Влияние экстракта Hypecoum erectum на морфофункциональное состояние печени крыс при тетрациклиновом гепатите

Влияние экстракта Hypecoum erectum на морфофункциональное состояние печени крыс при тетрациклиновом гепатите

А. А. ТОРОПОВА', С. М. НИКОЛАЕВ', Я. Г. РАЗУВАЕВА', А. В. ФЕДОРОВ2, З. Г. САМБУЕВА', И. П. УБЕЕВА3

1 Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ

2 Бурятский государственный университет, Улан-Удэ

3 Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования, Иркутск

Effect of Hypecoum erectum Extract on Morphofunctional State of the Liver in Rats with Tetracycline-Associated Hepatitis

A. A. TOROPOVA, S. M. NIKOLAEV, YA. G. RAZUVAEVA, A. V. FEDOROV, Z. G. SAMBUEVA, I. P. UBEEVA

Institute of General and Experimental Biology, Siberian Departmen, Russian Academy of Sciences, Ulan-Ude Buryat State University, Ulan-Ude

Irkutsk State Medical Academy for Postgraduate Training, Irkutsk

Исследовано влияние экстракта Hypecoum erectum L. на морфофункциональное состояние печени крыс при экспериментальном тетрациклиновом гепатите. Эксперименты проведены на 40 белых крысах линии Wistar. Экстракт H.erectum в дозе 50 мг/кг вводили животным в течение 5 дней на фоне применения тетрациклина гидрохлорида (1,0 г/кг массы). На 7-е сутки опыта определяли: концентрацию малонового диальдегида, активность каталазы, содержание АТФ, пирувата и лак-тата в гомогенате печени, а также содержание восстановленного глутатиона в крови; проводили патоморфологическое изучение печени. Установлено, что экстракт H.erectum ингибирует процессы перекисного окисления липидов, повышает активность эндогенной антиоксидантной системы организма, нормализует энергообеспеченность гепатоцитов и ограничивает развитие дистрофических процессов в печени.

Ключевые слова: тетрациклиновый гепатит, экстракт Hypecoum erectum L., гепатопротекторное влияние, антиокси-дантная активность, энергетический обмен.

The effect of Hypecoum erectum L. extract on the morphofunctional condition of the liver in rats with experimental tetracycline-associated hepatitis was studied. The experiment included 40 albino rats Wistar. The animals treated with tetracycline hydrochloride (1.0 g/kg body weight) were exposed to the extract in a dose of 50 mg/kg for 5 days. On the 7th day of the experiment the following indices were determined: malonic dialdehyde concentration, catalase activity, the levels of ATP, pyruvate and lactate in the liver homogenate, as well as the blood levels of reduced glutathione. The liver pathomorphological investigation was applied. The H.erectum extract was shown to inhibit lipid peroxidation, to increase the activity of the host endogenous antioxidant system, to normalize the hepatocyte energy provision and to limit the liver degeneration.

Key words: tetracycline-associated hepatitis, Hypecoum erectum L. extract, hepatoprotective effect, antioxidant activity, energy metabolism.

За последнее десятилетие возросла доля токсического поражения печени лекарственными препаратами или иными субстанциями неинфекционного происхождения. Так, на территории России острые медикаментозные поражения печени выявляются у 3—5% госпитализированных больных [1, 2]. Чаще всего их причиной являются противотуберкулёзные препараты, антибиотики (изониазид, амоксициллин/клавулановая кислота, тетрациклин), нестероидные противовоспалительные средства и ненаркотические анальгетики

© Коллектив авторов, 2014

Адрес для корреспонденции: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой. 6, ИОЭБСО РАН

(парацетамол), а также гормональные средства, цитостатики, антигипертензивные и антиаритмические препараты [3, 4]. В большинстве случаев острых лекарственных поражений печени отмена «причинного» препарата — достаточное условие для обратного развития патологических изменений. Однако нередко возникает ситуация, когда отмена гепатотоксического средства невозможна без создания непосредственной или отсроченной угрозы для жизни пациента. В связи с этим в комплексной терапии заболеваний печени различного генеза требуется использование безопасных многофункциональных гепатопротекторов, защищающих гепатоциты от повреждения и восстанавливающих их функцию. Наиболее перспек-

тивным в этом направлении является использование фитопрепаратов, характеризующихся широким спектром фармакологического действия, высокой эффективностью на ранних стадиях заболеваний, при вялотекущих и хронических заболеваниях, а также в периоды ремиссии болезни и реабилитации больных. Кроме того, гепатоза-щитные средства растительного происхождения, в комплексной фармакотерапии заболеваний печени потенцируют действие базисных средств, а также являются корректорами метаболических нарушений повреждённого органа [5, 6]. Особый интерес представляет дикорастущий вид Hypecoum erectum L. (семейство Papaveraceae). В тибетской медицине, а также в Монголии и Сибири настой H.erectum применяется при гепатитах, инфекционных и онкологических заболеваниях. В частности, установлена возможность использования H.erectum при тяжёлой токсической форме инфекционного гепатита с аллергическими реакциями [7, 8]. В экспериментах in vitro показано, что экстракт сухой H.erectum обладает выраженной мембраностабилизирующей и антиоксидант-ной активностью [9].

Целью настоящего исследования явилась оценка влияния экстракта сухого H.erectum на морфофункциональное состояние печени крыс при экспериментальном лекарственном (тетра-циклиновом) гепатите.

Материал и методы

Исследования выполнены на 40 белых крысах линии Wistar обоего пола с исходной массой 180-200 г. Содержание животных соответствовало «Правилам лабораторной практики» (GLP) и Приказу МЗ РФ № 708Н от 23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Экспериментальную работу осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г.), Правилами, принятыми в Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986). Протокол исследования согласован с этическим комитетом ИОЭБ СО РАН (протокол № 5 от 05.09.2010). Эвтаназию животных осуществляли методом мгновенной декапитации под лёгким эфирным наркозом.

Экстракт сухой из травы H.erectum получен экстракцией высушенной надземной части 96% этанолом двукратно при комнатной температуре в течение 2 ч, в соотношении сырье: экстрагент (1:10), затем 40% этанолом при температуре 90+5°С двукратно в течение 1 ч, затем водой, очищенной при 40°С в течение 1 ч. Конечный продукт получали высушиванием концентрированного экстракта в вакуум-сушильном шкафу. В полученном экстракте сухом H.erectum содержатся: каротиноиды — 27,97+0,85 мг%; полифенолы — 3,17+0,09%; флавоноиды — 0,14+0,01%: аскорбиновая кислота — 3,54+0,07%; водорастворимые полисахариды — 17,0+0,8%. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) обнаружено содержание в экстракте: кверцетина — 14,81 мкг/г; лютеолина — 15,56 мкг/г; цина-розида — 98,89 мкг/г; рутина — 430,37 мкг/г.

Лекарственное поражение печени у животных воспроизводили путём внутрижелудочного введения тетрациклина гидрохлорида в дозе 1,0 г/кг массы 1 раз в сутки в течение 5 дней

[10]. Крысам 1-й опытной группы, наряду с введением тетрациклина, водили per os экстракт H.erectum в дозе 50 мг/кг (экспериментально-терапевтическая доза) в виде водного раствора, на протяжении 7 дней. Животным 2-й опытной группы в качестве референтного препарата вводили карсил в дозе 50 мг/кг по аналогичной схеме. Контрольная группа животных на фоне введения тетрациклина получала эквиобъёмное количество воды очищенной по аналогичной схеме. Интервалы между введениями тетрациклина гидрохлорида и фитосредст-вом, а также воды в соответствующих группах животных составляли 4—5 часов с целью предотвращения взаимодействия антибиотика с растительным средством в желудочно-кишечном тракте [10]. Животным интактной группы тетрациклин гидрохлорид не вводили. В каждую группу входило по 10 животных. Исследование морфофункционального состояния печени проводили на 7 сутки от начала введения тетрациклина гидрохлорида.

Для оценки интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли концентрацию малонового диальдегида (МДА) в гомогенате печени [11]. О состоянии ан-тиоксидантной системы судили по активности каталазы в гомогенате печени [12], а также по содержанию восстановленного глутатиона (GSH) в крови [13]. Для изучения энергетического обмена клеток печени определяли содержание аденозитрифосфорной кислоты (АТФ) и концентрацию пировиноградной (пируват) и молочной (лактат) кислот в гомогенате печени [14]. Для патоморфологических исследований кусочки печени крыс фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Для выявления нейтральных липидов свежезамороженные срезы, приготовленные на криостате МК-25, окрашивали Суданом IV. На каждом микропрепарате в 20 полях зрения подсчитывали количество (%) гепатоцитов с жировой инфильтрацией. Значимость различий между указанными параметрами среди экспериментальных групп оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Результаты исследований показали (табл. 1), что введение животным тетрациклина в высоких дозах вызывает усиление процессов ПОЛ в мембранах гепатоцитов и снижение активности эндогенной антиокислительной системы, о чем свидетельствовало увеличение концентрации МДА в гомогенате печени в 2,1 раза и снижение активности каталазы и GSH в среднем в 2,0 раза по сравнению с данными животных интактной группы (табл. 1). Следует отметить, что GSH — наиболее важный и эффективный антиоксидант тиоловой группы и истощение запасов внутриклеточного глутатиона свидетельствует о выраженном напряжении прооксидантно-антиоксидантного баланса организма.

Установлено, что на фоне введения экстракта H.erectum в дозе 50 мг/кг на 7 сутки эксперимента наблюдалось ингибирование свободнорадикаль-ных реакций в биологических мембранах гепато-цитов при стимуляции антиоксидантного потенциала (табл. 1). Так содержание МДА в гомогенате печени животных указанной группы снижалось на 14 %, а активность каталазы и содержание GSH повышались на 23 и 58% соответственно, по сравнению с данными у крыс контрольной группы

Таблица 1. Влияние экстракта Н.егесЮт на показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантную систему организма белых крыс при тетрациклиновом повреждении печени

Показатели Группы животных

интактная (Н20) контрольная опытная 1 опытная 2

(тетрациклин+Н20) (тетрациклин+ (тетрациклин+

Н.егееШт) карсил)

МДА, мкмоль/г ткани 3,72+0,31 7,77+0,30 6,58+0,27* 7,31+0,16*

Каталаза, мкат/мг белка 7,19+0,14 3,58+0,25 4,42+0,18* 3,99+0,10

08И, мкмоль/л 14,01+1,02 7,43+0,53 11,73+0,62* 11,57+0,85*

Примечание. * - здесь и далее различия значимы по сравнению с данными у животных контрольной группы при р<0,05.

Таблица 2. Влияние экстракта Н.егесит на показатели энергообеспеченности гепатоцитов белых крыс при тетрациклиновом повреждении печени

Показатели Группы животных

интактная (Н20) контрольная опытная 1 опытная 2

(тетрациклин+Н20) (тетрациклин+ (тетрациклин+

Н.егееШт) карсил)

АТФ, мкМ/г ткани 2,35+0,16 0,82+0,08 1,79+0,05* 1,17+0,13*

Лактат, мМ/г ткани 1,45+0,04 2,71+0,07 2,17+0,07* 1,96+0,06*

Пируват, мМ/г ткани 0,136+0,012 0,130+0,007 0,145+0,010 0,139+0,003

Лактат/ Пируват 11:1 20:1 15:1 14:1

(табл. 1). По своей антиоксидантной активности экстракт сухой Н.егееШт не уступал референтному препарату.

Данные, представленные в табл. 2, показывают, что экспериментальное повреждение печени тетрациклином вызывает ухудшение энергообеспеченности гепатоцитов. Так, в гомогенате печени животных контрольной группы отмечалось снижение количества АТФ в 2,8 раза, что свидетельствует о нарушении функций митохондрий. Кроме того, наблюдалось увеличение содержания лактата на 87% по сравнению с показателем животных интактной группы. Все это характеризует напряжённость метаболических процессов аэробного и анаэробного гликолиза в организме. Полученные результаты согласуются с данными литературы о том, что на фоне введения больших доз указанного антибиотика происходит торможение аэробного фосфорилирования и снижение содержания АТФ [15]. Уровень пирувата на фоне тетрациклинового гепатита изменялся не столь значительно, как лактата, в связи с тем что пиро-виноградная кислота — величина нестабильная и является «точкой пересечения» многих метаболических путей.

Введение животным испытуемого фитосредст-ва нормализовало энергетическое состояние тканей печени при тетрациклиновом гепатите. Так, концентрация АТФ в гомогенате печени животных указанной группы повышалась в 2,2 раза, содержание лактата снижалось на 20 % по сравнению с аналогичными показателями у животных контрольной группы. Соотношение лактат/пируват в опытной группе животных, получавших экстракт Н.егееШт, составляло 15:1, тогда как в контрольной группе — 20:1 (см. табл. 2), что указывает на норма-

лизацию углеводного обмена. По исследуемым в эксперименте параметрам, экстракт сухой Н.егееШт проявлял более выраженное, чем карсил, анти-оксидантное и энергопротективное действие.

Патоморфологические исследования показали, что в печени животных контрольной группы выявлялись нарушения микроциркуляции в виде полнокровия центральных и портальных вен, ди-апедез лейкоцитов. Синусоидальные пространства были неравномерно расширены. В области центральной вены отмечались зернистая дистрофия и фокальный некроз гепатоцитов, сопровождающиеся полиморфноклеточной инфильтрацией. В зоне портальных трактов клеточная инфильтрация была более выражена; наблюдались значительные участки гепатоцитов с мелко-и среднекапельной жировой дистрофией, что подтверждалось гистохимической окраской на жир Суданом IV. Результаты морфометрических исследований показали, что количество гепато-цитов в области портальных трактов, подверженных жировой дистрофии, составляло в среднем 17,5% от всей популяции.

В печени животных, получавших экстракт Н.егееШт и карсил на фоне введения тетрациклина, на 7 сутки наблюдения отмечали менее выраженные структурные изменения по сравнению с контролем, характеризующиеся нарушениями микроциркуляции и умеренно выраженными дистрофическими процессами в печени. Гепато-циты в зоне центральной вены были подвержены зернистой дистрофии, при этом лейкоцитарная инфильтрация была менее выраженной, чем в контроле. На фоне введения испытуемых средств жировая дистрофия гепатоцитов в перипорталь-ной области выявлялась у 70% животных, тогда

как в контроле у 100%. По данным морфометри-ческих исследований, количество гепатоцитов с жировой дистрофией на фоне введения H.erectum составляло 8—13%, что было в среднем на 48% ниже показателя контрольных животных.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что поражение печени, вызванное тетрациклином, характеризуется повреждением мембран гепатоцитов, индукцией перекисного окисления липидов, снижением активности эндогенной антиоксидантной системы и развитием энергодефицитного состояния, что является причиной развития органических изменений в органе. Экстракт H.erectum в экспериментально-терапевтической дозе 50 мг/кг ограничивает негативное действие тетрациклина гидрохлорида на морфофункциональное состояние исследуемого органа, способствуя ингиби-рованию процессов ПОЛ и повышению активности эндогенной антиоксидантной системы, а также нормализуя энергетический статус гепа-

ЛИТЕРАТУРА

1. Галимова С.Ф. Лекарственные поражения печени (часть I). Трансплантология 2011; 1: 13—21.

2. Хазанов А.И., Плюснин С.В., Васильев А.П. и др. Клинические особенности острых лекарственных гепатитов. Росс журн гастроэн-терол гепатол колопроктол 2009; 4: 31—40.

3. Буторова Л.И., Калинин А.В. Лекарственные поражения печени. М.: 2010; 64.

4. Andrade R. J., Tulkens P.M. Hepatic safety of antibiotics used in primary care. J Antimicrob Chemother 2011; 66: 1431—1446.

5. Демидов В Н., Назаренко O.A., Егорова Е.Ю. и др. Эффективность применения препарата Прогепар при экспериментальном по-вревдении печени алкоголем и парацетамолом. Фарматека 2011; 2: 85—90.

6. Николаев С.М. Фитофармакотерапия и фитофармакопрофилак-тика заболеваний. Улан-Удэ: 2012; 286.

7. Асеева Т.А., Базарон Э.Г., Резанова О.И. Расшифровка тибетского названия растения «Бар-ба-да» и его применение в индо-тибет-ской медицине. Растит ресурс 1979; 2: 15: 293—296.

8. Тибетская медицина у бурят / Т.А. Асеева, Д.Б. Дашиев, А.Д. Да-шиев и др. Новосибирск: 2008; 324.

тоцитов и тем самым ограничивая развитие жировой дистрофии в клетках печени. Установленное влияние исследуемого средства обусловлено преимущественным содержанием в его составе полифенольных соединений, являющихся природными антиоксидантами. Широкий спектр фармакологической активности биофлавонои-дов, как известно, обусловлен их влиянием на многочисленные ферментные системы организма [16]. По влиянию на морфофункциональное состояние печени при тетрациклиновом гепатите эффект H.erectum сопоставим, а по действию на энергетический обмен превосходит референтный препарат карсил.

Полученные результаты сравнительных исследований позволяют рассматривать сухой экстракт H.erectum как безопасный многофункциональный гепатопротектор для фармакологической коррекции морфофункциональ-ного состояния печени при её лекарственном повреждении.

9. Торопова A.A., Разуваева Я.Г., Николаев С.М., Федоров A.B., Самбу-ева З.Г. Антиоксидантная и мембраностабилизирующая активность экстрактов Lomatogonium carinthiacum (Wulfen) Reichenb and Hypecoum erectum L. в модельных системах. Бюллетень ВСНЦ СО РАМН; 2012; 6: 88: 94-97.

10. Николаев С.М. Растительные лекарственные препараты при повреждениях гепатобилиарной системы. Новосибирск: 1992; 155.

11. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты. Современные методы в биохимии. М.: 1977: 67—69.

12. Королюк M.A., Иванова Л.И., Майорова И.Г. и др. Метод определения активности каталазы. Лаб дело 1988; 1: 16—19.

13. Темирбулатов P.A., Селезнев Е.И. Метод повышения интенсивности свободнорадикального окисления липидсодержащих компонентов крови и его диагностическое значение. Лаб дело; 1981; 4: 209—211.

14. Методы биохимических исследований / Под ред. М. И. Прохорова. Л.: 1982: 272.

15. Баган Н.Ю. Функционально-биохимическая характеристика и экспериментальная фармакотерапия тетрациклиновых поражений печени: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Киев: 1991.

16. Катикова О.Ю, Костин Я.В., Тишкин В.С. Гепатопротекторное действие препаратов растительного происхождения. Экспер клин фармакол 2002; 1: 41—43.