НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ГИСТОПЛАЗМОЗА HISTOPLASMA CAPSULATUM МЕТОДОМ АМПЛИФИКАЦИИ ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИХ ФРАГМЕНТОВ ДНК (DFR)
SET OF OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS FOR TYPING OF HISTOPLASMA CAPSULATUM STRAIN HISTOPLASMOSIS AGENT BY AMPLIFICATION OF DIFFERENTIATING DNA FRAGMENTS (DFR)

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии, эпидемиологии и может быть использовано для внутривидовой дифференциации штаммов Histoplasma capsulatum специалистами референс-центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней, а также научно-исследовательских организаций эпидемиологического и микробиологического профиля.
Микромицеты Histoplasma capsulatum являются возбудителями гистоплазмоза. Вид Н. capsulatum, на основании патогенности и морфологии дрожжевой формы клеток, подразделяют на 3 разновидности, две из которых – Н. capsulatum var. capsulatum и Н. capsulatum var. duboisii - способны вызывать заболевание у человека и животных. Третья разновидность - Н. capsulatum var. farciminosum - вызывает подкожные и язвенные поражения кожи только у лошадей и мулов. Kasuga Т. с соавторами установили, что Н. capsulatum состоит из восьми филогенетических групп, семь из которых могут выступать в качестве самостоятельных видов: Североамериканский класс 1, Североамериканский класс 2, Латиноамериканская группа А, Латиноамериканская группа В, Австралийская группа, Нидерландская группа, Евразийская группа и Африканская группа. Возможно, существуют и другие группы или филогенетические виды в Центральной и Южной Америке.
Генотипирование - комплексный анализ уникального для каждого живого организма генотипа на основе изучения его ДНК. Метод генотипирования на основе амплификации вариабельных регионов (DFR - different region) заключается в серии полимеразных цепных реакций с праймерами, фланкирующими фрагменты уникальных ДНК, существующих только у определенных штаммов, что позволяет проводить их внутривидовую дифференциацию.
Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления целевых участков ДНК. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.
Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных штаммов определенного вида микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генотипирования штаммов Н. capsulatum.
Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды, специфичные для штаммов возбудителя гистоплазмоза. Праймеры комплиментарны последовательностям ДНК дифференцирующего фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор дифференцирующего фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемых микромицетов.
Анализ литературы свидетельствует о том, что оптимальной схемы генотипирования штаммов Н. capsulatum на сегодняшний день не существует. Наиболее точным методом внутривидовой дифференциации данных микромицетов является мультилокусное сиквенс-типирование, предложенное Kasuga et al., 1999 [Phylogenetic Relationships of Varieties and Geographical Groups of the Human Pathogenic Fungus Histoplasma capsulatum Darling T. Kasuga, J.W. Taylor, T.J. White, J Clin Microbiol. 1999, Mar; 37(3): 653-663]. Однако, необходимость использования дорогостоящего оборудования и реактивов делают его доступным лишь для ограниченного числа лабораторий. Внутривидовое типирование методом ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК, в свою очередь, не обладает достаточной межлабораторной воспроизводимостью результатов. Типирование штаммов Н. capsulatum с помощью метода амплификации дифференцирующих фрагментов ДНК (DFR) является разумным компромиссом, позволяющим проводить воспроизводимые исследования с достаточной точностью, но при этом с низкой стоимостью. Для дифференциации возбудителя гистоплазмоза данный метод предложен нами впервые.
Наиболее близким аналогом изобретения является схема генотипирования методом амплификации дифференцирующих фрагментов для возбудителя мелиоидоза, предложенная Kwanjit Duangsonk с соавторами в 2006 г. [Use of а Variable Amplicon Typing Scheme Reveals Considerable Variation in the Accessory Genomes of Isolates of Burkholderia pseudomallei, Kwanjit Duangsonk, Daniel Gal, Mark Mayo, C. Anthony Hart, Bart J. Currie, and Craig Winstanley, J Clin Microbiol. 2006 Apr; 44(4): 1323-1334]. В доступной литературе публикаций по использованию для дифференциации возбудителя гистоплазмоза метода DFR не найдено.
Целью настоящего изобретения является разработка набора олигонуклеотидных праймеров для внутривидового типирования микромицетов Н.capsulatum методом амплификации дифференцирующих участков геномной ДНК.
Цель достигается конструированием набора специфичных олигонуклеотидов для внутривидового типирования штаммов возбудителя гистоплазмоза путем амплификации 7 дифференцирующих фрагментов ДНК Н. capsulatum, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющих следующую структуру:
для амплификации дифференцирующего фрагмента HcDFR3 длиной 504 п. н.;
для амплификации дифференцирующего фрагмента HcDFR7 длиной 199 п. н.;
для амплификации дифференцирующего фрагмента HcDFR8 длиной 172 п. н.;
для амплификации дифференцирующего фрагмента HcDFR9 длиной 166 п. н.;
для амплификации дифференцирующего фрагмента HcDFR10 длиной 188 п. н.;
для амплификации дифференцирующего фрагмента HcDFR 11 длиной 173 п. н.;
для амплификации дифференцирующего фрагмента HcDFR 12 длиной 134 п. н.
Характеристика набора олигонуклеотидных праймеров
Основываясь на последовательностях геномов, представленных в базе данных Broad Institute of MIT and Harvard (США) [http://archive.broadinstitute.org/ftp/pub/annotation/fungi/histoplasma_capsulatum/], были сконструированы 7 пар олигонуклеотидных праймеров, комплементарных дифференцирующим фрагментам геномов Н. capsulatum. Рассчитана длина каждого специфического фрагмента и подобрана температура отжига для каждой пары праймеров.
Апробация праймеров была осуществлена на штаммах Н. capsulatum из коллекционного центра ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора. Для выделения ДНК использовали обеззараженные суспензии микромицетов. Внутривидовую дифференциацию штаммов проводили посредством амплификации 7 вариабильных регионов ДНК возбудителя гистоплазмоза с помощью разработанного набора праймеров, с последующим построением бинарной матрицы амплификационных паттернов и их кластерным анализом. Визуализацию результатов проводили путем построения дендрограммы при помощи невзвешенного парно-группового метода UPGMA (Unweighted pair-group method using arithmetic averages) с использованием коэффициента генетической дистанции М. Nei и W. Li [Tamura К., Nei М., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035].
Примеры конкретного выполнения
Пример 1. Конструирование набора олигонуклеотидных праймеров для амплификации дифференцирующих фрагментов ДНК Н. capsulatum
На основе анализа in silico изучены нуклеотидные последовательности четырех штаммов Н. capsulatum WU24, Н. capsulatum G186AR, Н. capsulatum Н88 и Н. capsulatum H143 из генетической базы данных Broad Institute of MIT and Harvard
[http://archive.broadinstitute.org/ftp/pub/annotation/fungi/histoplasma_capsulatum/]. Проведено выравнивание последовательностей геномных ДНК указанных штаммов при помощи алгоритма Dot Plot, поиск вариабельных фрагментов геномов осуществляли посредством алгоритма Blastn. Подбор праймеров для типирования штаммов возбудителя гистоплазмоза Н. capsulatum методом амплификации DFR был проведен при помощи программного пакета VectorNTI Express 1.6.0 (Invitrogen, США). В качестве референсной последовательности для выравнивания был выбран геном штамма Н. capsulatum WU24. Выровненные последовательности были разделены на фрагменты длиной в 1000 нуклеотидов, которые в дальнейшем использовались для обнаружения вариабельных участков геномов Н. capsulatum при помощи алгоритма Blastn. Для работы отбирались последовательности длиной от 200 до 1000 п. о., обладающие гомологией менее 90%.
В результате сравнительного анализа геномных последовательностей была создана библиотека, состоящая из 204 вариабельных регионов Н. capsulatum. На основе данных регионов подобраны in silico 7 пар олигонуклеотидных праймеров для типирования штаммов возбудителя гистоплазмоза Н. capsulatum методом DFR. Структура выбранных пар праймеров была проанализирована (образование димеров, шпилек и других вторичных структур) при использовании компьютерных программ и показана их теоретическая пригодность для успешной инициации реакции амплификации вариабельных регионов Н. capsulatum.
В таблице 1 представлена характеристика разработанных олигонуклеотидных праймеров для амплификации дифференцирующих фрагментов ДНК возбудителя гистоплазмоза.
Пример 2. Амплификация дифференцирующих участков ДНК с помощью разработанного набора олигонуклеотидных праймеров для типирования штаммов Н. capsulatum методом DFR
Работу с микромицетами Н. capsulatum, включая обеззараживание, проводили согласно требованиям СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» и МУ 1.3. 2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение ДНК из чистых культур Н. capsulatum осуществляли после предварительного воздействия фермента «Chitinase from Trichoderma viride» («Sigma-ALDRICH», Германия) методом гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом [Сравнительный анализ методов выделения ДНК из клеток Histoplasma capsulatum Darling. Вьючнова Н.В., Ткаченко Г.А., Гришина М.А., Савченко С.С., Антонов В.А., Липницкий А.В. Проблемы медицинской микологии. 2009. Т. 11. №3. С. 38-42].
2
Для амплификации дифференцирующих участков ДНК возбудителя гистоплазмоза проводили постановку 7 отдельных реакций амплификации с разработанными нами олигонуклеотидными праймерами для внутривидового типирования штаммов Н. capsulatum методом DFR. В состав каждой реакционной смеси, кроме прямого и обратного праймеров, входили дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ), MgCl, реакционный буфер, фермент Taq-полимеразы (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва).
Этап амплификации проводили на четырехканальном программируемом термостате ТП4-ПЦР-01- «Терцик» («ДНК-Технология», Россия). Подготовленные реакционные смеси помещали в термоциклер с заданными параметрами: этап инициации - 95°С 5 мин; затем денатурация при 95°С - 10 с, температура отжига праймеров, которую подбирали индивидуально в зависимости от выбранного локуса, варьировали от 53°С до 63°С - 10 с (таблица 1), элонгация проходила при 72°С - 1 мин, количество циклов 42; заключительный этап элонгации 10 мин; режим хранения при 4°С.
Анализ продуктов ПЦР осуществляли с помощью электрофореза в 2% агарозном геле, сравнивая их с подвижностью полос маркеров молекулярного веса. Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждалась ее положением по отношению к контрольным маркерным фрагментам (леддер 50 - 2000 п. н. ДНК, DNA Ladder «AmpliSizeTMMolecularRuler» «BioRad», США).
На рисунке 1 изображена электрофореграмма продуктов амплификации ДНК музейных штаммов Н. capsulatum с помощью разработанных праймеров HcDFR 12s/HcDFR 12as из набора для типирования штаммов возбудителя гистоплазмоза методом амплификации дифференцирующих фрагментов ДНК (1. Н. capsulatum var. capsulatum 73002, 2. Н. capsulatum var. capsulatum 73004, 3. H. capsulatum var. capsulatum J- 185-B, 4. H. capsulatum var. capsulatum 510, 5. H. capsulatum var. duboisii 681, 6. H. capsulatum var. capsulatum B-580, 7. H. capsulatum var. capsulatum 6652, 8. H. capsulatum var. capsulatum 6650).
Пример 3. Применение набора олигонуклеотидных праймеров для типирования штаммов возбудителя гистоплазмоза методом амплификации дифференцирующих фрагментов ДНК (DFR) для внутривидовой дифференциации штаммов Н. capsulatum из коллекции ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.
Постановку реакции ПЦР для каждого штамма возбудителя гистоплазмоза из коллекции ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора осуществляли, как описано в примере 2. По результатам ПЦР составлена сводная таблица паттернов амплификации штаммов H. capsulatum (DFR-профили), отображающая наличие и отсутствие вариабельных DFR-локусов соответствующих размеров. Полученные данные были переведены в двоичную матрицу для последующего анализа in silico. Положительные результаты амплификации фиксировали как «1», а отрицательные как «0», что свидетельствовало о наличии или отсутствии определенного DFR-локуса у штаммов Н. capsulatum.
В таблице 2 представлены генетические DFR-профили исследуемых штаммов возбудителя гистоплазмоза в виде двоичной матрицы, к которой были добавлены паттерны, полученные при анализе in silico, четырех штаммов H.capsulatum (WU24, G186AR, Н88, Н144), геномы которых доступны в базе данных Broad Institute of MIT and Harvard.
Для визуализации результатов типирования построение дендрограммы проводили при помощи невзвешенного парно-группового метода UPGMA (Unweighted pair-group method using arithmetic averages) с использованием коэффициента генетической дистанции М. Nei и W. Li. В результате штаммы микромицетов из коллекции ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора при коэффициенте генетической дистанции, равном 0,05, были разделены на 6 групп. В первую группу вошли Н. capsulatum var. duboisii 681 и H. capsulatum var. capsulatum B-580. Вторая группа была представлена штаммами Н. capsulatum var. capsulatum 6652 и Н. capsulatum var. capsulatum 6650. Оставшиеся 4 штамма образовывали уникальные группы.
На рисунке 2 изображен результат кластерного анализа паттернов амплификации штаммов Н. capsulatum в виде дендрограммы и DFR-профили, полученные с помощью разработанного набора олигонуклеотидных праймеров для типирования штаммов возбудителя гистоплазмоза. Дендрограмма построена при помощи невзвешенного парно-группового метода UPGMA (Unweighted pair-group method using arithmetic averages) с использованием коэффициента генетической дистанции М. Nei и W. Li. Подчеркиванием обозначены штаммы из коллекции ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора. Черные квадраты указывают на наличие ампликонов вариабельных DFR-локусов. Белые квадраты указывают на отсутствие ампликонов DFR-локусов.
Таким образом, разработанный набор олигонуклеотидных праймеров позволяет проводить внутривидовое генетическое типирование штаммов H.capsulatum с высокой воспроизводимостью и разрешающей способностью, а также относительно низкой стоимостью. В предлагаемом методе используется только оборудование для проведения ПЦР с соответствующими реагентами, что может способствовать широкому внедрению данного молекулярно-генетического подхода в научно-исследовательских организациях и специализированных лабораториях эпидемиологического и микробиологического профиля.
Олигонуклеотидные праймеры, идентичные последовательностям нуклеотидов, изложенным в описании и формуле изобретения «Набор олигонуклеотидных праймеров для типирования штаммов возбудителя гистоплазмоза Histoplasma capsulatum методом амплификации дифференцирующих фрагментов ДНК (DFR)»:
5’ -CTTCTTATTCCTTGTATCAC -3’ - HcDFR 3s
5’ -CATCTTATTGTCACTGTTTC -3’ - HcDFR 3as
5’ -GAGTTTCTTACATCAATACA -3’ - HcDFR 7s
5’ -CTCTGCTTCTACTTATCTG -3’ - HcDFR 7as
5’ -GAAGCAGAAGCAGTATGAGG -3’ - HcDFR 8s
5’ -TACGGACAATGACAAATGAG -3’ - HcDFR 8as
5’ -GAAGCAGAAGCAGTATGAGG -3’ - HcDFR 9s
5’ -CAATGACAAATGAGCAGG -3’ -  HcDFR 9as
5’ -CAGTTGGATAGATGATGT -3’ - HcDFR 10s
5’ -ATGAAGAAGGAGTTGAG -3’ - HcDFR 10as
5’ -GAAGCAGAAGCAGTATGAGG -3’ - HcDFR 11s
5’ -ATACGGACAATGACAAATGA -3’ - HcDFR 11as
5’ -CGGACAATGACAAATGA -3’ - HcDFR 12s
5’ -CAAACAGCAGATAAAGACAA -3’ - HcDFR 12as