Изучение биологической активности политрила

Б. П. Струнин, Л. Ф. Саттарова, Л. К. Шарипова,

Н. А. Фролова, С. Ю. Гармонов, А. Ф. Исмагилова, П. А. Гуревич

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИТРИЛА

Изучены основные фармакотоксикологические свойства 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолинкарбоновой-3 кислоты (полит-рила) и показана возможность его применения в ветеринарии как антимикробного средства

В настоящее время в медицине и ветеринарии широко используются высоко активные антибактериальные препараты - ингибиторы ДНК-гиразы бактерий, относящиеся к классу 6-фторопроизводных 4-оксохинолинкарбоновых-3 кислот [1]. Одним из таких соединений с широким спектром антибактериального действия является 1,4-дигидро-7-пиперазил-4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолинкарбоновая-3 кислота (норфлоксацин -1) [2]:

1) X = N4 норфлоксацин, 2) X = О политрил.

В работе [3] отмечено, что фрагмент «В» - пиперазиновый цикл или другой азотсодержащий фрагмент - обеспечивает оптимизацию фармакокинетических свойств и повышение антимикробной активности. Учитывая, что фторохинолоны прочно зарекомендовали себя как высокоэффективные химиотерапевтические лекарственные вещества (ЛВ) системного действия с широким диапазоном показаний к применению при лечении инфекционных заболеваний и гнойно-воспалительных процессов, нами была поставлена задача конструирования хинолонокарбоновой кислоты с сохранением всех фрагментов норфлок-сацина и модификацией азотсодержащего гетероцикла - заменой атома азота на кислород. Представлялось, что это приведет к сокращению числа метаболитов ЛВ.

Был синтезирован [4] аналог норфлоксацина - 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолинкарбоновая-3 кислота (политрил - 2). При этом учитывалось, что фрагмент морфолина входит в состав ряда ЛВ и, следовательно, можно было ожидать проявления соединением 2 биологической активности. Предположения оправдались - политрил после многочисленных испытаний допущен для лечения бактериальных инфекций у сельскохозяйственных животных, в том числе, птиц [5]. Это антибактериальное средство для орального применения обладает антимикробным действием против грамотрицатель-ных и грамположительных микроорганизмов, механизм действия которого связан с нарушением синтеза белков микроорганизмами. Выделяется препарат из организма в основном с мочой и желчью.

Целью настоящей работы являлось изучение основных фармакотоксикологических свойств субстанции политрила.

Экспериментальная биологическая часть

Экспериментальные лабораторные исследования проведены на 578 белых беспородных мышах и мышах линии СВА и С57В1 с живой массой 18-20 г; на 184 белых крысах с массой 175-220 г. Лабораторные животные содержались в одинаковых зоогигиенических условиях вивария. Кормление животных проводили согласно суточной потребности лабораторных животных [6].

Изучение острой токсичности политрила проводили по общепринятой методике [7]. Политрил вводили перорально при помощи ротожелудочного зонда. На основании данных гибели животных от применения разных доз исследуемого соединения методом интегрирования по Беренсу [8] устанавливали абсолютно смертельную дозу (Ьйюо) и максимально переносимую дозу О-йо). Значения 1_0-|б и -084, найденные по характеристической кривой, построенной на основании интегрированных данных, использованы для определения коэффициентов вариабельности смертельных доз. Дозу, вызывающую гибель половины животных 1_050, рассчитывали по формуле Кербера, среднюю ошибку 1_050 определяли по формуле Гаддэма [8].

Противоязвенную активность определяли на моделях язв, вызванных индометаци-ном и ацетилсалициловой кислотой, путём двукратного введения их в желудок крысам через зонд с учётом эффективных доз [9].

Противовоспалительная активность политрила была изучена на общепринятых моделях воспалений, вызванных 2% раствором лидокаина гидрохлорида, 10% раствором яичного белка, 2% формалином в дозах по 0,05 мл каждого флогогена [10].

Определение антителообразующих клеток (АОК) в селезенке иммунизированных мышей определяли с помощью метода локального гемолиза в жидкой фазе [11]. Для иммунизации животных в качестве антигена использовали эритроциты барана, трижды отмытые физиологическим раствором. Антиген вводили внутрибрюшинно в оптимальной дозе 2х10 клеток на 20 г массы животного. Определение числа АОК в селезенке иммунизированных животных производили на 5 сутки после введения эритроцитов барана. Забой животных проводили под эфирным наркозом путем цервикальной дислокации.

Гиперчувствительность замедленного типа политрила на функциональную способность Т - эффекторов изучали в реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ), спровоцированной динитрофторобензолом в ацетоновом растворе. При постановке реакции сенсибилизацию мышей осуществляли нанесением 1 капли 1% раствора динит-рофторобензола на правый бок. Через 10 суток после сенсибилизации животные получали разрешающую дозу - по 1 капле 0,1%-ного раствора динитрофторобензола на каждую сторону правого уха. Через 24 часа определяли степень изменения массы пораженного уха в сравнении с контрольным. Интенсивность РГЗТ определяли как разницу в массах опытного и контрольного уха, выраженную в %. С целью более полного изучения влияния полит-рила на клеточно-опосредованные иммунные реакции дополнительно применялся метод формирования реакции ГЗТ у мышей внутривенным введением эритроцитов барана (2х106 клеток) - сенсибилизирующей дозы, и через 10 дней субплантарно в лапку (2х10 клеток) -разрешающей дозы. Спустя сутки после последнего введения, по приросту (в %) массы правой лапки нами определялась интенсивность РГЗТ.

Влияние политрила на кожу и слизистые оболочки мышей и крыс изучали путем нанесения на выстриженный участок кожи в межлопаточной области на протяжении 2-х

недель по одному разу в день по капле раствора ЛВ в вазелиновом масле. Реакцию кожи учитывали ежедневно по шкале оценки кожных проб [12]. Повторное местное действие изучали на крысах (самках), которым на кожу наносили соединение (по 2 капли) ежедневно, в течение трех недель. Действие политрила на слизистую оболочку глаза изучали на крысах-самцах. Для постановки пробы 1 каплю водного раствора вводили в коньюкти-вальный мешок крысе, во второй глаз (контрольный) вводили 1 каплю воды. Реакцию учитывали через 15 мин и через 24-48 часов (гиперчувствительность замедленного типа) [12].

Сенсибилизирующее действие политрила исследовали на морских свинках-альбиносах - половозрелых животных обоих полов массой тела 290-300 г. Разброс в экспериментальных группах по исходной массе не превышал ±10%. На выстриженный участок спины вводили внутрикожно изучаемое соединение в двукратных разведениях в концентрации, не вызывающей кожно-раздражающего действия. Затем вводили внутривенно по 0,5 мл 1%-ного раствора «синего Эванса». Через 30 минут животных забивали и определяли размеры синего пятна на внутренней стороне кожи в месте введения изучаемого соединения. Для контроля реактивности кожи на другой выстриженный участок вводили микрошприцем по 0,05 мл стерильного физиологического раствора. Разрешающие инъекции исследуемого соединения и «синего Эванса» вводили также и контрольным животным, которым в дни сенсибилизации опытных групп давали только стерильный физиологический раствор.

Влияние политрила на эффекторную способность Т-лимфоцитов в реакции трансплантационного иммунитета оценивали путём воспроизведения феномена «Трансплантант против хозяина» (РТПХ). Использовали метод количественной оценки РТПХ в регионарных узлах при локальном введении аллогенных клеток. Гибридам Р1 в правую заднюю лапку подкожно вводили клетки лимфатических узлов, взятых у мышей линии СВА (родительского генотипа). Лимфатические узлы гомогенизировали в камере Горяева, подсчитывали количество лимфоцитов, готовили раствор, содержащий в 0,5 мл 1х106 лимфоцитов. Приготовленную суспензию лимфоцитов вводили гибридам Р1 в подушечку задней лапки. Данным животным в течение 7 дней внутрь вводили политрил в дозе 5 мг/кг. Второй группе вводили оксиметилурацил (ОМУ) в дозе 50 мг/кг и третья группа служила контролем. На восьмые сутки животных забивали, определяли массу подколенных лимфатических узлов в опытной правой конечности и контрольной лапки, гомогенизировали лимфатические узлы и подсчитывали количество лимфоцитов.

Степень мутагенной активности политрила исследовали при выявлении генных мутаций индикаторных штаммов ТА1950, ТА98, ТА100 [13]. Штаммы ТА1950 и ТА100 позволяют учитывать мутации типа замены пар оснований, а ТА98 и ТА100 типа сдвига рамки считывания. Мутагенную активность изучали в условиях метаболической активации и без неё. Условия наличия или отсутствия метаболической активации создавали внесением в смесь кофакторов (НАДФ и глюкозо-6-фосфат). Для окончательного решения вопроса о степени мутагенной активности политрила использовали метод цитогенетического анализа клеток костного мозга. При этом учитывали хромосомные аберрации клеток костного мозга мышей линии С57В1. Препарат вводили в дозах 500 мг/кг однократно, а 5 и 50 мг/кг в течение 5 дней. При исследовании учитывали одиночные и парные фрагменты, хрома-тидные и хромосомные обмены. Отдельно регистрировали гены-пробелы.

Изучение эмбриотоксического действия политрила проведены на белых беспородных крысах. У самок весом 180-200 г периодически проводили цитологическое изучение вагинальных мазков для определения стадии астрального цикла. Для спаривания отбирали животных, находящихся в стадиях проэструса или эструса, предтечки и течки. Самок под-

саживали к самцам в соотношении 2:1 во вторую половину дня. На следующее утро изучали влагалищные мазки. При обнаружении в них сперматозоидов этот день считали первым днем беременности. Крысы получали препарат один раз в день с 1 по 21 день беременности. Контрольным животным вводили в те же сроки воду или крахмал. Самок забивали путем декапитации. Вскрывали брюшную полость матки, яичники помещали в чашку Петри с физиологическим раствором. В яичниках подсчитывали число желтых тел, в матке после её вскрытия - количество живых и мертвых плодов, а также места имплантации и резорбции зародышей. Плаценты и каждый плод взвешивали, измеряли кранио - каудальный размер, определяли пол и исследовали под бинокулярной лупой МБО-2. Внешний осмотр позволяет обнаружить дефекты глаз, мозга, лицевого черепа, конечностей, позвоночника, хвоста, брюшной стенки. Кроме того, 1/2 часть всех плодов исследовали с помощью мик-роанатомического метода Вильсона [14] для выявления дефектов внутренних органов и 1/2 часть - методом Доусона [15] для изучения состояния скелета. Показатель предимпланта-ционной гибели эмбрионов вычисляли как разность между количеством желтых тел и мест имплантаций, отнесенную к числу желтых тел, принятых за 100%. Показатель постим-плантационной гибели определяли как разность между числом мест имплантаций и живых плодов, отнесенную к числу мест имплантаций, принятых за 100 %.

Определение канцерогенной активности политрила проводили на аквариумных рыбках гуппи, которые были разделены на три группы: контрольную и две опытные по 40 голов в каждой. Рыбам 2 и 3 групп ежедневно со специально приготовленным кормом задавали аналогичный корм без добавки препарата. Ежедневно вели наблюдение за состоянием и активностью рыб. Существенных различий по этим показателям между контрольной и опытными группами не наблюдалось, рыбы полностью поедали задаваемый им корм.

Определение бактериостатической активности in vitro проводили методом серийных разведений в жидкой питательной среде. Бактерицидную активность изучали путем воздействия препаратов на тест объекты при комнатной температуре и дальнейшего культивирования золотистого стафилококка (штамм 209Р), кишечной палочки (штамм 1749). Бактериостатические и бактерицидные свойства определяли визуально по отсутствию роста культуры в пробирках после суточной и пятисуточной инкубации при температуре 37оС [16].

Микроскопические исследования проводились с использованием светового микроскопа ХЕКАУАЬ фирмы «САКЬ ZEISS» (Германия).

Экспериментальная химическая часть

Объектом исследования являлась субстанция политрила, синтезированная по ранее описанной нами методике [4]. С целью установления идентичности вновь синтезированного антимикробного средства предлагаемой структуре было проведено сравнение спектров ЯМР 1Н, 13С, 19F политрила (2) и норфлоксацина (1), выделенного из импортного препарата нолицин (синоним 1) и специально синтезированного. Как следует из сравнения спектральных данных политрил по своей структуре наиболее близок к норфлоксацину.

Спектр ЯМР 1Н политрила (2) /норфлоксацина(1) (ГМДС, D20, Bruker, 100 МГц), м.д.: 1,02 т/1,00 т (3Н, С13Н3); 2,6 т/2,6 с (8Н, 2N(CH2h); 2,7 т (4Н, 0(СН2Ь)/-; 3,81 к/3,80 к (2Н, NCH2); 6,43 с/6,45 с (1Н, С8Н=); 7,36 д/7,38 д (1Н, С5Н=, 3Jfh= 3,75 Гц); 7,98 с/8,00 с (1Н, С2Н); сигнал N-H протона не проявляется вследствие дейтерообмена с D20.

Спектр ЯМР 13С политрила (2)/норфлоксацина(1) (D2O, Bruker, 100 МГц), м. д.: 14,0/13,9 (С13); 49,1/49,1 (С12); 50,1/50,9 (С14); 66,6/44,9 (С15); 104,5/105,6 (С8); 112,0/111,9

(С5); 117,1/117,3 (С3); 122,4/122,7 (С10); 136,5/136,7 (С9); 144,1/144,8 (С7); 147,2/147,7 (С2); 152,7/153,1 (С6); 172,0/172,6 (С11); 175,0/175,2 (С4).

Атом фтора проявляется в спектре 19F 5 = - 48,1/- 48,2 ppm (Н20 + KF + D20).

Строение продукта 2 подтверждают данные масс-спектрометрии электронного удара (ЭУ) (TRACE MS «Finnigan MAT», энергии ионизирующих электронов 70 эВ, температура источника ионов 200°С при прямом вводе вещества). В масс-спектре 2 пик m/z 320 отвечает молекулярному иону (М+ .) молекулы со структурой 2. Первая стадия распада молекул 2 при ЭУ связана с разрывом C-С и С-0 связей в азотсодержащем насыщеннном гетероцикле. Данный процесс приводит к пику иона [M^2^O]+ m/z 276. Потеря самого гетероцикла М+' - ионом обусловливает появление в масс-спектре пика иона m/z 234. Наряду с этим процессом происходит миграция одного атома водорода к заряженному осколку с образованием иона с m/z 235. В дальнейшем последний ион теряет ОН - группу с образованием иона m/z 218. Присутствие в масс-спектре иона m/z 203, можно связать с последующим отщеплением СН 3- группы из иона m/z 218. Присутствие других осколочных ионов с малыми значениями m/z в масс-спектре ЭУ 2 вызвано, по-видимому, последовательным распадом при ЭУ отмеченных выше ионов.

Масс-спектр образца политрила, m/z (относительная интенсивность в % макс), ион: 320(0.8) [М+]*, 278(0.5), 277(3.5), 276(20.8) [М-С2Н40]+,275(0.9), 237(1.1), 236(2.1) 235(1.3), 234(2.3), 219(5.3), 218(24.9), 217 (2.4), 204(3.3), 203(19.9), 149 (11.8), 123 (13.8), 109(26.1), 107(19.9), 105(10.4), 91 (12.6), 85(27.6), 77(7.9) 69 (90.5), 57(80.1), 56(24.7), 43(100.0)^2^0]+, 41(76,9).

Результаты и их обсуждение

При изучении острой токсичности в дозах 2000-2300 мг/кг у мышей отмечалось незначительное угнетение, мыши забивались в угол, переставали двигаться, как бы «застывали» на месте. Через 2-3 часа после введения политрила животные приходили в нормальное состояние. При введении белым мышам политрила внутрь в дозах 2800-2900 мг/кг признаки отравления проявлялись через 30-40 минут. Отмечалась повышенная рефлекторная возбудимость, животные бегали по клетке. В течение судорожного периода погибло большинство мышей. Перенесшие судороги животные, как правило, выживали и в дальнейшем не погибали. Судороги чередовались с периодами покоя. Через 5-10 минут после введения политрила в желудок в дозе 5000 мг/кг животные теряли двигательную активность, а затем спустя 1 -2 минуты начинались судороги. В последующем животные принимали боковое положение, часть которых, не выходя из этого состояния, погибала от остановки дыхания. При вскрытии грудной клетки мы не смогли отметить каких-либо признаков сердечного автоматизма, который не удавалось вызвать механическим раздражением сердечной мышцы пинцетом. По-видимому, наиболее вероятной причиной гибели опытных животных, при введении им летальных доз политрила является остановка сердца. Подобные изменения были обнаружены и при введении токсических доз политрила крысам. Коэффициент вариабельности для белых мышей при пероральном применении составил

1,15, для крыс 1,12. Среднесмертельная доза политрила для белых мышей составила 2575,0±91,1 мг/кг, для крыс 3066,6±46,б мг/кг. Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что политрил относится к 4 классу опасности (малотоксичные вещества).

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что до настоящего времени остаются недостаточно изученными антиульцерогенные свойства производных фторохи-нолонового ряда [1]. Нами установлено, что при индукции язв индометацином политрил в

значительной мере предохраняет слизистую оболочку желудка. При применении политри-ла наблюдалось минимальное количество изъязвлений. При его введении в дозе 5 мг/кг противоязвенная активность составила 6,95, превысив таковую у животных, получавших фуразолидон, на 74,9%. В контрольной группе животных отмечались язвенные поражения в различных отделах желудка. Слизистая оболочка желудка была отечной, гиперемиро-ванной, с множественными редкоточечными эрозиями и крупными язвами. При моделировании «ацетилсалициловых» язв у крыс было установлено, что политрил в дозе 5 мг/кг обладает выраженной антиульцерогенной активностью. Так, при его применении индекс изъязвления уменьшился с 16,17±0,32 (контроль) до 2,9±0,3. Противоязвенная активность составила 6,30. Таким образом, политрил в дозе 5 мг/кг защищает слизистую оболочку желудка, не тормозя секреции кислоты.

Механизм противовоспалительного действия многих препаратов включает торможение циклооксигеназы, биосинтез простагландинов и тромбоксанов. Следствием угнетения синтеза простагландинов является повреждение желудочно-кишечного тракта, задержка натрия и воды, повышение давления и бронхоспазм. В проведенных экспериментах не отмечены побочные эффекты при длительном применении политрила в дозах от 3 до 6 мг/кг. Как показали исследования на моделях воспалений, вызванных формалином, каррагенином, ли-докаином и яичным белком политрил в дозах 2 - 6 мг/кг достоверно задерживает развитие воспалительного отека по сравнению с контролем. Так, политрил в дозе 5 мг/кг достоверно угнетает развитие отека при лидокаиновом воспалении на 27%, при белковом - на 29,4%, а при каррагениновом - на 38,7% по сравнению с вольтареном. Таким образом, политрил в дозе 5 мг/кг обладает наиболее выраженным антифлогистическим действием по сравнению с вольтареном и не отмечены побочные эффекты при длительном его применении в различных дозах.

Изучение возможности модуляции антителогенеза политрилом проводилось на белых неинбридных мышах, которых иммунизировали внутрибрюшинным введением оптимальной дозы 2 108 эритроцитов барана. Как видно из данных табл. 1, политрил в различных дозах в течение 7 дней на фоне иммунизации приводил к достоверному увеличению

Таблица 1 - Влияние политрила на образование антителообразующих клеток

Соединение Доза, мг/кг Количество животных Число АОК 106 пле-ноцитов Р по сравнению с контролем

Политрил 2 8 6000,0±192,0 <0,001

Политрил 3 8 6200,0±223,0 0,001

Политрил 4 8 7249,3±337,0 0,001

Политрил 5 8 7360,3±315,0 0,001

Политрил 6 8 7250,4±296,0 0,001

ОМУ 25 8 1390,5±99,0 0,001

Байтрил 8 8 1285,0±101,0 0,001

Контроль - 8 710,5±66,0 -

количества антителообразующих клеток (АОК). Причём максимальная активность проявилась при дозе 5 мг/кг (в 10,4 раза больше по сравнению с контрольным значением и в 5,3 раза активнее оксиметилурацила, байтрила, которые рекомендованы в качестве ростостимулирующих средств для телят и цыплят).

Нами исследована эффективность политрила при гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), моделированной методом «лапки». Супрессия клеточного звена иммунитета, судя по реакции ГЗТ к динитрофторобензолу и к эритроцитам барана, по-видимому, связана с противовоспалительным действием изучаемого препарата. Изучалось влияние политрила на формирование ГЗТ к эритроцитам барана на мышах линии С57ВL и СВА в сравнении с действием оксиметилурацила. Политрил вводили внутрь в течение 7 дней до сенсибилизации. При этом отмечалась тенденция к угнетению реакции гиперчувствительности замедленного типа у мышей линии СВА аналогично оксиметилурацилу, как при профилактическом, так и при лечебном введении (табл. 2). Таким образом, политрил обладает иммунотропными свойствами, основным вектором этого эффекта является иммуностимулирующее действие первичного звена иммунитета. Максимального иммунотропного эффекта можно ожидать в дозе 5 мг/кг, и дальнейшее увеличение дозы политрила не приводит к дальнейшей стимуляции иммунной системы.

Таблица 2 - Влияние политрила на реакцию гиперчувствительности замедленного типа к эритроцитам барана у мышей линии СВА

Наименование соединения Доза мг/кг Количество животных Средний процент увеличения лапки Р

I серия - профилактическое действие

Политрил 5 8 12,3±1,2 <0,05

Политрил б 8 12,3±1,2 0,05

Оксиметилурацил 25 8 13,9±1,3 0,05

Байтрил 8 8 17,9±2,1 0,05

Контроль - 8 18,б±1,9 -

II серия - лечебное действие

Политрил 5 8 13,1±1,2 0,05

Политрил б 8 13,1±1,2 0,05

Оксиметилурацил 25 8 15,2±1,5 0,05

Байтрил 8 8 17,9±2,1 0,05

Контроль - 8 19,0±1,б -

Оценка возможного раздражающего или повреждающего действия на кожу и развитие контактного неаллергического дерматита для политрила показала следующее. Однократная аппликация 5%-ного раствора политрила на кожу мышей не вызвала гиперемию. При изучении повторного местного раздражающего действия на месте аппликации полит-рила наблюдалась эритема. Через три недели под влиянием политрила, кроме эритемы, отмечена сухость кожи. У животных после нанесения изучаемого соединения на слизистую оболочку глаза, обнаружено незначительное покраснение конъюнктивы, удерживающееся в течение 20 минут. Через 30 минут признаки раздражения слизистой оболочки конъюнктивы глаза отсутствовали у всех животных. Таким образом, местное раздражающее действие политрила на кожу и слизистые оболочки глаз при однократном и повторном воздействии выражено слабо.

У морских свинок, которым внутрикожно вводился политрил, после добавления красителя «синего Эванса» диаметр пятна в подкожной клетчатке был в два раза меньше, чем у контрольных. Это указывает на наличие десенсибилизирующих свойств у политрила.

Оценку действия политрила на эффекторную способность Т-лимфоцитов в реакции трансплантационного иммунитета осуществляли воспроизведением феномена «трансплантант против хозяина» (РТПХ) на белых беспородных крысах. Эта реакция происходит за счет включения двух субпопуляций лимфоцитов, предшественников Т-эффекторов РТПХ и Т-амплификаторов. Как результат реакции - происходит накопление зрелых Т-клеток. Увеличение количества клеток в лимфоидных органах, селезенке или лимфатических узлах происходит не только вследствие пролиферации введенных лимфоцитов, но и в результате размножения собственных клеток реципиента [17]. Анализ результатов показывает, что политрил (доза 5 мг/кг) положительно влияет на эффекторную способность Т-лимфоцитов в реакции трансплантационного иммунитета, на что указывает значительно больший средний индекс ретракции (5,40±0,54) по сравнению с оксиметилурацилом (4,87±0,40, доза 50 мг/кг).

При испытании политрила с помощью теста Salmonella/микросомы на разных штаммах ТА98, ТА1950, ТА100 во всех случаях были получены отрицательные результаты, демонстрирующие отсутствие мутагенных свойств. При сравнении числа ревертантов контрольных и опытных данных в каждом варианте не выявлено статистически достоверных различий между ними. Данные, характеризующие индукцию клеток с хромосомными абберациями, показывают, что при однократном введении политрила в дозе 500 мг/кг, а также в дозе 5 и 50 мг/кг в течение 5 дней не обнаружено достоверного увеличения хромосомных аббераций при разных экспозициях. Качественный спектр хромосомных нарушений в контрольных и опытных группах включали гены и одиночные фрагменты. Общие результаты цитогенетических исследований представлены тем, что в течение 5 дней статистически достоверных различий между контрольными и опытными данными установлены не были. Это указывает на отсутствие повреждающего влияния испытуемого соединения на хромосомы мышей линии С57В!.

В опытах по исследованию эмбриотоксического действия политрила на крысах установлено отсутствие эмбриотропного действия. Результаты исследований эмбриотокси-ческого действия исследуемых соединений на крысах представлены в таблице 3, из которых видно, что политрил не влияет на число желтых тел в яичнике, мест имплантации и резорбции в матке.

Основные показатели, характеризующие эмбриотропное действие препарата - пре-димплантационная смертность зигот, постимплантационная гибель эмбрионов и общая эмбриональная смертность у опытных животных, получавших препарат в исследуемых до-

Таблица 3 - Влияние политрила на эмбриогенез крыс

Наименование «Политрил», мг/кг Контроль

показателей 5 25 50

Число желтых тел беременности 13,7 ± 0,40 13,8 ± 0,75 14,5 ± 0,23 14,4 ± 0,42

Число мест имплантации 13,2 ± 0,35 13,2 ± 0,54 14,2 ± 0,20 13,0 ± 0,20

Число мест резорбций 0,4 ± 0,16 0,2 ± 0,14 0,3 ± 0,19 0,2 ± 0,18

Число живых плодов 12,7 ± 0,44 13,0 ± 0,62 12,8 ± 0,12 12,5 ± 0,28

Масса плода, мг 2185 ± 18,72 2344 ± 19,60 2180 ± 25,28 2175 ± 26,43

Длина плода, мм 28,7 ± 0,65 22,5 ± 0,38 31,5 ± 0,40 32,4 ± 0,34

Масса планцеты, мг 465 ± 12,24 480 ± 7,36 482 ± 17,29 479 ± 16, 42

Размер плаценты, мм 12,6 ± 0,35 13,0 ± 0,35 13,2 ± 0,35 11,9 ± 0,27

Плодо-планцентный коэффициент 0,20 0,21 0,23 0,22

Смертность предим-плантац.,% 4,9 ± 1,85 5,0 ± 0,81 3,2 ± 1,36 2,9 ± 1,29

Смертность постим-плантац.,% 3,0 ± 1,45 0,7 ± 0,82 2,8 ± 1,27 2,9 ± 1,28

Смертность общая эм-брион.,% 7,9 ± 2,39 5,7 ±1,95 6,1 ± 2,18 5,7 ± 1,90

Количество самок/самцов в помете 55,3/44,7 43,0/57,0 51,1/48,9 57,2/42,8

зах были в близких пределах с контрольными (Р<0,05). При микроскопическом наружном осмотре плодов и их плацент в опытных и контрольных группах изменений не обнаружено. При анатомическом исследовании внутренних органов и костной системы плодов дефектов развития не выявлено, что указывает на отсутствие эмбриотоксического действия. Различия в массе плодов, их длине, массе плацент, их диаметре и плодоплацентарных коэффициентах были не достоверны (Р>0,05). Длина участков окостенения в закладках исследуемых костей и позвонков в опытных и контрольных группах отличалась незначительно (Р<0,05). Соотношение числа самок и самцов в помете от самок, получавших испытуемый препарат, не отличалось от контроля. Установлено, что роды у опытных самок, получавших политрил, наступали, как правило, на 23-24 дни беременности. В те же сроки наступали роды и у контрольных самок. Численность помета у самок, получавших препарат, была такой же, как и в контроле. Крысята рождались живые, без внешних аномалий. Длина и масса опытных крысят мало отличались от контроля на протяжении всего периода исследований. Как в опытных группах, так и в контроле шерстный покров у крысят появлялся на 3-5 день, ушные раковины открывались на 4-5 день, резцы прорезывались на 8-9, открывание глаз происходило на 16-18 день.

Канцерогенная активность политрила исследована на аквариумных рыбках гуппи. В течение 8 недель эксперимента в контрольной группе умерло 6 голов рыб, во второй опытной - 3 головы, в третьей - 7 голов. Таким образом, сохранность поголовья за первые 8 недель эксперимента по группам составила 63,0%, 92,5% и 82,5% соответственно. В течение оставшегося срока наблюдения с 9 до 20 недель существенных различий между группами по сохранности поголовья рыб также не зарегистрировали. В контроле умерло 5 голов, во второй опытной группе - 5 голов, в третьей - 6 голов. Таким образом, сохранность рыб за период эксперимента и период последующего наблюдения за ними составила 72,5%, 80,0% и 67,5% соответственно. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии отрицательного влияния политрила на сохранность рыб. Отход рыб гуппи не был связан с каким - либо заболеванием, а происходил, по-видимому, в результате установления иерархических отношений во вновь образованном сообществе.

Все умершие рыбы подвергались тщательному осмотру, их препарировали с последующим гистологическим исследованием гепатопанкреаса с целью обнаружения очагов опухолевого роста. В конце 4,8 и 20 недель эксперимента по 10 голов рыб в каждой группе (5 самцов и 5 самок) помещали в раствор эфира, затем проводили вскрытие, с последующей макро - и микроскопией внутренних органов. Полученные результаты представлены в табл. 4. При патологоанатомическом вскрытии и макроскопическом исследовании рыбок гуппи установлено, что каких - либо патологических изменений в пищеводе, кишечнике и щитовидной железе не обнаружено. При исследовании гепатопанкреаса регистрировали крупно - и мелкокапельную жировую дистрофию почечной ткани и гораздо реже точечные некрозы, у которых центральная зона заполнена эозинофильной массой детрита, а в периферической части обнаруживается прослойка регенерирующие гепатоцитов. Как видно из данных, представленных в таблице 4, наибольшее число патологических изменений в печени - 4% от поголовья наблюдали в первой контрольной группе, во 2 опытных группах процент патологии составил 2,8 и 3,2% соответственно. Гепатоцеллюлярная карцинома была зарегистрирована лишь у одной особи из контрольной группы. Опухоль состояла из атипичных полиморфных клеток и была отграничена от окружающей ткани капсулой.

Полученные данные свидетельствуют о том, что патологические изменения печени рыб гуппи являются спонтанными. Индуцирование опухолевого роста под действием изучаемого препарата не происходило. В группах, где рыбы в составе корма получали полит-рил, патологические изменения в гепатопанкреасе были на 1,2 и 0,8% ниже, чем в контроле, а очагов опухолевого роста зарегистрировано не было. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об отсутствии канцерогенной активности политрила.

Политрил обладает выраженной антибактериальной активностью. Антибактериальная активность политрила была проверена для музейных штаммов, а также полевых штаммов бактерий, изолированных от больных животных. Значения минимальных подавляющих концентраций политрила для полевых штаммов бактерий приведены в табл. 5. Как видно, политрил обладает значительной активностью по отношению к различным видам бактерий, в т.ч. к синегнойной палочке. Наиболее чувствительным микроорганизмом к тестируемому веществу оказался стафилококк, рост которого ингибировался при концентрации 0,19 мкг/мл.

Политрил был проверен на наличие у него химиотерапевтического действия на модели экспериментальной эшерихиозной септицемии. Результаты эксперимента отражены в табл. 6. Видно, что политрил обладает превентивными свойствами при заражении животных патогенной культурой кишечной палочки. В опытной группе гибели животных не зарегистрировано, в отличие от контрольной, где пало 6 мышей.

Таблица 4 - Результаты испытания канцерогенной активности политрила на рыбках гуппи

Периоды опыта, недели Группы Исследовано голов Патологические изменения в печени

Жировая дистрофия Точечный некроз Опухоли

1 10 1 - -

4 2 10 3 1 -

3 10 1 - -

1 1б 2 1 -

8 2 13 1 - -

3 17 2 - -

1 14 4 1 1

20 2 17 1 1 -

3 13 3 2 -

1 40 7 2 1

Итого: 2 40 5 2 -

3 40 б 2

Таблица 5 - Минимальная подавляющая концентрация (МПК) политрила для полевых штаммов бактерий

Штамм МПК препарата, мкг/мл

E.coli 510 < 0,19

S.aureus 509 0,39

P.aeruginosa 157 3,13

S.dublin 504 0,78

Таблица 6 - Превентивная активность политрила при колисепсисе (E.coli 510) у белых мышей

Группа Доза препарата Количество животных Пало Выжило

Опытная 5 мг/гол 12 - 12

Контрольная 0,4 мл дистиллированной воды 12 8 4

Таким образом, политрил обладает ярко выраженным антибактериальным действием, что делает его перспективным для использования в качестве антибактериального химиотерапевтического средства в ветеринарии и медицине.

Литература

1. Падейская Е.Н. Фторхинолоны ПЕ.Н. Падейская, В.П. Яковлев.- М.:«Биоинформ», 1995. 208 с.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Ч. I, Ч. II. М.: Новая волна, 1996. Ч. I. 731 с.; Ч. II. 685 с.

3. Падейская Е.Н. Антимикробная активность и механизм действия офлоксацина /Е.Н. Падейская, В.П. Яковлев //Антибиотики и химиотерапия. 1996. №9. С. 13-23.

4. Фассахова Л.Ф. Синтез, строение и биологическая активность 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1 -этил-хинолинкарбоновой-3 кислоты (Политрила) /Л. Ф. Фассахова, Б.П. Струнин, Н.А. Фролова, П.А. Гуревич //Вестник Казанского технол. ун-та. 2006. № 2. С. 208-210.

5. Свидетельство о государственной регистрации лекарственного средства для животных. - Рег. № ПВР-2-4.5/01547 от 6.02.2006 и № ПВР-2-4.5/01548 от 6.02.2006.

6. Ковалевский К.Л. Лабораторное животноводство. М.: Медецина, 1986. 324 с.

7. Саноцкий И.В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ. М.: Медицина, 1970. 245 с.

8. Беленький М.П. Основные приемы статистической обработки результатов наблюдений в области физиологии. М.: «Медицина», 1963. 126с.

9. Аничков С.В. Фармакотерапия язвенной болезни /С.В. Аничков, И.С. Заводская. Л.: Медгиз, 1965. С. 30-51.

10. Тринус Ф.П. Нестероидные противовоспалительные средства /Ф.П. Тринус, Н.Ф. Мохорт, Б.М. Клебанов. Киев, 1975 С. 204-231.

11. Cunningham A.J., Crenberg A. Further unprovement in the plague, techigue for detecting single antybody forming cell //Immunology. 1987. V.2. P. 99-600.

12. Любимов Б.И. Методические рекомендации по оценке аллергенных свойств фармакологических средств /Б.И. Любимов, М.И. Миронова. М., 1988. С. 3-18.

13. Ames B.N. Distinctive adjuvanticiti of analogs micobacterias water-soluble components //Cell. Im. 1973. Vol. 21. P. 243-246.

14. Wilson J. Embriological consideration in teratology methods administering agents and detecting malformations in experimental animals //Technigues. Univ. Chicago Press. 1965. P. 231-262.

15. Dawson A.B. Note on the staining of the sceletion cleared specimes with alizarin reds //Stain Tecnol. 1926. №1. P. 123-128.

16. Методы эксперементальной химиотерапии / Под ред. Г.Н. Першина. М.: Медецина, 1971. 426с.

17. Маянский А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге /А.Н. Маянский, Д.Н. Маянский. Новосибирск: Наука, 1981. С. 256.

© Б. П. Струнин - д-р техн. наук, проф. каф. оборудования пищевых производств КГТУ; Л. Ф. Саттарова - соиск. каф. органической химии КГТУ; Л. К. Шарипова - Башкирский государственный аграрный университет (БГАУ); Н. А. Фролова - студ. КГТУ; С. Ю. Гармонов - д-р хим. наук, проф. каф. инженерной экологии КГТУ; А. Ф. Исмагилова - д-р биол. наук, проф. БГАУ; П. А. Гуревич - д-р хм. наук, проф. каф. органической химии КГТУ.