СПОСОБ КОМПЛЕКСНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАЗВИТИЮ ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПСИХОАКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
METHOD FOR INTEGRATED ASSESSMENT OF GENETIC PREDISPOSITION TO DEVELOPMENT OF PSYCHOACTIVE SUBSTANCE ABUSE

Изобретение относится к области медицины, а именно к наркологии, и может быть использовано с целью идентификации среди населения группы лиц с высоким биологическим риском зависимости от психоактивных веществ (ПАВ), с целью проведения дифференцированной профилактики с включением общих социально-психологических и воспитательно-образовательных программ для всего населения и специальных для лиц с предрасположенностью к развитию наркологических заболеваний.
Клиническая практика свидетельствует, что не у всех членов семьи, имеющих наследственную предрасположенность к злоупотреблению (ПАВ), развивается алкоголизм или наркомания.
В связи с этим особое значение приобретает поиск «маркеров»-предикторов для выявления лиц с биологической наследственной предрасположенностью к злоупотреблению ПАВ.
Прямые причинно-следственные отношения между одним конкретным геном и зависимостью в целом отсутствуют.
Несколько исследований показали положительную связь между единичной заменой нуклеотида 118А→G (rs 1799971) гена µ-опиоидного рецептора 1 (OPRM1) и опиоидной зависимостью, а также с зависимостью от других веществ в различных популяциях (Bart, G. et al. 2004; Kapur, S. et al. 2007), тогда как другие исследования не нашли связи с этим SNP (Yuferov, V. et al. 2010).
Изучение связи аллели Al TaqI гена дофаминового рецептора типа 2 (DRD2) с употреблением алкоголя осталось спорным, в связи с противоречивыми результатами.
(Neville MJ, Johnstone EC, Walton RT: Identification and characterization of ANKK1: a novel kinase gene closely linked to DRD2 on chromosome band 11q23.1. Hum Mutat 2004, 23:540-45.
Blum K, Noble EP, Sheridan PJ, Montgomery A, Ritchie T, Jagadeeswaran P, Nogami H, Briggs AH, Cohn JB: Allelic association of human dopamine D2 receptor gene in alcoholism. J Am Med Assoc 1990, 263:2055-60.
Lucht M, Barnow S, Schroeder W, Grabe HJ, Rosskopf D, Brummer C, John U, Freyberger HJ, Herrmann FH: Alcohol consumption is associated with an interaction between DRD2 exon 8 A/A genotype and selfdirectedness in males. Neuropsychobiology 2007, 56:24-31.)
Исследования Prasad et al. показали незначительную частоту встречаемости генотипа Taq A1A1. Однако статистический анализ показал значимую (достоверную) связь генотипа Taq A1A1 с алкогольной зависимостью (Критерий Фишера р<0.05).
Таким образом, сочетание полигенного типа наследования предрасположенности и мультифакториального характера болезней зависимости делают методически неверным поиск единственного или главного «гена зависимости».
Известен способ комплексного определения генетической предрасположенности к развитию зависимости от психоактивных веществ, включающий исследование комплекса генов, кодирующих основные элементы дофаминергической системы, (Кибитов О.А. Генетика наркологических заболеваний: молекулярно-генетический профиль дофаминовой нейромедиаторной системы при алкоголизме и опийной наркомании. // Наркология, 2011. №9. С.25-42).
Однако исследование только комплекса генов, кодирующих основные элементы дофаминергической системы, не дает достаточно полной картины генетической предрасположенности, вследствие чего обусловлена недостаточно высокая точность ее определения.
Известен (VERDE Z. et al. ′Smoking genes′: a genetic association study. PLoS One. 2011; 6(10)) способ определения возможности использования определения в биологических объектах пациента методом полимеразной цепной реакции полиморфных вариантов генов двух систем: дофаминергической (DRD2-ANKK1 2137G>A) и опиоидной (OPRM1 118A>G) для оценки генетической предрасположенности к никотиновой зависимости.
Однако оценка вклада каждого гена производилась отдельно, не в комплексе. Установлено статистически значимое отличие в группах курильщиков и некурящих только по гену DRD2-ANKK1 2137G>A, по OPRM1 118A>G такого отличия не установлено. Таким образом, в данном источнике указывается возможность использования генов дофаминовой (DRD2-ANKK1) системы для оценки предрасположенности к никотиновой зависимости. При этом показатель OR (т.е. отношение частот встречаемости аллелей риска у курильщиков к такой же частоте у некурящих) составляет в случае DRD2-ANKK1 величину 3,6.
Известен способ (Реферат; CHEN D. et al. Association between polymorphisms of DRD2 and DRD4 and opioid dependence: evidence from the current studies. Am J Med Genet В Neuropsychiatr Genet. 2011 Sep; 156B(6):661-670), в котором исследовали связь присутствия полиморфных генов дофаминовой системы и предрасположенности к зависимости от опиатов. Величины OR определялись по каждому гену отдельно (нет комплексной оценки влияния генов), и максимальная OR составила 2.06 для гена DRD2.
Известен способ, принятый за прототип, в котором раскрывается способ выявления предрасположенности к зависимости от психоактивных веществ, включающий определение в биологических объектах пациента методом полимеразной цепной реакции аллелей риска в полиморфных генах дофаминовой, серотониновой, норадреналиновой и гаммааминомасляной кислоты систем нейромедиаторного обмена, и при выявлении полиморфных генов в каждой из нейромедиаторных систем, в комплексе с результатами психодиагностического тестирования, судят о недостаточности нейромедиаторного обмена данной системы (патент RU 2402974 С2, МПК опубл. 10.11.2010 пример 6, формула п.1).
Однако полной картины генетической предрасположенности к зависимости от психоактиных веществ данный способ не дает, и точность ее определения является недостаточной.
Предлагаемое изобретение решает задачу повышения точности объективного, раннего способа определения генетической предрасположенности к развитию зависимости от ПАВ, а также опережение клинического прогноза.
Поставленная задача решается способом комплексного определения генетической предрасположенности к развитию зависимости от психоактивных веществ, включающим определение в биологических объектах пациента методом полимеразной цепной реакции аллеля G в локусе rs1042173 гена SLC6A4 серотониновой системы нейромедиаторного обмена и хотя бы одного аллеля, выбранного из группы генов дофаминовой системы нейромедиаторного обмена, а именно G в локусе rs4680 гена COMT, G в локусе rs17851478 и/или С в локусе rs1611115 гена DBH, С в локусе rs6275 гена DRD2 и при выявлении по меньшей мере одного аллеля риска в той и в другой системе определяют генетическую предрасположенность к развитию зависимости от психоактивных веществ.
Новый подход позволит более точно оценить уровень генетического риска возникновения зависимости от ПАВ и наиболее полно охарактеризовать полигенное заболевание.
Проведенный нами анализ литературных источников показал, что каждый отдельно взятый полиморфный локус заявленных генов был предположительно потенциально значимым маркером риска развития зависимости от ПАВ. Поэтому мы предлагаем использовать данные полиморфных вариантов генов разных нейромедиаторных систем мозга, таких как: дофаминовая и серотониновая, что является новым подходом в генодиагностике предрасположенности к развитию зависимости от ПАВ, и, таким образом, сообщает всей совокупности признаков соответствие признакам «новизна» и «изобретательский уровень».
Техническим результатом предлагаемого нами изобретения является повышение точности оценки уровня генетического риска возникновения зависимости от ПАВ с 73% в прототипе до 81% и, следовательно, увеличение возможности наиболее полно характеризовать полигенное заболевание.
Для генотипирования пациентов, т.е. для выявления аллеля G в локусе rs1042173 гена SLC6A4 серотониновой системы нейромедиаторного обмена и аллелей группы генов дофаминовой системы нейромедиаторного обмена, а именно G в локусе rs4680 гена COMT, G в локусе rs17851478 и/или С в локусе rs1611115 гена DBH, С в локусе rs6275 гена DRD2, используют методику полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Polymeropoulos Н, Xiao H, Rath D. Merril С. Tetranucleotide repeat polymorphism at the human tyro-sine hydroxylase gene (TH). Nucleic Acid Res. 1991.19:3753), с помощью которой амплифицируют фрагменты ДНК, содержащие полиморфные локусы до концентрации достаточной для их разделения с помощью электрофореза.
Материалом для исследования являются образцы ДНК, выделенные из биологических объектов контрольных индивидуумов и больных наркоманией и алкоголизмом. Выделение геномной ДНК проводят методом фенольной экстракции с некоторыми модификациями (Strauss WM. Preparation of genomic DNA from mammalian tissue. In "Current Protocols in Molucular Biology (Ausubel FM et al., Eds.) Boston. MA / pp.2.2.1-2.2.3, 1990).
Выявления аллеля G в локусе rs1042173 гена SLC6A4 серотониновой системы нейромедиаторного обмена и аллелей группы генов дофаминовой системы нейромедиаторного обмена, а именно G в локусе rs4680 гена СОМТ, G в локусе rs17851478 и/или С в локусе rs1611115 гена DBH, С в локусе rs6275 гена DRD2 проводят с последующим разрезанием ПЦР-фрагментов эндонуклеазами рестрикции ApoI, FatI, BstENI, FauI и NcoI соответственно с помощью электрофоретического разделения продуктов рестрикции в 3-4% агарозном геле, окрашенном бромидом димидия. Электрофорез проводят в буфере ТАЕ 20 минут при 120 В. Визуализацию полученных результатов выполняют в ультрафиолетовом свете (УФ).
Определение точности метода
Было обследовано 1000 человек: 800 пациентов МНПЦ наркологии, из них 450 больных наркоманией, 350 больных алкоголизмом, а также 200 здоровых людей без признаков зависимости от ПАВ. Были протестированы образцы биологических объектов обследуемых с помощью ПЦР на наличие аллелей риска G в локусе rs1042173 гена SLC6A4, G rs4680 в локусе гена СОМТ, G в локусе rs17851478 и/или С в локусе rs1611115 гена DBH, С в локусе rs6275 гена DRD2, характеризующих состояние систем организма, играющих ключевую роль в развитии заболеваний зависимости.
У пациентов при одновременном выявлении аллеля G в локусе rs1042173 гена SLC6A4 серотониновой системы нейромедиаторного обмена и по меньшей мере одного аллеля группы генов дофаминовой системы нейромедиаторного обмена, а именно G в локусе rs4680 гена СОМТ, G в локусе rs17851478 и/или С в локусе rs1611115 гена DBH; С в локусе rs6275 гена DRD2 процент совпадения результата лабораторного исследования с клиническим диагнозом составил 82%. Для здоровых людей процент совпадения составил 91%.
Мы провели исследование у 200 пациентов аллелей риска в полиморфных генах комплекса указанных в прототипе нейромедиаторных систем: дофаминовой, серотониновой, норадреналиновой и гаммааминомасляной кислоты по полиморфным генам SerT, NPY, HTR2C, GAD2, DRD4, МАОА, МАОВ, DRD2, DBH, DAT при этом процент совпадения с клиническим диагнозом у больных заболеваниями зависимости составил 73%.
Пример 1
Пациент А. обратился в МНПЦ наркологии за консультацией по вопросу наличия у него возникновения зависимости от ПАВ в связи с тем, что его отец болен алкоголизмом, а сестра злоупотребляет наркотиками. Результаты медико-генетического исследования методом ПЦР свидетельствовали о наличие у пациента аллеля G в локусе rs 1042173 гена SLC6A4 серотониновой системы нейромедиаторного обмена и 1 аллеля группы генов дофаминовой системы нейромедиаторного обмена, а именно G rs4680 гена СОМТ, что позволило сделать заключение о генетической предрасположенности к зависимости от ПАВ. Пациенту А. даны рекомендации на формирование здорового образа жизни.
Пример 2
Пациентка В. обратилась в МНПЦ наркологии за консультацией по вопросу наличия у нее возникновения зависимости от ПАВ в связи с тем, что ее мать больна алкоголизмом и сестра злоупотребляет наркотиками. Результаты медико-генетического исследования методом ПЦР свидетельствовали о наличие у пациентки аллеля G в локусе rs1042173 гена SLC6A4 серотониновой системы нейромедиаторного обмена и аллеля группы генов дофаминовой системы нейромедиаторного обмена, а именно G в локусе rs17851478 гена DBH, что позволило сделать заключение о наличии генетической предрасположенности к злоупотреблению ПАВ.
Пример 3
Пациент И. обратился в МНПЦ наркологии за консультацией по вопросу наличия у него возникновения зависимости от ПАВ в связи с тем, что его отец болен алкоголизмом, а брат злоупотребляет наркотиками. Результаты медико-генетического исследования методом ПЦР свидетельствовали о наличие у пациента аллеля G в локусе rs 1042173 гена SLC6A4 серотониновой системы нейромедиаторного обмена и 2 аллелей группы генов дофаминовой системы нейромедиаторного обмена, а именно G rs4680 гена СОМТ, G rs17851478 гена DBH, что позволило сделать заключение о генетической предрасположенности к зависимости от ПАВ. Пациенту И. даны рекомендации на формирование здорового образа жизни.
Пример 4
Пациент С. поступил в стационар МНПЦ наркологии в состоянии наркотического опьянения. Анамнез: систематическое употребление героина в течение 6 лет. Сопутствующие заболевания: хронический гепатит С. Результаты медико-генетического исследования методом ПЦР свидетельствовали о наличие у пациента аллеля G в локусе rs1042173 гена SLC6A4 серотониновой системы нейромедиаторного обмена и 3 аллелей группы генов дофаминовой системы нейромедиаторного обмена, а именно G в локусе rs17851478 и С в локусе rs1611115 гена DBH, С в локусе rs6275 гена DRD2, что позволило сделать заключение о совпадении клинического и лабораторного прогноза.
Пример 5
Пациентка П. обратилась в МНПЦ наркологии за консультацией по вопросу наличия у нее возникновения зависимости от ПАВ в связи с тем, что ее мать больна алкоголизмом и двоюродная сестра злоупотребляет наркотиками. Результаты медико-генетического исследования методом ПЦР свидетельствовали о наличие у пациентки аллеля G в локусе rs1042173 гена SLC6A4 серотониновой системы нейромедиаторного обмена и 2 аллелей группы генов дофаминовой системы нейромедиаторного обмена, а именно G rs4680 гена СОМТ и G в локусе rs17851478 гена DBH, что позволило сделать заключение о наличии генетической предрасположенности к злоупотреблению ПАВ.
Пример 6
Пациентка К. обратилась в МНПЦ наркологии за консультацией по вопросу наличия у нее возникновения зависимости от ПАВ в связи с тем, что ее дядя болен наркоманией. Результаты медико-генетического исследования методом ПЦР свидетельствовали о наличие у пациентки 2 аллелей только группы генов дофаминовой системы нейромедиаторного обмена, а именно G в локусе rs17851478 гена DBH и С в локусе rs6275 гена DRD2 дофаминовой системы, что позволило сделать заключение об отсутствии генетической предрасположенности к злоупотреблению ПАВ.
Как видно из приведенных примеров, точность предлагаемого способа, характеризуемая процентом совпадения с клиническим диагнозом у больных заболеваниями зависимости, увеличилась по сравнению с прототипом с 73% до 81%.