Способ количественного определения глифосата и N-(фосфонометил)-иминодиуксусной кислоты
METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF GLYPHOSATE N-(PHOSPHONOMETHYL)-IMINODIACETIC ACID

Изобретение относится к аналитической химии, конкретно, к газовой хроматографии, и может быть использовано для количественного определения ингредиентов реакционной смеси, образующейся при каталитическом окислении N-(фосфонометил)иминодиуксусной кислоты (ФИДУК) пероксидом водорода или кислорода с образованием N-(фосфонометил)глицина (глифосата). N-(фосфонометил)глицин - пестицид, арборицид, гербицид с широким спектром активности. Глифосат является действующим началом препаратов, применяющихся для борьбы с сорняками, в том числе в России (раундап, торнадо, утал, форсат, фосулен, цидокор, глиалка, глисол, глитан, глифонин, глицел, интосорг, нитосорг).
В литературе описаны способы анализа глифосата, а также продуктов его биоразложения, основанные на различных физико-химических методах [Кузнецова Е.М., Гринько А.П., Чмиль В.Д. Методы определения глифосата в сельскохозяйственном и продовольственном сырье и продуктах питания // Проблеми харчування. 2008. V. 3-4. P. 55; Arkan T., Molnár-Perl I. The role of derivatization techniques in the analysis of glyphosate and aminomethyl-phosphonic acid by chromatography // Microchem. J. Elsevier B.V. 2015. V. 121. P. 99].
Наиболее простые способы качественного определения глифосата в смеси с продуктами его разложения основаны на методе тонкослойной хроматографии (ТСХ), где для визуализации результата разделения смеси используют или реакцию первичных и вторичных аминогрупп с нингидрином [Зеленкова Н.Ф., Винокурова Н.Г. Определение глифосата и продуктов его биодеградации хроматографическими методами. Журн. Аналит.Химии, 2008. Т. 63, №9, С.958], или дериватизацию с образованием нитрозопроизводных [Young J.C., Khan S.U., Marriage P.B. Fluorescence detection and determination of glyphosate via its N-nitroso derivative by thin-layer chromatography // J. Agric. Food Chem. 1977. V. 25, №4. P. 918]. При этом метод ТСХ можно также использовать для количественного анализа глифосата и его основного продукта разложения - N-аминометилфосфоновой кислоты (АМФК) [Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде: Справочник. - Т.2 / Сост.Клисенко М.А., Калинина А.А., Новикова К.Ф., Хохолькова Г.А. - М.: Агропромиздат, 1992. - 416 с]. Однако способы количественного определения методом ТСХ глифосата и ФИДУК при их совместном присутствии в смеси не описаны в технической литературе.
Известен способ анализа реакционных смесей, получающихся при каталитическом окислении ФИДУК, основанный на методе ИК-спектрометрии [Ющенко Д.Ю., Малышева Л.В., Баранова С.С., Хлебникова Т.Б., Пай З.П. Определение глифосата в продуктах окисления N-фосфонометилиминодиуксусной кислоты методом ИК-спектрометрии. Журн. Аналит.Химии, 2013. Т. 68, №11, С.1075], но этот подход дает только полуколичественную оценку содержания компонентов (определение мольного соотношения аналитов).
Описан способ анализа глифосата, основанный на методе ЯМР-спектроскопии [Cartigny B., Azaroual N., Imbenotte M., Mathieu D., Vermeersch G., Goullé J.., Lhermitte M. Determination of glyphosate in biological fluids by 1H and 31P NMR spectroscopy // Forensic Sci. Int. 2004. V. 143, №2-3. P. 141]. Существенными недостатками этого способа являются необходимость использования сложного оборудования (ЯМР-спектрометр) и высокие требования к квалификации обслуживающего персонала.
Известен способ количественного анализа глифосата в смеси с близким по строению природным гербицидом - глюфосинатом (RS-2-амино-4-гидроксиметилфосфоноилбутановая кислота) - и продуктами их разложения с использованием методов капиллярного электрофореза, где определение фосфоновых кислот после разделения смесей выполняют с использованием масс-спектрометрического детектора [Goodwin L., Startin J.R., Keely B.J., Goodall D.M. Analysis of glyphosate and glufosinate by capillary electrophoresis-mass spectrometry utilising a sheathless microelectrospray interface // J. Chromatogr. A. 2003. V. 1004, №1-2. P. 107]. Однако подобных подходов к количественному определению глифосата в смеси с ФИДУК в литературе также не описано.
Вследствие низкой летучести аминофосфоновых кислот способы количественного определения глифосата и продуктов его разложения методом газовой хроматографии (ГХ) с использованием пламенно-ионизационного детектора или детектора по теплопроводности без модификации аналитов не имеют практической значимости и не описаны в технической литературе. Существующие способы анализа аминофосфоновых кислот предполагают предваряющую анализ модификацию (дериватизацию) данных соединений с получением летучих производных (дериватов). Для решения этой задачи описаны системы реагентов: трифторэтанол / трифторуксусный ангидрид [Deyrup C.L., Chang S.M., Weintraub R.A., Moye H.A. Simultaneous esterification and acylation of pesticides for analysis by gas chromatography. 1. Derivatization of glyphosate and (aminomethyl)phosphonic acid with fluorinated alcohols-perfluorinated anhydrides // J. Agric. Food Chem. 1985. V. 33, №5. P. 944]; изобутиловый эфир муравьиной кислоты / диазометан [Kataoka H., Sakiyama N., Makita M. Gas chromatographic analysis of aminoalkylphosphonic acids and aminoalkyl phosphates // J. Chromatogr. A. 1988. V. 436, P. 67]; N-изобутоксикарбонил в щелочной среде [Kataoka H., Horii K., Makita M. Determination of The Herbicide Glyphosate and Its Metabolite (Aminomethyl)phosphonic Acid by Gas Chromatography with Flame Photometric Detection // Agric. Biol. Chem. 1991. V. 55, №1. P. 195]; N-метил-N-триметилсилилтрифторацетамид [Arkan T., Csámpai A., Molnár-Perl I. Alkylsilyl derivatization of glyphosate and aminomethylphosphonic acid followed by gas chromatography mass spectrometry // Microchem. J. 2016. V. 125. P. 219] и ряд других систем. Тем не менее, способов газохроматографического анализа смесей глифосата и ФИДУК в литературе также не описано.
Известны способы количественного анализа смесей глифосата с его метаболитами, основанные на методе высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). При этом в качестве элюента, как правило, используют фосфатные буферные растворы. Прямое детектирование аналитов осуществляют с использованием фотометрических детекторов при длине волны 195 нм [Moye H.A., Boning A.J. A Versatile Fluorogenic Labelling Reagent for Primary and Secondary Amines: 9-Fluorenylmethyl Chloroformate // Anal. Lett. 1979. V. 12, №1. P. 25]. Недостатком этого способа детектирования является его низкая чувствительность. Повышение чувствительности анализа возможно путем проведения предколоночной или постколоночной дериватизации аналитов с целью введения в молекулы фосфоновых кислот хромофорных групп, обладающих высокими значениями коэффициентов экстинкции в области УФ-излучения. Для предколоночной дериватизации используют такие реагенты, как 9-(фторметил)хлорформиат [Moye H.A., Boning A.J. A Versatile Fluorogenic Labelling Reagent for Primary and Secondary Amines: 9-Fluorenylmethyl Chloroformate // Anal. Lett. 1979. V. 12, №1. P. 25], 5-диметиламинонафталин-1-сульфонилхлорид [Зеленкова Н.Ф., Винокурова Н.Г., Леонтьевский А.А. Определение аминсодержащих фосфоновых кислот и аминокислот в виде дансильных производных хроматографическими методами. Журн. Аналит.Химии, 2010. Т. 65, №11, С.1169]. Постколоночную дериватизацию выполняют с использованием системы орто-фталевый альдегид / меркаптоэтанол, при этом полученные производные определяют флуориметрическим детектором (λвозбуждения=320 - 340 нм, λэмиссии=340 - 380 нм) [Winfield T.W. Determination of glyphosate in drinking water by direct aqueous injection HPLC, postcolumn derivatization, and fluorescence detection / T. W. Winfield // EPA. - Method 547, 1990. - 16 p]. Использование масс-спектрометрических детекторов позволяет выполнять анализ с высокой степенью чувствительности без дериватизации аналитов. [Nagatomi Y., Yoshioka T., Yanagisawa M., Uyama A., Mochizuki N. Simultaneous LC-MS/MS Analysis of Glyphosate, Glufosinate, and Their Metabolic Products in Beer, Barley Tea, and Their Ingredients // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2013. V. 77, №11. P. 2218].
Таким образом, значительное количество представленных в литературе методов количественного анализа глифосатсодержащих смесей основано на принципе их хроматографического разделения. Однако хроматографические методы анализа с пред- или пост-колоночной дериватизацией аналитов описаны только для количественного определения глифосата в смеси с продуктами его биоразложения.
Известные способы количественного определения глифосата и ФИДУК в продуктах реакции окисления ФИДУК основаны на методе ВЭЖХ с прямым фотометрическим определением аналитов при длине волны 190 - 200 нм [Pinel C., Landrivon E., Lini H., Gallezot P. Effect of the Nature of Carbon Catalysts on Glyphosate Synthesis // J. Catal. 1999. V. 182, №2. P. 515-519, Riley D.P., Fields D.L., Rivers W. Homogeneous catalysts for selective molecular oxygen driven oxidative decarboxylations // J. Am. Chem. Soc. 1991. V. 113, №9. P. 3371, Riley D.P., Fields D.L. Electron transfer agents in metal-catalyzed dioxygen oxidations: effective catalysts for the interception and oxidation of carbon radicals // J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114, №5. P. 1881].
Одним из недостатков этого метода является его низкая чувствительность, обусловленная тем, что значения коэффициентов молярной экстинкции аналитов относительно невысоки, т.к. в их молекулах присутствует только одна хромофорная функциональная группа - карбонильная. Вследствие этого максимумы поглощения исследуемых соединений, регистрируемые в диапазоне длин волн 200-800 нм, выражены нечетко, что приводит к значительной погрешности анализа. Использование метода ВЭЖХ для анализа продуктов реакции окисления ФИДУК также обладает рядом недостатков, к которым относятся сравнительно дорогостоящее и сложное оборудование, расходные материалы и реактивы, что осложняет количественный анализ глифосата и ФИДУК при совместном присутствии, особенно в условиях промышленного производства.
В этой связи использование метода газохроматографического анализа для решения задачи количественного определения глифосата и ФИДУК представляется практически значимым.
N,O
Наиболее близким к предлагаемому решению является способ количественного определения глифосата в смеси с основным продуктом его биоразложения - АМФК - методом ГХ [Ngim K.K., Green J., Cuzzi J., Ocampo M., Gu Z. Optimized Derivatization Procedure for Characterizing (Aminomethyl)phosphonic Acid Impurities by GC-MS // J. Chromatogr. Sci. 2011. V. 49, №1. P. 8], Перед ГХ-анализом проводят предколоночную дериватизацию аналитов, а именно, их силилирование с получением летучих силильных производных. В качестве дериватизирующих реагентов используются -бис-(триметилсилил)трифторацетамид (БСТФА) и триметилхлорсилан [Catrinck T.C.P.G., Aguiar M.C.S., Dias A., Silvério F.O., Fidêncio P.H., de Pinho G.P. Study of the Reaction Derivatization Glyphosate and Aminomethylphosphonic Acid (AMPA) with N,O-Bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide // Am. J. Anal. Chem. 2013. V. 2013, №4. P. 647].
К недостаткам прототипа можно отнести то, что описанный в нем способ предколоночной дериватизации глифосата в смеси с АМФК (основным продуктом его биоразложения) не применим для смесей глифосата с другими веществами (ФИДУК и пимелиновая кислота), так как не приводит к количественному силилированию всех компонентов. Другим недостатком прототипа является анализ полученных силильных производных с использованием газового хроматографа с масс-спектрометрическим детектором - относительно дорогого оборудования, требующего квалифицированного обслуживания.
Отличительным признаком предлагаемого технического решения являетсяопределение количественного содержания глифосата и ФИДУК при их совместном присутствии методом ГХ с использованием пламенно-ионизационного детектора, для чего выполняется предколоночная пробоподготовка, которая заключается в добавлении к анализируемому образцу внутреннего стандарта (пимелиновой кислоты или ее гомологов) и дериватизации полученной смеси с образованием летучих силильных производных аналитов.
Предлагаемое решение основано на получении летучих силильных производных глифосата и ФИДУК с использованием в качестве силилирующего агента БСТФА в среде растворителя пиридина и затем определение методом ГХ количественного содержания аналитов относительно внутреннего стандарта - силильного производного пимелиновой кислоты (ПК) или ее гомолога. В качестве внутреннего стандарта выбирают ПК или один из ее гомологов, которые отсутствует в испытуемой пробе, не взаимодействуют с определяемыми веществами и другими веществами пробы, полностью отделяются от веществ пробы и не содержат примеси с временами удерживания, совпадающими с временами удерживания определяемых веществ.
Изобретение решает задачу разработки эффективного способа количественного анализа глифосата и ФИДУК с использованием их силильных производных.
Технический результат - выполнение количественного анализа силильных производных глифосата и ФИДУК в присутствии внутреннего стандарта (силильного производного ПК или ее гомолога) методом ГХ с удовлетворительной точностью с получением воспроизводимых результатов.
Другими преимуществами предлагаемого способа являются:
- использование простого и доступного оборудования для проведения анализа;
- сокращение времени непосредственного анализа в сравнении с описанными методами жидкостной хроматографии для решения поставленной задачи.
Задача анализа глифосата и ФИДУК при их совместном присутствии в интервалах концентраций 5-98 мас.% каждого из компонентов решается методом газохроматографического анализа в присутствии внутреннего стандарта с предварительным получением соответствующих силильных производных указанных компонентов и внутреннего стандарта, то есть последовательным осуществлением предколоночной подготовки смеси глифосата и ФИДУК, введением внутреннего стандарта, дериватизацией аналитов, газохроматографическим анализом полученных летучих производных.
Описание предлагаемого технического решения.
31
Предколоночную подготовку смеси осуществляют способом модифицирования (дериватизации) глифосата, ФИДУК и внутреннего стандарта (ПК или ее гомолога) силилирующим агентом БСТФА в среде растворителя пиридина. Навески глифосата, ФИДУК, внутреннего стандарта (ПК или ее гомолога) общей массой 1.0-5.0 мг помещают в виалу, добавляют 20-100 мкл пиридина и 30-150 мкл БСТФА. Дериватизацию проводят при температуре 50-90°С в течение 30-60 мин. В этих условиях силилирование ПК или ее гомолога (внутреннего стандарта) протекает количественно с образованием единственного продукта - бис-силилированной ПК или ее гомолога. Силилирование ФИДУК и глифосата также протекает количественно, что подтверждается отсутствием характерных сигналов в спектрах ЯМР Р для исходных веществ [Ющенко Д.Ю., Малышева Л.В., Баранова С.С., Хлебникова Т.Б., Пай З.П. Определение глифосата в продуктах окисления N-фосфонометилиминодиуксусной кислоты методом ИК-спектрометрии // Журн. Аналит.Хим. 2013. Т. 68, №11. С.1075]. При силилировании ФИДУК образуется единственный продукт (ФИДУК-4ТМС), содержащий четыре триметилсилильные группы (ТМС). При силилировании глифосата в зависимости от времени проведения реакции возможно образование продуктов присоединения как 3-х, так и 4-х силильных групп, с образованием глифосат-3ТМС и глифосат-4ТМС, соответственно, коэффициенты чувствительности которых идентичны как при анализе с использованием пламенно-ионизационного детектора, так и детектора по теплопроводности. Строение всех образующихся силильных производных подтверждено методом ГХ-масс-спектрометрии и приведено на схеме:
ФИДУК-4ТМС  глифосат-3ТМС   глифосат-4ТМС
Задача количественного анализа глифосата и ФИДУК решается способом газохроматографического анализа силильных производных глифосата и ФИДУК относительно силильного производного внутреннего стандарта (ПК или ее гомолога) на кварцевой капиллярной колонке длиной 10-60 м и диаметром 0.25-0.54 мм с неполярной неподвижной фазой в следующих условиях хроматографирования: программированный нагрев от 80 до 280°С, температура испарителя 290°С, температура детектора 280°С, объем вводимой пробы - 1 мкл. Хроматограмма смеси силильных производных глифосата, ФИДУК и ПК (внутреннего стандарта), записанная в этих условиях, представлена на рисунке (Фиг.), где знаком «х» помечены не идентифицированные примеси. Величины времен удерживания компонентов анализируемой смеси представлены в таблице 1.
Таблица 1. Времена удерживания определяемых компонентов
№п/п
Компоненты
Время удерживания (t), мин
1
Силильное производное ПК
13.9
2
Глифосат-3ТМС
16.1
3
Глифосат-4ТМС
16.6
4
ФИДУК-4ТМС
19.2
5
Не идентифицированные примеси (х)
5.7; 14.8; 17.6
Метод внутреннего стандарта заключается в том, что к навеске анализируемого вещества добавляют известное количество внутреннего стандарта - постороннего соединения, дающего на хроматограмме хорошо разрешенный пик.
X
i
Массовую долю силильных производных глифосата и ФИДУК () в процентах вычисляют по формуле:
,
S
,
S
i
st
где  - площади пиков силильных производных глифосата, либо ФИДУК, либо внутреннего стандарта (ПК или ее гомолога);
K
,
К
i
st
-поправочные коэффициенты чувствительности силильных производных глифосата, либо ФИДУК, либо внутреннего стандарта (ПК или ее гомолога);
R
2
1.
- отношение массы силильной производной внутреннего стандарта (ПК или ее гомолога) m к массе силильных производных анализируемой пробы m
Расчет массовой доли глифосата в определяемой пробе проводят исходя из суммы площадей пиков силильных производных глифосат-3ТМС и глифосат-4ТМС.
r
Апробацию предложенного способа выполняют на образце, содержащем глифосат и ФИДУК, результаты среднеквадратичного отклонения повторяемости σ (%) содержания силильных производных глифосата и ФИДУК в присутствии внутреннего стандарта (ПК) для 5-ти параллельных измерений при доверительной вероятности 0.95 представлены в таблице 2.
Оценку точности и воспроизводимости предлагаемого способа выполняют по методу «введено-найдено» для серии модельных образцов, приготовленных таким образом, что они содержат одновременно ФИДУК, глифосат, а также возможные побочные продукты, образующиеся при реализации промышленных процессов получения глифосата [Tian J., Shi H., Li X., Yin Y., Chen L. Coupling mass balance analysis and multi-criteria ranking to assess the commercial-scale synthetic alternatives: a case study on glyphosate // Green Chemistry. 2012. T. 14, №7. C. 1990 doi 10.1039/c2gc35349k].
=
0.95, 3
=
Модельные образцы для примеров 1-8 готовят следующим образом. Точно измеренные количества стандартных водных растворов ФИДУК (6.500 г/л), глифосата (8.450 г/л) и примесей (10.00 г/л) смешивают с получением рабочих растворов с содержанием компонентов, соответствующим примерам, приведенным в Таблице 3. В качестве примесей используют муравьиную и ортофосфорную кислоты в соотношении 1:1. Точно измеренное количество рабочего раствора, содержащее ФИДУК, глифосат и примеси в суммарном количестве 0.5 мг, 1.5 мг и 2.5 мг помещают в виалу, упаривают воду при 60°C, добавляют равное по массе количество ПК. К образцам массой 1 мг, 3 мг и 5 мг добавляют 20 мл, 50 мл или 100 мкл пиридина и 30 мкл, 100 мкл и 150 мкл БСТФА соответственно. Образцы выдерживают при температуре 50-90°С в течение 30-60 мин, затем 5-10 мин при комнатной температуре и анализируют.Измерения проводят на хроматографе с пламенно-ионизационным детектором в описанных выше условиях. Полученные результаты оценки точности и воспроизводимости предлагаемого способа определения глифосата и ФИДУК приведены в таблице 3, количество измерений в каждой точке n=3, доверительный интервал P0.95, коэффициент Стьюдента t4.3.
r
Таблица 2. Среднеквадратичное отклонение повторяемости σ (%) содержания силильных производных глифосата и ФИДУК в присутствии внутреннего стандарта (ПК) для 5-ти параллельных измерений при доверительной вероятности 0.95.
Компоненты
Xi, %
σ<sub>r</sub>, %
Глифосат-3TMS
19.03
2.32
18.26
18.52
18.88
19.38
Глифосат-4TMS
20.63
2.54
20.18
19.76
19.64
19.33
ФИДУК-4TMS
28.13
2.80
28.77
29.15
26.84
27.15
Таблица 3. Результаты оценки точности и воспроизводимости предлагаемого способа определения глифосата и ФИДУК.
№примера
Введено
Масса образца с ПК, мг
Найдено, мас.%
Глифосат, мас.%
ФИДУК, мас.%
Примеси, мас.%
Суммарная масса, мг
С<sub>глифосат</sub>, σ<sub>r</sub>
С<sub>ФИДУК</sub>, σ
1
98.0
1.0
1.0
0.5
1
98.1±0.5, 0.2
-
1.5
3
97.9±0.6, 0.2
-
2.5
5
98.2±0.5, 0.2
-
2
90.0
5.0
5.0
0.5
1
90.9±0.5, 0.2
4.7±0.5, 0.9
1.5
3
91.2±0.5, 0.2
5.0±0.5, 0.7
2.5
5
89.7±0.4, 0.2
4.8±0.4, 0.9
3
80.0
10.0
10.0
0.5
1
79.6±0.5, 0.2
10±0.9, 0.5
1.5
3
80.1±0.5, 0.2
9.95±1.0, 0.5
2.5
5
79.8±0.6, 0.2
9.97±0.8, 0.5
4
70.0
20.0
10.0
0.5
1
70.2±0.7, 0.3
19.8±0.7, 0.2
1.5
3
69.9±0.8, 0.3
20.1±0.6, 0.2
2.5
5
69.7±0.9, 0.3
19.7±0.8, 0.2
5
20.0
70.0
10.0
0.5
1
19.8±0.5, 0.2
69.7±0.4, 0.2
1.5
3
19.7±0.6, 0.2
69.8±0.5, 0.2
2.5
5
20.2±0.6, 0.2
70.6±0.4, 0.2
6
10.0
80.0
10.0
0.5
1
10.0±0.6, 0.2
79.9±0.4, 0.2
1.5
3
9.8±0.6, 0.2
79.8±0.4, 0.2
2.5
5
9.9±0.5, 0.2
80.5±0.5, 0.2
7
5.0
90.0
5.0
0.5
1
4.9±0.3, 0.1
89.6±0.6, 0.3
1.5
3
4.7±0.2, 0.1
90.2±0.5, 0.3
2.5
5
5.0±0.2, 0.1
90.0±0.7, 0.3
8
1.0
98.0
1.0
0.5
1
-
98.3±0.3, 0.8
1.5
3
-
98.1±0.4, 0.8
2.5
5
-
97.9±0.3, 0.8
Таким образом, экспериментальным путем показано, что указанный технический результат обеспечивается именно совокупностью предложенных признаков, а именно складывается из следующих составляющих:
1. Проводят газохроматографический анализ с использованием пламенно-ионизационного детектора специально полученных летучих производных глифосата и ФИДУК.
2. Перед газохроматографическим анализом проводят предколоночную пробоподготовку: сначала вводят внутренний стандарт (пимелиновую кислоту или ее гомологи) в смесь глифосата и ФИДУК; затем проводят силилирование глифосата, ФИДУК и внутреннего стандарта (пимелиновой кислоты или ее гомологов) с получением летучих производных.
3. Проводят количественное определение методом ГХ дериватов глифосата, ФИДУК и внутреннего стандарта.
Как видно из данных, приведенных в таблицах 2 и 3,предлагаемый способ количественного анализа глифосата и ФИДУК позволяет решать поставленную задачу с удовлетворительной точностью с получением воспроизводимых результатов. Выполненные в лабораторных условиях эксперименты подтверждают существенность признаков, положенных в основу предлагаемого способа.