АЛГОРИТМ ОБНАРУЖЕНИЯ ДЛЯ ПЦР-АНАЛИЗА

1. Способ обнаружения гибридизации меченого нуклеотидного зонда с целевой нуклеиновой кислотой, включающий:
(a) приведение образца, который предположительно содержит целевую нуклеиновую кислоту, во взаимодействие с меченым нуклеотидным зондом, который гибридизуется с указанной целевой нуклеиновой кислотой;
(b) измерение интенсивности свечения указанной метки при первом значении температуры и при втором значении температуры, при этом указанное первое значение температуры меньше, чем указанное второе значение температуры;
(c) вычисление соотношения (i) интенсивности свечения указанной метки при указанном первом значении температуры к (ii) интенсивности свечения указанной метки при указанном втором значении температуры, при этом отношение, составляющее, по меньшей мере, 0,8, указывает на присутствие указанной целевой нуклеиновой кислоты.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на присутствие указанной целевой нуклеиновой кислоты указывает соотношение, составляющее, по меньшей мере, 0,9.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное первое значение температуры меньше, чем температура плавления указанного меченого нуклеотидного зонда, а указанная вторая температура выше, чем температура плавления указанного меченого нуклеотидного зонда.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что указанное второе значение температуры составляет приблизительно 85°С, приблизительно 86°С, приблизительно 87°С, приблизительно 88°С, приблизительно 89°С, приблизительно 90°С, приблизительно 91°С, приблизительно 92°С, приблизительно 93°С, приблизительно 94°С, или приблизительно 95°С.
5. Способ по п.3, отличающийся тем, что указанное первое значение температуры составляет приблизительно 40°С, приблизительно 41°С, приблизительно 42°С, приблизительно 43°С, приблизительно 44°С, приблизительно 45°С, приблизительно 46°С, приблизительно 47°С, приблизительно 48°С, приблизительно 49°С, приблизительно 50°С, приблизительно 51°С, приблизительно 52°С, приблизительно 53°С, приблизительно 54°С, приблизительно 55°С, приблизительно 56°С, приблизительно 57°С, приблизительно 58°С, приблизительно 59°С, приблизительно 60°С, приблизительно 61°С, приблизительно 62°С, приблизительно 63°С, приблизительно 64°С, приблизительно 65°С, приблизительно 66°С, приблизительно 67°С, приблизительно 68°С, приблизительно 69°С, приблизительно 70°С, приблизительно 71°С или приблизительно 72°С.
6. Способ по п.3, отличающийся тем, что указанное первое значение температуры составляет приблизительно 50°С, и указанное второе значение температуры составляет приблизительно 95°С.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный меченый нуклеотидный зонд содержит флуоресцентную метку.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанный нуклеотидный зонд дополнительно содержит молекулу гасителя, которая поглощает излучение указанной флуоресцентной метки так, что, когда молекула указанного гасителя и флуоресцентная метка находятся в непосредственной близости, флуоресцентное излучение указанной флуоресцентной метки не обнаруживается или, по меньшей мере, обнаруживается в меньшей степени, чем, когда молекула указанного гасителя и флуоресцентная метка не находятся в непосредственной близости.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный нуклеотидный зонд представляет собой молекулярный маяк или линейный зонд.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная целевая нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная целевая нуклеиновая кислота представляет собой РНК.
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что этапы (b) и (с) повторяют, по меньшей мере, дважды.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что среднее соотношение рассчитывают на основании многократных измерений.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанное измерение осуществляют после проведения реакции ПЦР.
15. Способ по п.13, отличающийся тем, что реакция ПЦР включает:
i) приведение образца, который предположительно содержит указанную целевую нуклеиновую кислоту, во взаимодействие с указанным меченым нуклеотидным зондом в растворе, содержащем подходящие праймеры, ферменты и субстраты, с получением реакционной смеси; и
ii) осуществление циклического воздействия на указанную реакционную смесь температур денатурации, отжига и удлинения цепи, подходящих для амплификации указанной целевой нуклеиновой кислоты.
16. Способ обнаружения гибридизации меченого нуклеотидного зонда с целевой нуклеиновой кислотой, включающий:
(a) приведение образца, который предположительно содержит целевую нуклеиновую кислоту, во взаимодействие с меченым нуклеотидным зондом, который гибридизуется с указанной целевой нуклеиновой кислотой;
(b) измерение интенсивности свечения указанной метки в, по меньшей мере, два различных момента времени; и
(c) вычисление углового коэффициента для изменения интенсивности свечения указанной метки как функции времени.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что положительный угловой коэффициент указывает на присутствие указанной целевой нуклеиновой кислоты, когда интенсивность сигнала, вырабатываемого указанным меченым нуклеотидным зондом больше, когда он связан с указанной целевой нуклеиновой кислотой, по сравнению с интенсивностью сигнала, вырабатываемого указанным меченым нуклеотидным зондом, когда он не связан с указанной целевой нуклеиновой кислотой.
18. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанная целевая нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.
19. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанная целевая нуклеиновая кислота представляет собой РНК.
20. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанный меченый нуклеотидный зонд представляет собой флуоресцентно-меченый нуклеотидный зонд.
21. Способ по п.20, отличающийся тем, что указанный нуклеотидный зонд представляет собой молекулярный маяк или линейный зонд.
22. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанное измерение осуществляют при изотермических условиях.
23. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанное измерение осуществляют после проведения указанной реакции ПЦР.
24. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанное измерение завершают в интервал времени, равный от приблизительно 1 до приблизительно 10 мин после завершения указанной реакции ПЦР.
25. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанная реакция ПЦР включает:
(i) приведение образца, который предположительно содержит указанную целевую нуклеиновую кислоту, во взаимодействие с указанным меченым нуклеотидным зондом в растворе, содержащем подходящие праймеры, ферменты, субстраты и буфер, с получением реакционной смеси; и
(ii) осуществление циклического воздействия на указанную реакционную смесь при температур денатурации, отжига и удлинения цепи, подходящих для амплификации указанной целевой нуклеиновой кислоты.
26. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанный угловой коэффициент рассчитывают путем вычисления первой производной от интенсивности свечения метки как функции времени.
27. Способ по п.26, отличающийся тем, что интенсивность свечения указанной метки как функцию времени рассчитывают путем подбора методом наименьших квадратов кривой для измерений интенсивности свечения указанной метки как функции времени.
28. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанный угловой коэффициент рассчитывают путем аппроксимации результатов измерений интенсивности свечения указанной метки как функции времени следующим уравнением:
у=mx+b,
в котором y представляет собой интенсивность свечения метки, х представляет собой время, и m представляет собой указанный угловой коэффициент.
29. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанный угловой коэффициент кривой рассчитывают по формуле:
,
1
1
2
2
1
2
где m представляет собой указанный угловой коэффициент кривой, (x, y) и (x, y) представляют собой, по меньшей мере, два различных момента времени и x≠х.
30. Способ по п.16, дополнительно включающий вычисление кинетики гибридизации указанных меченого нуклеотидного зонда и целевой нуклеиновой кислоты на основании указанного углового коэффициента интенсивности свечения метки как функции времени.
31. Способ по п.16, отличающийся тем, что применяют, по меньшей мере, два меченых нуклеотидных зонда, каждый из которых гибридизуется с различными целевыми нуклеиновыми кислотами, при этом каждый зонд гибридизуется при температуре, отличной от температуры гибридизации другого зонда.