ДИАГНОСТИКУМ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНЫЙ ЭРИТРОЦИТАРНЫЙ МОНОКЛОНАЛЬНЫЙ
PSEUDOTUBERCULOUS ERYTHROCYTIC MONOCLONAL DIAGNOSTICUM

Изобретение относится к области медицинской и ветеринарной микробиологии, в частности к проблеме получения эритроцитарных диагностикумов, и может быть использовано для идентификации возбудителя псевдотуберкулеза в бактериальных культурах, биологическом материале и объектах внешней среды при помощи реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).
Близкими по составу и (или) назначению к заявляемому решению являются диагностикумы: эритроцитарный сапной и мелиоидозный моноклональный, выпускаемый Волгоградским НИПЧИ, г.Волгоград [Саяпина Л.В., Касина И.В., Малахаева А.Н. и др. Оценка эффективности нового эритроцитарного сапного моноклонального диагностикума // Сб. научных трудов, посвященных 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 2003. - С.53-54]; эритроцитарный псевдотуберкулезный иммуноглобулиновый лабораторного изготовления [Дулатова М.В., Антонов B.C., Головачева С.Н. и др. Опыт применения иммуноглобулинового эритроцитарного препарата для ранней лабораторной диагностики псевдотуберкулеза // Журн. микробиол. - 1992. - №4. - С.55-57] и диагностикум латексный псевдотуберкулезный иммуноглобулиновый производства НИИ вакцин и сывороток, г.Санкт-Петербург [Шпилюк Г.Ф., Головешкина Т.Н., Володина И.Н. и др. Иммуноглобулиновые латексные препараты для экспресс-диагностики иерсиниозов // Журн. микробиол. - 1993. - №6. - С.92-93].
Известен диагностикум эритроцитарный сапной и мелиоидозный моноклональный, приготовление которого включает этапы: получение моноклональных антител на антиген возбудителей сапа и мелиоидоза, формалинизация эритроцитов, модификация поверхности эритроцитов танином, сенсибилизация их моноклональными антителами (МКАТ), лиофилизация эритроцитарного диагностикума. Препарат предназначен для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза в РНГА.
Известен также диагностикум псевдотуберкулезный эритроцитарный иммуноглобулиновый, в состав которого в качестве сенситина входят иммуноглобулины класса G из поливалентной псевдотуберкулезной агглютинирующей сыворотки. Препарат предназначался для определения антигенов Y. pseudotuberculosis в сыворотке крови больных. Лабораторная проверка показала, что с помощью разработанного эритроцитарного диагностикума можно выявить 800 тыс м.к./мл при отсутствии перекрестных реакций с антигенами возбудителей дизентерии, сальмонелл основных групп и кишечного иерсиниоза [Дулатова М.В., Антонов B.C., Головачева С.Н. и др. Опыт применения иммуноглобулинового эритроцитарного препарата для ранней лабораторной диагностики псевдотуберкулеза // Журн. микробиол. - 1992. - №4. - С.55-57]. При испытании диагностикума в клинике доля неспецифических реакций составила 15% (в том числе у пациентов с кишечным иерсиниозом). Кроме того, препарат не проверялся на специфичность по отношению к возбудителю чумы, который, как известно, является ближайшим родственником псевдотуберкулезного микроба и чаще всего дает перекрестные реакции. Вполне возможно, что недостаточная специфичность диагностикума определяется тем, что сенситином в нем являются поликлональные антитела, вызывающие перекрестные реакции с микроорганизмами других таксонов.
В связи с тем что данный препарат готовился как лабораторный образец, не проходил государственной сертификации и, соответственно, не производился, провести сравнительный анализ диагностических свойств названного и заявляемого псевдотуберкулезных эритроцитарных диагностикумов не представляется возможным.
Наиболее близким к заявляемому решению является диагностикум псевдотуберкулезный латексный иммуноглобулиновый жидкий производства НИИ вакцин и сывороток, г.Санкт-Петербург [Шпилюк Г.Ф., Головешкина Т.Н., Володина И.Н. и др. Иммуноглобулиновые латексные препараты для экспресс-диагностики иерсиниозов // Журн. микробиол. - 1993. - №6. - С.92-93]. На сегодняшний день это единственный сертифицированный и разрешенный к применению препарат для выявления возбудителя псевдотуберкулеза (наряду с иммуноглобулинами псевдотуберкулезными флуоресцирующими адсорбированными лошадиными) [Саяпина Л.В., Малахаева А.В., Барулина И.С. Состояние производства и внедрение новых препаратов для диагностики иерсиний // Инфекции, обусловленные иерсиниями: Материалы II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - СПб. НИИЭМ им. Пастера, 2006. С.121-122]. Препарат, приготовленный с использованием поливалентной сыворотки к Y. pseudotuberculosis I ceротипа, предназначен для индикации данного возбудителя в копрофильтратах путем постановки реакции агглютинации латекса (РАЛ) на стекле [Шпилюк Г.Ф., Головешкина Т.Н., Володина И.Н. и др. Иммуноглобулиновые латексные препараты для экспресс-диагностики иерсиниозов // Журн. микробиол. - 1993. - №6. - С.92-93].
Приготовление латексного иммуноглобулинового диагностикума включает этапы: получение иммуноглобулинов класса G из поливалентной псевдотуберкулезной агглютинирующей сыворотки, сенсибилизация частиц латекса иммуноглобулинами, консервация диагностикума. Общим с заявляемым диагностикумом является этап сенсибилизации специфическими иммуноглобулинами твердого носителя.
Наряду с такими положительными качествами, как скорость анализа и простота постановки, этому препарату присущи недостатки: невысокая чувствительность и относительная специфичность ввиду использования при его приготовлении поливалентной сыворотки, высокая стоимость анализа, а также сложность количественного определения возбудителя в анализируемом образце. Кроме того, препарат выпускается в жидком виде, что ограничивает срок его годности.
Наиболее перспективным подходом к совершенствованию средств и методов иммунохимического выявления возбудителя псевдотуберкулеза считается идентификация видоспецифических антигенов Y. pseudotuberculosis, получение МКАТ к ним и разработка с их использованием диагностических тест-систем [Дробков В.И., Дармов И.В. Иммунохимические методы диагностики псевдотуберкулеза (обзор) // Клиническая лабораторная диагностика. - 1993. - №5. - С.3-7]. На данный момент нет сведений о разработке и сертификации препаратов, основанных на этих принципах [Саяпина Л.В., Малахаева А.Н., Барулина И.С. Состояние производства и внедрение новых препаратов для диагностики иерсиний // Инфекции, обусловленные иерсиниями: Материалы II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - СПб. НИИЭМ им. Пастера, 2006. С.121-122].
Задачей изобретения является разработка высокочувствительного, специфичного и стабильного при хранении псевдотуберкулезного эритроцитарного моноклонального диагностикума, пригодного для выявления Y. pseudotuberculosis при помощи РНГА.
Поставленная задача решается благодаря тому, что в заявляемом диагностикуме предусмотрены отличия, связанные с использованием в качестве носителя специфического компонента формалинизированных эритроцитов барана; в качестве сенситина твердой фазы - МКАТ, полученных на липополисахаридный антиген «холодового» варианта псевдотуберкулезного микроба штамма 164/84 I сероварианта; кроме того, диагностикум подвергается лиофилизации.
Заявляемый диагностикум готовится по следующей схеме:
1. получение асцитной жидкости;
2. выделение МКАТ из асцитной жидкости;
3. приготовление формалинизированных эритроцитов барана;
4. сенсибилизация формалинизированных эритроцитов МКАТ;
5. лиофилизация приготовленного диагностикума.
1. Получение асцитной жидкости.
Культуру гибридных клеток YP-105C5 (получена и депонирована в 48 ЦНИИ Минобороны России) извлекают из сосуда Дьюара с жидким азотом и размораживают в водяной бане при температуре плюс 37°С. Содержимое ампулы переливают в центрифужный стакан со средой RPMI-1640 и центрифугируют при 1100 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в 10,0 мл среды RPMI-1640 и отбирают пробу для оценки качества рабочей культуры. Все работы выполняются с соблюдением правил асептики в ламинарном шкафу. Рабочая культура должна удовлетворять следующим требованиям: доля жизнеспособных клеток - не менее 80%; концентрация живых клеток - не менее 500 тыс кл/мл.
Приготовленную рабочую культуру вводят внутрибрюшинно белым мышам линии BALB/c в дозе 0,5-1,0 млн клеток. Через 7-10 сут контролируют приживление гибридом. Мышь с развитым асцитом умерщвляют цервикальной дислокацией, промывают брюшную полость 5,0 мл фосфатным буферным раствором (ФБР). Асцитную жидкость переносят в центрифужную пробирку и выдерживают 2-4 ч при комнатной температуре и 18 ч при температуре плюс 2-6°С, после чего центрифугируют в течение 10 мин при 1100 g. Надосадочную жидкость фильтруют через бумажный фильтр, смоченный ФБР, во флакон и отбирают пробу для оценки качества асцитной жидкости.
Асцитную жидкость контролируют по показателю специфической активности путем постановки иммуноферментного анализа (ИФА) с липополисахаридным антигеном псевдотуберкулезного микроба I сероварианта. Асцитную жидкость считают кондиционной, если титр МКАТ в ИФА составляет не менее 1:80000.
2. Выделение моноклональных антител из асцитной жидкости.
Полученную асцитную жидкость осаждают насыщенным раствором сульфата аммония в соотношении объемов 1:1, инкубируют при температуре от плюс 2 до плюс 6°С в течение 18-20 ч, после чего смесь центрифугируют в течение 20 мин при 7000 g. Надосадочную жидкость декантируют, а осадок растворяют в объеме ЗФР, равном исходному объему асцитной жидкости. Операцию повторяют еще раз, но с соотношением объемов 1,5:1. После второго переосаждения иммуноглобулины растворяют в минимальном объеме 0,1М карбонатного буферного раствора (КБР) с рН 9,5, достаточном для полного растворения осадка.
Раствор иммуноглобулинов диализуют против 1,0 л 0,1 М КБР с рН 9,5. Диализ осуществляют при температуре от плюс 2 до плюс 6°С в течение 18-24 ч. Смену КБР осуществляют через 2 и 8 ч. Отдиализованный раствор центрифугируют в течение 30 мин при 7000 g. Надосадочную жидкость декантируют, осадок выбрасывают.
Отдиализованный раствор иммуноглобулинов вводят в хроматографическую колонку с ДЭАЕ-сефарозой CL-4B из расчета не более 20 мг белка на 1 мл геля. Иммуноглобулины элюируют из колонки 0,05 М ФБР с рН 7,2±0,1, контролируя выход белка по экстинкции при длине волны 280 нм посредством проточного ультрафиолетового абсорбциометра и потенциометрического самописца. Иммуноглобулины G элюируются одним широким пиком.
Полученные препараты МКАТ консервируют путем добавления к ним раствора азида натрия до конечной концентрации 0,2 процента и хранят при температуре от плюс 2°С до плюс 6°С не более 7 сут или не более двух месяцев при температуре не выше минус 20°С.
Полученные препараты очищенных МКАТ контролируют по показателям серологической активности и концентрации белка. Серологическую активность определяют в ИФА, концентрацию белка - путем определения оптической плотности раствора на спектрофотометре (MR-580) при длине волны 280 нм. Концентрация белка в полученных препаратах очищенных МКАТ должна быть не менее 10,0 мг/мл. Очищенные МКАТ считают кондиционными, если при концентрации по белку 1,0 мг/мл они реагируют в ИФА с липополисахаридным антигеном псевдотуберкулезного микроба в титрах не менее 1:100000 (Препарат липополисахаридного антигена выделяют из культуры клеток Y. pseudotuberculosis, выращенной на плотной питательной среде при температуре от плюс 4 до плюс 6°С, методом «горячего водного фенола» [Westphal О., Jan К. Bacterial lipopolysaccharides. Methods Carbohydr. Chem. 1965, 6: 83-91]).
3. Приготовление формалинизированных эритроцитов барана.
Кровь у интактных баранов отбирают по 500 мл в стеклянные колбы с помещенными в них стерильными бусами. После взятия крови колбы непрерывно помешивают в течение 20 мин для адгезии фибрина на бусах. Дефибринированную кровь фильтруют через капроновую ткань; от сывороточных белков эритроциты отмывают 20-минутным центрифугированием при 1100 g и плюс 4°С 0,9%-ным раствором натрия хлорида (рН 6,8), охлажденным до той же температуры. Надосадочную жидкость удаляют; операцию отмывания эритроцитов повторяют 3-5 раз.
Для получения 8%-ной взвеси плотный осадок отмытых эритроцитов разводят в 12,5 раз 0,9%-ным раствором натрия хлорида, подогретого до плюс 37°С. В растворе формалина (ГОСТ 1625-75) определяют процентное содержание формальдегида в соответствии с МУК 4.1/4.2.588-96, с.100-102. Необходимый для формалинизации эритроцитов объем раствора формалина вычисляют по формуле: X=3V/C, где
Х - искомый объем,
V - объем приготовленной 8%-ной взвеси эритроцитов,
С - процент формальдегида в используемом растворе формалина.
Для получения 3%-ного раствора формальдегида к Х мл раствора формалина приливают (V-X) мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида.
В приготовленную 8%-ную взвесь эритроцитов при постоянном перемешивании приливают 3%-ный раствор формальдегида, подогретый до плюс 37°С. Бутыль со смесью помещают в оригинальный аппарат для формалинизации эритроцитов, автоматически поддерживающий температуру воды водяной бани и обеспечивающий непрерывное перемешивание воды в бане и эритроцитов внутри бутыли. Формалинизацию проводят при плюс 37°С в течение 18 ч. Затем формалинизированные эритроциты четырежды отмывают в 10-кратном объеме 0,9%-ного раствора натрия хлорида путем 15-минутного центрифугирования при 1100 g. Плотный осадок разводят в 10 раз 0,9%-ным раствором натрия хлорида. 10%-ную взвесь формалинизированных эритроцитов консервируют добавлением формальдегида до конечной концентрации 0,8%. Хранят при плюс 4°С в течение 3-5 лет. Для приготовления эритроцитарного диагностикума оптимальными являются эритроциты после хранения в течение года.
Перед использованием эритроциты контролируют на гомогенность и отсутствие склонности к спонтанному склеиванию. Для контроля гомогенности эритроциты разводят 0,9%-ным раствором натрия хлорида и одну каплю 0,5%-ной взвеси эритроцитов наносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и рассматривают при малом увеличении микроскопа. Эритроциты должны лежать изолированно, допускается 2-3 скопления, содержащих не более 10 эритроцитов в 10 полях зрения. Отсутствие склонности к спонтанному склеиванию: к 0,4 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида в полистироловой пластине добавляют 0,05 мл 2,5%-ной взвеси эритроцитов, гомогенизируют и оставляют при комнатной температуре на 2-3 ч. Эритроциты должны выпасть в осадок в виде "пуговки" или небольшого колечка с ровным краем. В случае появления спонтанной агглютинации серия эритроцитов бракуется.
4. Сенсибилизация формалинизированных эритроцитов МКАТ.
Необходимое количество 10% формалинизированных эритроцитов отмывают от формалина 0,9% раствором натрия хлорида (рН 7,2) путем 4-кратного 15-минутного центрифугирования при 1100 g. Затем эритроциты разводят подогретым до плюс 37°С 0,9%-ным раствором натрия хлорида (рН 7,2) до концентрации 5%. К полученной взвеси при постоянном перемешивании добавляют равный объем раствора танина в разведении 1:20000. Танизацию проводят в течение 15 мин при температуре взвеси плюс 37°С.
Взвесь отмывают 0,9% раствором натрия хлорида (рН 6,4) путем 3-кратного 20-минутного центрифугирования при 1100 g. Затем эритроциты разводят 0,9% раствором натрия хлорида (рН 6,4) до концентрации 5%.
Перед приготовлением основной партии диагностикума для данной серии формалинизированных эритроцитов и данной серии МКАТ определяют оптимальную сенсибилизирующую дозу последнего. Для этого 16 мл полученных эритроцитов разливают по 4 мл в 4 пробирки. Аликвоту приготовленного иммуноглобулина разводят 0,9% раствором натрия хлорида (рН 6,4) до 10, 20, 40, 80 мкг/мл и добавляют по 4 мл каждой концентрации в пробирки с эритроцитами (по одной концентрации иммуноглобулина на пробирку). После 60-минутной инкубации при плюс 45°С сенситин закрепляют в течение 30 мин при плюс 45°С добавлением глутарового альдегида до конечной концентрации 0,4%. Пробирки с сенсибилизированными эритроцитами 4-кратно отмывают 0,9% раствором натрия хлорида (рН 7,2) путем 10-минутного центрифугирования при 1100 g.
Полученные эритроциты, сенсибилизированные МКАТ в различных концентрациях, проверяют в РНГА с убитыми культурами Y. pseudotuberculosis I серотипа на чувствительность, а также с инактивированными культурами Y. pestis, Y. enterocolitica, E.coli на специфичность. Постановку РНГА осуществляют согласно инструкции по применению препарата. Оптимальной сенсибилизирующей дозой иммуноглобулина считают ту, при которой получают диагностикум, обладающий наиболее высокой чувствительностью и не выявляющий культуры вышеперечисленных гетерологичных микроорганизмов в концентрации 100 млн м.к./мл.
Для приготовления основной партии диагностикума к 5% взвеси танизированных эритроцитов при постоянном перемешивании добавляют равный объем, содержащий 1,5 оптимальные дозы иммуноглобулина в 0,9% растворе натрия хлорида (рН 6,4). После 60-минутной инкубации при плюс 45°С сенситин закрепляют в течение 30 мин при плюс 45°С добавлением глутарового альдегида до конечной концентрации 0,4%. Препарат 4-кратно отмывают 0,9% раствором натрия хлорида (рН 7,2) путем 20-минутного центрифугирования при 1100 g и тем же раствором доводят до 10% концентрации.
5. Лиофилизация приготовленного диагностикума.
Приготовленный препарат осаждают 10-минутным центрифугированием при 1100 g, осадок ресуспендируют в 10%-ном растворе сахарозы, центрифугируют 30 мин при 1100 g.
Для приготовления среды высушивания в 650,0 мл дистиллированной воды растворяют 100,0 г сахарозы, 10,0 г бычьего сывороточного альбумина (БСА), 10,0 г тетраборнокислого натрия и 1,0 г натрия азида. К полученному раствору под контролем рН и при постоянном перемешивании приливают (100,0±20,0) мл 3%-ного раствора янтарной кислоты до получения значения рН (7,0±0,1). Объем доводят дистиллированной водой до 900,0 мл, раствор тщательно перемешивают и хранят при плюс 4°С не более одного года.
Осадок отмытых 10%-ным раствором сахарозы эритроцитов разводят средой высушивания до 10%-ной концентрации и разливают во флаконы по (3,0±0,5) мл.
-1
2
Флаконы с диагностикумом помещают на полки, предварительно охлажденные до температуры минус 30°С, сублимационной камеры аппарата сублимационной сушки "МАСС-5". Камеру герметично закрывают. Диагностикум замораживают в течение 2-3 ч до достижения температуры материала не выше минус 25°С, затем создают в камере вакуум, поддерживаемый в течение всего процесса лиофилизации на уровне 1,1 Торр (13,33 н/м). Через 1,5-2,5 ч включают подогрев всех полок. Через 1 ч полки прогреваются до температуры плюс 28°С, поддерживаемой до конца лиофилизации, при этом температура во флаконах с диагностикумом через 12-14 ч также достигает плюс 28°С, после чего лиофилизацию продолжают в течение 5,5-6 ч. Продолжительность лиофилизации диагностикума - 20-22 ч.
По окончании процесса флаконы укупоривают резиновыми пробками, закрывают герметизирующими алюминиевыми колпачками и контролируют качество сухого диагностикума по следующим параметрам:
5.1. Растворимость - при добавлении во флакон 11,0 мл 0,9% раствора натрия хлорида препарат должен раствориться в течение 1 мин;
5.2. рН - должен находиться в пределах (7,0±0,2);
5.3. Потеря в массе при высушивании - не более 5%;
5.4. Гомогенность ресуспендированного препарата - под малым увеличением микроскопа - не более 3 скоплений по 10 и менее эритроцитов в 10 полях зрения;
5.5. Отсутствие спонтанной гемагглютинации - при добавлении к 0,4 мл 0,9% раствора натрия хлорида 0,05 мл 2,5% взвеси эритроцитов через 3 ч должна образоваться пуговка или узкое колечко;
5
5
5.6. Количество эритроцитов - в 1,0 мл 2,5% диагностикума 5,4·10±0,6·10м.к./мл;
5.7. Чувствительность - должен выявлять Y. pseudotuberculosis I cepoтипа в концентрации 500 тыс м.к./мл микрометодом в РНГА;
5.8. Специфичность - не должен выявлять в РНГА инактивированные формалином культуры Y. pestis, Y. enterocolitica, E.coli в концентрации 100 млн м.к./мл;
5.9. Качество герметизации флаконов - в соответствии с МУК 4.1/4.2.588-96, с.64.
Гарантийный срок хранения диагностикума при температуре от плюс 2 до 8°С составляет 2 года.
Сравнительную оценку специфичности и чувствительности РАЛ и РНГА при помощи рассматриваемых диагностикумов проводили с культурами Y. pseudotuberculosis I серотипа (штаммов 164/84, 147, 149, 847, 881, 66, 432, П15, Б5, 59, 282, 1179, 497, I, а также с культурой штамма 275, прилагаемой к комплекту латексного диагностикума), Y. pestis (штамма EV), Y. еnterocolitica (серогрупп О:3, О:5, О:9), Е. coli (штамма НВ-101). Все штаммы, кроме Y. pseudotuberculosis шт.275, депонированы в коллекции микробных культур 48 ЦНИИ Минобороны России. Постановку РАЛ и РИГА (микрометод) осуществляли согласно инструкциям по применению препаратов.
Специфичность РНГА проверяли путем ее торможения (постановкой РТНГА с сывороткой псевдотуберкулезной агглютинирующей в разведении 1:1000, добавляемой в каждую лунку в объеме 0,025 мл). РНГА считается специфической, если в РТНГА агглютинация отсутствует или наблюдается в меньшем числе лунок по сравнению с РНГА (на 3-4 лунки меньше). В опыте торможение составило 4 лунки.
При исследовании специфичности диагностикумов установлено, что ни с одним из изученных гетерологичных штаммов микроорганизмов в концентрации 100 млн м.к./мл испытываемые диагностикумы не дали положительных результатов, что говорит об их специфичности.
С целью сравнительного изучения чувствительности псевдотуберкулезного эритроцитарного моноклонального и латексного диагностикумов было испытано 15 штаммов Y. pseudotuberculosis I серотипа. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что диагностикум псевдотуберкулезный латексный иммуноглобулиновый уступает по чувствительности и спектру выявления культур Y. pseudotuberculosis I серотипа заявляемому образцу. Так, из 15 изученных штаммов лишь 6 были выявлены при помощи РАЛ с установленной НТД чувствительностью, 3 штамма выявлялись в концентрации 125 млн м.к./мл и выше, а 6, при концентрации микробных клеток в образце 500 млн, не обнаруживались вообще. Диагностикум псевдотуберкулезный эритроцитарный моноклональный позволял выявлять в РНГА 12 из 15 штаммов Y. pseudotuberculosis I серотипа в концентрации 250-500 тыс м.к./мл, 2 штамма - в концентрации 62,5-125,0 млн м.к./мл и 1 штамм - в концентрации более 125 млн м.к. в 1 мл образца.
В рамках выполнения этой работы было изучено влияние различных температурно-временных режимов хранения на специфическую активность заявляемого диагностикума. Исследование проводили путем постановки РНГА с тремя сериями сухого препарата, хранившимися разные сроки при двух температурных режимах. Каждую постановку РНГА обоими методами осуществляли в четырех повторностях, независимых друг от друга.
Результаты оценки сохраняемости разработанного диагностикума эритроцитарного псевдотуберкулезного моноклонального в процессе хранения при разных температурных режимах приведены в таблице 2.
Как следует из данных, представленных в таблице 2, заметное снижение специфической активности диагностикума наблюдалось после 6 месяцев хранения при температуре от плюс 18 до плюс 22°С. Снижения чувствительности указанного препарата не наблюдалось в случае постоянного хранения при температуре от плюс 2 до плюс 8°С в течение 2 лет. Таким образом, заявляемый диагностикум имеет преимущество перед ближайшим аналогом в сроке хранения (один год для латексного иммуноглобулинового жидкого диагностикума), что существенно расширяет возможности его применения.
Расчеты специалистов по рентабельности производства диагностических препаратов на основе МКАТ показали, что в технологическом процессе их изготовления самым дорогостоящим этапом являются эксперименты по получению гибридом продуцентов специфических иммуноглобулинов. После селекции гибридных клонов, стабильно секретирующих МКАТ к диагностически значимым антигенам того или иного микроорганизма, стоимость моноклональных диагностических препаратов падает ниже аналогичных показателей препаратов, изготовленных на основе поликлональных иммуноглобулинов. Таким образом, преимущества первых обусловлены не только их исключительной специфической активностью в отношении «критических»
Таблица 1Чувствительность РНГА с заявляемым диагностикумом и РАЛ с ближайшим аналогом
Вид, серотип
Количество штаммов
Процент выявляемых с регламентированной НТД* чувствительностью культур Y. pseudotuberculosis в...
РНГА
РАЛ
Y. pseudotuberculosis, I серотип
15
80
40
Примечание: * - утвержденная НТД диагностикума псевдотуберкулезного латексного иммуноглобулинового устанавливает чувствительность РАЛ не ниже 1,6 млн м.к./мл, проект НТД на эритроцитарный моноклональный диагностикум - не ниже 500 тыс м.к./мл
Таблица 2Результаты изучения сохраняемости диагностикума
Температурный режим хранения диагностикума
Номер серии
Специфическая активность диагностикума при исследовании культуры Y. pseudotuberculosis штамма 164/84, млн м.к./мл,
сразу после изготовления (n=4)
после хранения в течение…
21 сут (n=4)
3 мес (n=4)
6 мес (n=4)
12 мес (n=4)
18 мес (n=4)
24 мес (n=4)
Постоянно при температуре от плюс 18 до плюс 22°С
1
0,5
0,5
1,0
2,0
-
-
-
2
0,5
0,5
1,0
2,0
-
-
-
3
0,5
0,5
1,0
2,0
-
-
-
Постоянно при температуре от плюс 2 до плюс 8°С
1
0,5
-
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
2
0,5
-
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
3
0,5
-
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
Примечания: 1 n - общее количество определений2 «-» определения не проводили
Таблица 3Сравнительная стоимость одного анализа при использовании заявляемого диагностикума и ближайшего аналога
Диагностикум псевдотуберкулезный…
Стоимость комплекта, руб
Количество анализов
Стоимость одного анализа, руб
эритроцитарный моноклональный
300<sup>**</sup>
360
0,8
латексный иммуноглобулиновый
2200
250
8,8
Примечания: * - под одним анализом понимают: для РНГА - титрование антигена на 1 ряд двенадцатилуночного планшета, для РАЛ - анализ с одной разводкой антигена**- представлена расчетная стоимость одного комплекта эритроцитарного моноклонального диагностикума
антигенных детерминант, стандартностью параметров качества, но и экономической целесообразностью.
Сравнительная характеристика стоимости одного анализа при помощи рассматриваемых диагностикумов представлена в таблице 3.
Таким образом, заявляемый диагностикум позволяет проводить большее количество определений при разнице в стоимости одного анализа примерно в 10 раз по сравнению с диагностикумом псевдотуберкулезным латексным иммуноглобулиновым. Кроме того, технически гораздо проще и с большей экономией материала можно проводить определение титра антигена (его концентрации) в образце при помощи псевдотуберкулезного эритроцитарного моноклонального диагностикума.
Полученные результаты показали, что испытуемый препарат имеет преимущества перед ближайшим аналогом по следующим показателям:
по чувствительности и спектру выявления культур Y. pseudotuberculosis I серотипа: заявляемый образец позволяет идентифицировать в РНГА Y. pseudotuberculosis в концентрации 500 тыс м.к./мл в культурах 80% изученных штаммов, тогда как ближайший аналог выявлял в РАЛ культуры Y. pseudotuberculosis в концентрации 2-4 млн м.к./мл лишь в 40% случаев;
лиофилизация диагностикума псевдотуберкулезного эритроцитарного моноклонального позволила обеспечить срок годности препарата 2 года при температуре хранения от плюс 2 до плюс 8°С, в то время как срок годности ближайшего аналога, выпускаемого в жидком виде, - 1 год;
расчетная стоимость одного анализа, выполненного при помощи заявляемого диагностикума в 10 раз меньше стоимости анализа при использовании ближайшего аналога.
Таким образом, предложенный диагностикум обеспечивает высокие чувствительность, специфичность РНГА при выявлении псевдотуберкулезного микроба I серотипа, со сроком годности препарата - 2 года. Относительно низкая стоимость препарата делает анализ с помощью разработанного диагностикума более доступным для медицинской практики.