СПОСОБ ОТБОРА ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА, ПРИГОДНЫХ ДЛЯ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ
METHOD OF SELECTION OF HUMAN THROMBOCYTES FITNESS FOR CRYOPRESERVATION

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области медицины, а именно производственной и клинической трансфузиологии, и может быть использовано для отбора доноров тромбоцитов с целью получения тромбоцитного концентрата (ТК), пригодного для криоконсервирования.
Уровень техники
Из уровня техники известен метод оценки агрегационной активности тромбоцитов до и после процедур криоконсервирования с использованием диметилсульфоксида (ДМСО) в конечной концентрации 4-6% [Valeri C.R., Ragno G., Khuri S. Freezing human platelets with 6 percent dimethyl sulfoxide with removal of the supernatant solution before freezing and storage at -80 degrees С without postthaw processing // Transfusion. 2005; 45 (12): 1890-1898]. Однако известный метод не позволяет оценить чувствительность исходных тромбоцитов к ДМСО, не позволяет оценить структурную целостность исследуемых тромбоцитов перед криоконсервированием.
9
Наиболее близким к заявленному является способ оценки качества тромбоцитов до и после криохранения, основанный на оценке морфологического индекса тромбоцитов (МИТ) в фазово-контрастном микроскопе [Lazarus Н.М., Kaniecki-Green Е.А., Warm S.E., Aikawa M., Herzig R.H. Therapeutic effectiveness of frozen platelet concentrates for transfusion // Blood. 1981. Vol. 57, №2. P. - 243-249]. Метод предполагает выделение 4 морфологических типов тромбоцитов: 1 тип - дисковидные клетки (диски); 2 тип - сферические клетки (сферы); 3 тип - клетки с отростками (отростчатые клетки); 4 тип - баллонные (дегенеративные) клетки. Предлагается получение ТК у доноров методом аппаратного афереза на антикоагулянте ACD (7:1). Количество тромбоцитов в одной дозе КТ должно быть от 50 до 100×10. Морфологический анализ тромбоцитов проводят 2 раза - перед подготовкой ТК к криоконсервированию и после его разморозки. Образцы ТК криоконсервируют в присутствии 10% ДМСО и хранят при -80°С в течение 7 суток. Для оценки МИТ тромбоциты помещают на предметное стекло и с помощью фазово-контрастного микроскопа оценивают соотношение основных морфологических форм тромбоцитов в расчете на 100 клеток, при этом клеткам 1-го типа присваивают 4 балла, 2-го типа - 2 балла, 3-го типа - 1 балл, 4-го типа - 0 баллов. Затем число клеток каждого типа умножают на соответствующий балл и суммируют полученные величины. Значения МИТ варьируют от 0 до 400. В исходных ТК доноров значение МИТ может варьировать от 300 до 400 баллов, в криоконсервированных ТК после разморозки - от 100 до 300 баллов. При МИТ=200-300 баллов тромбоциты криоконсервированных ТК считаются пригодными для трансфузии, при МИТ<200 баллов - непригодными.
Однако данный метод не позволяет оценить целостность внутреннего состава исследуемых тромбоцитов и их чувствительность к ДМСО, не позволяет прогнозировать сохранность тромбоцитов ТК перед криоконсервированием, в результате чего сохраняется высокая вероятность криоконсервирования ТК с низкой сохранностью тромбоцитов и выбраковки ТК после криохранения.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является разработка способа отбора тромбоцитов, пригодных для криоконсервирования с учетом их устойчивости к ДМСО.
Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является разработка метода отбора ТК, пригодных для криоконсервирования, с прогнозируемой утратой не более 50-55% биологически полноценных клеток путем исследования интенсивности свечения витально окрашенных препаратов ТК в поле зрения микроскопа (объектив 40, увеличение 400).
Поставленная задача решается тем, что способ морфофункционального анализа тромбоцитов, содержащихся в тромбоцитном концентрате (ТК) для отбора тромбоцитов, пригодных для криоконсервирования, включает:
ТР
определение концентрации тромбоцитов (С, тыс./мкл) в ТК,
прижизненную окраску тромбоцитов красителем, приготовленным разведением 5-15 мг трипафлавина и 15-25 мг акридинового оранжевого при комнатной температуре в 100 мл фосфатного буфера при рН=7,2-7,4, посредством введения красителя в пробу ТК из расчета 200 мкл красителя на 1 мл тромбоцитного концентрата,
опыт
после чего осуществляют исследование препарата с окрашенными тромбоцитами с помощью флуоресцентного микроскопа с последующим определением средней интенсивности свечения (ИС) 1-го поля зрения микроскопа,
ТБГ25%
кроме того, по калибровочной кривой или по формуле определяют стандартное значение интенсивности свечения 1 поля зрения микроскопа у препарата с пробой ТК, содержащей 25% ТБГ (ИС),
ТБГ25%
опыт
опыт
ТБГ25%
опыт
ТБГ25%
после чего сравнивают ИС с ИС, при ИС>ИС тромбоциты считают пригодными для криоконсервирования, при уровне ТБГ менее 25% или ИС<ИС тромбоциты считают непригодными для криоконсервирования.
опыт
В конкретном варианте осуществления изобретения концентрацию тромбоцитов определяют посредством гематологического анализатора. Для исследования с помощью флуоресцентного микроскопа пробу с окрашенными тромбоцитами берут в количестве не менее 5 мкл. Окраску тромбоцитов осуществляют в пробирке в течение 2-5 минут. Оценку средней интенсивности свечения (ИС) 1-го поля зрения микроскопа осуществляют посредством усреднения интенсивностей свечения, по крайней мере, четырех полей зрения исследуемой пробы, которые определяют по их цифровым изображениям, увеличенным, по крайней мере, в 400 раз.
Согласно изобретению в пробе ТК с помощью витального окрашивания и флуоресцентной микроскопии выявляют клетки с высокой устойчивостью к ДМСО. Такие клетки содержат более 10 визуально различимых гранул, для их обозначения предложен термин «тромбоциты, богатые гранулами» (ТБГ). В эксперименте нами показано, что при концентрации 5-6% ДМСО адгезивная активность ТБГ значимо не снижалась в течение 1-1,5 часов, при 1,25-1,5% ДМСО - в течение 3-4 часов, при 0,3-0,6% ДМСО - в течение 20-24 часов. В то же время адгезивная активность тромбоцитов с 3-7 гранулами при 5-6% ДМСО начинала снижаться уже через 10-20 минут после внесения ДМСО в плазму с тромбоцитами. В процессе заморозки плазмы с тромбоцитами в присутствии 5-6% ДМСО до -84°С с последующей разморозкой адгезивная активность ТБГ (8-20 гранул) снижалась в 1,2-1,5 раза, а адгезивная активность тромбоцитов с 3-7 гранулами значительно больше - в 2-5 раз. Таким образом, была экспериментально выявлена зависимость чувствительности тромбоцитов человека к ДМСО от количества гранул, выявляемых с помощью витального окрашивания.
Для оценки содержания тромбоцитов, богатых гранулами, пробу с тромбоцитами окрашивают витальными флуорохромными красителями в течение 5-10 минут. Затем пипеткой отбирают 10-15 мкл смеси, переносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. Оценку прижизненно окрашенных тромбоцитов проводят с помощью флуоресцентного микроскопа (объектив ×100, числовая апертура 1.25, λ, возбуждения 450-490 нм, λ эмиссии - от 520 нм) в полуавтоматическом режиме. С помощью цифровой фотокамеры при экспозиции 0,25-0,5 сек получают цифровые изображения тромбоцитов и переносят в компьютер. Для морфометрического исследования тромбоцитов используют программу Adobe Photoshop. Оценивают цифровые изображения от 100 до 200 витально окрашенных клеток, регистрируют количество тромбоцитов, содержащих более 10 гранул на клетку, и выражают в процентах. Например, при исследовании 150 тромбоцитов 45 клеток имели более 10 гранул. Содержание тромбоцитов, богатых гранулами, равно 45:150×100=30%.
1
2
2
1
Для эффективного использования параметра содержания ТБГ с целью отбора ТК для криоконсервирования были определены референтные значения содержания ТБГ в исходных ТК, при которых сохранность биологически полноценных тромбоцитов после всех процедур криоконсервирования составит не менее 45-50%. Проведена серия экспериментов (таблица 1) по оценке эффективности криоконсервирования ТК в зависимости от содержания тромбоцитов, богатых гранулами. Кроме того, оценивали резистентность тромбоцитов к ДМСО. В исходной пробе определяли адгезивную активность тромбоцитов (AAT), затем в пробу вносили ДМСО до конечной концентрации 5-6%, экспозиция в течение 60 мин при комнатной температуре. Затем повторно определяли адгезивную активность тромбоцитов (ААТ). Резистентность тромбоцитов к ДМСО определяли как отношение ААТ:ААТ и выражали в %.
Например, в исходном ТК значение ААТ составляло 50%, после теста на резистентность к ДМСО - 24%, резистентность тромбоцитов к ДМСО составила 24:50⋅100=48%.
Таким образом, во всей популяции тромбоцитов крови человека ТБГ являются наиболее устойчивыми к криоконсервированию. Следовательно, концентрация ТБГ может служить маркером оценки пригодности ТК для криоконсервирования. В ТК, содержащих от 25 до 40% ТБГ, после криоконсервирования сохранялось не менее 50-60% биологически полноценных клеток. Последующие исследования показали, что по уровню ТБГ и сохранности содержания функционально пригодных клеток в ТК можно выделить 3 группы доноров. У доноров 1-й группы содержание ТБГ было менее 10% от всей популяции тромбоцитов, потому от таких доноров не рекомендована заготовка ТК. У доноров 2-й группы содержание ТБГ составило 10-24% от всей популяции клеток, тромбоциты имели нормальную биологическую полноценность и могли быть использованы при заготовке ТК короткого хранения, но не рекомендованы для криоконсервирования. У доноров 3-й группы тромбоциты имели нормальную биологическую полноценность, содержание ТБГ варьировало от 25-40%. Тромбоциты доноров 3 группы пригодны как для короткого хранения, так и для криоконсервирования.
Для оценки содержания ТБГ в ТК путем анализа всего поля зрения расчета было необходимо разработать калибровочную кривую, отражающую зависимость интенсивности свечения 1-го поля зрения микроскопа витально окрашенных клеток, содержащего 25% тромбоцитов, богатых гранулами (ТБГ), от общей концентрации тромбоцитов в аферезном ТК. Такой подход был нами смоделирован. Ранее нами выявлено, что наибольшая сохранность тромбоцитов (более 50%) при криоконсервировании ТК в присутствии 5-6% ДМСО наблюдается при относительном содержании ТБГ не менее 25% от всей популяции тромбоцитов, что было использовано для создания модели. В образцы плазмы доноров вносили 5-6% ДМСО и экспонировали при комнатной температуре в течение 30 мин для инактивации той части тромбоцитов с гранулами, которая не является ТБГ. Затем элиминировали из среды тромбоциты без гранул следующим способом. Окрашенную пробу вносили на предметное стекло и помещали в термостат при 37°С на 5 мин для запуска начальной стадии адгезии тромбоцитов с гранулами. Через 5 мин препарат вынимали из термостата, обрабатывали раствором антиагреганта тикагрелора (для остановки дальнейшей активации тромбоцитов с гранулами). После чего для удаления неадгезировавших тромбоцитов препарат промывали буферным раствором. В результате удалось получить препараты с разной концентрацией тромбоцитов, где относительное содержание клеток с гранулами составляло 95-98%, а концентрация среди них ТБГ - 25%. Это позволило построить калибровочную кривую (фиг. 1), отражающую взаимосвязь концентрации клеток в ТК и интенсивностью свечения поля зрения препарата, содержащего 25% ТБГ.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежом, где на фиг 1. представлена калибровочная кривая зависимости интенсивности свечения 1-го поля зрения витально окрашенного препарата, содержащего 25% тромбоцитов, богатых гранулами (ТБГ), от общей концентрации тромбоцитов в аферезном ТК.
Осуществление изобретения
Процедура отбора тромбоцитов человека, пригодных для криоконсервирования, включает следующие этапы.
1. Забор 1 мл из дозы ТК, заготовленной с помощью аппарата автоматического афереза, в сухую пробирку.
ТР
2. Подсчет общего количества тромбоцитов (С, тыс./мкл) в готовом ТК с помощью гематологического анализатора.
3. Приготовление витального красителя путем разведения 10 мг трипафлавина и 20 мг акридинового оранжевого при комнатной температуре в 100 мл фосфатного буфера (рН=7,2-7,4).
4. Окраска БоТП (Богатой тромбоцитами плазмы) или ТК доноров витальным красителем.
Для окрашивания 1 мл ТК (более 1000 тыс. клеток в мкл) требуется 200 мкл готового витального красителя. Окрашивание проводят в микропробирке в течение 2-5 мин при комнатной температуре, после чего 5 мкл пробы с окрашенными тромбоцитами переносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом.
БоТП характеризуется концентрацией тромбоцитов от 300 до 1000 тыс./мкл, ТК - более 1000 тыс./мкл.
опыт
5. Оценка средней интенсивности свечения 1 поля зрения (ИС, в фут-кандел).
опыт
Средняя интенсивность свечения анализируемой пробы (ИС) отражает реальную интенсивность свечения витально окрашенных тромбоцитов в 1-м поле зрения микроскопа. Витально окрашенные препараты ТК анализируют с помощью флуоресцентного микроскопа (объектив ×40, числовая апертура 0.6, λ возбуждения 450-490 нм, λ эмиссии - от 520 нм) в полуавтоматическом режиме. С помощью цифровой фотокамеры при экспозиции 0.25-0.5 сек получают цифровые изображения 10 разных полей зрения окрашенного препарата и переносят в компьютер. Для оценки интенсивности свечения 1 поля зрения используют программу Adobe Photoshop.
ТБГ25%
ТБГ25%
ТБГ25%
ТР
ТР
6. Оценка теоретической интенсивности свечения (ИС, в фут-кандел) поля зрения микроскопа витально окрашенных тромбоцитов стандартного препарата, где все клетки представлены тромбоцитами с гранулами и 25% всей популяции тромбоцитов составляют ТБГ. ИС рассчитывают по формуле: ИС=0,002×С+10,12, где С - концентрация тромбоцитов в исследуемой пробе.
Представленная формула позволяет рассчитать теоретическую интенсивность свечения поля зрения микроскопа в препарате, содержащем 25% ТБГ в зависимости от концентрации клеток в ТК
опыт
ТБГ25%
7. Сравнение ИС и ИС
опыт
ТБГ25%
Если ИС≥ИС, то исследуемый ТК содержит более 25% ТБГ и считается пригодным для криоконсервирования.
опыт
ТБГ25%
Если ИС<ИС, то исследуемый ТК содержит менее 25% ТБГ и считается непригодным для криоконсервирования.
Для наглядности приведем пример отбора тромбоцитов крови доноров для клинического использования и криоконсервирования.
Кадровый донор осуществил донацию тромбоцитов 1.09.2011 и затем пришел на повторную донацию через 2 недели (13.09.2011). В обоих случаях требовалось оценить качество тромбоцитов донора, их пригодность для клинического использования и криоконсервирования. Результаты оценки приведены в таблице 2.