ИДЕНТИФИКАЦИЯ ОПУХОЛЕАССОЦИИРОВАННЫХ АНТИГЕНОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ТЕРАПИИ
IDENTIFICATION OF TUMOUR-ASSOCIATED ANTIGENS FOR DIAGNOSTICS AND THERAPY

Уровень техники
+
+
Несмотря на междисциплинарные подходы и всестороннее применение классических терапевтических процедур, раковые заболевания все еще остаются в числе главных причин смертности. Более современные терапевтические концепции направлены на включение иммунной системы пациента в общую терапевтическую концепцию при помощи рекомбинантных противоопухолевых вакцин и других специфических мероприятий типа терапии с помощью антител. Предпосылкой успеха такой стратегии является распознавание опухолеспецифичных или опухолеассоциированных антигенов либо эпитопов иммунной системой пациента, эффекторные функции которой нужно при этом усилить. Раковые клетки в биологическом отношении существенно отличаются от исходных нераковых клеток. Эти отличия обусловлены генетическими изменениями, возникающими при развитии опухоли, и приводят, среди прочего, к образованию измененных в качественном или количественном отношении молекулярных структур у раковых клеток. Ассоциированные с раком структуры такого типа, которые распознаются иммунной системой конкретного несущего опухоль организма, именуются опухолеассоциированными антигенами. Специфическое распознавание опухолеассоциированных антигенов включает клеточные и гуморальные механизмы, составляющие два взаимозависимые звена: Т-лимфоциты CD4 и CD8 распознают прошедшие процессинг антигены, представленные на молекулах МНС (главного комплекса гистосовместимости) II и I класса, соответственно, тогда как B-лимфоциты вырабатывают молекулы циркулирующих антител, которые непосредственно связываются с антигенами, не подвергавшимися процессингу. Потенциальное клинико-терапевтическое значение опухолеассоциированных антигенов вытекает из того, что распознавание антигенов на клетках неоплазмы иммунной системой ведет к запуску цитотоксических эффекторных механизмов и, в присутствии хелперных T-клеток, может вызвать элиминацию раковых клеток (Pardoll, Nat. Med. 4: 525-31, 1998). В соответствии с этим главной задачей раковой иммунологии является молекулярное определение этих структур. Молекулярная природа этих антигенов оставалась загадочной в течение длительного времени. Лишь после разработки соответствующих методов клонирования стало возможным систематическое скринирование экспрессионных библиотек кДНК опухолей на предмет ассоциированных с ними антигенов путем анализа структуры мишеней цитотоксических T-лимфоцитов (van der Bruggen et al., Science 254: 1643-7, 1991) или при помощи циркулирующих аутоантител (Sahin et al., Curr. Opin. Immunol. 9: 709-16, 1997) в качестве зондов. С этой целью создавали экспрессионные библиотеки кДНК из свежей опухолевой ткани и подвергали их экспрессии рекомбинантными методами в виде белков в соответствующих системах. Выделенные из пациентов иммуноэффекторы, а именно клоны CTL с признаками опухолеспецифического лизиса либо циркулирующие аутоантитела, использовались для клонирования соответствующих антигенов.
За последние годы таким образом было идентифицировано множество антигенов при различных неоплазиях.
Однако зонды, используемые для идентификации антигенов классическими методами, обычно являются иммуноэффекторами (циркулирующими аутоантителами или клонами CTL) из пациентов на поздней стадии рака. Целый ряд данных показывает, что рак может привести к возникновению толерантности и анергизации T-клеток, а при развитии заболевания из репертуара иммуноэффекторов исчезают именно те специфичности, которые могли бы вызвать эффективное иммуноузнавание. Текущие исследования на пациентах пока не дали надежных данных о реальном действии ранее обнаруженных и используемых опухолеассоциированных антигенов. Следовательно, нельзя исключить того, что белки, вызывающие спонтанные иммунные ответы, не являются искомыми структурами.
Раскрытие изобретения
Целью настоящего изобретения является получение искомых структур-мишеней для диагностики и терапии раковых заболеваний.
Эта цель достигается объектами формулы изобретения.
В соответствии с изобретением идентифицированы гены, которые избирательно или аномально экспрессируются в раковых клетках и при этом образуют опухолеассоциированные антигены. Эти гены и/или их генетические продукты и/или производные и/или фрагменты применимы в качестве структур-мишеней для терапевтических и диагностических методов.
Опухолеассоциированные антигены, идентифицированные в соответствии с изобретением, имеют аминокислотную последовательность, которая кодируется нуклеиновой кислотой, выбранной из группы, состоящей из: (a) нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 и 64-67 из перечня последовательностей, ее часть или производную последовательность, (b) нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с нуклеиновой кислотой по п.а в строгих условиях, (c) нуклеиновой кислоты, вырожденной по отношению к нуклеиновой кислоте по п.a или b, и (d) нуклеиновой кислоты, комплементарной нуклеиновой кислоте по п.a, b или c. В предпочтительном воплощении опухолеассоциированный антиген, идентифицированный в соответствии с изобретением, имеет аминокислотную последовательность, которая кодируется нуклеиновой кислотой, выбранной из группы, состоящей из: (a) нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 и 64-67 из перечня последовательностей. В еще более предпочтительном воплощении опухолеассоциированный антиген, идентифицированный в соответствии с изобретением, включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 29, 31, 36, 40, 42, 46, 50-60, 63, 68 и 69 из перечня последовательностей, ее часть или производную последовательность.
Настоящее изобретение в общем касается применения идентифицированных по изобретению опухолеассоциированных антигенов либо их частей или производных, нуклеиновых кислот, кодирующих идентифицированные по изобретению опухолеассоциированные антигены либо их части или производные, нуклеиновых кислот, направленных против данных кодирующих нуклеиновых кислот, антител или T-клеток, направленных против идентифицированных по изобретению опухолеассоциированных антигенов либо их частей или производных, и/или клеток хозяина, экспрессирующих идентифицированные по изобретению опухолеассоциированные антигены либо их части или производные для терапии, диагностики и/или мониторинга неопластических заболеваний. Это может включать и применение комбинации из двух или нескольких таких антигенов, нуклеиновых кислот, антител, T-клеток и/или клеток хозяина, а в одном воплощении также и в сочетании с другими опухолеассоциированными антигенами, чем те, которые идентифицированы по изобретению, кодирующих их нуклеиновых кислот или нуклеиновых кислот, направленных против данных кодирующих нуклеиновых кислот, антител или T-клеток, направленных против данных опухолеассоциированных антигенов, и/или клеток хозяина, экспрессирующих данные опухолеассоциированные антигены.
В тех воплощениях изобретения, которые касаются применения антител, направленных против идентифицированных по изобретению опухолеассоциированных антигенов либо их частей или производных, также могут применяться и T-клеточные рецепторы, направленные против идентифицированных по изобретению опухолеассоциированных антигенов либо их частей или производных, необязательно в комплексе с молекулами МНС.
Особенно пригодными для терапии, профилактики, диагностики и/или мониторинга являются те части идентифицированных по изобретению опухолеассоциированных антигенов, которые не относятся к трансмембранной части, в особенности внеклеточные части опухолеассоциированных антигенов или входящие в их состав. Таким образом, в соответствии с изобретением, для терапии, профилактики, диагностики и/или мониторинга предпочтительны те части идентифицированных по изобретению опухолеассоциированных антигенов, которые не относятся к трансмембранной части, в особенности внеклеточные части опухолеассоциированных антигенов или входящие в их состав, либо соответствующие части нуклеиновых кислот, кодирующих идентифицированные по изобретению опухолеассоциированные антигены. Аналогичным образом предпочтительно применение таких антител, которые направлены против тех частей идентифицированных по изобретению опухолеассоциированных антигенов, которые не относятся к трансмембранной части, в особенности внеклеточных частей опухолеассоциированных антигенов или входящих в их состав.
Для терапии, профилактики и/или диагностики предпочтительными являются такие заболевания, при которых происходит избирательная экспрессия или аномальная экспрессия опухолеассоциированных антигенов, идентифицированных по изобретению.
Кроме того, изобретение касается нуклеиновых кислот и белков или пептидов, образующихся при альтернативном сплайсинге (сплайс-варианты) известных генов или при альтернативной трансляции через альтернативные рамки считывания. В этом аспекте изобретение касается нуклеиновых кислот, содержащих нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 28 и 49 из перечня последовательностей. Более того, в этом аспекте изобретение касается и белков или пептидов, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29 и 50 из перечня последовательностей.
Альтернативный сплайсинг гена последовательности транскрипта (сплайс-варианта). Трансляция сплайс-варианта на участке альтернативной последовательности приводит к альтернативному белку, который может заметно отличаться по структуре и функции от исходного белка. Опухолеассоциированные сплайс-варианты могут образовывать опухолеассоциированные транскрипты и опухолеассоциированные белки/антигены. Их можно использовать в качестве молекулярных маркеров как для выявления раковых клеток, так и для терапевтического воздействия на опухоли. Детектирование раковых клеток в образце из пациента может проводиться в соответствии с изобретением, например, методом ПЦР-амплификации после экстрагирования нуклеиновых кислот, с помощью олигонуклеотидов, специфичных к сплайс-вариантам.
В соответствии с изобретением, для детектирования подходят все системы детекции, зависящие от последовательности. К ним относятся, помимо ПЦР, к примеру, системы генных чипов/микроматриц, нозерн-гибридизация, методы на основе защиты от РНКаз (RDA) и другие. Общим для всех систем детекции является то, что они основываются на специфической гибридизации по меньшей мере с одной нуклеотидной последовательностью, специфичной для сплайс-варианта. Однако раковые клетки можно детектировать по изобретению и при помощи антител, распознающих специфический эпитоп, кодируемый сплайс-вариантом. Такие антитела могут быть получены при использовании для иммунизации таких пептидов, которые специфичны для данного сплайс-варианта. Особенно подходят для иммунизации такие аминокислотные последовательности, которые заметно отличаются от того варианта генетического продукта, который преимущественно вырабатывается в здоровых клетках. При этом детектирование раковых клеток с помощью антител может проводиться на образцах, взятых у пациента, или в виде интраскопии с помощью введенных внутривенно антител.
Наряду с применимостью для диагностики, сплайс-варианты с новыми или измененными эпитопами являются привлекательной мишенью для иммунотерапии, так как такие эпитопы можно использовать для наводки антител или Т-лимфоцитов, как описано в настоящем изобретении. При пассивной иммунотерапии антитела или T-лимфоциты, распознающие специфичные для сплайс-варианта эпитопы, передают адоптивный иммунитет. Как и в случае других антигенов, антитела могут вырабатываться и по стандартной методике с использованием полипептидов, содержащих такие эпитопы. В качестве альтернативы для иммунизации можно использовать нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды, содержащие данные эпитопы. Известны и подробно описаны различные методы получения эпитопоспецифичных T-лимфоцитов in vitro или in vivo (к примеру, Kessler JH et al., 2001; Sahin et al., 1997), которые также основываются на использовании пептидов, содержащих специфичные для сплайс-варианта эпитопы, или нуклеиновых кислот, кодирующих данные пептиды. Пептиды, содержащие специфичные для сплайс-варианта эпитопы, или нуклеиновые кислоты, кодирующие такие пептиды, могут применяться и в качестве фармацевтически активных веществ при активной иммунотерапии (напр., вакцинации, вакцинотерапии).
В одном аспекте изобретение касается фармацевтической композиции, включающей агента, распознающего идентифицированный по изобретению опухолеассоциированный антиген либо нуклеиновую кислоту, кодирующую опухолеассоциированный антиген, причем он предпочтительно специфичен для клеток, в которых происходит экспрессия или аномальная экспрессия опухолеассоциированных антигенов, идентифицированных по изобретению. В другом аспекте изобретение касается фармацевтической композиции, включающей агента, который: (I) ингибирует экспрессию или активность опухолеассоциированного антигена, идентифицированного по изобретению, и/или (II) обладает ингибирующей или разрушающей опухоли активностью и при этом избирателен в отношении клеток, экспрессирующих или аномально экспрессирующих опухолеассоциированный антиген, идентифицированный по изобретению, и/или (III) при введении он избирательно повышает количество комплексов между молекулой МНС и опухолеассоциированным антигеном, идентифицированным по изобретению, или его частью, к примеру, пептидным эпитопом. В определенных воплощениях данный агент может вызвать гибель клеток, ухудшение роста клеток, повреждение клеточной мембраны или секрецию цитокинов, а предпочтительно обладает ингибирующей опухоли активностью. В одном воплощении агентом является антисмысловая нуклеиновая кислота, которая избирательно гибридизуется с нуклеиновой кислотой, кодирующей опухолеассоциированный антиген, идентифицированный по изобретению. В другом воплощении агентом является короткая интерферирующая РНК (SiRNA), предпочтительно включающая смысловую нить РНК и антисмысловую нить РНК, причем смысловая и антисмысловая нити РНК образуют двойную спираль РНК, и при этом смысловая нить РНК включает нуклеотидную последовательность, практически идентичную заданной последовательности из 19-25 следующих друг за другом нуклеотидов в нуклеиновой кислоте, кодирующей опухолеассоциированный антиген, предпочтительно мРНК, кодирующей опухолеассоциированный антиген. В следующем воплощении агентом является антитело, которое избирательно связывается с опухолеассоциированным антигеном, в особенности активируемое комплементом или конъюгированное с токсином антитело, которое избирательно связывается с опухолеассоциированным антигеном. В предпочтительном воплощении антитело, которое избирательно связывается с опухолеассоциированным антигеном, конъюгировано с терапевтически полезным веществом и/или привлекает естественные или искусственные эффекторные механизмы к клеткам, экспрессирующим или аномально экспрессирующим данный опухолеассоциированный антиген. В следующем воплощении агентом являются цитотоксические T-лимфоциты, распознающие опухолеассоциированный антиген или его часть, связанные с молекулой МНС на клетке, и вызывающие лизис клеток, помеченных таким образом. В следующем воплощении агентом являются хелперные T-лимфоциты, которые усиливают эффекторные функции других клеток, специфически распознающих данный опухолеассоциированный антиген или его часть.
В следующем воплощении агент включает двух или несколько агентов, каждый из которых распознает другой опухолеассоциированный антиген и/или ингибирует экспрессию или активность другого опухолеассоциированного антигена и/или обладает ингибирующей опухоли или разрушающей опухоли активностью и при этом избирателен в отношении клеток, экспрессирующих или аномально экспрессирующих другой опухолеассоциированный антиген, и/или при введении он избирательно повышает количество комплексов между молекулой МНС и другим опухолеассоциированным антигеном или его частью, причем по меньшей мере один из данных различных опухолеассоциированных антигенов является антигеном, идентифицированным по изобретению. Предпочтительно опухолеассоциированный антиген, селективный в отношении опухолей, служит меткой для привлечения эффекторных механизмов в какое-то определенное место. Изобретение включает воплощения, в которых сам агент не обладает способностью к ингибированию активности опухолеассоциированного антигена либо не обладает ингибирующей или разрушающей опухоли активностью, но опосредует такое действие, в частности, путем привлечения эффекторных механизмов, в особенности механизмов, способных вызвать повреждение клеток, в определенное место, в частности, к опухоли или к раковым клеткам.
Активность опухолеассоциированного антигена, идентифицированного по изобретению, может представлять собой любую активность белка или пептида. В одном воплощении такая активность представляет собой энзиматическую активность.
В соответствии с изобретением, выражение "ингибировать экспрессию или активность" означает полное или практически полное ингибирование экспрессии или активности либо снижение экспрессии или активности.
Агент, при введении которого избирательно повышается количество комплексов между молекулой МНС и опухолеассоциированным антигеном, идентифицированным по изобретению, или его частью, включает один или несколько компонентов, выбранных из группы, состоящей из: (i) опухолеассоциированного антигена или его части, (ii) нуклеиновой кислоты, кодирующей данный опухолеассоциированный антиген или его часть, (iii) клеток хозяина, экспрессирующих данный опухолеассоциированный антиген или его часть, и (iv) выделенных комплексов между пептидным эпитопом данного опухолеассоциированного антигена и молекулой МНС.
Изобретение также касается фармацевтической композиции, включающей один или несколько компонентов, выбранных из группы, состоящей из: (i) опухолеассоциированного антигена, идентифицированного по изобретению, или его части, (ii) нуклеиновой кислоты, кодирующей идентифицированный по изобретению опухолеассоциированный антиген или его часть, (iii) антител, связывающихся с идентифицированным по изобретению опухолеассоциированным антигеном или его частью, (iv) антисмысловой нуклеиновой кислоты, специфически гибрйдизующейся с нуклеиновой кислотой, кодирующей идентифицированный по изобретению опухолеассоциированный антиген, (v) SiRNA, направленной против нуклеиновой кислоты, кодирующей идентифицированный по изобретению опухолеассоциированный антиген, (vi) клеток хозяина, экспрессирующих идентифицированный по изобретению опухолеассоциированный антиген или его часть, и (vii) выделенных комплексов между идентифицированным по изобретению опухолеассоциированным антигеном или его частью и молекулой МНС.
В одном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая идентифицированный по изобретению опухолеассоциированный антиген или его часть, в фармацевтической композиции находится в экспрессионном векторе и функционально связана с промотором. В другом воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая идентифицированный по изобретению опухолеассоциированный антиген или его часть, в фармацевтической композиции находится в вирусе, как подробно описано ниже.
В следующем воплощении клетки хозяина, входящие в фармацевтическую композицию по изобретению, секретируют опухолеассоциированный антиген или его часть, экспресссируют его на поверхности и предпочтительно также экспресссируют молекулы МНС, связывающиеся с данным опухолеассоциированным антигеном или его частью. В одном воплощении клетки хозяина экспресссируют молекулы МНС эндогенно. В другом воплощении клетки хозяина экспресссируют молекулы МНС и/или опухолеассоциированный антиген или его часть рекомбинантным способом. Клетки хозяина предпочтительно не являются пролиферативными. В предпочтительном воплощении клетки хозяина представляют собой антигенпрезентирующие клетки, в частности дендритные клетки, моноциты или макрофаги.
В следующем воплощении антитело, входящее в фармацевтическую композицию по изобретению, является моноклональным антителом. В других воплощениях антитело является химерным или гуманизированным антителом, фрагментом естественного антитела или синтетическим антителом. Антитело может быть конъюгировано с полезным для терапии или диагностики агентом, который в настоящем изобретении также именуется терапевтическим или диагностическим агентом.
Антисмысловая нуклеиновая кислота, входящая в фармацевтическую композицию по изобретению, может содержать последовательность из 6-50, в частности 10-30, 15-30 и 20-30, следующих друг за другом нуклеотидов нуклеиновой кислоты, кодирующей опухолеассоциированный антиген, идентифицированный по изобретению.
В следующих воплощениях опухолеассоциированный антиген или его часть, обеспечиваемый фармацевтической композицией по изобретению непосредственно либо посредством экспрессии нуклеиновой кислоты, связывается с молекулой МНС на поверхности клеток, причем это связывание предпочтительно вызывает цитолитическую реакцию и/или высвобождение цитокинов.
В предпочтительных воплощениях SiRNA, направленная на нуклеиновую кислоту согласно SEQ ID NO: 1, смысловая нить РНК имеет последовательность SEQ ID NO: 70, а антисмысловая нить РНК имеет последовательность SEQ ID NO: 71, либо смысловая нить РНК имеет последовательность SEQ ID NO: 72, а антисмысловая нить РНК имеет последовательность SEQ ID NO: 73.
Фармацевтическая композиция по изобретению может содержать фармацевтически совместимый носитель и/или адъювант.
Фармацевтическая композиция по изобретению предпочтительно применяется для лечения или профилактики заболеваний, характеризующихся избирательной экспрессией или аномальной экспрессией опухолеассоциированных антигенов. В предпочтительном воплощении заболевание является неопластическим заболеванием, предпочтительно раковым.
В предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция по изобретению имеет вид вакцины, которая может иметь терапевтическое или профилактическое применение. Такая вакцина предпочтительно включает идентифицированный по изобретению опухолеассоциированный антиген или его часть и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую идентифицированный по изобретению опухолеассоциированный антиген или его часть. В предпочтительных воплощениях нуклеиновая кислота находится в вирусе или клетках хозяина.
Изобретение также касается способов лечения, профилактики, диагностики или мониторинга, т.е. определения регрессирования, прогрессирования, течения и/или возникновения заболеваний, характеризующихся экспрессией или аномальной экспрессией одного или нескольких опухолеассоциированных антигенов, идентифицированных по изобретению, предпочтительно неопластических заболеваний, в особенности раковых. В одном воплощении лечение или профилактика включает введение фармацевтической композиции по изобретению.
Способы диагностики и/или способы мониторинга по изобретению обычно касаются детектирования и/или определения количества одного или нескольких параметров, выбранных из группы, состоящей из: (i) нуклеиновой кислоты, кодирующей идентифицированный по изобретению опухолеассоциированный антиген или его часть, (ii) опухолеассоциированного антигена, идентифицированного по изобретению, или его части, (iii) антител против идентифицированного по изобретению опухолеассоциированного антигена или его части, и (iv) T-лимфоцитов, предпочтительно цитотоксических или хелперных T-лимфоцитов, специфичных к идентифицированному по изобретению опухолеассоциированному антигену или его части и/или комплексу между опухолеассоциированным антигеном или его частью и молекулой МНС, в биологическом образце, взятом у пациента, предпочтительно у пациента, страдающего данным заболеванием, пациента с подозрением на данное заболевание или с вероятностью данного заболевания. Способы такого детектирования и/или определения количества описаны в настоящем изобретении и должны быть понятны специалистам.
Предпочтительно наличие такой нуклеиновой кислоты, опухолеассоциированного антигена или его части, антител и/или T-лимфоцитов либо повышение количества такой нуклеиновой кислоты, опухолеассоциированного антигена или его части, антител и/или T-лимфоцитов по сравнению с пациентами без данного заболевания указывает на наличие данного заболевания или вероятность возникновения данного заболевания.
Способы диагностики и/или мониторинга по изобретению включают и такие воплощения, в которых посредством детектирования и/или определения количества такой нуклеиновой кислоты, опухолеассоциированного антигена или его части, антител и/или T-лимфоцитов можно оценить и/или прогнозировать метастазирование данного заболевания, при этом предпочтительно наличие такой нуклеиновой кислоты, опухолеассоциированного антигена или его части, антител и/или T-лимфоцитов либо повышение количества такой нуклеиновой кислоты, опухолеассоциированного антигена или его части, антител и/или T-лимфоцитов по сравнению с пациентами без данного заболевания или без метастазов данного заболевания указывает на метастазирование данного заболевания или вероятность метастазирования данного заболевания.
В предпочтительных воплощениях такое детектирование и/или определение количества включает: (i) контактирование биологического образца с агентом, специфически связывающимся с нуклеиновой кислотой, кодирующей опухолеассоциированный антиген, или с ее частью, с опухолеассоциированным антигеном или его частью, с антителом или его частью или с T-лимфоцитами, и (ii) детектирование образования или определение количества комплекса между агентом и нуклеиновой кислотой или ее частью, опухолеассоциированным антигеном или его частью, антителом или его частью или T-лимфоцитами. В одном воплощении заболевание характеризуется экспрессией или аномальной экспрессией двух или нескольких разных опухолеассоциированных антигенов, а детектирование или определение количества включает детектирование или определение количества двух или нескольких нуклеиновых кислот, кодирующих два или несколько разных опухолеассоциированных антигенов или их частей, двух или нескольких разных опухолеассоциированных антигенов или их частей, двух или нескольких антител, связывающихся с двумя или несколькими разными опухолеассоциированными антигенами или их частями, и/или двух или нескольких разновидностей T-лимфоцитов, специфичных к двум или нескольким разным опухолеассоциированных антигенам или их частям, либо их комплексов с молекулами МНС. В другом воплощении биологический образец, взятый у пациента, сравнивают со сравнимым нормальным биологическим образцом.
Способы мониторинга по изобретению предпочтительно включают детектирование и/или определение количества одного или нескольких параметров, указанных выше, в первом образце в один момент времени и в другом образце во второй момент времени, при этом течение заболевания определяется путем сравнения двух образцов.
В соответствии с изобретением, детектирование нуклеиновой кислоты или ее части или определение количества нуклеиновой кислоты или ее части может проводиться с помощью олиго- или полинуклеотидного зонда, специфически гибридизующегося с данной нуклеиновой кислотой или ее частью, либо оно может проводиться путем избирательной амплификации данной нуклеиновой кислоты или ее части, например, амплификации методом ПЦР. В одном воплощении олиго- или полинуклеотидный зонд включает последовательность из 6-50, в частности 10-30, 15-30 и 20-30, следующих друг за другом нуклеотидов данной нуклеиновой кислоты.
В предпочтительных воплощениях опухолеассоциированный антиген или его часть, подлежащие детектированию или определению количества способами настоящего изобретения, находятся внутри клетки, на поверхности клетки или в комплексе с молекулой МНС. В соответствии с изобретением, детектирование опухолеассоциированного антигена или его части или определение количества опухолеассоциированного антигена или его части может проводиться с помощью антител, специфически связывающихся с данным опухолеассоциированным антигеном или его частью.
В соответствии с изобретением, детектирование антител или определение количества антител может проводиться с помощью белка или пептида, специфически связывающегося с данным антителом.
В соответствии с изобретением, детектирование или определение количества T-лимфоцитов, специфичных к опухолеассоциированному антигену или его части либо его комплексам с молекулой МНС, может проводиться с помощью клеток, презентирующих комплекс между данным опухолеассоциированным антигеном или его частью и молекулой МНС. Кроме того, T-лимфоциты можно детектировать по их пролиферации, продукции цитокинов и цитотоксической активности, запускаемых при специфической стимуляции комплексом между молекулой МНС и опухолеассоциированным антигеном или его частью. Т-лимфоциты также можно детектировать с помощью рекомбинантных молекул МНС или комплексов из двух или нескольких молекул МНС с иммуногенными фрагментами одного или нескольких опухолеассоциированных антигенов.
Агент, используемый для детектирования или определения количества в способах изобретения, к примеру, олиго- или полинуклеотидный зонд, антитело, белок или пептид либо клетки, предпочтительно подвергается мечению удобным для детектирования образом, в частности, с помощью детектируемого маркера типа радиоактивного маркера или ферментного маркера.
В предпочтительном аспекте изобретение касается способа лечения, профилактики, диагностики или мониторинга заболеваний, характеризующихся экспрессией или аномальной экспрессией опухолеассоциированного антигена, идентифицированного по изобретению, при этом способ включает введение антител, связывающихся с данным опухолеассоциированным антигеном или его частью и конъюгированных с терапевтическим или диагностическим агентом. Антитела могут являться моноклональными антителами. В других воплощениях антитела являются химерными или гуманизированными антителами либо фрагментами естественных антител.
В определенных воплощениях способы диагностики или мониторинга по изобретению заболеваний, характеризующихся экспрессией или аномальной экспрессией опухолеассоциированного антигена, идентифицированного по изобретению, выполняются на биологических образцах, содержащих или предположительно содержащих распространяющиеся раковые клетки или метастазирующие раковые клетки. К таким биологическим образцам относятся, к примеру, кровь, сыворотка крови, костный мозг, мокрота, бронхиальная жидкость и/или бронхиальный смыв.
В одном предпочтительном аспекте изобретение касается способа лечения пациентов, страдающих заболеванием, характеризующимся экспрессией или аномальной экспрессией опухолеассоциированного антигена, идентифицированного по изобретению, при этом способ включает: (i) получение образца, содержащего иммунореактивные клетки, у данного пациента или другого представителя того же вида, в частности у здорового лица, либо представителя другого вида, (ii) контактирование данного образца с клетками хозяина, экспрессирующими данный опухолеассоциированный антиген или его часть, в условиях, способствующих выработке цитолитических T-клеток против опухолеассоциированного антигена или его части, и (iii) введение цитолитических T-клеток пациенту в количестве, подходящем для лизиса клеток, экспрессирующих опухолеассоциированный антиген или его часть. В одном воплощении способ включает клонирование T-клеточного рецептора из полученных цитолитических T-клеток и перенос нуклеиновой кислоты, кодирующей этот T-клеточный рецептор, в T-клетки, полученные из данного пациента или другого представителя того же вида, в частности здорового лица, либо представителя другого вида, при этом T-клетки приобретают нужную специфичность и, как и в п.iii, могут быть введены пациенту.
В одном воплощении клетки хозяина эндогенно экспрессируют молекулу МНС. В другом воплощении клетки хозяина рекомбинантным путем экспрессируют молекулу МНС и/или опухолеассоциированный антиген или его часть. Предпочтительно клетки хозяина презентируют опухолеассоциированный антиген или его часть при помощи молекул МНС на своей поверхности. Клетки хозяина предпочтительно не являются пролиферативными. В предпочтительном воплощении клетки хозяина представляют собой антигенпрезентирующие клетки, в частности дендритные клетки, моноциты или макрофаги.
Изобретение также касается способа лечения заболеваний, характеризующихся экспрессией или аномальной экспрессией опухолеассоциированного антигена, идентифицированного по изобретению, при этом способ включает: (i) идентификацию клеток у пациента, экспрессирующих аномальное количество опухолеассоциированного антигена, (ii) получение образца данных клеток, (iii) культивирование данных клеток и (iv) введение данных клеток пациенту в количестве, подходящем для запуска иммунного ответа на эти клетки.
Настоящее изобретение также касается нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из: (a) нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 и 64-67, ее часть или производную последовательность, (b) нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с нуклеиновой кислотой по п.a в строгих условиях, (c) нуклеиновой кислоты, вырожденной по отношению к нуклеиновой кислоте по п.a или b, и (d) нуклеиновой кислоты, комплементарной нуклеиновой кислоте по п.a, b или с.Изобретение также касается нуклеиновой кислоты, кодирующей белок или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 29, 31, 36, 40, 42, 46, 50-60, 63, 68 и 69, ее часть или производную последовательность.
В следующем аспекте изобретение касается рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, в частности молекулы ДНК или РНК, включающей нуклеиновую кислоту по изобретению.
Изобретение также касается клеток хозяина, содержащих нуклеиновую кислоту или рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению.
Клетки хозяина также могут содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу МНС. В одном воплощении клетки хозяина эндогенно экспрессируют молекулу МНС. В другом воплощении клетки хозяина рекомбинантным путем экспрессируют молекулу МНС и/или нуклеиновую кислоту или рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению или ее часть. Предпочтительно клетки хозяина не являются пролиферативными. В предпочтительном воплощении клетки хозяина представляют собой антигенпрезентирующие клетки, в частности дендритные клетки, моноциты или макрофаги.
В следующем воплощении изобретение касается олигонуклеотидов, гибридизующихся с нуклеиновой кислотой, идентифицированной по изобретению, которые могут использоваться в качестве генетических зондов или "антисмысловых" молекул. Молекулы нуклеиновой кислоты в виде олигонуклеотидных праймеров или соответствующих зондов, гибридизующихся с идентифицированной по изобретению нуклеиновой кислотой или ее частью, могут использоваться для поиска нуклеиновых кислот, гомологичных данной нуклеиновой кислоте, идентифицированной по изобретению, напр., методами ПЦР-амплификации, саузерн- и нозерн-гибридизации. Гибридизация может проводиться в условиях низкой строгости, более предпочтительно в условиях средней строгости и наиболее предпочтительно в условиях высокой строгости.
В следующем аспекте изобретение касается белка или пептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, выбранной из группы, состоящей из: (a) нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 и 64-67, ее часть или производную последовательность, (b) нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с нуклеиновой кислотой по п.а в строгих условиях, (c) нуклеиновой кислоты, вырожденной по отношению к нуклеиновой кислоте по п.a или b, и (d) нуклеиновой кислоты, комплементарной нуклеиновой кислоте по п.a, b или c. В предпочтительном воплощении изобретение касается белка или пептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 29, 31, 36, 40, 42, 46, 50-60, 63, 68 и 69, ее часть или производную последовательность.
В следующем аспекте изобретение касается иммуногенного фрагмента опухолеассоциированного антигена, идентифицированного по изобретению. Такой фрагмент предпочтительно связывается с молекулой МНС или антителом, предпочтительно с рецептором HLA человека или антителом человека. В соответствии с изобретением, фрагмент содержит последовательность по меньшей мере из 6, в частности по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30 или по меньшей мере 50 аминокислот.
В этом аспекте изобретение в частности, касается пептида, имеющего или содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ED NOs: 51-60, 68 и 69 из перечня последовательностей, ее часть или производную последовательность.
В следующем аспекте изобретение касается агента, связывающегося с идентифицированным по изобретению опухолеассоциированным антигеном или его частью. В предпочтительном воплощении агентом является белок или пептид, в частности антитело, T-клеточный рецептор или молекула МНС. В следующих воплощениях антитело представляет собой моноклональное, химерное или гуманизированное антитело, антитело, полученное комбинаторными методами, или фрагмент антитела. В одном предпочтительном воплощении изобретение касается антитела, избирательно связывающегося с комплексом из (i) идентифицированного по изобретению опухолеассоциированного антигена или его части и (ii) молекулы МНС, с которой связывается данный идентифицированный по изобретению опухолеассоциированный антиген или его часть, причем данное антитело не связывается с самими компонентами по п.i или ii.
В частности, изобретение касается такого агента, в особенности антитела, которое специфически связывается с пептидом, имеющим или содержащим последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 51-60, 68 и 69 из перечня последовательностей, ее часть или производную последовательность.
D
D
D
В соответствии с изобретением, термин "связывание" предпочтительно относится к специфическому связыванию. "Специфическое связывание" означает, что такой агент, как антитело, прочнее связывается с такой мишенью, как эпитоп, к которому оно специфично, чем с другой мишенью. Агент прочнее связывается с первой мишенью, чем со второй мишенью, если он связывается с первой мишенью с меньшей константой диссоциации (K), чем константа диссоциации для второй мишени. Предпочтительно константа диссоциации (K) для той мишени, с которой агент связывается специфически, более чем в 10 раз, предпочтительно более чем в 20 раз, более предпочтительно более чем в 50 раз, еще более предпочтительно более чем в 100, 200, 500 или 1000 раз ниже, чем константа диссоциации (R) для такой мишени, с которой агент не связывается специфически.
Такие специфические антитела, к примеру, могут быть получены при иммунизации с помощью вышеприведенных пептидов.
Изобретение также касается конъюгатов между агентом по изобретению, связывающимся с идентифицированным по изобретению опухолеассоциированным антигеном или его частью, либо антителом по изобретению, и терапевтическим или диагностическим агентом. В одном воплощении терапевтическим или диагностическим агентом является токсин.
В следующем аспекте изобретение касается набора для выявления экспрессии или аномальной экспрессии опухолеассоциированного антигена, идентифицированного по изобретению, при этом набор включает средства для детектирования или определения количества: (i) нуклеиновой кислоты, кодирующей опухолеассоциированный антиген, или ее части, (ii) опухолеассоциированного антигена или его части, (iii) антител, связывающихся с опухолеассоциированным антигеном или его частью, и/или (iv) T-клеток, специфичных к опухолеассоциированному антигену или его части либо к его комплексу с молекулой МНС. В одном воплощении средствами для детектирования нуклеиновой кислоты или ее части являются молекулы нуклеиновых кислот, предназначенные для избирательной амплификации данной нуклеиновой кислоты, которые содержат, в частности, последовательность из 6-50, в особенности 10-30, 15-30 и 20-30, следующих друг за другом нуклеотидов данной нуклеиновой кислоты.
Раскрытие сущности изобретения
В соответствии с изобретением, "эталонный" или "контрольный" типа эталонный образец, стандарт или контрольный организм может использоваться для корреляции и сравнения результатов, полученных способами изобретения на исследуемых образцах или исследуемом организме, т.е. пациенте. Как правило, контрольным организмом является здоровый организм, в особенности организм, не страдающий раком.
"Контрольное значение" может быть установлено эмпирически по стандартам путем измерения достаточно большого числа контрольных образцов. Предпочтительно контрольное значение определяется при измерении по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 3, предпочтительно по меньшей мере 5, предпочтительно по меньшей мере 8, предпочтительно по меньшей мере 12, предпочтительно по меньшей мере 20, предпочтительно по меньшей мере 30, предпочтительно по меньшей мере 50 или предпочтительно по меньшей мере 100 контрольных образцов.
"Производное" нуклеиновой кислоты по изобретению означает, что в данной нуклеиновой кислоте имеется одна или несколько, к примеру, по меньшей мере 2, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 6, предпочтительно вплоть до 3, до 4, до 5, до 6, до 10, до 15 или до 20 замен, делеций и/или вставок нуклеотидов. Кроме того, термин "производное" охватывает и химическую модификацию нуклеиновой кислоты по основаниям нуклеотидов, по сахарам или по фосфату. Термин "производное" также охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие не встречающиеся в природе нуклеотиды и аналоги нуклеотидов.
В соответствии с изобретением, нуклеиновая кислота предпочтительно является дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) или рибонуклеиновой кислотой (РНК). Нуклеиновые кислоты по изобретению включают геномную ДНК, кДНК, мРНК, молекулы, полученные рекомбинантным путем и синтезированные химически, В соответствии с изобретением, нуклеиновая кислота может находиться в виде одноцепочечной или двухцепочечной молекулы и линейной или ковалентно замкнутой кольцевой молекулы.
В настоящем изобретении термин "РНК" обозначает молекулу, содержащую как минимум один рибонуклеотидный остаток. Под "рибонуклеотидом" подразумевается нуклеотид с гидроксильной группой в 2'-положении молекулы β-D-рибофуранозы. Термин охватывает двухцепочечную РНК, одноцепочечную РНК, выделенную РНК типа частично очищенной РНК, практически чистую РНК, синтетическую РНК, рекомбинантную РНК, а также модифицированную РНК, отличающуюся от природной РНК вставкой, делецией, заменой и/или модификацией одного или нескольких нуклеотидов. Такие модификации могут включать добавление безнуклеотидного вещества по концам РНК либо внутри молекулы РНК, например, по одному или нескольким нуклеотидам РНК. Нуклеотиды в молекулах РНК могут включать и нестандартные нуклеотиды, к примеру, не встречающиеся в природе или синтезированные химически нуклеотиды или дезоксинуклеотиды. Такие модифицированные молекулы РНК можно назвать аналогами либо аналогами природной РНК.
Описанные нуклеиновые кислоты по изобретению предпочтительно являются выделенными. Термин "выделенная нуклеиновая кислота" согласно изобретению означает, что нуклеиновая кислота была: (i) амплифицирована in vitro, к примеру, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), (ii) получена рекомбинантно посредством клонирования, (iii) очищена, к примеру, посредством расщепления и разделения методом гель-электрофореза, или (iv) синтезирована, к примеру, методами химического синтеза. Выделенная нуклеиновая кислота есть такая нуклеиновая кислота, которая доступна для манипулирования методами рекомбинантной ДНК.
2
4
Нуклеиновая кислота "комплементарна" другой нуклеиновой кислоте, если две последовательности способны гибридизоваться и образовать устойчивую двойную спираль между собою, при этом гибридизация предпочтительно проводится в условиях, дающих возможность специфической гибридизации между полинуклеотидами (строгие условия). Строгие условия описаны, к примеру, в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, или Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Asubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York, и означают, к примеру, гибридизацию при 65°C в гибридизационном буфере (3,5×SSC, 0,02% фиколла, 0,02% поливинилпирролидона, 0,02% бычьего сывороточного альбумина, 2,5 мМ NaHPO pH 7, 0,5% SDS, 2 мМ ЭДТА). SSC означает 0,15 М NaCl/0,15 M цитрат натрия, pH 7. После гибридизации мембрану, на которую переносили ДНК, промывают, к примеру, раствором 2×SSC при комнатной температуре, а затем 0,1-0,5×SSC/0,1×SDS при температуре до 68°C.
В соответствии с изобретением, комплементарные нуклеиновые кислоты содержат по меньшей мере 40%, в особенности по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичных нуклеотидов.
Термин "степень идентичности" служит для обозначения того, какой процент идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков между двумя подлежащими сравнению последовательностями получается после наилучшего совмещения, причем этот процент является чисто статистическим, а различия между двумя последовательностями распределяются случайным образом и по всей длине. Сопоставление двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей обычно проводится путем сравнения этих последовательностей после оптимального их совмещения, при этом сравнение проводится по отрезкам или "окошкам сравнения" с тем, чтобы идентифицировать и сравнить участки со сходными последовательностями. Оптимальное совмещение последовательностей для сравнения может осуществляться если не вручную, то при помощи алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman, 1991, Ads App. Math. 2, 482, при помощи алгоритма локальной гомологии Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, при помощи метода поиска сходства Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444, или при помощи компьютерных программ, в которых используются эти алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N и TFASTA в пакете Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).
Степень идентичности рассчитывается путем определения числа идентичных позиций между двумя сравниваемыми последовательностями, деления этого числа на число сравниваемых позиций и умножения полученного результата на 100 с тем, чтобы получить степень идентичности в процентах между этими двумя последовательностями.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие опухолеассоциированные антигены, в соответствии с изобретением могут присутствовать сами по себе или в комбинации с другими нуклеиновыми кислотами, в частности, с гетерологическими нуклеиновыми кислотами. В предпочтительных воплощениях нуклеиновая кислота функционально связана с контролирующими экспрессию последовательностями или регуляторными последовательностями, которые могут быть гомологичными или гетерологичными по отношению к данной нуклеиновой кислоте. Кодирующая последовательность и регуляторная последовательность "функционально" связаны друг с другом, если они ковалентно связаны друг с другом таким образом, что экспрессия или транскрипция кодирующей последовательности находится под контролем или под влиянием данной регуляторной последовательности. Если кодирующая последовательность должна транслироваться в функциональный белок, то с помощью регуляторной последовательности, функционально связанной с данной кодирующей последовательностью, индукция этой регуляторной последовательности приведет к транскрипции кодирующей последовательности, но не вызовет сдвига рамки считывания кодирующей последовательности или ее неспособность к трансляции в нужный белок или пептид.
Термин "контролирующая экспрессию последовательность" или "регуляторная последовательность" согласно изобретению охватывает промоторы, энхансеры и другие контрольные элементы, регулирующие экспрессию гена. В предпочтительных воплощениях изобретения контролирующие экспрессию последовательности могут подвергаться регуляции. Конкретная структура регуляторных последовательностей может варьировать в зависимости от биологического вида или типа клеток, но обычно она включает 5'-нетранскрибируемые и 5'-нетранслируемые последовательности, которые участвуют в инициации транскрипции и трансляции, соответственно, такие как блок TATA, кэппинг-последовательность, последовательность СААТ и др. В частности, 5'-нетранскрибируемые регуляторные последовательности содержат участок промотора, который включает последовательность промотора для транскрипционного контроля функционально связанного гена. Регуляторные последовательности также могут содержать последовательности энхансера или восходящего активатора.
В соответствии с изобретением, нуклеиновая кислота также может присутствовать и в комбинации с другой нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид, контролирующий секрецию из клеток хозяина белка или пептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой. В соответствии с изобретением, нуклеиновая кислота может присутствовать и в комбинации с другой нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид, вызывающий заякоривание кодируемого белка или пептида на клеточной мембране клеток хозяина или компартментализацию в определенные органеллы этих клеток. Также возможно комбинирование с такой нуклеиновой кислотой, которая представляет собой ген-репортер или какую-нибудь "метку".
В предпочтительном воплощении рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой вектор, если нужно, то с промотором, контролирующим экспрессию нуклеиновой кислоты, например, нуклеиновой кислоты, кодирующей опухолеассоциированный антиген, идентифицированный по изобретению. При этом термин "вектор" применяется в самом общем значении и означает любой промежуточный носитель для нуклеиновой кислоты, который дает возможность, к примеру, ввести данную нуклеиновую кислоту в прокариотические и/или эукариотические клетки и, если нужно, встроить ее в геном. Вектор такого типа предпочтительно подвергается репликации и/или экспрессии в клетках. Промежуточный носитель может быть адаптирован, к примеру, для использования при электропорации, при бомбардировке микрочастицами, при липосомальном введении, при переносе с помощью агробактерий или при встраивании с помощью ДНК- или РНК-содержащих вирусов. К векторам относятся плазмиды, фагоплазмиды, бактериофаги и вирусные геномы.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие опухолеассоциированный антиген, идентифицированный по изобретению, могут применяться для трансфицирования клеток хозяина. При этом нуклеиновая кислота означает и рекомбинантную ДНК, и рекомбинантную РНК. Рекомбинантная РНК может быть получена при транскрипции in vitro ДНК матрицы. Кроме того, она может быть модифицирована стабилизирующими последовательностями, кэппинг-последовательностями и последовательностями полиаденилирования перед применением.
В соответствии с изобретением, термин "клетка-хозяин" относится к любым клеткам, которые могут быть трансформированы или трансфицированы экзогенной нуклеиновой кислотой. Термин "клетка-хозяин" согласно изобретению охватывает прокариотические (напр., E.coli) и эукариотические клетки (напр., дендритные клетки, B-клетки, клетки CHO, клетки COS, клетки K562, дрожжевые клетки и клетки насекомых). Особое предпочтение отдается клеткам млекопитающих, таким как клетки человека, мыши, хомяка, свиньи, козы, приматов. Клетки могут происходить из многих типов клеток, в том числе первичных клеток и клеточных линий. Конкретные примеры включают кератиноциты, лейкоциты периферической крови, стволовые клетки из костного мозга и зародышевые стволовые клетки. В других воплощениях клетки хозяина представляют собой антигенпрезентирующие клетки, в частности дендритные клетки, моноциты или макрофаги. Нуклеиновая кислота может находиться в клетках-хозяевах в виде единственной копии или в виде двух или нескольких копий, а в одном воплощении она подвергается экспрессии в клетках-хозяинах.
В соответствии с изобретением, термин "экспрессия" применяется в самом общем значении и охватывает продукцию РНК или ДНК и белка. Он также включает частичную экспрессию нуклеиновых кислот. Кроме того, экспрессия может проходить кратковременно или устойчиво. Предпочтительные системы экспрессии в клетках млекопитающих включают pcDNA3.1 и pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA), которые содержат селекционный маркер типа гена, придающего устойчивость к G418 (и тем самым дают возможность проводить селекцию устойчиво трансфицированных линий клеток) и последовательности энхансера-промотора цитомегаловируса (CMV).
В тех случаях по изобретению, когда молекула МНС презентирует опухолеассоциированный антиген или его часть, экспрессионный вектор может включать и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей данную молекулу МНС. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу МНС, может находиться на том же самом экспрессионном векторе, что и нуклеиновая кислота, кодирующая опухолеассоциированный антиген или его часть, или же эти нуклеиновые кислоты могут находиться на различных экспрессионных векторах. В последнем случае эти два экспрессионных вектора можно совместно трансфицировать в клетки. Если клетки хозяина не экспрессируют ни опухолеассоциированный антиген или его часть, ни молекулу МНС, то кодирующие их нуклеиновые кислоты можно трансфицировать в клетки на одном и том же экспрессионном векторе либо на различных экспрессионных векторах. Если же клетки уже экспрессируют молекулу МНС, то можно трансфицировать в клетки только последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей опухолеассоциированный антиген или его часть.
Изобретение также охватывает наборы для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей опухолеассоциированный антиген. Такие наборы содержат, к примеру, пару праймеров для амплификации, которые гибридизуются с нуклеиновой кислотой, кодирующей опухолеассоциированный антиген. Праймеры предпочтительно содержат последовательность из 6-50, в частности 10-30, 15-30 и 20-30, следующих друг за другом нуклеотидов нуклеиновой кислоты и при этом не перекрываются, чтобы избежать образования димеров праймеров. Один из праймеров должен гибридизоваться с одной нитью нуклеиновой кислотой, кодирующей опухолеассоциированный антиген, а другой праймер должен гибридизоваться с комплементарной нитью в таком порядке, чтобы стала возможной амплификация нуклеиновой кислоты, кодирующей опухолеассоциированный антиген.
"Антисмысловые молекулы" или "антисмысловые нуклеиновые кислоты" могут использоваться для регулирования, в частности подавления, экспрессии нуклеиновой кислоты. Термин "антисмысловая молекула" или "антисмысловая нуклеиновая кислота" согласно изобретению относится к такому олигонуклеотиду, который представляет собой олигорибонуклеотид, олигодезоксирибонуклеотид, модифицированный олигорибонуклеотид или модифицированный олигодезоксирибонуклеотид и гибридизуется в физиологических условиях с ДНК, содержащей определенный ген, или с мРНК данного гена, и при этом ингибирует транскрипцию данного гена и/или трансляцию данной мРНК. В соответствии с изобретением, "антисмысловая молекула" также означает конструкцию, содержащую нуклеиновую кислоту или ее часть в обратной ориентации по отношению к своему естественному промотору. Антисмысловой транскрипт нуклеиновой кислоты или ее части может образовать двойную спираль с природной мРНК, определяющей фермент, и тем самым предотвратить накопление или трансляцию мРНК в активный фермент. Другая возможность заключается в использовании рибозимов для инактивирования нуклеиновой кислоты. Предпочтительные антисмысловые олигонуклеотиды по изобретению содержат последовательность из 6-50, в частности 10-30, 15-30 и 20-30, следующих друг за другом нуклеотидов искомой нуклеиновой кислоты и предпочтительно полностью комплементарны данной нуклеиновой кислоте или ее части.
В предпочтительных воплощениях антисмысловой олигонуклеотид гибридизуется с N-концевым или 5'-вышестоящим сайтом, к примеру, сайтом инициации трансляции, сайтом инициации транскрипции или сайтом промотора. В других воплощениях антисмысловой олигонуклеотид гибридизуется с 3'-нетранслируемым участком или сайтом сплайсинга мРНК.
В одном воплощении олигонуклеотид по изобретению состоит из рибонуклеотидов, дезоксирибонуклеотидов либо их комбинации, причем 5'-конец одного нуклеотида и 3'-конец другого нуклеотида соединяются друг с другом фосфодиэфирной связью. Такие олигонуклеотиды могут быть синтезированы обычным способом или получены рекомбинантным путем.
В предпочтительных воплощениях олигонуклеотид по изобретению является "модифицированным" олигонуклеотидом. При этом олигонуклеотид может подвергаться модификации самыми разными способами, не нарушающими его способность связываться со своей мишенью с тем, чтобы повысить, к примеру, его стабильность или терапевтическую эффективность. В соответствии с изобретением, термин "модифицированный олигонуклеотид" обозначает такой олигонуклеотид, у которого: (i) по меньшей мере два из его нуклеотидов соединяются друг с другом синтетической межнуклеозидной связью (т.е. такой межнуклеозидной связью, которая не является фосфодиэфирной связью) и/или (ii) с олигонуклеотидом ковалентно соединяется химическая группа, которая обычно не встречается в нуклеиновых кислотах. К предпочтительным синтетическим межнуклеозидным связям относятся фосфоротиоаты, алкилфосфонаты, фосфородитиоаты, эфиры фосфатов, алкилфосфонотиоаты, фосфорамидаты, карбаматы, карбонаты, триэфиры фосфатов, ацетамидаты, карбоксиметиловые эфиры и пептиды.
Термин "модифицированный олигонуклеотид" также охватывает олигонуклеотиды, содержащие ковалентно модифицированные основания и/или сахара. "Модифицированные олигонуклеотиды" включают, к примеру, такие олигонуклеотиды, у которых остатки сахаров ковалентно связаны с низкомолекулярными органическими группами, кроме гидроксильной группы в 3'-позиции и фосфатной группы в 5'-позиции. Модифицированные олигонуклеотиды могут содержать, к примеру, остаток 2-O-алкилированной рибозы или иного сахара типа арабинозы вместо рибозы.
Следует иметь в виду, что все вышеописанные воплощения в отношении олигонуклеотидов могут относиться и к полинуклеотидам.
Под "короткой интерферирующей РНК" или "SiRNA" в настоящем изобретении подразумевается выделенная молекула РНК, предпочтительно длиной более 10 нуклеотидов, более предпочтительно длиной более 15 нуклеотидов и наиболее предпочтительно длиной более 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, которая используется для идентификации заданного гена или подлежащей деградации мРНК. Наиболее предпочтительный размер SiRNA составляет 19-25 нуклеотидов SiRNA по изобретению может включать частично очищенную РНК, практически чистую РНК, синтетическую РНК или полученную рекомбинантным путем РНК, а также модифицированную РНК, отличающуюся от природной РНК вставкой, делецией, заменой и/или модификацией одного или нескольких нуклеотидов. Такие модификации могут включать добавление безнуклеотидного вещества, к примеру, по концам SiRNA либо по одному или нескольким внутренним нуклеотидам SiRNA; модификации, делающие SiRNA устойчивой к расщеплению нуклеазами (напр., употребление 2'-замещенных нуклеотидов или модификации в сахарофосфатном остове); либо замена одного или нескольких нуклеотидов SiRNA дезоксирибонуклеотидами. Кроме того, SiRNA может подвергаться модификации для повышения ее стабильности, как описано выше для модифицированных олигонуклеотидов, в частности, путем введения одной или нескольких фосфоротиоатных связей.
Одна или обе нити SiRNA к тому же могут содержать 3'-выступ (выступ на 3'-конце). В настоящем изобретении "3'-выступ" означает по меньшей мере один неспаренный нуклеотид, выступающий с 3'-конца одной нити РНК. Так, в одном воплощении SiRNA содержит по меньшей мере один 3'-выступ длиной от 1 до 6 нуклеотидов (в том числе рибонуклеотидов или дезоксирибонуклеотидов), предпочтительно длиной от 1 до 5 нуклеотидов, более предпочтительно от 1 до 4 нуклеотидов и особенно предпочтительно от 2 до 4 нуклеотидов. В том воплощении, в котором обе нити молекулы SiRNA содержат 3'-выступ, их длина может быть одинаковой или различной для каждой нити. В наиболее предпочтительном воплощении 3'-выступ имеется на обеих нитях SiRNA и длина его составляет 2 нуклеотида. Например, каждая нить SiRNA по изобретению может содержать 3'-выступ из дидезокситимидиловой кислоты ("TT") или диуридиловой кислоты ("uu").
Для того чтобы повысить стабильность SiRNA, 3'-выступы могут подвергаться стабилизации против деградации. В одном воплощении выступы стабилизируют путем включения пуриновых нуклеотидов типа аденозиновых или гуанозиновых нуклеотидов. С другой стороны, допускается замена пиримидиновых нуклеотидов модифицированными аналогами, напр., замена уридиновых нуклеотидов в 3'-выступах на 2'-дезокситимидин, что не влияет на эффективность деградации SiRNA. В частности, отсутствие 2'-гидроксила в 2'-дезокситимидине значительно повышает устойчивость 3'-выступа к нуклеазам в среде для тканевой культуры.
Смысловая и антисмысловая нити SiRNA могут составлять две комплементарные одноцепочечные молекулы РНК или составлять одну молекулу, в которой две комплементарные части подвергаются спариванию оснований и ковалентно соединяются одноцепочечной "шпилькой". То есть смысловой участок и антисмысловой участок могут ковалентно соединяться через молекулу линкера. Молекула линкера может представлять собой полинуклеотидный или безнуклеотидный линкер. Не придерживаясь какой-либо теории, можно полагать, что шпилька в последнем типе молекул SiRNA подвергается расщеплению внутри клетки белком "dicer" (или эквивалентным ему) с образованием двух отдельных молекул РНК со спаренными основаниями.
В настоящем изобретении "мРНК-мишень" или "мРНК мишени" означает такую молекулу РНК, которая является мишенью для понижающей регуляции.
SiRNA может экспрессироваться из содержащего pol III экспрессионного вектора без изменения ее места назначения, так как экспрессия из промоторов pol III считается эффективной только тогда, когда первым транскрибируемым нуклеотидом является пурин.
SiRNA по изобретению может быть направлена на любой отрезок примерно из 19-25 следующих друг за другом нуклеотидов в любой из последовательностей мРНК мишени ("последовательности мишени"). Методы выбора последовательностей мишени для SiRNA изложены, к примеру, в Tuschl Т. et al., "The siRNA User Guide", revised Oct. 11, 2002, все содержание которой включено в настоящее изобретение путем ссылки. "The siRNA User Guide" доступна через Интернет из веб-сайта, принадлежащего Dr. Thomas Tuschl из Лаборатории молекулярной биологии РНК, Rockefeller University, New York, USA, и ее можно найти при заходе на веб-сайт Рокфеллеровского университета и поиске по ключевому слову "siRNA". Итак, смысловая нить такой SiRNA содержит нуклеотидную последовательность, которая практически идентична любому непрерывному отрезку из 19-25 нуклеотидов в мРНК мишени.
В общем, последовательность мишени в мРНК мишени может быть выбрана из данной последовательности кДНК, соответствующей мРНК мишени, предпочтительно начиная с 50-100 нуклеотидов вниз (т.е. в 3'-направлении) от старт-кодона. Тем не менее, последовательность мишени может располагаться в 5'- или 3'-нетранслируемом участке или в районе старт-кодона.
SiRNA может быть получена целым рядом методов, известных специалистам в этой области. Например, SiRNA можно синтезировать химически или получить рекомбинантным путем известными в этой области способами, как-то система Drosophila in vitro, описанная в опубликованной заявке США 2002/0086356 от Tuschl et al., все содержание которой включено в настоящее изобретение путем отсылки.
Предпочтительно SiRNA синтезируют химически, используя блокированные надлежащим образом рибонуклеозидфосфорамидаты и стандартный синтезатор ДНК/РНК. SiRNA можно синтезировать в виде двух отдельных комплементарных молекул РНК или в виде одной молекулы РНК с двумя комплементарными участками.
С другой стороны, SiRNA можно также экспрессировать из рекомбинантной кольцевой или линейной ДНК-плазмиды с помощью любого подходящего промотора. Такие воплощения входят в настоящее изобретение, когда речь идет о введении SiRNA или включении SiRNA в фармацевтические композиции. Подходящими промоторами для экспрессии SiRNA по изобретению из плазмиды являются, к примеру, последовательности промоторов U6 или HI RNA pol III и промотор цитомегаловируса.
Выбор других подходящих промоторов остается за специалистами в этой области. Рекомбинантные плазмиды по изобретению также могут содержать индуцибельные или регулируемые промоторы для экспрессии SiRNA в определенной ткани или в определенной внутриклеточной среде.
При экспрессии из рекомбинантных плазмид SiRNA можно выделить из систем экспрессии в клеточных культурах стандартными методами либо экспрессировать ее внутриклеточно. Применение рекомбинантных плазмид для доставки SiRNA в клетки обсуждается более подробно ниже. SiRNA может экспрессироваться из рекомбинантной плазмиды в виде двух отдельных комплементарных молекул РНК или в виде одной молекулы РНК с двумя комплементарными участками.
Выбор плазмид, пригодных для экспрессии SiRNA, методы введения в плазмиду последовательностей нуклеиновых кислот для экспрессии SiRNA и методы доставки рекомбинантных плазмид в намеченные клетки доступны специалистам в этой области.
SiRNA также можно экспрессировать внутриклеточно in vivo из рекомбинантных вирусных векторов. Рекомбинантные вирусные векторы содержат последовательности, кодирующие SiRNA, и любой подходящий промотор для экспрессии последовательностей SiRNA. Рекомбинантные вирусные векторы также могут содержать индуцибельные или регулируемые промоторы для экспрессии SiRNA в определенной ткани или в определенной внутриклеточной среде. SiRNA может экспрессироваться из рекомбинантного вирусного вектора в виде двух отдельных комплементарных молекул РНК или в виде одной молекулы РНК с двумя комплементарными участками.
Термин "пептид" охватывает олиго- и полипептиды и относится к веществам, содержащим два или больше, предпочтительно 3 или больше, предпочтительно 4 или больше, предпочтительно 6 или больше, предпочтительно 8 или больше, предпочтительно 10 или больше, предпочтительно 13 или больше, предпочтительно 16 и больше, предпочтительно 21 или больше и предпочтительно вплоть до 8, 10, 20, 30, 40 или 50, в особенности 100 аминокислот, ковалентно соединенных пептидными связями. Термин "белок" относится к большим пептидам, предпочтительно к пептидам с более чем 100 аминокислотными остатками, но обычно термины "пептиды" и "белки" являются синонимами и в настоящем изобретении они применяются взаимозаменяемым образом.
Предпочтительно описанные белки и пептиды по изобретению являются выделенными. Термины "выделенный белок" или "выделенный пептид" означают, что белок или пептид был отделен от своей естественной среды. Выделенный белок или пептид может находиться в практически очищенном состоянии. Термин "практически очищенный" означает, что белок или пептид практически свободен от других веществ, с которыми он связан в природе или in vivo.
Такие белки и пептиды можно использовать, к примеру, при получении антител и в иммунологическом или диагностическом анализе либо в качестве лекарств. Описанные белки и пептиды по изобретению можно выделить из таких биологических образцов, как гомогенаты ткани или клеток, и их можно экспрессировать рекомбинантным путем во многих про- или эукариотических системах экспрессии.
В применении к настоящему изобретению "производные" белка или пептида либо аминокислотной последовательности включают варианты со вставкой аминокислот, варианты с делецией аминокислот и/или варианты с заменой аминокислот.
Варианты со вставкой аминокислот включают N- и/или C-концевые слияния, а также вставки одной, двух или нескольких аминокислот в определенную аминокислотную последовательность. В случае вариантов последовательностей со вставкой аминокислот происходит вставка одного или нескольких аминокислотных остатков в определенное место в аминокислотной последовательности, хотя возможна и случайная вставка с надлежащим скринингом образовавшихся продуктов. Варианты с делецией аминокислот характеризуются удалением одной или нескольких аминокислот из последовательности. Варианты с заменой аминокислот характеризуются удалением по меньшей мере одного остатка из последовательности и вставкой на его место другого остатка. Предпочтение отдается модификациям по тем положениям аминокислотной последовательности, которые не являются консервативными между гомологичными белками или пептидами, и/или замене одних аминокислот другими, обладающими близкими свойствами типа гидрофобности, гидрофильности, электроотрицательности, объема боковой цепи и др. (консервативные замены). Консервативные замены, к примеру, относятся к замене одной аминокислоты другой аминокислотой из той же группы, приведенной ниже, что и подлежащая замене аминокислота:
1) небольшие алифатические, неполярные или слабо полярные остатки: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);
2) отрицательно заряженные остатки и их амиды: Asn, Asp, Glu, Gin;
3) положительно заряженные остатки: His, Arg, Lys;
4) большие алифатические, неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val (Cys);
5) большие ароматические остатки: Phe, Tyr, Trp.
Вследствие их особой роли в архитектуре белков, три остатка представлены в скобках. Gly является единственным остатком без боковой цепи, поэтому он придает гибкость всей цепи. Pro обладает необычной геометрией, которая сильно ограничивает всю цепь. Cys может образовывать дисульфидный мостик.
Аминокислотные варианты, описанные выше, можно легко получить при помощи известных методов синтеза пептидов, таких, к примеру, как твердофазный синтез (Merrifield, 1964) и аналогичные методы или использование рекомбинантной ДНК. Обработка последовательностей ДНК для получения белков и пептидов с заменами, вставками или делециями подробно описана, к примеру, в Sambrook et al. (1989).
В соответствии с изобретением, "производные" белков и пептидов также охватывают единичные или множественные замены, делеции и/или вставки любых молекул, связанных с белком или пептидом, таких как углеводы, липиды и/или белки и пептиды. Термин "производные" также распространяется на все функциональные химические эквиваленты данных белков и пептидов.
В соответствии с изобретением, часть или фрагмент опухолеассоциированного антигена предпочтительно обладает функциональными свойствами того белка или пептида, из которого он происходит. Такие функциональные свойства включают взаимодействие с антителами, взаимодействие с другими пептидами или белками, избирательное связывание нуклеиновых кислот и ферментативную активность. Особенно важным свойством является способность к образованию комплекса с молекулами МНС и, если нужно, вырабатывать иммунный ответ, предпочтительно путем стимуляции цитотоксических или хелперных T-клеток. Часть или фрагмент опухолеассоциированного антигена по изобретению предпочтительно содержит последовательность по меньшей мере из 6, в частности по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30 или по меньшей мере 50 последовательных аминокислот опухолеассоциированного антигена. Часть или фрагмент опухолеассоциированного антигена по изобретению предпочтительно содержит последовательность из вплоть до 8, в частности до 10, до 12, до 15, до 20, до 30 или до 55 последовательных аминокислот опухолеассоциированного антигена. Часть или фрагмент опухолеассоциированного антигена предпочтительно представляет собой ту часть опухолеассоциированного антигена, которая не относится к трансмембранной части, в особенности внеклеточную часть антигена или входящую в ее состав.
Предпочтительно части или фрагменты опухолеассоциированного антигена по изобретению в особенности подходят для стимуляции цитотоксических T-лимфоцитов in vivo, а также для получения экспандированных и стимулированных T-лимфоцитов для терапевтической передачи адоптивного иммунитета ex vivo.
Часть или фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующей опухолеассоциированный антиген по изобретению, относится к той части нуклеиновой кислоты, которая кодирует по крайней мере опухолеассоциированный антиген и/или часть или фрагмент данного опухолеассоциированного антигена, как определено выше. Часть или фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующей опухолеассоциированный антиген, предпочтительно представляет собой ту часть нуклеиновой кислоты, которая соответствует открытой рамке считывания.
В соответствии с изобретением, предпочтительные воплощения должны включать получение "отрицательно доминантных" белков или пептидов, происходящих из опухолеассоциированных антигенов. Отрицательно доминантный белок или пептид представляет собой неактивный вариант белка или пептида, который, при взаимодействии с клеточным механизмом, вытесняет активный белок или пептид из взаимодействия с клеточным механизмом либо конкурирует с активным белком или пептидом, тем самым уменьшая действие данного активного белка.
Антисыворотки, содержащие специфические антитела, которые специфически связываются с белком мишени, могут быть получены различными стандартными способами, например, см. "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" by Philip Shepherd, Christopher Dean, ISBN 0-19-963722-9; "Antibodies: A Laboratory Manual" by Ed Harlow, David Lane, ISBN 0879693142; "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN 0879695447. При этом можно также получить аффинные и специфические антитела, распознающие сложные мембранные белки в нативном виде (Azorsa et al., J. Immunol. Methods 229: 35-48, 1999; Anderson et al., J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 107-116, 2000). Это в особенности относится к получению тех антител, которые собираются использовать в терапии, но также и ко многим диагностическим применениям. При этом можно проводить иммунизацию целым белком, внеклеточными частичными отрезками, а также клетками, экспрессирующими молекулу мишени в физиологически свернутом виде.
Моноклональные антитела обычно получают по гибридомной технологии (насчет технических деталей см. "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" by Philip Shepherd, Christopher Dean, ISBN 0-19-963722-9; "Antibodies: A Laboratory Manual" by Ed Harlow, David Lane, ISBN 0879693142; "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN 0879695447).
2
Известно, что лишь небольшая часть молекулы антитела - паратоп участвует в связывании антитела со своим эпитопом (см. Clark W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt I. (1991) Essential Immunology, 7th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford). Например, области pFc' и Fc являются эффекторами каскада комплемента, но не участвуют в связывании антигена. Антитело, именуемое фрагментом F(ab'), у которого область pFc' была удалена энзиматически либо которое было получено без области pFc', несет оба антигенсвязывающих участка полного антитела. Так же и антитело, именуемое фрагментом Fab, у которого область Fc была удалена энзиматически либо которое было получено без области Fc, несет один антигенсвязывающий участок интактной молекулы антитела. Кроме того, фрагменты Fab состоят из легкой цепи антитела, ковалентно связанной с частью тяжелой цепи данного антитела, именуемой Fd. Фрагменты Fd являются главными детерминантами специфичности антител (с одним фрагментом Fd может связываться до 10 различных легких цепей без изменения специфичности антитела), причем выделенные фрагменты Fd сохраняют способность к связыванию с эпитопом.
В пределах антигенсвязывающей части антитела располагаются определяющие комплементарность участки (CDR), которые непосредственно взаимодействуют с эпитопом антигена, и каркасные участки (FR), которые поддерживают третичную структуру паратопа. Фрагмент Fd тяжелой цепи и легкая цепь иммуноглобулинов типа IgG содержат по 4 каркасных участка (FR1-FR4), которые в каждом случае разделены тремя участками комплементарности (CDR1-CDR3). Участки CDR, в частности участки CDR3 и в особенности участок CDR3 тяжелой цепи, в большой степени отвечают за специфичность антител.
Не содержащие CDR участки антител млекопитающих могут быть заменены аналогичными участками антител, имеющих такую же или другую специфичность, при этом сохраняется специфичность исходного антитела к эпитопу. Это дало возможность разработать "гуманизированные антитела", у которых чужие участки CDR ковалентно соединяются с участками FR и/или Fc/pFc' человека, образуя функциональное антитело.
В качестве примера, в WO 92/04381 описано получение и применение гуманизированных мышиных антител RSV, у которых по меньшей мере часть участков FR мыши заменена участками FR человека. Антитела такого типа, в том числе фрагменты интактных антител, обладающие способностью к связыванию с антигеном, зачастую именуют "химерными" антителами.
2
В соответствии с изобретением, термин "антитело" также охватывает фрагменты F(ab'), Fab, Fvи Fd антител, химерные антитела, у которых участки Fc и/или FR и/или CDR1 и/или CDR2 и/или участки CDR3 легкой цепи заменены гомологичными последовательностями человека и не только человека, антитела с химерным фрагментом Fab, у которых участки FR и/или CDR1 и/или CDR2 и/или участки CDR3 легкой цепи заменены гомологичными последовательностями человека и не только человека, и антитела с химерным фрагментом Fd, у которых участки FR и/или CDR1 и/или CDR2 заменены гомологичными последовательностями человека и не только человека. Термин "антитело" также охватывает "одноцепочечные" антитела.
Изобретение также охватывает белки и пептиды, специфически связывающиеся с опухолеассоциированными антигенами. Связывающиеся вещества такого типа могут быть получены, к примеру, из библиотек вырожденных пептидов, которые можно получить прямо в растворе в иммобилизованном виде либо в виде библиотек фагового дисплея. Точно так же можно получить комбинаторные библиотеки пептидов по одной или нескольким аминокислотам. Также можно получить библиотеки из пептоидов и непептидных синтетических остатков.
Антитела также можно конъюгировать со специфическими диагностическими веществами для выявления клеток и тканей, экспрессирующих опухолеассоциированные антигены. Их также можно конъюгировать с терапевтически полезными веществами.
Диагностические вещества включают любые метки, функционирование которых заключается в том, чтобы: (i) издавать детектируемый сигнал, (ii) взаимодействовать со второй меткой, модифицируя детектируемый сигнал, издаваемый первой или второй меткой, напр., сигнал FRET (флуоресцентно-резонансного переноса энергии), (iii) отражать подвижность, напр., электрофоретическую подвижность в зависимости от заряда, гидрофобности, формы или других физических параметров, или (iv) служить фиксирующей молекулой, напр., аффинная метка, антитело/антиген или образование ионного комплекса. В качестве метки пригодны такие структуры, как флуоресцентные метки, люминесцентные метки, хромофорные метки, радиоизотопные метки, изотопные метки, предпочтительно устойчивые изотопные метки, изобарические метки, ферментные метки, метки на основе частиц, в частности металлических частиц, магнитных частиц, полимерных частиц, небольшие органические молекулы типа биотина, лиганды рецепторов или связывающие молекулы типа белков клеточной адгезии или лектинов, метки-последовательности, содержащие такие нуклеиновые кислоты и/или аминокислотные остатки, которые можно детектировать с помощью связывающих реагентов и др. Диагностические вещества включают, и не только, сульфат бария, иоцетамовую кислоту, иопаноевую кислоту, иподат кальция, диатризоат натрия, диатризоат меглумина, метризамид, тиропаноат натрия и средства радиодиагностики, в том числе такие позитронные излучатели, как фтор-18 и углерод-11, такие гамма-излучатели, как йод-123, технеций-99m, йод-131 и индий-111, такие нуклиды для ядерного магнитного резонанса, как фтор и гадолиний.
В соответствии с изобретением, термин "терапевтически полезное вещество" обозначает любые молекулы, которые могут оказывать лечебное действие. В соответствии с изобретением, терапевтически полезное вещество предпочтительно избирательно направляется на клетки, экспрессирующие один или несколько опухолеассоциированных антигенов, и к ним относятся противораковые средства, радиоактивные соединения, меченные иодом, токсины, цитостатические или цитолитические препараты и др. Противораковые средства включают, к примеру, аминоглутетимид, азатиоприн, блеомицина сульфат, бусульфан, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, циклофосфамид, циклоспорин, цитарабидин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубин, доксорубицин, таксол, этопозид, фторурацил, α-интерферон, ломустин, меркаптопурин, метотрексат, митотан, прокарбазин⋅HCl, тиогуанин, винбластин сульфат и винкристин сульфат. Другие противораковые препараты описаны, к примеру, в Goodman and Gilman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics". 8th Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc., в частности гл. 52 (Антинеопластические препараты) (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner). Токсины могут представлять собой белки, такие как антивирусный белок лаконоса, холерный токсин, коклюшный токсин, рицин, гелонин, абрин, дифтерийный экзотоксин или экзотоксин Pseudomonas. Токсинами могут служить и такие сильно-излучающие радионуклиды, как кобальт-60.
Термин "главный комплекс гистосовместимости", или "МНС", относится к комплексу генов, имеющихся у всех позвоночных. Белки или молекулы МНС участвуют в передаче сигналов между лимфоцитами и антигенпрезентирующими клетками при нормальных иммунных реакциях, связывая пептиды и презентируя их для распознавания T-клеточными рецепторами (TCR). Молекулы МНС связывают пептиды во внутриклеточном компартменте процессинга и презентируют эти пептиды на поверхности антигенпрезентирующих клеток для распознавания Т-клетками. У человека область МНС, называемая также HLA, располагается на хромосоме 6 и включает участки I класса и II класса. В одном предпочтительном воплощении всех аспектов изобретения молекула МНС представляет собой молекулу HLA.
"Понизить" или "ингибировать" в настоящем изобретении означает способность вызывать общее снижение уровня, напр., уровня белка или мРНК, предпочтительно на 20% или больше, более предпочтительно на 50% или больше и наиболее предпочтительно на 75% или больше по сравнению с контрольным образцом (напр., образцом, не обработанным SiRNA). Такое снижение или ингибирование экспрессии РНК или белка может произойти посредством направленного расщепления или деградации мРНК. Методы анализа экспрессии белков или экспрессии нуклеиновых кислот известны в этой области и включают, к примеру, метод ELISA, вестерн-блоттинг для анализа экспрессии белка и нозерн-блоттинг или защита от РНКаз для анализа РНК.
Термин "пациент" по изобретению обозначает человека, других приматов или других животных, в частности млекопитающих, как-то коров, лошадей, свиней, овец, коз, собак, кошек или таких грызунов, как мыши и крысы. В особенно предпочтительном воплощении пациентом является человек.
"Аномальная экспрессия" по изобретению означает, что экспрессия нарушена, предпочтительно повышена, по сравнению с ее состоянием у здорового индивидуума.
В соответствии с изобретением, термин "повышение" или "повышение количества" предпочтительно означает повышение по меньшей мере на 10%, в особенности по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 50% или по меньшей мере на 100%. Количество вещества также считается повышенным в тестируемом образце, к примеру, в биологическом образце по сравнению с контрольным образцом, если оно обнаруживается в тестируемом образце, но отсутствует или не обнаруживается в контрольном образце.
В соответствии с изобретением, термин "заболевание" относится к любому патологическому состоянию, при котором опухолеассоциированные антигены экспрессируются или аномально экспрессируются. "Аномальная экспрессия" по изобретению означает, что экспрессия нарушена, предпочтительно повышена, по сравнению с ее состоянием у здорового индивидуума. Повышение экспрессии означает повышение по меньшей мере на 10%, в особенности по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 50% или по меньшей мере на 100%. В одном воплощении опухолеассоциированный антиген экспрессируется только в ткани больного индивидуума, тогда как у здорового индивидуума экспрессия репрессирована. Одним из примеров таких заболеваний является рак, при этом термин "рак" по изобретению охватывает лейкемии, семиномы, меланомы, тератомы, лимфомы, нейробластомы, глиомы, рак прямой кишки, рак эндометрия, рак почек, рак надпочечников, рак щитовидной железы, рак крови, рак кожи, рак мозга, рак шейки матки, рак кишечника, рак печени, рак толстой кишки, рак желудка, рак кишечника, рак головы и шеи, желудочно-кишечный рак, рак лимфатических узлов, рак пищевода, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак уха, горла, носа (ENT), рак молочной железы, рак простаты, рак матки, рак яичников и рак легких, а также их метастазы. Примерами таковых являются карциномы легких, карциномы молочной железы, карциномы простаты, карциномы толстой кишки, почечно-клеточной карциномы, карциномы шейки матки либо метастазы типов рака или опухолей, описанных выше. Термин "рак" по изобретению также охватывает раковые метастазы.
Под "опухолью" понимается аномальная группа клеток или ткань, растущая путем быстрой, неконтролируемой пролиферации и продолжающая расти после прекращения того воздействия, которое вызвало рост новообразования. Опухоли проявляют частичное или полное отсутствие структурной организации и функциональной координации с нормальной тканью и обычно образуют особую массу ткани, которая может быть либо доброкачественной, либо злокачественной.
Под "метастазированием" понимается распространение раковых клеток из первоначального места в другую часть организма. Образование метастазов является очень сложным процессом и обусловлено отделением злокачественных клеток от первичной опухоли, инвазией внеклеточного матрикса, проникновением через базальные мембраны эндотелия в полости и сосуды организма, а затем, после переноса кровью, инфильтрацией органов-мишеней. В конечном счете, развитие новой опухоли на месте мишени зависит от ангиогенеза. Метастазирование зачастую происходит даже после удаления первичной опухоли потому, что клетки или компоненты опухоли могут остаться и приобрести метастатический потенциал. В одном воплощении термин "метастазирование" по изобретению относится к "удаленным метастазам", что означает метастазы, удаленные от первичной опухоли и локальной системы лимфатических узлов.
В соответствии с изобретением, биологический образец может представлять собой образец ткани, включая внутренние жидкости, и/или клеточный образец, и может быть получен традиционным методом типа тканевой биопсии, включая биопсию с проколом, и отбором проб крови, мокроты, бронхиальной жидкости, мокроты, мочи, кала или других жидкостей организма. В соответствии с изобретением, термин "биологический образец" охватывает и фракции из биологических образцов.
+
В соответствии с изобретением, термин "иммунореактивные клетки" обозначает клетки, которые могут дать начало иммунным клеткам (как-то B-клеткам, хелперным T-клеткам или цитолитическим T-клеткам) при соответствующей стимуляции. К иммунореактивным клеткам относятся гемопоетические стволовые клетки CD34, незрелые и зрелые T-клетки и незрелые и зрелые B-клетки. Если нужно получить цитолитические или хелперные T-клетки, распознающие опухолеассоциированный антиген, то иммунореактивные клетки подвергают контакту с клетками, экспрессирующими опухолеассоциированный антиген, в условиях, способствующих продукции, дифференцировке и/или отбору цитолитических T-клеток или хелперных T-клеток. Дифференцировка предшественников T-клеток в цитолитические T-клетки при соприкосновении с антигеном аналогична клональной селекции в иммунной системе.
Термины "T-клетки" и "T-лимфоциты" в настоящем изобретении применяются взаимозаменяемым образом и охватывают хелперные T-клетки и цитотоксические T-клетки, в том числе цитолитические T-клетки.
Некоторые терапевтические методы основываются на реакции иммунной системы пациента, приводящей к лизису таких антигенпрезентирующих клеток, как раковые клетки, несущие один или несколько опухолеассоциированных антигенов. В этой связи, к примеру, пациенту с клеточной патологией вводятся аутологические цитотоксические T-лимфоциты, специфичные к комплексу опухолеассоциированного антигена с молекулой МНС. Способы получения таких цитотоксических T-лимфоцитов in vitro известны. Пример способа дифференцировки T-клеток приведен в WO-A-9633265. В общем, у пациента берут образец, содержащий клетки типа клеток крови, и эти клетки подвергают контакту с клетками, презентирующими комплекс, которые могут вызвать размножение цитотоксических T-лимфоцитов (напр., дендритных клеток). Клетки мишени могут представлять собой трансфицированные клетки типа клеток COS. Такие трансфицированные клетки презентируют требуемый комплекс на своей поверхности, а при контакте с цитотоксическими T-лимфоцитами стимулируют их размножение. Затем прошедшие клональную экспансию аутологические цитотоксические T-лимфоциты вводятся пациенту.
В другом способе селекции специфичных к антигену цитотоксических T-лимфоцитов используются флуорогенные тетрамеры комплексов молекул МНС I класса с пептидами для получения специфических клонов цитотоксических T-лимфоцитов (Altman et al., Science 274: 94-96, 1996; Dunbar et al., Curr. Biol. 8: 413-416, 1998).
Настоящее изобретение также включает терапевтические методы, именуемые адоптивным переносом (Greenberg, J. Immunol. 136(5): 1917, 1986; Riddel et al., Science 257: 238, 1992; Lynch et al., Eur. J. Immunol. 21: 1403-1410, 1991; Kast et al., Cell 59: 603-674, 1989), в которых клетки, презентирующие требуемый комплекс (напр., дендритные клетки), смешивают с цитотоксическими T-лимфоцитами подлежащего лечению пациента, что приводит к размножению специфических цитотоксических T-лимфоцитов. Затем размноженные цитотоксические T-лимфоциты вводятся пациенту с клеточной патологией, характеризующейся тем, что определенные аномальные клетки презентируют специфический комплекс. Цитотоксические Т-лимфоциты затем лизируют аномальные клетки, и тем самым достигается требуемый терапевтический эффект.
Более того, клетки, презентирующие требуемый комплекс (напр., дендритные клетки), можно смешать с цитотоксическими Т-лимфоцитами здорового индивидуума или из другого вида (напр., мыши), что приведет к размножению специфических цитотоксических Т-лимфоцитов с высокой аффинностью. Высокоаффинный T-клеточный рецептор этих размноженных цитотоксических T-лимфоцитов можно клонировать и необязательно в некоторой степени гуманизировать, а полученные при этом T-клеточные рецепторы трансдуцировать путем генного переноса, например, с помощью ретровирусного вектора, в T-клетки пациента. Затем можно провести адоптивный перенос, используя эти генетически модифицированные T-лимфоциты (Stanislawski et al., Nat. Immunol. 2: 962-70, 2001; Kessels et al., Nat. Immunol. 2: 957-61,2001).
Адоптивный перенос не является единственной формой терапии, которую можно применять в соответствии с изобретением. Цитотоксические Т-лимфоциты можно также получить in vivo известными по сути методами. В одном методе используют непролиферативные клетки, экспрессирующие комплекс. При этом используют клетки, которые обычно экспрессируют этот комплекс, к примеру, облученные опухолеассоциированные клетки или клетки, трансфицированные одним или обоими генами, необходимыми для презентации комплекса (т.е. антигенного пептида и презентирующей молекулы МНС). Другой предпочтительной формой является введение опухолеассоциированного антигена в виде рекомбинантной РНК, которую можно ввести в клетки, к примеру, методом липосомного переноса или электропорации. Полученные клетки презентируют искомый комплекс и распознаются аутологическими цитотоксическими Т-лимфоцитами, которые затем размножаются.
Аналогичный эффект может быть достигнут смешиванием опухолеассоциированного антигена или его фрагмента с адъювантом, что создает возможность внедрения его в антигенпрезентирующие клетки in vivo. Опухолеассоциированный антиген или его фрагмент может быть представлен в виде белка, ДНК (напр., в составе вектора) или РНК. Опухолеассоциированный антиген подвергается процессингу с образованием пептида-партнера для молекулы МНС, тогда как его фрагмент может презентироваться и без дополнительного процессинга. Последнее справедливо в том случае, если фрагмент может связываться с молекулами МНС. Предпочтение отдается таким лекарственным формам, в которых полный антиген подвергается процессингу in vivo дендритными клетками, так как при этом вырабатываются хелперные Т-клеточные ответы, которые необходимы для эффективного иммунного ответа (Ossendorp et al., Immunol. Lett. 74: 75-9, 2000; Ossendorp et al., J. Exp. Med. 187: 693-702, 1998). В общем случае эффективное количество опухолеассоциированного антигена можно ввести пациенту, к примеру, посредством интрадермальной инъекции. Однако инъекции можно делать и интранодально в лимфатический узел (Maloy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 3299-303, 2001).
Фармацевтические композиции и способы лечения, описанные согласно изобретению, также можно использовать для иммунизации или вакцинации для терапевтического лечения или профилактики описанным в нем заболеваний. В соответствии с изобретением, термины "иммунизация" или "вакцинация" предпочтительно относятся к повышению или активации иммунного ответа на антиген. Можно использовать модели на животных для тестирования эффекта иммунизации на рак с применением опухолеассоциированного антигена или кодирующей его нуклеиновой кислоты. Так, можно ввести раковые клетки человека мышам для образования опухоли, и можно ввести одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих опухолеассоциированный антиген. В качестве меры эффективности иммунизации нуклеиновой кислотой можно измерить эффект на раковые клетки (например, уменьшение размера опухоли).
В составе композиции для иммунизации или вакцинации предпочтительно один или несколько опухолеассоциированных антигенов или их стимулирующих фрагментов вводятся вместе с одним или несколькими адъювантами, чтобы вызвать иммунный ответ или усилить иммунный ответ. Адъювант представляет собой вещество, которое включается в антиген или вводится вместе с ним и усиливает иммунный ответ. Адъюванты могут усиливать иммунный ответ за счет использования резервуара антигена (внеклеточного или в макрофагах), активации макрофагов и/или стимуляции определенных лимфоцитов. Адъюванты хорошо известны, к ним относятся (но не только) монофосфорил липида A (MPL, SmithKline Beecham), такие сапонины, как QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18, и GS-L1 (So et al., Mol. Cells 7: 178-186, 1997), неполный адъювант Фрейнда, полный адъювант Фрейнда, витамин E, монтанид, квасцы, олигонуклеотиды CpG (см. Kreig et al., Nature 374: 546-9, 1995) и различные эмульсии типа вода в масле, полученные из таких биологически разрушимых масел, как сквален и/или токоферол. Предпочтительно пептиды вводятся в смеси с DQS21/MPL. Соотношение DQS21 к MPL обычно составляет от 1:10 до 10:1, предпочтительно от 1:5 до 5:1 и особенно 1:1. Для введения человеку рецептуры вакцин обычно содержат DQS21 и MPL в пределах от 1 мкг до 100 мкг.
Можно вводить и другие вещества, стимулирующие иммунные ответы пациента. Например, при вакцинации можно использовать цитокины вследствие их регулирующих свойств на лимфоциты. К таким цитокинам относятся, к примеру, интерлейкин-12 (IL-12), который, как оказалось, усиливает защитное действие вакцин (см. Science 268: 1432-1434, 1995), GM-CSF и IL-18.
Существует целый ряд соединений, усиливающих иммунный ответ, которые поэтому можно использовать при вакцинации. К таким соединениям относятся костимулирующие молекулы, представленные в виде белков или нуклеиновых кислот, таких как B7-1 и B7-2 (CD80 и CD86, соответственно).
Изобретение также предусматривает введение нуклеиновых кислот, белков или пептидов. Белки и пептиды можно вводить известными по сути способами. В одном воплощении нуклеиновые кислоты вводятся методами ex vivo, т.е. выделяются клетки из пациента, эти клетки подвергаются генетической модификации для включения опухолеассоциированного антигена, а модифицированные клетки вводятся обратно пациенту. Обычно это включает введение функциональной копии гена в клетки пациента in vitro и обратное введение генетически измененных клеток пациенту. Функциональная копия гена находится под функциональным контролем регуляторных элементов, способствующих экспрессии гена в генетически измененных клетках. Методы трансфекции и трансдукции известны специалистам. Изобретение также предусматривает введение нуклеиновых кислот in vivo с помощью таких векторов, как вирусы и нацеленные на мишень липосомы. Если по изобретению указывается введение или включение в фармацевтические композиции нуклеиновых кислот, то это включает воплощения, в которых нуклеиновая кислота находится в таких векторах.
В предпочтительном воплощении вирус или вирусный вектор для введения нуклеиновой кислоты, кодирующей опухолеассоциированный антиген, выбирают из группы, состоящей из аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, поксвирусов, включая вирус коровьей оспы и ослабленные оспенные вирусы, вируса Семлики, ретровирусов, вируса Синдбис и вирусоподобных частиц Ту-частиц. Особое предпочтение отдается аденовирусам и ретровирусам. Как правило, ретровирусы являются дефектными по репликации (т.е. они неспособны образовывать инфекционные частицы).
Методы введения нуклеиновых кислот в клетки in vitro или in vivo включают трансфекцию при осаждении нуклеиновых кислот фосфатом кальция, трансфекцию нуклеиновых кислот, связанных с DEAE, трансфекцию или инфекцию вышеприведенными вирусами, несущими нужные нуклеиновые кислоты, трансфекцию с помощью липосом и др. В предпочтительных воплощениях предпочтение отдается направлению нуклеиновой кислоты в определенные клетки. В таких воплощениях носитель, используемый для введения нуклеиновой кислоты в клетки (напр., ретровирус или липосомы), может содержать связанную молекулу для контроля мишени. Например, в носитель нуклеиновой кислоты можно включить или присоединить к нему такие молекулы, как антитела, специфичные к мембранному белку на поверхности клеток мишени, или лиганд рецептора на клетках мишени. Предпочтительными антителами являются такие антитела, которые избирательно связываются с опухолеассоциированным антигеном. Если желательно введение нуклеиновой кислоты через липосомы, то в состав липосом можно включить белки, связывающиеся с поверхностным мембранным белком, участвующем в эндоцитозе, чтобы создать возможность контроля и/или захвата мишени. К таким белкам относятся белки капсид или их фрагменты, специфичные к определенному типу клеток, антитела к белкам, подвергающимся интернализации, белки, отправляющиеся внутрь клетки, и т.п.
Терапевтические композиции по изобретению можно вводить в виде фармацевтически совместимых препаратов. Такие препараты обычно могут содержать фармацевтически приемлемые концентрации солей, буферных веществ, консервантов, носителей, повышающих иммунитет вспомогательных веществ типа адъювантов, например, олигонуклеотидов CpG, цитокинов, хемокинов, сапонина, GM-CSF и/или РНК, а при необходимости и другие терапевтически активные соединения.
Терапевтически активные соединения по изобретению можно вводить любым традиционным способом, включая уколы или вливания. Введение может осуществляться, к примеру, перорально, внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно или трансдермально. Предпочтительно антитела вводятся терапевтически в легкие в виде аэрозоля. Антисмысловые нуклеиновые кислоты предпочтительно вводятся внутривенно при медленном введении.
Композиции по изобретению применяются в эффективных количествах. "Эффективное количество" означает такое количество, которое вызывает нужную реакцию или требуемый эффект само по себе или вместе с дополнительными дозами. При лечении определенной болезни или определенного заболевания, характеризующегося экспрессией одного или нескольких опухолеассоциированных антигенов, требуемая реакция предпочтительно касается торможения хода заболевания. Это включает замедление развития заболевания и, в особенности, прерывание или прекращение развития заболевания. Требуемая реакция при лечении болезни или заболевания также может заключаться в замедлении или предотвращении возникновения данной болезни или данного заболевания. В соответствии с изобретением, диагностика или лечение рака также может включать диагностику или лечение метастазов рака, либо уже возникших, либо появляющихся. В соответствии с изобретением, термин "лечение" включает терапевтическое и профилактическое лечение, т.е. профилактику.
Эффективное количество композиции по изобретению зависит от подлежащего лечению заболевания, тяжести болезни, индивидуальных параметров пациента, в том числе возраста, физиологического состояния, размера и веса, продолжительности лечения, типа сопровождающей терапии (если она есть), конкретного способа применения и других факторов.
Фармацевтические композиции по изобретению предпочтительно являются стерильными и содержат эффективное количество терапевтически активного вещества для получения нужной реакции или требуемого эффекта.
Вводимые дозы композиций по изобретению могут зависеть от различных параметров, таких как способ применения, состояние пациента, желательная продолжительность введения и т.д. В том случае, когда у пациента отмечается недостаточная реакция при исходной дозе, можно использовать более высокие дозы (или эффективно более высокие дозы, достигаемые при другом, более локальном способе применения).
В общем, дозы опухолеассоциированного антигена составляют от 1 нг до 1 мг, предпочтительно от 10 нг до 100 мг, и вводятся для лечения или для выработки или повышения иммунного ответа. Если требуется введение нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), кодирующих опухолеассоциированные антигены, то применяются дозы, составляющие от 1 нг до 0,1 мг.
Фармацевтические композиции по изобретению обычно применяются в фармацевтически приемлемых количествах и в фармацевтически приемлемых композициях. Термин "фармацевтически приемлемый" обозначает нетоксический материал, который не мешает действию активного компонента фармацевтической композиции. Препараты такого типа обычно могут содержать соли, буферные вещества, консерванты, носители, а при необходимости и другие терапевтически активные соединения. При использовании в медицине соли должны быть фармацевтически приемлемыми. Однако можно использовать соли, не являющиеся фармацевтически приемлемыми, для получения фармацевтически приемлемых солей, и они включены в настоящее изобретение. К фармакологически и фармацевтически приемлемым солям этого типа относятся, без ограничения, соли следующих кислот: соляной, бромоводородной, серной, азотной, фосфорной, малеиновой, уксусной, салициловой, лимонной, муравьиной, малоновой, янтарной кислоты и др. Фармацевтически приемлемый соли могут быть получены и в виде солей щелочных металлов или щелочноземельных металлов, к примеру, солей натрия, солей калия или солей кальция.
Фармацевтическая композиция по изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель. В соответствии с изобретением, термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к одному или нескольким совместимым твердым или жидким наполнителям, разбавителям или инкапсулирующим веществам, которые пригодны для введения человеку. Термин "носитель" относится к органическому или неорганическому компоненту природного или синтетического происхождения, с которым смешивают активный компонент для того, чтобы облегчить применение. Компоненты фармацевтической композиции по изобретению обычно таковы, что не возникает таких взаимодействий, которые существенно ухудшают требуемую фармацевтическую эффективность.
Фармацевтические композиции по изобретению могут содержать подходящие буферные вещества, к примеру, уксусную кислоту в виде соли, лимонную кислоту в виде соли, борную кислоту в виде соли и фосфорную кислоту в виде соли.
Фармацевтические композиции, если нужно, также могут содержать подходящие консерванты, к примеру, бензалкония хлорид, хлорбутанол, парабен и тимеросал.
Фармацевтические композиции обычно представлены в унифицированной лекарственной форме и могут быть получены известными по сути методами. Фармацевтические композиции по изобретению могут иметь вид капсул, таблеток, леденцов, растворов, суспензий, сиропов, эликсиров или, к примеру, эмульсий.
Композиции, пригодные для парентерального введения, обычно содержат стерильный водный или неводный препарат активного соединения, который предпочтительно изотоничен крови реципиента. Примерами совместимых носителей и растворителей являются раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве среды для растворов или суспензий обычно используют и стерильные жирные масла.
Настоящее изобретение раскрывается подробно на приведенных ниже фигурах и примерах, которые служат только для иллюстрации, но не для ограничения. Благодаря описанию и примерам, специалистам доступны дополнительные воплощения, которые также включены в изобретение.
Краткое описание фигур
Фиг.1. Экспрессия мРНК ISC-468.
A. Исследование методом ОТ-ПЦР с помощью специфичных к ISC-468 праймеров показало отсутствие заметной экспрессии во всех исследованных нормальных тканях за исключением плаценты. В. Экспрессия мРНК ISC-468 в карциномах головы и шеи, печени, почек и толстой кишки. C. Экспрессия мРНК ISC-468 в карциномах молочной железы, яичников и желудка.
Фиг.2. Количественный анализ методом ПЦР экспрессии мРНК ISC-468 в нормальных контрольных тканях и при раке молочной железы.
Исследование методом ПЦР в реальном времени с помощью специфичных к ISC-468 праймеров показало избирательную экспрессию мРНК в нормальных яичках, плаценте, желудке и РВМС, а также во всех биопсиях карциномы молочной железы.
Фиг.3. Специфическая экспрессия ISC-507 в нормальных яичках и в карциноме простаты.
Анализ методом ОТ-ПЦР с помощью специфичных к гену ISC-507 праймеров показал амплификацию кДНК исключительно в нормальных яичках (A) и биопсиях карциномы простаты (B).
Фиг.4. Количественная экспрессия ISC-507.
Количественный метод ОТ-ПЦР с помощью специфичных к ISC-507 праймеров показал избирательную экспрессию в образцах яичек, лимфатических узлов и простаты и в образцах рака простаты.
Фиг.5. Экспрессия ISC-466 в нормальных яичках и различных опухолевых образцах.
Анализ методом ОТ-ПЦР с помощью специфичных к ISC-466 праймеров показал отсутствие экспрессии в нормальных тканях за исключением плаценты (A) и наличие экспрессии в биопсиях карциномы головы и шеи и в биопсиях карциномы почек (B). Заметная экспрессия также обнаружена в клеточных линиях рака молочной железы и легких, а также в клеточных линиях рака яичников (C и D).
Фиг.6. Экспрессия мРНК ISC-518.
Анализ методом ОТ-ПЦР с помощью специфичных к ISC-518 праймеров показал отсутствие экспрессии в нормальных тканях за исключением яичек.
Фиг.7. Количественная экспрессия ISC-518.
Количественный метод ОТ-ПЦР показал высокую и избирательную экспрессию в нормальных яичках и в одном объединенном образце карциномы печени.
Фиг.8. Экспрессия ISC-477 в нормальных и опухолевых тканях.
Исследование методом ОТ-ПЦР с помощью специфичных к ISC-477 праймеров показало избирательную экспрессию в нормальных тканях плаценты и яичников (A) и высокую экспрессию в исследованных карциномах желудка (В), карциномах молочной железы и легких, толстой кишки и легких (C), а также в образцах карциномы яичников и поджелудочной железы (D).
Фиг.9. Экспрессия мРНК ISC-489.
Исследование методом ОТ-ПЦР с помощью специфичных к ISC-489 праймеров показало избирательную экспрессию в контрольной ткани плаценты, а также различные уровни экспрессии в образцах карциномы легких (A, C), карциномы желудка (B, C), опухолей головы и шеи (С) и образцах карциномы печени (C).
Фиг.10. Экспрессия ISC-461 в нормальных яичках и различных опухолевых образцах.
Исследование методом ОТ-ПЦР с помощью специфичных к ISC-461 праймеров показало избирательную экспрессию в контрольной ткани плаценты, а также различные уровни экспрессии в образцах карциномы молочной железы и меланомы (B), а также в клеточных линиях карциномы молочной железы, карциномы легких и меланомы (C) и клеточных линиях карциномы яичников (D).
Фиг.11. Экспрессия мРНК ISC-465 в плаценте и раковых образцах.
Исследование методом ОТ-ПЦР с помощью специфичных к ISC-465 праймеров показало избирательную экспрессию в плаценте (A) и в некоторых клеточных линиях, полученных из рака молочной железы, меланомы, рака легких или рака желудка (B).
Фиг.12. Количественная экспрессия Mem-030.
A. Количественный метод ОТ-ПЦР с помощью специфичных к Mem-030 праймеров показал значительную суперэкспрессию во всех исследованных образцах карциномы головы и шеи. Подвергали анализу следующие нормальные ткани: мочевой пузырь, головной мозг, костный мозг, шейку матки, толстую кишку, двенадцатиперстную кишку, сердце, легкие, лимфатические узлы, молочную железу, мышцы, яичники, РВМС, активированные РВМС, плаценту, предстательную железу, сетчатку, селезенку, желудок, яички, щитовидную железу и миндалины. B. Преобладание Mem-030 в карциномах пищевода, печени, матки и в тканях из меланомы.
Фиг.13. Количественная экспрессия Mem-055.
Количественный метод ОТ-ПЦР с помощью специфичных к Mem-055 праймеров показал высокую и избирательную экспрессию в нормальных контрольных тканях и значительную суперэкспрессию в тканях из рака желудка и молочной железы (A). Mem-055 также подвергается суперэкспрессии в карциномах печени, карциномах яичников и образцах рака молочной железы (B).
Фиг.14. Экспрессия мРНК Mem-062.
Анализ методом ОТ-ПЦР с помощью специфичных к Mem-064 праймеров показал избирательную экспрессию в яичках и слабую экспрессию в тканях из рака легких (A). Сильная, значительная экспрессия транскриптов Mem-064 отмечена в различных опухолях яичников (B).
Фиг.15. Специфическая экспрессия Mem-068 в нормальных яичках и почечно-клеточных карциномах.
Анализ методом ОТ-ПЦР с помощью специфичных к гену Mem-068 праймеров показал амплификацию кДНК в нормальных яичках, слабую в плаценте (A), в образцах почечно-клеточной карциномы и рака желудка (B).
Фиг.16. Экспрессия Mem-071 в нормальных яичках и различных опухолевых образцах.
Анализ методом ОТ-ПЦР с помощью специфичных к Mem-071 праймеров показал отсутствие экспрессии в нормальных тканях за исключением яичек (A). Заметная экспрессия также обнаружена в образцах почечно-клеточной карциномы и рака желудка (B).
Фиг.17. Экспрессия мРНК Mem-072.
Анализ методом ОТ-ПЦР с помощью специфичных к Mem-072 праймеров показал отсутствие экспрессии в нормальных тканях (A) и значительную экспрессию в различных образцах рака легких (A+B).
Фиг.18. Экспрессия Mem-106 в нормальных опухолевых тканях.
Исследование методом ОТ-ПЦР с помощью специфичных к Mem-106 праймеров показало отсутствие экспрессии в нормальных тканях за исключением яичек (A) и высокий уровень экспрессии в карциномах яичников и простаты, а также в меланомах и клеточных линиях рака толстой кишки (B).
Фиг.19. Экспрессия мРНК Mem-131.
Исследование методом ОТ-ПЦР с помощью специфичных к Mem-131 праймеров показало отсутствие значительной экспрессии во всех исследованных нормальных тканях за исключением активированных РВМС. Экспрессия мРНК Mem-131 в карциномах молочной железы и легких. Экспрессия мРНК Mem-131 в карциномах легких и яичников.
Фиг.20. Экспрессия мРНК ISC-468.
Исследование методом ОТ-ПЦР (A) и ПЦР в реальном времени (B) с помощью специфичных к ISC-468 праймеров показало избирательную экспрессию мРНК в нормальных яичках, плаценте и в 80% биопсий карциномы молочной железы.
Фиг.21. Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии ISC-468.
(A) Специфичность антител к ISC-468 проверяли окрашиванием клеток, трансфицированных ISC-468-eGFP. (B) Окрашивание фиксированных МеОН клеток, трансфицированных специфичными к ISC-468 дуплексами SiRNA либо контрольными дуплексами, не вызывающими сайленсинга. (C) Окрашивание нефиксированных клеток, трансфицированных специфичными к ISC-468 дуплексами SiRNA либо контрольными дуплексами, не вызывающими сайленсинга.
Фиг.22. Иммуногистохимический анализ экспрессии ISC-468.
Экспрессия не обнаружена в нормальной ткани молочной железы (A) 100×, (B) 200×. Напротив, наблюдалось сильное и однородное окрашивание мембран в образцах карциномы молочной железы (C)×100, (D)×200.
Фиг.23. Вызванное SiRNA подавление экспрессии мРНК ISC-468.
Трансфекция клеток специфичными к ISC-468 дуплексами SiRNA приводила к заметному подавлению экспрессии мРНК ISC-468 по сравнению с контрольными клетками.
Фиг.24. Анализ пролиферации клеток.
Трансфекция клеток специфичными к ISC-468 дуплексами SiRNA приводила к заметному нарушению пролиферации клеток по сравнению с контрольными клетками.
Фиг.25. Анализ клеточного цикла.
Трансфекция клеток специфичными к ISC-468 дуплексами SiRNA приводила к остановке G1/S в клетках карциномы молочной железы MCF-7 (A) и BT-549 (B) по сравнению с контрольными клетками.
Фиг.26. Фосфорилирование АКТ.
Трансфекция клеток специфичными к ISC-468 дуплексами SiRNA приводила к заметному нарушению фосфорилирования АКТ по сравнению с контрольными клетками.
Фиг.27. Ингибирование пролиферации антителами.
Инкубация клеток карциномы молочной железы MCF-7 со специфичными к ISC-468 антителами приводила к снижению пролиферации по сравнению с клетками, инкубированными с посторонними контрольными антителами.
Фиг.28. Анализ пролиферации клеток.
Трансфекция клеток специфичными к ISC-468 дуплексами SiRNA приводила к заметному нарушению хемотаксиса (A), хемокинеза (B) и инвазии (C) по сравнению с контрольными клетками.
Фиг.29. Корреляция с эстрогеновыми рецепторами.
Уровень экспрессии мРНК ISC-468 в образцах карциномы молочной железы коррелирует с состоянием эстрогеновых рецепторов. Приведены значения медиан, 10-й и 90-й процентилей вместе с отметками погрешностей.
Фиг.30. Обработка 17β-эстрадиолом.
Экспрессию мРНК ISC-468 индуцировали обработкой клеток положительной по эстрогеновым рецепторам линии карциномы молочной железы MCF-7 с помощью 100 нМ 17β-эстрадиола. Индукция не наблюдалась в клетках отрицательной по эстрогеновым рецепторам линии MDA-MB-231.
Фиг.31. Последовательности.
Представлены последовательности, приведенные в настоящем изобретении.
ПРИМЕРЫ
Материалы и методы
Методы и способы, приведенные в настоящем изобретении, выполняются известным по сути образом и описаны, к примеру, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Все методики, включая использование наборов и реагентов, выполняются в соответствии с информацией от производителя.
Экстракция РНК, получение примированной поли-d(Т) кДНК и анализ стандартным методом ОТ-ПЦР
Тотальную РНК экстрагировали из нативного тканевого материала, используя гуанидиния изотиоцианат в качестве хаотропного агента (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156-9, 1987). После экстракции подкисленным фенолом и осаждения изопропанолом РНК растворяли в обработанной DEPC воде.
Синтез первой нити кДНК из 4 мкг тотальной РНК проводили в 20 мкл реакционной смеси при помощи Superscript II (Invitrogen) в соответствии с инструкцией производителя. В качестве праймера использовали олигонуклеотид dT(18). Целостность и качество кДНК проверяли путем амплификации p53 методом ПЦР за 30 циклов (SEQ ID NO: 33, 34) с гибридизацией при температуре 67°C.
Создавали архив первых нитей кДНК из целого ряда нормальных тканей и опухолей. Для опытов по экспрессии подвергали амплификации 0,5 мкл этих кДНК в 30 мкл реакционной смеси, используя GOI-специфичные праймеры (см. ниже) и 1 ед. ДНК-полимеразы Taq HotStart (Qiagen). Реакционная смесь содержала по 150 мкМ dNTP, 0,3 мкМ каждого праймера и 3 мкл 10× реакционного буфера. Праймеры выбирали таким образом, чтобы они располагались в двух экзонах, а устранение помех от примеси геномной ДНК как причины ложно-положительных результатов проверяли тестированием не подвергавшейся обратной транскрипции ДНК в качестве матрицы. После 15 мин при 95°C для активации ДНК-полимеразы Taq выполняли 35 циклов ПЦР (0,5 мин при 94°C, 0,5 мин при определенной температуре гибридизации, 0,5 мин при 72°C и заключительное наращивание при 72°C в течение 6 мин). Отбирали 20 мкл из этой реакции, разделяли и анализировали на агарозном геле, окрашенном этидия бромидом.
Получение примированной случайными гексамерами кДНК и количественный метод ПЦР в реальном времени
t
Экспрессию некоторых генов анализировали количественно методом ПЦР в реальном времени. Продукты ПЦР детектировали, используя SYBR Green в качестве интеркалирующего репортерного красителя. Флуоресценция репортера SYBR Green подвергается тушению в растворе, поэтому краситель становится активным только после связывания с двухцепочечными фрагментами ДНК. Для количественного анализа используется повышение флуоресценции SYBR Green в результате специфической амплификации с помощью GOI-специфичных праймеров после каждого цикла ПЦР. Экспрессия гена мишени измеряется абсолютно либо относительно экспрессии контрольного гена с постоянным уровнем экспрессии в исследуемых тканях. Экспрессию измеряли после стандартизации образцов по 18S РНК в качестве так называемого гена «домашнего хозяйства» методом ΔΔ-C (РЕ Biosystems, USA). Реакции проводили в двух повторах, а определение - в трех повторах. Использовали набор QuantiTest SYBR Green PCR kit (Qiagen, Hilden) в соответствии с инструкциями производителя. кДНК синтезировали с помощью случайных праймеров (Invitrogen), используя описанную выше методику. Для ПЦР использовали порции по 5 мкл разведенной кДНК в общем объеме 30 мкл: 300 нМ смыслового праймера, 300 нМ антисмыслового праймера; начальная денатурация 15 мин при 95°C; 30 сек при 95°C, отжиг 30 сек, 30 сек при 72°C; 40 циклов. Последовательности используемых праймеров указаны в соответствующих примерах.
Клонирование и анализ последовательностей
Клонирование полных генов и фрагментов генов происходило стандартными методами. Для проверки последовательности подвергали амплификации соответствующие антигены с помощью корректирующей полимеразы pfu (Stratagene). По завершении ПЦР по концам ампликона лигировали аденозин с помощью ДНК-полимеразы Taq HotStart для клонирования фрагментов в соответствии с инструкциями производителя в вектор ТОРО-ТА. Секвенирование осуществляли через коммерческий сервис. Последовательности анализировали при помощи стандартных программ и алгоритмов прогнозирования.
Анализ пролиферации клеток
4
Через 24 ч после трансфекции дуплексами SiRNA начинали культивировать 1×10 клеток в среде с добавлением различных концентраций FCS на протяжении 48 ч. Пролиферацию анализировали, измеряя включение BrdU в новосинтезированные нити ДНК с помощью набора для анализа пролиферации клеток DELFIA (Perkin Elmer) в соответствии с инструкциями производителя на счетчике для нескольких меток Wallac Victor2 (Perkin Elmer).
Анализ клеточного цикла и апоптоза
Клетки культивировали в среде с добавлением FCS в различных концентрациях, собирали через 48 ч и окрашивали пропидия йодидом перед анализом содержания ДНК методом проточной цитометрии. Апоптозные клетки и клетки в фазах клеточного цикла S/G2/M подсчитывали с помощью программы CellQuest (Becton Dickinson).
Миграция клеток
4
Анализ миграции клеток проводили в камерах Transwell с размером пор мембраны 8,0 μм (BD Biosciences), а клетки культивировали в среде без сыворотки в течение 12 ч перед опытами. Для экспериментов с SiRNA клетки переводили в среду без сыворотки через 24 ч после трансфекции дуплексами SiRNA, как описано выше. В верхнюю камеру вносили 4×10 клеток в 400 мкл культуральной среды без сыворотки. Нижняя камера содержала 800 мкл культуральной среды с добавлением FCS, PDGF-BB (Sigma-Aldrich) или SDF-1α/CXCL12 (R&D Systems) в качестве хемоаттрактантов. Через 24 ч клетки, мигрировавшие на нижнюю сторону мембраны, фиксировали охлажденным во льду метанолом; мембраны вырезали, помещали на предметные стекла и обрабатывали Hoechst (Dako) для флуоресцентной микроскопии. Подсчитывали клетки в пяти произвольных полях зрения (увеличение ×100) для каждой мембраны. Все опыты ставили в трех повторах. Эффекты на хемокинез клеток анализировали по такой же схеме эксперимента (i) без добавления хемоаттрактантов в верхнюю и нижнюю камеры и (ii) с добавлением хемоаттрактантов и в верхнюю, и в нижнюю камеры.
Анализ инвазии in vitro
5
Анализ инвазии in vitro проводили в камерах Transwell с размером пор мембраны 8,0 μм (BD Biosciences), а клетки культивировали в среде без сыворотки в течение 12 ч перед опытами. Верхнюю камеру обрабатывали 100 мкл Matrigel (BD Biosciences), разведенного до 1 мг/мл средой без сыворотки. Камеру инкубировали при 37°C в течение 5 ч для образования геля. Для экспериментов с SiRNA клетки переводили в среду без сыворотки через 24 ч после трансфекции дуплексами SiRNA, как описано выше. В верхнюю камеру вносили 1×10 клеток в 400 мкл культуральной среды без сыворотки. Нижняя камера содержала 800 мкл культуральной среды с добавлением FCS в качестве хемоаттрактанта. Через 24 ч совершившие инвазию клетки на нижней стороне мембраны фиксировали охлажденным во льду метанолом; мембраны вырезали, помещали на предметные стекла и обрабатывали Hoechst (Dako) для флуоресцентной микроскопии. Подсчитывали клетки в пяти произвольных полях зрения (увеличение ×100) для каждой мембраны. Все опыты ставили в трех повторах.
Пример 1. Идентификация ISC-468 в качестве мишени для терапии и диагностики рака
ISC-468 (SEQ ID NO: 1) кодирует белок из 212 аминокислот (SEQ ID NO: 2) с молекулярным весом 23,6 кДа. Ранее он был описан как специфичный для плаценты белок, который экспрессируется во время беременности (Fant et al., Mol. Reprod. Dev. 63: 430-6, 2002).
Предполагается, что белок имеет отщепляемый сигнальный пептид из а.к. 1-23, за которым следует короткий предполагаемый трансмембранный домен (а.к. 25-47), судя по данным биоинформатики (TMpred, SOUSI). Остальная часть белка предположительно является внеклеточной и поэтому может использоваться согласно изобретению в качестве структуры-мишени для моноклональных антител.
В соответствии с изобретением, для амплификации кДНК, полученной из обширного списка нормальных и опухолевых тканей, использовали пару специфичных к гену ISC-468 праймеров (SEQ ID NO: 3, 4) при анализе методом ОТ-ПЦР. Как и ожидалось, плацента оказалась единственной нормальной тканью, экспрессирующей этот ген (фиг.1). Никакой значительной экспрессии не обнаружено ни в одной нормальной ткани других органов. Совсем неожиданно, при исследовании раковых образцов обнаружились высокие и значительные уровни экспрессии в ряде различных типов опухолей, включая карциномы толстой кишки, поджелудочной железы, пищевода, желудка, легких, молочной железы, яичников, головы и шеи, почек, простаты и печени (фиг.1 и 2, а также табл.1). Количественный анализ экспрессии ISC-468 методом ОТ-ПЦР в реальном времени в 60 образцах рака молочной железы показал, что 80% всех образцов экспрессируют значительные уровни ISC-468 (фиг.20A, B).
Избирательная и высокая экспрессия транскриптов ISC-468 в опухолях не была ранее известна и может использоваться согласно изобретению для методов молекулярной диагностики типа ОТ-ПЦР для выявления распространяющихся раковых клеток в сыворотке и костном мозге и для обнаружения метастазов в других тканях. Эта молекула также может использоваться в качестве специфической мишени для терапевтических подходов.
Для получения специфичных к ISC-468 антител по изобретению были выбраны, среди прочего, следующие пептиды: SEQ ID NO: 58, 59, 60, 68, 69, 2. Специфичность антител проверяли иммунофлуоресцентным анализом клеток, трансфицированных ISC-468-eGFP (фиг.2A).
Субклеточную локализацию ISC-468 в эндогенно экспрессирующих клеточных линиях рака молочной железы MCF-7 и BT-549 анализировали иммунофлуоресцентными методами. Окрашивание фиксированных МеОН (фиг.21B) и нефиксированных (фиг.21C) клеток показало, что ISC-468 локализуется на плазматических мембранах экспрессирующих клеток. Специфичность окрашивания проверяли по вызванному SiRNA подавлению экспрессии ISC-468, приводившему к потере окрашивания плазматических мембран.
Кроме того, использовали специфичные к ISC-468 антитела для иммуногистохимического анализа экспрессии ISC-468 в клинических образцах нормальной молочной железы и карциномы молочной железы. Экспрессия ISC-468 не обнаруживалась в образцах нормальной молочной железы (фиг.22A, B). Напротив, образцы карциномы молочной железы проявляли сильную и однородную экспрессию ISC-468 (фиг.22C, D). Выделялись сигналы на плазматической мембране экспрессирующих раковых клеток, подтверждая то, что ISC-468 является мембранным белком, который избирательно экспрессируется в раковых клетках.
Внеклеточные домены ISC-468 можно использовать согласно изобретению в качестве структур-мишеней для иммунодиагностики и терапии при помощи моноклональных антител. Кроме того, ISC-468 можно использовать согласно изобретению в качестве вакцины (РНК, ДНК, белок, пептиды) для выработки опухолеспецифичных иммунных ответов (опосредованных T- и B-клетками иммунных ответов).
Вызванное SiRNA подавление экспрессии ISC-468 осуществляли путем трансфекции клеток дуплексами SiRNA, специфически воздействующими на мРНК ISC-468 (SEQ ID NOs: 70-73). Трансфекция эндогенно экспрессирующих клеточных линий рака молочной железы MCF-7 и ВТ-549 приводила к устойчивому и специфическому снижению экспрессии мРНК ISC-468 (фиг.23).
Для того чтобы понять физиологическую роль экспрессии ISC-468, выполняли несколько основанных на SiRNA клеточных анализов in vitro. Трансфекция клеточных линий рака молочной железы MCF-7 и BT-549 дуплексами SiRNA приводила к заметному снижению пролиферации клеток по сравнению с соответствующими контролями при анализе пролиферации основанным на BrdU методом (фиг.24). Анализ клеточного цикла методом FACS показал, что прекращение пролиферации клеток было вызвано остановкой G1/S (фиг.25A, B). К тому же оказалось, что вызванное SiRNA выключение ISC-468 сильно влияет на сигнальный путь АКТ в эндогенно экспрессирующих раковых клетках путем ингибирования фосфорилирования АКТ (фиг.26). Более того, пролиферация клеток MCF-7 уменьшалась при инкубации клеток со специфичными к ISC-468 антителами против специфических пептидов ISC-468 (SEQ ID NO: 68, 69) по сравнению с посторонними контрольными антителами (фиг.27). Эти результаты свидетельствуют, что ISC-468 является решающим фактором для пролиферации раковых клеток, предположительно посредством индуцируемой факторами роста активации сигнального пути АКТ и др. Сам ISC-468 может представлять собой рецептор, ко-рецептор или мембранный шаперон для факторов роста, хемокинов или других веществ.
Кроме того, анализировали влияние экспрессии ISC-468 на миграционную способность раковых клеток. Вызванное SiRNA подавление экспрессии ISC-468 в клеточных линиях рака молочной железы MCF-7 и ВТ-549 приводило к заметному нарушению хемотаксиса, хемокинеза и инвазии клеток по данным анализа миграции через лунки (фиг.28A, B, C). Хемотаксис, хемокинез и инвазия являются решающими факторами для метастазирования раковых клеток в другие органы. Следовательно, экспрессия ISC-468 в раковых клетках могла бы быть положительным фактором для метастазирования раковых клеток.
В карциномах молочной железы оказалось, что экспрессия ISC-468 коррелирует с состоянием эстрогеновых рецепторов в опухоли. Количественный анализ экспрессии ISC-468 методом ОТ-ПЦР в реальном времени в 60 образцах рака молочной железы показал, что положительные по эстрогеновым рецепторам карциномы молочной железы проявляли значительно более высокий уровень экспрессии ISC-468, чем отрицательные по рецепторам опухоли (фиг.29). Соответственно, экспрессия ISC-468 индуцировалась в положительной по эстрогеновым рецепторам клеточной линии рака молочной железы MCF-7 при обработке 17β-эстрадиолом (фиг.30).
Пример 2. Идентификация ISC-507 в качестве мишени для терапии и диагностики рака
ISC-507 (SEQ ID NO: 5) кодирует белок из 754 аминокислот (SEQ ID NO: 6) с молекулярным весом 85,6 кДа. ISC-507 является представителем семейства цинксвязывающих белков с активностями дисинтегрина и металлопротеаз, которые могут функционировать как белки адгезии и/или эндопептидазы. Отмечалось, что представители этого семейства участвуют в ряде биологических процессов, включая оплодотворение, нейрогенез, развитие мышц и иммунные реакции (Seals et al., Genes Dev. 17(1): 7-30, 2003).
ISC-507 содержит один трансмембранный домен (а.к. 671-687), большую внеклеточную область на N-конце и более короткую цитоплазматическую область на С-конце.
Экспрессия ISC-507, как сообщалось, специфически ограничивается придатком яичка у млекопитающих, т.е. небольшой железой, примыкающей к яичку, которая играет определяющую роль в созревании спермы. Согласно литературе, ISC-507 переносится из придатка яичка на поверхность сперматозоидов и переходит на головку сперматозоидов при акросомной реакции (Adachi et al., Mol. Reprod. Dev. 64: 414-21, 2003).
Исследования методом ОТ-ПЦР с помощью специфичных к ISC-507 праймеров (SEQ ID NO: 7, 8) подтвердили избирательную экспрессию в яичках и отсутствие ISC-507 в любой другой нормальной ткани (табл.2, фиг.3) за исключением слабой экспрессии в тканях из предстательной железы и лимфатических узлов (табл.2, фиг.4).
Однако совсем неожиданно экспрессия ISC-507 наблюдалась в значительном числе случаев рака простаты (фиг.3, 4). Об участии этого белка в раковых заболеваниях ранее не сообщалось.
Отсутствие токсичности для соответствующих нормальных тканей и частая и значительная экспрессия ISC-507 при раке простаты делают этот белок согласно изобретению ценным диагностическим и терапевтическим маркером. Согласно изобретению, это включает выявление распространяющихся раковых клеток в сыворотке, костном мозге, моче и обнаружение метастазов в других органах методом ОТ-ПЦР. Кроме того, внеклеточные домены ISC-507 можно использовать согласно изобретению в качестве структур-мишеней для иммунодиагностики и терапии при помощи моноклональных антител. Кроме того, ISC-507 можно использовать согласно изобретению в качестве вакцины (РНК, ДНК, белок, пептиды) для выработки опухолеспецифичных иммунных ответов (опосредованных T- и B-клетками иммунных ответов).
Антитела для детектирования ISC-507 можно получить с помощью следующих пептидов и белков: SEQ ID NO: 51, 52, 53, 54, 55, 6, 56 и 57. В соответствии с изобретением антитела, связывающиеся с ISC-507, могут оказаться полезными в целях терапии или диагностики.
Пример 3. Идентификация ISC-466 в качестве мишени для терапии и диагностики рака
ISC-466 (SEQ ID NO: 9) кодирует белок из 426 аминокислот (SEQ ID NO: 10) с молекулярным весом 48,2 кДа. Он принадлежит к семейству специфичных для беременности гликопротеидов. Специфичные для беременности гликопротеиды человека (PSG) представляют собой группу молекул, которые главным образом вырабатываются синцитиотрофобластами плаценты во время беременности и входят в состав суперсемейства иммуноглобулиов (Beauchemin et al., Exp. Cell Res. 252(2): 243-9, 1999). Как и другие белки PSG, ISC-466 тоже, как сообщалось, ограничивается плацентой.
В соответствии с изобретением, для амплификации кДНК, полученной из обширного списка нормальных и опухолевых тканей, при анализе методом ОТ-ПЦР использовали пару специфичных к гену ISC-466 праймеров (SEQ ID NO: 11, 12). При анализе методом ОТ-ПЦР экспрессия ISC-466 проявлялась в нормальной плаценте и слабая экспрессия проявлялась в щитовидной железе и яичниках (табл.3, фиг 5A). Никакой значительной экспрессии не обнаружено ни в одной нормальной ткани других органов. Совсем неожиданно, при исследовании раковых клеточных линий обнаружились высокие и значительные уровни экспрессии в ряде различных типов опухолей, включая рак молочной железы (фиг.5C), рак легких (фиг.5C), рак яичников (фиг.5D) и карциномы головы и шеи и карциномы почек (фиг.5B).
В отличие от данных о том, что ISC-466 играет роль в колоректальном раке (Salahshor et al., ВМС Cancer 5: 66, 2005), наши исследования показали, что ISC-466 по изобретению является диагностическим и терапевтическим маркером рака головы и шеи, молочной железы, яичников, простаты и меланомы.
Пример 4. Идентификация ISC-518 в качестве мишени для терапии и диагностики рака
ISC-518 (SEQ ID NO: 13) кодирует продукт трансляции из 237 аминокислот (SEQ ID NO: 14). Однако какие-либо данные в отношении его тканевого распределения и связи с раком пока отсутствуют.
ISC-518 является гипотетическим геном/белком, который предсказан методами биоинформатики. Анализ последовательности показал, что этот белок имеет трансмембранный домен (а.к. 102-118). На внеклеточном С-конце находится функциональный домен, который встречается у гликопротеидов клеточной поверхности.
В соответствии с изобретением, для амплификации кДНК, полученной из обширного списка нормальных и опухолевых тканей, при анализе методом ОТ-ПЦР использовали пару специфичных к гену ISC-518 праймеров (SEQ ID NO: 15, 16). Единственной нормальной тканью, экспрессирующей этот ген, оказались яички, тогда как ни в одной нормальной ткани других органов значительной экспрессии ISC-518 не обнаружено (фиг.6, табл.4). Совсем неожиданно, при исследовании раковых образцов обнаружились высокие и значительные уровни экспрессии в гепатокарциномах (фиг.7).
Исследования методами биоинформатики показали, что кодируемый ISC-518 белок представляет собой молекулу клеточной поверхности. Ранее неизвестная избирательная экспрессия этой молекулы клеточной поверхности делает ее мишенью в целях терапии и для разработки диагностических методов выявления раковых клеток и терапевтических методов устранения раковых клеток.
Пример 5. Идентификация ISC-477 в качестве мишени для терапии и диагностики рака
ISC-477 (SEQ ID NO: 17) кодирует продукт трансляции из 130 аминокислот (SEQ ID NO: 18). ISC-477 является гипотетическим белком. Какие-либо публичные данные в отношении его тканевого распределения и связи с раком отсутствуют. При структурном анализе обнаруживается гидрофобная область, которая может представлять собой трансмембранную область или сигнальный пептид.
В соответствии с изобретением, для амплификации кДНК, полученной из обширного списка нормальных и опухолевых тканей, при анализе методом ОТ-ПЦР использовали пару специфичных к гену ISC-477 праймеров (SEQ ID NO: 19, 20). Единственными нормальными тканями, экспрессирующими этот ген, оказались плацента и яичники. А ни в одном другом нормальном органе значительной экспрессии ISC-477 не обнаружено (фиг.8A, табл.5). Совсем неожиданно, при исследовании раковых образцов высокие и значительные уровни экспрессии были обнаружены при раке легких, яичников, толстой кишки и желудка (фиг.8A-D, табл.5). Уровни экспрессии были явно выше, чем в нормальных яичниках.
Пример 6. Идентификация ISC-489 в качестве мишени для терапии и диагностики рака
ISC-489 (SEQ ID NO: 21) кодирует продукт трансляции из 363 аминокислот (SEQ ID NO: 22). Белок является новоописанным представителем семейства сопряженных с G-белками рецепторов. Однако какие-либо публичные данные в отношении его тканевого распределения и связи с раком отсутствуют.
В соответствии с изобретением, для амплификации кДНК, полученной из обширного списка нормальных и опухолевых тканей, при анализе методом ОТ-ПЦР использовали пару специфичных к гену ISC-489 праймеров (SEQ ID NO: 23, 24). Единственными нормальными тканями, экспрессирующими этот ген, оказались плацента и пищевод (слабая экспрессия). А ни в одном другом нормальном органе значительной экспрессии ISC-489 не обнаружено (фиг.9A, табл.6). Совсем неожиданно, при исследовании раковых образцов обнаружились высокие и значительные уровни экспрессии при раке головы и шеи и раке желудка (фиг.9B, 9C, табл.6).
Как представитель семейства сопряженных с G-белками рецепторов, ISC-489 является интегральным мембранным белком, имеющим 7 трансмембранных доменов и несколько внеклеточных петель, которые могут служить мишенями на клеточной поверхности.
Выраженная экспрессия и неожиданно высокая встречаемость ISC-489 в карциномах головы и шеи делают этот белок согласно изобретению весьма интересным диагностическим и терапевтическим маркером.
Пример 7. Идентификация ISC-461 в качестве мишени для терапии и диагностики рака
ISC-461 (SEQ ID NO: 25) кодирует белок из 419 аминокислот (SEQ ID NO: 26) с молекулярным весом 47,1 кДа. Он принадлежит к семейству специфичных для беременности гликопротеидов. Специфичные для беременности гликопротеиды человека (PSG) представляют собой группу молекул, которые главным образом вырабатываются синцитиотрофобластами плаценты во время беременности и входят в состав суперсемейства иммуноглобулиов (Beauchemin et al., Exp. Cell Res. 252(2): 243-9, 1999). Как и другие белки PSG, ISC-461 тоже, как сообщалось, ограничивается плацентой.
В соответствии с изобретением, для амплификации кДНК, полученной из обширного списка нормальных и опухолевых тканей, при анализе методом ОТ-ПЦР использовали пару специфичных к гену ISC-461 праймеров (SEQ ID NO: 11, 27). Как и ожидалось, плацента оказалась экспрессирующей этот ген, наряду со слабой экспрессией в яичках и яичниках (фиг.10A и 10B, табл.7). Никакой значительной экспрессии не обнаружено ни в одной нормальной ткани других органов. Совсем неожиданно, при исследовании раковых тканей и раковых клеточных линий обнаружились высокие и значительные уровни экспрессии в целом ряде типов опухолей, включая рак молочной железы (фиг.10C, табл.7), рак яичников (фиг.10D, табл.7) и меланому (фиг.10B, 10C, табл.7).
Следующей задачей в соответствии с изобретением была идентификация таких сплайс-вариантов ISC-461, которые можно было бы использовать для диагностики и для терапии. При исследовании сплайс-вариантов была идентифицирована сплайс-форма (SEQ ID NO: 28) и кодируемый ею белок (SEQ ID NO: 29).
Пример 8. Идентификация ISC-465 в качестве мишени для терапии и диагностики рака
ISC-465 (SEQ ID NO: 30) кодирует белок из 419 аминокислот (SEQ ID NO: 31) с молекулярным весом 47,0 кДа. Он принадлежит к семейству специфичных для беременности гликопротеидов. Специфичные для беременности гликопротеиды человека (PSG) представляют собой группу молекул, которые главным образом вырабатываются синцитиотрофобластами плаценты во время беременности и входят в состав суперсемейства иммуноглобулиов (Beauchemin et al., Exp. Cell Res. 252(2): 243-9, 1999). Как и другие белки PSG, ISC-465 тоже, как сообщалось, ограничивается плацентой.
В соответствии с изобретением, для амплификации кДНК, полученной из обширного списка нормальных и опухолевых тканей, при анализе методом ОТ-ПЦР использовали пару специфичных к гену ISC-465 праймеров (SEQ ID NO: 11, 32). Как и ожидалось, плацента оказалась экспрессирующей этот ген, наряду со слабой экспрессией в нормальных яичниках (фиг.11A, табл.8). Никакой значительной экспрессии не обнаружено ни в одной нормальной ткани других органов. Совсем неожиданно, при исследовании раковых тканей и раковых клеточных линий обнаружились высокие и значительные уровни экспрессии в целом ряде типов опухолей (фиг.11A, 11B, табл.8), особенно при раке молочной железы (фиг.11B, табл.8).
Избирательная и высокая экспрессия транскриптов ISC-465 в опухолях не была ранее известна и может использоваться согласно изобретению для методов молекулярной диагностики типа ОТ-ПЦР для выявления распространяющихся раковых клеток в сыворотке и костном мозге и для обнаружения метастазов в других тканях. Эта молекула также может использоваться в качестве специфической мишени для терапевтических подходов.
Пример 9. Идентификация Mem-030 в качестве мишени для терапии и диагностики рака
Mem-030 (SEQ ID NO: 35) кодирует белок из 592 аминокислот (SEQ ID NO: 36) с молекулярным весом 67,9 кДа. Mem-030 относится к белкам GBP, которые представляют собой большие ГТФазы, способные связывать ГТФ, ГДФ и ГМФ и катализировать гидролиз ГТФ в ГДФ, а также ГМФ (Cheng et al., J. Biol. Chem. 260: 15834-9, 1985). ГТФазы играют важную роль в клеточной пролиферации, дифференцировке, передаче сигналов и внутриклеточном транспорте белков, и они индуцируются интерфероном (Boehm et al., J. Immunol. 161(12): 6715-23, 1998). Кроме того, Mem-030 противодействует пролиферативному действию воспалительных цитокинов типа IFN-γ, интерлейкина 1-b (IL-1b) и α-фактора некроза опухолей (TNF-α) 1 на эндотелиальные клетки (Guenzi et al., EMBO J. 20(20): 5568-77, 2001).
В соответствии с изобретением, для амплификации кДНК, полученной из обширного списка нормальных и опухолевых тканей, при анализе методом ОТ-ПЦР в реальном времени использовали пару специфичных к гену Mem-030 праймеров (SEQ ID NO: 37, 38). Mem-030 проявляет повсеместный профиль экспрессии (фиг.12A, табл.9).
Совсем неожиданно, при исследовании раковых тканей и раковых клеточных линий обнаружились высокие и значительные уровни суперэкспрессии в целом ряде типов опухолей (фиг.12A, 12B), особенно при раке головы и шеи.
По данным биоинформатики и анализа литературы, гомологичный Mem-030 ген также может оказаться привлекательной мишенью для терапии (SEQ ID NO: 39) и кодирует белок из 586 аминокислот (SEQ ID NO: 40) с молекулярным весом 66,6 кДа.
Исследования методами биоинформатики показали, что оба белка представляют собой молекулы клеточной поверхности. Ранее неизвестная избирательная суперэкспрессия этой молекулы клеточной поверхности делает ее мишенью в целях терапии и для разработки диагностических методов выявления раковых клеток и терапевтических методов устранения раковых клеток.
Пример 10. Идентификация Mem-055 в качестве мишени для терапии и диагностики рака
Mem-055 (SEQ ID NO: 41) кодирует белок из 250 аминокислот (SEQ ID NO: 42) с молекулярным весом 27,9 кДа. Кодируемый этим геном белок представляет собой лизосомальную тиолредуктазу, которая при низких значениях pH может восстанавливать дисульфидные связи белков. Фермент экспрессируется конститутивно в антигенпрезентирующих клетках и индуцируется γ-интерфероном в других типах клеток. Этот фермент играет важную роль в процессинге антигенов при рестрикции, вызванной МНС II класса (Arunachalam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(2): 745-50, 2000).
Локализацию Mem-055 и топологию белка устанавливали путем анализа предполагаемых сигнальных последовательностей и трансмембранных доменов методами биоинформатики (TMpred, SOUSI). Mem-055 может иметь внеклеточную C-концевую область.
В соответствии с изобретением, для амплификации кДНК, полученной из обширного списка нормальных и опухолевых тканей, при анализе методом ОТ-ПЦР в реальном времени использовали пару специфичных к гену Mem-055 праймеров (SEQ ID NO: 43, 44). Mem-055 проявляет повсеместный профиль экспрессии (фиг.13A, табл.10).
Совсем неожиданно, при исследовании экспрессии Mem-055 в раковых тканях обнаружились высокие и значительные уровни суперэкспрессии в целом ряде типов опухолей (фиг.13A, 13B), особенно при раке желудка.
Mem-055 является структурой-мишенью для терапии и диагностики вследствие наличия предполагаемого трансмембранного домена и неожиданной суперэкспрессии при различных типах рака.
Пример 11. Идентификация Mem-062 в качестве мишени для терапии и диагностики рака
Mem-062 (SEQ ID NO: 45) кодирует белок из 271 аминокислоты (SEQ ID NO: 46) с молекулярным весом 30,7 кДа. Ранее Mem-062 был идентифицирован при компьютерном поиске и описан как экспрессирующийся специфически в яичках, предстательной железе и плаценте (Bera et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 312(4): 1209-15, 2003).
В соответствии с изобретением, при анализе методом ОТ-ПЦР использовали пару специфичных к гену Mem-062 праймеров (SEQ ID NO: 47, 48). Вне ожидания, Mem-062 проявлял специфичный для яичек профиль экспрессии (фиг.14A, табл.11). Никакой экспрессии не обнаружено ни в одной нормальной ткани других органов. Совсем неожиданно, при исследовании раковых тканей обнаружились значительные уровни экспрессии Mem-062 (фиг.14B), особенно при раке яичников.
Альтернативный сплайсинг приводит к образованию альтернативного транскрипта (SEQ ID NO: 49) и соответствующего продукта трансляции (SEQ ID NO: 50).
Пример 12. Идентификация Mem-068 в качестве мишени для терапии и диагностики рака
Mem-068 (SEQ ID NO: 61) идентифицирован как новый клон кДНК. При анализе методами биоинформатики (Genscan) Mem-068 был описан как ген с множественными экзонами на хромосоме 9 (SEQ ID NO: 62). Выведенная последовательность белка (SEQ ID NO: 63) содержит 751 аминокислоту и образует белок с молекулярным весом 82,4 кДа.
В соответствии с изобретением, при анализе методом ОТ-ПЦР использовали пару специфичных к гену Mem-068 праймеров. Вне ожидания, Mem-068 проявлял специфичный для яичек профиль экспрессии (фиг.15A, табл.12). Никакой экспрессии не обнаружено ни в одной нормальной ткани других органов, кроме плаценты (слабая экспрессия). Совсем неожиданно, при исследовании раковых тканей обнаружились значительные уровни экспрессии Mem-068 (фиг.15B), особенно при почечно-клеточном раке и раке желудка.
В соответствии с программой трансмембранного моделирования TMpred, Mem-068 может экспресссироваться на клеточной поверхности, что делает его интересной мишенью в целях терапии и диагностики.
Пример 13. Идентификация Mem-071 в качестве мишени для терапии и диагностики рака
Mem-071 (SEQ ID NO: 64) является новым клоном кДНК, который кодируется 2 экзонами на хромосоме 1.
В соответствии с изобретением, для амплификации кДНК, полученной из обширного списка нормальных и опухолевых тканей, при анализе методом ОТ-ПЦР использовали пару специфичных к гену Mem-071 праймеров. Единственной нормальной тканью, экспрессирующей этот ген, оказались яички (фиг.16A, табл.13). И наоборот, при исследовании раковых тканей обнаружились высокие и значительные уровни экспрессии при почечно-клеточном раке и раке желудка (фиг.16B, табл.13).
Неожиданно высокая встречаемость Mem-071 при почечно-клеточном раке делает этот белок согласно изобретению очень интересным диагностическим и терапевтическим маркером.
Пример 14. Идентификация Mem-072 в качестве мишени для терапии и диагностики рака
Mem-072 (SEQ ID NO: 65) идентифицирован как новый ген, который кодируется 3 экзонами на хромосоме 16.
В соответствии с изобретением, для амплификации кДНК, полученной из обширного списка нормальных и опухолевых тканей, при анализе методом ОТ-ПЦР использовали пару специфичных к гену Mem-072 праймеров. Никакой экспрессии не обнаружено во всех исследованных нормальных тканях (фиг.17A, табл.14). При исследовании раковых тканей и раковых клеточных линий обнаружились высокие и значительные уровни экспрессии в образцах рака легких (фиг.17B).
Избирательная и высокая экспрессия Mem-072 при раке легких не была ранее известна и может использоваться согласно изобретению для методов молекулярной диагностики типа ОТ-ПЦР для выявления распространяющихся раковых клеток в сыворотке и костном мозге и для обнаружения метастазов в других тканях. Эта молекула также может использоваться в качестве специфической мишени для терапевтических подходов.
Пример 15. Идентификация Mem-106 в качестве мишени для терапии и диагностики рака
Mem-106 (SEQ ID NO: 66) идентифицирован как новая кДНК, которая кодируется без интронов на хромосоме 2.
В соответствии с изобретением, при анализе методом ОТ-ПЦР использовали пару специфичных к гену Mem-106 праймеров. Вне ожидания, Mem-106 проявлял специфичный для яичек профиль экспрессии (фиг.18A, табл.15). Никакой экспрессии не обнаружено ни в одной нормальной ткани других органов. Совсем неожиданно, при исследовании раковых тканей обнаружились значительные уровни экспрессии Mem-106 (фиг.18B), особенно при раке яичников.
Mem-106 является структурой-мишенью для терапии и диагностики вследствие неожиданной суперэкспрессии при различных типах рака.
Пример 16. Идентификация Mem-131 в качестве мишени для терапии и диагностики рака
Mem-131 (SEQ ID NO: 67) идентифицирован как новый клон кДНК. Mem-131 представляет собой ген из 2 экзонов на хромосоме 15.
В соответствии с изобретением, для амплификации кДНК, полученной из обширного списка нормальных и опухолевых тканей, при анализе методом ОТ-ПЦР использовали пару специфичных к гену Mem-131 праймеров. Анализ методом ОТ-ПЦР показал экспрессию транскриптов Mem-131 только в нормальных активированных РВМС (табл.16, фиг.19A). Никакой значительной экспрессии не обнаружено ни в одной нормальной ткани других органов. Совсем неожиданно, при исследовании раковых образцов обнаружились высокие и значительные уровни экспрессии в различных типах опухолей, включая рак молочной железы (фиг.19B), рак легких (фиг.18B+C) и рак яичников (фиг.19C).
Эти исследования показали, что Mem-131 согласно изобретению является диагностическим и терапевтическим маркером рака легких, молочной железы и яичников.