СПОСОБ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО ОКРАШИВАНИЯ ТОТАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ОБРАЗЦОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ (ВАРИАНТЫ)

2
2
1. Способ иммуногистохимического окрашивания тотальных препаратов образцов биологической ткани, включающий фиксацию ткани раствором параформальдегида, постфиксацию, дегидратацию в метаноле, регидратацию в растворах метанола, пермеабилизацию, отмывку фосфатным буфером, инкубацию в растворе первичных антител, отмывку в буфере, инкубацию в растворе флуоресцентных вторичных антител, отмывку в буфере, дегидратацию, просветление в смеси бензил бензоата:бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1, отличающийся тем, что постфиксацию сначала проводят 0,5-1%-ным параформальдегидом в течение 24-48 ч при 4°C, а затем после трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, в растворе 20%-ного диметилсульфоксида в 100%-ном метаноле в течение 1-2 ч при температуре 4-20°C, после этого образец ткани отбеливают в растворе, содержащем 100%-ный метанол:диметилсульфоксид:30% HO в соотношении 4:1:1, в течение 2-4 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, затем отмывают 3 раза по 60 мин в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживают не менее, чем на 1 час при -70…-80°C, после чего регидратируют последовательно в 50, 25 и 12,5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 45-60 мин в каждом при комнатной температуре, затем образцы трижды отмывают от метанола фосфатным буфером, причем два раза отмывают по 1-2 ч при комнатной температуре, а последнюю отмывку проводят в течение ночи при 4°C, последующую пермеабилизацию образца проводят в фосфатном буфере, содержащем 2%-ный Triton Х-100, 5%-ную нормальную сыворотку, 5%-ный диметилсульфоксид, в течение 2 ч при комнатной температуре, затем образец отмывают трижды в фосфатном буфере, содержащем 0,2%-ный Triton Х-100, причем два раза отмывают по 30-60 мин при комнатной температуре, а последнюю отмывку проводят в течение ночи при 4°C, после этого проводят инкубацию последовательно в растворах первичных и вторичных антител, приготовленных на буфере, состоящем из 0,05М Tris-HCl с pH 7,5; 0.15М NaCl; 0,2% Triton X-100, 5% диметилсульфоксид и 2,5-5,0% нормальной сыворотки животного-хозяина вторичных антител, при 4°C в течение 48-72 ч, с отмывками после каждой инкубации в буфере, состоящем из 0,05М Tris-HCl с pH 7,5; 0,15М NaCl; 0,2% Triton X-100, сначала 3 раза по 60 мин при комнатной температуре, а затем в течение ночи при 4°C, окрашенные образцы дегидратируют последовательно в 50, 96%-ных растворах этанола в фосфатном буфере по 45-60 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживают сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2-3 раза по 45-60 мин, а затем в 2-бутоксиэтаноле при 4°C в течение 12-18 ч, дегидратированные образцы просветляют при комнатной температуре в течение 3-4 ч, способ окрашивания, начиная с операции постфиксации, проводят при помешивании со скоростью 650-800 об/мин.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ткань фиксируют методом транскардиальной перфузии 0,5-1% раствором параформальдегида, охлажденным до 4-10°C.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что ткань фиксируют методом погружения образца в 0,5-1% раствор параформальдегида в течение 24-48 ч при 4°C.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что дегидратированные образцы до окрашивания накапливают и хранят в 100% метаноле в условиях глубокой заморозки при -70…-80°C.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что дегидратированные образцы до окрашивания просветляют в смеси бензил бензоат:бензиловый спирт в соотношении 2:1 в течение 30 мин при комнатной температуре до состояния полной прозрачности, а затем экспонируют прозрачные образцы под ультрафиолетом в течение 1 ч, при 4-10°C, после чего препараты отмывают дважды в абсолютном метаноле в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем регидратируют и инкубируют с антителами.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что растворы первичных и/или вторичных антител дополнительно содержат 0,5-1% сапонин.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что инкубацию с антителами проводят в течение 4-7 суток
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что инкубационные растворы первичных и вторичных антител заменяют на свежие 2-3 раза через 24-48 ч инкубации.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что инкубационные растворы первичных и вторичных антител освежают добавлением новой порции антител.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что образцы ткани перед просветлением хранят в 2-бутоксиэтаноле при 4°C.
2
2
11. Способ иммуногистохимического окрашивания тотальных препаратов образцов биологической ткани, включающий фиксацию ткани раствором параформальдегида, постфиксацию, дегидратацию в метаноле, регидратацию в растворах метанола, пермеабилизацию, отмывку фосфатным буфером, инкубацию в растворе первичных антител, отмывку в буфере, дегидратацию, просветление в смеси бензил бензоата:бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1, отличающийся тем, что постфиксацию сначала проводят 0,5-1%-ным параформальдегидом в течение 24-48 ч при 4°C, а затем после трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, в растворе 20%-ного диметилсульфоксида в 100%-ном метаноле в течение 1-2 ч при температуре 4-20°C, после этого образец ткани отбеливают в растворе, содержащем 100%-ный метанол:диметилсульфоксид:30% HO в соотношении 4:1:1, в течение 2-4 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, затем отмывают 3 раза по 60 мин в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживают не менее, чем на 1 час при -70…-80°C, после чего регидратируют последовательно в 50, 25 и 12,5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 45-60 мин в каждом при комнатной температуре, затем образцы трижды отмывают от метанола фосфатным буфером, причем два раза отмывают по 1-2 ч при комнатной температуре, а последнюю отмывку проводят в течение ночи при 4°C, последующую пермеабилизацию образца проводят в фосфатном буфере, содержащем 2%-ный Triton Х-100, 5%-ную нормальную сыворотку, 5%-ный диметилсульфоксид, в течение 2 ч при комнатной температуре, затем образец отмывают трижды в фосфатном буфере, содержащем 0,2%-ный Triton Х-100, причем два раза отмывают по 30-60 мин при комнатной температуре, а последнюю отмывку проводят в течение ночи при 4°C, после этого проводят инкубацию в растворе флуоресцентно-меченных первичных антител, приготовленных на буфере, состоящем из 0,05М Tris-HCl с pH 7,5; 0,15М NaCl; 0,2% Triton X-100, 5% диметилсульфоксид и 2,5-5,0% нормальной сыворотки, при 4°C в течение 48-72 ч, после чего окрашенный образец отмывают в буфере, состоящем из 0,05М Tris-HCl с pH 7,5; 0,15М NaCl; 0,2% Triton X-100, сначала 3 раза по 60 мин при комнатной температуре, а затем в течение ночи при 4°C, образцы дегидратируют последовательно в 50, 96%-ных растворах этанола в фосфатном буфере по 45-60 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживают сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2-3 раза по 45-60 мин, а затем в 2-бутоксиэтаноле при 4°C в течение 12-18 ч, дегидратированные образцы просветляют при комнатной температуре в течение 3-4 ч, способ окрашивания, начиная с операции постфиксации, проводят при помешивании со скоростью 650-800 об/мин.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что ткань фиксируют методом транскардиальной перфузии 0,5-1% раствором параформальдегида, охлажденным до 4-10°C.
13. Способ по п.11, отличающийся тем, что ткань фиксируют методом погружения образца в 0,5-1% раствор параформальдегида в течение 24-48 ч при 4°C.
14. Способ по п.11, отличающийся тем, что дегидратированные образцы до окрашивания накапливают и хранят в 100% метаноле в условиях глубокой заморозки при -70…-80°C.
15. Способ по п.11, отличающийся тем, что дегидратированные образцы до окрашивания просветляют в смеси бензил бензоат:бензиловый спирт в соотношении 2:1 в течение 30 мин при комнатной температуре до состояния полной прозрачности, а затем экспонируют прозрачные образцы под ультрафиолетом в течение 1 ч, при 4-10°C, после чего препараты отмывают дважды в абсолютном метаноле в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем регидратируют и инкубируют с антителами.
16. Способ по п.11, отличающийся тем, что раствор первичных антител дополнительно содержит 0,5-1% сапонин.
17. Способ по п.11, отличающийся тем, что инкубацию с антителами проводят в течение 4-7 суток
18. Способ по п.11, отличающийся тем, что инкубационный раствор первичных антител заменяют на свежий 2-3 раза через 36-48 ч инкубации.
19. Способ по п.11, отличающийся тем, что инкубационный раствор первичных антител освежают добавлением новой порции антител.
20. Способ по п.11, отличающийся тем, что образцы ткани перед просветлением хранят в 2-бутоксиэтаноле при 4°C.