают замораживанием при наличии 1% сахарозы.
Высушенный замораживанием образец rPru p3 затем помещают в объем 20 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 6,86 до достижения концентрации белка 0,7 мг/мл. Для модификации с помощью KCNO к 2,5 мл раствора rPru p3 добавляют 50,25 мг тетрабората натрия десятиводного и 101,4 мг цианата калия. Соли вводили в раствор путем медленного перемешивания и величину рН необязательно доводили до 9,3 с помощью 1 М NaOH. Полученный раствор оставляли при медленном перемешивании в течение 16 часов в термостатической бане при 40°С в запаянном сосуде. В течение первых часов наблюдали за величиной рН и необязательно доводили добавлением 1 М фосфорной кислоты. Полученный таким образом препарат повторно подвергали гель-фильтрации на колонке G-25 для удаления избыточного количества реагента и стерилизовали на мембранах Millipore с размером пор 0,22 микрон. Для последующих анализов использовали его минимальную часть. Полученный процент замещения аминогрупп Pru p3, оцененный с помощью теста TNBS, должен составить 74%. Оставшееся количество образца, модифицированного с помощью KCNO, подвергали второй процедуре химической модификации с помощью фенилглиоксаля при экспериментальных условиях, описанных ниже.
Образец Pru p3, модифицированного с помощью KCNO, при концентрации белка 0,5 мг/мл доводят до величины рН 8, добавляя 0,1 М бикарбонат натрия. Затем туда добавляют PGO в 800-кратном молярном избытке по белку. Для расчета молярного избытка авторы полагают, что размер молекулы аллергена Pru p3 равен 10 кДа согласно базе данных UniProtKB, из которой получают 4 аргининовых остатка. Для содействия растворению PGO его предварительно растворяли в этиловом спирте при концентрации 0,3 М. Смесь оставляют при слабом перемешивании в течение 4 часов при 25°С. Затем реакция продолжается диализом или гель-фильтрацией против 20 мМ PBS. Полученная степень замещения аргининовых остатков должна составить 50%. После этого образец аллергена Pru p3, модифицированного с помощью KCNO/PGO, сравнивали с образцом, модифицированным с помощью KCNO, или нативным с точки зрения аллергенного потенциала посредством EAST-ингибирования, иммуногенной способности - посредством ELISA и размеров молекул - посредством SDS-PAGE.
Оценка аллергенности посредством EAST-ингибирования
С этой целью полистироловые шарики, предварительно обработанные глутаральдегидом, активировали аллергеном Pru p3 в пропорции 1 мкг белка на шарик.
Наряду с этим получают пул сыворотки человека, полученной от пациентов с записью в истории болезни об аллергии на персики, подтвержденной специфическим серологическим тестом.
В лунки планшета для проведения ELISA добавляют 30 мкл серийных разведений в PBS-2% BSA (разбавитель) рассматриваемых образцов (нативный Pru p3, Pru p3, модифицированный с помощью KCNO, Pru p3, модифицированный с помощью KCNO/PGO), предварительно доведя до одинаковой концентрации, и 20 мкл пулированной сыворотки; смесь оставляют при перемешивании в течение 2 часов при комнатной температуре. Одновременно получают образец положительного контроля, в котором в состав разбавителя входит ингибитор. В конце второго часа в каждую лунку добавляют шарик, активированный аллергеном Pru p3, и 50 мкл PBS-2% BSA, и планшет оставляют при перемешивании в течение ночи при комнатной температуре. Шарики затем отмывают и в каждую лунку добавляют 100 мкл раствора античеловеческого IgE-антитела, конъюгированного с пероксидазой, и инкубируют при перемешивании в течение 2 часов. После трех отмывок, добавив 100 мкл реагента ТМВ (фирмы BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) и инкубируя в течение 15 минут при 25°С, наблюдают развитие колориметрической реакции. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл 1N HCl, затем 100 мкл смеси из каждой лунки переносят в новый планшет и оценивают интенсивность развившейся окраски посредством спектрофотометрического считывания при 450 нм.
50
Детектированные оптические плотности преображают в проценты ингибирования относительно положительного контроля и строят график, в котором на оси Y отмечают процент ингибирования и на оси Х отмечают логарифм объема образца, использованного в тесте. На основе отмеченных точек строят прямую линейной регрессии, по которой определяют величину IC, представляющую объем в микролитрах образца, который требуется для 50% ингибирования связывания IgE с шариком. Такая величина обратно пропорциональна аллергенному потенциалу рассматриваемого образца.
Результаты, представленные на фиг.10, указывают на то, что модификация с помощью KCNO снижает аллергенную активность аллергена rPru p3 в 64 раза, тогда как модификация с помощью KCNO/PGO дополнительно снижает вышеуказанную активность, которая должна быть в 1422 раза ниже, чем у нативного аналога.
Оценка иммуногенности аллергена
Pru p3, модифицированного с помощью KCNO/PGO, посредством ELISA сыворотки предварительно иммунизированных мышей
а) Протокол иммунизации мышей
Группу мышей, составленную из четырех самок штамма Balb/c (фирмы Charles River), иммунизируют подкожно с помощью 200 мкл эмульсии, состоящей из 100 мкл полного адъюванта Фрейнда и 20 мкг аллергена Pru p3, модифицированного с помощью KCNO/PGO, в 100 мкл физиологического раствора. Другие три ревакцинации осуществляют с двухнедельными интервалами, заменяя полный адъювант неполным. Через семь дней после последней иммунизации осуществляют забор крови из хвоста мышей и с помощью ELISA измеряют антительный ответ на иммуноген, а также способность распознавать нативный белок.
b) Процедура тестирования
Тест осуществляют для проверки, сохраняет ли аллерген Pru p3, модифицированный с помощью KCNO/PGO, иммуногенный потенциал, то есть способность индуцировать у мыши при введении согласно протоколу, указанному ниже, IgG-ответ, направленный также и к нативному, немодифицированному Pru p3. С этой целью на лунках полистироловых планшетов для проведения анализов ELISA адсорбируют равные количества (0,1 мкг) аллергена Pru p3, нативного или модифицированного с помощью KCNO/PGO, в 50 мМ карбонатном/бикарбонатном буфере, рН 9,6, инкубируя при 4°С в течение 16 часов. Лунки затем отмывают раствором для отмывки (60 мМ фосфатный буфер, рН 6,5, содержащий 0,05% Tween 20) и свободные сайты насыщают раствором разбавителя (25% лошадиная сыворотка, 1 мМ EDTA, 0,05% Tween 20, 0,01% тиомерсал в 150 мМ фосфатном буфере, рН 7,4). В каждую лунку добавляют равные аликвоты (100 мкл) 10-кратных серийных разведений пула сыворотки мышей в буфере разбавителя и инкубируют при 25°С в течение 2 часов. После трех отмывок добавляют кроличью сыворотку с антимышиными IgG, конъюгированными с пероксидазой, в разведении 1:2000 в буфере разбавителя, смесь инкубируют при 25°С в течение 1,5 часов. После трех отмывок, добавив 100 мкл реагента ТМВ (фирмы BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) и инкубируя в течение 15 минут при 25°С, наблюдают развитие колориметрической реакции. Реакцию останавливают добавлением 100 мкл 1 N HCl и оценивают посредством спектрофотометрического считывания при 450 нм. Результаты по специфической реактивности IgG пулированной сыворотки мышей, иммунизированных Pru p3, модифицированным с помощью KCNO/PGO, как в отношении аллергена Pru p3, использованного для иммунизации, так и немодифицированного (нативного) аналога представлены на фиг.11. Как можно видеть на фиг.11, IgG-антитела, индуцированные обработкой Pru p3, модифицированным с помощью KCNO/PGO, способны распознавать также и нативные белки Pru p3, это указывает на то, что в аллергене Pru p3, модифицированном с помощью KCNO/PGO, сохраняются Т-клеточные эпитопы, которые аналогичны эпитопам, присутствующим в нативном аналоге. Поэтому Pru p3, модифицированный с помощью KCNO/PGO, сохраняет способность стимулировать иммунную систему подходящим образом, чтобы продуцировать специфические IgG-антитела, направленные также и против нативного Pru p3.
Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE)

Электрофорез осуществляли, используя акриламидные гели с градиентом 4-12%, расфасованные и используемые согласно указаниям производителя (минигели NuPAGE Novex, Invitrogen, Milan). Эта система для проведения электрофореза с партией с нейтральными величинами рН дает возможность лучшего разрешения полос в интересующем авторов диапазоне молекулярных масс.

Образцы аллергена Pru p3, нативного или модифицированного с помощью KCNO или KCNO/PGO, оценивали с помощью вышеупомянутой техники при восстанавливающих условиях (наличие 5% 2-меркаптоэтанола), загружая на гель одинаковое количество образца (5 мкг). Разделение осуществляют, соединяя прибор с микропроцессорным источником питания для проведения электрофореза 400/1000 и применяя постоянный ток 180 мА в течение около одного часа. В заключение, гель окрашивают коллоидным кумасси (набор для окрашивания Colloidal Blue, Novex, Invitrogen). Результаты, представленные на фиг.12, указывают на то, что размер молекулы аллергена rPru p3 не изменяется после модификации с помощью KCNO/PGO, таким образом, сохраняя свою мономерную форму.
Аллергенный экстракт или одиночные очищенные белки, модифицированные, как описано выше, могут быть использованы в лечении пациентов, страдающих аллергией, и введены парентеральным путем или назальным, или сублингвальным, или через слизистую ротовой полости, или пероральным, или бронхиальным с помощью подходящего устройства. Вышеуказанный продукт может быть получен также в высушенном замораживанием виде и затем восстановлен и введен, как указано для водной формы, или встроен в системы доставки (например, липосомы) или в виде порошка, который вводят в инертный эксципиент, например, лактозу, для введения назальным или бронхиальным путем с помощью специального устройства или смешан в таблетки необязательно с быстрым растворением для сублингвального введения/введения через слизистую ротовой полости или капсулы, которые необязательно создают устойчивыми к содержимому желудка, путем подходящей процедуры для перорального введения, или в виде биопленок или мукоадгезивных порошков для увеличения времени контакта со слизистой оболочкой щек и облегчения взаимодействия с локальными дендритными клетками.
Вышеупомянутый продукт также может быть получен в виде жировой суспензии, сиропа, эликсира с необязательным добавлением эксципиентов или веществ, делающих его приятным на вкус для сублингвального введения, через слизистую ротовой полости или перорального введения.
Вышеупомянутый продукт также может быть ассоциирован или конъюгирован с веществами, которые, как известно, проявляют адъювантную активность типа Th1 или Treg, такими как, например, CpG, производные бактерий, микобактерии, микоплазма, нейссерия, вирус или простейшие, включая неметилированные CpG, липопротеины или триацилированные липопептиды, липополисахариды (LPS) и производные типа липида А, синтетические вещества, такие как имиквимод, резиквимод, поли (I:C).
th
Композиция по изобретению, как правило, должна содержать большое число эксципиентов и/или носителей, адаптированных к типу выбранного введения, согласно тому, что известно специалистам в данной области, и тому, что сообщается, например, в руководстве Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub. Co., N.Y., USA, 17 edition, 1985.
Во всех этих фармацевтических препаративных формах препарат по изобретению должен присутствовать в количествах в диапазоне между 0,5 мкг (минимальная доза) и 200 мкг (поддерживающая доза) общего белка в соответствии с путем введения, который используется в осуществлении специфической иммунотерапии.