СПОСОБ НЕИНВАЗИВНОЙ ОЦЕНКИ СРЕДНЕГО УРОВНЯ НЕЙРОТРОФИЧЕСКОГО ФАКТОРА МОЗГА (BDNF) В ПЛАЗМЕ КРОВИ НА ОСНОВЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ МИКРОЭЛЕМЕНТНОГО АНАЛИЗА ВОЛОС
METHOD FOR NON-INVASIVE ASSESSMENT OF THE AVERAGE LEVEL OF NEUROTROPHIC FACTOR OF BRAIN (BDNF) IN BLOOD PLASMA BASED ON INDICATORS OF MICROELEMENT HAIR ANALYSIS

Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии и может быть использовано при лабораторной диагностике.
Brain-derived neurotrophicfactor (BDNF) - основной нейротрофический фактор мозга, стимулирующий нейропротекцию, развитие и восстановление нейронов [1]. Оценка уровня BDNF помогает прогнозировать возможные исходы и эффективность реабилитационных мероприятий при заболеваниях, сопровождающихся поражением нервной системы (инсульт, сосудистая деменция, нейродегенеративные заболевания), а также оценивать результативность терапии депрессии и когнитивных нарушений [2, 3]. BDNF в сыворотке крови - динамичный, флюктуирующий показатель и зависит от таких факторов как физическая активность, нейрональная активность, уровень глюкозы крови [4]. Этим обусловлена низкая диагностическая ценность однократного определения уровня BDNF в сыворотке крови.
Для объективной оценки состояния пациента (до начала и в динамике терапии) необходимо оценивать среднее значение уровней BDNF. На практике это подразумевает многократный забор крови на анализ, построение кривой динамики концентраций BDNF и нахождение среднего значения, что является весьма трудоемкой, дорогостоящей и тяжелой для пациента процедурой.
В настоящее время не существует способа, позволяющего неинвазивными методами оценивать уровень нейротрофического фактора мозга (BDNF) в плазме крови. Известны инвазивные способы определения уровня BDNF в плазме крови методом ИФА с использованием следующих тест систем типа «сэндвич»: Aviscera-Bioscience, Biosensis, Millipore-ChemiKineTM, Promega-Emax, R&D-System-Quantikine [5].
Способ определения уровня BDNF в плазме крови на основе количественного иммуноферментного метода сэндвичевого типа твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA) является вариантом непрямого неконкурентного гетерогенного ИФА, в котором в качестве иммуносорбента выступает антитело. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. Ферментативная реакция (цветная реакция) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител. Результат оценивается спектрофотометрически или визуально.
На наш взгляд, применение вышеназванного способа определения уровня BDNF в плазме крови имеет следующие недостатки:
1) Инвазивность (необходимость забора венозной крови у пациента);
2) Недостаточная информативность однократного определения уровня BDNF в плазме крови с точки зрения клинической медицины;
3) Невозможность единовременного определения среднего уровня BDNF необходимого врачам-клиницистам;
4) Необходимость многократных повторений в течение длительного промежутка времени для определения среднего уровня BDNF необходимого врачам-клиницистам;
5) Низкая доступность анализа в связи с отсутствием необходимых тест-систем в большинстве лабораторий страны.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка нового неинвазивного способа оценки среднего уровня нейротрофического фактора мозга (BDNF) в плазме крови, позволяющего избежать вышеперечисленных недостатков.
Нами предлагается новый способ неинвазивной оценки среднего уровня нейротрофического фактора мозга (BDNF) в плазме крови на основе показателей микроэлементного анализа волос, который позволяет достигнуть поставленной цели.
Предлагается способ неинвазивной оценки среднего уровня нейротрофического фактора мозга (BDNF) в плазме крови на основе показателей микроэлементного анализа волос, включающий определение уровней содержания фосфора, меди и лития в образцах волос длиной 1 см от корня волоса состриженных с затылочной части головы, образцов может быть в количестве от 3 до 5. Особенностью предлагаемого способа является то, что на основании этих данных рассчитывают средний уровень содержания BDNF в плазме крови по формуле:
BDNF(пкг/мл)=33*P(мкг/кг)+345*Cu(мкг/кг)+48178*Li(мкг/кг)+23810.
Результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в следующем: использование предлагаемого метода неинвазивной оценки среднего уровня BDNF в плазме крови на основе показателей микроэлементного анализа волос позволяет определить средний уровень BDNF за промежуток времени равный одному месяцу до момента забора волос на анализ, отслеживать основные тенденции развития патологических процессов нервной системы, объективизировать нейротрофическую и нейропротективную активность.
В исследовании принимали участие, после подписания информированного согласия, здоровые добровольцы (n=50), средний возраст 22 года (студенты медицинской академии), 54% юношей. Для каждого из участников были собраны значения 56 показателей состояния, в т.ч. демографических (возраст, пол, этническая принадлежность), неврологических (двигательные функции лицевой мускулатуры, мускулатуры конечностей), результаты психологического тестирования (методика А.Р. Лурия заучивания 10 слов, методика «таблица Шульте»: эффективность работы, психическая устойчивость).
Всем обследуемым каждые 5 дней в течение 1 месяца (30 дней) проводился забор крови для анализа на BDNF. Забор крови осуществлялся натощак с 8:00 до 9:00 из локтевой вены в количестве 5 мл в вакуумные пробирки (вакутейнеры) без наполнителя. Пробирки маркировали, плазма крови выделялась по стандартной методике и помещалась в холодильник. Для исследования уровня BDNF в плазме крови на основе количественного иммуноферментного метода сэндвичевого типа твердофазным иммуноферментным методом (ELISA) использованы наборы для количественного определения мозгового нейротрофического фактора (BDNF) человека в плазме; использовался иммуноферментный фотомер ImmunoGlum-2100 (США). Использованы стандарты - 3 флакона (8нг/флакон), содержащих рекомбинантный человеческий BDNF в белковом буфере с консервантами, лиофилизированный на 96 проб. Предварительное одностадийное разбавление образцов в соотношении 1:20. Общее время инкубации - 210 мин при 20-25 градусах Цельсия. Минимальное среднее детектируемое количество BDNF - менее 20 пг/мл. По результатам всех проб для каждого обследуемого был рассчитан средний уровень BDNF в плазме крови за 1 месяц.
На 30 день у всех обследуемых были получены образцы волос для проведения анализа на содержание 39 микроэлементов. Образцы получали путем состригания отрезков волос длиной 1 см от корня волоса с 3-5 мест на затылочной части головы, помещали в специальные конверты, затем пакеты с идентификационными записями. Анализ образцов волос проводили методом АЭС-ИСАП согласно описанной ниже методике. Анализировалось содержание Li, В, Na, Mg, Al, Si, P, K, Ca, Sc, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Ge, As, Se, Rb, Sr, Mo, Ag, Cd, Sn, Sb, Те, Cs, Ba, Hg, Tl, Pb, Bi, Th, U. Образцы волос были высушены при t=105°С в течение 6 ч в сушильном шкафу. После этого было проведено взвешивание на аналитических весах Perkin Elmer AD-6 Autobalance с точностью до 0,1 мг. Навески материала переносили в автоклав (тефлоновый сосуд Весселя) и добавляли 1 мл 70% HNO3 (ОСЧ), прошедшей вторичную перегонку, затем автоклав помещался в микроволновую систему пробоподготовки MD-2000 (СЕМ, США) обеспечивающее высокое давление и температуру кипения HNO3. После охлаждения полученных растворов в течение 60 минут от них были отобраны образцы в объеме 1 мл в пластиковые сосуды и разбавлены в 5 раз бидистиллированной и деионизированной водой. Для контроля чистоты анализа отдельно был приготовлен раствор "холостой пробы" с содержанием HNO3, H2O2, H2O в пропорциях, идентичных содержанию этих реагентов в исследуемых образцах. Описанная выше методика пробоподготовки с использованием СВЧ нагрева в тефлоновых "бомбах" позволяет проводить быстрое "вскрытие" биопробы, с высокой эффективностью разложить биологическую матрицу, влияющую на результаты анализа. В качестве внутреннего стандарта в растворы вводили индий в концентрации 25 мкг/л. Калибровочные растворы были приготовлены из стандартных растворов фирмы VTRC с известным содержанием в диапазоне 5- 1000 мкг/л (10-7%). Полученные растворы анализировались на масс-спектрометре с ионизацией в индуктивно-связанной плазме VG Plasma Quad PQ2 Turbo (Англия), рабочая мощность СВЧ генератора 1,3 кВт, расход плазмообразующего газа (аргон) 14 л/мин, расход транспортирующего газа 0,89 мл/мин. Проводилось 3 экспозиции каждого образца, время интегрирования сигнала 60 с. Результаты анализа "холостой пробы" автоматически вычитались в анализе. Единицы измерения - мкг/кг (ppb). Данный метод позволяет с высокой точностью проводить количественный анализ содержания элементов периодической системы Д.И. Менделеева в волосах и других биосубстратах.
Нами был проведен корреляционный и регрессионный анализ уровней содержания 39 микроэлементов в волосах и рассчитанного среднего уровня нейротрофического фактора BDNF в плазме крови с использованием стандартных методик однопараметрического регрессионного анализа, описанных в учебниках для ВУЗов [6]. В результате экспериментально нами были установлены достоверные прямые корреляции между средним уровнем BDNF в крови и содержанием фосфора, меди и лития в волосах (показано на фиг. 1-фиг. 4).
Установлено существование корреляции между содержанием фосфора в волосах и концентрацией BDNF в плазме крови (Фиг. 1, R2=0.13, т.е. коэффициент корреляции R=0.36). Регрессионная формула показывает, что увеличению содержания фосфора в волосах на каждые 10 мкг/кг соответствует повышение уровней BDNF в крови, в среднем, на 500 пкг/мл.
2
На Фиг. 1. показана корреляция между содержанием фосфора в волосах и концентрацией BDNF в плазме крови. Показана регрессионная формула и значение квадрата коэффициента корреляции (R).
2
Установлено существование корреляции между содержанием меди в волосах и концентрацией BDNF в плазме крови (Фиг. 2, R=0.13, т.е. коэффициент корреляции R=0.36). Регрессионная формула показывает, что увеличению содержания меди в волосах на каждые 10 мкг/кг соответствует повышение уровней BDNF в крови, в среднем, на 4725 пкг/мл.
2
Фиг. 2. - корреляция между содержанием меди в волосах и концентрацией BDNF в плазме крови. Показана регрессионная формула и значение квадрата коэффициента корреляции (R).
2
Установлено существование корреляции между содержанием лития в волосах и концентрацией BDNF в плазме крови (Фиг. 3., R=0.30, т.е. коэффициент корреляции R=0.55). Регрессионная формула показывает, что увеличению содержания лития в волосах на каждые 0.01 мкг/кг соответствует повышение уровней BDNF в крови почти на 800 пкг/мл.
2
На Фиг. 3. показана корреляция между содержанием лития в волосах и концентрацией BDNF в плазме крови. Показана регрессионная формула и значение квадрата коэффициента корреляции (R).
Таким образом, проведенный корреляционный и регрессионный анализ показал, что среднемесячные уровни нейротрофического фактора мозга (BDNF) в плазме крови прямо пропорциональны уровням фосфора, меди и лития в волосах.
Выявленные таким образом закономерности имеют диагностическое значение и пригодны для оценки среднего уровня BDNF в плазме крови за 1 месяца на основании показателей содержания фосфора, меди и лития в волосах. Методом регрессионного анализа разработана и протестирована регрессионная формула, позволяющая рассчитать средний уровень BDNF в плазме крови на основании уровней этих трех элементов в волосах:
BDNF(пкг/мл)=33*Р(мкг/кг)+345*Cu(мкг/кг)+48178*Li(мкг/кг)+23810. Данная формула характеризуется приемлемыми показателями качества регрессии (коэффициент корреляции между вычисленными (теоретическими) и экспериментально определенными уровнями BDNF составил R=0.52, ср. кв. откл. уровней BDNF - 4566 пкг/мл, Рис. 4).
Фиг. 4. Корреляция между экспериментально измеренными и вычисленными уровнями BDNF.
Для проверки точности предлагаемого способа оценки среднего уровня BDNF на основе микроэлементного анализа волос использовалась методика «скользящего контроля» (кросс-валидация) - стандартная методика тестирования моделей, которая уже более 30 лет используется в математической статистике и в машинном обучении [7].
Способ неинвазивной оценки среднего уровня нейротрофического фактора мозга (BDNF) в плазме крови на основе показателей микроэлементного анализа волос с использованием предлагаемой формулы осуществляется следующим образом. Проводят анализ отрезков волос длиной 1 см от корня волоса с 3-5 мест на затылочной части головы на содержание фосфора, меди и лития. Полученные значения подставляют в формулу
BDNF(пкг/мл)=33*Р(мкг/кг)+345*Cu(мкг/кг)+48178*Li(мкг/кг)+23810 и рассчитывают средний уровень BDNF за 1 месяц.
При использовании предлагаемой формулы возможное отклонение расчетного уровня BDNF от истинного составляет, в среднем, 4566 пкг/мл.
Таким образом, на основании предложенного метода возможна достаточно точная оценка среднего уровня BDNF плазмы крови неинвазивным методом.
Преимущества предлагаемого способа оценки среднего уровня BDNF плазмы крови:
1) неинвазивость (забор крови из вены не требуется);
2) позволяет оценить средний уровень BDNF плазмы на основании однократного анализа волос на микроэлементы;
3) доступен для проведения благодаря широкой распространенности тестов на содержание микроэлементов в волосах;
4) прост в выполнении и не требует сложных и экономически затратных технологических процессов, что имеет преимущество для широкого внедрения в практику здравоохранения.
Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет в течение короткого времени неинвазивно оценить средний уровень BDNF.
Источники информации
1. A BDNF autocrine loop in adult sensory neurons prevents cell death / A. Acheson, J.C. Conover, J.P. Fandl [et al.] // Nature. - 1994. - Vol. 374. - P. 450-453. doi: 10.1038/374450a0
2. Novel Blood-Based Biomarkers of Cognition, Stress, and Physical or Cognitive Training in Older Adults at Risk of Dementia: Preliminary Evidence for a Role of BDNF, Irisin, and the Kynurenine Pathway / , D. Laptinskaya, P. Fissler [et al.] // Journal of Alzheimers Disease. - 2017. - Vol. 59. - P. 1097-1111. doi: 10.3233/JAD-170447
3. Molecular mechanisms of cell death: central implication of ATP synthase in mitochondrial permeability transition / М. Bonora, M.R. Wieckowsk, C. Chinopoulos [et al.] // Oncogene. - 2015. - Vol. 34. - P. 1475-1486. doi: 10.1038/onc. 2014.96
4. Marosi, K. BDNF mediates adaptive brain and body responses to energetic challenges / K. Marosi, M.P. Mattson // Trends in endocrinology metabolism. - 2014. - Vol. 25. - P. 89-98. doi: 10.1016/j.tem. 2013.10.006
5. A method for reproducible measurements of serum BDNF: comparison of the performance of six commercial assays / A. Polacchini, G. Metelli, R. Francavilla [et al.] // Scientific Reports. - 2015. - Vol. 5: 17989. doi: 10.1038/srep 17989
6. Freedman, D.A. Statistical Models: Theory and Practice (revised edition) / D.A. Freedman. - Cambridge: Cambridge University Press, 2009. - 458 p.
7. Kohavi, R. A study of cross-validation and bootstrap for accuracy estimation and model selection / R. Kohavi // Proceedings of the Fourteenth International Joint Conference on Artificial Intelligence. - San Mateo, CA: Morgan Kaufmann Publishers Inc, 1995. Vol. 25. - P. 1137-1143. ISBN: l-55860-363-8