Способ оценки состояния акватории
METHOD OF ESTIMATION OF WATER AREA STATE

Изобретение относится к прикладной гидробиологии и физиологии гидробионтов и может быть использовано для предварительной экспресс-оценки общего уровня загрязненности акватории в естественной среде, в эксперименте и при культивировании.
В прибрежной зоне в условиях антропогенного пресса высокой интенсивности обитает множество представителей флоры и фауны. Эти гидробионты в силу особенностей биологии обладают определенным спектром адаптивных возможностей, позволяющих им существовать в экстремальных условиях среды - при гипоксии, аноксии, колебаниях температуры и солености, при высоких концентрациях загрязняющих веществ. Особенности физиолого-биохимических процессов при адаптации к условиям среды у этих организмов могут выступать в качестве биомаркеров, а сами виды можно использовать в качестве видов-индикаторов при оценке состояния водной среды.
Характерным представителем подобных гидробионтов в Черном море является морской ерш. Морскому ершу присущи оседлый образ жизни хищника-засадчика в литорали и сублиторали, малоподвижность и пониженный уровень обмена. Широкие адаптационные возможности ерша проявляются уже в раннем онтогенезе. Показано, что при экспозиции икринок в неразведенных сточных водах городского коллектора средняя продолжительность жизни эмбрионов ерша в 1,6-2 раза выше, чем у султанки, карася и хамсы и при развитии в нефтесодержащих сточных водах наименьший процент среди аномальных икринок зафиксирован для ерша. Следует также учитывать факт, что на протяжении онтогенеза ерш постоянно пребывает на дне, где многие загрязнители максимально концентрируются в придонных слоях и донных осадках. Благодаря этому в качестве вида-биоиндикатора при оценке состояния водной среды авторы данной методики выбрали морских ершей.
Известны исследования загрязнения местообитания морского ерша по изменчивости RAPD-PCR спектров ДНК в гомогенате мозга [Королёва А.В., Симчук А.П. Изменчивость RAPD-PCR спектров ДНК морского ерша в севастопольских бухтах с разной степенью антропогенного загрязнения. Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 25 (64). 2012, №3, с. 74-80]. Экстрагировали ДНК с помощью реагентов «ДНК-сорб-АМ». При амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб использовали ПЦР-смесь с Taq-полимеразой («АмплиСенс-200-1»). Амплификацию проводили в автоматическом режиме на программируемом амплификаторе с использованием приема «горячий старт». При этом пробирки с реагентами помещали в амплификатор, нагретый до температуры 93-94°С. Данный прием позволяет избежать неспецифического отжига праймеров. Продукты амплификации исследовали методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле в трис-боратном буфере с добавлением бромистого этидия. Это вещество встраивается в двухцепочечную молекулу ДНК и флуоресцирует в ультрафиолетовом свете. В таком виде ДНК-фрагменты были зафиксированы на цифровой фотоаппарат и проанализированы. Обнаружен уникальный ДНК-фрагмент у всех ершей, обитающих в более загрязненной акватории. У ершей из более загрязненных районов ДНК-спектры характеризуются большей степенью единообразия, что свидетельствует о жестком естественном отборе при антропогенном загрязнении. Недостаток такого метода - трудоемкость.
Установлены различия в электрофоретических спектрах белков мышечной ткани морского ерша в зависимости от интенсивности антропогенной загрузки [Королёва А.В., Залевская И.Н. Сравнительный анализ электрофоретического состава белков печени и мышечной ткани морского ерша, обитающего в бухтах с различным антропогенным воздействием, Экосистемы, их оптимизация и охрана, Симферополь, 2010, Вып. 3, с. 110-118] (прототип). По этой методике в гомогенатах мышечной ткани морского ерша определяли фракционный состав белков методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле. Окрашивание электрофореграмм проводили 1%-ным раствором амидочерного 10 В в 7%-ной уксусной кислоте. Стандартные среднестатистические электрофоретические спектры (ЭФ-спектры) рассчитывали с учетом относительной электрофоретической подвижности фракций. В более чистом районе у ершей по сравнению с загрязненным меньше фракций в ЭФ-спектрах белков мышечной ткани (18 против 24), ниже относительная электрофоретическая подвижность (0,00-1,02 против 0,00-1,15), слабее выражен миоальбумин (0,84 против 0,82-0,87) и менее гетерогенны преальбуминовые зоны (2 фракции против 4). Недостатком этого способа также является значительная трудоемкость.
Техническим результатом изобретения является значительное снижение трудоемкости.
Для каждого вида высокоспецифичными являются показатели крови, которые колеблются в достаточно узких пределах, что позволяет использовать их в качестве маркеров различных физиологических и патологических процессов, происходящих на организменном и экосистемном уровне. Так, лейкоцитарная формула является универсальным сигнальным показателем общих неспецифических адаптационных реакций, а количество элементов белой крови характеризует физиологическое состояние особи не только на организменном уровне, но может служить показателем функциональных возможностей для вида и для более широких систематических категорий. Исследование лейкоцитарной формулы рыб является важным элементом наблюдения за их физиологическим состоянием в рыбоводной практике и при комплексных исследованиях популяций в естественных условиях.
Сущность изобретения заключается в том, что способ оценки загрязнения акватории включает использование биоиндикаторов, в качестве видов биоиндикаторов при оценке состояния водной среды используют морских ершей, при этом изменение загрязнения водной среды определяют по количеству лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов в крови рыб, а именно при росте лимфоцитов от 79,4 до 93,87% и падении нейтрофилов от 9,28 и до 1,88%.
Исследования проводились в бухтах Севастополя.
В Севастопольскую бухту и прибрежные воды Севастополя поступает огромное количество элементов и веществ природного и техногенного происхождения, которые в силу особенностей рельефа и течений по-разному распределяются в акватории. Бухты Александровская и Мартынова являются частью полузамкнутой экологически напряженной Севастопольской бухты. Александровская бухта более удалена от открытой части моря, ее воды свободно сообщаются с внутренними водами Севастопольской бухты. Этот факт, а также увеличение стока р. Чёрная и сток ливневых вод в кутовой части бухты объясняют высокий уровень антропогенного воздействия в ней. В придонном водном слое бухты концентрация нефтепродуктов и ртути превышают ПДК соответственно в 6-106 и 2.5-10.0 раз; очень высоки концентрации меди, свинца, цинка в донных отложениях, что создает угрозу вторичного загрязнения. Более того, на отдельных участках акватории этой бухты в связи с ослаблением гидродинамики (особенно в придонном слое) наиболее велика вероятность формирования заморных полей в летний период.
Бухта Мартынова расположена непосредственно за входным створом Севастопольской бухты, и обновление вод в этом динамически активном районе происходит достаточно интенсивно. В грунтах этой бухты содержание ртути близко к природному уровню в морских шельфовых донных осадках, в то время как в других частях Севастопольской бухты концентрация ртути в 20 раз выше. В этой связи особенности изменения лейкоцитарной формулы у ершей из б. Мартынова позволяют предположить резко меняющийся режим поступления в нее загрязнителей.
Среди рассматриваемых бухт наиболее загрязненной является Карантинная. Уровень хлороформ-экстрагируемых веществ и нефтяных углеводородов в донных осадках бухты достигает соответственно 161 и 46 мг/100 г, что почти в 2 раза выше, чем в б. Мартынова.
Для взморья Балаклавы характерны частые сгонно-нагонные явления и ослабление пресса антропогенного воздействия, что и прослеживается в соотношении лейкоцитов у рыб из этого района.
Пример конкретного выполнения.
Для количественного анализа соотношения лейкоцитов у рыб использовали способ определения лейкоцитарной формулы. Кровь отбирали из хвостовой вены ершей из районов с разной степенью загрязненности. Сделали мазки на предметном стекле. После высушивания мазки 5 минут фиксировали жидкостью Май-Грюнвальда, промыли и окрасили 30 минут азурэозином по Романовскому-Гимза. После окраски препараты хорошо прополоскали сначала дистиллированной, а затем простой водой и снова высушили. Исследовали окрашенные препараты под световым микроскопом МБИ-9 с применением иммерсионного объектива.
Авторами установлено, что лейкоцитарная формула у ершей в бухтах с разной загрязненностью изменялась. Обнаружена закономерность - при возрастании уровня загрязнения в крови рыб количество лимфоцитов увеличивается, а сегментоядерных нейтрофилов уменьшается (р≤0,05). Отмечено также, что у ершей из относительно чистой бухты при возрастании уровня загрязнении в лейкоцитарной формуле оперативно увеличивается количество лимфоцитов и снижается - нейтрофилов. Так, уровень лимфоцитов у ершей из разных бухт варьировал от 79,4% до 93, 88%, а сегментоядерных нейтрофилов - от 1,88 до 9,28% (Табл). Таким образом, лимфоциты и сегментоядерные нейтрофилы крови морских ершей тонко реагируют на изменение параметров среды.
Предложенный способ обладает рядом преимуществ:
- предложен простой, эффективный и репрезентативный способ оценки загрязненности акватории;
- для оценки загрязнения достаточно проанализировать количества лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов.
Заявленный способ может быть использован как экспресс-метод для предварительной оценки загрязнения, поскольку, отловив рыбу и определив лейкоцитарную формулу (количество лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов), можно судить о примерном уровне экологического благополучия акватории и ее общем состоянии.