Интернализация пролин-богатых пептидов врожденного иммунитета в клетки человека in vitro

2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue

Экспериментальные модели Experimental models

острого панкреатита, что обосновывает ее применение в клинике.

ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ NK-КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ В ОТНОШЕНИИ КЛЕТОК ТРОФОБЛАСТА

Михайлова В.А., Баженов Д.О., Хохлова Е.В., Сельков С.А., Соколов Д.И.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург, Россия

ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия

Введение. NK—клетки, присутствующие в эндометрии матки, играют важную роль в процессе имплантации и в дальнейшем развитии плаценты. В течение про-лиферативной фазы менструального цикла NK-клетки матки представляют собой небольшую популяцию клеток, однако их количество в эндометрии значительно возрастает в секреторную фазу цикла. После имплантации зародыша в ходе децидуализации в эндометрии матки появляется большое количество децидуальных NK-клеток, составляющих до 70% всех лейкоцитов, присутствующих в децидуальной оболочке и примерно 30% всех клеток децидуальной оболочки. Данные литературы указывают на возможность формирования популяции NK-клеток децидуальной оболочки из NK-клеток периферической крови. В настоящее время малоизученным остается вопрос об изменении цитотоксической функции NK-клеток при контакте с клетками трофобласта при беременности. Для определения цитотоксической активности NK-клеток наиболее распространенным является метод, в котором оценивается гибель клеток-мишеней перевиваемой линии К562 после культивирования с NK-клетками. Данная система in vitro не учитывает особенностей межклеточных взаимодействий, которые могут происходить в децидуальной оболочке и плаценте, что не позволяет полноценно оценить вклад NK-клеток в развитие беременности. Поэтому целью настоящей работы была разработка и апробация нового метода оценки ци-тотоксической функции NK-клеток.

Материалы и методы. В исследование включено 89 пациентов, среди которых было 54 здоровые небеременные женщины без предшествующих беременностей в анамнезе, 14 здоровых мужчин и 21 здоровая женщина с физиологически протекающей беременностью на сроке 6-7 недель.

NK-клетки периферической крови оценивали в составе мононуклеаров, выделенных из периферической крови пациентов при помощи стандартного метода центрифугирования в градиенте плотности Histopaque-1077 (Sigma, США). После выделения мононуклеары периферической крови, содержащие NK-клетки, инкубировали в культуральной среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ пирувата натрия в течение 4 суток в присутствии IL-2 («Ронколейкин», ООО «НПК Биотех») и без него. Затем мононуклеары периферической крови в течение 4 часов инкубировали с клетками трофобласта линии Jeg-3, воспроизводящих основные морфологические, фено-

типические и функциональные характеристики инва-зивного трофобласта первого триместра беременности. Часть клеток трофобласта инкубировали в аналогичной культуральной среде без добавления мононуклеаров для определения базовой гибели клеток трофобласта. После этого оценивали количество нежизнеспособных клеток трофобласта. Полученные данные были статистически обработаны с помощью программы Statistica 10. Для сравнения полученных данных использовался U-критерий Манна—Уитни, являющийся непараметрическим аналогом t-критерия Стьюдента. Статистически значимыми признавались различия при p < 0,05.

Результаты. Установлено, что цитотоксическая активность NK-клеток в отношении клеток трофобласта была повышена в присутствии IL-2 по сравнению с цитоток-сической активностью NK-клеток, инкубированных без IL-2, во всех обследованных группах пациентов. Группа здоровых небеременных женщин не отличалась от группы здоровых мужчин по цитотоксическому эффекту NK-клеток в отношении клеток трофобласта как в присутствии IL-2, так и без него. Цитотоксическая активность NK-клеток в отношении клеток трофобласта была снижена в группе женщин с физиологической беременностью на сроке 6-7 недель по сравнению с группой здоровых небеременных женщин как в присутствии IL-2, так и без него.

Заключение. Таким образом, способность NK-клеток периферической крови повышать цитотоксическую активность в присутствии активатора (IL-2) в используемой нами системе свидетельствует о возможности применения данной модели для оценки изменений функционального состояния NK-клеток. Установленные различия цитотоксической активности NK-клеток в отношении трофобласта в группах беременных и небеременных женщин, вероятно, связаны прошедшей успешной имплантацией при физиологической беременности, и возможными контактами NK-клеток данных пациенток с клетками трофобласта in vivo, что приводит к снижению цитотоксической активности NK-клеток и преобладанию их регуляторной функции.

ИНТЕРНАЛИЗАЦИЯ ПРОЛИН-БОГАТЫХ ПЕПТИДОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА В КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO

Назаров А.С.1, 2, Кудрявцев И.В.1, Филатенкова Т.А.1, Копейкин П.М.1, Баландин С.В.3, Овчинникова Т.В.3, Артамонов А.Ю.1, Орлов Д.С.1, 2, Шамова О.В.1, 2

1 ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия

2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия

3 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия

Поиск соединений, обеспечивающих доставку лекарственных соединений в опухолевые клетки, является актуальной задачей биомедицинских исследований. Известно, что ряд пептидов, объединенных в группу Cell-Penetrating Peptides (CPP — проникающие в клетки пептиды), обладают способностью к интернализации в эукариотические клетки, а также могут переносить соединения различной природы через клеточные мембраны. Наиболее известные представители СРР — пенетратин,

«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017

Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya

ТАТ, пептид VP22 и др. В литературе имеются данные, что некоторые пептиды системы врожденного иммунитета, в частности антимикробные пептиды нейтрофильных гранулоцитов человека и животных, тоже обладают свойствами СРР и могут рассматриваться как перспективные прототипы средств доставки противоопухолевых соединений в неопластические клетки.

Цель. Изучение интернализации пролин-богатых пептидов, несущих флуоресцентную метку, в клетки человека в культуре. Объектом исследования служили синтетические аналоги пептидов семейства бактенеци-нов и их структурные модификации: минибактенецин miniChBac7.5Na, пептиды, представляющие собой фрагменты молекулы бактенецина ChBac5 — ChBac5 20-43 и ChBac5 7-22, бактенецин ChBac3.4 и его структурная модификация ChBac3.4-m. Для сравнения использовали пептид, относящийся к группе СРР — ТАТ (фрагмент кап-сидного белка вируса иммунодефицита человека, производства фирмы Sigma, США).

Материалы и методы. Исследуемые бактенецины получали путем твердофазного пептидного синтеза на приборе Symphony X (Protein Technologies, США). Осуществляли конъюгацию пептидов с флуоресцентным красителем BODIPY FL (Invitrogen, США), как описано (Шамова и соавт., 2007). Меченые пептиды очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Проникновение меченых пептидов в клетки К-562 (эритро-миелоидная лейкемия человека), ТНР-1 (моноцитарная лейкемия человека), мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) здоровых доноров in vitro количественно оценивали с помощью проточной цитоф-луориметрии по увеличению величины сигнала зелёной флуоресценции (BODIPY FL, Ex/Em 503/512) на приборе Navios™ (Beckman Coulter, США).

Результаты. Меченые пептиды в концентрации 0,2 мкМ инкубировали с клетками (100 000 клеток в 100 мкл среды RPMI 1640) в течение 60 мин при 37 °С, затем клетки осаждали центрифугированием и отмывали от избытка несвязавшегося пептида, ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере и анализировали на проточном цитофлуориметре. Перед измерением в пробы вносили раствор трипанового синего до конечной концентрации 40 мкг/мл, который служил в качестве «гасителя» флуоресценции BODIPY FL, так как, не проникая внутрь живых клеток, элиминировал сигнал от меченых пептидов, находящихся на поверхности клеток-мишеней. Установлено, что все исследуемые пептиды, несущие флуоресцентную метку, детектируются в клетках. Анализ показателей, характеризующих интенсивность флуоресценции, измеренной для трех типов клеток, обработанных пептидами, показал, что более эффективно все пептиды проникают в клетки К-562 и ТНР-1 по сравнению с МКПК здоровых доноров. Показатели, полученные для бактенецинов, были сравнимы или превышали таковые, полученные для пептида ТАТ (например, для пептида ChBac5 20-43 (0.2 мкМ) показатели интенсивности флуоресценции, выраженные в относительных единицах (отн. ед-цы), в случае клеток К-562 составили 10,1+2,32, клеток ТНР-1 - 65,3+13,4, МКПК - 5,76+2,2 отн. ед-ц; в то время как соответствующие показатели для пептида ТАТ (0,2 мкМ) составили 1,9+0,08, 4,1+1,2 и 1,26+0,07 отн. ед-ц). При этом наиболее выраженную способность проникать в исследуемые опухолевые клетки продемонстрировали пептиды ChBac5 20-43 и ChBac3.4-m.

Заключение. Полученные данные свидетельствуют о том, что исследуемые пролин-богатые пептиды обладают свойствами проникающих в клетки пептидов (CPP) и могут рассматриваться как прототипы соединений-переносчиков лекарственных средств в опухолевые клетки.

Работа поддержана грантом РФФИ № 17-04-02177а.

ВЛИЯНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ БАКТЕРИЙ НА ИММУНОТОКСИЧНОСТЬ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Нежинская Г.И.1, Ермоленко Е.И.1, 2, Евдокимова Н.Р. 1, Шабанов П.Г.1, Даниленко В.Н.3, Суворов А.Н.1, 2

1ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Ростя

2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Ростя

3 ФГБУ«Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова», Москва, Ростя

Пробиотики, созданные на основе одного или нескольких штаммов бактерий (чаще всего лактобацилл, бифидобактерий и энтерококков) оказывают влияние на микробиоту и практические все системы организма. Иммуномодулирующие действие пробиотических препаратов является одним из наиболее значимых для терапии и профилактики различных заболеваний, затрагивающих пищеварительную, нервную эндокринную и сердечнососудистую системы. Однако до сих пор остается малоизученной иммунотоксичность рассматриваемых препаратов.

Целью исследования являлось определение летальной дозы и иммунотоксического действия различных доз препарата М, включающего смесь пробиотических штаммов Enterococcus faecium L3, Lactobacillus rhamnosus K32, Bifidobacterium longum GT15 в реакциях гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), антителоо-бразования в селезенке (АОК) и оценки активности перитониальных макрофагов. В работе использовали мышей-самцов линии BALB/c (n = 90) и беспородных белых мышей (п = 120). Исследование разрабатываемой лекарственной формы M на острую токсичность показало, что LD50 составляет 2 х 109 КОЕ/мышь, а терапевтическая доза (1/100 LD50) — 2 х 107 КОЕ/мышь. В связи с данными результатами при исследовании иммунотоксичности были взяты дозы — 2 х 107 и 2 х 108 КОЕ/мышь. Препарат М вводили внутрижелудочно в соответствии с предполагаемым способом его применения в клинике (per os). Контрольные животные получали по 0,3 мл плацебо (0,9%-ный раствор NaCl). В качестве препарата сравнения использовали Линекс (Lek, Словения), содержащий L. acidophilus, B. infantis, E. faecium в дозе 5 х 107 КОЕ/мышь. Изучение влияния М на иммунитет было проведено в соответствии с ранее предложенными рекомендациями (Миронов А.Н. и соавт., 2013). Было показано, что пробиотик М в высокой дозе (2 х 108 КОЕ/мышь), но не в терапевтической, увеличивал (через 3, 6 и 24 ч) интенсивность ГЗТ, по сравнению с контролем (введением эритроцитов барана, р < 0,001, n = 10). Применение терапевтической дозы М стимулировало образование АОК в селезенке мышей (p < 0,05, n = 10), а использование высокой дозы существенно супрессировало его (р < 0,001, n = 10). Оценка модуляции ответа АОК при введении М и Линекса с оче-