ФОРМА ПРЕПАРАТА ДЛЯ ДОСТАВКИ БАКТЕРИЙ-ПРОБИОТИКОВ В ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА

Полезная модель относится к конструктивным формам препаратов-пробиотиков в виде разъемных или неразъемных капсул, таблеток, драже, гранул, пилюль, конфет и суппозиторий и может быть использована биотехнологии, медицине и фармацевтике.
Традиционная терапия бактериальных заболеваний включает широкое использование препаратов-антибиотиков. Однако указанные препараты часто токсичны, обладают широким бактерицидным действием, в том числе подавляют эндогенную микрофлору, что приводит к развитию различных осложнений, например дисбактериозов. Поэтому в последнее время предложены новые антибактериальные препараты, обладающие выраженной активностью против патогенных и условно-патогенных бактерий и не нарушающие микробиоценоз человека. В настоящее время существует целый ряд биопрепаратов из бактерий родов Bacillus,, или Bifidum, или Lactobacillus подавляющих рост патогенных и условно-патогенных бактерий: Биоспорин, Бактиспорин, Бактисубтил, Ветом, Субалин, Ветомгин, Ветоцил, Экофлор и др. Их терапевтическая эффективность определяется комплексным действием широкого набора метаболитов, которые способны продуцировать живые микробные клетки штаммов бактерий, входящих в состав препаратов. Активность пробиотиков осуществляется в просвете желудочно-кишечного тракта и связана прежде всего не с конкурентными взаимоотношениями за места прикрепления к слизистой, а с высокой антагонистической активностью в отношении патогенных микроорганизмов, без антагонистического действия на представителей нормальной микрофлоры, что создает условия для бесконкурентного восстановления резидентной аутофлоры.
Аналогом заявляемой полезной модели является известный лечебно-профилактический биопрепарат Бактиспорин на основе антагонистически активного штамма Bacillus subtilis 3H для лечения широкого круга заболеваний, выпускаемый в ампулах и используемый перорально в виде раствора (Патент РФ №21303166, кл. А61К 35/74, С12N 1/20, опубл. 20.05.1999.).
При такой препаративной форме нужны высокие дозы препарата для
достижения нужного эффекта лечения при некоторых видах заболеваний, например, дисбактериозе, бактериальном вагинозе. Жидкая форма препарата неудобна при применении, имеет малый срок хранения.
Известно средство для лечения урогенитальных заболеваний, включающее введение препарата Биоспорина в виде тампонов или свечей (Патент РФ №2131258, С12N 1/20, А61К 35/74, опубл. 10.02.99). Суппозиторий Биоспорин впервые был предложен для лечения кишечного дисбактериоза и состоит из двух штаммов: Bacillus subtilis 3 - аэробного микроорганизма и Bacillus licheniformis 31 - анаэробного микроорганизма. Такое сочетание штаммов было предложено в связи с тем, что в просвете кишечника существуют условия для жизнедеятельности как аэробных микроорганизмов (тонкий кишечник), так и анаэробных (толстый кишечник). В просвете урогенитального тракта (терапевтическая область) преимущественно существует аэробная или факультативно аэробная микрофлора. Анаэробная микрофлора существует в пристеночной области слизистой урогенитального тракта за счет своих адгезивных свойств (т.е. способности прикрепляться к клеткам, выстилающим слизистую).
Однако суппозитории применяют ректально или вагинально и не позволяют применять пробиотики перорально..
Известен аналог в виде таблетированной форме препарата-пробиотика, выполненный в виде дискообразного монолитного тела, содержащего биомассу на основе Bacillus subtilis, стабилизаторы на основе сахарожелатиновой среды или лактозы, отличающийся тем, что он дополнительно содержит глюконат кальция в количестве 1-10 мас.%, или сорбент и вспомогательные вещества. В качестве сорбента используют активированный уголь, карболонг, лактулозу, ацетилфталилцеллюлозу или гель фосфата алюминия. Биомасса бактерий и вспомогательные вещества в препарате находятся в соотношении (2:1)-(3:1). В качестве вспомогательных веществ используют стеарат кальция, тальк, и(или) крахмал, и(или) аэросил, глюкозу, сухое молоко и(или) метилцеллюлозу (патент РФ №2182009, МПК А61К 35/74, А61К 9/20, опубл. 2002 г.).
Недостатком такого препарата является недостаточная его эффективность вследствие отсутствия в нем компонентов-пребиотиков, а также веществ, обладающих прайминговым эффектом, связанным с усилением продукции
организмом эндогенных иммуномодуляторов цитокинового ряда.
6
Наиболее близким аналогом (прототипом) является сухая форма лечебно-профилактического препарата-пробиотика, состоящая из дозы биомассы спор бактерий рода Bacillus и сорбента (Патент на полезную модель РФ №43767, МПК А61К 9/48, опубл. 10.02.2005 г.). Сорбент состоит из природного цеолита, биомасса спор бактерий рода Bacillus имеет титр в конечном препарате не менее 10 кл/г, а сухая форма лечебно-профилактического препарата представляет собой таблетку, выполненную в виде монолитного дискообразного твердого тела, состоящего из смеси цеолита и биомассы спор бактерий рода Bacillus, или цилиндрическую пустотелую разъемную капсулу или пакет, заполненные порошком, состоящим из смеси цеолита и биомассы спор бактерий рода Bacillus. В качестве цеолита используют порошок минерала глауконит с размером частиц 0,01-0,1 мм. Разъемная пустотелая капсула выполнена из материала плавящегося под действием температуры организма, например из желатина.
Недостатком такого препарата является повышенная слипаемость отдельных изделий между собой под действием влаги и/или температуры (недостаток характерен для желатиновых и других покрытий) и недостаточная его эффективность вследствие отсутствия в нем компонентов-пребиотиков, а также веществ, обладающих прайминговым эффектом, связанным с усилением продукции организмом цитокинового ряда.
Техническим результатом полезной модели является снижение потерь влаги и слипаемости отдельных изделий между собой под действием температуры и повышение эффективности действия препарата-пробиотика и расширение сферы его применения путем создания биологически активных форм этого препарата в виде разъемных и неразъемных капсул, или таблеток в оболочке, или гранул, или драже, или пилюль, или суппозиторий, или конфет для профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, а также других бактериальных, вирусных и иммунодефицитных заболеваний человека.
Указанный технический результат достигается тем, что форма препарата для доставки бактерий-пробиотиков в организм выполнена в виде тела, содержащего ядро и окружающую его термо- и/или влаголабильную оболочку, причем ядро представляет собой гелевую матрицу, или спрессованную или рыхлую
5
порошкообразную основу с распределенной в ней сухой биомассой бактерий-пробиотиков, имеющих титр в конечном препарате не менее 10 КОЕ/г, отличающееся тем, что материал оболочки дополнительно содержит гуммиарабик или арабиногалактан в соотношении материал оболочки и гуммиарабик или арабиногалактан не менее 1:1, а в качестве основы содержимого ядра она содержит спрессованный или рыхлый порошок или гелевую матрицу из арабиногалактана, при следующем содержании компонентов формы (масс.%):
материал оболочки из термо- или влаголабильного материала
с гуммиарабиком или арабиногалактаном в
соотношении не менее 1:1
5,0-30,0
основа ядра из арабиногалактана,
содержащая бактерии-пробиотики
с титром не менее 10<sup>5</sup> КОЕ/г
остальное до 100%.
4
Основа ядра дополнительно содержит малые дозы интерферона 1 типа с активностью от 0,1 до 10 МЕ/г.
Препаративная форма представляет собой разъемную или неразъемную капсулу, или покрытые оболочкой таблетку, или гранулу, или драже, или пилюлю, или конфету, или суппозиторий.
Материалом оболочки разъемной или неразъемной капсулы, или гранулы, или пилюли является желатин, а материалом оболочки драже, или таблетки является ацетилфталилцеллюлоза или метилцеллюлоза.
Материалом оболочки конфеты является карамель из сахара или фруктозы, а материалом оболочки суппозитория является смесь полиэтиленоксидов с молекулярными массами 400 и 1200 в соотношении 1:1.
В качестве бактерий-пробиотиков она содержит биомассу бактерий рода Bacillus, или Bifidum, или Lactobacillus или их смесь в равных соотношениях.
Биомасса бактерий рода Bacillus содержит штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В 7048, и/или штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В 7092, и/или штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В 7038.
Биомасса бактерий рода Bifidum содержит штамм бактерий Bifidum bifidum 8-3 или Bifidobacterium longum ДBA-13, Bifidobacterium adolescentis ГО-13.
Биомасса бактерий рода Lactobacillus содержит штамм бактерий Lactobacillus
acidophilus 57S или Lactobacillus plantarum П-75.
Штамм бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 8-3 депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5799. Штамм Bifidobacterium longum ДВА-13 депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5894. Штамм Bifidobacterium adolescentis ГО-13 депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В-2944.
Штамм лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5863. Штамм Lactobacillus plantarum П-75 депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 3962.
Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В 7048 относится к аэробам. Это грамположительная бактерия, образующая споры. Штамм размножается при 15-50°С. Оптимальный рост наблюдается при температуре 36-37°С. Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В 7048 продуцирует антибиотик широкого спектра действия, подавляющий рост и развитие грибков, стафилокков, стрептококков и синегнойной палочки.
Штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В 7038 относится к аэробам. Это грамположительная палочка, способная образовывать споры. Штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В 7038 продуцирует антибиотик широкого спектра действия, подавляющий рост грибков, стафилокков, стрептококков и синегнойной палочки.
Рекомбинантный штамм бактерий Bacillus subilis ВКПМ В 7092 получен путем трансформации штамма Bacillus subtilis ВКПМ В 7048 рекомбинантной плазмидой ДНК рВМВ 5, содержащий ген альфа-2 интерферона. Полученный штамм IC-16 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ГНИИ Генетика под номером ВКПМ В 7092. Плазмида рВМВ 5 способна реплицироваться в бациллах и содержит в своем составе ген альфа-2-интерферона человека, промотор для экспрессии этого гена, сайт посадки рибосом (SD-сайт) и сигнальный пептид альфа-амилазы В. amyloliquefaciens для секреции интерферона в культуральную среду, а также несущую устойчивость к канамицину.
Исследована антибиотическая активность производственных штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В 7048, ВКПМ В 7092 и Bacillus licheniformis ВКПМ В 7038 по отношению друг к другу как составных частей комплексных препаратов. При этом
можно сделать вывод, что антагонизм клеток Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis не является существенной помехой для их совместного использования в препаратах.
Бактерии рода Bacillus, а именно природные штаммы В. subtilis или В. licheniformis, рекомбинантные штаммы тех же бактерий, но с введением в состав их генома гена человеческого лейкоцитарного интерферона, находятся в споровой или вегетативной форме в смеси с микродозами сухого порошка одного из типов интерферона человека. Эта комплексная смесь помещена в желатиновую капсулу с дополнительным включением в ее состав полисахарида арабиногалактана, который является эффективным пребиотиком и модулятором иммунного ответа, и в совокупности с вышеуказанными компонентами системы обеспечивает мощную иммуномодулирующую активность и позволяют восстанавливать активность дружественной микрофлоры, в частности стимулируя представителей анаэробной сахаролитической нормофлоры толстого кишечника. Данная полезная модель может быть использована для производства БАД или фармацевтических препаратов для профилактики и лечения дисбактериозов, опухолевых заболеваний, бактериальных и вирусных инфекций, таких как дизентерия, сальмонеллез, парентеральные и энтеральные гепатиты, грипп, ОРВИ, герпес, энтериты различной этиологии, хламидиоз и т.п., а также иммунодефицитных состояний.
Арабиногалактан, например, из лиственницы сибирской имеет высоко разветвленное строение - главная цепь молекулы состоит из звеньев галактозы, соединенных гликозидными связями β-(1-3), а боковые цепи со связями β-(1-6), состоят из звеньев галактозы и арабинозы, из единичных звеньев арабинозы, а также уроновых кислот, в основном глюкуроновой. Арабиногалактан лиственницы сибирской в отличие от других имеет молекулярную массу до 20 кД, хорошо растворим в водных растворах и обладает небольшой степенью полидисперсности. Соотношение звеньев галактозы и арабинозы, а также молекулярная масса арабиногалактана могут колебаться в зависимости от вида лиственницы. Арабиногалактан лиственницы сибирской обладает мощным иммуномодулирующим действием, как на клеточный, так и на гуморальный иммунный ответ. Кроме того, арабиногалактан активирует систему комплемента и является источником диетической клетчатки - растворимых пищевых волокон, которые помогают поддерживать нормальный баланс нормофлоры кишечника,
помогают перистальтике кишечника, обладают профилактическим эффектом в отношении онкологических заболеваний кишечника и помогают иммунной системе надежно функционировать.
Известно, что интерферон может участвовать в регуляции собственной экспрессии. В частности, предварительное введение небольших доз интерферона приводит к повышению продукции эндогенного интерферона. Это явление получило название прайминг (Stewart, 1979). В рамках проведенных модельных исследований показана роль интерферон-индуцируемых белков протеинкиназы и 2',5'-олигоаденилатсинтетазы в регуляции собственной экспрессии интерферона при прайминге. Эксперименты показывают, что в норме гены ИФН репрессированы и их считывание начинается только после индуцирующего воздействия которое может рассматриваться как позитивно регулирующий сигнал. На примере ИФН I типа показано, что при этом индуктор не взаимодействует с генами ИФН прямо, а сначала включает систему ядерных интерферон регулирующих факторов (ИРФ), в частности ИРФ-I, который, в свою очередь, способен включать считывание генов ИФН. На считывание генов ИРФ влияет не только индуктор (вирусная РНК и ее химические аналоги), но также ИФН (это объясняет феномен прайминга), интерлейкин-1 и фактор некроза опухоли [Fujita Т., Miyamoto M., Kimura Y. et al. Biol Interferon Syst. Osaka 1988; 25-32]. T.e, существует тесная функциональная связь ИФН с другими цитокинами в иммунном ответе, имеющая объективный базис в виде ИРФ в геноме, активирующегося под действием разных сигналов.
Заявляемая конструкция препаративной формы обеспечивает вначале действие арабиногалактана в чистом виде или в составе гуммиарабика, находящегося в оболочке, который являясь пребиотиком, подготавливает окружающую эндо среду для активного размножения бактерий-пробиотиков, содержащихся в ядре препарата, что повышает его эффективность действия по сравнению с аналогами и прототипом. Кроме того, указанное количественное содержание арабиноктана и гуммиарабика в оболочке заявленных препаративных форм значительно снижает высыханин (потеря влаги) и слипаемость отдельных изделий между собой под действием температуры (Пищевая промышленность, №1, 2004 // Л.Г.Ипатова, А.А.Кочеткова, О.Г.Шубина, Т.А.Духу, М.А.Левачева. Физиологические и технологические аспекты
применения пищевых волокон. Московский госуниверситет пищевых производств).
На фиг.1 показана в разрезе препаративная форма в виде таблетки, или драже или конфеты. На фиг.2 показана в разрезе препаративная форма в виде разъемной или неразъемной капсулы, или суппозитория. На фиг.3 показана в разрезе препаративная форма в виде гранулы.
Препаративная форма (фиг.1-3) содержит ядро 1, вокруг которого расположена оболочка 2. Форма представляет собой разъемную или неразъемную капсулу, или покрытые оболочкой таблетку, или гранулу, или драже, или пилюлю, или конфету, или суппозиторий. Материалом оболочки 2 разъемной или неразъемной капсулы, или гранулы, или пилюли является желатин с добавлением полисахарида арабиногалактана в соотношении 1:1. Материалом оболочки 2 драже, или таблетки является ацетилфталилцеллюлоза с добавлением арабиногалактана в соотношении 2:1. Материалом оболочки конфеты является карамель из сахара или фруктозы с добавлением арабиногалактана в соотношении 3:1, а материалом оболочки суппозитория является твердый кулинарный жир с добавлением арабиногалактана в соотношении 4:1.
5
Основа ядра 2 всех препаративных форм содержит арабиногалактан с бактериями-пробиотиками, имеющими титр не менее 10 КОЕ/г.
Ниже приведены примеры составов препаративных форм.
Пример 1. Разъемная или неразъемная капсула, масс.%:
материал оболочки из желатина
с гуммиарабиком или арабиногалактаном в
соотношении 1:1
20,0
основа ядра из арабиногалактана,
содержащая бактерии-пробиотики
7
с титром не менее 10 КОЕ/г и
альфа 2 интерфероном с активностью 1×10<sup>4</sup> ME/г
остальное до 100%.
Пример 2. Пилюля, масс.%:
материал оболочки из желатина
с гуммиарабиком или арабиногалактаном в
соотношении 1:1
30,0
основа ядра из арабиногалактана,
содержащая бактерии-пробиотики
6
с титром не менее 10 КОЕ/г и
альфа 2 интерфероном с активностью 1×10<sup>3</sup> МЕ/г
остальное до 100%.
Пример 3. Гранула, масс.%:
материал оболочки из желатина
с гуммиарабиком или арабиногалактаном в
соотношении 1:1
5,0
основа ядра из арабиногалактана,
содержащая бактерии-пробиотики
5
с титром не менее 10 КОЕ/г и
альфа 2 интерфероном с активностью 0,1 МЕ/г
остальное до 100%.
Пример 4. Драже, масс.%:
материал оболочки из ацетилфталилцеллюлозы
с гуммиарабиком или арабиногалактаном в
соотношении не менее 1:1
20,0
основа ядра из арабиногалактана,
содержащая бактерии-пробиотики
5
с титром не менее 10 КОЕ/г и
альфа 2 интерфероном с активностью 1×10<sup>2</sup> МЕ/г
остальное до 100%.
Пример 5. Таблетка, масс.%:
материал оболочки из метилцеллюлозы
с гуммиарабиком или арабиногалактаном в
соотношении не менее 1:1
15,0
основа ядра из арабиногалактана,
содержащая бактерии-пробиотики
5
с титром не менее 10 КОЕ/г и
альфа 2 интерфероном с
активностью 1×10<sup>3</sup> МЕ/г
остальное до 100%.
Пример 6. Конфета, масс.%:
материал оболочки из карамели из
сахара или фруктозы с гуммиарабиком
или арабиногалактаном в
соотношении не менее 1:1
15,0
основа ядра из арабиногалактана,
содержащая бактерии-пробиотики
с титром не менее 10<sup>5</sup> КОЕ/г
остальное до 100%.
Пример 7. Суппозиторий, масс.%:
материал оболочки из смеси полиэтиленоксидов
с мол. масс. 400 и 1200 (в соотношении 1:1)
гуммиарабиком или арабиногалактаном в
соотношении не менее 1:1
30,0
основа ядра из арабиногалактана,
содержащая бактерии-пробиотики
5
с титром не менее 10 КОЕ/г и
альфа 2 интерфероном с активностью 1×10<sup>3</sup> МЕ/г
остальное до 100%.
Механизм действия заявляемой формы доставки бактерий-пробиотиков заключается в том, что при пероральном приеме препарата (капсула, таблетка, гранула, драже, конфета и др) или ректально (суппозиторий) происходит проникновение композиции в ЖКТ, где имеется мощное представительство бактериальной флоры и иммунной системы организма человека (до 70% иммунокомпетентных клеток). После растворения оболочки препаративной формы арабиногалактан, являясь пребиотиком подготавливает эндогенную кишечную среду для последующего активного размножения бактерий-пробиотиков как привнесенной, так и существующей у конкретного индивидуума представителей пробиотической нормофлоры.
В процессе растворения ядра препаративной формы освобождаются малые дозы ИФН I типа с арабиногалактаном, который частично расщепляется и способствует дальнейшему активному размножению представителей пробиотической нормофлоры кишечника, а частично сорбируется на иммунокомпетентных клетках (ИКК) совместно с ИФН и способствует, обладая мощным мембранотропным эффектом его сорбции на ИКК и взаимодействию со специфичными ИФН-рецепторами, запуская каскадную реакцию цитокинового прайминга. При использовании капсулы (порошок или гелевая матрица) с пероральным применением («под язык») эффект действия
композиции будет начинаться еще ранее в области глоточного лимфоидного кольца. Вследствие этого эти ИКК становятся праймированными к супериндукции в них больших количеств гомологичного ИФН I и II-го типов, а после того как из споровых форм освободятся пробиотические бактерии рода Bacillus (или другие) и они будут оказывать иммуномодулирующее влияние на эти же ИКК своими поверхностными глико-, липопротеидами, а после начала их репродукции (особенно мощной в присутствии пребиотической локальной добавки арабиногалактана) уже дополнительно продуцирующимся в среду а-интерфероном человека (в случае рекомбинантных форм микроорганизмов рода Bacillus с геном а-интерферона человека) и стимулирующим уже суперпродукцию гомологичного ИФН I и II-го типов. При частином аутолизе бактерий в ЖКТ (в процессе их репродукции в ЖКТ) этому же каскадному процессу будут способствовать освобождающиеся в просвет кишечника нуклеиновые кислоты, липополисахариды и мурамилпептиды.
Выделяющиеся при супериндукции в ИКК ИФН I-го и II-го типов и соответствующая группа цитокинов (Ил-1, Ил-2 и др.) обеспечивают мощную неспецифическую противовирусную и противобактериальную защиту клеток макроорганизма (как локальных, так и отдаленных от места продукции) против внутриклеточных патогенов, а также формирование высокого уровня специфической противоинфекционной резистентности макроорганизма, (преимущественно клеточного звена) с активацией клеток макрофагов и Т-хелперов I-го типа, в отношении имеющихся у конкретного индивидуума патогенных вирусов и бактерий.
Таким образом, предлагаемая конструкция препаративной формы обеспечивает вначале действие арабиногалактана в чистом виде (или в составе гуммиарабика), находящегося в оболочке, который являясь пребиотиком, подготавливает среду для активного размножения бактерий-пробиотиков, содержащихся в ядре препарата, что повышает его эффективность действия при профилактике и лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта, а также других бактериальных, вирусных и иммунодефицитных заболеваний человека по сравнению с аналогами и прототипом.
Кроме того, указанное количественное содержание арабиноктана в оболочке заявленных препаративных форм значительно снижает высыхание (потеря влаги) и слипаемость отдельных изделий между собой под действием температуры.