Способ прогнозирования приживляемости эмбриона у коровы-реципиента в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов
METHOD FOR PREDICTION OF EMBRYO ENGRAFTMENT IN A RECIPIENT COW DURING EMBRYO TRANSPLANTATION TECHNOLOGY

Изобретение относится к воспроизводству сельскохозяйственных животных, а именно к области репродукции крупного рогатого скота, и может быть использовано как критерий прогноза риска отсутствия приживляемости трансплантируемого эмбриона у коровы-реципиента.
Производственный цикл технологии трансплантации эмбрионов включает в себя использование комплекса методов и оборудования в поэтапно выполняемых технологических процессах. Процедура отбора коров-доноров эмбрионов и отбора коров-реципиентов является начальным технологическим этапом. Последующие этапы состоят в выполнении стимуляции полиовуляции у коров-доноров и их искусственном осеменении, в извлечении эмбрионов у доноров и осуществлении оценки качества полученных эмбрионов, в применении криоконсервации эмбрионов (при необходимости), в проведении пересадки эмбрионов реципиентам.
Несмотря на более чем полувековую историю применения данной технологии у крупного рогатого скота в сельскохозяйственном производстве многих стран мира, ее итоговый результат, оцениваемый по показателю количества полученных зародышей от генетически ценных коров-доноров, а также по показателям стельности и наличию рожденных телят у коров-реципиентов, не всегда положительно стабилен. Рассматривая технологический этап, в процессе которого осуществляют пересадку свежеполученных или заморожено-оттаянных эмбрионов, следует отметить, что результат приживляемости трансплантированного зародыша (как правило, одной корове-реципиенту пересаживают один эмбрион) регистрируют на 21-25-й день от дня пересадки как положительный (стельность, свидетельствующая о наличии приживляемости эмбриона) или отрицательный (отсутствие стельности - отсутствие приживляемости эмбриона). В ветеринарной практике хозяйств, где производят массовые трансплантации эмбрионов, известно, что из общего количества коров-реципиентов факт приживляемости зародыша фиксируют не у каждого животного, что приводит к снижению плановых показателей выхода потомства и к убыточности мероприятия по пересадке. В среднем, при пересчете на всех использованных коров-реципиентов приживляемость трансплантированных эмбрионов колеблется в пределах 40-60%, и лишь в отдельных случаях достигает более высокого процента - 60-70% (Эффективность пересадки эмбрионов у телок-рецепиентов с высоким адаптивным потенциалом // Макаров А.В., Бригида А.В., Сорокин В.И., Скачкова О.А., Ковальчук С.Н. // Ветеринария и кормление №4,2018). Поскольку приведенная статистика в течение многих десятилетий существенно не изменилась, фактически не исключено, что порог эффективности данной технологии уже достигнут.Однако, несмотря на недостаточный уровень результативности, применение технологии на данном этапе ее развития в десятки раз превышает возможности естественного размножения малоплодных самок крупного рогатого скота. В промышленном скотоводстве многих странах мира потребность в пересадках эмбрионов, полученных от высокопродуктивных коров-доноров, продолжает возрастать. Так, например, в европейских странах, занимающихся трансплантацией эмбрионов крупного рогатого скота, по данным AETE (Association of embryo technology in Europe), количество пересадок в 2017 году увеличилось более чем на 44 тысячи по сравнению с аналогичным показателем 2014 года (в 2014 г. - 137802 пересадок, в 2017 г. - 181922 пересадок). В данной ситуации остается актуальным необходимость совершенствования технологии трансплантации эмбрионов, применяемой у крупного рогатого скота.
Проблема приживляемости пересаженных эмбрионов остается одной из ведущих и активно изучается в связи с поиском новых путей, приводящих к повышению результативности программ трансплантации эмбрионов. Как было показано, к известным на сегодняшний день факторам, снижающим показатели приживляемости эмбрионов после их переноса в репродуктивные органы реципиентов, относят: несоответствие синхронности полового цикла между донором и реципиентом при пересадке свежеполученных эмбрионов, а также асинхронность стадии развития эмбриона с половым циклом реципиента - при трансплантации замороженно-оттаянных зародышей (Effect of oestrous synchrony between embryo donors and recipients, embryo quality and state on the pregnancy rate in beef cattle Автор:: Rodrigues, M. С.C; Bonotto, A. L. M.; Acosta, D. A. V.; с соавторами. REPRODUCTION IN DOMESTIC ANIMALS Том: 53 Выпуск: 1 Стр.: 152-156. Опубликовано: FEB 2018 №2). Другими факторами, приводящими к ранней эмбриональной гибели трансплантированных эмбрионов, являются: низкий уровень жизнеспособности эмбриона, генетическая несовместимость эмбриона с реципиентом, повышенные концентрации простагландина (PG) F2a в организме реципиента после переноса эмбриона, стресс-факторы, связанные с условиями содержания и кормления реципиента (в частности, жара, жажда, голод, болезни, усталость), воспалительные процессы в организме реципиента (мастит, пневмония, хромота, заболевания репродуктивных органов) (Flunixin meglumine improves pregnancy rate in embryo recipient beef cows with an excitable temperament. Автор:: Kasimanickam, R. K.; Hall, J. В.; Estill, С.Т.; с соавторами. THERIOGENOLOGY Том: 107 Стр.: 70-77 Опубликовано: FEB 2018). Отмечена более низкая частота стельности у коров-реципиентов с буйным темпераментом по сравнению с коровами со спокойным темпераментом (Kasimanickam, R. Calm Temperament Improves Reproductive Performance of Beef Cows / R. Kasimanickam, M. Asay, S. Schroeder, V. Kasimanickam, J.M. Gay, J.P. Kastelic, J.B. Hall, W.D. Whittier // Reproduction in Domestic Animals, 2014. Vol.49, №6. https://doi.org/10.1111/rda.12436; Kasimanickam, R. Influence of Temperament Score and Handling Facility on Stress, Reproductive Hormone Concentrations, and Fixed Time AI Pregnancy Rates in Beef Heifers / R. Kasimanickam, S. Schroeder, M. Assay, V. Kasimanickam, D.A. Moore, J.M. Gay, W.D. Whittier // Reproduction in Domestic Animals, 2014. Vol.49, №5. https://doi.org/10.1111/rda.12368). Помимо того, категория доноров (корова или телка), от которой получен эмбрион, является еще одним фактором, влияющим на приживляемость трансплантированного эмбриона у коровы-реципиента. Имеются данные что эмбрионы, полученные от телок-доноров, имели более низкую жизнеспособность после переноса реципиентам по сравнению с эмбрионами, полученными от коров-доноров (Donor category and seasonal climate associated with embryo production and survivalin multiple ovulation and embryo transfer programs in Holstein cattle Автор:: Vieira, L. M.; Rodrigues, C. A.; Mendanha, M. F.; с соавторами. THERIOGENOLOGY Том: 82 Выпуск: 2 Стр.: 204-212 Опубликовано: JUL 15 2014). Установлен факт зависимости приживляемости трансплантируемого эмбриона от места его наложения в роге матки животного при манипуляциях по пересадке, при этом, отмечено наиболее частое наступление стельности в случаях расположения эмбриона ближе к верхушке рога матки (патент РФ на полезную модель №154919, 2015 г.). В свою очередь, поскольку расположить трансплантируемый эмбрион в верхушке рога матки технически сложно, значительно увеличивается период времени по осуществлению манипуляций в репродуктивных органах реципиента. Это может повлечь за собой отсутствие приживляемости эмбриона из-за риска утраты его жизнеспособности или риска травмирования репродуктивных органов животного, что является фактором, влияющим на показатели приживляемости эмбриона (Factors in cattle affecting embryo transfer pregnancies in recipient animals Автор:: Roper, David A.; Schrick, F. Neal; Edwards, J. Lannett; с соавторами. ANIMAL REPRODUCTION SCIENCE Том: 199 Стр.: 79-83 Опубликовано: DEC 2018).
Вследствие многофакторной зависимости процесса приживляемости трансплантированных эмбрионов у коров-реципиентов прогнозирование результативности метода пересадки эмбрионов является проблемой, требующей своего решения. Сочетание изложенных факторов, разнонаправленно влияющих на прогноз приживляемости эмбрионов, трудности в определении нормы и пороговых значений для каждого из параметров, приводят к сложности оценки суммарного эффекта этих факторов. До сих не существует эффективного метода прогнозирования, который позволил бы выявлять коров-реципиентов с высоким уровнем приживляемости трансплантируемых эмбрионов, что давало бы возможность своевременно корректировать тактику ведения мероприятия по пересадке эмбрионов, выранжировывая особей с вероятностью отсутствия приживляемости. Поэтому прогнозирование приживляемости пересаживаемого эмбриона у коровы или телки-реципиента имеет важное прикладное значение. Это, в конечном итоге, могло бы повысить эффективность реализации технологических возможностей эмбриотрансфера.
Известен способ, с помощью которого возможно прогнозирование вероятности высокого или низкого уровня приживляемости пересаженных эмбрионов у телок-реципиентов (прототип - Эффективность пересадки эмбрионов у телок-рецепиентов с высоким адаптивным потенциалом //Макаров А.В., Бригада А.В., Сорокин В.И., Скачкова О.А., Ковальчук С.Н. // Ветеринария и кормление №4, 2018, стр. 25-27). В способе на основании результатов исследований, проведенных с участием животных, отобранных в качестве телок-реципиентов в соответствии с ветеринарными и зоотехническими характеристиками, показано, что осуществление прогнозирования приживляемости пересаженных эмбрионов возможно с учетом двух оцениваемых показателей: индекс клинико-физиологических проявлений эструса (индекс КФПЭ) и качество (длина) желтого тела (КЖТ). При этом, у реципиента осуществляют индуцирование (вызывание) половой охоты, выполнение диагностики половой охоты, состоящей в выявлении клинико-физиологических проявлений признаков эструса (признаки половой охоты): рефлекс неподвижности, набухание вульвы, гиперемия слизистой, наличие слизи (течка), попытки садки, постовуляторные кровяные выделения. День, в который эти признаки проявляются, регистрируют как нулевой день полового цикла, от которого отсчитывают седьмой день полового цикла (день пересадки эмбриона). Индекс КФПЭ определяют, оценивая выявленные в течение этого нулевого дня признаки половой охоты с использованием бальной системы, представленной в таблице 1 прототипа, в которой каждый из таких признаков имеет соответствующий балл: рефлекс неподвижности (30 баллов), набухание вульвы (10 баллов), гиперемия слизистой (10 баллов), наличие слизи (течка) (15 баллов), попытки садки (20 баллов), постовуляторные кровяные выделения (15 баллов). Во время прихода обследуемого реципиента в половую охоту регистрируют выявленные признаки половой охоты и присваивают им соответствующие баллы, при суммировании которых получают индекс КФПЭ. На 7-й день полового цикла у реципиента непосредственно перед пересадкой эмбриона выполняют эхографическую визуализацию желтого тела, расположенного на поверхности яичника, с использованием оборудования для ультразвукового исследования, посредством которого осуществляют морфометрические измерения желтого тела, и определяют такой параметр, как длина желтого тела. Измеренную длину желтого тела фиксируют согласно следующей классификации качества желтого тела (КЖТ): КЖТ-1 (≤1,2 см); КЖТ- 2 (1,2-2,0 см); КЖТ- 3 (≥2,0 см). Затем показатели индекса КФПЭ и КЖТ, полученные у обследуемого реципиента, сопоставляют с значениями индекса КФПЭ и КЖТ, отраженными в таблице 2 прототипа, в которой представлены показатели результативности приживляемости эмбрионов (в процентном выражении). Согласно данным таблицы 2 прототипа, возможно прогнозирование вероятности «наличие» приживляемости пересаживаемых эмбрионов: 1) при значении показателя КЖТ-1 (≤1,2 см) и КФПЭ, равного 100, или 85, или 80 и менее, так как при аналогичном показателе КЖТ были прижиты эмбрионы у 30,8% реципиентов с КФПЭ=100, у 66,7% реципиентов с КФПЭ=85, у 30,0% реципиентов с КФПЭ=80 и менее; 2) при значении показателя КЖТ - 2 (1,2 - 2,0 см) и КФПЭ, равного 85, или 80 и менее, так как при аналогичном показателе КЖТ были прижиты эмбрионы у 68,0% реципиентов с КФПЭ=85, у 28,6% реципиентов с КФПЭ=80 и менее; 3) при значении показателя КЖТ-3 (≥2,0 см) и КФПЭ, равного 85, так как были прижиты эмбрионы у 42,9% реципиентов. При иных значениях КФПЭ и КЖТ прогнозируют вероятность отсутствия приживляемости эмбрионов, пересаживаемых корове-реципиенту.
Однако этот способ имеет недостатки в том, что при проведении прогнозирования приживляемости пересаживаемого эмбриона возможно получение недостаточно точного индекса КФПЭ, так как у находящейся в половой охоте телки или коровы-реципиента необходимо выявить большое количество разнородных признаков половой охоты (клинико-физиологические проявления признаков эструса). В практической деятельности животноводческих хозяйств диагностировать все эти признаки достаточно сложно, поскольку они проявляются либо вместе, либо по-отдельности на протяжении всего периода прихода коровы в половую охоту и имеется высокая погрешность в точности обнаружения указанных признаков. Кроме того, определение такого морфометрического параметра, как длина желтого тела, без учета объемных характеристик желтого тела снижает информативность метода. Это все вместе приводит к снижению точности результата прогнозирования приживляемости пересаживаемого эмбриона у коровы или телки-реципиента.
Техническим результатом изобретения является повышение точности и информативности прогнозирования приживляемости эмбрионов у коров-реципиентов, используемых в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов.
Технический результат достигается тем, что способ прогнозирования приживляемости эмбриона у коровы-реципиента в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов заключаеся в том, что у коровы-реципиента на нулевой день полового цикла выполняют диагностику половой охоты на предмет выявления клинико-физиологических проявлений признаков эструса (признаки половой охоты) «рефлекс неподвижности» и «течка» среди всех проявившихся в течение этого нулевого дня признаков половой охоты, а на 7-й день полового цикла непосредственно перед пересадкой эмбриона выполняют эхографическую визуализацию яичника и желтого тела с использованием оборудования для ультразвукового исследования, посредством которого осуществляют морфометрические измерения параметров яичника и желтого тела, в котором согласно изобретению, при выполнении диагностики половой охоты учитывают признаки половой охоты «рефлекс неподвижности» и «течка» только в случае, если они оба были проявлены в течение нулевого дня полового цикла, при этом, результат диагностики выражают показателем «наличие» или показателем «отсутствие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка», а морфометрические измерения параметров яичника и желтого тела на 7-й день полового цикла состоят в том, что морфометрически измеряют объем желтого тела и объем яичника, выполняют расчет отношения объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении (расчетный показатель), после чего значения расчетного показателя и показателя, полученного в результате диагностики, совместно используют в качестве прогностических критериев, и, при значении расчетного показателя 31%-50% и показателя «наличие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка» прогнозируют вероятность «наличие приживляемости эмбриона», а вероятность «отсутствие приживляемости эмбриона» прогнозируют при следующих значениях показателей: при значении расчетного показателя 30% и менее независимо от полученного показателя «наличие» или показателя «отсутствие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка», при значении расчетного показателя 31%-50% и показателя «отсутствие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка», при значении расчетного показателя более 50% независимо от показателя «наличие» или показателя «отсутствие» признаков половой охоты.
Способ прогнозирования приживляемости эмбриона у коровы-реципиента в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов (далее - способ прогнозирования, патентуемый способ) предназначен для применения у коров, предварительно отобранных по ветеринарным и зоотехническим характеристикам в качестве реципиентов, у которых начат процесс подготовки к пересадке эмбриона (охарактеризован ниже). Осуществление способа согласно заявляемому изобретению проводят в ходе процесса подготовки коровы-реципиента в заданное патентуемым способом время (на нулевой день полового цикла и на 7-й день полового цикла).
Характеристика процесса подготовки коров-реципиентов к пересадке эмбрионов состоит в следующем. При подготовке коровы-реципиента к пересадке эмбриона следует учитывать, что необходимым условием для пересадки является наличие у коровы-реципиента естественного или индуцированного (вызванного искусственно посредством введения животному гормональных препаратов) полового цикла, физиологическая норма продолжительности которого у самок крупного рогатого скота составляет 18-24 дней. У данного вида сельскохозяйственных животных половая цикличность может восстанавливаться уже через 18-25 дней после родов и проявляться во все сезоны года. Начало каждого нового полового цикла характеризуется проявлением признаков половой охоты, которая обычно длится 6-24 часа (в среднем 15 часов). Приход коровы в половую охоту сопровождается проявляемыми у нее клинико-физиологическими признаками эструса (признаки половой охоты): повышенная двигательная активность, отказ от корма, рефлекс неподвижности, частое мычание, потливость, снижение молочной продуктивности, течка, гиперемия слизистой, попытки садок, набухание вульвы, постовуляторные кровяные выделения (Об основах выявления половой охоты у крупного рогатого скота. Сайт Интернет: http://yariks.info/pijivotnovodstvo/jiv_34/, 2019 г.). Приход самки крупного рогатого скота в половую охоту обусловлен протеканием физиологических процессов, связанных с овуляцией (выходом созревшей яйцеклетки из фолликула, который происходит через 8 - 15 ч после окончания охоты). При осеменении коровы и оплодотворении яйцеклетки происходит образование зиготы с последующим развитием зародыша. Однако, поскольку речь идет о корове-реципиенте, участвующей в программе трансплантации эмбриона, во время индуцированного полового цикла она не подлежит осеменению, так как на место вышедшей при овуляции яйцеклетки, которая при отсутствии оплодотворения погибает и впоследствии рассасывается, будет пересажен эмбрион. Факт прихода коровы-реципиента в половую охоту (естественную или индуцированную) устанавливают в соответствии с общепринятыми способами выявления половой охоты (визуальный, вагинальный, ректальный, лабораторный, инструментальный) («Признаки половой охоты. Приложение №1», «Основные способы выявления половой охоты у коров и телок. Приложение №2» к Условиям применения биотехнологических методов искусственного осеменения племенных коров и телок, утвержденным приказом Минсельхоза России от 18 марта 2016 года N 102. http://pravo.gov.ru/proxy/ips/?docbody=&nd=102407825&intelsearch=21.07.2016%2C+N+00 01201607220043, 2019 г.). Поскольку каждый из названных способов не является универсальным по причине высокой погрешности в точности обнаружения указанных признаков, в ветеринарной практике эти способы зачастую применяют в том или ином сочетании. День, в который выявлен факт прихода коровы-реципиента в половую охоту, регистрируют как нулевой день полового цикла. От даты наступления нулевого дня ведут отсчет седьмого дня полового цикла, в течение которого должно быть проведена пересадка эмбриона. Седьмой день полового цикла является оптимальным днем для работ по пересадке эмбриона реципиенту в связи с тем, что пересаживаемые эмбрионы получают от коров-доноров только на седьмой день полового цикла. Вследствие этого, для сохранения жизнеспособности эмбриона в репродуктивных органах реципиента необходимо соблюдать синхронизацию полового цикла реципиента и стадию развития эмбриона.
Процесс подготовки коров-реципиентов к пересадке эмбрионов, с учетом вышеизложенного, включает выполнение работ, связанных с половым циклом: проведение диагностики половой охоты с выявлением клинико-физиологических проявлений признаков эструса, регистрация нулевого дня полового цикла и высчитывание седьмого дня полового цикла (день планируемой пересадки эмбриона). Для этого в одном из вариантов осуществляют подбор реципиентов в спонтанной (естественной) половой охоте. Другим вариантом является искусственное вызывание половой охоты путем гормональной обработки животного, позволяющей получить контролируемое наступление полового цикла у коровы-реципиента. При этом, за один день до начала работ по индуцированию половой охоты или предварительно в день проведения таких работ оценивают состояние яичников животных с проведением диагностики ректопальпаторным способом на предмет наличия/отсутствия сформированного желтого тела естественного полового цикла. Если на поверхности яичника у коровы-реципиента отчетливо пальпируется плотная ткань грибовидной формы, то констатируют наличие хорошо сформированного желтого тела и принимают решение о введении препарата простагландинового ряда F2α, содержащего действующее вещество клопростенол, под воздействием которого происходит прерывание естественного полового цикла и начало нового полового цикла, подконтрольного человеку. Если в процессе диагностики методом пальпации обнаруживают на поверхности яичника ярко-выраженную лунку (ямку), окруженную плотной тканью, то констатируют факт недавней овуляции и начальной стадии естественного полового цикла, при которой, как показывает практика, препарат простагландинового ряда F2α не действует на организм животного. В данном случае результат диагностики трактуют как отсутствие сформированного желтого тела естественного полового цикла, при котором принимают решение не индуцировать половую охоту (не вводить животному препарат простагландинового ряда F2α). Далее, корове-реципиенту, по отношению к которой принято решение начать у нее половой цикл, вводят препарат простагландинового ряда F2α, вызьтающий через 48-72 часов приход самки животного в половую охоту. В качестве препарата простагландинового ряда F2α, содержащего действующее вещество клопростенол, применяют, например, препарат «Эстрофан» (Инструкция к препарату «Эстрофан», производитель АО «Биовета», Чешская Республика, сайт Интернет: http://www.veterinarka.ru/vetmedicaments/estrofan.html 2019 г.). День прихода реципиента в половую охоту регистрируют как условно нулевой день полового цикла, от которого высчитывают седьмой день полового цикла - день планируемой пересадки эмбриона. Таким образом, выполнение работ, связанных с половым циклом коровы-реципиента при ее подготовке к пересадке эмбриона, является завершенным.
Патентуемый способ, как было отмечено выше, проводят в ходе осуществления вышеописанной процедуры подготовки коровы-реципиента к пересадке эмбриона. Способ, согласно изобретению, проводят в два этапа: первый этап - на нулевой день полового цикла (определенный в процессе подготовки коровы-реципиента к пересадке эмбриона) и второй этап - на 7-й день полового цикла (определенный в процессе подготовки коровы-реципиента к пересадке эмбриона) непосредственно перед пересадкой эмбриона.
На нулевой день полового цикла патентуемый способ осуществляют следующим образом. После того, как в процессе подготовки коровы-реципиента к пересадке эмбриона был определен нулевой день полового цикла, в этот же нулевой день полового цикла, являющийся регламентированным для цели проведения патентуемого способа, выполняют диагностику половой охоты на предмет выявления признаков половой охоты (клинико-физиологические проявления признаков эструса) «рефлекс неподвижности» и «течка» среди всех проявившихся в течение этого нулевого дня признаков половой охоты. Для этого применяют сочетанно визуальный, вагинальный и ректальный способы выявления половой охоты, 3 раза в сутки: в утренние, дневные и в вечерние часы. Полученные данные документируют. Учитывают признаки половой охоты «рефлекс неподвижности» и «течка» только в случае, если они оба были проявлены в течение нулевого дня полового цикла, при этом, результат диагностики выражают показателем «наличие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка». Если выявлен только признак «рефлекс неподвижности», а «течка» не выявлена, то результат диагностикик выражают показателем «отсутствие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка». Аналогично тому, если зафиксирована только «течка», а «рефлекс неподвижности» отсутствует, то результат диагностки также выражают показателем «отсутствие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка». Признаки половой охоты «рефлекс неподвижности» и «течка» являются главными при установлении факта прихода коровы в половую охоту, поскольку «рефлекс неподвижности» свидетельствует о ее готовности к спариванию, а наличие признака «течка» - о формировании благоприятной маточной среды для оплодотворения коровы. Отсутствие проявления одного из указанных признаков в нулевой день полового цикла свидетельствует о сбое гормонального фона в организме животного, и, как следствие, о нарушении протекания полового цикла, что может привести к последующей эмбриональной гибели зародыша, пересаженного на 7-й день полового цикла реципиенту. В связи с изложенным, признаки половой охоты «рефлекс неподвижности» и «течка» учитываются в рамках патентуемого способа только в совокупности (если они оба были проявлены в течение нулевого дня полового цикла). Результат диагностики, выраженный показателем «наличие» или показателем «отсутствие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка», является первым предикторным критерием, используемым для прогнозирования приживляемости пересаживаемого эмбриона в рамках патентуемого способа.
На 7-й день полового цикла непосредственно перед пересадкой эмбриона у коровы-реципиента выполняют эхографическую визуализацию яичника и желтого тела с использованием оборудования для ультразвукового исследования, посредством которого осуществляют морфометрические измерения параметров яичника и желтого тела. При этом, для цели проведения данного ультразвукового исследования до момента процедуры пересадки эмбриона должен быть обеспечен период времени, предшествующий началу пересадки и достаточный для проведения этого исследования, на реализацию которого необходимо, в среднем, 10-30 минут. В данный промежуток времени у коровы-реципиента проводят упомянутое ультразвуковое исследование с использованием УЗИ-сканера с линейным датчиком, например: Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия), EASI SCAN E4 («BCF Technology)), Великобритания), Kaixin KX5200 («Xuzhou Kaixin Electronic Instrument Co., Ltd», Китай). Затем при помощи графического редактора (программа, позволяющая обрабатывать и редактировать цифровые изображения на компьютере), например, ImageJ (National Institute of Health, США), AutoCAD (Autodesk, Inc., США) проводят постпроцессинговую морфометрию полученного ультразвукового изображения, на котором схематично отображают проекции структур желтого тела и яичника и определяют их объемы с помощью функции обвода или эллипса, которая позволяет вычислять объем в одной плоскости сканирования. Проводят вычисление отношения объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении (расчетный показатель). Полученное значение расчетного показателя, являющегося вторым предикторным критерием, фиксируют документально.
Затем значение показателя, поименованного выше как первый предикторный критерий (полученного в результате диагностики половой охоты), и значение расчетного показателя (второй предикторный критерий) совместно используют в качестве прогностических критериев. Для этого вычисленное значение расчетного показателя, сопоставляют с значением показателя «наличие» (или «отсутствие») совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка» в прогностической таблице 1 и подбирают соответствующий им показатель прогнозируемой вероятности приживляемости, который выражен в двух наименованиях показателей: «вероятность наличия приживляемости» и «вероятность отсутствия приживляемости».
Согласно показателям, отраженным в прогностической таблице (таблица 1), в которой отражена корреляционная связь предикторых критериев с тем или иным значением вероятности приживляемости эмбрионов, при значении расчетного показателя 31%-50% (столбец 1, строка 2) и при значении показателя оценки клинико-физиологических проявлений признаков эструса, определенного как «наличие», прогнозируют вероятность наличия приживляемости (столбец 2, строка 2), а при всех других комбинациях значений расчетного показателя и показателя оценки клинико-физиологических проявлений признаков эструса прогнозируют вероятность отсутствия приживляемости.
Для разработки метода прогнозирования приживляемости пересаженных эмбрионов проведено исследование, в процессе которого были отобраны в качестве реципиентов коровы мясного и молочного направлений продуктивности в количестве 250 голов (в соответствии с ветеринарными и зоотехническими характеристиками). Коровы были отобраны в экспериментальную группу реципиентов по следующим ветеринарным и зоотехническим характеристикам: не имеющие селекционной ценности, отобранные не ранее, чем за 60-70 дней после отела, без признаков нарушения обмена веществ (ожирение, дистрофия и т.д.), с отсутствием признаков патологий гениталий и инфекционных заболеваний (бруцеллез, туберкулез, вирусные респираторные заболевания, лейкоз, трихомоноз, вибриоз, ящур и др.). Для индуцирования полового цикла животным был введен в соответствии с инструкцией по применению препарат простагландинового ряда F2α «Эстрофан» (Инструкция к препарату «Эстрофан», производитель АО «Биовета», Чешская Республика, сайт Интернет: http://www.veterinarka.ru/vetmtdicaments/estrofan.html, 2019 г.). После введения препарата «Эстрофан» половая охота у всех животных исследуемой группы наступила через 48-72 часов, как это было предписано инструкцией по применению препарата. У каждого из экспериментальных животных индивидуально был выявлен факт прихода в половую охоту с использованием общепринятых методов выявления признаков половой охоты («Признаки половой охоты. Приложение №1», «Основные способы выявления половой охоты у коров и телок. Приложение №2» к Условиям применения биотехнологических методов искусственного осеменения племенных коров и телок, утвержденным приказом Минсельхоза России от 18 марта 2016 года N 102. http://pravo.gov.ru/proxy/ips/?docbody=&nd=102407825&intelsearch=21.07.2016%2C+N+00 01201607220043, 2019 г. ). При этом, применяли сочетанно визуальный, вагинальный и ректальный способы выявления половой охоты, 3 раза в сутки: в утренние, дневные и в вечерние часы. Документально фиксировали результаты исследований. Факт прихода животного в половую охоту регистрировали как нулевой день полового цикла, от которого был проведен отсчет 7-го дня полового цикла, предназначенный для пересадки эмбриона.
В рамках данного исследования у каждой из коров-реципиентов на 7-й день ее полового цикла до начала процедуры пересадки эмбриона была выполнена эхографическая визуализация яичника и желтого тела с использованием оборудования для ультразвукового исследования, посредством которого были осуществлены морфометрические измерения параметров яичника и желтого тела. При этом, использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц). Фиксировали черно-белые ультразвуковые изображения репродуктивных органов. Провели постпроцессинговую обработку с использованием графического редактора ImageJ (National Institute of Health, США) и морфометрически измерили объем желтого тела и объем яичника. У каждой коровы-реципиента выполнили расчет отношения объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении (расчетный показатель). При проведении данного ультразвукового исследования был определен период времени, израсходованный на проведение этого исследования и вычисление расчетного показателя, и было выявлено, что на выполнение данных действий, предшествующих началу пересадки эмбриона реципиенту, было использовано, в среднем, 10-30 минут.
Далее, непосредственно после окончания проведения ультразвукового исследования были проведены работы по пересадке эмбрионов (по одному эмбриону на одну корову-реципиента). Эмбрион пересаживали в рог матки ипсилатерально желтому телу. Процедуру трансплантации эмбрионов осуществляли с использованием жесткого шприца-катетера модификации Кассу, изготовленного под стандартные соломинки-пайеты объемом 0,25 или 0,5 мл. Для трансплантаций использовали замороженно-оттаянные семидневные эмбрионы, полученные методом in vivo, отличного и хорошего качества на стадии развития морула и бластоциста. Порода доноров эмбрионов - герефорд. Диагностику стельности проводили на 21-25-й день после пересадки эмбриона. Для эхографической визуализации плода использовали УЗИ - сканер Kaixin КХ5200 («Xuzhou Kaixin Electronic Instrument Co., Ltd», Китай) с линейным датчиком. В качестве рабочей частоты использовали 7,5 МГц. Все эхографические изображения репродуктивных органов фиксировали в черно-белом цвете. Наличие стельности свидетельствовало о наличии приживляемости эмбриона, а отсутствие стельности - об отсутствие приживляемости эмбриона.
Результаты проведенного исследования представлены в таблице 2. Для лучшей градации результатов исследования значения расчетного показателя в таблице 2 изложили в диапазонах с шагом в 10% (столбец 1). В рамках этих диапазонов отразили общее количество коров, у которых было получено соответствующее значение их индивидуального расчетного показателя (столбец 2). Кроме того, эти животные (сгруппированные в рамках указанных диапазонов) были сгруппированы в соответствии с показателем «наличие» или «отсутствие» признаков «рефлекс неподвижности и течка», проявленных в совокупности на нулевой день полового цикла (столбец 3). Количество коров-реципиентов, ранжированных по наличию или отсутствию признаков «рефлекс неподвижности и течка», изложено в столбце 4, при этом, указанное количество коров равняется количеству пересаженных эмбрионов, так как одной корове был пересажен один эмбрион. Результат приживляемости трансплантированных эмбрионов приведен в столбцах 5 и 6. При этом, в столбце 5 указано количество прижившихся эмбрионов (шт.) из расчета на всех коров, количество которых приведено в столбце 4, а в столбце 6 указаны показатели столбца 5, исчисленные в процентном выражении.
На основании данных таблицы 2 была проанализирована корреляционная связь между показателями приживляемости трансплантированных эмбрионов и значениями расчетного показателя (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении) и показателя «наличие» или «отсутствие» признаков половой охоты «рефлекс неподвижности и течка», проявленных в совокупности. Как видно из таблицы 2, при значении расчетного показателя (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении) 30% и менее при показателе «наличие» (равно, как и при показателе «отсутствие») признаков половой охоты «рефлекс неподвижности и течка», проявленных в совокупности, свидетельствует об отсутствии приживляемости. Значение расчетного показателя в диапазоне 31-50% при показателе «наличие» признаков половой охоты «рефлекс неподвижности и течка», проявленных в совокупности, свидетельствует о наличии высокого (более 50%) уровня приживляемости (67,2-75,2%), что в рамках настоящего исследования трактуется как вероятность наличия приживляемости. Однако, в этом же диапазоне расчетного показателя 31-50%, но при показателе «отсутствие» признаков половой охоты «рефлекс неподвижности и течка», проявленных в совокупности, приживляемость пересаженных эмбрионов составляла 9,5 -17,7%, что является критически низким (менее 20%) уровнем приживляемости эмбрионов и в рамках настоящего исследования трактуется как вероятность отсутствия приживляемости. Повышение значения расчетного показателя более 50% при показателе «наличие» (равно, как и при показателе «отсутствие») признаков половой охоты «рефлекс неподвижности и течка», проявленных в совокупности, как показано в таблице 2, свидетельствует об отсутствии приживляемости. На основании результатов исследования, отраженных в таблице 2, была составлена вышеприведенная прогностическая таблица (таблица 1), при помощи которой обеспечивается прогнозирование вероятности наличия или отсутствия приживляемости трансплантированного эмбриона у коровы-реципиента в рамках патентуемого способа.
Для сравнения патентуемого способа и способа-прототипа у всех коров, участвующих в вышеприведенном исследовании, помимо оценки показателей, характеризующих патентуемый способ, был проведен учет двух показателей, присущих способу-прототипу. Для этого, в соответствии с прототипом, на нулевой день полового цикла у коров-реципиентов экспериментальной группы вычисляли индекс клинико-физиологических проявлений эструса (индекс КФПЭ) и на 7-й день полового цикла до начала работ по пересадке эмбриона у коровы-реципиента измеряли длину желтого тела (качество желтого тела). Было установлено, что предлагаемый способ повышает точность прогнозирования приживляемости эмбриона у коровы-реципиента в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов на 19,5-28,4% по сравнению с прототипом (таблица 3).
Как видно из таблицы 3, при применении патентуемого способа возможно с большой долей вероятности по сравнению со способом-прототипом прогнозировать наличие или отсутствие приживляемости трансплантированного эмбриона у коровы-реципиента, используя прогностическую таблицу (таблица 1).
Работоспособность патентуемого способа подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Корова №24351, казахская белоголовая порода (мясное направление продуктивности), возраст 4 года, была отобрана в состав группы коров-реципиентов по ветеринарным зоотехническим характеристикам. Животному для вызывания (индуцирования) половой охоты был введен в соответствии с инструкцией по применению препарат простагландинового ряда F2α «Эстрофан» (Инструкция к препарату «Эстрофан», производитель АО «Биовета», Чешская Республика, сайт Интернет: http://www.veterinarka.ru/vetmedicaments/estrofan.html, 2019 г.). После введения препарата «Эстрофан» половая охота наступила через 48 часов, и был документально зафиксирован нулевой день полового цикла в соответствии с общепринятой практикой. У данной коровы-реципиента в течение этого нулевого дня проводили диагностику половой охоты на предмет выявления наличия признака «рефлекс неподвижности» и признака «течка» среди всех проявившихся в этот день признаков половой охоты (для цели прогнозирования приживляемости пересаживаемого эмбриона). Результат диагностики зафиксировали как «отсутствие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка». На седьмой день полового цикла за 15 минут до начала пересадки эмбриона провели эндоректальное исследование яичника с желтым телом с использованием метода ультразвуковой эхографии. Использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц), фиксировали черно-белые ультразвуковые изображения репродуктивных органов. Провели постпроцессинговую обработку данных изображений с использованием графического редактора ImageJ (National Institute of Health, США), морфометрически измерили объем желтого тела и объем яичника. На основании полученных данных вычислили расчетный показатель (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении), который составил 45,4%. Согласно прогностической таблице (таблица 1), данный показатель соответствовал прогнозируемой вероятности приживляемости, выраженной показателем «вероятность отсутствия приживляемости». После завершения патентуемого способа провели процедуру пересадки эмбриона в верхнюю треть рога матки с использованием шприц-катетера модификации Кассу. На 24-й день от дня пересадки эмбриона провели диагностику стельности с использованием метода ультразвуковой эхографии. Использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц). Результат обследования показал отсутствие стельности, что свидетельствовало об отсутствии приживляемости трансплантированного эмбриона.
Пример 2. Телка симментальской породы №35462 (мясо-молочное направление продуктивности), возраст 14 месяцев, была отобрана в состав коров-реципиентов по ветеринарным и зоотехническим характеристикам. Животному для вызывания (индуцирования) половой охоты был введен в соответствии с инструкцией по применению препарат простагландинового ряда F2α «Эстрофан» (Инструкция к препарату «Эстрофан», производитель АО «Биовета», Чешская Республика, сайт Интернет: http://www.veterinarka.ru/vetmedicaments/estrofan.html, 2019 г.). После введения препарата «Эстрофан» половая охота наступила через 56 часов, и был документально зафиксирован нулевой день полового цикла в соответствии с общепринятой практикой. У данной коровы-реципиента в течение этого нулевого дня проводили диагностику половой охоты на предмет выявления наличия признака «рефлекс неподвижности» и признака «течка» среди всех проявившихся в этот день признаков половой охоты (для цели прогнозирования приживляемости пересаживаемого эмбриона). Результат диагностики зафиксировали как «наличие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка». На седьмой день полового цикла за 20 минут до начала пересадки эмбриона провели эндоректальное исследование яичника с желтым телом с использованием метода ультразвуковой эхографии. Использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц), фиксировали черно-белые ультразвуковые изображения репродуктивных органов. Провели постпроцессинговую обработку данных изображений с использованием графического редактора ImageJ (National Institute of Health, США), морфометрически измерили объем желтого тела и объем яичника. На основании полученных данных вычислили расчетный показатель (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении), который составил 31,8%. Согласно прогностической таблице (таблица 1), данный показатель соответствовал прогнозируемой вероятности приживляемости, выраженной показателем «вероятность наличия приживляемости». После завершения патентуемого способа провели процедуру пересадки эмбриона в верхнюю треть рога матки с использованием шприц-катетера модификации Кассу. На 22-й день от дня пересадки эмбриона провели диагностику стельности с использованием метода ультразвуковой эхографии. Использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц). Результат обследования показал наличие стельности, что свидетельствовало о приживляемости трансплантированного эмбриона.
Пример 3. Телка голштинской породы №35462 (молочное направление продуктивности), возраст 15 месяцев, была отобрана в состав коров-реципиентов по ветеринарным и зоотехническим характеристикам. Животному для вызывания (индуцирования) половой охоты был введен в соответствии с инструкцией по применению препарат простагландинового ряда F2α «Эстрофан» (Инструкция к препарату «Эстрофан», производитель АО «Биовета», Чешская Республика, сайт Интернет: http://www.veterinarka.ru/vetmedicaments/estrofan.html, 2019 г.). После введения препарата «Эстрофан» половая охота наступила через 72 часа, и был документально зафиксирован нулевой день полового цикла в соответствии с общепринятой практикой. У данной коровы-реципиента в течение этого нулевого дня проводили диагностику половой охоты на предмет выявления наличия признака «рефлекс неподвижности» и признака «течка» среди всех проявившихся в этот день признаков половой охоты (для цели прогнозирования приживляемости пересаживаемого эмбриона). Результат диагностики зафиксировали как «наличие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка». На седьмой день полового цикла за 10 минут до начала пересадки эмбриона провели эндоректальное исследование яичника с желтым телом с использованием метода ультразвуковой эхографии. Использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц), фиксировали черно-белые ультразвуковые изображения репродуктивных органов. Провели постпроцессинговую обработку данных изображений с использованием графического редактора ImageJ (National Institute of Health, США), морфометрически измерили объем желтого тела и объем яичника. На основании полученных данных вычислили расчетный показатель (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении), который составил 28,5%. Согласно прогностической таблице (таблица 1), данный показатель соответствовал прогнозируемой вероятности приживляемости, выраженной показателем «вероятность отсутствия приживляемости». После завершения патентуемого способа провели процедуру пересадки эмбриона в верхнюю треть рога матки с использованием шприц-катетера модификации Кассу. На 24-й день от дня пересадки эмбриона провели диагностику стельности с использованием метода ультразвуковой эхографии. Использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц). Результат обследования показал отсутствие стельности, что свидетельствует об отсутствии приживляемости трансплантированного эмбриона.
Пример 4. Корова породы герефорд №35462 (мясное направление продуктивности), возраст 3 года, была отобрана в состав коров-реципиентов по ветеринарным и зоотехническим характеристикам. Животному для вызывания (индуцирования) половой охоты был введен в соответствии с инструкцией по применению препарат простагландинового ряда F2a «Эстрофан» (Инструкция к препарату «Эстрофан», производитель АО «Биовета», Чешская Республика, сайт Интернет: http://www.veterinarka.ru/vetmedicaments/estrofan.html, 2019 г.). После введения препарата «Эстрофан» половая охота наступила через 72 часа, и был документально зафиксирован нулевой день полового цикла в соответствии с общепринятой практикой. У данной коровы-реципиента в течение этого нулевого дня проводили диагностику половой охоты на предмет выявления наличия признака «рефлекс неподвижности» и признака «течка» среди всех проявившихся в этот день признаков половой охоты (для цели прогнозирования приживляемости пересаживаемого эмбриона). Результат диагностики зафиксировали как «наличие» совокупности признаков «рефлекс неподвижности и течка». На седьмой день полового цикла за 15 минут до начала пересадки эмбриона провели эндоректальное исследование яичника с желтым телом с использованием метода ультразвуковой эхографии. Использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц), фиксировали черно-белые ультразвуковые изображения репродуктивных органов. Провели постпроцессинговую обработку данных изображений с использованием графического редактора ImageJ (National Institute of Health, США), морфометрически измерили объем желтого тела и объем яичника. На основании полученных данных вычислили расчетный показатель (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении), который составил 56,9%. Согласно прогностической таблице (таблица 1), данный показатель соответствовал прогнозируемой вероятности приживляемости, выраженной показателем «вероятность отсутствия приживляемости». После завершения патентуемого способа провели процедуру пересадки эмбриона в верхнюю треть рога матки с использованием шприц-катетера модификации Кассу. На 24-й день от дня пересадки эмбриона провели диагностику стельности с использованием метода ультразвуковой эхографии. Использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц). Результат обследования показал отсутствие стельности, что свидетельствовало об отсутствии приживляемости трансплантированного эмбриона.
Предлагаемый способ позволяет повысить на 19,5-28,4% точность прогнозирования результативности приживляемости пересаживаемых эмбрионов коровам-реципиентам. Способ достаточно прост и доступен для производственной практики животноводческих хозяйств.