The Role of Sugar-related Regulation in the light-dependent alterations of Arabidopsis glutamate dehydrogenase genes expression

Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 10 No. 4 2014, pp. 67-76 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2014 by Garnik, Belkov, Tarasenko and Konstantinov

ORIGINAL ARTICLE

The Role of Sugar-related Regulation in the Light-dependent Alterations of Arabidopsis Glutamate Dehydrogenase Genes Expression

E.Yu. Garnik, V.I. Belkov, V.I. Tarasenko, Yu.M. Konstantinov

Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, PO 317, Irkutsk, 664033, Russia

*E-Mail: elsa74@yandex.ru

Received November 6, 2014

Expression of gdh1 and gdh2 genes of Arabidopsis thaliana increases in the dark and decreases in the light. The reason of such alteration seems to be a glucose rising in photosynthetic cell in the light, but this hypothesis needs to be confirmed. In this work we investigate the role of glucose and hexokinase 1 in the light-dependent regulation of the gdh1 and gdh2 expression. A comparison of expression profiles of apl3, gdh1, gdh2 genes in presenсe of exogenous sucrose in the dark and in the light has demonstrated that sugar-related repression of gdh1 and gdh2 genes is insufficient to provide the high decrease of their transcripts in the light. Using Arabidopsis mutant gin2-1 with a defect in hxk1 gene we demonstrated that such a decrease is not depended on the regulatory function of hexokinase 1. We presume that light- dependent alterations of gdh1 and gdh2 expression are mediated by some chloroplast-to-nucleus regulatory signals.

Key words: Arabidopsis thaliana, Arabidopsis mutants, glutamate dehydrogenase, hexokinase 1, sugar sensing and signaling

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

68

The Role of Sugar-related Regulation ...

ORIGINAL ARTICLE

Роль сахарозависимой регуляции в светозависимых изменениях экспрессии генов gdhl и gdh2

арабидопсиса

Е.Ю. Гарник, В.И. Бельков, В.И. Тарасенко, Ю.М. Константинов

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132, Россия

*E-Mail: elsa74@yandex.ru

Поступила в редакцию 6 Ноября 2014 г.

Уровень транскриптов генов арабидопсиса gdh1 и gdh2 возрастает в темноте и снижается на свету. Считается, что репрессия этих генов на свету происходит вследствие повышения уровня глюкозы в фотосинтезирующей клетке, однако механизмы этой репрессии до сих пор не изучались. В данной работе исследована роль глюкозы и гексокиназы 1 в светозависимой регуляции экспрессии генов gdh1 и gdh2. Соотнесение профилей экспрессии генов apl3, gdh1, gdh2 в присутствии экзогенной сахарозы в темноте и на свету показало, что сахарозависимая репрессия генов gdh1 и gdh2 не достигает уровней, наблюдаемых на свету. С использованием мутанта по гену hxk1 показано, что это снижение не зависит от регуляторной функции гексокиназы 1 -наиболее известного посредника глюкозозависимых путей регуляции генной экспрессии. По-видимому, светозависимые изменения экспрессии генов gdh1 и gdh2 опосредуются хлоропластно-ядерными сигналами.

Key words: гексокиназа 1, глутаматдегидрогеназа, мутанты арабидопсиса,

сахарозависимая регуляция экспрессии генов, Arabidopsis thaliana

Ядерные гены gdh1 и gdh2, кодирующие у арабидопсиса фермент митохондриальной локализации NAD-зависимую глутаматдегидрогеназу (GDH, EC 1.4.1.2), относятся к генам с циркадным типом регуляции. Количество их

транскриптов возрастает в десятки раз в темное время суток и снижается в светлое (Turano et a/., 2006). Механизмы, обусловливающие такой тип регуляции генов gdh1 и gdh2, не исследованы. В 2008 г. Miyashita с соавторами выдвинули версию,

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Garnik et al.

69

что GDH в растительной клетке играет роль Landsberg erecta были получены из Arabidopsis

«страховки» на случай углеводного голодания Biological Resource Center (The Ohio State

(Miyashita, Good, 2008). При этом предполагается, University, USA). Семена стерилизовали в

что посредником, обусловливающим репрессию растворе, одержавшем 70 % этанола и 0,05%

данных генов на свету, является глюкоза, Triton X 100, в течение восьми минут, трижды

образующаяся в ходе фотосинтеза (Miyashita, промывали стерильной водой и раскладывали на

Good, 2008). Единственным хорошо изученным стерильную плотную среду в чашках Петри,

посредником, передающим сигналы, возникающие равномерно по всей поверхности среды либо

при изменении уровня глюкозы в клетке растений, только вдоль диаметра чашки (вертикальное

на сегодняшний день является гексокиназа 1 выращивание). Среда для выращивания растений

(HXK1). Однако ни роль HXK1, ни участие каких- содержала: минеральные соли по Murasige, Skoog

либо иных известных регуляторных и сигнальных (Murasige, Skoog, 1962) - половинный состав,

механизмов в регуляции экспрессии генов фитогель («Sigma-Aldrich», США) - 0,8%. В ряде

семейства gdh до сегодняшнего дня не экспериментов в среде присутствовала сахароза

исследовались. («Helicon», Россия) - 2%. После стратификации

Ранее нами было показано, что снижение при +4 °С в течение трех суток чашки

уровня транскриптов генов gdhl и gdh2 на свету устанавливали в горизонтальном либо в

требует присутствия функционально активных вертикальном положении в ростовой камере, где

хлоропластов (Garnik et al., 2013). Это может проростки выращивали в течение 7

указывать на существование хлоропластно- (горизонтальное выращивание) или 14 суток

ядерной регуляции экспрессии генов (вертикальное выращивание) при температуре 23

глутаматдегидрогеназы, однако не исключает и °С, освещенности 150 мкЕ и длине светового дня

регуляторного влияния глюкозы как продукта 16 ч.

фотосинтеза. В данной работе мы исследуем Обработку растений 3% растворами маннитола

участие глюкозозависимой регуляции и роль HXK1 («Sigma-Aldrich», США) и сахарозы («Helicon»,

в светозависимых колебаниях экспрессии генов Россия) проводили на 14-е сутки после окончания

глутаматдегидрогеназы арабидопсиса. стратификации. Корни 14-суточных проростков,

MATERIALS AND METHODS выращенных описанным способом и выдержанных

Растительный материал и условия в темноте в течение 24 ч до начала обработки,

выращивания. Семена Arabidopsis thaliana (L.) орошали 3% растворами сахарозы либо маннитола

Heynh. экотип Columbia-0 (далее Col-0), экотип (контроль осмотических условий) и экспонировали

Landsberg erecta (далее Ler), а также мутантной на свету либо в темноте в течение четырех часов,

линии gin2-1 (CS6383) на основе экотипа после чего выделяли РНК из листовых пластинок.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

70

The Role of Sugar-related Regulation ...

Экстракция РНК. РНК экстрагировали из растительного материала при помощи TRI-Reagent («Sigma-Aldrich», США) согласно протоколу производителя. Гомогенизацию материала с TRIReagent проводили в гомогенизаторе TissueLyser («QIAGEN», США) в течение 2 мин при частоте 30 колебаний в секунду. Для денатурации белков использовали бромхлорпропанол («Sigma-

Aldrich», США). Осаждение нуклеиновых кислот, растворение осадка РНК и анализ в агарозном геле проводили, как описано ранее (Tarasenko et a/., 2009).

Синтез первой цепи кДНК. Для удаления возможных примесей ДНК к 8 мкл препарата РНК добавляли 1 мкл 10х буфера ДНКазы

(«Fermentas», Литва) и 0.5 мкл (0.5 единиц) ДНКазы. Инкубировали 30 мин при 37 °С. Для инактивации ДНКазы добавляли в реакционную смесь 1 мкл ЭДТА (25 мкМ) и прогревали 10 мин при 65 °С. Добавляли 1 мкл праймера oligo-dT (80 рМ) и прогревали 5 мин при 70 °С, инкубировали 5 минут на льду. К смеси добавляли 4 мкл 5х буфера обратной транскриптазы («Fermentas», Литва), 0.5 мкл (20 единиц) ингибитора РНКаз («Fermentas», Литва), 2 мкл 10 мМ смеси dNTP. Инкубировали 5 мин при 37 °С. Добавляли 0.7 мкл (140 единиц) обратной транскриптазы Rever Aid H Minus M-MulV («Fermentas», Литва). Инкубировали 60 мин при 42 °С. Инактивировали фермент инкубацией 10 мин при 70 °С.

Обратно-транскриптазная ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ). ОТ-ПЦР-РВ проводили с использованием готовой смеси реагентов SYBR

Select MasterMix («Applied Biosystems», США) и оборудования C1000 Thermal Cycler CFX96 RealTime System («Bio-Rad», США). Объем реакционной смеси составлял 10 мкл. ПЦР проводили по следующему протоколу: прогревание до 50 °С, 2 мин (согласно рекомендации

производителя), один цикл денатурации (95 °С, 3 мин), 36 циклов амплификации (95 °С, 20 с -60 °С, 30 с - 72 °С, 30 с), после чего образцы подвергались нагреву до 95 °С для последующего анализа кривых плавления. Ген yls8 (AT5g08290) был использован как референсный (Hong et a/., 2010). Список всех использованных праймеров приведен в таблице 1 (табл. 1). Все праймеры были предварительно проверены путем анализа продуктов ПЦР-реакции в агарозном геле, каждая пара давала единственный продукт требуемого размера. Анализ результатов и построение графиков проводили при помощи программного обеспечения CFX ManagerTM Software Version 1.6 («Bio-Rad», США).

RESULTS

В первой серии экспериментов корни растений арабидопсиса линии дикого типа Col-0 обрабатывали 3% растворами сахарозы либо маннитола (контроль осмотических условий) на свету либо в темноте. Методом ОТ-ПЦР-РВ оценивали изменения экспрессии генов apl3 и gdh2. Выдерживание 14-суточных проростков в темноте в течение 24 ч приводило к снижению уровня транскриптов гена apl3 в 40-50 раз. Обработка корней выдержанных в темноте проростков 3% раствором сахарозы приводила к

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Garnik et al.

71

тому, что уровень транскриптов apl3 поднимался до уровня в необработанных растениях на свету и выше. Обработка раствором сахарозы корней проростков, экспонируемых на свету, приводила к повышению экспрессии apl3 в 20 раз и более (рис. 1А). Экспрессия гена gdh2 была наиболее низкой в проростках, экспонированных на свету. После выдерживания проростков в темноте уровень транскриптов gdh2 возрастал в 8-9 раз. Обработка корней таких проростков 3% раствором сахарозы приводила к снижению уровня транскриптов, оставаясь, однако, значительно выше уровня в необработанных проростках на свету (рис. 1Б).

Для следующей серии экспериментов использовали линию растений арабидопсиса gin2-1, мутантную по гену гексокиназы 1 hxkl. Уровень

транскриптов гена hxkl у 14-суточных проростков линии дикого типа Ler был выше на свету, чем в темноте (рис. 2). Выращивание проростков линии Ler в течение 7 суток на среде, содержащей 2% сахарозы, приводило к повышению уровня транскриптов гена hxkl вдвое (рис. 3). У 14-суточных проростков линии gin2-1 не отмечали значимых изменений в экспрессии гена hxkl при выдерживании в темноте и на свету. Присутствие в среде 2% сахарозы также не приводило к значимому изменению уровня экспрессии гена hxkl у 7-суточных проростков линии gin2-1 (рис. 3).

Уровень транскриптов генов gdhl и gdh2 у 14-суточных проростков обеих линий в темноте повышался в 10 и более раз по сравнению с образцами, экспонировавшимися на свету (рис. 4).

Таблица 1. Последовательности праймеров, использованных в работе.

Ген Локус Продукт Последовательность праймеров

apl3 At4g39210 Большая субъединица АДФ-глюкозофосфорилазы Л:CGTGCGTCGGAGTATGGACTG П: AGATTTT GCTGCTT CTTGATGAGAC

gdhl At5g18170 альфа-субъединица NAD(H)-зависимой глутаматдегидрогеназы Л: CAGGGCAGCGTTTTGTCATCCA П: CGATACCATCCTT GTTCTTGATT GCT

gdh2 At5g07440 бета-субъединица NAD(H)-зависимой глутаматдегидрогеназы Л: CGCTCTTGGTGGTGTCCTGAA П: CTCCT CCTGCGTTTGCGTAGA

hxkl At4g29130 гексокиназа 1 Л: ATGGATGGTGGATTGTTTGAGCAT П: AAGGTAGAGAGAGT GAGAAGCAGCA

yls8 At5g08290 yellow-leaf-specific gene 8 (референсный ген) Л: GAGGTGCTT GCGTCTGTTGCT П: TGTCCTTGAGAGCCCAGTTGAT

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

72

The Role of Sugar-related Regulation ...

Рисунок 1 (А, Б). Уровень транскриптов генов apl3 и gdh2 в растениях линии дикого типа Col-0 в зависимости от условий освещения и присутствия экзогенной сахарозы.

Показаны результаты ОТ-ПЦР-РВ. Маннитол 3%, сахароза 3% - корни растений обработаны 3% раствором маннитола либо сахарозы за 4 часа до выделения РНК; темнота - в течение обработки маннитолом либо сахарозой растения экспонировали в темноте; свет - в течение обработки маннитолом либо сахарозой растения экспонировали на свету (освещенность 150 мкЕ). А -транскрипты гена apl3, Б - транскрипты гена gdh2.

Рисунок 2. Уровень транскриптов гена hxkl у растений линии дикого типа Ler и мутанта gin2-1 на свету и в темноте.

Показаны результаты ОТ-ПЦР-РВ. Время экспозиции на свету (освещенность 150 мкЕ) либо в темноте перед выделением РНК - 4 ч.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Garnik et al.

73

Рисунок 3. Уровень транскриптов гена hxkl у растений линии дикого типа Ler и мутанта gin2-1 в отсутствие и в присутствии экзогенной сахарозы.

Показаны результаты ОТ-ПЦР-РВ. Растения выращивали на плотных питательных средах. Контроль - сахароза в среде отсутствовала, сахароза 2% - среда содержала 2% сахарозы.

Рисунок 4. Уровень транскриптов генов gdhl, gdh2 у растений линии дикого типа Ler и мутанта gin2-1 на свету и в темноте.

Показаны результаты ОТ-ПЦР-РВ. Растения экспонировали на свету (освещенность 150 мкЕ) либо в темноте в течение 4 ч перед выделением РНК.

DISCUSSION

На сегодняшний день единственным и общепринятым объяснением суточных изменений уровня транскриптов генов глутаматдегидрогеназы

арабидопсиса является гипотеза сахарозависимой регуляции экспрессии этих генов. Хорошо известно, что причиной колебаний экспрессии этих генов в течение суток являются изменения

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

74

The Role of Sugar-related Regulation ...

освещенности (Turano et al., 1997). В 2008 r. сравнимой с репрессией этих генов на свету, не

Miyashita с соавторами провели серию удалось. В качестве маркера уровня глюкозы в

экспериментов с нокаут-мутантами по генам gdhl и клетках растений мы использовали ген apl3. Он

gdh2 и установили, что двойной мутант gdhl- кодирует большую субъединицу АДФ-

2/gdh2-1 значительно хуже переносил длительное глюкозофосфорилазы, первого фермента пути

выдерживание растений в темноте (6-12 суток) биосинтеза крахмала, и его экспрессия

(Miyashita, Good, 2008). На этом основании, а индуцируется при повышении в клетке уровня

также с учетом того, что продукт реакции, глюкозы (Rook et al., 2006). Соотнесение профилей

катализируемой GDH - 2-оксоглутарат - может экспрессии генов apl3 и gdh2 показало, что при

быть введен в цикл трикарбоновых кислот и обработке корней двухнедельных проростков

использован для получения энергии (Robinson et линии дикого типа Col-0 3% раствором сахарозы

al., 1992), авторы выдвинули следующую версию: в сахарозависимая репрессия гена gdh2

темноте, при снижении уровня глюкозы в клетке действительно происходит, однако ее, по всей

гены GDH дерепрессируются (gdh2 в большей видимости, недостаточно для обеспечения

степени, gdhl в меньшей), и повышение количества колебаний уровня транскриптов генов

активного фермента GDH позволяет клетке глутаматдегидрогеназы в том масштабе, который

использовать глутамат в катаболических реакциях имеет место при естественной смене светлого и

(Miyashita, Good, 2008). Насколько нам известно, темного времени суток (рис. 1А, 1Б).

экспериментальная проверка этой гипотезы Единственным хорошо изученным посредником,

никогда не производилась. Единственным передающим сигналы, возникающие при

аргументом в пользу существования изменении уровня глюкозы в клетке растений, на

сахарозависимой репрессии генов сегодняшний день является гексокиназа 1

глутаматдегидрогеназы арабидопсиса являются (Hausler et al., 2014). После активирования

данные Li с соавторами, полученные при помощи глюкозой молекула HXK1 входит в состав

ДНК-микрочипирования: в течение 2-6 часов после высокомолекулярного ядерного комплекса,

обработки 7-суточных проростков арабидопсиса регулирующего транскрипцию через прямое

3% раствором глюкозы уровень транскриптов генов связывание с промоторами соответствующих генов

gdhl и gdh2 снижался соответственно в 2 и 2,5 (Ramon et al., 2008). У растений арабидопсиса

раза (Li et al., 2006). линии gin2-1 в результате мутации по гену hxkl в

В нашей работе обработка проростков большой степени или полностью отсутствует

арабидопсиса экзогенной сахарозой также регуляторная функция HXK1. Это приводит к таким

приводила к некоторой репрессии генов gdhl и особенностям мутанта, как нечувствительность к

gdh2. Однако достичь глубокой репрессии, высоким концентрациям глюкозы при прорастании

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Garnik et al.

75

семян и ослабленная репрессия ядерных генов, связанных с фотосинтезом, в присутствии экзогенной глюкозы (Moore et al., 2003). Поскольку HXK1 регулирует в том числе и транскрипцию своего собственного гена hxkl, активируя его при повышении уровня глюкозы в клетке (Price et al., 2004), отсутствие изменений уровня транскриптов hxkl в присутствии сахарозы у растений gin2-1 в наших экспериментах подтверждает отсутствие у них регуляторной функции белка HXK1 (рис. 3). При этом совпадение профилей экспрессии генов глутаматдегидрогеназы у мутанта gin2-1 и растений дикого типа Ler на свету и в темноте свидетельствует о том, что светозависимые изменения экспрессии генов gdhl и gdh2 происходят независимо от регуляторной активности HXK1. Поскольку в присутствии экзогенной сахарозы мы все же наблюдали частичное снижение уровня транскриптов gdh2 (рис. 1Б), нельзя исключить участие не связанных с HXK1 сахарозависимых регуляторных путей. Существование последних для растений известно (Price et al., 2004), однако механизмы подобной регуляции на сегодняшний день изучены слабо (Hausler et al., 2014).

Ранее нами было показано, что обработка клеток гетеротрофной суспензионной культуры либо растений арабидопсиса в темноте ингибитором митохондриального транспорта электронов антимицином А приводит к значительному повышению уровня транскриптов гена gdh2 (Tarasenko et al., 2009; Garnik et al., 2013). Из этого следует, что в регуляции

экспрессии данного гена могут принимать участие ретроградные (в данном случае митохондриальноядерные) сигналы, однако пока нельзя сказать, имеет ли отношение обнаруженный нами ранее феномен митохондриально-ядерной регуляции гена gdh2 к регуляции светозависимых колебаний экспрессии генов глутаматдегидрогеназы.

Таким образом, в данной работе нами впервые показано, что светозависимая регуляция колебаний уровня транскриптов генов gdhl и gdh2 арабидопсиса не опосредуется гексокиназой 1. Сахарозависимая репрессия данных генов, не связанная с HXK1, возможна, однако ее недостаточно для многократного снижения экспрессии, наблюдаемого при переносе растений из темноты на свет. Учитывая показанную нами ранее необходимость присутствия

функциональных хлоропластов для снижения уровня транскриптов гена gdh2 на свету (Garnik et al., 2013), можно предполагать, что главную роль в обеспечении светозависимых изменений экспрессии данных генов играют регуляторные сигналы хлоропластно-ядерной природы.

ACKNOWLEDGMENT

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ 12-04-01148-а и 14-44-04001 р_сибирь_а. В работе использовано оборудование Байкальского аналитического центра (ЦКП) СО РАН при президиуме ИНЦ СО РАН.

REFERENCES

Garnik E.Yu., Belkov V.I., Tarasenko V.I., Potapova T.V., Korzun M.A., Konstantinov Yu.M.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

76

The Role of Sugar-related Regulation ...

The expression of Arabidopsis glutamate dehydrogenase gene gdh2 is induced under the influence of tetrapyrrole synthesis inhibitor norflurazon. J. Stress Physiol. Biochem., 4, 299309.

Hausler R., Heinrich L., Schmitz J., Flugge U.-I. (2014) How sugars might coordinate chloroplast and nuclear gene expression during acclimation to high light intensities. Molecular Plant, 7, 11211137.

Hong S.M., Bahn S.C., Lyu A., Jung H.S., Ahn J.H. (2010) Identification and testing of superior reference genes for starting pool of transcript normalization in Arabidopsis. Plant Cell Physiol., 51, 1694-1706.

Miyashita Y., Good A.G. (2008) NAD(H)-dependent glutamate dehydrogenase is essential for the survival of Arabidopsis thaliana during dark-induced carbon starvation. J. Exp. Bot., 59, 667680.

Moore B., Zhou L., Rolland F., Hall Q., Cheng W.H., Liu Y.X., Hwang I., Jones T., Sheen J. (2003) Role of the Arabidopsis glucose sensor HXK1 in nutrient, light, and hormonal signaling. Science, 300(5617), 332-336.

Murashige T., Skoog F. (1962) Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15, 473-497.

Price J., Laxmi A., St. Martin S.K., Jang J.-C. (2004) Global transcription profiling reveals multipler sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. Plant Cell, 16, 2128-2150.

Ramon M., Rolland F., Sheen J. (2008) Sugar sensing and signaling. The Arabidopsis Book, 6:e0117 (doi: 10.1199/tab.0117).

Rook F., Handingham A., Li Y., Bevan M.W. (2006) Sugar and ABA response pathways and the control of gene expression. Plant Cell Environ., 29, 426-434.

Tarasenko V.I., Garnik E.Yu., Shmakov V.N., Konstantinov Yu.M. (2009) Induction of Arabidopsis gdh2 gene expression during changes in redox state of the mitochondrial respiratory chain. Biochemistry (Mosc.), 74(1), 47-53.

Turano F., Thakkar S., Fang T., Weisemann J. (1997) Characterization and expression of NAD(H)-dependent glutamate dehydrogenase genes in Arabidopsis. Plant Physiol., 113, 1329-1341.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014