Способ подготовки для морфологических и молекулярно-генетических исследований образцов нематод, паразитирующих у жвачных животных
PREPARATION METHOD FOR MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR-GENETIC STUDIES OF NEMATODE SAMPLES PARASITIZING IN RUMINANT ANIMALS

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности - ветеринарной гельминтологии, и может быть использовано для диагностики нематодозов домашних и диких жвачных животных морфологическими и молекулярно-генетическими методами.
Нематоды, по числу зарегистрированных видов, являются наиболее распространенными гельминтами жвачных животных [1, 7]. Ущерб от заболеваний, вызываемых нематодами, складывается из ухудшения усвояемости корма, снижения темпов развития молодняка, повышения восприимчивости к инфекционным заболеваниям, снижения продуктивности [1, 6, 7]. У диких жвачных животных, кроме того, инвазия нематодами может приводить к массовой гибели в периоды суровых зим, засух, недостатка корма [3]. На территории России и сопредельных государств зарегистрировано несколько десятков видов нематод, паразитирующих у жвачных животных [1, 2, 3, 7]. Эти виды отличаются, как по особенностям биологии, так и по устойчивости к антигельминтным препаратам [8]. Методы прижизненной диагностики гельминтозов (копроовоскопия, копролярвоскопия) не всегда обеспечивают точную идентификацию нематод, паразитирующих у жвачных животных. В большинстве случаев при копроовоскопии таксономическая принадлежность нематод жвачных животных может быть определена только до уровня подотряда, а при копролярвоскопии - до рода [5]. Морфологические и молекулярно-генетические исследования нематод, собранных при гельминтологическом вскрытии (посмертная диагностика), дают возможность точно определить видовой состав нематод, однако существующие способы подготовки нематод к этим исследованиям имеют недостатки. Основной проблемой при микроскопировании нематод является недостаточная оптическая проницаемость их покровов, что мешает исследовать детали строения, важные для таксономической дифференциации (такие, как строение половой или пищеварительной системы).
Наиболее широко применяемым способом подготовки нематод для морфологических исследований является способ, описанный в руководстве по гельминтологическим исследованиям наземных млекопитающих [5]. Согласно этому способу, для повышения оптической проницаемости поверхностных тканей нематод применяют растворы на основе молочной кислоты, фенола или сочетания этих веществ в различной концентрации (в зависимости от размера нематоды и плотности ее кутикулы). Недостатком этого способа является то, что молочная кислота, даже в низких концентрациях, оказывает агрессивное воздействие на ткани нематод, что может привести к деформации нематоды, а в ряде случаев - к разрушению кутикулы нематоды и утрате ценного научного препарата. Также недостатком этого способа является использование фенола - вещества 2 класса опасности для здоровья, оказывающего канцерогенное воздействие [4]. Кроме того, обработка биологических объектов растворами, содержащими фенол, приводит к разрушению цепочек ДНК, что существенно затрудняет изучение этих образцов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), получившим в настоящее время широкое применение, как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях.
В связи с этим, в задачу данной работы входило создание способа подготовки образцов нематод жвачных для морфологических и молекулярно-генетических исследований, исключающего применение молочной кислоты и фенола и обеспечивающего пригодность образцов нематод, как для морфологических, так и для молекулярно-генетических (ПЦР) исследований.
Предлагаемый способ подготовки образцов нематод включает в себя:
1. Сбор образцов нематод во время гельминтологического вскрытия жвачных животных; 2. консервацию образцов нематод 96%-м этанолом; 3. промывание образцов нематод, предназначенных для морфологических исследований, в 0,9%-ном (изотоническом) растворе хлорида натрия; 4. обработку образцов нематод, предназначенных для морфологических исследований, 10-50%-м (в зависимости от размера нематоды) водным раствором глицерина (приготовление временных препаратов для микроскопирования); 6. промывание образцов нематод, предназначенных для молекулярно-генетических исследований, в дистиллированной воде комнатной температуры; 7. помещение образцов нематод, предназначенных для молекулярно-генетических исследований, в пластиковые пробирки объемом 0,5-1,5 мл; 8. заморозку образцов нематод, предназначенных для молекулярно-генетических исследований, при температуре - 20°С.
Предлагаемый способ обладает следующими преимуществами:
1. Не используется молочная кислота, что позволяет избежать деформации и разрушения нематод.
2. Не используется фенол - высоко опасное вещество, оказывающее вредное, в т.ч. канцерогенное воздействие на организм исследователя.
3. Обработка образцов нематод, предназначенных для морфологических исследований, раствором глицерина повышает в достаточной степени светопроницаемость кутикулы нематоды и, таким образом, облегчает исследование структур, важных для таксономической дифференциации.
4. Замораживание образцов нематод, предназначенных для молекулярно-генетических исследований, способствует разрушению клеточных структур и, таким образом, повышает эффективность выделения геномной ДНК из образцов.
Перечисленные положительные признаки предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, обеспечивают соответствие технического решения критерию «новизна» и это позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «существенные отличия».
Эффективность предлагаемого способа демонстрируется следующими примерами:
Пример 1. Подготовка для морфологического исследования образцов нематод.
Нематод, собранных при гельминтологическом вскрытии пищеварительного тракта жвачных животных, помещали во флаконы, заливали 96%-м этанолом, укупоривали герметичной крышкой, снабжали этикеткой с данными об исследованном животном, дате и месте вскрытия. Зафиксированные таким образом нематоды могут храниться неограниченное время. При необходимости морфологических исследований нематод извлекали из флакона, помещали в часовое стекло и промывали, добавляя 5-10 мл 0,9%-го (изотонического) раствора хлорида натрия. Затем нематод помещали на предметные стекла, в каплю 10%-го водного раствора глицерина, накрывали предметным стеклом, микроскопировали в проходящем свете при 40-400-кратном увеличении для определения морфологических отличий (строение полового аппарата самцов, особенности строения пищевода, наличие ротовой капсулы и др.), важных для таксономической дифференциации.
Пример 2. Подготовка для морфологического исследования образцов нематод рода Trichuris
Всех обнаруженных и собранных при гельминтологическом вскрытии в слепой и ободочной кишке нематод рода Trichuris помещали во флаконы, фиксировали 96%-м этанолом, аналогично примеру 1. При необходимости морфологических исследований нематод извлекали из флаконов, промывали в часовом стекле 0,9%-м раствором хлорида натрия помещали на предметные стекла, в каплю 50%-го водного раствора глицерина, накрывали предметным стеклом, микроскопировали в проходящем свете при 40-200-кратном увеличении для определения морфологических отличий, важных для видовой дифференциации. После определения обнаруженных видов трихурисов помещали во флаконы с 96%-м этанолом, снабжали этикеткой с указанием вида нематоды, данными о вскрытом животном, дате и месте вскрытия.
Пример 3. Подготовка для молекулярно-генетических и морфологических исследований образцов нематод.
Крупных нематод вида Ashworthius sidemi, длиной 1,5-2 см, обнаруженных при гельминтологическом вскрытии европейской косули, поместили в чашку Петри с 10 мл дистиллированной воды комнатной температуры. Затем нематод Ashworthius sidemi поместили в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл (по одному образцу в каждую пробирку) и замораживали при температуре - 20°С. При такой температуре образцы Ashworthius sidemi хранились около 30 суток, а затем были использованы для молекулярно-генетических исследований. В результате были получены участки рибосомальной ДНК длиной 794 пары нуклеотидов, что позволило подтвердить видовую принадлежность обнаруженных нематод.
Мелких нематод разных видов (длиной 0,5-1,0 см), обнаруженных в содержимом сычуга, аналогично примерам 1 и 2, фиксировали 96%-м этанолом, укупоривали герметичной крышкой, этикетировали. В дальнейшем, при необходимости уточнения данных о видовом составе, нематод извлекали из флакона, порциями по 10-20 особей, промывали в часовом стекле 0,9%-м раствором хлорида натрия, помещали на предметные стекла, изучали на временных тотальных препаратах с 10%-м водным раствором глицерина. После определения таксономической принадлежности по морфологическим признакам, часть образцов помещали в пробирки с 96%-м этанолом, этикетировали с указанием вида нематоды, данными о вскрытом животном, дате и месте вскрытия. Другую часть образцов промывали дистиллированной водой, помещали в пластиковые пробирки объемом 0,5 мл (по одному образцу в каждую пробирку) и помещали на хранение при температуре - 20°С. В дальнейшем замороженные образцы (нематоды видов Trichostrongylus axei, Trichostrongylus colubriformis, Mazamastrongylus dagestanica) были использованы для молекулярно-генетических исследований. В результате были получены участки рибосомальной ДНК длиной 700-750 пар нуклеотидов.
Полученные результаты показывают, что предлагаемый «Способ подготовки для морфологических и молекулярно-генетических исследований образцов нематод, паразитирующих у жвачных животных», по сравнению с прототипом [5], является более безопасным в применении, обеспечивает хорошую сохранность морфологических структур нематод, облегчает морфологические исследования образцов и позволяет проводить их молекулярно-генетические исследования.
Литература
1. Акбаев М.Ш., Водянов А.А., Косминков Н.Е., А.И. Ятусевич, Пашкин П.И., Василевич Ф.И. Паразитология и инвазионные болезни животных. - М.: Колос. - 1998. - 743 с.
2. Асадов С.М. Гельминтофауна жвачных животных СССР и ее эколого-географический анализ. - Баку: Издательство Академии наук Азербайджанской ССР. - 1960. - 512 с.
3. Говорка Я., Маклакова Л.П., Митух Я., Пельгунов А.Н., Рыковский А.С., Семенова М.К., Сонин М.Д., Эрхардова-Котрла Б., Юрашек В. Гельминты диких копытных Восточной Европы. - М.: Наука, 1988. - 208 с.
4. ТУ 6-09-40-3245-90. Фенол синтетический для медицинских целей. Чистый для анализа. Технические условия. Введен в действие с 01.07.1990.
5. Ивашкин В.М., Контримавичус В.Н., Назарова Н.С. Методы сбора и изучения гельминтов наземных млекопитающих. - М.: Наука. - 1971. - 124 с.
6. Сафиуллин Р.Т. Распространение и экономический ущерб от основных гельминтозов жвачных животных // Ветеринария. - 1997. - №6. - С. 28-32.
7. Скрябин К.И., Петров A.M. Основы ветеринарной нематодологии. - М.: Колос. - 1964. -527 с.
8. Cintra M.C.R., Teixeira V.N., Nascimento L.V., Sotomaior C.S. Lack of efficacy of monepantel against Trichostrongylus colubriformis in sheep in Brazil // Veterinary Parasitology. - 2016. - V. 216. - P. 4-6.