ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВЫХ НУКЛЕИНОВОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПУТЕМ РАСЩЕПЛЕНИЯ ЗОНДИРУЮЩЕГО ОЛИГОНУКЛЕОТИДА И ГИБРИДИЗАЦИИ

1. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО имеет одиночную метку; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РО; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5-нуклеазной активностью, с получением содержащего одиночную метку фрагмента;
(с) осуществление реакции гибридизации путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что содержащий одиночную метку фрагмент не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; и
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от одиночной метки на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
2. Способ по п. 1, где нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с узнающим мишень участком РО.
3. Способ по п. 1, где РО представляет собой 3'-тегированный РО,
дополнительно содержащий в своей 3'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, или 5'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с узнающим мишень участком РО.
4. Способ по п. 3, где одиночная метка располагается таким образом, что она не остается на содержащем тегирующий участок фрагменте, который высвобождается в результате расщепления РО.
5. Способ по п. 1, где РО представляет собой 3'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 3'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, или 5'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с частью тегирующего участка и частью узнающего мишень участка РО.
6. Способ по п. 1, где РО и/или СО блокирован по своему 3'-концу, чтобы не допустить его удлинения.
7. Способ по п. 1, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер или располагающийся "вверх по течению" зонд.
8. Способ по п. 1, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид имеет частично перекрывающуюся последовательность с узнающим мишень участком РО.
9. Способ по п. 1, где фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью, представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью, или нуклеазу FEN.
10. Способ по п. 1, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер, а фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью, представляет собой матричную полимеразу нуклеиновых кислот, обладающую 5'-нуклеазной
активностью.
11. Способ по п. 1, дополнительно включающий повторение стадий (а)-(b), (а)-(с) или (а)-(d) с денатурацией между повторяющимися циклами.
12. Способ по п. 1, где стадии (а)-(d) осуществляют в реакционном сосуде или в отдельных реакционных сосудах.
13. Способ по п. 1, где нуклеиновокислотная последовательность-мишень, содержит по меньшей мере два типа нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней.
14. Способ по п. 1, где нуклеиновокислотная последовательность-мишень содержит нуклеотидную вариацию.
15. Способ по любому из п.п. 1-14, который осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера.
16. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую донорную молекулу и акцепторную молекулу; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РО; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью, с разделением системы двух взаимодействующих меток, в результате чего образуются содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент;
(с) осуществление реакции гибридизации путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; при этом сигнал от дуплекса нерасщепленный РО/СО отличается от сигнала, поступающего тогда, когда по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО; и
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от системы двух взаимодействующих меток на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
17. Способ по п. 16, где нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с узнающим мишень участком РО, и система двух взаимодействующих меток локализована таким образом, что сигнал от донорной молекулы гасится акцепторной молекулой при образовании дуплекса нерасщепленный РО/СО, при этом при проведении стадии (d) осуществляют детекцию сигнала от акцепторной молекулы.
18. Способ по п. 16, где РО представляет собой 3'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 3'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, или 5'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с тегирующим участком РО, и система двух взаимодействующих меток локализована таким образом, что сигнал от донорной молекулы гасится акцепторной молекулой при образовании дуплекса нерасщепленный РО/СО, при этом при проведении стадии (d) осуществляют детекцию сигнала от акцепторной молекулы.
19. Способ по п. 16, где нуклеотидная последовательность в СО,
способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с узнающим мишень участком РО, и реакцию гибридизации на стадии (с) проводят в таких условиях, что фрагмент, содержащий донорную молекулу, не гибридизуется с СО; при этом система двух взаимодействующих меток локализована таким образом, что сигнал от донорной молекулы не гасится акцепторной молекулой при образовании дуплекса нерасщепленный РО/СО, и при проведении стадии (d) осуществляют детекцию сигнала от донорной молекулы.
20. Способ по п. 16, где РО представляет собой 3'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 3'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, или 5'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с тегирующим участком РО; содержащий донорную молекулу фрагмент содержит тегирующий участок, способный к гибридизации с СО, и в реакции гибридизации на стадии (с) фрагмент, содержащий донорную молекулу, гибридизуется с СО; при этом система двух взаимодействующих меток локализована таким образом, что сигнал от донорной молекулы гасится акцепторной молекулой при образовании дуплекса нерасщепленный РО/СО, при этом при проведении стадии (d) осуществляют детекцию сигнала от донорной молекулы.
21. Способ по п. 16, где РО представляет собой 3'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 3'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, или 5'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с частью тегирующего участка или частью узнающего мишень участка РО.
22. Способ по п. 16, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер,
и на стадии (b) для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера используют матричную полимеразу нуклеиновых кислот.
23. Способ по п. 16, дополнительно включающий повторение стадий (а)-(b), (а)-(с) или (а)-(d) с денатурацией между повторяющимися циклами.
24. Способ по п. 16, где стадии (а)-(d) осуществляют в реакционном сосуде или в отдельных реакционных сосудах.
25. Способ по любому из п.п. 16-24, который осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера.
26. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РО; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью с получением отщепленного фрагмента;
(с) осуществление реакции гибридизации в присутствии интеркалируюшего агента путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что отщепленный фрагмент не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; и
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от интеркалирующего агента на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
27. Способ по п. 26, где нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с узнающим мишень участком РО.
28. Способ по п. 26, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер, и на стадии (b) для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера используют матричную полимеразу нуклеиновых кислот.
29. Способ по п. 26, дополнительно включающий повторение стадий (а)-(b), (а)-(с) или (а)-(d) с денатурацией между повторяющимися циклами.
30. Способ по п. 26, где стадии (а)-(d) осуществляют в реакционном сосуде или в отдельных реакционных сосудах.
31. Способ по любому из п.п. 26-30, который осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера.
32. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО имеет одиночную метку;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью, с получением содержащего одиночную метку фрагмента;
(с) осуществление реакции гибридизации путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что содержащий одиночную метку фрагмент не гибридизуется
с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; и
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от одиночной метки на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
33. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую донорную молекулу и акцепторную молекулу;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью, с разделением системы двух взаимодействующих меток, в результате чего образуются содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент; (с) осуществление реакции гибридизации путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; при этом сигнал от дуплекса нерасщепленный РО/СО отличается от сигнала, поступающего тогда, когда по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО; и
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от системы двух взаимодействующих меток на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
34. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью с получением отщепленного фрагмента;
(с) осуществление реакции гибридизации в присутствии интеркалируюшего агента путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что отщепленный фрагмент не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; и
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от интеркалирующего агента на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
35. Набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО), на твердой подложке, содержащий:
(а) зондирующий олигонуклеотид (РО), содержащий узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени;
(b) располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РО; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или
его удлиненная цепь индуцирует расщепление РО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, и
(с) захватывающий олигонуклеотид (СО), иммобилизованный на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО, в результате чего РО, не расщепленный под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью, гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО.
36. Набор по п. 35, где РО имеет одиночную метку или систему двух взаимодействующих меток.
37. Набор по п. 35, где РО представляет собой 3'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 3'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, или 5'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с тегирующим участком РО.
38. Набор по п. 35, где РО представляет собой 3'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 3'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, или 5'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с частью тегирующего участка и частью узнающего мишень участка РО.
39. Набор по п. 35, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер или располагающийся "вверх по течению" зонд.
40. Набор по п. 35, дополнительно содержащий фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью.
41. Набор по п. 35, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид имеет частично перекрывающуюся последовательность с узнающим мишень участком РО.
42. Набор по п. 40, где фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью, представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью, или нуклеазу FEN.
43. Набор по п. 35, дополнительно содержащий интеркалирующий агент.
44. Набор по п. 35, где указанный набор используют для детекции по меньшей мере двух типов нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней, причем располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит по меньшей мере два типа располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов, РО содержит по меньшей мере два типа РО, и СО содержит по меньшей мере два типа СО.
45. Набор по п. 35, где указанный набор дополнительно содержит располагающийся "вниз по течению" праймер.
46. Набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО), на твердой подложке, содержащий:
(а) зондирующий олигонуклеотид (РО), содержащий узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; и
(b) захватывающий олигонуклеотид (СО), иммобилизованный на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО, в результате чего РО, не расщепленный под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью, гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО.