ВАКЦИНА ИНАКТИВИРОВАННАЯ СОРБИРОВАННАЯ ПРОТИВ ЯЩУРА ТИПА А
INACTIVATED SORBED VACCINE AGAINST FMD OF TYPE A

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении вакцины инактивированной сорбированной против ящура типа А.
Ящур животных продолжает оставаться мировой проблемой, к которой приковано внимание ветеринарных служб большинства государств мира и международных организаций (МЭБ, ФАО, ЕС, их комиссий и комитетов) [1].
Ящур представляет собой высококонтагиозное и быстро распространяющееся заболевание парнокопытных животных, проявляющееся лихорадкой, везикулярными поражениями слизистой оболочки ротовой полости, бесшерстных участков кожи головы, вымени, венчика, межкопытцевой щели и сопровождающееся нарушением движения. Для него характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению [2].
Контроль над ящуром значительно осложняется плюралитетом его возбудителя. Различают 7 серотипов вируса ящура (ВЯ): А, О, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2 и SAT-3. В пределах каждого серотипа обнаружены многочисленные антигенные варианты.
Причиной антигенного многообразия ВЯ является его чрезвычайно высокая изменчивость. Антигенные различия между вирусами возникают в результате спонтанных мутаций в определенных участках генома из-за ошибок вирусной РНК-полимеразы в процессе репликации вирусной РНК. Из всех участков генома максимальной вариабельностью отличается ген VP1, кодирующий основной иммуногенный белок вируса [3].
Для обеспечения устойчивого благополучия страны по ящуру в Российской Федерации реализуется система мероприятий, приоритетными в которой являются предупреждение заноса вируса ящура на территорию страны, а в районах высокой степени риска - вакцинопрофилактика. В Российской Федерации и странах СНГ для иммунизации крупного и мелкого рогатого скота против ящура применяют, как правило, инактивированные сорбированные, а для иммунизации свиней - инактивированные эмульсионные вакцины [4].
Технология изготовления противоящурной вакцины из инактивированного вируса начинается с подбора производственных штаммов на основе эпизоотологического анализа динамики ящура в стране и сопредельных государствах. При создании препаратов для специфической профилактики используют соответствующие типы вируса ящура и подбирают штаммы с широким антигенным спектром внутри типа с выраженной перекрестной иммуногенностью. Штамм с широким спектром иммуногенности и удовлетворяющий требованиям региона выбирают с помощью его испытания в реакции перекрестной защиты или чаще в реакции перекрестной нейтрализации. Как правило, в качестве производственного штамма используется популяция вируса, которая в совокупности с системой и условиями промышленного культивирования обеспечивает гарантированное и высокое накопление 146S и 75S компонентов вируса и получение иммуногенной вакцины.
Кроме того, производственному штамму предъявляются требования стабильности вируса в процессе очистки от тканевых компонентов и концентрирования, а также сохранения вируса при инактивации и длительном его хранении [5].
Хорошо известной особенностью возбудителя ящура является антигенная изменчивость штаммов в пределах одного серотипа, происходящая в различные временные промежутки, на разных территориях, зависящая от видового состава восприимчивого поголовья животных, его иммунного статуса и множества других факторов.
Считается, что основной причиной антигенной изменчивости является изменение аминокислотной последовательности в полипептидах вирусных белков, составляющих капсид вириона. Практически такие антигенные изменения могут выражаться как в незначительных отличиях между штаммами, улавливаемых только с помощью тонких методов молекулярного анализа, так и в появлении совершенно отличающихся штаммов, требующих использования новых средств специфической профилактики болезни, вызываемой этими штаммами [2,5].
т
Известны штаммы вируса ящура типа А, выделенные на территории СССР и использованные в качестве производственных при изготовлении противоящурных инактивированных вакцин. К ним относятся: штамм Ау №103, выделенный в 1962 году в Куйбышевской области; штамм А №2, выделенный в 1965 году в Таджикской ССР; штамм А №717/73, выделенный в 1973 году в Ставропольском крае. После ликвидации ящура, вызываемого близкими в антигенном отношении штаммами вируса, они были сняты с производства и в настоящее время поддерживаются лишь в Коллекции эпизоотических штаммов вируса ящура и других патогенов животных ФГБУ «ВНИИЗЖ» [2, 5].
22
Известна вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма А №550, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде адъюванта и поддерживающей среды в эффективном соотношении [6].
22
Штамм А №550 вируса ящура выделен в 1964 году в Азербайджане и используется в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах СНГ.
В качестве чувствительной биологической системы используют новорожденных крольчат, а в качестве поддерживающей среды -фосфатно-буферный раствор.
Для очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей используют хлороформ в 2% концентрации и последующее центрифугирование.
Для инактивации вируса используют формальдегид, а из адъювантов - гидроокись алюминия (ГОА) с сапонином.
22
Известна вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма А Ирак 24/64, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде адъюванта и поддерживающей среды в эффективном соотношении.
22
Штамм А Ирак 24/64 вируса ящура был передан в виде афтозного материала из института Рази (Иран) в 1967 году. В Российской Федерации используется в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах СНГ.
В качестве чувствительной биологической системы используют новорожденных крольчат, а в качестве поддерживающей среды -фосфатно-буферный раствор.
Для очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей используют хлороформ в 2% концентрации и последующее центрифугирование.
Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), а из адъювантов ГОА с сапонином.
Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма А №2045/Киргизия/2007, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде адъювантов и поддерживающую среду в соотношении, мкг [7]:
антигенный материал не менее
3,0
ГОА
11000,0÷15000,0
сапонин
500,0÷1500,0
поддерживающая среда
до 1000000,0
Штамм вируса ящура А №2045/Киргизия/2007 был выделен в Киргизской Республике от больной ящуром телки в 2007 г. Принадлежит к генетической линии, получившей название А Иран/2005 [8]. Используется в качестве производственного штамма при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах СНГ.
В качестве чувствительной биологической системы используют суспензионную культуру клеток ВНК-21, а в качестве поддерживающей среды - раствор Эрла без сыворотки с добавлением ферментативных гидролизатов мышц сухого (ФГМС), гидролизатов белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков при рН 7,4÷7,6.
Для очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей используют полигексаметиленгуанидин (ПГМГ), а для инактивации вируса - АЭЭИ. Для нейтрализации АЭЭИ в суспензию добавляют тиосульфат натрия.
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2045/Киргизия/2007 представляет собой суспензию преимущественно из 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура. В качестве адъювантов используют ГОА с сапонином.
Основной недостаток известных вакцин, в том числе и вакцины-прототипа, состоит в том, что они не обеспечивают надежной защиты восприимчивых животных от эпизоотического вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии, в Забайкальском крае и на Дальнем Востоке РФ.
В задачу создания настоящего изобретения входила разработка вакцины противоящурной инактивированной сорбированной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии, в Забайкальском крае и на Дальнем Востоке РФ.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала вакцин инактивированных сорбированных против ящура типа А.
Указанный технический результат достигнут созданием вакцины инактивированной сорбированной против ящура типа А, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.
3
Предлагаемая вакцина содержит в 1 см препарата: активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма вируса ящура А №2187/Кути/2013, полученного предпочтительно в суспензионной культуре клеток ВНК-21, в количестве не менее 3,0 мкг, и целевые добавки: ГОА предпочтительно в количестве 11000,0÷15000,0 мкг, сапонин предпочтительно в количестве 500,0÷1500,0 мкг и поддерживающую среду в количестве до 1000000,0 мкг.
Исходный вирус для получения штамма вируса ящура А №2187/Кути/2013 выделен в 2013 году в России. Штамм получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм адаптирован к первичнотрипсинизированным клеткам свиной почки и перевиваемым клеточным культурам ВНК-21, IBRS-2 и ПСГК-30.
Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют предпочтительно суспензионную культуру клеток ВНК-21, а в качестве поддерживающей среды раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,4÷7,6.
Для инактивации вируса используют АЭЭИ, который добавляют в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025÷0,05%. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию тиосульфата натрия [9].
Полученный антиген очищают от балластных примесей с помощью ПГМГ, который вносят в суспензию до концентрации 0,005÷0,007% [10].
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013 представляет собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 758 иммуногенные компоненты вируса ящура.
Количественное и качественное содержание вирусного сырья определяют методом турбидиметрии [11].
3
Для приготовления вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1 см не менее 0,5 мкг 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура.
3
3
Необходимую концентрацию 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура в предлагаемой вакцине, составляющую не менее 3 мкг в 1 см готового препарата, получают путем добавления в авирулентный и очищенный антигенный материал расчетного количества адъюванта-сорбента ГОА. Оптимальным является содержание ГОА в 1 см готового препарата в диапазоне от 11000,0 мкг до 15000,0 мкг.
3
К полученному концентрату добавляют дополнительно 10% водный раствор сапонина до его содержания в 1 см готового препарата в диапазоне от 500,0 мкг до 1500,0 мкг.
Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана.
1. Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А.
2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма вируса ящура А №2187/Кути/2013 в эффективном количестве.
3. Целевые добавки.
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1. вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А;
2. активное вещество;
3. целевые добавки.
По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вакцины является то, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А в эффективном количестве.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования.
1. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013, полученный в чувствительной биологической системе и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.
2. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток животного происхождения и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.
3. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.
3
4. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см готового препарата.
5. В качестве целевой добавки вакцина содержит адъювант-сорбент ГОА.
3
6. ГОА предпочтительно в количестве 11000,0÷15000,0 мкг в 1 смготового препарата.
7. В качестве целевой добавки вакцина содержит адъювант сапонин.
3
8. Сапонин предпочтительно в количестве 500,0÷1500,0 мкг в 1 смготового препарата.
9. В качестве целевой добавки вакцина содержит поддерживающую среду.
3
10. Поддерживающая среда в количестве до 1000000,0 мкг в 1 смготового препарата.
11. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А, ГОА, сапонин и поддерживающую среду в соотношении, мкг:
антигенный материал
не менее 3,0
ГОА
11000,0÷15000,0
сапонин
500,0÷1500,0
поддерживающая среда
до 1000000,0
Предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против вируса ящура серотипа А, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии, в Забайкальском крае и на Дальнем Востоке РФ.
Достижение технического результата от использования изобретения достигается тем, что в состав предлагаемой вакцины введен в качестве активного Вещества антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура серотипа А, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации обеспечивающего получение противоящурной вакцины сорбированной инактивированной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных против вируса ящура серотипа А, вызывающего вспышки заболевания в последние годы в странах Юго-Восточной Азии, в Забайкальском крае и на Дальнем Востоке РФ.
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2187/Кути/2013, был выделен в сентябре 2013 года от больных свиней в селе Кути Приаргунского района Забайкальского края (экспертиза №2187). Производственный штамм получен из данного изолята путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.
Штамм А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А депонирован 22 января 2014 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером (ссылкой): штамм вируса ящура А №2187/Кути/2013 (производственный).
Сущность изобретения пояснена на дендрограмме, отражающей филогенетическое взаимоотношения штаммов вируса ящура А №2187/Кути/2013 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1.
Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:
SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А;
SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А.
Штамм вируса ящура А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
Штамм вируса ящура А№2187/Кути/2013 типа А относится к семейству Picomaviridae, роду Aphtovirus, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм А№2187/Кути/2013 вируса ящура относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При иммунизации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА и РМН.
При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура типа А №2187/Кути/2013 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:40.
22
22
Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 вируса ящура типа А №2187/Кути/2013 и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм вируса ящура типа А №2187/Кути/2013 значительно отличается от производственных штаммов типа А. Степень нуклеотидных различий последовательностей штамма А №2187/Кути/2013 со штаммами вируса ящура серологического типа А составило: А №550 - 21,49%, А/Ирак/64 - 21,73%, А/Иран/96 - 22,03%, А/Армения/98 - 22,39%, А/Турция/Об - 22,11%, А/Иран/05 - 22,32%.
Таким образом, филогенетический анализ показал, что штамм А №2187/Кути/2013 принадлежит к генетической линии Юго-Восточная Азия 97 (Sea-97) топотипа Азия.
Антигенное родство штамма ВЯ А №2187/Кути/2013 с имеющимися производственными штаммами ВЯ типа А исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм А №2187/Кути/2013 антигенно отличается от производственных штаммов А22 №550, А №2179/Щелковский биокомбинат, А/Иран/97, А/Киргизия/07 (А/Иран/05). Штамм ВЯ А №2187/Кути/2013 имеется слабо выраженное антигенное родство со штаммом А/Турция/06 (А/Иран/05).
1
22
1
1
Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r) составило для А №550 - 0,13, А №2179/Щелковский биокомбинат - 0,11, А/Иран/97 - 0,004, А/Турция/06 - 0,37, А №2045/Киргизия/07 - 0,13. При значении r≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса [12, 13].
Биотехнологические характеристики
50
3
Штамм А №2187/Кути/2013 репродуцируется в первично-трипсинизированной монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), ВНК-21 и IB-RS-2, и в течение 18÷24 часов инкубирования вируса в указанных культурах клеток накапливается от 6,0 до 7,0 lg ТЦД/см. При высокой множественности заражения (1÷10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей (срок наблюдения).
Генотаксономическая характеристика
6
Штамм А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10 Д.
6
1
2
3
4
Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10 Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP, VP, VP и VP. Липопротеиновая оболочка отсутствует.
1
66a
Основным антигенным белком является VP. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.
Физические свойства
-18
3
Масса вириона составляет 8,4×10 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм А №2187/Кути/2013 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2÷7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.
Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.
Антигенная активность - введение инактивированного антигена морским свинкам индуцирует образование вирусоспецифических антител.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).
Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм А №2187/Кути/2013 по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа А, который обладает более высокой протективной и иммуногенной активностью.
Для снижения его эпизоотической опасности важна своевременная вакцинопрофилактика для предотвращения возникновения новых очагов болезни, для чего необходима высокоиммуногенная вакцина.
Разработана новая инактивированная сорбированная вакцина против ящура из штамма А №2187/Кути/2013. Экспериментально подтверждена возможность ее использования для профилактической иммунизации животных.
Пример 1.
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2187/Кути/2013, был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из проб афтозного материала, полученных в сентябре 2013 года от подозреваемых в заболевании ящуром свиней из села Кути Приаргунского района Забайкальского края (экспертиза №2187/2013). Пробы афтозного материала поступили в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 26 сентября 2013 года.
При выделении вируса с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [14].
2
3
50
Биологические и вирусологические методы включали выделение вируса, которое проводили на культуре первично трипсинизированных клеток СП, перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, IB-RS-2 с последующей адаптацией (3 пассажа). Для постановки биопроб на первичных и перевиваемых культурах клеток их выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см, отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1÷10 ТЦД на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали 10% хлороформа. После 30-минутного контакта при 37°С во флаконы вносили по 5 смподдерживающей среды и инкубировали при 37°С до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК на наличие вирусного антигена, при этом использовали коммерческие типоспецифические сыворотки, хранящихся в музее штаммов ФГБУ «ВНИИЗЖ». Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение 18÷24 часов проявлялось (%) 90÷100 ЦПД в монослое.
Вирус, адаптированный к культурам клеток IB-RS-2, использовали для получения антигена для РСК.
Эпизоотический изолят А №2187/Кути/2013, адаптированный к культуре клеток ПСГК-30, был использован для заражения суспензии клеток ВНК-21 с целью получения антигена для изготовления экспериментальной серии вакцины, а также для гипериммунизации морских свинок.
Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2.
Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о высокой адаптационной способности штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А к использованным клеточным культурам.
Изолированный с помощью перечисленных методов вирусный препарат был исследован в РСК с целью идентификации его типовой принадлежности (таблица 3). Проведена проверка штамма на отсутствие контаминации посторонними вирусами в ПЦР и ОТ-ПЦР.
Приведенные в таблице 3 результаты свидетельствуют о том, что в афтозном материале экспертизы №2187/Кути/2013 выявлен антиген вируса ящура типа А в разведении 1:2 в РСК. Контаминации бактериальной и грибной микрофлорой, микоплазмами и посторонними вирусами не обнаружено.
Полученному штамму вируса ящура типа А присвоено авторское наименование: штамм А №2187/Кути/2013.
Пример 2.
В таблице 4 приведены результаты культивирования штамма А№2187/Кути/2013 вируса ящура типа А в суспензии клеток ВНК-21, из которых следует:
1) штамм А №2187/Кути/2013 имеет время репродукции 12,60±0,47 ч;
3
2) у штамма А №2187/Кути/2013 наблюдается накопление вирусспецифического белка в пределах 2,98±0,13 мкг/см;
3
3) накопление иммуногенных компонентов (146S+75S) у штамма А №2187/Кути/2013 - 2,54±0,14 мкг/см.
Пример 3.
50
Инактивированную сорбированную вакцину против ящура типа А готовят из штамма вируса ящура А№2187/Кути/2013, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,4÷7,6. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,005÷0,2 ТЦД на клетку.
Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15÷20% раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 8,0÷8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025÷0,05%. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12÷24 часов при 36÷37°С и рН 7,2÷7,6 с перемешиванием через 5÷6 часов в течение 3÷5 минут. Остаток АЭЭИ нейтрализуют добавлением тиосульфата натрия.
В теплую суспензию добавляют 10% раствор ПГМГ до концентрации 0,005÷0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией.
В таблице 5 приведены результаты исследований по изучению влияния инактивации и очистки антигенного материала с помощью АЭЭИ и ПГМГ на иммуногенные (146S и 75S) компоненты вируса ящура штаммов А №2187/Кути/2013 и А №2045/Киргизия/2007.
Из приведенных в таблице 5 данных видно, что компоненты вируса ящура штамма А №2187/Кути/2013 сохраняются после инактивации и очистки в условиях производства. Особенно важным является тот факт, что в процессе инактивации и очистки вируса из штамма А №2187/Кути/2013 не произошло изменений в количестве 146S и 75S компонентов, полученных при репродукции вируса.
Пример 4.
3
Полученный антиген контролируют на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, 146S и 75S компонентов вируса и стерильность. Необходимую концентрацию 146S и 75S компонентов в 1 смадсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена ГОА.
3
3
3
Расчетный объем ГОА 3% концентрации добавляют в охлажденную суспензию антигена при работающей мешалке. Перемешивание ведут в течение 30 минут. После седиментации ГОА сливают расчетный объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,28±0,22 р<0,001 мг/см n=10, а концентрация 146S и 75S компонентов вируса ящура, по меньшей мере, 3,0 мкг/см готового препарата. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10% раствор сапонина до конечной концентрации 0,05÷0,15%, что соответствует 500,0÷1500,0 мкг сапонина в 1 см готовой вакцины. Вакцину расфасовывают в стеклянные или пластиковые флаконы и проводят контроль ее стерильности в соответствии с ГОСТом 28085-89.
Пример 5.
3
3
Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2,0 см, а затем подкожно в дозе 10,0 см. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут в течение 10 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или на морских свинках.
Вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым белым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.
Оптимальный компонентный состав полученной сорбированной вакцины против ящура типа А приведен в таблице 6.
Пример 6.
Изучена антигенная активность сорбированной вакцины из производственного штамма вируса ящура А №2045/Киргизия/2007 против гетерологичного штамма А №2187/Кути/2013. Уровень гуморального иммунитета оценивали против вакцинного штамма А №2045/Киргизия/2007 и против штамма А №2187/Кути/2013.
3
Испытание провели на 10 головах КРС. Сорбированную вакцину вводили подкожно в дозе 2,0 см. Результаты исследований представлены в таблице 7.
2
2
Из приведенных в таблице 7 данных видно, что сорбированная вакцина стимулировала у КРС выработку вируснейтрализующих антител против гомологичного штамма А №2045/Киргизия/2007 в количестве 4,80÷5,40 log. Против гетерологичного штамма А№2187/Кути/2013 титр вируснейтрализующих антител был в 3,7÷4,4 раза меньше и составлял 2,90÷3,25 log. Разница в титрах вируснейтрализующих антител является существенной и достоверной.
На 4 сутки после ревакцинации КРС количество вируснейтрализующих антител против вакцинного штамма А №2045/Киргизия/2007 возросло в 2 раза. Количество антител против вируса ящура штамма А №2187/Кути/2013 возросло незначительно.
Из опыта видно, что вакцина из производственного штамма А №2045/Киргизия/2007 не стимулирует выработку гуморального иммунитета для защиты животных от гетерологичного штамма А №2187/Кути/2013.
2
По рекомендациям МЭБ, титры вируснейтрализующих антител в сыворотках крови животных, иммунизированных цельной дозой вакцины, должны быть не менее 5,00 log [12].
Пример 7.
Проведены испытания сорбированной вакцины против ящура типа А, изготовленной так, как описано в примерах 3 и 4, и содержащей, мкг:
авирулентный и очищенный
антигенный материал из штамма
А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А
3,0
ГОА
13000,0
сапонин
750,0
поддерживающая среда
до 1000000,0
3
3
Авирулентность и безвредность полученной вакцины проверили на 5 головах КРС. Препарат вводили каждому животному под слизистую языка в дозе 2,0 см, а затем подкожно в дозе 10,0 см. Наблюдение за клиническим состоянием животных вели в течение 10 суток. На протяжении всего срока наблюдения отклонений в клиническом состоянии животных не выявлено, а это значит, что введенная вакцина авирулентна и безвредна.
50
50
3
По окончании контроля на авирулентность и безвредность вакцину проверили на иммуногенную активность для КРС. Испытание провели на 15 головах КРС. Результаты представлены в таблице 8. ИмД препарата была равна 0,25 см, т.е. в прививной дозе вакцины содержалось 8 PD.
50
По рекомендациям МЭБ, вакцина против ящура должна содержать, не менее 6 PD в прививном объеме для КРС [12].
Отсюда следует, что изготовленная вакцина из штамма вируса ящура А №2187/Кути/2013 имеет высокую иммуногенную активность.
Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина сорбированная инактивированная против ящура типа А, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления изобретения; вакцина, изготовленная из штамма А №2187/Кути/2013 в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии, в Забайкальском крае и на Дальнем Востоке.
Таблица 1
Антигенное соответствие (r<sub>1</sub>) в РМН штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А с производственными штаммами вируса ящура типа А
Штамм
Показатель r<sub>1</sub>
А22 №550
0,13
А №2179/Щелковский биокомбинат
0,11
А/Иран/97
0,004
А/Турция/06 (А/Иран/05)
0,37
А №2045/Киргизия/2007 (А/Иран/05)
0,13
r<sub>1</sub>≥0,3 - полевой изолят антигенно родственен производственному штамму, вакцина из производственного штамма может быть использована, если не будет найдено более родственного штамма и при условии, что животные будут иммунизированы более 1 раза;r<sub>1</sub><0,3 - полевой изолят отличается от производственного штамма, вакцина из которого не приемлема для защиты от заражения полевым изолятом
Таблица 2
Биологические свойства вируса эпизоотического штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А
Система репродукции вируса
Время проявления биологической активности (часы)
Количество адаптационных пассажей
Характеристика адаптированного материала
Активность в РСК
Титр инфекционной активности (lg ТЦД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>)
ПСГК-30
20
5
1:2
6,0
IB-RS-2
24
5
1:4
6,23
ВНК-21
18
5
1:2
7,0
Таблица 3
Определение типа вируса в 33%-ной суспензии афтозного материала в РСК (экспертиза №2187/Кути/2013)
Гипериммунные сыворотки в рабочем разведении
Экспертиза №2187
Контроль
цельный
1:2
1:4
1:8
к/а
А/Турция/06
А<sub>22</sub>/Ирак/64
O PanAsia2
Азия-1 Шамир 3/89
б/а
А/Турция/Об
+
-
-
-
4
4
-
-
-
А<sub>22</sub>/Ирак/64
4
4
-
-
4
-
-
-
O PanAsia2
-
-
-
-
-
-
4
-
-
Азия-1 Шамир 3/89
-
-
-
-
-
-
4
-
б/с
-
-
-
-
-
-
-
-
-
б/к
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Примечание: 4 - 100% задержка гемолиза;
«-« полный гемолиз;
б/с - без сыворотки;
б/а - без антигена;
б/к - без комплемента
Таблица 4
Культивирование вируса ящура штамм А №2187/Кути/2013 в суспензии клеток ВНК-21
n=10
№ п/п
Концентрация клеток, млн/см3
Доза заражения, ТЦД<sub>50</sub>/кл
Длительность репродукции, часы
Титр инфекционности вируса, lg ТЦД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>
ВСБ, мкг/см<sup>3</sup>
146S+75S компоненты, мкг/см<sup>3</sup>
% выхода 146S+75S компонентов
1
3,5
0,17
13,5
8,00
3,42
3,24
94,7
2
3,4
0,10
13,5
7,75
3,37
2,78
82,5
3
4,1
0,10
15
7,75
3,20
2,67
83,4
4
3,7
0,10
13
6,50
2,63
2,37
90,1
5
3,7
0,10
13
7,00
2,36
2,17
91,9
6
3,4
0,007
11
7,25
2,52
2,16
85,7
7
3,4
0,006
10,5
7,75
2,64
2,30
87,1
8
4,2
0,005
11
8,25
3,44
3,22
93,6
9
3,8
0,006
12
8,00
3,06
1,86
60,8
10
4,3
0,05
14
7,75
3,17
2,63
83,0
M±m
3,75±0,11 р<0,001
0,064±0,02 р<0,01
12,6±0,47 р<0,001
7,60±0,17 p<0,001
2,98±0,13 р<0,001
2,54±0,14 р<0,001
85,3±3,06 р<0,001
Таблица 5
Сравнительные данные по устойчивости вируса ящура штамма А №2045/Киргизия/2007 и штамма А №2187/Кути/2013 к инактивации аминоэтилэтиленимином и стерилизующей очистке полигексаметиленгуанидином
№ п/п
А №2045/Киргизия/2007
А №2187/Кути/2013
окончание культивирования
после инактивации и очистки
окончание культивирования
после инактивациии очистки
ВСБ, мкг/см<sup>3</sup>
146S+75S компоненты, мкг/см<sup>3</sup>
ВСБ, мкг/см<sup>3</sup>
146S+75S компоненты, мкг/см<sup>3</sup>
ВСБ, мкг/см<sup>3</sup>
146S+75S компоненты, мкг/см<sup>3</sup>
ВСБ, мкг/см<sup>3</sup>
146S+75S компоненты, мкг/см<sup>3</sup>
1
2,02
1,89
2,14
2,00
3,17
2,63
3,01
2,60
2
3,24
2,48
2,95
2,44
3,06
1,86
2,50
1,77
3
2,59
1,99
2,69
2,16
2,52
2,16
2,85
2,39
4
1,87
1,60
2,17
1,98
2,64
2,30
2,57
2,35
5
3,30
2,73
2,72
2,42
2,36
1,88
2,63
1,81
6
2,72
2,47
2,91
2,65
3,20
2,81
2,96
2,66
M±m
2,62±0,24 р<0,001
2,19±0,18 р<0,001
2,60±0,15 р<0,001
2,28±0,11 р<0,001
2,82±0,15 р<0,001
2,27±0,16 р<0,001
2,75±0,09 р<0,001
2,2б±0,16 р<0,001
Таблица 6
Оптимальная рецептура противоящурной инактивированной сорбированной вакцины из штамма вируса ящура №2187/Кути/2013 типа А (мкг в 1 см<sup>3</sup> готовой вакцины)
Компоненты вакцины
Минимум
Средний
Максимум
антигенный материал
3,0
>3,0
>3,0
ГОА
11000,0
13000,0
15000,0
сапонин
500,0
750,0
1500,0
поддерживающая среда
до 1000000,0
до 1000000,0
до 1000000,0
Таблица 7
Исследование гуморального иммунитета у КРС, привитого сорбированной вакциной из культурального вируса ящура А №2045/Киргизия/2007 против гетерологичного штамма А №2187/Кути/2013
№ п/п
Характеристика вакцины
Кратность вакцинации
№ животного
Количество вируснейтрализующих антител на 21 сутки после вакцинации, (092
А №2045/Киргизия/2007
А №2187/Кути/2013
1
Сорбированная ПД - 2 см<sup>3 </sup>1468+758-7,4 мкг А 2045/Киргизия/ 2007
1
1
5,50
2,00
2
5,50
3,50
3
5,25
2,50
4
5,50
4,75
5
5,25
3,50
M±m
5,40±0,06 р<0,001
3,25±0,44 р<0,001
2
Сорбированная ПД - 2 см<sup>3 </sup>1468+758-7,05 мкг А 2045/Киргизия/2007
1
1
4,00
2,25
2
4,50
3,00
3
5,00
3,00
4
5,25
4,00
5
5,25
2,25
M±m
4,80±0,24 р<0,001
2,90±0,32 р<0,001
2
на 4 сутки после ревакцинации
на 4 сутки после ревакцинации
1
5,00
2,75
2
5,25
3,00
3
5,75
4,00
4
7,50
4,50
5
5,50
3,00
M±m
5,80±0,44 р<0,001
3,3±0,27 р<0,001
Таблица 8
Контроль иммуногенной и протективной активности инактивированной сорбированной вакцины против ящура из штамма А №2187/Кути/2013
№№
Разведение
Наличие генерализации
Титры антител на 19 сутки после вакцинации против вируса ящура А №2187/Кути/2013, log<sub>2</sub>
ИМД<sub>50</sub>, см<sup>3</sup>
PD<sub>50</sub>
1
ц
-
6,25
0,25
8
2
-
6,50
3
-
7,00
4
-
5,50
5
-
5,75
6,20±0,27 р<0,001
6
1:4
-
4,00
7
+
3,00
8
-
6,00
9
-
4,75
10
-
4,75
4,50±0,49 р<0,001
11
1:16
-
3,25
12
+
1,75
13
+
2,50
14
+
2,25
15
+
2,75
2,50±0,25 р<0,001
K1
+
K2
+
Источники информации
1. Рахманов A.M. Программа совместных действий государств участников СНГ по профилактике и борьбе с ящуром и ее реализация // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2011. - Т.9. - С.29-46.
2. Ящур: монография / А.Н. Бурдов, А.И. Дудников, П.В. Малярец [и др.]. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.
3. Antigenic heterogeneity of a foot-and-mouth disease virus serotype in the field is mediated by very limited sequence variation at several antigenic sites / М. G. Mateu, J. Hernandez, М. A. Martinez [et al.] // J. Virol. - 1994. - Vol.68. - P.1407-1417.
4. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев [и др.]. - М.: ВНИИТИБП, 1998. - С.532-548.
5. Ререр X. Ящур: пер. с нем. / ГА. Сурковой; под ред. и с предисл. П.В. Малярца. - М.: Колос, 1971. - 432 с.
6. Временная инструкция по изготовлению и контролю противоящурной концентрированной гидроокись алюминиевой формолвакцины из лапинизированного вируса А22. Утверждена ГУВ СССР 25.03.1971 г.
7. Заявка 2012134084 Российская Федерация, МПК А61К 39/135, Вакцина против ящура типа А инактивированная / Д.А. Лозовой, В.В. Михалишин, Д. В. Михалишин, В.А. Стариков [и др.]; ФГБУ «ВНИИЗЖ» - Заявл. 09.08.2012; опублик. заявл. 20.02.2014 г.
8. Изучение биологических свойств вируса ящура линии А Иран/05 производственным штаммам типа Ag2 / М.В. Жильцова, С.Р. Кременчугская, А.И. Егорова, В.В. Борисов // Российский ветеринарный журнал - 2008. - Сентябрь. - С.15-16.
9. Пат.594771 Российская Федерация, МПК А61К 39/12, Средство для инактивации вирусов при изготовлении противовирусных препаратов/ Н.А. Улупов, А.И. Дудников, П.А. Гембицкий, Д.С. Жук; ВНИЯИ - Заявл. 07.05.1973; опубл. 07.07.93 г.
10. Пат.2054039 Российская Федерация, МПК А61К 39/135, Способ очистки и стерилизации культурального вируса ящура/ Т.Н. Лезова, Н.А. Улупов, В.В. Борисов, В.В. Михалишин, А.И. Дудников, П.А. Гембицкий; ВНИЯИ - Заявл. 07.02.1992; опубл. 10.02.1996 г.
11. Авт. свид. 784335 СССР, C12Q 1/02, Способ определения качества вирусного сырья / А.Ф. Бондаренко; ВНИЯИ - Заявл. 04.07.1979; опубл. 20.03.2000 г.
12. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. - 7th Ed. - Paris, 2012. - Vol.1, Chapter 2.1.5. - P.166-169.
13. Selection of foot-and-mouth disease vaccine strains a review / D.J. Paton, J.F. Valacher, J. Bergman [et al.] // Rev. Sci. Tech. OIE. - 2005. - Vol.24(3). - P.981-983.
14. Методические указания по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура / Гусев А.А., Захаров В.М., Шажко Ж.А. [и др.]. Владимир, 2002, 31 с.