ПРОЦЕСС ВЫДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЕВОГО ОЛИГОНУКЛЕОТИДА ИЗ СМЕСИ

1. Способ выделения целевого олигонуклеотида из смеси целевого олигонуклеотида и одной или более примесей, содержащий:
предоставление двухфазной жидкость-жидкостной хроматографической системы подвижная фаза - неподвижная фаза, содержащей первую жидкую подвижную фазу и жидкую неподвижную фазу, содержащую по меньшей мере одно вещество-обменник, которое устраняемо связывается с целевым олигонуклеотидом;
вызывание переноса первой жидкой подвижной фазой целевого олигонуклеотида в потоке относительно и в контакте с жидкой неподвижной фазой в колонке прибора для жидкость-жидкостной хроматографии, так что целевой олигонуклеотид становится связанным с веществом-обменником в жидкой неподвижной фазе;
затем вытеснение целевого олигонуклеотида из жидкой неподвижной фазы во вторую жидкую подвижную фазу, протекающую относительно и в контакте с неподвижной фазой через колонку посредством вещества-вытеснителя, способного к вытеснению целевого олигонуклеотида из жидкой неподвижной фазы во вторую подвижную фазу.
2. Способ по п. 1, содержащий этапы:
(1) предоставление первой жидкой фазы, содержащей целевой олигонуклеотид и одну или более примесей в растворе, и второй жидкой фазы, содержащей вещество-обменник, которое устраняемо связывается с целевым олигонуклеотидом, при этом первая и вторая жидкие фазы образуют две отдельные фазы при контакте друг с другом;
(2) введение второй жидкой фазы в прибор для центробежной распределительной хроматографии в качестве неподвижной жидкой фазы;
(3) введение первой жидкой фазы, содержащей целевой олигонуклеотид и одну или более примесей, в растворе в прибор для центробежной распределительной хроматографии, в качестве первой подвижной фазы и вызывание протекания этой первой жидкой фазы через прибор для центробежной распределительной хроматографии в контакте со второй жидкой неподвижной фазой, так что целевой олигонуклеотид становится устраняемо связанным с веществом-обменником во второй жидкой неподвижной фазе;
(4) введение третьей жидкой фазы, которая образует отдельную фазу при контакте со второй жидкой фазой и которая содержит в растворе по меньшей мере одно вещество-вытеснитель, способное к вытеснению целевого олигонуклеотида из второй жидкой фазы в прибор для центробежной распределительной хроматографии, в качестве второй подвижной фазы, и вызывание протекания этой второй подвижной фазы через прибор для центробежной распределительной хроматографии в контакте со второй жидкой фазой, так что целевой олигонуклеотид становится вытесненным из неподвижной фазы и поступает в раствор во второй подвижной фазе;
(5) выделение вытесненного целевого олигонуклеотида из второй подвижной фазы.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором целевой олигонуклеотид содержит 10-30 оснований.
4. Способ по п. 3, в котором целевой олигонуклеотид является 20-основным олигонуклеотидом, который имеет последовательность 5′-UCAAGGAAGAUGGCAUUUCA-3′.
5. Способ по любому из пп. 1, 2 или 4, в котором целевой олигонуклеотид отделяется от одной или более примесей, которые также являются олигонуклеотидом.
6. Способ по п. 1, в котором неподвижная фаза содержит смесь одной или более органических жидкостей, которые являются по существу несмешиваемыми с водой, и одной или более органических жидкостей, которые являются смешиваемыми с водой.
7. Способ по п. 6, в котором первая и вторая подвижная фазы содержат смесь одной или более органических жидкостей, которые являются смешиваемыми с водой, и воду.
1-6
1-6
1-8
8. Способ по п. 6 или 7, в котором неподвижная и подвижная фазы содержат соответствующие две равновесные фазы жидкостной системы, содержащие Cалкил Cалканоатный сложный эфир, C алканол и воду.
1-6
1-6
1-8
9. Способ по п. 8, в котором Cалкил Cалканоатный сложный эфир является этилацетатом и C алканол является 1-бутанолом.
1-8
10. Способ по п. 6 или 7, в котором неподвижная и подвижная фазы содержат соответствующие две равновесные фазы жидкостной системы, содержащие C алканол и воду.
1-8
11. Способ по п. 10, в котором C алканол является 1-пентанолом или 1-бутанолом.
1-8
1-8
12. Способ по п. 6 или 7, в котором неподвижная и подвижная фазы содержат соответствующие две равновесные фазы жидкостной системы, содержащие Cалканол, ди-(Cалкил)кетон и воду.
1-8
1-8
13. Способ по п. 12, в котором Cалканол является 1-бутанолом и ди-(Cалкил)кетон является метилизобутилкетоном.
1-8
14. Способ по п. 6 или 7, в котором неподвижная и подвижная фазы содержат соответствующие две равновесные фазы жидкостной системы, содержащие ди-(Cалкил)кетон и воду.
1-8
15. Способ по п. 14, в котором ди-(Cалкил)кетон является метилизобутилкетоном.
1-6
1-6
4-10
1-8
16. Способ по п. 6 или 7, в котором неподвижная и подвижная фазы содержат соответствующие две равновесные фазы жидкостной системы, содержащие Cалкил Cалкиловый эфир или Сциклический эфир, Cалканол и воду.
1-6
1-6
4-10
1-8
17. Способ по п. 16, в котором Cалкил Cалкиловый эфир и Cциклический эфир выбраны из метил-трет-бутилового эфира и 2-метилтетрагидрофурана, и Cалканол выбран из 1-пентанола и 1-бутанола.
18. Способ по любому из пп. 1, 2, 4, 6, 7, 9, 11, 13, 15 или 17, в котором первая подвижная фаза имеет pH 7-14.
19. Способ по любому из пп. 1, 2, 4, 6, 7, 9, 11, 13, 15 или 17, в котором концентрация целевого олигонуклеотида в колонке составляет 200 мг - 80 г на л.
20. Способ по п. 1, в котором вещество-обменник является солью органического амина с противоанионом.
21. Способ по п. 20, в котором соль является вторичной, третичной или четвертичной аммониевой солью.
22. Способ по п. 20 или 21, в котором вещество-обменник выбрано из смеси хлорида три-(н-октил)метиламмония и хлорида три-(н-децил)метиламмония, бромида цетилтриметиламмония, хлорида метилтриоктиламмония, хлорида бензалкония (также известного как хлорид алкилдиметилбензиламмония и ADBAC, являющегося смесью хлоридов алкилбензилдиметиламмония различных длин алкильной цепи), хлорида бензилтриметиламмония, хлорида тетрабутиламмония и Амберлита LA2 (высокомолекулярный, жирорастворимый вторичный амин, поставляемый в виде жидкости в основной форме) в протонированной форме.
23. Способ по п. 22, в котором вещество-обменник выбрано из: смеси хлорида три-(н-октил)метиламмония и хлорида три-(н-децил)метиламмония и хлорида бензалкония.
24. Способ по любому из пп. 1, 2, 4, 6 или 7, в котором концентрация вещества-обменника в неподвижной фазе составляет 5-500 мМ.
25. Способ по любому из пп. 1, 2, 4, 6 или 7, в котором вторая жидкая подвижная фаза имеет такую же композицию жидкостей, как первая подвижная фаза.
1-8
1-6
1-6
1-8
26. Способ по п. 25, в котором неподвижная фаза содержит преимущественно смесь Cалканола и Cалкил Cалканоатного сложного эфира, и вторая подвижная фаза содержит смесь воды и Cалканола.
1-6
1-8
1-8
27. Способ по п. 25, в котором неподвижная фаза содержит преимущественно смесь Cциклического эфира и Cалканола, и вторая подвижная фаза содержит преимущественно смесь воды и Cалканола.
28. Способ по любому из пп. 1, 2, 4, 6 или 7, в котором pH второй подвижной фазы лежит в диапазоне pH 7-14.
29. Способ по любому из пп. 1, 2, 4, 6 или 7, в котором вещество-вытеснитель содержит анионную группу, которая может являться одиночно или множественно заряженной.
30. Способ по п. 29, в котором вещество-вытеснитель выбрано из йодида натрия или калия, натриевой соли сахарина, желтого солнечного заката и амаранта.
31. Способ по любому из пп. 1, 2, 4, 6 или 7, в котором концентрация вещества-вытеснителя во второй подвижной фазе составляет 5-30 мМ.
32. Способ по любому из пп. 1, 2, 4, 6 или 7, в котором целевой олигонуклеотид затем выделяется из второй подвижной фазы.