Метаболиты оксида азота у цестоды Triaenophorus nodulosus (Pseudophyllidea)

эритроцитов (Р<0,01). При увеличении дозы до 20 инвазионных личинок, на 7-е сутки инвазии, количество эритроцитов с микроядрами превышало контроль в 3,2 раза (Р<0,05). На 14-е сутки у инвазированных животных количество эритроцитов с микроядрами было в 4,3 раза выше, чем в контроле (Р<0,001). На 21-е сутки эритроцитов с микроядрами было в 5,6 раза больше, чем в контроле (Р< 0,001).

На 42-е сутки у белых крыс количество эритроцитов с микроядрами несколько снизилось и составило 5,3±0,95 %о (Р<0,01).

Заключение. Максимальное количество эритроцитов с микроядрами установлено на 7 и 14-е сутки опыта при аскаридозе, на 20, 30 и 40-е сутки - при трихоцефалезе и на 14, 21 и 42-е сутки при эзофагостомозе при различных инвазирующих дозах. Наивысшая их частота обнаружена при максимальной дозе - 20 яиц и личинок на 1 г массы тела.

Литература: 1. Стибель В.В. Гельмштози свиней. - Львiв: Сполом, 2004. - 160 с. 2. Котельников Г.А. Гельминтологические исследования животных и окружающей среды. - М.: Колос, 1984. - 128 с. 3. Schmid W. // Mutat. Res. -1975. - Vol. 31, № 1. - P. 9-16.

Effects of vital nematode excretions on genom of white rats. Stibel V.V., Danko N.N., Svarchevsky O.A. Lvov S.Z. Gzhicky National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies.

Summary. One evaluated formation of micronuclei in erythrocytes of rats infected by Ascaridia, Trichuris and Oesophagostomum. All infections resulted in increase of the number of erythrocytes with micronuclei. The pattern of changes in respect of the number of erythrocytes containing micronuclei was dependent on particular nematode.

МЕТАБОЛИТЫ ОКСИДА АЗОТА У ЦЕСТОДЫ TRIAENOPHORUS NODULOSUS

Теренина Н.Б., Толстенков О.О. *, Онуфриев М.В. **

*Центр паразитологии Института проблем экологии и эволюции

им. А.Н. Северцова РАН

**Учреждение Российской академии наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Введение. Оксид азота представляет собой новую категорию нейрональных сигнальных веществ - нейротрансмиттерный газ, который в отличие от классических нейромедиаторов (ацетилхолина, биогенных аминов и др.) не может запасаться и освобождаться из везикул, а генерируется при необходимости с помощью фермента NO-синтазы из его метаболического предшественника - аминокислоты L-аргинина (Garthwaite, 1991; Snyder, 1992;

466

Vincent, 1995). В организме высших животных оксид азота имеет широкий спектр биологического действия, включая такие функции, как регуляция сосудистого тонуса, микроциркуляции и гемостаза, неспецифическая иммунологическая защита, нейротрансмиссия, регуляция активности генов и ферментов и др. В число конечных метаболитов оксида азота входят нитраты и нитриты (NOx). Используя методы, позволяющие регистрировать их уровень, можно косвенно судить об интенсивности метаболизма оксида азота (Archer, 1993).

В литературе появились сведения о наличии структур, содержащих оксид азота в нервной системе паразитических червей (Gustafsson et al., 1996, 2003; Terenina et al., 2003). Вместе с тем данные об этом нейромедиаторном веществе у гельминтов остаются довольно ограниченными. Задачей настоящей работы явилось исследование уровня метаболитов оксида азота, нитратов и нитритов (NOx) в тканях и среде содержания in vitro цестоды Triaenophorus nodulosus (Pseudophyllidae).

Материалы и методы. В работе использовали цестод Triaenophorus nodulosus из кишечника щуки. Суммарную концентрацию стабильных метаболитов оксида азота, нитратов и нитритов (NOx), определяли по интенсивности флюоресценции 2,3-диаминонафтотриазола, продукта реакции 2,3-диаминонафталина (ДАН) и нитрита в кислой среде (Misko et al., 1993) с модификациями (Lei et al., 1999).

C целью исследования возможной роли нитроксидергической системы в процессах адаптации гельминтов к различным температурным условиям эксперименты были проведены на двух группах гельминтов, одна из которых была инкубирована в физиологическом растворе при 4оС, а другая - при 26о С. Время инкубации составляло 6 часов. К части образцов в физиологический раствор был добавлен L-аргинин до конечной концентрации 5 мМ, к другой части образцов L-аргинин не добавляли. Для определения внеклеточного содержания NOx через разные сроки инкубации (2,5 час и 6 час) отбирали физиологический раствор. Внутриклеточный уровень NOx анализировали в супернатантах, полученных после гомогенизации тканей гельминтов (0,5-0,6 г) в 3-х объемах 20мМ Трис-HCl рН-7,4, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ и центрифугирования при 4оС при 15000g в течение 30 мин.

Физиологический раствор после инкубации в нём паразитов или супернатанты тканей депротеинизировали при 100оС и затем помещали в нитрит-регенирирующую систему, содержащую 0.125 Ед/мл нитратредуктазы, 0.025мМ НАДФН и 0.025мМ ФАД, 20мМ Трис-HCl рН-7.6 и инкубировали 30 мин при 370 С. Для окисления непрореагировавшего НАДФН, использовали систему лактатдегидрогеназа-пируват в концентрациях 150 Ед/мл и 10мМ соответственно. Затем добавляли 0.32 мМ ДАН в 0.62 N HCl и инкубировали 10 мин в темноте. Для стабилизации флюоресценции образовавшегося 2,3-диаминонафтотриазола добавляли NaOH до конечной концентрации 130мМ. Интенсивность флюоресценции измеряли на плашечном ридере Victor 1420 (Wallac Oy, Finland) при длине волны возбуждения 365нм и эмиссии 405нм. Для

467

расчета концентрации NOx был использован стандартный раствор нитрата или нитрита натрия в концентрациях от 0.1 до 2мкМ. Концентрацию NOx выражали в нмоль/мг белка супернатанта или в нмоль/мл буфера.

Результаты. Результаты исследования NOx в среде инкубации цестод (внеклеточное накопление метаболитов оксида азота) представлены в табл. 1. При всех применяемых временных и температурных условиях в среде инкубации паразитов выявлены метаболиты оксида азота. Обнаружено, что через 6 часов инкубации при низкой температуре (4оС) происходит увеличение уровня метаболитов оксида азота в среде обитания. В тех случаях, когда инкубация проводилась при более высокой температуре (26оС), подобных статистически значимых различий не наблюдалось. После 6-и часовой инкубации гельминтов при разных температурных условиях отмечена некоторая тенденция к снижению уровня NOx при 26оС по сравнению с соответствующими значениями при 4оС.

Таблица 1

Внеклеточное накопление метаболитов оксида азота (NOx ) (нмоль/мл) в среде инкубации цестод Triaenophorus nodulosus

Время инкубации Температура инкубации 150 мин 360 мин

4оС (n=5) 0,72±0,12 0,89±0,14*#

26оС (n=5) 0,71±0,06 0,55±0,09

Цифры в скобках - число экспериментов

* - достоверное отличие от группы «4оС,150 мин» при p<0,05;

# - тенденция к отличию от группы «26оС, 360 мин» при p<0,1.

Результаты определения уровня NOx в тканях цестод (внутриклеточное накопление метаболитов оксида азота) при 6-и часовой инкубации паразитов в различных температурных условиях представлены в табл. 2.

Таблица 2

Уровень (NOX) (нмоль/мг) в супернатантах ткани цестод Triaenophorus nodulosus через 360 мин инкубации

Условия инкубации Температура инкубации +5мМ L-аргинина -5мМ L-аргинина

4оС 1,36±0,19

26оС 1,48±0,16

468

Цифры в скобках - число экспериментов

* -достоверное отличие от группы «4оС, +5 мМ L-аргинина» при p<0,05.

Анализ результатов показывает наличие продуктов метаболизма оксида азота в тканях цестод при различных температурных режимах их инкубации в физиологическом растворе. При этом отмечено, что в присутствии субстрата синтазы оксида азота (5 мМ L-аргинина) значимых различий в уровне нитратов и нитритов в тканях гельминтов, инкубированных при разных температурах (4оС и 26оС), не выявлено. Отсутствие субстрата L-аргинина в инкубационном растворе не сказывалось на накоплении NOx при 26оС и было равно 1,63±0,17 нмоль/мг, в то время как при 4оС уровень метаболитов оксида азота увеличивался и составлял 2,44±0,33 нмоль/мг.

Таким образом, полученные результаты показали присутствие метаболитов оксида азота в тканях и среде содержания цестоды Triaenophorus nodulosus, что свидетельствует в пользу наличия нитроксидергической нейромедиаторной системы у исследованного представителя цестод. Выявление метаболитов оксида азота в инкубационном растворе показывает, что плоские черви обладают способностью не только продуцировать, но и секретировать NOx во внешнюю среду. Как известно, уровень метаболитов оксида азота косвенно отражает интенсивность метаболизма оксида азота. Полученные нами данные об увеличении уровня метаболитов при длительной (6 часов) инкубации паразитов при 4оС свидетельствует об увеличении интенсивности метаболизма оксида азота у Triaenophorus nodulosus в данных условиях. Тот факт, что существуют некоторые различия в уровне исследуемых метаболитов оксида азота при содержании паразитов в разных температурных условиях, говорит о возможном участии оксида азота в температурной адаптации цестод к условиям обитания (Поддержано грантом РФФИ № 08-04-000271).

Литература: l.Garthwaite J. //Trends Neurosci. - 1991. - 14 (2) - P. 60-67. 2. Snyder S.H. //Science. - 1992 - 257.- P. 494-496. 3.Vincent S.R. // In: Vincent, S., Editor. Nitric Oxide in the nervous system. London: Academic press. - 1995. -P.83-102; 4.Archer S. //FASEB J. -1993 - Vol.7. - P.349-360. 5. Misko T.R., Schilling R.J., Salvemini D. et al. //Anal. Biochem. 1993. V. 214. P. 11-16. 6. Lei B., Adachi N., Nagaro T., Arai T. //Brain. Res. Brain. Res. Protoc. 1999. V. 4. P. 415-419; 7. Gustafsson M.K.S, Lindholm A., Terenina N.B., Reuter M. // Parasitology. - 1996. - 113. - P. 559 - 565. 8. Gustafsson MKS, Gaivoronskaja TV, Terenina NB, Tolstenkov OO. // Helminthologia. - 2003. - V. 40. - P. 79-85. 9. Terenina, NB, Onufriev MV, Gulyaeva NV, Moiseeva YV & Gustafsson KMS. //Parasitology. - 2003. - V. 126.- P.585-590.

The nitric oxide metabolites in cestode Triaenophorus nodulosus (Pseudophyllidea). Terenina N.B., Tolstenkov O.O., Onufriev M.V. Centre of Parasitology of A.N. Severtsov Institute of Ecology and Evolution. Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology.

469

Summary. The levels of nitric oxide metabolites, nitrates and nitrites (NOx) were examined in cestode Triaenophorus nodulosus using fluorimetric method. The levels of the nitric oxide metabolites increased during incubation of parasites in cold condition. Some differences in levels of the nitric oxide metabolites were noted under different temperature regimes at incubation of cestodes.

ПРИМЕНЕНИЕ ХИТОЯНА В КОМПЛЕКСЕ С ФЕЗОЛОМ ДЛЯ БОРЬБЫ С ГАЛЛОВОЙ НЕМАТОДОЙ НА РАСТЕНИЯХ ОГУРЦА

*Удалова В.Б., **Удалова Ж.В., **Зиновьева С.В.

*ВНИИ гельминтологии им. К.И.Скрябина ** Центр паразитологии ИПЭЭ РАН

Введение. В основе создания современных средств защиты растений от различных патогенных организмов, в том числе нематод, лежит способность некоторых соединений влиять на иммунный статус растения. Известен целый ряд таких соединений природного и синтетического происхождения, среди которых хитозан является одним из наиболее доступных и эффективных. Хитозан не токсичен, подвергается биодеградации, биосовместим с окружающей средой, обладает антимикробными свойствами. При проникновении патогенных организмов в растение аминополисахариды индуцируют в ткани комплексную биохимическую защитную реакцию. Включение системы защиты в ответ на внедрение паразитических организмов не всегда достаточно эффективно и адекватно. Использование хитозана позволяет ускорить процессы защитных реакций, что вызвано генетически запрограммированными взаимоотношениями между растением-хозяином и хитинсодержащим паразитическим организмом (Озерецковская, 1995).

Известно, что хитозан. обладает высокой сорбционной способностью в отношении большого числа органических и неорганических веществ и используется в качестве биоразлагаемого носителя (Котельникова и др. 2003). Что позволяет создавать препараты направленного и пролонгированного действия. Нами была предпринята попытка совместить внесение двух соединений: низкомолекулярного хитозана и препарата из группы

бензимидазолов - фезола для защиты растений огурца от галловой нематоды Meloidogyne incognita.

Препараты на основе бензимидазолов обладают широким спектром действия. Они оказывают фунгицидное и нематицидное действия, а также могут обладать рострегулирующей активностью (Козлова, Шашенкова, 1978; Baum, Chen, 1986; Матевосян, Кононенко, 2006, Magnucka, Suzuki, Pietr et al., 2007). Они хорошо усваиваются через корни и разносятся вверх по сосудистой системе. Не фитотоксичны, т.е. не обжигают растения. Механизм

470