ГЕМОСТИМУЛИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ГЕМОПОЭЗА
HEMOSTIMULANT AND EXCITANT AND METHOD FOR HEMOPOIESIS STIMULATION

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и гематологии.
Высокая частота встречаемости заболеваний системы крови и гематологических осложнений, в том числе ятрогенного характера, резистентных к современной медикаментозной терапии [1, 2], является основанием для разработки новых гемостимуляторов.
Известно большое количество гемостимулирующих средств [1, 2].
Наиболее близким по природе происхождения к предлагаемому средству является препарат нативной гиалуронидазы, конъюгированной с полиоксидонием путем химического синтеза [3].
Существует иммобилизированная с помощью ионизирующего излучения (нанотехнологии электронно-лучевого синтеза) гиалуронидаза, введение которой приводит к увеличению содержания прогениторных клеток в организме [4].
Авторами изобретения впервые выявлена выраженная гемостимулирующая активность иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату прототипом является способ стимуляции миелопоэза с помощью препарата нативной гиалуронидазы, который вводят парентерально в дозе 1000 ЕД/кг 1 раз в сутки, в течение 2 дней [5].
Недостатком данного способа является его эффективность только в случае применения препарата гиалуронидазы в указанной высокой/токсичной дозе [5]. При этом использование данного средства даже в терапевтическом режиме зачастую приводит к развитию целого ряда побочных эффектов и осложнений [6, 7], связанных, в первую очередь, с его иммуногенностью.
Данный способ является наиболее близким к заявляемому по механизму действия и техническому результату и выбран в качестве прототипа.
Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение показаний к применению иммобилизированной гиалуронидазы и повышение безопасности и эффективности способа.
Поставленная задача достигается применением иммобилизированной с помощью технологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы в качестве гемостимулирующего средства. Препарат назначают парентерально либо перорально в дозе 10-1000 ЕД/кг 1 раз в сутки в течение 1-5 дней.
Новым в предлагаемом изобретении является применение иммобилизированной гиалуронидазы в качестве гемостимулирующего средства.
Используемое нами оригинальное средство иммобилизированной с помощью ионизирующего излучения гиалуронидазы [4] было разработано и получено НИИ фармакологии СО РАМН (г.Томск) совместно с ООО «Саентифик Фьючер Менеджмент» (г.Новосибирск). Иммобилизация гиалуронидазы осуществлялась на низкомолекулярном полиэтиленгликоле (400 до 4000 Да) направленным потоком ускоренных электронов с энергией электронов 2,5 МэВ, поглощенная доза от 2 до 10 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/час.
На сегодняшний день показана возможность стимуляции миелопоэза с помощью высоких доз препарата нативной гиалуронидазы [5]. Кроме того, известно, что иммобилизизация гиалуронидазы с помощью ионизирующего излучения на низкомолекулярном носителе сопровождается появлением новых физико-химических свойств у данного фермента, что делает эффективным его применение в качестве средства, увеличивающего популяцию родоначальных клеток различных классов (в том числе гемопоэтических предшественников) в костном мозге, в низких дозах [4]. При этом согласно литературным сведениям пегилированные (конъюгированные с полиэтиленгликолем) белковые средства являются более безопасными, чем их неконъюгированные аналоги [8].
Тем не менее способность кроветворных стволовых клеток к реализации своего ростового потенциала, проявляющегося увеличением образования зрелых клеток крови за счет стимуляции процессов их дифференцировки под влиянием модифицированной (иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза) гиалуронидазы, остается неизученной. В то же время известно, что процесс манипуляции разнородными субстанциями на молекулярном уровне [8, 9], в том числе с использованием физических факторов, обладающих высокой энергией, может сопровождаться непредсказуемыми изменениями не только стереохимической структуры исходных веществ, но и их функциональными характеристиками.
Факт применения иммобилизированной гиалуронидазы (имГД) с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции гемопоэза на фоне снижения риска развития осложнений и побочных эффектов за счет уменьшения лекарственной нагрузки на организм, для специалиста является неочевидным.
Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.
Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Способ осуществляют следующим образом:
Лабораторному животному 1 раз в сутки в течение 1-5 дней парентерально либо перорально вводят иммобилизированную гиалуронидазу в дозе 10-1000 ЕД/кг.
Эксперименты были проведены на мышах-самцах линии CBA/CaLac в количестве 543 штук, массой 18-20 г. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).
Эффективность стимуляции гемопоэза определялась на модели цитостатической миелосупрессии в соответствии с методическими указаниями по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ [10] с помощью стандартных и культуральных гематологических методов [11].
Пример 1
Моделирование цитостатической миелосупрессии осуществляли путем однократного внутрибрюшинного введения циклофосфана в максимально переносимой дозе (250 мг/кг) в 0,3 мл физиологического раствора. Опытным животным на фоне моделирования миелосупрессии вводили внутрибрюшинно (парентерально) 1 раз в сутки в течение 2-х дней препарат нативной гиалуронидазы («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ) в дозах 1000 и 50 ЕД/кг (способ прототип) и препарат иммобилизированной гиалуронидазы внутрибрюшинно (парентарально) в дозе 50 ЕД/кг (1 раз в сутки в течение 2-х дней) и перорально в дозах 50 и 10 ЕД/кг (1 раз в сутки в течение 1 и 5 дней соответственно). При этом доза «Лидазы» в 1000 ЕД/кг в предварительных экспериментах была определена как максимально эффективная у препарата нативной гиалуронидазы.
Введение препарата нативной гиалуронидазы на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии сопровождалось стимуляцией процессов регенерации эритроидного и гранулоцитарного ростков кроветворения, но только при использовании дозы 1000 ЕД/кг. В данном случае отмечалось существенное увеличение содержания кроветворных прекурсоров (КОЕ-Э, КОЕ-ГМ) и морфологически распознаваемых клеточных элементов эритроидного и грануломоноцитарного ростков кроветворения в гемопоэтической ткани (табл.1, 2). При этом указанные изменения сопровождались закономерным увеличением количества зрелых клеток эритроидного и гранулоцитарного ряда в периферической крови (табл.3).
Вместе с тем эффективность применения иммобилизированной гиалуронидазы (имГД) наблюдалась при ее использовании во всех режимах и способах введения (табл.1, 2, 3). При этом парентеральное введение 50 ЕД/кг имГД приводило к значительно более выраженному увеличению показателей активности кроветворения, чем при использовании в качестве гемостимулятора препарата нативной гиалуронидазы в дозе 1000 ЕД/кг. Так, отмечалось более существенное увеличение содержания кроветворных прекурсоров, эритроидных клеток, незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге. Аналогичные изменения имели место в периферической крови. Количество нейтрофилов, ретикулоцитов и эритроцитов значительно превосходило значения соответствующих показателей у животных, которым вводили «Лидазу» (табл.3). Кроме того, в отличие от стандартного препарата фермента использование имГД сопровождалось значительным увеличением числа тромбоцитов в периферической крови.
Таким образом, иммобилизированная гиалуронидаза оказывала выраженный стимулирующий эффект в отношении эритроидного, гранулоцитарного и мегакариоцитарного (тромбоцитарного) ростков кроветворения. Причем, данное вещество приводило к максимально быстрому восстановлению показателей костного мозга и периферической крови при цитостатической миелосупрессии как при парентеральном, так и пероральном его использовании в низких дозах.
В целом, исходя из полученных данных следует, что средство, представляющее собой гиалуронидазу, иммобилизированную на водорастворимом носителе с помощью ионизирующего излучения, обладает выраженной гемостимулирующей активностью. При этом эффективность данного средства значительно превышает таковую у стандартных препаратов гиалуронидазы.
Цитируемая литература:
1. Glaspy J.A. Hematopoietic management in oncology practice. Part 1. // Myeloid growth factors Oncology (Huntingt). - 2003. - Vol.17. - №11. - P.1593-1603.
2. Волкова M.A. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор граноцит и его клиническое применение // Тер. архив. - 1998. - №4. - С.80-84.
3. Дубницкая Л.В., Назаренко Т.А. Возможности применения препарата Лонгидаза в комплексной терапии патологических изменений эндометрия // Русский медицинский журнал. - 2008. - Т.16 - №19. - С.1248-1251.
4. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы // Вестник РАМН. - 2009. - №11. - С.7-10.
5. Патент (RU) на изобретение №2336899 «Способ стимуляции миелопоэза», 2008 г. Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В.
6. Anderson J.A. Allergic reactions to drugs and biologic agents. JAMA. - 1992 - vol.268. - p.2845-2857.
7. De Swarte R.D., Drug allergy. In: Patterson R. e.a. Allergic Diseases Diagnosis and Management, 4th ed. Philadelphia, Pa^ JB Lippincott. - 1993 - p.396-551.
8. Сейфулла Р.Д., Тимофеев А.Б., Орджоникидзе З.Г. и др. Проблемы использования нанотехнологии в фармакологии // Экспер. и клин. фарм. 2008. Том 71. №1. С.61-69.
9. Евдокимов Ю.М. Пространственно упорядоченные формы ДНК и ее комплексов - основа создания наноконструкций для медицины и биотехнологий // Российские нанотехнологии. - 2006. - №1-2. - С.256-264.
10. Дыгай A.M., Жданов В.В., Гольдберг В.Е. и др. Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. - 2002. - №1(9). - С.29-32.
11. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - С.130-145.
Таблица 1
Динамика содержания КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в костном мозге мышей линии CBA\CaLac (на 10<sup>5 </sup>неприлипающих миелокариоцитов) после введения дистиллированной воды (1), 50 ЕД/кг (2) и 1000 ЕД/кг «Лидазы» (3), а также 50 ЕД/кг внутрибрюшинно (4), 50 ЕД/кг перорально (5) и 10 ЕД/кг перорально (6) иммобилизированной ГД на фоне введения циклофосфана в МПД, (X±m)
Сроки исследования, сутки
КОЕ-Э
КОЕ-ГМ
Фон
6,75±0,73
4,50±0,38
1
9,50±0,50*
8,38±0,63*
3-е
2
8,88±0,81
8,00±0,87*
3
9,13±1,13*
12,38±0,82*#
4
18,50±0,50*#$
17,00±0,53#$
5
14,38±1,00*#$
14,63±0,51#$
6
15,25±0,33*#$
16,25±0,86#$
1
7,25±0,70
6,63±0,73*
5-е
2
7,50±0,53
5,75±0,75
3
10,13±0,44*#
7,88±0,55*
4
14,88±0,44*#$
10,75±0,45#$
5
9,38±0,42*#
8,75±0,49*#
6
12,25±0,65*#$
9,5±0,70#
1
6,38±0,68
4,25±0,56
10-е
2
5,75±0,37
5,50±0,42
3
7,88±0,83
7,14±0,70
4
10,00±0,71#
9,2±0,2#$
5
7,50±0,53
6,50±0,63*
6
12,1±0,33*#$
9,88±0,72#$
Примечание: * - различия достоверны по отношению к фону,
# - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана.
$ - различия достоверны с группой животных, получавших стандартный препарат гиалуронидазы в дозе 1000 ЕД/кг
Таблица
Динамика костномозгового кроветворения у мышей линии CBACaLac (×106/бедро) после введения дистиллированной воды (1), 50 ЕД/кг (2) и 1000 ЕД/кг «Лидазы» (3), а также 50 ЕД/кг внутрибрюшинно (4), 50 ЕД/кг перорально (5) и 10 ЕД/кг перорально (6) иммобилизированной ГД на фоне введения циклофосфана в МПД, (X±m)
Сроки исследования, сутки
Незрелые нейтрофильные гранулоциты
Зрелые нейтрофильные гранулоциты
Эозинофильные гранулоциты
Лимфоидные клетки
Моноциты
Эритроидные клетки
фон
1,10±0,10
3,72±0,31
0,47±0,09
3,38±0,30
0,48±0,06
1,77±0,32
3-е
1
0,04±0,01
0,11±0,04
0
1,87±0,15
0,55±0,04
0,18±0,05
2
0,05±0,02
0,16±0,03
0
1,57±0,13
0,60±0,11
0,13±0,03
3
0,13±0,03#
0,15±0,04
0
1,36±0,10#
0,42±0,09
0,31±0,02#
4
0,14±0,05#
0,17±0,04
0
1,29±0,12#
0,61±0,06
0,28±0,02#
5
0,15±0,02#
0,11±0,02
0,01±0,01
1,36±0,07#
0,36±0,04#
0,30±0,01#
6
0,17±0,11#
0,10±0,01
0,01±0,01
1,35±0,14#
0,39±0,11
0,45±0,02#
5-е
1
4,22±0,26
1,45±0,26
0,30±0,08
2,03±0,21
0,86±0,08
1,04±0,16
2
4,82±0,46
1,69±0,23
0,07±0,07
2,66±0,26
0,98±0,20
1,27±0,28
3
6,31±0,52#
2,2±0,11#
0,12±0,08
2,28±0,36
1,29±0,15
1,98±0,30#
4
8,49±0,50#
3,98±0,33#
0,17±0,10
2,62±0,23
2,14±0,22#$
2,78±0,19#$
5
5,77±0,44#
3,26±0,29#
0,31±0,08
2,88±0,09
0,90±0,12
1,74±0,08#
6
6,01±0,46#
2,26±0,26#
0,15±0,08
2,15±0,18
1,07±0,15
2,09±0,29#
10-е
1
1,00±0,18
6,65±0,45
0,76±0,45
1,82±0,25
0,60±0,09
0,35±0,06
2
0,80±0,11
6,57±0,53
0,51±0,10
1,87±0,17
0,66±0,14
0,39±0,03
3
0,99±0,06
6,11±0,57
0,33±0,10
2,39±0,50
0,94±0,21
1,29±0,19#
4
0,97±0,13
6,32±0,48
0,53±0,12
3,35±0,65#
1,00±0,09#
3,71±0,02#$
5
0,74±0,05
6,13±0,68*
0,29±0,10
2,49±0,56
1,39±0,26*#
2,63±0,22*#$
6
0,86±0,13
5,78±0,34
0,21±0,06
2,45±0,32
1,49±0,16#
3,1±0,15#$
Примечание: * - различия достоверны по отношению к фону,
# - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана
$ - различия достоверны с группой животных, получавших стандартный препарат гиалупонидазы в дозе 1000 ЕД/кг
Таблица 3
Показатели периферической крови у мышей линии CBACaLac после введения дистиллированной воды (1), 50 ЕД/кг (2) и 1000 ЕД/кг «Лидазы» (3), а также 50 ЕД/кг внутрибрюшинно (4), 50 ЕД/кг перорально (5) и 10 ЕД/кг перорально (6) иммобилизированной ГД на фоне введения циклофосфана в МПД, (X±m)
Сроки исследования, сутки
Эритроциты, Т/л
Ретикулоциты, в промиллях
Палочкоядерные нейтрофилы, Г/л
Сегментоядерные нейтрофилы, Г/л
Тромбоциты, Т/л
Фон
8,61±0,18
14,1±0,3
0,40±0,06
2,26±0,02
796,57±77,49
1
7,89±0,28
10,7±0,24
0,01±0,01
0,12±0,03
503,80±25,97
3-е
2
7,19±0,21
9,89±0,37
0,01±0,01
0,13±0,03
557,83±46,69
3
7,84±0,25
12,8±0,6#
0,02±0,01
0,17±0,02
505,67±24,25 
4
7,69±0,14
14,7±0,52#$
0,02±0,01*
0,15±0,01*
568,17±22,60*
5
7,59±0,18*
12,3±0,41*#
0,04±0,02*
0,14±0,06*
560,67±36,33*
6
7,54±0,45*
12,7±0,38*#
0,02±0,01*
0,15±0,01*
509,83±58,60*
1
7,53±0,15*
28,4±1,3*
0,16±0,04*
0,75±0,23*
349,40±36,84*
5-е
2
7,85±0,27*
27,6±2,4*
0,13±0,05*
0,65±0,10*
393,33±33,96*
3
8,59±0,12#
37,5±1,89*#
0,41±0,08#
1,7±0,16#
321,60±23,22*
4
9,53±0,35*#$
41,2±1,3#
0,83±0,25#$
2,47±0,16#$
672,83±22,69#$
5
8,06±0,30
34,5±0,96*#
0,99±0,31*#$
1,69±1,12#
450,83±11,12#
6
9,13±0,08#
32,7±2,3#
1,03±0,21#$
1,79±0,14#
727,67±74,10#
1
7,29±0,18*
15,6±1,4
1,31±0,32*
5,13±0,63*
977,33±27,66
10-е
2
7,18±0,15*
16,7±0,78*
1,71±0,42*
5,36±1,15*
843,33±100,51
3
7,33±0,15*
16,4±0,97*
1,17±0,23*
7,42±0,18*#
884,17±33,78
4
8,14±0,17$
24,3±1,7#$
1,25±0,14*
8,50±0,37*#$
1143,17±38,51#$
5
7,36±0,29*
19,4±0,45*#$
1,18±0,24
7,93±0,65#
1367,80±101,30#
6
8,53±0,18
26,7±1,84#$
1,48±0,26*
8,67±0,42*#$
803,83±98,77
Примечание:  - различия достоверны по отношению к фону,
различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана,
$ - различия достоверны с группой животных, получавших стандартный препарат гиалуронидазы в дозе 1000 ЕД/кг