СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ КИШЕЧНЫХ ВИРУСОВ В КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ И ВОДЕ МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ И ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
METHOD FOR DETECTION OF INTESTINAL VIRUSES IN CLINICAL SAMPLES OF REAL-TIME MULTIPLEX PCR AND LIST OF SEQUENCIES FOR IMPLEMENTING IT

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, медицинской вирусологии, молекулярной биологии и эпидемиологии. Изобретение предназначено для выявления и идентификации в клинических образцах и элюатах, полученных в результате концентрирования из воды, одиннадцати групп кишечных вирусов (энтеровирусов (ЭВ), полиовирусов (ПВ), ротавирусов А и С (РВА и РВС соответственно), аденовирусов (АДВ), норовирусов (НВ), саповирусов (СВ), вирусов гепатита А и Е (ВГА и ВГЕ соответственно), астровирусов (АВ), ортореовирусов (ОРВ) в присутствии внутреннего положительного контроля (ВПК) посредством мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени. Данный подход позволяет усовершенствовать технику ПЦР-анализа для диагностики острых кишечных инфекций (ОКИ) и может найти применение в эпидемиологических службах для мониторинга эпидемиологической обстановки и быстрой расшифровки вспышек ОКИ.
Уровень техники
Острые кишечные инфекции занимают второе место в структуре инфекционных заболеваний человека. Возбудителями ОКИ могут быть энтеровирусы, ротавирусы, аденовирусы, калицивирусы, астровирусы, коронавирусы и другие.
Энтеровирусы оказывают самое различное воздействие на организм, в том числе вызывают более 20 различных синдромов: полиомиелит, миокардит, перикардит, плевралгия, респираторные заболевания, конъюнктивит, гепатит, асептический менингит, энцефалит, диабет и др. Около 90-95% случаев полиовирусной инфекции и примерно 50% случаев ЕСНО и коксакивирусной инфекции протекают бессимптомно. Ротавирусы высококонтагиозны и являются главной причиной диареи у детей. Более чем у 90% детей антитела к ротавирусам появляются до трехлетнего возраста. Норовирусы и другие калицивирусы являются частой причиной вспышек гастроэнтеритов в школах, детских садах, больницах, лагерях отдыха. Большинство подростков имеют антитела к энтеральным калицивирусам. Аденовирусы и астровирусы чаще вызывают гастроэнтериты у детей и ограниченно патогенны для взрослых.
До настоящего времени «золотым стандартом» лабораторной диагностики энтеровирусной и аденовирусной инфекции и выявления энтеровирусов в окружающей среде остается реакция нейтрализации (РН) с типоспецифическими сыворотками в культуре чувствительных клеток. Для выявления кишечных вирусов также эффективно применяют реакции прямой и непрямой иммунофлуоресценции, иммунохроматографию (для ротавирусов, норовирусов и аденовирусов) и реакцию латекс-агглютинации, характеризующиеся меньшими затратами времени по сравнению с РН, но более низкой чувствительностью. Сложность, длительность и трудоемкость РН обусловлена различной чувствительностью клеточных культур к отдельным представителям рода Enterovirus и множеством их антигенных вариантов. По этой причине затруднена и разработка унифицированных диагностикумов, позволяющих быстро и эффективно проводить выявление и дифференциацию энтеровирусов. Кроме того, ряд кишечных вирусов (например, калицивирусы и вирусы гепатитов А и Е) с трудом или вовсе не поддаются культивированию. Выявление антител к вирусам в сыворотке пациентов с помощью твердофазного ИФА, как например для вирусов гепатита А и Е, является ретроспективным методом (выявляет не самого возбудителя, а регистрирует ответ организма на инфекцию). Все перечисленные методы в основном моноспецифичны, что затрудняет выявление смешанных кишечных инфекций. Решение перечисленных проблем в последние годы связывают с развитием молекулярных методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), специфичность которых основана на уникальности нуклеотидных последовательностей вирусных геномов. К числу МАНК относятся различные модификации полимеразной цепной реакции (ПЦР), в том числе ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Внедрение метода ПЦР в лабораторную практику стало одним из наиболее важных событий в клинической лабораторной диагностике. Достоинствами метода ПЦР являются высокая специфичность, чувствительность, универсальность процедуры, простота и удобство проведения анализа, автоматизация процессов, возможность выявления сразу нескольких патогенов в одной пробирке, при условии наличия в реакционной смеси нескольких пар соответствующих праймеров (мультиплексная ПЦР). Мультиплексный формат ПЦР-РВ сокращает трудоемкость, стоимость и продолжительность анализа.
Все МАНК включают три этапа:
- подготовка образца, обычно заключающаяся в выделении и концентрировании нуклеиновых кислот (НК), а также в освобождении от присутствующих в образце ингибиторов;
- ферментативная амплификация НК;
- выявление продуктов амплификации.
Известны научные публикации, в которых описано применение ПЦР для выявления и идентификации различных вирусов в биологических образцах (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21256076" \o "Journal of clinical virology : the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. - 2011-50(4) - P.308-313, J http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15645373" \o "Archives of virology. - 2005 - 150(6) - P.1175-1185, J Clin Microbiol. - 2004. - №42. - Р.1564-1569), а также ряд патентов (RU 2306341 C1, RU 2271003 C2, US 2006/0110724 A1, US 2007/0172835 A1, WO 2007/058499 A1, WO 2008/042450 A2). В перечисленных публикациях и патентах описаны различные форматы ПЦР, которые применяются для диагностики ОКИ, в том числе мультиплексная ПЦР с детекцией в агарозном геле, и ПЦР-РВ. Наиболее близкими аналогамим являются ПЦР-тест-системы, представленные в публикации Liu J. с соавторами (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21256076" \o "Journal of clinical virology : the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. - 2011-50(4) - P.308-313) и патенте WO 2008/042450 A2. Признаками, отличающими настоящее изобретение от перечисленных аналогов являются:
- нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, приведенные в перечне последовательностей;
- принцип учета результатов ПЦР;
- возможность проведения дифференциальной диагностики энтеровирусов и полиовирусов;
- использование внутреннего положительного контроля, представленного РНК-содержащим вирусом, который добавляется непосредственно в клинический образец перед выделением нуклеиновых кислот и позволяет контролировать эффективность выделения НК и наличие ингибиторов.
Технической задачей изобретения является создание способа идентификации кишечных вирусов с помощью мультиплексного ПЦР-анализа с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени. Данный подход позволяет одновременно выявлять в биологических образцах нуклеиновые кислоты 11 групп кишечных вирусов, не прибегая к использованию дополнительных методов выявления ампликонов (электрофорез ДНК в агарозном геле, ДНК-микрочипы), тем самым сокращая риск контаминации продуктами амплификации и процент технологических ошибок. Мультиплексный формат ПЦР-РВ сокращает трудоемкость, стоимость и продолжительность анализа.
1. Указанная задача достигается за счет того, что способ дифференциальной диагностики кишечных вирусов, характеризующийся выявлением в клинических образцах нуклеиновых кислот основных возбудителей кишечных вирусных инфекций человека - энтеровирусов, полиовирусов, ротавирусов А и С, аденовирусов, норовирусов, саповирусов, вирусов гепатита А и Е, астровирусов, ортореовирусов в присутствии внутреннего положительного контроля, предусматривающий проведение мультиплексной реакции обратной транскрипции (ОТ) и ПЦР-амплификации с детекцией в режиме реального времени, причем в качестве клинических образцов используют по выбору: 10-20% фекальные экстракты, образцы культуральной жидкости, элюаты, полученные в результате концентрирования вирусов из образцов сточной, водопроводной, речной воды и воды из других источников, отличающийся тем, что для его осуществления используют олигонуклеотиды - SEQ ID NO 1-61, на основе которых готовят смеси праймеров и зондов для проведения ПЦР-РВ; затем с использованием подобранных праймеров и зондов формируют реакционные смеси для мультиплексной ОТ и ПЦР, в которых флуоресцентномеченные зонды распределяют по реакционным смесям таким образом, чтобы в одной смеси находились зонды, меченные разными красителями; затем проводят мультиплексную реакцию обратной транскрипции и мультиплексную ПЦР-РВ (каждый образец анализируется в пяти реакционных смесях); наличие в изучаемой пробе нуклеиновых кислот того или иного кишечного вируса определяют ростом сигнала флуоресценции определенного красителя в одной из реакционных смесей; причем при проведении анализа проводят ряд контролей для исключения ложноположительных и ложноотрицательных результатов, для чего формируют пулы положительных контрольных образцов (ПКО), которые, наряду с внутренним положительным контролем (ВПК), анализируются при анализе каждой серии образцов, а в состав пулов положительных контролей входят нуклеиновые кислоты кишечных вирусов (КВ) или фрагменты геномов КВ, включающие области связывания праймеров для ОТ и ПЦР, полученные в реакции транскрипции (РНК-транскрипты), разведенные и смешанные в определенной концентрации так, чтобы в мультиплексной ПЦР-РВ они определялись на 25-30 цикле; в том случае, когда при постановке ПЦР-РВ наблюдается задержка в значениях пороговых циклов ВПК - это указывает на возможное присутствие ингибиторов в пробе, которые снизили чувствительность анализа, или на ошибки при выделении РНК или постановке реакции; такой образец анализируют повторно. Кроме того, для исключения ложноположительных результатов наряду со всеми образцами анализируют отрицательный контрольный образец (ОКО), в который, наряду со всеми исследуемыми и контрольными образцами вносится ВПК. В качестве ОКО используют дистиллированную воду. Кроме того, на стадии ПЦР с детекцией в режиме реального времени используют следующие олигонуклеотиды (распределенные по четырем реакционным смесям): смесь №1: SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12; смесь №2: SEQ ID NO 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27; смесь №3: SEQ ID NO 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46; смесь №4: SEQ ID NO 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53; смесь №5: SEQ ID NO 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61. Кроме того, каждый вирусспецифический набор праймеров и зондов может быть использован для выявления в образцах нуклеиновых кислот соответствующих вирусов в моноспецифическом формате, в том числе для выявления аденовирусов - SEQ ID NO 1, 2, 3, 4; энтеровирусов - SEQ ID NO 5, 6, 7, 8; ротавирусов А - SEQ ID NO 13, 14, 15, 16, 17; норовирусов - SEQ ID NO 18, 19, 20, 21, 22, 23; астровирусов - SEQ ID NO 24, 25, 26, 27; саповирусов - SEQ ID NO 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35; ортореовирусов - SEQ ID NO 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43; ротавирусов С - SEQ ID NO 44, 45, 46; вируса гепатита Е - SEQ ID NO 47, 48, 49, 50; вируса гепатита А - SEQ ID NO 51, 52, 53, 54; полиовирусов - SEQ ID NO 55, 56, 57; 58, 59, 60, 61. Кроме того, анализ предусматривает выявление ВПК (SEQ ID NO 9, 10, 11, 12), представленного РНК-содержащим вирусом или РНК-транскриптом, с целью контроля эффективности и качества выделения нуклеиновых кислот, в том числе наличие в образце ингибиторов реакций обратной транскрипции и ПЦР. Кроме того, при анализе образцов в реакционных смесях №1 и №5, проводят дифференциальное выявление энтеровирусов и полиовирусов.
Способ позволяет дифференциально выявлять в биологических образцах нуклеиновые кислоты основных возбудителей ОКИ - энтеровирусов, полиовирусов, ротавирусов А и С, аденовирусов, норовирусов, саповирусов, вирусов гепатита А и Е, астровирусов, ортореовирусов. Наличие в изучаемой пробе нуклеиновых кислот того или иного кишечного вируса определяется ростом сигнала флуоресценции определенного красителя в одной из реакционных смесей.
Способ может быть реализован на основе следующего перечня последовательностей.
Поставленная задача была решена путем подбора 12 наборов вирусспецифических праймеров (специфичные 11 кишечным вирусам и ВПК) для этапов анализа ОТ и ПЦР-РВ, а также формированием оптимальных реакционных смесей для проведения анализа. Выбор праймеров для ПЦР-РВ ограничивался несколькими критериями, такими как специфичность по отношению к геномным последовательностям вирусов соответствующей группы, высокая эффективность ПЦР, температура плавления не ниже 60°C, соотношение G/C в пределах от 40 до 70%, размер ПЦР-продуктов до 250 п.н.
Также были подобраны последовательности 17 гибридизационных зондов (по 1 или 2 на каждую группу вирусов, см. табл.1), нацеленных на область между праймерами. 5'-концевой нуклеотид каждого зонда модифицирован одним из 4 флуоресцентных красителей (FAM, ROX, R6G, Cy5 или аналогичными), а 3'-конец - одним из гасителей флуоресценции (BHQ1, BHQ2, BHQ3 или аналогичными). «Разгорание» флуоресцентного сигнала при накоплении специфического ампликона в процессе ПЦР-РВ происходит по принципу выщепления 5'-концевой метки зонда. Праймеры и зонды были направлены к следующим участкам вирусных геномов: АДВ - ген гексона, ЭВ - 5' NTR, РВА - сегмент 10, ген белка NSP4, НВ - ген белка VP1, АВ - ORF2, СВ - ORF1, ОРВ - сегмент 3, ген белка L1, РВС - сегмент 8, ген белка VP7, ПВ - ген белка VP1, ВГЕ - ORF1, ВГА - ген белка 2С.
Последовательности праймеров и зондов для ПЦР-РВ, соответствующие им расчетные размеры продуктов амплификации, выявляемые с их помощью вирусы и гены-мишени представлены в перечне последовательностей и в табл.1.
Таблица 1
Характеристика олигонуклеотидов для мультиплексной ПЦР-РВ.
Название
Размер ПЦР-продукта, п.н.
Выявляемый вирус, ген-мишень
SEQ ID NO 1
160
Аденовирусы, ген гексона
SEQ ID NO 2
SEQ ID NO 3
SEQ ID NO 4
SEQ ID NO 5
163
Энтеровирусы, 5'NTR
SEQ ID NO 6
SEQ ID NO 7
SEQ ID NO 8
SEQ ID NO 9
242
ВПК
SEQ ID NO 10
SEQ ID NO 11
SEQ ID NO 12
SEQ ID NO 13
130
Ротавирус А, сегмент 10, ген белка NSP4
SEQ ID NO 14
SEQ ID NO 15
SEQ ID NO 16
SEQ ID NO 17
SEQ ID NO 18
90
Норовирусы, ген белка VP1
SEQ ID NO 19
SEQ ID NO 20
SEQ ID NO 21
SEQ ID NO 22
SEQ ID NO 23
SEQ ID NO 24
165
Астровирусы, ORF2
SEQ ID NO 25
SEQ ID NO 26
SEQ ID NO 27
SEQ ID NO 28
116
Саповирусы, ORF1
SEQ ID NO 29
SEQ ID NO 30
SEQ ID NO 31
SEQ ID NO 32
SEQ ID NO 33
SEQ ID NO 34
SEQ ID NO 35
SEQ ID NO 36
146
Ортореовирусы, сегмент 3, ген белка L1
SEQ ID NO 37
SEQ ID NO 38
SEQ ID NO 39
SEQ ID NO 40
SEQ ID NO 41
SEQ ID NO 42
SEQ ID NO 43
SEQ ID NO 44
Ротавирус С, сегмент 8, ген белка VP7
SEQ ID NO 45
SEQ ID NO 46
SEQ ID NO 47
169
Вирус гепатита Е, ORF1
SEQ ID NO 48
SEQ ID NO 49
SEQ ID NO 50
SEQ ID NO 51
137
Вирус гепатита А, ген белка 2С
SEQ ID NO 52
SEQ ID NO 53
SEQ ID NO 54
SEQ ID NO 55
211
Полиовирус, ген белка VP1
SEQ ID NO 56
SEQ ID NO 57
SEQ ID NO 58
SEQ ID NO 59
SEQ ID NO 60
SEQ ID NO 61
С использованием подобранных праймеров и зондов сформированы 5 реакционных смесей для мультиплексной ОТ и ПЦР, которые включают оптимальные комбинации праймеров и зондов: смесь №1 - для выявления АДВ, ЭВ, ВПК; смесь №2 - РВА, НВ, АВ; смесь №3 - СВ, ОРВ, РВС; смесь №4 - ВГЕ, ВГА; смесь №5 - ПВ (табл.2). Флуоресцентномеченные зонды распределены по реакционным смесям таким образом, чтобы в одной смеси находились зонды, меченные разными красителями.
Таблица 2
Распределение вирусспецифических праймеров и зондов по реакционным смесям в мультиплексной ПЦР-РВ.
Краситель
Реакционная смесь
№1
№2
№3
№4
№5
FAM
АДВ
РВА
СВ
-
-
ROX
ЭВ
НВ
-
-
ПВ
R6G
ВПК
АВ
ОРВ
ВГЕ
-
Cy5
-
-
РВС
ВГА
-
Так как все перечисленные вирусы (кроме, аденовирусов) являются РНК-содержащими, то для их выявления необходимо проведение реакции обратной транскрипции (ОТ). В качестве праймеров для проведения мультиплексной реакции обратной транскрипции используют олигонуклеотиды, комплементарные фрагменту вирусного генома. Праймеры для проведения ОТ характеризуются температурой плавления ниже 59°C, но выше 45°C и особенностями первичной структуры, которые снижают вероятность отжига праймеров для ОТ на неспецифической РНК-матрице, увеличивая тем самым эффективность амплификации в образцах с высоким содержанием неспецифических НК. Смесь праймеров для проведения мультиплексной реакции ОТ содержит следующие праймеры в концентрации 2 пкмоль/реакцию каждого: SEQ ID NO 5, 9, 13, 20, 21, 24, 28, 29, 36, 37, 44, 48, 49, 51, 57, 58, 59.
Применение разработанной тест-системы на основе метода мультиплексной ПЦР-РВ подразумевает, что для анализа одного образца на наличие 11 кишечных вирусов, его необходимо проанализировать в 5-и реакционных смесях (табл.2). Наличие в изучаемой пробе нуклеиновых кислот того или иного кишечного вируса определяется ростом сигнала флуоресценции определенного красителя в одной из реакционных смесей.
При проведении анализа предусмотрен ряд контролей для исключения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Для этого сформированы пулы положительных контрольных образцов (ПКО-1, ПКО-2, ПКО-3, ПКО-4, ПКО-5), которые, наряду с ВПК, анализируются при анализе каждой серии образцов и контролируют этапы ОТ и ПЦР-РВ. В состав пулов положительных контролей входят лабораторные штаммы кишечных вирусов и охарактеризованные клинические образцы или РНК-транскрипты фрагментов геномов вирусов, разведенные и смешанные в определенной концентрации так, чтобы в мультиплексной ПЦР-РВ они определялись на 25-30 цикле. ПКО-1 содержит нуклеиновые кислоты АДВ, ЭВ, ВПК; ПКО-2 - РВА, НВ, АВ; ПКО-3 - СВ, ОРВ, РВС; ПКО-4 - ВГЕ, ВГА; ПКО-5 - ПВ. Положительные контрольные образцы разводят для того, чтобы контролировать возможность выявления вирусов в образцах с низким содержанием вируса. В каждый исследуемый образец включают ВПК, который при отсутствии ингибиторов должен определяться до 30 цикла амплификации. В том случае, когда при постановке ПЦР-РВ наблюдается задержка в значениях пороговых циклов ВПК, либо он не выявляется - это указывает на возможное присутствие ингибиторов в пробе, которые снизили чувствительность анализа, или на ошибки при постановке реакции. Такие образцы необходимо анализировать повторно. Таким образом, постановка ряда положительных контролей позволяет исключить ложноотрицательные образцы. Для исключения ложноположительных результатов наряду со всеми образцами анализируют отрицательный контрольный образец (ОКО), в качестве которого используют дистиллированную воду.
Таким образом, сущность изобретения заключается в том, что разработан подход для одновременного выявления в клинических образцах нуклеиновых кислот основных возбудителей кишечных вирусных инфекций человека - энтеровирусов, полиовирусов, ротавирусов А и С, аденовирусов, норовирусов, саповирусов, вирусов гепатита А и Е, астровирусов, ортореовирусов в присутствии внутреннего положительного контроля. В качестве образцов для исследования могут быть использованы 10-20% фекальные экстракты, образцы культуральной жидкости, элюаты, полученные в результате концентрирования вирусов из образцов сточной, водопроводной, речной воды и воды из других источников.
Способ дифференциальной диагностики кишечных вирусных инфекций методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени включает следующие этапы:
1) подготовка смесей праймеров, зондов для проведения ОТ и ПЦР-РВ и контрольных образцов (ВПК, ПКО-1, ПКО-2, ПКО-3, ПКО-4, ПКО-5 и ОКО);
2) выделение нуклеиновых кислот кишечных вирусов из исследуемых и контрольных образцов;
3) проведение мультиплексной реакции обратной транскрипции и мультиплексной ПЦР-РВ (каждый образец анализируется в пяти пробирках);
4) учет и интерпретация результатов анализа.
Этап 3 (проведение мультиплексной реакции обратной транскрипции и мультиплексной ПЦР-РВ) проводится в одном из трех вариантов.
1-й вариант - «Двухэтапная ОТ и ПЦР-РВ», предусматривающая последовательное проведение реакций ОТ и ПЦР в отдельных пробирках. После завершения реакции ОТ, часть продуктов ОТ (кДНК) переносится в пробирки, стрипы или 96-луночные ПЦР-планшеты для проведения ПЦР-РВ, в которые затем добавляется необходимое количество реакционной смеси для ПЦР-РВ.
2-й вариант - «Двухэтапная ОТ и ПЦР-РВ в одной пробирке», предусматривающая последовательное проведение реакций ОТ и ПЦР в одной пробирке. Реакция ОТ проводится в пробирках, стрипах или 96-луночных ПЦР-планшетах, пригодных для проведения ПЦР-РВ, в небольшом объеме. После завершения реакции ОТ в пробирки с продуктами реакции ОТ (кДНК) вносится реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ.
3-й вариант - «Одноэтапная ОТ и ПЦР-РВ», предусматривающая проведение реакций ОТ и ПЦР в одной пробирке в реакционной смеси, изначально содержащей все необходимые компоненты для реакций ОТ и ПЦР-РВ. «Одноэтапная ОТ и ПЦР» представляет собой наиболее удобный и наименее трудоемкий вариант постановки ОТ и ПЦР.
Осуществление изобретения.
Пример 1. Выделение вирусных нуклеиновых кислот.
Суммарную нуклеиновую кислоту (НК) выделяют при помощи одного из коммерческих наборов: «QIAmp Viral RNA mini kit», (Qiagen, Германия), ZR Viral RNA Kit™ (Zymo Research, США), «РИБО-сорб» (ИнтерЛабСервис, Россия), либо других специализированных коммерческих наборов для одновременного выделения вирусной РНК и ДНК, руководствуясь инструкцией фирмы-производителя. В основе перечисленных коммерческих наборов лежат модификации метода выделения НК, предложенного Boom R. с соавторами [Boom R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids//J Clin Microbiol. - 1990. - №28. - P.495-503]. Перед выделением НК к каждому исследуемому образцу и ОКО добавляют 10 мкл ВПК.
Пример 2. Проведение ПЦР-анализа в формате «Двухэтапная ОТ и ПЦР-РВ».
На первом этапе анализа в мультиплексной реакции ОТ получают кДНК, которая на этапе ПЦР служит матрицей для амплификации. В состав реакционной смеси для мультиплексной ОТ входят праймеры, которые вносят в пробирки, стрипы или планшеты для ПЦР в количестве 3 пкмоль каждого праймера (в объеме 5 мкл) на реакционную смесь.
В пробирки с праймерами добавляют по 10 мкл РНК, выделенной из исследуемых образцов, ПКО-1, ПКО-2, ПКО-3, ПКО-4 и ОКО, прогревают в течение 1 минуты при 95°C, затем охлаждают до комнатной температуры в течение 2-3 минут. Пробирки с образцами центрифугируют с целью осаждения конденсата. Далее, доводят объем реакционной смеси до 30 мкл, заранее приготовленной смесью, содержащей Буфер для M-MLV-ревертазы, дНТФ 0,15 мМ каждого, 30 ед. ревертазы вируса лейкоза Молони, и в течение 10 минут при 45°C получают кДНК. Все реагенты для реакции ОТ производства компании Синтол (Россия) или аналогичные. Для инактивации фермента смесь прогревают при 95°C в течение 5 минут и после охлаждения центрифугируют с целью осаждения конденсата. Далее, с образцами кДНК проводят ПЦР-РВ.
Реакцию мультиплексной ПЦР-РВ проводят в пробирках, стрипах или планшетах для ПЦР в объеме 50 мкл. Каждый образец анализируется в 5-и пробирках (реакционная смесь №1, №2, №3, №4 и №5), каждая из которых содержит реакционную смесь для ПЦР («Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ с Taq ДНК-полимеразой и ингибирующими активность фермента антителами», кат. №М-428, «Синтол», Россия или аналогичную), соответствующий ПЦР-смеси набор праймеров (по 6 пмоль каждого праймера - табл.3) и набор зондов (по 5 пмоль каждого зонда - табл.3), 2,5 ед. Taq ДНК полимеразы с ингибирующими активность фермента антителами («СибЭнзим», кат. №E351, Россия или аналогичной) и 10 мкл кДНК. Реакцию проводят в одном из перечисленных ниже термоциклеров: ДТ-96 (ДНК-Технология, Россия), АНК-32 (НИИ аналитического приборостроения РАН, Россия), Rotor-Gene™ 6000 (Corbett Research, Австралия), ICycler IQ5, Bio-Rad (США) или аналогичном. Программа ПЦР: 95°C - 90 сек - 1 цикл; 95˚C - 20 сек, 59°C - 35 cек - 45 циклов. Определение значений пороговых циклов осуществляют согласно руководству к прибору.
Таблица 3
Олигонуклеотиды, используемые в составе реакционных смесей в мультиплексной ПЦР-РВ
Название праймеров и зондов
Реакционная смесь
№1
№2
№3
№4
№5
SEQ ID NO 1
SEQ ID NO 13
SEQ ID NO 28
SEQ ID NO 47
SEQ ID NO 55
SEQ ID NO 2
SEQ ID NO 14
SEQ ID NO 29
SEQ ID NO 48
SEQ ID NO 56
SEQ ID NO 3
SEQ ID NO 15
SEQ ID NO 30
SEQ ID NO 49
SEQ ID NO 57
SEQ ID NO 5
SEQ ID NO 17
SEQ ID NO 31
SEQ ID NO 50
SEQ ID NO 58
SEQ ID NO 6
SEQ ID NO 18
SEQ ID NO 32
SEQ ID NO 51
SEQ ID NO 59
SEQ ID NO 7
SEQ ID NO 19
SEQ ID NO 34
SEQ ID NO 52
SEQ ID NO 60
SEQ ID NO 9
SEQ ID NO 21
SEQ ID NO 35
SEQ ID NO 53
SEQ ID NO 10
SEQ ID NO 22
SEQ ID NO 36
SEQ ID NO 54
SEQ ID NO 11
SEQ ID NO 23
SEQ ID NO 37
SEQ ID NO 12
SEQ ID NO 24
SEQ ID NO 38
SEQ ID NO 25
SEQ ID NO 39
SEQ ID NO 26
SEQ ID NO 40
SEQ ID NO 27
SEQ ID NO 41
SEQ ID NO 33
SEQ ID NO 42
SEQ ID NO 43
SEQ ID NO 44
SEQ ID NO 45
SEQ ID NO 46
При планировании анализа следует учитывать, что каждый исследуемый образец анализируется в пяти реакционных смесях на наличие НК 11 кишечных вирусов. Качество каждой реакционной смеси контролируют соответствующим ПКО и ОКО. Например, для того чтобы проанализировать 10 клинических образцов, на стадии ОТ и ПЦР нужно использовать по 60 пробирок - по 12 на каждую реакционную смесь (10 исследуемых образцов, соответствующий ПКО и ОКО, табл.4).
Таблица 4
Схема анализа 10 клинических образцов
Образцы после выделения НК
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
ПКО-1
ПКО-2
ПКО-3
ПКО-4
ПКО-5
ОКО
Реак. смесь №1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Реак. смесь №2
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
Реак. смесь №3
25
26
27
27
29
30
31
32
33
34
35
36
Реак. смесь №4
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
Реак. смесь №5
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Пример 3. Проведение ПЦР-анализа в формате «Двухэтапная ОТ и ПЦР-РВ в одной пробирке».
Существенное отличие ПЦР-анализа в формате «Двухэтапная ОТ и ПЦР-РВ в одной пробирке» от ПЦР-анализа в формате «Двухэтапная ОТ и ПЦР-РВ» заключается в отсутствии необходимости переноса кДНК из пробирок с продуктами ОТ, в отдельные пробирки для проведения ПЦР-РВ. Реакции ОТ и ПЦР-РВ проводят в одной пробирке (в пробирках, стрипах, планшетах, удовлетворяющих требованиям оборудования для проведения ПЦР-РВ). ПЦР-анализ в формате «Двухэтапная ОТ и ПЦР-РВ в одной пробирке» проводят следующим образом. При постановке реакции ОТ смеси праймеров вносят в пробирки, стрипы или планшеты для ПЦР в количестве 2 пкмоль каждого праймера (в объеме 5 мкл) на реакционную смесь. В пробирки с праймерами добавляют по 10 мкл РНК, выделенной из исследуемых образцов, ПКО-1, ПКО-2, ПКО-3, ПКО-4, ПКО-5 и ОКО и прогревают в течение 1 минуты при 95°C, затем охлаждают до комнатной температуры в течение 2-3 минут. Пробирки с образцами центрифугируют с целью осаждения конденсата. Далее доводят объем реакционной смеси до 25 мкл, заранее приготовленной смесью для ОТ, содержащий реакционную смесь для проведения ПЦР-РВ (кат. №М-428, Синтол, Россия, или аналогичную), 30 ед. ревертазы вируса лейкоза Молони, и в течение 10 минут при 45°C получают кДНК. Для инактивации фермента смесь прогревают при 95°C в течение 5 минут.
После стадии ОТ образцы центрифугируют с целью осаждения конденсата. К образцам кДНК добавляют реакционную смесь для ПЦР-РВ (кат. №М-428, Синтол, Россия, или аналогичную), соответствующий ПЦР-смеси набор праймеров (по 6 пмоль каждого праймера - табл.3) и набор зондов (по 5 пмоль каждого зонда - табл.3), 2,5 ед. Taq ДНК полимеразы с ингибирующими активность фермента антителами («СибЭнзим», кат. №E351, Россия или аналогичной), доводя общий объем смеси до 50 мкл, и проводят реакцию ПЦР-РВ. Реакцию проводят в одном из перечисленных ниже термоциклеров: ДТ-96 (ДНК-Технология, Россия), АНК-32 (НИИ аналитического приборостроения РАН, Россия), Rotor-Gene™ 6000 (Corbett Research, Австралия), ICycler IQ5, Bio-Rad (США) или аналогичном. При планировании анализа следует учитывать, что каждый исследуемый образец анализируется в пяти реакционных смесях в присутствии контрольных образцов. Например, для того чтобы проанализировать 10 клинических образцов, на стадии ОТ и ПЦР нужно использовать 60 пробирок - по 12 на каждую реакционную смесь (10 исследуемых образцов, соответствующий ПКО и ОКО, табл.4).
Пример 4. Проведение ПЦР-анализа в формате «Одноэтапная ОТ и ПЦР-РВ».
При постановке ПЦР-анализа в формате «Одноэтапная ОТ и ПЦР-РВ» используются те же исходные реагенты, что и в примере 3. Существенным отличием ПЦР-анализа в формате «Одноэтапная ОТ и ПЦР-РВ» от ПЦР-анализа в форматах «Двухэтапная ОТ и ПЦР-РВ» и «Двухэтапная ОТ и ПЦР-РВ в одной пробирке» заключается в отсутствии необходимости открывания пробирок с продуктами ОТ с целью внесения реакционной смеси для ПЦР-РВ, так как в реакционной смеси изначально присутствуют все необходимые компоненты для реакций ОТ и ПЦР-РВ.
Смеси праймеров вносят в пробирки, стрипы или планшеты, удовлетворяющие требованиям оборудования для проведения ПЦР-РВ, в количестве 2 пкмоль каждого праймера на реакционную смесь (в объеме 5 мкл). В пробирки с праймерами добавляют в соответствии со схемой эксперимента (табл.4) по 10 мкл исследуемой РНК, ПКО-1, ПКО-2, ПКО-3, ПКО-4, ПКО-5 и ОКО, и прогревают в течение 1 минуты при 95ºС, затем охлаждают до комнатной температуры в течение 2-3 минут. Пробирки с образцами центрифугируют с целью осаждения конденсата. Далее доводят объем реакционной смеси до 50 мкл, заранее приготовленной смесью, содержащей реакционную смесь для ПЦР (кат. №М-428, Синтол, Россия, или аналогичную), соответствующий ПЦР-смеси набор праймеров (по 6 пмоль каждого праймера - табл.3) и набор зондов (по 5 пмоль каждого зонда - табл.3), 30 ед. ревертазы вируса лейкоза Молони, 2,5 ед. Taq ДНК полимеразы с ингибирующими активность фермента антителами. Реакцию проводят в одном из перечисленных ниже термоциклеров: ДТ-96 (ДНК-Технология, Россия), АНК-32 (НИИ аналитического приборостроения РАН, Россия), Rotor-Gene™ 6000 (Corbett Research, Австралия), ICycler IQ5, Bio-Rad (США) или аналогичном. Программа для проведения одноэтапной ОТ и ПЦР-РВ: 45°C - 5 мин, 95°С - 120 сек - 1 цикл; 95°С - 20 сек, 59°С - 35 cек- 45 циклов. Определение значений пороговых циклов осуществляют согласно руководству к прибору. При планировании анализа следует учитывать, что каждый исследуемый образец анализируется в четырех реакционных смесях в присутствии контрольных образцов. Например, для того чтобы проанализировать 10 клинических образцов, на стадии ОТ и ПЦР нужно использовать 60 пробирок - по 12 на каждую реакционную смесь (10 исследуемых образцов, соответствующий ПКО и ОКО, табл.4).
Пример 5. Учет и интерпретация результатов анализа.
Учет результатов анализа, расчет пороговых циклов производят с помощью программного обеспечения к тому прибору для ПЦР-РВ, на котором проводился анализ, руководствуясь инструкцией производителя. Положительным считается образец, при анализе которого наблюдается рост флуоресцентного сигнала на одном из цветовых каналов амплификатора. Для интерпретации результатов анализа следует пользоваться таблицей 2. Например, при анализе образца в смеси №2 рост сигнала на канале FAM свидетельствует о присутствии в образце НК ротавируса А, на канале R6G - норовируса, ROX - астровируса. При анализе клинических образцов положительными считаются образцы, которые определяются до 33 цикла амплификации. Если образец выявляется на более позднем цикле, но при этом значения пороговых циклов ПКО и ВПК - в пределах нормы, а отрицательный контроль не определяется - он считается спорным и анализируется повторно. Если при повторной постановке результат сохраняется - образец считается положительным. Следует обращать внимание на значения пороговых циклов для ПКО и ВПК. В состав ПКО входят НК лабораторных штаммов и охарактеризованных образцов кишечных вирусов или РНК-транскрипты фрагментов геномов кишечных вирусов, разведенные и смешанные в определенной концентрации так, чтобы в мультиплексной ПЦР-РВ они определялись на 25-30 цикле. Также в каждое исследование включают ВПК, который при отсутствии ингибиторов должен определяться на 27-30 циклах амплификации. Если при постановке ПЦР-РВ наблюдается задержка в значениях пороговых циклов ВПК, например, вместо 27-30 цикла он определяется на 35-37, либо не определяется совсем - это указывает на возможное присутствие ингибиторов в пробе, которые снизили чувствительность анализа, на ошибки при постановке реакции или при выделении НК. Такой образец должен быть проанализирован повторно со стадии выделения НК. Таким образом, постановка контролей с ПКО и ВПК позволяет исключить ложноотрицательные результаты исследования. Для исключения ложноположительных результатов наряду со всеми образцами анализируют отрицательный контрольный образец (ОКО), в качестве которого можно использовать дистиллированную воду.
Пример 6. Дифференциальное выявление энтеровирусов и полиовирусов.
Энтеровирусы и полиовирусы по современной классификации относятся к одному роду (Enterovirus) семейства Picornaviridae и, следовательно, являются филогенетически-родственными вирусами. Праймеры и зонды для выявления энтеровирусов в реакции ОТ и ПЦР-РВ направлены к высококонсервативному для всего семейства 5'-нетранслируемому участку генома, таким образом олигонуклеотиды для выявления энтеровирусов выявляют и полиовирусы, что затрудняет интерпретацию результатов анализа. Для дифференциальной диагностики полиовирусов и энтеровирусов необходимо пользоваться следующими правилами.
1. Если отмечается одновременное нарастание сигнала флуоресценции на канале R6G в реакционной смеси №1 и смеси №5, либо только на канале R6G в смеси №5, то такой образец считать положительным по полиовирусу.
2. Если рост флуоресцентного сигнала наблюдается только в смеси №1 на канале R6G, то такой образец считать положительным по энтеровирусу.