УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПРОБОПОДГОТОВКИ КРОВИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ГЛЮКОЗЫ В ПЛАЗМЕ КРОВИ

Полезная модель относится к медицине, точнее к клинической лабораторной диагностике и эндокринологии, и может найти применение для диагностики сахарного диабета.
Распространенность сахарного диабета, нарушений толерантности к глюкозе и особенно гестационного сахарного диабета (ГСД) во всем мире и нашей стране неуклонно растет в последние 10-20 лет. ГСД - это заболевание, характеризующееся гипергликемией, впервые выявленной во время беременности, но не соответствующей критериям «манифестного» (впервые выявленного) сахарного диабета. Многоцентровое международное исследование «Гипергликемия и неблагоприятные исходы беременности», проведенное в двухтысячных годах, показало, что критерии диагностики ГСД требуют пересмотра. Так, среди наблюдаемых женщин неблагоприятные исходы беременности прямо пропорционально возрастали, начиная со значительно более низкого уровня гликемии, чем принятый ранее в качестве критерия наличия ГСД. В 2008 г. в США Международной ассоциацией групп изучения диабета и беременности IADPSG были предложены для обсуждения новые критерии диагностики ГСД, основанные на результатах исследования, включавшего более 23 тысяч беременных женщин, проходивших 75-граммовый оральный глюкозотолерантный тест (ОГТТ). Исследование показало, что у женщин, превысивших хотя бы одну из отрезных точек ОГТТ по уровню глюкозы в плазме венозной крови, частота рождения крупных детей или преэклампсии была повышена в два раза. У таких беременных также наблюдалось 45-процентное повышение частоты преждевременных родов и необходимости кесарева сечения. В  течение 2010-2012 годов ряд развитых стран, в том числе США, Япония, Германия, Израиль, Финляндия, самостоятельно приняли новые критерии постановки диагноза ГСД, руководствуясь результатами этого исследования. Эксперты Российской ассоциации эндокринологов и Российской ассоциации акушеров-гинекологов в результате многократных обсуждений данного вопроса также пришли к выводу о необходимости принятия новых критериев диагностики ГСД. Позже был создан Российский Консенсус по диагностике и лечению ГСД. В 2013 г. появились клинические рекомендации (протокол лечения) «Гестационный сахарный диабет: диагностика, лечение, послеродовое наблюдение», утвержденные Министерством Здравоохранения РФ. В этих документах наиболее четко сформулированы требования по правильной диагностике и выявлению гипергликемии (повышенной концентрации глюкозы в крови). Для популяции небеременных таких четких рекомендаций не существует, поэтому в разных медицинских учреждениях определяют концентрацию глюкозы в плазме крови, в сыворотке крови, в капиллярной крови и в цельной крови.
В стандартах для использования в аккредитованных клинико-диагностических лабораториях ЕС и России рекомендовано определение глюкозы обязательно в плазме крови с использованием фторида для предотвращения снижения уровня глюкозы при хранении проб. Особую актуальность такие рекомендации приобретают в связи с централизацией лабораторных исследований, т.е. выполнение анализов в крупных клинико-диагностических лабораториях, куда пробы крови доставляют транспортом из пунктов забора, например, из поликлиник или частных клиник. Для примера, из пункта забора крови в г. Мурманск пробы авиатранспортом компания «ИНВИТРО» доставляют в лабораторию г. Москвы, где происходит определение уровня глюкозы. В связи с этим актуальность правильной и своевременной диагностики диабета и нарушений толерантности к глюкозе очень высока. В первую очередь это касается диагностики нарушений углеводного обмена у беременных женщин.
В соответствии с Консенсусом и Рекомендациями диагностику нарушений углеводного обмена при беременности следует проводить в 2 этапа. При первом обращении беременной к акушеру-гинекологу или семейному врачу на сроке до 24 недель всем женщинам в обязательном порядке необходимо проводить следующие исследования: определение глюкозы в венозной плазме крови натощак, или определение глюкозы венозной плазмы в любое время дня вне зависимости от приема пищи, или определение уровня гликогемоглобина (HbA1c) с использованием сертифицированного в соответствии с National Glycohemoglobin Standartization Program (NGSP) и стандартизованного в соответствии с референсными значениями, принятыми в DCCT (Diabetes Control and Complications Study). В том случае, если результат исследования соответствует категории манифестного сахарного диабета (СД), уточняется его тип, и больная сразу должна передаваться для дальнейшего ведения эндокринологу. Если случайно определенный уровень глюкозы плазмы менее 11,1 ммоль/л, следует проводить определение глюкозы венозной плазмы натощак: согласно Консенсусу, при уровне глюкозы венозной плазмы натощак более 5,1 ммоль/л, но менее 7,0 ммоль/л устанавливается диагноз ГСД; при уровне глюкозы в плазме крови натощак менее 5,1 ммоль/л всем беременным, имеющим высокий риск развития ГСД, необходимо сразу проводить ОГТТ. При этом целесообразно и правильно назначать определение глюкозы натощак в специализированной лаборатории с забором крови из вены в пробирку с фторидом натрия (пробирка с серой крышкой, предназначенная для определения концентрации глюкозы). При этом анализ из капиллярной крови в лабораториях рекомендуется проводить только в случае крайней необходимости в связи с заметно меньшей точностью получаемого результата. Важно отметить, что, по мнению опытных клиницистов-эндокринологов, вред от вовремя не поставленного правильного диагноза ГСД гораздо выше, чем гипердиагностика, поскольку дальнейший алгоритм лечения заболевания подразумевает диету и тщательный контроль уровня глюкозы и других лабораторных показателей у беременной. На втором этапе диагностики ГСД для пациенток без выявленной на первом этапе гипергликемии следует проводить исследование с использованием ОГТТ на 24-28 неделе, а именно, тест с приемом 75 г глюкозы, который считается безопасным нагрузочным диагностическим тестом для выявления нарушения углеводного обмена во время беременности. Проводят тест утром натощак после 8-14-часового ночного голодания. Определение глюкозы венозной плазмы должно выполняться только в стационарной лаборатории на биохимических анализаторах либо на стационарных анализаторах глюкозы. Использование портативных средств самоконтроля (глюкометров) для проведения теста в соответствии с Консенсусом 2012 запрещено.
Следует отметить, что в недавнем исследовании при сравнении точности 43 глюкометров разных производителей, имеющих сертификацию Европейского Союза (ЕС), только 27 соответствовали критериям точности (ISO 15197), а смещение результатов от показаний референсных стационарных анализаторов достигало 14% [J Diabets Sci Technol. 2012 Sep 1; 6(5); 75]. Очень важным для постановки диагноза ГСД и последующего ведения таких пациенток является точное определение концентрации глюкозы, поскольку вариабельность получаемых результатов в зависимости от времени, прошедшего от забора крови до ее анализа, достаточно велика. Специалистам хорошо известно, что эритроциты крови используют глюкозу плазмы для поддержания своей жизнедеятельности, в связи с чем уровень глюкозы в плазме после забора крови постоянно снижается в течение каждого последующего часа. Это может привести к гиподиагностике сахарного диабета. При выполнении анализа в лаборатории позже 1 часа от забора крови в пробирку для забора крови должен быть добавлен фторид натрия для торможения гликолиза в эритроцитах, после центрифугирования крови рекомендуется переливать плазму крови в отдельную пробирку.
Настоящая полезная модель касается совершенствования устройства для пробоподготовки крови (вакуумных пробирок) с целью точного определения концентрации глюкозы в крови пациентов.
Нами проведен поиск по патентной и научно-технической литературе по выпуску и использованию пробирок для пробоподготовки крови для определения концентрации глюкозы в плазме крови.
Патенты CN 105193427. 2015818 FUZHOU CHANGGENG MEDICAL DEVICES СО LTD; CN 104510481. 20130926 WENZHOU GAODE MEDICAL INSTR CO LTD; CN 203169191. 20121018 FU SHTMING, CN 202489959. 20120228, DAYONG XU, CN 202430210. 2011123. SHIMING, Китай. В патентах описываются пробирки для сбора крови, содержащие фторид натрия и антикоагулянты, и способ их нанесения на стенки пробирки. В качестве антикоагулянтов предложены ЭДТА (этилендиаминтетраацетат), оксалат, гепарин и др. Пробирки используются для рутинного анализа крови.
Патенты CN 202430219, 20111123, Китай. Описаны пробирки с гелем для извлечения, очистки и активации мононуклеарных клеток и лимфоцитов крови. В качестве антикоагулянтов используют ЭДТА или цитрат, гепарин, буферный раствор Хэнкса. Извлечение мононуклеарных клеток повышает точность обследования пациентов.
ЕР 0193279. JAN 29, 1985; 2548507, Dec. 28, 2010, Япония. Описаны вакуумные трубки и их изготовление для сбора крови с покрытием внутренних стенок пробирки гидрофильным веществом, предотвращающим прилипание клеток крови к стенкам пробирки, и с разделительным гелем для отделения сыворотки от форменных элементов крови для рутинного анализа крови.
WO 2015132774, Маг. 7, 2014. Пастеровский институт - вакуумная трубка с антикоагулянтом для сбора крови и метод ее изготовления.
WO 02097432, 20010601, Финляндия. - пробирка с антикоагулянтом и способ выполнения анализа крови из ее образца. В качестве антикоагулянта использован ЭДТА.
US патенты 5320812, 5860937 Becton Dickinson, 5326535, 5246660 Becton Dickinson, Company (Franklin Lakes, NT) - патенты 1975-1999 годов старейшей американской фирмы «Becton Dickinson» (BD), основанной в 1887 г, производящей и продающей приборы, инструменты и реагенты, в том числе пробирки для забора крови. Компания ведет бизнес в 50 странах, имеет 30 тыс.сотрудников по всему миру и дочерние компании в Ирландии и Великобритании. Торговая марка «Вакутейнер» для разовых пробирок из пластика с дозированным вакуумом, предназначенных для забора проб венозной крови. Пробирки с серой крышкой - для анализа глюкозы, содержат фторид натрия и оксалат, не содержат разделительного геля.
В этих патентах описаны устройства для сбора крови с антикоагулянтом, ряд которых - с силиконовым покрытием их стенок.
US 3920549. Nov. 18, 1975. Corning Glass Works (Corning NY) - устройство для сбора крови, содержащее гелеподобный инертный материал с последующим анализом плазмы крови, без фторида.
Результаты поиска по фирмам, выпускающим пробирки для анализа глюкозы:
Greiner Bio-one Preanalytics (Австрия) - пробирки для определения глюкозы в венозной крови.
Corway, Эстония - пробирки для забора крови.
RUSTECH, Германия - системы для вакуумного взятия крови.
В России пробирки для анализа глюкозы со фторидом (серая крышка) выпускают фирмы:
ООО «Эйлитон», патент на ПМ 114277 - микропробирка с запорной крышкой и антикоагулянтом для взятия капиллярной крови.
Vaku Meyer ООО «Минимед», Брянская обл., основана в 1992 г., ТЗ 548792.
Crossmed.ru - выпускает пробирки с ЭДТА, оксалатом, гепарином и фторидом натрия для исследования глюкозы в диабетологии.
ЮНИВАК, ТЗ 564110.
Известно использование гелеподобного продукта вместе с ЭДТА (патент US 3920549 путем нанесения геля на дно пробирки перед внесением в нее ЭДТА, который разбрызгивают на поверхность геля. Такая пробирка (с сиреневой крышкой) предназначена для анализа плазмы, в частности для молекулярной диагностики и определения концентрации вируса, не подходит для определения глюкозы.
На основании проведенного анализа патентной и фирменной документации нами отмечено, что для определения концентрации глюкозы в плазме крови используются пробирки с нанесенной на ее стенки смеси фторида натрия и антикоагулянта, в качестве которого в большинстве из них используется ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) - пробирка с серой крышкой.
В качестве прототипа для настоящей полезной модели нами взята пробирка фирмы «UNIVAC» (ЗАО «А/О Юнимед», Москва) для исследований глюкозы с натрия фторидом и ЭДТА (серая крышка). Пробирка предназначена для исследования плазмы крови в диабетологии (измерение уровня глюкозы). Взятие венозной крови осуществляется «закрытым» вакуумным способом. Пробирка стерилизована радиационным методом. Материал пробирки - полиэтилентерефталат (ПЭТ). Крышка пробирки из пластика серого цвета (в соответствии с международным стандартом ISO 6710). Пробка крышки из бромбутилкаучука с углублением для многократного прокола. Наполнитель - ингибитор гликолиза натрия фторид и антикоагулянт (ЭДТА) для предотвращения свертывания крови.
Пробоподготовка крови по прототипу описана в Консенсусе по диагностике ГСД и включает следующие процедуры: после забора венозной крови пациента в первичную вакуумную пробирку, содержащую антикоагулянт и фторид, пробирку тщательно перемешивают для растворения указанных веществ. Далее первичную пробирку транспортируют в лабораторию, например автомобильным или авиа- транспортом. В лаборатории указанную пробирку центрифугируют в стандартных условиях, открывают крышку и дозатором персонал лаборатории отбирает верхний слой (плазму крови) и переносит ее во вторичную (пустую) пробирку, чтобы поместить плазму на борт биохимического анализатора (уровень глюкозы в плазме стабилен в течение длительного времени). Предварительно вторичную пробирку нумеруют или наклеивают штрих-код для идентификации пациента.
В прототипе, как и в других найденных нами источниках информации, при пробоподготовке крови для анализа глюкозы после центрифугирования крови в связи с отсутствием четкой границы между слоями плазмы и форменных элементов крови, возможностью смешивания слоев при транспортировке, тряске и т.д. производится перенос плазмы в другую пробирку с последующим определением в ней концентрации глюкозы. Проведенные нами исследования показали, что результаты такого анализа оказываются недостаточно точными и к тому же неудобными для практической работы.
К недостаткам прототипа можно отнести также высокую вероятность возникновения разрушения эритроцитов (гемолиза) при транспортировке пробирок с кровью из-за тряски и длительности хранения цельной крови, особенно у пожилых и ослабленных больных, а также у пациентов с искусственными клапанами сердца. В этих пробирках происходит окрашивание плазмы в красный цвет из-за возникновения гемолиза и это наблюдается в 4-10% случаев. Появление гемолиза в пробе пациента приводит к отказу лаборатории выполнять анализы в таком образце (выбраковка пробирок), так как появление гемоглобина в плазме приводит к ошибочным результатам при работе биохимических анализаторов. Обычно лаборатория трактует наличие гемолиза как наличие ошибки медицинского персонала при заборе крови и транспортировке и требует взять кровь у пациента еще раз. К недостаткам прототипа следует отнести и возможные ошибки при переливании крови для получения плазмы и подписывании персоналом лаборатории обычно вручную фамилии или номера пациента на вторичной пробирке, помещаемой в биохимический анализатор (человеческий фактор), что не обеспечивает гарантии определения глюкозы у того пациента, кровь которого доставлена в лабораторию. При выполнении пробоподготовки по прототипу не исключена также возможность заражения персонала гемоконтактными инфекциями, (отворачивание крышки первичной пробирки руками персонала, переливание плазмы крови во вторичную пробирку ручным дозатором), Кроме того увеличивается время работы персонала лаборатории, связанное с переливанием плазмы из первичной пробирки во вторичную, что приводит к возрастанию стоимости анализа. Необходимо при этом учесть расходы лаборатории на одноразовые наконечники дозаторов для переливания плазмы крови и стоимость вторичных пробирок, которые после выполнения анализа на глюкозу в биохимическом анализаторе необходимо дополнительно обеззараживать и утилизировать.
Технический результат настоящей полезной модели состоит в повышении точности определения концентрации глюкозы за счет забора крови в пробирку, на дно которой помещен разделительный инертный гель.
Этот результат достигается тем, что в известной вакуумной пробирке со штрих-кодом, защитной крышкой серого цвета в сборе с резиновой пробкой и нанесенной на стенки пробирки смеси фторида натрия и антикоагулянта с последующей стерилизацией пробирки радиационным методом, согласно заявляемой полезной модели, она дополнительно содержит разделительный инертный гель в количестве 0.6-1.2 г., расположенный на дне пробирки, в качестве антикоагулянта - оксалат калия.
Использование разделительного инертного геля (в результате подъема его со дна пробирки во время центрифугирования крови) позволяет отделить верхний слой (плазма крови) от форменных элементов, исключая гемолиз и снижение концентрации глюкозы за счет невозможности катаболизма («поедания») глюкозы плазмы эритроцитами - и тем самым гарантирует высокую точность определения ее концентрации.
За счет использования разделительного геля не требуется переноса плазмы крови в другую пробирку после центрифугирования, что позволяет проводить определение концентрации глюкозы в первичной пробирке, что отражает истинные уровни глюкозы в крови пациента, повышая точность определения ее концентрации и уменьшая при этом время пробоподготовки крови и снижая риск заражения персонала гемоконтактными инфекциями.
Количество добавляемого разделительного геля - 0.6-1.2 г - найдено нами опытным путем и в процессе многократного определения концентрации глюкозы показано, что это количество его является необходимым и достаточным для надежного отделения форменных элементов от плазмы крови при стандартной процедуре центрифугирования пробирки в течение 10 минут при объеме забираемой крови 3-4 мл.
Кроме того, использование разделительного геля исключает попадание в плазму нижнего слоя крови, содержащего сгустки и эритроциты, позволяя определять концентрацию глюкозы на автоматическом анализаторе непосредственно после центрифугирования пробирки и исключая возможность забивания иглы пробозаборника биохимического анализатора и выход его из строя.
К необходимости использования пробирок с гелем для пробоподготовки крови для анализа глюкозы нас побудили результаты выполненной нами на базе ФГБУ «Северо-западный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова» Минздрава России в 2016 - январе 2017 г. научно-исследовательской работы «Изучение влияния разделительного геля в вакуумных системах для забора и хранения крови на правильность определения глюкозы в плазме крови». Было проведено измерение концентрации глюкозы и степени гемолиза в плазме крови 30 пациентов.
Сравнение результатов определения глюкозы после забора крови в предлагаемое устройство с разделительным гелем, содержащим фторид натрия и в качестве антикоагулянта оксалат калия, и пробирки со фторидом натрия и ЭДТА (по прототипу), приведено в табл. 1.
1. ЭДТА-фторид-гель
2. Оксалат-фторид-гель
3. ЭДТА-фторид - устройство без разделительного геля (по прототипу)
Табл. 1. Уровень гемоглобина в плазме крови (г/л) после забора крови доноров с использованием устройств для пробоподготовки с использованием геля и по прототипу (в качестве антикоагулянтов добавлены ЭДТА и оксалат калия.
Как следует из табл.1, предлагаемые нами пробирки, содержащие в качестве антикоагулянта оксалат калия, показали статистически значимый меньший гемолиз, чем пробирки, содержащие ЭДТА.
В связи с этим использование в качестве антикоагулянта оксалата калия мы считаем существенным признаком ПМ.
При концентрации в плазме свободного гемоглобина более 0.8 г/л гемолиз определялся уже визуально, что при обычном порядке работы персоналом лаборатории приводит к выбраковке таких проб крови, т.е. делает их непригодными для анализа.
Из данного исследования вытекает целесообразность центрифугирования крови непосредственно в месте ее забора, до транспортировки, если это связано с длительностью ее или возможностью вибрации или перепада температур в пути. В таком случае вероятность гемолиза в дальнейшем полностью исключается.
Подготовка устройства для взятия крови у пациента и дальнейшее исследование ее осуществляется следующим образом.
После взятия крови вакуумным способом кровь в устройстве сразу перемешивают для растворения фторида и оксалата калия. Далее кровь центрифугируют в течение 1 часа от момента забора крови при 3000 оборотах в течение 10 минут для отделения плазмы, если планируется транспортировка крови с возможностью вибрации, тряски или длительного хранения при комнатной температуре. Определение глюкозы в плазме крови проводят в сроки до 24 часов хранения при комнатной температуре. Если лаборатория, выполняющая анализ на глюкозу плазмы крови, находится недалеко от пункта забора крови, то центрифугирование устройства может выполняться непосредственно в лаборатории, после чего устройство помещают в биохимический анализатор для проведения анализа. Определение глюкозы проводят на любом стационарном биохимическом автоматическом анализаторе, помещая штрих-кодированное устройство на борт анализатора.
Предлагаемое устройство по сравнению с известными имеет ряд преимуществ.
Повышает точность определения глюкозы.
Позволяет отказаться от процедуры переливания из образца крови верхнего слоя плазмы в отдельную (вторичную) пробирку, что снижает риски здоровью персонала лаборатории и возможность ошибок вследствие неправильной маркировки вторичных пробирок.
Устройство может помещаться в автоматический анализатор для определения глюкозы непосредственно после центрифугирования крови без риска захвата иглой пробозаборника прибора сгустков и эритроцитов.
В случае центрифугирования крови непосредственно в месте взятия крови исключается риск гемолиза пробы риск гемолиза пробы в ходе хранения и транспортировки
Устройство разработано и произведено авторами на заводе вакуумных систем «ОЮ ИнтерВак Технолоджи» г. Нарва и прошло апробацию в ФГБУ Северо-Западный Федеральный медицинский исследовательский Центр им. В.А. Алмазова МЗ России в 2016-2017 гг. с положительным результатом.