СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА, РАСТВОРИМОГО В ЩЕЛОЧНЫХ УСЛОВИЯХ
METHOD FOR MAKING LOW-MOLECULAR CHITOSAN, SOLUBLE IN ALKALINE ENVIRONMENT

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано в производстве биологически активных веществ с антибактериальными, антигрибными и иммуномодулирующими свойствами, а также в создании полимерных матриц для иммобилизации ДНК и лекарственных средств на основе низкомолекулярного хитозана, растворимого в щелочных условиях.
Хитозан - высокомолекулярный сополимер D-глюкозоамина и N-ацетил-D-глюкозоамина, соединенных 1,4-β-гликозидной связью. Хитозан обладает антибактериальными, антигрибковыми и иммуномодулирующими свойствами, может быть использован как адъювант, радиопротектор, компонент гелевых и мазевых композиций, как полимерная матрица для иммобилизации ДНК, лекарственных и других веществ, в качестве элиситора повышает устойчивость растений к грибным и вирусным заболеваниям (Куликов С.Н. с соавт. 2006. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение, 2002).
Главным недостатком высокомолекулярного хитозана массой более 50 кДа является его способность растворяться только в кислых растворах с рН 4,0-6,0, а также высокая вязкость получаемых растворов даже в концентрациях менее 1 мг/мл. Для снижения вязкости и улучшения растворимости высокомолекулярный хитозан подвергают деполимеризации. Полученный в процессе ферментативной деполимеризации низкомолекулярный хитозан способен растворяться в растворах с рН до 6,5-7,0 (Патент RU 2188829, патент RU 2073016).
Наиболее близким к нашему изобретению - способ получения хитозана, растворяющегося в щелочных условиях, является способ, использующий химическую модификацию хитозанового полимера за счет введения боковых углеводных групп через аминогруппу (Ильина А.В. с соавт. 2007) или через шестой углеродный атом глюкозаминного остатка (Kurita K. 2006). Существенными недостатками метода, который предусматривает введение боковых углеводных остатков через аминогруппы хитозана за счет образования Шиффова основания (Ильина А.В. с соавт. 2007), являются: неустойчивость производных при кислых значениях рН, а также уменьшение в полимерной цепи свободных аминогрупп, которые необходимы для обеспечения поликатионной природы хитозанового полимера. Существенным недостатком метода, который предусматривает введение боковых углеводных остатков через шестой углеродный атом глюкозаминного остатка (Kurita K. 2006), являются трудоемкость проведения химической модификации, а также использование дорогих реагентов.
Целью нашего изобретения является разработка эффективного и безотходного способа получения низкомолекулярного хитозана, растворимого в щелочных условиях, без использования дорогостоящей и сложной химической модификации.
Способ осуществляется следующим образом. Берем предварительно гидролизованный с помощью ферментативной деполимеризации низкомолекулярный хитозан (от 5 до 50 кДа), который растворяют в водном растворе кислоты, к полученному раствору при постоянном перемешивании добавляют раствор щелочи. При достижении раствором хитозана рН 7,0 или 7,4 добавление щелочи прекращают. Выпавший в осадок хитозан удаляют из раствора центрифугированием. Оставшийся раствор, содержащий фракцию низкомолекулярного хитозана, растворимого при рН 7,0 или 7,4, то есть растворимый в щелочных условиях, подвергаем лиофильному высушиванию. В зависимости от вида исходного низкомолекулярного хитозана выход низкомолекулярного хитозана, растворимого в щелочных условиях, составляет от 20 до 50%. Выпавшую в осадок фракцию подвергаем повторной ферментативной деполимеризации и используем повторно.
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка эффективного и безотходного способа получения низкомолекулярного хитозана, растворимого при щелочных значениях среды с высоким уровнем выхода продукта за счет применения предварительно гидролизованного с помощью ферментативной деполимеризации хитозана (от 5 до 50 кДа), а также повторного использования фракции хитозана, нерастворимой в щелочных условиях.
Пример 1. Получение низкомолекулярного хитозана, растворимого в щелочных условиях. Взвешиваем 1 г низкомолекулярного хитозана, предварительно гидролизованного с помощью ферментативной деполимеризации и имеющего средневязкостную молекулярную массу 10 кДа. Хитозан растворяем в 400 мл 0,025 н. растворе HCl. К полученному раствору хитозана порциями по 1 мл добавляем 0,2 н. раствор NaOH. При достижении рН 7,0 добавление раствора NaOH прекращают. Выпавший в осадок хитозан (фракция №1) отделяем центрифугированием. Оставшийся в растворе хитозан (фракция №2), растворимый при рН 7,0, осаждаем добавлением избытка NaOH, доводя рН раствора до 9,0. Фракцию №2 диализуем против воды для удаления солей и щелочи, затем лиофильно высушиваем. Масса полученного хитозана составляет 0,4 г, то есть выход низкомолекулярного хитозана составляет 40%. Полученная фракция №2 содержит низкомолекулярный хитозан со средневесовой молекулярной массой от 8 до 17 кДа и среднечисловой молекулярной массой от 3 до 8 кДа.
ЛИТЕРАТУРА
1. Куликов С.Н., Чирков С.Н., Ильина А.В., Лопатин С.А, Варламов В.П. Влияние молекулярной массы хитозана на его противовирусную активность в растениях. Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т.42. №2. С.224-228.
2. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. Москва: Наука, 2002. 368 с.
3. RU 2188829 C1, 10.09.2002.
4. RU 2073016 C1, 10.02.1997.
5. Kurita K. Chitin and chitosan: functional biopolymers from marine crustaceans. Marine Biotechnology. 2006. V.8. №3. P.203-226.
6. Ильина А.В., Варламов В.П. Галактозилированные производные низкомолекулярного хитозана: получение, свойства. Прикладная биохимия и микробиология. 2007. Т.43. №1. С.82-87.