Состояние кислородзависимого метаболизма нейтрофилов у больных муковисцидозом и его динамика при длительном лечении азитромицином

Медицинская Иммунология 2003, Т. 5, № 1-2, стр 121-124 ©2003, СПбРОРААКИ

Краткие сообщения

СОСТОЯНИЕ КИСЛ0Р0ДЗАВИСИМ0Г0 МЕТАБОЛИЗМА НЕЙТРОФИЛОВ У БОЛЬНЫХ МУК0ВИСЦИД030М И ЕГО ДИНАМИКА ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ЛЕЧЕНИИ АЗИТР0МИЦИН0М

Власова А.В., Кратнов А.Е.

Ярославская государственная медицинская академия

Резюме. В работе исследованы изменения состояния кислородзависимого метаболизма нейтрофилов у больных муковисцидозом (MB). У обследованных пациентов из мокроты чаще высевался Ps. aeruginosae (65,7%). При MB выявлено достоверное, по отношению к контролю, снижение спонтанной активности фермента миелопероксидазы нейтрофилов. Найдена связь развития повторных обострений хронического бронхита при MB в течение 3 месяцев наблюдения с более частой колонизацией дыхательных путей Ps. aeruginosae (50%> 12,5%), снижением образования супероксидного анион-радикала, активности миелопероксидазы в нейтрофилах и уменьшением уровня малонового диальдегида в плазме крови, что свидетельствует о дефекте микробиоцидности фагоцитов. Выявленное снижение активности миелопероксидазы нейтрофилов устранялось при длительном лечении больных MB азитромицином в субингибирующих концентрациях.

Ключевые слова: муковисцидоз, нейтрофилы, кислородзависимый метаболизм, азитромицин.

Vlasova A.V., Kratnov А.Е.

OXYGEN-DEPENDENT METABOLISM OF NEUTROPHILS IN PATIENTS

WITH CYSTIC FIBROSIS UNDER AZITHROMYCIN TREATMENT

Abstract. Alterations in oxygen-dependent metabolism of neutrophils in patients with cystic fibrosis

Известно, что главной причиной осложнений МВТР обеспечивает благоприятные условия для

и смертельного исхода у больных муковисцидо- колонизации лёгких Ps. aeruginosae. Результаты

зом (MB), который обусловлен мутацией гена му- исследований последних лет свидетельствуют,

ковисцидозного трансмембранного регуляторно- что азитромицин в субингибирующих концентрата белка (МВТР), является патология дыхатель- циях in vitro инактивирует экзоэнзимы Ps.

ных путей [5,14]. МВТР регулирует вязкость сек- aeruginosae [12, 16]. Накапливаясь в азурофиль-

рета экзокринных желёз и является рецептором ных гранулах нейтрофилов азитромицин, в ответ

эпителия бронхов, участвующим в очищении лёг- на стимуляцию рецепторного аппарата клетки,

ких от синегнойной палочки (Pseudomonas выделяется посредством секреторной дегрануля-

aeruginosae), предотвращая её первичную адгезию ции вместе с основным компонентом этих гранул

на эпителиоциты [18]. Изменение структуры - миелопероксидазой (МПО) [13]. Доказано, что

у больных MB на фоне обострения хронического бронхита, по сравнению с детьми, имеющими по-Адрес для переписки: роки развития лёгких, наблюдается более низкая

150040, г. Ярославль, проспект Октября, д. 28 “А”, активность МПО в нейтрофилах, однако влияние

кв. 28. Кратнов Андрей Евгеньевич азитромицина на активность этого фермента

Кафедра терапии педиатрического факультета у больных MB не изучено [2].

Ярославской государственной медицинской Целью данного исследования была оценка вли-

академии. Дом. тел.: (8-0852) 30-40-84. яния длительного лечения азитромицином в су-

Раб. тел.: (8-0852) 79-29-05. E-mail: duk@incap.ru бингибирующей концентрации на активность ми-

елопероксидазы нейтрофилов у больных муковис-цидозом.

Материалы и методы

Обследовано 18 детей, страдающих муковисци-дозом (мутация гена D F508) с тяжёлым или среднетяжёлым течением заболевания, в возрасте от 7 до16 лет. В исследование включали больных MB, находившихся на стационарном лечении с клиниколабораторными признаками обострения хронического бронхита. Контрольную группу составили 22 практически здоровых ребёнка (средний возраст 12,7±5,2 года) без проявлений хронического бронхита по результатам тщательного клинического обследования. Пациенты MB были поделены на 2-е подгруппы: в первую вошли дети, получавшие общепринятую базисную терапию, вторую составили больные, которым был дополнительно назначен азитромицин (Сумамед, “ПЛИВА”) по 250 мг в сутки через 2 дня в течение 3 месяцев с момента поступления в стационар.

Исследование крови больным MB проводили при поступлении и при выписке из стационара. Нейтрофилы выделяли из гепаринизированной крови на двойном градиенте плотности фиколл-ве-рографина [4]. Активность мембранной НАДФЧН-оксидазы нейтрофилов и продукцию ими супероксидного анион-радикала оценивали по данным теста восстановления нитросинего тетра-золия (НСТ-тест), который проводился количественным спектрофотометрическим методом по Т.А. Gentle и R.A. Thompson [11]. Для изучения функциональной активности миелопероксидазы в нейтрофилах использовали спектрофотометрический метод по М.З. Саидову и Б.В. Пинегину [8]. В качестве индуктора кислородзависимого метаболизма фагоцитов применялась взвесь убитых клеток Staphylococcus aureus штамма Р-209 в дозе 1-109/мл. О степени функциональной активности нейтрофилов судили по спонтанным, а о функциональном резерве клеток по стимулированным показателям НСТ-теста и МПО. Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) определяли по методу A. Digean и В. Мауег в модификации В. Гашковой и соавторов [3]. Об активности процесса перекисного окисления липидов судили по уровню малонового диальдегида в плазме крови

[1]. Всем больным MB было проведено трёхкратное микробиологическое исследование мокроты.

Результаты и обсуждение

У больных MB из мокроты чаще высевался Ps. aeruginosae (65,7%), в том числе в ассоциации со Staphylococcus aureus (38%) и изолированно (27,7%), реже наблюдался высев ассоциации Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae (33%). При этом у больных с повторным обострением хронического бронхита в течение 3 месяцев наблюдения после выписки из стационара чаще высевался из мокроты Ps. aeruginosae (50%>12,5%), тогда как среди пациентов с ремиссией преобладал высев St. aureus и Str. pneumoniae (37,5%>0%). Была выявлена зависимость возникновения повторного обострения хронического бронхолёгочного процесса при MB от состояния кислородзависимого метаболизма нейтрофилов. Как видно из таблицы 1, у больных MB общей группы, по сравнению с контролем, наблюдалось достоверное снижение спонтанной активности фермента МПО нейтрофилов (р<0,05) на фоне повышения уровня циркулирующих иммунных комплексов (р<0,05). У пациентов MB с повторным обострением хронического бронхита в течение 3 месяцев наблюдения отмечено дальнейшее достоверное снижение активности МПО в нейтрофилах по данным спонтанного (р<0,05) и индуцированного тестов (р<0,05), по сравнению с больными, вышедшими в ремиссию. Выявленное снижение спонтанной активности и резерва МПО в нейтрофилах коррелировало (г=0,4; р>0,05) с достоверным снижением уровня малонового диальдегида, который не отличался от контроля.

Известно, что основным компонентом антимикробной защиты нейтрофила считается система МПО азурофильных гранул, в то время как роль различных кислородных радикалов в киллинге микроорганизмов вызывает противоречивую интерпретацию [9]. В данном исследовании у больных MB с повторным обострением хронического бронхита обнаружено снижение в нейтрофилах спонтанной и индуцированной активности МПО, участвующей в образовании гипохлорит-аниона, которому принадлежит основная антимикробная функция. Это предполагает у определённой группы больных MB дефект мик-робиоцидной активности нейтрофилов вследствие

Табл. 1. СОСТОЯНИЕ КИСЛОРОДЗАВИСИМОГО МЕТАБОЛИЗМА НЕЙТРОФИЛОВ У БОЛЬНЫХ МУК0ВИСЦИД030М В ЗАВИСИМОСТИ ОТ РАЗВИТИЯ ПОВТОРНОГО ОБОСТРЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО БРОНХИТА В ТЕЧЕНИЕ 3 МЕСЯЦЕВ

Показатель Контроль

Спонтанный НСТ-тест 121,3±65,2 96,2+19,7 97,8±25,8 92,9+12,5

Индуцированный НСТ-тест 141,3±56,9 104,2+37,8 93,7+30,8* 123,0+45,4

Спонтанный МПО 17,4±5,1 10,2+6,5* 11,4+7,3 8,1 ±4,8* **

Индуцированный МПО 18,7±3,0 13,4±6,7 15,5+7,1 9,5+2,7* **

ЦИК 21,0±5,2 58,4±34,1* 54,0+36,4 66,2±33,3*

Малоновый диальдегид 16,9+0,1 71,4+33,1 82,4+26,3* 54,9±39,1**

Примечание: * - р< 0,05 по сравнению с показателями в контрольной группе;

**- р< 0,05 по сравнению с показателями детей с ремиссией хронического бронхита в течение 3 месяцев.

2003, Т.5, № 1-2

Воспаление у больных муковисцидозом

их негативного кондиционирования. Поэтому были рассмотрены исходные показатели метаболизма ней-трофилов при MB в зависимости от качественного состава микрофлоры, высевавшейся из мокроты в количестве больше 106 КОЕ. Из таблицы 2 видно, что в группе больных с изолированным высевом Ps. aeruginosae, по отношению к контролю (р<0,05) и к ассоциации St. aureus и Str. pneumoniae (р<0,01), показатели спонтанного НСТ-теста нейтрофилов (образование супероксидного анион-радикала) были достоверно ниже, что сопровождалось и более низким уровнем циркулирующих иммунных комплексов, который не отличался от контроля. Выявленное снижение активности мембранной НАДФЧН-окси-дазы нейтрофилов у больных с изолированным высевом Ps. aeruginosae наблюдалось на фоне достоверно более низкой активности МПО, по сравнению с показателями контроля и пациентов, у которых высевались ассоциации Ps. aeruginosae + St. aureus (p<0,05) и St. aureus + Str. pneumoniae (p<0,05). Выявленное снижение активности МПО в нейтрофи-лах у пациентов данной группы сопровождалось более низким уровнем малонового диальдегида, который не отличался от контроля, что свидетельствует о недостаточной активности процесса перекисного окисления липидов, участвующего в повреждении

мембран микробной клетки. Таким образом, у больных МВ наблюдается связь развития повторных обострений хронического бронхита с более частой колонизацией дыхательных путей Рз. aeruginosae, негативным кондиционированием нейтрофилов (снижение образования супероксидного анион-радикала, активности МПО) и уменьшением уровня малонового диальдегида в плазме крови.

Доказано, что Рх. aeruginosae секретирует негативные хемотактические факторы [9], которые, вероятно, и могут обуславливать деактивацию преимущественно системы МПО нейтрофила, сохраняя при этом запас реактивности и даже гиперреактивности фагоцитов [7]. Кроме того, негативное кондиционирование фагоцитов может быть обусловлено совместным участием эластаз Рь\ aeruginosae и нейтрофила, способных модифицировать Бс-фрагмент иммунного комплекса, предотвращая его связывание с Бс-рецептором [10]. Также известно, что Рз. aeruginosae препятствует процессу опсонизации путём выработки мукоидного полисахарида - алгината, который экранирует бактерию от специфических антител и фагоцитов [17]. Производить алгинат способны только мукоидные штаммы Рл\ aeruginosae, образование которых провоцируют кислородные радикалы [15]. С другой стороны Рх. aeruginosae выделяет

Табл. 2. ИСХОДНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ КИСЛОРОДЗАВИСИМОГО МЕТАБОЛИЗМА НЕЙТРОФИЛОВ У БОЛЬНЫХ МУКОВИСЦИДОЗОМ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВЫСЕВА ИЗ МОКРОТЫ МИКРООРГАНИЗМОВ В КОЛИЧЕСТВЕ > 106 КОЕ

Показатель Контроль

Спонтанный НСТ-тест 121,3+65,2 71,4±5,0Л 94,0+22,5 106,7±11,5 ***

Индуцированный НСТ-тест 141,3+56,9 98,5±12,0 105,8±52,5 104,4±30,4

Спонтанный МПО 17,4+5,1 6,0±0,9Л 11,6±5,6 ** 11,3±6,8***

Индуцированный МПО 18,7±3,0 10,1+0,9л 14,9±6,2 12,9±8,4

ЦИК 21,0±5,2 33,5±19 56,7±43,5 69,8±30,5л

Малоновый диальдегид 16,9±0,1 42,3±25,3 73,3+21,7л 81,9±38,8л

Примечание:л- р< 0,05 по сравнению с показателями в контрольной группе; **- р< 0,05 между I и II группами,

***- р< 0,05 между I и III группами.

Табл. 3. ДИНАМИКА КИСЛОРОДЗАВИСИМОГО МЕТАБОЛИЗМА НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ЛЕЧЕНИИ АЗИТРОМИЦИНОМ БОЛЬНЫХ МУКОВИСЦИДОЗОМ

Показатель Контроль

Базисная терапия

При поступлении При выписке При поступлении При выписке

Спонтанный НСТ-тест 121,3+65,2 97,8± 20,6 112,7±30,6 85,6±25,2 97,2±8,8

Индуцированный НСТ-тест 141,3+56,9 104,4±41,1 97,2±16,2 94,6±17,6 76,7±15,2

Спонтанный МПО 17,4+5,1 10,7±6,9* 13,7±5,5* 6,8±1,9* 28,7±0,4* **

Индуцированный МПО 18,7+3,0 13,4±6,8 15,3±6 11,3±2,3* 25,9±0,1* **

ЦИК 21,0±5,2 66,3±32,7* 64,7±61,7* 43,0±4,2 10,5±0,7*

Малоновый диальдегид 16,9±0,1 73,5±37,2* 85,1 ±44,1* 63,0±3,9* 89,3±41,1*

Примечание: *- р< 0,05 по сравнению с показателями в контрольной группе; **- р< 0,05 между различными группами лечения.

протеазы, которые могут модифицировать комплексы трансферрин-железо и/или лактоферрин-желе-зо, стимулируя продукцию гидроксил-радикала внутри нейтрофила [9, 10]. Можно предположить, что перекись водорода в нейтрофилах начинает расходоваться на образование гидроксил-радикала в реакциях Фентона и Хабера-Вайса, что может вызывать снижение активности МПО, основным субстратом для которой и является перекись водорода. Поскольку основная антимикробная функция, выполняемая нейтрофилами в организме, принадлежит гипохлорит-аниону, образуемому с участием МПО, а не гидроксил-радикалу, это может препятствовать эффективному киллингу Ps. aeruginosae нейтрофи-лами и обусловливает развитие повторного обострения у больных MB.

Результаты лечения в обеих группах пациентов MB представлены в таблице 3. Исходные показатели кислородзависимого метаболизма нейтрофи-лов в обеих подгруппах лечения были сопоставимы. У больных MB, дополнительно получавших азитромицин, к моменту выписки из стационара был выявлен достоверный рост активности МПО по данным спонтанного (р<0,005) и индуцированного тестов (р<0,05), как по сравнению с контролем, так и с показателями пациентов, находившихся на базисной терапии. Выявленный рост МПО сопровождался достоверным повышением уровня малонового диальдегида по сравнению с контролем. Известно, что макролиды действуют как си-нергисты кислородзависимых бактерицидных механизмов клетки [6, 9]. Кроме того, в исследованиях in vitro показано, что азитромицин в субингибирующих концентрациях способен снижать продукцию протеаз Ps. aeruginosa, что, вероятно, может приводить к росту активности МПО и образованию гипохлорит-аниона в нейтрофилах, способствуя повышению микробиоцидности фагоцитов [12,16]. Об этом свидетельствует более низкий процент (12%<25%) повторных обострений хронического бронхита у больных, получавших азитромицин, по сравнению с пациентами, находившимися на базисной терапии.

Список литературы

1. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма. Методические рекомендации СПб: ИКФ. - Фолиант. -2000. -104 с.

2. Власова А.В., Кратнов А.Е., Марушков В.И. Биоцидность нейтрофилов и моноцитов при хроническом бронхите у детей с муковисцидозом и пороками развития лёгких // Медицинская Иммунология. - Т. 4. - №2. - С.219.

3. Гашкова В., Матл И., Кашлик И. Циркулирующие комплексы у больных иммунокомплексными заболеваниями и после трансплантации почек // Чех. Мед. - 1978. - № 2. - С.117-122.

4. Зурочка А.В., Долгушин И.И., Власов А.В. Изучение латексиндуцированной люминолзависимой

хемилюминесценции плазмы крови // Лабораторное дело. - 1989. - №3. - С.32-36.

5. Капранов Н.И., Шабалова Л.А., Каширская Н.Ю. Муковисцидоз (современные достижения и проблемы). Методические рекомендации - М.: Мед-практика - М. - 2001. - 76 с.

6. Лабро М. Противовоспалительная активность макролидов: новые терапевтические возможности? // Клиническая фармакология и терапия. - 1998. -№7(4). - С.55-62.

7. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о ней-трофиле и макрофаге. - Новосибирск. - 1989. - 344с.

8. Саидов М.З., Пинегин Б.В. Спектрофотометрический способ определения активности миелопе-роксидазы в фагоцитирующих клетках // Лабораторное дело. - 1991. - №3. - С.56-59.

9. Тотолян А.А., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы. - СПб.: Наука. - 2001. - 231 с.

10. Doring G. Pulmonary aspects of cystic fibrosis: role of inflammation in lung distraction. An international simposium of the Forschungsgemeinschaft des Muk-oviszidose e. V. Held in Munich, on January 21-22,1994. - 1994. -91p.

11. Gentle T.A., Thompson R.A. Neutrophil function tests in clinical immunology // Clinical Immunology A Practical Approach. Eds. Gooi H.G., Chapel H. - New York: Oxford University Press. - 1990. - P. 57-59.

12. Grimwood К., To М., Rabin H.R., Woods D.E. Inhibition of pseudomonas aeruginosa exoenzym expression by subinhibitory antibiotic concentrations / / Antimicr. Agents. Chemother. - 1989. - Vol.33. -P.41-47.

13. Hand W.L., Hand D.L. Characteristics and mechanisms of azitromycin accumulation and efflux in human polimorphonuclear leucocytes // International J. of Antimicrobial Agents. - 2001. - Vol.18. -P.419-425.

14. Konstan M.W., Berger M. Current understanding of the inflammatory process in cystic fibrosis: onset and etiology // Pediatric Pulmonology. - 1997. -Vol.24. - P.137-142.

15. Mathee K., Sternberg C., Ciofu O. Oxigen radical induced phenotipic change from non-alginat producing to alginat-producing from Pseudomonas aeruginosa in biofilms //In Lorenzo V., ed. Pseudomonas ‘97. VI International Congress on Pseudomona: Molecular biology and biotechnology. Madrid, Spain. -1997. -116 p.

16. Molinari G., Guzman C.A., Pesce A., Schito G.C. Inhibition of pseudomonas aeruginosa virulence factors by subinhibitory concentrations of azithromycin and other macrolide antibiotics. // J. Antimicrob. Chemother. - 1993. - Vol.31(5). - P.681-688.

17. Perdersen S.S., Hoiby N., Espersen F., Koch C. Role of alginate in infection with mucoid Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis //Thorax. - 1992. -Vol.47. -P.6-13.

18. Pier G.B., Grout М., Zaidi T.S. Cystic fibrosis transmembrane conductanc regulator is an epithelial cell receptor for clearance of Pseudomonas aeruginosa from the lung // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. -Vol.94(22). - P. 12088-12093.

поступила в редакцию 15.10.2002 принята к печати 20.01.2003