ФРАКЦИОНИРОВАННЫЕ АНТИМИКРОБНЫЕ КОМПОЗИЦИИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
FRACTIONATED ANTIMICROBIAL COMPOSITIONS AND THEIR USE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
В настоящем изобретении предложены фракционированные полимерные композиции, которые обладают антибактериальной, противогрибковой и противовирусной активностью. Эти композиции полезны при лечении инфекционных заболеваний, вызываемых патогенами, и для других целей.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Быстрая эволюция лекарственно-устойчивых патогенов является важной проблемой общественного здравоохранения. (Fidel, P.L. et al., Clin. Microbiol. Rev., 1999, 12 (1): 80-96). Новые антимикробные соединения для лечения резистентных инфекций широко используются, и в нескольких публикациях сообщается об эффективных классах соединений. Публикация США № 2017/0013838 раскрывает противовирусные агенты формулы:
,
где HX представляет собой кислоту, n равно 3-20 и m равно 4-20. Такие соединения могут быть синтезированы тройной поликонденсацией гидрохлорида гуанидина с гексаметилендиамином и гидратом гидразина.
Международная публикация № WO 2016/118043 раскрывает гидразиновые гемостатические агенты формулы:
,
где n равно 1-20, m равно 1-10 и n x m ≥ 8.
Патент США № 8993712 раскрывает гидразиновые соединения формулы:
,
где n равно 1-3, m равно 2-10, z равно 4-20 и Х отсутствует или является кислотой. Такие соединения проявляют сильные антибактериальные и противогрибковые свойства.
Существует постоянная потребность в новых или улучшенных агентах, которые нацелены на устойчивые патогены, обладающих низкой токсичностью, повышенной антимикробной активностью и другими полезными свойствами. Соединения, композиции и способы, описанные здесь, направлены на достижение этих и других целей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предложены полимерные фракции, содержащие Формулу I, имеющие среднюю молекулярную массу от приблизительно 780 Да до приблизительно 5700 Да и молекулярное распределение менее чем приблизительно 10 кДа, Формула I имеет структуру:
,
где составляющие члены определены ниже.
В настоящем изобретении также предложены композиции, содержащие полимерные фракции Формулы I и фармацевтически приемлемый носитель.
В настоящем изобретении также предложены способы получения полимерных фракций Формулы I по изобретению, например, путем реакции тройной поликонденсации гексаметилендиамина, гидразингидрата и солей гуанидина и диализа неочищенного продукта для выделения конкретных фракций Формулы I.
В настоящем изобретении, кроме того, предложены способы ингибирования роста патологических агентов (например, бактериальных, грибковых, вирусных и протозойных агентов) или раковых клеток, включающие приведение в контакт агента с эффективным количеством полимерной фракции Формулы I по изобретению.
В настоящем изобретении также предложен способ лечения инфекции у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества полимерной фракции Формулы I по изобретению.
В настоящем изобретении также предложен способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества полимерной фракции Формулы I по изобретению.
В настоящем изобретении также предложен способ лечения инфекций дыхательных путей с помощью полимерных фракций Формулы I, в частности, инфекций легких (например, инфекций, вызванных смешанными бактериальными и грибковыми штаммами), а также хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), пневмонии, и вентилятор-ассоциированной пневмонии (ВАП).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Рис. 1
представляет собой масс-спектр препарата соединения, описанного в Примере 1.
На Рис. 2
показаны кривые зависимости доза-эффект от раковых клеток, выращенных в присутствии препарата соединения по изобретению, как описано в Примере 30.
На Рис. 3
показаны данные среднего графика скрининга раковых клеток, описанного в Примере 30.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение обеспечивает, среди прочего, биоцидные препараты, обладающие высокой антимикробной и противовирусной активностью и низкой токсичностью. В частности, в настоящем изобретении предложена  полимерная фракция Формулы I:
,
где n равно от 1 до 3; m равно от 4 до 14; z составляет от 1 до 6; и Х является кислотой.
Формула I может быть получена тройной поликонденсацией гексаметилендиамина, гидрата гидразина и солей гуанидина с образованием полимерного продукта, который включает все продукты, полученные в результате реакции полимеризации. Заявители неожиданно обнаружили, что когда полимер продукта Формулы I разделяется на фракции полимера на основе молекулярной массы и других обсуждаемых параметров, ниже, фракционированные препараты проявляют полезные свойства, например, низкую токсичность и повышенную эффективность.
В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса фракционированного препарата Формулы I составляет от приблизительно 780 Да до приблизительно 5700 Да.
В некоторых вариантах осуществления значения средней молекулярной массы относятся к форме свободного основания соединений Формулы I (без кислотной части). Например, в некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса формы свободного основания соединений Формулы I (без кислотной части) составляет от приблизительно 780 Да до приблизительно 5700 Да.
В некоторых вариантах осуществления изобретения средняя молекулярная масса соединений Формулы I (без кислотной части) составляет менее чем приблизительно 3680 Да.
В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса полимерной фракции Формулы I составляет приблизительно 1330 ± 10% Да.
В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса полимерной фракции Формулы I составляет приблизительно 1600 ± 10% Да.
В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса полимерной фракции Формулы I составляет приблизительно 1850 ± 10% Да.
В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса полимерной фракции Формулы I составляет приблизительно 2000 ± 10% Да.
В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса полимерной фракции Формулы I составляет приблизительно 2200 ± 10% Да.
В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса полимерной фракции Формулы I составляет приблизительно 2300 ± 10% Да.
В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса полимерной фракции Формулы I составляет приблизительно 2500 ± 10% Да.
В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса полимерной фракции Формулы I составляет приблизительно 2600 ± 10% Да.
В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса полимерной фракции Формулы I составляет приблизительно 2630 ± 10% Да.
В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса полимерной фракции Формулы I составляет приблизительно 2800 ± 10% Да.
В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса полимерной фракции Формулы I составляет приблизительно 3100 ± 10% Да.
В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса полимерной фракции Формулы I составляет приблизительно 3170 ± 10% Да.
В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса полимерной фракции Формулы I составляет приблизительно 3680 ± 10% Да.
В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса полимерной фракции Формулы I составляет приблизительно 5700 ± 10% Да.
В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса полимерных фракций Формулы I составляет от приблизительно 910 Да до приблизительно 1200 Да.
В некоторых других вариантах осуществления молекулярное распределение полимерной фракции Формулы I по изобретению составляет менее чем приблизительно 10 кДа.
В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса фракционированных препаратов Формулы I составляет от приблизительно 1330 Да до приблизительно 3500 Да.
В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса фракционированных препаратов Формулы I составляет приблизительно 1330 Да, или приблизительно 1340 Да, или приблизительно 1350 Да, или приблизительно 1360 Да, или приблизительно 1370 Да, или приблизительно 1380 Да, или приблизительно 1390 Да, или приблизительно 1400 Да, или приблизительно 1410 Да, или приблизительно 1420 Да, или приблизительно 1430 Да, или приблизительно 1440 Да, или приблизительно 1450 Да, или приблизительно 1460 Да, или приблизительно 1470 Да, или приблизительно 1480 Да, или приблизительно 1490 Да, или приблизительно 1500 Да, или приблизительно 1550 Да, или приблизительно 1600 Да, или приблизительно 1650 Да, или приблизительно 1700 Да, или приблизительно 1750 Да, или приблизительно 1800 Да, или приблизительно 1850 Да, или приблизительно 1900 Да, или приблизительно 1950 Да, или приблизительно 2000 Да, или приблизительно 2500 Да, или приблизительно 3000 Да, или приблизительно 3100 Да, или приблизительно 3200 Да, или приблизительно 3300 Да, 3400 Да, 3500 Да.
В некоторых вариантах осуществления фракция полимера по существу очищена, например, путем диализа, так что она по существу не содержит других полимерных компонентов, выходящих за пределы указанного диапазона молекулярных масс. В некоторых вариантах осуществления полимерная фракция Формулы I по существу изолирована от рецептуры продукта реакции Формулы I.
2
4
3
4
2
3
6
5
Структура Формулы I модифицирована кислотным фрагментом «Х», который включает любую кислотно-аддитивную соль, например, HCl, HSO, АcОН, HPO, HCO или CHCOOH.
В некоторых вариантах осуществления X представляет собой HCl.
2
4
В некоторых вариантах осуществления X представляет собой HSO.
В некоторых вариантах осуществления X представляет собой AcOH.
В некоторых вариантах осуществления n, m и z представляют средние значения составляющих компонентов в препарате фракционированного полимера.
В некоторых вариантах осуществления соотношение n: m составляет 1: 8.
В некоторых вариантах осуществления n равно 1.
В некоторых вариантах осуществления n равно 2.
В некоторых вариантах осуществления n равно 3.
В некоторых вариантах осуществления m равно 4.
В некоторых вариантах осуществления m равно 5.
В некоторых вариантах осуществления m равно 6.
В некоторых вариантах осуществления m равно 7.
В некоторых вариантах осуществления m равно 8.
В некоторых вариантах осуществления m равно 9.
В некоторых вариантах осуществления m равно 10.
В некоторых вариантах осуществления m равно 11.
В некоторых вариантах осуществления m равно 12.
В некоторых вариантах осуществления m равно 13.
В некоторых вариантах осуществления m равно 14.
В некоторых других вариантах осуществления z составляет от 1 до 6 или 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 или 6,0.
В некоторых вариантах осуществления z равен 1.
В некоторых вариантах осуществления z равен 1,3.
В некоторых вариантах осуществления z равен 1,4.
В некоторых вариантах осуществления z равен 1,7.
В некоторых вариантах осуществления z равен 1,8.
В некоторых вариантах осуществления z равен 1,9.
В некоторых вариантах осуществления z равен 2,0.
В некоторых вариантах осуществления z равен 2,4.
В некоторых вариантах осуществления z равен 2,8.
В некоторых вариантах осуществления z равен 4,3.
В некоторых вариантах осуществления фракция полимера Формулы I определяется так, что n равно 1, m равно 8, z равно 1,4 и X представляет собой HCl, средняя молекулярная масса составляет 1850 (± 10%) Да, а молекулярное распределение составляет менее чем приблизительно 3000 Да.
В некоторых вариантах осуществления фракция полимера Формулы I определяется таким образом, что n равно 1, m равно 8, z равно 2,4 и X представляет собой HCl, средняя молекулярная масса составляет 3170 (± 10%) Да, и молекулярное распределение составляет менее чем приблизительно 10 000 Да
В некоторых вариантах осуществления полимерная фракция Формулы I определяется так, что n равно 1, m равно 8, z равно 1,8 и X представляет собой HCl, средняя молекулярная масса составляет 2300 (± 10%) Да, а молекулярное распределение составляет от приблизительно 1000 до приблизительно 3000 Да.
В некоторых вариантах осуществления фракция полимера Формулы I определена так, что n равно 1, m равно 8, z равно 1,9, и X представляет собой HCl, средняя молекулярная масса составляет 2500 (± 10%) Да, и молекулярное распределение составляет от приблизительно 2000 до приблизительно 3000 Да.
В некоторых вариантах осуществления полимерная фракция Формулы I определяется так, что n равно 1, m равно 8, z равно 2,8, а X означает HCl, средняя молекулярная масса составляет 3680 (± 10%) Да, а молекулярное распределение составляет от приблизительно 3000 до приблизительно 5000 Да.
В некоторых вариантах осуществления фракция полимера Формулы I определяется таким образом, что n равно 3, m равно 4, z равно 1,4 и X представляет собой HCl, средняя молекулярная масса составляет 1600 (± 10%) Да, и распределение молекулярной массы составляет менее чем приблизительно 3000 Да.
В некоторых вариантах осуществления фракция полимера Формулы I определяется таким образом, что n равно 1, m равно 14, z равно 1,3 и X представляет собой HCl, средняя молекулярная масса составляет 3170 (± 10%) Да, и молекулярное распределение составляет менее чем приблизительно 10 000 Да.
2
4
В некоторых вариантах осуществления фракция полимера Формулы I определяется таким образом, что n равно 1, m равно 8, z равно 1,7, и X означает HSO, средняя молекулярная масса составляет 2600 (± 10%) Да, а молекулярное распределение составляет менее 10000 Да.
В некоторых вариантах осуществления фракция полимера Формулы I определяется таким образом, что n равно 1, m равно 8, z равно 1,7 и X равно АcОН, средняя молекулярная масса составляет 2200 (± 10%) Да, а молекулярное распределение составляет менее чем приблизительно 3000 Да.
В некоторых вариантах осуществления фракция полимера Формулы I определена так, что n равно 1, m равно 8, z равно 1 и X представляет собой HCl, средняя молекулярная масса составляет 1330 (+ 10%) Да, и молекулярное распределение составляет менее чем приблизительно 2 000 Да.
В некоторых вариантах осуществления фракция полимера Формулы I определена так, что n равно 1, m равно 8, z равно 2,4 и X представляет собой HCl, средняя молекулярная масса составляет 3100 (+ 10%) Да, и молекулярное распределение составляет менее чем приблизительно 5 000 Да.
В некоторых вариантах осуществления фракция полимера Формулы I определяется таким образом, что n равно 1, m равно 8, z равно 4,3 и Х представляет собой HCl, средняя молекулярная масса составляет 5700 (+ 10%) Да, а молекулярное распределение составляет от приблизительно 5000 до приблизительно  10 000 Да.
В некоторых вариантах осуществления фракция полимера Формулы I определена так, что n равно 1, m равно 8, z равно 2,0 и Х означает HCl, средняя молекулярная масса 5700 (+ 10%) Да и молекулярное распределение от приблизительно 2000 до приблизительно 10 000 Да.
Синтез
Соединения и полимерные фракции по изобретению, включая их соли, могут быть получены с использованием известных методов органического синтеза и могут быть синтезированы в соответствии с любым из многочисленных возможных путей синтеза. Например, в некоторых вариантах осуществления соединения Формулы I синтезируют путем тройной реакции поликонденсации гексаметилендиамина, гидразингидрата и солей гуанидина. Последующий диализ неочищенного продукта может быть выполнен для облегчения выделения препаратов Формулы I, имеющих узкое и точное распределение молекулярной массы. На этапе диализа фракционирование может включать один или несколько этапов фильтрации и концентрации с использованием соответствующего модуля диализа, выбранного специалистом в данной области.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу получения полимерной фракции Формулы I, включающему:
взаимодействие гексаметилендиамина с солью гуанидина и соединением, выбранным из группы, состоящей из гидрата гидразина, семикарбазида, хлоргидрата семикарбазида, карбогидразида и гидрохлорида аминогуанидина, при температуре от 175 до 195°С; а также выделение фракции полимера диализом.
В некоторых вариантах осуществления гексаметилендиамин и соль гуанидина подвергают взаимодействию с гидразингидратом с получением продукта полимеризации Формулы I.
В некоторых вариантах осуществления гексаметилендиамин и соль гуанидина подвергают взаимодействию с семикарбазидом с получением продукта полимеризации Формулы I.
В некоторых вариантах осуществления гексаметилендиамин и соль гуанидина реагируют с хлоргидратом семикарбазида с получением продукта полимеризации Формулы I.
В некоторых вариантах осуществления гексаметилендиамин и соль гуанидина реагируют с карбогидразидом.
В некоторых вариантах осуществления гексаметилендиамин и соль гуанидина реагируют с гидрохлоридом аминогуанидина с получением продукта полимеризации Формулы I.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к фракции полимера Формулы I, имеющей среднюю молекулярную массу от приблизительно 1330 Да до приблизительно 5700 Да и молекулярное распределение менее чем приблизительно 10 кДа, Формула I имеет структуру:
,
где n равно 1-3; m равно 4-14; z равно 1-6; и X представляет собой кислоту, полимерную фракцию получают способом, включающим взаимодействие гексаметилендиамина с солью гуанидина и соединением, выбранным из группы, состоящей из гидрата гидразина, семикарбазида, хлоргидрата семикарбазида, карбогидразида и гидрохлорида аминогуанидина, при температуре от 175 до 195°С; и выделение фракции полимера диализом.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединения Формулы I получают с использованием следующих реагентов и мол.% соотношений:
Реактив
моль %
соль гуанидина
50,0
гексаметилендиамин
31,25 - 46,87
гидрат гидразина
3,13 - 18,75 (до 100 %)*
вода
0-20
* В некоторых вариантах осуществления, мольный % гексаметилендиамин + гидразин равен мольному % гуанидина. Общий мол.% всех трех компонентов принимается за 100%.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединения Формулы I получают с использованием следующих реагентов и мол.% соотношений:
Реактив
моль %
соль гуанидина
50,0
гексаметилендиамин
31,25 - 46,87
семикарбазид
3,13 - 18,75 (до 100 %)*
вода
0-20
* В некоторых вариантах осуществления, мольный % гексаметилендиамин + гидразин равен мольному % гуанидина. Общий мол.% всех трех компонентов принимается за 100%.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединения Формулы I получают с использованием следующих реагентов и мол.% соотношений:
Реактив
моль %
соль гуанидина
50,0
гексаметилендиамин
31,25 - 46,87
хлоргидрат семикарбазида
3,13 - 18,75 (до 100 %)*
вода
0-20
* В некоторых вариантах осуществления, мольный % гексаметилендиамин + гидразин равен мольному % гуанидина. Общий мол.% всех трех компонентов принимается за 100%.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединения Формулы I получают с использованием следующих реагентов и мол.% соотношений:
Реактив
моль%
соль гуанидина
50,0
гексаметилендиамин
31,25 - 46,87
карбогидразид
1,57 - 9,37 (до 100 %)*
вода
0-50
* В некоторых вариантах осуществления, мольный % гексаметилендиамин + гидразин равен мольному % гуанидина. Общий мол.% всех трех компонентов принимается за 100%.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединения Формулы I получают с использованием следующих реагентов и мол.% соотношений:
Реактив
моль%
соль гуанидина
50,0
гексаметилендиамин
31,25 - 46,87
гидрохлорид аминогуанидина
3,13 - 18,75 (до 100 %)*
вода
0-20
* В некоторых вариантах осуществления, мольный % гексаметилендиамин + гидразин равен мольному % гуанидина. Общий мол.% всех трех компонентов принимается за 100%.
Методы
Соединения и полимерные фракции по изобретению обладают антимикробной активностью и могут ингибировать рост одного или нескольких патогенных и/или инфекционных агентов. Соответственно, соединения и полимерные фракции по изобретению могут быть использованы для ингибирования роста агента путем приведения в контакт  агента с одним или более из соединений и/или полимерных фракций, описанных здесь. В некоторых вариантах осуществления соединения и полимерные фракции могут действовать для ингибирования роста и/или активности бактериальных, грибковых, вирусных, протозойных агентов или раковых клеток. В других вариантах осуществления соединения по изобретению можно использовать для лечения инфекции у индивидуума или субъекта, нуждающегося в лечении, путем введения эффективного количества соединения или полимерной фракции по изобретению. В других вариантах осуществления соединения или полимерные фракции по изобретению можно использовать для лечения рака у индивидуума или субъекта, нуждающегося в таком лечении, путем введения и эффективного количества соединения или полимерной фракции по изобретению.
Агенты, в отношении которых настоящие соединения и полимерные фракции обладают ингибирующим и/или модулирующим действием, включают любой агент, способный вызывать инфекцию или заболевание. В некоторых вариантах соединения по изобретению могут быть селективными. Под «селективным» подразумевается, что соединение или фракции полимера связываются или ингибируют конкретный агент с большей аффинностью или активностью, соответственно, по сравнению, по меньшей мере, с одним другим соединением или частью полимера.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способам лечения и/или профилактики инфекционного заболевания или нарушения у индивидуума (например, пациента) путем введения индивидууму, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества или дозы соединения или фракции полимера по настоящему изобретению или  фармацевтической композиции на их основе. Инфекционное заболевание может включать любое заболевание, нарушение или состояние, которое прямо или косвенно связано с активностью патогена. Инфекционное заболевание может также включать любое заболевание, нарушение или состояние, которое можно предотвратить, улучшить или излечить, модулируя рост патогенного агента, такого как бактериальные, грибковые, вирусные и протозойные агенты.
В некоторых вариантах осуществления инфекция представляет собой смешанную инфекцию.
В некоторых вариантах осуществления инфекция представляет собой системную инфекцию.
В некоторых вариантах осуществления инфекция представляет собой зубную инфекцию.
В некоторых вариантах осуществления инфекция представляет собой инфекцию кожи и мягких тканей или инфекцию раны / язвы.
В некоторых вариантах осуществления инфекция представляет собой инфекцию слизистой оболочки.
В некоторых вариантах осуществления инфекция представляет собой инфекцию дыхательных путей.
В некоторых вариантах осуществления инфекция представляет собой инфекцию легких, включая инфекции легких, вызванные смешанными бактериальными, грибковыми и/или вирусными штаммами. В некоторых вариантах осуществления инфекция легких представляет собой хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), пневмонию, вентилятор-ассоциированную пневмонию (VAP), инфекцию легких у пациентов с муковисцидозом или грибковую пневмонию. Изобретение также относится к профилактике некоторых заболеваний, включая заболевания, изложенные в настоящем документе, например, профилактике грибковой пневмонии у пациентов с ослабленным иммунитетом. В некоторых вариантах осуществления инфекция представляет собой инфекцию кожи и/или мягких тканей.
В некоторых вариантах осуществления инфекция представляет собой инфекцию, связанную с абсцессами.
В некоторых вариантах осуществления инфекция представляет собой синусит.
В некоторых вариантах осуществления инфекция представляет собой зубную инфекцию.
В некоторых вариантах осуществления инфекция представляет собой офтальмологическую инфекцию.
В некоторых вариантах осуществления изобретение полезно для лечения опухоли.
В некоторых вариантах осуществления изобретение полезно для лечения и/или профилактики вирусной инфекции дыхательных путей.
В некоторых вариантах осуществления изобретение полезно для лечения и/или профилактики инфекции мочевыводящих путей.
В некоторых вариантах осуществления изобретение полезно для лечения и/или профилактики цистита.
В некоторых вариантах осуществления изобретение полезно для лечения и/или профилактики отита.
В некоторых вариантах осуществления изобретение полезно для лечения и/или профилактики перитонита и внутрибрюшного сепсиса.
В некоторых вариантах осуществления изобретение полезно для лечения и/или предотвращения эмпиемы плевры.
В некоторых вариантах осуществления изобретение полезно для лечения и/или предотвращения сепсиса.
В некоторых вариантах осуществления изобретение полезно для лечения и/или профилактики ВЗК, болезни Крона и/или клостридиальной инфекции.
В некоторых вариантах осуществления изобретение полезно для лечения и/или предотвращения инфекций, вызванных бактериями, вирусами или грибами с множественной лекарственной устойчивостью.
В некоторых вариантах осуществления изобретение полезно для лечения и/или профилактики инфекций, вызванных устойчивым к ванкомицину S. aureus (VRSA).
Burkholderia cepacia
В некоторых вариантах осуществления изобретение полезно для лечения и/или предотвращения инфекций, вызываемых бактериями .
В некоторых вариантах осуществления изобретение полезно для лечения и/или предотвращения роста микробных биопленок.
В некоторых вариантах осуществления изобретение полезно для обработки поверхностей, например поверхностей, встречающихся в природе (например, прудов).
Составы и лекарственные формы
При использовании в качестве лекарственного или фармацевтического средства препараты Формулы I, описанные здесь, можно вводить в форме фармацевтических композиций. Эти композиции могут быть получены способом, хорошо известным в области фармацевтики, и могут вводиться различными путями, в зависимости от того, желательно ли местное или системное лечение, и от области, подлежащей лечению. Введение может быть местным (включая трансдермальное, эпидермальное, офтальмологическое и на слизистые оболочки, включая интраназальную, вагинальную и ректальную доставку), легочное (например, путем ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, в том числе посредством небулайзера; интратрахеально или интраназально), перорально или парентерально. Парентеральное введение включает внутривенное, внутриартериальное, подкожное, внутрибрюшинное внутримышечное введение или инъекцию или инфузию; или внутричерепное, например, интратекальное или внутрижелудочковое введение. Парентеральное введение может быть в форме однократной болюсной дозы или может быть, например, с помощью непрерывного перфузионного насоса. Фармацевтические композиции и составы для местного применения могут включать трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Обычные фармацевтические носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и тому подобное могут быть необходимыми или желательными. Презервативы с покрытием, перчатки и тому подобное также могут быть полезны.
Данное изобретение также включает фармацевтические композиции, которые содержат в качестве активного ингредиента препараты Формулы I в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями (наполнителями). При изготовлении композиций по изобретению активный ингредиент обычно смешивают с эксципиентом, разбавляют эксципиентом или заключают в такой носитель в форме, например, водного раствора или капсулы, саше, бумаги или другого вещества. контейнер. Когда наполнитель служит разбавителем, он может быть твердым, полутвердым или жидким материалом, который действует как носитель, носитель или среда для активного ингредиента. Таким образом, композиции могут быть в форме суспензий, эмульсий, растворов, сиропов, аэрозолей (в виде твердого вещества или в жидкой среде), таблеток, пилюль, порошков, пастилок, саше, облаток, эликсиров, суспензий, эмульсий, растворов, сиропы, аэрозоли (в виде твердого вещества или в жидкой среде), мази, содержащие, например, до 10 мас.% активного соединения, мягкие и твердые желатиновые капсулы, суппозитории, стерильные растворы для инъекций и стерильные упакованные порошки.
Жидкие формы, в которые соединения и композиции по настоящему изобретению могут быть включены для местного, перорального или инъекционного введения, включают водные растворы, сиропы с соответствующим вкусом, водные или масляные суспензии и эмульсии, а также эликсиры и аналогичные фармацевтические носители.
Композиции для ингаляции или инсуффляции включают растворы и суспензии в фармацевтически приемлемых, водных или органических растворителях или их смеси и порошки. Жидкие или твердые композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые наполнители, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления композиции вводят пероральным или назальным дыхательным путем для местного или системного эффекта. Композиции можно распылять с использованием инертных газов. Распыленные растворы можно вдыхать непосредственно из распыляющего устройства, или распыляющее устройство можно прикрепить к палатке для лицевых масок или дыхательному аппарату с прерывистым положительным давлением. Композиции в виде раствора, суспензии или порошка можно вводить перорально или назально из устройств, которые доставляют композицию соответствующим образом.
В некоторых вариантах осуществления Формулу I и/или ее полимерные фракции вводят локально.
В некоторых вариантах осуществления Формулу I и/или ее полимерные фракции вводят путем инстилляции.
В некоторых вариантах осуществления Формулу I и/или ее полимерные фракции применяют местно.
В некоторых вариантах осуществления Формулу I и/или ее полимерные фракции вводят энтерально.
В некоторых вариантах осуществления Формулу I и/или ее полимерные фракции вводят парентерально.
В некоторых вариантах осуществления соединения и полимерные фракции по изобретению вводят в комбинации по меньшей мере с одним другим соединением или компонентом, который усиливает активность антимикробного агента. При использовании для лечения рака и/или роста опухоли соединения и фракции полимера можно вводить в комбинации с другими противомикробными или противораковыми лекарственными средствами.
В некоторых вариантах осуществления Формулы I и/или полимерные фракции по изобретению получают в форме раствора для ингаляции.
В некоторых вариантах осуществления Формулу I и/или ее полимерные фракции получают в форме порошка для ингаляции.
В некоторых вариантах осуществления Формула I и/или ее полимерные фракции предназначены для лечения инфекций легких при муковисцидозе, хронической обструктивной болезни легких, бронхоэктазии, трансплантации легких, грибковой пневмонии, вентилятор-ассоциированной пневмонии, и тому подобного.
В некоторых вариантах осуществления Формулу I и/или ее полимерные фракции готовят в растворе для закапывания. Такие растворы полезны, например, для лечения инфекций мочевыводящих путей, синусита, абсцессов, перитонита и эмпиемы легких.
В некоторых вариантах осуществления Формулу I и/или ее полимерные фракции получают в форме раствора, например, для стоматологических применений, например, для лечения корневых каналов, композиций для нанесения на пародонтальные карманы и растворов для полоскания полости рта и тому подобного.
Препараты для местного применения Формулы I и/или их полимерных фракций можно использовать для различных применений, например, для лечения язв, ожогов и для пропитки материалов.
Количество соединения или композиции, вводимых пациенту, будет варьироваться в зависимости от того, что вводится, цели введения, такой как профилактика или терапия, состояния пациента, способа введения и тому подобного. В терапевтических применениях композиции можно вводить пациенту, уже страдающему от заболевания, в количестве, достаточном для излечения или, по меньшей мере, частичного купирования симптомов заболевания и его осложнений. Эффективные дозы будут зависеть от состояния заболевания, подвергаемого лечению, а также от суждения лечащего врача в зависимости от таких факторов, как тяжесть заболевания, возраст, вес и общее состояние пациента и тому подобного.
Терапевтическая дозировка соединений и фракции полимера по настоящему изобретению могут варьироваться в зависимости, например, от конкретного применения, для которого проводится лечение, способа введения соединения, состояния здоровья и состояния пациента и решения назначающего врача. Пропорция или концентрация соединения по изобретению в фармацевтической композиции может варьироваться в зависимости от ряда факторов, включая дозировку, химические характеристики (например, гидрофобность) и путь введения. Например, соединения и полимерные фракции по изобретению могут быть предоставлены в водном физиологическом буферном растворе, содержащем от приблизительно 0,1 до приблизительно 10% мас./об. соединения для парентерального введения. Некоторые типичные диапазоны доз составляют от приблизительно 1 мкг / кг до приблизительно 1 г / кг массы тела в день. В некоторых вариантах осуществления диапазон доз составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 100 мг / кг массы тела в день. Дозировка, вероятно, зависит от таких переменных, как тип и степень прогрессирования заболевания или расстройства, общее состояние здоровья конкретного пациента, относительная биологическая эффективность выбранного соединения, состав эксципиента и способ его введения. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных из тест-систем in vitro или на моделях животных.
Изобретение будет описано более подробно с помощью конкретных примеров. Следующие примеры предлагаются в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения изобретения каким-либо образом. Специалисты в данной области техники легко распознают множество некритических параметров, которые могут быть изменены или модифицированы для получения по существу одинаковых результатов.
ПРИМЕРЫ
Используемые ниже реагенты и растворители могут быть получены из коммерческих источников, таких как Sigma-Aldrich. Результаты масс-спектрометрии представлены как отношение массы к заряду, за которым следует относительное содержание каждого иона (в скобках). В таблицах приведено единственное значение m / e для иона M + H (или, как отмечено, M-H), содержащего наиболее распространенные атомные изотопы.
Ниже приведены примеры соединений и полимерных фракций по изобретению.
Пример 1
Термостойкую 1-литровую колбу, снабженную газоотводной трубкой, мешалкой и термометром, загружали гидрохлоридом гуанидина (95,5 г, 1,0 моль, 48,7 мас.%), гексаметилендиамином (104,4 г, 0,9 моль, 48,7 мас. %) и гидразингидратом (5,0 г, 0,1 моль, 2,6 мас.%). Выходная трубка была соединена с приемником для улавливания аммиака. Содержимое колбы перемешивали и нагревали до 175-180°С с постепенным удалением воды и аммиака в течение 1 ч при 175-180°С. Затем температуру повышали до 190°С и содержимое колбы перемешивали в течение 1 часа. Теплую реакционную массу охлаждали до 130-140°С, при перемешивании добавляли горячую воду (150 мл) и смесь оставляли перемешиваться до полного растворения реакционной массы. Полученный раствор декантировали и колбу промывали водой (30 мл) и затем повторно объединяли с декантированным раствором. Объединенный раствор нейтрализовали кислотой до рН 6-7, и 330 мл водного раствора олигомера, имеющего концентрацию 50%, получали в виде прозрачной, практически бесцветной жидкости.
Воду (1200 мл) добавляли к 300 мл полученного 50% раствора олигомера с получением 10% раствора неочищенного продукта. Затем раствор фильтровали через мембранный модуль с верхним отсечением 3 кДа и получали 1250 мл фильтрата, содержащего 120 г указанного в заголовке соединения примера 1. Среднюю молекулярную массу 1850 (± 10%) Да определяли для указанного в заголовке соединения (в форме свободного основания без кислоты) путем кислотно-основного титрования остаточных концевых аминогрупп.
Соединение примера 1 исследовали с помощью MALDI-MS. 0,1 мл водного раствора α-циано-4-гидроксициннамовой кислоты (CHCA) добавляли к 0,1 мл 0,1 мг / мл водного раствора препарата примера 1 и перемешивали. 1 мкл полученного раствора наносили на мишень для MALDI и высушивали на воздухе. Полученный образец исследовали на приборе MALDI-TOF (Brucker Daltonics) с использованием рабочей частоты лазера 400 нм. Массовые ионы регистрировались в режиме положительных ионов в диапазоне m / z 480-2000 Да. Масс-спектр для препарата примера 1 показан на фиг.1.
Альтернативный синтез А:
Термостойкую 1-литровую колбу, снабженную газоотводной трубкой, мешалкой и термометром, загружали гидрохлоридом гуанидина (95,5 г, 1,0 моль, 48,7 мас.%), гексаметилендиамином (104,4 г, 0,9 моль, 48,7 мас. %) и семикарбазидом (7,5 г, 0,1 моль). Выходная трубка была соединена с приемником для улавливания аммиака. Содержимое колбы перемешивали и нагревали до 175-180°C с постепенным удалением воды и аммиака в течение 2 ч при 175-180°С. Затем температуру повышали до 190°С и содержимое колбы перемешивали в течение 1 часа. Теплую реакционную массу охлаждали до 130-140°С, при перемешивании добавляли горячую воду (150 мл) и смесь оставляли перемешиваться до полного растворения реакционной массы. Полученный раствор декантировали и колбу промывали водой (30 мл) и затем повторно объединяли с декантированным раствором. Объединенный раствор нейтрализовали кислотой до pН 6-7, и 330 мл водного раствора олигомера, имеющего концентрацию 50%, получали в виде прозрачной, практически бесцветной жидкости.
Воду (1200 мл) добавляли к 300 мл полученного 50% раствора олигомера с получением 10% раствора неочищенного продукта. Затем раствор фильтровали через мембранный модуль с верхним отсечением 3 кДа, и получали 1250 мл фильтрата, содержащего 120 г указанного в заголовке соединения примера 1.
Альтернативный синтез B:
Термостойкую 1-литровую колбу, снабженную газоотводной трубкой, мешалкой и термометром, загружали гидрохлоридом гуанидина (95,5 г, 1,0 моль, 48,7 мас.%), гексаметилендиамином (104,4 г, 0,9 моль, 48,7 мас. %) и хлоргидратом семикарбазида (11,05 г, 0,1 моль). Выходная трубка была соединена с приемником для улавливания аммиака. Содержимое колбы перемешивали и нагревали до 175-180°C с постепенным удалением воды и аммиака в течение 2 ч при 175-180°С. Затем температуру повышали до 190°С и содержимое колбы перемешивали в течение 1 часа. Теплую реакционную массу охлаждали до 130-140°С, при перемешивании добавляли горячую воду (150 мл) и смесь оставляли перемешиваться до полного растворения реакционной массы. Полученный раствор декантировали и колбу промывали водой (30 мл) и затем повторно объединяли с декантированным раствором. Объединенный раствор нейтрализовали кислотой до pН 6-7, и 330 мл водного раствора олигомера, имеющего концентрацию 50%, получали в виде прозрачной, практически бесцветной жидкости.
Воду (1200 мл) добавляли к 300 мл полученного 50% раствора олигомера с получением 10% раствора неочищенного продукта. Затем раствор фильтровали через мембранный модуль с верхним отсечением 3 кДа, и получали 1250 мл фильтрата, содержащего 120 г указанного в заголовке соединения примера 1.
Альтернативный синтез C:
Термостойкую 1-литровую колбу, снабженную газоотводной трубкой, мешалкой и термометром, загружали гидрохлоридом гуанидина (95,5 г, 1,0 моль, 48,7 мас.%), гексаметилендиамином (104,4 г, 0,9 моль, 48,7 мас. %) и хлоргидратом семикарбазида (11,05 г, 0,1 моль) и водой (5 мл). Выходная трубка была соединена с приемником для улавливания аммиака. Содержимое колбы перемешивали и нагревали до 175-180 °С с постепенным удалением воды и аммиака в течение 2 ч при 175-180 °С. Затем температуру повышали до 190°С и содержимое колбы перемешивали в течение 1 часа. Теплую реакционную массу охлаждали до 130-140°С, при перемешивании добавляли горячую воду (150 мл) и смесь оставляли перемешиваться до полного растворения реакционной массы. Полученный раствор декантировали и колбу промывали водой (30 мл) и затем повторно объединяли с декантированным раствором. Объединенный раствор нейтрализовали кислотой до pН 6-7, и 330 мл водного раствора олигомера, имеющего концентрацию 50%, получали в виде прозрачной, практически бесцветной жидкости.
Воду (1200 мл) добавляли к 300 мл полученного 50% раствора олигомера с получением 10% раствора неочищенного продукта. Затем раствор фильтровали через мембранный модуль с верхним отсечением 3 кДа, и получали 1250 мл фильтрата, содержащего 120 г указанного в заголовке соединения примера 1.
Альтернативный синтез D:
Термостойкую 1-литровую колбу, снабженную газоотводной трубкой, мешалкой и термометром, загружали гидрохлоридом гуанидина (95,5 г, 1,0 моль, 48,7 мас.%), гексаметилендиамином (104,4 г, 0,9 моль, 48,7 мас. %) и карбогидразидом (90 г, 0,1 моль). Выходная трубка была соединена с приемником для улавливания аммиака. Содержимое колбы перемешивали и нагревали до 175-180°С с постепенным удалением воды и аммиака в течение 2 ч при 175-180°С. Затем температуру повышали до 190°С и содержимое колбы перемешивали в течение 1 часа. Теплую реакционную массу охлаждали до 130-140°С, при перемешивании добавляли горячую воду (150 мл) и смесь оставляли перемешиваться до полного растворения реакционной массы. Полученный раствор декантировали и колбу промывали водой (30 мл) и затем повторно объединяли с декантированным раствором. Объединенное вещество нейтрализовали кислотой до pН 6-7, и 330 мл водного раствора олигомера, имеющего концентрацию 50%, получали в виде прозрачной, практически бесцветной жидкости.
Воду (1200 мл) добавляли к 300 мл полученного 50% раствора олигомера с получением 10% раствора неочищенного продукта. Затем раствор фильтровали через мембранный модуль с верхним отсечением 3 кДа, и получали 1250 мл фильтрата, содержащего 120 г указанного в заголовке соединения примера 1.
Альтернативный синтез E:
В термостойкую 1-литровую колбу, снабженную трубкой для выпуска газа, мешалкой и термометром, загружали гидрохлоридом гуанидина (95,5 г, 1,0 моль, 48,7 мас.%), гексаметилендиамином (104,4 г, 0,9 моль, 48,7 мас. %) и гидрохлоридом аминогуанидина (110,5 г, 0,1 моль). Выходная трубка была соединена с приемником для улавливания аммиака. Содержимое колбы перемешивали и нагревали до 175-180°C с постепенным удалением воды и аммиака в течение 2 ч при 175-180°С. Затем температуру повышали до 190°С и содержимое колбы перемешивали в течение 1 часа. Теплую реакционную массу охлаждали до 130-140°С, при перемешивании добавляли горячую воду (150 мл) и смесь оставляли перемешиваться до полного растворения реакционной массы. Полученный раствор декантировали и колбу промывали водой (30 мл) и затем повторно объединяли с декантированным раствором. Объединенный раствор нейтрализовали кислотой до pН 6-7, и 330 мл водного раствора олигомера, имеющего концентрацию 50%, получали в виде прозрачной, практически бесцветной жидкости.
Воду (1200 мл) добавляли к 300 мл полученного 50% раствора олигомера с получением 10% раствора неочищенного продукта. Затем раствор фильтровали через мембранный модуль с верхним отсечением 3 кДа, и получали 1250 мл фильтрата, содержащего 120 г указанного в заголовке соединения примера 1.
Пример 2
Термостойкую 1-литровую колбу, снабженную газоотводной трубкой, мешалкой и термометром, загружали гидрохлоридом гуанидина (95,5 г, 1,0 моль, 48,7 мас.%), гексаметилендиамином (104,4 г, 0,9 моль, 48,7 мас. %) и гидразингидратом (5,0 г, 0,1 моль, 2,6 мас.%). Выходная трубка была соединена с приемником для улавливания аммиака. Содержимое колбы перемешивали и нагревали до 175-180°С с постепенным удалением воды и аммиака в течение 2 ч при 175-180°С. Затем температуру повышали до 195°С и содержимое колбы перемешивали в течение 1 часа. Теплую реакционную массу охлаждали до 130-140°С, при перемешивании добавляли горячую воду (150 мл) и смесь оставляли перемешиваться до полного растворения реакционной массы. Полученный раствор декантировали и колбу промывали водой (30 мл) и затем повторно объединяли с декантированным раствором. Объединенный раствор нейтрализовали кислотой до рН 6-7, и 330 мл водного раствора олигомера, имеющего концентрацию 50%, получали в виде прозрачной, практически бесцветной жидкости.
Воду (1200 мл) добавляли к 300 мл полученного 50% раствора олигомера с получением 10% раствора неочищенного продукта. Затем раствор фильтровали через мембранный модуль с верхним отсечением 10 кДа и получали 1350 мл фильтрата, содержащего 130 г указанного в заголовке соединения примера 2. Среднюю молекулярную массу 3170 (± 10%) Да определяли для указанного в заголовке соединения (в форме свободного основания без кислоты) путем кислотно-основного титрования остаточных концевых аминогрупп.
Пример 3
Указанное в заголовке соединение получали, используя способ, изложенный в примере 1. В этом примере 600 мл полученного фильтрата (раствор олигомера с отсечкой по верхней массе 3000 Да) разбавляли водой до 5,9 л и подвергали диализу на мембранный модуль фильтра с мембраной, имеющей верхнюю граничную массу 1000 Да для отделения 5,4 л фильтрата. Оставшийся диализат отделяли, получая 450 мл раствора, содержащего 44 г соединения, указанного в заголовке примера 3. Для средней массы (2300 D) определяли соединение, указанное в заголовке (в форме свободного основания без кислоты).
Пример 4
Термостойкую 1-литровую колбу, снабженную газоотводной трубкой, мешалкой и термометром, загружали гидрохлоридом гуанидина (95,5 г, 1,0 моль, 48,7 мас.%), гексаметилендиамином (104,4 г, 0,9 моль, 48,7 мас. %) и гидразингидратом (5,0 г, 0,1 моль, 2,6 мас.%). Выходная трубка была соединена с приемником для улавливания аммиака. Содержимое колбы перемешивали и нагревали до 175-180°С с постепенным удалением воды и аммиака в течение 1 ч при 175-180°С. Затем температуру повышали до 190°С и содержимое колбы перемешивали в течение 4 часов. Теплую реакционную массу охлаждали до 130-140°С, при перемешивании добавляли горячую воду (150 мл) и смесь оставляли перемешиваться до полного растворения реакционной массы. Полученный раствор декантировали и колбу промывали водой (30 мл) и затем повторно объединяли с декантированным раствором. Объединенный раствор нейтрализовали кислотой до рН 6-7, и 330 мл водного раствора олигомера, имеющего концентрацию 50%, получали в виде прозрачной, практически бесцветной жидкости.
Воду (1200 мл) добавляли к 300 мл полученного 50% раствора олигомера с получением 10% раствора неочищенного продукта. Затем раствор фильтровали через мембранный модуль с верхним отсечением 3 кДа и получали 1300 мл фильтрата, содержащего 110 г нелетучего вещества. 600 мл этого фильтрата разбавляли водой до 5 л и подвергали диализу на фильтрующем мембранном модуле с мембраной, имеющей верхнюю граничную массу 2 кДа, чтобы отделить 4,7 л фильтрата. Оставшийся диализат отделяли, получая 290 мл раствора, содержащего 28 г указанного в заголовке соединения примера 4. Для указанного в заголовке соединения (в виде свободного основания без кислоты) определяли среднюю молекулярную массу 2500 (± 10%) Да.
Пример 5
Термостойкую 1-литровую колбу, снабженную газоотводной трубкой, мешалкой и термометром, загружали гидрохлоридом гуанидина (95,5 г, 1,0 моль, 48,7 мас.%), гексаметилендиамином (104,4 г, 0,9 моль, 48,7 мас. %) и гидразингидратом (5,0 г, 0,1 моль, 2,6 мас.%). Выходная трубка была соединена с приемником для улавливания аммиака. Содержимое колбы перемешивали и нагревали до 175-180°С с постепенным удалением воды и аммиака в течение 2 ч при 175-180°С. Затем температуру повышали до 195°С и содержимое колбы перемешивали в течение 1,5 часов. Теплую реакционную массу охлаждали до 130-140°С, при перемешивании добавляли горячую воду (150 мл) и смесь оставляли перемешиваться до полного растворения реакционной массы. Полученный раствор декантировали и колбу промывали водой (30 мл) и затем повторно объединяли с декантированным раствором. Объединенный раствор нейтрализовали кислотой до рН 6-7, и 330 мл водного раствора олигомера, имеющего концентрацию 50%, получали в виде прозрачной, практически бесцветной жидкости.
Воду (1200 мл) добавляли к 300 мл полученного 50% раствора олигомера с получением 10% раствора неочищенного продукта. Затем раствор фильтровали через мембранный модуль с верхним отсечением 5 кДа и получали 1230 мл фильтрата, содержащего 120 г олигомера с верхним отсечением по массе 5 кДа. 600 мл этого фильтрата разбавляли водой до 6 л и подвергали диализу на фильтрующем мембранном модуле с мембраной, имеющей верхнюю граничную массу 3 кДа, чтобы отделить 5,6 л фильтрата. Оставшийся диализат отделяли, получая 360 мл раствора, содержащего 35 г указанного в заголовке соединения примера 5. Для указанного в заголовке соединения (в форме свободного основания без кислоты), была определена средняя молекулярная масса 3680 (± 10%) Да.
Пример 6
Указанное в заголовке соединение получали способом, изложенным в примере 1, с использованием следующих реагентов:
Реактив
Моль
Гидрохлорид гуанидина
1,0
Гексаметилендиамин
0,66
Гидрат гидразина
0,33
Указанное в заголовке соединение примера 6 получали в виде 10% водного раствора. Средняя молекулярная масса указанного в заголовке соединения (в форме свободного основания без кислоты) составляла 1600 (± 10%) Да, как было определено кислотно-основным титрованием остаточных концевых аминогрупп.
Пример 7
Указанное в заголовке соединение получали способом, изложенным в примере 2, с использованием следующих реагентов:
Реагент
Моль
Гидрохлорид гуанидина
1,0
Гексаметилендиамин
0,9375
Гидрат гидразина
0,0625
Указанное в заголовке соединение примера 7 получали в виде 10% водного раствора. Средняя молекулярная масса указанного в заголовке соединения (в форме свободного основания без кислоты) составляла 2800 (± 10%) Да, как было определено кислотно-основным титрованием остаточных концевых аминогрупп.
Пример 8
Указанное в заголовке соединение получали способом, изложенным в примере 2, с использованием следующих реагентов:
Реагент
Моль
Сульфат гуанидина
1,0
Гексаметилендиамин
0,9
Гидрат гидразина
0,1
Указанное в заголовке соединение примера 8 получали в виде 10% водного раствора. Средняя молекулярная масса указанного в заголовке соединения (в форме свободного основания без кислоты) составляла 2600 (± 10%) Да, как было определено кислотно-основным титрованием остаточных концевых аминогрупп.
Пример 9
Указанное в заголовке соединение получали способом, изложенным в примере 1, с использованием следующих реагентов:
Реагент
Моль
Ацетат гуанидина
1,0
Гексаметилендиамин
0,9
Гидрат гидразина
0,1
Указанное в заголовке соединение примера 9 получали в виде 10% водного раствора. Средняя молекулярная масса указанного в заголовке соединения (в форме свободного основания без кислоты) составляла 2000 (± 10%) Да, как было определено кислотно-основным титрованием остаточных концевых аминогрупп.
Пример 10
Термостойкую 1-литровую колбу, снабженную газоотводной трубкой, мешалкой и термометром, загружали гидрохлоридом гуанидина (95,5 г, 1,0 моль, 48,7 мас.%), гексаметилендиамином (104,4 г, 0,9 моль, 48,7 мас. %) и гидразингидратом (5,0 г, 0,1 моль, 2,6 мас.%). Выходная трубка была соединена с приемником для улавливания аммиака. Содержимое колбы перемешивали и нагревали до 175-180°C с постепенным удалением воды и аммиака в течение 1 ч при 175-180°С. Затем температуру повышали до 190°С и содержимое колбы перемешивали в течение 1 часа. Теплую реакционную массу охлаждали до 130-140°С, при перемешивании добавляли горячую воду (150 мл) и смесь оставляли перемешиваться до полного растворения реакционной массы. Полученный раствор декантировали, а колбу промывали водой (30 мл) и затем повторно объединяли с декантированным раствором. Объединенный раствор нейтрализовали кислотой до рН 6-7, и 330 мл водного раствора олигомера, имеющего концентрацию 50%, получали в виде прозрачной, практически бесцветной жидкости.
Воду (1200 мл) добавляли к 300 мл полученного 50% раствора олигомера с получением 10% раствора неочищенного продукта. Затем раствор фильтровали через мембранный модуль с верхним отсечением 2 кДа и получали 1000 мл фильтрата, содержащего 80 г указанного в заголовке соединения примера 10. Среднюю молекулярную массу 1330 (± 10%) Да определяли для указанного в заголовке соединения (в форме свободного основания без кислоты) путем кислотно-основного титрования остаточных концевых аминогрупп.
Пример 11
Термостойкую 1-литровую колбу, снабженную газоотводной трубкой, мешалкой и термометром, загружали гидрохлоридом гуанидина (95,5 г, 1,0 моль, 48,7 мас.%), гексаметилендиамином (104,4 г, 0,9 моль, 48,7 мас. %) и гидразингидратом (5,0 г, 0,1 моль, 2,6 мас.%). Выходная трубка была соединена с приемником для улавливания аммиака. Содержимое колбы перемешивали и нагревали до 175-180°С с постепенным удалением воды и аммиака в течение 2 ч при 175-180°С. Затем температуру повышали до 195°С и содержимое колбы перемешивали в течение 1 часа. Теплую реакционную массу охлаждали до 130-140°С, при перемешивании добавляли горячую воду (150 мл) и смесь оставляли перемешиваться до полного растворения реакционной массы. Полученный раствор декантировали, а колбу промывали водой (30 мл) и затем повторно объединяли с декантированным раствором. Объединенный раствор нейтрализовали кислотой до рН 6-7, и 330 мл водного раствора олигомера, имеющего концентрацию 50%, получали в виде прозрачной, практически бесцветной жидкости.
Воду (1200 мл) добавляли к 300 мл полученного 50% раствора олигомера с получением 10% раствора неочищенного продукта. Затем раствор фильтровали через мембранный модуль с верхним отсечением 5 кДа и 1300 мл раствора, содержащего 126 г указанного в заголовке соединения из примера 11. Для указанного в заголовке соединения была определена средняя молекулярная масса 3100 (± 10%) Да (в форме свободного основания без кислоты) кислотно-основным титрованием остаточных концевых аминогрупп.
Пример 12
Термостойкую 1-литровую колбу, снабженную газоотводной трубкой, мешалкой и термометром, загружали гидрохлоридом гуанидина (95,5 г, 1,0 моль, 48,7 мас.%), гексаметилендиамином (104,4 г, 0,9 моль, 48,7 мас. %) и гидразингидратом (5,0 г, 0,1 моль, 2,6 мас.%). Выходная трубка была соединена с приемником для улавливания аммиака. Содержимое колбы перемешивали и нагревали до 175-180°С с постепенным удалением воды и аммиака в течение 2 ч при 175-180°С. Затем температуру повышали до 195°С и содержимое колбы перемешивали в течение 2 часов. Теплую реакционную массу охлаждали до 130-140°С, при перемешивании добавляли горячую воду (150 мл) и смесь оставляли перемешиваться до полного растворения реакционной массы. Полученный раствор затем выливали и колбу промывали водой (30 мл) и оба раствора объединяли. Объединенный раствор нейтрализовали кислотой до рН 6-7, и 330 мл водного раствора олигомера, имеющего концентрацию 50%, получали в виде прозрачной, практически бесцветной жидкости.
Воду (1200 мл) добавляли к 300 мл полученного 50% раствора олигомера с получением 10% раствора неочищенного продукта. Затем раствор фильтровали через мембранный модуль с верхним отсечением 10 кДа и 1350 мл раствора, содержащего 1270 г нелетучего вещества. 600 мл этого фильтрата разбавляли водой до 6 л и подвергали диализу на фильтрующем мембранном модуле с мембраной, имеющей верхнюю граничную массу 5 кДа, чтобы отделить 5,8 л фильтрата. Оставшийся диализат отделяли, получая 180 мл раствора, содержащего 9 г целевого соединения, указанного в заголовке, примера 12. Для соединения, указанного в заголовке (в форме свободного основания без кислоты), определяли среднюю молекулярную массу 5700 (± 10%) Да.
Пример 13
Термостойкую 1-литровую колбу, снабженную газоотводной трубкой, мешалкой и термометром, загружали гидрохлоридом гуанидина (95,5 г, 1,0 моль, 48,7 мас.%), гексаметилендиамином (104,4 г, 0,9 моль, 48,7 мас. %) и гидразингидратом (5,0 г, 0,1 моль, 2,6 мас.%). Выходная трубка была соединена с приемником для улавливания аммиака. Содержимое колбы перемешивали и нагревали до 175-180°С с постепенным удалением воды и аммиака в течение 2 часов, а затем повышали температуру при 195°С и перемешивали в течение часа. Затем температуру повышали до 195°С и содержимое колбы перемешивали в течение 2 часов. Теплую реакционную массу охлаждали до 130-140°С, при перемешивании добавляли горячую воду (150 мл) и смесь оставляли перемешиваться до полного растворения реакционной массы. Полученный раствор декантировали и колбу промывали водой (30 мл) и затем повторно объединяли с декантированным раствором. Объединенный раствор нейтрализовали кислотой до рН 6-7, и 330 мл водного раствора олигомера, имеющего концентрацию 50%, получали в виде прозрачной, практически бесцветной жидкости.
Воду (1200 мл) добавляли к 300 мл полученного 50% раствора олигомера с получением 10% раствора неочищенного продукта. Затем раствор фильтровали через мембранный модуль с верхним отсечением 10 кДа и 1350 мл раствора, содержащего 1270 г нелетучего вещества. 600 мл этого фильтрата разбавляли водой до 6 л и подвергали диализу на фильтрующем мембранном модуле с мембраной, имеющей верхнюю граничную массу 2 кДа, чтобы отделить 5,7 л фильтрата. Оставшийся диализат отделяли, получая 290 мл раствора, содержащего 28 г целевого соединения, указанного в заголовке, с формулой
Среднюю молекулярную массу 2630 (± 10%) Да определяли для указанного в заголовке соединения (в форме свободного основания без кислоты).
Пример 14
Структурные характеристики препаратов, выделенных в Примерах 1-13, показаны в Таблице 1. Элементный анализ препаратов Примера 1-12 (в расчете на сухое вещество) показан в Таблице 2.
Таблица 1
Пример No.
Кислота
n
m
z
Средняя ММ(+10% Da)
Пределы веса, Да
1
HCl
1
8
1,4
1850
до 3000
2
HCl
1
8
2,4
3170
до 10 000
3
HCl
1
8
1,8
2300
1000-3000
4
HCl
1
8
1,9
2500
2000-3000
5
HCl
1
8
2,8
3680
3000-5000
6
HCl
3
4
1,4
1600
до 3000
7
HCl
1
14
1,3
2800
до 10 000
8
H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
1
8
2,0
2600
до 10 000
9
АcОН
1
8
1,5
2000
до 3000
10
HCl
1
8
1
1330
до 2000
11
HCl
1
8
2,4
3100
до 5000
12
HCl
1
8
4,3
5700
5000 - 10 000
13
HCl
1
8
2,0
2630
2000 - 10 000
Таблица 2
Пример No.
Данные анализа элементов ,%
С
Н
N
Cl(S)
1
44,76
8,84
25,43
20,97
2
44,88
8,82
25,29
21,02
3
44,84
8,83
25,36
20,95
4
44,86
8,77
25,23
20,85
5
44,93
8,80
25,23
21,05
6
40,49
8,24
28,16
23,06
7
46,31
9,05
25,04
19,42
8
41,65
8,19
23,52
8,69
9
51,61
9,34
22,20
-
10
44,60
8,89
25,65
20,90
11
44,94
8,83
25,21
21,02
12
44,99
8,84
25,19
20,98
13
44,87
8,83
25,33
20,96
Сравнение биоцидной активности примеров 1-12 и препарата-прототипа, описанного в патенте США №8993712 (имеющего среднюю молекулярную массу от 5273 до 26000 Да), показано в следующих примерах. Препарат-прототип представляет собой соединение формулы:
где n = от 1 до 3; m = 2-10; z = 4-20; и Х отсутствует или является кислотой, имеющей среднее отношение n / m 1/9, степень полимеризации 40 и выше и средний вес молекулы полимера (без противоиона) в диапазоне от приблизительно 5273 Да до приблизительно 26000 Да.
Пример 15
В данном примере эффективность препаратов из Примера 1-12 была протестирована против различных бактерий (аэробных и анаэробных) и грибковых патогенов.
Изученные бактерии:
Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Fusobacterium nucleatum VT13-23, Staphylococcus aureus VT 10-209, Mycobacterium tuberculosis H37Rv
Изученные грибы
Candida albicans VT10-14, Candida glabrata VT14 to 140, Fusarium moniliforme VT1147 , Aspergillis fumigatus ATCC 20430
Питательные среды
для бактериального культивирования: бульон Мюллера-Хинтона, агар Мюллера-Хинтона, бульон Шедлера, агар Шедлера, агар Колумбии, агар бруцеллы и триптиказо-соевый агарДля выращивания грибов: бульон и агар Сабуро (bioMérieux, Франция)
Антимикробную активность оценивали методом серийных разведений. Соединения растворяли в стерильной воде и использовали в концентрациях от 500 до 0,0025 мг/л. Концентрации препарата в среде в соседних пробирках отличались в два раза. Экспериментальные результаты были собраны после 72-часового культивирования бактерий при 37°С. Данные приведены в таблице 3.
Таблица 3. Антибактериальная активность.
Пример No.
Кислота
Пределы веса, Да
Рейтинг по активности
S. aureus ATCC
E.coli    ATCC 9223
F. nucleatum
P. aeruginosa ATCC27853
M. tuberculosis H37Rv
1
HCl
до 3000
0,03(2)
3,1(7)
0,6-1,2 (3)
0,07(1)
0,06(6)
2
HCl
до 10 000
0,12
0,3(1)
0,3
0,7
0,03
3
HCl
1000-3000
0,03(2)
3,1( 7)
0,6-1,2 (3)
0,07(1)
0,06(6)
4
HCl
2000-3000
0,12(6)
0,7-1,5(4)
0,3 (1)
0,15-0,3(5)
0,015-0,03(2)
5
HCl
3000-5000
0,06(3)
0,7(3)
0,6 (4)
0,07(2)
0,12(7)
6
HCl
до 3000
0,6
12,4
2,4
0,6
0,48
7
HCl
до 10 000
0,48
1,2
1,2
2,8
0,24
8
H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
до 10 000
0,48
1,2
2,4
4,2
1,2
9
АcОН
до 3000
0,6
2,4
2,4
1,2
1,2(6)
10
HCl
до 2000
0,06-0,12(4)
6,2(8)
0,6 (2)
0,07-0,15(3)
0,12(8)
11
HCl
до 5000
0,015-0,03(1)
1,5-3,1(6)
0,6 (5)
0,15(6)
0,03(3)
12
HCl
5000 - 10 000
0,12-0,25(9)
1,5
0,6-1,2 (5)
0,15(8)
0,015(1)
13
HCl
2000 - 10 000
0,12
0,7
1,2
28
0,06
Прототип
0,25
0,7(2)
0,3
0,7
2,4
Эти данные указывают на то, что соединения по изобретению обладают выраженной антибактериальной активностью.
Таблица 4. Противогрибковая активность.
Пример No.
Кислота
Пределы веса, Да
МПК (мкг/мл)
C. albicans ATCC 14053
A. fumigatus ATCC 204305
F.moniliformes  VT 1147
1
HCl
до 3000
0,6-1,2 (3)
0,07(1)
0,9
2
HCl
до 10 000
0,3
0,7
2,5
3
HCl
1000-3000
0,6-1,2 (3)
0,07(1)
1,2
4
HCl
2000-3000
0,3 (1)
0,15-0,3(5)
5,4
5
HCl
3000-5000
0,6 (4)
0,07(2)
4,0
6 to 05
HCl
до 3000
2,4
0,6
1,2
7
HCl
до 10 000
1,2
2,8
5,4
8
H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
до 10 000
2,4
4,2
0,9
9
АcОН
до 3000
2,4
1,2
4,0
10
HCl
до 2000
0,6 (2)
0,07-0,15(3)
1,8
11
HCl
до 5000
0,6 (5)
0,15(6)
4,0
12
HCl
5000 - 10 000
0,6-1,2 (5)
0,15(8)
1,8
13
HCl
2000 - 10 000
0,6-1.2
0,15
1,8
Прототип
0,3
0,7
0,9
Эти данные указывают на то, что соединения по изобретению обладают выраженной противогрибковой активностью.
Пример 16
В этом примере была проверена противовирусная активность соединений по изобретению.
Изученные вирусы
РНК-содержащий полиовирус, ДНК-содержащий аденовирус, ДНК-содержащий вирус простого герпеса, РНК-содержащий вирус гепатита С, РНК-содержащий вирус иммунодефицита человека, РНК-содержащий вирус гриппа А.
Культура клеток
Непрерывная культура клеток Vero почек зеленой мартышки, клеток человека HeLa, клеток почек эмбриона свиньи (PEKC), лимфобластоидных клеток МТ-4 человека, клеток почек собак (MDCK).
Готовили 5,0%-ные водные растворы препаратов Примера 1-12. Время контакта вируса с агентом составляло 0,5-1,0 минуты при температуре 20 ± 2°С. Вирусную репродукцию в клетках оценивали по индуцированному вирусом цитопатическому эффекту, определяемому по степени ингибирования титра инфекционного вируса, измеренного как ЕС50. Данные приведены в таблице 5.
Таблица 5. Противовирусная активность.
Пример No.
Кислота
Пределы веса, Да
EC50
Адено-вирус
Вирус иммуно-дефицита
Вирус герпеса(HSV1)
Вирус полио-миелита
Вирус гриппа А
Вирус иммуно-дефицита
Вирус гепатита С
1
HCl
до 3000
0,8
0,5
0,12
0,9
0,25
0,3
0,15
2
HCl
до 10 000
3,5
2,0
0,48
0,45
4,0
0,9
1,0
3
HCl
1000-3000
0,2
1,0
0,06
1,8
0,5
0,6
0,6
4
HCl
2000-3000
1,6
3,5
0,28
1,8
4,0
1,8
0,6
5
HCl
3000-5000
3,5
3.5
0,48
3,6
2,0
3,6
0,6
6 to 05
HCl
до 3000
1,8
3,0
0,48
1,8
4,0
0,6
0,3
7
HCl
до10 000
7,0
5,0
1,8
3,6
4,0
4,0
1,2
8
H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
до 10 000
4,0
7,2
3,6
7,2
8,0
8,0
2,4
9
АcОН
до 3000
1,6
5,0
0,24
1,8
1,0
0,6
0,6
10
HCl
до 2000
1,8
1,7
0,06
0,9
0,12
0,6
0,3
11
HCl
до 5000
0..4
3,5
0,24
1,8
1,0
0,6
0,6
12
HCl
5000  до10 000
4,0
3,5
0,48
1,8
2,0
1,8
1,2
13
HCl
2000  до10 000
2,0
7/0
0,24
0459
0,24
0,6
1,0
14 Прототип
3,5
3,5
0,48
1,8
2,0
4,0
2,2
Эти данные указывают на то, что соединения по изобретению обладают выраженной вироцидной активностью в отношении простых и мультиструктурированных РНК- и ДНК-содержащих вирусов.
Пример 17
В этом эксперименте токсичность препаратов Формулы I была проанализирована с использованием анализа гемолиза красных кровяных клеток Ex Vivo (эритроциты человека). Эритроциты человека растворяли в PBS. Каждое соединение тестировали в 5 разведениях. Данные приведены в таблице 6.
Таблица 6. Токсичность для клеток MDCK.
Пример No.
Кислота
Пределы веса, Да
концентрация(мг / л) требуемая для лизирования 50% эритроцитов
1
HCl
до 3000
>500
2
HCl
до 10 000
>250
3
HCl
1000-3000
>500
4
HCl
2000-3000
>500
5
HCl
3000-5000
>250
6 до 05
HCl
до 3000
>250
7
HCl
до 10 000
>250
8
H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
до 10 00
>250
9
АcОН
до 3000
>500
10
HCl
до 2000
>500
11
HCl
до 5000
>250
12
HCl
5000 - 10 000
>500
13
HCl
2000 - 10 000
>250
Прототип
100
Данные о биологической активности и токсичности в примерах 13-16 демонстрируют неожиданные преимущества препаратов Формулы I. Не ограничиваясь какой-либо теорией изобретения, полагают, что способ по изобретению дает полимерные препараты, имеющие узкие и выгодные распределения молекулярной массы, которые обеспечивают высокий уровень активности против определенных патогенов. Удаление определенных компонентов с низкой и высокой молекулярной массой из препаратов дает фракции Формулы I, которые обладают низкой токсичностью, повышенной антимикробной активностью, облегчают проникновение через биологические мембраны, имеют полезные профили распада и другие полезные свойства. Определенные фракции соединений Формулы I имеют уникальные профили активности, которые нацелены на конкретные микроорганизмы. Например, препарат Примера 1 проявляет высокую активность в отношении многоклеточных грибов рода Aspergillus. Препарат в Примере 4 высокоэффективен в отношении одноклеточных грибов рода Candida. Препарат примера 11 проявляет высокую активность в отношении грамположительных бактерий. Препарат примера 2 активен против грамотрицательных бактерий. Микобактерии очень чувствительны к препарату в Примере 12. Соединения в Примерах 1, 2, 3, 10 и 13, каждое, проявляют высокую активность против специфических вирусов. Таким образом, подготовленные образцы имеют уникальные и неожиданные профили активности, полезные для нацеливания на определенные типы патогенов.
Пример 18
В этом примере противоопухолевую активность соединений Формулы I тестировали с использованием модели сплошной опухоли Эрлиха. Препарат Формулы I вводили одновременно с трансплантацией опухоли (0,2 мл 0,01% раствора) внутрибрюшинно. Контрольные животные получали воду (которая использовалась в качестве растворителя для тестируемых препаратов).
Таблица 7. Противоопухолевое действие.
Образец
Размер опухоли (мм3), сутки после трансплантации
7 дней
11 дней
14 дней
18 дней
22 дня
25 дней
No. 1
92,6
191,8
276,9
357,3
579,4
613,4
No. 3
83,4
177,0
253,9
312,5
542,6
631,9
No. 8
71,5
149,8
244,1
423,6
602,7
688,5
No. 10
101,7
211,2
307,5
508,6
599,5
730,4
Контроль
142,1
309,2
703,1
2095,0
3080,4
3360,5
Результаты показывают, что исследуемые образцы ингибируют рост опухоли у экспериментальных животных.
Пример 19
В этом эксперименте модель сплошной опухоли Эрлиха была использована для изучения комбинированного действия заявленного продукта с противораковыми препаратами. Препараты вводили одновременно с трансплантацией опухоли (0,2 мл 0,01% раствора) внутрибрюшинно. Контрольные животные получали воду (в качестве растворителя для тестируемых препаратов).
Таблица 8. Противоопухолевое действие.
Образец
Размер опухоли (мм3), сутки после трансплантации
7 дней
11 дней
14 дней
18 дней
22 дня
25 дней
No. 1
92,6
191,8
276,9
357,3
579,4
613,4
Цисплатин
72,4
180,7
243,3
345,8
548,2
607,7
No. 1 + Цисплатин
43,5
104,6
144,3
250,8
344,6
404,3
Контроль
142,1
309,2
703,1
2095,0
3080,4
3360,5
Результаты показывают, что исследуемый образец вместе с противоопухолевым препаратом ингибирует рост опухоли у экспериментальных животных. Как будет понятно специалисту в данной области, подобный противораковый эффект ожидается, когда препараты Формулы I комбинируют с другими противораковыми лекарственными средствами, например, алкилирующими агентами, антиметаболитами, антагонистами пурина, антагонистами пиримидина, растительными алкалоидами, антибиотиками, гормональными агентами и другими противоопухолевыми препаратами.
Пример 20
Соединения в данном документе были исследованы с помощью MALDI-MS в соответствии со способом, описанным в примере 1. В таблице 9 приведены значения массы (m / z) характеристических ионов MH + и их относительная интенсивность в масс-спектре примеров 1, 1a, 1b, 1c, 1d, 6, 9, 10 в диапазоне m / z 480-2000 Да.
Таблица 9
- Массы ионов MH + и их относительная интенсивность в масс-спектре заявляемого продукта (Примеры 1, 1a, 1b, 1c, 1d, 6, 9, 10) в диапазоне m / z 480-2000 Да.
483,3 (70)
845,5 (12)
1144,8 (8)
1409,9 (11)
1613,2 (51)
1875,3 (24)
498,3 (11)
847,6 (24)
1146,8 (4)
1412,0 (31)
1627,2 (11)
1892,4 (27)
523,3 (37)
848,6 (16)
1154,8 (10)
1427,0 (8)
1633,1 (11)
1894,4 (9)
540,4 (7)
864,6 (41)
1161,8 (8)
1429,0 (18)
1638,2 (8)
1910,4 (17)
563,3 (7)
879,6 (8)
1169,8 (14)
1430,1 (23)
1712,3 (19)
1932,4 (19)
565,3 (4)
887,5 (7)
1186,8 (19)
1437,0 (10)
1720,2 (18)
1934,4 (9)
582,4 (33)
904,6 (18)
1188,9 (92)
1444,1 (7)
1727,3 (8)
1935,4 (7)
608,4 (6)
906,7 (100)
1203,9 (18)
1452,0 (19)
1733,3 (7)
1950,4 (9)
622,4 (16)
921,7 (15)
1213,9 (9)
1470,1 (17)
1735,2 (8)
1959,4 (11)
624,4 (84)
946,6 (60)
1228,9 (58)
1471,1 (60)
1751,3 (8)
1974,4 (10)
639,4 (17)
961,7 (7)
1243,9 (12)
1486,1 (18)
1753,3 (13)
1976,4 (6)
664,4 (16)
986,7 (16)
1253,9 (10)
1493,0 (14)
1754,3 (23)
1977,4 (11)
665,4 (22)
988,7 (27)
1268,9 (18)
1511,1 (42)
1768,3 (36)
1991,4 (11)
679,4 (8)
1003,7 (7)
1270,9 (35)
1526,1 (10)
1774,2 (12)
1993,5 (8)
704,4 (3)
1005,7 (39)
1285,9 (4)
1534,0 (9)
1793,3 (10)
1994,5 (19)
706,4 (19)
1020,8 (6)
1288,0 (36)
1551,1 (16)
1794,3 (24)
723,5 (20)
1028,7 (19)
1295,9 (13)
1553,1 (21)
1808,3 (28)
746,5 (12)
1030,7 (9)
1303,0 (9)
1568,1 (9)
1816,2 (9)
748,5 (6)
1045,7 (21)
1310,9 (18)
1570,2 (18)
1818,3 (7)
763,5 (15)
1047,8 (81)
1328,0 (17)
1579,1 (10)
1833,3 (7)
765,6 (90)
1062,8 (23)
1330,0 (81)
1585,2 (8)
1835,3 (11)
780,6 (20)
1087,8 (60)
1345,0 (20)
1591,1 (10)
1836,3 (20)
805,5 (53)
1102,8 (12)
1370,0 (38)
1593,1 (12)
1850,3 (13)
806,5 (13)
1127,8 (16)
1371,0 (49)
1610,2 (12)
1852,4 (7)
820,5 (9)
1129,8 (24)
1385,0 (14)
1612,2 (49)
1868,4 (8)
Таблица 10
- Массы ионов МН + и их относительная интенсивность в масс-спектре заявляемого продукта (Примеры 2, 7, 8, 11, 13) в диапазоне m/z 480-2000 Да.
483,3 (90)
845,5 (8)
1144,8 (8)
1409,9 (11)
1613,2 (15)
1875,3 (14)
498,3 (10)
847,6 (11)
1146,8 (4)
1412,0 (31)
1627,2 (11)
1892,4 (5)
523,3 (30)
848,6 (15)
1154,8 (10)
1427,0 (8)
1633,1 (11)
1894,4 (3)
540,4 (3)
864,6 (41)
1161,8 (8)
1429,0 (18)
1638,2 (8)
1910,4 (3)
563,3 (5)
879,6 (6)
1169,8 (14)
1430,1 (23)
1712,3 (4)
1932,4 (4)
565,3 (5)
887,5 (8)
1186,8 (19)
1437,0 (10)
1720,2 (10)
1934,4 (2)
582,4 (24)
904,6 (18)
1188,9 (70)
1444,1 (7)
1727,3 (8)
1935,4 (3)
608,4 (5)
906,7 (50)
1203,9 (13)
1452,0 (19)
1733,3 (2)
1950,4 (7)
622,4 (3)
921,7 (15)
1213,9 (8)
1470,1 (17)
1735,2 (3)
1959,4 (6)
624,4 (90)
946,6 (30)
1228,9 (40)
1471,1 (32)
1751,3 (3)
1974,4 (5)
639,4 (15)
961,7 (4)
1243,9 (10)
1486,1 (10)
1753,3 (7)
1976,4 (6)
664,4 (20)
986,7 (3)
1253,9 (5)
1493,0 (6)
1754,3 (11)
1977,4 (8)
665,4 (20)
988,7 (21)
1268,9 (6)
1511,1 (19)
1768,3 (24)
1991,4 (3)
679,4 (4)
1003,7 (3)
1270,9 (15)
1526,1 (4)
1774,2 (12)
1993,5 (2)
704,4 (2)
1005,7 (25)
1285,9 (4)
1534,0 (9)
1793,3 (10)
1994,5 (2)
706,4 (6)
1020,8 (6)
1288,0 (13)
1551,1 (16)
1794,3 (24)
723,5 (23)
1028,7 (19)
1295,9 (5)
1553,1 (21)
1808,3 (19)
746,5 (3)
1030,7 (9)
1303,0 (3)
1568,1 (9)
1816,2 (6)
748,5 (5)
1045,7 (21)
1310,9 (3)
1570,2 (11)
1818,3 (5)
763,5 (10)
1047,8 (70)
1328,0 (10)
1579,1 (6)
1833,3 (3)
765,6 (100)
1062,8 (20)
1330,0 (53)
1585,2 (8)
1835,3 (3)
780,6 (25)
1087,8 (29)
1345,0 (20)
1591,1 (4)
1836,3 (6)
805,5 (03)
1102,8 (10)
1370,0 (38)
1593,1 (10)
1850,3 (4)
806,5 (10)
1127,8 (18)
1371,0 (49)
1610,2 (6)
1852,4 (4)
820,5 (15)
1129,8 (22)
1385,0 (14)
1612,2 (34)
1868,4 (5)
Таблица 11
- Массы ионов МН + и их относительная интенсивность в масс-спектре заявляемого продукта (Примеры 3, 4, 5, 13) в диапазоне m/z 480-2000 Да.
483,3 (10)
845,5 (12)
1144,8 (8)
1409,9 (11)
1613,2 (33)
1875,3 (24)
498,3 (1)
847,6 (24)
1146,8 (4)
1412,0 (31)
1627,2 (11)
1892,4 (27)
523,3 (3)
848,6 (16)
1154,8 (10)
1427,0 (8)
1633,1 (11)
1894,4 (9)
540,4 (3)
864,6 (80)
1161,8 (8)
1429,0 (18)
1638,2 (8)
1910,4 (17)
563,3 (1)
879,6 (15)
1169,8 (11)
1430,1 (23)
1712,3 (29)
1932,4 (22)
565,3 (1)
887,5 (7)
1186,8 (10)
1437,0 (10)
1720,2 (20)
1934,4 (9)
582,4 (17)
904,6 (18)
1188,9 (98)
1444,1 (7)
1727,3 (8)
1935,4 (7)
608,4 (9)
906,7 (88)
1203,9 (18)
1452,0 (19)
1733,3 (7)
1950,4 (9)
622,4 (10)
921,7 (21)
1213,9 (9)
1470,1 (17)
1735,2 (8)
1959,4 (11)
624,4 (65)
946,6 (25)
1228,9 (58)
1471,1 (60)
1751,3 (8)
1974,4 (10)
639,4 (12)
961,7 (710
1243,9 (12)
1486,1 (18)
1753,3 (13)
1976,4 (67
664,4 (1)
986,7 (5)
1253,9 (10)
1493,0 (14)
1754,3 (23)
1977,4 (10)
665,4 (2)
988,7 (2)
1268,9 (18)
1511,1 (25)
1768,3 (36)
1991,4 (6)
679,4 (5)
1003,7 (7)
1270,9 (10)
1526,1 (10)
1774,2 (12)
1993,5 (10)
704,4 (3)
1005,7 (95)
1285,9 (4)
1534,0 (9)
1793,3 (10)
1994,5 (19)
706,4 (1)
1020,8 (6)
1288,0 (95)
1551,1 (16)
1794,3 (24)
723,5 (2)
1028,7 (20)
1295,9 (13)
1553,1 (21)
1808,3 (28)
746,5 (2)
1030,7 (9)
1303,0 (9)
1568,1 (9)
1816,2 (9)
748,5 (3)
1045,7 (21)
1310,9 (18)
1570,2 (51)
1818,3 (7)
763,5 (5)
1047,8 (100)
1328,0 (17)
1579,1 (10)
1833,3 (7)
765,6 (70)
1062,8 (8)
1330,0 (81)
1585,2 (8)
1835,3 (11)
780,6 (2)
1087,8 (23)
1345,0 (10)
1591,1 (10)
1836,3 (20)
805,5 (16)
1102,8 (12)
1370,0 (10)
1593,1 (12)
1850,3 (13)
806,5 (1)
1127,8 (16)
1371,0 (24)
1610,2 (12)
1852,4 (7)
820,5 (1)
1129,8 (24)
1385,0 (14)
1612,2 (35)
1868,4 (8)
Пример 21
В этом примере эффективность препарата из Примера 1 была протестирована против легочных бактериальных патогенов у пациентов с муковисцидозом. Результаты этого исследования приведены в таблице 12.
Таблица 12. Активность примера 1 против устойчивых штаммов, обнаруженных у пациентов с муковисцидозом
Патоген
Число штамов
No. 1 (МПК)
No. 11(МПК)
TOBI (МПК)
Cayston (МПК)
P. aeruginosa
15
0,25-1,0
0,5
0,5-1,0
2,0-8,0
MDR-PA
10
0,5-8,0
0,5-4,0
128-256
128-256
S. aureus MSSA
10
0,25-0,5
0,25-0,5
0,5-2,0
8,0-64,0
S. aureus MRSA
10
0,25-4,0
0,25 -2,0
64-256
64-128
H. Influenzae
10
0,25-1,0
0,5-1,0
0,5-2,0
0,25-4,0
S. maltophilia
10
0,05-0,5
0,05-0,25
1,0-2,0
8,0-32,0
A.fumigatus
5
0,25-0,5
0,5-1,0
неэффективен
неэффективен
C.albicans
5
0,25-0,5
0,25-0,5
неэффективен
неэффективен
Эти данные показывают, что полимерные фракции по изобретению проявляют широкий спектр активности против устойчивых штаммов, обычно встречающихся у пациентов с МВ. Полимерные фракции по изобретению обладают повышенной активностью по сравнению с обычными лекарственными средствами, такими как TOBI и Cayston.
Пример 22
В этом примере эффективность препаратов была протестирована на животной модели смешанной респираторной инфекции.
Методы
. Эффективность примеров № 1, 5 и 10 исследовали в отношении бактериальных изолятов от пациентов с муковисцидозом. Значения MIC определяли методом макродилюции бульона в соответствии с рекомендациями CLSI. Для исследований in vivo 8-недельных мышей C57BL / 6 интраназально инфицировали P. aeruginosa MR-6 (2 × 107 КОЕ / мышь) + A. fumigatus (6 × 106 КОЕ / мышь). Лечение начинали через 12 ч после инфицирования примерами № 1, 5 и 10 или тобрамицином или азтреонамом, вводимым путем интраназальной ингаляции в 32 раза по MIC.
Результаты
A. fumigatus;
P. aeruginosa
A. fumigatus.
: примеры № 1, 5 и 10 показали высокий уровень антимикробной активности с MIC 0,25-0,5 мг/л против A. fumigatus и 1,0-4,0 мг/л против P. aeruginosa. Тобрамицин и азтреонам были менее активны; тобрамицин давал MIC 16-32 мг/л для P. aeruginosa и не был активен против  азтреонам давал MIC 64 мг/л для  и не был активен против
Таблица 13. Процент смертности через 96 ч после заражения.
Соединение
P. aeruginosa
A. fumigatus
P. aeruginosa+A. fumigatus
Необработанный контроль
40%
60%
100%
No1
0%
0%
10%
No5
0%
0%
10%
No11
10%
0%
10%
Тобрамицин
20%
40%
50%
Азтреонам
20%
30%
60%
Пример 23
В этом примере эффективность препаратов (примеры № 1 и 10) была протестирована для лечения синусита человека. Пациенты (всего 15) с синуситом подвергались прямой пункции пазухи и им закапывали 2 мл 0,05% № 1 (5 пациентов) и 0,05% № 10 (5 пациентов). Контрольным пациентам закапывали стерильный 0,9% физиологический раствор (5 пациентов). Клиническая эффективность рассматривалась как нормализация температуры и уменьшение боли. Микробиологическую эффективность определяли как уменьшение количества КОЕ после посева на колумбийский агар в течение 24 часов при 37°С через 48 часов после закапывания.
Таблица 14. Эффективность соединений для лечения синусита
Соединение
Количество КОЕ
Клиническое выздоровление
До обработки
48 часов после обработки
Контроль
9
9
6й день
No. 1
10
3
2й день
No. 10
12
1
2й день
Пример 24
В этом примере эффективность препаратов (примеры № 1 и 4) была протестирована для лечения цистита человека. Пациентам (всего 15) с циститом была проведена инстилляция мочевого пузыря с 10 мл 0,005% по примеру № 1 (5 пациентов) и 0,1% № 4 (5 пациентов). Контрольным пациентам проводили инстилляцию стерильным 0,9% физиологическим раствором (5 пациентов). Микробиологическую эффективность определяли как уменьшение количества КОЕ после посева на колумбийский агар в течение 24 часов при 37°С после 48 часов после закапывания.
Таблица 15. Эффективность соединений для лечения синусита
Соединение
Количество КОЕ
До обработки
48 часов после обработки
Контроль
12
9
No1
14
3
No 4
16
1
Пример 25
В этом примере эффективность препаратов была проверена против бактериофагов.
В частности, была исследована активность примеров № 1, 3, 9, 10, 12 и 13 на уровне 0,05% против бактериофагов, которые заражают Salmonella spp. Фаги подсчитывали по методу Гратиа (Kropinski et al. «Подсчет бактериофагов с помощью анализа с наложением двойного агара». Бактериофаги. Методы и протоколы, том 1: выделение, характеристика и взаимодействия, Humana Press, 2009, том 501, 69-76). Бактериофаги инкубировали с соединениями в течение 5 минут, затем фильтровали и промывали буфером PBS. Затем пробоотборник бактериофагов использовали в методе анализа бляшек для изучения их активности.
Таблица 16. Эффективность соединений против бактериофагов
Соединение
Титр бактериофага
Контроль (PBS)
7,5 × 10<sup>5</sup>
No. 1
0
No. 3
0
No. 9
0
No. 10
0
No. 12
0
No. 13
0
Пример 26
В этом примере эффективность примеров 1, 10 и 13 была протестирована против микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью.
Pseudomonas aeruginosa
Тестируемые бактериальные штаммы:  AGR 18 и MR23 мультирезистентны.
Candida glabrata
Грибковый штамм:  CG15, VT18, устойчивый к амфотерицину В и вориконазолу
Микробиологическую эффективность определяли как минимальную ингибирующую концентрацию. МПК был определен как самая низкая концентрация антибиотика, которая полностью ингибировала видимый рост
. aeruginosa
Бактерицидные активности примеров 1, 10 и 13 против мультирезистентных изолятов Pпоказаны ниже в таблице 17.
Таблица 17. Эффективность соединений против
P. aeruginosa
Противомикробное в-во
Точка невосприимчивости (мг/мл)
P. aeruginosa штаммМПК (мкг/мл)
AGR 18
MR23
Пр. 1
ND
2
4
Пр. 10
ND
1
2
Пр. 13
ND
2
2
Амикацин
≤ 16
128
256
Азтреонам
≤ 8
32
128
Цефтазидим
≤ 8
32
32
Пиперацилин
≤ 16
>256
256
Тобрамицин
≤ 4
32
32
C. glabrata
Бактерицидные активности примеров 1, 10 и 13 в отношении мультирезистентных изолятов  показаны ниже в таблице 18.
Таблица 18. Эффективность соединений против
C. glabrata и C. albicans
Противогрибковое в-во
Точка невосприимчивости (мкг/мл)
Минимальная фунгицидная концентрация(мкг / мл) против дрожжей
S
I
R
C. glabrata CG15 14053
C. albicans VT18
No1
ND<sup>a</sup>
0,06
0,03
No10
ND<sup>a</sup>
0,06
0,12
No13
ND<sup>a</sup>
0,12
0,06
AMB
ND<sup>a</sup>
4
8
VRZ
≤0,12
0,25-0,5
>1
8
4
aCLSI и EUCAST не установили контрольные точки восприимчивости для AMB и примеров 1, 10, 13.
I - промежуточный; R - устойчивый; S - восприимчивый.
Пример 27
В этом примере эффективность заявляемых препаратов была протестирована против устойчивого к ванкомицину S.aureus (VRSA).
МПК определяли с использованием метода макродилюции бульона с отрегулированным катионом бульоном Мюллера-Хинтона II (Becton Dickinson) в стандартном инокуляте (105 КОЕ / мл) в соответствии с рекомендациями CLSI. Культуры, использованные в этом исследовании, были бактериальными клиническими изолятами от человеческих инфекций. Данные для этих экспериментов приведены в таблице 19.
Таблица 19. Минимальные ингибирующие концентрации препаратов против изолятов
S. aureus
.
Антибиотик
Точка невосприимчивости (мкг/мл)
VRSA штамм МПК (мкг/мл)
MSSA штамм МПК (мкг/мл)
VT-V-18
VT-E-25
VT-A-199
ATCC 29213
Пр. 1
ND
0,06
0,125
0,06
0,125
Пр. 5
ND
0,125
0,25
0,25
0,5
Пр. 9
ND
0,06
0,25
0,06
0,5
Ципрофлоксацин
<4,0
64
16
256
0,5
Ампицилин
<0,5
64
32
16
0,25
Ванкомицин
<16,0
16
1
16
0,5
Меропенем
<4,0
32
128
128
0,125
Клиндамицин
<4,0
4
2
2
0,125
Даптомицин
<1,0
0,125
0,25
0,5
0,25
Пример 28
5
В этом примере эффективность заявляемых препаратов была проверена против предварительно сформированных биопленок. В частности, была протестирована эффективность примера 1 против предварительно сформированных 24-часовых биопленок. MIC для противомикробных препаратов определяли методом макродилюции бульона в соответствии с рекомендациями CLSI. Использовали стандартный бактериальный инокулят 5 × 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл. Серийные 2-кратные разведения противомикробных препаратов готовили в скорректированном на катионы MHB. MIC был определен как самая низкая концентрация антибиотика, которая полностью ингибировала видимый рост.
5
В каждую лунку 96-луночного планшета для микротитрования культуры полистирола с плоским дном (Sarstedt, Numbrecht, Germany) добавляли 200 мкл стандартизированного инокулята P. aeruginosa (5×10 КОЕ / мл) в скорректированном на катионы MHB. После 24-часовой инкубации при 37°С образцы биопленки дважды промывали забуференным фосфатом солевым раствором для удаления неприлипающих бактерий и затем подвергали воздействию в течение от 24 до 200 мкл МГБ, содержащего препараты по настоящему изобретению, в 1, 2, 4, 8 г. 16, 32 и 64 × MIC. Необработанные биопленки были использованы в качестве отрицательных контролей. После воздействия содержимое лунок аспирировали для предотвращения переноса противомикробных препаратов и каждую лунку трижды промывали стерильной деионизированной водой.
Чтобы оценить количество КОЕ, биопленки были тщательно очищены с особым вниманием к краям скважины (11). Содержимое лунки отсасывали, помещали в 1 мл изотонического фосфатного буфера (0,15 М, рН 7,2) и определяли общее количество КОЕ путем серийного разбавления и высевания на агар Мюллера-Хинтона. Данные были преобразованы в масштаб log10 и сравнены с необработанными контролями.
MBEC определяли как концентрации лекарственного средства, которое убивало 50 (MBEC50), 90 (MBEC90) и 100% (MBEC100) бактерий в предварительно сформированных биопленках. Чувствительность MBEC была определена с использованием руководящих принципов интерпретации 2012 года Института клинических и лабораторных стандартов. Все анализы включали минимум 3 повторения и были повторены в 3 независимых экспериментах. Результаты этих экспериментов приведены в Таблице 20.
Таблица 20. Результаты чувствительности для Примера 1 препаратов против
P. aeruginosa.
Изолят
MBEC<sub>50</sub> (мкг/мл)
MBEC<sub>90</sub> (мкг/мл)
MBEC<sub>100</sub> (мкг/мл)
P. aeruginosa AGR14
8
32
256
P. aeruginosa VT-CF-234
2
4
32
Пример 29
В этом примере была проверена эффективность препаратов общей обработки поверхностей.
Мы изучили способность примера 7 стерилизовать воду в пруду, имеющую размеры 7 футов × 5 футов × 2 фута (ширина × длина × высота). Перед исследованием воду брали из пруда, фильтровали и помещали на чашки с агаром Мюллера-Хинтона (Oxoid Ltd., Лондон, Англия) и инкубировали при 37°С в течение ночи. Оценка количества колониеобразующих единиц составила приблизительно 4 log10 КОЕ / мл. После добавления к тестируемому в воде соединения примера 7 до конечной концентрации 0,01% и посева на чашки с агаром Мюллера-Хинтона (Oxoid Ltd., Лондон, Англия) и инкубации при 37°С в течение ночи не наблюдалось видимого роста бактерий.
Пример 30
В этом примере фракционированный препарат, описанный в Примере 3, был протестирован на скрининге раковых клеток.
Методы.
Клеточные линии человека на панели скрининга рака выращивали в среде RPMI 1640, содержащей 5% эмбриональной бычьей сыворотки и 2 мМ L-глютамина. Клетки инокулировали в 96-луночные планшеты для микротитрования в 100 мкл среды при плотностях посева от 5000 до 40000 клеток / лунку в зависимости от времени удвоения отдельных клеточных линий. После инокуляции клеток планшеты для микротитрования инкубировали при 37°С, 5% СО2, 95% воздуха и 100% относительной влажности в течение 24 часов перед добавлением примера 3.
Через 24 часа две чашки каждой клеточной линии фиксировали на месте с помощью TCA, чтобы представить контрольное измерение клеточной популяции для каждой клеточной линии во время добавления примера 3 (Tz). Пример 3 солюбилизировали в диметилсульфоксиде при 400-кратной желаемой конечной максимальной тестовой концентрации и хранили в замороженном виде перед использованием. Во время добавления аликвоту замороженного концентрата из примера 3 оттаивали и разбавляли до двукратной желаемой конечной максимальной тестовой концентрации полной средой, содержащей 50 мкг / мл гентамицина. Дополнительные четыре, 10-кратные или ½ логарифмические серийные разведения делаются для обеспечения в общей сложности пяти концентраций из Примера 3 плюс контроль. Аликвоты по 100 мкл различных разведений добавляли в соответствующие лунки для микротитрования, содержащие 100 мкл среды, что приводило к требуемым конечным концентрациям Примера 3 в каждом образце.
После добавления Примера 3 планшеты инкубировали в течение дополнительных 48 часов при 37°С, 5% СО2, 95% воздуха и 100% относительной влажности. Для прилипших клеток анализ был прекращен добавлением холодного TCA. Клетки фиксировали in situ путем осторожного добавления 50 мкл холодной 50% (мас. / об.) ТСА (конечная концентрация, 10% ТСА) и инкубировали в течение 60 минут при 4°С. Супернатант отбрасывали, а планшеты пять раз промывали водопроводной водой и высушивали на воздухе. Раствор сульфородамина B (SRB) (100 мкл) в количестве 0,4% (вес / объем) в 1% уксусной кислоте добавляли в каждую лунку и планшеты инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. После окрашивания несвязанный краситель удаляли пять раз, промывая 1% уксусной кислотой, и планшеты сушили на воздухе. Связанное пятно впоследствии растворяли с помощью 10 мМ основания тризма, и оптическую плотность считывали на автоматическом планшет-ридере при длине волны 515 нм. Для суспензионных клеток методология была такой же, за исключением того, что анализ прекращали путем фиксации осевших клеток на дне лунок путем осторожного добавления 50 мкл 80% ТСА (конечная концентрация, 16% ТСА). Используя семь измерений оптической плотности [время ноль, (Tz), контрольный рост (C) и тестовый рост в присутствии примера 3 при пяти уровнях концентрации (Ti)], процентный рост рассчитывали для каждого уровня концентраций примера 3, Процент ингибирования роста рассчитывали следующим образом:
[(Ti-Tz) / (C-Tz)] × 100 для концентраций, для которых Ti> / = Tz
[(Ti-Tz) / Tz] × 100 для концентраций, для которых Ti <Tz
Были рассчитаны три параметра доза-ответ. Ингибирование роста на 50% (GI50) рассчитывали из [(Ti-Tz) / (C-Tz)] × 100 = 50, что является концентрацией примера 3, приводящей к снижению чистого белка на 50% (как измерено с помощью SRB-окрашивания) в контрольных клетках во время инкубации препарата. Концентрация примера 3, приводящая к полному ингибированию роста (TGI), была рассчитана из Ti = Tz. LC50 (концентрация лекарственного средства, приводящая к снижению измеренного белка на 50% в конце лечения препаратом по сравнению с таковой в начале), указывающая чистую потерю клеток после обработки, рассчитывается из [(Ti-Tz) / Tz ] × 100 = -50. Значения рассчитываются для каждого из этих трех параметров, если достигнут уровень активности; однако, если эффект не достигнут или превышен, значение для этого параметра выражается как большее или меньшее, чем максимальная или минимальная протестированная концентрация.
Список линий раковых клеток человека, используемых при скрининге in vitro, показан в таблице 21. Линии клеток поддерживаются в NCI-Frederick.
Таблица 21. Линии клеток, протестированные в скрининге in vitro
Название клеточной линии
Название панели
Время удвоения
Плотность инокуляции
CCRF-CEM
Лейкемия
26,7
40000
HL-60(TB)
Лейкемия
28,6
40000
K-562
Лейкемия
19,6
5000
MOLT-4
Лейкемия
27,9
30000
RPMI-8226
Лейкемия
33,5
20000
SR
Лейкемия
28,7
20000
A549/ATCC
Немелкоклеточная карцинома лёгкого
22,9
7500
EKVX
Немелкоклеточная карцинома лёгкого
43,6
20000
HOP-62
Немелкоклеточная карцинома лёгкого
39
10000
HOP-92
Немелкоклеточная карцинома лёгкого
79,5
20000
NCI-H226
Немелкоклеточная карцинома лёгкого
61
20000
NCI-H23
Немелкоклеточная карцинома лёгкого
33,4
20000
NCI-H322M
Немелкоклеточная карцинома лёгкого
35,3
20000
NCI-H460
Немелкоклеточная карцинома лёгкого
17,8
7500
NCI-H522
Немелкоклеточная карцинома лёгкого
38,2
20000
COLO 205
Толстая кишка
23,8
15000
HCC-2998
Толстая кишка
31,5
15000
HCT-116
Толстая кишка
17,4
5000
HCT-15
Толстая кишка
20,6
10000
HT29
Толстая кишка
19,5
5000
KM12
Толстая кишка
23,7
15000
SW-620
Толстая кишка
20,4
10000
SF-268
ЦНС
33,1
15000
SF-295
ЦНС
29,5
10000
SF-539
ЦНС
35,4
15000
SNB-19*
ЦНС
34,6
15000
SNB-75
ЦНС
62,8
20000
U251*
ЦНС
23,8
7500
LOX IMVI
Меланома
20,5
7500
MALME-3M
Меланома
46,2
20000
M14
Меланома
26,3
15000
MDA-MB-435**
Меланома
25,8
15000
SK-MEL-2
Меланома
45,5
20000
SK-MEL-28
Меланома
35,1
10000
SK-MEL-5
Меланома
25,2
10000
UACC-257
Меланома
38,5
20000
UACC-62
Меланома
31,3
10000
IGR-OV1
Яичник
31
10000
OVCAR-3
Яичник
34,7
10000
OVCAR-4
Яичник
41,4
15000
OVCAR-5
Яичник
48,8
20000
OVCAR-8
Яичник
26,1
10000
NCI/ADR-RES
Яичник
34
15000
SK-OV-3
Яичник
48,7
20000
786-0
Почечный
22,4
10000
A498
Почечный
66,8
25000
ACHN
Почечный
27,5
10000
CAKI-1
Почечный
39
10000
RXF 393
Почечный
62,9
15000
SN12C
Почечный
29,5
15000
TK-10
Почечный
51,3
15000
UO-31
Почечный
41,7
15000
PC-3
Простаты
27,1
7500
DU-145
Простаты
32,3
10000
MCF7
Молочной железы
25,4
10000
MDA-MB-231/ATCC
Молочной железы
41,9
20000
MDA-MB-468
Молочной железы
62
2000
HS 578T
Молочной железы
53,8
20000
MDA-NNot Available
Молочной железы
22,5
15000
BT-549
Молочной железы
53,9
20000
T-47D
Молочной железы
45,5
20000
* Анализ массива однонуклеотидного полиморфизма (SNP) показал, что линии SNB-19 и U251 получены от одного и того же человека. (Garraway LA, et al. Интегративный геномный анализ идентифицирует MITF как онкоген линии выживания, усиливающийся при злокачественной меланоме. Nature. 2005 Jul 7; 436 (7047): 117-22).
** MDA-MB-435, член группы NCI-DTP из 60 линий опухолевых клеток человека, десятилетиями использовался в качестве модели метастатического рака молочной железы человека. Эта линия клеток была получена в MD Anderson в 1976 году от плеврального выпота от 31-летней женщины с раком молочной железы в анамнезе (Cailleau R, Olive M, Cruciger QV. Длительные клеточные линии рака молочной железы человека метастатического происхождения: предварительные характеристики. In vitro. 1978, ноябрь; 14 (11): 911-5; Бринкли Б.Р., Белл П.Т., Вибле Л.Дж., Мейс М.Л., Тернер Д.С., Кайло Р.М. Вариации клеточной формы и цитоскелета в клетках карциномы молочной железы человека in vitro. Cancer Res. 1980 Sep; 40 (9): 3118-29.
Результаты этого эксперимента показаны в таблице 22. Кривые доза-ответ для скрининга раковых клеток показаны на фиг. 2. Данные, смещенные в виде среднего графика, показаны на фиг. 3.
Таблица 22. Результаты скрининга раковых клеток.
Концентрация Log10
Время
Средняя оптическая плотность
Процентный рост
Панель/Клеточная линия
Zero
Ctrl
-8.0
-7.0
-6.0
-5.0
-4.0
-8.0
-7.0
-6.0
-5.0
-4.0
GI50
TGI
LC50
Лейкемия
CCRF-CEM
0.599
2.409
2.412
2.434
2.138
0.680
0.629
100
101
85
4
2
2.72E-6
>1.00E-4
>1.00E-4
HL-60(TB)
0.683
1.833
1.995
1.732
1.306
0.625
0.556
114
91
54
-8
-19
1.17E-6
7.32E-6
>1.00E-4
K-562
0.213
1.816
1.774
1.838
0.572
0.125
0.195
97
101
22
-42
-8
4.47E-7
2.24E-6
>1.00E-4
MOLT-4
0.644
1.779
1.773
1.857
1.728
0.491
0.620
99
107
95
-24
-4
2.40E-6
6.31E-6
>1.00E-4
RPMI-8226
0.706
2.261
2.304
2.095
1.004
0.499
0.661
103
89
19
-29
-6
3.63E-7
2.48E-6
>1.00E-4
SR
0.272
1.118
1.098
1.121
0.768
0.205
0.306
98
100
59
-25
4
1.27E-6
-
>1.00E-4
Немелкоклеточный рак легких
A549/ATCC
0.412
1.816
1.804
1.755
1.281
0.165
0.224
99
96
62
-60
-46
1.25E-6
3.22E-6
-
EKVX
0.731
1.964
1.994
1.884
1.682
0.181
0.614
102
94
77
-75
-16
1.51E-6
3.21E-6
-
HOP-62
0.504
1.597
1.569
1.533
1.093
0.152
0.334
97
94
54
-70
-34
1.07E-6
2.72E-6
-
HOP-92
1.035
1.620
1.630
1.608
1.424
0.891
0.784
102
98
66
-14
-24
1.60E-6
6.71E-6
>1.00E-4
NCI-H226
1.176
2.737
2.723
2.675
2.461
0.389
0.249
99
96
82
-67
-79
1.65E-6
3.56E-6
7.70E-6
NCI-H23
0.629
1.893
2.008
1.919
1.301
0.186
0.527
109
102
53
-70
-16
1.06E-6
2.69E-6
-
NCI-H322M
0.687
1.686
1.730
1.673
1.612
0.410
0.042
104
99
93
-40
-94
2.09E-6
4.97E-6
1.52E-5
NCI-H460
0.226
2.446
2.507
2.273
0.822
0.086
0.207
103
92
27
-62
-9
4.42E-7
2.01E-6
-
NCI-H522
0.845
2.309
2.354
2.390
2.102
0.448
0.921
103
106
86
-47
5
1.86E-6
-
>1.00E-4
Рак толстой кишки
COLO 205
0.460
1.543
1.506
1.467
0.800
0.115
0.114
97
93
31
-75
-75
4.98E-7
1.97E-6
5.82E-6
HCC-2998
0.726
2.445
2.457
2.447
1.627
0.186
0.453
101
100
52
-74
-38
1.04E-6
2.59E-6
-
HCT-116
0.228
1.831
1.764
1.783
0.877
0.102
0.191
96
97
40
-55
-16
6.79E-7
2.64E-6
-
HCT-15
0.289
1.908
1.943
1.850
1.349
0.080
0.173
102
96
65
-72
-40
1.30E-6
2.99E-6
-
HT29
0.206
1.422
1.486
1.427
0.601
0.046
0.081
105
100
32
-78
-61
5.52E-7
1.97E-6
5.59E-6
KM12
0.388
1.975
2.030
1.872
0.701
0.104
0.194
103
93
20
-73
-50
3.89E-7
1.63E-6
1.00E-4
SW-620
0.256
1.962
1.994
1.835
1.176
0.175
0.191
102
93
54
-32
-25
1.11E-6
4.25E-6
>1.00E-4
Рак ЦНС
SF-268
0.559
1.936
1.998
1.923
1.497
0.154
0.525
104
99
68
-73
-6
1.35E-6
3.05E-6
-
SF-295
0.657
2.074
2.092
1.950
1.237
0.056
0.307
101
91
41
-91
-53
6.59E-7
2.04E-6
4.86E-6
SF-539
1.010
2.830
2.890
2.752
2.520
0.191
0.562
103
96
83
-81
-44
1.59E-6
3.20E-6
-
SNB-19
0.508
1.715
1.706
1.586
1.250
0.162
0.396
99
89
62
-68
-22
1.23E-6
2.98E-6
-
SNB-75
0.738
1.560
1.592
1.520
1.532
0.074
0.505
104
95
97
-90
-32
1.78E-6
3.29E-6
-
U251
0.329
1.543
1.533
1.526
1.046
0.059
0.285
99
99
59
-82
-13
1.16E-6
2.62E-6
-
Меланома
LOX IMVI
0.232
1.092
1.087
1.072
0.765
0.068
0.039
99
98
62
-71
-83
1.23E-6
2.93E-6
6.98E-6
MALME-3M
0.656
1.129
1.182
1.159
0.915
0.195
0.525
111
106
55
-70
-20
1.09E-6
2.74E-6
-
M14
0.399
1.386
1.389
1.321
0.901
0.091
0.095
100
93
51
-77
-76
1.02E-6
2.49E-6
6.12E-6
MDA-MB-435
0.526
2.758
2.764
2.597
0.862
0.071
0.040
100
93
15
-87
-92
3.55E-7
1.41E-6
4.37E-6
SK-MEL-2
0.969
2.130
2.195
2.120
2.011
0.203
0.495
106
99
90
-79
-49
1.72E-6
3.40E-6
-
SK-MEL-28
0.611
1.703
1.725
1.651
0.868
0.090
0.428
102
95
24
-85
-30
4.28E-7
1.65E-6
-
SK-MEL-5
0.826
3.135
3.135
3.055
1.515
0.058
0.166
100
97
30
-93
-80
4.98E-7
1.75E-6
4.46E-6
UACC-257
1.210
2.249
2.237
2.247
2.034
0.293
0.777
99
100
79
-76
-36
1.55E-6
3.25E-6
-
UACC-62
0.835
2.769
2.762
2.712
1.634
0.292
0.810
100
97
41
-65
-3
6.98E-7
2.45E-6
-
Ovarian Cancer
IGROV1
0.618
1.877
1.970
1.868
1.314
0.282
0.647
107
99
55
-54
2
1.12E-6
-
-
OVCAR-3
0.278
1.015
1.044
0.971
0.956
0.079
0.200
104
94
92
-72
-28
1.80E-6
3.64E-6
-
OVCAR-4
0.645
1.504
1.511
1.388
1.388
0.498
0.592
101
87
86
-23
-8
2.16E-6
6.19E-6
>1.00E-4
OVCAR-5
0.716
1.865
1.875
1.757
1.755
0.588
0.22
101
91
90
-18
-69
2.36E-6
6.80E-6
4.18E-5
OVCAR-8
0.476
1.980
1.973
1.996
1.199
0.065
0.374
100
101
48
-86
-22
9.18E-7
2.28E-6
-
NCI/ADR-RES
0.486
1.685
1.672
1.708
1.298
0.150
0.377
99
102
68
-69
-22
1.35E-6
3.12E-6
-
SK-OV-3
1.057
2.145
2.153
2.079
2.118
0.302
0.460
101
94
98
-71
-56
1.91E-6
3.78E-6
7.47E-6
Renal Cancer
786-0
0.446
1.789
1.832
1.684
1.217
0.060
0.251
103
92
57
-87
-44
1.13E-6
2.50E-6
-
A498
1.471
2.313
2.301
2.270
2.196
0.221
0.219
99
95
86
-85
-85
1.63E-6
3.19E-6
6.24E-6
ACHN
0.394
1.754
1.777
1.661
1.150
0.098
0.170
102
93
56
-75
-57
1.10E-6
2.66E-6
6.41E-6
CAKI-1
0.669
2.227
2.235
2.075
1.637
0.204
0.388
100
90
62
-70
-42
1.24E-6
2.96E-6
-
RXF 393
0.621
1.266
1.246
1.252
1.143
0.038
0.509
97
98
81
-94
-18
1.50E-6
2.90E-6
-
SN12C
0.367
1.435
1.436
1.376
0.955
0.179
0.295
100
94
55
-51
-20
1.12E-6
3.29E-6
-
TK-10
0.855
2.088
2.154
2.111
1.567
0.527
0.313
105
102
58
-38
-63
1.20E-6
3.99E-6
2.92E-5
UO-31
0.627
1.739
1.719
1.738
1.392
0.338
0.532
98
100
69
-46
-15
1.46E-6
3.97E-6
>1.00E-4
Prostate Cancer
PC-3
0.470
1.297
1.314
1.235
1.201
0.225
0.262
102
92
88
-52
-44
1.88E-6
4.26E-6
-
DU-145
0.383
1.597
1.665
1.590
1.257
0.077
0.040
106
99
72
-80
-90
1.40E-6
2.98E-6
6.36E-6
Breast Cancer
MCF7
0.435
2.145
2.248
2.095
1.864
0.117
0.253
106
97
84
-73
-42
1.64E-6
3.41E-6
-
MDA-MB-231/ATCC
0.452
1.176
1.173
1.124
0.922
0.157
0.197
100
93
65
-65
-57
1.30E-6
3.15E-6
7.63E-6
HS 578T
0.805
1.702
1.724
1.670
1.566
0.620
1.032
102
96
85
-23
25
2.10E-6
-
>1.00E-4
BT-549
0.895
1.675
1.739
1.558
1.325
0.323
0.740
108
85
55
-64
-17
1.10E-6
2.90E-6
-
T-47D
0.754
1.519
1.537
1.481
1.163
0.334
0.488
102
95
53
-56
-35
1.08E-6
3.09E-6
-
MDA-MB-468
0.788
1.420
1.437
1.367
1.212
0.360
0.377
103
92
67
-54
-52
1.38E-6
3.57E-6
9.20E-6
* Единицы плотности указаны в мкг / мл.