Способ выращивания растений земляники с использованием метода in vitro
METHOD FOR GROWING STRAWBERRY PLANTS USING IN VITRO METHOD

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к садоводству и может использоваться при выращивании рассады земляники, в том числе, в системе производства оздоровленного посадочного материала.
Земляника садовая (Fragaria х ananassa Duch.) является одной из ведущих ягодных культур, а использование метода клонального микроразмножения позволяет наиболее быстро нарастить значительные объемы здорового посадочного материала земляники для закладки производственных маточников, чем существенно ускорить процесс внедрения в практику новых перспективных сортов. Асептические условия культивирования растений in vitro объективно сопряжены с высокой влажностью воздуха, близкой к 100%, относительно низкой освещенностью в пределах 4-7 тыс. люксов и преимущественно гетеротрофным типом питания, что обуславливает системные проблемы в период адаптации микрорастений ex vitro в течение осенне-зимне-весеннего периода года. Трудоемкие и ресурсоемкие мероприятия по обеспечению жизнеспособности микрорастений на этом этапе и одновременно обязательные для их дальнейшего роста обусловлены необходимостью преодоления комплекса стрессовых факторов, включающих принципиально иные уровни инфекционного фона, влажности воздуха и субстрата, интенсивности и спектральных характеристик света, состава субстрата. Результативность адаптации, как конечного этапа, определяющего эффективность микроразмножения в целом, также зависит от физических параметров микрорастений и календарного периода года, когда непосредственно происходит перевод микрорастений в нестерильные условия.
Известен «Способ получения посадочного материала земляники в культуре ткани» (Патент РФ №2007072, А01Н 4/00, 15.02.1994), согласно которому предварительно размноженный in vitro материал земляники укореняют и адаптируют в один прием в культивационных сосудах, которые перед покрытием термоусадочной пленкой дополнительно закрывают пробками, выполненными из автоклавированного влажного перлита.
Существенным недостатком данного технического решения является невысокая технологичность приема использования пробок из перлита, совмещенного с посадкой в стерильных условиях ламинар-бокса, а также необходимость предварительной подготовки перлита посредством автоклавирования.
Известен также «Способ адаптации invivo плодовых и ягодных культур в двухслойном субстрате» (Патент RU 2335119, А01С 14/00, A01G 17/00, 10.10.2008), когда укорененные in vitro и предназначенные для адаптации микрорастения высаживают на двухслойный субстрат, верхний слой которого составляет стерильный перлит, а нижний - нестерилизованная смесь торфа, песка и почвы в соотношении 1:1:1, что позволяет повысить приживаемость растений, выращенных в культуре in vitro, к естественным условиям произрастания после пересадки.
Недостатком данного способа является необходимость выполнения двукратных операций по заполнению емкостей перед посадкой микрорастений на адаптацию, что снижает производительность, а также обязательная термическая подготовка перлита.
Кроме того, известен «Способ укоренения ремонтантной земляники в культуре invitro» (Патент РФ №2715695, А01Н 4/00, 02.03.2020), включающий укоренение микрочеренков in vitro на питательной среде по прописи Мурасиге-Скуга, дополненной продуктами жизнедеятельности восковой моли на фоне индолилмасляной кислоты в концентрации 0,5 мг/л. При использовании регламентированного освещения с соотношением в спектре красного, синего и белого света (2:1:1) и освещенностью 2500-3000 люкс это позволяет повысить процент укореняемости микрочеренков и сократить продолжительность укоренения.
Недостатком данного способа является то, что в качестве дополнительного ингредиента в питательную среду включен органический компонент не идентифицированного состава, активность и эффективность которого может варьировать, а кроме того, очевидных проблем с корнеобразованием у земляники практически не существует.
Также известен «Способ подготовки растений земляники садовой (Fragaria L.), размноженных in vitro, к условиям культивирования ex vitro» (Патент РФ №2302106, АОШ 4/00, 10.07.2007), который предусматривает получение микрорастений in vitro посредством укоренения микророзеток и последующую подготовку материала к адаптации в следующих условиях: выдержка в темноте на агаризованной питательной среде с 4-10% сахарозы при температуре от 1 до 10°С в течение 20-60 дней с последующей пересадкой в почвенный субстрат.
Реализация данного способа требует обеспечения специальных режимов культивирования в условиях холодильной камеры и последующей термической подготовки больших объемов почвенного субстрата для пересадки на адаптацию.
Общим недостатком всех известных способов является то, что все они вне зависимости от календарного периода года предусматривают обязательную пересадку укорененных микрорастений на адаптацию к нестерильным условиям, которая осуществляется в искусственных условиях, что неизбежно ведет к большим потерям материала, несмотря на весь комплекс превентивных мер.
Техническим результатом является повышение эффективности доращивания адаптированных микрорастений земляники за счет сохранения жизнеспособности точек роста в ходе дополнительных пересадок растительного материала на свежие порции питательной среды при полном удалении уже сформировавшихся листьев и корней.
Реализация предлагаемого способа.
Как показала практика, наиболее результативный период по адаптации микрорастений земляники к нестерильным условиям отмечается в календарные сроки с начала апреля по конец июля месяца, т.е. когда стабилизируются показатели сезонного солнечного светового потока и освещенность начинает превышать 13 тыс. лк, т.е. среднюю величину, характеризующую максимальную продуктивность фотосинтеза отдельного листа.
Поскольку земляника является многолетним вечнозеленым травянистым растением, то его эффективная вегетация в открытом грунте в условиях умеренного климата возможна в период с мая по сентябрь месяц в средней полосе, с апреля по ноябрь в южной зоне. Только этот период может быть ориентиром для фактической пересадки растений на место постоянного произрастания. Соответственно, только растения, подготовленные в период с марта по июль месяц, могут быть результативно пересажены в естественные условия с обеспечением полноценного развития и последующей успешной перезимовки. Целесообразность более поздней высадки пробирочных растений в сентябре в средней полосе и в октябре в южной зоне не высока из-за сложно прогнозируемых погодных условий этого календарного периода и значительно ухудшившихся режимов освещения. Посадка же растений в открытом грунте ранее апреля в южной зоне и ранее мая в средней полосе невозможна ни технически, ни технологически. Этими ограничениями определяется интервал подготовки материала in vitro в лабораторных условиях.
Предлагаемый способ предполагает размножение in vitro земляники на искусственных питательных средах, например, прописи Мурасиге-Скуга, в течение календарного года и укоренение микрочеренков в присутствии ауксинов, но высадку микрорастений на адаптацию в почвенный субстрат осуществляют не спустя 1 месяц после укоренения микрочеренков, согласно общепринятой методики, а откладывают на период стабильной солнечной активности с начала апреля по конец июля. Поскольку жизнеспособность укорененных пробирочных растений ограничена ресурсом пригодности питательной среды и не превышает, как правило, 1,5 месяца, то для обеспечения сохранности точек роста (меристем), у укорененных микрорастений в период с начала августа по февраль месяц, с периодичностью 1-1,5 месяца полностью удаляют сформировавшиеся и начинающие отмирать корни и листья, а их в виде вегетирующих почек высаживают повторно и дифференцированно на питательные среды, содержащие ауксин, учитывая при этом диаметр почки. При диаметре почки 2-3 мм используют среду с ИМК в концентрации 1,0 мг/л (среда для доращивания микрочеренков), при диаметре 4-5 мм - среду с ИМК 0,1 мг/л (среда для реабилитации микрочеренков), что позволяет полностью исключить потери материала в неблагоприятный для адаптации период и существенно выровнять параметры развития упомянутых групп растений к моменту посадки нестерильные условия. Высадку, накопленного таким образом материала, производят начиная с апреля в условиях теплицы при использовании верхнего мелкодисперсного полива или временного пленочного укрытия для поддержания высокой влажности. В качестве субстрата используют предварительно увлажненный торф или торфо-песчаную смесь без какой-либо температурной обработки. В качестве профилактической меры против развития грибных патогенов посаженные растения проливают 0,2%-ным раствором фунгицида, например, фундозола. Изобретение поясняется таблицами, где
- Таблица 1. Развитие микрорастений на питательной среде с ИМК 1,0 мг/л (среда для доращивания микрочеренков);
- Таблица 2. Динамика восстановления надземной части и корневой системы у вегетирующих почек после посадки на питательную среду с ИМК 0,1 мг/л (среда для реабилитации микрочеренков);
- Таблица 3. Приживаемость микрорастений земляники в ходе адлаптации в зависимости от подготовки субстрата, %.
Изобретение поясняется примером.
Пример 1.
Клональное микроразмножение земляники различных сортов проводили по общепринятой методике с использованием питательной среды Мурасиге-Скуга. Условия культивирования были следующие: световой день - 16 часов, освещенность на уровне растительного материала - 5-6 тыс.люксов, температура - 22-24°С. Пересадки пролиферируюших культур выполняли в течение всего календарного года ежемесячно на свежие питательные среды с содержанием 6-БАП (6-бензиламинопурина) в составе питательной среды 1,0 мг/л. Ежемесячно, для дальнейших циклов размножения использовалось порядка 15-20% полученного в предыдущем цикле материала, остальной высаживался на питательную среду для элонгации, т.е. для получения микрочеренков, удобных для проведения укоренения. В последнем случае такие микрочеренки на питательной среде с 6-БАП в концентрации 0,05 мг/л получали через 1 месяц после пересадки, вычленяли их в стерильных условиях ламинарного бокса и высаживали их поодиночно в пробирки, содержащие питательную среду с ауксином - ИМК (индолилмасляной кислотой) в концентрации 1,0 мг/л. Для укоренения использовали только хорошо развитые, по визуальной оценке, микрочеренки. Выход таких их колбы объемом 100 мл в зависимости от сорта составлял в пределах 5-15 штук. После высадки на среду с ауксином корнеобразование у микрочеренков начиналось на 4-6 день, а относительно высокая концентрация ИМК способствовала разрастанию их оснований, улучшению питания развивающихся листьев и стеблевой части. В связи с исчерпанием ресурса питательной среды в течение 1-1,5 месяцев из-за накопления продуктов жизнедеятельности растений и их окисления, что является основной причиной последующей гибели материала, у микрорастений полностью удалили имеющиеся корни и листья и пересадили их в виде вегетирующих почек на питательную среду с относительно низкой концентрацией ауксина (ИМК-0,1 мг/л) для реабилитации. Восстановление надземной части и корневой системы у вегетирующих почек диаметром 4-5 мм происходило в течение 20-40 дней, выживаемость составила 100%. Вегетирующие почки, не получившие достаточного развития, после обновления среза в базальной части равнозначно, как и первичные микрочеренки диаметром 2-3 мм высаживали на питательную среду с содержанием ИМК 1,0 мг/л для доращивания. Таким образом, удалось полностью исключить потери материала в неблагоприятный для адаптации период, работая с ним по приведенной выше схеме, и в итоге существенно выровнять параметры развития упомянутых групп растений к моменту посадки нестерильные условия. Высадку, подготовленного таким образом материала производили, начиная с апреля, в условиях теплицы при использовании верхнего мелкодисперсного полива или временного пленочного укрытия для поддержания высокой влажности. В качестве субстрата использовали предварительно увлажненный торф без какой-либо температурной стерилизации. В качестве профилактической меры против развития грибных патогенов посаженные растения проливали 0,2%-ным раствором фундозола.
Предлагаемое изобретение, прошедшее экспериментальную стадию, позволяет обеспечить повышение эффективности доращивания адаптированных микрорастений земляники за счет сохранения жизнеспособности точек роста в ходе дополнительных пересадок растительного материала на свежие порции питательной среды при полном удалении уже сформировавшихся листьев и корней.
Способ выращивания растений земляники с использованием метода in vitro