СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ НАРУШЕНИЙ РЕПРОДУКТИВНОГО ЗДОРОВЬЯ У ЖЕНЩИН ФЕРТИЛЬНОГО ВОЗРАСТА
METHOD FOR PREDICTING REPRODUCTIVE HEALTH DISORDERS IN WOMEN OF CHILDBEARING AGE

Изобретение относится к области медицины, в частности физиологии и патологии репродукции, и может использоваться для мониторинга риска нарушений репродуктивного здоровья у клинически здоровых женщин фертильного возраста в доклинический период.
Репродуктивное здоровье женщин, будучи важнейшей медико-социальной проблемой, в настоящее время довольно детально исследуется и с социальной [1, 2], и с экономической [1, 2, 3], и с психологической [4, 5], и с экологической [6, 7], и с медицинской [4] точек зрения. Медицинский аспект проблемы предусматривает изучение рисков нарушений репродуктивной функции [4, 8, 9], связанных с гормональными сдвигами [10, 11], иммуногенетическими признаками [12, 13, 14], отклонениями в функциональном состоянии клеток и молекулярных факторов иммунной системы [15, 16, 17, 18, 19], развитием аутоиммунного компонента, влияющего на течение и исходы беременности [20, 21, 22]. Существуют отдельные попытки  перейти на количественный уровень оценки отдельных факторов риска нарушений репродуктивной функции у женщин, в том числе без существенных отклонений лабораторных показателей, путем внедрения шкал, интегрирующих наиболее информативные критерии риска [23, 24, 25, 26].
1-4
1
2,3,4
2
1,3,4
3
1,2
4
1,2,3
1-4
Прототипом данного изобретения может служить способ прогнозирования нарушений репродуктивного здоровья, предназначенный для донозологической диагностики нарушений репродуктивной функции у женщин широкого возрастного диапазона и мужчин [27]. Для реализации способа предлагается определять коэффициенты, выраженные в баллах, для оценки профессионально-производственных, анамнестических, медико-биологических факторов женщины и мужчины с последующим расчетом диагностических показателей риска (R) по специальным формулам. При этом при значении R>1>R судят о преимущественно высоком риске развития мертворожденности, при значении R>1>R - врожденных пороков развития, при значении R>1>R - ранней неонатальной смерти ребенка, при R>1>R - спонтанных выкидышей, соответственно, при величине R<1 - судят об отсутствии риска развития вышеописанных состояний.
Достоинством способа можно считать его экономическую целесообразность, конкретность в прогнозировании отдельных нарушений репродукции, а также доступность, поскольку он базируется на таких качественных характеристиках, как возраст, место проживания, профессия партнеров, акушерско-гинекологический анамнез женщины,. Наряду с этим, у прототипа имеются недостатки, главный из которых заключается в отсутствии в перечне регистрируемых данных объективных показателей здоровья женщины и, соответственно, количественных характеристик репродуктивной функции. Еще один важный недостаток прототипа - это невозможность прогнозирования нарушений репродуктивного здоровья при отсутствии акушерского анамнеза, то есть у нерожавших женщин.
Задачей заявленного изобретения является повышение достоверности и точности прогнозирования нарушений репродуктивного здоровья у клинически здоровых женщин фертильного возраста.
Особенностью данного изобретения является то, что для достижения технического результата используется набор лабораторных количественных показателей репродуктивного здоровья женщин фертильного возраста с расчетом на этой основе 2-х интегральных маркеров репродуктивных нарушений (ИМНР1 и ИМНР2), которые учитывают «вклад» каждого показателя в нарушение репродуктивных функций. Способ основан на клинико-лабораторных данных, полученных на доклинической стадии заболевания, и исключает неоднозначное толкование результатов.
Расчет интегральных маркеров репродуктивных функций производится по следующим формулам:
2
ИМНР1=0,257*[ЦТЛ]+0,266*[ЕК]+0,122*[число В-лф]+0,107*[IgC]+0,209*[АТ β-ГП]
2
ИМНР2=0,341*[ПЛ]+0,257*[Е]+0,184*[Т4]-0,153*[КТ]
2
2
2
где ЦТЛ - процент CD3+CD8+ лимфоцитов среди всех лимфоцитов крови; ЕК - процент CD16+CD56+ лимфоцитов среди всех лимфоцитов крови; В - процент CD19+ лимфоцитов среди всех лимфоцитов крови; IgG - уровень иммуноглобулина класса G в миллиграммах в 1 миллилитре сыворотки крови; AT β-ГП - уровень IgG-аутоантител к β-гликопротеину-1 в единицах в 1 миллилитре сыворотки крови; ПЛ - уровень пролактина в наномолях в 1 литре сыворотки крови; Е - уровень эстрадиола в пикомолях в 1 литре сыворотки крови; Т4 - уровень общего тироксина в наномолях в 1 литре сыворотки крови; КТ - уровень кортизола в наномолях в 1 литре сыворотки крови. Для осуществления способа у женщин на основе специального анализа крови определяют 2 интегральных маркера риска нарушений репродукции (ИМНР1 и ИМНР2). Если величина ИМНР1>11,5 и/или ИМНР2>85, женщину относят к группе риска по нарушению репродуктивной функции.
Для осуществления способа у женщин натощак делают забор двух образцов венозной крови: 5 мл - в пробирку с ЭДТА, 10 мл - в сухую пробирку. Образец из пробирки с ЭДТА подвергают исследованию методом проточной цитофлуориметрии, например, с использованием проточного цитофлуориметра BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США) после автоматизированной пробоподготовки цельной крови с помощью станции автоматической пробоподготовки BD FACS Sample Prep Assistant II (Becton Dickinson, США) в соответствии с инструкцией по применению приборов и моноклональных антител. Для определения относительного числа лимфоцитов различных популяций/субпопуляций крови (относительного числа CD3+/CD8+ клеток, CD16+/CD56+ клеток, CD19+ клеток) целесообразно использовать стандартизированный комплект моноклональных антител (МКАТ) BD Multitest 6-Color TBNK Reagent (BD Biosciences), содержащий меченные PerCP-Cy5.5 anti-CD45 МКАТ, меченные FITC anti-CD3 МКАТ, меченные РЕ-Су7 anti-CD4 МКАТ, меченные АРС-Су7 anti-CD8 МКАТ, меченные АРС anti-CD19 МКАТ, меченные РЕ anti-CD16/anti-CD56 МКАТ.
2
Второй образец крови в сухой пробирке отстаивают при комнатной температуре до формирования сгустка, полученную сыворотку крови удаляют отсасыванием с последующим центрифугированием при 3000 об/мин на холоде в течение 10 минут, ее образцы при необходимости хранят при температуре -20°С. Для определения уровней пролактина и эстрадиола забор крови осуществляется на 3-5-й дни менструального цикла, для определения уровней общего тироксина, кортизола, IgG-иммуноглобулина, IgG-аутоантител к β-гликопротеину-1 учет дня менструального цикла не требуется. Уровни названных показателей устанавливают методом твердофазного иммуноферментного анализа, например, на анализаторе для иммунного анализа BioRad производства Sanofi Diagnostics Pasteur, (Франция - США) с помощью набора антител, входящих в тест-системы фирм «Monobind», «DRG» и «DSL». Исследование осуществляют в соответствии с инструкциями по применению прибора и антител.
После определения величин всех показателей их подставляют в формулы для расчета ИМНР1 и ИМНР2. Если величина ИМНР1>11.5 и/или ИМНР2>85, женщину относят к группе риска по нарушению репродуктивного здоровья.
В процессе разработки способа под наблюдением находились 90 женщин русской популяции, проживающих в Центрально-Черноземном регионе России (Липецкая область), имеющих в анамнезе беременности, в возрасте от 20 до 43 лет. Все женщины были клинически здоровы, что подтвердили результаты их диспансерного наблюдения. Анализ акушерско-гинекологического анамнеза с участием специалиста акушера-гинеколога позволил подразделить женщин на 2 группы. В первую группу вошли 30 женщин с сохранной репродуктивной функцией, у которых предшествующие беременности завершились рождением в срок здоровых детей (контроль). Во вторую группу условного риска входили 60 женщин, у которых при наличии физиологической нормы по лабораторным показателям имелись нарушения репродуктивной функции (невынашивание беременности, тяжелые гестозы, преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты, синдром задержки внутриутробного развития плода, антенатальная гибель плода и др.). Все женщины прошли детальное лабораторное обследование на состояние гормонального статуса (содержание в крови фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, пролактина, эстрогена, прогестерона, тестостерона, дигидроэпиандростерона, 17-ОН-прогестерона, тиреотропного гормона, общего трийодтиронина, общего тироксинеа, кортизола), иммунного статуса (доля наличия в крови Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток, ЕКТ, естественных киллеров, В-лимфоцитов, уровней IgM, IgG, IgA), наличие аутоиммунного процесса (содержание в крови IgG-аутоантител к к тиреоглобулину, тиреопероксидазе, суммарным фосфолипидам, β2-гликопротеину-1, аннексину V, протромбину, волчаночного антикоагулянта). Статистическая обработка данных проводилась на основе пакета программ SPSS (версия 21).
Результаты кластерного анализа, проведенного на основе полученных лабораторных данных, позволили выделить внутри группы с нарушениями репродуктивной функции две равные подгруппы - (1) с особенностями показателей иммунного статуса и (2) с особенностями показателей гормонального статуса, хотя и те и другие наблюдались в рамках физиологической нормы. Для данных, показавших статистически достоверные отклонения величин, в каждой подгруппе был выполнен регрессионный анализ и получены 2 уравнения линейной регрессии, каждое из которых было использовано для получения 2-х интегральных маркеров нарушений репродукции (ИМНР1 и ИМНР2).
Возможная прогностическая значимость ИМНР1 и ИМНР2 оценивалась путем их вычисления у каждой из 90 женщин с последующим определением 95% доверительных интервалов и построением ROC-кривых соотношения чувствительности и специфичности тестов, позволяющих охарактеризовать их прогностическую значимость в величинах площади под ROC-кривой - AUROC (рис. 1 и 2). Этот анализ показал, что при значениях ИМНР1 больше 11.5 и ИМНР2 больше 85 вероятность нарушений репродуктивной функции можно предсказать с почти абсолютной вероятностью (AUROC, соответственно, 0,999 и 0,998).
Предложенный способ иллюстрируется рис. 1 и 2, а также примерами его использования.
Рис. 1 - 95% доверительные интервалы величин ИМНР1 в группах сравнения и ROC-кривая прогностической значимости показателя.
Рис. 2 - 95% доверительные интервалы величин ИМНР2 в группах сравнения и ROC-кривая прогностической значимости показателя.
Пример 1. Женщина В., 22 лет, вступила в брак и планирует беременность. Ранее беременностей не было в связи с защищенным сексом. При исследовании ее венозной крови был получен следующий результат:
Цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+), % - 24,8% (норма 21,8±5,0%)
Естественные киллеры (CD16+CD56+), % - 16,8% (норма 13,5±2,9%)
В-лимфоциты (CD 19+), % - 12,9% (норма 9,5±4,1%)
IgG - 11,7 мг/мл (норма 11,1±2,5 мг/мл)
2
IgG-аутоантитела к β-гликопротеину-1 - 7,6 ЕД/мл (норма 4,6±2,6 ЕД/мл)
Пролактин - 138,7 нмоль/л (норма 208,9±107,4 нмоль/л)
Эстрадиол - 231,3 пмоль/л (норма 268,6±46,0 пмоль/л)
Общий тироксин - 83,4 нмоль/л (норма 101,9±24,2 нмоль/л)
Кортизол - 307,7 нмоль/л (272,0±63,6 нмоль/л)
ИМНР1=0,257*24,8+0,266*16,8+0,122*12,9+0,107*11,7+0,209*7,6=15,28
ИМНР2=0,341*138,7+0,257*231,3+0,184*83,4-0,153*309,0=75,02
Как следует из расчета интегральных маркеров нарушений репродукции у женщины В., ИМНР1>11.5, а ИМНР2<85, то есть по величине ИМНР1 ее можно отнести в группу риска. Последующее наблюдение в течение 3-х лет показало, что через 2 года после исследования у этой женщины развилась беременность, но на 16-й неделе она закончилась невынашиванием плода.
Пример 2. Женщина С., 28 лет, повторно вступила в брак и планирует беременность. В первом браке беременностей не было. При исследовании ее венозной крови был получен следующий результат:
Цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+), % - 16,7% (норма 21,8±5,0%)
Естественные киллеры (CD16+CD56+), % - 12,6% (норма 13,5±2,9%)
В-лимфоциты (CD19+), % - 7,9% (норма 9,5±4,1%)
IgG - 10,3 мг/мл (норма 11,1±2,5 мг/мл)
2
IgG-аутоантитела к β-гликопротеину-1 - 6,2 ЕД/мл (норма 4,6±2,6 ЕД/мл)
Пролактин - 310,7 нмоль/л (норма 208,9±107,4 нмоль/л)
Эстрадиол - 300,8 пмоль/л (норма 268,6±46,0 пмоль/л)
Общий тироксин - 83,4 нмоль/л (норма 101,9±24,2 нмоль/л)
Кортизол - 307,7 нмоль/л (272,0±63,6 нмоль/л)
ИМНР1=0,257*16.7+0,266*12,6+0,122*7,9+0,107*10,3+0,209*6,2=11,04
ИМНР2=0,341*310,7+0,257*300,8+0,184*83,4-0,153*309,0=151,33
Как следует из расчета интегральных маркеров нарушений репродукции, у женщины С., ИМНР1<11.5, а ИМНР2>85, то есть по величине ИМНР2 ее можно отнести в группу риска. Последующее наблюдение в течение 3-х лет показало, что в течение 1 года после исследования у этой женщины развилась беременность, роды носили преждевременный характер и наступили на 30-й неделе. Несмотря на то, что ребенка удалось спасти, по существующим в акушерстве оценкам имелось нарушение репродуктивной функции.
Литература:
1. Barat M.U., Agacayak Е., Bozkurt М. et al. (2016) There is a positive correlation between socioeconomic status and ovarian reserve in women of reproductive age. Med Sci Monit 22: 4386-4392.
2. Dadvand P., Wright J., Martinez D. et al. (2014) Inequality, green spaces, and pregnant women: roles of ethnicity and individual and neighbourhood socioeconomic status. Environ Int 71: 101-108.
3. Данишевский К.Д. (2013) Репродуктивное здоровье: глобальные цели развития и экономический потенциал России. Медицина N 2: 13-28.
4. Kiely М., El-Mohandes A.A., Gantz M.G. et al. (2011) Understanding the association of biomedical, psychosocial and behavioral risks with adverse pregnancy outcomes among African-Americans in Washington, DC. Matern Child Health J. 15: 85-95.
5. Rebello K., Silva J., Brito R.C.S. (2014) Fundamental factors in marital satisfaction: An assessment of Brazilian couples. Psychology. 5: 777-784.
6. Shougong W.; Rui Z. (2016) Female reproductive system pastes with ecological health care with detoxicating bacteriostasis. Patent CN205515196. publ. 31.01.2016.
7. Tomashevska L.A., Kravchun T.Y., Lemeshko L.P.; Buhaenko O.O., Andrienko L.H. (2011) Method for determination of reproductive function disorder under effect of harmful factors of environment. Patent UA 68686, publ. 23.08.2011.
8. Christiansen O.B. (2014) Advances of intravenous immunoglobulin G in modulation of anti-fetal immunity in selected at-risk populations: science and therapeutics. Clin Exp Immunol. 178: 120-122.
9. Koyuncu Т., Metintas S., Ayhan E. et al. (2016) Evaluation of reproductive health criteria in seasonal agricultural workers: a sample from Eskisehir, Turkey. Rural Remote Health. 16: 3489.
10. Болдоносова H.A., Дружинина Е.Б. (2014) Фолликуло- и оогенез: химические свойства и биологическое действие лютеинизирующего гормона. Сибирский медицинский журнал. 129: 28-31.
11. Gailly-Fabre Е., Kerlan V., Christin-Maitre S. (2015) Pregnancy-associated hormones and fetal-maternal relations. Ann Endocrinol (Paris). 76: 39-50.
12. Киселева A.H., Зайцева Г.А., Исаева H.B., Бутина Е.В. (2015) Особенности полиморфизма генов системы HLA при нарушениях процессов репродукции. Международный научно-исследовательский журнал. 38: 23-24.
13. Chen S., Liu Y., Sytwu H. (2012) Immunologic regulation in pregnancy: from mechanism to therapeutic strategy for immunomodulation. Clin Develop Immunol. 2012: 1-10.
14. Clark M.M., Chazara V., Sobel E.M. et al. (2017) Human birth weight and reproductive immunology: testing for interactions between maternal and offspring KIR and HLA-C genes. Hum Hered. 81: 181-193.
15. Erlebacher A. (2013) Mechanisms of T cell tolerance towards the allogeneic fetus. Nat Rev Immunol. 13: 23-33.
16. Jiang T.T., Chaturvedi V., Ertelt J.M. et al. (2014) Regulatory T cells: new keys for further unlocking the enigma of fetal tolerance and pregnancy complications. J Immunol. 192: 4949-4956.
17. Lee, S.K., Kim C.J., Kim D.J., Kang J.H. (2015) Immune cells in the female reproductive tract. Immune Netw. 15: 16-26.
18. Nardo L.G. (2005) Vascular endothelial growth factor expression in the endometrium during the menstrual cycle, implantation widow, and early pregnancy. Curr Opin Obstet Gynaecol. 17: 419-423.
19. Print C, Valtora R., Evans A. (2004) Soluble factors from human endometrium promote angiogenesis and regulate the endothelial cell transcriptome. HumReprod. 19: 2356-2366.
20. Доброхотова Ю.Э., Джобава Э.М., Озерова Р.И. (2010) Неразвивающаяся беременность: тромбоэмболические и клинико-иммунологические факторы. М: ГЭОТАР-Медиа. 144.
21. Al-Saab R., Haddad S. (2014) Detection of thyroid autoimmunity markers in euthyroid women with polycystic ovary syndrome: a case-control study from Syria. Int J Endocrinol Metab. 12: 79-54.
22. Kwak-Kim J., Skariah A., Wu L. et al. (2016) Humoral and cellular autoimmunity in women with recurrent pregnancy losses and repeated implantation failures: A possible role of vitamin D. Autoimmun Rev. 15: 943-947.
23. Терехова M.H. (1996) Способ прогнозирования нарушения развития гонад потомства. Патент РФ 94012697, опубл. 10.07.1996.
24. Bertolaccini M.L., Sanna G. (2016) Recent advances in understanding antiphospholipid syndrome. F1000Res. 5: 2908-2923.
25. Otomo K., Atsumi Т., Amengual O. et al. (2012) Efficacy of the antiphospholipid score for the diagnosis of antiphospholipid syndrome and its predictive value for thrombotic events. Arthritis Rheum. 64: 504-512.
26. Sciascia S., Cosseddu D., Montaruli B. et al. (2011) Risk Scale for the diagnosis of antiphospholipid syndrome. Ann Rheum Dis. 70: 1517-1518.
27. Иванова M.K., Ситдикова И.Д., Вазиев И.К., Халимова Д.Р. (2009) Способ прогнозирования нарушений репродуктивного здоровья. Патент РФ 2367354, опубл. 20.09.2009.