ПИТАТЕЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ГРУДНЫХ ДЕТЕЙ, РОЖДЕННЫХ С ПРОВЕДЕНИЕМ КЕСАРЕВА СЕЧЕНИЯ
NUTRITIONAL COMPOSITION FOR BABIES BORN BY CESAREAN SECTION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к способам вскармливания грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, и композициям, вводимым грудным детям, рожденным с проведением кесарева сечения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Перед рождением ребенка его желудочно-кишечный тракт в норме стерилен. Во время родов через естественные родовые пути желудочно-кишечный тракт ребенка инокулируется вагинальными и/или фекальными бактериями матери, в результате чего происходит колонизация желудочно-кишечного тракта грудного ребенка бактериями, происходящими от матери. Материнская здоровая кишечная микробиота оказывает многочисленные положительные воздействия на грудного ребенка, такие как снижение частоты возникновения инфекций и усиление иммунитета.
У грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, колонизация кишечными бактериями отложена и происходит колонизация бактериями, присутствующими в больничной среде, что приводит в результате к развитию отличающейся, менее оптимальной кишечной микробиоты. В Grönlund et al., 1999, JPGN 28:19-25 описывается, что в этом состоит отличие кишечной флоры после рождения с проведением кесарева сечения по сравнению с грудными детьми, рожденными через естественные родовые пути. Кишечная микробиота грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, включает меньше бактерий, меньше полезных бактерий и меньше видов полезных бактерий по сравнению с кишечной микробиотой грудных детей, рожденных через естественные родовые пути. В частности, профиль и содержание бактерий, продуцирующих молочную кислоту, таких как виды Bifidobacterium микробиоты грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, отличается от профиля и содержания в кишечнике видов Bifidobacterium грудных детей, рожденных через естественные родовые пути. Эти отличия в микробиоте продолжают существовать в детстве.
Смеси для питания грудных детей в норме созданы для имитации развития кишечной микробиоты у грудного ребенка, получающего грудное молоко, с условием, согласно которому грудные дети реагируют аналогично на грудное молоко и смесь для питания грудных детей. Однако в субпопуляциях грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, реакция отличается, поскольку колонизация отложена и менее оптимальна.
В EP 1776877 описывается применение по меньшей мере двух различных микроорганизмов или по меньшей мере одного микроорганизма и по меньшей мере одного неусвояемого олигосахарида или по меньшей мере двух различных видов Bifidobacterium, подвидов или штаммов для получения композиции для энтерального введения грудному ребенку, рожденному с проведением кесарева сечения. Эти бактерии являются живыми бактериями.
В WO 20070046698 описывается применение композиции, включающей неусвояемые олигосахариды, для получения композиции для энтерального введения грудному ребенку, рожденному с проведением кесарева сечения. Необязательно присутствуют молочнокислые бактерии.
Natren производит пробиотический продукт Life Start, который разработан специально для грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения. Life Start включает живые Bifidobacterium infantis.
Heyman et al., 2005, Acta Paediatrica 94:34-36 описывают применение не живых микроорганизмов в ферментированной смеси для питания грудных детей, предназначенной для здоровых грудных детей с положительным воздействием на функцию желудочно-кишечного тракта.
В US 2006/018890 описывается применение для лечения респираторной инфекции и острого среднего отита у грудных детей введением бифидобактерий и адгезией усиленного штамма. Предпочтительными являются живые бактерии, и экспериментальные данные показывают, что предпочтительны живые Bifidobacterium lactis и Lactobacillus GG.
В EP 1364586 описывается применение Lactobacillus paracasei и Bifidobacterium lactis для усиления оральной толерантности. Необязательно бактерии инактивируют. Необязательно эти бактерии добавляют в ферментированные продукты, за исключением смеси для питания грудных детей.
В Kirjavainen et al., 2003, JPGN 36:223-227 описывается применение жизнеспособных, а не инактивированных нагреванием LGG, являющееся возможным решением проблемы атопического дерматита и аллергии на коровье молоко. Тестируемые продукты представляют собой не ферментированные композиции.
В EP 1597978 описывается синергетическое воздействие полифруктозы и галактоолигосахаридов, ферментированных фекалиями новорожденных.
В US 2006/0233773 описывается применение Lactobacillus GG для профилактики или снижения развития респираторных аллергий. Эти бактерии являются живыми.
В Mcvay et al., 2008, J Pediatr Surg 43:25-29 описывается, что смесь для питания грудных детей с живыми пробиотическими бактериями превосходит смеси с химическим подкислением, смесь для питания грудных детей, ферментированная Lactococcis lactis, и контрольная смесь для питания грудных детей для снижения бактериальной колонизации легких и желудочно-кишечного тракта. Смесь тестируют на детенышах кроликов, рожденных с проведением кесарева сечения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Эксперименты на животных показывают, что уже в течение двух часов после рождения желудочно-кишечный тракт детеныша, рожденного через естественные родовые пути, демонстрирует иммунный ответ на бактерии, в то время как у детенышей, рожденных с проведением кесарева сечения, такого быстрого иммунного ответа не наблюдается. Этот ответ инициирован иммуногенными факторами против бактерий и указывает на индукцию толерантности к этим бактериям, что позволяет быструю колонизацию кишечника. Считается, что этот быстрый иммунный ответ очень важен для здорового развития грудного ребенка. Следовательно, особенно желательно иметь аналогичное воздействие у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, в частности, индукцию толерантности и быструю колонизацию кишечника бактериями.
Авторы обнаружили, что раннее воздействие на желудочно-кишечный тракт новорожденных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, молочных продуктов, ферментированных бактериями, продуцирующими молочную кислоту, индуцирует кишечную толерантность к этим бактериям аналогично детям, рожденным через естественные родовые пути, позволяя быструю колонизацию кишечника, как у детей, рожденных через естественные родовые пути.
Однако воздействия индуцирующего толерантность только ферментированного молока недостаточно для достаточной колонизации кишечника. Следовательно, очень важно, чтобы композиция по настоящему изобретению включала смесь олигосахаридов, эффективно улучшающих колонизацию кишечника бактериями, продуцирующими молочную кислоту.
Поскольку кишечная микробиота играет очень важную роль в развитии грудного ребенка, в частности в стимуляции иммунной системы, подверженности атопическим заболеваниям и устойчивости к инфекциям, это крайне важно для стимуляции быстрого и здорового развития кишечной микробиоты у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения.
Грудные дети, рожденные с проведением кесарева сечения, оказываются в больничной среде, что вызывает риск патогенных инфекций и/или диареи, вызываемой госпитальными инфекциями. Дополнительно, задержка развития здоровой кишечной микробиоты в результате ведет к более быстрой колонизации патогенными бактериями по сравнению с ситуацией, когда желудочно-кишечный тракт грудных детей инокулирован материнскими бактериями. В частности, настоящее изобретение относится к композиции, снижающей частоту и тяжесть инфекций и/или диареи у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, включая толерантность кишечника грудного ребенка к полезным бактериям, стимуляцию роста полезных бактерий, предпочтительно продуцирующих молочную кислоту, и/или снижение роста вредных бактерий. Следовательно, композиция по настоящему изобретению преимущественно может быть использована для лечения и/или профилактики инфекций у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения.
Грудные дети, рожденные с проведением кесарева сечения, имеют риск развития атопических заболеваний, таких как пищевая аллергия, астма, атопические дерматиты и/или аллергические риниты. В частности, настоящее изобретение относится к композиции, снижающей частоту и тяжесть атопических заболеваний, таких как атопическая экзема (или атопические дерматиты), аллергии и/или астмы у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, улучшая колонизацию кишечника полезными бактериями. Следовательно, настоящее изобретение преимущественно может быть использовано для лечения и/или профилактики аллергий у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения.
Молочный продукт, ферментированный бактериями, продуцирующими молочную кислоту, включает фрагменты бактерий, продуцирующих молочную кислоту, и/или продукты, выделяемые бактериями, продуцирующими молочную кислоту, такие как гликопротеины, гликолипиды, пептидогликаны, липотейховая кислота (LTA), жгутики, липопротеины, капсульные полисахариды и/или ДНК. Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения считают, что эти иммуногенные молекулы индуцируют толерантность желудочно-кишечного тракта к колонизации бактериями, продуцирующими молочную кислоту. Индуцирование толерантности к бактериям, продуцирующим молочную кислоту, в желудочно-кишечном тракте в результате приводит к более быстрой колонизации желательными бактериями, при этом, с другой стороны, отсутствие живых клеток в продукте в результате проводит к повышенной безопасности и продукту с улучшенными технологическими свойствами. Преимущество, связанное с безопасностью, является очень важным в случае грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, которые более чувствительны к инфекциям.
Композиция включает по меньшей мере два неусвояемых олигосахарида. Присутствие неусвояемых олигосахаридов стимулирует рост бактерий, продуцирующих молочную кислоту, таких как лактобактерии и/или бифидобактерии, снижает рост вредных бактерий в желудочно-кишечном тракте и/или напрямую преимущественно стимулирует иммунную систему. В результате это приводит к большей колонизации полезными бактериями. Следовательно, присутствие двух неусвояемых олигосахаридов и молочного продукта, полученного ферментацией бактериями, продуцирующими молочную кислоту, действует синергически и преимущественно приводит в результате, как к более быстрой, так и большей колонизации бактериями, продуцирующими молочную кислоту, такими как лактобактерии и/или бифидобактерии.
Присутствие по меньшей мере двух различных неусвояемых олигосахаридов в результате приводит к микробиоте, которая более разнообразна в отношении различных видов бактерий, продуцирующих молочную кислоту, как у грудных детей, рожденных через естественные родовые пути Присутствие по меньшей мере двух различных неусвояемых олигосахаридов и молочного продукта, полученного ферментацией бактериями, продуцирующими молочную кислоту, действуют синергически и в результате преимущественно приводит, как к более быстрой и более полной, так и к более разнообразной колонизации бактериями, продуцирующими молочную кислоту, в частности, лактобактериями и/или бифидобактериями.
Обнаружено, что композиция, включающая по меньшей мере два различных неусвояемых олигосахарида и молочный продукт, полученный ферментацией бактериями, продуцирующими молочную кислоту, оказывает синергическое воздействие на иммунный ответ при тестировании на двух животных моделях: вакцинированной модели и аллергической модели.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу получения питания для грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, включающему введение указанному грудному ребенку питательной композиции, включающей:
a. молочный продукт, где указанный молочный продукт является молочным субстратом, ферментируемым бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и указанный молочный субстрат включает по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из молока, сыворотки, сывороточного белка, гидролизата сывороточного белка, казеина, гидролизата казеина и/или лактозы,
3
b. менее чем 10 КОЕ бактерий, продуцирующих молочную кислоту, на г массы сухого вещества композиции, и
c. по меньшей мере два неусвояемых олигосахарида, выбранных из группы, состоящей из фруктоолигосахаридов, галактоолигосахаридов, глюкоолигосахаридов, арабиноолигосахаридов, маннанолигосахаридов, ксилоолигосахаридов, фукоолигосахаридов, арабиногалактоолигосахаридов, глюкоманноолигосахаридов, галактоманноолигосахаридов, олигосахаридов, содержащих сиаловую кислоту, и олигосахаридов, содержащих уроновую кислоту.
Также настоящее изобретение относится к питательной композиции, включающей:
a. молочный продукт, где указанный молочный продукт является молочным субстратом, ферментируемым бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и указанный молочный субстрат включает по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из молока, сыворотки, сывороточного белка, гидролизата сывороточного белка, казеина, гидролизата казеина и/или лактозы,
3
b. менее чем 10 КОЕ бактерий, продуцирующих молочную кислоту, на г массы сухого вещества композиции, и
c. по меньшей мере два неусвояемых олигосахарида, выбранных из группы, состоящей из фруктоолигосахаридов, галактоолигосахаридов, глюкоолигосахаридов, арабиноолигосахаридов, маннанолигосахаридов, ксилоолигосахаридов, фукоолигосахаридов, арабиногалактоолигосахаридов, глюкоманноолигосахаридов, галактоманноолигосахаридов, олигосахаридов, содержащих сиаловую кислоту, олигосахаридов, содержащих уроновую кислоту.
3
В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению питательной композиции по настоящему изобретению для питания грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения. Другими словами, настоящее изобретение относится к применению молочного продукта для получения питательной композиции, где указанная композиция включает a) молочный продукт, причем указанный молочный продукт является молочным субстратом, ферментируемым бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и указанный молочный субстрат включает по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из молока, сыворотки, сывороточного белка, гидролизата сывороточного белка, казеина, гидролизата казеина и/или лактозы, b) менее чем 10 КОЕ бактерий, продуцирующих молочную кислоту, на г массы сухого вещества композиции, и c) по меньшей мере два неусвояемых олигосахарида, выбранных из группы, состоящей из фруктоолигосахаридов, галактоолигосахаридов, глюкоолигосахаридов, арабиноолигосахаридов, маннанолигосахаридов, ксилоолигосахаридов, фукоолигосахаридов, арабиногалактоолигосахаридов, глюкоманноолигосахаридов, галактоманноолигосахаридов, олигосахаридов, содержащих сиаловую кислоту, олигосахаридов, содержащих уроновую кислоту, для обеспечения питания грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения.
3
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к питательной композиции, включающей a) молочный продукт, причем указанный молочный продукт является молочным субстратом, ферментируемым бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и указанный молочный субстрат включает по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из молока, сыворотки, сывороточного белка, гидролизата сывороточного белка, казеина, гидролизата казеина и/или лактозы, и b) менее чем 10 КОЕ бактерий, продуцирующих молочную кислоту, на г массы сухого вещества композиции для одного из применений, выбранных из группы, состоящей из
I) (i) лечения и/или профилактики заболеваний у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения и/или (ii) стимуляции здоровья грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения;
II) лечения заболеваний, выбранных из группы, состоящей из аллергии, экземы, астмы, инфекции и диареи грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения; и
III) индукции кишечной толерантности к бактериям, продуцирующим молочную кислоту, у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, и/или для применения для усиления колонизации микробиотой, богатой микробами, продуцирующими молочную кислоту, у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения.
3
Другими словами, настоящее изобретение относится к применению молочного продукта для получения питательной композиции, где указанная композиция включает a) молочный продукт, причем указанный молочный продукт является молочным субстратом, ферментируемым бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и указанный молочный субстрат включает по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из молока, сыворотки, сывороточного белка, гидролизата сывороточного белка, казеина, гидролизата казеина и/или лактозы, и b) менее чем 10 КОЕ бактерий, продуцирующих молочную кислоту, на г массы сухого вещества композиции для одного из применений, выбранных из группы, состоящей из
I) (i) лечения и/или профилактики заболеваний у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения и/или (ii) стимуляции здоровья грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения;
II) лечения заболеваний, выбранных из группы, состоящей из аллергии, экземы, астмы, инфекции и диареи грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения; и
III) индукции кишечной толерантности к бактериям, продуцирующим молочную кислоту, у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, и/или усиления колонизации микробиотой богатой микробами, продуцирующими молочную кислоту, у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения.
В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения в аспектах I), II) и III) композиция дополнительно включает по меньшей мере два неусвояемых олигосахарида, выбранных из группы, состоящей из фруктоолигосахаридов, галактоолигосахаридов, глюкоолигосахаридов, арабиноолигосахаридов, маннанолигосахаридов, ксилоолигосахаридов, фукоолигосахаридов, арабиногалактоолигосахаридов, глюкоманноолигосахаридов, галактоманноолигосахаридов, олигосахаридов, содержащих сиаловую кислоту, олигосахаридов, содержащих уроновую кислоту. Предпочтительно неусвояемые олигосахариды выбирают из группы, состоящей из галактоолигосахаридов и фруктоолигосахаридов. Предпочтительно композиция включает в пределах от 0,5 до 75 г неусвояемых олигосахаридов на 100 г массы сухого вещества композиции.
Используемый в данном описании термин «молочный субстрат», также определенный, как «водный субстрат» или просто «субстрат», относится к материалу, подвергаемому ферментации бактериями, продуцирующими молочную кислоту. Используемый в данном описании термин «молочный продукт» относится к продукту, являющемуся результатом ферментации субстрата бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и также определен, как «ферментированный продукт».
Ферментация представляет собой процесс получения энергии при окислении углеводов, таким образом, что лактоза, присутствующая в молоке, использует эндогенный электронный акцептор, который, как правило, представляет собой органическое соединение. Противоположно клеточному дыханию, где электроны взаимодействуют с экзогенным электронным акцептором, таким как кислород, через цепь транспорта электронов. В настоящем изобретении ферментация молочного продукта бактериями, продуцирующими молочную кислоту, имеет общепринятое значение превращения углеводов, присутствующих в молочном продукте, в органические кислоты. Эти полученные органические кислоты могут включать помимо молочной кислоты другие органические кислоты, такие как ацетаты. Предпочтительно, ферментируемый углевод является лактозой.
В данном описании ниже ссылка сделана на питательную композицию по настоящему изобретению или дополнительные или предпочтительные варианты осуществления питательной композиции по настоящему изобретению, а также применение по настоящему изобретению.
Кесарево сечение
Настоящее изобретение относится к энтеральному введению композиции, включающей молочный продукт, полученный ферментацией молочного субстрата бактериями, продуцирующими молочную кислоту, грудным детям, рожденным с проведением кесарева сечения. Кесарево сечение (к-сечение) представляет собой хирургическую процедуру, проведение родов с помощью полостной операции, при которой новорожденный извлекается через разрез брюшной стенки матери и затем стенки матки. Кесарево сечение, как правило, проводят, когда это безопаснее для матери или для ребенка по сравнению с родами через естественные родовые пути. В качестве альтернативы, женщина может выбрать кесарево сечение, а не роды через естественные родовые пути.
Молочный продукт, ферментированный бактериями, продуцирующими молочную кислоту
Питательная композиция по настоящему изобретению или применение по настоящему изобретению включает молочный продукт, который является молочным субстратом, ферментируемым бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и указанный молочный субстрат включает по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из молока, сыворотки, сывороточного белка, гидролизата сывороточного белка, казеина, гидролизата казеина и/или лактозы. Композиция по настоящему изобретению предпочтительно включает молочный продукт, получаемый способом, включающим следующие стадии:
2
10
a. инокуляцию бактерий, продуцирующих молочную кислоту, в водной среде, включающей молочный субстрат, в пределах от 1×10 до 5×10 КОЕ/мл, причем указанная водная среда имеет pH в предела от 4 до 8 и включает по меньшей мере один молочный субстрат, выбранный из группы, состоящей из молока, сыворотки, сывороточного белка, гидролизата сывороточного белка, казеина, гидролизата казеина, лактозы и их смесей,
b. инкубирование указанных бактерий, продуцирующих молочную кислоту, в указанной водной среде в аэробных или анаэробных условиях и при температуре в пределах от 20°C до 50°C, предпочтительно по меньшей мере 2 часа, и
c. инактивацию и/или физическое удаление живых клеток бактерий, продуцирующих молочную кислоту, из водной среды.
Необязательно за этим процессом может следовать одна или более из следующих стадий:
d. ультрафильтрация водной среды предпочтительно через одну или более фильтрационную мембрану с номинальным отсечением по молекулярной массе в пределах 100-300 кДа, таким образом, чтобы получить концентрированный ретентат,
e. фракционирование концентрированного ретентата, предпочтительно дегидратированием концентрированного ретентата, растворение дегидратированного ретентата в буфере, проведение гель-эксклюзивной хроматографии раствора ретентата, предпочтительно на колонке с предельным значением исключенной фракции 600 кДа, и
f. извлечение заданной фракции, предпочтительно извлекают исключенную фракцию по окончанию хроматографии, включающую или состоящую из молочного продукта.
Предпочтительно ферментированный продукт включает фрагменты клеток бактерий, таких как гликопротеины, гликолипиды, пептидогликаны, липотейховую кислоту (LTA), жгутики, липопротеины, ДНК и/или капсульные полисахариды. Эти фрагменты вызывают иммунный ответ в кишечнике новорожденного грудного ребенка, индуцируя, таким образом, толерантность, и ускоряют бактериальную колонизацию кишечника. Использование ферментированного молочного продукта, включающего инактивированные бактерии и/или фрагменты клеток, непосредственно, как части готового питательного продукта, в результате проводит к более высокой концентрации фрагментов бактериальных клеток. При использовании коммерческих препаратов пробиотиков их, как правило, промывают и отделяют от водной ростовой среды, включающей фрагменты бактериальных клеток, таким образом, снижая содержание или удаляя фрагменты бактериальных клеток. Дополнительно, во время ферментации и/или другого взаимодействия бактерий, продуцирующих молочную кислоту, с молочным субстратом, образуются дополнительные биоактивные соединения, такие как биоактивные пептиды и/или олигосахариды, которые также стимулируют иммунную систему и/или стимулируют колонизацию кишечной микробиотой. Следовательно, ферментированный молочный продукт оказывает усиленное воздействие по сравнению с не ферментированным молочным продуктом.
Предпочтительно питательная композиция включает в пределах от 5 до 100 масс.% ферментированного продукта по сухому веществу, более предпочтительно в пределах от 10 до 100 масс.%, еще более предпочтительно в пределах от 20 до 90 масс.%, еще более предпочтительно в пределах от 50 до 80 масс.%. Предпочтительно композиция включает в пределах от 1 до 100 масс.% ферментированного продукта на 100 мл, более предпочтительно в пределах от 2 до 100 масс.%, еще более предпочтительно в пределах от 5 до 50 масс.%, еще более предпочтительно в пределах от 10 до 20 масс.% на 100 мл.
Бактерии, продуцирующие молочную кислоту, используемые для получения ферментированного продукта
Бактерии, продуцирующие молочную кислоту, используемые для ферментации молочного субстрата, предпочтительно используют, как моно- или смешанную культуру. Бактерии, продуцирующие молочную кислоту, состоят из рода Bifidobacterium, Lactobacillus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus и Weissella. Предпочтительно бактерии, продуцирующие молочную кислоту, используемые для проведения ферментации, включают бактерии рода Lactobacillus и/или Bifidobacterium и/или Streptococcus.
Бифидобактерии представляют собой грамположительные, анаэробные разветвленные палочковидные бактерии. Виды Bifidobacterium по настоящему изобретению предпочтительно имеют по меньшей мере 95% идентичность последовательности 16 S рРНК при сравнении со штаммом соответствующих видов Bifidobacterium, более предпочтительно по меньшей мере 97% идентичность, как это определено в руководстве по этому вопросу, например, Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor (N.Y.) Laboratory Press. Также предпочтительно используемые бифидобактерии, описанные Scardovi, V. Genus Bifidobacterium, стр.1418 - стр.1434. В: Bergey's manual of systematic Bacteriology. Vol. 2. Sneath, P.H.A., N.S. Mair, M.E. Sharpe and J.G. Holt (ed.). Baltimore: Williams & Wilkins. 1986. стр 635. Предпочтительно бактерии, продуцирующие молочную кислоту, используемые для ферментации, включают или представляют собой по меньшей мере один Bifidobacterium, выбранный из группы, состоящей из B. breve, B. infantis, B. bifidum, B. catenulatum, B. adolescentis, B. thermophilum, B. gallicum, B. animalis или lactis, B. angulatum, B. pseudocatenulatum, B. thermacidophilum и B. longum более предпочтительно B. breve, B. infantis, B. bifidum, B. catenulatum, B. longum, еще более предпочтительно B. longum и B. breve, и даже более предпочтительно B. breve, наиболее предпочтительно B. breve 1-2219, депонированный в CNCM в Париже, Франция. Предпочтительно бактерии, продуцирующие молочную кислоту, используемые для ферментации, включают по меньшей мере один, более предпочтительно по меньшей мере два, еще более предпочтительно по меньшей мере три, наиболее предпочтительно по меньшей мере четыре различных вида Bifidobacterium. Предпочтительно бактерии, продуцирующие молочную кислоту, используемые для ферментации, включают по меньшей мере B. longum и/или B. breve. Указанные выше комбинации главным образом нацелены на повышение толерантности к большему количества различных микроорганизмов в кишечнике грудного ребенка, рожденного с проведением кесарева сечения. Это оказывает благотворное воздействие на грудного ребенка, обеспечивая большую пользу для здоровья.
Молочнокислые бактерии представляют собой грамположительные, анаэробные разветвленные палочковидные бактерии. Виды Lactobacillus по настоящему изобретению предпочтительно имеют по меньшей мере 95% идентичность последовательности 16 S рРНК при сравнении со штаммом соответствующих видов Lactobacillus, более предпочтительно по меньшей мере 97% идентичность, как это определено в руководстве по этому вопросу, например, Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor (N.Y.) Laboratory Press. Предпочтительно бактерии, продуцирующие молочную кислоту, используемые для ферментации, включают по меньшей мере один, более предпочтительно по меньшей мере два вида Lactobacillus, выбранных из группы, состоящей из L. casei, L. reuteri, L paracasei, L. rhamnosus, L. acidophilus, L. johnsonii, L. lactis, L. salivarius, L. crispatus, L. gasseri, L. zeae, L. fertnentum and L. plantarum, более предпочтительно L. casei, L. paracasei, L. rhamnosus, L. johnsonii, L. acidophilus, L. fermentum и еще более предпочтительно L. paracasei. Еще более предпочтительно бактерии, продуцирующие молочную кислоту, используемые для ферментации, включают Bifidobacterium breve и/или Lactobacillus paracasei, поскольку рост этих бактерий ослаблен в кишечнике при кормлении смесью для питания грудных детей, даже когда в смесь для питания грудных детей добавлены неусвояемые олигосахариды, по сравнению с кишечником грудных детей, получающих грудное вскармливание. Дополнительно, повышенное биоразнообразие оказывает стимулирующее воздействие на здоровье грудного ребенка, рожденного с проведением кесарева сечения.
Предпочтительно бактерии, продуцирующие молочную кислоту, используемые для ферментации, включают по меньшей мере один микроорганизм, выбранный из группы, состоящей из Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus и Weissella, более предпочтительно включает или представляет собой Streptococcus thermophilus. Дополнительно, повышенное биоразнообразие оказывает стимулирующее воздействие на здоровье грудного ребенка, рожденного с проведением кесарева сечения.
2
10
4
9
7
9
3
10
4
9
Предпочтительно инокулятная плотность составляет в пределах от 1×10 до 5×10, предпочтительно в пределах от 1×10 до 5×10 КОЕ бактерий, продуцирующих молочную кислоту/мл водной среды, содержащей молочный субстрат, более предпочтительно в пределах от 1×10 до 1×10 КОЕ бактерий, продуцирующих молочную кислоту/мл водной среды. Конечная плотность бактерий после ферментации предпочтительно составляет в пределах от 1×10 до 1×10, более предпочтительно в пределах от 1×10 до 1×10 КОЕ/мл водной среды, содержащей молочный субстрат.
2
4
5
11
10
9
Предпочтительно питательная композиция по настоящему изобретению включает инактивированные бактерии, продуцирующие молочную кислоту, и/или фрагменты бактерий, продуцирующих молочную кислоту, полученные из более чем 1×10 КОЕ бактерий, продуцирующих молочную кислоту, на г по сухому веществу готовой композиции, более предпочтительно 1×10 КОЕ, даже более предпочтительно 1×10 КОЕ. Предпочтительно инактивированные бактерии или фрагменты бактерий получены из менее чем 1×10 КОЕ бактерий, продуцирующих молочную кислоту, на г по сухому веществу готовой композиции, более предпочтительно 1×10 КОЕ, еще более предпочтительно 1×10 КОЕ.
Процесс ферментации
Ферментируемый молочный субстрат выбирают из группы, состоящей из молока, сыворотки, сывороточного белка, гидролизата сывороточного белка, казеина, гидролизата казеина, и лактозы, и их смесей, наиболее предпочтительно обезжиренного молока. Молоко может быть цельным молоком, полуобезжиренным молоком и/или обезжиренным молоком. Сыворотка может быть сладкой сывороткой и/или кислой сывороткой. Предпочтительно сыворотка присутствует в концентрации от 3 до 80 г по сухому веществу на л водной среды, содержащей молочный субстрат, более предпочтительно в концентрации от 40 до 60 г на л. Предпочтительно гидролизат сывороточного белка присутствует в пределах от 2 до 80 г по сухому веществу на л водной среды, содержащей молочный субстрат, более предпочтительно в концентрации от 5 до 15 г/л. Предпочтительно лактоза присутствует в пределах от 5 до 50 г по сухому веществу на л водного субстрата, более предпочтительно от 1 до 30 г/л. Предпочтительно водная среда, содержащая молочный субстрат, включает буферные соли для поддержания pH в заданных пределах. Предпочтительно в качестве буферных солей используют натрий или калий фосфорнокислый в пределах от 0,5 до 5 г/л, более предпочтительно в пределах от 1,5 до 3 г на л. Предпочтительно водная среда, содержащая молочный субстрат, включает цистеин в пределах от 0,1 до 0,5 г на л водного субстрата, более предпочтительно в пределах от 0,2 до 0,4 г/л. Наличие цистеина приводит к более низкому окислительно-восстановительному потенциалу субстрата, что является преимуществом для активности бактерий, продуцирующих молочную кислоту, в частности бифидобактерий. Предпочтительно водная среда, содержащая молочный субстрат, включает дрожжевой экстракт в пределах от 0,5 до 5 г/л водной среды, содержащей молочный субстрат, более предпочтительно в пределах от 1,5 до 3 г/л. Дрожжевой экстракт представляет собой богатый источник коферментов и факторов роста бактерий, продуцирующих молочную кислоту. Наличие дрожжевого экстракта усиливает ферментацию бактерий, продуцирующих молочную кислоту.
Соответственно водную среду, содержащую молочный субстрат, пастеризуют перед стадией ферментации для удаления нежелательных живых бактерий. Соответственно продукт пастеризуют после ферментации для инактивации ферментов. Соответственно инактивация ферментов происходит при температуре 75°C в течение 3 минут. Соответственно водную среду, содержащую молочный субстрат, гомогенизируют перед, и/или молочный продукт гомогенизируют после ферментации. Гомогенизация в результате позволяет получить более стабильный субстрат и/или ферментированный продукт, особенно в присутствии жира.
Предпочтительно ферментацию проводят при температуре в пределах от около 20°C до 50°C, более предпочтительно от 30°C до 45°C, еще более предпочтительно при температуре в пределах от около 37°C до 42°C. Оптимальная температура для роста и/или активности бактерий, продуцирующих молочную кислоту, более предпочтительно молочнокислые бактерии и/или бифидобактерии составляет в пределах от 37°C до 42°C.
Предпочтительно инкубацию проводят при pH в пределах от 4 до 8, более предпочтительно в пределах от 6 до 7,5. Такой pH не вызывает осаждение белка и/или ухудшение вкуса, при этом в то же самое время бактерии, продуцирующие молочную кислоту, такие как молочнокислый бактерии и/или бифидобактерии могут ферментировать молочный субстрат.
Предпочтительно время инкубации составляет по меньшей мере 2 часа, предпочтительно в пределах от 4 до 48 часов, более предпочтительно в пределах от 6 до 24 часов, еще более предпочтительно в пределах от 6 до 12 часов. Достаточно длительный период времени дает возможность ферментации и сопутствующему продуцированию фрагментов иммуногенных клеток, таких как гликопротеины, гликолипиды, пептидогликаны, липотейховая кислота (LTA), жгутики, липопротеины, ДНК и/или капсульные полисахариды, в более высокой степени, при этом время инкубации не должно быть слишком длительным по экономическим причинам.
Необязательно одна или более из следующих стадий может следовать за указанным выше процессом:
i) Ультрафильтрация молочного продукта после ферментации через мембранный фильтр с номинальным отсечением по молекулярной массе в пределах от 100 до 300 кДа, таким образом, чтобы получить концентрированный ретентат. Предпочтительно мембраны представляют собой полиэфирсульфоновые мембраны, и фильтрацию предпочтительно проводят при температуре ниже 60°C.
ii) Промывка концентрированного ретентата водой.
iii) Дегидратация концентрированного ретентата, предпочтительно при проведении лиофильной сушки.
iv) Растворение дегидратированного ретентата в буфере, предпочтительно в буфере Tris при pH 6-8.

v) Проведение гель-эксклюзивной хроматографии раствора ретентата на колонке с предельным значением извлеченной фракции 600 кДа, предпочтительно на Dextran или агарозной колонке, такой как Superdex 200.
vi) Обессоливание продукта мембраной с номинальным отсечение по молекулярной массе в пределах 10 кДа. Извлечение извлеченной фракции по окончанию хроматографии, включающей или состоящей из молочного продукта.
Для получения заданной питательной композиции могут быть добавлены дополнительные ингредиенты. Как правило, их добавляют после стадии vi), указанной выше. Для смеси для питания грудных детей могут быть добавлены такие ингредиенты, как обезжиренное молоко, сыворотка, лактоза, растительный жир, минеральные вещества, витамины и тому подобное, хорошо известные из уровня техники, предшествующего изобретению.
Предпочтительно молочный субстрат, предпочтительно обезжиренное молоко пастеризуют, охлаждают и ферментируют одним или более штаммом Lactobacillus до определенной степени кислотности, при которой ферментированный продукт охлаждают и хранят. Предпочтительно аналогично получают второй молочный продукт с использованием для ферментации одного или более вида Bifidobacterium. Затем два ферментированных продукта предпочтительно смешивают вместе и с другими компонентами с получением смеси для питания грудных детей, за исключением жирового компонента. Предпочтительно смесь подвергают предварительному нагреванию и затем ниже по технологической линии добавляют жир, гомогенизируют, пастеризуют и сушат.
Предпочтительно молочный субстрат, предпочтительно лактозу пастеризуют, охлаждают и ферментируют одним или более штаммом Streptococcus thermophilus, ферментированный продукт охлаждают и хранят. Предпочтительно аналогично получают второй молочный продукт с использованием обезжиренного молока и одного или более вида Bifidobacterium для ферментации. Затем два ферментированных продукта предпочтительно смешивают вместе и с другими компонентами с получением смеси для питания грудных детей, пастеризуют и сушат.
Предпочтительный способ получения ферментированного продукта по настоящему изобретению описан в WO 01/01785, в частности в Примерах 1 и 2. Предпочтительный способ получения ферментированного продукта по настоящему изобретению описан в WO 2004/093899, в частности в Примере 1.
Способы инактивации и/или физического удаления живых клеток
3
Живые клетки бактерий, продуцирующие молочную кислоту в молочном продукте, после ферментации предпочтительно по существу все удаляют, например, инактивацией и/или физическим удалением. Клетки предпочтительно инактивированны. Живые бактериальные клетки предпочтительно инактивируют способами, выбранными из группы, состоящей из тепловой обработки, облучения УФ, обработки ультразвуком, обработки кислородом, обработки бактерицидами, такими как этанол, сверхвысоким давлением, гомогенизацией высокого давления и/или с использованием деструктора клеток. Предпочтительно бактерии, продуцирующие молочную кислоту, инактивируют нагреванием после ферментации молочного продукта. Предпочтительными путями тепловой инактивации являются пастеризация, стерилизация, УВТ обработка, варка орошением горячей водой и/или распылительная сушка при температуре, при которой бактерии не выживают. Фрагменты клеток предпочтительно получают тепловой обработкой, обработкой ультразвуком, обработкой бактерицидами, такими как этанол, сверхвысоким давлением, гомогенизацией высокого давления и/или с использованием деструктора клеток. Предпочтительно интактные клетки бактерий удаляют из ферментированного продукта физическим удалением, таким как фильтрация или центрифугирование, например, центрифугирование в течение 1 ч при 3000 g, при этом интактные клетки остаются в осадке или ретентате, и фрагменты клеток остаются в супернатанте и/или фильтрате, соответственно. Инактивацию и/или физическое удаление живых клеток проводят таким образом, чтобы количество живых клеток бактерий, продуцирующих молочную кислоту, находилось ниже пределов определения при использовании традиционного метода пластинчатого посева, известного из уровня техники, предшествующего изобретению. Этот предел составляет менее чем 10 КОЕ живых клеток бактерий, продуцирующих молочную кислоту, на г сухой массы композиции.
Инактивация живых клеток имеет преимущество в том, что после получения готовая питательная композиция может быть пастеризована и/или стерилизована, с последующим снижением риска контаминации вредными микроорганизмами, такими как E. sakazakii. В частности, это важно для грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, поскольку у них отсрочена колонизация кишечника и они более подвержены инфекциям. Настоящее изобретение представляет собой жидкую, готовую к употреблению смесь для питания грудных детей, хранимую при комнатной температуре. Дополнительно, дозировка биоактивных компонентов, поучаемых каждым грудным ребенком и/или ребенком раннего возраста, может легко контролироваться, поскольку нет дополнительного роста в жидком продукте, нет роста в желудочно-кишечном тракте грудного ребенка. Последний является переменным фактором в зависимости от кишечной среды индивидуума и, следовательно, ведет к вариациям в степени положительного воздействия на грудного ребенка.
Дополнительные преимущества состоят в более легком хранении питательной композиции и снижении его стоимости, поскольку не требуется специальных мер для поддержания на приемлемом уровне жизнеспособности бактерий, продуцирующих молочную кислоту. В частности, это характерно для продуктов с активностью воды выше 0,3. Также при хранении продуктов с высокой активностью воды и/или смесей для питания грудных детей не происходит пост-подксиления в период после восстановления водой перед потреблением. Таким образом, избегается негативное воздействие, связанное с коагуляцией белков и плохим вкусом.
Неусвояемые олигосахариды
Предпочтительно композиция по настоящему изобретению включает по меньшей мере два неусвояемых олигосахарида.
Неусвояемые олигосахариды предпочтительно стимулируют рост бактерий, продуцирующих молочную кислоту, в частности, бифидобактерий и/или молочнокислых бактерий, более предпочтительно бифидобактерий. Присутствие неусвояемых олигосахаридов стимулирует рост бактерий, продуцирующих молочную кислоту, таких как молочнокислые бактерии и/или бифидобактерии, снижая рост вредных бактерий в желудочно-кишечном тракте, и/или непосредственно преимущественно стимулирует иммунную систему. В результате это приводит к большей колонизации полезными бактериями. Следовательно, присутствие, как неусвояемых олигосахаридов, так и молочного продукта, полученного ферментацией бактериями, продуцирующими молочную кислоту, действует синергически и соответственно приводит, как к более быстрой, так и большей колонизации бактериями, продуцирующими молочную кислоту, такими как молочнокислые бактерии и/или бифидобактерии.
Присутствие по меньшей мере двух различных неусвояемых олигосахаридов в результате приводит к микробиоте более разнообразной в отношении различных видов бактерий, продуцирующих молочную кислоту, как у грудных детей, рожденных через естественные родовые пути. Присутствие по меньшей мере двух различных неусвояемых олигосахаридов и молочного продукта, полученного ферментацией бактериями, продуцирующими молочную кислоту, действует синергически и соответственно приводит в результате к более быстрой и более высокой, наряду с более разнообразной колонизацией бактериями, продуцирующими молочную кислоту, в частности молочнокислыми бактериями и/или бифидобактериями. Используемый в данном описании термин «олигосахарид» относится к сахаридам со степенью полимеризации (СП) в пределах от 2 до 250, предпочтительно составляет в пределах от 2 до 100, более предпочтительно в пределах от 2 до 60, еще более предпочтительно в пределах от 2 до 10. Композиция по настоящему изобретению включает олигосахариды с СП в пределах от 2 до 100, сюда относятся композиции, которые содержат олигосахариды с СП в пределах от 2 до 5, СП в пределах от 50 до 70 и СП в пределах от 7 до 60. Используемый в данном описании термин «неусвояемые олигосахариды» относится к олигосахаридам, которые не усваиваются в кишечнике под действием кислот или пищеварительных ферментов, присутствующих в верхнем отделе пищеварительного тракта человека (тонкий кишечник и желудок), но которые предпочтительно ферментированы кишечной микробиотой человека. Усвояемыми считаются, например, глюкоза, фруктоза, галактоза, сахароза, лактоза, мальтоза и мальтодекстрины.
Предпочтительно присутствующие неусвояемые олигосахариды являются растворимыми. Используемый в данном описании термин «растворимый» относится к полисахаридам, волокнам или олигосахаридам, которые представляют собой вещество по меньшей мере растворимое согласно методу, описанному в L. Prosky et al., J. Assoc. Anal. Chem 71: 1017-1023, 1988).
Предпочтительно композиция по настоящему изобретению включает неусвояемые олигосахариды с СП в пределах от 2 до 250, более предпочтительно в пределах от 2 до 60. Неусвояемые углеводы представляют собой по меньшей мере два выбранных из группы, состоящей из фруктоолигосахаридов, галактоолигосахаридов, глюкоолигосахаридов, арабиноолигосахаридов, маннанолигосахаридов, ксилоолигосахаридов, фуколигосахаридов, арабиногалактоолигосахаридов, галюктоманноолигосахаридов, галактоманноолигосахаридов, олигосахаридов, содержащих сиаловую кислоту, и олигосахаридов, содержащих уроновую кислоту. Предпочтительно композиция по настоящему изобретению включает фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды и/или олигосахариды, содержащие галактуроновую кислоту, более предпочтительно галактоолигосахариды, наиболее предпочтительно бета-галактоолигосахариды. Группа олигосахаридов включает инулин, группа галактоолигосахаридов включает трансгалактоолигосахариды или бета-галактоолигосахариды, группа глюкоолигосахаридов включает гентио-, нигеро- и циклодекстринолигосахариды и полидекстрозу, группа арабиногалакто-олигосахаридов включает гуммиарабик, и группа галактоманноолигосахаридов включает частично гидролизованную гуаровую камедь.
Предпочтительно композиция по настоящему изобретению включает по меньшей мере два неусвояемых олигосахарида с различной средней степенью полимеризации (СП). Предпочтительные массовые соотношения:
a. (неусвояемые олигосахариды с СП в пределах от 2 до 5): (неусвояемые олигосахариды с СП 6, 7, 8 и/или 9)>1; и/или
b. (неусвояемые олигосахариды с СП в пределах от 10 до 60): (неусвояемые олигосахариды с СП 6, 7, 8 и/или 9)>1
предпочтительно оба массовых соотношения составляют выше 2, еще более предпочтительно выше 5.
Для дополнительного улучшения неусвояемые олигосахариды по настоящему изобретению предпочтительно имеют относительно высокое содержание короткоцепочечных олигосахаридов, поскольку они сильно стимулируют рост бифидобактерий. Следовательно, предпочтительно по меньшей мере 10 масс.% неусвояемых олигосахаридов в композиции по настоящему изобретению имеют СП в пределах от 2 до 5 (то есть, 2, 3, 4 и/или 5) и по меньшей мере, 5 масс.% имеют СП в пределах от 10 до 60. Предпочтительно по меньшей мере 50 масс.%, более предпочтительно по меньшей мере 75 масс.% неусвояемых нейтральных олигосахаридов имеют СП в пределах от 2 до 9 (то есть, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и/или 9).

Более предпочтительно композиция по настоящему изобретению включает галактоолигосахариды. Предпочтительно галактоолигосахариды выбирают из группы, состоящей из бета-галактоолигосахаридов, лакто-N-тетраозы (LNT) и лакто-N- неотетраозы (нео-LNT), фукозил-лактозы, фукозилированной LNT и фукозилированной нео-LNT. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения композиция включает бета- галактоолигосахариды. Бета-олигосахариды, используемые в настоящем изобретении, относятся к олигосахаридам, состоящим более чем на 50%, предпочтительно более чем на 65% из галактозных единиц на основе мономерных субъединиц, со степенью полимеризации (СП) в пределах от 2 до 20, в которой по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% галактозных единиц связанны бета-гликозидной связью, предпочтительно бета-1,4 гликозидной связью. Бета-гликозидная связь также преобладает в олигосахаридах грудного молока. Средняя степень СП предпочтительно составляет в пределах от 3 до 6. Глюкозная единица может присутствовать на восстанавливающем конце цепочки галактозных единиц. Бета-галактоолигосахариды иногда также называют трансгалактоолигосахаридами (ТОС). Подходящим источником бета-галактоолигосахаридов является VivinalGOS (коммерчески доступный от Borculo Domo Ingredients, Zwolle, Нидерланды). Другими подходящими источниками являются Oligomate (Yakult), CupOligo, (Nissin) и Bimmuno (Classado). Бета-галактоолигосахариды стимулируют рост бактерий, продуцирующих молочную кислоту, предпочтительно бифидобактерии.
Предпочтительно композиция включает фруктоолигосахариды. Фуктоолигосахариды, используемые в настоящем изобретении, относятся к углеводам, состоящим более чем на 50%, предпочтительно более чем на 65% из фруктозных единиц на основе мономерных субъединиц, в которых по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% фруктозных единиц связаны бета-гликозидной связью, предпочтительно бета-2,1 гликозидной связью. Глюкозная единица может присутствовать на восстанавливающем конце цепочки галактозных единиц. Предпочтительно фруктоолигосахариды имеют СП или среднюю степень СП в пределах от 2 до 250, более предпочтительно в пределах от 2 до 100, еще более в предпочтительных в пределах от 10 до 60. Фруктоолигосахариды включают леван, гидролизованный леван, инулин, гидролизованный инулин и синтезированные фруктоолигосахариды. Предпочтительно композиция включает короткоцепочечные фруктоолигосахариды со средней степенью полимеризации (СП), составляющей в пределах от 3 до 6, более предпочтительны гидролизованный инулин или синтетические фруктоолигосахариды. Предпочтительно композиция включает длинноцепочечные фруктоолигосахариды со средней СП более 20, такие как RaftilinHP. Предпочтительно композиция включает, как короткоцепочечные, так и длинноцепочечные фруктоолигосахариды. Подходящие для использования в композициях фруктоолигосахариды также легко коммерчески доступны, например, от RaftilineHP (Orafti).
Более предпочтительно композиция включает комбинацию галактоолигосахаридов, более предпочтительно длинноцепочечные фруктоолигосахариды. Такая смесь стимулирует рост здоровой кишечной микробиоты, в частности бифидобактерий, и снижает присутствие E. coli у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения. Смесь синергически стимулирует бактерии, продуцирующие молочную кислоту, в частности, бифидобактерии.
4
5
Композиция по настоящему изобретению включает олигосахариды, содержащие уроновую кислоту, более предпочтительно олигосахариды, содержащие галактуроновую кислоту. Используемый в данном описании термин олигосахариды, содержащие уроновую кислоту, относится к олигосахаридам, в которых по меньшей мере 50% моносахаридных единиц, присутствующих в олигосахариде, представляет собой уроновую кислоту. Используемый в данном описании термин олигосахариды, содержащие галактуроновую кислоту, относится к олигосахаридам, в которых по меньшей мере 50% моносахаридных единиц, присутствующих в олигосахариде, представляет собой галактуроновую кислоту. Олигосахариды, содержащие галактуроновую кислоту, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно получены при деградации пектина, пектата и/или полигалактуроновой кислоты. Предпочтительно деградированный пектин получают гидролизом и/или удалением бета-связи у фруктовых и/или овощных пектинов, более предпочтительно яблочного, лимонного и/или пектина сахарной свеклы, еще более предпочтительно яблочного, лимонного и/или пектина сахарной свеклы, деградированного по меньшей мере одной лиазой. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна концевая единица галактуроновой кислоты олигосахарида, содержащего галактуроновую кислоту, имеет двойную связь. Двойная связь эффективно защищает от присоединения патогенных бактерий к эпителиальным клеткам кишечника. Предпочтительно одна из концевых единиц галактуроновой кислоты включает C-C двойную связь.
Олигосахариды, содержащие галактуроновую кислоту, могут быть дериватизированны. Олигосахариды, содержащие галактуроновую кислоту, могут быть метоксилированы и/или амидированы. Предпочтительно олигосахариды, содержащие галактуроновую кислоту, характеризуются степенью метоксилирования выше 20%, предпочтительно выше 50%, еще более предпочтительно выше 70%. Олигосахариды, содержащие уроновую кислоту, снижают адгезию патогенных микроорганизмов к эпителиальным клеткам кишечника, снижая, таким образом, колонизацию (внутрибольничными) патогенными бактериями толстой кишки грудного ребенка, рожденного с проведением кесарева сечения. Дополнительно, олигосахариды, содержащие уроновую кислоту, предпочтительно стимулируют формирование здоровой кишечной микробиоты и ферментацию, что в результате ведет к продуцированию кишечных органических кислот и снижению кишечного pH, что ингибирует рост (внутрибольничных) патогенных бактерий.
Следовательно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция для применения по настоящему изобретению включает по меньшей мере бета-галактоолигосахариды. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция для применения по настоящему изобретению включает по меньшей мере короткоцепочечные фруктоолигосахариды и/или длинноцепочечные фруктоолигосахариды, предпочтительно длинноцепочечные фруктоолигосахариды. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция для применения по настоящему изобретению предпочтительно включает по меньшей мере олигосахариды, содержащие уроновую кислоту. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция для применения по настоящему изобретению предпочтительно включает по меньшей мере бета-галактоолигосахариды и по меньшей мере короткоцепочечные фруктоолигосахариды или длинноцепочечные фруктоолигосахариды или оба. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция для применения по настоящему изобретению предпочтительно включает по меньшей мере бета-галактоолигосахариды и по меньшей мере олигосахариды, содержащие уроновую кислоту. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция для применения по настоящему изобретению предпочтительно включает по меньшей мере короткоцепочечные фруктоолигосахариды и олигосахариды, содержащие уроновую кислоту. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция для применения по настоящему изобретению предпочтительно включает по меньшей мере бета-галактоолигосахариды и короткоцепочечные фруктооолигосахариды, и олигосахариды, содержащие уроновую кислоту, или по меньшей мере бета-галактоолигосахариды и длинноцепоченные фруктоолигосахариды, и олигосахариды, содержащие уроновую кислоту. Смесь по меньшей мере двух различных неусвояемых углеводов преимущественно стимулирует большую степень роста полезных бактерий кишечной микробиоты по сравнению с только одним неусвояемым углеводом. Смесь по меньшей мере двух различных неусвояемых углеводов преимущественно стимулирует большее разнообразие полезных бактерий кишечной микробиоты по сравнению с только одним неусвояемым углеводом. Предпочтительное массовое соотношение смеси двух различных неусвояемых углеводов, предпочтительно бета-галактоолигосахаридов и фруктоолигосахаридов составляет в пределах от 20 до 0,05, более предпочтительно в пределах от 20 до 1. Бета-галактоолигосахариды в большей степени подобны олигосахаридам грудного молока. Предпочтительно композиция включает бета-галактоолигосахариды с СП в пределах 2-10 и/или фруктоолигосахариды с СП в пределах 2-60. Эта комбинация синергически повышает содержание бифидобактерий и молочнокислых бактерий. Присутствие этих трех неусвояемых олигосахаридов дополнительно стимулирует бифидобактерии. Массовое соотношение трансгалактоолигосахарид:фруктоолигосахарид:продукт деградации пектина предпочтительно составляет в пределах от (20-2):1:(1-20), более предпочтительно (12-7):1:(1-3).
Предпочтительно композиция включает в пределах от 80 мг до 2 г неусвояемых олигосахаридов на 100 мл, более предпочтительно в пределах от 150 мг до 1,50 г, еще более предпочтительно в пределах от 300 мг до 1 г. По сухому веществу композиция предпочтительно включает в пределах от 0,25 масс.% до 20 масс.%, более предпочтительно в пределах от 0,5 масс.% до 10 масс.%, еще более предпочтительно в пределах от 1,5 масс.% до 7,5 масс.%. Более низкое содержание неусвояемых олигосахаридов будет оказывать меньшее стимулирующее воздействие на полезные бактерии в микробиоте, при этом большее содержание приведет к побочным эффектам метеоризма и дискомфорту в желудочно-кишечном тракте.
Рецептурный состав
Композиция по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой питательные и/или фармацевтические композиции и подходит для введения грудным детям. Композицию по настоящему изобретению предпочтительно вводят энтерально, более предпочтительно перорально.
Композицию по настоящему изобретению предпочтительно используют в качестве смеси для детского питания, предпочтительно смеси для питания грудных детей. Композиция по настоящему изобретению преимущественно может быть использована в качестве сбалансированного питания для грудных детей. Композиция по настоящему изобретению предпочтительно включает липиды, белки и углеводы и предпочтительно вводится в жидкой форме. Композиция по настоящему изобретению включает сухой пищевой продукт (например, порошки), сопровождаемые приложенными инструкциями о том, как смешивать указанную сухую пищевую смесь с подходящей жидкостью (например, водой).
Следовательно, настоящее изобретение также относится к композиции, где липиды обеспечивают в пределах от 5 до 50% всех калорий, белки обеспечивают в пределах от 5 до 50% всех калорий, и компонент неусвояемых углеводов обеспечивает в пределах от 15 до 90% всех калорий. Предпочтительно в композиции по настоящему изобретению липиды обеспечивают в пределах от 35 до 50% всех калорий, белки обеспечивают в пределах от 7,5 до 12,5% всех калорий и неусвояемые углеводы обеспечивают в пределах от 40 до 55% всех калорий. Для расчета % всех калорий для белка следует принимать во внимание общую энергию, обеспечиваемую белками, пептидами и аминокислотами.
Предпочтительно композиция по настоящему изобретению включает по меньшей мере один липид, выбранный из группы, состоящей из животных липидов (за исключением липидов человека) и растительных липидов. Предпочтительно композиция по настоящему изобретению включает комбинацию растительных липидов и по меньшей мере одного масла, выбранного из группы, состоящей из рыбьего жира, животного жира, масла из водорослей и бактериального масла. Композиция по настоящему изобретению не включает грудное молоко.
Белки, используемые в питательной композиции, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из белков животного происхождения, не принадлежащих к человеческим белкам (предпочтительно молочный белок), растительных белков (предпочтительно соевый белок и/или рисовый белок), их гидролизатов, свободных аминокислот и их смесей. Композиция по настоящему изобретению предпочтительно содержит казеин, сыворотку, гидролизованный казеин и/или гидролизованный сывороточный белок. Предпочтительно белок включает интактный белок, более предпочтительно коровьи интактные сывороточные белки и/или коровьи интактные казеиновые белки. Поскольку композицию по настоящему изобретению используют для снижения аллергических реакций у грудных детей, белок предпочтительно выбирают из группы, состоящей из гидролизованного молочного белка. Предпочтительно композиция по настоящему изобретению включает гидролизованный казеин и/или гидролизованный сывороточный белок, растительный белок и/или аминокислоты. Применение этих белков дополнительно снижает аллергические реакции у грудных детей. Применение этих гидролизованных белков преимущественно улучшает абсорбцию компонента пищевого белка незрелым кишечником грудного ребенка, рожденного с проведением кесарева сечения.
Композиция по настоящему изобретению предпочтительно включает усвояемые олигосахариды, выбранные из группы, состоящей из сахарозы, лактозы, мальтозы, галактозы, глюкозы, фруктозы, сухих веществ кукурузного сиропа, крахмала и мальтодекстринов, более предпочтительно лактозы.
-1
Предпочтительно композиция по настоящему изобретению имеет вязкость в пределах от 1 до 60 мПа*с, предпочтительно от 1 до 20 мПа*с, более предпочтительно от 1 до 10 мПа*с, наиболее предпочтительно от 1 до 6 мПа*с. Низкая вязкость гарантирует правильное введение жидкости, например, присущее прохождению через отверстие в соске. Также такая вязкость близка к вязкости грудного молока. Дополнительно, низкая вязкость ведет к нормальной эвакуации желудочного содержимого и лучшей усвояемости энергии, что существенно важно для грудных детей, нуждающихся в энергии для оптимального роста и развития. Предпочтительно композицию по настоящему изобретению получают смешиванием порошкообразной композиции с водой. Как правило, смесь для питания грудных детей получают таким способом. Также настоящее изобретение относится к расфасованной порошкообразной композиции, где указанная упаковка снабжена инструкцией по смешиванию порошка с подходящим количеством жидкости с получением в результате жидкой композиции с вязкостью в пределах от 1 до 60 мПа*с. Вязкость жидкости определяют с использованием Physica Rheometer MCR 300 (Physica Messtechnik GmbH, Ostfilden, Германия) при градиенте скорости сдвига 95 спри температуре 20°C.
Нерегулярный стул (например, твердый стул, недостаточный объем стула, диарея) является главной проблемой большинства детей. Это может быть вызвано высоким содержанием E. coli в фекалиях. Было обнаружено, что проблемы со стулом могут быть снижены при введении неусвояемых олигосахаридов в жидкий пищевой продукт с осмолярностью в пределах от 50 до 500 мОсмол/кг, более предпочтительно от 100 до 400 мОсмол/кг. Снижение проблем со стулом усиливает колонизацию и развитие здоровой кишечной микробиоты.
Исходя из сказанного выше, также важно, что композиция жидкого пищевого продукта не имеет избыточной калорийности, однако имеет калорийность, достаточную для питания пациента. Следовательно, предпочтительно жидкий пищевой продукт имеет калорийность в пределах от 0,1 до 2,5 ккал/мл, еще более предпочтительно имеет калорийность в пределах от 0,5 до 1,5 ккал/мл, наиболее предпочтительно от 0,6 до 0,8 ккал/мл.
Применение
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиция представляет собой энтеральную питательную композицию для введения грудным детям, рожденным с проведением кесарева сечения. Предпочтительно настоящее изобретение относится к I) (i) лечению и/или профилактике заболеваний у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения и/или (ii) стимуляции здоровья грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения. Заболевания предпочтительно выбирают из группы, состоящей из кишечных расстройств, вызванных низким содержание бифидобактерий в микробиоте. Предпочтительно заболевание выбирают из группы, состоящей из аллергии, экземы, астмы, инфекций и диареи.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению питательной композиции по настоящему изобретению для лечения заболеваний, выбранных из группы, состоящей из аллергии, экземы, астмы, инфекций и диареи.
Обеспечение новорожденного, рожденного с проведением кесарева сечения, молочным продуктом, молочный субстрат которого ферментирован бактериями, продуцирующими молочную кислоту, включающим иммуногенные факторы (инактивированные клетки и/или фрагменты бактерий, такие как гликопротеины, гликолипиды, пептидогликаны, липотейховая кислота (LTA), жгутики, липопротеины, капсульные полисахариды и/или ДНК, индуцирующие толерантность к этим бактериям, повышая, таким образом, колонизацию желудочно-кишечного тракта этими бактериями и/или снижая колонизацию вредными бактериями. Также эти иммуногенные факторы оказывают прямое воздействие на стимуляцию роста бифидобактерий и/или снижение роста вредных бактерий. Индуцирование толерантности к бактериям, продуцирующим молочную кислоту, в желудочно-кишечном тракте в результате приводит к более быстрой колонизации желательными бактериями, при этом, с другой стороны, отсутствие живых клеток в продукте в результате проводит к повышенной безопасности и продукту с улучшенными технологическими свойствами.
Предпочтительно настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или лечения инфекций и/или инфекционных заболеваний, в частности инфекций желудочно-кишечного тракта, более предпочтительно лечения и/или профилактики инфекций, вызванных одним или более микроорганизмом, выбранным из группы, состоящей из Staphylococcus (в частности, S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus), Streptococcus (в частности Streptococcus группы B), Clostridium (в частности, C. difficile), Bacillus (в частности B. subtilis, Pseudomonas (в частности, P. aeruginosa), Enterobacter, Klebsiella, Acinetobacter, Proteus, Aeromonas, и Escherichia, предпочтительно Escherichia coli (E. coli), указанный способ включает введение питательной композиции по настоящему изобретению. Предпочтительно композицию по настоящему изобретению используют в способе лечения и/или профилактики кишечной инфекции, кишечного воспаления и/или диареи у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения. Предпочтительно композицию по настоящему изобретению используют в способе модуляции иммунной системы у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения. Следовательно, в дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики системных инфекций, инфекций мочевыводящих путей, отитов и/или респираторных инфекций у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, указанный способ включает введение питательной композиции по настоящему изобретению.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики аллергии (в частности, по существу пищевой аллергии, более предпочтительно аллергии на коровье молоко), атопической экземы (например, атопические дерматиты), астмы, аллергического ринита и аллергических конъюктивитов у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, еще более предпочтительно аллергии и/или астмы, указанный способ включает введение грудному ребенку композиции, включающей молочный ферментированный продукт. Это оздоравливающее воздействие достигается воздействием на иммунную систему, стенку кишечника и/или кишечную микробиоту.
В контексте настоящего изобретения термин «профилактика» заболевания или определенного расстройства также означает «лечение индивидуума от риска возникновения» указанного заболевания или указанного определенного расстройства.
Введение композиции по настоящему изобретению в результате приводит к улучшению кишечной микробиоты и последующему образованию органических кислот в качестве конечных метаболических продуктов микробной ферментации. Повышенное содержание органических кислот приводит к повышению продуцирования слизи, улучшает созревание кишечника и/или улучшает кишечный барьер. Следовательно, в дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу снижения проницаемости стенок кишечника грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, указанный способ включает введение грудному ребенку композиции, включающей продукт, полученный ферментацией бактериями, продуцирующими молочную кислоту.
Предпочтительно композицию по настоящему изобретению используют для индуцирования толерантности в кишечнике грудного ребенка, рожденного с проведением кесарева сечения, к бактериям и/или для улучшения кишечной колонизации микробиотой грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, по отношению к микробиоте грудных детей, рожденных через естественные родовые пути и/или для быстрой колонизации микробиотой богатой бактериями, продуцирующими молочную кислоту, у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения.
Также настоящее изобретение относится к способу стимуляции и развития здоровой кишечной микробиоты у грудного ребенка, включающему стадии A: смешивания I) по существу питательной или фармацевтически приемлемой жидкости; и II) сухой композиции, где сухая композиция II включает ферментированный молочный продукт по настоящему изобретению, и стадию B) введения композиции, полученной на стадии A, грудному ребенку, рожденному с проведением кесарева сечения.
Настоящую композицию предпочтительно вводят грудному ребенку, рожденному с проведением кесарева сечения, в первый год жизни, предпочтительно в течение 3 месяцев после рождения, более предпочтительно в течение шести недель после рождения, еще более предпочтительно в течение двух недель после рождения, даже еще более предпочтительно в течение одной недели после рождения, еще более предпочтительно в течение 72 часов после рождения, наиболее предпочтительно в течение 48 часов после рождения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Воздействие неусвояемых олигосахаридов на микробиоту грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения

Грудным детям вводят смесь для питания грудных детей, дополненную 0,72 г/100 мл галактоолигосахаридов (GOS) со средней СП в пределах от 2 до 7 и 0,08 г/100 мл фруктоолигосахаридов со средней СП 20 (FOS, Raftilin HP) (GFSF-группа) или стандартную смесь для питания грудных детей без неусвояемых олигосахаридов (SF-группа).
Определяют содержание бифидобактерий в фекалиях. Процент рода Bifidobacterium от всех бактерий на первой неделе 4,3% у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения (n=44) против 19,8% у грудных детей, рожденных через естественные родовые пути (n=28). Через 6 недель процент бифидобактерий составляет 12,3% в SF-группе грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения (n=21) и 17,2% в GFSF-группе грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, (n=13). pH фекалий SF-группы грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, составляет 7,2 против 6,5 в GFSF-группе грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения. Процент E. coli составляет 11,8% в SF группе грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения, и 0% в GFSF-группе грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения. (См. Таблицу 1)
Эти результат указывают на то, что введение нейтральных неусвояемых олигосахаридов грудным детям, рожденным с проведением кесарева сечения (GFSF группа), приводит к большей бифидобактериальной флоре и пониженному содержанию потенциально патогенных бактерий по сравнению с грудными детьми, рожденными с проведением кесарева сечения, не получавшими неусвояемых олигосахаридов (SF группа). Дополнительно, результаты указывают на пониженное содержание E. Coli, благодаря введению неусвояемых олигосахаридов. Результаты указывают на преимущество применения неусвояемых олигосахаридов, в частности галактоолигосахаридов и фруктоолигосахаридов, в композиции по настоящему изобретению для дополнительного улучшения терапии грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения.
Таблица 1Процент Bifidobacteria у грудных детей, рожденных через естественные родовые пути и с проведением кесарева сечения, получающих смесь для питания грудных детей с (GFSF) или без (SF) неусвояемых олигосахаридов
Грудные дети
Bifidobacteria на первой неделе (%)
Bifidobacteria на шестой неделе (%)
рН фекалий
E. coli (%)
Рожденные через естественные родовые пути
19,8
Рожденные с проведением кесарева сечения SF
4,3
12,3
7,2
11,8
Рожденные с проведением кесарева сечения GFSF
4,3
12,3
6,5
0
Пример 2: Получение ферментированного молочного продукта, включающего инактивированные B. breve.
9
Ферментированный продукт с культурой B. breve CNCM 1-2219 получают с использованием двухстадийного способа. Заквасочную культуру в форме концентрированных гранул добавляют в пастеризованное обезжиренное молоко и инкубируют в течение 8 часов при температуре 37°C при анаэробных условиях. Во время процесса множество клеток B. breve возрастает до количества 3×10 КОЕ на мл, и подкисление от около pH 6,7 до pH в пределах от 4,5 до 5,0, указывая на то, что имеет место процесс ферментации. Следовательно, присутствует цистеин в пределах от 0,1 до 0,5 г на л и/или дрожжевой экстракт в пределах от 0,5 до 5 г/л водного субстрата.
6
3
Затем этот ферментированный продукт 10-кратно разводят концентрированным пастеризованным обезжиренным молоком (43 масс.% сухих веществ) с температурой 37°C. На этой стадии разведения начальный pH молока снижается до 6-6,1. После инкубирования в течение 8 часов при температуре 37°C в танке с периодическим перемешиванием в течение 10 минут каждые 2 часа pH остается в пределах 6-6,1 и популяция B. breve составляет 10 КОЕ/мл. Концентрат пастеризуют и затем сушат с использованием распылительной сушки и получают продукт, названный BbC50cf. Количество живых клеток B. breve составляет ниже предела определения (<10 КОЕ/г).
Пример 3: Синергическое воздействие ферментированного молочного продукта, включающего инактивированные B. breve и неусвояемые олигосахариды, на повышенный ThI ответ у вакцинированной мышиной модели
Способы:
Воздействие рационов, включающих (a) BbC50cf по Примеру 2 2; (b) комбинацию галактоолигосахаридов (Elixor) и фруктоолигосахаридов (Raftilin HP); и (c) комбинацию (a) и (b), тестируют на мышиных моделях, где ответ на антиген измеряют с использованием ответа гиперчувствительности замедленного типа (DTH). Этот DTH-ответ измеряют пролиферацией ThI клеток на ушах мышей после местной сенсибилизации антигеном, присутствующим в вакцине. При ответе на инфекцию и/или вакцинацию сенсибилизация антигеном вызывает пролиферацию ThI клеток. Эти ThI клетки образуют инфильтрат на ухе при его последующей сенсибилизации антигеном и вызывают опухание. Инфильтрация ThI клетками уха происходит в течение около 24 часов с отложенным опуханием. При большем количестве пролиферированных ThI клеток во время начальной вакцинации и/или инфекции наблюдается больший DTH-ответ при сенсибилизации антигеном.
BbC50cf подвергают лиофильной сушки и используют в рационе мышей в конечной концентрации 3 масс.%. Смесь неусвояемых олигосахаридов (GF), содержащую трансгалактоолигосахариды (GOS) (источник Vivinal-GOS (Borculo Domo Ingredients, Нидерланды)) и фруктоолигосахаридов (FPS) (источник RaftilineHP, Orafti, Tiense, Бельгия), используют в массовом соотношении GOS:FPS в пределах 9:1. Тестируют рационы, содержащие 1 масс.% GF от общей массы рациона мыши. Тестируют воздействие комбинации неусвояемых олигосахаридов и смеси, ферментированной B. breve (GF плюс BbC50cf), в рационе, содержащем 1 масс.% GF и 3 масс.% BbC50cf от общей массы рациона.
Используют самок мышей C57B1/6 в возрасте 6 недель (Harlan Nederland BV, Horst, Нидерланды), группу содержат при обычном 12 часовом режиме день/ночь. В группе 10 животных и 3 животных в группах отрицательного контроля Животные получают полусинтетические рационы (Research Diet Services, Wijk bij Duurstede, Нидерланды). Контрольные рационы получают согласно спецификациям AIN93G (Reeves et al (1993) J Nutrition 123 (11): 1923-31), в рационы на основе этих спецификаций добавляют олигосахариды.
Вакцинацию начинают после 20 дневной адаптации к новым условиям содержания и рационам. Образцы крови берут перед вакцинацией, день 0. В первый день вакцинации, день 1, вакцину вводят подкожно. После трех недель, проводят ревакцинацию (день 22). Через девять дней после повторной вакцинации (день 31), проводят измерение толщины базального слоя эпидермиса уха мыши с использованием пружинного микрометра Digimatic (Mitutoyo, Veenendaal, the Netherlands) и индуцируют ответ гиперчувствительности замедленного типа (DTH), проводя инъекцию раствора антигена в.к. (внутрикожно) в ушную раковину мыши. Через 24 часа (день 32), измеряют DTH-ответ, берут образец крови и умертвляют мышь. Из толщины уха через 24 часа вычитают толщину уха t=0.
Вакцины состоят из 100 мл в.к. (внутрикожно) инъекции смесь 1:1 раствора антигена и адъюванта Stimune (Specol, Cedi-diagnostics BV, Lelystad, Нидерданды). Раствор антигена представляет собой разведение 1:100 Influvac 2002/2003 (Solvay Pharmaceuticals, Weesp, Нидерданды) в PBS. Influvac представляет собой трехвалентную белковую вакцину, содержащую 3x3011 г/мл гемагглютинина трех различных штаммов вируса гриппа. Для DTH -ответов мышам вводят в.к. 25 мкл диализированной Influvac в оба уха в качестве DTH -сенсибилизации.
Результаты:
Рационы, содержащие дозировку 1 масс.% GF или 3 масс.% BbC50cf, оба индуцируют малое статистически не значимое повышение DTH-ответа. Комбинация 1 масс.% GF и 3 масс.% BbC50cf индуцирует статистически значимое 89% повышение DTH-ответа (см. Таблицу 2). Поскольку воздействие значительно выше, чем DTH-ответы рационов, содержащих только олигосахариды, и также гораздо выше, чем аддитивное воздействие GF и BbC50cf, которое может быть рассчитано, как 49% повышение DTH, эти результаты указывают на синергическое воздействие на повышение ThI ответа, вызванное введением неусвояемых олигосахаридов и BbC50cf. Наблюдаемое воздействие указывает на преимущество использования комбинации по меньшей мере двух различных неусвояемых углеводов и продукта, полученного ферментацией молочного продукта, включающего инактивированные бактерии, продуцирующие молочную кислоту, в применениях по настоящему изобретению.
Таблица 2DTH-ответ
Группа
Средний DTH, мкм (s.e.)
∆ DTH, мкм
Относительный DTH
Sham
-1,7 (4,6)
0
0
Placebo
67,6 (14,9)
69,3
1,00
GF
73,55 (8,6)
75,25
1,09
BbC50cf
95,55 (5,5)
97,25
1,40
GF+ BbC50cf
129,4* (17,1)
131,1
1,89
GF+ BbC50cf теоретически
101,50
103,2
1,49
*значительная разница с контролем (P<0,01).
Пример 4: Синергическое воздействие ферментированного молочный продукт, включающего инактивированные B. breve и неусвояемые олигосахариды, на повышение Th2 ответа у аллергической мышиной модели.
Способы:
Воздействие рационов Примера 3 тестируют на мышиных моделях, где ответ на аллерген измеряют с использованием ответа гиперчувствительности немедленного типа (ITH). Этот ITH-ответ измеряют на ушах на повышенный Th2 ответ после сенсибилизации аллергеном легких. При ответе на аллерген в легких тучные клетки почти сразу системно дерганулируются, включая уши. Все эти реакции включают IgE, который в свою очередь требует Th2 ответа во время развития T-хелперных клеток. Следовательно, повышенный ITH указывает на повышенный IgE и, следовательно, повышенный Th2 ответ.
Используют свободных от специфических патогенов самцов мышей BALB/c, полученных от Charles River (Maastricht, Нидерланды). Используют мышей в возрасте 6-9 недель, получающих пищу и воду без ограничения. Овальбумин (степень V) и ацетил-β-метилхолин хлорид (метахолин), доступные от Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, США). Гидроксид алюминия (Alumlmject), доступный от (Rockford, IL, США).
Те же рационы по Примеру 3 тестируют в течение 14 дней перед сенсибилизацией OVA и до окончания эксперимента. Самцов мышей сенсибилизирую двумя и.п. инъекциями 10 мкг овальбумина, абсорбируемого на 2,25 мг гидроксида алюминия, в 100 мкл соляного раствора или только соляной раствор на день 0 и 7. Мышей сенсибилизируют на день 35, 38 и 41 ингаляцией аэрозоля овальбумина в камере для облучения из плексиглаза в течение 20 минут. Аэрозоль получают, поместив раствор овальбумина (10 мг/мл) в солевом растворе в небулайзер Pari LC Star (Pari respiratory Equipment, Richmond, VA, США). Аэрозоли раствора овальбумина получают с использованием небулайзера. ITH измеряют через 1 час после сенсибилизации аллергеном овальбумина.
Результаты:
Результаты ITH приведены в Таблице 3.
Таблица 3ITH-ответ
Группа
Средний DTH, мкм (s.e.)
∆ DTH, мкм
Относительный DTH
Контроль
104,3 (3,8)
0
0
Placebo
184,7 (8,7)
80,4
1
GF
159,8 (17,9)*
55,5
0,69
BbC50cf
173,1 (20,3)
68,8
0,86
GF+ BbC50cf
136,6 (14,4)**
32,3
0,40
GF+ BbC50cf теоретически
151,7
47,4
0,59
* значительная разница с контролем (*P<0,05 и ** P<0,01).
Рационы, содержащие дозировку 1 масс.% GF или 3 масс.% BbC50cf, оба индуцируют малое снижение ITH-ответа. Комбинация 1 масс.% GF плюс 3 масс.% BbC50cf индуцирует статистически значимое 60% снижение ITH -ответа (см. таблицу 3). Поскольку воздействие значительно выше, чем ответы рационов, содержащих только олигосахариды, и также гораздо выше, чем аддитивное воздействие GF и BbC50cf, которое может быть рассчитано, как 40% снижение ITH-ответа, эти результаты указывают на синергическое воздействие, вызванное введением неусвояемых олигосахаридов и ферментированного молочного продукта на снижение Th2 ответа.
3
Наблюдаемое воздействие указывает на преимущество использования комбинации неусвояемых олигосахаридов и продукта, полученного ферментацией молочного субстрата бифидобактериями с последующей их инактивацией и/или удалением бифидобактерий, таким образом, что их содержание составляет менее 1×10 КОЕ в применениях по настоящему изобретению. Результаты эксперимента показывают, что настоящее изобретение преимущественно может быть использовано для профилактики и/или лечения, в частности, астмы, аллергии, атопических дерматитов, аллергических конъюктивитов, аллергии на домашнего пылевого клеща, крапивницы и аллергических ринитов.
Пример 5: Композиция для детей, рожденных с проведением кесарева сечения
Получают смесь для питания грудных детей, включающую на 100 г сухой смеси: 13 г белка (80% казеин и 20% сыворотка); 25,5 г растительного жира; 42,25 г лактозы; 16 г мальтодекстрина; 3 г минеральных веществ; 0,25 г витаминов.
2
2
9
В коровье молоко, нагретое до температуры 75°C, добавляют растительный жир. Смесь гомогенизируют в две стадии, на первой при 200 кг/см, на второй при 50 кг/см. Добавляют водные растворы лактозы, мальтодекстрина, витаминов и минеральных веществ. Затем композицию пастеризуют при температуре 115°C и концентрируют выпариванием до 48% сухих веществ. Концентрат охлаждают до температуры 37°C и инкубируют 5% культурой B. breve 1-2219 содержащей 10 бактерий/мл и ферментируют в течение 8 часов при температуре 37°C. Затем концентрат снова пастеризуют.
Для восстановления смеси для питания грудных детей высушенный распылительной сушкой концентрат в количестве 140 г добавляют на литр воды. 100 мл готовой к потреблению смеси включают 0,72 г бета-галактоолигосахаридов и 0,08 инулина. Упаковка и/или документация, сопровождающая продукт, указывает, что продукт может быть использован для a) стимуляции кишечной колонизации полезными бактериями, b) профилактики и/или лечения инфекций у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения; и/или c) профилактики и/или лечения аллергии у грудных детей, рожденных с проведением кесарева сечения.
Пример 6: Композиция для детей, рожденных с проведением кесарева сечения
Получают смесь для питания грудных детей, включающую 21 г/л белка, 24 г/л жира, 83 г/л углеводов, 8 г/л неусвояемых олигосахаридов, г/л минеральных веществ, 0,45 г/л витаминов.
2
2
9
В УВТ стерилизованное молоко при температуре 70°С добавляют жир и смесь гомогенизируют в две стадии, на первой при 200 кг/см, на второй при 50 кг/см. При температуре 37°C смесь инокулируют 1,5% культуры B. breve 1-2219, содержащей в пределах от 1 до 5×0 бактерий/мл, и ферментируют в течение 8 часов при температуре 37°C. Затем смесь охлаждают до температуры 5°C. Оставшиеся ингредиенты растворяют в воде и добавляют в полученный в результате продукт. Композиция включает на 100 мл готовой к потреблению смеси 0,72 г бета-галактоолигосахаридов и 0,08 г длинноцепочечного и/или короткоцепочечного инулина.
Полученную в результате смесь подвергают УВТ стерилизации при температуре 140°C в течение от 6 до 7 секунд и асептически расфасовывают.