Изучение апоптоза методом проточной цитофлуориметрии (обзор литературы)

УДК 577.24+57.086.8

В.В. Войткова

ИЗУЧЕНИЕ АПОПТОЗА МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИИ

Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока

Роспотребнадзора

Для изучения апоптоза широко применяется проточная цитометрия. В настоящее время открыто достаточно много маркеров клеточной смерти. Нами охарактеризованы методы, оценки степени апоптоза с помощью цитометрии, основанные на четырех направлениях (изменения цитоплазматической мембраны, активация каспаз, митохондриальные изменения, фрагментация ДНК). Коротко описаны, такие маркеры, апоптоза, как цитокины, транскрипционные факторы, перфорин и. другие.

Ключевые слова: апоптоз, проточная цитометрия

STUDY OF APOPTOSIS WITH USE OF FLOW CYTOMETRY

V.V. Voitkova Irkutsk Scientific Research Antiplague Institute of Siberia and Far East, Irkutsk

Flow cytometry is widely applied for studying apoptosis. At present many markers of cellular death are discovered. The some basic methods of apoptosis assessment by flow cytometry based, on changes of a cytoplasmic membrane and mitochondria, caspase activation, fragmentation of DNA are characterized. Other markers of apoptosis such, as cytokines, transcription, factors, perforin and others are shortly described.

Key words: apoptosis, flow cytometry

Проточная цитометрия — это уникальная современная технология, обеспечивающая быстрый, качественный и мультипараметрический анализ живых (мертвых) индивидуальных клеток, которая получила широкое распространение в таких областях медицины, как иммунология, фармакология, цитология, онкология, гематология, генетика, инфекционные болезни. Процессы, которые возможно исследовать с помощью данного метода, многообразны. В настоящее время одним из перспективных направлений рассматривается исследование различных путей гибели клеток. В частности, для изучения физиологического состояния клеток при различных заболеваниях применяется оценка степени апоптоза [7]. Точкой отсчета, с которой начинается возрастающий год от года интерес к вопросам апоптоза, является появление в 1972 г. известной работы Дж. Керра с соавторами, которые ввели в цитологию термин «апоптоз» и представление о программируемой гибели клеток [10].

Применение метода проточной цитометрии в изучении апоптоза позволяет проводить количественный подсчет апоптотических клеток. При этом трудности в идентификации этих клеток связаны с дифференцированием апоптотического и некротического сценария клеточной гибели. Кроме того, другой объективной характеристикой метода является возможность применения в раскрытии механизмов, ассоциированных с предрасположенностью клеток к апоптозу через активацию специфических каскадов внутриклеточной сигнализации. Поэтому проточную цитометрию более часто стали использовать для одновременного

иммуноцитохимического изучения молекулярных звеньев регуляции и/или инициации апоптоза, таких, как белки семейства Вс1-2, каспазы, протоонкогены (р53 или pRB). Активное использование методов цитометрии осуществляется с целью оценки функционирования процессов метаболизма митохондрий, окислительного стресса, внутриклеточного pH, транспортировки Са2+, которые также могут играть существенную роль в развитии апоптоза [5, 14].

Поскольку не все типы клеток проявляют классические особенности апоптоза для того, чтобы проанализировать и определить механизм гибели, необходимо исследование множественных аспектов. Тем более, мультипараметрическая природа проточной цитометрии предусматривает сложный анализ, который предполагает возможность изучения нескольких апоптотических характеристик путем комбинирования соответствующих красителей в одном образце, что обеспечивает всестороннюю и многомерную картину программируемой гибели клеток. Например, исследование апоптоза, основанное на применении ДНК-красителей как индикаторов проницаемости цитоплазматической мембраны, может быть комбинировано с методами оценки различных клеточных ответов, ассоциированных с клеточной смертью, включая потенциал митохондриальной мембраны, асимметрию фос-фатидилсерина.

Следует отметить, что одним из признаков, проявляющихся на ранних стадиях, принято считать уменьшение объема клетки в результате дегидротации, которое оценивают по малоугловому светорассеиванию (FSC) — по мере развития

апоптоза клетки уменьшаются в размерах и, как следствие этого процесса, снижается интенсивность светорассеяния [10, 13]. Отличительной особенностью развития некротического сценария клеточной гибели считается инициация набухания клетки в процессе повреждения ее мембраны и последующего лизиса [10]. Необходимо помнить, что изменение светорассеяния не является специфическим маркером при развитии любой формы клеточной гибели. Механическая травма клеток может способствовать появлению аналогичных изменений светорассеяния в процессе развития как апоптотической, так и некротической гибели клетки. Поэтому анализ светорассеяния следует совмещать с другими методами, обеспечивающими тонкую идентификацию молекулярного профиля клеточной гибели [20]. Несмотря на вышесказанное, комбинирование оценки FSC с мембранонепроницаемым флуорохромом, связывающим ДНК (например, йодид пропидия), может рассматриваться простейшим методом в мониторирова-нии динамики прогрессирования апоптоза [13].

Можно выделить 4 направления изучения апоптоза: изменения цитоплазматической мембраны; активация каспаз; митохондриальные изменения; фрагментация ДНК. К косвенным маркерам апоптоза относятся цитокины, транскрипционные факторы, активные формы кислорода, гранзимы (А и В) и перфорин, образраспознающие рецепторы, которые также коротко охарактеризованы.

ИЗУЧЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ

Изменение проницаемости цитоплазматической мембраны в результате потери транспортной функции в процессе апоптоза является индикатором клеточной смерти. Для оценки проницаемости цитоплазматической мембраны используются флуоресцирующие ДНК-красители (PI — йодид пропидия, 7-AAD — 7-амино- актиномизин, YO-PRO-1). Данный метод часто применяют для исследования жизнеспособности клеток, потому что он позволяет четко отличить живые клетки от мертвых и апоптотических, а также легко комбинируется с иммунофенотипированнием. Следует отметить, что при исследовании жизнеспособности клеток не рекомендуется использовать протоколы внутриклеточного анализа и фиксировать клетки, что влияет на проницаемость ДНК-красителей и искажает результаты [16]. Также следует обратить внимание на то, что степень проницаемости цитоплазматической мембраны по отношению к заряженным или незаряженным флуорохромам изменяется в зависимости от типа клеток, стадии и способа индукции апоптоза. Кроме того, оптимальные условия (концентрация антител, время и температура инкубации, ионный состав среды) для дифференцировки апоптотических клеток могут варьировать между различными клеточными системами, поэтому перед работой необходимо подбирать такие условия, которые позволяют получить достоверный результат [16, 20].

Для оценки количественного соотношения клеток, находящихся на разных стадиях апоптоза, как правило, комбинируют катионные красители, например PI и YO-PRO-1. Данная комбинация позволяет отследить «цикл смерти»: на ранних стадиях апоптотические клетки окрашиваются только YO-PRO-1; после повреждения цитоплазматической мембраны клетки начинают пропускать PI, который подавляет флуоресценцию YO-PRO-1 (флуоресценция в зеленом спектре уменьшается). В свою очередь на поздних стадиях апоптоза в результате повреждения ДНК уменьшается флуоресценция PI. Живые клетки не окрашиваются ни PI, ни YO-PRO-1 [20].

Триггером в реализации программы апоптоза является взаимодействие рецептора с лигандом. Поэтому одним из методов изучения характеристик цитоплазматической мембраны является оценка экспрессии рецепторов смерти, а также их лигандов (CD95, CD95L, TNFRI, DR4, DR5, DcR, TRAIL и TNF). Оценка экспрессии цитоплазматических маркеров апоптоза рассматривается как неотъемлемая часть изучения динамики апоптотического процесса ряда заболеваний, а также оценки эффективности терапии. Новые подходы к управлению иммунологическими процессами путем влияния на рецепторно-лигандные пути могут способствовать созданию иммуномодулирующих препаратов, способных регулировать атипичный и восстанавливать дефектный физиологический апоптоз.

В качестве еще одного из самых распространенных маркеров апоптотичских клеток рассматривается фосфатидилсерин, для оценки которого применяется флуорохром-конъюгированный Ан-нексин V — плацентарный антикоагулянтный протеин с молекулярной массой 35 — 36 кДа. Однако из-за того, что перемещение фосфатидилсерина с внутренней поверхности цитоплазматической мембраны на наружную наблюдается и при некрозе, он используется вместе с такими катионными красителями, как 7-ADD или PI, которые связываются с неповрежденной ДНК, но способны проникать внутрь клетки только при нарушении целостности цитоплазматической мембраны. Комбинированная окраска Аннексином V и PI позволяет идентифицировать живые клетки (Аннексин V-/PI-), ранние проапоптотические изменения (Аннексин V+/PI-), позднюю стадию апоптоза, сопровождающуюся вторичным некрозом клеток, и некротический вариант клеточной гибели (PI+). Таким образом, метод позволяет отличить живые клетки от клеток, находящихся в стадии апоптоза, и некротических клеток. При использовании PI следует помнить, что эта краска может связываться и с двуцепочечной РНК, поэтому клетки необходимо обрабатывать РНКазой для увеличения специфичности окрашивания [20].

Одним из возможных методов изучения свойств цитоплазматической мембраны является оценка мембранного потенциала (у), изучение которого основано на применении потенциал-чувствительной флуоресцентной краски — Оксанол diBA-C4-(3).

Данная краска не обладает цитотоксическими действиями, не блокирует ионные каналы и не вытесняется насосами. Метод основан на том, что отрицательно заряженный оксанол распределяется на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны, согласно уравнению Нернста. Деполяризация приводит к накоплению оксанола в клетки и, таким образом, к увеличению флуоресценции. Наоборот, гиперполяризация характеризуется уменьшением интенсивности флуоресценции. Протокол включает построение кривой калибровки (интенсивность флуоресценции, измеряемой для окрашенных клеток, против внеклеточной концентрации краски). Это позволяет оценить мембранный потенциал в милливольтах, используя показания флуоресценции клеток в деполяризованном состоянии. Следует отметить, что данная методика открывает новые возможности для исследования ионных каналов в биологии клеточных популяций, поскольку ионные каналы играют важную роль в жизнедеятельности и активации клеток [12]. Однако мембранный потенциал, измеряемый с помощью флуоресцентных потенциал-чувствительной флуоресцентной краске красок-индикаторов, чувствительных к мембранному потенциалу, обычно не дает абсолютных величин измеряемого параметра.

КАСПАЗЫ

Апоптоз — сложный многостадийный процесс, в котором роль ключевых посредников играют каспазы — семейство цистеиновых протеаз. Активация каспаз рассматривается как один из ранних маркеров апоптоза. В большинстве случаев активация каспаз предшествует уменьшению клеточной проницаемости, фрагментации ДНК, разрушению цитоскелета и перемещению («flipping») фосфатидилсерина. Поэтому комбинирование методов исследования активации каспаз с методами исследования поздних стадий апоптоза может обеспечить более полной информацией о смерти клеток, особенно на ранних стадиях, когда развивается биохимический сигнальный путь активации апоптоза [2, 6, 17].

Наиболее важной и универсальной по своему участию в осуществлении апоптоза является каспаза-3. Активированная каспаза-3 является мощным маркером клеток, подвергшихся апопто-зу, и поэтому стала почти синонимом клеточной гибели [18]. Это связано с тем, что после активации протеолиза прокаспазы-3 процесс гибели клетки считается необратимым. Каспаза-9 также играет важную роль при всех заболеваниях, в патогенез которых вовлечен апоптоз. Методы по оценки активации каспаз могут быть применены в исследовании цитотоксического действия лекарственных средств на определенные типы клеток.

Каспазы могут быть детектированы тремя методами:

1. Определение активных форм каспаз с помощью высокоспецифичных пептидных субстратов. Эти синтетические пептидные субстраты разработаны таким образом, что при протеолитическом

расщеплении высвобождается флуорохром или хромофор, например, pNA (р-нитроанилид) или AMC (7-амино-4-метокси кумарин), которые легко детектируются на проточном цитометре.

2. Использование ингибиторов каспаз (FLI-CA — ингибиторы каспаз, меченные флуорохро-мом). FLICA содержат флуорометил-кетоновую группу (FMK), которая связывается со специфическими сайтами активированных каспаз. Преимуществами использования FMK является то, что он представляет собой высокопроницаемый, растворимый, нецитотоксичный ингибитор. Использование ингибиторов каспаз как ключевого антиапоптотического инструмента в исследовании позволяет оценить степень вовлеченности какой-либо каспазы в активацию апоптоза и изучить нижележащие события, вызванные тем или иным апоптотическим фактором.

3. Использование нефлуоресцирующих субстратов к ферментам, которые способны трансформироваться в флуоресцирующую форму при активации (PhiPhiLux). PhiPhiLux был разработан на основе родамина (или родамин-подобного флуо-рохрома), который димеризован с помощью пептидного линкера (например DEVDGI, специфичный для каспазы-3). Непосредственная близость этих двух молекул подавляет их флуоресценцию. В клетке при расщеплении пептидного линкера, который является субстратом для изучаемой каспазы, высвобождается два флуоресцентных мономера [11].

МИТОХОНДРИАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ

В настоящее время роль митохондрий в апоп-тозе — предмет интенсивного исследования. Разработанные методы контроля функционального статуса митохондрий необходимы для определения их роли в апоптозе при различных патологиях.

Одним из основных показателей апоптоза, который можно измерить с помощью проточной цитофлуорометрии, служит снижение трансмембранного потенциала (Ауш), что приводит к катастрофическим последствиям клеточного дыхания и энергетики. Ауш происходит в следствии формирования митохондриальных пор или мегаканалов, образование которых могут вызвать NO, каспазы. Для измерения Ауш применяются такие липофильные катионные флуорохромы, как JC-1, 3,3'-дигексилоксакарбоцианин (DiOC6), CMXRos (хлорметил-Х-розамин), TMRE (тетра-метилродамин), родамин-123 [8]. Так, например, наиболее широкое распространение получила JC-1 краска, которая представляет собой положительно заряженную молекулу. JC-1 существует в виде агрегатов и мономеров, которые характеризуются различными эмиссионными спектрами. Митохондрии здоровых клеток впитывают краску, что приводит к формированию агрегатов (яркокрасная флюоресценция с максимумом эмиссии 590 нм, регистрируемая в двух каналах — FL1, FL2). При деполяризации происходит утечка краски из митохондрий в цитоплазму в качестве мономеров

(зеленая флуоресценция с максимумом эмиссии 529 нм, регистрируемая только по FL-1) [3]. Применение JC-1 краски является общим для изучения апоптоза в данной области.

Маркером вовлечения митохондриального пути в осуществление программы апоптоза может свидетельствовать увеличение цитоплазматической концентрации цитохрома с, на высвобождение которого влияют белки семейства Bcl-2. Кроме того, количественная оценка белков-активаторов и -ингибиторов семейства Bcl-2 является общепринятым маркером тяжести заболевания при различной патологии. Его компенсаторное нарастание может быть пропорционально тяжести заболевания. Снижение уровня белка может трактоваться как легкая степень тяжести различных патологических процессов.

ФРАГМЕНТАЦИЯ ДНК

Апоптотические клетки отличаются от некротических структурированностью ядерной морфологии и деградацией ДНК, тогда как при некрозе эти два процесса неструктурированы.

На последних стадиях апоптоза под действием эндонуклеаз в цепочке ДНК образуются гидроксильные (3'-ОН) группы, которые являются общепринятым биохимическим индикатором апоптоза. Для обнаружения 3'-ОН групп используется TUNEL-метод (терминальное дезоксиуридиновое мечение). Данный метод заключается в инкубировании клеток с терминальной дезоксинуклеотид-трансферазой (TdT), которая катализирует прикрепление бромированных дезоксиуридин трифос-фатов (Br-dUTP) к 3'-ОН-концу одноцепочечной и двухцепочечной ДНК. После встраивания Br-dUTP эти сайты определяются с помощью проточной цитометрии при окрашивании клеток антителами к BrdU. Следует отметить, что перед началом окрашивания клетки необходимо фиксировать, например, парафармальдегидом для предотвращения потерь низкомолекулярных фрагментов ДНК [9, 19].

Высокоточное изучение синтеза ДНК обеспечивает иммунофлуоресцентное окрашивание бромдезоксиуридином (BrdU). В данном методе аналог тимидина BrdU встраивается во вновь синтезированную ДНК клеток на S-стадии клеточного цикла (стадии синтеза ДНК). Встроившийся BrdU окрашивается анти-BrdU флуорохром-меченными антителами. Степень встраивания BrdU (уровень BrdU, ассоциированного с клетками) измеряется на проточном цитофлуориметре. Часто проводят параллельное окрашивание общей ДНК клеток для подсчета и характеристики клеток в зависимости от стадии клеточного цикла (например, G0/1, S или G2/M фазы, определяемые по интенсивности связывания 7-AAD). Маркером апоптоза в данном случае будет рассматриваться появление субди-плоидного или гиподиплоидного пика (sub-G1) [4]. При некрозе появления sub-G1 пика не происходит, однако оно может наблюдаться при механическом повреждении клеток [15]. Важно отметить, что преимуществом данного метода является возможность использования дополнительных флуоресцентных

антител, специфичных к другим клеточным молекулам. Этими молекулами могут быть поверхностные антигены или внутриклеточные белки (например, цитокины, циклины и др.), экспрессия которых связана с активацией клеток, клеточным циклом или гибелью. Такое комбинирование реагентов позволяет определять экспрессию поверхностных или внутриклеточных белков относительно активности синтеза ДНК (по уровню встраивания BrdU) изучаемыми клетками.

Существует множество факторов, влияющих на плоидность и жизненный цикл клетки. Поэтому следует помнить, что при сочетании в исследовании проточной ДНК-цитометрии с другими методами можно оценить плоидность клеток и определить долю клеток, находящихся в различных фазах митотического цикла (G0/G1, S и G2 + M), что дает более детализированную информацию относительно природы клеток и специфики клеточного цикла апоптотических клеток. Кроме того, измерение частоты встречаемости и фенотипических особенностей клеток, синтезирующих ДНК, а также их прохождение через клеточный цикл, обеспечивает существенную информацию для того, чтобы определить клеточные механизмы, которые лежат в основе иммунитета, воспаления, гематопоэза, неоплазии и других биологических ответов. В связи с этим проточная ДНК-цитометрия становится ценным диагностическим методом.

ДРУГИЕ МАРКЕРЫ АПОПТОЗА

Маркерами апоптоза также рассматриваются транскрипционные факторы (р53 и NF-kB), цитокины, гранзимы (A и В) и перфорин, белки теплового шока (внутриклеточные, внеклеточные и мембранные), образраспознающие рецепторы (Toll-подобные рецепторы, TWEAK, CD40), F-актин (флуоресцирующий фаллотоксин) и активные формы кислорода.

Роль цитокинов в регуляции апоптоза далеко не однозначна: для одних клеток они выступают в роли индуктора апоптоза, для других — в роли ингибитора. Эффект зависит от вида цитокина, от типа клеток, на которые направлено воздействие, от уровня их дифференцировки. Например, ИЛ-12 индуцирует апоптоз NK-клеток, ИЛ-4 и ИЛ-10 — периферических моноцитов человека, ИЛ-10 — Т-лимфоцитов. Кроме того, ИЛ-2, -4, -7 и -15, а также ИФН-а и -р полностью предотвращают гибель активированных Т-клеток in vitro. Важным свойством ИЛ-12 является усиление экспрессии FasL и индукция апоптоза. Центральное место в этом процессе, по мнению некоторых исследователей, принадлежит фактору некроза опухоли, поскольку достоверно известно, что он является потенциальным индуктором апоптоза, и уровень этого агрессивного цитокина коррелирует с интенсивностью апоптозного процесса. В связи с этим комплексная оценка про- и противовоспалительных цитокинов-модуляторов программируемой гибели клеток на различных стадиях патологического процесса многих заболеваний поможет углубить наше понимание механизмов дис-

регуляции этих процессов и, возможно, подскажет пути их преодоления [1].

Изучение экспрессии транскрипционных факторов также играет важную роль, поскольку они участвуют в регуляции индуцирования экспрессии ряда генов, которые отвечают за выживание и/или удаление клеток с помощью механизмов апоптоза. Уровень экспрессии перфорина в эф-фекторных лимфоцитах можно расценивать как маркер, свидетельствующий о цитотоксической активности клеток. Активные формы кислорода могут изменять соотношение между про- и анти-апоптотическими протеинами семейства Bcl-2, являющимися ключевыми регуляторами программируемой гибели клеток. Известно, что синтез ряда белков данного семейства находится под контролем редокс-чувствительных транскрипционных факторов, в частности, р53 активирует экспрессию Bid, а NF-kB — Bcl-xL. Таким образом, активные формы кислорода, являясь вторичными мессенджерами, могут изменять функционирование клетки вплоть до запуска в ней суицидальной программы. Учитывая ключевую роль дизрегуляции апоптоза в патогенезе ряда распространенных заболеваний человека, изучение роли окислительного стресса в механизмах изменения реализации программированной гибели клеток позволит создать новые патогенетически обоснованные технологии терапии социально значимых заболеваний.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Интерес к апоптозу в последние годы связан прежде всего с нарушением регуляции программируемой гибели клеток при инфекционных и вирусных заболеваниях, возбудители которых используют апоптоз в целях своей выгоды. Поэтому исследования в области апоптоза открывают новые перспективы в клеточной биологии и иммунологии. С помощью проточной цитометрии исследователи могут оценивать потенциальную уязвимость клеток со стороны различных факторов, регулирующих апоптоз. Кроме того, комплексное исследование апоптозных маркеров (рецепторы, цитокины, каспазы и т.д.) позволяет более полно охарактеризовать течение заболевания, динамику апоп-тотического процесса и понять патогенез многих заболеваний. Изучение механизмов регуляции различных этапов апоптоза с помощью проточной цитофлюориметрии позволяет определенным образом воздействовать на его отдельные этапы с целью их регуляции или коррекции.

Осознание роли апоптоза в повреждении определенных органов, тканей и клеток при различных патологиях способствует поиску новых подходов терапии, связанной с воздействием на иммунные механизмы регуляции гибели клеток (цитокины, иммуномодуляторы). Оценить эффективность применения таких лекарств может помочь проточная цитометрия с помощью определения характерных маркеров апоптоза.

Таким образом, проточная цитометрия может быть применена в фундаментальных исследова-

ниях для идентификации и измерения количества апоптотических клеток. Выбор специфического метода зависит от нескольких переменных (клеточная система, тип проточного цитометра, тип апоптоза, тип индуктора апоптоза). Однако независимо от метода, используемого для оценки апоптоза, в большинстве ситуаций необходимо подтверждать тип клеточной смерти с помощью исследования образца под микроскопом. Апоптотические клетки проявляют определенные морфологические изменения под световым, электронным и флуоресцентным микроскопом, что должно быть решающим фактором в двусмысленных ситуациях. Кроме того необходимо отметить, что апоптоз — последовательный процесс, который в зависимости от типа клеток и индуктора длятся около 1—8 часов, поэтому любой метод имеет оптимальное временя анализа апоптотического процесса.

В заключение стоит сказать, что, несмотря на некоторые нюансы, методы проточной цитоматрии могут обеспечить определенную количественную оценку апоптоза во всех ситуациях и поэтому представляются очень полезными для разнообразия биологических и клинических исследований, требующих количественной информации о смерти клеток.

ЛИТЕРАТУРА

1. Цыпленкова В. Г., Бескровнова Н. Н. Апоптоз (обзор) // Архив патологии. — 1996. — № 5. —

С. 71-77.

2. Castedo M., Hirsch T., Susin S.A. et al. Sequential acquisition of mitochondrial and plasma membrane alterations during early lymphocyte apoptosis / J. Immunol. - 1996. - Vol. 157 - P. 512-521.

3. Cossarizza A., Kalashnikova G., Crassilli E. et al. Mitochondrial modifications during rat thymocyte apoptosis: a study at the single cell level // Exp. Cell Res. - 1994. - Vol. 214, N 1. - P. 323-330.

4. Darzynkiewicz Z., Bruno S., Del Bino G. et al. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry // Cytometry. - 1992. - Vol. 13. - Р. 795-808.

5. Darzynkiewicz Z., Li X., Gong J. Assays of cell viability: discrimination of cells dying by apoptosis // Methods Cell Biol. - 1994. - Vol. 41. -P. 15-38.

6. Earnshaw W.C., Martins L.M., Kaufmann S.H. Mammalian caspases: structure, activation, substrates and functions during apoptosis // Annu. Rev. Bio-chem. - 1999. - Vol. 68. - P. 383-424.

7. Fadeel B., Gleiss B., Hogstrand K. et al. Phos-phatidylserine exposure during apoptosis is a cell-type-specific event and does not correlate with plasma membrane phospholipid scramblase expression // Bio-chem. Biophys. Res. Commun. - 1999. - Vol. 266, N 2. - P. 504-511.

8. Galluzzi L., Zamzami N., de La Motte Rouge T. et al. Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis / / Apopto-sis. - 2007. - Vol. 12. - P. 803-1

9. Gavrieli Y., Sherman Y., Ben-Sasson S.A. Identification of programmed cell death in situ via

specific labeling of nuclear DNA fragmentation. // J. Cell Biol. - 1992. - Vol. 119, N 3. - P. 493-501.

10. Kerr J.K, Wyilie A.H., Currie A. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics // Br. J. Cancer. - 1972. -Vol. 26. - P. 239-257.

11. Komoriya A., Packard B.Z., Brown M.J. et al. Assessment of caspase activities in intact apoptotic thymocytes using cell-permeable fluorogenic caspase substrates // J. Exp. Med. - 2000. - Vol. 191. -P. 1819-1828.

12. Krasznai Z., Márián T., Balkay L., Emri M. et al. Flow cytometric determination of absolute membrane potential of cells // J. Photochem. Photobiol. B. -1995. - Vol. 28. - P. 93-99.

13. M-Rubeai M. Flow cytometry applications in cell culture. - 1996. - 331 р.

14. Majno G., Joris I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death // Am. J. Pathol. -1995. - Vol. 146, N 1. - P. 3-15.

15. Nicoletti I., Migliorati G., Pagliacci M.C. et al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry // J. Immunol. Meth. — 1991. — Vol. 139. — P. 271 -279.

16. Ormerod M.G. Flow cytometry: A practical approach ; 3rd edit. — Oxford : Oxford University Press, 2000. — 276 p.

17. Overbeek R., Yildirim M., Reutelingsperger C., Haanen C. Early features of apoptosis detected by four different flow cytometry assays // Apoptosis. — 1998. — Vol. 3. — P. 115 — 120.

18. Patel T., Gores G.J., Kaufmann S.H. The role of proteases during apoptosis // FASEB J. — 1996. — Vol. 10. — P. 587 — 597.

19. Sanders E.J., Wride M.A. Ultrastructural identification of apoptotic nuclei using the TUNEL technique // Histochem. J. — 1996. — Vol. 28, N. 4. — Р. 275 — 281.

20. Shapiro H.M. Practical flow cytometry. — N.-Y. : Alan R. Liss, Inc., 1988. — 353 p.

Сведения об авторе

Войткова Валентина Владимировна - младший научный сотрудник лаборатории патофизиологии Иркутского научноисследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г Иркутск, ул. Трилиссера, д. 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35; e-mail: vvoitkova@mail.ru).