СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА СОМАТОТРОПИНА В ДРОЖЖАХ Saccharomyces cerevisiae НА ОСНОВЕ ПЛАЗМИДЫ pRS315

1. Промотор гена PRB1 дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
2. Рекомбинантная плазмида pSL-PRB1, обеспечивающая наработку ДНК промотор гена PRB1, возможность перенесения промотора в другие вектора и создание конструкций для экспрессии белков в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, имеющая размер 4,32 т.п.о. и состоящая из следующих элементов:
- BglII-HindIII фрагмент плазмидной ДНК бактериального вектора pSL301 размером 3,02 т.п.о., включающего бактериальный ген устойчивости к ампициллину и бактериальную область инициации репликации;
- HindIII-BglII фрагмент размером 1,3 т.п.о. являющимся промотором гена PRB1.
3. Рекомбинантная плазмида pRS-PRB1, обеспечивающая наработку ДНК промотора гена PRB1, возможность перенесения промотора в другие вектора и создание на ее основе конструкций для экспрессии белков в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, имеющая размер 6,17 т.п.о. и состоящая из следующих элементов:
- BamHI-HindIII фрагмент плазмидной ДНК бифункционального бактериально-дрожжевого вектора pRS316 размером 4,86 т.п.о., включающего бактериальный ген устойчивости к ампициллину, бактериальную область инициации репликации, дрожжевой ген URA3, дрожжевую область инициации репликации;
- HindIII-BamHI фрагмент плазмиды по п.2 размером 1,31 т.п.о., содержащий промотор гена PRB1.
4. Рекомбинантная, мультикопийная плазмида pFL-PRB1, обеспечивающая наработку ДНК промотора гена PRB1, возможность перенесения промотора в другие вектора и создание на ее основе конструкций для экспрессии белков в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, имеющая размер 7,40 т.п.о. и состоящая из следующих элементов:
- SacI-SalI фрагмент плазмидной ДНК бифункционального бактериально дрожжевого вектора pFL44L размером 6,04 т.п.о., включающего бактериальный ген устойчивости к ампициллину, бактериальную область инициации репликации, дрожжевой ген URA3, область инициации репликации двумикронной плазмиды, обеспечивающей мультикопийность;
- SalI-SacI фрагмент плазмиды по п.3 размером 1,36 т.п.о., содержащий промотор гена PRB1.
5. Способ получения ДНК промотора гена PRB1 по п.1, при котором проводят амплификацию с помощью Pfu полимеразы со следующими олигонуклеотидами:
5'-TATACCAGTACTGAACATCACCGTATCC-3' и
5'-TTTTCTAACTAGATCTTTGCTTGTTAGAAT-3'.
6. Способ конструирования плазмиды pSL-PRB1 по п.2, при котором осуществляют гидролиз вектора pSL301 ферментами рестрикции HindIII и BglII, полученный фрагмент pSL301 лигируют с BglII-HindIII - фрагментом пцр-продукта по п.5, затем полученной лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coli. и отбирают клоны, содержащие рекомбинантную плазмиду pSL-PRB1.
7. Способ конструирования плазмиды pRS-PRB1 по п.3, при котором осуществляют гидролиз вектора pRS316 ферментами рестрикции HindIII и BamHI, полученный фрагмент pRS316 лигируют с HindIII-BamHI - фрагментом pSL-PRB1 по п.6, затем полученной лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coli. и отбирают клоны, содержащие рекомбинантную плазмиду pSL-PRB1.
8. Способ конструирования плазмиды pFL-PRB1 по п.4, с разницей, что вместо pRS316 используют pFL44L, а вместо pSL-PRB1 pRS-PRB1 и гидролиз осуществляют рестриктазами SacI и SalI.