СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В ЛИСТЬЯХ СИРЕНИ ОБЫКНОВЕННОЙ
METHOD FOR QUANTIFYING AMOUNT OF FLAVONOIDS IN LEAVES OF ORDINARY LILAC

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной (Syringa vulgaris L.).
Действующая система контроля качества лекарственных препаратов требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений (БАС) с использованием современных методов анализа и актуальных данных об их физико-химических, спектральных и фармакологических свойствах, позволяющих объективно и селективно определять содержание целевых веществ [4].
Сирень обыкновенная (Syringa vulgaris L.) является одним из видов растений, не включенных в Государственную Фармакопею Российской Федерации XIV издания, но в качестве лекарственного растительного сырья (ЛРС), как источник государственного стандартного образца (ГСО) - сирингина зарегистрирована кора (ВФС 42-2106-92) [1,2]. Препараты на основе коры сирени обладают широким спектром фармакологической активности: иммуномодулирующим, адаптогенным, анксиолитическим и антидепессивным действием [3].
Особый интерес, наряду с фармакопейным сырьем - корой, представляют листья данного растения. Листья сирени обыкновенной (Syringa vulgaris L.) являются перспективным источником БАС, обладающих диуретическим и противовоспалительным действием. Однако, проблема стандартизации данного вида сырья остается нерешенной.
Прототипом для разработки данной методики является способ количественного определения флавоноидов в листьях тополя черного. Он основан на методе дифференциальной спектрофотометрии с использованием стандартного образца рутина. Недостатком данной методики является невозожность ее применения к сырью листьев сирени обыкновенной [8].
Таким образом, целью изобретения является разработка способа количественного определения суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной, обладающего высокой специфичностью, точностью и воспроизводимостью.
Техническим результатом является создание способа количественного определения суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной в пересчете на рутин.
Технический результат достигается тем, что предварительно получают водно-спиртовое извлечение из растительного сырья путем экстракции 1 г точной навески измельченного до размера частиц 1 мм растительного сырья 70% этиловым спиртом, в пересчете на вещество флавоноидной природы, методом дифференциальной спектрофотометрии в отношении «сырье-экстрагент» - 1:50, при степени измельчения сырья 1 мм. Определение флавоноидов проводят при длине волны 412 нм в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле:
где:
х - содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %;
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
o
D - оптическая плотность раствора Государственного стандартного образца рутина;
m - масса сырья, г;
o
m - масса Государственного стандартного образца рутина, г;
W - потеря в массе при высушивании, %;
в случае отсутствия стандартного образца рутина для расчета целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 240:
где:
х - содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %;
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
m - масса сырья, г;
240 - удельный показатель поглощения  Государственного стандартного образца рутина при длине волны 412 нм;
W - потеря в массе при высушивании, %.
При изучении спектральных характеристик было выявлено, что именно рутин определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из листьев сирени обыкновенной. Определено, что в УФ-спектре водно-спиртового извлечения сирени обыкновенной наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов (Фигура 1), как и в случае рутина (Фигура 2), где кривая 1 на фигуре 1 и фигуре 2 демонстрирует исходный раствор водно-спиртового извлечения из листьев сирени обыкновенной или исходный раствор рутина соответственно, а кривая 2 - раствор водно-спиртового извлечения из листьев сирени обыкновенной в присутствии алюминия хлорида или раствор рутина в присутствии алюминия хлорида соответственно.
Изучение УФ-спектров фигуры 2 (где кривая 1 - раствор рутина, а кривая 2 - раствор рутина с добавлением алюминия хлорида) показало, что раствор ГСО рутина в присутствии алюминия хлорида имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм. В УФ-спектре водно-спиртового извлечения из листьев сирени обыкновенной в дифференциальном варианте на фигуре 3 так же обнаруживается при длине волны 412 нм максимум поглощения, который соответствует максимуму поглощения спиртового раствора рутина.
Данный факт позволяет проводить спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной при аналитической длине волны 412 нм.
Также нами было изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. В таблице 1 представлена зависимость выхода флавоноидов листьев сирени обыкновенной от концентрации экстрагента. В результате эксперимента в качестве оптимального экстрагента нами был выбран 70% этиловый спирт, так как выход действующих веществ из сырья при его использовании максимален.
Далее нами был изучен вопрос относительно продолжительности экстракции на кипящей водяной бане, в таблице 2 представлена зависимость выхода флавоноидов листьев сирени обыкновенной от времени экстракции на кипящей водяной бане, при этом было выбрано время экстракции 45 минут, при котором наблюдался максимальный выход веществ.
В таблице 3 представлена зависимость выхода флавоноидов листьев сирени обыкновенной от соотношения «сырье-экстрагент». Из таблицы 3 видно, что максимальный выход действующих веществ наблюдается при соотношении «сырье-экстрагент» 1:50, по этой причине данное соотношение было выбрано нами в качестве оптимального.
Финальной стадией стало изучение влияния степени измельчения сырья на выход фенилпропаноидов из цветков сирени обыкновенной. Из таблицы 4 следует, что максимальный выход веществ наблюдался при экстракции частиц, проходящих сквозь сито диаметром 1 мм.
Учитывая, что увеличение числа операций на стадии пробоподготовки ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.
Таким образом, было определено, что оптимальными параметрами экстракции являются: однократное извлечение 70% этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 45 минут в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:50, степень измельчения частиц 1 мм.
Принимая по внимание тот факт, что специфическим для листьев сирени обыкновенной является рутин, а максимумы поглощения раствора рутина и водно-спиртового извлечения листьев сирени обыкновенной находятся в области 412 нм, целесообразным является определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин при длине волны 412 нм.
Способ реализуется следующим образом.
Аналитическую пробу воздушно-сухого сырья сирени обыкновенной измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г точной навески измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 45 минут. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через фильтр с красной полосой (извлечения из травы).
Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 96% этиловым спиртом (испытуемый раствор).
Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки 96% этиловым спиртом (раствор сравнения).
Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца рутина, добавляют к нему 3% спиртовой раствор алюминия хлорида, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при аналитической длине волны 412 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.
Приготовление раствора стандартного образца рутина
Около 0,025 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). После чего 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор Б рутина). Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%.
Измерение оптической плотности проводят при длине волны 412 нм через 40 минут после приготовления всех растворов.
Содержание суммы флавоноидов (х, %) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
где:
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
o
D - оптическая плотность раствора Государственного стандартного образца рутина;
m - масса сырья, г;
o
m - масса Государственного стандартного образца рутина, г;
W - потеря в массе при высушивании в процентах.
В случае отсутствия стандартного образца рутина для расчета целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 240:
где:
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
m - масса сырья, г;
240 - удельный показатель поглощения  Государственного стандартного образца рутина при 412 нм;
W - потеря в массе при высушивании в процентах.
Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.
Пример 1.
Аналитическую пробу сырья сирени обыкновенной (заготовлено в Ботаническом саду Самарского университета, 2016 г.) измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. 0,9907 г измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 45 минут. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса).
Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор).
Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (раствор сравнения).
Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца рутина, добавляют к нему 3% спиртовой раствор хлорида алюминия, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при длине волны 412 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.
Приготовление раствора стандартного образца рутина
0,025 г рутина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). После чего 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида, затем доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%. Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%.
Измерение оптической плотности проводят при длине волны 412 нм через 40 минут после приготовления всех растворов.
Содержание суммы флавоноидов (х, %) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
где:
0,6653 - оптическая плотность испытуемого раствора;
0,4202 - оптическая плотность раствора стандартного образца рутина;
0,9907 - масса сырья, г;
0,0202 - масса стандартного образца рутина, г;
10 - потеря в массе при высушивании в процентах.
Х=3,59%.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин равно 3,59%.
Пример 2.
При необходимости определения суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной, в случае отсутствия стандартного образца рутина, необходимо провести все действия из примера 1 до приготовления раствора стандартного образца рутина.
После измерения оптической плотности извлечения из листьев сирени обыкновенной при длине волны 412 нм, содержание суммы флавоноидов (х, %) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле, используя теоретическое значение удельного показателя поглощения рутина, равное 240:
где:
0,6653 - оптическая плотность испытуемого раствора;
0,9907 - масса сырья, г;
240 - удельный показатель поглощения  стандартного образца рутина при 412 нм;
10 - потеря в массе при высушивании в процентах.
Х=3,89%.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин равно 3,89%, что сопоставимо со значением, полученном в примере 1.
Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила ±6,12%.
Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в листьях сирени обыкновенной с использованием дифференциальной спектрофотометрии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими достоинствами:
1. Разработанный метод является более специфичным и селективным, а также позволяет проводить экстракцию сырья однократно 70% этиловым спиртом, позволяющим исчерпывающе извлекать целевые вещества (флавоноиды).
2. Пересчет суммы флавоноидов идет на специфическое для листьев сирени обыкновенной флавоноидное вещество - рутин, определяющее характер кривой поглощения в УФ-спектре испытуемого раствора (длина волны 412 нм)
3. Ошибка единичного определения предлагаемого способа составляет ±6,12%, что свидетельствует об объективности разработанного способа.
Этот способ можно применять в центрах контроля качества лекарственных средств, на фармацевтических предприятиях и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного анализа листьев сирени обыкновенной (Syringa vulgaris L.)
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. ВФС 42-2106-92 «Кора сирени обыкновенной».
2. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. М., 2018 г. Режим доступа: http://femb.ru/femb/pharmacopea.php. (дата обращения: 27.11.2019)
3. Климова И.Ю. Аналитические и технические исследования по разработке новых препаратов на основе коры сирени обыкновенной. / И.Ю. Климова - Самара, 2005. - 159 с
4. Куркин В.А. К вопросу о стандартизации лекарственного сырья содержащего флавоноиды и фенилпропаноиды / В.А. Куркин, О.В. Маевская, В.Б. Браславский и др. // Применение хроматографии в пищевой, микробиологической и медицинской промышленности: Материалы Всесоюзной конференции. Геленджик, 1990. - С. 85-86.
5. Куркин В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармац. вузов - Изд. 4-е, перераб. и доп. / В.А. Куркин. - Самара: ООО «Офорт», ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 2019. - 1278 с.
6. Куркин В.А., Запесочная Г.Г., Кривенчук П.Е. Флавоноиды и маннит из листьев Syringa vulgaris II Химия природных соединений - 1980. - 3. - С. 418-419.
7. Патент РФ №2701726 от 1.10.2019 «Способ количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного».