Способ прогнозирования степени риска развития гематогенных метастазов при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы на основе оценки экспрессии белка LIMCH1
METHOD FOR PREDICTING THE DEGREE OF RISK OF DEVELOPING HEMATOGENOUS METASTASES IN INVASIVE CARCINOMA OF A NON-SPECIFIC TYPE OF MAMMARY GLAND BASED ON THE ASSESSMENT OF THE EXPRESSION OF LIMCH1 PROTEIN

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способов прогнозирования риска развития гематогенных метастазов при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы на основе оценки экспрессии белка LIMCH1 у пациенток вне зависимости от проведенного лечения.
Число заболевших раком молочной железы растет с каждым годом. В 2017 году в России этот показатель составил 456,6 на 100000 человек [1]. Несвоевременность диагностики РМЖ, высокий удельный вес больных с запущенным опухолевым процессом (31,9%) и высокая одногодичная летальность (7,4%) обусловливают необходимость в совершенствовании подходов по определению риска прогрессирования рака молочной железы для ее профилактики и адекватного лечения пациентов. При этом, наиболее важной формой прогрессии рака молочной железы и причиной смертельного исхода у 90% пациентов является гематогенное метастазирование [2]. Кроме этого, существующие на сегодняшний день маркеры для прогнозирования риска прогрессии рака молочной железы не являются универсальными для всего контингента больных, что делает актуальным задачу по поиску маркеров, позволяющих формировать группы высокого и низкого риска.
В настоящее время для прогнозирования риска развития гематогенного метастазирования используют ряд клинических, гистологических, молекулярных и генетических маркеров. Наиболее признанными клиническими параметрами называют отсутствие отдаленного метастазирования на момент постановки диагноза, размер опухоли и метастатический статус лимфатических узлов. В частности, пациенты, имеющие первичную опухоль размером более 5 см и четыре и более пораженных лимфатических узлов, относятся к группе с высокой вероятностью развития метастазов [3, 4, 5]. К гистологическим маркерам относят степень злокачественности опухоли, определяемой на основании оценки количества митозов, наличия тубулярных структур и ядерного полиморфизма [6].
Опухоли, имеющие степень злокачественности равную 1, имеют низкий риск развития гематогенных метастазов, в то время как опухоли 2 и 3 степени злокачественности - промежуточный и высокий [4, 7]. Однако, описанные прогностические признаки только в 30% случаев оказываются эффективными [6].
Известен способ прогнозирования гематогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы у пациенток с хорошим ответом на неоадъювантную химиотерапию (патент RU №2627649), основанный на определении альвеолярных, тубулярных, трабекулярных, солидных структур и дискретных групп опухолевых клеток в ткани опухоли [8], однако способ применим только для определенной группы пациенток, а именно пациенток с хорошим ответом на неоадъювантную химиотерапию.
Известен способ прогнозирования развития метастазов у больных раком молочной железы (патент RU №2675236), основанный на анализе экспрессии генов MAGEA2, MAGEB1 и XAGE3 в ткани рака молочной железы [9]. Однако, способ предполагает наличие высокотехнологического оборудования, а также квалифицированных специалистов-генетиков, что делает его практически не доступным для внедрения в практику онкологических диспансеров.
Известен способ прогнозирования гематогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы на основе определения различных популяций циркулирующих опухолевых клеток в крови до лечения (Патент RU №2678202), который основан на определении различных популяций циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) до лечения пациента [10]. Однако, как и предыдущий, способ осуществляется с использованием высокотехнологичного оборудования, кроме того, требует существенных финансовых затрат на приобретение панели маркеров. Помимо этого, способ подразумевает дополнительное взятие биологического материала от больного.
В целом, все описанные способы являются трудоемкими и сложными в проведении способы.
Наиболее близким к предлагаемому является способ прогнозирования развития метастазов у больных раком молочной железы, который подразумевает оценку маркеров в ткани рака молочной железы. Проводят амплификацию в режиме реального времени в присутствии красителя EvaGreen Dye с использованием высокоспецифичных праймеров для генов MAGEA2, MAGEB1, XAGE3 и GAPDH, проводят анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора, рассчитывают относительную экспрессию генетических локусов по формуле 2-ΔCt, вычисляют коэффициент экспрессии генов - KMAGEA2, KMAGEB1, KXAGE3 по формуле K=Ecancer/Enormal, где Есапсег-относительная экспрессия генов в опухолевой ткани, Enormal- относительная экспрессия генов нормальной ткани молочной железы, и при значениях KMAGEA2<0,6±0,2, KMAGEB1<1,0±0,3 и KXAGE3<1,0±0,8 прогнозируют отсутствие метастазов, а при значениях KMAGEA2>3,5±0,9, KMAGEB1>17,7±2,1 и KXAGE3>14,7±1,5 прогнозируют развитие метастазов. Способ позволяет осуществить прогноз развития метастазов при раке молочной железы. Как и в предлагаемом нами, способ не требует дополнительных инвазивных манипуляций для пациента.
Среди недостатков данного способа можно отметить высокую стоимость генетических исследований и сравнительно невысокую чувствительность и специфичность. Помимо этого, существенной преградой для повсеместного применения данного способа является требование к квалификации персонала, выполняющего данный анализ.
Технический результат - упрощение, повышение точности и информативности способа.
Для достижения нового технического результата в способе прогнозирования степени риска развития гематогенных метастазов при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы на основе оценки экспрессии белка LIMCH1, включающем исследование опухолевой ткани пациента и последующий расчет диагностического показателя, в котором с помощью иммуногистохимических исследований, определяют значение цитоплазматической экспрессии белка LIMCH1 в опухолевых клетках и оценивают в баллах, при этом, если количество клеток с цитоплазматической экспрессией белка LIMCH1 более или равно 1, значение оценивают в 2 балла, если количество клеток с цитоплазматической экспрессией белка LIMCH1 менее 1, значение оценивают в 1 балл, далее рассчитывают значение уравнения регрессии Y по формуле:
-4,39 - значение коэффициента регрессии свободного члена;
X1 - значение цитоплазматической экспрессии белка LIMCH1 в опухолевых клетках инвазивной карциномы молочной железы в баллах;
3,04 - значение коэффициента регрессии этого признака,
Y
Y
далее определяют значение вероятности развития гематогенных метастазов Р по формуле: Р=e/(1+e), где е - математическая константа, равная 2,72
и при Р более или равно 50% определяют высокий, а при Р менее 50% - низкий риск развития гематогенных метастазов.
Способ осуществляют следующим образом.
Материалом для исследования служит опухолевая ткань, полученная в ходе оперативного лечения пациента. Производят вырезку фрагментов ткани опухоли размером 1×0,5×0,5 см. Материал фиксируют в 10-12% растворе забуференного формалина. Иммуногистохимическое исследование осуществляют по стандартной методике. Применяют антитела фирмы «Thermo» к белку LIMCH1 PrEST (поликлональное, 1:500, кроличье). С помощью иммуногистохимических исследований, определяют значение цитоплазматической экспрессии белка LIMCH1 в опухолевых клетках и оценивают в баллах, при этом, если количество клеток с цитоплазматической экспрессией белка LIMCH1 более или равно 1, значение оценивают в 2 балла, если количество клеток с цитоплазматической экспрессией белка LIMCH1 менее 1, значение оценивают в 1 балл, далее рассчитывают значение уравнения регрессии Y по формуле:
Y=-4,39+3,04*X1
-4,39 - значение коэффициента регрессии свободного члена;
X1 - значение цитоплазматической экспрессии белка LIMCH1 в опухолевых клетках инвазивной карциномы молочной железы в баллах;
3,04 - значение коэффициента регрессии этого признака,
далее определяют значение вероятности развития гематогенных метастазов Р по формуле:
е - математическая константа, равная 2,72,
и при Р более или равно 50% определяют высокий, а при Р менее 50% - низкий риск развития гематогенных метастазов.
Модель имеет высокую степень достоверности (х2=24,33; р=0,00001). Чувствительность 78%, специфичность 85%.
Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
. Больная Ш., 44 года с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы. Было выявлено отсутствие цитоплазматической экспрессии белка LIMCH1 в опухолевых клетках (1).
Y
Y
Была проведена оценка риска развития гематогенных метастазов согласно предлагаемому способу по формуле: Y=-4,39+3,04*1=-1,35. Значение вероятности развития гематогенных метастазов определяли по формуле: Р=e/(1+e)=0,2592/(1+0,2592)=0,2058. Вероятность развития гематогенных метастазов составила 20,58%.
При десятилетнем сроке наблюдения отмечалось отсутствие гематогенных метастазов.
Пример 2
. Больная К., 40 лет, с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы. Были выявлены следующие параметры: наличие цитоплазматической экспрессии белка LIMCH1 в опухолевых клетках (2).
Была проведена оценка риска развития гематогенных метастазов согласно предлагаемому способу: Y=-4,39+3,04*2=1,69. Значение вероятности развития гематогенных метастазов определяли по формуле:  Вероятность развития гематогенных метастазов составила 84,42% (>50%). Через 36 месяцев у больной были выявлены гематогенные метастазы в кости.
Предлагаемый способ основан на анализе данных иммуногистохимического исследования ткани первичной опухоли, анализе амбулаторных карт и медицинских карт стационарного больного.
1-3
0-3
0
Изучался операционный материал от 55 пациенток с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы, проходивших лечение в НИИ онкологии Томского НИМЦ. Средний возраст больных составил 52,9±13,4 лет, стадии TNМ. 29 пациенток на предоперационном этапе получили от 2 до 6 курсов полихимиотерапии по схеме FAC (5-фторурацил, адриамицин, циклофосфамид) или по схеме САХ (циклофосфан, адриамицин, кселода), 26 пациенток не получали неоадъювантную терапию. Операцию выполняли в объеме радикальной мастэктомии или радикальной резекции молочной железы.
Сроки наблюдения за больными составили 10 лет (120 месяцев). У 28 пациенток были диагностированы гематогенные метастазы. Наличие гематогенных метастазов у пациенток регистрировали на основании результатов анализа амбулаторных карт и медицинских карт стационарного больного, а также анализа канцер-регистра.
Макроскопической оценке подвергали ткань первичной опухоли. Производили вырезку фрагментов ткани новообразования молочной железы размером 1×0,5×0,5 см. Материал фиксировали в 10-12% растворе нейтрального формалина. Проводка материала осуществляли по стандартному протоколу. Иммуногистохимическое исследование выполняли следующим образом: готовили 5-мм срезы ткани на стеклах с поли-L-лизиновым покрытием (PolysineSlides, Thermo, США). Высушивали в течение 12 часов при 56°С, затем депарафинизировали ткань, проводя по серии ксилолов (3 раза по 10 минут) и спиртов (3 раза по 5 минут), и помещали на 10 минут в дистиллированную воду. После этого демаскировали ткань в ЭДТА-буфере (Dako, Дания) в модуле PT-LINK (Dako, Дания) в течение 20 минут при 97°С. После охлаждения стекол до комнатной температуры их переносили в фосфатный буфер (PBS) (Dako, Дания). Затем, на ткань наносили Peroxidase blocking reagent (Dako, Дания), инкубировали в течение 10 минут и промывали PBS однократно. Далее, стекла помещали во влажную камеру и в течение 25 минут инкубировали с первичными антителами против LIMCH1 (PrEST, поликлональное, 1:500, кроличье, Thermo). Затем промывали стекла PBS двукратно и наносили систему визуализации Dako EnVision (Dako, Дания) и инкубировали 15 минут. Затем наносили хромоген DAB на 5 минут и промывали водой. Препараты заключали канадским бальзамом.
Оценку результатов исследования проводили с помощью световой микроскопии, определяли наличие цитоплазматической экспрессии белка LIMCH1 в клетках опухоли. О наличии цитоплазматической экспрессии говорили, когда в более чем в одной клетке опухоли обнаруживали положительную иммуногистохимическую реакцию.
Статистическую обработку результатов выполняли с помощью пакета программ «Statistica 8.0 for Windows». Обсуждали результаты с достоверностью различий при р<0,05.
Для предсказания риска развития гематогенных метастазов использовали метод логистической регрессии. Была определена формула:
-4,39 - значение коэффициента регрессии свободного члена;
X1 - значение цитоплазматической экспрессии белка LIMCH1 в опухолевых клетках инвазивной карциномы молочной железы, при этом: Х1=1, если цитоплазматической экспрессии белка LIMCH1 в клетках опухоли нет; X1=2, если цитоплазматическая экспрессия белка LIMCH1 в клетках опухоли есть;
3,04 - значение коэффициента регрессии этого признака,
далее определяли значение вероятности развития гематогенных метастазов Р по формуле:
е - математическая константа, равная 2,72
и при Р≥50% определяли высокий, а при Р<50% - низкий риск развития гематогенных метастазов.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет с большей точностью и информативностью прогнозировать степень риска развития гематогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы, что позволит формировать группы пациентов с высоким и низким риском и определять соответствующую тактику ведения пациентов. Степень достоверности способа (х2=24,33; р=0,00001), чувствительность 78%, специфичность 85%.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания:
1. Злокачественные новообразования в России в 2017 году (заболеваемость и смертность). Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, - 2018. - илл. - 250 с.
2. Nguyen DX, Bos PD, Massague J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 2009; 9(4):274-284. doi:10.1038/nrc2622
3. Koscielny S et al. Breast cancer: Relationship between the size of the primary tumour and the probability of metastatic dissemination. British Journal of Cancer. 1984; 49(6):709-715.
4. Rosen PP et al. Pathological prognostic factors in stage I (T1N0M0) and stage II (T1N1M0) breast carcinoma: A study of 644 patients with median follow-up of 18 years. Journal of Clinical Oncology. 1989; 7(9):1239-1251.
5. Carter CL, Allen C, Henson DE. Relation of tumor size, lymph node status, and survival in 24,740 breast cancer cases. Cancer. 1989; 63(1):181-187.
6. Rakha EA et al. Breast cancer prognostic classification in the molecular era: The role of histological grade. Breast Cancer Research. 2010; 12(4):207.
7. Elston CW, Ellis IO. Pathological prognostic factors in breast cancer. I. The value of histological grade in breast cancer: Experience from a large study with long-term follow-up / C.W. Elston, I.O. Ellis // Histopathology. - 1991. - Vol. 19. - N. 5. - P. 403-410.
8. Геращенко T.C., Денисов E.B., Завьялова M.B., Крахмаль Н.В., Перельмутер В.М., Чердынцева Н.В., Слонимская Е.М., Литвяков Н.В., Савельева О.Е. Способ прогнозирования гематогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы у пациенток с хорошим ответом на неоадъювантную химиотерапии. Патент на изобретение RU 2627649, опубл. 09.08.2017.
9. Кит О.И., Водолажский Д.И., Франциянц Е.М., Кутилин Д.С., Могушкова Х.А., Вереникина Е.В. Способ прогнозирования развития метастазов у больных раком молочной железы. Патент на изобретение RU 2675236, опубл 18.12.2018.
10. Кайгородова Е.В., Перельмутер В.М., Тарабановская Н.А., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Способ прогнозирования гематогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы на основе определения различных популяций циркулирующих опухолевых клеток в крови до лечения. Патент на изобретение RU 2678202, 24.01.2019. Заявка №2018111333 от 29.03.2018.