Клиническое значение нитрозативного и оксидативного стресса при острых респираторных заболеваниях, осложненных развитием инфекционно-токсического шока

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ НИТРОЗАТИВНОГО И ОКСИДА-ТИВНОГО СТРЕССА ПРИ ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ, ОСЛОЖНЕННЫХ РАЗВИТИЕМ ИНФЕКЦИОННОТОКСИЧЕСКОГО ШОКА

ПИСКУН Д.В.. СЕМЕНОВ В.М.. СОЛОДКОВ А.П.

УО <<Витебский государственный медицинский ордена Дружбы народов

медицинский университет»

Резюме. Открытие оксида азота позволило пересмотреть патофизиологию многих процессов и заболеваний и побудило к поиску новых подходов к их фармакологической коррекции. Одной из проблем в этой связи являются вопросы патогенеза и терапии инфекционно-токсического шока (ИТШ).

Анализ причин госпитализации показал. что наибольшую группу пациентов. нуждающихся в госпитализации в отделение реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) составили больные острыми кишечными инфекциями и инфекциями дыхательных путей. Следует отметить. что у лиц наиболее активного работоспособного возраста (18-60 лет) инфекции дыхательных путей явились определяющими в структуре инфекций. послуживших поводом для госпитализации в данное отделение. При оценке показателей нитрозативного и оксида-тивного стресса у пациентов острыми респираторными заболеваниями/пневмониями. осложненными развитием ИТШ оказалось. что у них имеет место развитие как оксидативного. так и нитрозативного стресса.

Причем. показатели оксидативного стресса у пациентов с ИТШ имеют тенденцию к нарастанию вплоть до 6-х суток от момента возникновения шока. Назначение антиоксидантов курсом не менее 6 суток. будет способствовать как ингибированию процессов пероксидации. так и нормализации сосудистого тонуса путем непосредственного взаимодействия с оксидом азота.

Ключевые слова: нитрозативный стресс. оксидативный стресс. инфекционно-токсический шок. острые респираторные заболевания. оксид азота. антиоксиданты.

Abstract. Discovery of the nitric oxide let revise pathophysiology of many processes and diseases and prompt to the search of new approaches to their pharmacological correction. One of the problems in this respect is the questions of pathogenesis and therapy of septic shock.

The analysis of hospitalization causes showed that the largest group of patients who needed hospitalization to the resuscitation and intensive therapy department were people with acute intestinal infections and respiratory tract infections. We must note that respiratory tract infections were the most common in the structure of infections. causing the hospitalization to this department. among people of the most active efficient age (18-60). During the assessment of the indexes of nitrosative and oxidative stresses by the patients with acute respiratory diseases/pneumonias. complicated by the development of septic shock. it was found out that such patients have both oxidative and nitrosative stresses.

Moreover. indexes of oxidative stress by patients with septic shock tend to increasing up to 6 days from the moment when shock appeared. Administration of oxidative stress for not less than 6 days will assist both the inhibition of the perox-idatic processes and standartization of vascular tension by means of direct interaction with nitric oxide.

Адрес для корреспонденции: Республика

Беларусь. 210602. г.Витебск. пр-т Фрунзе. 27. Витебский медицинский университет. кафедра инфекционных болезней. - Пискун Д.В.

Успехи, достигнутые медициной в ХХ веке в области инфекционной патологии, способствовали развитию и совершенствованию методов профилактики и лечения заболеваний. Вместе с тем, острые респираторные заболевания и в третьем тысячелетии продолжают оставаться серьезной проблемой здравоохранения для большинства стран мира. При обычных ежегодных сезонных эпидемических вспышках острых респираторных заболеваний, в том числе гриппа, заболевает 10% населения. Это связано с тем, что для данной группы инфекций характерна исключительная легкость механизма передачи возбудителей и высокая интенсивность эпидемического процесса [8]. При неблагоприятном пре-морбидном фоне пациента, а также без адекватной терапии нередко встречается тяжелое течение болезни, часто требующее неотложных мер интенсивной терапии (ИТ).

Интенсивная терапия включает в себя целый комплекс мероприятий, применяемых при критических состояниях или угрозе их развития. Основной целью интенсивной терапии служит восстановление и/или поддержание жизненно важных органов и систем [4, 10]. Основными организационными принципами интенсивной терапии являются:

1) ее неотложность;

2) предупредительный характер (превентивность);

3) интернозологический подход к выбору патогенетических лечебных средств и методов;

4) правильное выделение ведущего синдрома.

Однако без глубокого понимания патофизиологии процессов не возможно полноценное выполнение ни одного из приведенных организационных принципов.

Конец прошлого века ознаменовался настоящим прорывом в медицине в связи с открытием молекулы оксида азота (N0), участвующей в регуляции целого ряда патологических и физиологических процессов в организме. Данное открытие позволило пересмотреть патофизиологию многих процессов и заболеваний и побудило к поиску новых подходов к их фармакологической коррекции.

Одной из проблем в этой связи являются вопросы патогенеза и терапии инфекционно-токсического шока (ИТШ). При разрушении бактериальных клеток выделяется эндотоксин, который связывется со специфическим белком плазмы, называемым липополисахарид (ЛПС)-связывающим протеином. Он образуется гепатоцитами и облегчает взаимодействие ЛПС с СБ-14, которые в большом количестве располагаются на макрофагах. Взаимодействие липополи-сахаридов с СБ-14 приводит к быстрому внутриклеточному тирозиновому фосфорилированию под воздействием фосфотирозинкиназы, в результате чего активируется каскад протеинкиназ, что приводит в конечном итоге к синтезу ФНОа, который является одним из основных медиаторов при ИТШ. В свою очередь ФНОа, цитокины, эндотоксины активируют индуцибельную N08-11 типа (iN0S-II типа), в результате чего активизируется синтез молекул оксида азота (N0) [14, 21]. Синтез оксида азота представляет собой процесс пятиэлектронного окисления азота терминальной гуанидиновой группы Ь-аргинина, который контролируется ферментом N0-синтетазой [5, 2, 16]. Молекулы N0 диффундируют в клетки гладких миоцитов сосудов и связываются со специфическими рецепторными сайтами гема, который является составной частью молекулярной структуры растворимой цитоплазматической гуанилатциклазы (цГМФ) [1, 7]. При этом происходит активация растворимой гуанилатциклазы и увеличение концентрации циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), который снижает уровень внутриклеточного кальция, что сопровождается расслаблением гладкомышечных клеток и вазодилятацией [13]. В физиологических условиях оксид азота взаимодействует с молекулярным кислородом с образованием двуокиси азота, в водных растворах разлагается на нитрит и нитрат (показатели нитрозативного стресса), которые могут депонироваться в составе различных химических соединений в стенке сосудов [19]. Параллельно с развитием нитрозативного стресса в организме человека идентифицируются процессы перекисного окисления липидов и возникает оксидативный стресс.

Казалось бы, что применив нейтрализующие антитела или растворимые рецепторы к ФНОа, как основному иммунному медиатору шока, предотвратит-ся дальнейший каскад реакций и мы справимся с этим патофизиологическим процессам. Однако клинические исследования по использованию данных веществ дали лишь отрицательный результат - увеличение смертности. По-видимому, это связано с тем, что ИТШ развивается у иммуноскомпрометиро-ванных лиц, а синтез ФНОа абсолютно необходим для того, чтобы преодолеть кандидоз и ряд бактериальных инфекций [9].

Поэтому для терапии данных пациентов должны использоваться препараты направленные на другие звенья патогенеза ИТШ.

Целью работы явилось изучение показателей нитрозативного и оксида-тивного стресса при острых респираторных заболеваниях/пневмониях, осложненных развитием инфекционно-токсического шока для оптимизации лечения данной группы пациентов.

Методы

Для оценки значимости острых респираторных заболеваний/пневмоний как инфекций, требующих проведения интенсивной терапии произведен анализ

1015 случаев госпитализации в данное отделение Витебской областной инфекционной клинической больницы.

Нами обследовано 30 пациентов с острыми респираторными заболеваниями/пневмониями. осложнившимися развитием инфекционно-токсического шока. находившихся на лечении в Витебской областной инфекционной клинической больницы. Группу сравнения составили 30 практически здоровых лиц. являющихся донорами Витебской областной станции переливания крови.

В работе определялись показатели нитрозативного (нитриты/нитраты) и оксидативного (малоновый диальдегид. диеновые конъюгаты) стресса в крови больных. взятой на 1. 3. 5-6 сутки от момента поступления в инфекционный стационар.

Определение уровня (нитритов/нитратов) проводили фотометрическим методом. С целью депротеинизации к 1 мл плазмы добавляли 1мл 6% раствора цинка сульфата. Оставляли на 1 час при температуре ниже 15°С. Центрифугировали при 6000 об/мин (3000 g). После депротеинизации к 1 мл супернатанта добавляли эквивалентное количество гидроксида натрия. Затем опять проводили центрифугирование и 1 мл надосадочной жидкости переносили в соответствующую по нумерации пластиковую пробирку с предварительно добавленными туда 0.11 г цинковой пыли. 0.5 мл аммиачного буфера. 20 мкл аммиачного комплекса сульфата меди. После чего пробирки встряхивали в течение 30 минут. Цинковую пыль осаждали центрифугированием при 3000 (1500 g) об/мин - 10 минут. Из каждой пластиковой пробирки переносили по 1 мл супернатанта в соответствующую по нумерации стеклянную пробирку. В каждую пробирку добавляли по 1 мл сульфаниловой кислоты и оставляли в холодильнике на 10 минут до завершения реакции диазотирования. Затем в каждую пробирку вносили по 1 мл раствора ацетата натрия и 1 мл раствора 1-нафтиламина солянокислого. Измеряли оптическую плотность спустя 30 минут при длине волны 520 нм. Концентрацию нитритов/нитратов рассчитывали по уравнению калибровочного графика с учетом разведения при депротеинизации.

Определение накопления малонового диальдегида проводили по следующей методике. К 0.15 мл плазмы приливали 1.5 мл 1% ортофосфорной кислоты. 0.5 мл 0.6% тиобарбитуровой кислоты. 0.05 мл FeSO4-7H2O. Затем полученный раствор помещали в кипящую водяную баню на 1 час. Охлаждали под струей проточной воды. Приливали 2 мл бутанола и перемешивали на стряхивателе. Проводили центрифугирование 10 минут при 3000 оборотах в минуту. Отбирали супернатант. Измеряли оптическую плотность при длине волны 535 нм против бутанола. Расчет проводили по формуле: МДА мкМ/л=Е опт. 85.47.

Определение накопления диеновых конъюгатов проводили по следующей методике. К 0.1 мл плазмы приливали 3 мл гептан-изопропиловой смеси. Стряхивали на стряхивателе 15 минут. Добавляли к раствору 0.5 мл соляной кислоты (pH=2). Перемешивали на стряхивателе 10 минут. Ждали расслоения фаз. Отбирали верхнюю (гептановую) фазу и переносили ее в пробирки. Измеряли оптическую плотность полученных экстрактов при длине волны 232 нм. В кон-

троле вместо плазмы добавляли 0,1 мл дистиллированной воды. Обработку контроля проводили параллельно опытным пробам.

Для расчета использовали следующую формулу:

Сх= Сп-Бх/Бп (мкМ/мг липида), где Сп - содержание гидроперекисей липидов в норме (у здоровых людей - 4,8 мкМ/мг липида), Бп - оптическая плотность контрольного раствора при длине волны 232 нм, Бх-оптическая плотность опытных проб при длине волны 232 нм.

Статистическую обработку данных проводили, рассчитывая среднюю арифметическую (М), стандартную ошибку средней арифметической (±т). При сравнении средних величин совокупностей применяли критерий Стьюдента, позволяющий установить достоверность различий (р). Коэффициент корреляции рассчитывали по Спирмену.

Результаты и обсуждение

Анализ причин госпитализации показал, что наибольшую группу пациентов, нуждающихся в госпитализации в ОРИТ составили больные острыми кишечными инфекциями (42,66±2,24%) и инфекциями дыхательных путей (32,12±1,46%) [6].

Удельный вес других групп инфекционных заболеваний был значительно ниже (нейроинфекций - 13,5±2,92%, вирусных гепатитов и циррозов печени -2,95±3,09%).

Следует отметить, что у лиц наиболее активного работоспособного возраста (18-60 лет) инфекции дыхательных путей явились определяющими в структуре инфекций, послуживших поводом для госпитализации в ОРИТ и их удельный вес составил 72,78±2,48%. Данное обстоятельство указывает на особую социальную значимость данной группы инфекций.

При оценке кинетики уровня нитритов/нитратов, отражающих нитроза-тивный стресс в организме, оказалось, что в первые сутки от момента поступления их концентрация в сыворотке составила 38,62 мкмоль/л, что оказалось намного выше, чем в контрольной группе доноров - 21,8 мкмоль/л, на третьи и 5-6 сутки - 43,29 и 39,47 мкмоль/л соответственно (р<0,05). Уровень показателя нитроксидемии в первые сутки оказался ниже, чем в 3 и 5-6 сутки, в связи с массивной инфузионной терапией.

Между изменением показателя периферической гемодинамики (уровнем АД) и уровнем конечных стабильных метаболитов оксида азота была выявлена сильная обратная корреляция (г=-0,9), что свидетельствует о важной роли активации синтеза N0 в патогенезе инфекционно-токсического шока при острых респираторных заболеваниях/пневмониях. Следовательно, у данной группы пациентов имеет место развитие выраженного нитрозативного стресса.

При оценке уровня малонового диальдегида, как одного из конечных продуктов перекисного окисления липидов, оказалось, что в первые сутки заболевания его уровень составил 79,48 нМ/г белка, а на третьи и шестые - 73,68 и 80,4 нМ/г белка соответственно (р<0,05). Показатель малонового диальдегида в контрольной группе доноров составил 59,51 нМ/г белка.

Уровни промежуточных продуктов пероксидации - диеновых конъюгатов также были значительно повышены. Так, в первые сутки их концентрация составила 71,98 нМ/г липида, а к шестым суткам достигла 185,67 нМ/г липида (р<0,05). В то время как в контрольной группе этот показатель составил всего 69,18 нМ/г липида.

Следовательно, у пациентов с острыми респираторными заболеваниями/пневмониями отмечается тенденция к нарастанию показателей оксидатив-ного стресса вплоть до шестых суток наблюдения. Ивестно, что оксидативный стресс характеризуется снижением уровня АТФ, повышением содержания гипоксантина, превращением ксантиндегидрогеназы в образующую прооксиданты ксантиноксидазу. В условиях гипоксии при восстановлении кровотока происходит приток молекулярного кислорода и кальция, что ускоряет взрыв ки-слородпроизводных свободных радикалов, возникающих в результате действия ксантиноксидазы и других оксидантных ферментов, в том числе и iN0S-II. Ок-сидантная среда генерирует перекиси липидов, которые увеличивают проницаемость для кальция и активируют фосфолипазу А2 [3, 12, 15]. В свою очередь, эти события запускают дальнейшую экспрессию индуцибельной N08-^ адгезивных молекул и выделение фактора, активирующего тромбоциты, лейкотрие-ны, тромбоксан А2 и другие индукторы воспаления. Нейтрофилы, курсирующие в этой неблагоприятной среде, также активируются, прилипают к реперфузиро-ванной ткани, генерируют супероксидные анион-радикалы и N0, образуют пе-роксинитрит, сопряженно индуцируя некроз тканей и усиливая тканевую гипоксию [1, 11, 18, 17, 20].

Выводы

1. Острые респираторные заболевания/пневмонии являются определяющими в структуре инфекционной заболеваемости у лиц наиболее активного работоспособного возраста, госпитализированных в ОРИТ, что указывает на особую социальную значимость лечения данных пациентов.

2. У пациентов с острыми респираторными заболеваниями/пневмониями, осложненными развитием инфекционно-токсического шока наблюдается развитие нитрозативного и оксидативного стресса, о чем свидетельствует увеличение уровня нитритов/нитратов, малонового диальдегида, диеновых конъюгатов в крови.

3. У данной группы пациентов выявлена сильная обратная корреляция между изменением показателя периферической гемодинамики (уровнем АД) и уровнем конечных стабильных метаболитов оксида азота, что свидетельствует о важной роли активации синтеза N0 при данном патофизиологическом процессе. В связи с этим пациентам с острыми респтраторными заболеваниями/пневмониями, осложненными развитием ИТШ целесообразно назначение ингибиторов iN0-синтетазы, таких как витамин В12, трентал.

4. Показатели оксидативного стресса у пациентов с ИТШ имеют тенденцию к нарастанию вплоть до 6-х суток от момента возникновения шока. Назначение антиоксидантов курсом не менее 6 суток, будет способствовать как инги-

бированию процессов пероксидации. так и нормализации сосудистого тонуса путем непосредственного взаимодействия с оксидом азота.

Литература

1. Голиков. П.П. Оксид азота в клинике неотложных заболеваний / П.П. Голиков. - М: ИД Медпрактика. 2004. - 180 с.

2. Функциональное состояние системы синтеза NO при различных патологических процессах / Солодков А.П. [и др.] // Дисфункция эндотелия: экспериментальные и клинические исследования: труды III международной научно-практической конференции. - Витебск: ВГМУ. 2004. - С. 241-247.

3. Значение химических свойств оксида азота для лечения онкологических заболеваний / Д.А Винк [и др.] // Биохимия. - 1998. - Вып. 7. - С. 948957.

4. Интенсивная терапия / В. Д. Малышев [и др.]. - М.: Медицина. 2002. - 584 с.

5. Манухина. Е.Б. Роль оксида азота в развитии и предупреждении дисфункции эндотелия / Е.Б. Манухина. И.Ю. Малышев // Вестник Витебского государственного медицинского университета. - 2003. - Т. №2. №2. - С. 5 - 18.

6. Материалы Российской научно-практической конференции. посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. - СПб. ВМедА. 2006. - С. 248.

7. Северина. И.С. Оксид азота. Роль растворимой гуанилатциклазы в механизмах его физиологических эффектов / И.С. Северина // Вопросы мед. химии. - 2002. - Вып. 1. - С. 4-30.

8. Селькова. Е.П. Профилактика и лечение острых респираторных вирусных инфекций: пособие для врачей / Е.П. Селькова; ГУ Научно -исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского. - Москва. 2004. - С. 4.

9. Сепсис. Клинико-патофизиологические аспекты интенсивной терапии / В.В. Мороз [и др.]. - Петрозаводск. 2004. - С. 31-34.

10. Baron. J.F. Yearbook of Intensive Care and Emergency Medicine / J.F. Baron. J.L. Vincent. - Berlin: Springer. 2000. - P. 443-466.

11. Cooke. J.P. Derangements of the nitric oxide syntase pathway. L-arginine. and cardiovascular diseases / J.P. Cooke. V.J. Dzau // Circulation. - 1997. -Vol. 96. - P. 379- 382.

12. Effect of increased cardiac output on hepatic and intestinal microcircu-latory blood flow. oxygenation. and metabolism in hyperdynamic murine septic shock / Gerd Albuszies [et al.] // Crit. Care Med. - 2005 - Vol. 33. N 10. - P. 23322338.

13. Furchgott. R. F. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine / R. F. Furchgott. G.V. Zawadski // Nature. - 1980. - Vol. 288. - P. 373- 376.

14. High circulating levels of interleukin-6 in patients with septic shock: Evolution during sepsis. prognostic value. and interplay with other cytokines / T. Ca-landra [et al.] // Am. J. Med. 1991. - V. 91. - P. 23-29.

15. Kellum. J.A. Fluid resuscitation and hyperchloremic acidosis in experimental sepsis: improved short-term survival and acid-base balance with Hextend compared with saline / J.A. Kellum // Crit. Care Med. - 2002. - V.30. - P. 300-305.

16. Kilbourn. R. Nitric oxide and shock / R. Kilbourn. D. Traberg. C. Szabo // Dis. Mon. - 1997 - Vol. 43. №5. - P. 277-348.

17. Multiorgan failure is an adaptive. endocrine-mediated. metabolic response to overwhelming systemic inflammation / M. Singer [et al.] // Lancet. - 2004. -V. 364. - P. 545- 548.

18. Persistent microcirculatory alterations are associated with organ failure and death in patients with septic shock / Y. Sakr [et al.] // Crit. Care. Med. - 2004. -32. - P. 1825-1831.

19. S-Nitrosylation of proteins with nitric oxide. Synthesis and characterization of biologically active compounds / J.S. Stamler [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1992. - Vol. 89. - P. 444-448.

20. Tsuchiya. T. Modulatory effect of L-NAME. a specific nitric oxide synthase (NOS) inhibitor. on stress-induced changes in plasma adrenocorticotropic hormone (ACTH) and corticosterone levels in rats: physiological significance of stress-induced NOS activation in hypothalamic-pituitary-adrenal axis // T. Tsuchiya. J. Ki-shimoto // Brain. Res. - 1997. - Vol. 776. - P. 68-74.

21. Tumor necrosis factor alpha and interleukin 1 beta are responsible for in vitro myocardial cell depression induced by human septic shock serum // A. Kumar [et al.] // J. Exp. Med. - 1996. - 183. - P. 949-958.