УСТРОЙСТВО ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ КЛЕТОК ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ

УСТРОЙСТВО для ЬЫДьЛЕНИЯ КЛЕТОК из БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ
Заявляемая полезная модель относится к области биологии и медицины, а именно к устройствам, позволяющим получать однотипные популяции клеток из гетергенных клеточных взвесей.
Необходимость разделения таких клеточных взвесей обусловлена задачами как биологического ( в работах по биотехнологии, иммунологии, генетике, аналитической цитологии, клеточной биохимии и др.), так и медицинского характера ( например, при лечении гемобластозов, лучевой болезни и т.д.).
В настоящее время для этих целей используются проточные цитофлуориметры типа: - Epics Elite фирмы Coulter Electronics (USA) или FACStar plus фирмы Beckton Dickinson (USA).
Эти устройства состоят из проточной камеры, вибрирующей с частотой 20 кГц, с центральным отверстием диаметром 80 -250 мкм, зарядного устройства, отклоняющих пластин, находящихся под напряжением 2-3 кВ, источника лазерного излучения, возбуждающего флуоресценцию клеток, оптико-электронного блока регистрации, усиления и обработки флуоресцентного сигнала, решающего устройства, системы подачи клеточной взвеси и сбора выделенной клеточной популяции.
При работе на этих установках клетки гетерогенной взвеси, предварительно окращенные флуоресцентнымикрасителями
флуорохромами или моноклональными антителами с флуоресцентными присадками, специфически связывающимися только с клетками определенного типа, поступают в проточную камеру. Клеточная взвесь, проходя через капиллярное отверстие проточной камеры принимает вид тонкой ламинарной струи, которая вытекает из выходного сопла. При этом клетки, находящиеся во взвеси, располагаются по центру струи друг за другом. Таким образом, происходит формирование моноклеточного потока. Проточная камера, формирующая струю, вибрирует за счет пьезокристалла, питающегося от звукового генератора, в результате чего ламинарная струйка разбивается на ряд отдельных капель. В среднем каждая сороковая капля содержит в себе по одной клетке, остальные капли пустые. Капли, следующие друг за другом, пересекают лазерный луч, возбуждающий флуоресценцию флуорохромов, окрашивающих клетки. Свет флуоресценции собирается, усиливается и регистрируется оптикоэлектронной системой, которая выдает сигнал на решающее устройство.
. 4 ;y. :- ff.
.-.tfjv.M.-V.
А61 J 1/0,5
.В зависимости от харктера сигнала флуоресценции (длины волны излучения или ее интенсивности) решающее устройство вырабатывает управляющий сигнал, приходящий на зарядный блок, который заряжает каплю с находящейся в ней клеткой зарядом статического электричества. Капли с клетками, имеющими другие флуоресцентные параметры или неокрашенные, заряжаются другим знаком заряда, не несущие клеток - не заряжаются. Заряженные капли проходят между дефлекторными пластинами, которые отклоняют их в зависимости от знака заряда в собирающие сосуды.
Таким образом, в одном сосуде собираются клетки, подлежащие вьщелению, а в другом все остальные.
Принципиальным недостатком данного устройства является невозможность выделения одновременно из одной и той же биологической жидкости нескольких различных клеточных популяций, что часто является необходимым и заставляет прибегать к последующим этапам сортировки, увеличивая время и затраты на выполнение данной процедуры.
Другим существенным недостатком является отсутствие полной герметизации установки, что исключало бы контакты исследуемого образца с внешней средой и, что необходимо при работе со стерильным или зараженным материалом. В ряде случаев соблюдение стерильности всей процедуры совершенно необходимо, например, при работах по пересадке клеток костного мозга, используемого при лечения лейкозов, лучевой болезни и т.д.
В устройстве, описанном Kamentsky L.A. - The rapid cell spectrofotometr в кн.: Autometed cell identification and cell sorting .Ed. by G.Z. Wide and G.F. Bakz. Acad. Press New-York and London, 1970, pp.111-121., используется другой тип проточной камеры, которая устанавливается на предметном столике микроскопа. Камера представляет собой герметически закрытый блок с оптическими окнами снизу и сверху для подсветки и регистрации клеток через объектив микроскопа. В камере имеется канавка, по которой протекает взвесь клеток, подлежащих вьщелению. Под некоторым углом к этой канавке имеется другая (отводящая) канавка, которая соединена с устройством, представляющим собой поршень, перемещаемый щаговым двигателем, что позволяет импульсно отсасывать часть протекающей жидкости вместе с находящимися в ней клетками в собирающую емкость. Имеется также источник света, облучающий клетки снизу, оптико - электронный блок, собирающий, усиливающий и регистрирующий оптический сигнал от клеток, и решающее устройство.
поглощения света), медленно протекает по канавке. При прохождении поля зрения микроскопа клеткой с оптической характеристикой соответствующей заданной, оптико-электронное устройство регистрирует ее и вырабатывает сигнал, который включает шаговый двигатель, приводящий в движение поршень, в силу чего часть жидкости вместе с этой клеткой отсасывается в отводящий канал и попадает в собираюшую емкость.
В данном устройстве практически исключен контакт исследуемого материала с внешней средой и, таким образом, легко могут быть соблюдены условия стерильности и работы с контагиозным материалом.
Однако, недостатком вьппеуказанного устройства является его низкая производительность и необходимость работать только с сильно разбавленными клеточными взвесями, так как в противном случае чистота выделенной взвеси клеток будет недостаточной.
Как и в предьщущем устройстве, одномоментно возможно вьщеление только одной клеточной субпопуляпии.
Еще одно устройство для выделения однотипных клеточных взвесей из гетерогенной по клеточному составу биологической жидкости описано в журнале: Cytometry. Jan F. Keij, Ad С. Groenewegen, George B.J.Dubelar, and Jan W.M.Visser. ffigh-Speed Photodamage Cell Selection Using a FrequencyDoubled Argon Ion Laser. Cytometry, 1995. Vol. 19, N 3, pp.209-216.
Данное устройство состоит из проточной камеры, представляющей собой узкий капилляр, имеющий сверху 2 оптических окна, источника лазерого излучения, возбуждающего флуоресценцию, сфокусированного на первое оптическое окно, источника излучения света с длиной волны 257 нм и мощностью 20 - 100 MW разрушающего клетки, сфокусированного на второе онтическое окно, оптико-электронного блока, собирающего, регистрирующего , усиливающего оптический сигнал и выдающего управляющий импульс, решающего блока, вырабатывающего запирающий сигнал, оптического затвора и системы сбора выделенных клеток.
Окрашенные клетки ( процедуры окраски не отличаются от нредыдущих ) протекают через капилляр проточной камеры за счет давления создаваемого на входе проточной системы, где пересекают луч первого лазера, возбуждающего флуоресценцию клетки. Свет флуоресценции проходит через оптическую систему и регистрируется оптическим детектором, который устанавливает принадлежность клетки к данному типу, после чего вырабатывает управляющий сигнал, поступающий , в свою очередь, на решающее устройство. Клетка же продолжает двигаться по капилляру далее, и пересекает луч второго (разрушающего) лазера. Если флуоресцентныепараметры
соответствуют заданным параметрам, то решающее устройство выдает запирающий сигнал, закрывающий оптический затвор, и свет разрушающего лазера не достигает клетки.
К положительным сторонам данного устройства относится высокая скорость работы (до 22000 клеток/с.) и чистота селекции (от 81 до 100%) клеток.
Недостатком данного устройства, как и всех вьппеописанных, является невозможность одновременного получения более одной клеточной субпопуляции из гетерогенной клеточной взвеси.
Данное устройство по числу совпадаюших признаков ближе всего сопоставимо с заявляемым и поэтому принято в качестве прототипа.
Технической задачей настоящей полезной модели является обеспечение возможности получения одновременно нескольких (3 и более) субпопуляций из одной гетерогенной клеточной взвеси.
Эта задача решается с помощью устройства состоящего из проточной камеры с входным и выходным отверстиями, соединенными соответственно с емкостями для подачи биологических жидкостей и сбора выделенных клеток, источника света, возбуждающего флуоресценцию, и источника лазерного  с д:шной волны 257 нм и мощностью 20 100 MW, расположенных над проточной камерой, оптико - электронного блока, включающего оптические элементы и детектор света, оптического затвора и решающего устройства, в котором, согласно предлагаемой полезной модели, проточная камера содержит 3 выходных отверстия расположенных относительно друг друга под углом 120°. Каждое выходное отверстие соединено канавками со входным отверстием, находящимся в центральной части проточной камеры и имеющим диаметр 80-100 мкм. Дополнителп.но устройство имеет опак-иллюминатор и вращающуюся призму, расположеннзтю под оптическим окном, а оптикоэлектронный блок содержит 3 детектора света.
Для лучшего понимания предлагаемой модели приведена принципиальная схема устройства (Фиг. 1 ), где:
1- проточная камера
2- емкости для сбора выделенных клеток
3- емкость для биологической жидкости
4- входное отверстие
5- выходные отверстия
6- источник света возбуждающий флуоресценцию
7- опак - иллюминатор
10-источник лазериого излучения с длиной волны 257 нм и мощностью 20-100MW
11- оптический затвор
12- вращающаяся призма
13- луч, возбуждающий флуоресценцию
14- лазерный луч, разрушающий клетку
Работа устройства осуществляется следующим образом:
Клеточная взвесь, содержащая разные типы клеток, предварительно окрашивается флуоресцентными красителями - флуорохромами или моноклональными антителами с флуоресцентными присадками, специфически связывающимися с клетками, подлежащими вьщелению. При этом важно, чтобы оптические параметры флуорохромов ( спектры флуоресценции, интенсивность и др.) окрашивающих различные типы клеток, не перекрывались. Современные методы позволяют проводить такие процедуры, окрашивая клеточные взвеси несколькими красителями с разными оптическими свойствами. Окрашенная таким образом взвесь помешается в емкость (3) и под влиянием давления, созданного на входе системы, поступает во входное отверстие (4) проточной камеры (1). Входное отверстие (4) находится в центре проточной камеры (1), имеет диаметр 80-100 мкм и служит для формирования моноклеточного потока, в котором клетки, находясь на некотором расстоянии друг от друга, двигаются по определенной траектории. Входное отверстие (4) камеры (1), сверху, через опак-иллюминатор (7), освещается светом возбуждающим флуоресценцию (13) флуорохрома от источнка излучения (6).
Таким образом формируется информационно - измерительный объем, проходя который каждая клетка начинает флуоресцировать, излучая спектр того красителя, который специфичен для данного типа клеток.
Свет флуоресценции попадает на один из 3 детекторов света оптико электронного блока (8), который по спектральным параметрам определяет, к какому типу относится данная клетка, и выдает об этом сигнал на управляющий блок ( 9). Пройдя информационно - измерительный объем, клетка попадает в один из каналов и следует по нему к выходному отверстию (5). Каналы в местах впадения их в выходные отверстия (5) периодически облучаются светом (14) от лазера (10), имеющего интенсивность излучения 20 - 100 MW и длинну волны 257 нм. Облучение живых клеток таким лучом, приводит практически к 100% их гибели и разрушению. Этот луч постоянно перемещается по кругу за счет вращающейся призмы (12).
вырабатывает импульс запрета, закрывающий оптическое окно (11).
Закрытие оптического окна происходит только на момент пересечения лазерным лучом того канала, который соответствует данному типу клетки.
Неповрежденная клетка следует по этому каналу камеры в собирающую емкость (2). Если клетка попадает в другой канал, то она уничтожается лазерным лучом. Весь путь движения клеток герметизирован.
Таким образом, предлагаемое устройство позволяет в стерильных условиях, с высокой скоростью одновременно сортировать и выделять 3 и более субпопуляций с высокой степенью чистоты сортируемого материала из гетерогенных по клеточному составу, биологических жидкостей и клеточных взвесей или очищать их от ненужных или патологических элементов.
Устройство разработано в лаборатории отдаленной лучевой патологии Центрального научно-исследовательского рентгено-радиологического института МЗ РФ.