Способ выявления и количественной оценки содержания ДНК U. diversum методом ПЦР в реальном времени в материале от взрослого крупного рогатого скота
METHOD FOR DETECTING AND QUANTIFYING DNA CONTENT OF UREAPLASMA DIVERSUM BY PCR METHOD IN REAL TIME IN ADULT CATTLE MATERIAL

Изобретение относится к области ветеринарии, микробиологии и биотехнологии может быть использовано для диагностики заболеваний человека и животных вирусной, бактериальной и др. этиологии.
Известен способ выявления и количественной оценки содержания ДНК U. diversum, заключающийся в постановке ПЦР в реальном времени с праймерами к гену 16S рРНК U. diversum с последующей оценкой содержания ДНК U. diversum в пробе. Количественная оценка в данном случае проводится путем сравнения порогового цикла детекции продуктов ПЦР с калибровочного графика. (Marques L.M., Amorim А.Т., Martins Н.В. et al. A quantitative TaqMan PCR assay for the detection of Ureaplasma diversum // Vet Microbiol. - 2013. - V. 167. N. 3-4. - P. 670-674).
Недостатками вышеизложенного способа количественной оценки содержания ДНК U. diversum являются:
- отсутствие внутреннего контроля качества препарата ДНК;
- отсутствие учета концентрации клеток крупного рогатого скота в исходном препарате, который позволяет сделать вывод о тяжести инфекции U. diversum.
Изобретение направлено на разработку способа выявления и количественной оценки содержания ДНК U. diversum методом ПЦР в реальном времени в материале, при этом обеспечено повышение точности количественной оценки содержания ДНК U. diversum в исследуемом препарате ДНК и возможность осуществления контроля качества исследуемого материала одновременно с проведением диагностического исследования.
Повышение точности обеспечено за счет учета концентрации ДНК клеток крупного рогатого скота в образце, отражающего его подлинность и качество отбора материала.
Способ предусматривает отбор клинического материала и постановку ПЦР в реальном времени с праймерами U. diversum с последующей оценкой содержания ДНК U. diversum в пробе.
В отличие от прототипа отбор клинического образца осуществляют от коровы со слизистой оболочки нижнего свода влагалища с захватом области ямки клитора и областей локализации пузырьковой сыпи при ее наличии, хранение в транспортной питательной среде, представляющей собой среду "УРЕАПЛАЗМА-СРЕДА". Одновременно проводят две реакции ПЦР в реальном времени, причем одна с праймерами к фрагменту гена 16S рРНК метилтрансферазы U. diversum, а вторая к фрагменту гена GAPDH быка домашнего (Bos taurus) с последующим анализом соотношения содержания ДНК U. diversum и ДНК быка домашнего, оцениваемым на основании соотношения пороговых циклов выявления продукта ПЦР в первой и второй реакции, при значениях соотношения больше нуля и меньше единицы делают вывод об активном инфекционном процессе U. diversum, при значениях больше единицы делают вывод о вялотекущей инфекции или носительстве.
Значения пороговых циклов определяются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени. Цикл, на котором наблюдается пересечение кривой флуоресценции на соответствующем с пороговой линией соответствует пороговому циклу детекции ДНК в образце.
«УРЕАПЛАЗМА-СРЕДА» выпускается ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, ее состав описан в патенте РФ 2568062.
Способ реализуется следующим образом: при постановке ПЦР в реальном времени используется смесь праймеров и зондов с флуоресцентными метками к гену 16S рРНК метилтрансферазы U. diversum и к гену GAPDH домашнего быка (Bos taurus). Реакция проводится с одновременной детекцией накопления продукта. После завершения реакции оцениваются следующие показатели: цикл ПЦР на котором происходит детектируемое накопление продукта реакции (пороговый цикл) детекции продукта реакции с праймерами и зондом к гену 16S рРНК метилтрансферазы U. diversum, пороговый цикл реакции с праймерами и зондом к гену GAPDH домашнего быка. Путем сравнения со стандартными образцами проводится оценка абсолютного содержания ДНК U. diversum и быка домашнего в исследуемом образце. Путем расчета соотношения двух этих показателей оценивается относительное содержание ДНК U. diversum в исследуемом образце, отражающее инфекционную нагрузку. На основе оценки накопления продукта реакции с праймерами и зондом к гену GAPDH домашнего быка осуществляется контроль качества исследуемого образца (препарата ДНК) и принимается решение о достоверности полученного результата. Положительным результатом считается присутствие накопления продукта ПЦР на матрице ДНК U. diversum, детектируемое до 40 цикла.
Для доказательства возможности промышленного использования изобретения были проведены исследования, описанные ниже.
У 32 коров с симптоматикой, характеризующейся наличием мелкой сыпи в области наружных половых органов без симптомов респираторных заболеваний. С целью исследования были взяты мазки с поверхности слизистых оболочек носовой полости (32 образца), преддверия влагалища (27 образцов) и влагалища (31 образец), всего 92 образца. Материал отбирался с помощью зондов. Для забора мазка из носовой полости зонд вводился на глубину 12-14 см. Забор мазка из преддверия влагалища проводился в области нижнего свода влагалища из ямки клитора.
Полученные образцы были исследованы на предмет носительства U. diversum с помощью предложенного метода. Результаты представлены в таблице №1.
При постановке ПЦР в реальном времени с праймерами к гену 16S рРНК метилтрансферазы U. diversum и к гену GAPDH быка домашнего, анализ графиков накопления продукта ПЦР для количественной оценки содержания ДНК U. diversum позволил выявить ДНК U. diversum в 18 образцах, анализ графиков накопления продукта ПЦР для количественной оценки содержания ДНК быка домашнего позволил выявить ДНК быка домашнего в 88 образцах. На основании выявления ДНК U. diversum установлено наличие патогена в 18 образцах. На основании выявления ДНК быка домашнего в дальнейший анализ было включено 88 образцов. 2 образца, не содержащих ДНК быка домашнего (2,17%) были признаны нерепрезентативными и исключены из исследования. В обоих образцах ДНК U. diversum выявлено не было, таким образом было исключено два ложноотрицательных результата. Пороговые циклы реакции представлены в табл. 1. Помимо этого была проведена реакция ПЦР с контрольными положительным и контрольным отрицательным образцами (ПКО и ВКО). В ПКО было установлено накопление продуктов ПЦР на матрице обоих мишеней, в ОКО результат реакции был отрицательным, что позволяет расценивать полученные данные как достоверные.
Анализ соотношения содержания ДНК U. diversum и быка домашнего, рассчитанный на основании значений пороговых циклов (ДНК U. diversum/быка домашнего) показал значения от 1,32 до 0,84 (табл. 1). Значения в диапазоне от 0 до 1 характерны для случаев, когда содержание уреаплазм в образце превышает содержание клеток хозяина. Более высокие значения соотношения пороговых циклов характерны для случаев, когда число уреаплазм меньше числа клеток. На основании анализа установлено, что в 9 образцах от 8 коров содержание уреаплазм выше, чем содержание клеток животного.
*"-" - образец отсутствует.
Учет содержания клеток животного (быка домашнего) образца при оценке инфекционной нагрузки U. diversum заключается в том, что в исследуемой пробе проводится количественная оценка содержания ДНК быка домашнего. Содержание ДНК быка домашнего в пробе отражает количество клеток в образце. Расчет соотношения содержания ДНК U. diversum и ДНК быка домашнего позволяет оценить инфекционную нагрузку, что может иметь значение при дифференциации носительства и инфекционного процесса.
Возможность контроля качества исследуемого препарата ДНК при идентификации носительства и тяжести инфекционного процесса достигается за счет проведения ПЦР в реальном времени для выявления ДНК быка домашнего. В биологическом, клиническом и патологическом материале от крупного рогатого скота всегда присутствует ДНК животного, от которого взят материал. Отсутствие ДНК быка домашнего в исследуемом препарате ДНК свидетельствует о нарушении процедуры взятия, обработки и хранения исследуемых образцов или их фальсификации. При отсутствии накопления продукта ПЦР в данной реакции результат исследования считается недостоверным. Это позволяет снизить частоту ложноотрицательных ответов и повысить специфичность и точность диагностической реакции при постановке клинико-эпизоотологического диагноза.