ИММУНОТЕРАПИЯ РАКА
CANCER IMMUNOTHERAPY

Перекрестная ссылка
Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 61/910,728, поданной 2 декабря 2013 года, включенной в данный документ путем ссылки во всей своей полноте.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, способу получения иммуногенных композиций и способам применения иммуногенных композиций для лечения клеточных пролиферативных расстройств или инфекционного заболевания, включая, например, рак и аутоиммунные расстройства.
Более конкретно, настоящее изобретение обеспечивает клетки, которые обрабатывают олигонуклеотидами, специально предназначенными для того, чтобы модулировать экспрессию генов-мишеней, участвующих в механизмах иммунорезистентности к опухоли.
Уровень техники
Иммунотерапия представляет собой «лечение заболевания путем вызова, усиления или подавления иммунного ответа». Иммунотерапии, предназначенные, для того, чтобы вызывать или усиливать иммунный ответ, представляет собой иммунотерапии активации, тогда как иммунотерапии, которые уменьшают или подавляют иммунный ответ, классифицируются, как иммунотерапии супрессии.
Иммунотерапия рака становится все более важной в клинической практике за последние десятилетия. Первичным подходом в современном стандарте лечения является пассивная иммунотерапия за счет использования рекомбинантных моноклональных антител (mAb). mAb действуют через механизмы, относящиеся к собственному гуморальному иммунному ответу организма, путем связывания с ключевыми антигенами, участвующими в развитии опухоли, и вызывая умеренные формы клеточно-опосредованного иммунитета, такие как антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC).
Другая группа восходящих иммунотерапевтических подходов основывается на
ex-vivo.
in vitro
введении клеток, способных разрушать опухолевые клетки. Введенные клетки могут быть собственными инфильтрирующими опухоль лимфоцитами (TIL) пациента, выделенными и распространенными В некоторых случаях, TIL способны распознавать множество связанных с опухолью антигенов (ТАА), в то время как в других случаях TIL могут быть повторно активированы и распространены для распознавания специфических антигенов. Терапевтические подходы, основанные на TIL, обычно называются как «адоптивный перенос клеток» (ACT).
Дальнейшие разработки ACT включают генетические модификации Т-клеток для экспрессии рецепторов, которые распознают специфические связанные с опухолью антигены (ТАА). Такие модификации могут вызвать экспрессию специфического рецептора Т-клеток (TCR) или химерного антигенного рецептора (CAR), состоящего из ТАА-специфического антитела, слитого с трансмембранным и цитоплазматическим доменами СОЗ/со-стимулирующей молекулы.
Способы ACT также могут рассматриваться как пассивные иммунотерапевтические подходы, в которых они действуют непосредственно на опухолевые клетки, не вызывая распространенный иммунный ответ. Однако, в отличие от mAb, агенты ACT способны полностью разрушать опухолевые клетки, в отличие от блокады выбранных рецепторов и умеренных клеточных ответов, таких как ADCC.
Продолжается разработка многочисленных способов активной иммунотерапии, которые восстанавливают способность собственной иммунной системы организма образовывать противоопухолевый ответ. Активные иммунотерапевтические агенты часто называют терапевтическими противораковыми вакцинами или просто противораковыми вакцинами. Многие противораковые вакцины в настоящее время находятся на клинических испытаниях, и Sipuleucell-T недавно стал первой такой вакциной, одобренной FDA Соединенных Штатов Америки.
Существует несколько классов противораковых вакцин, которые используют разные антигены и различные механизмы образования клеточно-опосредованного иммунного ответа. Один класс вакцин основан на пептидных фрагментах антигенов, селективно экспрессированных опухолевыми клетками. Пептиды вводят самостоятельно или в комбинации с иммуностимулирующими агентами, которые могут включать адъюванты и цитокины, такие как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF).
Другой класс противораковых вакцин основан на модифицированных (например, облученных сублетальными дозами) опухолевых клетках, используемых в качестве антигенов, также в комбинации с иммуностимулирующими агентами. Вакцины данного типа в настоящее время, находящиеся на клинических испытаниях, основаны как на аутологичных (например, OncoVAX, LipoNova), так и на аллогенных (например, Canvaxin, Onyvax-P, GVAX) опухолевых клеточных линиях.
in vivo.
Еще один класс противораковых вакцин использует дендритные клетки. По своей природе дендритные клетки (DC) являются «профессиональными» антигенпредставляющими клетками, способными образовывать сильный антиген-зависимый клеточно-опосредованный иммунный ответ, и вызывающими терапевтические Т-клетки Противораковые вакцины на основе DC обычно включают DC, выделенные у пациентов или полученные ex vivo, путем культивирования гемопоэтических клеток-предшественников или моноцитов пациента. DC дополнительно загружают опухолевыми антигенами и иногда объединяют с иммуностимулирующими агентами, такими как GM-CSF. В настоящее время большое количество DC-вакцин находится на клинических испытаниях, и первая одобренная FDA вакцина Sipuleucell-T основана на DC.
Механизмы иммуносупрессии и терапевтические подходы к ее смягчению
Одной из ключевых физиологических функций иммунной системы является распознавание и устранение неопластических клеток, поэтому существенным этапом любого прогрессирования опухоли является развитие механизмов иммунорезистентности. Однажды развившись, данные механизмы не только предотвращают природную иммунную систему от воздействия роста опухоли, но также ограничивают эффективность любых иммунотерапевтических подходов к лечению рака. Важный механизм иммунорезистентности включает иммуно-ингибирующие пути, иногда называемые иммунными контрольными точками. Иммуно-ингибирующие пути играют особенно важную роль во взаимодействии между опухолевыми клетками и CD8+ цитотоксическими Т-лимфоцитами, включая терапевтические агенты ACT. Среди важных иммунных контрольных точек находятся ингибирующие рецепторы, экспрессируемые на поверхности Т-клеток, такие как CTLA-4, PD1 и LAG3, среди прочих.
Научное и медицинское сообщество признало важность ослабления иммунных
контрольных точек. Одним путем смягчения иммуносупрессии является блокирование иммунных контрольных точек специально предназначенными агентами. CTLA-4-блокирующее антитело, ипилимумаб, недавно было одобрено FDA. Несколько молекул, блокирующих PD1, в настоящее время находятся в клинической разработке.
Механизмы иммуносупрессии также отрицательно влияют на функцию дендритных клеток и, как следствие, на эффективность противораковых вакцин на основе DC. Механизмы иммуносупрессии могут ингибировать способность DC представлять опухолевые антигены через путь МНС класса I и запускать не подверженные воздействию CD8+ Т-клетки для противоопухолевого иммунитета. Среди важных молекул, ответственных за механизмы иммуносупрессии в DC, являются ибиквитинлигаза А20 и высоко иммуносупрессивный белок SOCS1.
Эффективность иммунотерапевтических подходов к лечению рака может быть усилена путем объединения их с ингибиторами иммунных контрольных точек. Многочисленные проводящиеся доклинические и клинические исследования исследуют потенциальные синергии между противораковыми вакцинами и другими иммунотерапевтическими агентами и агентами блокирования контрольных точек, например, ипилимумабом. Такие комбинированные подходы могут потенциально привести к значительному улучшению клинических результатов.
et al. J.Clin. Endocrinol. Metab.,
Однако существует ряд недостатков использования противораковых иммунотерапевтических агентов в сочетании с ингибиторами контрольных точек. Например, блокирование иммунной контрольной точки может приводить к нарушению иммунной само-толерантности, тем самым, вызывая новый синдром аутоиммунных/аутовоспалительных побочных эффектов, обозначаемых как «связанные с иммунной системой побочные эффекты», в основном включая сыпь, колит, гепатит и эндокринопатии (Corsello, 2013, 98:1361).
Annals of Oncology,
Сообщенные профили токсичности ингибиторов контрольных точек отличаются от профилей токсичности, сообщенных для других классов онкологических агентов. Они принимают участие в воспалительных событиях в нескольких системах органов, включая кожную, желудочно-кишечную, эндокринную, легочную, печеночную, глазную и нервную систему. (Hodi, 2013, 24: Suppl, i7).
Ввиду вышеизложенного, существует потребность в новых противораковых терапевтических агентах, которые могут использоваться в комбинации с ингибиторами
контрольных точек, а также с другими классами онколитических агентов без риска неблагоприятных воспалительных событий в нескольких системах органов, о которых ранее сообщалось для ингибиторов контрольных точек. Иммунотерапевтические клетки в соответствии с настоящим изобретением, полученные путем обработки клеток комбинированными олигонуклеотидными агентами, нацеленные на гены, связанные с механизмами резистентности к опухолевым или инфекционным заболеваниям, а также способы получения таких терапевтических клеток и способы лечения заболеваний с помощью полученных терапевтических клеток, удовлетворяют данной давно испытываемой потребности.
Краткое описание вариантов осуществления изобретения
Эффективность иммунотерапевтических подходов к клеточным пролиферативным расстройствам и инфекционным заболеваниям может быть дополнена путем объединения их с ингибиторами иммунных контрольных точек. Многочисленные синергии между противораковыми вакцинами и другими иммунотерапевтическими агентами и агентами блокирования контрольных точек предоставляют возможности для комбинированных подходов, которые могут значительно улучшить клинические результаты, например, при пролиферативных клеточных расстройствах и иммунных заболеваниях.
ex vivo
Различные варианты осуществления изобретений, раскрытых в данной заявке, включают композиции, содержащие терапевтические клетки, полученные обработкой клеток олигонуклеотидами для того, чтобы модулировать экспрессию генов-мишеней, участвующих в механизмах иммунной супрессии. Олигонуклеотидный агент может быть антисмысловым олиогонуклеотидом (ASO), включая запертые нуклеиновые кислоты (LNA), метоксиэтильные гэпмеры и тому подобное, или киРНК, микроРНК, ингибитор микроРНК, морфолино, PNA и тому подобное. Олигонуклеотид предпочтительно представляет собой самодоставляемый (sd) агент РНКи. Олигонуклеотиды могут быть химически модифицированными, например, включая, по меньшей мере, одну 2-О-метил модификацию, 2'-фтор модификацию и/или фосфоротиоатную модификацию. Олигонуклеотиды могут включать одну или несколько гидрофобных модификаций, например, одну или несколько стериновых, холестериновых, витамин D, нафтильных, изобутильных, бензильных, индольных, триптофановых или фенилгидрофобных    модификаций.    Олигонуклеотид    может    представлять собой
гидрофобно-модифицированный киРНК-антисмысловой гибрид. Олигонуклеотиды могут использоваться в комбинации с трансмембранными системами доставки, такими как системы доставки, содержащие липиды.
В одном варианте осуществления, клетки получают и/или извлекают от пациента с раковым или инфекционным заболеванием, и могут представлять собой, например, инфильтрующие опухоль лимфоциты (TIL) и/или Т-клетки, антигенпредставляющие клетки, такие как дендритные клетки, природные клетки-киллеры, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, стволовые центральные Т-клетки памяти, и тому подобное. Т-клетки и NK-клетки предпочтительно сконструированы методами генной инженерии для того, чтобы экспрессировать высокоаффинные рецепторы Т-клеток (TCR) и/или рецепторы химерного антитела или рецепторы антитело-фрагмент-Т-клетки (CAR). В одном варианте осуществления, химерное антитело/антитело-фрагмент предпочтительно способно связываться с антигенами, экспрессированными на опухолевых клетках. Иммунные клетки могут быть сконструированы путем трансфекции плазмидой, вирусными носителями доставки или мРНК.
В одном варианте осуществления, химерное антитело или фрагмент способны связываться с рецепторами CD19 В-клеток и/или связываться с антигенами, экспрессированными на опухолях, таких как опухоли меланомы. Такие экспрессированные на меланоме антигены включают, например, GD2, GD3, HMW-MAA, VEGF-R2, и тому подобное.
Гены-мишени, идентифицированные в данной заявке для модификации, включают: цитотоксический Т-клеточный антиген 4 (CTLA4), белок запрограммированной гибели клетки 1 (PD1), бета-рецептор фактора роста опухоли (TGFR-бета), LAG3, TIM3 и аденозиновый рецептор А2а; антиапоптотические гены, включая, но не ограничиваясь этим: ВАХ, ВАС, Casp8 и Р53; А20 убиквитинлигазу (TNFAIP3, SOCS1 (супрессор цитокиновых сигналов), IDO (индоламин-2,3-диоксигеназа; разрушающий триптофан фермент), PD-L1 (CD274) (поверхностный рецептор, связующее вещество с PD1 на Т-клетках), лиганд Notch Deltal (DLL1), Jagged 1, Jagged 2, FasL (проапоптотическая поверхностная молекула), CCL17, CCL22 (секретируемые хемокины, которые привлекают клетки Treg), рецептор IL10 (IL10RA), р38 (МАРК 14), STAT3, TNFSF4 (OX40L), микроРНК miR-155, miR-146a, антиапоптотические гены, включая, но не ограничиваясь этим, ВАХ, ВАС, Casp8 и Р53, и подобные гены, и их комбинации. Репрезентативные
последовательности-мишени представлены в таблице 1.
Сконструированные терапевтические клетки обрабатывают агентами РНКи, предназначенными для ингибирования экспрессии одного или нескольких генов-мишеней. Агент РНКи может содержать направляющую последовательность, которая гибридизуется с геном-мишенью и ингибирует экспрессию гена-мишени посредством механизма интерференции РНК, где область-мишень выбрана из группы, представленной в таблице 1. Агент РНК может быть химически модифицированным и предпочтительно включает, по меньшей мере, одну 2'-0-метил, 2'-0-фтор и/или фосфоротиоатную модификацию, а также, по меньшей мере, одну гидрофобную модификацию, такую как холестерин, и тому подобное.
ex-vivo
ex vivo
Иммуногенные композиции, описанные в данной заявке, являются полезными для лечения пролиферативных расстройств, включая виды рака, и/или инфекционного заболевания, и их получают путем обработки клеток олигонуклеотидами для того, чтобы модулировать экспрессию генов-мишеней, участвующих в механизмах иммуннорезистентности к опухоли. Обработка клеток включает введение в клетки олигонуклеотида, способного нацеливаться и ингибировать экспрессию гена, участвующего в механизме супрессии опухоли, такого как гены, представленные в таблице 1. Олигонуклеотид может быть использован в комбинации с трансмембранной системой доставки, которая может содержать один или несколько из: липида(ов) и вектора, такого как вирусный вектор.
Настоящее изобретение включает способ лечения клеточного пролиферативного расстройства или инфекционного заболевания путем введения субъекту, нуждающемуся в этом, иммуногенной композиции, содержащей клетки, которые были обработаны одним или несколькими олигонуклеотидами для того, чтобы модулировать экспрессию одного или нескольких генов-мишеней, участвующих в механизмах иммуннорезистентности к опухоли, например, одного или нескольких генов-мишеней из таблицы 1.
Настоящее изобретение предпочтительно включает иммуногенные клетки, обработанные множеством олигонуклеотидных агентов, нацеленных на комбинацию генов-мишеней, описанных в данной заявке. Комбинация может быть нацелена на множество супрессорных генов рецепторов, генов цитокиновых рецепторов, регуляторных генов и/или апоптотических факторов для того, чтобы ингибировать механизмы иммуннорезистентности к опухоли.
Настоящее изобретение направлено на новые иммунотерапевтические клетки, способы получения иммунотерапевтических клеток и терапевтические способы применения таких клеток.
В данной заявке описывается новый способ ингибирования иммунных контрольных точек, применимый к широкому множеству иммунотерапий на основе клеток, включая, но не ограничиваясь этим, адаптивный перенос клеток, например, на основе TIL, TCR, CAR, и других типов клеток, а также противораковые вакцины на основе дендритных клеток. Технология самодоставляемой РНКи обеспечивает эффективную трансфекцию коротких олигонуклеотидов в любом типе клеток, включая иммунные клетки, обеспечивая повышенную эффективность иммунотерапевтических лечений. Кроме того, активированные иммунные клетки могут быть защищены посредством предотвращения апоптоза за счет ингибирования ключевых активаторов апоптотического пути, таких как ВАС, ВАХ, Casp8 н Р53, среди прочих.
Активированные иммунные клетки, модифицированные олигонуклеотидным переносом для одного терапевтического агента для введения субъекту, обеспечивают ряд преимуществ по сравнению с отдельно вводимыми комбинациями вакцин и иммунотерапевтических средств и отдельно вводимыми ингибиторами контрольных точек. Данные преимущества включают отсутствие побочных эффектов, связанных с ингибиторами контрольных точек в одном терапевтическом агенте (активированные иммунные клетки, модифицированные олигонуклеотидами, нацеленными на гены иммуннорезистентности).
Заявленные иммунотерапевтические клетки, способ получения иммунотерапевтических клеток путем введения олигонуклеотидных молекул, нацеленных на пути иммуннорезистентности, и способы лечения пролиферативного и инфекционного заболевания, улучшают любые известные иммунотерапевтические клетки и способы получения иммунотерапевтических клеток, поскольку они обеспечивают:
1) одну терапевтическую композицию, обеспечивающую комбинацию ингибиторов контрольных точек и других ингибиторов механизма иммуннорезистентности;
2) с пониженной токсичностью; и
3) повышенной эффективностью по сравнению с другими композициями.
Краткое описание чертежей
Вышеупомянутые признаки вариантов осуществления будут более понятны со ссылкой на следующее подробное описание, взятое со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых:
Фиг. 1 представляет собой схематическую диаграмму, показывающую структуру молекулы sdPHK.
Фиг. 2 представляет собой график, показывающий индуцированный sdPHK сайленсинг GAPDH и МАР4К4 в клетках HeLa.
Фиг. 3 представляет собой график, показывающий индуцированное sdPHK подавление нескольких мишеней с использованием агентов sdPHK, направленных на три гена в клетках NK-92.
Фиг. 4 представляет собой график, показывающий подавление экспрессии генов в первичных Т-клетках человека с использованием агентов sdPHK, нацеленных на ТР53 и МАР4К4.
Фиг. 5 представляет собой график, показывающий индуцированное sdPHK подавление CTLA4 и PD1 в первичных Т-клетках человека.
Фиг. 6 представляет собой график, показывающий уменьшение поверхностной экспрессии PDCD1 и CTLA-4 с использованием sdPHK в первичных Т-клетках человека.
Фиг. 7 представляет собой график, показывающий доставку sdPHK МАР4К4-суЗ в клетки Т и В в РВМС человека.
Подробное описание конкретных вариантов осуществления
Настоящее изобретение определяется формулой изобретения и включает олигонуклеотиды, специально предназначенные и выбранные для уменьшения и/или ингибирования экспрессии супрессоров иммуннорезистентности (ингибирующие олигонуклеотиды), композиции, содержащие клетки, модифицированные путем обработки такими ингибирующими олигонуклеотидами, способы получения таких композиций и способы применения композиций для лечения пролиферативных и/или инфекционных заболеваний. В частности, клетки обрабатывают комбинацией олигонуклеотидных агентов, причем каждый агент специально предназначен, чтобы препятствовать и снижать активность иммунного супрессора-мишени.
Предпочтительно, комбинация олигонуклеотидных агентов нацелена на несколько иммунных генов-супрессоров, выбранных из генов-ингибиторов контрольных точек, таких
как CTLA4, PD-1/PD-1L, BTLA (В и Т-лимфоцитарный аттенюатор), KIR (киллерные иммуноглобулиноподобные рецепторы), рецепторы В7-НЗ, В7-Н4 и рецептор TGF-бета типа 2; цитокиновых рецепторов, которые инактивируют иммунные клетки, таких как TGF-бета рецептор А и рецептор IL-10; регуляторных генов/транскрипционных факторов, модулирующих продуцирование цитокина иммунными клетками, такими как STAT-3 и Р38, miR-155, miR-146a; и апоптотических факторов, участвующих в каскадах, что приводит к гибели клетки, таких как р53 и Саср8.
Наиболее предпочтительно олигонуклеотидный агент представляет собой самодоставляемый агент РНКи, который представляет собой гидрофобно модифицированную киРНК-антисмысловую гибридную молекулу, содержащую двухцепочечную область из приблизительно 13-22 пар оснований с или без З'-липкого конца на каждой из смысловых и антисмысловых цепей и З'-одноцепочечного хвоста на антисмысловой цепи из приблизительно 2-9 нуклеотидов. Олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, одну 2'-0-метил модификацию, по меньшей мере, одну 2'-0-фтор модификацию и, по меньшей мере, одну фосфоротиоатную модификацию, а также, по меньшей мере, одну гидрофобную модификацию, выбранную из стерина, холестерина, витамина D, нафтила, изобутила, бензила, индола, триптофана, фенила и подобных гидрофобных модификаторов (смотрите фигуру 1). Олигонуклеотид может содержать множество таких модификаций.
Определения
Как используется в данном описании и прилагаемой формуле изобретения, следующие термины должны иметь указанные значения, если контекст не требует иного:
Пролиферативное заболевание, как используется в данной заявке, включает заболевания и расстройства, характеризующиеся чрезмерной пролиферацией клеток и метаболизмом клеточного матрикса, включая рак, атеросклероз, ревматоидный артрит, псориаз, идиопатический легочный фиброз, склеродермию, цирроз печени и тому подобное. Виды рака включают, но не ограничиваются этим, один или более из: мелкоклеточного рака легких, рака толстой кишки, рака молочной железы, рака легких, рака предстательной железы, рака яичников, рака поджелудочной железы, меланомы, гематологической злокачественности, такой как хронический миелоидный лейкоз, и подобных видов рака, при которых требуется иммунотерапевтическое вмешательство для
подавления иммунорезистентности, связанной с опухолью.
Иммунные гены-мишени могут быть сгруппированы, по меньшей мере, в четыре общие категории: (1) ингибиторы контрольных точек; (2) цитокиновые рецепторы, которые инактивируют иммунные клетки, (3) антиапоптотические гены; и (4) регуляторные гены, например, транскрипционные факторы.
Ингибиторы иммунных контрольных точек (ICI), как используется в данной заявке, включают иммунотерапевтические агенты, которые связываются с определенными белками контрольных точек, такими как цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген-4 (CTLA-4) и белок запрограммированной гибели клетки-1 (PD-1) и его лиганд PD-L1, для того, чтобы блокировать и отключать ингибирующие белки, которые предотвращают иммунную систему от атаки больных клеток, таких как раковые клетки, высвобождая опухолеспецифические Т-клетки для осуществления их эффекторной функции против опухолевых клеток.
Гены иммунорезистентности, связанной с опухолью, как используется в данной заявке, включают гены, участвующие в ингибировании контрольных точек иммунного ответа, такие как CTLA-4 и PD-1/PD-L1; TGF-бета, LAG3, Tim3, аденозиновый рецептор А2а;
Регуляторные гены, как используется в данной заявке, включают транскрипционные факторы и тому подобное, которые модулируют продуцирование цитокина иммунными клетками, и включают р38, STAT3, микроРНК miR-155, miR-146a;
Антиапоптотические гены, как используется в данной заявке, включают ВАХ, ВАС, Casp8, Р53 и тому подобное; и их комбинации.
Инфекционные заболевания, как используется в данной заявке, включают, но не ограничиваются этим, заболевания, вызванные патогенными микроорганизмами, включая, но не ограничиваясь этим, одну или несколько бактерий, вирусов, паразитов или грибов, при этом иммунотерапевтическое вмешательство подавляет иммунорезистентность и/или сверхактивный иммунный ответ, связанные с патогеном.
Иммуногенная композиция, как используется в данной заявке, включает клетки, обработанные одним или несколькими олигонуклеотидными агентами, при этом клетки содержат Т-клетки. Т-клетки могут быть сконструированы методами генной инженерии, например, для того, чтобы экспрессировать высокоаффинные рецепторы Т-клеток (TCR), рецепторы химерное антитело-Т-клетка (CAR), при этом фрагменты химерного антитела
способны связываться с рецепторами CD19 В-клеток и/или с антигенами, экспрессированными на опухолевых клетках. В одном варианте осуществления, фрагменты химерного антитела связывают антигены, экспрессированные на опухолях меланомы, выбранные из GD2, GD3, HMW-MAA и VEGF-R2.
Иммуногенные композиции, описанные в данной заявке, включают клетки, содержащие антигенпредставляющие клетки, дендритные клетки, сконструированные Т-клетки, природные клетки-киллеры, стволовые клетки, включая индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, и стволовые центральные Т-клетки памяти. Обработанная клетка также содержит один или множество олигонуклеотидных агентов, предпочтительно агентов sdPHKn, специально нацеленных на ген, участвующий в механизме иммуносупрессии, при этом олигонуклеотидный агент ингибирует экспрессию указанного гена-мишени.
В одном варианте осуществления, ген-мишень выбирают из А20 убиквитинлигазы, такой как TNFAIP3, SOCS1 (супрессор цитокиновых сигналов), ТугоЗ/Axl/Mer (супрессоры TLR сигналов), IDO (индоламин-2,3-диоксигеназа, разрушающий триптофан фермент), PD-L1/CD274 (поверхностный рецептор, связывает PD1 на Т-клетках), лиганда Notch Delta (DLL1), Jagged 1, Jagged 2, FasL (проапоптотическая поверхностная молекула), CCL17, CCL22 (секретируемые хемокины, которые привлекают клетки Treg), рецептора IL-10 (ILlORa), р38 (МАРК 14), STAT3, TNFSF4 (OX40L), микроРНК miR-155, miR-146a, антиапоптотических генов, включая, но не ограничиваясь этим, ВАХ, ВАС, Casp8 и Р53; и их комбинаций.
Особенно предпочтительными генами-мишенями являются те, которые показаны в таблице 1.
in vitro
Обработка ex-vivo, как используется в данной заявке, включает клетки, обработанные олигонуклеотидными агентами, которые модулируют экспрессию генов-мишеней, участвующих в механизмах иммуносупрессии. Олигонуклеотидный агент может представлять собой антисмысловой олигонуклеотид, включая, например, запертые нуклеотидные аналоги, метоксиэтильные гэпмеры, циклоэтил-В нуклеиновые кислоты, киРНК, микроРНК, ингибиторы микроРНК, морфолины, PNA, и тому подобное. Предпочтительно, олигонуклеотидный агент представляет собой агент sdPHKH, нацеленный на ген, участвующий в механизме иммуносупрессии. Клетки, обработанные олигонуклеотидным агентом, могут быть иммунными клетками, распространенными
in vitro,
in vivo,
in situ.
и могут быть клетками, полученными от субъекта, имеющего пролиферативное или инфекционное заболевание. Альтернативно, клетки или ткань могут быть обработаны например, инъекцией и/или внутривенной инъекцией
Олигонуклеотид или олигонуклеотидный агент, как используется в данной заявке, относится к молекуле, содержащей множество «нуклеотидов», включая дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды или модифицированные нуклеотиды, и их полимеры в одно- или двухцепочечной форме. Термин охватывает нуклеотиды, содержащие известные нуклеотидные аналоги или модифицированные каркасные остатки или связи, которые являются синтетическими, встречающимися в природе и не встречающимися в природе, которые имеют подобные связывающие свойства, что и у эталонной нуклеиновой кислоты, и которые метаболизируются по способу, аналогичному эталонным нуклеотидам. Примеры таких аналогов включают, без ограничения, фосфоротиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-0-метилрибонуклеотиды, пептид-нуклеиновые кислоты (PNA).
Нуклеотид, как используется в данной заявке, включает нуклеотиды с природными основаниями (стандартами) и модифицированными основаниями, хорошо известные в данной области техники. Нуклеотиды могут быть ^модифицированными или модифицированными в сахарном, фосфатном и/или основном фрагменте, (также взаимозаменяемо называемые как нуклеотидные аналоги, модифицированные нуклеотиды, неприродные нуклеотиды, нестандартные нуклеотиды и другие; смотрите, например, публикации РСТ №№ W0 92/07065 и WO 93/15187. Неограничивающие примеры основных модификаций, которые могут быть введены в молекулы нуклеиновых кислот, включают гипоксантин, пурин, пиридин-4-он, пиридин-2-он, фенил, псевдоурацил, 2,4,6-триметоксибензол, 3-метилурацил, дигидроуридин, нафтил, аминофенил, 5-алкилцитидины (например, 5-метилцитидин), 5-алкилуридины (например, риботимидин), 5-галогенуридин (например, 5-бромуридин) или 6-азапиримидины или 6-алкилпиримидины (например, 6-метилуридин и псевдоуридин), пропин и другие. Фраза «модифицированные основания» включает нуклеотидные основания, отличные от аденина, гуанина, цитозина и урацила, модифицированные, например, в положении Г, или их эквиваленты.
Как используется в данной заявке, термин «дезоксирибонуклеотид» охватывает природные     и     синтетические,     немодифицированные     и модифицированные
дезоксирибонуклеотиды. Модификации включают изменения в сахарном фрагменте, в основном фрагменте и/или в связях между дезоксирибонуклеотидом в олигонуклеотиде.
Как используется в данной заявке, термин «РНК» определяет молекулу, содержащую, по меньшей мере, один остаток рибонуклеотида. Термин «рибонуклеотид» определяет нуклеотид с гидроксильной группой в положении 2' b-D-рибофуранозного фрагмента. Термин РНК включает двухцепочечную РНК, одноцепочечную РНК, выделенную РНК, такую как частично очищенная РНК, по существу, чистую РНК, синтетическую РНК, рекомбинантно полученную РНК, а также измененную РНК, которая отличается от встречающейся в природе РНК добавлением, делецией, замещением и/или изменением одного или нескольких нуклеотидов. Нуклеотиды молекул РНК, описанные в данной заявке, могут также включать нестандартные нуклеотиды, такие как не встречающиеся в природе нуклеотиды или химически синтезированные нуклеотиды или дезоксинуклеотиды. Данные измененные РНК могут быть названы как аналоги или аналоги встречающейся в природе РНК.
Как используется в данной заявке, «модифицированный нуклеотид» относится кнуклеотиду, который имеет одну или несколько модификаций нуклеозида, нуклеиновогооснования, пентозного кольца или фосфатной группы. Например, модифицированныенуклеотиды исключают рибонуклеотиды, содержащие аденозинмонофосфат,гуанозинмонофосфат, уридинмонофосфат и цитидинмонофосфат, идезоксирибонуклеотиды, содержащие дезоксиаденозинмонофосфат,
дезоксигуанозинмонофосфат, дезокситимидинмонофосфат и дезоксицитидинмонофосфат. Модификации включают те, которые встречаются в природе, которые являются результатом модификации ферментами, которые модифицируют нуклеотиды, такими как метилтрансфераз ы.
Модифицированные нуклеотиды также включают синтетические или не встречающиеся в природе нуклеотиды. Синтетические или не встречающиеся в природе модификации у нуклеотидов включают те, которые имеют 2' модификации, например, 2'-О-метил, 2'-метоксиэтокси, 2'-фтор, 2'-аллил, 2'-0-[2-(метиламино)-2-оксоэтил], 4'-тио, 4'-СН2-0-2'-мостик, 4'-(СН2) 2-0-2'-мостик, 2'-LNA и 2'-0-(]Ч[-метилкарбамат) или те, которые содержат основные аналоги. По отношению к 2'-модифицированным нуклеотидам, как описано для настоящего изобретения, под «амино» понимают 2'-NH2 или 2'-0-NH2, которые могут быть модифицированными или ^модифицированными. Такие
модифицированные группы описаны, например, в патентах США №№ 5,672,695 и 6,248,878.
Как используется в данной заявке, «микроРНК» или «миРНК» относится к нуклеиновой кислоте, которая образует одноцепочечную РНК, причем одноцепочечная РНК обладает способностью изменять экспрессию (уменьшать или ингибировать экспрессию; модулировать экспрессию; непосредственно или опосредованно усиливать экспрессию) гена или гена-мишени, когда микроРНК экспрессируется в той же самой клетке, что и ген или ген-мишень. В одном варианте осуществления, микроРНК относится к нуклеиновой кислоте, которая имеет существенную или полную идентичность с геном-мишенью и образует одноцепочечную микроРНК. В некоторых вариантах осуществления, микроРНК может находиться в форме пре-микроРНК, при этом пре-микроРНК представляет собой двухцепочечную РНК. Последовательность микроРНК может соответствовать гену-мишени полной длины, или его подпоследовательности. Как правило, микроРНК составляет, по меньшей мере, приблизительно 15-50 нуклеотидов в длину (например, каждая последовательность одноцепочечной микроРНК составляет 15-50 нуклеотидов в длину, и двухцепочечная пре-микроРНК составляет приблизительно 15-50 пар оснований в длину). В некоторых вариантах осуществления, микроРНК составляет 20-30 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах осуществления, микроРНК составляет 20-25 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления, микроРНК составляет 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов в длину.
Ген-мишень, как используется в данной заявке, включает гены известные или идентифицированные как модулирующие экспрессию гена, участвующего в механизме иммунорезистентности, и может быть одной из нескольких групп генов, таких как супрессорные рецепторы, например, CTLA4 и PD1; цитокиновые рецепторы, которые инактивируют иммунные клетки, например, рецептор TGF-бета, LAG3, Tim3, аденозиновый рецептор А2а и рецептор IL10; регуляторные гены, например, STAT3, р38, mirl55 и mirl46a; и факторы апоптоза, участвующие в каскадах, приводящих к гибели клеток, например, Р53, Casp8, ВАХ, ВАС и их комбинациями. Смотрите также предпочтительные гены-мишени, представленные в таблице 1.
Как используется в данной заявке, короткая интерферирующая РНК (киРНК), иногда известная как малая интерферирующая РНК или сайленсирующая РНК, определяет группу молекул двухцепочечных РНК, включающую смысловые и антисмысловые цепи
РНК, каждая в общем из приблизительно 1022 нуклеотидов в длину, необязательно включающую 3'-липкий конец из 1-3 нуклеотидов. киРНК является активной в пути интерференции РНК (РНКи), и препятствует экспрессии специфических генов-мишеней с комплементарными нуклеотидными последовательностями.
Как используется в данной заявке, sdPHK относится к «самодоставляемым» агентам РНКи, которые образуются в виде асимметричного гибрида двухцепочечная РНК - антисмысловой олигонуклеотид. Двухцепочечная РНК включает направляющую (смысловую) цепь из приблизительно 19-25 нуклеотидов и пассажирскую (антисмысловую) цепь из приблизительно 10-19 нуклеотидов с дуплексным образованием, что в результате приводит к одноцепочечному фосфоротиолированному хвосту из приблизительно 5-9 нуклеотидов.
et ai,
J. Ocular Pharmacology and Therapeutics,
Последовательности РНК могут быть модифицированными стабилизирующими и гидрофобными модификациями, такими как стерины, например, холестерин, витамин D, нафтил, изобутил, бензил, индол, триптофан и фенил, которые придают стабильность и эффективное клеточное поглощение в отсутствие какого-либо трансфекционного реагента или состава. Тестирование анализов иммунных ответов касательно IFN-индуцированных белков указывает, что sdPHK продуцируют сниженный иммуностимулирующий профиль по сравнению с другими агентами РНКи. Смотрите, например, Byrne Dec. 2013, 29(10): 855-864.
Иммунотерапии на основе клеток:
Как правило, клетки получают от субъектов с пролиферативным заболеванием, таким как рак, или инфекционным заболеванием, таким как вирусная инфекция. Полученные клетки обрабатывают непосредственно, как получают, или могут быть распространены в клеточной культуре до обработки олигонуклеотидами. Клетки также могут быть генетически модифицированными, чтобы экспрессировать рецепторы, которые распознают специфические антигены, экспрессированные на поверхности опухолевых клеток (CAR), или внутриклеточные опухолевые антигены, представленные в МНС классе I (TCR).
Олигонуклеотидные агенты Антисмысловые олигонуклеотиды
Короткая интерферирующая РНК (киРНК), иногда известная как малая интерферирующая РНК или сайленсирующая РНК, представляет собой молекулу двухцепочечной РНК, как правило 19-25 пар оснований в длину. киРНК используется в интерференции РНК (РНКи), где она препятствует экспрессии специфических генов с комплементарными нуклеотидными последовательностями.
Двухцепочечная ДНК (дцРНК) может, как правило, использоваться для того, чтобы определить какую-либо молекулу, содержащую пару комплементарных цепей РНК, как правило, смысловые (пассажирские) и антисмысловые (направляющие) цепи, и может включать одноцепочечные области липкого конца. Термин дцРНК, в отличие от киРНК, как правило, относится к молекуле-предшественнику, которая включает последовательность молекулы киРНК, которая высвобождается из большей молекулы дцРНК под действием систем расщепления ферментов, включая Dicer.
sdPHK (самодоставляемая) представляет собой новый класс ковалентно модифицированных соединений РНКи, которые не требуют доставки носителя для проникновения в клетки и имеют улучшенную фармакологию по сравнению с традиционными киРНК. «Самодоставляемая РНК» или sdPHK представляет собой гидрофобно модифицированный интерферирующий РНК - антисмысловой гибрид, который демонстрирует высокую эффективность in vitro в первичных клетках и in vivo при местном введении. Сильное поглощение и/или сайленсинг без токсичности были продемонстрированы в нескольких тканях, включая дермальные, мышечные, опухолевые, альвеолярные макрофаги, спинной мозг и клетки и ткани сетчатки. В дермальном слое и сетчатке, внутрикожная и внутривитарная инъекция sdPHK в мг дозах вызывала эффективный и продолжительный сайленсинг.
Хотя sdPHK является превосходным функциональным геномическим инструментом, позволяющим РНКи в первичных клетках и in vivo, она имеет относительно низкий коэффициент попадания по сравнению с обычными киРНК. Хотя необходимость скринингировать большое количество последовательностей на ген не является ограничивающим фактором для терапевтических применений, она серьезно ограничивает применимость технологии sdPHK к функциональной геномике, где требуется экономически эффективный отбор соединений против тысячи генов. Для того, чтобы оптимизировать структуру, химию, положение нацеливания, предпочтения последовательности sdPHK и тому подобное, был разработан и использован собственный
алгоритм для прогнозирования эффективности sdPHK. Доступность реагентов sdPHK, которые активны во всех типах клеток ex vivo и in vivo позволяет функциональные геномики и исследования целевой стратификации/валидации.
Алгоритм собственной разработки
Последовательности sdPHK были выбраны на основе собственного алгоритма отбора, разработанного на основе функционального скрининга более, чем 500 последовательностей sdPHK в анализе репортерного гена люциферазы клеток HeLa. Регрессионный анализ использовался для установления корреляции между частотой появления специфического нуклеотида и модификацией в любом конкретном положении в дуплексе sdPHK и его функциональностью в анализе подавления генов. Данный алгоритм позволяет предсказать функциональные последовательности sdPHK, определяемые как имеющие более, чем 70% подавления при концентрации 1 мкМ, с вероятностью более, чем 40%.
В таблице 1 показаны прогнозированные гены-мишени, идентифицированные с использованием собственного алгоритма, и используемые в клеточных иммунотерапевтических композициях и способах, описанных в данной заявке.
Доставка агентов РНКи:
in vivo
in vivo
BTLA (В и Т-лимфоцитарный аттенюатор), KIR (киллерные иммуноглобулиноподобные рецепторы), рецепторы В7-НЗ и В7-Н4 и рецептор TGF-бета типа 2; применение BTLA (В и Т-лимфоцитарного аттенюатора), KIR (киллерных иммуноглобулиноподобных рецепторов), рецепторов В7-НЗ и В7-Н4 и рецептора TGF-бета типа 2; действие технологии РНКи на функциональные исследования геномики в prim BTLA (В и Т-лимфоцитарном аттенюаторе), KIR (киллерных иммуноглобулиноподобных рецепторах), рецепторах В7-НЗ и В7-Н4 и рецепторе TGF-бета типа 2; агу клетки и ограничены требованиями для формулирования киРНК в липидах или использование других способов доставки клеток. Для того, чтобы обойти проблемы доставки, технология самодоставляемой РНКи обеспечивает способ непосредственной трансфекции клеток агентом РНКи, без необходимости в дополнительных составах или способах. Способность трансфекции жестко трансфективных клеточных линий, высокая активность и простота использования являются характеристиками композиций и способов, которые
ex-vivo,
in vivo.
представляют значительные функциональные преимущества по сравнению с традиционными способами на основе киРНК. Технология sdPHKn позволяет непосредственно доставлять химически синтезированные соединения в широкий диапазон первичных клеток и тканей, как так и
in vitro
in vivo,
Для обеспечения BTLA (В и Т-лимфоцитарного аттенюатора), KIR (киллерных иммуноглобулиноподобных рецепторов), рецепторов В7-НЗ и В7-Н4 и рецептора TGF-бета типа 2; молекулы самодоставляемой, обычной киРНК требуют существенного уменьшения размеров и введения обширных химических модификаций, которые плохо переносятся комплексом РНКи, что в результате приводит к крайне низкой вероятности нахождения активных молекул (низкий коэффициент попадания). Напротив, технология sdPHK позволяет эффективную доставку РНКи в первичные клетки и ткани и с продемонстрированной эффективностью сайленсинга у людей.
et al.,
J. Ocular Pharmacology and Therapeutics,
Общая структура молекул sdPHK показана на фигуре 1. sdPHK образуются в виде гидрофобно-модифицированных киРНК-антисмысловых олигонуклеотидных гибридных структур, и описаны, например, в Byrne Dec. 2013, 29(10): 855-864.
Олигонуклеотидные модификации: 2'-0-метил, 2'-0-фтор, фосфоротиоатная
Олигонуклеотидные агенты предпочтительно содержат одну или несколько модификаций для того, чтобы увеличить стабильность и/или эффективность терапевтического агента, и осуществить эффективную доставку олигонуклеотида в клетки или ткань, подлежащие лечению. Такие модификации включают, по меньшей мере, одну
BTLA (В и Т-лимфоцитарный аттенюатор), KIR (киллерные иммуноглобулиноподобные рецепторы), рецепторы В7-НЗ и В7-Н4 и рецептор TGF-бета типа 2; BTLA (В и Т-лимфоцитарный аттенюатор), KIR (киллерные иммуноглобулиноподобные рецепторы), рецепторы В7-НЗ и В7-Н4 и рецептор TGF-бета типа 2; 2'-0-метил модификацию, по меньшей мере, одну 2'-0-фтор модификацию, и, по меньшей мере, одну дифосфоротиоатную модификацию. Кроме того, олигонуклеотид модифицируют для того, чтобы включить одну или несколько гидрофобных модификаций, выбранные из стерина, холестерина, витамина D, нафтила, изобутила, бензила, индола, триптофана и фенила. Гидрофобная модификация предпочтительно представляет собой стерин.
Доставка олигонуклеотидных агентов в клетки
Олигонуклеотиды могут быть доставлены в клетки в комбинации с трансмембранной системой доставки, предпочтительно содержащей липиды, вирусные векторы и тому подобное. Наиболее предпочтительно, олигонуклеотидный агент представляет собой самодоставляемый агент РНКи, который не требует каких-либо агентов доставки.
Комбинированная терапия
Наиболее предпочтительными для настоящего изобретения, например, являются конкретные комбинации элементов и/или альтернативы для конкретных потребностей. Данная цель достигается путем определения соответствующих генов, на которые должен быть нацелен олигонуклеотид для сайленсинга иммунных генов-супрессоров, и использования собственного алгоритма для выбора наиболее соответствующей последовательности-мишени.
Предпочтительным является то, что иммунотерапевтическая клетка является модифицированной для того, чтобы включать множественные олигонуклеотидные агенты, которые нацеливаются на разнообразные гены, участвующие в иммуносупрессии и предназначенные для выбранного целевого заболевания и генов. Например, предпочтительной иммунотерапевтической клеткой является Т-клетка, модифицированная для того, чтобы подавлять, как CTLA-4, так и PD-1.
Дополнительные комбинации олигонуклеотидов с родственными генами, участвующими в иммуносупрессии, включают разнообразные комбинации выбранных последовательностей-мишеней из таблицы 1.
BTLA (В и Т-лимфоцитарный аттенюатор), KIR (киллерные иммуноглобулиноподобные рецепторы), рецепторы В7-НЗ и В7-Н4 и рецептор TGF-бета типа 2; (В и Т-лимфоцитарный аттенюатор), KIR (киллерные иммуноглобулиноподобные рецепторы), рецепторы В7-НЗ и В7-Н4 и рецептор TGF-бета типа 2; предпочтительные BTLA (В и Т-лимфоцитарный аттенюатор), KIR (киллерные иммуноглобулиноподобные рецепторы), рецепторы В7-НЗ и В7-Н4 и рецептор TGF-бета типа 2; терапевтические комбинации включают клетки, сконструированные для того, чтобы подавлять экспрессию гена следующих генов-мишеней:
a) CTLA4 и PD1
b) STAT3 и р38
c) PD1 и BaxPDl, CTLA4, Lag-1, ILM-3 и ТР53
d) PD1 и Casp8
e) PD1 и IL10R
Терапевтические композиции, описанные в данной заявке, полезны для лечения субъекта, страдающего пролиферативным расстройством или инфекционным заболеванием. В частности, иммунотерапевтическая композиция полезна для лечения заболевания, характеризующегося подавлением иммунных механизмов субъектов. Описанные в данной заявке агенты sdPHK являются специально предназначенными для генов-мишеней, участвующих в связанных с заболеваниями путях иммуносупрессии.
Способы лечения субъекта включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, иммуногенной композиции, содержащей агент sdPHKn, способный ингибировать экспрессию генов, участвующих в механизмах иммуносупрессии, например, любого из генов, представленных в таблице 1 или иначе описанных в данной заявке.
Примеры
Варианты осуществления настоящего изобретения, описанные выше, предназначены только для примера; многочисленные варианты и модификации будут очевидными для квалифицированных специалистов в данной области техники. Подразумевается, что все такие варианты и модификации находятся в пределах объема настоящего изобретения, как определено в любом из пунктов прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1
Самодоставляемые РНКи иммунотерапевтические агенты
Иммунотерапевтических агенты, описанные в данной заявке, получали путем обработки клеток конкретными агентами sdPHK, предназначенными для нацеливания на и подавления специфических генов, участвующих в механизмах иммуносупрессии. В частности, следующие клетки и клеточные линии были успешно обработаны sdPHK и, как
было показано, подавляют, по меньшей мере, 70% экспрессии гена-мишени в указанных клетках человека.
Данные исследования продемонстрировали полезность данных иммуногенных агентов для подавления экспрессии генов-мишеней в клетках, обычно очень устойчивых к трансфекции, и предполагают, что агенты способны снижать экспрессию клеток-мишеней в любом типе клеток.
Пример 2
Олигонуклеотидные последовательности для ингибирования экспрессии
генов-мишеней
Несколько генов человека выбирали в качестве потенциальных генов-мишеней благодаря вовлечению в механизмы иммуносупрессии, включая следующие гены:
Каждый из перечисленных выше генов анализировали с использованием собственного алгоритма для определения предпочтительных последовательностей, нацеленных на sdPHK и областей-мишеней для каждого гена для предотвращения иммуносупрессии антигенпредставляющих клеток и Т-клеток. Результаты показаны в таблице 1.
Пример 3
Подавление гена-мишени (GAPDH) с использованием sdPHK в клетках HeLa
Клетки HeLa (АТСС CRM-CCL-2) субкультивировали 24 часа перед трансфекцией и сохраняли логарифмическую фазу. Эффективность нескольких GAPDH sdPHK тестировали с использованием количественной ПЦР с детекцией в реальном времени, включая G13 sdPHK, представленную в таблице 1.
Растворы GAPDH, МАР4К4 (положительный контроль) и NTC (без нацеленного контроля) sdPHK с удвоенной требуемой концентрацией получали в бессывороточной среде ЕМЕМ, путем разбавления 100 мкМ олигонуклеотидов до 0,2 - 4 мкМ.
Общий объем среды для каждой точки концентрации олигонуклеотидов рассчитывали как [50 мкл/лунку] х [количество повторов для каждой точки сыворотки]. Олигонуклеотиды распределяли в 96-луночный планшет в количестве 50 мкл/лунку.
Клетки собирали для трансфекции путем трипсинизации в 50 мл пробирке, дважды промывали средой, содержащей 10% FBS без антибиотиков, центрифугировали при 200 х g в течение 5 минут при комнатной температуре и повторно суспендировали в среде ЕМЕМ, содержащей удвоенное требуемое количество FBS для эксперимента (6%) и не содержащей антибиотиков. Концентрацию клеток доводили до  120000/мл, получая
конечную концентрацию 6000 клеток/50 мкл/лунку. Клетки распределяли в количестве 50 мкл/лунку в 96-луночный планшет с предварительно разбавленными олигонуклеотидами и помещали в инкубатор на 48 часов.
Анализ экспрессии генов в клетках HeLa с использованием количественной ПЦР с детекцией в реальном времени
РНК выделяли из трансфецированных клеток HeLa с использованием набора для полной очистки РНК PureLinkTM Pro96 (Ambion, № в каталоге 12173-011А), с помощью одностадийной количественной ПЦР с детекцией в реальном времени Quanta qScript XLT ToughMix, ROX (VWR, 89236672). Выделенную РНК анализировали на экспрессию генов с использованием анализов экспрессии генов человека MAP4K4-FAM (Taqman Hs0377405_ml) и GAPDH-VIC (Applied Biosystems, № в каталоге 4326317Е).
Инкубированный планшет центрифугировали и один раз промывали 100 мкл/лунку PBS и лизировали 60 мкл/лунку буфером, обеспеченным в наборе. Выделение РНК проводили в соответствии с инструкциями производителя, и РНК элюировали 100 мкл свободной от РНКазы воды и использовали неразбавленную для одностадийной количественной ПЦР.
Разбавления не трансфицированных (NT) клеток 1:5 и 1:25 получали для стандартной кривой с использованием свободной от РНКазы воды. Количественную ПЦР с детекцией в реальном времени проводили путем дозирования 9 мкл/лунку в низкопрофильный ПЦР-планшет и добавления 1 мкл РНК/лунку из ранее полученных образцов РНК. После кратковременного центрифугирования образцы помещали в циклический режим в реальном времени и амплифицировали с использованием установок, рекомендованных производителем.
Экспрессию гена GAPDH измеряли с помощью количественной ПЦР, нормировали до МАР4К4 и наносили на график в виде процента экспрессии в присутствии не нацеливающейся sdPHK. Результаты сравнивали с нормированными в соответствии со стандартной кривой. Как показано на фигуре 2, несколько агентов sdPHK, нацеленных на GAPDH или МАР4К4, значительно снижали свои уровни мРНК, что приводило к более, чем 80 - 90% подавления с 1 мкМ sdPHK. (Смотрите фигуру 2).
Пример 4
Сайленсинг множественных мишеней с использованием sdPHK в клетках NK-92
Клетки NK-92 получали от Conqwest и подвергали одностадийному анализу ПЦР с детекцией в реальном времени без очистки РНК с использованием набора FastLane Cell Multiplex (Qiagen, № в каталоге 216513). Для трансфекции, клетки NK-92 собирали центрифугированием и разбавляли средой RPMI, содержащей 4% FBS и IL2 1000 ед./мл и регулировали до 1000000 клеток/мл.
Множественные агенты sdPHK, нацеленные на МАР4К4, PPIB или GADPH разбавляли раздельно в бессывороточной среде RPM1 до 4 мкМ и индивидуально аликвотировали в количестве 50 мкл/лунку в 96-луночный планшет. Полученные клетки затем добавляли в количестве 50 мкл клеток/лунку в лунки или с МАР4К4, PPIB, или с GAPDH sdPHK. Клетки инкубировали в течение 24, 48 или 72 часов.
В указанные моменты времени помещенные в планшет трансфицированные клетки промывали один раз 100 мкл/лунку PBS и один раз FCW-буфером. После удаления супернатанта в каждую лунку добавляли смесь для обработки клеток из 23,5 мкл FCPL и 1,5 мкл раствора для разложения геномной ДНК и инкубировали в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем лизаты переносили на ПЦР-полоски и нагревали при 75°С в течение пяти минут.
Для настройки количественной ПЦР с детекцией в реальном времени лизаты смешивали с реагентами QuantiTect из набора FastLane Cell Multiplex и со смесью праймера и зонда для MAP4K4-FAM/GAPDH-VIC или PPIB-FAM/GAPDH-VIC. Использовали следующие анализы экспрессии гена Taqman: MAP4K4-FAM человека (Taqman, Hs00377405_ml), PPIB-FAM человека (Taqman, Hs00168719_ml) и GAPDH-VIC человека (Applied Biosystems, № в каталоге 4326317E).
Объем 9 мкл/лунку каждой реакционной смеси распределяли в низкопрофильный планшет ПЦР. Один мкл лизата на лунку добавляли из предварительно полученных лизатов. Образцы амплифицировали с использованием установок, рекомендованных производителем.
Результаты, показанные на фигуре 3, демонстрируют значительный сайленсинг каждой из множественных мишеней, МАР4К4, PPIB и GADPH с помощью агентов sdPHK, трансфицированных в клетки NK-92, который включает более, чем 75% ингибирования экспрессии каждой мишени в пределах от 24 до 72 часов инкубирования.
Пример 5
Сайленсинг ТР53 и МАР4К4 с использованием sdPHK в первичных Т-клетках
человека
Первичные Т-клетки человека получали от AllCell (СА) и культивировали в полной среде RPMI, содержащей 1000 МЕ/мл IL2. Клетки активировали с помощью анти-CD3/CD28 Dynabeads (Gibco, 11131) в соответствии с инструкциями производителя в течение, по меньшей мере, 4 дней до трансфекции. Клетки собирали путем кратковременного встряхивания, чтобы вывести шарики из клеток и отделить их с помощью предзначенного магнита.
Агенты sdPHK, нацеленные на ТР53 или МАР4К4, получали путем раздельного разбавления sdPHK до 0,2 - 4 мкМ в бессывороточной RPMI на образец (лунку) и индивидуально аликвотировали в количестве 100 мкл/лунку 96-луночного планшета. Клетки получали в среде RPMI, содержащей 4% FBS и IL2 2000 ед./мл в количестве 1000000 клеток/мл и высевали в количестве 100 мкл/лунку в 96-луночный планшет с предварительно разбавленными sdPHK.
В конце периода инкубирования трансфекции помещенные в планшет трансфицированные клетки промывали один раз 100 мкл/лунку PBS и обрабатывали реагентами набора FastLane Cell Multiplex, по существу, как описано для примера 4 и в соответствии с инструкциями производителя. Анализы экспрессии гена Taqman использовали в следующих комбинациях: человеческий MAP4K4-FAM/GAPDH-VIC или человеческий TP53-FAM (Taqman, Hs01034249_ml)/GAPDH-VIC. Объем 18 мкл/лунку' каждой реакционной смеси объединяли с 2 мкл лизатов на лунку из ранее полученных лизатов. Образцы амплифицировали как ранее (смотрите пример 4).
Результаты, показанные на фигуре 4, демонстрируют значительный сайленсинг как МАР4К4, так и ТР53 с помощью агентов sdPHK, трансфицированных в Т-клетки, достигающий 70-80% ингибирования экспрессии гена с помощью 1 - 2 мкМ sdPHK.
Пример 6
Иммунотерапевтическая комбинация sdPHK для лечения меланомы
Меланомы используют, по меньшей мере, два отдельных пути для подавления иммунной функции Т-клеток, и каждый из них включает как PD1, так и CTLA4. На
опухоли меланомы, экспрессирующие лиганд PD1, PD1L, могут быть нацелены Т-клетки, предварительно обработанные ex-vivo с помощью агентов sd-РНКи, специально предназначенных для нацеливания на PD1 и интерференции экспрессией PD1. PD1 также известен как PDCD1, и конкретные последовательности-мишени и области генов, идентифицированные и предсказанные для того, чтобы быть особенно функциональными в опосредованной sdPHK супрессии, показаны в таблице 1 для PDCD1 (NM 005018) и для CTLA4 (NM005214).
Лечение опухолей меланомы может быть осуществлено путем обеспечения Т-клеток меланомных клеток, таких как инфильтрирующие опухоль лимфоциты, предварительно обработанные ex-vivo комбинацией sdPHK, нацеленной на PD1/PDCD1 и CTLA4, например, нацеленной на одну или несколько из двадцати последовательностей-мишеней, перечисленных для PD1/PDCD1 и/или CTLA4. Комбинация sdPHK, нацеленная на PD1/PDCD1 и FASLG (NM 000639) и/или CTLA4, может увеличить токсичность Т-клеток в опухолях, экспрессирующих как PD1L, так и FAS.
В дополнение к и в комбинации с анти-СТЬА-4 и анти-PDl-sdPHK, Т-клетки, использованные для иммунотерапии меланомы, также могут быть обработаны с помощью sdPHK, нацеленной на другие гены, участвующие в иммуносупрессии опухоли. Данные рецепторы включают, но не ограничиваются ими, рецепторы TGF-бета типа 1 и 2, BTLA (связующее вещество индикатора проникновения вируса герпеса (HVEM), экспрессированное в клетках меланомы) и рецепторы интегринов, экспрессированных производными миелоидными супрессорными клетками (MDSC), такими как CD1 lb, CD 18 и CD29.
Для опухолей, чей профиль экспрессированных супрессивных белков неизвестен, любая комбинация sdPHK, нацеленных на PD1/PDCD1, и любого из известных супрессирующих рецепторов может быть полезна для снижения иммуносупрессии и повышения терапевтической эффективности.
Пример 7
Комбинация sdPHK для смягчения супрессии иммунных клеток
Супрессия Т-клеток или дендритных клеток может модулироваться различными цитокинами, такими как IL10 и/или TGF-бета. Супрессия соответствующих рецепторов в Т-клетках и дендритных клетках может быть полезной для их активности. Например,
обеспечение комбинации анти-PDl с анти-ILlOR sdPHK, как ожидается, смягчает индуцированную цитокином супрессию Т-клеток и дендритных клеток по сравнению с только анти-PDl.
Пример 8
Комбинация sdPHK для смягчения супрессии иммунных клеток
Когда механизм супрессии опухолей иммунных клеток может быть неизвестен, использование агентов sdPHK для подавления генов, участвующих в апоптозе (запрограммированной гибели клеток), таких как р53, Casp8 или другой ген, активирующих апоптоз, может быть полезным для увеличения активности иммунных клеток. Комбинация антирецепторных sdPHK с sdPHK против проапоптотических генов может дополнительно уменьшить гибель иммунных клеток и, таким образом, увеличить их активность. Например, комбинация анти-PDl с анти-р53 sdPHK может дополнительно защищать Т-клетки от подавления путем блокирования активации апоптоза.
Пример 9
Сайленсинг CTLA-4 и PDCD1 с использованием sdPHK в первичных Т-
клетках человека
Первичные Т-клетки человека культивировали и активировали, по существу, как описано в примере 5. Агенты sdPHK, нацеленные на PDCD1 и CTLA-4, получали путем раздельного разбавления sdPHK до 0,4 - 4 мкМ в бессывороточной RPMI на образец (лунку) и аликвотировали в количестве 100 мкл/лунку в 96-луночный планшет. Клетки получали в среде RPMI, содержащей 4% FBS и IL2 2000 ед./мл в количестве 1000000 клеток/мл и высевали в количестве 100 мкл/лунку в 96-луночный планшет с предварительно разбавленными sdPHK.
Через 72 ч трансфицированные клетки один раз промывали 100 мкл/лунку PBS иобрабатывали реагентами набора FastLane Cell Multiplex, по существу, как описано дляпримера 4 и в соответствии с инструкциями производителя. Анализы экспрессии генаTaqman использовали в следующих комбинациях: PDCD1-FAM человека (Taqman,Hs01550088_ml)/GAPDH-VIC        или        CTLA4-FAM человека (Taqman,
Hs03044418_ml)/GAPDH-VIC. Объем 18 мкл/лунку каждой реакционной смеси объединяли с  2  мкл лизатов на лунку из ранее  полученных лизатов. Образцы
амплифицировали как и раньше (смотрите пример 4).
Результаты, показанные на фигуре 5, демонстрируют значительный сайленсинг PDCD1 и CTLA-4 с использованием объединенных агентов sdPHK, доставляемых в Т-клетки, получая более, чем 60-70% ингибирование экспрессии гена с 2 мкМ sdPHK.
Пример 10
Снижение поверхностной экспрессии CTLA-4 и PDCD1 с использованием sdPHK в первичных Т-клетках человека
Первичные Т-клетки человека культивировали и активировали, по существу, как описано в примере 5.
Агенты sdPHK, нацеленные на CTLA-4 или PD1, раздельно разбавляли до 5 мкМ в бессывороточной RPMI на образец (лунку) и аликвотировали в количестве 250 мкл/лунку в 24-луночном планшете. Клетки, смешанные с магнитными шариками, собирали и доводили до 500000 клеток в 250 мкл среды RPMI, содержащей 4% FBS и IL2 2000 МЕ/мл. Клетки высевали в количестве 250 мкл/лунку в подготовленный планшет, содержащий предварительно разбавленные sdPHK. Через 24 часа к клеткам добавляли FBS для того, чтобы получить конечную концентрацию 10%.
После 72 часов инкубирования трансфицированные клетки собирали, отделяли от активирующих шариков с использованием магнита, как описано в примере 5. Клетки промывали PBS, центрифугировали и повторно суспендировали в блокирующем буфере (PBS с 3% BSA) в количестве 200000 клеток/50 мкл/образец.
Разбавления антител получали в блокирующем буфере. Антитела смешивали в двух комбинациях: анти-PDl/анти-СБЗ (разбавления 1:100 для обоих антител) и анти-CTLA4/aHTH-CD3 (10 мкл/106 клеток для анти-СТЬА4, 1:100 для CD3). Использовали следующие антитела: кроличьи моноклональные [SP7] к CD3 (Abeam, ab 16669); мышиные моноклональные [BNI3] к CTLA4 (Abeam, ab33320) и мышиные моноклональные [NAT105] к PD1 (Abeam, ab52587). Клетки смешивали с разбавленными антителами и инкубировали 30 минут на льду. Клетки затем дважды промывали PBS, содержащим 0,2% Tween-20 и 0,1% азида натрия.
Вторичные антитела разбавляли в блокирующем буфере и смешивали вместе, получая в результате окончательное разбавление 1:500 для антимышиного Су5 (Abeam, ab97037) и 1:2000 для антикроличьего Alexa-488 (Abeam, abl50077). Клетки смешивали с
разбавленными антителами в соотношении 1:1 и инкубировали в течение 30 минут на льду. Клетки промывали, как и раньше, и разбавляли в 500 мкл PBS на пробирку. Данные были получены непосредственно на цитометре Attune Acoustic Focusing (Applied Biosystems).
Как показано на фигуре 6, sdPHK эффективно снижали поверхностную экспрессию CTLA-4 и PD1 в активированных первичных Т-клетках человека.
Пример 11
Доставка МАР4К4 sdPHK в CD3- и СВ19-положительные подмножества мононуклеарных клеток периферической крови человека (РВМС)
РВМС культивировали в полной RPMI, дополненной 1,5% раствором РНА и 500 ед./мл IL2. Для трансфекции, РВМС собирали центрифугированием и разбавляли средой RPMI, содержащей 4% FBS и IL2 1000 ед./мл, и высевали в 24-луночный планшет в количестве 500000 клеток/лунку.
МАР4К4 sdPHK, меченную суЗ, добавляли к клеткам с конечной концентрацией 0,1 мкМ. После 72 часов инкубирования, трансфицированные клетки собирали, промывали PBS, центрифугировали и разбавляли в блокирующем буфере (PBS с 3% BSA) в количестве 200000 клеток/50 мкл/образец.
Разбавления антител получали в блокирующем буфере следующим образом: окончательное разбавление 1:100 анти-СЭЗ (Abeam, abl6669) и анти-СЭ19 в количестве 10 мкл/1000000 клеток (Abeam, ab31947). Клетки смешивали с разбавленными антителами и инкубировали 30 мин на льду. Клетки затем дважды промывали PBS, содержащим 0,2% Tween-20 и 0,1% азида натрия.
Вторичные антитела разбавляли в блокирующем буфере до конечного разбавления 1:500 для антимышиного Су5 (Abeam, ab97037) и 1:2000 для антикроличьего А1еха-488 (Abeam, abl50077). Клетки смешивали с разбавленными антителами в соотношении 1:1 и инкубировали 30 мин на льду. Клетки промывали, как и раньше, и разбавляли в 500 мкл PBS на пробирку. Данные были получены непосредственно на цитометре Attune Acoustic Focusing (Applied Biosystems).
На фигуре 7 показана эффективная трансфекция более 97% СЭЗ-положительных (t-клеток) и более 98% С019-позитивных (В-клеток) подмножеств в мононуклеарных клетках периферической крови человека (РВМС).