ХИМЕРНЫЙ ВИРУС РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ И ВАКЦИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННОГО ВИРУСА
CHIMERIC PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS AND VACCINE USING SAID VIRUS

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к химерному вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), который может быть использован в качестве вакцины, и химерный вирус по настоящему изобретению имеет низкую патогенность и высокую безопасность по сравнению с его исходным штаммом. Химерный PRRSV-вирус по настоящему изобретению может усиливать секрецию нейтрализующих антител, связанных с перекрестным иммунитетом, и обеспечить вакцину, которая сможет обеспечить эффективную защиту от репродуктивно-респираторного синдрома свиней.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Репродуктивно-респираторный синдром свиней (называемый далее PRRS) представляет собой инфекционное заболевание, наносящее наибольший ущерб свиноводству, наряду с цирковирусной инфекцией свиней и ящуром. PRRS приводит к стерильности у беременных свиней, репродуктивным расстройствам, таким как невынашивание, преждевременные роды или мертворождение, и к респираторным симптомам, таким как чихание, лихорадка и тому подобное, у молочных поросят и свиней в завершающей стадии откорма. Обычно тяжелые респираторные симптомы вызваны вторичными бактериальными или тому подобными инфекциями, развивающимися после инфицирования вирусом, но в случае хронической инфекции происходят уменьшение прибавки веса и повышение смертности без характерных клинических симптомов.
Это вирусное заболевание было впервые обнаружено в 1987 г. в Соединенных Штатах Америки, затем в Европе и в начале 90-х годов XX века было выявлено в Азии. До настоящего времени PRRS был эндемичен для стран с развитым свиноводством и распространился по всему миру, приводя к колоссальным экономическим потерям каждый год.
Возбудителем PRRS является вирус PRRS, принадлежащий к роду Arterivirus, семейству Arteriviridae и порядку Nidovirales. Вирус PRRS имеет геном из положительной смысловой одноцепочечной РНК и размер приблизительно 15,4 тысяч пар оснований (т.п.о.). В геноме вируса PRRS есть девять открытых рамок считывания (ORF) (Conzelmann et al., 1993; Meulenberg et al, 1993). Из них ORF1a и ORF1b, кодирующие неструктурные белки (NSP), составляют приблизительно 80% генома вируса (Bautista et al, 2002; Meulenberg et al., 1993; Snijder and Meulenberg, 1998, 2001). Известно, что из этих неструктурных белков NSP1-альфа, NSP1-бета и NSP2-NSP8 расположены в ORF1a, a NSP9-NSP12 - в ORF1b. ORF2-7, составляющие оставшиеся 20%, кодируют гликозилированные структурные белки GP2, GP3, GP4 и GP5, негликозилированный мембранный белок (М) и белок нуклеокапсида (N). Малые структурные белки GP2, GP3 и GP4 образуют гетеротримеры и действуют при проникновении вируса в клетку-хозяина, а большие структурные белки GP5 и М образуют гетеродимеры и действуют, повышая инфекционность вируса.
PRRS-вирус сильно мутирует ввиду его РНК-вирусной природы, поэтому между вирусами есть множество различий. PRRS-вирус разделяют главным образом на североамериканский тип и европейский тип. Существует тип I (Лелистадский вирус, LV), являющийся представителем европейского типа, и тип II, являющийся представителем североамериканского типа вирусного штамма (североамериканского штамма) АТСС VR2332 (последовательность генома VR2332 приведена в GenBank под регистрационным номером AY150564) (Murtaugh et al., Arch Virol. 1995; 140:1451-1460).
Известно, что степень различия генов североамериканского типа и европейского типа достигает 40%, поэтому перекрестная защита от обоих типов невозможна. Кроме того, часто не удается получить перекрестную защиту даже от мутантных штаммов, принадлежащих к одному и тому же типу (Meng, X.J. et al., 2000). Поэтому для каждого типа была изготовлена вакцина на основе стандартного мутантного штамма, но это не позволяет эффективно предупреждать PRRS из-за ее недостаточной способности обеспечивать перекрестную защиту. Для решения этой проблемы были предприняты различные попытки изготовить вакцину, эффективно обеспечивающую безопасность, иммуногенность и защиту.
В силу тяжести данного заболевания на протяжении приблизительно 20 лет, начиная с открытия вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), являющегося возбудителем репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), значительные усилия были вложены в разработку метода предупреждения инфекции, вызываемой данным вирусом, однако методы ее предупреждения и лечения до настоящего времени не разработаны. Для контроля над репродуктивно-респираторым синдромом свиней (PRRS) были разработаны различные вакцины, такие как инактивированные вакцины и ослабленные живые вакцины, но было обнаружено, что только ослабленные вакцины, обладающие инфекционной способностью, приводят к желаемому уровню защитного эффекта. Тем не менее, обеспечить защиту от разных вирусов репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV) с использованием одной вакцины затруднительно ввиду отсутствия перекрестного иммунитета к разным типам вирусов из-за широкого разнообразия вирусов репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV). Кроме того, существующие ослабленные вакцины могут быть получены только последовательным пассажем из 100-200 или более пассажей в клеточных линиях других видов животных, что приводит к продолжительному периоду разработки, и при этом трудно гарантировать эффективность и безопасность. Поэтому для каждого типа была изготовлена вакцина на основе стандартного мутантного штамма, но это не позволяет эффективно предупреждать PRRS из-за ее недостаточной способности обеспечивать перекрестную защиту.
Для решения этой проблемы были предприняты различные попытки изготовить вакцину, эффективно обеспечивающую безопасность, иммуногенность и защиту (заявка №10-2011-7004020; название изобретения: «Вакцина от высоко патогенного репродуктивно-респираторного синдрома свиней (HP-PRRS)»).
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая задача
Настоящее изобретение относится к химерному вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), который имеет низкую патогенность и высокую безопасность и усиливает секрецию нейтрализующих антител, к вакцине, содержащей указанный вирус, и к способу ее получения.
В одном примере химерный вирус может содержать
(1) нуклеиновокислотную последовательность открытой рамки считывания 1а (ORF1a) и ORF1b, имеющую происхождение из мутантного штамма LMY ver2 с регистрационным номером KСТС 13394 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, на 70% или более гомологичную указанной нуклеиновокислотной последовательности, сохраняющую в то же время функциональную эквивалентность указанной последовательности, и
(2) нуклеиновокислотную последовательность областей ORF2-ORF7 выделенного штамма ВР2017-2, имеющего регистрационный номер KCTC 13393 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, на 70% или более гомологичную указанной нуклеиновокислотной последовательности, сохраняющую в то же время функциональную эквивалентность указанной последовательности.
Техническое решение
Настоящее изобретение относится к химерному вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), который может быть использован в качестве вакцины. Химерный PRRSV-вирус по настоящему изобретению является ослабленным и поэтому имеет низкую патогенность и высокую безопасность по сравнению с его исходным штаммом и усиливает секрецию нейтрализующих антител, связанных с перекрестным иммунитетом, значительно усиливая посредством этого иммунитет у свиней. Соответственно, он может быть использован в качестве эффективной вакцины для предупреждения и лечения PRRS-заболевания.
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.
При использовании здесь «ослабленный вирус» относится к нетоксичному вирусу, способному индуцировать иммунный ответ у целевого млекопитающего, не приводя к клиническим признакам PRRS-заболевания, и также относится к уменьшению клинических признаков у животных, инфицированных ослабленным вирусом или не получающих ослабленный вирус, или к уменьшению тяжести признаков по сравнению с «контрольными» животными, инфицированными неослабленным вирусом PRRS. В данном контексте термин «уменьшение/уменьшенный» означает уменьшение по меньшей мере на 10%, предпочтительно 25%, более предпочтительно 50% или, наиболее предпочтительно, 100% или более по сравнению с контролем, как определено выше.
При использовании здесь «вакцинная композиция» может представлять собой химерный вирус PRRS или любой его иммуногенный фрагмент или участок, предпочтительно ослабленный химерный вирус PRRS, например, химерный вирус PRRS по настоящему изобретению. Это приводит к «иммунному ответу», такому как клеточный и/или антитело-опосредованный иммунный ответ на PRRSV. Предпочтительно, чтобы вакцинная композиция была способна обеспечивать профилактический иммунитет от PRRSV-инфекции и связанных с ней клинических признаков.
При использовании здесь «иммунный ответ» означает любой клеточно- и/или антитело-опосредованный иммунный ответ на химерный вирус или вакцину при их введении животному, которому вводят химерный PRRSV-вирус по настоящему изобретению или вакцинную композицию, содержащую указанный вирус. Обычно «иммунный ответ» включает, без ограничения, один или более из следующих эффектов: появление или активацию антигенов, входящих в состав соответствующей композиции или вакцины, или антител, В-клеток, хелперных Т-клеток, ингибирующих Т-клеток, и/или цитотоксических Т-клеток, и/или у5 Т-клеток, специфично индуцированных против антигенов. Предпочтительно, чтобы хозяин демонстрировал терапевтический или профилактический иммунный ответ, улучшающий резистентность к новой инфекции и/или уменьшающий клиническую тяжесть заболевания по сравнению с контролем, не получающим иммуногенную композицию или вакцину. Это предупреждение будет продемонстрировано, в наиболее благоприятном случае, отсутствием симптомов, связанных с указанной выше инфекцией у хозяина, и, включая это, уменьшением частоты или тяжести.
При использовании здесь «свиньи», «свинья» и «поросята» могут быть использованы совместимым образом.
«Приведение в контакт с вакциной» или «введение вакцины» означает введение химерного PRRSV-вируса или вакцины, содержащей указанный химерный PRRSV-вирус, описанный здесь, до воздействия, приводящего к PRRS-заболеванию.
«Предупреждать» или «предупреждение» означает уменьшение частоты клинического проявления PRRS или тяжести или частоты симптомов в результате введения PRRSV-вируса или вакцинной композиции, содержащей указанный PRRSV-вирус, по настоящему изобретению. Уменьшение тяжести или частоты является результатом сравнения с животным или группой животных без введения химерного PRRSV-вируса или вакцинной композиции, содержащей указанный PRRSV-вирус, по настоящему изобретению. Предпочтительно, животное может представлять собой свинью.
Для удобства последовательности, указанные здесь, описаны, исходя из ДНК-нуклеотидов, и в случае полинуклеотидов РНК-типа это означает последовательность, где весь тимин (Т) нуклеотидной последовательности или его часть заменены на урацил (U).
Здесь «состоящий из последовательности» применительно к определенной нуклеотидной последовательности и/или аминокислоте включает все из содержащего указанную последовательность, по существу содержащего указанную последовательность и/или состоящего из указанной последовательности, и, по необходимости, они могут быть соответствующим образом заменены и использованы.
Согласно настоящему изобретению предложен ослабленный химерный вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), представляющего собой вирусное заболевание, поражающее свиней.
Для решения указанной задачи, согласно настоящему изобретению, предложен полинуклеотид, содержащий структуру структурной формулы 1:
[структурная формула 1]
5'-[X]-[Y]-3'.
В указанной формуле [X] представляет собой нуклеиновокислотную последовательность генов областей ORF1a и ORF1b мутантного штамма LMY ver2, имеющего регистрационный номер 13394 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, на 70% или более гомологичную нуклеиновокислотной последовательности генов областей ORF1a и ORF1b, содержащую нуклеиновокислотную последовательность генов NSP1 (гена NSP1-альфа и гена NSP1-бета) мутантного штамма LMY ver2, имеющего регистрационный номер KСТС 13394 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеиновокислотной последовательности, например, содержащую
нуклеиновокислотную последовательность генов NSP1 мутантного штамма LMY ver2, или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеиновокислотной последовательности, и [Y] представляет собой нуклеиновокислотную последовательность генов областей ORF2-ORF7 мутантного штамма ВР2017-2, имеющего регистрационный номер KСТС 13393 BP, или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеиновокислотной последовательности. При использовании здесь «равная функция» может означать функцию, такую же, как желаемая функция, или качественно (активность) и/или количественно (уровень) сходную с ней. Например, аминокислотная последовательность белка, кодируемого рассматриваемым геном, может быть такой же, как аминокислотная последовательность белка, кодируемого геном дикого типа.
В одном примере [X] может содержать все виды точковых мутаций (молчащая мутация) в диапазоне, позволяющем сохранять аминокислотную последовательность белка NSP1, кодируемого геном NSP1, в нуклеиновокислотной последовательности гена NSP1, состоящей из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 11, и, например, он может быть выбран и использован свободным образом в диапазоне, направленном на уменьшение СВР-показателя гена NSP1.
Например, [X] может представлять собой мутацию, где заменены одно или более, 25 или более, 66 или более, 80 или более или все из 91 основания, выбранные из группы, состоящей из положения 222, положения 225, положения 237, положения 240, положения 252, положения 306, положения 309, положения 312, положения 315, положения 324, положения 327, положения 330, положения 333, положения 336, положения 339, положения 342, положения 345, положения 357, положения 363, положения 366, положения 378, положения 379, положения 381, положения 393, положения 396, положения 543, положения 546, положения 549, положения 555, положения 558, положения 561, положения 573, положения 579, положения 582, положения 588, положения 612, положения 618, положения 621, положения 627, положения 633, положения 639, положения 654, положения 673, положения 675, положения 678, положения 681, положения 684, положения 705, положения 708, положения 729, положения 735, положения 738, положения 741, положения 744, положения 747, положения 771, положения 786, положения 789, положения 792, положения 810, положения 825, положения 828, положения 838, положения 840, положения 846, положения 849, положения 858, положения 867, положения 879, положения 882, положения 885, положения 891, положения 900, положения 903, положения 906, положения 924, положения 936, положения 939, положения 948, положения 954, положения 963, положения 966, положения 1026, положения 1029, положения 1038, положения 1047, положения 1053, положения 1066, положения 1068, положения 1086, положения и положения 1110 нуклеиновокислотной последовательности гена NSP1, состоящей из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 11.
В одном примере [X] может содержать, в нуклеиновокислотной последовательности гена NSP1, состоящей из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 11, одну или более, 25 или более, 66 или более, 80 или более или все из 91 мутации, выбранные из группы, состоящей из мутации, где G в положении 222 заменен на С, мутации, где С в положении 225 заменен на А, мутации, где Т в положении 327 заменен на С, мутации, где А в положении 240 заменен на Т, мутации, где Т в положении 252 заменен на С, мутации, где А в положении 306 заменен на С, мутации, где Т в положении 309 заменен на С, мутации, где G в положении 312 заменен на А, мутации, где С в положении 315 заменен на А, мутации, где Т в положении 324 заменен на С, мутации, где С в положении 327 заменен на G, мутации, где G в положении 330 заменен на А, мутации, где С в положении 333 заменен на Т, мутации, где С в положении 336 заменен на G, мутации, где Т в положении 339 заменен на С, мутации, где А в положении 342 заменен на Т, мутации, где Т в положении 345 заменен на А, мутации, где А в положении 357 заменен на G, мутации, где Т в положении 363 заменен на А, мутации, где Т в положении 366 заменен на С, мутации, где С в положении 378 заменен на Т, мутации, где С в положении 379 заменен на А, мутации, где С в положении 381 заменен на G, мутации, где Т в положении 393 заменен на С, мутации, где Т в положении 396 заменен на А, мутации, где Т в положении 543 заменен на С, мутации, где Т в положении 546 заменен на С, мутации, где С в положении 549 заменен на А, мутации, где Т в положении 555 заменен на С, мутации, где Т в положении 558 заменен на С, мутации, где Т в положении 561 заменен на А, мутации, где С в положении 573 заменен на Т, мутации, где Т в положении 579 заменен на С, мутации, где G в положении 582 заменен на Т, мутации, где Т в положении 588 заменен на С, мутации, где Т в положении 612 заменен на С, мутации, где G в положении 618 заменен на С, мутации, где Т в положении 621 заменен на С, мутации, где А в положении 627 заменен на Т, мутации, где Т в положении 633 заменен на С, мутации, где Т в положении 639 заменен на G, мутации, где С в положении 654 заменен на Т, мутации, где С в положении 673 заменен на Т, мутации, где С в положении 675 заменен на А, мутации, где С в положении 678 заменен на Т, мутации, где С в положении 681 заменен на G, мутации, где С в положении 684 заменен на G, мутации, где G в положении 705 заменен на С, мутации, где С в положении 708 заменен на Т, мутации, где А в положении 729 заменен на С, мутации, где Т в положении 735 заменен на С, мутации, где G в положении 738 заменен на Т, мутации, где Т в положении 741 заменен на С, мутации, где Т в положении 744 заменен на С, мутации, где Т в положении 747 заменен на А, мутации, где Т в положении 771 заменен на С, мутации, где Т в положении 786 заменен на С, мутации, где С в положении 789 заменен на Т, мутации, где Т в положении 792 заменен на G, мутации, где С в положении 810 заменен на Т, мутации, где Т в положении 825 заменен на С, мутации, где С в положении 828 заменен на Т, мутации, где Т в положении 838 заменен на С, мутации, где G в положении 840 заменен на С, мутации, где С в положении 846 заменен на G, мутации, где G в положении 849 заменен на А, мутации, где А в положении 858 заменен на G, мутации, где Т в положении 867 заменен на С, мутации, где Т в положении 879 заменен на С, мутации, где С в положении 882 заменен на G, мутации, где С в положении 885 заменен на Т, мутации, где С в положении 891 заменен на Т, мутации, где Т в положении 900 заменен на С, мутации, где С в положении 903 заменен на А, мутации, где Т в положении 906 заменен на С, мутации, где G в положении 924 заменен на Т, мутации, где Т в положении 936 заменен на С, мутации, где Т в положении 939 заменен на С, мутации, где А в положении 948 заменен на С, мутации, где А в положении 954 заменен на С, мутации, где А в положении 963 заменен на Т, мутации, где Т в положении 966 заменен на С, мутации, где А в положении 1026 заменен на G, мутации, где G в положении 1029 заменен на С, мутации, где С в положении 1038 заменен на Т, мутации, где Т в положении 1047 заменен на С, мутации, где Т в положении 1053 заменен на С, мутации, где А в положении 1066 заменен на С, мутации, где А в положении 1068 заменен на С, мутации, где С в положении 1086 заменен на Т, и мутации, где Т в положении 1110 заменен на С.
Например, [X] может представлять собой нуклеиновокислотную последовательность гена NSP1 (SEQ ID NO: 12) и/или NSPl-бета (SEQ ID NO: 1; участок из 609 5'-концевых оснований SEQ ID NO: 12) мутантного штамма LMY ver2, имеющего регистрационный номер 13394 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеиновокислотной последовательности.
Кроме того, [Y] может представлять собой нуклеиновокислотную последовательность генов областей ORF2-ORF7 мутантного штамма ВР2017-2, имеющего регистрационный номер KСТС 13393 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеиновокислотной последовательности.
Согласно одному примеру настоящего изобретения, возможно также присутствие [А]n на 3'-конце [Y] структурной формулы 1. Указанное n представляет собой количество нуклеотидов, содержащих основание А, и может представлять собой целое число от 10 до 100. Предпочтительно, оно может представлять собой целое число от 10 до 80, от 10 до 70, от 10 до 60, от 10 до 50, от 10 до 40, от 10 до 30, от 15 до 80, от 15 до 70, от 15 до 60, от 15 до 50, от 15 до 40, от 15 до 30, от 20 до 30, от 20 до 26.
Полинуклеотид может представлять собой РНК, обратный транскриптом РНК (ДНК) или их комбинацию. Указанный полинуклеотид может функционировать как геном химерного PRRSV-вируса.
Соответственно, согласно другому примеру настоящего изобретения предложен химерный вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), содержащий полинуклеотид, имеющий структуру структурной формулы 1. Геном химерного PRRSV-вируса может представлять собой ДНК или РНК, предпочтительно РНК.
[X] соответствует области гена NSP1, содержащей NSP1-бета мутантного штамма LMY ver2, имеющего регистрационный номер 13394 ВР, и может представлять собой генный фрагмент, полученный обработкой генома мутантного штамма LMY ver2 рестриктазами AscI и PacI, и, например, может содержать нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 12 или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеотидной последовательности.
[Y] соответствует областям ORF2-ORF7 мутантного штамма ВР2017-2, имеющего регистрационный номер KСТС 13393 ВР, и может представлять собой генный фрагмент, полученный обработкой генома мутантного штамма ВР2017-2 рестриктазами AscI и PacI, и, например, может содержать нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеиновокислотной последовательности.
В одном примере структурная формула 1 может содержать нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеиновокислотной последовательности. Например, она может представлять собой нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
В Таблице 1 ниже часть, выделенная полужирным шрифтом, в нуклеотидной последовательности гена NSP1 LMY ver2 представляет собой область NSP1-бета.
(В приведенной таблице полинуклеотид (РНК), предложенный здесь, может содержать нуклеиновокислотную последовательность, где в последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1-4, Т заменены на U.)
Согласно настоящему изобретению, предложен химерный PRRSV-вирус, содержащий полинуклеотид структурной формулы 1 в качестве генома. Химерный PRRSV-вирус может включать вирусное потомство, культивированное в 1-80 пассажах, 1-70 пассажах, 1-60 пассажах, 1-50 пассажах, 1-40 пассажах, 1-30 пассажах, 1-20 пассажах или 1-10 пассажах.
[структурная формула 1]
5'-[X]-[Y]-3'.
В приведенной формуле [X] представляет собой нуклеиновокислотную последовательность гена NSP1 и/или NSP1-бета мутантного штамма LMY ver2, имеющего регистрационный номер 13394 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, на 70% или более гомологичную указанной нуклеиновокислотной последовательности, и [Y] представляет собой нуклеиновокислотную последовательность генов областей ORF2-ORF7 мутантного штамма ВР2017-2, имеющего регистрационный номер KCTC 13393 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, на 70% или более гомологичную указанной нуклеиновокислотной последовательности.
Например, [X] может представлять собой нуклеиновокислотную последовательность гена NSP1 и/или NSP1-бета мутантного штамма LMY ver2, имеющего регистрационный номер 13394 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более гомологичную указанной нуклеиновокислотной последовательности.
Кроме того, [Y] может представлять собой нуклеиновокислотную последовательность генов областей ORF2-ORF7 мутантного штамма ВР2017-2, имеющего регистрационный номер KСТС 13393 ВР, или нуклеиновокислотную последовательность, на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более гомологичную указанной нуклеиновокислотной последовательности.
Согласно одному примеру настоящего изобретения, возможно также присутствие [А]n на 3'-конце [Y] структурной формулы 1. Указанное n представляет собой количество нуклеотидов, содержащих основание А, и может представлять собой целое число от 10 до 100, и, например, может представлять собой целое число от 10 до 80, от 10 до 70, от 10 до 60, от 10 до 50, от 10 до 40, от 10 до 30, от 15 до 80, от 15 до 70, от 15 до 60, от 15 до 50, от 15 до 40, от 15 до 30, от 20 до 30, от 20 до 26.
Полинуклеотид может представлять собой РНК, обратный транскриптом РНК (ДНК) или их комбинацию. Указанный полинуклеотид может функционировать как геном химерного PRRSV-вируса. Соответственно, согласно другому примеру настоящего изобретения, предложен химерный вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), содержащий полинуклеотид, имеющий структуру структурной формулы 1. Геном химерного PRRSV-вируса может представлять собой ДНК или РНК, предпочтительно РНК.
[X] соответствует области гена NSP1, содержащей NSP1-бета мутантного штамма LMY ver2, имеющего регистрационный номер 13394 ВР, и может представлять собой генный фрагмент, полученный обработкой генома мутантного штамма LMY ver2 рестриктазами AscI и PacI, и, например, может содержать нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеотидной последовательности.
[Y] соответствует областям ORF2-ORF7 мутантного штамма ВР2017-2, имеющего регистрационный номер KСТС 13393 ВР, и может представлять собой генный фрагмент, полученный обработкой генома мутантного штамма ВР2017-2 рестриктазами AscI и PacI, и, например, может содержать нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеиновокислотной последовательности.
В одном примере структурная формула 1 может содержать нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или нуклеиновокислотную последовательность, гомологичную на 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 99,5% или более в диапазоне, позволяющем сохранять функцию, равную функции указанной нуклеиновокислотной последовательности. Например, она может представлять собой нуклеиновокислотную последовательность SEQ IN NO: 4.
Согласно одному конкретному примеру, предложен химерный PRRSV-вирус, содержащий нуклеиновокислотную последовательность, содержащую полинуклеотид SEQ ID NO: 4, в качестве генома, названный LMY+BP2017. Вирус LMY+BP2017 может представлять собой вирус, имеющий регистрационный номер KCTC 13394 ВР.
Мутантный штамм LMY ver2, являющийся каркасом химерного вируса LMY+BP2017, может представлять собой мутантный штамм PRRSV, содержащий мутантный NSP1-бета, где заменено по меньшей мере одно основание неструктурного белка 1-го типа (NSP1) SEQ ID NO: 5 исходного штамма LMY (регистрационный номер в GenBank DQ473474.1.).
Нуклеотидная последовательность, подлежащая замене, в нуклеотидной последовательности гена, кодирующего NSP1 и/или NSPl-бета штамма LMY, может быть выбрана с использованием известной программы SAVE (Synthetic Attenuated Virus Engineering) и, предпочтительно, может быть выбрана с использованием программы SAVE, разработанной авторами настоящего изобретения. Конкретно, она может представлять собой деоптимизированную нуклеотидную последовательность, полученную анализом генетически высокостабильной области NSP1 в геноме исходного штамма LMY с использованием программы SAVE, разработанной авторами настоящего изобретения, с последующим выбором и заменой части или всей нуклеотидной последовательности, демонстрирующей относительно высокое предпочтение пар кодонов (Codon Pair Bias, СРВ). Деоптимизированная нуклеотидная последовательность может содержать, в гене, кодирующем белок NSP1 штамма LMY, состоящем из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 11, одну или более, 25 или более, 66 или более, 80 или более или все из 91 мутации, выбранные из группы, состоящей из мутации, где G в положении 222 заменен на С, мутации, где С в положении 225 заменен на А, мутации, где Т в положении 327 заменен на С, мутации, где А в положении 240 заменен на Т, мутации, где Т в положении 252 заменен на С, мутации, где А в положении 306 заменен на С, мутации, где Т в положении 309 заменен на С, мутации, где G в положении 312 заменен на А, мутации, где С в положении 315 заменен на А, мутации, где Т в положении 324 заменен на С, мутации, где С в положении 327 заменен на G, мутации, где G в положении 330 заменен на А, мутации, где С в положении 333 заменен на Т, мутации, где С в положении 336 заменен на G, мутации, где Т в положении 339 заменен на С, мутации, где А в положении 342 заменен на Т, мутации, где Т в положении 345 заменен на А, мутации, где А в положении 357 заменен на G, мутации, где Т в положении 363 заменен на А, мутации, где Т в положении 366 заменен на С, мутации, где С в положении 378 заменен на Т, мутации, где С в положении 379 заменен на А, мутации, где С в положении 381 заменен на G, мутации, где Т в положении 393 заменен на С, мутации, где Т в положении 396 заменен на А, мутации, где Т в положении 543 заменен на С, мутации, где Т в положении 546 заменен на С, мутации, где С в положении 549 заменен на А, мутации, где Т в положении 555 заменен на С, мутации, где Т в положении 558 заменен на С, мутации, где Т в положении 561 заменен на А, мутации, где С в положении 573 заменен на Т, мутации, где Т в положении 579 заменен на С, мутации, где G в положении 582 заменен на Т, мутации, где Т в положении 588 заменен на С, мутации, где Т в положении 612 заменен на С, мутации, где G в положении 618 заменен на С, мутации, где Т в положении 621 заменен на С, мутации, где А в положении 627 заменен на Т, мутации, где Т в положении 633 заменен на С, мутации, где Т в положении 639 заменен на G, мутации, где С в положении 654 заменен на Т, мутации, где С в положении 673 заменен на Т, мутации, где С в положении 675 заменен на А, мутации, где С в положении 678 заменен на Т, мутации, где С в положении 681 заменен на G, мутации, где С в положении 684 заменен на G, мутации, где G в положении 705 заменен на С, мутации, где С в положении 708 заменен на Т, мутации, где А в положении 729 заменен на С, мутации, где Т в положении 735 заменен на С, мутации, где G в положении 738 заменен на Т, мутации, где Т в положении 741 заменен на С, мутации, где Т в положении 744 заменен на С, мутации, где Т в положении 747 заменен на А, мутации, где Т в положении 771 заменен на С, мутации, где Т в положении 786 заменен на С, мутации, где С в положении 789 заменен на Т, мутации, где Т в положении 792 заменен на G, мутации, где С в положении 810 заменен на Т, мутации, где Т в положении 825 заменен на С, мутации, где С в положении 828 заменен на Т, мутации, где Т в положении 838 заменен на С, мутации, где G в положении 840 заменен на С, мутации, где С в положении 846 заменен на G, мутации, где G в положении 849 заменен на А, мутации, где А в положении 858 заменен на G, мутации, где Т в положении 867 заменен на С, мутации, где Т в положении 879 заменен на С, мутации, где С в положении 882 заменен на G, мутации, где С в положении 885 заменен на Т, мутации, где С в положении 891 заменен на Т, мутации, где Т в положении 900 заменен на С, мутации, где С в положении 903 заменен на А, мутации, где Т в положении 906 заменен на С, мутации, где G в положении 924 заменен на Т, мутации, где Т в положении 936 заменен на С, мутации, где Т в положении 939 заменен на С, мутации, где А в положении 948 заменен на С, мутации, где А в положении 954 заменен на С, мутации, где А в положении 963 заменен на Т, мутации, где Т в положении 966 заменен на С, мутации, где А в положении 1026 заменен на G, мутации, где G в положении 1029 заменен на С, мутации, где С в положении 1038 заменен на Т, мутации, где Т в положении 1047 заменен на С, мутации, где Т в положении 1053 заменен на С, мутации, где А в положении 1066 заменен на С, мутации, где А в положении 1068 заменен на С, мутации, где С в положении 1086 заменен на Т, и мутации, где Т в положении 1110 заменен на С, без ограничения указанными вариантами.
При использовании программы SAVE можно провести количественную оценку СРВ, представляющего собой предпочтение, формирующееся при образовании пар кодонов в вирусных генах, с использованием компьютерного алгоритма, и, поскольку пролиферативные свойства вируса уменьшаются при уменьшении показателя СРВ (деоптимизации) и его ослаблении (Virus Attenuation by Genome-Scale Changes in Codon Pair Bias, Science, 2008, J. Robert Coleman et al), ослабленный мутантный штамм LMY ver2, используемый для получения химерного вируса по настоящему изобретению, может быть получен заменой части нуклеотидной последовательности с высоким показателем СРВ на нуклеотидную последовательность с низким показателем СРВ или, предпочтительно, проведением молчащих мутаций в соответствии с принципом деоптимизации пар кодонов. Мутантный штамм LMY ver2 может содержать ген, кодирующий белок NSP1-бета, состоящий из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:6, или ген, кодирующий белок NSP1, состоящий из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 12.
Кроме того, согласно настоящему изобретению, может быть предложена клетка, содержащая геном химерного PRRSV-вируса по настоящему изобретению. Клетка относится к клетке, трансфицированной геномом химерного вируса (ДНК, РНК или вектором, содержащим указанную ДНК или РНК) или химерным вирусом, содержащим указанный геном, для получения большого количества химерного вируса, и тип клетки не ограничен, если она соответствует поставленной задаче.
Согласно одному примеру настоящего изобретения, может быть предложена вакцинная композиция от вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, содержащая химерный PRRSV-вирус или его субкультивированное потомство.
Субкультивированное потомство может включать вирусное потомство, субкультивированное в 1-80 пассажах, 1-70 пассажах, 1-60 пассажах, 1-50 пассажах, 1-40 пассажах, 1-30 пассажах, 1-20 пассажах или 1-10 пассажах.
Согласно одному примеру настоящего изобретения, вакцина может представлять собой живую вакцину или инактивированную вакцину, но, предпочтительно, она представляет собой живую вакцину. Конкретно, ослабленный химерный вирус PRRS, описанный здесь, может представлять собой модифицированную живую вакцину, содержащую один или более чем один из указанных выше вирусных штаммов в жизнеспособном состоянии в фармацевтически приемлемом носителе. Более того или альтернативно, для изготовления инактивированной вакцины может быть использован инактивированный вирус.
Вакцина может дополнительно содержать одно или более, выбранное из группы, состоящей из носителей, разбавителей, эксципиентов и адъювантов. Тип фармацевтически приемлемого носителя не ограничен, но может включать все и любые растворители, дисперсионные среды, покрытия, стабилизаторы, консерванты, антибиотики и противогрибковые агенты, изотонические агенты, агенты, замедляющие всасывание, и тому подобное.
50
С другой стороны, эффективная доза ослабленного химерного вируса по настоящему изобретению, присутствующая в вакцинной композиции, может представлять собой такое количество вируса, которое приводит или может привести к иммунному ответу у животного, которому вводят указанную эффективную дозу вируса. Эффективное количество может зависеть от компонентов вакцины и схемы введения. Доза вакцинной композиции может входить в диапазон от 2 до 6, предпочтительно от 3 до 4 цитопатических доз 50% (TCID), и может варьировать в зависимости от типа субъекта, без ограничения указанными вариантами.
Геном химерного вируса LMY-BP2017 по настоящему изобретению и вакцинная композиция, содержащая указанный геном, могут быть использованы для предупреждения эффектов PRRS-заболевания у свиней. Кроме того, для предупреждения эффектов PRRS-заболевания у свиней могут быть использованы субъединицы, содержащие иммуногенные фрагменты или участки химерного вируса PRRS. Ослабленный химерный вирус по настоящему изобретению или вакцинная композиция, содержащая указанный вирус, могут быть введены профилактически до контакта свиньи со штаммом вируса PRRS, вызывающего PRRS, и могут быть введены свинье одновременно с контактом свиньи с таким штаммом вируса, и могут быть введены терапевтически после контакта рассматриваемой свиньи с таким штаммом вируса.
Вакцинная композиция, предложенная согласно настоящему изобретению, может быть использована для предупреждения репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), например, для предупреждения PRRS, вызванного североамериканским типом PRRSV. В одном примере североамериканский тип PRRSV может представлять собой штамм вируса II-го типа VR2332.
Ослабленный химерный PRRSV-вирус по настоящему изобретению или вакцинная композиция, содержащая указанный вирус, могут быть введены посредством перорального, парентерального, подкожного, внутримышечного, внутрикожного, сублингвального, трансдермального, ректального введения, введения через слизистую оболочку, ингаляционного введения, исходя из площади поверхности, трансбуккального введения или их комбинаций. Кроме того, ослабленный химерный вирус PRRS может быть введен в форме имплантата, способного к длительному высвобождению ослабленного вируса.
Ослабленный химерный PRRSV-вирус по настоящему изобретению или вакцинная композиция, содержащая указанный вирус, могут быть введены инъекцией, ингаляцией или трансплантацией, и инъекция особенно предпочтительна. В зависимости от желаемого периода и эффективности вакцинации или лечения, ослабленный химерный PRRSV-вирус или вакцинную композицию, содержащую указанный вирус, можно вводить один или несколько раз и периодически, например, на протяжении нескольких суток, нескольких недель или нескольких месяцев, в разных дозах каждый день. Инъекционное введение может быть проведено инъекцией в желаемом количестве, или подкожной инъекцией, или распылением в носовой полости, или, альтернативно, непрерывной инъекцией.
50
50
50
50
50
Согласно одному примеру настоящего изобретения, химерный PRRSV-вирус по настоящему изобретению может представлять собой вирус, имеющий показатель TCID, составляющий от 0,01 до 0,1 по сравнению с показателем TCID исходного штамма, который представляет собой показатель TCID вируса, измеренный приведением свиных альвеолярных макрофагов в контакт с химерным вирусом и его исходным штаммом (регистрационный номер в GenBank DQ473474.1.). Предпочтительно, измерение проводят после 2 суток и показатель TCID может составлять от 0,05 до 0,1. Химерный PRRSV-вирус по настоящему изобретению имеет показатель TCID, меньше, чем у исходного штамма, меньшие пролиферативные свойства и является ослабленным.
Кроме того, предложен вирус, где мутантный штамм имеет содержание нейтрализующих антител, измеренное введением химерного PRRSV-вируса по настоящему изобретению и его исходного штамма (регистрационный номер в GenBank DQ473474.1.) свинье, от 2 до 8 относительно исходного штамма, предпочтительно от 2 до 4. Измерение предпочтительно проводят через 28 суток. Нейтрализующее антитело означает антитело, обладающее нейтрализующей способностью против VR2332, типичного штамма североамериканского типа PRRSV. Соответственно, при введении ослабленного химерного вируса по настоящему изобретению или вакцинной композиции, содержащей указанный вирус, свинье у свиньи происходит увеличение титра нейтрализующих антител и экспрессии иммунных факторов, благодаря чему эффект иммунизации от PRRS может быть существенно увеличен.
Согласно одному конкретному примеру, показатель СРВ химерного PRRSV-вируса LMY+BP2017 по настоящему изобретению, описанного выше, меньше, чем у исходного штамма LMY (регистрационный номер в GenBank DQ473474.1.), и может предпочтительно составлять от -0,39 до 0, более предпочтительно от -0,35 до -0.20, подходящим образом от -0,35 до -0,26, например, -0,2393184052058128. При показателе СРВ менее -0,39 получение вируса затруднительно, а когда он превышает 0, проблема состоит в том, что его можно получить, но пролиферативные свойства не будут уменьшены и, таким образом, он не будет ослабленным. Соответственно, предпочтительно, чтобы ослабленный химерный вирус LMY+BP2017 по настоящему изобретению имел показатель СРВ, указанный выше.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложен химерный вирус LMY+BP2017, имеющий показатели CpG, Up А, составляющие от 1,0 до 3,0 относительно исходного штамма (регистрационный номер в GenBank DQ473474.L). Изменение отношения CpG, UpA является необходимым результатом деоптимизации, и увеличение показателей CpG, UpA эукариотических генов приводит к клеточному стрессу, и поэтому происходит уменьшение пролиферативных свойств вируса и, таким образом, возможно ослабление вируса. Химерный вирус LMY+BP2017 по настоящему изобретению имеет более высокие показатели CpG, UpA, чем исходный штамм, и, предпочтительно, его показатели больше в 1,0-3,0 раза, и, например, ослабленный химерный вирус по настоящему изобретению может иметь CpG 1,1753 и UpA 1,03.
Согласно одному примеру настоящего изобретения, предложен способ получения химерного вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, включающий обработку генома мутантного штамма LMY ver2, имеющего регистрационный номер 13394 ВР, рестриктазами AscI и PacI с получением полинуклеотидного фрагмента, обработку генома мутантного штамма ВР2017-2, имеющего регистрационный номер KСТС 13393 ВР, рестриктазами AscI и PacI с получением полинуклеотидного фрагмента и рекомбинацию полинуклеотидного фрагмента LMY ver2 и полинуклеотидного фрагмента ВР2017-2 с получением инфекционного клона.
Полинуклеотидный фрагмент, полученный обработкой генома мутантного штамма LMY ver2 рестриктазами AscI и PacI, может содержать область, кодирующую NSP1-бета.
Полинуклеотидный фрагмент, полученный обработкой генома мутантного штамма ВР2017-2 рестриктазами AscI и PacI, может содержать области ORF2-ORF7.
При рекомбинации фрагментов может быть использована лигаза, и химерный вирус может быть получен введением полученного инфекционного клона в клетку.
Клетка обозначает клетку, трансфицированную с использованием ДНК или РНК химерного вируса или вектором, содержащим указанную ДНК или РНК, инфекционным клоном или химерным вирусом, для получения большого количества химерного вируса, и тип клетки не ограничен.
Кроме того, согласно одному примеру настоящего изобретения может быть предложена композиция для предупреждения или лечения вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, содержащая указанную вакцинную композицию.
В предпочтительной форме композиция для предупреждения или лечения вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней по настоящему изобретению может содержать дополнительный компонент, известный специалистам в данной области, и может дополнительно содержать подходящие носители, эксципиенты и разбавители, обычно используемые для изготовления фармацевтической композиции.
Более того, она может быть использована как изготовленная в форме для перорального введения, такой как порошки, гранулы, таблетки, капсулы, суспензия, эмульсия, сироп, аэрозоли и тому подобное, препарата для наружного применения, суппозитория и стерильного раствора для инъекций. Предпочтительно использование подходящей композиции, известной в данной области, как раскрыто в соответствующем документе (Remington's Pharmaceutical Science, recently, Mack Publishing Company, Easton PA).
Носители, эксципиенты и разбавители, которые могут быть включены в фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, аравийскую камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло. При изготовлении композиции она может быть изготовлена с использованием разбавителя или эксципиента, такого как наполнитель, разбавитель, связывающий агент, увлажняющий агент, разрыхлитель, поверхностно-активное вещество и тому подобное. Твердые композиции для перорального введения включают таблетки, пилюли, порошок, гранулы, капсулы и тому подобное, и эти твердые композиции изготавливают смешиванием по меньшей мере одного эксципиента, например, крахмала, карбоната кальция, сахарозы, лактозы, желатина и тому подобного, с композицией. Кроме того, в дополнение к простому эксципиенту, смазывающий агент, такой как стеарат магния и тальк. Жидкие композиции для перорального введения включают суспензию, жидкость для перорального введения, эмульсию, сироп и тому подобное, и, в дополнение к обычно используемым простым разбавителям, воде и жидкому парафину, могут содержать различные эксципиенты, например, увлажняющий агент, подсластитель, ароматизатор, консервант и тому подобное. Композиции для парентерального введения включают стерильный водный раствор, неводные растворители, суспензию, эмульсию, лиофилизированные композиции и суппозитории. В качестве неводного растворителя и суспензии могут быть использованы пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, сложный эфир, подходящий для инъекционного введения, такой как этилолеат, и тому подобное. В качестве основы суппозиториев могут быть использованы Витепсол, Макрогол, Tween 61, масло какао, лаурин (laurinum), глицерожелатин и тому подобное.
Предпочтительная доза композиции по настоящему изобретению варьирует в зависимости от состояния и массы тела субъекта, тяжести заболевания, лекарственной формы и пути и периода введения, но может быть подходящим образом выбрана специалистами в данной области. Например, для предпочтительного эффекта, композицию по настоящему изобретению можно вводить в количестве от 0,0001 до 1000 мг/кг (массы тела) в сутки. Введение композиции можно проводить один раз в сутки или разделять на несколько раз.
Композиция по настоящему изобретению может быть введена субъекту различными способами. Можно предполагать любые способы введения.
Согласно другому примеру настоящего изобретения, может быть предложен способ предупреждения или лечения репродуктивно-респираторного синдрома свиней, включающий введение свинье вакцинной композиции по настоящему изобретению.
Введение вакцинной композиции, содержащей геном химерного вируса по настоящему изобретению, свинье позволяет усилить иммунный ответ свиньи на антигены PRRSV и, благодаря усилению иммунного ответа свиньи на антигены PRRSV, может быть предложен способ предупреждения или лечения репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Предпочтительно, он может происходить предупреждение.
Конкретно, способ может включать введение композиции подкожной инъекцией, внутривенной инъекцией, внутрикожной инъекцией, парентеральной инъекцией, внутримышечной инъекцией, безыгольной инъекцией, электропорацией, посредством пероральной доставки, интраназальной доставки, ороназальной доставки или любой их комбинацией.
Согласно настоящему изобретению, может быть предложен набор для осуществления любого из указанных выше способов. Данный набор может содержать контейнер, вакцинную композицию, предпочтительно содержащую ослабленный химерный вирус PRRS по настоящему изобретению, фармацевтически приемлемый носитель, адъювант и инструкции по введению иммуногенной композиции животному, нуждающемуся в этом, для уменьшения клинических признаков или эффектов PRRS-инфекции, предпочтительно частоты или тяжести PRRS. Набор может также содержать средства для проведения инъекции и/или других типы средств для введения. Кроме того, набор может содержать растворитель. Ослабленная вакцина может быть лиофилизирована и восстановлена растворителем с получением раствора для инъекции и/или ингаляции. Растворитель может представлять собой воду, физиологический раствор, буферный раствор или усиливающий растворитель. Набор может содержать отдельные контейнеры, содержащие ослабленный вирус, растворитель и/или фармацевтически приемлемый носитель. Инструкции могут представлять собой этикетки и/или распечатанные инструкции, прикрепленные к одному или более чем к одному контейнеру.
Полезные эффекты
Химерный PRRSV-вирус по настоящему изобретению может быть использован для эффективного предупреждения PRRS, существенно усиливая секрецию нейтрализующих антител при его введении свиньям, и может быть полезным образом использован в качестве вакцины для лечения PRRS.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На ФИГ. 1 показана общая геномная структура вируса PRRS.
На ФИГ. 2 представлено схематическое изображение, на котором показана геномная структура химерного вируса LMY+BP2017, синтезированного вырезанием части клона вируса LMY ver2 и вируса ВР2017-2, соответственно, и их лигированием.
На ФИГ. 3 показано филогенетическое дерево PRRSV-вируса LMY ver2 и химерного вируса LMY+BP2017.
На ФИГ. 4 показаны различия пролиферативных свойств PRRSV-вируса LMY ver2 и химерного вируса LMY+BP2017 в свиных альвеолярных макрофагах (РАМ-клетках).
На ФИГ. 5 приведено сравнение различий секреции нейтрализующих антител после введения свиньям PRRSV LMY, химерного вируса LMY+BP2017 и фосфатно-солевого буферного раствора (PBS).
ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее настоящее изобретение будет описано подробно посредством примеров. Тем не менее, последующие примеры приведены лишь для пояснения настоящего изобретения, и настоящее изобретение не ограничено последующими примерами.
Поскольку РНК легко разрушается, после проведения всех действий посредством ее преобразования в ДНК клетки трансфицировали, синтезируя РНК из полученной ДНК.
Пример 1: Получение химерного вируса 1-1.
Конструирование химерного вируса
Был сконструирован химерный вирус PRRS, содержащий область неструктурного белка (неструктурный белок 1-го типа, NSP1; SEQ ID NO: 11) мутантного штамма штамма LMY и областей ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 и ORF7 ВР2017-2, выделенного в 2017 г.
1-2. Получение ослабленного мутантного штамма LMY
Мутантный штамм LMY ver2 был получен заменой 91 основания нуклеотидной последовательности гена области NSP1 с использованием штамма LMY (регистрационный номер в GenBank DQ473474.1.), представляющего собой PRRS-штамм, выделенный традиционным Агентством по карантину. В гене области NSP1 были заменены 25 оснований области NSP1-альфа и 66 оснований области NSP1-бета.
Конкретно, рекомбинантный штамм LMY ver2 был получен посредством молчащей мутации части нуклеотидной последовательности в соответствии с принципом деоптимизации пар кодонов (Таблица 3) с применением общеизвестной программы SAVE (Synthetic Attenuated Virus Engineering [конструирование синтетических ослабленных вирусов]) или программы SAVE (Synthetic Attenuated Virus Engineering), разработанной авторами настоящего изобретения. Сначала программу SAVE использовали для количественной оценки показателя СРВ (предпочтения пар кодонов), представляющего собой предпочтение, формирующееся при взаимодействии кодонов гена вируса LMY, когда происходит образование их пар, с применением компьютерного алгоритма. Показатель СРВ изменяется при замене некоторых нуклеотидных последовательностей генов вируса LMY на другие нуклеотидные последовательности и тесно связан с пролиферативными свойствами вируса. Пролиферативные свойства вируса уменьшаются и ослабевают при деоптимизации показателя СРВ посредством замен в нуклеотидной последовательности (Virus Attenuation by Genome-Scale Changes in Codon Pair Bias, Science, 2008, J. Robert Coleman et al.). Авторы настоящего изобретения выбрали область NSP1 (NSP1-альфа и NSP1-бета, SEQ ID NO: 11) с высокой генетической стабильностью в геноме исходного штамма LMY, проанализировали ее программой SAVE и выбрали 25 оснований в области NSP1-альфа и 66 в области NSP1-бета, в общей сложности 91 основание, из областей оснований с относительно высокими показателями СРВ для получения мутантного штамма вируса LMY. Мутантный штамм вируса LMY с мутацией 91 нуклеотида в последовательности NSP1 (SEQ ID NO: 12), полученный описанным методом, был назван LMY ver2, и его нуклеотидная последовательность показана в Таблице 3 ниже. LMY ver2 имеет регистрационный номер 13394 ВР.
(В Таблице 3 участки последовательностей гена NSP1 LMY ver2, выделенные подчеркнутым полужирным шрифтом, представляют собой участки с мутациями оснований гена NSP1 LMY или гена NSP1-бета LMY.)
Затем, для подтверждения степени ослабления мутантного штамма LMY ver2 измеряли показатель СРВ. Измеренный показатель СРВ NSP1 исходного штамма LMY составлял приблизительно 0,0139, и измеренный показатель СРВ NSP1-бета составлял приблизительно 0,016, но измеренный показатель СРВ мутантного штамма LMY ver2 по настоящему изобретению составлял приблизительно -0,2393 для NSP1 и приблизительно -0,33 для NSP1-бета. Исходя из этого был сделан вывод об уменьшении пролиферативных свойств мутантного штамма LMY ver2 по настоящему изобретению в сравнении с традиционным исходным штаммом и о том, что данный штамм является ослабленным.
Затем получали инфекционный клон LMY ver2.
Сначала проводили разделение полноразмерной генной последовательности штамма LMY (регистрационный номер в GenBank DQ473474.1.) на 7 фрагментов и их синтез, соответственно. Из этих 7 фрагментов фрагмент 1 представлял собой область NSP1, и эту область синтезировали как фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 12) с заменой 91 основания в генной нуклеотидной последовательности области NSP1 штамма LMY. Синтезированный генный фрагмент последовательно разрезали рестриктазами, показанными в Таблице 5 ниже, и лигировали лигазой с получением одного инфекционного клона.
1-3. Конструирование химерного вирусного клона
Согласно схематическому изображению на ФИГ. 1, вирус PRRS содержит в общей сложности 8 ORF, а именно ORF1a, ORF1b и ORF2-7.
Из геномной области, содержащей полноразмерный структурный ген мутантного штамма LMY ver2, амплифицированный в Примере 1-1, области ORF2-ORF7 вырезали с использованием рестриктаз AscI и PacI. Затем геномную область штамма ВР2017, тот ее участок, который соответствует областям ORF2-ORF7 мутантного штамма LMY ver2, разрезали теми же рестриктазами AscI и PacI, и после этого участок ORF1a и ORF1b мутантного штамма LMY ver2 и участок, соответствующий областям ORF2-ORF7 штамма ВР2017, лигировали лигазой с получением рекомбинантного инфекционного клона, названного LMY+BP2017. Использованные рестриктазы показаны в Таблице 6 ниже.
Готовый инфекционный клон вводили в вектор с большим числом копий, в который были введены промотор CMV и ген устойчивости к ампициллину, затем трансфицировали им клетки ВНК (Корейский банк клеточных линий) с использованием липофектамина и в результате получали химерный вирус LMY+BP2017 по настоящему изобретению.
Химерный вирус LMY+BP2017 был депонирован в Микробном ресурсном центре Корейского исследовательского института биологических наук и биотехнологии (Microbial Resource Center of Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) 24 октября 2018 г. с присвоением регистрационного номера KCTC13675 ВР.
Пример 2. Измерение показателей CpG и UpA химерного вируса LMY+BP2017
Для оценки пролиферативных свойств химерного вируса LMY+BP2017, полученного в Примере 1, измеряли отношения CpG и UpA гена NSP1 химерного вируса LMY+BP2017 и показатели CpG и UpA гена NSP1-бета исходного штамма LMY.
Изменение отношений CpG и UpA вирусного гена является неизбежным результатом деоптимизации, и увеличение показателей CpG и UpA данного гена приводит к клеточному стрессу и уменьшению пролиферативных свойств вируса. Отношения CpG и UpA гена NSP1-бета химерного вируса LMY+BP2017 и вируса LMY измеряли с использованием программы SSE (версии 1.2), и полученные результаты показаны в Таблице 7 ниже.
Как показано в Таблице 7, было подтверждено, что показатели CpG и UpA химерного вируса LMY+BP2017 увеличивались по сравнению с исходным штаммом LMY, и, исходя из этого, удалось подтвердить значительное уменьшение пролиферативных свойств химерного вируса LMY+BP2017 по сравнению с исходным штаммом LMY.
Пример 3. Идентификация химерного штамма LMY+BP2017 3-1. Идентификация химерного штамма LMY+BP2017
Для идентификации химерного штамма LMY+BP2017 секвенировали области NSP1 химерного штамма LMY+BP2017, синтезированного в Примере 1, и штамма LMY (регистрационный номер в GenBank DQ473474.1.).
Конкретно, ПЦР проводили с использованием набора праймеров, приведенных в Таблице 8, позволяющего выявлять 1-1654 нуклеотиды, включая область NSP1, вируса LMY и набор для одностадийной ОТ-ПЦР (Intron) и, конкретно, после начальной ОТ при 45°С на протяжении 30 минут и 95°С на протяжении 5 минут, реакцию проводили при 94°С на протяжении 30 секунд, при 61°С на протяжении 30 секунд и при 72°С на протяжении 2 минут, повторяя этот цикл 38 раз. Затем продукты, амплифицированные в результате ПЦР, секвенировали, завершая идентификацию каждого штамма.
3-2. Сравнение гомологии с другими штаммами и филогенетическое дерево
Для подтверждения генетических различий между рекомбинантным вирусным штаммом LMYver2 по настоящему изобретению, полученным в Примере 1, и известным штаммом вируса PRRS измеряли идентичность последовательностей каждого штамма в области NSP1 с использованием программы Bio Edit, и результаты сравнения гомологии показаны в Таблице 9.
Как показано в Таблице 9, из результатов сравнения гомологии видно, что химерный вирус LMY+BP имеет уникальную последовательность, отличающуюся от других PRRS-штаммов.
Исходя из результатов сравнения гомологии, анализировали филогенетическое дерево с использованием программы BioEdit, повторяя анализ («Bootstrap») 1000 раз. На основании этого было построено приблизительное филогенетическое дерево химерного вируса LMY+BP2017 и LMY, показанное на ФИГ. 3. Исходя из филогенетического дерева, представленного на ФИГ. 3, можно определить систематическое положение настоящего вируса.
3-3. Исследование клеточного пассажа
Было проведено подтверждение продолжительности сохранения модифицированной области при пассаже химерного вируса LMY+BP2017, полученного в Примере 1. Химерный вирус LMY+BP2017 по настоящему изобретению стабилизировали 30-кратным пассажем в клетках MARC-145, являющихся известной клеточной линией, восприимчивой к вирусу PRRS, и для подтверждения мутаций гена каждые 10 пассажей проводили секвенирование с применением того же метода, что в Примере 3-1.
В результате подтверждающего секвенирования было подтверждено, что область замен в гене настоящего вируса оставалась неизменной даже после стабилизации 30 пассажами. В Таблице 10 ниже показаны число мутаций оснований (изменения нуклеотидов), сайты мутаций и аминокислотные мутации (изменения аминокислот) после каждого числа пассажей.
Как подтверждено в Таблице 10, даже при проведении более чем 30 пассажей мутации генов NSP1a или NSP1b ORF1a оставались неизменными и были выявлены только мутации белка NSP2 или ORF2a. Таким образом, было подтверждено сохранение мутаций гена, кодирующего белок NSP1, у вируса, полученного в Примере 1, даже после 40 пассажей.
Пример 4: Сравнение пролиферативных свойств LMY и химерного LMY+BP
50
Для подтверждения пролиферативных свойств химерного вируса LMY+BP2017, полученного в Примере 1, количество вируса, полученного после приведения макрофагов (РАМ, Porcine Alveolar Macrophage [свиной альвеолярный макрофаг]) в контакт с химерным вирусом LMY+BP2017 и его исходным штаммом, подтверждали, измеряя TCID.
6
5
50
50
Конкретно, РАМ-клетки аликвотировали по 2×10 клеток на лунку в 6-луночном планшете, содержавшем 2 мл среды RPMI (содержавшей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина и стрептомицина). Затем вносили LMY и химерный вирус LMY+BP2017 в разные лунки, соответственно, при отношении MOI 0,01, через 1 час после внесения весь супернатант удаляли и аликвотировали по 2 мл раствора поддерживающей среды RPMI (содержавшей 10% FBS, 1% пенициллина и стрептомицина). Через 2 суток после аликвотирования собирали супернатант из каждой лунки и измеряли TCID. Применительно к клеткам, использованным в последующем эксперименте, клетки MARC-145 сорбировали на лунки 96-луночного планшета по 2×10 клеток на лунку аликвотированием со 100 мкл среды Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM) (10% (об./об.) FBS, 1% (масс./об.) пенициллина, стрептомицин) заранее, за день до измерения TCID.
Вносимый вирус подготавливали следующим образом. В крайнюю левую лунку ряда 96-луночного планшета аликвотировали 200 мкл супернатанта, собранного заранее, а в другие лунки аликвотировали по 180 мкл среды DMEM (FBS без добавления антибиотиков). Затем с использованием мультипипетки из каждой лунки, начиная слева, отбирали по 20 мкл и проводили десятикратное разведение, аликвотируя их в лунку справа. Разведение проводили последовательно, меняя наконечники, и последнюю 12-ю лунку оставляли как отрицательный контроль. Полученный разведенный раствор вируса вносили в планшет, на который были сорбированы клетки MARC-145. Затем весь культуральный раствор клеток MARC-145 удаляли, в каждую лунку аликвотировали по 200 мкл PBS и удаляли его, повторяя промывку 3 раза. После этого вносили полученный раствор вируса, аликвотируя по 100 мкл в каждую лунку, и через 2 часа после внесения весть внесенный раствор удаляли и аликвотировали по 100 мкл нового поддерживающего раствора (среда DMEM, 10% FBS, 1% пенициллина, стрептомицин).
На протяжении приблизительно 7 суток после аликвотирования в клетках подтверждали агрегацию и апоптоз, являющиеся разновидностями СРЕ (цитопатогенного эффекта), и, в завершение, рассчитывали коэффициент разведения, при котором СРЕ присутствовал в 4 лунках, представляющих собой половину из 8 растворов, в которые был внесен вирус, исходя из коэффициента разведения непосредственно перед лункой без СРЕ. Окончательное значение рассчитывали умножением на 10, исходя из 1 мл.
50
Химерный штамм LMY+BP2017 и исходный штамм LMY были приведены в контакт со свиными альвеолярными макрофагами (РАМ-клетками), и показатели TCID, измеренные за 1-2 суток, показаны в Таблице 11 ниже и на ФИГ. 4.
50
50
Как видно из Таблицы 11 и ФИГ. 4, согласно показателю ТСID, измеренному на 2 сутки внесения штамма, когда вирус начинает образовываться в больших количествах, химерный LMY+BP2017 продемонстрировал в 100 раз меньший показатель TCID, чем LMY. Исходя из этого, можно было видеть, что пролиферативные свойства химерного вируса LMY+BP2017 по настоящему изобретению в РАМ-клетках (свиных альвеолярных макрофагах), являющихся основными инфицированными клетками при PRRS, были как минимум в 10 раз меньше, чем у LMY, и удалось подтвердить, что химерный вирус LMY+BP2017 по настоящему изобретению был ослабленным, поскольку его пролиферативные свойства были меньше, чем у исходного штамма LMY.
Пример 4: Подтверждение паттерна секреции нейтрализующих антител
5
5
50
50
Для подтверждения паттерна секреции нейтрализующих антител после введения химерного вируса по настоящему изобретению 12 свиней в возрасте 3 недель разделяли на 3 группы, по четыре свиньи в каждой, и вводили им LMY (10 TCID), химерный вирус LMY+BP2017 (10 ТСID) и PBS, по 2 мл каждое. Через 4 недели у свиней из каждой группы получали венозную кровь, выделяли по 2 мл сыворотки и измеряли количество нейтрализующих антител в сыворотке.
50
Конкретно, анализ проводили общеизвестным методом. До начала анализа все образцы сыворотки инактивировали нагреванием до 56°С на протяжении 45 минут. Инактивированную сыворотку добавляли к среде RPMI 1640 (10% FCS, 20 мМ L-глутамина, смесь антибиотиков и противогрибковых агентов: 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 50 мкг/мл гентамицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина В) и затем проводили двукратное разведение. После этого отбирали по 100 мкл каждой разведенной сыворотки и смешивали со 100 мкл подготовленного заранее штамма VR2332, 200 ТСID/мл, инкубировали при 37°С на протяжении 1 часа и затем приводили в контакт с монослоем клеток Marc-145, культивированных за день до этого. Затем, после инкубации при 37°С на протяжении одного часа, все внесенные растворы удаляли и заменяли на 200 мкл культурального раствора RPMI. После этого цитопатический эффект (СРЕ) проверяли каждый день, проводя культивирование при 37°С, и в каждой лунке СРЕ подтверждали после 5 суток культивирования. В лунках без СРЕ рост вируса подтверждали, проводя окрашивание антителом SDOW 17. Титр нейтрализующих антител измеряли, рассчитывая реципрокное значение максимального коэффициента разведения без признаков роста вируса, и результаты измерений показаны в Таблице 11 ниже и на ФИГ. 5.
Как показано в Таблице 11 и на ФИГ. 5, удалось подтвердить, что химерный вирус LMY+BP2017 приводил к значимо высокой секреции нейтрализующих антител клетками по сравнению с исходным штаммом LMY.
--->
Перечень последовательностей
<110>    BioPoA, Inc.
REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency)
<120>    Chimeric virus of porcine reproductive and respiratory syndrome
virus, and vaccine using same
<130>    OPP20194438KR
<150>    KR 10-2018-0171306
<151>    2018-12-27
<150>    KR 10-2019-0145389
<151>    2019-11-13
<160>    12
<170>    KoPatentIn 3.0
<210>    1
<211>    609
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    NSP1-бета LMY ver2
<400>    1
gctgctgtct acgatgttgg tcatggcgcc gtcatgtatg tggccgatga gagagtctcc         60
tgggcccctc gcggcgggga cgaagttaga ttcgaaacgg tcccacagga gcttaagtcg        120
gttgcgaacc aactctgcac gtcgttccca ccccaccacg tagtcgatat gtctaagttc        180
gcctttaccg cccccggttg cggcgtatct atgcgggtcg aacgtcaata cggctgtctc        240
cccgccgata cggtccccga aggcaactgc tggtggagct tgttcgattc gctcccactc        300
gaagtgcaag gcaaagagat tcgccacgct aaccaattcg ggtatcagac taagcatggc        360
gtatccggta agtacctaca gcggaggctg caaattaacg gtctccgcgc agtcgctgac        420
cctaacggac ctttcgtcgt acagtacttc tccgtcaagg agagttggat ccgccacttg        480
aaactagcgg aagaacctag ttaccccggg ttcgaggacc tcctccgcat aagggttgag        540
tctaacacgt caccattggc taacaaggac gaaaaaattt tccggtttgg cagtcataag        600
tggtacggc                                                                609
<210>    2
<211>    3188
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    ORF2-ORF7 BP2017-2
<400>    2
atgaaatggg gtccatgcaa agcctttttt acaaaattgg ccaacttttt gtggatgctt         60
tcacggagtt cttggtgtcc attgttgata tcattatatt tttggccatt ttgtttggct        120
tcaccatcgc cggttggctg gtggtctttt gcatcagatt ggtttgctcc gcgatactcc        180
gtacgcgccc tgccattcac tctgagcaat tacagaagat cttatgaggc ctttctttcc        240
cagtgccaag tggacattcc cacctgggga actaaacatc ctttggggat gctttggcac        300
cataaggtgt caaccctgat tgatgaaatg gtgtcgcgtc gaatgtaccg catcatggaa        360
aaagcagggc aggctgcctg gaaacaggtg gtgagcgagg ctacgctgtc tcgcattagt        420
agtttggatg tggtggctca ttttcagcat ctagccgcca ttgaagccga gacctgtaaa        480
tatttggcct cccggctgcc catgctacac aacctgcgca tgacaggttc aaatgtaacc        540
atagtgtata atagcacttt gaatcaggtg tttgctattt ttccaacccc tggttcccgg        600
ccaaagcttc atgattttca gcaatggtta atagctgtac attcctccat attttcctct        660
gttgcagctt cttgtactct ttttgttgtg ctgtggttgc gggttccaat actacgtact        720
gtttttggtt tccgctggtt aggggcaatt tttctttcga actcacagtg aattacacgg        780
tgtgtccacc ttgcctcacc cggcaagcag ccacagagat ctacgaaccc ggtaggtctc        840
tttggtgcag gatagggtat gaccgatgtg aggaggatga tcatgacgag ctagggttta        900
tggtaccgcc tggcctctcc agcgaaggcc acttgactag tgtttacgcc tggttggcgt        960
tcttgtcctt cagctacacg gcccagttcc atcccgagat attcgggata gggaatgtga       1020
gtcgagttta tgttgacatc aaacatcaac tcatctgcgc cgaacatgac gggcagaaca       1080
ccaccttgcc tcgtcatgac aacatttcag ccgtgtttca gacctattac caacatcaag       1140
tcgacggcgg caattggttt cacctagaat ggcttcgtcc cttcttttcc tcgtggttgg       1200
ttttaaatgt ctcttggttt ctcaggcgtt cgcctgcaaa ccatgtttca gttcgagtct       1260
tgcagatatt aagaccaaca ccaccgcagc ggcaagcttt gctgtcctcc aagacatcag       1320
ttgccttagg catcgcgact cggcctctga ggcgattcgc aaaatccctc agtgccgtac       1380
ggcgataggg acacccgtgt atgttaccat cacagccaat gtgacagatg agaattattt       1440
acattcttct gatctcctca tgctttcttc ttgccttttc tatgcttctg agatgagtga       1500
aaagggattt aaggtggtat ttggcaatgt gtcaggcatc gtggctgtgt gtgtcaattt       1560
taccagctac gtccaacatg tcaaggagtt tacccaacgc tccctggtgg tcgaccatgt       1620
gcggttgctc catttcatga cacctgagac catgaggtgg gcaactgttt tagcctgtct       1680
ttttgccatt ctgttggcaa tttgaatgtt taagtatgtt ggagaaatgc ttgaccgcgg       1740
gctgttgctc gcaattgctt tctttgtggt gtatcgtgcc gttctgtttt gctgtgctcg       1800
ccaacgccag caacgacagc agctcccatc tacagctgat ttacaacttg acgctatgtg       1860
agctgaatgg cacagattgg ctagctaaca aatttgattg ggcagtggag agttttgtca       1920
tctttcccgt tttgactcac attgtctcct atggtgccct cactaccagc catttccttg       1980
acacagtcgc tttagtcact gtgtctaccg ccgggtttgt tcacgggcgg tatgtcctaa       2040
gtagcatcta cgcggtctgt gccctggctg cgttgacttg cttcgtcatt aggtttgcaa       2100
agaattgcat gtcctggcgc tacgcgtgta ccagatatac caactttctt ctggacacta       2160
agggcggact ctatcgttgg cggtcgcctg tcatcataga gaaaaggggc aaagttgagg       2220
tcgaaggtca tctgatcgac ctcaaaagag ttgtgcttga tggttccgtg gcaaccccta       2280
taaccagagt ttcagcggaa caatggggtc gtccttagat gacttctgtc atgatagcac       2340
ggctccagaa aaggtgcttt tggcgttttc tattacctac acgccagtga tgatatatgc       2400
cctaaaggtg agtcgcggcc gactgctagg gcttctgcac cttttgatct tcctgaattg       2460
tgctttcacc ttcgggtaca tgactttcgc gcactttcag agtacaaata aggtcgcgct       2520
cactatggga gcagtagttg cactcctttg gggggtgtac tcagccatag aaacctggaa       2580
attcatcacc tccagatgcc gtttgtgctt gctaggccgc aagtacattc tggcccctgc       2640
ccaccacgtt gaaagtgccg caggctttca tccgattgcg gcaaatgata accacgcatt       2700
tgtcgtccgg cgtcccggct ccactacggt caacggcaca ttggtgcccg ggttaaaaag       2760
cctcgtgttg ggtggcagaa aagctgttaa acagggagtg gtaaaccttg tcaaatatgc       2820
caaataacaa cggcaagcag cagaagagaa agaaggggga tggccagcca gtcaatcagc       2880
tgtgccagat gctgggtaag atcatcgctc agcaaaacca gtccagaggc aagggaccgg       2940
gaaagaaaaa taagaagaaa aacccggaga agccccattt tcctctagcg actgaagatg       3000
atgtcagaca tcactttacc cctagtgagc ggcaattgtg tctgtcgtca atccagaccg       3060
cctttaatca aggcgctggg acttgcaccc tgtcagattc agggaggata agttacactg       3120
tggagtttag tttgcctacg catcatactg tgcgcctgat ccgcgtcaca gcatcaccct       3180
cagcatga                                                                3188
<210>    3
<211>    24
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    [A]n
<400>    3
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa                                                24
<210>    4
<211>    15443
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    Последовательность химерного вируса LMY-BP2017
<400>    4
atgacgtata ggtgttggct ctatgccttg acatttgtat tgtcaggagc tgtgaccatt         60
ggcacagtcc aaaacttgct gcgcagaaac acccttctgc gacagcctcc ttcaggggag        120
cttggggtct atccctagca ccttgcttct ggagttgcac tgctttacgg tctctccacc        180
cctttaacca tgtctgggat acttgatcgg tgcacgtgta cccccaatgc cagggtgttt        240
atggcggagg gccaagttta ctgcacacga tgtctcagtg cacggtctct ccttcccctg        300
aatctccaag tttctgagct cggggtgctg ggcctattct acaggcccga agagccactc        360
cggtggacgt tgccacgtgc attccccact gttgagtgct cccccgccgg ggcctgctgg        420
ctttctgcaa tctttccaat tgcacgaatg accagtggaa acctaaactt ccaacaaaga        480
atggtacggg tcgcagctga gatctacaga gttggccagc tcacccctgc agttttgaag        540
gctctacaag tttatgagcg gggttgccgc tggtatccca ttgttggacc tgtccctgga        600
gtggccgttt tcgccaactc cctgcatgtg agtgatagac ctttcccggg agcaactcac        660
gtattaacca acctgccact cccgcagaga cccaagcctg aggacttttg ccccttcgag        720
tgtgctatgg ctgctgtcta cgatgttggt catggcgccg tcatgtatgt ggccgatgag        780
agagtctcct gggcccctcg cggcggggac gaagttagat tcgaaacggt cccacaggag        840
cttaagtcgg ttgcgaacca actctgcacg tcgttcccac cccaccacgt agtcgatatg        900
tctaagttcg cctttaccgc ccccggttgc ggcgtatcta tgcgggtcga acgtcaatac        960
ggctgtctcc ccgccgatac ggtccccgaa ggcaactgct ggtggagctt gttcgattcg       1020
ctcccactcg aagtgcaagg caaagagatt cgccacgcta accaattcgg gtatcagact       1080
aagcatggcg tatccggtaa gtacctacag cggaggctgc aaattaacgg tctccgcgca       1140
gtcgctgacc ctaacggacc tttcgtcgta cagtacttct ccgtcaagga gagttggatc       1200
cgccacttga aactagcgga agaacctagt taccccgggt tcgaggacct cctccgcata       1260
agggttgagt ctaacacgtc accattggct aacaaggacg aaaaaatttt ccggtttggc       1320
agtcataagt ggtacggcgc tggtaagaga gcaaggaaag cacgctctcg tgcgactaat       1380
acagtcgctg accgcgcttt gtccgttcgt gaaatctggc aggccaagga gcatgaggtt       1440
accggcgcca ataaggctga gcacctcaaa cactactccc cacctgccga agggaattgt       1500
ggttggcact gcatttccgc catcgtcaac cggatggtta attccaaatt tgaaaccacc       1560
cttcccgaaa gagtgagacc tccagatgac tgggctaccg acgaggatct tgcgaatgcc       1620
atccaaatcc tcagactccc tgcggcctta gacaggaacg gtgcttgtgc tagcgccaag       1680
tacgtactta agctggaagg tgagcattgg actgtcactg tgacccctgg gatgtcccct       1740
tctttgctcc ctcttgaatg tgttcagggc tgttgtgggc acaagggcgg tcttggttcc       1800
ccagacgcag tcgaggtctc cggatttgac cctgcctgcc ttgaccgtct ggctgaggtg       1860
atgcacctgc ctagcagtgc tatcccagcc gctctggccg aaatgtctgg tgattccgat       1920
cgttcggctt ctccggtcac caccgtgtgg actgtttcgc agttctttgc ccgtcacagc       1980
ggaggaaatc accctgacca agtgcgctta gggaaaatca tcagcctttg tcaggtgatt       2040
gaggactgct gctgttccca gaacaaaacc aaccgggtca ccccggagga ggttgcagca       2100
aagattgacc tgtacctccg cggtgcaaca aatcttgaag aatgcttggc caggctcgag       2160
aaagcgcgcc cgccacgggt aatcgacacc ttctttgatt gggacgttgt gctccctggg       2220
gttgaggcag caacccaaac gaccaagctg ccccaggtca accagtgtcg tgctctggtc       2280
cctgttgtga ctcaaaagtc cttggacaac aactcggtcc ccctgaccgc cttttcactg       2340
gctaactact actaccgcgc gcaaggtgac gaagtttgtc accgtgaaag acttaatgcc       2400
gtgctttcca agctggaaga ggttgtccga gaagagtacg ggctcatgcc taccgggcct       2460
ggcccacggc ccacattgcc acgcgggctc gacgaactca aagaccagat ggaggtggac       2520
ttgctgaaac tggctaacgc ccaggcgact tctgacatga tggcttgggc agtcgagcag       2580
gttgacctaa aaacttgggt caagaactac ccgcggtgga tgccaccacc tcctccgcca       2640
aaagttcggc ctcgaaaaac gaagcctgtc aagagcttgc cagagggaaa gcccgccccc       2700
gcccctcgca ggagggttgg gactggttgt ggcagcccga cttcattggg cgatgatgtt       2760
cttaacagtt gggaagattt ggctgttggc agcccctcgg gtctcccgac cccccctgag       2820
ccggcaacac cttcgagtga gccagtggtt gtgtcagcac cgcagtgcat cttcagaccg       2880
gcgacgccct tgagtgagcc gaccccaatt cccgcacccc gtgggactgc gtctcgacca       2940
gtgacacctt tgagcgagcc gatccctgtg cctgcaccgc ggcgtaaatt tcagcaggcg       3000
agaaagttga gttcggcggt ggtaattccg ccgtaccagg acgagcccct ggatttgtcc       3060
gcttcctcgc tgactgaata tgaagccctt cctctagcgc cgccgcaaag cgagggcgct       3120
ctaagagtgg aggggcatga agttgaggaa gccctgagtg aaatctcaga catgtcgggt       3180
ggcactaaac ctgcgcccgt atcatcaagc agctccttgt ccagcgtgag aatcacacgc       3240
ccaaaacact cagctcaagc catcatcgac tcggtcgggc cctgcagtgg gcatctccaa       3300
gaggtgaagg agatatgcct tagtgtcatg cgcgaggcat gtgatgcgac taagctcaat       3360
gaccccgcta cgcaggaatg gctctctcgc atgtgggatc gggtggacat gctgacttgg       3420
cgcaacacgt ctgcttacca gacgcttagc accttaggtg gctggtcaag gttcctccca       3480
aaattgatac ttgagacacc gccgccctac ccgtgtgagt ttgtgatgat gccttacacg       3540
cctgcacctt ccgtgggtgc ggagagcgac ctcaccattg gctcagttgc tactgaggat       3600
gttccacgca tccttgagaa catggagaat gtcggcgaga tgactaacca gggacccttg       3660
gccttctccg aggataaacc ggtggatgac caaccttccg aagacctccg gacatcgtcg       3720
caaggacctg acgggagcac atcagctccg tccgcagata cagctggcgc cggctcatcc       3780
accgatttgc cgtcttcagg cggcgtggat gcggacggag ggggaccgct tcgggcggta       3840
aaaagaaaaa ccgaacggct ctttgaccaa ctgagtcgtc aggtttttga cctcgtctcc       3900
catctcccta ttttcttctc acgcctcttc aaccctggcg gtggttactc tccgggtgat       3960
tggggttttg cagcttttac tctattgtgc ctctttttat gttacagtta cccagcattt       4020
ggcatcgttc ccctcttggg tgtattttct gggtcttctc ggcgcgtgcg aatgggggtt       4080
tttggctgct ggttggcttt tgctgttggt ctgttcaagc ctgtgtccga cccagtcggc       4140
gctgcttgtg agtttgactc gccagaatgc agaaacatcc ttcattcttt tgagcttctc       4200
aaaccttggg accctgttcg cagccttgtt gtgggccccg tcggtctcgg ttttgccatt       4260
cttggcaggc tactgggcgg ggcacgcagc atctggcact ttttgcttag gcttggcatt       4320
gttgcagact gtgtcttggc tggagcttat gtgctttctc aaggtaggtg caaaaagtgt       4380
tggggatctt gtataagaac cgctcctaat gaggtcgctt tcaacgtgtt tccttttacg       4440
cgtgcaacca ggtcgtcact tgttgacctt tgcgatcggt tttgtgcgcc gagaggcatg       4500
gaccccattt ttctcgccac tgggtggcgt ggatgctggg ccggtcggag ccccattgag       4560
caaccctctg aaaaacccat cgcgtttgcc caattggatg aaaagaagat tacggctagg       4620
actgtggtcg cccagcctta tgatcccaac caagccgtaa agtgcctgcg ggtattgcag       4680
gcgggagggg cgatggtggc tgaggcggtc ccaaaagtgg tcagggtttc cgctgttcca       4740
tttcgagccc ccttttttcc taccggagtg aaggttgacc ctgaatgtag agtagtggtt       4800
gaccctgaca ctttcactgc agctctccgg tctggttact ccaccacaaa cctcgtcctc       4860
ggtgtggggg actttgccca gctgaatgga ttaaaaatca ggcaaatttc taagccttca       4920
ggggggggcc cacatctcat ggctgccctg catgttgcct gctcgatgat tttgcacatg       4980
tttgctggga tttatgtgac tgcggtgggt tcttgcggca ccggcaccaa cgatccgtgg       5040
tgcgcaaacc catttgccgt ccctggctac ggacctggct ccctctgcac gtccagattg       5100
tgtatttccc agcacggcct taccctgccc ttgacagcac ttgtggcggg attcggcatc       5160
caggaaattg ccttagtcgc tttgatcttt gtttccatcg gaggcattgc tcataggttg       5220
agttgtaaag ctgacatgct gtgtgttttg cttgcaattg ccagctatgt ttgggtacct       5280
cttacctggt tactttgtgt ttttccttgc tggttgcgct ggttttcttt gcatcccctt       5340
accgtcctat ggttggtgtt tttcttgatt tctgtgaata tgccttcagg aatcttggcc       5400
atggtgttgt tagtttctct ttggcttctt ggtcgttata ctaatgtcgc cggtcttgtc       5460
actccctacg acattcatca ttacaccagt ggcccccgcg gtgttgccgc attggctact       5520
gcaccagatg gaacctactt agccgctgtt cgccgcgctg cgttgactgg ccgcaccatg       5580
ttgttcaccc cgtcccagct tgggtctctt cttgagggcg ctttcagaac tcgaaagccc       5640
tcactgaaca ccgtcaatgt ggtcgggtcc tccatgggct ctggcggggt gtttaccatt       5700
gacgggaaag tcaggtgcgt gactgccaca catgtcctta cgggtaactc agccagggtt       5760
tccggaaccg gcttcaatca aatgcttgac tttgacgtaa aaggggattt cgctatagcc       5820
gattgcccga attggcaagg ggctgccccc aaaacccaat tctgcgagga tggatggact       5880
ggccgtgcct attggctaac atcctctggc gtcgaacccg gcgtcattgg gaaaggattc       5940
gccttctgct tcaccgcgtg cggcgattcc gggtccccag tgatcaccga ggccggtgag       6000
cttgtcggtg ttcacacggg atcgaataaa caaggggggg gtattgtcac acgcccctca       6060
ggccagtttt gtaatgtggc acccatcaag ctgagcgaat taagtgaatt ctttgctggg       6120
cctaaggtcc cgctcggtga tgtgaaggtt ggcagccaca taatcaaaga cacaagcgag       6180
gtgccttcag atctttgtgc cttgcttgct gccaaacctg aactggaagg aggtctctcc       6240
accgtccaac ttctgtgtgt gtttttcctt ctgtggagaa tgatgggaca tgcctggacg       6300
cccttggttg ctgtgggttt ctttattttg aatgagattc tcccggccgt cctggtccgg       6360
agtattttct cctttggaat gtttgtgcta tcctggctca cgccatggtc tgcgcaagtt       6420
ctgatgatca ggctcctgac agcagctctt aacaggaata gatgttcact tgcctttttc       6480
agcctcggtg cagtgaccgg ttttgttgca gatcttgcgg ctactcaggg gcatccgttg       6540
caggcagtga tgaatttgag cacctatgca ttcctgcctc gggtaatggt tgtgacttca       6600
ccagtcccag tgatcgcgtg tggtgttgtg cacctactcg ccatcattct gtacctgttt       6660
aaataccgta gcctgcacca tatccttgtt ggcgatggag tgttctcttc ggccttcttc       6720
ctgcgatatt ttgccgaagg aaagttgagg gaaggggtgt cacaatcctg cggaatgaat       6780
catgagtctc tgactggtgc cctcgctatg agactcaatg acgaggactt ggatttcctc       6840
atgaaatgga ctgattttaa gtgcttcgtt tctgcgtcca acatgaggaa tgcagcgggt       6900
caatttatcg aggctgcata tgctaaagca cttagagttg aactggccca gttggtgcag       6960
gttgataagg ttcgaggtac tatggccaaa cttgaagctt ttgctgatac tgtggcacct       7020
caactctcgc ccggtgatat tgttgtcgct ctcggccaca cgcctgttgg cagtatcttc       7080
gacttaaagg ttggtagcac caagcatacc ctccaagcca ttgagaccag ggttcttgct       7140
gggtccaaaa tgaccgtggc gcgcgtcgtc gacccgaccc ccacgccccc acccgcgccc       7200
gtgcccatcc ccctcccacc gaaagttctg gagaatggcc ccaacgcttg gggggatgag       7260
gaccgtttga ataagaagaa aagacgcagg atggaagccc tcggcatcta tgttatgggc       7320
gggaaaaagt accagaaatt ttgggacaag aactccggtg atgtgtttta tgaggaggtc       7380
cataacaaca cagatgagtg ggagtgtctc acagttggcg accctgccga ctttgaccct       7440
gagaagggaa ccctgtgtgg acatgtcacc attgacaaca aggcttacca tgtttacacc       7500
tcctcatctg gtaagaagtt cttggttccc gtcaacccag agaacggaag agttcaatgg       7560
gaagctgcaa agctttccgt ggagcaggcc ctaggcatga tgaatgtcga cggcgaactg       7620
actgccaagg aactggagaa actgaaaaga ataattgaca aactccaggg cctgactaag       7680
gagcagtgtt taaactgcta gccgccagcg acttgacccg ctgtggtcgc ggcggcttgg       7740
ttgttactga gacagcggtg aaaatagtca aatttcacaa tcggactttc actctggggc       7800
ctgtgaattt aaaagtggcc agtgaggttg agctaaaaga tgcggttgag cacaaccaac       7860
acccggttgc gaggccgatc gatggtggag ttgtgctcct gcgttccgcg gttccctcgc       7920
ttatagacgt cttgatctcc ggtgctgaca catctcccaa gttacttgcc cttcacgggc       7980
cgggaaacac tgggatcgat ggcacgctct gggatttcga gtccgaagcc actaaagagg       8040
aagtcgcact cagtgcgcaa ataatacagg cttgtgacat taggcgtggc gacgctcctg       8100
aaattggtct cccttataag ctgtaccctg ttaggggcaa ccctgagcgg gtgaaaggag       8160
ttctgcagaa tacaaggttt ggagacatac cctacaaaac ccctagtgac accgggagcc       8220
cagtgcacgc ggctgcctgc cttacgccca acgccactcc tgtgactgat gggcgttccg       8280
tcttggctac aaccatgccc cccgggtttg agttatatgt accgaccata ccagcgtctg       8340
tccttgatta ccttgactct aggcctgact gccctaaaca gctgacagag cacggctgcg       8400
aagacgccgc actgaaagac ctctctaaat atgacttatc tacccaaggc tttgtcttac       8460
ctggggttct tcgccttgtg cggaaatacc tgtttgccca tgtaggtaaa tgtccacccg       8520
ttcatcggcc ttctatttac cccgctaaga attctatggc tggaataaat gggaacaggt       8580
tcccaaccaa agacatccag agcgttcctg aaatcgacgt tctgtgcgca caggctgtgc       8640
gggaaaactg gcaaactgtc accccttgta ctcttaagaa acagtattgc gggaagaaga       8700
agaccaggac catactcggc accaataact tcattgcact ggcccaccga gcagtgttga       8760
gtggtgtcac ccagggcttc atgaaaaagg cgttcaactc gcccatcgcc ctcggaaaga       8820
acaagttcaa ggagctacag actccggtcc tgggcaggtg ccttgaagct gacctcgcat       8880
cctgtgatcg atccacgcct gcaattgttc gctggtttgc tgccaacctt ctttatgaac       8940
ttgcctgtgc tgaagagtat ctaccgtcgt atgtgctgaa ctgctgccac gacttactag       9000
tcacgcagtc cggcgcagtg actaagagag gtggcctgtc gtctggcgac ccgatcacct       9060
ctgtgtctaa caccatttac agtttggtga tctatgcaca gcacatggtg cttagttact       9120
ttaaaagtgg tcacccccat ggccttctgt tcttacaaga ccagctaaag tttgaggaca       9180
tgctcaaggt tcaacccctg atcgtctatt cggacgatct cgtgctgtat gccgagtctc       9240
ccaccatgcc aaattatcac tggtgggttg agcatctgaa tttgatgctg gggtttcaga       9300
cggacccaaa aaaaacagca ataacagatt cgccatcatt tctgggctgt agaataatga       9360
atgggcgcca gctagtcccc aaccgtgaca ggatcctcgc ggccctcgcc tatcacatga       9420
aggcaagtaa tgtttctgaa tactatgcct cagcggctgc aatactcatg gacagctgtg       9480
cttgtttgga gtatgatcct gaatggtttg aagaacttgt agttggaata gcgcagtgcg       9540
cccgcaagga tggctacagc tttcccggca cgccgttctt catgtccatg tgggaaaaac       9600
tcaggtccaa ttatgagggg aagaagtcga gagtgtgcgg gtactgcggg gccccggccc       9660
cgtacgctac tgcctgtggc ctcgacgtct gcatctacca cacccacttc caccagcatt       9720
gtccagtcac aatctggtgt ggccatccag cgggttctgg ttcttgtagt gagtgcaaat       9780
cccctgtagg gaaaggcaca aaccctttag acgaggtgct ggaacaagtc ccgtataagc       9840
ccccacggac cgttatcatg catgtagagc agggtctcac cccccttgat ccaggtagat       9900
accaaactcg ccgcggatta gtttccgtta ggcgtggaat taggggaaat gaagttgaac       9960
taccagacgg tgattatgct agcaccgcct tgctccctac ctgcaaagag atcaacatgg      10020
tcgctgtcgc ttccaatgta ttgcgcagca ggttcatcat cggcccaccc ggtgcaggga      10080
aaacatactg gctccttcaa caggtccagg acggtgatgt tatttacaca ccaactcacc      10140
agaccatgct tgacatgatc agggctttgg ggacgtgccg gttcaacgtc ccggcaggca      10200
caacgctgca attccctgtc ccctcccgca ccggtccgtg ggttcgcatc ctggccggcg      10260
gttggtgtcc tggcaagaat tccttcctag atgaagcagc gtattgcaac caccttgatg      10320
ttttgaggct tcttagcaaa actaccctca cctgtctagg agacttcaag caactccacc      10380
cagtgggttt tgattctcat tgttatgttt ttgacatcat gcctcaaact caactgaaga      10440
ccatctggag gttcggacag aatatctgtg atgccatcca gccagattac agggacaagc      10500
tcatgtccat ggtcaacaca acccgtgtga cctacgtgga aagacctgtc aggtatgggc      10560
aggtcctcac cccctaccac agggaccgag aggacgacgc catcactatt gactccagtc      10620
aaggcgccac attcgatgtg gtcacattgc atttgcccac taaagattca ctcaacaggc      10680
aaagagccct tgttgccatc accagggcta gacacgctat ctttgtgtat gacccacaca      10740
ggcagctgca gagcttgttt gatcttcctg caaaaggcac acccgtcaac cttgcagtgc      10800
accgcgacgg gcagctgatc gtacttgata gaaataacaa agaatgcacg gttgctcagg      10860
ctctaggcaa cggggataaa ttcagggcca cagacaagcg tgttgcagat tcactccgcg      10920
ccatttgtgc tgatctagaa gggtcgagtt ctccgctccc caaggtcgca cacaacttgg      10980
ggttttattt ctcacctgac ttaacacaat ttgccaaact cccagtggaa cttgcacctc      11040
attggcccgt ggtgacaacc cagaacaatg aaaagtggcc agatcggctg gtcgccagcc      11100
ttcgccctat ccataaatac agccgcgcgt gcatcggtgc cggctatatg gtgggccctt      11160
cggtgtttct aggcactcct ggggtcgtat catactttct tacaaaattt gttaaaggcg      11220
aggctcaaat gcttccagaa acagtcttca gcaccggccg aattgaggtg gattgccggg      11280
aatatcttga cgatcgggag cgggaagttg ctgcatccct cccacacgcc tttattggcg      11340
acgtcaaagg caccaccgtt ggcggatgtc atcatgtcac ctccaggtac cttcctcgct      11400
tccttcccaa agagtcagtt gcggtagtcg gggtctcaag ccccgggaaa gccgcgaagg      11460
caatgtgcac actgacagat gtgtacctcc cagatcttga agcctatctc cacccggaga      11520
cccagtccag gtgctggaaa atgatgttgg acttcaaaga agttcgactg atggtctgga      11580
aagacaaaac ggcctatttc caacttgagg gtcgttattt cacctggtat cagctcgcta      11640
gttatgcctc gtacgtccgt gttcctgtca actccacggt gtacttggac ccctgcatgg      11700
gcccagccca ttgcaacaga cgagttgtcg ggtccactca gtggggagct gacctcgcaa      11760
tcacccccta tgattatggc gccaagatca ttttgtctag cgcatatcac ggtgaaatgc      11820
cccctgggta caagattctg gcgtgtgcgg agttctcatt ggatgacccg gtcagataca      11880
aacacacctg gggatttgag tcggatacag cgtacctgta cgagttcact ggaaatggtg      11940
aggattggga agattataat gatgcgtttc gtgcgcgcca gaaagggaaa atttataagg      12000
ccactgccac cagcttgaag ttttatttcc ctccgggccc tgtcgttgaa ccaactttgg      12060
gcctgaactg aaggcgcgcc atgaaatggg gtccatgcaa agcctttttt acaaaattgg      12120
ccaacttttt gtggatgctt tcacggagtt cttggtgtcc attgttgata tcattatatt      12180
tttggccatt ttgtttggct tcaccatcgc cggttggctg gtggtctttt gcatcagatt      12240
ggtttgctcc gcgatactcc gtacgcgccc tgccattcac tctgagcaat tacagaagat      12300
cttatgaggc ctttctttcc cagtgccaag tggacattcc cacctgggga actaaacatc      12360
ctttggggat gctttggcac cataaggtgt caaccctgat tgatgaaatg gtgtcgcgtc      12420
gaatgtaccg catcatggaa aaagcagggc aggctgcctg gaaacaggtg gtgagcgagg      12480
ctacgctgtc tcgcattagt agtttggatg tggtggctca ttttcagcat ctagccgcca      12540
ttgaagccga gacctgtaaa tatttggcct cccggctgcc catgctacac aacctgcgca      12600
tgacaggttc aaatgtaacc atagtgtata atagcacttt gaatcaggtg tttgctattt      12660
ttccaacccc tggttcccgg ccaaagcttc atgattttca gcaatggtta atagctgtac      12720
attcctccat attttcctct gttgcagctt cttgtactct ttttgttgtg ctgtggttgc      12780
gggttccaat actacgtact gtttttggtt tccgctggtt aggggcaatt tttctttcga      12840
actcacagtg aattacacgg tgtgtccacc ttgcctcacc cggcaagcag ccacagagat      12900
ctacgaaccc ggtaggtctc tttggtgcag gatagggtat gaccgatgtg aggaggatga      12960
tcatgacgag ctagggttta tggtaccgcc tggcctctcc agcgaaggcc acttgactag      13020
tgtttacgcc tggttggcgt tcttgtcctt cagctacacg gcccagttcc atcccgagat      13080
attcgggata gggaatgtga gtcgagttta tgttgacatc aaacatcaac tcatctgcgc      13140
cgaacatgac gggcagaaca ccaccttgcc tcgtcatgac aacatttcag ccgtgtttca      13200
gacctattac caacatcaag tcgacggcgg caattggttt cacctagaat ggcttcgtcc      13260
cttcttttcc tcgtggttgg ttttaaatgt ctcttggttt ctcaggcgtt cgcctgcaaa      13320
ccatgtttca gttcgagtct tgcagatatt aagaccaaca ccaccgcagc ggcaagcttt      13380
gctgtcctcc aagacatcag ttgccttagg catcgcgact cggcctctga ggcgattcgc      13440
aaaatccctc agtgccgtac ggcgataggg acacccgtgt atgttaccat cacagccaat      13500
gtgacagatg agaattattt acattcttct gatctcctca tgctttcttc ttgccttttc      13560
tatgcttctg agatgagtga aaagggattt aaggtggtat ttggcaatgt gtcaggcatc      13620
gtggctgtgt gtgtcaattt taccagctac gtccaacatg tcaaggagtt tacccaacgc      13680
tccctggtgg tcgaccatgt gcggttgctc catttcatga cacctgagac catgaggtgg      13740
gcaactgttt tagcctgtct ttttgccatt ctgttggcaa tttgaatgtt taagtatgtt      13800
ggagaaatgc ttgaccgcgg gctgttgctc gcaattgctt tctttgtggt gtatcgtgcc      13860
gttctgtttt gctgtgctcg ccaacgccag caacgacagc agctcccatc tacagctgat      13920
ttacaacttg acgctatgtg agctgaatgg cacagattgg ctagctaaca aatttgattg      13980
ggcagtggag agttttgtca tctttcccgt tttgactcac attgtctcct atggtgccct      14040
cactaccagc catttccttg acacagtcgc tttagtcact gtgtctaccg ccgggtttgt      14100
tcacgggcgg tatgtcctaa gtagcatcta cgcggtctgt gccctggctg cgttgacttg      14160
cttcgtcatt aggtttgcaa agaattgcat gtcctggcgc tacgcgtgta ccagatatac      14220
caactttctt ctggacacta agggcggact ctatcgttgg cggtcgcctg tcatcataga      14280
gaaaaggggc aaagttgagg tcgaaggtca tctgatcgac ctcaaaagag ttgtgcttga      14340
tggttccgtg gcaaccccta taaccagagt ttcagcggaa caatggggtc gtccttagat      14400
gacttctgtc atgatagcac ggctccagaa aaggtgcttt tggcgttttc tattacctac      14460
acgccagtga tgatatatgc cctaaaggtg agtcgcggcc gactgctagg gcttctgcac      14520
cttttgatct tcctgaattg tgctttcacc ttcgggtaca tgactttcgc gcactttcag      14580
agtacaaata aggtcgcgct cactatggga gcagtagttg cactcctttg gggggtgtac      14640
tcagccatag aaacctggaa attcatcacc tccagatgcc gtttgtgctt gctaggccgc      14700
aagtacattc tggcccctgc ccaccacgtt gaaagtgccg caggctttca tccgattgcg      14760
gcaaatgata accacgcatt tgtcgtccgg cgtcccggct ccactacggt caacggcaca      14820
ttggtgcccg ggttaaaaag cctcgtgttg ggtggcagaa aagctgttaa acagggagtg      14880
gtaaaccttg tcaaatatgc caaataacaa cggcaagcag cagaagagaa agaaggggga      14940
tggccagcca gtcaatcagc tgtgccagat gctgggtaag atcatcgctc agcaaaacca      15000
gtccagaggc aagggaccgg gaaagaaaaa taagaagaaa aacccggaga agccccattt      15060
tcctctagcg actgaagatg atgtcagaca tcactttacc cctagtgagc ggcaattgtg      15120
tctgtcgtca atccagaccg cctttaatca aggcgctggg acttgcaccc tgtcagattc      15180
agggaggata agttacactg tggagtttag tttgcctacg catcatactg tgcgcctgat      15240
ccgcgtcaca gcatcaccct cagcatgatg ggctggcatt cttgaggcat ctcagtgttt      15300
gaattggaag aatgtgtggt gaatggcact gattgacatt gtgcctctaa gtcacctatt      15360
caattagggc gaccgtgtgg gggtgagatt taattggcga gaaccatgcg gccgaaatta      15420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa                                              15443
<210>    5
<211>    609
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    Последовательность NSP1-бета LMY
<400>    5
gctgctgtct acgatgttgg tcatggcgcc gtcatgtatg tggccgatga gagagtctcc         60
tgggcccctc gtggcgggga tgaagtaaga tttgaaactg tcccacagga gctcaagtcg        120
gttgcgaacc aactctgcac ctccttccca ccccaccacg tagtggacat gtctaagttc        180
gcctttacag cccctgggtg tggtgtttct atgcgggtcg aacgtcaata tggctgtctc        240
cccgctgaca ctgtccccga aggcaactgc tggtggagct tgtttgactc gctcccattg        300
gaagtccagg gcaaagaaat tcgccatgct aaccaatttg gctaccagac caagcatggt        360
gtctctggta agtacctaca gcggaggctg caaattaatg gtctccgagc agtagctgac        420
ccaaatggac ctttcgtcgt acagtacttc tccgtcaagg agagttggat ccgccacttg        480
aaactagcgg aagaacccag ttaccctggg tttgaggacc tcctcagaat aagggttgag        540
tctaacacgt caccattggc taacaaggat gaaaaaattt tccggtttgg cagtcataag        600
tggtacggc                                                                609
<210>    6
<211>    609
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    Последовательность NSP1-бета LMY ver2
<400>    6
gccgccgtat acgacgtcgg acatggcgcc gttatgtacg ttgccgacga gagagtctcc         60
tgggcccctc gcggcggcga cgaagttaga ttcgaaacgg tcccacagga gcttaagtcg        120
gttgcgaacc aattatgtac gtcgttccca ccccaccacg tagtcgatat gtctaagttc        180
gcctttaccg cccccggttg cggcgtatct atgcgggtcg aacgtcaata cggctgtctc        240
cccgccgata cggtccccga aggcaactgt tggtggagct tgttcgattc gctcccactc        300
gaagtgcaag gcaaagagat tcgccacgct aaccaattcg ggtatcagac taagcatggc        360
gtatccggta agtacctaca gcgtaggctg caaatcaacg gtctccgcgc agtcgctgac        420
cctaacggac ctttcgtcgt acagtacttc tccgtcaagg agagttggat ccgccacttg        480
aaactggccg aagaacctag ttaccccggg ttcgaggacc tcctccgcat aagggttgag        540
tctaatacgt caccattggc taacaaggac gaaaaaattt tccggtttgg cagtcataag        600
tggtacggc                                                                609
<210>    7
<211>    8
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    Сайт распознавания рестриктазы AscI
<400>    7
ggcgcgcc                                                                   8
<210>    8
<211>    8
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    Сайт распознавания рестриктазы PacI
<400>    8
ttaattaa                                                                   8
<210>    9
<211>    23
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    Прямой ПЦР-праймер для амплификации ДНК LMY
<400>    9
atgacgtata ggtgttggct cta                                                 23
<210>    10
<211>    20
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    Обратный ПЦР-праймер для амплификации ДНК LMY
<400>    10
ctgaggattt ggatggcatt                                                     20
<210>    11
<211>    1149
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    Ген NSP1 LMY
<400>    11
atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt tatggcggag         60
ggccaagttt actgcacacg atgtctcagt gcacggtctc tccttcccct gaatctccaa        120
gtttctgagc tcggggtgct gggcctattc tacaggcccg aagagccact ccggtggacg        180
ttgccacgtg cattccccac tgttgagtgc tcccccgccg gggcctgctg gctttctgca        240
atctttccaa ttgcacgaat gaccagtgga aacctaaact tccaacaaag aatggtacgg        300
gtcgcagctg agatctacag agttggccag ctcacccctg cagttttgaa ggctctacaa        360
gtttatgagc ggggttgccg ctggtatccc attgttggac ctgtccctgg agtggccgtt        420
ttcgccaact ccctgcatgt gagtgataga cctttcccgg gagcaactca cgtattaacc        480
aacctgccac tcccgcagag acccaagcct gaggactttt gccccttcga gtgtgctatg        540
gctgctgtct acgatgttgg tcatggcgcc gtcatgtatg tggccgatga gagagtctcc        600
tgggcccctc gtggcgggga tgaagtaaga tttgaaactg tcccacagga gctcaagtcg        660
gttgcgaacc aactctgcac ctccttccca ccccaccacg tagtggacat gtctaagttc        720
gcctttacag cccctgggtg tggtgtttct atgcgggtcg aacgtcaata tggctgtctc        780
cccgctgaca ctgtccccga aggcaactgc tggtggagct tgtttgactc gctcccattg        840
gaagtccagg gcaaagaaat tcgccatgct aaccaatttg gctaccagac caagcatggt        900
gtctctggta agtacctaca gcggaggctg caaattaatg gtctccgagc agtagctgac        960
ccaaatggac ctttcgtcgt acagtacttc tccgtcaagg agagttggat ccgccacttg       1020
aaactagcgg aagaacccag ttaccctggg tttgaggacc tcctcagaat aagggttgag       1080
tctaacacgt caccattggc taacaaggat gaaaaaattt tccggtttgg cagtcataag       1140
tggtacggc                                                               1149
<210>    12
<211>    1149
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    Ген NSP1 LMY ver2
<400>    12
atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt tatggcggag         60
ggccaagttt actgcacacg atgtctcagt gcacggtctc tccttcccct gaatctccaa        120
gtttctgagc tcggggtgct gggcctattc tacaggcccg aagagccact ccggtggacg        180
ttgccacgtg cattccccac tgttgagtgc tcccccgccg gcgcatgctg gctttccgct        240
atctttccaa tcgcacgaat gaccagtgga aacctaaact tccaacaaag aatggtacgg        300
gtcgccgccg aaatatacag agtcgggcaa cttacgcccg ctgtattgaa ggctctgcaa        360
gtatacgagc ggggttgtag gtggtatccc atcgtaggac ctgtccctgg agtggccgtt        420
ttcgccaact ccctgcatgt gagtgataga cctttcccgg gagcaactca cgtattaacc        480
aacctgccac tcccgcagag acccaagcct gaggactttt gccccttcga gtgtgctatg        540
gccgccgtat acgacgtcgg acatggcgcc gttatgtacg ttgccgacga gagagtctcc        600
tgggcccctc gcggcggcga cgaagttaga ttcgaaacgg tcccacagga gcttaagtcg        660
gttgcgaacc aattatgtac gtcgttccca ccccaccacg tagtcgatat gtctaagttc        720
gcctttaccg cccccggttg cggcgtatct atgcgggtcg aacgtcaata cggctgtctc        780
cccgccgata cggtccccga aggcaactgt tggtggagct tgttcgattc gctcccactc        840
gaagtgcaag gcaaagagat tcgccacgct aaccaattcg ggtatcagac taagcatggc        900
gtatccggta agtacctaca gcgtaggctg caaatcaacg gtctccgcgc agtcgctgac        960
cctaacggac ctttcgtcgt acagtacttc tccgtcaagg agagttggat ccgccacttg       1020
aaactggccg aagaacctag ttaccccggg ttcgaggacc tcctccgcat aagggttgag       1080
tctaatacgt caccattggc taacaaggac gaaaaaattt tccggtttgg cagtcataag       1140
tggtacggc                                                               1149
<---