СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ПОМОЩИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ПОДХОДА
METHOD FOR DETERMINING PHAGOCYTIC ACTIVITY OF NEUTROPHILS BY MICROBIOLOGICAL APPROACH

Данное изобретение относится к области медицины, в частности к клинической иммунологии, и решает проблему оценки неспецифического иммунитета макроорганизма по показателю фагоцитарной активности нейтрофилов простым, нетрудоемким способом, не требующим дорогостоящего специализированного оборудования и высококвалифицированных специалистов.
Определение фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) широко применяют для оценки состояния иммунной системы как в практической медицине, так и при проведении научно-исследовательских экспериментальных работ. Оценку фагоцитарной активности нейтрофилов используют при анализе реактивности организма на внедрение инфекционных агентов, включая бактерии, вирусы, грибы и паразиты; при анализе действия на организм новых иммунобиологических препаратов, обладающих иммуномостимулирующим действием; при изучении состояния иммуносупрессии организма на фоне течения хронического соматического заболевания с целью определения показаний для назначения иммунокоррекции; для определения динамики иммунологических показателей на фоне применения глюкокортикоидов, цитостатиков, а также других препаратов, используемых для подавления функции иммунной системы при системных, аутоиммунных заболеваниях и т.д.
Большинство исследований по оценке ФАН проводят при помощи методов микроскопии, с использованием микроскопов с высокой разрешающей способностью, и проточной цитофлуориметрии. Это дорогостоящее оборудование, требующее определенной специализации сотрудников для работы на нем.
Все вышесказанное обосновывает поиск простых, дешевых нетрудоемких методов оценки ФАН, которые могут быть использованы для оценки уровня иммунной системы макроорганизма при выполнении экспериментальной работы любого уровня.
Наиболее распространенный способ оценки ФАН, который, например, использован Надырченко Н.А. с соавт. в работе при определении способа прогнозирования перехода среднетяжелого течения нумулярной микробной экземы в тяжелое течение включает в себя инкубацию крови (40 мкл) с равным объемом суспензии латекса (диаметр частицы 1,49 мкм) при температуре 37°С в термостате в течение 30 мин в лунках полистеролового круглодонного планшета, с последующим центрифугированием, выделением лейкоцитов, ресуспендированием с 20 мкл фосфатнобуферного раствора. Из полученной суспензии делают мазок, фиксируют 96° этиловым спиртом и окрашивают 0,5% раствором нейтрального красного. Учет результата проводят в бинокулярном микроскопе Микмед-1 (Россия) под иммерсией (10×100) путем просматривания 200 клеток [Патент: Способ прогнозирования перехода средне-тяжелого течения нумулярной микробной экземы в тяжелое течение: пат.2 681 656 С1 Рос. Федерации / Надырченко Н.А., Хисматуллина З.Р., Надырченко Р.М.; заявл. 09.04.2018; опубл. 12.03.2019, Бюл. №8].
Преимуществом данного метода является то, что используется наиболее распространенный объект для анализа ФАН - латекс. Недостатком методики является необходимость наличия у специалистов навыков подсчета клеток методом микроскопии, а также недостаточная достоверность получения результатов, обусловленная отсутствием эффективной методики выделения лейкоцитов и стандартности использования определенного объема суспензии клеток для приготовления мазка.
Среди разработанных способов оценки ФАН - биохемилюминисцентный способ. Способ основан на измерении интенсивности свечения в смесях рекомбинантных люминесцирующих бактерий с фагоцитами в соотношении 10:1 в течение 60 мин при 37°С. В качестве рекомбинантных люминесцирующих бактерий используют микроорганизмы Escherichia coli с клонированными luxCDABE генами Photobacterium leiognathii, предварительно опсонизированные в течение 10 мин нормальным иммуноглобулином человека в конечной концентрации 6-10 мг/мл, а также тем, что в пробу дополнительно вносят люминол до конечной концентрации 10-3 М, после чего проводят раздельный учет интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции фагоцитов и биолюминесценции бактериальных клеток-мишеней. Преимуществом данного метода является то, что метод обеспечивает высокую достоверность результатов, которые авторы добиваются путем измерения свечения одной пробы в двух различных диапазонах спектра (<430 нм при оценке хемилюминесценции и >540 нм при оценке биолюминесценции), а также тем, что с учетом особенностей метода измерение свечения они ведут во всем спектральном диапазоне 380-600 нм, в двух отдельных пробах (в первую, для исключения биолюминесценции - опсонизированные рекомбинантные люминесцирующие бактерии вносят после дополнительной инкубации при 42°С в течение 10 мин; во вторую, для исключения хемилюминесценции - люминол не вносят [Патент: Биохемилюминисцентный способ оценки фагоцитарной активности нейтрофилов: пат. 2007139351 А Рос. Федерации / Дерябин Д.Г., Каримов И.Ф.; заявл. 23.10.2007; опубл. 27.04.2009, публикация №2 366 953].
Недостатком данного метода являются, с одной стороны, трудоемкость - необходимость дополнительного получения препарата на основе микроорганизма Escherichia coli с клонированными luxCDABE генами Photobacterium leiognathii (для этого специалисты должны владеть методами биотехнологии), с другой, необходимость использования дорогостоящего оборудования и специально обученных специалистов, которые должны иметь навык распознавания собственной биолюминисценции микроорганизмов.
Нишева Е.С. и Галустян А.Н. предложили способ определения ФАН периферической крови живых организмов, основанный на приготовлении смеси для исследования фагоцитоза, содержащей лейкоциты и объект фагоцитоза. Для этого авторы предлагают внести объект фагоцитоза в кровь с антикоагулянтом не позднее чем через 30 мин после ее забора, после чего заполнить полученной смесью два капилляра. После этого оба капилляра с содержимым ставят в термостат при температуре 37°С, причем один из капилляров инкубируют в течение 30 мин, а другой - в течение 2 ч. По окончанию инкубации капилляры с содержимым центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин. Непосредственно после центрифугирования проводят выделение лейкоцитов. Из отобранных осадков лейкоцитов, полученных после центрифугирования капилляров, делают мазки. Определяют в каждом из мазков число нейтрофилов, вступивших в фагоцитоз, и общее число поглощенных нейрофилами микробов. Рассчитывают показатели фагоцитоза: фагоцитарный индекс, фагоцитарное число, коэффициент фагоцитарного числа и индекс бактерицидности нейтрофилов. Сопоставляют полученные значения показателей фагоцитоза с нормальными величинами и по результатам сопоставления делают вывод о наличии или об отсутствии нарушений фагоцитарной активности нейтрофилов исследуемой периферической крови [Патент: Способ определения фагоцитарной активности периферической крови живых организмов: пат. 2003 107 776 А Рос. Федерации / Нишева Е.С., Галустян А.Н.; заявл. 12.03.2003; опубл. 20.12.2004, Бюл. №35].
Способ несложен в исполнении и в этом его преимущество. Однако в методике не указан объект фагоцитоза, отсутствует информация о необходимости использования специальных методов выделения изучаемых объектов (например, получение чистых культур микроорганизмов и др.), пробоподготовка объекта. Объективность получения результатов исследования может быть снижена предложенным в изобретении способом выделения лейкоцитов.
2
Наиболее близким к заявленному способу является способ оценки ФАН, использованный Сауткиным М.Ф. при оценке защитной функции кожи. Способ заключается в определении уровня фагоцитарной активности нейтрофилов путем расчета среднего числа поглощенных микробов на один подсчитанный нейтрофил с параллельным определением числа выросших колоний на 10 см кровяного агара [Патент: Способ оценки защитной функции кожи по уровню фагоцитарной активности нейтрофилов крови: пат. 2010125825 А Рос. Федерация / Сауткин, М.Ф.; заявл. 23.06.2010; опубл. 27.12.2011, Бюл. №36.].
В патентной базе «Федерального института промышленной собственности» представлены ограниченные сведения по алгоритму использования данного способа. Общим является подход по оценке выросших колоний на питательной среде. Недостатком является неизвестный микробный объект, используемый для анализа. По-видимому, это определенные виды микроорганизмов, способные расти на кровяном агаре, обладающие способностью к гемолизу. Кроме этого, корректность использования способа подтверждается путем установления корреляции между разными методами оценки ФАН, а не между контролем и опытом при использовании одного метода.
Отсутствие простых, нетрудоемких, стандартизированных методов оценки ФАН обосновывает целесообразность дальнейшего поиска новых подходов без использования дорогостоящего оборудования и высокоспециализированных специалистов при проведении экспериментальных исследований любого уровня.
Технический результат изобретения - расширение арсенала способов оценки неспецифического иммунитета путем разработки микробиологического подхода для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов.
Поставленный технический результат достигается путем отработки отдельных этапов и соблюдения условий выполнения заявленного способа, а именно, определения оптимальной концентрации Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), при засеве которой можно легко провести подсчет выросших колоний; соблюдение температурных режимов инкубации, соотношения объемов и концентраций культуры S. cerevisiae и мононуклеаров.
Для подтверждения объективности выбора оптимальных условий постановки способа определения фагоцитарной активности нейтрофилов микробиологическим методом приведены результаты трех серий опытов.
В работе использовали пекарские дрожжи («S. cerevisiae», Россия). Для культивирования дрожжей использовали чашки Петри со средой Сабуро, анаэростат АЭ-01 («Ники-МЛТ», Россия), термостат («SANYO INCUBATOR», Япония), бактериальные пипетки, шпателя. Оценку фагоцитарной активности проводили у 20 нелинейных мышей обоего пола весом, весом 15-20 г с индуцированным состоянием иммуносупрессии. Для создания иммуносупрессии применяли дексаметазон в ампулах 4 мг/мл (ОАО «ДАЛЬХИМФАРМ», Хабаровск). Для выделения селезенки у мышей использовали препаровальный столик, фиксирующие иглы, остроконечные и тупые ножницы, пинцеты, корнцанги, чашки Петри, пробирки типа «Эппендорф» («Eppendorf», Германия), металлические ситечки, пластиковые пробирки емкостью 15 мл («Gongdong», Китай), раствор Хэнкса («Thermo Fisher Scientific)), США), весы («ТехноГарант», Россия), 96% этиловый спирт (ГОСТ 18300-87). Для выделения лимфоцитов селезенки лабораторных животных использовали раствор фиколл-урографина ρ=1,088 г/мл («ПанЭко», Россия), фосфатно-солевой буфер с рН 7,4 («Росмедбио», Россия), одноканальные автоматические пипетки объемом 2,5-10 мкл, 200 мкл, 1000 мкл («Eppendorf» Германия), центрифужные стеклянные пробирки («Gongdong», Китай), настольную центрифугу лабораторную ОПн-ЗУ4.2. («DASTAN», Россия). Микроскопию и подсчет, выделенных из селезенки клеток, проводили в камере Горяева, используя микроскоп («Микмед-2», Россия).
На первом этапе, учитывая особенности роста дрожжей [Калимуллина Э.Т., Маргулис А.Б., Колпаков А.И., Куприянова-Ашина Ф.Г. / Особенности роста культуры Saccharomyces cerevisiae в присутствии экзогенных ауторегуляторов клеточной плотности популяции // Ученые записки Казанского университета. 2015. Т. 157, кн. 4. С.27-37], отработали оптимальную методику выращивания S. cerevisiae - определение концентрации и времени культивирования, которые позволяют провести подсчет выросших на среде Сабуро колоний культуры после инкубации в термостате.
Для этого готовили 2% суспензию пекарских дрожжей: 2 г сухих пекарских дрожжей растворяли в 100 мл стерильного раствора NaCl, выдерживали в течение 1 ч в термостате при температуре 26±2°С, через каждые 15 мин доставали и тщательно перемешивали. Полученную суспензию фильтровали через 3-4 слоя, для чистоты эксперимента (чтобы концентрация клеток S. cerevisiae всегда была постоянной) разливали по стерильным эппендорфам и хранили при температуре минус 20±2°С в течение 6 мес.
Непосредственно перед постановкой реакции 1,0 мл суспензии дрожжей размораживали при комнатной температуре и разводили 2% суспензию S. cerevisiae в два раза, получая 1% концентрацию клеток. Далее 1% раствор разводили с шагом 10 следующим образом: добавляя 100 мкл 1% концентрации клеток S. cerevisiae в 900 мкл 0,9% NaCl, получая 0,1% концентрацию; 100 мкл 0,1% концентрации клеток S. cerevisiae в 900 мкл 0,9% NaCl, получая 0,01% раствор. Из концентрации 0,01% готовили 0,005%; 0,0025%; 0,00125%; 0,000625% концентрации клеток S. cerevisiae.
Каждую концентрацию (0,1%, 0,01%, 0,005%, 0,0025%, 0,00125%, 0,000625%) клеток S. cerevisiae по 100 мкл засевали на 3 чашки Петри со средой Сабуро. Равномерно распределили по поверхности шпателем. Чашки с содержимым ставили в анаэростат и инкубировали при температуре 26±2°С. Учет результатов проводили через 18 ч. При большом количестве выросших колоний использовали метод расчета при делении чашки Петри на сектора. Результат оценки роста колоний S. cerevisiae на среде Сабуро при посеве различных концентраций микробных клеток представлен в таблице 1.
По результатам оценки было установлено, что через 18 ч роста на среде Сабуро можно провести подсчет количества колоний при посеве 100 мкл S. cerevisiae на питательную среду с концентрацией раствора клеток - 0,000625%. Данная концентрация для определения ФАН микробиологическим методом была определена как оптимальная и использована на дальнейших этапах разработки заявленного способа.
На втором этапе провели оценку фагоцитарной активности нейтрофилов. Для данного способа могут подходить как мононуклеары экспериментальных животных, так и клетки человека. Оценку фагоцитарной активности можно проводить на фоне использования иммуномодуляторов, иммуносупрессоров, используя при этом контрольную группу, не получающую препарат. Можно использовать заявленный способ и при прочих других поставленных исследователем условиях эксперимента, когда нужно оценить функциональную активность нейтрофилов.
Для подтверждения объективности заявленного способа с использованием микробиологического подхода мы использовали оценку ФАН у мышей с индуцированным состоянием иммуносупрессии в сравнении с контрольной группой без соответствующего состояния.
Состояние иммуносупрессии в опытной группе формировали введением 0,1 мл дексаметазона с концентрацией 40 мкг на животное в течение 3 суток. На 4-е сутки животных в контрольной и опытной группе подвергали эфтаназии, используя эфир.
Для получения мононуклеаров, выделенную селезенку от каждой мыши помещали в металлическое сито из нержавеющей стали и измельчали стерильным пинцетами, стараясь перевести в суспензию возможно большее число клеток. Полученную от каждой мыши клеточную суспензию собирали в пробирку стерильным шприцом через иголку и выпускали в центрифужную пробирку. Содержимое всех пробирок доводили раствором Хенкса до одинакового уровня и центрифугировали при режиме 1500 об/мин 15 мин. По окончанию центрифугирования надосадочную жидкость удаляли. Дальнейшее разделение клеток проводили, используя градиент плотности для выделения мононуклеаров из тканей мыши ρ=1,088 г/мл. С этой целью в отдельную пробирку добавляли 1 мл градиента плотности и аккуратно 1:1 наслаивали на него суспензию клеток, полученных от определенного животного, предварительно разведенных раствором Хенкса (1:1). Содержимое пробирок центрифугировали, используя тот же режим. По окончанию центрифугирования белую суспензию клеток (мононуклеаров) собирали в отдельную пробирку, доводили содержимое до 1 мл и определяли концентрацию клеток, используя камеру Горяева и световой микроскоп. Для определения ФАН, в заявленном способе, использовали концентрацию клеток 2106 кл/мл.
6
Используя заявленный способ можно определить ФАН, выделенных из периферической крови человека, например для оценки эффекта вновь разработанного иммуномодулятора; для корректировки дозы глюкокортикоидов, цитостатиков, назначенных пациентам при аутоиммунных заболеваниях; для оценки состояния иммунной системы на фоне течения хронического соматического заболевания с целью назначения иммунокорректирующей терапии. Методика выделения аналогична. Кровь из вены забирают в пробирку, куда предварительно добавляют гепарин (20-25 ЕД на 1 мл крови). В коническую центрифужную пробирку предварительно вносят градиент плотности для выделения мононуклеаров из крови человека - 1,077 г/мл. Можно для получения отдельно фракции мононуклеаров и нейтрофилов сделать двойной градиент: сначала градиент 1,119 г/мл (для выделения нейтрофилов), затем равный объем градиента 1,077 г/мл (для выделения мононуклеаров). На градиент 1,077 г/мл (или на двойной градиент - 1,119 г/мл/1,077 г/мл) аккуратно наслаивают предварительно разведенную раствором Хенкса (1:1) кровь человека, в соотношении кровыградиент - 1:1. Содержимое пробирок центрифугируют при режиме 1500 об/мин 15 мин. По окончанию центрифугирования белую суспензию клеток (мононуклеаров) переносят в отдельную пробирку, доводят содержимое до 1 мл и определяют концентрацию клеток, используя камеру Горяева и световой микроскоп. Для определения ФАН крови человека также используют концентрацию клеток 2⋅10 кл/мл.
При расчете концентрации клеток, выделенных из селезенки мышей (данную формулу можно использовать и при определении концентрации клеток, выделенных из периферической крови человека) использовали следующую формулу:
А=В⋅10 000⋅К,
где А - концентрация клеток, выделенных из селезенки мышей (из периферической крови человека) в 1 мл;
В - 10 000 - стандартный коэффициент при подсчете клеток в 50 квадрантах камеры Горяева;
К - коэффициент разведения клеток перед подсчетом.
6
6
6
После выделения мононуклеаров из селезенки нелинейных мышей и доведение их концентрации до 2⋅10 кл/мл приступали к третьему этапу - осуществлению микробиологического подхода для определения ФАН. Для этого в круглодонных полистероловых планшетах смешивали 100 мкл выделенных клеток в концентрации 2⋅10 кл/мл со 100 мкл 0,00125% раствора клеток S. cerevisiae, получая конечные значения показателей в смеси, соответственно, 1⋅10 кл/мл и 0,000625%.
Планшеты с содержимым инкубировали в течение 60 мин при температуре 37°С. По окончанию инкубации 100 мкл смеси из каждой лунки засевали на чашки Петри, которые помещали в анаэростат и инкубировали в течение 18 ч при температуре 26±2°С.
Результат сравнительной оценки ФАН в опытной (с индуцированным состоянием иммуносупрессии) и контрольной группах животных представлен в таблице 2.
Результат анализа роста колоний S. cerevisiae после воздействия на них мононуклеаров в процессе инкубации показал, что количество колоний S. cerevisiae меньше в контрольной группе (55,8±6,1), чем в опытной (93,9±11,8), которая была подвержена воздействию дексаметазона. У животных, находящихся в состоянии иммуносупрессии, снижена функциональная активность нейтрофилов, они хуже поглощают антиген в качестве, которого в данной микробиологической методике использован микробный препарат S. cerevisiae. Это проявляется в виде большего количества выросших колоний S. cerevisiae. Полученные данные определения ФАН у животных с состоянием иммуносупрессии, вызванным применением дексаметазона, закономерно подтверждают объективность использования микробиологического подхода, основанного на способности нейтрофилов, в зависимости от их функциональной активности в большей или меньшей степени поглощать клетки S. cerevisiae.
Если бы ФАН была оценена на фоне применения иммуностимулятора, то при его положительном эффекте, в результате использования заявленного способа следовало бы наблюдать снижение количества выросших колоний S. cerevisiae в опытной группе (у которой применялся иммуностимулятор) в сравнении с контролем.
Изобретение иллюстрируется примером, являющимся результатом трех серий опытов (в каждом опыте приняло участие по 10 контрольных и 10 опытных животных), целью которых стала оценка действия иммуносупрессора (дексаметазона) на организм лабораторных мышей. Последовательность всех трех серий опытов была проведена с учетом отработанных оптимальных условий постановки заявленного способа, следующим образом:
1) Приготовлена исходная концентрация в раствора Saccharomyces cerevisiae - 0,00125%.
6
2) Из ткани селезенки каждого животного, находящегося в опытной (с состоянием иммуносупрессии, вызванным дексаметазоном) и контрольной групп мышей приготовлена исходная концентрация мононуклеаров - 2⋅10 кл/мл.
6
3) В отдельно взятых лунках полистеролового кругло донного планшета сделана смесь, состоящая из Saccharomyces cerevisiae и мононуклеаров в соотношении объемов - 1:1 (100 мкл: 100 мкл) для каждого животного из опытной и контрольной групп, в результате чего конечные значения показателей в смеси составили, соответственно, 1⋅10 кл/мл и 0,000625%.
4) Проведена инкубация планшета с содержимым в анаэростате при температуре 36±1°С в течение 60 мин.
5) Через 60 мин из каждой лунки планшета, содержащей смесь по п. 3, засеяно по 100 мкл на отдельно взятую чашку Петри, с последующей инкубацией в анаэростате при температуре 26±2°С в течение 18 ч.
6) Через 18 ч в каждой чашке Петри провели подсчет колоний Saccharomyces cerevisiae и оценили ФАН в опытной и контрольной группах, используя следующие критерии:
- если количество колоний, выросших на чашках Петри от опытной группы, достоверно не отличается от контрольной, значит ФАН не изменилась, препарат, обладающий иммуносупрессивным действием не оказал своего влияния на клетки;
- если количество колоний, выросших на чашках Петри от опытной группы, достоверно больше, чем в контрольной группе, значит ФАН снизилась - препарат, обладающий иммуносупрессивным действием проявил свой эффект на организм, в результате чего фагоциты не смогли полноценно, как в контрольной группе, выполнить свою «пожирающую» функцию.
Результат трех серий опытов, проведенных с использованием микробиологического подхода по оценке ФАН в опытной (с индуцированным состоянием иммуносупрессии) и контрольной группах животных, представлен в таблице 3.
Техническим результатом изобретения является разработка способа определения ФАН при помощи микробиологического подхода с использованием Saccharomyces cerevisiae, который расширяет арсенал методов оценки активности нейтрофилов, решает проблему анализа неспецифического иммунитета макроорганизма простым, нетрудоемким способом, не требующим дорогостоящего специализированного оборудования и высококвалифицированных специалистов.