ГЕН-ВОССТАНОВИТЕЛЬ RF4 ДЛЯ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МУЖСКОЙ СТЕРИЛЬНОСТИ (CMS) C-ТИПА КУКУРУЗЫ, МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

1. Способ идентификации растения, содержащего функциональный ген-восстановитель для цитоплазматической мужской стерильности C-типа кукурузы, причем способ включает:
выделение молекул нуклеиновой кислоты из растения; и
скрининг выделенных молекул нуклеиновых кислот в отношении молекул нуклеиновых кислот, содержащих нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-197 и маркеров, обозначаемых как полиморфизмы ID №№ 1-106 в таблице 3, или их эквивалентов, где присутствие по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-197 и маркеров, упоминаемых в качестве полиморфизмов ID №№ 1-106 в таблице 3, или их эквивалентов, указывает на функциональный ген-восстановитель для цитоплазматической мужской стерильности C-типа кукурузы.
2. Способ по п. 1, где выделенные молекулы нуклеиновых кислот содержат молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-197 и маркеров, упоминаемых как полиморфизмы ID №№ 1-106 в таблице 3, на 8 хромосоме.
3. Способ по п. 1, где выделенные молекулы нуклеиновых кислот представляют собой геномную ДНК.
4. Способ по п. 1, где скрининг выделенных молекул нуклеиновых кислот в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-197 и маркеров, упоминаемых как полиморфизмы ID №№ 1-106 в таблице 3, или их эквивалентов, проводят с использованием конкурентной аллелеспецифической полимеразной цепной реакции.
5. Способ по п. 1, где нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-9; SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 109; SEQ ID NO: 111; SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 118-120; SEQ ID NO: 123; SEQ ID NO: 126; SEQ ID NO: 134; SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 137; SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 144; SEQ ID NO: 149; SEQ ID NO: 151; SEQ ID NO: 160; SEQ ID NO: 163; SEQ ID NO: 164; SEQ ID NO: 167; SEQ ID NO: 173; SEQ ID NO: 177; SEQ ID NO: 178; SEQ ID NO: 183; SEQ ID NO: 189-191; SEQ ID NO: 197; и маркеров, упоминаемых как полиморфизмы ID №№ 1-106 в таблице 3.
6. Способ по п. 5, где нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8 и DAS-CMS 1-34.
7. Способ по п. 5, где нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 126 и SEQ ID NO: 134, и маркеров, упоминаемых как полиморфизмы ID №№ 1-106 в таблице 3.
8. Способ по п. 1, дополнительно включающий определение генотипа растения по каждому из маркеров, указанных как полиморфизмы ID №№ 1-106 в таблице 3.
9. Растение, идентифицированное способом по п. 1.
10. Растение по п.9, где растение не продуцирует значительного количества полуфертильных растений при скрещивании с растением, имеющим признак способности отвечать на цитоплазматическую мужскую стерильность C-типа кукурузы.
11. Способ выделения гена Rf4 из кукурузы, причем способ включает:
1
скрещивание растения кукурузы с мужской стерильностью, имеющего признак цитоплазматической мужской стерильности C-типа, с растением кукурузы, являющимся восстановителем мужской стерильности, имеющим признак способности отвечать на цитоплазматическую мужскую стерильность C-типа, с получением растений кукурузы F;
1
2
самоопыление растений кукурузы F с получением растений кукурузы F;
2
классификацию фенотипов фертильности множества растений кукурузы F;
2
определение нуклеотидной последовательности по меньшей мере части области, соответствующей положениям от 86247 до 981888 хромосомы геномной ДНК, выделенной из каждого из множества растений кукурузы F;
идентификацию кодирующей последовательности в области, соответствующей положениям с 86247 по 981888 хромосомы, имеющей наибольшую частоту сцепления с фенотипом восстановленной фертильности, где идентифицированная кодирующая последовательность является геном Rf4 в кукурузе.
12. Способ по п. 11, где растением кукурузы с мужской стерильностью, имеющим признак цитоплазматической мужской стерильности C-типа, является BE4207.
13. Способ по п. 11, где растением кукурузы, являющимся восстановителем мужской стерильности, имеющим признак способности отвечать на цитоплазматическую мужскую стерильность C-типа, является XJH58.
14. Способ по п. 11, где растением кукурузы с мужской стерильностью, имеющим признак цитоплазматической мужской стерильности C-типа, является BE4207, и где растением кукурузы, являющимся восстановителем мужской стерильности, имеющим признак способности отвечать на цитоплазматическую мужскую стерильность C-типа, является XJH58.
15. Способ по п. 11, где геном Rf4 является фактор транскрипции спираль-петля-спираль GRMZM2G021276 (Rf4-bHLH).
2
16. Способ по п. 11, где множество растений кукурузы F включает по меньшей мере 500 растений кукурузы.
3
17. Способ по п. 11, где множество растений кукурузы F включает по меньшей мере 5000 растений кукурузы.
18. Способ восстановления цитоплазматической мужской стерильности в кукурузе, причем способ включает:
1
скрещивание женского стерильного растения кукурузы, имеющего признак цитоплазматической мужской стерильности C-типа, с растением кукурузы, являющимся восстановителем мужской стерильности, имеющим признак способности отвечать на цитоплазматическую мужскую стерильность C-типа, получая растения кукурузы F;
1
использование селекции с помощью маркеров для идентификации растения кукурузы F, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-197 и маркеров, обозначаемых как полиморфизмы ID №№ 1-106 в таблице 3; и
1
размножение идентифицированного растения кукурузы F, тем самым, восстанавливая мужскую стерильность в кукурузе.
19. Способ по п. 18, где нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-9; SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 109; SEQ ID NO: 111; SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 118-120; SEQ ID NO: 123; SEQ ID NO: 126; SEQ ID NO: 134; SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 137; SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 144; SEQ ID NO: 149; SEQ ID NO: 151; SEQ ID NO: 160; SEQ ID NO: 163; SEQ ID NO: 164; SEQ ID NO: 167; SEQ ID NO: 173; SEQ ID NO: 177; SEQ ID NO: 178; SEQ ID NO: 183; SEQ ID NO: 189-191; SEQ ID NO: 197; и маркеров, указанных как полиморфизмы ID №№ 1-106 в таблице 3.
20. Способ по п. 18, где нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 134, и маркеров, указанных как полиморфизмы ID №№ 1-106 в таблице 3.
21. Способ восстановления фертильности в кукурузе, причем способ включает введение выделенного гена Rf4-bHLH по п.15 в женское растение кукурузы, имеющее признак цитоплазматической мужской стерильности C-типа.
22. Способ по п. 21, где ген Rf4-bHLH вводят в женское растение кукурузы, имеющее признак цитоплазматической мужской стерильности C-типа, путем скрещивания с растением кукурузы, являющимся восстановителем мужской стерильности, содержащим ген Rf4-bHLH.
23. Способ получения гибридных семян кукурузы, причем способ включает: оплодотворение женского растения кукурузы, имеющего признак мужской стерильности CMS C-типа, пыльцой из мужского растения кукурузы, содержащего ген Rf4-bHLH; и
получение гибридных семян кукурузы из женского растения кукурузы.
24. Способ получения гибридных семян кукурузы, причем способ включает:
представление женского растения кукурузы, имеющего признак цитоплазматической мужской стерильности C-типа; оплодотворение женского растения кукурузы пыльцой из мужского растения кукурузы, содержащего ген Rf4-bHLH, по п.15; и
сбор гибридных семян кукурузы, развившихся в женском растении кукурузы.
25. Способ получения гибридных семян, причем способ включает:
получение молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность Rf4-bHLH кукурузы SEQ ID NO:220, или молекулы нуклеиновой кислоты, которая специфично гибридизуется с последовательностью Rf4-bHLH кукурузы SEQ ID NO: 220;
введение молекулы нуклеиновой кислоты в клетку растения или ткань растения желаемого вида с получением трансформированной клетки растения или ткани растения желаемого вида;
получение трансформированного цельного растения желаемого вида из клетки растения или ткани растения, в которую введена молекула нуклеиновой кислоты;
опыление женского растения желаемого вида с цитоплазматической мужской стерильностью пыльцой трансформированного цельного растения желаемого вида; и
получение гибридных семян из опыленного женского растения с цитоплазматической мужской стерильностью.
26. Способ по п. 25, где желаемый вид выбран из группы, состоящей из кукурузы; сои; люцерны; пшеницы; рапса; риса; сорго; свеклы; брахиподии; однодольных растений; двудольных растений; огурца; помидора; перца; яблока; груши; персика; вишни; красного дерева; сосны; дуба и цветущих декоративных растений.
27. Выделенный ген Rf4-bHLH кукурузы, содержащий нуклеотидную последовательность, которая, по существу, гомологична нуклеотидной последовательности, указанной в качестве SEQ ID NO: 220.
28. Функциональный вариант гена Rf4-bHLH кукурузы по п. 27.
29. Гомолог гена Rf4-bHLH кукурузы по п. 27, где гомолог представляет собой нативный ген из растения, отличного от Zea mays.
30. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по существу, гомологична SEQ ID NO: 225.
31. Растение, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты по п.30, где растение не является Zea mays.
32. Способ получения организма с помощью генной инженерии, включающий введение молекулы нуклеиновой кислоты по п. 30 в организм.
33. Способ выделения гомолога Rf4 из растения, причем способ включает:
получение геномной ДНК из растения;
контактирование геномной ДНК с нуклеотидной последовательностью, которая специфично гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты по п. 30; и
выделение одной или нескольких последовательности(ей) геномной ДНК, которая специфично гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, которая специфично гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты по п. 30, где одна или несколько последовательность(ей) геномной ДНК представляет собой гомолог Rf4-bHLH.
34. Способ восстановления цитоплазматической мужской стерильности в кукурузе, причем способ включает:
1
скрещивание женского стерильного растения кукурузы, имеющего признак цитоплазматической мужской стерильности C-типа, с растением кукурузы, являющимся восстановителем мужской стерильности, содержащим средства для восстановления фертильности кукурузы CMS-C, с получением растений кукурузы F;
1
идентификацию растения кукурузы F, содержащего средства для восстановления фертильности кукурузы CMS-C; и
1
размножение идентифицированного растения кукурузы F, тем самым, восстанавливая мужскую стерильность в кукурузе.
35. Способ идентификации растения, содержащего функциональный ген-восстановитель для цитоплазматической мужской стерильности C-типа кукурузы, причем способ включает:
выделение молекул нуклеиновых кислот из растения; и
контактирование выделенных молекул нуклеиновых кислот со средствами для идентификации растений кукурузы, имеющих ген для восстановления фертильности кукурузы CMS-C, с получением поддающегося детекции сигнала, который указывает на присутствие функционального гена-восстановителя для цитоплазматической мужской стерильности кукурузы в растении.
36. Способ переноса гена Rf4 кукурузы, причем способ включает:
(a) анализ с помощью зондов, которые специфично гибридизуются по меньшей мере с одним маркером, который сцеплен с геном Rf4 геномной ДНК первого растения с донорным генотипом и ДНК второго растения с реципиентным генотипом;
(b) половое скрещивание генотипов двух родительских растений с получением популяции потомков;
(c) анализ популяции потомков в отношении присутствия по меньшей мере одного маркера, который сцеплен с геном Rf4;
(d) обратное скрещивание особи из популяции потомков, которая содержит по меньшей мере один маркер, который сцеплен с геном Rf4, с реципиентным генотипом с получением популяции следующего поколения;
(e) определение того, содержит ли представитель популяции следующего поколения желаемый признак из генотипа реципиента и гена Rf4; и
(f) если ни один представитель популяции следующего поколения не содержит желаемый признак из реципиентного генотипа и гена Rf4, повторение стадий (d) и (e) до тех пор, пока не идентифицируют особь, который содержит желаемые признаки из реципиентного генотипа и гена Rf4.
37. Способ по п. 35, где проводят селекцию с помощью анализа маркеров Rf4 индивидуального потомства, полученного на каждой стадии скрещивания и обратного скрещивания в каждом поколении.
38. Способ введения гена Rf4-bHLH кукурузы в организм хозяина путем генетической трансформации, причем способ включает:
анализ геномной ДНК растения с помощью зондов, которые специфично гибридизуются с маркерами, сцепленными с геном Rf4, для идентификации гена Rf4 в растении;
выделение сегмента геномной ДНК растения, который специфично гибридизуется с зондами, которые специфично гибридизуются с маркерами, сцепленными с геном Rf4; введение выделенного сегмента геномной ДНК в организм хозяина; и
анализ ДНК организма хозяина с помощью зондов, которые специфично гибридизуются с маркерами, сцепленными с геном Rf4, для идентификации гена Rf4 в организме хозяина.
39. Способ по п. 38, где выделенный сегмент ДНК стабильно встраивается в геном организма хозяина.
40. Способ по п. 38, где организмом хозяина является цветущее растение.
41. Способ по п. 40, где организмом хозяина является Zea mays.
42. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 30, где полипептид содержит мутацию в аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 225, выбранную из группы, состоящей из:
аспарагин на гистидин в положении, соответствующем положению 103 SEQ ID NO: 225;
делеция аланина в положении, соответствующем положению 130 SEQ ID NO: 225;
фенилаланин на тирозин в положении, соответствующем положению 187 SEQ ID NO: 225; и
лейцин на пролин в положении, соответствующем положению 267 SEQ ID NO: 225.
43. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 42, где полипептид содержит тирозин в положении, соответствующем положению 187 в SEQ ID NO: 225.