ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ
DIAGNOSTIC MARKERS

Перекрестная ссылка на родственные заявки
Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на патент США №61/529917, поданной 31 августа 2011 года, раскрытие которой включено в настоящий документ с помощью ссылки в полном ее объеме.
Область техники
Настоящее изобретение относится к способам прогнозирования реакции на противораковую терапию на основе статуса метилирования гена.
Уровень техники
Настоящее изобретение относится к способам диагностики и лечения больных злокачественной опухолью. В частности, настоящее изобретение относится к способам определения, больных, на которых будет оказывать благоприятный эффект лечение с помощью ингибитора киназы рецептора эпидермального фактора роста (EGFR).
Злокачественная опухоль является общим названием для широкого спектра клеточных злокачественных новообразований, характеризуемых нерегулируемым ростом, отсутствием дифференцировки и способностью поражать локальные ткани и метастазировать. Эти опухолевые злокачественные новообразования поражают, с различными степенями поражения, каждую ткань и орган в организме.
За последние несколько десятилетий было разработано множество терапевтических средств для лечения различных типов злокачественной опухоли. Наиболее часто используемые типы противораковых средств включают: алкилирующие ДНК средства (например, циклофосфамид, ифосфамид), антиметаболиты (например, метотрексат, фолатный антагонист и 5-фторурацил, пиримидиновый антагонист), разрушители микротрубочек (например, винкристин, винбластин, паклитаксел), интеркаляторы ДНК (например, доксорубицин, дауномицин, цисплатин) и гормональное терапевтическое средство (например, тамоксифен, флутамид).
Семейство рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR) включает четыре близкородственных рецептора (HER1/EGFR, HER2 (ERBB2), HER3 (ERBB23) и HER4 (ERBB4)), вовлеченные в такие клеточные ответы, как дифференцировка и пролиферация. Сверхэкспрессия киназы EGFR, или его лиганда TGF-альфа, часто ассоциирована со многими злокачественными опухолями, включая злокачественные опухоли молочной железы, легкого, колоректальные злокачественные опухоли, злокачественные опухоли яичников, гипернефроидная злокачественная опухоль почки, злокачественные опухоли головы и шеи, глиобластомы и астроцитомы, и, как полагают, способствует злокачественному росту этих опухолей. Также было обнаружено, что клеточную канцерогенность повышает специфическая представляющая собой делецию мутация в гене EGFR (EGFRvIII). Активация EGFR-индуцируемых сигнальных путей запускает множество процессов, которые потенциально являются стимулирующими развитие злокачественной опухоли, например, пролиферацию, ангиогенез, подвижность и проникновение клеток, сниженный апоптоз и индукцию устойчивости к лекарственному средству. Повышенная экспрессия HER1/EGFR часто связана с прогрессирующим заболеванием, метастазами и неблагоприятным прогнозом. Например, при NSCLC и злокачественной опухоли желудка было показано, что повышенная экспрессия HER1/EGFR коррелирует с высокой скоростью метастазирования, плохой дифференцировкой опухоли и повышенной пролиферацией опухоли.
Сверхэкспрессию ERBB2 обычно рассматривают в качестве показателя неблагоприятного прогноза, особенно у больных с первичным заболеванием, которое вовлекает подмышечные лимфатические узлы ((Slamon et al., Science 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science 244:707-712 (1989); Ravdin and Chamness, Gene 159:19-27 (1995); и Hynes and Stem, Biochim Biophys Acta 1198:165-184 (1994) и было связано с восприимчивостью и/или устойчивостью к действию гормонального терапевтического средства и курсам химиотерапии, в том числе CMF (циклофосфамиду, метотрексату и фторурацилу) и антрациклинам (Baselga et al., Oncology 11 (3 Suppi 2):43-48 (1997)). Больных, которые были подвергнуты лечению с помощью антитела к HER2 трастузумаб, отбирают для терапии на основе сверхэкспрессии/амплификации HER2. См., например, патентные документы WO 99/31140, US 2003/0170234, WO 01/89566.
Мутации, которые активируют тирозинкиназную активность интегральных белков рецептора и/или усиливают дальнейшую передачу сигнала, были обнаружены у NSCLC и глиобластоме. Однако, роль мутаций в качестве основного механизма придания чувствительности к ингибиторам рецептора EGF, например эрлотинибу (TARCEVA) или гефитинибу (IRESSA™), до настоящего времени остается неоднозначной. Недавно появилась информация о том, что мутантная форма рецептора EGF полной длины позволяет прогнозировать восприимчивость на ингибитор тирозиновой киназы рецептора EGF, гефитиниб (Paez, J.G. et al. (2004) Science 304:1497-1500; Lynch, Т.J. et al. (2004) N. Engl. J. Med. 350:2129-2139). Исследования клеточных культур показали, что линии клеток, которые экспрессируют мутантную форму рецептора EGF (т.е. H3255), были более чувствительными к ингибированию роста ингибитором тирозиновой киназы рецептора EGF гефитинибом и что для ингибирования линий опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор EGF дикого типа необходимы намного более высокие концентрации гефитиниба. Результаты таких наблюдений позволяют предположить, что специфические мутантные формы рецептора EGF могут отображать более сильную чувствительность к ингибиторам рецептора EGF, но не определяют полностью не дающий ответа фенотип.
Совершенствование применения в качестве противоопухолевых средств соединений, которые прямо ингибируют киназную активность EGFR, а также антител, которые уменьшают киназную активность EGFR, блокируя активацию EGFR, являются областями интенсивных научно-исследовательских работ (de Bono J.S. and Rowinsky, E.K. (2002) Trends in Mol. Medicine 8:S19-S26; Dancey, J. and Sausville, E.A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313). Некоторые исследования продемонстрировали, раскрыли или позволили предположить, что некоторые ингибиторы киназ EGFR могут повышать цитолиз опухолевых клеток или новообразований при применении в сочетании с определенными другими противораковыми или химиотерапевтическими средствами или лекарственными препаратами (например, Herbst, R.S. et al. (2001) Expert Opin. Biol. Ther. 1:719-732; Solomon, B. et al. (2003) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 55:713-723; Krishnan, S. et al. (2003) Frontiers in Bioscience 8, e1-13; Grunwald, V. and Hidalgo, M. (2003) J. Nat. Cancer Inst. 95:851-867; Seymour L. (2003) Current Opin. Investig. Drugs 4(6):658-666; Khalil, M.Y. et al. (2003) Expert Rev. Anticancer Ther. 3:367-380; Bulgaru, A.M. et al. (2003) Expert Rev. Anticancer Ther. 3:269-279; Dancey, J. and Sausville, E.A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313; Ciardiello, F. et al. (2000) Clin. Cancer Res. 6:2053-2063; и публикация патента США №2003/0157104).
57
291
22
20
22
76
22
22
Эрлотиниб (например, эрлотиниб HCl, также известный как TARCEVA или OSI-774) является перорально доступным ингибитором киназы EGFR. In vitro, у эрлотиниба наблюдали существенную ингибиторную активность по отношению к киназе EGFR у ряда линий опухолевых клеток человека, включая колоректальную злокачественную опухоль и злокачественную опухоль молочной железы (Moyer J.D. et al. (1997) Cancer Res. :4838), а доклиническая оценка показала активность в отношении ряда EGFR-экспрессирующих ксенотрансплантатов опухоли человека (Pollack, V.A. et al. (1999) J. Pharmacol. Exp.Ther. :739). Совсем недавно у эрлотиниба наблюдали перспективную активность в испытаниях I и II фазы при ряде показаний, включая злокачественную опухоль шеи и головы (Soulieres, D., et al. (2004) J. Clin. Oncol. :77), NSCLC (Perez-Soler R, et al. (2001) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. :310a, abstract 1235), CRC (Oza, M., et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. :196a, abstract 785) and MBC (Winer, E., et al. (2002) Breast Cancer Res. Treat. :5115a, abstract 445). В испытании III фазы монотерапия эрлотинибом значительно пролонгировала продолжительность существования, задерживала прогрессирование заболевания и задерживала ухудшение связанных со злокачественной опухолью легких симптомов у больных с прогрессирующей стадией невосприимчивой к терапии NSCLC (Shepherd, F. et al. (2004) J. Clin. Oncology, :14S (July 15 Supplement), Abstract 7022). В то время как большинство данных клинических испытаний эрлотиниба относятся к его применению при NSCLC, предварительные результаты исследований I/II фазы продемонстрировали перспективную активность комбинированной терапии эрлотиниба и капецитабина/эрлотиниба у больных с широким диапазоном типов солидных опухолей человека, включая CRC (Oza, M., et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:196a, abstract 785) и MBC (Jones, R.J., et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. :45a, abstract 180). В ноябре 2004 года Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) одобрило эрлотиниб для лечения больных с локально прогрессирующей или метастазирующей немелкоклеточной злокачественной опухолью легкого (NSCLC) после по меньшей мере одной неудачной схемы приема лекарств до химиотерапии. Эрлотиниб является единственным лекарственным средством класса рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR), продемонстрировавшим в клиническом испытании III фазы повышение продолжительности существования у больных с прогрессирующей стадией NSCLC.
Лекарственное средство против новообразований в идеале будет избирательно уничтожать клетки злокачественной опухоли с широким терапевтическим индексом по отношению к его токсичности к незлокачественным клеткам. Оно также будет сохранять свою эффективность в отношении злокачественных клеток даже после продолжительного воздействия лекарственным средством. К сожалению, ни одно из существующих на настоящий момент химиотерапевтических средств не обладает таким идеальным профилем. Наоборот, большинство из них обладают очень узкими терапевтическими индексами. Кроме того, клетки злокачественной опухоли, подвергнутые действию почти сублетальных концентраций химиотерапевтического средства, будут очень часто развивать устойчивость к такому средству, а также довольно часто перекрестную устойчивость к некоторым другим противоопухолевым средствам в той же степени. Кроме того, для любого установленного типа злокачественной опухоли специалист зачастую не может прогнозировать какой больной вероятно отреагирует на конкретное лечение, даже более новыми генонаправленными терапевтическими средствами, такими как ингибиторы киназы EGFR, что таким образом влечет множество исследований методом проб и ошибок, даже при существенном риске и дискомфорте для больного, с целью обнаружения наиболее эффективного терапевтического средства.
Таким образом, существует необходимость в более эффективном лечении новообразований и других пролиферативных нарушений и более эффективных способах определения какие опухоли будут реагировать на какое лечение. Стратегии повышения терапевтической эффективности существующих лекарственных средств включали изменения схемы их введения, а также их применение с другими противораковыми или биохимическими модулирующими средствами. Комбинированная терапия хорошо известна как способ, который может в результате привести к большей эффективности и ослабить побочные эффекты по сравнению с применением терапевтически релевантной дозы каждого средства в отдельности. В некоторых случаях, эффективность комбинации лекарственных средств является аддитивной (эффективность комбинации приблизительно равна сумме эффектов от каждого лекарственного средства в отдельности), но в других случаях эффект является синергическим (эффективность комбинации больше, чем сумма эффектов каждого даваемого в отдельности лекарственного средства).
22
22
23
22
22
Мишень-специфичные терапевтические подходы, такие как эрлотиниб, обычно ассоциированы с уменьшенной токсичностью по сравнению с традиционными цитотоксичными средствами и, таким образом, годятся для применения в схемах комбинированного лечения. Перспективные результаты наблюдали в исследованиях I/II фазы эрлотиниба в комбинации с бевацизумабом (Mininberg, E.D., et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. :627a, abstract 2521) и гемцитабином (Dragovich, Т., (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. :223a, abstract 895). Из недавно полученных данных в испытаниях III фазы NSCLC видно, что эрлотиниб или гефитиниб в качестве терапии первой линии в комбинации со стандартной химиотерапией не повышали продолжительность существования (Gatzemeier, U., (2004) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. :617 (Abstract 7010); Herbst, R.S., (2004) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 23:617 (Abstract 7011); Giaccone, G, et al. (2004) J. Clin. Oncol. :777; Herbst, R., et al. (2004) J. Clin. Oncol. :785). Однако, результаты испытаний III фазы на злокачественной опухоли поджелудочной железы показали, что эрлотиниб в качестве терапии первой линии в комбинации с гемцитабином повышал продолжительность существования.
Некоторые группы исследовали потенциальные биомаркеры для прогнозирования реакции больного на ингибиторы EGFR (см., например, патентные документы WO 2004/063709, WO 2005/017493, WO 2004/111273, WO 2004/071572, US 2005/0019785 и US 2004/0132097). Один такой биомаркер представляет собой эпителиальный и мезенхимальный фенотип. В ходе большинства метастаз злокачественной опухоли важное изменение происходит в опухолевой клетке, известной как эпителиально-мезенхимальный переход (EMT) (Thiery, J.P. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:442-454; Savagner, P. (2001) Bioessays 23:912-923; Kang Y. and Massague, J. (2004) Cell 118:277-279; Julien-Grille, S., et al. Cancer Research 63:2172-2178; Bates, R.C. et al. (2003) Current Biology 13:1721-1727; Lu Z., et al. (2003) Cancer Cell. 4(6):499-515)). Эпителиальные клетки, которые имеют тесную связь друг с другом и характеризуются полярностью, дают начало мезенхимальным клеткам, которые имеют более слабую связь друг с другом и характеризуются утратой полярности, а также обладают способностью к перемещению. Такие мезенхимальные клетки могут распространяться в ткани, окружающие исходную опухоль, проникать в кровеносные и лимфатические сосуды и перемещаться в новые местоположения, где они делятся и формируют дополнительные опухоли. EMT не присутствует в здоровых клетках за исключением периода эмбриогенеза. При нормальных обстоятельствах TGF-β играет роль ингибитора роста, однако, в ходе метастазирования злокачественной опухоли TGF-β начинает активировать EMT.
Эпителиальный и мезенхимальный фенотипы ассоцировали с конкретными паттернами генной экспрессии. Например, в WO 2006101925 было показано, что эпителиальный фенотип ассоциирован с высокими уровнями экспрессии E-кадгерина, Brk, γ-катенина, α-катенина, кератина 8, кератина 18, коннексина 31, плакофилина 3, стратафина 1, ламинина альфа-5 и ST14, тогда как мезенхимальный фенотип ассоциирован с высокими уровнями экспрессии виментина, фибронектина, фибриллина-1, фибриллина-2, коллагена альфа-2(IV), коллагена альфа-2(V), LOXL1, нидогена, C11orf9, тенасцина, N-кадгерина, эмбрионального EDB+ фибронектина, тубулина альфа-3 и эпиморфина.
Эпигенетика представляет собой исследование наследуемых изменений в генной экспрессии или клеточном фенотипе, обусловленных механизмами, отличными от изменений в лежащей в основе последовательности ДНК - откуда и произошло название эпи- (греческое: под, нижний, внешний) -генетическая. Примеры таких изменений включают метилирование ДНК и модификация гистонов, оба из которых служат для модулирования генной экспрессии без изменения последовательности ассоциированных генов. Такие изменения могут быть соматически наследуемыми посредством деления клеток в течение остатка жизни организма и могут также передаваться следующим поколениям организма. Однако, изменения лежащей в основе последовательности ДНК организма отсутствуют; наоборот, негенетические факторы заставляют гены организма иначе вести себя или экспрессироваться.
Метилирование ДНК является ключевой частью нормального развития организма и клеточной дифференцировки у высших организмов. Метилирование ДНК устойчиво изменяет паттерн экспрессии генов в клетках, так чтобы клетки могли "помнить где они побывали"; например, клетки, запрограммированные как островки Лангерганса в ходе эмбрионального развития, остаются островками Лангерганса в течение жизни организма без необходимости в поддержке постоянных сигналов, сообщающих им, что им необходимо оставаться островками. Кроме того, метилирование ДНК подавляет экспрессию вирусных генов и других вредоносных элементов, которые постепенно были встроены в геном хозяина. Метилирование ДНК также формирует основу структуры хроматина, которая позволяет клеткам формировать бесчисленное множество характеристик, необходимых для многоклеточной жизни, из простой неизменной последовательности ДНК. Метилирование ДНК также играет ключевую роль в развитии почти всех типов злокачественных опухолей. Метилирование ДНК в 5-положении цитозина оказывает специфическое влияние, уменьшая генную экспрессию, и его обнаружили у каждого исследованного позвоночного. В соматических тканях взрослого метилирование ДНК обычно происходит в контексте CpG-динуклеотида, в то время как не-CpG метилирование распространено у эмбриональных стволовых клеток.
"CpG" является условным обозначением "-C-фосфат-G-", который представляет собой цитозин и гуанин, разделенный одним единственным фосфатом, фосфат соединяет вместе любые два нуклеозида в ДНК. Обозначение "CpG" используют для того, чтобы отличать такую линейную последовательность от образования пары CG-основания из цитозина и гуанина. Цитозины в динуклеотидах CpG могут быть метилированы с образованием 5-метилцитозина (5-mC). У млекопитающих метилирование цитозина в гене может привести к выключению гена. Ферменты, которые добавляют метальную группу в ДНК, называются ДНК-метилтрансферазами. У млекопитающий метилировано от 70% до 80% цитозинов CpG. Существуют участки генома, которые характеризуются более высокой концентрацией сайтов CpG, известные как CpG-островки. Эти "CpG-островки" также характеризуются более высоким, чем ожидалось, содержанием GC (т.е. >50%). Многие гены в геномах млекопитающих имеют CpG-островки, ассоциированные с началом гена. Поэтому, наличие CpG-островка используют для того, чтобы помочь в прогнозировании и аннотировании генов. CpG-островки являются невосприимчивыми к метилированию, что может помочь в поддержании открытой конфигурации хроматина. Кроме того, это может в результате привести к пониженной восприимчивости к транзициям и, как следствие, более высокой равновесной концентрации сохранившихся CpG. Метилирование сайтов CpG в промоторах генов может привести к их сайленсингу, особенности, обнаруживаемой у ряда злокачественных опухолей человека (например, сайленсинг опухолевых генов-супрессоров). И наоборот, пониженный уровень метилирования сайтов CpG был ассоциирован со сверхэкспрессией онкогенов в клетках злокачественной опухоли.
Сущность изобретения
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способу определения чувствительности роста опухолевых клеток к ингибированию с помощью ингибитора киназы EGFR, включающему определение статуса метилирования гена ERBB2 в опухолевой клетке образца, причем пониженный уровень метилирования гена ERBB2 указывает на то, что рост опухолевых клеток чувствителен к ингибированию с помощью ингибитора EGFR. Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу выявления больного злокачественной опухолью, на которого может оказать благоприятный эффект лечение с помощью ингибитора EFGR, включающему определение статуса метилирования гена ERBB2 из образца злокачественной опухоли больного, причем больного выявляют как такого, на которого может оказать благоприятный эффект лечение с помощью ингибитора EGFR, если статус метилирования гена ERBB2 определяют как пониженный уровень метилирования. Согласно одному варианту осуществления больному вводят терапевтически эффективное количество ингибитора EGFR, если больного выявляют как такого, на которого сможет оказать благоприятный эффект лечение с помощью ингибитора EGFR.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли у больного, включающему введение терапевтически эффективного количества ингибитора EGFR больному, причем больному до введения ингибитора EGFR поставили диагноз злокачественной опухоли, которая характеризуется пониженным уровнем метилирования гена ERBB2, и причем пониженный уровень метилирования гена ERBB2 указывает на терапевтическую восприимчивость объектом ингибитора EGFR.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу выбора терапии для больного злокачественной опухолью, включающему этапы определения статуса метилирования гена ERBB2 из образца злокачественной опухоли больного, и выбора ингибитора EGFR для терапии при определении гена ERBB2 как имеющего пониженный уровень метилирования. Согласно одному варианту осуществления больному вводят терапевтически эффективное количество ингибитора EGFR, такого как, например, эрлотиниб, цетуксимаб или панитумумаб.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу определения сверхэкспрессии гена ERBB2 в клетке, включающему определение статуса метилирования гена ERBB2 в клетке, причем пониженный уровень метилирования гена ERBB2 указывает на сверхэкспрессию ERBB2 в клетке.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли у больного, включающему введение терапевтически эффективного количества ингибитора HER2 больному, причем больному до введения ингибитора HER2 был поставлен диагноз злокачественной опухоли, которая характеризуется пониженным уровнем метилирования гена ERBB2, и причем пониженный уровень метилирования гена ERBB2 указывает на терапевтическую восприимчивость объектом ингибитора HER2.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу выбора терапии для больного злокачественной опухолью, включающему этапы определения статуса метилирования гена ERBB2 из образца злокачественной опухоли больного и выбора ингибитора HER2 для терапии при определении гена ERBB2 как имеющего пониженный уровень метилирования. Согласно одному варианту осуществления больному вводят терапевтически эффективное количество ингибитора HER2, такого как трастузумаб или T-DM1.
Согласно определенным вариантам осуществления описанных выше способов статус метилирования определяют у части гена ERBB2. Частью гена, используемого для определения статуса метилирования, является, например, энхансерный участок или энхансерный участок и промоторный участок. Согласно одному варианту осуществления часть гена, используемого для определения статуса метилирования, содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1. Согласно одному варианту осуществления часть гена, используемого для определения статуса метилирования, состоит из последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1. Согласно одному варианту осуществления часть гена, используемого для определения статуса метилирования, содержит участок с 6-ю повторами CpG. Согласно одному варианту осуществления часть гена, используемого для определения статуса метилирования, содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2. Согласно одному варианту осуществления часть гена, используемого для определения статуса метилирования, состоит из последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2.
Согласно определенным вариантам осуществления способов статус метилирования гена ERBB2 считают статусом с низким уровнем метилирования, если ген ERBB2 или его часть метилированы менее чем на приблизительно 50% или менее чем на приблизительно 20%..
Согласно определенным вариантам осуществления описанных выше способов статус метилирования определяют с помощью пиросеквенирования. Согласно определенным вариантам осуществления описанных выше способов ген ERBB2 получен из зафиксированной в формалине и залитой парафином (FFPE) ткани или из свежезамороженной ткани. Согласно определенным вариантам осуществления описанных выше способов выделенный из образца ткани ген ERBB2 перед пиросеквенированием предварительно амплифицируют.
Согласно определенным вариантам осуществления описанных выше способов опухолевая клетка представляет собой клетку опухоли NSCLC, или злокачественная опухоль представляет собой NSCLC.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 показана последовательность нуклеиновой кислоты энхансерного участка ERBB2 (SEQ ID NO: 1), содержащего 28 сайтов метилирования CpG (SEQ ID NO: 1).
На фигуре 2 приведен график, на котором показаны результаты анализа с применением пиросеквенирования статуса метилирования ERBB2 у удаленных хирургическим путем первичных опухолей NSCLC и равноценной нормальной ткани.
На фигуре 3 приведен график, на котором показаны результаты количественного анализа с применением пиросеквенирования статуса метилирования ERBB2 у эпителио-подобных и мезенхимально-подобных линий клеток NSCLC.
На фигуре 4 приведен график, на котором показана относительная экспрессия мРНК ERBB2 у клеток NSCLC по результатам анализа экспрессии гена Fludigm на основе технологии TaqMan.
На фигуре 5 приведен график, на котором показан процент метилирования сайтов CpG энхансера ERBB2 у линий клеток. Линии клеток приведены в порядке чувствительности к обработке эрлотинибом.
На фигуре 6 приведен график, на котором показаны результаты анализа с применением пиросеквенирования, которые представляют собой проценты метилирования в каждом из 6 отдельных сайтов CpG у удаленных хирургическим путем первичных опухолей NSCLC и равноценной нормальной ткани.
На фигуре 7 приведен график, на котором показан процент метилирования энхансерного участка ERBB2 у опухолевых клеток с высоким и низким уровнем экспрессии ERBB2.
На фигуре 8 приведен график, на котором показаны результаты анализа с применением пиросеквенирования метилирования ERBB2 и эпителиального/мезенхимального статуса у 47 образцов первичных опухолей NSCLC, полученных из архивных FFPE-микроскопических препаратов.
Подробное описание изобретения
I. Определения
Если не указано иное, то используемые в настоящем документе технические и научные термины имеют то же значение, которое обычно понимается рядовыми специалистами в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. В некоторых случаях термины с традиционно понимаемыми значениями приведены в настоящем документе для ясности и/или в качестве справочного материала, и включение в настоящий документ таких определений не следует понимать, как представляющее значительную разницу по сравнению с тем, что обычно понимается в данной области техники. Описанные или приведенные в качестве справочного материала методы и процедуры обычно хорошо понятны и широко используются специалистами в данной области техники с применением традиционной методики, как, например, широко используемые молекулярные методики клонирования, описываемые в работе Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. В соответствующих случаях, если не указано иное, процедуры, включающие применение коммерчески доступных наборов и реактивов, обычно осуществляют согласно определенным производителем протоколам и/или параметрам.
Таким образом, перед описанием способов, наборов и применений по настоящему изобретению следует понять, что настоящее изобретение не ограничено конкретными описанными методологией, протоколами, линиями клеток, видами или родами животных, конструктами и реагентами поскольку таковые, разумеется, могут изменяться. Также следует понимать, что применяемая в настоящем документе терминология приведена лишь с целью описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.
Стоит отметить, что применяемые в настоящем документе и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки на формы множественного числа, за исключением случаев, где контекст явно указывает иное.
По всему настоящему описанию и формуле изобретения слово "включают" или его варианты, такие как "включает" или "включающий", будут пониматься как предполагающие включение заданного числа или группы чисел, но не исключение любого другого числа или группы чисел.
Термин "злокачественная опухоль" у животных относится к присутствию клеток, обладающих характеристиками, типичными для канцерогенных клеток, такими как неконтролируемая пролиферация, бессмертие, метастатический потенциал, быстрый рост и скорость пролиферации и определенные характерные морфологические особенности. Во многих случаях клетки злокачественной опухоли будут находиться в форме опухоли, но такие клетки могут существовать и отдельно в организме животного или могут циркулировать с током крови в виде независимых клеток, таких лейкемические клетки.
Используемое в настоящем документе выражение "аномальный клеточный рост", если не указано иное, относится к клеточному росту, который не зависит от нормальных регуляторных механизмов (например, утрата контактного ингибирования). Это включает аномальный рост следующего: (1) опухолевых клеток (опухолей), которые пролиферируют посредством экспрессии мутантной тирозинкиназы или сверхэкспрессии рецепторной тирозинкиназы; (2) доброкачественных и злокачественных клеток других пролиферативных заболеваний, в которых происходит активация аберрантной тирозинкиназы; (4) любых опухолей, которые пролиферируют с участием рецепторных тирозинкиназ; (5) любых опухолей, которые пролиферируют посредством активации аберрантной серин/треонинкиназы и (6) доброкачественных и злокачественных клеток при других пролиферативных заболеваниях, в которых происходит активация аберрантной серин/трионинкиназы.
Используемый в настоящем документе термин "проведение лечения", если не указано иное, означает обращение, уменьшение, ингибирование развития или предупреждение, либо частично, либо полностью, роста опухолей, опухолевых метастаз или других канцерогенных или неопластических клеток у больного.
Используемый в настоящем документе термин "лечение", если не указано иное, относится к действию по проведению лечения.
Фраза "способ лечения" или ее эквивалент в случае применения по отношению, например, к злокачественной опухоли относится к процедуре или способу действия, который предназначен для уменьшения или удаления некоторого количества клеток злокачественной опухоли у животного или для облегчения симптомов злокачественной опухоли.
"Способ лечения" злокачественной опухоли или другого пролиферативного нарушения не обязательно означает, что клетки злокачественной опухоли или другого нарушения будут фактически удалены, что число клеток будет фактически уменьшено или нарушение будет фактически ослаблено или что симптомы злокачественной опухоли или другого нарушения будут фактически облегчены.
Термин "терапевтически эффективное средство" означает композицию, которая будет вызывать биологическую или медицинскую реакцию ткани, системы, животного или человека, которую желает добиться научный сотрудник, ветеринар, врач или другой медицинский сотрудник.
Термин "терапевтически эффективное количество" или "эффективное количество" означает количество рассматриваемого соединения или комбинации, которое будет вызывать биологическую или медицинскую реакцию ткани, системы, животного или человека, которую желает добиться научный сотрудник, ветеринар, врач или другой медицинский сотрудник.
Термины "ErbB1", "HER1", "рецептор эпидермального фактора роста" и "EGFR" и "киназа EGFR" применяют в настоящем документе взаимозаменяемо, и они относятся к EGFR, как раскрыто, например, в работе Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987), включая встречающиеся в природе его мутантные формы (например, делеционный мутант EGFR, описанный в работе у Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)). erbBI относится к гену, кодирующему белковый продукт EGFR.
Применяемый в настоящем документе термин "ингибитор киназы EGFR" и "ингибитор EGFR" относится к любому ингибитору киназы, который известен в настоящее время в данной области техники или который будет выявлен в будущем, и включает любую химическую структурную единицу, которая при введении больному приводит в результате к ингибированию биологической активности, ассоциированной с активацией рецептора EGF у больного, включая любые последующие биологические эффекты, которые в ином случае возникают в результате связывания EGFR с его природным лигандом. Такого рода ингибиторы киназы EGFR включают любое средство, которое может блокировать активацию EGFR или любые последующие биологические эффекты активации EGFR, имеющие отношение к проведению лечения злокачественной опухоли у больного. Такой ингибитор может действовать посредством связывания непосредственно с внутриклеточным доменом рецептора и ингибирования его киназной активности. Альтернативно, такой ингибитор может действовать посредством занятия лиганд-связывающего сайта или его части рецептора EGF, таким образом, делая рецептор недоступным для своего естественного лиганда с тем, чтобы предотвратить или уменьшить его нормальную биологическую активность. Альтернативно, такой ингибитор может действовать посредством модулирования димеризации полипептидов EGFR, или взаимодействия полипептида EGFR с другими белками, или усиления убиквитинирования и эндоцитозного расщепления EGFR. Ингибиторы киназы EGFR включают без ограничения низкомолекулярные ингибиторы, антитела или фрагменты антител, антисмысловые конструкты, малые ингибиторные РНК (т.е. РНК-интерференция при помощи dsRNA, RNAi) и рибозимы. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления ингибитор киназы EGFR представляет собой небольшую органическую молекулу или антитело, которое специфически связывается с EGFR человека.
Важной областью исследования стали ингибиторы функции рецептора EGF, для которых было показано, что клиническое применение и распознание ключевых сигнальных путей рецептора EGF, которые характеризуют подклассы больных, вероятнее всего получит преимущество от терапии. Мутации, которые активируют тирозинкиназную активность интегральных белков рецептора и/или усиливают дальнейшую передачу сигнала, были обнаружены у NSCLC и глиобластоме. In vitro и клинические исследования показали значительную изменчивость между рецепторными линиями клеток EGF д.т. и опухолями в их клеточных реакциях на ингибирование рецепторов EGF, которые, как было показано, отчасти происходят в результате независимой активации рецепторов EGF фосфатидилинозитол-3 киназного пути, что приводит к непрерывному фосфорилированию противоапоптической серин/треонинкиназы Akt. Активной областью исследования являются молекулярные факторы для альтернативных путей PI3-киназной активации и последующей невосприимчивости к действию ингибиторов рецепторов EGF. Например, рецептор инсулиноподобного фактора-1 (рецептор IGF-1), который сильно активирует PI3-киназный путь, вовлечен в клеточную устойчивость к действию ингибиторов EGF. Роли межклеточных и клеточно-адгезивных сетей, в которых также могут посылаться сигналы продолжения выживания посредством PI3-киназного пути при опосредовании невосприимчивости к избирательному ингибированию рецептора EGF, понятны меньше и можно сделать предположение, что они влияют на клеточную чувствительность к блокировке рецептора EGF. Способность опухолевых клеток сохранять сигналы роста и выживания при отсутствии адгезии с внеклеточным матриксом и межклеточных контактов является важной не только в контексте миграции клеток и метастазирования, но также и для сохранения клеточной пролиферации и выживаемости в рано-подобном опухолевом окружении, в котором внеклеточный матрикс перестраивает и уменьшается ингибирование посредством клеточного контакта. Ранее была определена сигнатура генной экспрессии EMT, которая коррелирует с чувствительностью in vitro линий клеток NSCLC к эрлотинибу (Yauch et al., 2005, Clin Cancer Res 11, 8686-8698).
Выражения "ErbB2" и "HER2" в настоящем документе используют взаимозаменяемо, и они относятся у человеческому белку HER2, описанному, например, в работах Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) и Yamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986) (номер доступа в Genebank X03363). Термин "erbB2" относится к гену, кодирующему человеческий ErbB2, a "neu" относится к гену, кодирующему крысиный p185neu.
"ErbB3" и "HER3" относятся к рецепторному полипептиду, который описан, например, в патентах США №№5183884 и 5480968, а также в работе Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989).
Термины " ErbB4" и "HER4" в настоящем документе относятся к рецепторному полипептиду, который описан, например, в патентной заявке EP №599274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); и Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993), включая их изоформы, которые, например, раскрыты в WO 99/19488, опубликованной 22 апреля 1999 года.
Под "пониженным уровнем метилирования" подразумевают, что большинство возможно метилированных сайтов CpG являются неметилированными. Согласно определенным вариантам осуществления пониженный уровень метилирования означает, что менее чем 50%, менее чем 45%, менее чем 40%, менее чем 35%, менее чем 30%, менее чем 25%, менее чем 20%, менее чем 15%, менее чем 10%, менее чем 5% или менее чем 1% возможных сайтов метилирования в части гена ERBB2 являются метилированными. В соответствии с одним вариантом осуществления часть гена ЕВВ2 содержит энхансерный участок ERBB2. Согласно одному варианту осуществления часть гена ЕВВ2 содержит энхансерный участок ERBB2 SEQ ID NO: 1, содержащий 28 сайтов метилирования CpG. В соответствии с еще одним вариантом осуществления пониженный уровень метилирования означает, что метилировано меньшее количество возможных сайтов метилирования по сравнению с геном ERBB2, который экспрессируется на нормальном уровне, например, в неопухолевой клетке. В соответствии с другим вариантом осуществления пониженный уровень метилирования означает, что ни один из сайтов CpG в энхансерном участке гена ERBB2 не является метилированным.
II. Способы и композиции
Настоящее изобретение частично относится к раскрытию того, что пониженный уровень метилирования гена ERBB2 коррелирует с высоким уровнем экспрессии ERBB2 и чувствительностью злокачественных опухолей к лечению при помощи ингибиторов киназы EGFR. Соответственно, настоящее изобретение относится к способу определения чувствительности опухоли к ингибированию клеточного роста при помощи ингибитора киназы EGFR у больного злокачественной опухолью, включающему получение образца опухоли и анализ образца опухоли для определения статуса метилирования ERBB2, причем определение статуса с низким уровнем метилирования ERBB2 указывает на то, что рост опухолевых клеток чувствителен к ингибированию при помощи лечения ингибитором EGFR.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу определения чувствительности роста опухолевых клеток к ингибированию с помощью ингибитора киназы EGFR, включающему определение статуса метилирования гена ERBB2 в опухолевой клетке образца, причем пониженный уровень метилирования гена ERBB2 указывает на то, что рост опухолевых клеток чувствителен к ингибированию с помощью ингибитора EGFR.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу выявления больного злокачественной опухолью, на которого может оказать благоприятный эффект лечение с помощью ингибитора EFGR, включающему определение статуса метилирования гена ERBB2 из образца злокачественной опухоли больного, такого как образец из раковой опухоли, причем больного выявляют как такого, на которого может оказать благоприятный эффект лечение с помощью ингибитора EGFR, если ген ERBB2 определяют как имеющий пониженный уровень митилирования. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления больному вводят терапевтически эффективное количество ингибитора EGFR на основании статуса с низким уровнем метилирования.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам выявления больного, на которого может оказать благоприятный эффект терапия с помощью ингибитора EGFR, причем способ включает определение пониженного уровня метилирования в части гена ERBB2, причем менее чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2% или 1% метилирования анализируемой части последовательности гена ERBB2 указывает на то, что на больного лечение более вероятно может оказать благоприятный эффект.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу выбора терапии для больного со злокачественной опухолью на основании статуса метилирования гена ERBB2 в образце, взятом из злокачественной опухоли больного, таком как образец раковой опухоли. Согласно одному варианту осуществления способ выбора терапии включает этапы определения статуса метилирования гена ERBB2 из образца злокачественной опухоли больного и выбора ингибитора EGFR для терапии при определении гена ERBB2 как имеющего пониженный уровень метилирования (статус метилирования рассматривают как статус пониженного уровня метилирования). Затем больному вводят терапевтически эффективное количество ингибитора EGFR на основании такого способа выбора. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ингибитором EFGR является эрлотиниб, цетуксимаб или панитумумаб.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения больного при помощи ингибитора EGFR, если больной страдает от злокачественной опухоли, характеризующейся пониженным уровнем метилирования ERBB2.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу определения того, сверхэкспрессируется ли ген ERBB2 в клетке, такой как клетка злокачественной опухоли, включающему определение статуса метилирования гена ERBB2 в клетке, причем определение того, что ген ERBB2 имеет пониженный уровень метилирования, указывает на сверхэкспрессию ERBB2 в клетке.
Ранее было показано, что сверхэкспрессия гена ERBB2 коррелирует с реакцией на ингибиторы HER2, такие как трастузумаб (HERCEPTIN, Genentech, Inc.) и T-DM1. См., например, патентные документы WO 99/31140, US 2003/0170234, WO 01/89566. В связи с этим, согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения больного при помощи ингибитора EGFR, если больной страдает от злокачественной опухоли, характеризующейся пониженным уровнем метилирования ERBB2. Соответственно, настоящее изобретение относится к способам выявления индивидуума, на которого может оказать благоприятный эффект терапия, включающая ингибитор HER2, причем способ включает определение пониженного уровня метилирования у части гена ERBB2, причем менее чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2% или 1% метилирования последовательности ERBB2 указывает на то, что на индивидуума лечение более вероятно может оказать благоприятный эффект.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли у больного, включающему введение терапевтически эффективного количества ингибитора HER2 больному, причем больному до введения ингибитора HER2 был поставлен диагноз злокачественной опухоли, характеризующейся пониженным уровнем метилирования ERBB2, и причем пониженный уровень метилирования ERBB2 указывает на терапевтическую восприимчивость объектом ингибитора HER2. Согласно одному варианту осуществления ингибитор HER2 представляет собой небольшую молекулу или антитело. Согласно одному варианту осуществления ингибитором HER2 является антитело, такое как трастузумаб или T-DM1.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу выбора терапии для больного злокачественной опухолью, включающему этапы определения статуса метилирования гена ERBB2 из образца злокачественной опухоли больного и выбора ингибитора HER2 для терапии при определении гена ERBB2 как имеющего пониженный уровень метилирования.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления приведенных выше способов определения статуса метилирования гена ERBB2 часть анализируемого в отношении статуса метилирования гена ERBB2 содержит энхансерный участок. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления часть гена ERBB2 содержит энхансерный участок и промоторный участок. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления часть гена ERBB2 является частью гена в местоположении на хромосоме chr17:37861100-37863650 (NCBI build 37/hg19) или содержит этот участок в своем составе. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления частью гена ERBB2 является последовательность, представленная SEQ ID NO: 1. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления часть гена ERBB2 содержит участок с 6-ю повторами CpG из SEQ ID NO: 1. Согласно одному варианту осуществления часть гена ERBB2 содержит участок с 6-ю повторами CpG из SEQ ID NO: 2.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления часть гена ERBB2 предварительно амплифицируют перед количественной, специфичной к участкам метилирования ПЦР.
Согласно определенным вариантам осуществления описанных выше способов статус метилирования гена ERBB2 или специфической части рассматривают как пониженный уровень метилирования при определении менее чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2% или 1% метилирования анализируемой части последовательности гена ERBB2.
Наличие и/или уровень/количество различных биомаркеров в образце можно проанализировать при помощи ряда методик, многие из которых известны в данной области и понятны любому специалисту, включая без ограничения иммуногистохимию ("IHC"), вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию, анализы молекулярных связей, ELISA, ELIFA, сортировку флуоресцентно-активированных клеток ("FACS"), MassARRAY, протеомику, количественные анализы крови (как, например ELISA сыворотки крови), биохимические анализы ферментативной активности, гибридизацию in situ, саузерн-анализ, нозерн-анализ, секвенирование всего генома, полимеразную цепную реакцию ("ПЦР") включая количественную ПЦР в реальном времени ("qRT-PCR") и другие способы обнаружения на основе амплификации, такие как, например, тест разветвленной ДНК, SISBA, ТМА и т.п.), RNA-Seq, FISH, анализ с использованием микрочипов, определение профиля генной экспрессии и/или серийный анализ экспрессии генов ("SAGE"), а также любой другой из широкого спектра анализов, которые можно осуществлять при помощи анализа белка, гена и/или ткани с использованием чипа. Типичные протоколы оценки статуса генов и генных продуктов можно найти, например, в работе Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) and 18 (PCR Analysis). Также можно применять объединенные иммуноанализы, как, например, доступные от Rules Based Medicine или Meso Scale Discovery ("MSD") ("MSD").
Хорошо известны способы оценки метилирования ДНК. Например, в работе Laird (2010) Nature Reviews Genetics 11:191-203 приведен обзор анализа метилирования ДНК. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способы оценки метилирования включают разделение случайным образом или фрагментирование случайным образом геномной ДНК, разрезание ДНК при помощи зависимого от метилирования или чувствительного к метилированию рестрикционного фермента и последующее избирательное выявление и/или анализ разрезанной или неразрезанной ДНК. Избирательное определение может включать, например, разделение разрезанной и неразрезанной ДНК (например, по размеру) и количественную оценку представляющей интерес последовательности, которая была разрезана или, альтернативно, которая не была разрезана. См., например, патент США №7186512. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способ может включать амплификацию интактной ДНК после расщепления рестрикционным ферментом, таким образом, амплифицируя только ДНК, которая не была расщеплена рестрикционным ферментом в амплифицированной области. См., например, заявки на патенты США №№10/971986, 11/071013 и 10/971339. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления амплификацию можно осуществлять с применением праймеров, которые являются геноспецифичными. Альтернативно, к концам случайным образом фрагментированной ДНК можно добавить адаптеры, ДНК можно расщепить посредством зависимого от метилирования или чувствительного к метилированию рестрикционного фермента, интактную ДНК можно амплифицировать с применением праймеров, которые гибридизируются с адапторными последовательностями. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления второй этап можно осуществить для определения наличия, отсутствия или количества конкретного гена в амплифицированном пуле ДНК. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ДНК амплифицируют при помощи количественной ПЦР в реальном времени.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способы включают расчет средней плотности метилирования в целевой последовательности в выборке геномной ДНК. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способ включает осуществление контакта геномной ДНК с зависимым от метилирования рестрикционным ферментом или чувствительным к метилированию рестрикционным ферментом в условиях, которые включают сохранение нерасщепленными по меньшей мере несколько копий потенциальных сайтов расщепления рестрикционным ферментом в локусе, количественную оценку интактных копий локуса и сравнение количества амплифицированного продукта с контрольным значением, представляющим собой количественный показатель метилирования контрольной ДНК, таким образом количественно оценивая среднюю плотность метилирования в локусе по сравнению с плотностью метилирования контрольной ДНК.
Количественный показатель метилирования локуса ДНК можно определить путем получения образца содержащей локус геномной ДНК, расщепления ДНК при помощи рестрикционного фермента, который либо чувствителен к метилированию, либо зависим от метилирования, и затем оценки количества интактной ДНК или оценки количества разрезанной ДНК в представляющем интерес локусе ДНК. Количество интактной или разрезанной ДНК будет зависеть от изначального количества содержащей локус геномной ДНК, количественного показателя метилирования в локусе и числа (т.е. доли) нуклеотидов в локусе, которые метилированы в геномной ДНК. Количественный показатель метилирования в локусе ДНК можно определить путем сравнения количества интактной ДНК или разрезанной ДНК с контрольным значением, представляющим собой количество интактной ДНК или разрезанной ДНК в обработанном аналогичным образом образце ДНК. Контрольное значение может представлять собой известное или прогнозируемое число метилированных нуклеотидов. Альтернативно, контрольное значение может представлять собой количество интактной или разрезанной ДНК из такого же локуса в другой (например, нормальной, не подверженной заболеванию) клетке или из второго локуса.
Путем применения чувствительного к метилированию или зависимого от метилирования рестрикционного фермента в условиях, которые включают сохранение нерасщепленными по меньшей мере несколько копий потенциальных сайтов расщепления рестрикционным ферментом в локусе и последующей количественной оценки оставшихся интактных копий и сравнения количества с контролем можно определить среднюю плотность метилирования локуса. Если чувствительный к метилированию рестрикционный фермент ввести в контакт с копиями локуса ДНК в условиях, которые включают сохранение нерасщепленными по меньшей мере несколько копий потенциальных сайтов расщепления рестрикционным ферментом в локусе, то оставшаяся интактная ДНК будет прямо пропорциональна плотности метилирования, и, таким образом, ее можно сравнить с контролем для определения относительной плотности метилирования локуса в образце. Аналогично, если зависимый от метилилирования рестрикционный фермент ввести в контакт с копиями локуса ДНК в условиях, которые включают сохранение нерасщепленными по меньшей мере несколько копий потенциальных сайтов расщепления рестрикционным ферментом в локусе, то оставшаяся интактная ДНК будет обратно пропорциональна плотности метилирования, и, таким образом, ее можно сравнить с контролем для определения относительной плотности метилирования локуса в образце. Подобные анализы раскрыты, например, в публикации заявки на патент США №10/971986.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, количественные способы амплификации (например, количественную ПЦР или количественную линейную амплификацию) можно применять для оценки количества интактной ДНК в локусе, фланкированном праймерами для амплификации, после рестрикционного расщепления. Способы количественной амплификация раскрыты, например, в патентах США №№6180349, 6033854 и 5972602, а также, например, в работе Gibson et al., Genome Research 6:995-1001 (1996); DeGraves et al., Biotechniques 34(1):106-10, 112-5 (2003); Deiman В et al., Mol Biotechnol. 20(2):163-79 (2002).
Дополнительные способы определения метилирования ДНК могут включать геномное секвенирование до или после обработки ДНК бисульфитом. См., например, работу Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831 (1992). При контакте бисульфита натрия с ДНК неметилированный цитозин превращается в урацил, в то время как метилированный цитозин не модифицируется.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления для определения метилирования ДНК применяют расщепление рестрикционным ферментом продуктов ПЦР, амплифицированных из преобразованной бисульфитом ДНК. См., например, работу Sadri & Hornsby, Nucl. Acids Res. 24:5058-5059 (1996); Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534 (1997).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления для определения метилирования ДНК применяют анализ MethyLight отдельно или в комбинации с другими способами (см., Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306 (1999)). Если кратко, в процессе MethyLight геномную ДНК преобразовывают в ходе реакции с бисульфитом натрия (в результате процесса обработки бисульфитом неметилированные основания цитозина превращаются в урацил). Затем осуществляют амплификацию представляющей интерес последовательности ДНК с применением праймеров ПЦР, которые гибридизируются с динуклеотидами CpG. С помощью праймеров, которые гибридизируются только с последовательностями, полученными в результате бисульфитного превращения неметилированной ДНК, (или альтернативно с метилированными последовательностями, которые не подверглись преобразованию) амплификация может показать статус метилирования последовательностей, с которыми гибридизируются праймеры. Аналогичным образом, продукт амплификации можно определить при помощи зонда, который специфично связывается с последовательностью, полученной в результате обработки бисульфитом неметилированной (или метилированной) ДНК. В случае необходимости для определения статуса метилирования можно применять как праймеры, так и зонды Таким образом, наборы для применения с MethyLight могут включать бисульфит натрия, а также праймеры или зонды с поддающейся обнаружению меткой (включая без ограничения Taqman или зонды с молекулярными маяками), которые различают метилированную и неметилированную ДНК, которая была обработана бисульфитом. Другие компоненты наборов могут включать, например, необходимые для амплификации ДНК реактивы, включая без ограничения буферы для ПЦР, дезоксинуклеотиды и термостабильную полимеразу.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления реакцию Ms-SNuPE (чувствительное к метилированию однонуклеотидное удлинение праймера) применяют отдельно или в комбинации с другими способами для определения метилирования ДНК (см. работу Gonzalgo & Jones Nucleic Acids Res. 25:2529-2531 (1997)). Метод Ms-SNuPE представляет собой количественный способ оценки различий метилирования в специфичных сайтах CpG, основанный на обработке бисульфитом ДНК с последующим однонуклеотидным удлинением працмера. Если кратко, проводят реакцию геномной ДНК с бисульфитом натрия для преобразования неметилированного цитозина в урацил, в то же время оставляя 5-метилцитозин без изменений. Затем осуществляют амплификацию необходимой целевой последовательности при помощи ПЦР-праймеров, специфичных к преобразованной бисульфитом ДНК, а полученный в результате продукт выделяют и применяют в качестве матрицы для анализа метилирования в представляющем интерес сайте(ах) CpG.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления специфичную к метилированию реакцию ПЦР ("MSP") применяют отдельно или в комбинации с другими способами для определения метилирования ДНК. Анализ MSP включает начальную модификацию ДНК при помощи бисульфита натрия, преобразовывая все неметилированные, но не метилированные, цитозины в урацил и последующую амплификацию с праймерами, специфичными к метилированной относительно неметилированной ДНК. См. рабоу Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, (1996); патент США №5 786 146. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления метилирование ДНК определяют при помощи анализа QIAGEN PyroMark CpG Assay, который заранее предусмотрен в анализах метилирования ДНК с применением пиросеквенирования.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления клеточный статус метилирования определяют при помощи высокопроизводительного анализа метилирования ДНК для определения чувствительности к ингибиторам EGFR. Если кратко, геномную ДНК выделяют из образца клетки или ткани (например, образца опухоли или образца крови) и преобразовывают в ходе реакции с бисульфитом натрия (в результате процесса обработки бисульфитом неметилированные остакти цитозина преобразовываются в урацил) с помощью стандартных известных в данной области анализов. Преобразованный бисульфитом ДНК-продукт амплифицируют, фрагментируют и гибридизируют с чипом, содержащим сайты CpG со всего генома, при помощи стандартных известных в данной области анализов. После гибридизации получают изображение чипа и обрабатывают для анализа статуса метилирования ДНК при помощи стандартных известных в данной области анализов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления образец ткани является зафиксированной в формалине и залитой парафином (FFPE) тканью. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления образцом ткани является свежезамороженная ткань. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенную из образца ткани ДНК перед превращением с помощью бисульфита предварительно амплифицируют. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенную из образца ткани ДНК перед превращением с помощью бисульфита предварительно амплифицируют с применением системы для одноэтапной RT-PCR Invitrogen Superscript III с Platinum Taq. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенную из образца ткани ДНК перед превращением с помощью бисульфита предварительно амплифицируют с применением анализа на основе технологии Taqman. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления реакцию с бисульфитом натрия проводят при помощи набора для метилирования ДНК Zymo EZ DNA Methylation Kit. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления преобразованную бисульфитом ДНК амплифицируют и гибридизируют с чипом при помощи набора Illumina Infinium HumanMethylation450 Beadchip Kit. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления чип визуализируют на Illumina iScan Reader. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изображения обрабатывают при помощи модуля для работы с результатами анализа метилирования программного обеспечения GenomeStudio. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления данные метилирования анализируют при помощи пакета программного обеспечения Bioconductor lumi. См. работу Du et al., Bioinformatics, 24(13):1547-1548 (2008).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления сайты метилирования ДНК ERBB2 выявляют при помощи секвенирующей ПЦР с обработкой бисульфитом (BSP) для определения чувствительности к действию ингибиторов EGFR. Если кратко, геномную ДНК выделяют из образца клетки или ткани (например, образца опухоли или образца крови) и преобразовывают в ходе реакции с бисульфитом натрия (в процессе обработки бисульфитом неметилированные остатки цитозина преобразовываются в урацил) при помощью стандартных известных в данной области методов. Преобразованный бисульфитом ДНК-продукт амплифицируют при помощи праймеров, сконструированных специфичными к преобразованной бисульфитом ДНК (например, бисульфит-специфичных праймеров) и лигируют в векторы для трансформации в клетку-хозяина при помощью стандартных известных в данной области методов. После отбора клеток-хозяев, содержащих представляющий интерес амплифицированный с помощью ПЦР преобразованный бисульфитом ДНК-продукт, ДНК-продукт выделяют и секвенируют для определения сайтов метилирования с помощью стандартных известных в данной области методов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления образец ткани является зафиксированной в формалине и залитой парафином (FFPE) тканью. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления образцом ткани является FFPE-ткань, которая была обработана для анализа IHC, например, в отношении экспрессии ERBB2. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления образцом ткани является FFPE-ткань, у которой наблюдают незначительную экспрессию или отсутствие экспрессии ERBB2 при IHC. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления образцом ткани является свежезамороженная ткань. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенную из образца ткани ДНК перед превращением с помощью бисульфита предварительно амплифицируют. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенную из образца ткани ДНК перед превращением с помощью бисульфита предварительно амплифицируют с применением системы для одноэтапной RT-PCR Invitrogen Superscript III с Platinum Taq. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенную из образца ткани ДНК перед превращением с помощью бисульфита предварительно амплифицируют с применением анализа на основе технологии Taqman. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления реакцию с бисульфитом натрия выполняют при помощи набора для метилирования ДНК Zymo EZ DNA Methylation-Gold Kit. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления праймеры, сконструированные специфичными к преобразованной бисульфитом ДНК, конструируют при помощи программного обеспечения Applied Biosystems Methyl Primer Express. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления преобразованный бисульфитом ДНК-продукт амплифицируют при помощи ПЦР с применением системы для одноэтапной RT-PCR Invitrogen Superscript III с Platinum Taq. В соответствии со следующими вариантами осуществления амплифицированный при помощи ПЦР преобразованной бисульфитом ДНК-продукт лигируют в вектор при помощи набора Invitrogen TOPO TA Cloning. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления клеткой-хозяином может быть бактерия. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления представляющий интерес выделенный, амплифицированный с помощью ПЦР, преобразованный бисульфитом ДНК-продукт секвенируют при помощи анализатора ДНК Applied Biosystems 3730x1 DNA Analyzer. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления праймеры, сконструированные специфичными к преобразованной бисульфитом ДНК, конструируют при помощи программного обеспечения Qiagen PyroMark Assay Design. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления преобразованный бисульфитом ДНК-продукт амплифицируют при помощи ПЦР с применением системы для одноэтапной RT-PCR Invitrogen Superscript III с Platinum Taq. В соответствии со следующими вариантами осуществления амплифицированный при помощи ПЦР, преобразованный бисульфитом продукт секвенируют при помощи Qiagen Pyromark Q24 и анализируют на Qiagen при помощи программного обеспечения PyroMark.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления сайты метилирования ДНК ERBB2 выявляют при помощи количественной специфичной к участкам метилирования ПЦР (QMSP) для определения чувствительности к действию ингибиторов EGFR или HER2. Если кратко, геномную ДНК выделяют из образца клетки или ткани и преобразовывают в ходе реакции с бисульфитом натрия (в процессе обработки бисульфитом неметилированные остатки цитозина преобразовываются в урацил) при помощью стандартных известных в данной области методов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления образец ткани является зафиксированной в формалине и залитой парафином (FFPE) тканью. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления образцом ткани является FFPE-ткань, которая была обработана для анализа IHC, например, в отношении экспрессии ERBB2. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления образцом ткани является FFPE-ткань, у которой наблюдают незначительную экспрессию или отсутствие экспрессии ERBB2 при IHC. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления образцом ткани является свежезамороженная ткань. Преобразованный бисульфитом продукт ДНК амплифицируют при помощи праймеров, сконструированных специфичными к преобразованной бисульфитом ДНК (например, праймеры для количественной, специфичной к участкам метилирования ПЦР). Преобразованный бисульфитом ДНК-продукт амплифицируют при помощи праймеров для количественной, специфичной к участкам метилирования ПЦР и анализируют на предмет метилирования при помощью стандартных известных в данной области методов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления образец ткани является зафиксированной в формалине и залитой парафином (FFPE) тканью. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления образцом ткани является свежезамороженная ткань. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенную из образца ткани ДНК перед превращением с помощью бисульфита предварительно амплифицируют с применением системы для одноэтапной RT-PCR Invitrogen Superscript III с Platinum Taq. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенную из образца ткани ДНК перед превращением с помощью бисульфита предварительно амплифицируют. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенную из образца ткани ДНК перед превращением с помощью бисульфита предварительно амплифицируют с применением анализа на основе технологии Taqman. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления реакцию с бисульфитом натрия выполняют при помощи коммерчески доступного набора. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления реакцию с бисульфитом натрия выполняют при помощи набора для метилирования ДНК Zymo EZ DNA Methylation-Gold Kit. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления праймеры, сконструированные специфичными к преобразованной бисульфитом ДНК, конструируют при помощи программного обеспечения Applied Biosystems Methyl Primer Express. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления преобразованную бисульфитом ДНК амплифицируют при помощи метода на основе Taqman. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления преобразованую бисульфитом ДНК амплифицируют на Applied Biosystems 7900HT и анализируют при помощи программного обеспечения Applied Biosystems SDS.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящее изобретение относится к способам определения метилирования ERBB2 посредством 1) IHC-анализа образцов опухоли, за которым следует 2) количественная специфичная к участкам метилирования ПЦР ДНК, выделенной из опухолевой ткани, используемой в IHC-анализе этапа 1. Если кратко, покровные стекла из IHC-микроскопических препаратов удаляют одним из двух способов: микроскопические препараты помещают в морозильную камеру по меньшей мере на 15 минут, затем с покровного стекла поддевают микроскопический препарат при помощи лезвия. Срезы затем инкубируют в ксилене при комнатной температуре для разрушения фиксирующей среды. Альтернативно, микроскопические препараты вымачивают в ксилене до тех пор, пока не отделится покровное стекло. Это может занять до нескольких дней. Все микроскопические препараты пропускают через процедуру депарафинизации, заключающуюся в 5 мин обработке ксиленом (×3) и 5 мин обработке 100% этанолом (×2). Ткани соскребают с микроскопических препаратов при помощи лезвий, и помещают в содержащий протеиназу К буфер для лизиса ткани, и инкубируют в течение ночи при 56°C. В случаях, когда ткань все еще присутствует после инкубирования, можно добавить дополнительные 10 мкл протеиназы К и ткань инкубировать в течение еще 30 мин Выделение ДНК продолжали, например, при помощи набора QIAamp DNA FFPE Tissue. Выделенная непосредственно из IHC-микроскопических препаратов ДНК подвергали QMSP-анализу при помощи описанных выше QMSP3 праймеров и зондов.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления преобразованную бисульфитом ДНК секвенируют посредством глубокого секвенирования. Глубокое секвенирование представляет собой способ, такой как прямое пиросеквенирование, при котором последовательность считывают множество раз. Глубокое секвенирование можно применять для определения маловероятных событий, таких как маловероятные мутации. Ультраглубокое секвенирование ограниченного числа локусов можно осуществить путем прямого пиросеквенирования ПЦР-продуктов и путем секвенирования более 100 ПЦР-продуктов за один цикл. Проблема при секвенировании преобразованной бисульфитом ДНК возникает вследствие низкой сложности последовательности после преобразования бисульфитом цитозиновых остатков в тиминовые (урациловые) остатки. Для уменьшения избыточности последовательностей можно задействовать бисульфитное секвенирование с упрощенным представлением (RRBS) посредством выбора лишь некоторых участков генома для секвенирования путем разделения по размеру фрагментов ДНК (Laird, PW Nature Reviews 11:195-203 (2010)). Нацеливание можно осуществлять при помощи захвата с помощью чипа или захвата по принципу ключ-замок перед секвенированием. Например, целенаправленный захват на фиксированных чипах или при помощи отбора гибридов в растворе может обогатить последовательности, на которые нацелена библиотека олигонуклеотидов ДНК или РНК, и его можно осуществить до или после преобразования бисульфитом. Альтернативно, захват по принципу ключ-замок обеспечивает повышенную эффективность обогащения путем объединения повышенной специфичности гибридизации двух связанных зондов, а последующая амплификация с универсальными праймерами обеспечивает более однородное представление, чем амплификация с локус-специфичными праймерами.
Дополнительные способы определения метилирования включают без ограничения амплификацию метилированных CpG-островков (см. работу Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12 (1999)) и способы, описанные, например, в публикации патента США 2005/0069879; Rein et al., Nucleic Acids Res. 26(10):2255-64 (1998); Oiek et al., Nat Genet. 17(3):275-6 (1997); Laird, PW Nature Reviews 11:195-203 (2010); и заявке PCT № WO 00/70090).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления экспрессию ERBB2 в клетке определяют путем оценки мРНК ERBB2 в клетке. Способы оценки мРНК в клетках хорошо известны и включают, например, гибридизационные анализы с применением комплементарных ДНК-зондов (как например, in situ гибридизация при помощи меченных рибозондов, специфичных к одному или нескольким генам, нозерн-блоттинг и родственные методы) и различные анализы с применением амплификации нуклеиновых кислот (такие как RT-PCR с применением комплементарные праймеров, специфичных к одному или нескольким генам, и другие способы обнаружения на основе амплификации, такие как, например, тест разветвленной ДНК, SISBA, ТМА и т.п.). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления экспрессию ERBB2 в тестовом образце сравнивают с эталонным образцом. Например, тестовый образец может быть образцом опухолевой ткани, а эталонный образец может быть из нормальной ткани или клетками, такими как РВМС.
Образцы от млекопитающих можно в целях удобства проанализировать в отношении мРНК при помощи нозерн-дот-блоттинга или анализа ПЦР. Кроме того, такие способы могут включать один или несколько этапов, которые позволяют определить уровни целевой мРНК в биологическом образце (например, посредством одновременного исследования уровней сравниваемой контрольной последовательности мРНК гена "домашнего хозяйства", такого как член семейства актинов). Необязательно, можно определить последовательность амплифицированной целевой кДНК.
Необязательные способы по настоящему изобретению включают протоколы, с помощью которых изучают или определяют мРНК, такие как целевые мРНК, в образце ткани или клеток посредством методов с использованием микрочипов. С помощью микрочипов для нуклеиновых кислот тестовые и контрольные образцы мРНК из тестовых или контрольных образцов ткани обратно транскрибируют и помечают для создания кДНК-зондов. Затем зонды гибридизируют с чипом с нуклеиновыми кислотами, иммобилизированными на твердой подложке. Чип конфигурируют таким образом, чтобы были известны последовательность и положение каждого элемента чипа. Например, отбор генов, в которых экспрессия коррелирует с повышенным или уменьшенным клиническим эффектом от анти-ангиогенной терапии, может быть осуществлен с помощью чипа на твердой подложке. Гибридизация меченного зонда с определенным элементом чипа указывает на то, что образец, из которого получен зонд, экспрессирует этот ген.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления наличие и/или уровень/количество измеряют путем наблюдения уровней экспрессии белка вышеупомянутого гена. Согласно определенным вариантам осуществления способ включает осуществление контакта биологического образца с антителами к описанному в настоящем документе биомаркеру в условиях, позволяющих осуществлению связывания биомаркера, и определение того, сформировался ли комплекс между антителами и биомаркером. Такой способ может быть способом in vitro или in vivo.
Согласно определенным вариантам осуществления, наличие и/или уровень/количество биомаркерных белков в образце исследуют с применением протоколов IHC и окрашивания. Было показано, что окрашивание IHC срезов ткани является надежным способом определения или выявления наличия белков в образце. В соответствии с одним аспектом, уровень биомаркера определяют с помощью способа, включающего следующее: (а) проведение IHC-анализа образца (такого как исследуемый образец злокачественной опухоли) с антителом; и b) определение уровня биомаркера в образце. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления интенсивность IHC-окрашивания определяют по отношению к эталонному значению.
IHC можно осуществлять в сочетании с дополнительными методами, такими как морфологическое окрашивание и/или флюоресцентная гибридизация in-situ. Доступны два основных IHC-способа, прямые и непрямые анализы. В соответствии с первым анализом связывание антитела с целевым антигеном определяют напрямую. Этот прямой анализ включает применение меченного реактива, такого как флуоресцентная метка или меченное ферментом первичное антитело, которое можно визуализировать без дополнительного взаимодействия с антителом. При типичном непрямом анализе неконъюгированное первичное антитело связывается с антигеном, а затем меченное вторичное антитело связывается с первичным антителом. При конъюгации вторичного антитела с ферментной меткой для обеспечения визуализации антигена добавляют хромогенный или флуорогенный субстрат. Происходит усиление сигнала, поскольку несколько вторичных антител могут реагировать с различными эпитопами на первичном антителе.
35
14
125
3
131
Применяемое для IHC первичное и/или вторичное антитело обычно будут метить при помощи поддающихся выявлению частей. Доступно множество меток, которые можно в целом сгруппировать в следующие категории: (a) радиоизотопы, такие как S, C, I, H и I; (b) коллоидные золотые частицы; (c) флюоресцентные метки, включающие без ограничения редкоземельные хелаты (хелаты европия), техасский красный, родамин, флюоресцеин, дансил, лиссамин, умбеллиферон, фикокритерин, фикоцианин или коммерчески доступные флуорофоры, такие как SPECTRUM ORANGE7 и SPECTRUM GREEN7, и/или производные любого одного или нескольких из приведенных выше; (d) доступны различные фермент-субстратные метки, и в патенте США №4275149 приведен обзор некоторых из них. Примеры ферментных меток включают люциферазы (например, люциферазу светлячка и бактериальную люциферазу, патент США №4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдегидрогеназу, уреазу, пероксидазу, такую как пероксидаза хрена (HRPO), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизозим, сахаридоксидазу (например, глюкооксидазу, галактозоксидазу и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу), гетероциклические оксидазы (такие как уриказа и ксантиноксидаза), лактопероксидазу, микропероксидазу и т.п.
Примеры фермент-субстрантных комбинаций включают, например, пероксидазу хрена (HRPO) с перекисью водорода в качестве субстрата, щелочную фосфатазу (AP) с пара-нитрофенилфосфатом в качестве хромогенного субстрата и β-D-галактозидазу (β-D-Gal) с хромогенным субстратом (например, p-нитрофенил-β-D-галактозидазой) или флюорогенным субстратом (например, 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозидазой). Для их общего обзора см. патенты США №№4275149 и 4318980.
Подготовленные таким образом препараты можно заключить в среду и накрыть покровным стеклом. Оценивание микроскопического препарата затем проводят, например, с помощью микроскопа, а также можно задействовать критерии интенсивности окрашивания, которые обычно применяют в данной области. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления оценка по таблице окрашивания приблизительно 1+ или выше является диагностической или прогностической. В соответствии с определенными вариантами осуществления оценка по таблице окрашивания приблизительно 2+ или выше в IHC-анализе является диагностической и/или прогностической. В соответствии с другими вариантами осуществления оценка по таблице окрашивания приблизительно 3 или выше является диагностической или прогностической. Согласно одному варианту осуществления понятно, что при исследовании клеток и/или ткани из опухоли или аденомы толстой кишки с помощью IHC окрашивание обычно определяют или оценивают в клетке опухоли и/или ткани (по сравнению со стромальной или окружающей тканью, которая может присутствовать в образце).
В соответствии с альтернативными способами образец можно ввести в контакт с специфичным к биомаркеру антителом в условиях, достаточных для образования комплекса антитело-биомаркер, а затем осуществить выявление комплекса. Наличие биомаркера можно определить рядом способов, как, например, посредством процедур вестерн-блоттинга и ELISA для анализа широкого спектра тканей и образцов, включая плазму и сыворотку крови. Доступен широкий диапазон методов иммуноанализа с применением такого формата анализа, см., например, патенты США №№4016043, 4424279 и 4018653. Они включают как одностадийные, так и двухстадийные или по типу "сэндвича" анализы неконкурентных типов, а также традиционные анализы по конкурентному связыванию. Такие анализы также включают прямое связывание меченного антитела с целевым биомаркером.
Наличие и/или уровень/количество выбранного биомаркера в образце ткани или клеток можно также исследовать посредством функционального анализа или анализа на основе активности. Так, например, если биомаркер является ферментом, можно провести известные в данной области анализы для определения или выявления наличия заданной ферментативной активности в образце ткани или клеток.
Согласно определенным вариантам осуществления образцы нормализуют как по различиям количества анализируемого биомаркера, так и по изменчивости качества используемых образцов и изменчивости между циклами анализа. Такую нормализацию можно выполнять путем определения и включения уровня определенных нормализующих биомаркеров, включая хорошо известные гены "домашнего хозяйства", как, например, АСТВ. Альтернативно, нормализация может быть основана на среднем или медианном сигнале всех анализируемых генов или большого их подкласса (подход глобальной нормализации). По принципу ген-за-геном измеренное нормализированное количество мРНК или белка рассматриваемой опухоли сравнивают с количеством, обнаруживаемым в эталонном наборе. Нормализованные уровни экспрессии для каждой мРНК или белка на тестируемую опухоль на объект можно выразить как процент уровня экспрессии, измеренного в эталонном наборе. Наличие и/или уровень экспрессии/количество, измеренные в конкретном рассматриваемом образце, который подлежит анализу, будет падать на несколько процентилей в рамках этого диапазона, что можно определить при помощи хорошо известных в данной области способов.
Согласно определенным вариантам осуществления относительный уровень экспрессии гена определяют следующим образом:
Относительная экспрессия гена 1 образца 1 = 2 ехр (ген домашнего хозяйства Ct - ген 1 Ct) с Ct определенным в образце.
Относительная экспрессия эталонной РНК гена 1 = 2 ехр (ген домашнего хозяйства Ct - ген 1 Ct) с Ct определенным в эталонном образце.
Нормализованная относительная экспрессия гена 1 образца 1 = (относительная экспрессия гена 1 образца 1 / относительная экспрессия эталонной РНК гена 1) × 100
Ct является пороговым циклом. Ct является числом циклов, за которые образующаяся в ходе реакции флуоресценция пересекает пороговую линию.
Все эксперименты нормализуют к эталонной РНК, которая является полной смесью РНК из различных источников ткани (например, эталонная РНК №636538 от Clontech, Маунтин-Вью, Калифорния). Идентичную эталонную РНК включают в каждый цикл qRT-PCR после сравнения результатов между различными экспериментальными циклами.
Согласно одному варианту осуществления образцом является клинический образец. В соответствии с другим вариантом осуществления образец применяют для диагностического анализа. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления образец получают из первичной или метастатической опухоли. Биопсию ткани часто используют для получения репрезентативного кусочка опухолевой ткани. Альтернативно, опухолевые клетки можно получить непрямым путем в форме тканей или жидкостей, которые известны или подразумевают содержание представляющих интерес опухолевых клеток. Так, например, образцы очагов злокачественной опухоли легких можно получить при помощи иссечения, бронхоскопии, тонкоигольной аспирационной биопсии, бронхиальной щеточной биопсии или из мокроты, плевральной жидкости или крови. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления образец включает циркулирующие опухолевые клетки, например циркулирующие клетки злокачественной опухоли крови, мочи или мокроты. Гены и продукты генов можно выявить из ткани злокачественной опухоли или опухолевой ткани или из других образцов организма, таких как моча, мокрота, сыворотка или плазма крови. Те же, что и обсуждаемые ранее методы выявления целевых генов или генных продуктов в раковых образцах можно применять и для других образцов организма. Клетки злокачественной опухоли могут отделиться от очагов злокачественной опухоли и появиться в таких образцах организма. При скрининге таких образцов организма в отношении таких злокачественных опухолей можно осуществить простую раннюю диагностику. Кроме того, прогресс терапии можно легче отслеживать путем тестирования таких образцов организма на предмет целевых генов или генных продуктов.
Согласно определенным вариантам осуществления эталонный образец, эталонная клетка, эталонная ткань, контрольный образец, контрольная клетка или контрольная ткань является отдельным образцом или объединенными множественными образцами от одного объекта или индивидуума, которые получают в один или несколько отличных моментов времени, по сравнению с получением тестового образца. Например, эталонный образец, эталонную клетку, эталонную ткань, контрольный образец, контрольную клетку или контрольную ткань получают в более ранний момент времени от того же объекта или индивидуума по сравнению с получением тестового образца. Такой эталонный образец, эталонную клетку, эталонную ткань, контрольный образец, контрольную клетку или контрольную ткань могут быть пригодны, если эталонный образец получен при первичном диагнозе злокачественной опухоли, а тестовый образец получен позже, когда злокачественная опухоль становится метастатической.
Согласно определенным вариантам осуществления эталонный образец, эталонная клетка, эталонная ткань, контрольный образец, контрольная клетка или контрольная ткань являются объединенными множественными образцами от одного или нескольких здоровых индивидуумов, которые не являются объектами или индивидуумами. Согласно определенным вариантам осуществления эталонный образец, эталонная клетка, эталонная ткань, контрольный образец, контрольная клетка или контрольная ткань являются объединенными множественными образцами от одного или нескольких индивидуумов с заболеванием или нарушением (например, злокачественной опухолью), которые не являются объектом или индивидуумом. Согласно определенным вариантам осуществления эталонный образец, эталонная клетка, эталонная ткань, контрольный образец, контрольная клетка, или контрольная ткань являются объединенными в пул образцами РНК из образцов нормальных тканей или объединенными в пул образцами плазмы крови или сыворотки крови от одного или нескольких индивидуумов, которые не являются объектом или индивидуумом. Согласно определенным вариантам осуществления эталонный образец, эталонная клетка, эталонная ткань, контрольный образец, контрольная клетка или контрольная ткань являются объединенными в пул образцами РНК из опухолевых тканей или объединенными в пул образцами плазмы крови или сыворотки крови от одного или нескольких индивидуумов с заболеванием или нарушением (например, злокачественной опухолью), которые не являются объектом или индивидуумом.
В способах по настоящему изобретению образцами ткани могут быть жидкости организма или выделения, такие как кровь, моча, слюна, кал, плевральная жидкость, лимфатическая жидкость, мокрота, перитонеальный выпот, секрет простаты, цереброспинальная жидкость (CSF) или любая другая отделяемая из организма жидкость или ее производное. Под кровью подразумевают цельную кровь, плазму крови, сыворотку крови или любое производное крови. Оценка опухолевых эпителиальных или мезенхимальных биомаркеров в таких жидкостях или выделениях организма может иногда быть предпочтительным в условиях, когда инвазивный способ отбора проб является нецелесообразным или затруднительным.
В способах по настоящему изобретению опухолевая клетка может быть клеткой злокачественной опухоли легких (например, немелкоклеточной злокачественной опухоли легкого (NSCLC)), клеткой злокачественной опухоли поджелудочной железы, клеткой злокачественной опухоли молочной железы, клеткой злокачественной опухоли шеи и головы, клеткой злокачественной опухоли желудка, клеткой злокачественной опухоли толстой кишки, клеткой злокачественной опухоли яичника или опухолевой клеткой из любого из ряда других злокачественных опухолей, которые описаны в настоящем документе ниже. Опухолевая клетка предпочтительно относится к типу, в отношении которого известно или ожидается, что он экспрессирует EGFR, как и все опухолевые клетки солидных опухолей. Киназа EGFR может быть дикого типа или мутантной формой.
В способах по настоящему изобретению опухоль может быть злокачественной опухолью легких (например, немелкоклеточной злокачественной опухолью легкого (NSCLC)), злокачественной опухолью поджелудочной железы, злокачественной опухолью молочной железы, злокачественной опухолью шеи и головы, злокачественной опухолью желудка, злокачественной опухолью толстой кишки, злокачественной опухолью яичника или опухолью из любого рода других злокачественных опухолей, которые описаны в настоящем документе ниже. Опухолевая клетка предпочтительно относится типу, в отношении чьих клеток известно или ожидается, что они экспрессируют EGFR, как и все солидные опухоли. EGFR может быть дикого типа или мутантной формой.
Ингибиторы и фармацевтические композиции
Подходящие для применения по настоящему изобретению иллюстративные ингибиторы киназы EGFR включают, например хиназолиновые ингибиторы киназы EGFR, пиридо-пиримидиновые ингибиторы киназы EGFR, пиримидо-пиримидиновые ингибиторы киназы EGFR, пирроло-пиримидиновые ингибиторы киназы EGFR, пиразоло-пиримидиновые ингибиторы киназы EGFR, фениламино-пиримидиновые ингибиторы киназы EGFR, оксиндольные ингибиторы киназы EGFR, индолокарбазольные ингибиторы киназы EGFR, фталазиновые ингибиторы киназы EGFR, изофлавоновые ингибиторы киназы EGFR, хиналоновые ингибиторы киназы EGFR и тирфостиновые ингибиторы киназы EGFR, как, например, те, которые описаны в приведенных далее патентных публикациях, и все фармацевтически приемлемые соли и сольваты ингибиторов киназы EGFR: международные патентные публикации №№ WO 96/33980, WO 96/30347, WO 97/30034, WO 97/30044, WO 97/38994, WO 97/49688, WO 98/02434, WO 97/38983, WO 95/19774, WO 95/19970, WO 97/13771, WO 98/02437, WO 98/02438, WO 97/32881, WO 98/33798, WO 97/32880, WO 97/3288, WO 97/02266, WO 97/27199, WO 98/07726, WO 97/34895, WO 96/31510, WO 98/14449, WO 98/14450, WO 98/14451, WO 95/09847, WO 97/19065, WO 98/17662, WO 99/35146, WO 99/35132, WO 99/07701 и WO 92/20642; европейские патентные публикации №№ EP 520722, EP 566226, EP 787772, EP 837063 и EP 682027; патентные заявки США №№5747498, 5789427, 5650415 и 5656643; и заявка на патент Германии № DE 19629652. Дополнительными неограничивающими примерами низкомолекулярных ингибиторов киназы EGFR включают любые из ингибиторов киназы EGFR, описанные в работе Traxler, P., 1998, Exp. Opin. Ther. Patents 8(12):1599-1625.
Конкретными предпочтительными примерами низкомолекулярных ингибиторов киназы EGFR, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, включают [6,7-бис(2-метоксиэтокси)-4-хиназолин-4-ил]-(3-этинилфенил)амин (также известный как OSI-774, эрлотиниб или TARCEVA™ (эрлотиниб HCl); OSI Pharmaceuticals/Genentech/Roche) (патент США №5747498; международная патентная заявка № WO 01/34574 и Moyer, J.D. et al. (1997) Cancer Res. 57:4838-4848); CI-1033 (ранее известное как PD 183805; Pfizer) (Sherwood et al., 1999, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 40:723); PD-158780 (Pfizer); AG-1478 (Университет Калифорнии (University of California)); CGP-59326 (Novartis); PKI-166 (Novartis); EKB-569 (Wyeth); GW-2016 (также известный как GW-572016 или лапатиниб дитозилат; GSK); и гефитиниб (также известный как ZD1839 или IRESSA™; Astrazeneca) (Woodbum et al., 1997, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 38:633). Особенно предпочтительным низкомолекулярным ингибитором киназы EGFR, который можно применить в соответствии с настоящим изобретением, является [[6,7-бис(2-метоксиэтокси)-4-хиназолин-4-ил]-(3-этинилфенил)амин (т.е. эрлотиниб), его гидрохлоридная соль (т.е. эрлотиниб HCl, TARCEVA™) или другие солевые формы (например, эрлотиниба мезилат).
Ингибиторы киназы EGFR на основе антитела включают любое антитело или фрагмент антитела к EGFR, который может частично или полностью блокировать активацию EGFR посредством его естественного лиганда. Неограничивающие примеры ингибиторов киназы EGFR на основе антител включают описанные в работе Modjtahedi, H., et al., 1993, Br. J. Cancer 67:247-253; Teramoto, T., et al., 1996, Cancer 77:639-645; Goldstein et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1:1311-1318; Huang, S.M., et al., 1999, Cancer Res. 15:59(8):1935-40; и Yang, X., et al., 1999, Cancer Res. 59:1236-1243. Так, ингибитор киназы EGFR может представлять собой моноклональное антитело Mab E7.6.3 (Yang, X.D. et al. (1999) Cancer Res. 59:1236-43), или Mab C225 (номер доступа АТСС HB-8508), или антитело, или фрагмент антитела, обладающий его специфичностью связывания. Подходящие ингибиторы киназы EGFR в виде моноклональных антител включают без ограничения IMC-C225 (также известный как цетуксимаб или ERBITUX™; Imclone Systems), ABX-EGF (Abgenix), EMD 72000 (Merck KgaA, Дармштадт), RH3 (York Medical Bioscience Inc.) и MDX-447 (Medarex/Merck KgaA).
Ряд ингибиторов HER2 хорошо известны в данной области. Такие ингибиторы включают антитела к HER2. Такие антитела предпочтительно являются моноклональными антителами. Они могут быть либо так называемыми химерными антителами, либо гуманизированными антителами, либо полностью человеческими антителами. Примеры гуманизированных антител к HER2 известны под INN-названиями трастузумаб и пертузумаб Трастузумаб продается компанией Genentech Inc. и F. Hoffmann-La Roche Ltd под торговым названием HERCEPTIN. Трастузумаб является антителом, которое имеет антиген-связывающие остатки, или производные из них, мышиного антитела 4D5 (АТСС CRL 10463, депонированное в Американскую коллекцию типовых культур, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852, согласно Будапештскому договору от 24 мая 1990 года). Иллюстративные гуманизированные антитела 4D5 включают huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 и huMAb4D5-8 (HERCEPTIN), как приведено в US 5821337.
Другим подходящим антителом к HER2 является трастузумаб-MCC-DM1 (T-DM1), конъюгат антитело-лекарственное средство (CAS, per. №139504-50-0), который имеет структуру:
где Tr представляет собой трастузумаб, связанный посредством линкерной части MCC с лекарственной частью майтансиноид, DM1 (US 5208020, US 6441163). Соотношение лекарственное средство к антителу или груз лекарственного средства показаны с помощью р в указанной выше структуре трастузумаб-MCC-DM1, и варьирует в целочисленных значениях от 1 до приблизительно 8. Значение р груза лекарственного средства составляет 1-8. Трастузумаб-MCC-DM1 включает все смеси различно нагруженных и связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство, причем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 лекарственных частей ковалентно связаны с антителом трастузумаб (US 7097840, US 2005/0276812, US 2005/0166993).
Другие антитела к HER2 с различными свойствами описаны в Tagliabue et al., Int. J. Cancer, 47:933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogene, 4:543-548 (1989); Cancer Res., 51:5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis, 3:350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA), 88:8691-8695 (1991); Bacus et al. Cancer Research, 52:2580-2589 (1992); Xu et al., Int. J. Cancer, 53:401-408 (1993); WO 94/00136; Kasprzyk et al., Cancer Research, 52:2771-2776 (1992); Hancock et al., Cancer Res., 51:4575-4580 (1991); Shawver et al., Cancer Res., 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al., Cancer Res., 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol. Chem., 267:15160-15167 (1992); патент США №5783186 и Klapper et al., Oncogene, 14:2099-2109 (1997). Дополнительные подробности об антигене HER2 и направленных на него антителах описаны в многочисленных патентных и непатентных публикациях (подходящий обзор см. в патенте США №5821337 и WO 2006/044908).
Способы по настоящему изобретению могут распространяться на соединения, которые ингибируют EGFR и дополнительную цель. Такие соединения называют в настоящем документе "биспецифичными ингибиторами". Согласно одному варианту осуществления биспецифичным ингибитором является ингибитор HER3/EGFR, EGFR/HER2, EGFR/HER4 или EGFR c-Met. Согласно одному варианту осуществления биспецифичным ингибитором является биспецифичное антитело. Согласно одному варианту осуществления биспецифичным ингибитором является биспецифичное антитело, которое содержит антиген-связывающий домен, который специфично связывается с EGFR и второй целью. Согласно одному варианту осуществления биспецифичным ингибитором является биспецифичное антитело, которое содержит антиген-связывающий домен, который специфично связывается с HER3 и EGFR. Согласно одному варианту осуществления биспецифичный ингибитор HER3/EGFR является биспецифичным антителом, которое содержит два идентичных антиген-связывающих домена. Такие антитела описаны в US 8193321, 20080069820, WO 2010108127, US 20100255010 и Schaefer et al. Cancer Cell, 20:472-486 (2011). Согласно одному варианту осуществления биспецифичным HER2/EGFR является лапатиниб/GW572016.
Дополнительные ингибиторы на основе антител можно получить в соответствии с известными способами посредством введения соответствующего антигена или эпитопа животному-хозяину, выбранному, например, среди прочих, из свиней, коров, лошадей, кроликов, коз, овец и мышей. Для увеличения выработки антител можно применять различные известные в данной области адъюванты.
Хотя пригодные при практическом осуществлении настоящего изобретения антитела могут быть поликлональными, моноклональные антитела являются предпочтительными. Моноклональные антитела можно приготовить и выделить при помощи любого метода, который включает получение молекул антител с помощью стабильной клеточной линии в культуре. Методы получения и выделения включают без ограничения метод с использованием гибридомы, изначально описанный в работе Kohler и Milstein (Nature, 1975, 256:495-497); метод с использованием B-клеточной гибридомы (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cote et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:2026-2030) и метод с использованием EBV-гибридомы (Cole et al, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).
Альтернативно, описанные для получения одноцепочечных антител методы (см., например, патент США №4946778) можно адаптировать для получения одноцепочечных антител с необходимой специфичностью. Ингибиторы на основе антител, пригодные при осуществлении на практике по настоящему изобретению, также включают фрагменты антител, включая без ограничения фрагменты F(ab').sub.2, которые можно получить посредством расщепления пепсином интактной молекулы антитела, и фрагменты Fab, которые можно получить посредством уменьшения количество дисульфидных мостиков у фрагментов F(ab').sub.2. Альтернативно, можно создать библиотеки экспрессии Fab и/или scFv (см., например, Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281), чтобы сделать возможной быструю идентификацию фрагментов с необходимой специфичностью.
Методы получения и выделения моноклональных антител и фрагментов антител хорошо известны в данной области и описаны у Hariow и Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory и у J.W. Goding, 1986, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, London. Гуманизированные антитела к EGFR и фрагменты антител можно также получить согласно известным методам, например, описанным в работе Vaughn, T.J. et al., 1998, Nature Biotech. 16:535-539 и в источниках, на которые приведены ссылки, и такие антитела или их фрагменты также пригодны при осуществлении на практике настоящего изобретения.
Ингибиторы для применения согласно настоящему изобретению альтернативно в своей основе могут нести конструкты антисмысловых олигонуклеотидов. Антисмысловые олигонуклеотиды, в том числе антисмысловые молекулы РНК и антисмысловые молекулы ДНК, будут действовать так, чтобы непосредственно блокировать трансляцию целевой мРНК путем ее связывания и, таким образом, предотвращения трансляции белка, или повышения разрушения мРНК, таким образом, понижая уровень целевого белка и, таким образом, активности клетки. Например, можно синтезировать антисмысловые олигонуклеотиды, которые состоят из по меньшей мере приблизительно 15 оснований и комплементарны уникальным участкам транскрибированной мРНК-последовательности, кодирующей EGFR или HER2, например, путем традиционных методов с созданием фосфодиэфирных связей, и ввести, например, с помощью внутривенной инъекции или инфузии. Из уровня техники хорошо известны способы применения методов с использованием антисмысловых последовательностей в отношении специфического ингибирования генной экспрессии генов, чья последовательность известна (например, смотри патенты США 6566135, 6566131, 6365354, 6410323, 6107091, 6046321 и 5981732).
Малые ингибиторные РНК (siRNA) также могут функционировать в качестве ингибиторов для применения согласно настоящему изобретению. Экспрессию целевого гена можно уменьшить путем осуществления контакта опухоли, объекта или клетки с малой двухцепочечной РНК (dsRNA) или вектором или конструктом, обуславливающим продукцию малой двухцепочечной РНК, так, чтобы специфично ингибировать экспрессию целевого гена (т.е. РНК-интерференция или RNAi). Способы выбора соответствующей dsRNA или dsRNA-кодирующего вектора хорошо известны из уровня техники в отношении генов, чья последовательность известна (например, смотри работу Tuschi, T., et al. (1999) Genes Dev. 13(24):3191-3197; Elbashir, S.M. et al. (2001) Nature 411:494-498; Hannon, G.J. (2002) Nature 418:244-251; McManus, M.T. and Sharp, P.A. (2002) Nature Reviews Genetics 3:737-747; Bremmelkamp, T.R. et al. (2002) Science 296:550-553; патенты США №6573099 и №6506559 и международные патентные публикации №№ WO 01/36646, WO 99/32619 и WO 01/68836).
Рибозимы также могут функционировать в качестве ингибиторов для применения согласно настоящему изобретению. Рибозимы представляют собой ферментативные молекулы РНК, которые могут катализировать специфическое расщепление РНК. Механизм действие рибозимов включает специфическую гибридизацию последовательностей гибозимных молекул с комплементарной целевой РНК с последующим эндонуклеотидным расщеплением. Сконструированные молекулы рибозимов со шпилькообразными или молоткообразными мотивами, которые специфично и эффективно катализируют эндонуклеотидное расщепление последовательностей мРНК, таким образом, входят в объем настоящего изобретения. Конкретные сайты рибозимного расщепления в любой потенциальной РНК-мишени изначально выявляют путем сканирования целевой молекулы в отношении сайтов рибозимного расщепления, которые, как правило, включают следующие последовательности: GUA, GUU и GUC. После выявления короткие последовательности РНК длиной от приблизительно 15 до 20 рибонуклеотидов, соответствующие участку целевого гена, содержащего сайт расщепления, можно оценить в отношении ожидаемых структурных особенностей, таких как вторичная структура, которые могут сделать олигонуклеотидную последовательность непригодной. Пригодность вероятных целей можно оценить путем тестирования их доступности для гибридизации с комплементарными олигонуклеотидами с помощью, например, анализов с помощью защиты от действия рибонуклеаз.
Пригодные в качестве ингибиторов как антисмысловые олигонуклеотиды, так и рибозимы можно получить с помощью известных способов. Эти способы включают методы химического синтеза, как, например, с помощью твердофазного химического синтеза с применением фосфорамидатов. Альтернативно, антисмысловые молекулы РНК можно создать с помощью in vitro или in vivo транскрипции последовательностей ДНК, кодирующих молекулу РНК. Такие последовательности ДНК можно встроить в широкий спектр векторов, которые несут в себе встроенные пригодные РНК-полимеразные промоторы, такие как полимеразные промоторы T7 или SP6. Различные модификации олигонуклеотидов по настоящему изобретению можно ввести в качестве средств повышения внутриклеточной стабильности и времени полужизни. Возможные модификации включают без ограничения добавление фланкирующих последовательностей рибонуклеотидов или дезоксирибонуклеотидов к 5' и/или 3' концам молекулы или использование в олигонуклеотидном остове фосфотиоатных или 2'-O-метильных вместо фосфодиэстеразных связей.
В контексте способов лечения по настоящему изобретению ингибиторы (такие как ингибитор EGFR или ингибитор HER2) применяют в качестве композиции, содержащей в составе фармацевтически приемлемый носитель и нетоксичное терапевтически эффективное количество соединения, являющегося киназным ингибитором EGFR (в том числе его фармацевтически приемлемые соли).
Термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к солям, полученным из фармацевтически приемлемых нетоксичных оснований или кислот. Если соединение по настоящему изобретению является кислым, то его соответствующую соль можно легко получить из фармацевтически приемлемых нетоксичных оснований, в том числе неорганических оснований и органических оснований. Полученные из таких неорганических оснований соли включают соли алюминия, аммония, кальция, меди (двухвалентной и одновалентной меди), трехвалентного железа, двухвалентного железа, лития, магния, марганца (трехвалентного и двухвалентного марганца), калия, натрия, цинка и др. Особенно предпочтительными являются соли аммония, кальция, магния, калия и натрия. Полученные из фармацевтически приемлемых органических нетоксичных оснований соли включают соли первичных, вторичных и третичных аминов, а также циклических аминов и замещенных аминов, таких как встречающиеся в природе и синтезированные замещенные амины. Другие фармацевтически приемлемые органические нетоксичные основания, из которых можно получить соли, включают ионообменные смолы, такие как, например, аргинин, бетаин, кофеин, холин, N',N'-дибензилэтилендиамин, диэтиламин, 2-диэтиламиноэтанол, 2-диметиламиноэтанол, этаноламин, этилендиамин, N-этилморфолин, N-этилпиперидин, глюкамин, глюкозамин, гистидин, гидрабамин, изопропиламин, лизин, метилглюкамин, морфолин, пиперазин, пиперидин, полиаминовые смолы, прокаин, пурины, теобромин, триэтиламин, триметиламин, трипропиламин, трометамин и т.п.
Если используемое по настоящему изобретению соединение является основным, то его соответствующую соль можно легко получить из фармацевтически приемлемых нетоксичных кислот, в том числе неорганических и органических кислот. Такие кислоты включают, например, уксусную, бензолсульфоновую, бензойную, камфорсульфоновую, лимонную, этансульфоновую, фумаровую, глюконовую, глутаминовую, бромистоводородную, соляную, изэтиновую, молочную, малеиновую, яблочную, миндальную, метансульфоновую, муциновую, азотную, памовую, пантотеновую, фосфорную, янтарную, серную, винную, п-толуолсульфоную кислоту и др. Особенно предпочтительными являются лимонная, бромистоводородная, соляная, малеиновая, фосфорная, серная и винная кислоты.
Используемые согласно настоящему изобретению фармацевтические композиции, содержащие ингибиторное соединение (включая его фармацевтически приемлемые соли) в качестве активного ингредиента, могут включать фармацевтически приемлемый носитель и необязательно другие терапевтические ингредиенты или вспомогательные вещества. Другие терапевтические средства могут включать такие цитотоксические, химиотерапевтические или противораковые средства или средства, усиливающие эффекты таких средств, которые перечислены выше. Композиции включают композиции, подходящие для перорального, ректального введения, местного применения и парентерального (включая подкожное, внутримышечное и внутривенное) введения, хотя наиболее подходящий путь в любом данном случае будет зависеть от конкретного хозяина и природы и тяжести состояний, из-за которых вводят активный ингредиент. Фармацевтические композиции традиционно могут быть представлены в стандартной лекарственной форме, и их можно получить с помощью любых хорошо известных в области фармации способов.
На практике, ингибиторные соединения (в том числе их фармацевтически приемлемые соли) по настоящему изобретению можно объединить в качестве активного ингредиента в однородной смеси с фармацевтическим носителем в соответствии с общепринятыми фармацевтическими методами приготовления лекарственных средств. Носитель может принимать широкий спектр форм в зависимости от формы препарата, необходимого для введения, например, перорального или парентерального (в том числе внутривенного). Таким образом, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть представлены в виде дискретных элементов для перорального введения, таких как капсулы, крахмальные облатки или таблетки, каждая из которых содержит предопределенное количество активного ингредиента. Дополнительно, композиции могут быть представлены в виде порошка, в виде гранул, в виде раствора, в виде суспензии в водной жидкости, в виде неводной жидкости, в виде эмульсии по типу масло-в-воде или в виде эмульсии по типу вода-в-масле. Помимо изложенных выше традиционных лекарственных форм ингибиторное соединение (в том числе его фармацевтически приемлемые соли каждого компонента) можно также вводить с помощью средств контролируемого высвобождения и/или устройств доставки. Комбинированные композиции можно получить с помощью любого из фармацевтических способов. В целом, такие способы включают этап приведения в ассоциацию активных ингредиентов с носителем, который представляет собой один или несколько необходимых ингредиентов. В целом, композиции получают путем однородного и тщательного смешивания активного ингредиента с жидкими носителями, или мелко измельченными твердыми носителями, или и теми, и другими. Затем продукт можно традиционно сформовать в необходимую форму.
Применяемое согласно настоящему изобретению ингибиторное соединение (в том числе его фармацевтически приемлемые соли) также можно включить в фармацевтические композиции в сочетании с одним или несколькими другими терапевтически активными соединениями. Другие терапевтически активные соединения могут включать такие цитотоксические, химиотерапевтические или противораковые средства или средства, усиливающие эффекты таких средств, которые перечислены выше.
Таким образом, согласно одному варианту осуществления по настоящему изобретению фармацевтическая композиция может включать ингибиторное соединение в сочетании с противораковым средством, причем противораковое средство представляет собой член, выбранный из группы, состоящей из алкилирующих лекарственных средств, антиметаболитов, ингибиторов образования микротрубочек, подофиллотоксинов, антибиотиков, нитрозомочевин, гормональных терапевтических средств, ингибиторов киназы, активаторов апоптоза опухолевых клеток и антиангиогенных средств.
Используемым фармацевтическим носителем может быть, например, твердое вещество, жидкость или газ. Примеры твердых носителей включают лактозу, сульфат кальция, сахарозу, тальк, желатин, агар, пектин, гуммиарабик, старат магния и стеариновую кислоту. Примерами жидких носителей являются сахарный сироп, арахисовое масло, оливковое масло и вода. Примеры газообразных носителей включают диоксид углерода и азот.
При получении композиций для пероральной лекарственной формы можно использовать любую удобную фармацевтическую среду. Например, воду, гликоли, масла, спирты, ароматизаторы, консерванты, красители и др. можно применять для получения пероральных жидких препаратов, таких как суспензии, крепкие настои и растворы, в то время как такие носители, как крахмалы, сахара, микрокристаллическая целлюлоза, разбавители, способствующие гранулированию средства, смазочные средства, вяжущие средства, средства для улучшения распадаемости таблеток и др. можно применять для получения твердых препаратов, такие как порошки, капсулы и таблетки. По причине их легкости введения таблетки капсулы являются предпочтительными пероральными единицами дозирования, при этом используют твердые фармацевтические носители. Необязательно, на таблетки можно нанести покрытие с помощью стандартных методов нанесения водных и неводных покрытий.
Таблетку, содержащую применяемую для настоящего изобретения композицию, можно получить путем спрессовывания или формования необязательно с одним или несколькими добавочными ингредиентами или вспомогательными веществами. Прессованные таблетки можно получить путем спрессовывания в подходящем устройстве активного ингредиента в свободнотекучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанного с вяжущим средством, смазочным средством, инертным разбавителем, поверхностно-активным средством или диспергатором. Сформованные таблетки можно получить путем формования в подходящем устройстве смеси порошкообразоного соединения, смоченного инертным жидким разбавителем. Каждая таблетка предпочтительно содержит от приблизительно 0,05 мг до приблизительно 5 г активного ингредиента, а каждая крахмальная облатка или капсула предпочтительно содержит от приблизительно 0,05 мг до приблизительно 5 г активного ингредиента.
Например, предназначенный для перорального введения людям состав может содержать от приблизительно 0,5 мг до приблизительно 5 г активного средства, составленного с соответствующим и подходящим количеством материала-носителя, которое может варьировать от приблизительно 5 до приблизительно 95 процентов от общей композиции. Стандартные лекарственные формы обычно будут содержать от приблизительно 1 мг до приблизительно 2 г активного ингредиента, как правило, 25 мг, 50 мг, 100 мг, 200 мг, 300 мг, 400 мг, 500 мг, 600 мг, 800 мг или 1000 мг.
Применяемые согласно настоящему изобретению фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения, можно получить в виде растворов или суспензий активных соединений в воде. Можно включить подходящее поверхностно-активное вещество, такое как, например, гидроксипропилцеллюлоза. Дисперсии также можно приготовить в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях в маслах. Дополнительно, для предупреждения роста вредных микроорганизмов можно включить консервант.
Применяемые согласно настоящему изобретению фармацевтические композиции, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы или дисперсии. Кроме того, композиции могут быть представлены в форме стерильных порошков для экстемпорального препарата таких стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Во всех случаях конечная инъекционная форма должна быть стерильной и должна быть фактически жидкой для легкой проходимости через иглу. Фармацевтические композиции должны быть стабильными в условиях производства и хранения, таким образом, предпочтительно должны быть защищены от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носителем может быть среда-растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль), растительные масла и их пригодные смеси.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть в пригодной для местного применения форме, такой как, например, аэрозоль, крем, мазь, лосьон, присыпка или др. Дополнительно, композиции могут быть представлены в форме, пригодной для применения в трансдермальных устройствах. Эти составы можно получить с использованием ингибиторного соединения (в том числе его фармацевтически приемлемых солей) посредством традиционных технологических способов. Например, крем или мазь готовят путем смешивания гидрофильного материала и воды вместе с приблизительно от 5 вес.% до приблизительно 10 вес.% соединения с получением крема или мази с необходимой консистенцией.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть представлены в форме, пригодной для ректального введения, причем носителем является твердое вещество. Предпочтительно, чтобы смесь была сформирована в суппозитории с однократной дозой. Пригодные носители включают какао-масло и другие материалы, традиционно применяемые в данной области техники. Суппозитории традиционно можно сформировать путем сначала смешивания композиции с размягченным или расплавленным носителем (носителями) с последующим резким охлаждением и формовкой в формах.
Помимо вышеупомянутых ингредиентов-носителей описанные выше фармацевтические составы могут включать, в соответствующих случаях, один или несколько дополнительных ингредиентов-носителей, таких как разбавители, буферы, ароматизаторы, вяжущие средства, поверхностно-активные средства, загустители, смазочные средства, консерванты (в том числе антиоксиданты) и др. Кроме того, можно включить другие вспомогательные вещества для того, чтобы сделать состав изотоническим с кровью предполагаемого реципиента. Содержащие ингибиторное соединение (в том числе его фармацевтически приемлемые соли) композиции можно приготовить в форме порошка или жидкого концентрата.
Уровни дозировки соединений, применяемые при практическом осуществлении настоящего изобретения, будут приблизительно такими, которые описаны в настоящем документе, или такими, которые описаны в данной области для этих соединений. Тем не менее, понятно, что конкретный уровень дозы для любого отдельного больного будет зависеть от ряда факторов, включая возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол, питание, время введения, путь введения, скорость выведения из организма, комбинации лекарственных средств и тяжести конкретного подвергаемого терапии заболевания.
При практическом осуществлении настоящего изобретения отдельно описанные в настоящем документе способы можно заменить на многие известные в данной области альтернативные экспериментальные способы, как, например, описанные в отличных руководствах и пособиях, доступных в областях техники, имеющих отношение к настоящему изобретению (например, Using Antibodies, A Laboratory Manual, edited by Harlow, E. and Lane, D., 1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (e.g. ISBN 0-87969-544-7); Roe B.A. et. al. 1996, DNA Isolation and Sequencing (Essential Techniques Series), John Wiley & Sons. (например, ISBN 0-471-97324-0); Methods in Enzymology: Chimeric Genes and Proteins", 2000, ed. J. Abelson, M. Simon, S. Emr, J. Thorner. Academic Press; Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001, 3rd Edition, by Joseph Sambrook and Peter MacCallum, (the former Maniatis Cloning manual) (например, ISBN 0-87969-577-3); Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Fred M. Ausubel, et. al. John Wiley & Sons (например, ISBN 0-471-50338-X); Current Protocols in Protein Science, Ed. John E. Coligan, John Wiley & Sons (например, ISBN 0-471-11184-8); и Methods in Enzymology: Guide to protein Purification, 1990, Vol. 182, Ed. Deutscher, M.P., Acedemic Press, Inc. (например, ISBN 0-12-213585-7)) или описанные на многих университетских и коммерческих вебсайтах, посвященных описанию экспериментальных способов в молекулярной биологии.
Специалисту в областях медицины будет понятно, что конкретный способ введения больному терапевтически эффективного количества описываемого в настоящем документе ингибитора (например, ингибитора киназы EGFR, биспецифичного ингибитора киназы EGFR или ингибитора HER2) после постановки больному диагноза о вероятной восприимчивости к действию ингибитора будет назначен по усмотрению лечащего врача. На способ введения, в том числе дозировку, комбинацию других противораковых средств, периодичность и частоту введения и др. может повлиять диагноз вероятной восприимчивости к действию ингибитора, а также состояние и история болезни больного. Таким образом, даже на больных, которым поставили диагноз опухолей с прогнозом, что они будут относительно нечувствительными к определенному типу ингибитора, лечение таким ингибитором все еще может оказать благоприятный эффект, особенно в сочетании с другими противораковыми средствами или средствами, которые могут изменить чувствительность опухоли к действию ингибитора.
В контексте настоящего изобретения "совместное введение" и "осуществление совместного введения" ингибитора с дополнительным противораковым средством (оба компонента в настоящем документе далее называют "двумя активными средствами") относятся к любому введению двух активных средств либо отдельно, либо вместе, при котором два активных средства вводят как часть соответствующей схемы дозирования, направленной на получение благоприятного эффекта комбинированной терапии. Таким образом, два активных средства можно вводить либо как часть одной фармацевтической композиции, либо в отдельных фармацевтических композициях. До, одновременно или после введения ингибитора, или в некоторой их комбинации, можно ввести дополнительное средство. Если ингибитор вводят больному через повторяющиеся интервалы, например, в ходе стандартного курса лечения, то дополнительное средство можно вводить до, одновременно или после каждого введения ингибитора, или в некоторой их комбинации, или через различные интервалы по отношению к лечению ингибитором, или в виде однократной дозы до, в любое время во время или после курса лечения ингибитором.
Обычно ингибитор будут вводить больному согласно схеме дозировки, которая включает наиболее эффективное лечение злокачественной опухоли (с точки зрения как эффективности, так и безопасности), от которой лечат больного, как известно из уровня техники и раскрыто, например, в международной патентной публикации № WO 01/34574. При осуществлении способа лечения по настоящему изобретению ингибитор можно вводить/применять любым известным из уровня техники эффективным способом, таким как пероральный, местный, внутривенный, интраперитонеальный, внутримышечный, внутрисуставной, подкожный, интраназальный, внутриглазной, вагинальный, ректальный или внутрикожный пути, в зависимости от подвергаемого лечению типа злокачественной опухоли, применяемого типа ингибитора (например, небольшая молекула, антитело, RNAi, рибозим или антисмысловой конструкт) и медицинского заключения лечащего врача, которое основано, например, на результатах опубликованных клинических исследований.
Количество вводимого ингибитора и периодичность введения ингибитора будет зависеть от типа (вида, пола, возраста, массы и т.д.) и состояния подвергаемого лечению больного, тяжести подвергаемого лечению заболевания или состояния и от пути введения. Например, ингибиторы по типу небольших молекул можно вводить больному в дозах, варьирующих от 0,001 до 100 мг/кг массы тела в день или в неделю за однократную или раздельные дозы или путем непрерывной инфузии (см., например, международную патентную публикацию № WO 01/34574). В частности, эрлотиниб HCl можно вводить больному в дозах, варьирующих от 5 до 200 мг в день или 100-1600 мг в неделю за однократную или раздельные дозы или путем непрерывной инфузии. Предпочтительная доза составляет 150 мг/день. Ингибиторы на основе антител или антисмысловые, RNAi или рибозимные конструкты можно вводить больному в дозах, варьирующих от 0,1 до 100 мг/кг массы тела в день или в неделю за однократную или раздельные дозы или путем непрерывной инфузии. В некоторых случаях уровни дозировки ниже нижнего предела вышеуказанного диапазона могут быть более приемлемыми, в то время как в других случаях можно использовать еще большие дозы, не вызывая вредный побочный эффект, при условии, что такие большие дозы сначала делят на несколько небольших доз для введения в течение дня.
Ингибиторы и другие дополнительные средства можно вводить либо отдельно, либо совместно одним и тем же или различными путями и в широком спектре различных лекарственных форм. Например, ингибитор предпочтительно вводят перорально или парентерально. Если ингибитором является эрлотиниб HCl (TARCEVA™), то предпочтительно пероральное введение. Как ингибитор, так и другие дополнительные средства можно вводить в однократных или множественных дозах.
Ингибитор можно вводить с различными фармацевтически приемлемыми инертными носителями в форме таблеток, капсул, пастилок для рассасывания, пастилок, леденцов, порошков, спреев, кремов, бальзамов, суппозиториев, желе, гелей, паст, лосьонов, мазей, крепких настоев, сиропов и т.п. Введение таких лекарственных форм можно осуществлять за однократную дозу или множество доз. Носители включают твердые разбавители или наполнители, стерильные водные среды и различные нетоксичные органические растворители и т.д. Пероральные фармацевтические композиции можно соответственно подсластить и/или ароматизировать.
Ингибитор можно объединить вместе с различными фармацевтически приемлемыми инертными носителями в форме спреев, кремов, бальзамов, суппозиториев, желе, гелей, паст, лосьонов, мазей и т.п. Введение таких лекарственных форм можно осуществлять за однократную дозу или множество доз. Носители включают твердые разбавители или наполнители, стерильные водные среды и различные нетоксичные органические растворители и др.
Все содержащие белковые ингибиторы составы следует выбирать так, чтобы избегать денатурации и/или распада и утраты биологической активности ингибитора.
th
Способы получения содержащих ингибитор фармацевтических композиций известны из уровня техники и описаны, например, в международной патентной публикации № WO 01/34574. В свете идеи настоящего изобретения, способы получения содержащих ингибитор фармацевтических композиций будут понятны из вышеупомянутых публикаций и из других известных справочных материалов, таких как Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 18 edition (1990).
Для перорального введения ингибиторов таблетки, содержащие одно или оба активных средства, объединяют с любым из различных формообразующих, таким как, например, микрокристаллическая целлюлоза, цитрат натрия, карбонат кальция, фосфат дикальция и глицин, наряду с различными разрыхлителями, такими как крахмал (и предпочтительно кукурузный, картофельный или маниоковый крахмал), альгиновая кислота и некоторые комплексные силикаты, вместе с вяжущими средствами для гранулирования по типу поливинилпирролидона, сахарозы, желатина и гуммиарабика. Кроме того, для таблетирования зачастую также очень полезны бывают смазывающие средства, такие как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк. Твердые композиции одного типа также можно использовать в качестве наполнителей в желатиновых капсулах, предпочтительные материалы в этой связи также включают лактозу или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли. Если для перорального введения необходимы водные суспензии и/или крепкие настои, то ингибитор можно объединять с различными подсластителями или ароматизаторами, пигментами или красителями и, при необходимости, также с эмульгаторами и/или суспендирующими средствами с такими разбавителями, как вода, этанол, пропиленгликоль, глицерин и различные подобные их комбинации.
Для парентерального введения любого или обоих активных средств можно использовать растворы либо в кунжутном или арахисовом масле, либо в водном пропиленгликоле, а также стерильные водные растворы, содержащие активное средство или его соответствующую водорастворимую соль. Такие стерильные водные растворы предпочтительно являются соответственно буферными, а также предпочтительно сделаны изотоническими, например, посредством достаточного количества солевого раствора или глюкозы. Эти конкретные водные растворы особенно пригодны с целью внутривенных, внутримышечных, подкожных и интраперитонеальных инъекций. Масляные растворы пригодны с целью внутрисуставных, внутримышечных и подкожных инъекций. Получение всех таких растворов в стерильных условиях легко осуществимо с применением хорошо известных специалистам в данной области техники стандартных фармацевтических методов. Любой выбранный для введения белковых ингибиторов парентеральный состав следует выбирать так, чтобы избежать денатурации и утраты биологической активности ингибитора.
Кроме того, возможно местное применение любого или обоих активных средств посредством, например, кремов, лосьонов, желе, гелей, паст, мазей, бальзамов и т.п., согласно стандартной фармацевтической практике. Например, можно приготовить местный состав, содержащий ингибитор в концентрации от приблизительно 0,1% (масса/объем) до приблизительно 5% (масса/объем).
Для ветеринарных целей активные средства можно вводить животным отдельно или совместно с применением любых из описанных выше форм и с помощью любого из описанных выше путей. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления ингибитор вводят в форме капсулы, пилюли, таблетки, жидкой большой дозы, инъекции или в виде имплантата. В качестве альтернативы, ингибитор можно вводить с кормом для животного и с этой целью для нормального корма для животного можно приготовить концентрированную кормовую добавку или премикс. Такие составы готовят общепринятым способом согласно стандартной ветеринарной практике.
Специалист в областях медицины, особенно касающихся применения диагностических тестов и лечения с помощью терапевтических средств, поймут, что биологические системы могут характеризоваться изменчивостью и не всегда могут быть полностью предсказуемы, и, таким образом, многие хорошие диагностические тесты или терапевтические средства иногда оказываются неэффективными. Таким образом, от решения лечащего врача полностью зависит определение наиболее подходящего курса лечения для отдельного больного, основываясь на результатах тестов, состояния и истории болезни больного и его собственном опыте. Могут даже иметь место случаи, например, когда врач выберет лечение больного ингибитором EGFR, даже если по прогнозам опухоль не является особенно чувствительной к действию ингибиторов киназы EGFR, исходя из полученных в результате диагностических тестов данных или из других критериев, особенно если все или большинство из других очевидных вариантов лечения не были успешны или если при получении другого лечения предполагают некоторую синергию. Тот факт, что ингибиторы EGFR в качестве класса лекарственных средств являются относительно хорошо переносимыми по сравнению со многими другими противораковыми лекарственными средствами, такими как более традицонные химитерапевтические или цитотоксические средства, применяемые при лечении злокачественной опухоли, делает их более практичным вариантом.
Способы рекламы
Приведенное в данном документе настоящее изобретение также относится к способу рекламы ингибитора EGFR или FIER2 или фармацевтически приемлемой композиции с ним, включающий продвижение среди целевой аудитории применения ингибитора или фармацевтической композиции с ним для лечения популяции больных некоторым типом злокачественной опухоли, который характеризуется пониженным уровнем метилирования ERBB2.
Реклама обычно представляет собой платную коммуникацию посредством неличных средств коммуникации, в которой указан спонсор и продвигают рекламное обращение. Реклама для указанных в настоящем документе целей включает популяризацию, связи с общественностью, размещение товаров в СМИ, спонсорство, страховку и продвижение продаж. Этот термин также включает финансируемые информационные публичные уведомления, появляющиеся в любом из печатных средств коммуникации, предназначенные для привлечения внимания массовой аудитории для убеждения, информирования, продвижения, мотивирования или иной модификации отношения в сторону благоприятной модели приобретения, поддержки или одобрения приведенного в настоящем документе изобретения.
Рекламу и продвижение приведенного в настоящем документе способа диагностики можно осуществлять с помощью различных средств. Примеры рекламных средств, применяемых для донесения таких рекламных обращений, включают телевидение, радио, фильмы, журналы, газеты, Интернет и рекламные стенды, в том числе рекламные ролики, которые представляют собой рекламные сообщения, появляющиеся в средствах вещания. Рекламные объявления также включают объявления в местах тележек для продуктов, на стенах перехода в аэропорту и по бокам автобусов или прослушиваемые при ожидании по телефону рекламные обращения или системе громкой связи в магазинах, или же визуальную или слуховую информацию можно разместить где угодно.
Более конкретные примеры средств продвижения или рекламы включают телевидение, радио, фильмы, Интернет, такие как Интернет-конференции и интернет-семинары, интерактивные компьютерные сети, предназначенные для одновременного обращения к пользователям, фиксированные или электронные рекламные стенды и другие публичные знаки, плакаты, традиционную или электронную литературу, такую как журналы и газеты, другие средства массовой информации, презентации или индивидуальные контакты с помощью, например, электронной почты, телефона, мгновенного сообщения, почты, курьера, массовой рассылки или курьерской рассылки, личные встречи и т.д.
Тип используемой рекламы будет зависеть от многих факторов, например, характера целевой аудитории, которой необходимо донести сообщение, например, больницы, страховые компании, клиники, доктора, медицинские сестры и больные, а также факторы стоимости и соответствующих попадающих под юрисдикцию законов и норм, которые регулируют рекламу лекарственных препаратов и диагностических средств. Реклама может быть индивидуализирована или специализирована, исходя из характеристик потребителя, определяемых взаимодействием служб и/или другими данными, такими как демографические данные и географическое местоположение потребителя.
Настоящее изобретение будет лучше понятно из приведенных далее примеров. Тем не менее, специалист в данной области техники без труда поймет, что конкретные обсуждаемые способы и результаты являются лишь иллюстрацией настоящего изобретения, которое более полно описано в приведенной после них формуле изобретения, и их не следует рассматривать как ограничивающие ее каким либо образом.
Все раскрытые в настоящем документе патенты, опубликованные заявки на выдачу патента и другие справочные материалы, таким образом, явно включены с помощью ссылки в их полном объеме.
III. Примеры
Пример 1 - Материалы и способы
Линии клеток: Все линии клеток NSCLC приобретали у Американской коллекции типовых культур клеток (АТСС) или получали от Adi Gazdar и John Minna из UT Southwestern. Линии иммортализированных клеток бронхиального эпителия (gBEC) и малых дыхательных путей (gSAC) создавали на базе Genentech с помощью трицистронного вектора, содержавшего cdk4, hTERT и G418 в качестве маркера для отбора. Трицистронный вектор конструировали из основы pQCXIN, содержавшей hTERT. Процесс иммортализации был основан на ранее опубликованных протоколах с некоторой модификацией (Ramirez et al., 2004, Cancer Res 64:9027; Sato et al., 2006, Cancer Res 66:2116). gBEC и gSAC характеризуются диплоидным кариотипом и являются неопухолеродными.
Образцы опухолей: анализы метилирования ДНК проводили на опухолевой ДНК, выделенной из FFPE-материала биопсии, полученного от больных, задействованных в TRIBUTE, испытании III фазы, финансированном при поддержке Genentech, для сравнения выживаемости 1079 NSCLC-больных IIIB стадии или IV стадии, которые получали эрлотиниб, вводимый параллельно со схемой карбоплатина и паклитаксела (n=539), с больными, которые получали только карбоплатин и паклитаксел (n=540) (Yauch et al., 2005, Clin Cancer Res 11:8686). ДНК была доступна от 343 больных TRIBUTE и 112 больных MetMAb.
2
Деметилирование геномной ДНК: клетки для использования в качестве отрицательных контролей в анализах метилирования выращивали в RPMI 1640, дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой и 2 мМ L-глутамином. Клетки высеивали в день 0 в количестве 4000-9000 клеток/см и обрабатывали дозой 1 мкМ 5-аза-2'-деоксицитидина (SIGMA-ALDRICH, кат. № A3656) или DMSO-контролем (кат. № D2650) на 1, 3 и 5 дни. На 6-й день клетки промывали один раз холодным фосфатно-солевым буферным раствором и собирали путем соскребания в тризол (Invitrogen, кат. №15596018) и экстрагировали РНК или мгновенно замораживали для последующей экстракции РНК.
Анализ метилирования Illumina Infinium: 1 мкг геномной ДНК от каждой из 96 линий клеток NSCLC преобразовывали с помощью бисульфита и анализировали на чипе для изучения метилирования Illumina Infinium 450K. Данные по метилированию обрабатывали с помощью программного пакета Bioconductor lumi (Du et al., 2008, Bioinformatics 24:1547). Платформа Infinium 450K включала наборы для анализа Infinium I и II на одном чипе. Набор для анализа Infinium I включает использование двух типов микроносителей на локус CpG, причем о метилированном состоянии сообщается с помощью красного красителя в одних случаях и зеленым красителем в других (идентично предыдущей платформе Infinium 27K). Набор для анализа Infinium II включает применение одного типа микроносителей и всегда сообщает о метилированном состоянии с помощью одного красителя, решая проблему с отклонением цвета. После отбрасывания одного чипа с высоким фоновым сигналом для оставшихся чипов применяли двух-стадийную процедуру нормализации. Во-первых, для каждого чипа строили корректировочную кривую по отклонению цвета из данных Infinium I с помощью способа выравнивания методов квантильной нормализации, эту корректировочную кривую затем применяли для всех данных от этого чипа. Во-вторых, чипы нормализовали друг к другу путем применения стандартной квантильной нормализации ко всем скорректированным по цвету сигналам.
2
После предварительной обработки для каждого образца рассчитывали как M-значения (log соотношения метилированных к неметилированным зондам), так и β-значения метилирования (изменение масштаба M-значений до диапазона 0-1 посредством логарифмического преобразования) (Du et al, 2010, BMC Bioinformatics 11:587). Для визуализации агломерационную иерархическую группировку β-значений проводили с помощью полного сцепления и евклидова расстояния. DMR выявляли путем сначала расчета скользящей средней M-значений для каждой линии клеток (окно 500 п.о., центрированное на исследуемых сайтах CpG), затем определяли критерий Стьюдента для противопоставления баллов в пределах окна, связанных с обучающей выборкой случайно выбранных 10 эпителио-подобных линий и 10 мезенхимально-подобных линий, p-значения DMR корректировали для контроля средней доли ложных отклонений гипотезы (Benjamini and Hochberg, 1995) и сравнивали с порогом 0,01. С целью улучшения в отношении более биологически релевантных явлений в последующих анализах рассматривали только те дифференциально метилированные участки, чьи средние баллы в пределах окна (i) отличались по меньшей мере на 2 между восприимчивой и устойчивой линиями и (ii) имели противоположный знак в двух наборах линий клеток. Наконец, близкие DMR, которые соответствовали всем таким критериям, сливали в единый DMR, если они были разделены менее чем 2 п.о.
Секвенирование и анализ с применением бисульфита: Для подтверждения статуса метилирования ДНК генов-кандидатов 2 мкг геномной ДНК преобразовывали с помощью бисульфита с применения набора EZ DNA Methylation-Gold kit (Zymo Research). Специфичные к преобразованной ДНК праймеры конструировали с применением программного обеспечения Methyl Primer Express, версии 1.0 (Applied Biosystems). ПЦР-амплификацию проводили с 1 мкл преобразованной с помощью бисульфита ДНК в 25-мкл реакционной среды с применением Platinum PCR supermix (Invitrogen). Условия термоциклирования в ходе ПЦР были следующими: 1 цикл начальной денатурации 95°C в течение 10 минут с последующими 10 циклами 94°C в течение 30 секунд, 65°C в течение 1 минуты, и понижая на 1°C каждый цикл, и 72°C в течение 1 минуты с последующими 30 циклами 94°C в течение 30 секунд, 55°C в течение 1,5 минуты и 72°C в течение 1 минуты с последующим конечным удлинением при 72°C в течение 15 минут. ПЦР-продукты разделяли электрофорезом с помощью 2% агарозных E-гелей, содержавших этидия бромид (Invitrogen), и визуализировали с применением камеры FluorChem 8900 (Alpha Innotech).
ПЦР-продукты лигировали в вектор pCR4-TOPO с помощью набора ТОРО TA Cloning kit (Invitrogen) согласно инструкциям производителя. 2 мкл лигированной плазмидной ДНК трансформировали в ТОРЮ компетентных бактерий (Invitrogen) и 100 мкл трансформированных бактерий высеивали на LB-агаровые чашки, содержавшие 50 мкг/мл карбенициллина (Teknova), и инкубировали в течение ночи при 37°C. Двенадцать колоний на линию клеток для каждого локуса-кандидата инокулировали в 1 мл LB, содержавшей 50 мкг/мл карбенициллина, и выращивали в течение ночи в термостате с покачивающим устройством при 37°C. Плазмидную ДНК выделяли с помощью набора Qiaprep miniprep kit в 96-луночном формате (Qiagen) и секвенировали на ДНК-анализаторе 3730х1 DNA Analyzer (Applied Biosystems). Данные по секвенированию анализировали с помощью программного обеспечения Sequencher версии 4.5 и программного обеспечения BiQ Analyzer. Преобразованные с помощью бисульфита последовательности сначала выравнивали и усекали по эталонным последовательностям для каждого локуса-кандидата с помощью Sequencher для оценки качества последовательности и подтверждения преобразования цитозина в ходе обработки бисульфитом натрия. Усеченные последовательности затем оценивали в отношении статуса метилирования в отдельных сайтах CpG с помощью программного обеспечения BiQ Analyzer.
Пиросеквенирование: Специфические к преобразованным бисульфитом последовательностям ПЦР (BSP) праймеры конструировали с помощью программного обеспечения Methyl Primer Express версии 1.0 (Applied Biosystems) или программного обеспечения PyroMark Assay Design версии 2.0 (Qiagen). ПЦР-праймеры синтезировали с 5'-биотиновой меткой либо на прямом, либо на обратном праймере для облегчения связывания ПЦР-продукта со стрептавидин-сефарозными гранулами. Праймеры для секвенирования конструировали в обратном направлении от ПЦР-праймера с 5'-биотиновой меткой с помощью программного обеспечения PyroMark Assay Design версии 2.0 (Qiagen). 1 мкл модифицированной бисульфитом ДНК амплифицировали в 25 мкл реакционной смеси с применением Platinum PCR Supermix (Invitrogen) и 20 мкл ПЦР-продукта использовали для секвенирования на Pyromark Q24 (Qiagen). ПЦР-продукты инкубировали со стрептавидин-сефарозными гранулами в течение 10 минут с последующими промываниями 70% этанолом, раствором для денатурации Pyromark и промывочным буфером Pyromark. Затем денатурированные ПЦР-продукты секвенировали с применением 0,3 мкМ праймера для секвенирования. Пирограммы визуализировали и оценивали на качество последовательности, а процент метилирования в отдельных сайтах CpG определяли с помощью программного обеспечения PyroMark версии 2.0.4 (Qiagen). Приведенные далее праймеры являются иллюстративными праймерами, использованными в анализах с применением пиросеквенирования ERBB2:
Праймеры для пиросеквенирования ERBB2:
1 прямой: 5'-GGTTTAAGTGGGTTAGGTGTG-3' (SEQ ID NO: 3),
1 обратный, биотин: 5'-СААТТАТАААСАТСТАААСССАААСТАСА-3' (SEQ ID NO: 4),
1 для секвенирования: 5'-AGTTTTATGTTTTATGGTTGA-3' (SEQ ID NO: 5),
прямой гнездовой: 5'-TAGTTTTATGTTTTATGGTTGATGGTT-3' (SEQ ID NO: 6),
обратный гнездовой, биотин: 5'-ССААААССААСТААСААААТАТАТАСС-3' (SEQ ID NO: 7),
гнездовой для секвенирования: 5'-TTGGGTAGGTATGTAGG-3' (SEQ ID NO: 8).
Анализ промоторной и энхансерной активности с помощью люциферазы-репортера: Промоторную и энхансерную активность дифференциально метилированного участка (выявленного с помощью анализа профиля, полученного с помощью чипа Infinium) гена ERBB2 оценивали с применением системы для анализа с помощью репортера Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Участок размером 1791 п.о. в первом интроне ERBB2 клонировали в вектор с люциферазой-репортером pGL4 согласно инструкциям производителя. Клетки трансфицировали контрольным промотором плюс предполагаемым энхансерным участком ERBB2 и люциферазную активность измеряли с помощью стандартного люминометра в моменты времени 24, 48 и 72 часа после трансфекции.
Специфичная к участкам метилирования количественная ПЦР: Анализы специфичной к участкам метилирования количественной ПЦР (qMSP) разрабатывали с помощью генетических локусов, выявленных в ходе нашего скрининга кандидатов как дифференциально метилированные у чувствительных и устойчивых к эрлотинибу линий клеток NSCLC. Минимум 10 нг преобразованной посредством бисульфита натрия ДНК амплифицировали с помощью 20X различных специализированных наборов для анализа экспрессии генов Taqman, Applied Biosystems, кат. №.4331348) с применением универсального мастер-микса для ПЦР TaqMan, без AmpErase UNG (Applied Biosystems, кат. №.4324018) с условиями циклирования 95°C 10 мин, затем 50 циклов 95°C в течение 15 секунд и 60°C в течение 1 мин Амплификацию проводили на системе 7900НТ и анализировали с помощью программного обеспечения SDS (Applied Biosystems). Содержание ДНК нормализовали с помощью анализа с применением meRNaseP Taqman.
Предварительная амплификация полученного в результате клинических испытаний FFPE-материала: Разрабатывали способ предварительной амплификации для анализа метилирования количеств ДНК в пг, извлеченных из зафиксированной в формалине и залитой парафином (FFPE) ткани. 2 мкл (эквивалент 10 пг - 1 нг) преобразованной бисульфитом ДНК сначала амплифицировали в 20 мкл реакционной среды с 0,1X концентрациями праймера-зонда qMSP с применением универсиального мастер-микса для ПЦР TaqMan, без AmpErase UNG (Applied Biosystems, кат. №.4324018) и условиями циклирования 95°C 10 мин, затем 14 циклов 95°C в течение 15 секунд и 60°C в течение 1 мин 1 мкл предварительно амплифицированного материала затем амплифицировали в ходе второй реакции ПЦР с условиями циклирования 95°C
10 мин, затем 50 циклов 95°C в течение 15 секунд и 60°C в течение 1 мин Содержание ДНК подтверждали с помощью предварительной амплификации со стандартным анализом с применением meRNaseP Taqman и только образцы, которые были положительными по meRNaseP, включали в последующий анализ реакций qMSP. Все реакции проводили в двух повторностях.
Пример 2 - пониженный уровень метилирования DMR ERBB2 коррелирует с эпителио-подобным фенотипом у линий клеток NSCLC и у первичных опухолей NSCLC
Сайт CpG возле экзона 4 протоонкогена ERBB2 выявляли как дифференциально метилированный участок (DMR) на основании профиля метилирования эпителио- и мезенхимально-подобных линий клеток NSCLC. Построение профиля метилирования проводили с помощью анализа метилирования Infinium, а проверку статуса метилирования осуществляли путем прямого секвенирования клонированных фрагментов преобразованной с помощью бисульфита ДНК.
Пиросеквенирование использовали для определения количественного статуса метилирования DMR у первичных опухолей NSCLC и равноценных нормальных тканях. Количественное метилирование определяли у 6 последовательных сайтов CpG с помощью аналитического программного обеспечения Pyromark с применением уравнения % метилирования = (C высота пика × 100 / C высота пика + T высота пика, фигура 2 (показывающего средний процент метилирования 6 отдельных сайтов CpG с P-значением p<0,06, определенным с помощью критерия Стьюдента). Как показано на фигуре 2, этот внутригенный DMR у ERBB2, по видимому, имеет пониженный уровень метилирования по сравнению с нормальной соседней тканью.
Анализ in silico этого участка с помощью браузера генома UCSC позволял предположить, что дифференциально метилированный сайт CpG, соответствующий зонду cg00459816 (зонд чипа для исследования метилирования Illumina Infinium 450K, II типа, представляющий отдельный сайт CpG в хромосомных координатах: NCBI build 36/hg18 chr17:35115639 (Illumina, Inc., Сан-Диего, Калифорния), перекрывающийся с возможным регуляторным элементом. Поскольку этот участок не находился в пределах CpG-островка и не был особенно богат в отношении GC, то разрабатывали фланкирующие этот участок праймеры для пиросеквенирования для определения его статуса метилирования в панели эпителио-подобных и мезенхимально-подобных линий клеток. Наблюдали паттерн пониженного уровня метилирования (среднее метилирование 6 сайтов CpG≤20%) у 13 из 16 эпителио-подобных линий по сравнению с мезенхимально-подобными линиями (среднее метилирование ≥70% у 20 из 21 мезенхимально-подобных линий, P<0,001). На фигуре 3 показаны результаты такого анализа, причем данные представлены в виде среднего +/- SD процента метилирования у 6 последовательных сайтов CpG в секвенированном участке.
Лишь одна мезенхимально-подобная линия, H1435, имела пониженный уровень метилирования в этом локусе. Такое исключение не было неожиданным с учетом наших предыдущих наблюдений, что по результатам анализа экспрессии EMT H1435 была выявлена как мезенхимально-подобная линия.
Пример 3 - пониженный уровень метилирования DMR ERBB2 коррелирует с экспрессией ERBB2
Относительный уровень экспрессии мРНК ERBB2 у линии клеток NSCLC определяли с помощью анализа генной экспрессии Fluidigm на основе технологии TaqMan. Как показано на фигуре 4, у эпителио-подобных линий наблюдали значительно более высокие уровни экспрессии ERBB2 (P<0,001), чем у мезенхимально-подобных линий. Результаты, что пониженный уровень метилирования у локуса ERBB2 высоко коррелировал как с высокой экспрессией HER2 у линий клеток, так и с эпителиальным фенотипом, указывают на то, что дифференциальное метилирование этого участка может служить в качестве прогностического биомаркера для ингибиторов сигнального пути EGFR или HER2.
Пример 4 - пониженный уровень метилирования DMR ERBB2 коррелирует с чувствительностью к эрлотинибу
50
2
Пониженный уровень метилирования ERBB2 сильно коррелировал с чувствительностью к эрлотинибу in vitro, что указывает на его потенциал в качестве прогностического клинического биомаркера ответа на эрлотиниб. На фигуре 5 показаны результаты анализа пиросеквенирования ERBB2 линии клеток NSCLC, из которых видно, что эта корреляция между пониженным уровнем метилирования ERBB2 и чувствительностью к эрлотинибу. Данные на этой фигуре 5 представлены в виде графика как среднее +/- SD метилирования 6 сайтов CpG относительно чувствительности к эрлотинибу. Для определения IC эрлотиниба клетки высеивали в четырех повторностях в количестве 3×10 клеток на лунку в 384-луночные планшеты в RPMI, содержавшей 0,5% FBS (среда для анализа) и инкубировали в течение ночи. Спустя 24 часа клетки обрабатывали средой анализа, содержавшей 3 нМ TGFα и эрлотиниба в диапазоне доз с конечной концентрации от 10 мкМ до 1 пМ. Спустя 72 часа жизнеспособность клеток измеряли с помощью набора Celltiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega). Приводящую к 50% ингибированию жизнеспособности клеток концентрацию эрлотиниба рассчитывали, исходя из анализа 4-параметрической кривой, и определяли минимум по результатам 2-х экспериментов.
Пример 5 - пониженный уровень метилирования DMR ERBB2 коррелирует с FFPE-образцами ткани с эпителио-подобным фенотипом
Свежезамороженные образцы обычно не получают в ходе диагностики NSCLC или в качестве части клинических испытаний, связанных со злокачественной опухолью легких. Таким образом, для того, чтобы подходить для клинических применений, анализ с применением пиросеквенирования должен включать возможность амплифицировать ограниченное количество расщепленной ДНК из зафиксированной в формалине и залитой парафином (FFPE) ткани (обычно <150 п.о.). В связи с высокой конкордантностью между двумя состояниями метилирования 6 смежных сайтов CpG в DMR ERBB2, полученной с помощью анализа с применением пиросеквенирования 228 - п.о. (фигура 6), анализ перестраивали для изучения только 2 сайтов CpG. В этом анализе пиросеквенирование использовали для определения статуса количественного метилирования DMR у линии клеток NSCLC. Количественное метилирование определяли в 6 последовательных сайтах CpG с помощью аналитического программного обеспечения Pyromark с применением уравнения % метилирования = (С высота пика × 100 / C высота пика + T высота пика). На фигуре 6 показан средний процент метилирования 6 отдельных сайтов CpG с P-значением, составляющим p<0,06, определенным с помощью критерия Стьюдента. Обозначение линий клеток в качестве эпителиальных или мезенхимальных ранее определяли с помощью 20-генной панели для определения генной экспрессии Fluidigm.
Пример 6 - пониженный уровень метилирования DMR ERBB2 коррелирует с эпителио-подобным фенотипом у первичных NSCLC-опухолей.
Статус метилирования ERBB2 затем оценивали у 42 FFPE NSCLC-опухолей поздней стадии развития (стадия IIIb/IV), для которых также были доступны данные по генной экспрессии. Пониженный уровень метилирования энхансера ERBB2 сильно коррелировал с экспрессией HER2 в биопсиях, полученных от больных, на которых впоследствии не оказала эффекта химиотерапия первой линии (P<0,011), в целом повторяя наблюдаемый у линий клеток паттерн (фигура 7). Пониженный уровень метилирования определяли с помощью пиросеквенирования и анализа генной экспрессии Fluidigm на основе технологии TaqMan. Процент метилирования представляли в виде среднего 2 сайтов CpG. Медианную пороговую точку использовали для разделения опухолей с высоким метилированием ERBB2 и низким метилированием ERBB2. P-значение определяли с помощью одностороннего U-критерия Манна-Уитни.
Проводили анализ с применением пиросеквенирования метилирования ERBB2 и эпителиального/мезенхимального статуса у 47 образцов первичных опухолей NSCLC, полученных из архивных срезов FFPE. Статус метилирования ERBB2 определяли с помощью анализа с применением пиросеквенирования. Опухоли, которые классифицировали как эпителио-подобные, имели низкий уровень метилирования в энхансере ERBB2 по сравнению с опухолями, классифицированными как мезенхимально-подобные (P<0,046), что указывало на сильную связь между статусом метилирования ERBB2 и общим фенотипом генной экспрессии, фигура 8 (данные представлены как среднее 2 сайтов CpG. Эпителио-подобный/мезенхимально-подобный статус определяли с помощью показателей, полученных в результате анализа генной экспрессии Fluidigm на основе технологии TaqMan. Медианную пороговую точку использовали для разделения показателей эпителио-подобной/мезенхимально-подобной экспресии. P-значение определяли с помощью критерия Стьюдента).