Возможности использования поликлональных крысиных антисывороток в антигенном анализе вирусов гриппа человека

очагах инфекции в организованных коллективах. Поскольку на практике выявить все инаппарант-ные формы заболевания у лиц, контактировавших с источником возбудителя, не представляется возможным, основной мерой профилактики вторич-

ных случаев заболевания в очаге должна стать иммунизация контактных лиц, не болевших ветряной оспой, не получивших вакцинации против этой инфекции или имеющих неизвестный анамнез в отношении нее.

Литература

1. Герасимов А.Н., Архипенко А.Ю. Влияние изменений в демографической структуре населения на заболеваемость антропонозными инфекциями // ВестникРАМН. 2001. № 1. С. 44 - 46.

2. Герасимов А.Н., Разжевайкин В.Н. Учет неоднородности популяций при исследовании распространенности инфекции // Труды Института системного анализа РАН. 2007. № 31 (1). С. 116 - 121.

3. Clancy D., Green N. Optimal intervention for an epidemic model under parameter uncertainty. Math. Biosci. 2007. V. 205 (2). P. 297 - 314.

Возможности использования поликлональных крысиных антисывороток в антигенном анализе вирусов гриппа человека

Д.М. Даниленко (daria.baibus@gmail.com), Н.И. Коновалова, А.В. Прокопец, Е.Р. Бильданова, М.Ю. Еропкин, А.А. Соминина

ФГБУ «НИИ гриппа» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Санкт-Петербург

Резюме

В статье представлены результаты сравнительного анализа реакции торможения гемагглютинации (РТГА), выполненной с использованием хорьковых и крысиных антисывороток. Показано, что крысиные антисыворотки могут успешно применяться в антигенном анализе, поскольку данные, полученные при их использовании, соответствуют данным, полученным на хорьковых антисыворотках. Высокие коэффициенты корреляции, рассчитанные для сравнения этих типов сывороток, подтверждают достоверность представленных результатов. Впервые проведено построение двумерных антигенных карт на основе данных РТГА с использованием крысиных антисывороток, позволяющих оценить направление эволюционной изменчивости вирусов гриппа.

Ключевые слова: хорьковые антисыворотки, крысиные антисыворотки, антигенная картография

Potential Use of Rat Polyclonal Antisera for Antigenic Analysis of Human Influenza Viruses

D.M. Danilenko (daria.baibus@gmail.com), N.I. Konovalova, A.V. Prokopetz, E.R. Bil'danova, M.Yu. Eropkin, A.A. Sominina

Research Institute of Influenza, the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Saint Petersburg

Abstract

The article presents the comparative data on hemagglutination inhibition test (HI) performed with ferret and rat antisera. The HI showed that rat antisera can be successfully used in antigenic analysis considering the fact that the gained data is fully comparable with that obtained for the ferret antisera. High indexes of correlation calculated to compare the results clearly demonstrate the validity of the data. For the first time we present two-dimensional antigenic maps based on HI tests with rat antisera which permit to evaluate the evolutionary trends of contemporary human influenza viruses. Key words: ferret antisera, rat antisera, antigenic cartography

Введение

Постоянные изменения поверхностных антигенов вирусов гриппа лежат в основе ежегодных эпидемий. Основным инструментом надзора за антигенными характеристиками вирусов гриппа явля-

ется реакция торможения гемагглютинации (РТГА) [5]. При этом международным принятым стандартом служат хорьковые постинфекционные антисыворотки, поскольку модель гриппозной инфекции у хорьков при интраназальном капельном заражении

считается наиболее приближенной к человеческой [6]. В то же время содержание, разведение хорьков и экспериментальная работа с ними представляют немалые трудности. Прежде всего для вирусологических опытов нельзя использовать хорьков, полученных из обычных звероводческих хозяйств, поскольку у них, как правило, уже есть антитела к различным вирусам гриппа в результате неконтролируемых контактов с обслуживающим персоналом и другими животными. Поэтому единственным надежным поставщиком хорьков для вирусологических исследований могут быть лицензированные ветеринарные фирмы, отсутствующие в России. Кроме того, высокие специальные требования к содержанию экспериментальных животных (изолированные помещения, индивидуальные клетки, специальные корма), а также необходимость наличия высококвалифицированных ветеринарных работников (например, для взятия иммунной крови у хорьков путем кардиопунктуры) делают такие исследования дорогостоящими и трудновыполнимыми.

НИИ гриппа уже длительное время с успехом использует для РТГА крысиные поликлональные антисыворотки, полученные путем внутрибрюшинной инъекции белым крысам эталонных и эпидемических штаммов гриппа [1 - 3].

Цель настоящей работы - сравнительное исследование результатов РТГА при использовании крысиных и хорьковых антисывороток.

ротку. Для удаления неспецифических ингибиторов сыворотки обрабатывали рецепторразрушающим энзимом ^Е) и прогревали при 56 °С в течение 30 минут. Рабочее разведение сыворотки 1:10 готовили на стерильном физиологическом растворе.

Проведение РТГА осуществляли стандартным методом, рекомендованным ВОЗ и Роспотребнад-зором РФ [5]. В РТГА использовали рабочее разведение антигена, содержащее в 25 мкл буфера четыре гемагглютинирующих единицы. В иммунологических планшетах с и-образным дном готовили последовательные двукратные разведения сыворотки в физиологическом растворе. К каждому разведению сывороток добавляли по 25 мкл тестируемого вируса в четырехкратном титре и оставляли на 30 минут при комнатной температуре. После инкубации в лунки добавляли по 50 мкл взвеси 0,5% куриных эритроцитов или 0,75% взвеси эритроцитов человека 0 (I) группы крови. По истечении 30 минут производили учет результатов реакции: реагирующим титром сыворотки считали то наибольшее ее разведение, при котором не наблюдалось агглютинации эритроцитов.

Статистическая обработка данных

Рассчитывали коэффициенты корреляции (г) данных, полученных в РТГА с крысиными и хорьковыми антисыворотками к соответствующим антигенам.

Материалы и методы Вирусы гриппа

Эталонные штаммы получены из Сотрудничающего центра ВОЗ по гриппу CDC & P, Атланта, США. Эпидемические российские изоляты выделены в НИИ гриппа и базовых вирусологических лабораториях (региональных центрах Роспотребнадзора). Для работы выбирались штаммы, наиболее репрезентативные для каждого эпидемического сезона и региона Российской Федерации.

Дополнительные доказательства достоверности результатов, основанных на использовании крысиных поликлональных антисывороток

Для большей убедительности полученные результаты были обработаны с использованием бесплатного программного обеспечения на сайте http://antigenic-cartography.org/ для построения двумерной антигенной карты. Антигенную картографию выполняли по методу, приведенному в работе [7].

Получение сывороток

Хорьковые постинфекционные антисыворотки к вирусам гриппа любезно предоставлены профессором Дж. МакКоли (Европейский сотрудничающий центр по гриппу ВОЗ - Национальный институт медицинских исследований, Лондон, Соединенное Королевство).

Крысиные антисыворотки получали путем четырехкратной внутрибрюшинной инъекции вируссо-держащей суспензии (полученной из аллантоисной полости куриных эмбрионов или из супернатанта клеток MDCK) с интервалом три-четыре дня белым беспородным крысам массой 300 - 400 г. Все манипуляции с животными проводили в соответствии с правилами гуманного обращения с лабораторными животными, утвержденными Минздравом России [4]. Через 9 - 12 дней после последней иммунизации производили обескровливание животных под эфирным наркозом и получали иммунную антисыво-

Результаты и обсуждение

Ввиду естественного пути заражения и выработки антител у хорьков в процессе инфекции, имитирующей заболевание гриппом у человека, неудивительно, что постинфекционные хорьковые антисыворотки обладают более высокими титрами антител по сравнению с большинством крысиных антисывороток. В то же время для всех исследованных подтипов вируса, кроме пандемического гриппа А(Н^1^т09, наблюдается очень высокая степень корреляции результатов РТГА, полученных с хорьковыми и крысиными антисыворотками (табл. 1 - 4). При этом если рассмотреть результаты тестирования только эталонных штаммов, то даже в случае пандемического гриппа степень корреляции высока (см. табл. 2). Там, где наблюдаются различия в результатах РТГА с хорьковыми и крысиными антисыворотками, они, как правило, не превышают 1/2 - 1/4 гомологичного титра,

Таблица 1.

Сравнительные данные по РТГА вирусов гриппа A

Антисыворотка Вирус А/Брисбен/10/07 А/Перт/16/09 А/Виктория/210/09 А/Виктория/208/09

крысиная

А/Брисбен/10/07 1 1 1/64 1/128 1/32 1/256 1/64 1/32

А/Перт/16/09 1/64 1/4 1 1 1/1 1/1 1/2 1/2

А/Виктория/210/09 1/32 1/8 1/1 1/1 1 1 1/2 1/2

А/Виктория/208/09 1/64 1/8 1/2 1/4 1/1 1/1 1 1

А/Астрахань/65/11 1/64 1/8 1/2 1/8 1/2 1/16 1/2 1/8

А/С.-Петербург/1/12 1/64 1/8 1/4 1/8 1/2 1/16 1/2 1/8

А/С.-Петербург/4/12 1/64 1/8 1/4 1/8 1/2 1/16 1/4 1/16

А/Петрозаводск/1/12 1/64 1/8 1/4 1/8 1/2 1/16 1/4 1/16

Коэфф. корр. (г) крыс./ хорьк. 0,989 0,948 0,907 0,871

Таблица 2.

Сравнительные данные по РТГА вирусов гриппа A

^^^ Антисыворотка А/калифорния/07/09 А/окленд/03/09 А/Гонконг/2212/10 А/Львов/06/09

Вирус крысиная

А/Калифорния/07/09 1 1 1/8 1/4 1/4 1/4 1/4 1/2

А/Окленд/03/09 1/1 1/1 1 1 1/2 1/2 1/2 1/1

А/Гонконг/2212/10 1/2 1/1 1/4 1/4 1 1 1/4 1/1

А/Львов/06/09 1/4 1/1 1/4 1/8 1/2 1/4 1 1

А/С.-Петербург/109/11 1/4 1/2 1/8 1/8 1/4 1/8 1/4 1/2

А/С.-Петербург/27/11 1/1 1/1 1/8 1/4 1/4 1/8 1/8 1/4

А/Астрахань/35/11 1/4 1/1 1/8 1/1 1/4 1/1 1/8 1/1

А/С.-Петербург/09/11 1/1 1/1 1/2 1/1 1/1 1/1 1/2 1/1

Коэфф. корр. (г) крыс./ хорьк. 0,436 0,611 0,673 0,492

Коэфф. корр. (г) крыс./ хорьк. (только для эталонных штаммов) 0,778 0,967 0,937 0,471

то есть находятся в пределах естественных колебаний ошибки измерения. Наибольшие различия в РТГА между крысиными и хорьковыми антисыворотками наблюдались при тестировании эпидемических изолятов. В отдельных случаях разница составила 1/8 гомологичного титра, что может свидетельствовать о более дифференцированном взаимодействии крысиных антисывороток с изменяющимися эпитопами в НА современных вирусов по сравнению с хорьковыми. Так, штаммы пандемического гриппа А/Львов/6/09 (Н^1^т и А)/ Астрахань/35/11 (Н^1^т реагировали с хорьковыми антисыворотками, полученными к эталон-

ному вирусу А/Калифорния/07/09 (Н^1^т, до гомологичного титра, в то время как с крысиными антисыворотками - лишь на 1/4 гомологичного титра, что указывает на небольшое отклонение данных штаммов от эталонного. Позднее было установлено, что эти вирусы обладают определенным набором аминокислотных замен, на основании которых они были выделены в отдельные генетические группы [8, 9].

Еще одним доказательством в пользу дифференцированного ответа, получаемого при использовании крысиных антисывороток, служит пример с вирусом викторианской линии гриппа В. Современный

Таблица 3.

Сравнительные данные по РТГА вирусов гриппа В ямагатской линии с крысиными и хорьковыми антисыворотками, кратность по отношению к гомологичному титру

^~^\^Антисыворотка Вирус В/флорида/04/06 В/Бангладеш/3333/07 В/Висконсин/01/10

крысиная

В/Флорида/04/06 1 1 1/1 1/1 1/2 1/2

В/Бангладеш/3333/07 1/1 1/2 1 1 1/1 1/1

В/Висконсин/01/10 1/4 1/8 1/4 1/4 1 1

В/Новосибирск/01/12 1/2 1/4 1/2 1/1 1/1 1/1

В/Новосибирск/02/12 1/2 1/4 1/2 1/2 1/1 1/1

В/Новосибирск/03/12 1/2 1/4 1/2 1/2 1/1 1/1

Коэфф. корр. (г) крыс./хорьк. 0,860 0,799 1,0

Таблица 4.

Сравнительные данные по РТГА вирусов гриппа В викторианской линии с крысиными и хорьковыми антисыворотками, кратность по отношению к гомологичному титру

^^^Антисыворотка Вирус В/Малайзия/2506/04 В/Брисбен/60/08 В/Гонконг/514/09

крысиная

В/Малайзия/2506/04 1 1 1/1 1/2 1/64 1/64

В/Брисбен/60/08 1/8 1/8 1 1 1/8 1/8

В/Гонконг/514/09 1/32 1/64 1/1 1/1 1 1

В/С.Петербург/44/12 1/32 1/128 1/4 1/8 1/64 1/4

В/С.-Петербург/18/12 1/32 1/128 1/2 1/4 1/1 1/1

В/С.-Петербург/40/12 1/32 1/128 1/1 1/4 1/1 1/1

В/С.-Петербург/41/12 1/32 1/128 1/2 1/8 1/2 1/2

В/Калининград/222/12 1/32 1/128 1/2 1/4 1/4 1/1

Коэфф. корр. (г) крыс./ хорьк. 0,999 0,724 0,820

эпидемический изолят В/Санкт-Петербург/44/12 реагирует с хорьковой антисывороткой к рефе-ренс-вирусу В/Гонконг/514/09 на 1/4 гомологичного титра, в то время как с крысиной антисывороткой, полученной к этому же антигену, разница в титрах достигает 64, что свидетельствует о принципиальном дрейфе данного изолята от используемого референс-вируса. В ходе генетического анализа выявлено, что этот вирус относится к отдельной ветви 1В генетического клайда 1, к которому принадлежат все современные викторианские вирусы, так как он несет три мутации ^58Р, 11464 R279K), не свойственные вакцинному штамму В/Брисбен/60/08. Более того, сотрудничающий центр ВОЗ по гриппу в Лондоне рекомендует использование в РТГА изолята В/ Санкт-Петербург/44/12 и антисыворотки, полученной к нему, поскольку данный вирус образует отдельную серологическую группу [8].

Полученные результаты указывают на адекватность и применимость в антигенном анализе вирусов гриппа крысиных поликлональных антисывороток.

Дополнительным аргументом для возможности использования крысиных антисывороток служат построенные на основе РТГА антигенные карты (рис. 1 - 4). Антигенная карта - это графический вариант представления результатов РТГА, позволяющий отобразить числовую разницу во взаимодействии вирусов с антисыворотками в виде расстояния на карте. Один квадрат карты соответствует разнице в РТГА, равной 1/2 гомологичного титра. Пандемический вирус А(Н^1^т09 не претерпел значимого антигенного дрейфа за два сезона циркуляции, что наглядно иллюстрирует антигенная карта на рисунке 1, на которой все изученные антигены (72 антигена) формируются в одну группу. При этом достаточно близко к данной группе рас-

Рисунок 1.

Антигенная картография для вирусов пандемического гриппа А

А/Калифорния/ 07/09

А/Калифорния/07/09

А/Свинья/ Айова/15/30

А/Свинья/ Айова/15/30

Рисунок 2.

Антигенная картография для вирусов гриппа А

Рисунок 3.

Антигенная картография для вирусов гриппа В викторианской разновидности

Рисунок 4.

Антигенная картография вирусов гриппа В ямагатской разновидности

положен эталонный вирус 30-х годов А/(H1N1) свинья/Айова/15/30, что доказывает антигенное родство этого штамма и современного пандемического вируса - тройного реассортанта свиного происхождения.

Антигенная карта А(H3N2), построенная по 154 антигенам и 12 антисывороткам, за 2007 - 2012 годы демонстрирует антигенный дрейф А/Висконсин/67/05 ^ А/Брис-бен/10/07^ А/Перт/16/09 ^ А/Викто-рия/208/09 ^ А/Виктория/361/11 с соответствующими обособленными антигенными группами, адекватно отражая наблюдавшиеся тенденции эволюции этого подтипа гриппа за исследованный период. Антигенные карты вирусов гриппа В за 2004 - 2012 годы викторианской (101 антиген, 12 антисывороток) и ямагатской (93 антигена, 18 антисывороток) разновидностей также дают наглядное представление об антигенном дрейфе вирусов этих линий и существовании гомогенных групп штаммов, последовательно сменявших друг друга в исследованный период на территории России.

Следует подчеркнуть, что это первый опыт антигенного картирования вирусов гриппа с использованием крысиных антисывороток.

Не менее важным аргументом в пользу использования крысиных антисывороток служит

простота работы и обращения с крысами в качестве лабораторных животных. Крысы не болеют гриппом в естественных условиях, а инфицированные животные не передают заболевание воздушно-капельным путем. В связи с этим возможно совместное содержание животных, иммунизированных разными подтипами вирусов гриппа, в одном помещении для инфицированных животных. Белые беспородные крысы доступны в ветеринарных питомниках и, по нашим данным, не имеют антител к вирусам гриппа в нормальной сыворотке крови, что свидетельствует об их невосприимчивости к заражению, в том числе и от обслуживающего персонала питомника. Следовательно, животные, поступающие для исследований, после прохождения карантина могут быть напрямую использованы для иммунизации.

Вывод

Представленные результаты исследования показывают, что крысиные поликлональные антисыворотки могут успешно применяться как при антигенном анализе, так и при осуществлении надзора за гриппом, а полученные с их помощью данные не уступают по достоверности данным РТГА с использованием хорьковых постинфекционных антисывороток.

Литература

1. Даниленко Д.М., Коновалова Н.И., Еропкин М.Ю. и др. Пандемический грипп 2009 года в России. Особенности выделения и биологические свойства вирусов // Вопросы вирусологии. 2011. Т. 56. № 2. С. 4 - 9.

2. Иванова А.В., Даниленко Д.М., Лобова Т. Г. и др. Антигенные и биологические свойства вирусов гриппа В, выделенных в России в 2006 - 2010 годах // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2011. № 1. С. 4 - 8.

3. Коновалова Н.И., Еропкин М.Ю., Гудкова Т.М. и др. Этиологическая характеристика эпидемий гриппа 2006 - 2009 годов в Российской Федерации (по данным НИИ гриппа СЗО РАМН) // Вопросы вирусологии. 2010. Т. 55. № 4. С. 9 - 15.

4. Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных: Приказ Минздрава СССР от 12.03.1977 года № 755.

5. Соминина А.А., Бурцева Е.И., Коновалова Н.И. и др. Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация: Методические рекомендации. - СПб., 2006. - 24 с.

6. Barber W.H., Small P.A. Jr. Local and systemic immunity to influenza infections in ferrets // Infection and Immunity. 1978. V. 21. P. 221 - 228.

7. Smith D.J., Lapedes A.S., de Jong J.C. Mapping the antigenic and genetic evolution of influenza virus // Science. 2004. V. 305. P 371 - 376.

8. WHO Influenza Centre (London): report prepared for the WHO annual consultation on the composition of influenza vaccine for the Southern Hemisphere 2013. 17th - 19th September 2012. http://www.nimr.mrc.ac.uk/documents/about//Interim_Report_September_2012_2.pdf

9. WHO Influenza Centre (London): report prepared for the WHO annual consultation on the composition of influenza vaccine for the Northern Hemisphere. 14th - 18th February 2010. http://www.nimr.mrc.ac.uk/documents/about/Interim_Report_September_2010.pdf