СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОБИОТИКОВ НА ОСНОВЕ ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ БИОМАССЫ АЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ ПО ОТНОШЕНИЮ К ПАТОГЕННЫМ МИКОБАКТЕРИЯМ
METHOD OF PROBIOTIC ANALYSIS FOR ANTAGONISTIC ACTIVITY CONCERNING LYOPHILISED AEROBIOTIC BACTERIA BIOMASS IN RELATION TO PATHOGENIC MYCOBACTERIA

Изобретение относится к микробиологии, касается способа оценки антагонистической активности пробиотиков на основе лиофилизированной биомассы аэробных бактерий и может быть использовано для отбора препаратов-пробиотиков медицинского и ветеринарного назначения.
Одним из показателей специфической активности пробиотиков и производственных штаммов для их изготовления является наличие антагонистического действия в отношении патогенной и условно патогенной микрофлоры.
Известен способ отсроченного антагонизма, когда подсев индикаторных штаммов на плотную питательную среду проводится через определенный период после посева испытуемой культуры [1].
Антагонистическую активность пробиотиков и бактериальных штаммов можно определить in vitro регламентированными способами, включающими совместное культивирование с индикаторными культурами в жидкой или на плотной питательной среде [2]. Определение антагонистической активности пробиотиков по отношению к индикаторным штаммам методом прямого антагонизма рассматривается нами в качестве предпочтительного аналога.
Общим недостатком известных способов является их неэффективность при определении антагонистической активности пробиотиков по отношению к микобактериям из-за особенностей биологии последних, касающихся скорости роста и требований к питательным средам, что затрудняет совместное культивирование с другими микроорганизмами.
Цель изобретения - повышение эффективности.
Поставленная цель достигается использованием для совместного культивирования среды, содержащей L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов:
L-аспарагин
0,4 г
калий фосфорнокислый двузамещенный
0,05 г
сернокислый магний
0,05 г
лимонная кислота
0,2 г
лимоннокислое аммиачное железо
0,005 г
пируват натрия
0,05 г
глицерин
4,0 г
агар
3,0 г
гумивит
10,0 мл
водный раствор желтка куриного яйца (1:1)
10,0 мл
дистиллированная вода
до 100,0 мл
Причем исследуемый материал вносят в количестве 16-32% от общего объема среды, после чего пробирки прогревают на кипящей водяной бане в течение 5 минут, а антагонистическую активность оценивают по отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением среды культивирования (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика (опыт).
Способ осуществляется следующим образом.
Ампулу с сухим пробиотиком вскрывают и регидратируют 0,9% раствором натрия хлорида. В стерильную пробирку с расплавленной и охлажденной до 70°С средой, содержащей L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду, инокулируют пробиотик в количестве 16-32% от общего объема среды, пробирку прогревают на кипящей водяной бане в течение 5 минут, после чего среду скашивают, а затем на поверхность косячка осуществляют посев индикаторного штамма с последующим культивированием при температурном (37°С) и временном (30 дней) оптимуме. Контроль - косячки расплавленной и охлажденной до 70°С среды, содержащей L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду, с добавлением среды культивирования.
Для приготовления среды в химически чистую стерильную колбу емкостью 200 мл наливают 30,0 мл дистиллированной воды, прогревают на водяной бане до 75-85°С. В воде растворяют последовательно 0,2 г лимонной кислоты, 0,4 г L-аспарагина, 0,05 г сернокислого магния, 0,05 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,005 г лимоннокислого аммиачного железа, 0,05 г пирувата натрия, 4,0 г глицерина, 10,0 мл гумивита и 3,0 г агара. Каждый компонент добавляют после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов устанавливают рН 7,1-7,2 10% раствором натрия гидроокиси, общий объем доводят до 90,0 мл стерильной дистиллированной водой. Раствор автоклавировают в течение 30 минут при 1 атм. Свежие куриные яйца хорошо промывают в проточной воде, протирают 96° этиловым спиртом, разбивают в стерильных условиях и отделяют белок от желтка. В стерильной колбе смешивают желток и дистиллированную воду в соотношении 1:1 и 10,0 мл полученного раствора добавляют в расплавленную агаровую среду и перемешивают.
Гумивит - щелочной гидролизат низинных сортов торфа (выпускается ООО Агропром) представляет собой высокодисперсный золь натриевых солей комплекса гумусных кислот - гуминовых, гуматомелановых и фульвокислот [3]. Раствор солей гумусных кислот состоит из длинных фрагментарных цепочек с различными функциональными группами, важнейшими из которых являются карбоксильные (СООН) и фенольные (ОН), способные образовывать хелатные комплексы с микроэлементами, что обеспечивает их высокую обменную емкость и транспорт в клетку микроорганизмов [4, 5]. Гумивит - жидкость темно-коричневого до черного цвета со специфическим сладковатым запахом, благодаря чему готовая среда имеет интенсивно коричневый цвет, на фоне которого хорошо видны даже мелкие колонии в начальной фазе роста.
Исследования проводили с использованием пробиотического препарата окарин (ИмБио, г.Нижний Новгород), представляющего собой лиофилизированную биомассу живых микробных культур - представителей нормальной микрофлоры кишечника здорового человека, включающих три штамма кишечных палочек и фекальный энтерококк.
Сущность изобретения поясняется примерами.
Пример 1. Определение антагонистической активности окарина (ИмБио, Нижний Новгород) по отношению к M.tuberculosis (шт.Academia), M.avium (шт.ГИСК), M.bovis (шт.Vallee, Ravenal).
Ампулу с сухим пробиотиком вскрывали и регидратировали 0,9% раствором натрия хлорида с температурой 15-20°С из расчета 1 мл на одну дозу препарата. Продолжительность регидратации при интенсивном встряхивании составляла 2-5 минут. В стерильную пробирку с 3,0 мл расплавленной и охлажденной до 70°С средой, содержащей 0,4 г L-аспарагина, 0,05 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,05 г сернокислого магния, 0,2 г лимонной кислоты, 0,005 г лимоннокислого аммиачного железа, 0,05 г пирувата натрия, 4,0 г глицерина, 3,0 г агара, 10,0 мл гумивита, 10,0 мл водного раствора желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду (до 100,0 мл), инокулировали побиотик в количестве 20% от общего объема среды (0,6 мл), пробирку прогревали на кипящей водяной бане в течение 5 минут, после чего среду скашивали, а затем на поверхность косячка осуществляли посев индикаторного штамма с последующим культивированием при температурном (37°С) и временном (30 дней) оптимуме. Контроль - косячок (3,0 мл) расплавленной и охлажденной до 70°С среды, содержащей 0,4 г L-аспарагина, 0,05 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,05 г сернокислого магния, 0,2 г лимонной кислоты, 0,005 г лимоннокислого аммиачного железа, 0,05 г пирувата натрия, 4,0 г глицерина, 3,0 г агара, 10,0 мл гумивита, 10,0 мл водного раствора желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду (до 100,0 мл) с добавлением казеинового бульона в количестве 20% от общего объема среды (0,6 мл). Количественную оценку проводили по отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением казеинового бульона (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика с последующим прогреванием (опыт).
Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Оценка антагонистической активности окарина по отношению к патогенным микобактериям
Пробиотический препарат
Индекс блокирования роста*
M.avium ГИСК
M.tuberculosis Academia
M.bovis Vallee
M.bovis Ravenal
Окарин в количестве 20% от общего объема среды
9
7
8
9
Примечание: отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением казеинового бульона (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика с последующим прогреванием (опыт).
Пример 2. Эффективность способа оценки антагонистической активности окарина (ИмБио, г.Нижний Новгород) по отношению к референс-штаммам M.tuberculosis (шт.Academia), M.avium (шт.ГИСК), M.bovis (шт.Vallee, Ravenal) в зависимости от количества пробиотика.
Схема оценки антагонистической активности как в примере 1. Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2
Антагонистическая активность окарина по отношению к патогенным микобактериям
Количество пробиотика, % от общего объема среды
Индекс блокирования роста*
M.avium ГИСК
M.tuberculosis Academia
M.bovis Vallee
M.bovis Ravenal
4,0
2
1
1
1
8,0
3
2
2
2
16,0
9
7
8
9
32,0
9
8
8
9
Примечание: отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением казеинового бульона (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика с последующим прогреванием (опыт).
Пример 3. Эффективность способа определения антагонистической активности окарина (ИмБио, Нижний Новгород) по отношению к клиническим штаммам M.bovis (№2 и 3) и M.avium (№4), выделенным из лимфатических узлов крупного рогатого скота, в зависимости от количества пробиотика. Схема определения антагонистической активности как в примере 1. Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3
Антагонистическая активность окарина по отношению к патогенным микобактериям
Количество пробиотика, % от общего объема среды
Индекс блокирования роста*
M.avium №4
M.bovis
№2
№3
4,0
3
2
2
8,0
5
2
2
16,0
9
7
7
32,0
9
8
7
Примечание: отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением казеинового бульона (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика с последующим прогреванием (опыт).
Проведенные исследования подтвердили возможность оценки антагонистической активности пробиотиков на основе лиофилизированной биомассы аэробных бактерий способом в соответствии с изобретением. Полученные результаты свидетельствуют о сопоставимости показателей антагонистической активности пробиотиков по отношению к референс-штаммам и клиническим изолятам, полученным от крупного рогатого скота с подтвержденным диагнозом на туберкулез. Применение способа предполагает наличие параметров величины индекса блокирования роста и концентрации исследуемого материала для каждого препарата. Способ прост в осуществлении и может быть использован в качестве основного или дополнительного теста при определении антагонистической активности пробиотиков на основе бактерий и их метаболитов.
Источники информации
1. Бифидобактерин сухой. ФС 42-3947.12.07.2000
2. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник под ред. проф. В.В.Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - С.341-343.
3. Гришин Г.И., Слинина К.Н. // Практик. - 2004. - №3-4. - С.80-82.
4. Левинский Б.В. Все о гуматах. - Иркутск: ИП Марков С.Е., 1999. - 198 с.
5. Сорокина Н.Ф. Физиология активности продуктов окисления торфам / Новые процессы и продукты переработки торфа. - Минск: Наука, 1982. - С.109-115.