СПОСОБ ОЧИСТКИ, МОДИФИКАЦИИ И СТЕРИЛИЗАЦИИ ПРОИЗВОДНЫХ КОСТНОЙ ТКАНИ И КОЖНОГО МАТРИКСА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СВЕРХКРИТИЧЕСКОГО ФЛЮИДА
METHOD FOR PURIFICATION, MODIFICATION AND STERILIZATION OF BONE TISSUE AND SKIN MATRIX DERIVATIVES USING SUPERCRITICAL FLUID

Направленная тканевая регенерация применяется для восполнения дефицита кости, возникшего в результате физического повреждения или инфицирования. В ходе регенерации кости запускается основной механизм заживления, представляющий собой комплекс динамических процессов, направленных на восстановление анатомической целостности и нормальных функций ткани.
Одной из основных проблем тканевой инженерии является то, что большинство выпускаемых биоматериалов инертны: они не принимают участия в процессе физиологического моделирования кости. Поскольку главной концепцией их создания изначально была биосовместимость, их функции ограничены поддержанием первоначального объема ткани (трехмерный каркас).
Материал, не обладающий никакими свойствами, кроме биосовместимости, при внедрении в организм становится, по сути, постоянным протезом. Его роль в реконструкции кости чрезвычайно мала. Активность остеокластов при введении гидроксиапатита, полученного искусственным путем, или естественного костного гидроксиапатита, подвергнутого грубой обработке, остается низкой, что существенно удлиняет процесс резорбции.
В то же время костные трансплантаты на основе ксеногенных биоматериалов также характеризуются отличной биосовместимостью, однако при этом имеют целый ряд преимуществ перед инертными биоматериалами: они обладают высокой остеокондуктивностью (способностью поддерживать жизнеспособность, рост и пролиферацию адгезировавшихся клеток костной ткани) и остеоиндуктивностью (способностью стимулировать направленную остеогенную дифференцировку прогениторных клеток), высокой пористостью по аналогии с аутологичным костным материалом, широкой доступностью (могут быть относительно легко получены по стандартизированным технологиям из бычьего или свиного биоматериала), высокой технологичностью (относительной простотой в организации и реализации технологической цепочки получения готового продукта из изначального материала, а также сравнительной простотой хранения и дальнейшего применения продукта) и оптимальным соотношением цена/качество.
Технология применения сверхкритических сред, в частности, сверхкритического углекислого газа обладает значительными преимуществами в сравнении с существующими стандартными методами очистки, модификации и стерилизации производных костной ткани и кожных матриксов, основанными преимущественно на методах химической, вакуумной или ультразвуковой очистки, в том числе: 1) позволяет получить биопрепарат без остаточных примесей растворителей и сопутствующих реагентов, что значительно повышает его биосовместимость и регенераторный потенциал (в том числе остеокондуктивные и остеоиндуктивные свойства); 2) снижает иммуногенность производных костной ткани и кожных матриксов вследствие эффективного экстрагирования протеогликанов, фосфолипидов и незакрепленных неколлагеновых белков; 3) дает возможность модификации степени пористости и площади поверхности производных костной ткани и кожных матриксов, что позволяет изменять скорость резорбции и улучшать интеграцию имплантируемых биоматериалов с окружающими тканями реципиента; 4) позволяет инкорпорировать в сформированную пористую структуру биоматериалов лекарственные средства или биоактивные молекулы (в частности, факторы роста и биоактивные пептиды), что дает возможность придавать производным костной ткани и кожным матриксам направленный регенераторный потенциал; 5) эффективно стерилизует производные костной ткани и кожные матриксы, при этом сохраняя их механические свойства; 6) значительно (в 10-20 раз) сокращает длительность процесса получения производных костной ткани и кожных матриксов.
На сегодняшний день существует острая потребность в эффективных способах подготовки костных материалов для трансплантации. В частности, на отечественном рынке на данный момент не существует технологий очистки и стерилизации производных костной ткани и кожных матриксов с помощью сверхкритических флюидов (сверхкритического углекислого газа). Данное изобретение обладает рядом свойств, необходимых для получения стерильного материала с улучшенными механическими свойствами, увеличенной биобезопасностью и повышенными остеоинтегративными свойствами.
Обнаруженные авторами аналоги изобретения перечислены ниже.
Известен способ получения деминерализованного костного матрикса в виде крошки (Патент РФ №2456003 С1), включающий измельчение кости, обработку фрагментов кости раствором Tween-80, удаление детергента, обработку смесью изопропанол-хлороформ в ультразвуковой бане, далее крошку отмывают водой, обрабатывают раствором HCl, промывают дистиллированной водой, помещают в фосфатный буфер, отмывают дистиллированной водой, полученные фрагменты заливают этиловым спиртом, крошку высушивают, измельчают с помощью мельницы и фракционируют с помощью виброгрохота на крошку определенного размера, лиофилизуют, стерилизуют при определенных условиях.
Известен способ получения трансплантата "БИО-МАТРИКС ИМПЛАНТ" для стоматологии (Патент РФ №2136297 С1). Изобретение относится к стоматологии и может быть использовано в челюстно-лицевой хирургии при дентальной имплантации и реконструкции костной ткани при ортопедии и травматологии. Сущность изобретения: костную ткань обрабатывают 0,1-0,3% раствором папаина не менее 10-24 часов при 65°С и рН 6,5, а затем 1% раствором перекиси водорода и 1% раствором этанола, взятых в соотношении 1: 1 в течение 24 часов, после чего последовательно в 30, 70, 96% растворах этилового спирта по 10 часов в каждом лиофилизируют и стерилизуют облучением дозой 2,5 Мград. Технический результат: повышение очистки трансплантата от фибриллярного коллагена и гликопротеинов, определяющих антигенность ткани.
3
Известен способ изготовления костных имплантов (патент РФ №2526429 С1). Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано для изготовления минерализованных костных имплантатов. Для этого фрагмент кости обдувают струей озоно-воздушной смеси с концентрацией озона 5-50 мг/м в течение 7-10 минут. Затем указанный фрагмент кости механически обрабатывают гидродинамической струей, в результате чего получают заготовку. Затем заготовку деминерализуют в растворе неорганической кислоты. Нейтрализуют остатки кислоты. Далее заготовку снова обрабатывают путем обдува указанной озоно-воздушной смесью в том же режиме. Способ обеспечивает полную стерилизацию костных имплантатов при сохранении их остеоиндуктивных свойств.
Известен способ извлечения липидов (Патент РФ №2115422 С1, статус - не действует). Способ получения органических веществ липидного характера достигается путем экстракции животного сырья углекислым газом в докритических и сверхкритических условиях при изменении давления и температурного режима процесса. Использование в качестве экстрагента углекислого газа обеспечивает возможность извлечения липидов из любых органов и тканей животного происхождения. Целью изобретения является извлечение липидов с использованием в качестве экстрагента углекислого газа - экологически чистого, не токсичного, взрыво- и пожаробезопасного, обладающего высокой селективностью, антиоксидантными и бактерицидными свойствами, позволяющего максимально сохранить биологические свойства извлекаемых компонентов. Сущность предлагаемого изобретения состоит в том, что впервые показана возможность извлечения липидов из животного сырья, плаценты человека и осадков, получаемых в процессе фракционирования крови человека, с использованием в качестве экстрагента диоксида углерода. Экстракцию осуществляют путем одноступенчатого или многоступенчатого изменения давления, температуры и длительности экстракции в диапазоне соответственно 1,8-38,5 МПа, от минус 34 до 45°С, от 2,5 до 17,5 часов.
Все приведенные аналоги изобретения используют стандартные технологии химической очистки и поэтому значительно уступают по эффективности и биобезопасности своего целевого использования при очистке производных костной ткани и кожных матриксов сверхкритическому углекислому газу вследствие ряда причин: 1) ограниченного проникновения реагента к очищаемой поверхности; 2) сохранения остаточного растворителя в структуре биологического матрикса (эффект «высыхающей капли»); 3) наличия выраженной цитотоксичности (этиловый спирт, ацетон, мочевина); 4) выраженной аллергенности.
В качестве прототипа способа очищения производных костной ткани и кожных матриксов, подлежащих последующей имплантации, можно рассмотреть патент US 6,217,614 В1 «Процесс обработки костных тканей и соответствующих имплантируемых биоматериалов». Данное изобретение относится к процессу обработки костных тканей животного или человеческого происхождения, а также соответствующего имплантируемого биоматериала. Согласно US 6,217,614 костная ткань была прочищена от изначально жирных органических веществ путем экстракции флюидом в сверхкритическом состоянии. Оптимальными условиями обработки были выбраны: температура - 31-60°С, давление - от 1,5*107 до 4*107 Па. Согласно изобретению, процесс включает в себя: 1) механическую очистку костной ткани от органических веществ; 2) разрез костной ткани согласно заранее определенной форме; 3) очистку костной ткани с целью извлечения составных частей, вредных для успешной имплантации, для чего в костную ткань проникает сверхкритический флюид, в котором растворяются и с которым извлекаются липидные органические вещества; 4) промывку, дегидратацию и стерилизацию костной ткани; 5) обработку костной ткани химическим и/или ферментативным способом с целью извлечения оставшихся белков; 6) высушивание в вентиляционной печи при температуре 30-60°C. Стерилизация может быть выполнена путем облучения либо β-частицами, либо γ-лучами.
Основные отличия способа, описанного в US 6,217,614, от способа, предлагаемого в настоящем изобретении, приведены ниже.
1) В прототипе производится обработка в сверхкритическом углекислом газе с последующей обработкой костной ткани химическим или ферментативным методом и итоговой обработкой в этаноле. Так как этанол является полярным растворителем и поэтому растворяет только полярные растворители, то неполярные токсичные вещества остаются в костной ткани. В предлагаемом в данном изобретении способе первичная очистка проводится химическими реагентами, и только затем проводится обработка сверхкритическим углекислым газом с сорастворителем-этанолом для более глубокой очистки.
2) В сравнении с прототипом, в предлагаемом изобретении обработка при помощи сверхкритического углекислого газа проводится в несколько стадий: сначала осуществляется статическая выдержка в сверхкритическом растворе, а далее идет проточное динамическое пропускание сквозь образец сверхкритического флюида для удаления загрязнителей и остаточного сорастворителя-этанола. Это позволяет, в отличие от прототипа, осуществить более глубокую очистку именно средой сверхкритического углекислого газа, что уменьшает количество стадий, используемых химических веществ и время последующей обработки.
3) Помимо более длительного времени обработки, в предлагаемом изобретении используется «пульсирующее» давление, суть которого заключается в поочередном повышении и понижении давления обработки, при этом данный способ не отражен в прототипе. Использование одностадийной обработки при единственном значении оптимального давления является приемлемым применительно к образцам с относительно небольшой толщиной и равномерной пористой структурой. В то же время, так как производные костной ткани характеризуются неоднородной пористой структурой, целесообразно использовать многостадийную обработку «пульсирующим» давлением. Перепад давления позволяет как добиться более глубокого проникновения сверхкритического флюида вглубь образца, так и улучшить растворяющую способность.
4) Кроме глубокой очистки от липидов, описанной в прототипе, в предлагаемом изобретении показаны данные, отражающие высокую степень очистки биологических матриксов от ДНК и белков, а также данные по стерилизующей способности изобретения, что демонстрирует его универсальный характер.
5) В отличие от прототипа, в предлагаемом изобретении показано использование технологии сверхкритической флюидной экстракции не только для очистки производных костной ткани, но и для очистки кожного матрикса, обладающего другой исходной структурой.
Сущность изобретения
Задачей данного изобретения является способа очистки материала для имплантации, состоящего из производных костной ткани или кожного матрикса, для получения материала с улучшенными механическими свойствами, увеличенной биобезопасностью и повышенными остеоинтегративными свойствами по сравнению с существующими аналогами. Данное изобретение предлагает новый процесс очистки, в котором в качестве растворителя при очистке производных костной ткани и кожного матрикса используется сверхкритический флюид, предпочтительно углекислый газ, что позволяет исключить перечисленные выше недостатки аналогов.
Отсутствие у сверхкритического углекислого газа жидкой фазы при нормальных условиях делает возможным по завершении технологического процесса модификации биологической ткани перевести углекислый газ из состояния плотной сверхкритической среды в состояние разреженного газа, исключая формирование жидкой фазы и образование эффекта «высыхающих капель жидкости». Технологический процесс возможно проводить без нагревания производных костной ткани и кожного матрикса, что позволяет сохранять их нативную нереконструированную структуру.
Одновременно с очисткой производных костной ткани и кожного матрикса сверхкритический углекислый газ способен выступать и в качестве растворителя для модифицирующих реагентов, в частности, для факторов роста и биоактивных пептидов, а также в качестве высокоэффективного стерилизующего вещества.
Указанная задача решается путем создания способа очистки материала костной ткани или кожного матрикса, включающего по меньшей мере следующие последовательные стадии: (а) обрабатывают указанный материал раствором перекиси водорода в течение 0,5-18 ч; (б) обрабатывают материал сверхкритическим флюидным раствором с добавлением сорастворителя в количестве 0,5-10% от массы подаваемого сверхкритического флюида в течение 15-60 мин при температуре 25-45°С и фиксированном давлении в интервале от 10 до 25 МПа; (в) обрабатывают материал сверхкритическим флюидным раствором с добавлением сорастворителя в количестве 0,5-10% от массы подаваемого сверхкритического флюида при температуре 25-45°С, при этом в процессе обработки повышают давление на по меньшей мере 5 МПа и затем понижают обратно до исходного значения давления, используемого на стадии б); (г) обрабатывают материал сверхкритическим флюидным раствором без добавления сорастворителя в течение 15-120 мин при температуре 25-45°С и значениях давления в интервале от 10 до 35 МПа. В предпочтительных вариантах изобретения в качестве сверхкритического флюидного раствора используется углекислый газ, находящийся в сверхкритическом состоянии. Другие низкотоксичные для живого организма вещества, или комбинации веществ, находящиеся в сверхкритическом состоянии и способные эффективно экстрагировать органические вещества, также могут быть использованы в настоящем способе в качестве замены сверхкритическому углекислому газу.
В качестве сверхкритического флюида в данном изобретении может быть использованы следующие вещества:
2
(1) сверхкритический СО - диоксид углерода в чистом виде или с сорастворителями (этиловый спирт, изопропиловый спирт) при температуре от 30 до 41°С и давлении от 73 атм;
2
(2) сверхкритический СО с азеотропообразователем (толуол, ксилол, пропанол, этилбензол, этиламиловый эфир, н-пропилацетат, изопропилацетат, н-бутилацетат, изобутилацетат отдельно или в комбинации) при температуре от 30 до 41°С и давлении от 73 атм;
2
(3) сверхкритический NO - окись азота в чистом виде или с сорастворителями при температуре от 37 до 41°С и давлении от 72 атм.
В некоторых вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что на стадии (в) повышение и понижение давления в процессе обработки происходит по меньшей мере два раза. В предпочтительных вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что в процессе обработки материала на стадии (г) по меньшей мере один раз повышают давление на по меньшей мере 5 МПа и затем понижают обратно до исходного значения давления.
В некоторых вариантах изобретения в качестве сорастворителя в данном способе используется этанол, а общая продолжительность стадии в) составляет 60-120 мин. В других вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что на стадии (а) материал обрабатывают раствором перекиси водорода в конечной концентрации 6%.
В некоторых вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что очищенный на стадиях (а)-(г) материал дополнительно стерилизуют бета или гамма-излучением в дозе 10-30 кГр.
При осуществлении изобретения достигается следующий технический результат: разработан новый способ, позволяющий проводить глубокую очистку предназначенных для имплантации материалов, состоящих из производных костной ткани или кожного матрикса. Предложенный способ увеличивает эффективность очистки, сохраняя при этом структуру обрабатываемого материала, что обеспечивает получение стерильного материала с улучшенными механическими свойствами, увеличенной биобезопасностью и повышенными остеоинтегративными свойствами.
Краткое описание рисунков
Рис. 1. Принципиальная схема экспериментальной установки: 1 - баллон с углекислым газом; 2 - фильтр-осушитель; 7, 11 - вентиль; 3 - термостат; 4 - теплообменник для охлаждения; 5 - расходомер; 6 - насос высокого давления; 8 - блок управления; 9 - манометр высокого давления; 10 - экстракционная ячейка; 12 - сборник экстракта.
Подробное раскрытие изобретения
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из». В описании данного изобретения под материалом костной ткани, а также производными костной ткани, следует понимать кортикальную и губчатую костную ткань раздельно или в комбинации в виде блоков различной величины и объемов, крошки различного размера, выделенных из эпифизов или диафизов крупных трубчатых костей или плоских костей. Под сверхкритическим флюидом, или сверхкритической жидкостью, следует понимать любое вещество, находящееся при температуре и давлении выше критической точки. У вещества, находящегося в сверхкритическом состоянии, исчезает различие между жидкой и газовой фазой.
Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
Основными преимуществами сверхкритических флюидов как растворителей являются: 1) сочетание свойств газов при высоких давлениях (низкая вязкость, высокий коэффициент диффузии) и жидкостей (высокая растворяющая способность); 2) быстрый массоперенос, осуществляемый благодаря низкой вязкости и высокому коэффициенту диффузии; 3) сочетание пренебрежимо малого межфазного натяжения с низкой вязкостью и высоким коэффициентом диффузии, облегчающее сверхкритическим флюидам проникновение в пористые среды по сравнению с жидкостями; 4) высокая чувствительность растворяющей способности сверхкритических флюидов к изменению давления или температуры.
В качестве сырья для описываемого способа подходят различные производные костной ткани (костный матрикс, костный минерал, костный коллаген I типа) и кожный экстрацеллюлярный матрикс с предварительно проведенной грубой или глубокой обработкой. Медицинское изделие должно соответствовать требованиям ГОСТ Р 50444 и ГОСТ Р ИСО 14630. Медицинское изделие должно иметь нативную волокнисто-пористую или трабекулярно-пористую структуру, может содержать в качестве активного остеокондуктивного компонента аморфный гидроксиапатит. Нативная коллагеновая матрица не должна содержать других посторонних механических включений.
Согласно данному изобретению, производные костной ткани и кожный матрикс могут быть очищены от подавляющей части липидов, ДНК и белка путем сверхкритической флюидной экстракции, состоящей из нескольких стадей. Преимущества изобретения по сравнению с аналогами состоят в уменьшении времени и стадий как предварительной, так и последующей обработки, снижении воздействия токсических растворителей, улучшении качества очистки.
Прочие цели, характеристики и достоинства данного изобретения будут объяснены в следующем описании, представляющую собой установку для осуществления способа в соответствии с данным изобретением.
Нижеследующие примеры осуществления способа приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения заявляемый способ очистки осуществляется как описано ниже. Принципиальная схема использованной установки представлена на Рисунке 1.
Перед началом эксперимента запускается термостат (3) для охлаждения теплообменника (4) и головок насоса (6). Процесс термостатирования продолжается до тех пор, пока температура охлаждающей жидкости не достигнет -5°С. В экстракционную ячейку (10) загружается экспериментальный образец. При экспериментах, предполагающих использование сорастворителя, в экстракционную ячейку (10) добавляется этиловый спирт в количестве 5% от массы подаваемого сверхкритического флюида. Далее открывается вентиль (7) и вентиль баллона (1), откуда углекислый газ с первоначальным давлением 5-6 МПа попадает в охлаждающий теплообменник (4) через фильтр-осушитель (2). После перехода в жидкую фазу углекислый газ через расходомер (5) поступает в насос высокого давления (6), где сжимается до заданного давления, после чего углекислый газ поступает в ячейку (10). Требуемая температура и давление задаются с помощью блока управления (8).
Производные костной ткани или кожный матрикс, полученные из ксеногенного костного биоматериала или дермы путем соответствующей механической очистки и химической обработки, разрезаются в нужных направлениях и до заранее определенной формы (блоков, пасты, крошки, мембраны-пластины). Затем производные костной ткани и кожный матрикс подвергаются дополнительной химической обработке, если это предусмотрено протоколом.
7
7
Производные костной ткани или кожный матрикс предварительно помещаются в экстракционную ячейку 10. Оптимальные условия обработки составляют: температура в диапазоне от 31 до 45°С, давление от 1*10 Па до 3,5*10 Па. При обработке кожного матрикса следует уменьшить температуру обработки во избежание ухудшения свойств конечного продукта. Первоначально экспериментальный образец обрабатывается статическим методом в течение 30-60 минут. Углекислый газ в сверхкритическом состоянии растворяет в себе большую часть органических веществ из кости, особенно липидов. Затем открывается вентиль (11) для осуществления обработки динамическим методом в течение 60-120 минут с расходом углекислого газа в 3-4 г/мин. Расход углекислого газа также регистрируется с помощью блока управления (8). Сброс давления осуществляется при закрытом вентиле (7) и открытом вентиле (8) в течении 45 минут. Полученный по завершению процесса обработки экстракт собирается в сборнике (12). Полученные образцы помещаются в пенициллиновый флакон емкостью 10 мл.
Для улучшения качества очищения в экстракционную ячейку добавляется этиловый спирт в количестве 5% от массы подаваемого сверхкритического флюида.
Возможна двухступенчатая обработка: первая ступень с добавлением этилового спирта при 30 минутах статической выдержки и 60 минут динамической выдержки, вторая ступень очистка при этих же параметрах с чистым углекислым газом. Суммарно время обработки соответственно увеличивается. Можно рекомендовать данные параметры обработки при высоких содержаниях белка в исходных образцах и при требовании сокращения остаточного растворителя в конечном продукте.
Также возможна очистка при пульсирующем давлении. Первоначально обработка ведется в статическом режиме при давлении 150 бар в течение 30 минут. Далее давление повышается до 250 бар и выдерживается также 30 мин. При динамической обработке первоначально выдерживается давление 250 бар и затем понижается до 150 бар с целью избегания резкого перепада давления. Данная методика помогает избежать конкурирования двух механизмов низкой диффузии и высокой растворяющей способности при высоком давлении. Первоначальная обработка при низком давлении обеспечивает проникновение флюида вглубь пористой структуры, а дальнейшее повышение давления повышает плотность углекислого газа, обеспечивая его лучшую растворяющую способность.
Обработка производных костной ткани и дермального матрикса сверхкритическим флюидом может комбинироваться с предварительной химической очисткой матриксов с использованием растворов детергентов, спиртов и раствора перекиси водорода с выдержкой до 18 часов. Дополнительная обработка гарантирует более эффективную экстракцию контаминирующих белков из костной ткани и уменьшает опасность отторжения производных костной ткани и кожного матрикса, обработанных вышеизложенным методом.
Перед упаковкой производные костной ткани или кожный матрикс подвергаются стерилизации. Она может осуществляться как β-, так и γ-излучением (предпочтительная мощность - 10-30 кГр). Перед имплантацией возможно повторное разрезание костной ткани или кожного матрикса для того, чтобы приспособить их персонально для реципиента.
Для доказательств возможности реализации заявленных назначений и достижения указанного технического результата авторы приводят следующие данные.
Стерильность получаемого в результате осуществления способа материала была определена согласно ГОСТ ISO 11737-2-2011. Для этого из образцов экстрагировали 1 мл стерильного физраствора при 37°С, после чего 10 мкл экстракта помещали на поверхность среды Мюллер-Хинтон (НИНЦФ, С-Петербург) для селекции стафилококков, поскольку образцы могут быть обсеменены именно этими микроорганизмами как автохтонной микрофлорой. Для флуориметрического определения количества ДНК использовался сорбентный метод и метод экстракции фенол-хлороформом по Маниатису. Экстракцию ДНК проводили при 70°С в течение 24 ч с помощью стандартного лизирующего раствора, содержащего гуанидинизотиоцианат и лаурилсаркозил натрия. В результате удалось выделить ДНК из препаратов с помощью модифицированного метода Маниатиса [Маниатис Т., Фрич Э., Дж. Сэмбрук «Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование, - «МИР», 1984, 478 с]. Содержание кальция определяли по ГОСТ ISO 12081-2013. Определение белка проводили по Кьельдалю ГОСТ 938.7-68 в модификации (Фармакопейная статья МЗ РФ: Определение белкового азота ОФС с реактивом Несслера с предварительным осаждением белкового материала в иммунобиологических лекарственных препаратах). Апирогенность была определена согласно ГОСТ ISO 10993-11 с помощью количественного LAL-теста и набора LAL Chromogenic Endpoint Assay.
После проведения очистки наблюдаются существенные визуальные и механические изменения образцов. Большинство образцов приобретают более светлые оттенки. Образцы стерильны. Содержание колониеобразующих единиц находится в пределах нормы. Среди физико-химических параметров наибольшее изменения претерпевают содержание ДНК и содержание белка; соответствующие данные по их содержанию в образцах представлены в Таблице 1.
Для доказательства эффективности способа исследуемые образцы были разделены на группы: (1) нативная костная ткань, (2) костная ткань, обезжиренная раствором этилового спирта, (3) костная ткань, обработанная этиловым спиртом, 6% перекисью водорода и 0,1N HCl для декальцинации.
В образцах костного матрикса допускается содержание ДНК менее 50 нг/мг образца (50 мкг/г образца). Данному критерию соответствуют все образцы после предварительной химической обработки. Образцы нативной костной ткани значимо очищались от ДНК-содержащих элементов.
При проведении очистки в среде сверхкритического углекислого газа также наблюдали значимое снижение содержания общего белка в смывах образцов.
Результаты обработки экстрацеллюлярного матрикса дермы представлены в Таблице 2. Условия для данного эксперимента были подобраны следующим образом: начальное давление - 30 МПа, температура обработки - 45°С, время статической обработки - 30 минут, время динамической обработки - 60 минут. С целью уменьшения теплового воздействия и увеличения эффективности очистки сверхкритическим флюидом обработку образца экстрацеллюлярного кожного матрикса проводили при более низкой температуре (40°С) и более длительном времени выдержки. Воздействие сверхкритического флюида привело к значимому снижению концентрации ДНК и общего белка в смывах образцов. Кроме того, наблюдали снижение бактериалной обсемененности с 1000 КОЕ/мл до 0 КОЕ/мл (Таблица 2).
Кальций не растворяется в среде сверхкритического диоксида углерода, поэтому его концентрация не изменялась.
Таким образом, преимущества предлагаемого способа включают: 1) эффективную очистку исходных производных костной ткани или кожного матрикса с помощью реагентов, находящихся в сверхкритическом состоянии; 2) формирование развитой пористости при очистке производных костной ткани или кожного матрикса; 3) уменьшение воздействия токсичных органических растворителей, что улучшает интеграцию биоматериала с тканями реципиента; 4) уменьшение времени и стадий обработки по сравнению с традиционными методами воздействия; 5) увеличение стандартизации и биобезопасности для персонала; 6) эффективное инкорпорирование модифицирующих веществ (к примеру, факторов роста и биоактивных пептидов) и эффективную стерилизацию материала без потери биологической активности данных модифицирующих веществ.
В предпочтительных вариантах изобретения для осуществления описываемого способа очистки необходимо выполнение следующих процедур:
1. Производные костной ткани и кожный матрикс для очищения от липидов, ДНК и белков должны быть обработаны флюидом в сверхкритическом состоянии путем проникновения во всем объеме в предварительно очищенную ткань;
2. Производные костной ткани и кожный матрикс должны быть пригодны к стерилизации и нетоксичны;
3. Перед обработкой исходные образцы при возможности следует предварительно измельчить с целью облегчения проникновения сверхкритического флюида;
4. Обязательно проведение глубокой предварительной обработки производных костной ткани и кожного матрикса (поскольку образцы группы без подобной обработки оказались непригодными для воздействия сверхкритического флюида и хранения в отличие от групп, где была проведена предварительная глубокая очистка);
5. Параметры обработки следует подбирать, исходя из исходных показателей содержания белка и ДНК в исходных образцах. Рекомендуемые диапазоны параметров составляют: для температуры обработки - 25-45°С, для давления - 100-350 бар, для времени статической обработки - 30-60 минут, для времени динамической обработки - до 120 минут.
В некоторых вариантах осуществления изобретения очистка производных костной ткани и кожного матрикса может быть двухступенчатой: первая ступень включает добавление к сверхкритическому углекислому газу этилового спирта с 30 минутами статической выдержки и 60 минутами динамической выдержки, вторая ступень очистки проводится при этих же параметрах с чистым сверхкритическим углекислым газом. Очистка производных костной ткани и кожного матрикса может производиться с использованием «пульсирующего» давления, суть которого заключается в поочередном повышении и понижении давления обработки (то есть в создании перепада давления). Очистка производных костной ткани и кожного матрикса может включать в себя дополнительную химическую обработку с использованием 6% раствора перекиси водорода с выдержкой до 18 часов. Очистка производных костной ткани и кожного матрикса допускает последующую стерилизацию как β-, так и γ- излучением в дозах 10-30 кГр. Модификация способа очистки производных костной ткани и кожного матрикса допускает инкорпорирование в пористую структуру материала дополнительных модифицирующих веществ (к примеру, факторов роста и биоактивных пептидов) после очистки, что дополнительно повышает остеокондуктивные и остеоиндуктивные свойства материала для имплантации.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные случаи приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть, понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.