ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ЭФФЕКТЫ ВИРУСНОГО ВЕКТОРА, КОДИРУЮЩЕГО ТОЛЛ-ПОДОБНЫЙ РЕЦЕПТОР И АГОНИСТ ТОЛЛ-ПОДОБНОГО РЕЦЕПТОРА
ANTI-TUMOR EFFECTS OF A VIRAL VECTOR ENCODING A TOLL-LIKE RECEPTOR AND A TOLL-LIKE RECEPTOR AGONIST

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Настоящее изобретение относится, в частности, к композициям, включающим в себя вирусные векторы, кодирующие толл-подобный рецептор (TLR) и агонист TLR, и к применению таких композиций для профилактики и лечения рака предстательной железы.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Рак предстательной железы является третьей по значимости причиной смерти от онкологических заболевания среди мужчин в Соединенных Штатах Америки. Ожидается, что число новых случаев рака предстательной железы, которое по прогнозам 2005 года составляло 220 тыс. человек в год, увеличится до более чем 380 тыс. человек к 2025 году по причине старения мужского населения. В настоящее время для лечения первичного рака предстательной железы используется хирургический метод, облучение, гормональная терапия или какая-либо их комбинация. Выбор метода лечения зависит от возраста и (или) операбельности пациента, а также от толерантности пациента к специфическим побочным эффектам, связанным с определенным методом лечения (включая, например, импотенцию). Для значительной части пациентов с раком предстательной железы существующие методы лечения обеспечивают лишь временное облегчение таких симптомов, в то время как развиваются устойчивые к кастрации и (или) метастатические формы рака предстательной железы. В настоящее время нет никаких эффективных фармакологических методов лечения распространенного рака предстательной железы. Недавние разработки вакцин против рака предстательной железы, таких как Sipuleucel-T, продемонстрировали ограниченную эффективность, но ни одна из них не продлила выживаемость более чем на несколько месяцев.
Соответственно, сохраняется острая необходимость в улучшенных способах и композициях для профилактики и лечения рака предстательной железы.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способы профилактики и (или) лечения рака предстательной железы у какого-либо пациента. В различных вариантах осуществления в способах по такому изобретению используется вектор, содержащий первую и вторую нуклеиновые кислоты, где первая нуклеиновая кислота кодирует толл-подобный рецептор, а вторая нуклеиновая кислота кодирует агонист толл-подобного рецептора. В различных вариантах осуществления в способах по такому изобретению используется клетка, трансдуцированная вектором, описанным в данной заявке. В каком-либо варианте осуществления вектор может представлять собой экспрессирующий вектор млекопитающего. В каком-либо варианте осуществления вектор может представлять собой аденовирусный вектор. В различных вариантах осуществления первая нуклеиновая кислота кодирует толл-подобный рецептор (TLR). В каком-либо варианте осуществления TLR представляет собой TLR-5, такой как TLR-5 человека. В различных вариантах осуществления вторая нуклеиновая кислота может кодировать агонист толл-подобного рецептора, который представляет собой флагеллин. В каком-либо варианте осуществления флагеллин представляет собой секретируемую форму флагеллина, такую как CBLB502S. В другом варианте осуществления флагеллин представляет собой негликозилированную секретируемую форму флагеллина, такую как CBLB502NQs.
В различных вариантах осуществления способы по такому изобретению обеспечивают профилактику и (или) лечение рака предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления способы по такому изобретению обеспечивают профилактику или уменьшение предраковых изменений в предстательной железе пациента. В некоторых вариантах осуществления способы по такому изобретению обеспечивают лечение рака предстательной железы, включая аденокарциному предстательной железы, мелкоклеточный рак предстательной железы, плоскоклеточный рак предстательной железы, саркому предстательной железы, переходноклеточный рак предстательной железы и (или) доброкачественную гиперплазию предстательной железы (ДГПЖ). В некоторых вариантах осуществления способы по такому изобретению обеспечивают профилактику метастазирования рака предстательной железы в один или несколько лимфатических узлов, легкие, кости, включая позвоночник, печень и (или) мозг. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способы уменьшения рецидивирования рака предстательной железы у пациента.
В различных вариантах осуществления настоящие способы полезны в качестве адъюванта к способам лечения, являющихся альтернативой резекции, например, у пациентов, которые отказываются от такой операции, как лучевая терапия или выжидательная тактика. Например, такие настоящие способы помогают уменьшить вероятность или рецидивирование, или метастазирование, несмотря на выбор менее агрессивного метода лечения лечащим врачом.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На ФИГ. 1а-1с, приведено схематическое изображение экспрессионных кассет Mobilan М-0 (фиг. 1a), Mobilan M-VM3 (фиг. 1b) и контроли -Ad-mCherry (фиг. 1с). Р - промотор, Т - терминатор транскрипции. В области d показана аминокислотная последовательность секретируемой формы какого-либо варианта флагеллина, т.е. CBLB502S с четырьмя потенциальными местами гликозилирования, имеющими остатки аспарагина (N).
На ФИГ. 2 показан процент мышей без опухолей C57BL/6 после иммунизации клетками TRAMP С2, инфицированными M-VM3 или контрольным аденовирусом Ad-mCherry. Мышей из группы контроля также иммунизировали неинфицированными и не вакцинировали. Гистограммы слева направо отображают мышей невакцинированных, неинфицированных, инфицированных Ad-mCherry или M-VM3.
На ФИГ. 3 представлена кривая Каплана-Мейера, показывающая выживаемость мышей после внутриопухолевой инъекции M-VM3 (или контрольного вируса, или PBS) с последующим хирургическим удалением опухолей.
На ФИГ. 4 представлена доменная структура бактериального флагеллина. След остова Са, распределение гидрофобной сердцевины и структурная информация F41. Четыре отдельные гидрофобные сердцевины, которые определяют домены D1, D2a, D2b и D3. Все атомы гидрофобной боковой цепи отображаются с остовом Са. Положение и область различных структурных признаков в такой аминокислотной последовательности флагеллина. Сверху вниз показано следующее: фрагмент F41; три складки β-листа; распределение вторичной структуры с α-спиралью, β-структурой и β-изгибом; периодическая метка на каждом 50-м остатке; домены D0, D1, D2 и D3; область осевого контакта субъединиц внутри протоэлемента; высоко консервативная аминокислотная последовательность и вариабельная область; точечные мутации в F41, которые продуцируют элементы различных суперспиралей. Буквы внизу обозначают морфологию мутантных элементов: L (D107E, R124A, R124S, G426A), прямой тип L; R (A449V), прямой тип R; С (D313Y, A414V, A427V, N433D), скрученный 33.
На ФИГ. 5 показано схематическое изображение доменов флагеллина Salmonella, их фрагментов и взаимодействия с TLR5. Темные полосы обозначают участки гена флагеллина, используемого для конструирования фрагментов, включающих в себя А, В, С, А' и В'.
На ФИГ. 6 изображены производные флагеллина. Доменная структура и приблизительные границы (координаты аминокислот) избранных производных флагеллина (перечислены справа). Домен FliC флагеллина Salmonella dublin кодируется в пределах 505 аминокислот (АК).
На ФИГ. 7 показана нуклеотидная и аминокислотная последовательность для следующих вариантов флагеллина: АА', АВ', ВА', ВВ', СА', СВ', А, В, С, GST-A', GST-B', AA'n1-170, AA'n1-163, AA'n54-170, AA'n54-163, AB'n1-170, AB'n1-163, AA'n1-129, AA'n54-129, AB'n1-129, AB'n54-129, AA'n1-100, AB'n1-100, AA'n1-70 и AB'n1-70. Лидерная последовательность pRSETb показана курсивом (лидер включает в себя Met, который также является аминокислотой 1 FliC). N-концевой константный домен подчеркнут. Аминокислотная линкерная последовательность выделена жирным шрифтом. С-концевой константный домен подчеркнут. GST, если присутствует, выделен цветом.
На ФИГ. 8А-8В показано сравнение аминокислотных последовательностей консервативного амино- (фиг. 8А) и карбокси- (фиг. 8В) конца из 21 вида бактерий. Тринадцать консервативных аминокислот, важных для активности TLR5, показаны штриховкой. Аминокислотные последовательности идентифицируются по их учетным номерам из TrEMBL (первая буква = Q) или Swiss-Prot (первая буква = Р).
На ФИГ. 9 показана аминокислотная последовательность для белка толл-подобного рецептора 5 человека.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, что вирусные векторы, кодирующие толл-подобный рецептор (напр., TLR5) и агонист TLR (напр., негликозилированная секретируемая форма флагеллина - CBLB502NQs) или клетки, трансдуцированные вирусными векторами, обеспечивают эффективную профилактику образования опухолей предстательной железы. Кроме того, вирусные векторы или клетки, трансдуцированные вирусными векторами, проявляли сильную антиметастатическую активность. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, полагают, что доставка таких вирусных векторов к опухолям или клеткам, трансдуцированным вирусными векторами, запускает мощную аутокринную/паракринную локальную активацию TLR5 и стимулирует врожденные и последующие адаптивные иммунные ответы, способные подавлять рост первичных опухолей, и также обеспечивает долгосрочную защиту от метастазов и рецидивов опухолей, независимо от естественного статуса экспрессии TLR5 в таких опухолях. Соответственно, в различных аспектах настоящее изобретение предлагает агенты и композиции для использования в качестве вакцинации против рака предстательной железы. Настоящее изобретение также предлагает применение агентов и композиций для лечения рака предстательной железы и профилактики метастазирования и (или) рецидивирования рака предстательной железы.
В различных вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает вирусные векторы, кодирующие толл-подобный рецептор (TLR) и агонист TLR. В различных вариантах осуществления TLR может представлять собой образ-распознающий рецептор (PRR) какого-либо типа. В некоторых вариантах осуществления TLR может распознавать молекулы, которые представляют собой консервативные молекулярные продукты, полученные из патогенов, включающих в себя грамположительные, грамотрицательные бактерии, грибы и вирусы, но отличаются от молекул-хозяев, которые в совокупности называют патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (РАМР). В некоторых вариантах осуществления TLR может также распознавать эндогенные молекулы, высвобождаемые из поврежденных или умирающих клеток, которые в совокупности называются молекулярными паттернами, ассоциированным с повреждением (DAMP). РАМР или DAMP могут быть агонистом TLR, как описано более детально ниже. В некоторых вариантах осуществления TLR может представлять собой фрагмент, вариант, аналог, гомолог или производное, которые рекрутируют адаптерные молекулы в цитоплазме клеток для распространения сигнала. В некоторых вариантах осуществления TLR может происходить от человека или других видов млекопитающих, таких как макака-резус, мышь или крыса. В некоторых вариантах осуществления TLR может быть по меньшей мере на 30-99% идентичен TLR, рекрутирующему адаптерные молекулы в цитоплазме клеток для распространения сигнала.
В различных вариантах осуществления TLR может представлять собой один из десяти-пятнадцати типов TLR, которые, по оценкам, имеются у большинства видов млекопитающих. TLR может быть одним из 13 TLR (называемых просто TLR1-TLR13), которые были идентифицированы совместно у людей и мышей, или может представлять собой эквивалентную форму, которая была обнаружена у других видов млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления TLR может представлять собой один из 11 элементов (TLR1-TLR11), которые были идентифицированы у людей. В различных вариантах осуществления TLR может представлять собой один из TLR, описанных в WO 2015/080631 и патенте США №9,205,095, полное содержание которого включено в данную заявку посредством ссылки.
В различных вариантах осуществления TLR может экспрессироваться иммунным клетками различного типа и может располагаться на поверхности или в цитоплазме клетки. В некоторых вариантах осуществления TLR может экспрессироваться на раковых клетках. Различные TLR и их экспрессия в раковых клетках представлены ниже:
В различных вариантах осуществления TLR, экспрессирущиеся на раковых клетках, могут осуществлять повышающую регуляцию каскада NF-κВ и продуцировать антиапоптотические белки, которые способствуют канцерогенезу и пролиферации раковых клеток.
Известно четыре адаптерных молекул TLR, участвующих в передаче сигналов. Эти белки известны как миелоидный фактор дифференцировки 88 (MyD88), Tirap (также называемый Mal), Trif и Tram. Адаптеры активируют другие молекулы внутри клетки, включая определенные протеинкиназы (IRAK1, IRAK4, TBK1 и IKKi), которые амплифицируют сигнал и в конечном итоге приводят к индукции или супрессии генов, управляющих воспалительным ответом. Сигнальные пути TLR во время распознавания патогена могут индуцировать иммунные реакции через внеклеточные и внутриклеточные пути, опосредованные MyD88, усилителем легкой каппа-цепи ядерного фактора активированных В-клеток (NF-κВ) и митоген-ассоциированной протеинкиназой (MAPK). В целом, передачей сигналов TLR активируются тысячи генов, и в совокупности TLR представляет собой один из наиболее плейотропных, но строго регулируемых шлюзов для генной модуляции.
TLR вместе с рецепторами интерлейкина-1 образуют суперсемейство рецепторов, известное как «суперсемейство рецепторов интерлейкина-1/толл-подобных рецепторов». Все члены этого семейства имеют общий так называемый TIR-домен (рецептор Toll-IL-1). Могут существовать три подгруппы доменов TIR. Белки с доменами TIR подгруппы I являются рецепторами интерлейкинов, которые продуцируются макрофагами, моноцитами и дендритными клетками, и все они имеют внеклеточные домены иммуноглобулина (Ig). Белки с доменами TIR подгруппы II являются классическими TLR и связываются непосредственно или опосредованно с молекулами микробного происхождения. Третья подгруппа белков, содержащих домены TIR (III), состоит из адапторных белков, которые являются исключительно цитозольными и опосредуют передачу сигналов от белков подгрупп 1 и 2. В различных вариантах осуществления TLR может представлять собой фрагмент, вариант, аналог, гомолог или производное, которые сохраняют домен TIR подгруппы I, домен TIR подгруппы II или домен TIR подгруппы III.
В некоторых вариантах осуществления TLR может функционировать в качестве димера. Например, хотя большинство TLR, по-видимому, функционирует в качестве гомодимеров, TLR2 образует гетеродимеры с TLR1 или TLR6, причем каждый димер обладает различной лигандной специфичностью. TLR может также зависеть от других корецепторов для обеспечения полной чувствительности к лиганду, например, в случае распознавания рецептором TLR4 липополисахаридов (LPS), для которого требуется MD-2. Известно, что CD14 и липополисахарид-связывающий белок (LBP) способствует представлению LPS в MD-2.
В конкретном варианте осуществления вирусные векторы по такому изобретению кодируют толл-подобный рецептор 5 (TLR5). Не желая ограничиваться какой-либо теорией, полагают, что TLR-5 может играть фундаментальную роль в распознавании патогенов и активации врожденного иммунитета. TLR-5 может распознавать РАМР, которые экспрессируются инфекционными агентами, и опосредовать выработку цитокинов, необходимых для развития эффективного иммунитета. TLR-5 может распознавать бактериальный флагеллин, главный компонент бактериальных жгутиков и какой-либо фактор вирулентности. В некоторых вариантах осуществления активация TLR может мобилизовать такой NF-κВ ядерного фактора и стимулировать выработку фактора некроза опухоли-альфа.
В различных вариантах осуществления вирусные векторы по такому изобретению совместно экспрессируют толл-подобный рецептор (TLR) и агонист TLR. В некоторых вариантах осуществления агонист TLR представляет собой РАМР, который может представлять собой консервативный молекулярный продукт, полученный из патогена. Патоген может представлять собой грамположительную бактерию, грамотрицательную бактерию, грибок или вирус. В некоторых вариантах осуществления агонист TLR может представлять собой лиганд молекулярного паттерна, ассоциированного с повреждением (DAMP), который может представлять собой эндогенную молекулу, высвобождаемую из поврежденных или умирающих клеток. DAMP или РАМР могут инициировать иммунный ответ через сигналы TLR и рекрутировать адаптерные молекулы в цитоплазме клеток для распространения сигнала. В некоторых вариантах осуществления агонист TLR может представлять собой агонист для TLR, который может представлять собой лиганд из следующей таблицы Б:
В различных вариантах осуществления агонист TLR может представлять собой фрагмент, вариант, аналог, гомолог или производное РАМР или DAMP, которые связывают TLR и индуцируют TLR-опосредованную активность, такую как активация активности NF-κВ. В некоторых вариантах осуществления фрагмент, вариант, аналог, гомолог или производное агониста TLR могут быть идентичны по меньшей мере на 30-99% аминокислотам агониста TLR и индуцировать TLR-опосредованную активность.
В некоторых вариантах осуществления агонист TLR может иметь своей целью TLR, такой как TLR-5. Агонист TLR может представлять собой агонист TLR-5 и стимулировать активность TLR-5. Агонист TLR может представлять собой антитело анти-TLR5 или другую малую молекулу.
В некоторых вариантах осуществления агонист TLR может представлять собой флагеллин. В некоторых вариантах осуществления флагеллин может представлять собой флагеллин или родственный флагеллину полипептид. Флагеллин может происходить из любого источника, включая различные виды грамположительных и грамотрицательных бактерий. Флагеллин может представлять собой полипептид флагеллина из любого вида грамположительных или грамотрицательных бактерий, включая, но не ограничиваясь ими, полипептид флагеллина, раскрытый в патентной публикации США №2003/000044429, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. Например, флагеллин может содержать аминокислотную последовательность из какого-либо вида бактерий, изображенных на фиг. 7 патентной публикации США №2003/0044429. Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды флагеллина, перечисленные на фиг. 7 патентной публикации США №2003/0044429, общедоступны в источниках, включая базу данных базы генетических данных GenBank Национального центра биотехнологической информации. В некоторых вариантах осуществления флагеллин также может представлять собой пептид флагеллина, соответствующий учетному номеру, указанному в результатах поиска в программе для обнаружения сходства последовательностей белков путем их локального выравнивания BLAST, которые показаны на фиг. 25 патентной публикации США №2003/000044429, или какой-либо его вариант. В некоторых вариантах осуществления флагеллин также может представлять собой полипептид флагеллина, как раскрыто в патентной публикации США №2009/0011982, содержание которой полностью включено в данную заявку. В некоторых вариантах осуществления флагеллин может представлять собой любой из полипептидов флагеллина, как раскрыто на фиг. 6 и 7 в данной заявке.
В некоторых вариантах осуществления флагеллин может представлять собой фрагмент, вариант, аналог, гомолог или производное флагеллина, которые связывают TLR5 и индуцируют TLR5-опосредованную активность, такую как активация активности NF-κВ. Фрагмент, вариант, аналог, гомолог или производное флагеллина могут быть по меньшей мере на 30-99% идентичны аминокислотам флагеллина, который связывает TLR5 и индуцирует TLR5-опосредованную активность.
В некоторых вариантах осуществления флагеллин может происходить из вида Salmonella, типичным примером которого является S. dublin (например, закодированный учетным номером базы генетических данных GenBank М84972). Связанный с флагеллином полипептид может представлять собой фрагмент, вариант, аналог, гомолог или производное М84972, или их комбинацию, которые связываются с TLR5 и индуцируют TLR5-опосредованную активность, такую как активация активности NF-kB. Фрагмент, вариант, аналог, гомолог или производное флагеллина могут быть получены с помощью рационального конструирования, основанного на доменной структуре флагеллина и консервативной структуре, распознаваемой TLR5.
В некоторых вариантах осуществления флагеллин может содержать по меньшей мере 10, 11, 12 или 13 из 13 консервативных аминокислот, показанных на фиг. 5 (положения 89, 90, 91, 95, 98, 101, 115, 422, 423, 426, 431, 436 и 452). В некоторых вариантах осуществления флагеллин может быть по меньшей мере на 30-99% идентичен аминокислотам 1-174 и 418-505 М84972. На фиг. 26 в публикации заявки на патент США №2009/0011982, содержание которой полностью включено в данную заявку, приведен процент идентичности амино- и карбоксиконца флагеллина с известной TLR-5-стимулирующей активностью, по сравнению с М84972.
В некоторых вариантах осуществления флагеллин может быть основным компонентом жгутика бактерий. Флагеллин может состоять из трех доменов (фиг. 4). Домен 1 (D1) и домен 2 (D2) могут быть прерывистыми и могут образовываться, когда остатки в таком аминоконце и карбоксиконце сближаются с образованием шпилечной структуры. Амино- и карбоксиконец, содержащие домены D1 и D2, могут быть наиболее консервативными, тогда как такой средний гипервариабельный домен (D3) может быть высоко вариабельным. Исследования с рекомбинантным белком, содержащим такие аминоконцевые домены D1 и D2 и карбоксиконцевые домены D1 и D2, разделенные шарниром Escherichia coli (ND1-2/ECH/CD2), показывают, что D1 и D2 могут быть биологически активными при соединении с элементом ЕСН. Такая химера, но не сам такой шарнир, может индуцировать деградацию IkBα, активацию NF-kB и продуцирование NO и IL-8 в двух клеточных линиях эпителия кишечника. Неконсервативный домен D3 может находиться на поверхности нити жгутика и может содержать основные антигенные эпитопы. Сильная провоспалительная активность флагеллина может проявляться в таких высококонсервативных областях N и С доменов D1 и D2 (см. фиг. 4).
Флагеллин может индуцировать активность NF-kB, связываясь с толл-подобным рецептором 5 (TLR5). TLR может распознавать консервативную структуру, специфичную для флагеллина. Консервативная структура может состоять из большой группы остатков, которые некоторым образом допускают изменение аминокислотного состава. В статье Smith et al., Nat Immunol. 4:1247-53 (2003), содержание которой включено в данную заявку посредством ссылки, идентифицировали 13 консервативных аминокислот в флагеллине, которые являются частью такой консервативной структуры, распознаваемой TLR5. Такие 13 консервативных аминокислот флагеллина, которые могут быть важны для активности TLR5, показаны на фиг. 5.
Были получены многочисленные делеционные мутанты флагеллина, которые сохраняют, по меньшей мере, некоторую TLRS-стимулирующую активность. В некоторых вариантах осуществления флагеллин может представлять собой делеционный мутант и может представлять собой делеционный мутант, раскрытый в примерах патента США №9,205,095, полное содержание которого включено в данную заявку посредством ссылки. Флагеллин может содержать последовательность, транслированную с отсутствующими аминокислотами 185-306 или 444-492 с учетным номером в базе генетических данных GenBank D13689 или с отсутствующими аминокислотами 179-415 с учетным номером в базе генетических данных GenBank М84973, или с каким-либо их вариантом.
В некоторых вариантах осуществления флагеллин может содержать вставки транспозона и изменения в вариабельном домене D3. Домен D3 может быть частично или полностью замещен шарнирным или линкерным полипептидом, который позволяет доменам D1 и D2 правильно укладываться, так что такой вариант стимулирует активность TLR5. Варианты шарнирных элементов могут быть обнаружены в белке MukB Е. coli и могут иметь последовательность, указанную в идентификаторе последовательности SEQ ID под №№3 и 4, или каком-либо их варианте, патента США №9,205,095, полное содержание которого включено в данную заявку посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления флагеллин, как описано выше, может дополнительно содержать какую-либо лидерную последовательность. В каком-либо варианте осуществления флагеллин, дополнительно содержащий лидерную последовательность, может представлять собой CBLB502S. В некоторых вариантах осуществления флагеллин представляет собой секретируемый вариант, раскрытый в патенте США №9,205,095, полное содержание которого включено в данную заявку посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления флагеллин представляет собой негликозилированную секретируемую форму флагеллина, раскрытую в WO 2015/080631, полное содержание которого включено в данную заявку посредством ссылки. В каком-либо варианте осуществления флагеллин включает в себя аминокислотную последовательность по идентификатору последовательности SEQ ID под №102 в WO 2015/080631, иначе называемую CBLB502NQs. Такой вариант CBLB502NQs включает в себя аминокислотную последовательность CBLB502, как показано на фиг. 1d, с четырьмя остатками аспарагина (которые являются потенциальными местами гликозилирования), замененными глутаминами. В каком-либо варианте осуществления аминокислотная последовательность CBLB502NQs является следующей:
Настоящее изобретение также относится к агенту, содержащему терапевтически эффективное количество TLR и агониста TLR. В некоторых вариантах осуществления агент может представлять собой вектор. В некоторых вариантах осуществления вектор может включать в себя первую нуклеиновую кислоту, кодирующую такой TLR, и вторую нуклеиновую кислоту, включающую в себя агонист TLR. Вектор может обладать способностью к трансдукции клеток млекопитающих. Вектор может обладать способностью к бицистронной экспрессии TLR и (или) агониста TLR с использованием сильных промоторов. Вектор может включать в себя только ген, кодирующий TLR, который может контролироваться сильным промотором. Вектор может быть доставлен в клетку млекопитающего вирусной или связанной с липосомами векторной системой. Вирусная векторная система может представлять собой аденовирус или цитомегаловирус. В каком-либо варианте осуществления вирусный вектор представляет собой аденовирусный вектор. В каком-либо варианте осуществления аденовирусный вектор не реплицируется.
В некоторых вариантах осуществления агент может представлять собой липосому, несущую вектор. Липосома может обладать способностью к трансдукции клеток млекопитающих и доставке вектора для экспрессии. В некоторых вариантах осуществления агент может представлять собой наночастицу, несущую вектор. В таких вариантах осуществления наночастица может быть способна к трансдукции клеток млекопитающих и доставке вектора для экспрессии.
В некоторых вариантах осуществления агент может представлять собой лекарственный препарат, который одновременно индуцирует экспрессию и активирует TLR, посредством чего опухолевые или инфицированные клетки подвергаются воздействию иммунной системы хозяина, имитируя ситуацию массивного проникновения через стенку кишечника. Агент может представлять собой лекарственный препарат, который экспрессирует TLR в сочетании с агонистом TLR, и может быть доставлен систематически в растворе для введения, такого как внутримышечное. Агент может представлять собой лекарственный препарат, который экспрессирует TLR в комбинации с агонистом TLR, который может экспрессироваться из одного и того же вектора, такого как аденовирусная или цитомегаловирусная векторная система. Агент может представлять собой лекарственный препарат, который экспрессирует TLR в комбинации с агонистом TLR, экспрессируемым в форме наночастицы, которая может переносить функциональный агонист на клеточную поверхность клетки млекопитающего.
Агент может представлять собой фармацевтический агент, содержащий лекарственный препарат, описанный выше, который может быть получен с использованием способов, хорошо известных в данной области техники. Агент также может включать в себя соагент.
В различных вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает вектор, который может включать в себя первую нуклеиновую кислоту, кодирующую TLR5, и вторую нуклеиновую кислоту, включающую в себя флагеллин. Вектор может обладать способностью к экспрессии TLR5 и (или) флагеллина с использованием сильного промотора. Экспрессионный вектор может дополнительно включать в себя лидерную последовательность, клонированную выше гена, кодирующего TLR5 и (или) флагеллин. В некоторых вариантах осуществления экспрессионный вектор может представлять собой векторную систему на основе pCD515. В различных вариантах осуществления экспрессионный вектор может представлять собой любой из векторов, как описано фиг. 1а и фиг. 1b.
Агент может представлять собой лекарственный препарат, который одновременно индуцирует экспрессию и активирует TLR, посредством чего опухолевые или инфицированные клетки подвергаются воздействию иммунной системы хозяина. Лекарственный препарат может быть в форме вирусной системы экспрессии, несущей вектор. Такой лекарственный препарат может представлять собой аденовирус, экспрессирующий функциональный TLR5 человека, в комбинации с:
агонистом TLR, доставляемым системно в растворе для введения, такого как внутримышечное;
агонистом TLR, экспрессируемым из того же аденовирусного вектора, что и такой TLR; или
агонистом TLR, экспрессируемым в форме наночастиц, несущих функциональный агонист TLR, такой как флагеллин, который может быть получен из CBLB502 на их поверхности. Наночастица может быть основана на бактериофаге Т7 или полностью сформирована для сохранения своей биологической активности. Нанопрепарат может обеспечивать дозозависимую активацию чувствительного к NF-κВ репортера и может приводить к интернализации клеток путем эндоцитоза для обеспечения эффективного подхода к иммунизации (Mobian АР-А).
В различных вариантах осуществления введение агентов с использованием способа, описанного в данной заявке, может выполняться перорально, парентерально, сублингвально, трансдермально, ректально, трансмукозально, местно, ингаляционно, трансбуккально или комбинацией указанных путей. Парентеральное введение включает в себя, помимо прочего, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, подкожное, внутримышечное, интратекальное и внутрисуставное. В каком-либо варианте осуществления путь введения внутриопухолевый.
В некоторых вариантах осуществления агент может вводиться одновременно или метрономически с другими видами лечения. Термин «одновременный» в разных грамматических формах или «одновременно» в контексте данной заявки означает, что агент и другое лечение вводят на протяжении 48 часов, предпочтительно 24 часов, более предпочтительно 12 часов, еще более предпочтительно 6 часов и наиболее предпочтительно 3 часа или менее одно после другого. Используемый в данной заявке термин «метрономически» означает введение агента в моменты времени, отличающиеся от другого такого лечения, и с какой-либо определенной частотой относительно повторного введения.
В некоторых вариантах осуществления агент может вводиться в любой момент до другого лечения, включая около 120 часов, 118 часов, 116 часов, 114 часов, 112 часов, 110 часов, 108 часов, 106 часов, 104 часа, 102 часа, 100 часов, 98 часов, 96 часов, 94 часа, 92 часа, 90 часов, 88 часов, 86 часов, 84 часа, 82 часа, 80 часов, 78 часов, 76 часов, 74 часа, 72 часа, 70 часов, 68 часов, 66 часов, 64 часа, 62 часа, 60 часов, 58 часов, 56 часов, 54 часа, 52 часа, 50 часов, 48 часов, 46 часов, 44 часа, 42 часа, 40 часов, 38 часов, 36 часов, 34 часа, 32 часа, 30 часов, 28 часов, 26 часов, 24 часа, 22 часа, 20 часов, 18 часов, 16 часов, 14 часов, 12 часов, 10 часов, 8 часов, 6 часов, 4 часа, 3 часа, 2 часа, 1 час, 55 минут, 50 минут, 45 минут, 40 минут, 35 минут, 30 минут, 25 минут, 20 минут, 15 минут, 10 минут, 9 минут, 8 минут, 7 минут, 6 минут, 5 минут, 4 минуты, 3 минуты, 2 минуты и 1 минуту. Агент может вводиться в любой момент до второго введения агента, включая около 120 часов, 118 часов, 116 часов, 114 часов, 112 часов, 110 часов, 108 часов, 106 часов, 104 часа, 102 часа, 100 часов, 98 часов, 96 часов, 94 часа, 92 часа, 90 часов, 88 часов, 86 часов, 84 часа, 82 часа, 80 часов, 78 часов, 76 часов, 74 часа, 72 часа, 70 часов, 68 часов, 66 часов, 64 часа, 62 часа, 60 часов, 58 часов, 56 часов, 54 часа, 52 часа, 50 часов, 48 часов, 46 часов, 44 часа, 42 часа, 40 часов, 38 часов, 36 часов, 34 часа, 32 часа, 30 часов, 28 часов, 26 часов, 24 часа, 22 часа, 20 часов, 18 часов, 16 часов, 14 часов, 12 часов, 10 часов, 8 часов, 6 часов, 4 часа, 3 часа, 2 часа, 1 час, 55 минут, 50 минут, 45 минут, 40 минут, 35 минут, 30 минут, 25 минут, 20 минут, 15 минут, 10 минут, 9 минут, 8 минут, 7 минут, 6 минут, 5 минут, 4 минуты, 3 минуты, 2 минуты и 1 минуту.
Агент может вводиться в любой момент после другого лечения, включая около 1 минуту, 2 минуты, 3 минуты, 4 минуты, 5 минут, 6 минут, 7 минут, 8 минут, 9 минут, 10 минут, 15 минут, 20 минут, 25 минут, 30 минут, 35 минут, 40 минут, 45 минут, 50 минут, 55 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 6 часов, 8 часов, 10 часов, 12 часов, 14 часов, 16 часов, 18 часов, 20 часов, 22 часа, 24 часа, 26 часов, 28 часов, 30 часов, 32 часа, 34 часа, 36 часов, 38 часов, 40 часов, 42 часа, 44 часа, 46 часов, 48 часов, 50 часов, 52 часа, 54 часа, 56 часов, 58 часов, 60 часов, 62 часа, 64 часа, 66 часов, 68 часов, 70 часов, 72 часа, 74 часа, 76 часов, 78 часов, 80 часов, 82 часа, 84 часа, 86 часов, 88 часов, 90 часов, 92 часа, 94 часа, 96 часов, 98 часов, 100 часов, 102 часа, 104 часа, 106 часов, 108 часов, 110 часов, 112 часов, 114 часов, 116 часов, 118 часов и 120 часов. Агент может вводиться в любой момент после второго введения агента, включая около 120 часов, 118 часов, 116 часов, 114 часов, 112 часов, 110 часов, 108 часов, 106 часов, 104 часа, 102 часа, 100 часов, 98 часов, 96 часов, 94 часа, 92 часа, 90 часов, 88 часов, 86 часов, 84 часа, 82 часа, 80 часов, 78 часов, 76 часов, 74 часа, 72 часа, 70 часов, 68 часов, 66 часов, 64 часа, 62 часа, 60 часов, 58 часов, 56 часов, 54 часа, 52 часа, 50 часов, 48 часов, 46 часов, 44 часа, 42 часа, 40 часов, 38 часов, 36 часов, 34 часа, 32 часа, 30 часов, 28 часов, 26 часов, 24 часа, 22 часа, 20 часов, 18 часов, 16 часов, 14 часов, 12 часов, 10 часов, 8 часов, 6 часов, 4 часа, 3 часа, 2 часа, 1 час, 55 минут, 50 минут, 45 минут, 40 минут, 35 минут, 30 минут, 25 минут, 20 минут, 15 минут, 10 минут, 9 минут, 8 минут, 7 минут, 6 минут, 5 минут, 4 минуты, 3 минуты, 2 минуты и 1 минуту.
В различных вариантах осуществления способ по такому изобретению может включать в себя введение агентов, представленных в данной заявке, в форме таблеток или пастилок, приготовленных традиционным способом. Например, таблетки и капсулы для перорального введения могут содержать обычные вспомогательные вещества, которые могут представлять собой связующие агенты, наполнители, смазывающие агенты, разрыхлители и смачивающие агенты. Связующие агенты включают в себя, помимо прочего, сироп, камедь, желатин, сорбит, трагакант, слизь крахмала и поливинилпирролидон. Наполнителями могут представлять собой лактозу, сахар, микрокристаллическую целлюлозу, кукурузный крахмал, кальция фосфат и сорбит. Смазывающие агенты включают в себя, помимо прочего, стеарат магния, стеариновую кислоту, тальк, полиэтиленгликоль и диоксид кремния. Разрыхлителями могут быть картофельный крахмал и натрия крахмал гликолят. Смачивающими агентами может быть лаурилсульфат натрия. Таблетки могут быть покрыты оболочкой в соответствии с методами, хорошо известными в данной области техники.
В некоторых вариантах осуществления агенты, представленные в данной заявке, также могут представлять собой жидкие препараты, такие как водные или масляные суспензии, растворы, эмульсии, сиропы и эликсиры. Агенты также могут быть в виде сухого продукта для разведения водой или другим подходящим растворителем перед использованием. Такие жидкие препараты могут содержать добавки, такие как суспендирующие агенты, эмульгирующие агенты, неводные растворители и консерванты. Суспендирующий агент может представлять собой сорбитовый сироп, метилцеллюлозу, глюкозу/сахарный сироп, желатин, гидроксиэтилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, гель стеарата алюминия и гидрогенизированные пищевые жиры. Эмульгирующие агенты могут представлять собой лецитин, сорбитанмоноолеат и камедь. Неводные растворители могут представлять собой пищевые масла, миндальное масло, фракционированное кокосовое масло, жирные сложные эфиры, пропиленгликоль и этиловый спирт. Консерванты могут представлять собой метил- или пропил-п-гидроксибензоат и сорбиновую кислоту.
В некоторых вариантах осуществления агенты, представленные в данной заявке, также могут быть в виде суппозиториев, которые могут содержать основы для суппозиториев, такие как масло какао или глицериды. Агенты, представленные в данной заявке, также могут быть предназначены для ингаляций, и могут быть в форме, такой как раствор, суспензия или эмульсия, которая может вводиться в виде сухого порошка или в форме аэрозоля с использованием пропеллента, такого как дихлордифторметан или трихлорфторметан. Агенты, представленные в данной заявке, также могут быть в виде трансдермальных препаратов, содержащих водные или неводные растворители, такие как кремы, мази, лосьоны, пасты, лекарственный пластырь, повязка или мембрана.
В некоторых вариантах осуществления агенты, представленные в данной заявке, также могут быть предназначены для парентерального введения, такого как инъекция, внутриопухолевая инъекция или непрерывная инфузия. Препараты для инъекций могут быть в форме суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных растворителях и могут содержать агенты для приготовления препаратов, включая, помимо прочего, суспендирующие, стабилизирующие и диспергирующие агенты. Агенты также могут быть предоставлены в форме порошка для разведения подходящим растворителем, включая, помимо прочего, стерильную апирогенную воду.
В некоторых вариантах осуществления агенты, представленные в данной заявке, также могут быть в виде депо-препарата, который может вводиться путем имплантации или внутримышечной инъекции. Агенты могут объединяться с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле), ионообменными смолами или в виде труднорастворимых производных (например, в виде труднорастворимой соли).
В различных вариантах осуществления способ по такому изобретению может включать в себя введение терапевтически эффективного количества агента пациенту, нуждающемуся в этом. Терапевтически эффективное количество, необходимое для применения в терапии, варьируется в зависимости от характера заболевания, подлежащего лечению, периода времени, требуемого для активации активности TLR, и возраста/состояния пациента. В различных вариантах осуществления дозы, используемые для лечения взрослого человека, находятся в диапазоне от 0,001 мг/кг до около 200 мг/кг в сутки. В некоторых вариантах осуществления доза может составлять от около 1 мг/кг до около 100 мг/кг в сутки. Желаемую дозу можно удобно вводить в виде одной дозы или в виде нескольких доз, вводимых через соответствующие интервалы, например, в виде двух, трех, четырех или более субдоз в сутки. В некоторых вариантах осуществления могут быть желательны или необходимы многократные дозы.
В различных вариантах осуществления такая дозировка может быть любой, такой как около 0,1 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,6 мг/кг, 0,7 мг/кг, 0,8 мг/кг, 0,9 мг/кг, 1 мг/кг, 25 мг/кг, 50 мг/кг, 75 мг/кг, 100 мг/кг, 125 мг/кг, 150 мг/кг, 175 мг/кг, 200 мг/кг, 225 мг/кг, 250 мг/кг, 275 мг/кг, 300 мг/кг, 325 мг/кг, 350 мг/кг, 375 мг/кг, 400 мг/кг, 425 мг/кг, 450 мг/кг, 475 мг/кг, 500 мг/кг, 525 мг/кг, 550 мг/кг, 575 мг/кг, 600 мг/кг, 625 мг/кг, 650 мг/кг, 675 мг/кг, 700 мг/кг, 725 мг/кг, 750 мг/кг, 775 мг/кг, 800 мг/кг, 825 мг/кг, 850 мг/кг, 875 мг/кг, 900 мг/кг, 925 мг/кг, 950 мг/кг, 975 мг/кг или 1000 мг/кг.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ лечения рака путем введения млекопитающему, нуждающемуся в этом, агента по такому изобретению. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, полагают, что такой способ предлагает иммунотерапию против рака путем превращения опухолевых клеток в состояние, реагирующее на агонист TLR, с целенаправленной внутриопухолевой стимуляцией TLR, таким образом фокусируя иммунный ответ на опухоль. Такой способ может быть использован для лечения первичных опухолей перед их хирургическим удалением с целью снижения риска развития метастазов, а также для лечения других опухолевых узлов. Такой способ может включать в себя внутриопухолевую инъекцию. Такой способ может включать в себя стадию введения агента в первичную опухоль перед ее хирургическим удалением, чтобы снижать риск развития метастазов, а также обеспечивать лечение других опухолевых узлов. Такой способ может быть использован для лечения любой опухоли, доступной для внутриопухолевой инъекции аденовируса.
В соответствии с настоящим изобретением можно лечить различные виды рака, включая карциному, рак мочевого пузыря (включая ускоренный и метастатический рак мочевого пузыря), молочной железы, толстой кишки (включая колоректальный рак), почек, печени, легких (включая мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легких и аденокарциному легких), яичников, предстательной железы, яичек, мочеполового тракта, лимфатической системы, прямой кишки, гортани, поджелудочной железы (включая экзокринный рак поджелудочной железы), пищевода, желудка, желчного пузыря, шейки матки, щитовидной железы и кожи (включая плоскоклеточный рак); гемопоэтические опухоли лимфоидного ряда, включая лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, волосаточклеточную лимфому, гистиоцитарную лимфому и лимфому Биркитта; гемопоэтические опухоли миелоидного ряда, включая острые и хронические миелогенные лейкозы, миелодиспластический синдром, миелоидный лейкоз и промиелоцитарный лейкоз; опухоли центральной и периферической нервной системы, включая астроцитому, нейробластому, глиому и шванномы; опухоли мезенхимального происхождения, включая фибросаркому, рабдомиоскаркому и остеосаркому; и другие опухоли, включая меланому, пигментную ксеродерму, кератоактантому, семиному, фолликулярный рак щитовидной железы, тератокарциному и рак желудочно-кишечного тракта или брюшно-тазовой полости.
В различных вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способы профилактики и (или) лечения рака предстательной железы путем введения агента по такому изобретению пациенту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой вектор (или аденовирус, включающий в себя вектор), который включает в себя первую нуклеиновую кислоту, кодирующую TLR5, и вторую нуклеиновую кислоту, включающую в себя негликозилированную секретируемую форму флагеллина (т.е. CBLB502NQs). В других вариантах осуществления агент представляет собой клетку, трансдуцированную вектором (или аденовирус, включающий в себя вектор), который включает в себя первую нуклеиновую кислоту, кодирующую TLR5, и вторую нуклеиновую кислоту, включающую в себя негликозилированную секретируемую форму флагеллина (т.е. CBLB502NQs).
В некоторых вариантах осуществления, представленных в данной заявке, имеет место способ профилактики и (или) лечения рака предстательной железы путем доставки клеток, трансдуцированных агентом по такому изобретению (напр., аденовирусная система, включающая в себя вектор, который коэкспрессирует TLR5 и CBLB502NQs). В каком-либо варианте осуществления клетки могут быть в виде клеточной вакцины. В некоторых вариантах осуществления способ может включать в себя введение клеточной вакцины в сочетании с любой другой вакцинацией, которая может включать в себя конструкцию, экспрессирующую выбранный антиген. Типичные клетки, которые могут быть трансдуцированы агентом по такому изобретению (напр., аденовирус, включающий в себя первую нуклеиновую кислоту, кодирующую TLR5, и вторую нуклеиновую кислоту, включающую в себя негликозилированную секретируемую форму флагеллина (т.е. CBLB502NQ)), включают в себя, помимо прочего, нормальные, предзлокачественные или злокачественные клетки. В некоторых вариантах осуществления клетки получают от пациента, которого подвергают лечению. Типичные клетки включают в себя нормальные или предзлокачественные клетки, такие как эпителиальные или стромальные клетки предстательной железы, полученные от пациента, которого подвергают лечению. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть получены из биоптатов, взятых у пациента. В некоторых вариантах осуществления могут использоваться клетки злокачественной опухоли предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления клетки злокачественной опухоли предстательной железы получают из опухолей, иссекаемых у пациента, которого подвергают лечению. В различных вариантах осуществления клетки (напр., клетки, полученные от пациента, которого подвергают лечению, путем биопсии или удаления опухоли), трансдуцируют вирусными векторами с применением методов, известных в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления клетки размножают ex vivo до и (или) после вирусной трансдукции. В некоторых вариантах осуществления клетки облучают до, во время или после вирусной трансдукции. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят пациенту, например, в форме клеточной вакцины. Дополнительные типичные клетки, которые могут быть использованы в способах по такому изобретению, включают в себя, помимо прочего, клетки, обладающие низкой экспрессией вируса Коксаки и рецептора аденовируса (CAR) и происходящие из гемопоэтические опухолей, опухолей мягких тканей, кожи, головы и шеи, головного мозга, шейки матки, молочной железы и пищевода; клетки, обладающие высокой экспрессией CAR и происходящие из опухолей мочевого пузыря, рака предстательной железы, тонкой кишки, щитовидной железы, яичек и толстой кишки; и клетки, обладающие средней экспрессией CAR и происходящие из опухолей легких, яичников, желудка, почек, меланомы, печени, эндокринной системы и мезотелиомы.
В различных вариантах осуществления способ может использоваться для профилактики и (или) лечения рака предстательной железы с помощью внутриклеточных или внутриопухолевых инъекций, что приводит к аутокринной активации передачи TLR-сигналов инфицированными клетками или микроокружением опухоли с минимальным системным эффектом и, таким образом, обеспечивает возможность врожденного иммунного ответа, специфичного для таких инфицированных клеток или микроокружения опухоли. В различных вариантах осуществления способы по такому изобретению обеспечивают непрерывную локальную передачу TLR5-сигналов, например, в клетках рака предстательной железы и (или) тканях предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления способы по такому изобретению не индуцируют системную передачу TLR5-сигналов. В различных вариантах осуществления способы по такому изобретению индуцируют локальное накопление мононуклеарных/лимфоидных клеток в предстательной железе для усиления противоопухолевого ответа и (или) подавления роста и прогрессирования опухоли. В некоторых вариантах осуществления естественные киллеры (NK) и (или) нейтрофилы рекрутируются в предстательную железу. В различных вариантах осуществления способы по такому изобретению приводят к активации передачи TLR-сигналов (напр., передачи TLR5-сигналов), которые устойчивы к нейтрализации нейтрализующими антителами к антифлагеллину.
В различных вариантах осуществления введение агентов или клеток по такому изобретению приводит к активации NF-κВ. В некоторых вариантах осуществления введение агентов или клеток по такому изобретению приводит к длительной активации NF-κВ в тканях предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления такая активация NF-κВ ограничивается локальной областью предстательной железы. В различных вариантах осуществления введение агентов или клеток по такому изобретению индуцирует экспрессию генов, вовлеченных в иммунные ответы, включая, помимо прочего, любые из генов, раскрываемые в данной заявке, такие как CXCL1, IL1B, S100A9, CCL7, CCL9, CXCL9, CXCL13, CXCL17, IKBKE, NFKBIZ, NLRC5, OASL1, NLRC5 и CLEC4A1.
В различных вариантах осуществления способы по такому изобретению обеспечивают профилактику и (или) лечение рака предстательной железы и (или) любого пролиферативного расстройства, характеризующееся патологическим ростом клеток, который возникает в предстательной железе. В каком-либо варианте осуществления способы по такому изобретению обеспечивают профилактику предраковых изменений в предстательной железе, включая образование и прогрессирование внутриэпителиальной неоплазии предстательной железы (ВЭНПЖ). ВЭНПЖ может диагностироваться и (или) отслеживаться способами, известными в данной области, такими как биопсия простаты. В каком-либо варианте осуществления способы по такому изобретению обеспечивают профилактику образования ВЭНПЖ, например, у пациентов, подверженных риску развития рака предстательной железы. В каком-либо варианте осуществления способы по такому изобретению обеспечивают профилактику прогрессирования ВЭНПЖ из ВЭНПЖ легкой степени (при которой клетки предстательной железы выглядят почти нормальными, как определяется, например, под микроскопом) в ВЭНПЖ тяжелой степени (при которой клетки предстательной железы выглядят патологическими). В каком-либо варианте осуществления способы по такому изобретению обеспечивают профилактику прогрессирования ВЭНПЖ в рак предстательной железы у пациента. В некоторых вариантах осуществления способы по такому изобретению обеспечивают профилактику развития пролиферативной воспалительной атрофии (ПВА) у пациента. В каком-либо варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает профилактику прогрессирования пролиферативной воспалительной атрофии (ПВА) в рак предстательной железы у пациента.
В различных вариантах осуществления способы по такому изобретению обеспечивают профилактику и (или) лечение аденокарцином предстательной железы. В каком-либо варианте осуществления аденокарцинома предстательной железы может иметь эпителиальное происхождение. В некоторых вариантах осуществления опухоли предстательной железы, подлежащие лечению, могут включать в себя просветные эпителиальные клетки предстательной железы, базальные эпителиальные клетки предстательной железы, стромальные клетки или комбинацию просветных эпителиальных, базальных эпителиальных клеток предстательной железы или стромальных клеток. В некоторых вариантах осуществления раковые опухоли предстательной железы, которые можно лечить, включают в себя просветные эпителиальные клетки предстательной железы CK8+. В некоторых вариантах осуществления раковые опухоли предстательной железы, для которых возможно лечение, могут включать в себя базальные эпителиальные клетки предстательной железы CK5+, которые также известны как стволовые/прогенитальные /базальные эпителиальные клетки. Другие виды рака предстательной железы, для которых возможна профилактика и (или) лечение, включают в себя, помимо прочего, мелкоклеточный рак предстательной железы, плоскоклеточный рак предстательной железы, саркому предстательной железы, переходноклеточный рак предстательной железы. В каком-либо варианте осуществления способы по такому изобретению обеспечивают профилактику и (или) лечение доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ), которая характеризуется как заболевание, при котором имеет место патологический рост эпителиальных клеток предстательной железы и препятствование ими оттоку мочи.
В различных вариантах осуществления рак предстательной железы, для которого осуществляется профилактика и (или) лечение, может представлять собой, например, первичный рак предстательной железы, локализированный в одном органе, локально-инвазивный распространенный рак предстательной железы, метастатический рак предстательной железы, устойчивый к кастрации рак предстательной железы или рецидивирующий устойчивый к кастрации рак предстательной железы. Метастатический рак предстательной железы характеризуется клетками рака предстательной железы, которые больше не ограничены одним органом. Рецидивирующий устойчивый к кастрации рак предстательной железы - это рак предстательной железы, который не реагирует на антиандрогеную терапию, или рак предстательной железы, который рецидивирует после антиандрогенной терапии.
В различных вариантах осуществления способы по такому изобретению обеспечивают профилактику прогрессирования рака предстательной железы. Прогрессирование рака предстательной железы может контролироваться способами, известными в данной области, например, биопсией предстательной железы. Например, патологоанатомы используют систему Глисона для описания степени дифференцировки клеток рака предстательной железы. В системе Глисона используется шкала степеней от 2 до 10. Более низкие баллы по шкале Глисона описывают хорошо дифференцированные, менее агрессивные опухоли. Более высокие баллы описывают плохо дифференцированные, более агрессивные опухоли. В различных вариантах осуществления способы по такому изобретению могут обеспечивать профилактику прогрессирование рака предстательной железы от низкой степени (напр., степень 2 по шкале Глисона) до более высокой степени рака предстательной железы (напр., степень 10 по шкале Глисона). В некоторых вариантах осуществления способы по такому изобретению могут вызывать регрессию рака предстательной железы, на что указывает, например, регрессия от рака предстательной железы более высокой степени по шкале Глисона до рака предстательной железы более низкой степени по шкале Глисона. В других вариантах осуществления стадия рака предстательной железы может определяться по системе международной классификации стадий злокачественных новообразований TNM Американского объединенного комитета по изучению рака, которая учитывает распространенность первичной опухоли (категория Т), распространенность (если имеет место) метастазов на регионарные лимфатические узлы (категория N), распространенность (если имеет место) метастазов на другие части тела (категория М), уровень ПСА; и шкале Глисона. В системе международной классификации стадий злокачественных новообразований TNM Американского объединенного комитета по изучению рака для определения общей стадии 1-4 объединяются различные факторы. Чем ниже число (напр., стадия 1), тем менее распространен рак. Чем выше число, такое как стадия 4, тем более распространен рак. В различных вариантах осуществления способы по такому изобретению могут обеспечивать профилактику прогрессирования рака предстательной железы, что отслеживается системой международной классификации стадий злокачественных новообразований TNM Американского объединенного комитета по изучению рака. В различных вариантах осуществления способы по такому изобретению могут вызывать регрессию рака предстательной железы, что отслеживается системой международной классификации стадий злокачественных новообразований TNM Американского объединенного комитета по изучению рака.
В различных вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет способ профилактики или уменьшения прогрессирования или метастазирования опухоли предстательной железы у пациента, включающий в себя введение пациенту эффективного количества агента по такому изобретению. В различных вариантах осуществления способы по такому изобретению могут использоваться для профилактики или уменьшения метастазирования опухоли в один или несколько лимфатических узлов, легкие, кости, включая позвоночник, печень и (или) мозг. В различных вариантах осуществления способы по такому изобретению могут использоваться для профилактики или уменьшения метастазирования опухоли в один или несколько надпочечников, молочных желез, глаз, почек, мышц, поджелудочную железу, слюнных желез и (или) селезенку. В некоторых вариантах осуществления способы по такому изобретению обеспечивают профилактику или уменьшение метастазирование опухоли в лимфатические узлы, легкие, позвоночник, почки и надпочечники. В различных вариантах осуществления агенты по такому изобретению вводят пациенту перед хирургическим удалением опухоли предстательной железы, чтобы предотвратить рецидивирование или метастазирование.
В контексте данной заявки в различных вариантах осуществления, уменьшение или профилактика прогрессирования рака предстательной железы включает в себя способ профилактики, пресечения, отсрочивания, предотвращения, устранения, предупреждения, прекращения, уменьшения или задержки прогрессирования рака предстательной железы у пациента. Считается, что раскрываемый способ уменьшает прогрессирование опухоли предстательной железы, если наблюдается уменьшение или задержка роста опухоли предстательной железы, метастазирования или одного или нескольких симптомов рака предстательной железы (напр., проблемы с мочеиспусканием, боль во время мочеиспускания, дискомфорт в области таза, отек ног в результате эдемы, кровь в моче, отек лимфатических узлов, боль в костях) у пациента с опухолью предстательной железы, по сравнению с контрольными субъектами с опухолью предстательной железы, которые не получали никакого агента, ингибирующего пролиферацию базальных эпителиальных клеток предстательной железы. Также считается, что раскрываемый способ уменьшает прогрессирование опухоли предстательной железы, если наблюдается уменьшение или задержка роста опухоли предстательной железы, метастазирования или одного, или нескольких симптомов рака предстательной железы (напр., проблемы с мочеиспусканием, боль во время мочеиспускания, дискомфорт в области таза, отек ног в результате эдемы, кровь в моче, отек лимфатических узлов, боль в костях) у пациента с опухолью предстательной железы после получения агента по такому изобретению, по сравнению с прогрессированием у такого субъекта до получения лечения. Таким образом, уменьшение или задержка роста опухоли предстательной железы может составлять около 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% или любое количественное уменьшение между этими цифрами.
Настоящее изобретение, кроме того, предлагает способы профилактики, пресечения, отсрочивания, предотвращения, устранения, предупреждения, прекращения, уменьшения или задержки начала, частоты или тяжести рецидива рака предстательной железы у пациента. В контексте данной заявки под повторным появлением рака предстательной железы подразумевается повторное появление одного или нескольких клинических симптомов рака предстательной железы после периода, лишенного одного или нескольких клинических симптомов рака предстательной железы. Рецидив рака предстательной железы может иметь место после лечения рака предстательной железы или после ремиссии. Рецидив может произойти через несколько дней, недель, месяцев или лет после лечения или после ремиссии. Например, считается, что такой раскрываемый способ снижает частоту возникновения рака предстательной железы, если наблюдается уменьшение или задержка начала, частоты или тяжести повторного появления рака предстательной железы или одного, или нескольких симптомов рака предстательной железы (напр., проблемы с мочеиспусканием, боль во время мочеиспускания, дискомфорт в области таза, отек ног в результате эдемы, кровь в моче, отек лимфатических узлов, боль в костях) у пациента, подверженного риску рецидива рака предстательной железы, по сравнению с контрольными субъектами, подверженными риску рецидива рака предстательной железы, которые не получали агента по такому изобретению. Также считается, что раскрываемый способ уменьшает рецидивирование рака предстательной железы, если наблюдается уменьшение или задержка начала, частоты или тяжести повторного появления рака предстательной железы или одного, или нескольких симптомов рака предстательной железы (напр., проблемы с мочеиспусканием, боль во время мочеиспускания, дискомфорт в области таза, отек ног в результате эдемы, кровь в моче, отек лимфатических узлов, боль в костях) у пациента, подверженного риску рецидива рака предстательной железы после получения агента по такому изобретению, по сравнению с прогрессированием заболевания у такого субъекта до получения лечения.
В контексте данной заявки в различных вариантах осуществления пациент, подверженный риску рецидива рака предстательной железы, представляет собой субъект, который подвергается риску повторного появления рака предстательной железы после лечения рака предстательной железы или после ремиссии от рака предстательной железы. Методы лечения рака предстательной железы включают в себя, помимо прочего, орхиэктомию (хирургическую кастрацию), простатэктомию, антиандрогенную терапию (например, Эулексином, Касодексом, Ниландроном и Низоралом), лучевую терапию, химиотерапию, терапию аналогами рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (например, Лупроном, Виадуром, Элигардом Золадексом, Трелстаром и Вантасом), антагонистами рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (например, Пленаксизом и) Фирмагоном или комбинацию этих методов лечения. Специалист в данной области может определить, существует ли риск рецидива рака предстательной железы у пациента. Например, пациента можно контролировать после лечения на предмет рецидива рака предстательной железы. Обычные контрольные визиты после лечения позволяют специалисту в данной области определить, лишен ли пациент клинических симптомов или появились ли снова клинические симптомы рака предстательной железы. Чтобы определить состояние пациента, может выполнятся анализ крови для измерения уровня ПСА. Результаты такого теста ПСА могут указывать на то, что рак предстательной железы может рецидивировать или рецидивировал (напр., уровень ПСА больше или равный около 4 нанограммам на миллилитр (нг/мл) крови, напр., от около 4 до около 10, напр., около 10 или более). Также могут использоваться методы визуализации, такие как рентгенография, МРТ, компьютерная томография и остеосцинтиграфия. Обследования лимфатических узлов, биопсии и пальцевые ректальные исследования также могут быть использованы для выявления пациентов с риском рецидива рака предстательной железы. Эти методы также могут быть использованы для определения стадии любого рецидива рака предстательной железы.
В различных вариантах осуществления способы, изложенные в данной заявке, могут быть использованы для лечения рака предстательной железы или уменьшения рецидивирования рака предстательной железы у пациента, который проходит, или который проходил, или который будет проходить лечение с применением одного или нескольких методов лечения рака предстательной железы. Такие методы лечения включают в себя, помимо прочего, орхиэктомию (хирургическую кастрацию), простатэктомию, антиандрогенную терапию (например, Эулексином, Касодексом, Ниландроном и Низоралом), лучевую терапию, химиотерапию, терапию аналогами рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (например, Лупроном, Виадуром, Элигардом, Золадексом, Трелстаром и Вантасом), антагонистами рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (например, Пленаксизом и) Фирмагоном или комбинацию этих методов лечения.
В каком-либо варианте осуществления способы по такому изобретению используются для лечения пациента, который проходит или который проходил или который будет проходить лечение лучевой терапией. В каком-либо варианте осуществления способы по такому изобретению используются для лечения пациента, который проходит, или который проходил, или который будет проходить лечение химиотерапией. Примеры химиотерапии включают в себя лечение химиотерапевтическими агентами, которые включают в себя, помимо прочего, алкилирующие агенты, такие как тиотепа и ЦИТОКСАН циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (напр., буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; калли статин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (напр., криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и СВ 1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, хлорметамина оксида гидрохлорид, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как ендииновые антибиотики (напр., калихеамицин, особенно калихеамицина гаммалл и калихеамицина омегалл (см., напр., Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; бисфосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также неокарзиностатина хромофор и родственные хромопротеиновые хромофоры ендииновых антибиотиков), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, каминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, АДРИАМИЦИН доксорубицин (включая морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезокси-доксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идаруцибин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-ФУ); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства, угнетающие функции надпочечников, такие как миноглютетимид, митотан, трилостан; добавки для восполнения фолиевой кислоты, такие как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамида гликозид; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглюцид; галлия нитрат; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; мейтансиноиды, такие как мейтансин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраерин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK (JHS Natural Products, Юджин, Орегон); разоксан; ризоксин; сизофуран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (напр., токсин Т-2, верракурин А; роридин А и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ара-С»); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, напр., ТАКСОЛ паклитаксел (Bristol-Myers Squibb Oncology, Принстон, Нью-Джерси), АБРАКСАН, не содержащий кремофора альбуминовая нанокомпозиция паклитаксела (American Pharmaceutical Partners, Шаумберг, 111.) и ТАКСОТЕР доксетаксел (Rhone-Poulenc Rorer, Энтони, Франция); хлоранбуцил; ГЕМЗАР гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; НАВЕЛБИН. винорелбин; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; иринотекан (Камптозар, СРТ-11) (включая схему лечения иринотеканом с 5-FU и лейковорином); ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (ДМФО); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; комбретастатин; лейковорин (LV); оксалиплатин, включая схему лечения оксалиплатином (ФОЛФОКС); лапатиниб (Тикерб); ингибиторы PKC-α, Raf, H-Ras, EGFR (напр., эрлотиниб (Тарцева)) и VEGF-A, которые снижают пролиферацию клеток, и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленного. В различных вариантах осуществления введение агентов по такому изобретению в сочетании с лучевой терапией и (или) химиотерапией обеспечивает профилактику или уменьшение метастазирования опухоли предстательной железы в одну или несколько областей местастазирования, описанных в данной заявке.
В каком-либо варианте осуществления способы по такому изобретению используются для лечения пациента, который проходит, или который проходил, или который будет проходить лечение одним или несколькими иммуномодуляторами, например, помимо прочего, агентами, которые модулируют иммунную контрольную точку. В различных вариантах осуществления иммуномодулирующий агент имеет своей целью один или несколько из PD-1, PD-L1 и PD-L2. В различных вариантах осуществления иммуномодулирующий агентом является ингибитор PD-1. В различных вариантах осуществления иммуномодулирующий агент представляет собой антитело, специфическое к одному или нескольким из PD-1, PD-L1 и PD-L2. Например, в некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующий агент представляет собой антитело, такое как, в качестве неограничивающего примера, ниволумаб (ONO-4538/BMS-936558, MDX1106, ОПДИВО, BRISTOL MYERS SQUIBB), пембролизумаб (КЕЙТРУДА, MERCK), пидилизумаб (CT-011, CURE TECH), MK-3475 (MERCK), BMS 936559 (BRISTOL MYERS SQUIBB), MPDL3280A (ROCHE), атезолизумаб (ТЕЦЕНТРИК, ROCHE), и дурвалумаб) (MEDI4736). В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующий агент имеет своей целью один или несколько из CD137 или CD137L. В различных вариантах осуществления иммуномодулирующий агент представляет собой антитело, специфическое к одному или нескольким из CD137 или CD137L. Например, в некоторых вариантах осуществления такой иммуномодулирующий агент представляет собой антитело, такое как, в качестве неограничивающего примера, урелумаб (также известный как BMS-663513 и антитело против 4-1ВВ). В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующим агентом является урелумаб (в необязательном порядке с одним или несколькими из ниволумаба, лирилумаба и урелумаба). В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующий агент представляет собой антитело, имеющее своей целью один или несколько из CTLA-4, АР2М1, CD80, CD86, SHP-2 и PPP2R5A. В различных вариантах осуществления иммуномодулирующий агент представляет собой антитело, специфическое к одному или нескольким из CTLA-4, АР2М1, CD80, CD86, SHP-2 и PPP2R5A. Например, в некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующий агент представляет собой антитело, такое как, в качестве неограничивающего примера, ипилимумаб (MDX-010, MDX-101, Йервой, BMS) и (или) тремелимумаб (Pfizer). В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующим агентом является ипилимумаб (в необязательном порядке с бавитуксимабом). В различных вариантах осуществления иммуномодулирующий агент имеет своей целью CD20. В различных вариантах осуществления иммуномодулирующий агент представляет собой антитело, специфическое к CD20. Например, в некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующий агент представляет собой антитело, такое как, в качестве неограничивающего примера, Офатумумаб (GENMAB), обинутузумаб (ГАЗИВА), AME-133v (APPLIED MOLECULAR EVOLUTION), Окрелизумаб (GENENTECH), TRU-015 (TRUBION/EMERGENT), велтузумаб (IMMU-106).
В различных вариантах осуществления введение агентов по такому изобретению в сочетании с одним или несколькими иммуномодуляторами обеспечивает профилактику или уменьшение метастазирование опухоли предстательной железы в одну или несколько областей местастазирования, описанных в данной заявке. Например, комбинированное лечение иммуномодулирующими агентами, такими как ингибиторы PD-1 или PD-L1 (напр., ОПДИВО, КЕЙТРУДА, ТЕЦЕНТРИК, или дурвалумаб), может обеспечивать профилактику метастазирования в легкие. В другом примере комбинированное лечение иммуномодулирующими агентами, такими как антитела к CTLA-4 (напр., ЙЕРВОЙ), может обеспечивать профилактику метастазирования в мозг.

В некоторых вариантах осуществления способы по такому изобретению используются для лечения пациента, который проходит, или который проходил, или который будет проходить лечение посредством одной или нескольких вакцинаций или другими иммунотерапевтическими способами лечения, включая, помимо прочего, Sipuleucel-T, аутологичную клеточную вакцину, состоящую из активированных антигенпрезентирующих клетки, нагруженных простатической кислой фосфатазой (ПКФ); PROSTVAC-VF, вакцину на основе поксвируса, разработанную для представления простат-специфического антигена (ПСА) и трех иммуностимулирующих молекул; GVAX, вакцину, состоящую из двух клеточных линий рака предстательной железы, разработанную для секреции гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-KCФF); и Ипилимумаб, антитело против цитотоксического антигена-4, ассоциированного с Т-лимфоцитами.

В некоторых вариантах осуществления способы по такому изобретению предлагают более эффективную клеточную вакцину против рака предстательной железы, чем другие виды вакцинации или иммунотерапевтические способы лечения рака предстательной железы, включая, помимо прочего, Sipuleucel-T, ВРХ-101, DCVAC/Pa, PROSTVAC-VF и GVAX.
В различных вариантах осуществления способы по такому изобретению используются для профилактики и (или) лечения рака предстательной железы у пациента, нуждающегося в этом. В различных вариантах осуществления пациент подвержен риску рака предстательной железы. В каком-либо варианте осуществления в семейном анамнезе пациента может иметься рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления пациент может иметь генетические нарушения, которые предрасполагают к развитию рака предстательной железы. Например, у пациента могут быть мутации в BRCA1 и (или) BRCA2. В некоторых вариантах осуществления пациент страдает ожирением.
В различных вариантах осуществления способы по такому изобретению предоставляются в качестве альтернативных способов лечения пациентам, которые хотят избежать побочных эффектов, связанных с традиционным лечением рака предстательной железы, таким как облучение, химиотерапия или хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах осуществления способы по такому изобретению могут использоваться пациентами, чтобы избежать побочных эффектов, включая, помимо прочего, недержание мочи, импотенцию и потерю репродуктивной способности.
Наборы
Данное изобретение также предоставляет наборы для введения любого агента (напр., аденовирусного вектора или клетки, трансдуцированной аденовирусным вектором), как описано в данной заявке. Набор представляет собой совокупность материалов или компонентов, включая по меньшей мере одну из фармацевтических композиций по такому изобретению, описанных в данной заявке. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления набор содержит по меньшей мере одну из фармацевтических композиций, описанных в данной заявке.
Точная природа компонентов, включаемых в набор, зависит от предназначения набора. В каком-либо варианте осуществления набор составляется с целью лечения людей.
В набор может включаться инструкция по применению. Инструкция по применению обычно включает в себя осязаемое выражение, описывающее методику, которая будет применяться при использовании компонентов набора для достижения желаемого результата, такого как лечение рака предстательной железы. В необязательном порядке набор также содержит другие полезные компоненты, такие как разбавители, буферы, фармацевтически приемлемые носители, шприцы, катетеры, аппликаторы, инструменты для пипетирования или измерения, перевязочные материалы или другие полезные принадлежности, что будет легко распознать специалистам данной области.
Материалы и компоненты, собранные в наборе, могут быть предоставлены практикующему врачу и могут при этом хранится любым удобным и подходящим способом, который сохранит их действенность и полезность. Например, компоненты могут предоставляться при комнатной температуре, охлажденными или замороженными. Компоненты обычно заключаются в подходящие упаковочные материалы. В различных вариантах осуществления упаковочный материал изготавливают хорошо известными способами, предпочтительно для обеспечения стерильной, свободной от загрязнений среды. Упаковочный материал может иметь внешнюю этикетку, на которой указан состав и (или) назначение набора и (или) его компонентов.
Определения
Используемые в данной заявке местоимения «какой-либо», «такой» в разных грамматических формах могут означать один или более чем один.
Кроме того, термин «около» при использовании в сочетании с каким-либо ссылочным числовым показателем означает такой ссылочный числовой показатель плюс или минус до 10% от указанного ссылочного числового показателя. Например, фраза «около 50» охватывает диапазон от 45 до 55.
Термин «эффективное количество» в разных грамматических формах, при его использовании в медицинских целях, представляет собой какое-либо количество, которое эффективно для обеспечения измеримого лечения, профилактики или снижения скорости патогенеза рассматриваемого заболевания.
В контексте данной заявки что-либо «уменьшается», если какой-либо показатель активности и (или) эффект снижается на значительную величину, например, на не менее чем около 10%, не менее чем около 20%, не мене чем около 30%, не менее чем около 40%, не менее чем около 50%, не менее чем около 60%, не менее чем около 70%, не менее чем около 80%, не менее чем около 90%, не менее чем около 95%, не менее чем около 97%, не менее чем около 98% или более чем, вплоть до и включая не менее чем около 100%, в присутствии агента или стимула относительно отсутствия такой модуляции. Как будет понятно специалисту в данной области техники, в некоторых вариантах осуществления активность снижается, и некоторые показания на последующих стадиях уменьшаются, но другие могут увеличиваться.
И наоборот, активность «увеличивается», если какой-либо показатель активности и (или) эффект увеличивается на значительную величину, например, на не менее чем около 10%, не менее чем около 20%, не мене чем около 30%, не менее чем около 40%, не менее чем около 50%, не менее чем около 60%, не менее чем около 70%, не менее чем около 80%, не менее чем около 90%, не менее чем около 95%, не менее чем около 97%, не менее чем около 98% или более чем, вплоть до и включая не менее чем около 100% или более, не менее чем в около 2 раза, не менее чем в около 3 раза, не менее чем в около 4 раза, не менее чем в около 5 раз, не менее чем в около 6 раз, не менее чем в около 7 раз, не менее чем в около 8 раз, не менее чем в около 9 раз, не менее чем в около 10 раз, не менее чем в около 50 раз, не менее чем в около 100 раз, в присутствии агента или стимула относительно отсутствия агента или стимула.
Как указано в данной заявке, все процентные содержания композиции приведены по массе всей композиции, если не указано иное. Как используется в данной заявке, слово «включать» и его варианты не имеют ограничительного характера, таким образом что перечисление элементов в каком-либо списке не исключает других подобных элементов, которые также могут быть полезны в композициях и способах по этой технологии. Аналогично, термин «может» и его варианты не имеют ограничительного характера, таким образом что изложение того, что какой-либо вариант осуществления может включать в себя определенные элементы или признаки, не исключает другие варианты осуществления настоящей технологии, не содержащие таких элементов или признаков.
Хотя открытый термин «включающий в себя» в различных грамматических формах в качестве синонима таких терминов, как включающий, содержащий или имеющий (обладающий), используется в данной заявке для описания и формулирования такого изобретения, настоящее изобретение или его варианты осуществления могут альтернативно быть описаны с использованием альтернативных терминов, таких как «состоящий из» или «состоящий по существу из».
Используемые в данной заявке слова «предпочтительный» в разных грамматических формах и «предпочтительно» относятся к вариантам осуществления такой технологии, которые обеспечивают определенные преимущества при определенных обстоятельствах. Однако другие варианты осуществления также могут быть предпочтительными при тех же или других обстоятельствах. Кроме того, изложение одного или нескольких предпочтительных вариантов осуществления не подразумевает, что другие варианты осуществления не являются полезными, и не имеет своей целью исключение из объема технологии других вариантов осуществления.
Количество описанных в данной заявке композиций, необходимое для достижения терапевтического эффекта, может быть определено эмпирически в соответствии с общепринятыми методиками для конкретной цели. Как правило, для терапевтических агентов для введения в терапевтических целях указывается фармакологически эффективная доза. «Фармакологически эффективное количество», «фармакологически эффективная доза», «терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество» относится к какому-либо количеству, достаточному для достижения желаемого физиологического эффекта, или количеству, способному достичь желаемого результата, в частности для лечения определенного расстройства или заболевания. В контексте данной заявки эффективное количество будет включать в себя количество, достаточное, например, для того, чтобы задерживать развитие симптома определенного расстройства или заболевания, изменять течение симптома такого расстройства или заболевания (напр., замедлять прогрессирование симптома такого заболевания), уменьшать или устранять один или несколько симптомов или проявлений такого расстройства или заболевания и купировать симптом расстройства или заболевания. Терапевтическое действие также включает в себя остановку или замедление прогрессирования основного заболевания или расстройства, независимо от того, достигнуто ли улучшение.
Эффективные количества, токсичность и терапевтическая эффективность могут быть определены по стандартным фармацевтическим методикам на клеточных культурах или экспериментальных животных, напр., для определения LD50 (доза, смертельная для около 50% популяции) и ED50 (доза, терапевтически эффективная в около 50% популяции). Дозировка может варьироваться, в зависимости от используемой лекарственной формы и используемого пути введения. Соотношение доз между токсическим и терапевтическим эффектами является терапевтическим индексом и может быть выражено как соотношение LD50/ED50. В некоторых вариантах осуществления предпочтительными являются композиции и способы, которые проявляют большие терапевтические индексы. Терапевтически эффективная доза может быть первоначально оценена из анализов in vitro, включая, например, анализы клеточных культур. Кроме того, доза может быть сформулирована в моделях на животных для достижения какого-либо диапазона концентрации в циркулирующей плазме, который включает в себя IC50, как определено на культуре клеток или на подходящей модели у животных. Уровни описанных композиций в плазме можно измерять, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Эффекты любой конкретной дозировки можно контролировать с помощью подходящего биоанализа. Дозировка может быть определена врачом и, при необходимости, скорректирована для соответствия наблюдаемым эффектам такого лечения.
В некоторых вариантах осуществления эффект будет приводить к количественному изменению, составляющему не менее чем около 10%, не менее чем около 20%, не менее чем около 30%, не менее чем около 50%, не менее чем около 70% или не менее чем около 90%. В некоторых вариантах осуществления эффект будет приводить к количественному изменению, составляющему около 10%, около 20%, около 30%, около 50%, около 70% или даже около 90% или более. Терапевтическое действие также включает в себя остановку или замедление прогрессирования основного заболевания или расстройства, независимо от того, достигнуто ли улучшение.
В контексте данной заявки «методы лечения» в равной степени применимы к использованию композиции для лечения заболеваний или расстройств, описанных в данной заявке, и (или) композиций для использования и (или) использований при производстве лекарственных средств для лечения заболеваний или расстройств, описанных в данной заявке. Данное изобретение дополнительно иллюстрируется следующими неограничивающими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Синтез бицистронного экспрессионного вектора TLR5/флагеллина и лечение опухолевых клеток
Векторные конструкции были созданы для экспрессии толл-подобного рецептора 5 (TLR-5) и флагеллина CBLB502, как описано в Патенте №9,205,095 и WO 2015/080631, США, полное содержание которых включено в данную заявку посредством ссылки. В частности, Mobilan М-0 представлял собой нереплицирующийся аденовирус, несущий бицистронную экспрессионную кассету, которая направляет конститутивную экспрессию полноразмерного TLR5 человека из промотора CMV, и секретируемую версию энтолимод-агониста TLR5 на основе флагеллина (CBLB502s) из промотора EF1 (фиг. 1а). Вестерн-блоттинг подтвердил продуцирование белков hTLR5 и CBLB502 М-0-инфицированными TLR5-негативными клетками MOSEC рака яичника мыши. Однако CBLB502s, продуцируемый в этих клетках, имел более заметный размер на блотах, чем ожидалось, и его удельная активность (отношение количества CBLB502s, измеренного с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, и его NF-κВ-активирующей способность в репортерных клетках HEK293-NF-κВ-lacZ) составила только ~1% от наблюдаемой для CBLB502, продуцируемого в Е. coli. Наличие четырех прогнозируемых мест гликозилирования в аминокислотной последовательности CBLB502 позволяет предположить, что CBLB502s, продуцируемый в клетках млекопитающих, может быть неактивным по причине гликозилирования. Действительно, обработка лизатов М-0-инфицированных клеток MOSEC дегликозилирующими ферментами приводила к сдвигу подвижности CBLB502s до ожидаемого размера. Соответственно, «негликозилированная» мутантная версия CBLB502 (CBLB502NQ), содержащая замены аргинина на глутамин во всех четырех прогнозируемых местах гликозилирования, продуцировалась в E.coli, и было обнаружено, что она обладает сходной специфической активностью в репортерных клетках HEK293-NF-κВ-lacZ, по сравнению с CBLB502. На основании этих результатов была создана новая бицистронная аденовирусная конструкция (названная Mobilan M-VM3) для направления экспрессии CBLB502NQ из промотора UbiC вместе с hTLR5, контролируемым промотором CMV (фиг. 1b).
Пример 2. Профилактическая противоопухолевая активность аденовирусного коэкспрессируюшего TLR5 и негликозилированного секретируемого варианта Флагеллина
Цель этого исследования заключалась в том, чтобы определить профилактическую эффективность противоопухолевой вакцинации облученными М-VM3-инфицированными клетками опухоли предстательной железы. Как описано в другом месте, M-VM3 представлял собой аденовирус, кодирующий TLR5, и негликозилированный секретируемый вариант флагеллина. Исследование проводилось с использованием линии клеток TRAMP-C2 опухоли предстательной железы мыши, которая может расти in vitro, а также подкожной опухоли у изогенных мышей C57BL/6. Такая изогенная модель позволила оценить М-VM3-индуцированные противоопухолевые ответы у иммунокомпетентных мышей.
Протокол эксперимента
Сорок самцов мышей C57BL/6 (в возрасте 8 недель) были приобретены у компании Taconic, Inc. (Джермантаун, штат Нью-Йорк, США). Мышей содержали в количестве ≤5 особей на клетку. Идентификация животных в каждой клетке проводилась путем перфорации уха. Мышей случайным образом распределяли по определенным группам лечения. Животным давали доступный на рынке корм для грызунов (5% простерилизованный корм для мышей и крыс 7012 Teklad LM-485, Harlan) и стерильную питьевую воду. Мышам предоставлялась подстилка из зерновых культур. На протяжении всего периода исследования все животные содержались в помещении с ограниченным доступом и с регулируемыми условиями при температуре 18-26°С, влажности воздуха 30-70%, 12-часовом светотемновом цикле (свет включался в 6:00 и выключался в 18:00). Животных акклиматизировали в таких условиях содержания как минимум за 3-5 дней до начала эксперимента.
-8
Была использована клеточная линия опухоли предстательной железы мыши TRAMP-C2 (клон, происходящий из спонтанной опухоли TRAMP). Клетки TRAMP-C2 выращивали на среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 100 мг/мл стрептомицина, 100 МЕ/мл пенициллина, 5 мкг/мл инсулина и 10 М дигидротестостерона.
12
12
Аденовирус M-VM3 является таким, как описано ранее. Концентрация материала аденовируса М-VM3 составляла 1,1×10 вирусных частиц/мл, и он хранился при температуре -80°С. В качестве контроля использовался аденовирус Ad-mCherry. В частности, это был аденовирус, экспрессирующий красный флуоресцентный белок (mCherry) под контролем промотора CMV. Концентрация материала аденовируса Ad-mCherry составляла 1×10 вирусных частиц/мл, и он хранился при температуре -80°С.
5
12
10
12
10
Была создана клеточная вакцина, включая летально облученные (доза 50 Гр) клетки TRAMP-C2, которые были инфицированы M-VM3. В частности, 70% конфлюэнтных клеток TRAMP-C2 было инфицировано M-VM3 (множественность заражения = 1,2×10) и облучено гамма-лучами в дозе 50 Гр через 48 часов после инфицирования. Для инфицирования клеток TRAMP-C2 материал вируса M-VM3 (в концентрации 1,1×10 вирусных частиц/мл) разбавляли аденовирусным буфером (20 мМ трис-HCl, 25 мМ NaCl, 2,5% глицерин) до конечной концентрации 2×10вирусных частиц/мл. Материал контрольного вируса Ad-mCherry (в концентрации 1×10вирусных частиц/мл) разбавляли в 50 раз аденовирусным буфером до конечной концентрации 2×10 вирусных частиц/мл.
5
5
Мышей вакцинировали следующим образом: мышей C57BL/6 (n=10 на группу) вакцинировали подкожно (п/к) М-VM3-инфицированными (множественность заражения = 1,2×10) клетками TRAMP-C2, облучаемыми через 48 часов после инфицирования вирусом. В качестве контроля использовали аналогично приготовленные клетки TRAMP-C2, которые были либо инфицированы Ad-mCherry (множественность заражения = 1,2×10), либо не были инфицированы. Четвертая группа мышей вакцинирована не была. Мышей вакцинировали, используя первично-бустерную стратегию (в дни 0, 14, 21).
7
7
Вакцинированных мышей впоследствии провоцировали неинфицированными клетками опухоли предстательной железы TRAMP-C2. Непосредственно перед инокуляцией неинфицированные клетки опухоли предстательной железы TRAMP-C2 (80% конфлюэнтных культур) извлекали из планшетов трипсинизацией, центрифугировали и один раз промывали в фосфатно-солевом буферном растворе. Клетки TRAMP-C2 ресуспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе в концентрации 5×10 клеток/мл. Мышей анестезировали изофлураном и выполняли одну п/к инъекцию 200 мкл клеточной суспензии (обеспечивающей доставку 1×10 клеток/мышь) в правую часть живота (выбритый участок) через 14 дней после последней вакцинации (то есть в день исследования 35).
3
Определяли и сравнивали между всеми группами лечения процент мышей, у которых не развились опухоли (мыши без опухолей) после провокации опухолью (38 дней). Рост подкожной опухоли контролировали до тех пор, пока не наступила смерть мыши или опухоли не достигли конечного размера, требующего эвтаназии (2000 мм). План такого исследования представлен ниже в таблице 1.
3
Животных ежедневно контролировали на предмет выживаемости и признаков заболеваемости. Рост опухоли контролировали путем измерения опухоли два раза в неделю. Опухоли измеряли цифровым штангенциркулем в двух измерениях (перпендикулярно друг другу), и полученные результаты измерения использовали для расчета объема опухоли в предположении, что опухолевое образование имеет форму удлиненного эллипсоида. Конечная точка размера опухоли была установлена на уровне 2000 мм. Животных умерщвляли, когда опухоли достигали размера конечной точки.
2
Мышей, выживших до конца исследования, усыпляли CO с последующей цервикальной дислокацией. Такое исследование было прекращено в день 38 после провокации опухолью. Кроме того, мышей подвергали эвтаназии тем же способом, когда их опухоль достигала конечной точки размера или если наблюдались значительные признаки заболеваемости.
Средний объем опухоли сравнивали между исследовательскими группами с использованием t-критерия Стьюдента (двухвыборочный, непарный с неодинаковой дисперсией) в среде Microsoft Excel 2010. р-значения ≤0,05 считались статистически значимыми.
Результаты эксперимента
Данные о росте опухоли после иммунизации и провокации опухолью (38 дней) представлены в таблице 2 ниже. Также см. фиг. 2.
5
6
Вакцинация мышей М-VM3-инфицированными (множественность заражения = 1,2×10) клетками (1×10) с использованием первично-бустерной стратегии (в дни 0, 14, 21) оказала благоприятное противоопухолевое действие на рост опухоли предстательной железы, по сравнению с группой мышей, которые были не вакцинированы, вакцинированы неинфицированными клетками или вакцинированы клетками, инфицированными контрольным вирусом Ad-mCherry. Это было продемонстрировано более низким процентом мышей, у которых развился п/к опухоли через 38 дней, из группы, иммунизированной М-VM3-инфицированными клетками. Как показано на фиг. 1, процент мышей без опухолей был значительно выше среды иммунизированных М-VM3-инфицированными клетками (70%), по сравнению с группами мышей, которые были невакцинированы (10%), вакцинированы неинфицированными клетками или вакцинированы Ad-mCherry-инфицированными клетками (30%). Этот эффект был статистически значимым (Р=0,02 для различия между группой мышей, иммунизированных М-VM3 и неинфицированными клетками в соответствии с точным критерием Фишера).
В целом эти данные указывают, что клеточная вакцинация с использованием M-VM3-инфицированных клеток эффективно предотвращает развитие опухоли.
Пример 3. Противометастатическая активность аденовирусного коэкспрессируюшего TLR5 и негликозилированного секретируемого варианта флагеллина
Цель этого исследования заключалась в том, чтобы протестировать M-VM3 на противометастатическую активность на модели опухоли предстательной железы TRAMP-C2, в которой смертность животных была связана с образованием метастазов опухоли после хирургического удаления подкожно растущих опухолей. Клетки TRAMP-C2 могут расти как подкожная опухоль у изогенных мышей C57BL/6, что позволило оценить M-VM3-индуцированный противометастатический эффект у иммунокомпетентных мышей.
Протокол эксперимента
Использовали модель опухоли предстательной железы изогенных мышей TRAMP-C2, которая включала в себя клетки рака предстательной железы TRAMP-C2, растущие у самцов мышей C57BL/6 (30 мышей).
В частности, тридцать самцов мышей C57BL/6 (в возрасте 8 недель) были приобретены у компании Taconic, Inc. (Джермантаун, штат Нью-Йорк, США). Мышей содержали в количестве ≤5 особей на клетку. Идентификация животных в каждой клетке проводилась путем перфорации уха. Мышей случайным образом распределяли по определенным группам лечения. Животным давали доступный на рынке корм для грызунов (5% простерилизованный корм для мышей и крыс 7012 Teklad LM-485, Harlan) и стерильную питьевую воду. Мышам предоставлялась подстилка из зерновых культур. На протяжении всего периода исследования все животные содержались в помещении с ограниченным доступом и с регулируемыми условиями при температуре 18-26°С, влажности воздуха 30-70%, 12-часовом светотемновом цикле (свет включался в 6:00 и выключался в 18:00). Животных акклиматизировали в таких условиях содержания как минимум за 3-5 дней до начала эксперимента.
7
7
7
Непосредственно перед инокуляцией клетки опухоли TRAMP-C2 (80% конфлюэнтных культур) извлекали из планшетов трипсинизацией, центрифугировали и один раз промывали в фосфатно-солевом буферном растворе. Клетки ресуспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе в концентрации 5×10 клеток/мл. Опухолевые клетки (1×10 клеток/мышь) вводили мышам C57BL/6 п/к в бок с целью индуцирования подкожных опухолей. В частности, мышей анестезировали изофлураном и выполняли одну п/к инъекцию 200 мкл клеточной суспензии (обеспечивающей доставку 1×10 клеток/мышь) в правую часть живота (выбритый участок).
3
8
8
Мышей с опухолями лечили, когда опухоли становились пальпируемыми (объем 100 мм). Это происходило примерно через 4 недели после инокуляции опухолевых клеток. Мыши с опухолью TRAMP-C2 получали контрольный носитель (аденовирусный буфер, группа 1), вирус Ad-mCherry (10 вирусных частиц, группа 2) или M-VM3 (10 вирусных частиц, группа 3). Все виды лечения включали в себя однократную внутриопухолевую инъекцию в центр опухоли. Инъекции осуществляли с использованием иглы 27-го калибра на мышах, анестезированных изофлураном, в асептических условиях с объемом инъекции 50 мкл на опухоль.
Опухоли удаляли хирургическим путем через 7 дней после инъекции. Операция проводилась в асептических условиях в боксе биологической защиты. Во время такой процедуры мышей анестезировали изофлураном. Подкожно вводили бупренорфин в концентрации 0,1 мг/кг (100 мкл) для обезболивания и физиологический раствор (500 мкл) для регидратации. Соответствующий участок выбривали и очищали с помощью бетадина с последующей обработкой 70% изопропиловым спиртом. На коже делали разрез стерильными ножницами. Опухоли удаляли из окружающей кожи и мышц, используя тупое рассечение. Опухоли удаляли и кожу стягивали с помощью зажимов для ран. Мышей держали в тепле и наблюдали за ними, пока они не пробуждались. За мышами наблюдали после операции и ежедневно после нее. Зажимы снимали после заживления кожи через 7-10 дней после операции.
План исследования и описание экспериментальных групп представлены ниже в таблице 3.
3
Животных ежедневно контролировали на предмет выживаемости и признаков заболеваемости. Рост опухоли контролировали путем измерения опухоли два раза в неделю. Опухоли измеряли цифровым штангенциркулем в двух измерениях (перпендикулярно друг другу), и полученные результаты измерения использовали для расчета объема опухоли в предположении, что опухолевое образование имеет форму удлиненного эллипсоида. Конечная точка размера опухоли была установлена на уровне 2000 мм. Животных умерщвляли, когда опухоли достигали размера конечной точки.
2
Мышей, выживших до конца исследования, усыпляли CO с последующей цервикальной дислокацией. Исследование было прекращено в день 150 после хирургического удаления опухолей. Кроме того, мышей подвергали эвтаназии тем же способом, когда их опухоль достигала конечной точки размера (см. раздел 4.4.10) или если наблюдались значительные признаки заболеваемости.
Средний объем опухоли сравнивался между исследуемыми группами с использованием t-критерия Стьюдента в среде Microsoft Excel 2010. р-значения ≤0,05 считались статистически значимыми.
Результаты эксперимента
8
8
Данные о выживаемости для мышей C57BL/6, несущих TRAMP-C2, с опухолями, подвергавшимися лечению разными аденовирусами: Ad-mCherry (1×10 вирусных частиц) или M-VM3 (1×10 вирусных частиц) или носителем (фосфатно-солевой буферный раствор) с последующим хирургическим удалением, представлены в таблице 4 ниже. Также см. фиг. 3.
8
8
Лечение мышей с подкожными опухолями, образованными клеточной линией рака предстательной железы TRAMP-C2, с помощью единичной внутриопухолевой инъекции M-VM3 (1×10 вирусных частиц) увеличивало выживаемость мышей после хирургического удаления опухолей, по сравнению с инъекцией Ad-mCherry (1×10 вирусных частиц) и фосфатно-солевого буферного раствора. В частности, 70% мышей, которые получили внутриопухолевую доставку М-VM3 до удаления опухоли, дожили до конца исследования на день 150. Напротив, только 30% мышей в группе, получавшей фосфатно-солевой буферный раствор, и 50% мышей в группе, получавшей Ad-mCherry, дожили до конца исследования (Р=0,06 для разницы между M-VM3 и контрольной группами мышей на день 150 согласно логранговому критерию).
В целом, эти данные убедительно свидетельствуют, что M-VM3 может эффективно использоваться в качестве лечения для профилактики метастазирования опухоли предстательной железы до хирургического удаления первичных опухолей предстательной железы.
Пример 4. Дополнительная функциональная характеристика аденовирусного коэкспрессирующего TLR5 и негликозилированного секретируемого варианта флагеллина
Дополнительные функциональные характеристики M-VM3 представлены в Приложении А, приведенном ниже. Номера фигур, представленные в Приложении А, не зависят от номеров фигур, представленных в другом месте данной заявки.
ЭКВИВАЛЕНТЫ
Хотя изобретение было описано в связи с его конкретными вариантами осуществления, следует понимать, что оно способно к дальнейшим модификациям, и эта заявка предназначена для охвата любых вариантов, применений или адаптации такого изобретения; в общем, в соответствии с принципами такого изобретения и включая отступления от настоящего раскрытия, которые входят в известную или общепринятую практику в области техники, к которой относится такое изобретение, и которые могут быть применены к существенным признакам, изложенным выше, и следующим образом в объеме прилагаемой формулы изобретения.
Специалисты в данной области техники распознают или смогут установить, используя не более чем обычные эксперименты, многочисленные эквиваленты конкретных вариантов осуществления, описанных конкретно в данной заявке. Такие эквиваленты предназначены для включения в объем следующей формулы изобретения.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПУТЕМ ССЫЛКИ
Все патенты и публикации, на которые имеются ссылки в данной заявке, полностью включены в данную заявку посредством ссылки.
Публикации, обсуждаемые в данной заявке, предоставлены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в данной заявке не должно быть истолковано как допущение того, что настоящее изобретение не имеет права предшествовать такой публикации в силу предшествующего изобретения.
Все используемые в настоящем документе заголовки предназначены только для структуризации и не предназначены для ограничения такого раскрытия каким-либо образом. Содержимое любого отдельного раздела может быть в равной степени применимо ко всем разделам.
Ссылки
1. Fernandez-Garcia ЕМ, Vera-Badillo FE, Perez-Valderrama B, Matos-Pita AS, Duran I. Immunotherapy in prostate cancer: review of the current evidence. Clinical & translational oncology : official publication of the Federation of Spanish Oncology Societies and of the National Cancer Institute of Mexico 2014.
2. Kaczanowska S, Joseph AM, Davila E. TLR agonists: our best frenemy in cancer immunotherapy. J Leukoc Biol 93: 847-863.
3. O'Neill LA, Bryant CE, Doyle SL. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev 2009; 61: 177-197.
4. Hennessy EJ, Parker AE, O'Neill LA. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics? Nat Rev Drug Discov 9: 293-307.
5. Eaves-Pyles TD, Wong HR, Odoms K, Pyles RB. Salmonella flagellin-dependent proinflammatory responses are localized to the conserved amino and carboxyl regions of the protein. Journal of immunology 2001; 167: 7009-7016.
6. Mizel SB, Bates JT. Flagellin as an adjuvant: cellular mechanisms and potential. Journal of immunology 185: 5677-5682.
7. Rhee SH. Basic and translational understandings of microbial recognition by toll-like receptors in the intestine. J Neurogastroenterol Motil 17: 28-34.
8. Cuadros C, Lopez-Hernandez FJ, Dominguez AL, McClelland M, Lustgarten J. Flagellin fusion proteins as adjuvants or vaccines induce specific immune responses. Infection and immunity 2004; 72: 2810-2816.
9. Means TK, Hayashi F, Smith KD, Aderem A, Luster AD. The Toll-like receptor 5 stimulus bacterial flagellin induces maturation and chemokine production in human dendritic cells. Journal of immunology 2003; 170: 5165-5175.
10. Garaude J, Kent A, van Rooijen N, Blander JM. Simultaneous targeting of toll- and nod-like receptors induces effective tumor-specific immune responses. Sci Transl Med 4: 120ra116.
11. Rhee SH, Im E, Pothoulakis C. Toll-like receptor 5 engagement modulates tumor development and growth in a mouse xenograft model of human colon cancer. Gastroenterology 2008; 135: 518-528.
12. Sfondrini L, Rossini A, Besusso D, Merlo A, Tagliabue E, Menard S et al. Antitumor activity of the TLR-5 ligand flagellin in mouse models of cancer. Journal of immunology 2006; 176: 6624-6630.
13. Soto LJ, 3rd, Sorenson BS, Kim AS, Feltis BA, Leonard AS, Saltzman DA. Attenuated Salmonella typhimurium prevents the establishment of unresectable hepatic metastases and improves survival in a murine model. J Pediatr Surg 2003; 38: 1075-1079.
14. Cai Z, Sanchez A, Shi Z, Zhang T, Liu M, Zhang D. Activation of Toll-like receptor 5 on breast cancer cells by flagellin suppresses cell proliferation and tumor growth. Cancer research 71: 2466-2475.
15. Burdelya LG, Brackett CM, Kojouharov B, Gitlin, II, Leonova KI, Gleiberman AS et al. Central role of liver in anticancer and radioprotective activities of Toll-like receptor 5 agonist. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110: E1857-1866.
16. Burdelya LG, Gleiberman AS, Toshkov I, Aygun-Sunar S, Bapardekar M, Manderscheid-Kern P et al. Toll-like receptor 5 agonist protects mice from dermatitis and oral mucositis caused by local radiation: implications for head-and-neck cancer radiotherapy. International journal of radiation oncology, biology, physics 2012; 83: 228-234.
17. Tosch C, Geist M, Ledoux C, Ziller-Remi C, Paul S, Erbs P et al. Adenovirus-mediated gene transfer of pathogen-associated molecular patterns for cancer immunotherapy. Cancer gene therapy 2009; 16: 310-319.
18. Faham A, Altin JG. Antigen-containing liposomes engrafted with flagellin-related peptides are effective vaccines that can induce potent antitumor immunity and immunotherapeutic effect. Journal of immunology 2010; 185: 1744-1754.
19 Akira S, Takeda K. Functions of toll-like receptors: lessons from KO mice. С R Biol 2004; 327: 581-589.
20. Carvalho FA, Aitken JD, Gewirtz AT, Vijay-Kumar M. TLR5 activation induces secretory interleukin-1 receptor antagonist (sIL-1Ra) and reduces inflammasome-associated tissue damage. Mucosal Immunol 4: 102-111.
21. Vijay-Kumar M, Carvalho FA, Aitken JD, Fifadara NH, Gewirtz AT. TLR5 or NLRC4 is necessary and sufficient for promotion of humoral immunity by flagellin. Eur J Immunol 40: 3528-3534.
22. Foster BA, Gingrich JR, Kwon ED, Madias C, Greenberg NM. Characterization of prostatic epithelial cell lines derived from transgenic adenocarcinoma of the mouse prostate (TRAMP) model. Cancer research 1997; 57: 3325-3330.
23. Greenberg NM, DeMayo F, Finegold MJ, Medina D, Tilley WD, Aspinall JO et al. Prostate cancer in a transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1995; 92: 3439-3443.
24. Gingrich JR, Greenberg NM. A transgenic mouse prostate cancer model. Toxicologic pathology 1996; 24: 502-504.
25. Gupta S, Ahmad N, Marengo SR, MacLennan GT, Greenberg NM, Mukhtar H. Chemoprevention of prostate carcinogenesis by alpha-difluoromethylornithine in TRAMP mice. Cancer research 2000; 60: 5125-5133.
26. Hurwitz AA, Foster BA, Kwon ED, Truong T, Choi EM, Greenberg NM et al. Combination immunotherapy of primary prostate cancer in a transgenic mouse model using CTLA-4 blockade. Cancer research 2000; 60: 2444-2448.
27. Mentor-Marcel R, Lamartiniere CA, Eltoum IE, Greenberg NM, Elgavish A. Genistein in the diet reduces the incidence of poorly differentiated prostatic adenocarcinoma in transgenic mice (TRAMP). Cancer research 2001; 61: 6777-6782.
28. Michael A, Ball G, Quatan N, Wushishi F, Russell N, Whelan J et al. Delayed disease progression after allogeneic cell vaccination in hormone-resistant prostate cancer and correlation with immunologic variables. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 2005; 11: 4469-4478.
29. Korman AJ, Peggs KS, Allison JP. Checkpoint blockade in cancer immunotherapy. Advances in immunology 2006; 90: 297-339.
30. Bramson JL, Hitt M, Addison CL, Muller WJ, Gauldie J, Graham FL. Direct intratumoral injection of an adenovirus expressing interleukin-12 induces regression and long-lasting immunity that is associated with highly localized expression of interleukin-12. Hum Gene Ther 1996; 7: 1995-2002.
ПРИЛОЖЕНИЕ А
Общая информация
17-19
Благодаря своей безопасности, а также эффективности, агонисты TLR5 являются перспективными противораковыми средствами. В отличие от многих других TLR, передача сигналов TLR5, будучи иммуностимулирующей, не индуцирует определенные сильно выраженные провоспалительные цитокины, которые могут приводить к самоусиливающемуся и потенциально опасному «цитокиновому шторму». Безопасность агонистов TLR5 подтверждается результатами двух клинических исследований, в которых >150 здоровым добровольцам вводили производное флагеллина энтолимод (ранее CBLB502), которое разрабатывает компания Cleveland BioLabs Inc. (CBLI) для защиты тканей и лечения опухолей.
3, 4, 6
8
Противоопухолевая/противометастатическая эффективность агонистов TLR5 коррелирует с уровнем экспрессии TLR5 самой опухолью  или в ткани, в которую метастазирует такая опухоль. Здесь была введена определенная стратегия для увеличения диапазона опухолей, которые можно эффективно лечить с помощью зависимой от агонистов TLR5 иммунотерапии. Был создан конструкт на основе аденовируса (Мобилан M-VM3) для прямой коэкспрессии TLR5 и секретируемый вариант энталимода в расчете на то, что доставка конструкта в опухоль обеспечит активную аутокринную/паракринную активацию TLR5 независимо от естественного статуса экспрессии TLR5 в опухоли. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, полагают, что передача сигналов TLR5 под действием Мобилана в опухоли будет стимулировать врожденные иммунные ответы, способные подавлять рост первичной опухоли, а также обеспечивать долговременную защиту от метастазов и рецидивов опухолей.
20
21
Чтобы проверить этот подход, в качестве мишени был выбран рак предстательной железы после обнаружения, что в большинстве случаев раковые клетки предстательной железы экспрессируют рецептор вируса Коксаки и рецептор аденовируса (CAR), необходимые для эффективного инфицирования векторами на основе аденовируса серотипа 5, такими как M-VM3 (Мобилан). Рак предстательной железы встречается крайне часто, риск диагностирования на протяжении жизни у мужчин, проживающих на территории США, составляет 14%, и он остается второй по значимости причиной смерти от рака в этой демографической группе. Поэтому разработка новых, более эффективных методов лечения рака предстательной железы крайне необходима.
21-26

27, 28
29-36
Хотя другие иммунотерапевтические подходы к лечению рака предстательной железы, включая клеточные вакцины (Sipuleucel-T, ВРХ-101, DCVAC / Pa GVAX), вирусные вакцины (PROSTVAC-VF) и антитела к белкам иммунных контрольных точек (CTLA-4, PD1/PD-L1), показали некоторую эффективность, ни одна из этих стратегий не продлила выживаемость более чем на несколько месяцев.
37-39
40-42
38
Для исследований с конструктом M-VM3 (Мобилан) использовалась хорошо известная модель TRAMP (трансгенная аденокарцинома предстательной железы мышей), которая практически полностью имитирует патогенез заболевания человека и широко применяется для оценки возможных методов лечения. В этой модели экспрессия больших и малых опухолевых антигенов SV40 из простат-специфического промотора пробазина крыс приводит к самопроизвольному развитию эпителиальной гиперплазии в предстательной железе к 8-недельному возрасту и далее к злокачественным аденокарциномам. Инфицирование клеток опухоли предстательной железы TRAMP конструкцией M-VM3 обеспечивало экспрессию как TLR5, так и секретируемого энтолимода - как ожидалось, - и индуцировало активацию NF-κВ in vitro и in vivo. Введение конструкта M-VM3 в опухоли предстательной железы у мышей TRAMP приводило к сильной индукции воспалительных генов, мобилизации в опухоли клеток врожденной иммунной системы и появлению признаков атрофии опухоли. Дальнейшее обоснование применения конструкта M-VM3 (Мобилан) против рака предстательной железы было обеспечено результатами, демонстрирующими, что внутриопухолевое (в/о) введение M-VM3 в п/к опухоли предстательной железы улучшало выживаемость животных после хирургической резекции опухолей (т.е. подавляло метастазирование опухолей) и что вакцинация мышей облученными клетками опухоли предстательной железы, инфицированными M-VM3, защищала мышей от провоцирования опухоли.
Результаты
Получение и характеризация конструктов M-VM3 (Мобилан)
43
Мобилан М-0 представляет собой нереплицирующийся аденовирус, несущий бицистронную экспрессионную кассету, которая направляет конститутивную экспрессию полноразмерного TLR5 человека из промотора CMV и секретируемую версию энтолимод-агониста TLR5 на основе флагеллина (CBLB502s) из промотора EF1 (фиг. 1А(а)). Вестерн-блоттинг подтвердил продуцирование белков hTLR5 и CBLB502 инфицированными М-0, отрицательными по TLR5 клетками MOSEC рака яичника мышей (фиг. 1В). Однако CBLB502s, продуцируемый в этих клетках, имел более заметный размер на 6 лотах, чем ожидалось, и его удельная активность (отношение количества CBLB502, измеренного с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, и его NF-κB-активирующей способности в репортерных клетках HEK293-NF-κВ-lacZ) составила только ~1% от наблюдаемой для CBLB502, продуцируемого в Е. coli. Наличие четырех прогнозируемых мест гликозилирования в такой аминокислотной последовательности CBLB502 позволяет предположить, что CBLB502, продуцируемый в клетках млекопитающих, может быть неактивным по причине гликозилирования. Действительно, обработка лизатов М-0-инфицированных клеток MOSEC дегликозилирующими ферментами приводила к сдвигу подвижности CBLB502 до ожидаемого размера (фиг. 1В(b)). «Негликозилированная» мутантная версия CBLB502 (CBLB502NQ), содержащая замены аргинина на глутамин во всех четырех прогнозируемых местах гликозилирования, продуцировалась в E.coli, и было обнаружено, что она обладает сходной специфической активностью в репортерных клетках HEK293-NF-κВ-lacZ, по сравнению с CBLB502 (фиг. 1С). На основании этих результатов была создан новый бицистронный аденовирусный конструкт (названный Мобилан M-VM3) для направления экспрессии CBLB502NQ из промотора UbiC вместе с hTLR5, контролируемым промотором CMV (фиг. 1А(b)). Удельная активность CBLB502NQ, продуцируемых в клетках MOSEC, инфицированных M-VM3, была несколько ниже, чем у CBLB502, продуцируемых E.coli (фиг. 1Е); по всей вероятности, это связано с частичным разрушением CBLB502NQ в момент экспрессии (фиг. 1D).
37
Обеспечение полностью функциональной аутокринной/паракринной передачи сигналов TLR5 с помощью конструкта M-VM3 было продемонстрировано в отрицательных по TLR5 клетках MOSEC (невосприимчивых к энтолимоду, фиг. S2, А-С) при выполнении ядерной транслокации субъединицы р65 NF-κВ в качестве индикатора ее активации (фиг. 2, А-В). Инфицирование вирусным конструктом M-VM3 также приводило к ядерной локализации р65 в культурах гепатоцитов мышей TLR5KO (фиг. S2, D-I). Наконец, поскольку это исследование фокусировалось на раке предстательной железы (см. ниже), функциональность M-VM3 была протестирована на клеточной линии рака предстательной железы TRAMP-C2, полученной из первичной опухоли предстательной железы мышей TRAMP. Клетки TRAMP-C2 стабильно трансфицировали конструктом репортера NF-κВ, а затем инфицировали M-VM3 или контрольным аденовирусом, который направляет экспрессию красного флуоресцентного белка, управляемого промотором CMV (Ad-mCherry). Дозозависимая активация NF-κВ наблюдалась в клетках TRAMP-C2, инфицированных M-VM3 (фиг. 2С).
Одним из потенциальных ограничений для клинического использования агонистов TLR5 является наличие чрезмерно высокого уровня флагеллин-специфичных нейтрализующих антител у ~10% людей (CBLI, неопубликовано), вероятно, из-за экспозиции флагеллированных энтеробактерий кишечной микрофлоры. Однако было установлено, что флагеллин-специфичные нейтрализующие антитела не оказывали значительного влияния на MLVM3-управляемую передачу сигналов TLR5 в репортерных клетках MOSEC-NF-κВ-зависимой люциферазы (фиг. 1F) даже при уровне антител, в 10 раз превышающим значение, необходимое для нейтрализации CBLB502NQ, добавляемых в среду с положительными по TLR5 репортерными клетками HEK293-NF-κВ-lacZ (фиг. S1). Не желая ограничиваться какой-либо теорией, полагают, что TLR5 взаимодействует в инфицированных M-VM3 клетках с CBLB502NQ во время совместной секреции, и комплекс либо не доступен, либо не может быть разрушен нейтрализующими антителами. Устойчивость М-VM3-индуцированной передачи сигналов TLR5 к нейтрализующим антителам позволила бы использовать его в лечении более широкой группы людей по сравнению с энтолимодом.
Выбор типа опухоли для лечения конструктом M-VM3 (Мобилан)
Для эффективного инфицирования клеток 5 серотипом аденовируса и его производными, такими как M-VM3, необходима мембранная экспрессия рецептора вируса Коксаки и аденовируса (CAR). Чтобы определить типы опухолей, потенциально поддающихся лечению конструктом M-VM3, микромассивы тканей человека (ТМА), полученные из базисной патологической системы Онкологического института Розуэлла Парка (RPCI), окрашивали антителами к CAR. При первоначальном окрашивании ТМА, включающего 252 образца (фиг. S3) и представляющего 23 различных типа опухолей и 12 различных здоровых тканей, типы опухолей разделяли на три категории: (i) низкая экспрессия CAR (опухоли кроветворной системы, мягких тканей, кожи, головы и шеи, головного мозга, шейки матки, молочной железы и пищевода); (ii) высокая экспрессия CAR (рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, тонкой кишки, щитовидной железы, яичек и толстой кишки); и (iii) средняя экспрессия CAR (опухоли легких, яичников, желудка, почек, печени, эндокринной системы, мезотелиомы и меланомы). Последующее окрашивание антителами к CAR массива ТМА, состоящего из 134 образцов опухоли предстательной железы, 134 образцов здоровой предстательной железы и 68 образцов других здоровых тканей, продемонстрировало, что 121 (90%) опухоль предстательной железы (а также здоровые ткани предстательной железы) были положительными по CAR (фиг. 3А). Это позволяет предполагать, что лечение конструктом M-VM3 может быть эффективным у подавляющего большинства пациентов с раком предстательной железы. Сильная экспрессия CAR также обнаруживалась в клетках рака предстательной железы мышей TRAMP-C2 (фиг. 3В).
8
Чтобы подтвердить, что клетки опухолей предстательной железы могут быть эффективно инфицированы аденовирусами, Ad-mCherry (5×10 в. ч./опухоль) вводили непосредственно в опухоли предстательной железы мышей TRAMP (фиг. 3С) и в полученные хирургическим путем образцы опухолей предстательной железы человека (фиг. 3D). В обоих случаях экспрессия mCherry наблюдалась в положительных по CAR эпителиальных клетках через 24 часа после инфицирования. Эти данные подтверждают вероятность эффективного инфицирования конструктом M-VM3 опухолей предстательной железы in vivo.
Конструкт M-VM3 (Мобилан) индуцирует длительную активацию NF-κВ
Для изучения функциональности конструкта M-VM3 в интактном животном измеряли экспрессию люциферазы в лизатах печени, кишечника и предстательной железы, полученных от мышей-репортеров Balb/C-Tg(IκBα-luc)Xen, через 48 часов после внутривенного (в/в) или внутрипростатного введения M-VM3 (фиг. 4А). В/в введение М-VM3 приводило к сильной активации NF-κВ в печени, меньшей активации в кишечнике и отсутствию существенной активации в предстательной железе. Напротив, внутрипростатное введение M-VM3 вызывало существенную активацию NF-κВ в ткани предстательной железы, некоторую активацию в кишечнике и отсутствие существенной активации в печени. Биолюминесцентная интраскопия всего тела у этих мышей через 3, 24 и 48 часов после внутрипростатных введений демонстрировала, что энтолимод индуцировал быструю активацию NF-κВ в области печени (через 3 часа), которая ослаблялась к 24 часам. Напротив, M-VM3 медленно активировала NF-κВ в нижней части живота (через 24 часа), и это продолжалось до 48 часов.
Продолжительная активация NF-κВ посредством M-VM3 была также продемонстрирована в культурах гепатоцитов мышей, несущих репортер NF-κВ-зависимой люциферазы, с использованием LumiCycle (фиг. 4С). Обработка гепатоцитов CBLB502 in vitro приводила к быстрой, но кратковременной активации NF-κВ. Напротив, активация NF-κВ в ответ на M-VM3 была отсроченной, но более стойкой. Эти наблюдения, указывающие, что конструкт M-VM3 способен обеспечивать непрерывную передачу сигналов TLR5 в ткани предстательной железы и что его доставка путем внутрипростатного введения в значительной степени ограничивает активацию NF-κВ локальной областью предстательной железы, подтверждают возможность использования конструкта M-VM3 для лечения рака предстательной железы.
Внутрипростатное введение M-VM3 мышам TRAMP приводит к снижению массы предстательной железы и мобилизации иммунных клеток в предстательную железу
Способность M-VM3 подавлять прогрессирование опухоли предстательной железы в модели TRAMP была проверена внутрипростатным введением M-VM3, Ad-mCherry или PBS мышам 12-недельного возраста. Через шесть недель мышей оценивали на наличие опухолей предстательной железы и измеряли вес каждой доли предстательной железы (передней, дорсальной, вентральной и латеральной) в качестве меры опухолевой нагрузки в доле. Кроме того, окрашенные г/э срезы соответствующих долей предстательной железы оценивали на предмет морфологических изменений. Средний вес вентральных долей (место введения) был значительно ниже у мышей, получавших M-VM3, по сравнению с контрольными Ad-mCherry и PBS (фиг. 5В). Вес других долей существенно не различался между группами. Эти результаты изначально продемонстрировали противоопухолевую эффективность M-VM3 у мышей TRAMP.
Гистологическое исследование показало, что лишь предстательные железы от мышей, которым вводили M-VM3 (фиг. 5А, В), но не от мышей, получавших PBS или Ad-mCherry (не показаны), содержали единичные железы или группы желез с признаками атрофии и дегенерации. Это было особенно заметно в вентральных долях (место введения), где железы имели вид аморфной эозинофильной массы с ядрами с признаками кариорексиса и кариолизиса. Кроме того, повышенное количество мононуклеарных (лимфоидных макрофагальных) клеток наблюдалось в интерстиции предстательной железы у 12 из 15 мышей, получавших M-VM3 (фиг. 5С), но в меньшей степени у животных, получавших Ad-mCherry (6 из 15), и не наблюдалось у мышей, получавших PBS (0 из 14).
Эти результаты предполагают, среди прочего, что индуцированное M-VM3 скопление мононуклеарных/лимфоидных клеток в интерстиции предстательной железы может участвовать в противоопухолевых иммунных ответах, способных подавлять рост и прогрессирование опухоли в модели TRAMP.
Введение конструкта M-VM3 в опухоль предстательной железы индуцирует экспрессию генов, участвующих в иммунных ответах
44
Для выявления изменений в экспрессии генов, лежащих в основе наблюдаемой мобилизации иммунных клеток в опухоль предстательной железы после введения конструкта M-VM3, проводили сравнение глобальных профилей экспрессии генов опухолей предстательной железы мышей TRAMP через 24 и 48 часов после однократной внутриопухолевой (в/о) инъекции M-VM3, Ad-mCherry или носителя. Для этого использовали полногеномные микромассивы Illumina. Через 24 часа после введения М-VM3 индуцировала 17 генов сильнее, чем Ad-mCherry (дополнительная таблица 1). С учетом известных механизмов активации передачи сигналов TLR5 энтолимодом, этот список включает несколько генов-мишеней NF-κВ, таких как CXCL1, IL1B и S100A9. Через 48 часов наблюдалось увеличение числа генов, специфически активированных М-VM3 по сравнению с Ad-mCherry (57 генов, дополнительная таблица 2). Этот перечень включает ряд генов, кодирующих цитокины/хемокины (IL1B, CCL7 и 9, CXCL9, 13 и 17), которые могут играть роль в мобилизации иммунных клеток в опухоль. Другими известными специфическими, индуцированными M-VM3 генами являются некоторые с их известной ролью в регуляции ответов NF-κВ (например, IKBKE и NFKBIZ) или противовирусной активности (например, NLRC5 и OASL1). Только четыре гена, индуцированные через 24 часа, оставались индуцированными через 48 часов (NLRC5, CLEC4A1, IL1B и S100A9). В частности, индуцированный M-VM3 ген NLRC5 может вносить вклад в противоопухолевый иммунный ответ и предотвращать ускользание опухоли от иммунной системы путем активации экспрессии молекул ГКТС класса I и компонентов антиген-процессирующего механизма.
Внутриопухолевая доставка M-VM3 стимулирует врожденный иммунный ответ
6, 8-10
Чтобы охарактеризовать инфильтрацию иммунных клеток в опухоли предстательной железы TRAMP в ответ на введение M-VM3, мышам TRAMP с пальпируемыми опухолями предстательной железы выполняли в/о инъекцию PBS, Ad-mCherry или М-VM3, и образцы опухолей предстательной железы и дренирующих опухоль лимфатических узлов (TDLN) получали через 2 или 7 дней. Поскольку активация TLR5 стимулирует рекрутинг нейтрофилов, NK-клеток и Т-клеток в печень , по результатам анализа FACS характеризовали сходные профили иммунных клеток в опухолях предстательной железы TRAMP. Существенный рекрутинг нейтрофилов к предстательной железе наблюдался на 2-й день после в/о введения M-VM3 или, в меньшей степени, после введения Ad-mCherry (фиг. 6А). Хотя M-VM3, по-видимому, стимулирует более сильный рекрутинг нейтрофилов, чем Ad-mCherry, эта разница не достигла статистической значимости (Р=0,22). NK-клетки также реагировали на M-VM3, но не на Ad-mCherry, и их кинетика отличалась от таковой у нейтрофилов и зависела от идентичности вируса (фиг. 6В). М-VM3-специфическая индукция NK-клеток не наблюдалась вплоть до 7-го дня после в/о введения.
+
+
+
+
+
Затем был охарактеризован приобретенный иммунный ответ, который включал Т-клетки CD8 и CD4. Уровни Т-клеток CD8 в опухолях TRAMP не изменялись на 7-й день после в/о введения ни Ad-mCherry, ни M-VM3 (фиг. 6С). Подобно ответу Т-клеток CD8, полноценные Т-клетки CD4, у которых отсутствовала экспрессия FoxP3 и, следовательно, не Treg, не демонстрировали статистической разницы на 7-й день после в/о введения. Наконец, было охарактеризовано влияние вводимого в/о вируса на иммуносупрессивные Treg в опухолях TRAMP и TDLN на 7-й день после введения. Ни один вирус существенно не влиял на уровни Treg в опухолях TRAMP (фиг. 6Е) и TDLN (фиг. 6F). Вместе эти результаты показывают, что в/о введение аденовируса (M-VM3 или Ad-mCherry) мышам TRAMP приводит к рекрутингу компонентов врожденного иммунитета к предстательной железе, не оказывая влияния на иммуносупрессивные Treg. Основным M-VM3-специфическим ответом был рекрутинг NK-клеток к предстательной железе и, в меньшей степени, рекрутинг нейтрофилов.
Конструкт М-ВМ3 обладает противометастатической активностью
45
3
Противометастатическая активность M-VM3 была протестирована на модели, в которой после резекции первичной опухоли происходит метастатическое разрастание рака предстательной железы TRAMP-C2. Мышам с п/к опухолями TRAMP-С2 (~100 мм) вводили однократно в/о PBS, Ad-mCherry или M-VM3. Первичные опухоли удаляли через 7 дней после инъекции, и животных контролировали на выживаемость до дня 150 после инъекции. Как показано на фиг. 7А, введение M-VM3 перед удалением опухоли улучшало выживаемость до дня 150 по сравнению с PBS и Ad-mCherry. Логарифмический анализ продемонстрировал, что разница в кинетике смертности между получавшей M-VM3 и контрольной группами была почти статистически значимой (Р=0,06). Эти результаты показывают, что конструкт M-VM3 может эффективно сочетаться с хирургическим вмешательством для предотвращения метастазирования опухоли предстательной железы.
Инфицированные конструктом M-VM3 клетки в качестве противораковой вакцины
Стимуляция противоопухолевого иммунитета с помощью конструкта M-VM3 позволяет предположить, что конструкт может быть полезен не только в качестве терапии, но и в качестве профилактической противораковой вакцины. Чтобы проверить эту возможность, клетки TRAMP-C2 инфицировали M-VM3, облучали смертельной дозой через 48 часов, а затем использовали для вакцинации мышей C57BL/6. Контрольные группы не вакцинировали или вакцинировали аналогично приготовленными инфицированными Ad-mCherry или неинфицированными клетками. Мышей вакцинировали п/к в дни исследования 0, 14 и 21 и затем провоцировали клетками TRAMP-C2 посредством п/к введения через 14 дней после последней вакцинации. Наблюдали за ростом подкожной опухоли в течение 38 дней после провокации либо до достижения опухолями конечного размера, требующего эвтаназии. Процент мышей, у которых развились опухоли, был значительно ниже в группе, иммунизированной инфицированными M-VM3 клетками, по сравнению со всеми тремя контрольными группами (фиг. 7В), что указывает на эффективность исследуемой стратегии вакцинации на основе M-VM3.
Обсуждение.
46
Иммунотерапевтические стратегии, направленные на стимулирование иммунной системы к атаке раковых клеток или блокирование иммуносупрессивных механизмов, имеют большие перспективы для улучшения лечения рака. Активация TLR5 может в частности быть привлекательным средством стимуляции противоопухолевых иммунных ответов. Чтобы расширить клиническое применение опосредованной TLR5 иммунотерапии для включения опухолей, которые не экспрессируют TLR5 в естественных условиях, был создан новый аденовирус (Мобилан M-VM3), который направляет коэкспрессию TLR5 и секретируемого агониста TLR5 на основе энтолимода и тем самым обеспечивает локальную активацию TLR5 при доставке в опухоль. Модели рака предстательной железы были использованы для тестирования M-VM3 по причине высокой частоты экспрессии CAR среди опухолей предстательной железы человека и предыдущей демонстрации их эффективного инфицирования аденовирусами. Это исследование подтвердило эффективное инфицирование опухолей предстательной железы мышей (in vivo) и полученных хирургическим путем образцов опухолей предстательной железы человека (ex vivo) при прямом внутриопухолевом введении аденовирусов, описанных в настоящем документе. В отличие от лечения энтолимодом, конструкт M-VM3 обеспечивала непрерывную локальную (не системную) передачу сигналов TLR5 в клетках рака предстательной железы TRAMP и в ткани предстательной железы мыши после внутрипростатного введения. Введение M-VM3 в опухоли предстательной железы TRAMP подавляло прогрессирование опухоли (на что указывает вес опухоли и результаты гистологического исследования) и приводило к рекрутингу компонентов врожденного иммунитета, включая нейтрофилы и NK-клетки. Участие этих иммунных механизмов может быть объяснено, не желая ограничиваться какой-либо теорией, профилем экспрессии специфичного к M-VM3 гена, наблюдаемой в экспериментах с микромассивами, и согласуется с более ранними исследованиями с флагеллином и энтолимодом.
21
55
21-24
Потенциальное использование агонистов TLR5 в качестве вакцинного адъюванта исследуется в настоящем изобретении. В этом исследовании однократная внутриопухолевая инъекция M-VM3 в п/к растущие опухоли TRAMP-C2 улучшала выживаемость мышей после хирургического удаления опухолей. Это позволяет предположить, что внутриопухолевая вакцинация M-VM3 может быть эффективной стратегией для предотвращения метастазирования у пациентов с раком предстательной железы. Также было установлено, что вакцинация мышей облученными смертельной дозой и инфицированными M-VM3 клетками TRAMP-C2 (прайм + 2 буста) защищала мышей от последующего п/к провокации клетками TRAMP-C2. Использование клеточной вакцинации против рака предстательной железы иллюстрируется Sipuleucel-T, одобренной FDA аутологичной клеточной вакциной, которая состоит из дендритных клеток пациента, нагруженных белком слияния простатической кислой фазы-гранулоцитов/макрофагов-колониестимулирующего фактора. Sipuleucel-T продлевала выживаемость у мужчин с метастатическим раком предстательной железы, но не влияла на время до прогрессирования заболевания. Испытания с GVAX, вакциной, состоящей из клеточных линий рака предстательной железы (LnCAP и РС3), экспрессирующих GM-CSF, были прекращены из-за отсутствия преимущества общей выживаемости. Представленные здесь данные позволяют предполагать, что конструкт M-VM3 может удовлетворить потребность в более эффективных клеточных вакцинах против рака предстательной железы.
В целом, среди прочего, эта работа предоставляет доказательства того, что использование M-VM3 может обеспечивать конститутивную передачу сигналов TLR5 в опухолях независимо от их статуса экспрессии TLR5, и демонстрирует, что такая передача сигналов приводит к противоопухолевым иммунным ответам, способным подавлять развитие опухоли предстательной железы, ее прогрессирование и метастазирование в разных экспериментальных условиях.
Материалы и методы
Мыши
37
tm1Flv
Мыши C57BL/6 (самцы в возрасте 6-8 недель) были приобретены у компании Taconic, Inc. (Hudson, NY, США). Мыши TRAMP были выведены в RPCI (Ресурс модели опухоли мышей). Мыши BALB/C-Tg(IκBα-luc)-Xen (несущие трансген репортера люциферазы светлячков, контролируемый промотором IKBα) были приобретены у компании Xenogen Corporation (Alameda, СА, США) и содержались в форме колонии в виварии RPCI. Мыши TLR5KO (B6.129S1-Tlr5) были приобретены в компании Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, США) и содержались, как указано выше.
Реагенты
56
Поликлональные антитела кроликов к CBLB502 (pAb), меченные биотином моноклональные антитела коз к CBLB502 pAb и к TLR5 человека 1В04 (mAb) были произведены компанией Cleveland BioLabs, Inc. (CBLI; Buffalo, NY, США). Антитела для иммуногистологических исследований включали поликлональные антитела кроликов к NF-κВ р65 (каталожный №7970; Abcam, Cambridge, Великобритания), моноклональные антитела крыс к цитокератину 8 (Troma-1; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa City, IA, США) и антитела к CAR (Н-300; каталожный № sc15405, Santa Cruz, СА, США). TNFα был приобретен у компании PeproTech Inc. (Rocky Hill, NJ, США) и LPS, продуцируемые E.coli 055:B5, были приобретены у Sigma-Aldrich (St Louis, МО, США). CBLB502 и CBLB502NQ были получены, как описано.
Культивируемые клетки
37
57
Клетка рака предстательной железы TRAMP-C2 поддерживалась, как описано. Для разработки стабильных репортерных клеточных линий NF-κ B-luc клетки MOSEC (от д-ра A. Odunsi, RPCI, Buffalo, NY, США) и клетки TRAMP-C2 трансдуцировали репортером Lenti NF-κВ (QIAGEN, Frederick, MD, США) с последующим отбором пуромицина. Первичные гепатоциты мышей выделяли, как описано.
Аденовирусы
12
12
12
Аденовирусные конструкты (Ad-mCherry, Мобилан М-0 и M-VM3) получали с использованием системы AdMax™ (Microbix Biosystems, Mississauga, Канада). Экспрессионные кассеты собирали в челночную плазмиду pDC515 и аденовирусную геномную плазмиду pBHGloxΔE1,3Cre использовали для рекомбинации для получения конечных конструктов. Полученные вирусы очищали от бляшек, амплифицировали и очищали при градиенте CsCl. Полученные конструкты Мобилан М-0, M-VM3 и Ad-mCherry содержали 1×10, 1,1×10 и 1×10 в. ч./мл соответственно.
Анализы люциферазы
56
43
Экспрессию NF-κВ-зависимой люциферазы в репортерных клеточных линиях и в экстрактах репортерных органов мышей измеряли, как описано в источниках  и , соответственно.
Визуализация экспрессии NF-κВ-зависимой люциферазы у живых мышей
43
Биолюминесцентная интраскопия выполнялась с использованием системы визуализации IVIS 50 (Xenogen), как описано.
Экспрессия NF-κВ-зависимой люциферазы в живых клетках
4
Гепатоциты NF-κВ-luc мышей инфицировали M-VM3 или Ad-mCherry (множественность заражения = 10) либо обрабатывали энтолимодом (0,1 мкг/мл) или PBS. Вирусосодержащую среду заменяли свежей средой через 3 ч (1 ч в случае энтолимода) и к клеткам добавляли люциферин. Активность люциферазы измеряли в LumiCycle 32 (Actimetrics, Wilmette, IL, США) в течение 3 дней. Вычитали исходный уровень активности люциферазы.
Твердофазный ИФА и вестерн-блоттинг
58
CBLB502 и его производные обнаруживали методом твердофазного ИФА и вестерн-блоттинга с использованием CBLB502-специфичных pAb, a TLR5 обнаруживали методом вестерн-блоттинга с использованием 1В04 mAb (см. Реагенты).
Иммуногистохимические исследования
43
Срезы опухолевых тканей и культивируемых клеток окрашивали, как описано.Первичные антитела: антитела к NF-κВ р65 (Abcam, каталожный №7970), цитокератину 8 (Troma-1; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa), CAR (SantaCruz, каталожный № sc-15405), интегрину альфа 6 (Abcam, каталожный № Ab62844-100). Изображения получали с использованием флуоресцентного микроскопа Axio Imager Z1 (Carl Zeiss, Йена, Германия), оснащенного высокочувствительной цифровой камерой CCD MRm (Carl Zeiss) и программным обеспечением AxioVision (версия 4.8.3).
Дегликозилирование CBLB502
9
Культуры MOSEC инфицировали при 50%-ной конфлюэнции М-0 (1×10 в. ч./мл). Через 48 ч готовили клеточные экстракты с использованием CelLytic М (Sigma-Aldrich). Лизаты очищали центрифугированием и обессоливали с использованием центрифуг. Дегликозилирование осуществляли с использованием набора реагентов Protein Deglycosylation Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA, США) в соответствии с протоколом производителя.
Инфицирование опухолей мыши и человека вирусом Ad-mCherry
7
9
-8
2
Мышам вводили п/к клетки TRAMP-C2 в количестве 1×10. Ad-mCherry (всего 2×10 в.ч.) вводили в 3 разные точки каждой опухоли (~100 мм). Образцы опухолей предстательной железы человека рассекали на кусочки размером 0,5×0,5×1 см, и в 2 кусочка от каждого пациента вводили Ad-mCherry, как и для опухолей мышей. Обработанные образцы от человека культивировали в обогащенной среде Игл, модифицированной по способу Дульбекко, в которую также добавляли инсулин (5 мкг/мл) и 10 М дигидротестостерон при 37°С, 5% СО.
Выполнение инъекций в предстательную железу
9
Выбривали область живота анестезированным мышам TRAMP. Используя асептическую технику, делали ножницами надрез 1 см над предстательной железы на вентральной поверхности животного через кожу и стенку тела и вводили M-VM3, Ad-mCherry или PBS в количестве 10 в. ч. (всего 50 мкл) в 3 точки в вентральной доле предстательной железы. Стенка тела сшивали 1-2 швами, а кожу скрепляли зажимами для ран.
Клеточная иммунизация мышей
5
6
7
Конфлюэнтные на 70% клетки TRAMP-C2 инфицировали M-VM3 или Ad-mCherry (множественность заражения = 1,2×10) и облучали через 48 ч (доза 50 Гр, источник гамма-облучения Shepherd 4000 Ci, цезий-137). Мышей C57BL/6 (n=10 на группу) не вакцинировали или вакцинировали п/к неинфицированными, инфицированными M-VM3 или Ad-mCherry клетками (1×10 клеток/мышь) в дни исследования 0, 14 и 21. Мышей провоцировали клетками TRAMP-C2 (1×10 клеток/мышь, подкожное введение). Через 14 дней после последней вакцинации. Рост опухолей контролировали в течение 38 дней после провокации.
Хирургическое удаление опухолей TRAMP-C2 после в/о введения конструкта М-VM3
3
7
8
8
45
В опухоли (~100 мм), которые развивались у мышей C57BL/6 через 4 недели после п/к инокуляции клеток TRAMP-C2 (1×10 клеток/мышь) вводили в/о PBS, Ad-mCherry (10 в. ч.) или M-VM3 (10 в. ч.) (50 мкл/опухоль). Опухоли удаляли хирургическим путем через 7 дней после выполнения инъекции, как описано.
FACS-анализ популяций иммунных клеток
43
Опухоли, в которые вводился M-VM3 либо Ad-mCherry или PBS, брали для анализа через 2, 7 или 14 дней после выполнения инъекции и взвешивали. Генерировали суспензии отдельных клеток и анализировали с выполнением FACS-анализа, как описано.
Микроматричный анализ
9
Профилирование экспрессии генов осуществляли с использованием полногеномного анализа экспрессии гена WG-6 мышей и анализа прямой гибридизации (Illumina, San Diego, СА, США). РНК готовили через 24 и 48 ч после введения M-VM3, Ad-mCherry (10 в.ч., 50 мкл в общей сложности в 3 точках) или PBS (2 мыши/группу) в пальпируемые спонтанные опухоли предстательной железы мышей TRAMP (возрастом 22-26 недель). Квантильную нормализацию и вычитание фона проводили с использованием ПО Illumina Genestudio. Гены, для которых наблюдался минимальный сигнал, равный 50, в обоих инфицированных аденовирусом повторностях и которые были индуцированы, по меньшей мере, двукратно Ad-mCherry или M-VM3 по сравнению с PBS, считали индуцированными для целей анализа.
Условные обозначения к графическим изображениям
Фигура 1. Аденовирусные конструкты и их характеризация in vitro.
(А) Схематическое изображение экспрессионных кассет в (а) Мобилан М-0, (b) Мобилан M-VM3 и (с) Ad-mCherry. Р - промотор, Т - терминатор транскрипции. (В) Вестерн-блоттинг Мобилан-направленной экспрессии белков в клетках MOSEC. (а) Детектирование с помощью антител к TLR5; лизаты неинфицированных (дорожка 1) и М-0-инфицированных клеток MOSEC (дорожка 2). (b) Детектирование с помощью анти-CBLB502 pAb кроликов; лизаты М-0-инфицированных клеток MOSEC, необработанных (дорожка 1) или обработанных смесью дегликозилирующих ферментов (дорожка 2). (С) Сравнение активности продуцируемых E. coliCBLB502 и CBLB502NQ в репортерных клетках HEK293-NF-κВ-lacZ. Инкубировали клетки в течение 24 ч; измеряли активность β-галактозидазы (OD414) в лизатах клеток с использованием субстрата ONPG. (D) Вестерн-блоттинг клеток MOSEC, инфицированных d-mCherry (дорожка 1), М-0 (дорожка 2) или M-VM3 (дорожка 3) с использованием анти-CBLB502 PAb кроликов. Белок с более низкой подвижностью на дорожке 3 представляет собой негликозилированные CBLB502NQ ожидаемого размера (31,5 кДа); белок с более высокой подвижностью предположительно является частично распавшейся формой CBLB502NQ. (Е) Сравнение активности CBLB502 и CBLB502NQ, продуцируемых в клетках MOSEC. Клетки MOSEC инфицировали М-0 или M-VM3, собирали среду через 48 часов и измеряли концентрации CBLB502 и CBLB502NQ методом твердофазного ИФА после тепловой инактивации остаточного аденовируса. Указанные количества белков, продуцируемых MOSEC, или стандарта CBLB502, продуцируемого Е. coli, применяли к клеткам HEK293-NF-κВ-lacZ и измеряли β-галактозидазу, как описано выше. (F) Влияние нейтрализующих антител к CBLB502 на передачу сигналов TLR5 в M-VM3-инфицированных люциферазных репортерных клетках MOSEC-NF-κВ. Клетки инфицировали M-VM3 в присутствии или в отсутствие избытка нейтрализующего анти-CBLB502 pAb кроликов. Активность люциферазы измеряли после 80 часов инкубации. Планки погрешностей отображают стандартное отклонение трехкратных измерений.
Фигура 2. Конструкт M-VM3 индуцирует активацию NF- κ В в репортерных клеточных линиях.
4
(А-В) Инфицирование M-VM3 (множественность заражения = 3×10) индуцирует ядерную транслокацию NF-κВ р65 в отрицательных по TLR5 клетках MOSEC через 24 ч после инфицирования (В, белая стрелка) по сравнению с контрольными неинфицированными клетками MOSEC (А, пустая стрелка). Для иммуноокрашивания использовали антитела к NF-κВ р65. (С) Индукция NF-κВ-зависимой экспрессии люциферазы в клетках TRAMP-C2, инфицированных M-VM3. Клетки TRAMP-C2, несущие NF-κ-зависимую конструкцию репортера люциферазы, инфицировали M-VM3 или Ad-mCherry с указанной множественностью заражения. Активность люциферазы измеряли в лизатах, полученных через 48 ч после инфицирования, и выражали в процентах от активности в неинфицированных клетках (установлено на уровне 100%).
Фигура 3. Опухоли предстательной железы мышей и человека экспрессируют CAR и эффективно инфицируются Ad-mCherry.
8
8
(А) Репрезентативная область микромассива опухоли предстательной железы человека (RPCI), окрашенного антителами к CAR (Т - образцы опухолевой и N - образцы здоровой ткани предстательной железы). (В) Экспрессия CAR (зеленым) в клетках TRAMP-C2, выявленная иммунофлуоресцентным окрашиванием антителами к CAR. (С) В опухоль предстательной железы мышей TRAMP вводили Ad-mCherry (5×10в. ч./опухоль). Через 24 часа обнаруживали экспрессию CAR (зеленым) и mCherry (красным) в эпителиальных клетках опухоли, положительных по CK8/18, маркеру эпителиальных клеток (сиреневым). Верхняя левая панель демонстрирует наложение флуоресценции CAR и mCherry. (D) В полученный хирургическим путем образец опухоли предстательной железы человека (RPCI) вводили AdCherry (5×10 в. ч./опухоль). Через 24 часа обнаруживали экспрессию CAR (зеленым) и mCherry (красным) в эпителиальных клетках опухоли, положительных по Troma I, маркеру эпителиальных клеток (сиреневым). Верхняя левая панель демонстрирует наложение флуоресценции CAR и mCherry.
Фигура 4. Индукция активности NF-κВ у репортерных мышей после введения конструкта M-VM3.
9
4
4
(А) Измерение активности люциферазы в экстрактах ткани печени (L), кишечника (I) и предстательной железы (Р) BALB/C-Tg(IkBa-luc)-Xen репортерных мышей по люциферазе NF-κВ после внутривенного и внутрипростатного введения (48 ч) M-VM3. Значения в относительных световых единицах (RLU) (на мг общего белка) в тканевых экстрактах мышей, обработанных M-VM3, рассчитывали путем вычитания значений RLU для мышей, обработанных PBS. (В) Мышам BALB/C-Tg(IkBa-luc)-Xen вводили однократно внутрипростатно PBS, CBLB502 (1 мкг/мышь) или M-VM3 (1×10  в. ч.) и проводили анализ через 3, 24 или 48 часов методом биолюминесцентной интраскопии Xenogen всего организма живых анестезированных животных. С) M-VM3 индуцирует длительную активацию NF-κВ в гепатоцитах живых мышей, несущих введенную конструкцию репортера NF-κВ-зависимой люциферазы. Клетки инфицировали M-VM3 (множественность заражения = 10) или Ad-mCherry (множественность заражения = 10) либо обрабатывали энтолимодом (0,1 мг/мл) или PBS (контроль), затем эти агенты удаляли из среды (3 часа для аденовируса и 1 час для энтолимода) и измеряли люциферазу с помощью LumiCycle. Вычитали уровень активности люциферазы из клеток, обработанных PBS.
Фигура 5. Влияние in vivo M-VM3 на опухоли предстательной железы на мышиной модели TRAMP.
(А, В) Повышенная инфильтрация лимфоидных/мононуклеарных/макрофагальных клеток (красная стрелка) в интерстиции между долями предстательной железы у мышей TRAMP, которым вводили M-VM3 (А), по сравнению с мышами TRAMP, которым вводили PBS (B). Окрашенные г/э срезы предстательной железы готовили через 6 недель после внутрипростатного введения M-VM3 или PBS. (С, D) Атрофические и дегенеративные изменения (области с красными звездочками) в клетках и целых долях предстательной железы у мышей TRAMP, обработанных M-VM3. Окрашенные г/э срезы предстательной железы готовили через 6 недель после внутрипростатного введения M-VM3. Области С и D являются двумя независимыми примерами от разных мышей, получавших M-VM3. (Е) Средний вес вентральных долей предстательной железы через 6 недель после внутрипростатного введения M-VM3, Ad-mCherry и PBS сорока пяти 12-недельным мышам TRAMP (по 15 мышей на группу, планки погрешностей обозначают стандартную ошибку среднего).
Фигура 6. Количественный анализ популяции клеток врожденной и приобретенной иммунной системы, рекрутированных в опухоли TRAMP и TDLN после в/о введения конструктов Ad-mCherry или M-VM3.
9
+
+
-
lo/-
hi
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
Образцы пальпируемых спонтанно образованных опухолей предстательной железы (А-Е) и TDLN (F) от мышей с опухолью TRAMP-C2 брали через 2 дня (для подсчета количества нейтрофилов) или через 7 дней (для подсчета количества NK-клеток и Т-клеток) после в/о введения PBS (носитель), Ad-mCherry (контроль) или M-VM3 (10 v.p всего 3 точки). Популяции иммунных клеток, отвечающих за специфический иммунитет, определяли в образцах количественно методом FACS и выражали как абсолютное количество клеток на грамм ткани предстательной железы или на TDLN. (А) Нейтрофилы определяли как CD45CD11bCD11cLy-6CLy-6G; (В) NK-клетки определяли как CD45CD3εNK1.1; (C) CD8 Т-клетки определяли как CD45CD3εCD8; (D) CD4 Т-клетки определяли как CD45CD3εFoxP3CD4; (Е) Treg определяли как CD45CD3εCD4FoxP3. Данные представлены в виде среднего значения ± СОС (N=3-7 мышей/группу).
Фигура 7. Противоопухолевые эффекты M-VM3.
8
8
(А) Выращивали опухоли TRAMP-C2п/к у мышей C57BL/6 и вводили в/о PBS, Ad-mCherry (5×10 в. ч.) или M-VM3 (5×10 в. ч.) в день 0. Опухоли удаляли хирургическим путем в день 7, и наблюдали мышей на предмет выживаемости до дня 150. (В) Мышей C57BL/6 (n=10 на группу) вакцинировали п/к M-VM3- или Ad-mCherry-инфицированными (облученными через 48 ч после инфицирования вирусом) или неинфицированными облученными клетками TRAMP-C2. Четвертую группу мышей не вакцинировали. Мышей вакцинировали в дни 0, 14 и 21 и затем провоцировали клетками TRAMP-C2 посредством п/к введения через 14 дней после последней вакцинации. Наблюдали за ростом опухоли в течение 38 дней после провокации либо до достижения опухолями конечного размера, требующего эвтаназии. Процент (%) мышей без опухоли определяли в день 38 после провокации.
Условные обозначения к дополнительным изображениям
Фигура 1S. Продуцирование CBLB502NQ в клетках MOSEC и титрование нейтрализирующих антител.
(А) Продуцирование CBLB502NQ посредством M-VM3 в клетках MOSEC. Репортерные клетки MOSEC-NF-κВ-зависимой люциферазы инфицировали указанными титрами М-VM3 и инкубировали в течение 80 часов; концентрацию CBLB502NQ в среде для культивирования клеток измеряли методом ELISA. (В) Ингибирование активности CBLB502 антителами к CBLB502. Репортерные клетки HEK293-NF-κВ-lacZ инкубировали с CBLB502 (0,01-25 нг/мл) в присутствии или в отсутствие нейтрализующего анти-CBLB502 pAb кроликов в течение 16 часов и измеряли β-галактозидазу в клеточных лизатах с использованием субстрата ONPG. Планки погрешностей отображают стандартное отклонение трехкратных измерений.
Фигура S2. Статус экспрессии TLR5 и TLR4 клетками MOSEC.
4
(А-С) Клетки MOSEC экспрессируют функциональный TLR4, но не TLR5. Клетки MOSEC обрабатывали PBS (A), CBLB502 (100 нг/мл) (В) или LPS (100 нг/мл) (С) в течение 30 минут, после чего посредством иммуногистохимического анализа выявляли ядерную транслокацию субъединицы р65 NF-κВ. Ядерная транслокация р65 наблюдалась в ~100% клеток, обработанных LPS, но не в клетках, обработанных энтолимодом или PBS. (D-I) Иммуногистохимическое обнаружение субъединицы р65 NF-κВ (зеленым, панели D и G) и hTLR5 (красным, панели Е и Н) в гепатоцитах мышей TLR5KO, инфицированных M-VM3 (множественность заражения = 3×10; панели GI) или оставленных неинфицированными (панели DF). Панели F и I отображают окрашивание ядер DAPI (синим). Окрашивание проводили через 24 часа после инфицирования. Экспрессия hTLR5 и ядерная транслокация NF-κВ р65 наблюдались в большинстве гепатоцитов, инфицированных M-VM3, от мышей TLR5KO (соответственно Н и G), но не в соответствующих неинфицированных контрольных гепатоцитах TLR5KO (Е, D).
Фигура S3. Состояние CAR в опухолях человека.
Микромассив тканей множественных опухолей человека окрашивали антителами к CAR. Показана репрезентативная панель из трех повторностей. Схема расположения образцов представлена в дополнительной таблице 3.
Дополнительные таблицы
Дополнительная таблица 1. Гены, индуцированные в опухоли TRAMP, через 24 ч после внутриопухолевой инъекции M-VM3 или Ad-mCherry.
Дополнительная таблица 2. Гены, индуцированные в опухоли TRAMP, через 48 ч после внутриопухолевой инъекции M-VM3 или Ad-mCherry.
Дополнительная таблица 3. Схема расположения разных образцов опухолевых и здоровых тканей в микромассиве тканей множественных опухолей для определения экспрессии CAR (фиг. 19).
1 Eaves-Pyles TD, Wong HR, Odoms K, Pyles RB. Salmonella flagellin-dependent proinflammatory responses are localized to the conserved amino and carboxyl regions of the protein. Journal of immunology 2001; 167: 7009-7016.
2 Garaude J, Kent A, van Rooijen N, Blander JM. Simultaneous targeting of toll- and nod-like receptors induces effective tumor-specific immune responses. Science translational medicine 2012; 4: 120ra116.
3 Rhee SH, Im E, Pothoulakis C. Toll-like receptor 5 engagement modulates tumor development and growth in a mouse xenograft model of human colon cancer. Gastroenterology 2008; 135: 518-528.
4 Sfondrini L, Rossini A, Besusso D, Merlo A, Tagliabue E, Menard S et al. Antitumor activity of the TLR-5 ligand flagellin in mouse models of cancer. Journal of immunology 2006; 176: 6624-6630.
5 Soto LJ, 3rd, Sorenson BS, Kim AS, Feltis BA, Leonard AS, Saltzman DA. Attenuated Salmonella typhimurium prevents the establishment of unresectable hepatic metastases and improves survival in a murine model. J Pediatr Surg 2003; 38: 1075-1079.
6 Cai Z, Sanchez A, Shi Z, Zhang T, Liu M, Zhang D. Activation of Toll-like receptor 5 on breast cancer cells by flagellin suppresses cell proliferation and tumor growth. Cancer research 2011; 71:2466-2475.
7 Burdelya LG, Gleiberman AS, Toshkov I, Aygun-Sunar S, Bapardekar M, Manderscheid-Kern P et al. Toll-like receptor 5 agonist protects mice from dermatitis and oral mucositis caused by local radiation: implications for head-and-neck cancer radiotherapy. International journal of radiation oncology, biology, physics 2012; 83: 228-234.
8 Burdelya LG, Brackett CM, Kojouharov B, Gitlin, II, Leonova KI, Gleiberman AS et al. Central role of liver in anticancer and radioprotective activities of Toll-like receptor 5 agonist. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2013; 110: E1857-1866.
9 Brackett CM, Kojouharov B, Veith J, Greene KF, Burdelya LG, Gollnick SO et al. Toll-like receptor-5 agonist, entolimod, suppresses metastasis and induces immunity by stimulating an NK-dendritic-CD8+ T-cell axis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2016; 113: E874-883.
10 Yang H, Brackett CM, Morales-Tirado VM, Li Z, Zhang Q, Wilson MW et al. The Toll-like receptor 5 agonist entolimod suppresses hepatic metastases in a murine model of ocular melanoma via an NK cell-dependent mechanism. Oncotarget 2016; 7: 2936-2950.
11 Yam C, Zhao M, Hayashi K, Ma H, Kishimoto H, McElroy M et al. Monotherapy with a tumor-targeting mutant of S. typhimurium inhibits liver metastasis in a mouse model of pancreatic cancer. The Journal of surgical research 2010; 164: 248-255.
12 Mizel SB, Bates JT. Flagellin as an adjuvant: cellular mechanisms and potential. Journal of immunology 2010; 185: 5677-5682.
13 Rhee SH. Basic and translational understandings of microbial recognition by toll-like receptors in the intestine. Journal of neurogastroenterology and motility 2011; 17: 28-34.
14 Cuadros C, Lopez-Hernandez FJ, Dominguez AL, McClelland M, Lustgarten J. Flagellin fusion proteins as adjuvants or vaccines induce specific immune responses. Infection and immunity 2004; 72: 2810-2816.
15 Means TK, Hayashi F, Smith KD, Aderem A, Luster AD. The Toll-like receptor 5 stimulus bacterial flagellin induces maturation and chemokine production in human dendritic cells. Journal of immunology 2003; 170: 5165-5175.
16 Kaczanowska S, Joseph AM, Davila E. TLR agonists: our best frenemy in cancer immunotherapy. Journal of leukocyte biology 2013; 93: 847-863.
17 Akira S, Takeda K. Functions of toll-like receptors: lessons from KO mice. С R Biol 2004; 327: 581-589.
18 Carvalho FA, Aitken JD, Gewirtz AT, Vijay-Kumar M. TLR5 activation induces secretory interleukin-1 receptor antagonist (sIL-1Ra) and reduces inflammasome-associated tissue damage. Mucosal immunology 2011; 4: 102-111.
19 Vijay-Kumar M, Carvalho FA, Aitken JD, Fifadara NH, Gewirtz AT. TLR5 or NLRC4 is necessary and sufficient for promotion of humoral immunity by flagellin. European journal of immunology 2010; 40: 3528-3534.
20 Hemmi S, Geertsen R, Mezzacasa A, Peter I, Dummer R. The presence of human coxsackievirus and adenovirus receptor is associated with efficient adenovirus-mediated transgene expression in human melanoma cell cultures. Hum Gene Ther 1998; 9: 2363-2373.
21 Fernandez-Garcia EM, Vera-Badillo FE, Perez-Valderrama B, Matos-Pita AS, Duran I. Immunotherapy in prostate cancer: review of the current evidence. Clinical & translational oncology: official publication of the Federation of Spanish Oncology Societies and of the National Cancer Institute of Mexico 2014.
22 Shi Y, Liu CH, Roberts Al, Das J, Xu G, Ren G et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: what we do and don't know. Cell research 2006; 16: 126-133.
23 Dranoff G, Jaffee E, Lazenby A, Golumbek P, Levitsky H, Brose K et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1993; 90: 3539-3543.
24 Simons JW, Sacks N. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-transduced allogeneic cancer cellular immunotherapy: the GVAX vaccine for prostate cancer. Urologic oncology 2006; 24: 419-424.
25 Michael A, Ball G, Quatan N, Wushishi F, Russell N, Whelan J et al. Delayed disease progression after allogeneic cell vaccination in hormone-resistant prostate cancer and correlation with immunologic variables. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 2005; 11: 4469-4478.
26 Korman AJ, Peggs KS, Allison JP. Checkpoint blockade in cancer immunotherapy. Advances in immunology 2006; 90: 297-339.
27 Arlen PM, Skarupa L, Pazdur M, Seetharam M, Tsang KY, Grosenbach DW et al. Clinical safety of a viral vector based prostate cancer vaccine strategy. The Journal of urology 2007; 178: 1515-1520.
28 Lubaroff DM, Konety BR, Link B, Gerstbrein J, Madsen T, Shannon M et al. Phase I clinical trial of an adenovirus/prostate-specific antigen vaccine for prostate cancer: safety and immunologic results. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 2009; 15: 7375-7380.
29 Kwon ED, Drake CG, Scher HI, Fizazi K, Bossi A, van den Eertwegh AJ et al. Ipilimumab versus placebo after radiotherapy in patients with metastatic castration-resistant prostate cancer that had progressed after docetaxel chemotherapy (CA184-043): a multicentre, randomised, double-blind, phase 3 trial. The Lancet Oncology 2014; 15: 700-712.
30 Topalian SL, Hodi FS, Brahmer JR, Gettinger SN, Smith DC, McDermott DF et al. Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. The New England journal of medicine 2012; 366: 2443-2454.
31 Sullivan RJ, Lorusso PM, Flaherty KT. The intersection of immune-directed and molecularly targeted therapy in advanced melanoma: where we have been, are, and will be. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 2013; 19:5283-5291.
32 Ott PA, Hodi FS, Robert C. CTLA-4 and PD-1/PD-L1 blockade: new immunotherapeutic modalities with durable clinical benefit in melanoma patients. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 2013; 19: 5300-5309.
33 Mamalis A, Garcha M, Jagdeo J. Targeting the PD-1 pathway: a promising future for the treatment of melanoma. Archives of dermatological research 2014; 306: 511-519.
34 Forde PM, Reiss KA, Zeidan AM, Brahmer JR. What lies within: novel strategies in immunotherapy for non-small cell lung cancer. The oncologist 2013; 18: 1203-1213.
35 Pardoll DM. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature reviews Cancer 2012; 12: 252-264.
36 Brahmer JR, Tykodi SS, Chow LQ, Hwu WJ, Topalian SL, Hwu P et al. Safety and activity of anti-PD-L1 antibody in patients with advanced cancer. The New England journal of medicine 2012; 366: 2455-2465.
37 Foster BA, Gingrich JR, Kwon ED, Madias C, Greenberg NM. Characterization of prostatic epithelial cell lines derived from transgenic adenocarcinoma of the mouse prostate (TRAMP) model. Cancer research 1997; 57: 3325-3330.
38 Greenberg NM, DeMayo F, Finegold MJ, Medina D, Tilley WD, Aspinall JO et al. Prostate cancer in a transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1995; 92: 3439-3443.
39 Gingrich JR, Greenberg NM. A transgenic mouse prostate cancer model. Toxicologic pathology 1996; 24: 502-504.
40 Gupta S, Ahmad N, Marengo SR, MacLennan GT, Greenberg NM, Mukhtar H. Chemoprevention of prostate carcinogenesis by alpha-difluoromethylornithine in TRAMP mice. Cancer research 2000; 60: 5125-5133.
41 Hurwitz AA, Foster BA, Kwon ED, Truong T, Choi EM, Greenberg NM et al. Combination immunotherapy of primary prostate cancer in a transgenic mouse model using CTLA-4 blockade. Cancer research 2000; 60: 2444-2448.
42 Mentor-Marcel R, Lamartiniere CA, Eltoum IE, Greenberg NM, Elgavish A. Genistein in the diet reduces the incidence of poorly differentiated prostatic adenocarcinoma in transgenic mice (TRAMP). Cancer research 2001; 61: 6777-6782.
43 Burdelya LG, Krivokrysenko VI, Tallant TC, Strom E, Gleiberman AS, Gupta D et al. An agonist of toll-like receptor 5 has radioprotective activity in mouse and primate models. Science 2008; 320: 226-230.
44 Rodriguez GM, Bobbala D, Serrano D, Mayhue M, Champagne A, Saucier С et al. NLRC5 elicits antitumor immunity by enhancing processing and presentation of tumor antigens to CD8(+) T lymphocytes. Oncoimmunology 2016; 5: e1151593.
45 Kwon ED, Foster BA, Hurwitz AA, Madias C, Allison JP, Greenberg NM et al. Elimination of residual metastatic prostate cancer after surgery and adjunctive cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) blockade immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1999; 96: 15074-15079.
46 Rauen KA, Sudilovsky D, Le JL, Chew KL, Hann B, Weinberg V et al. Expression of the coxsackie adenovirus receptor in normal prostate and in primary and metastatic prostate carcinoma: potential relevance to gene therapy. Cancer research 2002; 62: 3812-3818.
47 Galli R, Starace D, Busa R, Angelini DF, Paone A, De Cesaris P et al. TLR stimulation of prostate tumor cells induces chemokine-mediated recruitment of specific immune cell types. Journal of immunology 2010; 184: 6658-6669.
48 Leigh ND, Bian G, Ding X, Liu H, Aygun-Sunar S, Burdelya LG et al. A flagellin-derived toll-like receptor 5 agonist stimulates cytotoxic lymphocyte-mediated tumor immunity. PloS one 2014; 9: e85587.
49 de Melo FM, Braga CJ, Pereira FV, Maricato JT, Origassa CS, Souza MF et al. Anti-metastatic immunotherapy based on mucosal administration of flagellin and immunomodulatory P10. Immunology and cell biology 2015; 93: 86-98.
50 Lee SE, Hong SH, Verma V, Lee YS, Duong TN, Jeong K et al. Flagellin is a strong vaginal adjuvant of a therapeutic vaccine for genital cancer. Oncoimmunology 2016; 5: e1081328.
51 Tosch C, Geist M, Ledoux C, Ziller-Remi C, Paul S, Erbs P et al. Adenovirus-mediated gene transfer of pathogen-associated molecular patterns for cancer immunotherapy. Cancer gene therapy 2009; 16: 310-319.
52 Yu X, Guo С, Yi H, Qian J, Fisher PB, Subjeck JR et al. A multifunctional chimeric chaperone serves as a novel immune modulator inducing therapeutic antitumor immunity. Cancer research 2013; 73: 2093-2103.
53 Faham A, Altin JG. Antigen-containing liposomes engrafted with flagellin-related peptides are effective vaccines that can induce potent antitumor immunity and immunotherapeutic effect. Journal of immunology 2010; 185: 1744-1754.
54 Kaczanowska S, Davila E. Ameliorating the tumor microenvironment for antitumor responses through TLR5 ligand-secreting T cells. Oncoimmunology 2016; 5: e1076609.
55 Kantoff PW, Higano CS, Shore ND, Berger ER, Small EJ, Penson DF et al. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. The New England journal of medicine 2010; 363: 411-422.
56 Yoon SI, Kurnasov O, Natarajan V, Hong M, Gudkov AV, Osterman AL et al. Structural basis of TLR5-flagellin recognition and signaling. Science 2012; 335: 859-864.
57 Fougere-Deschatrette C, Imaizumi-Scherrer T, Strick-Marchand H, Morosan S, Charneau P, Kremsdorf D et al. Plasticity of hepatic cell differentiation: bipotential adult mouse liver clonal cell lines competent to differentiate in vitro and in vivo. Stem cells 2006; 24: 2098-2109.
58 Krivokrysenko VI, Toshkov IA, Gleiberman AS, Krasnov P, Shyshynova I, Bespalov I et al. The Toll-Like Receptor 5 Agonist Entolimod Mitigates Lethal Acute Radiation Syndrome in Non-Human Primates. PloS one 2015; 10: e0135388.