МЕСТНОЕ ПРИМЕНЕНИЕ 1-ГИДРОКСИ 3,5-БИС(4′ГИДРОКСИСТИРИЛ)БЕНЗОЛА
TOPICAL USE OF 1-HYDROXY 3,5-BIS(4′ HYDROXYSTYRYL)BENZENE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к композициям и способам местного применения 1-гидрокси 3,5-бис(4’гидроксистирил)бензола.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Известны активные вещества, воздействующие на кожу с целью устранения признаков ее старения, обеспечения противовоспалительного действия или осветления.
Отдельный класс противовоспалительных средств составляют вещества, которые ингибируют ядерный транскрипционный фактор каппа-би (NF-ĸB). Например, известно, что некоторые замещенные резорцины, такие как 4-гексилрезорцин и тетрагидрокуркуминоиды, являются ингибиторами NF-ĸB. Такие составы при нанесении на кожу обеспечивают воздействие, замедляющее ее старение. Однако только относительно небольшая группа составов была идентифицирована и как эффективная, и как косметически приемлемая.
Известно, что при нанесении на кожу противовоспалительных составов, они обеспечивают антипигментационное действие. Отдельный класс противовоспалительных средств, используемых с этой целью, составляют вещества, которые уменьшают содержание меланина в меланоцитах посредством ингибирования молекул медиаторов воспаления. Однако только относительно небольшая группа составов была идентифицирована как пригодная для местного применения для регулирования образования меланина в коже.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящее время изобретатели неожиданно установили, что 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол является потенциальным ингибитором NF-ĸB и пригоден для местного нанесения на кожу и что 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол и его косметически приемлемые соли могут использоваться для устранения признаков старения кожи, являются ингибиторами образования меланина в меланоцитах и могут наноситься на кожу, нуждающуюся в осветлении.
В одном аспекте настоящее изобретение предоставляет композицию, включающую 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол или его косметически приемлемую соль; и косметически приемлемый носитель для местного применения, включающий в себя ингредиент, выбранный из группы, состоящей из увлажняющих средств, эмульгаторов, умягчителей, влагоудерживающих средств и ароматизаторов.
Кроме того, настоящее изобретение предоставляет способ ухода за кожей человека, включающий в себя местное нанесение на кожу человека композиции, включающей 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол или его косметически приемлемую соль.
Настоящее изобретение также предоставляет способ ухода за кожей с признаками старения, включающий в себя местное нанесение на кожу, нуждающуюся в таком уходе, композиции, включающей 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол или его косметически приемлемую соль.
Настоящее изобретение предоставляет способ осветления кожи, включающий в себя стадию местного нанесения на кожу, нуждающуюся в осветлении, композиции, включающей 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол или его косметически приемлемую соль.
Кроме того, настоящее изобретение предоставляет способ ингибирования роста микроорганизма, включающий в себя применение для вышеупомянутого микроорганизма 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензола или его косметически приемлемой соли.
Другие особенности и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из подробного описания изобретения и пунктов формулы изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предполагается, что специалист в данной области, основываясь на данном описании, сможет использовать настоящее изобретение в его самом полном объеме. Приведенные ниже характерные варианты осуществления изобретения следует рассматривать лишь в качестве примеров, которые ни в коей мере не ограничивают раскрываемую сущность настоящей заявки на изобретение.
Все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, если только не указано иное, имеют общепринятое значение, понятное любому специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Кроме того, все публикации, заявки на патент, патенты и другие упоминаемые в настоящем документе, ссылки включены в настоящий документ путем отсылки. Если не указано иное, процентное содержание или концентрация указываются как весовая процентная доля или концентрация (то есть, % вес). Если не определено иное, все диапазоны приводятся с включением конечных точек, например, диапазон «от 4 до 9» включает точки 4 и 9.
Описанные в настоящем документе продукты могут также быть в готовой упакованной форме. В одном варианте осуществления изобретения упаковка представляет собой емкость, например пластмассовую, металлическую или стеклянную тубу или баночку, содержащую композицию. Также продукт может иметь дополнительную упаковку, например пластмассовую или картонную, в которую помещена упомянутая емкость. В одном варианте осуществления изобретения продукт содержит композицию, являющийся предметом изобретения, и инструкцию по нанесению композиции на кожу для лечения признаков ее старения, как описывается ниже. Такие инструкции могут быть напечатаны на емкости, на вложенной аннотации или на любой дополнительной упаковке.
В настоящем документе, термин «местное применение» означает непосредственное наложение или распределение по поверхности кожи, кожи волосистой части головы или по волосам, в частности, руками или с помощью специальных средств – салфетки, ролика или аэрозоля.
В настоящем документе, термин «косметически приемлемый» означает, что ингредиенты, к которым относится термин, подходят для применения в контакте с тканями тела (например, кожей или волосами), не оказывая при этом токсического воздействия, не проявляя несовместимости, нестабильности, не вызывая раздражения, аллергических реакций и т.п.
В настоящем документе, термин «косметический» относится к составу или веществу, улучшающему внешний вид, которое сохраняет, восстанавливает, придает, имитирует или повышает физическую привлекательность или создает эффект повышения привлекательности или молодости, особенно в отношении внешнего вида ткани или кожи.
В настоящем документе, формулировка «кожа, нуждающаяся в уменьшении признаков старения» означает кожу, имеющую, в числе прочих, следующие характеристики: обвисшая, дряблая, вялая, неровная, морщинистая, истонченная и имеющая неравномерный тон. Сокращение признаков старения означает увеличение упругости кожи, улучшение текстуры кожи, сокращение морщин на коже, улучшение тона кожи или устранение дефектов кожи, обусловленных агрессивными воздействиями внешней среды.
В настоящем документе, «увеличение упругости кожи» означает повышение упругости или эластичности кожи, профилактику потери упругости или эластичности кожи либо профилактику или устранение обвисания, дряблости и вялости кожи. Упругость или эластичность кожи можно измерить при помощи кутометра. См. справочник Handbook of Non-Invasive Methods and the Skin под ред. J. Serup, G. Jemec & G. Grove, глава 66.1 (2006 г.). Потеря эластичности или упругости кожи может быть результатом воздействия ряда факторов, включая, в числе прочих, старение, повреждение под воздействием окружающей среды или результатом нанесения косметических средств на кожу.
В настоящем документе, «улучшение текстуры кожи» означает разглаживание поверхности кожи для устранения бугров или впадин на поверхности кожи.
В настоящем документе, «улучшение проявлений морщин на коже» означает предотвращение, замедление, прекращение или обращение процесса образования морщин на коже. В настоящем документе, «морщина» включает тонкие линии, тонкие морщины и крупные морщины. К примерам морщин относятся, в том числе, тонкие линии вокруг глаз (например, «гусиные лапки»), морщины на лбу и щеках, межбровные морщины и мимические морщины вокруг рта.
В настоящем документе, термин «неровная кожа» означает состояние кожи, связанное с диффузной или пятнистой пигментацией, которую можно классифицировать как гиперпигментацию, например поствоспалительную гиперпигментацию.
В настоящем документе, термин «пятнистость» означает состояние кожи, связанное с ее покраснением или эритемой.
В настоящем документе, «устранение дефектов кожи, обусловленных агрессивными воздействиями внешней среды» означает уменьшение или профилактику повреждения кожи вследствие агрессивных воздействий внешней среды. Примеры агрессивных воздействий внешней среды включают в себя, в числе прочих, повреждение кожи при использовании очистителей (например, топических очистителей, содержащих поверхностно-активные вещества), декоративной косметики, при бритье, а также при воздействии факторов внешней среды, таких как УФ-излучение (например, повреждение под воздействием солнечного излучения или повреждение под воздействием УФ-излучения от искусственных источников, например УФ-ламп и имитаторов солнечного излучения), озон, выбросы в воздушную среду, загрязнение среды, хлор и хлорсодержащие соединения, а также сигаретный дым. Эффекты агрессивных воздействий внешней среды включают в себя, в числе прочих, окислительное или нитрозативное повреждение и модификации липидов, углеводов, пептидов, белков, нуклеиновых кислот и витаминов. Эффекты агрессивных воздействий внешней среды также включают в себя, в числе прочих, потерю жизнеспособности клеток, потерю или изменение клеточных функций, изменения экспрессии генов и/или белков.
В настоящем документе, «улучшение тона кожи» означает визуальное осветление кожи (например, осветление пигментных пятен или дефектов, уменьшение желтоватого цвета кожи и/или выравнивание цвета кожи).
В настоящем документе, «кожа, нуждающаяся в уменьшении признаков воспаления» означает кожу, показывающую покраснение или эритему, отечность, либо проявляющую реактивность или чувствительность к воздействию внешних элементов. Внешние элементы включают в себя, в числе прочих, солнечные лучи (УФ-излучение, излучение видимого спектра, ИК-излучение), микроорганизмы, атмосферные загрязнители, такие как озон, выхлопные газы, хлор и соединения, выделяющие хлор, сигаретный дым, холод, нагревание. Воспалительные расстройства и смежные состояния, которые подлежат лечению или профилактике с применением композиций, составляющих предмет настоящего изобретения, включают в себя, в числе прочего, следующее: артрит, бронхит, контактный дерматит, атопический дерматит, псориаз, себорейный дерматит, экзему, аллергический дерматит, полиморфные легкие высыпания, воспалительные дерматозы, фолликулит, алопецию, воздействие ядовитого сумаха, укусы насекомых, угревое воспаление, раздражение под воздействием внешних факторов, включая, в числе прочих, химические вещества, травмы, загрязнители (такие как сигаретный дым) и воздействие солнца, вторичные состояния, связанные с воспалением, включая, в числе прочего, ксероз, гиперкератоз, зуд, поствоспалительную гиперпигментацию, рубцевание и т.п. Предпочтительно воспалительные расстройства и смежные состояния, которые подлежат лечению или профилактике с применением способов, составляющих предмет настоящего изобретения, представляют собой артрит, воспалительные дерматозы, контактный дерматит, аллергический дерматит, атопический дерматит, полиморфные легкие высыпания, раздражение, включая эритему, обусловленную внешними факторами, угревое воспаление, псориаз, себорейный дерматит, экзему, воздействие ядовитого сумаха, укусы насекомых, фолликулит, алопецию, а также вторичные состояния и т.п.
В настоящем документе термин «осветление кожи» относится, по существу, к осветлению, отбеливанию и/или выравниванию тона кожи, цвета кожи и/или оттенка кожи, и/или уменьшению желтоватого цвета кожи, и/или осветлению или уменьшению гиперпигментированных пятен и/или дефектов, включая, в числе прочего, пигментные пятна, меланиновые пятна, возрастные пятна, пятна от солнца, старческое лентиго, веснушки, простое лентиго, пигментный солнечный кератоз, себорейный кератоз, меланоз, угревые отметины, поствоспалительную гиперпигментацию, лентигиноз, эфелиды, комбинации двух или более видов дефектов и т.п. В определенных вариантах осуществления «осветление кожи» также относится к увеличению сияния кожи, полупрозрачности и свечения и/или получению более сияющего, светящегося, полупрозрачного или визуально высвеченного тона кожи или уменьшения желтоватого цвета кожи. В определенных предпочтительных вариантах осуществления, «осветление кожи» относится к осветлению и выравниванию тона кожи, увеличению сияния кожи и/или осветлению возрастных пятен.
В настоящем документе термин «кожа, требующая отбеливания», относится, по существу, к коже, показывающей одно или более свойств, выбранных из группы, состоящей из: кожи, имеющей измеренное значение классификации цвета кожи человека (индивидуальный типологический угол, ITA) менее 41, как определено в РУКОВОДСТВЕ COLIPA: GUIDELINE FOR THE COLORIMETRIC DETERMINATION OF SKIN COLOUR TYPING AND PREDICTION OF THE MINIMAL ERYTHEMAL DOSE (MED) WITHOUT UV EXPOSURE, опубликованном в 2007 г., которое включено в настоящий документ путем ссылки и дополнительно описано ниже; потемневшей и/или желтоватой кожи, включая кожу, потемневшую под воздействием УФ-излучения; кожи с неровным тоном или кожи с одним или более гиперпигментированными пятнами и/или повреждениями, включая без ограничений пигментные пятна, меланиновые пятна, возрастные пятна, пятна от солнца, старческое лентиго, веснушки, простое лентиго, пигментный солнечный кератоз, себорейный кератоз, меланоз, угревые пятна, поствоспалительную гиперпигментацию, лентигиноз, эфелиды, комбинации двух или более из них и т.п. В руководстве COLIPA цвет кожи определяют в зависимости от значения ITA следующим образом: очень светлая кожа - >55; светлая кожа - 41–55, средний цвет кожи - 28–41, темная кожа - <28. В определенных предпочтительных вариантах осуществления, термин «кожа, нуждающаяся в осветлении» относится к коже со значением ITA менее 41, таким как приблизительно 40 или менее, приблизительно 35 или менее, приблизительно 30 или менее, либо более предпочтительно приблизительно 28 или менее. В других определенных предпочтительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к композициям и способам их использования для осветления кожи с тоном, выбранным из желтоватой и/или потемневшей кожи. В других определенных предпочтительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к композициям и способам использования для осветления кожи с дефектами, выбранными из группы, состоящей из возрастных пятен, веснушек, отметин после угревой сыпи и комбинаций двух или более дефектов.
В настоящем документе, если не указано другое, все процентные содержания ингредиентов в композициях представляют собой весовой процент активного/твердого ингредиента от общего веса композиции.
В настоящем документе, «по существу, не содержащий» ингредиент означает содержание такого ингредиента меньше, чем приблизительно 1% вес., например, меньше, чем приблизительно 0,5% вес., например, меньше, чем приблизительно 0,25% вес., например, меньше, чем приблизительно 0,1% вес. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, «по существу, не содержащий» означает полное отсутствие такого ингредиента.
Композиции, являющиеся предметом настоящего изобретения, подходят для ухода за кожей человека, например, кожей лица или тела, например, для устранения признаков старения или воспаления кожи. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, композиция, являющаяся предметом настоящего изобретения, используется для лечения линий и морщин и/или утраты эластичности кожи. Композиции, являющиеся предметом настоящего изобретения, подходят для ухода за кожей человека, например, кожей лица или тела, например, для осветления кожи.
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол
Композиции, являющиеся предметом настоящего изобретения, содержат 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирол)бензол или его косметически приемлемую соль.
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол является аналогом куркумина и имеет структуру, показанную ниже:
Как описано в патенте США №7745670, 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол можно получить путем взаимодействия 1-(бромметил)-4-метоксибензола с триэтилфосфатом с помощью реакции Арбузова для получения диэтил [(4-метоксифенил)метил]фосфоната. Он соединяется с 5-метоксибензол-1,3-дикарбальдегидом с помощью гидрида натрия в качестве основания в ТГФ с последующей реакцией с трихлоридом бора и дихлорметана для замещения метоксильных групп гидроксильными группами.
Соли 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензола можно получать, например, путем взаимодействия 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензола с основанием, таким как пиперазин или другим, для получения, по меньшей мере, - соли фенолята 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензола.
Композиции для местного применения
В общем случае, 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол или его соль присутствуют в составе композиции в косметически эффективном количестве, например, от приблизительно 0,01% до приблизительно 10%, преимущественно от приблизительно 0,1% до приблизительно 5%, более предпочтительно от приблизительно 0,2% до приблизительно 2% и еще более предпочтительнее от приблизительно 0,5% до приблизительно 1,5% вес. композиции.
Композиции, являющиеся предметом изобретения, применяют местно, нанося на кожу и (или) волосы человека.
Указанные композиции могут быть пастообразными продуктами. Они могут наноситься местно путем намазывания, например, намазывания на кожу или волосы, в частности, на кожу лица или рук.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, состав, являющийся предметом настоящего изобретения, наносится местно без напряжения.
Кроме 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензола, состав может также включать косметически приемлемый носитель для местного применения, который может составлять от приблизительно 50% до приблизительно 99,99% вес. композиции (например, от приблизительно 80% до приблизительно 99% вес. композиции). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, косметически приемлемый носитель для местного применения включает воду.
Указанный косметически приемлемый носитель для местного применения может быть непригодным для приема внутрь.
Указанный косметически приемлемый носитель для местного применения может включать в себя ингредиент, выбранный из одного или нескольких из пяти следующих классов: увлажняющие средства, эмульгаторы, умягчители, влагоудерживающие средства и отдушки. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, указанный косметически приемлемый носитель для местного применения включает ингредиенты из двух или нескольких вышеупомянутых классов, например, ингредиенты из, по меньшей мере, из трех или более таких классов.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанный косметически приемлемый носитель для местного применения включает воду, эмульгатор и умягчитель.
Композиции могут быть приготовлены в форме широкого ассортимента продуктов, к которым относятся, помимо прочих, лосьоны, кремы, гели, карандаши, спреи, мази, очищающие жидкости и твердые бруски для мытья, шампуни и кондиционеры для волос, средства фиксации волос, пасты, пенки, порошки, муссы, кремы для бритья, салфетки, пластыри, гидрогели, пленкообразующие продукты, маски для лица и кожи, пленки и средства декоративной косметики, такие как тональные кремы-основы и туши. Данные типы продуктов могут содержать несколько типов косметически приемлемых носителей для местного применения, включая, в том числе, растворы, суспензии, эмульсии, например, микроэмульсии и наноэмульсии, гели, твердые вещества и липосомы.
Композиции, используемые в рамках настоящего изобретения, могут быть изготовлены в форме растворов. Растворы обычно включают в себя водные или органические растворители (например, от приблизительно 50% до приблизительно 99,99% или от приблизительно 90% до приблизительно 99% косметически приемлемого водного или органического растворителя). Примеры пригодных органических растворителей включают в себя влагоудерживающие средства (например, водоудерживающие или гигроскопичные материалы), такие как пропиленгликоль, пентиленгликоль, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, глицерин, 1,2,4-бутантриол, сложные эфиры сорбита, 1,2,6-гексантриол; а также этиловый спирт и его смеси. Растворы могут дополнительно включать в себя увлажняющее средство, например, для получения пены, например, анионное, неионное или катионное увлажняющее средство.
Составы, используемые в рамках настоящего изобретения, могут быть приготовлены в форме раствора, содержащего умягчитель. Такие препараты, предпочтительно, содержат от приблизительно 2% до приблизительно 50% умягчителя(-ей). В настоящем документе, термином «умягчители» называются материалы, используемые для предотвращения или устранения сухости кожи, например, путем предотвращения трансэпидермальной потери воды. Примеры умягчителей включают в себя гидрофобные соединения, такие как растительные масла, минеральные масла (например, вазелиновое масло), сложные жирные эфиры (например, изопропилпальмитат, c12-c15 алкил бензоат), включая жирные эфиры глицерина, кремниевые масла (например, диметикон) и т.д.
Из такого раствора можно изготовить лосьон. Лосьоны, как правило, содержат от приблизительно 1% до приблизительно 20% (например, от приблизительно 5% до приблизительно 10%) умягчителя(-лей) и от приблизительно 50% до приблизительно 90% (например, от приблизительно 60% до приблизительно 80%) воды.
Другой тип продукта, который можно изготовить из раствора, представляет собой крем. Крем, как правило, содержит от приблизительно 5% до приблизительно 50% (например, от приблизительно 10% до приблизительно 20%) умягчителя(ей) и от приблизительно 45% до приблизительно 85% (например, от приблизительно 50% до приблизительно 75%) воды.
Несмотря на то что композиция, являющаяся предметом настоящего изобретения, должна, предпочтительно, содержать воду, композиция также может быть безводной или представлять собой мазь, содержащую не воду, а органические и (или) силиконовые растворители, масла, жиры и воски. Мазь может содержать простую основу из животных или растительных масел или полутвердых углеводов. Мазь может содержать от приблизительно 2% до приблизительно 10% умягчителя(ей) плюс от приблизительно 0,1% до приблизительно 2% загущающего (желирующего) средства.
Композиция может быть приготовлена в форме эмульсии. Если носитель для местного применения представляет собой эмульсию, то от приблизительно 1% до приблизительно 10% (например, от приблизительно 2% до приблизительно 5%) данного носителя будет составлять эмульгатор(-ы). Эмульгаторы могут быть неионными, анионными или катионными. Примеры пригодных эмульгаторов включают в себя те эмульгаторы, которые обычно идентифицируются таковыми в области личной гигиены и косметических препаратов, например, катионные эмульгаторы, такие как дистерилдимониум хлорид, неионные эмульгаторы, такие как стеарет-2, стеарет-21; анионные эмульгаторы, такие как цетил фосфат калия; полимерные эмульгаторы, такие как акрилоилдиметилтаурат/ВП сополимеры и т.д.
Лосьоны и кремы можно изготовить в форме эмульсий. Как правило, такие лосьоны содержат от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% эмульгатора(-ов). Такие кремы, как правило, содержат от приблизительно 1% до приблизительно 20% (например, от приблизительно 5% до приблизительно 10%) умягчителя(-ей); от приблизительно 20% до приблизительно 80% (например, от 30% до приблизительно 70%) воды; и от приблизительно 1% до приблизительно 10% (например, от приблизительно 2% до приблизительно 5%) эмульгатора(-ов).
Препараты для ухода за кожей на основе односторонней эмульсии, такие как лосьоны и кремы типа масло-в-воде и вода-в-масле, хорошо известны в косметической отрасли и могут использоваться в рамках настоящего изобретения. В рамках настоящего изобретения также можно использовать многофазные композиции – эмульсии, такие как вода-в-масле-в-воде или масло-в-воде-в-масле. В целом такие односторонние или многофазные эмульсии содержат воду, умягчители и эмульгаторы в качестве основных ингредиентов.
Композиции, составляющие предмет настоящего изобретения, также можно изготовить в форме геля (например, водного, спиртового, водно-спиртового или масляного геля с использованием подходящего гелеобразующего агента (агентов)). Подходящие гелеобразующие агенты для водных и/или спиртовых гелей включают в себя, в числе прочего, природные камеди, акриловую кислоту (загущенную сшитым полимером), акрилатные полимеры и сополимеры, а также производные целлюлозы (например, гидроксиметилцеллюлозу и гидроксипропилцеллюлозу). Соответствующие гелеобразующие агенты для масел (например, минерального масла) включают в себя, в числе прочего, гидрогенизированный сополимер бутилена/этилена/стирола и гидрогенизированный сополимер этилена/пропилена/стирола. В таких гелях содержание гелеобразующих агентов, как правило, составляет от приблизительно 0,1% до 5% вес.
Композиции, являющиеся предметом настоящего изобретения, также могут быть изготовлены в твердой форме (например, в форме палочек на основе воска, брусков мыла, порошка или салфеток, содержащих порошок).
Композиции, которые можно использовать в рамках настоящего изобретения, могут содержать, помимо вышеупомянутых компонентов, широкий спектр дополнительных маслорастворимых материалов и (или) водорастворимых материалов, традиционно применяемых в составах для ухода за кожей и волосами в известных специалистам концентрациях.
Дополнительные косметически активные вещества
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанная композиция включает дополнительный NFĸB-ингибитор, такие как замещенный резорцин, (E)-3-(4-метилфенилсульфонил)-2-пропеннитрил (такой как «Bay 11-7082», серийно выпускаемый Sigma-Aldrich из г. Сент-Луис, штат Миссури), тетрагидрокуркуминоид (такой как Tetrahydrocurcuminoid CG, серийно выпускаемый Sabinsa Corporation из г. Пискатауэй, штат Нью-Джерси), павловнин, экстракты Павловнии (Paulownia) (например, Павловнии войлочной (Paulownia tomentosa), Paulownia fortune, Paulownia elongate, Paulownia taiwaniana и/или Paulownia kawakamii), а также их комбинации.
В одном варианте осуществления композиция также содержит другое косметически активное вещество. В настоящем документе, под «косметически активным агентом» понимается соединение (например, синтетическое соединение или соединение, выделенное из природного источника или природного экстракта), оказывающее терапевтический или косметический эффект на кожу, включая, в числе прочих, омолаживающие активные вещества, противовоспалительные средства, стимуляторы тропоэластина, средства от угревой сыпи, противомикробные средства, противогрибковые средства, внешние анальгетики, солнцезащитные средства, антиоксиданты, кератолитические средства, витамины, осветлители кожи и средства укрепления кожи.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, такое соединение включают в себя осветлитель кожи, такой как ингибитор тирозиназы, средство сокращения меланина, ингибитор переноса меланосомы, включая антагонисты PAR-2, ретиноиды, антиоксиданты, транексамовая кислота, цетилэфир гидрохлорид транексамовой кислоты, средство отбеливания кожи, линолевая кислота, двунатриевая соль аденазинмонофосфата, экстракт ромашки (Chamomilla), аллантоин, замутнитель, тальк или кремнезем, цинковая соль и т.д. или другое средство, описанное в Solano et al. Pigment Cell Res. 19 (550–571) и Ando et al. Int J Mol Sci 11 (2566–2575).
Примеры подходящих ингибиторов тирозиназы включают в себя, в числе прочих, витамин C и его производные, витамин E и его производные, койевую кислоту, арбутин, резорцины, гидрохинон, флавоны (например, флавоноиды солодки, экстракт корня солодки, экстракт корня шелковицы, экстракт корня dioscorea coposita, экстракт камнеломки и т.д.), эллаговую кислоту, салицилаты и производные, глюкозамин и производные, фуллерен, хинокитиол, дикарбоновую кислоту, ацетилглюкозамин, 5,5'-дипропилдифенил-2,2'-диол (магнолигнан), 4-(4-гидроксифенил)-2-бутанол (4-HPB), комбинации двух или более из них и т.д.
Примеры производных витамина C включают в себя, в числе прочего, аскорбиновую кислоту и ее соли, 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, аскорбилфосфат натрия, аскорбилфосфат магния и натуральный экстракт, обогащенный витамином C.
Примеры производных витамина E включают в себя без ограничений альфа-токоферол, бета-токоферол, гамма-токоферол, дельта-токоферол, альфа-токотриенол, бета-токотриенол, гамма-токотриенол, дельта-токотриенол и их смеси, ацетат токоферола, фосфат токоферола и натуральные экстракты, обогащенные производными витамина E.
Примеры производных резорцина включают в себя, в числе прочих, резорцин, 4-замещенные резорцины, такие как 4-алкилрезорцины, такие как 4-бутилрезорцин (руцинол), 4-гексилрезорцин (SYNOVEA HR, SYNTHEON), фенилэтилрезорцин (SYMWHITE, SYMRISE), 1-(2,4-дигидроксифенил)-3-(2,4-диметокси-3-метилфенил)-пропан (Nivitol, UNIGEN) и т.д., а также натуральные экстракты, обогащенные резорцинами.
Примеры салицилатов включают в себя, в числе прочего, 4-метоксисалициловую кислоту соли калия, салициловую кислоту, ацетилсалициловую кислоту, 4-метоксисалициловую кислоту и их соли.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления, ингибиторы тирозиназы включают в себя 4-замещенный резорцин, производное витамина C или производное витамина E. В более предпочтительных вариантах осуществления, ингибиторы тирозиназы содержат фенилэтилрезорцин, 4-гексилрезорцин или аскорбил-2-глюкозид.
Примеры соответствующих агентов, стимулирующих деградацию меланина, включают в себя, в числе прочего, пероксиды и ферменты, такие как пероксидазы и лигниназы. В определенных предпочтительных вариантах осуществления, агенты, ингибирующие меланин, включают в себя пероксид или лигниназу.
Примеры соответствующих ингибиторов переноса меланосомы включают в себя антагонистов PAR-2, такие как ингибитор соевого трипсина или ингибитор Баумана-Бирка, витамин B3 и его производные, такие как ниацинамид, соевая эссенция, цельная соя, соевый экстракт. В определенных предпочтительных вариантах осуществления, агенты, ингибирующие меланосомный перенос, включают в себя соевый экстракт или ниацинамид.
Примеры ретиноидов включают в себя, в числе прочего, ретинол (витамин A-спирт), ретиналь (витамин A-альдегид), ретинилацетат, ретинилпропионат, ретиниллинолеат, ретиноевую кислоту, ретинилпальмитат, изотретиноин, тазаротен, бексаротен, адапален, комбинации двух или более веществ и т.п. В определенных предпочтительных вариантах осуществления, ретиноид выбирают из группы, состоящей из ретинола, ретиналя, ретинилацетата, ретинилпропионата, ретиниллинолеата, а также комбинаций двух или более веществ. В определенных более предпочтительных вариантах осуществления, ретиноид представляет собой ретинол.
Другие средства осветления кожи включают в себя витамин B5, витамин B12, гликолевую кислоту и экстракты Павловнии (например, Павловнии войлочной (Paulownia tomentosa), Paulownia fortunei, Paulownia elongate, Paulownia taiwaniana, и/или Paulownia kawakamii).
Примеры антиоксидантов включают в себя, в числе прочих, водорастворимые антиоксиданты, такие как сульфгидрильные соединения и их производные (например, метабисульфит натрия и N-ацетилцистеин, глютатион), липоевую кислоту и дигидролипоевую кислоту, стильбеноиды, такие как ресвератрол и производные, лактоферрин, агенты, хелатирующие железо и медь, а также аскорбиновую кислоту и производные аскорбиновой кислоты (например, аскорбил-2-глюкозид, аскорбилпальмитат и аскорбилполипептид). Растворимые в масле антиоксиданты, допустимые для использования в композициях, составляющих предмет настоящего изобретения, включают в себя без ограничений бутилированный гидрокситолуол, ретиноиды (например, ретинол и ретинилпальмитат), токоферолы (например, ацетат токоферола), токотриенолы и убихиноны. Натуральные экстракты, содержащие антиоксиданты, допустимые для использования в композициях, составляющих предмет настоящего изобретения, включают в себя без ограничений экстракты, содержащие флавоноиды и изофлавоноиды, а также их производные (например, генистеин и диадзеин), экстракты, содержащие ресвератрол, и т.п. Примеры таких натуральных экстрактов включают в себя экстракт семян винограда, экстракт зеленого чая, черного чая, белого чая, сосновой коры, пиретрума девичьего, экстракт пиретрума девичьего, свободный от партенолида, экстракт овса, экстракт ежевики, экстракт скумпии, экстракт сои, экстракт помело, экстракт зародышей пшеницы, гесперидин, экстракт винограда, экстракт портулака, ликохалькон, халькон, 2,2'-дигидроксихалькон, экстракт примулы, прополис и т.п.
Другие материалы
В составах могут присутствовать и другие различные материалы, известные специалистам. Они включают в себя влагоудерживающие средства, регуляторы pH, хелатные средства (например, ЭДТК), ароматизаторы, красители и консерванты (например, бутилгидрокситолуол, бензиловый спирт).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения в композиции, по существу, отсутствуют, преимущественно полностью отсутствуют консерванты. Это обусловлено тем, что 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол и его соли преимущественно активно участвуют в процессах подавления и уничтожения микроорганизмов. Соответственно, композиции, составляющие предмет настоящего изобретения, можно составлять с небольшим количеством обычных консервантов или вообще без них. Обычные консерванты выбраны, например, из группы, состоящей из парабенов, бензойной кислоты и ее солей, феноксиэтанола, изотиазолонов, имидазолидинилмочевины, йодопропинил бутилкарбамата, гидантоина DMDM, каприлил гликоля, дегидроуксусной кислоты, сорбиновой кислоты и ее солей, хлорфензина, глицерилкаприлата, фенилпропанола, левулината натрия, анисовой кислоты, этилгексилглицерина, бензилового спирта и их сочетаний.
Такие композиции, а также составы и продукты, содержащие эти композиции, могут быть изготовлены с использованием методов, хорошо известных среднему специалисту в данной области.
Способы применения
Составы, являющиеся предметом изобретения, могут применяться местно путем нанесения на кожу человека, например на кожу, которой необходимо лечение одного или нескольких признаков старения, описанных выше. В одном варианте осуществления изобретения композиции наносятся на кожу, которая нуждается в лечении борозд, морщин и (или) в лечении утраты эластичности. Композиции можно наносить на нуждающуюся в таком лечении кожу в рамках соответствующей схемы лечения, например, ежемесячно, еженедельно, через день, ежедневно, дважды в день и т.д.
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол, его косметически приемлемые соли и композиции, его содержащие, могут использоваться для обеспечения противомикробного воздействия (например, бактерицидного, противогрибкового, антивирусного или противопаразитарного эффектов).
В одном варианте осуществления изобретение предоставляет способ подавления роста микроорганизма, включающий применение для вышеупомянутого микроорганизма 1-гидроксил 3,5-бис(4'гидроксилстирил)бензола, его косметически приемлемой соли или композиции, их содержащей.
Микроорганизмы, которые могут быть подавлены или уничтожены таким применением, включают в себя грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии и грибки, включающие золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), эпидермальный стафилококк (Staphylococcus epidermidis), пропионовую бактерию акне (Propionibacterium acnes), кишечную палочку (Escherichia coli), синегнойную палочку (Pseudomonas aeruginosa), кандиду белую (Candida albicans) и черную плесень (Aspergillus niger).
Предполагается, что специалист в данной области, основываясь на данном описании, сможет использовать настоящее изобретение в его самом полном объеме. Приведенные ниже характерные варианты осуществления изобретения следует рассматривать лишь в качестве примеров, которые ни в коей мере не ограничивают раскрываемую сущность настоящей заявки на изобретение. Приводимые ниже неисключительные примеры являются дальнейшей иллюстрацией изобретения.
Пример 1. Ингибирование NF-ĸB
ТЕСТЫ ИНГИБИРОВАНИЯ NF-ĸB были выполнены для различных концентраций 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензола и контроля несущей среды (ДМСО). 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол был приготовлен, как описано в патенте США №7745670.
ТЕСТ ИНГИБИРОВАНИЯ NF-ĸB был выполнен следующим образом. Клетки сердечной мышечной ткани крыс H9c2 были приобретены у компании ATCC (г. Манасас, штат Вирджиния). Культуры поддерживали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) (компания Invitrogen Life Technologies, г. Карлсбад, штат Калифорния) с добавлением 10-процентной фетальной бычьей сыворотки, 100 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (компания Invitrogen life technologies, г. Карлсбад, штат Калифорния). 1×104 клеток, выращенных на 96-луночных планшетах, временно трансфицировали введением в каждую лунку по 0,45 мкг общей ДНК с использованием Lipofectamine 2000 (компания Invitrogen life technologies, г. Карлсбад, штат Калифорния). Во всех случаях трансфекции в качестве внутреннего контроля, помимо промотора люциферазы NF-kB, использовали конструкт с промотором тимидинкиназы и репортерным геном люциферазы Renilla (pRL-TK, компания Promega, г. Мадисон, штат Висконсин). Через сутки после трансфекции клетки обработали указанными образцами (в ДМСО в качестве несущей среды) в указанных концентрациях и стимулировали воздействием 100 нг/мл фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α, Sigma-Aldrich, г. Сент-Луис, штат Миссури) в течение приблизительно 24 часов, затем их лизировали для анализа люциферазы с использованием системы Dual-Luciferase Reporter System производства компании Promega (г. Мадисон, штат Висконсин) в соответствии с протоколом производителя. Иными словами, сначала измеряли активность люциферазы светляка (отображающую активность промотора NF-kB), затем активность люциферазы Renilla (внутренний контроль) с использованием люменометра LMAX производства Molecular Devices (г. Саннивейл, штат Калифорния). Для оценки активности каждого промотора использовали соотношение активностей двух данных люцифераз (RLU):
Ингибирование NF-ĸB = [1-(RLUобразец /RLUконтроль)]*100
где RLUобразец и RLUконтроль - нормализованные показатели активности люциферазы для образца и контроля соответственно.
Результаты приведены в таблице 1, где указано значение активации репортерного гена для NF-kB (люминесценция, L). Также приводится процентное значение ингибирования NF-kB.
ТАБЛИЦА 1
Активация репортерного гена для NF-kB (люминесценция, L)
Процентная доля ингибирования NF-kB
Без обработки
131,5±
-
Стимуляция с помощью TNFα (100 нг/мл), «L<sub>контроль</sub>»
452,4
-
TNFα + несущая среда (0,1% ДМСО)
588,3
0%
TNFα + 1-гидрокси 3,5-бис(4’гидроксистирил)бензол (0,2 мкг/мл)
585,5±
0,5%
TNFα + 1-гидрокси 3,5-бис(4’гидроксистирил)бензол (0,5 мкг/мл)
458,6±
22,1%
TNFα + 1-гидрокси 3,5-бис(4’гидроксистирил)бензол (1 мкг/мл)
283,8±
51,7%
TNFα + 1-гидрокси 3,5-бис(4’гидроксистирил)бензол (2 мкг/мл)
170,5±
71,0%
TNFα + 1-гидрокси 3,5-бис(4’гидроксистирил)бензол (4 мкг/мл)
22,6±
96,1%
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол продемонстрировал сильное снижение воспалительной реакции при содействии фактора NF-kB в клетках кожи человека.
Пример 2. Противовоспалительная активность
Противовоспалительная активность при местном применении 1-гидрокси 3,5-бис(4’гидроксистирил)бензола и его паперазиновая соль оценивались следующим образом.
2
2
Эпидермальные эквиваленты (EPI 200 HCF), многослойный и дифференцированный эпидермис, состоящий из нормальных человеческих эпидермальных кератиноцитов, приобрели у компании MatTek (г. Ашленд, штат Массачусетс). После получения эпидермальные эквиваленты инкубировали в течение 24 часов при 37°C в стабилизирующей среде без гидрокортизона. Эквиваленты были местно обработаны (2 мг/см) 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензолом в несущей среде этанол + пропиленгликоль 70:30 два часа перед облучением солнечным светом ультрафиолетового диапазона (имитатор солнечного света 1000W-Oriel, оборудованный фильтром Schott WG 320 1 мм; применяемая доза УФ-облучения: 70 кДж/м на длине волны 360 нм). Эквиваленты инкубировали в течение 24 часов при 37°C в стабилизирующей среде, затем надосадочную жидкость анализировали на высвобождение цитокина IL-8 с помощью доступных в продаже наборов (Millipore Corp., г. Биллерика, штат Массачусетс).
Результаты приведены в таблице 2.
ТАБЛИЦА 2
Образец
Изменение одной несущей среды (приведенной к 100)
% ингибирования после УФ-обработки
Несущая среда (70/30: этанол + пропиленгликоль)
100±28
-
Несущая среда + УФ
134±42
-
УФ + 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - свободный фенол (0,5%)
82±21
39%
УФ + 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - свободный фенол (1%)
80±26
40%
УФ + 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - паперазиновая соль (0,5%)
85±14
37%
УФ + 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - паперазиновая соль (1%)
81±31
40%
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол и его паперазиновая соль показали сильное снижение воспаления клеток кожи человека, вызванного УФ-излучением.
Пример 3. Индукция экспресии генов эластина и коллагена1A
Первичный фибробласт кожи человека (компания Lifeline Cell Technologies, г. Фредерик, штат Мэриленд) выращивался до слияния в среде DMEM (компания Invitrogen Life Technologies, г. Карлсбад, штат Калифорния) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина на 24-луночном планшете с культурами тканей, после чего была произведена обработка 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензолом (0,1мкг/мл) с TNF-a и без TNF-a на протяжении 48 часов. После обработки клетки подвергались лизису с помощью буфера RLT, и тотальная РНК была выделена с помощью мини-набора RNeasy (компания Qiagen, г. Валенсия, штат Калифорния). Количественная ПЦР была выполнена с помощью системы ПЦР Gene Amp PCR System 9700 и циклера системы ПЦР в реальном времени 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems)/Life Technologies, г. Карлсбад, штат Калифорния). Использовались праймеры эластина (Qiagen) и коллагена1α1 (последовательность заказчика - смысловая: 5'-TCC-CCA-GCT-GTC-TTA-TGG-CT-3' и антисмысловая: 5'-CAG-GCA-CGG-AAA-TTC-CTC-C-3'). Конститутивный ген GAPDH использовался для нормировки (последовательность праймера заказчика: F 5'-ATC-TCT-GCC-CCC-TCT-GCT-G-3' и R 5'-ATG-GTT-CAC-ACC-CAT-GAC-GA-3'; Компания Invitrogen/Life Technologies, г. Карлсбад, штат Калифорния). Кратность изменения в ПЦР (нормированная к GAPDH) подсчитывалась из данных без обработки.
Полученные результаты показаны в таблицах 3A и 3B.
ТАБЛИЦА 3A
Коллаген1A Нормированная кратность изменений в ПЦР (Средняя)
Эластин Нормированная кратность изменений в ПЦР (Средняя)
Без обработки
1,0
1,0
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол (0,1мкг/мл)
2,96
6,23
ТАБЛИЦА 3B
Коллаген1A Нормированная кратность изменений в ПЦР (Средняя)
Эластин Нормированная кратность изменений в ПЦР (Средняя)
Без обработки
1,0
1,0
TNF-α (10 нг/мл)
0,52
0,41
TNF-α (10 нг/мл) + 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол (0,1 мкг/мл)
1,36
1,12
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол увеличил экспрессию генов, связанных с производством коллагена и эластина.
Пример 4. Ингибирование TNFα - индуцированных уровней MMP-9
Способность 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензола ингибировать индуцированные TNF-a уровни MMP-9 была протестирована при различных уровнях концентрации следующим образом. Образование MMP-9, индуцированного TNFα, задействовано в нежелательном разрушении внеклеточного матрикса кожи человека.
2
Эпидермальные эквиваленты (EPI 200 HCF) были приобретены в компании MatTek (г. Ашленд, штат Массачусетс). После получения эпидермальные эквиваленты инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°C в стабилизирующей среде без гидрокортизона. Эквиваленты местно обрабатывали (2 мг/см) экстрактами 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензола в несущей среде 70% этиловый спирт/30% пропиленгликоль в течение 2-х часов перед обработкой TNFα (100 нг/мл). Эквиваленты инкубировали в течение 48 часов при температуре 37°C в стабилизирующей среде, затем анализировали MMP-9 в надосадочной жидкости с помощью доступных в продаже наборов (компания R&D Systems, г. Миннеаполис, штат Миннесота).
Результаты приведены в таблице 4.
ТАБЛИЦА 4
Обработка (доза в % масса/объем)
Среднее высвобождение MMP-9 (нг/мл)
Процент ингибирования производства MMP-9 (от одного TNFα)
Без обработки
1422±611
-
Только TNFa
3557±1181
-
TNFa + 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол (0,25%)
1392±627
60,9
TNFα + 1-гидрокси 3,5-бис(4’гидроксистирил)бензол (0,5%)
1012±249
71,6
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол ингибировал образование MMP-9, индуцированное TNFα.
Пример 5. Тест ингибирования меланогенеза
Ультрафиолетовое (УФ) излучение солнца является наиболее важным внешним раздражителем для образования меланина, вызывающего потемнение кожи. Снижение образования меланина в коже может быть достигнуто путем ингибирования нескольких шагов процесса биогенеза меланина. Тирозиназа является ключевым регуляторным ферментом меланогенеза. Агенты, ингибирующие тирозиназу, будут снижать синтез меланина.
1-гидрокси 3,5-бис(4’гидроксистирил)бензол (0,0001, 0,001 и 0,01% вес./объем) был протестирован на ингибирование тирозиназы следующим образом.
Образцы грибной тирозиназы (Sigma, T7755, 10 U/реакция) были протестированы с помощью образцов 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензола и эталонных образцов. Реакция была инициирована путем добавления 10 миллимолей L-дигидроксифенилаланина (Research Organics, #2111D) при температуре 37°C. Активность тирозиназы измерялась путем измерения поглощения света (оптической плотности) на длине волны 492 нм через 30 мин как в эталонных образцах (не подвергались воздействию тестового состава), так и в тестовых образцах, которые подверглись воздействию тестового состава.
Процент ингибирования тирозиназы определялся по уменьшению поглощения на 492 нм (относительно эталонного образца) по следующей формуле:
эталон
тест
эталон
Процент ингибирования тирозиназы = [T-T/T)]*100
эталон
тест
где T - это активность тирозиназы эталонного образца и T - это активность тирозиназы в присутствии тестового состава. Было проведено два параллельных тестирования образцов, и были подсчитаны средний процент ингибирования тирозиназы и среднеквадратичное отклонение. Средняя оптическая плотность эталонного образца составляла 0,622.
Результаты представлены в таблице 5.
ТАБЛИЦА 5
Процент ингибирования активности тирозиназы (среднее значение ± среднеквадратичное отклонение)
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - свободный фенол (0,0001%)
3,3±1,95
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - свободный фенол (0,001%)
8,21±1,27
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - свободный фенол (0,01%)
11,84±3,22
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - пиперазиновая соль (0,0001%)
2,03±3,94
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - пиперазиновая соль (0,001%)
11,52±3,16
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - пиперазиновая соль (0,01%)
16,64±2,76
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол показал существенное и зависящее от дозы ингибирование активности фермента тирозиназы.
Пример 6. Ингибирование меланогенеза, индуцированного УФ-излучением.
Были подготовлены один или несколько образцов клеток B16(F10), каждый из которых предварительно обработали тестовым образцом с последующей обработкой УФB, как описано ниже. При воздействии УФB происходила стимуляция меланогенеза в клетках, после чего тестируемые соединения оценивали на способность ингибировать или замедлять скорость меланогенеза. Клетки лизировали для измерения содержания белка на длины волны 595 нм и содержания меланина на длине волны 470 нм. Потенциал тестируемых соединений определяли путем сравнения % ингибирования, достигнутого в тестируемых соединениях, относительно обработанного эталонного образца.
2
2
В первые сутки, клетки мышиной меланомы B16(F10) высевали на планшеты 60 мм с плотностью ~1 миллион клеток на планшет и инкубировали в течение 48 часов при температуре 37°C в среде с содержанием 5% CO. На вторые сутки клетки с уровнем конфлюэнтности 90-100% были обработаны тестируемым соединением с заданной концентрацией (например, 25 мкг/мл) в течение двух часов (только для образцов с тестируемым соединением) с последующей обработкой УФВ 200 мДж/см (для тестируемых образцов и обработанного эталонного образца). Клетки отбирали на третьи сутки (24 ч после обработки УФB для тестируемых образцов и обработанного эталонного образца) и лизировали в белковом лизирующем буферном растворе (50 ммоль Tris, pH 8,2 ммоль ЭДТА, 150 ммоль NaCl и 1% Triton X 100 - неионогенное ПАВ производства компании BioRad, № по каталогу: 161-0407), а также центрифугировали.
Полученная надосадочная жидкость была хорошо перемешана с красителем белка для анализа (реактив для анализа белков Bio-rad), и затем на спектрофотометре (Molecular Devices VERSAmax) была измерена оптическая плотность (ОП) образца на длине волны 595 нм, которая записывалась как «ОП для анализа содержания белков». Клеточная масса, оставшаяся после удаления надосадочной жидкости, была растворена в щелочном буфере ДМСО и затем на спектрофотометре аналогичным образом на длине волны 470 нм был измерен коэффициент поглощения полученного раствора для определения содержания меланина. Коэффициент поглощения был записан как «ОП для анализа содержания меланина».
Эталонные образцы клеток мышиной меланомы B16(F10) были подготовлены и собраны, как указано выше, но без добавления какого-либо тестируемого образца и без воздействия УФВ (необработанный эталонный образец). Другие образцы были подготовлены и собраны, как указано выше, но без добавления тестируемого образца и с воздействием УФВ, как описано ниже (обработанный эталонный образец).
Были подготовлены по три образца для необработанных эталонных образцов, обработанных эталонных образцов и для каждого тестируемого образца, и во всех образцах была измерена оптическая плотность для определения содержания меланина и белков. Нормированный меланин для каждого необработанного эталонного образца (3 образца), обработанного эталонного образца (3 образца) и тестируемого образца (по 3 образца для каждого тестируемого соединения) определяли из следующего уравнения:
Нормированный меланин = ОП для анализа содержания меланина/ОП для анализа содержания белков.
Были подсчитаны средние значения нормированного меланина для необработанных эталонных образцов и обработанных эталонных образцов (сумма трех полученных значений, разделенная на три).
Значения воздействия для эталонного образца (которое можно понимать как увеличение меланина, вызванное воздействием УФ-излучения, без использования какого-либо тестируемого образца для снижения меланогенеза) было определено как разность между средним значением нормированного меланина обработанного эталонного образца и средним значением нормированного меланина необработанного эталонного образца. Аналогичным образом, значение воздействия для каждого тестируемого образца (которое можно понимать как дополнительное количество меланина относительно базового уровня образца, не обработанного УФ-излучением) было определено как разность между значением нормированного меланина тестируемого образца и средним значением нормированного меланина необработанного эталонного образца. Затем процент ингибирования для каждого тестируемого образца был получен из следующего уравнения:
Процент ингибирования = 100 × [(значение воздействия для эталонного образца – значение воздействия с тестируемым образцом)/значение воздействия для эталонного образца].
Среднее значение процента ингибирования было подсчитано как сумма трех полученных значений процента ингибирования для каждого тестируемого образца, разделенная на три.
Последовательность подсчета процента ингибирования показана на примере 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензола - свободный фенол (0,0001%) в таблице 6A ниже.
ТАБЛИЦА 6A
Пример подсчета процента ингибирования меланогенеза, вызванного воздействием УФ-излучения
Средний нормированный меланин, необработанный эталонный образец
0,122
Средний нормированный меланин, эталонный образец обработан УФB
0,234
Значение воздействия для эталонного образца
0,234-0,122=0,112
Значение нормированного меланина (образец двойного тестирования S1 и S2)
0,19 (S1)0,187(S2)
Значение воздействия для тестируемого образца
0,19-0,122=0,0680,187-0,122=0,065
Процент ингибирования для тестируемого образца
[(0,112-0,068)/0,112]×100=39,05% (S1)[(0,112-0,065)/0,112]×100=41,93% (S2)Среднее значение = (39,05+41,93)/2=40,49%
1-гидрокси 3,5-бис(4’гидроксистирил)бензол и его пиперазиновая соль были оценены с точки зрения ингибирования меланогенеза, вызванного УФ-излучением Тест описан выше. Результаты представлены в таблице 6B.
ТАБЛИЦА 6B
Процент ингибирования меланогенеза, вызванного УФ-излучением
Процент ингибирования меланогенеза, вызванного УФ-излучением (среднее значение ± среднеквадратичное отклонение)
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - свободный фенол (0,00001%)
18,93±5,92
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - свободный фенол (0,00005%)
33,27±4,39
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - свободный фенол (0,0001%)
40,49±2,04
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - пиперазиновая соль (0,00001%)
13,93±11,33
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - пиперазиновая соль (0,00005%)
33,52±1,54
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - пиперазиновая соль (0,0001%)
55,70±4,44
1-гидрокси 3,5-бис(4’гидроксистирил)бензол и его пиперазиновая соль показали сильное ингибирование меланогенеза, вызванного УФ-излучением.
Пример 7. Ингибирование пигментации
Ткани эпидермальных эквивалентов кожи, полученные с помощью системы MelanoDerm™ производства компании MatTek's, использовались следующим образом. Система MelanoDerm™ производства компании MatTek состоит из нормальных человеческих эпидермальных кератиноцитов (NHEK) и меланоцитов (NHM), которые культивировали для образования многослойной и высокодифференцированной модели эпидермиса человека. В частности, в следующих тестах использовали ткани MEL-300-B по 9 мм в диаметре.
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол и его пиперазиновая соль были приготовлены в соответствующей несущей среде и ежедневно наносились местно на модель кожи. Эксперимент длился 8 суток. Измерение проводили на 9 сутки.
Степень осветления для каждой ткани модели кожи (L-значение) определяли с помощью спектрофотометра (Konica Minolta CM-2600d). ΔL (степень осветления по сравнению с эталонным образцом, обработанным несущей средой (инертным веществом)) для каждого тестируемого образца подсчитывалась по следующей формуле:
ΔL = L-значение обработанного образца–L-значение эталонного образца
Полученные результаты приведены в таблице 7.
ТАБЛИЦА 7
Степень осветления (ΔL)
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - пиперазиновая соль (0,1%)
1,46±0,71
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - пиперазиновая соль (0,25%)
2,83±0,41
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - пиперазиновая соль (0,5%)
4,60±0,61
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол - свободный фенол (0,5%)
4,23±0,64
1-гидрокси 3,5-бис(4’гидроксистирил)бензол и его пиперазиновая соль показали ингибирование меланогенеза в тканях эпидермального эквивалента.
Пример 8
Активность 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензола была оценена на основании анализа грамположительных бактерий, грамотрицательных бактерий и двух представителей вида грибковых следующим образом.
Исходный 4% раствор (40 мг/мл) был приготовлен путем взвешивания 200 мг порошка 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензола (тестируемого препарата) в пробирке желтого цвета и растворения его в 5 мл ДМСО посредством интенсивного перемешивания при комнатной температуре.
Было выполнено тестирование антимикробной чувствительности для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) тестируемого препарата путем анализа питательной среды, основанного на стандартном протоколе Национального комитета по клиническим и лабораторным стандартам (НККЛС) (NCCLS, 2000). МИК в этом анализе была определена как самая низкая концентрация тестируемого препарата, которая ингибировала видимый рост исследуемых микроорганизмов.
Было протестировано семь разных микроорганизмов: три (3) грам-положительные бактерии (золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) (MO-012-015), эпидермальный стафилококк (Staphylococcus epidermidis)(MO-012-045) и пропионовая бактерия акне(Propionibacterium acnes) (ATCC# 6919)), две (2) грам-отрицательные бактерии (кишечная палочка(Escherichia coli) (ATCC# 8739) и синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) (ATCC# 9027)) и два (2) представителя вида грибковых (кандида белая(Candida albicans) (ATCC# 10231) и черная плесень (Aspergillus niger) (ATCC# 16404)). Все образцы, за исключением стафилококков, были получены из Американской коллекции типовых культур (АКТК). Два (2) образца стафилококков, были получены как клинические изоляты.
МИК для каждого из семи штаммов была определена для тестируемого препарата с помощью титров раствора, приготовленных из исходного 4% вес./объем раствора тестируемого препарата для получения составов для исследования с начальными концентрациями 1,00% вес./объем и 0,25% вес./объем.
Тест на антимикробную восприимчивость был выполнен в 96-луночном планшете для микротитрирования. Во время этого тестирования два титра стартовой концентрации раствора тестируемого препарата было последовательно приготовлены в первых 10 рядах микропланшета (ряды 11 и 12 служили в качестве положительных и отрицательных контрольных проб для тестируемого организма).
6
Для каждого организма была подготовлена взвесь инокулята, которая была подогнана для оптической плотности на длине волны 600 нм (OD600). Указанная взвесь была разведена в соотношении 1:100, и 100 мкл было добавлено в каждую лунку микропланшета для получения конечной взвеси ~1*10 КОЕ/лунка.
Планшеты были закрыты и инкубированы при температуре 35°C для бактерий (пропионовая бактерия акне (Propionibacterium acnes) была инкубирована в анаэробных условиях) и при температуре 25°C для грибковых. Микропланшеты инкубировали 48 часов, после чего была подсчитана МИК (планшеты с пропионовой бактерией акне (Propionibacterium acnes) инкубировали ~72 часа, планшеты с грибковыми инкубировались ~120 часов). МИК была самой низкой концентрацией антимикробного агента, которая не дала визуально проверенного роста после инкубации.
Анализ минимальной концентрации биоцида (МКБ) разработан для определения самой низкой концентрации, при которой тестируемый препарат демонстрирует бактерицидные и фунгицидные свойства по отношению к конкретному микроорганизму. После анализа планшета на МИК, репликатор Multi-Blot на 96 твердотельных пипеток был стерилизован на огне, охлажден и отцентрирован таким образом, что каждая пипетка погружалась в отдельную лунку микропланшета для МИК. Затем репликатор использовался для создания планшета со свежим агаром, чтобы небольшая аликвота объема из лунки микропланшета для МИК внедрялась в матрицу агара планшета для МКБ. Микропланшеты инкубировались 48 часов, после чего была подсчитана МКБ (планшеты с пропионовой бактерией акне (Propionibacterium acnes) инкубировались ~72 часа, планшеты с грибковыми инкубировались ~120 часов). Минимальная концентрация биоцида (МКБ) определялась как минимальная концентрация биоцида, при которой отсутствовал рост бактерий или грибков.
Значения МИК и МКБ подсчитывались для тестируемого препарата по отношению к каждому тестируемому организму. Полученные результаты приведены в таблице 8.
ТАБЛИЦА 8
Тест
Золотистый стафилококк
Эпидермальный стафилококк
Пропионовая бактерия акне
Кишечная палочка
Синегнойная палочка
Кандида белая
Черная плесень
МИК
0,0004%
0,0008%
0,0008%
0,031%
0,25%
≤0,002%
0,50%
МКБ
0,0008%
0,0008%
0,0008%
≥1,0%
≥1,0%
≥0,002%
≥1,0%
Данные представлены как значения (%, вес/объем) МИК и МКБ (минимальная ингибирующая концентрация и минимальная концентрация биоцида), и показывают, что 1-гидрокси 3,5-бис(4’гидроксистирил)бензол обнаружил ингибирование роста грамположительных бактерий, грамотрицательных бактерий и представителей вида грибковых. Состав также показал биоцидную активность по отношению к грамположительным бактериям и дрожжевым грибкам. Кроме того, указанные данные дают основание прийти к выводу, что 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол увеличил активность против грамположительных бактерий и дрожжевых грибков по сравнению с грамотрицательными бактериями и плесневыми грибками.
Пример 9
Композиция по данному изобретению подготовлена путем смешивания ингредиентов в таблице 9.
ТАБЛИЦА 9
Торговое название
Название по INCI
% вес
Деионизированная вода
Вода
70,64
Хлорид натрия
Хлорид натрия
0,01
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол
1,00
Снежно-белое вазелиновое масло
Вазелин
4,00
ISOFOL 28
Додецилгексадеканол
2,50
DOW CORNING Q7-9120 (20 сСт)
Диметикон
1,25
KESSCO IPP
Изопропилпальмитат
0,00
VARISOFT TA-100
Хлорид дистеарилдимония
5,00
Глицерин
Глицерин
12,00
Бензиловый спирт
Бензиловый спирт
0,60
В реакционный сосуд добавляют воду. Начинают перемешивание и добавляют соль, перемешивание продолжают до растворения соли. Включают нагрев и продолжают перемешивание до достижения температуры 85°C. 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол растворяется в глицерине, затем добавляется, но при этом перемешивание продолжается, и поддерживается температура 85°C. Добавляется хлорид дистеарилдимония, а также вазелиновое масло и додецилгексадеканол, диметикон и изопропилпальмитат. Композицию перемешивают при температуре 85°C еще 10-15 минут. Затем прекращается нагрев композиции, она перемешивается и охлаждается. При 40°C добавляется бензиловый спирт, при необходимости с водой, композиция перемешивается и охлаждается до 30-35°C. Затем композиция наполняет упаковку.
Композиция по данному изобретению подготовлена путем смешивания ингредиентов в таблице 10.
ТАБЛИЦА 10
Торговое название
Название по INCI
% вес.
Деионизированная вода
Вода
70,55
Снежно-белое вазелиновое масло
Вазелин
4,00
ISOFOL 28
Додецилгексадеканол
2,50
DOW CORNING Q7-9120 (20 сСт)
Диметикон
1,25
БГТ
БГТ
0,10
KESSCO IPP
Изопропилпальмитат
3,00
VARISOFT TA-100
Хлорид дистеарилдимония
5,00
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол
1,0
Глицерин
Глицерин
12,00
Ретинол 10S
Глицин сои (соя) масло и ретинол
1,00
Бензиловый спирт
Бензиловый спирт
0,60
В реакционный сосуд добавляют воду и устанавливают температуру 85°C. Начинают перемешивание и добавляют глицерин, перемешивание продолжают до растворения глицерина. Добавляется VARISOFT TA-100, а также вазелиновое масло и ISOFOL 28, DOW CORNING Q7-9120 20 CS и изопропилпальмитат. Композицию перемешивают при температуре 85°C еще 10-15 минут. Затем прекращается нагрев композиции, она перемешивается и охлаждается.
Композиция по данному изобретению подготовлена путем смешивания ингредиентов в таблице 11.
ТАБЛИЦА 11
Торговое название
Название по INCI
% вес.
Деионизированная вода
Вода
73
HYDROLITE 5
Пентиленгликоль
5
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол
5
NATRULON OSF
Олеосома сафлора красильного
10
FINSOLV TN
Алкилбензоат C12–15
4
ARISTOFLEX AVC
Сополимер акрилоилдиметилтаурата аммония/ВП
2
Экстракт Tanacetum parthenium
Сок листьев/цветов/стеблей Chrysanthemum Parthenium (пиретрума девичьего)
1
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол взвешивался и растворялся в HYDROLITE 5, деионизованная вода добавлялась до образования фазы A. Олеосомы и FINSOLV TN перемешивали до образования фазы B. Фаза B очень медленно добавлялась к фазе A при непрерывном перемешивании. Перемешивание продолжалось в течение 15 минут до получения однородной эмульсии. К эмульсии при непрерывном быстром перемешивании добавлялся ARISTOFLEX AVC до получения густого и однородного состава.
Композиция по данному изобретению подготовлена путем смешивания ингредиентов в таблице 12.
ТАБЛИЦА 12
Торговое название
Название по INCI
% вес.
Деионизированная вода
Вода
67,70
Карбомер
Поперечносшитая полиакриловая кислота
0,60
VERSENE NA
Двунатриевая ЭДТА
0,20
Brij 72
Стеарет-2
0,75
Brij 721
Стеарет-21
1,50
FINSOLV TN
Алкилбензоат C12–15
2,00
Диметикон NF
Силиконовая жидкость Dow corning Q7-9120 (20 сСт)
5,00
PHENONIP XB
Феноксиэтанол, метилпарабен, этилпарабен, пропилпарабен
1,00
LYS'LASTINE
Peucedanum graveolens (10% активного вещества)
10,00
SYMMATRIX
Мальтодекстрин, Rubus Fruticosus
10,00
Экстракт листьев (ежевики) (10% активного вещества)
1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол
0,25
Глицерин
Глицерин
1,0
Масляная фаза была приготовлена путем добавления FINSOLV TN в чистый стеклянный лабораторный стакан. Начинается перемешивание, и сосуд нагревают до температуры 55-60°C. Когда масляная фаза достигает температуры 55°C или выше, добавляются Brij 72 и Brij 721. Когда масляная фаза достигает температуры 55-60°C, ее продолжают выдерживать при данной температуре и перемешивают в течение 15 минут (или до достижения однородности). Затем поддерживается температура 55–60°C, и перемешивание продолжается до добавления к водной фазе.
Водную фазу получают путем добавления воды в чистый стеклянный лабораторный стакан. Начинается перемешивание, и сосуд нагревают до температуры 55-60°C. Добавляется двунатриевая ЭДТК. При температуре 55–60°C ингредиенты перемешивают в течение 15 минут или до достижения однородности. Затем поддерживается температура 55–60°C, и продолжается перемешивание для смешивания фаз.
Масляную фазу добавляют в водную фазу с усилением перемешивания, затем смешивают их при высокой скорости в течение 10–20 минут. При температуре 50°C или ниже добавляют диметикон. При температуре 40°C или ниже добавляют PHENONIP XB. Затем фазы перемешивают в течение 10 минут или до достижения однородности. Добавляют гидроксид натрия (целевое значение pH составляет 5,4). Затем композицию перемешивают в течение 10 минут или до достижения однородности. Затем добавляют LYS’LASTINE и SYMMATRIX. 1-гидрокси 3,5-бис(4'гидроксистирил)бензол взвешивался и растворялся в глицерине и добавлялся к смеси, которая перемешивалась до достижения однородности. Затем добавлялась вода в достаточном количестве, и композиция перемешивалась еще 10 минут.
Несмотря на то что раскрытие настоящего изобретения сопровождается его детальным описанием, подразумевается, что упомянутое описание имело целью проиллюстрировать, но не ограничивать область применения данного изобретения, которая определяется областью применения прилагаемых пунктов формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации входят в объем формулы изобретения.