Механизмы антиканцерогенного действия флавоноидов

Альтернативные убиквитин-конъюгирующие ферменты Е2 регулируют эндоцитоз рецептора интерферона-1

Christopher J. Carbone, Hui Zheng, Serge Y. Fuchs

Отдел биологии животных; Центр сравнительной онкологии Мари Лоу, Университет Пенсильвании, 380 S. University Avenue, Hill 316, Philadelphia, PA 19104, USA

Контакты: Serge Y. Fuchssyfuchs@vet.upenn.edu Автор перевода: Геннадий Альтерович Белицкий

Убиквитинирование сигнальных рецепторов, вызывающее их эндоцитоз, направлено на подавление передачи сигнала. Деградация рецептора интерферона 1-го типа (IFN1) на поверхности клетки осуществляется путем убиквитинирования комплекса лиганда с рецептором (IFNAR1). Принято считать, что убиквитинирование способствует взаимодействию между линейным мотивом комплекса IFNAR1 и соответствующими структурами системы эндоцитоза, однако механизм этого процесса остается неясным. В данной работе изучена роль двух различных акцепторных сайтов убиквитина на этом рецепторе. Предпочтительное полиуби-квитинирование сайтов Lys501 и Lys525/526 обеспечивается посредством Lys63- или Ьу^48-связанных цепей (K63- Ub и K48- Ub соответственно). Несмотря на то, что убиквитинлигаза SCFeTrcp E3 контролирует оба типа убиквитин-зависимого эндоцитоза IFNAR1, специфика этих процессов определяется двумя различными убиквитин-конъюгирующими ферментами E2 — Ubc13 и Cdc34. Эти ферменты могут непосредственно использоватьсяубиквитинлигазой SCFeTrcp E3 для создания K63-Ub или K48-Ub in vitro. Ubc13 принимает участие в эндоцитозе IFNAR1 путем модификации Lys501 с помощью K63- Ub, в то время как K48- Ub-специфичный Cdc34 изменяет эндоцитоз посредством конъюгации с убиквитином, которая происходит на Lys525/526. Совместный эффект обоих воздействий максимально стимулирует эндоцитоз IFNAR1, который обычно ингибирован конформационным несоответствием, связанным с наличием консервативного Pro470 во внутриклеточном домене IFNAR1.

Мы предлагаем модель, в которой эффекты обоих ферментов E2 объединяют отдельные составляющие системы полиубиквити-нирования, обеспечивая им взаимодействие с внутриклеточным доменом IFNAR1 при оптимальном пространственном расположении, что дает наибольшую скорость эндоцитоза рецептора.

Ключевые слова: IFNAR, интерферон, рецептор, убиквитин, эндоцитоз, E2

ем СМ

Endocytosis of the IFNAR1 chain of Type 1 interferon receptor is regulated by diverse E2 ubiquitin conjugation enzymes

Christopher J. Carbone, Hui Zheng, Serge Y. Fuchs

Department of Animal Biology and Mari Lowe Center for Comparative Oncology, School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania, 380 S. University Avenue, Hill 316, Philadelphia, PA 19104, USA

Ubiquitination of signaling receptors triggers their endocytosis to restrict the extent of cell signaling. Type 1 interferon (IFN1) eliminates its receptor from cell surface via stimulating the ubiquitination of its IFNAR1 chain. While it was suggested that this ubiquitination aids IFNAR1 internalization via relieving a steric hindrance of a linear motif within IFNAR1 from the endocytic machinery, the mechanisms involved remain poorly understood. Here we describe a specific role for two disparate ubiquitin acceptor sites within this receptor. These sites, Lys501 and Lys525/526, exhibit a preference for polyubiquitination via either Lys63- or Lys48-linked chains (K63- Ub and K48- Ub, respectively). Whereas the SCPTrcp E3 ubiquitin ligase controls either type of ubiquitination-dependent IFNAR1 endocytosis, the specificity of these processes is determined by two different E2 ubiquitin conjugating enzymes, Ubc13 and Cdc34. These enzymes can be directly used by SCFTrcp E3 ubiquitin ligase to generate either K63- Ub or K48- Ub in vitro. Ubc13 is involved in IFNAR1 endocytosis driven by the K63- Ub modification of Lys501, whereas the K48- Ub-specific Cdc34 affects receptor endocytosis via ubiquitin conjugation that occurs on Lys525/526. Both types of linkages combine to maximize IFNAR1 endocytosis otherwise suppressed by unfavorable conformation dependent on the presence of a conserved Pro470 within the intracellular domain of IFNAR1. We propose a model where alternate utilization of both E2s to assemble diverse polyubiquitin linkages cooperates to achieve IFNAR1 intracellular domain conformations and spatial arrangements that favor a maximal rate of receptor endocytosis.

Key words: IFNAR, interferon, receptor, ubiquitin, endocytosis, E2

Введение

Эндоцитоз сигнальных рецепторов клеточной поверхности является основным механизмом, который контролирует способность этих рецепторов взаимодействовать с аффинными внеклеточными лигандами, ограничивая выраженность и длительность реакции клетки на эти лиганды. Одной из посттрансляционных

модификаций, способствующих этому, является убиквитинирование белка. Процесс ковалентного присоединения к нему полипептидов убиквитина происходит в результате каскада ферментативных реакций, опосредованных убиквитин-активирующими ферментами ^1), убиквитин-конъюгирующими ферментами ^2) и убиквитинлигазой ^3) [1]. Убиквитинирование

ем СЧ

Ж ш

U

рецепторов является центральным механизмом, определяющим эффективность их эндоцитоза и, соответственно, ингибирование функций [2—4].

Тип убиквитинирования (моноубиквитинирова-ние или полиубиквитинирование с топологией поли-убиквитиновой цепи) а также вариант интернализации и/или постинтернализационной сортировки определяются в значительной степени типом рецептора. Многочисленные исследования показали, что поли-убиквитинирование по ЬуБбЗ-связанной цепочке играет большую роль в регуляции эндоцитоза многих белков клеточной поверхности, в том числе урацилпермеазы [5], рецептора фактора роста нервов TrkA [6], белков МНС класса II [7], рецепторов пролактина [8], химерных белков эндоцитоза [9], IFNAR1 рецептора интерферона 1-го типа (IFN1) и др. [10].

Интересно, что скорость эндоцитоза IFNAR1, рецептора, который играет ключевую роль в IFN1-сигнализации [11—13], оказалась чувствительной к гиперэкспрессии мутантов убиквитина K63R и K48R. Это вызвало предположение о том, что для полиубиквити-нирования необходимы оба лизина, как Lys63, так и Lys48 (K63-Ub и K48-Ub) [10]. IFNAR1 является субстратом для SCFeTrcp убиквитинлигазы E3, которая взаимодействует с рецептором после его фосфори-лирования по определенному фосфодегрону [14, 15] и способна присоединить как K63-Ub, так и K48-Ub к IFNAR1 in vitro [10]. Убиквитинирование может произойти по многим остаткам Lys внутриклеточного домена IFNAR1, но наибольшее число конъюгатов с убиквитином приходится на кластер из трех лизинов (Lys501, Lys525 и Lys526) [14], наличие которого необходимо для эффективного эндоцитоза IFNAR1 [10]. Убиквитинирование по данной совокупности также обнажает смежный линейный эндоцитозный мотив, связанный с Tyr466, который блокирован IFNAR1-связанной TYK2 Janus-киназой. В результате данный мотив может взаимодействовать с комплексом адап-тина АР2 с последующей интернализацией по клат-рин-зависимому пути [10, 16]. Хотя эти исследования говорят в пользу схемы, по которой убиквитинирова-ние IFNAR1 приводит к диссоциации TYK2 или кон-формационным изменениям в пределах внутриклеточного домена IFNAR1 [17, 18], многие важные вопросы остаются без ответа.

Масс-спектрометрический анализ показал присутствие K63-Ub и K48-Ub на диком типе IFNAR1 [10], однако остается неясным, необходима ли сборка обоих типов убиквитиновых цепей (или смешанных цепей) на IFNAR1 или на гипотетическом регуляторе эндоцитоза. Кроме того, предстоит еще выявить факторы, определяющие специфику топологии конкретных убиквитиновых акцепторов в кластерах Lys501, 525, 526 и конкретных конъюгирующих ферментах E2, используемых SCFpTrcp лигазой E3. Таким образом, механизм, с помощью которого каждый тип убиквитини-рования вносит свой вклад в регулирование IFNAR1

эндоцитоза, остается в значительной степени неизученным.

Целью данной работы было изучение конкретной роли конъюгирующих ферментов Е2, связанных с К63-иЬ или К48-иЬ на различных акцепторах лизина ШКАШ, в интернализации этого рецептора. Наши данные показывают, что комбинированное воздействие обоих типов связей максимизирует скорость ШКАШ-интернализации, и позволяют предположить, что убиквитинирование ШКАШ дает возможность внутриклеточному домену этого комплекса принять пространственную конформацию, благоприятную для его эндоцитоза.

Методика эксперимента

Плазмиды и клетки

Конструкции для экспрессии НА-меченного дикого типа, К48Я и К63Я убиквитина [19] были любезно предоставлены Йосефом Йорденом (Институт им. Вейцмана). Конструкция для экспрессии 1КК-сти-мулированного элемента ответа (КИЕ), обусловленного люциферазой [20], любезно предоставлена Куртом Хорватом (Северо-Западный университет). Экспрес-сионный вектор человеческого 1БКАК2 был любезно предоставлен Джоном Кролевски (Калифорнийский университет в Ирвайне). Конструкция для экспрессии доминантно-негативного мутанта иЬс13С87А была предоставлена Чжи Дж. Ченом (Юго-западный медицинский центр Университета Техаса). Векторы для экспрессии К-терминального БЬАО-меченного человеческого 1ККАЮ (дикого типа и мутантов К501, 525, 526Я) были описаны ранее [10]. Эти плазмиды послужили в качестве основы для генерации дополнительных конструкций К-РЬАО-1ККАШ для экспрессии мутантов К501Я и К525, 526 с помощью сайт-направленного мутагенеза; результаты были подтверждены секвени-рованием ДНК. Конструкты бИРНК для разрушения рТгср были описаны ранее [8, 21]. Олигонуклеотиды б1РНК для разрушения Сёс34 и иЬс13 были получены от компании Сигма.

Эмбриональные клетки почки человека 293Т, эмбриональные фибробласты мыши и клетки линии НеЬа (АТСС) растили в модифицированной по Дуль-бекко среде Игла с 10 % термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки с добавлением пенициллина и стрептомицина. Стабильные ШОБ-производ-ные клеточной линии для внесения убиквитина или мутантов иЬс13 были любезно предоставлены Чжи Дж. Ченом. Эти клетки хранили и использовали, как описано ранее [22]. Добавление тетрациклина (1 мкг/ мл в течение 72 ч) к этим клеткам подавляет экспрессию эндогенного убиквитина или эндогенного ИЬс13 одновременно с индукцией экспрессии экзогенной РНК-интерференции резистентного убиквитина (дикого типа или мутанта К63Я) или ИЬс13 (дикого типа или каталитически неактивного мутанта С87А). Транс-фекцию производили с помощью липофектамина

плюс, липофектамина 2000 или олигофектамина (Ин-витроген) в зависимости от типа клеток и эксперимента. Для всех трансфекций пустые векторы были включены в смеси, чтобы поддерживать одинаковое количество трансфицированных ДНК.

Реактивы, антитела, анализ по гену-репортеру

и иммунологический метод

Мышиный интерферон-p и человеческий интер-ферон-а (IFNa2) (роферон) были приобретены у компаний Рош и ПВЛ. Циклогексимид и другие химические соединения были приобретены у компании Сигма. Также были приобретены антитела против FLAG (M2, Сигма), убиквитин (FLys2, Биомол), HA (12CA5, Рош Берингер Маннхайм). Вторичные антитела были получены от Инвитроген и Рош Берингер Маннхайм. Иммунопреципитация и процедуры иммуноблоттин-га были описаны ранее [23—25].

Для анализа репортерных генов эмбриональные фибробласты мыши котрансфицировали с помощью плазмид, кодирующих человеческий IFNAR2, ISRE-лю-циферазы светляков (с вектором для конститутивной экспрессии люциферазы Renilla), а также различных человеческих IFNARl-конструкций. Спустя 24 ч после трансфекции клетки обрабатывали человеческим IFNa или мышиным IFNp (2000 ЕД/мл) в течение 30 мин. Затем среду удаляли, клетки инкубировали в течение 24 ч без интерферона, после чего определяли активность люциферазы с использованием системы двойного анализа репортерного гена люциферазы (Промега). Данные (нормированные до активности люциферазы Renilla) от трех независимых экспериментов (каждый в пяти повторах) представлены в произвольных единицах измерения в виде среднего значения с указанием ошибки среднего (М ± SE). Значения p были рассчитаны с использованием двустороннего t-критерия Стьюдента.

Анализ убиквитинирования IFNAR1

Реакции лигирования убиквитина in vitro проводили, как описано ранее [24], с помощью SCFpTrcp, выделенного из клеток 293Т по методике [26], и реком-бинантного E2s, включая рекомбинантный Cdc34 ([27], дар от Чжэнь-Цян Пан, Школа медицины Маунт-Синай) или 6His-Ubc13/Uve1 ([28, 29], дар от Зеев Ронаи, Институт Бернэм). Упакованные сферы (10 мкл), содержащие иммобилизованный SCPTrcp-HA, инкубировали с E1 (20 пмоль), mCdc34 или 6His-Ubc13/Uve1 (1 нмоль) в реакционной смеси (общий объем 30 мкл), содержащей 50 мМ Tris-HCl рН 7,4, 5 мМ MgCl2, 2 мМ NaF, 2 мМ аденозинтрифосфата, 0,6 мМ дитиотреито-ла и 1 мкг убиквитина. Смесь инкубировали при температуре 37 °С в течение 60 мин, кипятили в 20 мкл загрузочного буфера Лэммли, разделяли на полиакри-ламидном геле с додецилсульфатом натрия и анализировали с помощью иммуноблоттинга.

Для оценки убиквитинирования IFNAR1 in vivo образцы IFNAR1, меченные FLAG, были экспресси-

рованы в клетках 293Т. Анализируемые образцы клеток лизировали в смеси 1 % NP40, 50 мМ Трис рН 7,6, 150 мМ NaCl, 1 мМ NaVO4, 1 мМ фенилметансульфа-нилфторида, 2,5 мМ этилендиаминтетраацетата, содержащей смесь ингибиторов протеаз (1:500; Сигма), 1 мМ NaF и 20 мМ N-этилмалеимида. Концентрацию белка определяли по связыванию красителя Брэдфорда. Равные количества лизатов белка инкубировали с глобулами, связанными с M2, для образования им-мунопреципитата IFNAR1, меченного FLAG. Образцы промывали 3 раза с помощью 50 мМ Трис рН 7,4, 5 % глицерина, 1 М NaCl и 1 раз с помощью 50 мМ Трис рН 7,4, 5 % глицерина, 150 мМ NaCl, и после кипячения в буфере Лэммли, содержащем додецилсуль-фат натрия, аликвоту от каждой пробы анализировали с помощью иммуноблоттинга M2 FLAG, чтобы нормализовать уровни рецептора. На основании нормализации количества лизатов, которые дают сопоставимые уровни IFNAR1, были разделены электрофорезом в по-лиакриламидном геле с использованием додецилсуль-фата натрия и проанализированы с помощью иммуно-блоттинга с использованием антитела антиубиквитина (Биомол) или цепь-специфических антител антиполи-убиквитинов K63-Ub или K48-Ub (Миллипор).

Анализ интернализации IFNAR1

Интернализацию эндогенного или экзогенно экс-прессированного IFNAR1 определяли, используя способ на основе флуоресцентного метода, ранее подробно описанного [10, 16]. Клетки в 60-мм чашках трансфек-тировали с помощью указанных конструкций или индуцировали с помощью тетрациклина и высевали в одинаковом количестве на 24 луночные поли-Б-ли-зиновые чашки (Бектон Дикинсон). Клетки содержали на бессывороточной среде Игла, модифицированной по Дульбекко, и либо обрабатывали IFNa2a в течение определенного времени, либо хранили на льду и не подвергали воздействию IFNa2a (временная точка 0). Спустя различное время клетки промывали, блокировали и инкубировали с помощью анти-IFNAR1 AA3 антител [30] или анти-FLAG M2 антителами. Первичные антитела удаляли и клетки интенсивно промывали перед добавлением козьих антимышиных IgG H + L антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. После следующей промывки клетки инкубировали с помощью AmplexRed Ultra Reagent 10-ацетил-3,7-ди-гидроксифеноксазина (Molecular Probes). Аликвоты помещали в черную 96-луночную плашку (NUNC) и измеряли флуоресценцию, считывая ее с помощью индикаторной пластинки ридера Beckman Coulter DTX880 Mutimode с использованием фильтров с длиной волны 530 нм для возбуждения и 590 нм для излучения. Результаты рассчитывали по следующей формуле:

% интернализации = 100 — [(Vs — Vb) х tn/ (Vs - Vb) х t0] х 100, n

сч CM

Ж ш

CJ

ем

Ж ш

CJ

где Vs — показатели образцов; Vb — показатели фона (ложнотрансфицированные или исследованные с помощью нерелевантных антител); tn — временная точка n; t0 — временная точка 0.

Результаты

Поскольку SCFeTrcp Е3-лигаза активно использует Cdc34 убиквитин-конъюгирующий фермент Е2 для K48-Ub протеасомальных субстратов, таких как 1кВа [27], мы предположили, что он нужен для убиквити-нирования IFNAR1 и эндоцитоза. С другой стороны, специфичное убиквитинирование белков по K63 in vitro может быть достигнуто с помощью ряда ферментов Е2, при том что убиквитин-конъюгирующий фермент 13 (Ubc13 в комплексе с UevlA либо MMS2) оказался наиболее активным как при образовании этих связей in vivo, так и в К63-зависимых процессах, таких как ДНК-рекомбинация [31], репарация [32] и активация путей передачи сигнала [33—35].

В качестве подхода мы использовали РНК-интерференцию, чтобы определить роль этих E2s в убикви-тинировании и интернализации IFNAR1. Нокдаун Cdc34, который ингибировал K48-Ub IFNAR1, оценивали с помощью иммуноблоттинга, используя специфическое антитело (рис. 1а). И наоборот, K63-Ub IFNAR1 инактивировали в клетках РНК-интерференцией против Ubc13 (см. рис. 1а). Поскольку SCFeTrcp был способен использовать любой из этих ферментов для цепь-специфического лигирования убиквитина in vitro (рис. 16), можно полагать, что и в клетках как Cdc34, так и Ubc13 могут вносить свой вклад в процесс убиквитинирования IFNAR1 посредством K48-Ub и K63-Ub. Соответственно, нокдаун Cdc34 либо Ubc13 заметно замедлял кинетику интернализации эндогенного IFNAR1 в клетках 293Т (рис. 1в). Кроме того, экспрессия доминантно-негативного мутанта Ubc13 (Ubc13C87A [22]) ингибировала скорость интернализации N-терминального FLAG-меченного дикого типа IFNAR1 (рис. 1г). В совокупности эти данные позволяют предположить, что для максимальной скорости эндоцитоза IFNAR1 необходимы как Cdc34, так и Ubc13.

Далее мы стремились охарактеризовать кластер акцепторов убиквитина в пределах IFNAR1. Хотя было известно, что тройной мутант K501R/K525R/K526R (IFNAR13KR) обладает низкой способностью к общему убиквитинированию [14], интернализации и направленной миграции к лизосомам [10], а также деградации [14], роль специфичных акцепторов оставалась неясной. Вначале мы исследовали гипотетический канонический участок, представленный дублетом Lys525/526, расположенным на 9—10 аминокислотных остатков ближе к участку связывания pTrcp (534DSGNYS). Этот участок напоминает акцептор убиквитина Lys21/22 в IKBa (рис. 2а) и подходит под описание предпочтительных акцепторов убиквитина для SCFTrcp Е3-лигазы [36]. Ранее был отмечен низкий уровень

интернализации мутанта 1РКАЮЖЕ- [10]. Интересно, что мутация канонического (1^525/526) или дополнительного (1^501) участка давала промежуточный фенотип; эти мутанты эндоцитировались медленнее, чем дикий 1ККАШ, но быстрее, чем мутант 1РКАШ3КК (рис. 26). Это показывает, что на акцепторном кластере убиквитина оба участка — 1^525/526 и 1^501 способствуют максимальной скорости 1РКАЯ1-эндоци-тоза.

Основываясь на этих результатах, мы решили узнать, играет ли роль в регуляции стабильности и сигнализации 1РКАЯ1 его убиквитинирование по каноническим или дополнительным сайтам. Протеолиз РЬАО-1РКАШ оценивали с помощью анализа цикло-гексимида. Мутант 1РКАК13КЕ-, лишенный канонических и дополнительных сайтов, имел более длительный период полураспада по сравнению с белком дикого типа (рис. 2в). Этот результат согласуется с ранее полученными данными [14]. Промежуточная скорость деградации наблюдалась как для мутантов К501Я, так и К525/526Я (см. рис. 2в), указывая на то, что убикви-тинирование канонических и дополнительных сайтов способствует эффективной деградации 1РМАК1.

Чтобы проверить функциональную активность этих мутантов, мы коэкспрессировали их вместе с человеческим 1РКАК2 в фибробласты эмбриона мыши и оценили активацию стимулированного интерфероном ответа люциферазы. Экспрессия белков человека 1РКАЯ1 не влияла на индукцию люциферазы мышиным №N0, который функционирует за счет эндогенного мышиного рецептора №N1 (рис. 2г, синие полосы). Это свидетельствует о том, что уменьшение активации сигнального пути рецепторов IFN не сильно нарушается экспрессией этих белков человека. В то же время экспрессия дикого типа человеческого 1РКАШ задействует трансактивацию люциферазы с помощью короткого воздействия импульса с человеческим №N01; экспрессия мутанта IРNAR13KR значительно увеличивала чувствительность клеток мыши по отношению к человеческому 1РШ. IРNAR1-мутан-ты, дефектные по каноническим или дополнительным сайтам, значительно увеличили влияние человеческого №N01 (см. рис. 2г, черные полосы). Эти результаты показывают, что убиквитинирование на канонических или дополнительных сайтах способствует ослаблению клеточных ответов на 1РШ, вероятно, посредством регулирования IFNAR1 эндоцитоза и деградации.

В соответствии с ранее показанной ролью рТгер2 в убиквитинировании эндогенного IFNAR1 [10, 15], нокдаун этого белка заметно снизил уровень убикви-тинирования FLAG-IFNAR1WT (рис. 3а). Кроме того, эндоцитоз дикого типа IРNAR1 был также нарушен в клетках с РНК-интерференцией против рТгер2 (рис. 36). Важно отметить, что убиквитинирование и интернализация мутантов IРNAR1, дефектных по К525/526 или К501, были также подавлены после нокдауна рТгер2 (см. рис. 3а, б). Этот результат позволяет

а

в

г

1Р:М2 I8:K48-Ub

1Р:М2 IB:K63-Ub

1Р:М2 1В;М2

WCL: IB:Ubc13

IB:Cdc34 IB: [i-actin

60 50 40 30 20 10 О

50 40 30 20 10 О

б

ß-Trcp - + + +

Е1/АТРДЛЬ + + + +

Cdc34 + - + *

Ubc13 + - - +

175

СЧ êj

U

83

K43-Ub

K63-Ub

siCdc34

Ub

62 47 H 17583 -

62 -47

17583 -

62 -47 -

ж

ш

u

ßTrcp

мин

-+-CTI -m-Ubcl3C87A

ГI ' мин

Рис. 1. Роль Cdc34 и Ubc13 в убиквитинировании IFNAR1 и эндоцитозе:

а — специфическое полиубиквитинирование белков FLAG-IFNAR1 (очищенных от IFNa-стимулированного 293Tс помощью иммунопреципитации) анализировали с помощью иммуноблоттинга с использованием антител против K63- Ub и K48- Ub, а также антител против FLAG (М2). Уровни белков эндогенного Ubc13 или Cdc34 в лизатах цельных клеток (WCL) были измерены с помощью иммуноблоттинга с использованием указанных антител. Иммуноблот для ß-актина включен в качестве контроля;

б — in vitro реакцию лигирования убиквитина, катализируемую SCF3T"cp E3-убиквитинлигазой (опущено в качестве отрицательного контроля в левой полосе) в присутствии Cdc34 или комплекса Ubc13/UEV1, анализировали с помощью иммуноблоттинга с использованием антител против убиквитина Lys63 и Lys48, а также антител против неспецифических цепей убиквитина (Ub). Были также проанализированы уровни ßTrcp; в — влияние нокдауна Cdc34 или Ubc13 на интернализацию эндогенного IFNAR1 в клетках 293Т, обработанных IFNa (6000 ЕД/мл) в течение указанного времени, оценивали с помощью анти-IFNAR1 AA3 антител и выражали в процентах от потери иммунореактивности клеточной поверхности, рассчитанной из трех независимых экспериментов (каждый в пяти повторениях) в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего;

г — кинетику интернализации FLAG-IFNAR1 в клетках 293Т, которые получали контрольный вектор (ЦТЛ, pcDNA3) или вектор для экспрессии мутанта Ubc13C87A, обработанного IFNa (6000 ЕД/мл) в течение указанного времени, оценивали с помощью анти-FLAG-антител и выражали в процентах от потери иммунореактивности клеточной поверхности, рассчитанной из трех независимых экспериментов (каждый в пяти повторениях) в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего

s а

ем СЧ

Ж ш

U

SOI S1S/S16

IFNAR1 KflCHEKCnilNIIII A TV Е CT N ОТ D Е D H К КГ S S QTSQD SO N Y S

в

IF NA RI

m

K501R K5Z5.526R 3KR

1к6а

б

ü

50 40 30 20 10 О

:MFQAAffiPQfWAMFGPenaiKK£BUDDRHossiD£ CHX, h о 1.5 3 о 15 3 0 1,5 3 О LS I

HAG

p-actin

%

г

100 27 1 100 67 30 100 6Э 28 100 89 50

**

- IFN

nilFN M iiШ

WT K50IR K5Z5,526R 3KR Г2 only

Рис. 2. Роль специфических акцепторных сайтов убиквитина в интернализации и деградации НИЛЯ1 и 1¥ИАК1-опосредованной сигнальной системы НЫ:

а — сходства первичных детерминантов сайта мобилизации в Тгср и предполагаемых акцепторных участков убиквитина 1¥ЫЛК1 и 1кВа человека; б — показатели интернализации ГЬАО-меченных белков 1¥ЫЛК1, экспрессированных в клетках 293Т, после обработки НЫа (6000ЕД/мл) в течение указанного времени оценивали с помощью анти-ГЬЛО-антител и выражали в процентах от потери иммунореактивности клеточной поверхности, полученных в трех независимых экспериментах (каждый в пяти повторениях) в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего; в — оборот белков ¥ЬАО-!¥ИАК1 определяли в клетках 293Т, обработанных НЫа (6000МЕ/мл) и циклогексимидом (СНХ, 20мкг/мл) в течение указанного времени. Процент оставшегося сигнала 1¥ЫЛК1 (нормализованный относительно сигнала в-актина) по отношению к временной точке «0» (принятой за 100 %) изображен ниже;

г — относительная активность люциферазного репортера ШКЕ в мышиных эмбриональных фибробластах, обработанных человеческим 1¥ЫЛК2

предположить, что SCFpTrcp отвечает за убиквитиниро-вание как канонических, так и дополнительных участков IFNAR1 и что эффективный эндоцитоз IFNAR1 зависит от согласованного убиквитинирования этих участков, регулируемых той же Е3-убиквитинлигазой.

Поскольку наличие мутаций как в канонических, так и в дополнительных сайтах незначительно изменяло общее убиквитинирование IFNAR1 (см. рис. 3а), но заметно влияло на его интернализацию (см. рис. 2б, 3б), деградацию (см. рис. 2в) и сигнализацию (см. рис. 2г), нельзя исключить качественное различие в последствиях убиквитинирования этих сайтов. В самом деле, количественный масс-спектрометрический анализ связей полиубиквитина показал, что дикий тип IFNAR1 связан с цепями как K63-Ub, так и K48-Ub [10], однако большее количество К63-иЬ-связей было найдено на мутанте К525, 526R (65 ± 18 фмоль в FLAG-IFNAR1K525> 526R по сравнению с 3 ± 0 фмоль в FLAG-IFNAR1K501R (Ch.J. Carbone, S.Y Fuchs, неопубликованные данные). Недавнее создание антител, специфичных к топологии убиквитиновых цепей, дало возможность подтвердить этот вывод. Исследование иммуноблотов, содержащих очищенные иммуносорб-

ционным методом белки IFNAR1 с полиубиквитино-выми цепь-специфическими антителами, позволило обнаружить оба типа цепей на диком типе IFNAR1 (см. рис. 1а, 3в). Интересно, что мутация канонического участка (Lys525, 526) снизила уровни K48-Ub, в то время как мутант IFNAR1, лишенный дополнительного сайта (Lys501), практически не дал специфического сигнала на связывание с K63 (см. рис. 3в). Даже учитывая, что некоторое убиквитинирование может возникнуть в четырех других остатках Lys в пределах цитоплазматического домена IFNAR1, которые находятся за пределами исследуемого кластера, эти данные (вместе с рис. 1а) дают возможность предположить сценарий, где два разных акцепторных участка убиквитина могут быть избирательными для различных типов полиубиквитинирования, зависящих от специфического конъюгирующего фермента E2 (рис. 3г).

Далее мы исследовали роль конъюгирования с каноническими или дополнительными сайтами в регуляции эндоцитоза IFNAR1. Для этого мы использовали усиленную экспрессию мутантов убиквитина (K63R или K48R), которая может предотвратить элонгацию специфической цепи в клетках. Экспрессия этих спе-

а

IFNARl WT K501R K525,52SR shCON shBTR

в

IP: М2 IB: Lib

tP:M2 IB: M2

IB: P-Trcp

+ - + - + - + - + +

f* и м

ППППП

to

ГЧ C£ in Z T- Ю

s i_ о (ч

о 5 ^ ^

CM

CM

IP:M2

IB:

K48-Ub

И

IB:

K63-Ub

IB:

IFNAR1

X

г

-WT*i hCTl

— wndtjnt

-KSOintihCTI

-KWlR+ihBlR

-Ki2S,S26a+ihCTt

-kSZS,S26R*ihBTK

Акцепторный сайт EZ Основное-связывание

Канонический (К525/526) САт34 кав-иь

Дополнительный Ubcll КбЗ-Ub

: мин

Рис. 3. вTrcp-зависимая сборка цепей К63- Ub, связанных с цепям Lys501 и К48- Ub, конъюгированных в IFNAR1 с Lys525, 526: а — убиквитинирование белков IFNAR1, меченных FLAG, в клетках 293Т, обработанных в контроле shRNA (shCON) или ShRNA против $Trcp (shBTR), а также обработанных или не обработанных IFNa (6000МЕ/мл, 5 мин), анализировали денатурирующей иммунопреципитацией с помощью антитела М2 с последующим иммуноблоттингом с помощью антитела против убиквитина. Входы для каждого иммунопреципитиро-ванного образца были нормализованы, чтобы получить сопоставимые уровни IFNAR1. В качестве контроля проанализированы уровни эндогенных белковpTrcp ив-актина;

б — показатели интернализации в клетках, обработанных в контроле ShRNA против GFP (shCTL) или в Trcp (shBTR) для указанных белков FLAG-IFNAR1 проводили, как указано в подписи к рис. 2б;

в — специфическое полиубиквитинирование K48- и К63-белков IFNAR1, меченных FLAG, анализировали, как в панели а. Количество FLAG-мечен-ного IFNAR1 включено в качестве контроля загрузки;

г — резюме E2s и типов убиквитиновых связей, участвующих в модификации канонических и дополнительных акцепторных участков на IFNAR1

Ж ш

CJ

цифических мутантов ослабила скорость интернализации дикого типа рецептора 1РКАШ примерно на 50 % [10] и заметно снизила соответствующее связь-специфическое убиквитинирование белка 1РКАШ (рис. 4а). Важно отметить, что экспрессия мутанта убиквитина К48Я (но не К63Я) далее снижала эффективность интернализации 1РКАШК501Е- (рис. 4б). И наоборот, в клетках 293Т на эндоцитоз 1РКАК1К525, 526к-влияла принудительная экспрессия К63Я, но не мутант убиквитина К48Я (рис. 4в).

Вклад К63-связанных цепей в интернализацию 1ККАШ сопоставим с известной ролью этой модификации в эндоцитозе ряда других рецепторов, например ТгкА [6]. Большинство этих исследований, в том числе наши собственные работы на клетках млекопитающих, проводились с принудительной экспрессией мутантов убиквитина, которые завершают элонгацию цепочек специфических связей. Последние исследования изогенных и20Б-производных, в которых обработка тетрациклином дает нокдаун эндогенного

убиквитина наряду с параллельной экспрессией РНК-интерференции нечувствительного рекомбинантно-го убиквитина (дикого типа или мутанта К63Я [22, 37]), позволили нам дополнительно определить роль связь-специфических модификаций К63 в интернализации 1РКАЮ. В соответствии с результатами, полученными с помощью принудительной экспрессии убиквитина, эндоцитоз дикого типа 1РКАЯ1 был ингибирован в клетках, экспрессирующих уби-квитин К63Я (рис. 4г). Интересно, что эти клетки показали снижение скорости интернализации мутанта 1РКАШК525- 526а, но не его копии К501Я (см. рис. 4г). Эти результаты подтверждают присутствие К63-свя-занной цепи на акцепторном участке Ьуб501. Взятые вместе с данными убиквитинирования белка, эти результаты показывают, что убиквитинирование канонического участка К525/526 посредством К48-свя-занных цепей вместе с убиквитинированием К501 посредством К63-связанных цепей максимально стимулирует эндоцитоз ТРКАЯ1.

ем СЧ

а

JFNAR1 — WT

си а.

i_ и to

иь % t 10 5 *

IP: Flag IB:

MB-Ub

IB:

КбЗ-Ub IB:

IFNAR1

б

so

70

1 S

s Ü

1 -04 J.-:

0

K63-Jb~Lvs501

-fFJMffi WT+ Ub WT -RlKSOlR + UbWT -FI K501R f Ub K48R

-Hl KS01R + Ub K63R

15

мин

г

ж

ш

u

в

so

70 60 50 40 30 20 10 о

K4e-Ub~LysS2 5/526

-IfNARl WT + UbUST

-tfNARl KS2S,S26H * Ub

WT

-IfNARl KS25,526R * Vb

KiSR

-IFNAR1 К525,526R * Ub

K63R

15

мин

--IfNfiRl WT+Ubvn

--ttHAAl WT-ЮЬКЫН

-ItHAitl KiOlR tUbWf

— -ПМ1 ПШЯ * Ub K63R

---fftf Afil K52S, iiSRtUb

WT

--tfHARl K5I55Î6R + Ub

K63R

мин

Рис. 4. Несопоставимое действие убиквитиновых мутантов на интернализацию белков IFNAR1 с каноническими или дополнительными акцепторными участками убиквитина:

а — цепь-специфическое полиубиквитинирование дикого типа белков FLAG-IFNAR1, коэкспрессированных с указанными убиквитиновыми конструкциями и очищенных от стимулированного IFNa анализировали, как указано в подписи к рис. 3a;

б — кинетику интернализации FLAG-IFNAR1WT, коэкспрессированного с убиквитином дикого типа (WT, черная линия), сравнивали с кинетикой интернализации FLAG-IFNAR1K501R, коэкспрессированного с помощью убиквитина дикого типа (синяя линия), K63R убиквитина (красная линия) или K48R убиквитина (пурпурная линия) в клетках 293Т. Анализы проводили, как указано в подписи к рис. 2б;

в — кинетику интернализации FLAG-IFNAR1WT, коэкспрессированного с убиквитином дикого типа (WT, черная линия) сравнивали с кинетикой интернализации FLAG-IFNAR1K525,526R, коэкспрессированного с помощью убиквитина дикого типа (красная линия), K63R убиквитина (пурпурная линия), или K48R убикитина (синяя линия) в клетках 293Т. Анализы проводили, как указано в подписи к рис. 2б;

г — кинетика интернализации указанных FLAG-IFNAR1 белков в клетках U2OS, индуцированных для нокдауна эндогенного убиквитина и для ре-экспрессии убиквитина дикого типа (сплошные линии) либо убиквитина K63R (пунктирные линии) была проанализирована, как на рис. 2б

Для дальнейшей проверки предположения о том, что взаимодействие Б2б разного типа может определять судьбу 1РКАЮ через варианты сайт-специфического убиквитинирования, мы изучали влияние модуляции Б2б на интернализацию 1РКАЮ. Нокдаун Сёе34 замедлял кинетику интернализации эндогенного 1РКАШ (см. рис. 1в) и дикого типа РЬАО-1РКАШ, экспрессированного в клетках 293Т (рис. 5а). Интересно, что в клетках, подвергнутых РНК-интерференции против Сёе34, замедлялась интернализация мутанта РЬАО-1РКАК1К501Е-, но на эндоцитоз белка РЬАО-1РКАК1К525> 526к- это не влияло (см. рис. 5а). Эти данные позволяют предположить, что роль К48-ИЪ в стимулировании эффективного эндоцитоза 1РКАШ облегчается Сёе34-опосредованной конъюгацией уби-квитина с каноническим акцепторным участком (Ьуз525/526).

Учитывая, что 1уб501 1РКАЮ убиквитинируется К63-иЪ, который требует активности иЪе13 (см. рис. 1а, 3в), мы стремились определить, являлся ли этот Е2 также регулятором эндоцитоза 1РКАЯ1. Нокдаун иЪе13 заметно ингибировал скорость интернализации дикого типа 1РКАЮ или мутанта 1РКАК1К525> 526а, но не К63-иЪ-дефектного мутанта 1РКАК1К501а, экспрессированного в клетках 293Т (рис. 5б). Кроме того, принудительная экспрессия доминантно-негативного каталитически неактивного мутанта ИЪе13 (С87А) также снизила эффективность интернализации канонического сайт-специфического мутанта и ТРКАЮ^Т но не изменила эндоцитоз 1РКАК1К501Е- (рис. 5в). Эти результаты показывают, что Цэе13 способствует К63-ИЪ в убиквитинировании дополнительного акцепторного участка (1уб501) и играет существенную роль в эффективности эндоцитоза ТРКАШ.

а

ла

35

S

s ^

та . .

m :.: s

го

ÎТ 1 .

9

СсГс34+ LyiSÎS/5Î6 —

Х - _J

Г - —1

s —

/ у*

/ ùO —

—

_____J

в

б

л.Т

40

s J5

s

^ 30

го

m

s 1$

с;

го I 20

Œ

Ф J5

H

I

s H?

s

0

Ubtl3+ LysSOl

IFNAR1 WT+fI(Tl

IFNAR1 WT * stCdc 34

-IFHAKlK5<Slt+fiCTl

-IfHARl KSOlft * ttcée3*

-IFNAR1 K52S, S26R + îJtTl

IFNAR1 K525,52bR + «TCdrM

мин

1FNAR1 WT + tlCTL

IFNAR1 WT*siUbcl3

IFNAR1 K5D1R + SiCTL

• IFNAR1 K501R t SÎUbclî

IFNAR1 KS25.526R + siCTi

№ШМ K525,52GR +

aubtii

мин

г

-)fNARlWT*CTt

--¡fHARl WT + Ubtli CS?A

-if S A RI K50I R*CTL

-IfNARl K50J lî

Ubtl3Ci7A -if SARI KSÎS,SÎ6(t*Cn.

-IfNARl КBESUCH*

Ubil3 C&7A

мин

-л»*«

--JfJM« VVTVbcLltHA

-IfNAtll К501Й* LVifJj №T

-nmm кsojÎ ' ubcs3 ООН

-1Шлй1 iJbcii

WT

-itHAiti KtM,sim-obci) <t?A

мин

Рис. 5. Для достижения максимально эффективной интернализации IFNAR1 требуется комбинированное действие Сёе34-зависимого K48- Ub (собранного на Lys525, 526) и Ш>с13-зависимого K63- Ub (собранного на Lys501). Анализы проводили, как указано на рис. 2б: а — кинетика интернализации белков FLAG-IFNAR1, экспрессированных в клетках 293Т, обработанных контрольным RNAi (siCTL) или RNAi против Cdc34;

б — кинетика интернализации белков FLAG-IFNAR1, экспрессированных в клетках 293Т, обработанных контрольным RNAi (siCTL) или RNAi против Ubc13;

в — действие каталитически неактивного мутанта (C87A) Ubc13 на интернализацию белков FLAG-IFNAR1 в клетках 293Т. Трансфекцию клеток пустым векторомpCDNA3 использовали в качестве контроля (CTL);

г — кинетика интернализации белков FLAG-IFNAR1, экспрессированных в клетках U2OS, взятых для нокдауна эндогенного Ubc13 иреэкспрессии, либо дикого типа UBC13 или мутанта Ubc13C87A

ем СМ

Ж ш

CJ

Далее мы стремились подтвердить эти выводы, используя варианты клеточной линии Ш0Б, которые позволяют заменять эндогенный ИЪе13 рекомбинан-тными белками дикого типа или мутанта С87А [22]. Интернализация РЬАО-1РКАЯ1№Т явно нарушалась в клетках, которые экспрессировали каталитически активный мутантный белок иЪе13 (рис. 5г). Аналогичный результат наблюдался в случае К48-ИЪ-зависимо-го мутанта 1РКАШ, лишенного дополнительного сайта (1^501), но не на К63-ИЪ-зависимом мутанте (1РКАЮК525, 526а, см. рис. 5г). В совокупности эти результаты показывают, что иЪе13 участвует в сборке К63-связанных цепей на 1^501 1РКАШ и эта система взаимодействует с Сёе34-зависимой К48-ИЪ на 1^525, 526, способствуя эффективному эндоцитозу ШКАШ.

Ранее было показано, что базальный уровень эндоцитоза ШКАШ в интактных клетках человека ингибируется ТУК2 [38], который предотвращает взаимодействие специфического линейного эндоцитоз-ного мотива с АР2-системой эндоцитоза механическим комплексом (рис. 6а, б) [16]. Воздействие на

клетки IFN1 способствует привлечению комплекса ßTrcp и последующему убиквитинированию IFNAR1 [14, 15, 39—41]. В целом предполагается, что вызванное IFN сайт-специфическое (K501, 525, 526) убиквитинирование IFNAR1 стимулирует его интернализацию путем раскрытия этого линейного эндоцитозного мотива [10] по механизму, который еще предстоит понять.

Далее мы исследовали гипотетические механизмы, с помощью которых убиквитинирование IFNAR1 способствует раскрытию линейного эндоцитозного мотива. Учитывая, что связывание TYK2 с IFNAR1 было одинаковым в случае рецептора дикого типа и дефектного по убиквитинированию мутанта IFNAR13KR (рис. 6в), кажется маловероятным, что убиквитиниро-вание IFNAR1 диссоциирует TYK2 от его рецептора. Кроме того, после обработки клеток IFN на ранних стадиях эндоцитоза и направленной миграции в субклеточных фракциях TYK2 остается связанным с IFNAR1 [42], несмотря на то что убиквитинирование IFNAR1 и интернализация стимулируются IFN [14,

сч

ôj

а

б

ж

ш

u

И.sapiens Fl.RC TTIYVFF P SLK

P.troglodyte FLRCIHWFFPSLK

P.aiïubls LLRCIMYVFFPSLK

M. fascicalaris LLRCINYVFFl'SLK

В.taurus FLRCVKYVFFP S SK

E.cabellus LH0, СINYVFTP3SK

O.arics FLRCVKYVFFPSSK

$.зсго£а VS RCINYVFFP S SK

C, fàtniiidtis T.J.RCTSYVFFPSSK

G.gallüS VÏNKlKÏHFFPSOy

г

д

!fWAHl WT-IFN

IFNAR1 M 70G-IFN

IFNAR1 WT+fFtt

IFNAR1 Pi 70 G +JFJV

в

FLAG-IFNAR1: " HA-TYK2 +

TYK2 IFNAR1

TYK2

IP: M2 IB: НА

IB: M2

WCL IB: HA

40

35

! : та

s

! ' ü

ф I I

s .,;

О

-IfNAM WT —ШШ 3KR

-IFNAR1 3KR/P470G

мин

мин

Рис. 6. Комбинированное убиквитинирование канонических и дополнительных сайтов в IFNAR1 происходит выше места изменений конформации FNAR1, регулируемых консервативным Pro470:

а — консервативность специфического Pro-остатка (P470 в IFNAR1 человека, (красный шрифт), прилегающего к эндоцитозному мотиву (жирный шрифт), критического остатка Tyr, который взаимодействует с AP2 (подчеркнуто) на IFNAR1 указанных видов;

б — гипотетическая модель, которая предполагает роль пролин-опосредованного изгиба цепи IFNAR1, обусловленного связыванием с TYK2, в маскировке эндоцитозного мотива (красная точка) от эндоцитозного системного комплекса АР2. Убиквитинирование IFNAR1 предполагает вытеснение TYK2 или изменение взаимного пространственного расположения эндоцитозного мотива, цитоплазматической мембраны и АР2; в — указанные белки IFNAR1-FLAG (маркер на СООН-конце) с HA-меченным TYK2 или без него были коэкспрессированы в клетках 293Т. После обработки IFN(6000 ЕД/мл в течение 10мин) клетки снимали, лизировали и белки подвергали иммунопреципитации с анти-FLAG-антите-лом. После предварительного иммуноблоттинга с анти-FLAG-антителом (не показано) различное количество реакционной смеси наносили на другой гель, чтобы получить сопоставимый уровень FLAG-меченных белков IFNAR1 в каждой полосе. Эти реакции анализировали с помощью иммунопреципитации-иммуноблоттинга с использованием указанных антител. Показано также содержание HA-TYK2 в лизатах цельных клеток (WCL);

г — скорость интернализации FLAG-IFNAR1, экспрессированного в клетках 293Т, была проанализирована, как описано на рис. 2б, как в отсутствие добавленного IFNa, замещенного аналогичными объемами PBS;

д — скорость интернализации FLAG-IFNAR1, экспрессированного в клетках 293Т, была проанализирована, как описано на рис. 2б

15, 39]. Таким образом, мы рассмотрели альтернативную модель, где убиквитинирование 1РКАШ может изменять конформацию его внутриклеточного домена или его пространственное расположение по отношению к ТУК2 и плазменной мембране. Высококонсервативный остаток пролина, расположенный дисталь-но по отношению к эндоцитозному мотиву (например, Рго470 в человеческом 1РКАЮ, см. рис. 6а), может генерировать полипептидную цепочку, которая задерживает активацию эндоцитозного мотива (см. рис. 6б). Замена Рго470 на 01у, повышающий гибкость цепи, дает белок 1РКАК1Р470°, который эффективно взаимодействовал с ТУК2 (см. рис. 6в), проявляя при этом очень высокий уровень эндоцитоза даже без обработки ТРМ (рис. 6г). Поразительно, что мутация этого остат-

ка пролина в убиквитин-дефицитном 1РКАЮ3Ка в значительной степени восстановила способность этого мутанта к эффективной интернализации (рис. 6д). Эти результаты показывают, что убиквитинирование 1РКАЯ1, предшествующее пространственным изменениям внутриклеточного домена 1РМАШ, определяет эффективность эндоцитоза.

Обсуждение

Представленные данные показывают, что максимальная скорость эндоцитоза 1РМАЮ является совместной функцией К48-ИЪ, связанного с акцепторными сайтами убиквитина Ьуз525, 526, и К63-ИЪ, конъюгированного с сайтом Ьув501 (см. рис. 2—5). Хотя 8СРрТгер контролирует конъюгацию убиквитина со

всем кластером Lys, важным для эндоцитоза IFNAR1 (см. рис. 3), эти события зависят от альтернативной работы ферментов Cdc34 и Ubc13 E2, стимулирующих тополого-специфическую интернализацию цепочки убиквитина (см. рис. 5).

Cdc34-зависимая конъюгация K48-Ub с сайтами Lys525, 526 сопоставима с ранее опубликованными результатами на материале протеасомальных субстратов bTrcp [36]. Лизины 525 и 526 расположены на сайтах 9—10 IFNAR1 вблизи от сайта связывания bTrcp (например, дегрон 534DSGNYS539). В этом смысле они представляют собой канонические акцепторные участки для убиквитинирования, опосредованного SCPTrcp, аналогично Lys21/22 на 1кВа (см. рис. 2а) [14]. Преимущество такого расположения акцепторных участков убиквитина действительно сообщалось для bTrcp протеасомального субстрата р-катенина [43], и введение удвоенного остатка лизина на таком же расстоянии от сайта связывания bTrcp преобразовало латентный мембранный белок 1 вируса Эпштейна—Барр из псевдосубстрата в подлинный субстрат bTrcp [44]. Представленные здесь результаты соответствуют данным литературы о сходстве в расположении акцепторного участка протеасомальных субстратов SCFeTrcp и Lys525/526. Эти данные позволяют предположить, что многосторонние взаимодействия между SCPTrcp, Cdc34 как E2 и Lys21/22 в случае 1кВа [27] или Lys525, 526 в случае IFNAR1 (в этом исследовании) в качестве субстратов может быть благоприятным для элонгации полиубиквитиновой цепи К48-связанной топологии.

Однако в отличие от 1кВа, который является ци-тозольным белком и чьи основные акцепторные участки убиквитина Lys21/22 расположены в гибкой N-кон-цевой области [45], выбор участков конъюгации для IFNAR1 может быть зависим от пространственных ограничений, введенных фиксацией трансмембранного домена плазматической мембраны. Соответственно, SCPTrcp может иметь узкий спектр выбора субстрата среди остатков лизина IFNAR1 или среди цепей, преимущественно построенных на этих остатках. И наоборот, другой тип цепи, такой как K63-Ub, может быть построен этой Е3-лигазой на акцепторе Lys501 с использованием альтернативы Cdc34 Е2, например Ubc13. Эта возможность соответствует зависимости максимальной скорости эндоцитоза мутанта IFNAR1K525, 526R от наличия К63 на убиквитине и каталитической активности Ubc13 (см. рис. 4, 5). Наши результаты впервые продемонстрировали, что SCFeTrcp может напрямую использовать комплекс Ubc13/UEV1 в качестве Е2-фермента, чтобы катализировать элонгацию К63-связанной цепи in vitro (см. рис. 1б). Соответственно, подобный механизм, который может работать и in vivo, мог бы послужить в качестве самого простого объяснения для pTrcp/Ubc13/K63 цепь-зависимого эндоцитоза IFNAR1. Тем не менее остается вероятность, что необходимость и pTrcp, и Ubc13 для K63-связанного убиквитинирования IFNAR1

по Lys501 отражает непрямое регулирование, которое может включать в себя дополнительные E2s/E3s.

Возможные значения для других ферментов E2, таких как разнородные члены семейства UbcH5, показали способность убиквитинирования IFNAR1 in vitro [10], а также продемонстрировали роль в моно-убиквитинировании субстратов с последующей элонгацией К48-связанной цепи (посредством Cdc34 [27]) или К63-связанной цепи (посредством Ubc13 [46]), которые еще предстоит уточнить. Хотя мы не наблюдали последовательного изменения скорости IFNAR1-эндоцитоза в клетках, которые получили реагенты против членов семейства UbcH5 (Ch.J. Carbone, S.Y Fuchs, неопубликованные данные), роль этих видов E2 не может быть однозначно исключена.

Предстоит выяснить, как эти два типа полиуби-квитиновых цепей, построенные на двух разных ли-зинах акцепторного субстрата с помощью двух различных ферментов E2 могут взаимодействовать для раскрытия линейного эндоцитозного мотива и для увеличения скорости интернализации IFNAR1. С одной стороны, есть основания полагать, что степень интернационализации просто пропорциональна общему уровню убиквитина на кластере Lys501/525/526 IFNAR1, и оба акцепторных участка вносят свой вклад, формируя те цепи, которые могут быть эффективно созданы на данном остатке лизина субстрата в рамках возможной субстрат-лигазы E2. С другой стороны, мы не можем исключить, что эти различные типы цепей могут играть разную роль в мобилизации или перегруппировке белков, взаимодействующих с рецептором, и что эти две функции взаимно дополняют друг друга в механизме стимуляции эндоцитоза IFNAR1.

Примечательно, что придание пластичности внутриклеточному домену IFNAR1 посредством замены высококонсервативного Pro470 на глицин создает рецептор с очень высокой скоростью эндоцитоза даже при отсутствии стимуляции IFN1. Кроме того, введение замещения P470G значительно восстановило интернализацию IFNAR13KR с дефектом убиквитинирования (см. рис. 6). Этот результат позволяет предположить, что убиквитинирование IFNAR1 стимулирует его интернализацию, скорее всего через изменение конформации/пространственного расположения IFNAR1-внутриклеточного домена. В рамках этой модели вполне вероятно, что наличие двух типов полиубиквитиновых цепей на IFNAR1 может дополнительно стимулировать принятие конформа-ции, при которой возможен эндоцитоз. Учитывая, что цепочки K63-Ub и K48-Ub имеют очень различные конформации [47], взаимодействия между эндо-цитозным мотивом и эндоцитозным механизмом могут быть усилены и/или стабилизированы присутствием обоих типов цепей. Дальнейшие структурные исследования дадут возможность непосредственно исследовать этот механизм.

сч

см

Ж ш

CJ

ем

Приносим благодарность D.P. Baker, Z.J. Chen, C. Horvath, J. Krolewski, Z. Ronai, Z.Q. Pan и Y. Yarden за реактивы; J. Peng, B. Varghese и G. Swaminathan за техническую помощь на ранних стадиях этого проек-

та. Мы благодарны также Z. Q. Pan за критическое обсуждение рукописи. Этот проект был поддержан грантами Национального института здравоохранения на S. Y.F.

ЛИТЕРАТУРА

I. Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome _ pathway: on protein death and cell life.

= EMBO J 1998;17(24):7151-60. Q_ 2. Bonifacino J.S., Weissman A.M. Ubiquitin ^ and the control of protein fate in the secretory Z^ and endocytic pathways. Annu Rev Cell Dev ^ Biol 1998;14:19-57. W 3. Holler D., Dikic I. Receptor endocytosis via ubiquitin-dependent and -independent ^ pathways. Biochem Pharmacol = 2004;67(6):1013-7.

S 4. Huangfu W.C., Fuchs S.Y. Ubiquitination-^ dependent regulation of signaling receptors in cancer. Genes Cancer 2010;1(7):725-34.

5. Galan J.M., Haguenauer-Tsapis R.

^ Ubiquitin lys63 is involved in ubiquitination of a yeast plasma membrane protein. EMBO J 1997;16(19):5847-54.

6. Geetha T., Jiang J., Wooten M.W. Lysine 63 polyubiquitination of the nerve growth factor receptor TrkA directs internalization and signaling. Mol Cell 2005;20(2):301-12.

7. Duncan L.M., Piper S., Dodd R.B. et al. Lysine-63-linked ubiquitination is required for endolysosomal degradation of class I molecules. EMBO J 2006;25(8):1635-45.

8. Varghese B., Barriere H., Carbone C.J.

et al. Polyubiquitination of prolactin receptor stimulates its internalization, postinternalization sorting, and degradation via the lysosomal pathway. Mol Cell Biol 2008;28(17):5275-87.

9. Barriere H., Nemes C., Lechardeur D. et al. Molecular basis of oligoubiquitin-dependent internalization of membrane proteins in Mammalian cells. Traffic 2006;7(3):282-97.

10. Kumar K.G., Barriere H., Carbone C.J. et al. Site-specific ubiquitination exposes a linear motif to promote interferon-alpha receptor endocytosis. J Cell Biol 2007;179(5):935-50.

II. Constantinescu S.N., Croze E., Wang C. et al. Role of interferon alpha/beta receptor chain 1 in the structure and transmembrane signaling of the interferon alpha/beta receptor complex. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91(20):9602-6.

12. Colamonici O.R., Porterfield B., Domanski P. et al. Complementation of the interferon alpha response in resistant cells by expression of the cloned subunit of the interferon alpha receptor. A central role of this subunit in interferon alpha signaling. J Biol Chem 1994;269(13):9598-602.

13. Muller U., Steinhoff U., Reis L.F. et al. Functional role of type I and type II interferons in antiviral defense. Science 1994;264(5167):1918-21.

14. Kumar K.G., Krolewski J.J., Fuchs S.Y. Phosphorylation and specific ubiquitin acceptor sites are required for ubiquitination and degradation of the IFNAR1 subunit of type I interferon receptor. J Biol Chem 2004;279(45):46614-20.

15. Kumar K.G., Tang W., Ravindranath A.K. et al. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor. EMBO

J 2003;22(20):5480-90.

16. Kumar K.G., Varghese B., Banerjee A. et al. Basal ubiquitin-independent internalization of interferon alpha receptor is prevented by Tyk2-mediated masking

of a linear endocytic motif. J Biol Chem 2008;283(27):18566-72.

17. Fuchs S.Y. Hope and fear for interferon: the receptor-centric outlook on the future of interferon therapy. J Interferon Cytokine Res 2013;33(4):211-25.

18. Fuchs S.Y. Ubiquitination-mediated regulation of interferon responses. Growth Factors 2012;30(3):141-8.

19. Mosesson Y., Shtiegman K., Katz M.

et al. Endocytosis of receptor tyrosine kinases is driven by monoubiquitylation, not polyubiquitylation. J Biol Chem 2003;278(24):21323-6.

20. Parisien J.P., Lau J.F., Rodriguez J.J. et al. Selective STAT protein degradation induced by paramyxoviruses requires both STAT1 and STAT2 but is independent of alpha/beta interferon signal transduction. J Virol 2002;76(9):4190-8.

21. Li Y., Kumar K.G., Tang W. et al. Negative regulation of prolactin receptor stability and signaling mediated by SCF(beta-TrCP) E3 ubiquitin ligase. Mol Cell Biol 2004;24(9):4038-48.

22. Xu M., Skaug B., Zeng W., Chen Z.J. A ubiquitin replacement strategy in human cells reveals distinct mechanisms of IKK activation by TNFalpha and IL-1beta. Mol Cell 2009;36(2):302-14.

23. Soldatenkov V.A., Dritschilo A., Ronai Z., Fuchs S.Y. Inhibition of homologue of Slimb(HOS) function sensitizes human melanoma cells for apoptosis. Cancer Res 1999;59(20):5085-8.

24. Li Y., Gazdoiu S., Pan Z.Q., Fuchs S.Y. Stability of homologue of Slimb F-box

protein is regulated by availability of its substrate. J Biol Chem 2004;279(12): 11074-80.

25. Liu J., HuangFu W. C., Kumar K.G. et al. Virus-induced unfolded protein response attenuates antiviral defenses via phosphorylation-dependent degradation of the type I interferon receptor. Cell Host Microbe 2009;5(1):72-83.

26. Tan P., Fuchs S.Y., Chen A. et al. Recruitment of a ROC1-CUL1 ubiquitin ligase by Skp1 and HOS to catalyze the ubiquitination of I kappa B alpha. Mol Cell 1999;3(4):527-33.

27. Wu K., Kovacev J., Pan Z.Q. Priming and extending: a UbcH5/Cdc34 E2 handoff mechanism for polyubiquitination on a SCF substrate. Mol Cell 2010;37(6):784-96.

28. Topisirovic I., Gutierrez G.J., Chen M. et al. Control of p53 multimerization by Ubc13 is JNK-regulated. Proc Natl Acad Sci USA 2009;106(31):12676-81.

29. Laine A., Topisirovic I., Zhai D. et al. Regulation of p53 localization and activity by Ubc13. Mol Cell Biol 2006;26(23):8901-13.

30. Goldman L.A., Zafari M., Cutrone E.C. et al. Characterization of antihuman IFNAR-1 monoclonal antibodies: epitope localization and functional analysis. J Interferon Cytokine Res 1999;19(1):15-26.

31. Zhao G.Y., Sonoda E., Barber L.J. et al. A critical role for the ubiquitin-conjugating enzyme Ubc13 in initiating homologous recombination. Mol Cell 2007;25(5):663-75.

32. Hofmann R.M.,

Pickart C.M. Noncanonical MMS2-encoded ubiquitin-conjugating enzyme functions in assembly of novel polyubiquitin chains for DNA repair. Cell 1999;96(5):645-53.

33. Karin M., Gallagher E. TNFR signaling: ubiquitin-conjugated TRAFfic signals control stop-and-go for MAPK signaling complexes. Immunol Rev 2009;228(1):225-40.

34. Laine A., Ronai Z. Ubiquitin chains in the ladder of MAPK signaling. Sci STKE 2005;2005(281):re5.

35. Chen Z.J. Ubiquitin signalling in the NF-kappaB pathway. Nat Cell Biol 2005;7(8):758-65.

36. Fuchs S.Y., Spiegelman V.S., Kumar K.G. The many faces of beta-TrCP E3 ubiquitin ligases: reflections in the magic mirror of cancer. Oncogene 2004;23(11):2028-36.

37. Zeng W., Sun L., Jiang X. et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals

a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell 2010;141(2):315-30.

38. Ragimbeau J., Dondi E., Alcover A. et al. The tyrosine kinase Tyk2 controls IFNAR1 cell surface expression. EMBO J 2003;22(3):537-47.

39. Marijanovic Z., Ragimbeau J., Kumar K.G. et al. TYK2 activity promotes ligand-induced IFNAR1 proteolysis. Biochem J 2006;397(1):31-8.

40. Liu J., Plotnikov A., Banerjee A. et al. Ligand-independent pathway that controls stability of interferon alpha receptor. Biochem Biophys Res Commun 2008;367(2):388-93.

41. Carbone C.J., Zheng H., Bhattacharya S. et al. Protein tyrosine phosphatase 1B is a key

regulator of IFNAR1 endocytosis and a target for antiviral therapies. Proc Natl Acad Sci USA 2012;109(47):19226—31.

42. Payelle-Brogard B.,

Pellegrini S. Biochemical monitoring of the early endocytic traffic of the type I interferon receptor. J Interferon Cytokine Res 2010;30(2):89-98.

43. Wu G., Xu G., Schulman B.A. et al. Structure of a beta-TrCP1-Skp1-beta-catenin complex: destruction motif binding and lysine specificity of the SCF(beta-TrCP1) ubiquitin ligase. Mol Cell 2003;11(6):1445-56.

44. Tang W., Pavlish O.A., Spiegelman V.S. et al. Interaction of Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 with SCFHOS/beta-TrCP E3 ubiquitin ligase regulates extent of

NF-kappaB activation. J Biol Chem 2003;278(49):48942-9.

45. Karin M., Ben-Neriah Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa] B activity. Annu Rev Immunol 2000;18:621-63.

46. Windheim M., Peggie M., Cohen P. Two different classes of E2 ubiquitin-conjugating enzymes are required for the mono-ubiquitination of proteins and elongation by polyubiquitin chains with a specific topology. Biochem J 2008;409(3):723-9.

47. Tenno T., Fujiwara K., Tochio H. et al. Structural basis for distinct roles of Lys63-and Lys48-linked polyubiquitin chains. Genes Cells 2004;9(10):865-75.

CM

CM

Ж

Ш

u