МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ВНЕПЕЧЁНОЧНЫХ ЖЕЛЧНЫХ ПУТЕЙ И СПОСОБЫ ИХ ВЫДЕЛЕНИЯ

1. Выделенная мультипотентная стволовая клетка/клетка-предшественник млекопитающего, способная дифференцироваться в несколько эндодермальных клеточных линий, причем клетка получена из ткани желчных путей млекопитающего и клетка является позитивной:
(i) по меньшей мере по одному поверхностному маркеру стволовых клеток, причем предпочтительно поверхностный маркер стволовых клеток выбран из группы, состоящей из ЕрСАМ, N-CAM, CXCR4 и CD133;
(ii) по меньшей мере по одному маркеру, характерному для линии печеночных клеток;
(iii) по меньшей мере по одному маркеру, характерному для линии панкреатических клеток, и
(iv) по меньшей мере по одному маркеру линии эндодермальных клеток.
2. Выделенная стволовая клетка/клетка-предшественник млекопитающего по п. 1, представляющая собой мультипотентную стволовую клетку.
3. Выделенная стволовая клетка/клетка-предшественник млекопитающего по п. 1, где линия эндодермальных клеток представляет собой линию печеночных клеток, линию билиарных клеток, линию панкреатических клеток или их комбинацию.
4. Выделенная стволовая клетка/клетка-предшественник млекопитающего по п. 1, где ткань желчных путей представляет собой любую область желчных путей, включая ворота, общий печеночный проток, пузырный проток, общий проток, общий гепатопанкреатический проток и желчный пузырь.
5. Выделенная стволовая клетка/клетка-предшественник млекопитающего по п. 1, где млекопитающее представляет собой человек, предпочтительно плод, новорожденного, ребенка, взрослого или умершего человека вплоть до момента 72 часа после смерти, более предпочтительно умершего человека в течение 10 часов после смерти.
6. Выделенная стволовая клетка/клетка-предшественник млекопитающего по п. 1, где ткань желчных путей содержит перибилиарные железы или клетки-предшественники или стволовые клетки, полученные из перибилиарных желез или желчного пузыря.
7. Выделенная стволовая клетка/клетка-предшественник млекопитающего по п. 1, где ткань желчных путей содержит области, в которых желчные пути разветвляются.
8. Выделенная стволовая клетка/клетка-предшественник млекопитающего по п. 1, где мультипотентные клетки экспрессируют:
(i) по меньшей мере один маркер, характерный для линий печеночных клеток, предпочтительно HNF6, HES1, CK19, альбумин или альфа-фетопротеин (AFP);
(ii) по меньшей мере по один маркер, характерный для линий панкреатических клеток, предпочтительно PDX1, PROX1, NGN3 или инсулин;
и по меньшей мере один маркер, выбранный из маркеров категорий (а) или (b), где:
(a) по меньшей мере один эндодермальный поверхностный маркер, находящийся на стволовых клетках/клетках-предшественниках, предпочтительно CD133 (проминин), N-CAM, CXCR4 или ЕрСАМ;
(b) меньшей мере один транскрипционный фактор, характерный для эндодермальных стволовых клеток/клеток-предшественников, предпочтительно SOX 9, SOX17 или FOXA2.
9. Выделенная мультипотентная стволовая клетка/клетка-предшественник млекопитающего, которая проявляет по меньшей мере одно из следующего:
(i) ядерную экспрессию белка теломеразы;
(ii) экспрессию от низкой до умеренной генов плюрипотентности;
(iii) ядерную или околоядерную экспрессию классических эндодермальных транскрипционных факторов;
(iv) экспрессию поверхностных маркеров эндодермальных стволовых клеток/клеток-предшественников;
(v) отсутствие экспрессии или экспрессию от низкой до переменной маркеров линии зрелых печеночных клеток, зрелых клеток желчного протока или зрелых клеток эндокринной части поджелудочной железы, таких как гепатоциты, холангиоциты или островковые клетки; и
(vi) отсутствие экспрессии маркеров мезенхимальных клеток, эндотелиальных клеток или гемопоэтических клеток.
10. Выделенная стволовая клетка/клетка-предшественник млекопитающего по п. 9, где:
эндодермальные поверхностные маркеры предпочтительно включают одно из следующего: CD326/Эпитеалиальная молекула клеточной адгезии (ЕрСАМ), CD56/Нейрональная молекула клеточной адгезии (NCAM), CD133 (проминин), CXCR4 или их комбинации; или
эндодермальные транскрипционные факторы предпочтительно включают одно из следующего: SOX17, SOX 9, FOXA2, HES1, HNF6, PROX1, HNF3B (гепатоцитарный ядерный фактор-3В, SALL4 (белок Sal-like 4)), PDX 1, NGN3 или их комбинации; или
маркеры линии зрелых печеночных клеток, такие как гепатоциты, предпочтительно включают одно из следующего: Р450, такие как Р450-3А4; маркеры линии зрелых клеток желчного протока, такие как холангиоциты, предпочительно включают одно из следующего: рецептор секретина, аквапорины или их комбинации; и маркеры линии зрелых клеток поджелудочной железы, такие как островковые клетки, предпочтительно включают одно из следующего: высокие уровни инсулина, глюкагона, соматостатина, амилазы или их комбинации; или
маркер для мезенхимальных клеток предпочтительно представляет собой десмин, маркер для эндотелиальных клеток предпочтительно представляет собой рецептор VEGF; и маркер для гемопоэтических клеток предпочтительно представляет собой CD45.
11. Композиция, содержащая:
популяцию клеток, содержащую мультипотентные стволовые клетки/клетки-предшественники млекопитающего по любому из пп. 1-10; или
популяцию клеток млекопитающего, обогащенную мультипотентными стволовыми клетками/клетками-предшественниками по любому из пп. 1-10.
12. Способ получения мультипотентных стволовых клеток/клеток-предшественников млекопитающего, способных дифференцироваться в несколько эндодермальных клеточных линий, причем клетки получают из ткани желчных путей млекопитающего, способ включает получение ткани желчных путей, и последовательно, в любом порядке, или по существу одновременно, получение клеток, позитивных:
(i) по меньшей мере по одному поверхностному маркеру стволовых клеток, такому как ЕрСАМ, N-CAM, CXCR4 или CD133;
(ii) по меньшей мере по одному маркеру, характерному для линии печеночных клеток;
(iii) по меньшей мере по одному маркеру, характерному для линии панкреатических клеток,
(iv) по меньшей мере по одному маркеру линии эндодермальных клеток и необязательно по меньшей мере по одному маркеру, выбранному из (а) или (b):
(a) по меньшей мере один поверхностный маркер; и
(b) по меньшей мере один транскрипционный фактор, характерный для линий эндодермальных клеток.
13. Способ по п. 12, в котором мультипотентные стволовые клетки/клетки-предшественники млекопитающего получают посредством иммуноселекции и/или в селективных условиях культивирования, предпочтительно посредством иммуноселекции, включающей пэннинг, селекцию с помощью магнитных гранул, проточной цитометрии или их комбинации, более предпочтительно посредством проточной цитометрии.
14. Способ по п. 13, в котором селективные условия культивирования включают посев клеток на пластике, на гиалуронанах или на пластике, необязательно покрытом коллагеном IV, коллагеном III, ламинином, гиалуронанами, другими компонентами матрикса из эмбриональных тканей, фетальных тканей, тканей новорожденных или их комбинаций.
15. Способ по п. 13, дополнительно включающий инкубацию клеток в бессывороточной среде, содержащей минимальную среду с низким содержанием кальция, не содержащей меди и дополненной инсулином, трансферрином/Fe, селеном, цинком, свободными жирными кислотами, связанными с сывороточным альбумином, и, необязательно, липопротеином высокой плотности.
16. Способ по п. 15, в котором минимальная среда представляет собой RPMI 1640.
17. Способ по п. 15, в котором минимальная среда содержит менее 0.5 мМ кальция.
18. Способ по п. 13, в котором клетки культивируют в течение 7 дней- 21 дня или дольше.
19. Способ по п. 12, в котором ткань желчных путей включает ворота, общий печеночный проток, пузырный проток, общий проток, общий гепатопанкреатический проток и желчный пузырь или их комбинации.
20. Способ по п. 12, в котором ткань желчных путей взята из мест, в которых желчные пути разветвляется или содержат большое число перибилиарных желез.