Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда FGFR1 у разных видов млекопитающих на цитологических препаратах
METHOD FOR FLUORESCENT HYBRIDIZATION IN SITU USING THE FGFR1 DNA PROBE IN DIFFERENT MAMMALIAN SPECIES ON CYTOLOGICAL PREPARATIONS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к лабораторной диагностике и может быть использовано для получения цитогенетических препаратов, материал которого отобран от тонкоигольной аспирационной биопсии (ТИАБ). Это основано на применении тест-системы из специальных ДНК-зондов с меткой FGFR1 для проведения реакции флуоресцентной in situ гибридизации (fluorescent in situ hybridization - FISH).
Уровень техники
Известен способ выполнения комбинированного иммунологического и генетического исследования клеток, получивший название M-FICTION анализа (multicolor fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics as a tool for the investigation of neoplasms), взятый в качестве прототипа, (см., например, J.I. Martin-Subero, I. Chudoba, L. Harder, S. Gesk, W. Grote, F.J. Novo, M. J. Calasanz, and R. Siebert "Multicolor-FICTION Expanding the Possibilities of Combined Morphologic, Immunophenotypic, and Genetic Single Cell Analyses" / Am J Pathol. 2002 August; 161(2): 413-420.) Данный способ заключается в том, что клетки (находящиеся на поверхности предметного стекла) обрабатывают одним или несколькими флуоресцентно-меченными антителами, специфичными к их антигенам, отмывают, фиксируют, дегидратируют (с помощью растворов этилового спирта с возрастающими концентрациями) и высушивают. Затем те же клетки обрабатывают одним или несколькими флуоресцентно-меченными ДНК-зондами, комплиментарными к известным нуклеотидным последовательностям. Осуществляют денатурацию ДНК и гибридизацию, в результате которой каждый меченный зонд связывается с комплементарным ему участком гена. Затем выполняют отмывку. Проводят исследование препарата с помощью флуоресцентного микроскопа с наборами светофильтров, позволяющих определить флуоресценцию каждой используемой метки, а также при необходимости определить взаимное расположение меток. Может быть также получено трехмерное изображение каждой клетки. Для этого получают серию последовательных изображений, при разных расстояниях объектива микроскопа и осуществляют их компьютерную обработку. Проведение подобного анализа дает возможность одновременного обнаружения морфологических, иммунофенотипических, и генетических особенностей одних и тех же клеток.
Недостатком способа является большой расход дорогостоящих флуоресцентно- меченных антител при определении антигенов клеток, имеющих поверхностную локализацию. При этом невозможно проведение исследования с использованием немеченых антител, имеющих меньшую стоимость. Кроме того, вследствие ограниченного числа одновременно используемых флуоресцентных меток на разных клетках может быть определено лишь небольшое число поверхностных антигенов, что ограничивает число одновременное определяемых иммунологических субпопуляций клеток.
2
Известен «Усовершенствованный способ приготовления препаратов фиксированных клеток для флуоресцентной in situ гибридизации» (патент RU 2490635), при котором суспензии фиксированных клеток в объеме 5 мкл наносят на дно лунок, сформированных поверхностью предметного стекла и 8 круглыми отверстиями диаметром 9 мм в герметично приклеенной к стеклу полоске парафильма размерами 26×56 мм. Прилепляют полоску парафильма к предметному стеклу, нагревая стекло с парафильмом при температуре 60°С и одновременно раскатывая валиком в течение 3-5 сек. Впоследствии указанную полоску вместе с предметным стеклом нагревают при 95°С в течение 2 мин и затем сдирают ее со стекла.
Недостатком способа является трудоемкость, а также то, что в пределах одной лунки у исследователя нет возможности выбрать лучшую область для гибридизации.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип является способ, при котором FISH-реакцию проводят на традиционном мазке из шейки матки (мазок Папаниколау), представленный в статье Heselmeyer-Haddad K. и соавт. (Heselmeyer-Haddad K., Sommerfeld K., White N.M. et al. Genomic amplification of the Human Telomerase Gene (TERC) in Pap smears predicts the evelopment of cervical cancer/American Journal of Pathology, 2005, Vol. 166, №. 4, p. 1229-1238, doi: 10.1016/S0002-9440(10)62341-3). В способе сначала выполняют цитологическое исследование, для чего все мазки фиксируют, окрашивают согласно стандартным процедурам и заливают специальным клеем под покровное стекло. Когда препараты подготавливают для выполнения FISH, то покровные стекла удаляют путем инкубации препаратов в ксилоле в течение 2-4 дней, затем препараты дважды промывают в ксилоле, дегидратируют и обесцвечивают в смеси 0,5% HCl и 70% этанола в течение 1-2 часов.
Недостатки способа заключаются в неравномерном распределении клеток на предметном стекле, многослойности, потере клеток при фиксации, наличии элементов, приводящих к высокой фоновой флуоресценции, а также длительному (в течение нескольких суток) обработки исследуемого материала.
Раскрытие изобретения
Задачей заявляемого изобретения является разработка тест-системы для исследования и определения редких злокачественных типов опухолей молочной железы.
Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого способа, сводится к повышению точности диагностики при определении онкологического процесса.
Технический результат достигается с помощью метода флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 у разных видов млекопитающих на цитологических препаратах, включающий забор при помощи тонкоигольной аспирационной биопсии (ТИАБ) цитологического материала из опухолей молочных желез у животных, путем выдавливания живых клеток на предметное стекло, при этом проводится фиксация в 96% спирте с последующей сушкой при комнатной температуре в течение 10 минут, после чего наносится ДНК-зонд FGFR1 (Breakapart/Amplification Probe), с последующей денатурацией в автоматической FISH- системе в течение 5 минут при 80°С и гибридизацией при 37°С 16-18 часов, затем проводят отмывание буферными растворами в течение 3 минут, наносят флюоресцентный краситель DAPI;
Ген, кодирующий FGFR1, локализуется на хромосоме 8 в локусе p11.23 (8р11.23), при наличии опухолевой патологии данный ген подвергается многообразным изменениям, в том числе амплификации и мутации в различных экзонах. FGF21 - циркулирующий белок, состоящий из 181 аминокислот.FGF21 принадлежит к суперсемейству факторов роста фибробластов (FGF), которое получило название в связи со способностью стимулировать пролиферацию фибробластов. Факторы роста фибробластов имеют широкий спектр биологических функций, включая клеточный рост, ангиогенез, процессы регенерации и обмен веществ.
В настоящее время в опубликованных источниках отсутствуют какие-либо данные о применении флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 при раке молочной железы у лабораторных (крысы) и домашних млекопитающих (кошка, собака) животных.
Краткое описание чертежей и иных материалов
На фиг. 1 ген, кодирующий FGFR1, который локализуется на хромосоме 8 в локусе p11.23 (8р11.23);
На фиг. 2 сигнал Fibroblast Growth Factor Receptor 1 (FGFR1) в клетке фибробластического дифферона. ТИАБ из новообразований молочной железы у собаки. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). Фильтр FITC (зеленое свечение). Ок. 15, об. 100;
На фиг. 3 сигнал Fibroblast Growth Factor Receptor 1 (FGFR1) в клетке фибробластического дифферона у собаки. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). Фильтр Texas Red (красное свечение). Ок. 15, об. 100;
На фиг. 4 Количество клеток с сигналами гена FGFR1.
Осуществление изобретения
Исследования проводят на базе Научно-диагностического и лечебного ветеринарного центра ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» в гистологической лаборатории.
Цитологическое исследование материла, отобранного от тонкоигольной аспирационной биопсии (ТИАБ) из опухолей молочной железы, осуществляют следующим образом: при помощи шприца выдавливают живые клетки на предметное обезжиренное стекло, оставляют препараты сохнуть на воздухе в течение 20 минут. Фиксацию материала проводят путем протекания 96% этилового спирта по предметному стеклу, сушат стекло в вертикальном положении при комнатной температуре 10 минут. Затем на обратной стороне предметных стекол обводят маркером местоположение материала. На каждое клеточное пятно наносят при помощи 1-канальной автоматической пипетки (Eppendorf Reference 2, 0,5-10 мкл) по 1,5 мкл гибридизационной смеси FGFR1 (Breakapart/Amplification Probe). Такой объем полностью покрывает цитологический материал, что позволяет сократить используемую гибридизационную смесь FGFR1 (Breakapart/Amplification Probe) и получить больше образцов за одно исследование, по сравнению с указанным объемом в протоколе, в котором на предметное стекло наносится 10 мкл.
2
Далее накрывают каждый цитологический материал квадратным покровным 24×24 мм стеклом и наносят по краям покровного стекла универсальный резиновый клей Момент «Кристалл» для герметизации, который согласно проведенным исследованиям имеет высокую прочность склеивания, водостойкость клеевого соединения, теплостойкость и легкое снятие без повреждения исследуемого цитологического материала после проведения денатурации и гибридизации.
Проводят денатурацию на автоматической FISH-гибридизационной системе «ThermoBrite» (кампания StatSpin), устанавливают стекла на пластину и вставляют две увлажняющие полоски, смоченные в ультрачистой ионизированной воде, в держатели на внутренней стороне крышки. Далее устанавливают программу «Денатурация и Гибридизация». Денатурация - это когда молекула ДНК приобретает вид одноцепочечной нити. При реакции гибридизации происходит взаимодействие ДНК-зонда и комплементарным ему участком ядерной ДНК материала.
Денатурируют материал при 80°С - 5 минут. Потом происходит автоматическое охлаждение столика, на котором расположены предметные стекла, после чего происходит автоматическая гибридизация. При гибридизации инкубируют препараты в течение 18 часов при температуре 37°С у собак и 16 часов при температуре 37°С у кошек, в связи с разным сцеплением белков с ДНК-зондом.
2
После гибридизации удаляют клей с краев покровного стекла и при помощи гистологической иглы снимают стекло. Затем следует отмывка, которая включает внесение предметных стекол в предварительно нагретый до 72°С отмывочный буфер Prewarm Wash Buffer 1 (0,4 × SSC / 0,3% lgepal) на 2 минуты. После чего стекла быстро (чтобы не высохли клетки) промакивают вокруг исследуемых зон одноразовыми бумажными полотенцами для создания сухого поля вокруг материала и наносят гидрофобный слой восковым маркером (для предотвращения растекания реактивов). Далее наносят при помощи 1-канальной автоматической пипетки (Eppendorf Reference 2, 0,5-10 мкл) 20 мкм буфера Wash Buffer 2 (2 × SSC / 0,1% lgepal) на 1 минуту. Промакивают препараты одноразовыми бумажными полотенцами и наносят с помощью автоматической пипетки (Eppendorf Reference 2, 0,5-10 мкл) 15 мкл контрастирующего красителя DAPI (Antifadec0.1), содержащий флюорохромом, после чего накрывают каждое предметное стекло покровным стеклом размерами 24×24 мм.
После этого помещают в термостат при температуре 25°С, что время выдержки в термостате предметных стекол с флюорохромом для собак составляет 10 минут, для кошек составляет 15 минут. Затем предметные стекла с исследуемым цитологическим материалом помещают под темную светонепроницаемую пластину, после чего поочередно анализируют каждый препарат при помощи флюоресцентного микроскопа, остальные стекла с материалом остаются под темной светонепроницаемой пластиной для избежание попадания света, что влияет на экспрессию свечения.
Таким образом, время на проведение FISH-реакции составляет примерно 19 часов.
Результаты цитологического исследования. Материал, полученный от собак под номерами №1, 2, 5 показал, что количество клеток с свечением исследуемого гена FGFR1 занимают более 10% от общей площади. В них количество флюоресцирующих сигналов фильтров Texas Red красного и FITC зеленого свечений гена FGFR1 регистрировалось от 2 до 5. Свечения сигналов имеют выраженную экспрессию, что является признаком амплификации гена в клетках фибробластического дифферона, их активной пролиферации и синтеза белка коллагена.
Для верификации предложенного способа было проведено патогистологическое исследование опухолей молочных желез у собак, при котором были диагностированы такие новообразования, как инфильтративный рак неспецифического типа (G3), папиллярная аденокарцинома, плеоморфная аденокарцинома.
Материал, полученный от кошек под номерами №6, 9 показал, что количество клеток с свечением флюоресцирующих сигналов фильтров Texas Red красного и FITC зеленого свечений гена FGFR1 регистрировалось от 3 до 4. Свечения сигналов были выражены, что говорит об амплификации гена FGFR1 в клетках фибробластического дифферона.
Для верификации предложенного способа было проведено патогистологическое исследование опухолей молочных желез у кошек, при котором были диагностированы такие новообразования, как папиллярная аденокарцинома, протоковая карцинома in situ.
Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:
- непродолжительное время обработки материала;
-уменьшение количества артефактов, за счет сохранения целостности самой опухоли во время отбора материала;
- высокая оценка флюоресцентного сигнала в целых неповрежденных мембранах ядра клеточного материала;
- выполнение FISH на препаратах, полученных от ТИАБ при злокачественных опухолях молочной железы у лабораторных и домашних млекопитающих животных;
-снижение стоимости цитологического препарата за счет малого расхода жидких реактивов и буферов.