Способ ранней диагностики реакции отторжения трансплантата роговицы после сквозной кератопластики
METHOD FOR EARLY DIAGNOSIS OF CORNEAL GRAFT REJECTION AFTER PENETRATING KERATOPLASTY

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и предназначено для ранней диагностики реакции отторжения трансплантата роговицы после сквозной кератопластики.
Потеря зрения, связанная с повреждениями роговицы или ее патологическими изменениями, является актуальной проблемой в офтальмологии. Пересадка донорской роговицы является радикальным патогенетически ориентированным способом реабилитации пациентов с роговичной слепотой.
Функциональный результат пересадки роговицы, как известно, напрямую определяется характером биологической реакции на донорскую ткань. В общей массе наблюдений в течение первого года после операции прозрачно приживается от 60 до 90% трансплантата. В группе высокого риска (повторная кератопластика, лимбокератопластика или пересадка в васкуляризованное ложе) вероятность неблагоприятного исхода аллотрансплантации может достигать 70% [Hill J.С. Systemic cyclosporine in high-risk keratoplasty: long-term results. // Eye. - 1995. - Vol. 9. - p. 422-428].
Иммунная реакция тканевой несовместимости остается одной из самых распространенных причин неудовлетворительного результата сквозной кератопластики. Случаи развития реакции отторжения трансплантата роговицы по данным литературы колеблются от 2,3% до 65% в зависимости от факторов риска, имеющих место у реципиента [Shapiro MB, Mandel MR, Krachmer JH. Rejection. In:Bright B, ed. Corneal Surgery, Theory, Technique and Tissues. 2nd ed. St. Louis: CV Mosby; 1997:254-268].
При остром воспалительном процессе в результате нарушения гематоофтальмического барьера в роговицу попадают иммунокомпетентные клетки и крупные молекулы. При хроническом воспалении новообразованные сосуды становятся причиной "подключения" роговицы к сосудистой и лимфатической циркуляции. Кроме того, при воспалении увеличивается экспрессия антигена гистосовместимости. Предоперационное и послеоперационное воспаление глаза способствует усиленному выходу антиген-представляющих клеток (АПК) роговицы к дренирующим лимфатическим узлам, где они представляют донорские антигены Т-лимфоцитам, вызывая аллосенсибилизацию. Новообразованные кровеносные сосуды обеспечивают усиленный приток Т-эффекторных клеток и дополнительные АПК в трансплантаты роговицы. Эта популяция сохраняется в течение года после подавления воспаления. При активации сенсибилизированные Т-клетки распознают антигены роговицы и могут вызвать иммуноопосредованное отторжение трансплантата [Труфанов С.В., Суббот A.M., Маложен С.А., Саловарова Е.П., Крахмалева Д.А. Факторы риска, клинические проявления, методы профилактики и лечения реакции отторжения трансплантата роговицы Вестник офтальмологии. 2016; 132 (6): 108-116 doi: 10.17116/oftalma20161326108-116].
Отторжение трансплантата роговицы происходит, когда иммунный ответ хозяина, вызванный клетками и медиаторами врожденной и адаптивной иммунной реакции и направленный на антигены донорского лоскута, приводит к разрушению тканей. Иммунный ответ может развиваться в любом из основных слоев роговицы избирательно или в сочетании. Реакция в эпителии роговицы и строме бывает обратимой, но отторжение в эндотелиальном слое неизменно приводит к потере эндотелиальных клеток, вследствие этого трансплантат роговицы становится отечным, и прозрачность тканей снижается. Для подавления этого разрушительного иммунного процесса и восстановления прозрачности роговицы необходимо раннее выявление иммунных реакций и своевременное лечение [Claerhout I, Beele Н, Kestelyn P. Graft failure: I. Endothelial cell loss. International Ophthalmology. 2007; 28(3): 165-173. doi: 10.1007/s 10792-007-9087-0.]
В настоящее время, по существу, не существует объективных диагностических способов, служащих для раннего выявления реакции отторжения трансплантата роговицы.
Для выявления ранних признаков отторжения роговичного трансплантата было введено использование зеркальной микроскопии [Benetz В, Lass J, Gal R, Sugar A, Menegay H, Dontchev M et al. Endothelial Morphometric Measures to Predict Endothelial Graft Failure After Penetrating Keratoplasty. JAMA Ophthalmology. 2013; 131(5):601. doi:10.1001/jamaophthalmol.2013.1693], оптической когерентной томографии переднего сегмента (AS-OCT) [Liu Y, Lwin N, Chan N, Mehta J. Use of Anterior Segment Optical Coherence Tomography to Predict Corneal Graft Rejection in Small Animal Models. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2014; 55(10):6736-6741. doi: 10.1167/iovs. 14-14475;]. Однако зеркальная микроскопия способна визуализировать только эндотелиальный слой роговицы, a AS-OCT может продемонстрировать лишь увеличение толщины комплекса эндотелий/десцеметова мембрана, но не клеточные изменения в других роговичных слоях [Abou Shousha М, Yoo S, Sayed M, Edelstein S, Council M, Shah R et al. In Vivo Characteristics of Corneal Endothelium/Descemet Membrane Complex for the Diagnosis of Corneal Graft Rejection. American Journal of Ophthalmology. 2017; 178:27-37. doi:10.1016/j.ajo.2017.02.026].
Таким образом, в клинической практике эти методы обычно остаются второстепенными и лишь дополняют биомикроскопическую картину при оценке отторжения трансплантата.
Обычно диагноз отторжения аллотрансплантата роговицы основывается на жалобах и симптомах пациента, а также клинических признаках, обнаруженных при биомикроскопии на щелевой лампе [Panda A, Vanathi М, Kumar A, Dash Y, Priya S. Corneal Graft Rejection. Survey of Ophthalmology. 2007; 52(4):375-396. doi:10.1016/j.survophthal.2007.04.008]. Жалобы пациента при развитии реакции отторжения роговичного трансплантата, как правило, связаны с покраснением глаза, слезотечением, светобоязнью, снижением остроты зрения, которые являются неспецифическими симптомами воспаления роговицы. Основным способом диагностики реакции отторжения трансплантата при этом остается биомикроскопия. Данный способ принят за ближайший аналог. К сожалению, раннее отторжение трансплантата может быть пропущено при биомикроскопическом исследовании. Кроме того, некоторые состояния, такие как инфекции, могут искажать признаки и симптомы иммунной реакции, что приводит к пропущенной или поздней диагностике.
Таким образом, в настоящее время не существует универсального способа с высоким профилем безопасности и достоверности, позволяющего провести раннюю диагностику отторжения трансплантата при СКП на протяжении всего послеоперационного периода.
Задачей изобретения является разработка скринингового неинвазивного способа диагностики реакции отторжения роговичного трансплантата.
Техническим результатом предлагаемого способа является возможность своевременного проведения лечения начинающегося отторжения кератотрансплантата с сохранением его функции.
Технический результат достигается за счет оценки морфометрических характеристик иммунных дендритных клеток в роговице, отображающих локальный иммунный ответ.
В основе предлагаемого нами способа лежит оценка дендритных иммунных клеток по их плотности и активности на основе анализа конфокального изображения.
В последние годы в зарубежной и отечественной литературе активно обсуждается роль антиген-презентирующих иммунных клеток роговицы в инициации иммунной реакции. Предположительно, количество этих клеток в роговице реципиента коррелирует с реакцией отторжения трансплантата и частотой его помутнения - чем больше число клеток в ложе реципиента, тем больше риск иммунной реакции [Williams K, White М, Ash J, Coster D. Leukocytes in the Graft Bed Associated with Corneal Graft Failure. Ophthalmology. 1989; 96(1):38-44. doi:10.1016/s0161-6420(89)32949-6].
Конфокальная микроскопия роговицы (KMP) широко используется при исследовании заболеваний роговицы. Технология позволяет неинвазивно получать in vivo изображения роговицы на клеточном уровне с высоким разрешением и выявлять дендритные иммунные клетки в роговице. Такой квазигистологический вид диагностики может помочь в постановке диагноза неясных состояний или процессов роговицы, что облегчает исследование микроструктурных изменений и иммунных клеток аналогично гистопатологическим методам, которые зачастую пропускают изменения, выявленные при рутинных исследованиях с помощью щелевой лампы [Chirapapaisan С, Abbouda A, Jamali A et al. In Vivo Confocal Microscopy Demonstrates Increased Immune Cell Densities in Corneal Graft Rejection Correlating With Signs and Symptoms. Am J Ophthalmol. 2019; 203:26-36. doi:10.1016/j.ajo.2019.02.01314].
Предлагаемый способ основан на качественном и количественном анализе дендритных иммунных клеток в роговице при помощи конфокальной микроскопии.
2
Обоснованием для предлагаемого способа послужил ретроспективный анализ результатов исследования с использованием лазерной КМР, в котором мы выявили существенные различия плотности и морфологии (активности) дендритных иммунных клеток после отторжения трансплантата роговицы. Анализ полученных результатов показал, что при прозрачном приживлении трансплантата дендритные клетки выявлялись в небольшом количестве после кератопластики, они имели незрелую структуру с короткими отростками (степень активности 1). Плотность клеток у данных пациентов не достигала 400 кл/мм.
При возникновении реакции отторжения трансплантата у всех пациентов отмечалась выраженная аккумуляция дендритных иммунных клеток преимущественно в слоях базального эпителия и боуменовой мембраны, причем клетки приобретали более зрелую морфологию (степень активности 2-3).
Дендритные иммунные клетки, имели вид ярких корпускулярных частиц с древовидной морфологией и диаметром до 15 нм. Количество и морфологию дендритных клеток (ДК) оценивали по степени активности: 0 степень соответствовала отсутствию ДК; 1 степень - клетки без отростков; 2 степень (маленькие отростки) - размер отростков меньше, чем максимальный диаметр тела клетки; степень 3 - длина отростков превосходит максимальный диаметр тела клетки [Resch М, Marsovszky L,  Bocskai М,  Balog A. Dry Eye and Corneal Langerhans Cells in Systemic Lupus Erythematosus. Journal of Ophthalmology. 2015; 2015:1-8. doi: 10.1155/2015/543835]. Плотность дендритных клеток для сравнительного анализа следует оценивать, как показали полученные данные, в эпителиальном и слое боуменовой мембраны центральной зоны роговицы.
2
Способ осуществляют следующим образом. Проводят лазерную конфокальную микроскопию роговицы. На цифровом изображении центральной зоны роговицы определяют плотность дендритных клеток со 2-3 степенью активности в слоях базального эпителия и боуменовой мембраны. При их плотности более 400 кл/мм диагностируют реакцию отторжения.
Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.
2
Пример 1. Пациент К., 6 месяцев. Проведена кератопластика на OD по поводу помутнения роговицы после перенесенного кератита. На очередном осмотре при биомикроскопии глаз спокоен, трансплантат прозрачен, адаптирован, роговичные швы чистые. Visus OD=0,5 н/к. Проведена лазерная конфокальная микроскопия (Heidelberg Retinal Tomographer HRT-III, Heidelberg Engineering, Германия). Измерение плотности и активности иммунных дендритных клеток для проведения сравнительного анализа осуществляли с помощью графического редактора. В слое базального эпителия выявлены иммунные дендритные клетки 1 ст. активности, плотность 12,82 кл/мм, что свидетельствовало об отсутствии признаков начинающегося отторжения. Дальнейшие наблюдения в течение 2 лет показали, что трансплантат сохранял прозрачность. Visus OD=0,5 cyl -3,0 ах 110=0,7, что подтвердило адекватность предложенного способа для ранней диагностики отторжения роговичного трансплантата.
2
2
Пример 2. Пациент С.Обратился в ФГБНУ НИИГБ для планового осмотра через 6 месяцев после сквозной кератопластики по поводу кератоконуса. Активно жалоб не предъявлял, ранний и отдаленный послеоперационный период протекал без особенностей. При биомикроскопии оперированный левый глаз спокоен, трансплантат прозрачен, адаптирован, роговичные швы чистые. Visus OS=0,7 н/к. При конфокальной микроскопии в слоях базального эпителия и боуменовой мембраны были выявлены иммунные дендритные клетки 2 ст.активности, их плотность составляла 472,62 кл/мм. Через 2,5 недели пациент обратился уже с жалобами на снижение зрения, светобоязнь, покраснение и чувство засоренности в оперированном глазу. Visus 0,5 н/к. Плотность иммунных дендритных клеток со 2-3 ст. активности в слоях базального эпителия и боуменовой мембраны, выявленных при помощи КМР, увеличилась до 619,02 кл/мм. Был поставлен диагноз реакция отторжения трансплантата роговицы OS, в соответствии с этим назначена системная и локальная глюкокортикоидная терапия для стабилизации процесса.
2
Пример 3. Пациент Б. 2 года назад перенес сквозную кератопластику на правом глазу по поводу буллезной кератопатии. Обратился с жалобами на снижение зрения, светобоязнь, покраснение и боль в оперированном глазу, появившиеся 2 недели назад. При биомикроскопии OD: гиперемия конъюнктивы, трансплантат отечен, складки десцеметовой мембраны, преципитаты на эндотелии. Visus=0,05 н/к. При конфокальной микроскопии выявлена аккумуляция иммунных ДК с высокой степенью активности в слоях базального эпителия и боуменовой мембраны. Плотность ДК составила 804 кл/мм.
Был поставлен диагноз реакция отторжения трансплантата роговицы OD, назначена системная и локальная иммуносупрессивная терапия.
Таким образом, основным преимуществом предлагаемого способа является возможность неинвазивно с высокой степенью достоверности диагностировать отторжение трансплантата. Это позволяет своевременно определить тактику лечения, направленного на предупреждение развития иммунной реакции и повышения функциональных результатов кератопластики.