СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОЙ ГУБЧАТОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ ЖИВОТНЫХ МЕТОДОМ ИММУНО-ПЦР
IMMUNO-PCR DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR INFECTIOUS SPONGIFORM ENCEPHALOPATHY IN ANIMALS

Изобретение относится к области медицины, ветеринарии и биотехнологии, а именно к разработке способа диагностики инфекционной губчатой энцефалопатии животных методом иммуно-ПЦР в реальном времени.
Трансмиссивные губчатые энцефалопатии (TSE), или прионовые инфекции, - фатальная нейродегенеративная патология, встречающаяся у человека и многих видов животных, которая включает такие заболевания, как коровье бешенство (BSE), болезнь Крейцфельда-Якоба (CJD) в организме человека и скрепи у овец и коз. Эти болезни имеют длительные инкубационные периоды, но быстро прогрессируют с момента клинического начала заболевания. Все прионовые болезни смертельные и в настоящее время эффективных способов их лечения нет.
Sc
Патогенные прионы (PrP) выделяют в отдельный новый класс инфекционных агентов, представляющих собой аномальную изоформу нормального прионного белка PrP. Нормальный прионный белок - это гликопротеид, локализованный на клеточной поверхности и имеющий гликозилфосфатидилинозитольный «якорь».
Резко возросший интерес к группе прионных болезней и роли в их возникновении пищевого фактора во многом обусловлен начавшейся в 1986 г. эпизоотией губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота в Великобритании, на пике которой в 1992 г. регистрировалось около 1000 случаев заболеваний коров в неделю, а также с выявлением молодых людей с болезнью Крейтцфельдта-Якоба (новый вариант БКЯ) и доказательством возможности передачи этого заболевания людям в результате употребления в пищу мясопродуктов, полученных из зараженных животных.
По официальным данным в России с населением примерно 150 миллионов болезнь Крейцфельдта-Якоба ежегодно поражает около 150 человек. Учет таких пациентов ведется неактивно: случаи заболевания не выявляются и не регистрируются. Поэтому на современном этапе является важным налаживание в общегосударственном масштабе работы по регистрации прионных болезней человека и животных на всей территории страны с обращением особого внимания на группы риска.
Основными методами диагностики данной патологии остаются различные варианты иммунологического анализа, а именно: иммуногистохимическое (ИГХ), вестерн-блоттинг и имунноферментный анализ (ИФА). Так, известен способ (патент РФ№2281511) - определения прионного протеина «сэндвич-методом» ИФА в ткани мозга млекопитающих с использованием пары «антитело-конъюгат», включающей антитело и конъюгат антитела с пероксидазой хрена.
Патент № DE 19963198 А1 описывает способ диагностики нейродегенеративных заболеваний на формалин-фиксированных срезах тканей, включает в себя распространение и очистку образца ткани на мембране для инкубации с раствором протеазы.
В патенте № US 2007224593 А1 представлен метод диагностики трансмиссивной губчатой энцефалопатии. Изобретение включает метод диагностики и прогнозирования трансмиссивных губчатых энцефалопатии у млекопитающих в целых тканях и отдельных образцах, содержащих соединения, которые образуются в результате развития неамилоидной формы прионного заболевания. Увеличение подобных соединений в образцах мозга и других образцах по сравнению с нормальным уровнем контроля указывает на то, что млекопитающее страдает от заболевания, или имеется риск развития TSE, или что образец загрязнен TSE-инфицированным материалом.
Однако данные работы не позволяют устранить главные недостатки существующих систем: высокая инфекционная опасность для оператора; длительное время проведения исследования; недостаточная чувствительность (неоднозначность интерпретации отрицательных результатов исследования); в качестве образцов для исследования используют образцы различных частей мозга, таким образом, возможно только посмертное определение присутствия патогенной формы прионного белка в организме животного.
Известен также метод диагностики прионных заболеваний с использованием иммуно-ПЦР в реальном времени (патент № WO/2005/086647). Это техническое решение является наиболее близким к заявляемому по совокупности существенных признаков (прототип).
Согласно прототипу метод диагностики состоит из следующих этапов. Этап «immunocapture» использует антитела захвата (захват молекулы), специфичные для прионов, прикрепленные к твердой поддержке, которые взаимодействуют с прионами из образца. Этап «обнаружение» включает добавление различных биотинилированных антител (детектор - молекулы), а затем добавление компоновщик - молекулы (например, авидин или стрептавидин), которая связывается с биотинилированными антителами. Этап усиления включает добавление реагента усиления, который состоит из (I) полинуклеотидной молекулы и (II) биотиновой части. Полинуклеотидная молекула представлена последовательностью бактериофага лямбда размером 250 п.н. Далее проводится полимеразная цепная реакция. Данный метод может использоваться для обнаружения биомолекул в биологических образцах, таких как кровь, нейронная ткань и моча, а также в пробах окружающей среды, таких как вода, почва, воздух и биологические материалы. Недостатки метода: невысокая чувствительность определения при низком уровне содержания прионного белка в исследуемом образце и высокая стоимость анализа.
Задачей технического решения является создание простого и высокочувствительного метода для обнаружения низкого уровня патогенных белков в исследуемом образце, в качестве которых могут выступать биологические жидкости (кровь, моча и т.д.) и различные многокомпонентные составы.
Sc
Результат достигается за счет: 1) использования ДНК-мишени, не имеющей гомологов с последовательностями из базы данных GenBank AGGAGGTGGCCACGACTGCGAAGGAGGTGGCGTAGGATAGAGTCAGTCCTTGGCCTCCTTGGCCCAGTTAAGAAGTTGCAGCCACACACGCTGTTGTTGGGTTCGGGGCGGAGTTGCAGCCATCTACACAAACGATACCCTCGTGCAGCTGGAGAAGCAGCACGGCCTATTACCTGGAGGAGGATCGAAACTGA, что снижает риск ложных срабатываний за счет экзогенных загрязнений, 2) использования моноклонального антитела 15В3, которое реагирует с патогенным прионным белком, но не взаимодействует с нормальным, и способно обнаруживать PrP в гомогенатах зараженного материала без необходимости действия протеиназы K, что имеет большое значение для анализа крови и др. биологических жидкостей, 3) упрощения и удешевления анализа за счет иммобилизации антигена на подложке планшета без использования антител-захвата.
Иммуно-ПЦР-тест-система сочетает в себе универсальность иммуноферментного анализа с мощностью и чувствительностью ПНР. Данная тест-система позволяет обнаружить патогенный прионный белок с использованием специфических антител, меченных двухцепочечной ДНК (маркер). Учитывая огромные возможности усиления и специфичности ПЦР, иммуно-ПЦР-технология имеет чувствительность больше, чем все существующие системы обнаружения антигена, и может быть применена для обнаружения отдельных молекул антигена. Проведение полимеразной цепной реакции позволяет многократно увеличивать специфический участок нуклеотидной последовательности, что существенно повышает чувствительность метода и позволяет увеличить перечень образцов, пригодных для исследования. При разработке метода ПЦР в режиме реального времени, когда проба находится в закрытой пробирке, происходит снижение инфекционной опасности для оператора.
Способ диагностики инфекционной губчатой энцефалопатии животных осуществляется следующим образом:
1 этап - иммобилизация антигена (прионный белок) в лунках полистиролового 96-луночного планшета. Проводят инкубирование, удаляют несвязанный материал, впоследствии проводится блокировка незанятых участков пластика.
2 этап - связывание антигена с биотилированным антителом. Для определения адсорбированного материала в лунки вносятся биотинилированные моноклональные антитела к патогенному прионному белку, после чего проводится инкубация планшета.
3 этап - приготовление ДНК-репортера. В качестве связующего звена между антителом и ДНК-репортером используется стрептавидин-биотиновый комплекс.
Одна молекула стрептавидина, состоящая из четырех идентичных субъединиц, способна взаимодействовать с четырьмя молекулами биотина, что позволяет использовать его как связующую молекулу между двумя биотинсодержащими соединениями. В этом случае ДНК-хвост тоже биотинилируют, а стрептавидин выполняет функцию мостика, соединяя две молекулы, содержащие остатки биотина.
Получение конъюгатов (антител и ДНК с биотином) осуществляется достаточно легко и сопровождается минимальными изменениями их иммунологической активности.
Рекомбинантный стрептавидин предварительно инкубируют с биотинилированным ДНК-репортером.
4 этап - связывание биотилированного антитела с стрептавидиновым комплексом (комплекс стрептавидин - биотин - ДНК-мишень). Добавление стрептавидинового комплекса ДНК в лунки с последующей инкубацией планшета.
5 этап - проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием флуоресцентного зонда. Лунки промывают, а затем подвергаются ПЦР.
Приготовление пробы включает следующие операции.
-1
Исследуемый материал тщательно освобождают от жира и соединительной ткани. Навеску массой 3-4 г тщательно измельчают ножом на часовом стекле. К навеске измельченного сырья приливают дистиллированную воду в соотношении 1:6 (по массе) и ведут экстракцию на холоде при 0°С в течение 30 мин. Затем центрифугированием при частоте вращения 83 с в течение 5 мин отделяют осадок. Надосадочную жидкость осторожно декантируют и используют для количественного определения белков.
Осадок количественно переносят в фарфоровую ступку, растирают с песком и приливают солевой раствор Вебера в соотношении 1:6 к первоначальной массе навески мышечной ткани.
-1
Экстракцию проводят при 0°С в течение 20 мин. По истечении указанного времени экстракт отделяют центрифугированием в течение 10 мин при частоте вращения 83 с. Надосадочную жидкость декантируют и используют для количественного определения солерастворимых белков, а осадок подвергают последующей обработке.
3
-1
Осадок переносят в термостойкую пробирку, добавляют 10 см раствора гидроксида натрия с массовой долей 10% и нагревают на водяной бане до температуры 96°С. Полученный раствор после охлаждения центрифугируют в течение 5 мин при частоте вращения 83 с.
Конструирование ДНК-матрицы представляет собой этап построения подробной модели гена-мишени (ДНК-матрица) или иной последовательности нуклеиновой кислоты, которую планируется амплифицировать.
Чтобы снизить риск ложных срабатываний за счет экзогенных загрязнений ДНК, была разработана ДНК-матрица, не существующая в природе.
Была построена синтетическая последовательность длиной 194 п.н. (известно, что наиболее оптимальной длиной считают фрагменты в диапазоне 150-300 пар оснований), полученная случайным образом:
AGGAGGTGGCCACGACTGCGAAGGAGGTGGCGTAGGATAGAGTCAGTCCTTGGCCTCCTTGGCCCAGTTAAGAAGTTGCAGCCACACACGCTGTTGTTGGGTTCGGGGCGGAGTTGCAGCCATCTACACAAACGATACCCTCGTGCAGCTGG AGAAGCAGCACGGCCTATTACCTGGAGGAGGATCGAAACTGA
Созданная последовательность была проанализирована в GenBank с помощью программы BLAST. Используя данную программу, сравнили имеющуюся последовательность с последовательностями из базы данных и определили наличие гомологов. Анализ показал, что созданные нуклеотидные последовательности гомологов не имеют.
Антитела к патогенному прионному белку
В связи с высокой межвидовой гомологией, отмеченной для белка PrP, лучше выбирать антитела, для получения которых используют конъюгаты пептидов.
Так, в ходе анализа было выбрано мышиное моноклональное антитело 15В3 (компании Prionics), которое получено с помощью 3-х различных последовательностей (эпитопа) пептида PrP человека: 15b3-1 включает в себя остатки 142-148 GSDYEDR(YY); 15b3-2 остатки 162-170 YYRPVDQYS; 15b3-3 остатки 214-226 ClTQYQRESQAYY.
Sc
15B3-1 и 15B3-2 связаны с β-листами, которые накапливаются в PrP и 15B3-3 признает аминокислотные остатки вблизи С-конца.
sc
C
15В3 является антителом, которое специфически распознает аберрантно сложенные молекулы белка PrP, а не нормальные молекулы PrP (PrP). Специфичность антител, которая была разработана Prionics в 1997 году, была подтверждена в исследовании Biasini и коллег.
Sc
Антитела 15В3 способны обнаруживать PrP в гомогенатах зараженного материала без необходимости действия протеиназы К. Это имеет большое значение для анализа крови.
sc
c
Экспериментально было показано, что 15В3 реагирует с PrP человека, крупного рогатого скота, овцы, оленя, мыши и хомяка, но не реагирует с нормальными PCP прионами.
Конструирование праймеров
Одними из ключевых компонентов анализа являются «праймеры» - олигонуклеотидные последовательности длиной 15-30 п.н.
Олигонуклеотидные праймеры размером 20 п.н. были подобраны с помощью программы Primer3 с учетом последовательности ДНК-матрицы:
левый праймер - с 41 п.н. - AGTCAGTCCTTGGCCTCCTT
правый праймер - с 193 п.н. - CAGTTTCGATCCTCCTCCAG
Конструирование флуоресцентного зонда
Одним из важных компонентов ПЦР в реальном времени является флуоресцентный зонд, за счет которого можно достичь более высокой специфичности детекции результатов ПЦР. Он представляет собой олигонуклеотид, к которому присоединена молекула флуорофора, прикрепленного к 5'-концу олигонуклеотида зонда и гасителя на 3'-конце зонда.
С помощью программы Primer3 была выбрана следующая область зонда размером 20 п.н. - AGAAGCAGCACGGCCTATTA с параметрами:
Флуоресцентный зонд №1 - AGAAGCAGCACGGCCTATTA
Флуоресцентный зонд №2 - ATACCCTCGTGCAGCTGGAGAAGCA
В качестве флуорофора был использован карбоксифлуоресцин (FAM) как наиболее доступный и легко обнаруживающийся с помощью всех инструментов, существующих в настоящее время на рынке. В соответствии с диапазоном флуоресценции флуорофора был подобран подходящий гаситель - BHQ-1.
Пример 1. Обнаружение прионных белков в пробах, взятых у овец, с использованием иммуно-ПЦР-тест-системы
С помощью изобретения были протестированы пробы, взятые у овец. Протокол анализа следующий:
1) Приготовление пробы
-1
Исследуемый материал тщательно освобождают от жира и соединительной ткани. Навеску массой 3-4 г тщательно измельчают ножом на часовом стекле. К навеске измельченного сырья приливают дистиллированную воду в соотношении 1:6 (по массе) и ведут экстракцию на холоде при 0°С в течение 30 мин. Затем центрифугированием при частоте вращения 83 с в течение 5 мин отделяют осадок. Надосадочную жидкость осторожно декантируют и используют для количественного определения белков.
Осадок количественно переносят в фарфоровую ступку, растирают с песком и приливают солевой раствор Вебера в соотношении 1:6 к первоначальной массе навески мышечной ткани.
-1
Экстракцию проводят при 0°С в течение 20 мин. По истечении указанного времени экстракт отделяют центрифугированием в течение 10 мин при частоте вращения 83 с. Надосадочную жидкость декантируют и используют для количественного определения солерастворимых белков, а осадок подвергают последующей обработке.
3
-1
Осадок переносят в термостойкую пробирку, добавляют 10 см раствора гидроксида натрия с массовой долей 10% и нагревают на водяной бане до температуры 96°С. Полученный раствор после охлаждения центрифугируют в течение 5 мин при частоте вращения 83 с.
2) Пробу вносят по 100 мкл в лунки полистиролового 96-луночного планшета. Инкубируют при 37°С в течение 60 мин. Для выбора оптимальных условий адсорбции антигена на пластике проводится инкубирование антигена по 100 мкл на лунку в концентрациях 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10,0; 25,0; 50,0 мкг/мл в течение 30, 60, 90, 120, 150, 180 минут.
3) Несвязанный материал удаляется с лунок простым встряхиванием с последующей 3-кратной отмывкой (промывочный буфер: 50 ммоль/л Tris, 150 ммоль/л NaCl, 0,5 мл/л Твин 20).
4) Блокировка незанятых участков пластика внесением раствора PBS, содержащего бычий сывороточный альбумин, в лунки планшета по 100 мкл на лунку в течение 30 минут.
5) После удаления блокирующего раствора (путем промывки) для определения адсорбированного материала в лунки вносят по 100 мкл биотинилированных моноклональных антител к патогенному прионному белку 15В3 и инкубируют планшет в течение 2 часов при 18°С.
6) Удаляются несвязанные антитела путем 3-кратного промывания лунок раствором PBS, содержащим 1 мл/л Твин (Tween), и 3 раза раствором PBS, содержащим 15 г/л бычьего сывороточного альбумина.
7) Параллельно готовят ДНК-репортер. Получение конъюгатов (антител и ДНК с биотином) осуществляется достаточно легко и сопровождается минимальными изменениями их иммунологической активности. Рекомбинантный стрептавидин предварительно инкубируют в течение 45 мин при 4°С с биотинилированным ДНК-репортером в молярном соотношении 1:2.
8) Срептавидиновый комплекс ДНК затем добавляют в лунки и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.
9) Лунки промывают 5 раз PBS и 10 раз дистиллированной водой, а затем подвергаются ПНР-анализу, параметры которого представлены в табл.1 и 2.
Таблица 1
Компоненты ПНР
Компонент
Конечная концентрация
Количество компонента на 50 мкл смеси
10Х ПНР-буфер
IX
5 мкл
10 мМ смесь дНТФ
0,2 мМ каждого
1 мкл
Праймер 1 (50 мкМ)
1 мкМ
1 мкл
Праймер 2 (50 мкМ)
1 мкМ
1 мкл
Taq-ДНК-полимераза
1,25 ед.
0,5 мкл
25 мМ MgCl<sub>2</sub>
1-5 мМ
2-5 мкл
ДНК-матрица
0,1-1 мкг
Варьирует от концентрации образца
Деионизированная вода
-
До 50 мкл
Таблица 2
Параметры амплификации
Стадия
Количество циклов
Температура, °С
Время инкубации
Предварительная денатурация
1
95
1 мин
Денатурация
30
95
30 с
Отжиг
56
1 мин
Элонгация
72
30 с
Результаты, полученные в ходе выполнения исследований, представлены в табл.3.
Таблица 3
Результаты эксперимента
№, п/п
Наименование
Длина ПЦР-ампликона, п.н.
1
Положительный контроль
153
2
Исследуемый образец
-
Пример 2. Обнаружение прионных белков в пробах Bos taurus (корова) с использованием иммуно-ПЦР-тест-системы
С помощью изобретения были протестированы пробы, взятые у Bos taurus (корова). Протокол анализа следующий:
1) Приготовление пробы
-1
Исследуемый материал тщательно освобождают от жира и соединительной ткани. Навеску массой 3-4 г тщательно измельчают ножом на часовом стекле. К навеске измельченного сырья приливают дистиллированную воду в соотношении 1:6 (по массе) и ведут экстракцию на холоде при 0°С в течение 30 мин. Затем центрифугированием при частоте вращения 83 с в течение 5 мин отделяют осадок. Надосадочную жидкость осторожно декантируют и используют для количественного определения белков.
Осадок количественно переносят в фарфоровую ступку, растирают с песком и приливают солевой раствор Вебера в соотношении 1:6 к первоначальной массе навески мышечной ткани.
-1
Экстракцию проводят при 0°С в течение 20 мин. По истечении указанного времени экстракт отделяют центрифугированием в течение 10 мин при частоте вращения 83 с. Надосадочную жидкость декантируют и используют для количественного определения солерастворимых белков, а осадок подвергают последующей обработке.
3
-1
Осадок переносят в термостойкую пробирку, добавляют 10 см раствора гидроксида натрия с массовой долей 10% и нагревают на водяной бане до температуры 96°С. Полученный раствор после охлаждения центрифугируют в течение 5 мин при частоте вращения 83 с.
2) Пробу вносят по 100 мкл в лунки полистиролового 96-луночного планшета. Инкубируют при 37°С в течение 60 мин. Для выбора оптимальных условий адсорбции антигена на пластике проводится инкубирование антигена по 100 мкл на лунку в концентрациях 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10,0; 25,0; 50,0 мкг/мл в течение 30, 60, 90, 120, 150, 180 минут.
3) Несвязанный материал удаляется с лунок простым встряхиванием с последующей 3-кратной отмывкой (промывочный буфер: 50 ммоль/л Tris, 150 ммоль/л NaCl, 0,5 мл/л Твин 20).
4) Блокировка незанятых участков пластика внесением раствора PBS, содержащего бычий сывороточный альбумин, в лунки планшета по 100 мкл на лунку в течение 30 минут.
5) После удаления блокирующего раствора (путем промывки) для определения адсорбированного материала в лунки вносят по 100 мкл биотинилированных моноклональных антител к патогенному прионному белку 15В3 и инкубируют планшет в течение 2 часов при 18°С.
6) Удаляют несвязанные антитела путем 3-кратного промывания лунок раствором PBS, содержащим 1 мл/л Твин (Tween) и 3 раза раствором PBS, содержащим 15 г/л бычьего сывороточного альбумина.
7) Параллельно готовят ДНК-репортер. Получение конъюгатов (антител и ДНК с биотином) осуществляется достаточно легко и сопровождается минимальными изменениями их иммунологической активности. Рекомбинантный стрептавидин предварительно инкубируют в течение 45 мин при 4°С с биотинилированным ДНК-репортером в молярном соотношении 1:2.
8) Срептавидиновый комплекс ДНК затем добавляют в лунки и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.
9) Лунки промывают 5 раз PBS и 10 раз дистиллированной водой, а затем подвергают ПЦР-анализу, параметры которого представлены в табл.4 и 5.
Таблица 4
Компоненты ПНР
Компонент
Конечная концентрация
Количество компонента на 50 мкл смеси
10Х ПЦР-буфер
IX
5 мкл
10 мМ смесь дНТФ
0,2 мМ каждого
1 мкл
Праймер 1 (50 мкМ)
1 мкМ
1 мкл
Праймер 2 (50 мкМ)
1 мкМ
1 мкл
Taq-ДНК-полимераза
1,25 ед.
0,5 мкл
25 мМ MgCl<sub>2</sub>
1-5 мМ
2-5 мкл
ДНК-матрица
0,1-1 мкг
Варьирует от концентрации образца
Деионизированная вода
-
До 50 мкл
Таблица 5
Параметры амплификации
Стадия
Количество циклов
Температура, °С
Время инкубации
Предварительная денатурация
1
95
1 мин
Денатурация
30
95
30 с
Отжиг
56
1 мин
Элонгация
72
30 с
Результаты, полученные в ходе выполнения исследований, представлены в табл.6.
Таблица 6
Результаты эксперимента
№, п/п
Наименование
Длина ПЦР ампликона, п.н.
1
Положительный контроль
153
2
Исследуемый образец
-