МАТРИЧНЫЕ РИБОНУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ ДЛЯ УСИЛЕНИЯ ИММУННЫХ ОТВЕТОВ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
MATRIX RIBONUCLEIC ACIDS FOR ENHANCING IMMUNE RESPONSES AND THEIR APPLICATION METHODS

Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США, серийный №62/412,933, поданной 26 октября 2016 г.; предварительной заявке на патент США с серийным №62/467,034, поданной 3 марта 2017 г.; предварительной заявке на патент США с серийным №62/490,522, поданной 26 апреля 2017 года; и предварительной заявке на патент США с серийным №62/558,206, поданной 13 сентября 2017 г.Полное содержание вышеупомянутых заявок включено в данный документ посредством данной ссылки.
Уровень техники
Способность модулировать иммунный ответ полезна в различных клинических ситуациях, включая лечение рака и патогенных инфекций, а также в усилении ответов на вакцину для обеспечения защитного иммунитета. Существует ряд терапевтических средств для модуляции функции биологических путей и/или молекул, которые вовлекаются в такие заболеваниях, как рак и патогенные инфекции. Данные средства включают, например, низкомолекулярные ингибиторы, цитокины и терапевтические антитела. Некоторые из этих средств функционируют посредством модуляции иммунных реакций у субъекта, такие как цитокины, которые модулируют активность клеток в иммунной системе, или антитела-ингибиторы иммунных контрольных точек, такие как анти-CTLA-4 или анти-PD-L1, которые модулируют регуляцию иммунных ответов.
Кроме того, вакцины уже давно используются для стимуляции иммунного ответа против антигенов патогенов, чтобы тем самым обеспечить защитный иммунитет против последующего воздействия патогенов. Совсем недавно были разработаны вакцины с использованием антигенов, обнаруженных в опухолевых клетках, чтобы таким образом повысить противоопухолевую иммунореактивность. В дополнение к антигену(ам), используемому в вакцине, другие агенты могут быть включены в вакцинный препарат или использованы в комбинации с вакцинным препаратом для дальнейшего усиления иммунного ответа на вакцину. Такие агенты, которые повышают реактивность к вакцинам, упоминаются в данной области техники как адъюванты. Примеры обычно используемых вакцинных адъювантов включают гели и соли алюминия, монофосфориллипид А, MF59, эмульсию типа масло в воде, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, детергенты и сапонины растений. Данные адъюванты обычно используются с вакцинами на основе белков или пептидов. В настоящее время разрабатываются альтернативные виды вакцин, такие как вакцины на основе РНК.
В данной области техники существует потребность в дополнительных эффективных агентах, которые усиливают иммунные ответы на представляющий интерес антиген.
Сущность изобретения
Данное раскрытие обеспечивает матричные РНК (мРНК), кодирующие полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген(ы), называемый в данном документе как иммуностимуляторные конструкты. В некоторых вариантах осуществления матричные РНК (мРНК) являются химически модифицированными, называемыми в данном документе как модифицированная мРНК (ммРНК), причем ммРНК содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований. Альтернативно, мРНК может содержать в целом немодифицированные нуклеотидные основания. В одном варианте осуществления иммуностимуляторный конструкт относится к матричной РНК (мРНК), кодирующей полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген у субъекта (необязательно при этом указанная мРНК содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований), и причем иммунный ответ включает клеточный или гуморальный иммунный ответ, характеризующийся:
(i) стимуляцией сигнального пути интерферона типа I;
(ii) стимуляцией сигнального пути NFkB;
(iii) стимуляцией воспалительного ответа;
(iv) стимуляцией продукции цитокинов; или
(v) стимуляцией развития, активности или мобилизации дендритных клеток; и
(vi) комбинацией любого из (i) - (vi).
В некоторых вариантах осуществления конструкт имммуностимуляторной мРНК (или комбинация конструктов имммуностимуляторных мРНК) усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген в несколько раз, например, по отношению к иммунному ответу на антиген в отсутствии иммуностимулятора, или по отношению к низкомолекулярному агонисту, который усиливает иммунный ответ на антиген. Например, в различных вариантах осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген в 0,3-1000 раз, 1-750 раз, 5-500 раз, 7-250 раз или в 1-100 раз по сравнению, например, с иммунным ответом на антиген в отсутствии конструкта иммуностимуляторной мРНК или по сравнению, например, с иммунным ответом на антиген в присутствии низкомолекулярного агониста иммунного ответа на антиген. В некоторых вариантах осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген в 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раза, 7,5 раз, 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 75 раз, или более раз по сравнению, например, с иммунным ответом на антиген в отсутствии конструкта иммуностимуляторной мРНК или по сравнению, например, с иммунным ответом на антиген в присутствии низкомолекулярного агониста иммунного ответа на антиген.
Представляющий интерес антиген может быть эндогенным антигеном у субъекта (например, эндогенный опухолевый антиген) или экзогенный антиген, который предоставляется субъекту с помощью иммуностимуляторного конструкта (например, экзогенный опухолевый антиген или антиген патогена, включая вакцинные антигены). Таким образом, иммуностимуляторные мРНК согласно раскрытию полезны для потенцирования или усиления иммунного ответа in vivo против представляющих интерес антигенов, таких как опухолевые антигены при лечении рака или антигенов патогена при лечении, или вакцинации против инфекционных заболеваний.
В одном варианте осуществления представляющий интерес антиген является эндогенным антигеном, таким как опухолевый антиген, и конструкт иммуностимуляторной мРНК предоставляется субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции или усиления иммунного ответа против опухолевого антигена. В некоторых вариантах осуществления конструкт иммунностимуляторной мРНК вводят в комбинации с одним или более дополнительными агентами, например, конструктами мРНК, для стимуляции высвобождения эндогенных антигенов, например, путем индукции иммуногенной гибели клеток, такой как некроптоз или пироптоз. Соответственно, в другом аспекте изобретение обеспечивает конструкты мРНК (например, ммРНК), которые кодируют полипептид, который индуцирует иммуногенную гибель клеток, такую как некроптоз или пироптоз. В некоторых аспектах иммуногенная клеточная гибель, вызванная мРНК, приводит к высвобождению цитозольных компонентов из клетки (например, опухолевой клетки), так что иммунный ответ против клеточных антигенов (например, эндогенных опухолевых антигенов) стимулируется in vivo.
В других вариантах осуществления представляющий интерес антиген является экзогенным антигеном, который кодируется мРНК, такой как химически модифицированная мРНК (ммРНК), представленной в той же самой мРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте мРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторную и антигенную мРНК составляют (или совместно составляют) и вводят (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена у субъекта.
+
+
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, конструкт ммРНК), которая кодирует полипептид, который усиливает иммунный ответ, например, посредством стимуляции сигнального пути интерферона типа I, стимуляции сигнального пути NFkB, стимуляции воспалительного ответа, стимуляции продукции цитокинов или стимуляции развития, активности или мобилизации дендритных клеток. Усиление иммунного ответа на представляющего интерес антиген при помощи иммуностимуляторной мРНК приводит, например, к стимуляции продукции цитокинов, стимуляции клеточного иммунитета (Т-клеточных ответов), такого как антигенспецифические CD8или CD4Т-клеточные ответы, и/или к стимуляции гуморального иммунитета (B-клеточные ответы), такого как образование антигенспецифических антител, или к любой комбинаций вышеуказанных ответов.
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который функционирует в сигнальном пути ниже по меньшей мере одного Toll-подобного рецептора (TLR), тем самым усиливая иммунный ответ, примеры которого приведены в данном документе. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который стимулирует ответ интерферона типа I, примеры которого приведены в данном документе. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который стимулирует NFkB-опосредованный провоспалительный ответ, примеры которого приведены в данном документе. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который является внутриклеточным адаптерным белком, примеры которого приведены в данном документе. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который является внутриклеточным сигнальным белком, примеры которого приведены в данном документе. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который является фактором транскрипции, примеры которого приведены в данном документе. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который вовлечен в некроптоз или в образование некроптосом, примеры которого приведены в данном документе. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который участвует в пироптозе или в образовании инфламмасом, примеры которого приведены в данном документе. Также предлагаются композиции, которые содержат комбинации двух или более иммуностимуляторных мРНК (одного и того же типа класса или разных типов класса).
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека. В одном аспекте конститутивно активный полипептид STING человека содержит одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из V147L, N154S, V155M, R284M, R284K, R284T, E315Q, R375A и их комбинаций. В некоторых аспектах конститутивно активный полипептид STING человека содержит мутацию V155M (например, имеющую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, или кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 199, 1319 или 1320). В некоторых аспектах конститутивно активный полипептид STING человека содержит мутации V147L/N154S/V155M. В других аспектах конститутивно активный полипептид STING человека содержит мутации R284M/V147L/N154S/V155M. В других аспектах конститутивно активный полипептид STING человека содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-10 и 224. В другом аспекте конститутивно активный полипептид STING человека кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 199-208, 225, 1319, 1320, 1442-1450 и 1466.
В других аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую конститутивно активный полипептид IRF3 человека. В одном аспекте конститутивно активный полипептид IRF3 человека содержит мутацию S396D. В одном аспекте конститутивно активный полипептид IRF3 человек содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 210 или SEQ ID NO: 1452. В одном аспекте конститутивно активный полипептид IRF3 представляет собой полипептид IRF3 мыши, например, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 211 или SEQ ID NO: 1453.
В еще одних других аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую конститутивно активный полипептид IRF7 человека. В одном аспекте конститутивно активный полипептид IRF7 человека содержит одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из S475D, S476D, S477D, S479D, L480D, S483D, S487D и их комбинаций; делецию аминокислот 247-467; и комбинации вышеуказанных мутаций и/или делеций. В одном варианте осуществления конститутивно активный полипептид IRF7 человека содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 14-18. В одном варианте осуществления конститутивно активный полипептид IRF7 человека кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 213-217 и 1454-1459.
В еще одних других аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, выбранный из группы, состоящей из MyD88, TRAM, IRF1, IRF8, IRF9, TBK1, IKKi, STAT1, STAT2, STAT4, STAT6, c-FLIP, IKKα, IKKβ, RIPK1, гибрида TAK-TAB1, DIABLO, Btk, самоактивирующейся каспазы-1 и Flt3.
В других аспектах раскрытие обеспечивает композиции мРНК (например, композиции ммРНК), содержащие один или более конструктов мРНК (например, конструкты ммРНК), кодирующих представляющий интерес антиген(ы), и полипептид, который усиливает иммунный ответ против представляющего интерес антигена(ов), причем антиген(ы) и полипептид кодируются или одним и тем же конструктом мРНК (ммРНК), или отдельными конструктами мРНК (ммРНК), которые можно комбинировать и вводить одновременно или последовательно субъекту, нуждающемуся в этом. Любая из иммуностимуляторных мРНК (например, ммРНК), описанная в данном документе (одна или в комбинации), полезна в одной или более композициях для усиления иммунного ответа на представляющий интерес антиген(ы).
Соответственно, в некоторых аспектах раскрытие обеспечивает композицию, содержащую первую мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ, и вторую мРНК (например, ммРНК), кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес антиген, необязательно при этом указанные первая и вторая мРНК содержат одну или более модифицированных нуклеотидных оснований, и причем полипептид усиливает иммунный ответ по меньшей мере на один представляющий интерес антиген, когда композицию вводят субъекту. В одном аспекте композиция содержит один конструкт мРНК (например, ммРНК), кодирующий как по меньшей мере один представляющий интерес антиген, так и полипептид, который усиливает иммунный ответ по меньшей мере на один представляющий интерес антиген. В другом аспекте композиция содержит два конструкта мРНК (например, ммРНК), один из которых кодирует по меньшей мере один представляющий интерес антиген, а другой кодирует полипептид, который усиливает иммунный ответ по меньшей мере на один представляющий интерес антиген. В некоторых аспектах, когда композиция содержит два конструкта мРНК, два конструкта мРНК (например, ммРНК) совместно составляют в одной и той же композиции (такой как, например, липидная наночастица) и совместно вводят субъекту. В других аспектах, когда предоставляются два или более конструктов мРНК, такие конструкты мРНК могут быть составлены в различных композициях (таких как, например, две или более липидные наночастицы) и введены (например, одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом.
В других аспектах раскрытие обеспечивает композицию, содержащую первую мРНК (например, ммРНК), кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ, и вторую мРНК (например, ммРНК), кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес антиген, причем по меньшей мере один представляющий интерес антиген является по меньшей мере одним опухолевым антигеном. В одном аспекте по меньшей мере один опухолевый антиген представляет собой по меньшей мере один мутантный антиген KRAS. В одном аспекте по меньшей мере один мутантный антиген KRAS содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из G12D, G12V, G13D, G12C и их комбинаций. В одном аспекте по меньшей мере один мутантный антиген KRAS человека содержит аминокислотную последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 95-106 и 131-132. В других аспектах композиция содержит конструкт мРНК, кодирующий по меньшей мере один мутантный антиген KRAS человека и конститутивно активный полипептид STING человека, например, при этом мРНК кодирует аминокислотную последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 107-130. Иллюстративные нуклеотидные последовательности мРНК для конструктов, кодирующих по меньшей мере один мутантный антиген KRAS человека и конститутивно активный полипептид STING человека, приведены в SEQ ID NO: 220-223 и 1462-1465. В других аспектах опухолевый антиген представляет собой антиген онковируса (например, антиген вируса папилломы человека (HPV), такой как антиген HPV16 E6 или HPV E7, или их комбинация).
В других аспектах композиции согласно раскрытию по меньшей мере один представляющий интерес антиген является по меньшей мере одним антигеном патогена. В одном аспекте по меньшей мере один патогенный антиген относится к патогену, выбранному из группы, состоящей из вирусов, бактерий, простейших, грибов и паразитов. В одном варианте осуществления по меньшей мере один антиген патогена представляет собой по меньшей мере один вирусный антиген. В одном аспекте по меньшей мере один вирусный антиген представляет собой по меньшей мере один антиген вируса папилломы человека (HPV). В одном аспекте антиген HPV представляет собой антиген HPV16 E6 или HPV E7, или их комбинацию. В одном аспекте антиген HPV содержит аминокислотную последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 36-94. В других аспектах композиции согласно раскрытию по меньшей мере один антиген патогена представляет собой по меньшей мере один бактериальный антиген. В одном варианте осуществления по меньшей мере один бактериальный антиген представляет собой поливалентный антиген.
В одном варианте осуществления представляющий интерес антиген представляет собой один или более антигенов онкогенного вируса, такого как вирус папилломы человека (HPV), вирус гепатита B (HBV), вирус гепатита C (HCV), вирус Эпштейна-Барр (EBV), Т-лимфотропный вирус человека типа I (HTLV-I), герпесвирус саркомы Капоши (KSHV) или полиомавирус клеток Меркеля (MCV). В одном аспекте представляющий интерес антиген онкогенного вируса кодируется мРНК (например, химически модифицированной мРНК) и представляется на той же самой мРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представляется на другом конструкте мРНК в качестве иммуностимулятора. В некоторых аспектах иммуностимуляторную мРНК и вирусный антиген(ы) составляют (или совместно составляют) и вводят (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена(ов) онкогенного вируса у субъекта. В данном документе описаны подходящие антигены онкогенного вируса для применения с иммуностимуляторами.
В одном варианте осуществления представляющий интерес антиген представляет собой один или более опухолевых антигенов, которые включают персонализированную противораковую вакцину. В одном аспекте раскрытие обеспечивает вакцинный препарат, который включает мРНК (например, ммРНК), кодирующую один или более раковых антигенов, специфических для больного раком, называемых неоэпитопами, вместе с иммуностимуляторным конструктом, причем раковые антигены и иммуностимуляторы кодируются одинаковыми или разными мРНК (например, ммРНК). В данном документе описаны способы выбора раковых антигенов, специфических для больного раком, и создания персонализированных противораковых вакцин на их основе. Соответственно, в одном аспекте раскрытие обеспечивает персонализированную противораковую вакцину, содержащую один или более опухолевых антигенов, специфических для больного раком (например, один или более неоэпитопов), кодируемых одной или более мРНК (например, химически модифицированными мРНК), при этом раковые неоэпитопы кодируются одной и той же мРНК или разными мРНК (например, каждый раковый неоэпитоп кодируется в отдельном конструкте мРНК). В некоторых аспектах раковый неоэпитоп(ы) кодируется в том же самом конструкте мРНК, что и в иммуностимуляторном конструкте, или кодируется в другом конструкте мРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные мРНК и мРНК ракового антигена(ов) можно составлять (или совместно составлять) и вводить (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против ракового антигена(ов) у субъекта.
В одном аспекте конструкт мРНК кодирует персонализированный раковый антиген, который представляет собой конкатемерный раковый антиген, состоящий из 2-100 пептидных эпитопов. В другом аспекте конкатемерный раковый антиген содержит одно или более: а) 2-100 пептидных эпитопов, перемежающихся сайтами, чувствительными к расщеплению; b) мРНК, кодирующую каждый пептидный эпитоп, связанную непосредственно друг с другом без линкера; c) мРНК, кодирующую каждый пептидный эпитоп, связанную с одним или другим с помощью одного нуклеотидного линкера; d) каждый пептидный эпитоп, содержащий 25-35 аминокислот и включающий центрально расположенную SNP-мутацию; e) по меньшей мере 30% пептидных эпитопов, имеющих самую высокую аффинность к молекулам ГКГС класса I от субъекта; f) по меньшей мере 30% пептидных эпитопов, имеющих самую высокую аффинность к молекулам ГКГС класса II от субъекта; g) по меньшей мере 50% пептидных эпитопов, имеющих заявленную аффинность связывания ИК>500 нМ для HLA-A, HLA-B и/или DRB1; h) мРНК, кодирующую 20 пептидных эпитопов; i) 50% пептидных эпитопов, имеющих аффинность связывания для ГКГС класса I, и 50% пептидных эпитопов, имеющих аффинность связывания для ГКГС класса II; и/или j) мРНК, кодирующую пептидные эпитопы, расположенную таким образом, что пептидные эпитопы упорядочиваются для минимизации псевдоэпитопов.
В некоторых аспектах конкатемерный раковый антиген содержит 2-100 пептидных эпитопов, при этом каждый пептидный эпитоп содержит 31 аминокислоту и содержит центрально расположенную SNP-мутацию с 15 фланкирующими аминокислотами на каждой стороне SNP-мутации. В некоторых аспектах пептидные эпитопы представляют собой Т-клеточные эпитопы, В-клеточные эпитопы или комбинацию Т-клеточных эпитопов и В-клеточных эпитопов. В некоторых аспектах пептидные эпитопы включают по меньшей мере один эпитоп ГКГС класса I и по меньшей мере один эпитоп ГКГС класса II. В некоторых аспектах по меньшей мере 30% эпитопов представляют собой эпитопы ГКГС класса I, или по меньшей мере 30% эпитопов представляют собой эпитопы ГКГС класса II.
В одном варианте осуществления представляющий интерес антиген представляет собой по меньшей мере один бактериальный антиген, например, бактериальную вакцину, которая содержит по меньшей мере один бактериальный антиген и иммуностимуляторный конструкт, кодируемую в тех же или отдельных мРНК (например, ммРНК). В одном аспекте раскрытие обеспечивает бактериальную вакцину, которая содержит мРНК, кодирующую один или более бактериальных антигенов, вместе с иммуностимуляторным конструктом, при этом бактериальные антигены и иммуностимулятор кодируются одинаковыми или разными мРНК. Соответственно, в одном аспекте раскрытие обеспечивает бактериальную вакцину, содержащую один или более бактериальных антигенов (например, поливалентная вакцина) (например, кодируемых одной или более химически модифицированными мРНК), при этом бактериальные антигены кодируются одной и той же мРНК или разными мРНК (например, каждый бактериальный антиген кодируется в отдельном конструкте мРНК). В некоторых аспектах бактериальные антигены кодируются в том же конструкте мРНК, что и в иммуностимуляторном конструкте, или кодируются другим конструктом мРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные мРНК и мРНК бактериального антигена(ов) могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против бактериального антигена(ов) у субъекта
В некоторых вариантах осуществления бактериальную вакцину вводят субъекту для обеспечения профилактического лечения (т.е. предотвращает инфекцию). В некоторых вариантах осуществления бактериальную вакцину вводят субъекту для обеспечения терапевтического лечения (т.е. лечит инфекцию). В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина индуцирует гуморальный иммунный ответ у субъекта (то есть продукцию антител, специфических к представляющему интерес бактериальному антигену). В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина индуцирует адаптивный иммунный ответ у субъекта. Неограничивающие примеры подходящих бактерий включают Staphylococcus aureus.
В одном варианте осуществления представляющий интерес антиген представляет собой поливалентный антиген (то есть антиген содержит множество антигенных эпитопов, таких как множество антигенных пептидов, содержащих одинаковые или разные эпитопы), чтобы тем самым усиливать иммунный ответ против поливалентного антигена. В одном аспекте поливалентный антиген представляет собой конкатемерный антиген. В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе мРНК-вакцины содержат мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конкатемерный антиген, состоящий из 2-100 пептидных эпитопов (например, одинаковых или разных эпитопов). В одном варианте осуществления поливалентный антиген представляет собой раковый антиген. В другом варианте осуществления поливалентный антиген представляет собой бактериальный антиген. Неограничивающие примеры поливалентных антигенов описаны в данном документе.
Конструкт мРНК (например, ммРНК) согласно раскрытию (например, иммуностимуляторная мРНК, антигенкодирующая мРНК или их комбинация) может содержать, например, 5'-НТО, оптимизированную по кодонам открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, 3'-НТО и 3'-хвостовую область связанных нуклеозидов. В одном варианте осуществления мРНК дополнительно содержит один или более сайтов связывания микроРНК (миРНК).
5
1
1
5
2
5
5
5
5
5
6
6
5
1
1
5
5
В одном варианте осуществления конструкт модифицированной мРНК согласно раскрытию является полностью модифицированным. Например, в одном варианте осуществления ммРНК содержит псевдоуридин (ψ), псевдоуридин (ψ) и 5-метилцитидин (mC), 1-метилпсевдоуридин (mψ), 1-метилпсевдоуридин (mψ) и 5-метилцитидин (mC), 2-тиоуридин (sU), 2-тиоуридин и 5-метилцитидин (mC), 5-метоксиуридин (moU), 5-метоксиуридин (moU) и 5-метилцитидин (mC), 2'-O-метилуридин, 2'-O-метилуридин и 5-метилцитидин (mC), N6-метиладенозин (mA) или N6-метиладенозин (mA) и 5-метилцитидин (mC). В другом варианте осуществления ммРНК содержит псевдоуридин (ψ), N1-метилпсевдоуридин (mψ), 2-тиоуридин, 4'-тиоуридин, 5-метилцитозин, 2-тио-1-метил-1-дезазапсевдоуридин, 2-тио- 1-метилпсевдоуридин, 2-тио-5-азауридин, 2-тиодигидропсевдоуридин, 2-тиодигидроуридин, 2-тиопсевдоуридин, 4-метокси-2-тиопсевдоуридин, 4-метоксипсевдоуридин, 4-тио-1-метилпсевдоуридин, 4-тиопсевдоуридин, 5-азауридин, дигидропсевдоуридин, 5-метоксиуридин или 2'-O-метилуридин, или их комбинации. В еще одном варианте осуществления ммРНК содержит 1-метилпсевдоуридин (mψ), 5-метоксиуридин (moU), 5-метилцитидин (mC), псевдоуридин (ψ), α-тиогуанозин или α-тиоаденозин, или их комбинации.
В другом аспекте раскрытие относится к липидной наночастице, содержащей мРНК (например, модифицированную мРНК) согласно раскрытию. В одном варианте осуществления липидная наночастица представляет собой липосому. В другом варианте осуществления липидная наночастица содержит катионный и/или ионизируемый липид. В одном варианте осуществления катионный и/или ионизируемый липид представляет собой 2,2-дилинолеил-4-метиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (DLin-KC2-DMA) или дилинолеилметил-4-диметиламинобутират (DLin-MC3-DMA). В одном варианте осуществления липидная наночастица дополнительно содержит нацеливающий фрагмент, конъюгированный с наружной поверхностью липидной наночастицы.
В другом аспекте раскрытие относится к фармацевтической композиции, содержащей мРНК (например, ммРНК) согласно раскрытию или липидную наночастицу согласно изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуномодулирующую терапевтическую композицию по любому из предшествующих или связанных вариантов осуществления, при этом каждую мРНК составляют в одну и ту же или другую липидную наночастицу-носитель. В некоторых аспектах каждую мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген(ы) (например, раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген), составляют в одну и ту же или другую липидную наночастицу-носитель. В некоторых аспектах каждую мРНК, кодирующую иммуностимулятор, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген(ы), составляют в одну и ту же или другую липидную наночастицу-носитель. В некоторых аспектах каждую мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген(ы), составляют в одну и ту же липидную наночастицу-носитель, а каждую мРНК, кодирующую иммуностимулятор, составляют в другую липидную наночастицу-носитель. В некоторых аспектах каждую мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген(ы), составляют в одну и ту же липидную наночастицу-носитель, а каждую мРНК, кодирующую иммуностимулятор, составляют в одну и ту же липидную наночастицу-переносчик, как и каждую мРНК, кодирующую представляющую интерес антиген(ы). В некоторых аспектах каждую мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген(ы), составляют в другую липидную наночастицу-носитель, и каждую мРНК, кодирующую иммуностимулятор, составляют в ту же липидную наночастицу-носитель, как и каждую мРНК, кодирующую каждый представляющий интерес антиген(ы) (например, раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген).
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуномодулирующую терапевтическую композицию по любому из вышеупомянутых вариантов осуществления, при этом иммуномодулирующую терапевтическую композицию составляют в виде липидной наночастицы, причем липидная наночастица имеет мольное соотношение около 20-60% ионизируемого аминолипида: 5-25% фосфолипида: 25-55% стерола; и содержит 0,5-15% ПЭГ-модифицированного липида. В некоторых аспектах ионизируемый аминолипид выбирают из группы, состоящей, например, из 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолана (DLin-KC2-DMA), дилинолеилметил-4-диметиламинобутирата (DLin-MC3-DMA) и ди((Z) -нон-2-ен-1-ил)9-((4-(диметиламино)бутаноил)окси)гептадекандиоата (L319).
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуномодулирующую терапевтическую композицию по любому из предшествующих или связанных вариантов осуществления, при этом каждая мРНК содержит по меньшей мере одну химическую модификацию. В некоторых аспектах химическую модификацию выбирают из группы, состоящей из псевдоуридина, N1-метилпсевдоуридина, 2-тиоуридина, 4'-тиоуридина, 5-метилцитозина, 2-тио-1-метил-1-дезазапсевдоуридина, 2-тио-1-метилпсевдоуридина, 2-тио-5-азауридина, 2-тиодигидропсевдоуридина, 2-тиодигидроуридина, 2-тиопсевдоуридина, 4-метокси-2-тиопсевдоуридина, 4-метоксипсевдоуридина 4-тио-1-метилпсевдоуридина, 4-тиопсевдоуридина, 5-азауридина, дигидропсевдоуридина, 5-метилуридина, 5-метилуридина, 5-метоксиуридина и 2'-O-метилуридина.
В других аспектах раскрытие обеспечивает липидную наночастицу-носитель, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит:
(i) мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую антиген HPV; или
мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую антиген HPV16; или
мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую антиген HPV18; или
мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один антиген HPV E6; или
мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один антиген HPV E7; или
мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один антиген HPV Е6 и по меньшей мере один антиген HPV Е7; и
(ii) мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и
фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
В некоторых аспектах вышеуказанной липидной наночастицы-носителя конститутивно активный полипептид STING человека содержит мутацию V155M. В некоторых аспектах конститутивно активный полипептид STING человека содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1. В некоторых аспектах мРНК, кодирующая конститутивно активный полипептид STING человека, содержит 3'-НТО, содержащую по меньшей мере один сайт связывания микроРНК miR-122. В некоторых аспектах мРНК, кодирующая конститутивно активный полипептид STING человека, содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 199, 1319 или 1320.
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает липидную наночастицу по любому из предшествующих вариантов осуществления, причем липидная наночастица имеет мольное соотношение около 20-60% ионизируемого аминолипида: 5-25% фосфолипида: 25-55% стерола; и содержит 0,5-15% ПЭГ-модифицированного липида. В некоторых аспектах ионизируемый аминолипид выбирают из группы, состоящей, например, из 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолана (DLin-KC2-DMA), дилинолеилметил-4-диметиламинобутирата (DLin-MC3-DMA) и ди((Z)-нон-2-ен-1-ил)9-((4-(диметиламино)бутаноил)окси)гептадекандиоата (L319). В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица содержит Соединение 25 (в качестве ионизируемого аминолипида), DSPC (в качестве фосфолипида), холестерин (в качестве стерола) и ПЭГ-DMG (в качестве ПЭГ-модифицированного липида). В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица имеет мольное соотношение около 20-60%, Соединения 25: 5-25%, DSPC: 25-55% холестерина; и содержит 0,5-15% ПЭГ-DMG. В одном варианте осуществления липидная наночастица имеет мольное соотношение около 50% Соединения 25: около 10% DSPC: около 38,5% холестерина: около 1,5% ПЭГ-DMG (то есть Соединение 25: DSPC: холестерин: ПЭГ-DMG в соотношении около 50: 10: 38,5: 1,5). В одном варианте осуществления липидная наночастица имеет мольное соотношение 50% Соединения 25: 10% DSPC: 38,5% холестерина: 1,5% ПЭГ-DMG (то есть Соединение 25: DSPC: холестерин: ПЭГ-DMG в соотношении 50:10:38.5:1,5).
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает лекарственный препарат, такой как вакцина, содержащая любую из вышеуказанных или сходных липидных наночастиц-носителей, для применения в терапии, например, для профилактического или терапевтического лечения (например, лечения рака), необязательно с инструкциями по применению в такой терапии.
В некоторых аспектах, относящихся к вышеуказанному лекарственному препарату или вакцине, данное раскрытие обеспечивает первую липидную наночастицу-носитель, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один первый представляющий интерес антиген (например, по меньшей мере один раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает вторую липидную наночастицу-носитель, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один второй представляющий интерес антиген (например, по меньшей мере один раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает третью липидную наночастицу-носитель, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющие открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один третий представляющий интерес антиген (например, по меньшей мере один раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает четвертую липидную наночастицу-носитель, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющие открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один четвертый представляющий интерес антиген (например, по меньшей мере один (например, раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
В других аспектах раскрытие обеспечивает первую липидную наночастицу-носитель, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один антиген HPV (например, по меньшей мере один антиген Е6 и/или по меньшей мере один антиген Е7); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает вторую липидную наночастицу-носитель, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один второй антиген HPV (например, по меньшей мере один антиген Е6 и/или по меньшей мере один антиген Е7); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает третью липидную наночастицу-носитель, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющие открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один третий антиген HPV (например, по меньшей мере один антиген Е6 и/или по меньшей мере один антиген Е7); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает четвертую липидную наночастицу-носитель, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющие открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один четвертый антиген HPV (например, по меньшей мере один антиген Е6 и/или по меньшей мере один антиген Е7); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
В некоторых аспектах вышеупомянутого лекарственного препарата или вакцины каждая из первой, второй, третьей и четвертой липидных наночастиц-переносчиков содержит пептидный антиген, имеющий длину 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислот. В некоторых аспектах каждый пептидный антиген содержит 25 аминокислот в длину.
В некоторых аспектах вышеупомянутых первой, второй, третьей и четвертой липидных наночастиц-носителей, причем антиген(ы) HPV содержит одну или более аминокислотных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 36-72. В некоторых аспектах антиген(ы) HPV содержит одну или более аминокислотных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 73-94.
В некоторых аспектах вышеупомянутых первой, второй, третьей и четвертой липидных наночастиц-носителей конститутивно активный полипептид STING человека содержит мутацию V155M. В некоторых аспектах конститутивно активный полипептид STING человека содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1. В некоторых аспектах конститутивно активный полипептид STING человека содержит 3'-НТО, содержащую по меньшей мере один сайт связывания микроРНК miR-122. В некоторых аспектах мРНК, кодирующая конститутивно активный полипептид STING человека, содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 199, 1319 или 1320.
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает лекарственный препарат, такой как вакцина, содержащая любую из вышеуказанных или сходных липидных наночастиц-носителей, для применения в профилактическом или терапевтическом лечении (например, лечения рака), необязательно с инструкциями по применению в терапии. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает лекарственный препарат, такой как вакцина, содержащая любой из вышеуказанных первой, второй, третьей и четвертой липидных наночастиц-носителей, для применения в терапии рака, необязательно с инструкциями по применению в терапии рака.
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает лекарственный препарат, такой как вакцина, содержащая первую, вторую, третью и четвертую липидные наночастицы-носители, для применения в профилактическом или терапевтическом лечении (например, терапии рака), необязательно с инструкциями по применению в терапии, в которой:
(i) первая липидная наночастица-носитель содержит фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один первый представляющий интерес антиген (например, по меньшей мере один раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген, например, по меньшей мере один антиген E6 и/или по меньшей мере один антиген E7); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель;
(ii) вторая липидная наночастица-носитель содержит фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один второй представляющий интерес антиген (например, раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген, например, по меньшей мере один антиген E6 и/или по меньшей мере один антиген E7); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель;
(iii) третья липидная наночастица-носитель содержит фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один третий представляющий интерес антиген (например, раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген, например, по меньшей мере один антиген E6 и/или по меньшей мере один антиген E7); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель; и
(iv) четвертая липидная наночастица-носитель содержит фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит: мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один четвертый представляющий интерес антиген (например, раковый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген, например, по меньшей мере один антиген E6 и/или по меньшей мере один антиген E7); мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
В любом из вышеперечисленных или связанных аспектов раскрытие обеспечивает способ лечения субъекта, включающий: введение субъекту, нуждающемуся в этом, любую из вышеуказанных или связанных иммуномодулирующих терапевтических композиций, или любую из вышеуказанных или связанных липидных наночастиц-носителей. В некоторых аспектах иммуномодулирующую терапевтическую композицию или липидную наночастицу-носитель вводят в комбинации с другим терапевтическим агентом (например, противораковым терапевтическим агентом). В некоторых аспектах иммуномодулирующую терапевтическую композицию или липидную наночастицу-носитель вводят в комбинации с полипептидом-ингибитором контрольной точки. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой антитело или его фрагмент, которое специфически связывается с молекулой, выбранной из группы, состоящей из PD-1, PD-L1, TIM-3, VISTA, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR и LAG3.
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает композицию (например, вакцину), содержащую мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген, и мРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген (например, иммуностимулятор, например, полипептид STING), причем мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген (Аг), и мРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген (например, иммуностимулятор (ИС), например, полипептид STING), составляют при массовом соотношении Аг : ИС 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 или 20:1. Альтернативно, массовое соотношение ИС : Аг может быть, например: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10 или 1:20. В некоторых аспектах композицию составляют в массовом соотношении 5:1 мРНК, кодирующей представляющий интерес антиген, к мРНК, кодирующей полипептид, который усиливает иммунитет на представляющий интерес антигена (например, иммуностимулятор, например, полипептид STING) (т.е. соотношение Аг:ИС 5:1 или, альтернативно, соотношение ИС : Аг 1:5). В некоторых аспектах композицию составляют в массовом соотношении 10:1 мРНК, кодирующей представляющий интерес антиген, к мРНК, кодирующей полипептид, который усиливает иммунитет на представляющий интерес антиген (например, иммуностимулятор, например, полипептид STING) (т.е. соотношение Аг:ИС 10:1 или, альтернативно, соотношение ИС:Аг 1:10).
+
+
В другом аспекте раскрытие относится к способу усиления иммунного ответа на представляющий интерес антиген(ы), включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, композиции ммРНК согласно раскрытию, кодирующей представляющий интерес антиген(ы) и полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген(ы), или ее липидной наночастицы, или ее фармацевтической композиции, так что иммунный ответ на представляющий интерес антиген усиливается у субъекта. В одном аспекте усиление иммунного ответа у субъекта включает стимуляцию продукции цитокинов (например, β(или ФНО-α). В другом аспекте усиление иммунного ответа у субъекта включает стимуляцию антигенспецифической активности CD8Т-клеток, например, примирование, пролиферацию и/или выживаемость (например, увеличение популяции эффекторных Т-клеток/Т-клеток памяти). В одном аспекте усиление иммунного ответа у субъекта включает стимуляцию антигенспецифической активности CD4Т-клеток (например, повышение активности Т-хелперов). В других аспектах усиление иммунного ответа у субъекта включает стимуляцию B-клеточных ответов (например, увеличение продукции антител).
+
+
lo
В некоторых аспектах усиление иммунного ответа у субъекта включает стимуляцию продукции цитокинов, стимуляцию антигенспецифических ответов CD8T-клеток, стимуляцию антигенспецифических ответов CD4клеток-хелперов, увеличение популяции эффекторных CD62L T-клеток памяти, стимуляцию активности B-клеток или стимуляцию продукции антигенспецифических антител или любую комбинацию вышеуказанных ответов.
+
+
+
+
+
В некоторых аспектах усиленный иммунный ответ включает стимуляцию продукции цитокинов, причем цитокин представляет собой ИФН-γ или ФНО-α, или и то и другое. В некоторых аспектах усиленный иммунный ответ включает стимуляцию антигенспецифических ответов CD8T-клеток, причем антигенспецифический ответ CD8T-клеток включает пролиферацию CD8T-клеток или продукцию цитокинов CD8T-клеток, или и то и другое. В некоторых аспектах продукция цитокинов CD8Т-клетками увеличивается на по меньшей мере 5%, или по меньшей мере 10%, или по меньшей мере 15%, или по меньшей мере 20%, или по меньшей мере 25%, или по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 50%.
+
+
+
+
В некоторых аспектах усиленный иммунный ответ включает антигенспецифический ответ CD8T-клеток, причем ответ CD8T-клеток включает пролиферацию CD8T-клеток, и при этом процент CD8T-клеток в общей популяции T-клеток увеличивается на по меньшей мере 5%, или по меньшей мере 10%, или по меньшей мере 15%, или по меньшей мере 20%, или по меньшей мере 25%, или по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 50%.
+
+
lo
+
В некоторых аспектах усиленный иммунный ответ включает антигенспецифический ответ CD8T-клеток, причем ответ CD8T-клеток включает увеличение процента эффекторных CD62L T-клеток памяти среди CD8T-клеток.
В другом аспекте раскрытие относится к способу усиления иммунного ответа на представляющий интерес антиген(ы), причем способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, композиции мРНК согласно раскрытию, кодирующей представляющий интерес антиген(ы) и полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген(ы), или ее липидной наночастицы или ее фармацевтической композиции, так что иммунный ответ на представляющий интерес антиген усиливается у субъекта, при этом иммунный ответ на представляющий интерес антиген поддерживается в течение более 10 суток, более 15 суток, более 20 суток, более 25 суток, более 30 суток, более 40 суток, более 50 суток, более 60 суток, более 70 суток, более 80 суток, более 90 суток, более 100, 120, 150, 200, 250, 300 суток или 1 года, или более.
В одном аспекте раскрытие обеспечивает способы усиления иммунного ответа на представляющий интерес антиген(ы), причем субъекту вводят два разных конструкта иммуностимуляторных мРНК (например, ммРНК) (при этом один или оба конструкта также кодируют, или вводятся с конструктом мРНК (например, ммРНК), который кодирует представляющий интерес антиген(ы)), или одновременно, или последовательно. В одном аспекте субъекту вводят композицию иммуностимуляторной(ых) мРНК, которая стимулирует развитие или активность дендритных клеток, до введения субъекту композиции иммуностимуляторной(ых) ммРНК, которая стимулирует сигнальный путь интерферона типа I.
В других аспектах раскрытие обеспечивает способы стимуляции иммунного ответа на опухоль у субъекта, нуждающегося в этом, при этом способ включает введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей по меньшей мере один конструкт мРНК, кодирующий опухолевый антиген(ы) и конструкт мРНК, кодирующий полипептид, который усиливает иммунный ответ на опухолевый антиген(ы), или ее липидной наночастицы или ее фармацевтической композиции, так что иммунный ответ на опухоль стимулируется у субъекта. В одном аспекте опухоль представляет собой рак печени, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ), меланому, рак шейки матки или рак головы или шеи. В некоторых аспектах субъект представляет собой человека.
В одном варианте осуществления раскрытие обеспечивает способ предотвращения или лечения рака, ассоциированного с вирусом папилломы человека (HPV), у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение субъекту композиции, содержащей по меньшей мере один конструкт мРНК, кодирующий: (i) по меньшей мере один представляющий интерес антиген HPV и (ii) полипептид, который усиливает иммунный ответ против по меньшей мере одного представляющего интерес антигена HPV, так что иммунный ответ на по меньшей мере один интересующий антиген HPV усиливается. В одном варианте осуществления полипептид, который усиливает иммунный ответ против по меньшей мере одного представляющего интерес антигена(ов) HPV, представляет собой полипептид STING. В одном варианте осуществления по меньшей мере один антиген HPV представляет собой по меньшей мере один антиген E6, по меньшей мере один антиген E7 или комбинацию по меньшей мере одного антигена E6 и по меньшей мере одного антигена E7 (например, растворимых или внутриклеточных форм E6 и/или E7). В одном варианте осуществления по меньшей мере один антиген HPV и полипептид кодируются на отдельных мРНК и совместно составляют в липидную наночастицу перед введением субъекту. Альтернативно, антиген(ы) HPV и полипептид могут быть закодированы в одной и той же мРНК. В одном варианте осуществления субъект подвергается риску воздействия HPV, и композицию вводят до воздействия HPV. В другом варианте осуществления субъект инфицирован HPV или имеет рак, ассоциированный с HPV. В одном варианте осуществления рак, ассоциированный с HPV, выбирают из группы, состоящей из рака шейки матки, полового члена, влагалища, вульвы, анального канала и ротоглотки. В одном варианте осуществления субъекта, страдающего раком, также лечат ингибитором иммунной контрольной точки.
В другом аспекте раскрытие обеспечивает способы стимуляции иммунного ответа на патоген у субъекта, нуждающегося в этом, при этом способ включает введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей по меньшей мере один конструкт мРНК, кодирующий антиген(ы) патогена и конструкт мРНК, кодирующий полипептид, который усиливает иммунный ответ на антиген(ы) патогена, или ее липидной наночастицы или ее фармацевтической композиции, так что иммунный ответ на патоген стимулируется у субъекта. В одном аспекте патоген выбирают из группы, состоящей из вирусов, бактерий, простейших, грибов и паразитов. В одном аспекте патоген представляет собой вирус, такой как вирус папилломы человека (HPV). В одном аспекте патоген представляет собой бактерию. В одном аспекте субъект представляет собой человека.
В любом из вышеупомянутых или связанных аспектов раскрытие обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую липидную наночастицу и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых аспектах фармацевтическую композицию составляют для внутримышечной доставки.
В любом из вышеизложенных или связанных аспектов раскрытие обеспечивает липидную наночастицу и необязательный фармацевтически приемлемый носитель или фармацевтическую композицию для применения в усилении иммунного ответа у индивидуума (например, для лечения или задержки прогрессирования рака у индивидуума), причем лечение включает введение композиции в комбинации со второй композицией, при этом вторая композиция содержит полипептид-ингибитор контрольной точки и необязательный фармацевтически приемлемый носитель.
В любом из вышеизложенных или связанных аспектов раскрытие обеспечивает использование липидной наночастицы и необязательного фармацевтически приемлемого носителя при изготовлении лекарственного средства для усиления иммунного ответа у индивидуума (например, для лечения или задержки прогрессирования рака у индивидуума), причем лекарственное средство содержит липидную наночастицу и необязательный фармацевтически приемлемый носитель, и при этом лечение включает введение лекарственного средства, необязательно в комбинации с композицией, содержащей полипептид-ингибитор контрольной точки и необязательный фармацевтически приемлемый носитель.
В любом из вышеизложенных или связанных аспектов раскрытие обеспечивает набор, содержащий контейнер, содержащий липидную наночастицу и необязательный фармацевтически приемлемый носитель или фармацевтическую композицию, и листок-вкладыш, содержащий инструкции по введению липидной наночастицы или фармацевтической композиции для усиления иммунного ответа у индивидуума (например, лечения или задержки прогрессирования рака у индивидуума). В некоторых аспектах листок-вкладыш дополнительно содержит инструкции по введению липидной наночастицы или фармацевтической композиции отдельно или в комбинации с композицией, содержащей полипептид-ингибитор контрольных точек и необязательный фармацевтически приемлемый носитель для усиления иммунного ответа у индивидуума (например, для лечения или задержки прогрессирования рака у индивидуума).
В любом из вышеизложенных или связанных аспектов раскрытие обеспечивает набор, содержащий лекарственное средство, содержащее липидную наночастицу и необязательный фармацевтически приемлемый носитель или фармацевтическую композицию, и листок-вкладыш, содержащий инструкции по введению лекарственного средства отдельно или в комбинации с композицией, содержащей полипептид-ингибитор контрольных точек и необязательный фармацевтически приемлемый носитель для усиления иммунного ответа у индивидуума (например, для лечения или задержки прогрессирования рака у индивидуума). В некоторых аспектах набор дополнительно содержит листок-вкладыш, содержащий инструкции по введению первого лекарственного средства до, во время или после введения второго лекарственного средства для усиления иммунного ответа у индивидуума (например, лечения или задержки прогрессирования рака у индивидуума).
В любом из вышеупомянутых или связанных аспектов раскрытие обеспечивает липидную наночастицу, композицию или их применение, или набор, содержащий липидную наночастицу или композицию, как описано в данном документе, при этом полипептид-ингибитор контрольных точек ингибирует PD1, PD-L1, CTLA4 или их комбинацию. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой антитело. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой антитело, выбранное из анти-CTLA4 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывает CTLA4, анти-PD1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывает PD1, анти-PD-L1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывает PD-L1, и их комбинацию. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой анти-PD-L1 антитело, выбранное из атезолизумаба, авелумаба или дурвалумаба. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой анти-CTLA-4 антитело, выбранное из тремелимумаба или ипилимумаба. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой анти-PD1 антитело, выбранное из ниволумаба или пембролизумаба.
В связанных аспектах раскрытие обеспечивает способ снижения или уменьшения размера опухоли, или ингибирования роста опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту любой из вышеуказанных или связанных липидных наночастиц согласно раскрытию, или любой из вышеизложенных или связанных композиций согласно раскрытию.
В связанных аспектах раскрытие обеспечивает способ индукции противоопухолевого ответа у субъекта, страдающего раком, включающий введение субъекту любой из вышеуказанных или связанных липидных наночастиц согласно раскрытию, или любой из вышеупомянутых или связанных композиций согласно раскрытию. В некоторых аспектах противоопухолевый ответ включает Т-клеточный ответ. В некоторых аспектах Т-клеточный ответ включает CD8+Т-клетки.
В некоторых аспектах вышеуказанных способов композицию вводят при помощи внутримышечной инъекции.
В некоторых аспектах вышеупомянутых способов способ дополнительно включает введение второй композиции, содержащей полипептид-ингибитор контрольной точки и необязательный фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольных точек ингибирует PD1, PD-L1, CTLA4 или их комбинацию. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой антитело. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой антитело, выбранное из анти-CTLA4 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывает CTLA4, анти-PD1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывает PD1, анти-PD-L1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывает PD-L1, и их комбинацию. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой анти-PD-L1 антитело, выбранное из атезолизумаба, авелумаба или дурвалумаба. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой анти-CTLA-4 антитело, выбранное из тремелимумаба или ипилимумаба. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой анти-PD1 антитело, выбранное из ниволумаба или пембролизумаба.
В некоторых аспектах любого из вышеуказанных или связанных способов композицию, содержащую полипептид-ингибитор контрольной точки, вводят при помощи внутривенной инъекции. В некоторых аспектах композицию, содержащую полипептид-ингибитор контрольной точки, вводят один раз каждые 2-3 недели. В некоторых аспектах композицию, содержащую полипептид-ингибитор контрольной точки, вводят один раз каждые 2 недели или один раз каждые 3 недели. В некоторых аспектах композицию, содержащую полипептид-ингибитор контрольной точки, вводят до, одновременно или после введения липидной наночастицы или ее фармацевтической композиции.
Краткое описание графических материалов
На Фиг.  1 представлена гистограмма, демонстрирующая стимуляцию продукции ИФН-β в клетках TF1a, трансфицированных конститутивно активными конструктами мРНК STING.
На Фиг.  2 представлена гистограмма, демонстрирующая активацию интерферон-стимулируемого реагирующего элемента (ISRE) конститутивно активными конструктами STING. Варианты STING 23a и 23b соответствуют SEQ ID NO: 1, вариант STING 42 соответствует SEQ ID NO: 2, варианты STING 19, 21a и 21b соответствуют SEQ ID NO: 3, вариант STING 41 соответствует SEQ ID NO: 4, вариант STING 43 соответствует SEQ ID NO: 5, вариант STING 45 соответствует SEQ ID NO: 6, вариант STING 46 соответствует SEQ ID NO: 7, вариант STING 47 соответствует SEQ ID NO: 8, вариант STING 56 соответствует SEQ ID NO: 9 и вариант STING 57 соответствует SEQ ID NO: 10.
На Фиг. 3A-3B представлены гистограммы, демонстрирующие активацию интерферон-стимулируемого реагирующего элемента (ISRE) конститутивно активными конструктами IRF3 (Фиг. 3А) или конститутивно активными конструктами IRF7 (Фиг. 3B). Варианты IRF3 1, 3 и 4 соответствуют SEQ ID NO: 12, и варианты IRF3 2 и 5 соответствуют SEQ ID NO: 11 (варианты имеют разные метки). Вариант IRF7 36 соответствует SEQ ID NO: 18 и вариант 31 представляет собой мышиную версию SEQ ID NO: 18. Вариант IRF7 32 соответствует SEQ ID NO: 17 и вариант IRF7 33 соответствует SEQ ID NO: 14.
На Фиг. 4 представлена гистограмма, демонстрирующая активацию репортерного гена NFκB-люциферазы конститутивно активными конструктами мРНК cFLIP и IKKβ.
На Фиг. 5 представлен график, демонстрирующий активацию репортерного гена NFκB-люциферазы конститутивно активными конструктами мРНК RIPK1.
На Фиг. 6 представлена гистограмма, демонстрирующая индукцию ФНО-α в клетках SKOV3, трансфицированных конструктами мРНК DIABLO.
На Фиг. 7 представлена гистограмма, демонстрирующая индукцию интерлейкина-6 (ИЛ-6) в клетках SKOV3, трансфицированных конструктами мРНК DIABLO.
+
На Фиг. 8А-8В представлены графики, демонстрирующие внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8спленоцитов у мышей, иммунизированных конструктами вакцины на основе E6/E7 HPV, объединенными в состав с конструктами иммуностимуляторных мРНК STING, IRF3 или IRF7 на 21-е сутки после первой иммунизации. На Фиг. 8A показаны Е7-специфические ответы для ICS в отношении ИФН-γ. На Фиг. 8B показаны Е7-специфические ответы для ICS на ФНО-α.
+
На Фиг. 9A-9B представлены графики, демонстрирующие внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8спленоцитов у мышей, иммунизированных конструктами вакцины на основе E6/E7 HPV, объединенными в состав с конструктами иммуностимуляторных мРНК STING, IRF3 или IRF7. На Фиг. 9A показаны Е6-специфические ответы для ICS в отношении ИФН-γ. На Фиг. 9B показаны 67-специфические ответы для ICS на ФНО-α.
+
На Фиг. 10A-10B представлены графики, демонстрирующие E7-специфические ответы для внутриклеточного окрашивания (ICS) на ИФН-γ на 21-е сутки (Фиг. 10А) или 53-е сутки (Фиг. 10 В) для CD8спленоцитов от мышей, иммунизированных конструктами вакцины на основе Е6/Е7 HPV, объединенными в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING, IRF3 или IRF7.
+
На Фиг. 11A-11B представлены графики, демонстрирующие внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8спленоцитов на ИФН-γ на 21-е или 53-е сутки у мышей, иммунизированных конструктами вакцины на основе E6/E7 HPV, объединенными в состав с конструктами иммуностимуляторных мРНК STING, IRF3 или IRF7. На Фиг. 11А показаны E7-специфические ответы от мышей, иммунизированных внутриклеточным E6/E7. На Фиг. 11B показаны E7-специфические ответы от мышей, иммунизированных растворимым E6/E7.
+
+
На Фиг. 12А-12В представлены графики, демонстрирующие процент CD8bклеток среди живых CD45клеток на 21-е сутки (Фиг. 12А) или на 53-е сутки (Фиг. 12 В) для клеток селезенки от мышей, иммунизированных конструктами вакцины на основе Е6/Е7 HPV, объединенными в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING, IRF3 или IRF7.
+
На Фиг. 13А-13В представлены графики, демонстрирующие окрашивание E7-MHC1-тетрамером (специфическое для эпитопа RAHYNIVTF) на 21-е сутки (Фиг. 13А) или на 53-е сутки (Фиг. 13 В) для CD8bспленоцитов от мышей, иммунизированных конструктами вакцины на основе Е6/Е7 HPV, объединенными в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING, IRF3 или IRF7.
+
+
lo
+
lo
lo
lo
На Фиг. 14A-14D представлены графики, демонстрирующие, что большинство E7-тетрамерCD8имеют фенотип эффекторных CD62L памяти, при этом сравнение клеток E7-тетрамерCD8 на 21-е сутки и 53-е сутки демонстрирует, что этот фенотип эффекторных CD62L памяти сохранялся на протяжении всего исследования. На Фиг. 14А (21-е сутки) и 14 В (53-е сутки) показано увеличение % CD8 с фенотипом эффекторных CD62Llo памяти. На Фиг. 14C и 14D показано увеличение % E7-тетрамера+CD8, являющихся CD62L, в случае, когда мышей иммунизировали конструктами вакцины на основе E6/E7 HPV, объединенными в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING, IRF3 или IRF7.
+
На Фиг. 15A-15B представлены графики, демонстрирующие ответы, специфические к неоантигену MC38, для внутриклеточного окрашивания (ICS) на ИФН-γ на 21-е сутки (Фиг. 15A) или 35-е сутки (Фиг. 15 В) для CD8спленоцитов от мышей, иммунизированных конструктом вакцины на основе неоантигена MC38 (ADRvax), объединенным в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING, IRF3 или IRF7.
+
+
lo
+
На Фиг. 16А-16В представлены графики, демонстрирующие процент клеток CD8bсреди живых CD45клеток в селезенке или МКПК (Фиг. 16А) или процент CD62L клеток среди CD8bклеток в селезенке или МКПК (Фиг. 16B) от мышей, иммунизированных конструктом вакцины на основе неонтигена MC38 (ADRvax), объединенным в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING, IRF3 или IRF7.
На Фиг. 17 представлен график, демонстрирующий сравнения титров антител у мышей, получавших указанные конструкты мРНК бактериального антигена отдельно (по 0,2 мкг) или получавших конструкты мРНК бактериального пептида, объединенные в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING.
На Фиг. 18 показана частота мутаций NRAS и KRAS при колоректальном раке, как определено с использованием cBioPortal.
На Фиг. 19А-19С представлены графики, демонстрирующие объем опухоли у мышей, получавших профилактическое лечение, как указано с использованием конструкта E6/E7 HPV вместе с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING (отдельно или в комбинации с лечением анти-CTLA-4 или анти-PD1 на 6-е, 9-е и 12-е сутки) или до, или во время заражения опухолью TC1, которая экспрессирует E7 HPV, демонстрируя ингибирование роста опухоли посредством лечения E6/E7 HPV+STING. Некоторых мышей лечили на -14-е и -7-е сутки растворимым E6/E7+STING (Фиг. 19A) или внутриклеточным E6/E7+STING (Фиг. 19B), с заражением опухолью на 1-е сутки. Других мышей лечили на 1-е и 8-е сутки растворимым E6/E7+STING (Фиг. 19C), с заражением опухолью на 1-е сутки.
На Фиг. 20A-20I представлены графики, демонстрирующие объем опухоли у мышей, получавших терапевтическое лечение, как указано с использованием конструкта E6/E7 HPV вместе с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING (Фиг. 20A), отдельно или в комбинации с лечением анти-CTLA-4 на 13-е, 16-е и 19-е сутки (Фиг. 20B) или с лечением анти-PD1 на 13-е, 16-е и 19-е сутки (Фиг. 20C), после заражения опухолью TC1, которая экспрессирует E7 HPV, демонстрируя ингибирование роста опухоли посредством лечения E6/E7 HPV+STING. На Фиг. 20D-20I показано лечение лигандом DMXAA мышиного STING.
3
3
На Фиг. 21 представлены графики, демонстрирующие объем опухоли у мышей, получавших терапевтическое лечение, как указано с использованием конструкта E6/E7 HPV вместе с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING у мышей с опухолями объемом 200 мм (верхние графики) или объемом 300 мм (нижние графики).
+
На Фиг. 22 представлен график, демонстрирующий внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8спленоцитов для ИФН-γ у мышей, иммунизированных конструктом вакцины на основе ADR, объединенным в состав с иммуностимулятором STING при указанных соотношениях Аг:STING на 21-е сутки после первой иммунизации. CD8+клетки повторно стимулировали или композицией мутантных антигенов ADR (содержащей три пептида), или композицией ADR дикого типа (в качестве контроля).
+
На Фиг. 23 представлен график, демонстрирующий внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8спленоцитов для ФНО- (у мышей, иммунизированных конструктом вакцины на основе ADR, объединенным в состав с иммуностимулятором STING при указанных соотношениях Аг:STING на 21-е сутки после первой иммунизации. CD8+клетки повторно стимулировали или композицией мутантных антигенов ADR (содержащей три пептида), или композицией ADR дикого типа (в качестве контроля).
+
На Фиг. 24A-24C представлены графики, демонстрирующие внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8спленоцитов для ИФН-γ у мышей, иммунизированных конструктом вакцины ADR, объединенным в состав с иммуностимулятором STING при указанных соотношениях Аг:STING на 21-е сутки после первой иммунизации. CD8+клетки повторно стимулировали мутантным пептидом или пептидом дикого типа (в качестве контроля), содержащимся в композиции антигенов ADR. На Фиг. 24А показаны ответы на пептид Adpk1 в композиции ADR. На Фиг. 24B показан ответ на пептид Reps1 в композиции ADR. На Фиг. 24C показан ответ на пептид Dpagt1 в композиции ADR.
На Фиг. 25 представлен график, демонстрирующий антигенспецифические Т-клеточные ответы на эпитопы ГКГС класса I в отношении вакцины CA-132, измеренные методом иммуноферментных пятен (ELISpot) для ИФН-γ, у мышей, которых лечили комбинированным препаратом CA-132 и иммуностимулятора STING, при указанных различных соотношениях Аг: STING.
На Фиг. 26 представлена гистограмма, демонстрирующая антигенспецифические Т-клеточные ответы на эпитопы ГКГС класса I в отношении вакцины CA-132, после повторной стимуляции пептидом СА-87, как измерено методом иммуноферментных пятен для ИФН-γ, у мышей, которых лечили комбинированным препаратом CA-132 и иммуностимулятора STING, при указанных различных соотношениях Аг: STING.
+
На Фиг. 27 представлен график, демонстрирующий внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8спленоцитов для ИФН-γ у мышей, иммунизированных конструктом вакцины E7 HPV16, объединенным в состав с иммуностимулятором STING при указанных соотношениях Аг:STING на 21-е сутки после первой иммунизации.
На Фиг. 28А-28С представлены гистограммы, демонстрирующие результаты внутриклеточного окрашивания на ФНО-α (ICS) для CD8+Т-клеток от яванских макак, получавших лечение вакциной против HPV+конструктами STING, с последующей стимуляцией ex vivo или пулом пептидом Е6 HPV16 (Фиг. 28A), пулом пептидом Е7 HPV16 (Фиг. 28B) или средой (отрицательный контроль) (Фиг. 28C).
На Фиг. 29А-29С представлены гистограммы, демонстрирующие результаты внутриклеточного окрашивания на ИЛ-2 (ICS) для CD8+Т-клеток от яванских макак, получавших лечение вакциной против HPV+конструктами STING, с последующей стимуляцией ex vivo или пептидами Е6 HPV16 (Фиг. 29A), пулом пептидом Е7 HPV16 (Фиг. 29B) или средой (отрицательный контроль) (Фиг. 29C).
На Фиг. 30 представлен график, демонстрирующий результаты ИФА для анти-E6 IgG в сыворотке от яванских макак, получавших лечение вакциной против HPV+конструктами STING.
На Фиг. 31 представлен график, демонстрирующий результаты ИФА для анти-E7 IgG в сыворотке от яванских макак, получавших лечение вакциной против HPV+конструктами STING.
На Фиг. 32 представлен график, демонстрирующий результаты внутриклеточного окрашивания (ICS) для CD8+спленоцитов для ИФН-γ от мышей, иммунизированных вакциной на основе мутантного KRAS+конструктом STING, с последующей стимуляцией ex vivo пептидом KRAS-G12V. ex vivo stimulation with KRAS-G12V peptide.
На Фиг. 33 представлен график, демонстрирующий результаты внутриклеточного окрашивания (ICS) для CD8+спленоцитов на ИФН-γ от мышей, иммунизированных вакциной на основе мутантного KRAS+конструктом STING с последующей стимуляцией ex vivo пептидом KRAS-G12V.
На Фиг. 34 представлен график, демонстрирующий результаты внутриклеточного окрашивания (ICS) для CD8+спленоцитов на ИФН-γ от мышей, иммунизированных вакциной на основе мутантного KRAS+конструктом STING с последующей стимуляцией ex vivo пептидом KRAS-G12V.
На Фиг. 35 представлен график, демонстрирующий результаты внутриклеточного окрашивания (ICS) для CD8+спленоцитов на ИФН-γ от мышей, иммунизированных вакциной на основе мутантного KRAS+конструктом STING с последующей стимуляцией ex vivo пептидом KRAS-G12V.
На Фиг. 36 представлен график, демонстрирующий результаты внутриклеточного окрашивания (ICS) CD8+спленоцитов на ИФН-γ у мышей, иммунизированных конкатемером вирусного эпитопа A11 со STING или с нетранслируемыми контрольными конструктами мРНК (NTFIX), с последующей стимуляцией ex vivo отдельными вирусными эпитопами.
На Фиг. 37A-37B представлены графики, демонстрирующие внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8+спленоцитов у мышей, иммунизированных конструктами вакцины против HPV, объединенными в состав или с конструктами иммуностимуляторных мРНК STING, IRF3/IRF7 или IRF3/IRF7/IKKβ, на 21-е сутки после первой иммунизации. На Фиг. 37A показаны Е7-специфические ответы для ICS в отношении ИФН-γ. На Фиг. 37B показаны Е7-специфические ответы для ICS в отношении ФНО-α.
+
На Фиг. 38A-38C представлены графики, демонстрирующие внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8спленоцитов у мышей, иммунизированных антигеном OVA, объединенным в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING, TAK1, TRAM или MyD88, на 25-е сутки после первой иммунизации. На Фиг. 38A показаны OVA-специфические ответы для ICS на ИФН-γ. На Фиг. 38B показаны OVA-специфические ответы для ICS на ФНО-α. На Фиг. 38C показаны OVA-специфические ответы для ICS на ИЛ-2.
+
На Фиг. 39 представлена гистограмма, демонстрирующая внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8спленоцитов на ИФН-γ у мышей, иммунизированных антигеном OVA, объединенным в состав с конструктами иммуностимуляторными мРНК или STING, MAVS, IKKβ, каспазы 1+каспазы 4+IKKβ, MLKL или MLKL+STING на 21-е сутки после первой иммунизации. DMXAA, химический активатор STING, был использован в качестве препарата для сравнения.
+
На Фиг. 40 представлена гистограмма, демонстрирующая внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8спленоцитов на ИФН-γ у мышей, иммунизированных антигеном OVA, объединенным в состав с конструктами иммуностимуляторными мРНК или STING, MAVS, IKKβ, каспазы 1+каспазы 4+IKKβ, MLKL или MLKL+STING на 50-е сутки после первой иммунизации. DMXAA, химический активатор STING, был использован в качестве препарата для сравнения.
+
На Фиг. 41A-41B представлены гистограммы, демонстрирующие внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8спленоцитов на ИФН-γ у мышей, иммунизированных антигеном OVA, объединенных в состав или совместно введенных с указанными конститутивно активными мутантными конструктами STING. На Фиг. 41A показаны 21-е сутки после иммунизации. На Фиг. 41B показаны 90-е сутки после иммунизации.
+
На Фиг. 42A-42B представлены гистограммы, демонстрирующие внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8спленоцитов на ИФН-γ от мышей, истощенных по CD4, иммунизированных конструктами вакцины против HPV, объединенными в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING. На Фиг. 42A показаны 21-е сутки после иммунизации. На Фиг. 42B показаны 50-е сутки после иммунизации.
На Фиг. 43 приведены графики, демонстрирующие объем опухоли у мышей с опухолями TC1 HPV, которых лечили вакциной HPV-STING или отдельно, или в комбинации с анти-CD4 (для истощения CD4 Т-клеток) или анти-CD8 (для истощения CD8 Т-клеток).
lo
hi
+
На Фиг. 44А-44В представлены графики, демонстрирующие процент CD62L клеток среди CD4CD8клеток из селезенки мышей, иммунизированных конструктом вакцины на основе антигена МС38, объединенным в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING при указанных дозах Аг и STING. На Фиг. 44А показаны результаты для клеток селезенки на 21-е сутки. На Фиг. 44B показаны результаты для клеток селезенки на 54-е сутки.
На Фиг. 45 представлена гистограмма, демонстрирующая Т-клеточные ответы антигенспецифического ИФН-γ от мышей, иммунизированных мРНК, кодирующей конкатемер из 20 мышиных эпитопов (CA-132), в комбинации с иммуностимуляторной мРНК STING, по сравнению со стандартными адъювантами или необъединенными в состав (неинкапсулированными в LNP). Приведенные данные относятся к повторной стимуляции пептидами in vitro с использованием эпитопов класса II (CA-82 и CA-83), закодированных в конкатемере.
На Фиг. 46 представлена гистограмма, демонстрирующая Т-клеточные ответы антигенспецифического ИФН-γ  от мышей, иммунизированных мРНК, кодирующей конкатемер из 20 мышиных эпитопов (CA-132), в комбинации с иммуностимуляторной мРНК STING, по сравнению со стандартными адъювантами или необъединенными в состав (неинкапсулированными в LNP). Приведенные данные относятся к повторной стимуляции пептидами in vitro с использованием эпитопов класса I (CA-87, CA-90 и CA-93), закодированных в конкатемере.
На Фиг. 47 представлена гистограмма, демонстрирующая Т-клеточные ответы антигенспецифического ИФН-γ от мышей, иммунизированных мРНК, кодирующей конкатемер из 20 мышиных эпитопов (СА-132) в комбинации с иммуностимуляторной мРНК STING, причем конструкт STING вводили или одновременно с вакциной, 24 часа спустя или 48 часов спустя. Приведенные данные относятся к повторной стимуляции пептидами in vitro с использованием эпитопов класса II (CA-82 и CA-83) или эпитопов класса I (CA-87, CA-90 и CA-93), закодированных в конкатемере.
На Фиг. 48 показаны антигенспецифические ответы от мышей, иммунизированных мРНК, кодирующей конкатемер 52 мышиных эпитопов, в комбинации с иммуностимуляторной мРНК STING при различных дозах Аг и STING и соотношениях Аг:STING. Приведенные данные относятся к повторной стимуляции in vitro пептидной последовательностью, соответствующей эпитопу CA-82 класса II, закодированному в конкатемере.
На Фиг. 49 показаны антигенспецифические ответы от мышей, иммунизированных мРНК, кодирующей конкатемер 52 мышиных эпитопов, в комбинации с иммуностимуляторной мРНК STING при различных дозах Аг и STING и соотношениях Аг:STING. Приведенные данные относятся к повторной стимуляции in vitro пептидной последовательностью, соответствующей эпитопу CA-83 класса II, закодированному в конкатемере.
На Фиг. 50 показаны антигенспецифические ответы от мышей, иммунизированных мРНК, кодирующей конкатемер 52 мышиных эпитопов, в комбинации с иммуностимуляторной мРНК STING при различных дозах Аг и STING и соотношениях Аг:STING. Приведенные данные относятся к повторной стимуляции in vitro пептидной последовательностью, соответствующей эпитопу CA-87 класса I, закодированному в конкатемере.
На Фиг. 51 показаны антигенспецифические ответы от мышей, иммунизированных мРНК, кодирующей конкатемер 52 мышиных эпитопов, в комбинации с иммуностимуляторной мРНК STING при различных дозах Аг и STING и соотношениях Аг:STING. Приведенные данные относятся к повторной стимуляции in vitro пептидной последовательностью, соответствующей эпитопу CA-93 класса I, закодированному в конкатемере.
На Фиг. 52 показаны антигенспецифические ответы от мышей, иммунизированных мРНК, кодирующей конкатемер 52 мышиных эпитопов, в комбинации с иммуностимуляторной мРНК STING при различных дозах Аг и STING и соотношениях Аг:STING. Приведенные данные относятся к повторной стимуляции in vitro пептидной последовательностью, соответствующей эпитопу CA-113 класса I, закодированному в конкатемере.
На Фиг. 53 показаны антигенспецифические ответы от мышей, иммунизированных мРНК, кодирующей конкатемер 52 мышиных эпитопов, в комбинации с иммуностимуляторной мРНК STING при различных дозах Аг и STING и соотношениях Аг:STING. Приведенные данные относятся к повторной стимуляции in vitro пептидной последовательностью, соответствующей эпитопу CA-90 класса II, закодированному в конкатемере.
На Фиг. 54 представлена гистограмма, демонстрирующая жизнеспособность клеток Hep3B, трансфицированных конструктами мРНК MLKL 1-180, при измерении с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo.

На Фиг. 55 представлен график, демонстрирующий жизнеспособность клеток Hep3B, трансфицированных конструктами мРНК MLKL 1-180, при измерении с использованием системы считывания YOYO-3 для определения жизнеспособности клеток.
На Фиг. 56 представлен график, демонстрирующий высвобождение АТФ из клеток Hep3B, трансфицированных конструктами мРНК MLKL 1-180, что указывает на некроптоз.
На Фиг. 57 представлен график, демонстрирующий высвобождение HMGB1 из клеток HeLa, трансфицированных конструктами мРНК MLKL 1-180, что указывает на некроптоз.
На Фиг. 58 представлен график, демонстрирующий окрашивание клеточной поверхности кальретикулина на клетках, или ложно-трансфицированных, трансфицированных конструктом, индуцирующим апоптоз («PUMA»), или трансфицированных конструктом MLKL, указывая на некроптоз конструктом MLKL.
На Фиг. 59А-59С представлены гистограммы, демонстрирующие жизнеспособность клеток HeLa (Фиг. 59A), клеток B16F10 (Фиг. 59B), или клеток MC38 (Фиг. 59C), трансфицированных конструктами мРНК MLKL, GSDMD или RIP3K, как измерено с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo. * P<0,05; *** р<0,001 в сравнении с L2K ## р<0,01 в сравнении с HsMLKL (1-180).
На Фиг. 60 представлена гистограмма, демонстрирующая индукцию гибели в клетках NIH3T3, трансфицированных мультимеризующими конструктами мРНК RIPK3.
На Фиг. 61 представлена гистограмма, демонстрирующая индукцию высвобождения DAMP (высвобождение HMGB1) в клетках B16F10, трансфицированных мультимеризующим конструктом RIPK3, что указывает на некроптоз.
На Фиг. 62 представлена гистограмма, демонстрирующая жизнеспособность клеток SKOV3, трансфицированных конструктами мРНК DIABLO, при измерении с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo.
На Фиг. 63 представлена гистограмма, демонстрирующая индукцию клеточной гибели в клетках HeLa, трансфицированных конструктами мРНК каспазы-4, каспазы-5 или каспазы-11. Результаты демонстрируют среднее±СОС из четырех независимых экспериментов.
На Фиг. 64 представлена гистограмма, демонстрирующая индукцию клеточной гибели в клетках HeLa, трансфицированных конструктами ммРНК NLRP3, пирина или ASC. Результаты демонстрируют среднее±СОС из четырех независимых экспериментов.
На Фиг. 65A-65B представлены гистограммы, демонстрирующие активацию интерферон-стимулируемого реагирующего элемента (ISRE) конститутивно активными конструктами IRF3 (Фиг. 65A) или конструктами IRF7 (Фиг. 65B).
На Фиг. 66 представлена схема дизайна исследования для экспериментальных результатов, приведенных на Фиг. 67.
На Фиг. 67 представлена гистограмма, демонстрирующая высвобождение ИЛ-18 клетками HeLa, примированными иммуностимулятором, как указано, и трансфицированными конструктом каспазы-4, каспазы-5 или каспазы-11, как указано.
На Фиг. 68A-68K представлены графики, демонстрирующие эффект лечения указанными конструктами исполнительной мРНК, отдельно или в комбинации с указанным ингибитором иммунной контрольной точки, на рост опухолей MC38 у мышей.
На Фиг. 69A-69B представлены графики, демонстрирующие эффект лечения указанными конструктами исполнительной мРНК, отдельно или в комбинации с указанным иммуностимулятором и/или ингибитором иммунной контрольной точки, на рост опухолей MC38 у мышей (Фиг. 69A) и на процент выживаемости мышей (Фиг. 69B).
На Фиг. 70A-70B представлены графики, демонстрирующие эффект лечения конструктом мРНК STING в комбинации с анти-PD-1 по сравнению с одним носителем или контролем NT (пустым вектором)+анти-PD-1 на рост опухолей MC38 у мышей (Фиг. 70A) и на процент выживаемости мышей (Фиг. 70B).
Подробное описание сущности изобретения
Данное раскрытие обеспечивает композиции, такие как конструкты мРНК, кодирующие полипептид, который усиливает иммунные ответы на представляющий интерес антиген, называемые в данном документе конструктами иммуностимуляторных мРНК или иммуностимуляторными мРНК, включая химически модифицированные мРНК (ммРНК). Иммуностимуляторные мРНК согласно раскрытию усиливают иммунные ответы, например, активируя сигнальный путь интерферона типа I, стимулируя сигнальный путь NFkB или и тот и другой, так что стимулируются антигенспецифические ответы на представляющий интерес антиген. Иммуностимуляторные мРНК согласно раскрытию усиливают иммунные ответы на эндогенный антиген у субъекта, которому вводят иммуностимуляторную мРНК, или усиливают иммунные ответы на экзогенный антиген, который вводят субъекту с иммуностимуляторной мРНК (например, с конструктом мРНК, кодирующим представляющий интерес антиген, который совместно составляют и совместно вводят с иммуностимуляторной мРНК, или с конструктом мРНК, кодирующим представляющий интерес антиген, который составляют и вводят отдельно от иммуностимуляторной мРНК).
+
+
lo
Неожиданно было обнаружено, что введение иммуностимуляторной мРНК согласно данному раскрытию (например, мРНК, кодирующей конститутивно активный полипептид STING) или комбинации иммуностимуляторных мРНК субъекту стимулирует продукцию цитокинов (например, продукцию воспалительных цитокинов) стимулирует антигенспецифические ответы эффекторных CD8клеток, стимулирует антигенспецифические ответы CD4клеток-хелперов, увеличивает популяцию эффекторных CD62L Т-клеток памяти и стимулирует продукцию антигенспецифических антител к представляющему интерес антигену.
+
+
lo
Как подробно описано в примерах, было обнаружено, что введение иммуностимуляторной мРНК (или комбинации иммуностимуляторных мРНК) увеличивает процент CD8Т-клеток, которые являются положительными по ICS для одного или более цитокинов (например, ИФН-γ, ФНО-α  и/или ИЛ-2) в ответ на антиген и увеличивает процент CD8+Т-клеток в общей популяции Т-клеток (например, Пример 5 и Фиг. 8-12). Примечательно, что эти эффекты были длительными, поскольку более высокий процент антигенспецифических CD8Т-клеток, положительных по ICS для одного или более цитокинов, сохранялся в течение периода длительностью до 7 недель in vivo (Фиг. 11). Также было обнаружено, что введение конструкта мРНК (или комбинации иммуностимуляторных мРНК) увеличивает популяцию эффекторных CD62L Т-клеток памяти (например, Примеры 5, 6 и Пример 19), и что данный эффект сохраняется с течением времени (Пример 19 и Фиг. 44). Важно, что стимуляция антигенспецифических Т-клеточных ответов и продукции антител на мРНК-вакцину также было продемонстрировано у приматов, отличных от человека (например, Пример 12 и Фиг. 28-31).
В отношении бактериальной вакцины было показано, что введение конструкта иммуностимуляторной мРНК усиливает гуморальный ответ на бактериальную вакцину за счет увеличения образования антигенспецифических антител in vivo (например, Пример 7 и Фиг. 17).
В отношении противораковой вакцины было показано, что введение иммуностимуляторной мРНК приводит к устойчивому и длительному иммунному ответу против раковых неоэпитопов (Пример 6) и, как было показано, эффективно ингибирует рост опухоли при профилактической и терапевтической вакцинации вакциной против онковируса (Пример 10). Например, введение иммуностимуляторной мРНК с вакциной против HPV было эффективным (отдельно или в комбинации с ингибитором контрольной точки) в предотвращении роста HPV-экспрессирующих опухолевых клеток, in vivo (Фиг. 19), и терапевтическая вакцинация (т.е. после заражения опухолью) вакциной против HPV вместе с иммуностимуляторной мРНК (отдельно или в комбинации с ингибитором контрольной точки) была эффективной в индукции регрессии HPV-экспрессирующих опухолей in vivo (Фиг. 20). Примечательно, что введение иммуностимуляторной мРНК с терапевтической вакциной также показало эффективность в ингибировании крупных, определенных опухолей in vivo (Фиг. 21).
В отношении персонализированной противораковой вакцины было показано, что введение конструкта иммуностимуляторной мРНК усиливает антигенспецифические Т-клеточные ответы и образование антител на мРНК, кодирующую персонализированную противораковую вакцину (конкатемер), индуцирующую ответы ГКГС как класса I, так и класса II (например, Пример 20 и Фиг. 45-53). Было также обнаружено, что введение иммуностимуляторной мРНК потенцирует иммунные ответы на мРНК, кодирующую раковые антигены KRAS в различных форматах (мономеры и конкатемеры) (например, Пример 13 и Фиг. 32-36).
Также было продемонстрировано, что комбинации иммуностимуляторных мРНК, кодирующих индукторы интерферона типа I и активаторы NFκB (например, Пример 14 и Фиг. 37), также как иммуностимуляторные мРНК, кодирующие компоненты внутриклеточных сигнальных путей, которые функционируют в сигнальном пути ниже TLR (например, Пример 15 и Фиг. 38), усиливают антигенспецифические Т-клеточные ответы. Дополнительные комбинации иммуностимуляторных мРНК, кодирующих адаптерные белки (например, STING или MAVS), активаторы NFκB (например, IKKβ), индукторы инфламмасомы (например, каспазы 1/4) и индукторы некроптосомы (например, MLKL) также потенцируют антигенспецифические Т-клеточные ответы. Неожиданно, комбинация мРНК, кодирующей белок-адаптер (например, STING), и мРНК, кодирующей индуктор некроптосомы (например, MLKL), проявляла повышенную активность по сравнению с мРНК, кодирующей только MLKL (например, Пример 16 и Фиг. 39-40). Результаты на 90 сутки демонстрируют, что иммуностимуляторный эффект был длительным (например, Пример 18 и Фиг. 41).
Неожиданно было обнаружено, что добавление мРНК, кодирующей иммуностимулятор (например, STING), среди большинства соотношений антиген: иммуностимулятор (Аг: ИС) улучшало антигенспецифические Т-клеточные ответы по сравнению с одним антигеном (например, в Примере 20). Широта реактивности была неожиданной. Для четырех из шести протестированных антигенов (эпитопов) добавление мРНК, кодирующей иммуностимулятор, к антигену последовательно вызывало более высокие Т-клеточные ответы, чем один антиген. Таким образом, было обнаружено, что имеется широкая кривая нормального распределения в соотношении антиген: иммуностимулятор для улучшения иммуногенности.
Также было обнаружено, что добавление мРНК, кодирующей иммуностимулятор (например, STING), ко всем тестируемым антигенам, потенцирует иммунный ответ на антиген по сравнению с одним антигеном. В большинстве ситуаций было выявлено как минимум 2-кратное увеличение иммунной стимуляции, а для некоторых антигенов - еще большее усиление иммунной стимуляции (например, усиление более чем в 5 раз, более чем в 10 раз, более чем в 20 раз, более чем в 30 раз, более чем в 50 раз или более чем в 75 раз) (например, Пример 21).
Соответственно, данное раскрытие обеспечивает композиции, содержащие один или более конструктов мРНК (например, один или более конструкты ммРНК), причем один или более конструктов мРНК кодируют представляющий интерес антиген(ы) и, в том же или отдельном конструкте мРНК, кодируют полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает наночастицы, например, липидные наночастицы, которые содержат иммуностимуляторную мРНК, которая усиливает иммунный ответ, отдельно или в комбинации с мРНК, кодирующими представляющий интерес антиген. Раскрытие также обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие любую из мРНК, как описано в данном документе, или наночастицы, например, липидные наночастицы, содержащие любую из мРНК, как описано в данном документе.
В другом аспекте раскрытие обеспечивает композиции, содержащие один или более конструктов мРНК (например, один или более конструктов ммРНК), которые кодируют полипептид, который индуцирует иммуногенную клеточную гибель, например, некроптоз или пироптоз. Такие конструкты мРНК могут быть использованы в комбинации с конструктом иммуностимуляторной мРНК, согласно раскрытию для усиления высвобождения эндогенных антигенов in vivo, тем самым стимулируя иммунный ответ против эндогенных антигенов. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает наночастицы, например липидные наночастицы, которые содержат мРНК, индуцирующую иммуногенную клеточную гибель, отдельно или в комбинации с иммуностимуляторной мРНК. Раскрытие также обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие любую из мРНК, как описано в данном документе, или наночастицы, например, липидные наночастицы, содержащие любую из мРНК, как описано в данном документе.
В других аспектах раскрытие обеспечивает способы усиления иммунного ответа на представляющий интерес антиген(ы) путем введения субъекту только конструкта иммуностимуляторной мРНК (для эндогенных антигенов) или путем введения одной или более мРНК, кодирующих представляющий интерес антиген(ы), и мРНК, кодирующей полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген(ы), или их липидной наночастицы или их фармацевтической композиции, так что иммунный ответ на представляющий интерес антиген усиливается у субъекта. Способы усиления иммунного ответа можно использовать, например, для стимуляции иммуногенного ответа на опухоль у субъекта, для стимуляции иммуногенного ответа на патоген у субъекта или для усиления иммунного ответа на вакцину у субъекта.
Иммуностимуляторные мРНК
Один аспект раскрытия относится к мРНК, которые кодируют полипептид, который стимулирует или усиливает иммунный ответ против одного или более представляющих интерес антигенов. Такие мРНК, которые усиливают иммунные ответы на представляющие интерес антиген(ы), упоминаются в данном документе как конструкты иммуностимуляторных мРНК или иммуностимуляторные мРНК, включая химически модифицированные мРНК (ммРНК). Иммуностимулятор согласно раскрытию усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген у субъекта. Усиленный иммунный ответ может быть клеточным ответом, гуморальным ответом или и тем и другим. Используемый в данном документе термин «клеточный» иммунный ответ предназначен для охвата иммунных ответов, которые вовлекают или опосредованы Т-клетками, тогда как «гуморальный» иммунный ответ предназначен для охвата иммунных ответов, которые вовлекают или опосредуются В-клетками. Иммуностимулятор может усиливать иммунный ответ, например,
(i) стимуляцией сигнального пути интерферона типа I;
(ii) стимуляцией сигнального пути NFkB;
(iii) стимуляцией воспалительного ответа;
(iv) стимуляцией продукции цитокинов; или
(v) стимуляцией развития, активности или мобилизации дендритных клеток; и
(vi) комбинацией любого из (i) - (vi).
Используемый в данном документе термин «стимуляция сигнального пути интерферона типа I» предназначен для включения активации одного или более компонентов сигнального пути интерферона типа I (например, модификации фосфорилирования, димеризации или тому подобного таких компонентов для активации тем самым пути), стимуляции транскрипции интерферон-стимулируемым реагирующим элементом (ISRE) и/или стимуляции продукции или секреции интерферона типа I (например, ИФН-α, ИФН-β, ИФН-ε, ИФН-κ и/или ИФН-ω). Используемый в данном документе термин «стимуляция сигнального пути NFkB» предназначен для включения активации одного или более компонентов сигнального пути NFkB (например, модификации фосфорилирования, димеризации или тому подобное таких компонентов для активации тем самым пути), стимуляции транскрипции в сайте NFkB и/или стимуляции продукции генного продукта, экспрессия которого регулируется NFkB. Используемый в данном документе термин «стимуляция воспалительного ответа» предназначен для охвата стимуляции продукции воспалительных цитокинов (включая, но не ограничиваясь этим, интерфероны типа I, ИЛ-6 и/или ФНО-α). Используемый в данном документе термин «стимуляция развития, активности или мобилизации дендритных клеток» подразумевает прямую или косвенную стимуляцию созревания, пролиферации и/или функциональной активности дендритных клеток.
В некоторых вариантах осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген в несколько раз, например, по отношению к иммунному ответу на антиген в отсутствии иммуностимулятора, или по отношению к низкомолекулярному агонисту, который усиливает иммунный ответ на антиген. Например, в различных вариантах осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген в 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 7,5 раз, 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 75 раз или более по сравнению, например, с иммунным ответом на антиген в отсутствии конструкта иммуностимуляторной мРНК или по сравнению, например, с иммунным ответом на антиген в присутствии низкомолекулярного агониста иммунного ответа на антиген. В некоторых вариантах осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген в 0,3-1000 раз, 1-750 раз, 5-500 раз, 7-250 раз или в 10-100 раз по сравнению, например, с иммунным ответом на антиген в отсутствии конструкта иммуностимуляторной мРНК или по сравнению, например, с иммунным ответом на антиген в присутствии низкомолекулярного агониста иммунного ответа на антиген. Кратность усиления иммуностимуляторного конструкта может быть измерена с использованием стандартных способов, известных в данной области техники (например, как описано в Примерах). Например, уровень антигенспецифических Т-клеток, экспрессирующих воспалительные цитокины (например, ИФН-γ и/или ФНО-α), можно оценивать, например, с помощью метода внутриклеточного окрашивания (ICS) или анализа методом иммуноферментных пятен, как описано в Примерах
+
+
lo
+
+
lo
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую полипептид, который стимулирует или усиливает иммунный ответ у субъекта, нуждающегося в этом (например, потенцирует иммунный ответ у субъекта), например, индуцируя адаптивный иммунитет (например, посредством стимуляции продукции интерферона типа I), стимулируя воспалительный ответ, стимулируя сигнальный путь NFkB и/или стимулируя развитие, активность или мобилизацию дендритных клеток (ДК) у субъекта. В некоторых аспектах введение иммуностимуляторной мРНК нуждающемуся в этом субъекту усиливает клеточный иммунитет (например, Т-клеточный иммунитет), гуморальный иммунитет (например, В-клеточный иммунитет) или как клеточный, так и гуморальный иммунитет у субъекта. В некоторых аспектах введение иммуностимуляторной мРНК стимулирует продукцию цитокинов (например, продукцию воспалительных цитокинов), стимулирует антигенспецифические ответы эффекторных CD8клеток, стимулирует антигенспецифические ответы CD4клеток-хелперов, увеличивает популяцию эффекторных CD62L T-клеток памяти, стимулирует активность В-клеток или стимулирует продукцию антигенспецифических антител, включая комбинации вышеуказанных ответов. В некоторых аспектах введение иммуностимуляторной мРНК стимулирует продукцию цитокинов (например, продукцию воспалительных цитокинов) и стимулирует антигенспецифические ответы CD8эффекторных клеток. В некоторых аспектах введение иммуностимуляторной мРНК стимулирует продукцию цитокинов (например, продукцию воспалительных цитокинов) и стимулирует антигенспецифические ответы CD4клеток-хелперов. В некоторых аспектах введение иммуностимуляторной мРНК стимулирует продукцию цитокинов (например, продукцию воспалительных цитокинов) и увеличивает популяцию эффекторных CD62L Т-клеток памяти. В некоторых аспектах введение эффекторной мРНК стимулирует продукцию цитокинов (например, продукцию воспалительных цитокинов) и стимулирует активность В-клеток или стимулирует продукцию антигенспецифических антител.
+
+
В одном варианте осуществления иммуностимулятор усиливает антигенспецифические ответы CD8эффекторных клеток (клеточный иммунитет). Например, иммуностимулятор может увеличивать один или более показателей антигенспецифической активности CD8эффекторных клеток, включая, но не ограничиваясь, пролиферацию CD8+Т-клеток и продукцию CD8+Т-клеток. Например, в одном варианте осуществления иммуностимулятор увеличивает продукцию ИФН-γ, ФНО-α  и/или ИЛ-2 антигенспецифическими CD8+T-клетками. В различных вариантах осуществления иммуностимулятор может увеличивать продукцию цитокинов CD8+Т-клетками (например, продукцию ИФН-γ, ФНО-α  и/или ИЛ-2) в ответ на антиген (по сравнению с продукцией цитокинов CD8+T-клетками в отсутствии иммуностимулятора) на по меньшей мере 5% или по меньшей мере 10%, или по меньшей мере 15%, или по меньшей мере 20%, или по меньшей мере 25%, или по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 50%. Например, Т-клетки, полученные от субъекта, получившего лечение, можно стимулировать in vitro с использованием представляющего интерес антигена, а продукцию цитокинов CD8+Т-клетками можно оценивать in vitro. Продукцию цитокинов CD8+T-клетками можно определять стандартными методами, известными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь, измерение секретируемых уровней продукции цитокинов (например, ИФА или другим подходящим способом, известным в данной области техники для определения количества цитокинов в супернатанте) и/или определение процента CD8+Т-клеток, которые являются положительными по внутриклеточному окрашиванию (ICS) на цитокин. Например, внутриклеточное окрашивание (ICS) CD8+T-клеток на экспрессию ИФН-γ, ФНО-α и/или ИЛ-2 можно проводить способами, известными в данной области техники (см., например, Примеры). В одном варианте осуществления иммуностимулятор увеличивает процент CD8+Т-клеток, которые являются положительными по ICS на один или более цитокинов (например, ИФН-γ, ФНО-α и/или ИЛ-2) в ответ на антиген (по сравнению с процентом CD8+Т-клеток, которые являются положительными по ICS на цитокин(ы) в отсутствии иммуностимулятора) на по меньшей мере 5% или по меньшей мере 10%, или по меньшей мере 15%, или по меньшей мере 20%, или по меньшей мере 25%, или по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 50%.
В еще одном варианте осуществления иммуностимулятор увеличивает процент CD8+Т-клеток в общей популяции Т-клеток (например, селезеночных Т-клеток и/или МКПК) по сравнению с процентом CD8+Т-клеток в отсутствии иммуностимулятора. Например, иммуностимулятор может увеличить процент CD8+Т-клеток в общей популяции Т-клеток на по меньшей мере 5% или по меньшей мере 10%, или по меньшей мере, на 15%, или по меньшей мере 20%, или по меньшей мере 25%, или по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 50% по сравнению с процентом CD8+Т-клеток в отсутствии иммуностимулятора. Общий процент CD8+Т-клеток в общей популяции Т-клеток может быть определено стандартными методами, известными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь, сортировку флюоресцентно-активированных клеток (FACS) или сортировку магнитно-активированных клеток (MACS).
В другом варианте осуществления иммуностимулятор усиливает ответ опухолеспецифических иммунных клеток, что определяется уменьшением объема опухоли in vivo в присутствии иммуностимулятора по сравнению с объемом опухоли в отсутствии иммуностимулятора. Например, иммуностимулятор может уменьшить объем опухоли на по меньшей мере 5%, или по меньшей мере 10%, или по меньшей мере 15%, или по меньшей мере 20%, или по меньшей мере 25%, или по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 50% по сравнению с объемом опухоли в отсутствии иммуностимулятора. Измерение объема опухоли может быть определено способами, хорошо известными в данной области техники.
В другом варианте осуществления иммуностимулятор увеличивает активность B-клеток (гуморальный иммунный ответ), например, путем увеличения количества продукции антигенспецифических антител по сравнению с продукцией антигенспецифических антител в отсутствии иммуностимулятора. Например, иммуностимулятор может увеличить продукцию антигенспецифических антител на по меньшей мере 5%, или по меньшей мере 10%, или по меньшей мере 15%, или по меньшей мере 20%, или по меньшей мере 25%, или по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 50% по сравнению с продукцией антигенспецифических антител в отсутствии иммуностимулятора. В одном варианте осуществления оценивают продукцию антигенспецифического IgG. Продукцию антигенспецифических антител можно оценивать способами, хорошо известными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, ИФА, РИА и тому подобное, которые измеряют уровень антигенспецифического антитела (например, IgG) в образце (например, образце сыворотки).
lo
lo
lo
lo
lo
lo
В другом варианте осуществления иммуностимулятор увеличивает популяцию эффекторных CD62L Т-клеток памяти. Например, иммуностимулятор может увеличивать общий % CD62L T-клеток среди CD8+T-клеток. Среди других функций было показано, что популяция эффекторных CD62L Т-клеток памяти играет важную функцию в транспорте лимфоцитов (см., например, Schenkel, J.M. and Masopust, D. (2014) Immunity 41:886-897). В различных вариантах осуществления иммуностимулятор может увеличивать общий процент эффекторных CD62L T-клеток памяти среди CD8+T-клеток в ответ на антиген (по сравнению с общим процентом CD62L T-клеток в популяции CD8+T-клеток в отсутствии иммуностимулятора) на по меньшей мере 5% или по меньшей мере 10%, или по меньшей мере 15%, или по меньшей мере 20%, или по меньшей мере 25%, или по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 50%. Общий процент эффекторных CD62L T-клеток памяти среди CD8+T-клеток может быть определен стандартными методами, известными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, сортировку флюоресцентно-активированных клеток (FACS) или сортировку магнитно-активированных клеток (MACS).
Было показано, что способность конструкта иммуностимуляторной мРНК усиливать иммунный ответ на представляющий интерес антиген является длительной, причем усиленная иммуногенность наблюдается в течение длительных периодов времени, например, вплоть до 90 суток. Соответственно, в различных вариантах осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК может усиливать антигенспецифические иммунные ответы в течение по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 3 недель, по меньшей мере 4 недель, по меньшей мере одного месяца, по меньшей мере 5 недель, по меньшей мере 6 недель, по меньшей мере 7 недель, по меньшей мере 8 недель, по меньшей мере 9 недель, по меньшей мере 10 недель, по меньшей мере 11 недель, по меньшей мере 12 недель, по меньшей мере одного месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев или дольше.
Способность конструкта иммуностимуляторной мРНК усиливать иммунный ответ на представляющий интерес антиген можно оценить на системах мышиных моделей, известных в данной области техники. В одном варианте осуществления используется система иммунокомпетентной мышиной модели. В одном варианте осуществления система мышиной модели включает мышей C57/Bl6 (например, для оценки антигенспецифических ответов CD8+T-клеток на представляющий интерес антиген, такой как описанный в Примерах). В другом варианте осуществления система мышиной модели включает мышей BalbC или мышей CD1 (например, для оценки ответов B-клеток, таких как образование антигенспецифических антител).
В некоторых вариантах осуществления иммуностимуляторный полипептид согласно раскрытию функционирует в сигнальном пути ниже по меньшей мере одного Toll-подобного рецептора (TLR), тем самым усиливая иммунный ответ. Соответственно, в одном варианте осуществления иммуностимулятор не является TLR, но представляет собой молекулу в сигнальном пути TLR ниже от самого рецептора.
В некоторых вариантах осуществления полипептид стимулирует ответ интерферона типа I (ИФН). Неограничивающие примеры полипептидов, которые стимулируют ответ ИФН типа I, которые подходят для применения в качестве иммуностимулятора, включают STING, MAVS, IRF1, IRF3, IRF5, IRF7, IRF8, IRF9, TBK1, IKKα, IKKi, MyD88, TRAM, TRAF3, TRAF6, IRAK1, IRAK4, TRIF, IPS-1, RIG-1, DAI и IFI16. Конкретные примеры полипептидов, которые стимулируют ответ интерферона типа I (ИФН), описаны ниже.
В другом варианте осуществления полипептид стимулирует NFκВ-опосредованный провоспалительный ответ. Неограничивающие примеры полипептидов, которые стимулируют NFκB-опосредованный провоспалительный ответ, включают STING, c-FLIP, IKKβ, RIPK1, Btk, TAK1, TAK-TAB1, TBK1, MyD88, IRAK1, IRAK2, IRAK4, TAB2, TAB3, TRAF6, TRAM, MKK3, MKK4, MKK6 и MKK7. Конкретные примеры полипептидов, которые стимулируют NFκB-опосредованный провоспалительный ответ, описан ниже.
В другом варианте осуществления полипептид представляет собой внутриклеточный адаптерный белок. В одном варианте осуществления внутриклеточный адаптерный белок стимулирует ответ ИФН типа I. В другом варианте осуществления внутриклеточный адаптерный белок стимулирует NFκВ-опосредованный провоспалительный ответ. Неограничивающие примеры внутриклеточных адаптерных белков включают STING, MAVS и MyD88. Конкретные примеры внутриклеточных адаптерных белков описаны ниже.
В другом варианте осуществления полипептид представляет собой внутриклеточный сигнальный белок. В одном варианте осуществления полипептид представляет собой внутриклеточный сигнальный белок сигнального пути TLR. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный белок стимулирует ответ ИФН типа I. В другом варианте осуществления внутриклеточный сигнальный белок стимулирует NFκВ-опосредованный провоспалительный ответ. Неограничивающие примеры внутриклеточных сигнальных белков включают MyD88, IRAK 1, IRAK2, IRAK4, TRAF3, TRAF6, TAK1, TAB2, TAB3, TAK-TAB1, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, IKKα, IKKβ, TRAM, TRIF, RIPK1, и TBK1. Конкретные примеры внутриклеточных сигнальных белков описаны ниже.
В другом варианте осуществления полипептид представляет собой фактор транскрипции. В одном варианте осуществления фактор транскрипции стимулирует ответ ИФН типа I. В другом варианте осуществления фактор транскрипции стимулирует NFκВ-опосредованный провоспалительный ответ. Неограничивающие примеры факторов транскрипции включают IRF3 или IRF7. Конкретные примеры факторов транскрипции описаны ниже.
В другом варианте осуществления полипептид участвует в некроптозе или образовании некроптосом. Полипептид «участвует» в некроптозе или образовании некроптосом, если белок сам опосредует некроптоз или участвует с дополнительными молекулами в опосредовании некроптоза и/или в образовании некроптосом. Неограничивающие примеры полипептидов, участвующих в некроптозе или образовании некроптосом, включают MLKL, RIPK1, RIPK3, DIABLO и FADD. Конкретные примеры полипептидов, участвующих в некроптозе или образование некроптосом, описаны ниже.
В другом варианте осуществления полипептид участвует в пироптозе или образовании инфламмасом. Полипептид «участвует» в пироптозе или образовании инфламмасом, если белок сам опосредует пироптоз или участвует с дополнительными молекулами в опосредовании пироптоза и/или в образовании инфламмасом. Неограничивающие примеры полипептидов, участвующих в пироптозе или образовании инфламмасом, включают каспазу 1, каспазу 4, каспазу 5, каспазу 11, GSDMD, NLRP3, пириновый домен и ASC/PYCARD. Конкретные примеры полипептидов, участвующих в пироптозе или образовании инфламмасом, описаны ниже.
В некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию, кодирующая иммуностимулятор, может содержать одно или более модифицированных нуклеотидных оснований. Подходящие модификации дополнительно обсуждаются ниже.
В некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию, кодирующая иммуностимулятор, входит в состав липидной наночастицы. В одном варианте осуществления липидная наночастица дополнительно содержит мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген. В одном варианте осуществления липидную наночастицу вводят субъекту для усиления иммунного ответа против представляющего интерес антигена у субъекта. Подходящие наночастицы и способы применения дополнительно обсуждаются ниже.
В другом варианте осуществления раскрытие обеспечивает композиции, которые содержат комбинации двух или более иммуностимуляторных мРНК. Две или более иммуностимуляторных мРНК могут быть иммуностимуляторами одного и того же типа (например, два или более иммуностимулятора, которые стимулируют ответ интерферона типа I (ИФН)) или могут быть иммуностимуляторами различных типов. Соответственно, в одном варианте осуществления раскрытие обеспечивает композицию, содержащую первую матричную РНК (мРНК), кодирующую первый полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген у субъекта, вторую мРНК, кодирующую второй полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген у субъекта и, необязательно третью мРНК, кодирующую третий полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген у субъекта (и, необязательно, четвертую, пятую, шестую или более мРНК, кодирующие иммуностимуляторы),
причем иммунный ответ включает клеточный или гуморальный иммунный ответ, характеризующийся:
(i) стимуляцией сигнального пути интерферона типа I;
(ii) стимуляцией сигнального пути NFkB;
(iii) стимуляцией воспалительного ответа;
(iv) стимуляцией продукции цитокинов; или
(v) стимуляцией развития, активности или мобилизации дендритных клеток; и
(vi) комбинацией любого из (i) - (vi).
В некоторых вариантах осуществления первый, второй и/или необязательно третий полипептид (и необязательно четвертый, пятый, шестой или более полипептидов) функционируют в сигнальном пути ниже по меньшей мере одного Toll-подобного рецептора (TLR), тем самым усиливая иммунный ответ.
В различных вариантах осуществления комбинированные композиции:
(i) первый полипептид стимулирует ответ интерферона типа I (ИФН), а второй полипептид стимулирует NFκB-опосредованный провоспалительный ответ;
(ii) первый полипептид стимулирует ответ интерферона типа I (ИФН), а второй полипептид участвует в некроптозе или образовании некроптосом;
(iii) первый полипептид стимулирует ответ интерферона типа I (ИФН), а второй полипептид участвует в пироптозе или образовании инфламмасом;
(iv) первый полипептид стимулирует NFκB-опосредованный провоспалительный ответ, а второй полипептид участвует в некроптозе или образовании некроптосом;
(v) первый полипептид стимулирует NFκB-опосредованный провоспалительный ответ, а второй полипептид участвует в пироптозе или образовании инфламмасом;
(vii) первый полипептид стимулирует ответ интерферона типа I (ИФН), второй полипептид стимулирует NFκB-опосредованный провоспалительный ответ, а третий полипептид участвует в некроптозе или образовании некроптосом; или
(viii) первый полипептид стимулирует ответ интерферона типа I (ИФН), второй полипептид стимулирует NFκB-опосредованный провоспалительный ответ, а третий полипептид участвует в пироптозе или образовании инфламмасом.
Подходящие неограничивающие примеры каждой из этих категорий иммуностимуляторов перечислены выше и более подробно описаны ниже. Рассматриваются все комбинации перечисленных иммуностимуляторов.
В некоторых вариантах осуществления первый полипептид стимулирует ответ интерферона типа I (IFN) и выбирается из группы, состоящей из STING, MAVS, IRF1, IRF3, IRF5, IRF7, IRF8, IRF9, TBK1, IKKα, IKKi, MyD88, TRAM, TRAF3, TRAF6, IRAK1, IRAK4, TRIF, IPS-1, RIG-1, DAI и IFI16; и второй полипептид стимулирует NFκB-опосредованный провоспалительный ответ и выбирается из группы, состоящей из STING, c-FLIP, IKKβ, RIPK1, Btk, TAK1, TAK-TAB1, TBK1, MyD88, IRAK1, IRAK2, IRAK4, TAB2, TAB3, TRAF6, TRAM, MKK3, MKK4, MKK6 и MKK7. В некоторых вариантах осуществления первый полипептид представляет собой конститутивно активный IRF3, а второй полипептид представляет собой конститутивно активный IKKβ. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит мРНК, кодирующую конститутивно активный полипептид IRF7 (то есть композиция содержит мРНК, кодирующую конститутивно активный IRF3, конститутивно активный полипептид IRF7 и конститутивно активный IKKβ
В некоторых вариантах осуществления первый полипептид стимулирует ответ интерферона типа I (ИФН) и выбирается из группы, состоящей из STING, MAVS, IRF1, IRF3, IRF5, IRF7, IRF8, IRF9, TBK1, IKKα, IKKi, MyD88, TRAM, TRAF3, TRAF6, IRAK1, IRAK4, TRIF, IPS-1, RIG-1, DAI и IFI16; и второй полипептид участвует в некроптозе или образовании некроптосом и выбирается из группы, состоящей из MLKL, RIPK1, RIPK3, DIABLO и FADD. В некоторых вариантах осуществления первый полипептид представляет собой конститутивно активный STING, а второй полипептид представляет собой полипептид MLKL.
В некоторых вариантах осуществления первый полипептид стимулирует NFκB-опосредованный провоспалительный ответ и выбирается из группы, состоящей из STING, c-FLIP, IKKβ, RIPK1, Btk, TAK1, TAK-TAB1, TBK1, MyD88, IRAK1, IRAK2, IRAK4, TAB2, TAB3, TRAF6, TRAM, MKK3, MKK4, MKK6 и MKK7; и второй полипептид участвует в пироптозе или образовании инфламмасом и выбирается из группы, состоящей из каспазы 1, каспазы 4, каспазы 5, каспазы 11, GSDMD, NLRP3, пиринового домена и ASC/PYCARD. В некоторых вариантах осуществления первый полипептид представляет собой конститутивно активную IKKβ, а второй полипептид представляет собой полипептид каспазы-1. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит мРНК, кодирующую полипептид каспазы-4 (то есть композиция содержит мРНК, кодирующую конститутивно активную IKKβ, полипептид каспазы-1 и полипептид каспазы-4).
В некоторых вариантах осуществления комбинированная композиция согласно раскрытию, кодирующая два или более иммуностимуляторов, содержит одну или более мРНК, которые содержат одну или более модифицированных нуклеотидных оснований. Подходящие модификации дополнительно обсуждаются ниже.
В некоторых вариантах осуществления комбинированная композиция согласно раскрытию, кодирующая два или более иммуностимуляторов, входит в состав липидной наночастицы. В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица дополнительно содержит мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген. В некоторых вариантах осуществления липидную наночастицу вводят субъекту для усиления иммунного ответа против представляющего интерес антигена у субъекта. Подходящие наночастицы и способы применения дополнительно обсуждаются ниже.
Иммуностимуляторные мРНК, которые стимулируют интерферон типа I
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает иммуностимуляторную мРНК, кодирующую полипептид, который стимулирует или усиливает иммунный ответ против представляющего интерес антигена путем стимуляции или усиления сигнального пути интерферона типа I, тем самым стимулируя или усиливая продукцию интерферона типа I (ИФН). Было установлено, что для успешной индукции противоопухолевого или противомикробного адаптивного иммунитета требуется сигналинг ИФН типа I (см., например, Fuertes, M.B. et al. (2013) Trends Immunol. 34:67-73). Продукция ИФН типа I (включая ИФН-α, ИФН-β, ИФН-ε, ИФН-κ и ИФН-ω) играет роль в устранении микробных инфекций, таких как вирусные инфекции. Также было оценено, что ДНК клетки-хозяина (например, полученная из поврежденных или умирающих клеток) способна индуцировать продукцию интерферона типа I и что сигнальный путь ИФН I типа играет роль в развитии адаптивного противоопухолевого иммунитета. Тем не менее, многие патогены и раковые клетки развили механизмы для снижения или ингибирования ответов интерферона I типа. Таким образом, активация (включая стимуляцию и/или усиление) сигнального пути ИФН типа I у субъекта, нуждающегося в этом, путем обеспечения иммуностимуляторной мРНК согласно раскрытию субъекту стимулирует или усиливает иммунный ответ у субъекта в широком диапазоне клинических ситуаций, включая лечение рака и патогенных инфекций, а также для потенцирования ответов на вакцину для обеспечения защитного иммунитета.
Интерфероны типа I (ИФН) представляют собой провоспалительные цитокины, которые быстро продуцируются во множестве различных типов клеток, обычно при вирусной инфекции, и, как известно, обладают широким спектром эффектов. Классическими последствиями продукции ИФН типа I in vivo являются активация антимикробных клеточных программ и развитие врожденных и адаптивных иммунных ответов. ИФН типа I индуцирует внутреннее антимикробное состояние клеток в инфицированных и соседних клетках, что ограничивает распространение инфекционных агентов, особенно вирусных патогенов. ИФН типа I также модулирует активацию врожденных иммунных клеток (например, созревание дендритных клеток), чтобы способствовать презентации антигена и функциям натуральных клеток-киллеров. ИФН типа I также способствует развитию высокоаффинных антигенспецифических Т- и В-клеточных ответов и иммунологической памяти (Ivashkiv and Donlin (2014) Nat Rev Immunol 14(1):36-49)
ИФН типа I активирует дендритные клетки (ДК) и повышает их способность стимулировать Т-клетки посредством аутокринного сигналинга (Montoya et al., (2002) Blood 99:3263-3271). Воздействие ИФН типа I облегчает созревание ДК посредством увеличения экспрессии хемокиновых рецепторов и молекул адгезии (например, для стимуляции миграции ДК в дренирующие лимфатические узлы), костимулирующих молекул и презентации антигенов ГКГС класса I и класса II. ДК, которые созревают после воздействия ИФН типа I, могут эффективно стимулировать защитные Т-клеточные ответы (Wijesundara et al., (2014) Front Immunol 29(412) и ссылки в нем).
ИФН типа I может стимулировать или ингибировать активацию, пролиферацию, дифференцировку и выживание T-клеток, в значительной степени зависящие от времени сигналинга ИФН типа I относительно сигналинга T-клеточных рецепторов (Crouse et al., (2015) Nat Rev Immunol 15:231-242). Ранние исследования показали, что экспрессия ГКГС-I повышается в ответ на ИФН типа I во множестве типов клеток (Lindahl et al., (1976), J Infect Dis 133(Suppl):A66-A68; Lindahl et al., (1976) Proc Natl Acad Sci USA 17:1284-1287), что является необходимым условием для оптимальной стимуляции, дифференцировки, размножения и цитолитической активности Т-клеток. ИФН типа I может оказывать мощные костимулирующие эффекты на CD8 T-клетки, усиливая пролиферацию и дифференцировку CD8 T-клеток (Curtsinger et al., (2005) J Immunol 174:4465-4469; Kolumam et al., (2005) J Exp Med 202:637-650).
Подобно воздействиям на T-клетки, сигналинг ИФН типа I оказывает как положительное, так и отрицательное влияние на B-клеточные ответы в зависимости от времени и контекста воздействия (Braun et al., (2002) Int Immunol 14(4):411-419; Lin et al, (1998) 187(1):79-87). Сигналинг ИФН типа I может ингибировать выживаемость и созревание незрелых В-клеток. В отличие от незрелых В-клеток, воздействие ИФН типа I способствует активации В-клеток, продукции антител и переключению изотипа после вирусной инфекции или после экспериментальной иммунизации (Le Bon et al., (2006) J Immunol 176:4:2074-2078; Swanson et al., (2010) J Exp Med 207:1485-1500).
Был установлен ряд компонентов, участвующих в сигналинге ИФН типа I, включая STING, регуляторные факторы интерферонов, такие как IRF1, IRF3, IRF5, IRF7, IRF8, и IRF9, TBK1, IKKi, MyD88, MAVS и TRAM. Дополнительные компоненты, участвующие в сигнальном пути ИФН типа I, включают IKKα, TRAF3, TRAF6, IRAK-1, IRAK-4, TRIF, IPS-1, TLR-3, TLR-4, TLR-7, TLR-8, TLR-9, RIG-1, DAI и IFI16.
Соответственно, в одном варианте осуществления иммуностимуляторная мРНК кодирует любой из вышеупомянутых компонентов, участвующих в сигнальном пути ИФН типа I.
Иммуностимуляторная мРНК, кодирующая STING
Данное раскрытие охватывает мРНК (включая ммРНК), кодирующую STING, включая конститутивно активные формы STING, в качестве иммуностимуляторов. STING (стимулятор генов интерферона; также известный как трансмембранный белок 173 (TMEM173), медиатор активации IRF3 (MITA), метионин-пролин-тирозин-серин (MPYS) и стимулятор ИФН ЭР (ERIS)) представляет собой 379 аминокислот, резидентный трансмембранный белок эндоплазматического ретикулума (ЭР), который функционирует как сигнальная молекула, контролирующая транскрипцию генов иммунного ответа, включая ИФН I типа и провоспалительные цитокины (Ishikawa & Barber, (2008) Nature 455:647-678; Ishikawa et al., (2009) Nature 461:788-792; Barber (2010) Nat Rev Immunol 15(12):760-770).
STING функционирует как сигнальный адаптер, связывающий цитозольное обнаружение ДНК с сигнальной осью TBK1/IRF3/ИФН типа I. Функции сигнального адаптера STING активируются посредством прямого распознавания циклических динуклеотидов (CDN). Примеры CDN включают циклический ди-ГМФ (гуанозин-5'-монофосфат), циклический ди-АМФ (аденозин-5'-монофосфат) и циклический ГМФ-АМФ (cGAMP). CDN, изначально характеризуемые как повсеместно распространенные бактериальные вторичные мессенджеры, в настоящее время известны как класс патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMP), которые активируют сигнальную ось TBK1/IRF3/ИФН типа I посредством прямого взаимодействия со STING. STING способен распознавать аберрантные виды ДНК и/или CDN в цитозоле клетки, включая CDN, полученные от бактерий, и/или от белка циклической ГМФ-АМФ-синтазы (cGAS) хозяина. Белок cGAS представляет собой ДНК-сенсор, который вырабатывает cGAMP в ответ на обнаружение ДНК в цитозоле (Burdette et al., (2011) Nature 478:515-518; Sun et al., (2013) Science 339:786-791; Diner et al., (2013) Cell Rep 3:1355-1361; Ablasser et al., (2013) Nature 498:380-384).
При связывании с CDN, STING димеризуется и подвергается конформационному изменению, которое способствует образованию комплекса с TANK-связывающей киназой 1 (TBK1) (Ouyang et al., (2012) Immunity 36(6):1073-1086). Этот комплекс транслоцируется в перинуклеарное пространство Гольджи, что приводит к доставке TBK1 в эндолизосомные компартменты, где он фосфорилирует факторы транскрипции IRF3 и NF-κB (Zhong et al., (2008) Immunity 29:538-550). Недавнее исследование показало, что STING функционирует как каркас, связываясь как с TBK1, так и с IRF3, чтобы специфически стимулировать фосфорилирование IRF3 с помощью TBK1 (Tanaka & Chen, (2012) Sci Signal 5(214):ra20). Активация IRF3-, IRF7- и NF-κB-зависимых сигнальных путей индуцирует продукцию цитокинов и других белков, связанных с иммунным ответом, таких как ИФН типа I, которые стимулируют антипатогенную и/или противоопухолевую активность.
В ряде исследований было исследовано использование CDN-агонистов STING в качестве потенциальных вакцинных адъювантов или иммуномодулирующих агентов для вызова гуморальных и клеточных иммунных ответов (Dubensky et al., (2013) Ther Adv Vaccines 1(4):131-143 и ссылки в нем). Первоначальные исследования показали, что введение CDN, ц-ди-ГМФ, ослабляет инфекцию Staphylococcus aureus in vivo, сокращая количество восстановленных бактериальных клеток в мышиной модели инфекции, однако ц-ди-ГМФ не оказывал заметного ингибирующего или бактерицидного действия на бактериальные клетки in vitro, что указывает на то, что сокращение бактериальных клеток было связано с влиянием на иммунную систему хозяина (Karaolis et al., (2005) Antimicrob Agents Chemother 49:1029-1038; Karaolis et al., (2007) Infect Immun 75:4942-4950). Недавние исследования показали, что синтетические молекулы производные CDN, объединенные с противораковыми вакцинами, продуцирующими гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) (называемые STINGVAX), вызывают усиление противоопухолевых эффектов in vivo на терапевтических животных моделях рака по сравнению с иммунизацией только вакциной, продуцирующей ГМ-КСФ (Fu et al., (2015) Sci Transl Med 7(283):283ra52), что указывает на то, что CDN являются сильными вакцинными адъювантами.
Описаны мутантные белки STING, возникающие в результате полиморфизмов, картированных с геном TMEM173 человека, проявляющих мутацию с приобретением функции или конститутивно активный фенотип. Было показано, что при экспрессии in vitro мутантные аллели STING эффективно стимулируют индукцию ИФН типа I (Liu et al., (2014) N Engl J Med 371:507-518; Jeremiah et al., (2014) J Clin Invest 124:5516-5520; Dobbs et al., (2015) Cell Host Microbe 18(2):157-168; Tang & Wang, (2015) PLoS ONE 10(3):e0120090; Melki et al., (2017) J Allergy Clin Immunol In Press; Konig et al., (2017) Ann Rheum Dis 76(2):468-472; Burdette et al. (2011) Nature 478:515-518).
В данном документе представлены мРНК (включая химически модифицированные мРНК (ммРНК)), кодирующие конститутивно активные формы STING, в том числе мутантные изоформы STING человека для применения в качестве иммуностимуляторов, как описано в данном документе. мРНК, кодирующие конститутивно активные формы STING (например, ммРНК), включая мутантные изоформы STING человека, изложены в перечне последовательностей, приведенном в данном документе. Нумерация аминокислотных остатков для мутантных полипептидов STING человека, используемых в данном документе, соответствует нумерации, используемой для 379 аминокислотных остатков человеческого STING дикого типа (изоформа 1), доступных в данной области техники под номером доступа в базе данных Genbank NP_938023.
Соответственно, в одном аспекте раскрытие обеспечивает мРНК (например, ммРНК), кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутацию по аминокислотному остатку 155, в частности аминокислотную замену, такую как мутация V155M. В одном варианте осуществления мРНК (например, ммРНК) кодирует аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1. В одном варианте осуществления мутант STING V155M кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 199, 1319 или 1320. В одном варианте осуществления мРНК (например, ммРНК) содержит последовательность 3'-НТО, приведенную в SEQ ID NO: 209, которая содержит сайт связывания miR122.
В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутацию в аминокислотном остатке 284, такую как аминокислотная замена. Неограничивающие примеры остатков 284 замен включают R284T, R284M и R284K. В некоторых вариантах осуществления мутантный белок STING человека имеет мутацию R284T, например, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, или кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO 200 или SEQ ID NO: 1442. В некоторых вариантах осуществления мутантный белок STING человека имеет мутацию R284M, например, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 201 или SEQ ID NO: 1443. В некоторых вариантах осуществления мутантный белок STING человека имеет мутацию R284K, например, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4 или 224, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 202, 225, 1444 или 1466.
В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутацию в аминокислотном остатке 154, такую как аминокислотная замена, такую как мутация N154S. В некоторых вариантах осуществления мутантный белок STING человека имеет мутацию N154S, например, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 5, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 203 или SEQ ID NO: 1445.
В еще одних других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутацию в аминокислотном остатке 147, такую как аминокислотная замена, такую как мутация V147L. В некоторых вариантах осуществления мутантный белок STING человека, имеющий мутацию V147L, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 6, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 204 или SEQ ID NO: 1446.
В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутацию в аминокислотном остатке 315, такую как аминокислотная замена, такую как мутация E315Q. В некоторых вариантах осуществления мутантный белок STING человека, имеющий мутацию E315Q, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 7, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 205 или SEQ ID NO: 1447.
В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутацию в аминокислотном остатке 375, такую как аминокислотная замена, такую как мутация R375A. В некоторых вариантах осуществления мутантный белок STING человека, имеющий мутацию R375A, имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 8, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 206 или SEQ ID NO: 1448.
В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий одну или более, или комбинацию из двух, трех, четырех или более вышеуказанных мутаций. Соответственно, в одном аспекте раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из: V147L, N154S, V155M, R284T, R284M, R284K, E315Q и R375A, и их комбинации. В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из: V155M и R284T; V155M и R284M; V155M и R284K; V155M и V147L; V155M и N154S; V155M и E315Q; и V155M и R375A.
В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий V155M и одну, две, три или более из следующих мутаций: R284T; R284M; R284K; V147L; N154S; E315Q; и R375A. В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутации V155M, V147L и N154S. В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутации V155M, V147L, N154S и необязательно мутацию в аминокислоте 284. В еще одних других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутации V155M, V147L, N154S и мутацию в аминокислоте 284, выбранную из R284T, R284M и R284K. В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутации V155M, V147L, N154S и R284T. В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутации V155M, V147L, N154S и R284M. В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий мутации V155M, V147L, N154S и R284K.
В других вариантах осуществления раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, имеющий комбинацию мутаций в аминокислотном остатке 147, 154, 155 и, необязательно, 284, в частности аминокислотные замены, такие как V147L, N154S, V155M и, необязательно, R284M. В некоторых вариантах осуществления мутантный белок STING человека имеет мутации V147N, N154S и V155M, такие как аминокислотная последовательность, указанная в SEQ ID NO: 9, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 207 или SEQ ID NO: 1449. В некоторых вариантах осуществления мутантный белок STING человека имеет мутации R284M, V147N, N154S и V155M, такие как аминокислотная последовательность, указанная в SEQ ID NO: 10, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 208 или SEQ ID NO: 1450.
В другом варианте осуществления раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок STING человека, который является конститутивно активной усеченной формой полноразмерного белка дикого типа из 379 аминокислот, такой как конститутивно активный полипептид STING человека, состоящий из аминокислот 137-379.
Иммуностимуляторная мРНК, кодирующая регуляторный фактор интерферона (IRF)
Данное раскрытие обеспечивает мРНК (включая ммРНК), кодирующую регуляторные факторы интерферона, такие как IRF1, IRF3, IRF5, IRF7, IRF8 и IRF9 в качестве иммуностимуляторов. Семейство факторов транскрипции IRF участвует в регуляции экспрессии генов, что приводит к продукции интерферонов I типа (ИФН) во время врожденных иммунных ответов. На сегодняшний день идентифицировано девять IRF человека (IRF-1-IRF-9), причем каждый член семейства обладает обширной гомологией последовательностей в своих N-концевых связывающих доменах (DBD) (Mamane et al., (1999) Gene 237:1-14; Taniguchi et al., (2001) Annu Rev Immunol 19:623-655). В семействе IRF IRF1, IRF3, IRF5 и IRF7 специфически участвуют в качестве позитивных регуляторов транскрипции гена ИФН типа I (Honda et al., (2006) Immunity 25(3):349-360). IRF1 был первым членом семейства, для которого обнаружили, что он активирует промоторы гена ИФН типа I (Miyamoto et al., (1988) Cell 54:903-913). Хотя исследования демонстрируют, что IRF1 участвует в экспрессии гена ИФН типа I, нормальная индукция ИФН типа I наблюдалась в инфицированных вирусом IRF1-/- мышиных фибробластах, что свидетельствует об их заменимости (Matsuyama et al., (1993) Cell 75:83-97). Было также показано, что IRF5 не является обязательным для индукции ИФН типа I вирусами или агонистами TLR (Takaoka et al., (2005) Nature 434:243-249).
Соответственно, в некоторых аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую конститутивно активные формы IRF1, IRF3, IRF5, IRF7, IRF8 и IRF9 человека в качестве иммуностимуляторов. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую конститутивно активные формы человеческого IRF3 и/или IRF7.
Во время врожденных иммунных ответов IRF-3 играет критическую роль в ранней индукции ИФН типа I. Фактор транскрипции IRF3 конститутивно экспрессируется и перемещается между ядром и цитоплазмой клеток в латентной форме с преимущественно цитозольной локализацией до фосфорилирования (Hiscott (2007) J Biol Chem 282(21):15325-15329; Kumar et al., (2000) Mol Cell Biol 20(11):4159-4168). После фосфорилирования сериновых остатков на С-конце с помощью TBK-1 (TANK-связывающая киназа 1; также известная как T2K и NAK) и/или IKKε (индуцибельная IκB-киназа; также известная как IKKi), IRF3 транслоцируется из цитоплазмы в ядро (Fitzgerald et al., (2003) Nat Immuno 4(5):491-496; Sharma et al., (2003) Science 300:1148-1151; Hemmi et al., (2004) J Exp Med 199:1641-1650). Транскрипционная активность IRF3 опосредуется этими событиями фосфорилирования и транслокации. Модель для активации IRF3 предполагает, что С-концевое фосфорилирование вызывает конформационное изменение в IRF3, которое способствует гомо- и/или гетеродимеризации (например, с IRF7; см. Honda et al., (2006) Immunity 25(3):346-360), ядерной локализации и ассоциации с транскрипционными коактиваторами CBP и/или p300 (Lin et al., (1999) Mol Cell Biol 19(4):2465-2474). В то время как неактивный IRF3 конститутивно перемещается в и из ядра, фосфорилированные белки IRF3 остаются связанными с CBP и/или p300, сохраняются в ядре и индуцируют транскрипцию ИФН и других генов (Kumar et al., (2000) Mol Cell Biol 20(11):4159-4168).
В отличие от IRF3, IRF7 демонстрирует низкий уровень экспрессии в большинстве клеток, но сильно индуцируется сигналингом, опосредованным ИФН типа I, подтверждая мнение, что IRF3 в первую очередь ответственен за раннюю индукцию генов ИФН и что IRF7 участвует в поздней фазе индукции (Sato et al., (2000) Immunity 13(4):539-548). Связывание лиганда с рецептором ИФН типа I приводит к активации гетеротримерного активатора транскрипции, называемого ИФН-стимулируемым генным фактором 3 (ISGF3), который состоит из IRF9, STAT1 и STAT2 и отвечает за индукцию гена IRF7 (Marie et al., (1998) EMBO J 17(22):6660-6669). Как и IRF3, IRF7 может делиться между цитоплазмой и ядром после серинового фосфорилирования его С-концевой области, что обеспечивает его димеризацию и ядерную транслокацию. IRF7 образует гомодимер или гетеродимер с IRF3, и каждый из этих разных димеров по-разному действует на членов семейства генов ИФН типа I. IRF3 более сильным в активации гена ИФН-β, чем генов ИФН-α, тогда как IRF7 эффективно активирует гены ИФН-α и ИФН-β (Marie et al., (1998) EMBO J 17(22):6660-6669).
В данном документе представлены мРНК, кодирующие конститутивно активные формы IRF3 и IRF7, включая мутантные человеческие изоформы IRF3 и мутантные человеческие изоформы IRF7 для использования в качестве иммуностимуляторов, как описано в данном документе. мРНК, кодирующие конститутивно активные формы IRF3 и IRF7, включая мутантные человеческие изоформы IRF3 и IRF7, изложены в Перечне последовательностей в данном документе. Нумерация аминокислотных остатков для мутантных полипептидов IRF3 человека, используемых в данном документе, соответствует нумерации, используемой для 427 аминокислотных остатков человеческого IRF3 дикого типа (изоформа 1), доступных в данной области техники под номером доступа в базе данных Genbank NP_001562. Нумерация аминокислотных остатков для мутантных полипептидов IRF7 человека, используемых в данном документе, соответствует нумерации, используемой для 503 аминокислотных остатков человеческого IRF7 дикого типа (изоформа а), доступных в данной области техники под номером доступа в базе данных Genbank NP_001563.
Соответственно, в некоторых аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок IRF3 человека, который является конститутивно активным, например, имеющим мутацию в аминокислотном остатке 396, такую как аминокислотная замена, например, мутацию S396D, например, как указано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 211 или SEQ ID NO: 1463. В других аспектах конструкт мРНК кодирует конститутивно активный полипептид IRF3 мыши, содержащий мутацию S396D, например, как указано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в 210 или SEQ ID NO: 1452.
В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок IRF7 человека, который является конститутивно активным. В одном аспекте раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую конститутивно активный белок IR7, содержащий одну или более точечных мутаций (аминокислотные замены по сравнению с диким типом). В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую конститутивно активный белок IR7, содержащий усеченную форму белка (аминокислотные делеции по сравнению с диким типом). В еще одних других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую конститутивно активный белок IR7, содержащий усеченную форму белка, которая также содержит одну или более точечных мутаций (комбинация аминокислотных делеций и аминокислотных замен по сравнению с диким типом).
Аминокислотная последовательность дикого типа человеческого IRF7 (изоформа а) указана в SEQ ID NO: 13, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 212 или SEQ ID NO: 1454. Был получен ряд конститутивно активных форм человеческого IRF7, содержащий точечные мутации, делеции или и те и другие, по сравнению с последовательностью дикого типа. В одном аспекте раскрытие обеспечивает конструкт имуностимуляторной мРНК, кодирующий конститутивно активный полипептид IRF7, содержащий одну или более из следующих мутаций: S475D, S476D, S477D, S479D, L480D, S483D и S487D, и их комбинации. В других аспектах раскрытие обеспечивает ммРНК, кодирующую конститутивно активный полипептид IRF7, содержащий мутации S477D и S479D, как указано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 213 или SEQ ID NO: 1455. В другом аспекте раскрытие обеспечивает к мРНК, кодирующую конститутивно активный полипептид IRF7, содержащий мутации S475D, S477D и L480D, как указано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 214 или SEQ ID NO: 1456. В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую конститутивно активный полипептид IRF7, содержащий мутации S475D, S476D, S477D, S479D, S483D и S487D, как указано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 215 или SEQ ID NO: 1457. В другом аспекте раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую конститутивно активный полипептид IRF7, содержащий делецию аминокислотных остатков 247-467 (т.е. содержащий аминокислотные остатки 1-246 и 468-503), как указано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 216 или SEQ ID NO: 1458. В еще одних других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую конститутивно активный полипептид IRF7, содержащий делецию аминокислотных остатков 247-467 (т.е. содержащий аминокислотные остатки 1-246 и 468-503) и дополнительно содержащий мутации S475D, S476D, S477D, S479D, S483D и S487D, как указано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 217 или SEQ ID NO: 1459.
В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую усеченный неактивный «нулевой» полипептидный конструкт IRF7, содержащий делецию остатков 152-246 (т.е. содержащий аминокислотные остатки 1-151 и 247-503), как указано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 218 или SEQ ID NO: 1460 (используется, например, в целях контроля). В других аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую усеченный неактивный «нулевой» полипептидный конструкт IRF7, содержащий делецию остатков 1-151 (т.е. содержащий аминокислотные остатки 152-503), как указано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, или кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 219 или SEQ ID NO: 1461 (используется, например, в целях контроля).
Дополнительные иммуностимуляторные мРНК, которые активируют ИФН типа I
В дополнение к конструктам мРНК STING и IRF, описанным выше, раскрытие обеспечивает конструкты мРНК, кодирующие дополнительные компоненты сигнального пути ИФН типа I, которые можно использовать в качестве иммуностимуляторов для усиления иммунных ответов посредством активации сигнального пути ИФН типа I. Например, в одном варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК кодирует белок MyD88. В данной области техники известно, что MyD88 передает сигнал выше в направлении от IRF7. В одном аспекте раскрытие обеспечивает ммРНК, кодирующую конститутивно активный белок MyD88, такой как мутантный белок MyD88, имеющий одну или более точечных мутаций. В одном аспекте раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую мутантный белок MyD88 человека или мыши, имеющий замены L265P, как указано в SEQ ID NO: 134 (кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1409 или SEQ ID NO: 1480) и 135, соответственно.
В другом аспекте конструкт иммуностимуляторной мРНК кодирует белок MAVS (митохондриальный антивирусный сигнал). В данной области техники известно, что MAVS передает сигнал выше в направлении от IRF3/IRF7. Было показано, что MAVS играет важную роль в защитном интерфероновом ответе на двухцепочечные РНК-вирусы. Например, мыши, инфицированные ротавирусами, не имеющие MAVS, продуцируют значительно меньше ИФН-β и повышенные количества вируса, чем мыши с MAVS (Broquet, A.H. et al. (2011) J. Immunol. 186:1618-1626). Более того, было показано, что сигналинг RIG-1 или MDA5 через MAVS необходим для активации продукции ИФН-β клетками, инфицированными ротавирусом (Broquet et al., ibid). Также было показано, что MAVS является критическим для ответов интерферона I типа на вирус Коксаки В, опосредованный вместе с MDA5. (Wang, J.P. et al. (2010) J. Virol. 84:254-260). Кроме того, было показано, что, хотя различные классы рецепторов ответственны за распознавание РНК и ДНК в клетках, последующие сигнальные компоненты физически и функционально взаимосвязаны, и существует перекрестное взаимодействие между путями распознавания РНК RIG-1/MAVS и распознавания ДНК cGAS-STING в потенцировании эффективных противовирусных ответов, включая интерфероновые ответы (Zevini, A. et al. (2017) Trends Immunol. 38:194-205). В одном аспекте раскрытие охватывает мРНК, кодирующую конститутивно активный белок MAVS, такой как мутантный белок MAVS, имеющий одну или более точечных мутаций. В другом аспекте раскрытие охватывает белок MAVS дикого типа, который сверхэкспрессируется. В одном аспекте раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую белок MAVS, как показано в SEQ ID NO: 1387. Иллюстративная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок MAVS SEQ ID NO: 1387 приведена в SEQ ID NO: 1413 и SEQ ID NO: 1484.
В другом аспекте конструкт иммуностимуляторной мРНК кодирует белок TRAM (TICAM2). В данной области техники известно, что TRAM передает сигнал выше IRF3. В одном аспекте раскрытие включает ммРНК, кодирующую конститутивно активный белок TRAM, такой как мутантный белок TRAM, имеющий одну или более точечных мутаций. В другом аспекте раскрытие охватывает белок TRAM дикого типа, который сверхэкспрессируется. В одном аспекте раскрытие обеспечивает мРНК, кодирующую белок TRAM мыши, как показано в SEQ ID NO: 136. Иллюстративная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок TRAM SEQ ID NO: 136, приведена в SEQ ID NO: 1410 или SEQ ID NO: 1481.
В еще одних других аспектах раскрытие обеспечивает конструкт иммуностимуляторной мРНК, кодирующей TANK-связывающую киназу 1 (TBK1) или индуцибельную IκB-киназу (IKKi, также известную как IKKε), включая конститутивно активные формы TBK1 или IKKi, в качестве иммуностимуляторов. Было показано, что TBK1 и IKKi являются компонентами активируемой вирусом киназы, которая фосфорилирует IRF3 и IRF7, таким образом, действуя выше в направлении от IRF3 и IRF7 в сигнальном пути ИФН типа I (Sharma, S. et al. (2003) Science 300:1148-1151). TBK1 и IKKi участвуют в фосфорилировании и активации факторов транскрипции (например, IRF3/7 и NF-κB), которые индуцируют экспрессию генов ИФН типа I, а также генов, индуцируемых ИФН. (Fitzgerald, K.A. et al., (2003) Nat Immunol 4(5):491-496).
Соответственно, в одном аспекте раскрытие обеспечивает конструкт иммуностимуляторной мРНК, которая кодирует белок TBK1, включая конститутивно активную форму TBK1, включая мутантные изоформы TBK1 человека. В еще одних других аспектах конструкт иммуностимуляторной мРНК кодирует белок IKKi, включая конститутивно активную форму IKKi, включая мутантные изоформы IKKi человека.
Иммуностимуляторные мРНК, которые стимулируют воспалительные ответы
В других аспектах раскрытие обеспечивает конструкты иммуностимуляторных мРНК, которые усиливают иммунный ответ путем стимуляции воспалительного ответа. Неограничивающие примеры агентов, которые стимулируют воспалительный ответ, включают STAT1, STAT2, STAT4 и STAT6. Соответственно, раскрытие обеспечивает конструкт иммуностимуляторной мРНК, кодирующий один или комбинацию этих индуцирующих воспаление белков, включая конститутивно активную форму.
В данном документе предложены мРНК, кодирующие конститутивно активные формы STAT6, включая мутантные изоформы STAT6 человека для использования в качестве иммуностимуляторов, как описано в данном документе. мРНК, кодирующие конститутивно активные формы STAT6, включая мутантные изоформы STAT6 человека, изложены в приведенном в данном документе Перечне последовательностей. Нумерация аминокислотных остатков для мутантных полипептидов STAT6 человека, используемых в данном документе, соответствует нумерации, используемой для 847 аминокислотных остатков человеческого STAT6 дикого типа (изоформа 1), доступных в данной области техники под номером доступа в базе данных Genbank NP_001171550.1.
В одном варианте осуществления раскрытие обеспечивает конструкт мРНК, кодирующий конститутивно активный конструкт STAT6 человека, содержащий одну или более аминокислотных мутаций, выбранных из группы, состоящей из S407D, V547A, T548A, Y641F и их комбинаций. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует конститутивно активный конструкт STAT6 человека, содержащий мутации V547A и T548A, такой как последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 137. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует конститутивно активный конструкт STAT6 человека, содержащий мутацию S407D, такой как последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 138. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует конститутивно активный конструкт STAT6 человека, содержащий мутации S407D, V547A и T548A, такой как последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 139. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует конститутивно активный конструкт STAT6 человека, содержащий мутации V547A, T548A и Y641F, такие как последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 140.
Иммуностимуляторные мРНК, которые стимулируют сигналинг NFkB
В других аспектах раскрытие обеспечивает конструкты иммуностимуляторных мРНК, которые усиливают иммунный ответ путем стимуляции сигналинга NFkB, который, как известно, участвует в стимуляции иммунных ответов. Неограничивающие примеры белков, которые стимулируют сигналинг NFkB, включают STING, c-FLIP, IKKβ, RIPK1, Btk, TAK1, TAK-TAB1, TBK1, MyD88, IRAK1, IRAK2, IRAK4, TAB2, TAB3, TRAF6, TRAM, MKK3, MKK4, MKK6 и MKK7. Соответственно, конструкт иммуностимуляторной мРНК согласно раскрытию может кодировать любой из этих белков, индуцирующих путь NFkB, например, в конститутивно активной форме.
Подходящие конструкты STING, которые могут служить в качестве конструктов иммуностимуляторных мРНК, которые усиливают иммунный ответ посредством стимуляции сигналинга NFkB, описаны выше в подразделе по конструктам иммуностимуляторных мРНК, которые активируют ИФН типа I.
Подходящие конструкты MyD88, которые могут служить в качестве конструктов иммуностимуляторных мРНК, которые усиливают иммунный ответ посредством стимуляции сигналинга NFkB, описаны выше в подразделе по конструктам иммуностимуляторных мРНК, которые активируют ИФН типа I.
В одном варианте осуществления раскрытие обеспечивает конструкт иммуностимуляторной мРНК, которая активирует сигналинг NFκB, кодирующих белок c-FLIP (клеточный белок, ингибирующий каспазу 8 (FLICE)) (также известный в данной области техники как CASP8 и FADD-подобный регулятор апоптоза), включая конститутивно активный c-FLIP. В данном документе представлены ммРНК, кодирующие конститутивно активные формы c-FLIP, включая мутантные изоформы c-FLIP человека для использования в качестве иммуностимуляторов, как описано в данном документе. ммРНК, кодирующие конститутивно активные формы c-FLIP, включая мутантные изоформы c-FLIP человека, изложены в Перечне последовательностей в данном документе. Нумерация аминокислотных остатков для мутантных полипептидов c-FLIP человека, используемых в данном документе, соответствует нумерации, используемой для 480 аминокислотных остатков человеческого c-FLIP дикого типа (изоформа 1), доступных в данной области техники под номером доступа в базе данных Genbank NP_003870.
В одном варианте осуществления мРНК кодирует длинную (L) изоформу c-FLIP, содержащую два домена DED, домен p20 и домен p12, такую как имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 141. В другом варианте осуществления мРНК кодирует короткую (S) изоформу c-FLIP, кодирующую аминокислоты 1-227, содержащую два домена DED, такую как имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 142. В другом варианте осуществления мРНК кодирует продукт расщепления c-FLIP p22, кодирующий аминокислоты 1-198, такой как имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 143. В другом варианте осуществления мРНК кодирует продукт расщепления c-FLIP p43, кодирующий аминокислоты 1-376, такой как имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 144. В другом варианте осуществления мРНК кодирует продукт расщепления c-FLIP p12, кодирующий аминокислоты 377-480, такой как имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 145. Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие белки c-FLIP, обсуждаемые выше, приведены в SEQ ID NO: 1398-1402 и 1469-1473.
В другом варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК, который активирует сигналинг NFκB, кодирует конститутивно активный конструкт мРНК IKKα или конститутивно активный конструкт мРНК IKKβ. В одном варианте осуществления конститутивно активный полипептид IKKβ человека содержит мутации S177E и S181E, такой как последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 146. В одном варианте осуществления конститутивно активный полипептид IKKβ человека содержит мутации S177A и S181A, такой как последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 147. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует конститутивно активный полипептид IKKβ мыши. В одном варианте осуществления конститутивно активный полипептид IKKβ содержит мутации S177E и S181E, такой как последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 148. В одном варианте осуществления конститутивно активный полипептид IKKβ мыши содержит мутации S177A и S181A, такую как последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 149. Иллюстративная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок SEQ ID NO: 146, приведена в SEQ ID NO: 1414 и SEQ ID NO: 1485. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует конститутивно активный полипептид IKKα человека или мыши, содержащий мутацию PEST, такой как имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 150 (человек) (кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 151 или SEQ ID NO: 28) или 154 (мышь) (кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 155 или SEQ ID NO: 1429). В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует конститутивно активный полипептид IKKβ человека или мыши, содержащий мутацию PEST, такой как имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 152 (человек) (кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 153 или SEQ ID NO: 1397) или 156 (мышь) (кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 157 или SEQ ID NO: 1430).
В другом варианте осуществления раскрытие обеспечивает конструкт мРНК, который активирует сигналинг NFκB, кодирующий взаимодействующую с рецептором протеинкиназу 1 (RIPK1). Структура конструктов ДНК, кодирующих конструкты RIPK1, которые индуцируют иммуногенную клеточную гибель, описаны в данной области техники, например, в Yatim, N. et al. (2015) Science 350:328-334 или Orozco, S. et al. (2014) Cell Death Differ. 21:1511-1521, и могут быть использованы при разработке подходящих конструктов РНК, которые приведены в данном документе, также для активации сигналинга NFkB (см. Примеры). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-555 RIPK1 полипептида RIPK1 человека или мыши, а также домен IZ, такого как имеющего последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 158 (человек) или 161 (мышь). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-555 RIPK1 полипептида RIPK1 человека или мыши, а также домены EE и DM, такого как имеющего последовательность, приведенную в SEQ ID N: 159 (человек) или 162 (мышь). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-555 RIPK1 полипептида RIPK1 человека или мыши, а также домены RR и DM, такого как имеющего последовательность, приведенную в SEQ ID N: 160 (человек) или 163 (мышь). Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды RIPK1, описанные выше, приведены в SEQ ID NO: 1403-1408 и 1474-1479.
В еще одном варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК, которая активирует сигналинг NFκB, кодирует полипептид Btk, такой как мутантный полипептид Btk, такой как полипептид Btk (E41K) (например, кодирующий аминокислотную последовательность ОРС, приведенную в SEQ ID NO: 173).
В еще одном варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК, которая активирует сигналинг NFκB, кодирует белок TAK1, такой как конститутивно активный TAK1.
В еще одном варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК, которая активирует сигналинг NFκB, кодирует белок TAK-TAB1, такой как конститутивно активный TAK-TAB1. В одном варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК кодирует белок TAK-TAB1 человека, такой как имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 164. Иллюстративная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок TAK-TAB1 SEQ ID NO: 164, приведена в SEQ ID NO: 1411 или SEQ ID NO: 1482.
Иммуностимуляторные мРНК, кодирующие внутриклеточные адаптерные белки
В одном варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой внутриклеточный адаптерный белок. Внутриклеточные адаптеры (также называемые адаптерными белками, передающими сигналы) представляют собой белки, которые являются аксессуарами для основных белков в пути передачи сигналов. Адаптерные белки содержат множество белок-связывающих модулей, которые связывают белок-связывающих партнеров вместе и облегчают создание более крупных сигнальных комплексов. Эти белки, как правило, сами по себе не обладают какой-либо внутренней ферментативной активностью, но вместо этого опосредуют специфические белок-белковые взаимодействия, которые управляют образованием белковых комплексов.
В одном варианте осуществления внутриклеточный адаптерный белок стимулирует ответ ИФН типа I. В другом варианте осуществления внутриклеточный адаптерный белок стимулирует NFκВ-опосредованный провоспалительный ответ.
В одном варианте осуществления внутриклеточный адаптерный белок представляет собой белок STING, такой как конститутивно активная форма полипептида STING, включая мутантные изоформы STING человека. STING был определен в данной области техники как адаптер эндоплазматического ретикулума, который облегчает сигналинг врожденного иммунитета, и было показано, что он активирует как NFkB-опосредованный, так и IRF3/IRF7-опосредованный пути транскрипции для индукции экспрессии ИФН I типа (см., например, Ishikawa, H. and Barber, G.H. (2008) Nature 455:674-678). Например, STING действует в качестве адаптерного белка при активации TBK1 (выше в направлении от NFkB-опосредованной и IRF3/IRF-опосредованной транскрипции) после активации cGAS и IFI16 при помощи двухцепочечной ДНК (например, вирусной ДНК). Подходящие конструкты мРНК, кодирующие STING, подробно описаны выше в разделе иммуностимуляторов, которые активируют интерферон типа I.
В другом варианте осуществления внутриклеточный адаптерный белок представляет собой белок MAVS, такой как конститутивно активная форма полипептида MAVS, включая мутантные изоформы MAVS человека. MAVS также известен в данной области техники как VISA (вирус-индуцированный сигнальный адаптер), IPS-1 или Cardif. В данной области было установлено, что MAVS действует как внутриклеточный адаптерный белок в активации TBK1 (выше в направлении от NFkB-опосредованной и IRF3/IRF-опосредованной транскрипции) после активации цитоплазматической РНК-хеликазы RIG-1 и MDA5 с помощью двухцепочечной РНК (например, двухцепочечные РНК-вирусы). Подходящие конструкты мРНК, кодирующие MAVS, подробно описаны выше в подразделе иммуностимуляторов, которые активируют интерферон типа I.
В другом варианте осуществления внутриклеточный адаптерный белок представляет собой белок MyD88, такой как конститутивно активная форма полипептида MyD88, включая мутантные изоформы MyD88 человека. MyD88 был определен в данной области техники как внутриклеточный адаптерный белок, который используется TLR для активации ответов ИФН типа I и NFkB-опосредованных провоспалительных ответов (см., например, O'Neill, L.A. et al. (2003) J. Endotoxin Res. 9:55-59). Подходящие конструкты мРНК, кодирующие MyD88, подробно описаны выше в подразделе об иммуностимуляторах, которые активируют ответы ИФН типа I.
Иммуностимуляторные мРНК, кодирующие внутриклеточные сигнальные белки
В другом варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой внутриклеточный сигнальный белок. Используемый в данном документе термин «внутриклеточный сигнальный белок» относится к белку, участвующему в пути передачи сигнала и обычно обладающему ферментативной активностью (например, киназной активностью). В одном варианте осуществления полипептид представляет собой внутриклеточный сигнальный белок сигнального пути TLR (то есть полипептид представляет собой внутриклеточную молекулу, которая функционирует в трансдукции TLR-опосредованного сигналинга, но не является самим TLR). В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный белок стимулирует ответ ИФН типа I. В другом варианте осуществления внутриклеточный сигнальный белок стимулирует NFκВ-опосредованный провоспалительный ответ.Неограничивающие примеры внутриклеточных сигнальных белков включают MyD88, IRAK 1, IRAK2, IRAK4, TRAF3, TRAF6, TAK1, TAB2, TAB3, TAK-TAB1, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, IKKα, IKKβ, TRAM, TRIF, RIPK1, и TBK1. Конкретные примеры внутриклеточных сигнальных белков описаны в подразделах об иммуностимуляторах, которые активируют интерферон типа I или активируют сигналинг NFκB.
Иммуностимуляторные мРНК, кодирующие факторы транскрипции
В другом варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой фактор транскрипции. Фактор транскрипции содержит по меньшей мере один специфический для последовательности ДНК-связывающий домен и функционирует для регуляции скорости транскрипции гена(ов) в мРНК. В одном варианте осуществления фактор транскрипции стимулирует ответ ИФН типа I. В другом варианте осуществления фактор транскрипции стимулирует NFκВ-опосредованный провоспалительный ответ. Неограничивающие примеры факторов транскрипции включают IRF3 или IRF7. Конкретные примеры конструктов IRF3 и IRF7 описаны в подразделе об иммуностимуляторах, которые активируют интерферон типа I.
Иммуностимуляторные мРНК, кодирующие полипептиды, участвующие в некроптозе или образовании некроптосом
В другом варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, участвует в некроптозе или образовании некроптосом. Полипептид «участвует» в некроптозе или образовании некроптосом, если белок сам опосредует некроптоз или участвует с дополнительными молекулами в опосредовании некроптоза и/или в образовании некроптосом. Неограничивающие примеры полипептидов, участвующих в некроптозе или образовании некроптосом, включают MLKL, RIPK1, RIPK3, DIABLO и FADD.
Подходящие конструкты мРНК, кодирующие RIPK1, подробно описаны выше в разделе иммуностимуляторов, которые активируют сигналинг NFκB.
В одном варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой псевдокиназу смешанного происхождения (MLKL). Конструкты MLKL индуцируют некроптотическую клеточную гибель, характеризующуюся высвобождением DAMP. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-180 MLKL человека или мыши. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих MLKL, или их фрагмента, индуцирующего иммуногенную клеточную гибель, кодируют аминокислоты 1-180 MLKL человека или мыши, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 1327 и 1328, соответственно. Иллюстративная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок MLKL SEQ ID NO: 1327, приведена в SEQ ID NO: 1412 и SEQ ID NO: 1483.
В другом варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК является взаимодействующий с рецептором протеинкиназой-3 (RIPK3). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK3, который мультимеризуется сам с собой (гомоолигомеризация). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK3, который димеризуется с RIPK1. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует киназный домен и домен RHIM в RIPK3. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует киназный домен RIPK3, домен RHIM в RIPK3 и два домена FKBP (F>V). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK3 (например, содержащий киназный домен и домен RHIM в RIPK3) и домен IZ (например, тример IZ). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK3 (например, содержащий киназный домен и домен RHIM в RIPK3) и один или более доменов EE или RR (например, доменов 2xEE или доменов 2xRR). Кроме того, структура конструктов ДНК, кодирующих конструкты RIPK3, которые индуцируют иммуногенную клеточную гибель, описаны далее, например, в Yatim, N. et al. (2015) Science 350:328-334 или Orozco, S. et al. (2014) Cell Death Differ. 21:1511-1521, и могут быть использованы при разработке подходящих конструктов РНК. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих RIPK3, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1329-1344 и 1379. Иллюстративная нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид RIPK3 SEQ ID NO: 1339, приведена в SEQ ID NO: 1415 и SEQ ID NO: 1486.
В другом варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК кодирует белок с низкой pI, прямо связывающий IAP, (DIABLO) (также известный как SMAC/DIABLO). Как описано в приведенных в данном документе примерах, конструкты DIABLO индуцируют высвобождение цитокинов. В одном варианте осуществления раскрытие обеспечивает конструкт мРНК, кодирующий последовательность изоформы 1 человеческого DIABLO дикого типа, такую как последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 165 (соответствует 239-аминокислотному предшественнику изоформы 1 DIABLO человека, раскрытому в данной области техники под номером доступа Genbank NP_063940.1). В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует последовательность изоформы 1 DIABLO человека, содержащую мутацию S126L, такую как последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 166. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 56-239 изоформы 1 DIABLO человека, такой как последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 167. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 56-239 изоформы 1 DIABLO человека и содержит мутацию S126L, такой как имеющей последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 168. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует последовательность изоформы 3 человеческого DIABLO дикого типа, такую как последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 169 (соответствует 195-аминокислотной изоформы 3 DIABLO человека, раскрытой в данной области техники под номером доступа Genbank NP_001265271.1). В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует последовательность изоформы 3 DIABLO человека, содержащую мутацию S82L, такую как последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 170. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 56-195 изоформы 3 DIABLO человека, такой как последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 171. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 56-195 изоформы 3 DIABLO человека и содержит мутацию S82L, такой как имеющей последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 172. Иллюстративная нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид DIABLO SEQ ID NO: 169, приведена в SEQ ID NO: 1416 и SEQ ID NO: 1487.
В другом варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой FADD (белок, взаимодействующий с доменом смерти Fas-рецептора). Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих FADD, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1345-1351. Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие белки FADD, приведены в SEQ ID NO: 1417-1422 и 1488-1493.
Иммуностимуляторные мРНК, кодирующие полипептиды, вовлеченные в пироптоз или образование инфламмасом
В другом варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, участвует в пироптозе или образовании инфламмасом. Полипептид «участвует» в пироптозе или образовании инфламмасом, если белок сам опосредует пироптоз или участвует с дополнительными молекулами в опосредовании пироптоза и/или в образовании инфламмасом. Неограничивающие примеры полипептидов, участвующих в пироптозе или образовании инфламмасом, включают каспазу 1, каспазу 4, каспазу 5, каспазу 11, GSDMD, NLRP3, пириновый домен и ASC/PYCARD.
В одном варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой каспазу 1. В одном варианте осуществления полипептид каспазы 1 представляет собой полипептид самоактивирующейся каспазы-1 (например, кодирующий любую из аминокислотных последовательностей ОРС, приведенных в SEQ ID NO: 175-178), который может способствовать расщеплению про-ИЛ-1β и про-ИЛ-18 до их соответствующих зрелых форм.
В другом варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой каспазу-4 или каспазу-5, или каспазу-11. В различных вариантах осуществления конструкты каспазы-4, -5 или -11 могут кодировать (i) полноразмерную каспазу-4, каспазу-5 или каспазу-11 дикого типа; (ii) полноразмерную каспазу-4, -5 или -11 плюс домен IZ; (iii) каспазу-4, -5 или -11 c удаленным N-концом плюс домен IZ; (iv) полноразмерную каспазу-4, -5 или -11 плюс домен DM; или (v) каспазу-4, -5 или -11 c удаленным N-концом плюс домен DM. Примеры форм каспазы-4 и каспазы-11 c удаленным N-концом содержат аминокислотные остатки 81-377. Пример формы каспазы-5 c удаленным N-концом содержит аминокислотные остатки 137-434. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих каспазу-4, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1352-1356. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих каспазу-5, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1357-1361. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих каспазу-11, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1362-1366.
В одном варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой гасдермин D (GSDMD). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует последовательность человеческого GSDMD дикого типа. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-275 человеческого GSDMD. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 276-484 человеческого GSDMD. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует мышиный GSDMD дикого типа. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-276 мышиного GSDMD. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 277-487 мышиного GSDMD. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих GSDMD, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1367-1372.
В другом варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой NLRP3. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих NLRP3, кодируют аминокислотные последовательности ОРС, приведенные в SEQ ID NO: 1373 или 1374.
В другом варианте осуществления полипептид, кодируемый конструктом иммуностимуляторной мРНК, представляет собой апоптоз-ассоциированный крапчато-подобный белок, содержащий CARD (ASC/PYCARD) или его фрагмент, такой как домен. В одном варианте осуществления полипептид представляет собой домен B30.2 пирина. В другом варианте осуществления полипептид представляет собой домен B30.2 пирина, содержащий мутацию V726A. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих домен B30.2 пирина, кодируют аминокислотные последовательности ОРС, приведенные в SEQ ID NO: 1375 или 1376. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих ASC, кодируют аминокислотные последовательности ОРС, приведенные в SEQ ID NO: 1377 или 1378.
Дополнительные иммуностимуляторные мРНК
Данное раскрытие обеспечивает дополнительные конструкты иммуностимуляторных мРНК. В некоторых вариантах осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК кодирует полипептид SOC3 (например, кодирующий аминокислотную последовательность ОРС, приведенную в SEQ ID NO: 174).
В еще одних других вариантах осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК кодирует белок, который модулирует активность дендритных клеток (ДК), такую как стимуляция продукции, активности или мобилизации ДК. Неограничивающим примером белка, который стимулирует мобилизацию ДК, является FLT3. Соответственно, в одном варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК кодирует белок FLT3.
Конструкт иммуностимуляторной мРНК обычно содержит, помимо полипептид-кодирующих последовательностей, структурные характеристики, как описано в данном документе для конструктов мРНК (например, модифицированные нуклеотидные основания, 5'-кэп, 5'-НТО, 3'-НТО, miR-связывающий сайт(ы), поли(А)-хвост, как описано в данном документе). Подходящие компоненты конструкта мРНК являются такими, как описано в данном документе.
Представляющие интерес антигены, включая мРНК
Иммуностимуляторные мРНК согласно раскрытию полезны в комбинации с любым типом антигена, для которого желательно усиление иммунного ответа, включая последовательности мРНК, кодирующие по меньшей мере один представляющий интерес антиген (или в том же, или в отдельном конструкте мРНК), для усиления иммунных ответов против представляющего интерес антигена, такого как опухолевый антиген или антиген патогена. Таким образом, иммуностимуляторные мРНК согласно раскрытию усиливают, например, ответы мРНК-вакцины, тем самым действуя в качестве генетических адъювантов. В одном варианте осуществления представляющий интерес антиген(ы) представляет собой опухолевый антиген. В другом варианте осуществления антиген(ы) представляющий интерес антиген(ы) представляет собой антиген патогена. В различных вариантах осуществления антиген(ы) патогена может быть из патогена, выбранного из группы, состоящей из вирусов, бактерий, простейших, грибов и паразитов.
В одном варианте осуществления антиген представляет собой эндогенный антиген, такой как опухолевый антиген или антиген патогена, высвобождаемый in situ. Альтернативно, антиген представляет собой экзогенный антиген. Экзогенный антиген может быть введен совместно с конструктом иммуностимуляторной мРНК или, альтернативно, может быть введен до или после конструкта иммуностимуляторной мРНК. Экзогенный антиген может быть объединен в состав с конструктом иммуностимуляторной мРНК или, альтернативно, может быть составлен отдельно от конструкта иммуностимуляторной мРНК. В одном варианте осуществления экзогенный антиген кодируется конструктом мРНК (например, конструктом ммРНК), или таким же или другим конструктом мРНК, отличным от того, который кодирует иммуностимулятор. В других вариантах осуществления антиген может представлять собой, например, белок, пептид, гликопротеин, полисахарид или липид.
В одном варианте осуществления представляющий интерес антиген(ы) представляет собой опухолевый антиген. В одном варианте осуществления опухолевый антиген содержит опухолевый неоэпитоп, например, мутантный пептид из опухолевого антигена. В одном варианте осуществления опухолевый антиген представляет собой антиген Ras. В данной области техники описано полный анализ мутаций Ras при раке (Prior, I.A. et al. (2012) Cancer Res. 72:2457-2467). Соответственно, аминокислотная последовательность Ras, содержащая по меньшей мере одну мутацию, связанную с раком, может быть использована в качестве представляющего интерес антигена. В одном варианте осуществления опухолевый антиген представляет собой мутантный антиген KRAS. Мутантные антигены KRAS участвуют в приобретенной устойчивости к определенным терапевтическим агентам (см., например, Misale, S. et al. (2012) Nature 486:532-536; Diaz, L.A. et al. (2012) Nature 486:537-540). Кроме того, противоопухолевые вакцины, содержащие по меньшей мере один мутантный пептид RAS и антиметаболитный химиотерапевтический агент, были описаны в данной области техники (патент США №9,757,399, полное содержание которого специально включено в данный документ посредством ссылки). Соответственно, любой из мутантных пептидов RAS, описанных в патенте США №9,757,349, может быть использован в качестве антигена согласно раскрытию, например, в комбинации с иммуностимулятором согласно раскрытию для усиления противоопухолевого иммунного ответа против опухолевого антигена Ras.
В одном варианте осуществления мутантный антиген KRAS содержит аминокислотную последовательность, имеющую одну или более мутаций, выбранных из G12D, G12V, G13D и G12C и их комбинаций. Неограничивающие примеры мутантных антигенов KRAS включают те, которые содержат одну или более аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 95-106 и 131-132. В одном варианте осуществления мутантный антиген KRAS представляет собой один или более мутантных 15-мерных пептидов KRAS, содержащих мутацию, выбранную из G12D, G12V, G13D и G12C, неограничивающие примеры которых приведены в SEQ ID NO: 95-97. В другом варианте осуществления мутантный антиген KRAS представляет собой один или более мутантных 25-мерных пептидов KRAS, содержащих мутацию, выбранную из G12D, G12V, G13D и G12C, неограничивающие примеры которых приведены в SEQ ID NO: 98-100 и 131. В другом варианте осуществления мутантный антиген KRAS представляет собой один или более мутантных 3×15-мерных пептидов KRAS (3 копии 15-мерного пептида), содержащих мутацию, выбранную из G12D, G12V, G13D и G12C, неограничивающие примеры которых приведены в SEQ ID NO: 101-103. В другом варианте осуществления мутантный антиген KRAS представляет собой один или более мутантных 3×25-мерных пептидов KRAS (три копии 25-мерного пептида), содержащих мутацию, выбранную из G12D, G12V, G13D и G12C, неограничивающие примеры которых приведены в SEQ ID NO: 104-106 и 132. В другом варианте осуществления мутантный антиген KRAS представляет собой 100-мерный конкатемерный пептид из 25-мерных пептидов, содержащих мутации G12D, G12V, G13D и G12C (то есть 100-мерный конкатемер SEQ ID NO: 98, 99, 100 и 131). Соответственно, в одном варианте осуществления мутантный антиген KRAS содержит конструкт мРНК, кодирующий SEQ ID NO: 98, 99, 100 и 131. Дополнительное описание мутантных антигенов KRAS, их аминокислотных последовательностей и кодирующих их последовательностей мРНК раскрыто в заявке США, серийный номер 62/453,465, полное содержание которой специально включено в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления мутантный антиген KRAS представляет собой 100-мерный конкатемерный пептид из 25-мерных пептидов, содержащих мутации G12D, G12V, G13D и G12C, кодируемые нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1321 или 1322.
В одном варианте осуществления опухолевый антиген кодируется конструктом мРНК, которая также содержит иммуностимулятор (то есть также кодирует полипептид, который усиливает иммунный ответ против опухолевого антигена). Неограничивающие примеры таких конструктов включают конструкты KRAS-STING, кодирующие одну из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 107-130. Неограничивающие примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих конструкты KRAS-STING, приведены в SEQ ID NO: 220-223.
В еще одном варианте осуществления опухолевый антиген представляет собой антиген онкогенного вируса. В одном варианте осуществления онкогенный вирус представляет собой вирус папилломы человека (HPV), а антиген(ы) HPV представляет собой антиген E6 и/или E7. Неограничивающие примеры антигенов Е6 HPV включают антигены, содержащие аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 36-72. Неограничивающие примеры антигенов Е7 HPV включают антигены, содержащие аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 73-94. В других вариантах осуществления антиген HPV представляет собой белок E1, E2, E4, E5, L1 или L2 или его последовательность антигенного пептида. Подходящие антигены HPV описаны дополнительно в заявке PCT №PCT/US2016/058314, полное содержание которой специально включено в данный документ посредством ссылки.
В другом варианте осуществления опухолевый антиген кодируется противораковой мРНК-вакциной. Подходящие противораковые мРНК-вакцины подробно описаны в заявке PCT №PCT/US2016/044918, полное содержание которой специально включено в данный документ посредством ссылки.
В еще одном варианте осуществления опухолевый антиген представляет собой эндогенный опухолевый антиген, такой как опухолевый антиген, который высвобождается при разрушении опухолевых клеток in situ. В данной области техники установлено, что существуют естественные механизмы, которые приводят к гибели клеток in vivo, приводящей к высвобождению внутриклеточных компонентов, так что иммунный ответ может стимулироваться против внутриклеточных компонентов. Такие механизмы упоминаются в данном документе как иммуногенная клеточная гибель и включают некроптоз и пироптоз. Соответственно, в одном варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК согласно раскрытию вводят субъекту, имеющему опухоль, в условиях, при которых происходит эндогенная иммуногенная клеточная гибель, так что высвобождается один или более эндогенных опухолевых антигенов, тем самым усиливая иммунный ответ против опухолевых антигенов. В одном варианте осуществления конструкт иммуностимуляторной мРНК вводят субъекту, имеющему опухоль, вместе со вторым конструктом мРНК, кодирующим «конструкт исполнительной мРНК», который стимулирует иммуногенную клеточную гибель опухолевых клеток у субъекта. Примеры конструктов исполнительной мРНК включают конструкты, кодирующие MLKL, RIPK3, RIPK1, DIABLO, FADD, GSDMD, каспазу-4, каспазу-5, каспазу-11, пирин, NLRP3 и ASC/PYCARD. Конструкты исполнительной мРНК и их применение в комбинации с конструктом иммуностимуляторной мРНК более подробно описаны в заявке США №62/412,933, полное содержание которой специально включено в данный документ посредством ссылки.
В одном варианте осуществления представляющий интерес антиген(ы) представляет собой патогенный антиген. В одном варианте осуществления антиген патогена содержит вирусный антиген. В одном варианте осуществления вирусный антиген представляет собой антиген вируса папилломы человека (HPV). В одном варианте осуществления антиген HPV представляет собой антиген E6 или E7. Неограничивающие примеры антигенов Е6 HPV включают антигены, содержащие аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 36-72. Неограничивающие примеры антигенов Е7 HPV включают антигены, содержащие аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 73-94. В других вариантах осуществления антиген HPV представляет собой белок E1, E2, E4, E5, L1 или L2 или его последовательность антигенного пептида. Подходящие антигены HPV описаны дополнительно в заявке PCT №PCT/US2016/058314, полное содержание которой специально включено в данный документ посредством ссылки. В другом варианте осуществления вирусный антиген представляет собой антиген вируса простого герпеса (HSV), такой как антиген HSV-1 или HSV-2. Например, вирусный антиген может представлять собой гликопротеин B, гликопротеин C, гликопротеин D, гликопротеин E, гликопротеин I, антиген ICP4 или ICP0 HSV (HSV-1 или HSV-2). Подходящие антигены HSV описаны дополнительно в заявке PCT №PCT/US2016/058314, полное содержание которой специально включено в данный документ посредством ссылки.
В одном варианте осуществления антиген патогена представляет собой бактериальный антиген. В одном варианте осуществления бактериальный антиген представляет собой поливалентный антиген (то есть антиген содержит множество антигенных эпитопов, таких как множество антигенных пептидов, содержащих разные эпитопы). В одном варианте осуществления бактериальный антиген представляет собой антиген Chlamydia, такой как антиген MOMP, OmpA, OmpL, OmpF или OprF. Подходящие антигены Chlamydia описаны дополнительно в заявке PCT №PCT/US2016/058314, полное содержание которой специально включено в данный документ посредством ссылки.
В одном варианте осуществления антиген патогена кодируется конструктом мРНК, которая также содержит иммуностимулятор (то есть также кодирует полипептид, который усиливает иммунный ответ против опухолевого антигена).
Конструкт мРНК, кодирующий представляющий интерес антиген(ы), обычно содержит, в дополнение к последовательностям, кодирующим антиген, другие структурные характеристики, как описано в данном документе для конструктов мРНК (например, модифицированные нуклеотидные основания, 5'-кэп, 5'-НТО, 3'-НТО, miR-связывающий сайт(ы), поли(А)-хвост, как описано в данном документе). Подходящие компоненты конструкта мРНК являются такими, как описано в данном документе.
Онковирусы
В одном варианте осуществления иммуностимуляторный конструкт используют для усиления иммунного ответа против одного или более антигенов из онкогенного вируса (онковируса). Вирусные инфекции являются причиной значительной части всех онкологических заболеваний человека. Было подсчитано, что примерно 12% всех случаев злокачественных новообразований человека во всем мире имеют вирусную этиологию (Parkin (2006) Int J Cancer 118:3030-3044). Термин «онковирус» относится к любому вирусу с ДНК- и/или РНК-геномом, способным вызывать рак, и может использоваться как синоним терминам «вирус опухоли» или «вирус рака». Международное агентство по изучению рака при Всемирной организации здравоохранения (IARC) признало семь онковирусов человека в качестве биологических канцерогенов группы 1, для которых имеются «достаточные данные, указывающие на наличие канцерогенности для людей», включая вирус гепатита B (HBV), вирус гепатита C (HCV), вирус Эпштейна-Барр (EBV), вирусы папилломы человека высокого риска (HPV), Т-лимфотропный вирус человека типа 1 (HTLV-1), вирус иммунодефицита человека (HIV) и герпесвирус саркомы Капоши (KSHV) (Bouvard et al., (2009) Lancet Oncol 10:321-322). Полиомавирус клеток Меркеля (MCV) представляет собой недавно открытый онковирус, который IARC классифицирует как биологический канцероген группы 2А (Feng et al., (2008) Science 319 (5866): 1096-1100).
Значительные достижения в области безопасности, эффективности и способности охватить экономически неблагополучные группы населения вакцинами против патогенных вирусов (например, полиомиелит, грипп) явились причиной разработки и внедрения стратегии профилактической и терапевтической вакцинации против онковирусов (Schiller and Lowy (2010) Ann Rev Microbiol 64:23-41). Соответственно, в одном аспекте иммуностимуляторный конструкт можно использовать для усиления иммунного ответа против одного или более представляющих интерес антигенов онкогенного вируса. Например, представляющий интерес антиген(ы) из онкогенного вируса может кодироваться химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК антигена могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена(ов) онкогенного вируса у субъекта Неограничивающие примеры онкогенных вирусов и их подходящих антигенов для применения в комбинации с иммуностимуляторным конструктом для усиления иммунного ответа против онкогенного вируса описаны ниже.
А. Папилломавирусы человека (HPV)
В одном варианте осуществления онковирусный антиген относится к вирусу папилломы человека (HPV). Рак шейки матки является четвертым наиболее распространенным во всем мире злокачественным заболеванием, поражающим женщин (Wakeham and Kavanagh (2014) Curr Oncol Rep 16(9):402). Инфекция вируса папилломы человека (HPV) связана почти со всеми случаями рака шейки матки и является причиной нескольких других видов рака, включая: рак полового члена, влагалища, вульвы, анального канала и ротоглотки (Forman et al., (2012) Vaccine 30 Suppl 5:F12-23; Maxwell et al., (2016) Annu Rev Med 67:91-101). На сегодняшний день было выявлено и секвенировано более 300 папилломавирусов, включая более 200 типов HPV, которые классифицированы в соответствии с их онкогенным потенциалом. Связь между развитием рака шейки матки и инфекцией типов HPV высокого риска хорошо известна и дает обоснование для анализа ДНК HPV во время скрининга шейки матки и для разработки профилактических вакцин (Egawa et al., (2015) Viruses 7(7):3863-3890). Среди типов HPV высокого риска HPV16 и HPV18 являются основными типами вируса папилломы, ответственными за около 70% случаев рака шейки матки (Walboomers et al., (1999) J Pathol 189 (1):12-19; Clifford et al., (2002) Bri J Cancer 88:63-73).
Идентификация HPV в качестве этиологического агента рака шейки матки и других злокачественных новообразований мочеполовой системы дала возможность снизить заболеваемость и смертность, вызванные HPV-ассоциированным раком, путем вакцинации и других терапевтических стратегий, направленных на инфекцию HPV (zur Hausen (2002) Nat Rev Cancer 2(5):342-350). Существуют профилактические вакцины против ВПЧ, нацеленные на основной капсидный белок L1 вирусной частицы HPV (Harper et al., (2010) Discov Med 10(50):7-17; Kash et al., (2015) J Clin Med 4(4):614-633). Эти вакцины не позволили неинфицированным людям заразиться HPV -инфекцией, также как предварительно инфицированным пациентам от повторного инфицирования. Однако доступные в настоящее время вакцины против HPV не способны лечить или устранять определенные HPV-инфекции и поражения, связанные с HPV (Ma et al., (2012) Expert Opin Emerg Drugs 17(4):469-492). Терапевтические вакцины против HPV представляют собой потенциальный подход к лечению существующих HPV-инфекций и связанных с ними заболеваний. В отличие от профилактических вакцин против HPV, которые могут генерировать нейтрализующие антитела против вирусных частиц, терапевтические вакцины против HPV могут стимулировать клеточные иммунные ответы для специфического нацеливания и уничтожения инфицированных клеток.
Хотя многие HPV-инфекции остаются бессимптомными и устраняются иммунной системой, могут развиться персистентные HPV-инфекции, которые в дальнейшем могут перерасти в внутриэпителиальную неоплазию шейки матки и/или карциному шейки матки низкой или высокой степени тяжести (Ostor (1993) Int J Gynecol pathol 12(2):186-192; Ghittoni et al., (2015) Ecancermedicalscience 9:526). Вирусная ДНК HPV интегрируется в геном хозяина при многих HPV -ассоциированных поражениях и злокачественных новообразованиях. Эта интеграция может привести к удалению ранних (E1, E2, E4 и E5) и поздних (L1 и L2) генов. Удаление L1 и L2 во время процесса интеграции исключает использование профилактических вакцин против HPV-ассоциированных злокачественных новообразований. Кроме того, Е2 является негативным регулятором для онкогенов Е6 и Е7 HPV. Удаление E2 во время интеграции приводит к увеличению экспрессии E6 и E7 и, как полагают, способствует HPV-ассоциированному канцерогенезу. Онкобелки E6 и E7 необходимы для инициации и поддержания HPV-ассоциированных злокачественных новообразований и экспрессируются в трансформированных клетках. Терапевтические вакцины против HPV, нацеленные на Е6 и Е7, могут обойти проблему иммунной толерантности к аутоантигенам, потому что эти кодируемые вирусом онкогенные белки являются чужеродными белками для человеческого организма. По этим причинам онкобелки Е6 и Е7 HPV служат идеальной мишенью для терапевтических вакцин против HPV.
Соответственно, в одном аспекте иммуностимуляторный конструкт можно использовать для усиления иммунного ответа против одного или более представляющих интерес антигенов HPV. Например, представляющий интерес антиген(ы) из HPV может быть закодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК антигена HPV могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена(ов) HPV у субъекта.
В некоторых вариантах осуществления РНК-вакцина (например, мРНК) (например, содержащая иммуностимуляторный конструкт и конструкт антигена HPV в одной и той же или разных мРНК) содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один полипептид антигена HPV или его иммуногенного фрагмента (например, иммуногенный фрагмент, способный индуцировать иммунный ответ на HPV). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид HPV выбирают из E1, E2, E4, E5, E6, E7, L1 и L2 и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид выбирают из E1, E2, E4, E5, E6 и E7. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид представляет собой E6, E7 или комбинацию E6 и E7. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид представляет собой L1, L2 или комбинацию L1 и L2.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один цитокин представляет собой L1. В некоторых вариантах осуществления белок L1 получают из серотипов HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 30, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 или 82.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид представляет собой L1, L2 или комбинацию L1 и L2 и E6, E7, или комбинацию E6 и E7.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид относится к штамму HPV: HPV 16-ого типа (HPV16), HPV 18-ого типа (HPV18), HPV 26-ого типа (HPV26), HPV 31-ого типа (HPV31), HPV 33-ого типа (HPV33), HPV 35-ого типа (HPV35), HPV 45-ого типа (HPV45), HPV 51-ого типа (HPV51), HPV 52-ого типа (HPV52), HPV 53-ого типа (HPV53), HPV 56-ого типа (HPV56), HPV 58-ого типа (HPV58), HPV 59-ого типа (HPV59), HPV 66-ого типа (HPV66), HPV 68-ого типа (HPV68), HPV 82-ого типа (HPV82) или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид относится к штамму HPV: HPV16, HPV18 или их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид относится к штамму HPV: HPV 6-ого типа (HPV6), HPV 11-ого типа (HPV11), HPV 13-ого типа (HPV13), HPV 40-ого типа (HPV40), HPV 42-ого типа (HPV42), HPV 43-ого типа (HPV43), HPV 44-ого типа (HPV44), HPV 54-ого типа (HPV54), HPV 61-ого типа (HPV61), HPV 70-ого типа (HPV70), HPV 72-ого типа (HPV72), HPV 81-ого типа (HPV81), HPV 89-ого типа (HPV89) или их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид относится к штамму HPV: HPV 30-ого типа (HPV30), HPV 34-ого типа (HPV34), HPV 55-ого типа (HPV55), HPV 62-ого типа (HPV62), HPV 64-ого типа (HPV64), HPV 67-ого типа (HPV67), HPV 69-ого типа (HPV69), HPV 71-ого типа (HPV71), HPV 73-ого типа (HPV73), HPV 74-ого типа (HPV74), HPV 83-ого типа (HPV83), HPV 84-ого типа (HPV84), HPV 85-ого типа (HPV85) или их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления вакцина содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один (например, один, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь) белок E1, E2 Е4, Е5, Е6, Е7, L1 и L2, полученный из HPV, или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления вакцина содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один (например, один, два, три, четыре, пять или шесть) полипептид, выбранный из белка E1, E2, E4, Е5, Е6 и Е7, полученный из HPV, или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления вакцина содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один полипептид, выбранный из белка Е6 и Е7, полученного из HPV, или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления вакцина содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, выбранный из белка L1 или L2, полученного из HPV, или их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который структурно модифицирует инфицированную клетку.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который образует часть или весь вирусный капсид HPV.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который способен к самосборке в вирусоподобные частицы.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который отвечает за связывание HPV с инфицируемой клеткой.
Некоторые варианты осуществления изобретения касаются способов лечения и/или предотвращения инфекции HPV у людей, где одна или более композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид HPV или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения HPV).
В некоторых вариантах осуществления раскрытие относится к способам лечения и/или предотвращения рака, возникающего и/или причинно связанного с инфекцией HPV. В некоторых вариантах осуществления раскрытие обеспечивает способ снижения инфекции HPV или по меньшей мере одного симптома, вызванного инфекцией HPV. В некоторых вариантах осуществления раскрытие обеспечивает способ снижения риска развития рака шейки матки, полового члена, влагалища, вульвы, анального канала или ротоглотки у субъекта. В каждом из этих способов одна или более из композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид HPV или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения HPV).
Необязательно, субъекту, нуждающемуся в лекарственном средстве, которое предотвращает и/или лечит инфекцию HPV, предоставляется лекарственное средство, содержащее иммуностимуляторный конструкт и одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих по меньшей мере один полипептид HPV или его иммуногенный фрагмент, чтобы вызвать иммунный ответ, направленный на HPV и/или на клетки субъекта, инфицированные HPV. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к снижению титра вируса HPV. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к продукции нейтрализующих анти-HPV антител. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к цитотоксическому T-клеточному ответу, направленному на клетки, инфицированные HPV.
B. Вирус гепатита В (HBV)
В одном варианте осуществления онковирусный антиген относится к вирусу гепатита B (HBV). Вирус гепатита В (HBV) представляет собой вирус, содержащий двухцепочечную ДНК, принадлежащий к семейству Hepadnaviridae. При заражении людей HBV вызывает заболевание гепатитом B. Помимо того, что оно вызывает гепатит, заражение HBV может привести к развитию цирроза и гепатоцеллюлярной карциноме. Соответственно, в другом аспекте иммуностимуляторный конструкт можно использовать для усиления иммунного ответа против одного или более представляющих интерес антигенов вируса гепатита B (HBV). Например, представляющий интерес антиген(ы) из HBV может быть закодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК антигена HBV могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена(ов) HBV у субъекта.
th
th
Геном HBV кодирует четыре перекрывающиеся открытые рамки считывания (то есть гены), обозначенные буквами S, C, P и X (Ganem et al., (2001) Fields Virology 4 ed.; Hollinger et al., (2001) Fields Virology 4 ed.). Ген S кодирует поверхностные белки вирусной оболочки, HBsAg (поверхностный антиген вируса гепатита В), и может быть структурно и функционально разделен на области пре-S1, пре-S2 и S. Существует три формы HBsAG: малая (S), средняя (M) и большая (L). Коровый или С-ген имеет прекоровые и коровые области. Множество кодонов инициации трансляции в рамке считывания являются особенностью генов S и C, которые дают родственные, но функционально отличные белки. Ген C кодирует или вирусный нуклеокапсидный HBcAg, или E-aнтиген гепатита B (HBeAg) в зависимости от того, инициируется ли трансляция из коровых или прекоровых областей, соответственно. Коровый белок самостоятельно собирается в капсидоподобную структуру. Прекоровая ОРС кодирует сигнальный пептид, который направляет продукт трансляции в эндоплазматический ретикулум инфицированной клетки, где белок дополнительно процессируется с образованием секретируемого HBeAg. Функция HBeAg в значительной степени не охарактеризована, хотя он вовлечен в иммунную толерантность, функция которой заключается в обеспечении персистентной инфекции (Milich and Liang (2003) Hepatology 38:1075-1086. Полимераза (pol) представляет собой большой белок из приблизительно 800 аминокислот и кодируется ОРС P. Pol функционально разделена на три домена: концевой белковый домен, который участвует в капсидировании и инициации синтеза минус-цепи; домен обратной транскриптазы (ОТ), который катализирует синтез генома; и домен рибонуклеазы H, который разрушает предгеномную РНК и облегчает репликацию. ОРС X HBV кодирует белок длиной 16,5 кДа (HBxAg) с множеством функций, включая сигнальную трансдукцию, транскрипционную активацию, репарацию ДНК и ингибирование деградации белка (Cross et al., (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:8078-8082; Bouchard and Schneider (2004) J Virol 78:12725-12734). Механизм этой активности и биологическая функция HBxAg в жизненном цикле вируса остаются в основном неизвестными. Однако хорошо известно, что HBxAg необходим для развития инфекции HBV in vivo и может способствовать онкогенному потенциалу HBV (Liang (2009) Hepatology 49 (Suppl S5):S13-S21).
Несмотря на наличие эффективной профилактической вакцины, более 240 миллионов человек остаются хронически инфицированными HBV, и более 500000 человек ежегодно умирают от заболеваний печени, вызванных хронической инфекцией (информационный бюллетень по гепатиту B FS204 Всемирной организации здравоохранения (2015)). Доступные в настоящее время варианты лечения инфекции HBV включают аналоги нуклеоз(т)идов и альфа-интерферон (ИФН-α). Однако эти способы лечения имеют несколько ограничений. Аналоги нуклеоз(т)идов эффективно подавляют репликацию вируса, но не устраняют инфекцию. После прекращения лечения аналогами нуклеоз(т)идов вирус быстро восстанавливается у инфицированного человека. Кроме того, длительное лечение противовирусными препаратами может привести к образованию устойчивых к лекарственным средствам мутантных вирусов. В отличие от аналогов нуклеоз(т)идов, ИФН-α, который обладает как противовирусной, так и иммуномодулирующей активностью, может давать более стойкие результаты у некоторых пациентов. Однако лечение ИФН-α часто ассоциируется с высокой частотой побочных эффектов, что делает его неоптимальным вариантом лечения. Таким образом, разработка новых эффективных способов лечения связанных с HBV инфекции и заболевания имеет важное значение. (Reynolds et al., (2015) J Virol 89(20):10407-10415).
+
+
R
Инфекция HBV и ее лечение обычно контролируются путем обнаружения вирусных антигенов и/или антител против антигенов. При заражении HBV первым обнаруживаемым антигеном является поверхностный антиген гепатита B (HBsAg), за которым следует антиген «e» гепатита B (HBeAg). Клиренс вируса выявляется появлением антител IgG в сыворотке против HBsAg и/или против корового антигена (HBcAg), также известный как сероконверсия. Многочисленные исследования демонстрируют, что на репликацию вируса, уровень виремии и прогрессирование до хронического состояния у HBV-инфицированных индивидуумов прямо и косвенно влияет HBV-специфический клеточный иммунитет, опосредованный CD4хелперными (T) и CD8цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ). Пациенты с прогрессирующим хроническим заболеванием имеют тенденцию иметь отсутствующие, более слабые или узко направленные HBV-специфические Т-клеточные ответы по сравнению с пациентами, которые устраняют острую инфекцию (см., например, Chisari, 1997, J Clin Invest 99: 1472- 1477; Maini et al, 1999, Gastroenterology 117: 1386-1396; Rehermann et al, 2005, Nat Rev Immunol 2005; 5:215-229; Thimme et al, 2001, J Virol 75: 3984-3987; Urbani et al, 2002, J Virol 76: 12423-12434; Wieland and Chisari, 2005, J Virol 79: 9369-9380; Webster et al, 2000, Hepatology 32: 1117-1124; Penna et al, 1996, J Clin Invest 98: 1185- 1194; Sprengers et al, 2006, J Hepatol 2006; 45: 182-189.)
В некоторых вариантах осуществления РНК-вакцина (например, мРНК) (например, содержащая иммуностимуляторный конструкт и конструкт антигена HBV в одной и той же или разных мРНК) содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один полипептид антигена HBV или его иммуногенного фрагмента (например, иммуногенный фрагмент, способный индуцировать иммунный ответ на HBV). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид HBV выбирают из HBsAg (S, M или L), HBcAg, HBeAg, HBxAg, Pol и их комбинаций.
Основываясь на межгрупповой дивергенции между секвенированными геномами, HBV был классифицирован филогенетически на 9 генотипов, A-I, с предполагаемым 10-м генотипом, J, выделенным из одного индивидуума. Генотипы HBV дополнительно подразделяют на по меньшей мере 35 субгенотипов. Различия в генотипе влияют на степень тяжести заболевания, течение заболевания и вероятность осложнений, ответ на лечение и, возможно, ответ на вакцинацию (Kramvis et al., (2005), Vaccine 23 (19): 2409-2423; Magnius and Norder, (1995), Intervirology 38 (1-2): 24-34).
Генотип A HBV дополнительно подразделяют на субгенотипы A1, A2, A4 и квази-субгенотип A3, последняя группа последовательностей не соответствует критериям классификации субгенотипов. Генотип B HBV дополнительно подразделяют на 6 субгенотипов B1, B2, B4-B6 и квази-субгенотип B3. Генотип C HBV, самый старый генотип HBV, дополнительно подразделяют на 16 субгенотипов C1-C16, что отражает продолжительную эндемичность в популяции людей. Генотип D HBV дополнительно подразделяют на 6 субгенотипов D1-D6. Генотип F HBV дополнительно подразделяют на 4 субгенотипа F1-F4. Генотип I дополнительно подразделяют на 2 субгенотипа I1 и I2. Кроме того, HBV классифицировали по серологии на 4 основных серотипа adr, adw, ayr и ayw на основе антигенных эпитопов, присутствующих в белках оболочки HBV (Kramvis (2014) Intervirology 57:141-150).
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид HBV относится к генотипу A HBV (например, любому из субгенотипов A1-A4), генотипу B HBV (например, любому из субгенотипов B1-B6), генотипу C HBV (например, любому из субгенотипов C1-C16), генотипу D HBV (например, любому из субгенотипов D1-D6), генотипу E HBV, генотипу F HBV (например, любому из субгенотипов F1-F4), генотипу G HBV или генотипу I HBV (например, любому из субгенотипов I1-I2).
Некоторые варианты осуществления изобретения касаются способов лечения и/или предотвращения инфекции HBV у людей, где одна или более композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид HBV или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения HBV).
В некоторых вариантах осуществления раскрытие относится к способам лечения и/или предотвращения рака, возникающего и/или причинно связанного с инфекцией HBV. В некоторых вариантах осуществления раскрытие обеспечивает способ снижения инфекции HBV или по меньшей мере одного симптома, вызванного инфекцией HBV. В некоторых вариантах осуществления раскрытие обеспечивает способ уменьшения повреждения печени у субъекта. В каждом из этих способов одна или более из композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид HBV или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения HBV).
Необязательно, субъекту, нуждающемуся в лекарственном средстве, которое предотвращает и/или лечит инфекцию HBV, предоставляется лекарственное средство, содержащее иммуностимуляторный конструкт и одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих по меньшей мере один полипептид HBV или его иммуногенный фрагмент, чтобы вызвать иммунный ответ, направленный на HBV и/или на клетки субъекта, инфицированные HBV. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к снижению титра вируса HBV. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к продукции нейтрализующих анти-HBV антител. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к цитотоксическому T-клеточному ответу, направленному на клетки, инфицированные HBV.
В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующая терапевтическая нуклеиновая кислота (например, матричная РНК, мРНК) содержит по меньшей мере один (например, мРНК) полинуклеотид, имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один антигенный полипептид HBV или его иммуногенный фрагмент (например, иммуногенный фрагмент способен вызывать иммунный ответ на HBV). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из HBsAg, HBcAg, HBeAg, HBxAg или Pol.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из предварительных и/или подтвержденных генотипов и/или субгенотипов HBV. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из предварительных или неопределенных генотипов или субгенотипов HBV.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который структурно модифицирует инфицированную клетку.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который образует часть или весь вирусный капсид HBV.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который способен к самосборке в вирусоподобные частицы.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который отвечает за связывание вируса HBV с инфицируемой клеткой.
C. Вирус гепатита С (HCV)
В одном варианте осуществления онковирусный антиген относится к вирусу гепатита C (HCV). Вирус гепатита С (HCV) представляет собой малый вирус c оболочкой, содержащий положительно-полярную одноцепочечную рибонуклеиновую кислоту, который вызывает гепатит С, вирусное инфекционное заболевание, поражающее в первую очередь печень. Соответственно, в другом аспекте иммуностимуляторный конструкт может быть использован для усиления иммунного ответа против одного или более представляющих интерес антигенов вируса гепатита С (HCV). Например, представляющий интерес антиген(ы) из HCV может быть закодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК антигена HCV могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена(ов) HCV у субъекта.
РНК-геном HCV кодирует большой полипротеин из 3010 аминокислот, который совместно посттрансляционно процессируется протеазами и пептидазами, кодируемыми клетками и вирусами, для получения зрелых структурных и неструктурных (NS) белков. Структурные белки HCV включают коровый белок (альтернативно C или p22) и два гликопротеина оболочки E1 и E2 (альтернативно gp35 и gp70, соответственно). Неструктурные (NS) белки включают NS1 (альтернативно p7), NS2 (альтернативно p23), NS3 (альтернативно p70), NS4A (альтернативно p8), NS4B (альтернативно p27), NS5A (альтернативно p56/58) и NS5B (альтернативно p68) (Ashfaq et al., (2011) Virol J 8:161).
На основании филогенетического анализа и секвенирования всех геномов вируса, варианты HCV в настоящее время подразделены на 7 отдельных генотипов и более 80 подтвержденных и предварительных подтипов (Smith et al., (2014) Hepatology 59(1):318-327). Международный комитет по таксономии вирусов (ICTV) поддерживает и регулярно обновляет таблицы эталонных изолятов, подтвержденных и предварительных подтипов, неопределенных изолятов HCV, номеров доступа и аннотированных выравниваний (http://talk.ictvonline.org/links/hcv/hcv-classification.htm). Подтипы HCV 1a, 1b, 2a и 3a считаются «эпидемическими подтипами», которые распространены по всему миру и составляют значительную часть случаев инфекций HCV в странах с высоким уровнем дохода. Считается, что эти подтипы быстро распространились за годы до открытия передачи HCV через зараженную кровь, препараты крови, внутривенное употребление наркотиков и другие пути (Smith et al., (2005) J Gen Virol 78(Pt2):321-328; Pybus et al., (2005) Infect Genet Evol 5:131-139; Magiorkinis et al., (2009) PLoS Med 6:e1000198). Другие подтипы HCV, которые считаются «эндемичными» штаммами, являются сравнительно редкими и распространяются в течение более длительных периодов времени в более ограниченных регионах. Эндемичные штаммы генотипов 1 и 2 в основном локализованы в Западной Африке, 3 в Южной Азии, 4 в Центральной Африке и на Ближнем Востоке, 5 в Южной Африке и 6 в Юго-Восточной Азии. (Simmonds (2001) J Gen Virol 82:693:712; Pybus et al., (2009) J Virol 83:1071-1082). На сегодняшний день зарегистрировано только одно заражение генотипом 7 (Murphy et al., (2007) J Clin Microbiol 45:1102-1112).
HCV естественным образом заражает только людей, хотя было показано, что шимпанзе подвержены экспериментальному заражению (Pfaender et al., (2014) Emerg Microbes Infect 3:e21). Хроническая вирусная инфекция, вызванная HCV, является основной причиной цирроза, заболеваний печени, портальной гипертензии, ухудшения функции печени и рака (например, гепатоцеллюлярная карцинома, ГЦК). (Webster et al., (2015) Lancet 385(9973):1124-1135). По оценкам, более 160-170 миллионов человек во всем мире страдают гепатитом С, что в конечном итоге приводит к смерти около 350000 человек в год (Zaltron et al., (2012) BMC Infect Dis 12(Suppl 2):S2; Lavanchy (2011) Clin Microbiol Infect 17:107-115). Во всем мире примерно четверть всех случаев цирроза и ГЦК связана с инфекцией HCV. Однако в областях с высокой эндемичностью HCV обычно составляет более 50% случаев ГЦК и цирроза печени (Perz et al., (2006) J Hepatol 45(4):529-538). Хронически инфицированные люди имеют более низкое качество жизни по сравнению с населением в целом (Bezemer et al., (2012) BMC Gastroenterol 12:11).
Переливание крови и компонентов крови ранее было основным путем передачи HCV до внедрения универсального скрининга (Zou et al., (2010) Transfusion 50(7):1495-1504). В настоящее время чрескожная передача посредством внутривенного употребления наркотиков является основным путем передачи в развитых странах (Cornberg et al., (2011) Liver Int 31(Suppl 2):30-60; Nelson et al., (2011) Lancet 378(9791:571-583). Социальные услуги, такие как программы обмена игл и шприцев (NSP) и опиоидная заместительная терапия (OST), могут эффективно снизить передачу HCV среди людей, употребляющих инъекционные наркотики (PWID), но этих подходов может быть недостаточно для снижения распространенности HCV до низких уровней (Turner et al., (2011) Addiction 106(11)1978-1988; Vikermann et al., (2012) Addiction 107(11):1984-1995). Совсем недавно были разработаны и использованы высокоэффективные противовирусные препараты прямого действия (DAA) для лечения инфекций HCV (например, боцепревир, телапревир, симепревир, софосбувир, ледипасвир, омбитасвир, паритапревир, ритонавир, дасабувир, даклатасвир, элбасвир, гразопревир, велпатасвир). Поскольку DAA может приводить к устойчивому вирусологическому ответу (УВО, альтернативно «вирусное излечение») у многих пациентов, эти препараты демонстрируют потенциал для подхода «лечение как профилактика» для снижения распространенности HCV (Smith-Palmer et al., (2015) BMC Infect Dis 15:19). Тем не менее, высокие финансовые затраты и проблемы, связанные с решениями о возмещении убытков, в отношении этих методов лечения, в настоящее время ограничивают их широкое применение (Martin et al., (2011) J Hepatol 54(6):1137-1144; Martin et al., (2012) Hepatology 55(1):49-57; Brennan and Shrank (2014) JAMA 312(6):593-594).
Вакцинация против HCV является альтернативной стратегией лечения и/или профилактики для снижения распространенности HCV. Ранние исследования вакцины против HCV у экспериментально инфицированных шимпанзе показали, что субъединичная вакцина, состоящая из гликопротеинов вирусной оболочки E1 (gp35) и E2 (gp72), выявила высокую эффективность гуморального ответа, которая эффективно контролировала и облегчала клиренс гомологичного вируса генотипа 1a HCV (Choo et al., (1994) Proc Nat Acad Sci USA 91(4):1294-1298). Исследования Фазы I, проведенные на людях, продемонстрировали, что вакцина, содержащая гликопротеины E1 и E2, вызывает широко реактивные нейтрализующие антитела (Law et al., (2013) PLoS ONE 8(3):e59776). Альтернативный подход к вакцинации, разработанный для генерации Т-клеточных ответов против HCV, также был протестирован в исследованиях Фазы 1 с участием людей и продемонстрировал высокую иммуногенность (Barnes et al., (2012) Sci Trans Med 4(115):115ra1). Эти исследования продемонстрировали, что как гуморальные, опосредованные антителами иммунные ответы, так и/или адаптивные, опосредованные Т-клетками ответы являются многообещающими подходами для разработки профилактической и/или терапевтической вакцины против HCV.
В некоторых вариантах осуществления РНК-вакцина (например, мРНК) (например, содержащая иммуностимуляторный конструкт и конструкт антигена HCV в одной и той же или разных мРНК) содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один полипептид антигена HCV или его иммуногенного фрагмента (например, иммуногенный фрагмент, способный индуцировать иммунный ответ на HCV). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид HCV выбирают из корового белка (C, p22), E1 (gp35), E2 (gp70), NS1 (p7), NS2 (p23), NS3 (p70), NS4A (p8), NS4B (p27), NS5A (p56/58), NS5B (p68) и их комбинации.
Некоторые варианты осуществления изобретения касаются способов лечения и/или предотвращения инфекции HCV у людей, где одна или более композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид HCV или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения HCV). Необязательно, субъекту, нуждающемуся в лекарственном средстве, которое предотвращает и/или лечит инфекцию HCV, предоставляется лекарственное средство, содержащее одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт и по меньшей мере один полипептид HCV или его иммуногенный фрагмент, чтобы вызвать иммунный ответ, направленный на HCV и/или на клетки субъекта, инфицированные HCV. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к снижению титра вируса HCV и/или установлению устойчивого вирусологического ответа. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к продукции нейтрализующих анти-HCV антител. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к цитотоксическому T-клеточному ответу, направленному на клетки, инфицированные HCV.
В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующая терапевтическая нуклеиновая кислота (например, матричная РНК, мРНК) содержит по меньшей мере один (например, мРНК) полинуклеотид, имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один антигенный полипептид HCV или его иммуногенный фрагмент (например, иммуногенный фрагмент способный вызывать иммунный ответ на HCV). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из корового белка (C, p22), E1 (gp35), E2 (gp70), NS1 (p7), NS2 (p23), NS3 (p70), NS4A (p8), NS4B (p27), NS5A (p56/58), NS5B (p68) и их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из подтвержденных генотипов и/или подтипов HCV 1, 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1g, 1h, 1i, 1j, 1k, 1l, 1m, 1n, 2, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2i, 2j, 2k, 2l, 2m, 2q, 2r, 2t, 2u, 3, 3a, 3b, 3d, 3e, 3g, 3h, 3i, 3k, 4, 4a, 4b, 4c, 4d, 4f, 4g, 4k, 4l, 4m, 4n, 4o, 4p, 4q, 4r, 4s, 4t, 4v, 4w, 5, 5a, 6, 6a, 6b, 6c, 6d, 6e, 6f, 6g, 6h, 6i, 6j, 6k, 6l, 6m, 6n, 6o, 6p, 6q, 6r, 6s, 6t, 6u, 6v, 6w, 6xa, 6xb, 6xc, 6xd, 6xe, 7 или 7a. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из предварительных генотипов и/или подтипов HCV 1f, 2g, 2h, 2n, 2o, 2p, 2s, 3c, 3f, 4e, 4h, 4i или 4j. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из предварительных или неопределенных изолятов HCV.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который структурно модифицирует инфицированную клетку.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который образует часть или весь вирусный капсид HCV.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который способен к самосборке в вирусоподобные частицы.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который отвечает за связывание HCV с инфицируемой клеткой.
D. Вирус Эпштейна-Барр (EBV)
В одном варианте осуществления онковирусный антиген относится к вирусу Эпштейна-Барр (EBV). Вирус Эпштейна-Барр (EBV), альтернативно вирус герпеса человека 4 типа (HHV-4), является этиологическим агентом инфекционного мононуклеоза и связан с большим количеством доброкачественных и злокачественных заболеваний, включая несколько видов рака человека (например, лимфома Ходжкина, неходжкинская лимфома, лимфома Беркитта, рак молочной железы, гепатоцеллюлярные карциномы, рак желудочно-кишечного тракта/желудка, посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание (PTLD), лимфома центральной нервной системы (ЦНС), рак носоглотки, рассеянный склероз, EBV-ассоциированные лимфомы, волосистая лейкоплакия полости рта, диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома, СПИД-ассоциированная лимфома) (Jha et al., (2016) Front Microbiol 7(1602) и ссылки в ней). EBV является чрезвычайно распространенным вирусом, инфицирующим>95% взрослого населения мира (Cohen (2000) N Engl J Med 343:481-492). Соответственно, в другом аспекте иммуностимуляторный конструкт может быть использован для усиления иммунного ответа против одного или более представляющих интерес антигенов вируса Эпштейна-Барр (EBV). Например, представляющий интерес антиген(ы) из EBV может быть закодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК антигена EBV могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена(ов) EBV у субъекта.
Геном EBV представляет собой молекулу линейной двухцепочечной ДНК (дцДНК) длиной примерно 172 т.п.н. Геном EBV обладает кодирующим потенциалом для примерно 80 вирусных белков, многие из которых остаются не охарактеризованными. Характерные гены EBV, включая соответствующие им генные продукты и предполагаемую функцию, если они известны, включают BKRF1 (EBNA1) [поддержание плазмиды, репликация ДНК, регуляция транскрипции], BYRF1 (EBNA2) [транс-активация], BLRF3/BERF1 (EBNA3A, альтернативно EBNA3) [регуляция транскрипции], BERF2a/b (EBNA3B, альтернативно EBNA4), BERF3/4 (EBNA3C, альтернативно EBNA6) [регуляция транскрипции], BWRF1 (EBNA-LP, альтернативно EBNA5) [транс-активация], BNLF1 (LMP1) [В-клеточная выживаемость, антиапоптоз], BNRF1 (LMP2A/B, альтернативно TP1/2) [поддержание латентности], BARF0 (A73, RPMS1), EBER1/2 (малые РНК) [регуляция врожденного иммунитета], BZLF1 (ZEBRA/Zta/EB1) [транс-активация, инициация литического цикла], BRLF1 [транс-активация, инициация литического цикла], BILF4 [транс-активация, инициация литического цикла], BMRF1 [транс-активация], BALF2 [связывание ДНК], BALF5 [ДНК-полимераза], BORF2 [субъединица рибонуклеотидредуктазы], BARF1 [субъединица рибонуклеотидредуктазы], BXLF1 [тимидинкиназа], BGLF5 [щелочная экзонуклеаза], BSLF1 [праймаза], BBLF4 [хеликаза], BKRF3 [урацил-ДНК-гликозилаза], BLLF1 (gp350/220) [главный гликопротеин оболочки], BXLF2 (gp85, альтернативно gH) [слияние оболочки вируса-хозяина], BKRF2 (gp25, альтернативно gL) [слияние оболочки вируса-хозяина], BZLF2 (gp42) [слияние оболочки вируса-хозяина, связывает ГКГС класса II], BALF4 (gp110, альтернативно gB), BDLF3 (gp100-150), BILF2 (gp55-78), BCRF1 [вирусный интерлейкин-10], и BHRF1 [вирусный аналог bcl-2] (Liebowitz and Kieff (1993) Epstein-Barr virus. In: The Human Herpesvirus. Roizman B, Whitley RJ, Lopez C, editors, New York, pp.107-172; Li et al., (1995) J Virol 69:3987-3994; Nolan and Morgan (1995) J Gen Virol 76:1381-1392; Thompson and Kurzrock (2004) Clin Cancer Res 10:803-821; Young and Murray (2003) Oncogene 22:5108-5121).
В некоторых вариантах осуществления РНК-вакцина (например, мРНК) (например, содержащая иммуностимуляторный конструкт и конструкт антигена EBV в одной и той же или разных мРНК) содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один полипептид антигена EBV или его иммуногенного фрагмента (например, иммуногенный фрагмент, способный индуцировать иммунный ответ на EBV). Любой из вышеупомянутых белков EBV можно использовать в качестве антигенного полипептида EBV. Иммуногенные белки EBV и их эпитопы были описаны в данной области техники (например, Rajcani J. et al. (2014) Recent Pat. Antiinfect. Drug Discover. 9:62-76). В некоторых вариантах осуществления антигенный полипептид EBV выбирают из группы, состоящей из BLLF1 (gp350/220), BZLF1/Zta, EBNA2, EBNA3, EBNA6, LMP1, LMP2A и их комбинаций.
Известно, что два основных типа EBV заражают людей: EBV-1 и EBV-2 (альтернативно известные как типы A и B или как штамм B95-8 и штамм AG876, соответственно). Два типа EBV различаются по последовательности генов, которые кодируют ядерные антигены EBV EBNA-2, EBNA-3A/3, EBNA-3B/4, и EBNA-3C/6 (Sample et al., (1990) J Virol 64:4084-4092; Dambaugh et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:7632-7636). В пределах двух основных типов EBV наблюдается значительное разнообразие штаммов EBV, выделенных из клинических образцов, что может играть роль в типе и степени тяжести заболевания. Первая полная последовательность генома EBV, B95-8, была опубликована в 1984 году (Baer et al., (1984) Nature 310:207-211). Сообщалось о последовательностях генома 22 дополнительных EBV (AG876, GD1, GD2, HKNPC1, Akata, Mutu, C666-1, M81, Raji, K4123-Mi и K4413-Mi), а также восьми последовательностей EBV, полученных из клинических образцов карциномы носоглотки, и три генома EBV, полученные в рамках проекта «1000 геномов» (Tsai et al., (2013) Cell Rep 5:458-470; Dolan et al., (2006) Virology 350-164-170; Palser et al., (2015) J Virol 89(10):5222-5237, а также приведенные там ссылки). В недавнем отчете были проанализированы геномные последовательности 71 нового генома EBV, включая первый геном EBV, секвенированный непосредственно из слюны. Эти новые геномные последовательности EBV были проанализированы в комбинации с 12 ранее опубликованными штаммами. Данный анализ продемонстрировал, что установленная генетическая карта генома EBV (NC_007605) является репрезентативной для изолятов EBV из разных географических мест и разных типов инфекции. Общепринятая классификация EBV типа 1 и типа 2 была пересмотрена в этом исследовании, и было установлено, что она остается основной формой вариации, в основном объясняемой вариациями в EBNA2 и EBNA3A, -B и -C (Palser et al., (2015) J Virol 89(10):5222-5237).
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид EBV относится к EBV-1 или EBV-2.
Некоторые варианты осуществления изобретения касаются способов лечения и/или предотвращения инфекции EBV у людей, где одна или более композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид EBV или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения EBV). Необязательно, субъекту, нуждающемуся в лекарственном средстве, которое предотвращает и/или лечит инфекцию EBV, предоставляется лекарственное средство, содержащее одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт и по меньшей мере один полипептид EBV или его иммуногенный фрагмент, чтобы вызвать иммунный ответ, направленный на EBV и/или на клетки субъекта, инфицированные EBV. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к снижению титра вируса EBV и/или установлению устойчивого вирусологического ответа. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к продукции нейтрализующих анти-EBV антител. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к цитотоксическому T-клеточному ответу, направленному на клетки, инфицированные EBV.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который структурно модифицирует инфицированную клетку.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который образует часть или весь вирусный капсид EBV.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который способен к самосборке в вирусоподобные частицы.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который отвечает за связывание EBV с инфицируемой клеткой.
E. Т-лимфотропный вирус человека типа 1 (HTLV-1)
В одном варианте осуществления онковирусный антиген относится к Т-лимфотропному вирусу человека типа 1 (HTLV-1). Человеческий Т-клеточный лимфотропный вирус типа 1 (HTLV-1, альтернативно Т-лимфотропный вирус человека или вирус Т-клеточной лимфомы человека) представляет собой ретровирус, способный вызывать персистентную инфекцию у людей. HTLV-1 инфицирует около 10-20 миллионов человек во всем мире, и хотя у большинства людей инфекция протекает бессимптомно, у 3% - 5% инфицированных людей развивается очень злокачественная и терапевтически некурабельная Т-клеточная лейкемия/лимфома взрослых (ATL) (Gessain et al., (2012) Front Microbiol 3:388; Taylor et al., (2005) Oncogene 24:6047-6057). Инфекция HTLV также причинно связана с несколькими воспалительными и иммуноопосредованными расстройствами, в первую очередь с HTLV-ассоциированной миелопатией/тропическим спастическим парапарезом (HAM/TSP). Приблизительно у 0,25% -3,8% людей, инфицированных HTLV-1, развивается HAM/TSP (Yamano and Sato (2012) Front Microbiol 3:389). Передача HTLV-1 человеком требует переноса инфицированных вирусом клеток посредством грудного вскармливания, полового акта, переливания компонентов крови, содержащих клетки, и совместного использования игл и/или шприцев (например, внутривенное употребление наркотиков). Соответственно, в другом аспекте иммуностимуляторный конструкт можно использовать для усиления иммунного ответа против одного или более представляющих интерес антигенов человеческого лимфотропного Т-клеточного вируса типа 1 (HTLV-1). Например, представляющий интерес антиген(ы) из HTLV-1 может быть закодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК антигена HTLV-1 могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена(ов) HTLV-1 у субъекта.
HTLV-1 представляет собой сложный ретровирус; в дополнение к стандартному репертуару структурных белков и ферментов, общих для всех ретровирусов (gag, pol, pro и env), 3'-область генома HTLV-1 (альтернативно называемой областью pX) кодирует вспомогательные гены tax, rex, p12, p21, p13, p30 и HBZ. Tax и HBZ незаменимы в онкогенном процессе ATL (Giam and Semmes (2016) Viruses 8(6):161). Подобно другим ретровирусам, после передачи вирусная обратная транскриптаза генерирует провирусную ДНК из геномной РНК вируса. Провирус интегрируется в геном хозяина с помощью вирусной интегразы. Впоследствии считается, что инфекция HTLV-1 распространяется только через делящиеся клетки с минимальным образованием частиц. Количественное определение провируса отражает количество клеток, инфицированных вирусом HTLV-1, что определяет провирусную нагрузку (Concalves et al., (2010) Clin Microbiol Rev 23(3):577-589).
В некоторых вариантах осуществления РНК-вакцина (например, мРНК) (например, содержащая иммуностимуляторный конструкт и конструкт антигена HTLV-1 в одной и той же или разных мРНК) содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один полипептид антигена HTLV-1 или его иммуногенного фрагмента (например, иммуногенный фрагмент, способный индуцировать иммунный ответ на HTLV-1). В некоторых вариантах осуществления антигенный полипептид HTLV-1 выбирают из группы, состоящей из gag, pol, pro, env, tax, rex, p12, p21, p13, p30, HBZ, и их комбинаций.
Некоторые варианты осуществления изобретения касаются способов лечения и/или предотвращения инфекции HTLV-1 у людей, где одна или более композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид HTLV-1 или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения HTLV-1). Необязательно, субъекту, нуждающемуся в лекарственном средстве, которое предотвращает и/или лечит инфекцию HTLV-1, предоставляется лекарственное средство, содержащее одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт и по меньшей мере один полипептид HTLV-1 или его иммуногенный фрагмент, чтобы вызвать иммунный ответ, направленный на HTLV-1 и/или на клетки субъекта, инфицированные HTLV-1. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к снижению титра вируса HTLV-1 и/или установлению устойчивого вирусологического ответа. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к продукции нейтрализующих анти-HTLV-1 антител. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к цитотоксическому T-клеточному ответу, направленному на клетки, инфицированные HTLV-1.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который структурно модифицирует инфицированную клетку.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который образует часть или весь вирусный капсид HTLV-1.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который способен к самосборке в вирусоподобные частицы.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который отвечает за связывание HTLV-1 с инфицируемой клеткой.
F. Герпесвирус саркомы Капоши (KSHV)
В другом варианте осуществления онковирусный антиген относится к герпесвирусу саркомы Капоши (KSHV). Герпесвирус, ассоциированный с саркомой Капоши (KSHV; альтернативно, человеческий герпесвирус-8, HHV-8) представляет собой γ-герпесвирус, содержащий двухцепочечную ДНК, принадлежащий роду Rhadinovirus из семейства Herpesviridae. KSHV является этиологическим агентом всех форм саркомы Капоши, рака, обычно встречающегося у пациентов со СПИДом, и причинно связан с первичной выпотной лимфомой (PEL; альтернативно лимфома полостей тела, BCBL), некоторыми типами многоочаговой болезни Кастлемана (MCD); альтернативно плазмобластной лимфомой, связанной с многоочаговой болезнью Кастлемана (MCD), и воспалительным цитокиновым синдромом, вызванным KSHV (KICS) (Chang et al., (1994) Science 266:1865-1869; Dupin et al., (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:4546-4551; Boshoff & Weiss (2002) Nat Rev Cancer 2(5):373-382; Yarchoan et al., (2005) Nat Clin Pract Oncol 2(8):406-415; Cesarman et al., (1995) N Engl J Med 332(18):1186-1191; Staudt et al., (2004) Cancer Res 64(14):4790-4799; Soulier et al., (1995) Blood 86:1276-1280; Uldrick et al., (2010) Clin Infect Dis 51:350-358)). Соответственно, в другом аспекте иммуностимуляторный конструкт может быть использован для усиления иммунного ответа против одного или более представляющих интерес антигенов герпесвируса саркомы Капоши (KSHV). Например, представляющий интерес антиген(ы) из KSHV может быть закодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК антигена KSHV могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена(ов) KSHV у субъекта.
Геном KSHV содержит молекулу дцДНК размером приблизительно 165 т.п.н. и демонстрирует высокую степень идентичности последовательностей среди вирусных штаммов и изолятов. Две основные области гена, K1/VIP (вариабельный иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив, кодируемый 5'-концом генома KSHV) и K15/LAMP (мембранный белок, ассоциированный с латентностью, кодируемый 3'-концом генома KSHV), расположенные на концевых областях вирусного генома, сильно изменчивы по сравнению с центральной геномной областью (Zong et al., (1999) J Virol 73:4156-4170; Poole et al., (1999) 73:6646-6660).
Изменчивость последовательности гена K1 привела к определению пяти основных подтипов KSHV (A, B, C, D и E), демонстрируя до 35% вариабельности на уровне аминокислот по вирусным штаммам. Секвенирование гена K15 привело к дополнительному разделению последовательностей KSHV с вариантами, обозначенными как аллели P, M или N, различающимися на уровне аминокислот до 70% (Hayward & Zong (2007) Curr Top Microbiol Immunol 312:1-42). Девять других вирусных геномных локусов (приблизительно 5,6% генома) содержат дополнительную вариабельность (T0,7/K12, K2, K3, ORF18/19, ORF26, K8, ORF73), а также два локуса в пределах областей гена ORF75, в пределах центральной, более консервативной области генома KSHV. На основании вариабельности K1/K15, классификации штаммов и вариабельности девяти ОРF известные геномы KSHV в настоящее время подразделены на 12 основных генотипов (Strahan et al., (2016) Viruses 8(4):92).
По существу, все случаи саркомы Капоши характеризуются KSHV, а для онкогенеза требуется постоянное присутствие KSHV. Геном KSHV обладает кодирующим потенциалом примерно для 90 белков, многие из которых, как известно, опосредуют репликацию вируса, взаимодействия вирус-хозяин, онкогенез, и подавление иммунного ответа и ускользание от иммунологического надзора (Dittmer & Damania (2013) Curr Opin Virol 3:238-244), и которые могут считаться потенциальными терапевтическими целями. Характерные гены KSHV, включая соответствующие им генные продукты и/или предполагаемую функцию, если они известны, включают ORFK1 (гликопротеин; сигнальный белок ITAM KSHV, KIS), ORF4 (контрольный белок комплемента Капоши, KCP; капошица), ORF6 (оцДНК-связывающий белок), ORF11 (дУТФаза-связанный белок, DURP), ORFK2 (вирусный гомолог интерлейкина-6, vIL6), ORF70 (тимидилатсинтаза), ORFK4 (vCCL-2, vMIP-II, MIP-1b), ORFK4.1 (vCCL-3, vMIP-III, BCK), ORFK5 (модулятор иммунного ответа 2, MIR-2; E3 убиквитинлигаза), ORFK6 (vCCL-1, vMIP-I, MIP-1a), PAN (экспрессия позднего гена), ORF16 (vBCL2, гомолог Bcl2), ORF17.5 (каркасный белок или белок сборки, SCAF), ORF18 (регуляция позднего гена), ORF34 (связывается с HIF-1α), ORF35 (требуется для эффективной реактивации литического вируса), ORF36 (вирусная серин/треонин-специфическая протеинкиназа), ORF37 (sox), ORF38 (белок суперкапсида), ORF39 (гликопротеин M, gM), ORF45 (белок суперкапсида; активатор RSK), ORF46 (урацил-дегликозилаза), ORF47 (гликопротеин L, gL), ORF50 (RTA), ORFK8 (k-bZIP; белок, ассоциированный с репликацией, RAP), ORF57 (экспорт/сплайсинг мРНК), ORF58, ORF59 (фактор процессивности), ORF60 (рибонуклеопротеинредуктаза), ORF61 (рибонуклеопротеинредуктаза), ORFK12 (капошин), ORF71 (vFLIP, ORFK13), ORF72 (vCyclin, vCYC), ORF73 (латентный ассоциированный ядерный антиген 1, LANA1), ORF8 (гликопротеин B, gB), ORF9 (ДНК-полимераза), ORF10 (регулятор функции интерферона), ORFK3 (модулятор иммунного ответа 1, MIR-1; E3 убиквитинлигаза), K5/6-AS, ORF17 (протеаза), ORF21 (тимидинкиназа), ORF22 (гликопротеин H, gH), ORF23 (спрогнозированный гликопротеин), ORF24 (важный для репликации), ORF25 (главный белок капсида, MCP), ORF26 (минорный белок капсида; триплексный компонент 2, TRI-2), ORF27 (гликопротеин), ORF28 (гомолог BDLF3 EBV), ORF29 (упаковка белка), ORF30 (регуляция позднего гена), ORF31 (ядерный и цитоплазматический), ORF32 (белок суперкапсида), ORF33 (белок суперкапсида), ORF40/41 (геликаза-праймаза), ORF42 (белок суперкапсида), ORF43 (портальный белок капсида), ORF44 (геликаза), ORF45.1, ORFK8.1A (гликопротеин, gp8.1A), ORFK8.1B (гликопротеин gp8.1B, ORF52 (белок суперкапсида), ORF53 (гликопротеин N, gN), ORF54 (дУТФаза/иммуномодулирующий), ORF55 (белок суперкапсида), ORF56 (репликация ДНК), ORFK9 (vIRF1), ORFK10 (vIRF4), ORFK10.5 (vIRF3, LANA2), ORFK11 (vIRF2), ORF62 (триплексный компонент 1, TRI-1), ORF65 (малый белок капсида; малый капсомер-взаимодействующий белок, SCIP), ORF66 (капсид), ORF67 (ядерный эгрессивный комплекс), ORF67.5, ORF68 (гликопротеин), ORF69 (ядерный эгрессивный BRLF2), ORFK14 (vOX2), ORF74 (vGPCR), ORF75 (FGARAT), ORF2 (дигидрофолатредуктаза), ORF7 (вирионный белок, vGPCR), ORF48, ORF49 (активирует JNK/p38), ORF63 (гомолог NLR), ORF64 (деубиквитиназа), ORFK15 (LMP1/2), и ORFK7 (вирусный ингибитор апоптоза, vIAP).
В некоторых вариантах осуществления РНК-вакцина (например, мРНК) (например, содержащая иммуностимуляторный конструкт и конструкт антигена KSHV в одной и той же или разных мРНК) содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один полипептид антигена KSHV или его иммуногенного фрагмента (например, иммуногенный фрагмент, способный индуцировать иммунный ответ на KSHV). Любой из вышеупомянутых белков KSHV можно использовать в качестве антигенного полипептида KSHV.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид KSHV относится к подтипу A KSHV, подтипу B KSHV, подтипу C KSHV, подтипу D KSHV или подтипу E KSHV.
Некоторые варианты осуществления изобретения касаются способов лечения и/или предотвращения инфекции KSHV у людей, где одна или более композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид KSHV или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения KSHV). Необязательно, субъекту, нуждающемуся в лекарственном средстве, которое предотвращает и/или лечит инфекцию KSHV, предоставляется лекарственное средство, содержащее одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт и по меньшей мере один полипептид KSHV или его иммуногенный фрагмент, чтобы вызвать иммунный ответ, направленный на KSHV и/или на клетки субъекта, инфицированные KSHV. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к снижению титра вируса KSHV и/или установлению устойчивого вирусологического ответа. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к продукции нейтрализующих анти-KSHV антител. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к цитотоксическому T-клеточному ответу, направленному на клетки, инфицированные KSHV.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который структурно модифицирует инфицированную клетку.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который образует часть или весь вирусный капсид KSHV.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который способен к самосборке в вирусоподобные частицы.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который отвечает за связывание KSHV с инфицируемой клеткой.
G. Полиомавирус клеток Меркеля (MCPyV)
В другом варианте осуществления онковирусный антиген относится к полиомавирусу клеток Меркеля (MCPyV). Полиомавирус клеток Меркеля (MCPyV) представляет собой, вирус без оболочки, содержащий двухцепочечную ДНК, из семейства Polyomaviridae и является этиологическим агентом карциномы из клеток Меркеля (MCC). MCC является редкой, но агрессивной формой рака кожи, связанной с пожилым возрастом, чрезмерным воздействием ультрафиолетового излучения, иммунодефицитными состояниями и наличием MCPyV. Приблизительно 1500 новых случаев MCC диагностируется в год в США, что представляет собой относительно редкий рак; однако, заболеваемость МСС за последние два десятилетия утроилась, и количество диагнозов продолжают увеличиваться на 5-10% ежегодно. Несмотря на свою редкость, MCC является одним из самых смертельных и агрессивных онкологических заболеваний кожи со смертностью более 30% (Agelli and Clegg (2003) J Am Acad Dermatol 49:832-841; Becker et al., (2009) Cell Mol Life Sci 66:1-8; Calder and Smoller (2010) Adv Anat Pathol 17:155-161; Hodgson, (2005) J Sur Oncol 89:1-4; Lemos and Nghiem, (2007) J Invest Dermatol 127:2100-2103). Соответственно, в другом аспекте иммуностимуляторный конструкт может быть использован для усиления иммунного ответа против одного или более представляющих интерес антигенов полиомавируса клеток Меркеля (MCPyV). Например, представляющий интерес антиген(ы) из MCPyV может быть закодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК антигена MCPyV могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против антигена(ов) MCPyV у субъекта.
MCC возникает из злокачественной трансформации клеток Меркеля (альтернативно клеток Меркеля-Ранвье или осязательных эпителиоцитов), которые являются механорецепторными клетками, участвующими в восприятии прикосновения и/или тактильном ощущении (Woo et al., (2016) Trends Cell Biol 25(2):74-81). MCPyV присутствует в 80% - 85% клинических образцов опухолей MCC (Feng et al., (2008) Science 319:1096-1100; Dalianis and Hirsch (2013) Virology 437:63-72, а также приведенные в них ссылки). MCPyV считается единственным полиомавирусом человека на сегодняшний день, вызывающим опухоли у его естественного хозяина (Arora et al., (2012) Curr. Opin. Virol 2:489-498; Spurgeon and Lambert (2013) Virology 435:118-130).
Вирусная ДНК MCPyV клонально интегрирована в 80%-85% опухолей MCC. Геном прототипного вируса (MCV350) представляет собой кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК, содержащую 5387 пар оснований. Секвенированные геномы всех штаммов MCPyV составляли в среднем ~ 5,4 тысяч пар нуклеотидов. Геном MCPyV содержит раннюю и позднюю кодирующие области, экспрессируемые в двух направлениях и разделенные некодирующей регуляторной областью, которая содержит точку начала репликации вируса. Ранняя область MCPyV (альтернативно «Т-антигенный локус») имеет размер приблизительно 3 т.п.н. и кодирует гены, которые экспрессируются первыми при заражении (Feng et al., (2011) PLoS ONE 6:e22468; Feng et al., (2008) Science 319:1096-1100; Neumann et al., (2011) PLoS ONE 6:e29112). Ранняя область MCPyV экспрессирует три T-антигена (белка): большой T-антиген (LT), малый T-антиген (sT) и T-антиген массой 57 кДа (57kT) (Shuda et al., (2009) Int J Cancer 125 (6):1243-9; Shuda et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105 (42):16272-7). В дополнение к трем Т-антигенам локус раннего гена MCPyV также кодирует четвертый белок, альтернативную открытую рамку считывания Т-антигена (ALTO). ALTO транскрибируется из 200-аминокислотной области MUR LT и, по-видимому, эволюционно связан со средним T-антигеном мышиного полиомавируса (Carter et al., (2013) Proc Natl Acad Sci USA 110:12744-12749).
Область позднего гена MCPyV кодирует открытые рамки считывания для основного капсидного белка - вирусный белок 1 (VP1), и минорных капсидных белков 2 и 3 (VP2 и VP3). Геном MCPyV экспрессирует 22-нуклеотидную вирусную миРНК (MCV-miR-M1-5p) из поздней цепи, которая, скорее всего, автоматически регулирует экспрессию ранних вирусных генов во время поздней фазы инфекции (Lee et al., (2011) J Clin Virol 52(3):272-5; Seo et al., (2009) Virology 383(2):183-7). Исследования подтверждают, что конститутивная экспрессия вирусных Т-антигенов необходима для вирус-индуцированной трансформации (Spurgeon and Lambert (2013) Virology 435 (1): 118-130, а также приведенные в них ссылки).
В некоторых вариантах осуществления РНК-вакцина (например, мРНК) (например, содержащая иммуностимуляторный конструкт и конструкт антигена MCPyV в одной и той же или разных мРНК) содержит по меньшей мере один полинуклеотид РНК (например, мРНК), имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один полипептид антигена MCPyV или его иммуногенного фрагмента (например, иммуногенный фрагмент, способный индуцировать иммунный ответ на MCPyV). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид MCPyV или его иммуногенный фрагмент выбирают из большого T-антигена (LT), малого T-антигена (sT), Т-антигена массой 57 кДа (57kT), альтернативного T-антигена (ALTO), основного капсидного белка - вирусный белок 1 (VP1), минорных капсидных вирусных белков 2 или 3 (VP2 или VP3) и их комбинаций.
Некоторые варианты осуществления изобретения касаются способов лечения и/или предотвращения инфекции MCPyV у людей, где одна или более композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид MCPyV или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения MCPyV).
В некоторых вариантах осуществления раскрытие относится к способам лечения и/или предотвращения рака, вызванного и/или причинно связанного с инфекцией MCPyV, при этом одна или более композиций, описанных в данном документе, которые содержат одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт, и по меньшей мере один полипептид MCPyV или его иммуногенный фрагмент, который был продемонстрирован или спрогнозирован специалистом в данной области техники для получения иммунного ответа, предоставляется нуждающемуся в этом субъекту (например, человеку, который инфицирован или подвержен риску заражения MCPyV).
Необязательно, субъекту, нуждающемуся в лекарственном средстве, которое предотвращает и/или лечит инфекцию MCPyV, предоставляется лекарственное средство, содержащее одну или более иммуномодулирующих терапевтических нуклеиновых кислот, кодирующих иммуностимуляторный конструкт и по меньшей мере один полипептид MCPyV или его иммуногенный фрагмент, чтобы вызвать иммунный ответ, направленный на MCPyV и/или на клетки субъекта, инфицированные MCPyV. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к снижению титра вируса MCPyV. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к продукции нейтрализующих анти-MCPyV антител. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ приводит к цитотоксическому T-клеточному ответу, направленному на клетки, инфицированные MCPyV.
В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующая терапевтическая нуклеиновая кислота (например, матричная РНК, мРНК) содержит по меньшей мере один (например, мРНК) полинуклеотид, имеющий открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере один антигенный полипептид MCPyV или его иммуногенный фрагмент (например, иммуногенный фрагмент способен вызывать иммунный ответ на MCPyV). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из большого T-антигена (LT), малого T-антигена (sT), T-антигена массой 57 кДа (57kT), альтернативного T-антигена (ALTO), основного капсидного белка - вирусный белок 1 (VP1), минорных капсидных вирусных белков 2 или 3 (VP2 или VP3) и их комбинаций.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из предварительных и/или подтвержденных генотипов и/или подтипов MCPyV (например, см. Martel-Jantin et al., (2014) J Clin Microbiol 52(5):1687-1690; Hashida et al., 2014 J. Gen. Virol. 95:135-141; Matsushita et al., (2014) Virus Genes 48:233-242; Baez et al., (2016) Virus Res 221:1-7, полное содержание которых включено в данный документ посредством ссылки).. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один антигенный полипептид или его иммуногенный фрагмент выбирают из неопределенных изолятов MCPyV.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который структурно модифицирует инфицированную клетку.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который образует часть или весь вирусный капсид MCPyV.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который способен к самосборке в вирусоподобные частицы.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полинуклеотид РНК кодирует антигенный полипептид, который отвечает за связывание вируса MCPyV с инфицируемой клеткой.
Персонализированные противораковые вакцины
В некоторых аспектах данное раскрытие обеспечивает персонализированную противораковую вакцину, содержащую один или более конструктов мРНК, причем один или более конструктов мРНК кодирует полипептид, который усиливает иммунный ответ (то есть иммуностимулятор) на представляющий интерес раковый антиген. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес раковый антиген кодируется или тем же самым, или отдельным конструктом мРНК. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес раковый антиген является специфическим для субъекта. Например, представляющий интерес раковый антиген (например, выбранный и/или сконструированный, как описано ниже) может быть закодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК ракового антигена могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против ракового антигена(ов) у субъекта. В данном документе описаны подходящие раковые антигены, включая персонализированные антигены, специфические для субъекта, страдающего раком, для применения с иммуностимуляторами.
Например, вакцина может включать мРНК, кодирующую один или более раковых антигенов, специфических для каждого субъекта, называемых неоэпитопами. Антигены, которые экспрессируются в опухолевых клетках или опухолевыми клетками, называются «опухолеассоциированными антигенами». Конкретный опухолеассоциированный антиген может или не может также экспрессироваться в нераковых клетках. Многие опухолевые мутации хорошо известны в данной области техники. Опухолеассоциированные антигены, которые не экспрессируются или редко экспрессируются в нераковых клетках или экспрессия которых в нераковых клетках достаточно снижена по сравнению с экспрессией в раковых клетках и которые вызывают иммунный ответ, индуцированный при вакцинации, называются неоэпитопами. Неоэпитопы являются полностью чужеродными для организма и, следовательно, не вызывают иммунного ответа против здоровых тканей и не маскируются защитными компонентами иммунной системы. В некоторых воплощениях желательны персонализированные вакцины на основе неоэпитопов, поскольку такие вакцинные композиции будут максимизировать специфичность в отношении конкретной опухоли пациента. Неоэпитопы, происходящие из мутаций, могут возникать в результате точечных мутаций, несинонимичных мутаций, приводящих к различным аминокислотам в белке; мутаций с прочитанным терминатором, в которых стоп-кодон модифицирован или удален, что приводит к трансляции более длинного белка с новой опухолеспецифической последовательностью на С-конце; мутаций сайта сплайсинга, которые приводят к включению интрона в зрелую мРНК и, таким образом, к уникальной опухолеспецифической последовательности белка; хромосомных перестроек, которые приводят к образованию химерного белка с опухолеспецифическими последовательностями на стыке 2 белков (например, слияние генов); мутаций или делеций со сдвигом рамки считывания, которые приводят к новой открытой рамке считывания с новой опухолеспецифической белковой последовательностью; и транслокаций.
Способы создания персонализированных противораковых вакцин обычно включают идентификацию мутаций, например, с использованием методов глубокого секвенирования нуклеиновых кислот или белков, идентификации неоэпитопов, например, с использованием утвержденных алгоритмов прогнозирования связывания пептид-ГКГС или других аналитических методов для создания набора кандидатных T-клеточных эпитопов, которые могут связываться с аллелями HLA пациента и основаны на мутациях, присутствующих в опухолях, необязательной демонстрации антигенспецифических Т-клеток против выбранных неоэпитопов или демонстрации того, что кандидат-неоэпитоп связан с белками HLA на поверхности опухоли, и разработку вакцины.
Примеры методов идентификации мутаций включают, но не ограничиваются ими, динамическую аллель-специфическую гибридизацию (DASH), микропланшетный диагональный электрофорез в геле (MADGE), пиросеквенирование, олигонуклеотид-специфическое лигирование, систему TaqMan, а также различные технологии ДНК-чипов, т.е. чипы Affymetrix SNP и методы, основанные на генерации малых сигнальных молекул путем инвазивного расщепления с последующей масс-спектрометрией или иммобилизацией замыкающими кольцо зондами и амплификацией по типу катящегося кольца.
Методы глубокого секвенирования нуклеиновых кислот или белков известны в данной области техники. Можно использовать любой метод секвенирования. Например, секвенирование нуклеиновой кислоты может быть выполнено для целых опухолевых геномов, опухолевых экзомов (ДНК, кодирующая белок) или опухолевых транскриптомов. Технологии одномолекулярного секвенирования в реальном времени путем синтеза основана на обнаружении флуоресцентных нуклеотидов, так как они включены в растущую цепь ДНК, которая дополняет секвенируемую матрицу. Существуют и другие методы быстрого высокопроизводительного секвенирования. Секвенирование белков может быть выполнено на опухолевых протеомах. Кроме того, масс-спектрометрия белков может быть использована для идентификации или подтверждения наличия мутированных пептидов, связанных с белками ГКГС, на опухолевых клетках. Пептиды могут быть элюированы кислотой из опухолевых клеток или из молекул HLA, которые иммунопреципитируют из опухоли, а затем идентифицируют с использованием масс-спектрометрии. Результаты секвенирования можно сравнить с известными контрольными наборами или с секвенированием, выполненным для нормальной ткани пациента.
В некоторых вариантах осуществления эти неоэпитопы связываются с белками HLA класса I с большей аффинностью, чем пептид дикого типа, и/или способны активировать противоопухолевые CD8 Т-клетки. Идентичные мутации в любом конкретном гене редко обнаруживаются в опухолях.
Белки ГКГС класса I присутствуют на поверхности практически всех клеток организма, включая большинство опухолевых клеток. Белки ГКГС класса I нагружены антигенами, которые обычно происходят из эндогенных белков или из патогенов, присутствующих в клетках, и затем представляются цитотоксическим Т-лимфоцитам (ЦТЛ). Т-клеточные рецепторы способны распознавать и связывать пептиды, образующие комплексы с молекулами ГКГС класса I. Каждый цитотоксический Т-лимфоцит экспрессирует уникальный Т-клеточный рецептор, который способен связывать специфические комплексы ГКГС/пептид.
Используя компьютерные алгоритмы, можно прогнозировать потенциальные неоэпитопы, такие как Т-клеточные эпитопы, то есть пептидные последовательности, которые связаны молекулами ГКГС класса I или класса II в форме пептид-презентирующего комплекса, и затем, в этой форме распознаются Т-клеточными рецепторами Т-лимфоцитов. Примеры программ, полезных для идентификации пептидов, которые будут связываться с ГКГС, включают, например: Lonza Epibase, SYFPEITHI (Rammensee et al., Immunogenetics, 50 (1999), 213-219) и HLA_BIND (Parker et al., J. Immunol., 152 (1994), 163-175).
Как только предполагаемые неоэпитопы выбраны, они могут быть дополнительно протестированы с использованием анализов in vitro и/или in vivo. Стандартные лабораторные анализы in vitro, такие как анализы методом иммуноферментных пятен, могут использоваться с изолятом от каждого пациента, чтобы уточнить перечень неоэпитопов, выбранных на основе алгоритма прогнозирования.
В некоторых вариантах осуществления противораковые мРНК-вакцины и способы вакцинации включают эпитопы или антигены, основанные на специфических мутациях (неоэпитопах) и экспрессируемых генами зародышевой линии рака (антигены, общие для опухолей, обнаруженных у множества пациентов, называемые в данном документе «традиционными раковыми антигенами» или «общими раковыми антигенами»). В некоторых вариантах осуществления традиционный антиген представляет собой тот, который, как известно, обнаруживается при онкологических заболеваниях или опухолях вообще, или при конкретном типе рака или опухоли. В некоторых вариантах осуществления традиционный раковый антиген представляет собой немутированный опухолевый антиген. В некоторых вариантах осуществления традиционный раковый антиген представляет собой мутированный опухолевый антиген.
В некоторых вариантах осуществления вакцины могут дополнительно содержать мРНК, кодирующую один или более немутированных опухолевых антигенов. В некоторых вариантах осуществления вакцины могут дополнительно содержать мРНК, кодирующую один или более мутированных опухолевых антигенов.
Многие опухолевые антигены известны в данной области техники. В некоторых вариантах раковый или опухолевый антиген является одним из следующих антигенов: CD2, CD19, CD20, CD22, CD27, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD47, CD52, CD56, CD70, CD79, CD137, 4- IBB, 5T4, AGS-5, AGS-16, ангиопоэтин 2, B7.1, B7.2, B7DC, B7H1, B7H2, B7H3, BT-062, BTLA, CAIX, раково-эмбриональный антиген, CTLA4, Cripto, ED-B, ErbBl, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFL7, EpCAM, EphA2, EphA3, EphB2, FAP, фибронектин, рецептор фолиевой кислоты, ганглиозид GM3, GD2, глюкокортикоид-индуцированный рецептор фактора некроза опухоли (GITR), gpl00, gpA33, GPNMB, ICOS, IGF1R, интегрин av, интегрин ανβ, LAG-3, антиген Ley, мезотелин, c-MET, мембранный антиген карбоангидраза IX, MUC1, MUC16, нектин-4, NKGD2, NOTCH, OX40, OX40L, PD-1, PDL1, PSCA, PSMA, RANKL, ROR1, ROR2, SLC44A4, синдекан-1, TACI, TAG-72, тенасцин, TIM3, TRAILRl, TRAILR2,VEGFR- 1, VEGFR-2, VEGFR-3, и их варианты.
Используемый в данном документе эпитоп, также известный как антигенная детерминанта, представляет собой часть антигена, который распознается иммунной системой в соответствующих условиях, в частности антителами, В-клетками или Т-клетками. Эпитопы включают В-клеточные эпитопы и Т-клеточные эпитопы. В-клеточные эпитопы представляют собой пептидные последовательности, которые необходимы для распознавания специфическими антителообразующими В-клетками. В-клеточные эпитопы относятся к определенной области антигена, которая распознается антителом. Часть антитела, которая связывается с эпитопом, называется паратопом. Эпитоп может представлять собой конформационный эпитоп или линейный эпитоп, основанный на структуре и взаимодействии с паратопом. Линейный или непрерывный эпитоп определяется первичной аминокислотной последовательностью определенной области белка. Последовательности, которые взаимодействуют с антителом, расположены рядом друг с другом последовательно на белке, и эпитоп обычно может быть имитирован одним пептидом. Конформационные эпитопы представляют собой эпитопы, которые определяются конформационной структурой нативного белка. Эти эпитопы могут быть непрерывными или прерывистыми, то есть компоненты эпитопа могут располагаться на различных частях белка, которые в структуре свернутого нативного белка располагаются близко друг к другу.
Т-клеточные эпитопы представляют собой пептидные последовательности, которые в ассоциации с белками на АПК, необходимы для распознавания специфическими Т-клетками. Т-клеточные эпитопы подвергаются процессингу внутри клеток и презентации на поверхности АПК, где они связаны с молекулами ГКГС, включая ГКГС класса II и MHC класса I.
В других аспектах противораковая вакцина согласно изобретению содержит мРНК-вакцину, кодирующую множество пептидных эпитопных антигенов, расположенных с одним или более перемежающимися универсальными Т-клеточными эпитопами типа II. Универсальные Т-клеточные эпитопы типа II включают, но не ограничиваются ими, ILMQYIKANSKFIGI (столбнячный токсин; SEQ ID NO: 226), FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE, (столбнячный токсин; SEQ ID NO: 227), QYIKANSKFIGITE (столбнячный токсин; SEQ ID NO: 228) QSIALSSLMVAQAIP (дифтерийный токсин; SEQ ID NO: 229), и AKFVAAWTLKAAA (пан DR эпитоп (PADRE); SEQ ID NO: 230). В некоторых вариантах осуществления мРНК-вакцина содержит один и тот же универсальный Т-клеточный эпитоп типа II. В других вариантах осуществления мРНК-вакцина содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 различных универсальных Т-клеточных эпитопов типа II. В некоторых вариантах осуществления один или более универсальный Т-клеточный эпитоп(-ов) типа II распределен между каждым раковым антигеном. В других вариантах осуществления один или более универсальный Т-клеточный эпитоп(ов) типа II находится между каждыми 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 100 раковыми антигенами.
Эпитопы могут быть идентифицированы с использованием бесплатной или коммерческой базы данных (например, Lonza Epibase, antitope). Такие инструменты полезны для прогнозирования наиболее иммуногенных эпитопов в целевом антигенном белке. Затем выбранные пептиды могут быть синтезированы и подвергнуты скринингу на панелях HLA человека, и наиболее иммуногенные последовательности могут быть использованы для конструирования мРНК, кодирующих антиген(ы). Одна стратегия картирования эпитопов цитотоксических Т-клеток основана на генерации эквимолярных смесей четырех С-концевых пептидов для каждого номинального 11-мерного белка в его пределах. Эта стратегия позволит получить антиген из библиотеки, который содержит все возможные активные эпитопы ЦТЛ.
Пептидный эпитоп может быть любой длины, приемлемой для эпитопа. В некоторых воплощениях пептидный эпитоп состоит из 9-30 аминокислот.В других вариантах осуществления длина составляет 9- 22, 9-29, 9-28, 9-27, 9-26, 9-25, 9-24, 9-23, 9-21, 9-20, 9-19, 9-18, 10-22, 10-21, 10-20, 11-22, 22-21, 11-20, 12-22, 12-21, 12-20,13-22, 13-21, 13-20, 14-19, 15-18, или 16-17 аминокислот.
Персонализированные противораковые вакцины содержат несколько эпитопов. В некоторых вариантах осуществления персонализированные противораковые вакцины кодируют 48-54 персонализированных раковых антигенов. В одном варианте осуществления персонализированные противораковые вакцины кодируют 52 персонализированных раковых антигена. В некоторых вариантах осуществления каждый из персонализированных раковых антигенов кодируется отдельной открытой рамкой считывания. В некоторых вариантах осуществления персонализированные противораковые вакцины состоят из 45 или более, 46 или более, 47 или более, 48 или более, 49 или более, 50 или более, 51 или более, 52 или более, 53 или более, 54 или более, или 55 или более антигенов. В других вариантах осуществления персонализированные противораковые вакцины состоят из 1000 или менее, 900 или менее, 500 или менее, 100 или менее, 75 или менее, 50 или менее, 40 или менее, 30 или менее, 20 или менее или 100 или менее эпитопов. В еще одних других вариантах осуществления персонализированные противораковые вакцины имеют 3-100, 5-100, 10-100, 15-100, 20-100, 25-100, 30-100, 35-100, 40-100, 45-100, 50-100, 55-100, 60-100, 65-100, 70-100, 75-100, 80-100, 90-100, 5-50, 10-50, 15-50, 20-50, 25-50, 30-50, 35-50, 40-50, 45-50, 100-150, 100-200, 100-300, 100-400, 100-500, 50-500, 50-800, 50-1000 или 100-1000 раковых антигенов.
В некоторых вариантах осуществления оптимальная длина пептидного эпитопа может быть получена с помощью следующей процедуры: синтезирования V5-метки конкатемер-тестируемого протеазного сайта, его введения в ДК (например, с использованием процедуры РНК-сжатия), лизиса клеток и затем выполнения вестерн-блоттинга против V5 для оценки расщепления в сайтах протеаз.
Способ сдавливания РНК представляет собой метод внутриклеточной доставки, с помощью которого различные вещества могут доставляться в широкий спектр живых клеток. Клетки подвергаются микрофлюидному конструированию, которое вызывает быструю механическую деформацию. Деформация приводит к временному разрушению мембраны и вновь образованным временным порам. Затем вещество пассивно диффундирует в цитозоль клетки через временные поры. Данный способ может быть использован для различных типов клеток, включая первичные фибробласты, эмбриональные стволовые клетки и множество иммунных клеток, и было показано, что он обладает относительно высокой эффективностью для большинства применений и не повреждает нестойкие вещества, такие как квантовые точки или белки, посредством своих воздействий. Sharei et al., PNAS (2013); 110(6):2082-7.
Неоэпитопы могут быть сконструированы так, чтобы оптимально связываться с ГКГС, чтобы стимулировать устойчивый иммунный ответ. В некоторых вариантах осуществления каждый пептидный эпитоп содержит антигенную область и область, стабилизирующую ГКГС.Область, стабилизирующая ГКГС, представляет собой последовательность, которая стабилизирует пептид в ГКГС.Область, стабилизирующая ГКГС, может иметь длину 5-10, 5-15, 8-10, 1-5, 3-7 или 3-8 аминокислот.В еще других вариантах осуществления антигенная область имеет длину 5-100 аминокислот.Пептиды взаимодействуют с молекулами ГКГС класса I путем конкурентного аффинного связывания в эндоплазматической сети, прежде чем они будут представлены на поверхности клетки. Аффинность отдельного пептида напрямую связана с его аминокислотной последовательностью и наличием специфических мотивов связывания в определенных положениях внутри аминокислотной последовательности. Представляемый пептид в ГКГС удерживается дном пептидсвязывающей полости в центральной области α1/α2 -гетеродимера (молекулы, состоящей из двух неидентичных субъединиц). Последовательность остатков дна пептидсвязывающей полости определяет, какие именно пептидные остатки он связывает.
Оптимальные области связывания могут быть идентифицированы с помощью компьютерного сравнения аффинности сайта связывания (карман ГКГС) для конкретной аминокислоты в каждой аминокислоте в сайте связывания для каждого из целевых эпитопов, чтобы идентифицировать идеальную связывающую область для всех исследованных антигенов. Области, стабилизирующие ГКГС, эпитопов могут быть идентифицированы с использованием матриц прогнозирования аминокислот точек данных для сайта связывания. Матрица прогнозирования аминокислот представляет собой таблицу, в которой первая и вторая оси определяют точки данных. Матрицы прогнозирования могут быть сгенерированы, как показано в Singh, H. and Raghava, G.P.S. (2001), “ProPred: prediction of HLA-DR binding sites.” Bioinformatics, 17(12), 1236-37).
В некоторых вариантах осуществления область, стабилизирующая ГКГС, разработана на основе конкретной ГКГС субъекта. Таким образом, область, стабилизирующая ГКГС, может быть оптимизирована для каждого пациента.
В некоторых случаях каждый эпитоп антигена может содержать область, стабилизирующую ГКГС. Все области, стабилизирующие ГКГС, внутри эпитопов могут быть одинаковыми или они могут быть разными. Области, стабилизирующие ГКГС, могут находиться в N-концевой части пептида или в C-концевой части пептида. Альтернативно, области, стабилизирующие ГКГС, могут находиться в центральной области пептида. Неоэпитопы в некоторых вариантах осуществления имеют длину 13 остатков или менее и обычно состоят из около 8-11 остатков, в частности, 9 или 10 остатков. В других вариантах осуществления неоэпитопы могут быть сконструированы так, чтобы быть более длинными. Например, неоэпитопы могут иметь удлинения в 2-5 аминокислот в направлении N- и C-конца каждого соответствующего генного продукта. Использование более длинного пептида может обеспечить эндогенный процессинг клетками пациента и может привести к более эффективной презентации антигена и индукции Т-клеточных ответов.
Неоэпитопы, выбранные для включения в вакцину, обычно будут пептидами с высокой аффинностью связывания. В некоторых аспектах неоэпитоп связывает белок HLA с большей аффинностью, чем пептид дикого типа. В некоторых вариантах осуществления неоэпитоп имеет ИК50 по меньшей мере менее 5000 нМ, по меньшей мере менее 500 нМ, по меньшей мере менее 250 нМ, по меньшей мере менее 200 нМ, по меньшей мере менее 150 нМ, по меньшей мере менее 100 нМ, по меньшей мере менее 50 нМ или менее. Как правило, пептиды с прогнозированной ИК50<50 нМ обычно рассматривают как пептиды со средней или высокой аффинностью связывания, и отбирают для проверки их аффинности эмпирическим путем с использованием биохимических анализов связывания HLA. Наконец, будет определено, может ли иммунная система человека создавать эффективные иммунные ответы против этих мутированных опухолевых антигенов и, таким образом, эффективно убивать опухоли, но не нормальные клетки.
Неоэпитопы, имеющие желаемую активность, могут быть модифицированы при необходимости, чтобы обеспечить определенные желаемые свойства, например, улучшенные фармакологические характеристики, в то же время увеличивая или по меньшей мере сохраняя практически всю биологическую активность немодифицированного пептида для связывания желаемой молекулы ГКГС и активации соответствующей Т-клетки или В-клетки. Например, неоэпитопы могут подвергаться различным изменениям, таким как замены, или консервативные, или неконсервативные, где такие изменения могут обеспечивать определенные преимущества при их использовании, такие как улучшенное связывание ГКГС.Под консервативными заменами подразумевается замена аминокислотного остатка другим, который биологически и/или химически сходен, например, один гидрофобный остаток на другой или один полярный остаток на другой. Замены включают комбинации, такие как Gly, Ala; Val, Ile, Leu, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; и Phe, Tyr. Эффект единичных аминокислотных замен также может быть исследован с использованием D-аминокислот. Такие модификации могут быть сделаны с использованием хорошо известных способов синтеза пептидов, как описано, например, в Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany & Merrifield, The Peptides, Gross & Meienhofer, eds. (N.Y., Academic Press), pp.1-284 (1979); и Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, Ill., Pierce), 2d Ed. (1984).
Неоэпитопы также можно модифицировать путем увеличения или уменьшения аминокислотной последовательности соединения, например путем добавления или удаления аминокислот.Пептиды, полипептиды или аналоги также могут быть модифицированы путем изменения порядка или состава определенных остатков, при этом легко понять, что определенные аминокислотные остатки, необходимые для биологической активности, например, остатки в критических контактирующих сайтах или консервативные остатки, обычно не могут быть изменены без вредного влияния на биологическую активность.
Как правило, для определения влияния электростатического заряда, гидрофобности и т.д. на связывание используют серию пептидов с единичными аминокислотными заменами. Например, для определения различных паттернов чувствительности к различным молекулам ГКГС и рецепторам Т-клеток или В-клеток по длине пептида делают ряд замен положительно заряженных (например, Lys или Arg) или отрицательно заряженных (например, Glu) аминокислот.Кроме того, может быть сделано множество замен с использованием небольших относительно нейтральных фрагментов, таких как Ala, Gly, Pro или подобных остатков. Замены могут быть гомоолигомерами или гетероолигомерами. Количество и типы остатков, которые замещаются или добавляются, зависят от необходимого расстояния между основными точками контакта и определенными требуемыми функциональными характеристиками (например, гидрофобность в противовес гидрофильности). С помощью таких замен можно также повысить аффинность связывания с молекулой ГКГС или Т-клеточным рецептором по сравнению с аффинностью исходного пептида. В любом случае в таких заменах должны использоваться аминокислотные остатки или другие молекулярные фрагменты, выбранные таким образом, чтобы избежать, например, стерических помех и влияния заряда, которые могут нарушить связывание.
Неоэпитопы также могут содержать изостеры двух или более остатков в неоэпитопах. Как определено в данном документе изостер представляет собой последовательность из двух или более остатков, которые могут быть заменены второй последовательностью, поскольку стерическая конформация первой последовательности соответствует сайту связывания, специфическому для второй последовательности. Данный термин, в частности, включает модификации пептидного остова, хорошо известные специалистам в данной области техники. Такие модификации включают модификации амидного азота, альфа-углеродного атома, амидного карбонила, полную замену амидной связи, удлинения, делеции или сшивки остова. См., в общем, Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol.VII (Weinstein ed., 1983).
Анализ иммуногенности является важной частью при выборе оптимальных неоэпитопов для включения в вакцину. Иммуногенность может быть оценена, например, путем анализа ГКГС-связывающей способности неоэпитопа, разнородности HLA, положения мутации, прогнозируемой реактивности T-клеток, фактической реактивности T-клеток, структуры, приводящей к определенным конформациям и получающимся в результате воздействия растворителя, и представления специфических аминокислот. Известные алгоритмы, такие как алгоритм прогнозирования NetMHC, можно использовать для прогнозирования способности пептида связываться с общими аллелями HLA-A и -B. Структурную оценку пептида, связанного с ГКГС, также можно проводить с помощью программ для 3-мерного анализа in silico и/или для стыковки белков. Использование спрогнозированной структуры эпитопа при связывании с молекулой ГКГС, например, полученной при помощи алгоритма Rosetta, можно использовать для оценки степени воздействия растворителя аминокислотных остатков эпитопа, когда эпитоп связан с молекулой ГКГС. Реактивность Т-клеток может быть оценена экспериментально с использованием эпитопов и Т-клеток in vitro. Альтернативно, реактивность Т-клеток может быть оценена с использованием наборов данных Т-клеточный ответ/последовательность.
Важным компонентом неоэпитопа, включенного в вакцину, является отсутствие аутореактивности. Предполагаемые неоэпитопы могут быть подвергнуты скринингу для подтверждения того, что эпитоп ограничен опухолевой тканью, например, возникающей в результате генетических изменений в злокачественных клетках. Предпочтительно, эпитоп не должен присутствовать в нормальной ткани пациента, и, следовательно, подобные эпитопы отфильтровываются из набора данных.
В других аспектах раскрытие обеспечивает способ получения противораковой мРНК-вакцины путем выделения образца у субъекта, идентификации множества раковых антигенов в образце, определения Т-клеточных эпитопов из множества раковых антигенов, приготовления противораковой мРНК-вакцины, имеющей открытую рамку считывания, кодирующую антиген и полипептид, который усиливает иммунный ответ на антиген, при этом антиген содержит по меньшей мере один из Т-клеточных эпитопов. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает определение силы связывания Т-клеточных эпитопов с ГКГС субъекта. В других вариантах осуществления способ дополнительно включает определение поверхности Т-клеточного рецептора (поверхность TCR) для каждого эпитопа и выбор эпитопов, имеющих поверхность TCR с низким сходством с эндогенными белками. Т-клеточные эпитопы могут быть оптимизированы для обеспечения силы связывания с ГКГС субъекта. В некоторых вариантах осуществления поверхность TCR для каждого эпитопа имеет низкое сходство с эндогенными белками.
Например, технология, называемая JanusMatrix (Epivax), которая исследует перекрестно-реактивные Т-клеточные эпитопы как с HLA-связывающей, так и с обращенной к TCR сторонам, позволяющая проводить сравнения между различными большими базами данных геномных последовательностей, может быть использована для идентификации эпитопов, имеющих предпочтительную поверхность к TCR и силу связывания с ГКГС. Набор алгоритмов может использоваться отдельно или вместе с JanusMatrix для оптимизации выбора эпитопа. Например, EpiMatrix использует перекрывающиеся 9-мерные рамки, полученные из консервативных последовательностей целевого белка, и оценивает их по потенциальной аффинности связывания с панелью аллелей HLA класса I или класса II; каждый анализ рамка-в-аллеле, которое имеет высокие оценки и, по прогнозам, будет связываться, представляет собой предполагаемый Т-клеточный эпитоп. ClustiMer получает выходные данные EpiMatrix и идентифицирует кластеры из 9-меров, которые содержат большое количество предполагаемых Т-клеточных эпитопов. BlastiMer автоматизирует процесс отправки ранее идентифицированных последовательностей в BLAST, чтобы определить, имеют ли они сходство с геномом человека; любые подобные сходные последовательности могут быть допущены или могут вызвать нежелательный аутоиммунный ответ.EpiAssembler использует консервативные иммуногенные последовательности, идентифицированные Conservatrix и EpiMatrix, и объединяет их вместе для формирования высокоиммуногенных консенсусных последовательностей. JanusMatrix может использоваться для скрининга последовательностей, которые могут потенциально вызывать нежелательный аутоиммунный или ответ регуляторных Т-клеток из-за гомологии с последовательностями, кодируемыми геномом человека. VaccineCAD может быть использован для связывания эпитопов-кандидатов в структуру в виде «бус на нитке» при минимизации неспецифических соединительных эпитопов, которые могут быть созданы в процессе связывания.
Способы получения персонализированных противораковых вакцин в соответствии с раскрытием включают идентификацию мутаций с использованием таких методов, как методы глубокого секвенирования нуклеиновых кислот или белков, как описано в данном документе, для образцов ткани. В некоторых вариантах осуществления выполняется первоначальная идентификация мутаций в транскриптоме пациента. Данные из транскриптома пациента сравнивают с информацией о последовательностях из экзома пациента для идентификации специфических для пациента и специфических для опухоли мутаций, которые экспрессируются. Сравнение обеспечивает набор предполагаемых неоэпитопов, называемых мутаномом. Мутаном может включать приблизительно 100-10000 мутаций-кандидатов на пациентов. Мутаном подвергается тщательному анализу данных с использованием набора запросов или алгоритмов для определения оптимального набора мутаций для генерации неоантигенной вакцины. В некоторых вариантах осуществления мРНК-вакцина на основе неоантигенов разрабатывают и изготавливают.Затем пациента лечат с использованием вакцины.
В некоторых вариантах осуществления весь способ от начала процесса идентификации мутации до начала лечения пациента выполняют менее чем за 2 месяца. В других вариантах осуществления весь процесс осуществляют за 7 недель или менее, 6 недель или менее, 5 недель или менее, 4 недели или менее, 3 недели или менее, 2 недели или менее, или менее 1 недели. В некоторых вариантах осуществления весь способ выполняют менее чем за 30 суток.
Процесс идентификации мутации может включать анализ транскриптома и экзома или только анализ транскриптома или экзома. В некоторых вариантах осуществления анализ транскриптома выполняют первым, а анализ экзома выполняют вторым. Анализ проводят на биологическом образце или образце ткани. В некоторых вариантах осуществления биологический образец или образец ткани представляет собой образец крови или сыворотки. В других вариантах осуществления образец представляет собой образец тканей из банка или трансформацию B-клеток с использованием EBV.
После синтеза мРНК-вакцины, ее вводят пациенту. В некоторых вариантах осуществления вакцину вводят по графику в течение периода длительностью до двух месяцев, до трех месяцев, до четырех месяцев, до пяти месяцев, до шести месяцев, до семи месяцев, до восьми месяцев, до девяти месяцев. до десяти месяцев, до одиннадцати месяцев, до 1 года, до 1½ лет, до двух лет, до трех лет или до четырех лет. График может быть одинаковым или может изменяться. В некоторых вариантах осуществления график составляется еженедельно в течение первых 3 недель, а затем ежемесячно.
В любой момент лечения пациент может быть обследован для определения того, являются ли мутации в вакцине по-прежнему целесообразными. На основании этого анализа вакцина может быть скорректирована или изменена для включения одной или более различных мутаций или для удаления одной или более мутаций.
Было признано и оценено, что путем анализа определенных свойств мутаций, связанных с раком, можно оценить и/или отобрать оптимальные неоэпитопы для включения в мРНК-вакцину. Свойство неоэпитопа или набора неоэпитопов может включать, например, оценку экспрессии на уровне гена или транскрипта у пациента при помощи РНК-секвенирования или другого анализа нуклеиновых кислот, тканеспецифическую экспрессию в доступных базах данных, известных антионкогенов/онкосупрессоров, вариант оценки достоверности стимуляции, аллель-специфическую экспрессию RNA-seq, консервативное или неконсервативное замещение AA, положение точечной мутации (оценка центрирования в отношении увеличения вовлечения TCR), положение точечной мутации (оценка закрепления в отношении дифференциального связывания HLA), а именно:<100% гомологии основного эпитопа с данными WES пациента, ИК50 для 8-мерного -11-мерного HLA-A и -B, ИК50 для 15-мерных -20-мерных HLA-DRB1, показатель разнородности (т.е. число HLA пациентов, для которых прогнозируется связывание), ИК50 для 8-мерных-11-мерных HLA-C, ИК50 для 15-мерных-20-мерных HLA-DRB3-5, ИК50 для 15-мерных-20-мерных HLA-DQB1/A1, ИК50 для 15-мерных-20-мерных HLA-DPB1/A1, соотношение между классом I и классом II, разнообразие пациентов HLA-A охваченные аллотипы -B и DRB1, доля точечной мутации в сравнении со сложными эпитопами (например, сдвигом рамки считывания) и/или показателями связывания псевдоэпитопа HLA.
В некоторых вариантах осуществления свойства ассоциированных с раком мутаций, используемых для идентификации оптимальных неоэпитопов, представляют собой свойства, связанные с типом мутации, количеством мутаций в образце пациента, иммуногенностью, отсутствием аутореактивности и природой пептидной композиции.
Тип мутации должен быть определен и рассмотрен как фактор, определяющий, должен ли предполагаемый эпитоп быть включен в вакцину. Тип мутации может варьироваться. В некоторых случаях может быть желательно включить несколько разных типов мутаций в одну вакцину. В других случаях один тип мутации может быть более желательным. Значение для конкретной мутации может быть оценено и рассчитано.
Обилие мутаций в образце пациента также может учитываться и приниматься во внимание при принятии решения о том, следует ли включать предполагаемый эпитоп в вакцину. Многочисленные мутации могут способствовать более устойчивому иммунному ответу.
В некоторых вариантах осуществления персонализированные противораковые мРНК-вакцины, описанные в данном документе, могут использоваться для лечения рака.
Противораковые мРНК-вакцины могут вводиться профилактически или терапевтически как часть схемы активной иммунизации здоровым людям или на ранней или поздней стадиях рака и/или на стадии метастатического рака. В одном варианте осуществления эффективное количество противораковой мРНК-вакцины, предоставленной клетке, ткани или субъекту, может быть достаточным для иммунной активации и, в частности, антигенспецифической иммунной активации.
В некоторых вариантах осуществления противораковая мРНК-вакцина может вводиться с противораковым терапевтическим средством, включая, но не ограничиваясь этим, традиционную противораковую вакцину. Противораковая мРНК-вакцина и противораковое терапевтическое средство можно комбинировать для дальнейшего усиления иммунотерапевтических ответов. Противораковая мРНК-вакцина и другое терапевтическое средство могут вводиться одновременно или последовательно. В тех случаях, когда другие терапевтические агенты вводят одновременно, их могут вводить в тех же или разных составах, тем не менее вводят в одно и то же время. Другие терапевтические агенты вводят последовательно друг с другом и с противораковой мРНК-вакциной, если введение других терапевтических агентов и противораковой мРНК-вакцины временно разделено. Разделение во времени между введением этих соединений может занимать считанные минуты или может быть более длительным, например, часы, дни, недели, месяцы. Другие терапевтические агенты включают, но не ограничиваются ими, противораковое терапевтическое средство, адъюванты, цитокины, антитела, антигены и т.д.
В другом варианте осуществления пептидные эпитопы находятся в форме конкатемерного ракового антигена, состоящего из 2-100 пептидных эпитопов. В некоторых вариантах осуществления конкатемерный раковый антиген содержит одно или более из: a) 2-100 пептидных эпитопов, перемежающихся сайтами, чувствительными к расщеплению; b) мРНК, кодирующую каждый пептидный эпитоп, связанную непосредственно друг с другом без линкера; c) мРНК, кодирующую каждый пептидный эпитоп, связанную с одним или другим с помощью одного нуклеотидного линкера; d) каждый пептидный эпитоп, содержащий 25-35 аминокислот и включающий центрально расположенную SNP-мутацию; e) по меньшей мере 30% пептидных эпитопов, имеющих самую высокую аффинность к молекулам ГКГС класса I от субъекта; f) по меньшей мере 30% пептидных эпитопов, имеющих самую высокую аффинность к молекулам ГКГС класса II от субъекта; g) по меньшей мере 50% пептидных эпитопов, имеющих заявленную аффинность связывания ИК>500 нМ для HLA-A, HLA-B и/или DRB1; h) мРНК, кодирующую 45-55 пептидных эпитопов; i) мРНК, кодирующую 52 пептидных эпитопов j) 50% пептидных эпитопов, имеющих аффинность связывания для ГКГС класса I, и 50% пептидных эпитопов, имеющих аффинность связывания для ГКГС класса II; k) мРНК, кодирующую пептидные эпитопы, расположенную таким образом, что пептидные эпитопы упорядочиваются для минимизации псевдоэпитопов l) по меньшей мере 30% пептидных эпитопов, являющихся пептидами, связывающими ГКГК класса I длиной 15 аминокислот; и/или m) по меньшей мере 30% пептидных эпитопов, являющихся пептидами, связывающими ГКГС класса II длиной 21 аминокислота.
Бактериальные вакцины
В некоторых аспектах данное раскрытие обеспечивает бактериальную вакцину, содержащую один или более конструктов мРНК, причем один или более конструктов мРНК кодирует полипептид, который усиливает иммунный ответ (то есть иммуностимулятор) на представляющий интерес бактериальный антиген. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес бактериальный антиген кодируется тем же или отдельным конструктом мРНК. В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина содержит один или более конструктов мРНК, кодирующих полипептид, который усиливает иммунный ответ, и один или более конструктов мРНК, кодирующих по меньшей мере один представляющий интерес бактериальный антиген. Например, представляющий интерес бактериальный антиген может быть закодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК бактериального антигена могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против ракового антигена у субъекта. В данном документе описаны подходящие бактериальные антигены для применения с иммуностимуляторами.
В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина является профилактической (то есть предотвращает инфекцию). В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина является терапевтической (то есть лечит инфекцию). В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина индуцирует гуморальный иммунный ответ (то есть продукцию антител, специфических к представляющему интерес бактериальному антигену). В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина индуцирует адаптивный иммунный ответ.Адаптивный иммунный ответ возникает в ответ на столкновение с антигеном или иммуногеном, где иммунный ответ специфичен для антигенных детерминант антиген/иммуноген. Примерами адаптивных иммунных ответов являются индукция продукции антигенспецифических антител или антигенспецифическая индукция/активация Т-хелперных лимфоцитов или цитотоксических лимфоцитов.
В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина индуцирует защитный адаптивный иммунный ответ, причем у субъекта индуцируется антигенспецифический иммунный ответ как реакция на иммунизацию (искусственную или естественную) антигеном, при этом иммунный ответ способен защитить субъект против последующих проблем с антигеном или связанным с патологией агентом, который содержит антиген.
В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе бактериальная вакцина используется для лечения инфекции, вызванной Staphylococcus aureus. В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина, описанная в данном документе, используется для лечения инфекции устойчивым к антибиотикам Staphylococcus aureus. В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина, описанная в данном документе, используется для лечения инфекции, вызванной метициллин-резистентной Staphylococcus aureus (MRSA).
Нозокомиальные инфекции являются одной из наиболее распространенных и дорогостоящих проблем для системы здравоохранения США, причем S. aureus является второй по значимости причиной таких инфекций. MRSA ответственна за 40-50% всех нозокомиальных инфекций S. aureus. Кроме того, недавние исследования демонстрируют, что S. aureus также является основным медиатором эндопротезной инфекции. Одним из наиболее важных механизмов, используемых S. aureus для подавления иммунного ответа хозяина и развития ее в персистентную инфекцию, является образование хорошо сформированной биопленки. Биопленка представляет собой микробное сообщество, в котором бактериальные клетки прикреплены к гидратированной поверхности и встроены в полисахаридную матрицу. Бактерии в биопленке проявляют измененный фенотип в своем росте, экспрессии генов и продукции белка.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления бактериальные вакцины, описанные в данном документе, предотвращают возникновение опосредованных биопленкой хронических инфекций S. aureus. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет интерес, если он обнаружен в биопленке, образуемой S. aureus. Примеры таких антигенов описаны в патенте США №9265820, который включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления бактериальная вакцина содержит по меньшей мере один полипептид, экспрессируемый планктонной формой бактерий, и по меньшей мере один полипептид, экспрессируемый биопленочной формой бактерий.
В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес бактериальный антиген получают из S. aureus. Устойчивый к лекарственным средствам S. aureus экспрессирует ряд представленных на поверхности белков, которые являются кандидатами в качестве мишеней вакцин, а также кандидатами в качестве иммунизирующих агентов для получения антител, которые нацелены на S. aureus. Примеры таких антигенов описаны в публикациях РСТ №WO 2012/136653 и WO 2015/082536 и в Ramussen, K. et al, Vaccine, Vol.34: 4602-4609 (2016), каждая из которых включен в данный документ путем ссылки во всей их полноте.
Специалисту в данной области техники будет понятно, что идентичность, количество и размер различных белков S. aureus, которые могут кодироваться мРНК, для бактериальных вакцин, описанных в данном документе, могут варьироваться. Например, вакцина может содержать мРНК, кодирующую только части полноразмерных полипептидов. В некоторых вариантах осуществления вакцина может содержать мРНК, кодирующую комбинацию частей и полноразмерных полипептидов.
Идентичность экспрессируемых планктонной и биопленочной формами полипептидов, кодируемых мРНК, включенной в бактериальные вакцины, описанные в данном документе, конкретно не ограничена, но каждый представляет собой полипептид из штамма S. aureus. В некоторых вариантах полипептид представляется на поверхности бактерий.
В одном варианте осуществления бактериальный антиген представляет собой поливалентный антиген (то есть антиген содержит множество антигенных эпитопов, таких как множество антигенных пептидов, содержащих разные эпитопы, такие как конкатермерный антиген).
В другом варианте осуществления бактериальный антиген представляет собой антиген Chlamydia, такой как антиген MOMP, OmpA, OmpL, OmpF или OprF. Подходящие антигены Chlamydia описаны дополнительно в заявке PCT №PCT/US2016/058314, полное содержание которой специально включено в данный документ посредством ссылки.
Поливалентные вакцины
Иммуностимулирный конструкт может быть использован в комбинации с поливалентным антигеном (то есть антиген содержит множество антигенных эпитопов, таких как множество антигенных пептидов, содержащих разные эпитопы, такие как конкатермерный антиген), чтобы тем самым усилить иммунный ответ против поливалентного антигена. В одном варианте осуществления поливалентный антиген представляет собой раковый антиген. В другом варианте осуществления поливалентный антиген представляет собой бактериальный антиген. Например, представляющий интерес поливалентный антиген (например, сконструированный, как описано ниже) может быть кодирован химически модифицированной мРНК (ммРНК), представленной в той же ммРНК, что и иммуностимуляторный конструкт, или представленной в другом конструкте ммРНК в качестве иммуностимулятора. Иммуностимуляторные ммРНК и ммРНК поливалентного антигена могут быть составлены (или совместно составлены) и введены (одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в этом, для стимуляции иммунного ответа против поливалентного антигена у субъекта. Подходящие поливалентные антигены, в том числе раковые антигены и бактериальные антигены, для применения с иммуностимуляторами описаны в данном документе.
В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе мРНК-вакцины содержат мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конкатемерный антиген, состоящий из 2-100 пептидных эпитопов.
В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе конкатемерные вакцины могут включать множество копий одного неоэпитопа, множество разных неоэпитопов, основанных на одном типе мутации, то есть точечной мутации, множество разных неоэпитопов, основанных на множестве типов мутаций, неоэпитопы и другие антигены, такие как опухолеассоциированные антигены или сенсибилизирующие антигены.
В некоторых вариантах осуществления конкатемерный антиген может включать сенсибилизирующий антиген, также иногда называемый антигеном памяти. Сенсибилизирующий антиген представляет собой антиген, с которым ранее сталкивался человек, и для которого есть предсуществующие лимфоциты памяти. В некоторых вариантах осуществления сенсибилизирующий антиген может представлять собой антиген инфекционного заболевания, с которым индивидуум, вероятно, сталкивался, такой как антиген гриппа. Сенсибилизирующий антиген помогает стимулировать более сильный иммунный ответ.
В дополнение к пептидным эпитопам конкатемерный антиген может иметь одну или более нацеливающих последовательностей. Используемая в данном документе нацеливающая последовательность относится к пептидной последовательности, которая облегчает поглощение пептида внутриклеточными компартментами, такими как эндосомы, для процессинга и/или презентации в детерминантах ГКГС класса I или II.
Нацеливающая последовательность может присутствовать на N-конце и/или С-конце эпитопа конкатемерного антигена, или непосредственно примыкает к нему, или разделена линкером сайта, чувствительного к расщеплению. Нацеливающие последовательности имеют различные длины, например, длину в 4-50 аминокислот.
Нацеливающая последовательность может представлять собой, например, эндосомную нацеливающую последовательность. Эндосомная нацеливающая последовательность представляет собой последовательность, полученную из эндосомного или лизосомального белка, о котором известно, что он находится в компартментах процессинга Аг ГКГС класса II, таких как инвариантная цепь, лизосом-ассоциированные мембранные белки (LAMP1,4 LAMP2) и дендритная клетка (DC) -LAMP или последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с ней. Кроме того, могут быть использованы иллюстративная нуклеиновая кислота, кодирующая фрагмент сигнального пептида ГКГС класса I (78 п.н., сигнал секреции (sec)) и трансмембранный и цитозольный домены, включая стоп-кодон (сигнал направленной миграции ГКГС класса I (MITD), 168 п.н.), оба амплифицированы из активированных МКПК, (смысловая sec 5'-aag ctt agc ggc cgc acc atg cgg gtc acg gcg ccc cga acc-3 '(SEQ ID NO: 1314); антисмысловая sec, 5′-ctg cag gga gcc ggc cca ggt ctc ggt cag-3′ (SEQ ID NO: 1315); смысловая MITD, 5′-gga tcc atc gtg ggc att gtt gct ggc ctg gct-3′ (SEQ ID NO: 1316); и антисмысловая MITD, 5′-gaa ttc agt ctc gag tca agc tgt gag aga cac atc aga gcc-3′ (SEQ ID NO: 1317).
Представление ГКГС класса I обычно является неэффективным процессом (фактически представлен только 1 пептид из 10000 деградированных молекул). Примирование CD8 T-клеток с АПК обеспечивает недостаточную плотность поверхностных комплексов пептид/ГКГС I, что приводит к слабым ответам у пациентов, которые проявляются нарушенной секрецией цитокинов и уменьшенным пулом памяти. Способы, описанные в данном документе, способны повысить эффективность представления ГКГС класса I. Последовательности, нацеленные на ГКГС класса I, включают последовательности сигнала направленной миграции ГКГС класса I (MITD) и последовательности PEST (усиливают антигенспецифические CD8 Т-клеточные ответы, предположительно, путем нацеливания на белки для быстрой деградации).
В некоторых вариантах осуществления мРНК-вакцины можно комбинировать с агентами для стимуляции образования антигенпрезентирующих клеток (АПК), например, путем превращения не-АПК в псевдо-АПК. Презентация антигена является ключевым этапом в инициации, усилении и продолжительности иммунного ответа. В этом процессе фрагменты антигенов представляются через главный комплекс гистосовместимости (ГКГС) или человеческий лейкоцитарный антиген (HLA) Т-клеткам, вызывая антигенспецифический иммунный ответ.Для иммунопрофилактики и иммунотерапии усиление этого ответа важно для повышения эффективности. мРНК-вакцины согласно изобретению могут быть сконструированы или усовершенствованы для обеспечения эффективной презентации антигена. Одним из способов усиления процессинга и презентации АПК является обеспечение лучшего нацеливания мРНК-вакцин на антигенпрезентирующие клетки (АПК). Другой подход включает активацию АПК клеток с помощью иммуностимулирующих составов и/или компонентов.
Альтернативно, способы перепрограммирования не-АПК в АПК могут быть использованы с мРНК-вакцинами, описанными в данном документе. Важно отметить, что большинство клеток, которые поглощают составы мРНК и являются мишенями их терапевтического действия, не являются АПК. Следовательно, разработка способа превращения этих клеток в АПК была бы полезна для эффективности. Способы и подходы к доставке РНК-вакцин, например мРНК-вакцин в клетки, в то же время способствуют изменению не-АПК в АПК, представлены в данном документе. В некоторых вариантах осуществления мРНК, кодирующая молекулу перепрограммирования АПК, включена в мРНК-вакцину или вводится совместно с мРНК-вакциной.
Молекула перепрограммирования АПК, используемая в данном документе, представляет собой молекулу, которая способствует переходу не-АПК клетки к АПК-подобному фенотипу. АПК-подобный фенотип представляет собой свойство, которое обеспечивает процессинг ГКГС класса II. Таким образом, клетка АПК, имеющая АПК-подобный фенотип, представляет собой клетку, имеющую одну или более экзогенных молекул (молекула перепрограммирования АПК), которая обладает улучшенными процессинговыми способностями ГКГС класса II по сравнению с той же клеткой, не имеющей одну или более экзогенных молекул. В некоторых вариантах осуществления молекула перепрограммирования АПК представляет собой CIITA (центральный регулятор экспрессии ГКГС класса II); шаперон, такой как CLIP, HLA-DO, HLA-DM и т.д. (усилители загрузки фрагментов антигена в ГКГС класса II) и/или костимулирующую молекулу, такую как CD40, CD80, CD86 и т.д. (усилители распознавания Т-клеточных антигенов и Т-клеточной активации).
Белок CIITA представляет собой трансактиватор, который усиливает активацию транскрипции генов ГКГС класса II (Steimle et al., 1993, Cell 75:135-146) путем взаимодействия с консервативным набором ДНК-связывающих белков, которые связываются с промоторной областью класса II. Функция активации транскрипции CIITA была сопоставлена с аминоконцевым кислотным доменом (аминокислоты 26-137). Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, который взаимодействует с CIITA, называется CIITA-взаимодействующим белком 104 (также называемым в данном документе CIP104). Было показано, что как CITTA, так и CIP104 усиливают транскрипцию с промоторов ГКГС класса II и, таким образом, являются полезными в качестве молекулы перепрограммирования АПК согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления молекула перепрограммирования АПК представляет собой полноразмерную CIITA, CIP104 или другие родственные молекулы или их активные фрагменты, такие как аминокислоты 26-137 CIITA, или аминокислоты, имеющие по меньшей мере 80% идентичность последовательности с ними и сохраняющие способность усиливать активацию транскрипции генов ГКГС класса II.
В некоторых вариантах осуществления молекулу перепрограммирования АПК доставляют субъекту в форме мРНК, кодирующей молекулу перепрограммирования АПК. По существу, описанные в данном документе мРНК-вакцины могут включать мРНК, кодирующую молекулу перепрограммирования АПК. В некоторых вариантах осуществления мРНК является моноцистронной. В других вариантах осуществления она является полицистроннной. В некоторых вариантах осуществления мРНК, кодирующая один или более антигенов, находится в отдельном составе от мРНК, кодирующей молекулу перепрограммирования АПК. В других вариантах осуществления мРНК, кодирующая один или более антигенов, находится в том же составе, что и мРНК, кодирующая молекулу перепрограммирования АПК. В некоторых вариантах осуществления мРНК, кодирующую один или более антигенов, вводят субъекту одновременно с мРНК, кодирующей молекулу перепрограммирования АПК. В других вариантах осуществления мРНК, кодирующую один или более антигенов, вводят субъекту в другое время, чем мРНК, кодирующую молекулу перепрограммирования АПК. Например, мРНК, кодирующая молекулу перепрограммирования АПК, можно вводить до мРНК, кодирующей один или более антигенов. мРНК, кодирующая молекулу перепрограммирования АПК, может быть введена непосредственно до, по меньшей мере за 1 час до, по меньшей мере за 1 сутки до, по меньшей мере за одну неделю до или, по меньшей мере за один месяц до мРНК, кодирующей антигены. Альтернативно, мРНК, кодирующая молекулу перепрограммирования АПК, можно вводить после мРНК, кодирующей один или более антигенов. мРНК, кодирующая молекулу перепрограммирования АПК, может быть введена сразу после, по меньшей мере через 1 час, по меньшей мере через 1 сутки, по меньшей мере через одну неделю или по меньшей мере через один месяц после мРНК, кодирующей антигены.
В других вариантах осуществления нацеливающая последовательность представляет собой сигнал убиквитинирования, который присоединен на одном или обоих концах кодируемого пептида. В других вариантах осуществления нацеливающая последовательность представляет собой сигнал убиквитинирования, который присоединен к внутреннему сайту кодируемого пептида и/или к любому концу. Таким образом, мРНК может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнал убиквитинирования на одном или обоих концах нуклеотидов, кодирующих конкатемерный пептид. Убиквитинирование, посттрансляционная модификация, представляет собой процесс присоединения убиквитина к субстратному целевому белку. Сигнал убиквитинирования представляет собой пептидную последовательность, которая обеспечивает нацеливание и процессинг пептида в одну или более протеасом. Посредством нацеливания и процессинга пептида с помощью сигнала убиквитинирования внутриклеточный процессинг пептида может более точно воспроизводить процессинг антигена в антигенпрезентирующих клетках (АПК).
Убиквитин является регуляторным белком массой 8,5 кДа, который содержится почти во всех тканях эукариотических организмов. В геноме человека есть четыре гена, которые продуцируют убиквитин: UBB, UBC, UBA52, и RPS27A. UBA52 и RPS27A кодируют одну копию убиквитина, слитого с рибосомными белками L40 и S27a, соответственно. Гены UBB и UBC кодируют белки-предшественники полиубиквитина. Есть три этапа к убиквитинированию, выполняемые тремя ферментами. Активирующие убиквитин ферменты, также называемые ферментами E1, модифицируют убиквитин так, чтобы он находился в реактивном состоянии. Е1 связывается как с АТФ, так и с убиквитином, катализируя ацил-аденилирование С-конца убиквитина. Затем убиквитин переносится в цистеиновый остаток активного сайта, высвобождая АМФ. В конечном итоге, тиоэфирная связь образуется между С-концевой карбоксильной группой убиквитина и сульфгидрильной группой цистеина E1. В геноме человека UBA1 и UBA6 являются двумя генами, которые кодируют ферменты E1.
Активированный убиквитин затем подвергают воздействию убиквитин-конъюгирующих ферментов Е2, которые переносят убиквитин из Е1 на цистеин активного центра Е2 посредством реакции транс(тио)эстерификации. Е2 связывается как с активированным убиквитином, так и с ферментом Е1. У людей есть 35 различных ферментов E2, характеризующихся их высоко консервативной структурой, которая известна как убиквитин-конъюгирующая каталитическая складка (UBC). Убиквитин-лигазы Е3 облегчают заключительную стадию каскада убиквитинирования. Обычно они создают изопептидную связь между лизином целевого белка и С-концевым глицином убиквитина. Существуют сотни лигаз Е3; некоторые также активируют ферменты E2. Ферменты Е3 функционируют как модули распознавания субстрата системы и взаимодействуют как с Е2, так и с субстратом. Ферменты обладают одним из двух доменов: домен гомологичного карбоксильному концу E6-AP (HECT) или домен действительно интересного нового гена (RING) (или близкородственный домен U-бокса). Ферменты E3 с доменом HECT временно связывают убиквитин, когда образуется облигатный тиоэфирный промежуточный продукт с цистеином активного центра E3, тогда как ферменты E3 с доменом RING катализируют прямой перенос от фермента E2 к субстрату.
Число убиквитинов, добавленных к антигену, может повысить эффективность стадии процессинга. Например, при полиубиквитинировании дополнительные молекулы убиквитина добавляются после того, как первая была присоединена к пептиду. Получающаяся в результате убиквитиновая цепь создается путем связывания глицинового остатка молекулы убиквитина с лизином убиквитина, связанным с пептидом. Каждый убиквитин содержит семь остатков лизина и N-конец, который может служить сайтом для убиквитинирования. Когда четыре или более молекул убиквитина присоединены к остатку лизина на пептидном антигене, 26S протеасома распознает комплекс, интернализует его и разлагает белок до небольших пептидов.
Убиквитин дикого типа имеет следующую последовательность (Homo sapiens):
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG (SEQ ID NO: 1318)
В некоторых вариантах осуществления эпитопы связаны сайтом, чувствительным к расщеплению. Сайт, чувствительный к расщеплению, представляет собой пептид, который чувствителен к расщеплению ферментом или протеазой. Эти сайты также называют сайтами расщепления протеазой. В некоторых вариантах осуществления протеаза представляет собой внутриклеточный фермент.В некоторых вариантах осуществления протеаза представляет собой протеазу, обнаруженную в антигенпрезентирующей клетке (АПК). Таким образом, сайты расщепления протеазой соответствуют протеазам с высоким содержанием (высоко экспрессируемых) в АПК. Сайт, чувствительный к расщеплению, который чувствителен к ферменту АПК, называется сайтом, чувствительным к расщеплению АПК. Протеазы, экспрессируемые в АПК, включают, но не ограничиваются ими, цистеиновые протеазы, такие как: катепсин B, катепсин H, катепсин L, катепсин S, катепсин F, катепсин Z, катепсин V, катепсин O, катепсин C и катепсин K, и аспарагиновые протеазы, такие как катепсин D, катепсин E и аспарагиновая эндопептидаза.
Ниже приведены примеры сайтов, чувствительных к расщеплению АПК:
Катепсин B: расщепление на карбоксильной стороне связей Arg-Arg
Катепсин D имеет следующие предпочтительные последовательности расщепления:
P6 P5 P4 P3 P2 P1 ↓ P1′ P2′ P3′ P4′
Xaa Xaa Xaa Xaa гидро гидро ↓ гидро Xaa Xaa Xaa
Xaa Xaa Xaa Xaa Glu гидро ↓ гидро Xaa Xaa Xaa,
где Xaa=любой аминокислотный остаток, гидро=Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp или Tyr и ↓=сайт расщепления
Катепсин Н: Arg-↓-NHMec; Bz-Arg-↓-NhNap; Bz-Arg-↓NHMec; Bz-Phe-Cal-Arg-↓-NHMec; Pro-Gly-↓-Phe
Катепсин S и F: Xaa-Xaa-Val-Val-Arg-Xaa-Xaa
где Xaa=любой аминокислотный остаток
Катепсин V: Z-Phe-Arg-NHMec; Z-Leu-Arg-NHMec; Z-Val-Arg-NHMec
Катепсин О: Z-Phe-Arg-NHMec и Z-Arg-Arg-NHMec
Катепсин C имеет следующие предпочтительные последовательности расщепления:
P2
P1
↓
P1′
P2′
P3′
P4′
не Arg
не Pro
↓
не Pro
Xaa
Xaa
Xaa
не Lys
не Pro
↓
не Pro
Xaa
Xaa
Xaa,
где Xaa=любой аминокислотный остаток и ↓=сайт расщепления
Катепсин Е: Arg-X, Glu-X, и Arg-Arg
Аспарагиновая эндопептидаза: после остатков аспарагина
Катепсин L имеет следующие предпочтительные последовательности расщепления:
P6 P5 P4 P3 P2 P1 ↓ P1′ P2′ P3′ P4′
Xaa Xaa Xaa гидрофобный Phe Arg ↓ Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa Xaa Xaa ароматический Phe Arg ↓ Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa Xaa Xaa гидрофобный Arg Arg ↓ Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa Xaa Xaa ароматический Arg Arg ↓ Xaa Xaa Xaa Xaa,
где Xaa=любой аминокислотный остаток, гидрофобный=Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp или Tyr, ароматический=Phe, Trp, His, или Tyr и ↓=сайт расщепления
В некоторых вариантах осуществления сайт, чувствительный к расщеплению, представляет собой сайты, чувствительные к катепсину B или S. Иллюстративные сайты, чувствительные к катепсину В, включают, но не ограничиваются ими, сайты, указанные в SEQ ID NO: 226-615. Иллюстративные сайты, чувствительные к катепсину S включают, но не ограничиваются ими, сайты, указанные в SEQ ID NO: 616-1313.
В некоторых вариантах осуществления противораковые мРНК-вакцины и способы вакцинации включают мРНК, кодирующую конкатемерный раковый антиген, состоящий из одного или более неоэпитопов и одного или более традиционных раковых антигенов. В некоторых вариантах осуществления мРНК кодирует 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более традиционных раковых антигенов в дополнение к закодированным неоэпитопам.
В некоторых вариантах осуществления конкатемерный антиген кодирует 5-10 раковых пептидных эпитопов. В еще других вариантах осуществления конкатемерный антиген кодирует 25-100 раковых пептидных эпитопов. В некоторых вариантах осуществления противораковые мРНК-вакцины и способы вакцинации включают эпитопы или антигены, основанные на специфических мутациях (неоэпитопах) и экспрессируемых генами зародышевой линии рака (антигены, общие для опухолей, обнаруженных у множества пациентов). В некоторых вариантах осуществления противораковые мРНК-вакцины и способы вакцинации включают один или более традиционных эпитопов или антигенов, например, один или более эпитопов или антигенов, которые можно найти в традиционной противораковой вакцине.
Неоэпитопы, выбранные для включения в конкатемерный антиген, обычно будут пептидами с высокой аффинностью связывания. Неоэпитопы в конкатемерном конструкте могут быть одинаковыми или разными, например, они могут различаться по длине, аминокислотной последовательности или и тому и другому.
В некоторых вариантах осуществления неоэпитопы перемежаются линкерами.
В некоторых вариантах осуществления вакцина может представлять собой полицистронную вакцину, содержащую несколько неоэпитопов, или одну или более одиночных мРНК-вакцин, или их комбинацию.
В некоторых вариантах осуществления бактериальные мРНК-вакцины и способы вакцинации включают мРНК, кодирующую конкатемерный бактериальный антиген, состоящий из одного или более бактериальных антигенов. В некоторых вариантах осуществления мРНК кодирует 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более бактериальных антигенов.
Композиции иммуностимуляторных мРНК и представляющих интерес антигенов
В другом аспекте раскрытие обеспечивает композицию, содержащую по меньшей мере одну химически модифицированную матричную РНК (ммРНК), кодирующую: (i) по меньшей мере один представляющий интерес антиген; и (ii) по меньшей мере один полипептид, который усиливает иммунный ответ против по меньшей мере одного представляющего интерес антигена, когда по меньшей мере одну ммРНК вводят субъекту, при этом указанная ммРНК содержит одно или более модифицированных нуклеиновых оснований. Таким образом, раскрытие относится к композициям, содержащим по меньшей мере одну иммуностимуляторную мРНК и по меньшей мере одну мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген, при этом один конструкт мРНК может кодировать как представляющий интерес антиген(ы), так и полипептид, который усиливает иммунный ответ на антиген(ы) или, альтернативно, композиция может содержать два или более отдельных конструктов мРНК, первую мРНК и вторую мРНК, причем первая мРНК кодирует по меньшей мере один представляющий интерес антиген, а вторая мРНК кодирует полипептид, который усиливает иммунный ответ на антиген(ы) (т.е. вторая мРНК содержит иммуностимулятор).
В этих вариантах осуществления, включающих первую мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген(ы), и вторую мРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген(ы), первую мРНК и вторую мРНК можно совместно комбинировать (например, перед совместным введением), например, совместно составлены в одной и той же липидной наночастице.
В этих вариантах осуществления, включающих одну мРНК, кодирующую как представляющий интерес антиген(ы), так и полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген(ы), последовательности, кодирующие полипептид, могут быть расположены в конструкте мРНК по ходу или против хода транскрипции от последовательностей, кодирующих представляющих интерес антиген. Например, неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих как антиген, так и иммуностимуляторный полипептид, включают такие, которые кодируют по меньшей мере один мутантный антиген KRAS и конститутивно активный полипептид STING, например, кодирующие аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 107-130. В одном варианте осуществления конститутивно активный полипептид STING расположен на N-терминальном конце конструкта (т.е. по ходу транскрипции от последовательностей, кодирующих антиген), как показано в SEQ ID NO: 107-118. В другом варианте осуществления конститутивно активный полипептид STING расположен на С-терминальном конце конструкта (т.е. против хода транскрипции от последовательностей, кодирующих антиген), как показано в SEQ ID NO: 119-130.
Различные мРНК, кодирующие представляющие интерес антигены (например, мРНК-вакцины), которые можно использовать в комбинации с иммуностимуляторной мРНК согласно раскрытию, описаны более подробно ниже.
Конструкты мРНК, индуцирующие иммуногенную клеточную гибель
В другом аспекте раскрытие обеспечивает конструкты мРНК (например, ммРНК), кодирующие полипептиды, которые индуцируют иммуногенную клеточную гибель, такую как некроптоз или пироптоз. Иммуногенная клеточная гибель, индуцированная мРНК, приводит к высвобождению цитозольных компонентов из клетки, так что иммунный ответ против клетки стимулируется in vivo. Таким образом, мРНК согласно изобретению можно использовать для стимуляции иммунного ответа in vivo против представляющих интерес клеток, таких как опухоли, при лечении рака. мРНК, кодирующую полипептид, который вызывает иммуногенную клеточную гибель, можно использовать отдельно или, альтернативно, можно использовать в комбинации с одним или более дополнительными агентами, которые стимулируют или усиливают иммунологическую реактивность. Такие дополнительные агенты включают агенты, которые стимулируют адаптивный иммунитет, например, стимуляцию продукции интерферона типа I, агенты, которые индуцируют активацию или примирование Т-клеток, и/или агенты, которые модулируют одну или более иммунных контрольных точек. Такие дополнительные агенты также могут представлять собой мРНК или, альтернативно, могут представлять собой агент другого типа, такой как белок, антитело или малая молекула. В одном варианте осуществления дополнительный агент представляет собой один или более конструктов иммуностимуляторной мРНК согласно раскрытию.
Иммуногенная клеточная гибель отличается от неиммуногенной клеточной гибели клеток тем, что иммуногенная клеточная гибель приводит к высвобождению внутриклеточных компонентов из клетки в окружающую среду, так что эти компоненты становятся доступными для стимуляции иммунного ответа. Был идентифицирован ряд внутриклеточных компонентов, которые обычно высвобождаются во время иммуногенной клеточной гибели, называемых «молекулярные структуры, ассоциированные с повреждениями» или DAMP, включая АТФ, HMGB1, ИЛ-1a, мочевую кислоту, фрагменты ДНК, гистоны и содержимое митохондрий. DAMP могут высвобождаться внеклеточно, или определенные DAMP транслоцируются из внутренней части клетки на клеточную поверхность (например, кальретикулин, который транслоцируется из просвета эндоплазматического ретикулума на клеточную поверхность). Таким образом, высвобождение DAMP служит индикатором иммуногенной клеточной гибели. Иммуногенная клеточная гибель также характеризуется стимуляцией провоспалительных цитокинов.
Два типа иммуногенной клеточной гибели представляет собой некроптоз и пироптоз. Каждый из этих типов запрограммированной гибели клеток имеет характерные особенности, которые отличают их друг от друга и от апоптоза, который является формой запрограммированной неиммуногенной клеточной гибели. Отличительными характеристиками апоптоза является то, что он зависит от каспазы (например, зависит от каспаз-инициаторов, таких как каспаза-8 и -10 для апоптоза, индуцируемого рецептором смерти, или каспаза-9 для самоиндуцируемого апоптоза, и самим собой) и приводит к уплотнению цитоплазмы и сжатию клеток, блеббингу плазматической мембраны (но не потере целостности плазматической мембраны), повышенной внутриклеточной концентрации кальция и пермеабилизации внешней митохондриальной мембраны (MOMP). Важно отметить, что апоптоз не приводит к высвобождению внутриклеточных компонентов в окружающую среду и считается толерогенным. Напротив, некроптоз не зависит от активности каспазы, но зависит от активности киназы, называемой взаимодействующей с рецептором протеинкиназой 1 (RIPK1). Фактически, активация каспаз ингибирует некроптоз, поскольку, например, активированные каспаза-8 и -10 инактивируют RIPK1. Когда RIPK1 активирован, он взаимодействует с RIPK3, что приводит к образованию комплекса некросом. Гибель клеток в результате некроптоза также зависит от псевдокиназы смешанного происхождения (MLKL). Некроптоз характеризуется клеточным коллапсом и потерей целостности плазматической мембраны, включая высвобождение DAMP. Пироптоз также характеризуется высвобождением DAMP, но отличается от некроптоза тем, что он зависит от гасдермина D (GSDMD), белка-3 семейства NLR, содержащего пириновый домен (NLRP3; кодирует криопирин) и каспазы-1, а также от каспазы-4 и каспазы-5 у людей и каспазы-11 у мышей, что приводит к индукции инфламмасом. Дополнительные формы независимой от каспазы иммуногенной клеточной гибели, которые приводят к разрыву плазматической мембраны и воспалению, включают регулируемый некроз, зависимый от проницаемости митохондрий (MPT-RN), ферроптоз, партанатоз и нетоз (для обзора см., например, Linkermann, A. et al. (2014) Nat. Rev. Immunol. 14:759-767).
В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает мРНК, кодирующую полипептид, который индуцирует некроптоз. В другом варианте осуществления изобретение обеспечивает мРНК, кодирующую полипептид, который индуцирует пироптоз. В еще других вариантах осуществления изобретение обеспечивает мРНК, кодирующую полипептид, который индуцирует MPT-RN, ферроптоз, партанатоз или нетоз.
В одном варианте осуществления полипептид, который индуцирует некроптоз, представляет собой псевдокиназу смешанного происхождения (MLKL), или ее фрагмент, вызывающий иммуногенную клеточную гибель. Как описано далее в Примерах 22-23, конструкты MLKL индуцируют некроптотическую клеточную гибель, характеризующуюся высвобождением DAMP. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-180 MLKL человека или мыши. В одном варианте осуществления конструкт MLKL содержит один или более сайтов связывания miR. В одном варианте осуществления конструкт MLKL содержит сайт связывания miR122, сайт связывания miR142-3p или оба сайта связывания, например, в 3'-НТО или в 5'-НТО. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих MLKL, или их фрагмента, индуцирующего иммуногенную клеточную гибель, кодируют аминокислоты 1-180 MLKL человека или мыши, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 1327 и 1328, соответственно.
В другом варианте осуществления полипептид представляет собой взаимодействующую с рецептором протеинкиназу 3 (RIPK3) или ее фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель. Как описано далее в Примере 24, конструкты RIPK3 индуцируют некроптотическую клеточную гибель. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK3, который мультимеризуется сам с собой (гомоолигомеризация). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK3, который димеризуется с RIPK1. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует киназный домен и домен RHIM в RIPK3. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует киназный домен RIPK3, домен RHIM в RIPK3 и два домена FKBP (F>V). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK3 (например, содержащий киназный домен и домен RHIM в RIPK3) и домен IZ (например, тример IZ). В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK3 (например, содержащий киназный домен и домен RHIM в RIPK3) и один или более доменов EE или RR (например, доменов 2xEE или доменов 2xRR). Кроме того, структура конструктов ДНК, кодирующих конструкты RIPK3, которые индуцируют иммуногенную клеточную гибель, описаны далее, например, в Yatim, N. et al. (2015) Science 350:328-334 или Orozco, S. et al. (2014) Cell Death Differ. 21:1511-1521, и могут быть использованы при разработке подходящих конструктов РНК. В одном варианте осуществления конструкт RIPK3 содержит один или более сайтов связывания miR. В одном варианте осуществления конструкт RIPK3 содержит сайт связывания miR122, сайт связывания miR142-3p или оба сайта связывания, например, в 3'-НТО или 5'-НТО. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих RIPK3, или их фрагменты, индуцирующие иммуногенную клеточную гибель, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1329-1344.
В другом варианте осуществления полипептид представляет собой взаимодействующую с рецептором протеинкиназу 1 (RIPK1) или ее фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-155 полипептида RIPK1 человека или мыши. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK1 и домен IZ. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK1 и домен DM. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует полипептид RIPK1 и один или более доменов EE или RR. Кроме того, структура конструктов ДНК, кодирующих конструкты RIPK1, которые индуцируют иммуногенную клеточную гибель, описаны далее, например, в Yatim, N. et al. (2015) Science 350:328-334 или Orozco, S. et al. (2014) Cell Death Differ. 21:1511-1521, и могут быть использованы при разработке подходящих конструктов РНК. В одном варианте осуществления конструкт RIPK1 содержит один или более сайтов связывания miR. В одном варианте осуществления конструкт RIPK1 содержит сайт связывания miR122, сайт связывания miR142-3p или оба сайта связывания, например, в 3'-НТО или в 5'-НТО. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих RIPK1, или их фрагменты, индуцирующие иммуногенную клеточную гибель, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 158-163.
В другом варианте осуществления полипептид представляет собой белок с низкой pI, прямо связывающий IAP, (DIABLO) (также известный как SMAC/DIABLO), или его фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель. Как описано в примерах, конструкты DIABLO индуцируют клеточную гибель и высвобождение цитокинов. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует последовательность изоформы 1 человеческого DIABLO дикого типа. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует последовательность изоформы 1 человеческого DIABLO, содержащую мутацию S126L. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 56-239 изоформы 1 человеческого DIABLO. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 56-239 изоформы 1 человеческого DIABLO и содержит мутацию S126L. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует последовательность изоформы 3 человеческого DIABLO дикого типа. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует последовательность изоформы 3 человеческого DIABLO, содержащую мутацию S27L. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 56-240 изоформы 3 человеческого DIABLO. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 56-240 изоформы 3 человеческого DIABLO и содержит мутацию S27L. В одном варианте осуществления конструкт DIABLO содержит один или более сайтов связывания miR. В одном варианте осуществления конструкт DIABLO содержит сайт связывания miR122, сайт связывания miR142-3p или оба сайта связывания, например, в 3'-НТО или в 5'-НТО. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих DIABLO, или их фрагменты, индуцирующие иммуногенную клеточную гибель, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 165-172.
В другом варианте осуществления полипептид представляет собой FADD (белок, взаимодействующий с доменом смерти Fas-рецептора) или его фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель. В одном варианте осуществления конструкт FADD содержит один или более сайтов связывания miR. В одном варианте осуществления конструкт FADD содержит сайт связывания miR122, сайт связывания miR142-3p или оба сайта связывания, например, в 3'-НТО или в 5'-НТО. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих FADD, или их фрагменты, индуцирующие иммуногенную клеточную гибель, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1345-1351.
В другом варианте осуществления изобретение обеспечивает мРНК, кодирующую полипептид, который индуцирует пироптоз. В одном варианте осуществления полипептид представляет собой гасдермин D (GSDMD) или его фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель. В одном варианте осуществления конструкт мРНК кодирует последовательность человеческого GSDMD дикого типа. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-275 человеческого GSDMD. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 276-484 человеческого GSDMD. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует мышиный GSDMD дикого типа. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 1-276 мышиного GSDMD. В другом варианте осуществления конструкт мРНК кодирует аминокислоты 277-487 мышиного GSDMD. В одном варианте осуществления конструкт GSDMD содержит один или более сайтов связывания miR. В одном варианте осуществления конструкт GSDMD содержит сайт связывания miR122, сайт связывания miR142-3p или оба сайта связывания, например, в 3'-НТО или в 5'-НТО. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих GSDMD или, их фрагменты, индуцирующие иммуногенную клеточную гибель, кодируют любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1367-1372.
В другом варианте осуществления полипептид представляет собой каспазу-4 или каспазу-5, или каспазу-11 или их фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель. В различных вариантах осуществления конструкты каспазы-4, -5 или -11 могут кодировать (i) полноразмерную каспазу-4, каспазу-5 или каспазу-11 дикого типа; (ii) полноразмерную каспазу-4, -5 или -11 плюс домен IZ; (iii) каспазу-4, -5 или -11 c удаленным N-концом плюс домен IZ; (iv) полноразмерную каспазу-4, -5 или -11 плюс домен DM; или (v) каспазу-4, -5 или -11 c удаленным N-концом плюс домен DM. Примеры форм каспазы-4 и каспазы-11 c удаленным N-концом содержат аминокислотные остатки 81-377. Пример формы каспазы-5 c удаленным N-концом содержит аминокислотные остатки 137-434. В одном варианте осуществления конструкт каспазы-4, -5 или -11 содержит один или более сайтов связывания miR. В одном варианте осуществления конструкт каспазы-4, -5 или -11 содержит сайт связывания miR122, сайт связывания miR142-3p или оба сайта связывания, например, в 3'-НТО или в 5'-НТО. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих каспазу-4, или их фрагменты, индуцирующие иммуногенную клеточную гибель, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1352-1356. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих каспазу-5, или их фрагменты, индуцирующие иммуногенную клеточную гибель, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1357-1361. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих каспазу-11, или их фрагменты, индуцирующие иммуногенную клеточную гибель, содержат ОРС, имеющую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1362-1366.
В одном варианте осуществления полипептид представляет собой NLRP3 или его фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель. В одном варианте осуществления конструкт NLRP3 содержит один или более сайтов связывания miR. В одном варианте осуществления конструкт NLRP3 содержит сайт связывания miR122, сайт связывания miR142-3p или оба сайта связывания, например, в 3'-НТО или 5'-НТО. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих NLRP3, или их фрагментов, индуцирующих иммуногенную клеточную гибель, кодируют аминокислотные последовательности ОРС, приведенные в SEQ ID NO: 1373 или 1374.
В другом варианте осуществления полипептид представляет собой апоптоз-ассоциированный крапчато-подобный белок, содержащий CARD (ASC/PYCARD) или его фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель, такой как пириновый домен. В одном варианте осуществления полипептид представляет собой домен B30.2 пирина. В другом варианте осуществления полипептид представляет собой домен B30.2 пирина, содержащий мутацию V726A. В одном варианте осуществления конструкт ASC/PYCARD или пирина содержит один или более сайтов связывания miR. В одном варианте осуществления конструкт ASC/PYCARD или пирина содержит сайт связывания miR122, сайт связывания miR142-3p или оба сайта связывания, например, в 3'-НТО или в 5'-НТО. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих домен B30.2 пирина, кодируют аминокислотные последовательности ОРС, приведенные в SEQ ID NO: 1375 или 1376. Неограничивающие примеры конструктов мРНК, кодирующих ASC, кодируют аминокислотные последовательности ОРС, приведенные в SEQ ID NO: 1377 или 1378.
мРНК согласно изобретению, кодирующие полипептид, который вызывает иммуногенную клеточную гибель, можно использовать в комбинации с другими агентами, которые стимулируют воспалительную и/или иммунную реакцию и/или регулируют иммунореактивность. Чтобы иммунный ответ против раковых клеток был эффективным в уничтожении раковых клеток, был описан ряд событий, которые должны происходить поэтапно и иметь возможность развиваться и расширяться многократно. Данный процесс называется противораковым иммунным циклом (см., например, Chen, D.S. and Mellman, I. (2013) Immunity, 39:1-10). Эти последовательные события включают: (i) высвобождение антигенов раковых клеток; (ii) презентацию ракового антигена (например, дендритными клетками или другими антигенпрезентирующими клетками); (iii) примирование и активацию Т-клеток; (iv) миграцию Т-клеток (например, ЦТЛ) в опухоль; (v) инфильтрацию Т-клеток в опухоль; (vi) распознавание раковых клеток Т-клетками; и (vii) уничтожение раковых клеток.
Соответственно, другой аспект изобретения относится к дополнительным агентам, которые можно использовать в комбинации с мРНК согласно изобретению, кодирующей полипептид, который индуцирует иммуногенную клеточную гибель, чтобы стимулировать или усиливать иммунный ответ против клеточных антигенов из клетки-мишени, подлежащей уничтожению. Такие дополнительные агенты могут стимулировать или способствовать воспалительному и/или иммунному ответу. Дополнительно или альтернативно, такие дополнительные агенты могут регулировать иммунологическую реактивность, например, действуя в качестве модулятора иммунной контрольной точки. Дополнительным агентом также может быть мРНК, например, имеющая структурные характеристики, как описано в данном документе для конструктов мРНК (например, модифицированные нуклеотидные основания, 5'-кэп, 5'-НТО, 3'-НТО, miR-связывающий сайт(ы), поли(А)-хвост, как описано в данном документе). Альтернативно, дополнительный агент может представлять собой агент, не являющийся мРНК, такой как белок, антитело или малая молекула.
В одном варианте осуществления дополнительный агент усиливает иммунный ответ, например, индуцирует адаптивный иммунитет (например, стимулируя продукцию интерферона типа I), стимулирует воспалительный ответ, стимулирует сигналинг NFkB и/или стимулирует мобилизацию дендритных клеток (DC). В одном варианте осуществления агент, который индуцирует адаптивный иммунитет, представляет собой интерферон типа I. Например, фармацевтическая композиция, содержащая интерферон типа I, может быть использована в качестве агента. Альтернативно, в другом варианте осуществления дополнительный агент, который индуцирует адаптивный иммунитет, представляет собой агент, который стимулирует продукцию интерферона типа I. Неограничивающие примеры агентов, которые стимулируют продукцию интерферона типа I, включают STING, IRF1, IRF3, IRF5, IRF6, IRF7 и IRF8. Неограничивающие примеры агентов, которые стимулируют воспалительный ответ, включают STAT1, STAT2, STAT4, STAT6, NFAT и C/EBPb. Неограничивающие примеры агентов, которые стимулируют сигналинг NFkB, включают IKKβ, c-FLIP, RIPK1, ИЛ-27, ApoF и PLP. Неограничивающим примером агента, который стимулирует мобилизацию ДК, является FLT3. Еще один агент, который потенцирует иммунные ответы, представляет собой DIABLO (SMAC/DIABLO).
В одном варианте осуществления агент, который потенцирует иммунный ответ, представляет собой конструкт иммуностимуляторной мРНК согласно раскрытию, неограничивающие примеры которой включают конструкты, кодирующие полипептид STING, IRF3, IRF7, STAT6, Myd88, Btk(E41K), TAK-TAB1, DIABLO (SMAC/DIABLO), TRAM(TICAM2) или полипептид самоактивирующейся каспазы-1, конструкты мРНК конститутивно активной IKKβ, конститутивно активной IKKα, c-FLIP и RIPK1.
В другом варианте осуществления дополнительный агент индуцирует активацию или примирование Т-клеток. Например, дополнительный агент, который индуцирует активацию или примирование Т-клеток, может представлять собой цитокин или хемокин. Неограничивающие примеры цитокинов или хемокинов, которые индуцируют активацию или примирование Т-клеток, включают ИЛ-12, ИЛ-36 гамма, CCL2, CCL4, CCL20 и CCL21. В одном варианте осуществления агент представляет собой фармацевтическую композицию, которая содержит цитокин или хемокин. В другом варианте осуществления агент представляет собой агент, который индуцирует продукцию цитокина или хемокина. В другом варианте осуществления агент представляет собой конструкт мРНК, кодирующий цитокин или хемокин. В другом варианте осуществления агент представляет собой конструкт мРНК, кодирующий полипептид, который индуцирует хемокин или цитокин.
В другом варианте осуществления дополнительный агент модулирует иммунную контрольную точку. В данной области техники были описаны различные ингибиторы иммунных контрольных точек, включая ингибиторы PD-1, ингибиторы PD-L1 и ингибиторы CTLA-4. Другие модуляторы иммунных контрольных точек могут быть нацелены на OX-40, OX-40L или ICOS. В одном варианте осуществления агент, который модулирует иммунную контрольную точку, представляет собой антитело. В другом варианте осуществления агент, который модулирует иммунную контрольную точку, представляет собой белок или низкомолекулярный модулятор. В другом варианте осуществления агент (такой как мРНК) кодирует модулятор-антитело иммунной контрольной точки.
В одном варианте осуществления дополнительный агент, который модулирует иммунную контрольную точку, нацелен на PD-1. Неограничивающие примеры иммунотерапевтических агентов, которые нацелены на PD-1, включают пембролизумаб, алемтузумаб, атезолизумаб, ниволумаб, ипилимумаб, пидилизумаб, офатумумаб, ритуксимаб, MEDI0680 и PDR001, AMP-224, PF-06801591, BGB-A317, REGN2810, SHR-1210, TSR-042, авелумаб, дурвалумаб и аффимер.
В одном варианте осуществления дополнительный агент, который модулирует иммунную контрольную точку, нацелен на PD-L1. Неограничивающие примеры иммунотерапевтических агентов, которые нацелены на PD-L1, включают авелумаб (MSB0010718C), атезолизумаб (MPDL3280A), дурвалумаб (MEDI4736) и BMS936559.
В одном варианте осуществления дополнительный агент, который модулирует иммунную контрольную точку, нацелен на CTLA-4. Неограничивающие примеры иммунотерапевтических агентов, которые нацелены на CTLA-4, включают ипилимумаб, тремелимумаб и AGEN1884.
В одном варианте осуществления дополнительный агент, который модулирует иммунную контрольную точку, нацелен на OX-40 или OX-40L. В одном варианте осуществления агент, который нацелен на OX-40 или OX-40L, представляет собой конструкт мРНК, кодирующий полипептид Fc-OX-40L. В еще других вариантах осуществления агент, который нацеливается на OX-40 или OX-40L, представляет собой иммуностимулирующее агонистическое анти-OX-40 или анти-OX-40L антитело, примеры которого известны в данной области техники, включают MEDI6469 (агонистическое анти-OX40 антитело) и MOXR0916 (агонистическое анти-OX40 антитело).
В еще одном другом варианте осуществления дополнительный агент, который модулирует иммунную контрольную точку, представляет собой агонист пути ICOS.
Компоненты конструкта мРНК
мРНК может быть природной или не встречающейся в природе мРНК. мРНК может содержать одно или более модифицированных нуклеотидных оснований, нуклеозидов или нуклеотидов, как описано ниже, и в этом случае ее можно назвать «модифицированной мРНК» или «ммРНК». Как описано в данном документе «нуклеозид» определяется как соединение, содержащее молекулу сахара (например, пентозу или рибозу) или ее производное в комбинации с органическим основанием (например, пурином или пиримидином) или его производным (также упоминается в данном документе как «нуклеотидное основание»). Как описано в данном документе, «нуклеотид» определяется как нуклеозид, содержащий фосфатную группу.
мРНК может содержать 5'-нетранслируемую область (5'-НТО), 3'-нетранслируемую область (3'-НТО) и/или кодирующую область (например, открытую рамку считывания). Иллюстративная 5'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 21. Другая иллюстративная 5'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 1323. Иллюстративная 3'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 22. Иллюстративная 3'-НТО, содержащая сайты связывания miR-122 и miR-142-3p, для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 23. мРНК может содержать любое подходящее количество пар оснований, включая десятки (например, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100), сотни (например, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 или 900) или тысячи (например, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000) пар оснований. Любое количество (например, все, некоторые или ни одного) нуклеотидных оснований, нуклеозидов или нуклеотидов может быть аналогом канонических типов, замещенного, модифицированного или иного не встречающегося в природе. В определенных вариантах осуществления все конкретные типы нуклеотидных оснований могут быть модифицированы.
В некоторых вариантах осуществления мРНК, как описано в данном документе, может содержать структуру 5'-кэп, терминирующий нуклеотид, необязательно последовательность Козак (также известную как консенсусная последовательность Козак), «шпильку», поли(А)-последовательность и/или сигнал полиаденилирования.
7
7
7
7
7
7
7,O3′
7,O3′
7,O2′
7
7
7
7,O3′
7,O3′
7,O2′
2
2
2
2
2
2
Структура 5'-кэп или типы кэп-структур представляют собой соединение, содержащее две части нуклеозида, соединенные линкером, и могут быть выбраны из природной кэп-структуры, не встречающейся в природе кэп-структуры или аналога кэп-структуры или аналога кэп-структуры с правильной ориентацией (ARCA). Тип кэп-структуры может содержать один или более модифицированных нуклеозидов и/или линкерных фрагментов. Например, природная кэп-структура мРНК может содержать гуаниновый нуклеотид и гуаниновый нуклеотид (G), метилированный в положении 7, соединенные трифосфатной связью в их 5'положениях, например, mG(5')ppp(5')G, обычно записывается как mGpppG. Тип кэп-структуры также может быть аналогом кэп-структуры с правильной ориентацией. Неограничивающий перечень возможных типов кэп-структур включает mGpppG, mGpppmG, m3′dGpppG, mGpppG, mGppppG, mGppppG, mGpppmG, m3′dGpppG, mGpppG, mGppppG, и mGppppG.
мРНК может вместо или дополнительно содержать терминирующий нуклеозид. Например, терминирующий нуклеозид может включать те нуклеозиды, которые дезоксигенированы в 2' и/или 3' положениях их сахарной группы. Такие типы могут включать 3'дезоксиаденозин (кордицепин), 3'дезоксиуридин, 3'дезоксицитозин, 3'дезоксигуанозин, 3'дезокситимин, и 2',3'дидезоксинуклеозиды, такие как 2',3'дидезоксиаденозин, 2',3'дидезоксиуридин, 2',3'дидезоксицитозин, 2',3'дидезоксигуанозин, и 2',3'дидезокситимин. В некоторых вариантах осуществления включение терминирующего нуклеотида в мРНК, например при 3'-конце, может привести к стабилизации мРНК, как описано, например, в международной патентной публикации №WO 2013/103659.
мРНК может вместо или дополнительно содержать «шпильку», такую как гистоновую шпильку. «Шпилька» может содержать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более пар нуклеотидных оснований. Например, шпилька может содержать 4, 5, 6, 7 или 8 пар нуклеотидных оснований. Шпилька может быть расположена в любой области мРНК. Например, шпилька может быть расположена в, до или после нетранслируемой области (5'-нетранслируемой области или 3'-нетранслируемой области), кодирующей области или последовательности или поли(А)-хвоста. В некоторых вариантах осуществления шпилька может влиять на одну или более функций мРНК, таких как инициация трансляции, эффективность трансляции и/или терминация транскрипции.
мРНК может вместо или дополнительно содержать поли(А)-последовательность и/или сигнал полиаденилирования. Поли(А)-последовательность может состоять полностью или в основном из адениновых нуклеотидов или их аналогов или производных. Поли(А)-последовательность может представлять собой хвост, расположенный рядом с 3'-нетранслируемой областью мРНК. В некоторых вариантах осуществления поли(А)-последовательность может влиять на ядерный экспорт, трансляцию и/или стабильность мРНК.
мРНК может вместо или дополнительно содержать сайт связывания микроРНК.
В некоторых вариантах осуществления мРНК представляет собой бицистронную мРНК, содержащую первую кодирующую область и вторую кодирующую область с промежуточной последовательностью, содержащей последовательность участка внутренней посадки рибосомы (IRES), которая позволяет инициировать внутреннюю трансляцию между первой и второй кодирующими областями, или с промежуточной последовательностью, кодирующей саморасщепляющийся пептид, такой как пептид 2А. Последовательности IRES и пептиды 2А обычно используются для усиления экспрессии множества белков из одного и того же вектора. Множество последовательностей IRES известны и доступны в данной области техники и могут быть использованы, включая, например, IRES вируса энцефаломиокардита.
В одном варианте осуществления полинуклеотиды согласно данному раскрытию могут содержать последовательность, кодирующую саморасщепляющийся пептид. Саморасщепляющийся пептид может представлять собой, но не ограничиваясь этим, пептид 2А. Разнообразные пептиды 2А известны и доступны в данной области техники и могут быть использованы, включая, например, пептид 2А вируса ящура, пептид 2А вируса ринита А, пептид 2А вируса Thosea asigna и пептид 2А тешовируса-1 свиней. Пептиды 2A используются несколькими вирусами для синтеза двух белков из одного транскрипта путем ухода с рибосомы, так что нормальная пептидная связь нарушается в пептидной последовательности 2A, в результате чего в одном трансляционном событии образуются два прерывистых белка. В качестве неограничивающего примера, пептид 2А может иметь последовательность белка: GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 24), его фрагменты или варианты. В одном варианте осуществления пептид 2А расщепляется между последним глицином и последним пролином. В качестве другого неограничивающего примера, полинуклеотиды согласно данному раскрытию могут содержать полинуклеотидную последовательность, кодирующую пептид 2А, имеющий последовательность белка GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 24), его фрагменты или варианты. Одним из примеров полинуклеотидной последовательности, кодирующей пептид 2А, является: GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT (SEQ ID NO: 25). В одном иллюстративном варианте осуществления пептид 2А кодируется следующей последовательностью: 5'-TCCGGACTCAGATCCGGGGATCTCAAAATTGTCGCTCCTGTCAAACAAACTCTTAACTTTG ATTTACTCAAACTGGCTGGGGATGTAGAAAGCAATCCAGGTCCACTC-3'(SEQ ID NO: 26). Полинуклеотидная последовательность пептида 2А может быть модифицирована или оптимизирована по кодонам способами, описанными в данном документе, и/или известными в данной области техники.
В одном варианте осуществления эта последовательность может использоваться для разделения кодирующих областей двух или более представляющих интерес полипептидов. В качестве неограничивающего примера, последовательность, кодирующая пептид F2A, может находиться между первой кодирующей областью A и второй кодирующей областью B (A-F2Apep-B). Присутствие пептида F2A приводит к расщеплению одного длинного белка между глицином и пролином в конце пептидной последовательности F2A (NPGP расщепляется с образованием NPG и P), образуя тем самым отдельный белок A (с 21 аминокислотой присоединенного пептида F2A, заканчивающегося NPG) и отдельный белок B (с 1 аминокислотой P присоединенного пептида F2A). Аналогично, для других пептидов 2A (P2A, T2A и E2A) присутствие пептида в длинном белке приводит к расщеплению между глицином и пролином в конце последовательности пептида 2A (NPGP расщепляется с образованием NPG и P). Белок А и белок В могут представлять собой одинаковые или разные представляющие интерес пептиды или полипептиды. В конкретных вариантах осуществления белок A представляет собой полипептид, который вызывает иммуногенную клеточную гибель, а белок B представляет собой другой полипептид, который стимулирует воспалительный и/или иммунный ответ, и/или регулирует иммунологическую реактивность (как описано далее ниже).
Модифицированные мРНК
Хотя в некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию полностью содержит немодифицированные нуклеотидные основания, нуклеозиды или нуклеотиды, в некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований, нуклеозидов или нуклеотидов (называемых «модифицированными мРНК» или «ммРНК»). В некоторых вариантах осуществления модифицированные мРНК могут иметь полезные свойства, включая повышенную стабильность, внутриклеточную задержку, улучшенную трансляцию и/или отсутствие значительной индукции врожденного иммунного ответа клетки, в которую вводится мРНК, по сравнению с эталонной немодифицированной мРНК. Следовательно, использование модифицированных мРНК может повышать эффективность продукции белка, внутриклеточное удержание нуклеиновых кислот, а также сохранять пониженную иммуногенность.
В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит одно или более (например, 1, 2, 3 или 4) различных модифицированных нуклеотидных оснований, нуклеозидов или нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления мРНК cодержит одно ли более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более) различных модифицированных нуклеотидных оснований, нуклеозидов или нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированная мРНК может иметь пониженную деградацию в клетке, в которую введена мРНК, по сравнению с соответствующей немодифицированной мРНК.
2
4
5
3
5
5
5
5
5
5
5
5
2
5
2
5
5
2
5
2
5
5
5
2
5
5
2
5
1
5
2
1
4
3
5
3
3
5
5
2
5
2
5
5
5
3
5
В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеотидное основание представляет собой модифицированный урацил. Иллюстративные нуклеотидные основания и нуклеозиды, имеющие модифицированный урацил, включают псевдоуридин (ψ), пиридин-4-один рибонуклеозид, 5-азауридин, 6-азауридин, 2-тио-5-азауридин, 2-тиоуридин (sU), 4-тиоуридин (sU), 4-тиопсевдоуридин, 2-тиопсевдоуридин, 5-гидроксиуридин (hoU), 5- аминоаллилуридин, 5-галоуридин (например, 5-иодуридин 5-бромуридин), 3-метилуридин (mU), 5-метоксиуридин (moU), уридин-5-оксиуксусную кислоту (cmoU), метиловый эфир уридин-5-оксиуксусной кислоты (mcmoU), 5-карбоксиметилуридин (cmU), 1-карбоксиметилпсевдоуридин, 5-карбоксигидроксиметилуридин (chmU), метиловый эфир 5-карбоксигидроксиметилуридина (mchmU), 5-метоксикарбонилметилуридин (mcmU), 5-метоксикарбонилметил-2-тиоуридин (mcmsU), 5-аминометил-2-тиоуридин (nmsU), 5-метиламинометилуридин (mnmU), 5-метиламинометил-2-тиоуридин (mnmsU), 5-метиламинометил-2-селеноуридин (mnmseU), 5-карбамоилметилуридин (ncmU), 5-карбоксиметиламинометилуридин (cmnmU), 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин (cmnmsU), 5-пропинилуридин, 1-пропинилпсевдоуридин, 5-тауринометилуридин (τmU), 1-тауринометилпсевдоуридин, 5-тауринометил-2-тиоуридин (τmsU), 1-тауринометил-4-тиопсевдоуридин, 5-метилуридин (mU, т.е. имеющий основание нуклеиновой кислоты дезокситимин), 1-метилпсевдоуридин (mψ), 5-метил-2-тиоуридин (msU), 1-метил-4-тиопсевдоуридин (msψ), 4-тио-1-метилпсевдоуридин, 3-метилпсевдоуридин (mψ), 2-тио-1-метилпсевдоуридин, 1-метил-1-дезазапсевдоуридин, 2-тио-1-метил-1-дезазапсевдоуридин, дигидроуридин (D), дигидропсевдоуридин, 5,6-дигидроуридин, 5-метилдигидроуридин (mD), 2-тиодигидроуридин, 2-тиодигидропсевдоуридин, 2-метоксиуридин, 2-метокси-4-тиоуридин, 4-метоксипсевдоуридин, 4-метокси-2-тиопсевдоуридин, N1-метилпсевдоуридин, 3-(3-амино-3-карбоксипропил)уридин (acpU), 1-метил-3-(3-амино-3-карбоксипропил)псевдоуридин (acp ψ), 5-(изопентениламинометил)уридин (inmU), 5-(изопентениламинометил)-2-тиоуридин (inmsU), (-тиоуридин, 2'-O-метилуридин (Um), 5,2'-O-диметилуридин (mUm), 2'-O-метилпсевдоуридин (ψm), 2-тио-2'-O-метилуридин (sUm), 5-метоксикарбонилметил-2'-O-метилуридин (mcmUm), 5-карбамоилметил-2'-O-метилуридин (ncmUm), 5-карбоксиметиламинометил-2'-O-метилуридин (cmnmUm), 3,2'-O-диметилуридин (mUm),и 5-(изопентениламинометил)-2'-O-метилуридин (inmUm), 1-тиоуридин, дезокситимидин, 2'-F-арауридин, 2'-F-уридин, 2'-OH-арауридин, 5-(2-карбометоксивинил)уридин и 5-[3-(1-Е-пропениламино)уридин].
3
4
5
4
5
5
2
5
4
4
5
4
2
2
В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеотидное основание представляет собой модифицированный цитозин. Иллюстративные нуклеотидные основания и нуклеозиды, имеющие модифицированный цитозин, включают 5-азацитидин, 6-азацитидин, псевдоизоцитидин, 3-метилцитидин (mC), N4-ацетилцитидин (acC), 5-формилцитидин (fC), N4-метилцитидин (mC), 5-метилцитидин (mC), 5-галогенцитидин (например, 5-иодцитидин), 5-гидроксиметилцитидин (hmC), 1-метилпсевдоизоцитидин, пирролоцитидин, пирролопсевдоизоцитидин, 2-тиоцитидин (sC), 2-тио-5-метилцитидин, 4-тиопсевдоизоцитидин, 4-тио-1-метилпсевдоизоцитидин, 4-тио-1-метил-1-дезазапсевдоизоцитидин, 1-метил-1-дезазапсевдоизоцитидин, зебуларин, 5-азазебуларин, 5-метилзебуларин, 5-аза-2-тиозебуларин, 2-тиозебуларин, 2-метоксицитидин, 2-метокси-5-метилцитидин, 4-метоксипсевдоизоцитидин, 4-метокси-1-метилпсевдоизоцитидин, лизидин (kC), α-тиоцитидин, 2'-O-метилцитидин (Cm), 5,2'-O-диметилцитидин (mCm), N4-ацетил-2'-O-метилцитидин (acCm), N4,2'-O-диметилцитидин (mCm), 5-формил-2'-O-метилцитидин (fCm), N4,N4,2'-O-триметилцитидин (mCm), 1-тиоцитидин, 2'-F-арацитидин, 2'-F-цитидин и 2'-OH-арацитидин.
1
2
6
2
6
6
2
6
6
2
6
6
6
6
6
2
6
6
6
2
6
6
6
6
1
2
2
В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеотидное основание представляет собой модифицированный аденин. Иллюстративные нуклеотидные основания и нуклеозиды, имеющие модифицированный аденин, включают α-тиоаденозин, 2-аминопурин, 2,6-диаминопурин, 2-амино-6-галогенпурин (например, 2-амино-6-хлорпурин), 6-галогенпурин (например, 6-хлорпурин), 2-амино-6-метилпурин, 8-азидоаденозин, 7-дезазааденин, 7-дезаза-8-азааденин, 7-дезаза-2-аминопурин, 7-дезаза-8-аза-2-аминопурин, 7-дезаза-2,6-диаминопурин, 7-дезаза-8-аза-2,6-диаминопурин, 1-метиладенозин (mA), 2-метиладенин (mA), N6-метиладенозин (mA), 2-метилтио-N6-метиладенозин (msmA), N6-изопентениладенозин (iA), 2-метилтио-N6-изопентениладенозин (msiA), N6-цис-гидроксиизопентенил)аденозин (ioA), 2-метилтио-N6-(цис-гидроксиизопентенил)аденозин (msioA), N6-глицинилкарбамоиладенозин (gA), N6-треонилкарбамоиладенозин (tA), N6-метил-N6-треонилкарбамоиладенозин (mtA), 2-метилтио-N6-треонилкарбамоиладенозин (msgA), N6,N6-диметиладенозин (mA), N6-гидроксинорвалилкарбамоиладенозин (hnA), 2-метилтио-N6-гидроксинорвалилкарбамоиладенозин (mshnA), N6-ацетиладенозин (acA), 7-метиладенин, 2-метилтиоаденин, 2-метоксиаденин, α-тиоаденозин, 2'-O-метиладенозин (Am), N6,2'-O-диметиладенозин (mAm), N6,N6,2'-O-триметиладенозин (mAm), 1,2'-O-диметиладенозин (mAm), 2'-O-рибозиладенозин (фосфат) (Ar(p)), 2-амино-N6-метилпурин, 1-тиоаденозин, 8-азидоаденозин, 2'-F-арааденозин, 2'-F-аденозин, 2'-OH-арааденозин и N6-(19-аминопентаоксанонадецил)-аденозин.
1
+
7
1
2
2
2,7
2,2,7
2
2
1
2,7
1
2
0
1
2
2
В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеотидное основание представляет собой модифицированный гуанин. Иллюстративные нуклеотидные основания и нуклеозиды, имеющие модифицированный гуанин, включают α-тиогуанозин, инозин (I), 1-метилинозин (mI), виозин (imG), метилвиозин (mimG), 4-деметилвиозин (imG-14), изовиозин (imG2), вибутозин (yW), пероксивибутозин (oyW), гидроксивибутозин (OhyW), недостаточно модифицированный гидроксивибутозин (OhyW*), 7-дезазагуанозин, квеуозин (Q), эпоксиквеуозин (oQ), галактозилквеуозин (galQ), маннозилквеуозин (manQ), 7-циано-7-дезазагуанозин (preQ), 7-аминометил-7-дезазагуанозин (preQ), археозин (G), 7-дезаза-8-азагуанозин, 6-тиогуанозин, 6-тио-7-дезазагуанозин, 6-тио-7-дезаза-8-азагуанозин, 7-метилгуанозин (mG), 6-тио-7-метилгуанозин, 7-метилинозин, 6-метоксигуанозин, 1-метилгуанозин (mG), N2-метилгуанозин (mG), N2,N2-диметилгуанозин (mG), N2,7-диметилгуанозин (mG), N2,N2,7-диметилгуанозин (mG), 8-оксогуанозин, 7-метил-8-оксо-гуанозин, 1-метил-6-тиогуанозин, N2-метил-6-тиогуанозин, N2,N2-диметил-6-тиогуанозин, α-тиогуанозин, 2'-O-метилгуанозин (Gm), N2-метил-2'-O-метилгуанозин (mGm), N2,N2-диметил-2'-O-метилгуанозин (mGm), 1-метил-2'-O-метилгуанозин (mGm), N2,7-диметил-2'-O-метилгуанозин (mGm), 2'-O-метилинозин (Im), 1,2'-O-диметилинозин (mIm), 2'-O-рибозилгуанозин (фосфат) (Gr(p)), 1-тиогуанозин, О6-метилгуанозин, 2'-F-арагуанозин и 2'-F-гуанозин.
В некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию содержит комбинацию одного или более из вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований (например, комбинацию из 2, 3 или 4 вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований).
1
1
1
1
1
В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеотидное основание представляет собой псевдоуридин (ψ), N1-метилпсевдоуридин (mψ), 2-тиоуридин, 4'-тиоуридин, 5-метилцитозин, 2-тио-1-метил-1-дезазапсевдоуридин, 2-тио- 1-метилпсевдоуридин, 2-тио-5-азауридин, 2-тиодигидропсевдоуридин, 2-тиодигидроуридин, 2-тиопсевдоуридин, 4-метокси-2-тиопсевдоуридин, 4-метоксипсевдоуридин, 4-тио-1-метилпсевдоуридин, 4-тиопсевдоуридин, 5-азауридин, дигидропсевдоуридин, 5-метоксиуридин или 2'-O-метилуридин. В некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию содержит комбинацию одного или более из вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований (например, комбинацию из 2, 3 или 4 вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований). В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеотидное основание представляет собой N1-метилпсевдоуридин (mψ), и мРНК согласно раскрытию полностью модифицирована N1-метилпсевдоуридином (mψ). В некоторых вариантах осуществления N1-метилпсевдоуридин (mψ) представляет 75-100% урацилов в мРНК. В некоторых вариантах осуществления N1-метилпсевдоуридин (mψ) представляет 100% урацилов в мРНК.
4
5
5
2
В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеотидное основание представляет собой модифицированный цитозин. Иллюстративные нуклеотидные основания и нуклеозиды, имеющие модифицированный цитозин, включают N4-ацетилцитидин (acC), 5-метилцитидин (mC), 5-галогенцитидин (например, 5-иодцитидин), 5-гидроксиметилцитидин (hmC), 1-метил-псевдоизоцитидин, 2-тиоцитидин (sC), 2-тио-5-метилцитидин. В некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию содержит комбинацию одного или более из вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований (например, комбинацию из 2, 3 или 4 вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований).
1
2
6
В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеотидное основание представляет собой модифицированный аденин. Иллюстративные нуклеотидные основания и нуклеозиды, имеющие модифицированный аденин, включают 7-дезазааденин, 1-метиладенозин (mA), 2-метиладенин (mA), N6-метиладенозин (mA). В некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию содержит комбинацию одного или более из вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований (например, комбинацию из 2, 3 или 4 вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований).
1
7
1
0
1
В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеотидное основание представляет собой модифицированный гуанин. Иллюстративные нуклеотидные основания и нуклеозиды, имеющие модифицированный гуанин, включают инозин (I), 1-метилинозин (mI), виозин (imG), метилвиозин (mimG), 7-дезазагуанозин, 7-циано-7-дезазагуанозин (preQ), 7-аминометил-7-дезазагуанозин (preQ), 7-метилгуанозин (mG), 1-метилгуанозин (mG), 8-оксогуанозин, 7-метил-8-оксогуанозин. В некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию содержит комбинацию одного или более из вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований (например, комбинацию из 2, 3 или 4 вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований).
1
5
5
В некоторых вариантах осуществления модифициованное основание представляет собой 1-метилпсевдоуридин (mψ), 5-метоксиуридин (moU), 5-метилцитидин (mC), псевдоуридин (ψ), α-тиогуанозин или α-тиоаденозин. В некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию содержит комбинацию одного или более из вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований (например, комбинацию из 2, 3 или 4 вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных оснований).
5
1
1
5
2
5
5
5
5
5
6
6
5
В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит псевдоуридин (ψ). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит псевдоуридин (ψ) и 5-метилцитидин (mC). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 1-метилпсевдоуридин (mψ). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 1-метилпсевдоуридин (mψ) и 5-метилцитидин (mC). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 2-тиоуридин (sU). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 2-тиоуридин и 5-метилцитидин (mC). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 5-метоксиуридин (moU). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 5-метоксиуридин (moU) и 5-метилцитидин (mC). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 2'-O-метилуридин. В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 2'-O-метилуридин и 5-метилцитидин (mC). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит N6-метиладенозин (mA). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит N6-метиладенозин (mA) и 5-метилцитидин (mC).
5
5
В определенных вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию является равномерно модифицированной (то есть полностью модифицированной, модифицированной по всей последовательности) для конкретной модификации. Например, мРНК может быть равномерно модифицирована 5-метилцитидином (mC), что означает, что все остатки цитозина в последовательности мРНК заменены 5-метилцитидином (mC). Подобным образом, мРНК согласно раскрытию может быть равномерно модифицирована для любого типа нуклеозидного остатка, присутствующего в последовательности, путем замены модифицированным остатком, таким как указанные выше.
В некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию может быть модифицирована в кодирующей области (например, в открытой рамке считывания, кодирующей полипептид). В других вариантах осуществления мРНК может быть модифицирована в областях помимо кодирующей области. Например, в некоторых вариантах осуществления предложены 5'-НТО и/или 3'-НТО, причем одна или обе могут независимо содержать одну или более различных модификаций нуклеозидов. В таких вариантах осуществления модификации нуклеозидов также могут присутствовать в кодирующей области.
Примеры модификаций нуклеозидов и их комбинаций, которые могут присутствовать в ммРНК согласно данному раскрытию, включают, но не ограничиваются ими, описанные в публикациях заявок на патенты PCT: WO2012045075, WO2014081507, WO2014093924, WO2014164253 и WO2014159813.
ммРНК согласно раскрытию может содержать комбинацию модификаций сахара, нуклеотидного основания и/или межнуклеозидной связи. Эти комбинации могут содержать любую одну или более модификаций, описанных в данном документе.
Примеры модифицированных нуклеозидов и комбинаций модифицированных нуклеозидов представлены ниже в Таблице 1 и Таблице 2. Данные комбинации модифицированных нуклеотидов могут быть использованы для образования ммРНК согласно раскрытию. В определенных вариантах осуществления модифицированные нуклеозиды могут быть частично или полностью замещены природными нуклеотидами мРНК согласно раскрытию. В качестве неограничивающего примера природный уридиновый нуклеотид может быть замещен модифицированным нуклеозидом, описанным в данном документе. В другом неограничивающем примере природный нуклеозид уридин может быть частично замещен (например, около 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99,9% природных уридинов) по меньшей мере одним модифицированным нуклеозидом, раскрытым в данном документе.
Таблица 1. Комбинации модификаций нуклеозидов
Модифицированный нуклеотид
Комбинация модифицированных нуклеотидов
α-тиоцитидин
α-тиоцитидин/5-иодуридин
α-тиоцитидин/N1-метилпсевдоуридин
α-тиоцитидин/α-тиоуридин
α-тиоцитидин/5-метилуридин
α-тиоцитидин/псевдоуридин
около 50% цитозинов представляют собой α-тио-цитидин
псевдоизоцитидин
псевдоизоцитидин/5-иодуридин
псевдоизоцитидин/N1-метилпсевдоуридин
псевдоизоцитидин/α-тиоуридин
псевдоизоцитидин/5-метилуридин
псевдоизоцитидин/псевдоуридин
около 25% цитозинов представляют собой псевдоизоцитидин
псевдоизоцитидин/около 50% уридинов представляют собой N1-метил-псевдоуридин и около 50% уридинов представляют собой псевдоуридин
псевдоизоцитидин/около 25% уридинов представляют собой N1-метилпсевдоуридин и около 25% уридинов представляют собой псевдоуридин
пирролоцитидин
пирролоцитидин/5-иодуридин
пирролоцитидин/N1-метилпсевдоуридин
пирролоцитидин/α-тиоуридин
пирролоцитидин/5-метилуридин
пирролоцитидин/псевдоуридин
около 50% цитозинов представляют собой пирролоцитидин
5-метилцитидин
5-метилцитидин/5-иодуридин
5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин
5-метилцитидин/α-тиоуридин
5-метилцитидин/5-метилуридин
5-метилцитидин/псевдоуридин
около 25% цитозинов представляют собой 5-метилцитидин
около 50% цитозинов представляют собой 5-метилцитидин
5-метилцитидин/5-метоксиуридин
5-метилцитидин/5-бромуридин
5-метилцитидин/2-тиоуридин
5-метилцитидин/около 50% уридинов представляют собой 2-тиоуридин
около 50% уридинов представляют собой 5-метилцитидин/около 50% уридинов представляют собой 2-тиоуридин
N4-ацетилцитидин
N4-ацетилцитидин/5-иодуридин
N4-ацетилцитидин/N1-метилпсевдоуридин
N4-ацетилцитидин/α-тиоуридин
N4-ацетилцитидин/5-метилуридин
N4-ацетилцитидин/псевдоуридин
около 50% цитозинов представляют собой N4-ацетилцитидин
около 25% цитозинов представляют собой N4-ацетилцитидин
N4-ацетилцитидин/5-метоксиуридин
N4-ацетилцитидин/5-бромуридин
N4-ацетилцитидин/2-тиоуридин
около 50% цитозинов представляют собой N4-ацетилцитидин/около 50% уридинов представляют собой 2-тиоуридин
Таблица 2. Модифицированные нуклеозиды и их комбинации
1-(2,2,2-трифторэтил)псевдо-УТФ
1-этилпсевдо-УТФ
1-метилпсевдо-У-альфа-тио-ТФ
1-метилпсевдоуридин ТФ, АТФ, ГТФ, ЦТФ
1-метилпсевдо-УТФ/5-метил-ЦТФ/АТФ/ГТФ
1-метилпсевдо-УТФ/ЦТФ/АТФ/ГТФ
1-пропилпсевдо-УТФ
25% 5-аминоаллил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
25% 5-аминоаллил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
25% 5-бром-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
25% 5-бром-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
25% 5-бром-ЦТФ+75% ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ
25% 5-карбокси-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
25% 5-карбокси-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
25% 5-этил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
25% 5-этил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
25% 5-этинил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
25% 5-этинил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
25% 5-фтор-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
25% 5-фтор-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
25% 5-формил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
25% 5-формил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
25% 5-гидроксиметил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
25% 5-гидроксиметил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
25% 5-иод-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
25% 5-иод-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
25% 5-метокси-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
25% 5-метокси-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
25% 5-метил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% 1-метилпсевдо-УТФ
25% 5-метил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
25% 5-метил-ЦТФ+75% ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% 1-метилпсевдо-УТФ
25% 5-метил-ЦТФ+75% ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% УТФ
25% 5-метил-ЦТФ+75% ЦТФ/5-метокси-УТФ
25% 5-метил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% 1-метилпсевдо-УТФ
25% 5-метил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
25% 5-фенил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
25% 5-фенил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
25% 5-трифторметил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
25% 5-трифторметил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
25% 5-трифторметил-ЦТФ+75% ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ
25% N4-Ac-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
25% N4-Ac-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
25% N4-Bz-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
25% N4-Bz-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
25% N4-метил-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
25% N4-метил-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
25% псевдоизо-ЦТФ+75% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
25% псевдоизо-ЦТФ+75% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
25% 5-бром-ЦТФ/75% ЦТФ/псевдо-УТФ
25% 5-метокси-УТФ/25% 5-метил-ЦТФ /АТФ/ГТФ
25% 5-метокси-УТФ/5-метил-ЦТФ/АТФ/ГТФ
25% 5-метокси-УТФ/75% 5-метил-ЦТФ /АТФ/ГТФ
25% 5-метокси-УТФ/ЦТФ/АТФ/ГТФ
25% 5-метокси-УТФ/50% 5-метил-ЦТФ /АТФ/ГТФ
2-амино-АТФ
2-тио-ЦТФ
2-тиопсевдоуридин ТФ, АТФ, ГТФ, ЦТФ
2-тиопсевдо-УТФ
2-тио-УТФ
3-метил-ЦТФ
3-метилпсевдо-УТФ
4-тио-УТФ
50% 5-бром-ЦТФ+50% ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ
50% 5-гидроксиметил-ЦТФ+50% ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ
50% 5-метокси-УТФ/5-метил-ЦТФ/АТФ/ГТФ
50% 5-метил-ЦТФ+50% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% 1-метилпсевдо-УТФ
50% 5-метил-ЦТФ+50% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
50% 5-метил-ЦТФ+50% ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% 1-метилпсевдо-УТФ
50% 5-метил-ЦТФ+50% ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% УТФ
50% 5-метил-ЦТФ+50% ЦТФ/5-метокси-УТФ
50% 5-метил-ЦТФ+50% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% 1-метилпсевдо-УТФ
50% 5-метил-ЦТФ+50% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
50% 5-трифторметил-ЦТФ+50% ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ
50% 5-бром-ЦТФ/50% ЦТФ/псевдо-УТФ
50% 5-метокси-УТФ/25% 5-метил-ЦТФ /АТФ/ГТФ
50% 5-метокси-УТФ/50% 5-метил-ЦТФ /АТФ/ГТФ
50% 5-метокси-УТФ/75% 5-метил-ЦТФ /АТФ/ГТФ
50% 5-метокси-УТФ/ЦТФ/АТФ/ГТФ
5-аминоаллил-ЦТФ
5-аминоаллил-ЦТФ/ 5-метокси-УТФ
5-аминоаллил-УТФ
5-бром-ЦТФ
5-бром-ЦТФ/5-метокси-УТФ
5-бром-ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ
5-бром-ЦТФ/псевдо-УТФ
5-бромцитидин ТФ, АТФ, ГТФ, УТФ
5-бром-УТФ
5-карбокси-ЦТФ/5-метокси-УТФ
5-этил-ЦТФ/5-метокси-УТФ
5-этинил-ЦТФ/5-метокси-УТФ
5-фтор-ЦТФ/5-метокси-УТФ
5-формил-ЦТФ/5-метокси-УТФ
5-гидроксиметил-ЦТФ/5-метокси-УТФ
5-гидроксиметил-ЦТФ
5-гидроксиметил-ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ
5-гидроксиметил-ЦТФ/5-метокси-УТФ
5-гидроксиметилцитидин ТФ, АТФ, ГТФ, УТФ
5-иод-ЦТФ/5-метокси-УТФ
5-Me-ЦТФ/5-метокси-УТФ
5-метоксикарбонил метил-УТФ
5-метокси-ЦТФ/5-метокси-УТФ
5-метоксиуридин ТФ, АТФ, ГТФ, УТФ
5-метокси-УТФ
5-метокси-УТФ
5-метокси-УТФ/N6-изопентенил-АТФ
5-метокси-УТФ/25% 5-метил-ЦТФ/АТФ/ГТФ
5-метокси-УТФ/5-метил-ЦТФ/АТФ/ГТФ
5-метокси-УТФ/75% 5-метил-ЦТФ/АТФ/ГТФ
5-метокси-УТФ/ЦТФ/АТФ/ГТФ
5-метил-2-тио-УТФ
5-метиламинометил-УТФ
5-метил-ЦТФ/5-метокси-УТФ
5-метил-ЦТФ/5-метокси-УТФ (кэп 0)
5-метил-ЦТФ/5-метокси-УТФ (без кэпа)
5-метил-ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% 1-метилпсевдо-УТФ
5-метил-ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
5-метил-ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% 1-метилпсевдо-УТФ
5-метил-ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% УТФ
5-метил- ЦТФ/5-метокси-УТФ/N6-Ме-АТФ
5-метил-ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% 1-метилпсевдо-УТФ
5-метил-ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
5-фенил-ЦТФ/5-метокси-УТФ
5-трифторметил-ЦТФ/5-метокси-УТФ
5-трифторметил-ЦТФ
5-трифторметил-ЦТФ/5-метокси-УТФ
5-трифторметил-ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ
5-трифторметил-ЦТФ/псевдо-УТФ
5-трифторметил-УТФ
5-трифторметилцитидин ТФ, АТФ, ГТФ, УТФ
75% 5-аминоаллил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
75% 5-аминоаллил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
75% 5-бром-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
75% 5-бром-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
75% 5-карбокси-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
75% 5-карбокси-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
75% 5-этил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
75% 5-этил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
75% 5-этинил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
75% 5-этинил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
75% 5-фтор-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
75% 5-фтор-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
75% 5-формил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
75% 5-формил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
75% 5-гидроксиметил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
75% 5-гидроксиметил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
75% 5-иод-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
75% 5-иод-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
75% 5-метокси-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
75% 5-метокси-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
75% 5-метокси-УТФ/5-метил-ЦТФ/АТФ/ГТФ
75% 5-метил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% 1-метилпсевдо-УТФ
75% 5-метил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
75% 5-метил-ЦТФ+25% ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% 1-метилпсевдо-УТФ
75% 5-метил-ЦТФ+25% ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% УТФ
75% 5-метил-ЦТФ+25% ЦТФ/5-метокси-УТФ
75% 5-метил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% 1-метилпсевдо-УТФ
75% 5-метил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
75% 5-фенил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
75% 5-фенил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
75% 5-трифторметил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
75% 5-трифторметил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
75% 5-трифторметил-ЦТФ+25% ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ
75% N4-Ac-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
75% N4-Ac-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
75% N4-Bz-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
75% N4-Bz-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
75% N4-метил-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
75% N4-метил-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
75% псевдоизо-ЦТФ+25% ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
75% псевдоизо-ЦТФ+25% ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
75% 5-бром-ЦТФ/25% ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ
75% 5-бром-ЦТФ/25% ЦТФ/псевдо-УТФ
75% 5-метокси-УТФ/25% 5-метил-ЦТФ /АТФ/ГТФ
75% 5-метокси-УТФ/50% 5-метил-ЦТФ /АТФ/ГТФ
75% 5-метокси-УТФ/75% 5-метил-ЦТФ /АТФ/ГТФ
75% 5-метокси-УТФ/ЦТФ/АТФ/ГТФ
8-аза-АТФ
Альфа-тио-ЦТФ
ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% 1-метилпсевдо-УТФ
ЦТФ/25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ
ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% 1-метилпсевдо-УТФ
ЦТФ/50% 5-метокси-УТФ+50% УТФ
ЦТФ/5-Метокси-УТФ
ЦТФ/5-метокси-УТФ (кэп 0)
ЦТФ/5-метокси-УТФ (без кэпа)
ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% 1-метилпсевдо-УТФ
ЦТФ/75% 5-метокси-УТФ+25% УТФ
ЦТФ/УТФ (без кэпа)
N1-Me-ГТФ
N4-Ac-ЦТФ
N4Ac-ЦТФ/1-метилпсевдо-УТФ
N4Ac-ЦТФ/5-метокси-УТФ
N4-ацетилцитидин ТФ, АТФ, ГТФ, УТФ
N4-Bz-ЦТФ/5-метокси-УТФ
N4-метил ЦТФ
N4-метил-ЦТФ/5-метокси-УТФ
Псевдоизо-ЦТФ/5-метокси-УТФ
псевдо-У-альфа-тио-ТФ
псевдоуридин ТФ, АТФ, ГТФ, ЦТФ
псевдо-УТФ/5-метил-ЦТФ/АТФ/ГТФ
метиловый эфир УТФ-5-оксиуксусной кислоты
Ксантозин
В соответствии с раскрытием полинуклеотиды согласно раскрытию могут быть синтезированы, чтобы содержать комбинации или отдельные модификации из Таблицы 1 или Таблицы 2.
Если указана одна модификация, указанный нуклеозид или нуклеотид представляет 100 процентов того нуклеотида или нуклеозида, A, U, G или C, который был модифицирован. Там, где указаны проценты, они представляют собой процентное содержание данного конкретного трифосфата нуклеотидного основания A, U, G или C от общего количества присутствующего трифосфата A, U, G или C. Например, комбинация: 25% 5-аминоаллил-ЦТФ+75% ЦТФ/ 25% 5-метокси-УТФ+75% УТФ относится к полинуклеотиду, где 25% цитозинтрифосфаты представляют собой 5-аминоаллил-ЦТФ, в то время как 75% цитозинов представляют собой ЦТФ; тогда как 25% урацилов представляют собой 5-метокси-УТФ, в то время как 75% урацилов представляют собой УТФ. Если в списке нет модифицированных УТФ, то встречающиеся в природе АТФ, ЦТФ, ГТФ и/или ЦТФ используются в 100% сайтов этих нуклеотидов, обнаруженных в полинуклеотиде. В этом примере все нуклеотиды ГТФ и АТФ остаются немодифицированными.
мРНК согласно данному раскрытию, или их области могут быть оптимизированы по кодонам. Методы оптимизации кодонов известны в данной области техники и могут быть полезны для различных целей: согласования частот кодонов в организмах-хозяевах для обеспечения надлежащего свертывания, сдвига в данных содержания GC для повышения стабильности мРНК или уменьшения вторичных структур, минимизации тандемных повторных кодонов или базовых прогонов, которые могут нарушать конструирование или экспрессию генов, настраивания области контроля транскрипции и трансляции, вставки или удаления последовательности переноса белков, удаления/добавления сайтов посттрансляционной модификации в кодируемых белках (например, сайты гликозилирования), добавления, удаления или перетасовке белковых доменов, вставки или удаления сайтов рестрикции, модификации сайтов связывания рибосом и сайтов деградации мРНК, регуляции скорости трансляции, чтобы позволить различным доменам белка правильно сворачиваться, или уменьшать или устранять проблемные вторичные структуры в полинуклеотиде. В данной области техники известны инструменты, алгоритмы и сервисы оптимизации; неограничивающие примеры включают сервисы от GeneArt (Life Technologies), DNA2.0 (Menlo Park, CA) и/или проприетарные методы. В одном варианте осуществления последовательность мРНК оптимизируют с использованием алгоритмов оптимизации, например, для оптимизации экспрессии в клетках млекопитающих или повышения стабильности мРНК.
В определенных вариантах осуществления данное раскрытие включает полинуклеотиды, имеющие по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности последовательности с любой из полинуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе.
мРНК согласно данному раскрытию могут быть получены способами, доступными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, транскрипцию in vitro (IVT) и методы синтеза. Можно использовать ферментативные (IVT), твердофазные, жидкофазные, комбинированные методы синтеза, синтез малых областей и способы лигирования. В одном варианте осуществления мРНК получают с использованием методов ферментативного синтеза IVT. Способы получения полинуклеотидов с помощью IVT известны в данной области техники описаны в международной заявке PCT/US2013/30062, содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки. Соответственно, данное раскрытие также включает полинуклеотиды, например ДНК, конструкты (например, плазмиды) и векторы (например, вирусные векторы), которые можно использовать для транскрипции in vitro мРНК, описанной в данном документе.
Неприродные модифицированные нуклеотидные основания могут быть введены в полинуклеотиды, например, мРНК, во время синтеза или после синтеза. В определенных вариантах осуществления модификации могут быть на межнуклеозидных связях, пуриновых или пиримидиновых основаниях или сахаре. В конкретных вариантах осуществления модификация может быть введена на конце полинуклеотидной цепи или где-либо еще в полинуклеотидной цепи; с использованием химического синтеза или полимеразы. Примеры модифицированных нуклеиновых кислот и их синтез раскрыты в заявке PCT №PCT/US2012/058519. Синтез модифицированных полинуклеотидов также описан в Verma and Eckstein, Annual Review of Biochemistry, vol. 76, 99-134 (1998).
Для конъюгирования полинуклеотидов или их областей с различными функциональными группами, такими как нацеливающие агенты или агенты доставки, флуоресцентные метки, жидкости, наночастицы и т.д. можно использовать или методы ферментативного, или химического лигирования. Конъюгаты полинуклеотидов и модифицированных полинуклеотидов рассматриваются в Goodchild, Bioconjugate Chemistry, vol. 1(3), 165-187 (1990).
Сайты связывания микроРНК (миРНК)
Полинуклеотиды согласно раскрытию могут содержать регуляторные элементы, например сайты связывания микроРНК (миРНК), сайты связывания фактора транскрипции, структурированные последовательности и/или мотивы мРНК, искусственные сайты связывания, сконструированные так, чтобы действовать в качестве псевдорецепторов для молекул, связывающих эндогенную нуклеиновую кислоту, и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, содержащие такие регуляторные элементы, упоминаются как содержащие «сенсорные последовательности». Неограничивающие примеры сенсорных последовательностей описаны в публикации США 2014/0200261, содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид (например, рибонуклеиновая кислота (РНК), например, матричная РНК (мРНК)) согласно раскрытию содержит открытую рамку считывания (ОРС), кодирующую представляющий интерес полипептид, и дополнительно содержит один или более сайт(ов) связывания миРНК. Включение или вставка сайта(ов) связывания миРНК обеспечивает регуляцию полинуклеотидов согласно раскрытию и, в свою очередь, полипептидов, кодируемых из них, на основе тканеспецифической и/или специфической для клеточного типа экспрессии природных миРНК.
миРНК, например природная миРНК, представляет собой некодирующую РНК длиной 19-25 нуклеотидов, которая связывается с полинуклеотидом и подавляет экспрессию генов или путем снижения стабильности, или путем ингибирования трансляции полинуклеотида. Последовательность миРНК содержит «затравочную» область, то есть последовательность в области положений 2-8 зрелой миРНК. Затравочная область миРНК может содержать положения 2-8 или 2-7 зрелой миРНК. В некоторых вариантах осуществления затравочная область миРНК может содержать 7 нуклеотидов (например, нуклеотиды 2-8 зрелой миРНК), где комплементарный сайт семян в соответствующем сайте связывания миРНК фланкирован аденозином (A), противоположным положению 1 миРНК. В некоторых вариантах осуществления затравочная область миРНК может содержать 6 нуклеотидов (например, нуклеотиды 2-7 зрелой миРНК), где комплементарный сайт семян в соответствующем сайте связывания миРНК фланкирован аденозином (A), противоположным положению 1 миРНК. См., например, Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP; Mol Cell. 2007 Jul 6;27(1):91-105. Профилирование миРНК целевых клеток или тканей может проводиться для определения наличия или отсутствия миРНК в клетках или тканях. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид (например, рибонуклеиновая кислота (РНК), например, матричная РНК (мРНК)) согласно раскрытию содержит один или более сайтов связывания микроРНК, целевые последовательности РНК, комплементарные последовательности микроРНК или комплементарные последовательности затравочной области микроРНК. Такие последовательности могут соответствовать, например, иметь комплементарность с любой известной микроРНК, такой как те, которые описаны в публикации США US2005/0261218 и публикации США US2005/0059005, содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.
Используемый в данном документе термин «сайт связывания микроРНК (миРНК или miR)» относится к последовательности в пределах полинуклеотида, например, в пределах ДНК или в пределах транскрипта РНК, в том числе в 5'-НТО и/или 3'-НТО, которая имеет достаточную комплементарность ко всей или к области миРНК для взаимодействия, соединения с или связывания с миРНК. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид согласно раскрытию содержит ОРС, кодирующую представляющий интерес полипептид, и дополнительно содержит один или более сайт(ов) связывания миРНК. В иллюстративных вариантах осуществления 5'-НТО и/или 3'-НТО полинуклеотида (например, рибонуклеиновой кислоты (РНК), например, матричной РНК (мРНК)) содержит один или более сайт(ов) связывания миРНК.
Сайт связывания миРНК, имеющий достаточную комплементарность с миРНК, относится к степени комплементарности, достаточной для облегчения миРНК-опосредованной регуляции полинуклеотида, например, миРНК-опосредованной репрессии трансляции или деградации полинуклеотида. В иллюстративных аспектах раскрытия, сайт связывания миРНК, имеющий достаточную комплементарность к миРНК, относится к степени комплементарности, достаточной для облегчения миРНК-опосредованной деградации полинуклеотида, например, расщепления мРНК, опосредованного направляемым миРНК РНК-индуцируемым комплексом сайленсинга (RISC). Сайт связывания миРНК может иметь комплементарность, например, с последовательностью миРНК из 19-25 нуклеотидов, с последовательностью миРНК из 19-23 нуклеотидов или с последовательностью миРНК из 22 нуклеотидов. Сайт связывания миРНК может быть комплементарен только части миРНК, например, части менее 1, 2, 3 или 4 нуклеотидов природной полноразмерной последовательности миРНК. Полная или абсолютная комплементарность (например, полная комплементарность или абсолютная комплементарность по всей или значительной части длины природной миРНК) является предпочтительной, если желаемой регуляцией является деградация мРНК.
В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК содержит последовательность, которая имеет комплементарность (например, частичную или полную комплементарность) с затравочной последовательностью миРНК. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК содержит последовательность, которая обладает полной комплементарностью с затравочной последовательностью миРНК. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК содержит последовательность, которая имеет комплементарность (например, частичную или полную комплементарность) с последовательностью миРНК. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК содержит последовательность, которая обладает полной комплементарностью с последовательностью миРНК. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК обладает полной комплементарностью с последовательностью миРНК, но для 1, 2 или 3 нуклеотидных замен, концевых добавлений и/или усечений.
В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК имеет ту же длину, что и соответствующая миРНК. В других вариантах осуществления сайт связывания миРНК на один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать нуклеотидов короче, чем соответствующая миРНК на 5'-конце, 3'- конце или обоих. В других вариантах осуществления сайт связывания микроРНК на два нуклеотида короче, чем соответствующая микроРНК на 5'-конце, 3'-конце или обоих. Сайты связывания миРНК, которые короче, чем соответствующие миРНК, по-прежнему способны разрушать мРНК, содержащую один или более сайтов связывания миРНК, или предотвращать трансляцию мРНК.
В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК связывает соответствующую зрелую миРНК, которая является частью активного RISC, содержащего дайсер. В другом варианте осуществления связывание сайта связывания миРНК с соответствующей миРНК в RISC приводит к деградации мРНК, содержащую сайт связывания миРНК, или препятствует трансляции мРНК. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК обладает достаточной комплементарностью по отношению к миРНК, так что комплекс RISC, содержащий миРНК, расщепляет полинуклеотид, содержащий сайт связывания миРНК. В других вариантах осуществления сайт связывания миРНК имеет неполную комплементарность, так что комплекс RISC, содержащий миРНК, индуцирует нестабильность в полинуклеотиде, содержащем сайт связывания миРНК. В другом варианте осуществления сайт связывания миРНК имеет неполную комплементарность, так что комплекс RISC, содержащий миРНК, репрессирует транскрипцию полинуклеотида, содержащего сайт связывания миРНК.
В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК имеет одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать несоответствий с соответствующей миРНК.
В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК имеет по меньшей мере около десяти, по меньшей мере около одиннадцати, по меньшей мере около двенадцати, по меньшей мере около тринадцати, по меньшей мере около четырнадцати, по меньшей мере около пятнадцати, по меньшей мере около шестнадцати, по меньшей мере около семнадцати, при по меньшей мере около восемнадцати, по меньшей мере около девятнадцати, по меньшей мере около двадцати или по меньшей мере около двадцати одного смежных нуклеотидов, комплементарных по меньшей мере около десяти, по меньшей мере около одиннадцати, по меньшей мере около двенадцати, по меньшей мере около тринадцати, по меньшей мере около четырнадцати, по меньшей мере около пятнадцати, по меньшей мере около шестнадцати, по меньшей мере около семнадцати, по меньшей мере около восемнадцати, по меньшей мере около девятнадцати, по меньшей мере около двадцати или по меньшей мере около двадцати одного, соответственно, смежного нуклеотидам соответствующей миРНК.
Путем встраивания одного или более сайтов связывания миРНК в полинуклеотид согласно раскрытию, полинуклеотид может быть нацелен на деградацию или пониженную трансляцию, при условии наличия рассматриваемой миРНК. Это может уменьшить нежелательные эффекты при доставке полинуклеотида. Например, если полинуклеотид согласно раскрытию не предназначен для доставки в ткань или клетку, но в конечном итоге является указанной тканью или клеткой, то миРНК, присутствующая в ткани или клетке, может ингибировать экспрессию представляющего интерес гена, если один или множество сайтов связывания миРНК встроены в 5'-НТО и/или 3'-НТО полинуклеотида.
Наоборот, сайты связывания миРНК могут быть удалены из полинуклеотидных последовательностей, в которых они встречаются в природе, для увеличения экспрессии белка в определенных тканях. Например, сайт связывания для конкретной миРНК может быть удален из полинуклеотида для улучшения экспрессии белка в тканях или клетках, содержащих миРНК.
В одном варианте осуществления полинуклеотид согласно раскрытию может содержать по меньшей мере один сайт связывания миРНК в 5'-НТО и/или 3'-НТО для регуляции цитотоксических или цитопротекторных терапевтических средств на основе мРНК к конкретным клеткам, таким как, но не ограничиваясь этим, нормальные клетки и/или раковые клетки. В другом варианте осуществления полинуклеотид согласно раскрытию может содержать два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более сайтов связывания миРНК в 5'-НТО и/или 3'-НТО для регуляции цитотоксических или цитопротекторных терапевтических средств на основе мРНК к конкретным клеткам, таким как, но не ограничиваясь этим, нормальные клетки и/или раковые клетки.
Регуляция экспрессии во множестве тканях может быть достигнута путем введения или удаления одного или более сайтов связывания миРНК, например, одного или более отдельных сайтов связывания миРНК. Решение о том, удалять или вставлять сайт связывания миРНК, может быть принято на основе паттернов экспрессии миРНК и/или их профилирования в тканях и/или клетках в процессе развития и/или болезни. Сообщалось об идентификации миРНК, сайтов связывания миРНК, а также об их паттернах экспрессии и роли в биологии (например, Bonauer et al., Curr Drug Targets 2010 11:943-949; Anand and Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176; Contreras and Rao Leukemia 2012 26:404-413 (2011 Dec 20. doi: 10.1038/leu.2011.356); Bartel Cell 2009 136:215-233; Landgraf et al, Cell, 2007 129:1401-1414; Gentner and Naldini, Tissue Antigens. 2012 80:393-403 и ссылки, цитируемые в них; каждая из которых полностью включена в данный документ посредством ссылки).
миРНК и сайты связывания миРНК могут соответствовать любой известной последовательности, включая неограничивающие примеры, описанные в публикациях США №2014/0200261, 2005/0261218 и 2005/0059005, каждая из которых полностью включена в данный документ посредством ссылки.
Примеры тканей для которых известно, что миРНК регулирует мРНК и тем самым экспрессию белка, включают, но не ограничиваются ими, печень (miR-122), мышцы (miR-133, miR-206, miR-208), эндотелиальные клетки (miR -17-92, miR-126), миелоидные клетки (miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27), жировую ткань (let-7, miR-30c), эпителиальные клетки сердца (miR-1d, miR-149), почек (miR-192, miR-194, miR-204) и легких (let-7, miR-133, miR-126).
В частности, известно, что миРНК дифференциально экспрессируются в иммунных клетках (также называемых гемопоэтическими клетками), таких как антигенпрезентирующие клетки (АПК) (например, дендритные клетки и макрофаги), макрофаги, моноциты, B-лимфоциты, T-лимфоциты, гранулоциты, природные клетки-киллеры и т.д. миРНК, специфические для иммунных клеток, участвуют в иммуногенности, аутоиммунности, иммунном ответе на инфекцию, воспалении, а также в нежелательном иммунном ответе после генной терапии и трансплантации тканей/органов. Специфические для иммунных клеток миРНК также регулируют многие аспекты развития, пролиферации, дифференцировки и апоптоза гемопоэтических клеток (иммунных клеток). Например, miR-142 и miR-146 экспрессируются исключительно в иммунных клетках, особенно в больших количества в миелоидных дендритных клетках. Было продемонстрировано, что иммунный ответ на полинуклеотид можно блокировать путем добавления сайтов связывания miR-142 к 3'-НТО полинуклеотида, что обеспечивает более стабильный перенос генов в тканях и клетках. miR-142 эффективно разрушает экзогенные полинуклеотиды в антигенпрезентирующих клетках и подавляет цитотоксическую элиминацию трансдуцированных клеток (например, Annoni A et al., blood, 2009, 114, 5152-5161; Brown BD, et al., Nat med. 2006, 12(5), 585-591; Brown BD, et al., blood, 2007, 110(13): 4144-4152, каждый из которых включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки).
Антиген-опосредованный иммунный ответ может относиться к иммунному ответу, запускаемому чужеродными антигенами, которые при попадании в организм подвергаются процессингу антигенпрезентирующими клетками и отображаются на поверхности антигенпрезентирующих клеток. Т-клетки могут распознавать представленный антиген и вызывать цитотоксическую элиминацию клеток, которые экспрессируют антиген.
Введение сайта связывания miR-142 в 5'-НТО и/или 3'-НТО полинуклеотида согласно раскрытию может избирательно подавлять экспрессию гена в антигенпрезентирующих клетках посредством опосредованной miR-142 деградации, ограничивая презентацию антигена в антигенпрезентирующих клетках (например, в дендритных клетках) и тем самым предотвращая антиген-опосредованный иммунный ответ после доставки полинуклеотида. Затем полинуклеотид стабильно экспрессируется в целевых тканях или клетках без запуска цитотоксической элиминации.
В одном варианте осуществления сайты связывания для миРНК, которые, как известно, экспрессируются в иммунных клетках, в частности в антигенпрезентирующих клетках, могут быть встроены в полинуклеотид согласно раскрытию для подавления экспрессии полинуклеотида в антигенпрезентирующих клетках посредством миРНК-опосредованной деградации РНК, ослабляя антиген-опосредованный иммунный ответ.Экспрессия полинуклеотида поддерживается в неиммунных клетках, в которых специфические для иммунных клеток миРНК не экспрессируются. Например, в некоторых вариантах осуществления для предотвращения иммуногенной реакции против специфического для печени белка может быть удален любой сайт связывания miR-122, а сайт связывания miR-142 (и/или mirR-146) может быть встроен в 5'-НТО и/или 3'-НТО полинуклеотида согласно раскрытию.
Для дополнительной стимуляции селективной деградации и подавления в АПК и макрофаге, полинуклеотид согласно раскрытию может содержать дополнительный негативный регуляторный элемент в 5'-НТО и/или 3'-НТО, один или в комбинации с сайтами связывания miR-142 и/или miR-146. В качестве неограничивающего примера, еще одним негативным регуляторным элементом является конститутивный элемент деградации (CDE).
Специфические для иммунных клеток миРНК включают, но не ограничиваются ими, hsa-let-7a-2-3p, hsa-let-7a-3p, hsa-7a-5p, hsa-let-7c, hsa-let-7e-3p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7g-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7i-3p, hsa-let-7i-5p, miR-10a-3p, miR-10a-5p, miR-1184, hsa-let-7f-1--3p, hsa-let-7f-2--5p, hsa-let-7f-5p, miR-125b-1-3p, miR-125b-2-3p, miR-125b-5p, miR-1279, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-132-3p, miR-132-5p, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-143-3p, miR-143-5p, miR-146a-3p, miR-146a-5p, miR-146b-3p, miR-146b-5p, miR-147a, miR-147b, miR-148a-5p, miR-148a-3p, miR-150-3p, miR-150-5p, miR-151b, miR-155-3p, miR-155-5p, miR-15a-3p, miR-15a-5p, miR-15b-5p, miR-15b-3p, miR-16-1-3p, miR-16-2-3p, miR-16-5p, miR-17-5p, miR-181a-3p, miR-181a-5p, miR-181a-2-3p, miR-182-3p, miR-182-5p, miR-197-3p, miR-197-5p, miR-21-5p, miR-21-3p, miR-214-3p, miR-214-5p, miR-223-3p, miR-223-5p, miR-221-3p, miR-221-5p, miR-23b-3p, miR-23b-5p, miR-24-1-5p,miR-24-2-5p, miR-24-3p, miR-26a-1-3p, miR-26a-2-3p, miR-26a-5p, miR-26b-3p, miR-26b-5p, miR-27a-3p, miR-27a-5p, miR-27b-3p,miR-27b-5p, miR-28-3p, miR-28-5p, miR-2909, miR-29a-3p, miR-29a-5p, miR-29b-1-5p, miR-29b-2-5p, miR-29c-3p, miR-29c-5p, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-331-5p, miR-339-3p, miR-339-5p, miR-345-3p, miR-345-5p, miR-346, miR-34a-3p, miR-34a-5p,, miR-363-3p, miR-363-5p, miR-372, miR-377-3p, miR-377-5p, miR-493-3p, miR-493-5p, miR-542, miR-548b-5p, miR548c-5p, miR-548i, miR-548j, miR-548n, miR-574-3p, miR-598, miR-718, miR-935, miR-99a-3p, miR-99a-5p, miR-99b-3p и miR-99b-5p. Кроме того, новые миРНК могут быть идентифицированы в иммунных клетках посредством гибридизации на микрочипах и анализа срезов (например, Jima DD et al, Blood, 2010, 116:e118-e127; Vaz C et al., BMC Genomics, 2010, 11,288, содержание каждой из которых включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки).
миРНК, которые, как известно, экспрессируются в печени, включают, но не ограничиваются ими, miR-107, miR-122-3p, miR-122-5p, miR-1228-3p, miR-1228-5p, miR-1249, miR-129-5p, miR-1303, miR-151a-3p, miR-151a-5p, miR-152, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-199b-3p, miR-199b-5p, miR-296-5p, miR-557, miR-581, miR-939-3p и miR-939-5p. Сайты связывания миРНК из любой специфической для печени миРНК могут быть введены или удалены из полинуклеотида согласно раскрытию для регуляции экспрессии полинуклеотида в печени. Специфические для печени сайты связывания миРНК могут быть сконструированы отдельно или дополнительно в комбинации с сайтами связывания миРНК иммунных клеток (например, АПК) в полинуклеотиде согласно раскрытию.
миРНК, которые, как известно, экспрессируются в легких, включают, но не ограничиваются ими, let-7a-2-3p, let-7a-3p, let-7a-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-127-3p, miR-127-5p, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-130b-3p, miR-130b-5p, miR-133a, miR-133b, miR-134, miR-18a-3p, miR-18a-5p, miR-18b-3p, miR-18b-5p, miR-24-1-5p, miR-24-2-5p, miR-24-3p, miR-296-3p, miR-296-5p, miR-32-3p, miR-337-3p, miR-337-5p, miR-381-3p и miR-381-5p. Сайты связывания миРНК из любой специфической для легких миРНК могут быть введены или удалены из полинуклеотида согласно раскрытию для регуляции экспрессии полинуклеотида в легком. Специфические для легкого сайты связывания миРНК могут быть сконструированы отдельно или дополнительно в комбинации с сайтами связывания миРНК иммунных клеток (например, АПК) в полинуклеотиде согласно раскрытию.
миРНК, которые, как известно, экспрессируются в сердце, включают, но не ограничиваются ими, miR-1, miR-133a, miR-133b, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-186-3p, miR-186-5p, miR-208a, miR-208b, miR-210, miR-296-3p, miR-320, miR-451a, miR-451b, miR-499a-3p, miR-499a-5p, miR-499b-3p, miR-499b-5p, miR-744-3p, miR-744-5p, miR-92b-3p и miR-92b-5p. Сайты связывания миРНК из любой специфической для сердца микроРНК могут быть введены или удалены из полинуклеотида согласно раскрытию для регуляции экспрессии полинуклеотида в сердце. Специфические для сердца сайты связывания миРНК могут быть сконструированы отдельно или дополнительно в комбинации с сайтами связывания миРНК иммунных клеток (например, АПК) в полинуклеотиде согласно раскрытию.
миРНК, которые, как известно, экспрессируются в нервной системе, включают, но не ограничиваются ими, miR-124-5p, miR-125a-3p, miR-125a-5p, miR-125b-1-3p, miR-125b-2-3p, miR-125b-5p,miR-1271-3p, miR-1271-5p, miR-128, miR-132-5p, miR-135a-3p, miR-135a-5p, miR-135b-3p, miR-135b-5p, miR-137, miR-139-5p, miR-139-3p, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-153, miR-181c-3p, miR-181c-5p, miR-183-3p, miR-183-5p, miR-190a, miR-190b, miR-212-3p, miR-212-5p, miR-219-1-3p, miR-219-2-3p, miR-23a-3p, miR-23a-5p,miR-30a-5p, miR-30b-3p, miR-30b-5p, miR-30c-1-3p, miR-30c-2-3p, miR-30c-5p, miR-30d-3p, miR-30d-5p, miR-329, miR-342-3p, miR-3665, miR-3666, miR-380-3p, miR-380-5p, miR-383, miR-410, miR-425-3p, miR-425-5p, miR-454-3p, miR-454-5p, miR-483, miR-510, miR-516a-3p, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-571, miR-7-1-3p, miR-7-2-3p, miR-7-5p, miR-802, miR-922, miR-9-3p и miR-9-5p. миРНК, находящиеся в значительном количестве в нервной системе, дополнительно включают те, которые специфически экспрессируются в нейронах, включая, но не ограничиваясь, miR-132-3p, miR-132-3p, miR-148b-3p, miR-148b-5p, miR-151a-3p, miR-151a-5p, miR-212-3p, miR-212-5p, miR-320b, miR-320e, miR-323a-3p, miR-323a-5p, miR-324-5p, miR-325, miR-326, miR-328, miR-922 и те, которые специфически экспрессируются в глиальных клетках, включая, но не ограничиваясь, miR-1250, miR-219-1-3p, miR-219-2-3p, miR-219-5p, miR-23a-3p, miR-23a-5p, miR-3065-3p, miR-3065-5p, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-32-5p, miR-338-5p и miR-657. Сайты связывания миРНК из любой специфической для ЦНС миРНК могут быть введены или удалены из полинуклеотида согласно раскрытию для регуляции экспрессии полинуклеотида в нервной системе. Специфические для нервной системы сайты связывания миРНК могут быть сконструированы отдельно или дополнительно в комбинации с сайтами связывания миРНК иммунных клеток (например, АПК) в полинуклеотиде согласно раскрытию.
миРНК, которые, как известно, экспрессируются в поджелудочной железе, включают, но не ограничиваются ими, miR-105-3p, miR-105-5p, miR-184, miR-195-3p, miR-195-5p, miR-196a-3p, miR-196a-5p, miR-214-3p, miR-214-5p, miR-216a-3p, miR-216a-5p, miR-30a-3p, miR-33a-3p, miR-33a-5p, miR-375, miR-7-1-3p, miR-7-2-3p, miR-493-3p, miR-493-5p и miR-944. Сайты связывания миРНК из любой специфической для миРНК поджелудочной железы могут быть введены или удалены из полинуклеотида согласно раскрытию для регуляции экспрессии полинуклеотида в поджелудочной железе. Специфические для поджелудочной железы сайты связывания миРНК могут быть сконструированы отдельно или дополнительно в комбинации с сайтами связывания миРНК иммунных клеток (например, АПК) в полинуклеотиде согласно раскрытию.
миРНК, которые, как известно, экспрессируются в почках, включают, но не ограничиваются ими, miR-122-3p, miR-145-5p, miR-17-5p, miR-192-3p, miR-192-5p, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-20a-3p, miR-20a-5p, miR-204-3p, miR-204-5p, miR-210, miR-216a-3p, miR-216a-5p, miR-296-3p, miR-30a-3p, miR-30a-5p, miR-30b-3p, miR-30b-5p, miR-30c-1-3p, miR-30c-2-3p, miR30c-5p, miR-324-3p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-363-3p, miR-363-5p и miR-562. Сайты связывания миРНК из любой специфической для почки миРНК могут быть введены или удалены из полинуклеотида согласно раскрытию для регуляции экспрессии полинуклеотида в почке. Специфические для почки сайты связывания миРНК могут быть сконструированы отдельно или дополнительно в комбинации с сайтами связывания миРНК иммунных клеток (например, АПК) в полинуклеотиде согласно раскрытию.
миРНК, которые, как известно, экспрессируются в мышцах, включают, но не ограничиваются ими, let-7g-3p, let-7g-5p, miR-1, miR-1286, miR-133a, miR-133b, miR-140-3p, miR-143-3p, miR-143-5p, miR-145-3p, miR-145-5p, miR-188-3p, miR-188-5p, miR-206, miR-208a, miR-208b, miR-25-3p и miR-25-5p.Сайты связывания миРНК из любой специфической для мышц миРНК могут быть введены или удалены из полинуклеотида согласно раскрытию для регуляции экспрессии полинуклеотида в мышце. Специфические для мыщц сайты связывания миРНК могут быть сконструированы отдельно или дополнительно в комбинации с сайтами связывания миРНК иммунных клеток (например, АПК) в полинуклеотиде согласно раскрытию.
миРНК также дифференцированно экспрессируются в различных типах клеток, таких как, но не ограничиваясь ими, эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки и адипоциты.
миРНК, которые, как известно, экспрессируются в эндотелиальных клетках, включают, но не ограничиваются ими, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-100-3p, miR-100-5p, miR-101-3p, miR-101-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-1236-3p, miR-1236-5p, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-17-5p, miR-17-3p, miR-18a-3p, miR-18a-5p, miR-19a-3p, miR-19a-5p, miR-19b-1-5p, miR-19b-2-5p, miR-19b-3p, miR-20a-3p, miR-20a-5p, miR-217, miR-210, miR-21-3p, miR-21-5p, miR-221-3p, miR-221-5p, miR-222-3p, miR-222-5p, miR-23a-3p, miR-23a-5p, miR-296-5p, miR-361-3p, miR-361-5p, miR-421, miR-424-3p, miR-424-5p, miR-513a-5p, miR-92a-1-5p, miR-92a-2-5p, miR-92a-3p, miR-92b-3p и miR-92b-5p. Многие новые миРНК обнаружены в эндотелиальных клетках в результате глубокого секвенирования (например, Voellenkle C. et al., RNA, 2012, 18, 472-484, включенная в данный документ в полном объеме посредством ссылки). Сайты связывания миРНК из любой специфической для эндотелиальных клеток миРНК могут быть введены или удалены из полинуклеотида согласно раскрытию для регуляции экспрессии полинуклеотида в эндотелиальных клетках.
миРНК, которые, как известно, экспрессируются в эпителиальных клетках, включают, но не ограничиваются ими, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-1246, miR-200a-3p, miR-200a-5p, miR-200b-3p, miR-200b-5p, miR-200c-3p, miR-200c-5p, miR-338-3p, miR-429, miR-451a, miR-451b, miR-494, miR-802 и miR-34a, miR-34b-5p, miR-34c-5p, miR-449a, miR-449b-3p, miR-449b-5p, специфические для респираторных реснитчатых эпителиальных клеток, семейство let-7, miR-133a, miR-133b, miR-126, специфические для эпителиальных клеток легкого, miR-382-3p, miR-382-5p специфические для эпителиальных клеток почки, и miR-762, специфические для эпителиальных клеток роговицы. Сайты связывания миРНК из любой специфической для эпителиальных клеток миРНК могут быть введены или удалены из полинуклеотида согласно раскрытию для регуляции экспрессии полинуклеотида в эпителиальных клетках.
Кроме того, большая группа миРНК, находящиеся в значительном количестве в эмбриональных стволовых клетках, контролируя самообновление стволовых клеток, а также развитие и/или дифференцировку различных клеточных линий, таких как нервные клетки, кардиомиоциты, гемопоэтические клетки, клетки кожи, остеогенные клетки, и мышечные клетки (например, Kuppusamy KT et al., Curr. Mol Med, 2013, 13(5), 757-764; Vidigal JA and Ventura A, Semin Cancer Biol. 2012, 22(5-6), 428-436; Goff LA et al., PLoS One, 2009, 4:e7192; Morin RD et al., Genome Res,2008,18, 610-621; Yoo JK et al., Stem Cells Dev. 2012, 21(11), 2049-2057, каждая из которых включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки). миРНК, находящиеся в значительном количестве в эмбриональных стволовых клетках, включают, но не ограничиваются ими, let-7a-2-3p, let-a-3p, let-7a-5p, let7d-3p, let-7d-5p, miR-103a-2-3p, miR-103a-5p, miR-106b-3p, miR-106b-5p, miR-1246, miR-1275, miR-138-1-3p, miR-138-2-3p, miR-138-5p, miR-154-3p, miR-154-5p, miR-200c-3p, miR-200c-5p, miR-290, miR-301a-3p, miR-301a-5p, miR-302a-3p, miR-302a-5p, miR-302b-3p, miR-302b-5p, miR-302c-3p, miR-302c-5p, miR-302d-3p, miR-302d-5p, miR-302e, miR-367-3p, miR-367-5p, miR-369-3p, miR-369-5p, miR-370, miR-371, miR-373, miR-380-5p, miR-423-3p, miR-423-5p, miR-486-5p, miR-520c-3p, miR-548e, miR-548f, miR-548g-3p, miR-548g-5p, miR-548i, miR-548k, miR-548l, miR-548m, miR-548n, miR-548o-3p, miR-548o-5p, miR-548p, miR-664a-3p, miR-664a-5p, miR-664b-3p, miR-664b-5p, miR-766-3p, miR-766-5p, miR-885-3p, miR-885-5p,miR-93-3p, miR-93-5p, miR-941,miR-96-3p, miR-96-5p, miR-99b-3p и miR-99b-5p. Многие спрогнозированные новые миРНК обнаруживаются путем глубокого секвенирования в эмбриональных стволовых клетках человека (например, Morin RD et al., Genome Res,2008,18, 610-621; Goff LA et al., PLoS One, 2009, 4:e7192; Bar M et al., Stem cells, 2008, 26, 2496-2505, содержание каждой из которых включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки).
В одном варианте осуществления сайты связывания специфических для эмбриональных стволовых клеток миРНК могут быть включены или удалены из 3'-НТО полинуклеотида согласно раскрытию для модуляции развития и/или дифференцировки эмбриональных стволовых клеток, чтобы ингибировать старение стволовых клеток при дегенеративном состоянии (например, дегенеративные заболевания) или для стимуляции старения и апоптоза стволовых клеток при патологическом состоянии (например, раковых стволовых клеток).
Многие исследования экспрессии миРНК проводятся для профилирования дифференциальной экспрессии миРНК в различных раковых клетках/тканях и других заболеваниях. Некоторые миРНК аномально сверхэкспрессируются в определенных раковых клетках, а другие недостаточно экспрессируются. Например, миРНК дифференциально экспрессируются в раковых клетках (WO2008/154098, US2013/0059015, US2013/0042333, WO2011/157294); раковых стволовых клетках (US2012/0053224); злокачественных новообразованиях и заболеваниях поджелудочной железы (US2009/0131348, US2011/0171646, US2010/0286232, US8389210); астме и воспалении (US8415096); раке простаты (US2013/0053264); гепатоцеллюлярной карциноме (WO2012/151212, US2012/0329672, WO2008/054828, US8252538); клетки рака легкого (WO2011/076143, WO2013/033640, WO2009/070653, US2010/0323357); Т-клеточной лимфоме кожи (WO2013/011378); клетки колоректального рака (WO2011/0281756, WO2011/076142); лимфатических узлах положительных по раку (WO2009/100430, US2009/0263803); раке носоглотки (EP2112235); хронической обструктивной болезни легких (US2012/0264626, US2013/0053263); раке щитовидной железы (WO2013/066678); клетках рака яичников (US2012/0309645, WO2011/095623); клетках рака молочной железы (WO2008/154098, WO2007/081740, US2012/0214699), лейкозе и лимфоме (WO2008/073915, US2009/0092974, US2012/0316081, US2012/0283310, WO2010/018563), содержание каждой из которых включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
В качестве неограничивающего примера, сайты связывания миРНК для миРНК, которые сверхэкспрессируются в определенных раковых и/или опухолевых клетках, могут быть удалены из 3'-НТО полинуклеотида согласно раскрытию, восстанавливая экспрессию, подавленную сверхэкспрессированными миРНК, в раковых клетках, таким образом улучшая соответствующую биологическую функцию, например, стимуляцию и/или репрессию транскрипции, остановку клеточного цикла, апоптоз и гибель клеток. Нормальные клетки и ткани, в которых экспрессия миРНК не повышена, останутся без изменений.
миРНК также может регулировать сложные биологические процессы, такие как ангиогенез (например, miR-132) (Anand и Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176). В полинуклеотидах согласно раскрытию сайты связывания миРНК, которые участвуют в таких процессах, могут быть удалены или введены для того, чтобы адаптировать экспрессию полинуклеотидов к биологически соответствующим типам клеток или соответствующим биологическим процессам. В этом контексте полинуклеотиды согласно раскрытию определяются как ауксотрофные полинуклеотиды.
В некоторых вариантах терапевтическое окно и/или дифференциальная экспрессия (например, тканеспецифическая экспрессия) полипептида согласно раскрытию может быть изменена путем включения сайта связывания миРНК в мРНК, кодирующую полипептид. В одном примере мРНК может содержать один или более сайтов связывания миРНК, которые связаны миРНК, которые имеют более высокую экспрессию в одном типе ткани по сравнению с другим. В другом примере мРНК может содержать один или более сайтов связывания миРНК, которые связаны миРНК, которые имеют более низкую экспрессию в раковой клетке по сравнению с нераковой клеткой той же ткани по происхождению. Когда он присутствует в раковой клетке, которая экспрессирует низкие уровни такой миРНК, полипептид, кодируемый мРНК, обычно проявляет повышенную экспрессию.
Клетки рака печени (например, клетки гепатоцеллюлярной карциномы) обычно экспрессируют низкие уровни miR-122 по сравнению с нормальными клетками печени. Следовательно, мРНК, кодирующая полипептид, который содержит по меньшей мере один сайт связывания miR-122 (например, в 3'-НТО мРНК), обычно будет экспрессировать сравнительно низкие уровни полипептида в нормальных клетках печени и сравнительно высокие уровни полипептида в раковых клетках печени. Если полипептид способен индуцировать иммуногенную клеточную гибель, это может вызвать преимущественное иммуногенное клеточное уничтожение клеток рака печени (например, клеток гепатоцеллюлярной карциномы) по сравнению с нормальными клетками печени.
В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит по меньшей мере один сайт связывания miR-122, по меньшей мере два сайта связывания miR-122, по меньшей мере три сайта связывания miR-122, по меньшей мере четыре miR-122 или по меньшей мере пять сайтов связывания miR-122. В одном аспекте сайт связывания миРНК связывает miR-122 или является комплементарным к miR-122. В другом аспекте сайт связывания миРНК связывается с miR-122-3p или miR-122-5p.В конкретном аспекте сайт связывания миРНК содержит нуклеотидную последовательность на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% идентичную SEQ ID NO: 1326, причем сайт связывания миРНК связывается с miR-122. В другом аспекте сайт связывания миРНК содержит нуклеотидную последовательность на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% идентичную SEQ ID NO: 26, причем сайт связывания миРНК связывается с miR-122. Данные последовательности приведены ниже в Таблице 3.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид согласно раскрытию содержит сайт связывания миРНК, причем сайт связывания миРНК содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из Таблицы 3, включая одну или более копий любой одной или более последовательностей сайта связывания миРНК. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид согласно раскрытию дополнительно содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более одинаковых или разных сайтов связывания миРНК, выбранных из Таблицы 3, включая любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК связывается с miR-142 или является комплементарным к miR-142. В некоторых вариантах осуществления miR-142 содержит SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК связывается с miR-142-3p или miR-142-5p. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания miR-142-3p содержит SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания miR-142-5p содержит SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК содержит нуклеотидную последовательность на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% идентичную SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 31.
Таблица 3. Репрезентативные микроРНК и сайты связывания микроРНК
SEQ ID NO.
Описание
Последовательность
127
mmiR-142
GACAGUGCAGUCACCCAUAAAGUAGAAAGCACUACUAACAGCACUGGAGGGUGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGAUGAGUGUACUGUG
128
mmiR-142-3p
UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA
129
сайт связывания mmiR-142-3p
UCCAUAAAGUAGGAAACACUACA
130
mmiR-142-5p
CAUAAAGUAGAAAGCACUACU
131
сайт связывания mmiR-142-5p
AGUAGUGCUUUCUACUUUAUG
1324
miR-122
CCUUAGCAGAGCUGUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGUGUCUAAACUAUCAAACGCCAUUAUCACACUAAAUAGCUACUGCUAGGC
32
miR-122-3p
AACGCCAUUAUCACACUAAAUA
1325
сайт связывания miR-122-3p
UAUUUAGUGUGAUAAUGGCGUU
33
miR-122-5p
UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG
1326
сайт связывания miR-122-5p
CAAACACCAUUGUCACACUCCA
В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК вставляют в полинуклеотид согласно раскрытию в любом положении полинуклеотида (например, 5'-НТО и/или 3'-НТО). В некоторых вариантах осуществления 5'-НТО содержит сайт связывания миРНК. В некоторых вариантах осуществления 3'-НТО содержит сайт связывания миРНК. В некоторых вариантах осуществления 5'-НТО и 3'-НТО содержат сайт связывания миРНК. Сайт вставки в полинуклеотид может находиться где угодно в полинуклеотиде, пока вставка сайта связывания миРНК в полинуклеотид не мешает трансляции функционального полипептида в отсутствии соответствующей миРНК; и в присутствии миРНК вставка сайта связывания миРНК в полинуклеотид и связывание сайта связывания миРНК с соответствующей миРНК способны расщеплять полинуклеотид или предотвращать трансляцию полинуклеотида.
В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК вставляют через по меньшей мере около 30 нуклеотидов по ходу транскрипции от стоп-кодона ОРС в полинуклеотиде согласно раскрытию, который содержит ОРС. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК вставляют через по меньшей мере около 10 нуклеотидов, по меньшей мере около 15 нуклеотидов, по меньшей мере около 20 нуклеотидов, по меньшей мере около 25 нуклеотидов, по меньшей мере около 30 нуклеотидов, по меньшей мере около 35 нуклеотидов, по меньшей мере около 40 нуклеотидов, по меньшей мере около 45 нуклеотидов, по меньшей мере около 50 нуклеотидов, по меньшей мере около 55 нуклеотидов, по меньшей мере около 60 нуклеотидов, по меньшей мере около 65 нуклеотидов, по меньшей мере около 70 нуклеотидов, по меньшей мере около 75 нуклеотидов, по меньшей мере около 80 нуклеотидов, по меньшей мере около 85 нуклеотидов, по меньшей мере около 90 нуклеотидов, по меньшей мере около 95 нуклеотидов или по меньшей мере около 100 нуклеотидов по ходу транскрипции от стоп-кодона ОРС в полинуклеотиде согласно раскрытию. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК вставляют через от около 10 нуклеотидов до около 100 нуклеотидов, от около 20 нуклеотидов до около 90 нуклеотидов, от около 30 нуклеотидов до около 80 нуклеотидов, от около 40 нуклеотидов до около 70 нуклеотидов, от около 50 нуклеотидов до около 60 нуклеотидов, от около 45 нуклеотидов до около 65 нуклеотидов по ходу транскрипции от стоп-кодона ОРС в полинуклеотиде согласно раскрытию.
На генную регуляцию миРНК может влиять последовательность, окружающая миРНК, такая как, но не ограничиваясь, вид окружающей последовательности, тип последовательности (например, гетерологичная, гомологичная, экзогенная, эндогенная или искусственная), регуляторные элементы в окружающей последовательности и/или структурные элементы в окружающей последовательности. На миРНК может влиять 5'-НТО и/или 3'-НТО. В качестве неограничивающего примера, 3'-НТО, не принадлежащая человеку, может усиливать регуляторный эффект последовательности миРНК на экспрессию представляющего интерес полипептида по сравнению с 3'-НТО человека того же типа последовательности.
В одном варианте осуществления другие регуляторные элементы и/или структурные элементы 5'-НТО могут влиять на миРНК-опосредованную регуляцию генов. Одним из примеров регуляторного элемента и/или структурного элемента является структурированный IRES (участок внутренней посадки рибосомы) в 5'-НТО, который необходим для связывания фактор элонгации трансляции для инициации трансляции белка. Связывание EIF4A2 с этим вторично структурированным элементом в 5'-НТО является необходимым для миРНК-опосредованной экспрессии генов (Meijer HA et al., Science, 2013, 340, 82-85, включенная в данный документ во всей полноте посредством ссылки). Полинуклеотиды согласно раскрытию могут, кроме того, содержать эту структурированную 5'-НТО для усиления микроРНК-опосредованной регуляции генов.
По меньшей мере один сайт связывания миРНК может быть встроен в 3'-НТО полинуклеотида согласно раскрытию. В этом контексте по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере десять или более сайтов связывания миРНК могут быть встроены в 3'-НТО полинуклеотида согласно раскрытию. Например, от 1 до 10, от 1 до 9, от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, 2 или 1 сайтов связывания миРНК могут быть встроены в 3'-НТО полинуклеотида согласно раскрытию. В одном варианте осуществления сайты связывания миРНК, включенные в полинуклеотид согласно раскрытию, могут быть одинаковыми или могут быть разными сайтами миРНК. Комбинация различных сайтов связывания миРНК, включенных в полинуклеотид согласно раскрытию, может содержать комбинации, в которые включено более одной копии любого из различных сайтов миРНК. В другом варианте осуществления сайты связывания миРНК, включенные в полинуклеотид согласно раскрытию, могут нацеливаться на одни и те же или разные ткани в организме. В качестве неограничивающего примера уровень экспрессии в определенных типах клеток (например, гепатоцитах, миелоидных клетках, эндотелиальных клетках, раковых клетках и т.д.) может быть уменьшен посредством введения сайтов связывания миРНК, специфических для ткани, типа клеток или заболевания, в 3'-НТО полинуклеотида согласно раскрытию.
В одном варианте осуществления сайт связывания миРНК может быть встроен вблизи 5'-конца 3'-НТО, примерно посередине между 5'-концом и 3'-концом 3'-НТО и/или рядом с 3'-концом 3'-НТО в полинуклеотиде согласно раскрытию. В качестве неограничивающего примера сайт связывания миРНК может быть встроен вблизи 5'-конца 3'-НТО и примерно посередине между 5'-концом и 3'-концом 3'-НТО. В качестве другого неограничивающего примера сайт связывания миРНК может быть встроен вблизи 3'-конца 3'-НТО и примерно посередине между 5'-концом и 3'-концом 3'-НТО. В качестве еще одного другого неограничивающего примера сайт связывания миРНК может быть встроен около 5'-конца 3'-НТО и около 3'-конца 3'-НТО.
В другом варианте осуществления 3'-НТО может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 сайтов связывания миРНК. Сайты связывания миРНК могут быть комплементарны последовательности миРНК, затравочной последовательности миРНК и/или последовательностям миРНК, фланкирующим затравочную последовательность.
В одном варианте осуществления полинуклеотид согласно раскрытию может быть сконструирован так, чтобы содержать более одного сайта миРНК, экспрессируемого в разных тканях или разных типах клеток субъекта. В качестве неограничивающего примера, полинуклеотид согласно раскрытию может быть сконструирован так, чтобы содержать miR-192 и miR-122 для регуляции экспрессии полинуклеотида в печени и почках субъекта. В другом варианте осуществления полинуклеотид согласно раскрытию может быть сконструирован так, чтобы содержать более одного сайта миРНК для одной и той же ткани.
В некоторых вариантах осуществления терапевтическое окно и/или дифференциальная экспрессия, связанная с полипептидом, кодируемым полинуклеотидом согласно раскрытию, может быть изменено(а) сайтом связывания миРНК. Например, полинуклеотид, кодирующий полипептид, который обеспечивает сигнал смерти, может быть сконструирован для более высокой экспрессии в раковых клетках благодаря сигнатуре миРНК этих клеток. В тех случаях, когда раковая клетка экспрессирует более низкий уровень конкретной миРНК, полинуклеотид, кодирующий сайт связывания для данной миРНК (или миРНК), будет экспрессироваться более высоко. Следовательно, полипептид, который обеспечивает сигнал смерти, запускает или индуцирует клеточную гибель в раковой клетке. Соседние неопухолевые клетки, имеющие более высокую экспрессию той же самой миРНК, будут менее подвержены влиянию закодированного сигнала смерти, поскольку полинуклеотид будет экспрессироваться на более низком уровне из-за эффектов связывания миРНК с сайтом связывания или «сенсором», закодированным в 3'-НТО. И наоборот, сигналы выживания клеток или цитопротекторные сигналы могут быть доставлены в ткани, содержащие раковые и нераковые клетки, причем миРНК имеет более высокую экспрессию в раковых клетках - в результате снижается сигнал выживания для раковых клеток и увеличивается сигнал выживания для нормальных клеток. Может быть сконструировано и введено множество полинуклеотидов, имеющих разные сигналы, основанные на использовании сайтов связывания миРНК, как описано в данном документе.
В некоторых вариантах осуществления экспрессию полинуклеотида согласно раскрытию можно контролировать путем включения по меньшей мере одной сенсорной последовательности в полинуклеотид и приготовления полинуклеотида в форме для введения. В качестве неограничивающего примера полинуклеотид согласно раскрытию может быть нацелен на ткань или клетку путем включения сайта связывания миРНК и заключения полинуклеотида в липидную наночастицу, содержащую катионный липид, включая любой из липидов, описанных в данном документе.
Полинуклеотид согласно раскрытию может быть сконструирован для более локальной экспрессии в конкретных тканях, типах клеток или биологических условиях на основе паттернов экспрессии миРНК в различных тканях, типах клеток или биологических условий. Посредством введения тканеспецифических сайтов связывания миРНК полинуклеотид согласно раскрытию может быть сконструирован для оптимальной экспрессии белка в ткани или клетке или в контексте биологического состояния.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид согласно раскрытию может быть сконструирован так, чтобы содержать сайты связывания миРНК, которые или имеют 100% идентичность с известными затравочными последовательностями миРНК, или имеют идентичность менее 100% с затравочными последовательностями миРНК. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид согласно раскрытию может быть сконструирован для включения сайтов связывания миРНК, которые имеют по меньшей мере: 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с известными затравочными последовательностями миРНК. Затравочная последовательность миРНК может быть частично мутирована для уменьшения аффинности связывания миРНК и, как таковая, приводит к уменьшенной ингибирующей модуляции полинуклеотида. По сути, степень соответствия или несоответствия между сайтом связывания миРНК и затравочной областью миРНК может действовать как реостат для более тонкой настройки способности миРНК модулировать экспрессию белка. Кроме того, мутация в незатравочной области сайта связывания миРНК также может влиять на способность миРНК модулировать экспрессию белка.
В одном варианте осуществления последовательность миРНК может быть включена в петлю шпильки.
В другом варианте осуществления затравочная последовательность миРНК может быть включена в петлю шпильки, а сайт связывания миРНК может быть включена в 5' или 3' стебля шпильки.
В одном варианте осуществления усиливающий трансляцию элемент (TEE), может быть включен в 5'-конец стебля шпильки, и затравочная область миРНК может быть включена в стебель шпильки. В другом варианте осуществления TEE может быть включен в 5'-конец стебля шпильки, затравочная область миРНК может быть включена в стебель шпильки, а сайт связывания миРНК может быть включен в 3'-конец стебля или последовательность после шпильки. Затравочная область миРНК и сайт связывания миРНК могут иметь одинаковые и/или разные последовательности миРНК.
В одном варианте осуществления включение последовательности миРНК и/или последовательности TEE изменяет форму области шпильки, что может увеличивать и/или уменьшать трансляцию. (см., например, Kedde et al., "A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3′UTR controls miR-221 and miR-22 accessibility." Nature Cell Biology. 2010, включенная в данный документ в полном объеме посредством ссылки).
В одном варианте осуществления 5'-НТО полинуклеотида согласно раскрытию может содержать по меньшей мере одну последовательность миРНК. Последовательность миРНК может представлять собой, но не ограничивается этим, последовательность из 19 или 22 нуклеотидов и/или последовательность миРНК без затравочной области.
В одном варианте осуществления последовательность миРНК в 5'-НТО может быть использована для стабилизации полинуклеотида согласно раскрытию, описанному в данном документе.
В другом варианте осуществления последовательность миРНК в 5'-НТО полинуклеотида согласно раскрытию может быть использована для уменьшения доступности сайта инициации трансляции, такого как, но не ограничиваясь, стартовый кодон. Смотрите, например, Matsuda et al., PLoS One. 2010 11(5):e15057; включенную в данное описание в полном объеме посредством ссылки, в которой используются олигонуклеотиды и комплексы соединения экзона (EJC) около стартового кодона (от -4 до+37, где A кодонов AUG равен+1) антисмысловых закрытых нуклеиновых кислот (LNA), чтобы уменьшить доступ к первому стартовому кодону (AUG). Matsuda продемонстрировал, что изменение последовательности около стартового кодона с помощью LNA или EJC влияет на эффективность, длину и структурную стабильность полинуклеотида. Полинуклеотид согласно раскрытию может содержать последовательность миРНК вместо последовательности LNA или EJC, описанной Matsuda et al., около сайта инициации трансляции, чтобы уменьшить доступ к сайту инициации трансляции. Сайт инициации трансляции может быть до, после или внутри последовательности миРНК. В качестве неограничивающего примера сайт инициации трансляции может быть расположен в последовательности миРНК, такой как затравочная последовательность или сайт связывания. В качестве другого неограничивающего примера сайт инициации трансляции может быть расположен в последовательности miR-122, такой как затравочная последовательность или сайт связывания mir-122.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид согласно раскрытию может содержать по меньшей мере одну миРНК для ослабления презентации антигена антигенпрезентирующими клетками. миРНК может представлять собой полную последовательность миРНК, затравочную последовательность миРНК, последовательность миРНК без затравочной области или их комбинацию. В качестве неограничивающего примера миРНК, включенная в полинуклеотид согласно раскрытию, может быть специфической для системы кроветворения. В качестве другого неограничивающего примера миРНК, включенная в полинуклеотид согласно раскрытию для ослабления презентации антигена, представляет собой miR-142-3p.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид согласно раскрытию может содержать по меньшей мере одну миРНК для ослабления экспрессии кодируемого полипептида в представляющей интерес ткани или клетке. В качестве неограничивающего примера, полинуклеотид согласно раскрытию может содержать по меньшей мере один сайт связывания miR-122 для ослабления экспрессии представляющего интерес кодируемого полипептида в печени. В качестве другого неограничивающего примера полинуклеотид согласно раскрытию может содержать по меньшей мере один сайт связывания miR-142-3p, затравочную последовательность miR-142-3p, сайт связывания miR-142-3p без затравочной области, сайт связывания miR-142-5p, затравочную последовательность miR-142-5p, сайт связывания miR-142-5p без затравочной области, сайт связывания miR-146, затравочную последовательность miR-146 и/или сайт связывания miR-146 без затравочной последовательности.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид согласно раскрытию может содержать по меньшей мере один сайт связывания миРНК в 3'-НТО для селективной деградации терапевтических средств на основе мРНК в иммунных клетках, чтобы вызывать нежелательные иммуногенные реакции, вызванные доставкой терапевтических средств. В качестве неограничивающего примера сайт связывания миРНК может сделать полинуклеотид согласно раскрытию более нестабильным в антигенпрезентирующих клетках. Неограничивающие примеры этих миРНК включают mir-142-5p, mir-142-3p, mir-146a-5p и mir-146-3p.
В одном варианте осуществления полинуклеотид согласно раскрытию содержит по меньшей мере одну последовательность миРНК в области полинуклеотида, которая может взаимодействовать с РНК-связывающим белком.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид согласно раскрытию (например, РНК, например, мРНК) содержит (i) нуклеотидную последовательность с оптимизированной последовательностью (например, ОРС) и (ii) сайт связывания миРНК (например, сайт связывания миРНК, который связывается с miR-142).
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид согласно раскрытию содержит модифицированную урацилом последовательность, кодирующую полипептид, описанный в данном документе, и сайт связывания миРНК, раскрытый в данном документе, например, сайт связывания миРНК, который связывается с miR-142. В некоторых вариантах осуществления модифицированная урацилом последовательность, кодирующая полипептид, содержит по меньшей мере одно химически модифицированное нуклеотидное основание, например, 5-метоксиурацил. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 95% типа нуклеотидного основания (например, урацила) в модифицированной урацилом последовательности, кодирующей полипептид согласно раскрытию, представляет собой модифицированные нуклеотидные основания. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 95% урацила в модифицированной урацилом последовательности, кодирующей полипептид, представляет собой 5-метоксиуридин. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, раскрытый в данном документе, и сайт связывания миРНК, составляют с агентом доставки, например, соединением, имеющим формулу (I), например, любого из соединений 1-147.
Модифицированные полинуклеотиды, содержащие функциональные элементы РНК
Данное раскрытие обеспечивает синтетические полинуклеотиды, содержащие модификацию (например, элемент РНК), причем модификация обеспечивает желаемую трансляционную регуляторную активность. В некоторых вариантах осуществления раскрытие обеспечивает полинуклеотид, содержащий 5'-нетранслируемую область (НТО), инициирующий кодон, полноразмерную открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, 3'-НТО и по меньшей мере одну модификацию, причем по меньшей мере одна модификация обеспечивает желательную трансляционную регуляторную активность, например, модификацию, которая способствует и/или повышает точность трансляции мРНК. В некоторых вариантах осуществления желательная трансляционная регуляторная активность представляет собой цис-действующую регуляторную активность. В некоторых вариантах осуществления желаемая трансляционная регуляторная активность представляет собой увеличение времени пребывания 43S преинициирующего комплекса (PIC) или рибосомы при инициирующем кодоне или вблизи него. В некоторых вариантах осуществления желательная трансляционная регуляторная активность представляет собой увеличение инициации синтеза полипептида при или из инициирующего кодона. В некоторых вариантах осуществления желательная трансляционная регуляторная активность представляет собой увеличение количества полипептида, транслированного из полноразмерной открытой рамки считывания. В некоторых вариантах осуществления желательная трансляционная регуляторная активность представляет собой увеличение точности декодирования инициирующего кодона с помощью PIC или рибосомы. В некоторых вариантах осуществления желательная трансляционная регуляторная активность представляет собой ингибирование или уменьшение ослабленного сканирования PIC или рибосомой. В некоторых вариантах осуществления желательная трансляционная регуляторная активность представляет собой снижение скорости декодирования инициирующего кодона с помощью PIC или рибосомы. В некоторых вариантах осуществления желаемая трансляционная регуляторная активность представляет собой ингибирование или снижение инициации синтеза полипептида в любом кодоне в мРНК, кроме инициирующего кодона. В некоторых вариантах осуществления желательная трансляционная регуляторная активность представляет собой ингибирование или уменьшение количества полипептида, транслируемого с любой открытой рамки считывания в мРНК, кроме полноразмерной открытой рамки считывания. В некоторых вариантах осуществления желательная трансляционная регуляторная активность представляет собой ингибирование или снижение продукции аберрантных продуктов трансляции. В некоторых вариантах осуществления желательная трансляционная регуляторная активность представляет собой комбинацию одной или более из вышеупомянутых трансляционных регуляторных активностей.
Соответственно, данное раскрытие обеспечивает полинуклеотид, например, мРНК, содержащую элемент РНК, который содержит последовательность и/или вторичную структуру(ы) РНК, которая обеспечивает желаемую трансляционную регуляторную активность, как описано в данном документе. В некоторых аспектах мРНК содержит элемент РНК, который содержит последовательность и/или вторичную структуру(ы) РНК, которая способствует и/или усиливает точность трансляции мРНК. В некоторых аспектах мРНК содержит элемент РНК, который содержит последовательность и/или вторичную структуру(ы) РНК, которая обеспечивает желаемую трансляционную регуляторную активность, такую как ингибирование и/или уменьшение ослабленного сканирования. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, которая содержит элемент РНК, который содержит последовательность и/или вторичную структуру(ы) РНК, которая ингибирует и/или уменьшает ослабленное сканирование, тем самым способствуя точности трансляции мРНК.
В некоторых вариантах осуществления элемент РНК содержит природные и/или модифицированные нуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления элемент РНК содержит последовательность соединенных нуклеотидов или их производных или аналогов, которая обеспечивает требуемую трансляционную регуляторную активность, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления элемент РНК содержит последовательность соединенных нуклеотидов или их производных или аналогов, которая образует или сворачивается в стабильную вторичную структуру РНК, причем вторичная структура РНК обеспечивает желаемую трансляционную регуляторную активность, как описано в данном документе. Элементы РНК могут быть идентифицированы и/или охарактеризованы на основе первичной последовательности элемента (например, GC-богатого элемента), посредством вторичной структуры РНК, образованной элементом (например, шпилькой), по расположению элемента в молекуле РНК (например, расположенной в 5'-НТО мРНК) по биологической функции и/или активности элемента (например, «элемента, усиливающего трансляцию») и любой их комбинации.
В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает мРНК, имеющую одну или более структурных модификаций, которые ингибируют ослабленное сканирование и/или способствуют точности трансляции мРНК, причем по меньшей мере одна из структурных модификаций представляет собой GC-богатый элемент РНК. В некоторых аспектах раскрытие обеспечивает модифицированную мРНК, содержащую по меньшей мере одну модификацию, при этом по меньшей мере одна модификация представляет собой GC-богатый элемент РНК, содержащий последовательность соединенных нуклеотидов или их производных или аналогов, предшествующий консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК. В одном варианте осуществления GC-богатый элемент РНК расположен через около 30, около 25, около 20, около 15, около 10, около 5, около 4, около 3, около 2 или около 1 нуклеотид(ов) против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК. В другом варианте осуществления GC-богатый элемент РНК расположен через 15-30, 15-20, 15-25, 10-15 или 5-10 нуклеотидов против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак. В другом варианте осуществления GC-богатый элемент РНК расположен непосредственно рядом с консенсусной последовательностью Козак в 5'-НТО мРНК.
В любом из вышеизложенных или связанных аспектов раскрытие обеспечивает GC-богатый элемент РНК, который содержит последовательность 3-30, 5-25, 10-20, 15-20, около 20, около 15, около 12, около 10, около 7, около 6 или около 3 нуклеотидов, их производных или аналогов, соединенных в любом порядке, при этом состав последовательности представляет собой 70-80% цитозина, 60-70% цитозина, 50% - 60% цитозина, 40-50% цитозина, 30-40% цитозиновых оснований. В любом из вышеизложенных или связанных аспектов раскрытие обеспечивает GC-богатый элемент РНК, который содержит последовательность 3-30, 5-25, 10-20, 15-20, около 20, около 15, около 12, около 10, около 7, около 6 или около 3 нуклеотидов, их производных или аналогов, соединенных в любом порядке, при этом состав последовательности представляет собой около 80% цитозина, около 70% цитозина, около 60% цитозина, около 50% цитозина, около 40% цитозина или около 30% цитозина.
В любом из вышеперечисленных или связанных аспектов раскрытие обеспечивает GC-богатый элемент РНК, который содержит последовательность из 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 или 3 нуклеотида, или их производных или аналогов, соединенных в любом порядке, при этом состав последовательности представляет собой 70-80% цитозина, 60-70% цитозина, 50% -60% цитозина, 40-50% цитозина, или 30-40% цитозина. В любом из вышеперечисленных или связанных аспектов раскрытие обеспечивает GC-богатый элемент РНК, который содержит последовательность из 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 или 3 нуклеотида, или их производных или аналогов, соединенных в любом порядке, при этом состав последовательности представляет собой около 80% цитозина, около 70% цитозина, около 60% цитозина, около 50% цитозина, около 40% цитозина или около 30% цитозина.
В некоторых вариантах осуществления раскрытие обеспечивает модифицированную мРНК, содержащую по меньшей мере одну модификацию, при этом по меньшей мере одна модификация представляет собой GC-богатый элемент РНК, содержащий последовательность соединенных нуклеотидов или их производных или аналогов, предшествующий консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК, причем GC-богатый элемент РНК расположен через около 30, около 25, около 20, около 15, около 10, около 5, около 4, около 3, около 2 или около 1 нуклеотид(ов) против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК, и при этом GC-богатый элемент РНК, содержит последовательность 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов или их производных или аналогов, соединенных в любом порядке, причем состав последовательности представляет собой>50% цитозина. В некоторых вариантах осуществления композиция последовательности представляет собой >55% цитозина, >60% цитозина, >65% цитозина, >70% цитозина, >75% цитозина, >80% цитозина, >85% цитозина или >90% цитозина.
В других аспектах раскрытие обеспечивает модифицированную мРНК, содержащую по меньшей мере одну модификацию, причем по меньшей мере одна модификация представляет собой GC-богатый элемент РНК, содержащий последовательность соединенных нуклеотидов или их производных или аналогов, предшествующий консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК, при этом GC-богатый элемент РНК расположен через около 30, около 25, около 20, около 15, около 10, около 5, около 4, около 3, около 2 или около 1 нуклеотид(ов) против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК, и причем GC-богатый элемент РНК содержит последовательность около 3-30, 5-25, 10-20, 15-20 или около 20, около 15, около 12, около 10, около 6 или около 3 нуклеотидов или их производных или аналогов, при этом последовательность содержит повторяющийся GC-мотив, в которой повторяющийся GC-мотив представляет собой [CCG]n, где n=1-10, n=2-8, n=3-6 или n=4-5. В некоторых вариантах осуществления последовательность содержит повторяющийся GC-мотив [CCG]n, где n=1, 2, 3, 4 или 5. В некоторых вариантах осуществления последовательность содержит повторяющийся GC-мотив [CCG]n, где n=1, 2 или 3. В некоторых вариантах осуществления последовательность содержит повторяющийся GC-мотив [CCG]n, где n=1. В некоторых вариантах осуществления последовательность содержит повторяющийся GC-мотив [CCG]n, где n=2. В некоторых вариантах осуществления последовательность содержит повторяющийся GC-мотив [CCG]n, где n=3. В некоторых вариантах осуществления последовательность содержит повторяющийся GC-мотив [CCG]n, где n=4 (SEQ ID NO: 1384). В некоторых вариантах осуществления последовательность содержит повторяющийся GC-мотив [CCG]n, где n=5 (SEQ ID NO: 1382).
В другом аспекте раскрытие обеспечивает модифицированную мРНК, содержащую по меньшей мере одну модификацию, при этом по меньшей мере одна модификация представляет собой GC-богатый элемент РНК, содержащий последовательность соединенных нуклеотидов или их производных или аналогов, предшествующий консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК, при этом GC-богатый элемент РНК содержит любую из последовательностей, указанных в Таблице 4. В одном варианте осуществления GC-богатый элемент РНК расположен через около 30, около 25, около 20, около 15, около 10, около 5, около 4, около 3, около 2 или около 1 нуклеотид(ов) против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК. В другом варианте осуществления GC-богатый элемент РНК расположен через около 15-30, 15-20, 15-25, 10-15 или 5-10 нуклеотидов против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак. В другом варианте осуществления GC-богатый элемент РНК расположен непосредственно рядом с консенсусной последовательностью Козак в 5'-НТО мРНК.
В других аспектах раскрытие обеспечивает модифицированную мРНК, содержащую по меньшей мере одну модификацию, причем по меньшей мере одна модификация представляет собой GC-богатый элемент РНК, содержащий последовательность V1 [CCCCGGCGCC] (SEQ ID NO: 1383), как указано в Таблице 4, или их производные или аналоги, предшествующий консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК. В некоторых вариантах осуществления GC-богатый элемент РНК содержит последовательность V1, как указано в Таблице 4, расположенную непосредственно рядом с консенсусной последовательностью Козак и против хода транскрипции от нее в 5'-НТО мРНК. В некоторых вариантах осуществления GC-богатый элемент РНК содержит последовательность V1, как указано в Таблице 4, расположенную через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 оснований против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК. В других вариантах осуществления GC-богатый элемент РНК содержит последовательность V1, как указано в Таблице 4, расположенную через 1-3, 3-5, 5-7, 7-9, 9-12 или 12-15 оснований против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК.
В других аспектах раскрытие обеспечивает модифицированную мРНК, содержащую по меньшей мере одну модификацию, при этом по меньшей мере одна модификация представляет собой GC-богатый элемент РНК, содержащий последовательность V2 [CCCCGGC], как указано в Таблице 4, или ее производные или аналоги, предшествующие консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК. В некоторых вариантах осуществления GC-богатый элемент РНК содержит последовательность V2, как указано в Таблице 4, расположенную непосредственно рядом с консенсусной последовательностью Козак и против хода транскрипции от нее в 5'-НТО мРНК. В некоторых вариантах осуществления GC-богатый элемент РНК содержит последовательность V2, как указано в Таблице 4, расположенную через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 оснований против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК. В других вариантах осуществления GC-богатый элемент РНК содержит последовательность V2, как указано в Таблице 4, расположенную через 1-3, 3-5, 5-7, 7-9, 9-12 или 12-15 оснований против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК.
В других аспектах раскрытие обеспечивает модифицированную мРНК, содержащую по меньшей мере одну модификацию, при этом по меньшей мере одна модификация представляет собой GC-богатый элемент РНК, содержащий последовательность EK [GCCGCC], как указано в Таблице 4, или ее производные или аналоги, предшествующие консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК. В некоторых вариантах осуществления GC-богатый элемент РНК содержит последовательность EK, как указано в Таблице 4, расположенную непосредственно рядом с консенсусной последовательностью Козак и против хода транскрипции от нее в 5'-НТО мРНК. В некоторых вариантах осуществления GC-богатый элемент РНК содержит последовательность EK, как указано в Таблице 4, расположенную через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 оснований против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК. В других вариантах осуществления GC-богатый элемент РНК содержит последовательность EK, как указано в Таблице 4, расположенную через 1-3, 3-5, 5-7, 7-9, 9-12 или 12-15 оснований против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК.
В еще других аспектах раскрытие обеспечивает модифицированную мРНК, содержащую по меньшей мере одну модификацию, причем по меньшей мере одна модификация представляет собой GC-богатый элемент РНК, содержащий последовательность V1 [CCCCGGCGCC] (SEQ ID NO: 1383), как указано в Таблице 4, или их производные или аналоги, предшествующий консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК, при этом 5'-НТО содержит следующую последовательность, приведенную в Таблице 4:
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGA (SEQ ID NO: 1384).
В некоторых вариантах осуществления GC-богатый элемент РНК содержит последовательность V1, как указано в Таблице 4, расположенную непосредственно рядом с консенсусной последовательностью Козак и против хода транскрипции от нее в последовательности 5'-НТО, приведенной в Таблице 4. В некоторых вариантах осуществления GC-богатый элемент РНК содержит последовательность V1, как указано в Таблице 4, расположенную через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 оснований против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК, при этом 5'-НТО содержит следующую последовательность, приведенную в Таблице 4:
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGA (SEQ ID NO: 1384).
В других вариантах осуществления GC-богатый элемент РНК содержит последовательность V1, как указано в Таблице 4, расположенную через 1-3, 3-5, 5-7, 7-9, 9-12 или 12-15 оснований против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак в 5'-НТО мРНК, при этом 5'-НТО содержит следующую последовательность, приведенную в Таблице 4:
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGA (SEQ ID NO: 1384).
В некоторых вариантах осуществления 5'-НТО содержит следующую последовательность, приведенную в Таблице 4:
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCGCCACC (SEQ ID NO: 1385)
В некоторых вариантах осуществления 5'-НТО содержит следующую последовательность, приведенную в Таблице 4:
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCACC (SEQ ID NO: 1386)
Таблица 4
SEQ ID NO:
5'-НТО
Последовательность 5'-НТО
1380
Стандартный
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC
1384
НТО
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGA
1385
V1-UTR
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCGCCACC
1386
V2-UTR
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCACC
GC-богатые элементы РНК
Последовательность
K0 (Традиционная консенсусная последовательность Козак)
[GCCA/GCC]
EK
[GCCGCC]
1383
V1
[CCCCGGCGCC]
V2
[CCCCGGC]
(CCG)<sub>n</sub>, где n=1-10
[CCG]<sub>n</sub>
(GCC)<sub>n</sub>, где n=1-10
[GCC]<sub>n</sub>
1381
(CCG)<sub>n</sub>, где n=4
[CCGCCGCCGCCG]
1382
(CCG)<sub>n</sub>, где n=5
[CCGCCGCCGCCGCCG]
В другом аспекте раскрытие обеспечивает модифицированную мРНК, содержащую по меньшей мере одну модификацию, причем по меньшей мере одна модификация представляет собой GC-богатый элемент РНК, содержащий стабильную вторичную структуру РНК, содержащую последовательность нуклеотидов или их производных или аналогов, соединенных в определенном порядке, которые образует шпильку или петлю-на-стебле. В одном варианте осуществления стабильная вторичная структура РНК находится против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак. В другом варианте осуществления стабильная вторичная структура РНК расположена через около 30, около 25, около 20, около 15, около 10 или около 5 нуклеотидов против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак. В другом варианте осуществления стабильная вторичная структура РНК расположена через около 20, около 15, около 10 или около 5 нуклеотидов против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак. В другом варианте осуществления стабильная вторичная структура РНК расположена через около 5, около 4, около 3, около 2, около 1 нуклеотид против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак. В другом варианте осуществления стабильная вторичная структура РНК расположена через около 15-30, около 15-20, около 15-25, около 10-15 или около 5-10 нуклеотидов против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак. В другом варианте осуществления стабильная вторичная структура РНК расположена через 12-15 нуклеотидов против хода транскрипции от консенсусной последовательности Козак. В другом варианте осуществления стабильная вторичная структура РНК имеет ΔG около -30 ккал/моль, от около -20 до -30 ккал/моль, около -20 ккал/моль, от около -10 до -20 ккал/моль, около -10 ккал/моль, от около -5 до -10 ккал/моль.
В другом варианте осуществления модификация функционально связана с открытой рамкой считывания, кодирующей полипептид, и при этом модификация и открытая рамка считывания являются гетерологичными.
В другом варианте осуществления последовательность GC-богатого элемента РНК состоит исключительно из нуклеотидных оснований гуанина (G) и цитозина (C).
Элементы РНК, которые обеспечивают желаемую трансляционную регуляторную активность, как описано в данном документе, могут быть идентифицированы и охарактеризованы с использованием известных методов, таких как профилирование рибосом. Профилирование рибосом представляет собой метод, который позволяет определять положения PIC и/или рибосом, связанных с мРНК (см., например, Ingolia et al., (2009) Science 324 (5924):218-23, включенной в данный документ посредством ссылки). Метод основан на защите области или сегмента мРНК с помощью PIC и/или рибосомы от расщепления нуклеазой. Защита приводит к генерации фрагмента РНК длиной 30 п.н., называемого «область узнавания». Последовательность и частоту областей узнавания РНК можно анализировать способами, известными в данной области техники (например, РНК-секвенирование). Область узнавания примерно расположена по центру на А-сайте рибосомы. Если PIC или рибосома находятся в определенном положении или месте вдоль мРНК, области узнавания, генерируемые в этом положении, будут относительно распространенными. Исследования показали, что в положениях, где PIC и/или рибосома проявляют пониженную процессивность, образуется больше областей узнавания, а в положениях, где PIC и/или рибосома проявляет повышенную процессивность образуется меньше областей узнавания (Gardin et al., (2014) eLife 3:e03735). В некоторых вариантах осуществления время нахождения или время пребывания PIC или рибосомы в дискретном положении или месте вдоль полинуклеотида, содержащего любой один или более элементов РНК, описанных в данном документе, определяют с помощью профилирования рибосомы.
Средства доставки
Общая часть
мРНК согласно раскрытию может быть составлена в виде наночастиц или других средств доставки, например, для защиты их от деградации при доставке субъекту. Иллюстративные наночастицы описаны в Panyam,  J. & Labhasetwar, V. Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003) и Peer, D. et al. Nature Nanotech. 2, 751-760 (2007). В некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию инкапсулируют в наночастицу. В конкретных вариантах осуществления наночастица представляет собой частицу, имеющую по меньшей мере один размер (например, диаметр), меньший или равный 1000 нМ, меньший или равный 500 нМ, или меньший или равный 100 нМ. В конкретных вариантах осуществления наночастица включает липид. Липидные наночастицы включают, но не ограничиваются ими, липосомы и мицеллы. Может присутствовать любой из ряда липидов, включая катионные и/или ионизируемые липиды, анионные липиды, нейтральные липиды, амфипатические липиды, пегилированные липиды и/или структурные липиды. Такие липиды можно использовать отдельно или в комбинации. В конкретных вариантах осуществления липидная наночастица содержит одну или более мРНК, описанных в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления составы липидных наночастиц мРНК, описанных в данном документе, могут содержать один или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) катионных и/или ионизируемых липидов. Такие катионные и/или ионизируемые липиды включают, но не ограничиваются ими, 3-(дидодециламин)-N1,N1,4-тридодецил-1-пиперазинэтанамин (KL10), N1-[2-(дидодециламино)этил]-N1,N4,N4-тридодецил-1,4-пиперазиндиэтанамин (KL22), 14,25-дитридецил-15,18,21,24-тетрааза-октатриаконтан (KL25), 1,2дилинолеилоксиN,Nдиметиламинопропан (DLin-DMA), 2,2дилинолеил4диметиламинометил[1,3]диоксолан (DLin-K-DMA), гептатриаконта6,9,28,31 тетраен19ил 4(диметиламино)бутаноат (DLin-MC3-DMA), 2,2дилинолеил4(2диметиламиноэтил)[1,3]диоксолан (DLin-KC2-DMA), 2({8[(3β)холест5ен3илокси]октил}окси)N,Nдиметил3[(9Z,12Z)октадека9,12диен1илокси]пропан1амин (октил-CLinDMA), (2R)2({8[(3β)холест5ен3элокси]октил}окси)N,Nдиметил3[(9Z,12Z)октадека9,12диен1илокси]пропан1амин (октил-CLinDMA (2R)), (2S)2({8[(3β)холест5ен3илокси]октил}окси)N,Nдиметил3[(9Z,12Z)октадека9,12диен1илокси]пропан1амин (октил-CLinDMA (2S)).N,N-диолеил-N,N-диметиламмоний хлорид (DODAC); N-(2,3-диолеилокси)пропил-N,N--N-триметиламмоний хлорид (DOTMA); N,N-дистеарил-N,N-диметиламмоний бромид (DDAB); N-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмоний хлорид (DOTAP); 1,2-диолеилокси-3-триметиламинопропан гидрохлорид (DOTAP.Cl); 3-β-(N--(N',N'-диметиламиноэтан)-карбамоил)холестерин (DC-Chol), N-(1-(2,3-диолеилокси)пропил)-N-2-(сперминкарбоксамидо)этил)-N,N-диметил-аммоний трифторацетат (DOSPA), диоктадециламидоглицил карбоксиспермин (DOGS), 1,2-диолеил-3-диметиламмоний пропан (DODAP), N,N-диметил-2,3-диолеилокси)пропиламин (DODMA), и N-(1,2-димиристоилоксипроп-3-ил)-N,N-диметил-N-гидроксиэтил аммония бромид (DMRIE). Кроме того, можно использовать ряд коммерческих препаратов катионных и/или ионизируемых липидов, таких как, например, LIPOFECTIN (включая DOTMA и DOPE, доступный от GIBCO/BRL) и LIPOFECTAMINE (включая DOSPA и DOPE, доступный от GIBCO/BRL). KL10, KL22 и KL25 описаны, например, в патенте США №8691750, который включен в данный документ во всей полноте посредством ссылки. В конкретных вариантах осуществления липид представляет собой DLin-MC3-DMA или DLin-KC2-DMA.
Анионные липиды, пригодные для использования в наночастицах липидных согласно раскрытию, включают, но не ограничиваются ими, фосфатидилглицерин, кардиолипин, диацилфосфатидилсерин, диацилфосфатидную кислоту, N-додеканоил фосфатидилэтаноламин, N-сукцинил фосфатидилэтаноламин, N-глутарил фосфатидилэтаноламин, лизилфосфатидилглицерин, и другие анионные модифицированные группы, присоединенные к нейтральным липидам.
Нейтральные липиды, подходящие для применения в липидных наночастицах согласно раскрытию, включают, но не ограничиваются ими, диацилфосфатидилхолин, диацилфосфатидилэтаноламин, керамид, сфингомиелин, дигидросфингомиелин, цефалин и цереброзиды. Липиды, имеющие различные группы ацильных цепей с различной длиной цепи и степенью насыщения, доступны или могут быть выделены или синтезированы с помощью хорошо известных методик. Кроме того, могут быть использованы липиды, содержащие смеси цепей насыщенных и ненасыщенных жирных кислот. В некоторых вариантах осуществления нейтральные липиды, используемые в раскрытии, представляют собой DOPE, DSPC, DPPC, POPC или любой связанный фосфатидилхолин. В некоторых вариантах осуществления нейтральный липид может состоять из сфингомиелина, дигидросфингомиелина или фосфолипидов с другими концевыми группами, такими как серин и инозит.
В некоторых вариантах осуществления амфипатические липиды включены в наночастицы согласно раскрытию. Иллюстративные амфипатические липиды, подходящие для использования в наночастицах согласно раскрытию, включают, но не ограничиваются ими, сфинголипиды, фосфолипиды и аминолипиды. В некоторых вариантах осуществления фосфолипид выбирают из группы, включающей 1,2дилинолеоил-sn-глицеро3фосфохолин (DLPC), 1,2димиристоил-sn-глицерофосфохолин (DMPC), 1,2диолеил-sn-глицеро3фосфохолин (DOPC), 1,2дипальмитоил-sn-глицеро3фосфохолин (DPPC), 1,2дистеароил-sn-глицеро3фосфохолин (DSPC), 1,2диундеканоил-sn-глицерофосфохолин (DUPC), 1пальмитоил2олеоил-sn-глицеро3фосфохолин (POPC), 1,2диOоктадеценил-sn-глицеро3фосфохолин (18:0 Diether PC), 1олеоил2холестерилгемисукциноил-sn-глицеро3фосфохолин (OChemsPC), 1 гексадецил-sn-глицеро3фосфохолин (C16 Lyso PC), 1,2дилиноленоил-sn-глицеро3фосфохолин, 1,2диарахидоноил-sn-глицеро3фосфохолин, 1,2дидокозагексаеноил-sn-глицеро3фосфохолин,1,2диолеоил-sn-глицеро3фосфоэтаноламин (DOPE), 1,2дифитаноил-sn-глицеро3фосфоэтаноламин (ME 16.0 PE), 1,2дистеароил-sn-глицеро3фосфоэтаноламин, 1,2дилиноленоил-sn-глицеро3фосфоэтаноламин, 1,2дилиноленоил-sn-глицеро3фосфоэтаноламин, 1,2диарахидоноил-sn-глицеро3фосфоэтаноламин, 1,2дидокозагексаеноил-sn-глицеро3фосфоэтаноламин, 1,2диолеоил-sn-глицеро3фосфорац(1 глицерол) хлорид натрия (DOPG), и сфингомиелин. Другие не содержащие фосфор соединения, такие как сфинголипиды, семейства гликосфинголипидов, диацилглицерины и β-ацилоксикислоты, также могут быть использованы. Кроме того, такие амфипатические липиды могут быть легко смешаны с другими липидами, такими как триглицериды и стерины.
В некоторых вариантах осуществления липидный компонент наночастицы согласно раскрытию может включать один или более пегилированных липидов. Пегилированный липид (также известный как ПЭГ-липид или ПЭГ-модифицированный липид) представляет собой липид, модифицированный полиэтиленгликолем. Липидный компонент может содержать один или более пегилированных липидов. Пегилированный липид может быть выбран из неограничивающей группы, состоящей из ПЭГ-модифицированных фосфатидилэтаноламинов, ПЭГ-модифицированных фосфатидных кислот, ПЭГ-модифицированных церамидов, ПЭГ-модифицированных диалкиламинов, ПЭГ-модифицированных диацилглицеринов и ПЭГ-модифицированных диалкилглицеринов. Например, пегилированный липид может представлять собой липид ПЭГ-c-DOMG, ПЭГ-DMG, ПЭГ-DLPE, ПЭГ-DMPE, ПЭГ-DPPC, или ПЭГ-DSPE.
Липидная наночастица согласно раскрытию может содержать один или более структурных липидов. Иллюстративные неограничивающие структурные липиды, которые могут присутствовать в липидных наночастицах согласно раскрытию, включают холестерин, фекостерин, ситостерин, кампестерин, стигмастерин, брассикастерин, эргостерин, томатидин, томатин, урсоловую кислоту или альфа-токоферол.
В некоторых вариантах осуществления одна или более мРНК согласно раскрытию могут быть составлены в виде липидной наночастицы, имеющей диаметр от около 1 нм до около 900 нм, например, от около 1 нм до около 100 нм, от около 1 нм до около 200 нм, от около 1 до около 300 нм, от около 1 до около 400 нм, от около 1 до около 500 нм, от около 1 до около 600 нм, от около 1 до около 700 нм, от около 1 до около 800 нм, от около 1 до около нм 900 нм. В некоторых вариантах осуществления наночастица может иметь диаметр от около 10 нм до около 300 нм, от около 20 нм до около 200 нм, от около 30 нм до около 100 нм или от около 40 нм до около 80 нм. В некоторых вариантах осуществления наночастица может иметь диаметр от около 30 нм до около 300 нм, от около 40 нм до около 200 нм, от около 50 нм до около 150 нм, от около 70 до около 110 нм или от около 80 нм до около 120 нм. В одном варианте осуществления мРНК может быть составлена в виде липидной наночастицы, имеющей диаметр от около 10 до около 100 нм, включая интервалы между ними, такие как, но не ограничиваясь этим, от около 10 до около 20 нм, от около 10 до около 30 нм, от около 10 до около 40 нм, от около 10 до около 50 нм, от около 10 до около 60 нм, от около 10 до около 70 нм, от около 10 до около 80 нм, от около 10 до около 90 нм, от около 20 до около 30 нм, около 20 до около 40 нм, от около 20 до около 50 нм, от около 20 до около 60 нм, от около 20 до около 70 нм, от около 20 до около 80 нм, от около 20 до около 90 нм, от около 20 до около 100 нм, от около 30 до около 40 нм, от около 30 до около 50 нм, от около 30 до около 60 нм, от около 30 до около 70 нм, от около 30 до около 80 нм, от около 30 до около 90 нм, от около 30 до около 100 нм, от около 40 до около 50 нм, от около 40 до около 60 нм, от около 40 до около 70 нм, от около 40 до около 80 нм, от около 40 до около 90 нм, от около 40 до около 100 нм, от около 50 до около 60 нм, от около 50 до около 70 нм, от около 50 до около 80 нм, от около 50 до около 90 нм, от около 50 до около 100 нм, от около 60 до около 70 нм, от около 60 до около 80 нм, от около 60 до около 90 нм, от около 60 до около 100 нм, от около 70 до около 80 нм, от около 70 до около 90 нм, от около 70 до около 100 нм, от около 80 до около 90 нм, от около 80 до около 100 нм и/или от около 90 до около 100 нм. В одном варианте осуществления мРНК может быть составлена в виде липидной наночастицы, имеющей диаметр от около 30 нм до около 300 нм, от около 40 нм до около 200 нм, от около 50 нм до около 150 нм, от около 70 до около 110 нм или от около 80 нм до около 120 нм, включая диапазоны между ними.
В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица может иметь диаметр более 100 нм, более 150 нм, более 200 нм, более 250 нм, более 300 нм, более 350 нм, более 400 нм, более 450 нм более 500 нм, более 550 нм, более 600 нм, более 650 нм, более 700 нм, более 750 нм, более 800 нм, более 850 нм, более 900 нм или более 950 нм.
В некоторых вариантах осуществления размер липидной наночастицы может быть увеличен и/или уменьшен. Изменение размера частиц может помочь противодействовать биологической реакции, такой как, но не ограничиваясь этим, воспаление, или может увеличить биологический эффект мРНК, доставляемой пациенту или субъекту.
В определенных вариантах осуществления желательно нацеливать наночастицу, например, липидную наночастицу согласно раскрытию, с использованием нацеливающего фрагмента, который специфичен для типа клеток и/или типа ткани. В некоторых вариантах осуществления наночастица может быть нацелена на конкретную клетку, ткань и/или орган с использованием нацеливающего фрагмента. В конкретных вариантах осуществления наночастица содержит одну или более мРНК, описанных в данном документе, и нацеливающий фрагмент.Иллюстративные неограничивающие нацеливающие фрагменты включают лиганды, рецепторы клеточной поверхности, гликопротеины, витамины (например, рибофлавин) и антитела (например, полноразмерные антитела, фрагменты антител (например, Fv-фрагменты, одноцепочечные Fv-фрагменты (scFv), Fab'-фрагменты) или F(ab')2-фрагменты), однодоменные антитела, верблюжьи антитела и их фрагменты, человеческие антитела и их фрагменты, моноклональные антитела и полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела)). В некоторых вариантах осуществления нацеливающий фрагмент может представлять собой полипептид. Нацеливающий фрагмент может содержать весь полипептид (например, пептид или белок) или его фрагменты. Нацеливающий фрагмент обычно располагается на внешней поверхности наночастицы таким образом, что нацеливающий фрагмент был доступен для взаимодействия с мишенью, например, рецептором клеточной поверхности. В данной области техники известно и доступно множество различных нацеливающих фрагментов и способов, включая те, которые описаны, например, в Sapra et al., Prog. Lipid Res. 42(5):439-62, 2003 and Abra et al., J. Liposome Res. 12:1-3, 2002.
В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица (например, липосома) может содержать поверхностный слой гидрофильных полимерных цепей, таких как цепи полиэтиленгликоля (ПЭГ) (см., например, Allen et al., Biochimica et Biophysica Acta 1237: 99-108, 1995; DeFrees et al., Journal of the American Chemistry Society 118: 6101-6104, 1996; Blume et al., Biochimica et Biophysica Acta 1149: 180-184,1993; Klibanov et al., Journal of Liposome Research 2: 321-334, 1992; патент США №5013556; Zalipsky, Bioconjugate Chemistry 4: 296-299, 1993; Zalipsky, FEBS Letters 353: 71-74, 1994; Zalipsky, в Stealth Liposomes Chapter 9 (Lasic and Martin, Eds) CRC Press, Boca Raton Fla., 1995). В одном подходе нацеливающий фрагмент для нацеливания липидной наночастицы связан с полярной концевой группой липидов, образующих наночастицу. В другом подходе нацеливающий фрагмент прикрепляется к дистальным концам цепей ПЭГ, образующих гидрофильный полимерный слой (см., например, Klibanov et al., Journal of Liposome Research 2: 321-334, 1992; Kirpotin et al., FEBS Letters 388: 115-118, 1996).
Могут быть использованы стандартные способы связывания нацеливающего фрагмента или фрагментов. Например, можно использовать фосфатидилэтаноламин, который можно активировать для присоединения целевых групп, или дериватизированные липофильные соединения, такие как дериватизированный липидами блеомицин. Липосомы, нацеленные липосомы, могут быть сконструированы с использованием, например, липосом, которые включают белок А (см., например, Renneisen et al., J. Bio. Chem., 265:16337-16342, 1990 и Leonetti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 87:2448-2451, 1990). Другие примеры конъюгации антител раскрыты в патенте США №6027726. Примеры нацеливающих фрагментов также могут включать другие полипептиды, которые специфичны для клеточных компонентов, включая антигены, связанные с новообразованиями или опухолями. Полипептиды, используемые в качестве нацеливающих фрагментов, могут быть присоединены к липосомам через ковалентные связи (см., например, Heath, Covalent Attachment of Proteins to Liposomes, 149 Methods in Enzymology 111-119 (Academic Press, Inc. 1987)). Другие способы нацеливания включают систему биотин-авидин.
В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица согласно раскрытию содержит нацеливающий фрагмент, который нацеливает липидную наночастицу на клетку, включая, но не ограничиваясь этим, гепатоциты, клетки толстой кишки, эпителиальные клетки, гемопоэтические клетки, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, клетки легкого, остеоциты, стволовые клетки, мезенхимальные клетки, нервные клетки, клетки сердца, адипоциты, гладкомышечные клетки сосудов, кардиомиоциты, клетки скелетных мышц, бета-клетки, клетки гипофиза, клетки синовиальной оболочки, клетки яичников, клетки яичка, фибробласты, В-клетки, Т-клетки, ретикулоциты, лейкоциты, гранулоциты и опухолевые клетки (включая первичные опухолевые клетки и метастатические опухолевые клетки). В конкретных вариантах осуществления нацеливающий фрагмент нацеливает липидную наночастицу на гепатоцит.В других вариантах осуществления нацеливающий фрагмент нацеливает липидную наночастицу на клетку толстой кишки. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий фрагмент нацеливает липидную наночастицу на клетку рака печени (например, клетку гепатоцеллюлярной карциномы) или клетку колоректального рака (например, первичную опухоль или метастазы).
Липидные наночастицы
В одном наборе вариантов осуществления предложены липидные наночастицы (LNP). В одном варианте осуществления липидная наночастица содержит липиды, включая ионизируемый липид, структурный липид, фосфолипид и одну или более мРНК. Каждую из LNP, описанных в данном документе, можно использовать в качестве состава для мРНК, описанной в данном документе. В одном варианте осуществления липидная наночастица содержит ионизируемый липид, структурный липид, фосфолипид, ПЭГ-модифицированный липид и одну или более мРНК. В некоторых вариантах осуществления LNP содержит ионизируемый липид, ПЭГ-модифицированный липид, стерин и фосфолипид. В некоторых вариантах осуществления LNP имеет мольное соотношение около 20-60% ионизируемого липида: около 5-25% фосфолипида: около 25-55% стерола; и около 0,5-15% ПЭГ-модифицированного липида. В некоторых вариантах осуществления LNP содержит мольное соотношение около 50% ионизируемого липида, около 1,5% ПЭГ-модифицированного липида, около 38,5% холестерина и около 10% фосфолипида. В некоторых вариантах осуществления LNP содержит мольное соотношение около 55% ионизируемого липида, около 2,5% ПЭГ-липида, около 32,5% холестерина и около 10% фосфолипида. В некоторых вариантах осуществления ионизируемый липид представляет собой ионизируемый амино- или катионный липид, а нейтральный липид представляет собой фосфолипид, а стерин представляет собой холестерин. В некоторых вариантах осуществления LNP имеет мольное соотношение 50: 38,5: 10: 1,5 для ионизируемого липида: холестерина: DSPC (1,2-диоктадеканоил-sn-глицеро-3-фосфохолин): ПЭГ-DMG.
a. Ионизируемый липид
Данное раскрытие обеспечивает фармацевтические композиции с предпочтительными свойствами. Например, липиды, описанные в данном документе, (например, те, которые имеют любую из формул (I), (IA), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (III), (IV), (V) или (VI) могут быть преимущественно использованы в композициях липидных наночастиц для доставки терапевтических и/или профилактических агентов в клетки или органы млекопитающих. Например, липиды, описанные в данном документе, имеют небольшую иммуногенность или не имеют ее вообще. Например, описанные в данном документе липидные соединения обладают более низкой иммуногенностью по сравнению с эталонным липидом (например, MC3, KC2 или DLinDMA). Например, композиция, содержащая липид, раскрытый в данном документе, и терапевтический или профилактический агент, имеет повышенный терапевтический индекс по сравнению с соответствующей композицией, которая содержит эталонный липид (например, MC3, KC2 или DLinDMA) и тот же терапевтический или профилактический агент.В частности, данная заявка обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие:
(a) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес полипептид; и
(b) агент доставки.
В некоторых вариантах осуществления агент доставки включает липидное соединение, имеющее формулу (I)
где
1
530
520
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R”M'R';
2
3
114
214
2
3
R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R*OR”, или R и R, которые вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют гетероцикл или карбоцикл;
4
3
6
2
n
2
n
2
16
2
n
2
3
2
2
2
2
2
2
2
8
2
n
9
2
9
2
2
2
2
2
9
2
9
2
9
2
9
2
R выбирают из группы, состоящей из С- карбоцикла, (CH)Q, (CH)CHQR, CHQR, CQ(R), и незамещенного C алкила, где Q выбирают из карбоцикла, гетероцикла, OR, O(CH)N(R), C(O)OR, OC(O)R, CX, CXH, CXH, CN, N(R), C(O)N(R), N(R)C(O)R, N(R)S(O)R, N(R)C(O)N(R), N(R)C(S)N(R), N(R)R, O(CH)OR, N(R)C(=NR)N(R), N(R)C(=CHR)N(R), OC(O)N(R), N(R)C(O)OR, N(OR)C(O)R, N(OR)S(O)R, N(OR)C(O)OR, N(OR)C(O)N(R), N(OR)C(S)N(R), N(OR)C(=NR)N(R), N(OR)C(=CHR)N(R), C(=NR)N(R), C(=NR)R, C(O)N(R)OR, и C(R)N(R)C(O)OR, и каждый n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4 и 5;
5
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
6
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
2
М и М' независимо выбирают из C(O)O, OC(O), C(O)N(R'), N(R')C(O), C(O), C(S), C(S)S, SC(S), CH(OH), P(O)(OR')O, S(O), SS, арильной группы и гетероарильной группы;
7
1-3
2-3
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
8
3-6
R выбирают из группы, состоящей из C карбоцикла и гетероцикла;
9
2
1-6
2
2
2
2-6
3-6
R выбирают из группы, состоящей из H, CN, NO, C алкила, -OR, -S(O)R, -S(O)N(R), C алкенила, C карбоцикла и гетероцикла;
1
3
2
3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H;
1
18
2
18
каждый R' независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила, R*YR”, YR” и H;
3-14
3-14
каждый R” независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила;
1-12
2-12
каждый R* независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила;
3-6
каждый Y независимо представляет собой С карбоцикл;
каждый X независимо выбирают из группы, состоящей из F, Cl, Br и I; и m выбирают из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 13,
или их солей или стереоизомеров.
В некоторых вариантах осуществления поднабор соединений формулы (I) включает соединения, в которых
1
520
520
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R”M'R';
2
3
114
214
2
3
R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R*OR”, или R и R, которые вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют гетероцикл или карбоцикл;
4
36
2
n
2
n
2
16
2
n
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
R выбирают из группы, состоящей из C карбоцикла, (CH)Q, (CH)CHQR, CHQR, CQ(R), и незамещенного C алкила, где Q выбирают из карбоцикла, гетероцикла, OR, O(CH)N(R), C(O)OR, OC(O)R, CX, CXH, CXH, CN, N(R), C(O)N(R), N(R)C(O)R, N(R)S(O)R, N(R)C(O)N(R), N(R)C(S)N(R), и C(R)N(R)C(O)OR, и каждый n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4 и 5;
5
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
6
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
2
М и М' независимо выбирают из C(O)O, OC(O), C(O)N(R'), N(R')C(O), C(O), C(S), C(S)S, SC(S), CH(OH), P(O)(OR')O, S(O), арильной группы и гетероарильной группы;
7
1-3
2-3
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
1-18
2-18
каждый R' независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR” и H;
3-14
3-14
каждый R” независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила;
1-12
2-12
каждый R* независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила;
3-6
каждый Y независимо представляет собой С карбоцикл;
каждый X независимо выбирают из группы, состоящей из F, Cl, Br и I; и m выбирают из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 13,
или их солей или стереоизомеров, где алкильные и алкенильные группы могут быть линейными или разветвленными.
4
2
n
2
n
2
2
В некоторых вариантах осуществления поднабор соединений формулы (I) включает соединения, в которых, если R представляет собой (CH)Q, (CH)CHQR, CHQR, или CQ(R), тогда (i) Q не является N(R), если n равно 1, 2, 3, 4 или 5, или (ii) Q не является 5, 6 или 7-членным гетероциклоалкилом, если n равно 1 или 2.
В других вариантах осуществления другой поднабор соединений формулы (I) включает соединения, в которых
1
530
520
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R”M'R';
2
3
114
214
2
3
R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R*OR”, или R и R, которые вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют гетероцикл или карбоцикл;
4
36
2
n
2
n
2
16
36
2
n
2
3
2
2
2
2
2
2
2
8
2
n
9
2
9
2
2
2
2
2
9
2
9
2
9
2
9
1-3
R выбирают из группы, состоящей из C карбоцикла, (CH)Q, (CH)CHQR, CHQR, CQ(R), и незамещенного C алкила, где Q выбирают из C карбоцикла, 5-14-членного гетероарила, имеющего один или более гетероатомов, выбранных из N, O, и S, OR, O(CH)N(R), C(O)OR, OC(O)R, CX, CXH, CXH, CN, C(O)N(R), N(R)C(O)R, N(R)S(O)R, N(R)C(O)N(R), N(R)C(S)N(R), CRN(R)C(O)OR, N(R)R, O(CH)OR, N(R)C(=NR)N(R), N(R)C(=CHR)N(R), OC(O)N(R), N(R)C(O)OR, N(OR)C(O)R, N(OR)S(O)R, N(OR)C(O)OR, N(OR)C(O)N(R), N(OR)C(S)N(R), N(OR)C(=NR)N(R), N(OR)C(=CHR)N(R), C(=NR)N(R), C(=NR)R, C(O)N(R)OR, и 5-14-членного гетероциклоалкила, имеющего один или более гетероатомов, выбранных из N, O и S, который замещен одним или более заместителями, выбранными из оксо(=O), OH, амино и C алкила, и каждый n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4 и 5;
5
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
6
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
2
М и М' независимо выбирают из C(O)O, OC(O), C(O)N(R'), N(R')C(O), C(O), C(S), C(S)S, SC(S), CH(OH), P(O)(OR')O, S(O), SS, арильной группы и гетероарильной группы;
7
1-3
2-3
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
8
3-6
R выбирают из группы, состоящей из C карбоцикла и гетероцикла;
9
2
1-6
2
2
2
2-6
3-6
R выбирают из группы, состоящей из H, CN, NO, C алкила, -OR, -S(O)R, -S(O)N(R), C алкенила, C карбоцикла и гетероцикла;
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
1-18
2-18
каждый R' независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR” и H;
3-14
3-14
каждый R” независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила;
1-12
2-12
каждый R* независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила;
3-6
каждый Y независимо представляет собой С карбоцикл;
каждый X независимо выбирают из группы, состоящей из F, Cl, Br и I; и
m выбирают из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 13,
или их солей или стереоизомеров.
В других вариантах осуществления другой поднабор соединений формулы (I) включает соединения, в которых
1
530
520
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R”M'R';
2
3
114
214
2
3
R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R*OR”, или R и R, которые вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют гетероцикл или карбоцикл;
4
36
2
n
2
n
2
1
6
3
6
2
n
2
3
2
2
2
2
2
2
2
1
3
R выбирают из группы, состоящей из C карбоцикла, (CH)Q, (CH)CHQR, CHQR, CQ(R), и незамещенного C- алкила, где Q выбирают из C- карбоцикла, 5-14- членного гетероарила, имеющего один или более гетероатомов, выбранных из N, O и S, -OR, O(CH)N(R), C(O)OR, OC(O)R, CX, CXH, CXH, CN, C(O)N(R), N(R)C(O)R, N(R)S(O)R, N(R)C(O)N(R), N(R)C(S)N(R), CRN(R)C(O)OR, и 5-14-членного гетероциклоалкила, имеющего один или более гетероатомов, выбранных из N, O и S, который замещен одним или более заместителями, выбранными из оксо(=O), OH, амино и C- алкила, и каждый n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4 и 5;
5
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
6
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
2
М и М' независимо выбирают из C(O)O, OC(O), C(O)N(R'), N(R')C(O), C(O), C(S), C(S)S, SC(S), CH(OH), P(O)(OR')O, S(O), арильной группы и гетероарильной группы;
7
1-3
2-3
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
1
3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C алкенила и H;
1-18
2-18
каждый R' независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR” и H;
3-14
3-14
каждый R” независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила;
1-12
2-12
каждый R* независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила;
3-6
каждый Y независимо представляет собой С карбоцикл;
каждый X независимо выбирают из группы, состоящей из F, Cl, Br и I; и
m выбирают из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 13,
или их солей или стереоизомеров.
В еще одних других вариантах осуществления другой поднабор соединений формулы (I) включает соединения, в которых
1
520
520
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R”M'R';
2
3
114
214
2
3
R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R*OR”, или R и R, которые вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют гетероцикл или карбоцикл;
4
36
2
n
2
n
2
1
6
3
6
2
n
2
3
2
2
2
2
2
2
2
8
2
n
9
2
9
2
2
2
2
2
9
2
9
2
9
9
2
4
2
n
4
2
n
4
2
R выбирают из группы, состоящей из C карбоцикла, (CH)Q, (CH)CHQR, CHQR, CQ(R), и незамещенного C- алкила, где Q выбирают из C- карбоцикла, 5-14- членного гетероцикла, имеющего один или более гетероатомов, выбранных из N, O и S, OR, O(CH)N(R), C(O)OR, OC(O)R, CX, CXH, CXH, CN, C(O)N(R), N(R)C(O)R, N(R)S(O)R, N(R)C(O)N(R), N(R)C(S)N(R), CRN(R)C(O)OR, N(R)R, O(CH)OR, N(R)C(=NR)N(R), N(R)C(=CHR)N(R), OC(O)N(R), N(R)C(O)OR, N(OR)C(O)R, N(OR)S(O)R, N(OR)C(O)OR, N(OR)C(O)N(R), N(OR)C(S)N(R), N(OR)C(=NR)N(R), N(OR)C(=CHR)N(R), C(=NR)R, C(O)N(R)OR, и C(=NR)N(R), и каждый n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4 и 5; и если Q представляет собой 5-14-членный гетероцикл и (i) R представляет собой (CH)Q, в котором n равно 1 или 2, или (ii) R представляет собой (CH)CHQR, в котором n равно 1, или (iii) R представляет собой -CHQR и CQ(R), тогда Q представляет собой или 5-14-членный гетероарил, или 8-14-членный гетероциклоалкил;
5
1
3
2
3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H;
6
1
3
2
3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H;
2
М и М' независимо выбирают из C(O)O, OC(O), C(O)N(R'), N(R')C(O), C(O), C(S), C(S)S, SC(S), CH(OH), P(O)(OR')O, S(O), SS, арильной группы и гетероарильной группы;
7
1-3
2-3
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
8
3-6
R выбирают из группы, состоящей из C карбоцикла и гетероцикла;
9
2
1-6
2
2
2
2-6
3-6
R выбирают из группы, состоящей из H, CN, NO, C алкила, -OR, -S(O)R, -S(O)N(R), C алкенила, C карбоцикла и гетероцикла;
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
1-18
2-18
каждый R' независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR” и H;
3-14
3-14
каждый R” независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила;
1-12
2-12
каждый R* независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила;
3-6
каждый Y независимо представляет собой С карбоцикл;
каждый X независимо выбирают из группы, состоящей из F, Cl, Br и I; и
m выбирают из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 13,
или их солей или стереоизомеров.
В еще одних других вариантах осуществления другой поднабор соединений формулы (I) включает соединения, в которых
1
520
520
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R”M'R';
2
3
114
214
2
3
R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R*OR”, или R и R, которые вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют гетероцикл или карбоцикл;
4
36
2
n
2
n
2
1
6
3
6
2
n
2
3
2
2
2
2
2
2
2
4
2
n
4
2
n
4
2
R выбирают из группы, состоящей из C карбоцикла, (CH)Q, (CH)CHQR, CHQR, CQ(R), и незамещенного C- алкила, где Q выбирают из C- карбоцикла, 5-14- членного гетероцикла, имеющего один или более гетероатомов, выбранных из N, O и S, OR, O(CH)N(R), C(O)OR, OC(O)R, CX, CXH, CXH, CN, C(O)N(R), N(R)C(O)R, N(R)S(O)R, N(R)C(O)N(R), N(R)C(S)N(R), CRN(R)C(O)OR, и каждый n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4 и 5; и если Q представляет собой 5-14-членный гетероцикл и (i) R представляет собой (CH)Q, в котором n равно 1 или 2, или (ii) R представляет собой (CH)CHQR, в котором n равно 1, или (iii) R представляет собой CHQR, и CQ(R), тогда Q представляет собой или 5-14-членный гетероарил, или 8-14-членный гетероциклоалкил;
5
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
6
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
2
М и М' независимо выбирают из C(O)O, OC(O), C(O)N(R'), N(R')C(O), C(O), C(S), C(S)S, SC(S), CH(OH), P(O)(OR')O, S(O), арильной группы и гетероарильной группы;
7
1-3
2-3
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
1-18
2-18
каждый R' независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR” и H;
3-14
3-14
каждый R” независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила;
1-12
2-12
каждый R* независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила;
3-6
каждый Y независимо представляет собой С карбоцикл;
каждый X независимо выбирают из группы, состоящей из F, Cl, Br и I; и
m выбирают из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 13,
или их солей или стереоизомеров.
В еще других вариантах осуществления другой поднабор соединений формулы (I) включает соединения, в которых
1
530
520
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R”M'R';
2
3
114
214
2
3
R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R*OR”, или R и R, которые вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют гетероцикл или карбоцикл;
4
3
6
2
n
2
n
2
16
3
6
2
n
2
3
2
2
2
2
2
2
2
8
2
n
9
2
9
2
2
2
2
2
9
2
9
2
9
9
2
Rвыбирают из группы, состоящей из С- карбоцикла, (CH)Q, (CH)CHQR, CHQR, CQ(R), и незамещенного C алкила, где Q выбирают из С- карбоцикла, 5-14-членного гетероарила, имеющего один или более гетероатомов, выбранных из N, O, и S, -OR, O(CH)N(R), C(O)OR, OC(O)R, CX, CXH, CXH, CN, C(O)N(R), N(R)C(O)R, N(R)S(O)R, N(R)C(O)N(R), N(R)C(S)N(R), CRN(R)C(O)OR, N(R)R, O(CH)OR, N(R)C(=NR)N(R), N(R)C(=CHR)N(R), OC(O)N(R), N(R)C(O)OR, N(OR)C(O)R, N(OR)S(O)R, N(OR)C(O)OR, N(OR)C(O)N(R), N(OR)C(S)N(R), N(OR)C(=NR)N(R), N(OR)C(=CHR)N(R), C(=NR)R, C(O)N(R)OR, и C(=NR)N(R), и каждый n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4 и 5;
5
1
3
2
3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H;
6
1
3
2
3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H;
2
М и М' независимо выбирают из C(O)O, OC(O), C(O)N(R'), N(R')C(O), C(O), C(S), C(S)S, SC(S), CH(OH), P(O)(OR')O, S(O), SS, арильной группы и гетероарильной группы;
7
1
3
2
3
R выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H;
8
3
6
R выбирают из группы, состоящей из C- карбоцикла и гетероцикла;
9
2
1
6
2
2
2
2
6
3
6
R выбирают из группы, состоящей из H, CN, NO, C- алкила, -OR, -S(O)R, -S(O)N(R), C- алкенила, C- карбоцикла и гетероцикла;
1
3
2
3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H;
1
18
2
18
каждый R' независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила, R*YR”, YR” и H;
3
14
3
14
каждый R” независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила;
1
12
2
12
каждый R* независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила;
3
6
каждый Y независимо представляет собой С- карбоцикл;
каждый X независимо выбирают из группы, состоящей из F, Cl, Br и I; и
m выбирают из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 13,
или их солей или стереоизомеров.
В еще других вариантах осуществления другой поднабор соединений формулы (I) включает соединения, в которых
1
520
520
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R”M'R';
2
3
114
214
2
3
R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R*OR”, или R и R, которые вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют гетероцикл или карбоцикл;
4
36
2
n
2
n
2
16
36
2
n
2
3
2
2
2
2
2
2
2
R выбирают из группы, состоящей из C карбоцикла, (CH)Q, (CH)CHQR, CHQR, CQ(R), и незамещенного C алкила, где Q выбирают из C карбоцикла, 5-14-членного гетероарила, имеющего один или более гетероатомов, выбранных из N, O и S, -OR, O(CH)N(R), C(O)OR, OC(O)R, CX, CXH, CXH, CN, C(O)N(R), N(R)C(O)R, N(R)S(O)R, N(R)C(O)N(R), N(R)C(S)N(R), CRN(R)C(O)OR, и каждый n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4 и 5;
5
1
3
2
3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H;
6
1
3
2
3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H;
2
М и М' независимо выбирают из C(O)O, OC(O), C(O)N(R'), N(R')C(O), C(O), C(S), C(S)S, SC(S), CH(OH), P(O)(OR')O, S(O), арильной группы и гетероарильной группы;
7
1
3
2
3
R выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H;
1
3
2
3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H;
1
18
2
18
каждый R' независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила, R*YR”, YR” и H;
3
14
3
14
каждый R” независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила;
1
12
2
12
каждый R* независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила;
3
6
каждый Y независимо представляет собой С- карбоцикл;
каждый X независимо выбирают из группы, состоящей из F, Cl, Br и I; и
m выбирают из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 13,
или их солей или стереоизомеров.
В еще одних других вариантах осуществления другой поднабор соединений формулы (I) включает соединения, в которых
1
530
520
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R”M'R';
2
3
214
214
2
3
R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R*OR”, или R и R, которые вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют гетероцикл или карбоцикл;
4
2
n
2
n
2
R представляют собой (CH)Q или (CH)CHQR, где Q представляет собой N(R), и n выбирают из 3, 4 и 5;
5
1
3
2
3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H;
6
1
3
2
3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H;
2
М и М' независимо выбирают из C(O)O, OC(O), C(O)N(R'), N(R')C(O), C(O), C(S), C(S)S, SC(S), CH(OH), P(O)(OR')O, S(O), SS, арильной группы и гетероарильной группы;
7
1
3
2
3
R выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H;
1
3
2
3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H;
1
18
2
18
каждый R' независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила, R*YR”, YR” и H;
3
14
3
14
каждый R” независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила;
1
12
1
12
каждый R* независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила;
3
6
каждый Y независимо представляет собой С- карбоцикл;
каждый X независимо выбирают из группы, состоящей из F, Cl, Br и I; и
m выбирают из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 13,
или их солей или стереоизомеров.
В еще одних других вариантах осуществления другой поднабор соединений формулы (I) включает соединения, в которых
1
520
520
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R”M'R';
2
3
214
214
2
3
R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R*OR”, или R и R, которые вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют гетероцикл или карбоцикл;
4
2
n
2
n
2
R представляют собой (CH)Q или (CH)CHQR, где Q представляет собой N(R), и n выбирают из 3, 4 и 5;
5
1
3
2
3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H;
6
1
3
2
3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H;
2
М и М' независимо выбирают из C(O)O, OC(O), C(O)N(R'), N(R')C(O), C(O), C(S), C(S)S, SC(S), CH(OH), P(O)(OR')O, S(O), арильной группы и гетероарильной группы;
7
1
3
2
3
R выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H;
1
3
2
3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H;
1
18
2
18
каждый R' независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила, R*YR”, YR” и H;
3
14
3
14
каждый R” независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила;
1
12
1
12
каждый R* независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила;
3
6
каждый Y независимо представляет собой С- карбоцикл;
каждый X независимо выбирают из группы, состоящей из F, Cl, Br и I; и
m выбирают из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 13,
или их солей или стереоизомеров.
В еще других вариантах осуществления другой поднабор соединений формулы (I) включает соединения, в которых
1
530
520
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R”M'R';
2
3
114
214
2
3
R и R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R*OR”, или R и R, которые вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют гетероцикл или карбоцикл;
4
2
n
2
n
2
2
R выбирают из группы, состоящей из (CH)Q, (CH)CHQR, CHQR, и CQ(R), где Q представляет собой N(R), и n выбирают из 1, 2, 3, 4 и 5;
5
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
6
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
2
М и М' независимо выбирают из C(O)O, OC(O), C(O)N(R'), N(R')C(O), C(O), C(S), C(S)S, SC(S), CH(OH), P(O)(OR')O, S(O), SS, арильной группы и гетероарильной группы;
7
1-3
2-3
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
1-18
2-18
каждый R' независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR” и H;
3-14
3-14
каждый R” независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила;
1-12
1-12
каждый R* независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила;
3-6
каждый Y независимо представляет собой С карбоцикл;
каждый X независимо выбирают из группы, состоящей из F, Cl, Br и I; и
m выбирают из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 13,
или их солей или стереоизомеров.
В еще других вариантах осуществления другой поднабор соединений формулы (I) включает соединения, в которых
1
520
520
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R”M'R';
2
3
114
214
2
3
R и R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R*OR”, или R и R, которые вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют гетероцикл или карбоцикл;
4
2
n
2
n
2
2
R выбирают из группы, состоящей из (CH)Q, (CH)CHQR, CHQR, и CQ(R), где Q представляет собой N(R), и n выбирают из 1, 2, 3, 4 и 5;
5
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
6
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
2
М и М' независимо выбирают из C(O)O, OC(O), C(O)N(R'), N(R')C(O), C(O), C(S), C(S)S, SC(S), CH(OH), P(O)(OR')O, S(O), арильной группы и гетероарильной группы;
7
1-3
2-3
R выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
1-3
2-3
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила и H;
1-18
2-18
каждый R' независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR” и H;
3-14
3-14
каждый R” независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила;
1-12
1-12
каждый R* независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила;
3-6
каждый Y независимо представляет собой С карбоцикл;
каждый X независимо выбирают из группы, состоящей из F, Cl, Br и I; и
m выбирают из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 13,
или их солей или стереоизомеров.
В определенных вариантах осуществления поднабор соединений формулы (I) включает соединения формулы (IA):
(IA),
1
4
1
3
2
n
2
2,
2
8
9
2
9
2
2
или их соль или стереоизомер, где l выбирают из 1, 2, 3, 4 и 5; m выбирают из 5, 6, 7, 8 и 9; М представляет собой связь или М'; R представляет собой незамещенный C- алкил или ((CH)Q, в котором Q представляет собой OH, NHC(S)N(R), NHC(O)N(R)N(R)C(O)R, N(R)S(O)R, N(R)R, NHC(=NR)N(R), NHC(=CHR)N(R), OC(O)N(R), N(R)C(O)OR, гетероарил или гетероциклоалкил; M и M(независимо выбирают из C(O)O, OC(O), C(O)N(R'), P(O)(OR')O, SS, арильной группы и гетероарильной группы; и
2
3
1
14
2
14
R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, C- алкила и C- алкенила.
В некоторых вариантах осуществления поднабор соединений формулы (I) включает соединения формулы (IA) или их соли или стереоизомеры,
где
l выбирают из 1, 2, 3, 4 и 5; m выбирают из 5, 6, 7, 8 и 9;
1
М представляет собой связь или М';
4
1
3
2
n
2
2
R представляет собой незамещенный C- алкил или (CH)Q, в котором Q представляет собой OH, NHC(S)N(R), или NHC(O)N(R);
M и M(независимо выбирают из C(O)O, OC(O), C(O)N(R'), P(O)(OR')O, арильной группы и гетероарильной группы; и
2
3
1-14
2-14
R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, C алкила и C алкенила.
В определенных вариантах осуществления поднабор соединений формулы (I) включает соединения формулы (II):
(II)
1
4
13
2
n
2
2
2
8
9
2
9
2
2
или их соль или стереоизомер, где l выбирают из 1, 2, 3, 4 и 5; M представляет собой связь или M'; R представляет собой незамещенный C алкил, или (CH)Q, в котором n представляет собой 2, 3 или 4, и Q представляет собой OH, NHC(S)N(R), NHC(O)N(R), N(R)C(O)R, N(R)S(O)R, N(R)R, NHC(=NR)N(R), NHC(=CHR)N(R), -OC(O)N(R), N(R)C(O)OR, гетероарил или гетероциклоалкил; M и M(независимо выбирают из C(O)O, OC(O), C(O)N(R'), P(O)(OR')O, SS, арильной группы и гетероарильной группы; и
2
3
1-14
2-14
R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, C алкила и C алкенила.
В некоторых вариантах осуществления поднабор соединений формулы (I) включает соединения формулы (II) или их соли или стереоизомеры, где
l выбирают из 1, 2, 3, 4 и 5;
1
М представляет собой связь или М';
4
1
3
2
n
2
2
R представляет собой незамещенный C- алкил или (CH)Q, в котором n равно 2, 3, или 4, и Q представляет собой OH, NHC(S)N(R), или NHC(O)N(R);
M и M(независимо выбирают из C(O)O, OC(O), C(O)N(R'), P(O)(OR')O, арильной группы и гетероарильной группы; и
2
3
1
14
2
14
R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, C- алкила и C- алкенила.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) имеет формулу (IIa),
(IIa),
4
или его соль, где R является таким, как описано выше.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) имеет формулу (IIb),
(IIb),
4
или его соль, где R является таким, как описано выше.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) имеет формулу (IIc),
(IIc),
4
или его соль, где R является таким, как описано выше.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) имеет формулу (IIe):
(IIe),
4
или его соль, где R является таким, как описано выше.
4
2
n
2
n
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (IIa), (IIb), (IIc) или (IIe) содержит R, который выбирают из (CH)Q и (CH)CHQR, где Q, R и n являются такими, как определено выше.
2
n
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
В некоторых вариантах Q выбирают из группы, состоящей из OR, OH, O(CH)N(R), OC(O)R, CX, CN, N(R)C(O)R, N(H)C(O)R, N(R)S(O)R, N(H)S(O)R, N(R)C(O)N(R), N(H)C(O)N(R), N(H)C(O)N(H)(R), N(R)C(S)N(R), N(H)C(S)N(R), N(H)C(S)N(H)(R), и гетероцикла, где R является таким, как определено выше. В некоторых аспектах n равно 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления Q представляет собой OH, NHC(S)N(R), или NHC(O)N(R).
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) имеет формулу (IId):
2
3
5
14
5
14
5
6
или его соль, причем R и R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила и C- алкенила, n выбирают из 2, 3 и 4, и R', R'', R, R и m являются такими, как определено выше.
2
8
3
5
9
5
6
В некоторых аспектах соединения формулы (IId), R представляет собой C алкил. В некоторых аспектах соединения формулы (IId), R представляет собой CC алкил. В некоторых аспектах соединения формулы (IId), m равно 5, 7 или 9. В некоторых аспектах соединения формулы (IId) каждый R представляет собой Н. В некоторых аспектах соединения формулы (IId) каждый R представляет собой Н.
В другом аспекте данная заявка обеспечивает липидную композицию (например, липидную наночастицу (LNP)), содержащую: (1) соединение, имеющее формулу (I); (2) необязательно вспомогательный липид (например, фосфолипид); (3) необязательно структурный липид (например, стерин); и (4) необязательно липидный конъюгат (например, ПЭГ-липид). В иллюстративных вариантах осуществления липидная композиция (например, LNP) дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, например, инкапсулированный в ней полинуклеотид.
Используемый в данном документе термин «алкил» или «алкильная группа» означает линейный или разветвленный насыщенный углеводород, содержащий один или более атомов углерода (например, один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать или более атомов углерода).
1
14
Обозначение «C- алкил» означает линейный или разветвленный насыщенный углеводород, содержащий 114 атомов углерода. Алкильная группа может быть необязательно замещенной.
Используемый в данном документе термин «алкенил» или «алкенильная группа» означает линейный или разветвленный углеводород, содержащий два или более атомов углерода (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать или более атомов углерода) и по меньшей мере одну двойную связь.
2
14
18
18
Обозначение «C- алкенил» означает линейный или разветвленный углеводород, содержащий 214 атомов углерода и по меньшей мере одну двойную связь. Алкенильная группа может содержать одну, две, три, четыре или более двойных связей. Например, C алкенил может содержать одну или более двойных связей. C алкенильная группа, содержащая две двойные связи, может представлять собой линолеильную группу. Алкенильная группа может быть необязательно замещенной.
Используемый в данном документе термин «карбоцикл» или «карбоциклическая группа» означает моно- или полициклическую систему, содержащую одно или более колец атомов углерода. Кольца могут состоять из трех-, четырех-, пяти-, шести-, семи-, восьми-, девяти-, десяти-, одиннадцати-, двенадцати-, тринадцати-, четырнадцати- или пятнадцатичленных колец.
3
6
Обозначение «С- карбоцикл» означает карбоцикл, содержащий одно кольцо с 3-6 атомами углерода. Карбоциклы могут содержать одну или более двойных связей и могут быть ароматическими (например, арильные группы). Примеры карбоциклов включают циклопропильную, циклопентильную, циклогексильную, фенильную, нафтильную и 1,2дигидронафтильную группы. Карбоциклы могут быть необязательно замещены.
Используемый в данном документе термин «гетероцикл» или «гетероциклическая группа» означает моно- или полициклическую систему, содержащую одно или более колец, где по меньшей мере одно кольцо содержит по меньшей мере один гетероатом. Гетероатомы могут представлять собой, например, атомы азота, кислорода или серы. Кольца могут представлять собой трех-, четырех-, пяти-, шести-, семи-, восьми-, девяти-, десяти-, одиннадцати- или двенадцатичленные кольца. Гетероциклы могут содержать одну или более двойных связей и могут быть ароматическими (например, гетероарильные группы). Примеры гетероциклов включают имидазолильную, имидазолидинильную, оксазолильную, оксазолидинильную, тиазолильную, тиазолидинильную, пиразолидинильную, пиразолильную, изоксазолидинильную, изоксазолильную, изотиазолидинильную, изотиазолильную, морфолинильную, пирролильную, пирролидильную, фурильную, тиофенильную, пиридинильную, пиперидинильную, хинолильную и изохинолильную группы. Гетероциклы могут быть необязательно замещены.
2
Используемый в данном документе термин «биоразлагаемая группа» представляет собой группу, которая может способствовать более быстрому метаболизму липида у субъекта. Биоразлагаемая группа может представлять собой, но не ограничиваются ими, C(O)O, OC(O), C(O)N(R'), N(R')C(O), C(O), C(S), C(S)S, SC(S), CH(OH), P(O)(OR')O, S(O), арильную группу и гетероарильную группу.
Используемый в данном документе термин «арильная группа» представляет собой карбоциклическую группу, содержащую одно или более ароматических колец. Примеры арильных групп включают фенильные и нафтильные группы.
Используемый в данном документе термин «гетероарильная группа» представляет собой гетероциклическую группу, содержащую одно или более ароматических колец. Примеры гетероарильных групп включают пирролил, фурил, тиофенил, имидазолил, оксазолил и тиазолил. Как арильная, так и гетероарильная группы могут быть необязательно замещены. Например, М и М' могут быть выбраны из неограничивающей группы, состоящей из необязательно замещенного фенила, оксазола и тиазола. В приведенных в данном документе формулах М и М' могут быть независимо выбраны из приведенного выше перечня биоразлагаемых групп.
2
4
2
4
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
Алкильные, алкенильные и циклические (например, карбоциклильные и гетероциклильные) группы могут быть необязательно замещены, если не указано иное. Необязательные заместители могут быть выбраны из группы, состоящей из, но не ограничиваясь этим, атома галогена (например, хлоридной, бромидной, фторидной или йодидной группы), карбоновой кислоты (например, C(O)OH), спирта (например, гидроксила, OH), сложного эфира (например, C(O)OR или OC(O)R), альдегида (например, C(O)H), карбонила (например, C(O)R, альтернативно представленного C=O), ацилгалогенида (например, C(O)X, в которой Х представляет собой галогенид, выбранный из бромида, фторида, хлорида и йодида), карбоната (например, OC(O)OR), алкокси (например, OR), ацеталя (например, C(OR)R”“, в которой каждый OR представляет собой алкоксигруппы, которые могут быть одинаковыми или разными, и R"" представляет собой алкильную или алкенильную группу), фосфат (например, P(O)), тиол (например, SH), сульфоксид (например, S(O)R), сульфиновую кислоту (например, S(O)OH), сульфоновую кислоту (например, S(O)OH), тиал (например, C(S)H), сульфат (например, S(O)), сульфонил (например, S(O)), амид (например, C(O)NR, или N(R)C(O)R), азидо (например, N), нитро (например, NO), циано (например, CN), изоциано (например, NC), ацилокси (например, OC(O)R), амино (например, NR, NRH, или NH), карбамоил (например, OC(O)NR, OC(O)NRH,или OC(O)NH), сульфонамид (например, S(O)NR, S(O)NRH, S(O)NH, N(R)S(O)R, N(H)S(O)R, N(R)S(O)H, или N(H)S(O)H), алкильную группу, алкенильную группу и циклильную (например, карбоциклильную или гетероциклильную) группу.
1
6
В любом из предшествующих R представляет собой алкильную или алкенильную группу, как определено в данном документе. В некоторых вариантах осуществления сами группы заместителей могут быть дополнительно замещены, например, одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью или шестью заместителями, как определено в данном документе. Например, C- алкильная группа может быть дополнительно замещена одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью или шестью заместителями, как описано в данном документе.
Соединения любой из формул (I), (IA), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) и (IIe) включают один или более следующих признаков, когда это применимо.
4
3
6
2
n
2
n
2
3
6
2
n
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
В некоторых вариантах осуществления R выбирают из группы, состоящей из C- карбоцикла, (CH)Q, (CH)CHQR, CHQR, и CQ(R), где Q выбирают из C- карбоцикла, 5-14-членного ароматического или неароматического гетероцикла, имеющего один или более гетероатомов, выбранных из N, O, S и P, OR, O(CH)N(R), C(O)OR, OC(O)R, CX, CXH, CXH, CN, N(R), C(O)N(R), N(R)C(O)R, N(R)S(O)R, N(R)C(O)N(R), N(R)C(S)N(R), и C(R)N(R)C(O)OR, и каждый n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4 и 5.
4
36
2
n
2
n
2
3
6
2
n
2
3
2
2
2
2
2
2
2
1
3
В другом варианте осуществления R выбирают из группы, состоящей из C карбоцикла, (CH)Q, (CH)CHQR, CHQR, и CQ(R), где Q выбирают из С- карбоцикла, 5-14-членного гетероарила, имеющего один или более гетероатомов, выбранных из N, O, и S, OR, O(CH)N(R), C(O)OR, OC(O)R, CX, CXH, CXH, CN, C(O)N(R), N(R)C(O)R, N(R)S(O)R, N(R)C(O)N(R), N(R)C(S)N(R), C(R)N(R)C(O)OR, и 5-14-членного гетероциклоалкила, имеющего один или более гетероатомов, выбранных из N, O и S, который замещен одним или более заместителями, выбранными из оксо (=O), OH, амино и C- алкила, и каждый n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4 и 5.
4
3
6
2
n
2
n
2
3
6
2
n
2
3
2
2
2
2
2
2
2
4
2
n
4
2
n
4
2
В другом варианте осуществления R выбирают из группы, состоящей из C- карбоцикла, (CH)Q, (CH)CHQR, CHQR, и CQ(R), где Q выбирают из С- карбоцикла, 5-14-членного гетероцикла, имеющего один или более гетероатомов, выбранных из N, O и S, OR, O(CH)N(R), C(O)OR, OC(O)R, CX, CXH, CXH, CN, C(O)N(R), N(R)C(O)R, N(R)S(O)R, N(R)C(O)N(R), N(R)C(S)N(R), C(R)N(R)C(O)OR, и каждый n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4, и 5; и если Q представляет собой 5-14-членный гетероцикл и (i) R представляет собой (CH)Q в которой n равно 1 или 2, или (ii) R представляет собой (CH)CHQR, в которой n равно 1, или (iii) R представляет собой CHQR, и CQ(R), тогда Q представляет собой 5-14-членный гетероарил или 8-14-членный гетероциклоалкил.
4
3
6
2
n
2
n
2
3
6
2
n
2
3
2
2
2
2
2
2
2
В другом варианте осуществления R выбирают из группы, состоящей из C- карбоцикла, (CH)Q, (CH)CHQR, CHQR, и CQ(R), где Q выбирают из С- карбоцикла, 5-14-членного гетероарила, имеющего один или более гетероатомов, выбранных из N, O и S, OR, O(CH)N(R), C(O)OR, OC(O)R, CX, CXH, CXH, CN, C(O)N(R), N(R)C(O)R, N(R)S(O)R, N(R)C(O)N(R), N(R)C(S)N(R), C(R)N(R)C(O)OR, и каждый n независимо выбирают из 1, 2, 3, 4 и 5.
4
1
4
В другом варианте осуществления R представляет собой незамещенный C- алкил, например, незамещенный метил.
4
2
n
2
n
2
В определенных вариантах осуществления раскрытие обеспечивает соединение, имеющее формулу (I), где R представляет собой (CH)Q или (CH)CHQR, где Q представляет собой N(R), и n выбирают из 3, 4 и 5.
4
2
n
2
n
2
2
В некоторых вариантах осуществления раскрытие обеспечивает соединение, имеющее формулу (I), где R выбирают из группы, состоящей из (CH)Q, (CH)CHQR, CHQR, и CQ(R), где Q представляет собой -N(R), и n выбирают из 1, 2, 3, 4 и 5.
2
3
214
214
2
3
4
2
n
2
n
2
В некоторых вариантах осуществления раскрытие обеспечивает соединение, имеющее формулу (I), где R и R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и R*OR”, или R и R, которые вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют гетероцикл или карбоцикл, и R представляет собой (CH)Q или (CH)CHQR, где Q представляет собой N(R), и n выбирают из 3, 4 и 5.
2
3
214
214
2
3
В определенных вариантах осуществления R и R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила, C алкенила, R*YR”, YR”, и -R*OR”, или R и R, которые вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют гетероцикл или карбоцикл.
1
5
20
5
20
В некоторых вариантах осуществления Rвыбирают из группы, состоящей из C- алкила и C- алкенила.
1
В других вариантах осуществления R выбирают из группы, состоящей из -R*YR”, YR” и R”M'R'.
1
8
8
312
3
4
8
4
5
6
7
8
В определенных вариантах осуществления R выбирают из R*YR” и YR”. В некоторых вариантах осуществления Y представляет собой циклопропильную группу. В некоторых вариантах осуществления R* представляет собой C алкил или C алкенил. В определенных вариантах осуществления R” представляет собой C алкил. Например, R” может представлять собой C алкил. Например, R” может представлять собой C- алкил (например, C, C, C, C или C алкил).
1
5
20
1
6
1
8
1
9
1
14
1
18
В некоторых вариантах осуществления R представляет собой C- алкил. В некоторых вариантах осуществления R представляет собой C алкил. В некоторых вариантах осуществления R представляет собой C алкил. В некоторых вариантах осуществления R представляет собой C алкил. В некоторых вариантах осуществления R представляет собой C алкил. В некоторых вариантах осуществления R представляет собой C алкил.
1
5
20
1
18
1
В некоторых вариантах осуществления R представляет собой C- алкенил. В некоторых вариантах осуществления R представляет собой C алкенил. В некоторых вариантах осуществления R представляет собой линолеил.
1
1
В некоторых вариантах осуществления R является разветвленным (например, декан-2-ил, ундекан-3-ил, додекан-4-ил, тридекан-5-ил, тетрадекан-6-ил, 2-метилундекан-3-ил, 2- метилдекан-2-ил, 3-метилундекан-3-ил, 4-метилдодекан-4-ил или гептадека-9-ил). В определенных вариантах осуществления R представляет собой .
1
5
20
5
20
5
20
5
20
3
6
В определенных вариантах осуществления R представляет собой незамещенный C- алкил или C- алкенил. В некоторых вариантах осуществления R' представляет собой замещенный С- алкил или С- алкенил (например, замещенный С- карбоцикл, такой как 1-циклопропилнонил).
1
В других вариантах осуществления R представляет собой R”M'R'.
38
610
1
В некоторых вариантах осуществления R' выбирают из R*YR” и YR”. В некоторых вариантах осуществления Y представляет собой C циклоалкил. В некоторых вариантах осуществления Y представляет собой C арил. В некоторых вариантах осуществления Y представляет собой циклопропильную группу. В некоторых вариантах осуществления Y представляет собой циклогексильную группу. В определенных вариантах осуществления R* представляет собой C алкил.
3
12
3
12
1
4
9
4
5
6
7
8
9
В некоторых вариантах осуществления R”выбирают из группы, состоящей из C- алкила и C- алкенила. В некоторых вариантах осуществления R”, смежный с Y, представляет собой С алкил. В некоторых вариантах осуществления R”, смежный с Y, представляет собой C- алкил (например, C, C, C, C или C или C алкил).
4
4
5
5
6
6
7
7
9
9
В некоторых вариантах осуществления R' выбирают из C алкила и C алкенила. В определенных вариантах осуществления R' выбирают из C алкила и C алкенила. В некоторых вариантах осуществления R' выбирают из C алкила и C алкенила. В некоторых вариантах осуществления R' выбирают из C алкила и C алкенила. В некоторых вариантах осуществления R' выбирают из C алкила и C алкенила.
11
11
12
12
13
13
14
14
15
15
16
16
17
17
18
18
В других вариантах осуществления R' выбирают из C алкила и C алкенила. В других вариантах осуществления R' выбирают из C алкила, C алкенила, C алкила, C алкенила, C алкила, C алкенила, C алкила, C алкенила, C алкила, C алкенила, C алкила, C алкенила, C алкила и C алкенила. В некоторых вариантах осуществления R' является разветвленным (например, декан-2-ил, ундекан-3-ил, додекан-4-ил, тридекан-5-ил, тетрадекан-6-ил, 2-метилундекан-3-ил, 2 -метилдекан-2-ил, 3-метилундекан-3-ил, 4-метилдодекан-4-ил или гептадека-9-ил). В определенных вариантах осуществления R' представляет собой .
118
1
18
1
15
3
6
В определенных вариантах осуществления R' является незамещенным C алкилом. В некоторых вариантах осуществления R' представляет собой замещенный С- алкил (например, С- алкил, замещенный С- карбоциклом, таким как 1-циклопропилнонил).
3
14
3
14
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
В некоторых вариантах осуществления R”выбирают из группы, состоящей из C- алкила и C- алкенила. В некоторых вариантах осуществления R” представляет собой C алкил, C алкил, C алкил, C алкил, C алкил или C алкил. В некоторых вариантах осуществления R” представляет собой C алкил, C алкил, C алкил, C алкил, C алкил или C алкил.
В некоторых вариантах осуществления M(представляет собой C(O)O. В некоторых вариантах осуществления M(представляет собой OC(O).
В других вариантах осуществления М' представляет собой арильную группу или гетероарильную группу. Например, М' может быть выбран из группы, состоящей из фенила, оксазола и тиазола.
В некоторых вариантах осуществления M представляет собой C(O)O. В некоторых вариантах осуществления M представляет собой OC(O). В некоторых вариантах М представляет собой C(O)N(R'). В некоторых вариантах М представляет собой P(O)(OR')O.
В других вариантах осуществления М представляет собой арильную группу или гетероарильную группу. Например, М может быть выбран из группы, состоящей из фенила, оксазола и тиазола.
В некоторых вариантах осуществления М является таким же, как М'. В других вариантах осуществления M отличается от M'.
5
6
В некоторых вариантах осуществления каждый R представляет собой Н. В некоторых таких вариантах осуществления каждый R также представляет собой Н.
7
7
1
3
В некоторых вариантах осуществления R представляет собой Н. В других вариантах осуществления R представляет собой С- алкил (например, метил, этил, пропил или изопропил).
2
3
5
14
5
14
В некоторых вариантах осуществления R и R независимо представляют собой C- алкил или C- алкенил.
2
3
2
3
8
2
3
2
2
3
3
2
3
4
2
3
5
2
3
6
2
3
7
В некоторых вариантах осуществления R и R являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления R и R представляют собой C алкил. В определенных вариантах осуществления R и R представляют собой C алкил. В других вариантах осуществления R и R представляют собой C алкил. В некоторых вариантах осуществления R и R представляют собой C алкил. В определенных вариантах осуществления R и R представляют собой C алкил. В других вариантах осуществления R и R представляют собой C алкил. В некоторых вариантах осуществления R и R представляют собой C алкил.
2
3
2
8
3
1
7
1
2
3
4
5
6
7
9
В других вариантах осуществления R и R являются разными. В некоторых вариантах осуществления R представляет собой C алкил. В некоторых вариантах осуществления R представляет собой C- (например, C, C, C, C, C, C, или C алкил) или C алкил.
7
3
В некоторых вариантах осуществления R и R представляют собой H.
2
В определенных вариантах осуществления R представляет собой H.
В некоторых вариантах осуществления m равно 5, 7 или 9.
4
2
n
2
n
В некоторых вариантах осуществления R выбирают из (CH)Q и (CH)CHQR.
2
n
2
3
2
2
2
2
2
2
2
В некоторых вариантах Q выбирают из группы, состоящей из OR, OH, O(CH)N(R), OC(O)R, CX, CN, N(R)C(O)R, N(H)C(O)R, N(R)S(O)R, N(H)S(O)R, N(R)C(O)N(R), N(H)C(O)N(R), N(H)C(O)N(H)(R), N(R)C(S)N(R), N(H)C(S)N(R), N(H)C(S)N(H)(R), C(R)N(R)C(O)OR, карбоцикла и гетероцикла.
В некоторых вариантах Q представляет собой OH.
1
3
В некоторых вариантах осуществления Q представляет собой замещенный или незамещенный 5-10-членный гетероарил, например, Q представляет собой имидазол, пиримидин, пурин, 2-амино-1,9-дигидро-6H-пурин-6-он-9 ил (или гуанин-9-ил), аденин-9-ил, цитозин-1-ил или урацил-1-ил. В некоторых вариантах осуществления Q представляет собой замещенный 5-14-членный гетероциклоалкил, например, замещенный одним или более заместителями, выбранными из оксо (=O), OH, амино и C- алкила. Например, Q представляет собой 4-метилпиперазинил, 4-(4-метоксибензил)пиперазинил или изоиндолин-2-ил-1,3-дион.
6
10
3
6
В определенных вариантах осуществления Q представляет собой незамещенный или замещенный C- арил (такой как фенил) или C- циклоалкил.
4
2
2
4
2
3
4
2
4
4
4
В некоторых вариантах осуществления n равно 1. В других вариантах осуществления n равно 2. В дополнительных вариантах осуществления n равно 3. В некоторых других вариантах осуществления n равно 4. Например, R может представлять собой (CH)OH. Например, R может представлять собой (CH)OH. Например, R может представлять собой (CH)OH. Например, R может представлять собой бензил. Например, R может представлять собой 4-метоксибензил.
4
3
6
4
3
6
4
1
6
4
В некоторых вариантах осуществления R представляет собой C- карбоцикл. В некоторых вариантах осуществления R представляет собой C- циклоалкил. Например, R может быть циклогексилом, необязательно замещенным, например, ОН, галогеном, С- алкилом и т.д. Например, R может представлять собой 2-гидроксициклогексил.
В некоторых вариантах осуществления R представляет собой H.
1
3
2
3
4
2
3
2
2
3
В некоторых вариантах осуществления R представляет собой незамещенный C- алкил или незамещенный C- алкенил. Например, R может представлять собой CHCH(OH)CH или CHCH(OH)CHCH.
1
3
2
4
2
2
В некоторых вариантах осуществления R представляет собой замещенный С- алкил, например, CHOH. Например, R может представлять собой CHCH(OH)CHOH.
2
3
2
3
2
3
3
20
3
18
3
15
3
12
3
10
2
3
36
2
3
6
3
6
2
3
5
3
6
2
3
2
3
2
3
7
15
В некоторых вариантах осуществления R и R вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют гетероцикл или карбоцикл. В некоторых вариантах осуществления R и R вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют 5-14-членный ароматический или неароматический гетероцикл, имеющий один или более гетероатомов, выбранных из N, O, S и P. В некоторых вариантах осуществления R и R вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенный C- карбоцикл (например, C- карбоцикл, C- карбоцикл, C- карбоцикл или C- карбоцикл), или ароматический, или неароматический. В некоторых вариантах осуществления R и R вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют C карбоцикл. В других вариантах осуществления R и R вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют С карбоцикл, такой как циклогексильная или фенильная группа. В некоторых вариантах осуществления гетероцикл или С- карбоцикл замещают одной или более алкильными группами (например, при одном и том же атоме кольца или при соседних или несмежных атомах кольца). Например, Rи R вместе с атомом, к которому они присоединены, могут образовывать циклогексильную или фенильную группу, имеющую одну или более С алкильных замен. В определенных вариантах осуществления гетероцикл или С- карбоцикл, образованный R и R, замещают карбоциклическими группами. Например, Rи R вместе с атомом, к которому они присоединены, могут образовывать циклогексильную или фенильную группу, которая замещена циклогексилом. В некоторых вариантах осуществления R и R вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют карбоцикл C-, такой как циклогептильная, циклопентадеканильная или нафтильная группа.
4
2
n
2
n
2
n
2
3
2
2
2
2
2
2
В некоторых вариантах осуществления R выбирают из (CH)Q и (CH)CHQR. В некоторых вариантах Q выбирают из группы, состоящей из OR, OH, O(CH)N(R), OC(O)R, CX, CN, N(R)C(O)R, N(H)C(O)R, N(R)S(O)R, N(H)S(O)R, N(R)C(O)N(R), N(H)C(O)N(R), N(H)C(O)N(H)(R), N(R)C(S)N(R), N(H)C(S)N(R), N(H)C(S)N(H)(R), и гетероцикла. В других вариантах осуществления Q выбирают из группы, состоящей из имидазола, пиримидина и пурина.
2
3
2
3
3
6
3
6
2
3
5
В некоторых вариантах осуществления R и R вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют гетероцикл или карбоцикл. В некоторых вариантах осуществления R и R вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют карбоцикл C-, такой как фенильная группа. В некоторых вариантах осуществления гетероцикл или С- карбоцикл замещают одной или более алкильными группами (например, при одном и том же атоме кольца или при соседних или несмежных атомах кольца). Например, R и R вместе с атомом, к которому они присоединены, могут образовывать фенильную группу, имеющую одну или более С алкильных замен.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтических композиций согласно данному раскрытию соединение формулы (I) выбирают из группы, состоящей из:
(Соединение 1),
(Соединение 2),
(Соединение 3),
(Соединение 4),
(Соединение 5),
(Соединение 6),
(Соединение 7),
(Соединение 8),
(Соединение 9),
(Соединение 10),
(Соединение 11),
(Соединение 12),
(Соединение 13),
(Соединение 14),
(Соединение 15),
(Соединение 16),
(Соединение 17),
(Соединение 18),
(Соединение 19),
(Соединение 20),
(Соединение 21),
(Соединение 22),
(Соединение 23),
(Соединение 24),
(Соединение 25),
(Соединение 26),
(Соединение 27),
(Соединение 28),
(Соединение 29),
(Соединение 30),
(Соединение 31),
(Соединение 32),
(Соединение 33),
(Соединение 34),
(Соединение 35),
(Соединение 36),
(Соединение 37),
(Соединение 38),
(Соединение 39),
(Соединение 40),
(Соединение 41),
(Соединение 42),
(Соединение 43),
(Соединение 44),
(Соединение 45),
(Соединение 46),
(Соединение 47),
(Соединение 48),
(Соединение 49),
(Соединение 50),
(Соединение 51),
(Соединение 52),
(Соединение 53),
(Соединение 54),
(Соединение 55),
(Соединение 56),
(Соединение 57),
(Соединение 58),
(Соединение 59),
(Соединение 60),
(Соединение 61),
(Соединение 62),
(Соединение 63),
(Соединение 64),
(Соединение 65),
(Соединение 66),
(Соединение 67),
(Соединение 68),
(Соединение 69),
(Соединение 70),
(Соединение 71),
(Соединение 72),
(Соединение 73),
(Соединение 74),
(Соединение 75),
(Соединение 76),
(Соединение 77),
(Соединение 78),
(Соединение 79),
(Соединение 80),
(Соединение 81),
(Соединение 82),
(Соединение 83),
(Соединение 84),
(Соединение 85),
(Соединение 86),
(Соединение 87),
(Соединение 88),
(Соединение 89),
(Соединение 90),
(Соединение 91),
(Соединение 92),
(Соединение 93),
(Соединение 94),
(Соединение 95),
(Соединение 96),
(Соединение 97),
(Соединение 98),
(Соединение 99),
(Соединение 100),
(Соединение 101),
(Соединение 102),
(Соединение 103),
(Соединение 104),
(Соединение 105),
(Соединение 106),
(Соединение 107),
(Соединение 108),
(Соединение 109),
(Соединение 110),
(Соединение 111),
(Соединение 112),
(Соединение 113),
(Соединение 114),
(Соединение 115),
(Соединение 116),
(Соединение 117),
(Соединение 118),
(Соединение 119),
(Соединение 120),
(Соединение 121),
(Соединение 122),
(Соединение 123),
(Соединение 124),
(Соединение 125),
(Соединение 126),
(Соединение 127),
(Соединение 128),
(Соединение 129),
(Соединение 130),
(Соединение 131),
(Соединение 132),
(Соединение 133),
(Соединение 134),
(Соединение 135),
(Соединение 136),
(Соединение 137),
(Соединение 138),
(Соединение 139),
(Соединение 140),
(Соединение 141),
(Соединение 142),
(Соединение 143),
(Соединение 144),
(Соединение 145),
(Соединение 146),
(Соединение 147),
(Соединение 148),
(Соединение 149),
(Соединение 150),
(Соединение 151),
(Соединение 152),
(Соединение 153),
(Соединение 154),
(Соединение 155),
(Соединение 156),
(Соединение 157),
(Соединение 158),
(Соединение 159),
(Соединение 160),
(Соединение 161),
(Соединение 162),
(Соединение 163),
(Соединение 164),
(Соединение 165),
(Соединение 166),
(Соединение 167),
(Соединение 168),
(Соединение 169),
(Соединение 170),
(Соединение 171),
(Соединение 172),
(Соединение 173),
(Соединение 174),
(Соединение 175),
(Соединение 176),
(Соединение 177),
(Соединение 178),
(Соединение 179),
(Соединение 180),
(Соединение 181),
(Соединение 182),
(Соединение 183),
(Соединение 184),
(Соединение 185),
(Соединение 186),
(Соединение 187),
(Соединение 188),
(Соединение 189),
(Соединение 190),
(Соединение 191),
(Соединение 192),
(Соединение 193),
(Соединение 194),
(Соединение 195),
(Соединение 196),
(Соединение 197),
(Соединение 198),
(Соединение 199),
(Соединение 200),
(Соединение 201),
(Соединение 202),
(Соединение 203),
(Соединение 204),
(Соединение 205),
(Соединение 206),
(Соединение 207),
(Соединение 208),
(Соединение 209),
(Соединение 210),
(Соединение 211),
(Соединение 212),
(Соединение 213),
(Соединение 214),
(Соединение 215),
(Соединение 216),
(Соединение 217),
(Соединение 218),
(Соединение 219),
(Соединение 220),
(Соединение 221),
(Соединение 222),
(Соединение 223),
(Соединение 224),
(Соединение 225),
(Соединение 226),
(Соединение 227),
(Соединение 228),
(Соединение 229),
(Соединение 230), (Соединение 231),
(Соединение 232),
а также их соли и изомеры.
В других вариантах осуществления соединение формулы (I) выбирают из группы, состоящей из соединения 1-соединения 147 или их солей или стереоизомеров.
В некоторых вариантах осуществления предложены ионизируемые липиды, содержащие центральный пиперазиновый фрагмент. Описанные в данном документе липиды могут преимущественно использоваться в композициях липидных наночастиц для доставки терапевтических и/или профилактических агентов в клетки или органы млекопитающих. Например, липиды, описанные в данном документе, имеют небольшую иммуногенность или не имеют ее вообще. Например, описанные в данном документе липидные соединения обладают более низкой иммуногенностью по сравнению с эталонным липидом (например, MC3, KC2 или DLinDMA). Например, композиция, содержащая липид, раскрытый в данном документе, и терапевтический или профилактический агент, имеет повышенный терапевтический индекс по сравнению с соответствующей композицией, которая содержит эталонный липид (например, MC3, KC2 или DLinDMA) и тот же терапевтический или профилактический агент.
В некоторых вариантах осуществления агент доставки включает липидное соединение, имеющее формулу (III)
(III),
или их соли или стереоизомеры, где
кольцо A представляет собой или ;
t представляет собой 1 или 2;
1
2
А и А каждый независимо выбирают из СН или N;
2
2
Z представляет собой СН или отсутствует, при этом когда Z представляет собой СН, пунктирные линии (1) и (2), каждая, представляют собой одинарную связь; и когда Z отсутствует, пунктирные линии (1) и (2) обе отсутствуют;
1
2
3
4
5
5
20
5
20
R, R, R, R, и R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила, R”MR', R*YR”, YR”, и R*OR”;
2
каждый М независимо выбирают из группы, состоящей из C(O)O, OC(O), OC(O)O, C(O)N(R'), N(R')C(O), C(O), C(S), C(S)S, SC(S), CH(OH), P(O)(OR')O, S(O), арильной группы и гетероарильной группы;
1
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
X, X, и X независимо выбирают из группы, состоящей из связи, CH, (CH)-, CHR, CHY, C(O), C(O)O, OC(O), -C(O)-CH-, -CH-C(O)-, C(O)O-CH, OC(O)-CH, CH-C(O)O, CH-OC(O), CH(OH), C(S), и CH(SH ;
3
6
каждый Y независимо представляет собой С- карбоцикл;
1
12
2
12
каждый R* независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила;
1
3
3
6
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила и C- карбоцикла;
1
12
2
12
каждый R' независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H; и
3
12
3
12
каждый R” независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, С- алкенила,
при этом когда кольцо А представляет собой , то
1
2
3
2
i) по меньшей мере один из X, X и X не является CH; и/или
1
2
3
4
5
ii) по меньшей мере один из R, R, R, R, и R представляет собой R”MR'.
В некоторых вариантах осуществления соединение имеет любую из формул (IIIa1) - (IIIa6):
(IIIa1),
(IIIa2),
(IIIa3),
(IIIa4),
(IIIa5), или
(IIIa6).
Соединения формулы (III) или любой из (IIIa1) - (IIIa6) включают один или несколько следующих свойств, когда это применимо.
В некоторых вариантах осуществления кольцо А представляет собой .
В некоторых вариантах осуществления кольцо А представляет собой или .
В некоторых вариантах осуществления кольцо А представляет собой .
В некоторых вариантах осуществления кольцо А представляет собой .
В некоторых вариантах осуществления кольцо А представляет собой , , или .
2
В некоторых вариантах осуществления кольцо A представляет собой или , где кольцо, в котором атом N связан с X.
2
В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой СН.
В некоторых вариантах осуществления Z отсутствует.
1
2
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из А и А представляет собой N.
1
2
В некоторых вариантах осуществления каждый из A и A представляет собой N.
1
2
В некоторых вариантах осуществления каждый из A и A представляет собой CH.
1
2
В некоторых вариантах осуществления A представляет собой N и A представляет собой CH.
1
2
В некоторых вариантах осуществления A представляет собой CH и A представляет собой N.
1
2
3
1
1
2
3
2
2
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из X, X и X не является CH. Например, в определенных вариантах осуществления X не является CH. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из X, X и X представляет собой -C(O)-.
2
2
2
2
2
2
2
В некоторых вариантах осуществления X представляет собой -C(O)-, C(O)O, OC(O), -C(O)-CH-, -CH-C(O)-, C(O)O-CH, OC(O)-CH, CH-C(O)O, или CH-OC(O).
3
3
2
2
2
2
2
2
2
В некоторых вариантах осуществления X представляет собой -C(O)-, C(O)O, OC(O), -C(O)-CH-, -CH-C(O)-, C(O)O-CH, OC(O)-CH, CH-C(O)O, или CH-OC(O). В других вариантах осуществления Xпредставляет собой -CH-.
3
2
2
В некоторых вариантах осуществления X представляет собой связь или -(CH)-.
1
2
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
В некоторых вариантах осуществления R и R являются одинаковыми. В определенных вариантах осуществления R, Rи R являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления R и R являются одинаковыми. В определенных вариантах осуществления R, R, R, R и R являются одинаковыми.
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
3
3
5
5
6
6
7
7
5
5
1
1
2
2
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из R, R, R, R, и R представляет собой R”MR'. В некоторых вариантах осуществления по большей мере одно из R, R, R, R, и R представляет собой R”MR'. Например, по меньшей мере один из R, R и R может представлять собой R”MR', и/или по меньшей мере один из R и R представляет собой R”MR'. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один М представляет собой C(O)O. В некоторых вариантах осуществления каждый М представляет собой C(O)O. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один М представляет собой OC(O). В некоторых вариантах осуществления каждый М представляет собой OC(O). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один М представляет собой OC(O)O. В некоторых вариантах осуществления каждый М представляет собой OC(O)O. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один R” представляет собой C алкил. В определенных вариантах осуществления каждый R” представляет собой C алкил. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один R” представляет собой C алкил. В определенных вариантах осуществления каждый R” представляет собой C алкил. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один R” представляет собой C алкил. В определенных вариантах осуществления каждый R” представляет собой C алкил. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один R” представляет собой C алкил. В определенных вариантах осуществления каждый R” представляет собой C алкил. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один R' представляет собой C алкил. В определенных вариантах осуществления каждый R' представляет собой C алкил. В других вариантах осуществления по меньшей мере один R' представляет собой C алкил. В определенных вариантах осуществления каждый R' представляет собой C алкил. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один R' представляет собой C алкил. В определенных вариантах осуществления каждый R' представляет собой C алкил.
1
2
3
4
5
12
1
2
3
4
5
12
В некоторых вариантах по меньшей мере один из R, R, R, R, и R представляет собой C алкил. В определенных вариантах осуществленияR, R, R, R и R представляют собой C алкил.
В определенных вариантах осуществления соединение выбирают из группы, состоящей из:
(Соединение 233),
(Соединение 234),
(Соединение 235),
(Соединение 236),
(Соединение 237),
(Соединение 238),
(Соединение 239),
(Соединение 240),
(Соединение 241),
(Соединение 242),
(Соединение 243),
(Соединение 244),
(Соединение 245),
(Соединение 246),
(Соединение 247),
(Соединение 248),
(Соединение 274),
(Соединение 275),
(Соединение 276),
(Соединение 277),
(Соединение 278),
(Соединение 279),
(Соединение 280),
(Соединение 281),
(Соединение 282),
(Соединение 283),
(Соединение 284),
(Соединение 285),
(Соединение 286),
(Соединение 287),
(Соединение 288),
(Соединение 289),
(Соединение 290),
(Соединение 291),
(Соединение 292),
(Соединение 293),
(Соединение 294),
(Соединение 295),
(Соединение 296),
(Соединение 297),
(Соединение 298),
(Соединение 300),
(Соединение 301),
(Соединение 302),
(Соединение 303),
(Соединение 304),
(Соединение 305),
(Соединение 306),
(Соединение 307),
(Соединение 308),
(Соединение 310),
(Соединение 311),
(Соединение 312),
(Соединение 313),
(Соединение 314),
(Соединение 315),
(Соединение 316),
(Соединение 317),
(Соединение 318),
(Соединение 319),
(Соединение 320),
(Соединение 321),
(Соединение 322),
(Соединение 323),
(Соединение 324),
(Соединение 325),
(Соединение 326),
(Соединение 327),
(Соединение 328),
(Соединение 329),
(Соединение 330),
(Соединение 331),
(Соединение 332),
(Соединение 333),
(Соединение 334),
(Соединение 335),
(Соединение 336),
(Соединение 337),
(Соединение 338),
(Соединение 339),
(Соединение 340), и
(Соединение 341).
В некоторых вариантах осуществления агент доставки включает соединение 236.
В некоторых вариантах осуществления агент доставки включает соединение, имеющее формулу (IV)
(IV),
или его соль или стереоизомер, где
1
2
1
2
А и А каждый независимо выбирают из СН или N, и по меньшей мере один из А и А представляет собой N;
2
2
Z представляет собой СН или отсутствует, при этом когда Z представляет собой СН, пунктирные линии (1) и (2), каждая, представляют собой одинарную связь; и когда Z отсутствует, пунктирные линии (1) и (2) обе отсутствуют;
1
2
3
4
5
6
20
620
R, R, R, R, и R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C алкенила;
при этом когда кольцо А представляет собой , то
1
2
3
4
5
1
12
18
18
i) R, R, R, R и R являются одинаковыми, при этом R не является С алкилом, С алкилом или С алкенилом;
1
2
3
4
5
620
ii) только один из R, R, R, R и R выбирают из C алкенила;
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
iii) по меньшей мере один из R, R, R, R, и R имеет другое число атомов углерода, чем по меньшей мере один другой из R, R, R, R, и R;
1
2
3
620
4
5
620
iv) R, R, и R выбирают из C алкенила, а R и R выбирают из C алкила; или
1
2
3
620
4
5
620
v) R, R и R выбирают из C алкила, и R и R выбирают из C алкенила.
В некоторых вариантах осуществления соединение имеет формулу (IVa):
(IVa).
Соединения формулы (IV) или (IVa) включают одно или более из следующих свойств, когда это применимо.
2
В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой СН.
В некоторых вариантах осуществления Z отсутствует.
1
2
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из А и А представляет собой N.
1
2
В некоторых вариантах осуществления каждый из A и A представляет собой N.
1
2
В некоторых вариантах осуществления каждый из A и A представляет собой CH.
1
2
В некоторых вариантах осуществления A представляет собой N и A представляет собой CH.
1
2
В некоторых вариантах осуществления A представляет собой CH и A представляет собой N.
1
2
3
4
5
12
18
18
1
2
3
4
5
9
14
В некоторых вариантах осуществления R, R, R, R, и R являются одинаковыми и не являются C алкилом, C алкилом или C алкенилом. В некоторых вариантах осуществления R, R, R, R, и R являются одинаковыми и представляют собой C алкил или C алкил.
1
2
3
4
5
620
1
2
3
4
5
4
520
4
12
18
В некоторых вариантах осуществления только один из R, R, R, R, и Rвыбирают из C алкенила. В некоторых таких вариантах осуществления R, R, R, R, и R имеют одинаковое количество атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления R выбирают из C алкенила. Например, R может представлять собой C алкенил или C алкенил.
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из R, R, R, R, и R имеет другое количество атомов углерода, чем по меньшей мере один другой из R, R, R, R, и R.
1
2
3
620
4
5
620
1
2
3
620
4
5
620
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
18
1
2
3
4
5
В некоторых вариантах осуществления R, R, и R выбирают из C алкенила, а R и R выбирают из C алкила. В других вариантах осуществления R, R, и R выбирают из C алкила, а R и R выбирают из C алкенила. В некоторых вариантах осуществления R, R и R имеют одинаковое количество атомов углерода, и/или R и R имеют одинаковое количество атомов углерода. Например, R, R, и R, или R и R могут иметь 6, 8, 9, 12, 14 или 18 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления R, R, и R, или R и R представляют собой C алкенил (например, линолеил). В некоторых вариантах осуществления R, R, и R, или R и R представляют собой алкильные группы, содержащие 6, 8, 9, 12 или 14 атомов углерода.
1
2
3
4
5
3
1
2
4
5
4
1
2
3
5
В некоторых вариантах осуществления R имеет другое количество атомов углерода, чем R, R, R, и R. В других вариантах осуществления R имеет другое количество атомов углерода, чем R, R, R, и R. В дополнительных вариантах осуществления R имеет другое количество атомов углерода, чем R, R, R, и R.
В некоторых вариантах осуществления соединение выбирают из группы, состоящей из:
(Соединение 249),
(Соединение 250),
(Соединение 251),
(Соединение 252),
(Соединение 253),
(Соединение 254),
(Соединение 255),
(Соединение 256),
(Соединение 257),
(Соединение 258),
(Соединение 259),
(Соединение 260),
(Соединение 261),
(Соединение 262),
(Соединение 263),
(Соединение 264),
(Соединение 265), и
(Соединение 266).
В других вариантах осуществления агент доставки включает соединение, имеющее формулу (V)
(V),
или его соли или стереоизомеры, в которых
3
A представляет собой CH или N;
4
2
3
4
А представляет собой СН или NH; и по меньшей мере один из А и А представляет собой N или NH;
2
2
Z представляет собой СН или отсутствует, при этом когда Z представляет собой СН, пунктирные линии (1) и (2), каждая, представляют собой одинарную связь; и когда Z отсутствует, пунктирные линии (1) и (2) обе отсутствуют;
1
2
3
5
20
5
20
R, R и R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила, R”MR', R*YR”, YR”, и R*OR”;
2
каждый М независимо выбирают из C(O)O, OC(O), C(O)N(R'), N(R')C(O), C(O), C(S), C(S)S, SC(S), CH(OH), P(O)(OR')O, S(O), арильной группы и гетероарильной группы;
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
X и X независимо выбирают из группы, состоящей из CH, (CH), CHR, CHY, C(O), C(O)O, OC(O), -C(O)-CH-, -CH-C(O)-, C(O)OCH, OC(O)CH, CH-C(O)O, CHOC(O), CH(OH), C(S), и CH(SH) ;
3
6
каждый Y независимо представляет собой С- карбоцикл;
1
12
2
12
каждый R* независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила;
1
3
3
6
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила и C- карбоцикла;
1
12
2
12
каждый R' независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H; и
3
12
3
12
каждый R” независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, С- алкенила.
В некоторых вариантах осуществления соединение имеет формулу (Va):
Соединения формулы (V) или (Va) включают одно или более из следующих свойств, когда это применимо.
2
В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой СН.
В некоторых вариантах осуществления Z отсутствует.
3
4
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из A и A представляет собой N или NH.
3
4
В некоторых вариантах осуществления A представляет собой N и A представляет собой NH.
3
4
2
В некоторых вариантах осуществления A представляет собой N и A представляет собой CH.
3
4
В некоторых вариантах осуществления A представляет собой CH и A представляет собой NH.
1
2
1
1
2
2
2
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из X, и X не является CH. Например, в определенных вариантах осуществления X не является CH. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из X и X представляет собой -C(O)-.
2
2
2
2
2
2
2
В некоторых вариантах осуществления X представляет собой -C(O)-, C(O)O, OC(O), -C(O)-CH-, -CH-C(O)-, C(O)O-CH, OC(O)-CH, CH-C(O)O, или CH-OC(O).
1
2
3
520
5
20
1
2
3
1
2
3
6
9
12
14
1
2
3
18
1
2
3
В некоторых вариантах осуществления R, R, и R независимо выбирают из группы, состоящей из C алкила и C- алкенила. В некоторых вариантах осуществления R, R, и R являются одинаковыми. В определенных вариантах осуществления R, R, и R представляют собой C, C, C или C алкил. В других вариантах осуществления R, R, и R представляют собой C алкенил. Например, R, R и R могут представлять собой линолеил.
В некоторых вариантах осуществления соединение выбирают из группы, состоящей из:
(Соединение 267),
(Соединение 268),
(Соединение 269),
(Соединение 270),
(Соединение 271),
(Соединение 272),
(Соединение 273), и
(Соединение 309).
В других вариантах осуществления агент доставки включает соединение, имеющее формулу (VI):
(VI),
или его соли или стереоизомеры, в которых
6
7
6
7
А и А каждый независимо выбирают из СН или N, при этом по меньшей мере один из А и А представляет собой N;
2
2
Z представляет собой СН или отсутствует, при этом когда Z представляет собой СН, пунктирные линии (1) и (2), каждая, представляют собой одинарную связь; и когда Z отсутствует, пунктирные линии (1) и (2) обе отсутствуют;
4
5
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Х и Х независимо выбирают из группы, состоящей из CH, CH)-, CHR, CHY, C(O), C(O)O, OC(O), -C(O)-CH-, -CH-C(O)-, C(O)OCH, OC(O)-CH, CH-C(O)O, CH-OC(O), CH(OH), C(S), и CH(SH);
1
2,
3
4
5
5
20
520
R, R R, R, и R каждый независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C алкенила, R”MR', R*YR”, YR”, и R*OR”;
2
каждый М независимо выбирают из группы, состоящей из C(O)O, OC(O), C(O)N(R'), N(R')C(O), C(O), C(S), C(S)S, SC(S), CH(OH), P(O)(OR')O, S(O) арильной группы и гетероарильной группы;
3
6
каждый Y независимо представляет собой С- карбоцикл;
1
12
2
12
каждый R* независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила;
1
3
3
6
каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила и C- карбоцикла;
1
12
2
12
каждый R' независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C- алкенила и H; и
3
12
3
12
каждый R” независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, С- алкенила.
1
2
3
4
5
6
20
620
В некоторых вариантах осуществления R, R, R, R, и R независимо выбирают из группы, состоящей из C- алкила, C алкенила.
1
2
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
В некоторых вариантах осуществления R и R являются одинаковыми. В определенных вариантах осуществления R, Rи R являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления R и R являются одинаковыми. В определенных вариантах осуществления R, R, R, R и R являются одинаковыми.
1
2
3
4
5
9
12
1
2
3
4
5
9
12
14
1
2
3
4
5
9
В некоторых вариантах по меньшей мере один из R, R, R, R, и R представляет собой C- алкил. В некоторых вариантах осуществления каждый из R, R, R, R, или Rнезависимо представляет собой C, C или C алкил. В некоторых вариантах осуществления каждый из R, R, R, R, и R представляет собой С алкил.
6
7
6
7
В некоторых вариантах осуществления Aпредставляет собой N и A представляет собой N. В некоторых вариантах осуществления A представляет собой CH и A представляет собой N.
4
5
4
5
2
В некоторых вариантах осуществления X представляет собой CH и X представляет собой -C(O)-. В некоторых вариантах осуществления X и X представляют собой -C(O)-.
6
7
2
6
7
1
2
3
4
5
4
5
4
5
В некоторых вариантах осуществления, когда A представляет собой N и A представляет собой N, по меньшей мере один из X и X не является CH, например, по меньшей мере один из X и Xпредставляет собой -C(O)-. В некоторых вариантах осуществления, когда A представляет собой N и A представляет собой N, по меньшей мере один из R, R, R, R и R представляет собой R”MR'.
1
2
3
4
5
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из R, R, R, R, и R не является R”MR'.
В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой
(Соединение 299).
В других вариантах осуществления агент доставки включает соединение, имеющее формулу:
(Соединение 342).
Аминные фрагменты липидных соединений, раскрытых в данном документе, могут быть протонированы при определенных условиях. Например, центральный аминный фрагмент липида в соответствии с формулой (I) обычно протонируется (то есть положительно заряжен) при рН ниже рКа аминогруппы и по существу не заряжается при рН выше рКа. Такие липиды могут быть отнесены к ионизируемым аминополипидам.
В одном конкретном варианте осуществления ионизируемый аминолипид представляет собой соединение 18. В другом варианте осуществления ионизируемый аминолипид представляет собой соединение 236.
В некоторых вариантах осуществления количество ионизируемого аминополипида, например, соединения формулы (I), составляет от около 1 до 99 мол.% в липидной композиции.
В одном варианте осуществления количество ионизируемого аминополипида, например, соединения формулы (I), составляет по меньшей мере около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 мол.% в липидной композиции.
В одном варианте осуществления количество ионизируемого аминополипида, например, соединения формулы (I), находится в диапазоне от около 30 мол.% до около 70 мол.%, от около 35 мол.% до около 65 мол.%, от около 40 мол.% до около 60 мол.% и от около 45 мол.% до около 55 мол.% в липидной композиции.
В одном конкретном варианте осуществления количество ионизируемого аминополипида, например, соединения формулы (I), составляет около 50 мол.% в липидной композиции.
В дополнение к ионизируемому аминополипиду, раскрытому в данном документе, например соединению формулы (I), липидная композиция фармацевтических композиций, раскрытых в данном документе, может содержать дополнительные компоненты, такие как фосфолипиды, структурные липиды, ПЭГ-липиды и любую их комбинацию.
b. Фосфолипиды
Липидная композиция фармацевтической композиции, раскрытая в данном документе, может содержать один или более фосфолипидов, например, один или более насыщенных или (поли)ненасыщенных фосфолипидов или их комбинацию. Как правило, фосфолипиды содержат фосфолипидный фрагмент и один или более фрагментов жирных кислот.
Фосфолипидный фрагмент может быть выбран, например, из неограничивающей группы, состоящей из фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилглицерина, фосфатидилсерина, фосфатидовой кислоты, 2-лизофосфатидилхолина и сфингомиелина.
Фрагмент жирной кислоты может быть выбран, например, из неограничивающей группы, состоящей из лауриновой кислоты, миристиновой кислоты, миристолевой кислоты, пальмитиновой кислоты, пальмитолеиновой кислоты, стеариновой кислоты, олеиновой кислоты, линолевой кислоты, альфа-линоленовой кислоты, эруковой кислоты, фитановой кислоты, арахидиновой кислоты, арахидоновой кислоты, эйкозапентаеновой кислоты, бегеновой кислоты, докозапентаеновой кислоты и докозагексаеновой кислоты.
Конкретные фосфолипиды могут облегчать слияние с мембраной. Например, катионный фосфолипид может взаимодействовать с одним или более отрицательно заряженными фосфолипидами мембраны (например, клеточной или внутриклеточной мембраны). Слияние фосфолипида с мембраной может позволить одному или более элементам (например, терапевтическому агенту) липидсодержащей композиции (например, LNP) проходить через мембрану, обеспечивая, например, доставку одного или более элементов к целевой ткани.
Также предусмотрены неприродные виды фосфолипидов, включая природные виды с модификациями и заменами, включая разветвление, окисление, циклизацию и алкины. Например, фосфолипид может быть функционализован или перекрестно-сшит с одним или более алкинами (например, алкенильной группой, в которой одна или более двойных связей заменены тройной связью). При соответствующих условиях реакции алкиновая группа может подвергаться катализируемой медью циклоприсоединению при воздействии азида. Такие реакции могут быть полезны для функционализации липидного бислоя композиции наночастиц для облегчения проникновения через мембрану или клеточного распознавания или для конъюгации композиции наночастиц с полезным компонентом, таким как нацеливающий фрагмент или фрагмент для визуализации (например, краситель).
Фосфолипиды включают, но не ограничиваются ими, глицерофосфолипиды, такие как фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилсерины, фосфатидилинозитолы, фосфатидилглицерины и фосфатидные кислоты. Фосфолипиды также включают фосфосфинголипид, такой как сфингомиелин.
Примеры фосфолипидов включают, но не ограничиваются ими, следующее:
В определенных вариантах осуществления фосфолипид, полезный или потенциально полезный в данном изобретении, представляет собой аналог или вариант DSPC (1,2-диоктадеканоил-sn-глицеро-3-фосфохолин). В определенных вариантах осуществления фосфолипид, полезный или потенциально полезный в данном изобретении, представляет собой соединение формулы (IX):
(IX),
(или его солью, где:
1
1
1
каждый Rнезависимо представляет собой необязательно замещенный алкил; или необязательно два R соединены вместе с промежуточными атомами с образованием необязательно замещенного моноциклического карбоциклила или необязательно замещенного моноциклического гетероциклила; или необязательно три R соединены вместе с промежуточными атомами с образованием необязательно замещенного бициклического карбоциклила или необязательно замещенного бициклического гетероциклила;
n равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;
m равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;
А имеет формулу:  или ;
2
N
N
N
N
N
N
N
1
6
1
6
каждый пример L независимо представляет собой связь или необязательно замещенный C-алкилен, где одно метиленовое звено необязательно замещенного C- алкилена необязательно заменено O, N(R), S, C(O), C(O)N(R), NRC(O), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(R), NRC(O)O, или NRC(O)N(R);
2
2
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
1
30
1
30
1
30
2
2
2
2
2
2
2
2
2
каждый пример R независимо представляет собой необязательно замещенный C- алкил, необязательно замещенный C- алкенил или необязательно замещенный C- алкинил; необязательно, где одно или более метиленовых звеньев R независимо замещены необязательно замещенным карбоциклиленом, необязательно замещенным гетероциклиленом, необязательно замещенным ариленом, необязательно замещенным гетероариленом, N(R), O, S, C(O), C(O)N(R), NRC(O), NRC(O)N(R), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(R), NRC(O)O, C(O)S, SC(O), C(=NR), C(=NR)N(R), NRC(=NR), NRC(=NR)N(R), C(S), C(S)N(R), NRC(S), NRC(S)N(R), S(O), OS(O), S(O)O, OS(O)O, OS(O), S(O)O, OS(O)O, N(R)S(O), S(O)N(R), N(R)S(O)N(R), OS(O)N(R), N(R)S(O)O, S(O), N(R)S(O), S(O)N(R), N(R)S(O)N(R), OS(O)N(R), или N(R)S(O)O;
N
каждый пример R независимо представляет собой водород, необязательно замещенный алкил или защитную группу азота;
Кольцо B представляет собой необязательно замещенный карбоциклил, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил; и
p представляет собой 1 или 2;
при условии, что соединение не имеет формулу:
,
2
где каждый пример R независимо представляет собой незамещенный алкил, незамещенный алкенил или незамещенный алкинил.
i) Модификации фосфолипидной головки
1
1
В некоторых вариантах осуществления фосфолипид, полезный или потенциально полезный в данном изобретении, содержит модифицированную фосфолипидную головку (например, модифицированную холиновую группу). В некоторых вариантах осуществления фосфолипид с модифицированной головкой представляет собой DSPC или его аналог с модифицированным четвертичным амином. Например, в вариантах осуществления формулы (IX) по меньшей мере один из R не является метилом. В некоторых вариантах по меньшей мере один из R не является водородом или метилом. В определенных вариантах осуществления соединение формулы (IX) имеет одну из следующих формул:
или его соль, где:
каждый t независимо представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;
каждый u независимо представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10; и
каждый v независимо представляет собой 1, 2 или 3.
В определенных вариантах осуществления соединение формулы (IX) имеет одну из следующих формул:
или его соль.
В определенных вариантах осуществления соединение формулы (IX) является одним из следующих:
(Соединение 400)
(Соединение 401)
(Соединение 402)
(Соединение 403)
(Соединение 404)
(Соединение 405)
(Соединение 406)
(Соединение 407)
(Соединение 408)
(Соединение 409),
или его соль.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (IX) имеет формулу (IX-a):
(IX-a),
или его соль.
В определенных вариантах осуществления фосфолипиды, полезные или потенциально полезные в данном изобретении, содержат модифицированную головку. В определенных вариантах осуществления фосфолипид с модифицированной головкой, описанной в данном документе, представляет собой DSPC или его аналог с модифицированной структурой головки. Например, в некоторых вариантах осуществления формулы (IX-a) группа A не относится к следующей формуле:
.
В определенных вариантах осуществления соединение формулы (IX-a) имеет одну из следующих формул:
или его соль.
В определенных вариантах осуществления соединение формулы (IX) является одним из следующих:
или его соли.
В определенных вариантах осуществления фосфолипид, полезный или потенциально полезный в данном изобретении, содержит циклический фрагмент вместо глицеридного фрагмента. В некоторых вариантах осуществления фосфолипид, полезный в данном изобретении, представляет собой DSPC (1,2-диоктадеканоил-sn-глицеро-3-фосфохолин) или его аналог, с циклическим фрагментом вместо глицеридного фрагмента. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (IX) имеет формулу (IX-b):
,
(IX-b),
или его соль.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (IX-b) имеет формулу (IX-b-1):
(IX-b-1),
или его соль, где:
w равно 0, 1, 2 или 3.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (IX-b) имеет формулу (IX-b-2):
(IX-b-2),
или его соль.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (IX-b) имеет формулу (IX-b-3):
(IX-b-3),
или его соль.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (IX-b) имеет формулу (IX-b-4):
(IX-b-4),
или его соль.
В определенных вариантах осуществления соединение формулы (IX-b) имеет одну из следующих формул:
или его соли.
(ii) Модификации фосфолипидного хвоста
2
2
2
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
1
30
2
2
2
2
2
2
2
2
2
В определенных вариантах осуществления фосфолипид, полезный или потенциально полезный в данном изобретении, содержит модифицированный хвост.В некоторых вариантах осуществления фосфолипид, полезный или потенциально полезный в данном изобретении, представляет собой DSPC (1,2-диоктадеканоил-sn-глицеро-3-фосфохолин) или его аналог с модифицированным хвостом. Как описано в данном документе, «модифицированный хвост» может быть хвостом с более короткими или более длинными алифатическими цепями, алифатическими цепями с введенным разветвлением, алифатическими цепями с введенными заместителями, алифатическими цепями, в которых один или более метиленов замещены циклическими или гетероатомными группами, или с любой их комбинацией. Например, в некоторых вариантах осуществления соединение (IX) имеет формулу (IX-a) или его соль, где по меньшей мере один пример R представляет собой каждый пример R, необязательно замещенный C- алкилом, причем один или больше метиленовых звеньев R независимо замещены необязательно замещенным карбоциклиленом, необязательно замещенным гетероциклиленом, необязательно замещенным ариленом, необязательно замещенным гетероариленом, N(R), O, S, C(O), C(O)N(R), NRC(O), NRC(O)N(R), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(R), NRC(O)O, C(O)S, SC(O), C(=NR), C(=NR)N(R), NRC(=NR), NRC(=NR)N(R), C(S), C(S)N(R), NRC(S), NRC(S)N(R), S(O), OS(O), S(O)O, OS(O)O, OS(O), S(O)O, OS(O)O, N(R)S(O), S(O)N(R), N(R)S(O)N(R), OS(O)N(R), N(R)S(O)O, S(O), N(R)S(O), S(O)N(R), N(R)S(O)N(R), OS(O)N(R), или N(R)S(O)O.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (IX) имеет формулу (IX-c):
(IX-c),
или его соль, где:
каждый х независимо представляет собой целое число от 0 до 30 включительно; и
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
2
2
2
2
2
2
2
2
2
каждый пример G независимо выбирают из группы, состоящей из необязательно замещенного карбоциклилена, необязательно замещенного гетероциклилена, необязательно замещенного арилена, необязательно замещенного гетероарилена, N(R), O, S, C(O), C(O)N(R), NRC(O), NRC(O)N(R), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(R), NRC(O)O, C(O)S, SC(O), C(=NR), C(=NR)N(R), NRC(=NR), NRC(=NR)N(R), C(S), C(S)N(R), NRC(S), NRC(S)N(R), S(O), OS(O), S(O)O, OS(O)O, OS(O), S(O)O, OS(O)O, N(R)S(O), S(O)N(R), N(R)S(O)N(R), OS(O)N(R), N(R)S(O)O, S(O), N(R)S(O), S(O)N(R), N(R)S(O)N(R), OS(O)N(R), или N(R)S(O)O. Каждый вариант представляет отдельный вариант осуществления данного изобретения.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (IX-c) имеет формулу (IX-c-1):
(IX-c-1),
или его соль, где:
каждый случай v независимо представляет собой 1, 2 или 3.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (IX-c) имеет формулу (IX-c-2):
(IX-c-2),
или его соль.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (IX-c) имеет следующую формулу:
,
или его соль.
В определенных вариантах осуществления соединение формулы (IX-c) является следующим:
,
или его соль.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (IX-c) имеет формулу (IX-c-3):
(IX-c-3),
или его соль.
В определенных вариантах осуществления соединение формулы (IX-c) имеет следующие формулы:
,
или его соль.
В определенных вариантах осуществления соединение формулы (IX-c) является следующим:
,
или его соль.
В некоторых вариантах осуществления фосфолипид, полезный или потенциально полезный в данном изобретении, содержит модифицированный фосфохолиновый фрагмент, где алкильная цепь, связывающая четвертичный амин с фосфорильной группой, не является этиленом (например, n не равен 2). Следовательно, в определенных вариантах осуществления фосфолипид, полезный или потенциально полезный в данном изобретении, представляет собой соединение формулы (IX), где n равно 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Например, в определенных вариантах осуществления соединение формулы (IX) имеет одну из следующих формул:
или его соль.
В определенных вариантах осуществления соединение формулы (IX) является одним из следующих:
(Соединение 411)
(Соединение 412)
(Соединение 413)
(Соединение 414),
или его соли.
с.Альтернативные липиды
В определенных вариантах осуществления вместо фосфолипида согласно изобретению используется альтернативный липид. Неограничивающие примеры таких альтернативных липидов включают следующее:
d. Структурные липиды
Липидная композиция фармацевтической композиции, раскрытая в данном документе, может содержать один или более структурных липидов. Используемый в данном документе термин «структурный липид» относится к стеринам, а также к липидам, содержащим фрагменты стеринов.
Включение структурных липидов в липидную наночастицу может помочь уменьшить агрегацию других липидов в частице. Структурные липиды могут быть выбраны из группы, включающей, но не ограничиваются этим, холестерин, фекостерин, ситостерин, эргостерин, кампестерин, стигмастерин, брассикастерин, томатидин, томатин, урсоловую кислоту, альфа-токоферол, гопаноиды, фитостерины, стероиды и их смеси. В некоторых вариантах осуществления структурный липид представляет собой стерин. Как здесь определено, «стерины» представляют собой подгруппу стероидов, состоящую из стероидных спиртов. В определенных вариантах осуществления структурный липид представляет собой стероид. В определенных вариантах осуществления структурный липид представляет собой холестерин. В определенных вариантах осуществления структурный липид представляет собой аналог холестерина. В определенных вариантах осуществления структурный липид представляет собой альфа-токоферол. Примеры структурных липидов включают, но не ограничиваются ими, следующее:
В одном варианте осуществления количество структурного липида (например, стерина, такого как холестерин) в липидной композиции фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе, находится в диапазоне от около 20 мол.% до около 60 мол.%, от около 25 мол.% до около 55 мол.%, от около 30 мол.% до около 50 мол.% или от около 35 мол.% до около 45 мол.%.
В одном варианте осуществления количество структурного липида (например, стерина, такого как холестерин) в липидной композиции, раскрытой в данном документе, находится в диапазоне от около 25 мол.% до около 30 мол.%, от около 30 мол.% до около 35 мол.% или от около 35 мол.% до около 40 мол.%.
В одном варианте осуществления количество структурного липида (например, стерина, такого как холестерин) в липидной композиции, раскрытой в данном документе, составляет около 24 мол.%, около 29 мол.%, около 34 мол.% или около 39 мол.%.
В некоторых вариантах осуществления количество структурного липида (например, стерина, такого как холестерин) в липидной композиции, раскрытой в данном документе, составляет по меньшей мере около 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60 мол.%.
е. Полиэтиленгликоль (ПЭГ)-липиды
Липидная композиция фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе, может содержать один или более полиэтиленгликоль (ПЭГ)-липидов.
Используемый в данном документе термин «ПЭГ-липид» относится к липидам, модифицированным полиэтиленгликолем (ПЭГ). Неограничивающие примеры ПЭГ-липидов включают ПЭГ-модифицированные фосфатидилэтаноламин и фосфатидную кислоту, конъюгаты ПЭГ-церамиды (например, ПЭГ-CerC14 или ПЭГ-CerC20), ПЭГ-модифицированные диалкиламины и ПЭГ-модифицированные 1,2-диацилоксипропан-3-амины. Такие липиды также называют пегилированными липидами. Например, ПЭГ-липид может представлять собой липид ПЭГ-c-DOMG, ПЭГ-DMG, ПЭГ-DLPE, ПЭГDMPE, ПЭГ-DPPC, или ПЭГ-DSPE.
В некоторых вариантах осуществления ПЭГ-липид включает, но не ограничивается ими, 1,2-димиристоил-sn-глицерин метоксиполиэтиленгликоль (ПЭГ-DMG), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [амино(полиэтиленгликоль)] (ПЭГ-DSPE), ПЭГ-дистерилглицерин (ПЭГ-DSG), ПЭГ-дипалметолеил, ПЭГ-диолеил, ПЭГ-дистеарил, ПЭГ-диацилгликамид (ПЭГ-DAG), ПЭГ-дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (ПЭГ-DPPE) или ПЭГ-1,2-димиристилоксилпропил-3-амин (ПЭГ-c-DMA).
В одном варианте осуществления ПЭГ-липид выбирают из группы, состоящей из ПЭГ-модифицированного фосфатидилэтаноламина, ПЭГ-модифицированной фосфатидной кислоты, ПЭГ-модифицированного церамида, ПЭГ-модифицированного диалкиламина, ПЭГ-модифицированного диацилглицерина, ПЭГ-модифицированного диалкилглицерина и их смеси.
14
22
14
16
2
2k
В некоторых вариантах осуществления липидный фрагмент ПЭГ-липидов включает такие, которые имеют длину от около С до около С, предпочтительно от около С до около С. В некоторых вариантах осуществления фрагмент ПЭГ, например mPEG-NH, имеет размер около 1000, 2000, 5000, 10000, 15000 или 20000 дальтон. В одном варианте осуществления ПЭГ-липид представляет собой PEG-DMG.
В одном варианте осуществления описанные в данном документе липидные наночастицы могут содержать ПЭГ-липид, который представляет собой недиффундирующий ПЭГ. Неограничивающие примеры недиффундирующих ПЭГ включают ПЭГ-DSG и ПЭГ-DSPE.
ПЭГ-липиды известны в данной области техники, такие как те, которые описаны в патенте США №8158601 и публикации международной заявки №WO 2015/130584 A2, которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
В целом, некоторые из других липидных компонентов (например, ПЭГ-липидов) различных формул, описанных в данном документе, могут быть синтезированы, как описано в международной заявке на патент №PCT/US2016/000129, поданной 10 декабря 2016 года, под названием «Композиции и способы для доставки терапевтических агентов», которая включена во всей полноте посредством ссылки.
Липидный компонент композиции липидных наночастиц может включать одну или более молекул, содержащие полиэтиленгликоль, такие как ПЭГ или ПЭГ-модифицированные липиды. Такие виды могут альтернативно называться пегилированными липидами. ПЭГ-липид представляет собой липид, модифицированный полиэтиленгликолем. ПЭГ-липид может быть выбран из неограничивающей группы, включая ПЭГ-модифицированные фосфатидилэтаноламины, ПЭГ-модифицированные фосфатидные кислоты, ПЭГ-модифицированные церамиды, ПЭГ-модифицированные диалкиламины, ПЭГ-модифицированные диацилглицерины, ПЭГ-модифицированные диалкилглицерины и их смеси. Например, ПЭГ-липид может представлять собой липид ПЭГ-c-DOMG, ПЭГ-DMG, ПЭГ-DLPE, ПЭГDMPE, ПЭГ-DPPC, или ПЭГ-DSPE.
В некоторых вариантах осуществления ПЭГ-модифицированные липиды представляют собой модифицированные формы ПЭГ DMG. ПЭГ-DMG имеет следующую структуру:
В одном варианте осуществления ПЭГ-липиды, используемые в данном изобретении, могут представлять собой пегилированные липиды, описанные в международной публикации №WO2012099755, содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки. Любой из этих иллюстративных ПЭГ-липидов, описанных в данном документе, может быть модифицирован для включения гидроксильной группы в цепь ПЭГ. В некоторых вариантах осуществления ПЭГ-липид представляет собой ПЭГ-OH липид. Как обычно определено в данном документе, «ПЭГ-OH липид» (также называемый в данном документе «гидрокси-пегилированный липид») представляет собой пегилированный липид, имеющий одну или более гидроксильных (-ОН) групп в липиде. В определенных вариантах осуществления ПЭГ-ОН липид содержит одну или более гидроксильных групп в цепи ПЭГ. В некоторых вариантах осуществления ПЭГ-ОН или гидрокси-пегилированный липид содержит группу -ОН в конце цепи ПЭГ. Каждый вариант представляет отдельный вариант осуществления данного изобретения.
В некоторых вариантах осуществления ПЭГ-липид, используемый в данном изобретении, представляет собой соединение формулы (VII). В данном документе представлены соединения формулы (VII):
(VII),
или их соли, где:
3
O
R представляет собой -OR;
O
R представляет собой водород, необязательно замещенный алкил или защитную группу кислорода;
r представляет собой целое число от 1 до 100, включительно;
1
N
N
N
N
N
N
N
1
10
1
10
L представляет собой необязательно замещенный C- алкилен, при этом по меньшей мере один метилен из необязательно замещенного C- алкилена независимо заменен необязательно замещенным карбоциклиленом, необязательно замещенным гетероциклиленом, необязательно замещенным ариленом, необязательно замещенным гетероариленом, O, N(R), S, C(O), C(O)N(R), NRC(O), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(R), NRC(O)O или NRC(O)N(R);
D представляет собой фрагмент, полученный при помощи методов клик-химии, или фрагмент, расщепляемый в физиологических условиях;
m равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;
А имеет формулу:  или ;
2
N
N
N
N
N
N
N
1
6
1
6
каждый пример L независимо представляет собой связь или необязательно замещенный C-алкилен, где одно метиленовое звено необязательно замещенного C- алкилена необязательно заменено O, N(R), S, C(O), C(O)N(R), NRC(O), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(R), NRC(O)O, или NRC(O)N(R);
2
2
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
1
30
1
30
1
30
2
2
2
2
2
2
2
2
2
каждый пример R независимо представляет собой необязательно замещенный C- алкил, необязательно замещенный C- алкенил или необязательно замещенный C- алкинил; необязательно, где одно или более метиленовых звеньев R независимо замещены необязательно замещенным карбоциклиленом, необязательно замещенным гетероциклиленом, необязательно замещенным ариленом, необязательно замещенным гетероариленом, N(R), O, S, C(O), C(O)N(R), NRC(O), NRC(O)N(R), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(R), NRC(O)O, C(O)S, SC(O), C(=NR), C(=NR)N(R), NRC(=NR), NRC(=NR)N(R), C(S), C(S)N(R), NRC(S), NRC(S)N(R), S(O), OS(O), S(O)O, OS(O)O, OS(O), S(O)O, OS(O)O, N(R)S(O), S(O)N(R), N(R)S(O)N(R), OS(O)N(R), N(R)S(O)O, S(O), N(R)S(O), S(O)N(R), N(R)S(O)N(R), OS(O)N(R), или N(R)S(O)O;
N
каждый пример R независимо представляет собой водород, необязательно замещенный алкил или защитную группу азота;
Кольцо B представляет собой необязательно замещенный карбоциклил, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил; и
p представляет собой 1 или 2.
3
O
O
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (VII) представляет собой ПЭГ-ОН липид (т.е. R представляет собой -OR, и R представляет собой водород). В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (VII) имеет формулу (VII-OH):
(VII-OH),
или его соль.
В некоторых вариантах осуществления D представляет собой группу, полученную при помощи методов клик-химии (например, триазол). В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (VII) имеет формулу (VII-a-1) или (VII-a-2):
(VII-a-1) (VII-a-2),
или его соль.
В определенных вариантах осуществления соединение формулы (VII) имеет одну из следующих формул:
или его соль, где
s равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10.
В определенных вариантах осуществления соединение формулы (VII) имеет одну из следующих формул:
или его соль.
В определенных вариантах осуществления соединение формулы (VII) имеет одну из следующих формул:
или его соль.
В определенных вариантах осуществления соединение формулы (VII) имеет одну из следующих формул:
(Соединение 415),
(Соединение 416),
(Соединение 417),
(Соединение 418),
или его соль.
В некоторых вариантах осуществления D представляет собой фрагмент, расщепляемый в физиологических условиях (например, сложный эфир, амид, карбонат, карбамат, мочевину). В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (VII) имеет формулу (VII-b-1) или (VII-b-2):
или его соль.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (VII) имеет формулу (VII-b-1-OH) или (VII-b-2-OH):
или его соль.
В определенных вариантах осуществления соединение формулы (VII) имеет одну из следующих формул:
или его соль.
В определенных вариантах осуществления соединение формулы (VII) имеет одну из следующих формул:
или его соль.
В определенных вариантах осуществления соединение формулы (VII) имеет одну из следующих формул:
или его соль.
В определенных вариантах осуществления соединение формулы (VII) имеет одну из следующих формул:
или его соли.
В некоторых вариантах осуществления ПЭГ-липид, используемый в данном изобретении, представляет собой пегилированную жирную кислоту. В некоторых вариантах осуществления ПЭГ-липид, используемый в данном изобретении, представляет собой соединение формулы (VIII). В данном документе представлены соединения формулы (VIII):
(VIII),
или его соли, где:
3
O
R представляет собой -OR;
O
R представляет собой водород, необязательно замещенный алкил или защитную группу кислорода;
r представляет собой целое число от 1 до 100, включительно;
5
5
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
10
40
10
40
10
40
2
2
2
2
2
2
2
2
2
R представляет собой необязательно замещенный C- алкил, необязательно замещенный C- алкенил или необязательно замещенный C- алкинил; и необязательно одну или более метиленовых групп R заменяют необязательно замещенным карбоциклиленом, необязательно замещенным гетероциклиленом, необязательно замещенным ариленом, необязательно замещенным гетероариленом, N(R), O, S, C(O), C(O)N(R), NRC(O), NRC(O)N(R), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(R), NRC(O)O, C(O)S, SC(O), C(=NR), C(=NR)N(R), NRC(=NR), NRC(=NR)N(R), C(S), C(S)N(R), NRC(S), NRC(S)N(R), S(O), OS(O), S(O)O, OS(O)O, OS(O), S(O)O, OS(O)O, N(R)S(O), S(O)N(R), N(R)S(O)N(R), OS(O)N(R), N(R)S(O)O, S(O), N(R)S(O), S(O)N(R), N(R)S(O)N(R), OS(O)N(R), или N(R)S(O)O; и
N
каждый пример R независимо представляет собой водород, необязательно замещенный алкил или защитную группу азота.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (VIII) имеет формулу (VIII-OH):
(VIII-OH),
или его соль. В некоторых вариантах осуществления r равно 45.
В определенных вариантах осуществления соединение формулы (VII) имеет одну из следующих формул:
(Соединение 419),
(Соединение 420),
(Соединение 421),
(Соединение 422),
(Соединение 423),
(Соединение 424),
(Соединение 425),
(Соединение 426),
или его соль. В некоторых вариантах осуществления r равно 45.
В еще других вариантах осуществления соединение формулы (VIII) представляет собой:
(Соединение 427),
или его соль.
В одном варианте осуществления соединение формулы (VIII) представляет собой
(Соединение 428).
В одном варианте осуществления количество ПЭГ-липида в липидной композиции фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе, составляет от около 0,1 мол.% до около 5 мол.%, от около 0,5 мол.% до около 5 мол.%, от около 1 мол.% до около 5 мол.%, от около 1,5 мол.% до около 5 мол.%, от около 2 мол.% до около 5 мол.%, от около 0,1 мол.% до около 4 мол.%, от около 0,5 мол.% до около 4 мол.%, от около 1 до около 4 мол.%, от около 1,5 мол.% до около 4 мол.%, от около 2 мол.% до около 4 мол.%, от около 0,1 мол.% до около 3 мол.%, от около 0,5 мол.% до около 3 мол.%, от около 1 мол.% до около 3 мол.%, от около 1,5 мол.% до около 3 мол.%, от около 2 мол.% до около 3 мол.%, от около 0,1 мол.% до около 2 мол.%, от около 0,5 мол.% до около 2 мол.%, от около 1 мол.% до около 2 мол.%, от около 1,5 мол.% до около 2 мол.%, от около 0,1 мол.% до около 1,5 мол.%, от около 0,5 мол.% до около 1,5 мол.% или от около 1 мол.% до около 1,5 мол.%.
В одном варианте осуществления количество ПЭГ-липида в липидной композиции, раскрытой в данном документе, составляет около 2 мол.%. В одном варианте осуществления количество ПЭГ-липида в липидной композиции, раскрытой в данном документе, составляет около 1,5 мол.%.
В одном варианте осуществления количество ПЭГ-липида в липидной композиции, раскрытой в данном документе, составляет по меньшей мере около 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 или 5 мол. %.
В некоторых аспектах липидная композиция фармацевтических композиций, раскрытых в данном документе, не содержит ПЭГ-липид.
f. Другие ионизируемые аминолипиды
Липидная композиция фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе, может содержать один или более ионизируемых аминополипидов в дополнение или вместо липида в соответствии с формулами (I), (II), (III), (IV), (V) или (VI).
Ионизируемые липиды могут быть выбраны из неограничивающей группы, состоящей из 3- (дидодециламино) -N1, N1,4-тридодецил-1-пиперазинэтанамина (KL10), N1-[2- (дидодециламино)этил]N1,N4,N4 -тридодецил-1,4-пиперазиндиэтанамина (KL22), 14,25-дитридецил-15,18,21,24-тетрааза-октатриаконтана (KL25), 1,2-дилиноилилокси-N,N-диметиламинопропан (DLin-DMA), 2,2-дилинолил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксолана (DLin-K-DMA), гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил 4-(диметиламино)бутаноата (DLin-MC3-DMA), 2,2-дилинолеил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксолана (DLin-KC2-DMA), 1,2-диолеилокси-N, N-диметиламинопропана (DODMA), (13Z, 165Z)-N,N-диметил-3-нонидокоза-13-16-диен-1-амина (L608), 2-({8-[(3β)холест5-ен3илокси]октил}окси)-N,N-диметил-3-[(9Z,12Z)-октадека-9,12-диен-1-илокси]пропан-1-амина (октил-CLinDMA), (2R)-2-({8-[(3β)-холест-5-ен-3-илокси]октил}окси)-N, N-диметил-3-[(9Z,12Z)-октадека-9,12-диен-1-илокси]пропан-1-амина (октил-CLinDMA (2R)) и (2S)-2-({8-[(3β)-холест-5ен3илокси]октил}окси)N,Nдиметил3-[(9Z,12Z)октадека 9,12диен1илокси]пропан1-амина (Octyl-CLinDMA (2S)). В дополнение к этому ионизируемый аминолипид может также представлять собой липид, содержащий циклическую аминогруппу.
Ионизируемые липиды также могут представлять собой соединения, раскрытые в международной публикации №WO 2017/075531 А1, включенной во всей полноте в данный документ посредством ссылки. Например, ионизируемые аминополипиды включают, но не ограничиваются ими:
;
;
и любую их комбинацию.
Ионизируемые липиды также могут представлять собой соединения, раскрытые в международной публикации №WO 2015/199952 А1, включенной во всей полноте в данный документ посредством ссылки. Например, ионизируемые аминополипиды включают, но не ограничиваются ими:
и любую их комбинацию.
g. Композиции наночастиц
Липидная композиция фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе, может включать один или более компонентов в дополнение к тем, которые описаны выше. Например, липидная композиция может включать одну или более молекул усилителя проницаемости, углеводов, полимеров, агентов, изменяющих свойства поверхности, (например, поверхностно-активных веществ) или других компонентов. Например, молекула, усиливающая проницаемость, может представлять собой молекулу, описанную в публикации заявки на патент США №2005/0222064. Углеводы могут включать простые сахара (например, глюкозу) и полисахариды (например, гликоген и его производные и аналоги).
Полимер может быть включен в и/или использован для инкапсулирования или частичного инкапсулирования фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе, (например, фармацевтической композиции в форме липидных наночастиц). Полимер может быть биоразлагаемым и/или биосовместимым. Полимер может быть выбран из, но не ограничиваются ими, полиаминов, простых полиэфиров, полиамидов, сложных полиэфиров, поликарбаматов, полиуретанов, поликарбонатов, полистиролов, полиимидов, полисульфонов, полиуретанов, полиацетиленов, полиэтиленов, полиэтилениминов, полиизоцианатов, полиакрилатов, полиметакрилатов, полиакрилонитрилов, и полиарилатов.
Соотношение между липидной композицией и полинуклеотидом может находиться в диапазоне от около 10:1 до около 60:1 (мас./мас.).
В некоторых вариантах осуществления соотношение между липидной композицией и полинуклеотидом может находиться в диапазоне от около 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1, 47:1, 48:1, 49:1, 50:1, 51:1, 52:1, 53:1, 54:1, 55:1, 56:1, 57:1, 58:1, 59:1 или 60:1 (мас./мас.). В некоторых вариантах осуществления соотношение массы липидной композиции к массе полинуклеотида, кодирующего терапевтический агент, составляет около 20:1 или около 15:1.
В одном варианте осуществления описанные в данном документе липидные наночастицы могут содержать полинуклеотиды (например, мРНК) в массовом соотношении липид:полинуклеотид 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1 или 70:1, или в диапазоне или любом из этих соотношений, таких как, но не ограничиваясь, от 5:1 до около 10:1, от около 5:1 до около 15:1, от около 5:1 до около 20:1, от около 5:1 до около 25:1, от около 5:1 до около 30:1, от около 5:1 до около 35:1, от около 5:1 до около 40:1, от около 5:1 до около 45:1, от около 5:1 до около 50:1, от около 5:1 до около 55:1. от около 5:1 до около 60:1, от около 5:1 до около 70:1, от около 10:1 до около 15:1, от около 10:1 до около 20:1, от около 10:1 до около 25:1, от около 10:1 до около 30:1, от около 10:1 до около 35:1, от около 10:1 до около 40:1, от около 10:1 до около 45:1, от около 10:1 до около 50:1, от около 10:1 до около 55:1, от около 10:1 до около 60:1, от около 10:1 до около 70:1, от около 15:1 до около 20:1, от около 15:1 до около 25:1, от около 15:1 до около 30:1, от около 15:1 до около 35:1, от около 15:1 до около 40:1, от около 15:1 до около 45:1, от около 15:1 до около 50:1, от около 15:1 до около 55:1, от около 15:1 до около 60:1 или от около 15:1 до около 70:1.
В одном варианте осуществления описанные в данном документе липидные наночастицы могут содержать полинуклеотид в концентрации от около 0,1 мг/мл до 2 мг/мл, такой как, но не ограничиваясь этим, 0,1 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,3 мг/мл, 0,4 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,6 мг/мл, 0,7 мг/мл, 0,8 мг/мл, 0,9 мг/мл, 1,0 мг/мл, 1,1 мг/мл, 1,2 мг/мл, 1,3 мг/мл, 1,4 мг/мл, 1,5 мг/мл, 1,6 мг/мл, 1,7 мг/мл, 1,8 мг/мл, 1,9 мг/мл, 2,0 мг/мл или более 2,0 мг/мл.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, раскрытые в данном документе, составлены в виде липидных наночастиц (LNP). Соответственно, данное раскрытие также обеспечивает композиции наночастиц, содержащие (i) липидную композицию, содержащую агент доставки, такой как соединение формулы (I) или (III), как описано в данном документе, и (ii) полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид. В такой композиции наночастиц липидная композиция, раскрытая в данном документе, может инкапсулировать полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид.
Композиции наночастиц обычно имеют размер порядка микрометров или меньше и могут включать липидный бислой. Композиции наночастиц охватывают липидные наночастицы (LNP), липосомы (например, липидные везикулы) и липоплексы. Например, композиция наночастиц может представлять собой липосому, имеющую липидный бислой диаметром 500 нм или менее.
Композиции наночастиц включают, например, липидные наночастицы (LNP), липосомы и липоплексы. В некоторых вариантах осуществления композиции наночастиц представляют собой везикулы, имеющие один или более липидных бислоев. В определенных вариантах осуществления композиция наночастиц имеет два или более концентрических бислоя, разделенных водными компартментами. Липидные бислоя могут быть функционализированы и/или перекрестно-сшиты друг с другом. Липидные бислоя могут содержать один или более лигандов, белков или каналов.
В некоторых вариантах осуществления композиции наночастиц согласно данному раскрытию содержат по меньшей мере одно соединение в соответствии с формулами (I), (III), (IV), (V) или (VI). Например, композиция наночастиц может содержать одно или более из соединений 1-147 или одно или более из соединений 1-342. Композиции наночастиц могут также содержать множество других компонентов. Например, композиция наночастиц может содержать один или более других липидов в дополнение к липиду в соответствии с формулами (I), (II), (III), (IV), (V) или (VI), например, (i) по меньшей мере один фосфолипид, (ii) по меньшей мере один структурный липид, (iii) по меньшей мере один ПЭГ-липид или (iv) любую их комбинацию. Включение структурного липида может быть необязательным, например, когда липиды в соответствии с формулой III используются в композициях липидных наночастиц согласно изобретению.
В некоторых вариантах осуществления композиция наночастиц содержит соединение формулы (I) (например, соединения 18, 25, 26 или 48). В некоторых вариантах осуществления композиция наночастиц содержит соединение формулы (I) (например, соединения 18, 25, 26 или 48) и фосфолипид (например, DSPC).
В некоторых вариантах осуществления композиция наночастиц содержит соединение формулы (III) (например, соединение 236). В некоторых вариантах осуществления композиция наночастиц содержит соединение формулы (III) (например, соединение 236) и фосфолипид (например, DOPE или DSPC).
В некоторых вариантах осуществления композиция наночастиц содержит липидную композицию, состоящую или состоящую по существу из соединения формулы (I) (например, соединений 18, 25, 26 или 48). В некоторых вариантах осуществления композиция наночастиц содержит липидную композицию, состоящую или состоящую по существу из соединения формулы (I) (например, соединений 18, 25, 26 или 48) и фосфолипида (например, DSPC).
В некоторых вариантах осуществления композиция наночастиц содержит липидную композицию, состоящую или состоящую по существу из соединения формулы (III) (например, соединения 236). В некоторых вариантах осуществления композиция наночастиц содержит липидную композицию, состоящую или состоящую по существу из соединения формулы (III) (например, соединения 236) и фосфолипида (например, DOPE или DSPC).
В одном варианте осуществления липидная наночастица содержит ионизируемый липид, структурный липид, фосфолипид, ПЭГ-модифицированный липид и мРНК. В некоторых вариантах осуществления LNP содержит ионизируемый липид, ПЭГ-модифицированный липид, стерин и фосфолипид. В некоторых вариантах осуществления LNP имеет мольное соотношение около 20-60% ионизируемого липида: около 5-25% фосфолипида: около 25-55% стерола; и около 0,5-15% ПЭГ-модифицированного липида. В некоторых вариантах осуществления LNP содержит мольное соотношение около 50% ионизируемого липида, около 1,5% ПЭГ-модифицированного липида, около 38,5% холестерина и около 10% фосфолипида. В некоторых вариантах осуществления LNP содержит мольное соотношение около 55% ионизируемого липида, около 2,5% ПЭГ-липида, около 32,5% холестерина и около 10% фосфолипида. В некоторых вариантах осуществления ионизируемый липид представляет собой ионизируемый аминолипид, а нейтральный липид представляет собой фосфолипид, а стерин представляет собой холестерин. В некоторых вариантах осуществления LNP имеет мольное соотношение 50: 38,5: 10: 1,5 для ионизируемого липида: холестерина: DSPC: ПЭГ-липид. В некоторых вариантах осуществления ионизируемый липид представляет собой соединение 18 или соединение 236, а ПЭГ-липид представляет собой соединение 428 или ПЭГ-DMG.
В некоторых вариантах осуществления LNP имеет мольное соотношение 50: 38,5: 10: 1,5 для соединения 18: холестерина: фосфолипида: соединения 428. В некоторых вариантах осуществления LNP имеет мольное соотношение 50: 38,5: 10: 1,5 для соединения 18: холестерина: DSPC: соединения 428. В некоторых вариантах осуществления LNP имеет мольное соотношение 50: 38,5: 10: 1,5 для соединения 18: холестерина: фосфолипида: ПЭГ-DMG. В некоторых вариантах осуществления LNP имеет мольное соотношение 50: 38,5: 10: 1,5 для соединения 18: холестерина: DSPC: ПЭГ-DMG.
В некоторых вариантах осуществления LNP имеет мольное соотношение 50: 38,5: 10: 1,5 для соединения 236: холестерина: фосфолипида: соединения 428. В некоторых вариантах осуществления LNP имеет мольное соотношение 50: 38,5: 10: 1,5 для соединения 236: холестерина: DSPC: соединения 428.
В некоторых вариантах осуществления LNP имеет мольное соотношение 40: 38,5: 20: 1,5 для соединения 18: холестерина: фосфолипида: соединения 428. В некоторых вариантах осуществления LNP имеет мольное соотношение 40: 38,5: 20: 1,5 для соединения 18: холестерина: DSPC: соединения 428. В некоторых вариантах осуществления LNP имеет мольное соотношение 40: 38,5: 20: 1,5 для соединения 18: холестерина: фосфолипида: ПЭГ-DMG. В некоторых вариантах осуществления LNP имеет мольное соотношение 40: 38,5: 20: 1,5 для соединения 18: холестерина: DSPC: ПЭГ-DMG.
В некоторых вариантах осуществления композиция наночастиц может иметь состав соединения 18: фосфолипида: холестерина: соединения 428 с мольным отношением 50: 10: 38,5: 1,5. В некоторых вариантах осуществления композиция наночастиц может иметь состав соединения 18: DSPC: холестерина: соединения 428 с мольным отношением 50: 10: 38,5: 1,5. В некоторых вариантах осуществления композиция наночастиц может иметь состав соединения 18: фосфолипида: холестерина: ПЭГ-DMG с мольным отношением 50: 10: 38,5: 1,5. В некоторых вариантах осуществления композиция наночастиц может иметь состав соединения 18: DSPC: холестерина: ПЭГ-DMG с мольным отношением 50: 10: 38,5: 1,5.
В некоторых вариантах осуществления LNP имеет значение полидисперсности менее 0,4. В некоторых вариантах осуществления LNP имеет общий нейтральный заряд при нейтральном pH. В некоторых вариантах осуществления LNP имеет средний диаметр 50-150 нм. В некоторых вариантах осуществления LNP имеет средний диаметр 80-100 нм.
Как в целом определено в данном документе термин «липид» относится к малой молекуле, которая обладает гидрофобными или амфифильными свойствами. Липиды могут быть природными или синтетическими. Примеры классов липидов включают, но не ограничиваются ими, жиры, воски, стеринсодержащие метаболиты, витамины, жирные кислоты, глицеролипиды, глицерофосфолипиды, сфинголипиды, сахаролипиды и поликетиды и преноловые липиды. В некоторых случаях амфифильные свойства некоторых липидов приводят к тому, что они образуют липосомы, везикулы или мембраны в водных средах.
В некоторых вариантах осуществления липидная наночастица (LNP) может содержать ионизируемый липид. Используемый в данном документе термин «ионизируемый липид» имеет свое обычное значение в данной области техники и может относиться к липиду, содержащему один или более заряженных фрагментов. В некоторых вариантах осуществления ионизируемый липид может быть положительно заряженным или отрицательно заряженным. Ионизируемый липид может быть положительно заряженным, и в этом случае его можно назвать «катионным липидом». В некоторых вариантах осуществления молекула ионизируемого липида может содержать аминогруппу и может упоминаться как ионизируемые аминополипиды. Используемый в данном документе «заряженный фрагмент» представляет собой химический фрагмент, который несет формальный электронный заряд, например, одновалентный (+1 или -1), двухвалентный (+2 или -2), трехвалентный (+3 или -3) и т.д. Заряженный фрагмент может быть анионным (то есть отрицательно заряженным) или катионным (то есть положительно заряженным). Примеры положительно заряженных фрагментов включают аминогруппы (например, первичные, вторичные и/или третичные амины), аммониевые группы, пиридиниевую группу, гуанидиновые группы и имидизольные группы. В конкретном варианте осуществления заряженные фрагменты содержат аминогруппы. Примеры отрицательно заряженных групп или их предшественников включают карбоксилатные группы, сульфонатные группы, сульфатные группы, фосфонатные группы, фосфатные группы, гидроксильные группы и тому подобное. Заряд заряженного фрагмента может изменяться, в некоторых случаях, в зависимости от условий окружающей среды, например, изменения pH могут изменять заряд фрагмента и/или приводить к тому, что фрагмент становится заряженным или незаряженным. Как правило, плотность заряда молекулы может быть выбрана по желанию.
Следует понимать, что термины «заряженный» или «заряженный фрагмент» не относятся к «частичному отрицательному заряду» или «частичному положительному заряду» в молекуле. Термины «частичный отрицательный заряд» и «частичный положительный заряд» имеют обычное значение в данной области техники. «Частичный отрицательный заряд» может возникнуть, когда функциональная группа содержит связь, которая становится поляризованной так, что электронная плотность притягивается к одному атому связи, создавая частичный отрицательный заряд на атоме. Специалисты в данной области техники, как правило, определяют связи, которые могут поляризоваться таким образом.
В некоторых вариантах осуществления ионизируемый липид представляет собой ионизируемый аминополипид, иногда называемый в данной области техники «ионизируемым катионным липидом». В одном варианте осуществления ионизируемый аминолипид может иметь положительно заряженную гидрофильную головку и гидрофобный хвост, которые связаны через линкерную структуру.
В дополнение к этому ионизируемый липид может также представлять собой липид, содержащий циклическую аминогруппу.
В одном варианте осуществления ионизируемый липид может быть выбран из, но не ограничиваясь этим, ионизируемого липида, описанного в международных публикациях №№WO2013086354 и WO2013116126; содержание каждой из которых включено в полный объем в данный документ посредством ссылки.
В еще одном варианте осуществления ионизируемый липид может быть выбран из, но не ограничиваясь этим, формулы CLI-CLXXXXII патента США №7404969; каждый из которых включен во всей полноте в данный документ посредством ссылки.
В одном варианте осуществления липид может представлять собой расщепляемый липид, такой как те, которые описаны в международной публикации №WO2012170889, включенной во всей полноте в данный документ посредством ссылки. В одном варианте осуществления липид может быть синтезирован способами, известными в данной области техники и/или как описано в международных публикациях №№WO2013086354; содержание каждой из которых включено во всей полноте в данный документ посредством ссылки.
Композиции наночастиц могут быть охарактеризованы различными способами. Например, микроскопия (например, трансмиссионная электронная микроскопия или сканирующая электронная микроскопия) может использоваться для изучения морфологии и распределения по размерам композиции наночастиц. Метод динамического рассеяния света или потенциометрия (например, потенциометрическое титрование) могут использоваться для измерения дзета-потенциалов. Метод динамического рассеяния света также может быть использован для определения размеров частиц. Такие инструменты, как Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Малверн, Вустершир, Великобритания), также могут использоваться для измерения множества характеристик композиции наночастиц, таких как размер частиц, коэффициент полидисперсности и дзета-потенциал.
В некоторых вариантах осуществления композиция наночастиц содержит липидную композицию, состоящую или состоящую по существу из соединения формулы (I) (например, соединений 18, 25, 26 или 48). В некоторых вариантах осуществления композиция наночастиц содержит липидную композицию, состоящую или состоящую по существу из соединения формулы (I) (например, соединений 18, 25, 26 или 48) и фосфолипида (например, DSPC или MSPC).
Композиции наночастиц могут быть охарактеризованы различными способами. Например, микроскопия (например, трансмиссионная электронная микроскопия или сканирующая электронная микроскопия) может использоваться для изучения морфологии и распределения по размерам композиции наночастиц. Метод динамического рассеяния света или потенциометрия (например, потенциометрическое титрование) могут использоваться для измерения дзета-потенциалов. Метод динамического рассеяния света также может быть использован для определения размеров частиц. Такие инструменты, как Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Малверн, Вустершир, Великобритания), также могут использоваться для измерения множества характеристик композиции наночастиц, таких как размер частиц, коэффициент полидисперсности и дзета-потенциал.
Размер наночастиц может помочь противодействовать биологическим реакциям, таким как, но не ограничиваясь этим, воспаление, или может увеличить биологический эффект полинуклеотида.
Используемый в данном документе термин «размер» или «средний размер» в контексте композиций наночастиц относится к среднему диаметру композиции наночастицы.
В одном варианте осуществления полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, составлен в виде липидных наночастиц, имеющих диаметр от около 10 до около 100 нм, такой как, но не ограничиваясь этим, от около 10 до около 20 нм, от около 10 до около 30 нм, от около 10 до около 40 нм, от около 10 до около 50 нм, от около 10 до около 60 нм, от около 10 до около 70 нм, от около 10 до около 80 нм, от около 10 до около 90 нм, от около 20 до около 30 нм, около 20 до около 40 нм, от около 20 до около 50 нм, от около 20 до около 60 нм, от около 20 до около 70 нм, от около 20 до около 80 нм, от около 20 до около 90 нм, от около 20 до около 100 нм, от около 30 до около 40 нм, от около 30 до около 50 нм, от около 30 до около 60 нм, от около 30 до около 70 нм, от около 30 до около 80 нм, от около 30 до около 90 нм, от около 30 до около 100 нм, от около 40 до около 50 нм, от около 40 до около 60 нм, от около 40 до около 70 нм, от около 40 до около 80 нм, от около 40 до около 90 нм, от около 40 до около 100 нм, от около 50 до около 60 нм, от около 50 до около 70 нм, от около 50 до около 80 нм, от около 50 до около 90 нм, от около 50 до около 100 нм, от около 60 до около 70 нм, от около 60 до около 80 нм, от около 60 до около 90 нм, от около 60 до около 100 нм, от около 70 до около 80 нм, от около 70 до около 90 нм, от около 70 до около 100 нм, от около 80 до около 90 нм, от около 80 до около 100 нм и/или от около 90 до около 100 нм.
В одном варианте осуществления наночастицы имеют диаметр от около 10 до 500 нм. В одном варианте осуществления наночастица имеет диаметр более 100 нм, более 150 нм, более 200 нм, более 250 нм, более 300 нм, более 350 нм, более 400 нм, более 450 нм более 500 нм, более 550 нм, более 600 нм, более 650 нм, более 700 нм, более 750 нм, более 800 нм, более 850 нм, более 900 нм, более 950 нм или более 1000 нм.
В некоторых вариантах осуществления самый большой размер композиции наночастицы составляет 1 мкм или меньше (например, 1 мкм, 900 нм, 800 нм, 700 нм, 600 нм, 500 нм, 400 нм, 300 нм, 200 нм, 175 нм, 150 нм, 125 нм, 100 нм, 75 нм, 50 нм или меньше).
Композиция наночастиц может быть относительно гомогенной. Коэффициент полидисперсности может быть использован для указания гомогенности композиции наночастиц, например, распределения частиц по размерам композиции наночастиц. Небольшой (например, менее 0,3) коэффициент полидисперсности обычно указывает на узкое распределение частиц по размерам. Композиция наночастиц может иметь коэффициент полидисперсности от около 0 до около 0,25, такой как 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,20, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24 или 0,25. В некоторых вариантах осуществления коэффициент полидисперсности композиции наночастиц, раскрытой в данном документе, может составлять от около 0,10 до около 0,20.
Дзета-потенциал композиции наночастиц можно использовать для указания электрокинетического потенциала композиции. Например, дзета-потенциал может описывать поверхностный заряд композиции наночастиц. Композиции наночастиц с относительно низкими зарядами, положительными или отрицательными, обычно желательны, так как более высоко заряженные частицы могут нежелательно взаимодействовать с клетками, тканями и другими элементами в организме. В некоторых вариантах осуществления дзета-потенциал композиции наночастиц, раскрытой в данном документе, может составлять от около -10 мВ до около+20 мВ, от около -10 мВ до около+15 мВ, от около 10 мВ до около+10 мВ, от около от -10 мВ до+5 мВ, от около -10 мВ до около 0 мВ, от около -10 мВ до около -5 мВ, от около -5 мВ до около+20 мВ, от около -5 мВ до около+15 мВ, от около -5 мВ до около+10 мВ, от около -5 мВ до около+5 мВ, от около -5 мВ до около 0 мВ, от около 0 мВ до около+20 мВ, от около 0 мВ до около+15 мВ, от около 0 мВ до около+10 мВ, от около 0 мВ до около+5 мВ, от около+5 мВ до около+20 мВ, от около+5 мВ до около+15 мВ или от около+5 мВ до+10 мВ.
В некоторых вариантах осуществления дзета-потенциал липидных наночастиц может составлять от около 0 мВ до около 100 мВ, от около 0 мВ до около 90 мВ, от около 0 мВ до около 80 мВ, от около 0 мВ до около 70 мВ, от около 0 мВ до около 60 мВ, от около 0 мВ до около 50 мВ, от около 0 мВ до около 40 мВ, от около 0 мВ до около 30 мВ, от около 0 мВ до около 20 мВ, от около 0 мВ до около 10 мВ, от около 10 мВ до около 100 мВ, от около 10 мВ до около 90 мВ, от около 10 мВ до около 80 мВ, от около 10 мВ до около 70 мВ, от около 10 мВ до около 60 мВ, от около 10 мВ до около 50 мВ, от около 10 мВ до около 40 мВ, от около 10 мВ до около 30 мВ, от около 10 мВ до около 20 мВ, от около 20 мВ до около 100 мВ, от около 20 мВ до около 90 мВ, от около 20 до около 80 мВ, от около 20 мВ до около 70 мВ, от около 20 мВ до около 60 мВ, от около 20 мВ до около 50 мВ, от около 20 мВ до около 40 мВ, от около 20 мВ от около 30 мВ, от около 30 мВ до около 100 мВ, от 30 мВ до около 90 мВ, от около 30 мВ до около 80 мВ, от около 30 мВ до около 70 мВ, от около 30 до около 60 мВ, от около 30 мВ до около 50 мВ, от около 30 мВ до около 40 мВ, от около 40 мВ до около 100 мВ, от около 40 мВ до около 90 мВ, от около 40 мВ до около 80 мВ, от около 40 мВ до около 70 мВ, от около 40 мВ до около 60 мВ и от около 40 мВ до около 50 мВ. В некоторых вариантах осуществления дзета-потенциал липидных наночастиц может составлять от около 10 мВ до около 50 мВ, от около 15 мВ до около 45 мВ, от около 20 мВ до около 40 мВ и от около 25 мВ до около 35 мВ. В некоторых вариантах осуществления дзета-потенциал липидных наночастиц может составлять около 10 мВ, около 20 мВ, около 30 мВ, около 40 мВ, около 50 мВ, около 60 мВ, около 70 мВ, около 80 мВ, около 90 мВ и около 100 мВ.
Термин «эффективность инкапсуляции» полинуклеотида описывает количество полинуклеотида, которое инкапсулируется или иным образом связывается с композицией наночастиц после приготовления, по отношению к обеспечиваемому исходному количеству. Как используется в данном документе, «инкапсуляция» может относиться к полной, значительной или частичной капсуляции, окружению, ограничению, заключению.
Эффективность инкапсуляции является предпочтительно высокой (например, близка к 100%). Эффективность инкапсуляции может быть измерена, например, путем сравнения количества полинуклеотида в растворе, содержащем композицию наночастиц, до и после разрушения композиции наночастиц одним или более органическими растворителями или детергентами.
Флуоресценцию можно использовать для измерения количества свободного полинуклеотида в растворе. Для описанных в данном документе композиций наночастиц эффективность инкапсуляции полинуклеотида может составлять, например, по меньшей мере 50%. 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. В некоторых вариантах осуществления эффективность инкапсуляции может составлять по меньшей мере 80%. В определенных вариантах осуществления эффективность инкапсуляции может составлять по меньшей мере 90%.
Количество полинуклеотида, присутствующего в фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе, может зависеть от множества факторов, таких как размер полинуклеотида, желаемая мишень и/или применение или другие свойства композиции наночастиц, а также от свойств полинуклеотида.
Например, количество мРНК, полезной в композиции наночастиц, может зависеть от размера (выраженного в виде длины или молекулярной массы), последовательности и других характеристик мРНК. Относительные количества полинуклеотида в составе наночастиц также могут варьироваться.
Относительные количества липидной композиции и полинуклеотида, присутствующего в композиции липидных наночастиц согласно данному раскрытию, могут быть оптимизированы в соответствии с соображениями эффективности и переносимости. Для композиций, содержащих мРНК в качестве полинуклеотида, соотношение N:P может служить полезным показателем.
Поскольку соотношение N:P композиции наночастиц контролирует как экспрессию, так и переносимость, желательны композиции наночастиц с низким соотношением N:P и сильной экспрессией. Соотношения N:P варьируются в зависимости от соотношения липидов к РНК в композиции наночастиц.
Как правило, более низкое соотношение N:P является предпочтительным. Одна или более РНК, липидов и их количества могут быть выбраны для обеспечения соотношения N:P от около 2:1 до около 30:1, такого как 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 12:1, 14:1, 16:1, 18:1, 20:1, 22:1, 24:1, 26:1, 28:1 или 30:1. В определенных вариантах осуществления соотношение N:P может составлять от около 2:1 до около 8:1. В других вариантах осуществления соотношение N:P составляет от около 5:1 до около 8:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение N:P составляет от 5:1 до 6:1. В одном конкретном аспекте соотношение N:P составляет около 5,67:1.
В дополнение к предоставлению композиций наночастиц, данное раскрытие также обеспечивает способы получения липидных наночастиц, включающие инкапсулирование полинуклеотида. Такой способ включает использование любой из фармацевтических композиций, раскрытых в данном документе, и получение липидных наночастиц в соответствии со способами получения липидных наночастиц, известными в данной области техники. См., например, Wang et al. (2015) “Delivery of oligonucleotides with lipid nanoparticles” Adv. Drug Deliv. Rev. 87:68-80; Silva et al. (2015) “Delivery Systems for Biopharmaceuticals. Part I: Nanoparticles and Microparticles” Curr. Pharm. Technol. 16: 940-954; Naseri et al. (2015) “Solid Lipid Nanoparticles and Nanostructured Lipid Carriers: Structure, Preparation and Application” Adv. Pharm. Bull. 5:305-13; Silva et al. (2015) “Lipid nanoparticles for the delivery of biopharmaceuticals” Curr. Pharm. Biotechnol. 16:291-302, и ссылки, цитируемые в них.
Фармацевтические композиции
Данное раскрытие включает фармацевтические композиции, содержащие мРНК или наночастицу (например, липидную наночастицу), описанные в данном документе, в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми наполнителями, носителями или разбавителями. В конкретных вариантах осуществления мРНК присутствует в наночастице, например, в липидной наночастице. В конкретных вариантах осуществления мРНК или наночастица присутствует в фармацевтической композиции. В различных вариантах осуществления одна или более мРНК, присутствующих в фармацевтической композиции, инкапсулированы в наночастицу, например, в липидную наночастицу. В конкретных вариантах осуществления мольное соотношение первой мРНК ко второй мРНК составляет около 1:50, около 1:25, около 1:10, около 1:5, около 1:4, около 1:3, около 1:2, около 1:1, около 2:1, около 3:1, около 4:1 или около 5:1, около 10:1, около 25:1 или около 50:1. В конкретных вариантах осуществления мольное cоотношение первой мРНК ко второй мРНК превышает 1:1.
В некоторых вариантах осуществления композиция, раскрытая в данном документе, содержит мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген (Аг), и мРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген (например, иммуностимулятор (ИС), например, полипептид STING), причем мРНК, кодирующую представляющий интерес антиген (Аг), и мРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген (например, иммуностимулятор, например, полипептид STING), (ИС) составляют при массовом соотношении Аг:ИС 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 или 20:1. Альтернативно, массовое соотношение ИС: Аг может составлять, например, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10 или 1:20. В некоторых вариантах осуществления композиция составлена при массовом соотношении Аг:ИС 1:1. 1,25:1, 1,50:1, 1,75:1, 2,0:1, 2,25:1, 2,50:1, 2,75:1, 3,0:1, 3,25:1, 3,50:1, 3,75:1, 4,0:1, 4,25:1, 4,50:1, 4,75:1 или 5:1 мРНК, кодирующей представляющий интерес антиген, к мРНК, кодирующей полипептид, который усиливает иммунитет к представляющему интерес антигену (например, иммуностимулятор, например, полипептид STING). В некоторых вариантах осуществления композицию составляют в массовом соотношении 5:1 мРНК, кодирующей представляющий интерес антиген, к мРНК, кодирующей полипептид, который усиливает иммунитет на представляющий интерес антигена (например, иммуностимулятор, например, полипептид STING) (соотношение Аг:ИС 5:1 или, альтернативно, соотношение ИС:Аг 1:5). В некоторых вариантах осуществления композицию составляют в массовом соотношении 10:1 мРНК, кодирующей представляющий интерес антиген, к мРНК, кодирующей полипептид, который усиливает иммунитет на представляющий интерес антигена (например, иммуностимулятор, например, полипептид STING) (соотношение Аг:ИС 10:1 или, альтернативно, соотношение ИС:Аг 1:10).
Совместные составы, которые содержат как конструкт мРНК, кодирующий иммуностимулятор, так и конструкт мРНК, кодирующий представляющий интерес антиген, могут быть особенно полезны для примирования CD8+Т-клеток и индукции антигенспецифических иммунных ответов (например, противоопухолевого иммунитета). В данной области техники сообщалось, что для активации CD8+Т-клеток необходима прямая активация антигенпрезентирующих клеток (АПК) с помощью патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMP), тогда как АПК, косвенно активируемые провоспалительными медиаторами, не были эффективны в примировании CD8+T-клеток. (Kratky, W. et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108:17414-17419). Соответственно, совместное составление конструктов мРНК, кодирующих иммуностимулятор и представляющий интерес антиген, может быть особенно полезным для непосредственной активации АПК и примирования CD8+T-клеток.
st
Фармацевтические композиции могут необязательно содержать одно или более дополнительных активных веществ, например, терапевтически и/или профилактически активные вещества. Фармацевтические композиции согласно данному раскрытию могут быть стерильными и/или апирогенными. Общие подходы по составлению и/или изготовлению фармацевтических агентов можно найти, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21 ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (включенной во всей полноте в данный документ посредством ссылки). В конкретных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит мРНК и липидную наночастицу или их комплексы.
Составы фармацевтических композиций, описанных в данном документе, могут быть получены любым способом, известным или разработанным в дальнейшем в области фармакологии. В целом, такие способы приготовления могут включать стадию объединения активного ингредиента с наполнителем или одним или более другими вспомогательными ингредиентами, а затем, при необходимости, и/или желательно, разделения, формования и/или упаковку продукта в желаемую емкость однократной или многократной дозы.
Относительные количества активного ингредиента, фармацевтически приемлемого наполнителя и/или любых дополнительных ингредиентов в фармацевтической композиции в соответствии с раскрытием будут варьироваться в зависимости от индивидуальных особенностей, телосложения и/или состояния субъекта, которого лечат, и, кроме того, в зависимости от пути введения композиции. Например, композиция может включать от 0,1% до 100%, например, от 0,5% до 70%, от 1% до 30%, от 5% до 80% или по меньшей мере 80% (мас./мас) активного ингредиента.
мРНК согласно раскрытию может быть составлена с использованием одного или более наполнителей для: (1) повышения стабильности; (2) увеличения трансфекции клеток; (3) обеспечения пролонгированного или отсроченного высвобождения (например, из депо-препарата мРНК); (4) изменения биораспределения (например, нацеливания мРНК на конкретные ткани или типы клеток); (5) увеличения трансляции полипептида, кодируемого мРНК in vivo; и/или (6) изменения профиля высвобождения полипептида, кодируемого мРНК in vivo. В дополнение к традиционным наполнителям, таким как любые и все растворители, дисперсионные среды, разбавители или другие жидкие носители, дисперсионные или суспензионные добавки, поверхностно-активные агенты, изотонические агенты, загущающие или эмульгирующие агенты, консерванты, носители согласно данному раскрытию могут включать, без ограничений, липидоиды, липосомы, липидные наночастицы (например, липосомы и мицеллы), полимеры, липоплексы, наночастицы типа ядро/оболочка, пептиды, белки, углеводы, клетки, трансфицированные мРНК (например, для трансплантации субъекту), гиалуронидазу, аналоги наночастиц и их комбинации. Соответственно, составы согласно раскрытию могут содержать один или более наполнителей, каждый в количестве, которое вместе увеличивает стабильность мРНК, увеличивает трансфекцию клеток мРНК, увеличивает экспрессию полипептида, кодируемого мРНК, и/или изменяет профиль высвобождения мРНК-кодируемого полипептида. Кроме того, мРНК согласно данному раскрытию могут быть составлены с использованием самособирающихся наночастиц нуклеиновых кислот.
Различные носители для составления фармацевтических композиций и способы приготовления композиции известны в данной области техники (см. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; включенных во всей полноте в данный документ посредством ссылки). Применение среды со стандартным наполнителем может рассматриваться в рамках объема данного раскрытия, за исключением того, что любая среда со стандартным наполнителем может быть несовместима с веществом или его производными, например, вызывая любой нежелательный биологический эффект или иным вредным образом взаимодействуя с любым другим компонентом(ами) фармацевтической композиции. Наполнители могут включать, например: антиадгезивы, антиоксиданты, связывающие вещества, покрывающие вещества, добавки для прессования, разрыхлители, красящие вещества (красители), средства для смягчения, эмульгаторы, наполнители (разбавители), пленкообразователи или покрывающие вещества, вещества, способствующие скольжению (усилители сыпучести), смазывающие вещества, консерванты, печатные краски, сорбенты, суспендирующие или диспергирующие средства, подсластители и гидратационную воду. Иллюстративные наполнители включают, без ограничения, следующие: бутилированный гидрокситолуол (BHT), карбонат кальция, фосфат кальция (двухосновный), стеарат кальция, кросскармелозу, сшитый поливинилпирролидон, лимонную кислоту, кросповидон, цистеин, этилцеллюлозу, желатин, гидроксипропилцеллюлозу гидроксипропилметилцеллюлозу, лактозу, стеарат магния, мальтит, маннит, метионин, метилцеллюлозу, метилпарабен, микрокристаллическую целлюлозу, полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон, повидон, прежелатинизированный крахмал, пропилпарабен, ретинилпальмитат, шеллак, диоксид кремния, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, цитрат натрия, натрий-гликолят крахмала, сорбит, крахмал (кукурузный), стеариновую кислоту, сахарозу, тальк, диоксид титана, витамин A, витамин E, витамин C и ксилит.
В некоторых вариантах осуществления составы, описанные в данном документе, могут содержать по меньшей мере одну фармацевтически приемлемую соль. Примеры фармацевтически приемлемых солей, которые могут быть включены в состав согласно раскрытию, включают, но не ограничиваются ими, кислотно-аддитивные соли, соли щелочных или щелочноземельных металлов, соли минеральных или органических кислот основных остатков, таких как амины; щелочные или органические соли кислотных остатков, таких как карбоновые кислоты; и тому подобное. Репрезентативные кислотно-аддитивные соли включают ацетат, уксусную кислоту, адипинат, альгинат, аскорбат, аспартат, бензолсульфонат, бензолсульфоновую кислоту, бензоат, бисульфат, борат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, цитрат, циклопентанепропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, глюкогептонат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидробромид, гидрохлорид, гидроиодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактобионат, лактат, лаурат, лаурилсульфат, малат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, стеарат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, толуолсульфонат, ундеканоат, валерианат и тому подобное. Репрезентативные соли щелочных или щелочноземельных металлов включают соли натрия, лития, калия, кальция, магния и тому подобное, а также нетоксичные катионы аммония, четвертичного аммония и амина, включая, но не ограничиваясь этим, аммоний, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний, метиламин, диметиламин, триметиламин, триэтиламин, этиламин и тому подобное.
В некоторых вариантах осуществления составы, описанные в данном документе, могут содержать по меньшей мере один тип полинуклеотида. В качестве неограничивающего примера, составы могут содержать 1, 2, 3, 4, 5 или более 5 мРНК, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления составы, описанные в данном документе, могут содержать по меньшей мере одну мРНК, кодирующую полипептид, и по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, такую как, но не ограничиваясь этим, киРНК, кшРНК, мякРНК и миРНК.
Жидкие лекарственные формы, например, для парентерального введения, включают, но не ограничиваются ими, фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, наноэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и/или эликсиры. В дополнение к активным ингредиентам, жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно применяемые в настоящем уровне техники, например, такие как вода или другие растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, масло зародышей пшеницы, оливковое, касторовое и кунжутное масло), глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот и сорбитана, а также их смеси. Помимо инертных разбавителей композиции для перорального применения могут дополнительно содержать адъюванты, такие как смачивающие агенты, эмульгаторы и суспендирующие агенты. В некоторых вариантах осуществления для парентерального введения композиции смешивают с солюбилизирующими агентами, такими как CREMAPHOR, спирты, масла, модифицированные масла, гликоли, полисорбаты, циклодекстрины, полимеры и/или их комбинации.
Инъекционные формы, например, стерильные инъецируемые водные или масляные суспензии, могут быть приготовлены в соответствии с известным уровнем техники с использованием подходящих диспергирующих агентов, смачивающих агентов и/или суспендирующих агентов. Стерильные инъекционные формы могут представлять собой стерильные инъекционные растворы, суспензии и/или эмульсии в нетоксичных парентерально приемлемых разбавителях и/или растворителях, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые могут быть использованы, - вода, раствор Рингера, U.S.P. (Фармакопея США), и изотонический раствор хлорида натрия. Стерильные, нелетучие масла традиционно используются в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для данной цели можно использовать любое нелетучее масло со слабовыраженным вкусом, включая синтетические моно- или диглицериды. Жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, могут быть использованы при приготовлении инъекционных растворов. Инъекционные составы можно стерилизовать, например, путем фильтрации через задерживающий бактерии фильтр и/или путем включения стерилизующих агентов в форме стерильных твердых композиций, которые можно растворять или диспергировать в стерильной воде или другой стерильной инъекционной среде непосредственно перед применением.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, включающие по меньшей мере одну мРНК, описанную в данном документе, вводят млекопитающим (например, людям). Хотя описания фармацевтических композиций, представленные в данном документе, в основном направлены на фармацевтические композиции, которые подходят для введения людям, специалисту в данной области техники должно быть понятно, что такие композиции обычно подходят для введения любому другому животному, например, млекопитающему, отличному от человека. Модификация фармацевтических композиций, подходящих для введения людям для того, чтобы сделать композиции, подходящие для введения различным животным, хорошо понятна, и квалифицированный ветеринарный фармаколог может разработать и/или выполнить такую модификацию с помощью обычных, если таковые имеются, экспериментов. Субъекты, которым предполагается введение фармацевтических композиций, включают, но не ограничиваются ими, людей и/или других приматов; млекопитающих, включая коммерчески значимых млекопитающих, таких как крупный рогатый скот, свиньи, лошади, овцы, кошки, собаки, мыши и/или крысы; и/или птиц, включая коммерчески значимых птиц, таких как домашняя птица, куры, утки, гуси и/или индейки. В конкретных вариантах осуществления субъекту предоставляют две или более мРНК, описанные в данном документе. В конкретных вариантах осуществления первую и вторую мРНК предоставляют субъекту одновременно или в разное время, например, последовательно. В конкретных вариантах осуществления первую и вторую мРНК предоставляют субъекту в одной и той же фармацевтической композиции или составе, например, для облегчения поглощения обеих мРНК одними и теми же клетками.
Данное раскрытие также включает наборы, содержащие контейнер, содержащий мРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ.В другом варианте осуществления набор содержит контейнер, содержащий мРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ, а также одну или более дополнительных мРНК, кодирующих один или более представляющих интерес антигенов. В других вариантах осуществления набор содержит первый контейнер, содержащий мРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ, и второй контейнер, содержащий одну или более мРНК, кодирующих один или более представляющих интерес антигенов. В конкретных вариантах осуществления мРНК для усиления иммунного ответа и мРНК, кодирующие антиген(ы), присутствуют в одинаковых или разных наночастицах и/или фармацевтических композициях. В конкретных вариантах осуществления мРНК лиофилизируют, сушат или сушат сублимацией.
Способы усиления иммунных ответов
+
+
lo
Раскрытие обеспечивает способ усиления иммунного ответа на представляющий интерес антиген у субъекта, например, у человека. В одном варианте осуществления способ включает введение субъекту композиции согласно раскрытию (или ее липидной наночастицы, или ее фармацевтической композиции), содержащей по меньшей мере один конструкт мРНК, кодирующий: (i) по меньшей мере один представляющий интерес антиген и (ii) полипептид, который усиливает иммунный ответ против представляющего интерес антигена(ов), так что повышается иммунный ответ на представляющий интерес антиген(ы). В одном варианте осуществления усиление иммунного ответа включает стимуляцию продукции цитокинов. В другом варианте осуществления усиление иммунного ответа включает усиление клеточного иммунитета (Т-клеточных ответов), такое как стимуляция антигенспецифической активности CD8Т-клеток, стимуляция антигенспецифической активности CD4Т-клеток или увеличение процента эффекторных CD62L Т-клеток памяти. В другом варианте осуществления усиление иммунного ответа включает усиление гуморального иммунитета (B-клеточных ответов), такого как стимуляция продукции антигенспецифических антител.
В одном варианте осуществления способа иммуностимуляторная мРНК кодирует полипептид, который стимулирует сигнальный путь интерферона I типа (например, иммуностимулятор кодирует полипептид, такой как STING, IRF3, IRF7 или любой из дополнительных иммуностимуляторов, описанных в данном документе). В другом варианте осуществления способа иммуностимулятор кодирует полипептид, который стимулирует сигнальный путь NFkB, стимулирует воспалительный ответ или стимулирует развитие, активность или мобилизацию дендритных клеток. В одном варианте осуществления способ включает введение субъекту композиции мРНК, которая стимулирует развитие, активность или мобилизацию дендритных клеток, перед введением субъекту композиции мРНК, которая стимулирует сигнальный путь интерферона I типа. Например, композицию мРНК, которая стимулирует развитие или активность дендритных клеток, можно вводить за 1-30 суток, например, за 3 суток, 5 суток, 7 суток, 10 суток, 14 суток, 21 сутки, 28 суток до введения композиции мРНК, что стимулирует сигнальный путь интерферона типа I.
+
+
lo
Усиление иммунного ответа у субъекта против представляющего интерес антигена(ов) с помощью иммуностимулятора согласно раскрытию может быть оценено различными способами, установленными в данной области техники для оценки иммунных ответов, включая, но не ограничиваясь, способы, описанные в Примерах. Например, в различных вариантах осуществления усиление оценивают по уровням внутриклеточного окрашивания (ICS) CD8клеток на ИФН- (или ФНО-α, процентному содержанию селезеночных или периферических CD8bклеток или процентному содержанию селезеночных или периферических эффекторных CD62L клеток памяти.
Сообщалось, что проявление STING-опосредованного сигналинга может варьироваться между различными типами клеток, при этом T-клетки, в частности, демонстрируют более сильный STING ответ по сравнению с другими типами клеток (например, макрофагами и дендритными клетками), наряду с тем, что T-клетки демонстрируют повышенное уровни экспрессии STING (Gulen, MF et al. (2017) Nature Comm. 8(1):427). Таким образом, величина сигналинга STING может приводить к отчетливым эффекторным ответам, что позволяет регулировать и тонко настраивать STING-опосредованные ответы в зависимости от дозы, экспрессии для клеточного типа и/или объединения в совместный препарат с представляющим интерес антигеном (например, соотношение Аг:STING). Данные, описанные в примерах, демонстрируют, что существует широкое терапевтическое окно, в котором STING проявляет эффективность в усилении антигенспецифических иммунных ответов.
Композиции согласно раскрытию вводят субъекту в эффективном количестве. В общем, эффективное количество композиции позволит эффективно продуцировать кодированный полипептид в клетке. Показатели эффективности могут включать трансляцию полипептида (обозначенную посредством экспрессии полипептида), уровень деградации мРНК и показатели иммунного ответа.
Способы индукции иммуногенной клеточной гибели
Изобретение обеспечивает способы индукции иммуногенной клеточной гибели в клетке, например, в клетке млекопитающего. В одном варианте осуществления клетка представляет собой человеческую клетку. В некоторых вариантах осуществления способ индукции иммуногенной клеточной гибели клеток в клетке включает приведение в контакт клетки с мРНК, описанной в данном документе, например, с мРНК, кодирующей полипептид, который индуцирует иммуногенную клеточную гибель, такую как некроптоз или пироптоз. В определенных вариантах осуществления такой способ включает приведение в контакт клетки с выделенной мРНК, кодирующей полипептид, который индуцирует иммуногенную клеточную гибель. В конкретных вариантах осуществления клетку приводят в контакт с композицией липидных наночастиц, содержащей мРНК, кодирующую полипептид, который индуцирует иммуногенную клеточную гибель. При контакте клетки с композицией липидных наночастиц или выделенной мРНК, мРНК может быть захвачена и перенесена в клетку для синтеза полипептида, который индуцирует иммуногенную клеточную гибель. В одном варианте осуществления иммуногенная клеточная гибель характеризуется набуханием клеток, разрывом плазматической мембраны и высвобождением цитозольного содержимого клетки. В одном варианте осуществления иммуногенная клеточная гибель характеризуется высвобождением АТФ и HMGB1 из клетки.
Изобретение, кроме того, обеспечивает способы селективной индукции иммуногенной клеточной гибели в раковых клетках по сравнению с нормальными клетками. В некоторых вариантах осуществления способ селективной индукции иммуногенной клеточной гибели в раковой клетке включает приведение в контакт клетки с мРНК, описанной в данном документе, например, с мРНК, кодирующей полипептид, который индуцирует иммуногенную клеточную гибель, причем мРНК дополнительно содержит регуляторный элемент, который уменьшает экспрессию полипептида в нормальных клетках по сравнению с раковыми клетками. В конкретных вариантах осуществления регуляторный элемент представляет собой сайт связывания для микроРНК, которая имеет более высокую экспрессию в нормальных клетках, чем раковые клетки (например, сайт связывания miR-122), где связывание микроРНК с сайтом связывания ингибирует экспрессию полипептида. В конкретных вариантах осуществления клетку приводят в контакт с композицией наночастиц, содержащей мРНК, содержащую область, кодирующую полипептид, и сайт связывания микроРНК. При контакте клетки с композицией наночастиц или выделенной мРНК, мРНК может быть захвачена и перенесена в клетку для синтеза полипептида. Экспрессия полипептида в раковых клетках выше, чем в нормальных клетках, что приводит к большей индукции иммуногенной клеточной гибели раковых клеток, чем нормальных клеток.
Как правило, стадия приведения в контакт клетки млекопитающего с композицией (например, выделенной мРНК, наночастицей или фармацевтической композицией согласно изобретению) может быть выполнена in vivo, ex vivo, в культуре или in vitro. В иллюстративных вариантах осуществления изобретения стадию приведения в контакт клетки млекопитающего с композицией (например, выделенной мРНК, наночастицей или фармацевтической композицией согласно изобретению) выполняют in vivo или ex vivo. Количество композиции, контактирующей с клеткой, и/или количество мРНК в ней, может зависеть от типа клетки или ткани, с которыми контактируют, способа введения, физико-химических характеристик композиции и мРНК (например, размера, заряда и химического состава) в ней и других факторов. В общем, эффективное количество композиции позволит эффективно продуцировать кодированный полипептид в клетке. Показатели эффективности могут включать трансляцию полипептида (обозначенную посредством экспрессии полипептида), уровень деградации мРНК и показатели иммунного ответа.
Стадия приведения в контакт композиции, содержащей мРНК или выделенную мРНК, с клеткой может включать или вызывать трансфекцию. В некоторых вариантах осуществления фосфолипид, включенный в наночастицу липида, может облегчать трансфекцию и/или повышать эффективность трансфекции, например, путем взаимодействия и/или слияния с клеточной или внутриклеточной мембраной. Трансфекция может обеспечить трансляцию мРНК внутри клетки.

Способность композиции согласно изобретению (например, липидной наночастицы или выделенной мРНК) индуцировать иммуногенную клеточную гибель может быть легко определена, например, путем сравнения способности композиции индуцировать иммуногенную клеточной гибель по сравнению с известными агентами или манипуляциями, которые может вызывать иммуногенную клеточную гибель, включая, но не ограничиваясь: вовлечение рецепторов TNFR, TLR или TCR, повреждение ДНК или вирусную инфекцию. В данной области техники известны различные способы определения того, может ли агент вызывать иммуногенную клеточную гибель, например, красящие вещества и красители (например, CELLTOX™, MITOTRACKER Red, йодид пропидия и YOYO3), анализы жизнеспособности клеток и анализы (например, ИФА), детектирующие высвобождение DAMP («молекулярные структуры, ассоциированные с повреждениями»), включая высвобождение АТФ, HMGB1, ИЛ-1a, мочевой кислоты, фрагментов ДНК и/или содержимого митохондрий.
Профилактические и терапевтические способы
Способы раскрытия для усиления иммунного ответа на представляющий интерес антиген(ы) у субъекта, можно использовать в различных клинических, профилактических или терапевтических применениях. Например, способы можно использовать для стимуляции противоопухолевого иммунитета у субъекта с опухолью или у субъекта с риском развития опухоли (например, потенциально подверженного воздействию онкогенного вируса, такого как HPV). Кроме того, способы можно использовать для стимуляции иммунитета против патогена у субъекта, такого как лечение субъекта, страдающего от патогенной инфекции, или для обеспечения защитного иммунитета субъекту против патогена (например, вакцинация против патогена) до воздействия возбудителя.
Соответственно, в одном аспекте раскрытие относится к способу стимуляции иммуногенного ответа на опухоль или опухолевый антиген у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение субъекту композиции согласно изобретению (или ее липидной наночастицы, или ее фармацевтической композиции), содержащий по меньшей мере один конструкт мРНК, кодирующий: (i) по меньшей мере один представляющий интерес опухолевый антиген и (ii) полипептид, который усиливает иммунный ответ против представляющего интерес опухолевого антигена(ов), так что повышается иммунный ответ на представляющий интерес опухолевый антиген(ы). Подходящие представляющие интерес опухолевые антигены включают описанные в данном документе (например, опухолевые неоантигены, включая мутантные антигены KRAS; антигены онкогенного вируса, включая антигены HPV). В одном варианте осуществления способа субъекту вводят конструкт мутантный антиген-STING мРНК KRAS, кодирующий последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 107-130.
Раскрытие также обеспечивает способы лечения или профилактики рака у субъекта, нуждающегося в этом, которые включают обеспечение или введение по меньшей мере одной композиции мРНК, описанной в данном документе (то есть иммуностимуляторной мРНК и мРНК, кодирующей антиген, в том же или отдельных конструктах мРНК) субъекту. В связанных вариантах осуществления субъекту предоставляют или вводят наночастицу (например, липидную наночастицу), содержащую мРНК. В других связанных вариантах осуществления субъекту предоставляют или вводят фармацевтическую композицию согласно раскрытию субъекту. В конкретных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит мРНК, кодирующую антиген и иммуностимуляторный полипептид, как описано в данном документе, или она содержит наночастицу, содержащую мРНК. В конкретных вариантах осуществления мРНК присутствует(ют) в наночастице, например, в липидной наночастице. В конкретных вариантах осуществления мРНК или наночастица присутствует в фармацевтической композиции.
В определенных вариантах осуществления субъекту, нуждающемуся в этом, был поставлен диагноз рак или считается, что он подвержен риску развития рака. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак печени, колоректальный рак, меланому, рак поджелудочной железы, НМРЛ, рак шейки матки, или рак головы или шеи. В конкретных вариантах осуществления рак печени представляет собой гепатоцеллюлярную карциному. В некоторых вариантах осуществления колоректальный рак представляет собой первичную опухоль или метастазы. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой гематопоэтический рак. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, хронический миеломоноцитарный лейкоз, миелодистрофический синдром (в том числе рефрактерные анемии и рефрактерные цитопении) или миелопролиферативные новообразования или болезни (в том числе истинную полицитемию, эссенциальный тромбоцитоз и первичный миелофиброз). В других вариантах осуществления рак представляет собой рак крови или гематопоэтический рак. В еще других вариантах осуществления рак представляет собой рак, ассоциированный с HPV, такой как рак шейки матки, полового члена, влагалища, вульвы, анального канала и/или ротоглотки.
Селективность в отношении определенного типа рака может быть достигнута путем комбинации использования подходящего состава LNP (например, нацеливания на конкретные типы клеток) в комбинации с соответствующим регуляторным сайтом(ами) (например, микроРНК), встроенным в конструкт мРНК.
В некоторых вариантах осуществления мРНК, наночастицы или фармацевтическую композицию вводят пациенту парентерально. В конкретных вариантах осуществления субъект является млекопитающим, например, человеком. В различных вариантах субъекту предоставляют эффективное количество мРНК.
Способы лечения рака могут дополнительно включать лечение субъекта дополнительными агентами, которые усиливают противоопухолевый ответ у субъекта и/или которые являются цитотоксичными для опухоли (например, химиотерапевтические агенты). Подходящие терапевтические агенты для применения в комбинированной терапии включают низкомолекулярные химиотерапевтические агенты, включая ингибиторы протеинтирозинкиназы, а также биологические противораковые агенты, такие как противораковые антитела, включая, но не ограничиваясь, те, которые обсуждаются ниже. Комбинированная терапия может включать введение субъекту ингибитора иммунной контрольной точки для усиления противоопухолевого иммунитета, такой как ингибиторы PD-1, ингибиторы PD-L1 и ингибиторы CTLA-4. Другие модуляторы иммунных контрольных точек могут быть нацелены на OX-40, OX-40L или ICOS. В одном варианте осуществления агент, который модулирует иммунную контрольную точку, представляет собой антитело. В другом варианте осуществления агент, который модулирует иммунную контрольную точку, представляет собой белок или низкомолекулярный модулятор. В другом варианте осуществления агент (такой как мРНК) кодирует модулятор-антитело иммунной контрольной точки. Неограничивающие примеры ингибиторов иммунной контрольной точки, которые можно использовать в комбинированной терапии, включают пембролизумаб, алемтузумаб, ниволумаб, пидилизумаб, офатумумаб, ритуксимаб, MEDI0680 и PDR001, AMP-224, PF-06801591, BGB-A317, REGN2810, SHR-1210, TSR-042, аффимер, авелумаб (MSB0010718C), атезолизумаб (MPDL3280A), дурвалумаб (MEDI4736), BMS936559, ипилимумаб, тремелимумаб, AGEN1884, MEDI6469 и MOXR0916.
В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает способ профилактики или лечения рака, ассоциированного с HPV, у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение субъекту композиции согласно раскрытию (или ее липидной наночастицы, или ее фармацевтической композиции), содержащей по меньшей мере один конструкт мРНК, кодирующий: (i) по меньшей мере один представляющий интерес антиген HPV и (ii) полипептид, который усиливает иммунный ответ против представляющего интерес антигена(ов) HPV, так что повышается иммунный ответ на представляющий интерес антиген(ы) HPV. В различных вариантах осуществления рак, ассоциированный c HPV представляет собой рак шейки матки, полового члена, влагалища, вульвы, анального канала и/или ротоглотки. В некоторых вариантах осуществления антиген(ы) HPV, кодируемый конструктом(ами) мРНК, представляет собой по меньшей мере один антиген E6, по меньшей мере один антиген E7 или как по меньшей мере один антиген E6, так и по меньшей мере один антиген E7. В одном варианте осуществления антиген(ы) Е6 и/или антиген(ы) Е7 являются растворимыми. В другом варианте осуществления антиген(ы) Е6 и/или антиген(ы) Е7 являются внутриклеточными. В одном варианте осуществления полипептид, который усиливает иммунный ответ против представляющего интерес антигена(ов) HPV, представляет собой полипептид STING (например, конститутивно активный полипептид STING). В одном варианте осуществления антиген(ы) HPV и полипептид STING кодируются на разных мРНК и совместно составляют в липидную наночастицу перед совместным введением субъекту. В другом варианте осуществления антиген(ы) HPV и полипептид STING кодируются на одной и той же мРНК. В одном варианте осуществления композицию, кодирующую антиген(ы) HPV и иммуностимулятор, вводят субъекту, подверженному риску воздействия HPV, чтобы тем самым обеспечить профилактическую защиту от инфекции HPV и развития рака(ов), ассоциированного с HPV. В другом варианте осуществления композицию, кодирующую антиген(ы) HPV и иммуностимулятор, вводят субъекту, инфицированному HPV и/или имеющему рак, ассоциированный с HPV, чтобы тем самым обеспечить терапевтическую активность против HPV посредством усиления иммунного ответа против HPV у субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъекта с раком, ассоциированным с HPV, также лечат ингибитором иммунной контрольной точки (например, анти-CTLA-4, анти-PD-1, анти-PD-L1 или тому подобным) в комбинации с лечением HPV+иммуностимуляторной вакциной.
В другом аспекте раскрытие относится к способу стимуляции иммуногенного ответа на патоген у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение субъекту композиции согласно раскрытию (или ее липидной наночастицы, или ее фармацевтической композиции), содержащей по меньшей мере один конструкт мРНК, кодирующий: (i) по меньшей мере один представляющий интерес антиген патогена и (ii) полипептид, который усиливает иммунный ответ против представляющего интерес антигена(ов) патогена, так что повышается иммунный ответ на представляющий интерес антиген(ы) патогена. В одном варианте осуществления по меньшей мере один антиген патогена относится к патогену, выбранному из группы, состоящей из вирусов, бактерий, простейших, грибов и паразитов.
Подходящие представляющие интерес антигены патогена включают те, которые описаны в данном документе. В одном варианте осуществления антиген(ы) патогена представляет собой вирусный антиген(ы). В одном варианте осуществления антиген(ы) патогена представляет собой антиген вируса папилломы человека (HPV), такой как антиген E6 (например, содержащий аминокислотную последовательность, как приведено в любой из SEQ ID NO: 36-72) или антиген E7 (например, содержащий аминокислотную последовательность, как приведено в любой из SEQ ID NO: 73-94). В одном варианте осуществления антиген(ы) патогена представляет собой бактериальный антиген(ы), такой как поливалентный бактериальный антиген.
В одном варианте осуществления способа стимуляции иммуногенного ответа на патогенный антиген(ы) у субъекта, нуждающегося в этом, конструкт(ы) мРНК, липидную наночастицу или фармацевтическую композицию вводят субъекту парентерально. В одном варианте осуществления мРНК(ы), липидную наночастицу или фармацевтическую композицию вводят при помощи инфузии один раз в неделю.
Фармацевтическая композиция, содержащая одну или более мРНК согласно раскрытию, может быть введена субъекту любым подходящим путем. В некоторых вариантах осуществления композиции согласно раскрытию вводят одним или более различными путями, включая парентеральный (например, подкожной, внутрикожной, внутривенной, внутрибрюшинной, внутримышечной, внутрисуставной, внутриартериальной, интрасиновиальной, интрастернальной, интратекальной, внутриочаговой или внутричерепной инъекции а также с помощью любой подходящей техники инфузии), пероральный, транс- или интрадермальный, интердермальный, ректальный, интравагинальный, местный (например, с помощью порошков, мазей, кремов, гелей, лосьонов и/или капель), мукозальный, назальный, буккальный, энтеральный, витреальный, внутриопухолевый, сублингвальный, интраназальный; путем интратрахеальной инстилляции, бронхиальной инстилляции и/или ингаляции; в виде орального спрея и/или порошка, назального спрея и/или аэрозоля, и/или через катетер для воротной вены. В некоторых вариантах осуществления композицию можно вводить внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, внутриартериально, внутриопухолево, подкожно или путем ингаляции. В некоторых вариантах композицию вводят внутримышечно. Однако данное раскрытие охватывает доставку композиций согласно раскрытию любым подходящим способом, принимая во внимание вероятные достижения в области доставки лекарств. В общем, наиболее подходящий путь введения будет зависеть от множества факторов, включая природу фармацевтической композиции, содержащей одну или более мРНК (например, ее стабильность в различных средах организма, таких как кровоток и желудочно-кишечный тракт), и состояние пациента (например, способен ли пациент переносить определенные пути введения).
В определенных вариантах осуществления композиции согласно раскрытию могут вводиться в дозах, достаточных для доставки от около 0,0001 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 0,001 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 0,005 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 0,01 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 0,1 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 1 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 2 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 5 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 0,0001 мг/кг до около 5 мг/кг, от около 0,001 мг/кг до около 5 мг/кг, от около 0,005 мг/кг до около 5 мг/кг, от около 0,01 мг/кг до около 5 мг/кг, от около 0,1 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 1 мг/кг до около 5 мг/кг, от около 2 мг/кг до около 5 мг/кг, от около 0,0001 мг/кг до около 1 мг/кг, от около 0,001 мг/кг до около 1 мг/кг, от около 0,005 мг/кг до около 1 мг/кг, от около 0,01 мг/кг до около 1 мг/кг, или от около 0,1 мг/кг до около 1 мг/кг в данной дозе, причем доза в 1 мг/кг обеспечивает 1 мг мРНК или наночастиц на 1 кг массы тела субъекта. В конкретных вариантах осуществления может быть введена доза от около 0,005 мг/кг до около 5 мг/кг мРНК или наночастиц согласно раскрытию.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно раскрытию, содержащая как конструкт иммуностимуляторной РНК (например, конструкт STING), так и конструкт антигена (например, конструкт вакцины), составлена так, что она оптимизирована как функция от фиксированной дозы иммуностимуляторного конструкта. Неограничивающие примеры фиксированной дозы иммуностимуляторного конструкта включают 0,001 мг/кг, 0,005 мг/кг, 0.01 мг/кг, 0,05 мг/кг, 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг, 10 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 10 мг/кг, от 0,001 мг/кг до 10 мг/кг, от 0,005 мг/кг до 10 мг/кг, от 0,01 мг/кг до 10 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг, от 1 мг/кг до 10 мг/кг, от 2 мг/кг до 10 мг/кг, от 5 мг/кг до 10 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 5 мг/кг, от 0,001 мг/кг до 5 мг/кг, от 0,005 мг/кг до 5 мг/кг, от 0,01 мг/кг до 5 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг, от 1 мг/кг до 5 мг/кг, от 2 мг/кг до 5 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 1 мг/кг, от 0,001 мг/кг до 1 мг/кг, от 0,005 мг/кг до 1 мг/кг, от 0,01 мг/кг до 1 мг/кг, или от 0,1 мг/кг до 1 мг/кг в данной дозе, причем доза в 1 мг/кг обеспечивает 1 мг мРНК на 1 кг массы тела субъекта.
В другом варианте осуществления композиция согласно раскрытию, содержащая как конструкт иммуностимуляторной РНК (например, конструкт STING), так и конструкт антигена (например, конструкт вакцины), составлена так, что она оптимизирована как функция от фиксированной дозы конструкта антигена. Неограничивающие примеры фиксированной дозы конструкта антигена включают 0,001 мг/кг, 0,005 мг/кг, 0.01 мг/кг, 0.05 мг/кг, 0.1 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг, 10 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 10 мг/кг, от 0,001 мг/кг до 10 мг/кг, от 0,005 мг/кг до 10 мг/кг, от 0,01 мг/кг до 10 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг, от 1 мг/кг до 10 мг/кг, от 2 мг/кг до 10 мг/кг, от 5 мг/кг до 10 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 5 мг/кг, от 0,001 мг/кг до 5 мг/кг, от 0,005 мг/кг до 5 мг/кг, от 0,01 мг/кг до 5 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг, от 1 мг/кг до 5 мг/кг, от 2 мг/кг до 5 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 1 мг/кг, от 0,001 мг/кг до 1 мг/кг, от 0,005 мг/кг до 1 мг/кг, от 0,01 мг/кг до 1 мг/кг, или от 0,1 мг/кг до 1 мг/кг в данной дозе, причем доза в 1 мг/кг обеспечивает 1 мг мРНК на 1 кг массы тела субъекта.
В некоторых вариантах осуществления доза полинуклеотида РНК (полинуклеотид иммуностимуляторной РНК, полинуклеотида РНК, кодирующей антиген, или обоих) в иммуномодулирующей терапевтической композиции составляет 1-5 мкг, 5-10 мкг, 10-15 мкг, 15-20 мкг, 10-25 мкг, 20-25 мкг, 20-50 мкг, 30-50 мкг, 40-50 мкг, 40-60 мкг, 60-80 мкг, 60-100 мкг, 50-100 мкг, 80-120 мкг, 40-120 мкг, 40-150 мкг, 50-150 мкг, 50-200 мкг, 80-200 мкг, 100-200 мкг, 100-300 мкг, 120-250 мкг, 150-250 мкг, 180-280 мкг, 200-300 мкг, 30-300 мкг, 50-300 мкг, 80-300 мкг, 100-300 мкг, 40-300 мкг, 50-350 мкг, 100-350 мкг, 200-350 мкг, 300-350 мкг, 320-400 мкг, 40-380 мкг, 40-100 мкг, 100-400 мкг, 200-400 мкг, или 300-400 мкг на дозу. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующую терапевтическую композицию вводят субъекту путем внутрикожной или внутримышечной инъекции. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующую терапевтическую композицию вводят субъекту в нулевые сутки. В некоторых вариантах осуществления вторую дозу иммуномодулирующей терапевтической композиции вводят субъекту на седьмые сутки или четырнадцатые сутки или двадцать первые сутки.
В некоторых вариантах осуществления дозу 25 микрограммов полинуклеотида РНК включают в иммуномодулирующую терапевтическую композицию, вводимую субъекту. В некоторых вариантах осуществления дозу 10 микрограммов полинуклеотида РНК включают в иммуномодулирующую терапевтическую композицию, вводимую субъекту. В некоторых вариантах осуществления дозу 30 микрограммов полинуклеотида РНК включают в иммуномодулирующую терапевтическую композицию, вводимую субъекту. В некоторых вариантах осуществления дозу 100 микрограммов полинуклеотида РНК включают в иммуномодулирующую терапевтическую композицию, вводимую субъекту. В некоторых вариантах осуществления дозу 50 микрограммов полинуклеотида РНК включают в иммуномодулирующую терапевтическую композицию, вводимую субъекту. В некоторых вариантах осуществления дозу 75 микрограммов полинуклеотида РНК включают в иммуномодулирующую терапевтическую композицию, вводимую субъекту. В некоторых вариантах осуществления дозу 150 микрограммов полинуклеотида РНК включают в иммуномодулирующую терапевтическую композицию, вводимую субъекту. В некоторых вариантах осуществления дозу 400 микрограммов полинуклеотида РНК включают в иммуномодулирующую терапевтическую композицию, вводимую субъекту. В некоторых вариантах осуществления дозу 300 микрограммов полинуклеотида РНК включают в иммуномодулирующую терапевтическую композицию, вводимую субъекту. В некоторых вариантах осуществления дозу 200 микрограммов полинуклеотида РНК включают в иммуномодулирующую терапевтическую композицию, вводимую субъекту. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид РНК накапливается в 100 раз более высоком уровне в региональном лимфатическом узле по сравнению с периферическим лимфатическим узлом. В других вариантах осуществления иммуномодулирующая терапевтическая композиция является химически модифицированной, а в других вариантах осуществления иммуномодулирующая терапевтическая композиция не является химически модифицированной.
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество представляет собой общую дозу 1-100 мкг.В некоторых вариантах осуществления эффективное количество представляет собой общую дозу 100 мкг.В некоторых вариантах осуществления эффективное количество представляет собой дозу 25 мкг, вводимую субъекту всего один или два раза. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество представляет собой дозу 100 мкг, вводимую субъекту всего два раза. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество представляет собой дозу 1 мкг - 10 мкг, 1 мкг - 20 мкг, 1 мкг - 30 мкг, 5 мкг - 10 мкг, 5 мкг - 20 мкг, 5 мкг - 30 мкг, 5 мкг - 40 мкг, 5 мкг - 50 мкг, 10 мкг - 15 мкг, 10 мкг - 20 мкг, 10 мкг - 25 мкг, 10 мкг - 30 мкг, 10 мкг - 40 мкг, 10 мкг - 50 мкг, 10 мкг - 60 мкг, 15 мкг - 20 мкг, 15 мкг - 25 мкг, 15 мкг - 30 мкг, 15 мкг - 40 мкг, 15 мкг - 50 мкг, 20 мкг - 25 мкг, 20 мкг - 30 мкг, 20 мкг - 40 мкг 20 мкг - 50 мкг, 20 мкг - 60 мкг, 20 мкг - 70 мкг, 20 мкг - 75 мкг, 30 мкг - 35 мкг, 30 мкг - 40 мкг, 30 мкг - 45 мкг, 30 мкг - 50 мкг, 30 мкг - 60 мкг, 30 мкг - 70 мкг, 30 мкг - 75 мкг, которые могут быть введены субъекту всего один или два раза, или более.
Дозу могут вводить один или более раз в сутки в том же или другом количестве для достижения желаемого уровня экспрессии мРНК и/или эффекта (например, терапевтического эффекта). Желаемую дозу можно доставлять, например, три раза в сутки, два раза в сутки, один раз в сутки, через сутки, каждые третьи сутки, каждую неделю, каждые две недели, каждые три недели или каждые четыре недели. В некоторых вариантах осуществления желаемая доза может быть доставлена с использованием нескольких способов введения (например, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати, двенадцати, тринадцати, четырнадцати или более введений). Например, в определенных вариантах осуществления композицию согласно раскрытию, содержащую как конструкт иммуностимуляторной мРНК (например, конструкт STING), так и конструкт антигена (например, конструкт вакцины), вводят по меньшей мере два раза, при этом вторую дозу вводят через по меньшей мере одни сутки или по меньшей мере 3 суток, или по меньшей мере 7 суток, или по меньшей мере 10 суток, или по меньшей мере 14 суток, или по меньшей мере 21 сутки, или по меньшей мере 28 суток, или по меньшей мере 35 суток, или по меньшей мере 42 сутки или по меньшей мере 48 суток после введения первой дозы. В некоторых вариантах осуществления первую и вторую дозу вводят на 0-е и 2-е сутки, соответственно, или на 0-е и 7-е сутки, соответственно, или на 0-е и 14-е сутки, соответственно, или на 0-е и 21-е сутки, соответственно, или на 0-е и 48-е сутки, соответственно. Дополнительные дозы (то есть третьи дозы, четвертые дозы и т.д.) можно вводить по той же или другой схеме, по которой вводили первые две дозы. Например, в некоторых вариантах осуществления первую и вторую дозы вводят с интервалом в 7 суток, а затем после этого одну или более дополнительных доз вводят еженедельно. В другом варианте осуществления первую и вторую дозу вводят с интервалом в 7 суток, а затем после этого одну или более дополнительных доз вводят каждые две недели.
В некоторых вариантах осуществления однократную дозу можно вводить, например, до или после хирургической процедуры или в случае острого заболевания, расстройства или патологического состояния. Конкретный терапевтически эффективный, профилактически эффективный или иным образом подходящий уровень дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая степень тяжести и идентификацию подлежащего лечению расстройства, если таковое имеется; одну или более используемых мРНК; конкретную применяемую композицию; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион пациента; время введения, путь введения и скорость выведения конкретной применяемой фармацевтической композиции; продолжительность лечения; препараты, применяемые в комбинации или совмещающиеся с конкретной применяемой фармацевтической композицией; и подобные факторы, хорошо известные в области медицины.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию согласно раскрытию можно вводить в комбинации с другим агентом, например, другим терапевтическим агентом, профилактическим агентом и/или диагностическим агентом. Под «в комбинации с» не подразумевается, что агенты должны вводить одновременно и/или составлять для совместной доставки, хотя эти способы доставки находятся в объеме данного раскрытия. Например, одну или более композиций, содержащих одну или более разных мРНК, можно вводить в комбинации. Композиции можно вводить одновременно, до или после одной или более других необходимых терапевтических средств или медицинских процедур. Каждый дополнительный фармацевтический агент можно вводить в дозе и/или по схеме, определенной для данного фармацевтического агента. В некоторых вариантах осуществления данное раскрытие охватывает доставку композиций согласно раскрытию или их композиций для визуализации, диагностики или профилактики в комбинации с агентами, которые улучшают их биодоступность, уменьшают и/или модифицируют их метаболизм, ингибируют их выведение и/или модифицируют их распределение в организме.
Иллюстративные терапевтические агенты, которые можно вводить в комбинации с композициями согласно раскрытию, включают, но не ограничиваются ими, цитотоксические, химиотерапевтические и другие терапевтические агенты. Цитотоксические агенты могут включать, например, таксол, цитохалазин В, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенипозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, пуромицин, майтанзиноиды, рахелмицин и их аналоги. Радиоактивные ионы также могут быть использованы в качестве терапевтических агентов и могут включать, например, радиоактивный йод, стронций, фосфор, палладий, цезий, иридий, кобальт, иттрий, самарий и празеодим. Другие терапевтические агенты могут включать, например, антиметаболиты (например, метотрексат, 6 меркаптопурин, 6 тиогуанин, цитарабин, и 5фторурацил, и декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотепа, хлорамбуцил, рахелмицин, мелфалан, кармустин, ломустин, циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин C, и цис-дихлородиамминплатина (II) (DDP), и цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин, блеомицин, митрамицин и антрамицин), и антимитотические агенты (например, винкристин, винбластин, таксол и майтанзиноиды).
Конкретная комбинация методов лечения (терапевтических средств или процедур) для применения в комбинированном режиме будет учитывать совместимость необходимых терапевтических средств и/или процедур и желаемого терапевтического эффекта, который должен быть достигнут.Также должно быть понятно, что применяемые методы лечения могут достигать желаемого эффекта при том же расстройстве (например, композиция, полезная для лечения рака, может вводиться одновременно с химиотерапевтическим средством), или они могут достигать различных эффектов (например, контроль любых нежелательных явлений).
Ингибиторы иммунных контрольных точек, такие как пембролизумаб или ниволумаб, которые нацелены на взаимодействие между рецептором программируемой смерти 1/лигандом 1 белка программируемой смерти (PD-1/PD-L1) и PD-L2, недавно были одобрены для лечения различных злокачественных новообразований и в настоящее время исследуется в клинических испытаниях в отношении различных онкологических заболеваний, включая меланому, плоскоклеточный рак головы и шеи (HNSCC).
Соответственно, один аспект раскрытия относится к комбинированной терапии, в которой субъекта предварительно лечат антагонистом PD-1 до введения липидной наночастицы или композиции согласно данному раскрытию. В другом аспекте субъекта лечили моноклональным антителом, которое связывается с PD-1, до введения липидной наночастицы или композиции согласно данному раскрытию. В другом аспекте субъекту вводили липидную наночастицу или композицию согласно раскрытию до проведения терапии моноклональными анти-PD-1 антителами. В некоторых аспектах терапия моноклональными анти-PD-1 антителами включает ниволумаб, пембролизумаб, пидилизумаб или любую их комбинацию.
В другом аспекте субъекта лечили моноклональным антителом, которое связывается с PD-L1, до введения липидной наночастицы или композиции согласно данному раскрытию. В другом аспекте субъекту вводят липидную наночастицу или композицию до проведения терапии моноклональными анти-PD-L1 антителами. В некоторых аспектах терапия моноклональными анти-PD-L1 антителами включает дурвалумаб, авелумаб, MEDI473, BMS-936559, азолизумаб или любую их комбинацию.
В некоторых аспектах субъект лечился антагонистом CTLA-4 до лечения композициями согласно данному раскрытию. В другом аспекте субъекта предварительно лечили моноклональным антителом, которое связывается с CTLA-4, до введения липидной наночастицы или композиции согласно данному раскрытию. В некоторых аспектах субъекту вводили липидную наночастицу или композицию перед лечением моноклональным анти-CTLA-4 антителом. В некоторых аспектах терапия анти-CTLA-4 антителами включает ипилимумаб или тремелимумаб.
В любом из вышеизложенных или связанных аспектов раскрытие обеспечивает липидную наночастицу и необязательный фармацевтически приемлемый носитель или фармацевтическую композицию для применения в лечении или задержке прогрессирования рака у индивидуума, причем лечение включает введение композиции в комбинации со второй композицией, при этом вторая композиция содержит полипептид-ингибитор контрольной точки и необязательный фармацевтически приемлемый носитель.
В любом из вышеизложенных или связанных аспектов раскрытие обеспечивает использование липидной наночастицы и необязательного фармацевтически приемлемого носителя при изготовлении лекарственного средства для лечения или задержки прогрессирования рака у индивидуума, причем лекарственное средство содержит липидную наночастицу и необязательный фармацевтически приемлемый носитель, и при этом лечение включает введение лекарственного средства в комбинации с композицией, содержащей полипептид-ингибитор контрольной точки и необязательный фармацевтически приемлемый носитель.
В любом из вышеизложенных или связанных аспектов раскрытие обеспечивает набор, содержащий контейнер, содержащий липидную наночастицу и необязательный фармацевтически приемлемый носитель или фармацевтическую композицию, и листок-вкладыш, содержащий инструкции по введению липидной наночастицы или фармацевтической композиции для лечения или задержки прогрессирования рака у индивидуума. В некоторых аспектах листок-вкладыш дополнительно содержит инструкции по введению липидной наночастицы или фармацевтической композиции в комбинации с композицией, содержащей полипептид-ингибитор контрольных точек и необязательный фармацевтически приемлемый носитель для лечения или задержки прогрессирования рака у индивидуума.
В любом из вышеизложенных или связанных аспектов раскрытие обеспечивает набор, содержащий лекарственное средство, содержащее липидную наночастицу и необязательный фармацевтически приемлемый носитель, или фармацевтическую композицию и листок-вкладыш, содержащий инструкции по введению лекарственного средства отдельно или в комбинации с композицией, содержащей полипептид-ингибитор контрольных точек и необязательный фармацевтически приемлемый носитель для лечения или задержки прогрессирования рака у индивидуума. В некоторых аспектах набор дополнительно содержит листок-вкладыш, содержащий инструкции по введению первого лекарственного средства до, во время или после введения второго лекарственного средства для лечения или задержки прогрессирования рака у индивидуума.
В любом из вышеупомянутых или связанных аспектов раскрытие обеспечивает липидную наночастицу, композицию или их применение, или набор, содержащий липидную наночастицу или композицию, как описано в данном документе, при этом полипептид-ингибитор контрольных точек ингибирует PD1, PD-L1, CTLA4 или их комбинацию. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой антитело. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой антитело, выбранное из анти-CTLA4 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывает CTLA4, анти-PD1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывает PD1, анти-PD-L1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывает PD-L1, и их комбинацию. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой анти-PD-L1 антитело, выбранное из атезолизумаба, авелумаба или дурвалумаба. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой анти-CTLA-4 антитело, выбранное из тремелимумаба или ипилимумаба. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой анти-PD1 антитело, выбранное из ниволумаба или пембролизумаба.
В связанных аспектах раскрытие обеспечивает способ снижения или уменьшения размера опухоли, или ингибирования роста опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту любой из вышеуказанных или связанных липидных наночастиц согласно раскрытию, или любой из вышеизложенных или связанных композиций согласно раскрытию.
В связанных аспектах раскрытие обеспечивает способ индукции противоопухолевого ответа у субъекта, страдающего раком, включающий введение субъекту любой из вышеуказанных или связанных липидных наночастиц согласно раскрытию, или любой из вышеупомянутых или связанных композиций согласно раскрытию. В некоторых аспектах противоопухолевый ответ включает Т-клеточный ответ.В некоторых аспектах Т-клеточный ответ включает CD8+Т-клетки.
В некоторых аспектах вышеупомянутых способов способ дополнительно включает введение второй композиции, содержащей полипептид-ингибитор контрольной точки и необязательный фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольных точек ингибирует PD1, PD-L1, CTLA4 или их комбинацию. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой антитело. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой антитело, выбранное из анти-CTLA4 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывает CTLA4, анти-PD1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывает PD1, анти-PD-L1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывает PD-L1, и их комбинацию. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой анти-PD-L1 антитело, выбранное из атезолизумаба, авелумаба или дурвалумаба. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой анти-CTLA-4 антитело, выбранное из тремелимумаба или ипилимумаба. В некоторых аспектах полипептид-ингибитор контрольной точки представляет собой анти-PD1 антитело, выбранное из ниволумаба или пембролизумаба.
В некоторых аспектах любого из вышеуказанных или связанных способов композицию, содержащую полипептид-ингибитор контрольной точки, вводят при помощи внутривенной инъекции. В некоторых аспектах композицию, содержащую полипептид-ингибитор контрольной точки, вводят один раз каждые 2-3 недели. В некоторых аспектах композицию, содержащую полипептид-ингибитор контрольной точки, вводят один раз каждые 2 недели или один раз каждые 3 недели. В некоторых аспектах композицию, содержащую полипептид-ингибитор контрольной точки, вводят до, одновременно или после введения липидной наночастицы или ее фармацевтической композиции.
В любом из вышеупомянутых или связанных аспектов раскрытие обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую липидную наночастицу и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых аспектах фармацевтическую композицию составляют для внутримышечной доставки.
Терапевтические способы индукции иммуногенной клеточной гибели
Изобретение обеспечивает способ стимуляции иммуногенного ответа на опухоль у субъекта, нуждающегося в этом, например, у человека. В одном варианте осуществления способ включает введение субъекту эффективного количества мРНК согласно изобретению, кодирующей полипептид, который индуцирует иммуногенную клеточную гибель таким образом, что у субъекта стимулируется иммуногенный ответ на опухоль. В другом варианте осуществления способ включает введение субъекту эффективного количества липидной наночастицы согласно изобретению, содержащей мРНК, кодирующую полипептид, который вызывает иммуногенную клеточную гибель таким образом, что у субъекта стимулируется иммуногенный ответ на опухоль. В еще одном варианте осуществления способ включает введение субъекту фармацевтической композиции согласно изобретению (например, содержащей мРНК или липидную наночастицу согласно изобретению) таким образом, что у субъекта стимулируется иммуногенный ответ на опухоль.
В различных вариантах осуществления способ может включать введение субъекту одного или более дополнительных агентов, которые стимулируют воспалительную и/или иммунную реакцию и/или регулируют иммунореактивность, чтобы тем самым дополнительно стимулировать или усиливать иммуногенный ответ на опухоль у субъекта. Подходящие типы агентов для применения в качестве дополнительных агентов описаны выше. В одном варианте субъекту вводят один дополнительный агент.В другом варианте субъекту вводят два дополнительных агента, причем эти дополнительные агенты отличаются друг от друга. В еще одном варианте осуществления субъекту вводят три дополнительных агента, причем эти дополнительные агенты отличаются друг от друга.
В одном варианте осуществления способ дополнительно включает введение субъекту по меньшей мере одного агента, который потенцирует иммунный ответ, например, индуцирует адаптивный иммунитет (например, стимулируя продукцию интерферона типа I), стимулирует воспалительный ответ, стимулирует сигналинг NFkB и/или стимулирует мобилизацию дендритных клеток (ДК). В одном варианте осуществления способ дополнительно включает введение субъекту по меньшей мере одного агента, который индуцирует адаптивный иммунитет.В одном варианте осуществления агент, который индуцирует адаптивный иммунитет, представляет собой интерферон типа I (например, фармацевтическая композиция, содержащая интерферон типа I). В другом варианте осуществления агент, который индуцирует адаптивный иммунитет, стимулирует интерферон типа I. Неограничивающие примеры агентов (например, конструктов мРНК), которые стимулируют адаптивный иммунитет, включают STING, IRF1, IRF3, IRF5, IRF6, IRF7 и IRF8. В другом варианте осуществления агент стимулирует воспалительный ответ.Неограничивающие примеры агентов (например, конструктов мРНК), которые стимулируют воспалительный ответ, включают STAT1, STAT2, STAT4, STAT6, NFAT и C/EBPb. В другом варианте осуществления агент стимулирует сигналинг NFκB. Неограничивающие примеры агентов (например, конструктов мРНК), которые стимулируют сигналинг NFκB, включают IKKβ, c-FLIP, RIPK1, ИЛ-27, ApoF и PLP. В другом варианте агент стимулирует мобилизацию ДК. Неограничивающим примером агента, который стимулирует мобилизацию ДК, является FLT3. В еще одном варианте осуществления агент, который потенцирует иммунные ответы, представляет собой DIABLO (SMAC/DIABLO) (например, конструкты мРНК DIABLO).
В другом варианте осуществления способ дополнительно включает введение субъекту по меньшей мере одного агента, который индуцирует активацию или примирование Т-клеток. В одном варианте осуществления агент, который индуцирует активацию или примирование Т-клеток, представляет собой цитокин или хемокин. Неограничивающие примеры цитокинов или хемокинов, которые индуцируют активацию или примирование Т-клеток, включают ИЛ-12, ИЛ-36 гамма, CCL2, CCL4, CCL20 и CCL21. В одном варианте осуществления агент, который индуцирует активацию или примирование Т-клеток, представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую ИЛ-12, ИЛ-36 гамма, CCL2, CCL4, CCL20 или CCL21. В другом варианте осуществления агент, который индуцирует активацию или примирование Т-клеток, представляет собой агент (например, конструкт мРНК), который кодирует ИЛ-12, ИЛ-36 гамма, CCL2, CCL4, CCL20 или CCL21. В еще одном варианте осуществления агент представляет собой конструкт мРНК, кодирующий полипептид, который индуцирует хемокин или цитокин (например, индуцирует ИЛ-12, ИЛ-36 гамма, CCL2, CCL4, CCL20 или CCL21).
В другом варианте осуществления способ дополнительно включает введение субъекту по меньшей мере одного агента, который модулирует иммунную контрольную точку. В одном варианте осуществления агент, который модулирует иммунную контрольную точку, представляет собой антитело. В другом варианте осуществления агент, который модулирует иммунную контрольную точку, представляет собой агент (например, конструкт мРНК), который кодирует антитело. В одном варианте осуществления агент, который модулирует иммунную контрольную точку, представляет собой ингибитор CTLA-4, неограничивающие примеры которого включают ипилимумаб, тремелимумаб и AGEN1884. В другом варианте осуществления агент, который модулирует иммунную контрольную точку, представляет собой ингибитор PD-1, неограничивающие примеры которого включают пембролизумаб, алемтузумаб, атезолизумаб, ниволумаб, ипилимумаб, пидилизумаб, офатумумаб, ритуксимаб, MEDI0680 и PDR001, AMP-224, PF -06801591, BGB-A317, REGN2810, SHR-1210, TSR-042, авелумаб, дурвалумаб и аффимер. В другом варианте осуществления агент, который модулирует иммунную контрольную точку, представляет собой ингибитор PD-L1, неограничивающие примеры которого включают атезолизумаб, авелумаб, дурвалумаб и BMS936559. В еще одном варианте осуществления агент, который модулирует иммунную контрольную точку, модулирует активность OX-40 или OX-40L, неограничивающие примеры которого включают Fc-OX-40L, MEDI6469 (агонистическое анти-OX40 антитело) и MOXR0916 (агонистическое анти-ОХ40 антитело). В еще одном варианте осуществления агент, который модулирует иммунную контрольную точку, модулирует активность ICOS (например, агонисты пути ICOS).
В одном варианте осуществления в дополнение к введению мРНК, кодирующей полипептид, который индуцирует иммуногенную клеточную гибель, способ дополнительно включает введение: (i) по меньшей мере одного агента, который потенцирует иммунный ответ (например, индуцирует адаптивный иммунитет, стимулирует интерферон типа I, стимулирует воспалительный ответ, стимулирует сигналинг NFκB и/или стимулирует мобилизацию ДК); и (ii) по меньшей мере одного агента, которого индуцирует активацию или примирование Т-клеток. В другом варианте осуществления способ дополнительно включает введение: (i) по меньшей мере одного агента, который потенцирует иммунный ответ (например, индуцирует адаптивный иммунитет, стимулирует интерферон типа I, стимулирует воспалительный ответ, стимулирует сигналинг NFκB и/или стимулирует мобилизацию ДК); и (ii) по меньшей мере один агент, который модулирует иммунную контрольную точку. В другом варианте осуществления способ дополнительно включает введение: (i) по меньшей мере один агент, который индуцирует активацию или примирование Т-клеток; и (ii) по меньшей мере один агент, который модулирует иммунную контрольную точку. В еще одном варианте осуществления способ дополнительно включает введение субъекту: (i) по меньшей мере одного агента, который потенцирует иммунный ответ (например, индуцирует адаптивный иммунитет, стимулирует интерферон типа I, стимулирует воспалительный ответ, стимулирует сигналинг NFκB и/или стимулирует мобилизацию ДК); (ii) по меньшей мере одного агента, которого индуцирует активацию или примирование Т-клеток и (iii) по меньшей мере одного агента, который модулирует иммунную контрольную точку.
В одном варианте осуществления способа стимуляции иммуногенного ответа на опухоль у субъекта, нуждающегося в этом, конструкт мРНК, липидную наночастицу или фармацевтическую композицию вводят субъекту парентерально. В одном варианте осуществления мРНК, липидную наночастицу или фармацевтическую композицию вводят при помощи инфузии один раз в неделю. В одном варианте осуществления опухоль представляет собой клетку рака печени, колоректального рака или меланомы.
В другом аспекте изобретение обеспечивает способ стимуляции иммуногенного ответа на опухоль у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение субъекту эффективного количества:
(i) первой химически модифицированной матричной РНК (ммРНК), кодирующей полипептид, который индуцирует иммуногенную клеточную гибель, причем указанная первая ммРНК содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований;
и по меньшей мере одной из:
(ii) второй ммРНК, кодирующей полипептид, который усиливает иммунный ответ (например, индуцирует адаптивный иммунитет, стимулирует интерферон типа I, стимулирует воспалительный ответ, стимулирует сигналинг NFκB и/или стимулирует мобилизацию ДК); при этом указанная вторая ммРНК содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований;
(iii) третьей ммРНК, кодирующей полипептид, который индуцирует активацию или примирование Т-клеток, причем указанная третья ммРНК содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований; и/или
(iv) четвертой ммРНК, кодирующей полипептид, который модулирует иммунную контрольную точку, при этом указанная четвертая ммРНК содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований,
так что у субъекта формируется иммуногенный ответ на опухоль.
Первая ммРНК, вторая ммРНК, третья ммРНК и/или четвертая ммРНК могут присутствовать в той же фармацевтической композиции или липидной наночастице, которые вводятся субъекту. Альтернативно, первая ммРНК, вторая ммРНК, третья ммРНК и/или четвертая ммРНК могут присутствовать в различных фармацевтических композициях или липидных наночастицах, которые вводят субъекту.
В одном варианте осуществления первую ммРНК и вторую ммРНК вводят субъекту. В другом варианте осуществления первую ммРНК и третью ммРНК вводят субъекту. В другом варианте осуществления первую ммРНК и четвертую ммРНК вводят субъекту. В другом варианте осуществления первую ммРНК, вторую ммРНК и третью ммРНК вводят субъекту. В другом варианте осуществления первую ммРНК, вторую ммРНК и четвертую ммРНК вводят субъекту. В другом варианте осуществления первую ммРНК, третью ммРНК и четвертую ммРНК вводят субъекту. В другом варианте осуществления первую ммРНК, вторую, третью ммРНК вводят субъекту.
В одном варианте осуществления полипептид, кодируемый первой ммРНК, выбирают из группы, состоящей из MLKL, RIPK3, RIPK1, DIABLO, FADD, GSDMD, каспазы-4, каспазы-5, каспазы-11, NLRP3, ASC/CARD и пирина. В одном варианте осуществления полипептид, кодируемый второй ммРНК, выбирают из группы, состоящей из DIABLO, STING, IRF1, IRF3, IRF5, IRF6, IRF7, IRF8, STAT1, STAT2, STAT4, STAT6, NFAT, C/EBPb, IKKβ, c-FLIP, RIPK1, ИЛ-27, ApoF, PLP и FLT3. В одном варианте осуществления полипептид, кодируемый второй ммРНК, выбирают из группы, состоящей из DIABLO, STING, IRF3, IRF7, STAT6, IKKβ, c-FLIP и RIPK1. В одном варианте осуществления полипептид, кодируемый третьей ммРНК, выбирают из группы, состоящей из ИЛ-12, ИЛ-36 гамма, CCL2, CCL4, CCL20 и CCL21. В одном варианте осуществления полипептид, кодируемый четвертой ммРНК, выбирают из группы, состоящей из ингибиторов PD-1, ингибиторов PD-L1, ингибиторов CTLA-4, агонистов OX-40, агонистов пути OX-40L и ICOS.
Изобретение также обеспечивает способы лечения или профилактики рака у субъекта, нуждающегося в этом, которые включают предоставление или введение субъекту мРНК, кодирующей полипептид, описанный в данном документе. В связанных вариантах осуществления субъекту предоставляют или вводят наночастицу (например, липидную наночастицу), содержащую мРНК. В других связанных вариантах осуществления субъекту предоставляют или вводят фармацевтическую композицию согласно изобретению субъекту. В конкретных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит мРНК, кодирующую полипептид, описанный в данном документе, или она содержит наночастицу, содержащую мРНК. В конкретных вариантах осуществления мРНК присутствует в наночастице, например, в липидной наночастице. В конкретных вариантах осуществления мРНК или наночастица присутствует в фармацевтической композиции. В определенных вариантах осуществления субъекту, нуждающемуся в этом, был поставлен диагноз рак или считается, что он подвержен риску развития рака. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак печени, колоректальный рак или меланому. В конкретных вариантах осуществления рак печени представляет собой гепатоцеллюлярную карциному. В некоторых вариантах осуществления колоректальный рак представляет собой первичную опухоль или метастазы. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой гематопоэтический рак. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, хронический миеломоноцитарный лейкоз, миелодистрофический синдром (в том числе рефрактерные анемии и рефрактерные цитопении) или миелопролиферативные новообразования или болезни (в том числе истинную полицитемию, эссенциальный тромбоцитоз и первичный миелофиброз). В других вариантах осуществления рак представляет собой рак крови или гематопоэтический рак. Селективность в отношении определенного типа рака может быть достигнута путем комбинации использования подходящего состава LNP (например, нацеливания на конкретные типы клеток) в комбинации с соответствующим регуляторным сайтом(ами) (например, микроРНК), встроенным в конструкт мРНК.
В некоторых вариантах осуществления мРНК, наночастицу или фармацевтическую композицию вводят пациенту парентерально. В конкретных вариантах осуществления субъект является млекопитающим, например, человеком. В различных вариантах субъекту предоставляют эффективное количество мРНК.
Изобретение дополнительно обеспечивает способы лечения или профилактики рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающие обеспечение субъекта эффективным количеством мРНК, описанной в данном документе, например мРНК, кодирующей полипептид, который индуцирует иммуногенную клеточную гибель, при этом мРНК дополнительно содержит регуляторный элемент, который усиливает экспрессию полипептида в раковых клетках по сравнению с нормальными клетками. В конкретных вариантах осуществления регуляторный элемент представляет собой сайт связывания для микроРНК, которая имеет более высокую экспрессию в нормальных клетках, чем раковые клетки (например, сайт связывания miR-122), где связывание микроРНК с сайтом связывания ингибирует экспрессию полипептида. В конкретных вариантах осуществления мРНК присутствует в наночастице, например, в липидной наночастице. В конкретных вариантах осуществления мРНК или наночастица присутствует в фармацевтической композиции. Наночастица или выделенная мРНК может быть захвачена и перенесена в клетки субъекта для синтеза полипептида, вызывающего иммуногенную клеточную гибель. В конкретных вариантах осуществления экспрессия полипептида в раковых клетках выше, чем в нормальных клетках, что приводит к большей индукции иммуногенной клеточной гибели раковых клеток, чем нормальных клеток.
В определенных вариантах осуществления данное изобретение включает способ лечения или профилактики рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий предоставление субъекту первой мРНК, описанной в данном документе, например, мРНК, кодирующей полипептид, который индуцирует иммуногенную клеточную гибель, в комбинации с терапевтическим агентом, таким как химиотерапевтический препарат или другой противораковый агент.Подходящие терапевтические агенты для применения в комбинированной терапии включают низкомолекулярные химиотерапевтические агенты, включая ингибиторы протеинтирозинкиназы, а также биологические противораковые агенты, такие как противораковые антитела. Другие подходящие терапевтические агенты для применения в комбинированной терапии описаны ниже.
Фармацевтическая композиция, содержащая одну или более мРНК согласно изобретению, может быть введена субъекту любым подходящим путем. В некоторых вариантах осуществления композиции согласно изобретению вводят одним или более различными путями, включая парентеральный (например, подкожной, внутрикожной, внутривенной, внутрибрюшинной, внутримышечной, внутрисуставной, внутриартериальной, интрасиновиальной, интрастернальной, интратекальной, внутриочаговой или внутричерепной инъекции а также с помощью любой подходящей техники инфузии), пероральный, транс- или интрадермальный, интердермальный, ректальный, интравагинальный, местный (например, с помощью порошков, мазей, кремов, гелей, лосьонов и/или капель), мукозальный, назальный, буккальный, энтеральный, витреальный, внутриопухолевый, сублингвальный, интраназальный; путем интратрахеальной инстилляции, бронхиальной инстилляции и/или ингаляции; в виде орального спрея и/или порошка, назального спрея и/или аэрозоля, и/или через катетер для воротной вены. В некоторых вариантах осуществления композицию можно вводить внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, внутриартериально, внутриопухолево, подкожно или путем ингаляции. Однако данное раскрытие охватывает доставку композиций согласно изобретению любым подходящим способом, принимая во внимание вероятные достижения в области доставки лекарств. В общем, наиболее подходящий путь введения будет зависеть от множества факторов, включая природу фармацевтической композиции, содержащей одну или более мРНК (например, ее стабильность в различных средах организма, таких как кровоток и желудочно-кишечный тракт), и состояние пациента (например, способен ли пациент переносить определенные пути введения).
В определенных вариантах осуществления композиции согласно изобретению могут вводиться в дозах, достаточных для доставки от около 0,0001 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 0,001 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 0,005 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 0,01 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 0,1 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 1 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 2 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 5 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 0,0001 мг/кг до около 5 мг/кг, от около 0,001 мг/кг до около 5 мг/кг, от около 0,005 мг/кг до около 5 мг/кг, от около 0,01 мг/кг до около 5 мг/кг, от около 0,1 мг/кг до около 10 мг/кг, от около 1 мг/кг до около 5 мг/кг, от около 2 мг/кг до около 5 мг/кг, от около 0,0001 мг/кг до около 1 мг/кг, от около 0,001 мг/кг до около 1 мг/кг, от около 0,005 мг/кг до около 1 мг/кг, от около 0,01 мг/кг до около 1 мг/кг, или от около 0,1 мг/кг до около 1 мг/кг в данной дозе, причем доза в 1 мг/кг обеспечивает 1 мг мРНК или наночастиц на 1 кг массы тела субъекта. В конкретных вариантах осуществления может быть введена доза от около 0,005 мг/кг до около 5 мг/кг мРНК или наночастиц согласно изобретению.
Дозу могут вводить один или более раз в сутки в том же или другом количестве для достижения желаемого уровня экспрессии мРНК и/или эффекта (например, терапевтического эффекта). Желаемую дозу можно доставлять, например, три раза в сутки, два раза в сутки, один раз в сутки, через сутки, каждые третьи сутки, каждую неделю, каждые две недели, каждые три недели или каждые четыре недели. В некоторых вариантах осуществления желаемая доза может быть доставлена с использованием нескольких способов введения (например, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати, двенадцати, тринадцати, четырнадцати или более введений). В некоторых вариантах осуществления однократную дозу можно вводить, например, до или после хирургической процедуры или в случае острого заболевания, расстройства или патологического состояния. Конкретный терапевтически эффективный, профилактически эффективный или иным образом подходящий уровень дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая степень тяжести и идентификацию подлежащего лечению расстройства, если таковое имеется; одну или более используемых мРНК; конкретную применяемую композицию; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион пациента; время введения, путь введения и скорость выведения конкретной применяемой фармацевтической композиции; продолжительность лечения; препараты, применяемые в комбинации или совмещающиеся с конкретной применяемой фармацевтической композицией; и подобные факторы, хорошо известные в области медицины.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию согласно изобретению можно вводить в комбинации с другим агентом, например, другим терапевтическим агентом, профилактическим агентом и/или диагностическим агентом. Под «в комбинации с» не подразумевается, что агенты должны вводить одновременно и/или составлять для совместной доставки, хотя эти способы доставки находятся в объеме данного раскрытия. Например, одну или более композиций, содержащих одну или более разных мРНК, можно вводить в комбинации. Композиции можно вводить одновременно, до или после одной или более других необходимых терапевтических средств или медицинских процедур. Каждый дополнительный фармацевтический агент можно вводить в дозе и/или по схеме, определенной для данного фармацевтического агента. В некоторых вариантах осуществления данное раскрытие охватывает доставку композиций согласно изобретению или их композиций для визуализации, диагностики или профилактики в комбинации с агентами, которые улучшают их биодоступность, уменьшают и/или модифицируют их метаболизм, ингибируют их выведение и/или модифицируют их распределение в организме.
Иллюстративные терапевтические агенты, которые можно вводить в комбинации с композициями согласно изобретению, включают, но не ограничиваются ими, цитотоксические, химиотерапевтические и другие терапевтические агенты. Цитотоксические агенты могут включать, например, таксол, цитохалазин В, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенипозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, пуромицин, майтанзиноиды, рахелмицин и их аналоги. Радиоактивные ионы также могут быть использованы в качестве терапевтических агентов и могут включать, например, радиоактивный йод, стронций, фосфор, палладий, цезий, иридий, кобальт, иттрий, самарий и празеодим. Другие терапевтические агенты могут включать, например, антиметаболиты (например, метотрексат, 6 меркаптопурин, 6 тиогуанин, цитарабин, и 5фторурацил, и декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотепа, хлорамбуцил, рахелмицин, мелфалан, кармустин, ломустин, циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин C, и цис-дихлородиамминплатина (II) (DDP), и цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин, блеомицин, митрамицин и антрамицин), и антимитотические агенты (например, винкристин, винбластин, таксол и майтанзиноиды).
Конкретная комбинация методов лечения (терапевтических средств или процедур) для применения в комбинированном режиме будет учитывать совместимость необходимых терапевтических средств и/или процедур и желаемого терапевтического эффекта, который должен быть достигнут.Также должно быть понятно, что применяемые методы лечения могут достигать желаемого эффекта при том же расстройстве (например, композиция, полезная для лечения рака, может вводиться одновременно с химиотерапевтическим средством), или они могут достигать различных эффектов (например, контроль любых нежелательных явлений).
Другие варианты осуществления раскрытия
E1. Химически модифицированная матричная РНК (ммРНК), кодирующая полипептид, который индуцирует иммуногенную клеточную гибель, причем указанная ммРНК содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований.
E2. ммРНК по варианту осуществления 1, причем полипептид индуцирует некроптоз.
E3. ммРНК по варианту осуществления 2, причем полипептид представляет собой псевдокиназу смешанного происхождения (MLKL), или ее фрагмент, вызывающий иммуногенную клеточную гибель.
E4. ммРНК по варианту осуществления 3, причем полипептид MLKL содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1 или 2.
E5. ммРНК по варианту осуществления 2, причем полипептид представляет собой взаимодействующую с рецептором протеинкиназу 3 (RIPK3) или ее фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель.
E6. ммРНК по варианту осуществления 5, причем полипептид RIPK3 содержит аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 3-19.
E7. ммРНК по варианту осуществления 2, причем полипептид представляет собой взаимодействующую с рецептором протеинкиназу 1 (RIPK1) или ее фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель.
E8. ммРНК по варианту осуществления 7, причем полипептид RIPK1 содержит аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 62-67.
E9. ммРНК по варианту осуществления 2, причем полипептид представляет собой белок с низкой pI (DIABLO), прямо связывающий IAP, или его фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель.
E10. ммРНК по варианту осуществления 9, причем полипептид DIABLO содержит аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 26-33.
E11. ммРНК по варианту осуществления 2, причем полипептид представляет собой белок, взаимодействующий с доменом смерти Fas-рецептора (FADD) или его фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель.
E12. ммРНК по варианту осуществления 11, причем полипептид FADD содержит аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 56-61.
E13. ммРНК по варианту осуществления 1, причем полипептид индуцирует пироптоз.
E14. ммРНК по варианту осуществления 13, причем полипептид представляет собой гасдермин D (GSDMD) или его фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель.
E15. ммРНК по варианту осуществления 14, причем полипептид GSDMD содержит аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 20-25.
E16. ммРНК по варианту осуществления 13, причем полипептид представляет собой каспазу-4 или его фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель.
E17. ммРНК по варианту осуществления 16, причем полипептид каспазы-4 содержит аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 34-38.
E18. ммРНК по варианту осуществления 13, причем полипептид представляет собой каспазу-5 или его фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель.
E19. ммРНК согласно варианту осуществления 18, причем полипептид каспазы-5 содержит аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 39-43.
E20. ммРНК согласно варианту осуществления 13, причем полипептид представляет собой каспазу-11 или его фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель.
E21. ммРНК согласно варианту осуществления 20, причем полипептид каспазы-11 содержит аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 44-48.
E22. ммРНК согласно варианту осуществления 13, причем полипептид представляет собой NLRP3 или его фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель.
E23. ммРНК согласно варианту осуществления 22, причем полипептид NLRP3 содержит аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 51-52.
E24. ммРНК согласно варианту осуществления 13, причем полипептид представляет собой пириновый домен или его фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель.
E25. ммРНК согласно варианту осуществления 24, причем полипептид пиринового домена содержит аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 49-50.
E26. ммРНК согласно варианту осуществления 13, причем полипептид представляет собой ASC/PYCARD или его фрагмент, индуцирующий иммуногенную клеточную гибель.
E27. ммРНК согласно варианту осуществления 26, причем полипептид ASC/PYCARD содержит аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 53-54.
E28. ммРНК по любому из предшествующих вариантов осуществления, причем ммРНК содержит 5'-НТО, оптимизированную по кодонам открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, 3'-НТО и 3'-хвостовую область связанных нуклеозидов.
E29. ммРНК согласно варианту осуществления 28, причем ммРНК дополнительно содержит один или более сайтов связывания микроРНК (миРНК).
E30. ммРНК по любому из предшествующих вариантов осуществления, причем ммРНК является полностью модифицированной.
E31. ммРНК по любому из предшествующих вариантов осуществления, причем ммРНК содержит псевдоуридин (ψ), псевдоуридин (ψ) и 5-метилцитидин (m5C), 1-метилпсевдоуридин (m1ψ), 1-метилпсевдоуридин (m1ψ) и 5-метилцитидин (m5C), 2-тиоуридин (s2U), 2-тиоуридин и 5-метилцитидин (m5C), 5-метоксиуридин (mo5U), 5-метоксиуридин (mo5U) и 5-метилцитидин (m5C), 2'-O-метилуридин, 2'-O-метилуридин и 5-метилцитидин (m5C), N6-метиладенозин (m6A) или N6-метиладенозин (m6A) и 5-метилцитидин (m5C).
E32. ммРНК по любому из предшествующих вариантов осуществления, причем ммРНК содержит псевдоуридин (ψ), N1-метилпсевдоуридин (m1ψ), 2-тиоуридин, 4'-тиоуридин, 5-метилцитозин, 2-тио-1-метил-1-дезазапсевдоуридин, 2-тио- 1-метилпсевдоуридин, 2-тио-5-азауридин, 2-тиодигидропсевдоуридин, 2-тиодигидроуридин, 2-тиопсевдоуридин, 4-метокси-2-тиопсевдоуридин, 4-метоксипсевдоуридин, 4-тио-1-метилпсевдоуридин, 4-тиопсевдоуридин, 5-азауридин, дигидропсевдоуридин, 5-метоксиуридин или 2'-O-метилуридин, или их комбинации.
E33. ммРНК по любому из предшествующих вариантов осуществления, причем ммРНК содержит 1-метилпсевдоуридин (m1ψ), 5-метоксиуридин (mo5U), 5-метилцитидин (m5C), псевдоуридин (ψ), α-тиогуанозин или (-тиоаденозин или их комбинацию.
E34. Липидная наночастица, содержащая ммРНК по любому из вариантов осуществления 1-33.
E35. Липидная наночастица по варианту осуществления 34, которая представляет собой липосому.
E36. Липидная наночастица по варианту осуществления 34, которая содержит катионный и/или ионизируемый липид.
E37. Липидная наночастица по варианту осуществления 36, причем катионный и/или ионизируемый липид представляет собой 2,2-дилинолеил-4-метиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (DLin-KC2-DMA) или дилинолеилметил-4-диметиламинобутират (DLin-MC3-DMA).
E38. Липидная наночастица по любому из вариантов осуществления 34-37, причем липидная наночастица дополнительно содержит нацеливающий фрагмент, конъюгированный с наружной поверхностью липидной наночастицы.
E39. Фармацевтическая композиция, содержащая ммРНК по любому из вариантов осуществления 1-33 или липидную наночастицу по любому из осуществления 34-38, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.
E40. Способ индукции иммуногенной клеточной гибели клетки, включающий приведение в контакт клетки с ммРНК по любому из вариантов осуществления 1-33, липидной наночастицой по любому из вариантов осуществления 34-38 или фармацевтической композицией по варианту осуществления 39, так что происходит иммуногенная клеточная гибель клетки.
E41. Способ по варианту осуществления 40, в котором иммуногенная клеточная гибель характеризуется набуханием клеток, разрывом плазматической мембраны и высвобождением цитозольного содержимого клетки.
E42. Способ по варианту осуществления 41, в котором АТФ и HMGB1 высвобождаются из клетки.
E43. Способ по любому из вариантов осуществления 40-42, в котором приведение в контакт происходит in vitro или in vivo.
E44. Способ по любому из вариантов осуществления 40-43, в котором клетка представляет собой раковую клетку.
E45. Способ по варианту осуществления 44, в котором раковая клетка представляет собой клетку рака печени, клетку колоректального рака или клетку меланомы.
E46. Способ по любому из вариантов осуществления 40-45, в котором клетка представляет собой человеческую клетку.
E47. Способ стимуляции иммуногенного ответа на опухоль у субъекта, нуждающегося в этом, способ, включающий введение субъекту эффективного количества ммРНК по любому из вариантов осуществления 1-33, липидной наночастицы по любому из вариантов осуществления 34-38 или фармацевтической композиции по варианту осуществления 39, так что у субъекта стимулируется иммуногенный ответ на опухоль.
E48. Способ по варианту осуществления 47, который дополнительно включает введение субъекту по меньшей мере одного агента, который усиливает иммунный ответ, при этом по меньшей мере один агент, который усиливает иммунный ответ, индуцирует адаптивный иммунитет, стимулирует интерферон типа 1, стимулирует воспалительный ответ, стимулирует сигналинг NFκB или стимулирует мобилизацию дендритных клеток.
E49. Способ по варианту осуществления 48, в котором по меньшей мере один агент индуцирует адаптивный иммунитет путем стимуляции интерферона типа 1.
E50. Способ по варианту осуществления 47, который дополнительно включает введение субъекту по меньшей мере одного агента, который индуцирует активацию или примирование Т-клеток.
E51. Способ по варианту осуществления 50, в котором агент, который индуцирует активацию или примирование Т-клеток, представляет собой цитокин или хемокин.
E52. Способ по варианту осуществления 47, который дополнительно включает введение субъекту по меньшей мере одного агента, который модулирует иммунную контрольную точку.
E53. Способ по варианту осуществления 47, который дополнительно включает введение субъекту: (i) по меньшей мере одного агента, который усиливает иммунный ответ; (ii) по меньшей мере одного агента, который индуцирует активацию или примирование Т-клеток; и (iii) по меньшей мере одного агента, который модулирует иммунную контрольную точку.
E54. Способ по любому из вариантов осуществления 47-53, в котором ммРНК, липидную наночастицу или фармацевтическую композицию вводят субъекту парентерально.
E55. Способ по варианту осуществления 54, в котором ммРНК, липидную наночастицу или фармацевтическую композицию вводят при помощи инфузии один раз в неделю.
E56. Способ по любому из вариантов осуществления 47-55, в котором субъект представляет собой человека.
E57. Способ по любому из вариантов осуществления 47-56, в котором опухоль представляет собой рак печени или колоректальный рак.
E58. Способ стимуляции иммуногенного ответа на опухоль у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение субъекту эффективного количества:
(i) первой химически модифицированной матричной РНК (ммРНК), кодирующей полипептид, который индуцирует иммуногенную клеточную гибель, причем указанная первая ммРНК содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований;
и по меньшей мере одной из:
(ii) второй ммРНК, кодирующей полипептид, который потенцирует иммунный ответ, причем указанная вторая ммРНК содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований;
(iii) третьей ммРНК, кодирующей полипептид, который индуцирует активацию или примирование Т-клеток, причем указанная третья ммРНК содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований; и/или
(iv) четвертой ммРНК, кодирующей полипептид, который модулирует иммунную контрольную точку, при этом указанная четвертая ммРНК содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований, так что у субъекта формируется иммуногенный ответ на опухоль.
E59. Способ по варианту осуществления 58, в котором вторая ммРНК кодирует полипептид, который индуцирует адаптивный иммунитет, стимулирует интерферон типа 1, стимулирует воспалительный ответ, стимулирует сигналинг NFκB или стимулирует мобилизацию дендритных клеток.
E60. Способ по варианту осуществления 58, в котором первую ммРНК и вторую ммРНК вводят субъекту.
E61. Способ по варианту осуществления 58, в котором первую ммРНК, вторую ммРНК и третью ммРНК вводят субъекту.
E62. Способ по варианту осуществления 58, в котором первую ммРНК, вторую ммРНК, третью ммРНК и четвертую ммРНК вводят субъекту.
E63. Способ по любому из вариантов осуществления 58-62, в котором первая ммРНК, вторая ммРНК, третья ммРНК и/или четвертая ммРНК присутствуют в тех же фармацевтических композициях или липидной наночастице, которые вводят субъекту.
E64. Способ по любому из вариантов осуществления 58-63, в котором полипептид, кодируемый первой ммРНК, выбирают из группы, состоящей из MLKL, RIPK3, RIPK1, DIABLO, FADD, GSDMD, каспазы-4, каспазы-5, каспазы-11, NLRP3, ASC/PYCARD и пирина.
E65. Способ по любому из вариантов осуществления 58-64, в котором полипептид, кодируемый второй ммРНК, выбирают из группы, состоящей из DIABLO, STING, IRF1, IRF3, IRF5, IRF6, IRF7, IRF8, STAT1, STAT2, STAT4, STAT6, NFAT, C/EBPb, IKKβ, c-FLIP, RIPK1, ИЛ-27, ApoF, PLP и FLT3.
E66. Способ по любому из вариантов осуществления 58 и 60-64, в котором полипептид, кодируемый третьей ммРНК, выбирают из группы, состоящей из ИЛ-12, ИЛ-36 гамма, CCL2, CCL4, CCL20 и CCL21.
E67. Способ по любому из вариантов осуществления 58 и 61-65, в котором полипептид, кодируемый четвертой ммРНК, выбирают из группы, состоящей из ингибиторов PD-1, ингибиторов PD-L1, ингибиторов CTLA-4, агонистов OX-40, агонистов пути OX-40L и ICOS.
E68. Способ стимуляции иммуногенного ответа на опухоль у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение субъекту эффективного количества:
(i) по меньшей мере одной первой химически модифицированной матричной РНК (ммРНК), кодирующей полипептид, который индуцирует иммуногенную клеточную гибель, причем указанная первая ммРНК содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований;
и по меньшей мере одной из:
(ii) по меньшей мере одной второй ммРНК, кодирующей полипептид, который потенцирует иммунный ответ, причем указанная вторая ммРНК содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований; и/или
(iii) ингибитора иммунной контрольной точки,
так что у субъекта формируется иммуногенный ответ на опухоль.
E69. Способ по варианту осуществления 68, в котором по меньшей мере одна первая ммРНК кодирует полипептид, выбранный из группы, состоящей из MLKL, Diablo, RIPK3 и их комбинаций.
E70. Способ по варианту осуществления 69, в котором первая ммРНК кодирует MLKL.
E71. Способ по варианту осуществления 69, в котором первая ммРНК кодирует Diablo.
E72. Способ по варианту осуществления 69, в котором первая ммРНК кодирует RIPK3.
E73. Способ по варианту осуществления 69, в котором первая ммРНК содержит две ммРНК, одну, кодирующую MLKL, и одну, кодирующую Diablo.
E74. Способ по варианту осуществления 69, в котором первая ммРНК содержит две ммРНК, одну, кодирующую MLKL, и одну, кодирующую RIPK3.
E75. Способ по варианту осуществления 69, в котором первая ммРНК содержит две ммРНК, одну, кодирующую RIPK3, и одну, кодирующую Diablo.
Е76. Способ по любому из вариантов осуществления 68-75, в котором вторая ммРНК кодирует STING.
E77. Способ по любому из вариантов осуществления 68-76, в котором ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой анти-CTLA-4 антитело.
E78. Способ по любому из вариантов осуществления 68-76, в котором ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой анти-PD-1 антитело.
E79. Химически модифицированная матричная РНК (ммРНК), кодирующая полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес антиген у субъекта, при этом указанная ммРНК содержит одну или более модифицированных нуклеотидных оснований, и причем иммунный ответ включает клеточный или гуморальный иммунный ответ, характеризующийся:
(i) стимуляцией сигнального пути интерферона типа I;
(ii) стимуляцией сигнального пути NFkB;
(iii) стимуляцией воспалительного ответа;
(iv) стимуляцией продукции цитокинов; или
(v) стимуляцией развития, активности или мобилизации дендритных клеток; и
(vi) комбинацией любого из (i) - (vi).
E80. ммРНК по варианту осуществления 79, причем представляющий интерес антиген представляет собой эндогенный антиген у субъекта.
E81. ммРНК по варианту осуществления 79, причем представляющий интерес антиген представляет собой экзогенный антиген, совместно вводимый субъекту с ммРНК.
E82. ммРНК по варианту осуществления 81, причем представляющий интерес антиген кодируется ммРНК.
E83. ммРНК по любому из вариантов осуществления 79-82, которая кодирует конститутивно активный полипептид STING человека.
E84. ммРНК по варианту осуществления 83, причем конститутивно активный полипептид STING человека содержит одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из V147L, N154S, V155M, R284M, R284K, R284T, E315Q, R375A и их комбинации.
E85. ммРНК по варианту осуществления 84, причем конститутивно активный полипептид STING человека содержит мутацию V155M.
E86. ммРНК по варианту осуществления 84, причем конститутивно активный полипептид STING человека содержит мутации R284M/V147L/N154S/V155M.
E87. ммРНК по варианту осуществления 84, причем конститутивно активный полипептид STING человека содержит аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1-10, или кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в любой из SEQ ID NO: 199-208, 225, 1319 или 1320.
E88. ммРНК по любому из вариантов осуществления 79-82, причем ммРНК кодирует конститутивно активный полипептид IRF3.
E89. ммРНК по варианту осуществления 88, причем конститутивно активный полипептид IRF3 содержит мутацию S396D.
E90. ммРНК по варианту осуществления 89, причем конститутивно активный полипептид IRF3 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 11-12.
E91. ммРНК по любому из вариантов осуществления 79-82, причем ммРНК кодирует конститутивно активный полипептид IRF7 человека.
E92. ммРНК по варианту осуществления 91, причем конститутивно активный полипептид IRF7 человека содержит одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из S475D, S476D, S477D, S479D, L480D, S483D, S487D, делеции аминокислот 247-467 и их комбинаций.
E93. ммРНК по варианту осуществления 91, причем конститутивно активный полипептид IRF7 человека содержит аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 14-18.
E94. ммРНК по любому из вариантов осуществления 79-82, причем полипептид выбирают из группы, состоящей из MyD88, TRAM, IRF1, IRF8, IRF9, TBK1, IKKi, STAT1, STAT2, STAT4, STAT6, c-FLIP, IKKβ, RIPK1, TAK-TAB1, DIABLO, Btk, самоактивирующейся каспазы-1 и Flt3.
E95. ммРНК по любому из вариантов осуществления 79-82, причем полипептид стимулирует сигналинг интерферона типа I.
E96. ммРНК по любому из вариантов осуществления 79-82, причем полипептид стимулирует сигналинг NFkB.
E97. ммРНК по любому из вариантов осуществления 79-82, причем полипептид стимулирует продукцию цитокинов.
E98. ммРНК по любому из вариантов осуществления 79-82, причем иммунный ответ, усиленный полипептидом, представляет собой клеточный иммунный ответ.
E99. ммРНК по любому из вариантов осуществления 79-82, причем иммунный ответ, усиленный полипептидом, представляет собой гуморальный иммунный ответ.
E100. Композиция, содержащая ммРНК по любому из вариантов осуществления 79, 81-99 и вторую ммРНК, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес антиген, причем указанная вторая ммРНК содержит одну или более модифицированных нуклеотидных оснований и при этом полипептид усиливает иммунный ответ по меньшей мере на один представляющий интерес антиген, когда композицию вводят субъекту.
E101. Композиция по варианту осуществления 100, которая содержит один конструкт ммРНК, кодирующий как по меньшей мере один представляющий интерес антиген, так и полипептид, который усиливает иммунный ответ на по меньшей мере один представляющий интерес антиген.
E102. Композиция по варианту осуществления 100, которая содержит два конструкта ммРНК, один из которых кодирует по меньшей мере один представляющий интерес антиген, а другой кодирует полипептид, который усиливает иммунный ответ на по меньшей мере один представляющий интерес антиген.
E103. Композиция согласно варианту осуществления 102, причем два конструкта ммРНК совместно составляют в липидную наночастицу.
E104. Композиция по любому из вариантов осуществления 100-103, причем по меньшей мере один представляющий интерес антиген представляет собой по меньшей мере один опухолевый антиген.
E105. Композиция по п варианту осуществления 104, причем по меньшей мере один опухолевый антиген представляет собой по меньшей мере один мутантный антиген KRAS.
E106. Композиция по варианту осуществления 105, причем по меньшей мере один мутантный антиген KRAS содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из G12D, G12V, G13D, G12C и их комбинаций.
E107. Композиция по варианту осуществления 105, причем по меньшей мере один мутантный антиген KRAS содержит аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 95-106 и 131-132, или кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1321 или 1322.
E108. Композиция по варианту осуществления 105, которая содержит ммРНК, кодирующую по меньшей мере один мутантный антиген KRAS и конститутивно активный полипептид STING, при этом ммРНК кодирует аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 107-130.
E109. Композиция по любому из вариантов осуществления 100-103, причем по меньшей мере один представляющий интерес антиген представляет собой по меньшей мере один антиген патогена.
E110. Композиция по варианту осуществления 109, причем по меньшей мере один антиген патогена относится к патогену, выбранному из группы, состоящей из вирусов, бактерий, простейших, грибов и паразитов.
E111. Композиция по варианту осуществления 110, причем по меньшей мере один антиген патогена представляет собой по меньшей мере один вирусный антиген.
E112. Композиция по варианту осуществления 111, причем по меньшей мере один вирусный антиген представляет собой по меньшей мере один антиген вируса папилломы человека (HPV).
E113. Композиция по варианту осуществления 112, причем по антиген HPV представляет собой антиген E6 HPV16 или E7 HPV или их комбинацию.
E114. Композиция по варианту осуществления 113, причем один антиген HPV содержит аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 36-94.
E115. Композиция по варианту осуществления 110, причем по меньшей мере один антиген патогена представляет собой по меньшей мере один бактериальный антиген.
E116. ммРНК или композиция по любому из вариантов осуществления 79-115, причем ммРНК содержит 5'-НТО, оптимизированную по кодонам открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, 3'-НТО и 3'-хвостовую область связанных нуклеозидов.
E117. ммРНК или композиция согласно варианту осуществления 116, причем ммРНК дополнительно содержит один или более сайтов связывания микроРНК (миРНК).
E118. ммРНК или композиция по любому из вариантов осуществления 79-117, причем ммРНК является полностью модифицированной.
E119. ммРНК или композиция по любому из вариантов осуществления 79-118, причем ммРНК содержит псевдоуридин (ψ), псевдоуридин (ψ) и 5-метилцитидин (m5C), 1-метилпсевдоуридин (m1ψ), 1-метилпсевдоуридин (m1ψ) и 5-метилцитидин (m5C), 2-тиоуридин (s2U), 2-тиоуридин и 5-метилцитидин (m5C), 5-метоксиуридин (mo5U), 5-метоксиуридин (mo5U) и 5-метилцитидин (m5C), 2'-O-метилуридин, 2'-O-метилуридин и 5-метилцитидин (m5C), N6-метиладенозин (m6A) или N6-метиладенозин (m6A) и 5-метилцитидин (m5C).
E120. ммРНК или композиция по любому из вариантов осуществления 79-119, причем мРНК содержит псевдоуридин (ψ), N1-метилпсевдоуридин (m1ψ), 2-тиоуридин, 4'-тиоуридин, 5-метилцитозин, 2-тио-1-метил-1-дезазапсевдоуридин, 2-тио- 1-метилпсевдоуридин, 2-тио-5-азауридин, 2-тиодигидропсевдоуридин, 2-тиодигидроуридин, 2-тиопсевдоуридин, 4-метокси-2-тиопсевдоуридин, 4-метоксипсевдоуридин, 4-тио-1-метилпсевдоуридин, 4-тиопсевдоуридин, 5-азауридин, дигидропсевдоуридин, 5-метоксиуридин или 2'-O-метилуридин, или их комбинации.
E121. ммРНК или композиция по любому из вариантов осуществления 79-120, причем ммРНК содержит 1-метилпсевдоуридин (m1ψ), 5-метоксиуридин (mo5U), 5-метилцитидин (m5C), псевдоуридин (ψ), α-тиогуанозин или (-тиоаденозин или их комбинацию.
E122. Липидная наночастица, содержащая ммРНК или композицию по любому из вариантов осуществления 79-121.
E123. Липидная наночастица по варианту осуществления 122, которая представляет собой липосому.
E124. Липидная наночастица по варианту осуществления 122, которая содержит катионный и/или ионизируемый аминолипид.
E125. Липидная наночастица по варианту осуществления 124, причем катионный и/или ионизируемый аминолипид представляет собой 2,2-дилинолеил-4-метиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (DLin-KC2-DMA) или дилинолеилметил-4-диметиламинобутират (DLin-MC3-DMA).
E126. Липидная наночастица по любому из вариантов осуществления 122-125, причем липидная наночастица дополнительно содержит нацеливающий фрагмент, конъюгированный с наружной поверхностью липидной наночастицы.
E127. Фармацевтическая композиция, содержащая ммРНК или композицию по любому из вариантов осуществления 79-121 или липидную наночастицу по любому из осуществления 122-126, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.
E128. Способ усиления иммунного ответа на представляющий интерес антиген, включающий введение субъекту ммРНК или композиции по любому из вариантов осуществления 79-121, липидной наночастицы по любому из вариантов осуществления 122-126 или фармацевтической композиции по варианту осуществления 127, так что у субъекта усиливается иммунный ответ на представляющий интерес антиген.
E129. Способ по варианту осуществления 128, в котором усиление иммунного ответа включает стимуляцию продукции цитокинов.
E130. Способ по варианту осуществления 128, в котором усиление иммунного ответа включает стимуляцию антигенспецифической активности CD8+T-клеток.
E131. Способ по варианту осуществления 128, в котором усиление иммунного ответа включает стимуляцию продукции антигенспецифических антител.
E132. Способ по варианту осуществления 128, который включает введение субъекту композиции мРНК, которая стимулирует развитие или активность дендритных клеток, перед введением субъекту композиции мРНК, которая стимулирует сигнальный путь интерферона типа I.
E133. Способ стимуляции иммуногенного ответа на опухоль у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества ммРНК или композиции по любому из вариантов осуществления 79-121 или ее липидной наночастицы или ее фармацевтической композиции, так что у субъекта стимулируется иммуногенный ответ на опухоль.
E134. Способ по варианту осуществления 133, в котором опухоль представляет собой рак печени, колоректальный рак, меланому, рак поджелудочной железы, немелкоклеточный рак легких (НМРЛ), рак шейки матки или рак головы или шеи.
E135. Способ по варианту осуществления 133, в котором субъект представляет собой человека.
E136. Способ стимуляции иммуногенного ответа на патоген у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества ммРНК по любому из вариантов осуществления 79-99 и 116-121 или композиции по любому из вариантов осуществления 100-115, или их липидной наночастицы, или их фармацевтической композиции, так что у субъекта стимулируется иммуногенный ответ на патоген.
E137. Способ по варианту осуществления 136, в котором патоген выбирают из группы, состоящей из вирусов, бактерий, простейших, грибов и паразитов.
E138. Способ по варианту осуществления 137, в котором патоген представляет собой вирус.
E139. Способ по варианту осуществления 138, в котором патоген представляет собой вирус папилломы человека (HPV).
E140. Способ по варианту осуществления 137, в котором патоген представляет собой бактерию.
E141. Способ по варианту осуществления 136, в котором субъект представляет собой человека.
E142. Способ предотвращения или лечения рака, ассоциированного с вирусом папилломы человека (HPV), у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение субъекту композиции, содержащей по меньшей мере один конструкт мРНК, кодирующий: (i) по меньшей мере один представляющий интерес антиген HPV и (ii) полипептид, который усиливает иммунный ответ против по меньшей мере одного представляющего интерес антигена HPV, так что иммунный ответ на по меньшей мере один интересующий антиген HPV усиливается.
E143. Способ по варианту осуществления 142, в котором полипептид, который усиливает иммунный ответ против по меньшей мере одного представляющего интерес антигена(ов) HPV, представляет собой полипептид STING.
E144. Способ по варианту осуществления 142, в котором по меньшей мере один антиген HPV представляет собой по меньшей мере один антиген E6, по меньшей мере один антиген E7 или комбинацию по меньшей мере одного антигена E6 и по меньшей мере одного антигена E7.
E145. Способ по варианту осуществления 142, в котором по меньшей мере один антиген HPV и полипептид кодируются на отдельных мРНК и совместно составляют в липидную наночастицу перед введением субъекту.
E146. Способ по варианту осуществления 142, в котором субъект подвергается риску воздействия HPV, и композицию вводят до воздействия HPV.
E147. Способ по варианту осуществления 142, в котором субъект инфицирован HPV или имеет рак, ассоциированный с HPV.
E148. Способ по варианту осуществления 147, в котором рак выбирают из группы, состоящей из рака шейки матки, полового члена, влагалища, вульвы, анального канала и ротоглотки.
E149. Способ по варианту осуществления 148, в котором субъекта также лечат ингибитором иммунной контрольной точки.
E150. Композиция, содержащая первую химически модифицированную матричную РНК (ммРНК), кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ по меньшей мере на один представляющий интерес антиген онкогенного вируса у субъекта, и вторую ммРНК, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес антиген онкогенного вируса, причем каждая ммРНК содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований, и при этом иммунный ответ включает клеточный или гуморальный иммунный ответ, характеризующийся:
(i) стимуляцией сигнального пути интерферона типа I;
(ii) стимуляцией сигнального пути NFkB;
(iii) стимуляцией воспалительного ответа;
(iv) стимуляцией продукции цитокинов; или
(v) стимуляцией развития, активности или мобилизации дендритных клеток; и
(vi) комбинацией любого из (i) - (vi).
E151. Композиция по варианту осуществления 150, которая содержит один конструкт ммРНК, кодирующий как по меньшей мере один представляющий интерес антиген онкогенного вируса, так и полипептид, который усиливает иммунный ответ на по меньшей мере один представляющий интерес антиген онкогенного вируса.
E152. Композиция по варианту осуществления 150 или 151, причем по меньшей мере один представляющий интерес антиген онкогенного вируса получают из онкогенного вируса, выбранного из группы, состоящей из: вируса папилломы человека (HPV), вируса гепатита B (HBV), вируса гепатита C (HCV), вируса Эпштейна-Барр (EBV), Т-лимфотропного вируса человека типа 1 (HTLV-1), герпесвируса саркомы Капоши (KSHV) или полиомавируса клеток Меркеля (MCV).
E153. Композиция по варианту осуществления 150 или 151, причем по меньшей мере один представляющий интерес антиген онкогенного вируса выбирают из группы антигенов HPV, состоящей из: Е1, Е2, Е4, Е5, Е6, Е7, L1, L2 и их комбинаций.
E154. Композиция по варианту осуществления 150 или 151, причем по меньшей мере один представляющий интерес антиген онкогенного вируса выбирают из группы антигенов HBV, состоящей из: HBsAg, HBcAg, HBeAg, HBxAg, Pol, и их комбинаций.
E155. Композиция по варианту осуществления 150 или 151, причем по меньшей мере один представляющий интерес антиген онкогенного вируса выбирают из группы антигенов HCV, состоящей из: корового белка (C, p22), E1 (gp35), E2 (gp70), NS1 (p7), NS2 (p23), NS3 (p70), NS4A (p8), NS4B (p27), NS5A (p56/58), NS5B (p68) и их комбинации.
E156. Композиция по варианту осуществления 150 или 151, причем по меньшей мере один представляющий интерес антиген онкогенного вируса представляет собой антигенный полипептид из EBV-1 или EBV-2.
E157. Композиция по варианту осуществления 150 или 151, причем по меньшей мере один представляющий интерес антиген онкогенного вируса выбирают из группы антигенов HTLV-1, состоящей из: gag, pol, pro, env, tax, rex, p12, p21, p13, p30, HBZ, и их комбинаций.
E158. Композиция по варианту осуществления 150 или 151, причем по меньшей мере один онкогенный вирусный антиген представляет собой антигенный полипептид из подтипа A KSHV, подтипа B KSHV, подтипа C KSHV, подтипа D KSHV, подтипа E KSHV или их комбинаций.
E159. Композиция по варианту осуществления 150 или 151, причем по меньшей мере один представляющий интерес антиген онкогенного вируса выбирают из группы антигенов MCPyV, состоящей из: большого T-антигена (LT), малого T-антигена (sT), Т-антигена массой 57 кДа (57kT), альтернативного T-антигена (ALTO), основного капсидного белка - вирусный белок 1 (VP1), минорных капсидных вирусных белков 2 или 3 (VP2 или VP3) и их комбинаций.
E160. Композиция по любому из вариантов осуществления 150-159, причем по меньшей мере один антиген онкогенного вируса представляет собой конкатемерный антиген онкогенного вируса, состоящий из 2-20 антигенов онкогенных вирусов.
E161. Композиция по варианту осуществления 160, причем конкатемерный антиген онкогенного вируса содержит один или более из:
а) 22-20 антигенов онкогенных вирусов, перемежающихся сайтами, чувствительными к расщеплению;
b) ммРНК, кодирующей каждый антиген онкогенного вируса, связанной непосредственно друг с другом без линкера; и/или
c) ммРНК, кодирующей каждый онкогенный вирус, связанной с одним или с другим одним нуклеотидным линкером.
E162. Композиция по любому из вариантов осуществления 150-161, дополнительно содержащая сигнал убиквитинирования.
E163. Композиция по варианту осуществления 162, причем сигнал убиквитинирования расположен на С-конце ммРНК.
E164. Композиция по любому из вариантов осуществления 161-163, причем по меньшей мере один из сайтов расщепления представляет собой сайт расщепления АПК.
E165. Композиция по варианту осуществления 164, причем сайт расщепления представляет собой сайт расщепления для сериновой протеазы, треониновой протеазы, цистеиновой протеазы, аспартатной протеазы, протеазы глутаминовой кислоты или металлопротеазы.
E166. Композиция по варианту осуществления 165, причем сайт расщепления предназначен для цистеиновой протеазы.
E167. Композиция по варианту осуществления 166, причем цистеиновая протеаза представляет собой катепсин В.
E168. Композиция по варианту осуществления 164, причем сайт расщепления содержит аминокислотную последовательность GFLG, Arg-↓-NHMec; Bz-Arg-↓-NhNap; Bz-Arg-↓NHMec; Bz-Phe-Cal-Arg-↓-NHMec; Pro-Gly-↓-Phe; Xaa-Xaa-Val-Val-Arg-Xaa-X или Arg-Arg, где Xaa представляет собой любой аминокислотный остаток.
E169. Композиция по любому из вариантов осуществления 150-168, дополнительно содержащая сенсибилизирующий антиген.
E170. Композиция по варианту осуществления 169, причем сенсибилизирующий антиген представляет собой мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую сенсибилизирующий антиген.
E171. Композиция по варианту осуществления 169 или 170, причем сенсибилизирующий антиген включен в конкатемерный антиген.
E172. Композиция по любому из вариантов осуществления 150-171, дополнительно содержащая эндосомную нацеливающую последовательность.
E173. Композиция по варианту осуществления 172, причем эндосомная нацеливающая последовательность содержит по меньшей мере часть трансмембранного домена лизосомального мембранного белка (LAMP-1).
E174. Композиция по варианту осуществления 172, причем эндосомная нацеливающая последовательность содержит по меньшей мере часть трансмембранного домена инвариантной цепи (Ii).
E175. Композиция, содержащая первую химически модифицированную матричную РНК (ммРНК), кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на по меньшей мере один антиген, полученный из HPV, и вторую ммРНК, кодирующую по меньшей мере один антиген, полученный из HPV, при этом каждая ммРНК содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований.
E176. Композиция по варианту осуществления 175, причем вторая ммРНК кодирует антиген E6 HPV и/или антиген Е7 HPV.
E177. Композиция по варианту осуществления 175 или 176, причем первая ммРНК кодирует конститутивно активный полипептид STING человека.
E178. Композиция по любому из вариантов осуществления 150-177, причем каждую ммРНК составляют в одну и ту же или разные липидные наночастицы.
E179. Композиция по варианту осуществления 178, причем каждую ммРНК, кодирующую антиген онкогенного вируса, составляют в одну и ту же или разные липидные наночастицы.
E180. Композиция по варианту осуществления 179, причем каждую ммРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на антиген онкогенного вируса, составляют в одну и ту же или разные липидные наночастицы.
E181. Композиция по любому из вариантов осуществления 178-180, причем каждую ммРНК, кодирующую антиген онкогенного вируса, составляют в одну и ту же липидную наночастицу, и каждую ммРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на антиген онкогенного вируса, составляют в другую липидную наночастицу.
E182. Композиция по любому из вариантов осуществления 178-180, причем каждую ммРНК, кодирующую антиген онкогенного вируса, составляют в одну и ту же липидную наночастицу, и каждую ммРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на антиген онкогенного вируса, составляют в ту же самую липидную наночастицу, что и каждую ммРНК, кодирующую антиген онкогенного вируса.
E183. Композиция по любому из вариантов осуществления 178-180, причем каждую ммРНК, кодирующую антиген онкогенного вируса, составляют в отдельной липидной наночастице, и каждую ммРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на антиген онкогенного вируса, составляют в одну и ту же липидную наночастицу как и каждую ммРНК, кодирующую каждый антиген онкогенного вируса.
E184. Липидная наночастица-носитель, содержащая фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит:
ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конкатемер антигенов онкогенных вирусов;
ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на конкатемер антигенов онкогенных вирусов; и
фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
E185. Липидная наночастица-носитель, содержащая фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит:
по меньшей мере одну ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую антиген онкогенного вируса;
ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на антиген онкогенного вируса; и
фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
E186. Липидная наночастица-носитель, содержащая фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит:
ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конкатемер антигенов HPV;
ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и
фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
E187. Липидная наночастица-носитель по варианту осуществления 186, причем конкатемер антигенов HPV содержит антигены E6 и E7 HPV.
E188. Липидная наночастица-носитель, содержащая фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит:
ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую вирусный антиген E6 HPV;
ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую вирусный антиген E7 HPV;
ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека; и
фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
E189. Вакцина, содержащая:
первую наночастицу, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую первый представляющий интерес антиген онкогенного вируса, ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на первый представляющий интерес антиген онкогенного вируса и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель;
вторую наночастицу, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую второй представляющий интерес антиген онкогенного вируса, ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на второй представляющий интерес антиген онкогенного вируса и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель;
третью наночастицу, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую третий представляющий интерес антиген онкогенного вируса, ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на третий представляющий интерес антиген онкогенного вируса и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель;
четвертую наночастицу, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую четвертый представляющий интерес антиген онкогенного вируса, ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на четвертый представляющий интерес антиген онкогенного вируса и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель; или
их комбинацию.
E190. Вакцина, содержащая:
наночастицу, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конкатемерный представляющий интерес антиген онкогенного вируса, ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на конкатемерный представляющий интерес антиген онкогенного вируса и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
E191. Вакцина, содержащая:
первую наночастицу, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую антиген E6 HPV, ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель; и
вторую наночастицу, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую антиген E7 HPV, ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конститутивно активный полипептид STING человека, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
E192. Способ предотвращения роста опухоли у субъекта, инфицированного онкогенным вирусом, включающий введение субъекту композиции, липидной наночастицы-носителя или вакцины по любому из вариантов осуществления 150-191, так что рост опухоли у субъекта предотвращается.
E193. Способ по варианту осуществления 192, в котором у субъекта не обнаруживается опухоль до введения.
E194. Способ ингибирования роста опухоли у субъекта, инфицированного онкогенным вирусом, включающий введение субъекту композиции, липидной наночастицы-носителя или вакцины по любому из вариантов осуществления 150-191, так что рост опухоли у субъекта ингибируется.
E195. Способ по варианту осуществления 194, в котором образование опухоли перед введением является результатом заражения онкогенным вирусом.
E196. Способ лечения рака у субъекта, больного раком, инфицированного онкогенным вирусом, включающий введение субъекту композиции, липидной наночастицы-носителя или вакцины по любому из вариантов осуществления 150-191, так что рак лечится у субъекта.
E197. Способ по варианту осуществления 196, в котором рак является результатом заражения онкогенным вирусом.
E198. Персонализированная противораковая вакцина, содержащая первую химически модифицированную матричную РНК (ммРНК), кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ по меньшей мере на один представляющий интерес раковый антиген у субъекта, и вторую ммРНК, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес раковый антиген, причем каждая ммРНК содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований, и при этом иммунный ответ включает клеточный или гуморальный иммунный ответ, характеризующийся:
(i) стимуляцией сигнального пути интерферона типа I;
(ii) стимуляцией сигнального пути NFkB;
(iii) стимуляцией воспалительного ответа;
(iv) стимуляцией продукции цитокинов; или
(v) стимуляцией развития, активности или мобилизации дендритных клеток; и
(vi) комбинацией любого из (i) - (vi).
E199. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 198, которая содержит один конструкт ммРНК, кодирующий как по меньшей мере один представляющий интерес раковый антиген, так и полипептид, который усиливает иммунный ответ на по меньшей мере один представляющий интерес раковый антиген.
E200. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 198 или 199, в котором по меньшей мере один представляющий интерес раковый антиген представляет собой конкатемерный раковый антиген, состоящий из 2-100 пептидных эпитопов.
E201. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 200, причем конкатемерный раковый антиген содержит одно или более из:
а) 2-100 пептидных эпитопов, перемежающихся сайтами, чувствительными к расщеплению;
b) мРНК, кодирующую каждый пептидный эпитоп, которые связаны непосредственно друг с другом без линкера;
c) мРНК, кодирующую каждый пептидный эпитоп, который связан с одним или другим с помощью одного нуклеотидного линкера;
d) каждый пептидный эпитоп, содержащий 25-35 аминокислот и включающий в себя центрально расположенную SNP-мутацию;
e) по меньшей мере 30% пептидных эпитопов, имеющих самую высокую аффинность к молекулам ГКГС класса I, от субъекта;
f) по меньшей мере 30% пептидных эпитопов, имеющих самую высокую аффинность к молекулам ГКГС класса II, от субъекта;
g) по меньшей мере 50% пептидных эпитопов, имеющих заявленную аффинность связывания IC>500 нМ для HLA-A, HLA-B и/или DRB1;
h) мРНК, кодирующую 20 пептидных эпитопов;
i) 50% пептидных эпитопов, имеющих аффинность связывания для ГКГС класса I, и 50% пептидных эпитопов, имеющих аффинность связывания для ГКГС класса II; и/или
j) мРНК, кодирующую пептидные эпитопы, расположенные таким образом, что пептидные эпитопы упорядочиваются для минимизации псевдоэпитопов.
E202. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 201, причем каждый пептидный эпитоп содержит 31 аминокислоту и содержит центрально расположенную SNP-мутацию с 15 фланкирующими аминокислотами на каждой стороне SNP-мутации.
E203. Персонализированная противораковая вакцина по любому из вариантов осуществления 200-202, причем пептидные эпитопы представляют собой Т-клеточные эпитопы и/или В-клеточные эпитопы.
E204. Персонализированная противораковая вакцина по любому из вариантов осуществления 200-203, причем пептидные эпитопы содержат комбинацию Т-клеточных эпитопов и В-клеточных эпитопов.
E205. Персонализированная противораковая вакцина по любому из вариантов осуществления 200-204, причем по меньшей мере 1 из пептидных эпитопов представляет собой Т-клеточный эпитоп.
E206. Персонализированная противораковая вакцина по любому из вариантов осуществления 200-205, причем по меньшей мере 1 из пептидных эпитопов представляет собой B-клеточный эпитоп.
E207. Персонализированная противораковая вакцина по любому из вариантов осуществления 200-206, причем Т-клеточный эпитоп содержит от 8 до 11 аминокислот.
E208. Персонализированная противораковая вакцина по любому из вариантов осуществления 200-207, причем В-клеточный эпитоп содержит от 13 до 17 аминокислот.
E209. Персонализированная противораковая вакцина по любому из вариантов осуществления 198-208, дополнительно содержащая сигнал убиквитинирования.
E210. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 209, причем сигнал убиквитинирования расположен на С-конце ммРНК.
E211. Персонализированная противораковая вакцина по любому из вариантов осуществления 201-210, причем по меньшей мере один из сайтов, чувствительных к расщеплению, представляет собой сайт расщепления АПК.
E212. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 211, причем сайт расщепления представляет собой сайт расщепления для сериновой протеазы, треониновой протеазы, цистеиновой протеазы, аспартатной протеазы, протеазы глутаминовой кислоты или металлопротеазы.
E213. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 212, причем сайт расщепления предназначен для цистеиновой протеазы.
E214. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 213, причем цистеиновая протеаза представляет собой катепсин В.
E215. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 214, причем сайт расщепления содержит аминокислотную последовательность GFLG, Arg-↓-NHMec; Bz-Arg-↓-NhNap; Bz-Arg-↓NHMec; Bz-Phe-Cal-Arg-↓-NHMec; Pro-Gly-↓-Phe; Xaa-Xaa-Val-Val-Arg-Xaa-X или Arg-Arg, где Xaa представляет собой любой аминокислотный остаток.
E216. Персонализированная противораковая вакцина по любому из вариантов осуществления 200-215, причем каждый пептидный эпитоп содержит антигенную область и область, стабилизирующую ГКГС.
E217. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 216, причем область, стабилизирующая ГКГС, имеет длину 5-10 аминокислот.
E218. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 216 или 217, причем антигенная область имеет длину 5-100 аминокислот.
E219. Персонализированная противораковая вакцина по любому из вариантов осуществления 200-218, причем пептидные эпитопы были оптимизированы для обеспечения силы связывания с ГКГС субъекта.
E220. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 219, причем поверхность TCR для каждого эпитопа имеет низкое сходство с эндогенными белками.
E221. Персонализированная противораковая вакцина по любому из вариантов осуществления 198-220, дополнительно содержащая сенсибилизирующий антиген.
E222. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 221, причем сенсибилизирующий антиген представляет собой антиген инфекционного заболевания.
E223. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 221 или 222, причем сенсибилизирующий антиген представляет собой мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую сенсибилизирующий антиген.
E224. Персонализированная противораковая вакцина по любому из вариантов осуществления 221-223, причем сенсибилизирующий антиген представляет собой пептидный эпитоп в конкатемерном антигене.
E225. Персонализированная противораковая вакцина по любому из вариантов осуществления 221 и 223-224, причем сенсибилизирующий антиген представляет собой антиген гриппа.
E226. Персонализированная противораковая вакцина по любому из вариантов осуществления 198-225, дополнительно содержащая эндосомную нацеливающую последовательность.
E227. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 226, причем эндосомная нацеливающая последовательность содержит по меньшей мере часть трансмембранного домена лизосомального мембранного белка (LAMP-1).
E228. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 226, причем эндосомная нацеливающая последовательность содержит по меньшей мере часть трансмембранного домена инвариантной цепи (Ii).
E229. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 200, причем пептидные эпитопы включают по меньшей мере один эпитоп ГКГС класса I и по меньшей мере один эпитоп ГКГС класса II.
E230. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 229, причем по меньшей мере 30% эпитопов представляют собой эпитопы ГКГС класса I.
E231. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 229, причем по меньшей мере 30% эпитопов представляют собой эпитопы ГКГС класса II.
E232. Персонализированная противораковая вакцина по любому из вариантов осуществления 198-231, дополнительно содержащая ОРС, кодирующую один или более традиционных раковых антигенов.
E233. Персонализированная противораковая вакцина по любому из вариантов осуществления 198-232, дополнительно содержащая мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую один или более традиционных раковых антигенов.
E234. Персонализированная противораковая вакцина по любому из вариантов осуществления 198-233, причем полипептид, который усиливает иммунный ответ по меньшей мере на один представляющий интерес антиген у субъекта, представляет собой конститутивно активный полипептид STING человека.
E235. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 234, причем конститутивно активный полипептид STING человека содержит одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из V147L, N154S, V155M, R284M, R284K, R284T, E315Q, R375A и их комбинации.
E236. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 235, причем конститутивно активный полипептид STING человека содержит мутацию V155M.
E237. Персонализированная противораковая вакцина по варианту осуществления 235, причем конститутивно активный полипептид STING человека содержит мутации R284M/V147L/N154S/V155M.
E238. Композиция, содержащая персонализированную противораковую вакцину по любому из вариантов осуществления 198-238.
E239. Композиция по варианту осуществления 238, причем каждую ммРНК составляют в одну и ту же или разные липидные наночастицы.
E240. Композиция по варианту осуществления 239, причем каждую ммРНК, кодирующую представляющий интерес раковый антиген, составляют в одну и ту же или разные липидные наночастицы.
E241. Композиция по варианту осуществления 240, причем каждую ммРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес раковый антиген, составляют в одну и ту же или разные липидные наночастицы.
E242. Композиция по любому из вариантов осуществления 239-241, причем каждую ммРНК, кодирующую представляющий интерес раковый антиген, составляют в одну и ту же липидную наночастицу, и каждую ммРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес раковый антиген, составляют в другую липидную наночастицу.
E243. Композиция по любому из вариантов осуществления 239-241, причем каждую ммРНК, кодирующую представляющий интерес раковый антиген, составляют в одну и ту же липидную наночастицу, и каждую ммРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес раковый антиген, составляют в одну и ту же липидную наночастицу, что и каждую ммРНК, кодирующую представляющий интерес раковый антиген.
E244. Композиция по любому из вариантов осуществления 239-241, причем каждая ммРНК, кодирующую представляющий интерес раковый антиген, составляют в отдельной липидной наночастице, и каждую ммРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес раковый антиген, составляют в одну ту же липидную наночастицу, что и каждую ммРНК, кодирующую каждый представляющий интерес раковый антиген.
E245. Липидная наночастица-носитель, содержащая фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит:
ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую представляющий интерес конкатемерный раковый антиген;
ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес конкатемерный раковый антиген;
и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
E246. Липидная наночастица-носитель, содержащая фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит:
по меньшей мере одну ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую представляющий интерес раковый антиген;
ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес раковый антиген; и
фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
E247. Персонализированная противораковая вакцина, содержащая:
липидную наночастицу, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одну ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую представляющий интерес раковый антиген у субъекта, и ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес раковый антиген и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
E248. Персонализированная противораковая вакцина, содержащая:
липидную наночастицу, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одну ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую представляющий интерес конкатемерный раковый антиген, и ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес раковый антиген и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
E249. Способ вакцинации субъекта, включающий:
введение субъекту, страдающему раком, персонализированной противораковой вакцины или композиции по любому из вариантов осуществления 198-248 для вакцинации субъекта.
E250. Способ лечения субъекта с использованием персонализированной противораковой вакцины, включающий выделение образца у субъекта, идентификацию набора неоэпитопов путем анализа транскриптома пациента и/или экзома пациента из образца для получения специфического для пациента мутанома, выбор набора неоэпитопов для вакцины из мутанома на основе силы связывания ГКГС, разнообразия связывания ГКГС, прогнозируемой степени иммуногенности, низкой аутореактивности и/или реактивности Т-клеток, получение мРНК для кодирования набора неоэпитопов и полипептида, который усиливает иммунный ответ на неоэпитопы и введение персонализированной противораковой вакцины субъекту в течение двух месяцев после выделения образца от субъекта.
E251. Способ по варианту осуществления 250, в котором персонализированную противораковую вакцину вводят субъекту в течение одного месяца после выделения образца от субъекта.
E252. Способ по варианту осуществления 250 или 251, в котором персонализированная противораковая вакцина дополнительно кодирует один или более традиционных раковых антигенов.
E253. Способ по варианту осуществления 252, в котором один или более традиционных раковых антигенов кодируются одной и той же мРНК, которая кодирует набор неоэпитопов.
E254. Способ по варианту осуществления 252, в котором один или более традиционных раковых антигенов кодируются другой мРНК, чем мРНК, которая кодирует набор неоэпитопов.
E255. Способ по любому из вариантов осуществления 250-254, в котором персонализированную противораковую вакцину вводят в комбинации с противораковым терапевтическим агентом.
E256. Способ по варианту осуществления 255, в котором противораковый терапевтический агент представляет собой традиционную противораковую вакцину.
E257. Бактериальная вакцина, содержащая первую химически модифицированную матричную РНК (ммРНК), кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ по меньшей мере на один представляющий интерес бактериальный антиген у субъекта, и вторую ммРНК, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес бактериальный антиген, причем каждая ммРНК содержит одно или более модифицированных нуклеотидных оснований, и при этом иммунный ответ включает клеточный или гуморальный иммунный ответ, характеризующийся:
(i) стимуляцией сигнального пути интерферона типа I;
(ii) стимуляцией сигнального пути NFkB;
(iii) стимуляцией воспалительного ответа;
(iv) стимуляцией продукции цитокинов; или
(v) стимуляцией развития, активности или мобилизации дендритных клеток; и
(vi) комбинацией любого из (i) - (vi).
E258. Бактериальная вакцина по варианту осуществления 257, которая содержит один конструкт ммРНК, кодирующий как по меньшей мере один представляющий интерес бактериальный антиген, так и полипептид, который усиливает иммунный ответ на по меньшей мере один представляющий интерес бактериальный антиген.
E259. Бактериальная вакцина по варианту осуществления 257 или 258, причем по меньшей мере один представляющий интерес бактериальный антиген представляет собой конкатемерный бактериальный антиген, состоящий из 2-10 бактериальных антигенов.
E260. Бактериальная вакцина по варианту осуществления 259, причем конкатемерный раковый антиген содержит одно или более из:
а) 2-10 бактериальных антигенов, перемежающихся сайтами, чувствительными к расщеплению;
b) ммРНК, кодирующей каждый бактериальный антиген, связанной непосредственно друг с другом без линкера; и/или
c) ммРНК, кодирующей каждый бактериальный антиген, связанной с одним или с другим одним нуклеотидным линкером.
E261. Бактериальная вакцина по любому из вариантов осуществления 257-260, дополнительно содержащая сигнал убиквитинирования.
E262. Бактериальная вакцина по варианту осуществления 261, причем сигнал убиквитинирования расположен на С-конце ммРНК.
E263. Бактериальная вакцина по любому из вариантов осуществления 260-262, причем по меньшей мере один из сайтов расщепления представляет собой сайт расщепления АПК.
E264. Бактериальная вакцина по варианту осуществления 263, причем сайт расщепления представляет собой сайт расщепления для сериновой протеазы, треониновой протеазы, цистеиновой протеазы, аспартатной протеазы, протеазы глутаминовой кислоты или металлопротеазы.
E265. Бактериальная вакцина по варианту осуществления 264, причем сайт расщепления предназначен для цистеиновой протеазы.
E266. Бактериальная вакцина по варианту осуществления 265, причем цистеиновая протеаза представляет собой катепсин В.
E267. Бактериальная вакцина по варианту осуществления 263, причем сайт расщепления содержит аминокислотную последовательность GFLG, Arg-↓-NHMec; Bz-Arg-↓-NhNap; Bz-Arg-↓NHMec; Bz-Phe-Cal-Arg-↓-NHMec; Pro-Gly-↓-Phe; Xaa-Xaa-Val-Val-Arg-Xaa-X или Arg-Arg, где Xaa представляет собой любой аминокислотный остаток.
E268. Бактериальная вакцина по любому из вариантов осуществления 257-267, дополнительно содержащая сенсибилизирующий антиген.
E269. Бактериальная вакцина по варианту осуществления 268, причем сенсибилизирующий антиген представляет собой антиген инфекционного заболевания.
E270. Бактериальная вакцина по варианту осуществления 268 или 269, причем сенсибилизирующий антиген представляет собой мРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую сенсибилизирующий антиген.
E271. Бактериальная вакцина по любому из вариантов осуществления 268-270, причем сенсибилизирующий антиген включен в конкатемерный антиген.
E272. Бактериальная вакцина по любому из вариантов осуществления 268-271, причем сенсибилизирующий антиген представляет собой антиген гриппа.
E273. Бактериальная вакцина по любому из вариантов осуществления 257-272, дополнительно содержащая эндосомную нацеливающую последовательность.
E274. Бактериальная вакцина по варианту осуществления 273, причем эндосомная нацеливающая последовательность содержит по меньшей мере часть трансмембранного домена лизосомального мембранного белка (LAMP-1).
E275. Бактериальная вакцина по варианту осуществления 273, причем эндосомная нацеливающая последовательность содержит по меньшей мере часть трансмембранного домена инвариантной цепи (Ii).
E276. Бактериальная вакцина по любому из вариантов осуществления 257-275, причем вакцина индуцирует гуморальный иммунный ответ.
E277. Бактериальная вакцина по любому из вариантов осуществления 257-275, причем вакцина индуцирует адаптивный иммунный ответ.
E278. Бактериальная вакцина по варианту осуществления 277, причем адаптивный иммунный ответ включает индукцию продукции антигенспецифических антител или антигенспецифическую индукцию/активацию Т-хелперных лимфоцитов или цитотоксических лимфоцитов.
E279. Бактериальная вакцина по любому из вариантов осуществления 257-278, причем представляющий интерес бактериальный антиген получают из Staphylococcus aureus.
E280. Композиция, содержащая бактериальную вакцину по любому из вариантов осуществления 257-279.
E281. Композиция по варианту осуществления 280, причем каждую ммРНК составляют в одну и ту же или разные липидные наночастицы.
E282. Композиция по варианту осуществления 281, причем каждую ммРНК, кодирующую представляющий интерес бактериальный антиген, составляют в одну и ту же или разные липидные наночастицы.
E283. Композиция по варианту осуществления 282, причем каждую ммРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес бактериальный антиген, составляют в одну и ту же или разные липидные наночастицы.
E284. Композиция по любому из вариантов осуществления 281-283, причем каждую ммРНК, кодирующую представляющий интерес бактериальный антиген, составляют в одну и ту же липидную наночастицу, и каждую ммРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на бактериальный антиген, составляют в другую липидную наночастицу.
E285. Композиция по любому из вариантов осуществления 281-283, причем каждую ммРНК, кодирующую представляющий интерес бактериальный антиген, составляют в одну и ту же липидную наночастицу, и каждую ммРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на бактериальный антиген, составляют в одну и ту же липидную наночастицу, что и каждую ммРНК, кодирующую бактериальный антиген.
E286. Композиция по любому из вариантов осуществления 281-283, причем каждую ммРНК, кодирующую бактериальный антиген, составляют в другую липидную наночастицу, и каждую ммРНК, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на бактериальный антиген, составляют в одну и ту же липидную наночастицу, что и каждую ммРНК, кодирующую каждый бактериальный антиген.
E287. Липидная наночастица-носитель, содержащая фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит:
ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую конкатемер бактериальных антигенов;
ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на конкатемер бактериальных антигенов; и
фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
E288. Липидная наночастица-носитель, содержащая фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит:
по меньшей мере одну ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую бактериальный антиген;
ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на бактериальный антиген; и
фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
E289. Бактериальная вакцина, содержащая:
наночастицу, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую представляющий интерес бактериальный антиген, ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес бактериальный антиген и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
E290. Бактериальная вакцина, содержащая:
наночастицу, содержащую фармацевтическую композицию, причем фармацевтическая композиция содержит ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую представляющий интерес конкатемерный бактериальный антиген, ммРНК, имеющую открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, который усиливает иммунный ответ на представляющий интерес конкатемерный бактериальный антиген и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
E291. Способ вакцинации субъекта против заражения представляющей интерес бактерией, включающий:
введение субъекту бактериальной вакцины, композиции или липидной наночастицы-носителя по любому из вариантов осуществления 257-290 для вакцинации субъекта.
E292. Способ по варианту осуществления 291, в котором представляющая интерес бактерия представляет собой Staphylococcus aureus.
E293. Способ по варианту осуществления 291, в котором представляющая интерес бактерия представляет собой метициллин-резистентную Staphylococcus aureus (MRSA).
E294. Способ лечения субъекта с бактериальной инфекцией, включающий:
введение субъекту бактериальной вакцины, композиции или липидной наночастицы-носителя по любому из вариантов осуществления 257-290 для лечения субъекта.
E295. Способ по варианту осуществления 294, в котором бактериальная инфекция вызвана Staphylococcus aureus.
E296. Способ по варианту осуществления 294, в котором бактериальная инфекция вызвана метициллин-резистентной Staphylococcus aureus (MRSA).
Определения
Введение: Используемый в данном документе термин «введение» относится к способу доставки композиции субъекту или пациенту. Способ введения может быть выбран для целевой доставки (например, для конкретной доставки) в конкретную область или систему организма. Например, введение может быть парентеральным (например, подкожной, внутрикожной, внутривенной, внутрибрюшинной, внутримышечной, внутрисуставной, внутриартериальной, интрасиновиальной, интрастернальной, интратекальной, внутриочаговой или внутричерепной инъекции а также с помощью любой подходящей методики инфузии), пероральным, транс- или интрадермальным, интердермальным, ректальным, интравагинальным, местным (например, с помощью порошков, мазей, кремов, гелей, лосьонов и/или капель), мукозальным, назальным, буккальным, энтеральным, витреальным, внутриопухолевым, сублингвальным, интраназальным; путем интратрахеальной инстилляции, бронхиальной инстилляции и/или ингаляции; в виде орального спрея и/или порошка, назального спрея и/или аэрозоля, и/или через катетер для воротной вены.
Приблизительно, около: Как используется в данном документе термины «приблизительно» или «около» применительно к одному или более значениям, представляющим интерес, относятся к значению, которое аналогично установленному эталонному значению. В некоторых вариантах осуществления термин «приблизительно» или «около» относится к диапазону значений, которые попадают в пределы 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее в любую сторону (больше или меньше) от установленного эталонного значения, если не указано иное или иное не очевидно из контекста (за исключением случаев, когда такое число превышало бы 100% от возможного значения).
Рак: Используемый в данном документе термин «рак» представляет собой патологическое состояние, включающее аномальный и/или нерегулируемый рост клеток. Термин рак охватывает доброкачественные и злокачественные опухоли. Типичные неограничивающие виды рака включают рак коры надпочечников, распространенный рак, рак анального канала, апластическую анемию, рак желчных протоков, рак мочевого пузыря, рак костей, костный метастаз, опухоли головного мозга, рак мозга, рак молочной железы, детский рак, рак неизвестной первичной локализации, болезнь Каслмана, рак шейки матки, колоректальный рак, рак эндометрия, рак пищевода, семейство опухолей Юинга, рак глаз, рак желчного пузыря, желудочно-кишечные карциноидные опухоли, желудочно-кишечные стромальные опухоли, гестационную трофобластическую опухоль, болезнь Ходжкина, саркому Капоши, почечно-клеточную карциному, рак гортани и гортаноглотки, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, хронический лимфолейкоз, хронический миелолейкоз, хронический миеломоноцитарный лейкоз, миелодиспластический синдром (включая рефрактерные анемии и рефрактерные цитопении), миелопролиферативные новообразования или заболевания (включая истинную полицитемию, эссенциальный тромбоцитоз и первичный миелофиброз), рак печени (например, гепатоцеллюлярную карциному), немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, карциноидную опухоль легкого, лимфому кожи, злокачественную мезотелиому, множественную миелому, миелодиспластический синдром, рак полости носа и околоносовых пазух, рак носоглотки, нейробластому, неходжкинскую лимфому, рак полости рта и ротоглотки, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак полового члена, опухоли гипофиза, рак предстательной железы, ретинобластому, рабдомиосаркому, рак слюнных желез, саркому мягких тканях у взрослых, базальноклеточный и плоскоклеточный рак кожи, меланому, рак тонкой кишки, рак желудка, рак яичек, рак горла, рак тимуса, рак щитовидной железы, саркому матки, рак влагалища, рак вульвы, макроглобулинемию Вальденстрема, опухоль Вильмса и вторичные онкологические заболевания, вызванные противоопухолевой терапией. В конкретных вариантах осуществления рак представляет собой рак печени (например, гепатоцеллюлярную карциному) или колоректальный рак. В других вариантах осуществления рак представляет собой рак крови или гематопоэтический рак.
Расщепляемый линкер: Используемый в данном документе термин «расщепляемый линкер» относится к линкеру, как правило, пептидному линкеру (например, длиной около 5-30 аминокислот, как правило, длиной около 10-20 аминокислот), который может быть включен в полицистронные конструкты мРНК, такие как что эквимолярные уровни нескольких генов могут быть получены из одной и той же мРНК. Неограничивающие примеры расщепляемых линкеров включают семейство пептидов 2А, включая F2A, P2A, T2A и E2A, впервые обнаруженные в пикорнавирусе, которые при включении в конструкт мРНК (например, между двумя полипептидными доменами) функционируют, заставляя рибосому пропускать синтез пептидной связи на С-конце элемента 2А, что приводит к разделению между концом последовательности 2А и следующим по ходу транскрипции пептидом.
Конъюгированные: Используемый в данном документе термин «конъюгированный» при использовании в отношении двух или более фрагментов означает, что фрагменты физически соединены или связаны друг с другом, или напрямую, или через один или более дополнительных фрагментов, которые служат связующим агентом, с образованием структуры, которая является достаточно стабильной, так что фрагменты остаются физически связанными в условиях, в которых используется структура, например, в физиологических условиях. В некоторых вариантах осуществления два или более фрагментов могут быть конъюгированы посредством прямого образования ковалентной химической связи. В других вариантах осуществления два или более фрагментов могут быть конъюгированы посредством образования ионной связи или водородной связи.
Приведение в контакт: Используемый в данном документе термин «приведение в контакт» означает установление физической связи между двумя или более объектами. Например, приведение в контакт клетки с мРНК или композицией липидной наночастицы означает, что клетка и мРНК или липидная наночастица достигают взаимодействия при физическом контакте. Способы приведения в контакт клеток с внешними объектами как in vivo, in vitro, так и ex vivo хорошо известны в области биологии. В иллюстративных вариантах осуществления раскрытия стадию приведения в контакт клетки млекопитающего с композицией (например, выделенной мРНК, наночастицей или фармацевтической композицией согласно раскрытию) выполняют in vivo. Например, приведение в контакт композиции липидных наночастиц и клетки (например, клетки млекопитающего), которая может находиться в организме (например, млекопитающем), может осуществляться любым подходящим путем введения (например, парентеральным введением в организм, включая внутривенное, внутримышечное, внутрикожное и подкожное введение). Для клетки, присутствующей in vitro, композиция (например, липидная наночастица или выделенная мРНК) и клетка могут контактировать, например, путем добавления композиции к культуральной среде клетки и могут включать или приводить к трансфекции. Кроме того, более чем одна клетка может контактировать с композицией наночастиц.
Инкапсулировать: Используемый в данном документе термин «инкапсулировать» означает заключать, окружать или заключать в оболочку. В некоторых вариантах осуществления соединение, полинуклеотид (например, мРНК) или другая композиция могут быть полностью инкапсулированы, частично инкапсулированы или по существу инкапсулированы. Например, в некоторых вариантах осуществления мРНК согласно раскрытию может быть инкапсулирована в липидную наночастицу, например, липосому.
Эффективное количество: Используемый в данном документе термин «эффективное количество» агента представляет собой такое количество, которое достаточно для достижения полезных или желаемых результатов, например, клинических результатов, и, как таковое, «эффективное количество» зависит от контекста, в котором оно применяется. Например, в контексте введения агента, который лечит рак, эффективное количество агента представляет собой, например, количество, достаточное для достижения лечения, как определено в данном документе, рака по сравнению с ответом, полученным без введения агента. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой количество доставляемого агента (например, нуклеиновой кислоты, лекарственного средства, терапевтического агента, диагностического агента или профилактического агента), которое является достаточным при введении субъекту, страдающему или подверженному инфекции, заболеванию, расстройству и/или патологическому состоянию, для лечения, улучшения симптомов, диагностики, предотвращения и/или задержки начала инфекции, заболевания, расстройства и/или патологического состояния.
Экспрессия: Используемый в данном документе термин «экспрессия» последовательности нуклеиновой кислоты относится к одному или более из следующих событий: (1) продукции матрицы РНК из последовательности ДНК (например, путем транскрипции); (2) процессинга РНК-транскрипта (например, путем сплайсинга, редактирования, образования 5'-кэп-структуры и/или процессинга 3'-конца); (3) трансляции РНК в полипептид или белок; и (4) посттрансляционной модификации полипептида или белка.
Идентичность: Используемый в данном документе термин «идентичность» относится к общему сходству между полимерными молекулами, например, между полинуклеотидными молекулами (например, молекулами ДНК и/или молекулами РНК) и/или между полипептидными молекулами. Например, вычисление процентной идентичности двух полинуклеотидных последовательностей может быть выполнено путем выравнивания двух последовательностей с целью оптимального сравнения (например, гэпы могут быть введены в одну или обе из первой и второй последовательностей нуклеиновых кислот для оптимального выравнивания и неидентичные последовательности могут игнорироваться с целью сравнения). В некоторых вариантах осуществления длина последовательности, выровненной для целей сравнения, составляет по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% длины эталонной последовательности. Затем сравнивают нуклеотиды в соответствующих положениях нуклеотидов. Когда положение в первой последовательности занято тем же нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы в этой позиции идентичны. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией от числа совпадающих положений в последовательностях с учетом числа гэпов и длины каждого гэпа, которые необходимо вносить для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно осуществлять с помощью математического алгоритма. Например, процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями может быть определен с использованием способов, таких как описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; и Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Например, процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями может быть определен с использованием алгоритма Meyers и Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17), который был включен в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием таблицы весов замен остатков PAM120, штрафа за продолжение гэпа 12 и штрафа за открытие гэпа 4. Процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями, в качестве альтернативы, может быть определен с использованием программы GAP из пакета программного обеспечения GCG с использованием матрицы NWSgapdna.CMP. Способы, обычно используемые для определения процента идентичности между последовательностями, включают, но не ограничиваются теми, которые описаны в Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988); включенной в данный документ посредством ссылки. Методики определения идентичности запрограммированы в общедоступных компьютерных программах. Иллюстративное компьютерное программное обеспечение для определения гомологии между двумя последовательностями включает, но не ограничивается этим, пакет программ GCG, Devereux et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387,1984, BLASTP, BLASTN, и FASTA, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215, 403, 1990.
Фрагмент: «Фрагмент», как используется в данном документе, относится к части. Например, фрагменты белков могут включать полипептиды, полученные перевариванием полноразмерного белка, выделенного из культивируемых клеток, или полученные методами рекомбинантной ДНК.
GC-богатый: Используемый в данном документе термин «GC-богатый» относится к композиции нуклеотидных оснований полинуклеотида (например, мРНК) или любой его части (например, элемента РНК), содержащей нуклеотидные основания гуанина (G) и/или цитозина (C), или их производные или аналоги, при этом содержание GC составляет более около 50%. Термин «GC-богатый» относится ко всему или к части полинуклеотида, включая, но не ограничиваясь этим, ген, некодирующую область, 5'-НТО, 3'-НТО, открытую рамку считывания, элемент РНК, мотив последовательности или любую отдельную последовательность, фрагмент или сегмент, который содержит около 50% долю GC. В некоторых вариантах осуществления изобретения GC-богатые полинуклеотиды или любые их части состоят исключительно из нуклеотидных оснований гуанина (G) и/или цитозина (C).
Содержание GC: Используемый в данном документе термин «содержание GC» относится к процентному содержанию нуклеотидных оснований в полинуклеотиде (например, мРНК) или его части (например, элемент РНК), которые представляют собой нуклеотидные основания, гуанин (G) и цитозин (C), или их производные или аналоги (из общего числа возможных нуклеотидных оснований, включая аденин (A) и тимин (T) или урацил (U) и их производные или аналоги в ДНК и в РНК). Термин «содержание GC» относится ко всему или к части полинуклеотида, включая, но не ограничиваясь этим, ген, некодирующую область, 5'- или 3'-НТО, открытую рамку считывания, элемент РНК, мотив последовательности или любую отдельную последовательность, фрагмент или сегмент.
Генетический адъювант: «Генетический адъювант», как используется в данном документе, относится к конструкту мРНК (например, конструкту ммРНК), который усиливает иммунный ответ на вакцину, например, посредством стимуляции продукции цитокинов и/или путем стимуляции продукции антигенспецифических эффекторных клеток (например, CD8 Т-клеток). Генетический адъювантный конструкт мРНК может, например, кодировать полипептид, который стимулирует интерферон типа I (например, активирует сигналинг интерферона типа I) или который способствует развитию или активности дендритных клеток.
Гетерологичный: Используемый в данном документе термин «гетерологичный» означает, что последовательность (например, аминокислотная последовательность или полинуклеотид, который кодирует аминокислотную последовательность) обычно не присутствует в данном полипептиде или полинуклеотиде. Например, аминокислотная последовательность, которая соответствует домену или мотиву одного белка, может быть гетерологичной по отношению ко второму белку.
Гидрофобная аминокислота: «Гидрофобная аминокислота», как используется в данном документе, представляет собой аминокислоту, имеющую незаряженную неполярную боковую цепь. Примерами природных гидрофобных аминокислот являются аланин (Ala), валин (Val), лейцин (Leu), изолейцин (Ile), пролин (Pro), фенилаланин (Phe), метионин (Met) и триптофан (Trp).
Иммуностимулятор: Используемый в данном документе термин «иммуностимулятор» относится к конструкту мРНК (например, конструкту ммРНК), который усиливает иммунный ответ, например, на представляющий интерес антиген (или на эндогенный антиген у субъекта, которому вводят иммуностимулятор, или на экзогенный антиген, который вводится совместно с иммуностимулятором), например, посредством стимуляции ответов Т-клеток, В-клеток или дендритных клеток, включая, но не ограничиваясь этим, продукцию цитокинов, стимуляцию продукции антител или стимуляцию продукции антигенспецифических иммунных клеток (например, CD8+T-клеток или CD4+T-клеток).
Met
Инициирующий кодон: Используемый в данном документе термин «инициирующий кодон», используемый взаимозаменяемо с термином «стартовый кодон», относится к первому кодону открытой рамки считывания, который транслируется рибосомой и состоит из триплета связанных нуклеотидных оснований аденина-урацила-гуанина. Инициирующий кодон обозначается первыми буквенными кодами аденина (A), урацила (U) и гуанина (G) и часто пишется просто как «AUG». Хотя природные мРНК могут использовать кодоны, отличные от AUG, в качестве инициирующего кодона, которые упоминаются в данном документе как «альтернативные инициирующие кодоны», инициирующие кодоны полинуклеотидов, описанные в данном документе, используют кодон AUG. В процессе инициации трансляции последовательность, содержащая инициирующий кодон, распознается путем комплементарного спаривания оснований с антикодоном инициаторной тРНК (Met-tRNAi), связанной рибосомой. Открытые рамки считывания могут содержать более одного инициирующего кодона AUG, которые упоминаются в данном документе как «альтернативные инициирующие кодоны».
Инициирующий кодон играет критическую роль в инициации трансляции. Инициирующий кодон является первым кодоном открытой рамки считывания, которая транслируется рибосомой. Как правило, инициирующий кодон содержит нуклеотидный триплет AUG, однако в некоторых случаях инициация трансляции может происходить в других кодонах, состоящих из отдельных нуклеотидов. Инициация трансляции у эукариот представляет собой многоэтапный биохимический процесс, который включает многочисленные взаимодействия белок-белок, белок-РНК и РНК-РНК между молекулами матричными РНК (мРНК), 40S рибосомальной субъединицей, другими компонентами механизма трансляции (например, эукариотическими факторами инициации; eIF). Современная модель инициации трансляции мРНК постулирует, что преинициирующий комплекс (альтернативно «43S преинициирующий комплекс»; сокращенно «PIC») транслоцируется из сайта рекрутирования на мРНК (обычно 5'-кэп) в инициирующий кодон сканируя нуклеотиды в направлении от 5 'до 3', пока не встретится первый кодон AUG, который находится в специфическом нуклеотидном контексте, вызывающем трансляцию (последовательность Козак) (Kozak (1989) J Cell Biol 108:229-241). Сканирование с помощью PIC заканчивается комплементарным спариванием оснований между нуклеотидами, содержащими антикодон инициаторной транспортной РНК Met-tRNAiMet и нуклеотидами, содержащими инициирующий кодон мРНК. Продуктивное спаривание оснований между кодоном AUG и антикодоном Met-tRNAiMet вызывает серию структурных и биохимических событий, которые завершаются присоединением большой 60S рибосомной субъединицы к PIC с образованием активной рибосомы, которая способна к удлинению трансляции.
Вставка: Используемый в данном документе термин «вставка» или «добавление» относится к изменению аминокислотной или нуклеотидной последовательности, приводящему к добавлению одного или более аминокислотных остатков или нуклеотидов, соответственно, к молекуле по сравнению с эталонной последовательностью, например, последовательностью, обнаруженной в природной молекуле. Например, аминокислотная последовательность гетерологичного каркасного полипептида (например, домен BH3) может быть вставлена в полипептид каркаса (например, каркасный полипептид SteA) в сайте, который поддается вставке. В некоторых вариантах осуществления вставка может быть заменой, например, если аминокислотная последовательность, которая образует петлю каркасного полипептида (например, петли 1 или петли 2 SteA или производного SteA), заменяется аминокислотной последовательностью гетерологичного полипептида.
Сайт вставки: Используемый в данном документе термин «сайт вставки» представляет собой положение или область каркасного полипептида, которая поддается вставке аминокислотной последовательности гетерологичного полипептида. Следует понимать, что сайт вставки также может относиться к положению или области полинуклеотида, которая кодирует полипептид (например, кодон полинуклеотида, который кодирует данную аминокислоту в каркасном полипептиде). В некоторых вариантах осуществления вставка аминокислотной последовательности гетерологичного полипептида в каркасный полипептид практически не влияет на стабильность (например, конформационную стабильность), уровень экспрессии или общую вторичную структуру каркасного полипептида.
Выделенное: Используемый в данном документе термин «выделенное» относится к веществу или объекту, которые были отделены по меньшей мере от некоторых компонентов, с которыми оно было связано (будь то в природе или в экспериментальных условиях). Выделенные вещества могут иметь различную степень чистоты по отношению к веществам, с которыми они связаны. Выделенные вещества и/или объекты могут быть отделены по меньшей мере от около 10%, около 20%, около 30%, около 40%, около 50%, около 60%, около 70%, около 80%, около 90% или более из других компонентов, с которыми они были изначально связаны. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенные агенты составляют более около 80%, около 85%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или более около 99% чистоты. Как используется в данном документе, вещество является «чистым», если оно по существу не содержит других компонентов.
Последовательность Козак: Термин «последовательность Козак» (также называемая «консенсусной последовательностью Козак») относится к элементу, усиливающему инициацию трансляции, который усиливает экспрессию гена или открытой рамки считывания, и который у эукариот находится в 5'-НТО. Консенсусная последовательность Козак первоначально была определена как последовательность GCCRCC, где R=пурин, после анализа влияния отдельных мутаций, окружающих инициирующий кодон (AUG), на трансляцию гена препроинсулина (Kozak (1986) Cell 44:283-292). Полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, содержат консенсусную последовательность Козак или ее производное или модификацию. (Примеры композиций энхансера трансляции и способы их применения см. в патенте США №5807707 (Andrews et al.), включенного в данный документ во всей полноте посредством ссылки; патенте США №5723332 (Chernajovsky), включенного в данный документ во всей полноте посредством ссылки; патенте США №№5891665 (Wilson), включенном в данный документ в полном объеме путем ссылки.
Ослабленное сканирование: Может возникнуть явление, известное как «ослабленное сканирование», когда PIC обходит инициирующий кодон и вместо этого продолжает сканирование по ходу транскрипции, пока не будет распознан другой или альтернативный инициирующий кодон. В зависимости от частоты появления, обход инициирующего кодона комплексом PIC может привести к снижению эффективности трансляции. Кроме того, может происходить трансляция из этого кодона AUG, расположенного далее по ходу транскрипции, что приведет к получению нежелательного, аберрантного продукта трансляции, который может быть неспособен вызвать желаемый терапевтический ответ.В некоторых случаях аберрантный продукт трансляции может фактически вызвать вредный ответ (Kracht et al., (2017) Nat Med 23(4):501-507).
Липосома: Используемый в данном документе термин «липосома» означает структуру, содержащую липидсодержащую мембрану, окружающую внутреннюю часть воды. Липосомы могут иметь одну или более липидных мембран. Липосомы включают однослойные липосомы (также известные в данной области техники как однослойные липосомы) и многослойные липосомы (также известные в данной области техники как многослойные липосомы).
Метастазирование: Используемый в данном документе термин «метастазирование» означает процесс, посредством которого рак распространяется от места, в котором он впервые возник в виде первичной опухоли, до отдаленных мест в организме. Вторичная опухоль, возникшая в результате этого процесса, может быть названа «метастазом». мРНК: Используемый в данном документе термин «мРНК» относится к матричной рибонуклеиновой кислоте. мРНК может быть природной или не встречающейся в природе. Например, мРНК может содержать модифицированные и/или не встречающиеся в природе компоненты, такие как одно или более нуклеотидных оснований, нуклеозидов, нуклеотидов или линкеров. мРНК может содержать кэп-структуру, терминирующий нуклеозид, шпильку, поли(А)-последовательность и/или сигнал полиаденилирования. мРНК может иметь нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид. Трансляция мРНК, например, трансляция мРНК in vivo внутри клетки млекопитающего, может продуцировать полипептид. Традиционно базовые компоненты молекулы мРНК включают по меньшей мере кодирующую область, 5'-нетранслируемую область (5'-НТО), 3'-НТО, 5'-кэп и поли(А)-последовательность.
микроРНК (миРНК): Используемый в данном документе термин «микроРНК (миРНК)» представляет собой малую некодирующую молекулу РНК, которая может функционировать в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов (например, путем сайленсинга РНК, например, при помощи расщепления мРНК, дестабилизации мРНК путем укорочения его поли(А)-хвоста и/или интерференции с эффективностью трансляции мРНК в полипептид с помощью рибосомы). Длина зрелой миРНК обычно составляет около 22 нуклеотидов.
микроРНК-122 (miR-122): Используемый в данном документе термин «микроРНК-122 (miR-122)» относится к любой нативной miR-122 из любого позвоночного животного, включая, например, людей, если не указано иное. miR-122 обычно экспрессируется на высоком уровне в печени, где она может регулировать метаболизм жирных кислот. Уровни miR-122 снижаются при раке печени, например, гепатоцеллюлярной карциноме. miR-122 является одной из наиболее высокоэкспрессируемых миРНК в печени, где она регулирует мишени, включая, но не ограничиваясь, CAT-1, CD320, AldoA, Hjv, Hfe, ADAM10, IGFR1, CCNG1, и ADAM17. Зрелая человеческая miR-122 может иметь последовательность AACGCCAUUAUCACACUAAAUA (SEQ ID NO: 32, соответствует hsa-miR-122-3p) или UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG (SEQ ID NO: 33, что соответствует hsa-miR-122-5p).
микроРНК-21 (miR-21): Используемый в данном документе термин «микроРНК-21 (miR-21)» относится к любой нативной miR-21 из любого позвоночного животного, включая, например, людей, если не указано иное. Уровни miR-21 повышаются при раке печени, например, гепатоцеллюлярной карциноме, по сравнению с нормальной печенью. Зрелая человеческая miR-21 может иметь последовательность UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA (SEQ ID NO: 34, что соответствует has-miR-21-5p) или 5'- CAACACCAGUCGAUGGGCUGU - 3' (SEQ ID NO: 35, что соответствует has-miR-21-3p).
микроРНК-142 (miR-142): Используемый в данном документе термин «микроРНК-142 (miR-142)» относится к любой нативной miR-142 из любого позвоночного животного, включая, например, людей, если не указано иное. miR-142 обычно экспрессируется на высоком уровне в миелоидных клетках. Зрелая человеческая miR-142 может иметь последовательность uguaguguuuccuacuuuaugga (SEQ ID NO: 28, что соответствует hsa-miR-142-3p) или cauaaaguagaaagcacuacu (SEQ ID NO: 30, что соответствует hsa-miR-142-5p).
Сайт связывания микроРНК (миРНК): Используемый в данном документе термин «сайт связывания микроРНК (миРНК)» относится к сайту-мишени миРНК, сайту распознавания миРНК или любой нуклеотидной последовательности, с которой миРНК связывается или ассоциирует.В некоторых вариантах осуществления сайт связывания миРНК представляет собой нуклеотидную область или область полинуклеотида (например, мРНК), с которой связывается по меньшей мере «затравочная» область миРНК. Следует понимать, что «связывание» может следовать традиционным правилам гибридизации Уотсона-Крика или может отражать любую стабильную ассоциацию миРНК с целевой последовательностью в или рядом с сайтом микроРНК.
Затравочная область миРНК: Используемый в данном документе термин «затравочная» область миРНК относится к последовательности в области положений 2-8 зрелой миРНК, которая обычно обладает идеальной комплементарностью Уотсона-Крика относительно сайта связывания миРНК. Затравочная область миРНК может содержать положения 2-8 или 2-7 зрелой миРНК. В некоторых вариантах осуществления затравочная область миРНК может содержать 7 нуклеотидов (например, нуклеотиды 2-8 зрелой миРНК), где комплементарный сайт семян в соответствующем сайте связывания миРНК фланкирован аденином (A), противоположным положению 1 миРНК. В некоторых вариантах осуществления затравочная область миРНК может содержать 6 нуклеотидов (например, нуклеотиды 2-7 зрелой миРНК), где комплементарный сайт семян в соответствующем сайте связывания миРНК фланкирован аденином (A), противоположным положению 1 миРНК. При ссылке на сайт связывания миРНК затравочную последовательность миРНК следует понимать как имеющую комплементарность (например, частичную, существенную или полную комплементарность) с затравочной последовательностью миРНК, которая связывается с сайтом связывания миРНК.
Модифицированный: Используемый в данном документе термин «модифицированный» или «модификация» относится к измененному состоянию или изменению состава или структуры полинуклеотида (например, мРНК) или молекулы, представленных в данном документе. Полинуклеотиды и молекулы могут быть модифицированы различными способами, в том числе химически, структурно и/или функционально. Например, полинуклеотиды могут быть структурно модифицированы путем включения одного или более элементов РНК, причем элемент РНК содержит последовательность и/или вторичную структуру (структуры) РНК, которая обеспечивает одну или более функций (например, трансляционную регуляторную активность). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды модифицируют введением неприродных нуклеозидов и/или нуклеотидов, например, поскольку они относятся к природным рибонуклеотидам A, U, G и C. Неканонические нуклеотиды, такие как кэп-структуры, не считаются «модифицированными», хотя они отличаются от химической структуры рибонуклеотидов A, C, G, U. Соответственно, полинуклеотиды и молекулы согласно раскрытию могут состоять из одной или более модификаций (например, могут включать одну или более химических, структурных или функциональных модификаций, включая любую их комбинацию).
Наночастица: Используемый в данном документе термин «наночастица» относится к частице, имеющей какую-либо одну структурную особенность в масштабе менее около 1000 нм, которая проявляет новые свойства по сравнению с объемным образцом из того же материала. Обычно наночастицы имеют любую структурную особенность в масштабе менее чем около 500 нм, менее чем около 200 нм или около 100 нм. Также обычно наночастицы имеют любую одну структурную особенность в масштабе от около 50 нм до около 500 нм, от около 50 нм до около 200 нм или от около 70 до около 120 нм. В иллюстративных вариантах осуществления наночастица представляет собой частицу, имеющую один или более размеров порядка около 1-1000 нм. В других иллюстративных вариантах осуществления наночастица представляет собой частицу, имеющую один или более размеров порядка около 10-500 нм. В других иллюстративных вариантах осуществления наночастица представляет собой частицу, имеющую один или более размеров порядка около 50-200 нм. Сферическая наночастица имела бы диаметр, например, около 50-100 или 70-120 нанометров. Наночастица чаще всего ведет себя как единое целое с точки зрения ее транспорта и свойств. Отмечено, что новые свойства, которые отличают наночастицы от соответствующего объемного материала, обычно проявляются в размере менее 1000 нм или в размере около 100 нм, но наночастицы могут иметь больший размер, например, для частиц, которые являются продолговатыми, трубчатыми и тому подобное. Хотя размер большинства молекул вписывается в вышеприведенную схему, отдельные молекулы обычно не называют наночастицами.
Нуклеиновая кислота: Используемый в данном документе термин «нуклеиновая кислота» используется в самом широком смысле и охватывает любое соединение и/или вещество, которое включает полимер нуклеотидов. Эти полимеры часто называют полинуклеотидами. Иллюстративные нуклеиновые кислоты или полинуклеотиды согласно раскрытию включают, но не ограничиваются ими, рибонуклеиновые кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), гибриды ДНК-РНК, РНКи-индуцирующие агенты, агенты РНКи, киРНК, кшРНК, миРНК, антисмысловые РНК, рибозимы, каталитическую ДНК, РНК, которые индуцируют образование тройной спирали, треозо-нуклеиновые кислоты (ТНК), гликоль-нуклеиновые кислоты (ГНК), пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК), закрытые нуклеиновые кислоты (ЗНК, включая ЗНК, имеющую β-D-рибо-конфигурацию, α-ЗНК, имеющую α-L-рибо-конфигурацию (диастереомер ЗНК), 2'-амино-ЗНК, имеющую 2'-аминофункционализацию, и 2'-амино-α-ЗНК, имеющую 2'-аминофункционализацию), или их гибриды. Кроме того, нуклеиновая кислота может быть в форме конструкта нуклеиновой кислоты, такого как плазмида или вектор (например, вирусный вектор, вектор экспрессии).
Нуклеотидное основание: Используемый в данном документе термин «нуклеотидное основание» (альтернативно «нуклеотидное основание» или «азотистое основание») относится к гетероциклическому соединению пурина или пиримидина, обнаруженному в нуклеиновых кислотах, включая любые производные или аналоги природных пуринов и пиримидинов, которые придают улучшенные свойства (например, аффинность связывания, резистентность к нуклеазе, химическую стабильность) нуклеиновой кислоте или ее части или сегмента. Аденин, цитозин, гуанин, тимин и урацил являются нуклеотидными основаниями, преимущественно встречающимися в природных нуклеиновых кислотах. Другие природные, неприродные и/или синтетические нуклеотидные основания, известные в данной области техники и/или описанные в данном документе, могут быть включены в нуклеиновые кислоты.
Нуклеозид/нуклеотид: Используемый в данном документе термин «нуклеозид» относится к соединению, содержащему молекулу сахара (например, рибозу в РНК или дезоксирибозу в ДНК), или его производному или аналогу, ковалентно связанному с нуклеотидным основанием (например, пурином или пиримидином) или его производным или аналогом (также называемым в данном документе «нуклеотидным основанием»), но не содержащим межнуклеозидную связывающую группу (например, фосфатную группу). Используемый в данном документе термин «нуклеотид» относится к нуклеозиду, ковалентно связанному с межнуклеозидной связывающей группой (например, фосфатной группой), или к любому его производному, аналогу или модификации, которые придают улучшенные химические и/или функциональные свойства (например, аффинность связывания, резистентность к нуклеазам, химическую стабильность) нуклеиновой кислоте или ее части или сегменту.
Открытая рамка считывания: Используемый в данном документе термин «открытая рамка считывания», сокращенно обозначенный как «ОРС», относится к сегменту или области молекулы мРНК, которая кодирует полипептид. ОРС содержит непрерывный участок непересекающихся кодонов в рамке считывания, начиная с инициирующего кодона и заканчивая стоп-кодоном, и транслируется рибосомой.
Пациенты: Используемый в данном документе термин «пациент» относится к субъекту, который может обратиться или нуждается в лечении, требует лечение, получает лечение, получит лечение, или субъект, который находится под наблюдением квалифицированного специалиста в отношении конкретного заболевания или патологического состояния. В конкретных вариантах осуществления пациентом является человеком. В некоторых вариантах осуществления пациентом является пациент, страдающий от рака (например, рака печени или колоректального рака).
Фармацевтически приемлемый: Фраза «фармацевтически приемлемый» используется в данном документе для обозначения таких соединений, материалов, композиций и/или лекарственных форм, которые в рамках рационального медицинского решения, являются подходящими для применения в контакте с тканями людей и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или другой проблемы или осложнения, соразмерно разумному соотношению пользы/риска.
Фармацевтически приемлемый наполнитель: Фраза «фармацевтически приемлемый наполнитель», используемая в данном документе, относится к любому ингредиенту, отличному от соединений, описанных в данном документе (например, носитель, способный суспендировать или растворять активное соединение) и имеющему свойства не вызывать токсичности и воспалительного эффекта для пациента. Наполнители могут включать, например, следующее: антиадгезивы, антиоксиданты, связывающие вещества, покрытия, добавки для прессования, разрыхлители, красящие вещества (красители), мягчительные средства, эмульгаторы, наполнители (разбавители), пленкообразователи или покрытия, вкусоароматические добавки, ароматизаторы, вещества, способствующие скольжению (усилители сыпучести), смазывающие вещества, консерванты, печатные краски, сорбенты, суспендирующие или диспергирующие средства, подсластители и гидратационную воду. Иллюстративные наполнители включают, без ограничения, следующие: бутилированный гидрокситолуол (BHT), карбонат кальция, фосфат кальция (двухосновный), стеарат кальция, кросскармелозу, сшитый поливинилпирролидон, лимонную кислоту, кросповидон, цистеин, этилцеллюлозу, желатин, гидроксипропилцеллюлозу гидроксипропилметилцеллюлозу, лактозу, стеарат магния, мальтит, маннит, метионин, метилцеллюлозу, метилпарабен, микрокристаллическую целлюлозу, полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон, повидон, прежелатинизированный крахмал, пропилпарабен, ретинилпальмитат, шеллак, диоксид кремния, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, цитрат натрия, натрий-гликолят крахмала, сорбит, крахмал (кукурузный), стеариновую кислоту, сахарозу, тальк, диоксид титана, витамин A, витамин E, витамин C и ксилит.
Фармацевтически приемлемые соли: Используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемые соли» относится к производным раскрытых соединений, в которых исходное соединение модифицировано путем преобразования существующего кислотного или основного фрагмента в его солевую форму (например, путем взаимодействия группы свободного основания с подходящей органической кислотой). Примеры фармацевтически приемлемых солей включают, но не ограничиваются этим, соли минеральных или органических кислот основных остатков, таких как амины; щелочные или органические соли кислых остатков, таких как карбоновые кислоты; и т.д. Репрезентативные кислотно-аддитивные соли включают ацетат, уксусную кислоту, адипинат, альгинат, аскорбат, аспартат, бензолсульфонат, бензолсульфоновую кислоту, бензоат, бисульфат, борат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, цитрат, циклопентанепропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, глюкогептонат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидробромид, гидрохлорид, гидроиодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактобионат, лактат, лаурат, лаурилсульфат, малат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, стеарат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, толуолсульфонат, ундеканоат, валерианат и тому подобное. Репрезентативные соли щелочных или щелочноземельных металлов включают соли натрия, лития, калия, кальция, магния и тому подобное, а также нетоксичные катионы аммония, четвертичного аммония и амина, включая, но не ограничиваясь этим, аммоний, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний, метиламин, диметиламин, триметиламин, триэтиламин, этиламин и тому подобное. Фармацевтически приемлемые соли согласно данному раскрытию включают обычные нетоксичные соли исходного соединения, образованные, например, из нетоксичных неорганических или органических кислот. Фармацевтически приемлемые соли согласно данному раскрытию могут быть синтезированы из исходного соединения, которое содержит основной или кислотный фрагмент, обычными химическими способами. Как правило, такие соли могут быть получены взаимодействием форм этих соединений в виде свободной кислоты или основания со стехиометрическим количеством подходящего основания или кислоты в воде или в органическом растворителе или в их смеси; как правило, неводные среды, такие как эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил, являются предпочтительными. Списки подходящих солей можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p.1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl and C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, и Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977), каждая из которых включена в данный документ во всей полноте посредством ссылки.
Полипептид: Используемый в данном документе термин «полипептид» или «представляющий интерес полипептид» относится к полимеру из аминокислотных остатков, обычно соединенных пептидными связями, которые могут быть получены естественным (например, выделены или очищены) или синтетическим путем.
Преинициирующий комплекс (PIC): Используемый в данном документе термин «преинициирующий комплекс» (альтернативно «43S преинициирующий комплекс»; сокращенно «PIC») относится к рибонуклеопротеиновому комплексу, содержащему 40S рибосомную субъединицу, эукариотическим факторам инициации (eIF1, eIF1A, eIF3, eIF5) и тройному комплексу eIF2-GTP-Met-tRNAiMet, который способен по существу присоединяться к 5'-кэп-структуре молекулы мРНК и после присоединения выполнять рибосомное сканирование 5'-НТО.
Элемент РНК: Используемый в данном документе термин «элемент РНК» относится к части, фрагменту или сегменту молекулы РНК, которая обеспечивает биологическую функцию и/или обладает биологической активностью (например, трансляционной регуляторной активностью). Модификация полинуклеотида путем включения одного или более элементов РНК, таких как описанные в данном документе, обеспечивает одно или более желаемых функциональных свойств для модифицированного полинуклеотида. Элементы РНК, как описано в данном документе, могут быть встречающимися в природе, не встречающимися в природе, синтетическими, сконструированными или любой их комбинацией. Например, элементы природной РНК, которые обеспечивают регуляторную активность, включают элементы, обнаруженные в транскриптомах вирусов, прокариотических и эукариотических организмов (например, людей). Было показано, что элементы РНК, в частности эукариотические мРНК и транслированные вирусные РНК, участвуют в обеспечении многих функций в клетках. Иллюстративные природные элементы РНК включают, но не ограничиваются ими, элементы инициации трансляции (например, участок внутренней посадки рибосомы (IRES), см. Kieft et al., (2001) RNA 7(2):194-206), усиливающие трансляцию элементы (например, усиливающий трансляцию элемент мРНК APP, см. Rogers et al., (1999) J Biol Chem 274(10):6421-6431), элементы стабильности мРНК (например, богатые AU элементы (ARE), см. Garneau et al., (2007) Nat Rev Mol Cell Biol 8(2):113-126), элементы репрессии трансляции (см., например, Blumer et al., (2002) Mech Dev 110(1-2):97-112), белок-связывающие элементы РНК (например, железосвязывающий элемент, см. Selezneva et al., (2013) J Mol Biol 425(18):3301-3310), элементы цитоплазматического полиаденилирования (Villalba et al., (2011) Curr Opin Genet Dev 21(4):452-457), и элементы каталитической РНК (например, рибозимы, см. Scott et al., (2009) Biochim Biophys Acta 1789(9-10):634-641).
Время пребывания: Используемый в данном документе термин «время пребывания» относится ко времени нахождения преинициирующего комплекса (PIC) или рибосомы в дискретном положении или местоположении вдоль молекулы мРНК.
Субъект: Используемый в данном документе термин «субъект» относится к любому организму, которому можно вводить композицию в соответствии с данным раскрытием, например, для экспериментальных, диагностических, профилактических и/или терапевтических целей. Иллюстративные субъекты включают животных (например, млекопитающих, таких как мыши, крысы, кролики, приматы, отличные от человека, и люди) и/или растения. В некоторых вариантах осуществления субъектом может быть пациент.
По существу: Используемый в данном документе термин «по существу» относится к качественному состоянию, демонстрирующему общую или почти полную степень или степень представляющей интерес характеристики или свойства. Специалист в области биологических наук поймет, что биологические и химические явления редко, если вообще когда-либо, доходят до завершения и/или переходят к завершению, достижению или избеганию абсолютного результата. Таким образом, термин «по существу» используется в данном документе для обозначения потенциального недостатка полноты, присущей многим биологическим и химическим явлениям.
Страдающий от: У индивидуума, который «страдает» от заболевания, расстройства и/или патологического состояния, было диагностировано или он имеет один или более симптомов заболевания, расстройства и/или патологического состояния.
Нацеливающий фрагмент: Используемый в данном документе термин «нацеливающий фрагмент» представляет собой соединение или агент, который может нацеливать наночастицу на конкретный тип клетки, ткани и/или органа.
Терапевтический агент: Термин «терапевтический агент» относится к любому агенту, который при введении субъекту обладает терапевтическим, диагностическим и/или профилактическим эффектом и/или вызывает желаемый биологический и/или фармакологический эффект.
Трансфекция: Используемый в данном документе термин «трансфекция» относится к способам введения препарата (например, полинуклеотида, такого как мРНК) в клетку.
Трансляционная регуляторная активность: Используемый в данном документе термин «трансляционная регуляторная активность» (используется взаимозаменяемо с «трансляционной регуляторной функцией») относится к биологической функции, механизму или процессу, который модулирует (например, регулирует, влияет, контролирует, изменяет) активность трансляционного аппарата, включая активность PIC и/или рибосомы. В некоторых аспектах желаемая трансляционная регуляторная активность способствует и/или повышает точность трансляции мРНК. В некоторых аспектах желаемая трансляционная регуляторная активность уменьшает и/или ингибирует ослабленное сканирование. Субъект: Используемый в данном документе термин «субъект» относится к любому организму, которому можно вводить композицию в соответствии с данным раскрытием, например, для экспериментальных, диагностических, профилактических и/или терапевтических целей. Иллюстративные субъекты включают животных (например, млекопитающих, таких как мыши, крысы, кролики, приматы, отличные от человека, и люди) и/или растения. В некоторых вариантах осуществления субъектом может быть пациент.
Лечение: Используемый в данном документе термин «лечение» относится к частичному или полному облегчению, ослаблению, улучшению, облегчению, задержке начала, ингибированию прогрессирования, уменьшению тяжести и/или уменьшению частоты возникновения одного или более симптомов или проявлений конкретной инфекции, заболевания, расстройства и/или патологического состояния. Например, «лечение» рака может относиться к ингибированию выживания, роста и/или распространения опухоли. Лечение может быть назначено субъекту, у которого нет признаков заболевания, расстройства и/или патологического состояния, и/или субъекту, у которого проявляются только ранние признаки заболевания, расстройства и/или патологического состояния, с целью снижения риска развития патологии, связанной с заболеванием, расстройством и/или патологическим состоянием.
Предотвращение: Используемый в данном документе термин «предотвращение» относится к частичному или полному ингибированию появления одного или более симптомов или проявлений конкретной инфекции, заболевания, расстройства и/или патологического состояния.
Опухоль: Как используется в данном документе «опухоль» представляет собой аномальный рост ткани, будь то доброкачественный или злокачественный.
Немодифицированный: Используемый в данном документе термин «немодифицированный» относится к любому веществу, соединению или молекуле до того, как он будет каким-либо образом изменен. Немодифицированный может, но не всегда, относиться к дикому типу или нативной форме биомолекулы. Молекулы могут подвергаться серии модификаций, в результате чего каждая модифицированная молекула может служить в качестве «немодифицированной» исходной молекулы для последующей модификации.
Содержание уридина: Термины «содержание уридина» или «содержание урацила» являются взаимозаменяемыми и относятся к количеству урацила или уридина, присутствующего в определенной последовательности нуклеиновой кислоты. Содержание уридина или урацила может быть выражено как абсолютное значение (общее количество уридина или урацила в последовательности) или относительное (процентное содержание уридина или урацила по отношению к общему числу нуклеотидных оснований в последовательности нуклеиновой кислоты).
Уридин-модифицированная последовательность: Термины «уридин-модифицированная последовательность» относятся к оптимизированной по последовательности нуклеиновой кислоте (например, к синтетической последовательности мРНК) с различным общим или локальным содержанием уридина (более высоким или низким содержанием уридина) или с различными структурами уридина (например, градиентное распределение или кластеризация) в отношении содержания уридина и/или структуры уридина предполагаемой последовательности нуклеиновой кислоты. В содержании данного раскрытия термины «уридин-модифицированная последовательность» и «урацил-модифицированная последовательность» считаются эквивалентными и взаимозаменяемыми.
«Кодон с высоким уровнем уридина» определяется как кодон, содержащий два или три уридина, «кодон с низким уровнем уридина» определяется как кодон, содержащий один уридин, и «безуридиновый кодон» представляет собой кодон без каких-либо уридинов. В некоторых вариантах осуществления уридин-модифицированная последовательность содержит замены кодонов с высоким уровнем уридина кодонами с низким уровнем уридина, замены кодонов с высоким уровнем уридина кодонами без уридина, замены кодонов с низким уровнем уридина кодонами с высоким уровнем уридина, замены кодонов с низким уровнем уридина кодонами без уридина, замена кодонов без уридина кодонами с низким уровнем уридина, замена кодонов без уридина кодонами с высоким уровнем уридина и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления кодон с высоким уровнем уридина может быть заменен другим кодоном с высоким уровнем уридина. В некоторых вариантах осуществления кодон с низким уровнем уридина может быть заменен другим кодоном с низким уровнем уридина. В некоторых вариантах осуществления кодон без уридина может быть заменен другим кодоном без уридина. Уридин-модифицированная последовательность может быть обогащенной уридином или обедненный уридином.
Обогащенная уридином: Используемые в данном документе термины «обогащенный уридином» и грамматические варианты относятся к увеличению содержания уридина (выраженного в абсолютном значении или в процентном значении) в оптимизированной по последовательности нуклеиновой кислоте (например, синтетической последовательности мРНК) по отношению к содержанию уридина в соответствующей кандидатной последовательности нуклеиновой кислоты. Обогащение уридином может быть осуществлено путем замены кодонов в предполагаемой последовательности нуклеиновой кислоты синонимичными кодонами, содержащими меньше нуклеотидных оснований уридина. Обогащение уридином может быть глобальным (т.е. относительно всей длины предполагаемой последовательности нуклеиновой кислоты) или локальным (т.е. относительно подпоследовательности или области предполагаемой последовательности нуклеиновой кислоты).
Обедненная уридином: Используемые в данном документе термины «обедненный уридином» и грамматические варианты относятся к уменьшению содержания уридина (выраженного в абсолютном значении или в процентном значении) в оптимизированной по последовательности нуклеиновой кислоте (например, синтетической последовательности мРНК) по отношению к содержанию уридина в соответствующей кандидатной последовательности нуклеиновой кислоты. Обеднение уридином может быть осуществлено путем замены кодонов в предполагаемой последовательности нуклеиновой кислоты синонимичными кодонами, содержащими меньше нуклеотидных оснований уридина. Обеднение уридином может быть глобальным (т.е. относительно всей длины предполагаемой последовательности нуклеиновой кислоты) или локальным (т.е. относительно подпоследовательности или области предполагаемой последовательности нуклеиновой кислоты).
Эквиваленты и объем
Специалисты в данной области техники распознают или смогут установить, используя не более чем обычные эксперименты, множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления в соответствии с раскрытым в данном документе описанием. Объем данного раскрытия не предназначен для ограничения нижеприведенным описанием, а скорее соответствует изложенному в прилагаемой формуле изобретения.
В формуле изобретения формы единственного числа могут означать один или более чем один, если не указано иное или это иным образом не очевидно из контекста. Пункты формулы изобретения или описания, которые включают «или» между одним или более членами группы, считаются удовлетворенными, если один, более одного или все члены группы присутствуют, применяются или имеют отношение к определенному продукту или способу, если не указано иное или это иным образом не очевидно из контекста. Описание изобретения включает в себя варианты осуществления изобретения, в которых ровно один член группы присутствует в, применяется в или иным образом относится к данному продукту или способу. Описание изобретения включает в себя варианты осуществления изобретения, в которых более чем один из группы членов присутствует в, применяется в или иным образом относится к данному продукту или способу.
Также отмечается, что термин «содержащий» предназначен для того, чтобы быть открытым и допускать включения дополнительных элементов или этапов, но не требует этого. В тех случаях, когда в данном документе используется термин «содержащий», термин «состоящий из», таким образом, также охватывается и раскрывается.
Когда указаны диапазоны, включаются конечные точки. Кроме того, следует понимать, что если не указано иное или это иным образом не очевидно из контекста и понимания специалиста в данной области техники, значения, которые выражаются как диапазоны, могут принимать любое конкретное значение или поддиапазон в указанных диапазонах в разных вариантах осуществления изобретения, до десятой части единицы нижнего предела диапазона, если из контекста явно следует иное.
Все цитируемые источники, например, ссылки, публикации, базы данных, записи в базах данных и статьи, цитируемые в данном документе, включены в данную заявку посредством ссылки, даже если это прямо не указано в цитировании. В случае противоречивых утверждений цитируемого источника и данной заявки, утверждение в данной заявке имеет преимущественную силу.
Примеры
Раскрытие будет более полно понято с помощью ссылки на следующие примеры. Однако их не следует рассматривать как ограничивающие объем раскрытия. Понятно, что примеры и варианты осуществления, описанные в данном документе, предназначены только для иллюстративных целей и что различные модификации или изменения в их свете будут предложены специалистам в данной области техники и должны быть включены в сущность и сферу применения этой заявки и объема прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1: Конструкты иммуностимуляторной мРНК STING
В данном примере был создан ряд конструктов ммРНК, которые кодируют конститутивно активированные формы STING человека, и конструкты были протестированы на их способность стимулировать продукцию интерферона-β (ИФН-β). Белок STING человека, кодируемый этими конструктами, был конститутивно активирован путем введения одной или более точечных мутаций. Следующие одиночные или комбинированные точечные мутации были протестированы: (i) V155M; (ii) R284T; (iii) V147L/N154S/V155M; и (iv) R284M/V147L/N154S/V155M. Данные конструкты обычно также кодируют эпитопную метку на N-конце или С-конце для облегчения обнаружения. Были проверены различные эпитопные метки (FLAG, Myc, CT, HA, V5). Кроме того, все конструкты, содержащие кэп 1 5'Cap (7mG(5')ppp(5')NlmpNp), 5'-НТО, 3'-НТО, поли(А)-хвост из 100 нуклеотидов, и были полностью модифицированы 1-метил-псевдоуридином (m1ψ). Аминокислотные последовательности ОРС репрезентативных конститутивно активных конструктов STING человека без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 1-10. Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие эти аминокислотные последовательности, приведены в SEQ ID NO: 199-208 и 1442-1450. Иллюстративная 5'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 21 и 1323. Иллюстративная 3'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 22. Иллюстративная 3'-НТО, содержащая сайты связывания miR-122 и miR-142-3p, для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 23.
Чтобы определить, могут ли конститутивно активные конструкты STING стимулировать продукцию ИФН-β, конструкты были трансфицированы в клетки TF1a человека. Конструкты человеческого и мышиного STING дикого типа (неконститутивно активные) использовали в качестве отрицательных контролей. Двадцать пять тысяч клеток на лунку высевали в 96-луночные планшеты, и конструкты ммРНК (250 нг) трансфицировали в них с использованием Lipofectamine 2000. Через 24 и 48 часов супернатанты собирали и определяли уровни ИФН-β при помощи стандартного ИФА. Результаты, приведенные на Фиг. 1, демонстрируют, что конститутивно активные конструкты STING стимулировали продукцию ИФН-β по сравнению с контролями (неконститутивно активными) человеческого и мышиного STING дикого типа. В то время как все четыре мутантных конструкта STING стимулировали продукцию ИФН-β, мутант V155M и мутант R284T проявили наибольшую активность. Эти результаты демонстрируют способность конститутивно активных конструктов мРНК STING усиливать иммунные ответы посредством стимуляции продукции ИФН-β.
Во второй серии экспериментов репортерный ген, транскрипция которого управлялась интерферон-стимулируемым реагирующим элементом (ISRE), использовали для проверки способности панели конститутивно активных конструктов мРНК STING активировать ISRE в репортерной мышиной линии клеток STING KO, происходящей из меланоцитов B16. Результаты, приведенные на Фиг. 2, демонстрируют, что конститутивно активные конструкты STING стимулировали экспрессию репортерного гена, что указывает на то, что конструкты были способны активировать интерферон-стимулируемый реагирующий элемент (ISRE).
Пример 2: Конструкты иммуностимуляторных мРНК IRF3 и IRF7
В этом примере был создан ряд конструктов ммРНК, которые кодируют конститутивно активированные формы IRF3 или IRF7, и конструкты были протестированы на их способность активировать интерферон-стимулируемый реагирующий элемент (ISRE). Аминокислотные последовательности ОРС репрезентативных конститутивно активных конструктов IRF3 мыши и человека, содержащих точечную мутацию S396D, без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 11-12. Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие эти аминокислотные последовательности, приведены в SEQ ID NO: 210-211. Аминокислотная последовательность ОРС конструкта человеческого IRF7 дикого типа без какой-либо эпитопной метки приведена в SEQ ID NO: 13 (кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 212). Аминокислотные последовательности ОРС репрезентативных конститутивно активных конструктов IRF7 человека без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 14-18. Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие эти аминокислотные последовательности, приведены в SEQ ID NO: 213-217 и 142-1459. Аминокислотные последовательности ОРС репрезентативных конструктов укороченных IRF7 человека (неактивные «нулевые» мутации) без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 19-20. Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие эти аминокислотные последовательности, приведены в SEQ ID NO: 218-219. Данные конструкты обычно также кодируют эпитопную метку на N-конце или С-конце для облегчения обнаружения. Были проверены различные эпитопные метки (FLAG, Myc, CT, HA, V5). Кроме того, все конструкты, содержащие кэп 1 5'Cap (7mG(5')ppp(5')NlmpNp), 5'-НТО, 3'-НТО, поли(А)-хвост из 100 нуклеотидов, и были полностью модифицированы 1-метил-псевдоуридином (m1ψ). Иллюстративная 5'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 21 и 1323. Иллюстративная 3'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 22. Иллюстративная 3'-НТО, содержащая сайты связывания miR-122 и miR-142-3p, для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 23.
Репортерную клеточную линию, использованную в Примере 1, транскрипцию которого управлялась интерферон-стимулируемый реагирующий элемент (ISRE), использовали для проверки способности конститутивно активных конструктов мРНК IRF3 и IRF7 активировать ISRE. Результаты, приведенные на Фиг. 3А-3 В, которые демонстрируют, что конститутивно активные конструкты IRF3 (Фиг. 3А) и конститутивно активные конструкты IRF7 (Фиг. 3B) стимулировали экспрессию репортерного гена, что указывает на то, что конструкты были способны активировать интерферон-стимулируемый реагирующий элемент (ISRE).
Пример 3: Конструкты иммуностимуляторных мРНК IKKβ, cFLIP и RIPK1
В данном примере репортерный ген люциферазы, транскрипция которого управлялась сигнальным путем NFκB, был использован для тестирования способности конститутивно активных конструктов мРНК IKK, cFLIP и RIPK1 активировать сигналинг NFκB.
Конститутивно активный конструкт IKKβ содержал следующие две точечные мутации: S177E/S181E. Конститутивно активные конструкты IKKα или IKKβ содержали мутации PEST. Аминокислотные последовательности ОРС конститутивно активных конструктов IKKβ без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 146-149. Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие белок SEQ ID NO: 146, приведены в SEQ ID NO: 1414 и 1485. Аминокислотные последовательности ОРС конститутивно активных конструктов IKKα или IKKβ, содержащих мутацию PEST, без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 150, 152, 154 и 156 (кодируются нуклеотидными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 151, 153, 155 и 157, соответственно, или SEQ ID NO: 1428, 1397, 1429 и 1430, соответственно). Конститутивно активные конструкты cFLIP содержали cFLIP-L, cFLIP-S (aк 1-227), cFLIP p22 (aк 1-198), cFLIP p43 (aк 1-376) или cFLIP p12 (aк 377-480). Аминокислотные последовательности ОРС конструктов cFLIP без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 141-145. Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие данные белки cFLIP, приведены в SEQ ID NO: 1398-1402 и 1469-1473. Структуры различных конститутивно активных конструктов RIPK1 дополнительно описаны, например, в Yatim, N. et al. (2015) Science 350:328-334 или Orozco, S. et al. (2014) Cell Death Differ. 21:1511-1521. Аминокислотные последовательности ОРС конститутивно активных конструктов RIPK1 без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 158-163. Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие данные белки RIPK1, приведены в SEQ ID NO: 1403-1408 и 1474-1479. В дополнение к открытой рамке cчитывания, все конструкты, содержащие кэп 1 5'Cap (7mG(5')ppp(5')NlmpNp), 5'-НТО, 3'-НТО, поли(А)-хвост из 100 нуклеотидов, и были полностью модифицированы 1-метил-псевдоуридином (m1ψ). Иллюстративная 5'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 21 и 1323. Иллюстративная 3'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 22. Иллюстративная 3'-НТО, содержащая сайты связывания miR-122 и miR-142-3p, для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 23.
В первой серии экспериментов конструкты или cFLIP, или IKKβ (12,5 нг РНК) трансфицировали в клетки B16F10, MC38 или HEK293 вместе с репортерным геном NFκB-luc, и проводили анализ репортерного гена двойной люциферазы через 24 часа после трансфекции в качестве индикатора активации сигналинга NFκB. Результаты, приведенные на Фиг. 4, демонстрируют, что конститутивно активные конструкты cFLIP и IKKβ стимулировали экспрессию репортерного гена, что указывает на то, что конструкты были способны активировать сигналинг NFκB. Во второй серии экспериментов конструкты RIPK1 трансфицировали в клетки B16F10 вместе с репортерным геном NFκB-luc, и проводили анализ репортерного гена двойной люциферазы через 24 часа после трансфекции в качестве индикатора активации сигналинга NFκB. Результаты, приведенные на Фиг. 5, демонстрируют, что конститутивно активные конструкты RIPK1 стимулировали экспрессию репортерного гена, что указывает на то, что конструкты были способны активировать сигнальный путь NFκB.
Пример 4: Конструкты иммуностимуляторной мРНК DIABLO
В данном примере был создан ряд конструктов ммРНК, которые кодируют DIABLO, и конструкты были протестированы на их способность индуцировать продукцию цитокинов. Данные конструкты обычно также кодируют эпитопную метку на N-конце или С-конце для облегчения обнаружения. Были проверены различные эпитопные метки (FLAG, Myc, CT, HA, V5). Кроме того, все конструкты, содержащие кэп 1 5'Cap (7mG(5')ppp(5')NlmpNp), 5'-НТО, 3'-НТО, поли(А)-хвост из 100 нуклеотидов, и были полностью модифицированы 1-метил-псевдоуридином (m1ψ). Аминокислотные последовательности ОРС конструктов DIABLO без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 165-172. Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие белок DIABLO SEQ ID NO: 169, приведены в SEQ ID NO: 1416 и 1487. Иллюстративная 5'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 21 и 1323. Иллюстративная 3'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 22. Иллюстративная 3'-НТО, содержащая сайты связывания miR-122 и miR-142-3p, для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 23.
Чтобы определить, могут ли конструкты DIABLO индуцировать продукцию цитокинов, конструкты трансфицировали в клетки SKOV3. Десять тысяч клеток на лунку высевали в 96-луночные планшеты, и конструкты ммРНК трансфицировали в них с использованием Lipofectamine 2000. Была измерена стимуляция продукции цитокинов конструктами ммРНК DIABLO в клетках SKOV3. Результаты, приведенные на Фиг. 6 для ФНО-α и на Фиг. 7 для интерлейкина 6 (ИЛ-6), демонстрируют, что ряд конструктов ммРНК DIABLO стимулирует продукцию цитокинов клетками SKOV3.
Пример 5: Иммуностимуляторные мРНК усиливают ответы в отношении вакцины против HPV
В данном примере была исследована эффективность и длительность ответов на вакцину на основе мРНК E6/E7 вируса папилломы человека (HPV), используемую в комбинации с иммуностимуляторами STING, IRF3 или IRF7. Известно, что специфический иммунный ответ на вирус папилломы человека (HPV) в микроокружении шейки матки играет ключевую роль в эрадикации инфекции и уничтожении мутированных клеток. Однако известно, что HPV высокого риска модулируют иммунные клетки для создания иммуносупрессивного микроокружения (см., например, Prata, T.T. et al. (2015) Immunology 146:113-121). Таким образом, подход к вакцинации против HPV, который приводит к устойчивому и длительному иммунному ответу, крайне желателен.
Вакцины против HPV, использованные в этом примере, представляли собой конструкты мРНК, кодирующие или внутриклеточные, или растворимые формы антигенов HPV 16 Е6 и Е7, обозначенные в данном документе как iE6/E7 и sE6/E7, соответственно. Для создания растворимого формата сигнальный пептид, необходимый для секреции, был слит с N-концом антигена. Последовательность сигнального пептида была получена из V-III области HAH каппа-цепи Ig. Мышей иммунизировали внутримышечно вакциной на основе мРНК iE6/E7 или sE6/E7 (в дозе 0,25 мг/кг) на 0-е и 14-е сутки в комбинации с контрольным конструктом мРНК (NTFIX) или конструктом иммуностимуляторной мРНК STING, IRF3 или IRF7 (в дозе 0,25 мг/кг). Конститутивно активный иммуностимулятор STING содержал мутацию V155M (мышиный вариант, соответствующий SEQ ID NO: 1). Конститутивно активный иммуностимулятор IRF3 содержал мутацию S396D (соответствующий SEQ ID NO: 12). Конститутивно активный иммуностимулятор IRF7 содержал внутреннюю делецию и шесть точечных мутаций (мышиный вариант, соответствующий SEQ ID NO: 18). Конструкт вакцины против HPV и иммуностимуляторный конструкт совместно составляли в липидные наночастицы MC3.
На 21 и 53 сутки клетки селезенки и мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) от мышей в каждой тестируемой группе повторно стимулировали ex vivo в течение 4 часов при 37 градусах C в присутствии GolgiPlug™ (содержащего брефельдин A; BD Biosciences) одним из следующих способов: или пулом пептидов E6 (содержащим 37 пептидов E6, последовательности которых приведены в SEQ ID NO: 36-72), пулом пептидов E7 (содержащим 22 пептида E7, последовательности которых приведены в SEQ ID NO: 73-94), одиночным пептидом Е6 (8 отдельных пептидов), одиночным пептидом Е7 (7 отдельных пептидов) или в отсутствии пептидов (контроль). Каждый пептид давали в дозе 0,2 мкг/мл. Ответы на CD8 вакцины оценивали путем внутриклеточного окрашивания (ICS) на ИФН-γ или ФНО-α.
Репрезентативные результаты ICS для E7-специфических ответов клеток селезенки на 21-е сутки в отношении ИФН-γ и ФНО-α приведены на Фиг. 8A (ИФН-γ) и на Фиг. 8B (ФНО-α). Репрезентативные результаты ICS для E6-специфических ответов клеток селезенки на 21-е сутки в отношении ИФН-γ и ФНО-α приведены на Фиг. 9A (ИФН-γ) и на Фиг. 9B (ФНО-α). Результаты на Фиг. 8A-8B и 9A-9B демонстрируют, что ответы на CD8 вакцины (как на внутриклеточный, так и на растворимый антигенный формат) были значительно усилены, когда иммуностимуляторы STING, IRF3 или IRF7 были совместно составлены с вакциной, причем эпитоп E7 был сильнее и менее вариабельным, чем эпитоп Е6, а растворимая форма антигена сильнее, чем внутриклеточная форма антигена. Было показано, что эти усиленные ответы на CD8 вакцины при помощи иммуностимуляторов являются длительными, о чем свидетельствуют репрезентативные данные ICS в отношении ИФН-γ клеток селезенки на 21 сутки в сравнении с E7-специфическими клетками селезенки на 53 сутки, приведенные на Фиг. 10А и 10 В, соответственно. Результаты, аналогичные данным о клетках селезенки, наблюдались в экспериментах с МКПК (данные не показаны). Способность STING улучшать длительность антигенспецифических CD8 ответов дополнительно демонстрируется данными ICS на ИФН-γ, приведенными на Фиг. 11А (Е7-специфические ответы от мышей, иммунизированных внутриклеточным Е6/Е7) и на Фиг. 11B (E7-специфические ответы от мышей, иммунизированных растворимым E6/E7), в которых в течение 7-недельного эксперимента было продемонстрировано, что у мышей, получавших STING, сохранялся более высокий процент антигенспецифических CD8 T-клеток.
+
+
+
Также был исследован процент CD8bклеток среди живых CD45клеток. Результаты 21-х суток по сравнению с 53-ми сутками для клеток селезенки приведены на Фиг. 12А и 12 В, соответственно. Результаты демонстрируют, что иммуностимуляторы (в частности, конструкт STING) увеличивают общую популяцию CD8bна 21-е сутки, но не на 53-и сутки.
lo
+
lo
+
+
Способность иммунностимуляторных конструктов усиливать ответ на CD8 вакцину была дополнительно подтверждена окрашиванием E7-MHC1-тетрамером. Репрезентативные результаты для клеток селезенки на 21-е и 53-и приведены на Фиг. 13А и 13 В, соответственно. Результаты окрашивания E7-MHC-1-тетрамером соответствовали результатам ICS, рассмотренным выше, хотя они были более вариабельными. Как показано на Фиг. 14A-14D, было обнаружено, что большинство тетрамер-положительных клеток CD8 имеют фенотип эффекторных CD62L клеток памяти. Сравнение 21-х суток и 53-х суток для E7-тетрамерCD8 клеток показало, что данный фенотип эффекторных CD62L клеток памяти сохранялся на протяжении всего исследования. Дополнительные эксперименты с окрашиванием продемонстрировали, что иммуностимуляторы немного снижали % всех Foxp3Treg CD4 Т-клеток (данные не показаны) и не изменяли % CD138плазмобластов (данные не показаны).
Пример 6: Иммуностимуляторные мРНК усиливают ответы в отношении вакцины против рака MC38
В данном примере исследованы специфическая активность и устойчивость ответов на противораковую вакцину на основе мРНК MC38, используемую в комбинации с конструктами иммуностимуляторных STING, IRF3 или IRF7. Модель мышиной опухоли MC38 использовали для идентификации иммуногенных мутантных пептидов, содержащих неоэпитопы, способные стимулировать противоопухолевые Т-клеточные ответы (см., например, Yadav, M. et al. (2014) Nature 515:572-576). Таким образом, подход к вакцинации против рака, который приводит к устойчивому и длительному иммунному ответу против опухолевых неоэпитопов, является весьма желательным.
MC38-вакцина, использованная в данном примере, представляла собой конструкт мРНК, кодирующий конкатемер ADR трех 25-мерных мутантных пептидов, содержащих опухолевые неоэпитопы, полученные из Adpgk, Dpagt1 и Reps1 (данная вакцина также упоминается в данном документе как ADRvax). Конструкт мРНК кодирует открытую рамку считывания, приведенную в SEQ ID NO: 179, который также включает в себя N-концевой His-tag (гистидиновая метка) для легкого обнаружения. Мышей иммунизировали внутримышечно вакциной на основе мРНК ADRvax (в дозе 0,25 мг/кг) на 0-е и 14-е сутки в комбинации с контрольным конструктом мРНК (NTFIX) или с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING, IRF3 или IRF7 (в дозе 0,25 мг/кг). Конститутивно активный иммуностимулятор STING содержал мутацию V155M (мышиный вариант, соответствующий SEQ ID NO: 1). Конститутивно активный иммуностимулятор IRF3 содержал мутацию S396D (соответствующий SEQ ID NO: 12). Конститутивно активный иммуностимулятор IRF7 содержал внутреннюю делецию и шесть точечных мутаций (мышиный вариант, соответствующий SEQ ID NO: 18). Конструкт вакцины на основе MC38 и иммуностимуляторный конструкт совместно составляли в липидные наночастицы MC3.
+
+
+
На 21-е и 35-е сутки CD8клетки селезенки мышей в каждой тестируемой группе повторно стимулировали ex vivo в течение 4 часов при 37 градусах C в присутствии GolgiPlug™ (содержащего брефельдин A; BD Biosciences) или пептидами ADR дикого типа или мутантными MC38 (1 мкг/мл на пептид) и CD8 вакцины оценивали путем внутриклеточного окрашивания (ICS) на ИФН-γ. Репрезентативные данные ICS для ответов, специфических для ADR MC38, на 21-е сутки и 35-е сутки для CD8клеток селезенки по ИФН-γ представлены на 15А (21-е сутки) и Фиг. 15B (35-е сутки). Подобные результаты наблюдали для ICS на ФНО-α и для CD8МКПК. Результаты демонстрируют, что ответы на CD8-вакцины были значительно усилены иммуностимуляторным конструктом STING и умеренно усилены иммуностимуляторными конструктами IRF3 и IRF7. Первоначальное улучшение антигенспецифического ответа CD8 для мышей, получавших иммуностимуляторы, наблюдалось на 21-е сутки (примерно 5% против 1% для лечения STING по сравнению с контролем), которые продолжали улучшаться на 35-е сутки (до 15% для лечения STING по сравнению с контролем), тем самым демонстрируя продолжительность ответа.
+
+
+
+
lo
+
+
Также был исследован процент CD8bклеток среди живых CD45клеток. Результаты для клеток селезенки и МКПК на 35-е сутки приведены на Фиг. 16А, который демонстрирует, что конструкты иммуностимуляторов увеличивают общую популяцию CD8b. Как показано на Фиг. 16B, большинство CD8клеток селезенки и МКПК, как было установлено, имеют фенотип эффекторных CD62клеток памяти. Дополнительные эксперименты с окрашиванием продемонстрировали, что иммуностимуляторный конструкт STING и IRF7 немного снижал % общего количества Foxp3Treg CD4 T-клеток (данные не показаны). Дополнительные эксперименты с окрашиванием показали, что иммуностимуляторы не изменяли % CD138плазмобластов (данные не показаны).
Пример 7: Иммуностимуляторные мРНК усиливают ответы на бактериальные вакцины
В данном примере была исследована эффективность ответов на бактериальную вакцину на основе мРНК, используемую в комбинации с иммуностимулятором STING, в частности, влияние иммуностимулятора на гуморальный иммунный ответ (продукцию антител) против бактериальных антигенов.
Бактериальная вакцина, использованная в данном примере, представляла собой пул конструктов мРНК, кодирующих панель бактериальных антигенных пептидов, которые были созданы в данной области техники для обеспечения защитного иммунитета против бактериальной инфекции. Таким образом, вакцина, использованная в данном примере, представляла собой поливалентную бактериальную вакцину на основе мРНК. Конструкты мРНК бактериального пептидного антигена кодировали ОРС для пептидных антигенов и также содержали кэп 1 5'Cap (7mG(5')ppp(5')NlmpNp), 5'-НТО, 3'-НТО, поли(А)-хвост из 100 нуклеотидов, и были полностью модифицированы 1-метил-псевдоуридином (m1ψ). Иллюстративная 5'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 21 и 1323. Иллюстративная 3'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 22. Иллюстративная 3'-НТО, содержащая сайты связывания miR-122 и miR-142-3p, для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 23. Данные конструкты необязательно также могут кодировать эпитопную метку на N-конце или С-конце для облегчения обнаружения. Были проверены различные эпитопные метки (FLAG, Myc, CT, HA, V5).
Конструкты мРНК бактериального пептидного антигена вводили мышам в дозе 0,2 мкг или 0,8 мкг на антиген на 0-е, 14-е и 28-е сутки или отдельно, или в комбинации с конструктом иммуностимуляторного мРНК STING. Конститутивно активный иммуностимулятор STING содержал мутацию V155M (мышиный вариант, соответствующий SEQ ID NO: 1). Сыворотку собирали до обработки и на 14-е, 28-е и 35-е сутки. Титры антител сравнивали между мышами, которых лечили только конструктами мРНК бактериального пептидного антигена, и теми мышами, которых лечили конструктами мРНК бактериального пептидного антигена в комбинации с конструктами мРНК STING. Мыши, получавшие лечение более высокой дозой (0,8 мкг) конструктов мРНК бактериального антигенного пептида, показали умеренное влияние на титры антигенспецифических антител при комбинированном лечении конструктами STING (данные не показаны). Однако, как показано на ФИГ. 17, комбинированное лечение конструктами STING продемонстрировало значительное влияние на титры антигенспецифических антител у мышей, которых лечили более низкой дозой (0,2 мкг) конструктов мРНК бактериального пептидного антигена (называемых РНК 0298, 2753, 2723, 2635, 1507, 0992 и 0735 на Фиг. 17). Данные результаты демонстрируют, что иммуностимулятор STING усиливает гуморальный иммунный ответ против бактериальных пептидных антигенов, кодируемых конструктами бактериальных вакцин на основе мРНК, особенно когда конструкт бактериальной вакцины на основе мРНК используется в более низких дозах.
Пример 8: Конструкты мРНК KRAS-STING
Сообщалось о всестороннем исследовании мутаций Ras при различных типах рака (Prior, I.A. et al. (2012) Cancer Res. 72:2457-2467). Данное исследование продемонстрировало, что тремя наиболее частыми мутациями KRAS при колоректальном раке являются G12D, G12V и G13D. Был подготовлен ряд мутантных конструктов мРНК KRAS, которые кодируют один или более пептидов KRAS, содержащих одну из этих трех мутаций, для использования в качестве противоопухолевых вакцин на основе мРНК KRAS. Кроме того, для изучения влияния иммуностимуляторов на основе мРНК на ответы на KRAS-вакцины был приготовлен ряд конструктов мРНК, которые кодируют один или более мутантных пептидов KRAS, связанных на N-конце или С-конце, с последовательностью, кодирующей STING, в качестве иммунностимулятора. Таким образом, в этих конструктах мРНК KRAS-STING вакцинный антиген(ы) и иммуностимулятор кодируются одним и тем же конструктом мРНК.
Были получены конструкты мРНК мутантного пептида KRAS, которые кодировали: 15-мерный пептид, имеющий мутацию G12D, G12V или G13D (аминокислотная последовательность, которого приведена в SEQ ID NO: 95-97, соответственно); 25-мерный пептид, имеющий мутацию G12D, G12V или G13D (SEQ ID NO: 98-100, соответственно); три копии 15-мерного пептида, имеющего мутацию G12D, G12V или G13D (SEQ ID NO: 101-103, соответственно); или три копии 25-мерного пептида, имеющего мутацию G12D, G12V или G13D (SEQ ID NO: 104-106, соответственно). Дополнительные конструкты кодировали одну копию или три копии 25-мерного пептида, имеющего мутацию G12C (SEQ ID NO: 131-132 соответственно) или 25-мерный пептид дикого типа (SEQ ID NO: 133). В некоторых вариантах осуществления мутация G12C KRAS может использоваться в комбинации с мутацией G12D, G12V или G13D или их комбинациями. Нуклеотидные последовательности, кодирующие эти мутантные пептиды KRAS, представлены в Примере 9.
Были получены конструкты мРНК мутантного пептида KRAS-STING, имеющие кодирующую последовательность STING на N-конце, которая кодировала: 15-мерный пептид, имеющий мутацию G12D, G12V или G13D (аминокислотная последовательность, которого приведена в SEQ ID NO: 107-109, соответственно); 25-мерный пептид, имеющий мутацию G12D, G12V или G13D (SEQ ID NO: 110-112, соответственно); три копии 15-мерного пептида, имеющего мутацию G12D, G12V или G13D (SEQ ID NO: 113-115, соответственно); или три копии 25-мерного пептида, имеющего мутацию G12D, G12V или G13D (SEQ ID NO: 116-118, соответственно). В некоторых вариантах осуществления мутация G12C KRAS может использоваться в комбинации с мутацией G12D, G12V или G13D или их комбинациями. Репрезентативные нуклеотидные последовательности, кодирующие эти конструкты пептида KRAS-STING, имеющие кодирующую последовательность STING на N-конце, приведены в SEQ ID NO: 220 и 222.
Были получены конструкты мРНК мутантного пептида KRAS-STING, имеющие кодирующую последовательность STING на C-конце, которая кодировала: 15-мерный пептид, имеющий мутацию G12D, G12V или G13D (аминокислотная последовательность, которого приведена в SEQ ID NO: 119-121, соответственно); 25-мерный пептид, имеющий мутацию G12D, G12V или G13D (SEQ ID NO: 122-124, соответственно); три копии 15-мерного пептида, имеющего мутацию G12D, G12V или G13D (SEQ ID NO: 125-127, соответственно); или три копии 25-мерного пептида, имеющего мутацию G12D, G12V или G13D (SEQ ID NO: 128-130, соответственно). В некоторых вариантах осуществления мутация G12C KRAS может использоваться в комбинации с мутацией G12D, G12V или G13D или их комбинациями. Репрезентативные нуклеотидные последовательности, кодирующие эти конструкты пептида KRAS-STING, имеющие кодирующую последовательность STING на C-конце, приведены в SEQ ID NO: 221 и 223.
Данные конструкты также могут кодировать эпитопную метку на N-конце или С-конце для облегчения обнаружения. Могут быть использованы разные эпитопные метки (например, FLAG, Myc, CT, HA, V5). Кроме того, все конструкты, содержащие кэп 1 5'Cap (7mG(5')ppp(5')NlmpNp), 5'-НТО, 3'-НТО, поли(А)-хвост, и были полностью модифицированы 1-метил-псевдоуридином (m1ψ). Иллюстративная 5'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 21 и 1323. Иллюстративная 3'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 22. Иллюстративная 3'-НТО, содержащая сайты связывания miR-122 и miR-142-3p, для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 23.
+
Для анализа ответов на вакцины у мышей, получавших или конструкт вакцины на основе мРНК мутантного пептида(ов) KRAS, или конструкт мРНК мутантного пептида(ов) KRAS-иммуностимулятора STING, мышей (HLA-A*11:01 или HLA-A*) 2:01; Taconic) лечили конструктом вакцины на основе мРНК мутантного пептида KRAS (например, кодирующий один из SEQ ID NO: 95-106) или конструктом мРНК мутантного пептида(ов) KRAS-иммуностимулятора STING (например, кодирующий один из SEQ ID NO: 107-130). Мышей иммунизируют внутримышечно на 1-е и 15-е сутки (0,5 мг/кг) и умерщвляют на 22-е сутки. Чтобы проверить ответы в отношении CD8 вакцины, CD8клетки селезенки и МКПК повторно стимулируют ex vivo в течение 4 часов при 37 градусах C в присутствии GolgiPlug™ (содержащего брефельдин A; BD Biosciences) или мутантными пептидами KRAS (G12D, G12V или G13D), или пептидом KRAS дикого типа (1 мкг/мл на пептид). Ответы в отношении CD8 вакцины можно затем оценить путем внутриклеточного окрашивания (ICS) на ИФН-γ и/или ФНО-α. Усиленные ответы ICS для ИФН-γ и/или ФНО-α у мышей, получавших вакцину на основе мутантного пептида KRAS с конструктом иммуностимуляторной мРНК STING, по сравнению с лечением конструктом мРНК-вакцины на основе мутантного пептида KRAS, указывает на то, что иммуностимулятор STING усиливает KRAS-специфические ответы в отношении CD8 вакцины.
Пример 9: Применение конструкта иммуностимуляторной мРНК в комбинации с активирующими конструктами мРНК мутантного онкогенного пептида KRAS
В данном примере конструкты мРНК мутантного пептида KRAS используются в комбинации с отдельной конститутивно активным конструктом иммуностимуляторной мРНК STING для усиления иммунных ответов на мутантные пептиды KRAS.
KRAS является наиболее часто мутируемым онкогеном при раке человека (~ 15%). Мутации KRAS происходят в основном в паре «горячих точек мутагенеза» и активируют онкоген. Предыдущие исследования показали ограниченную способность количественно увеличивать Т-клетки, специфические в отношении онкогенной мутации. Тем не менее, многое из этого было сделано в контексте наиболее распространенного аллеля HLA (A2, который встречается у ~ 50% представителей европеоидной расы). Совсем недавно было продемонстрировано, что (а) специфические Т-клетки могут вырабатываться против точечных мутаций в отношении менее распространенных аллелей HLA (A11, C8) и (b) выращивание данных клеток ex-vivo и введение их обратно пациенту опосредовало резкий ответ опухоли у пациента с раком легкого. (N Engl J Med 2016; 375:2255-2262December 8, 2016DOI: 10.1056/NEJMoa1609279).
Как показано в Таблице 5 ниже, при CRC (колоректальный рак) только 3 мутации (G12V, G12D и G13D) составляют 96% мутаций KRAS у этой злокачественной опухоли. Кроме того, все пациентом с CRC устанавливают стандартную мутацию в отношении KRAS как стандарт лечения.
Таблица 5
COSMIC* учет вариантов
Все типы рака
%
CRC
%
G12S
1849
1%
G12V
9213
4%
5215
29%
G12C
435
2%
G12D
13634
7%
8083
44%
G12A
2179
1%
G12R
1244
1%
G13D
5084
2%
4267
23%
18%
96%
Тестируемые
208629
18271
*http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/gene/analysis?In=KRAS
В другом наборе данных COSMIC 73,68% мутаций KRAS при колоректальном раке приходится на эти 3 мутации (G12V, G12D и G13D) (Таблица 6).
Таблица 6
рак толстой кишки
%
рак прямой кишки
%
общая
%
12D
635
35,04
178
33,46
813
34,68
12V
364
20,09
124
23,31
488
20,82
13D
338
18,65
88
16,54
426
18,17
73,68
Prior et al. исследовали и суммировали изоформ-специфические точечные мутаций в отношении HRAS, KRAS и NRAS, соответственно (Prior et al. Cancer Res. 2012 May 15; 72(10): 2457-2467). Данные, представляющие общее количество опухолей с каждой точечной мутацией, были собраны из выпуска COSMIC v52. Сообщается о наиболее частых мутациях для каждой изоформы в отношении каждого типа рака (см. Таблицу 2, Prior et al.).
Кроме того, вторичные мутации KRAS были выявлены у пациентов, устойчивых к блокаде EGFR. RAS находится ниже EGFR, и было обнаружено, что он представляет собой механизм устойчивости к методам лечения блокадой EGFR. Композиции и способы, описанные в данном документе могут быть нацелены на мутантные опухоли KRAS, устойчивые к блокаде EGFR. В нескольких случаях у одного и того же пациента было выявлено более одной мутации KRAS (одновременно могут встречаться до четырех разных мутаций). Diaz et al. сообщает об этих вторичных мутациях KRAS после установления блокады EGFR (см. дополнительную Таблицу 2), и Misale et al. сообщает о вторичных мутациях KRAS после блокады EGFR (см. Фиг. 3B) (Diaz et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers, Nature 486:537 (2012); Misale et al. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer, Nature 486:532 (2012)). Этот спектр мутаций, по-видимому, несколько отличается от мутантов первичной опухоли при колоректальном раке.
Как показано на ФИГ. 18, NRAS также мутирует при колоректальном раке, но с меньшей частотой, чем KRAS, на основе анализа данных, доступных в cBioPortal.
В данном примере животным вводят иммуномодулирующую терапевтическую композицию, которая содержит мРНК, кодирующую по меньшей мере один активирующий мутантный пептид онкогена, например, по меньшей мере одну активирующую мутацию KRAS, отдельно или в комбинации с конструктом иммуностимуляторной мРНК, например, конститутивно активный конструкт мРНК STING, например, кодирующий последовательность, как показано в любой из SEQ ID NO: 1-10, такой как, например, конструкт мРНК, кодирующий конститутивно активный белок STING человека, содержащий мутацию V155M, имеющую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, и кодирующий нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 199.
Иллюстративные последовательности мутантных пептидов KRAS и конструкты мРНК приведены в Таблицах 7-9.
Таблица 7: Последовательности мутантных пептидов KRAS
Последовательность 9 АА
15mer
25mer
G12D
VVGADGVGK(SEQ ID NO:180)
MKLVVVGADGVGKSAL (SEQ ID NO:95)
MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO:98)
G12V
VVGAVGVGK(SEQ ID NO:181)
MKLVVVGAVGVGKSAL (SEQ ID NO:96)
MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO:99)
G13D
VGAGDVGKS(SEQ ID NO:182)
MLVVVGAGDVGKSALT (SEQ ID NO:97)
MTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO:100)
G12C
VVGACGVGK(SEQ ID NO:183)
MKLVVVGACGVGKSA (SEQ ID NO:184)
MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO:131)
ДТ
MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO:133)
Таблица 8: Аминокислотные последовательности мутантных KRAS
МУТАНТ KRAS
АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
KRAS(G12D)15mer
MKLVVVGADGVGKSAL (SEQ ID NO:95)
KRAS(G12V)15mer
MKLVVVGAVGVGKSAL (SEQ ID NO:96)
KRAS(G13D)15mer
MLVVVGAGDVGKSALT (SEQ ID NO:97)
KRAS(G12D)25mer
MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO:98)
KRAS(G12V)25mer
MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO:99)
KRAS(G13D)25mer
MTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO:100)
KRAS(G12D)15mer^3
MKLVVVGADGVGKSALKLVVVGADGVGKSALKLVVVGADGVGKSAL (SEQ ID NO:101)
KRAS(G12V)15mer^3
MKLVVVGAVGVGKSALKLVVVGAVGVGKSALKLVVVGAVGVGKSAL (SEQ ID NO:102)
KRAS(G13D)15mer^3
MLVVVGAGDVGKSALTLVVVGAGDVGKSALTLVVVGAGDVGKSALT (SEQ ID NO:103)
KRAS(G12D)25mer^3
MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO:104)
KRAS(G12V)25mer^3
MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO:105)
KRAS(G13D)25mer^3
MTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO:106)
KRAS(G12C)25mer
MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO:131)
KRAS(G12C)25mer^3
MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO:132)
KRAS(WT)25mer
MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO:133)
Таблица 9: Последовательности мРНК мутантного антигена KRAS
Название мРНК
Последовательность ОРС (аминокислотная)
Последовательность ОРС (нуклеотидная)
KRAS(G12D)25mer
MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO: 98)
ATGACCGAGTACAAGCTGGTGGTGGTGGGCGCCGACGGCGTGGGCAAGAGCGCCCTGACCATCCAGCTGATCCAG (SEQ ID NO:185)
KRAS(G12V)25mer
MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO: 99)
ATGACCGAGTACAAGCTGGTGGTGGTGGGCGCCGTGGGCGTGGGCAAGAGCGCCCTGACCATCCAGCTGATCCAG (SEQ ID NO:186)
KRAS(G13D)25mer
MTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO: 100)
ATGACCGAGTACAAGCTGGTGGTGGTGGGCGCCGGCGACGTGGGCAAGAGCGCCCTGACCATCCAGCTGATCCAG (SEQ ID NO:187)
KRAS(G12D)25mer^3
MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO: 104)
ATGACCGAGTACAAGTTAGTGGTTGTGGGCGCCGACGGCGTGGGCAAGAGCGCCCTCACCATCCAGCTTATCCAGATGACGGAATATAAGTTAGTAGTAGTGGGAGCCGACGGTGTCGGCAAGTCCGCTTTGACCATTCAACTTATTCAGATGACAGAGTATAAGCTGGTCGTTGTAGGCGCAGACGGCGTTGGAAAGTCGGCACTGACGATCCAGTTGATCCAG (SEQ ID NO:188)
KRAS(G12V)25mer^3
MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO: 105)
ATGACCGAGTACAAGCTCGTCGTGGTGGGCGCCGTGGGCGTGGGCAAGAGCGCCCTAACCATCCAGTTGATCCAGATGACCGAATATAAGCTCGTGGTAGTCGGAGCGGTGGGCGTTGGCAAGTCAGCGCTAACAATACAACTAATCCAAATGACCGAATACAAGCTAGTTGTAGTCGGTGCCGTCGGCGTTGGAAAGTCAGCCCTTACAATTCAGCTCATTCAG (SEQ ID NO:189)
KRAS(G13D)25mer^3
MTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO: 106)
ATGACCGAGTACAAGCTCGTAGTGGTTGGCGCCGGCGACGTGGGCAAGAGCGCCCTAACCATCCAGCTCATCCAGATGACAGAATATAAGCTTGTGGTTGTGGGAGCAGGAGACGTGGGAAAGAGTGCGTTGACGATTCAACTCATACAGATGACCGAATACAAGTTGGTGGTGGTCGGCGCAGGTGACGTTGGTAAGTCTGCACTAACTATACAACTGATCCAG (SEQ ID NO:190)
KRAS(G12C)25mer
MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO: 131)
ATGACCGAGTACAAGCTGGTGGTGGTGGGCGCCTGCGGCGTGGGCAAGAGCGCCCTGACCATCCAGCTGATCCAG (SEQ ID NO:191)
KRAS(G12C)25mer^3
MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO: 132)
ATGACCGAGTACAAGCTCGTGGTTGTTGGCGCCTGCGGCGTGGGCAAGAGCGCCCTCACCATCCAGCTCATCCAGATGACAGAGTATAAGTTAGTCGTTGTCGGAGCTTGCGGAGTTGGAAAGTCGGCGCTCACCATTCAACTCATACAAATGACAGAATATAAGTTAGTGGTGGTGGGTGCGTGTGGCGTTGGCAAGAGTGCGCTTACTATCCAGCTCATTCAG (SEQ ID NO:192)
KRAS(WT)25mer
MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQ (SEQ ID NO: 133)
ATGACCGAGTACAAGCTGGTGGTGGTGGGCGCCGGCGGCGTGGGCAAGAGCGCCCTGACCATCCAGCTGATCCAG (SEQ ID NO:193)
Химия: модифицированный уридинами N1-метилпсевдоуридин (m1ψ)
Кэп: C1
Хвост: T100
Последовательность 5'-НТО (стандартное 5' фланкирование (включает синтез FP+сайт T7+5'-НТО)): TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC (SEQ ID NO: 21)
Последовательность 5'-НТО (без промотора): GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC
(SEQ ID NO: 194)
Последовательность 3'-НТО (человеческая 3'-НТО без XbaI): TGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC (SEQ ID NO: 22)
В первом исследовании, посвященном изучению влияния конструкта иммуностимуляторной мРНК STING на антигенные ответы KRAS in vivo, мышам HLA-A* 2:01 Tg (Taconic, штамм 9659F, n=4) вводят мРНК, кодирующую мутированный KRAS, следующим образом: мРНК, кодирующую мутированный KRAS (отдельно или в комбинации со STING), вводят на 1-е сутки, отбор крови на 8-е сутки, мРНК, кодирующую мутированный KRAS (отдельно или в комбинации со STING), вводят на 15-е сутки, животное, умерщвляют на 22-е сутки. Исследуемые группы показаны в Таблице 10 следующим образом:
Таблица 10
Исследуемая группа
Группа
Тестовый/контрольный материал
Иммуно-стимулятор
Носитель
Способ введения
Схема применения
KRAS-MUT
1
KRAS G12D
(NTFIX) отсутствует
Соединение 25
ВМ
1-е, 15-е сутки
2
KRAS G12V
(NTFIX) отсутствует
Соединение 25
ВМ
1-е, 15-е сутки
3
KRAS G13D
(NTFIX) отсутствуе
Соединение 25
ВМ
1-е, 15-е сутки
KRAS-MUT+STING
4
KRAS G12D
STING V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 15-е сутки
5
KRAS G12V
STING V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 15-е сутки
6
KRAS G13D
STING V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 15-е сутки
Без Аг
7
NTFIX
NTFIX
Соединение 25
ВМ
1-е, 15-е сутки
Только STING
8
NTFIX
STING V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 15-е сутки
мРНК вводят животным в дозе 0,5 мг/кг (10 мкг на 20 г массы животного). Конструкты KRAS и STING вводят в соотношении 1:1. Повторную стимуляцию ex vivo (1 мкг/мл на пептид) тестируют в течение 4 часов при 37 градусах Цельсия в присутствии GolgiPlug (брефельдин А). Внутриклеточное окрашивание цитокинов (ICS) тестируют на KRAS G12D, KRAS G12V, KRAS G13D, KRAS G12WT, KRAS G13WT и в отсутствии пептида.
мРНК, кодирующую мутации KRAS, отдельно или в комбинации с мРНК, кодирующей конститутивно активный STING, тестируют на способность к выработке Т-клеток. Эффективность мРНК, кодирующей мутации KRAS, сравнивают, например, с пептидной вакцинацией. Эффект иммуностимулятора STING определяется путем сравнения лечения только с использованием мутантных пептидов KRAS в комбинации с иммуностимулятором STING. Например, ответы в отношении CD8 вакцины могут оцениваться путем внутриклеточного окрашивания (ICS) для ИФН-γ и/или ФНО-α, как описано в данном документе. Усиленные ответы ICS для ИФН-γ и/или ФНО-α у мышей, получавших вакцину на основе мутантного пептида KRAS в комбинации с конструктами иммуностимуляторной мРНК STING, по сравнению с лечением одним только конструктом мРНК-вакцины на основе мутантного пептида KRAS, указывает на то, что иммуностимулятор STING усиливает KRAS-специфические ответы в отношении CD8 вакцины.
Во втором исследовании, посвященном изучению влияния конструкта иммуностимуляторной мРНК STING на иммунные ответы в отношении различных форм конструктов мРНК мутантного пептидного антигена KRAS, мышам HLA*A*11:01 Tg (Taconic, штамм 9660F, n=4) вводят мРНК, кодирующую различные формы мРНК мутантного пептидного антигена KRAS, в комбинации с конструктом иммуностимуляторного мРНК STING следующим образом: мРНК, кодирующую мутированный KRAS в комбинации со STING, вводят на 1-е сутки, отбор крови на 8-е сутки, мРНК, кодирующую мутированный KRAS, в комбинации со STING вводят на 15-е сутки, животное умерщвляют на 22-е сутки.
Типы тестируемых мутантных конструктов KRAS были следующими: (i) мРНК, кодирующая одиночный мутантный пептидный антиген KRAS 25mer, содержащий или мутацию G12D, G12V, G13D или G12C («синглет»); (ii) мРНК, кодирующая конкатемер из трех 25-мерных пептидных антигенов (таким образом, образующих 75-мерный), каждый из которых содержит мутации G12D, G12V и G13D («KRAS-3MUT»); (iii) мРНК, кодирующая конкатемер из четырех 25-мерных пептидных антигенов (таким образом, образующих 100-мерный), каждый из которых содержит мутации G12D, G12V, G13D и G12C («KRAS-4MUT»); или (iv) четыре отдельные мРНК, вводимые совместно, каждая из которых кодирует один мутантный пептидный антиген KRAS 25mer, содержащий мутацию G12D, G12V, G13D или G12C («Single x 4»).
Аминокислотные и нуклеотидные последовательности G12D 25mer приведены в SEQ ID NO: 98 и 185, соответственно. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности G12V 25mer приведены в SEQ ID NO: 99 и 186, соответственно. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности G13D 25mer приведены в SEQ ID NO: 100 и 187, соответственно. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности G12C 25mer приведены в SEQ ID NO: 131 и 191, соответственно. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности KRAS-3MUT 75mer приведены в SEQ ID NO: 195 и 196, соответственно. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности KRAS-4MUT 100mer приведены в SEQ ID NO: 197 и 198, соответственно. Дополнительные нуклеотидные последовательности KRAS-4MUT 100mer приведены в SEQ ID NO: 1321 и 1322.
Исследуемые группы приведены в Таблице 11 следующим образом:
Таблица 11
Исследуемая группа
Группа
Тестовый/контрольныйматериал
Иммуно-стимулятор
Носитель
Способ введения
Схемаприменения
KRAS-MUTСинглет
1
KRAS G12D
STING (V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 15-е сутки
2
KRAS G12V
STING (V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 15-е сутки
3
KRAS G13D
STING (V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 15-е сутки
4
KRAS G12C
STING (V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 15-е сутки
KRAS-MUTКонкатемер
5
KRAS-3MUT
STING (V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 15-е сутки
6
KRAS-4MUT
STING (V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 15-е сутки
Single X 4
7
G12D+G12V+G12C+G13D
STING (V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 15-е сутки
Только STING
8
NTFIX
STING (V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 15-е сутки
мРНК вводят животным в дозе 0,5 мг/кг (10 мкг на 20 г массы животного). Конструкты KRAS и STING вводят в соотношении 1:1. Повторную стимуляцию ex vivo (1 мкг/мл на пептид) тестируют в течение 4 часов при 37 градусах Цельсия в присутствии GolgiPlug (брефельдин А). Внутриклеточное окрашивание цитокинов (ICS) тестируют на KRAS G12D, KRAS G12V, KRAS G13D, G12C, KRAS G12WT, KRAS G13WT и в отсутствии пептида.
Тестируется способность различных мРНК, кодирующих мутации KRAS в комбинации с мРНК, кодирующей конститутивно активный STING, генерировать ответы Т-клеток, чтобы можно было сравнить влияние иммуностимулятора STING на различные отличающиеся конструкты KRAS. Например, ответы в отношении CD8 вакцины могут оцениваться путем внутриклеточного окрашивания (ICS) для ИФН-γ и/или ФНО-α, как описано в данном документе.
Пример 10: Профилактическая или терапевтическая вакцинация вакциной против HPV в комбинации с иммуностимулятором STING ингибирует рост опухоли
В данном примере мышей лечили вакциной против HPV в комбинации с иммуностимулятором STING до, одновременно или после заражения опухолевыми клетками TC1. TC-1 представляет собой мышиную модель опухоли, экспрессирующую E7 HPV16, известную в данной области техники (см., например, Bartkowiak et al. (2015) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112:E5290-5299). Вакцины против HPV, использованные в этом примере, представляли собой конструкты мРНК, кодирующие или внутриклеточные, или растворимые формы антигенов HPV 16 Е6 и Е7, обозначенные в данном документе как iE6/E7 и sE6/E7, соответственно, как описано в Примере 5. Конститутивно активный иммуностимулятор STING, используемый в этом примере, содержал мутацию V155M, как описано в Примере 5. Конструкт вакцины против HPV и иммуностимуляторный конструкт совместно составляли в липидные наночастицы MC3. Некоторых мышей также лечили ингибитором иммунной контрольной точки (или анти-CTLA-4, или анти-PD-1).
5
В первой серии экспериментов по изучению профилактической активности вакцинации HPV+STING мышей C57/ B6 лечили путем внутримышечной инъекции 0,5 мг/кг вакцины HPV+STING (кодирующей или sE6/E7, или iE6/E7) на (i) -7-е и -14-е сутки или (ii) 1-е и 8-е сутки с последующей подкожной инъекцией 2×10 клеток TC1 на 1-е сутки. Некоторых мышей также лечили на 6-е, 9-е и 12-е сутки или анти-CTLA-4 (клон 9H10), или анти-PD-1 (RMP1-14). Репрезентативные результаты, представленные как объем опухоли в зависимости от времени, представлены на графиках Фиг. 19A-19C, где на Фиг. 19А и 19 В приведены данные для мышей, получавших лечение на -14-е и -7-е сутки или sE6/E7 (Фиг. 19A), или iE6/E7 (Фиг. 19B) и Фиг. 19C приведены данные для мышей, получавших лечение на 1-е и 8-е сутки sE6/E7. Результаты демонстрируют, что у всех мышей, получавших лечение вакциной HPV+STING (отдельно или в комбинации с ингибиторами иммунной контрольной точки), наблюдалось полное ингибирование роста опухоли в течение нескольких недель по сравнению с контрольными мышами (получавшими лечение контрольным конструктом мРНК NTFIX, отдельно или в комбинации с ингибитором иммунной контрольной точки). Таким образом, эти эксперименты демонстрируют, что профилактическая вакцинация (т.е. до или одновременно с заражением опухолью) вакциной против HPV вместе с иммуностимулятором STING эффективна для предотвращения роста опухолевых клеток, экспрессирующих HPV, in vivo.
5
Во второй серии экспериментов по изучению терапевтической активности вакцинации HPV+STING мышам C57/B6 вводили 2×10 клеток TC1 подкожно на 1-е сутки с последующей внутримышечной инъекцией 0,5 мг/кг вакцины HPV+STING (кодирующая sE6/E7) на 8-е и 15-е сутки. Некоторых мышей также лечили на 13-е, 16-е и 19-е сутки или анти-CTLA-4 (клон 9H10), или анти-PD-1 (RMP1-14). Репрезентативные результаты, представленные как объем опухоли в зависимости от времени, представлены на графиках Фиг. 20A-20I. Результаты демонстрируют, что у мышей, получавших лечение вакциной HPV+STING (отдельно или в комбинации с ингибиторами иммунной контрольной точки), наблюдалась регрессия опухоли (Фиг. 20A-20C), по сравнению с контрольными мышами, получавшими лечение контрольным конструктом мРНК NTFIX, отдельно или в комбинации с ингибитором иммунной контрольной точки (Фиг. 20D-20F) или контрольными мышами, получавших лечение конструктом sE6/E7 в комбинации с контрольным соединением DMXAA (химический активатор STING), отдельно или в комбинации с ингибитором иммунной контрольной точки (Фиг. 20G-20I). Таким образом, эти эксперименты демонстрируют, что терапевтическая вакцинация (т.е. после заражения опухолью) вакциной против HPV вместе с иммуностимулятором STING эффективна в индукции регрессии опухолей, экспрессирующих HPV, in vivo.
5
3
3
В третьей серии экспериментов для изучения эффективности терапевтической вакцины HPV-STING при более крупных опухолях TC1 мышам C57/B6 вводили 2×10 клеток TC1 подкожно, и опухолям позволяли расти до объема 200 мм или 300 мм, что затем было обозначено как 1-е сутки Мышей затем лечили на 1-е и 8-е сутки внутримышечной инъекцией вакцины HPV+STING (кодирующей sE6/E7). Группы лечения и соответствующие дозы приведены в Таблице 12.
Таблица 12
Объем опухоли (мм<sup>3</sup>)
Группа
Доза 1 Vax(1-е сутки), мкг
Доза 2 Vax(8-е сутки), мкг
200
ФСБ
отсутствует
отсутствует
sE6/7+NFTIX (1:1)
10
10
sE6/7+STING (1:1)
10
5
sE6/7+NFTIX (1:1)+200 мкг DMXAA
10
10
300
ФСБ
отсутствует
отсутствует
sE6/7+NFTIX (1:1)
10
10
sE6/7+STING (1:1)
10
Отсутствует
sE6/7+NFTIX (1:1)+200 мкг DMXAA
10
10
3
3
Результаты, приведенные на Фиг. 21, демонстрируют объем опухоли в течение 22 суток (верхние графики для опухолей размером 200 мм и нижние графики для опухолей размером 300 мм). Результаты демонстрируют, что терапевтическая вакцина HPV-STING проявляет эффективность в подавлении более крупных опухолей, экспрессирующих HPV, in vivo.
Пример 11: Определение оптимального массового соотношения антиген: иммуностимулятор при разработке вакцины мРНК
В данном примере исследования проводились на животных, которых лечили представляющим интерес антигеном (Аг) в комбинации с иммуностимулятором при различных соотношениях Аг: иммуностимулятор, с последующим изучением ответов Т-клеток на антиген для определения оптимальных соотношений Aг: иммунностимулятор в усилении иммунного ответа на представляющий интерес антиген.
В первой серии экспериментов мышей лечили вакциной MC38, кодирующей конкатемер ADR трех 25-мерных мутантных пептидов, содержащих опухолевые неоэпитопы, полученные из Adpgk, Dpagt1 и Reps1 (данная вакцина также упоминается в данном документе как ADRvax), как описано в Примере 6, в комбинации с конститутивно активным иммуностимуляторным конструктом STING. Конститутивно активный иммуностимулятор STING, используемый в этом примере, содержал мутацию V155M, как описано в Примере 5. Конструкты ADRvax и STING были совместно составлены в катионную липидную наночастицу SM102 (содержащую соединение 25) при различных соотношениях Aг:STING, согласно плану клинического исследования, обобщенному ниже в Таблице 13.
Таблица 13
Группа
Аг:STINGСоотношение
Доза Аг(мкг)
Доза STING(мкг)
NTFIX (мкг)
Суммарная мРНК (мкг)
Носитель
Способ введения
Схема применения
1
Без Агконтроль
0
3
3
6
SM102
ВМ
1-е, 15-е сутки
2
1:1
3
3
0
3
5:1
0,6
2,4
4
10:1
0,3
2,7
5
20:1
0,15
2,85
6
1:0 (без STING)
0
3
7
1:1
5
5
0
10
8
1: 0 (без STING)
0
5
+
+
Мышам вводили внутримышечно на 1-е и 15-е сутки. На 21-е сутки, CD8клетки селезенки мышей в каждой тестируемой группе повторно стимулировали ex vivo в течение 4 часов при 37 °С в присутствии GolgiPlug™ (содержащего брефельдин A; BD Biosciences) или диким типом, или мутантными пептидами ADR MC38 (1 мкг/мл пептида, объединенные) и ответы на CD8 вакцины оценивали путем внутриклеточного окрашивания (ICS) на ИФН-γ или ФНО-α. Репрезентативные результаты ICS для ADR-специфических ответов MC38 по CD8клеткам селезенки на 21-е сутки для ИФН-γ показаны на Фиг. 22 и для ФНО-α показаны на Фиг. 23. Сопоставимые результаты наблюдались на 21-е сутки с МКПК. Кроме того, эксперимент проводили по прошествии 54-х суток, при этом результаты на клетках селезенки на 54-е сутки были сопоставимы с результатами, полученными на клетках селезенки на 21-е сутки. Кроме того, ответы в отношении CD8 вакцины на каждый из трех отдельных эпитопов в ADRvax (то есть пептиды Adpk1, Reps1 и Dpagt1) также оценивали посредством ICS для ИФН-γ после стимуляции отдельными эпитопами. Результаты, приведенные на Фиг. 24А (для пептида Adpk1), Фиг. 24B (для пептида Reps1) и Фиг. 24C (для пептида Dpagt1).
Результаты демонстрируют, что все тестируемые соотношения Aг:STING (в диапазоне от 1:1 до 20:1) проявляли адъювантный эффект STING по сравнению с контролем. Для антигена ADRvax в целом было установлено, что оптимальное соотношение Aг:STING составляет 5:1. Для отдельных пептидных эпитопов в ADRvax оптимальное соотношение Aг:STING для пептида Adpgk1 составляло 5:1, тогда как оптимальное соотношение Aг:STING для пептида Reps1 составляло 10:1 (ответы на третий пептид, Dpagt1, были очень низкими с или без STING, что соответствует недоминантному эпитопу, как было известно в данной области техники). Было также обнаружено, что STING увеличивает общий процент CD8+клеток среди CD45+Т-клеток, при этом наблюдаются ответы на дозы (данные не показаны), и было обнаружено, что он увеличивает общий процент CD62L клеток среди CD44hi CD8+клеток (подмножество эффекторных клеток памяти) с наблюдаемыми ответами на дозы (данные не приведены). Кроме того, результаты, полученные на клетках МПКП, соответствовали результатам на клетках селезенки (данные не приведены). Таким образом, эти эксперименты подтвердили способность STING действовать в качестве иммуностимулятора в усилении иммунных ответов против антигена ADRvax и, кроме того, продемонстрировали определение оптимального соотношения Aг: иммуностимулятор для лечения, в соотношениях, которые рассматриваются как наиболее оптимальные, отличные от 1:1 (например, соотношения 5:1 или 10:1 более эффективны, чем 1:1). Результаты также демонстрируют, что оптимальное соотношение Aг: иммуностимулятор может отличаться в зависимости от конкретного используемого представляющего интерес антигена.
Во втором эксперименте приматов, отличных от человека, лечили вакциной против HPV, кодирующей внутриклеточный E6/E7(iE6/E7), как описано в Примере 5, в комбинации с конститутивно активным иммуностимуляторным конструктом STING при варьировании соотношения Aг:STING (в виде катионных липидных наночастиц SM102), согласно плану клинического исследования, приведенному ниже в Таблице 14.
Таблица 14
Группа
Лечение
Аг:STINGСоотношение
мкгАг
мкгSTING
мкгNTFIX
n
Общая доза Аг
1
Только STING
-
-
100
-
3
100 мкг
2
Аг:STING
1:1
50
50
-
3
Аг:STING
5:1
83,33
16,67
-
4
Аг:STING
10:1
90,9
9,09
5
Только Аг
-
90
-
10
Никаких клинических результатов не наблюдалось по прошествии 24-х суток после первой дозы (вводимой внутримышечно), что указывает на отсутствие реакций в месте инъекции и на то, что начальное лечение было получено безопасно. После начальной дозы на 1-е сутки животные получают двухнедельный период восстановления, а затем получают вторую дозу на 14-е сутки, после чего следует еще один двухнедельный период восстановления. Дальнейший анализ безопасности определяется по клинической патологии (клиническая биохимия, гематология и коагуляция) на 2-е, 16-е и 30-е сутки. Анализ антиантител и ELISpot или ICS в отношении ИФН-γ и CD4 и CD8 клеток проводят для оценки усиления иммунных ответов на вакцину против HPV с помощью STING при различных тестируемых соотношениях.
В третьей серии экспериментов модельный конкатемерный антиген с использованием известных мышиных эпитопов был протестирован на мышах в комбинации с конститутивно активным иммуностимулятором STING в различных соотношениях. Конкатемерный антиген, называемый в данном документе CA-132, содержит 20 известных мышиных эпитопов, которые, как считается, представлены антигенами ГКГС класса I и класса II мыши CB6. Эти эпитопы были получены с веб-сайта IEDB.org, общедоступной базы данных эпитопов, полученной из литературы. Ожидается, что эпитопы класса I будут представлены на молекулах ГКГС класса I и будут вызывать ответ CD8+, в то время как эпитопы класса II должны быть представлены на молекулах ГКГС класса II и запускать ответы CD4+T-клеток. Конструкт антигена CA-132 кодирует эпитопы класса I и класса II, что позволяет оценивать ответы CD4 и CD8 Т-клеток. Более того, считается, что включение эпитопов класса II в конкатемерный антиген (таким образом запуская ответ CD4) помогает индуцировать более сильный ответ CD8 Т-клеток. Таким образом, подход к конструированию антигена СА-132 также может быть использован при конструировании других конструктов конкатемерных антигенов (например, для персонализированных противораковых вакцин или для бактериальных вакцин, как описано в данном документе).
Конструкт антигена CA-132 и конструкт иммуностимулятора STING совместно составляли в катионных липидных наночастицах SM102 и вводили мышам CB6 внутримышечно в следующих дозах: CA-132 только по 1 мкг, 3 мкг или 10 мкг, STING отдельно по 3 мкг, CA-132+STING по 3 мкг каждый или 1 мкг каждый (соотношение 1:1), CA-132 по 3 мкг и STING по 1 мкг (соотношение Aг:STING 3:1) или CA-132 по 1 мкг и STING по 3 мкг (соотношение Aг:STING 1:3). Антигенспецифические Т-клеточные ответы на эпитопы класса I в конструкте антигена СА-132 исследовали с помощью анализа ELISpot на ИФН-γ, результаты которого показаны на Фиг. 25. Результаты продемонстрировали увеличение ответов ИФН-γ на эпитопы класса I при введении в состав STING. Эти результаты были подтверждены повторной стимуляцией CD8+T-клеток одним из эпитопов класса I в антигене CA-132 (эпитоп CA-87) с последующим анализом ELISpot для ИФН-γ, результаты которого показаны на Фиг. 26. Эти результаты продемонстрировали способность STING иммуностимулировать антигенспецифические ответы CD8+T-клеток при соотношениях Aг:STING 1:1, 3:1 и 1:3.
В четвертой серии экспериментов мышей C57/Bl6 лечили на 1-е и 14-е сутки вакциной против E7 HPV16 (описанной в Примере 5) в комбинации с конститутивно активным конструктом иммуностимулятора STING при различных соотношениях Aг:STING. мРНК были совместно составлены в липидные наночастицы, содержащие: Соединение 25: холестерин: DSPC: ПЭГ-DMG (при соотношениях 50: 38,5: 10: 1,5 соответственно) в соответствии с планом клинического исследования, приведенным ниже в Таблице 15.
Таблица 15
Группа
Лечение
Аг:STINGСоотношение
мкгАг
мкгSTING
1
Только STING
-
0
3
2
Аг:STING
1:1
3
3
3
Аг:STING
5:1
3
0,6
4
Аг:STING
10:1
3
0,3
5
Аг:STING
20:1
3
0,15
6
Только Аг
0
3
0
7
Аг:STING
1:1
5
5
8
Только Аг
0
5
0
На 21-е сутки мышей умерщвляли и с помощью ICS оценивали экспрессию ИФН-γ CD8+T клетками, как описано в данном документе. Результаты, приведенные на Фиг. 27, демонстрируют сильный иммуностимулирующий эффект конструкта мРНК STING при соотношениях Аг:STING 1:1, 5:1 и 10:1.
Таким образом, эти исследования подтвердили способность конструкта иммуностимулятора STING усиливать иммунные ответы на представляющий интерес антиген и продемонстрировали определение оптимальных соотношений Aг:STING для лечения.
Пример 12: Иммуностимулирование при помощи STING у приматов, отличных от человека
В данном примере приматов, отличных от человека (яванских макак), лечили мРНК, кодирующей вакцину против HPV, в комбинации с иммуностимулятором STING с последующим оцениванием антигенспецифического Т-клеточного ответа и гуморального иммунного ответа. Конструкт вакцины против HPV, использованный в данном примере, описан в Примере 5. Конструкт конститутивно активного иммуностимулятора STING, используемый в данном примере, содержал мутацию V155M, как описано в Примере 5. Конструкт вакцины против HPV и конструкт иммуностимуляторной мРНК были совместно составлены в липидные наночастицы, содержащие: соединение 25: холестерин: DSPC: ПЭГ-DMG в соотношениях 50: 38,5: 10: 1,5, соответственно. Были испытаны различные соотношения STING:Аг.Контрольных животных лечили мРНК, кодирующими или только антигены HPV, или только иммуностимулятор STING.
Пятнадцать самцов яванских макак, 2-5 лет и весом 2-5 кг, получали лечение в соответствии с дизайном исследования, приведенным ниже в Таблице 16.
Таблица 16
Группа
Описание
Соотношение
Суммарная мРНК (мкг)
NTFIX
STING(мкг)
Аг HPV(мкг)
n
1
Только Аг
100
10
90
3
2
Только STING
100
100
0
3
3
STING:Аг
1:1
100
50
50
3
4
STING:Аг
1:5
100
17
83
3
5
STING:Аг
1:10.
100
9
91
3
Образец МКПК отбирали за 7 суток до введения с последующим внутримышечным введением LNP с мРНК животным на 1-е сутки и 15-е сутки. Образец МКПК отбирали на 29-е сутки после введения. В ходе исследования не было отмечено токсичности или других серьезных клинических проявлений, что свидетельствует о хорошей переносимости LNP с мРНК.
Для изучения способности иммуностимулятора STING усиливать антигенспецифические ответы CD8+T-клеток проводили внутриклеточное окрашивание цитокинов (ICS) в отношении ФНО-α и ИЛ-2. МКПК стимулировали ex vivo с помощью пула пептидов E6 HPV16 или пула пептидов E7 HPV16 в течение 6 часов при 37 °C. Стимуляцию PMA/иономицином использовали в качестве положительного контроля, а стимуляцию только средой использовали в качестве отрицательного контроля.
Репрезентативные результаты для ICS на ФНО-α представлены на Фиг. 28А-28С, где на Фиг. 28А продемонстрированы результаты для стимуляции ex vivo пулом пептидов Е6, на Фиг. 28B продемонстрированы результаты для стимуляции ex vivo пулом пептидов Е7, и на Фиг. 28C продемонстрированы результаты для стимуляции ex vivo контролем со средой. Между группой до и после введения дозы, иммунизированной одним антигеном (Группа 1) не наблюдалось никакого увеличения количества ФНО-α+CD8 T-клеток. Иммунизация с применением только одного STING (группа 2) имела незначительное влияние на количество ФНО-α+CD8 T-клеток. Напротив, группы, иммунизированные STING+Аг (группы 3, 4, 5), продемонстрировали значительное увеличение антигенспецифических ФНО-α+CD8 T-клеток. Кроме того, группа 5, которая была иммунизирована «совпадающей» дозой антигена STING:Аг (соотношение 1:10), продемонстрировала значительное увеличение антигенспецифических ФНО-α+CD8 T-клеток по сравнению с контролями группы 1 и группы 2.
Репрезентативные результаты для ICS на ИЛ-2 представлены на Фиг. 29A-29C, где на Фиг. 29А продемонстрированы результаты для стимуляции ex vivo пулом пептидов Е6, на Фиг. 29B продемонстрированы результаты для стимуляции ex vivo пулом пептидов Е7, и на Фиг. 29C продемонстрированы результаты для стимуляции ex vivo контролем со средой. У всех иммунизированных животных наблюдалось умеренное увеличение частоты встречаемости ИЛ-2+CD8 Т-клеток между дозами до и после введения (группы 1-5). Однако увеличение ИЛ-2+CD8 Т-клеток было наиболее детектируемым в группах, получавших STING:Аг в соотношениях 1:1 и 1:5 (группы 3 и 4), тогда как животные, получавшие STING:Аг в соотношении 1:10 не продемонстрировало увеличение ИЛ-2+CD8 Т-клеток по сравнению с контролем. Увеличение ИЛ-2 согласуется с известной способностью субпопуляций Т-клеток секретировать ИЛ-2 во время активных Т-клеточных ответов.
Для исследования влияния лечения STING:Аг на NHP (приматов, отличных от человека) на образование антигенспецифических антител, проводили E6-специфический и E7-специфический ИФА. Планшеты покрывали или рекомбинантным E6 (Prospec; №HPV-005 His HPV16 E6), или рекомбинантным E7 (ProteinX; №2003207 His HPV16 E7). В качестве положительного контроля использовали мышиное анти-Е6 моноклональное антитело от Alpha Diagnostics International (№HPV16E6 1-M). В качестве положительного контроля использовали мышиное анти-Е7 моноклональное антитело от Fisher/Life Technologies (№280006-EA). Антитело против мышиного IgG-HRP от Jackson ImmunoResearch (№715-035-150) использовали в качестве вторичного антитела для положительного контроля. В качестве вторичного антитела для сыворотки NHP использовали антитело против обезьяньего IgG-HRP от Abcam (№ab112767).
Планшеты покрывали рекомбинантным E6 или E7 (500 нг/лунку; 100 мкл/лунку) при 4 °С в течение ночи и затем блокировали с использованием TBS SuperBlock в течение 1 часа при комнатной температуре. Первичное антитело добавляли (100 мкл/лунку) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Положительные контрольные антитела серийно разводили. Сыворотку NHP разбавляли 1:5000. После промывки добавляли вторичное антитело (100 мкл/лунку) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Положительный контроль антитела против мышиного IgG-HRP разводили 1:5000. Для сывороток NHP антитело против обезьяньего IgG-HRP разбавляли 1:30000. Цвет проявлялся в течение 5 минут (анти-E6) или в течение 10 минут (анти-E7), затем останавливали и считывали при 450 нм.
Репрезентативные результаты для IgG против E6 HPV16 приведены на Фиг. 30. Репрезентативные результаты для IgG против E7 HPV16 приведены на Фиг. 31. Результаты как для анти-Е6, так и для анти-Е7 демонстрируют, что лечение животных STING:Аг, особенно, в соотношениях 1:5 и 1:10, приводила к усилению образования антигенспецифических антител.
Соответственно, результаты, описанные в данном документе, для исследования приматов, отличных от человека, подтверждают, что STING иммуностимулирует антигенспецифические ответы Т-клеток и продукцию антител против антигена мРНК-вакцины in vivo.
Пример 13: Иммуногенность различных форматов вакцин KRAS-STING у трансгенных мышей HLA*A11
В данном примере, для изучения влияния конструктов мРНК иммуностимулятора STING на иммунные ответы в отношении различных форм мутантных конструктов мРНК пептидного антигена KRAS, мышам HLA*A*11:01 Tg (Taconic, штамм 9660F, n=3) вводили мРНК, кодирующую различные формы мутантных конструктов мРНК пептидного антигена KRAS, в комбинации с конструктами иммуностимуляторной мРНК STING, следующим образом: мРНК, кодирующую мутантный KRAS в комбинации со STING, вводили на 0-е и 14-е сутки, животных умерщвляли на 21-е сутки. Мыши были в возрасте 6-9 недель на 0-е сутки. мРНК вводили животным в дозе 0,5 мг/кг (10 мкг на 20 г веса животного). Конструкты KRAS и STING вводят в соотношении 5:1 (Аг:STING). Конструкт мРНК совместно составляли в катионную липидную наночастицу SM102 (содержащую Соединение 25).
Типы тестируемых мутантных конструктов KRAS были следующими: (i) мРНК, кодирующая одиночный мутантный пептидный 25-мерный антиген KRAS, содержащий мутацию G12D, G12V, G13D или G12C («мономер»); (ii) мРНК, кодирующая конкатемер из трех 25-мерных пептидных антигенов (таким образом, образующих 75-мерный), каждый из которых содержит мутации G12D, G12V и G13D («конкатемер KRAS-3MUT»); (iii) мРНК, кодирующая конкатемер из четырех 25-мерных пептидных антигенов (таким образом, получается 100-мерный), каждый из которых содержит мутации G12D, G12V, G13D и G12C («конкатемер KRAS-4MUT»); или (iv) четыре отдельные мРНК, вводимые вместе, каждая из которых кодирует один мутантный пептидный 25-мерный антиген KRAS, содержащий мутацию G12D, G12V, G13D или G12C («объединенные мономеры»). Аминокислотные и нуклеотидные последовательности конструктов представляют собой такие, как описано в Примере 9. Конкатемерный антиген вирусного эпитопа A11 также тестировали в комбинации со STING или контрольной мРНК (NTFIX) («подтвержденный Aг A11»).
Тестируемые группы показаны в Таблице 17 следующим образом:
Таблица 17
Исследуемая группа
Группа
Тестовый/контрольный материал
Иммуно-стимулятор
Носитель
Способ введения
Схема применения
KRAS-MUTМономер
1
KRAS G12D
STING (V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 14-е сутки
2
KRAS G12V
STING (V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 14-е сутки
3
KRAS G13D
STING (V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 14-е сутки
4
KRAS G12C
STING (V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 14-е сутки
KRAS-MUTКонкатемер
5
KRAS-3MUT
STING (V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 14-е сутки
6
KRAS-4MUT
STING (V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 14-е сутки
7
KRAS-4MUT.var1
STING (V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 14-е сутки
Объединенные мономеры
8
G12D+G12V+G12C+G13D
STING (V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 14-е сутки
Подтвержденные Аг A11
9
Конкатемер вирусного эпитопа A11
STING (V155M)
Соединение 25
ВМ
1-е, 14-е сутки
10
Конкатемер вирусного эпитопа A11
NTFIX
Соединение 25
ВМ
1-е, 14-е сутки
В первой серии экспериментов по оценке антигенспецифических ответов CD8+T- В первой серии экспериментов по оценке антигенспецифических ответов CD8+T-клеток на антигены KRAS, клетки селезенки на 21-е сутки от мышей повторно стимулировали ex vivo пептидами мономера KRAS (2 мкг/мл на пептид) в течение 5 часов при 37 градусах Цельсия в присутствии GolgiPlug (брефельдина А). Внутриклеточное окрашивание цитокинов (ICS) (ИФН-γ) проводили в отношении KRAS G12D (aa*7/8-16), KRAS G12V (aa*7/8-16), KRAS G13D (aa*7/8-16)), G12C (aa*7/8-16), KRAS ДТ (aa*7/8-16) и без пептида.
Результаты ICS для KRAS-G12V-специфических ответов приведены на Фиг. 32. Результаты ICS для KRAS-G12D-специфических ответов приведены на Фиг. 33. Эти результаты демонстрируют, что анти-KRAS-G12V и анти-KRAS-G12D-специфические CD8+T-клетки были обнаружены у мышей, иммунизированных соответствующей вакциной KRAS-STING (мономер или конкатемер), и повторно стимулированных родственным пептидом. Сравнимый % ИФН-гамма-положительных CD8+T-клеток наблюдали, когда мутантные KRAS вводили мышам в качестве мономера или конкатемеров. Ответы, наблюдаемые с G12V, были сильнее, чем ответы, наблюдаемые с G12D. В данном эксперименте ответы анти-KRAS G12C и анти-KRAS G13D не наблюдались (данные не приведены).
Во второй серии экспериментов по оценке антиген-специфических ответов CD8+T-клеток на антигены KRAS, клетки селезенки от мышей на 21-е сутки совместно культивировали с HLA*A11-экспрессирующими клетками-мишенями (клетками Cos7-A11), которые активировали с помощью соответствующих пептидов KRAS (контроль G12V, G12D или ДТ), с последующим ICS (ИФН-γ). Результаты совместного культивирования Cos7-A11 для KRAS-G12V-специфических ответов приведены на Фиг. 34. Результаты совместного культивирования Cos7-A11 для KRAS-G12D-специфических ответов приведены на Фиг. 35. Эти результаты демонстрируют, что анти-KRAS-G12V и анти-KRAS-G12D-специфические CD8+Т-клеточные ответы были обнаружены у мышей, иммунизированных соответствующей вакциной KRAS-STING (мономер или конкатемер), и повторно стимулированы клеточной линией экспрессирующей A11+, активированной с помощью G12V или G12D. Таким образом, результаты этого второго набора экспериментов в отношении выявления антигенспецифических ответов CD8+T-клеток в отношении антигенов KRAS были очень похожи на результаты первого набора экспериментов с использованием повторной стимуляции родственными пептидами.
В итоге, способность STING потенцировать антигенспецифический ответ на известные A*11-рестриктированные вирусные эпитопы оценивали с использованием клеток селезенки мышей на 21-е сутки, иммунизированных конкатемером вирусного эпитопа A11. Восемь вирусных эпитопов (EBV BRLF1, FLU, HIV NEF, EBV, коровый антиген HBV, HCV, CMV и BCL-2L1) (по 25 аминокислот каждая) конкатемеризованы и кодировались мРНК для использования в качестве антигена в комбинации со STING в трансгенных мышах A11 (группа лечения 9 в Таблице 17). Конкатемер вирусного эпитопа A11 также вводили вместе с контрольной мРНК NTFIX (группа лечения 10 в Таблице 17). Пять из восьми эпитопов (EBV BRLF1, FLU, HIV NEF, EBV, коровый антиген HBV) подтверждены связывающими веществами A11 с относительно низкими прогнозированными ИК50; другие три эпитопа (HCV, CMV и BCL-2L1) имели более умеренные спрогнозированные аффинности к A11, но не были подтверждены экспериментально. Аминокислотные последовательности для вирусных эпитопов, а также их ИК50 приведены ниже в Таблице 18.
Таблица 18
Ген
Пептид
ann_IC50
% ранга
Подтверждение в литературе
BV BRLF1
ATIGTAMYK (SEQ ID NO: 1388)
6,03
0,2
Y
FLU
SIIPSGPLK (SEQ ID NO: 1389)
5
0,25
Y
HIV NEF
AVDLSHFLK (SEQ ID NO: 1390)
20,31
0,25
Y
EBV
AVFDRKSDAK (SEQ ID NO:1391)
55,63
0,5
Y
Коровый антиген HBV
YVNVNMGLK (SEQ ID NO: 1392)
69,82
0,5
Y
HCV
RVCEKMALY (SEQ ID NO: 1393)
304,91
1,3
CMV
KLGGALQAK (SEQ ID NO: 1394)
736,59
1,6
Клетки селезенки на 21-е сутки повторно стимулировали ex vivo отдельными вирусными эпитопами A*11, с последующим ICS (ИФН-γ и ФНО-α) для выявления антигенспецифических CD8+T-клеточных ответов. Антигенспецифические CD8+Т-клеточные ответы наблюдали для четырех из восьми вирусных эпитопов (EBV, EBV BRLF1, FLU и HIV NEF) и, как показано на Фиг. 36, STING стимулированные ответы Т-клеток для трех из этих вирусных эпитопов (EBV, EBV BRLF1 и FLU).
Соответственно, результаты, описанные в данном документе, для трансгенных мышей HLA*A11, демонстрируют, что STING иммуностимулирует антигенспецифические Т-клеточные анти-KRAS ответы, а также антивирусные ответы на другие A11-рестриктированные вирусные антигены и способен иммуностимулировать ответы на антигены вакцины в различных формах (мономерных и конкатемерных).
Пример 14: Иммуностимулирование STING восстанавливается активацией
интерферона типа 1 и NFкB
В данном примере для сравнения иммуностимуляторного эффекта STING с иммуностимуляторами, которые или активируют интерферон типа 1 (конститутивно активные IRF3 и IRF7), или активируют NFкB (конститутивно активную IKKβ) использовали систему мышиной модели вакцины против HPV. Конструкт мРНК STING (мутация V155M) описана в Примере 1. Конститутивно активные конструкты мРНК IRF3 и IRF7 описаны в Примере 2. Конститутивно активный конструкт IKKβ описана в Примере 3. Система мышиной модели против HPV описана в Примере 5. Мышей иммунизировали вакциной против HPV в комбинации с: (i) контрольным конструктом (NTFIX), (ii) конструктом STING, (iii) конструктом IRF3/IRF7 или (iv) конструктом IRF3/IRF7/IKKβ.
Клетки селезенки от мышей на 21-е сутки в каждой тестируемой группе повторно стимулировали ex vivo в течение 4 часов при 37 °С в присутствии GolgiPlug™ (содержащего брефельдин A; BD Biosciences) или одиночными пептидами E7 (3 отдельных пептида), или пулом пептидов E7, как описано в Примере 5. Ответы на CD8 вакцины оценивали путем внутриклеточного окрашивания (ICS) на ИФН-γ или ФНО-α. Репрезентативные результаты ICS для E7-специфических ответов клеток селезенки на 21-е сутки в отношении ИФН-γ и ФНО-α приведены на Фиг. 37A (ИФН-γ) и на Фиг. 37B (ФНО-α). Эксперимент проводили по прошествии 50-х суток, при этом результаты на клетках селезенки на 50-е сутки были сопоставимы с результатами, полученными на 21-е сутки. Результаты демонстрируют, что комбинация конститутивно активного IRF3+ и конститутивно активного IRF7+ конститутивно активного IKKβ приводила к появлению STING-опосредованного адъювантного фенотипа. Таким образом, эти результаты демонстрируют, что иммуностимулирующая активность STING может быть восстановлена путем использования конструктов, которые активируют интерферон типа 1 и NFkB.
Пример 15: Иммуностимулирование путем модуляции внутриклеточных путей
В данном примере иммуностимулирующий эффект STING сравнивали с эффектом иммуностимуляторов, которые модулируют внутриклеточные пути. Были протестированы конструкты иммуностимуляторных мРНК, кодирующие TAK1, TRAM или MyD88, каждая из которых является внутриклеточным сигнальным белком, который функционирует в сигнальном пути ниже TLR. Конститутивно активный конструкт STING (V155M) описан в Примере 1. Репрезентативная аминокислотная последовательность, кодируемая конструктом TAK1, приведена в SEQ ID NO: 164 (кодируется иллюстративными нуклеотидными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 1411 и 1482). Репрезентативная аминокислотная последовательность, кодируемая конструктом TRAM, приведена в SEQ ID NO: 136 (кодируется иллюстративными нуклеотидными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 1410 и 1481). Репрезентативные аминокислотные последовательности, кодируемые конструктами MyD88, приведены в SEQ ID NO: 134 (кодируется иллюстративными нуклеотидными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 1409 и 1480) и SEQ ID NO: 135. Мышей иммунизировали мРНК, кодирующей овальбумин, в качестве тестируемого антигена в комбинации с конструктом мРНК, кодирующей или: (i) STING, (ii) TAK1, (iii) TRAM, или (iv) MyD88. Конструкт мРНК антигена OVA и конструкт иммуностимуляторной мРНК были совместно составлены в липидные наночастицы, содержащие: соединение 25: холестерин: DSPC: ПЭГ-DMG в соотношениях 50: 38,5: 10: 1,5, соответственно. Мышей иммунизировали внутримышечно на 1-е и 15-е сутки в дозе 0,5 мг/кг.
На 25-е сутки клетки селезенки от мышей в каждой тестируемой группе повторно стимулировали ex vivo в течение 4 часов при 37 °С в присутствии GolgiPlug™ (содержащего брефельдин A; BD Biosciences) или с пептидом OVA (ГКГС класса I). Ответы на CD8 вакцины оценивали путем внутриклеточного окрашивания (ICS) на ИФН-γ, ФНО-α или ИЛ-2. Репрезентативные результаты ICS для OVA-специфических ответов клеток селезенки на 25-е сутки в отношении ИФН-γ, ФНО-α и ИЛ-2 приведены на Фиг. 38A (ИФН-γ), на Фиг. 38B (ФНО-α) и Фиг. 38C (ИЛ-2). Эксперимент проводили по прошествии 50-х суток, при этом результаты на клетках селезенки на 50-е сутки были сопоставимы с результатами, полученными на 25-е сутки. Результаты демонстрируют, что конструкты TAK1, TRAM и MyD88 продемонстрировали иммуностимулирующую активность, сходную со STING. Таким образом, эти результаты демонстрируют, что иммунные ответы могут быть усилены путем модуляции внутриклеточных путей с использованием конструктов мРНК, кодирующих компоненты таких внутриклеточных путей, в частности компоненты, которые функционируют в сигнальном пути ниже TLR.
Пример 16: Иммуностимулирование с помощью адаптерных белков и индукции инфламмасом или некроптосом
В данном примере иммуностимулирующую способность панели конструктов мРНК сравнивали на мышах с использованием овальбумина в качестве тестируемого антигена (как описано в Примере 15). Панель конструктов мРНК кодирует или адаптерные белки STING, или MAVS (митохондриальный антивирусный сигнал), конститутивно активный IKKβ (который активирует NFкB), каспазы 1/4 (участвует в индукции инфламмасом) или MLKL (участвует в индукции некроптосом). Конститутивно активный конструкт STING (V155M) описан в Примере 1. Конститутивно активный конструкт IKKβ описан в Примере 3 и кодирует аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 152 (кодируется иллюстративными нуклеотидными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 153 и 1397). Репрезентативная аминокислотная последовательность, кодируемая конструктом MAVS, приведена в SEQ ID NO: 1387 (кодируется иллюстративными нуклеотидными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 1413 и 1484). Репрезентативная аминокислотная последовательность, кодируемая конструктами MLKL, приведена в SEQ ID NO: 1327 (кодируется иллюстративными нуклеотидными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 1412 и 1483) и 1328. Репрезентативные аминокислотные последовательности, кодируемые конструктами каспазы-1, приведены в SEQ ID NO: 175-178 (кодируется иллюстративными нуклеотидными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 1395 и 1467). Репрезентативные аминокислотные последовательности, кодируемые конструктами каспазы-4, приведены в SEQ ID NO: 1352-1356 (кодируется иллюстративными нуклеотидными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 1396 и 1468). Мышей иммунизировали мРНК, кодирующей овальбумин, в качестве тестируемого антигена в комбинации с конструктом мРНК, кодирующей или: (i) STING; (ii) MAVS; (iii) IKKβ; (iv) каспазу 1/4+IKKβ; (v) MLKL; или (vi) MLKL+STING. В качестве контролей использовали конструкт NTFIX и DMXAA (химический активатор STING-зависимых путей врожденного иммунитета). Конструкт мРНК антигена OVA и конструкт иммуностимуляторной мРНК были совместно составлены в липидные наночастицы, содержащие: соединение 25: холестерин: DSPC: ПЭГ-DMG в соотношениях 50: 38,5: 10: 1,5, соответственно. Мышей иммунизировали внутримышечно на 1-е и 15-е сутки в дозе 0,5 мг/кг.
Клетки селезенки от мышей в каждой тестируемой группе повторно стимулировали ex vivo в течение 4 часов при 37 °С в присутствии GolgiPlug™ (содержащего брефельдин A; BD Biosciences) или с пептидом OVA (ГКГС класса I). Антигенспецифические CD8 ответы оценивали путем внутриклеточного окрашивания (ICS) в отношении ИФН-γ. Репрезентативные результаты ICS для OVA-специфических ответов клеток селезенки на 21-е сутки для ИФН-γ приведены на Фиг. 39. Репрезентативные результаты ICS для OVA-специфических ответов клеток селезенки на 50-е сутки для ИФН-γ приведены на Фиг. 40. Результаты демонстрируют, что все адаптерные соединения (STING и MAVS), индукция инфламмасом (с помощью каспазы 1/4+IKKβ) или индукция некроптосом (с помощью MLKL) приводят к иммуностимулированию антигенспецифических CD8 ответов. Кроме того, комбинация MLKL и STING проявляла повышенную активность по сравнению с одним MLKL. Более того, результаты на 50-е сутки демонстрируют, что иммуностимулирующий эффект был длительным. Эти результаты демонстрируют, что иммунные ответы могут усиливаться адаптерными белками, индукцией инфламмасом или индукцией некроптосом.
Пример 17: Сравнение конститутивно активных конструктов STING
В данном примере мышей C57/Bl6 иммунизировали конструктом мРНК, кодирующим антиген OVA, объединенным в состав или совместно введенным с различными конститутивно активными мутантными конструктами мРНК STING. Были протестированы конститутивно активные конструкты STING: (i) p23 (V155M); (ii) p57 (R284M/V147L/N154S/V155M); (iii) p56 (V147L/N154S/V155M); и (iv) p19 (R284M). Все конструкты были протестированы при объединении в состав с конструктом антигена OVA. Также был протестирован конструкт р23, вводимый совместно и с конструктом антигена OVA, но составленный отдельно. Мышей иммунизировали на 1-е и 14-е сутки.
На 21-е сутки мышей умерщвляли и с помощью ICS оценивали экспрессию ИФН-γ CD8+T клетками, как описано в данном документе. Результаты, приведенные на Фиг. 41A, демонстрирует, что все протестированные конститутивно активные мутантные конструкты STING проявляют способность иммуностимулировать антигенспецифический ответ CD8+T-клеток на антиген OVA в условиях in vivo (по сравнению с контролем NTFIX). Кроме того, конструкт р23 иммуностимулировал антигенспецифические ответы CD8+Т-клеток как в том случае, когда его комбинировали с конструктом антигена OVA, так и когда его вводили совместно с конструктом антигена OVA, но составляли отдельно. Более того на 90-е сутки мышей умерщвляли и с помощью ICS оценивали экспрессию ИФН-γ CD8+T клетками, как описано в данном документе. Результаты, приведенные на Фиг. 41 В, который демонстрирует, что иммуностимулирующий эффект конститутивно активных мутантных конструктов STING является длительным.
Пример 18: Роль CD4 и CD8 T-клеток в STING-опосредованном иммуностимулировании
В данном примере мышей, истощенных по CD4 или истощенных по CD8, использовали для оценки роли CD4+или CD8+T-клеток в STING-опосредованном иммуностимулировании. В первой серии экспериментов для истощения CD4 клеток мышам внутрибрюшинно инъецировали анти-CD4 мкАт GK1,5 на -3-е, -1-е, 11-е и 13-е сутки эксперимента. Эффективность истощения была подтверждена проточной цитометрией. Мышей вакцинировали на 1-е и 15-е с сутки с помощью антигенной вакцины HPV16 E6/E7, объединенной в состав с конструктом STING (V155M), внутримышечно в дозе 0,5 мг/кг.Вакцину и конструкты мРНК STING были совместно составлены в липидные наночастицы, содержащие: соединение 25: холестерин: DSPC: ПЭГ-DMG в соотношениях 50: 38,5: 10: 1,5, соответственно, при соотношении 1:1.
На 21-е и 50-е сутки мышей умерщвляли и с помощью ICS оценивали экспрессию ИФН-γ CD8+T клетками, как описано в данном документе. Результаты, приведенные на Фиг. 42A (21-е сутки) и на Фиг. 42B (50-е сутки). Аналогичные результаты наблюдались для экспрессии ФНО-α CD8+Т-клетками, как оценивали с помощью ICS (данные не показаны). Результаты демонстрируют, что адъювантный эффект, опосредованный STING, в значительной степени не зависит от помощи CD4+T-клеток.
5
3
Во второй серии экспериментов роль CD4 и CD8 T-клеток в эффекте вакцины HPV-STING на рост опухолевых клеток была исследована с использованием модели TC1, описанной в Примере 10. Клетки TC1 HPV (2 (10 клеток) имплантировали подкожно мышам C57/B6, и опухоли выращивали до объема, равного 100 мм, что считалось 1-ми сутками. На 1-е и 8-е сутки мышам внутривенно вводили растворимую антигенную вакцину HPV16 E6/E7, объединенную в состав с конструктом STING (V155M) (соотношение sE6/E7 и STING 1:1), в дозе 10 мкг.Контрольных мышей лечили только ФСБ. Кроме того, на 1-е, 4-е, 7-е, 10-е сутки и затем каждые две недели до конца исследования мышей лечили или анти-CD4 (мкАт GK1.5), или анти-CD8 (мкАт 2.43) для истощения CD4 Т-клеток или CD8 клеток, соответственно. Контрольные мыши не получали истощающих антител. Группы лечения и соответствующие дозы приведены в Таблице 19.
Таблица 19
Объем опухоли (мм<sup>3</sup>)
Группа
Доза 1 Vax(1-е сутки), мкг
Доза 2 Vax(8-е сутки), мкг
Лечение
100
ФСБ
отсутствует
отсутствует
отсутствует
sE6/7+STING (1:1)
10
10
ФСБ
sE6/7+STING (1:1)
10
5
анти-CD8 (2,43)
sE6/7+STING (1:1)
10
10
анти-CD4 (GK1.5)
Результаты, приведенные на Фиг. 43, демонстрируют объем опухоли в течение 22 суток. Результаты демонстрируют, что истощение CD4+T-клеток не оказывает значительного влияния на противоопухолевую эффективность вакцины HPV-STING, тогда как истощение CD8+T-клеток действительно влияет на противоопухолевую эффективность вакцины HPV-STING, демонстрируя тем самым, что эффективность вакцины зависит от CD8+T-клеток, но не от CD4+T-клеток.
Пример 19: STING смещает CD8 клетки к фенотипу эффекторных клеток памяти
lo
lo
hi
lo
В данном примере, чтобы дополнительно подтвердить результаты, представленные в Примерах 5 и 6, относительно эффекторных CD62L клеток памяти, были проведены дополнительные эксперименты, в которых мышей C57/Bl6 иммунизировали вакциной MC38 с различными концентрациями, объединенной в состав с различными концентрациями конструкта иммуностимуляторной мРНК STING. Используемые количества/соотношения Аг и STING были такими же, как указано в Таблице 15 Примера 11. Мышей иммунизировали на 1-е и 14-е сутки. На 21-е и 54-е сутки исследовали процент эффекторных CD62L клеток памяти среди CD44CD8+клеток. Результаты, приведенные на Фиг. 44A (21-е сутки) и на Фиг. 44B (54-е сутки). Результаты демонстрируют, что конструкт иммуностимуляторной мРНК STING смещает популяцию CD8 клеток к фенотипу эффекторных клеток памяти (CD62L клетки).
Пример 20: STING иммуностимулирует ответы на конкатемерную вакцину
при различных соотношениях антиген:STING
В данном примере исследовано, может ли иммуностимулятор, такой как конститутивно активный STING, стимулировать ответы Т-клеток на конкатемерную вакцину. В качестве вакцины был использован конструкт мРНК, кодирующий конкатемер CA-132 (описанный в Примере 11), который кодирует эпитопы класса I и класса II, и было исследовано влияние конструкта мРНК STING на ответы Т-клеток в отношении эпитопов класса I и класса II. мРНК CA-132 и STING или совместно составляли и доставляли одновременно, или совместно не составляли, с замедленной доставкой мРНК STING. Животным давали примирующую дозу на 1-е сутки и стимулирующую дозу на 15-е сутки. Спленоциты отбирали на 21-е сутки.
Различный материал тестировали для определения иммуногенности в момент добавления STING при различных соотношениях к конкатемерной вакцине, для сравнения STING с коммерчески доступными общепризнанными адъювантами, для определения, зависит ли иммуногенность от времени введения дозы STING, и для изучения иммуногенности мРНК без составления при введении вместе со STING. Были протестированы следующие материалы/условия: CA-132 (3 мкг), CA-132 (3 мкг) с Poly I:C (полиинозиновая-полицитидиловая кислота) (10 мкг), CA-132 (3 мкг) с MPLA (5 мкг), STING (1 мкг)/CA-132 (3 мкг), STING (0,6 мкг)/CA-132 (3 мкг), STING (0,6 мкг)/CA-57 (3 мкг), STING (0,6 мкг)/CA-132 (3 мкг) (через 24 часа), STING (0,6 мкг)/CA-132 (3 мкг) (через 48 часов), STING (0,6 мкг)/CA-132 (3 мкг) (не составляли) и STING (6 мкг)/CA-132 (30 мкг) (не составляли). CA-57 представляет собой конкатемер из 5 эпитопов класса II (все они содержатся в CA-132).
Результаты представлены на Фиг. 45-47. Когда антигенспецифические ответы ИФН-γ были исследованы с эпитопами класса II, обнаружилось, что STING усиливает иммунный ответ на эпитопы ГКГС класса II, кодируемые мРНК. STING проявил себя сопоставимо с коммерчески доступными адъювантами (разница в дозе в 5-10 раз) Хотя оба протестированных соотношения работали, соотношение 1:5 STING:антиген действовало лучше, чем соотношение 1:3 (Фиг. 45). Подобные результаты получены с использованием эпитопов класса I, как описано выше и показано на Фиг. 46. Аналогично, соотношение 1:5 STING:антиген оказалось лучше, чем соотношение 1:3 для эпитопов класса I.
Дополнительно, было обнаружено, что введение дозы STING в более поздний момент времени (24 часа) приводило к аналогичному увеличению иммуногенности по отношению к совместной доставке (Фиг. 47).
В дополнительном эксперименте исследовано влияние различных соотношений STING:антиген с использованием 52-х мышиных эпитопов. Мыши получали примирующую дозу на 1-е сутки, стимулирующую дозу на 8-е сутки, и спленоциты отбирали на 15-е сутки. Т-клеточные ответы на повторную стимуляцию оценивали с использованием ELISpot и FACS. Повторную стимуляцию Т-клеток in vitro проводили с помощью пептидных последовательностей, соответствующих эпитопам, закодированным в конкатемере. Исследованы Т-клеточные ответы в отношении пептидов эпитопов класса II (CA-82 и CA-83) и четырех пептидов эпитопов класса I (CA-87, CA-93, CA-113 и CA-90).
Неожиданно, было обнаружено, что добавление STING для большинства тестируемых соотношений улучшало Т-клеточные ответы по сравнению с одним антигеном и никогда не демонстрировало худших результатов, чем с одним антигеном. Широта реактивности была неожиданной. Для четырех из шести протестированных антигенов (эпитопов) добавление STING к антигену в общей дозе 10-30 мкг последовательно приводило к более высоким Т-клеточным ответам, чем для дозы в 50 мкг для одного антигена. Таким образом, имеется широкая кривая нормального распределения для соотношения STING:антиген в отношении улучшения иммуногенности.
Исследуемые группы были такими, как показано ниже в Таблице 20.
Таблица 20
Соотношение STING:Аг
0:1
20:1
5:1
1:1
1:5
1:20
Суммарная мРНК (мкг)
NTFIX(мкг)
Аг(мкг)
STING(мкг)
Аг(мкг)
STING(мкг)
Аг(мкг)
STING(мкг)
Аг(мкг)
STING(мкг)
Аг(мкг)
STING(мкг)
Аг(мкг)
0,15
2,85
0,15
0,5
9,5
0,5
1,5
28,6
1,5
3
27
3
2,85
0,15
2,4
0,6
1,5
1,5
0,6
2,4
0,15
2,85
10
20
10
9,5
0,5
8,3
1,4
5,0
5,0
1,4
8,3
0,5
9,5
30
0
30
28,6
1,4
25,0
4,2
15,0
15,0
4,2
25,0
1,4
28,6
50
0
20
Среди эпитопов класса II, CA-82 (результаты представлены на Фиг. 48) и CA-83 (результаты представлены на Фиг. 49) показано, что добавление STING увеличивало Т-клеточные ответы при соотношениях менее чем 1:1 (STING:антиген) по сравнению с группой, содержащей только антиген, в том числе в дозах до 50 мкг одного антигена. В левой части Фиг. 49 показано, что добавление STING увеличивает Т-клеточный ответ при всех соотношениях по отношению к группе только с антигеном.
Подобные результаты наблюдали для эпитопов класса I. CA-87 (результаты приведены на Фиг. 50), CA-93 (результаты приведены на Фиг. 51), CA-113 (результаты приведены на Фиг. 52), и CA-90 (результаты приведены на Фиг. 53) - все продемонстрировали, что соотношения STING:антиген вызывали более высокие Т-клеточные ответы по сравнению с группой только с антигеном в сравнении с суммарной дозой мРНК.
Пример 21: Кратное увеличение STING-опосредованной иммуностимуляции
В данном примере для исследования величины иммуностимуляции, опосредованной STING для различных антигенов, мышей лечили STING в комбинации с различными антигенами. В первой серии экспериментов, мышей лечили STING в комбинации с одним из следующих ранее описанных антигенов: (i) HPV16 E7 (внутриклеточный); (ii) HPV16 E7 (растворимый); (iii) неоантиген MC38 ADR (внутриклеточный); или (iv) OVA (растворимый). 2,5 мкг антигена Е7 HPV16 или 5 мкг неоантигена MC38 ADR вводили с 5 мкг STING. HPV16 E7 был совместно составлен с E6, что привело к соотношению антиген: STING 1:1 для антигенов HPV и ADR. На 21-е и 50+сутки, клетки селезенки отбирали и Т-клетки, экспрессирующие ИНФ-γ, также оценивали посредством внутриклеточного окрашивания (ICS), как описано в данном документе. Результаты рассчитаны как кратное увеличение иммунного ответа и суммированы ниже в Таблице 21 (результаты 21-х суток) и Таблице 22 (результаты 50+суток).
Таблица 21
Антиген
Формат
Кратное увеличение (21-е сутки)
Эксп 1
Эксп 2
Эксп 3
Среднее
E7 HPV16
внутриклеточный
33,90
22,56
28,23
E7 HPV16
растворимый
2,50
3,98
6,31
4,26
неоантиген MC38 ADR
внутриклеточный
4,57
11,67
8,12
OVA
растворимый
18,12
3,67
7,57
9,79
Таблица 22
Антиген
Формат
Кратное изменение (50+сутки)
Эксп 1
Эксп 2
Эксп 3
Среднее
E7 HPV16
внутриклеточный
13,33
13,33
E7 HPV16
растворимый
3,60
4,11
4,58
4,10
неоантиген MC38 ADR
внутриклеточный
27,80
86,00
56,90*
OVA
растворимый
29,85
4,93
17,39
*=35-е сутки
Во второй серии экспериментов мышей лечили STING в комбинации с конкатемерной вакциной CA-132, описанной в Примере 20, и ответы антигенспецифических Т-клеток на различные эпитопы в конкатемерной вакцине оценивали анализом ELISpot в отношении экспрессии ИФН-γ. Результаты рассчитаны как кратное увеличение иммунного ответа и приведены ниже в Таблице 23
Таблица 23
Эпитоп
Диапазон кратного увеличения
CA-82
0,3-318
CA-83
1,7-78
CA-87
0,7-974
CA-93
1,3-1148
CA-113
1,5-725
Результаты демонстрируют, что, хотя кратное увеличение иммунореактивности, опосредованное STING, варьировалось в зависимости от антигена, для большинства тестируемых антигенов STING вызывал по меньшей мере 2-кратное увеличение иммунореактивности, а для некоторых антигенов демонстрировал еще большее усиление иммунореактивности (например, более чем 5-кратное, более чем 10-кратное, более чем 20-кратное, более чем 30-кратное, более чем 50-кратное или более чем 75-кратное усиление) по сравнению с одним антигеном (то есть антиген+мРНК NTFIX).
Пример 22: Конструкты ммРНК MLKL индуцируют клеточную гибель
В данном примере был создан ряд конструктов ммРНК, которые кодируют аминокислотные остатки 1-180 MLKL человека или мыши и конструкты были протестированы на их способность вызывать клеточную гибель. Данные конструкты обычно также кодируют эпитопную метку на N-конце или С-конце для облегчения обнаружения. Были проверены различные эпитопные метки (FLAG, Myc, CT, HA, V5). Кроме того, все конструкты, содержащие кэп 1 5'Cap (7mG(5')ppp(5')NlmpNp), 5'-НТО, 3'-НТО, поли(А)-хвост из 100 нуклеотидов, и были полностью модифицированы 1-метил-псевдоуридином (m1ψ). В некоторых конструктах 3'-НТО содержал сайты связывания miR-122 и miR-142-3p.Аминокислотные последовательности открытой рамки считывания (ОРС) конструктов MLKL 1-180 человека и мыши без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 1327 и 1328, соответственно. Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие белок MLKL SEQ ID NO: 1327, приведены в SEQ ID NO: 1412 и 1483. Иллюстративная 5'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 21 и 1323. Иллюстративная 3'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 22. Иллюстративная 3'-НТО, содержащая сайты связывания miR-122 и miR-142-3p, для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 23.
Чтобы определить, могут ли конструкты MLKL 1-180 индуцировать клеточную гибель, конструкты были трансфицированы в клетки гепатомы человека Hep3B. Двадцать тысяч клеток HeLa на лунку высевали в 96-луночные планшеты, и конструкты ммРНК трансфицировали в них с использованием Lipofectamine 2000. Через 24 часа клеточную гибель измеряли с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo™ (Promega). Результаты, приведенные на Фиг. 54, демонстрируют, что конструкты ммРНК MLKL 1-180 были способны индуцировать гибель клеток HeLa.

Эти результаты были подтверждены проведением аналогичных экспериментов с конструктами ммРНК MLKL 1-180 и клетками Hep3B в присутствии YOYO-3 (Life Technologies), красителя ДНК, который поглощается преимущественно мертвыми клетками, который используется для измерения степени гибели клеток. Эксперименты, проведенные с использованием системы считывания YOYO-3 для определения жизнеспособности клеток, результаты которой приведены на Фиг. 55 подтвердили, что конструкты ммРНК MLKL 1-180 были способны индуцировать гибель клеток гепатомы Hep3B.
Пример 23: Конструкты ммРНК MLKL вызывают некроптоз
В данном примере была исследована способность конструктов ммРНК MLKL 1-180 вызывать некроптоз. Некроптоз характеризуется разрывом плазматической мембраны и вытеканием цитозольного содержимого в окружающую область. Это можно проверить на анализ in vitro путем обнаружения вытекания молекулярных структур, ассоциированных с повреждениями, (DAMP) в культуральную среду.
В первой серии экспериментов конструкты ммРНК MLKL 1-180 трансфицировали в клетки HeLa (как описано в Примере 22), и измеряли высвобождение АТФ, DAMP в качестве индикатора некроптоза. Высвобождение АТФ определяли с использованием анализа ENLITEN(ATP (Promega). Результаты, которые приведены на Фиг. 56, демонстрируют, что конструкты ммРНК MLKL 1-180 индуцируют высвобождение АТФ из клеток, что указывает на то, что конструкты вызывают некроптоз.
4
2
Для подтверждения того, что происходит некроптоз, была проведена вторая серия экспериментов, в которых конструкты ммРНК MLKL 1-180 трансфицировали в клетки HeLa и высвобождение HMGB1, другого DAMP, измеряли в качестве индикатора некроптоза. Высвобождение HMGB1 было обнаружено с использованием анализа ИФА HMGB1. Для этого набора экспериментов клетки HeLa (2 (10 клеток/100 мкл/лунку) трансфицировали смесью для трансфекции (20 мкл), содержащей конструкт мРНК (200 нг/лунку; объем 1 мкл), липофектамин (объем 0,2 мкл/лунку) и Opti-MEM (18,8 мкл/объем лунки). Перед трансфекцией клеток смесь для трансфекции инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре и затем поверх клеток добавляли смесь для трансфекции. Планшеты с культурами аккуратно постукивали и затем инкубировали при 37(С, 5% СО в течение 0, 1, 3 и 6 часов. В каждый из этих моментов времени супернатант объемом 110 мкл удаляли, объединяли и центрифугировали при 1000 об/мин. 50 мкл супернатанта на трансфекцию использовали в стандартном ИФА HMGB1. Результаты, приведенные на Фиг. 57, демонстрируют, что конструкты ммРНК MLKL 1-180 индуцируют высвобождение HMGB1 из клеток, что указывает на то, что конструкты вызывают некроптоз.
В третьей серии экспериментов изучали влияние обработки конструктом ммРНК MLKL 1-180 на экспрессию на клеточной поверхности кальретикулина (CRT), молекулы DAMP, которая обычно находится в просвете эндоплазматического ретикулума, но транслоцируется на поверхность умирающих клеток после индукции некроптоза, где она опосредует фагоцитоз макрофагами и дендритными клетками. Клетки или ложно-трансфицировали, трансфицировали конструктом, индуцирующим апоптоз («PUMA»), или трансфицировали конструктом ммРНК MLKL 1-180 (huMLKL.4HB(1-180).cHA miR122/142-3p) и окрашивали клеточную поверхность стандартными методами на экспрессию кальретикулина. Результаты, приведенные на Фиг. 58, демонстрирует, что конструкт MLKL, но не конструкт, индуцирующий апоптоз, индуцировал транслокацию CRT на клеточную поверхность, тем самым дополнительно подтверждая, что конструкт MLKL вызывал некроптоз.

В четвертой серии экспериментов изучалось влияние ингибитора - некросульфонамида (NSA) на клеточную гибель, вызванную MLKL. NSA является ингибитором, который специфически нацелен на MLKL. Было показано, что NSA ингибирует клеточную гибель зависимым от концентрации образом (измеренная с использованием YOYO-3 в качестве регистрируемого показателя; данные не показаны), индуцированную конструктом MLKL, подтверждая тем самым, что наблюдаемая гибель клеток была некроптотической гибелью клеток, индуцированной MLKL.
Пример 24: Конструкты ммРНК RIPK3 и GSDMD индуцируют клеточную гибель
В данном примере был создан ряд конструктов ммРНК, которые кодируют RIPK3 и GSDMD, и конструкты были протестированы на их способность индуцировать клеточную гибель. Данные конструкты обычно также кодируют эпитопную метку на N-конце или С-конце для облегчения обнаружения. Были проверены различные эпитопные метки (FLAG, Myc, CT, HA, V5). Кроме того, все конструкты, содержащие кэп 1 5'Cap (7mG(5')ppp(5')NlmpNp), 5'-НТО, 3'-НТО, поли(А)-хвост из 100 нуклеотидов, и были полностью модифицированы 1-метил-псевдоуридином (m1Ψ). Аминокислотные последовательности ОРС конструктов RIP3K без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 1329-1344. Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие белок RIPK3 SEQ ID NO: 1339, приведены в SEQ ID NO: 1415 и 1486. Аминокислотные последовательности ОРС конструктов GSDMD без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 1367-1372. Иллюстративная 5'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 21 и 1323. Иллюстративная 3'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 22. Иллюстративная 3'-НТО, содержащая сайты связывания miR-122 и miR-142-3p, для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 23.

Чтобы определить, могут ли конструкты RIPK3 или GSDMD вызывать клеточную гибель, конструкты были трансфицированы в три различных типа клеток: клетки HeLa, клетки B16F10 и клетки MC38. Пять тысяч клеток на лунку высевали в 96-луночные планшеты, и конструкты ммРНК трансфицировали в них с использованием Lipofectamine 2000. Через 24 часа клеточную гибель измеряли с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (Promega). Результаты, приведенные на Фиг. 59А (клетки HeLa), Фиг. 59B (клетки B16F10) и Фиг. 59C (клетки MC38), с данными для конструктов MLKL (1-180) также приведены для сравнения. Результаты демонстрируют, что конструкты ммРНК RIPK3 были способны индуцировать клеточную гибель во всех трех типах клеток с эффективностью, сравнимой с наблюдаемой для конструкта MLKL (1-180). Результаты также демонстрируют, что конструкт GSDMD также способен индуцировать клеточную гибель во всех трех типах клеток, хотя и с меньшей активностью, чем наблюдаемая для конструкта MLKL (1-180). Аналогичные результаты наблюдали для экспериментов, проведенных с системой считывания YOYO-3.

Был создан ряд дополнительных конструктов RIPK3, которые были разработаны для олигомеризации. Эти конструкты содержат белковые домены (тример IZ или хиральные домены лейциновой застежки (EE и RR)), которые приводят к тримеризации и олигомеризации белков. Индуцированное образование димера или тримера RIPK3 приводит к появлению олигомеров с более высокой молекулярной массой и индукции некроптоза (для справки см. Yatim et al., Science, 2015 и Orozco et al. Cell Death Differ, 2014). Эти конструкты были протестированы на их способность вызывать клеточную гибель путем трансфекции в клетки NIH3T3. Клеточную гибель измеряли с использованием системы считывания YOYO-3 через 15 часов после трансфекции. Результаты, приведенные на Фиг. 60 и в Таблице 24, демонстрируют, что мультимеризующие конструкты RIPK3 индуцируют гибель клеток NIH3T3.
Таблица 24
Белок
Димеризация с B/B гомодимеризатором
Связывается с RIPK1
ΔN-Fv-Caspase-8.nFLG
Да
Нет
muRIPK3ΔC-2xSGTA.DM.cV5
Нет
Нет
ΔN-SGTA.DM-Caspase-8.nFlg
Нет
Нет
muRIPK3ΔC-2xSrc.DM.cV5
Нет
Нет
ΔN-Src.DM-Caspase-8.nFlg
Нет
Нет
huRIPK3.del.C-2xFv.cV5
Да
Нет
muRIPK3-2xFV.cV5
Да
Да
muRIPK3-IZ.Trimer
Нет
Да
Способность мультимеризующихся конструктов RIPK3 индуцировать высвобождение DAMP исследовали как индикатор индукции некроптоза конструктами. Клетки B16F10 трансфицировали или мультимеризующимся конструктом RIPK3 (тример RIPK3-IZ), конструктом, индуцирующим апоптоз (PUMA), конструктом MLKL 1-180 (huMLKL.4HB (1-180).cHA miR122/142-3p), приведенном в Примере 23, для индукции высвобождения DAMP, или контрольным конструктом ЗФБ. Высвобождение HMGB1 было обнаружено с использованием анализа ИФА HMGB1. Результаты, приведенные на Фиг. 61, демонстрируют, что мультимеризующий конструкт RIPK3 индуцировал высвобождение HMGB1 на тех же уровнях, что и конструкт MLKL.

В другой серии экспериментов изучалось влияние ингибитора GSK'872 на гибель клеток, индуцированную RIPK3. GSK'872 является ингибитором, который специфически нацелен на RIPK3. Было показано, что GSK'872 ингибирует клеточную гибель зависимым от концентрации образом (измеренная с использованием YOYO-3 в качестве регистрируемого показателя; данные не показаны), индуцированную конструктами RIPK3, подтверждая тем самым, что наблюдаемая клеточная гибель была некроптотической клеточной гибелью клеток, индуцированной RIPK3.
Пример 25: Конструкты ммРНК DIABLO индуцируют клеточную гибель
В данном примере был создан ряд конструктов ммРНК, которые кодируют DIABLO, и конструкты были протестированы на их способность индуцировать клеточную гибель. Данные конструкты обычно также кодируют эпитопную метку на N-конце или С-конце для облегчения обнаружения. Были проверены различные эпитопные метки (FLAG, Myc, CT, HA, V5). Кроме того, все конструкты, содержащие кэп 1 5'Cap (7mG(5')ppp(5')NlmpNp), 5'-НТО, 3'-НТО, поли(А)-хвост из 100 нуклеотидов, и были полностью модифицированы 1-метил-псевдоуридином (m1Ψ). Аминокислотные последовательности ОРС конструктов DIABLO без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 165-172. Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие белок DIABLO SEQ ID NO: 169, приведены в SEQ ID NO: 1416 и 1487. Иллюстративная 5'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 21 и 1323. Иллюстративная 3'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 22. Иллюстративная 3'-НТО, содержащая сайты связывания miR-122 и miR-142-3p, для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 23.

Чтобы определить, могут ли конструкты DIABLO вызывать гибель клеток, конструкты были трансфицированы в клетки SKOV3. Десять тысяч клеток на лунку высевали в 96-луночные планшеты, и конструкты ммРНК трансфицировали в них с использованием Lipofectamine 2000. Через 41 часа клеточную гибель измеряли с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (Promega). Результаты, приведенные на Фиг. 62, демонстрируют, что ряд конструктов ммРНК DIABLO были способны индуцировать клеточную гибель.
Пример 26: Конструкты ммРНК каспазы 4, каспазы-5, каспазы-11, пирина, NLRP3 и ASC индуцируют клеточную гибель

В данном примере конструкты ммРНК, кодирующие различные формы каспазы-4, каспазы-5, каспазы-11, пирина, NLRP3 или ASC, были получены и трансфицированы в клетки для оценки их способности вызывать клеточную гибель с использованием красителя ДНК YOYO-3 (Life Technologies) для измерения степени клеточной гибели.
В первой серии экспериментов была создана панель конструктов ммРНК, которые кодируют различные белки каспазы-4, -5 или -11, и конструкты были протестированы на их способность вызывать гибель клеток. Исследуемые конструкты кодируют одно из (i) полноразмерной каспазы-4, каспазы-5 или каспазы-11 дикого типа; (ii) полноразмерной каспазы-4, -5 или -11 плюс домен IZ; (iii) каспазы-4, -5 или -11 c удаленным N-концом плюс домен IZ; (iv) полноразмерной каспазы-4, -5 или -11 плюс домен DM; или (v) каспазы-4, -5 или -11 c удаленным N-концом плюс домен DM. Формы каспазы-4 и каспазы-11 с удаленным N-концом содержали аминокислотные остатки 81-377, тогда как формы каспазы-5 с удаленным N-концом содержали аминокислотные остатки 137-434. Данные конструкты обычно также кодируют эпитопную метку (например, FLAG, Myc, CT, HA, V5) на N-конце или С-конце для облегчения обнаружения. Кроме того, все конструкты, содержащие кэп 1 5'Cap (7mG(5')ppp(5')NlmpNp), 5'-НТО, 3'-НТО, поли(А)-хвост из 100 нуклеотидов, и были полностью модифицированы 1-метил-псевдоуридином (m1ψ). Аминокислотные последовательности ОРС конструктов каспазы-4 без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 1352-1356. Аминокислотные последовательности ОРС конструктов каспазы-5 без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 1357-1361. Аминокислотные последовательности ОРС конструктов каспазы-11 без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 1362-1366. Иллюстративная 5'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 21 и 1323. Иллюстративная 3'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 22. Иллюстративная 3'-НТО, содержащая сайты связывания miR-122 и miR-142-3p, для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 23.
Чтобы определить, могут ли конструкты каспазы-4, -5 и -11 вызывать клеточную гибель, конструкты были трансфицированы в клетки HeLa с использованием Lipofectamine 2000. Через 24 часа измеряли гибель клеток с использованием красителя ДНК YOYO-3. Результаты, приведенные на Фиг. 63, демонстрируют, что все пять форм конструктов ммРНК каспазы-4, каспазы-5 и каспазы-11 были способны индуцировать гибель клеток HeLa.
Во второй серии экспериментов была создана панель конструктов ммРНК, которые кодируют различные белки пирина, NLRP3 или ASC, и конструкты были протестированы на их способность вызывать клеточную гибель. Данные конструкты обычно также кодируют эпитопную метку (например, FLAG, Myc, CT, HA, V5) на N-конце или С-конце для облегчения обнаружения. Кроме того, все конструкты, содержащие кэп 1 5'Cap (7mG(5')ppp(5')NlmpNp), 5'-НТО, 3'-НТО, поли(А)-хвост из 100 нуклеотидов, и были полностью модифицированы 1-метил-псевдоуридином (m1Ψ). Аминокислотные последовательности ОРС конструктов пирина без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 1375 и 1376. Аминокислотные последовательности ОРС конструктов NLRP3 без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 1373 и 1374. Аминокислотные последовательности ОРС конструктов ASC без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 1377 и 1378. Иллюстративная 5'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 21 и 1323. Иллюстративная 3'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 22. Иллюстративная 3'-НТО, содержащая сайты связывания miR-122 и miR-142-3p, для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 23.
Чтобы определить, могут ли конструкты NLRP3 и ASC вызывать клеточную гибель, конструкты были трансфицированы в клетки HeLa с использованием Lipofectamine 2000. Через 24 часа измеряли гибель клеток с использованием красителя ДНК YOYO-3. Результаты, приведенные на Фиг. 64, демонстрируют, что конструкты ммРНК пирина, NLRP3 и ASC были способны индуцировать гибель клеток HeLa.
Пример 27: Конструктивно активные конструкты ммРНК IRF3 и IRF7 активируют
интерферон-стимулируемый реагирующий элемент (ISRE)
В данном примере репортерный ген, транскрипцию которого управлялась интерферон-стимулируемый реагирующий элемент (ISRE), использовали для проверки способности конститутивно активных конструктов мРНК IRF3 и IRF7 активировать ISRE. Конститутивно активные конструкты IRF3 и IRF7 были получены и описаны ниже. Данные конструкты обычно также кодируют эпитопную метку на N-конце или С-конце для облегчения обнаружения. Были проверены различные эпитопные метки (FLAG, Myc, CT, HA, V5). Кроме того, все конструкты, содержащие кэп 1 5'Cap (7mG(5')ppp(5')NlmpNp), 5'-НТО, 3'-НТО, поли(А)-хвост из 100 нуклеотидов, и были полностью модифицированы 1-метил-псевдоуридином (m1Ψ). Аминокислотные последовательности ОРС репрезентативных конститутивно активных конструктов IRF3 мыши и человека, содержащих точечную мутацию S396D, без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 11 и 12, соответственно. Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие данные белки IRF3, приведены в SEQ ID NO: 210 и 211, соответственно, и в SEQ ID NO: 1452 и 1453, соответственно. Аминокислотные последовательности ОРС репрезентативных конститутивно активных конструктов IRF7 человека без какой-либо эпитопной метки приведены в SEQ ID NO: 13-20. Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие данные белки IRF7, приведены в SEQ ID NO: 212-219, соответственно, и в SEQ ID NO: 1454-1461. Иллюстративная 5'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 21 и 1323. Иллюстративная 3'-НТО для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 22. Иллюстративная 3'-НТО, содержащая сайты связывания miR-122 и miR-142-3p, для применения в конструктах приведена в SEQ ID NO: 23.
Результаты, приведенные на Фиг. 65А-В, демонстрируют, что как конститутивно активные конструкты IRF3 (Фиг. 65А), так и конститутивно активные конструкты IRF7 (Фиг. 65B) стимулировали экспрессию репортерного гена, что указывает на то, что конструкты были способны активировать интерферон-стимулируемый реагирующий элемент (ISRE).
Пример 28: Влияние примирования на высвобождение воспалительных цитокинов клетками, обработанными пироптотическими конструктами, вызывающими пироптоз
В данном примере изучалось влияние примирования клеток иммуностимулятором перед трансфекцией пироптотическим конструктом мРНК на высвобождение клетками провоспалительных цитокинов.
Дизайн исследования приведен на Фиг. 66. На 1-е сутки 10000 клеток HeLa на лунку высевали в 96-луночные планшеты. На 2-е сутки клетки обрабатывали одним из иммуностимуляторов, приведенным на Фиг. 66 (конститутивно активные конструкты IKKβ описаны далее в Примере 3). На 3-е сутки клетки трансфицировали одним из конструктов мРНК каспазы-4, каспазы-5 или каспазы-11, приведенных на Фиг. 66 (конструкты каспазы-4, -5 и -11 описаны далее в Примере 26). На 4-е сутки супернатанты собирали и анализировали на уровни воспалительного цитокина ИЛ-18 с помощью стандартного ИФА.
Результаты, приведенные на Фиг. 67, который демонстрирует, что примирование клеток, в частности, иммуностимуляторами, ИЛ-1α или конститутивно активным конструктом IKKβ с мутацией PEST, стимулировало высвобождение провоспалительных цитокинов клетками HeLa, в частности теми, которые обработаны конструктами каспазы-4 или каспазы-5. Эти результаты демонстрируют преимущество комбинирования иммуностимулятора с конструктом мРНК, кодирующим полипептид, который стимулирует иммуногенную клеточную гибель для усиления провоспалительного ответа.
Пример 29: Противоопухолевые эффекты исполнительной мРНК, отдельно или в комбинации с иммуностимулятором и/или ингибитором иммунной контрольной точки
В данном примере изучали влияние исполнительной мРНК на рост опухоли in vivo у мышей. Конструкты исполнительной мРНК, кодирующие MLKL, RIPK3 или DIABLO, использовались отдельно или в комбинации, а также в комбинации с иммуностимулятором (конструкт мРНК STING) и/или ингибитором иммунной контрольной точки (анти-CTLA4 или анти-PD-1 антитело).
5
3
В первой серии экспериментов мышей, имеющих опухоли карциномы толстой кишки MC38 (5 (10 клеток, имплантированных подкожно; опухоли размером ~ 100-120 мм во время лечения), разделяли на одиннадцать групп лечения и внутриопухолево вводили им следующие конструкты мРНК каждые две недели в течение 4 недель (1-е, 4-е, 8-е, 11-е, 17-е, 20-е, 24-е и 27-е сутки), при этом определенные группы также получали ингибиторы иммунной контрольной точки, как указано: (i) NT-MOD как отрицательный контроль; (ii) huMLKL.4HB(1-180).cHA miR122/142-3p (12,5 мкг/животное); (iii) DIABLO (12,5 мкг/животное); (iv) muRIPK3-IZ.Trimer (12,5 мкг/животное); (v) huMLKL.4HB(1-180).cHA miR122/142-3p (12,5 мкг/животное)+анти-CTLA4 9H10 (5 мг/кг внутрибрюшинно на 1-е сутки, 2,5 мг/кг внутрибрюшинно на 4-е и 7-е сутки; (vi) DIABLO (12,5 мкг/животное)+анти-CTLA4 9H10 (5 мг/кг, внутрибрюшинно на 1-е сутки, 2,5 мг/кг внутрибрюшинно на 4-е и 7-е сутки); (vii) muRIPK3-IZ.Trimer (12,5 мкг/животное)+анти-CTLA4 9H10 (5 мг/кг внутрибрюшинно в 1-е сутки, 2,5 мг/кг внутрибрюшинно на 4 и 7 сутки); (viii) NT-MOD+анти-CTLA4 9H10 (5 мг/кг внутрибрюшинно на 1-е сутки, 2,5 мг/кг внутрибрюшинно на 4-е и 7-е сутки); (ix) huMLKL.4HB(1-180).cHA miR122/142-3p (12,5 мкг/животное)+DIABLO (12,5 мкг/животное); (x) huMLKL.4HB(1-180).cHA miR122/142-3p (12,5 мкг/животное)+DIABLO (12,5 мкг/животное)+анти-CTLA4 9H10 (5 мг/кг внутрибрюшинно на 1-е сутки, 2,5 мг/кг внутрибрюшинно на 4-е и 7-е сутки); и (xi) анти-CTLA4 9H10 (5 мг/кг внутрибрюшинно на 1-е сутки, 2,5 мг/кг внутрибрюшинно на 4е и 7е сутки)+антиPD1 RMP114 (5 мг/кг внутрибрюшинно раз в две недели в течение двух недель) в качестве положительного контроля.
3
Результаты, приведенные на Фиг. 68A-68K, соответствующие одиннадцати группам лечения, описанным выше, демонстрируют объем опухоли (мм) у мышей в течение времени эксперимента. Кроме того, сыворотку собирали через 10 часов и 24 часа после первой внутриопухолевой инъекции и анализировали на экспрессию воспалительных цитокинов с использованием ProcataPlex (Affymetrix). Анализ цитокинов показал, что уровни ИФН-α, ИЛ-6, ФНО-α, GRO α (CXCL1), MIP-1 α  (CCL3), MIP-1β (CCL4) и RANTES (CCL5) были повышены в группах лечения по сравнению с контрольными группами.
5
3
Во второй серии экспериментов мышей, имеющих опухоли карциномы толстой кишки MC38 (5×10 клеток, имплантированных подкожно; опухоли размером ~ 100-120 мм во время лечения), делили на семь групп лечения и внутриопухолево вводили им следующие конструкты мРНК еженедельно в течение 4 недель (1-е, 8-е, 15-е, 22-е сутки): (i) NTMOD в качестве отрицательного контроля; (ii) NTMOD+STING; (iii) MLKL+STING; (iv) Diablo+STING; (v) RIPK3+STING; (vi) MLKL+Diablo+STING; и (vii) RIPK3+Diablo+STING. Все группы получали антиCTLA4 (внутрибрюшинно) в дозе 5 мг/кг на 1е сутки и в дозе 2,5 мг/кг на 4е и 7е сутки.
3
Результаты, приведенные на Фиг. 69A, соответствующие семи группам лечения, описанным выше, демонстрируют объем опухоли (мм) у мышей в течение времени эксперимента, а на Фиг. 69B демонстрируют процент выживаемости указанных групп лечения в течение эксперимента. Кроме того, сыворотку собирали через 10 часов и 24 часа после первой внутриопухолевой инъекции и анализировали на экспрессию воспалительных цитокинов с использованием ProcataPlex (Affymetrix). Анализ цитокинов показал, что уровни ИФН-α, ИЛ-6, ФНО-α, GRO-α (CXCL1), MIP1 α (CCL3), MIP1β (CCL4) и RANTES (CCL5) были повышены в группах лечения по сравнению с контрольными группами.
5
В третьей серии экспериментов мышей, имеющих опухоли карциномы толстой кишки MC38 (5×10 клеток, имплантированных подкожно), делили на три группы лечения и внутриопухолево вводили им следующие конструкты мРНК еженедельно в течение 4 недель (1е, 8е, 15е, 22е сутки): (i) контроль носителем; (ii) NTMOD+антиPD1; (iii) STING+антиPD1. АнтиPD1 вводили внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг раз в две недели в течение 2 недель.
3
Результаты, приведенные на Фиг. 70A, соответствующие трем группам лечения, описанным выше, демонстрируют объем опухоли (мм) у мышей в течение времени эксперимента, а на Фиг. 70B демонстрируют процент выживаемости групп лечения в течение эксперимента.
Другие варианты осуществления изобретения
Необходимо понимать, что хотя данное раскрытие было изложено в сочетании с его подробным описанием, вышеприведенное описание предназначено для иллюстрации, но не для ограничения объема данного раскрытия, который определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и изменения находятся в рамках следующих пунктов формулы изобретения.
Все ссылки, описанные в данном документе, включены посредством ссылки во всей их полноте.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQ ID NO:
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
1
MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNMAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS(huSTING(V155M); без эпитопной метки)
2
MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNVAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDtLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS(Hu STING(R284T); без эпитопной метки)
3
MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNVAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDmLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS(hu STING(R284M); без эпитопной метки)
4
MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNVAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDkLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS (Hu STING(R284K); без эпитопной метки)
5
MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFsVAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS(Hu STING(N154S); без эпитопной метки)
6
MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAlCEKGNFNVAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS(Hu STING(V147L); без эпитопной метки)
7
MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNVAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQqPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS(Hu STING(E315Q); без эпитопной метки)
8
MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNVAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLaTDFS(Hu STING(R375A); без эпитопной метки)
9
MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISALCEKGNFSMAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS(Hu STING(V147L/N154S/V155M); без эпитопной метки)
10
MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISALCEKGNFSMAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDMLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS(Hu STING(R284M/V147L/N154S/V155M); без эпитопной метки)
11
METPKPRILPWLVSQLDLGQLEGVAWLDESRTRFRIPWKHGLRQDAQMADFGIFQAWAEASGAYTPGKDKPDVSTWKRNFRSALNRKEVLRLAADNSKDPYDPHKVYEFVTPGARDFVHLGASPDTNGKSSLPHSQENLPKLFDGLILGPLKDEGSSDLAIVSDPSQQLPSPNVNNFLNPAPQENPLKQLLAEEQWEFEVTAFYRGRQVFQQTLFCPGGLRLVGSTADMTLPWQPVTLPDPEGFLTDKLVKEYVGQVLKGLGNGLALWQAGQCLWAQRLGHSHAFWALGEELLPDSGRGPDGEVHKDKDGAVFDLRPFVADLIAFMEGSGHSPRYTLWFCMGEMWPQDQPWVKRLVMVKVVPTCLKELLEMAREGGASSLKTVDLHIDNSQPISLTSDQYKAYLQDLVEDMDFQATGNI(супермышиный IRF3 S396D; без эпитопной метки)
12
MGTPKPRILPWLVSQLDLGQLEGVAWVNKSRTRFRIPWKHGLRQDAQQEDFGIFQAWAEATGAYVPGRDKPDLPTWKRNFRSALNRKEGLRLAEDRSKDPHDPHKIYEFVNSGVGDFSQPDTSPDTNGGGSTSDTQEDILDELLGNMVLAPLPDPGPPSLAVAPEPCPQPLRSPSLDNPTPFPNLGPSENPLKRLLVPGEEWEFEVTAFYRGRQVFQQTISCPEGLRLVGSEVGDRTLPGWPVTLPDPGMSLTDRGVMSYVRHVLSCLGGGLALWRAGQWLWAQRLGHCHTYWAVSEELLPNSGHGPDGEVPKDKEGGVFDLGPFIVDLITFTEGSGRSPRYALWFCVGESWPQDQPWTKRLVMVKVVPTCLRALVEMARVGGASSLENTVDLHIDNSHPLSLTSDQYKAYLQDLVEGMDFQGPGET(суперчеловеческий IRF3 S396D; без эпитопной метки)
13
MALAPERAAPRVLFGEWLLGEISSGCYEGLQWLDEARTCFRVPWKHFARKDLSEADARIFKAWAVARGRWPPSSRGGGPPPEAETAERAGWKTNFRCALRSTRRFVMLRDNSGDPADPHKVYALSRELCWREGPGTDQTEAEAPAAVPPPQGGPPGPFLAHTHAGLQAPGPLPAPAGDKGDLLLQAVQQSCLADHLLTASWGADPVPTKAPGEGQEGLPLTGACAGGPGLPAGELYGWAVETTPSPgpqpaalttgeaaapesphqaepylspspsactavqepspgaldvtimykgrtvlqkvvghpsctflygppdpavratdpqqvafpspaelpdqkqlryteellrhvapglhlelrgpqlwarrmgkckvywevggppgsaspstpacllprncdtpifdfrvffqelvefrarqrrgsprytiylgfgqdlsagrpkekslvlvklepwlcrvhlegtqrEGVSSLDSSSLSLCLSSANSLYDDIECFLMELEQPA(Изоформа A Hu IRF7 дикого типа; P037 без эпитопной метки)
14
MALAPERAAPRVLFGEWLLGEISSGCYEGLQWLDEARTCFRVPWKHFARKDLSEADARIFKAWAVARGRWPPSSRGGGPPPEAETAERAGWKTNFRCALRSTRRFVMLRDNSGDPADPHKVYALSRELCWREGPGTDQTEAEAPAAVPPPQGGPPGPFLAHTHAGLQAPGPLPAPAGDKGDLLLQAVQQSCLADHLLTASWGADPVPTKAPGEGQEGLPLTGACAGGPGLPAGELYGWAVETTPSPgpqpaalttgeaaapesphqaepylspspsactavqepspgaldvtimykgrtvlqkvvghpsctflygppdpavratdpqqvafpspaelpdqkqlryteellrhvapglhlelrgpqlwarrmgkckvywevggppgsaspstpacllprncdtpifdfrvffqelvefrarqrrgsprytiylgfgqdlsagrpkekslvlvklepwlcrvhlegtqrEGVSSLDSSdLdLCLSSANSLYDDIECFLMELEQPA(конститутивно активный Hu IRF7 S477D/S479D; P033 без эпитопной метки)
15
MALAPERAAPRVLFGEWLLGEISSGCYEGLQWLDEARTCFRVPWKHFARKDLSEADARIFKAWAVARGRWPPSSRGGGPPPEAETAERAGWKTNFRCALRSTRRFVMLRDNSGDPADPHKVYALSRELCWREGPGTDQTEAEAPAAVPPPQGGPPGPFLAHTHAGLQAPGPLPAPAGDKGDLLLQAVQQSCLADHLLTASWGADPVPTKAPGEGQEGLPLTGACAGGPGLPAGELYGWAVETTPSPgpqpaalttgeaaapesphqaepylspspsactavqepspgaldvtimykgrtvlqkvvghpsctflygppdpavratdpqqvafpspaelpdqkqlryteellrhvapglhlelrgpqlwarrmgkckvywevggppgsaspstpacllprncdtpifdfrvffqelvefrarqrrgsprytiylgfgqdlsagrpkekslvlvklepwlcrvhlegtqrEGVSSLDdSdLSdCLSSANSLYDDIECFLMELEQPA(конститутивно активный Hu IRF7 S475D/S477D/L480D; P034 без эпитопной метки)
16
MALAPERAAPRVLFGEWLLGEISSGCYEGLQWLDEARTCFRVPWKHFARKDLSEADARIFKAWAVARGRWPPSSRGGGPPPEAETAERAGWKTNFRCALRSTRRFVMLRDNSGDPADPHKVYALSRELCWREGPGTDQTEAEAPAAVPPPQGGPPGPFLAHTHAGLQAPGPLPAPAGDKGDLLLQAVQQSCLADHLLTASWGADPVPTKAPGEGQEGLPLTGACAGGPGLPAGELYGWAVETTPSPgpqpaalttgeaaapesphqaepylspspsactavqepspgaldvtimykgrtvlqkvvghpsctflygppdpavratdpqqvafpspaelpdqkqlryteellrhvapglhlelrgpqlwarrmgkckvywevggppgsaspstpacllprncdtpifdfrvffqelvefrarqrrgsprytiylgfgqdlsagrpkekslvlvklepwlcrvhlegtqrEGVSSLDdddLdLCLdSANdLYDDIECFLMELEQPA(конститутивно активный Hu IRF7 S475D/S476D/S477D/S479D/S483D/S487D; P035 без эпитопной метки)
17
MALAPERAAPRVLFGEWLLGEISSGCYEGLQWLDEARTCFRVPWKHFARKDLSEADARIFKAWAVARGRWPPSSRGGGPPPEAETAERAGWKTNFRCALRSTRRFVMLRDNSGDPADPHKVYALSRELCWREGPGTDQTEAEAPAAVPPPQGGPPGPFLAHTHAGLQAPGPLPAPAGDKGDLLLQAVQQSCLADHLLTASWGADPVPTKAPGEGQEGLPLTGACAGGPGLPAGELYGWAVETTPSPEGVSSLDSSSLSLCLSSANSLYDDIECFLMELEQPA(конститутивно активный усеченный Hu IRF7 1-246+468-503; P032 без эпитопной метки)
18
MALAPERAAPRVLFGEWLLGEISSGCYEGLQWLDEARTCFRVPWKHFARKDLSEADARIFKAWAVARGRWPPSSRGGGPPPEAETAERAGWKTNFRCALRSTRRFVMLRDNSGDPADPHKVYALSRELCWREGPGTDQTEAEAPAAVPPPQGGPPGPFLAHTHAGLQAPGPLPAPAGDKGDLLLQAVQQSCLADHLLTASWGADPVPTKAPGEGQEGLPLTGACAGGPGLPAGELYGWAVETTPSPEGVSSLDdddLdLCLdSANdLYDDIECFLMELEQPA(конститутивно активный усеченный Hu IRF7 1-246+468-503 плюс S475D/S476D/S477D/S479D/S483D/S487D; P036 без эпитопной метки)
19
MALAPERAAPRVLFGEWLLGEISSGCYEGLQWLDEARTCFRVPWKHFARKDLSEADARIFKAWAVARGRWPPSSRGGGPPPEAETAERAGWKTNFRCALRSTRRFVMLRDNSGDPADPHKVYALSRELCWREGPGTDQTEAEAPAAVPPPQgpqpaalttgeaaapesphqaepylspspsactavqepspgaldvtimykgrtvlqkvvghpsctflygppdpavratdpqqvafpspaelpdqkqlryteellrhvapglhlelrgpqlwarrmgkckvywevggppgsaspstpacllprncdtpifdfrvffqelvefrarqrrgsprytiylgfgqdlsagrpkekslvlvklepwlcrvhlegtqrEGVSSLDSSSLSLCLSSANSLYDDIECFLMELEQPA(усеченный Hu IRF7 1-151+247-503; P038 без эпитопной метки; нулевая мутация)
20
MGGPPGPFLAHTHAGLQAPGPLPAPAGDKGDLLLQAVQQSCLADHLLTASWGADPVPTKAPGEGQEGLPLTGACAGGPGLPAGELYGWAVETTPSPgpqpaalttgeaaapesphqaepylspspsactavqepspgaldvtimykgrtvlqkvvghpsctflygppdpavratdpqqvafpspaelpdqkqlryteellrhvapglhlelrgpqlwarrmgkckvywevggppgsaspstpacllprncdtpifdfrvffqelvefrarqrrgsprytiylgfgqdlsagrpkekslvlvklepwlcrvhlegtqrEGVSSLDSSSLSLCLSSANSLYDDIECFLMELEQPA(усеченный Hu IRF7 152-503; P039 без эпитопной метки; нулевая мутация)
21
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC(5'-НТО)
22
TGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(3'-НТО)
23
TGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCCAAACACCATTGTCACACTCCATCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTCCATAAAGTAGGAAACACTACATGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(3'-НТО с сайтами miR-122 и miR-142-3p)
24
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(аминокислотная последовательность пептида 2А)
25
GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT(Нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид 2А)
26
TCCGGACTCAGATCCGGGGATCTCAAAATTGTCGCTCCTGTCAAACAAACTCTTAACTTTGATTTACTCAAACTGGCTGGGGATGTAGAAAGCAATCCAGGTCCACTC(Нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид 2А)
27
GACAGUGCAGUCACCCAUAAAGUAGAAAGCACUACUAACAGCACUGGAGGGUGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGAUGAGUGUACUGUG(miR-142)
28
UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA(miR-142-3p)
29
UCCAUAAAGUAGGAAACACUACA(сайт связывания miR-142-3p)
30
CAUAAAGUAGAAAGCACUACU(miR-142-5p)
31
AGUAGUGCUUUCUACUUUAUG(сайт связывания miR-142-5p)
32
AACGCCAUUAUCACACUAAAUA(miR-122-3p)
33
UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG(miR-122-5p)
34
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(miR-21-5p)
35
CAACACCAGUCGAUGGGCUGU(miR-21-3p)
36
MHQKRTAMFQDPQER(пептид Е6 HPV)
37
RTAMFQDPQERPRKL(пептид Е6 HPV)
38
FQDPQERPRKLPQLC(пептид Е6 HPV)
39
QERPRKLPQLCTELQ(пептид Е6 HPV)
40
RKLPQLCTELQTTIH(пептид Е6 HPV)
41
QLCTELQTTIHDIIL(пептид Е6 HPV)
42
ELQTTIHDIILECVY(пептид Е6 HPV)
43
LECVYCKQQLLRRII(пептид Е6 HPV)
44
IILECVYCKQQLLRR(пептид Е6 HPV)
45
CVYCKQQLLRREVYD
46
KQQLLRREVYDFAFR(пептид Е6 HPV)
47
LRREVYDFAFRDLCI(пептид Е6 HPV)
48
VYDFAFRDLCIVYRD(пептид Е6 HPV)
49
AFRDLCIVYRDGNPY(пептид Е6 HPV)
50
LCIVYRDGNPYAVCD(пептид Е6 HPV)
51
YRDGNPYAVCDKCLK(пептид Е6 HPV)
52
NPYAVCDKCLKFYSK(пептид Е6 HPV)
53
VCDKCLKFYSKISEY(пептид Е6 HPV)
54
CLKFYSKISEYRHYC(пептид Е6 HPV)
55
YSKISEYRHYCYSLY(пептид Е6 HPV)
56
SEYRHYCYSLYGTTL(пептид Е6 HPV)
57
HYCYSLYGTTLEQQY(пептид Е6 HPV)
58
SLYGTTLEQQYNKPL(пептид Е6 HPV)
59
TTLEQQYNKPLCDLL(пептид Е6 HPV)
60
QQYNKPLCDLLIRCI(пептид Е6 HPV)
61
KPLCDLLIRCINCQK(пептид Е6 HPV)
62
DLLIRCINCQKPLCP(пептид Е6 HPV)
63
RCINCQKPLCPEEKQ(пептид Е6 HPV)
64
CQKPLCPEEKQRHLD(пептид Е6 HPV)
65
LCPEEKQRHLDKKQR(пептид Е6 HPV)
66
EKQRHLDKKQRFHNI(пептид Е6 HPV)
67
HLDKKQRFHNIRGRW(пептид Е6 HPV)
68
KQRFHNIRGRWTGRC(пептид Е6 HPV)
69
HNIRGRWTGRCMSCC(пептид Е6 HPV)
70
GRWTGRCMSCCRSSR(пептид Е6 HPV)
71
GRCMSCCRSSRTRRE(пептид Е6 HPV)
72
SCCRSSRTRRETQL(пептид Е6 HPV)
73
MHGDTPTLHEYMLDL(пептид E7 HPV)
74
TPTLHEYMLDLQPET(пептид E7 HPV)
75
HEYMLDLQPETTDLY(пептид E7 HPV)
76
LDLQPETTDLYCYEQ(пептид E7 HPV)
77
PETTDLYCYEQLNDS(пептид E7 HPV)
78
DLYCYEQLNDSSEEE(пептид E7 HPV)
79
YEQLNDSSEEEDEID(пептид E7 HPV)
80
NDSSEEEDEIDGPAG(пептид E7 HPV)
81
EEEDEIDGPAGQAEP(пептид E7 HPV)
82
EIDGPAGQAEPDRAH(пептид E7 HPV)
83
PAGQAEPDRAHYNIV(пептид E7 HPV)
84
AEPDRAHYNIVTFCC(пептид E7 HPV)
85
RAHYNIVTFCCKCDS(пептид E7 HPV)
86
NIVTFCCKCDSTLRL(пептид E7 HPV)
87
FCCKCDSTLRLCVQS(пептид E7 HPV)
88
CDSTLRLCVQSTHVD(пептид E7 HPV)
89
LRLCVQSTHVDIRTL(пептид E7 HPV)
90
VQSTHVDIRTLEDLL(пептид E7 HPV)
91
HVDIRTLEDLLMGTL(пептид E7 HPV)
92
RTLEDLLMGTLGIVC(пептид E7 HPV)
93
DLLMGTLGIVCPICS(пептид E7 HPV)
94
GTLGIVCPICSQKP(пептид E7 HPV)
95
MKLVVVGADGVGKSAL(KRAS(G12D)15mer)
96
MKLVVVGAVGVGKSAL(KRAS(G12V)15mer)
97
MLVVVGAGDVGKSALT(KRAS(G13D)15mer)
98
MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQ(KRAS(G12D)25mer)
99
MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQ(KRAS(G12V)25mer)
100
MTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQ(KRAS(G13D)25mer)
101
MKLVVVGADGVGKSALKLVVVGADGVGKSALKLVVVGADGVGKSAL(KRAS(G12D)15mer^3)
102
MKLVVVGAVGVGKSALKLVVVGAVGVGKSALKLVVVGAVGVGKSAL(KRAS(G12V)15mer^3)
103
MLVVVGAGDVGKSALTLVVVGAGDVGKSALTLVVVGAGDVGKSALT(KRAS(G13D)15mer^3)
104
MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQ(KRAS(G12D)25mer^3)
105
MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQ(KRAS(G12V)25mer^3)
106
MTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQ(KRAS(G13D)25mer^3)
107
(KRAS(G12D)15mer_nt.STING(V155M))
108
(KRAS(G12V)15mer_nt.STING(V155M)
109
(KRAS(G13D)15mer_nt.STING(V155M)
110
(KRAS(G12D)25mer_nt.STING(V155M))
111
(KRAS(G12V)25mer_nt.STING(V155M)
112
(KRAS(G13D)25mer_nt.STING(V155M)
113
MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNMAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFSATNFSLLKQAGDVEENPGPMKLVVVGADGVGKSALKLVVVGADGVGKSALKLVVVGADGVGKSAL(KRAS(G12D)15mer^3_nt.STING(V155M))
114
MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNMAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFSATNFSLLKQAGDVEENPGPMKLVVVGAVGVGKSALKLVVVGAVGVGKSALKLVVVGAVGVGKSAL(KRAS(G12V)15mer^3_nt.STING(V155M)
115
MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNMAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFSATNFSLLKQAGDVEENPGPMLVVVGAGDVGKSALTLVVVGAGDVGKSALTLVVVGAGDVGKSALT(KRAS(G13D)15mer^3_nt.STING(V155M)
116
MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNMAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFSATNFSLLKQAGDVEENPGPMTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQ(KRAS(G12D)25mer^3_nt.STING(V155M))
117
MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNMAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFSATNFSLLKQAGDVEENPGPMTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQ(KRAS(G12V)25mer^3_nt.STING(V155M)
118
MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNMAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFSATNFSLLKQAGDVEENPGPMTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQ(KRAS(G13D)25mer^3_nt.STING(V155M)
119
(KRAS(G12D)15mer_ct.STING(V155M))
120
(KRAS(G12V)15mer_ct.STING(V155M)
121
(KRAS(G13D)15mer_ct.STING(V155M)
122
(KRAS(G12D)25mer_ct.STING(V155M))
123
(KRAS(G12V)25mer_ct.STING(V155M)
124
(KRAS(G13D)25mer_ct.STING(V155M)
125
MKLVVVGADGVGKSALKLVVVGADGVGKSALKLVVVGADGVGKSALATNFSLLKQAGDVEENPGPMPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNMAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS(KRAS(G12D)15mer^3_ct.STING(V155M))
126
MKLVVVGAVGVGKSALKLVVVGAVGVGKSALKLVVVGAVGVGKSALATNFSLLKQAGDVEENPGPMPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNMAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS(KRAS(G12V)15mer^3_ct.STING(V155M)
127
MLVVVGAGDVGKSALTLVVVGAGDVGKSALTLVVVGAGDVGKSALTATNFSLLKQAGDVEENPGPMPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNMAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS(KRAS(G13D)15mer^3_ct.STING(V155M)
128
MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQATNFSLLKQAGDVEENPGPMPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNMAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS(KRAS(G12D)25mer^3_ct.STING(V155M))
129
MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQATNFSLLKQAGDVEENPGPMPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNMAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS(KRAS(G12V)25mer^3_ct.STING(V155M)
130
MTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQATNFSLLKQAGDVEENPGPMPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNMAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS(KRAS(G13D)25mer^3_ct.STING(V155M)
131
MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQ(KRAS(G12C)25mer)
132
MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQ(KRAS(G12C)25mer^3)
133
MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQ(KRAS(WT)25mer)
134
MSAGDPRVGSGSLDSFMFSIPLVALNVGVRRRLSLFLNPRTPVAADWTLLAEEMGFEYLEIRELETRPDPTRSLLDAWQGRSGASVGRLLELLALLDREDILKELKSRIEEDCQKYLGKQQNQESEKPLQVARVESSVPQTKELGGITTLDDPLGQTPELFDAFICYCPNDIEFVQEMIRQLEQTDYRLKLCVSDRDVLPGTCVWSIASELIEKRCRRMVVVVSDDYLQSKECDFQTKFALSLSPGVQQKRPIPIKYKAMKKDFPSILRFITICDYTNPCTKSWFWTRLAKALSLP(человеческий myd88(L265P); P4027 без эпитопной метки)
135
MAAGGPGAGSAAPVSSTSSLPLAALNMRVRRRLSLFLNVRTQVAADWTALAEEMDFEYLEIRQLETQADPTGRLLDAWQGRPGASVGRLLELLTKLGRDDVLLELGPSIEEDCQKYILKQQQEEAEKPLQVAAVDSSVPRTAELAGITTLDDPLGHMPERFDAFICYCPSDIQFVQEMIRQLEQTNYRLKLCVSDRDVLPGTCVWSIASELIEKRCRRMVVVVSDDYLQSKECDFQTKFALSLSPGAHQKRPIPIKYKAMKKEFPSILRFITVCDYTNPCTKSWFWTRLAKALSLP(мышиный myd88(L265P); P4028 без эпитопной метки)
136
MGVGKSKLDKCPLSWHKKDSVDADQDGHESDSKNSEEACLRGFVEQSSGSEPPTGEQDQPEAKGAGPEEQDEEEFLKFVILHAEDDTDEALRVQDLLQNDFGIRPGIVFAEMPCGRLHLQNLDDAVNGSAWTILLLTENFLRDTWCNFQFYTSLMNSVSRQHKYNSVIPMRPLNSPLPRERTPLALQTINALEEESQGFSTQVERIFRESVFERQQSIWKETRSVSQKQFIA(мышиный TRAM (TICAM2); P4033 без эпитопной метки)
137
MSLWGLVSKMPPEKVQRLYVDFPQHLRHLLGDWLESQPWEFLVGSDAFCCNLASALLSDTVQHLQASVGEQGEGSTILQHISTLESIYQRDPLKLVATFRQILQGEKKAVMEQFRHLPMPFHWKQEELKFKTGLRRLQHRVGEIHLLREALQKGAEAGQVSLHSLIETPANGTGPSEALAMLLQETTGELEAAKALVLKRIQIWKRQQQLAGNGAPFEESLAPLQERCESLVDIYSQLQQEVGAAGGELEPKTRASLTGRLDEVLRTLVTSCFLVEKQPPQVLKTQTKFQAGVRFLLGLRFLGAPAKPPLVRADMVTEKQARELSVPQGPGAGAESTGEIINNTVPLENSIPGNCCSALFKNLLLKKIKRCERKGTESVTEEKCAVLFSASFTLGPGKLPIQLQALSLPLVVIVHGNQDNNAKATILWDNAFSEMDRVPFVVAERVPWEKMCETLNLKFMAEVGTNRGLLPEHFLFLAQKIFNDNSLSMEAFQHRSVSWSQFNKEILLGRGFTFWQWFDGVLDLTKRCLRSYWSDRLIIGFISKQYAASLLLNEPDGTFLLRFSDSEIGGITIAHVIRGQDGSPQIENIQPFSAKDLSIRSLGDRIRDLAQLKNLYPKKPKDEAFRSHYKPEQMGKDGRGYVPATIKMTVERDQPLPTPELQMPTMVPSYDLGMAPDSSMSMQLGPDMVPQVYPPHSHSIPPYQGLSPEESVNVLSAFQEPHLQMPPSLGQMSLPFDQPHPQGLLPCQPQEHAVSSPDPLLCSDVTMVEDSCLSQPVTAFPQGTWIGEDIFPPLLPPTEQDLTKLLLEGQGESGGGSLGAQPLLQPSHYGQSGISMSHMDLRANPSW(STAT6 V547A/T548A); P008 без эпитопной метки)
138
MSLWGLVSKMPPEKVQRLYVDFPQHLRHLLGDWLESQPWEFLVGSDAFCCNLASALLSDTVQHLQASVGEQGEGSTILQHISTLESIYQRDPLKLVATFRQILQGEKKAVMEQFRHLPMPFHWKQEELKFKTGLRRLQHRVGEIHLLREALQKGAEAGQVSLHSLIETPANGTGPSEALAMLLQETTGELEAAKALVLKRIQIWKRQQQLAGNGAPFEESLAPLQERCESLVDIYSQLQQEVGAAGGELEPKTRASLTGRLDEVLRTLVTSCFLVEKQPPQVLKTQTKFQAGVRFLLGLRFLGAPAKPPLVRADMVTEKQARELSVPQGPGAGAESTGEIINNTVPLENSIPGNCCSALFKNLLLKKIKRCERKGTESVTEEKCAVLFSASFTLGPGKLPIQLQALDLPLVVIVHGNQDNNAKATILWDNAFSEMDRVPFVVAERVPWEKMCETLNLKFMAEVGTNRGLLPEHFLFLAQKIFNDNSLSMEAFQHRSVSWSQFNKEILLGRGFTFWQWFDGVLDLTKRCLRSYWSDRLIIGFISKQYVTSLLLNEPDGTFLLRFSDSEIGGITIAHVIRGQDGSPQIENIQPFSAKDLSIRSLGDRIRDLAQLKNLYPKKPKDEAFRSHYKPEQMGKDGRGYVPATIKMTVERDQPLPTPELQMPTMVPSYDLGMAPDSSMSMQLGPDMVPQVYPPHSHSIPPYQGLSPEESVNVLSAFQEPHLQMPPSLGQMSLPFDQPHPQGLLPCQPQEHAVSSPDPLLCSDVTMVEDSCLSQPVTAFPQGTWIGEDIFPPLLPPTEQDLTKLLLEGQGESGGGSLGAQPLLQPSHYGQSGISMSHMDLRANPSW(STAT6 (S407D); P009 без эпитопной метки)
139
MSLWGLVSKMPPEKVQRLYVDFPQHLRHLLGDWLESQPWEFLVGSDAFCCNLASALLSDTVQHLQASVGEQGEGSTILQHISTLESIYQRDPLKLVATFRQILQGEKKAVMEQFRHLPMPFHWKQEELKFKTGLRRLQHRVGEIHLLREALQKGAEAGQVSLHSLIETPANGTGPSEALAMLLQETTGELEAAKALVLKRIQIWKRQQQLAGNGAPFEESLAPLQERCESLVDIYSQLQQEVGAAGGELEPKTRASLTGRLDEVLRTLVTSCFLVEKQPPQVLKTQTKFQAGVRFLLGLRFLGAPAKPPLVRADMVTEKQARELSVPQGPGAGAESTGEIINNTVPLENSIPGNCCSALFKNLLLKKIKRCERKGTESVTEEKCAVLFSASFTLGPGKLPIQLQALDLPLVVIVHGNQDNNAKATILWDNAFSEMDRVPFVVAERVPWEKMCETLNLKFMAEVGTNRGLLPEHFLFLAQKIFNDNSLSMEAFQHRSVSWSQFNKEILLGRGFTFWQWFDGVLDLTKRCLRSYWSDRLIIGFISKQYAASLLLNEPDGTFLLRFSDSEIGGITIAHVIRGQDGSPQIENIQPFSAKDLSIRSLGDRIRDLAQLKNLYPKKPKDEAFRSHYKPEQMGKDGRGYVPATIKMTVERDQPLPTPELQMPTMVPSYDLGMAPDSSMSMQLGPDMVPQVYPPHSHSIPPYQGLSPEESVNVLSAFQEPHLQMPPSLGQMSLPFDQPHPQGLLPCQPQEHAVSSPDPLLCSDVTMVEDSCLSQPVTAFPQGTWIGEDIFPPLLPPTEQDLTKLLLEGQGESGGGSLGAQPLLQPSHYGQSGISMSHMDLRANPSW(STAT6 (S407D/V547A/T548A); P010 без эпитопной метки)
140
MSLWGLVSKMPPEKVQRLYVDFPQHLRHLLGDWLESQPWEFLVGSDAFCCNLASALLSDTVQHLQASVGEQGEGSTILQHISTLESIYQRDPLKLVATFRQILQGEKKAVMEQFRHLPMPFHWKQEELKFKTGLRRLQHRVGEIHLLREALQKGAEAGQVSLHSLIETPANGTGPSEALAMLLQETTGELEAAKALVLKRIQIWKRQQQLAGNGAPFEESLAPLQERCESLVDIYSQLQQEVGAAGGELEPKTRASLTGRLDEVLRTLVTSCFLVEKQPPQVLKTQTKFQAGVRFLLGLRFLGAPAKPPLVRADMVTEKQARELSVPQGPGAGAESTGEIINNTVPLENSIPGNCCSALFKNLLLKKIKRCERKGTESVTEEKCAVLFSASFTLGPGKLPIQLQALSLPLVVIVHGNQDNNAKATILWDNAFSEMDRVPFVVAERVPWEKMCETLNLKFMAEVGTNRGLLPEHFLFLAQKIFNDNSLSMEAFQHRSVSWSQFNKEILLGRGFTFWQWFDGVLDLTKRCLRSYWSDRLIIGFISKQYAASLLLNEPDGTFLLRFSDSEIGGITIAHVIRGQDGSPQIENIQPFSAKDLSIRSLGDRIRDLAQLKNLYPKKPKDEAFRSHYKPEQMGKDGRGFVPATIKMTVERDQPLPTPELQMPTMVPSYDLGMAPDSSMSMQLGPDMVPQVYPPHSHSIPPYQGLSPEESVNVLSAFQEPHLQMPPSLGQMSLPFDQPHPQGLLPCQPQEHAVSSPDPLLCSDVTMVEDSCLSQPVTAFPQGTWIGEDIFPPLLPPTEQDLTKLLLEGQGESGGGSLGAQPLLQPSHYGQSGISMSHMDLRANPSW(STAT6 (V547A/T548A/Y641F); P011 без эпитопной метки)
141
SAEVIHQVEEALDTDEKEMLLFLCRDVAIDVVPPNVRDLLDILRERGKLSVGDLAELLYRVRRFDLLKRILKMDRKAVETHLLRNPHLVSDYRVLMAEIGEDLDKSDVSSLIFLMKDYMGRGKISKEKSFLDLVVELEKLNLVAPDQLDLLEKCLKNIHRIDLKTKIQKYKQSVQGAGTSYRNVLQAAIQKSLKDPSNNFRLHNGRSKEQRLKEQLGAQQEPVKKSIQESEAFLPQSIPEERYKMKSKPLGICLIIDCIGNETELLRDTFTSLGYEVQKFLHLSMHGISQILGQFACMPEHRDYDSFVCVLVSRGGSQSVYGVDQTHSGLPLHHIRRMFMGDSCPYLAGKPKMFFIQNYVVSEGQLEDSSLLEVDGPAMKNVEFKAQKRGLCTVHREADFFWSLCTADMSLLEQSHSSPSLYLQCLSQKLRQERKRPLLDLHIELNGYMYDWNSRVSAKEKYYVWLQHTLRKKLILSYT(hu-cFLIP-L; P1006 без эпитопной метки)
142
SAEVIHQVEEALDTDEKEMLLFLCRDVAIDVVPPNVRDLLDILRERGKLSVGDLAELLYRVRRFDLLKRILKMDRKAVETHLLRNPHLVSDYRVLMAEIGEDLDKSDVSSLIFLMKDYMGRGKISKEKSFLDLVVELEKLNLVAPDQLDLLEKCLKNIHRIDLKTKIQKYKQSVQGAGTSYRNVLQAAIQKSLKDPSNNFRLHNGRSKEQRLKEQLGAQQEPVKKS(hu-cFLIP-S(1-227); P1007 без эпитопной метки)
143
SAEVIHQVEEALDTDEKEMLLFLCRDVAIDVVPPNVRDLLDILRERGKLSVGDLAELLYRVRRFDLLKRILKMDRKAVETHLLRNPHLVSDYRVLMAEIGEDLDKSDVSSLIFLMKDYMGRGKISKEKSFLDLVVELEKLNLVAPDQLDLLEKCLKNIHRIDLKTKIQKYKQSVQGAGTSYRNVLQAAIQKSLKD(hu-cFLIP-p22(1-198); P1008 без эпитопной метки)
144
SAEVIHQVEEALDTDEKEMLLFLCRDVAIDVVPPNVRDLLDILRERGKLSVGDLAELLYRVRRFDLLKRILKMDRKAVETHLLRNPHLVSDYRVLMAEIGEDLDKSDVSSLIFLMKDYMGRGKISKEKSFLDLVVELEKLNLVAPDQLDLLEKCLKNIHRIDLKTKIQKYKQSVQGAGTSYRNVLQAAIQKSLKDPSNNFRLHNGRSKEQRLKEQLGAQQEPVKKSIQESEAFLPQSIPEERYKMKSKPLGICLIIDCIGNETELLRDTFTSLGYEVQKFLHLSMHGISQILGQFACMPEHRDYDSFVCVLVSRGGSQSVYGVDQTHSGLPLHHIRRMFMGDSCPYLAGKPKMFFIQNYVVSEGQLEDSSLLEVD(hu-cFLIP-p43(1-376); P1009 без эпитопной метки)
145
GPAMKNVEFKAQKRGLCTVHREADFFWSLCTADMSLLEQSHSSPSLYLQCLSQKLRQERKRPLLDLHIELNGYMYDWNSRVSAKEKYYVWLQHTLRKKLILSYT(hu-cFLIP-p12(377-480); P1010 без эпитопной метки)
146
MSWSPSLTTQTCGAWEMKERLGTGGFGNVIRWHNQETGEQIAIKQCRQELSPRNRERWCLEIQIMRRLTHPNVVAARDVPEGMQNLAPNDLPLLAMEYCQGGDLRKYLNQFENCCGLREGAILTLLSDIASALRYLHENRIIHRDLKPENIVLQQGEQRLIHKIIDLGYAKELDQGELCTEFVGTLQYLAPELLEQQKYTVTVDYWSFGTLAFECITGFRPFLPNWQPVQWHSKVRQKSEVDIVVSEDLNGTVKFSSSLPYPNNLNSVLAERLEKWLQLMLMWHPRQRGTDPTYGPNGCFKALDDILNLKLVHILNMVTGTIHTYPVTEDESLQSLKARIQQDTGIPEEDQELLQEAGLALIPDKPATQCISDGKLNEGHTLDMDLVFLFDNSKITYETQISPRPQPESVSCILQEPKRNLAFFQLRKVWGQVWHSIQTLKEDCNRLQQGQRAAMMNLLRNNSCLSKMKNSMASMSQQLKAKLDFFKTSIQIDLEKYSEQTEFGITSDKLLLAWREMEQAVELCGRENEVKLLVERMMALQTDIVDLQRSPMGRKQGGTLDDLEEQARELYRRLREKPRDQRTEGDSQEMVRLLLQAIQSFEKKVRVIYTQLSKTVVCKQKALELLPKVEEVVSLMNEDEKTVVRLQEKRQKELWNLLKIACSKVRGPVSGSPDSMNASRLSQPGQLMSQPSTASNSLPEPAKKSEELVAEAHNLCTLLENAIQDTVREQDQSFTALDWSWLQTEEEEHSCLEQAS (huIKK2ca(S177E/S181E); P4005 без эпитопной метки)
147
MSWSPSLTTQTCGAWEMKERLGTGGFGNVIRWHNQETGEQIAIKQCRQELSPRNRERWCLEIQIMRRLTHPNVVAARDVPEGMQNLAPNDLPLLAMEYCQGGDLRKYLNQFENCCGLREGAILTLLSDIASALRYLHENRIIHRDLKPENIVLQQGEQRLIHKIIDLGYAKELDQGALCTAFVGTLQYLAPELLEQQKYTVTVDYWSFGTLAFECITGFRPFLPNWQPVQWHSKVRQKSEVDIVVSEDLNGTVKFSSSLPYPNNLNSVLAERLEKWLQLMLMWHPRQRGTDPTYGPNGCFKALDDILNLKLVHILNMVTGTIHTYPVTEDESLQSLKARIQQDTGIPEEDQELLQEAGLALIPDKPATQCISDGKLNEGHTLDMDLVFLFDNSKITYETQISPRPQPESVSCILQEPKRNLAFFQLRKVWGQVWHSIQTLKEDCNRLQQGQRAAMMNLLRNNSCLSKMKNSMASMSQQLKAKLDFFKTSIQIDLEKYSEQTEFGITSDKLLLAWREMEQAVELCGRENEVKLLVERMMALQTDIVDLQRSPMGRKQGGTLDDLEEQARELYRRLREKPRDQRTEGDSQEMVRLLLQAIQSFEKKVRVIYTQLSKTVVCKQKALELLPKVEEVVSLMNEDEKTVVRLQEKRQKELWNLLKIACSKVRGPVSGSPDSMNASRLSQPGQLMSQPSTASNSLPEPAKKSEELVAEAHNLCTLLENAIQDTVREQDQSFTALDWSWLQTEEEEHSCLEQAS (huIKK2null(S177A/S181A); P4006 без эпитопной метки)
148
MSWSPSLPTQTCGAWEMKERLGTGGFGNVIRWHNQATGEQIAIKQCRQELSPKNRNRWCLEIQIMRRLNHPNVVAARDVPEGMQNLAPNDLPLLAMEYCQGGDLRRYLNQFENCCGLREGAVLTLLSDIASALRYLHENRIIHRDLKPENIVLQQGEKRLIHKIIDLGYAKELDQGELCTEFVGTLQYLAPELLEQQKYTVTVDYWSFGTLAFECITGFRPFLPNWQPVQWHSKVRQKSEVDIVVSEDLNGAVKFSSSLPFPNNLNSVLAERLEKWLQLMLMWHPRQRGTDPQYGPNGCFRALDDILNLKLVHVLNMVTGTVHTYPVTEDESLQSLKTRIQENTGILETDQELLQKAGLVLLPDKPATQCISDSKTNEGLTLDMDLVFLLDNSKINYETQITPRPPPESVSCILQEPKRNLSFFQLRKVWGQVWHSIQTLKEDCNRLQQGQRAAMMSLLRNNSCLSKMKNAMASTAQQLKAKLDFFKTSIQIDLEKYKEQTEFGITSDKLLLAWREMEQAVEQCGRENDVKHLVERMMALQTDIVDLQRSPMGRKQGGTLDDLEEQARELYRKLREKPRDQRTEGDSQEMVRLLLQAIQSFEKKVRVIYTQLSKTVVCKQKALELLPKVEEVVSLMNEDERTVVRLQEKRQKELWNLLKIACSKVRGPVSGSPDSMNVSRLSHPGQLMSQPSSACDSLPESDKKSEELVAEAHALCSRLESALQDTVKEQDRSFTTLDWSWLQMEDEERCSLEQACD (muIKK2ca(S177E/S181E); P4002 без эпитопной метки)
149
MSWSPSLPTQTCGAWEMKERLGTGGFGNVIRWHNQATGEQIAIKQCRQELSPKNRNRWCLEIQIMRRLNHPNVVAARDVPEGMQNLAPNDLPLLAMEYCQGGDLRRYLNQFENCCGLREGAVLTLLSDIASALRYLHENRIIHRDLKPENIVLQQGEKRLIHKIIDLGYAKELDQGALCTAFVGTLQYLAPELLEQQKYTVTVDYWSFGTLAFECITGFRPFLPNWQPVQWHSKVRQKSEVDIVVSEDLNGAVKFSSSLPFPNNLNSVLAERLEKWLQLMLMWHPRQRGTDPQYGPNGCFRALDDILNLKLVHVLNMVTGTVHTYPVTEDESLQSLKTRIQENTGILETDQELLQKAGLVLLPDKPATQCISDSKTNEGLTLDMDLVFLLDNSKINYETQITPRPPPESVSCILQEPKRNLSFFQLRKVWGQVWHSIQTLKEDCNRLQQGQRAAMMSLLRNNSCLSKMKNAMASTAQQLKAKLDFFKTSIQIDLEKYKEQTEFGITSDKLLLAWREMEQAVEQCGRENDVKHLVERMMALQTDIVDLQRSPMGRKQGGTLDDLEEQARELYRKLREKPRDQRTEGDSQEMVRLLLQAIQSFEKKVRVIYTQLSKTVVCKQKALELLPKVEEVVSLMNEDERTVVRLQEKRQKELWNLLKIACSKVRGPVSGSPDSMNVSRLSHPGQLMSQPSSACDSLPESDKKSEELVAEAHALCSRLESALQDTVKEQDRSFTTLDWSWLQMEDEERCSLEQACD muIKK2null(S177A/S181A); P4003 без эпитопной метки)
150
MERPPGLRPGAGGPWEMRERLGTGGFGNVCLYQHRELDLKIAIKSCRLELSTKNRERWCHEIQIMKKLNHANVVKACDVPEELNILIHDVPLLAMEYCSGGDLRKLLNKPENCCGLKESQILSLLSDIGSGIRYLHENKIIHRDLKPENIVLQDVGGKIIHKIIDLGYAKDVDQGELCTEFVGTLQYLAPELFENKPYTATVDYWSFGTMVFECIAGYRPFLHHLQPFTWHEKIKKKDPKCIFACEEMSGEVRFSSHLPQPNSLCSLVVEPMENWLQLMLNWDPQQRGGPVDLTLKQPRCFVLMDHILNLKIVHILNMTSAKIISFLLPPDESLHSLQSRIERETGINTGSQELLSETGISLDPRKPASQCVLDGVRGCDSYMVYLFDKSKTVYEGPFASRSLSDCVNYIVQDSKIQLPIIQLRKVWAEAVHYVSGLKEDYSRLFQGQRAAMLSLLRYNANLTKMKNTLISASQQLKAKLEFFHKSIQLDLERYSEQMTYGISSEKMLKAWKEMEEKAIHYAEVGVIGYLEDQIMSLHAEIMELQKSPYRRQGDLMESLEQRAIDLYKQLKHRPSDHSYSDSTEMVKIIVHTVQSQDRVLKELFGHLSKLLGCKQKIIDLLPKVEVALSNIKEADNTVMFMQGKRQKEIWHLLKIACTQAAARALVGAALEGAVAPQAAAWLPPAAAEHDHALACVVAPQDGEAAAQMIEENLNCLGHLAAIIHEANEEQGNSMMNLDWSWLTEЧеловеческая конститутивно активная IKK-альфа (мутация PEST) P.4013/4014 без эпитопной метки - аминокислота
151
ATGGAACGCCCCCCTGGACTGAGGCCTGGAGCAGGAGGACCCTGGGAAATGCGCGAACGGCTGGGTACTGGTGGTTTCGGCAACGTGTGCCTCTACCAGCATCGGGAGTTGGACCTGAAGATCGCCATCAAGTCCTGCCGCCTGGAGCTGTCGACCAAGAACCGGGAACGCTGGTGTCATGAAATCCAGATTATGAAAAAGCTGAACCACGCTAACGTGGTCAAAGCTTGCGACGTGCCCGAAGAACTGAATATCCTGATCCACGATGTGCCCCTCCTCGCAATGGAGTACTGCAGCGGAGGCGATCTCCGGAAGCTGCTCAACAAGCCGGAGAACTGCTGTGGCCTTAAAGAGAGCCAGATTCTGAGCCTTCTGTCGGACATCGGCTCGGGTATCCGATATCTTCACGAGAACAAGATTATTCACAGAGATCTGAAGCCAGAGAACATCGTGCTGCAAGATGTCGGAGGAAAGATCATTCATAAGATCATCGACCTGGGATACGCCAAGGACGTGGATCAAGGCGAACTGTGCACCGAATTCGTGGGAACCCTCCAGTACCTGGCCCCGGAACTGTTCGAAAACAAACCCTACACCGCCACCGTGGACTACTGGTCCTTTGGAACTATGGTGTTCGAGTGTATAGCTGGCTACCGGCCATTTCTCCATCACTTGCAGCCCTTCACCTGGCACGAAAAGATCAAGAAGAAGGACCCCAAGTGCATTTTCGCGTGCGAAGAGATGTCGGGGGAAGTGCGCTTCTCGTCCCACTTGCCCCAGCCCAACTCCCTGTGCTCCCTGGTGGTCGAACCGATGGAAAACTGGCTGCAACTGATGCTGAACTGGGATCCTCAACAGCGCGGTGGACCAGTGGATCTGACTCTGAAGCAGCCCAGATGCTTCGTGCTGATGGACCATATCCTGAACCTCAAGATCGTCCACATCCTGAACATGACCTCCGCCAAGATCATTTCCTTCCTCCTCCCGCCCGATGAGAGCCTGCACTCACTGCAGTCCAGAATCGAGAGGGAAACCGGTATTAACACTGGGTCACAGGAACTCCTGTCCGAAACCGGAATCTCTCTGGACCCTCGCAAGCCAGCATCCCAGTGCGTCCTGGATGGGGTCAGGGGATGCGACTCGTACATGGTCTACCTCTTCGATAAGTCAAAGACCGTCTACGAGGGACCCTTTGCCAGCCGGAGCCTGTCAGACTGCGTGAACTACATCGTGCAGGACTCTAAGATTCAGCTGCCAATTATCCAGCTCCGGAAAGTCTGGGCAGAAGCGGTGCACTACGTGTCCGGACTGAAAGAGGACTACTCCCGGCTGTTCCAGGGCCAGAGGGCAGCCATGCTGTCCCTGCTCCGCTACAACGCCAACCTCACGAAGATGAAGAACACCCTGATCTCCGCGTCACAACAACTGAAGGCCAAGCTGGAATTCTTCCACAAGTCCATTCAATTGGATCTGGAGCGGTACTCCGAGCAGATGACTTACGGCATTAGCTCCGAAAAGATGCTCAAGGCCTGGAAGGAGATGGAGGAGAAGGCCATTCATTATGCCGAAGTGGGGGTGATCGGATACCTGGAGGATCAGATCATGTCCCTTCATGCCGAGATTATGGAACTCCAGAAGTCCCCGTACCGGAGGCAGGGCGATTTGATGGAGAGCTTGGAACAACGCGCCATCGACCTGTACAAGCAGCTCAAGCACAGACCGAGCGACCACTCGTACTCCGACTCGACTGAGATGGTGAAAATTATCGTGCACACCGTGCAGTCCCAAGACCGGGTCCTGAAGGAGCTGTTCGGACACCTGAGCAAGCTGCTGGGGTGCAAGCAAAAGATCATTGACCTTCTGCCAAAAGTGGAGGTGGCCCTGAGCAACATTAAGGAAGCCGACAACACCGTGATGTTCATGCAGGGCAAGCGGCAGAAGGAGATCTGGCATCTTCTCAAGATCGCGTGTACCCAGGCTGCAGCGAGAGCCTTGGTGGGCGCTGCCCTGGAAGGTGCCGTGGCACCACAGGCCGCTGCTTGGCTGCCTCCTGCTGCTGCTGAGCACGATCACGCACTGGCCTGCGTGGTGGCACCGCAGGACGGAGAGGCTGCCGCGCAGATGATCGAGGAAAACCTGAACTGCCTGGGTCACCTGGCTGCCATCATCCACGAAGCCAACGAGGAGCAAGGAAACAGCATGATGAATCTCGACTGGAGCTGGCTGACTGAGЧеловеческая конститутивно активная IKK-альфа (мутация PEST) P.4013/4014 без эпитопной метки - нуклеотид
152
MSWSPSLTTQTCGAWEMKERLGTGGFGNVIRWHNQETGEQIAIKQCRQELSPRNRERWCLEIQIMRRLTHPNVVAARDVPEGMQNLAPNDLPLLAMEYCQGGDLRKYLNQFENCCGLREGAILTLLSDIASALRYLHENRIIHRDLKPENIVLQQGEQRLIHKIIDLGYAKELDQGELCTEFVGTLQYLAPELLEQQKYTVTVDYWSFGTLAFECITGFRPFLPNWQPVQWHSKVRQKSEVDIVVSEDLNGTVKFSSSLPYPNNLNSVLAERLEKWLQLMLMWHPRQRGTDPTYGPNGCFKALDDILNLKLVHILNMVTGTIHTYPVTEDESLQSLKARIQQDTGIPEEDQELLQEAGLALIPDKPATQCISDGKLNEGHTLDMDLVFLFDNSKITYETQISPRPQPESVSCILQEPKRNLAFFQLRKVWGQVWHSIQTLKEDCNRLQQGQRAAMMNLLRNNSCLSKMKNSMASMSQQLKAKLDFFKTSIQIDLEKYSEQTEFGITSDKLLLAWREMEQAVELCGRENEVKLLVERMMALQTDIVDLQRSPMGRKQGGTLDDLEEQARELYRRLREKPRDQRTEGDSQEMVRLLLQAIQSFEKKVRVIYTQLSKTVVCKQKALELLPKVEEVVSLMNEDEKTVVRLQEKRQKELWNLLKIACSKVRGPVAGAPDAMNAARLAQPGQLMAQPATAANALPEPAKKAEELVAEAHNLCTLLENAIQDTVREQDQSFTALDWSWLQTEEEEHSCLEQASЧеловеческая конститутивно активная IKK-бета (мутация PEST) P.4015/4016 без эпитопной метки - аминокислота
153
ATGTCGTGGTCCCCCTCACTTACTACTCAAACTTGCGGCGCCTGGGAAATGAAGGAAAGACTCGGTACCGGGGGATTTGGAAACGTGATCCGGTGGCACAACCAAGAAACCGGAGAGCAAATTGCGATCAAGCAGTGTAGACAGGAACTGAGCCCTCGGAACAGAGAGCGGTGGTGCCTGGAGATTCAGATTATGCGCCGGCTGACCCATCCGAACGTGGTGGCTGCCAGGGATGTCCCGGAGGGCATGCAGAACCTGGCCCCTAACGACCTCCCACTCCTGGCCATGGAATACTGCCAGGGTGGCGATCTGCGGAAGTACCTTAACCAATTCGAAAACTGCTGTGGACTCAGGGAAGGGGCCATTCTGACTCTCTTGTCGGACATCGCCAGCGCCCTGAGATACCTCCACGAGAACAGAATCATCCATCGCGATCTGAAGCCGGAGAACATTGTGCTGCAACAGGGCGAACAGCGGCTGATCCACAAAATCATTGATCTCGGATATGCCAAGGAACTGGACCAGGGCGAACTCTGCACCGAATTCGTGGGCACTCTCCAGTACCTGGCACCCGAGTTGCTGGAGCAGCAGAAGTACACCGTCACCGTCGACTACTGGTCCTTCGGAACCCTCGCATTCGAATGTATCACTGGCTTCCGCCCTTTCCTGCCTAACTGGCAGCCTGTGCAGTGGCATTCGAAGGTCCGGCAGAAATCGGAGGTGGACATCGTGGTGTCCGAGGATCTGAACGGCACAGTGAAGTTCTCCTCCTCACTGCCTTACCCCAACAACCTCAACTCCGTGCTGGCCGAACGGCTGGAAAAGTGGCTCCAGCTTATGCTGATGTGGCATCCACGCCAGCGGGGTACTGATCCGACCTACGGTCCGAACGGGTGCTTCAAGGCCCTGGACGACATACTGAACCTCAAGCTCGTGCACATCCTCAATATGGTGACCGGCACGATCCATACTTACCCCGTCACCGAGGACGAATCGTTGCAGTCACTGAAGGCTCGGATCCAGCAGGACACCGGGATTCCCGAAGAGGACCAGGAACTTCTGCAGGAAGCGGGACTGGCGTTGATCCCCGACAAGCCTGCCACCCAGTGCATCTCTGACGGGAAGCTGAATGAAGGTCACACCCTGGATATGGACCTTGTGTTCCTGTTCGACAATTCCAAGATCACCTACGAGACTCAGATTAGCCCTAGGCCTCAGCCGGAATCCGTGTCGTGCATCCTGCAAGAACCGAAGCGGAATCTGGCGTTCTTTCAACTGCGGAAAGTGTGGGGCCAAGTCTGGCACAGCATTCAGACACTGAAGGAGGATTGCAACCGGCTGCAGCAAGGACAGCGCGCCGCTATGATGAATCTGCTGCGCAACAATTCCTGCCTCTCAAAAATGAAGAACTCCATGGCCTCGATGTCCCAGCAATTGAAGGCCAAGCTGGATTTCTTCAAGACCTCGATCCAGATCGACCTGGAAAAGTACAGCGAGCAGACCGAGTTCGGAATCACCTCCGACAAGCTGCTGTTGGCATGGCGGGAGATGGAACAAGCGGTGGAGCTGTGCGGACGCGAAAACGAGGTCAAACTGTTGGTGGAAAGAATGATGGCCCTGCAGACCGACATCGTGGACCTCCAGCGATCCCCTATGGGCCGGAAGCAGGGTGGCACCCTCGATGACCTGGAAGAACAGGCTCGGGAGCTGTACAGGCGCCTGCGGGAAAAGCCGCGGGACCAGAGAACTGAAGGGGATTCCCAGGAGATGGTGCGCCTGCTGCTTCAAGCCATCCAGTCATTCGAAAAGAAGGTCCGCGTGATCTACACCCAACTGAGCAAGACTGTGGTGTGCAAGCAGAAGGCCCTCGAACTGCTGCCGAAGGTGGAGGAGGTCGTGTCCCTGATGAACGAGGACGAAAAGACGGTCGTGAGACTCCAGGAAAAGAGACAGAAGGAACTGTGGAACCTTCTCAAGATTGCCTGCTCCAAAGTGCGCGGACCTGTGGCTGGAGCTCCCGACGCCATGAACGCCGCTAGACTCGCGCAGCCTGGACAGCTCATGGCCCAGCCCGCAACTGCAGCTAACGCCCTGCCCGAACCAGCGAAGAAGGCGGAGGAGCTTGTGGCGGAAGCCCACAACCTGTGCACCCTGCTCGAAAACGCCATCCAGGACACTGTGCGGGAACAAGACCAATCCTTCACCGCCCTGGATTGGTCATGGCTGCAGACTGAGGAAGAGGAGCACTCCTGTCTGGAGCAAGCCTCCЧеловеческая конститутивно активная IKK-бета (мутация PEST) P.4015/4016 без эпитопной метки - нуклеотид
154
MERPPGLRPGAGGPWEMRERLGTGGFGNVSLYQHRELDLKIAIKSCRLELSSKNRERWCHEIQIMKKLDHANVVKACDVPEELNFLINDVPLLAMEYCSGGDLRKLLNKPENCCGLKESQILSLLSDIGSGIRYLHENKIIHRDLKPENIVLQDVGGKTIHKIIDLGYAKDVDQGELCTEFVGTLQYLAPELFENKPYTATVDYWSFGTMVFECIAGYRPFLHHLQPFTWHEKIKKKDPKCIFACEEMTGEVRFSSHLPQPNSLCSLIVEPMESWLQLMLNWDPQQRGGPIDLTLKQPRCFALMDHILNLKIVHILNMTSAKIISFLLPCDESLHSLQSRIERETGINTGSQELLSETGISLDPRKPASQCVLDGVRGCDSYMVYLFDKSKTVYEGPFASRSLSDCVNYIVQDSKIQLPIIQLRKVWAEAVHYVSGLKEDYSRLFQGQRAAMLSLLRYNANLTKMKNTLISASQQLKAKLEFFRKSIQLDLERYSEQMTYGISSEKMLKAWKEMEEKAIHYSEVGVIGYLEDQIMSLHTEIMELQKSPYGRRQGDLMESLEQRAIDLYKQLKHRPPDHLYSDSTEMVKIIVHTVQSQDRVLKELFGHLSKLLGCKQKIIDLLPKVEVALSNIKEADNTVMFMQGKRQKEIWHLLKIACTQAAARALVGAALEGAVAPPVAAWLPPALADREHPLTCVVAPQDGEALAQMIEENLNCLGHLAAIIREANEDQSSSLMSLDWSWLAEМышиная конститутивно активная IKK-альфа (мутация PEST) P.4017/4018 без эпитопной метки - аминокислота
155
ATGGAAAGACCGCCTGGATTGCGACCTGGAGCCGGAGGACCCTGGGAAATGAGAGAGAGATTGGGTACTGGAGGCTTCGGAAATGTCTCGCTGTACCAGCACCGCGAGCTCGACCTGAAGATCGCGATCAAGTCCTGTCGCCTGGAGCTGTCCAGCAAGAACAGAGAGCGGTGGTGCCACGAGATCCAGATTATGAAGAAGCTGGACCATGCCAACGTCGTGAAGGCTTGCGATGTCCCGGAGGAACTCAATTTCCTTATTAACGACGTGCCGCTTCTCGCGATGGAGTACTGCTCAGGCGGCGACTTGCGCAAGCTGCTTAACAAGCCCGAAAACTGCTGCGGTCTGAAGGAATCCCAAATTCTGTCACTCCTGTCCGATATTGGCTCAGGAATCCGCTACCTTCATGAGAATAAGATCATCCACCGCGACCTGAAGCCTGAGAACATTGTGCTGCAGGATGTCGGGGGAAAGACTATCCACAAGATAATCGACCTGGGATACGCCAAGGACGTCGATCAAGGGGAACTGTGCACCGAATTCGTGGGGACTCTCCAGTACTTGGCCCCCGAACTGTTTGAAAACAAGCCCTACACCGCCACCGTGGATTACTGGTCCTTCGGGACTATGGTGTTCGAGTGTATTGCCGGCTATCGCCCCTTTCTGCACCACCTCCAGCCCTTTACTTGGCACGAAAAGATCAAGAAGAAGGATCCGAAGTGCATCTTCGCTTGCGAAGAGATGACCGGAGAAGTCCGGTTTTCCAGCCATCTGCCTCAGCCGAACTCCCTGTGTTCCCTGATTGTGGAACCCATGGAGAGCTGGTTGCAGCTCATGCTCAACTGGGATCCGCAGCAACGCGGTGGCCCAATCGATCTTACCCTTAAGCAGCCTCGGTGCTTCGCGCTGATGGACCACATCCTCAATCTGAAGATCGTGCACATCCTGAACATGACTTCCGCCAAGATCATCTCCTTCCTGCTGCCGTGCGACGAAAGCCTGCACTCACTGCAGAGCCGGATCGAACGGGAGACAGGCATAAACACGGGATCGCAAGAACTGCTGTCCGAAACCGGCATCTCCCTGGACCCACGGAAGCCTGCCTCCCAATGCGTCCTGGACGGAGTGCGGGGTTGCGACTCATACATGGTGTACCTCTTCGATAAGTCAAAGACCGTGTATGAAGGACCCTTCGCCTCCCGCTCCCTGAGCGACTGCGTGAACTACATCGTGCAGGACTCGAAGATCCAGCTGCCGATTATCCAGCTTCGGAAGGTCTGGGCGGAGGCTGTGCACTACGTGTCCGGTTTGAAAGAGGATTATAGCCGCCTGTTCCAGGGACAGAGAGCCGCCATGCTGTCCCTCCTCCGGTACAACGCCAACCTGACCAAGATGAAGAACACCCTGATCAGCGCCTCGCAGCAGCTGAAGGCCAAGCTGGAGTTCTTCCGGAAGTCGATCCAGCTCGACCTCGAAAGGTACTCAGAACAGATGACCTACGGAATTTCCTCCGAGAAGATGCTGAAAGCCTGGAAGGAAATGGAGGAGAAGGCCATTCACTACTCCGAAGTGGGCGTCATTGGCTACTTGGAGGACCAAATCATGTCTCTGCACACCGAAATCATGGAACTCCAGAAGTCGCCTTACGGACGACGCCAAGGGGACCTGATGGAGAGCCTGGAACAGCGGGCCATCGATCTGTACAAGCAACTGAAGCATAGGCCGCCCGACCATCTCTACTCCGACTCGACTGAAATGGTGAAGATTATTGTGCATACAGTGCAGAGCCAGGACAGAGTGCTGAAGGAGCTGTTCGGCCACCTGTCCAAGCTCCTGGGTTGCAAGCAGAAGATTATCGATCTGTTGCCCAAGGTGGAAGTGGCCCTGTCTAACATCAAAGAAGCCGACAACACTGTGATGTTTATGCAAGGAAAGCGGCAGAAAGAAATCTGGCACCTTCTGAAAATCGCGTGCACCCAGGCTGCAGCTAGGGCACTCGTGGGTGCAGCGCTTGAAGGCGCCGTGGCACCTCCTGTCGCTGCCTGGTTGCCACCCGCGCTTGCTGACAGAGAGCACCCACTGACTTGTGTGGTGGCCCCACAGGACGGAGAAGCACTGGCCCAGATGATTGAGGAGAACCTGAACTGTCTGGGACACCTTGCCGCCATTATCCGGGAGGCCAACGAGGACCAGTCCTCGTCCCTGATGTCCCTGGATTGGTCATGGCTCGCTGAAМышиная конститутивно активная IKK-альфа (мутация PEST) P.4017/4018 без эпитопной метки - нуклеотид
156
MSWSPSLPTQTCGAWEMKERLGTGGFGNVIRWHNQATGEQIAIKQCRQELSPKNRNRWCLEIQIMRRLNHPNVVAARDVPEGMQNLAPNDLPLLAMEYCQGGDLRRYLNQFENCCGLREGAVLTLLSDIASALRYLHENRIIHRDLKPENIVLQQGEKRLIHKIIDLGYAKELDQGELCTEFVGTLQYLAPELLEQQKYTVTVDYWSFGTLAFECITGFRPFLPNWQPVQWHSKVRQKSEVDIVVSEDLNGAVKFSSSLPFPNNLNSVLAERLEKWLQLMLMWHPRQRGTDPQYGPNGCFRALDDILNLKLVHVLNMVTGTVHTYPVTEDESLQSLKTRIQENTGILETDQELLQKAGLVLLPDKPATQCISDSKTNEGLTLDMDLVFLLDNSKINYETQITPRPPPESVSCILQEPKRNLSFFQLRKVWGQVWHSIQTLKEDCNRLQQGQRAAMMSLLRNNSCLSKMKNAMASTAQQLKAKLDFFKTSIQIDLEKYKEQTEFGITSDKLLLAWREMEQAVEQCGRENDVKHLVERMMALQTDIVDLQRSPMGRKQGGTLDDLEEQARELYRKLREKPRDQRTEGDSQEMVRLLLQAIQSFEKKVRVIYTQLSKTVVCKQKALELLPKVEEVVSLMNEDERTVVRLQEKRQKELWNLLKIACSKVRGPVAGAPDAMNVARLAHPGQLMAQPASACDALPESDKKAEELVAEAHALCSRLESALQDTVKEQDRSFTTLDWSWLQMEDEERCSLEQACDМышиная конститутивно активная IKK-бета (мутация PEST) P.4019/4020 без эпитопной метки - аминокислота
157
ATGAGCTGGAGCCCTTCACTGCCAACCCAAACCTGTGGAGCCTGGGAAATGAAAGAAAGACTGGGAACCGGAGGTTTCGGCAACGTGATCCGCTGGCATAACCAGGCCACTGGGGAGCAGATTGCCATCAAGCAGTGCCGGCAGGAGCTGTCCCCGAAGAACCGCAACCGGTGGTGCCTGGAAATCCAGATCATGCGGCGGCTTAACCACCCCAACGTGGTCGCCGCGAGAGATGTGCCGGAGGGCATGCAAAACCTGGCCCCCAACGATCTCCCGCTGTTGGCGATGGAGTATTGCCAGGGTGGCGATCTGCGGCGCTACCTGAATCAATTCGAGAACTGCTGCGGTCTGCGCGAAGGAGCTGTGCTTACGCTGCTCTCGGACATCGCCTCGGCGCTGAGATACCTCCACGAAAATCGGATCATCCACCGAGATCTCAAGCCGGAAAACATTGTGCTTCAGCAAGGGGAAAAGCGCCTCATCCATAAGATCATCGATCTCGGCTACGCCAAGGAGTTGGACCAGGGGGAGCTCTGCACTGAATTCGTGGGAACTCTGCAGTACTTGGCGCCCGAACTGCTGGAGCAACAGAAGTACACTGTGACCGTGGACTACTGGTCCTTTGGAACCCTGGCCTTCGAGTGCATTACTGGCTTCCGGCCTTTCCTTCCAAACTGGCAGCCGGTGCAGTGGCACTCAAAGGTCCGCCAGAAGTCCGAAGTGGACATCGTGGTGTCCGAGGACTTGAACGGCGCCGTGAAGTTCTCGTCCTCCCTGCCCTTCCCGAACAACCTCAACTCCGTGCTGGCCGAGAGGCTGGAAAAGTGGCTGCAGCTTATGCTGATGTGGCACCCTAGACAGCGCGGAACTGATCCGCAGTACGGCCCGAACGGCTGTTTTAGGGCCCTGGACGACATTCTGAACCTGAAACTCGTCCACGTGCTTAACATGGTCACCGGTACCGTCCATACCTATCCGGTCACCGAGGACGAATCCCTGCAGTCCCTCAAGACTCGGATTCAGGAGAATACCGGCATTCTGGAAACCGACCAGGAGCTGCTGCAGAAGGCCGGACTGGTGCTGCTCCCCGATAAGCCCGCAACCCAGTGCATCTCAGACTCCAAGACCAACGAGGGCCTGACTCTCGACATGGACCTGGTGTTCCTGCTCGACAACAGCAAGATCAACTACGAAACCCAAATTACCCCTAGACCACCACCTGAATCCGTGAGCTGCATACTGCAGGAGCCCAAGCGCAACCTCTCCTTCTTCCAACTCCGGAAGGTCTGGGGCCAAGTGTGGCACTCCATTCAGACTCTGAAGGAAGATTGTAACAGGCTGCAGCAGGGACAGAGAGCCGCCATGATGAGCCTTCTGAGGAACAACTCTTGCCTGTCAAAGATGAAGAACGCCATGGCTTCCACCGCGCAGCAGTTGAAGGCGAAGCTGGACTTCTTTAAGACCTCCATCCAAATCGACCTGGAGAAGTACAAGGAACAGACTGAGTTCGGGATTACGAGCGATAAACTCCTGCTCGCTTGGCGGGAAATGGAGCAAGCAGTGGAGCAGTGCGGACGGGAGAACGACGTCAAGCATCTCGTGGAGCGGATGATGGCGCTGCAGACCGACATTGTCGACTTGCAGCGCTCTCCAATGGGACGGAAGCAGGGAGGGACTCTGGACGATCTGGAGGAACAGGCCCGGGAACTGTACAGAAAGCTGAGGGAGAAGCCCCGGGATCAAAGAACCGAAGGAGACTCGCAAGAGATGGTGCGCCTGCTGCTGCAGGCGATCCAGTCCTTCGAGAAGAAGGTCCGCGTGATCTACACTCAGCTGTCCAAGACCGTGGTCTGTAAACAGAAGGCCCTGGAACTGCTCCCGAAAGTGGAAGAAGTGGTGTCGCTCATGAATGAGGACGAGAGAACCGTGGTGCGCCTCCAAGAAAAGCGGCAGAAGGAACTCTGGAACCTCCTCAAGATTGCCTGCTCGAAAGTGCGGGGACCTGTGGCTGGTGCTCCTGACGCCATGAACGTGGCCAGGCTTGCTCACCCTGGCCAACTTATGGCCCAGCCTGCATCCGCCTGTGACGCACTGCCCGAGTCGGACAAGAAGGCCGAAGAACTGGTCGCCGAAGCCCACGCACTGTGCAGCCGCCTGGAAAGCGCGCTGCAGGACACCGTGAAGGAGCAGGACCGCAGCTTTACCACTCTTGATTGGTCCTGGCTGCAAATGGAGGACGAAGAACGGTGCTCCCTGGAACAGGCCTGCGACМышиная конститутивно активная IKK-бета (мутация PEST) P.4019/4020 без эпитопной метки - нуклеотид
158
MQPDMSLNVIKMKSSDFLESAELDSGGFGKVSLCFHRTQGLMIMKTVYKGPNCIEHNEALLEEAKMMNRLRHSRVVKLLGVIIEEGKYSLVMEYMEKGNLMHVLKAEMSTPLSVKGRIILEIIEGMCYLHGKGVIHKDLKPENILVDNDFHIKIADLGLASFKMWSKLNNEEHNELREVDGTAKKNGGTLYYMAPEHLNDVNAKPTEKSDVYSFAVVLWAIFANKEPYENAICEQQLIMCIKSGNRPDVDDITEYCPREIISLMKLCWEANPEARPTFPGIEEKFRPFYLSQLEESVEEDVKSLKKEYSNENAVVKRMQSLQLDCVAVPSSRSNSATEQPGSLHSSQGLGMGPVEESWFAPSLEHPQEENEPSLQSKLQDEANYHLYGSRMDRQTKQQPRQNVAYNREEERRRRVSHDPFAQQRPYENFQNTEGKGTAYSSAASHGNAVHQPSGLTSQPQVLYQNNGLYSSHGFGTRPLDPGTAGPRVWYRPIPSHMPSLHNIPVPETNYLGNTPTMPFSSLPPTDESIKYTIYNSTGIQIGAYNYMEIGGTSSSGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIEA(huRIPK1(1-555).IZ.TM; TH1021 без эпитопной метки)
159
MQPDMSLNVIKMKSSDFLESAELDSGGFGKVSLCFHRTQGLMIMKTVYKGPNCIEHNEALLEEAKMMNRLRHSRVVKLLGVIIEEGKYSLVMEYMEKGNLMHVLKAEMSTPLSVKGRIILEIIEGMCYLHGKGVIHKDLKPENILVDNDFHIKIADLGLASFKMWSKLNNEEHNELREVDGTAKKNGGTLYYMAPEHLNDVNAKPTEKSDVYSFAVVLWAIFANKEPYENAICEQQLIMCIKSGNRPDVDDITEYCPREIISLMKLCWEANPEARPTFPGIEEKFRPFYLSQLEESVEEDVKSLKKEYSNENAVVKRMQSLQLDCVAVPSSRSNSATEQPGSLHSSQGLGMGPVEESWFAPSLEHPQEENEPSLQSKLQDEANYHLYGSRMDRQTKQQPRQNVAYNREEERRRRVSHDPFAQQRPYENFQNTEGKGTAYSSAASHGNAVHQPSGLTSQPQVLYQNNGLYSSHGFGTRPLDPGTAGPRVWYRPIPSHMPSLHNIPVPETNYLGNTPTMPFSSLPPTDESIKYTIYNSTGIQIGAYNYMEIGGTSSSGSDGSGSGSGSITIRAAFLEKENTALRTEIAELEKEVGRCENIVSKYETRYGPL(huRIPK1(1-555).EE.DM; TH1022 без эпитопной метки)
160
MQPDMSLNVIKMKSSDFLESAELDSGGFGKVSLCFHRTQGLMIMKTVYKGPNCIEHNEALLEEAKMMNRLRHSRVVKLLGVIIEEGKYSLVMEYMEKGNLMHVLKAEMSTPLSVKGRIILEIIEGMCYLHGKGVIHKDLKPENILVDNDFHIKIADLGLASFKMWSKLNNEEHNELREVDGTAKKNGGTLYYMAPEHLNDVNAKPTEKSDVYSFAVVLWAIFANKEPYENAICEQQLIMCIKSGNRPDVDDITEYCPREIISLMKLCWEANPEARPTFPGIEEKFRPFYLSQLEESVEEDVKSLKKEYSNENAVVKRMQSLQLDCVAVPSSRSNSATEQPGSLHSSQGLGMGPVEESWFAPSLEHPQEENEPSLQSKLQDEANYHLYGSRMDRQTKQQPRQNVAYNREEERRRRVSHDPFAQQRPYENFQNTEGKGTAYSSAASHGNAVHQPSGLTSQPQVLYQNNGLYSSHGFGTRPLDPGTAGPRVWYRPIPSHMPSLHNIPVPETNYLGNTPTMPFSSLPPTDESIKYTIYNSTGIQIGAYNYMEIGGTSSSGSDGSGSGSGSLEIRAAFLEKENTALRTRAAELRKRVGRCRNIVSKYETRYGPL(huRIPK1(1-555).RR.DM; TH1023 без эпитопной метки)
161
MQPDMSLDNIKMASSDLLEKTDLDSGGFGKVSLCYHRSHGFVILKKVYTGPNRAEYNEVLLEEGKMMHRLRHSRVVKLLGIIIEEGNYSLVMEYMEKGNLMHVLKTQIDVPLSLKGRIIVEAIEGMCYLHDKGVIHKDLKPENILVDRDFHIKIADLGVASFKTWSKLTKEKDNKQKEVSSTTKKNNGGTLYYMAPEHLNDINAKPTEKSDVYSFGIVLWAIFAKKEPYENVICTEQFVICIKSGNRPNVEEILEYCPREIISLMERCWQAIPEDRPTFLGIEEEFRPFYLSHFEEYVEEDVASLKKEYPDQSPVLQRMFSLQHDCVPLPPSRSNSEQPGSLHSSQGLQMGPVEESWFSSSPEYPQDENDRSVQAKLQEEASYHAFGIFAEKQTKPQPRQNEAYNREEERKRRVSHDPFAQQRARENIKSAGARGHSDPSTTSRGIAVQQLSWPATQTVWNNGLYNQHGFGTTGTGVWYPPNLSQMYSTYKTPVPETNIPGSTPTMPYFSGPVADDLIKYTIFNSSGIQIGNHNYMDVGLNSQPPNNTCKEESTSGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIEA(msRIPK1(1-555).IZ.TM; TH1024 без эпитопной метки)
162
MQPDMSLDNIKMASSDLLEKTDLDSGGFGKVSLCYHRSHGFVILKKVYTGPNRAEYNEVLLEEGKMMHRLRHSRVVKLLGIIIEEGNYSLVMEYMEKGNLMHVLKTQIDVPLSLKGRIIVEAIEGMCYLHDKGVIHKDLKPENILVDRDFHIKIADLGVASFKTWSKLTKEKDNKQKEVSSTTKKNNGGTLYYMAPEHLNDINAKPTEKSDVYSFGIVLWAIFAKKEPYENVICTEQFVICIKSGNRPNVEEILEYCPREIISLMERCWQAIPEDRPTFLGIEEEFRPFYLSHFEEYVEEDVASLKKEYPDQSPVLQRMFSLQHDCVPLPPSRSNSEQPGSLHSSQGLQMGPVEESWFSSSPEYPQDENDRSVQAKLQEEASYHAFGIFAEKQTKPQPRQNEAYNREEERKRRVSHDPFAQQRARENIKSAGARGHSDPSTTSRGIAVQQLSWPATQTVWNNGLYNQHGFGTTGTGVWYPPNLSQMYSTYKTPVPETNIPGSTPTMPYFSGPVADDLIKYTIFNSSGIQIGNHNYMDVGLNSQPPNNTCKEESTSGSDGSGSGSGSITIRAAFLEKENTALRTEIAELEKEVGRCENIVSKYETRYGPL(msRIPK1(1-555).EE.DM; TH1025 без эпитопной метки)
163
MQPDMSLDNIKMASSDLLEKTDLDSGGFGKVSLCYHRSHGFVILKKVYTGPNRAEYNEVLLEEGKMMHRLRHSRVVKLLGIIIEEGNYSLVMEYMEKGNLMHVLKTQIDVPLSLKGRIIVEAIEGMCYLHDKGVIHKDLKPENILVDRDFHIKIADLGVASFKTWSKLTKEKDNKQKEVSSTTKKNNGGTLYYMAPEHLNDINAKPTEKSDVYSFGIVLWAIFAKKEPYENVICTEQFVICIKSGNRPNVEEILEYCPREIISLMERCWQAIPEDRPTFLGIEEEFRPFYLSHFEEYVEEDVASLKKEYPDQSPVLQRMFSLQHDCVPLPPSRSNSEQPGSLHSSQGLQMGPVEESWFSSSPEYPQDENDRSVQAKLQEEASYHAFGIFAEKQTKPQPRQNEAYNREEERKRRVSHDPFAQQRARENIKSAGARGHSDPSTTSRGIAVQQLSWPATQTVWNNGLYNQHGFGTTGTGVWYPPNLSQMYSTYKTPVPETNIPGSTPTMPYFSGPVADDLIKYTIFNSSGIQIGNHNYMDVGLNSQPPNNTCKEESTSGSDGSGSGSGSLEIRAAFLEKENTALRTRAAELRKRVGRCRNIVSKYETRYGPL(msRIPK1(1-555).RR.DM; TH1026 без эпитопной метки)
164
MSTASAASSSSSSSAGEMIEAPSQVLNFEEIDYKEIEVEEVVGRGAFGVVCKAKWRAKDVAIKQIESESERKAFIVELRQLSRVNHPNIVKLYGACLNPVCLVMEYAEGGSLYNVLHGAEPLPYYTAAHAMSWCLQCSQGVAYLHSMQPKALIHRDLKPPNLLLVAGGTVLKICDFGTACDIQTHMTNNKGSAAWMAPEVFEGSNYSEKCDVFSWGIILWEVITRRKPFDEIGGPAFRIMWAVHNGTRPPLIKNLPKPIESLMTRCWSKDPSQRPSMEEIVKIMTHLMRYFPGADEPLQYPCQEFGGGGGQSPTLTLQSTNTHTQSSSSSSDGGLFRSRPAHSLPPGEDGRVEPYVDFAEFYRLWSVDHGEQSVVTAP(человеческий TAK1-TAB1; P4031 без эпитопной метки)
165
MAALKSWLSRSVTSFFRYRQCLCVPVVANFKKRCFSELIRPWHKTVTIGFGVTLCAVPIAQKSEPHSLSSEALMRRAVSLVTDSTSTFLSQTTYALIEAITEYTKAVYTLTSLYRQYTSLLGKMNSEEEDEVWQVIIGARAEMTSKHQEYLKLETTWMTAVGLSEMAAEAAYQTGADQASITARNHIQLVKLQVEEVHQLSRKAETKLAEAQIEELRQKTQEEGEERAESEQEAYLRED(Diablo.1; без эпитопной метки)
166
MAALKSWLSRSVTSFFRYRQCLCVPVVANFKKRCFSELIRPWHKTVTIGFGVTLCAVPIAQKSEPHSLSSEALMRRAVSLVTDSTSTFLSQTTYALIEAITEYTKAVYTLTSLYRQYTSLLGKMNLEEEDEVWQVIIGARAEMTSKHQEYLKLETTWMTAVGLSEMAAEAAYQTGADQASITARNHIQLVKLQVEEVHQLSRKAETKLAEAQIEELRQKTQEEGEERAESEQEAYLRED(Diablo.1(S126L); без эпитопной метки)
167
MAVPIAQKSEPHSLSSEALMRRAVSLVTDSTSTFLSQTTYALIEAITEYTKAVYTLTSLYRQYTSLLGKMNSEEEDEVWQVIIGARAEMTSKHQEYLKLETTWMTAVGLSEMAAEAAYQTGADQASITARNHIQLVKLQVEEVHQLSRKAETKLAEAQIEELRQKTQEEGEERAESEQEAYLRED(Diablo.1(56-239); без эпитопной метки)
168
MAVPIAQKSEPHSLSSEALMRRAVSLVTDSTSTFLSQTTYALIEAITEYTKAVYTLTSLYRQYTSLLGKMNLEEEDEVWQVIIGARAEMTSKHQEYLKLETTWMTAVGLSEMAAEAAYQTGADQASITARNHIQLVKLQVEEVHQLSRKAETKLAEAQIEELRQKTQEEGEERAESEQEAYLRED(Diablo.1(56-239/S126L); без эпитопной метки)
169
MAALKSWLSRSVTSFFRYRQCLCVPVVANFKKRCFSELIRPWHKTVTIGFGVTLCAVPIAQAVYTLTSLYRQYTSLLGKMNSEEEDEVWQVIIGARAEMTSKHQEYLKLETTWMTAVGLSEMAAEAAYQTGADQASITARNHIQLVKLQVEEVHQLSRKAETKLAEAQIEELRQKTQEEGEERAESEQEAYLRED(Diablo.3; TH2003 без эпитопной метки)
170
MAALKSWLSRSVTSFFRYRQCLCVPVVANFKKRCFSELIRPWHKTVTIGFGVTLCAVPIAQAVYTLTSLYRQYTSLLGKMNLEEEDEVWQVIIGARAEMTSKHQEYLKLETTWMTAVGLSEMAAEAAYQTGADQASITARNHIQLVKLQVEEVHQLSRKAETKLAEAQIEELRQKTQEEGEERAESEQEAYLRED(Diablo.3(S82L); TH2001 без эпитопной метки)
171
MAVPIAQAVYTLTSLYRQYTSLLGKMNSEEEDEVWQVIIGARAEMTSKHQEYLKLETTWMTAVGLSEMAAEAAYQTGADQASITARNHIQLVKLQVEEVHQLSRKAETKLAEAQIEELRQKTQEEGEERAESEQEAYLRED(Diablo.3(56-195); TH2002 без эпитопной метки)
172
MAVPIAQAVYTLTSLYRQYTSLLGKMNLEEEDEVWQVIIGARAEMTSKHQEYLKLETTWMTAVGLSEMAAEAAYQTGADQASITARNHIQLVKLQVEEVHQLSRKAETKLAEAQIEELRQKTQEEGEERAESEQEAYLRED(Diablo.3(56-195/S82L); без эпитопной метки)
173
MAAVILESIFLKRSQQKKKTSPLNFKKRLFLLTVHKLSYYKYDFERGRRGSKKGSIDVEKITCVETVVPEKNPPPERQIPRRGEESSEMEQISIIERFPYPFQVVYDEGPLYVFSPTEELRKRWIHQLKNVIRYNSDLVQKYHPCFWIDGQYLCCSQTAKNAMGCQILENRNGSLKPGSSHRKTKKPLPPTPEEDQILKKPLPPEPAAAPVSTSELKKVVALYDYMPMNANDLQLRKGDEYFILEESNLPWWRARDKNGQEGYIPSNYVTEAEDSIEMYEWYSKHMTRSQAEQLLKQEGKEGGFIVRDSSKAGKYTVSVFAKSTGDPQGVIRHYVVCSTPQSQYYLAEKHLFSTIPELINYHQHNSAGLISRLKYPVSQQNKNAPSTAGLGYGSWEIDPKDLTFLKELGTGQFGVVKYGKWRGQYDVAIKMIKEGSMSEDEFIEEAKVMMNLSHEKLVQLYGVCTKQRPIFIITEYMANGCLLNYLREMRHRFQTQQLLEMCKDVCEAMEYLESKQFLHRDLAARNCLVNDQGVVKVSDFGLSRYVLDDEYTSSVGSKFPVRWSPPEVLMYSKFSSKSDIWAFGVLMWEIYSLGKMPYERFTNSETAEHIAQGLRLYRPHLASEKVYTIMYSCWHEKADERPTFKILLSNILDVMDEES(Btk(E41K); P4029 без эпитопной метки)
174
MVTHSKFPAAGMSRPLDTSLRLKTFSSKSEYQLVVNAVRKLQESGFYWSAVTGGEANLLLSAEPAGTFLIRDSSDQRHFFTLSVKTQSGTKNLRIQCEGGSFSLQSDPRSTQPVPRFDCVLKLVHHYMPPPGAPSFPSPPTEPSSEVPEQPSAQPLPGSPPRRAYYIYSGGEKIPLVLSRPLSSNVATLQHLCRKTVNGHLDSYEKVTQLPGPIREFLDQYDAPL(SOCS3; P4030 без эпитопной метки)
175
MRMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEADQTSGNYLNMQDSQGVLSSFPAPQAVQDNPAMPTSSGSEGNVKLCSLEEAQRIWKQKSAEIYPIMDKSSRTRLALIICNEEFDSIPRRTGAEVDITGMTMLLQNLGYSVDVKKNLTASDMTTELEAFAHRPEHKTSDSTFLVFMSHGIREGICGKKHSEQVPDILQLNAIFNMLNTKNCPSLKDKPKVIIIQACRGDSPGVVWFKDSVGVSGNLSLPTTEEFEDDAIKKAHIEKDFIAFCSSTPDNVSWRHPTMGSVFIGRLIEHMQEYACSCDVEEIFRKVRFSFEQPDGRAQMPTTERVTLTRCFYLFPGH(IZ_hsCASP1 (самоактивирующаяся человеческая каспаза 1); P2024 без эпитопной метки)
176
MRMKQLEDKIEELLSKIYHLENEIARLKKLIGEADQTSGNYLNMQDSQGVLSSFPAPQAVQDNPAMPTSSGSEGNVKLCSLEEAQRIWKQKSAEIYPIMDKSSRTRLALIICNEEFDSIPRRTGAEVDITGMTMLLQNLGYSVDVKKNLTASDMTTELEAFAHRPEHKTSDSTFLVFMSHGIREGICGKKHSEQVPDILQLNAIFNMLNTKNCPSLKDKPKVIIIQACRGDSPGVVWFKDSVGVSGNLSLPTTEEFEDDAIKKAHIEKDFIAFCSSTPDNVSWRHPTMGSVFIGRLIEHMQEYACSCDVEEIFRKVRFSFEQPDGRAQMPTTERVTLTRCFYLFPGH(DM_hsCASP1 (самоактивирующаяся человеческая каспаза 1); P2025 без эпитопной метки)
177
MRMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERSAPSAETFVATEDSKGGHPSSSETKEEQNKEDGTFPGLTGTLKFCPLEKAQKLWKENPSEIYPIMNTTTRTRLALIICNTEFQHLSPRVGAQVDLREMKLLLEDLGYTVKVKENLTALEMVKEVKEFAACPEHKTSDSTFLVFMSHGIQEGICGTTYSNEVSDILKVDTIFQMMNTLKCPSLKDKPKVIIIQACRGEKQGVVLLKDSVRDSEEDFLTDAIFEDDGIKKAHIEKDFIAFCSSTPDNVSWRHPVRGSLFIESLIKHMKEYAWSCDLEDIFRKVRFSFEQPEFRLQMPTADRVTLTKRFYLFPGH(IZ_mmCASP1 (самоактивирующаяся мышиная каспаза 1); P2026 без эпитопной метки)
178
MRMKQLEDKIEELLSKIYHLENEIARLKKLIGERSAPSAETFVATEDSKGGHPSSSETKEEQNKEDGTFPGLTGTLKFCPLEKAQKLWKENPSEIYPIMNTTTRTRLALIICNTEFQHLSPRVGAQVDLREMKLLLEDLGYTVKVKENLTALEMVKEVKEFAACPEHKTSDSTFLVFMSHGIQEGICGTTYSNEVSDILKVDTIFQMMNTLKCPSLKDKPKVIIIQACRGEKQGVVLLKDSVRDSEEDFLTDAIFEDDGIKKAHIEKDFIAFCSSTPDNVSWRHPVRGSLFIESLIKHMKEYAWSCDLEDIFRKVRFSFEQPEFRLQMPTADRVTLTKRFYLFPGH(DM_mmCASP1 (самоактивирующаяся мышиная каспаза 1); P2027 без эпитопной метки)
179
MHHHHHHHHHHGKPIPNPLLGLDSTGIPVHLELASMTNMELMSSIVHQQVFPTEAGQSLVISASIIVFNLLELEGDYRGRVLELFRAAQLANDVVLQIMELCGATR(Канкатемер ADR с меткой HIS)
180
VVGADGVGK(KRAS G12D 9mer)
181
VVGAVGVGK(KRAS G12V 9mer)
182
VGAGDVGKS(KRAS G13D 9mer)
183
VVGACGVGK(KRAS G12C 9mer)
184
MKLVVVGACGVGKSA(KRAS G12C 15mer)
185
ATGACCGAGTACAAGCTGGTGGTGGTGGGCGCCGACGGCGTGGGCAAGAGCGCCCTGACCATCCAGCTGATCCAG(нуклеотидная последовательность KRAS G12D 25mer)
186
ATGACCGAGTACAAGCTGGTGGTGGTGGGCGCCGTGGGCGTGGGCAAGAGCGCCCTGACCATCCAGCTGATCCAG(нуклеотидная последовательность KRAS G12V 25mer)
187
ATGACCGAGTACAAGCTGGTGGTGGTGGGCGCCGGCGACGTGGGCAAGAGCGCCCTGACCATCCAGCTGATCCAG(нуклеотидная последовательность KRAS G13D 25mer)
188
ATGACCGAGTACAAGTTAGTGGTTGTGGGCGCCGACGGCGTGGGCAAGAGCGCCCTCACCATCCAGCTTATCCAGATGACGGAATATAAGTTAGTAGTAGTGGGAGCCGACGGTGTCGGCAAGTCCGCTTTGACCATTCAACTTATTCAGATGACAGAGTATAAGCTGGTCGTTGTAGGCGCAGACGGCGTTGGAAAGTCGGCACTGACGATCCAGTTGATCCAG(нуклеотидная последовательность KRAS G12D 25mer^3)
189
ATGACCGAGTACAAGCTCGTCGTGGTGGGCGCCGTGGGCGTGGGCAAGAGCGCCCTAACCATCCAGTTGATCCAGATGACCGAATATAAGCTCGTGGTAGTCGGAGCGGTGGGCGTTGGCAAGTCAGCGCTAACAATACAACTAATCCAAATGACCGAATACAAGCTAGTTGTAGTCGGTGCCGTCGGCGTTGGAAAGTCAGCCCTTACAATTCAGCTCATTCAG(нуклеотидная последовательность KRAS G12V 25mer^3)
190
ATGACCGAGTACAAGCTCGTAGTGGTTGGCGCCGGCGACGTGGGCAAGAGCGCCCTAACCATCCAGCTCATCCAGATGACAGAATATAAGCTTGTGGTTGTGGGAGCAGGAGACGTGGGAAAGAGTGCGTTGACGATTCAACTCATACAGATGACCGAATACAAGTTGGTGGTGGTCGGCGCAGGTGACGTTGGTAAGTCTGCACTAACTATACAACTGATCCAG(нуклеотидная последовательность KRAS G13D 25mer^3)
191
ATGACCGAGTACAAGCTGGTGGTGGTGGGCGCCTGCGGCGTGGGCAAGAGCGCCCTGACCATCCAGCTGATCCAG(нуклеотидная последовательность KRAS G12C 25mer)
192
ATGACCGAGTACAAGCTCGTGGTTGTTGGCGCCTGCGGCGTGGGCAAGAGCGCCCTCACCATCCAGCTCATCCAGATGACAGAGTATAAGTTAGTCGTTGTCGGAGCTTGCGGAGTTGGAAAGTCGGCGCTCACCATTCAACTCATACAAATGACAGAATATAAGTTAGTGGTGGTGGGTGCGTGTGGCGTTGGCAAGAGTGCGCTTACTATCCAGCTCATTCAG(нуклеотидная последовательность KRAS G12C 25mer^3)
193
ATGACCGAGTACAAGCTGGTGGTGGTGGGCGCCGGCGGCGTGGGCAAGAGCGCCCTGACCATCCAGCTGATCCAG(нуклеотидная последовательность KRAS WT 25mer)
194
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC(последовательность 5'-НТО; без промотора)
195
MUEYKLVVVGADGVGKSALUIQLIQMUEYKLVVVGAVGVGKSALUIQLIQMUEYKLVVVGAGDVGKSALUIQLIQ(аминокислотная последовательность KRAS(G12D G12V G13D) 75mer “3MUT”)
196
ATGACCGAGTACAAGCTCGTTGTAGTCGGCGCCGACGGCGTGGGCAAGAGCGCCTTGACCATCCAGTTGATCCAGATGACCGAATATAAGTTGGTGGTGGTAGGCGCAGTGGGAGTTGGCAAGTCAGCACTCACAATTCAGCTCATTCAAATGACAGAATACAAGTTAGTCGTTGTAGGAGCAGGCGACGTCGGCAAGAGTGCCTTAACCATTCAACTAATCCAG(нуклеотидная последовательность KRAS(G12D G12V G13D) 75mer “3MUT”)
197
MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQMTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQ(аминокислотная последовательность KRAS(G12D G12V G13D G12C) 100mer “4MUT”)
198
ATGACCGAGTACAAGCTCGTGGTCGTCGGCGCCGACGGGGTAGGCAAGTCCGCTCTGACCATTCAGCTCATCCAGATGACGGAGTACAAACTCGTGGTAGTGGGAGCCGTGGGTGTGGGCAAGAGCGCGCTCACCATCCAACTCATCCAAATGACCGAATATAAACTCGTCGTGGTGGGAGCCGGCGACGTGGGAAAGAGCGCCCTTACCATCCAGTTAATCCAGATGACAGAATACAAGCTGGTGGTGGTCGGTGCCTGCGGCGTGGGTAAGTCCGCCCTGACAATCCAGCTGATCCAG(нуклеотидная последовательность KRAS(G12D G12V G13D G12C) 100mer “4MUT”)
199
ATGCCCCACAGTAGCCTCCACCCCAGCATCCCCTGCCCCAGAGGCCACGGCGCACAGAAGGCCGCCCTGGTGCTGCTGAGCGCCTGTCTGGTGACCCTGTGGGGTCTGGGCGAGCCCCCCGAGCACACCCTGCGGTACCTCGTGCTGCATCTGGCCAGCCTGCAGCTGGGCCTGCTGCTGAACGGCGTGTGCAGCCTGGCCGAAGAGCTGAGACACATCCACAGCAGATACAGAGGCTCCTACTGGAGAACCGTCAGAGCCTGCCTCGGCTGTCCCCTGAGAAGAGGCGCCCTGCTGCTCCTGAGCATCTACTTCTACTACAGCCTGCCCAACGCCGTGGGCCCCCCCTTCACCTGGATGCTGGCCCTGCTGGGCCTGAGCCAGGCCCTGAACATCCTGCTGGGCCTGAAGGGCTTGGCCCCCGCCGAGATCTCCGCCGTGTGCGAGAAGGGCAACTTCAACATGGCCCATGGCCTTGCCTGGTCCTACTACATCGGCTACCTGAGACTGATCCTGCCCGAGCTGCAGGCCAGAATCAGAACCTACAACCAGCACTACAACAACCTGCTGAGAGGCGCCGTGAGCCAAAGACTGTACATCCTGCTGCCCCTGGACTGCGGCGTGCCCGACAACCTTAGCATGGCCGACCCCAACATCAGATTCCTGGACAAGCTGCCCCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCATCAAGGACAGAGTGTACAGCAACAGCATCTACGAGCTGCTGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCTGCGTGCTGGAGTACGCCACCCCCCTGCAGACCCTGTTCGCCATGAGCCAGTACAGCCAGGCCGGCTTCAGCAGAGAGGACAGACTGGAGCAAGCCAAGCTGTTCTGCAGAACCCTGGAGGACATCCTGGCGGACGCCCCCGAGAGCCAAAACAACTGCAGACTGATCGCCTACCAGGAGCCCGCCGACGACAGCAGCTTCAGCCTGAGCCAGGAAGTGCTGAGACACCTGAGACAGGAAGAGAAGGAGGAGGTGACCGTGGGAAGCCTGAAGACCAGCGCCGTGCCCAGCACCAGCACCATGAGCCAGGAGCCCGAGCTGCTGATCAGCGGCATGGAGAAGCCCCTGCCCCTGAGAACCGACTTCAGC (huSTING(V155M); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
200
ATGCCTCACAGCAGCCTGCACCCTAGCATCCCTTGCCCTAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCTGGTGCTGCTGAGCGCCTGCCTGGTGACCCTGTGGGGCCTGGGCGAGCCTCCTGAGCACACCCTGAGATACCTGGTGCTGCACCTGGCCAGCCTGCAGCTGGGCCTGCTGCTGAACGGCGTGTGCAGCCTGGCCGAGGAGCTGAGACACATCCACAGCAGATACAGAGGCAGCTACTGGAGAACCGTGAGAGCCTGCCTGGGCTGCCCTCTGAGAAGAGGCGCCCTGCTGCTGCTGAGCATCTACTTCTACTACAGCCTGCCTAACGCCGTGGGCCCTCCTTTCACCTGGATGCTGGCCCTGCTGGGCCTGAGCCAGGCCCTGAACATCCTGCTGGGCCTGAAGGGCCTGGCCCCTGCCGAGATCAGCGCCGTGTGCGAGAAGGGCAACTTCAACGTGGCCCACGGCCTGGCCTGGAGCTACTACATCGGCTACCTGAGACTGATCCTGCCTGAGCTGCAGGCCAGAATCAGAACCTACAACCAGCACTACAACAACCTGCTGAGAGGCGCCGTGAGCCAGAGACTGTACATCCTGCTGCCTCTGGACTGCGGCGTGCCTGACAACCTGAGCATGGCCGACCCTAACATCAGATTCCTGGACAAGCTGCCTCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCATCAAGGACAGAGTGTACAGCAACAGCATCTACGAGCTGCTGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCTGCGTGCTGGAGTACGCCACCCCTCTGCAGACCCTGTTCGCCATGAGCCAGTACAGCCAGGCCGGCTTCAGCAGAGAGGACACCCTGGAGCAGGCCAAGCTGTTCTGCAGAACCCTGGAGGACATCCTGGCCGACGCCCCTGAGAGCCAGAACAACTGCAGACTGATCGCCTACCAGGAGCCTGCCGACGACAGCAGCTTCAGCCTGAGCCAGGAGGTGCTGAGACACCTGAGACAGGAGGAGAAGGAGGAGGTGACCGTGGGCAGCCTGAAGACCAGCGCCGTGCCTAGCACCAGCACCATGAGCCAGGAGCCTGAGCTGCTGATCAGCGGCATGGAGAAGCCTCTGCCTCTGAGAACCGACTTCAGC (Hu STING(R284T); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
201
ATGCCCCACAGCAGCCTGCACCCCTCCATCCCCTGTCCCAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCTGGTGCTGCTGAGCGCCTGCCTGGTGACCTTATGGGGCCTGGGCGAGCCCCCCGAGCACACCCTGAGATACCTGGTCCTGCACCTGGCCAGCCTCCAGCTGGGCCTGCTGCTCAACGGCGTGTGTAGCCTGGCCGAGGAGCTGAGACACATCCACAGCAGATACAGAGGCAGCTACTGGAGAACCGTGAGAGCCTGCCTGGGTTGCCCACTGAGAAGAGGAGCTCTGCTGCTGCTGAGCATCTACTTCTACTACTCGCTGCCCAACGCTGTGGGCCCCCCCTTCACCTGGATGCTGGCCCTGCTGGGTCTGAGCCAGGCCCTGAACATCCTCCTGGGCCTGAAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGATAAGCGCCGTTTGCGAGAAGGGCAACTTCAACGTGGCCCATGGCCTGGCCTGGAGCTACTACATCGGCTACTTACGCCTGATCCTGCCCGAGCTGCAGGCCAGAATCAGAACCTACAACCAGCATTACAACAACCTGCTGAGAGGCGCCGTGAGCCAGAGACTGTATATCCTGCTGCCCCTGGACTGCGGCGTGCCCGACAACCTGAGCATGGCCGACCCCAACATCAGATTCCTGGACAAGCTCCCCCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGAATCAAAGACAGAGTGTATAGCAACAGCATCTACGAGCTGCTGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCTGCGTACTGGAGTACGCCACCCCCTTGCAGACCCTGTTTGCCATGAGCCAGTACAGCCAGGCCGGCTTCAGCAGAGAGGACATGCTGGAGCAGGCCAAGCTGTTCTGCAGAACCCTGGAGGACATCCTGGCCGACGCCCCCGAGAGCCAGAACAACTGCAGACTGATCGCCTACCAAGAGCCCGCCGACGACAGCAGCTTCAGCTTAAGCCAGGAGGTGCTGAGACATCTGAGACAGGAGGAGAAGGAGGAGGTGACCGTGGGCAGCCTCAAGACCAGCGCTGTGCCCTCTACCAGCACCATGAGCCAGGAGCCCGAGCTGCTGATCAGCGGCATGGAGAAGCCCCTGCCCCTGAGAACAGACTTCAGC (hu STING (R284M); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
202
ATGCCCCATAGCAGCCTGCACCCCAGCATCCCCTGCCCCAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCTGGTCCTGCTGAGCGCATGCCTGGTCACCCTGTGGGGCCTGGGCGAGCCCCCCGAGCACACCCTGAGATACCTGGTGCTGCACCTCGCCAGCCTGCAGCTGGGCCTGCTGCTGAACGGCGTGTGCAGCCTGGCCGAGGAGCTGAGACACATCCACAGCAGATATAGAGGCAGCTACTGGAGAACCGTGAGAGCTTGCCTCGGCTGCCCCCTGAGAAGAGGCGCCCTGCTGCTGCTGAGCATCTACTTTTACTACAGCCTGCCCAACGCTGTGGGCCCCCCTTTCACGTGGATGCTCGCCCTGCTGGGACTGAGCCAGGCCCTGAACATCCTGCTGGGCCTTAAGGGCCTAGCCCCCGCCGAGATCAGCGCCGTGTGCGAGAAGGGCAACTTCAATGTGGCCCACGGCCTGGCCTGGAGCTACTACATCGGCTACCTGAGACTGATCCTGCCCGAGCTGCAGGCCAGAATCAGAACCTACAATCAGCACTACAACAACCTGCTGAGAGGCGCCGTGAGCCAGAGACTGTACATCCTGCTGCCCCTGGACTGCGGCGTGCCCGACAACCTCAGCATGGCCGACCCCAACATCAGATTCCTGGACAAGCTGCCCCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCATCAAGGATCGCGTGTACAGCAACAGCATCTACGAGCTGCTGGAAAACGGCCAGAGAGCCGGAACCTGCGTGCTGGAGTACGCCACACCCCTGCAGACCCTGTTCGCCATGAGCCAGTACAGCCAGGCCGGCTTCAGCAGAGAGGACAAGCTGGAGCAGGCCAAGCTGTTCTGCAGAACCCTGGAGGATATCCTCGCCGACGCCCCCGAGAGCCAGAACAACTGCAGGCTGATCGCGTACCAGGAGCCCGCTGACGACAGCAGCTTTAGCCTGAGCCAGGAGGTGCTGAGACATCTGCGTCAAGAGGAAAAGGAGGAGGTGACCGTGGGCTCCCTGAAGACCAGCGCCGTGCCCAGCACCAGCACCATGAGCCAGGAGCCCGAGCTGCTGATCAGCGGCATGGAGAAGCCACTGCCCCTCAGAACCGACTTCAGC (Hu STING (R284K); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
203
ATGCCTCACAGCAGCCTGCACCCTAGCATCCCTTGCCCTAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCTGGTGCTGCTGAGCGCCTGCCTGGTGACCCTGTGGGGCCTGGGCGAGCCTCCTGAGCACACCCTGAGATACCTGGTGCTGCACCTGGCCAGCCTGCAGCTGGGCCTGCTGCTGAACGGCGTGTGCAGCCTGGCCGAGGAGCTGAGACACATCCACAGCAGATACAGAGGCAGCTACTGGAGAACCGTGAGAGCCTGCCTGGGCTGCCCTCTGAGAAGAGGCGCCCTGCTGCTGCTGAGCATCTACTTCTACTACAGCCTGCCTAACGCCGTGGGCCCTCCTTTCACCTGGATGCTGGCCCTGCTGGGCCTGAGCCAGGCCCTGAACATCCTGCTGGGCCTGAAGGGCCTGGCCCCTGCCGAGATCAGCGCCGTGTGCGAGAAGGGCAACTTCAGCGTGGCCCACGGCCTGGCCTGGAGCTACTACATCGGCTACCTGAGACTGATCCTGCCTGAGCTGCAGGCCAGAATCAGAACCTACAACCAGCACTACAACAACCTGCTGAGAGGCGCCGTGAGCCAGAGACTGTACATCCTGCTGCCTCTGGACTGCGGCGTGCCTGACAACCTGAGCATGGCCGACCCTAACATCAGATTCCTGGACAAGCTGCCTCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCATCAAGGACAGAGTGTACAGCAACAGCATCTACGAGCTGCTGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCTGCGTGCTGGAGTACGCCACCCCTCTGCAGACCCTGTTCGCCATGAGCCAGTACAGCCAGGCCGGCTTCAGCAGAGAGGACAGACTGGAGCAGGCCAAGCTGTTCTGCAGAACCCTGGAGGACATCCTGGCCGACGCCCCTGAGAGCCAGAACAACTGCAGACTGATCGCCTACCAGGAGCCTGCCGACGACAGCAGCTTCAGCCTGAGCCAGGAGGTGCTGAGACACCTGAGACAGGAGGAGAAGGAGGAGGTGACCGTGGGCAGCCTGAAGACCAGCGCCGTGCCTAGCACCAGCACCATGAGCCAGGAGCCTGAGCTGCTGATCAGCGGCATGGAGAAGCCTCTGCCTCTGAGAACCGACTTCAGC (Hu STING(N154S); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
204
ATGCCTCACAGCAGCCTGCACCCTAGCATCCCTTGCCCTAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCTGGTGCTGCTGAGCGCCTGCCTGGTGACCCTGTGGGGCCTGGGCGAGCCTCCTGAGCACACCCTGAGATACCTGGTGCTGCACCTGGCCAGCCTGCAGCTGGGCCTGCTGCTGAACGGCGTGTGCAGCCTGGCCGAGGAGCTGAGACACATCCACAGCAGATACAGAGGCAGCTACTGGAGAACCGTGAGAGCCTGCCTGGGCTGCCCTCTGAGAAGAGGCGCCCTGCTGCTGCTGAGCATCTACTTCTACTACAGCCTGCCTAACGCCGTGGGCCCTCCTTTCACCTGGATGCTGGCCCTGCTGGGCCTGAGCCAGGCCCTGAACATCCTGCTGGGCCTGAAGGGCCTGGCCCCTGCCGAGATCAGCGCCCTGTGCGAGAAGGGCAACTTCAACGTGGCCCACGGCCTGGCCTGGAGCTACTACATCGGCTACCTGAGACTGATCCTGCCTGAGCTGCAGGCCAGAATCAGAACCTACAACCAGCACTACAACAACCTGCTGAGAGGCGCCGTGAGCCAGAGACTGTACATCCTGCTGCCTCTGGACTGCGGCGTGCCTGACAACCTGAGCATGGCCGACCCTAACATCAGATTCCTGGACAAGCTGCCTCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCATCAAGGACAGAGTGTACAGCAACAGCATCTACGAGCTGCTGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCTGCGTGCTGGAGTACGCCACCCCTCTGCAGACCCTGTTCGCCATGAGCCAGTACAGCCAGGCCGGCTTCAGCAGAGAGGACAGACTGGAGCAGGCCAAGCTGTTCTGCAGAACCCTGGAGGACATCCTGGCCGACGCCCCTGAGAGCCAGAACAACTGCAGACTGATCGCCTACCAGGAGCCTGCCGACGACAGCAGCTTCAGCCTGAGCCAGGAGGTGCTGAGACACCTGAGACAGGAGGAGAAGGAGGAGGTGACCGTGGGCAGCCTGAAGACCAGCGCCGTGCCTAGCACCAGCACCATGAGCCAGGAGCCTGAGCTGCTGATCAGCGGCATGGAGAAGCCTCTGCCTCTGAGAACCGACTTCAGC (Hu STING(V147L); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
205
ATGCCTCACAGCAGCCTGCACCCTAGCATCCCTTGCCCTAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCTGGTGCTGCTGAGCGCCTGCCTGGTGACCCTGTGGGGCCTGGGCGAGCCTCCTGAGCACACCCTGAGATACCTGGTGCTGCACCTGGCCAGCCTGCAGCTGGGCCTGCTGCTGAACGGCGTGTGCAGCCTGGCCGAGGAGCTGAGACACATCCACAGCAGATACAGAGGCAGCTACTGGAGAACCGTGAGAGCCTGCCTGGGCTGCCCTCTGAGAAGAGGCGCCCTGCTGCTGCTGAGCATCTACTTCTACTACAGCCTGCCTAACGCCGTGGGCCCTCCTTTCACCTGGATGCTGGCCCTGCTGGGCCTGAGCCAGGCCCTGAACATCCTGCTGGGCCTGAAGGGCCTGGCCCCTGCCGAGATCAGCGCCGTGTGCGAGAAGGGCAACTTCAACGTGGCCCACGGCCTGGCCTGGAGCTACTACATCGGCTACCTGAGACTGATCCTGCCTGAGCTGCAGGCCAGAATCAGAACCTACAACCAGCACTACAACAACCTGCTGAGAGGCGCCGTGAGCCAGAGACTGTACATCCTGCTGCCTCTGGACTGCGGCGTGCCTGACAACCTGAGCATGGCCGACCCTAACATCAGATTCCTGGACAAGCTGCCTCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCATCAAGGACAGAGTGTACAGCAACAGCATCTACGAGCTGCTGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCTGCGTGCTGGAGTACGCCACCCCTCTGCAGACCCTGTTCGCCATGAGCCAGTACAGCCAGGCCGGCTTCAGCAGAGAGGACAGACTGGAGCAGGCCAAGCTGTTCTGCAGAACCCTGGAGGACATCCTGGCCGACGCCCCTGAGAGCCAGAACAACTGCAGACTGATCGCCTACCAGCAGCCTGCCGACGACAGCAGCTTCAGCCTGAGCCAGGAGGTGCTGAGACACCTGAGACAGGAGGAGAAGGAGGAGGTGACCGTGGGCAGCCTGAAGACCAGCGCCGTGCCTAGCACCAGCACCATGAGCCAGGAGCCTGAGCTGCTGATCAGCGGCATGGAGAAGCCTCTGCCTCTGAGAACCGACTTCAGC (Hu STING (E315Q); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
206
ATGCCTCACAGCAGCCTGCACCCTAGCATCCCTTGCCCTAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCTGGTGCTGCTGAGCGCCTGCCTGGTGACCCTGTGGGGCCTGGGCGAGCCTCCTGAGCACACCCTGAGATACCTGGTGCTGCACCTGGCCAGCCTGCAGCTGGGCCTGCTGCTGAACGGCGTGTGCAGCCTGGCCGAGGAGCTGAGACACATCCACAGCAGATACAGAGGCAGCTACTGGAGAACCGTGAGAGCCTGCCTGGGCTGCCCTCTGAGAAGAGGCGCCCTGCTGCTGCTGAGCATCTACTTCTACTACAGCCTGCCTAACGCCGTGGGCCCTCCTTTCACCTGGATGCTGGCCCTGCTGGGCCTGAGCCAGGCCCTGAACATCCTGCTGGGCCTGAAGGGCCTGGCCCCTGCCGAGATCAGCGCCGTGTGCGAGAAGGGCAACTTCAACGTGGCCCACGGCCTGGCCTGGAGCTACTACATCGGCTACCTGAGACTGATCCTGCCTGAGCTGCAGGCCAGAATCAGAACCTACAACCAGCACTACAACAACCTGCTGAGAGGCGCCGTGAGCCAGAGACTGTACATCCTGCTGCCTCTGGACTGCGGCGTGCCTGACAACCTGAGCATGGCCGACCCTAACATCAGATTCCTGGACAAGCTGCCTCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCATCAAGGACAGAGTGTACAGCAACAGCATCTACGAGCTGCTGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCTGCGTGCTGGAGTACGCCACCCCTCTGCAGACCCTGTTCGCCATGAGCCAGTACAGCCAGGCCGGCTTCAGCAGAGAGGACAGACTGGAGCAGGCCAAGCTGTTCTGCAGAACCCTGGAGGACATCCTGGCCGACGCCCCTGAGAGCCAGAACAACTGCAGACTGATCGCCTACCAGGAGCCTGCCGACGACAGCAGCTTCAGCCTGAGCCAGGAGGTGCTGAGACACCTGAGACAGGAGGAGAAGGAGGAGGTGACCGTGGGCAGCCTGAAGACCAGCGCCGTGCCTAGCACCAGCACCATGAGCCAGGAGCCTGAGCTGCTGATCAGCGGCATGGAGAAGCCTCTGCCTCTGGCCACCGACTTCAGC (Hu STING (R375A); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
207
ATGCCTCACAGCAGCCTGCACCCTAGCATCCCTTGCCCTAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCTGGTGCTGCTGAGCGCCTGCCTGGTGACCCTGTGGGGCCTGGGCGAGCCTCCTGAGCACACCCTGAGATACCTGGTGCTGCACCTGGCCAGCCTGCAGCTGGGCCTGCTGCTGAACGGCGTGTGCAGCCTGGCCGAGGAGCTGAGACACATCCACAGCAGATACAGAGGCAGCTACTGGAGAACCGTGAGAGCCTGCCTGGGCTGCCCTCTGAGAAGAGGCGCCCTGCTGCTGCTGAGCATCTACTTCTACTACAGCCTGCCTAACGCCGTGGGCCCTCCTTTCACCTGGATGCTGGCCCTGCTGGGCCTGAGCCAGGCCCTGAACATCCTGCTGGGCCTGAAGGGCCTGGCCCCTGCCGAGATCAGCGCCCTGTGCGAGAAGGGCAACTTCAGCATGGCCCACGGCCTGGCCTGGAGCTACTACATCGGCTACCTGAGACTGATCCTGCCTGAGCTGCAGGCCAGAATCAGAACCTACAACCAGCACTACAACAACCTGCTGAGAGGCGCCGTGAGCCAGAGACTGTACATCCTGCTGCCTCTGGACTGCGGCGTGCCTGACAACCTGAGCATGGCCGACCCTAACATCAGATTCCTGGACAAGCTGCCTCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCATCAAGGACAGAGTGTACAGCAACAGCATCTACGAGCTGCTGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCTGCGTGCTGGAGTACGCCACCCCTCTGCAGACCCTGTTCGCCATGAGCCAGTACAGCCAGGCCGGCTTCAGCAGAGAGGACAGACTGGAGCAGGCCAAGCTGTTCTGCAGAACCCTGGAGGACATCCTGGCCGACGCCCCTGAGAGCCAGAACAACTGCAGACTGATCGCCTACCAGGAGCCTGCCGACGACAGCAGCTTCAGCCTGAGCCAGGAGGTGCTGAGACACCTGAGACAGGAGGAGAAGGAGGAGGTGACCGTGGGCAGCCTGAAGACCAGCGCCGTGCCTAGCACCAGCACCATGAGCCAGGAGCCTGAGCTGCTGATCAGCGGCATGGAGAAGCCTCTGCCTCTGAGAACCGACTTCAGC (Hu STING(V147L/N154S/V155M); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
208
ATGCCTCACAGCAGCCTGCACCCTAGCATCCCTTGCCCTAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCTGGTGCTGCTGAGCGCCTGCCTGGTGACCCTGTGGGGCCTGGGCGAGCCTCCTGAGCACACCCTGAGATACCTGGTGCTGCACCTGGCCAGCCTGCAGCTGGGCCTGCTGCTGAACGGCGTGTGCAGCCTGGCCGAGGAGCTGAGACACATCCACAGCAGATACAGAGGCAGCTACTGGAGAACCGTGAGAGCCTGCCTGGGCTGCCCTCTGAGAAGAGGCGCCCTGCTGCTGCTGAGCATCTACTTCTACTACAGCCTGCCTAACGCCGTGGGCCCTCCTTTCACCTGGATGCTGGCCCTGCTGGGCCTGAGCCAGGCCCTGAACATCCTGCTGGGCCTGAAGGGCCTGGCCCCTGCCGAGATCAGCGCCCTGTGCGAGAAGGGCAACTTCAGCATGGCCCACGGCCTGGCCTGGAGCTACTACATCGGCTACCTGAGACTGATCCTGCCTGAGCTGCAGGCCAGAATCAGAACCTACAACCAGCACTACAACAACCTGCTGAGAGGCGCCGTGAGCCAGAGACTGTACATCCTGCTGCCTCTGGACTGCGGCGTGCCTGACAACCTGAGCATGGCCGACCCTAACATCAGATTCCTGGACAAGCTGCCTCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCATCAAGGACAGAGTGTACAGCAACAGCATCTACGAGCTGCTGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCTGCGTGCTGGAGTACGCCACCCCTCTGCAGACCCTGTTCGCCATGAGCCAGTACAGCCAGGCCGGCTTCAGCAGAGAGGACATGCTGGAGCAGGCCAAGCTGTTCTGCAGAACCCTGGAGGACATCCTGGCCGACGCCCCTGAGAGCCAGAACAACTGCAGACTGATCGCCTACCAGGAGCCTGCCGACGACAGCAGCTTCAGCCTGAGCCAGGAGGTGCTGAGACACCTGAGACAGGAGGAGAAGGAGGAGGTGACCGTGGGCAGCCTGAAGACCAGCGCCGTGCCTAGCACCAGCACCATGAGCCAGGAGCCTGAGCTGCTGATCAGCGGCATGGAGAAGCCTCTGCCTCTGAGAACCGACTTCAGC (Hu STING(R284M/V147L/N154S/V155M); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
209
TGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCTAGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCCAAACACCATTGTCACACTCCAGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(3'-НТО, используемая в конструкте STING V155M, содержащем сайт связывания miR122)
210
ATGGAGACCCCCAAGCCTAGAATCCTGCCCTGGCTGGTGAGCCAGCTGGACCTGGGCCAGCTGGAGGGCGTAGCCTGGCTGGACGAGAGCAGAACCAGATTCAGAATCCCCTGGAAGCACGGCCTGAGACAAGACGCCCAGATGGCCGACTTCGGCATCTTCCAGGCCTGGGCCGAGGCCAGCGGCGCCTACACCCCTGGCAAGGATAAGCCCGATGTGAGCACCTGGAAGAGAAACTTCAGAAGCGCCCTGAACAGAAAGGAGGTGCTGAGACTGGCCGCCGACAATAGCAAGGACCCCTACGACCCCCACAAGGTGTACGAGTTCGTTACCCCCGGCGCCAGGGACTTCGTGCACCTGGGCGCCAGCCCCGACACCAACGGCAAGAGCAGCCTGCCCCACAGCCAGGAGAACCTGCCCAAGCTGTTCGATGGCCTGATCCTGGGCCCCCTGAAGGACGAGGGCAGCAGCGACCTGGCCATCGTGAGCGACCCTAGCCAGCAGCTGCCCTCCCCCAACGTGAACAACTTCCTGAACCCCGCCCCCCAGGAGAACCCCCTGAAGCAACTGCTGGCCGAGGAGCAGTGGGAGTTCGAGGTGACCGCCTTCTACAGAGGCAGACAGGTGTTCCAGCAGACCCTGTTCTGCCCCGGCGGCCTGAGACTGGTAGGCAGCACCGCTGACATGACCCTGCCCTGGCAGCCCGTGACCCTGCCCGACCCCGAAGGCTTTCTGACCGACAAGCTGGTGAAGGAGTACGTCGGCCAAGTGCTGAAGGGCCTGGGCAACGGCCTGGCCCTGTGGCAGGCCGGCCAGTGCCTGTGGGCCCAGAGACTCGGCCACAGCCACGCCTTCTGGGCCCTGGGCGAGGAACTCCTGCCCGATAGCGGCAGAGGCCCCGACGGCGAGGTGCACAAGGACAAGGACGGCGCCGTGTTCGACCTGCGCCCCTTCGTGGCCGACCTGATCGCCTTCATGGAGGGCAGCGGCCACAGCCCCAGATATACCCTGTGGTTCTGCATGGGCGAGATGTGGCCCCAGGACCAGCCCTGGGTGAAGAGACTGGTGATGGTGAAGGTGGTGCCCACCTGCCTGAAAGAGCTGCTGGAGATGGCCAGAGAGGGCGGCGCCAGCTCCCTGAAAACCGTGGACCTGCACATTGACAACAGCCAGCCCATCAGCCTGACCAGCGACCAGTACAAGGCCTACCTGCAGGACCTGGTGGAGGACATGGACTTCCAGGCCACCGGCAACATC (супермышиный IRF3 S396D; без эпитопной метки)
211
ATGGGCACCCCCAAGCCCAGAATCCTGCCCTGGCTGGTGAGCCAGCTGGACCTGGGCCAGCTGGAGGGAGTGGCCTGGGTGAACAAGAGCAGAACCAGATTCAGAATCCCCTGGAAGCACGGCCTCAGACAGGACGCCCAGCAGGAGGACTTCGGCATTTTTCAGGCTTGGGCCGAGGCCACCGGCGCCTACGTGCCCGGCAGAGACAAGCCCGACCTGCCCACCTGGAAAAGAAACTTCAGAAGCGCCTTGAATAGAAAGGAGGGCCTGAGACTGGCCGAGGACAGAAGCAAGGACCCCCACGACCCTCACAAGATCTACGAGTTCGTGAATAGCGGCGTGGGCGACTTTAGCCAGCCCGACACCAGCCCCGACACCAACGGCGGCGGCAGCACCAGCGACACGCAGGAGGACATCCTGGATGAACTGCTGGGCAACATGGTGCTGGCCCCCCTGCCCGATCCCGGCCCCCCTTCGCTTGCCGTGGCCCCCGAGCCCTGCCCCCAGCCCCTGAGAAGCCCCTCTCTGGATAACCCCACCCCCTTCCCCAACCTGGGCCCCAGCGAGAATCCACTGAAGAGACTTCTGGTCCCCGGCGAGGAGTGGGAGTTCGAGGTGACCGCCTTCTACAGAGGCAGACAGGTGTTCCAGCAGACCATCAGCTGCCCCGAAGGCCTGAGATTAGTGGGCAGCGAAGTGGGCGACAGGACCCTGCCCGGGTGGCCCGTGACCCTGCCCGATCCCGGCATGAGCCTGACCGACAGAGGTGTGATGAGCTACGTGAGACACGTGCTGAGCTGCCTGGGCGGCGGCCTGGCACTGTGGAGAGCCGGCCAGTGGCTGTGGGCCCAGAGACTGGGCCACTGCCACACCTACTGGGCCGTGAGCGAGGAGCTGCTGCCCAACAGCGGCCACGGCCCCGACGGCGAGGTGCCCAAGGACAAGGAAGGGGGCGTGTTCGACCTGGGCCCCTTCATCGTAGACCTGATCACCTTTACCGAGGGCAGCGGCAGGAGCCCCAGATACGCCCTGTGGTTCTGCGTGGGCGAAAGCTGGCCCCAGGACCAGCCCTGGACCAAGAGACTGGTGATGGTGAAGGTAGTGCCCACCTGCCTGAGAGCCTTAGTGGAGATGGCCAGAGTGGGCGGGGCCAGCAGCCTGGAGAACACCGTGGATCTTCACATCGACAACAGCCACCCCCTGAGCCTGACCAGCGACCAGTACAAGGCCTACCTGCAGGACCTGGTGGAGGGCATGGACTTCCAGGGCCCCGGCGAGACC (суперчеловеческий IRF3 S396D; без эпитопной метки)
212
ATGGCGCTGGCCCCCGAAAGAGCCGCCCCCAGAGTCCTCTTCGGCGAATGGCTCCTTGGCGAAATTTCGTCGGGCTGCTACGAGGGCTTACAATGGCTGGATGAGGCGAGAACCTGTTTCAGGGTGCCCTGGAAACACTTCGCCAGAAAGGATCTAAGCGAAGCAGATGCTAGAATTTTTAAGGCTTGGGCCGTGGCCAGGGGAAGATGGCCCCCCTCGAGCAGAGGCGGCGGCCCTCCCCCCGAGGCAGAAACGGCCGAGAGAGCCGGATGGAAAACCAATTTCAGATGCGCCCTGAGATCTACAAGAAGATTCGTGATGCTTAGAGACAACAGCGGAGATCCCGCCGATCCCCATAAGGTGTATGCCCTGTCCCGGGAGCTGTGCTGGAGGGAAGGGCCTGGCACTGACCAGACCGAAGCCGAAGCCCCCGCGGCCGTGCCGCCGCCCCAAGGAGGCCCACCAGGCCCTTTCCTCGCTCACACCCACGCCGGTCTGCAAGCCCCGGGACCTCTACCTGCCCCTGCCGGCGATAAAGGCGACCTGTTGCTGCAGGCCGTCCAACAGAGCTGCCTGGCCGATCATCTGCTCACAGCCAGCTGGGGCGCTGACCCCGTCCCAACAAAGGCCCCCGGTGAGGGCCAAGAAGGCCTGCCTCTGACCGGCGCCTGTGCCGGCGGCCCTGGCCTGCCTGCTGGCGAGCTGTACGGATGGGCTGTCGAAACCACTCCCTCCCCCGGCCCCCAACCTGCGGCCCTGACAACCGGCGAGGCAGCCGCACCCGAAAGCCCCCACCAGGCCGAACCCTACCTCAGTCCCAGCCCCTCCGCCTGCACCGCTGTGCAGGAGCCCAGCCCCGGTGCTCTGGACGTAACAATCATGTACAAAGGCAGAACCGTGCTTCAGAAGGTGGTTGGACACCCCTCCTGTACTTTTCTCTACGGCCCCCCCGACCCTGCCGTGAGAGCTACCGACCCGCAACAGGTGGCCTTTCCCTCGCCCGCCGAACTGCCCGATCAAAAACAGCTGAGATACACCGAGGAGCTGCTGAGACACGTGGCGCCGGGCTTACACCTAGAGTTGAGAGGCCCCCAACTCTGGGCCAGACGCATGGGCAAGTGTAAGGTGTACTGGGAGGTCGGGGGCCCTCCCGGCTCTGCCAGCCCCAGCACCCCTGCTTGTCTCTTGCCCAGAAACTGTGATACCCCCATCTTCGACTTCCGTGTATTTTTCCAGGAACTGGTCGAGTTTAGAGCCAGACAGAGACGAGGCAGCCCCAGATATACAATCTACCTCGGCTTCGGCCAGGACCTGAGTGCCGGCAGACCTAAGGAGAAGTCGCTGGTCCTAGTGAAGTTAGAGCCCTGGCTATGTAGAGTGCACCTGGAGGGCACCCAGAGAGAAGGAGTGAGCAGCCTGGACAGCAGCAGCCTGAGTCTGTGCCTGAGCTCCGCCAACTCGCTGTATGATGACATCGAGTGTTTCCTCATGGAGCTGGAGCAGCCCGCC(изоформа A Hu IRF7 дикого типа; P037 без эпитопной метки)
213
ATGGCCCTTGCCCCTGAGCGGGCCGCCCCCAGAGTGTTATTCGGCGAGTGGCTGCTGGGCGAGATCAGCAGCGGCTGCTACGAGGGACTGCAGTGGCTGGACGAGGCTAGAACCTGCTTCAGAGTGCCCTGGAAGCATTTCGCCAGAAAAGACCTGAGCGAGGCTGATGCTAGAATCTTCAAAGCCTGGGCTGTGGCCCGAGGAAGATGGCCCCCCAGCAGCAGAGGAGGCGGCCCTCCTCCCGAGGCCGAAACCGCAGAGCGTGCTGGCTGGAAAACCAACTTTAGGTGTGCCCTGAGGAGCACCAGAAGATTCGTTATGCTCAGAGACAACAGCGGGGACCCCGCCGACCCGCACAAGGTGTACGCCTTAAGTAGGGAGCTGTGCTGGAGAGAGGGACCGGGGACCGACCAAACCGAGGCTGAGGCGCCCGCCGCCGTTCCACCTCCCCAGGGTGGTCCCCCAGGGCCCTTTCTGGCACACACCCACGCCGGATTACAGGCGCCAGGGCCCTTACCCGCCCCCGCCGGAGACAAAGGCGACCTCCTGCTGCAAGCCGTGCAACAAAGCTGCCTGGCCGATCACTTACTAACCGCTAGCTGGGGCGCCGATCCTGTTCCCACCAAGGCCCCCGGTGAAGGGCAAGAAGGACTGCCCTTAACCGGCGCCTGTGCCGGAGGCCCTGGTCTGCCAGCCGGCGAGCTGTACGGTTGGGCTGTCGAAACAACACCCAGTCCGGGCCCACAGCCTGCCGCTCTGACCACCGGCGAAGCCGCCGCCCCCGAGAGCCCACACCAGGCTGAACCCTACCTGAGCCCCAGCCCCAGCGCCTGCACCGCTGTGCAGGAGCCTAGCCCCGGCGCTCTTGATGTGACAATAATGTACAAGGGCAGGACCGTGCTGCAAAAGGTCGTGGGCCATCCGTCGTGTACCTTTCTGTACGGCCCTCCAGACCCCGCGGTTAGAGCCACCGACCCCCAGCAAGTCGCCTTCCCCTCCCCCGCCGAACTGCCCGACCAAAAGCAGCTGCGGTACACAGAAGAACTACTTAGACACGTGGCCCCCGGTCTGCACTTGGAGCTGAGAGGCCCCCAGCTCTGGGCCAGAAGAATGGGCAAGTGCAAAGTGTACTGGGAGGTGGGCGGCCCACCCGGCTCAGCTTCGCCCTCCACACCCGCATGCCTGCTGCCCAGAAATTGCGACACGCCCATCTTCGATTTTAGAGTGTTCTTTCAGGAGTTGGTGGAGTTCAGAGCCAGACAAAGACGCGGCAGCCCCAGATACACCATTTACCTCGGCTTCGGCCAGGACCTCAGCGCTGGCAGACCCAAGGAGAAGAGTCTGGTCCTCGTGAAGCTGGAGCCCTGGCTGTGCAGAGTGCACCTGGAGGGCACCCAGCGTGAAGGCGTGAGCAGCCTGGATTCAAGCGACCTGGACCTATGCCTAAGCAGCGCTAACTCACTGTACGACGATATCGAATGCTTCCTGATGGAACTGGAGCAGCCTGCC(конститутивно активный Hu IRF7 S477D/S479D; P033 без эпитопной метки)
214
ATGGCCCTGGCACCCGAGAGGGCCGCCCCCAGGGTGCTCTTCGGCGAGTGGTTACTAGGCGAAATTAGCAGCGGCTGCTATGAAGGCCTTCAGTGGCTGGACGAGGCCAGAACCTGCTTTAGAGTTCCCTGGAAGCACTTCGCCCGGAAAGATCTCTCTGAAGCCGACGCCAGAATATTCAAGGCCTGGGCTGTCGCCAGGGGCAGGTGGCCACCCTCCAGCCGAGGTGGCGGCCCTCCCCCTGAGGCTGAGACTGCGGAAAGGGCGGGCTGGAAGACCAATTTCAGATGCGCTCTGAGAAGCACCAGACGTTTTGTGATGCTAAGAGACAATAGCGGCGATCCCGCCGACCCCCATAAGGTATACGCACTGAGCCGAGAGCTCTGTTGGAGAGAAGGCCCCGGCACCGACCAGACCGAGGCTGAAGCCCCTGCAGCCGTGCCCCCCCCTCAAGGCGGGCCCCCCGGCCCCTTCCTGGCCCATACCCATGCAGGGTTACAAGCACCCGGGCCCTTGCCCGCCCCAGCGGGAGACAAGGGCGACCTCTTACTGCAGGCCGTGCAACAAAGTTGTCTGGCGGACCACCTGCTGACCGCATCATGGGGCGCGGATCCTGTGCCCACCAAGGCACCCGGCGAAGGCCAGGAGGGCCTGCCCTTGACCGGCGCCTGCGCTGGCGGACCCGGCCTACCTGCTGGCGAACTGTATGGCTGGGCCGTAGAGACGACTCCCAGCCCTGGCCCACAACCCGCGGCTTTGACCACCGGCGAAGCCGCCGCCCCCGAGTCTCCGCACCAGGCCGAGCCTTACCTCAGCCCAAGCCCTAGCGCCTGCACCGCCGTGCAAGAACCTAGCCCCGGAGCCCTGGATGTGACAATCATGTACAAGGGTAGAACCGTACTGCAAAAGGTGGTGGGTCATCCCAGCTGCACCTTTCTTTACGGCCCACCCGACCCTGCCGTGCGAGCCACAGACCCACAACAGGTCGCCTTCCCAAGCCCCGCCGAACTGCCCGATCAGAAACAGCTGAGATATACAGAGGAGCTTCTGCGGCACGTAGCTCCCGGCCTACATCTCGAGCTGAGGGGCCCACAACTGTGGGCCAGACGCATGGGCAAATGCAAGGTCTACTGGGAAGTGGGAGGCCCCCCCGGCAGCGCATCTCCCAGCACGCCCGCGTGCCTGCTGCCTAGAAATTGCGACACCCCCATCTTTGACTTCCGGGTATTCTTTCAGGAGCTGGTAGAGTTCAGAGCCAGGCAGCGGAGGGGCTCCCCCAGATACACAATCTACCTGGGCTTCGGACAGGACCTGTCCGCCGGCCGCCCCAAGGAAAAGAGCCTGGTGCTGGTGAAGCTGGAGCCCTGGCTGTGTAGGGTACACCTCGAAGGCACCCAGAGAGAAGGAGTGAGCTCGCTTGATGACAGCGATCTGTCGGATTGCCTTAGCAGCGCCAACAGCCTGTATGATGATATCGAGTGCTTCCTTATGGAACTGGAGCAGCCCGCC (конститутивно активный Hu IRF7 S475D/S477D/L480D; P034 без эпитопной метки)
215
ATGGCCCTAGCCCCCGAAAGAGCAGCTCCCAGAGTGCTGTTCGGCGAATGGCTGCTTGGCGAGATCAGCAGCGGCTGCTACGAAGGCCTGCAGTGGCTGGACGAAGCCCGCACCTGTTTCAGAGTGCCCTGGAAGCACTTCGCTAGAAAGGATTTGAGCGAGGCTGATGCTAGAATCTTTAAGGCTTGGGCTGTGGCAAGAGGCAGATGGCCGCCTAGTAGCAGAGGGGGCGGACCTCCCCCCGAGGCTGAGACCGCTGAGAGAGCAGGGTGGAAAACCAACTTCAGATGCGCGCTGAGAAGCACCCGAAGATTCGTGATGCTACGTGACAATAGCGGCGACCCCGCCGACCCCCACAAAGTGTACGCCCTGTCCCGAGAACTTTGCTGGAGAGAGGGACCCGGCACCGATCAAACAGAGGCTGAGGCCCCGGCCGCTGTACCCCCGCCCCAAGGAGGCCCCCCAGGCCCCTTTCTGGCTCATACACATGCCGGCCTGCAGGCACCCGGGCCCCTCCCGGCTCCTGCCGGCGACAAGGGCGATCTCCTTCTCCAGGCCGTGCAGCAGAGCTGCCTGGCCGATCACCTGCTGACCGCCTCGTGGGGCGCCGACCCCGTGCCCACCAAAGCCCCGGGTGAAGGCCAAGAGGGGCTCCCTTTAACCGGAGCATGCGCCGGAGGCCCCGGCCTGCCAGCCGGCGAGTTATATGGCTGGGCTGTGGAGACCACACCCTCCCCCGGCCCTCAACCCGCTGCCCTGACCACCGGTGAGGCCGCCGCCCCCGAGAGCCCACACCAGGCCGAACCCTACCTGAGCCCTAGCCCTAGCGCCTGCACCGCCGTGCAAGAACCCAGCCCCGGAGCCCTGGATGTGACCATTATGTACAAGGGCCGGACAGTGCTGCAAAAGGTTGTGGGACACCCGAGCTGCACCTTTCTGTACGGTCCGCCTGACCCCGCCGTGAGAGCCACGGACCCGCAGCAGGTGGCCTTCCCCTCACCCGCGGAGCTGCCCGACCAAAAGCAACTCAGATACACAGAAGAACTATTGCGTCACGTCGCGCCCGGCCTGCATCTGGAGCTGAGAGGCCCCCAGCTCTGGGCCAGAAGGATGGGCAAATGCAAGGTGTACTGGGAGGTGGGAGGCCCCCCCGGCAGCGCCAGCCCCAGCACTCCCGCGTGCCTGCTGCCCAGAAATTGCGACACTCCCATCTTCGATTTCAGGGTGTTCTTCCAGGAGCTGGTGGAGTTCAGAGCCAGGCAGAGAAGGGGTAGCCCCAGATACACAATCTATCTAGGCTTTGGACAAGATCTGAGCGCCGGCCGGCCTAAGGAAAAAAGCCTGGTGCTGGTAAAGCTGGAGCCGTGGCTTTGTAGAGTGCACCTGGAGGGGACGCAGCGAGAGGGCGTGAGCAGCTTAGACGACGATGACTTGGATCTGTGTCTCGACAGCGCCAACGACTTGTACGACGACATCGAGTGCTTCCTGATGGAACTGGAGCAGCCCGCC (конститутивно активный Hu IRF7 S475D/S476D/S477D/S479D/S483D/S487D; P035 без эпитопной метки)
216
ATGGCCCTGGCCCCCGAGAGAGCCGCCCCCAGAGTGCTCTTCGGCGAGTGGCTGCTGGGCGAGATAAGCAGCGGCTGCTACGAAGGTCTGCAGTGGCTAGACGAGGCCAGAACCTGCTTTAGAGTGCCCTGGAAGCACTTCGCTCGAAAGGACCTGTCCGAGGCCGATGCTAGAATTTTTAAGGCTTGGGCCGTCGCTAGGGGAAGATGGCCCCCTAGCAGTAGAGGCGGCGGCCCCCCTCCCGAAGCCGAGACGGCCGAGAGGGCCGGCTGGAAAACCAATTTCAGATGCGCCCTGAGGAGCACCCGCAGGTTCGTAATGCTGCGAGACAATAGCGGCGATCCTGCGGATCCTCACAAGGTTTACGCCTTGAGTAGAGAACTGTGCTGGCGGGAGGGCCCCGGAACCGACCAGACGGAGGCAGAGGCACCCGCTGCCGTGCCCCCCCCTCAAGGAGGACCCCCTGGACCCTTTCTGGCCCACACCCACGCTGGTCTGCAGGCCCCAGGCCCACTGCCCGCCCCAGCGGGCGATAAGGGTGACCTGCTCCTACAGGCGGTGCAACAGAGCTGTCTGGCCGACCACCTGTTGACCGCCAGCTGGGGGGCCGACCCGGTGCCCACCAAAGCTCCCGGAGAGGGCCAAGAAGGCCTCCCACTAACTGGCGCCTGCGCCGGGGGCCCGGGATTACCCGCCGGCGAGCTGTATGGCTGGGCCGTGGAGACCACGCCCAGCCCCGAGGGCGTGTCGTCCCTGGACAGCAGCAGCCTGAGCCTGTGCCTGAGCTCCGCCAACAGCCTGTATGACGACATCGAGTGCTTCCTGATGGAGCTGGAACAACCCGCC (конститутивно активный усеченный Hu IRF7 1-246+468-503; P032 без эпитопной метки)
217
ATGGCACTGGCGCCTGAAAGAGCCGCTCCGCGTGTGCTCTTCGGCGAGTGGCTGCTGGGCGAGATCAGCTCCGGCTGCTACGAGGGTCTACAGTGGCTGGACGAGGCCAGAACCTGTTTTAGAGTGCCCTGGAAGCACTTCGCGAGAAAGGACCTGAGCGAGGCCGACGCCAGAATCTTCAAAGCCTGGGCAGTGGCTAGGGGCAGATGGCCTCCCAGCAGCCGGGGCGGCGGCCCACCCCCCGAGGCCGAAACCGCCGAAAGAGCTGGCTGGAAGACCAACTTCAGATGCGCCCTGAGAAGCACCAGAAGATTTGTCATGCTGAGAGATAATTCAGGAGACCCCGCCGACCCTCACAAGGTGTACGCCCTGTCCAGAGAGCTGTGTTGGAGAGAGGGCCCCGGAACCGACCAGACCGAGGCCGAGGCTCCAGCTGCCGTGCCACCCCCCCAAGGCGGACCACCCGGCCCCTTCTTGGCACATACGCACGCCGGCCTCCAGGCTCCCGGCCCTCTGCCCGCCCCTGCTGGTGACAAAGGCGATCTGCTGCTGCAAGCCGTCCAGCAATCCTGCTTGGCTGACCACCTGCTGACCGCTAGCTGGGGAGCCGACCCCGTTCCCACCAAGGCTCCCGGAGAAGGACAGGAGGGCCTGCCCCTTACCGGCGCTTGCGCGGGGGGCCCTGGCTTGCCTGCCGGCGAACTGTACGGCTGGGCCGTGGAGACCACGCCTTCCCCCGAGGGCGTGTCCAGCCTGGACGATGATGACCTGGATCTGTGCCTGGACAGCGCCAACGACCTGTACGATGACATCGAGTGCTTTTTGATGGAGCTGGAGCAGCCCGCC (конститутивно активный усеченный Hu IRF7 1-246+468-503 плюс S475D/S476D/S477D/S479D/S483D/S487D; P036 без эпитопной метки)
218
ATGGCCCTGGCCCCCGAGAGAGCCGCGCCCAGAGTGCTGTTCGGCGAATGGCTGCTGGGCGAGATCAGCAGCGGCTGCTATGAGGGCCTGCAGTGGCTCGACGAAGCCAGGACGTGCTTCAGAGTCCCCTGGAAGCACTTCGCCAGAAAGGATCTGAGCGAGGCTGACGCCAGAATCTTCAAGGCCTGGGCAGTTGCGCGTGGGAGATGGCCCCCCAGCTCGCGGGGCGGCGGTCCCCCCCCTGAGGCCGAGACCGCCGAAAGAGCCGGATGGAAAACCAACTTTCGATGCGCCCTCAGAAGCACCAGACGGTTTGTGATGCTGAGAGATAACAGCGGCGACCCTGCAGACCCCCATAAAGTGTATGCCCTGAGCAGAGAGCTGTGTTGGCGAGAGGGCCCCGGAACCGACCAAACCGAGGCCGAGGCCCCCGCCGCCGTACCCCCCCCTCAAGGCCCCCAGCCTGCTGCTCTGACCACGGGAGAAGCCGCCGCTCCTGAGAGCCCCCACCAAGCCGAGCCCTATCTGAGCCCTAGCCCCAGCGCCTGCACCGCCGTGCAGGAGCCCTCACCGGGCGCCCTAGACGTGACCATCATGTACAAGGGGCGCACGGTGCTGCAAAAGGTGGTGGGCCACCCCAGCTGCACCTTCCTGTACGGCCCCCCCGACCCTGCCGTGAGAGCCACCGACCCCCAGCAAGTCGCCTTCCCCAGCCCCGCCGAGCTGCCCGACCAGAAGCAGCTGAGGTACACCGAGGAGTTGCTGAGACATGTGGCCCCCGGCTTGCACCTCGAGCTGAGAGGCCCGCAGCTCTGGGCCAGAAGAATGGGCAAGTGCAAGGTGTACTGGGAGGTGGGCGGCCCCCCCGGCAGCGCGAGCCCAAGCACCCCGGCCTGCCTGCTGCCTAGAAACTGCGACACCCCTATCTTCGACTTCAGAGTATTTTTCCAGGAGCTGGTCGAGTTCAGGGCCAGACAGCGTAGAGGCAGCCCCAGATACACCATCTACCTTGGATTCGGCCAGGACCTGAGCGCCGGCAGACCCAAAGAGAAGTCCCTGGTACTGGTGAAGCTAGAGCCCTGGCTGTGTAGGGTGCATCTGGAAGGCACCCAAAGAGAGGGCGTAAGCTCGCTTGACAGCAGCAGCCTCAGCCTGTGCCTGAGCAGCGCTAACAGCTTATACGACGACATCGAGTGCTTCCTGATGGAGCTGGAACAACCCGCC (усеченный Hu IRF7 1-151+247-503; P038 без эпитопной метки; нулевая мутация)
219
ATGGGCGGCCCTCCCGGGCCTTTCCTGGCCCATACACACGCCGGCCTACAGGCTCCTGGCCCTCTGCCCGCCCCGGCCGGCGACAAGGGCGACCTCCTGCTGCAGGCCGTGCAGCAGTCCTGTCTGGCCGACCACCTGCTGACTGCTAGCTGGGGCGCCGATCCCGTGCCCACCAAGGCCCCAGGAGAGGGGCAAGAGGGCCTGCCTCTAACCGGCGCATGCGCAGGTGGACCAGGCCTCCCCGCCGGCGAGCTGTATGGTTGGGCCGTGGAGACAACCCCCAGCCCCGGCCCGCAGCCTGCTGCGCTGACCACAGGCGAGGCCGCTGCCCCTGAGAGCCCCCACCAAGCTGAACCCTACCTGAGCCCCAGCCCCTCTGCCTGCACAGCGGTGCAGGAGCCCAGTCCCGGCGCCTTGGACGTGACCATCATGTATAAGGGCAGGACTGTGTTACAAAAGGTAGTGGGCCACCCAAGTTGTACCTTTCTGTACGGGCCCCCCGACCCAGCCGTGCGCGCCACCGACCCCCAGCAGGTGGCCTTCCCCAGCCCCGCTGAGTTGCCCGATCAGAAACAACTCCGGTACACCGAGGAATTACTTAGACATGTGGCTCCCGGCCTGCATCTGGAGCTTAGAGGTCCACAGTTGTGGGCCAGAAGAATGGGCAAGTGCAAGGTTTATTGGGAGGTCGGAGGCCCCCCGGGCAGCGCCAGCCCCAGCACCCCCGCCTGTCTTCTGCCCAGAAACTGCGACACCCCAATCTTCGATTTCAGAGTGTTTTTCCAGGAACTGGTGGAGTTCAGAGCAAGGCAAAGAAGAGGCAGCCCTAGATACACCATCTACCTGGGCTTTGGCCAAGACCTGAGCGCCGGCAGACCCAAGGAAAAATCCCTGGTCCTGGTGAAACTGGAGCCCTGGCTGTGCAGAGTCCACCTGGAGGGCACCCAGAGAGAGGGCGTGAGCAGCCTGGACTCGAGCAGCCTGTCCCTGTGTCTGAGCAGCGCGAATTCGCTATATGACGACATCGAATGCTTTCTGATGGAGCTGGAACAGCCCGCC (усеченный Hu IRF7 152-503; P039 без эпитопной метки; нулевая мутация)
220
ATGCCTCACAGCAGCCTCCACCCTAGCATCCCTTGCCCTAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCTCGTGCTTTTAAGCGCCTGCTTGGTGACCCTTTGGGGCTTGGGCGAGCCTCCAGAGCACACCTTGAGATATTTGGTGCTCCACCTGGCCAGCCTTCAGCTGGGCTTGTTACTCAACGGCGTGTGCAGCCTGGCCGAGGAGCTGAGACACATCCACAGCAGATACAGAGGCAGCTACTGGAGAACCGTGAGAGCGTGTCTGGGCTGCCCTCTGAGAAGAGGCGCCTTGCTTCTTCTCAGTATCTACTTCTACTACTCCCTGCCTAACGCCGTGGGCCCTCCTTTCACCTGGATGCTGGCACTGCTCGGCCTCAGCCAGGCCCTGAACATCTTGTTGGGCTTGAAGGGCCTGGCCCCTGCCGAGATCAGCGCCGTGTGCGAGAAGGGCAACTTCAACATGGCCCACGGATTGGCTTGGAGCTACTACATCGGCTACCTGAGACTGATCCTGCCTGAGCTGCAGGCCAGAATCAGAACCTACAACCAGCACTACAACAACCTGCTGCGCGGCGCAGTGAGCCAGAGACTGTATATTCTGCTGCCTCTGGACTGCGGCGTGCCTGACAACCTGAGCATGGCCGACCCTAACATCAGATTCCTGGACAAGCTGCCTCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCATCAAGGACAGAGTGTACAGCAACAGCATCTATGAGCTGCTCGAGAATGGCCAGAGAGCCGGCACCTGCGTGCTGGAGTACGCCACCCCTCTGCAGACCCTGTTCGCCATGAGCCAGTATAGTCAAGCTGGCTTCAGCAGAGAGGACAGACTGGAGCAGGCCAAGCTGTTCTGCAGAACCCTGGAGGACATTCTGGCTGACGCCCCTGAGAGCCAGAACAACTGCCGACTGATCGCCTACCAGGAACCAGCCGACGACAGCAGCTTCAGTCTTTCTCAGGAGGTTCTTCGCCACTTGCGCCAGGAGGAGAAGGAGGAGGTGACCGTGGGCAGCCTGAAGACCTCCGCAGTCCCTAGCACCAGCACCATGAGTCAGGAGCCGGAGCTATTAATCAGCGGCATGGAGAAGCCTCTTCCACTCCGAACCGACTTCAGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCAGGTGACGTTGAGGAGAATCCGGGACCTATGACCGAGTACAAGCTGGTGGTTGTGGGCGCCGACGGCGTGGGCAAGAGCGCCCTGACCATCCAGCTGATCCAG
221
ATGACCGAGTACAAGCTAGTAGTCGTGGGCGCCGACGGCGTGGGCAAGAGCGCCCTCACCATCCAGCTAATCCAGGCCACCAACTTCAGCTTGCTCAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCAGGCCCTATGCCTCACAGCAGCCTTCACCCTAGCATCCCTTGCCCTAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCTGGTGCTGCTGAGCGCCTGCCTGGTGACCCTGTGGGGCCTGGGCGAGCCTCCTGAGCACACCCTGAGATATCTGGTGCTTCACCTGGCCAGTTTACAGCTGGGCCTGCTTCTTAACGGCGTGTGCAGCCTGGCCGAGGAGCTGAGACACATCCACAGCAGATACAGAGGCAGCTACTGGAGAACCGTGAGAGCCTGCCTAGGCTGCCCTCTGAGAAGAGGCGCTCTGTTGCTACTTTCCATCTACTTCTACTACTCCCTGCCTAACGCCGTGGGCCCTCCTTTCACTTGGATGCTGGCGTTGCTGGGTCTGAGCCAGGCCCTGAACATCCTTCTCGGTCTGAAGGGCCTGGCCCCTGCCGAGATCAGCGCCGTGTGCGAGAAGGGCAACTTCAACATGGCCCACGGACTCGCCTGGAGCTACTACATCGGCTACCTGAGACTGATCCTGCCTGAGCTGCAGGCCAGAATCAGAACCTACAACCAGCACTACAACAACCTGCTGCGGGGCGCCGTGAGCCAGAGACTGTATATACTTCTTCCTCTGGACTGCGGCGTGCCTGACAACCTGAGCATGGCCGACCCTAACATCAGATTCCTGGACAAGCTGCCTCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCATCAAGGACAGAGTGTACAGCAACTCCATTTATGAGCTGCTCGAGAATGGCCAGAGAGCCGGCACCTGCGTGCTGGAGTACGCCACCCCTCTGCAGACCCTGTTCGCCATGAGCCAGTACAGTCAGGCTGGATTCAGCAGAGAGGACAGACTGGAGCAGGCCAAGCTGTTCTGCAGGACACTGGAGGACATACTAGCAGACGCCCCTGAGAGCCAGAACAACTGCAGACTGATTGCCTACCAGGAGCCTGCGGACGACAGCTCCTTCAGTCTGAGTCAGGAGGTGTTGCGGCACTTACGCCAAGAAGAGAAGGAGGAGGTGACCGTGGGCAGCCTGAAGACTAGCGCTGTGCCTAGCACCAGCACAATGTCACAGGAGCCGGAATTGCTAATCAGCGGCATGGAGAAGCCTCTCCCATTACGTACCGACTTCAGC(KRAS(G12D)25mer_ct.STING(V155M))
222
ATGCCTCACAGCAGCCTTCACCCTAGCATCCCTTGCCCTAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCTAGTGCTCCTTAGCGCCTGCCTCGTGACCCTATGGGGCTTAGGCGAGCCTCCAGAGCACACCTTGAGATACCTCGTCCTCCACCTGGCTAGTCTACAGCTGGGCCTTCTCCTCAACGGCGTGTGCAGCCTGGCCGAGGAGCTGAGACACATCCACAGCAGATACAGAGGCAGCTACTGGAGAACCGTGAGAGCGTGCCTGGGCTGCCCTCTGAGAAGAGGCGCACTGCTGTTACTCAGCATCTACTTCTACTACTCACTGCCAAACGCCGTGGGCCCTCCTTTCACCTGGATGCTGGCCTTGCTCGGATTGAGCCAGGCCCTGAACATTTTACTGGGATTGAAGGGCCTGGCCCCTGCCGAGATCAGCGCCGTGTGCGAGAAGGGCAACTTCAACATGGCCCACGGCCTAGCTTGGAGCTACTACATCGGCTACCTGAGACTGATCCTGCCTGAGCTGCAGGCCAGAATCAGAACCTACAACCAGCACTACAACAACCTGCTGCGTGGAGCGGTGAGCCAGAGACTGTATATCCTCCTGCCTCTGGACTGCGGAGTGCCTGACAACCTGAGCATGGCCGACCCTAACATCAGATTCCTGGACAAGCTGCCTCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCATCAAGGACAGAGTGTACAGCAACTCAATCTACGAGCTGTTGGAGAATGGCCAGAGAGCCGGCACCTGCGTGCTGGAGTACGCCACCCCTCTGCAGACCCTGTTCGCCATGAGCCAGTACTCTCAGGCAGGCTTCAGCAGAGAGGACAGACTGGAGCAGGCCAAGCTGTTCTGCAGAACCCTGGAGGACATCCTGGCGGACGCCCCTGAGAGCCAGAACAACTGCCGGCTTATCGCCTACCAGGAGCCAGCAGACGACAGCAGCTTCTCTCTCTCACAAGAGGTACTGCGCCATCTTCGCCAGGAGGAGAAGGAGGAGGTGACCGTGGGCAGCCTGAAGACATCCGCCGTACCTAGCACCAGCACCATGTCTCAGGAACCGGAACTGTTGATCAGCGGCATGGAGAAGCCTCTGCCACTGCGCACCGACTTCAGCGCCACCAACTTCTCCCTACTGAAGCAAGCCGGTGACGTTGAAGAGAACCCTGGCCCTATGACCGAGTACAAGCTGGTAGTAGTAGGCGCCGACGGCGTGGGCAAGAGCGCCCTGACCATCCAGCTGATCCAGATGACTGAATATAAGCTTGTCGTCGTGGGCGCAGATGGCGTTGGTAAGAGCGCACTTACAATTCAACTCATTCAGATGACGGAGTATAAGCTGGTGGTGGTCGGAGCTGACGGCGTAGGCAAGAGTGCCCTTACTATTCAGCTAATTCAG(KRAS(G12D)25mer^3_nt.STING(V155M))
223
ATGACCGAGTACAAGCTTGTGGTGGTTGGCGCCGACGGCGTGGGCAAGAGCGCCTTAACCATCCAGCTTATCCAGATGACAGAGTATAAGCTAGTGGTGGTCGGCGCAGACGGAGTGGGAAAGAGTGCATTAACTATTCAACTCATCCAAATGACCGAATACAAGCTAGTAGTTGTGGGTGCAGATGGCGTCGGCAAGTCTGCACTGACAATTCAGCTCATCCAGGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCTGGCCCTATGCCTCACAGCAGCCTGCACCCTAGCATCCCTTGCCCTAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCTGGTGCTGCTGAGCGCCTGCCTGGTGACCCTGTGGGGCCTGGGCGAGCCTCCTGAGCACACCCTGAGATACCTAGTTTTGCACCTGGCTTCTCTGCAGCTGGGCCTACTGCTCAACGGCGTGTGCAGCCTGGCCGAGGAGCTGAGACACATCCACAGCAGATACAGAGGCAGCTACTGGAGAACCGTGAGAGCATGCTTAGGCTGCCCTCTGAGAAGAGGCGCTCTGCTCCTCTTGTCCATCTACTTCTACTACTCGCTACCTAACGCCGTGGGCCCTCCTTTCACCTGGATGCTGGCCCTCTTGGGATTAAGCCAGGCCCTGAACATCTTGCTGGGACTGAAGGGCCTGGCCCCTGCCGAGATCAGCGCCGTGTGCGAGAAGGGCAACTTCAACATGGCCCACGGACTCGCTTGGAGCTACTACATCGGCTACCTGAGACTGATCCTGCCTGAGCTGCAGGCCAGAATCAGAACCTACAACCAGCACTACAACAACCTGCTGCGGGGAGCAGTGAGCCAGAGACTGTATATTCTGCTCCCTCTGGACTGCGGCGTGCCTGACAACCTGAGCATGGCCGACCCTAACATCAGATTCCTGGACAAGCTGCCTCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCATCAAGGACAGAGTGTACAGCAACAGCATTTACGAGCTGCTGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCTGCGTGCTGGAGTACGCCACCCCTCTGCAGACCCTGTTCGCCATGAGCCAGTACTCCCAGGCAGGATTCAGCAGAGAGGACAGACTGGAGCAGGCCAAGCTGTTCTGCCGTACTCTTGAGGACATCCTTGCAGACGCCCCTGAGAGCCAGAACAACTGCCGGTTGATTGCCTACCAGGAACCGGCAGACGACAGCTCATTCTCCTTGTCTCAGGAGGTCCTTAGACACCTGCGGCAGGAGGAGAAGGAGGAGGTGACCGTGGGCAGCCTGAAGACATCCGCCGTGCCTAGCACGTCTACCATGTCCCAGGAGCCGGAACTGCTAATCAGCGGCATGGAGAAGCCTCTGCCTCTCAGGACCGACTTCAGC(KRAS(G12D)25mer^3_ct.STING(V155M))
224
MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNVAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDkLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFST(Hu STING (R284K) var; без эпитопной метки)
225
ATGCCCCATAGCAGCCTGCACCCCAGCATCCCCTGCCCCAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCTGGTCCTGCTGAGCGCATGCCTGGTCACCCTGTGGGGCCTGGGCGAGCCCCCCGAGCACACCCTGAGATACCTGGTGCTGCACCTCGCCAGCCTGCAGCTGGGCCTGCTGCTGAACGGCGTGTGCAGCCTGGCCGAGGAGCTGAGACACATCCACAGCAGATATAGAGGCAGCTACTGGAGAACCGTGAGAGCTTGCCTCGGCTGCCCCCTGAGAAGAGGCGCCCTGCTGCTGCTGAGCATCTACTTTTACTACAGCCTGCCCAACGCTGTGGGCCCCCCTTTCACGTGGATGCTCGCCCTGCTGGGACTGAGCCAGGCCCTGAACATCCTGCTGGGCCTTAAGGGCCTAGCCCCCGCCGAGATCAGCGCCGTGTGCGAGAAGGGCAACTTCAATGTGGCCCACGGCCTGGCCTGGAGCTACTACATCGGCTACCTGAGACTGATCCTGCCCGAGCTGCAGGCCAGAATCAGAACCTACAATCAGCACTACAACAACCTGCTGAGAGGCGCCGTGAGCCAGAGACTGTACATCCTGCTGCCCCTGGACTGCGGCGTGCCCGACAACCTCAGCATGGCCGACCCCAACATCAGATTCCTGGACAAGCTGCCCCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCATCAAGGATCGCGTGTACAGCAACAGCATCTACGAGCTGCTGGAAAACGGCCAGAGAGCCGGAACCTGCGTGCTGGAGTACGCCACACCCCTGCAGACCCTGTTCGCCATGAGCCAGTACAGCCAGGCCGGCTTCAGCAGAGAGGACAAGCTGGAGCAGGCCAAGCTGTTCTGCAGAACCCTGGAGGATATCCTCGCCGACGCCCCCGAGAGCCAGAACAACTGCAGGCTGATCGCGTACCAGGAGCCCGCTGACGACAGCAGCTTTAGCCTGAGCCAGGAGGTGCTGAGACATCTGCGTCAAGAGGAAAAGGAGGAGGTGACCGTGGGCTCCCTGAAGACCAGCGCCGTGCCCAGCACCAGCACCATGAGCCAGGAGCCCGAGCTGCTGATCAGCGGCATGGAGAAGCCACTGCCCCTCAGAACCGACTTCAGCACC(Hu STING (R284K) var; без эпитопной метки)
226
EGAMVAATQGAAAAAGSGAGTGGGTASGGTEGGSAESEGAKЧувствительный к катепсину B сайт
227
AMVAATQGAAAAAGSGAGTGGGTASGGTEGGSAESEGAKЧувствительный к катепсину B сайт
228
GGGGGGGGAGAAGGGGGGENYDDPHKЧувствительный к катепсину B сайт
229
MVAATQGAAAAAGSGAGTGGGTASGGTEGGSAESEGAKЧувствительный к катепсину B сайт
230
QLLCGAAIGTHEDDKYRЧувствительный к катепсину B сайт
231
FSHHFEDADNIYIFLELCSRKSЧувствительный к катепсину B сайт
232
YXLVGAGAIGCELLKЧувствительный к катепсину B сайт
233
IPESCSFGYHAGGWGKPPVDETGKPLЧувствительный к катепсину B сайт
234
VAATQGAAAAAGSGAGTGGGTASGGTEGGSASEGAKЧувствительный к катепсину B сайт
235
SEADIEGPLPAKDIHLDLPSNNЧувствительный к катепсину B сайт
236
HFNALGGWGELQNSVKЧувствительный к катепсину B сайт
237
FAQALGLTEAVKЧувствительный к катепсину B сайт
238
TSVLAAANPIESQWNPKЧувствительный к катепсину B сайт
239
QLLQANPILESFGNAKЧувствительный к катепсину B сайт
240
TSILAAANPISGHYDRЧувствительный к катепсину B сайт
241
IXXANPLLEAFGNAKЧувствительный к катепсину B сайт
242
LYGAQFHPEVGLTENGKЧувствительный к катепсину B сайт
243
PQGQAPPLSQAQGHPGIQTPQRЧувствительный к катепсину B сайт
244
AAASAAAASAASGSPGPGEGSAGGEKRЧувствительный к катепсину B сайт
245
IXXXFLGASLKDEVLKЧувствительный к катепсину B сайт
246
LTISPDYAYGATGHPGIIPPHЧувствительный к катепсину B сайт
247
LTISPDYAYGATGHPGIIPPHAЧувствительный к катепсину B сайт
248
ILISLATGHREEGGENLDQЧувствительный к катепсину B сайт
249
LSELTQQLAQATGKPPQYIAVHVVPDQЧувствительный к катепсину B сайт
250
LSELTQQLAQATGKPPQYIAVHVVPDQLЧувствительный к катепсину B сайт
251
DATNVGDEGGFAPNILENKЧувствительный к катепсину B сайт
252
ILAQATSDLVNAIKЧувствительный к катепсину B сайт
253
VXXVXQHAVGIVVNKЧувствительный к катепсину B сайт
254
GSLAEAVGSPPPAATPTPTPPTRЧувствительный к катепсину B сайт
255
SXGLPVGAVINCADNTGAKЧувствительный к катепсину B сайт
256
YCFSEMAPVCAVVGGILAQEIVKЧувствительный к катепсину B сайт
257
HVYGYSMAYGPAQHAISTEKЧувствительный к катепсину B сайт
258
LWQLSKPRPGCSVLGPLPLLЧувствительный к катепсину B сайт
259
MILIQDGSQNTNVDKPLRЧувствительный к катепсину B сайт
260
TYSMVVVPLYDTLGPGAIRYIIЧувствительный к катепсину B сайт
261
HFAMMHGGTGFAGIDSSSPEVKЧувствительный к катепсину B сайт
262
GXLKPGMVVTFAPVNVTTEVKЧувствительный к катепсину B сайт
263
FNALFAQGNYSEAAKЧувствительный к катепсину B сайт
264
GPIHIGGPPGFASSSGKPGPTVIKЧувствительный к катепсину B сайт
265
GFGFVTFDDHDPVDKЧувствительный к катепсину B сайт
266
DQGSCGSCWAFGAVEAISDRЧувствительный к катепсину B сайт
267
GXNFGFGDSRGGGGNFGPGPGЧувствительный к катепсину B сайт
268
HDLFDSGFGGGAGVETGGKЧувствительный к катепсину B сайт
269
CYLFGGLANDSEDPKЧувствительный к катепсину B сайт
270
TTEDSVMLNGFGTVVNALGKЧувствительный к катепсину B сайт
271
LTEGLHGFHVHEFGDNTAGCЧувствительный к катепсину B сайт
272
GYAFIEYEHERЧувствительный к катепсину B сайт
273
MFIGGLSWDTSKKЧувствительный к катепсину B сайт
274
MFIGGLSWDTTKKЧувствительный к катепсину B сайт
275
SMGFIGHYLDQKЧувствительный к катепсину B сайт
276
SMGFIGHYLDQKЧувствительный к катепсину B сайт
277
ALXGGIGFIHHNCTPEFQANEЧувствительный к катепсину B сайт
278
NLQSTFSGFGFINSENVFKЧувствительный к катепсину B сайт
279
GFCFITYTDEEPVKKЧувствительный к катепсину B сайт
280
MPMFIVNTNVPRЧувствительный к катепсину B сайт
281
VSEIFVELQGFLAAEQDIRЧувствительный к катепсину B сайт
282
GFCFLEYEDHKЧувствительный к катепсину B сайт
283
QAVSMFLGAVEEAKKЧувствительный к катепсину B сайт
284
KPXKPMQFLGDEETVRKЧувствительный к катепсину B сайт
285
GAAEPHTIAAFLGGAAAQEVIKЧувствительный к катепсину B сайт
286
MIPCDFLIPVQTQHPIRЧувствительный к катепсину B сайт
287
QGAPTSFLPPEASQLKPDRЧувствительный к катепсину B сайт
288
STGGAPTFNVTVTKЧувствительный к катепсину B сайт
289
MVYMFQYDSTHGKЧувствительный к катепсину B сайт
290
HFPMTHGNTGFSGIESSSPEVKЧувствительный к катепсину B сайт
291
AVAFSPVTELKKЧувствительный к катепсину B сайт
292
GFGFVTFSSMAEVDAAMAARPHЧувствительный к катепсину B сайт
293
TCGFDFTGAVEDISKЧувствительный к катепсину B сайт
294
EYSGLSDGYGFTTDLFGRЧувствительный к катепсину B сайт
295
GQHVXGSPFQFTVGPLGEGGAHKЧувствительный к катепсину B сайт
296
GFGFVDFNSEEDAKЧувствительный к катепсину B сайт
297
FXFVEFEDPRЧувствительный к катепсину B сайт
298
FXFVEFEDPRЧувствительный к катепсину B сайт
299
IELFVGGELIDPADDRKЧувствительный к катепсину B сайт
300
MFVGGLSWDTSKKЧувствительный к катепсину B сайт
301
AFSAFVGQMHQQGILKЧувствительный к катепсину B сайт
302
GILFVGSGVSGGEEGARЧувствительный к катепсину B сайт
303
IIAFVGSPVEDNEKDLVKЧувствительный к катепсину B сайт
304
DYAFVHFEDRЧувствительный к катепсину B сайт
305
GYAFVHFETQEAADKЧувствительный к катепсину B сайт
306
GYGFVHFETQEAAERЧувствительный к катепсину B сайт
307
NYGFVHIEDKЧувствительный к катепсину B сайт
308
ITLPVDFVTADKFDENAKЧувствительный к катепсину B сайт
309
GFGFVTFDDHDPVDKЧувствительный к катепсину B сайт
310
LPNFGFVVFDDSEPVQKЧувствительный к катепсину B сайт
311
GFGFVYFQNHDAADKЧувствительный к катепсину B сайт
312
YQFWDTQPVPKЧувствительный к катепсину B сайт
313
QLLCGAAIGTHEDDKYRЧувствительный к катепсину B сайт
314
QLLCGAAIGTHEDDKYRЧувствительный к катепсину B сайт
315
PPAGGGGGAGGAGGGPPPGPPGAGDRЧувствительный к катепсину B сайт
316
FGGSFAGSFGGAGGHAPGVARЧувствительный к катепсину B сайт
317
CNPIISGLYQGAGGPGPGGFGAQGPKЧувствительный к катепсину B сайт
318
PGLNLPPPIGGAGPPLGLPKPKЧувствительный к катепсину B сайт
319
QPXVDGFLVGGASLKPEFVDIINAKЧувствительный к катепсину B сайт
320
VTGDHIPTPQDLPQRЧувствительный к катепсину B сайт
321
YGGELVPHFPARЧувствительный к катепсину B сайт
322
YQGAGGPGPGGFGAQGPKЧувствительный к катепсину B сайт
323
EYFGGFGEVESIELPMDNKЧувствительный к катепсину B сайт
324
ALVLGGFAHMDTETKЧувствительный к катепсину B сайт
325
VSHVSTGGGASLELLEGKЧувствительный к катепсину B сайт
326
AEGGGGGGRPGAPAAGDGKЧувствительный к катепсину B сайт
327
RGGGGGGSGGIGYPYPRЧувствительный к катепсину B сайт
328
NMGGPYGGGNYGPGGSGGSGGYGЧувствительный к катепсину B сайт
329
GTGGVDTAATGGVFDISNLDRЧувствительный к катепсину B сайт
330
HFNALGGWGELQNSVKЧувствительный к катепсину B сайт
331
PESCSFGYHAGGWGKPPVDETGKPLЧувствительный к катепсину B сайт
332
SSLPNFCGIFNHLERЧувствительный к катепсину B сайт
333
AMALXGGIGFIHHNCTPEFЧувствительный к катепсину B сайт
334
AMALXGGIGFIHHNCTPEFQANEЧувствительный к катепсину B сайт
335
EWIKPIMFSGGIGSMEADHISKЧувствительный к катепсину B сайт
336
GDGPVQGIINFEQKЧувствительный к катепсину B сайт
337
EMAPVCAVVGGILAQEIVKЧувствительный к катепсину B сайт
338
LAFHGILLHGLEDRЧувствительный к катепсину B сайт
339
MGVVAGILVQNVLKЧувствительный к катепсину B сайт
340
FTASAGIQVVGDDLTVTNPKЧувствительный к катепсину B сайт
341
TPYQIACGISQGLADNTVIAKЧувствительный к катепсину B сайт
342
YPIEHGIVTNWDDMEKЧувствительный к катепсину B сайт
343
VASGIPAGWXGLDCGPESSKKЧувствительный к катепсину B сайт
344
LFVGGLDWSTTQETLRЧувствительный к катепсину B сайт
345
HGGSLGLGLAAMGTARЧувствительный к катепсину B сайт
346
IFVGGLSANTVVEDVKЧувствительный к катепсину B сайт
347
LFIGGLSFETTDDSLRЧувствительный к катепсину B сайт
348
LFIGGLSFETTDESLRЧувствительный к катепсину B сайт
349
LFIGGLSFETTEESLRЧувствительный к катепсину B сайт
350
MFXGGLSWDTSKKЧувствительный к катепсину B сайт
351
DAVSGMGVIVHIIEKЧувствительный к катепсину B сайт
352
GGNFGFGDSRЧувствительный к катепсину B сайт
353
GTTGSGAGSGGPGGLTSAAPAGGDKKЧувствительный к катепсину B сайт
354
IISGLYQGAGGPGPGGFGAQGPKЧувствительный к катепсину B сайт
355
IISGLYQGAGGPGPGGFGAQGPKЧувствительный к катепсину B сайт
356
GGGLLIGGQAWDWANQGEDERVЧувствительный к катепсину B сайт
357
GNFGGSFAGSFGGAGGHAPGVARЧувствительный к катепсину B сайт
358
NFGGSFAGSFGGAGGHAPGVARЧувствительный к катепсину B сайт
359
SAADTKPGTTGSGAGSGGPGGLTSAAPAGGDKKЧувствительный к катепсину B сайт
360
AATQGAAAAAGSGAGTGGGTASGGTEGGSAESEGAKЧувствительный к катепсину B сайт
361
GSSGGSGAKPSDAASEAARЧувствительный к катепсину B сайт
362
IQFHFHWGSLDGQGSEHTVDKЧувствительный к катепсину B сайт
363
MILIQDGSQNTNVDKPLRЧувствительный к катепсину B сайт
364
KGTFTDDLHKЧувствительный к катепсину B сайт
365
QQSHFAMMHGGTGFAGIDSSSPEVKЧувствительный к катепсину B сайт
366
VAVLISGTGSNLQALIDSTRЧувствительный к катепсину B сайт
367
FLAAGTHLGGTNLDFQЧувствительный к катепсину B сайт
368
LVLGTHTSDEQNHLЧувствительный к катепсину B сайт
369
TGGVDTAATGGVFDISNLDRЧувствительный к катепсину B сайт
370
TGGVDTAAVGGVFDVSNADRЧувствительный к катепсину B сайт
371
AVXIVAAGVGEFEAGISKЧувствительный к катепсину B сайт
372
EILTLLQGVHQGAGFQDIPKЧувствительный к катепсину B сайт
373
MKPLMGVIYVPLTDKEKЧувствительный к катепсину B сайт
374
ECISXHVGQAGVQIGNACWEЧувствительный к катепсину B сайт
375
HFNALGGWGELQNSVKЧувствительный к катепсину B сайт
376
ESCSFGYHAGGWGKPPVDETGKPLЧувствительный к катепсину B сайт
377
AGYVTHLMKЧувствительный к катепсину B сайт
378
TMFSSEVQFGHAGACANQASETAVAKЧувствительный к катепсину B сайт
379
MPFPVNHGASSEDTLLKЧувствительный к катепсину B сайт
380
FFLHHLIAEIHTAEIRATЧувствительный к катепсину B сайт
381
NXSAXQVLIEHIGNLDRЧувствительный к катепсину B сайт
382
GGYVLHIGTIYGDLKЧувствительный к катепсину B сайт
383
DXHLGGEDFDNRЧувствительный к катепсину B сайт
384
GILGPPPPSFHLGGPAVGPRЧувствительный к катепсину B сайт
385
PTPPPTLHLVPEPAAPPPPЧувствительный к катепсину B сайт
386
YGPQYGHPPPPPPPPEYGPHADSPVЧувствительный к катепсину B сайт
387
KHSGPNSADSANDGFVRЧувствительный к катепсину B сайт
388
RPELLTHSTTEVTQPRЧувствительный к катепсину B сайт
389
LXGHVGFDSLPDQLVNKЧувствительный к катепсину B сайт
390
AASATQTIAAAQHAASTPKЧувствительный к катепсину B сайт
391
CLTQSGIAGGYKPFЧувствительный к катепсину B сайт
392
ELAQIAGRPTEDEDEKEKЧувствительный к катепсину B сайт
393
AITIAGVPQSVTECVKЧувствительный к катепсину B сайт
394
GLCAIAQAESLRЧувствительный к катепсину B сайт
395
KPTALIGVAAIGGAFSEQILKЧувствительный к катепсину B сайт
396
DYMNVQCHACIGGTNVGEDIRЧувствительный к катепсину B сайт
397
NTQNFQSLHNIGSVVQHSEGKPLЧувствительный к катепсину B сайт
398
LKPPTLIHGQAPSAGLPSQKPKЧувствительный к катепсину B сайт
399
VLIIGGGDGGVLRЧувствительный к катепсину B сайт
400
GCITIIGGGDTATCCAKЧувствительный к катепсину B сайт
401
GRPSETGIIGIIDPECRЧувствительный к катепсину B сайт
402
EAFGWHAIIVDGHSVEELCKЧувствительный к катепсину B сайт
403
LAAAILGGVDQIHIKPGЧувствительный к катепсину B сайт
404
LYSILGTTLKDEGKЧувствительный к катепсину B сайт
405
MILIQDGSQNTNVDKPLRЧувствительный к катепсину B сайт
406
LAMQEFMILPVGAANFRЧувствительный к катепсину B сайт
407
VPYLIAGIQHSCQDIGAKЧувствительный к катепсину B сайт
408
TVAGGVHISGLHTESAPRЧувствительный к катепсину B сайт
409
VAVLISGTGSNLQALIDSTRЧувствительный к катепсину B сайт
410
GITAIGGTSTISSEGTQHSYSEEEKЧувствительный к катепсину B сайт
411
AGVSISVVHGNLSEEAAKЧувствительный к катепсину B сайт
412
HVTQAHVQTGITAAPPPHPGAPHPPQЧувствительный к катепсину B сайт
413
AGLFLPGSVGITDPCESGNFRЧувствительный к катепсину B сайт
414
AFAHITGGGLLENIPRЧувствительный к катепсину B сайт
415
ILAQITGTEHLKЧувствительный к катепсину B сайт
416
TFXNITPAEVGVLVGKЧувствительный к катепсину B сайт
417
HSSGIVADLSEQSLKЧувствительный к катепсину B сайт
418
EDGNEEDKENQGDETQGQQPPQRЧувствительный к катепсину B сайт
419
PGPSGITIPGKPGAQGVPGPPGЧувствительный к катепсину B сайт
420
GLTKPAALAAAPAKPGGAGGSKЧувствительный к катепсину B сайт
421
LGAQLADLHLDNKЧувствительный к катепсину B сайт
422
SLVASLAEPDFVVTDFAKЧувствительный к катепсину B сайт
423
MSLPLLAGGVADDINTNKKЧувствительный к катепсину B сайт
424
QPYAVSELAGHQTSAESWGTGRЧувствительный к катепсину B сайт
425
VTVAGLAGKDPVQCЧувствительный к катепсину B сайт
426
IITLAGPTNAIFKЧувствительный к катепсину B сайт
427
STHGLAILGPENPKЧувствительный к катепсину B сайт
428
ASAELALGENSEVLKЧувствительный к катепсину B сайт
429
ILISLATGHREEGGENLDQЧувствительный к катепсину B сайт
430
AMSRPFGVALLFGGVDEKЧувствительный к катепсину B сайт
431
LQATAHAQAQLGCPVIIHPGRЧувствительный к катепсину B сайт
432
ILAGLGFDPEMQNRPTЧувствительный к катепсину B сайт
433
PERPQQLPHGLGGIGMGLGPGGQPIDANHLNKЧувствительный к катепсину B сайт
434
QLMQLIGPAGLGGLGGLGALTGPGЧувствительный к катепсину B сайт
435
HFNALGGWGELQNSVKЧувствительный к катепсину B сайт
436
MGAGLGHGMDRЧувствительный к катепсину B сайт
437
THMTAIVGMALGHRPIPNQPPTЧувствительный к катепсину B сайт
438
PHGLGGIGMGLGPGGQPIDANHLNKЧувствительный к катепсину B сайт
439
ASQGDSISSQLGPIHPPPRЧувствительный к катепсину B сайт
440
VWQLGSSSPNFTLEGHEKЧувствительный к катепсину B сайт
441
YVATLGVEVHPLЧувствительный к катепсину B сайт
442
KLIADYSPDDIFNЧувствительный к катепсину B сайт
443
TXGLIFVVDSNDRЧувствительный к катепсину B сайт
444
VPEFQFLIGDEAATHLKЧувствительный к катепсину B сайт
445
CNINLLPLPDPIPSGLMEЧувствительный к катепсину B сайт
446
LITEMVALNPDFKPPADYKPPAЧувствительный к катепсину B сайт
447
NQVALNPQNTVFDAKЧувствительный к катепсину B сайт
448
GLLKPGLNVVLEGPKЧувствительный к катепсину B сайт
449
GVNLPGAAVDLPAVSEKЧувствительный к катепсину B сайт
450
ISXGLPVGAVINCADNTGAKЧувствительный к катепсину B сайт
451
GQVCLPVISAENWKЧувствительный к катепсину B сайт
452
EILTLLQGVHQGAGFQDIPKЧувствительный к катепсину B сайт
453
NNQFQALLQYADPVSAQHAKЧувствительный к катепсину B сайт
454
LFIGGLSFETTDDSLRЧувствительный к катепсину B сайт
455
AIQLSGAEQLEALKЧувствительный к катепсину B сайт
456
DVSIEDSVISLSGDHCIIGRЧувствительный к катепсину B сайт
457
EYLLSGDISEAEHCLKЧувствительный к катепсину B сайт
458
VVISSDGQFALSGSWDGTLRЧувствительный к катепсину B сайт
459
VHEQLAALSQGPISKPKЧувствительный к катепсину B сайт
460
LVXLXXETALLSSGFSLEDPQTHЧувствительный к катепсину B сайт
461
GPDGLTAFEATDNQAIKЧувствительный к катепсину B сайт
462
ALYWLSGLTCTEQNFISKЧувствительный к катепсину B сайт
463
IITLTGPTNAIFKЧувствительный к катепсину B сайт
464
LATQLTGPVMPVRЧувствительный к катепсину B сайт
465
FPSLLTHNENMVAKЧувствительный к катепсину B сайт
466
LEXLXTINXGLTSIANLPKЧувствительный к катепсину B сайт
467
ALLLLLVGGVDQSPRЧувствительный к катепсину B сайт
468
GKPVGLVGVTELSDAQKKЧувствительный к катепсину B сайт
469
VNVAGLVLAGSADFKЧувствительный к катепсину B сайт
470
QGYIGAALVLGGVDVTGPHЧувствительный к катепсину B сайт
471
LYTLVLTDPDAPSRЧувствительный к катепсину B сайт
472
AQIHDLVLVGGSTRЧувствительный к катепсину B сайт
473
LNHVAAGLVSPSLKSDTSSKЧувствительный к катепсину B сайт
474
IEVGLVVGNSQVAFEKЧувствительный к катепсину B сайт
475
GYHQSASEHGLVVIAPDTSPRЧувствительный к катепсину B сайт
476
GYHQSASEHGLVVIAPDTSPRЧувствительный к катепсину B сайт
477
QDHPWLLSQNLVVKPDQLIKЧувствительный к катепсину B сайт
478
MGLAMGGGGGASFDRЧувствительный к катепсину B сайт
479
QLPHGLGGIGMGLGPGGQPIDANHLNKЧувствительный к катепсину B сайт
480
VVVLMGSTSDLGHCEKЧувствительный к катепсину B сайт
481
MALIQMGSVEEAVQAЧувствительный к катепсину B сайт
482
TTGFGMIYDSLDYAKЧувствительный к катепсину B сайт
483
WLLAEMLGDLSDSQLKЧувствительный к катепсину B сайт
484
QAQYLGMSCDGPFKPDHЧувствительный к катепсину B сайт
485
AHSSMVGVNLPQKЧувствительный к катепсину B сайт
486
SGPVVAMVWEGLNVVKЧувствительный к катепсину B сайт
487
VNTQNFQSLHNIGSVVQHSEGKPLЧувствительный к катепсину B сайт
488
LYVSNLGIGHTRЧувствительный к катепсину B сайт
489
VYVGNLGNNGNKTELERЧувствительный к катепсину B сайт
490
IVDLLQMLEMNMAIAFPAЧувствительный к катепсину B сайт
491
VLAQNSGFDLQETLVKЧувствительный к катепсину B сайт
492
QQSHFPMTHGNTGFSGIESSSPEVKЧувствительный к катепсину B сайт
493
ILIANTGMDTDKIKЧувствительный к катепсину B сайт
494
NNTVTPGGKPNKЧувствительный к катепсину B сайт
495
VVNVANVGAVPSGQDNIHRЧувствительный к катепсину B сайт
496
MPFPVNHGASSEDTLLKЧувствительный к катепсину B сайт
497
RPKDPGHPYЧувствительный к катепсину B сайт
498
ELDIMEPKVPDDIYKЧувствительный к катепсину B сайт
499
AETSQQEASEGGDPASPALSLSЧувствительный к катепсину B сайт
500
LLAAQNPLSQADRPHQЧувствительный к катепсину B сайт
501
PDNFXFGQSGAGNNWAKЧувствительный к катепсину B сайт
502
MIAGQVLDINLAAEPKЧувствительный к катепсину B сайт
503
IILNSHSPAGSAAISQQDFHPKЧувствительный к катепсину B сайт
504
GAVAVSAAPGSAAPAAGSAPAAAEEKЧувствительный к катепсину B сайт
505
SAAGAAGSAGGSSGAAGAAGGGAGAGTRPGDGGTASAGAAGPGAATKЧувствительный к катепсину B сайт
506
FTASAGIQVVGDDLTVTNPKЧувствительный к катепсину B сайт
507
FGIVTSSAGTGTTEDTEAKKЧувствительный к катепсину B сайт
508
SLYQSAGVAPESFEYIEAHGTGTKЧувствительный к катепсину B сайт
509
VSEIDEMFEARKMЧувствительный к катепсину B сайт
510
FGGSFAGSFGGAGGHAPGЧувствительный к катепсину B сайт
511
FGGSFAGSFGGAGGHAPGVARЧувствительный к катепсину B сайт
512
AADTKPGTTGSGAGSGGPGGLTSAAPAGGDKKЧувствительный к катепсину B сайт
513
ATQGAAAAAGSGAGTGGGTASGGTEGGSAESEGAKЧувствительный к катепсину B сайт
514
EIELIGSGGFGQVFKЧувствительный к катепсину B сайт
515
KPGTTGSGAGSGGPGGLTSAAPAGGDKKЧувствительный к катепсину B сайт
516
LYANXVXSGGTTMYPGIADRЧувствительный к катепсину B сайт
517
RSGKYDLDFKЧувствительный к катепсину B сайт
518
HDGYGSHGPLLPLPSRЧувствительный к катепсину B сайт
519
SLFSSIGEVESAKЧувствительный к катепсину B сайт
520
LQSIGTENTEENRЧувствительный к катепсину B сайт
521
SLVASLAEPDFVVTDFAKЧувствительный к катепсину B сайт
522
AEPMGEKPVGSLAGIGEVLGKЧувствительный к катепсину B сайт
523
VQEAINSLGGSVFPKЧувствительный к катепсину B сайт
524
SAAAASAASGSPGPGEGSAGGEKRЧувствительный к катепсину B сайт
525
QTIDNSQGAYQEAFDISKKЧувствительный к катепсину B сайт
526
FGIVTSSAGTGTTEDTEAKЧувствительный к катепсину B сайт
527
FGIVTSSAGTGTTEDTEAKKЧувствительный к катепсину B сайт
528
XSSFDLDYDFQRЧувствительный к катепсину B сайт
529
FQAGTSKPLHSSGINVNAAPFЧувствительный к катепсину B сайт
530
HIGGPPGFASSSGKPGPTVIKЧувствительный к катепсину B сайт
531
XSSGPGASSGTSGDHGELVVRЧувствительный к катепсину B сайт
532
ELVSSSSSGSDSDSEVDKKЧувствительный к катепсину B сайт
533
MDSTEPPYSQKRЧувствительный к катепсину B сайт
534
VVVLMGSTSDLGHCEKЧувствительный к катепсину B сайт
535
ILDSVGIEADDDRLNKЧувствительный к катепсину B сайт
536
STQPISSVGKPASVIKЧувствительный к катепсину B сайт
537
ALQSVGQIVGEVLKЧувствительный к катепсину B сайт
538
VSSLAEGSVTSVGSVNPAENFRЧувствительный к катепсину B сайт
539
TGSISSSVSVPAKPERЧувствительный к катепсину B сайт
540
YXXXXXXYSQSYGGYENQKЧувствительный к катепсину B сайт
541
IYWGTATTGKPHVЧувствительный к катепсину B сайт
542
MVQTAVVPVKKЧувствительный к катепсину B сайт
543
MMLGTEGGEGFVVKЧувствительный к катепсину B сайт
544
XTFIAIKPDGVQRЧувствительный к катепсину B сайт
545
VSHVSTGGGASLELLEGKЧувствительный к катепсину B сайт
546
AAAAAGSGAGTGGGTASGGTEGGSAESEGAKЧувствительный к катепсину B сайт
547
TIGNSCGTIGLIHAVANNQDKЧувствительный к катепсину B сайт
548
TGEEIFGTIGMRPNAKЧувствительный к катепсину B сайт
549
TTQFSCTLGEKFEETTADGRЧувствительный к катепсину B сайт
550
GCTATLGNFAKЧувствительный к катепсину B сайт
551
YVATLGVEVHPLЧувствительный к катепсину B сайт
552
LAATNALLNSleftKЧувствительный к катепсину B сайт
553
GPGASSGTSGDHGELVVRЧувствительный к катепсину B сайт
554
STTTGHLIYKЧувствительный к катепсину B сайт
555
ALSAADTKPGTTGSGAGSGGPGGLTSAAPAGGDKKЧувствительный к катепсину B сайт
556
STTTGHLIYKЧувствительный к катепсину B сайт
557
VTIIGPATVGGIKPGCFKЧувствительный к катепсину B сайт
558
TVVFSHPPIGTVGLTEDEAIHKЧувствительный к катепсину B сайт
559
GSPTSLGTWGSWIGPDHDKЧувствительный к катепсину B сайт
560
GSPTSLGTWGSWIGPDHDKFЧувствительный к катепсину B сайт
561
IHFPLATYAPVISAEKЧувствительный к катепсину B сайт
562
ANPQVGVAFPHIKЧувствительный к катепсину B сайт
563
TCTTVAFTQVNSEDKЧувствительный к катепсину B сайт
564
VLTGVAGEDAECHAAKЧувствительный к катепсину B сайт
565
NIPPYFVALVPQEEELDDQKЧувствительный к катепсину B сайт
566
GQETAVAPSLVAPALNKPKЧувствительный к катепсину B сайт
567
QGQETAVAPSLVAPALNKPKЧувствительный к катепсину B сайт
568
GFVTFSSMAEVDAAMAARPHЧувствительный к катепсину B сайт
569
VDYYTTTPALVFGKPVRЧувствительный к катепсину B сайт
570
VDYYTTTPALVFGKPVRЧувствительный к катепсину B сайт
571
ASQPXVDGFLVGGASLKPEFVDIINAKЧувствительный к катепсину B сайт
572
TIIGPATVGGIKPGCFKЧувствительный к катепсину B сайт
573
GGVDTAAVGGVFDVSNADRЧувствительный к катепсину B сайт
574
TTVHAITATQKЧувствительный к катепсину B сайт
575
EEVRPQDTVSVIGGVAGGSKЧувствительный к катепсину B сайт
576
QVIGTGSFFPKЧувствительный к катепсину B сайт
577
ASGNYATVISHNPETKЧувствительный к катепсину B сайт
578
MKPLMGVIYVPLTDKEKЧувствительный к катепсину B сайт
579
FSVCVLGDQQHCDEAKЧувствительный к катепсину B сайт
580
ENAFCNLAAIVPDSVGRHSPAЧувствительный к катепсину B сайт
581
AYVGNLPFNTVQGDIDAIFKЧувствительный к катепсину B сайт
582
TLTTVQGIADDYDKKЧувствительный к катепсину B сайт
583
CISXHVGQAGVQIGNACWEЧувствительный к катепсину B сайт
584
THALQWPSLTVQWLPEVTKPEGKЧувствительный к катепсину B сайт
585
ASVPAGGAVAVSAAPGSAAPAAGSAPAAAEEKЧувствительный к катепсину B сайт
586
YEEVSVSGFEEFHRЧувствительный к катепсину B сайт
587
CMTTVSWDGDKLQCVQKЧувствительный к катепсину B сайт
588
MHGGGPTVTAGLPLPKЧувствительный к катепсину B сайт
589
LALVTGGEIASTFDHPELVKЧувствительный к катепсину B сайт
590
LEGTLLKPNMVTPGHACTQKЧувствительный к катепсину B сайт
591
XVVESAYEVIKЧувствительный к катепсину B сайт
592
ILAQVVGDVDTSLPRЧувствительный к катепсину B сайт
593
CFSEMAPVCAVVGGILAQEIVKЧувствительный к катепсину B сайт
594
ETEDTFXADLVVGLCTGQIKЧувствительный к катепсину B сайт
595
EGPAVVGQFIQDVKЧувствительный к катепсину B сайт
596
MLISGYALNCVVGSQGMPKЧувствительный к катепсину B сайт
597
HWPFMVVNDAGRPKЧувствительный к катепсину B сайт
598
SGPVVAMVWEGLNVVKЧувствительный к катепсину B сайт
599
ALQDEWDAVMLHSFTLRQЧувствительный к катепсину B сайт
600
EYFSWEGAFQHVGKЧувствительный к катепсину B сайт
601
ATVASGIPAGWMGLDCGPESSKЧувствительный к катепсину B сайт
602
ATVASGIPAGWMGLDCGPESSKKЧувствительный к катепсину B сайт
603
DCAFYDPTHAWSGGLDHQLKЧувствительный к катепсину B сайт
604
QFQALLQYADPVSAQHAKЧувствительный к катепсину B сайт
605
EQPQHPLHVTYAGAAVDELGKЧувствительный к катепсину B сайт
606
TFSYAGFEMQPKЧувствительный к катепсину B сайт
607
GYIWNYGAIPQTWEDPGHNDKЧувствительный к катепсину B сайт
608
DYTGYNNYYGYGDYSNQQSGYGKЧувствительный к катепсину B сайт
609
QSGYGGQTKPIFRЧувствительный к катепсину B сайт
610
VPLIESGTAGYLGQVTTIKKЧувствительный к катепсину B сайт
611
GILGYTEHQVVSSDFNSDTHЧувствительный к катепсину B сайт
612
GILGYTEHQVVSSDFNSDTHSSЧувствительный к катепсину B сайт
613
QTCVXHYTGMLEDGKKЧувствительный к катепсину B сайт
614
QTCVXHYTGMLEDGKKFDSЧувствительный к катепсину B сайт
615
AXYVTHLMKЧувствительный к катепсину B сайт
616
KVSVRЧувствительный к катепсину S сайт
617
TVGLRЧувствительный к катепсину S сайт
618
PMGLPЧувствительный к катепсину S сайт
619
PMGAPЧувствительный к катепсину S сайт
620
MDLAAAAEPGAGSQHLEVRЧувствительный к катепсину S сайт
621
EGAMVAATQGAAAAAGSGAGTGGGTASGGTEGGSAESEGAKЧувствительный к катепсину S сайт
622
GTSFDAAATSGGSASSEKЧувствительный к катепсину S сайт
623
AMVAATQGAAAAAGSGAGTGGGTASGGTEGGSAESEGAKЧувствительный к катепсину S сайт
624
GILAADESTGSIAKЧувствительный к катепсину S сайт
625
PAAPALSAADTKPGTTGSGAGSGGPGGLTЧувствительный к катепсину S сайт
626
MVAATQGAAAAAGSGAGTGGGTASGGTEGGSAESEGAKЧувствительный к катепсину S сайт
627
SSIQATTAAGSGHPTSCCЧувствительный к катепсину S сайт
628
NEAIQAAHDAVAQEGQCRЧувствительный к катепсину S сайт
629
QFGLPAEAVEAANKGDVEAFAKЧувствительный к катепсину S сайт
630
LVIPNTLAVNAAQDSTDLVAKЧувствительный к катепсину S сайт
631
EALAAMNAAQVKPLGKЧувствительный к катепсину S сайт
632
APRPPVSAASGRPQDDTDSSRЧувствительный к катепсину S сайт
633
GDPQEAKPQEAAVAPEKPPASDETKЧувствительный к катепсину S сайт
634
EGDMIVCAAYAHELPKЧувствительный к катепсину S сайт
635
GILAADESTGSIAKЧувствительный к катепсину S сайт
636
PEEACSFILSADFPALVVKЧувствительный к катепсину S сайт
637
GWNAYIDNLMADGTCQDAAIVGYKЧувствительный к катепсину S сайт
638
YLAADKDGNVTCERЧувствительный к катепсину S сайт
639
LPVDFVTADKFDENAKЧувствительный к катепсину S сайт
640
TXEAEAAHGTVTRЧувствительный к катепсину S сайт
641
TVFAEHISDECKЧувствительный к катепсину S сайт
642
TVFAEHISDECKRЧувствительный к катепсину S сайт
643
DLEAEHVEVEDTTLNRЧувствительный к катепсину S сайт
644
CAEIAHNVSSKЧувствительный к катепсину S сайт
645
EAAAAGGGVGAGAGGGCGPGGADSSKPRЧувствительный к катепсину S сайт
646
YXLVGAGAIGCELLKЧувствительный к катепсину S сайт
647
LIYAGKILNDDTALKЧувствительный к катепсину S сайт
648
FGDNTAGCTSAGPHFNPLSRЧувствительный к катепсину S сайт
649
IITLAGPTNAIFKЧувствительный к катепсину S сайт
650
EIVHXQAGQCGNQIGAKЧувствительный к катепсину S сайт
651
AICAGPTALLAHEIGFGSKЧувствительный к катепсину S сайт
652
SHEHSPSDLEAHFVPLVKЧувствительный к катепсину S сайт
653
ELQAHGADELLKЧувствительный к катепсину S сайт
654
SWADLVNAHVVPGSGVVKЧувствительный к катепсину S сайт
655
TFIAIKPDGVQRЧувствительный к катепсину S сайт
656
GYIWNYGAIPQTWEDPGHNDKЧувствительный к катепсину S сайт
657
ATATXXAKPQITNPKЧувствительный к катепсину S сайт
658
TTETAQHAQGAKPQVQPQKЧувствительный к катепсину S сайт
659
VASYLLAALGGNSSPSAKЧувствительный к катепсину S сайт
660
IALPAPRGSGTASDЧувствительный к катепсину S сайт
661
QIGNVAALPGIVHRЧувствительный к катепсину S сайт
662
DGTVLCELINALYPEGQAPVKЧувствительный к катепсину S сайт
663
DGTVLCELINALYPEGQAPVKKЧувствительный к катепсину S сайт
664
DFTVSAMHGDMDQKЧувствительный к катепсину S сайт
665
LVTDCVAAMNPDAVLRЧувствительный к катепсину S сайт
666
HELQANCYEEVKDRЧувствительный к катепсину S сайт
667
CSLQAAAILDANDAHQTETSSSQVKЧувствительный к катепсину S сайт
668
SGLGRPQLQGAPAAEPMAVPЧувствительный к катепсину S сайт
669
QETAVAPSLVAPALNKPKЧувствительный к катепсину S сайт
670
AQXAAPASVPAQAPKЧувствительный к катепсину S сайт
671
GETIFVTAPHEATAGIIGVNRЧувствительный к катепсину S сайт
672
EYSSELNAPSQESDSHPRЧувствительный к катепсину S сайт
673
DQVTAQEIFQDNHEDGPTAKЧувствительный к катепсину S сайт
674
LHEEEIQELQAQIQEQHVQЧувствительный к катепсину S сайт
675
QQQRPLEAQPSAPGHSVKЧувствительный к катепсину S сайт
676
AAHTANFLLNASGSTSTPAPSRЧувствительный к катепсину S сайт
677
IXXXFLGASLKDEVLKЧувствительный к катепсину S сайт
678
NVEEADAAMAASPHAVDGNTVELKЧувствительный к катепсину S сайт
679
ALLVTASQCQQPAENKЧувствительный к катепсину S сайт
680
QSSWGMMGMLASQQNQSGPSGNNQNQGNMQRЧувствительный к катепсину S сайт
681
LPPGFSASSTVEKPSKЧувствительный к катепсину S сайт
682
AAVPSGASTGIYEALEЧувствительный к катепсину S сайт
683
LNCQVIGASVDSHFCHЧувствительный к катепсину S сайт
684
GANQYTFHLEATENPGALIKЧувствительный к катепсину S сайт
685
LSELTQQLAQATGKPPQYIAVHЧувствительный к катепсину S сайт
686
AGEQEGAMVAATQGAAAAAGSGAGTGGGTASGGTEGGSAESEGAKЧувствительный к катепсину S сайт
687
ISSIQATTAAGSGHPTSCCЧувствительный к катепсину S сайт
688
GLGATTHPTAAVKЧувствительный к катепсину S сайт
689
IEPPPLDAVIEAEHTLRЧувствительный к катепсину S сайт
690
SXGLPVGAVINCADNTGAKЧувствительный к катепсину S сайт
691
VNVANVGAVPSGQDNIHRЧувствительный к катепсину S сайт
692
QFLECAQNQGDIKЧувствительный к катепсину S сайт
693
GGLTDEAALSCCSDADPSTKЧувствительный к катепсину S сайт
694
ILSCGEVIHVKЧувствительный к катепсину S сайт
695
AIVDCGFEHPSEVQЧувствительный к катепсину S сайт
696
HYYEVSCHDQGLCRЧувствительный к катепсину S сайт
697
MLVQCMQDQEHPSIRЧувствительный к катепсину S сайт
698
DVVICPDASLEDAKKЧувствительный к катепсину S сайт
699
SGYAFVDCPDEHWAMKЧувствительный к катепсину S сайт
700
FVLCPECENPETDLHVNPKЧувствительный к катепсину S сайт
701
IAILTCPFEPPKPKЧувствительный к катепсину S сайт
702
IAILTCPFEPPKPKЧувствительный к катепсину S сайт
703
AATEQYHQVLCPGPSQDDPLHPLNKЧувствительный к катепсину S сайт
704
AIVICPTDEDLKDRЧувствительный к катепсину S сайт
705
ATAHAQAQLGCPVIIHPGRЧувствительный к катепсину S сайт
706
IIPGXMCQGGDFTRЧувствительный к катепсину S сайт
707
IIPGXMCQGGDFTRЧувствительный к катепсину S сайт
708
PALYWLSGLTCTEQNFISKЧувствительный к катепсину S сайт
709
MTVGCVAGDEESYEVFKЧувствительный к катепсину S сайт
710
ATVAFCDAQSTQEIHEKЧувствительный к катепсину S сайт
711
NYGILADATEQVGQHKЧувствительный к катепсину S сайт
712
LQDCEGLIVRЧувствительный к катепсину S сайт
713
QISAGYXPVXDCHTAHIACKЧувствительный к катепсину S сайт
714
QISAGYXPVXDCHTAHIACKЧувствительный к катепсину S сайт
715
TGEPCCDWVGDEGAGHFVKЧувствительный к катепсину S сайт
716
DATNVGDEGGFAPNILENKЧувствительный к катепсину S сайт
717
NILDFPQHVSPSKЧувствительный к катепсину S сайт
718
DHVVSDFSEHGSLKЧувствительный к катепсину S сайт
719
ADNELSPECLDGAQHFLKЧувствительный к катепсину S сайт
720
IQTLGYFPVGDGDFPHQKЧувствительный к катепсину S сайт
721
DXQEXXXFLLDGLHEDLNRЧувствительный к катепсину S сайт
722
MILIQDGSQNTNVDKPLRЧувствительный к катепсину S сайт
723
FTISDHPQPIDPLLKЧувствительный к катепсину S сайт
724
VNPTXFFDIAVDGEPLGRЧувствительный к катепсину S сайт
725
YEDICPSTHNMDVPNIKЧувствительный к катепсину S сайт
726
NGSIYNPEVLDITEETLHSRЧувствительный к катепсину S сайт
727
QHIVNDMNPGNLHЧувствительный к катепсину S сайт
728
MLLDSEQHPCQLKЧувствительный к катепсину S сайт
729
EGLMLDSHEELYKЧувствительный к катепсину S сайт
730
TAGDTHLGGEDFDNRЧувствительный к катепсину S сайт
731
PGGLLLGDVAPNFEANTTVGRЧувствительный к катепсину S сайт
732
NDGATILSMMDVDHQIAKЧувствительный к катепсину S сайт
733
GEEGLTLNLEDVQPHDLGKЧувствительный к катепсину S сайт
734
TIDNSQGAYQEAFDISKKЧувствительный к катепсину S сайт
735
IVGFFDDSFSEAHSEFLKЧувствительный к катепсину S сайт
736
QEEASGVALGEAPDHSYESLRЧувствительный к катепсину S сайт
737
DPVQEAWAEDVDLRЧувствительный к катепсину S сайт
738
PMIYICGECHTENEIKЧувствительный к катепсину S сайт
739
HMSEFMECNLNELVKЧувствительный к катепсину S сайт
740
MGYAEEAPYDAIHVGЧувствительный к катепсину S сайт
741
MADQLTEEQIAEFKЧувствительный к катепсину S сайт
742
YLAEFATGNDRKЧувствительный к катепсину S сайт
743
LAELEEFINGPNNAHIQЧувствительный к катепсину S сайт
744
XEFTDHLVKЧувствительный к катепсину S сайт
745
FCVGFLEGGKDSCQGDSGGPVVCЧувствительный к катепсину S сайт
746
LLAEGHPDPDAELQRЧувствительный к катепсину S сайт
747
GLTEGLHGFHЧувствительный к катепсину S сайт
748
FVHWYVGEGMEEGEFSEARЧувствительный к катепсину S сайт
749
MLLHEGQHPAQLRЧувствительный к катепсину S сайт
750
YHGYTFANLGEHEFVEEKЧувствительный к катепсину S сайт
751
TVFAEHISDECKЧувствительный к катепсину S сайт
752
VILEEHSTCENEVSKЧувствительный к катепсину S сайт
753
LLTEIHGGAGGPSGRЧувствительный к катепсину S сайт
754
AHLMEIQVNGGTVAEKЧувствительный к катепсину S сайт
755
ISWLDANTLAEKDEFEHKЧувствительный к катепсину S сайт
756
XEKFEDENFILKЧувствительный к катепсину S сайт
757
SAVEAGSEVSEKPGQEAPVLPKЧувствительный к катепсину S сайт
758
ILNEKPTTDEPEKЧувствительный к катепсину S сайт
759
YLAEKYEWDVAEARЧувствительный к катепсину S сайт
760
CLELFXELAEDKENYЧувствительный к катепсину S сайт
761
CLELFXELAEDKENYKЧувствительный к катепсину S сайт
762
MEELHNQEVQKЧувствительный к катепсину S сайт
763
GVNVAGVSLQELNPEMGTDNDSENWKЧувствительный к катепсину S сайт
764
ASDIAMTELPPTHPIRЧувствительный к катепсину S сайт
765
VVVAENFDEIVNNENKЧувствительный к катепсину S сайт
766
IXEGCEEPATHNALAKЧувствительный к катепсину S сайт
767
VTEQGAELSNEERЧувствительный к катепсину S сайт
768
AVTEQGHELSNEERЧувствительный к катепсину S сайт
769
QVDQEEPHVEEQQQQTPAENKЧувствительный к катепсину S сайт
770
VVFEQTKVIADNVKЧувствительный к катепсину S сайт
771
NIFVGENILEESENLHNADQPLRЧувствительный к катепсину S сайт
772
LFIHESIHDEVVNRЧувствительный к катепсину S сайт
773
VTNGIEEPLEESSHEPEPEPESETKЧувствительный к катепсину S сайт
774
GIVEESVTGVHRЧувствительный к катепсину S сайт
775
QCPSVVSLLSESYNPHVRЧувствительный к катепсину S сайт
776
ASLQETHFDSTQTKЧувствительный к катепсину S сайт
777
TFGETHPFTKЧувствительный к катепсину S сайт
778
VMLGETNPADSKPGTIRЧувствительный к катепсину S сайт
779
GADFLVTEVENGGSLGSKЧувствительный к катепсину S сайт
780
LPTEAYISVEEVHDDGTPTSKЧувствительный к катепсину S сайт
781
MEEVPHDCPGADSAQAGRЧувствительный к катепсину S сайт
782
VDENCVGFDHTVKPVЧувствительный к катепсину S сайт
783
VHVVPDQLMAFGGSSEPCALCЧувствительный к катепсину S сайт
784
IWCFGPDGTGPNILTЧувствительный к катепсину S сайт
785
YVXFGPHAGKЧувствительный к катепсину S сайт
786
EFAGFQCQIQFGPHNEQKЧувствительный к катепсину S сайт
787
KPXKPMQFLGDEETVRKЧувствительный к катепсину S сайт
788
MVYMFQYDSTHGKЧувствительный к катепсину S сайт
789
EELGFRPEYSASQLKЧувствительный к катепсину S сайт
790
HLEFSHDQYRЧувствительный к катепсину S сайт
791
TCGFDFTGAVEDISKЧувствительный к катепсину S сайт
792
GFGFVDFNSEEDAKЧувствительный к катепсину S сайт
793
NYGFVHIEDKЧувствительный к катепсину S сайт
794
GFGFVTFDDHDPVDKЧувствительный к катепсину S сайт
795
LPNFGFVVFDDSEPVQKЧувствительный к катепсину S сайт
796
QLLCGAAIGTHEDDKЧувствительный к катепсину S сайт
797
QLLCGAAIGTHEDDKYRЧувствительный к катепсину S сайт
798
MTNGFSGADLTEICQRЧувствительный к катепсину S сайт
799
VQGEVMEGADNQGAGEQGRPVRЧувствительный к катепсину S сайт
800
MGGHGYGGAGDASSGFHGGHFЧувствительный к катепсину S сайт
801
LGNVLGGLISGAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTAMRЧувствительный к катепсину S сайт
802
FGGSFAGSFGGAGGHAPGVARЧувствительный к катепсину S сайт
803
VLVVGAGGIGCELLKЧувствительный к катепсину S сайт
804
VTADHGPAVSGAHNTIICARЧувствительный к катепсину S сайт
805
CEALAGAPLDNAPKЧувствительный к катепсину S сайт
806
STGGAPTFNVTVTKЧувствительный к катепсину S сайт
807
KGCDVVVIPAGVPRЧувствительный к катепсину S сайт
808
FSPAGVEGCPALPHKЧувствительный к катепсину S сайт
809
HSSLAGCQIINYRЧувствительный к катепсину S сайт
810
SSEVGYDAMAGDFVNMVEKЧувствительный к катепсину S сайт
811
SIEDSVISLSGDHCIIGRЧувствительный к катепсину S сайт
812
VTGDHIPTPQDLPQRЧувствительный к катепсину S сайт
813
NGDTFLGGEDFDQALLRЧувствительный к катепсину S сайт
814
IVYICCGEDHTAALTKЧувствительный к катепсину S сайт
815
MVDGNVSGEFTDLVPEKЧувствительный к катепсину S сайт
816
MAAQGEPQVQFKЧувствительный к катепсину S сайт
817
QALAVHLALQGESSSEHFLKЧувствительный к катепсину S сайт
818
AFYNNVLGEYEEYITKЧувствительный к катепсину S сайт
819
LLNQMDGFDTLHRЧувствительный к катепсину S сайт
820
GLTEGLHGFHVHEFGЧувствительный к катепсину S сайт
821
GLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTЧувствительный к катепсину S сайт
822
AADSYFSLLQGFINSLDESTQESKЧувствительный к катепсину S сайт
823
INPYLLGTMAGGAADCSFWERЧувствительный к катепсину S сайт
824
QHDLFDSGFGGGAGVETGGKЧувствительный к катепсину S сайт
825
TTHFVEGGDAGNREDQINRЧувствительный к катепсину S сайт
826
SQPIAQQPLQGGDHSGNYGYKЧувствительный к катепсину S сайт
827
GTDGTDNPLSGGDQYQNITVHRЧувствительный к катепсину S сайт
828
GCITXIGGGDTATCCAKЧувствительный к катепсину S сайт
829
WGSGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGRKSSSAAAЧувствительный к катепсину S сайт
830
LAAGSLAAPGGGGGSAGGARPЧувствительный к катепсину S сайт
831
GSXXXGGGSYNDFGNYЧувствительный к катепсину S сайт
832
VNAANXSLLGGGGVDGCIHRЧувствительный к катепсину S сайт
833
FCVGFLEGGKDSCQGDSGGPVVCЧувствительный к катепсину S сайт
834
LVDGQIFCLHGGLSPSIDTLDHIRЧувствительный к катепсину S сайт
835
MFXGGLSWDTSKKЧувствительный к катепсину S сайт
836
DPQELLEGGNQGEGDPQAEGRЧувствительный к катепсину S сайт
837
NMGGPYGGGNYGPGGSGGSGGYGGRЧувствительный к катепсину S сайт
838
RGGPGGPGGPGGPMGRЧувствительный к катепсину S сайт
839
SVLDDWFPLQGGQGQVHLRЧувствительный к катепсину S сайт
840
IIMEYLGGGSALDLLRЧувствительный к катепсину S сайт
841
SHFAMMHGGTGFAGIDSSSPEVKЧувствительный к катепсину S сайт
842
QGFQLTHSLGGGTGSGMGTLLIЧувствительный к катепсину S сайт
843
MADYLISGGTSYVPDDGLTЧувствительный к катепсину S сайт
844
VTVAGGVHISGLHЧувствительный к катепсину S сайт
845
VTVAGGVHISGLHTЧувствительный к катепсину S сайт
846
VTVAGGVHISGLHTEЧувствительный к катепсину S сайт
847
YAVSELAGHQTSAESWGTGRЧувствительный к катепсину S сайт
848
TFQGHTNEVNAIKЧувствительный к катепсину S сайт
849
GDGPVQGIINFEQKЧувствительный к катепсину S сайт
850
VTIIGPATVGGIKPGCFKЧувствительный к катепсину S сайт
851
FSLPGMEHVYGIPEHADNLRЧувствительный к катепсину S сайт
852
LPPSGAVPVTGIPPHVVKЧувствительный к катепсину S сайт
853
MDGIVPDIAVGTKЧувствительный к катепсину S сайт
854
RGIWHNDNKЧувствительный к катепсину S сайт
855
GKPEIEGKPESEGEPGSETRЧувствительный к катепсину S сайт
856
YDINAHACVTGKPISQGGIHGRЧувствительный к катепсину S сайт
857
ELTQQLAQATGKPPQYIAVHЧувствительный к катепсину S сайт
858
NPKPFLNGLTGKPVMVKЧувствительный к катепсину S сайт
859
CPSILGGLAPEKDQPKЧувствительный к катепсину S сайт
860
VASGIPAGWXGLDCGPESSKKЧувствительный к катепсину S сайт
861
QVLQGLDYLHSKЧувствительный к катепсину S сайт
862
GALEGLPRPPPPVKЧувствительный к катепсину S сайт
863
LFIGGLSFETTDESLRЧувствительный к катепсину S сайт
864
VFVGGLSPDTSEEQIKЧувствительный к катепсину S сайт
865
MFXGGLSWDTSKKЧувствительный к катепсину S сайт
866
NVIIWGNHSSTQYPDVNHAKЧувствительный к катепсину S сайт
867
LLSGLAEGLGGNIEQLVARЧувствительный к катепсину S сайт
868
LVINGNPITIFQERЧувствительный к катепсину S сайт
869
SAAMLGNSEDHTALSRЧувствительный к катепсину S сайт
870
IFQGNVHNFEKЧувствительный к катепсину S сайт
871
NNPPTLEGNYSKPLKЧувствительный к катепсину S сайт
872
MVGPAVIVDKKЧувствительный к катепсину S сайт
873
MMLGPEGGEGFVVKЧувствительный к катепсину S сайт
874
SIYEALGGPHDPNVAKЧувствительный к катепсину S сайт
875
TFQGPNCPATCGRЧувствительный к катепсину S сайт
876
IMGPNYTPGKKЧувствительный к катепсину S сайт
877
MVIITGPPEAQFKЧувствительный к катепсину S сайт
878
AFGLTDDQVSGPPSAPAEDRЧувствительный к катепсину S сайт
879
TVQGPPTSDDIFERЧувствительный к катепсину S сайт
880
FVIGGPQGDAGLTGRЧувствительный к катепсину S сайт
881
IITLXGPTNAIFKЧувствительный к катепсину S сайт
882
KPPTLIHGQAPSAGLPSQKPKЧувствительный к катепсину S сайт
883
RGQGGYPGKPRЧувствительный к катепсину S сайт
884
RPDNFXFGQSGAGNNWAKЧувствительный к катепсину S сайт
885
GLLALSSALSGQSHLAIKЧувствительный к катепсину S сайт
886
ALPPVLTTVNGQSPPEHSAPAKЧувствительный к катепсину S сайт
887
QSGYGGQTKPIFRЧувствительный к катепсину S сайт
888
LSGQTNIHLSKЧувствительный к катепсину S сайт
889
VVLMSHLGRPDGVPMPDKЧувствительный к катепсину S сайт
890
VVLMSHLGRPDGVPMPDKYЧувствительный к катепсину S сайт
891
QQSIAGSADSKPIDVSRЧувствительный к катепсину S сайт
892
VTLGPVPEIGGSEAPAPQNKЧувствительный к катепсину S сайт
893
NFGGSFAGSFGGAGGHAPGVARЧувствительный к катепсину S сайт
894
MMDYLQGSGETPQTDVRЧувствительный к катепсину S сайт
895
DSVWGSGGGQQSVNHLVKЧувствительный к катепсину S сайт
896
PQVAIICGSGLGGLTDKЧувствительный к катепсину S сайт
897
PTSSEQGGLEGSGSAAGEGKPALSEEERЧувствительный к катепсину S сайт
898
TVEQLLTGSPTSPTVEPEKPTRЧувствительный к катепсину S сайт
899
GCLEGSQGTQALHKЧувствительный к катепсину S сайт
900
LLAVSAPALQGSRPGETEENVRЧувствительный к катепсину S сайт
901
IXXGSSGAQGSGGGSTSAHYЧувствительный к катепсину S сайт
902
VAFTGSTEVGHLIQKЧувствительный к катепсину S сайт
903
VVVLMGSTSDLGHCEKЧувствительный к катепсину S сайт
904
MVELLGSYTEDNASQARЧувствительный к катепсину S сайт
905
IYWGTATTGKPHVAЧувствительный к катепсину S сайт
906
IVGFCWGGTAVHHLMЧувствительный к катепсину S сайт
907
GVVPLAGTDGETTTQGLDGLSERЧувствительный к катепсину S сайт
908
GXVXFXGTDHIDQWNKЧувствительный к катепсину S сайт
909
SVSGTDVQEECRЧувствительный к катепсину S сайт
910
MMLGTEGGEGFVVKЧувствительный к катепсину S сайт
911
IAFHQDGSLAGTGGLDAFGRЧувствительный к катепсину S сайт
912
LNFSHGTHEYHAETIKЧувствительный к катепсину S сайт
913
LVLGTHTSDEQNHLVЧувствительный к катепсину S сайт
914
ALHWLVLGTHTSDEQNHLVVARЧувствительный к катепсину S сайт
915
VLSGTIHAGQPVKЧувствительный к катепсину S сайт
916
IITITGTQDQIQNAQYЧувствительный к катепсину S сайт
917
GGTSDVEVNEKЧувствительный к катепсину S сайт
918
VLTGVAGEDAECHAAKЧувствительный к катепсину S сайт
919
TGGVDTAAVGGVFDVSNADRЧувствительный к катепсину S сайт
920
FIVDGWHEMDAENPLHЧувствительный к катепсину S сайт
921
TMFSSEVQFGHAGACANQASETAVAKЧувствительный к катепсину S сайт
922
PIYDVLQMVGHANRPLQDDEGRЧувствительный к катепсину S сайт
923
EWAHATIIPKЧувствительный к катепсину S сайт
924
KHEANNPQLKЧувствительный к катепсину S сайт
925
MVNHFIAEFKЧувствительный к катепсину S сайт
926
LVXHFVEEFKЧувствительный к катепсину S сайт
927
MPFPVNHGASSEDTLLKЧувствительный к катепсину S сайт
928
NXCWELYCLEHGIQPDGQMPSDKЧувствительный к катепсину S сайт
929
NXCWELYCLEHGIQPDGQMPSDKЧувствительный к катепсину S сайт
930
VHAGPFANIAHGNSSIIADRЧувствительный к катепсину S сайт
931
INQVFHGSCITEGNELTKЧувствительный к катепсину S сайт
932
FELQHGTEEQQEEVRЧувствительный к катепсину S сайт
933
EQQEAIEHIDEVQNEIDRЧувствительный к катепсину S сайт
934
AVEALAAALAHISGATSVDQRЧувствительный к катепсину S сайт
935
RHLAPTGNAPASRЧувствительный к катепсину S сайт
936
LLTDFCTHLPNLPDSTAKЧувствительный к катепсину S сайт
937
VDEFVTHNLSFDEINKЧувствительный к катепсину S сайт
938
ATLELTHNWGTEDDETQSYЧувствительный к катепсину S сайт
939
EEFTAFLHPEEYDYMKЧувствительный к катепсину S сайт
940
QXFHPEQLITGKЧувствительный к катепсину S сайт
941
PVTHNLPTVAHPSQAPSPNQPTKЧувствительный к катепсину S сайт
942
AXXXXXQHQAGQAPHLGЧувствительный к катепсину S сайт
943
CNFTDGALVQHQEWDGKЧувствительный к катепсину S сайт
944
GVLHQFSGTETNKЧувствительный к катепсину S сайт
945
QIGAVVSHQSSVIPDRЧувствительный к катепсину S сайт
946
IEPNEVTHSGDTGVETDGRЧувствительный к катепсину S сайт
947
HYAHTDCPGHADYVKЧувствительный к катепсину S сайт
948
TICSHVQNMIKЧувствительный к катепсину S сайт
949
LLGHWEEAAHDLAЧувствительный к катепсину S сайт
950
TYTIANQFPLNKЧувствительный к катепсину S сайт
951
NPTXFFDIAVDGEPLGRЧувствительный к катепсину S сайт
952
LVSIGAEEIVDGNAKЧувствительный к катепсину S сайт
953
TTDGVYEGVAIGGDRYPGSTFЧувствительный к катепсину S сайт
954
THINIVVIGHVDSGKЧувствительный к катепсину S сайт
955
DNDFCGTDMTIGTDSALHRЧувствительный к катепсину S сайт
956
VLXNMEIGTSLFDEEGAKЧувствительный к катепсину S сайт
957
VCTLAIIDPGDSDIIRЧувствительный к катепсину S сайт
958
GCITIIGGGDTATCCAKЧувствительный к катепсину S сайт
959
TFNQVEIKPEMIGHЧувствительный к катепсину S сайт
960
CQLEINFNTLQTKЧувствительный к катепсину S сайт
961
HLEINPDHPIVEЧувствительный к катепсину S сайт
962
HLEINPDHSIIETLRЧувствительный к катепсину S сайт
963
VPYLIAGIQHSCQDIGAKЧувствительный к катепсину S сайт
964
VLSIQSHVIRЧувствительный к катепсину S сайт
965
ELGITALHIKЧувствительный к катепсину S сайт
966
LVAIVDPHIKЧувствительный к катепсину S сайт
967
TLTIVDTGIGMTKЧувствительный к катепсину S сайт
968
LVAIVDVIDQNRЧувствительный к катепсину S сайт
969
QIILEKEETEELKRЧувствительный к катепсину S сайт
970
XKHPDADSLYЧувствительный к катепсину S сайт
971
CIGKPGGSLDNSEQKЧувствительный к катепсину S сайт
972
HHIYLEGTLLKPNMVTPGHACTQKЧувствительный к катепсину S сайт
973
LTQQLAQATGKPPQYIAVHЧувствительный к катепсину S сайт
974
SSPPELPDVMKPQDSGSSANEQAVQЧувствительный к катепсину S сайт
975
LQELEKYPGIQTRЧувствительный к катепсину S сайт
976
WIGLDLSNGKPRЧувствительный к катепсину S сайт
977
MPFLELDTNLPANRЧувствительный к катепсину S сайт
978
ETALLSSGFSLEDPQTHANRЧувствительный к катепсину S сайт
979
EAFSLFDKDGDGTITTKЧувствительный к катепсину S сайт
980
YELGRPAANTKЧувствительный к катепсину S сайт
981
GNPICSLHDQGAGGNGNVLKЧувствительный к катепсину S сайт
982
VILHLKEDQTEYLEERЧувствительный к катепсину S сайт
983
IQQLCEDIIQLKPDVVITEKЧувствительный к катепсину S сайт
984
IQQLCEDIIQLKPDVVITEKЧувствительный к катепсину S сайт
985
TLNNDIMLIKЧувствительный к катепсину S сайт
986
NQVALNPQNTVFDAKЧувствительный к катепсину S сайт
987
NQVALNPQNTVFDAKЧувствительный к катепсину S сайт
988
STATLAWGVNLPAHTVIIKЧувствительный к катепсину S сайт
989
EXLELPEDEEEKKЧувствительный к катепсину S сайт
990
GVNLPGAAVDLPAVSEKЧувствительный к катепсину S сайт
991
RLPPAAGDEPЧувствительный к катепсину S сайт
992
LDLPPYETFЧувствительный к катепсину S сайт
993
DGDSVMVLPTIPEEEAKKЧувствительный к катепсину S сайт
994
EIVHLQAGQCGNQIGAKЧувствительный к катепсину S сайт
995
DVSIEDSVISLSGDHCIIGRЧувствительный к катепсину S сайт
996
SSAPGPLELDLTGDLESFKKЧувствительный к катепсину S сайт
997
FLEMCNDLLARЧувствительный к катепсину S сайт
998
TTGFGMIYDSLDYAKЧувствительный к катепсину S сайт
999
XMNPTNTVFDAKЧувствительный к катепсину S сайт
1000
EDAMAMVDHCLKЧувствительный к катепсину S сайт
1001
ANXVXSGGXTMYPGIADRЧувствительный к катепсину S сайт
1002
ALQDLENAASGDAAVHQRЧувствительный к катепсину S сайт
1003
DPVTNLNNAFEVAEKЧувствительный к катепсину S сайт
1004
XNAGPNTNGSQFFЧувствительный к катепсину S сайт
1005
NYSVFYYEIQNAPEQACHЧувствительный к катепсину S сайт
1006
ELISNASDALDKIRЧувствительный к катепсину S сайт
1007
YYFNHITNASQWERPSGNSSSGGKЧувствительный к катепсину S сайт
1008
TNDWEDHLAVKЧувствительный к катепсину S сайт
1009
AFHNEAQVNPERKЧувствительный к катепсину S сайт
1010
NCLTNFHGMDLTRЧувствительный к катепсину S сайт
1011
TNVANFPGHSGPITЧувствительный к катепсину S сайт
1012
ILNNGHAFNVEFDDSQDKЧувствительный к катепсину S сайт
1013
IEQLQNHENEDIYKЧувствительный к катепсину S сайт
1014
PVFVHAGPFANIAHGNSSIIADRЧувствительный к катепсину S сайт
1015
VWYVSNIDGTHIAKЧувствительный к катепсину S сайт
1016
CDEVMQLLLENLGNENVHRЧувствительный к катепсину S сайт
1017
QDQRPLHPVANPHAEISTKЧувствительный к катепсину S сайт
1018
XNPLDAGAAEPIЧувствительный к катепсину S сайт
1019
LIPQLVANVTNPNSTEHMKЧувствительный к катепсину S сайт
1020
SAAMLGNSEDHTALSRЧувствительный к катепсину S сайт
1021
NYQQNYQNSESGEKNEGSESAPEGQAQQRЧувствительный к катепсину S сайт
1022
LGEMWNNTAADDKQPYEKЧувствительный к катепсину S сайт
1023
IMQNTDPHSQEYVEHLKЧувствительный к катепсину S сайт
1024
ILIANTGMDTDKIKЧувствительный к катепсину S сайт
1025
AWVWNTHADFADECPKPELLЧувствительный к катепсину S сайт
1026
DHASIQMNVAEVDKVTGRЧувствительный к катепсину S сайт
1027
ALANVNIGSLICЧувствительный к катепсину S сайт
1028
EHGXXTNWDDMEKЧувствительный к катепсину S сайт
1029
SAAQAAAQTNSNAAGKЧувствительный к катепсину S сайт
1030
EETFEAAMLGQAEEVVQERЧувствительный к катепсину S сайт
1031
PPYDEQTQAFIDAAQEARЧувствительный к катепсину S сайт
1032
LEQGQAIDDLMPAQKЧувствительный к катепсину S сайт
1033
SLHQAIEGDTSGDFLKЧувствительный к катепсину S сайт
1034
QLQQAQAAGAEQEVEKЧувствительный к катепсину S сайт
1035
YLEVVLNTLQQASQAQVDKЧувствительный к катепсину S сайт
1036
YLEVVLNTLQQASQAQVDKЧувствительный к катепсину S сайт
1037
FLSELTQQLAQATGKPPQYIЧувствительный к катепсину S сайт
1038
FLSELTQQLAQATGKPPQYIAЧувствительный к катепсину S сайт
1039
FLSELTQQLAQATGKPPQYIAVHЧувствительный к катепсину S сайт
1040
MTSMGQATWSDPHKЧувствительный к катепсину S сайт
1041
EELGLIEQAYDNPHEALSRЧувствительный к катепсину S сайт
1042
SLGTIQQCCDAIDHLCRЧувствительный к катепсину S сайт
1043
AAAAAAQQQQQCGGGGATKPAVSGKЧувствительный к катепсину S сайт
1044
NSCNQCNEPRPEDSRЧувствительный к катепсину S сайт
1045
VLIAFAQYLQQCPFEDHVKЧувствительный к катепсину S сайт
1046
DSLLQDGEFSMDLRЧувствительный к катепсину S сайт
1047
YFLGSIVNFSQDPDVHFKЧувствительный к катепсину S сайт
1048
VFSWLQQEGHLSEEEMARЧувствительный к катепсину S сайт
1049
VMSQEIQEQLHKЧувствительный к катепсину S сайт
1050
KQEPVKPEEGRЧувствительный к катепсину S сайт
1051
LWYCDLQQESSGIAGILKЧувствительный к катепсину S сайт
1052
KQEYDESGPSIVHRЧувствительный к катепсину S сайт
1053
ETEAICFFVQQFTDMEHNRЧувствительный к катепсину S сайт
1054
VTEQGAELSNEERЧувствительный к катепсину S сайт
1055
AYMGNVLQGGEGQAPTRЧувствительный к катепсину S сайт
1056
AVTEQGHELSNEERЧувствительный к катепсину S сайт
1057
VAHTFVVDVAQGTQVTGRЧувствительный к катепсину S сайт
1058
VGQGYPHDPPKЧувствительный к катепсину S сайт
1059
IYAVEASTMAQHAEVLVKЧувствительный к катепсину S сайт
1060
TLAIYFEVVNQHNAPIPQGGRЧувствительный к катепсину S сайт
1061
ELAQIAGRPTEDEDEKEKЧувствительный к катепсину S сайт
1062
MDEMATTQISKDELDELKЧувствительный к катепсину S сайт
1063
YPHLGQKPGGSDFLRЧувствительный к катепсину S сайт
1064
TMLELLNQLDGFQPNTQVKЧувствительный к катепсину S сайт
1065
ILLELLNQMDGFDQNVNVKЧувствительный к катепсину S сайт
1066
LLNQMDGFDTLHRЧувствительный к катепсину S сайт
1067
FQESAEAILGQNAAYLGELKЧувствительный к катепсину S сайт
1068
HPCFIIAEIGQNHQGDLDVAKЧувствительный к катепсину S сайт
1069
LLQDHPWLLSQNLVVKPDQLIKЧувствительный к катепсину S сайт
1070
ALPAVQQNNLDEDLIRKЧувствительный к катепсину S сайт
1071
ALGQNPTNAEVLKЧувствительный к катепсину S сайт
1072
NYQQNYQNSESGEKЧувствительный к катепсину S сайт
1073
NYQQNYQNSESGEKNEGSESAPEGQAQQRЧувствительный к катепсину S сайт
1074
CGAPSATQPATAETQHIADQVRЧувствительный к катепсину S сайт
1075
QAAAAAAQQQQQCGGGGATKPAVSGKЧувствительный к катепсину S сайт
1076
IDVTDFLSMTQQDSHAPLRЧувствительный к катепсину S сайт
1077
IGSCTQQDVELHVQKЧувствительный к катепсину S сайт
1078
LFPLNQQDVPDKFKЧувствительный к катепсину S сайт
1079
IGQQPQQPGAPPQQDYTKЧувствительный к катепсину S сайт
1080
HQAAAAAAQQQQQCGGGGATKPAVSGKЧувствительный к катепсину S сайт
1081
MFTQQQPQELARЧувствительный к катепсину S сайт
1082
LQQQQRPEDAEDGAEGGGKЧувствительный к катепсину S сайт
1083
LQQQQRPEDAEDGAEGGGKRЧувствительный к катепсину S сайт
1084
SSEADMECLNQRPPENPDTDKЧувствительный к катепсину S сайт
1085
SSEADMECLNQRPPENPDTDKNVQЧувствительный к катепсину S сайт
1086
NVNPESQLIQQSEQSESETAGSTKЧувствительный к катепсину S сайт
1087
PDNFXFGQSGAGNNWAKЧувствительный к катепсину S сайт
1088
SQTCEFNMIEQSGPPHEPRЧувствительный к катепсину S сайт
1089
SAVLPPEDMSQSGPSGSHPQGPRЧувствительный к катепсину S сайт
1090
IEFLQSHENQEIYQKЧувствительный к катепсину S сайт
1091
NTVSQSISGDPEIDKKЧувствительный к катепсину S сайт
1092
LLIHQSLAGGIIGVKЧувствительный к катепсину S сайт
1093
MVXYLANLTQSQIALNEKЧувствительный к катепсину S сайт
1094
PPKPEPFQFGQSSQKPPVAGGKЧувствительный к катепсину S сайт
1095
NGNYCVLQMDQSYKPDENEVRЧувствительный к катепсину S сайт
1096
ILVGDVGQTVDDPYATFVKЧувствительный к катепсину S сайт
1097
ADDVDLEQVANETHGHVGЧувствительный к катепсину S сайт
1098
ADDVDLEQVANETHGHVGAЧувствительный к катепсину S сайт
1099
SINFLHQVCHDQTPTTKЧувствительный к катепсину S сайт
1100
CTTVAFTQVNSEDKGALAKЧувствительный к катепсину S сайт
1101
QQLQQVPGLLHRЧувствительный к катепсину S сайт
1102
SQQYPAARPAEPЧувствительный к катепсину S сайт
1103
DFCIQVGRNIIHGSDSVKЧувствительный к катепсину S сайт
1104
VLMSHLGRPDGVPMPDKYЧувствительный к катепсину S сайт
1105
VLMSHLGRPDGVPMPDKYSЧувствительный к катепсину S сайт
1106
AQVARPGGDTIFGKЧувствительный к катепсину S сайт
1107
FMSVQRPGPYDRPGTARЧувствительный к катепсину S сайт
1108
VLVERSAAETVTKЧувствительный к катепсину S сайт
1109
FLPSARSSPASSPEЧувствительный к катепсину S сайт
1110
RPELGSEGLGSAAHGSQPDLRЧувствительный к катепсину S сайт
1111
MPDQGMTSADDFFQGTKЧувствительный к катепсину S сайт
1112
DVPAPSTSADKVESLDVDSEAKЧувствительный к катепсину S сайт
1113
QVCLPVISAENWKPATKЧувствительный к катепсину S сайт
1114
GFGSGDDPYSSAEPHVSGVKЧувствительный к катепсину S сайт
1115
EFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRЧувствительный к катепсину S сайт
1116
TYFSCTSAHTSTGDGTAMITRЧувствительный к катепсину S сайт
1117
TYSLGSALRPSTSRЧувствительный к катепсину S сайт
1118
VSDQELQSANASVDDSRЧувствительный к катепсину S сайт
1119
APGSAAPAAGSAPAAAEEKЧувствительный к катепсину S сайт
1120
APGSAAPAAGSAPAAAEEKЧувствительный к катепсину S сайт
1121
APGSAAPAAGSAPAAAEEKЧувствительный к катепсину S сайт
1122
APGSAAPAAGSAPAAAEEKKЧувствительный к катепсину S сайт
1123
NEGSESAPEGQAQQRЧувствительный к катепсину S сайт
1124
QVEPLDPPAGSAPGEHVFVKЧувствительный к катепсину S сайт
1125
PTGEAGPSCSSASDKLPRЧувствительный к катепсину S сайт
1126
YYTSASGDEMVSLKЧувствительный к катепсину S сайт
1127
NQQGAHSALSSASTSSHNLQЧувствительный к катепсину S сайт
1128
EALLSSAVDHGSDEVKЧувствительный к катепсину S сайт
1129
DYMVEIDILASCDHPNIVKЧувствительный к катепсину S сайт
1130
MESCGIHETTFЧувствительный к катепсину S сайт
1131
QLSSCLPNIVPKЧувствительный к катепсину S сайт
1132
LIXSDGHEFIVKЧувствительный к катепсину S сайт
1133
EIVDGGVILESDPQQVVHRЧувствительный к катепсину S сайт
1134
SLEDALSSDTSGHFRЧувствительный к катепсину S сайт
1135
VGVEAHVDIHSDVPKGANSFЧувствительный к катепсину S сайт
1136
VILGSEAAQQHPEEVRЧувствительный к катепсину S сайт
1137
XSEDKGALAKЧувствительный к катепсину S сайт
1138
GGTSXXSSEGTQHSYSEEEKЧувствительный к катепсину S сайт
1139
CALGGTSELSSEGTQHSYSEEEKYЧувствительный к катепсину S сайт
1140
MDPNIVGSEHYDVARЧувствительный к катепсину S сайт
1141
SPAPSSVPLGSEKPSNVSQDRЧувствительный к катепсину S сайт
1142
MTQAGVEELESENKIPATQKЧувствительный к катепсину S сайт
1143
MLLDSEQHPCQLKЧувствительный к катепсину S сайт
1144
GLGNVLGGLISGAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTAMRЧувствительный к катепсину S сайт
1145
IMDDLTEVLCSGAGGVHSGGSGDGAGSGGPGAQNHVKЧувствительный к катепсину S сайт
1146
ATQGAAAAAGSGAGTGGGTASGGTEGGSAESEGAKЧувствительный к катепсину S сайт
1147
LEPAPLDSLCSGASAEEPTSHRЧувствительный к катепсину S сайт
1148
VIGSGCNLDSARЧувствительный к катепсину S сайт
1149
WXLNSGDGAFYGPKЧувствительный к катепсину S сайт
1150
FFDMAYQGFASGDGDKDAWAVRЧувствительный к катепсину S сайт
1151
VSIEDSVISLSGDHCIIGRЧувствительный к катепсину S сайт
1152
EYLLSGDISEAEHCLKЧувствительный к катепсину S сайт
1153
DDGLFSGDPNWFPKЧувствительный к катепсину S сайт
1154
WQHDLFDSGFGGGAGVETGGKЧувствительный к катепсину S сайт
1155
DSVWGSGGGQQSVNHLVKЧувствительный к катепсину S сайт
1156
PEGPNEAEVTSGKPEQEVPDAEEEKЧувствительный к катепсину S сайт
1157
VQSGNINAAKЧувствительный к катепсину S сайт
1158
YQYGGLNSGRPVTPPRЧувствительный к катепсину S сайт
1159
VLQATVVAVGSGSKGKGGEIQPVSVKЧувствительный к катепсину S сайт
1160
GILFVGSGVSGGEEGARЧувствительный к катепсину S сайт
1161
IEFLQSHENQEIYQKЧувствительный к катепсину S сайт
1162
LDEVITSHGAIEPDKDNVRЧувствительный к катепсину S сайт
1163
EHPVIESHPDNALEDLRЧувствительный к катепсину S сайт
1164
LIQSHPESAEDLQEKЧувствительный к катепсину S сайт
1165
TIVITSHPGQIVKЧувствительный к катепсину S сайт
1166
IEWLESHQDADIEDFKЧувствительный к катепсину S сайт
1167
GYPHLCSICDLPVHSNKЧувствительный к катепсину S сайт
1168
SEPCALCSLHSIGKIGGAQNRЧувствительный к катепсину S сайт
1169
LQSIGTENTEENRЧувствительный к катепсину S сайт
1170
LFIHESIHDEVVNRЧувствительный к катепсину S сайт
1171
VTFNINNSIPPTFDGEEEPSQGQKЧувствительный к катепсину S сайт
1172
NLNTLCWAIGSISGAMHEEDEKRЧувствительный к катепсину S сайт
1173
EASATNSPCTSKPATPAPSEKЧувствительный к катепсину S сайт
1174
PPNPNCYVCASKPEVTVRЧувствительный к катепсину S сайт
1175
ICSKPVVLPKЧувствительный к катепсину S сайт
1176
QFHFHWGSLDGQGSEHTVDKЧувствительный к катепсину S сайт
1177
QFHFHWGSLDGQGSEHTVDKKЧувствительный к катепсину S сайт
1178
GNPICSLHDQGAGGNGNVLKЧувствительный к катепсину S сайт
1179
EANFTVSSMHGDMPQKЧувствительный к катепсину S сайт
1180
NQLTSNPENTVFDAKЧувствительный к катепсину S сайт
1181
QVLVGSYCVFSNQGGLVHPKЧувствительный к катепсину S сайт
1182
DLQSNVEHLTEKЧувствительный к катепсину S сайт
1183
EEMQSNVEVVHTYRЧувствительный к катепсину S сайт
1184
APVQPQQSPAAAPGGTDEKPSGKЧувствительный к катепсину S сайт
1185
APVQPQQSPAAAPGGTDEKPSGKЧувствительный к катепсину S сайт
1186
NDGPVTIELESPAPGTATSDPKЧувствительный к катепсину S сайт
1187
INSLFLTDLYSPEYPGPSHRЧувствительный к катепсину S сайт
1188
NGSLDSPGKQDTEEDEEEDEKDKЧувствительный к катепсину S сайт
1189
SAAAASAASGSPGPGEGSAGGEKRЧувствительный к катепсину S сайт
1190
SAAAASAASGSPGPGEGSAGGEKRЧувствительный к катепсину S сайт
1191
NADTDLVSWLSPHDPNSVVTKЧувствительный к катепсину S сайт
1192
LSPPYSSPQEFAQDVGRЧувствительный к катепсину S сайт
1193
IIAFVGSPVEDNEKDLVKЧувствительный к катепсину S сайт
1194
MESQEPTESSQNGKЧувствительный к катепсину S сайт
1195
AXASQLDCNFLKЧувствительный к катепсину S сайт
1196
SQGDSISSQLGPIHPPPRЧувствительный к катепсину S сайт
1197
LGGLLKPTVASQNQNLPVAKЧувствительный к катепсину S сайт
1198
SSWGMMGMLASQQNQSGPSGNNQNQGNMQRЧувствительный к катепсину S сайт
1199
DEYLINSQTTEHIVKЧувствительный к катепсину S сайт
1200
YQLGLAYGYNSQYDEAVAQFSKЧувствительный к катепсину S сайт
1201
GLLLLSVVVTSRPEAFQPHЧувствительный к катепсину S сайт
1202
RPASVSSSAAVEHEQRЧувствительный к катепсину S сайт
1203
FGIVTSSAGTGTTEDTEAKЧувствительный к катепсину S сайт
1204
FGIVTSSAGTGTTEDTEAKKЧувствительный к катепсину S сайт
1205
STASAPAAVNSSASADKPLSNMKЧувствительный к катепсину S сайт
1206
EALLSSAVDHGSDEVKЧувствительный к катепсину S сайт
1207
VSWLEYESSFSNEEAQKЧувствительный к катепсину S сайт
1208
IXXGSSGAQGSGGGSTSAHYЧувствительный к катепсину S сайт
1209
HIGGPPGFASSSGKPGPTVIKЧувствительный к катепсину S сайт
1210
FEMYEPSELESSHLTDQDNEIRЧувствительный к катепсину S сайт
1211
SPDDDLGSSNWEAADLGNEERЧувствительный к катепсину S сайт
1212
GDSQVSSNPTSSPPGEAPAPVSVDSEPSЧувствительный к катепсину S сайт
1213
FVNGQPRPLESSQVKYLRЧувствительный к катепсину S сайт
1214
KPLTSSSAAPQRPISTQRЧувствительный к катепсину S сайт
1215
IHIGGPPGFASSSGKPGPTVIKЧувствительный к катепсину S сайт
1216
ELVSSSSSGSDSDSEVDKKЧувствительный к катепсину S сайт
1217
LLDSSTVTHLFKЧувствительный к катепсину S сайт
1218
PPPAAPPPSSSSVPEAGGPPIKKЧувствительный к катепсину S сайт
1219
YVELFLNSTAGASGGAYEHRЧувствительный к катепсину S сайт
1220
SHELSDFGLESTAGEIPVVAIRЧувствительный к катепсину S сайт
1221
ECEEEAINIQSTAPEEEHESPRЧувствительный к катепсину S сайт
1222
EGTGSTATSSSSTAGAAGKЧувствительный к катепсину S сайт
1223
PLHSIISSTESVQGSTSKЧувствительный к катепсину S сайт
1224
VAFTGSTEVGHLIQKЧувствительный к катепсину S сайт
1225
LALVTGGEIASTFDHPELVKЧувствительный к катепсину S сайт
1226
ATIELCSTHANDASALRЧувствительный к катепсину S сайт
1227
VHITLSTHECAGLSERЧувствительный к катепсину S сайт
1228
EEEEPQAPQESTPAPPKKЧувствительный к катепсину S сайт
1229
SITILSTPEGTSAACKЧувствительный к катепсину S сайт
1230
ETLASSDSFASTQPTHSWKЧувствительный к катепсину S сайт
1231
VVVLMGSTSDLGHCEKЧувствительный к катепсину S сайт
1232
VLLSNLSSTSHVPEVDPGSAELQKЧувствительный к катепсину S сайт
1233
LFDSTTLEHQKЧувствительный к катепсину S сайт
1234
TQLEGLQSTVTGHVERЧувствительный к катепсину S сайт
1235
GSESGGSAVDSVAGEHSVSGRЧувствительный к катепсину S сайт
1236
YEILQSVDDAAIVIKЧувствительный к катепсину S сайт
1237
NDLSICGTLHSVDQYLNIKЧувствительный к катепсину S сайт
1238
ILDSVGIEADDDRЧувствительный к катепсину S сайт
1239
ILDSVGIEADDDRLNKЧувствительный к катепсину S сайт
1240
IYVASVHQDLSDDDIKЧувствительный к катепсину S сайт
1241
ELQSVKPQEAPKЧувствительный к катепсину S сайт
1242
HYTEGAELVDSVLDVVRKЧувствительный к катепсину S сайт
1243
LAEGSVTSVGSVNPAENFRЧувствительный к катепсину S сайт
1244
GSPTSLGTWGSWIGPDHDKЧувствительный к катепсину S сайт
1245
VLNSYWVGEDSTYKЧувствительный к катепсину S сайт
1246
SLGTADVHFERЧувствительный к катепсину S сайт
1247
MAGTAFDFENMKЧувствительный к катепсину S сайт
1248
VLATAFDTTLGGRЧувствительный к катепсину S сайт
1249
VELFLNSTAGASGGAYEHRЧувствительный к катепсину S сайт
1250
APPPSGSAVSTAPQQKPIGKЧувствительный к катепсину S сайт
1251
SQIFSTASDNQPTVTIKЧувствительный к катепсину S сайт
1252
IYWGTATTGKPHVAЧувствительный к катепсину S сайт
1253
MMLGTEGGEGFVVKЧувствительный к катепсину S сайт
1254
FGAVWTGDNTAEWDHLKЧувствительный к катепсину S сайт
1255
VSHVSTGGGASLELLЧувствительный к катепсину S сайт
1256
VSHVSTGGGASLELLEЧувствительный к катепсину S сайт
1257
VSHVSTGGGASLELLEGKЧувствительный к катепсину S сайт
1258
ILISLATGHREEGGENLDQARЧувствительный к катепсину S сайт
1259
TLDQCIQTGVDNPGHPFIKЧувствительный к катепсину S сайт
1260
SGFTLDDVIQTGVDNPGHPYЧувствительный к катепсину S сайт
1261
DLTTGYDDSQPDKKЧувствительный к катепсину S сайт
1262
FFFGTHETAFLGPKЧувствительный к катепсину S сайт
1263
FPSLLTHNENMVAKЧувствительный к катепсину S сайт
1264
YEDICPSTHNMDVPNIKЧувствительный к катепсину S сайт
1265
DYALHWLVLGTHTSDEQNHLVVARЧувствительный к катепсину S сайт
1266
FGTINIVHPKЧувствительный к катепсину S сайт
1267
SMVNTKPEKTEEDSEEVRЧувствительный к катепсину S сайт
1268
VTLLTPAGATGSGGGTSGDSSKGEDKQDRЧувствительный к катепсину S сайт
1269
PGETLTEILETPATSEQEAEHQRЧувствительный к катепсину S сайт
1270
NSVQTPVENSTNSQHQVKЧувствительный к катепсину S сайт
1271
AXXITPVPGGVGPMTVЧувствительный к катепсину S сайт
1272
STVLTPMFVETQASQGTLQTRЧувствительный к катепсину S сайт
1273
TFTTQETITNAETAKЧувствительный к катепсину S сайт
1274
SPVSTRPLPSASQKЧувствительный к катепсину S сайт
1275
TNEQWQMSLGTSEDHQHFTЧувствительный к катепсину S сайт
1276
QEIIXQLDVTTSEYEKEKЧувствительный к катепсину S сайт
1277
LLAFLLAELGTSGSIDGNNQLVIKЧувствительный к катепсину S сайт
1278
LXNMEIGTSLFDEEGAKЧувствительный к катепсину S сайт
1279
AEKPAETPVATSPTATDSTSGDSSRЧувствительный к катепсину S сайт
1280
LLETTDRPDGHQNNLRЧувствительный к катепсину S сайт
1281
AQTITSEXXSTTTTTHITKЧувствительный к катепсину S сайт
1282
ADAVGMSTVPEVIVARЧувствительный к катепсину S сайт
1283
IHFPLATYAPVISAEKЧувствительный к катепсину S сайт
1284
DTXVXXDTYNCDLHFKЧувствительный к катепсину S сайт
1285
VVIGMDVAASEFFRЧувствительный к катепсину S сайт
1286
GXXXXXIGLXVADLAESIMKЧувствительный к катепсину S сайт
1287
ANPQVGVAFPHIKЧувствительный к катепсину S сайт
1288
PQEAKPQEAAVAPEKPPASDETKЧувствительный к катепсину S сайт
1289
HFSVEGQLEFRЧувствительный к катепсину S сайт
1290
VATLGVEVHPLVFHЧувствительный к катепсину S сайт
1291
HWPFQVINDGDKPKЧувствительный к катепсину S сайт
1292
LPVPAFNVINGGSHAGNKЧувствительный к катепсину S сайт
1293
EVANGIESLGVKPDLPPPPSKЧувствительный к катепсину S сайт
1294
TYYDVLGVKPNATQEELKKЧувствительный к катепсину S сайт
1295
ETVAVKPTENNEEEFTSKЧувствительный к катепсину S сайт
1296
SLLVNPEGPTLMRЧувствительный к катепсину S сайт
1297
NWMNSLGVNPHVNHLYЧувствительный к катепсину S сайт
1298
HGLLVPNNTTDQELQHIRЧувствительный к катепсину S сайт
1299
QELEFLEVQEEYIKDEQKЧувствительный к катепсину S сайт
1300
LEGTLLKPNMVTPGHACTQKЧувствительный к катепсину S сайт
1301
FVNVVPTFGKKЧувствительный к катепсину S сайт
1302
EDLVFIFWAPESAPLKЧувствительный к катепсину S сайт
1303
AIYIDASCLTWEGQQFQGKЧувствительный к катепсину S сайт
1304
EQPQHPLHVTYAGAAVDELGKЧувствительный к катепсину S сайт
1305
SPDGHLFQVEYAQEAVKKЧувствительный к катепсину S сайт
1306
NYKPPAQKЧувствительный к катепсину S сайт
1307
VYNYNHLMPTRЧувствительный к катепсину S сайт
1308
LAEAELEYNPEHVSRЧувствительный к катепсину S сайт
1309
MPYQYPALTPEQKЧувствительный к катепсину S сайт
1310
TSSANNPNLMYQDECDRRЧувствительный к катепсину S сайт
1311
VGINYQPPTVVPGGDLAKЧувствительный к катепсину S сайт
1312
YMACCXLYRGDVVPKЧувствительный к катепсину S сайт
1313
SYCYVSKEELKЧувствительный к катепсину S сайт
1314
Aagcttagcggccgcaccatgcgggtcacggcgccccgaacc(смысловой праймер sec)
1315
Ctgcagggagccggcccaggtctcggtcag(антисмысловой праймер sec)
1316
Ggatccatcgtgggcattgttgctggcctggct(смысловой праймер MITD)
1317
Gaattcagtctcgagtcaagctgtgagagacacatcagagcc(антисмысловой праймер MITD)
1318
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG(убиквитин)
1319
5'<sup>7Me</sup>G<sub>ppp</sub>G<sub>2</sub>'<sub>OMe</sub>GGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGCCCCACAGUAGCCUCCACCCCAGCAUCCCCUGCCCCAGAGGCCACGGCGCACAGAAGGCCGCCCUGGUGCUGCUGAGCGCCUGUCUGGUGACCCUGUGGGGUCUGGGCGAGCCCCCCGAGCACACCCUGCGGUACCUCGUGCUGCAUCUGGCCAGCCUGCAGCUGGGCCUGCUGCUGAACGGCGUGUGCAGCCUGGCCGAAGAGCUGAGACACAUCCACAGCAGAUACAGAGGCUCCUACUGGAGAACCGUCAGAGCCUGCCUCGGCUGUCCCCUGAGAAGAGGCGCCCUGCUGCUCCUGAGCAUCUACUUCUACUACAGCCUGCCCAACGCCGUGGGCCCCCCCUUCACCUGGAUGCUGGCCCUGCUGGGCCUGAGCCAGGCCCUGAACAUCCUGCUGGGCCUGAAGGGCUUGGCCCCCGCCGAGAUCUCCGCCGUGUGCGAGAAGGGCAACUUCAACAUGGCCCAUGGCCUUGCCUGGUCCUACUACAUCGGCUACCUGAGACUGAUCCUGCCCGAGCUGCAGGCCAGAAUCAGAACCUACAACCAGCACUACAACAACCUGCUGAGAGGCGCCGUGAGCCAAAGACUGUACAUCCUGCUGCCCCUGGACUGCGGCGUGCCCGACAACCUUAGCAUGGCCGACCCCAACAUCAGAUUCCUGGACAAGCUGCCCCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCAUCAAGGACAGAGUGUACAGCAACAGCAUCUACGAGCUGCUGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCUGCGUGCUGGAGUACGCCACCCCCCUGCAGACCCUGUUCGCCAUGAGCCAGUACAGCCAGGCCGGCUUCAGCAGAGAGGACAGACUGGAGCAAGCCAAGCUGUUCUGCAGAACCCUGGAGGACAUCCUGGCGGACGCCCCCGAGAGCCAAAACAACUGCAGACUGAUCGCCUACCAGGAGCCCGCCGACGACAGCAGCUUCAGCCUGAGCCAGGAAGUGCUGAGACACCUGAGACAGGAAGAGAAGGAGGAGGUGACCGUGGGAAGCCUGAAGACCAGCGCCGUGCCCAGCACCAGCACCAUGAGCCAGGAGCCCGAGCUGCUGAUCAGCGGCAUGGAGAAGCCCCUGCCCCUGAGAACCGACUUCAGCUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCCAAACACCAUUGUCACACUCCAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCUAG<sub>OH</sub>3'где: A,C G и U=АМФ, ЦМФ, ГМФ и N1-(УМФ, соответственно; Me=метил; p=неорганический фосфат; подчеркивание=сайт связывания miR-122(Последовательность мРНК STING; CX-012871)
1320
AUGCCCCACAGUAGCCUCCACCCCAGCAUCCCCUGCCCCAGAGGCCACGGCGCACAGAAGGCCGCCCUGGUGCUGCUGAGCGCCUGUCUGGUGACCCUGUGGGGUCUGGGCGAGCCCCCCGAGCACACCCUGCGGUACCUCGUGCUGCAUCUGGCCAGCCUGCAGCUGGGCCUGCUGCUGAACGGCGUGUGCAGCCUGGCCGAAGAGCUGAGACACAUCCACAGCAGAUACAGAGGCUCCUACUGGAGAACCGUCAGAGCCUGCCUCGGCUGUCCCCUGAGAAGAGGCGCCCUGCUGCUCCUGAGCAUCUACUUCUACUACAGCCUGCCCAACGCCGUGGGCCCCCCCUUCACCUGGAUGCUGGCCCUGCUGGGCCUGAGCCAGGCCCUGAACAUCCUGCUGGGCCUGAAGGGCUUGGCCCCCGCCGAGAUCUCCGCCGUGUGCGAGAAGGGCAACUUCAACAUGGCCCAUGGCCUUGCCUGGUCCUACUACAUCGGCUACCUGAGACUGAUCCUGCCCGAGCUGCAGGCCAGAAUCAGAACCUACAACCAGCACUACAACAACCUGCUGAGAGGCGCCGUGAGCCAAAGACUGUACAUCCUGCUGCCCCUGGACUGCGGCGUGCCCGACAACCUUAGCAUGGCCGACCCCAACAUCAGAUUCCUGGACAAGCUGCCCCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCAUCAAGGACAGAGUGUACAGCAACAGCAUCUACGAGCUGCUGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCUGCGUGCUGGAGUACGCCACCCCCCUGCAGACCCUGUUCGCCAUGAGCCAGUACAGCCAGGCCGGCUUCAGCAGAGAGGACAGACUGGAGCAAGCCAAGCUGUUCUGCAGAACCCUGGAGGACAUCCUGGCGGACGCCCCCGAGAGCCAAAACAACUGCAGACUGAUCGCCUACCAGGAGCCCGCCGACGACAGCAGCUUCAGCCUGAGCCAGGAAGUGCUGAGACACCUGAGACAGGAAGAGAAGGAGGAGGUGACCGUGGGAAGCCUGAAGACCAGCGCCGUGCCCAGCACCAGCACCAUGAGCCAGGAGCCCGAGCUGCUGAUCAGCGGCAUGGAGAAGCCCCUGCCCCUGAGAACCGACUUCAGC (huSTING(V155M); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
1321
5'<sup>7Me</sup>G<sub>ppp</sub>G<sub>2</sub>'<sub>OMe</sub>GGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGACCGAGUACAAGCUCGUGGUCGUCGGCGCCGACGGGGUAGGCAAGUCCGCUCUGACCAUUCAGCUCAUCCAGAUGACGGAGUACAAACUCGUGGUAGUGGGAGCCGUGGGUGUGGGCAAGAGCGCGCUCACCAUCCAACUCAUCCAAAUGACCGAAUAUAAACUCGUCGUGGUGGGAGCCGGCGACGUGGGAAAGAGCGCCCUUACCAUCCAGUUAAUCCAGAUGACAGAAUACAAGCUGGUGGUGGUCGGUGCCUGCGGCGUGGGUAAGUCCGCCCUGACAAUCCAGCUGAUCCAGUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCUAG<sub>OH</sub>3'где: A,C G и U=АМФ, ЦМФ, ГМФ и N1-(УМФ, соответственно; Me=метил; p=неорганический фосфат(последовательность мРНК конкатемера KRAS; CX-012908)
1322
AUGACCGAGUACAAGCUCGUGGUCGUCGGCGCCGACGGGGUAGGCAAGUCCGCUCUGACCAUUCAGCUCAUCCAGAUGACGGAGUACAAACUCGUGGUAGUGGGAGCCGUGGGUGUGGGCAAGAGCGCGCUCACCAUCCAACUCAUCCAAAUGACCGAAUAUAAACUCGUCGUGGUGGGAGCCGGCGACGUGGGAAAGAGCGCCCUUACCAUCCAGUUAAUCCAGAUGACAGAAUACAAGCUGGUGGUGGUCGGUGCCUGCGGCGUGGGUAAGUCCGCCCUGACAAUCCAGCUGAUCCAG(нуклеотидная последовательность KRAS(G12D G12V G13D G12C) 100mer “4MUT”)
1323
GGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC(5'-НТО)
1324
CCUUAGCAGAGCUGUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGUGUCUAAACUAUCAAACGCCAUUAUCACACUAAAUAGCUACUGCUAGGC(miR-122)
1325
UAUUUAGUGUGAUAAUGGCGUU(сайт связывания miR-122-3p)
1326
CAAACACCAUUGUCACACUCCA(сайт связывания miR-122-5p)
1327
MENLKHIITLGQVIHKRCEEMKYCKKQCRRLGHRVLGLIKPLEMLQDQGKRSVPSEKLTTAMNRFKAALEEANGEIEKFSNRSNICRFLTASQDKILFKDVNRKLSDVWKELSLLLQVEQRMPVSPISQGASWAQEDQQDADEDRRAFQMLRRDNEKIEASLRRLEINMKEIKETLRQY (аминокислотная последовательность ОРС MLKL(1-180) человека; без эпитопной метки)
1328
MDKLGQIIKLGQLIYEQCEKMKYCRKQCQRLGNRVHGLLQPLQRLQAQGKKNLPDDITAALGRFDEVLKEANQQIEKFSKKSHIWKFVSVGNDKILFHEVNEKLRDVWEELLLLLQVYHWNTVSDVSQPASWQQEDRQDAEEDGNENMKVILMQLQISVEEINKTLKQCSLKPTQEIPQD(аминокислотная последовательность ОРС MLKL(1-180) мыши; без эпитопной метки)
1329
MSSVKLWPTGASAVPLVSREELKKLEFVGKGGFGVVFRAHHRTWNHDVAVKIVNSKKISWEVKAMVNLRNENVLLLLGVTEDLQWDFVSGQALVTRFMENGSLAGLLQPECPRPWPLLCRLLQEVVLGMCYLHSLNPPLLHRDLKPSNILLDPELHAKLADFGLSTFQGGSQSGSGSGSGSRDSGGTLAYLDPELLFDVNLKASKASDVYSFGILVWAVLAGREAELVDKTSLIRETVCDRQSRPPLTELPPGSPETPGLEKLKELMIHCWGSQSENRPSFQDCEPKTNEVYNLVKDKVDAAVSEVKHYLSQHRSSGRNLSAREPSQRGTEMDCPRETMVSKMLDRLHLEEPSGPVPGKCPERQAQDTSVGPATPARTSSDPVAGTPQIPHTLPFRGTTPGPVFTETPGPHPQRNQGDGRHGTPWYPWTPPNPMTGPPALVFNNgvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkVdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellklegvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkVdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkle(muRIPK3ΔC-2xFV; TH1001 без эпитопной метки)
1330
MSSVKLWPTGASAVPLVSREELKKLEFVGKGGFGVVFRAHHRTWNHDVAVKIVNSKKISWEVKAMVNLRNENVLLLLGVTEDLQWDFVSGQALVTRFMENGSLAGLLQPECPRPWPLLCRLLQEVVLGMCYLHSLNPPLLHRDLKPSNILLDPELHAKLADFGLSTFQGGSQSGSGSGSGSRDSGGTLAYLDPELLFDVNLKASKASDVYSFGILVWAVLAGREAELVDKTSLIRETVCDRQSRPPLTELPPGSPETPGLEKLKELMIHCWGSQSENRPSFQDCEPKTNEVYNLVKDKVDAAVSEVKHYLSQHRSSGRNLSAREPSQRGTEMDCPRETMVSKMLDRLHLEEPSGPVPGKCPERQAQDTSVGPATPARTSSDPVAGTPQIPHTLPFRGTTPGPVFTETPGPHPQRNQGDGRHGTPWYPWTPPNPMTGPPALVFNNggggsggggsKKRLAYAIIQFLHDQLRHGGLSSDAQESLEVAIQCLETAFGVTVEDSDLALKKRLAYAIIQFLHDQLRHGGLSSDAQESLEVAIQCLETAFGVTVEDSDLAL(muRIPK3ΔC-2xSGTA.DM; TH1003 без эпитопной метки)
1331
MSSVKLWPTGASAVPLVSREELKKLEFVGKGGFGVVFRAHHRTWNHDVAVKIVNSKKISWEVKAMVNLRNENVLLLLGVTEDLQWDFVSGQALVTRFMENGSLAGLLQPECPRPWPLLCRLLQEVVLGMCYLHSLNPPLLHRDLKPSNILLDPELHAKLADFGLSTFQGGSQSGSGSGSGSRDSGGTLAYLDPELLFDVNLKASKASDVYSFGILVWAVLAGREAELVDKTSLIRETVCDRQSRPPLTELPPGSPETPGLEKLKELMIHCWGSQSENRPSFQDCEPKTNEVYNLVKDKVDAAVSEVKHYLSQHRSSGRNLSAREPSQRGTEMDCPRETMVSKMLDRLHLEEPSGPVPGKCPERQAQDTSVGPATPARTSSDPVAGTPQIPHTLPFRGTTPGPVFTETPGPHPQRNQGDGRHGTPWYPWTPPNPMTGPPALVFNNggggsggggsGAMEPENKYLPELMAEKDSLDPSFTHAMQLLTAEIEKIQKGGAMEPENKYLPELMAEKDSLDPSFTHAMQLLTAEIEKIQKG(muRIPK3ΔC-2xSrc.DM; TH1005 без эпитопной метки)
1332
MSCVKLWPSGAPAPLVSIEELENQELVGKGGFGTVFRAQHRKWGYDVAVKIVNSKAISREVKAMASLDNEFVLRLEGVIEKVNWDQDPKPALVTKFMENGSLSGLLQSQCPRPWPLLCRLLKEVVLGMFYLHDQNPVLLHRDLKPSNVLLDPELHVKLADFGLSTFQGGSQSGTGSGEPGGTLGYLAPELFVNVNRKASTASDVYSFGILMWAVLAGREVELPTEPSLVYEAVCNRQNRPSLAELPQAGPETPGLEGLKELMQLCWSSEPKDRPSFQECLPKTDEVFQMVENNMNAAVSTVKDFLSQLRSSNRRFSIPESGQGGTEMDGFRRTIENQHSRNDVMVSEWLNKLNLEEPPSSVPKKCPSLTKRSRAQEEQVPQAWTAGTSSDSMAQPPQTPETSTFRNQMPSPTSTGTPSPGPRGNQGAERQGMNWSCRTPEPNPVTGRPLVNTFGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETS(huRIPK3.del.C-2xFv; TH1007 без эпитопной метки)
1333
MSCVKLWPSGAPAPLVSIEELENQELVGKGGFGTVFRAQHRKWGYDVAVKIVNSKAISREVKAMASLDNEFVLRLEGVIEKVNWDQDPKPALVTKFMENGSLSGLLQSQCPRPWPLLCRLLKEVVLGMFYLHDQNPVLLHRDLKPSNVLLDPELHVKLADFGLSTFQGGSQSGTGSGEPGGTLGYLAPELFVNVNRKASTASDVYSFGILMWAVLAGREVELPTEPSLVYEAVCNRQNRPSLAELPQAGPETPGLEGLKELMQLCWSSEPKDRPSFQECLPKTDEVFQMVENNMNAAVSTVKDFLSQLRSSNRRFSIPESGQGGTEMDGFRRTIENQHSRNDVMVSEWLNKLNLEEPPSSVPKKCPSLTKRSRAQEEQVPQAWTAGTSSDSMAQPPQTPETSTFRNQMPSPTSTGTPSPGPRGNQGAERQGMNWSCRTPEPNPVTGRPLVNTF(huRIPK3.del.C; TH1008 без эпитопной метки)
1334
MSSVKLWPTGASAVPLVSREELKKLEFVGKGGFGVVFRAHHRTWNHDVAVKIVNSKKISWEVKAMVNLRNENVLLLLGVTEDLQWDFVSGQALVTRFMENGSLAGLLQPECPRPWPLLCRLLQEVVLGMCYLHSLNPPLLHRDLKPSNILLDPELHAKLADFGLSTFQGGSQSGSGSGSGSRDSGGTLAYLDPELLFDVNLKASKASDVYSFGILVWAVLAGREAELVDKTSLIRETVCDRQSRPPLTELPPGSPETPGLEKLKELMIHCWGSQSENRPSFQDCEPKTNEVYNLVKDKVDAAVSEVKHYLSQHRSSGRNLSAREPSQRGTEMDCPRETMVSKMLDRLHLEEPSGPVPGKCPERQAQDTSVGPATPARTSSDPVAGTPQIPHTLPFRGTTPGPVFTETPGPHPQRNQGDGRHGTPWYPWTPPNPMTGPPALVFNN(muRIPK3.del.C; TH1009 без эпитопной метки)
1335
MSSVKLWPTGASAVPLVSREELKKLEFVGKGGFGVVFRAHHRTWNHDVAVKIVNSKKISWEVKAMVNLRNENVLLLLGVTEDLQWDFVSGQALVTRFMENGSLAGLLQPECPRPWPLLCRLLQEVVLGMCYLHSLNPPLLHRDLKPSNILLDPELHAKLADFGLSTFQGGSQSGSGSGSGSRDSGGTLAYLDPELLFDVNLKASKASDVYSFGILVWAVLAGREAELVDKTSLIRETVCDRQSRPPLTELPPGSPETPGLEKLKELMIHCWGSQSENRPSFQDCEPKTNEVYNLVKDKVDAAVSEVKHYLSQHRSSGRNLSAREPSQRGTEMDCPRETMVSKMLDRLHLEEPSGPVPGKCPERQAQDTSVGPATPARTSSDPVAGTPQIPHTLPFRGTTPGPVFTETPGPHPQRNQGDGRHGTPWYPWTPPNPMTGPPALVFNNCSEVQIGNYNSLVAPPRTTASSSAKYDQAQFGRGRGWQPFHKggggsggggsKKRLAYAIIQFLHDQLRHGGLSSDAQESLEVAIQCLETAFGVTVEDSDLALKKRLAYAIIQFLHDQLRHGGLSSDAQESLEVAIQCLETAFGVTVEDSDLAL(muRIPK3-2xSGTA.DM; TH1010 без эпитопной метки)
1336
MSSVKLWPTGASAVPLVSREELKKLEFVGKGGFGVVFRAHHRTWNHDVAVKIVNSKKISWEVKAMVNLRNENVLLLLGVTEDLQWDFVSGQALVTRFMENGSLAGLLQPECPRPWPLLCRLLQEVVLGMCYLHSLNPPLLHRDLKPSNILLDPELHAKLADFGLSTFQGGSQSGSGSGSGSRDSGGTLAYLDPELLFDVNLKASKASDVYSFGILVWAVLAGREAELVDKTSLIRETVCDRQSRPPLTELPPGSPETPGLEKLKELMIHCWGSQSENRPSFQDCEPKTNEVYNLVKDKVDAAVSEVKHYLSQHRSSGRNLSAREPSQRGTEMDCPRETMVSKMLDRLHLEEPSGPVPGKCPERQAQDTSVGPATPARTSSDPVAGTPQIPHTLPFRGTTPGPVFTETPGPHPQRNQGDGRHGTPWYPWTPPNPMTGPPALVFNNCSEVQIGNYNSLVAPPRTTASSSAKYDQAQFGRGRGWQPFHKggggsggggsGAMEPENKYLPELMAEKDSLDPSFTHAMQLLTAEIEKIQKGGAMEPENKYLPELMAEKDSLDPSFTHAMQLLTAEIEKIQKG(muRIPK3-2xSrc.DM; TH1011 без эпитопной метки)
1337
MSSVKLWPTGASAVPLVSREELKKLEFVGKGGFGVVFRAHHRTWNHDVAVKIVNSKKISWEVKAMVNLRNENVLLLLGVTEDLQWDFVSGQALVTRFMENGSLAGLLQPECPRPWPLLCRLLQEVVLGMCYLHSLNPPLLHRDLKPSNILLDPELHAKLADFGLSTFQGGSQSGSGSGSGSRDSGGTLAYLDPELLFDVNLKASKASDVYSFGILVWAVLAGREAELVDKTSLIRETVCDRQSRPPLTELPPGSPETPGLEKLKELMIHCWGSQSENRPSFQDCEPKTNEVYNLVKDKVDAAVSEVKHYLSQHRSSGRNLSAREPSQRGTEMDCPRETMVSKMLDRLHLEEPSGPVPGKCPERQAQDTSVGPATPARTSSDPVAGTPQIPHTLPFRGTTPGPVFTETPGPHPQRNQGDGRHGTPWYPWTPPNPMTGPPALVFNNCSEVQIGNYNSLVAPPRTTASSSAKYDQAQFGRGRGWQPFHKgvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkVdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellklegvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkVdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkle(muRIPK3-2xFV; TH1012 без эпитопной метки)
1338
MSCVKLWPSGAPAPLVSIEELENQELVGKGGFGTVFRAQHRKWGYDVAVKIVNSKAISREVKAMASLDNEFVLRLEGVIEKVNWDQDPKPALVTKFMENGSLSGLLQSQCPRPWPLLCRLLKEVVLGMFYLHDQNPVLLHRDLKPSNVLLDPELHVKLADFGLSTFQGGSQSGTGSGEPGGTLGYLAPELFVNVNRKASTASDVYSFGILMWAVLAGREVELPTEPSLVYEAVCNRQNRPSLAELPQAGPETPGLEGLKELMQLCWSSEPKDRPSFQECLPKTDEVFQMVENNMNAAVSTVKDFLSQLRSSNRRFSIPESGQGGTEMDGFRRTIENQHSRNDVMVSEWLNKLNLEEPPSSVPKKCPSLTKRSRAQEEQVPQAWTAGTSSDSMAQPPQTPETSTFRNQMPSPTSTGTPSPGPRGNQGAERQGMNWSCRTPEPNPVTGRPLVNIYNCSGVQVGDNNYLTMQQTTALPTWGLAPSGKGRGLQHPPPVGSQEGPKDPEAWSRPQGWYNHSGKgvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkVdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellklegvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkVdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkle(huRIPK3-2xFv; TH1013 без эпитопной метки)
1339
MSSVKLWPTGASAVPLVSREELKKLEFVGKGGFGVVFRAHHRTWNHDVAVKIVNSKKISWEVKAMVNLRNENVLLLLGVTEDLQWDFVSGQALVTRFMENGSLAGLLQPECPRPWPLLCRLLQEVVLGMCYLHSLNPPLLHRDLKPSNILLDPELHAKLADFGLSTFQGGSQSGSGSGSGSRDSGGTLAYLDPELLFDVNLKASKASDVYSFGILVWAVLAGREAELVDKTSLIRETVCDRQSRPPLTELPPGSPETPGLEKLKELMIHCWGSQSENRPSFQDCEPKTNEVYNLVKDKVDAAVSEVKHYLSQHRSSGRNLSAREPSQRGTEMDCPRETMVSKMLDRLHLEEPSGPVPGKCPERQAQDTSVGPATPARTSSDPVAGTPQIPHTLPFRGTTPGPVFTETPGPHPQRNQGDGRHGTPWYPWTPPNPMTGPPALVFNNCSEVQIGNYNSLVAPPRTTASSSAKYDQAQFGRGRGWQPFHKggikkeieaikkeqeaikkkieaiekeiea(muRIPK3-IZ.Trimer; TH1015 без эпитопной метки)
1340
MSSVKLWPTGASAVPLVSREELKKLEFVGKGGFGVVFRAHHRTWNHDVAVKIVNSKKISWEVKAMVNLRNENVLLLLGVTEDLQWDFVSGQALVTRFMENGSLAGLLQPECPRPWPLLCRLLQEVVLGMCYLHSLNPPLLHRDLKPSNILLDPELHAKLADFGLSTFQGGSQSGSGSGSGSRDSGGTLAYLDPELLFDVNLKASKASDVYSFGILVWAVLAGREAELVDKTSLIRETVCDRQSRPPLTELPPGSPETPGLEKLKELMIHCWGSQSENRPSFQDCEPKTNEVYNLVKDKVDAAVSEVKHYLSQHRSSGRNLSAREPSQRGTEMDCPRETMVSKMLDRLHLEEPSGPVPGKCPERQAQDTSVGPATPARTSSDPVAGTPQIPHTLPFRGTTPGPVFTETPGPHPQRNQGDGRHGTPWYPWTPPNPMTGPPALVFNNCSEVQIGNYNSLVAPPRTTASSSAKYDQAQFGRGRGWQPFHKgggyipeaprdgqayvrkdgewvllstfl(muRIPK3-Foldon; TH1016 без эпитопной метки)
1341
MSSVKLWPTGASAVPLVSREELKKLEFVGKGGFGVVFRAHHRTWNHDVAVKIVNSKKISWEVKAMVNLRNENVLLLLGVTEDLQWDFVSGQALVTRFMENGSLAGLLQPECPRPWPLLCRLLQEVVLGMCYLHSLNPPLLHRDLKPSNILLDPELHAKLADFGLSTFQGGSQSGSGSGSGSRDSGGTLAYLDPELLFDVNLKASKASDVYSFGILVWAVLAGREAELVDKTSLIRETVCDRQSRPPLTELPPGSPETPGLEKLKELMIHCWGSQSENRPSFQDCEPKTNEVYNLVKDKVDAAVSEVKHYLSQHRSSGRNLSAREPSQRGTEMDCPRETMVSKMLDRLHLEEPSGPVPGKCPERQAQDTSVGPATPARTSSDPVAGTPQIPHTLPFRGTTPGPVFTETPGPHPQRNQGDGRHGTPWYPWTPPNPMTGPPALVFNNCSEVQIGNYNSLVAPPRTTASSSAKYDQAQFGRGRGWQPFHKGSDGSGSGSGSITIRAAFLEKENTALRTEIAELEKEVGRCENIVSKYETRYGPLGSDGSGSGSGSITIRAAFLEKENTALRTEIAELEKEVGRCENIVSKYETRYGPL(muRIPK3-2xEE; TH1017 без эпитопной метки)
1342
MSSVKLWPTGASAVPLVSREELKKLEFVGKGGFGVVFRAHHRTWNHDVAVKIVNSKKISWEVKAMVNLRNENVLLLLGVTEDLQWDFVSGQALVTRFMENGSLAGLLQPECPRPWPLLCRLLQEVVLGMCYLHSLNPPLLHRDLKPSNILLDPELHAKLADFGLSTFQGGSQSGSGSGSGSRDSGGTLAYLDPELLFDVNLKASKASDVYSFGILVWAVLAGREAELVDKTSLIRETVCDRQSRPPLTELPPGSPETPGLEKLKELMIHCWGSQSENRPSFQDCEPKTNEVYNLVKDKVDAAVSEVKHYLSQHRSSGRNLSAREPSQRGTEMDCPRETMVSKMLDRLHLEEPSGPVPGKCPERQAQDTSVGPATPARTSSDPVAGTPQIPHTLPFRGTTPGPVFTETPGPHPQRNQGDGRHGTPWYPWTPPNPMTGPPALVFNNCSEVQIGNYNSLVAPPRTTASSSAKYDQAQFGRGRGWQPFHKGSDGSGSGSGSLEIRAAFLEKENTALRTRAAELRKRVGRCRNIVSKYETRYGPLGSDGSGSGSGSLEIRAAFLEKENTALRTRAAELRKRVGRCRNIVSKYETRYGPL(muRIPK3-2xRR; TH1018 без эпитопной метки)
1343
MSSVKLWPTGASAVPLVSREELKKLEFVGKGGFGVVFRAHHRTWNHDVAVKIVNSKKISWEVKAMVNLRNENVLLLLGVTEDLQWDFVSGQALVTRFMENGSLAGLLQPECPRPWPLLCRLLQEVVLGMCYLHSLNPPLLHRDLKPSNILLDPELHAKLADFGLSTFQGGSQSGSGSGSGSRDSGGTLAYLDPELLFDVNLKASKASDVYSFGILVWAVLAGREAELVDKTSLIRETVCDRQSRPPLTELPPGSPETPGLEKLKELMIHCWGSQSENRPSFQDCEPKTNEVYNLVKDKVDAAVSEVKHYLSQHRSSGRNLSAREPSQRGTEMDCPRETMVSKMLDRLHLEEPSGPVPGKCPERQAQDTSVGPATPARTSSDPVAGTPQIPHTLPFRGTTPGPVFTETPGPHPQRNQGDGRHGTPWYPWTPPNPMTGPPALVFNNCSEVQIGNYNSLVAPPRTTASSSAKYDQAQFGRGRGWQPFHKGSDGSGSGSGSITIRAAFLEKENTALRTEIAELEKEVGRCENIVSKYETRYGPL(muRIPK3-EE; TH1019 без эпитопной метки)
1344
MSSVKLWPTGASAVPLVSREELKKLEFVGKGGFGVVFRAHHRTWNHDVAVKIVNSKKISWEVKAMVNLRNENVLLLLGVTEDLQWDFVSGQALVTRFMENGSLAGLLQPECPRPWPLLCRLLQEVVLGMCYLHSLNPPLLHRDLKPSNILLDPELHAKLADFGLSTFQGGSQSGSGSGSGSRDSGGTLAYLDPELLFDVNLKASKASDVYSFGILVWAVLAGREAELVDKTSLIRETVCDRQSRPPLTELPPGSPETPGLEKLKELMIHCWGSQSENRPSFQDCEPKTNEVYNLVKDKVDAAVSEVKHYLSQHRSSGRNLSAREPSQRGTEMDCPRETMVSKMLDRLHLEEPSGPVPGKCPERQAQDTSVGPATPARTSSDPVAGTPQIPHTLPFRGTTPGPVFTETPGPHPQRNQGDGRHGTPWYPWTPPNPMTGPPALVFNNCSEVQIGNYNSLVAPPRTTASSSAKYDQAQFGRGRGWQPFHKGSDGSGSGSGSLEIRAAFLEKENTALRTRAAELRKRVGRCRNIVSKYETRYGPL(muRIPK3-RR; TH1020 без эпитопной метки)
1345
MGCVCSSNPEDDWMENGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIEAGSGGGSGSGGGSDPFLVLLHSLSGSLSGNDLMELKFLCRERVSKRKLERVQSGLDLFTVLLEQNDLERGHTGLLRELLASLRRHDLLQRLDDFEAGTATAAPPGEADLQVAFDIVCDNVGRDWKRLARELKVSEAKMDGIEEKYPRSLSERVRESLKVWKNAEKKNASVAGLVKALRTCRLNLVADLVEEAQESVSKSENMSPVLRDSTVSSSETP(Myr(Lck)-IZ-L-msFADD; TH3002 без эпитопной метки)
1346
MGCVCSSNPEDDWMENGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIEAGSGGGSGSGGGSPGEEDLCAAFNVICDNVGKDWRRLARQLKVSDTKIDSIEDRYPRNLTERVRESLRIWKNTEKENATVAHLVGALRSCQMNLVADLVQEVQQARDLQNRSGAMSPMSWNS(Myr(Lck)-IZ-L-huFADD-DD; TH3003 без эпитопной метки)
1347
MGCVCSSNPEDDWMENGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIEAGSGGGSGSGGGSPPGEADLQVAFDIVCDNVGRDWKRLARELKVSEAKMDGIEEKYPRSLSERVRESLKVWKNAEKKNASVAGLVKALRTCRLNLVADLVEEAQESVSKSENMSPVLRDSTVS(Myr(Lck)-IZ-L-msFADD-DD; TH3004 без эпитопной метки)
1348
MGQTVTTPLSLTLDHWGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIEAGSGGGSGSGGGSDPFLVLLHSVSSSLSSSELTELKFLCLGRVGKRKLERVQSGLDLFSMLLEQNDLEPGHTELLRELLASLRRHDLLRRVDDFEAGAAAGAAPGEEDLCAAFNVICDNVGKDWRRLARQLKVSDTKIDSIEDRYPRNLTERVRESLRIWKNTEKENATVAHLVGALRSCQMNLVADLVQEVQQARDLQNRSGAMSPMSWNSDASTSEAS(Myr(MMSV)-IZ-L-huFADD; TH3005 без эпитопной метки)
1349
MGQTVTTPLSLTLDHWGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIEAGSGGGSGSGGGSDPFLVLLHSLSGSLSGNDLMELKFLCRERVSKRKLERVQSGLDLFTVLLEQNDLERGHTGLLRELLASLRRHDLLQRLDDFEAGTATAAPPGEADLQVAFDIVCDNVGRDWKRLARELKVSEAKMDGIEEKYPRSLSERVRESLKVWKNAEKKNASVAGLVKALRTCRLNLVADLVEEAQESVSKSENMSPVLRDSTVSSSETP(Myr(MMSV)-IZ-L-msFADD; TH3006 без эпитопной метки)
1350
MGQTVTTPLSLTLDHWGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIEAGSGGGSGSGGGSPGEEDLCAAFNVICDNVGKDWRRLARQLKVSDTKIDSIEDRYPRNLTERVRESLRIWKNTEKENATVAHLVGALRSCQMNLVADLVQEVQQARDLQNRSGAMSPMSWNS(Myr(MMSV)-IZ-L-huFADD-DD; TH3007 без эпитопной метки)
1351
MGQTVTTPLSLTLDHWGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIEAGSGGGSGSGGGSPPGEADLQVAFDIVCDNVGRDWKRLARELKVSEAKMDGIEEKYPRSLSERVRESLKVWKNAEKKNASVAGLVKALRTCRLNLVADLVEEAQESVSKSENMSPVLRDSTVS(Myr(MMSV)-IZ-L-msFADD-DD; TH3008 без эпитопной метки)
1352
MRMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERAEGNHRKKPLKVLESLGKDFLTGVLDNLVEQNVLNWKEEEKKKYYDAKTEDKVRVMADSMQEKQRMAGQMLLQTFFNIDQISPNKKAHPNMEAGPPESGESTDALKLCPHEEFLRLCKERAEEIYPIKERNNRTRLALIICNTEFDHLPPRNGADFDITGMKELLEGLDYSVDVEENLTARDMESALRAFATRPEHKSSDSTFLVLMSHGILEGICGTVHDEKKPDVLLYDTIFQIFNNRNCLSLKDKPKVIIVQACRGANRGELWVRDSPASLEVASSQSSENLEEDAVYKTHVEKDFIAFCSSTPHNVSWRDSTMGSIFITQLITCFQKYSWCCHLEEVFRKVQQSFETPRAKAQMPTIERLSMTRYFYLFPGN(Каспаза-4, полноразмерная+домен IZ; P2006 без эпитопной метки)
1353
MRMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERQISPNKKAHPNMEAGPPESGESTDALKLCPHEEFLRLCKERAEEIYPIKERNNRTRLALIICNTEFDHLPPRNGADFDITGMKELLEGLDYSVDVEENLTARDMESALRAFATRPEHKSSDSTFLVLMSHGILEGICGTVHDEKKPDVLLYDTIFQIFNNRNCLSLKDKPKVIIVQACRGANRGELWVRDSPASLEVASSQSSENLEEDAVYKTHVEKDFIAFCSSTPHNVSWRDSTMGSIFITQLITCFQKYSWCCHLEEVFRKVQQSFETPRAKAQMPTIERLSMTRYFYLFPGN(Каспаза-4, N.del+домен IZ; P2009 без эпитопной метки)
1354
MRMKQLEDKIEELLSKIYHLENEIARLKKLIGERAEGNHRKKPLKVLESLGKDFLTGVLDNLVEQNVLNWKEEEKKKYYDAKTEDKVRVMADSMQEKQRMAGQMLLQTFFNIDQISPNKKAHPNMEAGPPESGESTDALKLCPHEEFLRLCKERAEEIYPIKERNNRTRLALIICNTEFDHLPPRNGADFDITGMKELLEGLDYSVDVEENLTARDMESALRAFATRPEHKSSDSTFLVLMSHGILEGICGTVHDEKKPDVLLYDTIFQIFNNRNCLSLKDKPKVIIVQACRGANRGELWVRDSPASLEVASSQSSENLEEDAVYKTHVEKDFIAFCSSTPHNVSWRDSTMGSIFITQLITCFQKYSWCCHLEEVFRKVQQSFETPRAKAQMPTIERLSMTRYFYLFPGN(Каспаза-4, полноразмерная+домен DM; P2012 без эпитопной метки)
1355
MRMKQLEDKIEELLSKIYHLENEIARLKKLIGERQISPNKKAHPNMEAGPPESGESTDALKLCPHEEFLRLCKERAEEIYPIKERNNRTRLALIICNTEFDHLPPRNGADFDITGMKELLEGLDYSVDVEENLTARDMESALRAFATRPEHKSSDSTFLVLMSHGILEGICGTVHDEKKPDVLLYDTIFQIFNNRNCLSLKDKPKVIIVQACRGANRGELWVRDSPASLEVASSQSSENLEEDAVYKTHVEKDFIAFCSSTPHNVSWRDSTMGSIFITQLITCFQKYSWCCHLEEVFRKVQQSFETPRAKAQMPTIERLSMTRYFYLFPGN(Каспаза-4, N.del+домен DM; P2015 без эпитопной метки)
1356
MAEGNHRKKPLKVLESLGKDFLTGVLDNLVEQNVLNWKEEEKKKYYDAKTEDKVRVMADSMQEKQRMAGQMLLQTFFNIDQISPNKKAHPNMEAGPPESGESTDALKLCPHEEFLRLCKERAEEIYPIKERNNRTRLALIICNTEFDHLPPRNGADFDITGMKELLEGLDYSVDVEENLTARDMESALRAFATRPEHKSSDSTFLVLMSHGILEGICGTVHDEKKPDVLLYDTIFQIFNNRNCLSLKDKPKVIIVQACRGANRGELWVRDSPASLEVASSQSSENLEEDAVYKTHVEKDFIAFCSSTPHNVSWRDSTMGSIFITQLITCFQKYSWCCHLEEVFRKVQQSFETPRAKAQMPTIERLSMTRYFYLFPGN(Каспаза-4, полноразмерная, дикого типа; P2018 без эпитопной метки)
1357
MRMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERAEDSGKKKRRKNFEAMFKGILQSGLDNFVINHMLKNNVAGQTSIQTLVPNTDQKSTSVKKDNHKKKTVKMLEYLGKDVLHGVFNYLAKHDVLTLKEEEKKKYYDTKIEDKALILVDSLRKNRVAHQMFTQTLLNMDQKITSVKPLLQIEAGPPESAESTNILKLCPREEFLRLCKKNHDEIYPIKKREDRRRLALIICNTKFDHLPARNGAHYDIVGMKRLLQGLGYTVVDEKNLTARDMESVLRAFAARPEHKSSDSTFLVLMSHGILEGICGTAHKKKKPDVLLYDTIFQIFNNRNCLSLKDKPKVIIVQACRGEKHGELWVRDSPASLALISSQSSENLEADSVCKIHEEKDFIAFCSSTPHNVSWRDRTRGSIFITELITCFQKYSCCCHLMEIFRKVQKSFEVPQAKAQMPTIERATLTRDFYLFPGN (Каспаза-5, полноразмерная+домен IZ; P2007 без эпитопной метки)
1358
MRMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERDQKITSVKPLLQIEAGPPESAESTNILKLCPREEFLRLCKKNHDEIYPIKKREDRRRLALIICNTKFDHLPARNGAHYDIVGMKRLLQGLGYTVVDEKNLTARDMESVLRAFAARPEHKSSDSTFLVLMSHGILEGICGTAHKKKKPDVLLYDTIFQIFNNRNCLSLKDKPKVIIVQACRGEKHGELWVRDSPASLALISSQSSENLEADSVCKIHEEKDFIAFCSSTPHNVSWRDRTRGSIFITELITCFQKYSCCCHLMEIFRKVQKSFEVPQAKAQMPTIERATLTRDFYLFPGN (Каспаза-5, N.del+домен IZ; P2010 без эпитопной метки)
1359
MRMKQLEDKIEELLSKIYHLENEIARLKKLIGERAEDSGKKKRRKNFEAMFKGILQSGLDNFVINHMLKNNVAGQTSIQTLVPNTDQKSTSVKKDNHKKKTVKMLEYLGKDVLHGVFNYLAKHDVLTLKEEEKKKYYDTKIEDKALILVDSLRKNRVAHQMFTQTLLNMDQKITSVKPLLQIEAGPPESAESTNILKLCPREEFLRLCKKNHDEIYPIKKREDRRRLALIICNTKFDHLPARNGAHYDIVGMKRLLQGLGYTVVDEKNLTARDMESVLRAFAARPEHKSSDSTFLVLMSHGILEGICGTAHKKKKPDVLLYDTIFQIFNNRNCLSLKDKPKVIIVQACRGEKHGELWVRDSPASLALISSQSSENLEADSVCKIHEEKDFIAFCSSTPHNVSWRDRTRGSIFITELITCFQKYSCCCHLMEIFRKVQKSFEVPQAKAQMPTIERATLTRDFYLFPGN (Каспаза-5, полноразмерная+домен DM; P2013 без эпитопной метки)
1360
MRMKQLEDKIEELLSKIYHLENEIARLKKLIGERDQKITSVKPLLQIEAGPPESAESTNILKLCPREEFLRLCKKNHDEIYPIKKREDRRRLALIICNTKFDHLPARNGAHYDIVGMKRLLQGLGYTVVDEKNLTARDMESVLRAFAARPEHKSSDSTFLVLMSHGILEGICGTAHKKKKPDVLLYDTIFQIFNNRNCLSLKDKPKVIIVQACRGEKHGELWVRDSPASLALISSQSSENLEADSVCKIHEEKDFIAFCSSTPHNVSWRDRTRGSIFITELITCFQKYSCCCHLMEIFRKVQKSFEVPQAKAQMPTIERATLTRDFYLFPGN (Каспаза-5, N.del+домен DM; P2016 без эпитопной метки)
1361
MRMKQLEDKIEELLSKIYHLENEIARLKKLIGERDQKITSVKPLLQIEAGPPESAESTNILKLCPREEFLRLCKKNHDEIYPIKKREDRRRLALIICNTKFDHLPARNGAHYDIVGMKRLLQGLGYTVVDEKNLTARDMESVLRAFAARPEHKSSDSTFLVLMSHGILEGICGTAHKKKKPDVLLYDTIFQIFNNRNCLSLKDKPKVIIVQACRGEKHGELWVRDSPASLALISSQSSENLEADSVCKIHEEKDFIAFCSSTPHNVSWRDRTRGSIFITELITCFQKYSCCCHLMEIFRKVQKSFEVPQAKAQMPTIERATLTRDFYLFPGN (Каспаза-5, полноразмерная, дикого типа; P2019 без эпитопной метки)
1362
MRMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERAENKHPDKPLKVLEQLGKEVLTEYLEKLVQSNVLKLKEEDKQKFNNAERSDKRWVFVDAMKKKHSKVGEMLLQTFFSVDPGSHHGEANLEMEEPEESLNTLKLCSPEEFTRLCREKTQEIYPIKEANGRTRKALIICNTEFKHLSLRYGANFDIIGMKGLLEDLGYDVVVKEELTAEGMESEMKDFAALSEHQTSDSTFLVLMSHGTLHGICGTMHSEKTPDVLQYDTIYQIFNNCHCPGLRDKPKVIIVQACRGGNSGEMWIRESSKPQLCRGVDLPRNMEADAVKLSHVEKDFIAFYSTTPHHLSYRDKTGGSYFITRLISCFRKHACSCHLFDIFLKVQQSFEKASIHSQMPTIDRATLTRYFYLFPGN (Каспаза-11, полноразмерная+домен IZ; P2005 без эпитопной метки)
1363
MRMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERPGSHHGEANLEMEEPEESLNTLKLCSPEEFTRLCREKTQEIYPIKEANGRTRKALIICNTEFKHLSLRYGANFDIIGMKGLLEDLGYDVVVKEELTAEGMESEMKDFAALSEHQTSDSTFLVLMSHGTLHGICGTMHSEKTPDVLQYDTIYQIFNNCHCPGLRDKPKVIIVQACRGGNSGEMWIRESSKPQLCRGVDLPRNMEADAVKLSHVEKDFIAFYSTTPHHLSYRDKTGGSYFITRLISCFRKHACSCHLFDIFLKVQQSFEKASIHSQMPTIDRATLTRYFYLFPGN(Каспаза-11, N.del+домен IZ; P2008 без эпитопной метки)
1364
MRMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERPGSHHGEANLEMEEPEESLNTLKLCSPEEFTRLCREKTQEIYPIKEANGRTRKALIICNTEFKHLSLRYGANFDIIGMKGLLEDLGYDVVVKEELTAEGMESEMKDFAALSEHQTSDSTFLVLMSHGTLHGICGTMHSEKTPDVLQYDTIYQIFNNCHCPGLRDKPKVIIVQACRGGNSGEMWIRESSKPQLCRGVDLPRNMEADAVKLSHVEKDFIAFYSTTPHHLSYRDKTGGSYFITRLISCFRKHACSCHLFDIFLKVQQSFEKASIHSQMPTIDRATLTRYFYLFPGN (Каспаза-11, полноразмерная+домен DM; P2011 без эпитопной метки)
1365
MRMKQLEDKIEELLSKIYHLENEIARLKKLIGERAENKHPDKPLKVLEQLGKEVLTEYLEKLVQSNVLKLKEEDKQKFNNAERSDKRWVFVDAMKKKHSKVGEMLLQTFFSVDPGSHHGEANLEMEEPEESLNTLKLCSPEEFTRLCREKTQEIYPIKEANGRTRKALIICNTEFKHLSLRYGANFDIIGMKGLLEDLGYDVVVKEELTAEGMESEMKDFAALSEHQTSDSTFLVLMSHGTLHGICGTMHSEKTPDVLQYDTIYQIFNNCHCPGLRDKPKVIIVQACRGGNSGEMWIRESSKPQLCRGVDLPRNMEADAVKLSHVEKDFIAFYSTTPHHLSYRDKTGGSYFITRLISCFRKHACSCHLFDIFLKVQQSFEKASIHSQMPTIDRATLTRYFYLFPGN(Каспаза-11, N.del+домен DM; P2014 без эпитопной метки)
1366
MAENKHPDKPLKVLEQLGKEVLTEYLEKLVQSNVLKLKEEDKQKFNNAERSDKRWVFVDAMKKKHSKVGEMLLQTFFSVDPGSHHGEANLEMEEPEESLNTLKLCSPEEFTRLCREKTQEIYPIKEANGRTRKALIICNTEFKHLSLRYGANFDIIGMKGLLEDLGYDVVVKEELTAEGMESEMKDFAALSEHQTSDSTFLVLMSHGTLHGICGTMHSEKTPDVLQYDTIYQIFNNCHCPGLRDKPKVIIVQACRGGNSGEMWIRESSKPQLCRGVDLPRNMEADAVKLSHVEKDFIAFYSTTPHHLSYRDKTGGSYFITRLISCFRKHACSCHLFDIFLKVQQSFEKASIHSQMPTIDRATLTRYFYLFPGN (Каспаза-11, полноразмерная, дикого типа; P2017 без эпитопной метки)
1367
GSAFERVVRRVVQELDHGGEFIPVTSLQSSTGFQPYCLVVRKPSSSWFWKPRYKCVNLSIKDILEPDAAEPDVQRGRSFHFYDAMDGQIQGSVELAAPGQAKIAGGAAVSDSSSTSMNVYSLSVDPNTWQTLLHERHLRQPEHKVLQQLRSRGDNVYVVTEVLQTQKEVEVTRTHKREGSGRFSLPGATCLQGEGQGHLSQKKTVTIPSGSTLAFRVAQLVIDSDLDVLLFPDKKQRTFQPPATGHKRSTSEGAWPQLPSGLSMMRCLHNFLTDGVPAEGAFTEDFQGLRAEVETISKELELLDRELCQLLLEGLEGVLRDQLALRALEEALEQGQSLGPVEPLDGPAGAVLECLVLSSGMLVPELAIPVVYLLGALTMLSETQHKLLAEALESQTLLGPLELVGSLLEQSAPWQERSTMSLPPGLLGNSWGEGAPAWVLLDECGLELGEDTPHVCWEPQAQGRMCALYASLALLSGLSQEPH(GSDMD человека; SAW001 без эпитопной метки)
1368
GSAFERVVRRVVQELDHGGEFIPVTSLQSSTGFQPYCLVVRKPSSSWFWKPRYKCVNLSIKDILEPDAAEPDVQRGRSFHFYDAMDGQIQGSVELAAPGQAKIAGGAAVSDSSSTSMNVYSLSVDPNTWQTLLHERHLRQPEHKVLQQLRSRGDNVYVVTEVLQTQKEVEVTRTHKREGSGRFSLPGATCLQGEGQGHLSQKKTVTIPSGSTLAFRVAQLVIDSDLDVLLFPDKKQRTFQPPATGHKRSTSEGAWPQLPSGLSMMRCLHNFLTD(GSDMD (1-275) человека; SAW002 без эпитопной метки)
1369
GVPAEGAFTEDFQGLRAEVETISKELELLDRELCQLLLEGLEGVLRDQLALRALEEALEQGQSLGPVEPLDGPAGAVLECLVLSSGMLVPELAIPVVYLLGALTMLSETQHKLLAEALESQTLLGPLELVGSLLEQSAPWQERSTMSLPPGLLGNSWGEGAPAWVLLDECGLELGEDTPHVCWEPQAQGRMCALYASLALLSGLSQEPH(GSDMD (276-484) человека; SAW003 без эпитопной метки)
1370
PSAFEKVVKNVIKEVSGSRGDLIPVDSLRNSTSFRPYCLLNRKFSSSRFWKPRYSCVNLSIKDILEPSAPEPEPECFGSFKVSDVVDGNIQGRVMLSGMGEGKISGGAAVSDSSSASMNVCILRVTQKTWETMQHERHLQQPENKILQQLRSRGDDLFVVTEVLQTKEEVQITEVHSQEGSGQFTLPGALCLKGEGKGHQSRKKMVTIPAGSILAFRVAQLLIGSKWDILLVSDEKQRTFEPSSGDRKAVGQRHHGLNVLAALCSIGKQLSLLSDGIDEEELIEAADFQGLYAEVKACSSELESLEMELRQQILVNIGKILQDQPSMEALEASLGQGLCSGGQVEPLDGPAGCILECLVLDSGELVPELAAPIFYLLGALAVLSETQQQLLAKALETTVLSKQLELVKHVLEQSTPWQEQSSVSLPTVLLGDCWDEKNPTWVLLEECGLRLQVESPQVHWEPTSLIPTSALYASLFLLSSLGQKPC(GSDMD мыши; SAW004 без эпитопной метки)
1371
PSAFEKVVKNVIKEVSGSRGDLIPVDSLRNSTSFRPYCLLNRKFSSSRFWKPRYSCVNLSIKDILEPSAPEPEPECFGSFKVSDVVDGNIQGRVMLSGMGEGKISGGAAVSDSSSASMNVCILRVTQKTWETMQHERHLQQPENKILQQLRSRGDDLFVVTEVLQTKEEVQITEVHSQEGSGQFTLPGALCLKGEGKGHQSRKKMVTIPAGSILAFRVAQLLIGSKWDILLVSDEKQRTFEPSSGDRKAVGQRHHGLNVLAALCSIGKQLSLLSD(GSDMD (1-276) мыши; SAW005 без эпитопной метки)
1372
GIDEEELIEAADFQGLYAEVKACSSELESLEMELRQQILVNIGKILQDQPSMEALEASLGQGLCSGGQVEPLDGPAGCILECLVLDSGELVPELAAPIFYLLGALAVLSETQQQLLAKALETTVLSKQLELVKHVLEQSTPWQEQSSVSLPTVLLGDCWDEKNPTWVLLEECGLRLQVESPQVHWEPTSLIPTSALYASLFLLSSLGQKPC(GSDMD (277-487) мыши; SAW006 без эпитопной метки)
1373
MKMASTRCKLARYLEDLEDVDLKKFKMHLEDYPPQKGCIPLPRGQTEKADHVDLATLMIDFNGEEKAWAMAVWIFAAINRRDLYEKAKRDEPKWGSDNARVSNPTVICQEDSIEEEWMGLLEYLSRISICKMKKDYRKKYRKYVRSRFQCIEDRNARLGESVSLNKRYTRLRLIKEHRSQQEREQELLAIGKTKTCESPVSPIKMELLFDPDDEHSEPVHTVVFQGAAGIGKTILARKMMLDWASGTLYQDRFDYLFYIHCREVSLVTQRSLGDLIMSCCPDPNPPIHKIVRKPSRILFLMDGFDELQGAFDEHIGPLCTDWQKAERGDILLSSLIRKKLLPEASLLITTRPVALEKLQHLLDHPRHVEILGFSEAKRKEYFFKYFSDEAQARAAFSLIQENEVLFTMCFIPLVCWIVCTGLKQQMESGKSLAQTSKTTTAVYVFFLSSLLQPRGGSQEHGLCAHLWGLCSLAADGIWNQKILFEESDLRNHGLQKADVSAFLRMNLFQKEVDCEKFYSFIHMTFQEFFAAMYYLLGGGSGGGSGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIEA(hu.caNLRP3(PYD_NACHT_IZ); P3005 без эпитопной метки)
1374
MTSVRCKLAQYLEDLEDVDLKKFKMHLEDYPPEKGCIPVPRGQMEKADHLDLATLMIDFNGEEKAWAMAVWIFAAINRRDLWEKAKKDQPEWNDTCTSHSSMVCQEDSLEEEWMGLLGYLSRISICKKKKDYCKMYRRHVRSRFYSIKDRNARLGESVDLNSRYTQLQLVKEHPSKQEREHELLTIGRTKMRDSPMSSLKLELLFEPEDGHSEPVHTVVFQGAAGIGKTILARKIMLDWALGKLFKDKFDYLFFIHCREVSLRTPRSLADLIVSCWPDPNPPVCKILRKPSRILFLMDGFDELQGAFDEHIGEVCTDWQKAVRGDILLSSLIRKKLLPKASLLITTRPVALEKLQHLLDHPRHVEILGFSEAKRKEYFFKYFSNELQAREAFRLIQENEVLFTMCFIPLVCWIVCTGLKQQMETGKSLAQTSKTTTAVYVFFLSSLLQSRGGIEEHLFSDYLQGLCSLAADGIWNQKILFEECDLRKHGLQKTDVSAFLRMNVFQKEVDCERFYSFSHMTFQEFFAAMYYLLGGGSGGGSGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIEA(mu.caNLRP3(PYD_NACHT_IZ); P3007 без эпитопной метки)
1375
MAKTLGDHLLNTLEELLPYDFEKFKFKLQNTSLEKGHSKIPRGHMQMARPVKLASLLITYYGEEYAVRLTLQILRATNQRQLAEELRKATGTEHLIEENRVGGSVQSSVENKAKSVKVPDVPEGDGTQQNNDESDTLPSSQAEVGKGPQKKSLTKRKDQRGPESLDSQTKPWTRSTAPLYRRTQGTQSPGDKESTASAQLRRNVSSAGRLQGLYNNAPGRRESKKAEVYVYLPSGKKRPRSLEITTYSREGEPPNSEVLPTQEETRNGSLIRMRTATLNGRTTGALEKGTGIPEHSMVLDEKTFRNMSSKTSLIGEERCPTSWTENGNGSPETTESSGETAGSILSDPEVPLSLCEKPAKTPEDPASLGQAACEGRSQDKAVCPLCHTQEGDLRGDTCVQSSCSCSIAPGDPKASGRCSICFQCQGLLARKSCEAQSPQSLPQCPRHMKQVLLLFCEDHREPICLICRLSLEHQGHRVRPIEEAALEYKEQIREQLERLREMRGYVEEHRLQGDKKTDDFLKQTEIQKQKISCPLEKLYQLLEKQEQLFVTWLQELSQTISKVRETYYTRVSLLDEMIEELEAKQDQPEWDLMQDIGITLHRAKMMSASELLDTPPGVKEKLHLLYQKSKSVEKNMQCFSEMLSSEMAFSASDVAKWEGRQPSATQVQGLVPTVHLKCDGAHTQDCDVVFYPEREAGGSEPKDYLHPQPAQDTPELHEIHSRNNKRKFKSFLKWKPSFSRTDWRLRTCCYRDLDQAAAHPNLIFSMI(muPYRIN-B30.2(V726A); P3002 без эпитопной метки)
1376
MAKTLGDHLLNTLEELLPYDFEKFKFKLQNTSLEKGHSKIPRGHMQMARPVKLASLLITYYGEEYAVRLTLQILRATNQRQLAEELRKATGTEHLIEENRVGGSVQSSVENKAKSVKVPDVPEGDGTQQNNDESDTLPSSQAEVGKGPQKKSLTKRKDQRGPESLDSQTKPWTRSTAPLYRRTQGTQSPGDKESTASAQLRRNVSSAGRLQGLYNNAPGRRESKKAEVYVYLPSGKKRPRSLEITTYSREGEPPNSEVLPTQEETRNGSLIRMRTATLNGRTTGALEKGTGIPEHSMVLDEKTFRNMSSKTSLIGEERCPTSWTENGNGSPETTESSGETAGSILSDPEVPLSLCEKPAKTPEDPASLGQAACEGRSQDKAVCPLCHTQEGDLRGDTCVQSSCSCSIAPGDPKASGRCSICFQCQGLLARKSCEAQSPQSLPQCPRHMKQVLLLFCEDHREPICLICRLSLEHQGHRVRPIEEAALEYKEQIREQLERLREMRGYVEEHRLQGDKKTDDFLKQTEIQKQKISCPLEKLYQLLEKQEQLFVTWLQELSQTISKVRETYYTRVSLLDEMIEELEAKQDQPEWDLMQDIGITLHRAKMMSASELLDTPPGVKEKLHLLYQKSKSVEKNMQCFSEMLSSEMAFSASDVAKWEGRQPSATQVQGLVPTVHLKCDGAHTQDCDVVFYPEREAGGSEPKDYLHPQPAQDTPELHEIHSRNNKRKFKSFLKWKPSFSRTDWRLRTCCYRDLDQAAAHPNLIFSMISEMEMFNVPELIGAQAHAVNVILDAETAYPNLIFSDDLKSVRLGNKWERLPDGPQRFDSCIIVLGSPSFLSGRRYWEVEVGDKTAWILGACKTSISRKGNMTLSPENGYWVVIMMKENEYQASSVPPTRLLIKEPPKRVGIFVDYRVGSISFYNVTARSHIYTFASCSFSGPLQPIFSPGTRDGGKNTAPLTICPVGGQGPD(muPYRIN-B30.2; P3004 без эпитопной метки)
1377
MGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIEAGSGAAPAGIQAPPQSAAKPGLHFIDQHRAALIARVTNVEWLLDALYGKVLTDEQYQAVRAEPTNPSKMRKLFSFTPAWNWTCKDLLLQALRESQSYLVEDLERS(hu.caASC(IZ_CARD); P3006 без эпитопной метки)
1378
MGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIEAGSGAVAAAASVPAQSTARTGHFVDQHRQALIARVTEVDGVLDALHGSVLTEGQYQAVRAETTSQDKMRKLFSFVPSWNLTCKDSLLQALKEIHPYLVMDLEQS(mu.caASC(IZ_CARD); P3008 без эпитопной метки)
1379
MSCVKLWPSGAPAPLVSIEELENQELVGKGGFGTVFRAQHRKWGYDVAVKIVNSKAISREVKAMASLDNEFVLRLEGVIEKVNWDQDPKPALVTKFMENGSLSGLLQSQCPRPWPLLCRLLKEVVLGMFYLHDQNPVLLHRDLKPSNVLLDPELHVKLADFGLSTFQGGSQSGTGSGEPGGTLGYLAPELFVNVNRKASTASDVYSFGILMWAVLAGREVELPTEPSLVYEAVCNRQNRPSLAELPQAGPETPGLEGLKELMQLCWSSEPKDRPSFQECLPKTDEVFQMVENNMNAAVSTVKDFLSQLRSSNRRFSIPESGQGGTEMDGFRRTIENQHSRNDVMVSEWLNKLNLEEPPSSVPKKCPSLTKRSRAQEEQVPQAWTAGTSSDSMAQPPQTPETSTFRNQMPSPTSTGTPSPGPRGNQGAERQGMNWSCRTPEPNPVTGRPLVNIYNCSGVQVGDNNYLTMQQTTALPTWGLAPSGKGRGLQHPPPVGSQEGPKDPEAWSRPQGWYNHSGK(huRIPK3; TH1014 без эпитопной метки)
1380
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC(5'-НТО)
1381
CCGCCGCCGCCG(GC-богатый элемент РНК)
1382
CCGCCGCCGCCGCCG(GC-богатый элемент РНК)
1383
CCCCGGCGCC(GC-богатый элемент РНК)
1384
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGA(5'-НТО)
1385
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCGCCACC(5'-НТО - V1)
1386
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCACC(5'-НТО-V2)
1387
MEHDLERGPPGPRRPPRGPPLSSSLGLALLLLLLALLFWLYIVMSDWTGGALLVLYSFALMLIIIILIIFIFRRDLLCPLGALCILLLMITLLLIALWNLHGQALFLGIVLFIFGCLLVLGIWIYLLEMLWRLGATIWQLLAFFLAFFLDLILLIIALYLQQNWWTLLVDLLWLLLFLAILIWMYYHGQRPFAEDKTYKYICRNFSNFCNVDVVEILPYLPCLTARDQDRLRATCTLSGNRDTLWHLFNTLQRRPGWVEYFIAALRGCELVDLADEVASVYQSYQPRTSDRPPDPLEPPSLPAERPGPPTPAAAHSIPYNSCREKEPSYPMPVQETQAPESPGENSEQALQTLSPRAIPRNPDGGPLESSSDLAALSPLTSSGHQEQDTELGSTHTAGATSSLTPSRGPVSPSVSFQPLARSTPRASRLPGPTGSVVSTGTSFSSSSPGLASAGAAEGKQGAESDQAEPIICSSGAEAPANSLPSKVPTTLMPVNTVALKVPANPASVSTVPSKLPTSSKPPGAVPSNALTNPAPSKLPINSTRAGMVPSKVPTSMVLTKVSASTVPTDGSSRNEETPAAPTPAGATGGSSAWLDSSSENRGLGSELSKPGVLASQVDSPFSGCFEDLAISASTSLGMGPCHGPEENEYKSEGTFGIHVAENPSIQLLEGNPGPPADPDGGPRPQADRKFQEREVPCHRPSPGALWLQVAVTGVLVVTLLVVLYRRRLH(MAVS человека)
1388
ATIGTAMYK (EBV BRLF1)
1389
SIIPSGPLK (FLU)
1390
AVDLSHFLK (HIV NEF)
1391
AVFDRKSDAK (EBV)
1392
YVNVNMGLK (коровый антиген HBV)
1393
RVCEKMALY (HCV)
1394
KLGGALQAK (CMV)
1395
ATGAGAATGAAGCAGCTGGAGGACAAGATCGAGGAGCTGCTGAGCAAGATCTACCACCTGGAGAACGAGATCGCCAGACTGAAGAAGCTGATCGGCGAGGCCGACCAGACCAGCGGCAACTACCTGAACATGCAGGACAGCCAGGGCGTGCTGAGCAGCTTCCCCGCCCCCCAGGCCGTGCAGGACAACCCCGCCATGCCCACCAGCAGCGGCAGCGAGGGCAACGTGAAGCTGTGCAGCCTGGAGGAGGCCCAGAGAATCTGGAAGCAGAAGAGCGCCGAGATCTACCCCATCATGGACAAGAGCAGCAGAACCAGACTGGCCCTGATCATCTGCAACGAGGAGTTCGACAGCATCCCCAGAAGAACCGGCGCCGAGGTGGACATCACCGGCATGACCATGCTGCTGCAGAACCTGGGCTACAGCGTGGACGTGAAGAAGAACCTGACCGCCAGCGACATGACCACCGAGCTGGAGGCCTTCGCCCACAGACCCGAGCACAAGACCAGCGACAGCACCTTCCTGGTGTTCATGAGCCACGGCATCAGAGAGGGCATCTGCGGCAAGAAGCACAGCGAGCAGGTGCCCGACATCCTGCAGCTGAACGCCATCTTCAACATGCTGAACACCAAGAACTGCCCCAGCCTGAAGGACAAGCCCAAGGTGATCATCATCCAGGCCTGCAGAGGCGACAGCCCCGGCGTGGTGTGGTTCAAGGACAGCGTGGGCGTGAGCGGCAACCTGAGCCTGCCCACCACCGAGGAGTTCGAGGACGACGCCATCAAGAAGGCCCACATCGAGAAGGACTTCATCGCCTTCTGCAGCAGCACCCCCGACAACGTGAGCTGGAGACACCCCACCATGGGCAGCGTGTTCATCGGCAGACTGATCGAGCACATGCAGGAGTACGCCTGCAGCTGCGACGTGGAGGAGATCTTCAGAAAGGTGAGATTCAGCTTCGAGCAGCCCGACGGCAGAGCCCAGATGCCCACCACCGAGAGAGTGACCCTGACCAGATGCTTCTACCTGTTCCCCGGCCACDM_hsCASP1 (самоактивирующаяся человеческая каспаза-1); P2025 без эпитопной метки)
1396
ATGAGAATGAAGCAGCTGGAGGACAAGATCGAGGAGCTGCTGAGCAAGATCTATCACCTGGAGAACGAGATCGCCAGACTGAAGAAGCTGATCGGCGAGAGACAGATCAGCCCCAACAAGAAGGCCCACCCCAACATGGAGGCCGGACCGCCTGAGAGCGGCGAGAGCACCGACGCCCTGAAGCTGTGCCCCCACGAGGAGTTCCTGAGACTGTGCAAGGAGAGAGCCGAGGAGATCTACCCCATCAAGGAGAGAAACAACAGAACCAGACTGGCCCTGATCATCTGCAACACCGAGTTCGACCACCTGCCCCCCAGAAACGGCGCCGACTTCGACATCACCGGCATGAAGGAGCTGCTGGAGGGCCTGGACTACAGCGTGGACGTGGAGGAGAACCTGACCGCCAGAGACATGGAGAGCGCCCTGAGAGCCTTCGCCACCAGACCCGAGCACAAGAGCAGCGACAGCACCTTCCTGGTGCTGATGAGCCACGGCATCCTGGAGGGCATCTGCGGCACCGTGCACGACGAGAAGAAGCCCGACGTGCTGCTGTACGACACCATCTTCCAGATCTTCAACAACAGAAACTGCCTGAGCCTGAAGGACAAGCCCAAGGTGATCATCGTGCAGGCCTGCAGAGGCGCCAACAGAGGCGAGCTGTGGGTGAGAGACAGCCCCGCCAGCCTGGAGGTGGCCAGCAGCCAGAGCAGCGAGAACCTGGAGGAGGACGCCGTGTACAAGACCCACGTGGAGAAGGACTTCATCGCCTTCTGCAGCAGCACCCCCCACAACGTGAGCTGGAGAGACAGCACCATGGGCAGCATCTTCATCACCCAGCTGATAACCTGCTTCCAGAAGTACAGCTGGTGCTGCCACCTGGAGGAGGTGTTCAGAAAGGTGCAGCAGAGCTTCGAGACCCCCAGAGCCAAGGCCCAGATGCCCACCATCGAGAGACTGAGCATGACCAGATACTTCTACCTGTTCCCCGGCAAC(Каспаза-4, N.del+домен DM; P2015 без эпитопной метки)
1397
ATGTCGTGGTCCCCCTCACTTACTACTCAAACTTGCGGCGCCTGGGAAATGAAGGAAAGACTCGGTACCGGGGGATTTGGAAACGTGATCCGGTGGCACAACCAAGAAACCGGAGAGCAAATTGCGATCAAGCAGTGTAGACAGGAACTGAGCCCTCGGAACAGAGAGCGGTGGTGCCTGGAGATTCAGATTATGCGCCGGCTGACCCATCCGAACGTGGTGGCTGCCAGGGATGTCCCGGAGGGCATGCAGAACCTGGCCCCTAACGACCTCCCACTCCTGGCCATGGAATACTGCCAGGGTGGCGATCTGCGGAAGTACCTTAACCAATTCGAAAACTGCTGTGGACTCAGGGAAGGGGCCATTCTGACTCTCTTGTCGGACATCGCCAGCGCCCTGAGATACCTCCACGAGAACAGAATCATCCATCGCGATCTGAAGCCGGAGAACATTGTGCTGCAACAGGGCGAACAGCGGCTGATCCACAAAATCATTGATCTCGGATATGCCAAGGAACTGGACCAGGGCGAACTCTGCACCGAATTCGTGGGCACTCTCCAGTACCTGGCACCCGAGTTGCTGGAGCAGCAGAAGTACACCGTCACCGTCGACTACTGGTCCTTCGGAACCCTCGCATTCGAATGTATCACTGGCTTCCGCCCTTTCCTGCCTAACTGGCAGCCTGTGCAGTGGCATTCGAAGGTCCGGCAGAAATCGGAGGTGGACATCGTGGTGTCCGAGGATCTGAACGGCACAGTGAAGTTCTCCTCCTCACTGCCTTACCCCAACAACCTCAACTCCGTGCTGGCCGAACGGCTGGAAAAGTGGCTCCAGCTTATGCTGATGTGGCATCCACGCCAGCGGGGTACTGATCCGACCTACGGTCCGAACGGGTGCTTCAAGGCCCTGGACGACATACTGAACCTCAAGCTCGTGCACATCCTCAATATGGTGACCGGCACGATCCATACTTACCCCGTCACCGAGGACGAATCGTTGCAGTCACTGAAGGCTCGGATCCAGCAGGACACCGGGATTCCCGAAGAGGACCAGGAACTTCTGCAGGAAGCGGGACTGGCGTTGATCCCCGACAAGCCTGCCACCCAGTGCATCTCTGACGGGAAGCTGAATGAAGGTCACACCCTGGATATGGACCTTGTGTTCCTGTTCGACAATTCCAAGATCACCTACGAGACTCAGATTAGCCCTAGGCCTCAGCCGGAATCCGTGTCGTGCATCCTGCAAGAACCGAAGCGGAATCTGGCGTTCTTTCAACTGCGGAAAGTGTGGGGCCAAGTCTGGCACAGCATTCAGACACTGAAGGAGGATTGCAACCGGCTGCAGCAAGGACAGCGCGCCGCTATGATGAATCTGCTGCGCAACAATTCCTGCCTCTCAAAAATGAAGAACTCCATGGCCTCGATGTCCCAGCAATTGAAGGCCAAGCTGGATTTCTTCAAGACCTCGATCCAGATCGACCTGGAAAAGTACAGCGAGCAGACCGAGTTCGGAATCACCTCCGACAAGCTGCTGTTGGCATGGCGGGAGATGGAACAAGCGGTGGAGCTGTGCGGACGCGAAAACGAGGTCAAACTGTTGGTGGAAAGAATGATGGCCCTGCAGACCGACATCGTGGACCTCCAGCGATCCCCTATGGGCCGGAAGCAGGGTGGCACCCTCGATGACCTGGAAGAACAGGCTCGGGAGCTGTACAGGCGCCTGCGGGAAAAGCCGCGGGACCAGAGAACTGAAGGGGATTCCCAGGAGATGGTGCGCCTGCTGCTTCAAGCCATCCAGTCATTCGAAAAGAAGGTCCGCGTGATCTACACCCAACTGAGCAAGACTGTGGTGTGCAAGCAGAAGGCCCTCGAACTGCTGCCGAAGGTGGAGGAGGTCGTGTCCCTGATGAACGAGGACGAAAAGACGGTCGTGAGACTCCAGGAAAAGAGACAGAAGGAACTGTGGAACCTTCTCAAGATTGCCTGCTCCAAAGTGCGCGGACCTGTGGCTGGAGCTCCCGACGCCATGAACGCCGCTAGACTCGCGCAGCCTGGACAGCTCATGGCCCAGCCCGCAACTGCAGCTAACGCCCTGCCCGAACCAGCGAAGAAGGCGGAGGAGCTTGTGGCGGAAGCCCACAACCTGTGCACCCTGCTCGAAAACGCCATCCAGGACACTGTGCGGGAACAAGACCAATCCTTCACCGCCCTGGATTGGTCATGGCTGCAGACTGAGGAAGAGGAGCACTCCTGTCTGGAGCAAGCCTCGЧеловеческая конститутивно активная IKK-бета (мутация PEST) P.4015 без эпитопной метки
1398
ATGAGCGCCGAGGTGATCCACCAGGTGGAGGAGGCCCTGGACACCGACGAGAAGGAGATGCTGCTGTTCCTGTGCAGAGACGTGGCCATCGACGTGGTGCCCCCCAACGTGAGAGACCTGCTGGACATCCTGAGAGAGAGAGGCAAGCTGAGCGTGGGCGACCTGGCCGAGCTGCTGTACAGAGTGAGAAGATTCGACCTGCTGAAGAGAATCCTGAAGATGGACAGAAAGGCCGTGGAGACCCACCTGCTGAGAAACCCCCACCTGGTGAGCGACTACAGAGTGCTGATGGCCGAGATCGGCGAGGACCTGGACAAGAGCGACGTGAGCAGCCTGATCTTCCTGATGAAGGACTACATGGGCAGAGGCAAGATCAGCAAGGAGAAGAGCTTCCTGGACCTGGTGGTGGAGCTGGAGAAGCTGAACCTGGTGGCCCCCGACCAGCTGGACCTGCTGGAGAAGTGCCTGAAGAACATCCACAGAATCGACCTGAAGACCAAGATCCAGAAGTACAAGCAGAGCGTGCAGGGCGCCGGCACCAGCTACAGAAACGTGCTGCAGGCCGCCATCCAGAAGAGCCTGAAGGACCCCAGCAACAACTTCAGACTGCACAACGGCAGAAGCAAGGAGCAGAGACTGAAGGAGCAGCTGGGCGCCCAGCAGGAGCCCGTGAAGAAGAGCATCCAGGAGAGCGAGGCCTTCCTGCCCCAGAGCATCCCCGAGGAGAGATACAAGATGAAGAGCAAGCCCCTGGGCATCTGCCTGATCATCGACTGCATCGGCAACGAGACCGAGCTGCTGAGAGACACCTTCACCAGCCTGGGCTACGAGGTGCAGAAGTTCCTGCACCTGAGCATGCACGGCATCAGCCAGATCCTGGGCCAGTTCGCCTGCATGCCCGAGCACAGAGACTACGACAGCTTCGTGTGCGTGCTGGTGAGCAGAGGCGGCAGCCAGAGCGTGTACGGCGTGGACCAGACCCACAGCGGCCTGCCCCTGCACCACATCAGAAGAATGTTCATGGGCGACAGCTGCCCCTACCTGGCCGGCAAGCCCAAGATGTTCTTCATCCAGAACTACGTGGTGAGCGAGGGCCAGCTGGAGGACAGCAGCCTGCTGGAGGTGGACGGCCCCGCCATGAAGAACGTGGAGTTCAAGGCCCAGAAGAGAGGCCTGTGCACCGTGCACAGAGAGGCCGACTTCTTCTGGAGCCTGTGCACCGCCGACATGAGCCTGCTGGAGCAGAGCCACAGCAGCCCCAGCCTGTACCTGCAGTGCCTGAGCCAGAAGCTGAGACAGGAGAGAAAGAGACCCCTGCTGGACCTGCACATCGAGCTGAACGGCTACATGTACGACTGGAACAGCAGAGTGAGCGCCAAGGAGAAGTACTACGTGTGGCTGCAGCACACCCTGAGAAAGAAGCTGATCCTGAGCTACACC (hu-cFLIP-L; P1006 без эпитопной метки)
1399
ATGAGCGCCGAGGTGATCCACCAGGTGGAGGAGGCCCTGGACACCGACGAGAAGGAGATGCTGCTGTTCCTGTGCAGAGACGTGGCCATCGACGTGGTGCCCCCCAACGTGAGAGACCTGCTGGACATCCTGAGAGAGAGAGGCAAGCTGAGCGTGGGCGACCTGGCCGAGCTGCTGTACAGAGTGAGAAGATTCGACCTGCTGAAGAGAATCCTGAAGATGGACAGAAAGGCCGTGGAGACCCACCTGCTGAGAAACCCCCACCTGGTGAGCGACTACAGAGTGCTGATGGCCGAGATCGGCGAGGACCTGGACAAGAGCGACGTGAGCAGCCTGATCTTCCTGATGAAGGACTACATGGGCAGAGGCAAGATCAGCAAGGAGAAGAGCTTCCTGGACCTGGTGGTGGAGCTGGAGAAGCTGAACCTGGTGGCCCCCGACCAGCTGGACCTGCTGGAGAAGTGCCTGAAGAACATCCACAGAATCGACCTGAAGACCAAGATCCAGAAGTACAAGCAGAGCGTGCAGGGCGCCGGCACCAGCTACAGAAACGTGCTGCAGGCCGCCATCCAGAAGAGCCTGAAGGACCCCAGCAACAACTTCAGACTGCACAACGGCAGAAGCAAGGAGCAGAGACTGAAGGAGCAGCTGGGCGCCCAGCAGGAGCCCGTGAAGAAGAGC (hu-cFLIP-S(1-227); P1007 без эпитопной метки)
1400
ATGAGCGCCGAGGTGATCCACCAGGTGGAGGAGGCCCTGGACACCGACGAGAAGGAGATGCTGCTGTTCCTGTGCAGAGACGTGGCCATCGACGTGGTGCCCCCCAACGTGAGAGACCTGCTGGACATCCTGAGAGAGAGAGGCAAGCTGAGCGTGGGCGACCTGGCCGAGCTGCTGTACAGAGTGAGAAGATTCGACCTGCTGAAGAGAATCCTGAAGATGGACAGAAAGGCCGTGGAGACCCACCTGCTGAGAAACCCCCACCTGGTGAGCGACTACAGAGTGCTGATGGCCGAGATCGGCGAGGACCTGGACAAGAGCGACGTGAGCAGCCTGATCTTCCTGATGAAGGACTACATGGGCAGAGGCAAGATCAGCAAGGAGAAGAGCTTCCTGGACCTGGTGGTGGAGCTGGAGAAGCTGAACCTGGTGGCCCCCGACCAGCTGGACCTGCTGGAGAAGTGCCTGAAGAACATCCACAGAATCGACCTGAAGACCAAGATCCAGAAGTACAAGCAGAGCGTGCAGGGCGCCGGCACCAGCTACAGAAACGTGCTGCAGGCCGCCATCCAGAAGAGCCTGAAGGAC(hu-cFLIP-p22(1-198); P1008 без эпитопной метки)- нуклеотид
1401
ATGAGCGCCGAGGTGATCCACCAGGTGGAGGAGGCCCTGGACACCGACGAGAAGGAGATGCTGCTGTTCCTGTGCAGAGACGTGGCCATCGACGTGGTGCCCCCCAACGTGAGAGACCTGCTGGACATCCTGAGAGAGAGAGGCAAGCTGAGCGTGGGCGACCTGGCCGAGCTGCTGTACAGAGTGAGAAGATTCGACCTGCTGAAGAGAATCCTGAAGATGGACAGAAAGGCCGTGGAGACCCACCTGCTGAGAAACCCCCACCTGGTGAGCGACTACAGAGTGCTGATGGCCGAGATCGGCGAGGACCTGGACAAGAGCGACGTGAGCAGCCTGATCTTCCTGATGAAGGACTACATGGGCAGAGGCAAGATCAGCAAGGAGAAGAGCTTCCTGGACCTGGTGGTGGAGCTGGAGAAGCTGAACCTGGTGGCCCCCGACCAGCTGGACCTGCTGGAGAAGTGCCTGAAGAACATCCACAGAATCGACCTGAAGACCAAGATCCAGAAGTACAAGCAGAGCGTGCAGGGCGCCGGCACCAGCTACAGAAACGTGCTGCAGGCCGCCATCCAGAAGAGCCTGAAGGACCCCAGCAACAACTTCAGACTGCACAACGGCAGAAGCAAGGAGCAGAGACTGAAGGAGCAGCTGGGCGCCCAGCAGGAGCCCGTGAAGAAGAGCATCCAGGAGAGCGAGGCCTTCCTGCCCCAGAGCATCCCCGAGGAGAGATACAAGATGAAGAGCAAGCCCCTGGGCATCTGCCTGATCATCGACTGCATCGGCAACGAGACCGAGCTGCTGAGAGACACCTTCACCAGCCTGGGCTACGAGGTGCAGAAGTTCCTGCACCTGAGCATGCACGGCATCAGCCAGATCCTGGGCCAGTTCGCCTGCATGCCCGAGCACAGAGACTACGACAGCTTCGTGTGCGTGCTGGTGAGCAGAGGCGGCAGCCAGAGCGTGTACGGCGTGGACCAGACCCACAGCGGCCTGCCCCTGCACCACATCAGAAGAATGTTCATGGGCGACAGCTGCCCCTACCTGGCCGGCAAGCCCAAGATGTTCTTCATCCAGAACTACGTGGTGAGCGAGGGCCAGCTGGAGGACAGCAGCCTGCTGGAGGTGGAC(hu-cFLIP-p43(1-376); P1009 без эпитопной метки)- нуклеотид
1402
ATGGGCCCCGCCATGAAGAACGTGGAGTTCAAGGCCCAGAAGAGAGGCCTGTGCACCGTGCACAGAGAGGCCGACTTCTTCTGGAGCCTGTGCACCGCCGACATGAGCCTGCTGGAGCAGAGCCACAGCAGCCCCAGCCTGTACCTGCAGTGCCTGAGCCAGAAGCTGAGACAGGAGAGAAAGAGACCCCTGCTGGACCTGCACATCGAGCTGAACGGCTACATGTACGACTGGAACAGCAGAGTGAGCGCCAAGGAGAAGTACTACGTGTGGCTGCAGCACACCCTGAGAAAGAAGCTGATCCTGAGCTACACC(hu-cFLIP-p12(377-480); P1010 без эпитопной метки)- нуклеотид
1403
ATGCAGCCCGACATGAGCCTGAACGTGATCAAGATGAAGAGCAGCGACTTCCTGGAATCGGCCGAGCTGGACAGCGGCGGCTTCGGCAAGGTGAGCCTGTGCTTCCACAGAACTCAGGGCCTGATGATCATGAAGACCGTGTACAAGGGCCCCAATTGCATCGAGCACAACGAGGCCTTACTGGAGGAGGCCAAGATGATGAACAGACTGAGACATTCGAGAGTGGTCAAGTTACTGGGCGTGATCATCGAGGAAGGCAAGTACAGCCTGGTGATGGAGTACATGGAAAAGGGCAACCTGATGCACGTGCTGAAGGCCGAGATGAGCACCCCCCTGAGCGTGAAGGGCAGAATCATCCTGGAGATTATCGAGGGGATGTGCTACCTGCACGGCAAGGGCGTGATCCACAAGGACCTGAAGCCGGAGAACATCCTGGTGGACAACGACTTCCACATCAAGATCGCCGACCTGGGCCTGGCCAGCTTTAAGATGTGGAGCAAGCTGAACAACGAGGAGCACAACGAGTTAAGAGAGGTGGACGGCACCGCCAAGAAGAACGGCGGCACCTTATACTACATGGCCCCCGAGCACCTGAACGATGTGAACGCCAAGCCCACCGAGAAGAGCGACGTGTACTCCTTTGCCGTGGTCCTGTGGGCCATCTTCGCCAACAAGGAGCCCTACGAGAACGCCATTTGCGAGCAGCAGCTGATCATGTGCATTAAGAGCGGCAACAGACCCGACGTGGACGACATCACCGAGTACTGCCCCAGAGAGATTATCAGCCTGATGAAGCTGTGCTGGGAGGCCAACCCCGAGGCTAGACCCACCTTCCCTGGGATCGAGGAGAAATTCAGACCCTTCTACCTGAGCCAGCTGGAGGAGAGCGTGGAAGAGGACGTGAAGAGCCTGAAGAAAGAGTACAGCAACGAGAACGCTGTGGTGAAGCGCATGCAGAGCCTGCAGCTGGACTGCGTGGCCGTCCCCAGCAGCAGAAGCAACAGTGCCACCGAGCAGCCGGGCTCGCTGCACTCCAGCCAGGGCCTGGGCATGGGCCCCGTGGAGGAGAGCTGGTTCGCCCCCTCGCTGGAGCACCCCCAGGAGGAGAACGAACCTAGCCTGCAGAGCAAGCTGCAGGACGAGGCCAACTACCACCTGTACGGCAGCAGAATGGACAGACAGACCAAGCAGCAACCAAGACAGAACGTGGCCTACAACAGAGAGGAGGAACGAAGAAGAAGAGTGAGCCACGACCCCTTCGCCCAGCAGAGACCCTACGAGAACTTCCAGAACACCGAGGGCAAGGGCACCGCCTATAGCAGCGCCGCCAGCCACGGCAACGCAGTGCACCAGCCCAGCGGCCTGACCTCTCAGCCCCAGGTGCTGTACCAGAATAATGGCCTGTATAGCAGCCACGGCTTCGGCACCAGACCCCTGGACCCAGGCACCGCCGGCCCTAGAGTGTGGTACAGACCCATCCCAAGCCACATGCCCAGCCTGCACAACATACCGGTGCCCGAGACAAACTACTTGGGCAACACCCCCACCATGCCCTTCAGCAGCCTGCCCCCCACAGACGAGAGCATCAAGTACACCATCTATAACAGCACCGGCATCCAGATCGGCGCCTACAACTATATGGAGATCGGCGGTACCAGCAGCAGCGGCGGCATCAAGAAGGAGATAGAGGCAATCAAGAAGGAGCAGGAGGCCATCAAGAAGAAGATCGAAGCCATCGAGAAGGAGATTGAGGCC (huRIPK1(1-555).IZ.TM; TH1021 без эпитопной метки) - нуклеотид
1404
ATGCAGCCCGACATGAGCCTGAATGTGATCAAGATGAAGAGCAGCGACTTCCTGGAGAGCGCCGAGCTGGATAGCGGCGGATTCGGCAAGGTGAGCCTGTGCTTCCACAGAACCCAAGGCCTGATGATCATGAAGACCGTGTACAAGGGACCCAACTGCATCGAGCACAACGAAGCCCTGTTAGAGGAAGCCAAGATGATGAATAGACTGCGTCACTCTAGGGTGGTTAAACTGCTGGGCGTGATCATCGAGGAGGGCAAGTACAGCCTGGTGATGGAGTACATGGAGAAGGGCAACCTTATGCACGTGCTGAAGGCCGAGATGTCCACCCCCCTGAGCGTGAAGGGCAGAATCATCCTGGAGATCATCGAGGGAATGTGTTATCTGCATGGCAAGGGCGTGATCCACAAAGACCTGAAGCCCGAGAACATCCTGGTGGACAACGATTTCCACATCAAGATCGCCGACCTGGGCCTGGCCAGCTTCAAGATGTGGAGCAAGCTGAACAACGAGGAGCACAACGAACTGAGAGAGGTGGATGGCACCGCCAAGAAAAACGGCGGCACCCTGTATTACATGGCCCCCGAGCACCTGAACGACGTGAACGCCAAGCCCACCGAGAAGAGCGACGTTTACAGCTTTGCCGTGGTGCTGTGGGCCATCTTCGCCAACAAGGAGCCCTACGAGAACGCCATCTGCGAGCAGCAGCTGATCATGTGCATCAAGAGCGGCAACAGACCCGACGTGGACGACATCACCGAGTACTGCCCCCGTGAGATCATTAGCCTGATGAAGCTGTGCTGGGAGGCCAACCCCGAGGCCAGACCCACCTTCCCCGGCATTGAGGAGAAGTTCAGACCCTTCTACCTGAGCCAGTTAGAGGAAAGCGTGGAGGAGGACGTGAAAAGCCTGAAGAAAGAGTACTCTAACGAGAACGCCGTGGTGAAACGCATGCAGAGCCTGCAGCTGGATTGCGTGGCCGTGCCCAGCTCCAGAAGCAACAGCGCCACCGAACAACCTGGCAGCCTGCACAGCTCCCAGGGCCTGGGCATGGGCCCCGTGGAGGAGAGCTGGTTCGCCCCCTCCCTGGAGCATCCGCAGGAGGAGAACGAGCCCTCTCTGCAGTCCAAGCTGCAAGACGAGGCCAACTACCACCTGTACGGCAGCAGAATGGACAGACAGACCAAGCAGCAACCCAGACAAAATGTGGCCTACAATAGAGAGGAGGAGAGAAGAAGAAGAGTGAGCCACGACCCTTTCGCCCAGCAGAGACCCTACGAGAACTTCCAGAATACCGAGGGCAAGGGTACCGCCTACAGCTCAGCGGCCTCGCACGGCAACGCCGTGCACCAGCCCAGCGGCCTGACCAGCCAGCCCCAGGTGCTGTACCAAAACAACGGCCTGTATAGCTCCCACGGCTTTGGCACCAGACCCCTGGACCCCGGCACCGCCGGCCCCAGAGTCTGGTATAGACCCATCCCCAGCCATATGCCTAGCCTGCACAACATCCCCGTGCCCGAGACCAACTACCTGGGCAATACCCCCACCATGCCGTTCAGCAGCTTACCCCCCACCGACGAGAGCATCAAGTACACCATCTACAACAGCACCGGCATCCAGATCGGCGCCTACAACTACATGGAAATCGGCGGAACCAGCAGCAGCGGCAGCGACGGCAGCGGCTCCGGAAGCGGAAGCATAACCATCAGGGCCGCCTTCCTGGAGAAGGAAAATACCGCGCTGAGAACAGAGATTGCCGAGTTAGAAAAGGAGGTGGGCAGATGCGAGAACATAGTGAGCAAGTACGAGACCAGATACGGCCCCCTG (huRIPK1(1-555).EE.DM; TH1022 без эпитопной метки) - нуклеотид
1405
ATGCAACCCGACATGAGCTTGAACGTGATCAAGATGAAGAGCAGCGATTTCCTGGAGAGCGCCGAGCTGGACAGCGGCGGCTTCGGCAAGGTGAGCCTGTGTTTCCACAGAACCCAGGGCCTGATGATCATGAAGACAGTGTACAAGGGCCCCAACTGCATCGAGCACAACGAGGCCCTGCTGGAGGAGGCTAAGATGATGAACAGACTGAGACACAGCAGAGTCGTGAAGCTGCTGGGCGTGATCATCGAAGAGGGCAAGTACAGCCTGGTGATGGAGTACATGGAGAAAGGCAACCTTATGCACGTGCTCAAGGCCGAGATGAGCACCCCTCTGAGCGTGAAGGGAAGAATCATCCTGGAGATCATCGAGGGCATGTGCTACCTGCACGGCAAGGGCGTCATCCATAAGGACCTGAAGCCCGAGAATATCCTTGTGGACAACGACTTCCATATCAAGATCGCCGACCTCGGCCTGGCCAGCTTCAAGATGTGGAGCAAGCTGAACAACGAGGAGCACAACGAGCTGAGAGAGGTAGACGGCACCGCCAAGAAAAATGGCGGCACCCTGTACTACATGGCTCCCGAGCACCTGAATGACGTGAACGCCAAGCCTACCGAAAAGAGCGACGTGTATAGCTTCGCCGTGGTGCTCTGGGCCATCTTCGCCAACAAGGAGCCTTATGAGAATGCAATCTGCGAGCAGCAGCTGATCATGTGCATCAAGAGCGGCAACAGACCCGACGTGGACGACATCACCGAATACTGCCCCAGAGAGATCATCAGCCTGATGAAGCTGTGCTGGGAGGCCAACCCCGAGGCCAGACCCACCTTCCCCGGCATTGAGGAGAAGTTCAGACCCTTCTACCTGAGCCAGTTGGAAGAGAGCGTGGAGGAGGACGTCAAAAGCCTGAAGAAGGAGTACAGCAACGAGAACGCCGTCGTGAAGAGAATGCAGAGCCTGCAGCTGGACTGCGTGGCCGTGCCTAGCAGCAGAAGCAACAGCGCCACCGAGCAGCCCGGCAGCCTGCACAGCAGCCAGGGCCTTGGAATGGGCCCCGTGGAGGAAAGCTGGTTCGCCCCCAGCCTTGAGCATCCGCAGGAGGAGAACGAGCCCAGCCTGCAGAGCAAGCTGCAGGACGAAGCCAACTATCACCTGTACGGCAGCAGAATGGACCGACAGACCAAGCAGCAGCCCAGACAGAACGTGGCCTATAACCGAGAGGAGGAGAGAAGAAGAAGGGTGAGCCACGACCCCTTCGCCCAACAGAGACCCTACGAGAACTTCCAGAACACCGAGGGCAAGGGCACCGCTTACAGTAGCGCCGCAAGCCACGGCAACGCCGTGCACCAACCTAGCGGACTGACCAGCCAGCCCCAGGTGCTGTACCAAAACAACGGTCTGTACAGCTCACACGGCTTCGGGACCAGACCCTTAGATCCCGGAACCGCCGGCCCCAGAGTATGGTATAGACCCATCCCCAGCCACATGCCCAGCTTGCACAACATCCCCGTGCCCGAGACCAACTACCTGGGCAACACCCCCACCATGCCCTTCAGCAGCCTGCCCCCCACCGACGAGAGCATCAAATATACCATCTACAACAGCACCGGAATCCAGATCGGGGCCTACAATTACATGGAGATCGGAGGCACCAGCAGCAGCGGCAGCGACGGTAGCGGAAGCGGCAGCGGCAGCCTCGAGATCAGAGCCGCCTTCCTGGAGAAGGAGAACACCGCCCTGAGAACCAGAGCCGCCGAACTGAGAAAGAGAGTGGGCAGATGCAGAAACATCGTGAGCAAGTACGAGACCAGATACGGCCCCCTG (huRIPK1(1-555).RR.DM; TH1023 без эпитопной метки) - нуклеотид
1406
ATGCAGCCTGACATGAGCCTGGACAATATCAAGATGGCCAGCAGCGACCTGCTCGAGAAGACCGACCTGGACAGTGGCGGCTTCGGAAAAGTGAGCCTGTGCTACCACAGGTCTCACGGGTTCGTGATCCTGAAGAAGGTGTACACCGGCCCCAACAGAGCCGAGTATAATGAGGTGCTGCTGGAGGAGGGCAAGATGATGCACAGACTGAGACATAGCAGAGTGGTGAAGCTGCTGGGCATCATCATCGAGGAGGGAAACTACAGCCTGGTTATGGAGTACATGGAGAAGGGCAACCTAATGCACGTGTTGAAGACCCAGATAGACGTGCCACTGAGCTTAAAGGGCAGAATCATCGTGGAGGCTATCGAGGGCATGTGCTACCTGCACGACAAGGGCGTGATCCACAAAGACCTGAAGCCCGAGAACATACTCGTGGATAGAGATTTCCACATCAAGATCGCCGACCTGGGCGTGGCCAGCTTCAAGACTTGGAGCAAGCTGACAAAGGAGAAGGACAACAAGCAGAAGGAGGTGAGCAGCACCACCAAGAAAAACAACGGCGGCACCCTGTACTACATGGCCCCTGAGCACCTGAACGACATCAACGCCAAGCCCACCGAGAAGAGCGACGTGTATAGCTTCGGCATCGTGCTGTGGGCCATCTTTGCTAAGAAAGAGCCCTACGAGAACGTGATCTGCACCGAGCAGTTCGTCATCTGCATCAAGAGCGGCAACAGACCCAATGTGGAGGAGATCCTGGAATACTGCCCCAGAGAGATCATCAGCCTCATGGAGAGATGCTGGCAGGCCATCCCTGAGGACAGACCCACCTTCCTGGGCATTGAGGAGGAGTTCAGACCCTTCTACCTGAGCCACTTCGAGGAGTACGTGGAGGAGGACGTGGCCAGTCTGAAAAAGGAGTATCCAGACCAGAGCCCCGTGCTGCAGAGAATGTTCAGCCTGCAGCACGACTGTGTGCCCCTGCCCCCCAGCAGAAGCAACAGCGAGCAGCCGGGCAGCCTGCACAGCAGCCAGGGCTTACAAATGGGACCCGTGGAGGAGAGCTGGTTCAGCAGTAGCCCCGAGTACCCCCAGGACGAGAACGACAGGTCGGTCCAGGCCAAGCTCCAGGAAGAGGCCAGCTACCACGCCTTCGGCATCTTCGCCGAGAAGCAAACCAAGCCCCAGCCCAGACAAAACGAAGCCTACAACAGAGAGGAAGAGAGAAAGAGACGCGTAAGCCACGACCCCTTTGCCCAACAGAGAGCCAGAGAAAACATCAAGAGCGCCGGCGCCCGGGGCCACTCGGATCCGAGCACCACTAGCAGAGGCATCGCTGTGCAGCAACTCAGCTGGCCCGCCACCCAGACCGTGTGGAACAACGGCCTGTACAACCAGCACGGCTTCGGCACCACCGGCACCGGCGTTTGGTACCCCCCCAACCTGTCGCAGATGTACAGCACCTACAAAACCCCCGTGCCCGAGACCAACATCCCCGGCAGCACCCCCACCATGCCCTATTTCAGCGGCCCCGTGGCCGACGACCTGATCAAGTACACCATCTTCAACAGCAGCGGCATCCAGATCGGCAACCACAATTACATGGACGTGGGCCTGAACAGCCAGCCACCCAACAACACCTGCAAGGAAGAAAGCACCAGCGGCGGCATCAAGAAGGAAATCGAGGCCATCAAGAAGGAGCAGGAAGCCATAAAGAAGAAAATCGAGGCCATCGAGAAGGAGATCGAGGCC (msRIPK1(1-555).IZ.TM; TH1024 без эпитопной метки) - нуклеотид
1407
ATGCAGCCCGACATGAGCCTGGACAACATTAAGATGGCCAGTAGCGACCTGCTGGAGAAGACCGACCTGGATAGCGGGGGCTTCGGCAAGGTGAGCCTGTGCTACCACAGAAGCCACGGATTCGTGATCCTGAAGAAGGTGTACACCGGCCCCAACAGAGCCGAGTACAACGAGGTGCTGCTGGAGGAGGGCAAGATGATGCATAGACTGAGACACAGCAGAGTGGTGAAACTGCTGGGGATCATCATCGAAGAGGGCAACTATAGCCTGGTGATGGAATACATGGAGAAGGGCAACCTGATGCACGTGCTGAAGACCCAGATCGACGTGCCCCTGAGCCTGAAGGGCAGAATCATCGTGGAGGCCATCGAGGGTATGTGCTACCTGCACGATAAGGGCGTGATCCACAAGGACCTGAAACCTGAAAACATCTTAGTGGACAGAGACTTCCACATCAAGATCGCCGACCTGGGAGTGGCTAGCTTCAAGACCTGGAGCAAACTGACCAAGGAGAAGGATAACAAGCAGAAGGAAGTGAGCAGCACCACCAAGAAAAACAACGGAGGCACCCTGTACTACATGGCCCCCGAGCATCTGAACGACATCAACGCCAAGCCCACCGAGAAGAGCGACGTGTACTCCTTCGGCATCGTCTTATGGGCCATCTTCGCCAAGAAGGAGCCCTACGAGAACGTGATCTGCACCGAACAGTTTGTGATCTGCATCAAGAGCGGCAATAGACCCAACGTGGAGGAGATCCTGGAGTACTGCCCCAGAGAGATCATCAGCCTGATGGAGAGGTGCTGGCAGGCTATCCCCGAGGACAGACCCACCTTTCTGGGCATCGAGGAAGAGTTCAGACCCTTCTATCTGAGCCACTTCGAGGAGTATGTTGAGGAGGACGTGGCCAGCCTGAAGAAGGAGTACCCCGACCAGAGCCCCGTGCTGCAGAGAATGTTCAGCCTGCAACACGATTGCGTGCCGCTGCCCCCCAGCAGATCGAATAGCGAGCAGCCAGGCAGCCTACACAGCAGTCAGGGCCTGCAGATGGGCCCCGTGGAGGAAAGCTGGTTCAGCAGCAGCCCCGAGTACCCCCAGGACGAGAATGACAGAAGCGTGCAAGCAAAGCTGCAAGAGGAGGCCAGCTACCACGCCTTCGGCATCTTCGCCGAGAAACAGACTAAGCCCCAGCCCAGACAGAACGAGGCCTACAACAGAGAGGAGGAGAGAAAAAGACGAGTGAGCCACGACCCCTTCGCCCAGCAGAGAGCCAGAGAGAATATCAAGAGCGCCGGCGCCAGAGGCCACAGCGACCCCAGCACCACCAGCAGAGGAATCGCCGTGCAGCAGCTGAGCTGGCCCGCCACCCAGACCGTGTGGAACAACGGCCTGTACAACCAGCACGGCTTTGGCACCACCGGCACCGGCGTGTGGTATCCCCCCAACCTGAGCCAGATGTACAGCACCTATAAAACCCCTGTGCCGGAGACCAATATCCCCGGCAGCACCCCTACCATGCCCTACTTCAGCGGCCCCGTGGCCGACGACCTGATCAAGTACACGATCTTCAACAGCAGCGGCATCCAGATAGGCAACCACAACTACATGGACGTGGGCCTGAACAGCCAACCCCCCAATAACACCTGCAAGGAGGAGTCCACCAGCGGCAGCGACGGCAGCGGCAGCGGCAGCGGCAGCATAACCATCAGAGCTGCTTTCCTGGAGAAGGAGAACACCGCTCTGAGAACCGAGATCGCCGAGCTGGAGAAGGAGGTCGGCAGATGCGAGAATATCGTGAGCAAGTACGAGACCAGATACGGACCCCTG (msRIPK1(1-555).EE.DM; TH1025 без эпитопной метки) - нуклеотид
1408
ATGCAGCCTGATATGAGCCTGGACAACATCAAGATGGCCAGCAGCGACTTGCTGGAGAAGACCGATCTGGACTCCGGCGGCTTTGGCAAGGTGAGCCTGTGTTACCACAGAAGCCACGGCTTCGTGATCCTGAAAAAGGTGTACACCGGCCCCAATAGAGCAGAGTACAACGAGGTGCTGCTGGAGGAGGGCAAGATGATGCACAGACTGAGGCATAGCAGAGTGGTGAAACTGCTGGGCATCATCATTGAGGAGGGCAACTACAGCCTGGTGATGGAGTACATGGAGAAGGGCAACCTGATGCATGTGCTGAAGACCCAAATCGACGTGCCCCTGTCGCTGAAGGGCAGAATCATCGTGGAGGCCATCGAGGGGATGTGCTACCTGCACGACAAGGGCGTGATCCACAAGGACCTGAAGCCCGAGAACATCCTGGTGGATAGAGACTTCCACATCAAGATCGCCGACCTGGGCGTTGCCAGCTTCAAGACCTGGTCTAAACTGACCAAGGAGAAAGACAACAAGCAGAAGGAGGTGAGCAGCACCACCAAGAAGAACAACGGCGGAACACTGTACTATATGGCCCCTGAGCACCTGAACGACATCAACGCCAAGCCCACCGAGAAAAGCGATGTTTACAGCTTCGGCATCGTGCTGTGGGCCATCTTCGCCAAGAAGGAGCCCTACGAGAACGTGATCTGCACCGAGCAGTTCGTGATCTGCATCAAGAGCGGCAACAGACCCAACGTGGAGGAAATCCTGGAGTACTGCCCCAGAGAGATCATCAGCCTGATGGAGAGATGCTGGCAGGCCATCCCCGAGGACCGTCCCACGTTCCTGGGCATCGAAGAGGAGTTCCGGCCCTTCTACCTGAGCCATTTCGAGGAGTATGTGGAGGAGGACGTGGCCAGCCTGAAGAAGGAGTACCCCGACCAGAGCCCAGTGCTGCAGAGAATGTTCAGCCTTCAACACGACTGCGTGCCCCTGCCTCCCTCAAGAAGCAACAGCGAGCAGCCCGGCAGCTTGCACAGCAGCCAGGGCCTGCAGATGGGCCCCGTGGAGGAGAGCTGGTTTAGCAGCAGCCCCGAGTACCCCCAGGACGAGAATGACAGAAGCGTGCAAGCCAAGTTACAGGAGGAGGCCAGCTACCACGCCTTTGGAATCTTCGCCGAGAAGCAGACCAAGCCCCAGCCCAGACAGAACGAGGCCTACAACAGAGAGGAGGAGAGAAAAAGAAGAGTGAGCCACGACCCCTTCGCCCAGCAGAGAGCCAGAGAGAACATTAAGAGCGCCGGCGCGAGAGGCCACAGCGACCCCAGCACCACAAGCAGAGGCATCGCCGTGCAGCAATTGAGCTGGCCCGCCACCCAGACCGTGTGGAACAACGGCCTGTATAACCAGCACGGCTTCGGAACCACCGGCACCGGCGTGTGGTACCCCCCCAATCTGAGCCAGATGTACAGCACTTACAAGACCCCCGTGCCCGAAACCAACATCCCCGGCAGCACCCCCACCATGCCCTACTTCAGCGGCCCCGTGGCCGACGACCTCATCAAGTACACAATATTTAACAGCAGCGGCATCCAGATCGGCAACCACAACTACATGGACGTGGGCCTGAACAGCCAGCCCCCGAACAATACCTGCAAGGAGGAGAGCACAAGCGGCTCTGACGGCAGCGGCAGCGGCAGCGGCTCACTGGAGATCAGAGCTGCCTTCCTGGAAAAGGAGAACACCGCTCTGAGAACCAGAGCCGCCGAGCTGCGAAAGAGAGTAGGCAGATGCAGAAACATCGTGAGCAAGTACGAGACCAGATACGGTCCCCTG (msRIPK1(1-555).RR.DM; TH1026 без эпитопной метки) - нуклеотид
1409
ATGAGCGCCGGCGACCCCAGAGTGGGCAGCGGCAGCCTGGACAGCTTCATGTTCAGCATCCCCCTGGTGGCCCTGAACGTGGGCGTGAGAAGAAGACTGAGCCTGTTCCTGAACCCCAGAACCCCCGTGGCCGCCGACTGGACCCTGCTGGCCGAGGAGATGGGCTTCGAGTACCTGGAGATCAGAGAGCTGGAGACCAGACCCGACCCCACCAGAAGCCTGCTGGACGCCTGGCAGGGCAGAAGCGGCGCCAGCGTGGGCAGACTGCTGGAGCTGCTGGCCCTGCTGGACAGAGAGGACATCCTGAAGGAGCTGAAGAGCAGAATCGAGGAGGACTGCCAGAAGTACCTGGGCAAGCAGCAGAACCAGGAGAGCGAGAAGCCCCTGCAGGTGGCCAGAGTGGAGAGCAGCGTGCCCCAGACCAAGGAGCTGGGCGGCATCACCACCCTGGACGACCCCCTGGGCCAGACCCCCGAGCTGTTCGACGCCTTCATCTGCTACTGCCCCAACGACATCGAGTTCGTGCAGGAGATGATCAGACAGCTGGAGCAGACCGACTACAGACTGAAGCTGTGCGTGAGCGACAGAGACGTGCTGCCCGGCACCTGCGTGTGGAGCATCGCCAGCGAGCTGATCGAGAAGAGATGCAGAAGAATGGTGGTGGTGGTGAGCGACGACTACCTGCAGAGCAAGGAGTGCGACTTCCAGACCAAGTTCGCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGTGCAGCAGAAGAGACCCATCCCCATCAAGTACAAGGCCATGAAGAAGGACTTCCCCAGCATCCTGAGATTCATCACCATCTGCGACTACACCAACCCCTGCACCAAGAGCTGGTTCTGGACCAGACTGGCCAAGGCCCTGAGCCTGCCC(myd88(L265P) человека; P4027 без эпитопной метки) - нуклеотид
1410
ATGGGCGTGGGCAAGAGCAAGCTGGACAAGTGCCCCCTGAGCTGGCACAAGAAGGACAGCGTGGACGCCGACCAGGACGGCCACGAGAGCGACAGCAAGAACAGCGAGGAGGCCTGCCTGAGAGGCTTCGTGGAGCAGAGCAGCGGCAGCGAGCCCCCCACCGGCGAGCAGGACCAGCCCGAGGCCAAGGGCGCCGGCCCCGAGGAGCAGGACGAGGAGGAGTTCCTGAAGTTCGTGATCCTGCACGCCGAGGACGACACCGACGAGGCCCTGAGAGTGCAGGACCTGCTGCAGAACGACTTCGGCATCAGACCCGGCATCGTGTTCGCCGAGATGCCCTGCGGCAGACTGCACCTGCAGAACCTGGACGACGCCGTGAACGGCAGCGCCTGGACCATCCTGCTGCTGACCGAGAACTTCCTGAGAGACACCTGGTGCAACTTCCAGTTCTACACCAGCCTGATGAACAGCGTGAGCAGACAGCACAAGTACAACAGCGTGATCCCCATGAGACCCCTGAACAGCCCCCTGCCCAGAGAGAGAACCCCCCTGGCCCTGCAGACCATCAACGCCCTGGAGGAGGAGAGCCAGGGCTTCAGCACCCAGGTGGAGAGAATCTTCAGAGAGAGCGTGTTCGAGAGACAGCAGAGCATCTGGAAGGAGACCAGAAGCGTGAGCCAGAAGCAGTTCATCGCC(мышиный TRAM (TICAM2); P4033 без эпитопной метки) - нуклеотид
1411
ATGAGCACCGCCAGCGCCGCCAGCTCAAGCTCCTCCTCTAGCGCCGGCGAGATGATCGAGGCCCCCAGCCAGGTGCTGAACTTCGAGGAGATCGACTACAAGGAAATCGAGGTGGAGGAGGTGGTGGGCAGAGGCGCCTTCGGCGTGGTGTGCAAGGCCAAGTGGAGAGCCAAGGACGTGGCCATCAAGCAGATCGAGAGCGAGTCCGAGAGAAAGGCCTTCATCGTGGAGCTGAGACAGCTGAGCAGAGTGAACCACCCCAACATCGTGAAGCTGTACGGCGCCTGCCTGAACCCCGTGTGCCTGGTGATGGAGTACGCCGAGGGCGGCAGCCTGTACAACGTGCTGCACGGCGCCGAGCCCCTGCCCTACTACACCGCCGCCCACGCCATGAGCTGGTGCCTGCAGTGCAGCCAGGGCGTGGCCTACCTGCACAGCATGCAGCCCAAGGCCCTGATCCACCGCGATCTGAAGCCCCCCAACCTGCTGCTGGTGGCCGGCGGCACCGTGCTGAAGATCTGCGACTTCGGCACCGCCTGCGACATCCAGACCCACATGACCAACAACAAGGGATCAGCTGCGTGGATGGCCCCCGAGGTGTTCGAGGGCAGCAACTACAGCGAGAAGTGCGACGTGTTCAGCTGGGGCATCATCCTGTGGGAGGTGATCACCAGAAGAAAGCCCTTCGACGAGATCGGCGGCCCCGCCTTCAGAATCATGTGGGCCGTGCACAACGGCACCAGACCGCCGCTGATCAAGAACCTGCCCAAGCCCATCGAGTCCCTGATGACCAGATGCTGGAGCAAGGACCCGAGCCAGAGGCCCAGCATGGAAGAGATCGTTAAGATCATGACCCACCTGATGAGATACTTCCCGGGCGCCGATGAACCGCTGCAGTACCCCTGCCAGGAGTTCGGCGGAGGCGGCGGCCAGAGCCCCACCCTGACCCTGCAGAGCACCAACACCCACACCCAGAGCAGCAGCAGTAGCAGCGACGGCGGCCTGTTCAGAAGCAGACCCGCCCACAGCCTGCCCCCCGGCGAGGACGGCAGAGTGGAGCCCTACGTGGACTTCGCCGAGTTCTACAGACTGTGGAGCGTGGACCACGGCGAGCAGAGCGTGGTGACCGCCCCC(TAK1-TAB1 человека; P4031 без эпитопной метки) - нуклеотид
1412
ATGGAGAACCTGAAGCACATCATCACCCTGGGCCAGGTGATCCACAAGAGATGCGAGGAGATGAAGTACTGCAAGAAGCAGTGCAGAAGACTGGGCCACAGAGTGCTGGGCCTGATCAAGCCCCTGGAGATGCTGCAGGACCAGGGCAAGAGAAGCGTGCCCAGCGAGAAGCTGACCACCGCCATGAACAGATTCAAGGCCGCCCTGGAGGAGGCCAACGGCGAGATCGAGAAGTTCAGCAACAGAAGCAACATCTGCAGATTCCTGACCGCCAGCCAGGACAAGATCCTGTTCAAGGACGTGAACAGAAAGCTGAGCGACGTGTGGAAGGAGCTGAGCCTGCTGCTGCAGGTGGAGCAGAGAATGCCCGTGAGCCCCATCAGCCAGGGCGCCAGCTGGGCCCAGGAGGACCAGCAGGACGCCGACGAGGACAGAAGAGCCTTCCAGATGCTGAGAAGAGACAACGAGAAGATCGAGGCCAGCCTGAGAAGACTGGAGATCAACATGAAGGAGATCAAGGAGACCCTGAGACAGTAC (нуклеотидная последовательность ОРС MLKL(1-180) человека; без эпитопной метки)
1413
ATGGAGCACGACCTTGAGAGAGGCCCTCCGGGCCCTAGAAGACCTCCTCGAGGTCCTCCACTTAGCAGCAGCTTGGGCCTCGCTCTCTTATTGTTGCTACTTGCCTTGTTGTTCTGGTTGTACATCGTGATGAGCGACTGGACCGGCGGCGCCCTTCTGGTGCTGTACAGCTTCGCCCTGATGCTGATCATTATCATACTGATTATCTTCATATTCAGAAGAGATCTGCTGTGCCCTCTGGGCGCCTTATGCATTCTGCTTTTGATGATCACTCTGCTCCTCATCGCACTCTGGAACCTGCACGGCCAGGCCCTGTTCCTGGGCATCGTGCTGTTCATCTTCGGCTGCCTCCTCGTGCTTGGAATCTGGATCTACCTGCTGGAGATGCTGTGGAGACTAGGTGCCACCATCTGGCAGCTGCTGGCCTTCTTCCTGGCATTCTTCTTAGACCTGATTCTGCTCATTATTGCCCTATACCTGCAGCAGAACTGGTGGACCCTACTCGTTGATCTCCTGTGGCTACTGCTGTTCCTTGCTATCCTGATTTGGATGTACTACCACGGACAAAGACCTTTCGCCGAGGACAAGACCTACAAGTACATCTGCAGAAACTTCAGCAACTTCTGCAACGTGGACGTGGTGGAGATCCTGCCTTACCTGCCTTGCCTGACCGCCAGGGACCAGGACAGACTGAGAGCCACCTGCACCCTGAGCGGCAACAGAGACACCCTGTGGCACCTGTTCAACACCCTGCAGAGGCGCCCTGGCTGGGTGGAGTACTTCATCGCCGCCCTGAGAGGCTGCGAGTTGGTTGACCTCGCCGACGAGGTGGCCAGCGTGTACCAGAGCTACCAGCCTAGAACCAGCGACAGGCCGCCTGACCCTCTGGAGCCTCCTAGCCTGCCTGCCGAACGGCCTGGCCCACCTACCCCTGCCGCCGCCCACAGCATCCCTTACAACTCCTGTCGGGAGAAGGAGCCTAGCTACCCTATGCCTGTGCAGGAAACGCAGGCCCCAGAAAGTCCTGGCGAGAACAGCGAGCAGGCCTTGCAGACTCTGAGCCCTAGAGCCATCCCTAGAAACCCTGACGGCGGTCCTCTCGAGAGTTCCAGCGACCTGGCTGCACTCTCCCCACTGACCAGCAGCGGCCACCAGGAGCAGGACACCGAGCTGGGCAGCACCCACACCGCCGGCGCTACCTCAAGCCTTACCCCTAGCCGGGGCCCAGTCAGCCCTAGCGTGAGCTTCCAGCCTCTGGCCAGAAGCACACCAAGAGCCAGCAGACTTCCAGGACCAACCGGCAGCGTGGTGAGCACCGGCACCAGCTTCAGTTCCTCTAGCCCAGGCTTAGCCAGCGCCGGAGCGGCCGAGGGCAAGCAGGGCGCCGAGAGCGACCAGGCCGAGCCTATCATCTGTTCCTCGGGTGCCGAGGCCCCTGCCAACAGCCTACCTAGCAAGGTGCCTACCACACTGATGCCAGTTAACACCGTGGCCCTGAAGGTTCCAGCCAACCCTGCTTCCGTTTCTACAGTGCCGTCCAAGCTGCCGACGTCATCCAAGCCTCCGGGAGCCGTGCCATCTAACGCCCTGACCAATCCAGCTCCAAGCAAGCTCCCAATCAACAGCACCAGAGCCGGCATGGTGCCTTCAAAGGTGCCGACCTCCATGGTGCTGACCAAGGTGAGCGCCTCTACCGTGCCAACCGACGGATCTTCTCGGAACGAGGAGACACCTGCTGCTCCTACTCCAGCGGGCGCAACTGGAGGCTCCTCGGCTTGGCTGGACAGTTCTAGCGAGAATAGAGGCCTGGGTAGTGAGCTGAGTAAGCCGGGCGTGCTCGCAAGCCAGGTGGACAGCCCTTTCAGCGGCTGCTTCGAAGACCTTGCAATTTCCGCATCTACCAGTCTAGGCATGGGCCCTTGCCACGGCCCTGAGGAGAACGAGTACAAGAGCGAGGGCACCTTCGGCATCCACGTGGCCGAGAACCCTAGCATCCAGCTGCTTGAGGGCAATCCTGGACCACCAGCCGATCCTGATGGCGGACCTAGACCTCAGGCCGACAGAAAGTTCCAGGAGAGAGAGGTGCCTTGTCATAGACCTTCCCCAGGCGCTCTTTGGCTGCAGGTGGCCGTGACCGGTGTCCTCGTCGTGACATTACTGGTGGTGCTCTACAGAAGAAGACTGCAC (нуклеотидная последовательность ОРС CA-hMAVS; без эпитопной метки)
1414
ATGAGCTGGTCCCCAAGCCTCACGACCCAGACCTGCGGCGCTTGGGAGATGAAGGAGAGACTGGGCACGGGGGGCTTTGGCAACGTGATCAGATGGCATAATCAGGAAACCGGAGAGCAGATTGCTATCAAGCAGTGTAGACAGGAGCTAAGCCCCCGCAATAGAGAGAGGTGGTGCCTGGAAATTCAGATTATGAGAAGACTGACCCATCCCAATGTGGTCGCCGCAAGAGACGTCCCCGAAGGCATGCAGAACCTGGCCCCCAATGACCTGCCTCTTCTGGCCATGGAATACTGCCAGGGCGGCGACCTGCGGAAGTACCTGAATCAGTTTGAAAATTGCTGCGGCCTGAGAGAGGGCGCCATATTGACACTGCTGAGCGACATCGCCAGCGCCCTGAGATACCTGCACGAGAACAGAATAATTCACAGAGACCTGAAGCCGGAGAATATTGTGCTGCAGCAGGGTGAACAGAGGCTCATCCATAAGATCATCGACCTGGGGTACGCCAAGGAGCTGGATCAGGGCGAGCTGTGTACCGAGTTTGTGGGGACTCTGCAATACCTGGCCCCCGAGCTCCTGGAACAGCAGAAGTACACCGTCACAGTGGATTATTGGAGCTTCGGCACGCTGGCCTTCGAGTGCATCACGGGCTTTAGGCCGTTTCTGCCCAATTGGCAGCCCGTGCAATGGCACAGCAAGGTCAGACAGAAAAGCGAGGTCGACATCGTAGTGAGCGAAGACCTGAACGGCACTGTCAAGTTCAGTAGCTCCCTCCCCTACCCTAACAATCTGAACAGCGTGCTGGCAGAGCGGCTGGAGAAGTGGCTACAACTAATGCTGATGTGGCACCCCCGACAGCGTGGCACCGACCCCACCTACGGGCCCAACGGATGCTTCAAGGCCCTGGACGACATTCTCAACCTGAAGCTGGTGCACATCTTGAATATGGTGACCGGCACCATCCACACCTACCCCGTGACCGAAGACGAAAGCTTGCAGAGCCTGAAGGCCAGAATTCAACAGGACACAGGCATCCCCGAAGAGGATCAAGAGCTGCTGCAGGAAGCCGGCCTGGCTTTGATTCCCGACAAACCAGCCACCCAGTGCATTAGCGACGGCAAGCTGAACGAGGGCCACACCCTGGACATGGACCTGGTGTTCCTGTTCGACAACAGCAAGATTACCTACGAGACCCAAATCAGCCCAAGGCCCCAACCCGAGAGCGTGAGCTGCATCCTGCAAGAGCCCAAGAGGAATCTGGCCTTCTTCCAACTAAGAAAGGTGTGGGGCCAAGTGTGGCACAGCATCCAGACTCTGAAGGAAGACTGCAATAGACTGCAACAAGGACAGCGAGCCGCCATGATGAACCTGTTAAGAAACAACAGCTGCTTATCTAAGATGAAGAACAGCATGGCCTCCATGAGCCAGCAGCTGAAAGCCAAACTGGATTTCTTCAAGACCAGCATCCAGATCGACCTGGAGAAGTACAGCGAGCAGACGGAGTTCGGGATCACCAGCGACAAGCTGCTGCTGGCTTGGAGGGAAATGGAACAGGCCGTGGAGCTGTGCGGCAGAGAGAACGAGGTTAAACTGCTGGTAGAGCGGATGATGGCCCTGCAGACCGACATTGTAGACCTCCAGAGAAGCCCTATGGGAAGAAAACAGGGCGGAACACTGGACGACCTGGAGGAGCAGGCTAGAGAGCTGTACAGAAGACTTAGAGAGAAGCCCAGAGACCAAAGAACCGAGGGCGACAGCCAGGAGATGGTGAGACTGCTGCTACAGGCTATTCAAAGTTTCGAGAAGAAAGTGAGAGTGATCTACACCCAACTCAGCAAAACCGTGGTGTGTAAGCAGAAGGCCCTGGAGCTGCTGCCCAAGGTTGAGGAGGTTGTCAGCCTGATGAATGAGGATGAGAAGACCGTGGTGAGACTGCAAGAGAAAAGGCAGAAAGAACTGTGGAACCTTTTAAAGATTGCCTGCAGCAAGGTGAGGGGCCCTGTATCAGGATCCCCCGACTCTATGAACGCCAGCAGACTGAGCCAGCCCGGTCAACTGATGAGCCAGCCCTCTACCGCCAGCAACTCCCTGCCCGAGCCAGCCAAGAAGAGCGAGGAACTGGTGGCCGAGGCCCACAATCTGTGCACCCTACTGGAGAACGCCATTCAGGACACCGTTCGCGAGCAGGACCAGAGCTTCACCGCCCTGGACTGGAGCTGGCTGCAGACTGAGGAGGAAGAGCACAGCTGCCTGGAGCAGGCCAGC(huIKK2ca(S177E/S181E); P4005 без эпитопной метки) - нуклеотид
1415
ATGAGCAGCGTGAAGCTCTGGCCCACCGGCGCCAGCGCCGTGCCCCTAGTGAGCCGGGAGGAGCTTAAGAAGCTCGAGTTCGTGGGCAAGGGCGGCTTCGGCGTGGTGTTCCGGGCCCACCACCGGACCTGGAACCACGACGTGGCCGTGAAGATCGTGAACAGCAAGAAGATCAGCTGGGAGGTGAAGGCCATGGTGAACCTGCGGAACGAGAACGTGTTGCTGCTGCTGGGCGTGACCGAGGACCTGCAGTGGGACTTCGTGAGCGGCCAGGCCTTGGTTACCCGGTTCATGGAGAACGGCAGCCTGGCCGGCCTGCTGCAGCCCGAGTGCCCCCGGCCCTGGCCCCTGCTGTGCCGGCTACTGCAGGAGGTGGTGCTGGGCATGTGCTACCTGCACAGCCTGAACCCCCCACTTCTGCACCGGGACCTGAAGCCCAGCAACATCCTGCTGGACCCCGAGCTGCACGCCAAGCTGGCCGACTTCGGCCTGAGCACCTTCCAGGGCGGCAGCCAGAGCGGCTCCGGATCTGGCAGCGGAAGCCGGGACAGCGGCGGCACCCTGGCCTACCTGGACCCAGAGCTGCTGTTCGACGTGAACCTCAAGGCCAGCAAGGCCTCCGACGTGTACAGCTTCGGCATCCTGGTGTGGGCCGTGCTGGCTGGAAGGGAGGCCGAGCTGGTGGACAAGACCAGCCTGATCCGGGAGACAGTGTGCGACCGGCAGAGCCGGCCTCCTCTCACCGAACTGCCCCCCGGCAGCCCCGAGACTCCTGGCCTGGAGAAGCTGAAGGAGCTCATGATCCACTGCTGGGGCTCCCAGAGCGAGAACCGGCCCAGCTTCCAGGACTGCGAGCCCAAGACCAACGAGGTGTACAACCTGGTGAAGGACAAGGTGGACGCCGCCGTGAGCGAGGTCAAGCACTACCTGAGCCAGCACCGGAGCAGCGGCCGGAACCTGAGCGCCCGGGAGCCCAGCCAGCGGGGCACCGAGATGGACTGTCCTCGCGAGACAATGGTGAGCAAGATGCTGGATCGGCTGCACCTGGAGGAGCCTTCAGGCCCCGTGCCCGGCAAGTGTCCTGAGAGACAGGCCCAGGACACCAGCGTGGGCCCTGCCACCCCTGCACGGACCAGCAGCGACCCCGTGGCCGGCACCCCCCAGATCCCCCACACCCTGCCCTTCAGAGGCACCACTCCAGGCCCGGTGTTCACGGAGACACCTGGACCACACCCCCAGCGGAACCAGGGCGACGGTAGACACGGCACACCATGGTACCCATGGACACCTCCTAACCCCATGACCGGTCCACCTGCCCTGGTGTTCAACAACTGCAGCGAGGTGCAGATCGGCAACTACAACAGCCTGGTGGCCCCTCCTAGGACCACCGCCAGCAGCAGCGCCAAGTACGATCAGGCACAGTTCGGCCGGGGCAGAGGTTGGCAGCCCTTCCACAAGGGAGGAATCAAGAAGGAGATCGAGGCCATTAAGAAGGAACAGGAAGCTATAAAGAAGAAGATTGAAGCTATCGAGAAGGAAATTGAGGCC(muRIPK3-IZ.Trimer; TH1015 без эпитопной метки) - нуклеотид
1416
ATGGCCGCTCTGAAGTCATGGCTCTCAAGAAGTGTGACCAGCTTCTTCAGGTATAGGCAGTGCCTGTGCGTGCCGGTCGTTGCTAACTTTAAAAAACGCTGTTTCAGCGAGCTGATTCGCCCATGGCACAAAACCGTGACCATCGGGTTCGGAGTCACACTGTGCGCTGTCCCAATCGCACAAGCTGTGTATACGCTTACCTCACTTTACAGACAGTACACATCTTTGCTGGGAAAGATGAATTCTGAGGAGGAAGACGAGGTGTGGCAAGTTATTATTGGCGCCAGAGCCGAAATGACATCGAAGCATCAGGAATACCTGAAACTTGAGACCACATGGATGACGGCAGTCGGACTCTCCGAGATGGCAGCCGAAGCAGCCTACCAGACAGGTGCCGACCAGGCTAGCATCACAGCTCGGAACCATATCCAATTGGTAAAGCTGCAGGTCGAAGAGGTCCACCAACTAAGCCGAAAAGCCGAAACCAAACTGGCTGAAGCCCAGATTGAAGAACTGCGGCAAAAAACCCAGGAAGAGGGCGAGGAGCGAGCCGAATCTGAGCAAGAAGCTTATCTGCGGGAAGAT(Diablo.3; TH2003 без эпитопной метки) - нуклеотид
1417
ATGGGCTGCGTGTGCAGCAGCAACCCCGAGGACGACTGGATGGAGAACGGCGGCATCAAGAAGGAGATAGAAGCCATTAAGAAAGAGCAGGAGGCCATCAAGAAGAAGATCGAGGCCATCGAGAAGGAGATCGAAGCCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCAGTGGCGGCGGCAGCGACCCCTTCCTGGTGCTGCTGCACAGCTTAAGCGGCAGCCTGAGCGGCAACGACCTGATGGAGCTGAAGTTCCTGTGTAGAGAGAGAGTGAGCAAGAGAAAGCTGGAGAGAGTGCAGAGCGGCCTGGACCTGTTCACCGTGCTGCTGGAGCAGAACGACCTGGAAAGAGGCCACACCGGCTTGCTGAGAGAGTTGCTGGCCTCACTGAGAAGACACGATCTGCTGCAGAGACTGGACGACTTCGAGGCCGGCACCGCCACCGCCGCCCCCCCCGGAGAAGCCGACCTGCAGGTGGCCTTCGACATCGTGTGCGACAACGTGGGCAGAGACTGGAAGAGATTGGCCAGAGAGCTGAAGGTGAGCGAGGCCAAGATGGACGGCATCGAGGAGAAGTACCCCAGAAGCCTGAGCGAGAGAGTGAGAGAGAGCCTGAAGGTGTGGAAGAACGCCGAGAAGAAGAACGCCAGCGTGGCTGGGCTGGTGAAGGCCCTGAGAACCTGCAGACTGAACCTGGTGGCCGATCTGGTGGAGGAGGCCCAGGAGAGCGTGAGCAAGAGCGAGAACATGAGCCCCGTGCTGAGAGACAGCACCGTGAGTAGCAGCGAGACCCCC(Myr(Lck)-IZ-L-msFADD; TH3002 без эпитопной метки) - нуклеотид
1418
ATGGGCTGCGTGTGCAGCAGCAACCCCGAGGACGACTGGATGGAGAACGGCGGCATCAAAAAGGAGATCGAGGCCATCAAGAAGGAGCAGGAGGCCATCAAGAAGAAGATCGAGGCCATCGAGAAAGAGATAGAGGCCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCCCCGGCGAGGAGGACCTGTGCGCCGCCTTCAACGTGATCTGCGACAACGTGGGCAAGGACTGGAGAAGACTGGCCAGACAGCTGAAGGTGAGCGACACCAAGATCGACAGCATCGAGGACAGATACCCCAGAAACCTGACCGAGAGAGTGAGAGAGAGCCTGAGAATCTGGAAGAACACCGAGAAGGAGAACGCCACCGTGGCCCACCTGGTGGGCGCCCTGAGAAGCTGCCAGATGAACCTGGTGGCCGACCTGGTGCAGGAGGTGCAGCAGGCCAGAGACCTGCAGAACAGAAGCGGCGCCATGAGCCCCATGAGCTGGAACAGC(Myr(Lck)-IZ-L-huFADD-DD; TH3003 без эпитопной метки) - нуклеотид
1419
ATGGGCTGCGTGTGCAGCAGCAACCCCGAGGACGACTGGATGGAGAACGGCGGCATCAAGAAAGAGATCGAGGCCATCAAAAAGGAGCAGGAGGCCATCAAGAAGAAGATCGAGGCCATCGAGAAGGAGATCGAGGCCGGCTCTGGCGGCGGCAGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCCCCCCCGGCGAGGCCGACTTACAGGTGGCCTTCGACATCGTGTGCGACAACGTGGGCAGAGACTGGAAGAGACTGGCCAGAGAGCTGAAGGTGAGCGAGGCCAAGATGGACGGCATCGAGGAGAAGTACCCCAGAAGCCTGAGCGAGAGAGTGAGAGAGAGCCTGAAGGTGTGGAAGAACGCCGAGAAGAAGAACGCCAGCGTGGCCGGCCTGGTGAAGGCCCTGAGAACCTGCAGACTGAACCTGGTGGCCGACCTGGTGGAGGAGGCCCAGGAGAGCGTGAGCAAGAGCGAGAACATGAGCCCCGTGCTGAGAGACAGCACCGTGAGC(Myr(Lck)-IZ-L-msFADD-DD; TH3004 без эпитопной метки) - нуклеотид
1420
ATGGGCCAGACCGTGACCACCCCCCTGAGCCTCACCCTGGATCACTGGGGCGGCATCAAGAAAGAGATCGAGGCCATCAAGAAGGAGCAGGAGGCCATCAAGAAGAAGATCGAAGCCATCGAGAAGGAGATCGAGGCCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGACCCCTTCCTGGTGCTGCTGCACAGCGTGTCCAGCAGCCTGAGCAGCAGCGAGCTGACCGAGCTGAAGTTCCTGTGCCTGGGCAGAGTGGGCAAAAGAAAGCTGGAGAGAGTGCAGAGCGGCCTGGACCTCTTCAGCATGCTGCTGGAGCAGAACGACTTGGAGCCCGGCCACACCGAGCTGCTGAGAGAGCTGCTGGCCAGCCTGCGGAGACACGACCTGCTGAGAAGAGTGGATGACTTCGAGGCCGGCGCCGCCGCCGGCGCCGCCCCCGGCGAGGAGGACCTGTGCGCCGCCTTCAACGTGATCTGCGACAACGTGGGCAAGGATTGGAGAAGATTAGCCAGACAGCTGAAGGTGAGTGACACCAAGATTGACAGCATCGAGGACAGATACCCCAGAAACCTGACCGAGAGAGTCAGAGAGAGCCTGAGAATCTGGAAGAATACCGAGAAGGAGAACGCCACCGTGGCCCACCTGGTGGGCGCCCTGAGAAGCTGCCAGATGAACCTGGTGGCCGACCTGGTGCAGGAGGTGCAGCAGGCCAGAGACCTGCAGAACAGAAGCGGCGCCATGAGCCCCATGAGCTGGAACAGCGACGCCAGCACCAGCGAGGCCAGC(Myr(MMSV)-IZ-L-huFADD; TH3005 без эпитопной метки) - нуклеотид
1421
ATGGGCCAGACAGTGACCACCCCCCTGTCCCTGACCTTGGACCACTGGGGCGGCATCAAGAAGGAGATCGAGGCCATCAAGAAGGAGCAGGAGGCCATCAAAAAGAAGATCGAAGCCATTGAGAAGGAGATCGAGGCCGGAAGCGGGGGCGGCAGCGGCAGCGGCGGAGGAAGCGACCCCTTCCTGGTGCTGCTGCATAGCCTGTCAGGCAGCCTGAGCGGCAACGATCTGATGGAGCTGAAGTTCCTGTGCCGCGAGAGAGTGAGCAAGAGAAAGCTGGAGAGAGTACAGAGCGGCCTGGACCTGTTCACCGTGCTGCTGGAGCAGAATGACCTGGAGAGAGGCCACACCGGCTTGCTGAGAGAGTTGCTGGCCAGCCTGAGAAGGCACGACCTGCTGCAGAGACTGGACGACTTCGAGGCCGGCACCGCCACCGCCGCCCCCCCCGGCGAAGCGGACCTGCAGGTGGCCTTCGACATCGTGTGCGACAACGTGGGCAGAGACTGGAAGAGACTGGCCAGAGAACTGAAGGTGAGCGAGGCCAAAATGGACGGCATCGAGGAGAAGTACCCCAGAAGCCTGAGCGAGAGAGTGAGAGAGAGCCTGAAGGTGTGGAAGAACGCCGAGAAGAAGAACGCCAGCGTGGCCGGCCTGGTGAAGGCCCTGAGAACATGCAGACTGAACCTGGTGGCCGATCTTGTGGAGGAGGCCCAGGAGAGCGTGAGCAAGAGCGAAAACATGAGCCCCGTGCTGAGAGACAGCACCGTGAGCAGCAGCGAGACCCCC(Myr(MMSV)-IZ-L-msFADD; TH3006 без эпитопной метки) - нуклеотид
1422
ATGGGCCAGACCGTGACCACCCCCCTGAGCCTGACCCTGGACCACTGGGGCGGCATCAAGAAGGAGATCGAGGCCATCAAGAAGGAGCAGGAGGCCATCAAGAAGAAGATTGAGGCTATCGAGAAGGAGATCGAGGCCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCCCCGGCGAGGAGGACCTGTGCGCCGCCTTCAACGTGATCTGCGACAACGTGGGCAAGGACTGGAGAAGACTGGCCAGACAGCTGAAGGTGAGCGACACCAAGATCGACAGCATCGAGGACAGATACCCCAGAAACCTGACCGAGAGAGTGAGAGAGAGCCTGAGAATCTGGAAGAACACCGAGAAGGAGAACGCCACCGTGGCCCACCTGGTGGGCGCCCTGAGAAGCTGCCAGATGAACCTGGTGGCCGACCTGGTGCAGGAGGTGCAGCAGGCCAGAGACCTGCAGAACAGAAGCGGCGCCATGAGCCCCATGAGCTGGAACAGC(Myr(MMSV)-IZ-L-huFADD-DD; TH3007 без эпитопной метки) - нуклеотид
1423
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC(5'-НТО)
1424
UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(3'-НТО)
1425
UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCCAAACACCAUUGUCACACUCCAUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(3'-НТО с сайтами mi-122 и mi-142-3p)
1426
GGAAGCGGAGCUACUAACUUCAGCCUGCUGAAGCAGGCUGGAGACGUGGAGGAGAACCCUGGACCU(Нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид 2А)
1427
UCCGGACUCAGAUCCGGGGAUCUCAAAAUUGUCGCUCCUGUCAAACAAACUCUUAACUUUGAUUUACUCAAACUGGCUGGGGAUGUAGAAAGCAAUCCAGGUCCACUC(Нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид 2А)
1428
AUGGAACGCCCCCCUGGACUGAGGCCUGGAGCAGGAGGACCCUGGGAAAUGCGCGAACGGCUGGGUACUGGUGGUUUCGGCAACGUGUGCCUCUACCAGCAUCGGGAGUUGGACCUGAAGAUCGCCAUCAAGUCCUGCCGCCUGGAGCUGUCGACCAAGAACCGGGAACGCUGGUGUCAUGAAAUCCAGAUUAUGAAAAAGCUGAACCACGCUAACGUGGUCAAAGCUUGCGACGUGCCCGAAGAACUGAAUAUCCUGAUCCACGAUGUGCCCCUCCUCGCAAUGGAGUACUGCAGCGGAGGCGAUCUCCGGAAGCUGCUCAACAAGCCGGAGAACUGCUGUGGCCUUAAAGAGAGCCAGAUUCUGAGCCUUCUGUCGGACAUCGGCUCGGGUAUCCGAUAUCUUCACGAGAACAAGAUUAUUCACAGAGAUCUGAAGCCAGAGAACAUCGUGCUGCAAGAUGUCGGAGGAAAGAUCAUUCAUAAGAUCAUCGACCUGGGAUACGCCAAGGACGUGGAUCAAGGCGAACUGUGCACCGAAUUCGUGGGAACCCUCCAGUACCUGGCCCCGGAACUGUUCGAAAACAAACCCUACACCGCCACCGUGGACUACUGGUCCUUUGGAACUAUGGUGUUCGAGUGUAUAGCUGGCUACCGGCCAUUUCUCCAUCACUUGCAGCCCUUCACCUGGCACGAAAAGAUCAAGAAGAAGGACCCCAAGUGCAUUUUCGCGUGCGAAGAGAUGUCGGGGGAAGUGCGCUUCUCGUCCCACUUGCCCCAGCCCAACUCCCUGUGCUCCCUGGUGGUCGAACCGAUGGAAAACUGGCUGCAACUGAUGCUGAACUGGGAUCCUCAACAGCGCGGUGGACCAGUGGAUCUGACUCUGAAGCAGCCCAGAUGCUUCGUGCUGAUGGACCAUAUCCUGAACCUCAAGAUCGUCCACAUCCUGAACAUGACCUCCGCCAAGAUCAUUUCCUUCCUCCUCCCGCCCGAUGAGAGCCUGCACUCACUGCAGUCCAGAAUCGAGAGGGAAACCGGUAUUAACACUGGGUCACAGGAACUCCUGUCCGAAACCGGAAUCUCUCUGGACCCUCGCAAGCCAGCAUCCCAGUGCGUCCUGGAUGGGGUCAGGGGAUGCGACUCGUACAUGGUCUACCUCUUCGAUAAGUCAAAGACCGUCUACGAGGGACCCUUUGCCAGCCGGAGCCUGUCAGACUGCGUGAACUACAUCGUGCAGGACUCUAAGAUUCAGCUGCCAAUUAUCCAGCUCCGGAAAGUCUGGGCAGAAGCGGUGCACUACGUGUCCGGACUGAAAGAGGACUACUCCCGGCUGUUCCAGGGCCAGAGGGCAGCCAUGCUGUCCCUGCUCCGCUACAACGCCAACCUCACGAAGAUGAAGAACACCCUGAUCUCCGCGUCACAACAACUGAAGGCCAAGCUGGAAUUCUUCCACAAGUCCAUUCAAUUGGAUCUGGAGCGGUACUCCGAGCAGAUGACUUACGGCAUUAGCUCCGAAAAGAUGCUCAAGGCCUGGAAGGAGAUGGAGGAGAAGGCCAUUCAUUAUGCCGAAGUGGGGGUGAUCGGAUACCUGGAGGAUCAGAUCAUGUCCCUUCAUGCCGAGAUUAUGGAACUCCAGAAGUCCCCGUACCGGAGGCAGGGCGAUUUGAUGGAGAGCUUGGAACAACGCGCCAUCGACCUGUACAAGCAGCUCAAGCACAGACCGAGCGACCACUCGUACUCCGACUCGACUGAGAUGGUGAAAAUUAUCGUGCACACCGUGCAGUCCCAAGACCGGGUCCUGAAGGAGCUGUUCGGACACCUGAGCAAGCUGCUGGGGUGCAAGCAAAAGAUCAUUGACCUUCUGCCAAAAGUGGAGGUGGCCCUGAGCAACAUUAAGGAAGCCGACAACACCGUGAUGUUCAUGCAGGGCAAGCGGCAGAAGGAGAUCUGGCAUCUUCUCAAGAUCGCGUGUACCCAGGCUGCAGCGAGAGCCUUGGUGGGCGCUGCCCUGGAAGGUGCCGUGGCACCACAGGCCGCUGCUUGGCUGCCUCCUGCUGCUGCUGAGCACGAUCACGCACUGGCCUGCGUGGUGGCACCGCAGGACGGAGAGGCUGCCGCGCAGAUGAUCGAGGAAAACCUGAACUGCCUGGGUCACCUGGCUGCCAUCAUCCACGAAGCCAACGAGGAGCAAGGAAACAGCAUGAUGAAUCUCGACUGGAGCUGGCUGACUGAGЧеловеческая конститутивно активная IKK-альфа (мутация PEST) P.4013/4014 без эпитопной метки - нуклеотид
1429
AUGGAAAGACCGCCUGGAUUGCGACCUGGAGCCGGAGGACCCUGGGAAAUGAGAGAGAGAUUGGGUACUGGAGGCUUCGGAAAUGUCUCGCUGUACCAGCACCGCGAGCUCGACCUGAAGAUCGCGAUCAAGUCCUGUCGCCUGGAGCUGUCCAGCAAGAACAGAGAGCGGUGGUGCCACGAGAUCCAGAUUAUGAAGAAGCUGGACCAUGCCAACGUCGUGAAGGCUUGCGAUGUCCCGGAGGAACUCAAUUUCCUUAUUAACGACGUGCCGCUUCUCGCGAUGGAGUACUGCUCAGGCGGCGACUUGCGCAAGCUGCUUAACAAGCCCGAAAACUGCUGCGGUCUGAAGGAAUCCCAAAUUCUGUCACUCCUGUCCGAUAUUGGCUCAGGAAUCCGCUACCUUCAUGAGAAUAAGAUCAUCCACCGCGACCUGAAGCCUGAGAACAUUGUGCUGCAGGAUGUCGGGGGAAAGACUAUCCACAAGAUAAUCGACCUGGGAUACGCCAAGGACGUCGAUCAAGGGGAACUGUGCACCGAAUUCGUGGGGACUCUCCAGUACUUGGCCCCCGAACUGUUUGAAAACAAGCCCUACACCGCCACCGUGGAUUACUGGUCCUUCGGGACUAUGGUGUUCGAGUGUAUUGCCGGCUAUCGCCCCUUUCUGCACCACCUCCAGCCCUUUACUUGGCACGAAAAGAUCAAGAAGAAGGAUCCGAAGUGCAUCUUCGCUUGCGAAGAGAUGACCGGAGAAGUCCGGUUUUCCAGCCAUCUGCCUCAGCCGAACUCCCUGUGUUCCCUGAUUGUGGAACCCAUGGAGAGCUGGUUGCAGCUCAUGCUCAACUGGGAUCCGCAGCAACGCGGUGGCCCAAUCGAUCUUACCCUUAAGCAGCCUCGGUGCUUCGCGCUGAUGGACCACAUCCUCAAUCUGAAGAUCGUGCACAUCCUGAACAUGACUUCCGCCAAGAUCAUCUCCUUCCUGCUGCCGUGCGACGAAAGCCUGCACUCACUGCAGAGCCGGAUCGAACGGGAGACAGGCAUAAACACGGGAUCGCAAGAACUGCUGUCCGAAACCGGCAUCUCCCUGGACCCACGGAAGCCUGCCUCCCAAUGCGUCCUGGACGGAGUGCGGGGUUGCGACUCAUACAUGGUGUACCUCUUCGAUAAGUCAAAGACCGUGUAUGAAGGACCCUUCGCCUCCCGCUCCCUGAGCGACUGCGUGAACUACAUCGUGCAGGACUCGAAGAUCCAGCUGCCGAUUAUCCAGCUUCGGAAGGUCUGGGCGGAGGCUGUGCACUACGUGUCCGGUUUGAAAGAGGAUUAUAGCCGCCUGUUCCAGGGACAGAGAGCCGCCAUGCUGUCCCUCCUCCGGUACAACGCCAACCUGACCAAGAUGAAGAACACCCUGAUCAGCGCCUCGCAGCAGCUGAAGGCCAAGCUGGAGUUCUUCCGGAAGUCGAUCCAGCUCGACCUCGAAAGGUACUCAGAACAGAUGACCUACGGAAUUUCCUCCGAGAAGAUGCUGAAAGCCUGGAAGGAAAUGGAGGAGAAGGCCAUUCACUACUCCGAAGUGGGCGUCAUUGGCUACUUGGAGGACCAAAUCAUGUCUCUGCACACCGAAAUCAUGGAACUCCAGAAGUCGCCUUACGGACGACGCCAAGGGGACCUGAUGGAGAGCCUGGAACAGCGGGCCAUCGAUCUGUACAAGCAACUGAAGCAUAGGCCGCCCGACCAUCUCUACUCCGACUCGACUGAAAUGGUGAAGAUUAUUGUGCAUACAGUGCAGAGCCAGGACAGAGUGCUGAAGGAGCUGUUCGGCCACCUGUCCAAGCUCCUGGGUUGCAAGCAGAAGAUUAUCGAUCUGUUGCCCAAGGUGGAAGUGGCCCUGUCUAACAUCAAAGAAGCCGACAACACUGUGAUGUUUAUGCAAGGAAAGCGGCAGAAAGAAAUCUGGCACCUUCUGAAAAUCGCGUGCACCCAGGCUGCAGCUAGGGCACUCGUGGGUGCAGCGCUUGAAGGCGCCGUGGCACCUCCUGUCGCUGCCUGGUUGCCACCCGCGCUUGCUGACAGAGAGCACCCACUGACUUGUGUGGUGGCCCCACAGGACGGAGAAGCACUGGCCCAGAUGAUUGAGGAGAACCUGAACUGUCUGGGACACCUUGCCGCCAUUAUCCGGGAGGCCAACGAGGACCAGUCCUCGUCCCUGAUGUCCCUGGAUUGGUCAUGGCUCGCUGAAМышиная конститутивно активная IKK-альфа (мутация PEST) P.4017/4018 без эпитопной метки - нуклеотид
1430
AUGAGCUGGAGCCCUUCACUGCCAACCCAAACCUGUGGAGCCUGGGAAAUGAAAGAAAGACUGGGAACCGGAGGUUUCGGCAACGUGAUCCGCUGGCAUAACCAGGCCACUGGGGAGCAGAUUGCCAUCAAGCAGUGCCGGCAGGAGCUGUCCCCGAAGAACCGCAACCGGUGGUGCCUGGAAAUCCAGAUCAUGCGGCGGCUUAACCACCCCAACGUGGUCGCCGCGAGAGAUGUGCCGGAGGGCAUGCAAAACCUGGCCCCCAACGAUCUCCCGCUGUUGGCGAUGGAGUAUUGCCAGGGUGGCGAUCUGCGGCGCUACCUGAAUCAAUUCGAGAACUGCUGCGGUCUGCGCGAAGGAGCUGUGCUUACGCUGCUCUCGGACAUCGCCUCGGCGCUGAGAUACCUCCACGAAAAUCGGAUCAUCCACCGAGAUCUCAAGCCGGAAAACAUUGUGCUUCAGCAAGGGGAAAAGCGCCUCAUCCAUAAGAUCAUCGAUCUCGGCUACGCCAAGGAGUUGGACCAGGGGGAGCUCUGCACUGAAUUCGUGGGAACUCUGCAGUACUUGGCGCCCGAACUGCUGGAGCAACAGAAGUACACUGUGACCGUGGACUACUGGUCCUUUGGAACCCUGGCCUUCGAGUGCAUUACUGGCUUCCGGCCUUUCCUUCCAAACUGGCAGCCGGUGCAGUGGCACUCAAAGGUCCGCCAGAAGUCCGAAGUGGACAUCGUGGUGUCCGAGGACUUGAACGGCGCCGUGAAGUUCUCGUCCUCCCUGCCCUUCCCGAACAACCUCAACUCCGUGCUGGCCGAGAGGCUGGAAAAGUGGCUGCAGCUUAUGCUGAUGUGGCACCCUAGACAGCGCGGAACUGAUCCGCAGUACGGCCCGAACGGCUGUUUUAGGGCCCUGGACGACAUUCUGAACCUGAAACUCGUCCACGUGCUUAACAUGGUCACCGGUACCGUCCAUACCUAUCCGGUCACCGAGGACGAAUCCCUGCAGUCCCUCAAGACUCGGAUUCAGGAGAAUACCGGCAUUCUGGAAACCGACCAGGAGCUGCUGCAGAAGGCCGGACUGGUGCUGCUCCCCGAUAAGCCCGCAACCCAGUGCAUCUCAGACUCCAAGACCAACGAGGGCCUGACUCUCGACAUGGACCUGGUGUUCCUGCUCGACAACAGCAAGAUCAACUACGAAACCCAAAUUACCCCUAGACCACCACCUGAAUCCGUGAGCUGCAUACUGCAGGAGCCCAAGCGCAACCUCUCCUUCUUCCAACUCCGGAAGGUCUGGGGCCAAGUGUGGCACUCCAUUCAGACUCUGAAGGAAGAUUGUAACAGGCUGCAGCAGGGACAGAGAGCCGCCAUGAUGAGCCUUCUGAGGAACAACUCUUGCCUGUCAAAGAUGAAGAACGCCAUGGCUUCCACCGCGCAGCAGUUGAAGGCGAAGCUGGACUUCUUUAAGACCUCCAUCCAAAUCGACCUGGAGAAGUACAAGGAACAGACUGAGUUCGGGAUUACGAGCGAUAAACUCCUGCUCGCUUGGCGGGAAAUGGAGCAAGCAGUGGAGCAGUGCGGACGGGAGAACGACGUCAAGCAUCUCGUGGAGCGGAUGAUGGCGCUGCAGACCGACAUUGUCGACUUGCAGCGCUCUCCAAUGGGACGGAAGCAGGGAGGGACUCUGGACGAUCUGGAGGAACAGGCCCGGGAACUGUACAGAAAGCUGAGGGAGAAGCCCCGGGAUCAAAGAACCGAAGGAGACUCGCAAGAGAUGGUGCGCCUGCUGCUGCAGGCGAUCCAGUCCUUCGAGAAGAAGGUCCGCGUGAUCUACACUCAGCUGUCCAAGACCGUGGUCUGUAAACAGAAGGCCCUGGAACUGCUCCCGAAAGUGGAAGAAGUGGUGUCGCUCAUGAAUGAGGACGAGAGAACCGUGGUGCGCCUCCAAGAAAAGCGGCAGAAGGAACUCUGGAACCUCCUCAAGAUUGCCUGCUCGAAAGUGCGGGGACCUGUGGCUGGUGCUCCUGACGCCAUGAACGUGGCCAGGCUUGCUCACCCUGGCCAACUUAUGGCCCAGCCUGCAUCCGCCUGUGACGCACUGCCCGAGUCGGACAAGAAGGCCGAAGAACUGGUCGCCGAAGCCCACGCACUGUGCAGCCGCCUGGAAAGCGCGCUGCAGGACACCGUGAAGGAGCAGGACCGCAGCUUUACCACUCUUGAUUGGUCCUGGCUGCAAAUGGAGGACGAAGAACGGUGCUCCCUGGAACAGGCCUGCGACМышиная конститутивно активная IKK-бета (мутация PEST) P.4019/4020 без эпитопной метки - нуклеотид
1431
AUGACCGAGUACAAGCUGGUGGUGGUGGGCGCCGACGGCGUGGGCAAGAGCGCCCUGACCAUCCAGCUGAUCCAG(Нуклеотидная последовательность KRAS G12D 25mer)
1432
AUGACCGAGUACAAGCUGGUGGUGGUGGGCGCCGUGGGCGUGGGCAAGAGCGCCCUGACCAUCCAGCUGAUCCAG(Нуклеотидная последовательность KRAS G12V 25mer)
1433
AUGACCGAGUACAAGCUGGUGGUGGUGGGCGCCGGCGACGUGGGCAAGAGCGCCCUGACCAUCCAGCUGAUCCAG(Нуклеотидная последовательность KRAS G13D 25mer)
1434
AUGACCGAGUACAAGUUAGUGGUUGUGGGCGCCGACGGCGUGGGCAAGAGCGCCCUCACCAUCCAGCUUAUCCAGAUGACGGAAUAUAAGUUAGUAGUAGUGGGAGCCGACGGUGUCGGCAAGUCCGCUUUGACCAUUCAACUUAUUCAGAUGACAGAGUAUAAGCUGGUCGUUGUAGGCGCAGACGGCGUUGGAAAGUCGGCACUGACGAUCCAGUUGAUCCAG(Нуклеотидная последовательность KRAS G12D 25mer^3)
1435
AUGACCGAGUACAAGCUCGUCGUGGUGGGCGCCGUGGGCGUGGGCAAGAGCGCCCUAACCAUCCAGUUGAUCCAGAUGACCGAAUAUAAGCUCGUGGUAGUCGGAGCGGUGGGCGUUGGCAAGUCAGCGCUAACAAUACAACUAAUCCAAAUGACCGAAUACAAGCUAGUUGUAGUCGGUGCCGUCGGCGUUGGAAAGUCAGCCCUUACAAUUCAGCUCAUUCAG(Нуклеотидная последовательность KRAS G12V 25mer^3)
1436
AUGACCGAGUACAAGCUCGUAGUGGUUGGCGCCGGCGACGUGGGCAAGAGCGCCCUAACCAUCCAGCUCAUCCAGAUGACAGAAUAUAAGCUUGUGGUUGUGGGAGCAGGAGACGUGGGAAAGAGUGCGUUGACGAUUCAACUCAUACAGAUGACCGAAUACAAGUUGGUGGUGGUCGGCGCAGGUGACGUUGGUAAGUCUGCACUAACUAUACAACUGAUCCAG(Нуклеотидная последовательность KRAS G13D 25mer^3)
1437
AUGACCGAGUACAAGCUGGUGGUGGUGGGCGCCUGCGGCGUGGGCAAGAGCGCCCUGACCAUCCAGCUGAUCCAG(Нуклеотидная последовательность KRAS G12C 25mer)
1438
AUGACCGAGUACAAGCUCGUGGUUGUUGGCGCCUGCGGCGUGGGCAAGAGCGCCCUCACCAUCCAGCUCAUCCAGAUGACAGAGUAUAAGUUAGUCGUUGUCGGAGCUUGCGGAGUUGGAAAGUCGGCGCUCACCAUUCAACUCAUACAAAUGACAGAAUAUAAGUUAGUGGUGGUGGGUGCGUGUGGCGUUGGCAAGAGUGCGCUUACUAUCCAGCUCAUUCAG(Нуклеотидная последовательность KRAS G12C 25mer^3)
1439
AUGACCGAGUACAAGCUGGUGGUGGUGGGCGCCGGCGGCGUGGGCAAGAGCGCCCUGACCAUCCAGCUGAUCCAG(Нуклеотидная последовательность KRAS WT 25mer)
1440
GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC(последовательность 5'-НТО; без промотора)
1441
AUGACCGAGUACAAGCUCGUUGUAGUCGGCGCCGACGGCGUGGGCAAGAGCGCCUUGACCAUCCAGUUGAUCCAGAUGACCGAAUAUAAGUUGGUGGUGGUAGGCGCAGUGGGAGUUGGCAAGUCAGCACUCACAAUUCAGCUCAUUCAAAUGACAGAAUACAAGUUAGUCGUUGUAGGAGCAGGCGACGUCGGCAAGAGUGCCUUAACCAUUCAACUAAUCCAG(нуклеотидная последовательность KRAS(G12D G12V G13D) 75mer “3MUT”)
1442
AUGCCUCACAGCAGCCUGCACCCUAGCAUCCCUUGCCCUAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCUGGUGCUGCUGAGCGCCUGCCUGGUGACCCUGUGGGGCCUGGGCGAGCCUCCUGAGCACACCCUGAGAUACCUGGUGCUGCACCUGGCCAGCCUGCAGCUGGGCCUGCUGCUGAACGGCGUGUGCAGCCUGGCCGAGGAGCUGAGACACAUCCACAGCAGAUACAGAGGCAGCUACUGGAGAACCGUGAGAGCCUGCCUGGGCUGCCCUCUGAGAAGAGGCGCCCUGCUGCUGCUGAGCAUCUACUUCUACUACAGCCUGCCUAACGCCGUGGGCCCUCCUUUCACCUGGAUGCUGGCCCUGCUGGGCCUGAGCCAGGCCCUGAACAUCCUGCUGGGCCUGAAGGGCCUGGCCCCUGCCGAGAUCAGCGCCGUGUGCGAGAAGGGCAACUUCAACGUGGCCCACGGCCUGGCCUGGAGCUACUACAUCGGCUACCUGAGACUGAUCCUGCCUGAGCUGCAGGCCAGAAUCAGAACCUACAACCAGCACUACAACAACCUGCUGAGAGGCGCCGUGAGCCAGAGACUGUACAUCCUGCUGCCUCUGGACUGCGGCGUGCCUGACAACCUGAGCAUGGCCGACCCUAACAUCAGAUUCCUGGACAAGCUGCCUCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCAUCAAGGACAGAGUGUACAGCAACAGCAUCUACGAGCUGCUGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCUGCGUGCUGGAGUACGCCACCCCUCUGCAGACCCUGUUCGCCAUGAGCCAGUACAGCCAGGCCGGCUUCAGCAGAGAGGACACCCUGGAGCAGGCCAAGCUGUUCUGCAGAACCCUGGAGGACAUCCUGGCCGACGCCCCUGAGAGCCAGAACAACUGCAGACUGAUCGCCUACCAGGAGCCUGCCGACGACAGCAGCUUCAGCCUGAGCCAGGAGGUGCUGAGACACCUGAGACAGGAGGAGAAGGAGGAGGUGACCGUGGGCAGCCUGAAGACCAGCGCCGUGCCUAGCACCAGCACCAUGAGCCAGGAGCCUGAGCUGCUGAUCAGCGGCAUGGAGAAGCCUCUGCCUCUGAGAACCGACUUCAGC (Hu STING(R284U); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
1443
AUGCCCCACAGCAGCCUGCACCCCUCCAUCCCCUGUCCCAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCUGGUGCUGCUGAGCGCCUGCCUGGUGACCUUAUGGGGCCUGGGCGAGCCCCCCGAGCACACCCUGAGAUACCUGGUCCUGCACCUGGCCAGCCUCCAGCUGGGCCUGCUGCUCAACGGCGUGUGUAGCCUGGCCGAGGAGCUGAGACACAUCCACAGCAGAUACAGAGGCAGCUACUGGAGAACCGUGAGAGCCUGCCUGGGUUGCCCACUGAGAAGAGGAGCUCUGCUGCUGCUGAGCAUCUACUUCUACUACUCGCUGCCCAACGCUGUGGGCCCCCCCUUCACCUGGAUGCUGGCCCUGCUGGGUCUGAGCCAGGCCCUGAACAUCCUCCUGGGCCUGAAGGGCCUGGCCCCCGCCGAGAUAAGCGCCGUUUGCGAGAAGGGCAACUUCAACGUGGCCCAUGGCCUGGCCUGGAGCUACUACAUCGGCUACUUACGCCUGAUCCUGCCCGAGCUGCAGGCCAGAAUCAGAACCUACAACCAGCAUUACAACAACCUGCUGAGAGGCGCCGUGAGCCAGAGACUGUAUAUCCUGCUGCCCCUGGACUGCGGCGUGCCCGACAACCUGAGCAUGGCCGACCCCAACAUCAGAUUCCUGGACAAGCUCCCCCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGAAUCAAAGACAGAGUGUAUAGCAACAGCAUCUACGAGCUGCUGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCUGCGUACUGGAGUACGCCACCCCCUUGCAGACCCUGUUUGCCAUGAGCCAGUACAGCCAGGCCGGCUUCAGCAGAGAGGACAUGCUGGAGCAGGCCAAGCUGUUCUGCAGAACCCUGGAGGACAUCCUGGCCGACGCCCCCGAGAGCCAGAACAACUGCAGACUGAUCGCCUACCAAGAGCCCGCCGACGACAGCAGCUUCAGCUUAAGCCAGGAGGUGCUGAGACAUCUGAGACAGGAGGAGAAGGAGGAGGUGACCGUGGGCAGCCUCAAGACCAGCGCUGUGCCCUCUACCAGCACCAUGAGCCAGGAGCCCGAGCUGCUGAUCAGCGGCAUGGAGAAGCCCCUGCCCCUGAGAACAGACUUCAGC (hu STING (R284M); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
1444
AUGCCCCAUAGCAGCCUGCACCCCAGCAUCCCCUGCCCCAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCUGGUCCUGCUGAGCGCAUGCCUGGUCACCCUGUGGGGCCUGGGCGAGCCCCCCGAGCACACCCUGAGAUACCUGGUGCUGCACCUCGCCAGCCUGCAGCUGGGCCUGCUGCUGAACGGCGUGUGCAGCCUGGCCGAGGAGCUGAGACACAUCCACAGCAGAUAUAGAGGCAGCUACUGGAGAACCGUGAGAGCUUGCCUCGGCUGCCCCCUGAGAAGAGGCGCCCUGCUGCUGCUGAGCAUCUACUUUUACUACAGCCUGCCCAACGCUGUGGGCCCCCCUUUCACGUGGAUGCUCGCCCUGCUGGGACUGAGCCAGGCCCUGAACAUCCUGCUGGGCCUUAAGGGCCUAGCCCCCGCCGAGAUCAGCGCCGUGUGCGAGAAGGGCAACUUCAAUGUGGCCCACGGCCUGGCCUGGAGCUACUACAUCGGCUACCUGAGACUGAUCCUGCCCGAGCUGCAGGCCAGAAUCAGAACCUACAAUCAGCACUACAACAACCUGCUGAGAGGCGCCGUGAGCCAGAGACUGUACAUCCUGCUGCCCCUGGACUGCGGCGUGCCCGACAACCUCAGCAUGGCCGACCCCAACAUCAGAUUCCUGGACAAGCUGCCCCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCAUCAAGGAUCGCGUGUACAGCAACAGCAUCUACGAGCUGCUGGAAAACGGCCAGAGAGCCGGAACCUGCGUGCUGGAGUACGCCACACCCCUGCAGACCCUGUUCGCCAUGAGCCAGUACAGCCAGGCCGGCUUCAGCAGAGAGGACAAGCUGGAGCAGGCCAAGCUGUUCUGCAGAACCCUGGAGGAUAUCCUCGCCGACGCCCCCGAGAGCCAGAACAACUGCAGGCUGAUCGCGUACCAGGAGCCCGCUGACGACAGCAGCUUUAGCCUGAGCCAGGAGGUGCUGAGACAUCUGCGUCAAGAGGAAAAGGAGGAGGUGACCGUGGGCUCCCUGAAGACCAGCGCCGUGCCCAGCACCAGCACCAUGAGCCAGGAGCCCGAGCUGCUGAUCAGCGGCAUGGAGAAGCCACUGCCCCUCAGAACCGACUUCAGC (Hu STING (R284K); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
1445
AUGCCUCACAGCAGCCUGCACCCUAGCAUCCCUUGCCCUAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCUGGUGCUGCUGAGCGCCUGCCUGGUGACCCUGUGGGGCCUGGGCGAGCCUCCUGAGCACACCCUGAGAUACCUGGUGCUGCACCUGGCCAGCCUGCAGCUGGGCCUGCUGCUGAACGGCGUGUGCAGCCUGGCCGAGGAGCUGAGACACAUCCACAGCAGAUACAGAGGCAGCUACUGGAGAACCGUGAGAGCCUGCCUGGGCUGCCCUCUGAGAAGAGGCGCCCUGCUGCUGCUGAGCAUCUACUUCUACUACAGCCUGCCUAACGCCGUGGGCCCUCCUUUCACCUGGAUGCUGGCCCUGCUGGGCCUGAGCCAGGCCCUGAACAUCCUGCUGGGCCUGAAGGGCCUGGCCCCUGCCGAGAUCAGCGCCGUGUGCGAGAAGGGCAACUUCAGCGUGGCCCACGGCCUGGCCUGGAGCUACUACAUCGGCUACCUGAGACUGAUCCUGCCUGAGCUGCAGGCCAGAAUCAGAACCUACAACCAGCACUACAACAACCUGCUGAGAGGCGCCGUGAGCCAGAGACUGUACAUCCUGCUGCCUCUGGACUGCGGCGUGCCUGACAACCUGAGCAUGGCCGACCCUAACAUCAGAUUCCUGGACAAGCUGCCUCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCAUCAAGGACAGAGUGUACAGCAACAGCAUCUACGAGCUGCUGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCUGCGUGCUGGAGUACGCCACCCCUCUGCAGACCCUGUUCGCCAUGAGCCAGUACAGCCAGGCCGGCUUCAGCAGAGAGGACAGACUGGAGCAGGCCAAGCUGUUCUGCAGAACCCUGGAGGACAUCCUGGCCGACGCCCCUGAGAGCCAGAACAACUGCAGACUGAUCGCCUACCAGGAGCCUGCCGACGACAGCAGCUUCAGCCUGAGCCAGGAGGUGCUGAGACACCUGAGACAGGAGGAGAAGGAGGAGGUGACCGUGGGCAGCCUGAAGACCAGCGCCGUGCCUAGCACCAGCACCAUGAGCCAGGAGCCUGAGCUGCUGAUCAGCGGCAUGGAGAAGCCUCUGCCUCUGAGAACCGACUUCAGC (Hu STING(N154S); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
1446
AUGCCUCACAGCAGCCUGCACCCUAGCAUCCCUUGCCCUAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCUGGUGCUGCUGAGCGCCUGCCUGGUGACCCUGUGGGGCCUGGGCGAGCCUCCUGAGCACACCCUGAGAUACCUGGUGCUGCACCUGGCCAGCCUGCAGCUGGGCCUGCUGCUGAACGGCGUGUGCAGCCUGGCCGAGGAGCUGAGACACAUCCACAGCAGAUACAGAGGCAGCUACUGGAGAACCGUGAGAGCCUGCCUGGGCUGCCCUCUGAGAAGAGGCGCCCUGCUGCUGCUGAGCAUCUACUUCUACUACAGCCUGCCUAACGCCGUGGGCCCUCCUUUCACCUGGAUGCUGGCCCUGCUGGGCCUGAGCCAGGCCCUGAACAUCCUGCUGGGCCUGAAGGGCCUGGCCCCUGCCGAGAUCAGCGCCCUGUGCGAGAAGGGCAACUUCAACGUGGCCCACGGCCUGGCCUGGAGCUACUACAUCGGCUACCUGAGACUGAUCCUGCCUGAGCUGCAGGCCAGAAUCAGAACCUACAACCAGCACUACAACAACCUGCUGAGAGGCGCCGUGAGCCAGAGACUGUACAUCCUGCUGCCUCUGGACUGCGGCGUGCCUGACAACCUGAGCAUGGCCGACCCUAACAUCAGAUUCCUGGACAAGCUGCCUCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCAUCAAGGACAGAGUGUACAGCAACAGCAUCUACGAGCUGCUGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCUGCGUGCUGGAGUACGCCACCCCUCUGCAGACCCUGUUCGCCAUGAGCCAGUACAGCCAGGCCGGCUUCAGCAGAGAGGACAGACUGGAGCAGGCCAAGCUGUUCUGCAGAACCCUGGAGGACAUCCUGGCCGACGCCCCUGAGAGCCAGAACAACUGCAGACUGAUCGCCUACCAGGAGCCUGCCGACGACAGCAGCUUCAGCCUGAGCCAGGAGGUGCUGAGACACCUGAGACAGGAGGAGAAGGAGGAGGUGACCGUGGGCAGCCUGAAGACCAGCGCCGUGCCUAGCACCAGCACCAUGAGCCAGGAGCCUGAGCUGCUGAUCAGCGGCAUGGAGAAGCCUCUGCCUCUGAGAACCGACUUCAGC (Hu STING(V147L); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
1447
AUGCCUCACAGCAGCCUGCACCCUAGCAUCCCUUGCCCUAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCUGGUGCUGCUGAGCGCCUGCCUGGUGACCCUGUGGGGCCUGGGCGAGCCUCCUGAGCACACCCUGAGAUACCUGGUGCUGCACCUGGCCAGCCUGCAGCUGGGCCUGCUGCUGAACGGCGUGUGCAGCCUGGCCGAGGAGCUGAGACACAUCCACAGCAGAUACAGAGGCAGCUACUGGAGAACCGUGAGAGCCUGCCUGGGCUGCCCUCUGAGAAGAGGCGCCCUGCUGCUGCUGAGCAUCUACUUCUACUACAGCCUGCCUAACGCCGUGGGCCCUCCUUUCACCUGGAUGCUGGCCCUGCUGGGCCUGAGCCAGGCCCUGAACAUCCUGCUGGGCCUGAAGGGCCUGGCCCCUGCCGAGAUCAGCGCCGUGUGCGAGAAGGGCAACUUCAACGUGGCCCACGGCCUGGCCUGGAGCUACUACAUCGGCUACCUGAGACUGAUCCUGCCUGAGCUGCAGGCCAGAAUCAGAACCUACAACCAGCACUACAACAACCUGCUGAGAGGCGCCGUGAGCCAGAGACUGUACAUCCUGCUGCCUCUGGACUGCGGCGUGCCUGACAACCUGAGCAUGGCCGACCCUAACAUCAGAUUCCUGGACAAGCUGCCUCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCAUCAAGGACAGAGUGUACAGCAACAGCAUCUACGAGCUGCUGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCUGCGUGCUGGAGUACGCCACCCCUCUGCAGACCCUGUUCGCCAUGAGCCAGUACAGCCAGGCCGGCUUCAGCAGAGAGGACAGACUGGAGCAGGCCAAGCUGUUCUGCAGAACCCUGGAGGACAUCCUGGCCGACGCCCCUGAGAGCCAGAACAACUGCAGACUGAUCGCCUACCAGCAGCCUGCCGACGACAGCAGCUUCAGCCUGAGCCAGGAGGUGCUGAGACACCUGAGACAGGAGGAGAAGGAGGAGGUGACCGUGGGCAGCCUGAAGACCAGCGCCGUGCCUAGCACCAGCACCAUGAGCCAGGAGCCUGAGCUGCUGAUCAGCGGCAUGGAGAAGCCUCUGCCUCUGAGAACCGACUUCAGC (Hu STING (E315Q); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
1448
AUGCCUCACAGCAGCCUGCACCCUAGCAUCCCUUGCCCUAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCUGGUGCUGCUGAGCGCCUGCCUGGUGACCCUGUGGGGCCUGGGCGAGCCUCCUGAGCACACCCUGAGAUACCUGGUGCUGCACCUGGCCAGCCUGCAGCUGGGCCUGCUGCUGAACGGCGUGUGCAGCCUGGCCGAGGAGCUGAGACACAUCCACAGCAGAUACAGAGGCAGCUACUGGAGAACCGUGAGAGCCUGCCUGGGCUGCCCUCUGAGAAGAGGCGCCCUGCUGCUGCUGAGCAUCUACUUCUACUACAGCCUGCCUAACGCCGUGGGCCCUCCUUUCACCUGGAUGCUGGCCCUGCUGGGCCUGAGCCAGGCCCUGAACAUCCUGCUGGGCCUGAAGGGCCUGGCCCCUGCCGAGAUCAGCGCCGUGUGCGAGAAGGGCAACUUCAACGUGGCCCACGGCCUGGCCUGGAGCUACUACAUCGGCUACCUGAGACUGAUCCUGCCUGAGCUGCAGGCCAGAAUCAGAACCUACAACCAGCACUACAACAACCUGCUGAGAGGCGCCGUGAGCCAGAGACUGUACAUCCUGCUGCCUCUGGACUGCGGCGUGCCUGACAACCUGAGCAUGGCCGACCCUAACAUCAGAUUCCUGGACAAGCUGCCUCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCAUCAAGGACAGAGUGUACAGCAACAGCAUCUACGAGCUGCUGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCUGCGUGCUGGAGUACGCCACCCCUCUGCAGACCCUGUUCGCCAUGAGCCAGUACAGCCAGGCCGGCUUCAGCAGAGAGGACAGACUGGAGCAGGCCAAGCUGUUCUGCAGAACCCUGGAGGACAUCCUGGCCGACGCCCCUGAGAGCCAGAACAACUGCAGACUGAUCGCCUACCAGGAGCCUGCCGACGACAGCAGCUUCAGCCUGAGCCAGGAGGUGCUGAGACACCUGAGACAGGAGGAGAAGGAGGAGGUGACCGUGGGCAGCCUGAAGACCAGCGCCGUGCCUAGCACCAGCACCAUGAGCCAGGAGCCUGAGCUGCUGAUCAGCGGCAUGGAGAAGCCUCUGCCUCUGGCCACCGACUUCAGC (Hu STING (R375A); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
1449
AUGCCUCACAGCAGCCUGCACCCUAGCAUCCCUUGCCCUAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCUGGUGCUGCUGAGCGCCUGCCUGGUGACCCUGUGGGGCCUGGGCGAGCCUCCUGAGCACACCCUGAGAUACCUGGUGCUGCACCUGGCCAGCCUGCAGCUGGGCCUGCUGCUGAACGGCGUGUGCAGCCUGGCCGAGGAGCUGAGACACAUCCACAGCAGAUACAGAGGCAGCUACUGGAGAACCGUGAGAGCCUGCCUGGGCUGCCCUCUGAGAAGAGGCGCCCUGCUGCUGCUGAGCAUCUACUUCUACUACAGCCUGCCUAACGCCGUGGGCCCUCCUUUCACCUGGAUGCUGGCCCUGCUGGGCCUGAGCCAGGCCCUGAACAUCCUGCUGGGCCUGAAGGGCCUGGCCCCUGCCGAGAUCAGCGCCCUGUGCGAGAAGGGCAACUUCAGCAUGGCCCACGGCCUGGCCUGGAGCUACUACAUCGGCUACCUGAGACUGAUCCUGCCUGAGCUGCAGGCCAGAAUCAGAACCUACAACCAGCACUACAACAACCUGCUGAGAGGCGCCGUGAGCCAGAGACUGUACAUCCUGCUGCCUCUGGACUGCGGCGUGCCUGACAACCUGAGCAUGGCCGACCCUAACAUCAGAUUCCUGGACAAGCUGCCUCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCAUCAAGGACAGAGUGUACAGCAACAGCAUCUACGAGCUGCUGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCUGCGUGCUGGAGUACGCCACCCCUCUGCAGACCCUGUUCGCCAUGAGCCAGUACAGCCAGGCCGGCUUCAGCAGAGAGGACAGACUGGAGCAGGCCAAGCUGUUCUGCAGAACCCUGGAGGACAUCCUGGCCGACGCCCCUGAGAGCCAGAACAACUGCAGACUGAUCGCCUACCAGGAGCCUGCCGACGACAGCAGCUUCAGCCUGAGCCAGGAGGUGCUGAGACACCUGAGACAGGAGGAGAAGGAGGAGGUGACCGUGGGCAGCCUGAAGACCAGCGCCGUGCCUAGCACCAGCACCAUGAGCCAGGAGCCUGAGCUGCUGAUCAGCGGCAUGGAGAAGCCUCUGCCUCUGAGAACCGACUUCAGC (Hu SUING(V147L/N154S/V155M); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
1450
AUGCCUCACAGCAGCCUGCACCCUAGCAUCCCUUGCCCUAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCUGGUGCUGCUGAGCGCCUGCCUGGUGACCCUGUGGGGCCUGGGCGAGCCUCCUGAGCACACCCUGAGAUACCUGGUGCUGCACCUGGCCAGCCUGCAGCUGGGCCUGCUGCUGAACGGCGUGUGCAGCCUGGCCGAGGAGCUGAGACACAUCCACAGCAGAUACAGAGGCAGCUACUGGAGAACCGUGAGAGCCUGCCUGGGCUGCCCUCUGAGAAGAGGCGCCCUGCUGCUGCUGAGCAUCUACUUCUACUACAGCCUGCCUAACGCCGUGGGCCCUCCUUUCACCUGGAUGCUGGCCCUGCUGGGCCUGAGCCAGGCCCUGAACAUCCUGCUGGGCCUGAAGGGCCUGGCCCCUGCCGAGAUCAGCGCCCUGUGCGAGAAGGGCAACUUCAGCAUGGCCCACGGCCUGGCCUGGAGCUACUACAUCGGCUACCUGAGACUGAUCCUGCCUGAGCUGCAGGCCAGAAUCAGAACCUACAACCAGCACUACAACAACCUGCUGAGAGGCGCCGUGAGCCAGAGACUGUACAUCCUGCUGCCUCUGGACUGCGGCGUGCCUGACAACCUGAGCAUGGCCGACCCUAACAUCAGAUUCCUGGACAAGCUGCCUCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCAUCAAGGACAGAGUGUACAGCAACAGCAUCUACGAGCUGCUGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCUGCGUGCUGGAGUACGCCACCCCUCUGCAGACCCUGUUCGCCAUGAGCCAGUACAGCCAGGCCGGCUUCAGCAGAGAGGACAUGCUGGAGCAGGCCAAGCUGUUCUGCAGAACCCUGGAGGACAUCCUGGCCGACGCCCCUGAGAGCCAGAACAACUGCAGACUGAUCGCCUACCAGGAGCCUGCCGACGACAGCAGCUUCAGCCUGAGCCAGGAGGUGCUGAGACACCUGAGACAGGAGGAGAAGGAGGAGGUGACCGUGGGCAGCCUGAAGACCAGCGCCGUGCCUAGCACCAGCACCAUGAGCCAGGAGCCUGAGCUGCUGAUCAGCGGCAUGGAGAAGCCUCUGCCUCUGAGAACCGACUUCAGC (Hu STING(R284M/V147L/N154S/V155M); без эпитопной метки; нуклеотидная последовательность)
1451
UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCCAAACACCAUUGUCACACUCCAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(3'-НТО, используемая в конструкте STING V155M, содержащем сайт связывания miR122)
1452
AUGGAGACCCCCAAGCCUAGAAUCCUGCCCUGGCUGGUGAGCCAGCUGGACCUGGGCCAGCUGGAGGGCGUAGCCUGGCUGGACGAGAGCAGAACCAGAUUCAGAAUCCCCUGGAAGCACGGCCUGAGACAAGACGCCCAGAUGGCCGACUUCGGCAUCUUCCAGGCCUGGGCCGAGGCCAGCGGCGCCUACACCCCUGGCAAGGAUAAGCCCGAUGUGAGCACCUGGAAGAGAAACUUCAGAAGCGCCCUGAACAGAAAGGAGGUGCUGAGACUGGCCGCCGACAAUAGCAAGGACCCCUACGACCCCCACAAGGUGUACGAGUUCGUUACCCCCGGCGCCAGGGACUUCGUGCACCUGGGCGCCAGCCCCGACACCAACGGCAAGAGCAGCCUGCCCCACAGCCAGGAGAACCUGCCCAAGCUGUUCGAUGGCCUGAUCCUGGGCCCCCUGAAGGACGAGGGCAGCAGCGACCUGGCCAUCGUGAGCGACCCUAGCCAGCAGCUGCCCUCCCCCAACGUGAACAACUUCCUGAACCCCGCCCCCCAGGAGAACCCCCUGAAGCAACUGCUGGCCGAGGAGCAGUGGGAGUUCGAGGUGACCGCCUUCUACAGAGGCAGACAGGUGUUCCAGCAGACCCUGUUCUGCCCCGGCGGCCUGAGACUGGUAGGCAGCACCGCUGACAUGACCCUGCCCUGGCAGCCCGUGACCCUGCCCGACCCCGAAGGCUUUCUGACCGACAAGCUGGUGAAGGAGUACGUCGGCCAAGUGCUGAAGGGCCUGGGCAACGGCCUGGCCCUGUGGCAGGCCGGCCAGUGCCUGUGGGCCCAGAGACUCGGCCACAGCCACGCCUUCUGGGCCCUGGGCGAGGAACUCCUGCCCGAUAGCGGCAGAGGCCCCGACGGCGAGGUGCACAAGGACAAGGACGGCGCCGUGUUCGACCUGCGCCCCUUCGUGGCCGACCUGAUCGCCUUCAUGGAGGGCAGCGGCCACAGCCCCAGAUAUACCCUGUGGUUCUGCAUGGGCGAGAUGUGGCCCCAGGACCAGCCCUGGGUGAAGAGACUGGUGAUGGUGAAGGUGGUGCCCACCUGCCUGAAAGAGCUGCUGGAGAUGGCCAGAGAGGGCGGCGCCAGCUCCCUGAAAACCGUGGACCUGCACAUUGACAACAGCCAGCCCAUCAGCCUGACCAGCGACCAGUACAAGGCCUACCUGCAGGACCUGGUGGAGGACAUGGACUUCCAGGCCACCGGCAACAUC (супермышиный IRF3 S396D; без эпитопной метки)
1453
AUGGGCACCCCCAAGCCCAGAAUCCUGCCCUGGCUGGUGAGCCAGCUGGACCUGGGCCAGCUGGAGGGAGUGGCCUGGGUGAACAAGAGCAGAACCAGAUUCAGAAUCCCCUGGAAGCACGGCCUCAGACAGGACGCCCAGCAGGAGGACUUCGGCAUUUUUCAGGCUUGGGCCGAGGCCACCGGCGCCUACGUGCCCGGCAGAGACAAGCCCGACCUGCCCACCUGGAAAAGAAACUUCAGAAGCGCCUUGAAUAGAAAGGAGGGCCUGAGACUGGCCGAGGACAGAAGCAAGGACCCCCACGACCCUCACAAGAUCUACGAGUUCGUGAAUAGCGGCGUGGGCGACUUUAGCCAGCCCGACACCAGCCCCGACACCAACGGCGGCGGCAGCACCAGCGACACGCAGGAGGACAUCCUGGAUGAACUGCUGGGCAACAUGGUGCUGGCCCCCCUGCCCGAUCCCGGCCCCCCUUCGCUUGCCGUGGCCCCCGAGCCCUGCCCCCAGCCCCUGAGAAGCCCCUCUCUGGAUAACCCCACCCCCUUCCCCAACCUGGGCCCCAGCGAGAAUCCACUGAAGAGACUUCUGGUCCCCGGCGAGGAGUGGGAGUUCGAGGUGACCGCCUUCUACAGAGGCAGACAGGUGUUCCAGCAGACCAUCAGCUGCCCCGAAGGCCUGAGAUUAGUGGGCAGCGAAGUGGGCGACAGGACCCUGCCCGGGUGGCCCGUGACCCUGCCCGAUCCCGGCAUGAGCCUGACCGACAGAGGUGUGAUGAGCUACGUGAGACACGUGCUGAGCUGCCUGGGCGGCGGCCUGGCACUGUGGAGAGCCGGCCAGUGGCUGUGGGCCCAGAGACUGGGCCACUGCCACACCUACUGGGCCGUGAGCGAGGAGCUGCUGCCCAACAGCGGCCACGGCCCCGACGGCGAGGUGCCCAAGGACAAGGAAGGGGGCGUGUUCGACCUGGGCCCCUUCAUCGUAGACCUGAUCACCUUUACCGAGGGCAGCGGCAGGAGCCCCAGAUACGCCCUGUGGUUCUGCGUGGGCGAAAGCUGGCCCCAGGACCAGCCCUGGACCAAGAGACUGGUGAUGGUGAAGGUAGUGCCCACCUGCCUGAGAGCCUUAGUGGAGAUGGCCAGAGUGGGCGGGGCCAGCAGCCUGGAGAACACCGUGGAUCUUCACAUCGACAACAGCCACCCCCUGAGCCUGACCAGCGACCAGUACAAGGCCUACCUGCAGGACCUGGUGGAGGGCAUGGACUUCCAGGGCCCCGGCGAGACC (суперчеловеческий IRF3 S396D; без эпитопной метки)
1454
AUGGCGCUGGCCCCCGAAAGAGCCGCCCCCAGAGUCCUCUUCGGCGAAUGGCUCCUUGGCGAAAUUUCGUCGGGCUGCUACGAGGGCUUACAAUGGCUGGAUGAGGCGAGAACCUGUUUCAGGGUGCCCUGGAAACACUUCGCCAGAAAGGAUCUAAGCGAAGCAGAUGCUAGAAUUUUUAAGGCUUGGGCCGUGGCCAGGGGAAGAUGGCCCCCCUCGAGCAGAGGCGGCGGCCCUCCCCCCGAGGCAGAAACGGCCGAGAGAGCCGGAUGGAAAACCAAUUUCAGAUGCGCCCUGAGAUCUACAAGAAGAUUCGUGAUGCUUAGAGACAACAGCGGAGAUCCCGCCGAUCCCCAUAAGGUGUAUGCCCUGUCCCGGGAGCUGUGCUGGAGGGAAGGGCCUGGCACUGACCAGACCGAAGCCGAAGCCCCCGCGGCCGUGCCGCCGCCCCAAGGAGGCCCACCAGGCCCUUUCCUCGCUCACACCCACGCCGGUCUGCAAGCCCCGGGACCUCUACCUGCCCCUGCCGGCGAUAAAGGCGACCUGUUGCUGCAGGCCGUCCAACAGAGCUGCCUGGCCGAUCAUCUGCUCACAGCCAGCUGGGGCGCUGACCCCGUCCCAACAAAGGCCCCCGGUGAGGGCCAAGAAGGCCUGCCUCUGACCGGCGCCUGUGCCGGCGGCCCUGGCCUGCCUGCUGGCGAGCUGUACGGAUGGGCUGUCGAAACCACUCCCUCCCCCGGCCCCCAACCUGCGGCCCUGACAACCGGCGAGGCAGCCGCACCCGAAAGCCCCCACCAGGCCGAACCCUACCUCAGUCCCAGCCCCUCCGCCUGCACCGCUGUGCAGGAGCCCAGCCCCGGUGCUCUGGACGUAACAAUCAUGUACAAAGGCAGAACCGUGCUUCAGAAGGUGGUUGGACACCCCUCCUGUACUUUUCUCUACGGCCCCCCCGACCCUGCCGUGAGAGCUACCGACCCGCAACAGGUGGCCUUUCCCUCGCCCGCCGAACUGCCCGAUCAAAAACAGCUGAGAUACACCGAGGAGCUGCUGAGACACGUGGCGCCGGGCUUACACCUAGAGUUGAGAGGCCCCCAACUCUGGGCCAGACGCAUGGGCAAGUGUAAGGUGUACUGGGAGGUCGGGGGCCCUCCCGGCUCUGCCAGCCCCAGCACCCCUGCUUGUCUCUUGCCCAGAAACUGUGAUACCCCCAUCUUCGACUUCCGUGUAUUUUUCCAGGAACUGGUCGAGUUUAGAGCCAGACAGAGACGAGGCAGCCCCAGAUAUACAAUCUACCUCGGCUUCGGCCAGGACCUGAGUGCCGGCAGACCUAAGGAGAAGUCGCUGGUCCUAGUGAAGUUAGAGCCCUGGCUAUGUAGAGUGCACCUGGAGGGCACCCAGAGAGAAGGAGUGAGCAGCCUGGACAGCAGCAGCCUGAGUCUGUGCCUGAGCUCCGCCAACUCGCUGUAUGAUGACAUCGAGUGUUUCCUCAUGGAGCUGGAGCAGCCCGCC(Изоформа A Hu IRF7 дикого типа; P037 без эпитопной метки)
1455
AUGGCCCUUGCCCCUGAGCGGGCCGCCCCCAGAGUGUUAUUCGGCGAGUGGCUGCUGGGCGAGAUCAGCAGCGGCUGCUACGAGGGACUGCAGUGGCUGGACGAGGCUAGAACCUGCUUCAGAGUGCCCUGGAAGCAUUUCGCCAGAAAAGACCUGAGCGAGGCUGAUGCUAGAAUCUUCAAAGCCUGGGCUGUGGCCCGAGGAAGAUGGCCCCCCAGCAGCAGAGGAGGCGGCCCUCCUCCCGAGGCCGAAACCGCAGAGCGUGCUGGCUGGAAAACCAACUUUAGGUGUGCCCUGAGGAGCACCAGAAGAUUCGUUAUGCUCAGAGACAACAGCGGGGACCCCGCCGACCCGCACAAGGUGUACGCCUUAAGUAGGGAGCUGUGCUGGAGAGAGGGACCGGGGACCGACCAAACCGAGGCUGAGGCGCCCGCCGCCGUUCCACCUCCCCAGGGUGGUCCCCCAGGGCCCUUUCUGGCACACACCCACGCCGGAUUACAGGCGCCAGGGCCCUUACCCGCCCCCGCCGGAGACAAAGGCGACCUCCUGCUGCAAGCCGUGCAACAAAGCUGCCUGGCCGAUCACUUACUAACCGCUAGCUGGGGCGCCGAUCCUGUUCCCACCAAGGCCCCCGGUGAAGGGCAAGAAGGACUGCCCUUAACCGGCGCCUGUGCCGGAGGCCCUGGUCUGCCAGCCGGCGAGCUGUACGGUUGGGCUGUCGAAACAACACCCAGUCCGGGCCCACAGCCUGCCGCUCUGACCACCGGCGAAGCCGCCGCCCCCGAGAGCCCACACCAGGCUGAACCCUACCUGAGCCCCAGCCCCAGCGCCUGCACCGCUGUGCAGGAGCCUAGCCCCGGCGCUCUUGAUGUGACAAUAAUGUACAAGGGCAGGACCGUGCUGCAAAAGGUCGUGGGCCAUCCGUCGUGUACCUUUCUGUACGGCCCUCCAGACCCCGCGGUUAGAGCCACCGACCCCCAGCAAGUCGCCUUCCCCUCCCCCGCCGAACUGCCCGACCAAAAGCAGCUGCGGUACACAGAAGAACUACUUAGACACGUGGCCCCCGGUCUGCACUUGGAGCUGAGAGGCCCCCAGCUCUGGGCCAGAAGAAUGGGCAAGUGCAAAGUGUACUGGGAGGUGGGCGGCCCACCCGGCUCAGCUUCGCCCUCCACACCCGCAUGCCUGCUGCCCAGAAAUUGCGACACGCCCAUCUUCGAUUUUAGAGUGUUCUUUCAGGAGUUGGUGGAGUUCAGAGCCAGACAAAGACGCGGCAGCCCCAGAUACACCAUUUACCUCGGCUUCGGCCAGGACCUCAGCGCUGGCAGACCCAAGGAGAAGAGUCUGGUCCUCGUGAAGCUGGAGCCCUGGCUGUGCAGAGUGCACCUGGAGGGCACCCAGCGUGAAGGCGUGAGCAGCCUGGAUUCAAGCGACCUGGACCUAUGCCUAAGCAGCGCUAACUCACUGUACGACGAUAUCGAAUGCUUCCUGAUGGAACUGGAGCAGCCUGCC(конститутивно активный Hu IRF7 S477D/S479D; P033 без эпитопной метки)
1456
AUGGCCCUGGCACCCGAGAGGGCCGCCCCCAGGGUGCUCUUCGGCGAGUGGUUACUAGGCGAAAUUAGCAGCGGCUGCUAUGAAGGCCUUCAGUGGCUGGACGAGGCCAGAACCUGCUUUAGAGUUCCCUGGAAGCACUUCGCCCGGAAAGAUCUCUCUGAAGCCGACGCCAGAAUAUUCAAGGCCUGGGCUGUCGCCAGGGGCAGGUGGCCACCCUCCAGCCGAGGUGGCGGCCCUCCCCCUGAGGCUGAGACUGCGGAAAGGGCGGGCUGGAAGACCAAUUUCAGAUGCGCUCUGAGAAGCACCAGACGUUUUGUGAUGCUAAGAGACAAUAGCGGCGAUCCCGCCGACCCCCAUAAGGUAUACGCACUGAGCCGAGAGCUCUGUUGGAGAGAAGGCCCCGGCACCGACCAGACCGAGGCUGAAGCCCCUGCAGCCGUGCCCCCCCCUCAAGGCGGGCCCCCCGGCCCCUUCCUGGCCCAUACCCAUGCAGGGUUACAAGCACCCGGGCCCUUGCCCGCCCCAGCGGGAGACAAGGGCGACCUCUUACUGCAGGCCGUGCAACAAAGUUGUCUGGCGGACCACCUGCUGACCGCAUCAUGGGGCGCGGAUCCUGUGCCCACCAAGGCACCCGGCGAAGGCCAGGAGGGCCUGCCCUUGACCGGCGCCUGCGCUGGCGGACCCGGCCUACCUGCUGGCGAACUGUAUGGCUGGGCCGUAGAGACGACUCCCAGCCCUGGCCCACAACCCGCGGCUUUGACCACCGGCGAAGCCGCCGCCCCCGAGUCUCCGCACCAGGCCGAGCCUUACCUCAGCCCAAGCCCUAGCGCCUGCACCGCCGUGCAAGAACCUAGCCCCGGAGCCCUGGAUGUGACAAUCAUGUACAAGGGUAGAACCGUACUGCAAAAGGUGGUGGGUCAUCCCAGCUGCACCUUUCUUUACGGCCCACCCGACCCUGCCGUGCGAGCCACAGACCCACAACAGGUCGCCUUCCCAAGCCCCGCCGAACUGCCCGAUCAGAAACAGCUGAGAUAUACAGAGGAGCUUCUGCGGCACGUAGCUCCCGGCCUACAUCUCGAGCUGAGGGGCCCACAACUGUGGGCCAGACGCAUGGGCAAAUGCAAGGUCUACUGGGAAGUGGGAGGCCCCCCCGGCAGCGCAUCUCCCAGCACGCCCGCGUGCCUGCUGCCUAGAAAUUGCGACACCCCCAUCUUUGACUUCCGGGUAUUCUUUCAGGAGCUGGUAGAGUUCAGAGCCAGGCAGCGGAGGGGCUCCCCCAGAUACACAAUCUACCUGGGCUUCGGACAGGACCUGUCCGCCGGCCGCCCCAAGGAAAAGAGCCUGGUGCUGGUGAAGCUGGAGCCCUGGCUGUGUAGGGUACACCUCGAAGGCACCCAGAGAGAAGGAGUGAGCUCGCUUGAUGACAGCGAUCUGUCGGAUUGCCUUAGCAGCGCCAACAGCCUGUAUGAUGAUAUCGAGUGCUUCCUUAUGGAACUGGAGCAGCCCGCC (конститутивно активный Hu IRF7 S475D/S477D/L480D; P034 без эпитопной метки)
1457
AUGGCCCUAGCCCCCGAAAGAGCAGCUCCCAGAGUGCUGUUCGGCGAAUGGCUGCUUGGCGAGAUCAGCAGCGGCUGCUACGAAGGCCUGCAGUGGCUGGACGAAGCCCGCACCUGUUUCAGAGUGCCCUGGAAGCACUUCGCUAGAAAGGAUUUGAGCGAGGCUGAUGCUAGAAUCUUUAAGGCUUGGGCUGUGGCAAGAGGCAGAUGGCCGCCUAGUAGCAGAGGGGGCGGACCUCCCCCCGAGGCUGAGACCGCUGAGAGAGCAGGGUGGAAAACCAACUUCAGAUGCGCGCUGAGAAGCACCCGAAGAUUCGUGAUGCUACGUGACAAUAGCGGCGACCCCGCCGACCCCCACAAAGUGUACGCCCUGUCCCGAGAACUUUGCUGGAGAGAGGGACCCGGCACCGAUCAAACAGAGGCUGAGGCCCCGGCCGCUGUACCCCCGCCCCAAGGAGGCCCCCCAGGCCCCUUUCUGGCUCAUACACAUGCCGGCCUGCAGGCACCCGGGCCCCUCCCGGCUCCUGCCGGCGACAAGGGCGAUCUCCUUCUCCAGGCCGUGCAGCAGAGCUGCCUGGCCGAUCACCUGCUGACCGCCUCGUGGGGCGCCGACCCCGUGCCCACCAAAGCCCCGGGUGAAGGCCAAGAGGGGCUCCCUUUAACCGGAGCAUGCGCCGGAGGCCCCGGCCUGCCAGCCGGCGAGUUAUAUGGCUGGGCUGUGGAGACCACACCCUCCCCCGGCCCUCAACCCGCUGCCCUGACCACCGGUGAGGCCGCCGCCCCCGAGAGCCCACACCAGGCCGAACCCUACCUGAGCCCUAGCCCUAGCGCCUGCACCGCCGUGCAAGAACCCAGCCCCGGAGCCCUGGAUGUGACCAUUAUGUACAAGGGCCGGACAGUGCUGCAAAAGGUUGUGGGACACCCGAGCUGCACCUUUCUGUACGGUCCGCCUGACCCCGCCGUGAGAGCCACGGACCCGCAGCAGGUGGCCUUCCCCUCACCCGCGGAGCUGCCCGACCAAAAGCAACUCAGAUACACAGAAGAACUAUUGCGUCACGUCGCGCCCGGCCUGCAUCUGGAGCUGAGAGGCCCCCAGCUCUGGGCCAGAAGGAUGGGCAAAUGCAAGGUGUACUGGGAGGUGGGAGGCCCCCCCGGCAGCGCCAGCCCCAGCACUCCCGCGUGCCUGCUGCCCAGAAAUUGCGACACUCCCAUCUUCGAUUUCAGGGUGUUCUUCCAGGAGCUGGUGGAGUUCAGAGCCAGGCAGAGAAGGGGUAGCCCCAGAUACACAAUCUAUCUAGGCUUUGGACAAGAUCUGAGCGCCGGCCGGCCUAAGGAAAAAAGCCUGGUGCUGGUAAAGCUGGAGCCGUGGCUUUGUAGAGUGCACCUGGAGGGGACGCAGCGAGAGGGCGUGAGCAGCUUAGACGACGAUGACUUGGAUCUGUGUCUCGACAGCGCCAACGACUUGUACGACGACAUCGAGUGCUUCCUGAUGGAACUGGAGCAGCCCGCC (конститутивно активный Hu IRF7 S475D/S476D/S477D/S479D/S483D/S487D; P035 без эпитопной метки)
1458
AUGGCCCUGGCCCCCGAGAGAGCCGCCCCCAGAGUGCUCUUCGGCGAGUGGCUGCUGGGCGAGAUAAGCAGCGGCUGCUACGAAGGUCUGCAGUGGCUAGACGAGGCCAGAACCUGCUUUAGAGUGCCCUGGAAGCACUUCGCUCGAAAGGACCUGUCCGAGGCCGAUGCUAGAAUUUUUAAGGCUUGGGCCGUCGCUAGGGGAAGAUGGCCCCCUAGCAGUAGAGGCGGCGGCCCCCCUCCCGAAGCCGAGACGGCCGAGAGGGCCGGCUGGAAAACCAAUUUCAGAUGCGCCCUGAGGAGCACCCGCAGGUUCGUAAUGCUGCGAGACAAUAGCGGCGAUCCUGCGGAUCCUCACAAGGUUUACGCCUUGAGUAGAGAACUGUGCUGGCGGGAGGGCCCCGGAACCGACCAGACGGAGGCAGAGGCACCCGCUGCCGUGCCCCCCCCUCAAGGAGGACCCCCUGGACCCUUUCUGGCCCACACCCACGCUGGUCUGCAGGCCCCAGGCCCACUGCCCGCCCCAGCGGGCGAUAAGGGUGACCUGCUCCUACAGGCGGUGCAACAGAGCUGUCUGGCCGACCACCUGUUGACCGCCAGCUGGGGGGCCGACCCGGUGCCCACCAAAGCUCCCGGAGAGGGCCAAGAAGGCCUCCCACUAACUGGCGCCUGCGCCGGGGGCCCGGGAUUACCCGCCGGCGAGCUGUAUGGCUGGGCCGUGGAGACCACGCCCAGCCCCGAGGGCGUGUCGUCCCUGGACAGCAGCAGCCUGAGCCUGUGCCUGAGCUCCGCCAACAGCCUGUAUGACGACAUCGAGUGCUUCCUGAUGGAGCUGGAACAACCCGCC (конститутивно активный усеченный Hu IRF7 1-246+468-503; P032 без эпитопной метки)
1459
AUGGCACUGGCGCCUGAAAGAGCCGCUCCGCGUGUGCUCUUCGGCGAGUGGCUGCUGGGCGAGAUCAGCUCCGGCUGCUACGAGGGUCUACAGUGGCUGGACGAGGCCAGAACCUGUUUUAGAGUGCCCUGGAAGCACUUCGCGAGAAAGGACCUGAGCGAGGCCGACGCCAGAAUCUUCAAAGCCUGGGCAGUGGCUAGGGGCAGAUGGCCUCCCAGCAGCCGGGGCGGCGGCCCACCCCCCGAGGCCGAAACCGCCGAAAGAGCUGGCUGGAAGACCAACUUCAGAUGCGCCCUGAGAAGCACCAGAAGAUUUGUCAUGCUGAGAGAUAAUUCAGGAGACCCCGCCGACCCUCACAAGGUGUACGCCCUGUCCAGAGAGCUGUGUUGGAGAGAGGGCCCCGGAACCGACCAGACCGAGGCCGAGGCUCCAGCUGCCGUGCCACCCCCCCAAGGCGGACCACCCGGCCCCUUCUUGGCACAUACGCACGCCGGCCUCCAGGCUCCCGGCCCUCUGCCCGCCCCUGCUGGUGACAAAGGCGAUCUGCUGCUGCAAGCCGUCCAGCAAUCCUGCUUGGCUGACCACCUGCUGACCGCUAGCUGGGGAGCCGACCCCGUUCCCACCAAGGCUCCCGGAGAAGGACAGGAGGGCCUGCCCCUUACCGGCGCUUGCGCGGGGGGCCCUGGCUUGCCUGCCGGCGAACUGUACGGCUGGGCCGUGGAGACCACGCCUUCCCCCGAGGGCGUGUCCAGCCUGGACGAUGAUGACCUGGAUCUGUGCCUGGACAGCGCCAACGACCUGUACGAUGACAUCGAGUGCUUUUUGAUGGAGCUGGAGCAGCCCGCC (конститутивно активный усеченный Hu IRF7 1-246+468-503 плюс S475D/S476D/S477D/S479D/S483D/S487D; P036 без эпитопной метки)
1460
AUGGCCCUGGCCCCCGAGAGAGCCGCGCCCAGAGUGCUGUUCGGCGAAUGGCUGCUGGGCGAGAUCAGCAGCGGCUGCUAUGAGGGCCUGCAGUGGCUCGACGAAGCCAGGACGUGCUUCAGAGUCCCCUGGAAGCACUUCGCCAGAAAGGAUCUGAGCGAGGCUGACGCCAGAAUCUUCAAGGCCUGGGCAGUUGCGCGUGGGAGAUGGCCCCCCAGCUCGCGGGGCGGCGGUCCCCCCCCUGAGGCCGAGACCGCCGAAAGAGCCGGAUGGAAAACCAACUUUCGAUGCGCCCUCAGAAGCACCAGACGGUUUGUGAUGCUGAGAGAUAACAGCGGCGACCCUGCAGACCCCCAUAAAGUGUAUGCCCUGAGCAGAGAGCUGUGUUGGCGAGAGGGCCCCGGAACCGACCAAACCGAGGCCGAGGCCCCCGCCGCCGUACCCCCCCCUCAAGGCCCCCAGCCUGCUGCUCUGACCACGGGAGAAGCCGCCGCUCCUGAGAGCCCCCACCAAGCCGAGCCCUAUCUGAGCCCUAGCCCCAGCGCCUGCACCGCCGUGCAGGAGCCCUCACCGGGCGCCCUAGACGUGACCAUCAUGUACAAGGGGCGCACGGUGCUGCAAAAGGUGGUGGGCCACCCCAGCUGCACCUUCCUGUACGGCCCCCCCGACCCUGCCGUGAGAGCCACCGACCCCCAGCAAGUCGCCUUCCCCAGCCCCGCCGAGCUGCCCGACCAGAAGCAGCUGAGGUACACCGAGGAGUUGCUGAGACAUGUGGCCCCCGGCUUGCACCUCGAGCUGAGAGGCCCGCAGCUCUGGGCCAGAAGAAUGGGCAAGUGCAAGGUGUACUGGGAGGUGGGCGGCCCCCCCGGCAGCGCGAGCCCAAGCACCCCGGCCUGCCUGCUGCCUAGAAACUGCGACACCCCUAUCUUCGACUUCAGAGUAUUUUUCCAGGAGCUGGUCGAGUUCAGGGCCAGACAGCGUAGAGGCAGCCCCAGAUACACCAUCUACCUUGGAUUCGGCCAGGACCUGAGCGCCGGCAGACCCAAAGAGAAGUCCCUGGUACUGGUGAAGCUAGAGCCCUGGCUGUGUAGGGUGCAUCUGGAAGGCACCCAAAGAGAGGGCGUAAGCUCGCUUGACAGCAGCAGCCUCAGCCUGUGCCUGAGCAGCGCUAACAGCUUAUACGACGACAUCGAGUGCUUCCUGAUGGAGCUGGAACAACCCGCC (усеченный Hu IRF7 1-151+247-503; P038 без эпитопной метки; нулевая мутация)
1461
AUGGGCGGCCCUCCCGGGCCUUUCCUGGCCCAUACACACGCCGGCCUACAGGCUCCUGGCCCUCUGCCCGCCCCGGCCGGCGACAAGGGCGACCUCCUGCUGCAGGCCGUGCAGCAGUCCUGUCUGGCCGACCACCUGCUGACUGCUAGCUGGGGCGCCGAUCCCGUGCCCACCAAGGCCCCAGGAGAGGGGCAAGAGGGCCUGCCUCUAACCGGCGCAUGCGCAGGUGGACCAGGCCUCCCCGCCGGCGAGCUGUAUGGUUGGGCCGUGGAGACAACCCCCAGCCCCGGCCCGCAGCCUGCUGCGCUGACCACAGGCGAGGCCGCUGCCCCUGAGAGCCCCCACCAAGCUGAACCCUACCUGAGCCCCAGCCCCUCUGCCUGCACAGCGGUGCAGGAGCCCAGUCCCGGCGCCUUGGACGUGACCAUCAUGUAUAAGGGCAGGACUGUGUUACAAAAGGUAGUGGGCCACCCAAGUUGUACCUUUCUGUACGGGCCCCCCGACCCAGCCGUGCGCGCCACCGACCCCCAGCAGGUGGCCUUCCCCAGCCCCGCUGAGUUGCCCGAUCAGAAACAACUCCGGUACACCGAGGAAUUACUUAGACAUGUGGCUCCCGGCCUGCAUCUGGAGCUUAGAGGUCCACAGUUGUGGGCCAGAAGAAUGGGCAAGUGCAAGGUUUAUUGGGAGGUCGGAGGCCCCCCGGGCAGCGCCAGCCCCAGCACCCCCGCCUGUCUUCUGCCCAGAAACUGCGACACCCCAAUCUUCGAUUUCAGAGUGUUUUUCCAGGAACUGGUGGAGUUCAGAGCAAGGCAAAGAAGAGGCAGCCCUAGAUACACCAUCUACCUGGGCUUUGGCCAAGACCUGAGCGCCGGCAGACCCAAGGAAAAAUCCCUGGUCCUGGUGAAACUGGAGCCCUGGCUGUGCAGAGUCCACCUGGAGGGCACCCAGAGAGAGGGCGUGAGCAGCCUGGACUCGAGCAGCCUGUCCCUGUGUCUGAGCAGCGCGAAUUCGCUAUAUGACGACAUCGAAUGCUUUCUGAUGGAGCUGGAACAGCCCGCC (усеченный Hu IRF7 152-503; P039 без эпитопной метки; нулевая мутация)
1462
AUGCCUCACAGCAGCCUCCACCCUAGCAUCCCUUGCCCUAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCUCGUGCUUUUAAGCGCCUGCUUGGUGACCCUUUGGGGCUUGGGCGAGCCUCCAGAGCACACCUUGAGAUAUUUGGUGCUCCACCUGGCCAGCCUUCAGCUGGGCUUGUUACUCAACGGCGUGUGCAGCCUGGCCGAGGAGCUGAGACACAUCCACAGCAGAUACAGAGGCAGCUACUGGAGAACCGUGAGAGCGUGUCUGGGCUGCCCUCUGAGAAGAGGCGCCUUGCUUCUUCUCAGUAUCUACUUCUACUACUCCCUGCCUAACGCCGUGGGCCCUCCUUUCACCUGGAUGCUGGCACUGCUCGGCCUCAGCCAGGCCCUGAACAUCUUGUUGGGCUUGAAGGGCCUGGCCCCUGCCGAGAUCAGCGCCGUGUGCGAGAAGGGCAACUUCAACAUGGCCCACGGAUUGGCUUGGAGCUACUACAUCGGCUACCUGAGACUGAUCCUGCCUGAGCUGCAGGCCAGAAUCAGAACCUACAACCAGCACUACAACAACCUGCUGCGCGGCGCAGUGAGCCAGAGACUGUAUAUUCUGCUGCCUCUGGACUGCGGCGUGCCUGACAACCUGAGCAUGGCCGACCCUAACAUCAGAUUCCUGGACAAGCUGCCUCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCAUCAAGGACAGAGUGUACAGCAACAGCAUCUAUGAGCUGCUCGAGAAUGGCCAGAGAGCCGGCACCUGCGUGCUGGAGUACGCCACCCCUCUGCAGACCCUGUUCGCCAUGAGCCAGUAUAGUCAAGCUGGCUUCAGCAGAGAGGACAGACUGGAGCAGGCCAAGCUGUUCUGCAGAACCCUGGAGGACAUUCUGGCUGACGCCCCUGAGAGCCAGAACAACUGCCGACUGAUCGCCUACCAGGAACCAGCCGACGACAGCAGCUUCAGUCUUUCUCAGGAGGUUCUUCGCCACUUGCGCCAGGAGGAGAAGGAGGAGGUGACCGUGGGCAGCCUGAAGACCUCCGCAGUCCCUAGCACCAGCACCAUGAGUCAGGAGCCGGAGCUAUUAAUCAGCGGCAUGGAGAAGCCUCUUCCACUCCGAACCGACUUCAGCGCCACCAACUUCAGCCUGCUGAAGCAGGCAGGUGACGUUGAGGAGAAUCCGGGACCUAUGACCGAGUACAAGCUGGUGGUUGUGGGCGCCGACGGCGUGGGCAAGAGCGCCCUGACCAUCCAGCUGAUCCAG
1463
AUGACCGAGUACAAGCUAGUAGUCGUGGGCGCCGACGGCGUGGGCAAGAGCGCCCUCACCAUCCAGCUAAUCCAGGCCACCAACUUCAGCUUGCUCAAGCAGGCCGGCGACGUGGAGGAGAACCCAGGCCCUAUGCCUCACAGCAGCCUUCACCCUAGCAUCCCUUGCCCUAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCUGGUGCUGCUGAGCGCCUGCCUGGUGACCCUGUGGGGCCUGGGCGAGCCUCCUGAGCACACCCUGAGAUAUCUGGUGCUUCACCUGGCCAGUUUACAGCUGGGCCUGCUUCUUAACGGCGUGUGCAGCCUGGCCGAGGAGCUGAGACACAUCCACAGCAGAUACAGAGGCAGCUACUGGAGAACCGUGAGAGCCUGCCUAGGCUGCCCUCUGAGAAGAGGCGCUCUGUUGCUACUUUCCAUCUACUUCUACUACUCCCUGCCUAACGCCGUGGGCCCUCCUUUCACUUGGAUGCUGGCGUUGCUGGGUCUGAGCCAGGCCCUGAACAUCCUUCUCGGUCUGAAGGGCCUGGCCCCUGCCGAGAUCAGCGCCGUGUGCGAGAAGGGCAACUUCAACAUGGCCCACGGACUCGCCUGGAGCUACUACAUCGGCUACCUGAGACUGAUCCUGCCUGAGCUGCAGGCCAGAAUCAGAACCUACAACCAGCACUACAACAACCUGCUGCGGGGCGCCGUGAGCCAGAGACUGUAUAUACUUCUUCCUCUGGACUGCGGCGUGCCUGACAACCUGAGCAUGGCCGACCCUAACAUCAGAUUCCUGGACAAGCUGCCUCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCAUCAAGGACAGAGUGUACAGCAACUCCAUUUAUGAGCUGCUCGAGAAUGGCCAGAGAGCCGGCACCUGCGUGCUGGAGUACGCCACCCCUCUGCAGACCCUGUUCGCCAUGAGCCAGUACAGUCAGGCUGGAUUCAGCAGAGAGGACAGACUGGAGCAGGCCAAGCUGUUCUGCAGGACACUGGAGGACAUACUAGCAGACGCCCCUGAGAGCCAGAACAACUGCAGACUGAUUGCCUACCAGGAGCCUGCGGACGACAGCUCCUUCAGUCUGAGUCAGGAGGUGUUGCGGCACUUACGCCAAGAAGAGAAGGAGGAGGUGACCGUGGGCAGCCUGAAGACUAGCGCUGUGCCUAGCACCAGCACAAUGUCACAGGAGCCGGAAUUGCUAAUCAGCGGCAUGGAGAAGCCUCUCCCAUUACGUACCGACUUCAGC(KRAS(G12D)25mer_ct.STING(V155M))
1464
AUGCCUCACAGCAGCCUUCACCCUAGCAUCCCUUGCCCUAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCUAGUGCUCCUUAGCGCCUGCCUCGUGACCCUAUGGGGCUUAGGCGAGCCUCCAGAGCACACCUUGAGAUACCUCGUCCUCCACCUGGCUAGUCUACAGCUGGGCCUUCUCCUCAACGGCGUGUGCAGCCUGGCCGAGGAGCUGAGACACAUCCACAGCAGAUACAGAGGCAGCUACUGGAGAACCGUGAGAGCGUGCCUGGGCUGCCCUCUGAGAAGAGGCGCACUGCUGUUACUCAGCAUCUACUUCUACUACUCACUGCCAAACGCCGUGGGCCCUCCUUUCACCUGGAUGCUGGCCUUGCUCGGAUUGAGCCAGGCCCUGAACAUUUUACUGGGAUUGAAGGGCCUGGCCCCUGCCGAGAUCAGCGCCGUGUGCGAGAAGGGCAACUUCAACAUGGCCCACGGCCUAGCUUGGAGCUACUACAUCGGCUACCUGAGACUGAUCCUGCCUGAGCUGCAGGCCAGAAUCAGAACCUACAACCAGCACUACAACAACCUGCUGCGUGGAGCGGUGAGCCAGAGACUGUAUAUCCUCCUGCCUCUGGACUGCGGAGUGCCUGACAACCUGAGCAUGGCCGACCCUAACAUCAGAUUCCUGGACAAGCUGCCUCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCAUCAAGGACAGAGUGUACAGCAACUCAAUCUACGAGCUGUUGGAGAAUGGCCAGAGAGCCGGCACCUGCGUGCUGGAGUACGCCACCCCUCUGCAGACCCUGUUCGCCAUGAGCCAGUACUCUCAGGCAGGCUUCAGCAGAGAGGACAGACUGGAGCAGGCCAAGCUGUUCUGCAGAACCCUGGAGGACAUCCUGGCGGACGCCCCUGAGAGCCAGAACAACUGCCGGCUUAUCGCCUACCAGGAGCCAGCAGACGACAGCAGCUUCUCUCUCUCACAAGAGGUACUGCGCCAUCUUCGCCAGGAGGAGAAGGAGGAGGUGACCGUGGGCAGCCUGAAGACAUCCGCCGUACCUAGCACCAGCACCAUGUCUCAGGAACCGGAACUGUUGAUCAGCGGCAUGGAGAAGCCUCUGCCACUGCGCACCGACUUCAGCGCCACCAACUUCUCCCUACUGAAGCAAGCCGGUGACGUUGAAGAGAACCCUGGCCCUAUGACCGAGUACAAGCUGGUAGUAGUAGGCGCCGACGGCGUGGGCAAGAGCGCCCUGACCAUCCAGCUGAUCCAGAUGACUGAAUAUAAGCUUGUCGUCGUGGGCGCAGAUGGCGUUGGUAAGAGCGCACUUACAAUUCAACUCAUUCAGAUGACGGAGUAUAAGCUGGUGGUGGUCGGAGCUGACGGCGUAGGCAAGAGUGCCCUUACUAUUCAGCUAAUUCAG(KRAS(G12D)25mer^3_nt.STING(V155M))
1465
AUGACCGAGUACAAGCUUGUGGUGGUUGGCGCCGACGGCGUGGGCAAGAGCGCCUUAACCAUCCAGCUUAUCCAGAUGACAGAGUAUAAGCUAGUGGUGGUCGGCGCAGACGGAGUGGGAAAGAGUGCAUUAACUAUUCAACUCAUCCAAAUGACCGAAUACAAGCUAGUAGUUGUGGGUGCAGAUGGCGUCGGCAAGUCUGCACUGACAAUUCAGCUCAUCCAGGCCACCAACUUCAGCCUGCUGAAGCAGGCCGGCGACGUGGAGGAGAACCCUGGCCCUAUGCCUCACAGCAGCCUGCACCCUAGCAUCCCUUGCCCUAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCUGGUGCUGCUGAGCGCCUGCCUGGUGACCCUGUGGGGCCUGGGCGAGCCUCCUGAGCACACCCUGAGAUACCUAGUUUUGCACCUGGCUUCUCUGCAGCUGGGCCUACUGCUCAACGGCGUGUGCAGCCUGGCCGAGGAGCUGAGACACAUCCACAGCAGAUACAGAGGCAGCUACUGGAGAACCGUGAGAGCAUGCUUAGGCUGCCCUCUGAGAAGAGGCGCUCUGCUCCUCUUGUCCAUCUACUUCUACUACUCGCUACCUAACGCCGUGGGCCCUCCUUUCACCUGGAUGCUGGCCCUCUUGGGAUUAAGCCAGGCCCUGAACAUCUUGCUGGGACUGAAGGGCCUGGCCCCUGCCGAGAUCAGCGCCGUGUGCGAGAAGGGCAACUUCAACAUGGCCCACGGACUCGCUUGGAGCUACUACAUCGGCUACCUGAGACUGAUCCUGCCUGAGCUGCAGGCCAGAAUCAGAACCUACAACCAGCACUACAACAACCUGCUGCGGGGAGCAGUGAGCCAGAGACUGUAUAUUCUGCUCCCUCUGGACUGCGGCGUGCCUGACAACCUGAGCAUGGCCGACCCUAACAUCAGAUUCCUGGACAAGCUGCCUCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCAUCAAGGACAGAGUGUACAGCAACAGCAUUUACGAGCUGCUGGAGAACGGCCAGAGAGCCGGCACCUGCGUGCUGGAGUACGCCACCCCUCUGCAGACCCUGUUCGCCAUGAGCCAGUACUCCCAGGCAGGAUUCAGCAGAGAGGACAGACUGGAGCAGGCCAAGCUGUUCUGCCGUACUCUUGAGGACAUCCUUGCAGACGCCCCUGAGAGCCAGAACAACUGCCGGUUGAUUGCCUACCAGGAACCGGCAGACGACAGCUCAUUCUCCUUGUCUCAGGAGGUCCUUAGACACCUGCGGCAGGAGGAGAAGGAGGAGGUGACCGUGGGCAGCCUGAAGACAUCCGCCGUGCCUAGCACGUCUACCAUGUCCCAGGAGCCGGAACUGCUAAUCAGCGGCAUGGAGAAGCCUCUGCCUCUCAGGACCGACUUCAGC(KRAS(G12D)25mer^3_ct.STING(V155M))
1466
AUGCCCCAUAGCAGCCUGCACCCCAGCAUCCCCUGCCCCAGAGGCCACGGCGCCCAGAAGGCCGCCCUGGUCCUGCUGAGCGCAUGCCUGGUCACCCUGUGGGGCCUGGGCGAGCCCCCCGAGCACACCCUGAGAUACCUGGUGCUGCACCUCGCCAGCCUGCAGCUGGGCCUGCUGCUGAACGGCGUGUGCAGCCUGGCCGAGGAGCUGAGACACAUCCACAGCAGAUAUAGAGGCAGCUACUGGAGAACCGUGAGAGCUUGCCUCGGCUGCCCCCUGAGAAGAGGCGCCCUGCUGCUGCUGAGCAUCUACUUUUACUACAGCCUGCCCAACGCUGUGGGCCCCCCUUUCACGUGGAUGCUCGCCCUGCUGGGACUGAGCCAGGCCCUGAACAUCCUGCUGGGCCUUAAGGGCCUAGCCCCCGCCGAGAUCAGCGCCGUGUGCGAGAAGGGCAACUUCAAUGUGGCCCACGGCCUGGCCUGGAGCUACUACAUCGGCUACCUGAGACUGAUCCUGCCCGAGCUGCAGGCCAGAAUCAGAACCUACAAUCAGCACUACAACAACCUGCUGAGAGGCGCCGUGAGCCAGAGACUGUACAUCCUGCUGCCCCUGGACUGCGGCGUGCCCGACAACCUCAGCAUGGCCGACCCCAACAUCAGAUUCCUGGACAAGCUGCCCCAGCAGACCGGCGACCACGCCGGCAUCAAGGAUCGCGUGUACAGCAACAGCAUCUACGAGCUGCUGGAAAACGGCCAGAGAGCCGGAACCUGCGUGCUGGAGUACGCCACACCCCUGCAGACCCUGUUCGCCAUGAGCCAGUACAGCCAGGCCGGCUUCAGCAGAGAGGACAAGCUGGAGCAGGCCAAGCUGUUCUGCAGAACCCUGGAGGAUAUCCUCGCCGACGCCCCCGAGAGCCAGAACAACUGCAGGCUGAUCGCGUACCAGGAGCCCGCUGACGACAGCAGCUUUAGCCUGAGCCAGGAGGUGCUGAGACAUCUGCGUCAAGAGGAAAAGGAGGAGGUGACCGUGGGCUCCCUGAAGACCAGCGCCGUGCCCAGCACCAGCACCAUGAGCCAGGAGCCCGAGCUGCUGAUCAGCGGCAUGGAGAAGCCACUGCCCCUCAGAACCGACUUCAGCACC(Hu STING (R284K) var; без эпитопной метки)
1467
AUGAGAAUGAAGCAGCUGGAGGACAAGAUCGAGGAGCUGCUGAGCAAGAUCUACCACCUGGAGAACGAGAUCGCCAGACUGAAGAAGCUGAUCGGCGAGGCCGACCAGACCAGCGGCAACUACCUGAACAUGCAGGACAGCCAGGGCGUGCUGAGCAGCUUCCCCGCCCCCCAGGCCGUGCAGGACAACCCCGCCAUGCCCACCAGCAGCGGCAGCGAGGGCAACGUGAAGCUGUGCAGCCUGGAGGAGGCCCAGAGAAUCUGGAAGCAGAAGAGCGCCGAGAUCUACCCCAUCAUGGACAAGAGCAGCAGAACCAGACUGGCCCUGAUCAUCUGCAACGAGGAGUUCGACAGCAUCCCCAGAAGAACCGGCGCCGAGGUGGACAUCACCGGCAUGACCAUGCUGCUGCAGAACCUGGGCUACAGCGUGGACGUGAAGAAGAACCUGACCGCCAGCGACAUGACCACCGAGCUGGAGGCCUUCGCCCACAGACCCGAGCACAAGACCAGCGACAGCACCUUCCUGGUGUUCAUGAGCCACGGCAUCAGAGAGGGCAUCUGCGGCAAGAAGCACAGCGAGCAGGUGCCCGACAUCCUGCAGCUGAACGCCAUCUUCAACAUGCUGAACACCAAGAACUGCCCCAGCCUGAAGGACAAGCCCAAGGUGAUCAUCAUCCAGGCCUGCAGAGGCGACAGCCCCGGCGUGGUGUGGUUCAAGGACAGCGUGGGCGUGAGCGGCAACCUGAGCCUGCCCACCACCGAGGAGUUCGAGGACGACGCCAUCAAGAAGGCCCACAUCGAGAAGGACUUCAUCGCCUUCUGCAGCAGCACCCCCGACAACGUGAGCUGGAGACACCCCACCAUGGGCAGCGUGUUCAUCGGCAGACUGAUCGAGCACAUGCAGGAGUACGCCUGCAGCUGCGACGUGGAGGAGAUCUUCAGAAAGGUGAGAUUCAGCUUCGAGCAGCCCGACGGCAGAGCCCAGAUGCCCACCACCGAGAGAGUGACCCUGACCAGAUGCUUCUACCUGUUCCCCGGCCACDM_hsCASP1 (самоактивирующаяся человеческая каспаза-1); P2025 без эпитопной метки)
1468
AUGAGAAUGAAGCAGCUGGAGGACAAGAUCGAGGAGCUGCUGAGCAAGAUCUAUCACCUGGAGAACGAGAUCGCCAGACUGAAGAAGCUGAUCGGCGAGAGACAGAUCAGCCCCAACAAGAAGGCCCACCCCAACAUGGAGGCCGGACCGCCUGAGAGCGGCGAGAGCACCGACGCCCUGAAGCUGUGCCCCCACGAGGAGUUCCUGAGACUGUGCAAGGAGAGAGCCGAGGAGAUCUACCCCAUCAAGGAGAGAAACAACAGAACCAGACUGGCCCUGAUCAUCUGCAACACCGAGUUCGACCACCUGCCCCCCAGAAACGGCGCCGACUUCGACAUCACCGGCAUGAAGGAGCUGCUGGAGGGCCUGGACUACAGCGUGGACGUGGAGGAGAACCUGACCGCCAGAGACAUGGAGAGCGCCCUGAGAGCCUUCGCCACCAGACCCGAGCACAAGAGCAGCGACAGCACCUUCCUGGUGCUGAUGAGCCACGGCAUCCUGGAGGGCAUCUGCGGCACCGUGCACGACGAGAAGAAGCCCGACGUGCUGCUGUACGACACCAUCUUCCAGAUCUUCAACAACAGAAACUGCCUGAGCCUGAAGGACAAGCCCAAGGUGAUCAUCGUGCAGGCCUGCAGAGGCGCCAACAGAGGCGAGCUGUGGGUGAGAGACAGCCCCGCCAGCCUGGAGGUGGCCAGCAGCCAGAGCAGCGAGAACCUGGAGGAGGACGCCGUGUACAAGACCCACGUGGAGAAGGACUUCAUCGCCUUCUGCAGCAGCACCCCCCACAACGUGAGCUGGAGAGACAGCACCAUGGGCAGCAUCUUCAUCACCCAGCUGAUAACCUGCUUCCAGAAGUACAGCUGGUGCUGCCACCUGGAGGAGGUGUUCAGAAAGGUGCAGCAGAGCUUCGAGACCCCCAGAGCCAAGGCCCAGAUGCCCACCAUCGAGAGACUGAGCAUGACCAGAUACUUCUACCUGUUCCCCGGCAAC(Каспаза-4, N.del+домен DM; P2015 без эпитопной метки)
1469
AUGAGCGCCGAGGUGAUCCACCAGGUGGAGGAGGCCCUGGACACCGACGAGAAGGAGAUGCUGCUGUUCCUGUGCAGAGACGUGGCCAUCGACGUGGUGCCCCCCAACGUGAGAGACCUGCUGGACAUCCUGAGAGAGAGAGGCAAGCUGAGCGUGGGCGACCUGGCCGAGCUGCUGUACAGAGUGAGAAGAUUCGACCUGCUGAAGAGAAUCCUGAAGAUGGACAGAAAGGCCGUGGAGACCCACCUGCUGAGAAACCCCCACCUGGUGAGCGACUACAGAGUGCUGAUGGCCGAGAUCGGCGAGGACCUGGACAAGAGCGACGUGAGCAGCCUGAUCUUCCUGAUGAAGGACUACAUGGGCAGAGGCAAGAUCAGCAAGGAGAAGAGCUUCCUGGACCUGGUGGUGGAGCUGGAGAAGCUGAACCUGGUGGCCCCCGACCAGCUGGACCUGCUGGAGAAGUGCCUGAAGAACAUCCACAGAAUCGACCUGAAGACCAAGAUCCAGAAGUACAAGCAGAGCGUGCAGGGCGCCGGCACCAGCUACAGAAACGUGCUGCAGGCCGCCAUCCAGAAGAGCCUGAAGGACCCCAGCAACAACUUCAGACUGCACAACGGCAGAAGCAAGGAGCAGAGACUGAAGGAGCAGCUGGGCGCCCAGCAGGAGCCCGUGAAGAAGAGCAUCCAGGAGAGCGAGGCCUUCCUGCCCCAGAGCAUCCCCGAGGAGAGAUACAAGAUGAAGAGCAAGCCCCUGGGCAUCUGCCUGAUCAUCGACUGCAUCGGCAACGAGACCGAGCUGCUGAGAGACACCUUCACCAGCCUGGGCUACGAGGUGCAGAAGUUCCUGCACCUGAGCAUGCACGGCAUCAGCCAGAUCCUGGGCCAGUUCGCCUGCAUGCCCGAGCACAGAGACUACGACAGCUUCGUGUGCGUGCUGGUGAGCAGAGGCGGCAGCCAGAGCGUGUACGGCGUGGACCAGACCCACAGCGGCCUGCCCCUGCACCACAUCAGAAGAAUGUUCAUGGGCGACAGCUGCCCCUACCUGGCCGGCAAGCCCAAGAUGUUCUUCAUCCAGAACUACGUGGUGAGCGAGGGCCAGCUGGAGGACAGCAGCCUGCUGGAGGUGGACGGCCCCGCCAUGAAGAACGUGGAGUUCAAGGCCCAGAAGAGAGGCCUGUGCACCGUGCACAGAGAGGCCGACUUCUUCUGGAGCCUGUGCACCGCCGACAUGAGCCUGCUGGAGCAGAGCCACAGCAGCCCCAGCCUGUACCUGCAGUGCCUGAGCCAGAAGCUGAGACAGGAGAGAAAGAGACCCCUGCUGGACCUGCACAUCGAGCUGAACGGCUACAUGUACGACUGGAACAGCAGAGUGAGCGCCAAGGAGAAGUACUACGUGUGGCUGCAGCACACCCUGAGAAAGAAGCUGAUCCUGAGCUACACC (hu-cFLIP-L; P1006 без эпитопной метки)
1470
AUGAGCGCCGAGGUGAUCCACCAGGUGGAGGAGGCCCUGGACACCGACGAGAAGGAGAUGCUGCUGUUCCUGUGCAGAGACGUGGCCAUCGACGUGGUGCCCCCCAACGUGAGAGACCUGCUGGACAUCCUGAGAGAGAGAGGCAAGCUGAGCGUGGGCGACCUGGCCGAGCUGCUGUACAGAGUGAGAAGAUUCGACCUGCUGAAGAGAAUCCUGAAGAUGGACAGAAAGGCCGUGGAGACCCACCUGCUGAGAAACCCCCACCUGGUGAGCGACUACAGAGUGCUGAUGGCCGAGAUCGGCGAGGACCUGGACAAGAGCGACGUGAGCAGCCUGAUCUUCCUGAUGAAGGACUACAUGGGCAGAGGCAAGAUCAGCAAGGAGAAGAGCUUCCUGGACCUGGUGGUGGAGCUGGAGAAGCUGAACCUGGUGGCCCCCGACCAGCUGGACCUGCUGGAGAAGUGCCUGAAGAACAUCCACAGAAUCGACCUGAAGACCAAGAUCCAGAAGUACAAGCAGAGCGUGCAGGGCGCCGGCACCAGCUACAGAAACGUGCUGCAGGCCGCCAUCCAGAAGAGCCUGAAGGACCCCAGCAACAACUUCAGACUGCACAACGGCAGAAGCAAGGAGCAGAGACUGAAGGAGCAGCUGGGCGCCCAGCAGGAGCCCGUGAAGAAGAGC (hu-cFLIP-S(1-227); P1007 без эпитопной метки)
1471
AUGAGCGCCGAGGUGAUCCACCAGGUGGAGGAGGCCCUGGACACCGACGAGAAGGAGAUGCUGCUGUUCCUGUGCAGAGACGUGGCCAUCGACGUGGUGCCCCCCAACGUGAGAGACCUGCUGGACAUCCUGAGAGAGAGAGGCAAGCUGAGCGUGGGCGACCUGGCCGAGCUGCUGUACAGAGUGAGAAGAUUCGACCUGCUGAAGAGAAUCCUGAAGAUGGACAGAAAGGCCGUGGAGACCCACCUGCUGAGAAACCCCCACCUGGUGAGCGACUACAGAGUGCUGAUGGCCGAGAUCGGCGAGGACCUGGACAAGAGCGACGUGAGCAGCCUGAUCUUCCUGAUGAAGGACUACAUGGGCAGAGGCAAGAUCAGCAAGGAGAAGAGCUUCCUGGACCUGGUGGUGGAGCUGGAGAAGCUGAACCUGGUGGCCCCCGACCAGCUGGACCUGCUGGAGAAGUGCCUGAAGAACAUCCACAGAAUCGACCUGAAGACCAAGAUCCAGAAGUACAAGCAGAGCGUGCAGGGCGCCGGCACCAGCUACAGAAACGUGCUGCAGGCCGCCAUCCAGAAGAGCCUGAAGGAC(hu-cFLIP-p22(1-198); P1008 без эпитопной метки)- нуклеотид
1472
AUGAGCGCCGAGGUGAUCCACCAGGUGGAGGAGGCCCUGGACACCGACGAGAAGGAGAUGCUGCUGUUCCUGUGCAGAGACGUGGCCAUCGACGUGGUGCCCCCCAACGUGAGAGACCUGCUGGACAUCCUGAGAGAGAGAGGCAAGCUGAGCGUGGGCGACCUGGCCGAGCUGCUGUACAGAGUGAGAAGAUUCGACCUGCUGAAGAGAAUCCUGAAGAUGGACAGAAAGGCCGUGGAGACCCACCUGCUGAGAAACCCCCACCUGGUGAGCGACUACAGAGUGCUGAUGGCCGAGAUCGGCGAGGACCUGGACAAGAGCGACGUGAGCAGCCUGAUCUUCCUGAUGAAGGACUACAUGGGCAGAGGCAAGAUCAGCAAGGAGAAGAGCUUCCUGGACCUGGUGGUGGAGCUGGAGAAGCUGAACCUGGUGGCCCCCGACCAGCUGGACCUGCUGGAGAAGUGCCUGAAGAACAUCCACAGAAUCGACCUGAAGACCAAGAUCCAGAAGUACAAGCAGAGCGUGCAGGGCGCCGGCACCAGCUACAGAAACGUGCUGCAGGCCGCCAUCCAGAAGAGCCUGAAGGACCCCAGCAACAACUUCAGACUGCACAACGGCAGAAGCAAGGAGCAGAGACUGAAGGAGCAGCUGGGCGCCCAGCAGGAGCCCGUGAAGAAGAGCAUCCAGGAGAGCGAGGCCUUCCUGCCCCAGAGCAUCCCCGAGGAGAGAUACAAGAUGAAGAGCAAGCCCCUGGGCAUCUGCCUGAUCAUCGACUGCAUCGGCAACGAGACCGAGCUGCUGAGAGACACCUUCACCAGCCUGGGCUACGAGGUGCAGAAGUUCCUGCACCUGAGCAUGCACGGCAUCAGCCAGAUCCUGGGCCAGUUCGCCUGCAUGCCCGAGCACAGAGACUACGACAGCUUCGUGUGCGUGCUGGUGAGCAGAGGCGGCAGCCAGAGCGUGUACGGCGUGGACCAGACCCACAGCGGCCUGCCCCUGCACCACAUCAGAAGAAUGUUCAUGGGCGACAGCUGCCCCUACCUGGCCGGCAAGCCCAAGAUGUUCUUCAUCCAGAACUACGUGGUGAGCGAGGGCCAGCUGGAGGACAGCAGCCUGCUGGAGGUGGAC(hu-cFLIP-p43(1-376); P1009 без эпитопной метки)- нуклеотид
1473
AUGGGCCCCGCCAUGAAGAACGUGGAGUUCAAGGCCCAGAAGAGAGGCCUGUGCACCGUGCACAGAGAGGCCGACUUCUUCUGGAGCCUGUGCACCGCCGACAUGAGCCUGCUGGAGCAGAGCCACAGCAGCCCCAGCCUGUACCUGCAGUGCCUGAGCCAGAAGCUGAGACAGGAGAGAAAGAGACCCCUGCUGGACCUGCACAUCGAGCUGAACGGCUACAUGUACGACUGGAACAGCAGAGUGAGCGCCAAGGAGAAGUACUACGUGUGGCUGCAGCACACCCUGAGAAAGAAGCUGAUCCUGAGCUACACC(hu-cFLIP-p12(377-480); P1010 без эпитопной метки)- нуклеотид
1474
AUGCAGCCCGACAUGAGCCUGAACGUGAUCAAGAUGAAGAGCAGCGACUUCCUGGAAUCGGCCGAGCUGGACAGCGGCGGCUUCGGCAAGGUGAGCCUGUGCUUCCACAGAACUCAGGGCCUGAUGAUCAUGAAGACCGUGUACAAGGGCCCCAAUUGCAUCGAGCACAACGAGGCCUUACUGGAGGAGGCCAAGAUGAUGAACAGACUGAGACAUUCGAGAGUGGUCAAGUUACUGGGCGUGAUCAUCGAGGAAGGCAAGUACAGCCUGGUGAUGGAGUACAUGGAAAAGGGCAACCUGAUGCACGUGCUGAAGGCCGAGAUGAGCACCCCCCUGAGCGUGAAGGGCAGAAUCAUCCUGGAGAUUAUCGAGGGGAUGUGCUACCUGCACGGCAAGGGCGUGAUCCACAAGGACCUGAAGCCGGAGAACAUCCUGGUGGACAACGACUUCCACAUCAAGAUCGCCGACCUGGGCCUGGCCAGCUUUAAGAUGUGGAGCAAGCUGAACAACGAGGAGCACAACGAGUUAAGAGAGGUGGACGGCACCGCCAAGAAGAACGGCGGCACCUUAUACUACAUGGCCCCCGAGCACCUGAACGAUGUGAACGCCAAGCCCACCGAGAAGAGCGACGUGUACUCCUUUGCCGUGGUCCUGUGGGCCAUCUUCGCCAACAAGGAGCCCUACGAGAACGCCAUUUGCGAGCAGCAGCUGAUCAUGUGCAUUAAGAGCGGCAACAGACCCGACGUGGACGACAUCACCGAGUACUGCCCCAGAGAGAUUAUCAGCCUGAUGAAGCUGUGCUGGGAGGCCAACCCCGAGGCUAGACCCACCUUCCCUGGGAUCGAGGAGAAAUUCAGACCCUUCUACCUGAGCCAGCUGGAGGAGAGCGUGGAAGAGGACGUGAAGAGCCUGAAGAAAGAGUACAGCAACGAGAACGCUGUGGUGAAGCGCAUGCAGAGCCUGCAGCUGGACUGCGUGGCCGUCCCCAGCAGCAGAAGCAACAGUGCCACCGAGCAGCCGGGCUCGCUGCACUCCAGCCAGGGCCUGGGCAUGGGCCCCGUGGAGGAGAGCUGGUUCGCCCCCUCGCUGGAGCACCCCCAGGAGGAGAACGAACCUAGCCUGCAGAGCAAGCUGCAGGACGAGGCCAACUACCACCUGUACGGCAGCAGAAUGGACAGACAGACCAAGCAGCAACCAAGACAGAACGUGGCCUACAACAGAGAGGAGGAACGAAGAAGAAGAGUGAGCCACGACCCCUUCGCCCAGCAGAGACCCUACGAGAACUUCCAGAACACCGAGGGCAAGGGCACCGCCUAUAGCAGCGCCGCCAGCCACGGCAACGCAGUGCACCAGCCCAGCGGCCUGACCUCUCAGCCCCAGGUGCUGUACCAGAAUAAUGGCCUGUAUAGCAGCCACGGCUUCGGCACCAGACCCCUGGACCCAGGCACCGCCGGCCCUAGAGUGUGGUACAGACCCAUCCCAAGCCACAUGCCCAGCCUGCACAACAUACCGGUGCCCGAGACAAACUACUUGGGCAACACCCCCACCAUGCCCUUCAGCAGCCUGCCCCCCACAGACGAGAGCAUCAAGUACACCAUCUAUAACAGCACCGGCAUCCAGAUCGGCGCCUACAACUAUAUGGAGAUCGGCGGUACCAGCAGCAGCGGCGGCAUCAAGAAGGAGAUAGAGGCAAUCAAGAAGGAGCAGGAGGCCAUCAAGAAGAAGAUCGAAGCCAUCGAGAAGGAGAUUGAGGCC (huRIPK1(1-555).IZ.TM; TH1021 без эпитопной метки) - нуклеотид
1475
AUGCAGCCCGACAUGAGCCUGAAUGUGAUCAAGAUGAAGAGCAGCGACUUCCUGGAGAGCGCCGAGCUGGAUAGCGGCGGAUUCGGCAAGGUGAGCCUGUGCUUCCACAGAACCCAAGGCCUGAUGAUCAUGAAGACCGUGUACAAGGGACCCAACUGCAUCGAGCACAACGAAGCCCUGUUAGAGGAAGCCAAGAUGAUGAAUAGACUGCGUCACUCUAGGGUGGUUAAACUGCUGGGCGUGAUCAUCGAGGAGGGCAAGUACAGCCUGGUGAUGGAGUACAUGGAGAAGGGCAACCUUAUGCACGUGCUGAAGGCCGAGAUGUCCACCCCCCUGAGCGUGAAGGGCAGAAUCAUCCUGGAGAUCAUCGAGGGAAUGUGUUAUCUGCAUGGCAAGGGCGUGAUCCACAAAGACCUGAAGCCCGAGAACAUCCUGGUGGACAACGAUUUCCACAUCAAGAUCGCCGACCUGGGCCUGGCCAGCUUCAAGAUGUGGAGCAAGCUGAACAACGAGGAGCACAACGAACUGAGAGAGGUGGAUGGCACCGCCAAGAAAAACGGCGGCACCCUGUAUUACAUGGCCCCCGAGCACCUGAACGACGUGAACGCCAAGCCCACCGAGAAGAGCGACGUUUACAGCUUUGCCGUGGUGCUGUGGGCCAUCUUCGCCAACAAGGAGCCCUACGAGAACGCCAUCUGCGAGCAGCAGCUGAUCAUGUGCAUCAAGAGCGGCAACAGACCCGACGUGGACGACAUCACCGAGUACUGCCCCCGUGAGAUCAUUAGCCUGAUGAAGCUGUGCUGGGAGGCCAACCCCGAGGCCAGACCCACCUUCCCCGGCAUUGAGGAGAAGUUCAGACCCUUCUACCUGAGCCAGUUAGAGGAAAGCGUGGAGGAGGACGUGAAAAGCCUGAAGAAAGAGUACUCUAACGAGAACGCCGUGGUGAAACGCAUGCAGAGCCUGCAGCUGGAUUGCGUGGCCGUGCCCAGCUCCAGAAGCAACAGCGCCACCGAACAACCUGGCAGCCUGCACAGCUCCCAGGGCCUGGGCAUGGGCCCCGUGGAGGAGAGCUGGUUCGCCCCCUCCCUGGAGCAUCCGCAGGAGGAGAACGAGCCCUCUCUGCAGUCCAAGCUGCAAGACGAGGCCAACUACCACCUGUACGGCAGCAGAAUGGACAGACAGACCAAGCAGCAACCCAGACAAAAUGUGGCCUACAAUAGAGAGGAGGAGAGAAGAAGAAGAGUGAGCCACGACCCUUUCGCCCAGCAGAGACCCUACGAGAACUUCCAGAAUACCGAGGGCAAGGGUACCGCCUACAGCUCAGCGGCCUCGCACGGCAACGCCGUGCACCAGCCCAGCGGCCUGACCAGCCAGCCCCAGGUGCUGUACCAAAACAACGGCCUGUAUAGCUCCCACGGCUUUGGCACCAGACCCCUGGACCCCGGCACCGCCGGCCCCAGAGUCUGGUAUAGACCCAUCCCCAGCCAUAUGCCUAGCCUGCACAACAUCCCCGUGCCCGAGACCAACUACCUGGGCAAUACCCCCACCAUGCCGUUCAGCAGCUUACCCCCCACCGACGAGAGCAUCAAGUACACCAUCUACAACAGCACCGGCAUCCAGAUCGGCGCCUACAACUACAUGGAAAUCGGCGGAACCAGCAGCAGCGGCAGCGACGGCAGCGGCUCCGGAAGCGGAAGCAUAACCAUCAGGGCCGCCUUCCUGGAGAAGGAAAAUACCGCGCUGAGAACAGAGAUUGCCGAGUUAGAAAAGGAGGUGGGCAGAUGCGAGAACAUAGUGAGCAAGUACGAGACCAGAUACGGCCCCCUG (huRIPK1(1-555).EE.DM; TH1022 без эпитопной метки) - нуклеотид
1476
AUGCAACCCGACAUGAGCUUGAACGUGAUCAAGAUGAAGAGCAGCGAUUUCCUGGAGAGCGCCGAGCUGGACAGCGGCGGCUUCGGCAAGGUGAGCCUGUGUUUCCACAGAACCCAGGGCCUGAUGAUCAUGAAGACAGUGUACAAGGGCCCCAACUGCAUCGAGCACAACGAGGCCCUGCUGGAGGAGGCUAAGAUGAUGAACAGACUGAGACACAGCAGAGUCGUGAAGCUGCUGGGCGUGAUCAUCGAAGAGGGCAAGUACAGCCUGGUGAUGGAGUACAUGGAGAAAGGCAACCUUAUGCACGUGCUCAAGGCCGAGAUGAGCACCCCUCUGAGCGUGAAGGGAAGAAUCAUCCUGGAGAUCAUCGAGGGCAUGUGCUACCUGCACGGCAAGGGCGUCAUCCAUAAGGACCUGAAGCCCGAGAAUAUCCUUGUGGACAACGACUUCCAUAUCAAGAUCGCCGACCUCGGCCUGGCCAGCUUCAAGAUGUGGAGCAAGCUGAACAACGAGGAGCACAACGAGCUGAGAGAGGUAGACGGCACCGCCAAGAAAAAUGGCGGCACCCUGUACUACAUGGCUCCCGAGCACCUGAAUGACGUGAACGCCAAGCCUACCGAAAAGAGCGACGUGUAUAGCUUCGCCGUGGUGCUCUGGGCCAUCUUCGCCAACAAGGAGCCUUAUGAGAAUGCAAUCUGCGAGCAGCAGCUGAUCAUGUGCAUCAAGAGCGGCAACAGACCCGACGUGGACGACAUCACCGAAUACUGCCCCAGAGAGAUCAUCAGCCUGAUGAAGCUGUGCUGGGAGGCCAACCCCGAGGCCAGACCCACCUUCCCCGGCAUUGAGGAGAAGUUCAGACCCUUCUACCUGAGCCAGUUGGAAGAGAGCGUGGAGGAGGACGUCAAAAGCCUGAAGAAGGAGUACAGCAACGAGAACGCCGUCGUGAAGAGAAUGCAGAGCCUGCAGCUGGACUGCGUGGCCGUGCCUAGCAGCAGAAGCAACAGCGCCACCGAGCAGCCCGGCAGCCUGCACAGCAGCCAGGGCCUUGGAAUGGGCCCCGUGGAGGAAAGCUGGUUCGCCCCCAGCCUUGAGCAUCCGCAGGAGGAGAACGAGCCCAGCCUGCAGAGCAAGCUGCAGGACGAAGCCAACUAUCACCUGUACGGCAGCAGAAUGGACCGACAGACCAAGCAGCAGCCCAGACAGAACGUGGCCUAUAACCGAGAGGAGGAGAGAAGAAGAAGGGUGAGCCACGACCCCUUCGCCCAACAGAGACCCUACGAGAACUUCCAGAACACCGAGGGCAAGGGCACCGCUUACAGUAGCGCCGCAAGCCACGGCAACGCCGUGCACCAACCUAGCGGACUGACCAGCCAGCCCCAGGUGCUGUACCAAAACAACGGUCUGUACAGCUCACACGGCUUCGGGACCAGACCCUUAGAUCCCGGAACCGCCGGCCCCAGAGUAUGGUAUAGACCCAUCCCCAGCCACAUGCCCAGCUUGCACAACAUCCCCGUGCCCGAGACCAACUACCUGGGCAACACCCCCACCAUGCCCUUCAGCAGCCUGCCCCCCACCGACGAGAGCAUCAAAUAUACCAUCUACAACAGCACCGGAAUCCAGAUCGGGGCCUACAAUUACAUGGAGAUCGGAGGCACCAGCAGCAGCGGCAGCGACGGUAGCGGAAGCGGCAGCGGCAGCCUCGAGAUCAGAGCCGCCUUCCUGGAGAAGGAGAACACCGCCCUGAGAACCAGAGCCGCCGAACUGAGAAAGAGAGUGGGCAGAUGCAGAAACAUCGUGAGCAAGUACGAGACCAGAUACGGCCCCCUG (huRIPK1(1-555).RR.DM; TH1023 без эпитопной метки) - нуклеотид
1477
AUGCAGCCUGACAUGAGCCUGGACAAUAUCAAGAUGGCCAGCAGCGACCUGCUCGAGAAGACCGACCUGGACAGUGGCGGCUUCGGAAAAGUGAGCCUGUGCUACCACAGGUCUCACGGGUUCGUGAUCCUGAAGAAGGUGUACACCGGCCCCAACAGAGCCGAGUAUAAUGAGGUGCUGCUGGAGGAGGGCAAGAUGAUGCACAGACUGAGACAUAGCAGAGUGGUGAAGCUGCUGGGCAUCAUCAUCGAGGAGGGAAACUACAGCCUGGUUAUGGAGUACAUGGAGAAGGGCAACCUAAUGCACGUGUUGAAGACCCAGAUAGACGUGCCACUGAGCUUAAAGGGCAGAAUCAUCGUGGAGGCUAUCGAGGGCAUGUGCUACCUGCACGACAAGGGCGUGAUCCACAAAGACCUGAAGCCCGAGAACAUACUCGUGGAUAGAGAUUUCCACAUCAAGAUCGCCGACCUGGGCGUGGCCAGCUUCAAGACUUGGAGCAAGCUGACAAAGGAGAAGGACAACAAGCAGAAGGAGGUGAGCAGCACCACCAAGAAAAACAACGGCGGCACCCUGUACUACAUGGCCCCUGAGCACCUGAACGACAUCAACGCCAAGCCCACCGAGAAGAGCGACGUGUAUAGCUUCGGCAUCGUGCUGUGGGCCAUCUUUGCUAAGAAAGAGCCCUACGAGAACGUGAUCUGCACCGAGCAGUUCGUCAUCUGCAUCAAGAGCGGCAACAGACCCAAUGUGGAGGAGAUCCUGGAAUACUGCCCCAGAGAGAUCAUCAGCCUCAUGGAGAGAUGCUGGCAGGCCAUCCCUGAGGACAGACCCACCUUCCUGGGCAUUGAGGAGGAGUUCAGACCCUUCUACCUGAGCCACUUCGAGGAGUACGUGGAGGAGGACGUGGCCAGUCUGAAAAAGGAGUAUCCAGACCAGAGCCCCGUGCUGCAGAGAAUGUUCAGCCUGCAGCACGACUGUGUGCCCCUGCCCCCCAGCAGAAGCAACAGCGAGCAGCCGGGCAGCCUGCACAGCAGCCAGGGCUUACAAAUGGGACCCGUGGAGGAGAGCUGGUUCAGCAGUAGCCCCGAGUACCCCCAGGACGAGAACGACAGGUCGGUCCAGGCCAAGCUCCAGGAAGAGGCCAGCUACCACGCCUUCGGCAUCUUCGCCGAGAAGCAAACCAAGCCCCAGCCCAGACAAAACGAAGCCUACAACAGAGAGGAAGAGAGAAAGAGACGCGUAAGCCACGACCCCUUUGCCCAACAGAGAGCCAGAGAAAACAUCAAGAGCGCCGGCGCCCGGGGCCACUCGGAUCCGAGCACCACUAGCAGAGGCAUCGCUGUGCAGCAACUCAGCUGGCCCGCCACCCAGACCGUGUGGAACAACGGCCUGUACAACCAGCACGGCUUCGGCACCACCGGCACCGGCGUUUGGUACCCCCCCAACCUGUCGCAGAUGUACAGCACCUACAAAACCCCCGUGCCCGAGACCAACAUCCCCGGCAGCACCCCCACCAUGCCCUAUUUCAGCGGCCCCGUGGCCGACGACCUGAUCAAGUACACCAUCUUCAACAGCAGCGGCAUCCAGAUCGGCAACCACAAUUACAUGGACGUGGGCCUGAACAGCCAGCCACCCAACAACACCUGCAAGGAAGAAAGCACCAGCGGCGGCAUCAAGAAGGAAAUCGAGGCCAUCAAGAAGGAGCAGGAAGCCAUAAAGAAGAAAAUCGAGGCCAUCGAGAAGGAGAUCGAGGCC (msRIPK1(1-555).IZ.TM; TH1024 без эпитопной метки) - нуклеотид
1478
AUGCAGCCCGACAUGAGCCUGGACAACAUUAAGAUGGCCAGUAGCGACCUGCUGGAGAAGACCGACCUGGAUAGCGGGGGCUUCGGCAAGGUGAGCCUGUGCUACCACAGAAGCCACGGAUUCGUGAUCCUGAAGAAGGUGUACACCGGCCCCAACAGAGCCGAGUACAACGAGGUGCUGCUGGAGGAGGGCAAGAUGAUGCAUAGACUGAGACACAGCAGAGUGGUGAAACUGCUGGGGAUCAUCAUCGAAGAGGGCAACUAUAGCCUGGUGAUGGAAUACAUGGAGAAGGGCAACCUGAUGCACGUGCUGAAGACCCAGAUCGACGUGCCCCUGAGCCUGAAGGGCAGAAUCAUCGUGGAGGCCAUCGAGGGUAUGUGCUACCUGCACGAUAAGGGCGUGAUCCACAAGGACCUGAAACCUGAAAACAUCUUAGUGGACAGAGACUUCCACAUCAAGAUCGCCGACCUGGGAGUGGCUAGCUUCAAGACCUGGAGCAAACUGACCAAGGAGAAGGAUAACAAGCAGAAGGAAGUGAGCAGCACCACCAAGAAAAACAACGGAGGCACCCUGUACUACAUGGCCCCCGAGCAUCUGAACGACAUCAACGCCAAGCCCACCGAGAAGAGCGACGUGUACUCCUUCGGCAUCGUCUUAUGGGCCAUCUUCGCCAAGAAGGAGCCCUACGAGAACGUGAUCUGCACCGAACAGUUUGUGAUCUGCAUCAAGAGCGGCAAUAGACCCAACGUGGAGGAGAUCCUGGAGUACUGCCCCAGAGAGAUCAUCAGCCUGAUGGAGAGGUGCUGGCAGGCUAUCCCCGAGGACAGACCCACCUUUCUGGGCAUCGAGGAAGAGUUCAGACCCUUCUAUCUGAGCCACUUCGAGGAGUAUGUUGAGGAGGACGUGGCCAGCCUGAAGAAGGAGUACCCCGACCAGAGCCCCGUGCUGCAGAGAAUGUUCAGCCUGCAACACGAUUGCGUGCCGCUGCCCCCCAGCAGAUCGAAUAGCGAGCAGCCAGGCAGCCUACACAGCAGUCAGGGCCUGCAGAUGGGCCCCGUGGAGGAAAGCUGGUUCAGCAGCAGCCCCGAGUACCCCCAGGACGAGAAUGACAGAAGCGUGCAAGCAAAGCUGCAAGAGGAGGCCAGCUACCACGCCUUCGGCAUCUUCGCCGAGAAACAGACUAAGCCCCAGCCCAGACAGAACGAGGCCUACAACAGAGAGGAGGAGAGAAAAAGACGAGUGAGCCACGACCCCUUCGCCCAGCAGAGAGCCAGAGAGAAUAUCAAGAGCGCCGGCGCCAGAGGCCACAGCGACCCCAGCACCACCAGCAGAGGAAUCGCCGUGCAGCAGCUGAGCUGGCCCGCCACCCAGACCGUGUGGAACAACGGCCUGUACAACCAGCACGGCUUUGGCACCACCGGCACCGGCGUGUGGUAUCCCCCCAACCUGAGCCAGAUGUACAGCACCUAUAAAACCCCUGUGCCGGAGACCAAUAUCCCCGGCAGCACCCCUACCAUGCCCUACUUCAGCGGCCCCGUGGCCGACGACCUGAUCAAGUACACGAUCUUCAACAGCAGCGGCAUCCAGAUAGGCAACCACAACUACAUGGACGUGGGCCUGAACAGCCAACCCCCCAAUAACACCUGCAAGGAGGAGUCCACCAGCGGCAGCGACGGCAGCGGCAGCGGCAGCGGCAGCAUAACCAUCAGAGCUGCUUUCCUGGAGAAGGAGAACACCGCUCUGAGAACCGAGAUCGCCGAGCUGGAGAAGGAGGUCGGCAGAUGCGAGAAUAUCGUGAGCAAGUACGAGACCAGAUACGGACCCCUG (msRIPK1(1-555).EE.DM; TH1025 без эпитопной метки) - нуклеотид
1479
AUGCAGCCUGAUAUGAGCCUGGACAACAUCAAGAUGGCCAGCAGCGACUUGCUGGAGAAGACCGAUCUGGACUCCGGCGGCUUUGGCAAGGUGAGCCUGUGUUACCACAGAAGCCACGGCUUCGUGAUCCUGAAAAAGGUGUACACCGGCCCCAAUAGAGCAGAGUACAACGAGGUGCUGCUGGAGGAGGGCAAGAUGAUGCACAGACUGAGGCAUAGCAGAGUGGUGAAACUGCUGGGCAUCAUCAUUGAGGAGGGCAACUACAGCCUGGUGAUGGAGUACAUGGAGAAGGGCAACCUGAUGCAUGUGCUGAAGACCCAAAUCGACGUGCCCCUGUCGCUGAAGGGCAGAAUCAUCGUGGAGGCCAUCGAGGGGAUGUGCUACCUGCACGACAAGGGCGUGAUCCACAAGGACCUGAAGCCCGAGAACAUCCUGGUGGAUAGAGACUUCCACAUCAAGAUCGCCGACCUGGGCGUUGCCAGCUUCAAGACCUGGUCUAAACUGACCAAGGAGAAAGACAACAAGCAGAAGGAGGUGAGCAGCACCACCAAGAAGAACAACGGCGGAACACUGUACUAUAUGGCCCCUGAGCACCUGAACGACAUCAACGCCAAGCCCACCGAGAAAAGCGAUGUUUACAGCUUCGGCAUCGUGCUGUGGGCCAUCUUCGCCAAGAAGGAGCCCUACGAGAACGUGAUCUGCACCGAGCAGUUCGUGAUCUGCAUCAAGAGCGGCAACAGACCCAACGUGGAGGAAAUCCUGGAGUACUGCCCCAGAGAGAUCAUCAGCCUGAUGGAGAGAUGCUGGCAGGCCAUCCCCGAGGACCGUCCCACGUUCCUGGGCAUCGAAGAGGAGUUCCGGCCCUUCUACCUGAGCCAUUUCGAGGAGUAUGUGGAGGAGGACGUGGCCAGCCUGAAGAAGGAGUACCCCGACCAGAGCCCAGUGCUGCAGAGAAUGUUCAGCCUUCAACACGACUGCGUGCCCCUGCCUCCCUCAAGAAGCAACAGCGAGCAGCCCGGCAGCUUGCACAGCAGCCAGGGCCUGCAGAUGGGCCCCGUGGAGGAGAGCUGGUUUAGCAGCAGCCCCGAGUACCCCCAGGACGAGAAUGACAGAAGCGUGCAAGCCAAGUUACAGGAGGAGGCCAGCUACCACGCCUUUGGAAUCUUCGCCGAGAAGCAGACCAAGCCCCAGCCCAGACAGAACGAGGCCUACAACAGAGAGGAGGAGAGAAAAAGAAGAGUGAGCCACGACCCCUUCGCCCAGCAGAGAGCCAGAGAGAACAUUAAGAGCGCCGGCGCGAGAGGCCACAGCGACCCCAGCACCACAAGCAGAGGCAUCGCCGUGCAGCAAUUGAGCUGGCCCGCCACCCAGACCGUGUGGAACAACGGCCUGUAUAACCAGCACGGCUUCGGAACCACCGGCACCGGCGUGUGGUACCCCCCCAAUCUGAGCCAGAUGUACAGCACUUACAAGACCCCCGUGCCCGAAACCAACAUCCCCGGCAGCACCCCCACCAUGCCCUACUUCAGCGGCCCCGUGGCCGACGACCUCAUCAAGUACACAAUAUUUAACAGCAGCGGCAUCCAGAUCGGCAACCACAACUACAUGGACGUGGGCCUGAACAGCCAGCCCCCGAACAAUACCUGCAAGGAGGAGAGCACAAGCGGCUCUGACGGCAGCGGCAGCGGCAGCGGCUCACUGGAGAUCAGAGCUGCCUUCCUGGAAAAGGAGAACACCGCUCUGAGAACCAGAGCCGCCGAGCUGCGAAAGAGAGUAGGCAGAUGCAGAAACAUCGUGAGCAAGUACGAGACCAGAUACGGUCCCCUG (msRIPK1(1-555).RR.DM; TH1026 без эпитопной метки) - нуклеотид
1480
AUGAGCGCCGGCGACCCCAGAGUGGGCAGCGGCAGCCUGGACAGCUUCAUGUUCAGCAUCCCCCUGGUGGCCCUGAACGUGGGCGUGAGAAGAAGACUGAGCCUGUUCCUGAACCCCAGAACCCCCGUGGCCGCCGACUGGACCCUGCUGGCCGAGGAGAUGGGCUUCGAGUACCUGGAGAUCAGAGAGCUGGAGACCAGACCCGACCCCACCAGAAGCCUGCUGGACGCCUGGCAGGGCAGAAGCGGCGCCAGCGUGGGCAGACUGCUGGAGCUGCUGGCCCUGCUGGACAGAGAGGACAUCCUGAAGGAGCUGAAGAGCAGAAUCGAGGAGGACUGCCAGAAGUACCUGGGCAAGCAGCAGAACCAGGAGAGCGAGAAGCCCCUGCAGGUGGCCAGAGUGGAGAGCAGCGUGCCCCAGACCAAGGAGCUGGGCGGCAUCACCACCCUGGACGACCCCCUGGGCCAGACCCCCGAGCUGUUCGACGCCUUCAUCUGCUACUGCCCCAACGACAUCGAGUUCGUGCAGGAGAUGAUCAGACAGCUGGAGCAGACCGACUACAGACUGAAGCUGUGCGUGAGCGACAGAGACGUGCUGCCCGGCACCUGCGUGUGGAGCAUCGCCAGCGAGCUGAUCGAGAAGAGAUGCAGAAGAAUGGUGGUGGUGGUGAGCGACGACUACCUGCAGAGCAAGGAGUGCGACUUCCAGACCAAGUUCGCCCUGAGCCUGAGCCCCGGCGUGCAGCAGAAGAGACCCAUCCCCAUCAAGUACAAGGCCAUGAAGAAGGACUUCCCCAGCAUCCUGAGAUUCAUCACCAUCUGCGACUACACCAACCCCUGCACCAAGAGCUGGUUCUGGACCAGACUGGCCAAGGCCCUGAGCCUGCCC(myd88(L265P) человека; P4027 без эпитопной метки) - нуклеотид
1481
AUGGGCGUGGGCAAGAGCAAGCUGGACAAGUGCCCCCUGAGCUGGCACAAGAAGGACAGCGUGGACGCCGACCAGGACGGCCACGAGAGCGACAGCAAGAACAGCGAGGAGGCCUGCCUGAGAGGCUUCGUGGAGCAGAGCAGCGGCAGCGAGCCCCCCACCGGCGAGCAGGACCAGCCCGAGGCCAAGGGCGCCGGCCCCGAGGAGCAGGACGAGGAGGAGUUCCUGAAGUUCGUGAUCCUGCACGCCGAGGACGACACCGACGAGGCCCUGAGAGUGCAGGACCUGCUGCAGAACGACUUCGGCAUCAGACCCGGCAUCGUGUUCGCCGAGAUGCCCUGCGGCAGACUGCACCUGCAGAACCUGGACGACGCCGUGAACGGCAGCGCCUGGACCAUCCUGCUGCUGACCGAGAACUUCCUGAGAGACACCUGGUGCAACUUCCAGUUCUACACCAGCCUGAUGAACAGCGUGAGCAGACAGCACAAGUACAACAGCGUGAUCCCCAUGAGACCCCUGAACAGCCCCCUGCCCAGAGAGAGAACCCCCCUGGCCCUGCAGACCAUCAACGCCCUGGAGGAGGAGAGCCAGGGCUUCAGCACCCAGGUGGAGAGAAUCUUCAGAGAGAGCGUGUUCGAGAGACAGCAGAGCAUCUGGAAGGAGACCAGAAGCGUGAGCCAGAAGCAGUUCAUCGCC(мышиный TRAM (TICAM2); P4033 без эпитопной метки) - нуклеотид
1482
AUGAGCACCGCCAGCGCCGCCAGCUCAAGCUCCUCCUCUAGCGCCGGCGAGAUGAUCGAGGCCCCCAGCCAGGUGCUGAACUUCGAGGAGAUCGACUACAAGGAAAUCGAGGUGGAGGAGGUGGUGGGCAGAGGCGCCUUCGGCGUGGUGUGCAAGGCCAAGUGGAGAGCCAAGGACGUGGCCAUCAAGCAGAUCGAGAGCGAGUCCGAGAGAAAGGCCUUCAUCGUGGAGCUGAGACAGCUGAGCAGAGUGAACCACCCCAACAUCGUGAAGCUGUACGGCGCCUGCCUGAACCCCGUGUGCCUGGUGAUGGAGUACGCCGAGGGCGGCAGCCUGUACAACGUGCUGCACGGCGCCGAGCCCCUGCCCUACUACACCGCCGCCCACGCCAUGAGCUGGUGCCUGCAGUGCAGCCAGGGCGUGGCCUACCUGCACAGCAUGCAGCCCAAGGCCCUGAUCCACCGCGAUCUGAAGCCCCCCAACCUGCUGCUGGUGGCCGGCGGCACCGUGCUGAAGAUCUGCGACUUCGGCACCGCCUGCGACAUCCAGACCCACAUGACCAACAACAAGGGAUCAGCUGCGUGGAUGGCCCCCGAGGUGUUCGAGGGCAGCAACUACAGCGAGAAGUGCGACGUGUUCAGCUGGGGCAUCAUCCUGUGGGAGGUGAUCACCAGAAGAAAGCCCUUCGACGAGAUCGGCGGCCCCGCCUUCAGAAUCAUGUGGGCCGUGCACAACGGCACCAGACCGCCGCUGAUCAAGAACCUGCCCAAGCCCAUCGAGUCCCUGAUGACCAGAUGCUGGAGCAAGGACCCGAGCCAGAGGCCCAGCAUGGAAGAGAUCGUUAAGAUCAUGACCCACCUGAUGAGAUACUUCCCGGGCGCCGAUGAACCGCUGCAGUACCCCUGCCAGGAGUUCGGCGGAGGCGGCGGCCAGAGCCCCACCCUGACCCUGCAGAGCACCAACACCCACACCCAGAGCAGCAGCAGUAGCAGCGACGGCGGCCUGUUCAGAAGCAGACCCGCCCACAGCCUGCCCCCCGGCGAGGACGGCAGAGUGGAGCCCUACGUGGACUUCGCCGAGUUCUACAGACUGUGGAGCGUGGACCACGGCGAGCAGAGCGUGGUGACCGCCCCC(TAK1-TAB1 человека; P4031 без эпитопной метки) - нуклеотид
1483
AUGGAGAACCUGAAGCACAUCAUCACCCUGGGCCAGGUGAUCCACAAGAGAUGCGAGGAGAUGAAGUACUGCAAGAAGCAGUGCAGAAGACUGGGCCACAGAGUGCUGGGCCUGAUCAAGCCCCUGGAGAUGCUGCAGGACCAGGGCAAGAGAAGCGUGCCCAGCGAGAAGCUGACCACCGCCAUGAACAGAUUCAAGGCCGCCCUGGAGGAGGCCAACGGCGAGAUCGAGAAGUUCAGCAACAGAAGCAACAUCUGCAGAUUCCUGACCGCCAGCCAGGACAAGAUCCUGUUCAAGGACGUGAACAGAAAGCUGAGCGACGUGUGGAAGGAGCUGAGCCUGCUGCUGCAGGUGGAGCAGAGAAUGCCCGUGAGCCCCAUCAGCCAGGGCGCCAGCUGGGCCCAGGAGGACCAGCAGGACGCCGACGAGGACAGAAGAGCCUUCCAGAUGCUGAGAAGAGACAACGAGAAGAUCGAGGCCAGCCUGAGAAGACUGGAGAUCAACAUGAAGGAGAUCAAGGAGACCCUGAGACAGUAC (нуклеотидная последовательность ОРС MLKL(1-180) человека; без эпитопной метки)
1484
AUGGAGCACGACCUUGAGAGAGGCCCUCCGGGCCCUAGAAGACCUCCUCGAGGUCCUCCACUUAGCAGCAGCUUGGGCCUCGCUCUCUUAUUGUUGCUACUUGCCUUGUUGUUCUGGUUGUACAUCGUGAUGAGCGACUGGACCGGCGGCGCCCUUCUGGUGCUGUACAGCUUCGCCCUGAUGCUGAUCAUUAUCAUACUGAUUAUCUUCAUAUUCAGAAGAGAUCUGCUGUGCCCUCUGGGCGCCUUAUGCAUUCUGCUUUUGAUGAUCACUCUGCUCCUCAUCGCACUCUGGAACCUGCACGGCCAGGCCCUGUUCCUGGGCAUCGUGCUGUUCAUCUUCGGCUGCCUCCUCGUGCUUGGAAUCUGGAUCUACCUGCUGGAGAUGCUGUGGAGACUAGGUGCCACCAUCUGGCAGCUGCUGGCCUUCUUCCUGGCAUUCUUCUUAGACCUGAUUCUGCUCAUUAUUGCCCUAUACCUGCAGCAGAACUGGUGGACCCUACUCGUUGAUCUCCUGUGGCUACUGCUGUUCCUUGCUAUCCUGAUUUGGAUGUACUACCACGGACAAAGACCUUUCGCCGAGGACAAGACCUACAAGUACAUCUGCAGAAACUUCAGCAACUUCUGCAACGUGGACGUGGUGGAGAUCCUGCCUUACCUGCCUUGCCUGACCGCCAGGGACCAGGACAGACUGAGAGCCACCUGCACCCUGAGCGGCAACAGAGACACCCUGUGGCACCUGUUCAACACCCUGCAGAGGCGCCCUGGCUGGGUGGAGUACUUCAUCGCCGCCCUGAGAGGCUGCGAGUUGGUUGACCUCGCCGACGAGGUGGCCAGCGUGUACCAGAGCUACCAGCCUAGAACCAGCGACAGGCCGCCUGACCCUCUGGAGCCUCCUAGCCUGCCUGCCGAACGGCCUGGCCCACCUACCCCUGCCGCCGCCCACAGCAUCCCUUACAACUCCUGUCGGGAGAAGGAGCCUAGCUACCCUAUGCCUGUGCAGGAAACGCAGGCCCCAGAAAGUCCUGGCGAGAACAGCGAGCAGGCCUUGCAGACUCUGAGCCCUAGAGCCAUCCCUAGAAACCCUGACGGCGGUCCUCUCGAGAGUUCCAGCGACCUGGCUGCACUCUCCCCACUGACCAGCAGCGGCCACCAGGAGCAGGACACCGAGCUGGGCAGCACCCACACCGCCGGCGCUACCUCAAGCCUUACCCCUAGCCGGGGCCCAGUCAGCCCUAGCGUGAGCUUCCAGCCUCUGGCCAGAAGCACACCAAGAGCCAGCAGACUUCCAGGACCAACCGGCAGCGUGGUGAGCACCGGCACCAGCUUCAGUUCCUCUAGCCCAGGCUUAGCCAGCGCCGGAGCGGCCGAGGGCAAGCAGGGCGCCGAGAGCGACCAGGCCGAGCCUAUCAUCUGUUCCUCGGGUGCCGAGGCCCCUGCCAACAGCCUACCUAGCAAGGUGCCUACCACACUGAUGCCAGUUAACACCGUGGCCCUGAAGGUUCCAGCCAACCCUGCUUCCGUUUCUACAGUGCCGUCCAAGCUGCCGACGUCAUCCAAGCCUCCGGGAGCCGUGCCAUCUAACGCCCUGACCAAUCCAGCUCCAAGCAAGCUCCCAAUCAACAGCACCAGAGCCGGCAUGGUGCCUUCAAAGGUGCCGACCUCCAUGGUGCUGACCAAGGUGAGCGCCUCUACCGUGCCAACCGACGGAUCUUCUCGGAACGAGGAGACACCUGCUGCUCCUACUCCAGCGGGCGCAACUGGAGGCUCCUCGGCUUGGCUGGACAGUUCUAGCGAGAAUAGAGGCCUGGGUAGUGAGCUGAGUAAGCCGGGCGUGCUCGCAAGCCAGGUGGACAGCCCUUUCAGCGGCUGCUUCGAAGACCUUGCAAUUUCCGCAUCUACCAGUCUAGGCAUGGGCCCUUGCCACGGCCCUGAGGAGAACGAGUACAAGAGCGAGGGCACCUUCGGCAUCCACGUGGCCGAGAACCCUAGCAUCCAGCUGCUUGAGGGCAAUCCUGGACCACCAGCCGAUCCUGAUGGCGGACCUAGACCUCAGGCCGACAGAAAGUUCCAGGAGAGAGAGGUGCCUUGUCAUAGACCUUCCCCAGGCGCUCUUUGGCUGCAGGUGGCCGUGACCGGUGUCCUCGUCGUGACAUUACUGGUGGUGCUCUACAGAAGAAGACUGCAC (нуклеотидная последовательность ОРС CA-hMAVS; без эпитопной метки)
1485
AUGAGCUGGUCCCCAAGCCUCACGACCCAGACCUGCGGCGCUUGGGAGAUGAAGGAGAGACUGGGCACGGGGGGCUUUGGCAACGUGAUCAGAUGGCAUAAUCAGGAAACCGGAGAGCAGAUUGCUAUCAAGCAGUGUAGACAGGAGCUAAGCCCCCGCAAUAGAGAGAGGUGGUGCCUGGAAAUUCAGAUUAUGAGAAGACUGACCCAUCCCAAUGUGGUCGCCGCAAGAGACGUCCCCGAAGGCAUGCAGAACCUGGCCCCCAAUGACCUGCCUCUUCUGGCCAUGGAAUACUGCCAGGGCGGCGACCUGCGGAAGUACCUGAAUCAGUUUGAAAAUUGCUGCGGCCUGAGAGAGGGCGCCAUAUUGACACUGCUGAGCGACAUCGCCAGCGCCCUGAGAUACCUGCACGAGAACAGAAUAAUUCACAGAGACCUGAAGCCGGAGAAUAUUGUGCUGCAGCAGGGUGAACAGAGGCUCAUCCAUAAGAUCAUCGACCUGGGGUACGCCAAGGAGCUGGAUCAGGGCGAGCUGUGUACCGAGUUUGUGGGGACUCUGCAAUACCUGGCCCCCGAGCUCCUGGAACAGCAGAAGUACACCGUCACAGUGGAUUAUUGGAGCUUCGGCACGCUGGCCUUCGAGUGCAUCACGGGCUUUAGGCCGUUUCUGCCCAAUUGGCAGCCCGUGCAAUGGCACAGCAAGGUCAGACAGAAAAGCGAGGUCGACAUCGUAGUGAGCGAAGACCUGAACGGCACUGUCAAGUUCAGUAGCUCCCUCCCCUACCCUAACAAUCUGAACAGCGUGCUGGCAGAGCGGCUGGAGAAGUGGCUACAACUAAUGCUGAUGUGGCACCCCCGACAGCGUGGCACCGACCCCACCUACGGGCCCAACGGAUGCUUCAAGGCCCUGGACGACAUUCUCAACCUGAAGCUGGUGCACAUCUUGAAUAUGGUGACCGGCACCAUCCACACCUACCCCGUGACCGAAGACGAAAGCUUGCAGAGCCUGAAGGCCAGAAUUCAACAGGACACAGGCAUCCCCGAAGAGGAUCAAGAGCUGCUGCAGGAAGCCGGCCUGGCUUUGAUUCCCGACAAACCAGCCACCCAGUGCAUUAGCGACGGCAAGCUGAACGAGGGCCACACCCUGGACAUGGACCUGGUGUUCCUGUUCGACAACAGCAAGAUUACCUACGAGACCCAAAUCAGCCCAAGGCCCCAACCCGAGAGCGUGAGCUGCAUCCUGCAAGAGCCCAAGAGGAAUCUGGCCUUCUUCCAACUAAGAAAGGUGUGGGGCCAAGUGUGGCACAGCAUCCAGACUCUGAAGGAAGACUGCAAUAGACUGCAACAAGGACAGCGAGCCGCCAUGAUGAACCUGUUAAGAAACAACAGCUGCUUAUCUAAGAUGAAGAACAGCAUGGCCUCCAUGAGCCAGCAGCUGAAAGCCAAACUGGAUUUCUUCAAGACCAGCAUCCAGAUCGACCUGGAGAAGUACAGCGAGCAGACGGAGUUCGGGAUCACCAGCGACAAGCUGCUGCUGGCUUGGAGGGAAAUGGAACAGGCCGUGGAGCUGUGCGGCAGAGAGAACGAGGUUAAACUGCUGGUAGAGCGGAUGAUGGCCCUGCAGACCGACAUUGUAGACCUCCAGAGAAGCCCUAUGGGAAGAAAACAGGGCGGAACACUGGACGACCUGGAGGAGCAGGCUAGAGAGCUGUACAGAAGACUUAGAGAGAAGCCCAGAGACCAAAGAACCGAGGGCGACAGCCAGGAGAUGGUGAGACUGCUGCUACAGGCUAUUCAAAGUUUCGAGAAGAAAGUGAGAGUGAUCUACACCCAACUCAGCAAAACCGUGGUGUGUAAGCAGAAGGCCCUGGAGCUGCUGCCCAAGGUUGAGGAGGUUGUCAGCCUGAUGAAUGAGGAUGAGAAGACCGUGGUGAGACUGCAAGAGAAAAGGCAGAAAGAACUGUGGAACCUUUUAAAGAUUGCCUGCAGCAAGGUGAGGGGCCCUGUAUCAGGAUCCCCCGACUCUAUGAACGCCAGCAGACUGAGCCAGCCCGGUCAACUGAUGAGCCAGCCCUCUACCGCCAGCAACUCCCUGCCCGAGCCAGCCAAGAAGAGCGAGGAACUGGUGGCCGAGGCCCACAAUCUGUGCACCCUACUGGAGAACGCCAUUCAGGACACCGUUCGCGAGCAGGACCAGAGCUUCACCGCCCUGGACUGGAGCUGGCUGCAGACUGAGGAGGAAGAGCACAGCUGCCUGGAGCAGGCCAGC(huIKK2ca(S177E/S181E); P4005 без эпитопной метки) - нуклеотид
1486
AUGAGCAGCGUGAAGCUCUGGCCCACCGGCGCCAGCGCCGUGCCCCUAGUGAGCCGGGAGGAGCUUAAGAAGCUCGAGUUCGUGGGCAAGGGCGGCUUCGGCGUGGUGUUCCGGGCCCACCACCGGACCUGGAACCACGACGUGGCCGUGAAGAUCGUGAACAGCAAGAAGAUCAGCUGGGAGGUGAAGGCCAUGGUGAACCUGCGGAACGAGAACGUGUUGCUGCUGCUGGGCGUGACCGAGGACCUGCAGUGGGACUUCGUGAGCGGCCAGGCCUUGGUUACCCGGUUCAUGGAGAACGGCAGCCUGGCCGGCCUGCUGCAGCCCGAGUGCCCCCGGCCCUGGCCCCUGCUGUGCCGGCUACUGCAGGAGGUGGUGCUGGGCAUGUGCUACCUGCACAGCCUGAACCCCCCACUUCUGCACCGGGACCUGAAGCCCAGCAACAUCCUGCUGGACCCCGAGCUGCACGCCAAGCUGGCCGACUUCGGCCUGAGCACCUUCCAGGGCGGCAGCCAGAGCGGCUCCGGAUCUGGCAGCGGAAGCCGGGACAGCGGCGGCACCCUGGCCUACCUGGACCCAGAGCUGCUGUUCGACGUGAACCUCAAGGCCAGCAAGGCCUCCGACGUGUACAGCUUCGGCAUCCUGGUGUGGGCCGUGCUGGCUGGAAGGGAGGCCGAGCUGGUGGACAAGACCAGCCUGAUCCGGGAGACAGUGUGCGACCGGCAGAGCCGGCCUCCUCUCACCGAACUGCCCCCCGGCAGCCCCGAGACUCCUGGCCUGGAGAAGCUGAAGGAGCUCAUGAUCCACUGCUGGGGCUCCCAGAGCGAGAACCGGCCCAGCUUCCAGGACUGCGAGCCCAAGACCAACGAGGUGUACAACCUGGUGAAGGACAAGGUGGACGCCGCCGUGAGCGAGGUCAAGCACUACCUGAGCCAGCACCGGAGCAGCGGCCGGAACCUGAGCGCCCGGGAGCCCAGCCAGCGGGGCACCGAGAUGGACUGUCCUCGCGAGACAAUGGUGAGCAAGAUGCUGGAUCGGCUGCACCUGGAGGAGCCUUCAGGCCCCGUGCCCGGCAAGUGUCCUGAGAGACAGGCCCAGGACACCAGCGUGGGCCCUGCCACCCCUGCACGGACCAGCAGCGACCCCGUGGCCGGCACCCCCCAGAUCCCCCACACCCUGCCCUUCAGAGGCACCACUCCAGGCCCGGUGUUCACGGAGACACCUGGACCACACCCCCAGCGGAACCAGGGCGACGGUAGACACGGCACACCAUGGUACCCAUGGACACCUCCUAACCCCAUGACCGGUCCACCUGCCCUGGUGUUCAACAACUGCAGCGAGGUGCAGAUCGGCAACUACAACAGCCUGGUGGCCCCUCCUAGGACCACCGCCAGCAGCAGCGCCAAGUACGAUCAGGCACAGUUCGGCCGGGGCAGAGGUUGGCAGCCCUUCCACAAGGGAGGAAUCAAGAAGGAGAUCGAGGCCAUUAAGAAGGAACAGGAAGCUAUAAAGAAGAAGAUUGAAGCUAUCGAGAAGGAAAUUGAGGCC(muRIPK3-IZ.Trimer; TH1015 без эпитопной метки) - нуклеотид
1487
AUGGCCGCUCUGAAGUCAUGGCUCUCAAGAAGUGUGACCAGCUUCUUCAGGUAUAGGCAGUGCCUGUGCGUGCCGGUCGUUGCUAACUUUAAAAAACGCUGUUUCAGCGAGCUGAUUCGCCCAUGGCACAAAACCGUGACCAUCGGGUUCGGAGUCACACUGUGCGCUGUCCCAAUCGCACAAGCUGUGUAUACGCUUACCUCACUUUACAGACAGUACACAUCUUUGCUGGGAAAGAUGAAUUCUGAGGAGGAAGACGAGGUGUGGCAAGUUAUUAUUGGCGCCAGAGCCGAAAUGACAUCGAAGCAUCAGGAAUACCUGAAACUUGAGACCACAUGGAUGACGGCAGUCGGACUCUCCGAGAUGGCAGCCGAAGCAGCCUACCAGACAGGUGCCGACCAGGCUAGCAUCACAGCUCGGAACCAUAUCCAAUUGGUAAAGCUGCAGGUCGAAGAGGUCCACCAACUAAGCCGAAAAGCCGAAACCAAACUGGCUGAAGCCCAGAUUGAAGAACUGCGGCAAAAAACCCAGGAAGAGGGCGAGGAGCGAGCCGAAUCUGAGCAAGAAGCUUAUCUGCGGGAAGAU(Diablo.3; TH2003 без эпитопной метки) - нуклеотид
1488
AUGGGCUGCGUGUGCAGCAGCAACCCCGAGGACGACUGGAUGGAGAACGGCGGCAUCAAGAAGGAGAUAGAAGCCAUUAAGAAAGAGCAGGAGGCCAUCAAGAAGAAGAUCGAGGCCAUCGAGAAGGAGAUCGAAGCCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCAGUGGCGGCGGCAGCGACCCCUUCCUGGUGCUGCUGCACAGCUUAAGCGGCAGCCUGAGCGGCAACGACCUGAUGGAGCUGAAGUUCCUGUGUAGAGAGAGAGUGAGCAAGAGAAAGCUGGAGAGAGUGCAGAGCGGCCUGGACCUGUUCACCGUGCUGCUGGAGCAGAACGACCUGGAAAGAGGCCACACCGGCUUGCUGAGAGAGUUGCUGGCCUCACUGAGAAGACACGAUCUGCUGCAGAGACUGGACGACUUCGAGGCCGGCACCGCCACCGCCGCCCCCCCCGGAGAAGCCGACCUGCAGGUGGCCUUCGACAUCGUGUGCGACAACGUGGGCAGAGACUGGAAGAGAUUGGCCAGAGAGCUGAAGGUGAGCGAGGCCAAGAUGGACGGCAUCGAGGAGAAGUACCCCAGAAGCCUGAGCGAGAGAGUGAGAGAGAGCCUGAAGGUGUGGAAGAACGCCGAGAAGAAGAACGCCAGCGUGGCUGGGCUGGUGAAGGCCCUGAGAACCUGCAGACUGAACCUGGUGGCCGAUCUGGUGGAGGAGGCCCAGGAGAGCGUGAGCAAGAGCGAGAACAUGAGCCCCGUGCUGAGAGACAGCACCGUGAGUAGCAGCGAGACCCCC(Myr(Lck)-IZ-L-msFADD; TH3002 без эпитопной метки) - нуклеотид
1489
AUGGGCUGCGUGUGCAGCAGCAACCCCGAGGACGACUGGAUGGAGAACGGCGGCAUCAAAAAGGAGAUCGAGGCCAUCAAGAAGGAGCAGGAGGCCAUCAAGAAGAAGAUCGAGGCCAUCGAGAAAGAGAUAGAGGCCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCCCCGGCGAGGAGGACCUGUGCGCCGCCUUCAACGUGAUCUGCGACAACGUGGGCAAGGACUGGAGAAGACUGGCCAGACAGCUGAAGGUGAGCGACACCAAGAUCGACAGCAUCGAGGACAGAUACCCCAGAAACCUGACCGAGAGAGUGAGAGAGAGCCUGAGAAUCUGGAAGAACACCGAGAAGGAGAACGCCACCGUGGCCCACCUGGUGGGCGCCCUGAGAAGCUGCCAGAUGAACCUGGUGGCCGACCUGGUGCAGGAGGUGCAGCAGGCCAGAGACCUGCAGAACAGAAGCGGCGCCAUGAGCCCCAUGAGCUGGAACAGC(Myr(Lck)-IZ-L-huFADD-DD; TH3003 без эпитопной метки) - нуклеотид
1490
AUGGGCUGCGUGUGCAGCAGCAACCCCGAGGACGACUGGAUGGAGAACGGCGGCAUCAAGAAAGAGAUCGAGGCCAUCAAAAAGGAGCAGGAGGCCAUCAAGAAGAAGAUCGAGGCCAUCGAGAAGGAGAUCGAGGCCGGCUCUGGCGGCGGCAGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCCCCCCCGGCGAGGCCGACUUACAGGUGGCCUUCGACAUCGUGUGCGACAACGUGGGCAGAGACUGGAAGAGACUGGCCAGAGAGCUGAAGGUGAGCGAGGCCAAGAUGGACGGCAUCGAGGAGAAGUACCCCAGAAGCCUGAGCGAGAGAGUGAGAGAGAGCCUGAAGGUGUGGAAGAACGCCGAGAAGAAGAACGCCAGCGUGGCCGGCCUGGUGAAGGCCCUGAGAACCUGCAGACUGAACCUGGUGGCCGACCUGGUGGAGGAGGCCCAGGAGAGCGUGAGCAAGAGCGAGAACAUGAGCCCCGUGCUGAGAGACAGCACCGUGAGC(Myr(Lck)-IZ-L-msFADD-DD; TH3004 без эпитопной метки) - нуклеотид
1491
AUGGGCCAGACCGUGACCACCCCCCUGAGCCUCACCCUGGAUCACUGGGGCGGCAUCAAGAAAGAGAUCGAGGCCAUCAAGAAGGAGCAGGAGGCCAUCAAGAAGAAGAUCGAAGCCAUCGAGAAGGAGAUCGAGGCCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGACCCCUUCCUGGUGCUGCUGCACAGCGUGUCCAGCAGCCUGAGCAGCAGCGAGCUGACCGAGCUGAAGUUCCUGUGCCUGGGCAGAGUGGGCAAAAGAAAGCUGGAGAGAGUGCAGAGCGGCCUGGACCUCUUCAGCAUGCUGCUGGAGCAGAACGACUUGGAGCCCGGCCACACCGAGCUGCUGAGAGAGCUGCUGGCCAGCCUGCGGAGACACGACCUGCUGAGAAGAGUGGAUGACUUCGAGGCCGGCGCCGCCGCCGGCGCCGCCCCCGGCGAGGAGGACCUGUGCGCCGCCUUCAACGUGAUCUGCGACAACGUGGGCAAGGAUUGGAGAAGAUUAGCCAGACAGCUGAAGGUGAGUGACACCAAGAUUGACAGCAUCGAGGACAGAUACCCCAGAAACCUGACCGAGAGAGUCAGAGAGAGCCUGAGAAUCUGGAAGAAUACCGAGAAGGAGAACGCCACCGUGGCCCACCUGGUGGGCGCCCUGAGAAGCUGCCAGAUGAACCUGGUGGCCGACCUGGUGCAGGAGGUGCAGCAGGCCAGAGACCUGCAGAACAGAAGCGGCGCCAUGAGCCCCAUGAGCUGGAACAGCGACGCCAGCACCAGCGAGGCCAGC(Myr(MMSV)-IZ-L-huFADD; TH3005 без эпитопной метки) - нуклеотид
1492
AUGGGCCAGACAGUGACCACCCCCCUGUCCCUGACCUUGGACCACUGGGGCGGCAUCAAGAAGGAGAUCGAGGCCAUCAAGAAGGAGCAGGAGGCCAUCAAAAAGAAGAUCGAAGCCAUUGAGAAGGAGAUCGAGGCCGGAAGCGGGGGCGGCAGCGGCAGCGGCGGAGGAAGCGACCCCUUCCUGGUGCUGCUGCAUAGCCUGUCAGGCAGCCUGAGCGGCAACGAUCUGAUGGAGCUGAAGUUCCUGUGCCGCGAGAGAGUGAGCAAGAGAAAGCUGGAGAGAGUACAGAGCGGCCUGGACCUGUUCACCGUGCUGCUGGAGCAGAAUGACCUGGAGAGAGGCCACACCGGCUUGCUGAGAGAGUUGCUGGCCAGCCUGAGAAGGCACGACCUGCUGCAGAGACUGGACGACUUCGAGGCCGGCACCGCCACCGCCGCCCCCCCCGGCGAAGCGGACCUGCAGGUGGCCUUCGACAUCGUGUGCGACAACGUGGGCAGAGACUGGAAGAGACUGGCCAGAGAACUGAAGGUGAGCGAGGCCAAAAUGGACGGCAUCGAGGAGAAGUACCCCAGAAGCCUGAGCGAGAGAGUGAGAGAGAGCCUGAAGGUGUGGAAGAACGCCGAGAAGAAGAACGCCAGCGUGGCCGGCCUGGUGAAGGCCCUGAGAACAUGCAGACUGAACCUGGUGGCCGAUCUUGUGGAGGAGGCCCAGGAGAGCGUGAGCAAGAGCGAAAACAUGAGCCCCGUGCUGAGAGACAGCACCGUGAGCAGCAGCGAGACCCCC(Myr(MMSV)IZLmsFADD; TH3006 без эпитопной метки) нуклеотид
1493
AUGGGCCAGACCGUGACCACCCCCCUGAGCCUGACCCUGGACCACUGGGGCGGCAUCAAGAAGGAGAUCGAGGCCAUCAAGAAGGAGCAGGAGGCCAUCAAGAAGAAGAUUGAGGCUAUCGAGAAGGAGAUCGAGGCCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCCCCGGCGAGGAGGACCUGUGCGCCGCCUUCAACGUGAUCUGCGACAACGUGGGCAAGGACUGGAGAAGACUGGCCAGACAGCUGAAGGUGAGCGACACCAAGAUCGACAGCAUCGAGGACAGAUACCCCAGAAACCUGACCGAGAGAGUGAGAGAGAGCCUGAGAAUCUGGAAGAACACCGAGAAGGAGAACGCCACCGUGGCCCACCUGGUGGGCGCCCUGAGAAGCUGCCAGAUGAACCUGGUGGCCGACCUGGUGCAGGAGGUGCAGCAGGCCAGAGACCUGCAGAACAGAAGCGGCGCCAUGAGCCCCAUGAGCUGGAACAGC(Myr(MMSV)IZLhuFADDDD; TH3007 без эпитопной метки) нуклеотид