СПОСОБ ОЦЕНКИ ИЗМЕНЕНИЯ СОСТОЯНИЯ ЦИТОСКЕЛЕТА ЭРИТРОЦИТОВ
METHOD OF ESTIMATING CHANGE IN ERYTHROCYTE CYTOSKELETON CONDITION

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным методам исследований.
Известен способ оценки изменения состояния цитоскелета эритроцитов, взятый за прототип (Mohandas N. et al., Blood. V.59. P.768-774), включающий выделение эритроцитов из крови, получение из них замкнутых теней и определение механической стабильности при высокой скорости сдвига. Однако способ трудоемок (получение замкнутых теней) и требует дорогого специального оборудования (эктацитометра).
Задача создания нового, несложного, высокочувствительного, не требующего специального оборудования, способа определения изменения состояния цитоскелета эритроцитов является актуальной.
Задача достигается способом, который заключается в том, что эритроциты выделяют из крови, помещают в кювету агрегометра, куда в качестве агента, вызывающего агрегацию эритроцитов, добавляют хлористый лантан до конечной концентрации 400-600 мкМ. Процесс агрегации регистрируется фотоколориметрически с записью на самописце в виде агрегатограммы. Об изменении состояния цитоскелета эритроцитов судят по снижению агрегационной способности эритроцитов.
Способ упрощает процедуру оценки изменения состояния цитоскелета эритроцитов.
Способ осуществляется следующим образом. Эритроциты трижды отмывают от плазмы и белых клеток центрифугированием в 10-кратном объеме физиологического раствора. Отмытые эритроциты ресуспендируют в соотношении 1:200 в забуференном физиологического растворе (10 мМ трис-HCl, 146 мМ NaCl, pH 7.4), после чего суспензию клеток помещают в кювету для изучения агрегации и добавляют хлористый лантан до конечной концентрации 400-600 мкМ. Регистрацию агрегационной способности эритроцитов осуществляют фотометрическим методом (Шереметьев Ю.А. и др. Биофизика. 2000. Т.45. №1. С.79-82).
Известно, что при pH среды выше 8,0 и при повышенном содержании внутриклеточного АТФ в эритроцитах происходит снижение стабильного состояния цитоскелета (Low P.S. et al., Blood 1991. Vol.7. P.1581-1586; Sheetz M.P., Casaly J.J. Biol. Chem. 1980. Vol.255. P.9955-9960).
Нами выяснено, что при высоких концентрациях хлористого лантана (400-600 мкМ) у эритроцитов с измененным состоянием цитоскелета происходит снижение агрегационной способности.
Пример 1. Оценка изменения состояния цитоскелета эритроцитов, инкубированных при pH 8,5. Из таблицы видно, что после инкубации суспензии эритроцитов при pH 8,5 в течение 10 мин происходит снижение их агрегационной способности после добавления 500 мкМ хлористого лантана.
2
4
Пример 2. Оценка изменения состояния цитоскелета эритроцитов, имеющих повышенный уровень АТФ. Эритроциты с повышенным уровнем АТФ (уровень АТФ повышался до 2,86±0,17 мкмоль/мл относительно 1,16±0,08 мкмоль/мл в контроле) получали после их инкубации в буферной среде (15 мМ трис-HCl, 146 мМ NaCl, pH 7,6), содержащей 2 мМ аденина, 10 мМ инозина, 10 мМ глюкозы и 150 мМ NaHPO в течение 15 ч при 37°С.
Из таблицы видно, что при повышении АТФ в эритроцитах происходит снижение их агрегационной способности после добавления 500 мкМ хлористого лантана.
Приведенные примеры показывают возможности применения способа оценки изменения состояния цитоскелета эритроцитов.
Концентрация лантана, мкМ
Максимальная амплитуда агрегатограммы, мм
Контроль
Эритроциты с повышенным уровнем АТФ
pH 8,5
500
60,20±4,50
30,15±3,45
33,61±3,60