ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕРГЕНСПЕЦИФИЧЕСКИХ JgG-АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА (JgG-AT-ИФА)

Полезная модель относится к медицине, а именно, к лабораторной диагностике.
В последнее годы, по данным Всемирной организации здравоохранения, растет число патологий, вызванных недостаточностью иммунной системы. К таким заболеваниям относятся и пищевая аллергия и связанные с ней аллергические заболевания. Распространенность аллергических заболеваний имеет более высокие значения в регионах (районах) с экологически неблагоприятной обстановкой, обусловленной антропогенными воздействиями на окружающую среду, и зависит как от характера аллергенного окружения, так и от климатогеографических особенностей (Пищевая аллергия у детей. Современные аспекты. - Ревякина В.А., Боровик Т.Э., Российский Аллергологический Журнал, №2, 2004.) Отмечено, что пищевая аллергия с возрастом теряет свою доминирующую роль и некоторые непереносимые пищевые продукты в раннем детском возрасте не вызывают обострений аллергических заболеваний у взрослых. Однако, к примеру, клинические проявления поллиноза у взрослых могут усиливаться и даже провоцироваться приемом свежих фруктов и овощей, что объясняется наличием перекрестно-реагирующих свойств между пыльцевыми и пищевыми аллергенами (Пищевая аллергия у детей. Современные аспекты. - Ревякина В.А., Боровик Т.Э., Российский Аллергологический Журнал, №2, 2004.)
Таким образом, проблема аллергических болезней и, в частности, пищевой аллергии, является важной медико-социальной проблемой современности, значение которой будет возрастать в последующие годы. Следовательно, решение практических медицинских вопросов этой проблемы в значительной степени зависит от качества специфической аллергодиагностики.
Считается, что у большинства пациентов антитело, типично отвечающее за аллергическую реакцию, принадлежит к IgE-изотипу. Однако отмечают, что не все аллергические реакции являются IgE-зависимыми. В 2001 г. Европейской академией аллергии и клинической иммунологии в новой номенклатуре
nd
аллергических заболеваний было предложено аллергические заболевания определять как IgE-опосредованную и не IgE-опосредованную повышенную чувствительность организма к различным аллергенам. (Johansson S.G.O. et al. A revised nomenclature for allergy. An EAACI position statement from the EAACI nomenclature task force. Allergy, 2001, v.56, p.813-824.). Указывают, что при не IgE-опосредованной аллергии антитело может принадлежать к изотипу IgG, как при анафилаксии, сывороточной болезни, пищевой аллергии, где в основе лежат иммунные комплексы (антиген + IgG антитело) (Gell PGH, Coombs RRA/ Clinical aspects of immunology. 2 ed. Oxsford: Blackwell, 1968: 575-596.)
Следовательно, определение уровня специфических антител класса IgG в диагностике аллергических заболеваний представляется важным критерием в комплексе диагностических мероприятий.
Среди лабораторных методов в специфической диагностике аллергий наиболее информативными являются иммунологические: радиоаллергосорбентный тест (PACT) и метод иммуноферментного анализа (ИФА), выявляющие с большой достоверностью специфические IgE и IgG-антитела к различным пищевым аллергенам. Диагностическая ценность данных методов очень высока и составляет 87-93%, информативность же кожного тестирования пищевыми аллергенами - лишь 49%. (Аллергические болезни. Диагностика и лечение. Под ред. Р.Паттерсона. М., Гэотар Мед., 2000, с.733.). Более приемлема для клинического использования, по мнению исследователей, полуколичественная оценка (Комарова М.В. Синельникова Л.В. Фуфыгина Е.Г. К вопросу об исследовании пищевой непереносимости по немедленному и замедленному механизмам. - Сборник научных трудов: "Екатеринбургский консультативно-диагностический центр: итоги 15-летней деятельности в практическом здравоохранении". - Екатеринбург, 2004. - С.229-230).
Вместе с тем, по исследованиям литературных данных последних лет, определение специфических IgG-антител в клинико-диагностических лабораториях России представлены с использованием наборов реагентов и тест-систем только зарубежных компаний:
Компания "Хитачи Кемикл Диагностикс Инк." США) предлагает хемилюминесцентный метод определения специфических IgE и IgG - множественный аллергосорбентный тест с применением хемилюминесцентного анализа (MAST-CLA).
Сущность метода MAST-CLA заключается в проведении реакции аллергенспецифический IgE(IgG) с последующей меткой образовавшегося комплекса фотореагентом и определении его свечения, интенсивность которого пропорциональна концентрации специфического IgE(IgG) в сыворотке пациента.
Компания Dade Behring (США) предлагает измерение специфических иммуноглобулинов крови на основе нефелометрического метода. Метод основан на реакции преципитации комплекса «белок - высоко специфичная сыворотка». Для этого производятся измерения бокового рассеяния лазерного излучения на длине волны 480 нм. с использованием автоматического анализатора.
Голландская фирма "Medland Systems" предлагает определение специфических IgE и IgG в сыворотке крови с использованием электродиагностического хемилюминисцентного аппарата CLA-1.
Предлагаемые для специфической диагностики аллергены иммобилизованы на твердофазном носителе, в роли которого выступает нитроцеллюлозный диск (аллергодиск) диаметра лунки микропланшета (при определении специфических IgE-антител) либо поверхность пластиковых пробирок или лунок микропланшета (при определении специфических IgG-антител).
Наиболее близкой по техническому решению является тест-система для определения специфических IgG-антител к пищевым аллергенам фирмы Dr.Fooke Laboratorien GmbH [дистрибьютор фирмы Dr.Fooke Laboratorien GmbH (Германия) - ЗАО "БиоХимМак Диагностика", г.Москва].
Для проведения анализа предлагаются следующие реагенты:
1. Тест-система, включающая конъюгат анти-IgG-щелочная фосфатаза, субстрат PNPP (п-нитрофенилфосфат) в таблетках, субстратный буфер, буфер для промывки, буфер для разбавления сыворотки, стоп-раствор. Регистрация оптической плотности осуществляется при 405 нм.
2. Набор калибраторов для построения калибровочной кривой, включающий контрольные сыворотки.
3. Аллергены, иммобилизованные на твердофазном носителе (пробирки или стрипы).
Предлагаются тест-системы пробирочного и микропланшетного форматов. Индивидуально для каждого пациента составляется панель аллергенов на основании общего перечня аллергенов. При определении аллерген-специфических IgG-антител используются аллергены, иммобилизованные на поверхности пластиковых пробирок или в лунках разъединяющихся на ячейки стрипов в зависимости от формата.
Принцип метода: аллергены иммобилизованы на твердофазном носителе (микропланшетный вариант). Калибраторы предварительно разводят титрованием. Сыворотку крови предварительно разводят в 100 раз и по 100 мкл вносят в лунки планшета. Аллергены связываются со специфическими антителами, присутствующими в сыворотке крови пациента. Избыток антител удаляется на стадии промывки. На следующем этапе фермент-меченые антитела связываются с аллерген-антительным комплексом. После промывки и удаления несвязавшихся компонентов добавляется субстратный раствор, взаимодействующий с ферментом, в результате образуется цветной комплекс. Оптическая плотность полученного раствора прямо пропорциональна концентрации специфических IgG-антител в образце сыворотки.
Однако, указанная тест-система для определения специфических иммуноглобулинов класса G, имеет ряд существенных недостатков:
- внесение калибраторов на сенсибилизированную аллергенами поверхность твердофазного полистиролового планшета, что снижает уровень ковалентной связи с антителами,
- использование токсического субстрата (PNPP в таблетках),
- дополнительные затраты времени и реактивов на предварительное разведение сыворотки пациентов, титрование калибраторов, приготовление субстратхромогенной смеси;
- дорогостоящее оборудование и реагенты, что обусловливает высокую стоимость набора и, соответственно, анализа для одного пациента;
- использование аллергенов пищевых продуктов, не отвечающих климатогеографическим, экологическим зонам нашей страны и традициям питания;
- длительность постановки реакции.
Вышеперечисленное не позволяет широко использовать тест-систему в практическом здравоохранении.
Поставлена задача разработки тест-системы для полуколичественного иммуноферментного определения специфических IgG-антител к широкому спектру отечественных пищевых аллергенов в сыворотке крови пациентов (IgG-AT-ИФА).
Поставленная задача осуществляется посредством предлагаемой тест-системы IgG-AT-ИФА, в состав которой входят следующие реагенты, упакованные в одной коробке:
Референс-реагент 1 (Р1) - 96-луночные наборные стрипированнные планшеты размером 125×85, из прозрачного полимерного материала (кат.№95029100 Thermo Labsystems, кат.№70507 Greiner) с горизонтальными и вертикальными рядами лунок (8×12). используемые в качестве твердофазного носителя.
В лунках вертикального ряда №1 находятся иммобилизованные моноклональные антитела (МКАТ) анти-IgG.
В референс-реагенте использован «сэндвич»-вариант твердофазного иммуноферментного анализа, обеспечивающий высокую прочность связей: одно из моноклональных анти-IgG-антител (МКАТ) служит для сенсибилизации поверхности твердой фазы и обеспечивает связывание IgG из калибраторов. Второе МКАТ, меченое ферментом, взаимодействует со второй антигенной детерминантой связанных на твердой фазе молекул IgG.
В лунках вертикальных рядов с №2 по №12 находятся иммобилизованные пищевые аллергены, очищенные, стандартизованы по содержанию азота белка (ОАО "Биомед" им. И.И.Мечникова).
Референс-реагент 2 (Р2) - калибровочные пробы: КПА, КПВ, КПС, КПD, КПО-содержащие известное количество IgG (400, 200, 100, 50 и 0 мкг/мл) и соответствующие по ОП - 4, 3, 2, 1, 0 классам (калибрование по стандарту WHO 67/97), жидкие, готовые к применению.
Указанный диапазон калибраторов объясняется тем, что на пищевые продукты могут образоваться специфические антитела (в низких концентрациях), не вызывая аллергической реакции, но фиксируемые в ИФА.
Реагент 3 (Р3) - полистироловые наборные стрипы фирмы "Thermo Lab-systems" (Финляндия) или фирмы "Greiner" (Германия) покрытые пищевыми аллергенами с концентрацией 40 мкг/мл путем физической сорбции - 20 стрипов (рядов) по 10 стрипов (рядов) разной специфичности в каждом планшете.
Использование наборных стрипов указанных фирм позволяет использовать единичные лунки, что дает возможность избежать периода накопления необходимого для цельных или стриповых 96-луночных планшет сывороток пациентов и сократить время постановки диагноза.
Реагент 4 (Р4) - конъюгат [антитела моноклональные диагностические против легких и тяжелых полипептидных цепей иммуноглобулинов человека с ферментом пероксидазой из хрена. Рабочее разведение конъюгата 1:100 (изготовлен в Санкт-Петербурге ФСП №42-0190-0593-00 от 16.01.2002 г.). Использование указанного конъюгата позволяет улавливать специфические IgG-антитела всех подклассов, независимо от патогенетического механизма развития реакции гиперчувствительности.
Реагент 5 (Р5) - промывающий раствор, концентрированный, рН 7,4. Компоненты трио-буфера подобраны с учетом отсутствия перекрестных реакций с другими реагентами тест-системы, что исключает регистрацию неспецифических реакций.
Реагент 6 (Р6) - субстрат-хромогенная смесь (ТМБ). Система ТМБ-субстрат обеспечивает примерно в 10 раз более высокую чувствительность выявления пероксидазы, чем другие системы и, кроме того, менее токсична.
Реагент 7 (Р7) - стоп-реагент [кислота серная (ГОСТ 4204-79), 1N].
Чувствительность полуколичественного метода анализа оценивается минимальным уровнем IgG-антител (1 класс), при котором еще можно обнаружить в иммуноферментной реакции различие в оптической плотности между КПD и КПО, не содержащей IgG-антитела.
Точность определяется способностью тест-системы давать одинаковые результаты при тестировании одной и той же сыворотки на одном стрипе. Выражается коэффициентом вариации различных специфичностей в 8 репликантах каждого образца сыворотки.
Техника постановки реакции
Перед началом работы набор извлекают из холодильника и выдерживают в течение 30 мин. при комнатной температуре. Реагенты перед использованием тщательно перемешивают и готовят рабочие растворы:
Промывающий раствор, 10-кратный концентрат, разводят в 10 раз дистиллированной водой. К одному объему Р5 добавляют 9 объемов дистиллированной воды, рН 7,4.
Рабочий раствор конъюгата МКАТ анти IgG готовят путем разведения в 100 раз промывающим раствором.
Раствор субстрат хромогенной смеси готов к употреблению
Во все лунки стрипов вносят по 90 мкл промывающего раствора. В лунки А-Н первого ряда вносят по 10 мкл калибраторов в дублях. В остальные лунки вносят по 10 мкл исследуемых сывороток. Планшет помещают в термостат на 1 час при t° +37°С.
Содержимое лунок удаляют путем стряхивания из перевернутого планшета. Во все лунки планшета вносят по 150 мкл промывающего раствора, удаляют путем стряхивания. Процедуру повторяют 3 раза.
Во все лунки вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата.
Планшеты инкубируют в течение 1 часа при температуре +37°С.
Повторяют процедуру промывания 5 раз.
Во все лунки планшета вносят по 100 мкл субстрат хромогенной смеси. Выдерживают в защищенном от света месте при комнатной температуре в течение 5-30 мин.
Вносят стоп-реагент по 50 мкп в каждую лунку планшета.
Учет проводят на спектрофотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм. Анализ считается действительным, если:
- ОП КПО не превышает 0,2;
- ОП КПА превышает 1,5;
- ОП КПD превышает показатели ОП КПО.
Рассчитывают среднюю арифметическую между показателями ОП дублей калибраторов для построения калибровочной кривой с последующим определением содержания в каждом из тестируемых образцов сывороток.
Результаты тестирования представляются как точное содержание специфических антител в 1 мл сыворотки и в общепринятой системе классов значений RAST.
Сравнительный анализ исследований сыворотки пациентов в предлагаемой полезной модели проводили с исследованиями этих же образцов сывороток с использованием диагностического набора по определению специфических
IgG-антител к пищевым аллергенам фирмы Dr.Fooke Laboratorien GmbH (Германия).
Исследовалась сыворотка 114 пациентов, мужчин и женщин в возрасте от 18 до 65 лет (средний возраст 34±4,2). Обследуемые пациенты были разделены на 3 группы в соответствии с диагнозами:
- 1 группу составили 31 человек (средний возраст 29±3,1) с диагнозом: хроническая рецидивирующая крапивница неясной этиологии в стадии неполной ремиссии;
- 2 группа - 28 человек (средний возраст 39±2,5) - пациенты гастроэнтерологического отделения с диагнозами: хронический эрозивный энтероколит, хронический эрозивный гастрит в стадии неполной ремиссии;
- 3 группа - 35 человек (средний возраст 33±2,7) с диагнозом: аллергический ринит;
- 4 группу - 20 человек (средний возраст 37±4,1) составили практически здоровые сотрудники лаборатории Центра Специализированных видов медицинской помощи.
Результаты кожных скарификационных проб и исследований сывороток пациентов 1 группы (31 чел.) в предлагаемой тест-системе и тест-системе фирмы Dr.Fooke Laboratorien GmbH представлены в Таблице 1.
Сравнительный анализ полученных результатов свидетельствует о том, что иммуноферментное определение специфических IgG-антител предлагаемой тест-системой IgG-AT-ИФА не уступает, а в некоторых случаях (3-й и 4-й классы) даже превосходит показатели тест-системы Dr.Fooke Laboratorien GmbH. Это, на наш взгляд, может быть обусловлено различием антигеннго/гаптенного состава аллергенов отечественного производства, используемых в тест- системе IgG-AT-ИФА и аллергенов, используемых фирмой Dr.Fooke Laboratorien GmbH.
Отсутствие показателя очень высокой степени сенсибилизации (4+) при кожных скарификационных пробах может объясняться как истощением специфического иммунного ответа кожных покровов у таких пациентов, так и предупреждение развития таких реакций медицинским персоналом аллергологического кабинета.
Результаты определения специфических IgG-антител между тест-системой IgG-AT-ИФА и тест-системой фирмы Dr.Fooke Laboratorien GmbH во 2-й,
3-ей и 4-ой (контрольной) группах пациентов представлены в Таблицах 2, 3 и 4 соответственно. Отличия, отмечаемые в аллергенах ржаной, пшеничной, овсяной муки и цитрусовых могут быть обусловлены различием "регионального" антигенного состава отечественных и зарубежных аллергенов.
Таким образом, полученные результаты сравнения позволяют сделать вывод о том, что предлагаемая полезная модель в виде тест-системы для полуколичественного иммуноферментного определения специфических IgG-антител в сыворотке крови человека (IgG-AT-ИФА) может конкурировать с зарубежными аналогами. Минимальное количество сыворотки, расходуемой на 1 аллерген (10 мкл) позволяет рекомендовать использование тест-системы как в практическом здравоохранении вообще, так и в педиатрии, в частности.
Предлагаемая полезная модель:
1. Позволяет определять специфические IgG-антитела к широкому спектру пищевых аллергенов, определяемых как «региональные»;
2. Дешева, с достаточно коротким временем постановки, что позволяет ее использование в скрининговых исследованиях;
3. Безопасна в диагностике;
4. Высокочувствительна и воспроизводима;
5. Использование предлагаемой полезной модели возможно в любой клинической лаборатории, имеющей планшетный или стриповый спектрофотометр.