Влияние комплексного антигенного препарата Bacillus anthracis и иммуномодуляторов на функциональную активность клеток фагоцитарной системы в эксперименте

вторичного иммунного ответа ХЧВ не вызывает сомнений, а включение ревакцинации этим препаратом в общую систему мероприятий по вакцино-профилактике чумной инфекции является обоснованным.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алексеева Н.Ю., Калита С.А., Савинова И.В. и др. // Иммунол. и специфич. профилакт. особо опасных инф. -Саратов, 1993. - С. 145. - 2. Аубакиров С.А. // Там же. -С. 139. - 3. Бунин К.В., Гапочко К.Г. Прививочные реакции при иммунизации живыми вакцинами. - М.: Медицина, 1970. - 295 с. - 4. Дальвадянц С.М., Сероглазов В.В. // Матер. VII съезда Всерос. об-ва эпидемиол., микробиол. и пара-зитол. - М., 1997. - Т. 2. - С. 85-86. - 5. Дальвадянц С.М., Дятлов И.А., Еремин С.А., Кутырев В.В. // Пробл. особо опасных инф. - 2003. - Вып. 86. - С. 123-132. -6. Исупов И.В., Бугоркова С.А., Кутырев В.В. Патоморфологические аспекты доклинических испытаний различных вакцин против чумы сибирской язвы и холеры. - Саратов, 2004. - 179 с. - 7. Котлярова Р.И., Ледовская А.П., Власьянц О.В. // Тр. Азербайджанск. противочумн. ст. -1962. - Т. 3. - С. 250-256. - 8. Котлярова Р.И. Значение дозы кратности вакцинации и ревакцинации в иммуногенезе при чуме: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, 1965. - 21 с. -9. Меркулов Г. А. Курс патогистологической техники. - М.: Медицина, 1969. - 423 с. - 10. Мишанькин Б.Н., Лопатина Н.В. // Биотехнол. - 1996. - № 4. - С. 3-9. - 11. Методические указания (МУ 3.3.1.1113-02): Основные требования к вакцинным штаммам чумного микроба. - М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2002. - 63 с. -12. Назарова Л.С., Исупов И.В., Самойлова Л.В. и др. // Патогенез и механизмы формирования иммунол. к особо опасным инф. - Саратов, 1987. - С. 9-16. - 13. Назарова Л.С., Исупов И.В., Самойлова Л.В. и др. // ЖМЭИ. -1994. - № 6. - С. 65-66. - 14. Николаев Н. И. // Специфич. профилакт. особо опасных инф. М.: Медицина, 1964. - С. 314. - 15. Овсянников В. И. Экспериментальное обоснование коротких схем экстренной профилактики чумы в динамике

иммуногенеза после одно и многократных прививок: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, 1991. - 21 с. - І6. Онищен -ко Г.Г., Дроздов И.Г. // Bестн. РАМН. - 2QQ4. - № 5. -С. 14-2Q. - І7. Сагеева О.Ф., Самойлова Л^. // Пробл. особо опасных инф. - 1969. - Bbm. 3 (7). - С. 26-33. -І8. Самойлова Л^. // Специфич. профилакт. особо опасных инф. - М., 1964. - С. 78-87. - І9. Самойлова Л^. // Совр. асп. профилакт. зоонозн. инф. - Иркутск, 1984. - Ч. 1. - С. 132133. - 20. Черкасский П.Л. Руководство по общей эпидемиологии. - М.: Медицина. - 2QQ1. - 56Q с. - 2І. Чичерин Ю^., Евстигнеев B.^, Романов B.E. и др. // Акт. вопр. профилакт. опасных инф. забол.: Тез. докл. межведомств. науч. конф. - Киров, 1991. - С. 125-126. - 22. Meyer K.F. // Бюл. B03. - 1971. - Т. 42, № 5. - С. 689-7Q4. - 23. Kutyrev V.V., Dalvadyants S.M., Dyatlov I.A. // 8th Intern. Symposium on Yersinia, September 4-8, 2QQ2. - Turku, Finland, 2QQ2. - P. 1Q8.

S.A.Bugorkova, R.A.Beloborodov, S.M.Dalvadyants

Morphologic Characterization of Guinea-Pig Immunocompetent Organs after Revaccination with Live and Chemical Plague Vaccines

Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe ", Saratov

A comparative morphologic study involving the methods of morpho-metric analysis of the immune system organs and possible adverse responses in guinea pigs associated with their revaccination with the preparations of chemical and live plague vaccines (CHPV and LPV, respectively) demonstrated the advantageous application of the CHPV preparation to induce the secondary immune reaction. Good prospects were shown for the morphome-tric method to be used in the morphologic studies to describe the immunoge-nesis depending on the character of the revaccination preparation, peculiarities of vaccine antigenic components and the schedule of its inoculation.

Key words: live and chemical vaccines, immunocompetent organs, morphometry.

Поступила 17.03.06.

УДК 616.981.51:616.-097

В.И.Дубровина, А.В.Родзиковский, О.Б.Колесникова, Т.П.Старовойтова,

С.А.Витязева, Т.А.Иванова, Т.Т.Шкаруба

ВЛИЯНИЕ КОМПЛЕКСНОГО АНТИГЕННОГО ПРЕПАРАТА BACILLUS ANTHRACIS И ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ФАГОЦИТАРНОЙ СИСТЕМЫ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока, Иркутск

Результаты проведенных исследований расширяют сведения о закономерностях взаимоотношения микроб-фагоцит и намечают направления изысканий в области изучения механизмов формирования резистентности макроорганизма к возбудителю сибирской язвы. Впервые разработан химически связанный иммуногенный комплекс клеточных стенок и антигенов сибиреязвенного микроба, испытана иммуномодулирующая активность арабиногалактана и сквалена, а также показаны пути коррекции функционального состояния системы мононуклеарных фагоцитов арабиногалактаном и скваленом при взаимодействии с сибиреязвенным микробом.

Ключевые слова: фагоциты, иммунитет, Bacillus anthracis СТИ, антигены, иммуномодуляторы.

В настоящее время для стимуляции неспецифической резистентности организма большое внимание уделяется полисахаридам растительного и животного происхождения. В частности, для повышения иммуногенности химической сибиреязвенной вакцины на основе протективного антигена Bacillus anthracis нашел применение сквален - субстрат, широко распространенный в тканях растений,

животных и человека [9].

Предпринятое нами экспериментальное изучение действия подобных препаратов - сирингина, К-212, диквертина, арабиногалактана из лиственницы сибирской sibirica), любезно предоставлен-

ных сотрудниками Иркутского института химии им.

А.Е.Фаворского, - на клетки системы мононуклеар-ных фагоцитов (СМФ) показало, что по физико-

химическим свойствам, способу применения, доступности и главное - иммуномодулирующим свойствам в качестве возможного иммуностимулятора в наибольшей степени соответствует арабиногалактан (АГ) [2]. Сведения о его применении для иммуностимуляции при сибирской язве в доступной литературе отсутствуют.

Материалы и методы

Работа выполнена на модели беспородных морских свинок весом 300-350 г (597 животных). Животных выводили из эксперимента воздушной эмболией сосудов сердца в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных.

Для иммунизации использовали B. anthracis СТИ-1 и комплексный антигенный препарат, включающий клеточные стенки, протективный антиген и белок С сибиреязвенного микроба, конъюгированные дигидратом адипиновой кислоты (ДАК-конъю-гат) и перекрестной сшивкой глутаральдегидом (ГА-конъюгат). Препараты вводили животным однократно подкожно во внутреннюю поверхность бедра в 0,5 мл физиологического раствора: СТИ-1 -в дозе 10 спор (1шБ50 - 3162 споры), ДАК-конъю-гат - в количестве 25 мкг. В качестве заражающего использовали вирулентный штамм B. anthracis И-9 (БЬ50 для морских свинок - 50 спор).

Адгезивные свойства фагоцитов крови иммунизированных морских свинок исследовали по методу И.С.Фрейдлина [8]. Индекс адгезии рассчитывали по отношению количества клеток, прилипших в опытных и контрольных (фагоциты интактных животных) препаратах, и выражали в процентах.

Активность кислородзависимого метаболизма (КЗМ) в фагоцитах иммунизированных морских свинок определяли с помощью НСТ-теста [12] в монослое клеток [10]. Интенсивность окислительных процессов в клетках оценивали по проценту формазанположительных клеток (ФП) и цитохимическому показателю активности (ЦПА), выраженному в условных единицах [11]. Контролем служили фагоциты интактных животных.

Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49) и НАДФН-оксидазы (КФ 1.6.2.4) определяли по методу Р.П.Нарциссова [4], активность миелопероксидазы (МПО, КФ 1.11.1.7) -по методу В.Е.Пигаревского [6]. Пробы фотометри-ровали на приборе ЛЮМАМ Р-8 при Х=466 нм (Г6ФДГ, НАДФН-оксидаза) или 406 нм (МПО). Активность кислой и щелочной фосфатаз изучали гистохимически [7].

Статистическую обработку результатов опытов проводили по методам И.А.Ойвина [5], И.П.Ашма-рина и А.А.Воробьева [1] и Е.В.Монцевичюте-Эрингене [3].

Результаты и обсуждение

В опытах на морских свинках установлено, что в высоких дозах (5 мг в расчете на сухой вес на одно животное) ДАК-конъюгат проявлял реактоген-ность, которая выражалась нагноением в месте введения, сдвигом формулы крови влево, увеличением числа моноцитов, появлением атипичных лимфоцитов. В дозах менее 5 мг патологические изменения

3 сут 7 сут 14 сут 21 сут

Срок наблюдения

Влияние ДАК-конъюгата, арабиногалактана и сквалена на синтез монооксида азота перитонеальными макрофагами морских свинок:

| | - ДАК-конъюгат+АГ; | - ДАК-конъюгат+АГ+СКВ;

[Щ] - СТИ;  - интактные

со стороны органов и систем животных были минимальными. Оба препарата в дозах менее 5 мг не токсичны и слабореактогенны для белых мышей.

В предварительных опытах для определения оптимальной иммунизирующей дозы препараты комплексного антигена вводили морским свинкам в дозах от 25 до 500 мкг на одно животное. Оптимальные результаты получены при введении животным по 25 мкг каждого из препаратов.

В основных опытах морских свинок иммунизировали однократно путем инъекции по 25 мг антигенных препаратов. Контрольные животные получали по 103 спор живой вакцины СТИ-1. Через 14 дней животным вводили споры вирулентного штамма В. аnthracis И-9 в дозе 20 БЬ50. К концу контрольного срока (10 сут) из общего числа свинок, иммунизированных ДАК-конъюгатом, выжили 62 %, ГА-конъюгатом - 45 %, вакциной СТИ-1 - 40 % животных. Все контрольные невакцинированные животные погибли. Таким образом, оба препарата комплексного антигена обладали протективной активностью, но более выраженной у ДАК-конъюгата.

Для возможного усиления протективной активности ДАК-конъюгат испытан в опытах на морских свинках на иммуногенную активность при сочетанном введении с АГ и скваленом. Для сравнения служили зараженные непривитые животные и зараженные животные, предварительно привитые вакциной СТИ.

Показано, что АГ и сквален повышали иммуно-генную эффективность ДАК-конъюгата в 1,1 и 1,2 раза соответственно (р<0,05).

При изучении показателей неспецифической резистентности морских свинок, иммунизированных комплексом антигенов и вакциной СТИ, установлено, что ДАК-конъюгат стимулирует адгезивную активность макрофагов в отношении сибиреязвенного микроба (минимальные и максимальные показатели: 74,0±1,3 - 118,8±3,2, при р<0,05). При введении его совместно с иммуномодуляторами адгезивная активность еще более возрастает во все сроки наблюдения, особенно на 14-е сутки (64,8±2,1 - 128,2±2,7, при р<0,05). Наибольшей стимулирующей активностью характеризуется ДАК-

Таблица 1

Индекс завершенности фагоцитоза перитонеальных макрофагов морских свинок, иммунизированных ДАК-конъюгатом, ДАК-конъюгатом в сочетании с арабиногалакганом и скваленом

Антиген Срок наблюдения , сут

СТИ - 21,9±0,2 - 86,9±13,2 + 1,8±0,3

ДАК-конъюгат - 110,9±42,6 - 11,6±0,9* - 0,6±0,1*

ДАК-конъюгат+АГ + 48,4±1,2* + 18,1±1,1* + 6,5±0,6*

ДАК-конъюгат - 15,6±2,3* - 17,5±3,2* - 2,6±0,3*

+АГ+СКВ

Контроль -142,2±2,6 -132,3±3,6 -136,3±3,3

Примечание. (+)-завершенный фагоцитоз; (-)-незавершенный.

* р<0,05.

конъюгат в сочетании с АГ и скваленом (87.5± 1.7 -154,5±2,2, при р<0,05).

АГ и сквален при сочетанном применении с ДАК-конъюгатом оказывают стимулирующее действие и на поглотительную активность фагоцитов. Этот вывод подтверждает положительная тенденция изменения использованных показателей эффективности фагоцитоза. Однако наиболее впечатляющим в этом плане является почти двукратный рост индекса завершенности фагоцитоза - показателя, свидетельствующего о качественном сдвиге в процессе, определяющем судьбу возбудителя сибирской язвы в макроорганизме (табл. 1).

Для выяснения вопроса, на какие звенья кисло-родзависимого бактерицидного механизма фагоцитоза влияют вакцина СТИ и комплексный препарат в процессе иммунизации морских свинок исследована активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, НАДФ-Н-оксидазы и миелопероксидазы - участников бактерицидного механизма фагоцитов.

Полученные результаты показали, что ДАК-конъюгат в сочетании с арабиногалактаном и сква-леном оказывает стимулирующее воздействие на выработку активных форм кислорода в макрофагах при фагоцитозе B. anthracis СТИ-1, что выражалось в более высоких по сравнению с другими группами животных значениях ФП и ЦПА на 3, 7, 10, 14-е и 30-е сутки наблюдения (153,8±1,7 - 153,3±3,2).

Пик окислительной активности приходится на 14-е сутки после инъекции препаратов (174,0±2,2), в последующие сроки имеет место постепенное снижение количества формазанположительных клеток, характеризующих активность КЗМ в фагоцитах иммунных животных. Процесс иммуногенеза сопровождается активацией в отдельные сроки после инъекции морским свинкам вакцины СТИ и комплексного препарата активности Г6ФДГ и НАДФ-Н-оксидазы, что свидетельствует об усилении окисления глюкозы в гексозомонофосфатном шунте, наработке восстановленной формы НАДФ, усилению бактерицидного метаболизма фагоцитов и, как следствие, к повышению антимикробного действия фагоцитов. Активация обоих ферментов в клетках крови на 10-е сутки происходит интенсивнее у животных, вакцинированных комплексом, чем вакциной СТИ.

Установлено, что фагоциты иммунных морских свинок по миелопероксидазной активности превосходят аналогичные клетки интактных животных. Закономерных различий в активности миелопероксида-зы в зависимости от введенного препарата (ДАК-

конъюгат, ДАК-конъюгат+АГ, или ДАК-конъю-гат+АГ+СКВ) не выявлено.

В ПЯЛ иммунных морских свинок, иммунизированных ДАК-конъюгатом в сочетании с АГ или СКВ, экзоцитоз неферментных катионных белков при поглощении сибиреязвенного микроба происходит более активно, чем в лейкоцитах как интакт-ных животных, так и животных, иммунизированных вакцинным штаммом или только ДАК-конъюгатом.

Известно, что эндогенная окись азота (N0) является одним из важнейших факторов неспецифической антиинфекционной защиты макроорганизма. Дефицит N0 способствует размножению возбудителей в тканях и внутри фагоцитирующих клеток, что сопровождается усилением тяжести течения инфекционного процесса и его хронизацией.

Установлено, что ДАК-конъюгат в сочетании с АГ и скваленом по интенсивности влияния на продукцию N0 (р<0,05) несколько превосходит ДАК-конъюгат с АГ и значительно - СТИ. Заметный прирост содержания К0-синтазы в перитонеальных макрофагах наблюдается уже на 3-и сутки после иммунизации животных по сравнению с интактны-ми и сохраняется в последующие сроки (р<0,05). Макрофаги морских свинок, которым ДАК-конъю-гат вводили одновременно с АГ и скваленом, на 1421-е сутки после вакцинации по интенсивности синтеза монооксида азота, обладающего бактерицидными и цитотоксическими свойствами, превосходили макрофаги животных, получивших СТИ (рисунок), что свидетельствует о повышении активности К0-синтазы фагоцитов этих животных и их антиинфекционной защиты.

При гистохимическом изучении установлено, что в иммунокомпетентных клетках крови и органах морских свинок, получивших ДАК-конъюгат, ДАК-конъюгат+АГ или ДАК-конъюгат+АГ+СКВ, к 7-м суткам резко (почти на 50 %) снижалась активность КФ по сравнению с соответствующими показателями у животных контрольной группы (вакцина СТИ). Однако с 14-х суток наблюдалось повышение активности фермента, а к 21 -м суткам, особенно в группе животных, вакцинированных ДАК-конъю-гат+АГ+СКВ, показатели активности КФ в имму-нокомпетентных клетках вакцинированных морских свинок превосходили показатели у интактных животных (табл. 2).

Снижение активности КФ в исследуемых лимфоидных органах в первые сроки иммунизации, на наш взгляд, может быть обусловлено включением клеточного звена иммунитета, то есть частичным расходованием фермента на гидролитическую деградацию антигенного материала. Повышение активности фермента в органах свидетельствует об активизации гуморальной реакции иммунитета, направленной на выработку антител.

Таким образом, иммунизация экспериментальных животных ДАК-конъюгатом в сочетании с иммуномодуляторами (АГ и скваленом) сопровождается стимуляцией реакций фагоцитов, ответственных за внутриклеточную инактивацию сибиреязвенного микроба. АГ и сквален оказывают комплексное воздействие на макроорганизм, в результате которого в организме животных, получивших иммуномодулирующие препараты, происходит подав-

Содержание кислой фосфатазы в лимфатических узлах и селезенке опытных животных

Таблица 2

Am'HreR Срок наблюдения , сут

3 7 14 21

селезенка | л/у селезенка 1 л/у селезенка | л/у селезенка | л/у

СТИ-1 14,3±3,1 11,1±1,6 11,0±4,7 7,5±2,3 17,1±1,6 19,7±10,0 25,8±1,6 27,6±2,3

ДAK-конъюгат 23,6±2,0* 19,5±7,8* 23,1±3,1* 20,0±3,9* 22,2±3,1 20,0±1,56 26,5±2,4 22,3±3,1

ДAK+AГ 17,8±2,7 16,3±3,9 15,3±9,0 12,3±10,9* 18,6±7,8 15,3±3,1 19,0±4,7 19,0±4,7

ДAK+AГ+СКВ 21,0±2,3* 19,5±3,1* 15,5±1,6 14,8±1,6* 22,7±3,9* 18,7±3,1 26,5±2,3 27,6±2,З

1 р<0,05

ление размножения патогенных микробов. Этот факт имеет большое значение, поскольку замедление размножения микроорганизмов в ходе инфекционного процесса может снизить тяжесть и изменить исход заболевания.

Установленные в ходе экспериментов данные указывают на перспективность применения исследованных препаратов для создания напряженного иммунитета при сибирской язве и возможность их применения при экстренной профилактике болезни.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Л.: Наука, 1962. - 180 с. - 2. Дубровина В. И., Г олубинский Е.П., Борсук Г.И. и др. // Мед. паразитол. и паразитарн. бол. -2001. - № 3. - С. 44-46. - 3. Монцевичюте-Эрингене Е.В. // Патол. физиол. и эксп. терапия. - 1964. - № 4. - С. 7178. - 4. Нарциссов Р.П. // Архив анатомии и гистологии. -1969. - № 5. - С. 85-91. - 5. Ойвин В.А. // Патол. физиол. и эксп. терапия. - 1960. - № 4. - С. 76-85. - 6. Пигаревский В.Е., Мазинг Ю.А. // Лаб. дело. - 1981. - № 10. - С. 579582. - 7. Сафронова В.М., Локтев Н.А., Рак Л.А., Логвиненко О. В. Цитоэнзимохимические исследования лейкоцитов периферической крови лабораторных животных / Ставроп. н.-и. противочумн. ин-т. - Ставрополь, 1994. - 102 с. -Деп. в ВНТИ РФ 25.05.94; № 648. - 8. Фрейдлин И.С. Методы изучения фагоцитирующих клеток при оценке иммунного

статуса человека: Учеб. пособие. - Л., 1986. - 37 с. - 9. Ivins B.E., Pitt M.L., Fellows P.F. et al. // Vaccine. - 1998. -Vol. 16, N 11-12. - P. 1141-1148. - 10. Hirsch J.G. // J. Exp. Med. - 1956. - Vol. 103. - P. 613-615. - 11. Kaplow L.S. // Blood. - 1955. - Vol. 10, N 10. - P. 1023-1029. - 12. Park B.H. // Lancet. - 1968. - Vol. 2, N 7567. - P. 532-534.

V.I.Dubrovina, A.V.Rodzikovsky, O.B.Kolesnikova, T.P.Starovoitova, S.A.Vityazeva, T.A.Ivanova, T.T.Shkaruba

Effect of the Complex Bacillus anthracis Preparation and Immunomodulators upon Functional Activity of the Phagocytic System under the Experiment

Anti-Plague Research Institute for Siberia and the Far East, Irkutsk

The results presented in the work expand our knowledge about the regularities of interactions among microbial and phagocytic cells and outline the directions for the investigations into the mechanisms determining the formation of macroorganism’s resistance to the anthrax pathogen. A chemically bound immunogenic complex of cell walls and B. anthracis antigens was designed for the first time. Immunomodulating activities of arabinoga-lactan and squalene were tested to show these preparations as useful means of correcting the functional state of the mononuclear phagocytic system during contact with the anthrax agent.

Key words: phagocytes, immunity, Bacillus anthracis STI, antigens, immunomodulators.

Поступила 26.06.06.

УДК 616.981.452:616.9-084

В.А.Сафронов, А.А.Лопатин, С.М.Дальвадянц

ИСКУССТВЕННЫЕ НЕЙРОННЫЕ СЕТИ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ ЭФФЕКТИВНОСТИ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ЧУМЫ

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов

Приведен краткий анализ проблемы моделирования в иммунологии. Представлены результаты прогнозирования эффективности применения средств специфической профилактики чумы на модели морских свинок, находящихся на разном поствакцинальном уровне, с применением искусственной нейронной сети. На основании экспериментальных данных построена и верифицирована информационная модель иммунологических реакций, протекающих при ревакцинации с учетом косвенных аналитических и интегральных показателей иммунитета. Нейросетевая модель позволяет прогнозировать эффективность иммунизации, выраженную в проценте выживших животных в группе ревакцинированных и подвергшихся заражению чумой.

Ключевые слова: чума, живая чумная вакцина, химическая чумная вакцина, иммунизация, вакцинация, моделирование, прогнозирование, искусственные нейронные сети.

Исследования, выполненные в последние десятилетия на различных видах животных [1, 8, 15], а также ограниченные испытания на волонтерах [7, 21], свидетельствуют о необходимости совершенст-

вования существующей системы специфической профилактики чумы [14, 16]. Применение живой чумной вакцины (ЖЧВ) в качестве единственного иммунизирующего агента не способствует дости-