ВАКЦИНА ПРОТИВ РЕСПИРАТОРНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
VACCINE AGAINST RESPIRATORY DISEASE OF CATTLE

Данное изобретение относится к вакцинам для лечения респираторного заболевания крупного рогатого скота. Такие вакцины содержат комбинацию антигенов вируса гриппа D крупного рогатого скота и антигенов Mannheimia haemolytica.
Респираторное заболевание крупного рогатого скота (РЗКРС) является наиболее значимым заболеванием, негативно сказывающимся на скотопромышленности в Соединенных Штатах, приводя к ежегодным потерям, которые по оценкам превышают один миллиард долларов. Широко используются многочисленные коммерческие вакцины с переменным составом на основе комбинаций инактивированных и модифицированных живых бактерий и вирусов; тем не менее, заболеваемость РЗКРС увеличивается в течение последних нескольких десятилетий. Считается, что стресс у животных, часто вызываемый перемещением и содержанием животных, предрасполагает крупный рогатый скот к РЗКРС. Ряд вирусов играют установленные роли в патогенезе РЗКРС, включая вирус вирусной диареи крупного рогатого скота, герпесвирус 1 крупного рогатого скота, респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота, вирус парагриппа 3 крупного рогатого скота, вирус ринита крупного рогатого скота и, возможно, вирус гриппа D (IDV) (Ferguson et al, J. Virol. 90:5636-42, 2016).
Впервые выделенный из организма свиней с острым респираторным заболеванием, предполагаемый вирус гриппа D был впоследствии идентифицирован у крупного рогатого скота во многих странах. Телята, инокулированные IDV, демонстрировали только легкое респираторное заболевание по сравнению с контролем, а репликация вируса была обнаружена в дыхательных путях, что связано со значительным увеличением числа нейтрофилов в трахее. Наибольшие вирусные титры присутствовали в носовых раковинах со снижением в тканях, находящихся ниже в дыхательных путях. IDV передавался контактирующим животным и всем инокулированным и подвергшимся воздействию сероконвертированным животным. В то время как серологические исследования свиной и человеческой сыворотки выявили низкий уровень распространенности антител (9,5 и 1,3% соответственно), в нескольких исследованиях было обнаружено, что антитела к IDV почти повсеместно распространены у крупного рогатого скота, причем до 94% новорожденных телят мясного крупного рогатого скота являются серопозитивными в отношении IDV, вероятно, благодаря наличию материнских антител. Поскольку известно, что материнские антитела создают помехи для вакцинации и развития активного иммунитета, присутствие антител во время вакцинации может снижать иммунный ответ на вакцину.
Хотя не установлено окончательно, IDV может быть частью комплекса респираторного заболевания крупного рогатого скота (КРЗКРС). Были предложены коммерческие вакцины против IDV, например, в US 9278999 и WO2014/015091, но не были введены в обращение, вероятно, частично вследствие недавнего открытия IDV и его неизвестной (и, возможно, незначительной) роли в патогенезе РЗКРС. Включение IDV в коммерческие вакцины против РЗКРС может повысить их эффективность, если инфекция IDV усугубляет заболевание, вызываемое другими респираторными патогенами крупного рогатого скота, а не IDV является оппортунистической инфекцией при РЗКРС, вызванном другими патогенами.
В данном изобретении предложена иммуногенная композиция, содержащая антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica. Комбинированная вакцина обеспечивает повышенную эффективность против РЗКРС по сравнению с моновалентными вакцинами в отдельности. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой инактивированную бактерию или экстракты из инактивированных бактерий, такие как экстракт белка наружной мембраны. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой рекомбинантно полученный антиген, такой как рекомбинантный лейкотоксин (rLKT).
В данном изобретении предложена иммуногенная композиция, содержащая антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica, при этом антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота представляет собой инактивированный вирус. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус. Антиген модифицированного живого вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус, модифицированный путем деоптимизации кодонов. Модифицированный живой вирус, модифицированный путем деоптимизации кодонов, может иметь один или более деоптимизированных геномных сегментов с последовательностью кДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19.
В данном изобретении предложена иммуногенная композиция, содержащая антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica, которая дополнительно содержит по меньшей мере один антиген из дополнительного патогена крупного рогатого скота. Дополнительным патогеном крупного рогатого скота может быть вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (BRSV), герпесвирус крупного рогатого скота (BHV), вирус парагриппа 3 (PI3), Pasteurella multocida, виды Leptospira и Histophilus somni, а также любая их комбинация.
В данном изобретении предложена вакцина против респираторного заболевания крупного рогатого скота, содержащая вирус гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica и фармацевтически приемлемый наполнитель, стабилизатор, солюбилизатор или разбавитель и, необязательно, адъювант. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой инактивированную бактерию или экстракты из инактивированных бактерий, такие как экстракт белка наружной мембраны. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой рекомбинантно полученный антиген, такой как рекомбинантный лейкотоксин. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой инактивированный вирус. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус. Антиген модифицированного живого вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус, модифицированный путем деоптимизации кодонов.
В данном изобретении предложена вакцина против респираторного заболевания крупного рогатого скота, содержащая вирус гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica и фармацевтически приемлемый наполнитель, стабилизатор, солюбилизатор или разбавитель и, необязательно, адъювант, которая дополнительно содержит по меньшей мере один антиген из дополнительного патогена крупного рогатого скота. Дополнительным патогеном крупного рогатого скота может быть вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (BRSV), герпесвирус крупного рогатого скота (BHV), вирус парагриппа 3 (PI3), Pasteurella multocida, виды Leptospira и Histophilus somni, а также любая их комбинация.
В данном изобретении предложен способ лечения респираторного заболевания крупного рогатого скота, включающий введение крупному рогатому скоту иммуногенной композиции, содержащей антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой инактивированную бактерию или экстракты из инактивированных бактерий, такие как экстракт белка наружной мембраны. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой рекомбинантно полученный антиген, такой как рекомбинантный лейкотоксин. Введение можно осуществлять перорально, интраназально, интратрахеально или путем инъекции, например, подкожно или внутримышечно.
В данном изобретении предложен способ лечения респираторного заболевания крупного рогатого скота, включающий введение крупному рогатому скоту иммуногенной композиции, содержащей антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica, при этом антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота представляет собой инактивированный вирус. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус. Антиген модифицированного живого вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус, модифицированный путем деоптимизации кодонов. Введение можно осуществлять перорально, интраназально, интратрахеально или путем инъекции, например, подкожно или внутримышечно.
В данном изобретении предложен способ лечения респираторного заболевания крупного рогатого скота, включающий введение крупному рогатому скоту иммуногенной композиции, содержащей антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica, которая дополнительно содержит по меньшей мере один антиген из дополнительного патогена крупного рогатого скота. Дополнительным патогеном крупного рогатого скота может быть вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (BRSV), герпесвирус крупного рогатого скота (BHV), вирус парагриппа 3 (PI3), Pasteurella multocida, виды Leptospira и Histophilus somni, а также любая их комбинация. Введение можно осуществлять перорально, интраназально, интратрахеально или путем инъекции, например, подкожно или внутримышечно.
В данном изобретении предложен способ лечения респираторного заболевания крупного рогатого скота, включающий введение крупному рогатому скоту вакцины против респираторного заболевания крупного рогатого скота, содержащей вирус гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica и фармацевтически приемлемый наполнитель, стабилизатор, солюбилизатор или разбавитель и, необязательно, адъювант. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой инактивированную бактерию или экстракты из инактивированных бактерий, такие как экстракт белка наружной мембраны. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой рекомбинантно полученный антиген, такой как рекомбинантный лейкотоксин. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой инактивированный вирус. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус. Антиген модифицированного живого вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус, модифицированный путем деоптимизации кодонов. Введение можно осуществлять перорально, интраназально, интратрахеально или путем инъекции, например, подкожно или внутримышечно.
В данном изобретении предложен способ лечения респираторного заболевания крупного рогатого скота, включающий введение крупному рогатому скоту вакцины против респираторного заболевания крупного рогатого скота, содержащей вирус гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica и фармацевтически приемлемый наполнитель, стабилизатор, солюбилизатор или разбавитель и, необязательно, адъювант, которая дополнительно содержит по меньшей мере один антиген из дополнительного патогена крупного рогатого скота. Дополнительным патогеном крупного рогатого скота может быть вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (BRSV), герпесвирус крупного рогатого скота (BHV), вирус парагриппа 3 (PI3), Pasteurella multocida, виды Leptospira и Histophilus somni, а также любая их комбинация. Введение можно осуществлять перорально, интраназально, интратрахеально или путем инъекции, например, подкожно или внутримышечно.
В данном изобретении предложено применение комбинации антигена вируса гриппа D крупного рогатого скота и антигена Mannheimia haemolytica при лечении респираторного заболевания крупного рогатого скота. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой инактивированную бактерию или экстракты из инактивированных бактерий, такие как экстракт белка наружной мембраны. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой рекомбинантно полученный антиген, такой как рекомбинантный лейкотоксин. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой инактивированный вирус. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус. Антиген модифицированного живого вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус, модифицированный путем деоптимизации кодонов. Лечение можно осуществлять перорально, интраназально, интратрахеально или путем инъекции, например подкожно или внутримышечно. Лечение можно осуществлять терапевтически или профилактически. Указанная комбинация может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель, стабилизатор, солюбилизатор или разбавитель и, необязательно, адъювант. Указанная комбинация может дополнительно содержать по меньшей мере один антиген из дополнительного патогена крупного рогатого скота. Дополнительным патогеном крупного рогатого скота может быть вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (BRSV), герпесвирус крупного рогатого скота (BHV), вирус парагриппа 3 (PI3), Pasteurella multocida, виды Leptospira и Histophilus somni, а также любая их комбинация.
В данном изобретении предложено применение антигена вируса гриппа D крупного рогатого скота и антигена Mannheimia haemolytica при производстве лекарственного средства от респираторного заболевания крупного рогатого скота. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой инактивированную бактерию или экстракты из инактивированных бактерий, такие как экстракт белка наружной мембраны. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой рекомбинантно полученный антиген, такой как рекомбинантный лейкотоксин. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой инактивированный вирус. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус. Антиген модифицированного живого вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус, модифицированный путем деоптимизации кодонов. Лекарственное средство можно вводить перорально, интраназально, интратрахеально или путем инъекции, например подкожно или внутримышечно. Введение можно осуществлять терапевтически или профилактически. Лекарственное средство может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель, стабилизатор, солюбилизатор или разбавитель и, необязательно, адъювант.Лекарственное средство может дополнительно содержать по меньшей мере один антиген из дополнительного патогена крупного рогатого скота. Дополнительным патогеном крупного рогатого скота может быть вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (BRSV), герпесвирус крупного рогатого скота (BHV), вирус парагриппа 3 (PI3), Pasteurella multocida, виды Leptospira и Histophilus somni, а также любая их комбинация.
В данном изобретении предложена композиция, содержащая антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica, для применения при лечении, снижении степени или предотвращении респираторного заболевания крупного рогатого скота у крупного рогатого скота. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой инактивированную бактерию или экстракты из инактивированных бактерий, такие как экстракт белка наружной мембраны. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой рекомбинантно полученный антиген, такой как рекомбинантный лейкотоксин. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой инактивированный вирус. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус. Антиген модифицированного живого вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус, модифицированный путем деоптимизации кодонов. Указанную композицию можно вводить перорально, интраназально, интратрахеально или путем инъекции, например подкожно или внутримышечно. Указанная композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель, стабилизатор, солюбилизатор или разбавитель и, необязательно, адъювант. Указанная композиция может дополнительно содержать по меньшей мере один антиген из дополнительного патогена крупного рогатого скота. Дополнительным патогеном крупного рогатого скота может быть вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (BRSV), герпесвирус крупного рогатого скота (BHV), вирус парагриппа 3 (PI3), Pasteurella multocida, виды Leptospira и Histophilus somni, а также любая их комбинация.
Термин «крупный рогатый скот», употребляемый для обозначения животного, в отношении которого применяют изобретение, означает любого представителя рода Bos, включая домашний крупный рогатый скот (Bos Taurus).
В контексте данного документа термин «вирус гриппа D крупного рогатого скота» (IDV) означает РНК-вирус семейства orthomyxoviridae. IDV считается родом, отдельным от вирусов гриппа А, В и С, хотя IDV оказался наиболее близок к вирусу гриппа С.Геном IDV содержит семь линейных отрицательно-полярных одноцепочечных молекул РНК. Два репрезентативных изолята IDV описаны в Таблице 1 без ограничения заявленного изобретения. Так как IDV является РНК-вирусом, ожидается, что он будет иметь высокую частоту мутаций, приводящую к процессу, называемому «антигенным дрейфом», состоящему в небольших изменениях в геноме, результатом которых являются вирусы с отличающимися антигенными свойствами.
В контексте данного документа термин «вирус» может означать вид вируса или, взаимозаменяемо, отдельную инфекционную единицу, которая может содержать нуклеиновые кислоты, белки и липидную мембрану. Отдельную инфекционную единицу также называют «вирусной частицей» или «вирионом», причем последние термины являются синонимами.
В контексте данного документа термин «штамм» или «изолят» вируса означает набор генетически гомологичных вирионов. Два вируса считаются «гомологичными», если эти вирусы картируются на одну и ту же филогенетическую кладу. Два вируса считаются «гетерологичными», если эти вирусы картируются на разные филогенетические клады. Степень полиморфизма среди изолятов IDV еще не была оценена.
«Процент идентичности» можно определить путем расчета числа идентичных нуклеотидов в одинаковых позициях в нуклеиновой кислоте. Расчет процента идентичности включает определение оптимального выравнивания между двумя или более последовательностями. Для определения процента идентичности можно использовать компьютерные программы и алгоритмы, такие как Basic Local Alignment Search Tool (средство поиска основного локального выравнивания или BLAST). BLAST является одним из многочисленных ресурсов, предоставляемых Национальным центром биотехнологической информации США. Поскольку генетический код является вырожденным, и более чем один кодон может кодировать заданную аминокислоту, кодирующие области нуклеиновых кислот считаются идентичными, если нуклеиновые кислоты кодируют идентичные полипептиды.
В контексте данного документа термин «модифицированный живой вирус» применим к любой отдельной вирусной частице (т.е. «вириону») или множеству вирусных частиц, генетическая последовательность которых была изменена относительно генетической последовательности встречающегося в природе вируса дикого типа. Изменения включают, без ограничения, генетические мутации, такие как вставки и делеции нуклеотидов, а также транзиции и трансверсии, которые приводят к замене одного нуклеотида другим нуклеотидом. Изменения можно осуществлять путем адаптации вируса дикого типа к репликации в тканевой культуральной системе и продолжения пассирования вируса в тканевой культуральной системе, в результате чего вирус накапливает генетические мутации. Изменения также можно осуществлять, используя молекулярные технологии. Одна такая молекулярная технология включает искусственное изменение частоты использования кодонов вируса или «деоптимизацию кодонов». Подобные технологии были описаны, например, в US 8846051; US 9476032; и US 2016/024477 (US Ser. №14/777204), которые в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки.
Аттенуированные вирусы составляют подгруппу модифицированных живых вирусов. В контексте данного документа термин «аттенуированный» или «аттенуация» означает, что способность вируса вызывать или усугублять клиническое заболевание была снижена или устранена. Аттенуированный вирус все еще может инфицировать клетку-хозяина in vitro или in vivo, и эта инфекция может приводить к субклиническим эффектам в организме-хозяине, но эта инфекция не приводит к появлению одного или более клинических симптомов заболевания.
Напротив, в контексте данного документа «инактивированные» вирусы или бактерии означают патогены, которые более не могут реплицироваться в организме-хозяине. Инактивированные патогены считаются убитыми или мертвыми. Инактивацию можно осуществлять различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, химические изменения, химические или физические изменения в структуре патогена или химические или физические изменения в геномных нуклеиновых кислотах патогена.
«Антиген» представляет собой любую молекулу, которую иммунная система организма способна специфически обнаруживать. Как правило, антиген представляет собой белок, кодируемый геномом патогена или полученный из продуктов генома патогена. Антиген может представлять собой цельный вирион или бактерию или их часть, или выделенный полипептид. Антигены могут быть получены естественным путем или рекомбинантно. Присутствие антигенов может специфически обнаруживаться поверхностными антигенными рецепторами как Т-лимфоцитов организма-хозяина, так и В-лимфоцитов организма-хозяина, и молекулами антител, синтезируемыми клетками-хозяевами. Неограничивающим примером антигена IDV может быть гликопротеин гемагглютинин-эстераза. Неограничивающими примерами антигенов Mannheimia могут быть экстракт белков наружной мембраны (т.е. смесь частично очищенных антигенов) и рекомбинантно экспрессируемый полипептид лейкотоксина.
«Иммуногенность» относится к способности антигена вызывать иммунный ответ, причем указанный иммунный ответ включает как антиген-специфические ответы, так и не-антиген-специфические ответы или естественные иммунные ответы. «Защитный иммунитет» представляет собой иммунный ответ, который может ослаблять или предотвращать клинические симптомы, когда иммунизированное животное стимулируют или подвергают воздействию патогенного штамма. Как понятно специалисту в данной области техники, защитный иммунитет может снижаться со временем или с возрастом иммунизированного животного. В контексте данного документа защитный иммунитет должен быть эффективным в течение по меньшей мере четырех месяцев, но предпочтительно по меньшей мере шести месяцев, от последней даты иммунизации. Защитный иммунитет может быть вызван однократной дозой вакцины. Можно применять вторую или дополнительную дозу для повышения или продления защитного иммунного ответа. Например, повышение защитного иммунного ответа у племенной коровы может привести к повышению уровня материнских антител у телят.
В отличие от антигена «адъювант» представляет собой неспецифический стимулятор иммунного ответа. Адъювант может стимулировать естественный иммунный ответ путем связывания и активации паттерн-распознающего рецептора (ПРР). Такими стимуляторами ПРР могут быть, например, вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты, липиды из бактерий или паразитов или бактериальные белки или токсины, или любой искусственно сконструированный миметик таких молекул. Адъюванты также включают, без ограничения: неорганические соединения, которые агрегируют антигены для облегчения распознавания В-лимфоцитами или поглощения фагоцитами, такие как квасцы, гидроксид алюминия, фосфат алюминия, гидроксид фосфата кальция или сульфат аммония; масла; и детергенты. Адъюванты также могут быть хозяйскими медиаторами иммунной сигнализации, такими как, без ограничения, цитокины, лимфокины, хемокины, интерфероны, анафилатоксины, факторы роста, факторы дифференцировки и молекулы адгезии.
nd
В контексте данного документа «иммуногенная композиция» представляет собой композицию, которая вызывает иммунный ответ при введении животному. Иммуногенная композиция содержит по меньшей мере один антиген и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель, стабилизатор, солюбилизатор или разбавитель. Описание фармацевтически приемлемых наполнителей, стабилизаторов, солюбилизаторов или разбавителей можно найти, например, в "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," Lloyd V. Allen, ed., Pharmaceutical Press, London, UK, 22 edition, 2012. Антиген может быть целым вирусом, бактерией или другим патогеном, живым или инактивированным. Антиген также может быть выделенной, очищенной или частично очищенной антигенной молекулой из вируса, бактерии или другого патогена. Антиген может быть полипептидом, полисахаридом, нуклеиновой кислотой или липидом. Антиген является по меньшей мере частично выделенным из его естественного окружения, которое может содержать факторы, могущие разбавлять, неправильно направлять или препятствовать эффективному иммунному ответу на антиген.
В контексте данного документа термин «вакцина» представляет собой иммуногенную композицию, которая стимулирует иммунную систему животного к развитию защиты, устойчивости, предотвращению или лечению симптома заболевания при введении нуждающемуся в этом животному, причем указанный симптом вызван патогенным организмом, например вирусом или бактерией. Вакцина может содержать, без ограничения, вирусные антигены или интактные вирионы, живые или инактивированные, в композиции с фармацевтически приемлемыми адъювантами, наполнителями, стабилизаторами, солюбилизаторами или разбавителями и, необязательно, адъювантом. Вакцина может содержать, без ограничения, бактериальные антигены или интактные бактерии, живые или инактивированные, в композиции с фармацевтически приемлемыми адъювантами, наполнителями, стабилизаторами, солюбилизаторами или разбавителями и, необязательно, адъювантом. Вакцина может содержать несколько антигенов из нескольких патогенов.
В контексте данного документа термины «процесс лечения», «лечить» или «лечение» включают подавление, замедление, прекращение, уменьшение, улучшение или обращение прогрессирования или тяжести существующего симптома, расстройства, патологического состояния или заболевания. Лечение можно применять профилактически или терапевтически.
В контексте данного документа термин «введение» включает, но не ограничивается этим, кожное, подкожное, внутримышечное, мукозальное, субмукозальное, трансдермальное, интратрахеальное, пероральное или интраназальное введение. Введение можно проводить путем инъекции или местного применения.
Следующие экспериментальные примеры являются иллюстративными в отношении вакцин против респираторного заболевания крупного рогатого скота. Понятно, что другие варианты реализации и применения будут очевидны для специалистов в данной области техники и что изобретение не ограничено этими конкретными иллюстративными примерами или предпочтительными вариантами реализации.
ПРИМЕР 1
В этом исследовании оценивали, развивается ли респираторный патогенез у крупного рогатого скота возрастом 6-9 месяцев при введении вируса гриппа D (IDV) с высоким титром и можно ли уменьшить этот патогенез с помощью гомологичной инактивированной вакцины.
В этом исследовании использовали в общей сложности 83 голштинских или гибридных голштинских телят возрастом приблизительно 6 месяцев. Животным давали акклиматизироваться в течение минимум 5 суток в их новом окружении на испытательной станции. Помещение для содержания состояло из изоляционного помещения ABSL-2 с автоматической линией подачи корма и открытой системой резервуаров с водой в каждом помещении. Животные соответствовали следующим критериям включения: отрицательный результат BVDV-PI по данным ушного выщипа и ИФА с захватом антигена (АСЕ); хорошее состояние здоровья на основании физикального осмотра, проведенного на 0 сутки; и сероотрицательный результат в отношении IDV. Животных случайным образом распределяли по группам обработки (Таблица 2), используя план случайного распределения. От исследовательского персонала, проводящего клинические наблюдения, собирающего образцы и анализирующего образцы, была скрыта информация относительно типа обработки. После применения каждого вида обработки (например, вакцинации) животных помещали в группу обработки таким образом, чтобы каждая группа находилась в изолированном загоне без возможности физического контакта между каждой группой обработки, за исключением телят из четвертой группы обработки (Т04), которых содержали вместе со стимулированными животными (группы Т02 и Т03).
Экспериментальная вакцина содержала инактивированный бета-проприолактоном (BPL) IDV, штамм Р/бычий/КБЛ 4-22/2012. Вакцину стандартизировали до 640 гемагглютинирующих единиц (ГАЕ) на дозу. Антиген разделяли на партии и готовили/дополняли с 30% EMULSIGEN D. Вакцина проходила модифицированный тест на стерильность, состоящий из нанесения конечного продукта на кровяной агар, инкубации при 37°С и исследования колоний, сформированных приблизительно через 48 часов. Колонии выявлены не были, а продукт считали стерильным. Телят вакцинировали (2,0 мл) путем подкожной (ПК) инъекции в правую сторону шеи (1-дюймовая игла 20 калибра) на 0 сутки и на 14 сутки. Животных осматривали приблизительно через 1 (один) час после вакцинации для оценки ответа на вакцинацию. Никаких аномальных явлений отмечено не было.
6
50
Стимуляцию проводили на 35 сутки (возраст ~7 месяцев). На 35 сутки (35 с) каждого теленка интраназально стимулировали (5,0 мл; 2,5 мл/ноздря) IDV, штамм D/бычий/KS/14-22/2012 при 10 TCID.
Всех животных оценивали в отношении угнетенности, состояния организма и дыхательной недостаточности на 35 сутки посредством вскрытия и делали оценку. Животных оценивали и записывали оценки перед перемещением или кормлением. Ректальную температуру тела измеряли ежесуточно в течение периода стимуляции (сутки 35-45). Температуру измеряли приблизительно в одно и то же время каждые сутки. Один образец крови брали не менее чем за 7 суток до прибытия на испытательную станцию, а остальные образцы крови для определения ингибирования гемагглютинации IDV брали на 0, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 84, 98, 112 сутки. Один образец мазка из носа брали по меньшей мере за 7 суток до прибытия на испытательную станцию, а остальные мазки из носа брали у всех животных на 35 (до стимуляции), 37, 39, 41, 43 и 45 сутки. Мазки помещали в пробирку с транспортной средой. Пробирки метили с указанием даты сбора, идентификации животного (номер ушной бирки), типа образца (носового) и номера исследования. Пробирки незамедлительно охлаждали, помещая их в кулер, содержащий пакеты со льдом. Пробирки хранили при -70°С.
На 35, 37, 39, 41, 43 и 45 сутки соответствующих животных гуманно умерщвляли для оценки поражения легких, сбора жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) и соответствующей ткани. У каждого животного удаляли легкие. Жидкость БАЛ собирали в асептических условиях из вырезанных легких. Стерильный фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) пипетировали в легкие и пипетировали обратно, аккуратно массируя легкие. Извлеченную жидкость БАЛ помещали в пробирку, которую держали на льду. Каждый образец жидкости БАЛ разделяли на две аликвоты и метили с указанием ID животного и даты получения образца. Оба набора аликвот хранили в замороженном виде (≤ -20°С).
Каждую из семи легочных долей исследовали как визуально, так и путем пальпации в отношении наличия характерных грубых поражений, связанных с IDV. Количество поражений/уплотнений в каждой легочной доле оценивали и записывали в виде действительного значения от 0 до 100% от доли. Количество поражений (оценку) в каждой доле подставляли во взвешенную формулу, чтобы рассчитать пораженный процент легких. Вес, приписываемый каждой из семи долей (в соответствии с относительной массой долей легких), является следующим: левая апикальная доля = 10%; левая сердечная доля = 10%; левая диафрагмальная доля = 25%; правая апикальная доля = 10%; правая сердечная доля = 10%; правая диафрагмальная доля = 25%; и добавочная доля = 10%. В результате добавления взвешенных процентов получили композитную оценку легочных поражений.
Ткани легкого, носовой раковины и трахеи исследовали при вскрытии в отношении наличия поражений, а часть вырезали для иммуногистохимии. Трахеобронхиальный лимфатический узел также вырезали для иммуногистохимической оценки. Все образцы окрашивали гематоксилином и эозином для структурной оценки, а также окрашивали в отношении вируса IDV, используя стандартные методы иммуногистохимии.
50
50
Назальные мазки оценивали в отношении IDV с помощью РВ-ПЦР, используя набор специфических праймеров, разработанный ветеринарно-диагностической лабораторией Университета штата Канзас (KSU). Среднее значение со стандартным отклонением значения порогового цикла (СТ) исследуемых назальных мазков экстраполировали, используя стандартную кривую известной инфицирующей дозы вируса IDV для тканевой культуры (TCID), для получения значения вирусного титра в назальных мазках. Значение СТ экстраполировали, используя стандартную кривую известной инфицирующей дозы вируса IDV для тканевой культуры (TCID), для получения значения вирусного титра (Таблица 3).
50
Жидкость бронхоальвеолярного лаважа (Таблица 4) и трахеальные мазки (41, 43 и 45 сутки) (Таблица 5) также оценивали в отношении вируса IDV с помощью РВ-ПЦР, а значение СТ экстраполировали, используя стандартную кривую известной инфицирующей дозы вируса IDV для тканевой культуры (TCID), для получения значения вирусного титра для каждой группы образцов.
Анализ оценок поражения верхних дыхательных путей и легких, как указано выше, проводился заслепленным исследователем. Композитные оценки поражений легких приведены в Таблице 6 в виде средняя композитная оценка/число животных на группу в каждый момент времени.
Наблюдали невысокие оценки поражения легких со слабо выраженной тенденцией к небольшими различиями между вакцинированными и стимулированными животными. Для дополнительного изучения общей патологии легких, вызванной IDV, можно использовать большую статистическую мощность, а также уточнение модели стимуляции. Общие патологические исследования верхних дыхательных путей, исключительно трахеи, продемонстрировали наличие слизистого экссудата с пиковыми результатами через 4 и 6 суток после стимуляции.
Фиксированные образцы ткани из носовой раковины и трахеи обрабатывали, окрашивали гематоксилином и эозином, а затем окрашивали антителом, специфическим в отношении вируса IDV. Количество положительных образцов из общего числа животных на группу для образцов ткани носовой раковины и для образцов ткани трахеи представлено в Таблицах 7 и 8, соответственно.
2
Серологические титры антител оценивали на 0, 14, 21, 28, 35 и 42 сутки исследования (СИ) для серологической конверсии в вакцину. Средний геометрический титр (СГТ) титра ингибирования гемагглютинации (ИГ) сыворотки из каждой группы приведен в Таблице 9. Серологическая оценка показывает повышение титра ИГ против IDV в вакцинированных группах по сравнению с невакцинированными. Для дополнительного возможного повышения титра антител можно провести обычную оптимизацию дозы и вакцины. Для сравнения, в случае людей считается, что титр ИГ 40 (5,3 log) в целом защищает от инфицирования вирусом гриппа А, но не полностью снимает симптомы заболевания.
Клинические проявления угнетенного состояния и оценка состояния тела были в целом обыкновенными. Стимулированные животные демонстрировали дыхательную недостаточность с пиковыми клиническими признаками на 6 сутки после стимуляции. Различий в дыхательной недостаточности между вакцинированными и невакцинированными животными не наблюдали.
Первичная цель этого исследования состояла в том, чтобы оценить, способен ли вирус гриппа D (IDV) крупного рогатого скота вызывать клинический патогенез, и выяснить, способен ли препарат гомологичной инактивированной вакцины предотвращать клинический патогенез. У животных, стимулированных IDV, репликация вируса происходила в верхних дыхательных путях согласно данным РВ-ПЦР. Кинетика репликации вируса указывает на то, что самые высокие вирусные титры приходились на 6 сутки после стимуляции. Наблюдали тенденцию к большему количеству вируса в носовых мазках, трахеальных мазках и ЖБАЛ 2-ой группы лечения (Т02) по сравнению с вакцинированными группами, при этом наибольшие различия наблюдали в трахеальных мазках и образцах ЖБАЛ. Кроме того, проводили иммуногистохимическое окрашивание IDV на фиксированных срезах тканей верхних дыхательных путей (носовые раковины и трахея). Стимулированные животные были положительными в отношении вируса IDV по результатам окрашивания, причем пять из пяти телят были положительными на 6 сутки после стимуляции. Ни одно животное, получавшее вакцину, не было положительным в отношении IDV по результатам ИГХ-окрашивания. Можно предположить, что иммунизация может ограничивать уровень вирусного распространения путем снижения вирусной нагрузки в верхних дыхательных путях. Кроме того, контактирующая контрольная группа (Т04) продемонстрировала, что вирус передавался от стимулированных животных (Т02) наивным животным, которых содержали в том же помещении.
На основании результатов этого исследования можно заключить, что IDV реплицируется в верхних дыхательных путях и вызывает легкое воспаление, на основании иммуногистохимических наблюдений. Эта вирусная инфекция может быть важным фактором комплекса респираторного заболевания крупного рогатого скота, при котором профилактическое вмешательство, такое как применение вакцины, может улучшить общее состояние здоровья крупного рогатого скота.
ПРИМЕР 2
В этом исследовании оценивали предположение, что инфекция верхних дыхательных путей, вызываемая вирусом гриппа D, предшествует или усугубляет более тяжелую вторичную инфекцию Mannheimia haemolytica.
В этом исследовании использовали в общей сложности 70 голштинских или гибридных голштинских телят возрастом 5-9 месяцев. Животным давали акклиматизироваться в течение минимум 5 суток в их новом окружении на испытательной станции. Помещение для содержания состояло из изоляционного помещения ABSL-2 с автоматической линией подачи корма и открытой системой резервуаров с водой в каждом помещении. Животные соответствовали следующим критериям включения: отрицательный результат BVDV-PI по данным ушного выщипа и ИФА с захватом антигена (АСЕ); хорошее состояние здоровья на основании физикального осмотра, проведенного на 0 сутки; и сероотрицательный результат в отношении лейкотоксина (LKT) М. haemolytica.
Экспериментальная вакцина против IDV содержала инактивированный BPL штамм IDV, штамм D/бычий/NE/103795/2012. Штамм вируса гриппа, используемый для иммунизации и стимуляции изменяли с D/бычий/KS/14-22/2012 на D/бычий/NE/103795/2012 из-за того, что последний вирус был лучше для увеличения масштабов. Вакцины стандартизировали до 1280 ГАЕ на дозу. Антиген разделяли на партии и готовили/дополняли 1:1 по массе с SEPPIC MONTANIDE ISA 201 VG. Перед применением вакцина проходила 7-суточный тест на стерильность флаконов со средой в жидкой тиогликолятной среде (FTM) и триптическом соевом бульоне (TSB).
Вакцина М. haemolytica содержала экстракт инактивированных белков наружной мембраны (БНМ) и рекомбинантный LKT (rLKT). Вакцины стандартизировали до 250 мкг БНМ и 125 мкг LKT на дозу. Антиген разделяли на партии и готовили/дополняли 1:1 по массе с SEPPIC MONTANIDE ISA 201 VG. Перед применением вакцина проходила 7-суточный тест на стерильность флаконов со средой в бульонах FTM и TSB.
Комбинированная вакцина содержала инактивированный BPL IDV, штамм D/бычий/NE/103795/2012 плюс экстракт инактивированных белков наружной мембраны (БНМ) и rLKT. Вакцины стандартизировали до 1280 ГАЕ на дозу IDV, 250 мкг БНМ и 125 мкг LKT на дозу. Антиген разделяли на партии и готовили/дополняли 1:1 по массе с SEPPIC MONTANIDE ISA 201 VG. Перед применением вакцина проходила 7-суточный тест на стерильность флаконов со средой в бульоне FTM и TSB.
Все кандидатные животные, которые соответствовали критериям отбора и критериям включения/исключения, подходили для включения. Животных случайным образом распределяли по группам обработки, используя план случайного распределения. От исследовательского персонала, проводящего клинические наблюдения, собирающего образцы и анализирующего образцы, была скрыта информация относительно типа обработки. Исследователь, который проводил оценку поражения легких, был заслеплен в отношении ID конкретного теленка во время оценки.
После прибытия на место испытаний животных содержали в трех изоляционных помещениях ABSL-2. Группы Т01, Т02, Т05, Т06 и Т07 были размещены в двух помещениях (25 животных на помещение) с равным распределением групп лечения по помещениям. Группы Т03 и Т04 были размещены в отдельном третьем помещении для предотвращения заражения наивных животных IDV, который выделяют стимулированные IDV животные. Животных смешивали в трех помещениях. После стимуляции М, haemolytica на 41 сутки исследования (СИ41) проводили повторную сортировку всего стада для равномерного распределения групп лечения (Т01-Т07) между тремя изоляционными помещениями ABSL-2 с 23-24 животными на помещение. После пересортировки получали равномерное представление каждой группы обработки (3-4 животных на группу на помещение).
Телят вакцинировали (2,0 мл) путем подкожной (ПК) инъекции в правую сторону шеи (1-дюймовая игла 18-го калибра) на 0 сутки и в левую сторону шеи на 14 сутки. Животных осматривали приблизительно через 1 (один) час после вакцинации для оценки ответа на вакцинацию. Исследуемых животных ежесуточно осматривали для определения общего состояния здоровья, начиная с -5 суток и вплоть до 48 суток. Наблюдения проводили приблизительно в одно и то же время каждые сутки. Наблюдения за здоровьем животных состояли из визуальной оценки животных в отношении показателей здоровья животных.
5,7
50
Стимуляцию вирусом D проводили на 35 сутки (возраст ~6-10 месяцев) для групп Т01, Т02, Т05, Т06 и Т07. На 35 сутки каждого теленка интраназально стимулировали с помощью одноразового распылителя PREVAL (10,0 мл; 5 мл/ноздря) IDV, штамм D/бычий/NE/103795/2012 при 10 TCID.
2
7
2
IDV получали следующим образом. В три роллерных полистироловых флакона для тканевого культивирования объемом 850 см высевали клетки ST-C с целевой плотностью 2 × 10 клеток/флакон (т.е. 23529 клеток/см) в среду ЕМЕМ с 7,5% ФБС и 4 мМ L-глутамином. Роллерные флаконы центрифугировали при 0,25 об/мин при 37°С. Через 7 суток клетки инфицировали. Для инфицирования используемую среду сначала заменяли одной предварительно нагретой средой ЕМЕМ, a IDV (D/бычий/NE/103795/2012) добавляли при множественности заражения (MOI) 0,05. После дополнительных 3 суток инкубации при 0,25 об/мин и 37°С весь роллерный флакон и его содержимое собирали путем замораживания при -80°С, размораживания, и проводили асептическое распределение.
2
Во время сбора образцов отбирали образцы для анализа вирусных титров. Для анализа клетки ST-C высевали при 15000 клеток/лунка в 96-луночные планшеты. Через 3 суток после высевания, когда клетки были на ~95% конфлюэнтными, лунки два раза промывали ФСБ, после чего в каждую лунку добавляли 100 мкл ЕМЕМ с 0,2 мл/л гентамицина. Затем собранные образцы IDV серийно разводили 1:10 перед добавлением в каждую лунку по 100 мкл каждого разведения. После дополнительных 3 суток инкубации при 37°С и 5% СО планшеты фиксировали 80% ацетоном при -20°С в течение по меньшей мере 20 минут перед высушиванием при 37°С. Для окрашивания первичное антитело разводили в Д-ФСБ, добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. После трех промывок в ФСБ вторичное антитело разбавляли в Д-ФСБ, добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37°С в течение 75 минут. После двух промывок в ФСБ результаты получали визуально под флуоресцентным микроскопом и проводили расчеты по уравнению Спирмена-Карбера.
9
9
Стимуляцию Mannheimia haemolytica проводили на 41 сутки (возраст ~6-10 месяцев) для групп Т01, Т03, Т04, Т05, Т06 и Т07. На 41 сутки каждого теленка из групп Т01, Т03, Т05, Т06 и Т07 стимулировали интраназально с помощью одноразового распылителя (5,0 мл; 2,5 мл/ноздря) и интратрахеально с помощью эндоскопа (5,0 мл) в месте бифуркации гортань/трахея штаммом М. haemolytica при 10 КОЕ/мл. На 41 сутки каждого теленка из группы Т04 стимулировали интратрахеально путем определения области бифуркации трахеи и вытягивания приблизительно на 10 см и доставки 60 мл штамма М. haemolytica при 10 КОЕ/мл с помощью эндоскопа.
Ректальную температуру тела измеряли ежесуточно в течение периода стимуляции (сутки 35-48). Температуру измеряли приблизительно в одно и то же время каждые сутки.
Один образец крови брали минимум за 7 суток до прибытия в исследовательский центр, а остальные образцы крови для определения ингибирования гемагглютинации IDV и анти-М. haemolytica LKT антитела брали на -2, 14, 21, 28, 35, 41 и 48 сутки.
Один образец мазка из носа брали минимум за 7 суток до прибытия в исследовательский центр, а остальные мазки из носа брали у всех животных на 35 (до стимуляции), 37, 39, 41, 43, 45 и 47 сутки. Кроме того, мазки из трахеи получали при вскрытии на 48 сутки.
На 48 сутки указанных животных гуманно умерщвляли для оценки поражения легких, сбора жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) и сбора ткани. У каждого животного удаляли легкие, а жидкость БАЛ собирали в асептических условиях из вырезанных легких. Стерильный фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) пипетировали в легкие и собирали пипеткой, аккуратно массируя легкие. Экстракт жидкости БАЛ помещали в пробирку, которую держали на льду. Каждый образец жидкости БАЛ разделяли на две аликвоты и метили с указанием ID животного и даты получения образца. Оба набора аликвот хранили в замороженном виде (≤ -20°С).
Каждую из семи легочных долей исследовали как визуально, так и путем пальпации в отношении наличия характерных грубых поражений, связанных с М. haemolytica и/или IDV. Количество поражений/уплотнений в каждой легочной доле оценивали и записывали в виде действительного значения от 0 до 100% от доли. Количество поражений (оценку) в каждой доле подставляли во взвешенную формулу, чтобы рассчитать пораженный процент легких. Вес, приписываемый каждой из семи долей (в соответствии с относительной массой долей легких), является следующим: левая апикальная доля = 10%; левая сердечная доля = 10%; левая диафрагмальная доля = 25%; правая апикальная доля = 10%; правая сердечная доля = 10%; правая диафрагмальная доля = 25%; и добавочная доля = 10%.
При вскрытии исследовали ткани носовых раковин, трахеи, трахеобронхиального лимфатического узла и легких в отношении поражений и делали срез каждой из них. Срез делили таким образом, чтобы поместить одну половину в фиксатор (забуференный формалин или эквивалентный раствор) для иммуногистохимической оценки, а также окрасить гематоксилином и эозином для структурной оценки, а другую половину поместить в РНК-LATER или заморозить при -70°С для ПЦР-анализа цитокинов и воспалительных генов.
Первичную переменную, оценку общего процентного поражения легких на СИ48, рассчитывали и анализировали, как в примере 1. Вторичные переменные суммировали или анализировали, в том числе суточную оценку угнетенности, суточную оценку состояния организма, суточную оценку дыхательной активности и суточную ректальную температуру тела от СИ35 до СИ48, а также смертность и исключение от СИ35 до СИ48.
Объединяли и анализировали данные по семи обработкам Т01, Т02, Т03, Т04, Т05, Т06 и Т07. В случае каждой переменной расчеты проводили для каждого животного, потому что животное было экспериментальной единицей. Все испытания проводили на уровне значимости 5%, если не указано иное.
Оценки общего процентного поражения легких на 48 сутки преобразовывали, используя arsin (кв. корень (общая процентная оценка легких)), и анализировали, используя линейный анализ смешанной модели (SAS PROC MIXED v 9.4 или выше) с фиксированным эффектом, на обработку. Линейные контрасты проводили, используя следующие попарные сравнения:
Т01 против Т02, Т03, Т04;
Т02 против Т03, Т04;
Т03 против Т04; и
Т04 против Т05, Т06 и Т07.
Для каждой группы обработки рассчитывали средние значения, полученные методом наименьших квадратов (LSMEANs), и стандартные погрешности, а также средние арифметические значения и стандартные отклонения, и представляли обратно преобразованные результаты.
Кроме того, представляли сводные статистические данные для минимизированных фракций (MF) (R версия 3.0.3 (2014-03-06)). Распределение по частоте суточных оценок угнетенности, суточной оценки состояния организма и суточных оценок дыхательной активности получали для каждого момента времени для обработки.
Было два случая смерти из-за заболеваемости, оба в группе обработки 4. Ни в одной другой группе смертность зарегистрирована не было.
Основная цель этого исследования состояла в том, чтобы оценить показатели смертности и поражения легких в разных группах обработки и оценить предположение о том, что инфекция верхних дыхательных путей, вызванная вирусом гриппа D, предшествует более тяжелой вторичной инфекции Mannheimia haemolytica. Средние оценки поражения легких у животных, стимулированных интраназально М. haemolytica после стимуляции вирусом гриппа D, продемонстрировали более чем четырехкратное увеличение по сравнению с животными, которых интраназально стимулировали только М, haemolytica (группа Т01 = 5,6 и группа Т03 = 1,2, соответственно). Это подтверждает предположение, что инфицирование верхних дыхательных путей IDV приводит к повышению вероятности миграции М. haemolytica из верхних дыхательных путей, где он обычно колонизируется, в нижние дыхательные пути и легкие, где начинает проявляться патология.
Средняя оценка поражения легких у крупного рогатого скота, стимулированного IDV и М. haemolytica, была ниже, чем наблюдаемая в традиционной модели инфекции М. haemolytica, в которой больший объем бактерий (60 мл по сравнению с 10 мл интраназально/интратрахеально) доставляется непосредственно в легкие. Различия в степени тяжести можно объяснить снижением дозы и анатомической и механической иммунологической защитой между верхними дыхательными путями и легкими.
Кроме того, комбинированная инактивированная вакцина, содержащая антигены как IDV, так и М. haemolytica, обеспечивала статистически значимую защиту (по данным MF) при двойной стимуляции с оценкой поражения легких, которая могла бы считаться эффективной, поскольку существующие статистические критерии описывают для М. haemolytica модели, используемые для лицензирования вакцин (>0,4 MF с положительными верхней и нижней границами). Моновалентные вакцины против IDV (средняя оценка поражения легких 2,5) и М. haemolytica (средняя оценка поражения легких 0,9) обеспечивали MF выше этих критериев, но верхняя и нижняя доверительные границы не соответствовали удовлетворительным критериям. Следовательно, комбинированная вакцина против IDV и М. haemolytica является эффективным подходом для контроля респираторных заболеваний крупного рогатого скота.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ЭЛАНКО ЮэС ИНК.
<120>  ВАКЦИНА ПРОТИВ РЕСПИРАТОРНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
<130>  P21011
<160>  19
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  2356
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  cDNA from influenza D virus
<400>  1
cagaggatgt caccactatt aacgctcgca aaagagtatg caaatctcac aaaggataag       60
aaatcatgca aattgctgtc gcaagggacc gtgtcaagct acaccacttt taagaaatgg      120
acaacatcga gaaaagagaa aaacccatcc cttcgaatga gatgggcaat gggaagcaag      180
ttcccaatca tggcaaacag agaaattttg gaagaagctg ggataccaga acaatgggaa      240
gggatagacc tttggtcaaa aaaggatgat gtttcaaagt tggggatggt gttagcgtct      300
cccgcagcca taacttactg gaatttttgt ggacctggag tggacaattc ttctgtaata      360
agggatgttt acaaagcaaa atttatgaaa aaagagagat ggagagagac tctgtgggga      420
ccaatgaact ttgaactggt gggtaaacaa agaagagtgg ttgaaactca accagtggaa      480
ataaaactaa accaaaaaga aataaaagaa ctaacgatgt gggttctttt tgaggatgaa      540
gcaaaccttg caagcaaatt catacaggaa aatttctcac ttgtcctgtc attaagagaa      600
ctttacaagg gaaaggcagt aaataaagat gttgcagctt ttatgattgc acaccaattt      660
tctcccgaga agaggttctt acccactttt ggccccatta gaccagaaag gatggagcta      720
ctccactgtt tagggggtga cttctggaag atagaggcag taactgcagg gagtctgaat      780
gaagaacaaa agaagagaga tgttagagca gttgccagaa aaatttgcct tagagcaagt      840
gtggacttat ttactccagc agagaagata agggactata tatcaagtgt gacaatgaga      900
tttggaacag tagaaagaac gttcgaagac gtaataagaa acagtgatga tatatctgcg      960
gaagtgacct tatgcaaagc ggcacttgga tgcgaattgg gcaaaagcat gagctttggg     1020
aatctaaatc tgaggaaagt cagtggggaa gcagaaacaa tagaaaaaac agtatattgg     1080
ggattaaagc ccataaaata caaatgctgg agaggagagg aaacatttta ttgcgaactg     1140
aggaaagtaa cttgtatgtt tagaaggtct gaaggcctag attgggctaa cattggacct     1200
ggttcacctg aagaaagaag agagctcttg gcaatggtga tgatattctg cagagatggg     1260
agattctttg aatctgcacc agttaatatt gatgaatcat tctttagaac aagactgaat     1320
aaagaaatac cttatcaata tgtgctgcta aaatgggtaa ggcaatcgag agacaacttg     1380
gatgccttgt tgagtacaag aggactgata cctgctcata ttggacaatt cggaaaagga     1440
atgggaatag atggaagtag ctcatcttct atggtttaca agggggtcat gttgtcgaaa     1500
acaccgatag acatagtgga gagcaaagag aagcacaggc tgtttttaaa tgacaatata     1560
gaagcgataa cagagagagg agcaatggtt gcatccataa tggacctatc agaggataat     1620
agagaaacat ttaacgatgt gacttttaac catgtcgact tagctgttct caaagatgaa     1680
aaaactgcaa taataaagat ctatcgatca ctggtggaaa gaataaacac tgatgatgat     1740
ggcctacctg ctttgataat gggtaaaaga tatttagagt tgtatcaatt agatgaagtg     1800
aaagacgcgg tcgggctaat accaaaacgg atgctggggg cgtattccta ccaggcaaga     1860
cagctcatac aatcgcagat caaaaatgac agttatagcc ttcctgaaat aataaaattg     1920
ctgcccttct gttacagccc tccaaagaaa atgttatttg atgggacttt ccatttcaaa     1980
aatcaaatgt atgttaggcc tgggataaac acaaaccttt tcagttttag taagaccgac     2040
aaaagcaaga tatatgtgaa cggaagcgca gtgaaaataa agcttgtgct cggagacgat     2100
gaaatggaca ccagtcttgc ctttgttgaa ggatttcaag tttgtgaata tgatccaaga     2160
gcacctttga taccaagaag agatttgaga ctgattgggt tcggaaagaa agttagagtt     2220
tttgttggtc agggacagga gaaaaccctg gtgaggacga gctccaaaag agccgcctcc     2280
catgatgtaa acaaaaacat tcgtagaatg cgtctggaag tttgaagcac attgaaaaaa     2340
tcctcttgct actgct                                                     2356
<210>  2
<211>  2261
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  cDNA from influenza D virus
<400>  2
acgtcaatga tatcattgac atacccatac actggggcac ctcctatgtc acatggaaca       60
tcgaccaaat actcaatgga gactgtgtca agaacttact cctacagtag aactaaaaaa      120
gaggtacctt cgggaatatt cccaataaag agaaggaaat tctgtaacac aatagaagac      180
aaagaaaacc tggaaaaacc gaatggaaat gttgatataa atttcatgtt atcgctggca      240
gaaatgctgg aagaaaagat gggaaaaggg ttcttcaaat tctgtgccaa tgaagctgaa      300
gctgaaattt tgaagatgca cttcagcaag ctcactgaag gaaggcaaac ttatgactgg      360
acaagtgaaa gaaatatgcc agcagccacc gctcttcagc taacagtaga cgctatacaa      420
gaaacacagg gaacattcaa aggaactacc atggttgaat attgcaacaa gatattagaa      480
atgatggatt ggccagaagt gaaattcaaa aaggtcagaa tgattgttca gaggcattgg      540
gacccgaaaa ccaaaaaaga aataaaaatg aagtctccaa cattgatgat aacaaagatt      600
ggaagagaag aattcataaa gaggatatgc acgataaaca ccatggccaa agacggagaa      660
agaggaaaat acaaaagaag agctatagcc acccccggga tgggaatcag gccattctca      720
aaaattgtgg aaactttagc acaaaagatt tgtgagagac tagcagagag cggtttgcct      780
gttgggggaa atgagaagaa agccaaacta aaaactacgg tctcttcaac aaactcaaaa      840
ctacaagaag ggcagttcat ggtaaacata acaggggaca acagcaagtg gaatgaatgt      900
cagcaaccag aagcttatct tgcaatgttg gcatacatta ctaaagacag cagcaactta      960
atgaaagatc tctgctcagt agctccaaca ttgttctgca ataagtacgt gaaaatggga     1020
caaggtttcc gagcaaaaaa caaaagaaaa accaaagaaa tagtgatacc cgcaaaaagg     1080
atgaaagaaa ggaaagaatt gatgaacgcg gaatggaggg acctgtttga aacaatagaa     1140
ccttacatgg atggagagtg ctgcttcttg gggggaggaa tgctgatggg aatgtttaac     1200
atgttgtcaa ctgtttttgg agtcatgaca ttaaattaca gggaggaagc attggccaga     1260
aggaactgtt actggactgg gctacaaagt tcagatgatt ttgtgctctt ttgcatctct     1320
aaaacttggc cagagatgga gatgactatt ctaaaattca tcgctgtttg caagttgatg     1380
ggaataaaca tgtctttgga aaaatcctac gggtgcttgc ctgaactttt tgagttcaca     1440
agcatgttct tttccgggga ttttgtctca aacatagcct tggagttacc tgctttcaca     1500
acagctggaa tgaatgaagg aaccgacttc acagctgcga tgtctgtcat aagaacaaac     1560
atgatcaata atggactttc tcctgggact gctttaatgg ccctgcgaat ttgtctgcag     1620
gaatttagag caacatacag agtacaccct tatgactctg gagtgaagaa tcatcgaatg     1680
aaaatcataa ggaaattcat tgaaactatt gaaaacaaag atggattgct gatatcagat     1740
ggcgggaaat taatgaacaa tatctcaagt ttgcacatcc ctgaagaaat attgaaagag     1800
gatttgatgg atccctccta caggaacaga gttttcaatc ctaggaaccc ctttacacag     1860
tttgagaaga cagttgacat ctttaaggca agtgggccta taagagtaga ggagaacgaa     1920
gcagttgtat caacgcattc ctttaaaaca aggagcaata ggacattgct aaacacagac     1980
atgagggcaa tggctctcga agagaaaaga taccaagttg tttgcaacat gtaccgatcg     2040
gtcttcgaaa gtgcagacgt taacacccca ataggatcaa tgtcgatggg agaggcaatt     2100
gaagccaaaa tccttgaccg ggccagaacc cagtttgaaa atggaatcat agggggagaa     2160
gaatattctg aaatcaaaag actaatcgag gacgccaagc gtcaacgact gtctgtttaa     2220
gctttgcgtt gtttaataac agaaaaatcc tcttgctact g                         2261
<210>  3
<211>  2194
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  cDNA from influenza D virus
<400>  3
agcagatatc aggagattta gaaatgtcta gtgtaatcag agaaatcgca aagcgattct       60
tggaacaagc aacgataaac atcgctgaag aagtggtcag agaatatgga gaccatgaaa      120
gaacaatgat atctgttgga gttcatttcc aagcttgctg ccttataagt gatgaatata      180
cccttgagga tgagacaacc ccaagatacg ttcttttgga gggattgaga agacaagagg      240
ctataagcaa gcagaataac atttgctcca ctttgggatt ggaacccttg agaaatctag      300
cagatatttt tgatcgaaaa acaagaagat tccttgaaat aggaattaca aagagagaat      360
ccgatgagta ttaccaggaa aagttcaaca aaataggaaa tgacatggac atacatgttt      420
tcacatatga aggcaaatat ttcagcaaca atcccaatgg gttggaagac atccaaaaga      480
caagaatttt tacattccta tcttttgtgt cagacgaatt gagaaaagag aacatgttca      540
cagaaatgta tgttacagaa gaaggggcac ctgagcttga aatgtacaag tcaaagcttt      600
tcattgcaat gagagacgag agcgtgcctt tgccttacat aaactatgag caccttagga      660
caagatgtga aacattcaaa agaaatcagg ctgaatgcga agcaaaggta gcggatgtgg      720
cttcacggct aaaaatcaaa ctggaacatc tagaagaaaa caaactgcgg ccgctagaga      780
taccgaagga gaaagaggct ccctatacgc acaaatttat gatgaaagat gcttggttct      840
ttgcaaaacc tcatgattcg gagagagcac aaccgcaaca gatattgtat gatttctttg      900
aagcagcaaa catggggttc atgacgacat ccccaaaacc gatattcgga aagcaaggac      960
tgatgtatca ctccctctgg gggcagataa aaagggcaat aaaggacaag agaaatgagt     1020
tggagccttc agaacagagg gacttccttt gtggaattgg aagagcctcc aagaaaatac     1080
aggaggacaa atggcaagaa tccagagagg aagagtttaa acaagaagag actaaagggg     1140
cagctaagag ggggttccca acatggttta atgaagaatg gctttgggca atgagggact     1200
caggggatgg ggacaacaaa ataggggatt ggatacccat ggcagaaatg cctccctgca     1260
agaatgaaat ggaagattat gcaaaaaaga tgtgtgaaga attagaatcc aaaatacagg     1320
gaacaaattg tgctagggaa atgtccaagt tgatacatac aattgggagc ttacatacag     1380
aatgtaggaa ctttcccgga aaggtcaaga tagtgcctat atactgcaga gggacactga     1440
gaggggaatc aactgactgt ttgtttggaa tagcaataaa agggaaatcc catttaaaca     1500
aagatgatgg aatgtatact gttgtaactt ttgagttttc cactgaagaa ccaaatccaa     1560
gcaaacatga aaaatatacg gtcttcgaag ctggaacagt gcctgtggaa gccgtggtgt     1620
taactcccaa aagggaaaga gttctcaaag agaagaaatt gtttctttat tgcagaacta     1680
ctggaatgag caagttaaag aacgattggt tttctaaatg caggagatgt cttataccaa     1740
caatggagac tgtagagcag atagtgctga aagaatgcgc tctgaaagaa gaaaacagag     1800
tttcagagat gttggagaat aagagagctt ggattgccca tgagaacgga gagaatctta     1860
caagattggt atcaacaaag ctcaaagact tgtgtagaat gctaattgtg acacaatttt     1920
attactgtat atataacgac aatcagttgg aaggattctg taacgagcaa aagaaattcc     1980
ttatgtttct tcaagcagat aaggactcaa aatctgcatt tacttttaat cagaaagggt     2040
tatatgaaaa aattgaagag tgtattgtca gcaatccatt atgtattttc ctagctgata     2100
ggctgaacaa attatttctt gtagccaagt ccaatggagc taagtacttt gaatgaccaa     2160
aggccttgta atgttaaaaa tctccttgct actg                                 2194
<210>  4
<211>  2049
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  cDNA from influenza D virus
<400>  4
gcagatagca ggagattttc aaagatgttt ttgcttctag caacaattac agcaataact       60
gcttgccaag cagaaagaga actgatatgt atagtgcaaa gagtgaatga aagcttctct      120
cttcactctg gatttggagg aaatgtttac agcatgaaga ctgagccaat gactggattc      180
acaaatgtga ccaaaggtgc tagtgtcatc aaccaaaaag actgggttgg attcggagat      240
tcaaggacag acttgactaa tgctcagttt ccagcgtctt cagatgtccc attggcagtg      300
gcaaagaagt ttaggtcatt gtcaggggct tcgttaatgt tgtcagcttt tggacctcct      360
ggcaaggttg attaccttta tcaaggatgc gggaaagaaa aagtatttta tgaaggggta      420
aactggtccc ctgaggcagg aattgattgc tttgggtcaa actggactca gacaaaaaag      480
gacttctatt cgaggatata tgaagctgct agaggcagca cgtgcatgac ccttgtaaat      540
tctctagaca ccaagatatc atcaaaaaca gccacagctg gaaccacatc ttcttgttct      600
tcaagctgga tgaaaagccc gttgtggtat gcagaatctt ctgttaatcc tggagctaga      660
cctcaagctt gtgggactga gcaatcagca acttttactt tgccgacaag tttcggaatt      720
tacaaatgca acaagcatgt agtgcaactt tgttactttg tgtatgaaaa caaaacagca      780
tttaacactc ttggctgtgg agattattac caaaattact atgacgggaa tggaaacctg      840
gtagggggag tggataacag agtggcagca tacagaggaa tagcaggctc tagagttaaa      900
attgaatgtc cttcaaaaat cttgaaccct gggacttaca gcattagatc aacaccaaaa      960
ttccttctgg taccaaaaag gtcatattgc ttcgacactg atggagggta ccctatacaa     1020
gtggttcaat ctgagtggtc agcttcacga agatcagata atgccactga agaagcatgc     1080
ctacaaacag aaggatgtat tttcatcaaa aagacaaccc cttatgtagg agaagcagat     1140
gacaaccatg gggacattga gatgaggcaa ctcttgagtg ggcttggcaa caacgacaca     1200
gtgtgtgttt cccaaagtgg atacacaaaa ggagagaccc cttttgtaaa ggattatttg     1260
agtcctccca agtatggcag atgtcagttg aaaactgaca gtggaagaat cccaactcta     1320
ccttctgggt tgataatacc gcaagcaggg actgattctt taatgagaac tttgacacca     1380
gcaacaagga tcttcggaat agatgactta gtcttcgggc ttttattcat agggtttgtc     1440
gcaggaggag ttgcaggagg ttacttctgg ggaagatcaa gtggaggggg tggtggtgcc     1500
tcggtgagca gtacgcaggc tggatttgac aaaatcggaa aagatataca gcagcttcgg     1560
aatgacacaa atgcagcaat tgaaggcttc aacgggagaa ttgcccatga tgagcaagcc     1620
attaagaatt tggcaaaaga aatcgaagat gcaagggcag aagctttggt aggggaactt     1680
ggtataataa gatccctcat agttgccaac ataagcatga acctaaaaga atctttatat     1740
gaactcgcaa accaaataac aaagagagga ggaggaattg cacaagaagc aggcccaggg     1800
tgttggtatg ttgactccga aaactgtgat gcaagctgca aggagtacat tttcaacttc     1860
aatggcagtg ccactgtccc cacattgagg ccagttgaca ccaatgttgt aataacatcg     1920
gatccttatt acttgggctc gaccatagct ctctgtcttt tgggtctgat ggcgattgct     1980
gcttttgttg gtgtgagttg gatctgttgc aagaaataga atcttagaaa aaatctcctt     2040
gctactgct                                                             2049
<210>  5
<211>  1776
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  cDNA from influenza D virus
<400>  5
agcagatagc aggagattat taagcaatat ggactcaaca aaagcccaaa cgcctgaaga       60
gcaaagagca aagaatgcca aaaccatcct tgagaacata cagatatatg aaaggatgtg      120
tgatctcttt ggggtgtcag aagatgacaa actgataatt gagaacagta tttcaattga      180
gagaatgata agagttgtaa cagataagaa atatcaagac aagaaactaa agaatgctgg      240
aagtgatctt gaaaagattg caaatgcagg gaaagttttc tgccgattgg tggagtcaac      300
agctgggaaa tgtagtgcaa gattgggaat ggcactgaaa cccaacgttg aggcagtcct      360
gaccgatgta ctcgggaatg agctggatag ggctgctgtg cttgggaaaa ggatggggtt      420
tacagcaatg ttcaaatcaa acctggaaga ggttttgtac caaagaggaa agaatcagct      480
taaaaagagg aatgctgcag aaactttcac tctttcacaa ggtgcttcgc tagaggcaag      540
atttaggccc ataatggaaa aacacctagg tgttgggact gttgtggcgt caataaagaa      600
tatcctggca agcaaaaaga acgggaacta caggaacaag atggtgagga aacctggagg      660
aaacagagaa agctggtcac cattggagag agaaatatcc tttctgaaca agaagttgtt      720
tcctggacca atgaggcagc tctgcaagaa attcgaatac ttgaacgacc aagagaagca      780
actggcctta aacctcatgc tggatgcaag tctcatcctg aagccacaag tgactcataa      840
aatgataatg ccttggtcaa tgtggctggc tgtgaagaaa tatgcagaaa tgaacaaggg      900
atcacccagt cttgaagacc tcgcagccta ttctggagta agagccttta tggccttcaa      960
tacagcttgc tacatgagta aattcaccat tgggaaggga attgtgggag atgcagagat     1020
catggaaaat ggaaacgaca agatgcaaac tcttgcaatg gcttgttttg gactggcgta     1080
tgaagacacc gggattgttg cagcaatgat ctcccaaccc atgaagaaaa gatatcagtt     1140
gagggtgggg aacttcaacc ctccagaaga aggaacaata aaaggaacaa gcgccggcta     1200
tttccacaag tgggctgaat ttggaaatag gctgcctttc aacagttttg gaactggtga     1260
atccaaacag ataagcaact caggagtgtt tgcagtgcag aggcccagca ctactaacat     1320
tcaaagactg gcagagctaa tggctaggaa tactggagaa accagcgaca actttactca     1380
gttggttcag aaaataagag aacaagtggg gacctttgct gatcaaaaag caaatcttcg     1440
agagttcacc ggaggatata tttatgatat tactgacgta acgaagagca accccaagat     1500
acctcagttg ggtggggact ctttcttctt tgagttcacc ggaagcgacg ttccaagaac     1560
tggagccaaa agaagagtgg gaggagctga tgatgtgacc cctggaactt cccagcccaa     1620
gaaaagagga aggcaaggtg ccggagcaga atcaagtatg gacattgaaa cagttggtga     1680
agattaactc ttctttggat ggttctgttg cagtccccag tgggtgttaa aggtgttggt     1740
ttgtcttatt taacaaaaaa tctccttgct actgct                               1776
<210>  6
<211>  1219
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  cDNA from influenza D virus
<400>  6
agcataagca gaggatattt ttgacgcaat ggcacaagaa caactacttg ctgaacttga       60
gggatacctc agaggaatta acccaatgac caggcaaaca attttgagat ctgcaagagg      120
tggaatggat agcgctaggg atgcagcaag agcagcgaag aagggagaaa tgcaactaac      180
aagtggagag agtatagtgg tgcacatatg cctgagggcc atgtaccctg gaataaagcc      240
atggtcagaa gccaaaaaag atcttgataa agctacagaa ggactgagtg gaaaagacag      300
caaaagcata agaaaggctt tgaggaaggc gggagacctg acagggataa aggagatgat      360
gatgatgtat gaaatgaggg aggacaaaaa agcagaaatg gtggagcaaa tctacgacga      420
tccagaggat tttacagaag atgtaaggct tgggaccgtt gctgcctggc ttcaatgcaa      480
aaacaaaagg agcgagaaat atcatcacaa aatgtcaatg tctggaagca ctgcacttgc      540
cttgggagat gcccaaaaag ctggaatggc catagaaaat atggccagtg ttgtaccaat      600
gaaaaaagag gcccaggcac tgcacaaaga cgcagaagtc ttaattgaac tggcaagaat      660
agcatatggg tcaagagcaa tggaaggaca cctgcaaaat gcaatggacg gaattggaag      720
caaagtcagt ggaatggcta atcttgctct aaaaaggtca gttcttactt tgttaatgtt      780
ggtaatttgt gggatatcca cctgtgtaaa tgctgaaact gtggaagaat tttgtagaaa      840
gaaactaaat cagacggaag aaaaggttta tgtccattgt ttcaatgagg atgatagtcg      900
ggcaatgact ctagctgctt tgatacttgg atgctttagt atgctttaca ttttaataaa      960
ggcaatactg atgcttttgt tgacaatcat aaatggaaga ccaaatggaa gttgggatga     1020
cttgaaacat gttgtaaaat gtttttcaga gactggaagt gagaacttcg ccagggatat     1080
aatggtcctg gagtccaggc gagatgggga ggagacaagc tccctggagg agggactggg     1140
ccctccattg agtggattca atgaaaatgg tgtattcatg gaaacattat aatcgcgaaa     1200
aaatcctctt gctactgct                                                  1219
<210>  7
<211>  869
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  cDNA from influenza D virus
<400>  7
gcagatatca ggggtgtaca atttcaatat gtctgaaaat aagtcagtga acacaacaaa       60
tatcagagca gcaatctccg aattggcatt gggcgcagcc agctggatgg attcctctgg      120
attaatgact ttcgagaaaa tgagaaagtc tgctgagaat tcactgagag tcgaacaggt      180
ttatgaaccg agaacttggg aagatgcagt ggccgaaggt agagaaattc taggattcac      240
tactattgct gccttaagaa aaccagagga gactcatgct gttgaattgg gaaagaacat      300
tatctatccc ttaggaggaa atcctttcta tctgagccca tgtaccattg acactctgta      360
tgagccaaag ctcataagac aaggagaagt cttgggagta aaatatcgga actgcaattg      420
ctttgtaaaa actgctgaac tattagtgac cgacatggga gaaatcattg tgctcttttg      480
cagaaacact gagaaaccag cttactgcct taagaatttc cgtagaggag atgacccaga      540
gaagtcagta cgaaagatac tcagaatttg gagaagtgga cttgttgttg ccgttgatgc      600
ggaatctaga gatgagatca gacgatacaa atctggatgt gaaacagatc ccttctggag      660
aagagaaggc gcaactactg gagaggttca ggagttgctt ggtgtcattg ataaggttga      720
aatccaagct gggagtagcg atggtgaact ctttgactaa ccaggatatg agggccgctt      780
tggatgaaat caagtcagtt tcgagaacaa tttcaatgtt aaaagaatgt attcgttctt      840
tagtatgaaa aaaccccttg ctatctgct                                        869
<210>  8
<211>  2337
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  cDNA from influenza D virus
<400>  8
tatcgctcgc aaaagagtat gcaaatctca caaaggataa gaaatcatgc aaattgctgt       60
cgcaagggac cgtgtcaagc tacaccactt ttaagaaatg gacaacatcg agaaaagaga      120
aaaacccatc ccttcgaatg agatgggcaa tgggaagcaa gttcccaatc atggcaaaca      180
gagaaatttt ggaagaagct gggataccag aacaatggga agggatagac ctttggtcaa      240
aaaaggatga tgtttcaaag ttggggatgg tgttagcgtc tccagcagcc ataacttact      300
ggaatttttg tggacctgga gtggacaatt cttctgtaat aagggatgtt tacaaagcaa      360
aatttatgaa aaaagagaga tggagagaga ctctgtgggg accaatgaac tttgaactgg      420
tgggtaaaca aagaagaatg gttgaaactc aaccagtgga aataaaacta aaccaaaaag      480
aaataaaaga actgacgatg tgggttcttt ttgaggatga agcaaacctt gcaagtaaat      540
tcatacagga aaatttctca cttgtcctgt cattaagaga actttacaag ggaaaggcag      600
taaataaaga tgttgcagct tttatgattg cacaccaatt ttctcccgag aagaggttct      660
tacccacttt tggccccatt agaccagaaa ggatggagct gctccactgt ttagggggtg      720
acttctggaa gatagaggca gtaactgcag ggagcttgaa tgaagaacaa aagaagagag      780
atgttagagc agttgccaga aaaatttgcc ttagagcaag tgtggactta tttactccag      840
cagagaagat aagggactat atatcaagtg tgacaatgag atttggaaca gtagaaagaa      900
cgttcgaaga cgtaataaga aacagtgatg atatatctgc ggaagtgacc ctatgcaaag      960
cggcacttgg atgcgaattg ggcaaaagca tgagctttgg gaatctaaat ctgaggaaag     1020
tcagtggaga agcagaaaca atagaaaaaa cagtatattg gggattaaag cccataaaat     1080
acaaatgctg gagaggagag gaaacatttt attgcgaact gaggaaagta acttgtatgt     1140
ttagaaggtc tgaaggccta gattgggcta acattggacc tggttcacct gaagaaagaa     1200
gagagctctt ggcaatggtg atgatattct gcagagatgg gagatttttt gaatctgcac     1260
cagttaatat tgatgaatca ttctttagaa caagactgaa taaagaaata ccttatcaat     1320
atgtgctgct aaaatgggta aggcaatcga gagacaactt ggatgccttg ttgagtacaa     1380
gaggactgat acctgctcat attggacaat ttggaaaagg aatgggaata gatggaagta     1440
gctcatcttc tatggtttac aagggagtca tgttgtcgaa gacaccgata gacatagtgg     1500
agagcaaaga gaagcacagg ttgtttttaa atgacaatat agaagcgata acagagagag     1560
gagcaatggt tgcatccata atggacctat cagaggataa tagagaaaca tttaacgatg     1620
tgacttttaa ccatgtcgac ctagctgttc tcaaagatga aaaaactgca ataataaaga     1680
tctatcgatc actggtggaa agaataaaca ctgatgatga tggcctacct gctttgataa     1740
tgggtaaaag atatttagag ttgtatcaat tagatgaagt gagagacgcg gtcgggctaa     1800
taccaaaacg gatgctgggg gcgtattcct accaggcaag acagctcata caatcgcaga     1860
tcaaaaatga cagttatagc cttcctgaaa taataaagtt gctgcccttc tgttacagcc     1920
ctccaaagaa aatgttattt gatgggactt tccatttcaa aaatcaaatg tatgttaggc     1980
ctgggataaa cacaaacctt ttcagtttta gtaagaccga caaaagcaag atatatgtga     2040
acggaagcgc agtgaaaata aagcttgtgc tcggagacga tgaaatggac accagtcttg     2100
cctttgttga aggatttcaa gtttgtgaat atgatccaag agcacctttg ataccaagaa     2160
gagatttgag actgattggg ttcggaaaga aagttagagt ttttgttggt cagggacagg     2220
agaaaaccct ggtgaggacg agctccaaaa gagccgcctc ccatgatgta agcaaaaaca     2280
ttcgtagaat gcgtctggaa gtttgaagca cattgaaaaa atcctcttgc tactgct        2337
<210>  9
<211>  2307
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  cDNA from influenza D virus
<400>  9
caatggaaat aaacccatat ctactcatgc taaacaatga tataacgtca atgatatcat       60
tgacataccc atatactggg gcacctccta tgtcacatgg aacatcgacc aaatactcaa      120
tggagactgt gtcaagaact tactcctaca gtagaactaa aaaagaggta ccttcgggaa      180
tattcccaat agagagaagg aaattctgta acacaataga agacaaagaa aacctggaaa      240
aaccgaatgg aaatgttgat ataaatttca tgttatcgct ggcagaaatg ctggaagaaa      300
agatggggaa agggtttttc aaattctgtg ccaatgaagc tgaagctgaa attttgaaga      360
tgcacttcag caagctcact gaaggaaggc aaacttatga ctggacaagt gaaagaaata      420
tgccagcagc caccgctctt cagctaacag tagacgctat acaagaaaca cagggaacat      480
tcaaaggaac taccatggtt gaatattgca acaagatatt agaaatgatg gattggccgg      540
aagtgaaatt caaaaaggtc agaatgattg ttcagaggca ttgggacccg aaaaccaaaa      600
aagaaataaa aatgaagtct ccaacattga tgataacaaa gattggaaga gaagaattca      660
taaagagaat atgcacgata aataccatgg ccaaagacgg agaaagagga aaatacaaaa      720
gaagagctat agccaccccc gggatgggaa tcaggccatt ctcaaaaatt gtggaaactt      780
tagcacaaaa gatttgtgag agactagcag agagcggttt gcctgttggg ggaaatgaga      840
agaaagccaa actaaaaact acggtctctt caacaaactc aaaactacaa gaagggcagt      900
tcatggtaaa cataacaggg gacaacagca agtggaatga atgtcagcaa ccagaagctt      960
atcttgcaat gttggcatac attactaaag acagcagcaa cttaatgaaa gatctctgct     1020
cagtagcacc aacattgttc tgcaataagt atgtaaaaat gggacaaggt ttccgagcaa     1080
aaaacaaaag aaaaaccaaa gaaatagtga tacccgcaaa aaagatgaaa gaaaggaaag     1140
aattgatgaa cgcggaatgg agggacctat ttgaaacaat agaaccttac atggatggag     1200
agtgctgctt cttgggggga ggaatgctga tgggaatgtt taacatgttg tcaactgttt     1260
ttggagtcat gacattaaat tacagggagg aagcattggc caaaaggaac tgttactgga     1320
ctgggctaca aagttcagat gattttgtgc tcttttgcat ctctaggact tggccagaga     1380
tggagatgac tattctaaaa ttcatcgctg tttgcaagtt gatgggaata aacatgtctt     1440
tggaaaaatc ctacgggtgc ttgcctgaac tttttgagtt cacaagcatg ttcttttccg     1500
gggattttgt ctcaaacata gcattggagt tacctgcttt cacaacagct ggaatgaatg     1560
aaggaaccga cttcacagct gcgatgtctg tcataagaac aaacatgatt aataatggac     1620
tttctcctgg gactgcttta atggccctgc gaatttgtct gcaggaattt agagcaacat     1680
acagagtaca cccttatgat tctggagtga agaatcatcg aatgaaaatc ataaggaaat     1740
tcattgaaac tattgaaaac aaagatggat tgctgatatc agatggcggg aaattaatga     1800
acaatatctc aagtttgcac atccctgaag aaatattgaa agaggatttg atggatccct     1860
cctacaggaa cagagttttc aatcctagga acccctttac acagtttgag aagacagttg     1920
acatctttaa ggcaagtgga cctataaggg tagaggagaa cgaggcagtt gtatcaacgc     1980
attcctttag aacaaggagc aataggacat tgctaaatac agacatgagg gcaatggctc     2040
tcgaagagaa aagataccaa gttgtttgca acatgtaccg atcggtcttc gaaagtgcag     2100
acgttaacac cccaatagga tcaatgtcga tgggagaggc aattgaagcc aaaatccttg     2160
accgggccag aacccagttt gaaaatggaa tcataggggg agaagaatat tctgaaatca     2220
aaagactaat cgaggacgcc aagcgtcaac gactgtctgt ttaagctttg cgttgtttaa     2280
taacagaaaa atcctcttgc tactgct                                         2307
<210>  10
<211>  2196
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  cDNA from influenza D virus
<400>  10
agcagatagc aggagattta gaaatgtcta gtgtaatcag agaaatcgca aagcgattct       60
tggaacaagc aacgataaac atcgctgaag aagtggtcag agaatatgga gaccatgaaa      120
gaacaatgat atctgttgga gttcatttcc aagcttgctg ccttataagt gatgaatata      180
cccttgagga tgagacaacc ccaagatacg ttcttttgga gggattgaaa agacaagagg      240
ctataagcaa gcagaataac atttgctcca ctttgggatt ggagcccttg agaaatctag      300
cagatatttt tgatcgaaaa acaaaaagat tccttgaggt aggaattaca aggagagaat      360
ccgatgagta ttaccaggaa aagttcaaca aaataggaaa tgacatggac atacatgttt      420
tcacatatga aggcaaatac ttcagcaaca atcccaatgg gttggaagac atccaaaaga      480
caagaatttt tacattccta tcttttgtgt cagacgaatt gagaaaagag aacatgttca      540
cagaaatgta tgttacagaa gaaggggcac ctgagcttga aatgtacaag tcaaagcttt      600
tcattgcgat gagagacgag agcgtgcctt tgccttacat aaactatgag caccttagaa      660
caagatgtga aacattcaaa agaaatcagg ctgaatgcga agcaaaggta gcggatgtgg      720
cttcacggct aaaaatcaaa ctggaacatc tagaagaaaa taaactgcgg ccgctagaga      780
taccgaagga gaaagaggct ccctatacac acaaattttt gatgaaagat gcttggttct      840
ttgcaaaacc tcatgattcg gagagagcac aaccgcaaca gatattgtat gatttctttg      900
aagcagcaaa catggggttc atgacgacat ccccaaaacc gatattcgga aagcaaggac      960
tgatgtatca ctccctctgg gggcagacaa aaagagcaat aaaggacaag agaaatgagt     1020
tggagccttc agaacagaga gacttccttt gtggaattgg aagagcctcc aagaaaatac     1080
aggaggacaa atggcaagaa tccagagagg aagagtttaa acaagaagag actaaagggg     1140
cagctaagag ggggttccca acatggttta atgaagaatg gctttgggca atgagggatt     1200
caggggatgg ggacaataaa ataggggatt ggatacccat ggcagaaatg cctccttgca     1260
agaatgagat ggaagattat gcaaaaaaga tgtgtgaaga attagaatcc aaaatacagg     1320
gaacaaattg tgctagggaa atgtccaagt tgatacatac aattgggagc ttacatacag     1380
aatgtaggaa ctttcccgga aaggtcaaga tagtgcctat atactgcaga gggacactga     1440
gaggggaatc aactgactgt ttgtttggaa tagcaataaa agggaaatcc catttaaaca     1500
aagatgatgg aatgtatact gttgtaactt ttgagttttc cactgaagaa ccaaatccaa     1560
gcaaacatga aaaatatacg gtcttcgaag ctggaacagt gcctgtggaa gccgtggtgt     1620
taactcccaa aagggaaaga gttctcaaag agaagaaatt gttcctttat tgcagaacta     1680
ctggaatgag caagttaaag aacgattggt tttctaaatg caggagatgt cttataccaa     1740
caatggagac tgtagagcag atagtgctga aagaatgcgc tctgaaagaa gaaaacagag     1800
tttcagagat gttggagaat aagagagctt ggattgccca tgagaacgga gagaatctta     1860
caagattggt atcaacaaag ctcaaagact tgtgtagaat gctaattgtg acacaatttt     1920
attactgtat atataatgac aatcaattgg aaggattctg taacgagcaa aagaaattcc     1980
ttatgtttct tcaagcagat aaggactcaa aatctgcatt tacttttaat cagaaagggt     2040
tatatgaaaa aattgaagag tgtattgtca gcaatccatt atgtattttc ctagctgata     2100
ggctaaacaa attatttctt gtagccaagt ccaatggagc taagtacttt gaatgaccaa     2160
aggccttgta atgttaaaaa tctccttgct actgct                               2196
<210>  11
<211>  2045
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  cDNA from influenza D virus
<400>  11
gcagatagca ggagattttc aaagatgttt ttgcttctag caacaattac agcaataact       60
gcttgccaag cagaaagaga actgatatgc atagtgcaaa gagtgaatga aagcttctct      120
cttcactctg gatttggagg aaatgtttac agcatgaaga ctgagccaat gactggattc      180
acaaacgtga ccaaaggtgc tagtgtcatc aaccaaaaag actggattgg attcggagat      240
tcaagaacag acttgaataa tgatcagttt ccagcgtctt cagatgttcc attggcagtg      300
gcgaagaagt ttcggtcatt gtcaggggct tcgctgatgt tgtcagcttt tgggcctcct      360
ggcaaggttg actacctcta tcaaggatgt gggaaagaga aagtatttta tgaaggggta      420
aactggtccc ctgaggcagg aattgattgc tttggatcaa actggactca gacaaagaag      480
gacttctatt cgaagatata tgaagctgct agaagcagca catgcatgac tcttgtaaat      540
tctcttgaca ccaagatatc atcaacaaca gctacggctg gaaccgcatc ttcttgttct      600
tcaagttgga tgaaaagccc gttgtggtat gcagaatctt ctgttaatcc tggagctaaa      660
cctcaagttt gtgggactga gcaatcggca acttttactt tgccgacaag cttcggaatt      720
tacaaatgca acaagcatgt agtgcagctt tgttactttg tatacgaaaa caaaacaaca      780
tttaacactt ttggctgtgg agattattac caaaattact atgatgggaa tggaaacctg      840
atagggggaa tggataacag agtggcagca tacagaggaa tagcaaacgc tggagttaaa      900
attgaatgtc cttccaaaat cttgaaccct gggacttaca gcattagatc aacaccaaga      960
ttcctcctag taccaaaaag gtcatactgc ttcgacactg atggagggta ccctatacaa     1020
gtagttcaat ctgagtggtc agcttcacga agatcagata atgccacaga agaagcatgc     1080
ctacaaacag aaggatgtat tttcatcaaa aagacaaccc cttatgtagg agaagcagat     1140
gacaaccatg gagacattga gatgaggcaa ctcttgagtg ggcttggcaa caatgacaca     1200
gtgtgcgttt cccaaagtgg atacacaaaa ggagagaccc cttttgtaaa ggattatttg     1260
agtcctccca agtatggcag atgtcagttg aaaactgaca gtggaagaat cccaactcta     1320
ccttctgggt tgataatacc gcaagcaggg actgactctt taatgacaac tttgacgcca     1380
gcaacaagga tcttcggaat agatgactta atcttcgggc ttttattcgt ggggtttgtc     1440
gcaggagggg tcgcaggagg ttacttctgg ggaagatcaa atggaagggg tggtggtgcc     1500
tcggtgagca gtacgcaggc tggatttgac aaaatcggaa aagatataca gcagcttcgg     1560
aatgacacaa atgcagcaat tgaaggcttc aacgggagaa ttgcccatga tgagcaagcc     1620
attaagaatt tggcaaaaga aatcgaagat gcaagggcag aggctttggt aggggaactt     1680
ggtataataa gatccctcat agttgccaac ataagcatga atctaaaaga atctttatat     1740
gaactagcaa accaaataac aaaaagagga ggaggaattg cacaagaagc aggcccaggg     1800
tgttggtatg ttgactccga aaactgtgat gcaagctgca aagagtacat tttcaacttc     1860
aatggaagtg ccactgtccc cacattgagg ccagttgaca ccaaggttgt aataacatcg     1920
gatccttatt acttgggttc gaccatagct ctctgtcttt tggggctggt ggcgattgct     1980
gcttctgttg gtgtgatttg gatctgttgc aagaaataga atcttagaaa aaatctcctt     2040
gctac                                                                 2045
<210>  12
<211>  1774
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  cDNA from influenza D virus
<400>  12
agcagatagc aggagattat taagcaatat ggactcaaca aaagcccaaa cgcctgaaga       60
gcagagagca aagaatgcca aaaccatcct tgagaacata cagatatatg aaaggatgtg      120
tgatctcttt ggggtgtcag aagatgacaa actgataatt gagaacagta tttcaattga      180
gagaatgata agagttgtaa cagataagaa ataccaagac aaaaaactaa agaatgccgg      240
aagtgatcct gaaaagattg caaatgcagg gaaagttttc tgtcgattgg tggagtcaac      300
agctgggaaa tgtagtgcaa gattgggaat ggcactgaaa cccaacgttg aggcagtcct      360
gaccgatgta ctcgggaatg aactggatag ggctgctgtg cttgggaaaa gaatggggtt      420
ttcagcaatg ttcaaatcaa acctggaaga ggttttgtac caaagaggaa agaatcagct      480
taaaaagagg aatgctgcag aaactttcac tctttcacaa ggtgcttcgc tagaggcaag      540
atttaggccc ataatggaaa aacacctagg tgttgggact gttgtggcgt caataaagaa      600
tatcctggca agcaaaaaga acgggaacta caggaacaag atggtgagga aacctggagg      660
aaacagagag agctggtcac cattggagag agagatatcc tttctgaaca agaagctgtt      720
tcctggacca atgaggcagc tctgcaagaa attcgaatac ttgaacgacc aagagaagca      780
actggcctta aaccttatgc tggatgcaag tctcatccta aaaccgcaag tgactcacaa      840
aatgataatg ccttggtcaa tgtggctggc tgtgaagaag tatgcagaaa tgaacaaggg      900
atcacccagt cttgaagacc tcgcagccta ttctggagta agagccttta tggccttcaa      960
tacagcttgc tacatgagta aattcaccat tgggaaggga attgtgggag atgcagagat     1020
catggaaaat ggaaacgaca agatgcaaac tcttgcaatg gcttgttttg gactggcgta     1080
tgaagacacc gggattgttg ctgcaatgat ctcccaaccc atgaagaaaa gatatcagtt     1140
gagagtgggg aacttcaatc ctccagaaga aggaacaata aaaggaacaa gcgccggcta     1200
tttccacaag tgggctgaat ttggaaatag gctgcctttc aacagttttg gaactggtga     1260
atccaaacag ataagcaact caggagtgtt tgcagtgcag aggcccagca ctactaacat     1320
tcaaagactg gcagagctaa tggctaggaa taccggagaa accagcgaca actttactca     1380
gttggttcag aaaataagag aacaagtggg ggcctttgct gatcaaaaag caaatcttcg     1440
agagttcacc ggaggatata tttatgacat tactgacgta acgaagagca accccaagat     1500
acctcagttg ggtggggact ctttcttctt tgaattcacc ggaagcgacg ttccaagaac     1560
tggagccaaa agaagagtgg gaggagctga tgatgtgacc cctggaactt cccagcccaa     1620
gaaaagagga aggcaaggtg ccggagcaga atcaagtatg gacattgaaa cagttggtga     1680
agattaactc atctttggat ggttctgttg cagtccccag tgggtgttaa aggtgttggt     1740
ttgtcttatt taacaaaaaa tctccttgct actg                                 1774
<210>  13
<211>  1218
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  cDNA from influenza D virus
<400>  13
gcagaagcag aggatatttt tgacgcaatg gcacaagaac aactacttgc tgaacttgag       60
ggatacctca gaggagttaa cccaatgacc aggcaaacga ttatgaagtc tgcaagaggt      120
gggatggata gtgctaagga ggcagcaaaa gcagcgaaga agggagaaat gcaactaaca      180
agtggagaga gcatagtggt gcacatatgc ctgagagcca tgtaccctgg aataaagcca      240
tggtcagaag ccaaaaaaga tcttgataaa gctacagaag gactgagtgg aaaagacagc      300
aaaaatataa gaaaagctct gaggaaggca ggagacctga cagggataaa ggagatgatg      360
atgatgtatg aaatgaggga ggacaaaaaa gcagaaatgg tagagcaaat ctacgatgac      420
ccagaggatt ttacagaaga tgtaaggctt gggaccgttg ctgcctggct tcaatgcaaa      480
aacaaaagga gcgagaaata tcatcacaag atgtcaatgt ctggaagcac tgcacttgcc      540
ttgggagatg cccaaaaggc cggaatggcc atagaaaata tggctagtgt tgtgccaatg      600
aaaaaagagg cccaggcact gcacaaagac gcagaagttt tgattgaact ggcaagaata      660
gcatatgggt caagagcaat ggaagggcac ctgcaaaatg caatggacgg aattggaagc      720
aaagtcagtg gaatggctaa tcttgcccta aaaaggtcag ttcttacttt gttaatgttg      780
gtaatttgtg ggatccccac ttgtgtaaat gctgaaactg tggaagaatt ttgtagaaag      840
aaactaaatc agacggaaga aaaggtttat gtccattgtt tcaatgagga tgatggtcgg      900
gcaatgactt tagctgcttt gatacttgga tgctttagta tgctttacat tttaataaag      960
gcaatactga tgcttttgtt gacaatcata aatggaagac caaatggaaa ttgggatgac     1020
ttgaaacatg ttgtaaaatg tttttcagag actggaagtg agaacttcgc cagggatata     1080
atggtcctgg aatccaggcg agatggggag gagacaagct ccccagagga gggactaggc     1140
cctccattga gtggattcaa tgaaaatggt gtattcatgg aaacattata atcgcgaaaa     1200
aatcctcttg ctactgct                                                   1218
<210>  14
<211>  869
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  cDNA from influenza D virus
<400>  14
gcagatagca ggggtgtaca atttcaatat gtctgaaaat aagtcagtga acacaacaaa       60
tatcagagca gcaatctccg aattggcatt gggcgcagcc agctggatgg attcctctgg      120
gttaatgact ttcgagaaaa tgagaaagtc tgctgagaat tcactgagag tcgaacaggt      180
ttatgaaccg agaacttggg aagatgcagt ggctgaaggt agagaaattc taggattcac      240
tactattgct gccttaagaa aaccagagga gactcatgct gttgaattgg ggaagaacat      300
tatctatccc ttaggaggaa accctttcta tctaagccca tgtaccattg acactctgta      360
tgagccaaag ctcataagac aaggagaagt ctttggagta aaatatcgga actgcaattg      420
ctttgtaaaa actgctgaac tattagtgac cgacatggga gaaatcattg tgctcttttg      480
cagaaacact gagaaaccag cttactgcct taagaatttc cgtagaggag atgacccaga      540
gaagtcagta cgaaagatac tcagaatttg gagaagtgga cttgttgttg ccgttgatgc      600
ggaatctaga gatgaaatca gacgatacaa atctggatgt gaaacagatc ccttctggag      660
aagagaaggc gcaactactg gagaggttca ggagttgctt ggtgtcatta ataaggttga      720
aatccaagct gggagtagcg atggtgaact ctttgactaa ccaggatatg agggccgctt      780
tggatgaaat caagtcagtt tcgagaacaa tttcaatgtt aaaagaatgt attcgttctt      840
tagtatgaaa aaaccccttg atatctgct                                        869
<210>  15
<211>  2364
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  cDNA from influenza D virus
<400>  15
agcagaagca gaggatgtca ctactattaa cgctcgcaaa agagtatgca aatctcacaa       60
aggataagaa atcatgcaaa ttgctgtcgc aagggaccgt gtcaagctac accactttta      120
agaaatggac aacatcgaga aaagagaaaa acccatccct tcgaatgaga tgggcaatgg      180
gatctaagtt tccgataatg gctaatagag aaatactcga agaggcaggg atacccgaac      240
aatgggaagg tatagatcta tggagtaaaa aagacgatgt gtctaagtta gggatggtgt      300
tagcgtcacc tgcagcaata acgtattgga atttttgtgg tccaggagtg gataactcta      360
gcgtaattag ggatgtgtat aaagcgaaat ttatgaaaaa agagagatgg agagagacac      420
tatggggtcc tatgaatttc gaactcgtag ggaaacaacg gagagtagta gaaacgcaac      480
ccgttgagat aaaactgaat caaaaagaga taaaggaatt gactatgtgg gtgctattcg      540
aagacgaagc gaatctggct agtaaattta tacaggaaaa ctttagctta gtgttgtcac      600
ttagggaatt gtataagggg aaggcagtga ataaagacgt agcagcattt atgatagcac      660
accaatttag tcccgaaaaa agattcttac ctacattcgg acctattaga cccgaaagaa      720
tggaattgtt gcattgctta gggggggatt tttggaaaat cgaagcggtt accgcaggat      780
cacttaacga ggagcagaaa aaaagagacg ttagggcagt cgctagaaag atatgcctta      840
gagctagcgt tgatctgttt acacctgccg aaaaaattag ggattacata tctagcgtta      900
ctatgagatt cggaacagtc gaaagaacat tcgaagacgt aattaggaat agcgatgata      960
taagcgcaga agtgacacta tgtaaagcag cattaggttg cgaattgggg aagtctatgt     1020
cattcggaaa tcttaacctt agaaaggtta gcggagaagc cgaaactatc gaaaaaacag     1080
tgtattgggg acttaagcct ataaaatata aatgttggag aggcgaagag acattctatt     1140
gcgaacttag aaaagtgaca tgcatgttta gacgatccga agggttagat tgggctaaca     1200
tagggccagg atcacccgaa gagagaaggg aattgctcgc aatggttatg atattttgta     1260
gagacggaag atttttcgaa agcgcaccag tgaatataga cgaatcattt tttagaacta     1320
gacttaacaa agagatacca taccaatacg tactgcttaa atgggttagg caatctaggg     1380
ataacttaga cgcactattg tcaactaggg gactgatacc cgcacatata gggcaattcg     1440
gaaagggaat ggggatagac ggatctagta gtagttctat ggtgtataag ggagtgatgc     1500
tatctaagac acctatcgat atagtcgaat cgaaagagaa acatagattg ttccttaacg     1560
ataacataga ggcaataacc gaaagaggcg caatggttgc gtcaattatg gatcttagcg     1620
aagataatag ggaaactttt aacgatgtga cattcaatca cgttgatcta gccgtactga     1680
aagacgaaaa aactgcgata attaagatat atagatcact agtcgaaaga ataaatactg     1740
acgatgacgg actgccagca ctgataatgg gaaagagata tctcgaattg tatcaattgg     1800
acgaagtgaa agacgccgtg ggactgatac ctaaaagaat gttaggcgca tactcatatc     1860
aggctagaca attgatacaa tcgcaaatta aaaacgatag ttatagtctg ccagagataa     1920
taaaactgtt accattttgt tatagtccac ctaaaaaaat gctattcgac ggaacttttc     1980
actttaaaaa ccaaatgtac gttagaccag ggataaatac taatctgttt agcttttcga     2040
aaaccgataa gtctaagata tacgttaacg gatccgcagt taagataaag ttagtgttag     2100
gcgatgacga aatggatact agtctcgcat tcgttgaggg atttcaggtc tgcgaatacg     2160
atcctagagc accactgata ccaagaagag atttgagact gattgggttc ggaaagaaag     2220
ttagagtttt tgttggtcag ggacaggaga aaaccctggt gaggacgagc tccaaaagag     2280
ccgcctccca tgatgtaagc aaaaacattc gtagaatgcg tctggaagtt tgaagcacat     2340
tgaaaaaatc ctcttgctac tgct                                            2364
<210>  16
<211>  2330
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  cDNA from influenza D virus
<400>  16
agcagaagca gaggatttta taacaatgga aataaaccca tatctactca tgttaaacaa       60
tgatataacg tcaatgatat cattgacata cccatacact ggggcacctc ctatgtcaca      120
tggaacatcg accaaatact caatggagac tgtgtcaaga acttactcct acagtagaac      180
taaaaaagag gtaccttcgg gaatattccc aataaagaga aggaaattct gtaacacaat      240
agaagacaaa gaaaacctgg aaaaaccgaa tggaaatgtt gatataaatt tcatgttatc      300
gttagccgaa atgttagagg aaaaaatggg aaagggtttc tttaaatttt gcgctaacga      360
agccgaagcc gaaatactga aaatgcactt tagcaagttg accgaaggta gacagacata      420
cgattggact agtgaacgaa atatgccagc cgcaaccgca ttgcaattga cagtcgacgc      480
tatacaggaa acacagggga cattcaaagg gactactatg gtcgaatact gtaataagat      540
actcgaaatg atggattggc ctgaagtgaa attcaaaaaa gttagaatga tagtgcaacg      600
acattgggat cctaagacta aaaaagagat taaaatgaaa agtcctacat tgatgattac      660
gaaaatcgga agagaggaat tcataaaaag gatatgcaca atcaatacta tggctaaaga      720
cggagagaga gggaagtaca aaagaagggc aatcgctaca cctggaatgg ggattaggcc      780
attctctaag atagtcgaaa cattagcgca aaagatatgc gaaaggttag ccgaatccgg      840
attgcccgta gggggaaacg aaaaaaaggc taagcttaag actaccgtta gtagtactaa      900
ctctaagttg caggaagggc aatttatggt taacataaca ggcgataact caaaatggaa      960
cgaatgccag caaccggaag catacttagc tatgttggca tacataacga aagactcatc     1020
taaccttatg aaagacctat gtagcgttgc gccaacattg ttttgcaata aatacgttaa     1080
gatgggacag gggtttaggg ctaaaaacaa acgaaaaact aaagagatag tgatacccgc     1140
taagagaatg aaagagagaa aagagttgat gaacgctgaa tggagagacc tattcgaaac     1200
aatcgaacca tacatggacg gagagtgttg tttcttagga ggggggatgt tgatgggaat     1260
gttcaatatg ctatcaaccg tattcggagt tatgacactt aactataggg aagaggcact     1320
agctagacga aattgttatt ggacagggtt gcaatctagc gacgatttcg tactgttttg     1380
catatctaag acatggcctg aaatggaaat gacaatactg aaattcatag ccgtatgcaa     1440
attgatgggg attaacatgt cactcgaaaa atcatacgga tgcttacccg aattgttcga     1500
attcacttca atgtttttta gcggagattt cgtttcgaat atcgcactcg aattgcctgc     1560
attcactacc gcaggaatga acgagggaac cgatttcaca gccgcaatgt ccgttattag     1620
gactaacatg attaataacg gactgtcacc aggaaccgca ttgatggcac ttaggatatg     1680
cttgcaggaa tttagggcta catacagagt gcatccatac gatagcggag tgaaaaacca     1740
tagaatgaaa attattagga aatttatcga aacaatcgaa aacaaagacg gactattgat     1800
tagcgacgga gggaaattga tgaataacat atctagtcta cacatacccg aagagatact     1860
gaaagaggat ctgatggacc catcatatag gaatagggtt tttaacccta gaaacccatt     1920
tacgcaattc gaaaagacag tcgacatatt caaagctagc ggacctatta gggtcgaaga     1980
gaacgaagcc gttgtgtcaa cacactcatt caaaactagg tctaatagga cactactgaa     2040
taccgatatg agagctatgg cactcgaaga gaaaagatac caagtcgtat gcaatatgta     2100
tagatccgta ttcgaatccg cagacgttaa cacacctatc ggatcaatgt cgatgggaga     2160
ggcaattgaa gccaaaatcc ttgaccgggc cagaacccag tttgaaaatg gaatcatagg     2220
gggagaagaa tattctgaaa tcaaaagact aatcgaggac gccaagcgtc aacgactgtc     2280
tgtttaagct ttgcgttgtt taataacaga aaaatcctct tgctactgct                2330
<210>  17
<211>  2195
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  cDNA from influenza D virus
<400>  17
agcagaagca ggagatttag aaatgtctag tgtaatcaga gaaatcgcaa agcgattctt       60
ggaacaagca acgataaaca tcgctgaaga agtggtcaga gaatatggag accatgaaag      120
aacaatgata tctgttggag ttcatttcca agcttgctgc cttataagtg atgaatatac      180
cttggaggac gaaactacac ctagatacgt actgttggag ggattgagac ggcaagaggc      240
aatatccaaa cagaataaca tttgttcaac attggggttg gaacccctta gaaacctagc      300
cgatatattc gatagaaaga ctaggagatt cttagagata gggattacga aaagggaatc      360
cgacgaatat tatcaagaga aattcaataa gatagggaac gatatggaca tacatgtgtt      420
tacatacgaa gggaaatatt tttccaataa ccctaacgga ttggaagaca tacaaaaaac      480
taggattttt acattcctat cattcgtttc cgacgaattg agaaaagaga atatgtttac      540
ggaaatgtac gttaccgaag agggagcacc cgaactcgaa atgtataagt ctaagttgtt      600
catagctatg agagacgaat ccgttccctt accctatatt aattacgaac atcttagaac      660
tagatgcgaa acattcaaac ggaatcaggc agaatgcgaa gctaaagtgg cagacgtagc      720
tagcagactg aaaattaagc ttgagcatct cgaagagaat aagcttagac ccttagagat      780
accgaaagag aaagaggcac catatacaca taagtttatg atgaaagacg catggttttt      840
cgctaaacca cacgattccg aaagagcgca accgcaacag atactatacg attttttcga      900
agcagctaat atggggttta tgacaacatc ccctaagcct atattcggaa aacagggatt      960
gatgtatcat agcctatggg ggcaaattaa gagagcaatt aaggataaga gaaacgaact     1020
cgaacctagc gaacagagag actttctttg cggaataggg agagctagca aaaagataca     1080
agaggataaa tggcaagagt ctagggaaga ggaattcaaa caggaagaga ctaagggagc     1140
agctaaaagg gggtttccga catggtttaa cgaagaatgg ttatgggcta tgagggatag     1200
cggagacgga gacaataaga taggcgattg gatacctatg gccgaaatgc caccatgtaa     1260
aaacgaaatg gaggattacg ctaaaaaaat gtgcgaagag ttagagtcta agatacaggg     1320
aactaattgc gctagggaaa tgtcaaaact gatacataca atagggtcat tgcatacaga     1380
gtgtagaaac tttcccggaa aggttaagat agtgccaatt tattgtagag ggacacttag     1440
gggggaatca actgattgcc tattcggaat cgcaattaag ggaaaatccc atcttaacaa     1500
agacgacgga atgtatacag ttgtgacatt cgaattctca actgaggaac ctaatccctc     1560
aaaacacgaa aagtatacgg tattcgaagc aggaacagtg ccagtcgaag ccgtagtgtt     1620
gacacctaag agagagagag tgcttaaaga gaaaaaattg tttttgtatt gtagaacaac     1680
agggatgtca aaactgaaaa acgattggtt ttcgaaatgt agacgatgtc tgataccgac     1740
aatggagaca gtcgaacaga tagtgcttaa ggaatgcgca cttaaggaag agaatagggt     1800
tagcgaaatg cttgagaata agagagcatg gatcgcacac gaaaacggag agaatctgac     1860
tagattggtg tcaactaagc ttaaagacct atgtagaatg ttgatagtga cacaattcta     1920
ttattgtata tataacgata accaattgga ggggttttgt aacgaacaga aaaaattcct     1980
tatgtttttg caggcagata aggattccaa atccgcattt acttttaatc agaaagggtt     2040
atatgaaaaa attgaagagt gtattgtcag caatccatta tgtattttcc tagctgatag     2100
gctgaacaaa ttatttcttg tagccaagtc caatggagct aagtactttg aatgaccaaa     2160
ggccttgtaa tgttaaaaat ctccttgcta ctgct                                2195
<210>  18
<211>  2049
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  cDNA from influenza D virus
<400>  18
agcagaagca ggagattttc aaagatgttt ttgcttctag caacaattac agcaataact       60
gcttgccaag cagaaagaga actgatatgt atagtgcaaa gagtgaatga aagcttctct      120
cttcactctg ggttcggtgg taacgtatac tctatgaaaa ccgaacctat gacagggttt      180
actaacgtta ctaagggggc tagtgtaatt aaccaaaagg attgggtcgg gttcggagac      240
tctaggaccg atcttactaa cgcacaattt cccgcatcat ctgacgtacc attagcagtc      300
gcaaaaaaat ttagatcgct atctggagca tcacttatgc ttagcgcatt cggcccacca      360
ggaaaggttg actatttgta tcagggatgt ggaaaggaaa aagtgtttta cgaaggagtt      420
aattggtcac ctgaagccgg catcgattgt ttcggatcta attggacaca aactaaaaaa      480
gacttttact ctagaatata cgaagccgct aggggatcga catgcatgac attggttaac      540
tcacttgaca ctaagattag ttcgaaaacc gctacagccg gaactactag ttcatgttca      600
tctagttgga tgaaatcacc attgtggtat gctgaatcta gcgttaaccc aggagctagg      660
ccgcaagcat gcggcactga gcaatccgct acatttacat tgcctacatc attcggaata      720
tataagtgta ataagcatgt agtgcaattg tgttatttcg tatacgaaaa caaaaccgca      780
ttcaatacgt taggttgcgg agactattat cagaattatt acgacggaaa cggaaacctc      840
gtggggggaa tggacaatag agtcgcagca tataggggga tagccggatc aggagttaaa      900
atcgaatgcc ctagcaagat acttaatccc ggcacatact caattaggtc tacacctaaa      960
tttctgttag tgcctaagag gtcatattgt ttcgatacag acggagggta tccgatacag     1020
gtagtgcaat ccgaatggtc agctagtaga agatccgata acgcaaccga agaggcatgc     1080
ttgcagactg agggatgtat ttttattaaa aaaactacac catacgtagg agaagcagac     1140
gataatcatg gcgatatcga aatgagacaa ttgttgtcag ggttagggaa taacgatacc     1200
gtatgcgttt cgcaatctgg gtatactaaa ggcgaaacac cattcgttaa ggattatctg     1260
tcaccaccta aatacggtag atgtcaattg aaaaccgata gcggcagaat acctacattg     1320
cctagcggat tgattatacc gcaagccgga actgactcac ttatgcggac attgacacct     1380
gcaactcgaa tattcggaat agacgattta gtgttcggac tattgttcat agggttcgtt     1440
gcaggaggcg tcgcaggggg gtatttttgg ggtagatcta gcggaggggg agggggagct     1500
agcgttagta gtacacaagc cggattcgat aagataggga aggatataca gcaacttagg     1560
aacgatacta acgcagcaat cgaagggttt aacggtagaa tcgcacatga cgaacaggca     1620
attaagaatc tcgctaaaga gatagaggac gctagagccg aagcactcgt aggcgaattg     1680
gggataatta gatcattgat cgttgcgaat atatctatga atcttaaaga gtcactatac     1740
gaactagcta accaaattac gaaaagagga gggggaatcg cacaagaggc aggacctgga     1800
tgttggtatg ttgatagcga aaattgcgac gctagttgta aagagtatat ttttaacttt     1860
aacggatccg caacagtgcc tacacttagg ccagtcgata ctaacgtagt gattactagt     1920
gatccttatt acttgggctc gaccatagct ctctgtcttt tgggtctgat ggcgattgct     1980
gcttttgttg gtgtgagttg gatctgttgc aagaaataga atcttagaaa aaatctcctt     2040
gctactgct                                                             2049
<210>  19
<211>  1775
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  cDNA from influenza D virus
<400>  19
agcagaagca ggagattatt aagcaatatg gactcaacaa aagcccaaac gcctgaagaa       60
caaagagcaa agaatgccaa aaccatcctt gagaacatac agatatatga aaggatgtgt      120
gatctctttg gagttagtga agacgataaa ttgataatag aaaactcaat tagtatcgaa      180
agaatgatta gggtggtgac cgataaaaag tatcaggata agaaactgaa aaacgcaggt      240
tccgatctgg aaaaaatcgc taacgcaggg aaggtgtttt gtagactggt ggagtcaact      300
gccggaaagt gtagcgctag actgggaatg gcacttaagc ctaacgttga ggcagtgttg      360
actgacgtac tgggtaacga actcgatagg gccgcagtgt tgggaaagag aatgggtttt      420
accgctatgt tcaaatctaa tctcgaagag gttctgtatc agagagggaa gaaccaactg      480
aaaaagagaa acgctgcaga gacattcaca ctgtcacagg gtgctagtct tgaggctagg      540
tttagaccaa ttatggagaa acacctaggg gttggaaccg tagtcgctag tattaagaat      600
atactcgcta gcaagaaaaa cggtaactat aggaataaga tggttaggaa acccggaggg      660
aatagggagt catggtcacc ccttgagaga gagattagct ttctgaataa aaaactgttt      720
cccggaccta tgcgacaatt gtgcaaaaaa ttcgaatacc ttaacgatca ggaaaagcaa      780
ttggcattga accttatgct tgacgctagt ctgatactga aaccacaagt gacacataag      840
atgattatgc catggtcaat gtggttagcc gttaagaaat acgctgagat gaataaggga      900
tcaccctcac tcgaagacct agccgcatat tccggcgtga gagcgtttat ggcattcaat      960
accgcatgct atatgtcaaa gtttactatc ggaaagggga tcgtgggaga cgcagagatt     1020
atggaaaacg gaaacgataa gatgcagaca ctagctatgg catgcttcgg actggcatac     1080
gaagataccg gaatagtggc agcaatgata tcccaaccta tgaaaaaacg ttatcaattg     1140
agagttggaa actttaaccc acccgaagag ggaactatta agggaactag cgcagggtat     1200
tttcacaaat gggccgaatt cggaaataga ctgccattca atagtttcgg aactggagaa     1260
tcgaaacaga ttagcaatag cggagtgttc gcagtgcaac gacctagtac tactaacata     1320
cagagactag ccgaattgat ggctaggaat accggagaga ctagcgataa ctttacgcaa     1380
ttggtgcaaa agattaggga acaggttgga acattcgcag accaaaaggc taaccttagg     1440
gaattcacag gggggtatat atacgatata actgacgtta ctaagtctaa ccctaagata     1500
ccccaactcg ggggggattc attctttttc gaatttaccg gatccgacgt acctagaacc     1560
ggagcgaaaa gaagggttgg gggggcagac gacgttactc ccggaactag ccaacctaaa     1620
aaaaggggga gacagggagc cggagcagaa tcaagtatgg acattgaaac agttggtgaa     1680
gattaactct tctttggatg gttctgttgc agtccccagt gggtgttaaa ggtgttggtt     1740
tgtcttattt aacaaaaaat ctccttgcta ctgct                                1775
<---