СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЯ ПОДВИДОВ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА
METHOD FOR DIFFERENTIATION OF TULAREMIA MICROBIAL SUBSPECIES

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине, в частности в лабораторной диагностике туляремии.
Существуют общепринятые методы обнаружения возбудителя туляремии. Однако из-за отсутствия существенных внутривидовых антигенных отличий невозможно использовать данные методы для подвидовой дифференциации [Nutter J.E. Antigens of Pasteurella tularensis: preparative procedures. Appl. Microbiol. 1971; 22:44-8].
Подвиды Francisella tularensis также дифференцируются по биохимическим свойствам [Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. М.: Медицина; 1975. 192 с.].
Однако этот способ является достаточно трудоемким и требует работы с живой культурой.
В настоящее время для внутривидового типирования широко применяется VNTR метод (Variable Number Tandem Repeat - вариабельные нуклеотидные тандемные повторы). И, хотя данный метод позволяет дифференцировать не только подвиды, но и отдельные штаммы, он требует использования большого набора праймеров для получения однозначного ответа о подвидовой принадлежности анализируемого генетического материала, и, следовательно, больших затрат времени. Так, для VNTR-типирования F.tularensis применяется набор из 25 пар праймеров. Кроме того, для достоверного сравнения генетических профилей исследуемых образцов требуется разделять ампликоны, различающиеся по размеру лишь на несколько пар оснований, что значительно затрудняет и замедляет анализ [Johansson A., Farlow J. Larsson Р., Dukerich М., Chambers Е., Bystrom М., Fox J., Chu М., Forsman М., Sjöstedt A., Keim P. Worldwide genetic relationships among Francisella tularensis isolates determined by multiple-locus variable-number tandem repeat analysis. J. Bacteriol. 2004; 186:5808-18].
Причинами, препятствующими достижению технического результата, являются использование большого набора праймеров для получения однозначного ответа о подвидовой принадлежности анализируемого генетического материала и значительные затраты времени.
Применение RAPD метода (Randomly Amplified Polymorphic DNA - ПЦР с использованием случайных праймеров) позволяет относительно просто проводить внутривидовое дифференцирование туляремийного микроба [De la Puente-Redondo V.A., del Blanco N.G., Gutierrez-Martin C.B., Garcia-Pena F.J., Ferri E.F.R. Comparison of different Approaches for typing of Francisella tularensis strains. J. Clin. Microbiol. 2000; 38(3):1016-22].
Однако метод RAPD-PCR имеет низкую степень воспроизводимости при детекции микроорганизмов. Используемые случайные праймеры дают не однозначный сигнал при идентификации, что не позволяет достаточно надежно различать штаммы, относящиеся к различным подвидам возбудителя туляремии.
Техническим результатом заявленного изобретения является точный, ускоренный, и высокоспецифичный способ дифференцирования подвидов F.tularensis, что является необходимой составляющей эпидемиологического надзора за туляремийной инфекцией.
По результатам анализа последовательности нуклеотидов хромосомной ДНК подвидов F. tularensis были сконструированы праймеры на специфические регионы генов iglC и специфические регионы хромосомы, содержащие Chi-последовательности, подобные таковым у Е. coli. После проведения амплификации этих фрагментов ДНК выявлялись специфические светящиеся полосы у штаммов F.tularensis, принадлежащих к разным подвидам.
Технический результат заявленного изобретения достигается тем, что предложен способ дифференцирования подвидов F.tularensis, основанный на проведении ПЦР-амплификации, с использованием специфических для гена iglC и регионов хромосомы, содержащих Chi-последовательности подобные Е.coli, праймеров FiglC -AAGGATAAGACCTGTCTG, RiglC -TTGAAACCATACCGGGTA и Chi1f CTAGG-GCTGGTGG-G, с последующим электрофорезом продуктов амплификации и с последующей дифференциацией путем сравнения электрофоретической подвижности полученных ампликонов с подвижностью маркерных фрагментов ДНК, причем при наличии специфической светящейся полосы на уровне 986 п.о. данные штаммы регистрируют как род Francisella, а характер распределения полос в диапазоне ~190 и ~830 п.о. позволяет дифференцировать исследуемые образцы на уровне подвидов туляремийного микроба: ~190 п.о. для subsp. novicida, ~500-570 п.о. для subsp. mediasiatica, ~570 п.о. для subsp. holarctica, тогда как для subsp. tularensis характерен фрагмент размером ~500 п.о.
Отличием предлагаемого изобретения является одновременное применение трех праймеров, что позволяет проводить по результатам одной реакции индикацию возбудителя туляремии по наличию полосы размером 986 п.о. и идентификацию его подвидов по распределению амликонов размером от 280 до 830 п.о. в агарозном геле.
Изобретение иллюстрируется следующим примером.
Пример.
Апробация данного способа дифференцирования штаммов F.tularensis была проведена на 12 штаммах F.tularensis различного географического происхождения: F. tularensis (subsp.tularensis Schu, A-cole и 8859, subsp. holarctica 15, 503 и 21/400, subsp. holarctica bv. japonica Jasoe и Miura, subsp. mediasiatica 117 и 120, subsp. novicida Utah).
2
Штаммы F.tularensis выращивали на FT-агаре (ФБУН ГНЦ ПМБ). Через 24 часа после появления роста изолированных колоний отбирали 1 колонию, переносили в пробирку с 300 мкл деионизованной воды, выдерживали 15 мин при 95°С, центрифугировали при 13000 оборотов 1 мин и 1 мкл супернатанта добавляли в реакционную смесь. ПЦР проводили в режиме автоматической амплификации. ПЦР смесь содержала 2,5 мМ MgCl, 10 мМ Tris/HCl (рН 8.3), 50 мМ KCl, 0,5 мкМ каждого праймера, 0,2 мкМ каждого нуклеотида и 1 ед Taq - полимеразы в окончательном объеме 25 мкл.
Для постановки ПЦР использовали праймеры: FiglC -AAGGATAAGACCTGTCTG, RiglC -TTGAAACCATACCGGGTA на область гена iglC размером 986 п.о. присутствующего у рода Francisella и праймер Chi1f, содержащий chi-сайт Escherichia coli 5'GCTGGTGG 3'. Последовательность праймера Chi1f, помимо chi-последовательности, содержит также фланкирующие нуклеотиды: 5'CTAGG-GCTGGTGG-G 3'.
В качестве отрицательного контроля в каждом опыте проводили ПЦР с ДНК других видов патогенных микроорганизмов: Bacillus antracis (штамм СТИ-1), Yersinia pestis (штамм EV НИИЭГ), Yersinia pseudotuberculosis (штамм st1).
Полученные ампликоны подвергали электрофорезу в 1,5% агарозном геле при 160 V в течение 1 часа. Гель окрашивали стандартным раствором этидия бромида, результат реакции выявляли с помощью УФ-трансиллюминатора и фотографировали. После проведения амплификации этих фрагментов ДНК выявлялись специфические светящиеся полосы у штаммов F.tularensis, относящихся к разным подвидам. Учет результатов реакции осуществляли путем определения размеров ампликонов. В качестве маркера молекулярного веса использовали DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва).
Сравнение подвижности доминирующих по интенсивности ампликонов различных подвидов F.tularensis при амплификации с праймером Chi1f позволило выявить общие для штаммов туляремийного микроба фрагменты ДНК размерами ~280 и ~830 п.о. Штаммы F.tularensis subsp. novicida отличаются от других штаммов вида F.tularensis отсутствием полос в области ~190 п.о. У среднеазиатского подвида туляремийного микроба отсутствует ампликон в области ~500-570 п.о. Штаммы голарктического подвида, в том числе японского биовара, отличаются от штаммов неарктического подвида F.tularensis наличием полосы размером ~570 п.о., тогда как для subsp tularensis характерен фрагмент размером ~500 п.о. У голарктического подвида отсутствует фрагмент размером ~950 п.о. Кроме того, праймер Chi1f применяется как положительный контроль ПЦР-амплификации.
Также возможно проведение амплификации с одновременным использованием праймеров FiglC, RiglC и Chi1f, что уменьшает время анализа. В данном случае в пробах, содержащих ДНК F.tularensis, появляется мажорная полоса фрагмента гена iglC размером 986 п.о., характерная для рода Francisella.
Таким образом, предлагаемый нами способ дифференцирования подвидов возбудителя туляремии позволяет в течение трех часов дать заключение о принадлежности исследуемого образца к роду Francisella по наличию мажорной полосы фрагмента гена iglC размером 986 п.о. в пробах, содержащих ДНК F.tularensis, характерной для данного рода, а также установить видовую и подвидовую принадлежность по распределению полос, ~190 п.о. для subsp. novicida, ~500-570 п.о. для subsp. mediasiatica, ~570 п.о. для subsp. holarctica, тогда как для subsp. tularensis характерен фрагмент размером ~500 п.о.
Сравнительные исследования по генотипированию подвидов туляремийного микроба полностью коррелировали и точно дифференцировали штаммы подвидов F.tularensis.