Влияние женских половых стероидных гормонов на микробицидную активность нейтрофилов

Влияние женских половых стероидных гормонов на микробицидную активность нейтрофилов

С.В. ШИРШЕВ, И.В. НЕКРАСОВА

Effect of female sex hormones on microbicidal activity of neutrophils

S.V. SHIRSHEV, I.V. NEKRASOVA

Лаборатория иммунорегуляции Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Пермь

Исследовано влияние эстрадиола и прогестерона на ферментативную, окислительную и фагоцитарную функции нейтрофилов человека. Показано, что половые гормоны в дозах, характерных для беременности, дифференцированно стимулируют спонтанную активность эластазы нейтрофилов и усиливают ферментативную активность миелопероксидазы. Эстрадиол и прогестерон не влияют на спонтанную, но стимулируют индуцированную Escherichia coli люминолзависи-мую хемилюминесценцию нейтрофилов. Одновременно стероиды угнетают фагоцитарную активность данных клеток. Выявленная в работе модулирующая активность женских половых стероидов в отношении функций нейтрофилов, по-видимому, может реализовываться при беременности.

Ключевые слова: беременность, эстрадиол, прогестерон, иммунология репродукции, нейтрофилы.

The objective of the present work was to study effects of estradiol and progesterone on enzymatic, oxidative, and phagocytic function of human neutrophils. It was shown that sex hormones applied at the doses equivalent to their concentrations in pregnant women selectively stimulated spontaneous activity of neutrophilic elastase and increased myeloperoxidase enzymatic activity. Neither estradiol nor progesterone had apparent effect on baseline spontaneous hemiluminescence of neutrophils but stimulated E.coli-induced luminol-dependent hemiluminescence. Simultaneously, both steroids inhibited phagocytic activity of these cells. It is concluded that this modulating action of female sex steroids on neutrophil functions is likely to come out during pregnancy.

Key words: pregnancy, estradiol, progesterone, immunology of reproduction, neutrophils.

Эстрадиол (Е2) и прогестерон (Рг) — важные гормоны, контролирующие репродуктивную функцию женского организма. Они также способны оказывать ярко выраженное иммуномодулирующее действие [1]. Данные гормоны реализуют свои эффекты посредством связывания со специфическими рецепторами — ER и PR, которые также обнаружены на клетках иммунной системы [2, 3].

Нейтрофилы — наиболее многочисленная популяция лейкоцитов — являются основными клеточными эффекторами неспецифической защиты организма. Обладая высокой реактивностью в ответ на действие хемотаксических и других факторов, эти клетки первыми появляются в очаге поражения и определяют пусковые механизмы развития воспаления и ранних защитных реакций [4—6]. Их вклад в процессы иммунного реагирования определяется поглощением и деструкцией патогена, а также наличием ряда биологически активных соединений, в том числе ферментов, влияющих на интенсивность развития иммунного ответа. Нейтрофилы известны также как активные участники родовой деятельности [1], в связи с чем исследование изменения их функций в период гестации является актуальной проблемой иммунологии репродукции.

© С.В. Ширшев, И.В. Некрасова, 2009

Цель работы — оценка влияния Е2, Pr и их комбинации на микробицидную активность нейтрофилов.

Материал и методы

В работе использовали сепарированные нейтрофилы периферической венозной крови здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста. Для выделения нейтрофилов применяли двойной градиент плотности фиколл-верографина (Pharmacia, Швеция; Спофа, Чехия). Плотности верхнего и нижнего градиентов составили 1,077 и 1,112 г/мл. Чистота популяции фракционированных нейтрофилов составила 90%; жизнеспособность клеток, определяемая в тесте с эозином, — 95—98%. Гормоны использовали в концентрациях, отражающих их уровни в крови соответственно в I и III триместрах беременности: Е2 (Sigma, США) — 1 и 10 нг/мл [7], Pr (Sigma, США) — 20 и 100 нг/мл [7]. Нейтрофилы (1-106/мл) инкубировали в течение 60 мин при температуре 37 °С с гормонами, после чего исследовали функциональную активность клеток.

Влияние гормонов на микробицидный потенциал оценивали по активности ферментов, секрети-

е-mail: shirshev@iegm.ru

руемых нейтрофилами, — эластазы и миелоперок-сидазы (МПО), которые определяли в клеточных супернатантах. Активность эластазы определяли с использованием синтетического субстрата N-альфа-бензол^-аргинин-этилового эфира гидрохлорида, растворенного в ацетонитриле [8], спектрофото-метрическим методом. В лунку 96-луночного плоскодонного планшета вносили 0,02 мл клеточного супернатанта, добавляли 0,15 мл прогретого до 25°С трис-буфера и 0,03 мл 0,01 М субстратного раствора ВАЕЕ. Затем ex tempore регистрировали оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре Anthos HMTL III (Labtec Instruments, Австрия) при длине волны 340 нм в течение 15 мин с интервалами 5 мин. Активность эластазы выражали в количестве гидролизованного субстрата (нМ) на 106 клеток за минуту (нМ/106 кл./мин).

Активность МПО тестировали спектрофотоме-трически [9, 10]. Для этого 0,05 мл клеточного супернатанта помещали в лунки 96-луночного планшета, затем вносили 0,1 мл субстратной смеси, состоящей из 0,04% ортофенилендиамина и 0,014% Н2О2 на фосфатцитратном буфере. По истечении 10 мин инкубации при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением 0,1 мл 10% H2SO4. Интенсивность оптической плотности фиксировали в многоканальном спектрофотометре Anthos HMTL III при длине волны 492 нм. Результаты выражали в единицах оптической плотности (E).

В ряде проб для стимуляции активности эластазы и МПО использовали зимозан А (Sigma, США), опсонизированный пулом сывороток.

В качестве интегрального теста для определения микробицидной активности нейтрофилов исследовали люминолзависимую хемилюминесценцию (ЛЗХЛ). Активаторами фагоцитов в стимулированном варианте ЛЗХЛ служили опсонизированные бактерии Escherichia coli (штамм К-12). В лунку плоскодонного планшета вносили 0,18 мл раствора, содержащего 110 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, 2,5 мМ MgCl2, 5 мМ глюкозы и 110-4 М люминола. После инкубации в течение 3—5 мин при температуре 37 °С и замера фонового свечения добавляли 0,02 мл клеточной суспензии и при непрерывном перемешивании измеряли интенсивность спонтанной ЛЗХЛ. Затем в лунку добавляли 0,02 мл опсонизиро-ванных бактерий E. coli К-12 и фиксировали интенсивность стимулированной ЛЗХЛ в течение 30 мин через каждые 10 мин.

Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли по степени снижения свечения люминесцентного генно-инженерного штамма бактерий E. coli lux+, которые являлись объектом фагоцитоза [11]. Для оптимального выражения результатов исследования рассчитывали индекс фагоцитарной активности (ИФА), отражающий процент гашения биолюминесценции в сравнении с исходным уровнем:

ИФА = 100 х (Х1-Х2)/Х1, где Х1 — интенсивность биолюминесценции контрольной пробы (бактерии), Х2 — опытной пробы (бактерии + нейтрофилы). Динамику фагоцитоза оценивали в течение 30 мин, производя замеры каждые 10 мин.

Измерение показателей фагоцитоза и ЛЗХЛ проводили с использованием люминометра Luminoskan Ascent (Финляндия). Результаты выражали в относительных световых единицах (related light units, RLU).

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием парного ¿-критерия Стьюдента в пакете программ Microsoft Office Excel 2003. При этом вычисляли среднее значение и стандартное отклонение (М±б). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

При исследовании спонтанной ЛЗХЛ выявлено, что Е2 достоверно повышал ее уровень только в дозе, соответствующей таковой в III триместре беременности. Pr не влиял на данный показатель. Одновременное действие Е2 и Pr на продукцию активных метаболитов кислорода в разных концентрационных соотношениях также не было статистически значимым (см. таблицу).

В индуцированном E. coli варианте ЛЗХЛ Pr повышал данный показатель (рис. 1, а) на 10-й и 20-й минутах исследования в дозе, соответствующей таковой в III триместре беременности. Е2, наоборот, угнетал ЛЗХЛ нейтрофилов, что проявилось на 30-й минуте исследования (рис. 1, б). При одновременном действии гормонов в дозах, также характерных для таковых в III триместре, наблюдался выраженный стимулирующий эффект на 20-й и 30-й минутах (рис. 1, в). Таким образом, практически не влияя на фоновый окислительный потенциал, при антигенной стимуляции гормоны репродукции в дозах, характерных для III триместра беременности, усиливают активность свободнорадикального окисления в нейтрофилах.

Учитывая, что биоцидное действие нейтрофи-лов, направленное на внеклеточную деструкцию патогенов, осуществляется за счет выброса активных форм кислорода с последующей их трансформацией МПО в перекись водорода и галогениды, экстрацел-люлярную окислительную активность нейтрофилов оценивали как по продукции активных форм кислорода, так и по активности секретируемой МПО.

В ходе исследования было выявлено увеличение спонтанной активности МПО под действием Pr в дозе, характерной для таковой в III триместре беременности, что согласуется с имеющимися в литературе данными о росте окислительной активности МПО в ходе гестации [12]. Pr повышал уровень

Рис. 1. Влияние Pr (а), Е2 (б), а также их физиологических сочетаний (в) на стимулированную люминолзависимую хемилюминесцен-цию (ЛЗХЛ) нейтрофилов.

a — p=0,03; b — p=0,02; c — p=0,04; d — p=0,01; e — p=0,04; значениер указано только для достоверных различий (р<0,05) по сравнению с контролем. RLU — относительные световые единицы.

стимулированной МПО в дозе, соответствующей таковой в I триместре беременности. Е2 не давал самостоятельный эффект, а при одновременном воздействии гормонов на клетки стимулирующее действие Pr сохранялось как в спонтанном, так и в стимулированном варианте (см. таблицу). Известно, что сама МПО, а также гипохлорит способны активировать коллагеназу [13], которая наряду с эластазой участвует в процессе дилатации шейки матки перед родами [14].

Pr как самостоятельно, так и в комбинации с Е2, в дозе, соответствующей таковой в I триместре беременности, усиливал спонтанную активность эластазы, которая участвует в процессе инвазивно-го роста синцитиотрофобласта [15]. Е2, напротив, не влияя на данный показатель в спонтанном варианте, при стимуляции нейтрофилов зимозаном угне-

тал активность эластазы в дозе, соответствующей таковой в III триместре беременности. Однако при одновременном с Pr воздействии на клетки этот депрессивный эффект Е2 отменялся (см. таблицу). Таким образом, стимуляция спонтанной активности эластазы, с одной стороны, способствует повышению неспецифической резистентности организма матери при беременности, а с другой, необходима для ремоделирования тканей в процессе роста син-цитиотрофобласта.

При исследовании фагоцитарной активности нейтрофилов установлено ее снижение под действием Pr в дозе, соответствующей таковой в III триместре беременности, на 30-й минуте (рис. 2, а). Е2 угнетал данный показатель в дозе, характерной для таковой в I триместре беременности, уже на 1-й мин измерения, а в дозе, соответствующей таковой в III

Таблица. Влияние женских половых стероидов на окислительную и ферментативную активности нейтрофилов

Экспериментальное воздействие Спонтанная Спонтанная Стимулированная Спонтанная активность Стимулированная

ЛЗХЛ, RLU активность активность эластазы, активность эластазы,

МПО, Е МПО, Е нМ/106 кл/мин нМ/106 кл/мин

Контроль 0,05+0,027 0,68+0,100 1,00+0,225 0,51+0,287 0,66+0,316

Pr (20 нг/мл) 0,07+0,051 0,93+0,456 1,26+0,421* (р=0,02) 0,97+0,421* (р=0,04) 0,54+0,347

Pr (100 нг/мл) 0,06+0,051 0,85+0,235* (р=0,02) 1,22+0,514 0,52+0,453 0,70+0,470

Е2 (1 нг/мл) 0,07+0,056 0,76+0,164 1,13+0,301 1,14+0,805 1,35+0,874

Е2

Pr (20 нг/мл) + Е2 (1 нг/мл) 0,07+0,054 0,81+0,309 1,22+0,331* (р=0,02) 1,72+0,35* (р=0,004) 0,57+0,365

Pr (100 нг/мл) + Е2 (10 нг/мл) 0,06+0,047 0,76+0,142* (р=0,01) 1,28+0,567 0,83+0,564 0,57+0,377

Примечание. Значениер указано только для достоверных различий (р<0,05) по сравнению с контролем; КЬи — относительные световые единицы; Е — единицы оптической плотности; Е2 — эстрадиол; Рг — прогестерон.

Рис. 2. Влияние Pr (а), Е2 (б), а также их физиологических сочетаний (в) на фагоцитарную активность нейтрофилов.

а, Ь, с, д:р=0,04; значение р указано только для достоверных различий (р<0,05) в сравнении с контролем. RLU — относительные световые единицы.

триместре беременности — на 10-й минуте (рис. 2, б). В ряде работ также подтверждается супрессорное действие эстрогенов только в отношении фагоцитарной активности лейкоцитов свиней [16]. При одновременном действии гормонов в дозе, характерной для таковой в III триместре беременности, фагоцитарная активность нейтрофилов также снижалась на 10-й минуте (рис. 2, в). По-видимому, данный эффект стероидов определяется в большей степени негеномным действием Е2. Имеются данные о том, что сыворотка беременных обладает способностью супрессировать фагоцитоз микроорганизмов, включая E. coli [17].

Анализируя полученные данные, можно полагать, что гормоны репродукции в дозе, соответствующей таковой в I триместре беременности, способствуют успешной имплантации и последующей плацентации, повышая спонтанную активность МПО и эластазы. При этом в дозе, соответствующей таковой в III триместре беременности, комбинация Е2 и Pr стимулирует окислительную активность ней-трофилов, что, возможно, обусловлено участием НАДФ-оксидазного комплекса и МПО данных клеток в индукции родовой деятельности.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ширшев С.В. Механизмы иммунноэндокринного контроля процессов репродукции. Т. 2. Екатеринбург: УрО РАН 2002; 557.

2. Ciocca D.R., Roig L.M. Estrogen receptors in human nontarget tissues: biological and clinical implications. Endocr Rev 1995; 16: 35—62.

3. Szekeres-Bartho J., Hadnagy J., Pacsa A.S. The suppressive effect of progesterone on lymphocyte cytotoxicity: unique progesterone sensitivity of pregnancy lymphocytes. J Reprod Immunol 1985; 7: 121 — 128.

Выводы

1. Гормоны репродукции в дозах, характерных для таковых в для I триместре беременности, стимулируют спонтанную ферментативную активность эластазы нейтрофилов.

2. Е2 и Pr повышают как спонтанную, так и индуцированную активность МПО, при участии которой образуется такой важный бактерицидный агент, как гипохлорная кислота.

3. Комбинация исследуемых гормонов не влияет на спонтанную ЛЗХЛ нейтрофилов, тогда как на индуцированную E. coli продукцию кислородных метаболитов нейтрофилами оказывает активирующий эффект в дозе, соответствующей таковой в III триместре беременности.

4. Одновременно стероиды угнетают фагоцитарную активность нейтрофилов, что, возможно, нивелируется повышением их окислительного потенциала.

Работа выполнена при поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

4. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К. Окислительный стресс при воспалении. Успехи соврем биол 1997; 117: 155—171.

5. Потапнев М.П. Цитокиновая сеть нейтрофилов при воспалении. Иммунология 1995; 4: 34—40.

6. Haslett C., Savill J.S., Meagher L.C. The neutrophil. Curr Opin Immunol 1989; 2: 10—21.

7. Kase N.G., Reyniak J.V. Endocrinology of pregnancy. Mount Sinai J Med 1985; 52: 11—34.

8. O'Connor C.M., Gaffney K, Keane J. et al. Alpha 1-Proteinase inhibitor, elastase activity, and lung disease severity in cystic fibrosis. Am Rev Respir Dis 1993; 148: 1665—1671.

9. Бакуев М.М., Саидов М.З., Бутаков А.А. Особенности секреции миелопероксидазы в хемилюминесцентном ответе нейтрофилов человека при контакте со стимуляторами различной природы. Иммунология 1991; 1: 15—21.

10. Практикум по иммунологии: Уч. пособие для студ. высш. учеб. заведений. Под ред. И.А. Кондратьевой и А.А. Ярили-на. 2-е изд. М: ИЦ «Академия» 2004; 272.

11. Ширшев С.В., Куклина Е.М., Заморина С.А. и др. Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека по степени гашения биолюминесценции. Пат. 2292553 РФ. Бюл. 2007; 3.

12. Selvaraj R.J., Sbarra A.J., Thomas G.B. et al. A microtechnique for studying chemiluminescence response of phagocytes using whole blood and its application to the evaluation of phagocytes in pregnancy. J Reticuloendothel Soc 1982; 31: 3—16.

13. Weiss S.J., Peppin G, Ortiz X. et al. Oxidative autoactivation of latent collagenase by human neutrophils. Science 1985; 227: 747—749.

14. Kelly R.W. Pregnancy maintance and parturition: The role of prostaglandin in manipulating the immune and inflammatory response. Endocr Rev 1994; 15: 684—706.

15. Harris L.K., Aplin J.D. Vascular remodeling and extracellular matrix breakdown in the uterine spiral arteries during pregnancy. Re-prod Sci 2007; 14: 28—34.

16. Magnusson U. In vitro effects of prepartum concentration of oestradiol-17ß on cell-mediated immunity and phagocytosis by porcine leucocytes. Vet Immunol Immunopathol 1991; 28: 117— 126.

17. Björksten B, Söderström T, Damber M. G. et al. Polymorphonuclear leucocyte function during pregnancy. Scand J Immunol 1978; 8: 257—262.

V ВСЕРОССИЙСКИЙ ДИАБЕТОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС Москва, май 2010 г.

Организаторы

Министерство здравоохранения и социального развития РФ ФГУ Эндокринологический научный центр Российская ассоциация эндокринологов Место проведения

Российская академия медицинских наук

Основные научно-практические направления конгресса:

— Эпидемиология, регистр сахарного диабета.

— Генетика, иммуногенетика сахарного диабета и его поздних осложнений.

— Методы лечения и профилактики сахарного диабета и его осложнений: инсулинотерапия; пероральные сахароснижающие средства; диетотерапия; диабетическая ретинопатия; нейропатия; диабетическая нефропатия; сахарный диабет и патология сердечно-сосудистой системы; диабетическая стопа; обучение больных сахарным диабетом, сахарный диабет у детей и подростков; сахарный диабет в пожилом возрасте; сахарный диабет и беременность; ожирение и сахарный диабет.

— Инновации в диагностике, лечении и профилактике сахарного диабета и его осложнений Тезисы выступлений принимаются до 1 февраля 2010 г. Вся информация о порядке оформления тезисов размещена на сайте www.endocrincentr.ru в разделе «Конгрессы и симпозиумы»

Регистрация

Для предварительной регистрации необходимо выслать в адрес Оргкомитета заполненную регистрационную форму по электронному адресу: post@endocrincentr.ru или факсу (499)126-3306

Контакты

117036 Москва, ул. Дм. Ульянова, 11. ФГУ Эндокринологический научный центр, научно-организационный отдел.

Телефоны Оргкомитета: (499)129-0124, (499)126-3306, (499)124-6203

Вся информация о конгрессе размещена на официальном сайте ФГУ Эндокринологический научный центр www.endocrincentr.ru в разделе «Конгрессы и симпозиумы»