Способ создания модели для изучения физиологии и патологии пренатального периода онтогенеза на курином эмбрионе
METHOD FOR CREATING A MODEL FOR STUDYING THE PHYSIOLOGY AND PATHOLOGY OF A PRENATAL PERIOD OF ONTOGENESIS ON A CHICKEN EMBRYO

Предлагаемое изобретение для изучения физиологии и патологии пренатального периода онтогенеза в лабораторных условиях на куриных эмбрионах открытым методом ex ovo относится к области экспериментальной медицины, а именно к эмбриологии, патологической физиологии и ветеринарии. Главным предназначением предложенного способа является культивирование куриных эмбрионов в лабораторных условиях с целью их дальнейшего использования для изучения физиологии и патологии пренатального периода онтогенеза, а также для скрининга эмбриотоксичных и тератогенных веществ.
В настоящее время в медицине остро стоит проблема лечения врожденных пороков развития, ее решение невозможно без знаний их патогенеза. Поэтому изучение физиологии и патологии внутриутробного периода развития позвоночных является одной из центральных задач медицины и ветеринарии. В клинической медицине знание этиологии и патогенеза врожденных пороков развития необходимо для разработки новых методов их профилактики и лечения.
Одним из наиболее удобных объектов при проведении исследований по изучению физиологии и патологии пренатального периода онтогенеза является куриный эмбрион, что обусловлено его доступностью, удобством манипуляций и относительно коротким эмбриональным периодом (Kain K.Н. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research // Developmental Dynamics. - 2014. - V. 243. - №. 2. - P. 216-228). Считается, что механизмы эмбрионального развития схожи у всех позвоночных, поэтому результаты исследований справедливы для большинства представителей класса, включая млекопитающих и человека (Kintner С.R., Dodd J. Hensen’s node induces neural tissue in Xenopus ectoderm. Implications for the action of the organizer in neural induction // Development. - 1991. - V. 113. - №. 4. - P. 1495-1505; Hatta K., Takahashi Y. Secondary axis induction by heterospecific organizers in zebrafish // Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. - 1996. - V. 205. - №. 2. - P. 183-195). Отдельно стоит подчеркнуть необходимость изучения эмбриотоксичности и тератогенности различных веществ, что является важной задачей при испытании новых лекарственных препаратов, биологически активных добавок и прочих продуктов.
Традиционные способы работы с куриными эмбрионами основаны на применении гистологических методик, которые требуют фиксации тканей, что делает такой метод изучения поэтапным в связи с необходимостью прерывания онтогенеза. Эта особенность не позволяет изучать эмбриогенез в динамике на одной и той же группе эмбрионов, использовать современные методы визуализации и проводить различные манипуляции (Hamburger V., Hamilton Н.L. A series of normal stages in the development of the chick embryo // Journal of Morphology. - 1951. - V. 88. - P. 49-92).
К более перспективным способам изучения пренатального периода онтогенеза относятся методы работы с куриным эмбрионом in ovo, особенностью которых является выполнение наблюдения и манипуляций с эмбрионом за счет формирования небольшого отверстия в скорлупе яйца со стороны воздушного мешка (Barfurth D., Dragendorff О. Versuche  Regeneration des Auges und der Linse beim  // Anat. Anz. - 1902. - V. 21. - P. 185-199). При таком методе имеется возможность наблюдать весь период эмбрионального развития на одном эмбрионе, а также проводить различные манипуляции. Однако выживаемость куриных эмбрионов при использовании данного метода значительно ниже, а размер и расположение отверстия накладывают существенные ограничения на объем доступных вмешательств, а также предоставляют довольно скудные возможности применения техник визуализации, поскольку воздушный мешок выстлан богато васкуляризованной хориоаллантоисной мембраной (Andacht Т., Hu W., Ivarie R. Rapid and improved method for windowing eggs accessing the stage X chicken embryo // Molecular Reproduction and Development: Incorporating Gamete Research. - 2004. - V. 69. - №. 1. - P. 31-34).
В связи с недостатками вышеописанных способов культивирования куриных эмбрионов целесообразно применение безскорлупного выращивания - ex ovo. Описано большое количество методик выращивания куриных эмбрионов в чашках Петри (New D. А. Т. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro // Development. - 1955. - V. 3. - №. 4. - P. 326-331). Однако такой способ не позволяет охватить весь период пренатального онтогенеза, так как зародыши гибнут еще на относительно ранних стадиях развития из-за неестественного положения в чашке Петри, при котором нарушается закладка органов и систем, а также не происходит замыкание хориоаллантоисной мембраны из-за чего развивается гипоксия.
Наиболее перспективным способом выращивания куриных эмбрионов является использование систем, условия в которых максимально приближены к естественным. Этого можно добиться применением полимерных пленок, заменяющих скорлупу, которые, обладают определенной проницаемостью для газов, а также принимают овоидную или близкую к ней форму. Одна из первых таких систем предполагала применение политетрафторэтиленовой пленки и использовалась для культивирования перепелов (Kamihira М. Improved hatching for in vitro quail embryo culture using surrogate eggshell and artificial vessel // Development, growth & differentiation. - 1998. - V. 40. - №. 4. - P. 449-455). Выживаемость эмбрионов в экспериментах на данной системе составила 43%. Фактором, существенно ее ограничившим, авторы признали гипоксию эмбрионов.
Ближайшим аналогом предлагаемого способа инкубации куриных эмбрионов является способ, предложенный Tahara и соавт.(Tahara Y., Obara K. A novel shell-less culture system for chick embryos using a plastic film as culture vessels // The Journal of Poultry Science. - 2014. - V. 51. - №. 3. - P. 307-312). Для безскорлупного культивирования куриного эмбриона, согласно методике, используют пластиковые стаканы и полиметилпентеновую пленку, образующие простую в изготовлении систему для инкубации. В качестве донатора ионов кальция используется лактат кальция, а в качестве антисептика в системе применяют хлорид бензалкония. Выживаемость эмбрионов в исследованиях авторов методики составила 57%, что во многом удалось достигнуть благодаря дополнительной оксигенации эмбрионов на поздних стадиях.
Лактат кальция - кальциевая соль молочной кислоты, порошок белого цвета, медленно растворим в холодной воде, благодаря чему в системе не происходило резкого закисления среды. Является донором ионов кальция, тем самым выполняя одну из функций скорлупы.
Чистый кислород - в исследовании авторы методики подавали его в систему с 17-х суток инкубации, когда эмбрион резко увеличивает потребление кислорода и начинает легочное дыхание. Это позволило избежать развития характерной для поздних стадий инкубации гипоксии.
Недостатками указанного способа является относительно низкая доступность названных компонентов, а именно полиметилпентеновой пленки и хлорида бензалкония. Также стоит отметить, что дополнительная оксигенация снижает влажность в системе для культивирования, что отрицательно сказывается на выживаемости куриных эмбрионов. Использование лактата кальция приводит к относительно неравномерному поступлению ионов кальция по мере его растворения, а образующаяся молочная кислота способствует развитию ацидоза.
Задачи:
1) разработать простой и дешевый способ культивирования куриных эмбрионов ex ovo для использования их в качестве модели для изучения физиологии и патологии пренатального периода онтогенеза;
2) повысить удобство манипуляций и использования технологий визуализации при работе с куриным эмбрионом;
3) обеспечить выживаемость куриных эмбрионов при их культивировании в системе ex ovo не ниже 50%;
4) повысить доступность культивирования куриных эмбрионов для широкого круга исследователей.
Сущностью изобретения является создание способа культивирования куриных эмбрионов ex ovo при использовании особой системы для культивирования на основе широкодоступных компонентов, условия в которой приближены к естественным.
Основными компонентами системы для культивирования куриных эмбрионов ex ovo являются:
Пластиковые стаканы объемом 500 мл.
Полиэтиленовая пленка пищевая, толщиной 8-12 мкм, формирующая избирательный газовый барьер.
Альгинат кальция - кальциевая соль альгиновой кислоты. При добавлении воды образует высоковязкую субстанцию, выполняет функцию донора ионов кальция. Обеспечивает постепенную, равномерную отдачу ионов кальция без развития ацидоза.
Трубки от системы для внутривенных инфузий использованы для подачи кислорода.
Увлажнитель-очиститель воздуха с ультразвуковым испарителем. Наличие испарителя позволяет существенно увеличить влажность подаваемого воздуха и, тем самым, предотвратить пересыхание поверхности культивируемого куриного эмбриона.
Бензилдиметил [3-(миристоиламино)пропил] аммонийхлорид моногидрат - 0,01% раствор (Мирамистин), антисептик на водной основе, при испарении повышает влажность внутри системы и выполняет антисептическую функцию. Достоинствами антисептика является отсутствие выявленных эмбриотоксических свойств, а также pH около 6.5, благодаря чему не происходит избыточного закисления среды в системе.
Гентамицина сульфат, антибиотик, в дозировке 0,4 мг на один куриный эмбрион. Данный антибиотик не метаболизируется, благодаря чему имеет место его продолжительное действие.
Кислородный генератор. Оксигенация позволяет избежать гипоксии на поздних сроках инкубации куриных эмбрионов, что существенно повышает их выживаемость.
Техническим результатом является культивирование куриного эмбриона ex ovo до получения живого цыпленка на 21-22 сутки инкубации, данный способ служит моделью для изучения физиологии и патологии пренатального периода онтогенеза.
Система для культивирования куриного эмбриона представляет из себя полиэтиленовый стакан объемом 500 мл, в котором, в «мешке» сформированном и закрытом полиэтиленовой пленкой, развивается куриный эмбрион. При этом в стакане для культивирования на 6 день инкубации сбоку на высоте 2 см от дна выполняют отверстия диаметром 7-8 мм для последующего подвода воздуха при помощи трубок от системы для внутривенных инфузий. На дно стакана для культивирования предварительно вносят 30 мл раствора бензилдиметил[3-(миристоиламино)пропил]аммоний хлорид моногидрата (мирамистин). На стакан в верхней части натягивают полиэтиленовую пленку и формируют «мешок». Далее в верней части пленки, по ее периметру, с внутренней стороны изготавливают 8 вентиляционных отверстий диаметром 7-9 мм. Это крайняя часть пленки, которая не контактирует с эмбрионом. На дно сформированного из пленки «мешка» добавляют 450-500 мг альгината кальция. Непосредственно перед переносом эмбриона в систему к альгинату кальция добавляют 3 мл высокоочищенной воды и перемешивают получившуюся смесь до получения густой кашицы. Схема системы для культивирования представлена в приложении к патенту (фиг. 1).
Оплодотворенные куриные яйца подвергают преинкубации в течение 45-50 часов при 38°С и влажности 80%. По истечении этого срока куриные яйца извлекают из инкубатора. Скорлупу каждого яйца обрабатывают хлоргексидином, после чего удаляют с применением твердосплавного шаровидного бора и микромотора с прямым наконечником, при этом снимают скорлупу на тупом конце яйца, со стороны воздушного мешка. Подскорлуповую оболочку вскрывают при помощи пинцета для микроманипуляций. Все содержимое куриного яйца аккуратно перемещают в сформированный из пленки «мешок» прямо на поверхность смеси из альгината кальция и высокоочищенной воды. При переносе содержимого куриного яйца манипуляцию следует выполнять таким образом, чтобы желточная оболочка сохранилась неповрежденной и куриный эмбрион оказался по центру на поверхности желтка, что обеспечивает условия для нормального развития куриного эмбриона, формирования хориоаллантоисной мембраны и хорошего газообмена. Инсулиновым шприцом сверху на желток в систему вносят 0,4 мг гентамицина сульфата. Далее на стакан сверху натягивают полиэтиленовую пленку и закрепляют ее резинкой к наружной поверхности стакана для культивирования. После этого систему для культивирования куриного эмбриона помещают в термостат для инкубации при температуре 38°С и влажности 80%. Полки с системами для культивирования куриных эмбрионов располагают под углом 8-10°. Каждые 10-12 часов производят наклон полок термостата в противоположную сторону, что является критически важным для формирования хориоаллантоисной мембраны. На 6 день инкубации выполняют отверстие на боковой поверхности стакана на высоте 3 см от его дна. Такой срок был выбран исходя из особенностей развития эмбриона, так как известно, что с шестых суток увеличивается потребление им кислорода. Начиная с 17 дня инкубации, в стакан подают обогащенную кислородом увлажненную воздушную смесь. В качестве прибора для подачи обогащенной кислородом воздушной смеси используется концентратор кислорода из атмосферного воздуха, от которого с помощью трубок от системы для внутривенных инфузий обогащенный кислородом воздух подают в увлажнитель-очиститель с дистиллированной водой, который располагают внутри термостата. В увлажнителе расположен ультразвуковой испаритель, существенно повышающий эффективность увлажнения используемой газовой смеси. Далее также с помощью трубок от систем для внутривенных инфузий обогащенную кислородом увлажненную воздушную смесь подают в стаканы для культивирования через отверстия на их боковых поверхностях. На 17-е сутки в норме цыпленок производит клювом прокол хориоаллантоисной мембраны. В случае, если это не происходит, ножницами выполняют разрез в проекции клюва, при этом избегая значительного повреждения сосудов хориоаллантоисной мембраны. На 21-22 сутки живые цыплята извлекаются из системы для культивирования.
Способ апробирован на 100 куриных эмбрионах породы Хай-Лайн Браун, которые подвергались преинкубации в течение 45-50 часов в инкубаторе, после чего были извлечены из яиц с помощью твердосплавного бора и микромотора с прямым наконечником и помещены в системы для инкубации, в которые предварительно добавили 450-500 мг альгината кальция и 3 мл дистиллированной воды. Использовали инкубатор MJA3 (Россия). Далее с помощью инсулинового шприца добавили гентамицина сульфат в расчете 0,4 мг на куриный эмбрион. Сверху систему для культивирования куриного эмбриона накрыли полиэтиленовой пленкой и поместили в инкубатор, в котором поддерживалась температура на уровне 38°С и влажность около 80%. На 6-е стуки изготовили отверстие в стакане для культивирования на высоте 3 см. от дна. Каждые 12 часов производили наклон полок инкубатора в противоположную сторону с формированием угла 8-10°. С 17-х суток с помощью трубок от систем для внутривенных инфузий, очистителя-увлажнителя и кислородного генератора Armed 7F-3L (Россия) производят подачу обогащенной кислородом увлажненной воздушной смеси, необходимой для жизнедеятельности куриных эмбрионов. По истечении инкубационного периода, на 21 сутки, пленку разрезали и извлекли из систем для культивирования живых цыплят. В результате исследования была достигнута выживаемость 82% до 17 суток пренатального периода онтогенеза и 58% на 21-е сутки при использовании генератора кислорода.
Пример 1. Куриный эмбрион породы Хай-Лайн Браун подвергли преинкубации в инкубаторе течение 45-50 часов при температуре около 38°С и влажности 80%, после чего извлекли из яйца с помощью шаровидного твердосплавного бора и микромотора с прямым наконечником и затем поместили в систему для инкубации (фиг. 1). Далее с помощью инсулинового шприца добавили 0.4 мг гентамицина сульфата. Сверху систему для культивирования куриного эмбриона накрыли полиэтиленовой пленкой и поместили в инкубатор MJA3 (Россия), в котором поддерживалась температура на уровне 38°С и влажность около 80%. На 6-е стуки было изготовлено отверстие в стакане для культивирования на высоте 3 см. Каждые 12 часов производили наклон полки инкубатора в противоположную сторону с формированием угла 8-10°. С 17-х суток с помощью трубок от систем для внутривенных инфузий и кислородного генератора Armed 7F-3L (Россия) производили оксигенацию эмбриона обогащенной кислородом воздушной смесью, проведенной через очиститель-увлажнитель с ультразвуковым испарителем. На 21-е сутки пленку разрезали и извлекли из системы живого цыпленка. На протяжении всего периода инкубации производился видеомониторинг развития эмбриона с помощью камеры Recam А100 (Китай). Фотография эмбриона на 13-е сутки развития представлена в приложении к патенту (фиг. 2).
Пример 2. В этом эксперименте модель служила для изучения эмбриотоксических свойств хлорамфеникола. Куриный эмбрион породы Хай-Лайн Браун подвергли преинкубации в течение 45-50 часов при температуре около 38°С и влажности 80%, после чего извлекли из яйца с помощью шаровидного твердосплавного бора и микромотора с прямым наконечником и поместили в систему для инкубации (фиг. 1). Далее с помощью инсулинового шприца добавили в систему 6 мг хлорамфеникола. Сверху систему накрыли полиэтиленовой пленкой и поместили в инкубатор MJA3 (Россия), в котором поддерживалась температура на уровне 38°С и влажность около 80%. На 6-е стуки было изготовлено отверстие в стакане на высоте 3 см. Каждые 12 часов производили наклон полки инкубатора в противоположную сторону с формированием угла 8-10°. С 17-х суток с помощью трубок от систем для внутривенных инфузий и кислородного генератора Armed 7F-3L (Россия) производили оксигенацию эмбриона обогащенной кислородом воздушной смесью, проведенной через очиститель-увлажнитель с ультразвуковым испарителем. На 21-е сутки культивирования пленку разрезали и извлекли из системы живого цыпленка. При сравнительном анализе моделей с применением хлорамфеникола и гентамицина сульфата было выявлено отрицательное влияние хлорамфеникола на эмбриональное развитие, проявившееся несоответствием эмбрионального развития нормальным срокам, низкой подвижностью эмбриона во время инкубации и недостаточным развитием цыпленка после извлечения. Фотография эмбриона на 13-е сутки развития (приблизительно соответствует 8-му дню инкубации в норме, видны аномалии развития) представлена в приложении к патенту (фиг. 3).
Разработан способ безскорлупного культивирования куриных эмбрионов. Метод не требует сложного технического оборудования, либо же использования дорогих расходных материалов. Однако он открывает большое поле деятельности для проведения различных экспериментов, в частности фундаментальных работ в области эмбриологии, патологической физиологии, а также в ветеринарии.