СПОСОБ ПОДГОТОВКИ СИМБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ РОДА Xenorhabdus, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ НЕМАТОД ВИДА Steinernema feltiae protense, К ХРАНЕНИЮ
METHOD OF PREPARING SYMBIOTIC BACTERIA OF GENUS Xenorhabdus, ISOLATED FROM NEMATODES OF GENUS Steinernema feltiae protense, FOR STORAGE

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения симбиотических бактерий энтомопатогенных нематод семейства Steinemematidae для хранения и накопления при промышленном производстве биомассы этих паразитов, применяемых в качестве биологических средств защиты растений от насекомых вредителей. При культивировании энтомопатогенных нематод в питательной среде большое значение имеет подготовка чистой культуры симбиотических бактерий, которые встречаются в двух формах: первичной и вторичной. Нематоды размножаются в присутствии первичной формы, тогда как вторичные формы бактерий могут прекращать развитие нематод. Поэтому под термином «симбиотические бактерии»  понимается первичная форма.
Известен способ получения чистых колоний первичных форм симбиотических бактерий, при этом культуру симбиотических бактерий подготавливают и хранят на на агаризированных косяках в пробирках (4). Чистые культуры первичных форм симбиотических бактерий получают по методу Г.Пойнара (Poinar G.O. The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp. // Nematologica. 1966. Vol.12, №1. P.31-35 [9]) путем заражения нематодами гусениц большой вощинной моли (Galleria melonella), выращенных по методу Датки и др. (Dutky S.R., et al. A technique for the mass propogation oe the DD-136 nematode // J. Insect Pathol. - 1964. - Vol.6, №4. - P.417-422 [6]), с последующим отбором бактериальных клеток из гемолимфы насекомых и посевом их на питательный агар Макконки, содержащий красители - бромтимоловый голубой (0,004%) и трифенилтетразолиум хлорид (0,025%).
Спустя трое суток после выращивания бактерий при 25°С проводят отбор колоний первичных форм по морфологическим признакам колоний и по характеру их окраски. Идентификация первичных форм симбиотических бактерий проводят по методу Акюрста (4). Для получения большого количества культуры симбиотических бактерий необходимо повторять весь процесс постоянно и многократно, так как хранится культура 10-15 дней.
Недостатками  такого способа являются короткий срок сохраняемости полученной  бактериальной культуры (10-15 дней) и невозможность накопления большой массы  культуры, трудоемкость процесса, связанного с необходимостью вновь повторять этап выделения
чистой культуры бактерий из природной популяции инвазионных личинок нематод. В связи  с этим временные затраты снижают стабильность промышленного производства нематодных препаратов в целом.
°
°
Наиболее близким из известных способов подготовки к хранению симбиотических бактерий, при котором культуру  симбиотических бактерий выращивают в питательных колбах Эрленмейра, в течение трех суток на качалке при температуре 25-28С. Затем осуществляют заморозку бактериальных клеток путем добавления к питательному бульону с бактериями 17% глицерина с последующим быстрым охлаждением до -18С. Для быстрого оттаивания бактерий культуры помещаются на реактивацию в  водяную баню при 56°С на реактивацию (Akhurst R.J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp. bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes Neoaplectana and Heterorhabditis // J. Gen. Microbial. 1980. Vol.121, №2. P.303-309 [4]).
Недостатками такого способа подготовки является то, что в замороженном состоянии чистая культура бактерий хранится также короткий период (15-20 дней) и со значительным снижением биологической активности. Для накопления биомассы необходимо вновь повторять этап замораживания и реактивации бактериальной культуры. Процесс промышленного получения биопрепарата, который предусматривает постоянное наличие большого количества чистой культуры первичной формы симбиотических бактерий. Для длительного хранения и накопления большой биомассы чистой культуры бактерий в промышленных масштабах этот способ подготовки также не пригоден.
Задачей изобретения  является  получение культуры симбиотических бактерий с высокой выживаемостью и биологической активностью и возможностью длительного хранения для накопления при использовании биомассы первичной формы в условиях промышленного производства биопрепаратов на основе энтомопатогенных нематод.
°
Поставленная задача решается следующим путем: в полученную на питательной среде культуру симбиотических бактерий (род Xenorhabdus) энтомопатогенных нематод (семейство Steinemematidae) вводят в соотношении 1:1-2 защитную среду. В  качестве среды используют: 20% лактозы, 10% полиглюкина, 3% тиомочевины, 3% аскорбиновой кислоты, 3% дикстрина и воду - остальное до 100%. Затем полученную культуру замораживают при -40С с последующей лиофильной сушкой до остаточной влажности 3-5%.
Компонентный состав защитной среды подобран с учетом допустимых параметров аналогичных сред, используемых в микробиологии. Использование лиофильной сушки известно для подготовки различных бактерий к длительному хранению (Опарин Ю.Г. Повреждение и защита биоматериалов при замораживании и лиофилизации. Биотехнология. 1996, 7:3-11 [2]; Ярцев М.Я. и др. Патент РФ №2053790, А61К 39/02. «Способ изготовления вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных» [3]; Manzano M. et al. Simple and Fast PCR Protocol to Detect Listeria monocytogenes from Meat. // J.Sci. Food Agriculture. 1997. - V.74 - n. 1. - p.25-30 [10]; Wang B.J.C., et al. Fermentation and enzyme technology. N-Y.: John Willey and sons. 1979 180 p. [11]).
Однако для наших целей не были разработаны и не использовались. Путем дополнительного введения   защитной среды, в том числе декстрина и подбора соотношений компонентов ней, а также соотношения с биомассой культуры симбиотических бактерий, удалось достичь решения поставленной задачи.
Пример 1
8
Для лиофилизации культуральную жидкость с развившейся культурой бактерий рода Xenorhabdus, выделенных из нематод вида Steinemema feltiae protense сем. Stein-emematidae (численность бактериальных клеток в 1 мл питательного бульона 1,2·10) смешивают со 100 мл защитной среды. Полученная суспензия микроорганизмов разливается по 2 мл в стерильные пенициллиновые флаконы. Флаконы ставятся на поддон из нержавеющей стали и помещаются в морозильную камеру на замораживание. Замораживание лиофилизируемых образцов при -40° следует проводить в течение трех часов минимум. После чего включается вакуум и проводят лиофильное высушивание в течение примерно 48 часов до остаточной влажности в образцах 3-5%. Высушенные образцы стерильно укупоривают резиновыми пробками и помещают в холодильник при +4°С на хранение.
Для приготовления 100 мл защитной среды берут следующие навески реактивов - 20,0 г лактозы, 10,0 г полиглюкина, 3,0 г тиомочевины, 3,0 г аскорбиновой кислоты, 3,0 г декстрина, остальное - вода.
В стеклянный стакан емкостью 300 мл наливают 80 мл теплой (примерно 60-70°С) дистиллированной воды. Стакан помещается на магнитную мешалку с включенным подогревом и скоростью оборотов 500-700 оборотов в минуту. Сначала в стакан высыпается навеска лактозы, после растворения которой в стакан дробно добавляется навеска полиглюкина. Смесь перемешивается до получения прозрачного раствора, затем добавляются навески тиомочевины, аскорбиновой кислоты, декстрина, и вновь перемешивается до получения истинного раствора. После этого магнитная мешалка выключается, стакан закрывается алюминиевой фольгой, и раствор остывает до комнатной температуры.
Полученный раствор имеет сильнокислую реакцию, поэтому не требует дополнительной стерилизации. Дальнейшие манипуляции с защитной средой необходимо проводить в стерильных условиях. Показатель кислотности рН раствора доводится на рН метре добавлением 0.2 М раствора гидроокиси натрия до 7.0+/-0.1 ед. Объем защитной среды доводится до 100 мл стерильной дистиллированной водой. После чего в защитную среду вносится 100 мл культуры симбиотических бактерий и смешивают в объемном соотношении 1:1.
Чистые культуры первичных форм симбиотических бактерий для экспериментов получены по методу Г.Пойнара (Poinar G.O. The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp. // Nematologica. 1966. Vol.12, №1. P.31-35 [9]) путем заражения нематодами вида Steeinemema feltiae protense гусениц Galena mellonella, выращенных по методу Датки и др. (6), с последующим отбором бактериальных клеток (Xenorhabdus sp.) из гемолимфы насекомых и посевом их на питательный агар Макконки, содержащий красители - бромтимоловый голубой (0,004%) и трифенилтетразолиум хлорид (0,025%).
Для размножения нематод в наших опытах использована питательная среда со следующим компонентным составом: соевая мука - 16%, куриное яйцо - 20%, кукурузное масло - 5%, дрожжи пивные 1%, поролоновая крошка 8% и вода - 50%. Аналогичный компонентный состав ИПС с незначительными изменениями рекомендуется зарубежными авторами и для культивирования нематод в жидкой питательной среде (Buecher E.J., Popiel I. Liquid culture of the entomogenous nematode Steinemema feltiae with its bacterial symbiont // J. Nematol. - 1989. - Vol.21, №2. - P.199-200 [5]; Friedman M.J. Commercial production and development // Entomopathogenic nematodes in biological control. - Eds.: R.Gaugler and H.K.Kaya. - Boca Ration, FL: CRC Press, 1990. - P.153-172 [7].
В контрольном варианте (прототип) использовалась чистая культура симбиотических бактерий, выращенная на питательном бульоне.
Оценку качества бактериальных культур проводили по трем показателям: 1) выход бактериальной культуры после хранения; 2) выход культуры нематод, развившейся в присутствии бактерий после их хранения; 3) инвазионная активность нематод после их развития в присутствии культуры бактерий полученной предложенным способом в сравнении с прототипом.
3
Культивирование нематод на искусственной питательной среде (ИПС) проведено по одной методике, т.е. с использованием колб Эрленмейера объемом 500 см (6).
После завершения цикла развития нематод в ИПС, полученные культуры нематод оценивали на инвазионную активность по методу Веремчук и Данилова (Веремчук Г.В., Данилов Л.Г. Методические указания по определению инвазионной активности нематодных культур рода Neoaplectana (Steinemematidae). Л., 1978, 7 стр. [1]).
Показатель инвазионной активности нематодно-бактериальных комплексов служил критерием окончательной оценки качества бактериальных культур. Выход биомассы нематод после завершения цикла развития нематод в ИПС приведен в таблицах в расчете на одну колбу, т.е. на 60 г ИПС.
После оценки качества бактериальных культур при различных способах их получения после хранения у бактерий, выделенных из нематод Steinemema feltiae protense, отмечено четырехкратное увеличение интенсивности роста бактериальных клеток по сравнению с прототипом (Таблица 1, п.2).
При оценке качества бактериальных клеток после хранения по интенсивности развития нематодно-бактериального комплекса на искусственной питательной среде и инвазионной активности его в отношении насекомых-хозяев было установлено, что выход инвазионных личинок нематод на 10% превышал этот показатель по сравнению с прототипом (Таблица 2, п.2).
Не установлено снижение инвазионной активности у нематод, развившихся в присутствии симбиотических бактерий, хранившихся в лиофилизированном состоянии (соотношение культуральной жидкости и защитной среды 1:1) в течение 7 месяцев (Таблица 3).
Пример 2.
Подготовку культуры бактерий проводили так же, как и в примере 1, но соотношение культуральной жидкости с защитной средой составляло 1:2. Для приготовления защитной среды для лиофильного высушивания симбиотических бактерий в расчете 200 мл в стеклянный стакан емкостью 300 мл наливают 160 мл теплой (примерно 60-70°С)  дистиллированной воды. В расчете на 200 мл защитной среды для лиофильного высушивания симбиотических бактерий берут следующие навески реактивов - 40,0 г лактозы, 20,0 г полиглюкина, 6,0 г тиомочевины, 6,0 г аскорбиновой кислоты, 6,0 г декстрина, остальное - вода. Объем защитной среды доводится до 200 мл стерильной дистиллированной водой. После чего в защитную среду вносится 100 мл культуры симбиотических бактерий и смешивается с защитной средой в объемном соотношении 1:2.
При  оценке качества бактериальных культур после хранения у бактерий, выделенных из нематод Steinemema feltiae protense и подготовленных по предложенному способу,  отмечено трехкратное увеличение интенсивности роста бактериальных клеток по сравнению с прототипом (Таблица 1, п.3).
При оценке качества бактериальных клеток после хранения по интенсивности развития нематодно-бактериального комплекса на искусственной питательной среде и инвазионной активности его в отношении  насекомых-хозяев было установлено, что выход инвазионных личинок нематод этот показатель был на одном уровне по сравнению с прототипом (Таблица 2, п.3).
Не установлено также снижение инвазионной активности у нематод, развившихся в присутствии симбиотических бактерий, подготовленных по предложенному способу и  хранившихся в лиофилизированном состоянии (соотношение культуральной жидкости и защитной среды 1:2) в течение 7 месяцев (Таблица 3, п.3).
Таким образом, симбиотические бактерии, подготовленные по предложенному способу  (при соотношении культуральной жидкости и защитной среды 1:2), после 7 месяцев хранения  по двум показателям соответствуют прототипу, а по интенсивности роста бактерий в 3 раза превышают соответствующие показатели прототипа.
Предложенный способ подготовки  чистых культур симбиотических бактерий рода Xenorhabdus, выделенных из нематод  вида Steinemema feltiae protense, позволяет увеличить срок хранения культуры до 7 месяцев с сохранением и даже  увеличением ее качественных показателей. Это позволяет накапливать запас посевного материала чистых культур симбиотических бактерий с высокими показателями выживаемости, биологической активности для успешного и стабильного режима функционирования  промышленного производства по сравнению с прототипом.
Предложенный способ позволяет  за счет повышения качества бактериальной культуры обеспечить ее длительное хранение и накопление. Снизить    трудоемкость процесса, исключив повторяемость этапа получения биопрепарата  на основе нематод, также повысить  их качество. Таким образом, снимается один из критических вопросов в технологиях массового производства биологических препаратов, изготавливаемых на основе энтомопатогенных нематод.
Таблица 1
Выход бактериальных культур рода Xenorhabdus sp. на питательном бульоне после хранения (численность бактериальных клеток в 1 мл питательного бульона)
Вид нематод
№
Варианты
Культивирование бактерий в питательном бульоне в течение 48 часов
Steinemema feltiae protense
1
Контроль - в пробирках на агаризованных косяках (прототип) после хранения
1,2·10<sup>8</sup>
2
Способ при лиофилизации (соотношение культуральной жидкости и защитной среды 1:1) в течение 7 месяцев после хранения
3,8·10<sup>8</sup>
3
Способ при лиофилизации (соотношение культуральной жидкости и защитной среды 1:2) в течение 7 месяцев после хранения
3,6·10<sup>8</sup>
Таблица 2
Выход нематодной культуры (сем. Steinemematidae) в присутствии симбиотических бактерий (Xenorhabdus sp.) после хранения
Вид нематод
№
Варианты
Выход зрелой культуры нематод после развития нематодно-бактериального комплекса, млн
Steinemema feltiae protense
1
Контроль - в пробирках на агаризованных косяках (прототип) после хранения
15,5±4,2
2
Способ при лиофилизации (соотношение культуральной жидкости и защитной среды 1:1) в течение 7 месяцев после хранения
16,2±2,5
3
Способ при лиофилизации (соотношение культуральной жидкости и защитной среды 1:2) в течение 7 месяцев после хранения
14,5±4,4
Таблица 3
Инвазионная (энтомопатогенная) активность нематоднод в отношении тест-насекомых (Galleria mellonella) с бактериями, полученными по предложенному способу после хранения
Вид нематод
№
Варианты
Показатель патогенности нематод, LD<sub>50</sub>
Steinemema feltiae protense
1
Контроль - в пробирках на агаризованных косяках (прототип) после хранения
22,8±2,7
2
Способ при лиофилизации (соотношение культуральной жидкости и защитной среды 1:1) в течение 7 месяцев после хранения
22,3±3,6
3
Способ при лиофилизации (соотношение культуральной жидкости и защитной среды 1:2) в течение 7 месяцев после хранения
25,1±6,7
Источники информации
1. Веремчук Г.В., Данилов Л.Г. Методические указания по определению инвазионной активности нематодных культур рода Neoaplectana (Steinemematidae). Л., 1978, 7 стр.
2. Опарин Ю.Г. Повреждение и защита биоматериалов при замораживании и лиофилизации. Биотехнология. 1996, 7: 3-11.
3. Ярцев М.Я., Шишов В.П., Раевский А.А., Коротеева Л.А., Павленко И.В. Патент РФ №2053790, А61К 39/02. «Способ изготовления вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных».
4. Akhurst R.J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp. bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes Neoaplectana and Heterorhabditis // J. Gen. Microbial. 1980. Vol.121, №2. P.303-309.
5. Buecher E.J., Popiel I. Liquid culture of the entomogenous nematode Steinemema feltiae with its bacterial symbiont // J. Nematol. - 1989. - Vol.21, №2. - P.199-200.
6. Dutky S.R., Thompson J.V., Cantwel G.E. A technique for the mass propogation of the DD-136 nematode // J. Insect Pathol. - 1964. - Vol.6, №4. - P.417-422.
7. Friedman M.J. Commercial production and development // Entomopathogenic nematodes in biological control. - Eds.: R.Gaugler and H.K.Kaya. - Boca Ration, FL: CRC Press, 1990. - P.153-172.
8. Han R., Wouts W.M. Development of Heterorhabditis spp. strains as characteristics of possible Xenorhabdus luminescens subspecies // Rev. Nematol. 1990. Vol.13. P.411-415.
9. Poinar G.O. The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp. // Nematologica. 1966. Vol.12, №1. P.31-35.
10. Manzano M., Cocolin L., Ferroni P., Cantoni C., Comi G. A Simple and Fast PCR Protocol to Detect Listeria monocytogenes from Meat. // J.Sci. Food Agriculture. 1997. - V.74 - n.1. - p.25-30;
11. Wang B.J.C., Cooney C.L., Demain A.L. Fermentation and enzyme technology. N-Y.: John Willey and sons. 1979 180 p.).