СПОСОБ ОЧИСТКИ Аро-2 LIGAND/TRAIL ПОСРЕДСТВОМ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ НА ХОЛОДЕ

1. Способ выделения Apo2L/TRAIL из смеси, включающий
(а) нанесение смеси на катионообменную колонку;
(b) промывание катионообменной колонки уравновешивающим буфером, где несвязывающиеся компоненты, присутствующие в смеси, удаляются;
(c) элюирование Apo2L/TRAIL, прикрепленного к катионообменной колонке, элюирующим буфером;
(d) постепенное охлаждение элюата до температуры приблизительно от 2 до 4°С, при котором Apo2L/TRAIL спонтанно преципитирует в кристаллической форме, и получение смеси маточного раствора и кристаллов Apo2L/TRAIL, и
(е) выделение Apo2L/TRAIL из смеси, полученной в шаге (d), с чистотой не менее приблизительно 99%.
2. Способ по п.1, где смесь, наносимая на катионообменную колонку, является культуральной средой или клеточным лизатом Apo2L/TRAIL продуцирующих клеток.
3. Способ по п.2, где указанная смесь является лизатом клеток Apo2L/TRAIL продуцирующих E.coli клеток-хозяев.
4. Способ по п.3, где указанный лизат очищают до нанесения на катионообменную колонку.
5. Способ по п.1, где элюат, полученный в шаге (c), подвергают стадии кристаллизации по (d) без дополнительной очистки.
6. Способ по п.1, где катионообменной колонкой является SP-Sepharose колонка.
7. Способ по п.6, где рН смеси, наносимой на указанную колонку, составляет или доведен до приблизительно 7,5.
2
4
8. Способ по п.6, где элюирование Apo2L/TRAIL проводится в элюирующем буфере, содержащем 100-200 мМ NaCl или 100-150 мМ NaSO в буфере с рН, доведенным до 7,5-7,8.
9. Способ по п.1, где в шаге (d) элюат охлаждается с температуры приблизительно от 15 до 30°С до температуры приблизительно от 2 до 8°С в течение приблизительно от 1 до 60 ч.
10. Способ по п.9, где в шаге (d) элюат охлаждается до температуры от примерно 2 до 8°С в течение примерно от 1 до 8 ч.
11. Способ по п.9, где в шаге (d) элюат охлаждается до температуры от примерно 2 до 8°С в течение примерно 1 ч.
12. Способ по п.11, где в шаге (d) элюат охлаждается до 4°С в течение примерно 1 ч.
13. Способ по п.1, где рН элюата составляет или доводится до рН 7,0-8,0 перед кристаллизацией.
14. Способ по п.13, где рН элюата составляет или доводится до примерно рН 7,3 перед кристаллизацией.
15. Способ по п.13, где рН элюата составляет или доводится до рН 7,5-8,0 после кристаллизации.
16. Способ по п.1, где в шаге (d) поддерживается температура приблизительно от 2 до 4°С до достижения или почти достижения равновесной растворимости Apo2L/TRAIL.
17. Способ по п.16, где в шаге (d) растворимость Apo2L/TRAIL снижается при добавлении антирастворителя.
18. Способ по п.17, где указанный антирастворитель выбирается из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), MPD, этанола, изопропанола и диоксана.
19. Способ по п.18, где молекулярная масса ПЭГ составляет между примерно 400 и 10000 Да.
20. Способ по п.19, где молекулярная масса ПЭГ составляет 400, 3350 или 10000 Да.
21. Способ по п.1, где в шаге (е) Apo2L/TRAIL выделяется в форме кристаллов, отделенных от маточного раствора, путем фильтрования, или центрифугирования, или их сочетания.
22. Способ по п.21, где рН маточного раствора доведен до приблизительно 8,0 до фильтрации для снижения растворимости.
23. Способ по п.1, далее включающий стадии по растворению кристаллов Apo2L/TRAIL, полученных в стадии (d), и подвергание полученного раствора повторной стадии очищения на колонке.
24. Способ по п.23, где указанная вторая стадия хроматографического очищения является хроматографией гидрофобных взаимодействий.
25. Способ по п.24, где хроматография гидрофобных взаимодействий проводится на Phenyl-Sepharose колонке.
26. Способ по п.23, где указанная вторая стадия хроматографического очищения является катионообменной хроматографией.
27. Способ по п.26, где катионообменная хроматография проводится на СМ-Sepharose или SP-Sepharose колонке.
28. Способ по п.23, где Apo2L/TRAIL выделяют и переводят в состав вслед за стадией второй хроматографической очистки путем ультрафильтрации-диафильтрации.
29. Способ по п.1, где указанная чистота составляет по меньшей мере примерно 99,5%.
30. Способ по п.1, где указанная чистота составляет по меньшей мере примерно 99,9%.