Способ производства ростовой среды с содержанием нанофильтрата творожной сыворотки, предназначенной для выращивания пробиотических культур
METHOD FOR PRODUCING A GROWTH MEDIUM CONTAINING A NANOFILTRATE OF CURD WHEY INTENDED FOR CULTIVATION OF PROBIOTIC CULTURES

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, в частности, к способам получения ростовой среды для пробиотических (лакто- и бифидобактерий) бактерий и может быть использовано для производства лечебно-профилактических и лечебных препаратов.
В настоящее время в Российской Федерации  идет активная разработка и внедрение безопасных, эффективных пробиотических препаратов при выращивании сельскохозяйственных животных и получении продукции животноводства. Пробиотики, нормализуя микрофлору кишечника животных, подавляют развитие кишечной палочки и гнилостных бактерий. Продукты жизнедеятельности молочнокислых бактерий благотворно влияют на секреторную деятельность желудочно-кишечного тракта, возбуждают аппетит, повышают усвояемость корма.
Важное значение имеет среда, на которой культивируют бактерии. Она должна быть достаточно бюджетной для производства, иметь низкую стоимость,   включать  белковые основы и специфические стимулирующие компоненты, соответствующие потребностям бактерий.
Изобретение позволяет получить питательную среду обеспечивающую накопительный рост, длительное хранение при поддержании определённой массы жизнеспособных микроорганизмов, без утраты их пробиотических свойств и не требовать особенных условий хранения.
Широко известна кукурузно-лактозная среда (КЛС) для культивирования бифидобактерий и молочнокислых бактерий (ТУ 10-02-02-789-192-95). Однако КЛС не содержит гидролизованных белковых компонентов, что не обеспечивает при культивировании длительных сроков сохранности конечного продукта. Кроме того, она обладает высокой стоимостью.
Известен способ получения среды для выращивания пробиотических микроорганизмов на основе печеночного настоя. Для его приготовления к 1000 мл дистиллированной воды добавляют пептон, хлористый натрий, глюкозу, дрожжевой экстракт и печеночный настой. Смесь нагревают до кипения. После охлаждения фильтруют через ватно-марлевый фильтр и устанавливают рН - 6,8. Среду стерилизуют автоклавированием при 1 атм 30 минут. Среда имеет соломенный цвет с серо-белым осадком, легко разбивающимся при встряхивании (ТУ 9337-001-00668554-03 «Бифидобактерин», изготовляемый в Вологодском филиале ФГБНУ ВИЭВ). Недостатком известного способа получения ростовой среды является высокая себестоимость препарата. Использование компонентов животного происхождения при производстве биологических препаратов в ряде стран ограничено, в связи с эпизоотической ситуацией. Также в продуктах животноводства могут содержаться антибиотики, что отрицательно влияет на культивирование микроорганизмов.
Известна также питательная среда для накопления биомассы бактерий на основе молочной сыворотки (RU 2326939). Среда хотя и дает высокую скорость роста, не имеет достаточного количества питательных веществ (белков, пептидов, аминокислот) для длительной сохранности микробных клеток, что очень важно для препаратов-пробиотиков. Дополнительным эффектом высоких ростовых показателей является повышение титруемой кислотности, негативно отражающееся на органолептических свойствах продукта и сохранности микроорганизмов.
Известен способ приготовления гидролизатной среды с использованием в качестве белковой основы смеси компонентов животного и растительного происхождения (Биологически активная добавка к пище и способ ее приготовления, RU 2207019).
Известен способ предусматривающий приготовление питательной среды для производства бактериальной закваски на основе ферментативного гидролизата белкового компонента с использованием соевого молока. Недостатком данного способа – многокомпонентность, сложность и длительность приготовления, ограниченный срок хранения – заявленный периода хранения закваски 30 суток (Патент РФ №2169472, МКП А23С9/12, А61К35/74.опубликовано 27.06.2001).
Известен способ культивирования бифидобактерий на питательной среде включающей, мас. %: лактопептон (5,0-7,0), цистеин солянокислый (0,001-0,005), дрожжевой автолизат (2,0-4,0), обрат молока (основа) - остальное (RU 2326940 С1). Недостатком описанной среды является нестабильность культивирования бактерий из-за несбалансированности по минеральному составу (отсутствуют минеральные компоненты).
Известен способ культивирования бифидобактерий в питательной среде, содержащей гидролизат гороха, отвар листьев и стеблей люцерны, кукурузный экстракт, Д(-)-лактозу, натрий фосфорнокислый однозамещенный, сульфат железа семиводный, цистеин и осветленную творожную сыворотку (RU 2644679).
Известен способ получения питательной среды для культивирования лактобактерий, включающей отвар капусты, глюкозу и в качестве дополнительных источников питания гидролизат крови убойных животных, дрожжевой аутолизат и молочную сыворотку (RU 2551960). Недостатком является специфичность ингредиентов (необходимость использования свежей крови животных) и сложный процесс кислотного гидролиза последней.
Известен способ получения кормового соево-кукурузного субстрата, предназначенного для выращивания пробиотических культур. Способ предусматривает использование измельченных бобов сои и зерна кукурузы для получения выварочного бульона и питательного субстрата для выращивания  пробиотических культур (RU 2685886 C 1).
Наиболее близким по технической сущности, выбранным в качестве прототипа, является «Способ приготовления питательной среды для выращивания пробиотических культур». Способ предусматривает получение соевого гидролизата из расчета 24 – 28 граммов сухого соевого молока на 1 л воды. Гидролиз проводится под воздействием фермента пепсина в течение 48 часов, обеспечивая полный гидролиз белков. Гидролизат подвергают фильтрации и стерилизации, с последующим добавлением пептона, глюкозы и воды в заданном соотношении компонентов с получением питательной среды. Питательную среду фильтруют, устанавливают рН в пределах 6,8 – 7,0 и стилизуют при заданных параметрах (RU 2646163 C1). Среда позволяет в течение короткого времени получить большую массу микроорганизмов. Недостатком данного способа получения является ограниченность  среды по питательным компонентам. Интенсивный рост микроорганизмов приводит к быстрому истощению питательных ресурсов среды и ее закислению, что негативно сказывается на сохранении жизнеспособности пробиотических микроорганизмов. Кроме, того в жидкой питательной среде происходит быстрое осаждение микробной массы, приводящее к пространственной ограниченности, снижению контакта клеток со средой, нарушению обменных процессов.
Целью наших исследований была разработка новой питательной среды для выращивания пробиотических культур (бифидобактерий), обеспечивающей оптимальное накопление и сохранение микробной массы в жизнеспособном состоянии, простой в производстве.
Наша задача решается тем, что на стадии приготовления ростовой среды в воду, помимо соевого гидролизата и пептона, вносится нанофильтрат творожной сыворотки, содержащий лактулозу в массовой доле 70% в сухом веществе. Технология производства нанофильтрата творожной сыворотки защищена патентом RU 2617940 (владелец  ФГБОУ ВО Вологодская ГМХА) (RU)). Нанофильтрат вносится в количестве 3% от объёма подготавливаемой питательной среды. Лактулоза обладает одним из самых высоких пребиотических индексов, кроме того попадая в организм она не расщепляется в верхних отделах желудочно-кишечного тракта, переходит в толстый кишечник, выполняя роль пребиотика.  Продукт растительного гидролиза обеспечивает полноценный белковый состав питательной среды, а лактулоза служит источником углеводов.
Кроме того в ростовую среду вносится агар-агар в количестве, обеспечивающем его содержание в объёме подготавливаемой среды 0,2%, что обеспечивает равномерное распределение микробной массы в процессе роста по объему среды.
Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию «новизна».
Анализ патентной и научно-технической информации показал отсутствие аналогичных способов экстренной профилактики иерсиниозов животных. При анализе известных решений в области ветеринарии признаки, отличающие заявляемое решение от прототипа, не выявлены. Это позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «существенные отличия».
Пример 1. Приготовление питательной среды в оптимальных параметрах.
7
9
Сухое соевое молоко в количестве 28 г размешивают в одном литре воды подогретой до 45-50°С, постоянно помешивая до получения однородной жидкости. После охлаждения смеси до 37ºС в неё вносят  фермент и помещают в термостат. Через 48 часов гидролизат фильтруют и автоклавируют при 1 атм в течение часа. Далее готовят ростовую среду. Для ее приготовления к фильтрованной воды добавляют 1 г пептона, 120 мл соевого гидролизата, 30 мл нанофильтрата творожной сыворотки и 2 г агар-агара микробиологического. Смесь нагревают до кипения. После охлаждения фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают рН - 6,8 – 7,0. Среду стерилизуют автоклавированием при 1 атм 30 минут. Среда готова для использования. В ростовую среду вносят посевной материал, приготовленный на чистых культурах Bifidobacterium thermophilum тп-87 из расчёта соотношения посевного материала и ростовой среды - 1:20. В серии посевов получена конечная концентрация 1,3×10 КОЕ/г. Лактулоза в оптимальной концентрации обеспечивает высокую ростовую продуктивность пробиотической культуры. Проверка жизнеспособности микробных клеток через 3 месяца показала рост до 9 разведения 1,4×10 КОЕ/г.
Пример 2. Приготовление притягательной среды  с внесением увеличенного количества нанофильтрата творожной сыворотки - 50 г.
4
Сухое соевое молоко в количестве 28 г размешивают в одном литре воды подогретой до 45-50°С, постоянно помешивая до получения однородной жидкости. После охлаждения смеси до 37ºС в неё вносят фермент и помещают в термостат. Через 48 часов гидролизат фильтруют и автоклавируют при 1 атм в течение часа. Далее готовят ростовую среду. Для ее приготовления к фильтрованной воды добавляют 1 г пептона, 120 мл соевого гидролизата, 50 мл нанофильтрата творожной сыворотки и 2 г агар-агара микробиологического. Смесь нагревают до кипения. После охлаждения фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают рН - 6,8 – 7,0. Среду стерилизуют автоклавированием при 1 атм 30 минут. Среда готова для использования. В ростовую среду вносят посевной материал, приготовленный на чистых культурах Bifidobacterium thermophilum тп-87 из расчёта соотношения посевного материала и ростовой среды - 1:20. В серии посевов получена конечная концентрация 2,5×10 КОЕ/г. Лактулоза в больших количествах оказывает угнетающее действие на рост пробиотической культуры.
Пример 3. Приготовление питательной среды без внесения агар-агара микробиологического
9
5
Сухое соевое молоко в количестве 28 г размешивают в одном литре воды подогретой до 45-50°С, постоянно помешивая до получения однородной жидкости. После охлаждения смеси до 37ºС в неё вносят  фермент и помещают в термостат. Через 48 часов гидролизат фильтруют и автоклавируют при 1 атм в течение часа. Далее готовят ростовую среду. Для ее приготовления к фильтрованной воды добавляют 1 г пептона, 120 мл соевого гидролизата, 30 мл нанофильтрата творожной сыворотки. Смесь нагревают до кипения. После охлаждения фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают рН 6,8–7,0. Среду стерилизуют автоклавированием при 1 атм 30 минут. Среда готова для использования. В ростовую среду вносят посевной материал, приготовленный на чистых культурах Bifidobacterium thermophilum тп-87 из расчёта соотношения посевного материала и ростовой среды - 1:20. В серии посевов получена конечная концентрация 2,5×10 КОЕ/г. Проверка жизнеспособности микробных клеток через 3 месяца показала рост до 5 разведения 3,2×10 КОЕ/г. Таким образом, агаризация среды приводила к замедлению скорости накопления микробной массы, но способствовала их более длительной сохранности.