Способ получения ортотопической PDX-модели глиобластомы головного мозга человека на иммунодефицитных мышах для доклинического изучения противоопухолевых эффектов цитостатических препаратов
METHOD FOR OBTAINING AN ORTHOTOPIC PDX MODEL OF HUMAN BRAIN GLIOBLASTOMA ON IMMUNODEFICIENT MICE FOR PRECLINICAL STUDY OF ANTITUMOR EFFECTS OF CYTOSTATIC DRUGS

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и касается способа получения ортотопической PDX-модели глиобластомы головного мозга человека на иммунодефицитных мышах для доклинического изучения противоопухолевых эффектов цитостатических препаратов, сохраняющей гистологические характеристики донорской опухоли, адаптированной к росту и характеризующейся стабильной кинетикой у иммунодефицитных мышей Balb/c Nude. Изобретение позволяет проводить доклинические испытания цитостатических препаратов на модели, сохраняющей определенные гистологические характеристики опухолевого материала, полученного от пациента-донора и обладающей сходным уровнем пролиферативной активности опухолевой ткани.
Глиомы представляют собой наиболее часто встречающиеся солидные опухоли центральной нервной системы, на долю которых приходится почти 80% всех первичных новообразований головного мозга (см. Hanif F. et al. Glioblastoma multiforme: a review of its epidemiology and pathogenesis through clinical presentation and treatment //Asian Pacific journal of cancer prevention: APJCP. – 2017. – Т. 18. – №. 1. – С. 3.). Выделяют астроцитарные опухоли, возникающие из клеток астроглии, олигодендроглиомы, эпендимомы и смешанные глиомы (см. Ростовцев Д. М. Злокачественные супратенториальные астроцитарные опухоли организация медицинской помощи, новые технологии и результаты лечения: дис. – Воен.-мед. акад. им. СМ Кирова, 2016.; Agnihotri S. et al. Glioblastoma, a brief review of history, molecular genetics, animal models and novel therapeutic strategies //Archivum immunologiae et therapiae experimentalis. – 2013. – Т. 61. – №. 1. – С. 25-41.).
Глиобластомы (ГБ) представляют собой наиболее агрессивный вид первичных астроцитарных опухолей, среди которых выделяют два основных подтипа: первичную глиобластому головного мозга, являющуюся наиболее распространенным вариантом данного типа новообразований (80% случаев) и вторичную глиобластому (см. Ghosh D., Nandi S., Bhattacharjee S. Combination therapy to checkmate Glioblastoma: clinical challenges and advances //Clinical and translational medicine. – 2018. – Т. 7. – №. 1. – С. 33). Первичная глиобластома проявляется в более позднем периоде и характерна для пациентов со средним возрастом 62 года, в то время как вторичная ГБ прогрессирует у молодых пациентов (средний возраст 45 лет) из астроцитом или олигодендроглиом низкой степени злокачественности (см. Kleihues P., Ohgaki H. Primary and secondary glioblastomas: from concept to clinical diagnosis //Neuro-oncology. – 1999. – Т. 1. – №. 1. – С. 44-51.).
Кроме того, выделяют редкий подтип данных опухолей, определяющийся как первичная глиобластома с областями анапластической олигодендроглиомы и участками некроза с пролиферацией сосудов (см. Louis D. N. et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system //Acta neuropathologica. – 2007. – Т. 114. – №. 2. – С. 97-109.). Описанные подтипы характеризуются тенденцией к множественному поражению головного мозга в связи с инфильтративным ростом, гетерогенностью клеточного состава и радиорезистентностью субпопуляции стволовых клеток глиобластомы, что приводит к интенсивному росту опухолевых клеток, оставшихся после проведения циторедуктивных операций и курсов химио- и радиотерапии (см. Дяченко А. А. и др. Эпидемиология первичных опухолей головного мозга:(обзор литературы) //Вестник Российского научного центра рентгенорадиологии Минздрава России. – 2013. – Т. 1. – №. 13.; Шулев Ю. А. и др. Принципы хирургии первичных опухолей головного и спинного мозга //Практическая онкология. – 2013. – Т. 14. – №. 3-2013. – С. 148.).
Прогноз для пациентов с глиобластомой остается неблагоприятным, учитывая, что медиана выживаемости составляет 14-15 месяцев с момента постановки диагноза (см. Ohka F., Natsume A., Wakabayashi T. Current trends in targeted therapies for glioblastoma multiforme //Neurology research international. – 2012. – Т. 2012.).
Понимание механизмов ангиогенеза, клеточной миграции и пролиферативных путей, поиск причин резистентности опухолевых клеток глиобластомы к химио- и радиотерапии, а также разработка новых противоопухолевых препаратов являются актуальными вопросами онкологии, в решении которых ключевую роль играют PDX-модели, позволяющие воссоздать необходимые темпы инвазии и пролиферации клеток глиобластомы и сохранить гистологические характеристики опухолевого материала, полученного от пациента-донора. Определенный уровень экпрессии биомаркеров, выявляющийся в опухолевом материале реципиента и сохраняющийся после многократного пассирования является неотъемлемым условием возможности использования животной модели для апробации и внедрения таргетных терапевтических субстанций в практику. Таким образом, идеальная животная модель глиобластомы головного мозга человека должна характеризоваться воспроизводимостью скорости роста и степени злокачественности, коротким временем индукции роста опухолевого узла, а также стандартной выживаемостью. Кроме того, ксенографт должен иметь внутрипаренхимный рост, свойственный глиобластоме, характеризоваться неоваскуляризацией и отсутствием инкапсуляции.
Расширение арсенала PDX-моделей глиобластомы головного мозга, способных сохранить важнейшие молекулярно-генетические характеристики опухолевого материла пациентов-доноров, обеспечит проведение доклинического изучения терапевтических эффектов цитостатических препаратов. Данная модель позволит обнаружить наиболее эффективную дозу препарата, что позволит минимизировать его токсичность и снизить вероятность возникновения некротических процессов.
Известен способ создания модели ксенотрансплантации глиобластомы человека с имуносупрессией орогастральным циклоспорином с помощью подкожной инокуляции культуры клеток глиобластомы, полученной из биоматериала пациента-донора, на 2 сутки после инициации иммуносупрессии путем введения циклоспорина в желудочно-кишечный тракт в дозе 5 мг/кг самцам крыс Вистер весом 229-337 г (см. Cunha A. M. et al. A murine model of xenotransplantation of human glioblastoma with imunosupression by orogastric cyclosporin //Arquivos de neuro-psiquiatria. – 2011. – Т. 69. – №. 1. – С. 112-117.). Данный способ обеспечивает быстрый рост опухоли в связи с проведением иммуносупрессии циклоспорином и простую оценку объемов опухолевого узла без необходимости умерщвления модельного животного. Проведенный исследователями гистопатологический анализ показал отсутствие инкапсуляции, что является одним из критериев соответствия ксенографта глиобластоме головного мозга человека. Недостатком данного способа является невозможность использования данной модели в практике в связи с отсутствием инфильтрации опухолевых клеток в соседние структуры. Кроме того, рост подкожного ксенографта происходит за счет увеличения массы опухолевой ткани, а не за счет миграции клеток глиобластомы, которая обеспечивается органоспецифичным микроокружением и является одной из отличительных особенностей туморогенеза глиобластомы головного мозга человека.
Известен способ создания мышиной модели глиобластомы, предполагающий использование векторов на основе птичьих ретровирусов для переноса мутантного гена EGFR на глиальные клетки-предшественники и астроциты у трансгенных мышей (см. Holland E. C. A mouse model for glioma: biology, pathology, and therapeutic opportunities //Toxicologic pathology. – 2000. – Т. 28. – №. 1. – С. 171-177). Данный способ обеспечивает возможность индукции поражения головного мозга модельного животного, сходные с таковыми у человека благодаря экспрессии конститутивно активной мутантной формы EGFR, амплифицированной в 30-50% глиобластомы головного мозга человека, в клетках глии животного. Описанный метод позволяет имитировать необходимый уровень пролиферации сосудов ксенографта и получить уровень экспрессии глиального фибриллярного кислого белка и нестина, характерный для опухоли человека. Недостатком данного способа является невозможность индукции глиобластомы головного мозга у модельного животного, в точности повторяющей характеристики опухолевой ткани человека, с помощью одной мутации EGFR.
Известен способ создания модели глиобластомы, предполагающий разработку доклинической модели глиобластомы головного мозга мышей с помощью индукции сверхэкспрессии EGFR дикого и мутантного типа (vIII) (см. Zhu H. et al. Oncogenic EGFR signaling cooperates with loss of tumor suppressor gene functions in gliomagenesis //Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2009. – Т. 106. – №. 8. – С. 2712-2716.). Данный способ обеспечивает возможность индукции опухоли центральной нервной системы модельного животного, характеризующейся тем, что наблюдается интенсивный инфильтративный рост новообразования благодаря коактивации дикого и мутантного типа EGFR, сочетанной с потерей опухоли Ink4A/Arf и PTEN. Недостатком данного способа является сложность, дороговизна и длительность процесса создания трансгенных моделей глиобластомы головного мозга, а также сложность визуализации процесса роста новообразования и проведения замеров объема опухолевого материала.
Известен способ индукции глиомы высокой степени злокачественности в результате постнатальной потери PTEN или экспрессии мутантного типа EGFR в модели глиомы трансгенной мыши (см. Wei Q. et al. High-grade glioma formation results from postnatal pten loss or mutant epidermal growth factor receptor expression in a transgenic mouse glioma model //Cancer research. – 2006. – Т. 66. – №. 15. – С. 7429-7437.). Данный способ обеспечивает быстрое развитие опухоли, характеризующейся интенсивным инфильтративным ростом и инвазией. Недостатком данного способа является высокий темп роста новообразования, который сразу приводит к прогрессирующей глиоме головного мозга, что делает невозможным изучение процесса инициации туморогеназа. Кроме того, возможно получение различных подтипов опухолей, в том числе астроцитомы и олигодендроглиомы.
Таким образом, описанные способы получения модели глиобластомы головного мозга, предполагающие проведение иммуносупрессии путем орогастрального введения циклоспорина, использование векторов на основе птичьих ретровирусов, индукции сверхэкспрессии EGFR дикого и мутантного типа (vIII), а также постнатальной потери PTEN не позволяют имитировать инфильтрацию опухолевых клеток в соседние структуры, не повторяют органоспецифичного микроокружения, свойственного глиобластоме головного мозга человека. Подкожные ксенографты обеспечивают доступность визуализации опухолевой ткани и оценку объемов опухолевого узла без необходимости умерщвления модельного животного. Однако, не сохраняют ряд особенностей опухолевого материала пациента-донора.
Кроме того, часть указанных методов создания трансгенных моделей глиобластомы являются дорогими и сложными в выполнении, а некоторые способы характеризуются длительным периодом инициации роста опухоли, что является недостатком в связи с небольшой продолжительностью жизни модельных животных.
Технический результат изобретения заключается в получении ортотопической PDX-модели глиобластомы головного мозга человека на иммунодефицитных мышах для доклинического изучения противоопухолевых эффектов цитостатических препаратов, сохраняющей гистологические характеристики донорской опухоли, адаптированной к росту и характеризующейся стабильной кинетикой у иммунодефицитных мышей Balb/c Nude.
3
3
Поставленная задача решается тем, что осуществляют наркотизацию мышей, проведение имплантации опухолевого материала, полученного от пациента после хирургической резекции глиобластомы, путем рассечения кожи на голове иммунодефицитной мыши, отступая 2 мм от точки межглазничной ширины, формирования при помощи бора отверстия в черепе, в которое помещают опухолевый фрагмент объемом 8 мм, затем над дефектом кости черепа накладывают тахокомб, после чего ушивают операционную рану, по достижении опухолевым материалом объема 36 мм ксенографты глиобластомы головного мозга человека перевивают до 5 пассажа. Способ иллюстрируется следующими фигурами:
Фиг.1 – глиобластома пациента-донора. Типичные структуры – полиморфизм опухолевых клеток. Изменения в стенках сосудов. Обширные очаги некроза. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 200.
Фиг.2 - PDX-модель глиобластомы человека на иммунодефицитной мыши Balb/c Nude. Полиморфные клетки с высокой митотической активностью. Видны фигуры патологических митозов, а также мелкие очаги некрозов. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 400.
Способ осуществляют следующим образом.
После проведения пациенту хирургической резекции глиобластомы, выделяют опухолевый фрагмент, исключая области некроза и васкуляризации, помещают его в чашку Петри со средой 199.
3
Животное наркотизируют с помощью внутримышечного введения препаратов Ксилазин и «Золетил 100» согласно протоколу (см. Патент RU № 2712916, опубл. 03.02.2020, Бюл. №4). Далее проводят имплантацию опухолевого материала путем рассечения кожи на голове иммунодефицитной мыши, отступая 2 мм от точки межглазничной ширины, формирования при помощи бора отверстия в черепе, в которое помещают опухолевый фрагмент объемом 8 мм, извлеченный из среды 199. Затем над дефектом кости черепа накладывают тахокомб, после чего ушивают операционную рану.
3
По достижении опухолевым материалом объема 36 мм ксенографты глиобластомы головного мозга человека перевивали указанным способом до 5 пассажа (см. табл.1).
Доля приживления ксенотрансплантата увеличивалась с каждой генерацией и составляла в 1, 2 и 3-м пассажах 20, 50 и 66% соответственно. Начиная с 4-го пассажа наблюдалась адаптация глиобластомы к росту (100% приживления).
Данным способом было создано 50 ортотопических PDX-моделей глиобластомы головного мозга на иммунодефицитных мышах.
Таблица 1
Характеристика роста PDX-модели глиобластомы человека различных генераций на иммунодефицитных мышах
№ пассажа
Сайт имплантации
% приживления опухолевого материала в организме мыши-реципиента
Объем, при котором проводили пересадку опухолевого материала
Время от момента имплантации опухолевого материала до его пересадки
1
Ортотопический (интракраниально)
20%
36 мм<sup>3</sup>
104 суток
2
Ортотопический (интракраниально)
50%
36 мм<sup>3</sup>
74 суток
3
Ортотопический (интракраниально)
66%
36 мм<sup>3</sup>
40 суток
4
Ортотопический (интракраниально)
100%
36 мм<sup>3</sup>
28 суток
5
Ортотопический (интракраниально)
100%
36 см<sup>3</sup>
16 суток
Провели морфологическое исследование, в результате которого в глиальной опухоли пациента-донора, имеющей структуры глиобластомы и состоящей преимущественно из мелких клеток, выделили очаги некроза, располагающиеся в ткани мозга и вокруг сосудов (см. фиг. 1). Вокруг сосудов в очагах некроза имелись псевдопалисадные структуры, представленные многоядерным частоколом вытянутых гиперхромных ядер. В сосудах отмечалась выраженная пролиферация эндотелия. В большинстве полей зрения наблюдалась резко выраженная атипия клеток и высокая митотическая активность.
Проведенное ИГХ исследование фрагмента, полученного после хирургической резекции, дало основание подтвердить диагноз и выявить экспрессию глиального кислого фибриллярного белка в опухолевых клетках, ядерную экспрессию р53, которая составила 90% и Ki67 – 70%, что свидетельствует о высокой пролиферативной активности.
В ходе морфологического исследования в представленных PDX-моделях глиобластомы были обнаружены структуры опухоли – глиобластомы, аналогичные первичной опухоли (пациента-донора). В опухоли определялись обширные поля, состоящие из мелких клеток. Отмечалась высокая митотическая активность с наличием фигур патологических митозов, вокруг сосудов наблюдались псевдопалисадные структуры. Кроме того, наблюдалась выраженная пролиферация эндотелия сосудов и немногочисленные очаги некроза (см. фиг. 2).
Таким образом, данные морфологического исследования и ИГХ- исследования в представленных PDX-моделях глиобластомы свидетельствовали о наличии аналогичных структур глиобластомы, характерных для донорского фрагмента опухолевого материала.
После проверки соответствия полученных PDX-моделей 5 генерации предъявляемым требованиям провели изучение противоопухолевой активности темозоломида, который вводили внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг один раз в сутки в течение 21 дня. Наблюдение осуществляли в течение 26 дней, замер опухоли провели после некропсии и резекции опухоли на 26 сутки эксперимента.
Оценку противоопухолевой эффективности темозоломида на полученных ортотопических PDX-моделях глиобластомы головного мозга человека на иммунодефицитных мышах проводили на основании показателя торможения роста опухоли - ТРО%):
3
3
где  и  – средний объем опухоли (мм) в контрольной и опытных группах соответственно, расчитанные по формуле Шрека для эллипсоида– V=а×в×с×p/6, где V – объем опухоли (мм), а, в, с – максимальные диаметры эллипсоида в трех плоскостях (мм).
3
Средний объем ксенографтов на 26 сутки эксперимента в группах 1 (темозоломид) и 2 (контроль) составил 74,5±5,7 и 174,6±7,5 мм соответственно. ТРО равнялся 57,3%. Таким образом, была показана противоопухолевая эффективность темозоломида, применяющемся в клинической практике в качестве противоопухолевого препарата для лечения глиобластом, на ортотопической PDX-модели глиобластомы головного мозга человека на иммунодефицитных мышах.
Технико-экономическая эффективность заключается в том, что изобретение позволяет получить ортотопическую PDX-модель глиобластомы головного мозга человека на иммунодефицитных мышах для доклинического изучения противоопухолевых эффектов цитостатических препаратов, которая сохраняет гистологические характеристики опухолевого материала, полученного от пациента-донора, адаптирована к росту и характеризуется стабильной кинетикой у иммунодефицитных мышей Balb/c Nude.