Микробиоценоз верхних отделов пищеварительного тракта у детей с гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью и хроническим гастродуоденитом

4. Организация и проведение эпидемиологического надзора в природных очагах чумы на территории Российской Федерации: Метод. указания. М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора МЗ России; 2002.

5. Организация, обеспечение и оценка противоэпидемической готовности медицинских учреждений к проведению мероприятий в случае завоза или возникновения особо опасных инфекций, контагиозных вирусных геморрагических лихорадок, инфекционных болезней неясной этиологии, представляющих опасность для населения Российской Федерации и международного сообщения: Метод. указания. М.; 2001.

6. Boulanger L. L., Ettestad P., Fogarty J. D. et al. Gentamicin and tetracyclines for the treatment of human plague: review of 75 cases in New Mexico, 1985-1999. Clin. Infect. Dis. 2004; 38; 378-85.

7. BryskierA. Antimicrobial agents. ASM Press, USA; 2005.

8. GalimandM., GuiyouleA., GerbaudG. et al. Multidrug resistance in Yersinia pestis mediated by a transferable plasmid. N. Engl. J. Med. 1997; 337 (10): 677-80.

9. Rasoamanana В., Coulanges P., Michel P., Rasolofonirina N. Sensibilite de Yersinia pestis aux antibiotiques: 277 souches isolees a Madagascar entre 1926 en 1989. Arch. Inst. Pasteur Madagascar. 1989; 56: 37-53.

10. Welch T. J., Fricke W. F., McDermott P. F. et al. Multiple antimicrobial resistance in plague: an emerging public health risk. PloS One. 2007; 21 (2): e309.

11. Wong J. D., Barash J. R., Sandfort R. F., Janda J. M. Susceptibilities of Yersinia pestis strains to 12 antimicrobial agents. Antimicrob. Agents chemother. 2000; 44 (7): 1995-6.

Поступила 13.06.12

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013

УДК 616.33-008.17-032:611.329]-06:616.342-002.2]-078

Ю. С. Апенченко, В. м. Червинец, И. И. Иванова, Н. В. Басалаева, Е. А. Беляева

микробиоценоз верхних отделов пищеварительного тракта у детей

С ГАСТРОЭЗОфАГЕАЛьНОЙ РЕфЛЮКСНОЙ БОЛЕЗНьЮ И ХРОНИчЕСКИМ ГАСТРОДУОДЕНИТОМ

Тверская государственная медицинская академия

Рассматривается микробный спектр слизистой оболочки пищевода и желудка детей с гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью и хроническим гастродуоденитом. У пациентов с заболеваниями верхних отделов пищеварительного тракта условно-патогенные микроорганизмы выделяются чаще, их штаммы обладают факторами агрессии и цитотоксичностью. У детей с рефлюксной болезнью микробный пейзаж в пищеводе шире как в количественном, так и в видовом отношении по сравнению не только со здоровыми подростками, но и с детьми с изолированным гастродуоденитом.

Ключевые слова: микрофлора, пищеварительный тракт, дети, гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь, хронический гастродуоденит

Yu.S. Apentchenko, V.M. Tchervinetz, I.I. Ivanova, N.B. Basalayeva, Ye.A. Beliyeva

THE MICROBIOCENOSIS OF UPPER PARTS OF DIGESTIVE TRACT OF CHILDREN WITH GASTROESOPHAGEAL REFLUX DISEASE AND CHRONIC GASTRODUODENITIS

The article considers the microbe .specter of mucous coat of esophagus and .stomach in children with gastro esophageal reflux disease and chronic gastroduodenitis. In patients with diseases of upper parts of digestive tract, the opportunistic pathogenic bacteria are isolated more often and their strains have aggression factors and cytotoxicity. In children with reflux disease the microbe landscape of esophagus is larger both in numerical and specific respect as compared to healthy adolescents and children with isolated gastroduodenitis.

Key words: microflora, digestive tract, children, gastro esophageal reflux disease, chronic gastroduodenitis

Болезни органов пищеварительной системы в структуре соматической патологии у детей занимают одно из ведущих мест. По некоторым данным, их распространенность превышает 400%о [6]. На рост гастроэнтерологических заболеваний влияют особенности современного образа жизни и питания, стрессы, неблагоприятная экологическая обстановка, в определенной мере - широкое внедрение ультразвукового и эндоскопического методов диагностики. В настоящее время отмечаются уменьше-

Для корреспонденции:

Апенченко Юлия Сергеевна, доц. каф. педиатрии Адрес: 170100, Тверь, ул. Советская, 4 Телефон: (4822)32-17-79 E-mail: apen@mail.ru

ние частоты выявляемости язвенной болезни и гастро-дуоденитов и рост частоты заболеваний пищевода [6]. К ним в первую очередь относится гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ).

ГЭРБ - хроническое рецидивирующее заболевание, в основе которого лежит патологический гастроэзофа-геальный рефлюкс (ГЭР), отличающийся от физиологического прежде всего продолжительностью, частотой и наличием клинической симптоматики. По данным многоцентрового эпидемиологического исследования МЭГРЕ, распространенность ГЭРБ в популяции составляет 13,3% [4].

Одним из нерешенных аспектов проблемы ГЭРБ является сочетание ее с инфицированностью Helicobacter pylori, причем высказываются противоположные точки зрения: H. pylory способствует возникновению ГЭРБ, и H. pylori способствует предупреждению ГЭРБ. По дан-

микробиология

ным Н. O'Connor, хеликобактерная инфекция, вызывая гиперсекрецию, может способствовать развитию ГЭРБ, тем не менее эпидемиологические исследования не подтверждают это [10]. Ц. Г. Масевич и И. А. Лосева, обследовав группу больных, у которых Н. pylori определялся на слизистой оболочке не только желудка, но и пищевода, выявили у них более выраженные эндоскопические изменения в пищеводе [5]. Предположение о протективной роли Н. pylori относительно развития ГЭРБ основано на эпидемиологических данных о том, что рефлюксная болезнь при хеликобактерной инфекции встречается реже, чем у неинфицированных пациентов. Возможно, это связано не только с выработкой аммиака в результате инфицирования. Чем больше выраженность воспаления в теле желудка, тем чаще атрофия, ниже секреция кислоты и меньше вероятность развития ГЭРБ, и наоборот [9].

Микробиоценоз верхних отделов пищеварительного тракта состоит не только из Н. pylori. Несмотря на то что традиционно постулируется скудность мукозной микрофлоры гастродуоденальной зоны из-за бактерицидного действия желудочного сока, В. М. Червинец, С. Н. Базлов и соавт. выделили различные микроорганизмы из биоптатов слизистой оболочки у 90% здоровых лиц. При обострении язвенной болезни из биоптатов пе-риульцерозной зоны выделялось большее количество микроорганизмов, всегда в сочетаниях с цитотоксично-стью [1, 7].

Обнаружен определенный микробиоценоз желудка у детей с хроническим гастродуоденитом (ХГД), причем микробный пейзаж был разным при Н. pylori-ассоциированном гастродуодените и гастродуодените без инфекции Н. pylori [3]. Изменяются спектр и количество микроорганизмов и у больных эзофагитами [8].

Материалы и методы. Предпринята попытка оценить микробный спектр верхних отделов пищеварительного тракта у детей с ГЭРБ и ХГД. Для изучения особенностей микробиоценоза слизистой оболочки обследовано 45 детей в возрасте от 15 до 18 лет.

Все обследованные разделены на 3 группы. В 1-ю группу вошло 14 детей с ГЭРБ, во 2-ю группу - 13 детей с ХГД и в 3-ю группу (контрольную) - 18 здоровых добровольцев без заболеваний верхних отелов пищеварительного тракта. У всех получено информированное согласие на проведение исследования.

Помимо клинико-анамнестического метода исследования, использовались возможности инструментальной и лабораторной диагностики: детям проводились 24-часовая рН-метрия, эзофагогастродуоденоскопия (ЭГДС), микробиологическое исследование биоптатов слизистой оболочки верхних отделов пищеварительного тракта.

Суточный мониторинг рН выполняли с помощью портативного прибора Гастроскан-24 в условиях свободной активности обследуемого с последующей дешифровкой записи на персональном компьютере с помощью программы "Исток-система". Во время исследования дети вели дневник с указанием возникающих жалоб, времени приема пищи и медикаментов, сна, горизонтального и вертикального положения тела.

Для оценки кислых ГЭР использовали общепринятые показатели, предложенные DeMeester: процент времени с рН в пищеводе менее 4 (в том числе в горизонтальном и вертикальном положении тела), общее число рефлюк-сов за сутки, число рефлюксов продолжительностью более 5 мин, длительность наиболее продолжительного рефлюкса. На основании этих данных рассчитывался интегративный показатель DeMeester.

ГЭР расценивался как физиологический, если забросы были непродолжительными, возникали не более 46 раз в сутки, в основном после еды, в вертикальном положении. Характеризующие их цифровые показатели были в пределах нормы по DeMeester.

Если время, в течение которого в пищеводе регистрировался рН менее 4,0, превышало 4,2% от общего времени исследования (более 1 ч за сутки), или общее число кислых забросов было больше 46 в сутки, делалось заключение о наличии патологического кислого ГЭР.

ЭГДС проводилась для оценки состояния слизистой оболочки верхних отделов пищеварительного тракта и определения наличия эзофагита, гастродуоденита.

Диагноз ГЭРБ и ХГД ставился на основании характерных клинических проявлений: жалоб пациентов, объективного статуса и результатов инструментального обследования.

Микробная обсемененность верхних отделов пищеварительного тракта определялась в биоптатах слизистой оболочки нижней трети пищевода и тела желудка, взятых при ЭГДС. Биопсийный материал помещали в транспортную среду Portagerm-pylori (ВВL), предназначенную для сохранения Н. pylori, а также в транспортную среду Амиес. Время транспортировки в лабораторию составляло от 30 мин до 2 ч.

Посевы культивировали соответственно в аэробных, анаэробных и микроаэрофильных условиях с использованием микроанаэростатов (BBL) и газогенераторных пакетов Gas Pack Plus (ВВГ) и Campy Рак Plus (BBL) в течение 24-72 ч при 37oC. Идентификацию бактерий осуществляли с помощью идентификационных АР1-систем ("Bio Merieux").

Количество бактерий определяли путем подсчета колониеобразующих единиц на 1 г биоптата (КОЕ/г) с учетом массы биоптата и разведения [2, 7].

Протеолитические ферменты у микроорганизмов выявляли по наличию зон просветления вокруг колоний при посеве на среды с казеином. Цитотоксичность микроорганизмов определяли путем инкубации тестируемых штаммов с культурой клеток Шр-2. Степень выраженности цитотоксичности учитывали по изменению характера монослоя в виде отслоения клеток, изменения их морфологии, наличию деструкции [7].

Значимость различий определялась по критерию углового преобразования Фишера.

Результаты и обсуждение. По результатам ЭГДС у всех детей 1-й и 2-й группы определялся поверхностный гастрит и дуоденит. Катаральный эзофагит выявлен у 50% детей с ГЭРБ и у 46,2% детей без ГЭРБ.

Микробиоценоз пищевода. Из слизистой оболочки пищевода у детей с ГЭРБ выделялись представители 13 родов микроорганизмов, у детей без ГЭРБ - 8 родов, у здоровых подростков - 10 родов. Микроорганизмы определялись в ассоциации из 3-7 культур у детей с ХГД и из 3-5 культур у здоровых лиц. Чаще сочетались стафилококки, стрептококки, лактобациллы. У детей с ГЭРБ к этому сочетанию нередко присоединялись сар-цины, у детей без ГЭРБ - бактероиды.

У всех детей с ГЭРБ из слизистой оболочки пищевода выделялись стафилококки, стрептококки и бактероиды, у половины и более - лактобациллы, энтеробакте-рии и грибы рода Candida. Сарцины, бациллы и актино-мицеты обнаруживали только у детей с ГЭРБ. Наиболее часто среди представителей микробиоценоза пищевода у детей с ХГД выявляли стафилококки, стрептококки и лактобациллы. В группе контроля более половины детей выделяли только Н. pylori (табл. 1).

Таблица 1

Частота выделения (в %) микроорганизмов из слизистой оболочки пищевода обследованных детей

Таблица 2

Частота выделения (в %) микроорганизмов из слизистой оболочки тела желудка обследованных детей

Микроорганизм 1-я группа

Staphylococcus sp. 100 100 100

Streptococcus sp. 100** 69,2 50,0

Helicobacter pylori 0** 0** 61,1

Lactobacillus sp. 64,3 76,9* 38,9

Enterobacteriaceae 50,0* 30,8 22,2

Bacteroides sp. 100** 38,5 27,8

Candida sp. 50,0** 30,8** 0

Veillonella sp. 21,4 23,1 11,1

Sarcina sp. 35,7** 0 0

Stomatococcus sp. 28,6 30,8 27,8

Bacillus sp. 14,3* 0 0

Actinomyces sp. 14,3* 0 0

Corynebacterium sp. 14,3 0 11,1

Neisseria sp. 14,3 0 11,1

Микроорганизм 1-я группа

Staphtylococcus sp. 100** 100** 61,1

Streptococcus sp. 100*4 76,9* 44,4

Helicobacter pylori 14,3 0** 33,3

Lactobacillus sp. 42,9 46,2 44,4

Enterobacteriaceae 35,7 15,4 22,2

Bacteroides sp. 85,7** 53,8* 16,7

Candida sp. 21,4 23,1 27,8

Micrococcus sp. 28,6 46,2 22,2

Sarcina sp. 57,1** 15,4 5,6

Stomatococcus sp. 35,7** 0 0

Bacilus sp. 21,4 15,4 22,2

Actinomyces sp. 14,3 7,7 5,6

Corynebacterium sp. 14,3 30,8 27,8

Neisseria sp. 21,4 7,7 5,6

Примечание. Здесь и в табл. 2 разница статистически значима по сравнению с контрольной группой: * -p < 0,05, ** -p < 0,001.

Несмотря на то что стафилококки выделены у 100% детей, в том числе у всех здоровых, у пациентов с ГЭРБ отмечена активность факторов агрессии у этих микроорганизмов (гемолизин, лецитиназа). Гемолитические стрептококки выявлялись только у детей с ГЭРБ (см. рисунок).

У здоровых подростков из слизистой оболочки пищевода не выделялись микроорганизмы, обладающие цито-токсичностью. Среди подростков с ГЭРБ и ХГД цитоток-сичностью обладали 100% стрептококков, 74,1% грибов рода Candida, 62,9% стафилококков и 55,6% Н. pylori.

Н. pylori обладает уреазной активностью, что лежит в основе главных методов диагностики этой инфекции в гастроэнтерологии. В данном исследовании уреазная активность стрептококков выявлена у половины детей с ГЭРБ и ХГД, уреазная активность стафилококков - почти у 60% детей с ГЭРБ и ХГД и у половины здоровых подростков,

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

***

64,3 ** 53,8

*** 42,9

11,1

0 0

Гемолитические Стафилококки Гемолитические стафилококки с лецитиназной стрептококки активностью

1-я группа

2-я группа

3-я группа

Активность факторов агрессии микроорганизмов, выделенных из слизистой оболочки обследованных детей.

Разница статистически значима по сравнению с контрольной группой: ** -р < 0,01, *** -р < 0,001.

уреазная активность грибов рода Candida - у 1/3 детей с ГЭРБ и ХГД. Время проявления уреазной активности различных микроорганизмов различалось: у Н. pylori оно составляло 20-30 мин, у других микроорганизмов - 12-24 ч, у стафилококков с гемолитической активностью - 1,5-2 ч.

Количество микроорганизмов у детей с ГЭРБ и ХГД было больше по сравнению с группой контроля и в ряде случаев составляло 4 lg КОЕ/г и более. Это касалось в частности, стафилококков, стрептококков, вейлонелл, энтеро-бактерий, бактероидов и грибов рода Candida. Количество стафилококков, вейлонелл, сарцин, бактероидов, грибов Candida, актиномицетов больше у детей с ГЭРБ по сравнению не только с группой контроля, но и со 2-й группой.

Микробиоценоз желудка. Исследование биоптатов слизистой оболочки тела желудка показало, что у всех подростков групп обследования и группы контроля выделялось 13-15 родов микроорганизмов. Их спектры у детей 1-й и 2-й групп в значительной степени совпадали. Ассоциации бактерий у детей с ГЭРБ и ХГД обычно представлены сочетанием 4-6 родов бактерий, что больше, чем у здоровых лиц (обычно 1-4 культуры).

У всех детей с ГЭРБ из тела желудка выделялись стафилококки и стрептококки, более чем у половины бактероиды и сарцины. Только у детей 1-й группы выделялись стоматококки. У детей с ХГД микробный спектр чаще представлен стафилококками, стрептококками и бактероидами. В 3-й группе только стафилококки присутствовали в биоптатах из тела желудка более чем у половины подростков, остальные микроорганизмы выявлялись значительно реже (табл. 2).

Гемолитические стафилококки выявлены у детей 1-й и 2-й групп в 71,4% и 61,5% случаев соответственно и лишь у 22,2% лиц в контрольной группе (р < 0,01), гемолитические стрептококки - у 35,7% в 1-й группе и у 30,4% во 2 группе в сравнении с 11,1% здоровых (р < 0,05). Стафилококки с лецитиназой в группе контроля не выделялись.

Количество стафилококков, стрептококков, бактероидов у детей с ГЭРБ и ХГД было больше, чем у здоровых детей и почти во всех случаях превышало 4 lg КОЕ/г. В большем количестве у больных детей 1-й и 25-й групп встречались микроорганизмы с факторами патогенности.

микробиология

Заключение. Микробный спектр слизистой оболочки пищевода и желудка у всех обследованных подростков представлен в большей степени нормальной и реже условно-патогенной микрофлорой. Спектр микроорганизмов, выделенных у больных с ГЭРБ и ХГД, шире, их количество часто превышало 4 lg КОЕ/г. Штаммы микроорганизмов у детей с ГЭРБ и ХГД обладают факторами агрессии (гемолизин, лецитиназа) и цитотоксичностью, наличие которой рассматривается как фактор патогенности.

В то же время Н. pylori чаще встречается в слизистой оболочке пищевода и тела желудка здоровых подростков. Уреазную активность имеет не только Н. pylori, но у данного микроорганизма она проявляется намного быстрее.

У детей с ГЭРБ микробный спектр в пищеводе шире, количество выделенных бактерий больше по сравнению не только со здоровыми подростками, но и с детьми с изолированным ХГД. В то же время различия в микробиоценозе желудка между детьми 1-й и 2-й групп не столь существенны, хотя определяются различия с контрольной группой. Мы считаем, что при ГЭРБ повреждающее действие на слизистую оболочку пищевода агрессивного желудочного содержимого приводит к созданию благоприятных условий для развития микробной флоры в данном отделе пищеварительного тракта.

ЛИТЕРАТУРА

1. Базлов С. Н., Червинец В. М., Егорова Е. Н. Эффективность трансэндоскопической санации ульцерозного процесса при рецидиве язвенной болезни, ассоциированной с дисбактериозом гастродуоде-нальной зоны. Альманах клинической медицины. 2006; 14: 13-7.

2. Егорова Е. Н. Микробная флора и лизоцим слизистой оболочки гастродуоденальной зоны при язвенной болезни и возможности их коррекции: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. СПб.; 1999.

3. Казимирова А. А., Казачков Е. Л. Структурно-функциональное состояние слизистой оболочки желудка и его микробиоценоз при хроническом гастрите у детей. Уральский медицинский журнал. 2009; 4: 17-21.

4. Лазебник Л. Б., Машарова А. А., Бордин Д. С. и др. Многоцентровое исследование "Эпидемиология гастроэзофагеальной рефлюксной болезни в России" (МЭГРЕ): первые итоги. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2009; 6: 4-12.

5. Масевич Ц. Г., Лосева И. А. Гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь в сочетании с инфицированием пилорическим хелико-бактером. Терапевтический архив. 1998; 70 (2): 26-8.

6. Цветкова Л. Н., Горячева О. А., Цветков П. М. и др. Гастроэнтерологическая патология у детей: патоморфоз заболеваний и совершенствование методов диагностики на современном этапе. В кн.: Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей. М.; 2011: 5-8.

7. Червинец В. М. Изменение микробиоценоза при воспалительных и эрозивно-язвенных поражениях пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки и пути его коррекции: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М.; 2002.

8. Червинец В. М. Микрофлора воспалительно-эрозивных участков пищевода при эзофагитах. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2002; 2: 73-5.

9. El-SeragН. В., SonnenbergA., JamalМ. М. et al. Corpus gastritis is protective against reflux oesophagitis. Gut. 1999; 45: 181-5.

10. O'Connor H. J. Review article: Helicobacter pylori and gastroesophageal reflux disease - clinical implications and management. Aliment. Pharmacol. Ther. 1999; 13: 111-27.

Поступила 04.07.12

© Т. А. ГРИШКИНА, В. м. САмыГИН, 2013 УДК 616-002.828-078

Т. А. Гришкина, В. м. Самыгин

СПОСОБ идентификации микроскопических ГРИБОВ РОДА CoCCiDioiDEs spp. iN ViTRo

Волгоградский государственный технический университет министерства образования и науки РФ

Исследованы морфологические особенности микроскопических грибов рода Coccidioides spp. при культивировании на культуре клеток мышиных спленоцитов. Шаммы С. immitis и С. posadasii в течение 5-7 сут конверсируют из мицелиальной в сферульную форму, что позволяет использовать данный тест для идентификации возбудителей кокцидиоидомикоза.

Ключевые слова: Coccidioides immitis, Coccidioides posadasii, возбудители кокцидиоидомикоза, мицелиальная форма, сферулы

T.A. Grishkina, V.M. Samygin

THE MODE OF IDENTIFICATION OF MICROSCOPIC FUNGI OF GENUS OF COCCIDIDOIDES SPP. IN VITRO The article deals with analysis of morphologic characteristics of microscopic fungi of genus of Coccididoides spp. under cultivation on culture of mouse splenocytes culture. During two days, the strains of C.imitis and C.posadasii converse from filamentous to spherulic form. This process makes it possible to apply this test to identify agents of coccidioidomycosis.

Key words: Coccididoides imitis, agent of coccidioidomycosis, filamentous form, spherula

Для корреспонденции:

Гришкина Татьяна Александровна, канд. мед. наук, доц. каф. пром.

экологии и безопасности жизнедеятельности

Адрес: 400005, Волгоград, пр. Ленина, 56/39

Телефон: (8442)23-16-80

E-mail: tatyana@ovel.ru

Кокцидиоидомикоз (болезнь Вернике-Посады - неконтагиозный системный микоз, проявляющийся как первичная легочная инфекция, либо как прогрессирующие гранулематозные поражения кожи, суставов, костей, внутренних органов и мозговых оболочек [14]. Возбудители кокцидиоидомикоза Coccidioides spp. до недавнего