Влияние инсулина и глюкозы in vitro на функциональную активность Т-хелперов-17 при сахарном диабете 2-го типа

ВЛИЯНИЕ ИНСУЛИНА И ГЛЮКОЗЫ IN VITRO НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ Т-ХЕЛПЕРОВ-17 ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ 2-ГО ТИПА

И.В. Кологривова

ФГБУ "НИИ кардиологии" СО РАМН, Томск E-mail: ikologrivova@gmail.com

INFLUENCE OF INSULIN AND GLUCOSE ON THE FUNCTIONAL ACTIVITY OF T-HELPER-17 IN VITRO IN TYPE 2 DIABETES

I.V. Kologrivova

Federal State Budgetary Institution "Research Institute for Cardiology" of Siberian Branch under the Russian Academy of Medical Sciences, Tomsk

Изучали влияние инсулина и глюкозы на функциональную активность T-лимфоцитов-хелперов 17-го типа (Th17). Число Th17 ex vivo оценивали у 32 пациентов с сахарным диабетом (СД) 2-го типа, 12 пациентов с нарушением толерантности к углеводам (НТУ) и 24 здоровых добровольцев. Мононуклеары периферической крови пациентов с СД 2-го типа и здоровых добровольцев культивировали в течение 24 ч в среде, содержащей 5, 10 и 20 ммоль/л глюкозы или следующие сочетания инсулина и глюкозы: 5 ммоль/л глюкозы и 10-10 моль/л инсулина, 5 ммоль/л глюкозы и 10-8 моль/л инсулина, 20 ммоль/л глюкозы и 10-8 моль/л инсулина. Оценивали число активных Th17 в культуре и количество секретированного IL-17A. Пациенты с НТУ характеризовались повышенным содержанием Th17 ex vivo. У пациентов с Сд 2-го типа мононуклеары внутриклеточно продуцировали больше IL-17 по сравнению со здоровыми добровольцами после культивирования в течение суток при 5 ммоль/л глюкозы. При 10 ммоль/л глюкозы в среде внутриклеточная продукция IL-17 была выше, чем при 5 ммоль/л как у пациентов, так и у здоровых добровольцев. У пациентов с СД 2-го типа культивирование клеток с 20 ммоль/л глюкозы приводило к увеличению стимулированной форбол-миристат-ацетатом внутриклеточной продукции IL-17 по

сравнению с 5 ммоль/л глюкозы. Инсулин при всех используемых концентрациях приводил к активации спонтанной внутриклеточной продукции iL-17 у пациентов и здоровых добровольцев. Сочетание 20 мммоль/л глюкозы и 10-8 моль/л инсулина вызывало увеличение количества активных Th17 у здоровых добровольцев. Таким образом, мы показали, что метаболические нарушения при СД 2-го типа могут ассоциироваться с увеличением функциональной активности Th17 in vitro.

Ключевые слова: сахарный диабет 2-го типа, воспаление, Т-хелперы 17-го типа, инсулин, глюкоза.

Influence of insulin and glucose on functional activity of Th17 in vitro was studied. The study included 11 patients with diabetes mellitus type 2 (DM2) and 13 non-diabetic volunteers. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were cultured for 24 hours in the medium containing 5, 10 and 20 mmol/L of glucose; or the following combinations of insulin and glucose concentrations: 5 mmol/L glucose and 10-10 mol/L insulin, 5 mmol/L glucose and 10-8 mol/L insulin, 20 mmol/L glucose and 10-8 mol/L insulin. Number of active Th17 in culture and quantity of secreted IL-17A were estimated. Percentage of Th17 ex vivo was studied in 32 patients with DM2, 12 patients with impaired glucose tolerance (IGT), and in 24 nondiabetic healthy volunteers. Patients with IGT were characterized by the elevated number of Th17 ex vivo. PBMC from patients with DM2 revealed enhanced intracellular production of IL-17 compared to PBMC from healthy volunteers when cultured in medium with 5 mmol/L glucose for 24 hours. Elevation of glucose content in the medium up to 10 mmol/L caused an increase in spontaneous intracellular production of IL-17 both in patients and in healthy volunteers compared to 5 mmol/L glucose. In patients with DM2, cultivation of PBMC with 20 mmol/L of glucose led to the elevation of PMA-stimulated intracellular production of IL-17 compared to 5 mmol/L glucose. Insulin at all the used concentrations stimulated Th17 in healthy volunteers and in patients with DM2. Intracellular production of IL-17 increased in the group of healthy volunteers when the medium was supplied both with 10-8 mol/L insulin and 20 mmol/L glucose. Our study shows that metabolic disturbances during DM2 may be accompanied by the increase of the Th17 functional activity in vitro.

Key words: diabetes mellitus type 2, inflammation, T-helper type 17, insulin, glucose.

Введение

Сахарный диабет (СД) 2-го типа привлекает все большее внимание исследователей, но механизмы его развития до сих пор изучены недостаточно. При этом заболеваемость СД 2-го типа и развитие его осложнений остаются серьезными проблемами во всем мире [1].

В настоящее время известно, что СД 2-го типа ассоциируется с развитием субклинического воспаления, проявляющегося, в частности, увеличением содержания интерлейкина (ІЬ)-ір, Ш6 и фактора некроза опухолей (Т№)-а в циркуляции [3]. Эти цитокины могут создавать провоспалительное микроокружение, благоприятное для активации недавно открытой субпопуляции Т-лимфоци-тов - Т-хелперов 17-го типа (ТЫ7). Несмотря на значительный потенциал ТЫ7 модулировать воспаление, мы встретили лишь незначительное число работ, посвященных изучению функционирования данных клеток у пациентов с СД 2-го типа [3, 10].

На ранних этапах развития СД 2-го типа, как правило, наблюдается гиперинсулинемия [6]. Инсулин может влиять на функцию Т-лимфоцитов, но транспорт глюкозы в лимфоцитах является независимым от инсулина, т.к. в норме они не экспрессируют переносчик глюкозы GLuT-4, а несут на своей поверхности GLUT-1 и GLUT-3 [7, 9].

Известно, что повышенная постпрандиальная концентрация глюкозы (после приема пищи) является основным фактором риска развития микро- и макрососудистых осложнений при СД 2-го типа [8]. Если в норме содержание глюкозы через 2 ч после приема пищи не превышает 5 ммоль/л, то у пациентов с Сд 2-го типа постпрандиаль-ная гипергликемия может достигать 20 ммоль/л [2]. Нарушение толерантности к углеводам (НТУ) обычно предшествует развитию СД 2-го типа. Постпрандиальное содержание глюкозы при этом патологическом состоянии является повышенным, но не так выражено, как при СД 2-го типа и обычно не превышает 10 ммоль/л [2].

Цель исследования: изучение влияния различных концентраций инсулина и глюкозы в условиях in vitro на функциональную активность Th17 у пациентов с нарушениями углеводного обмена.

Материал и методы

В исследование вошли 32 пациента с СД 2-го типа (возраст - 45-61 лет; 14 мужчин/18 женщин), 12 пациентов с НТУ (возраст - 56-61 лет; 5 мужчин/7 женщин) и 24 практически здоровых добровольца (возраст - 40-59 лет; 10 мужчин/14 женщин). У пациентов с СД 2-го типа и НТУ лабораторно было подтверждено наличие гипергликемии и гиперинсулинемии. Мононуклеарные клетки из гепаринизированной венозной крови, взятой утром натощак, выделяли путем центрифугирования на градиенте плотности (Histopaque 1119, Sigma-Aldrich, США).

Для оценки внутриклеточной продукции IL-17A мононуклеары культивировали на среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% L-глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина при 37 °C, 5% CO2 в присутствии GolgiPlug (Bd Pharmingen, США). Оценивали как спонтанную внутриклеточную продукцию IL-17, так и стимулированную форбол-12-миристат-13-ацета-том (ФМА; 50 нг/мл, Sigma-Aldrich, США) с иономицином (1 мг/мл, Sigma-Aldrich, США). Через 6 ч 100 мл взвеси мононуклеаров окрашивали анти^4 моноклональными антителами, меченными фикоэритрином-цианином-5 (PE-Cy5, Becton Dickinson, США), фиксировали, увеличивали проницаемость клеточных мембран и окрашивали анти-IL-17A моноклональными антителами, меченными фикоэритрином (PE, Becton Dickinson, США). Анализ клеток проводили на проточном цитометре FACSCalibur с использованием программы CellQuestPro (BD Biosciences, США).

У 11 здоровых добровольцев и 13 пациентов с СД 2-го типа изучали влияние инсулина и глюкозы на продукцию IL-17. Для этого 106 клеток культивировали в про-

бирках емкостью 15 мл в течение 24 ч при 37 °С и 5% CO2 в 1 мл среды RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% L-глутамина и 1% пенициллина/ стрептомицина. В культуральную среду добавляли инсулин и D-глюкозу в различных концентрациях (оба реагента - Sigma Aldrich, США). Три пробирки имели концентрацию D-глюкозы 5, 10 и 20 ммоль/л и не содержали инсулина. В трех пробирках было создано следующее сочетание концентраций инсулина и D-глюкозы: 5 ммоль/л глюкозы и 10-10 моль/л инсулина; 5 ммоль/л глюкозы и 10-8 моль/л инсулина; 20 ммоль/л глюкозы и 10-8 моль/л инсулина. In vitro концентрации инсулина и глюкозы были выбраны таким образом, чтобы соответствовать условиям, которые имеют место in vivo в ходе развития СД 2-го типа. Для контроля осмолярности была использована пробирка, содержащая 5 ммоль/л D-глюкозы и 15 ммоль/л D-маннитола. Через 24 ч супернатанты клеточных культур собирали и хранили при -40 °С для последующего определения секретированного IL-17 методом иммуноферментного анализа (Вектор-БЕСТ, Россия). Клетки ресуспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе и оценивали внутриклеточную продукцию IL-17 методом проточной цитометрии. Для оценки жизнеспособности клетки окрашивали 7-актиноамино-мицином D (7-AAD, Becton Dickinson, США). Жизнеспособность клеток варьировала от 95 до 98%.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ SPSS 11.5.0 for Windows (SPSS Inc., США). Использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни и критерий Вилкоксона для связных выборок. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Результаты представлены в виде медианы и интерквартильного размаха.

Результаты

Анализ ex vivo показал, что пациенты с НТУ характеризовались большим количеством активных Th17 после стимуляции ФМА с иономицином по сравнению со здоровыми добровольцами и пациентами с СД 2-го типа (р=0,015 и р=0,023 соответственно, рис. 1).

После инкубации клеток в течение 24 ч в среде с содержанием глюкозы 5 ммоль/л процент Т-клеток, внутрикле-точно продуцирующих IL-17 спонтанно и после стимуляции ФМА с иономи-цином, был значительно выше у пациентов с СД 2-го типа по сравнению с контрольной группой (рис. 2 А).

Инкубация мононуклеаров здоровых добровольцев в среде с концентрацией глюкозы 10 и 20 ммоль/л привела к увеличению спонтанной внутриклеточной продукции IL-17 по сравнению с концентрацией глюкозы в среде 5 ммоль/л (р=0,010 и р=0,002 соответственно; рис. 2 А). У пациентов с СД 2-го типа увеличение спонтанной внутриклеточной продукции IL-17 наблюда-

лось только при концентрации глюкозы в среде 10 ммоль/ л (р=0,044).

Стимуляция ФМА с иономицином мононуклеаров периферической крови у пациентов с СД 2-го типа приводила к более выраженному увеличению продукции цито-кина при содержании глюкозы в среде 20 ммоль/л по сравнению с 5 ммоль/л глюкозы (р=0,001; рис. 2 Б). В группе здоровых добровольцев процент активированных Th17 после стимуляции ФМА с иономицином достоверно не различался при различном содержании глюкозы в среде (рис. 2 А). Инкубация с D-маннитолом не приводила к изменению внутриклеточной продукции IL-17 как в группе пациентов с Сд 2-го типа, так и в группе здоровых добровольцев (рис. 2). Следовательно, наблюдаемое изменение продукции цитокинов связано именно с воздействием глюкозы, а не с изменением осмолярности среды.

Добавление 10-10 и 10-8 моль/л инсулина in vitro приводило к увеличению содержания IL-17-продуцирующих Th17 как в группе здоровых добровольцев, так и в группе пациентов с СД 2-го типа (р=0,005 и р=0,002 соответственно при 10-10 моль/л инсулина; р=0,003 и р=0,047 соответственно при 10-8 моль/л инсулина; рис. 3 А).

В группе здоровых добровольцев процент Th17, внут-риклеточно продуцирующих IL-17, после стимуляции ФМА с иономицином, был выше при содержании в среде 10-10 и 10-8 моль/л инсулина по сравнению со средой без инсулина (р=0,001 и р=0,007 соответственно; рис. 3 Б).

У пациентов с СД 2-го типа количество активированных Th17 не зависело от концентрации инсулина в среде, если клетки стимулировали ФМА с иономицином после 24 ч культивирования. Процент Th17, продуцирующих IL-17, оставался высоким как в отсутствии инсулина, так и при содержании 10-10 и 10-8 моль/л инсулина в среде (рис. 3 Б).

Культивирование мононуклеаров здоровых добровольцев в среде, содержащей повышенные концентрации инсулина (10-8 моль/л) и глюкозы (20 ммоль/л), приводило к увеличению количества активированных Th17 по

Рис. 1. Примеры точечных диаграмм, отражающих процент Th17 ex vivo у пациентов с СД 2-го типа (n=32), пациентов с нТу (n=12) и здоровых добровольцев (n=24). Процент указан от общего количества CD4+-лимфоцитов

сравнению с условиями культивирования без инсулина с содержанием глюкозы 5 ммоль/л (рис. 3). Данный эффект совместного воздействия высоких концентраций инсулина и глюкозы наблюдался как при стимуляции ФМА и иономицином (р=0,001), так и в отсутствии стимуляции (р=0,005).

В мононуклеарах пациентов с СД 2-го типа спонтанная и стимулированная ФМА с иономицином внутриклеточная продукция IL-17 при сочетанном воздействии 10-8 моль/л инсулина и 20 ммоль/л глюкозы не отличалась от условий культивирования без инсулина и оставалась на высоком уровне (рис. 3).

Содержание секретированного IL-17 после 24 ч культивирования было относительно низким при всех концентрациях глюкозы и инсулина, созданных in vitro в нашем исследовании, и граничило с пределом чувствительности используемого набора ИФА (2 пг/мл), рисунки 2 В и 3 В, поэтому мы не смогли сделать какого-либо заключения о влиянии инсулина и глюкозы на секрецию IL-17.

Обсуждение

Мы показали увеличение функциональной активности Th17 у пациентов с СД 2-го типа, что отражалось в активации внутриклеточного синтеза IL-17 после культивирования в течение 24 ч. В соответствии с нашими результатами, активация Th17 имеет место даже при небольшом увеличении концентрации глюкозы в среде, т.е. отклонение оси дифференцировки Th17 может предшествовать развитию СД 2-го типа, что мы наблюдали ex vivo у пациентов с НТУ.

Несмотря на увеличение внутриклеточной продукции IL-17, мы не выявили влияния глюкозы и инсулина на секрецию данного цитокина in vitro. Вероятно, для интенсивной секреции IL-17 необходимо наличие дополнительного активационного сигнала. Так, A. Lenarczyk и соавт. показали, что при секреции IL-17 важную роль играет митогенная стимуляция лимфоцитов [4].

Наши результаты свидетельствуют о том, что инсулин наряду с глюкозой может стимулировать активацию Th17, действуя как сам по себе, так и в сочетании с глюкозой. Мы полагаем, что инсулин не оказывал влияния на стимулированную продукцию цитокина в Th17 у пациен-

тов с СД 2-го типа, т.к. клетки уже подвергались воздействию высоких концентраций инсулина и глюкозы in vivo. Известно, что гипергликемия может приводить к активации протеинкиназы С (PKC) с последующим ингибированием инсулинового сигналинга [5]. Вероятно, дополнительная активация данного пути in vitro с помощью ФМА привела к блокированию внутриклеточного сигна-линга инсулина и вызвала различный ответ на воздействие инсулина в группах пациентов и здоровых добровольцев. Необходимы дальнейшие исследования, направленные на выяснение роли PKC в сигналинге инсулина и глюкозы при синтезе IL-17.

Рис. 2. Влияние различных концентраций глюкозы на 24-часовую спонтанную внутриклеточную продукцию 1-17 (А), стимулированную ФМА с иономицином внутриклеточную продукцию 1Ь-17 (Б), секрецию 1-17 (В) мононуклеарами периферической крови у пациентов с СД 2-го типа (п=13) и здоровых добровольцев (п=11); А и Б - указан процент клеток от СБ4+-лимфоцитов, В - концентрация в пг/мл; * - р<0,05 по сравнению с концентрацией глюкозы в среде 5 ммоль/л; # - р<0,05 по сравнению со здоровыми добровольцами; о - экстремумы.

Рис. 3. Влияние различных концентраций инсулина на 24-часовую спонтанную внутриклеточную продукцию 1-17 (А), стимулированную ФМА с иономицином внутриклеточную продукцию 1Ь-17 (Б), секрецию 1-17 (В) мононуклеарами периферической крови у пациентов с СД 2-го типа (п=13) и здоровых добровольцев (п=11); А и Б - указан процент клеток от СБ4+-лимфоцитов, В - концентрация в пг/мл; * - р<0,05 по сравнению с условиями без инсулина и 5 ммоль/л глюкозы в среде; # - р<0,05 по сравнению со здоровыми добровольцами; о - экстремумы.

Таким образом, в соответствии с нашими данными, метаболические нарушения при СД 2-го типа ассоциируются с повышенной активацией линии ^П-лимфо-цитов, что может значительно увеличивать риск развития воспаления у пациентов и, следовательно, осложнений диабета.

Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям в рамках Федеральной целевой научно-технической программы “Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы” (Государственный контракт № 02.527.11.0007

от 30 апреля 2009 г.)

Литература

1. Гарганеева Н.П. Психосоциальные аспекты сахарного диабета 2-го типа: инновации профилактики // Сибирский медицинский журнал (Томск). - 2011. - Т. 26, № 4. - С. 121 — 125.

2. Airola P. Hypoglycemia: a better approach. - Phoenix, Arizona : Health Plus., 1977. - 191 p.

3. Jagannathan-Bogdan M., McDonnell M.E., Shin H. et al. Elevated proinflammatory cytokine production by a skewed T cell compartment requires monocytes and promotes inflammation in type 2 diabetes // J. Immunol. - 2011. - Vol. 186. - P. 11621172.

4. Lenarczyk A., Helsloot J., Farmer K. et al. Antigen-induced IL-17 response in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy controls // Clin. Exp. Immunol. - 2000. - Vol. 122. -P. 41-48.

5. Oldenborg P.-A., Sehlin J. Hyperglycemia in vitro attenuates insulin-stimulated chemokinesis in normal human neutrophils. Role of protein kinase C activation // J. Leukoc. Biol. - 1999. -Vol. 65. - P. 635-640.

6. Shanik M.H., Xu Y., Skrha J. et al. Insulin resistance and hyperinsulinemia // Diabetes Care. - 2008. - Vol. 31, Suppl. 2. - P. S262-S268.

7. Szablewski L., Sobczyk-Kopciol A., Oleszczak B. et al. GLUT4 is expressed in circulating lymphocytes of diabetic patients. A method to detect early prediabetic stages? // Diabetologia Croatica. - 2007. - Vol. 36. - P. 69-76.

8. Tenzer-Iglesias P., Brunton S. Managing postprandial glucose levels in patients with diabetes // J. Fam. Pract. Suppl. - 2008. -Vol. 57, No. 1. - P. S17-S24.

9. Van der Weerd K., Dik W.A., Schrijver B. et al. Morbidly obese human subjects have increase peripheral blood CD4+ T cells with skewing toward a Treg- and Th2-dominated phenotype // Diabetes. - 2012. - Vol. 61, № 2. - P. 401-408.

10. Zeng C., Shi X., Zhang B. et al. The imbalance of Th17/Th1/ Tregs in patients with type 2 diabetes: relationship with metabolic factors and complications // J. Mol. Med. (Berl.). -2012. - Vol. 90, No. 2. - P. 175-186.

Поступила 02.04.2013

Сведения об авторе

Кологривова Ирина Вячеславовна, научный сотрудник отделения функциональной и лабораторной диагностики ФГБУ “НИИ кардиологии” СО РАМН. Адрес: 634012, г. Томск, ул. Киевская, 111а.

E-mail: ikologrivova@gmail.com.