ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для терапевтического и диагностического применения в лечении заболеваний и нарушений, которые вызваны или связаны с нейрофибриллярными клубками. В частности, изобретение относится к антителам, которые специфично узнают и связываются с фосфорилированными патологическими конформерами Tau-белка, а также к способам и композициям, включающим указанные антитела для терапевтического и диагностического применения в лечении таупатий, включая болезнь Альцгеймера (БА).
Нейрофибриллярные клубки и нейропильные нити (NT) являются основными нейропатологическими признаками болезни Альцгеймера (БА). Они состоят из ассоциированного с микротрубочками Tau-белка, который подвергся посттрансляционным модификациям, включающим фосфорилирование, деамидирование и изомеризацию по аспарагинильным или аспартильным остаткам. Они образуются в результате агрегации гиперфосфорилированного Tau-белка и его конформеров. БА разделяет такую патологию со многими нейродегенеративными таупатиями, в особенности с определенными типами лобно-височной деменции (FTD).
Tau-белок представляет собой свободнорастворимый, "несвернутый" в нативной форме белок, который сильно связывается с микротрубочками (MT), обеспечивая их сборку и стабильность. MT имеют большое значение для цитоскелетной целостности нейронов и, таким образом, для правильного формирования и функционирования нейронных цепей и, следовательно, для обучения и памяти. Связывание Tau с MT контролируется динамическим фосфорилированием и дефосфорилированием, как продемонстрировано главным образом in vitro и на ненейронных клетках. Из-за большого количества возможных сайтов фосфорилирования (>80), точный вклад каждого и идентичность ответственных киназ остаются в значительной степени неопределенными in vivo.
В мозге при БА Tau-патология развивается после, и поэтому вероятно в ответ на амилоидную патологию, которая составляет сущность гипотезы амилоидного каскада. Это основано на и показано исследованиями у пациентов с БА и синдромом Дауна, а также подтверждено исследованиями на трансгенных мышах с комбинированной амилоидной и Tau-патологией (Lewis et al., 2001; Oddo et al., 2004; Ribe et al., 2005; Muyllaert et al., 2006; 2008; Terwel et al., 2008).
Точное определение сроков обоих патологий у пациентов с БА, а также механизмов, которые связывают амилоидную с Tau патологией, остаются в значительной степени невыясненными, но, как предполагается, включают активацию путей сигнализации нейронов, которые действуют на или посредством GSK3 и cdk5 как главных "Tau-киназ" (см. обзор Muyllaert et al., 2006, 2008).
Гипотеза, согласно которой таупатия является не безвредным побочным эффектом, а главной причиной патологии при БА, основывается на обоснованных генетических, патологических и экспериментальных наблюдениях, которые полностью подтверждают друг друга:
- в случаях семейной БА с ранним началом, которая обусловлена мутациями в белке-предшественнике амилоида (APP) или пресенилине, непременной причиной патогенного процесса является накопление амилоида, но при этом патология неизменно включает коллатеральную таупатию, идентичную таупатии при спорадических случаях БА с поздним началом;
- тяжесть когнитивной дисфункции и деменции коррелирует с таупатией, а не с амилоидной патологией, что недавно подтверждалось несколькими клиническими исследованиями фазы 1 и 2, которые включают PiB ПЭТ-визуализацию амилоида и идентифицируют множество "ложноположительных случаев": лица с нормальной когнитивной функцией, имеющие высокую амилоидную нагрузку мозга;
- при семейной FTD, таупатия вызывается мутантным Tau и непосредственно вызывает нейродегенерацию, без амилоидной патологии;
- в экспериментальных моделях на мышах, когнитивные нарушения, вызванные амилоидной патологией, почти полностью устраняются при отсутствии Tau-белка (Roberson et al., 2007).
Взятые вместе аргументы подтверждают гипотезу, что Tau-белок является ведущим фактором когнитивного нарушения при БА и связанных нейродегенеративных таупатиях.
Новым значительным методом лечения БА является пассивная иммунотерапия специфичными mAb, устраняющая амилоидные пептиды и их агрегаты, которые, как предполагают, являются нейротоксичными или синаптотоксичными.
Иммунотерапия, направленная против Tau-патологии, предложенная в настоящей заявке, как ожидают, будет противодействовать патологическим конформерам Tau-белка, которые, как известно или предполагается, вызывают синаптическую дисфункцию и нейродегенерацию. Амилоидная патология, вызываемая внутринейронными агрегатами гиперфосфорилированного Tau-белка, как предполагается, действует синергически в когнитивном и дегенеративном каскаде патологических событий, которые ведут от умеренного когнитивного нарушения (MCI) к тяжелой деменции при БА. Комбинация tau-направленного лечения с амилоидо-направленным (или любым другим) лечением, таким образом, составляет предпочтительное и по существу более эффективное лечение БА, в противоположность существующей монотерапии.
Другие терапевтические методы, которые направлены на Tau-белок, неэффективны и включают главным образом:
- ингибиторы киназ, которые, как предполагают, увеличивают фосфорилирование Tau до патологических уровней;
- соединения, которые блокируют цитоплазматическую агрегацию гиперфосфорилированного Tau-белка.
Указанные подходы имеют различные недостатки специфичности и эффективности, что характеризует проблему, которую они разделяют с попытками модифицировать метаболизм APP и амилоида, и подчеркивает важность непрерывного поиска дополнительных вариантов лечения, включая иммунотерапию против Tau.
Фактически никаких усилий не предпринимали для определения - не считая мишени - патологических Tau-конформеров in vivo. В клиническом испытании фазы II Αβ42, клубковая патология, по-видимому, не была хорошо ни изучена, ни проанализирована более тщательно (Nicoll et al., 2003; Masliah et al., 2005). С другой стороны, экспериментальная иммунотерапия против амилоида в доклинической мышиной модели с комбинированной БА-подобной патологией также продемонстрировала эффект в отношении Tau-патологии, хотя Tau агрегаты сохранились (Oddo et al., 2004).
Некоторые сомнения прозвучали по поводу возможности достижения внутриклеточного Tau-белка иммунотерапией. Этому противоречило новое экспериментальное исследование в модели таупатии на мышах (Asuni et al., 2007). Было показано уменьшение клубковой патологии и функциональные улучшения при вакцинировании полученным на основе Tau-белка фосфо-пептидом. Эти данные подтверждают предыдущие сообщения касательно иммунотерапии, направленной на α-синуклеин при болезни Паркинсона (БП) и модели болезни телец Леви (Masliah et al., 2005, 2011) и супероксиддисмутазу в модели амиотрофического бокового склероза (АБС) (Urushitiani et al., 2007). Указанные заболевания являются примерами, в которых внутриклеточные белки приводят к синаптическим дефектам и нейродегенерации посредством пока еще не полностью изученных механизмов. С другой стороны, рекомбинантный полноразмерный Tau-белок, продуцируемый в бактериях и выделенный из них, оказался неподходящим в качестве вакцины, хотя используемые адъюванты, а именно полный адъювант Фрейнда и токсин коклюша, возможно, способствовали получению отрицательного результата в данном исследовании (Rosenmann et al., 2006).
Существует неудовлетворенная потребность в пассивных и/или активных иммунотерапиях, которые противодействуют патологическим белковым конформерам, которые, как известно, или как предполагается, вызывают нейродегенеративные нарушения, такие как амилоидную патологию при БА, вызванную, например, внутринейронными агрегатами гиперфосфорилированного Tau-белка, которые так же типичны для БА, как и амилоид.
Указанная неудовлетворенная потребность может быть удовлетворена в рамках настоящего изобретения посредством предоставления связывающих белков, узнающих и связывающихся с главными патологическими фосфо-эпитопами Tau-белка. В частности настоящее изобретение предоставляет специфичные антитела против линейных и конформационных, простых и сложных фосфо-эпитопов на Tau-белке, в особенности на агрегированном Tau-белке, которые, как предполагают, ответственны за синапто- и нейротоксичность при таупатиях, включая БА.
Таким образом, настоящее изобретение в одном варианте осуществления относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, где связывающий пептид или белок, или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с фосфо-эпитопом на агрегированном Tau-белке, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело обладают высокой аффинностью связывания с растворимым и нерастворимым Tau-белком, и модулируют уровни растворимого и нерастворимого Tau, в особенности в мозге, в частности с константой диссоциации по меньшей мере 10 нМ, в частности по меньшей мере 8 нМ, в частности по меньшей мере 5 нМ, в частности по меньшей мере 2 нМ, в частности по меньшей мере 1 нМ, в частности по меньшей мере 500 пМ, в частности по меньшей мере 400 пМ, в частности по меньшей мере 300 пМ, в частности по меньшей мере 200 пМ, в частности по меньшей мере 100 пМ, в частности по меньшей мере 50 пМ.
4
-1
-1
4
-1
-1
5
-1
-1
5
-1
-1
6
-1
-1
6
-1
-1
7
-1
-1
Во втором варианте осуществления настоящее изобретение относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности к связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело обладают константой скорости ассоциации 10 Мс или больше, в частности 3-5 × 10 Мс или больше, в частности 10 Мс или больше; в частности 2-9 × 10 Мс или больше; в частности 10 Мс или больше, в частности 1-4 × 10 Мс или больше, в частности 10 Мс или больше.
5
-1
-1
6
-1
-1
4
-1
-1
5
-1
-1
5
-1
-1
6
-1
-1
В третьем варианте осуществления настоящее изобретение относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело обладают высокой аффинностью связывания с константой диссоциации по меньшей мере 4 нМ и константой скорости ассоциации 10 Мсили больше, в частности константой диссоциации по меньшей мере 3 нМ и константой скорости ассоциации 10 Мс или больше, в частности константой диссоциации по меньшей мере 2 нМ и константой скорости ассоциации 10 Мс или больше, в частности константой диссоциации по меньшей мере 1 нМ и константой скорости ассоциации 10 Мс или больше, в частности константой диссоциации по меньшей мере 200 пМ и константой скорости ассоциации 10 Мс или больше, в частности константой диссоциации по меньшей мере 100 пМ и константой скорости ассоциации 10 Мс или больше.
Один вариант осуществления (4) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело связываются с эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека, показанном в SEQ ID NO: 67, выбранным из группы, состоящей из Tau а/к 15-20, включающих фосфорилированный Tyr в положении 18 (Y18), Tau а/к 405-412, включающих фосфорилированный Ser в положении 409 (pS409), Tau а/к 405-411, включающих фосфорилированный Ser в положении 409 (pS409); и Tau а/к 208-218, включающих фосфорилированный Thr в положении 212 (pT212) и фосфорилированный Ser в положении 214 (pS214).
Один вариант осуществления (5) относится к связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где указанный пептид связывается с эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека, но прежде всего на Tau-белке человека, показанном в SEQ ID NO: 67, включающем Tau а/к 15-20 с фосфорилированным Tyr в положении 18 (Y18).
Один вариант осуществления (6) относится к связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где указанный пептид связывается с эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека, но прежде всего на Tau-белке человека, показанном в SEQ ID NO: 67, включающем Tau а/к 405-412 с фосфорилированным Ser в положении 409 (pS409).
Один вариант осуществления (7) относится к связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где указанный пептид связывается с эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека, но прежде всего на Tau-белке человека, показанном в SEQ ID NO: 67, включающем Tau а/к 405-411 с фосфорилированным Ser в положении 409 (pS409).
Один вариант осуществления (8) относится к связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где указанный пептид связывается с эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека, но прежде всего на Tau-белке человека, показанном в SEQ ID NO: 67, включающем Tau а/к 208-218 с фосфорилированным Thr в положении 212 (pT212) и фосфорилированным Ser в положении 214 (pS214).
В другом варианте осуществления (9) настоящее изобретение относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит, в частности в последовательности, CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 21, 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81, 93, 101, 106, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 70%, в частности по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 96%, в частности по меньшей мере на 97%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной указанным последовательностям; CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, 74, 82, 94, 102, 107, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 96%, в частности по меньшей мере на 97%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной указанным последовательностям, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 23, 26, 31, 34, 75, 83, 95, 103, 108, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 60%, в частности по меньшей мере на 70%, в частности по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 96%, в частности по меньшей мере на 97%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной указанным последовательностям; и/или второй связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 12, 15, 18, 70, 78, 89, 98, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 96%, в частности по меньшей мере на 97%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной указанным последовательностям; CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 13, 16, 19, 71, 79, 90, 99, 115, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 96%, в частности по меньшей мере на 97%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной указанным последовательностям, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 14, 17, 20, 72, 80, 91, 100, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 96%, в частности по меньшей мере на 97%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% или на 100%, идентичной указанным последовательностям.
Один вариант осуществления (10) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 21, 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 85% идентичной указанным последовательностям; CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, 74, 82, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной указанным последовательностям, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 23, 26, 31, 34, 75, 83, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 80% идентичной указанным последовательностям; и/или домен антитела, который содержит CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 12, 15, 18, 70, 78, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной указанным последовательностям: CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 3, 16, 19, 71, 79, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 85% идентичной указанным последовательностям, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 14, 17, 20, 72, 80, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 85% идентичной указанным последовательностям.
Один вариант осуществления (11) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 21, 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной указанным последовательностям; CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, 74, 82, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной указанным последовательностям, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 23, 26, 31, 34, 75, 83, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной указанным последовательностям; и/или второй связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 12, 15, 18, 70, 78, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной указанным последовательностям; CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 13, 16, 19, 71, 79, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной указанным последовательностям, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 14, 17, 20, 72, 80, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной указанным последовательностям.
Один вариант осуществления (12) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен (домен антитела), который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 21, 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной указанным последовательностям; CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, 74, 82, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 23, 26, 31, 34, 75, 83, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной указанным последовательностям; и/или второй связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 12, 15, 18, 70, 78, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 13, 16, 19, 71, 79, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной указанным последовательностям, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 14, 17, 20, 72, 80, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной указанным последовательностям.
Один вариант осуществления (13) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 21, 24, 27, 28, 29, 32, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 98% идентичной указанным последовательностям; CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:; 22, 25, 30, 33, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 23, 26, 31, 34, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной указанным последовательностям; и/или второй связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 12, 15, 18, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 13, 16, 19, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной указанным последовательностям, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 14, 17, 20, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной указанным последовательностям.
Один вариант осуществления (14) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 21, 24, 27, 28, 29, 32, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 98% идентичной указанным последовательностям; CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 23, 26, 31, 34, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 98% идентичной указанным последовательностям; и/или второй связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 12, 15, 18, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 13, 16, 19, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 98% идентичной указанным последовательностям, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 14, 17, 20, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной указанным последовательностям.
Один вариант осуществления (15) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 21, 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81, 93, 101 или 106, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, 74, 82, 94, 102 или 107, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 23, 26, 31, 34, 75, 83, 95, 103 или 108, и/или второй связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 12, 15, 18, 70, 78, 89 или 98, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 13, 16, 19, 71, 79, 90, 99 или 115, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 14, 17, 20, 72, 80, 91 или 100.
Один вариант осуществления (16) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 21, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 76%, в частности по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% идентичной указанной последовательности, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 22, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95%, в частности на 98%, в частности на 99% идентичной указанной последовательности, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 23, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 66%, в частности по меньшей мере на 70%, в частности по меньшей мере на 75%, в частности по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% идентичной указанной последовательности, и/или второй связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 12, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95%, в частности на 98%, в частности на 99% идентичной указанной последовательности, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 13, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 88%, в частности по меньшей мере на 90%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% идентичной указанной последовательности, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 14, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 66%, в частности по меньшей мере на 70%, в частности по меньшей мере на 75%, в частности по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% идентичной указанной последовательности.
Один вариант осуществления (17) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 24, или SEQ ID NO: 27, или SEQ ID NO: 28, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 88%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% идентичной указанным последовательностям, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 25, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95%, в частности на 98%, в частности на 99%, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 26, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 66%, в частности по меньшей мере на 70%, в частности по меньшей мере на 75%, в частности по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99%, идентичной указанной последовательности, и/или второй связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 12, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95%, в частности на 98%, в частности на 99% идентичной указанной последовательности, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 13, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 88%, в частности по меньшей мере на 90%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% идентичной указанной последовательности, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 14, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 66%, в частности по меньшей мере на 70%, в частности по меньшей мере на 75%, в частности по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% идентичной указанной последовательности.
Один вариант осуществления (18) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, согласно варианту осуществления (15), включающим первый связывающий домен, где CDR1 имеет аминокислотную последовательность, которая показана в SEQ ID NO: 27, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 88% идентичную указанной последовательности.
Один вариант осуществления (19) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, согласно варианту осуществления (15), включающим первый связывающий домен, где CDR1 имеет аминокислотную последовательность, которая показана в SEQ ID NO: 28, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 88% идентичную указанной последовательности.
Один вариант осуществления (20) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 29, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 30, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 31, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95%, в частности на 98%, в частности на 99% идентичной указанной последовательности, и/или второй связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 15, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95%, в частности на 98%, в частности на 99% идентичной указанной последовательности, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 16, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или на 99% идентичной указанной последовательности, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 17, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 36%, в частности по меньшей мере на 40%, в частности по меньшей мере на 50%, в частности по меньшей мере на 60%, в частности по меньшей мере на 70%, в частности по меньшей мере на 75%, в частности по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% идентичной указанной последовательности.
Один вариант осуществления (21) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 32, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 33, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 34, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95%, в частности на 98%, в частности на 99% идентичной указанной последовательности, и/или второй связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 18, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95%, в частности на 98%, в частности на 99% идентичной указанным последовательностям, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 19, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или на 99% идентичной указанной последовательности, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 20, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 63%, в частности по меньшей мере на 70%, в частности по меньшей мере на 75%, в частности по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% идентичной указанной последовательности.
Один вариант осуществления (22) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 73, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 74, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 75, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 96%, в частности по меньшей мере на 97%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной указанной последовательности, и/или второй связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 70, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 95%, в частности на 98%, в частности на 99% идентичной указанной последовательности, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 71, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или на 99% идентичной указанной последовательности, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 72, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 96%, в частности по меньшей мере на 97%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной указанной последовательности.
Один вариант осуществления (23) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 81, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 82, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 83, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 96%, в частности по меньшей мере на 97%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной указанной последовательности, и/или второй связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 78, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 79, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 80, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 96%, в частности по меньшей мере на 97%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной указанной последовательности.
Один вариант осуществления (24) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 93, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 94, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 95, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 96%, в частности по меньшей мере на 97%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной любому из вышеуказанных CDR, и/или второй связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 89, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 90, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 91, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 96%, в частности по меньшей мере на 97%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной любому из вышеуказанных CDR.
Один вариант осуществления (25) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 101, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 102, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 103, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 96%, в частности по меньшей мере на 97%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной любому из вышеуказанных CDR, и/или второй связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 98, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 99, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 100, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 96%, в частности по меньшей мере на 97%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной любому из вышеуказанных CDR.
Один вариант осуществления (26) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 106, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 107, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 108, или аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 96%, в частности по меньшей мере на 97%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной любому из вышеуказанных CDR, и/или второй связывающий домен, который содержит в последовательности CDR1 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 89, CDR2 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 115, и CDR3 с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 91, или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 96%, в частности по меньшей мере на 97%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной любому из вышеуказанных CDR.
В другом варианте осуществления (27) настоящее изобретение относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную указанным последовательностям, и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную указанным последовательностям.
В одном варианте осуществления (28) настоящее изобретение относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную указанным последовательностям, и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 91% идентичную указанным последовательностям.
Один вариант осуществления (29) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен (домен антитела), который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную указанным последовательностям; и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 91% идентичную указанным последовательностям.
В другом варианте осуществления (30) настоящее изобретение относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 69, 77, 116/92, 97, 105, или аминокислотную последовательность, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 96%, в частности по меньшей мере на 97%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную указанным последовательностям, и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 68, 76, 88, 96, 104, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, в частности по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 86%, в частности по меньшей мере на 87%, в частности по меньшей мере на 88%, в частности по меньшей мере на 89%, в частности по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, в частности по меньшей мере на 95%, в частности по меньшей мере на 96%, в частности по меньшей мере на 97%, в частности по меньшей мере на 98%, в частности по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную указанным последовательностям.
Один вариант осуществления (31) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% и на 94%, соответственно, идентичную указанным последовательностям; и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 91% идентичную указанной последовательности.
Один вариант осуществления (32) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 8, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную указанной последовательности; и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную указанной последовательности.
Один вариант осуществления (33) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 9, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную указанной последовательности; и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную указанной последовательности.
Один вариант осуществления (34) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99% идентичную указанной последовательности; и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 89% идентичную указанной последовательности.
Один вариант осуществления (35) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 11, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 98% идентичную указанной последовательности; и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 5, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 87% идентичную указанной последовательности.
Один вариант осуществления (36) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 69, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 98% или на 99% идентичную указанной последовательности; и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 68, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, 91%, 92% или на 93% идентичную указанной последовательности.
Один вариант осуществления (37) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 77, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 93%, 94% или на 95% идентичную указанной последовательности; и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 76, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 88%, 89% или на 90% идентичную указанной последовательности.
Один вариант осуществления (38) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 116, 92 или 118, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 93%, 94% или на 95% идентичную указанным последовательностям; и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 88, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, 91%, 92% или на 93% идентичную указанной последовательности.
Один вариант осуществления (39) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 97, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99% идентичную указанной последовательности; и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 96, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 86%, 87%, 88% или на 90% идентичную указанной последовательности.
Один вариант осуществления (40) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 105, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 98% или на 99% идентичную указанной последовательности; и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 104, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 88%, 89% или на 90% идентичную указанной последовательности.
В другом варианте осуществления (41) настоящее изобретение относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, согласно вариантам осуществления (22)-(24), где указанный первый связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 21-34, и указанный второй связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 12-20.
Один вариант осуществления (42) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, согласно варианту осуществления (31), где указанный первый связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 21-23 и SEQ ID NO: 24-26, соответственно, и указанный второй связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 12-14.
Один вариант осуществления (43) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, согласно варианту осуществления (32), где указанный первый связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 27, 25, 26, и указанный второй связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 12-14.
Один вариант осуществления (44) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, согласно варианту осуществления (33), где указанный первый связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 28, 25 и 26, и указанный второй связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 12-14.
Один вариант осуществления (45) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, согласно варианту осуществления (34), где указанный первый связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 29-31, и указанный второй связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 15-17.
Один вариант осуществления (46) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, согласно варианту осуществления (35), где указанный первый связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 32-34, и указанный второй связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 18-20.
Один вариант осуществления (47) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, согласно варианту осуществления (27), где указанный первый связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 73-75, и указанный второй связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 70-72.
Один вариант осуществления (48) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, согласно варианту осуществления (27), где указанный первый связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 81-83, и указанный второй связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 78-80.
Один вариант осуществления (49) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, согласно варианту осуществления (27), где указанный первый связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 101-103, и указанный второй связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 98-100.
Один вариант осуществления (50) настоящего изобретения относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, согласно варианту осуществления (27), где указанный первый связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 89, 115 и 91, и указанный второй связывающий домен содержит CDR, показанные в SEQ ID NO: 106-108.
В еще одном варианте осуществления (51) настоящее изобретение относится к связывающему пептиду или белку, или их функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, в особенности связывающему пептиду или антителу согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело включают:
a. первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6, и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1; или
b. первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 7 и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1; или
c. первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 8, и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2; или
d. первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 9, и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3; или
e. первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10, и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4; или
f. первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 11, и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 5; или
g. первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 69, и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 68; или
h. первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 77, и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 76; или
i. первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 116, и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 88; или
j. первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 92, и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 88; или
k. первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 97 и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6; или
l. первый связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 105, и/или второй связывающий домен, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 104.
В одном варианте осуществления (52) изобретения, связывающий пептид согласно любому из предыдущих вариантов осуществления является антителом, в особенности антителом изотипа IgG2a, IgG2b или IgG3, в особенности поликлональным антителом, моноклональным антителом, химерным антителом, гуманизированным антителом или полностью человеческим антителом.
Один вариант осуществления (48) изобретения относится к полинуклеотиду, кодирующему связывающий пептид согласно любому из предыдущих вариантов осуществления.
В одном варианте осуществления (53) указанный полинуклеотид включает молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из:
a. молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35-45, SEQ ID NO: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 и 117;
b. молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая обладает по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 35-45, SEQ ID NO: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 и 117;
c. молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая обладает по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 35-45, SEQ ID NO: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 и 117;
d. молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая обладает по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 35-45, SEQ ID NO: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 и 117;
e. молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая обладает по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 35-45, SEQ ID NO: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 и 117;
f. молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая обладает по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 35-45, SEQ ID NO: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 и 117;
g. молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, комплементарная цепь которой гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты согласно любому из a)-f);
h. молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая отличается от нуклеотидной последовательности, определенной в любом из a)-g), вследствие вырожденности генетического кода,
4
-1
-1
4
-1
-1
5
-1
-1
5
-1
-1
6
-1
-1
6
-1
-1
7
-1
-1
где указанная молекула нуклеиновой кислоты, определенная в любом из a)-h), узнает и специфично связывается с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности на Tau-белке человека, показанном в SEQ ID NO: 67, выбранным из группы, состоящей из Tau а/к 15-20, включающих фосфорилированный Tyr в положении 18 (Y18), Tau а/к 405-412, включающих фосфорилированный Ser в положении 409 (pS409), Tau а/к 405-411, включающих фосфорилированный Ser в положении 409 (pS409); и Tau а/к 208-218, включающих фосфорилированный Thr в положении 212 (pT212) и фосфорилированный Ser в положении 214 (pS214), Tau а/к 393-401, включающих фосфорилированный Ser в положении 396 (pS396), Tau а/к 396-401, включающих фосфорилированный Ser в положении 396 (pS396), Tau а/к 394-400, включающих фосфорилированный Ser в положении 396 (pS396), Tau а/к 402-406, включающих фосфорилированный Ser в положении 404 (pS404), и Tau а/к 393-400, включающих фосфорилированный Ser в положении 396 (pS396), где, в одном варианте осуществления, указанный связывающий пептид обладает высокой аффинностью связывания с константой диссоциации по меньшей мере 10 нМ, в частности по меньшей мере 8 нМ, в частности по меньшей мере 5 нМ, в частности по меньшей мере 2 нМ, в частности по меньшей мере 1 нМ, в частности по меньшей мере 500 пМ, в частности по меньшей мере 400 пМ, в частности по меньшей мере 300 пМ, в частности по меньшей мере 200 пМ, в частности по меньшей мере 100 пМ, в частности по меньшей мере 50 пМ, и/или имеет константу скорости ассоциации 10 Мс или больше, в частности 3-5 × 10 Мс или больше, в частности 10 Мс или больше, в частности 6-9 × 10 Мс или больше, в частности 10 Мс или больше, в частности 1-4 × 10 Мс или больше, в частности 10 Мс или больше, но, в одном варианте осуществления, не связывается с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами.
В различных вариантах осуществления (54) изобретения предложен связывающий пептид или его функциональная часть, в особенности антитело, в особенности моноклональное антитело или его функциональная часть, или полинуклеотид, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, или комбинации перечисленного, которые способны специфично узнавать и связываться с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека, в особенности ассоциированном с микротрубочками Tau-белке, в особенности агрегированном ассоциированном с микротрубочками и гиперфосфорилированном Tau-белке, такой как Tau-белок, присутствующий на парных спиральных филаментах (PHF), которые являются структурами, преобладающими в нейрофибриллярных клубках, нейропильных нитях и дистрофических аксонах, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами.
В определенном варианте осуществления (55) изобретения, человеческий Tau-белок является человеческим Tau-белком, показанным в SEQ ID NO: 67.
Связывающие пептиды и антитела согласно любому из предыдущих вариантов осуществления могут, таким образом, применяться (56) для снижения уровней общего растворимого Tau-белка, в особенности растворимого фосфорилированного Tau-белка, в мозге, в особенности в коре головного мозга и/или гиппокампе, млекопитающего или человека, содержащих повышенные уровни растворимого Tau-белка и/или растворимого фосфорилированного Tau-белка.
Связывающие пептиды и антитела согласно любому из предыдущих вариантов осуществления также могут применяться (57) для снижения уровней парных спиральных филаментов, содержащих гиперфосфорилированный Tau-белок (pTau PHF), в мозге, в особенности в коре головного мозга и/или гиппокампе, млекопитающего или человека, содержащих повышенные уровни указанных pTau парных спиральных филаментов (pTau PHF).
Снижение уровня общего растворимого Tau-белка и/или растворимого фосфорилированного Tau-белка, и/или pTau парных спиральных филаментов (pTau PHF) в мозге, в особенности в коре головного мозга и/или гиппокампе, млекопитающего или человека, содержащих повышенные уровни указанных вариантов Tau-белка, которые способствуют развитию ассоциированных с Tau-белком заболеваний, нарушений или состояний у указанного млекопитающего или человека, может привести к улучшению и/или устранению симптомов, связанных с такими заболеваниями, нарушениями или состояниями, ассоциированными с Tau-белком (58).
Связывающие пептиды и антитела согласно любому из предыдущих вариантов осуществления могут, таким образом, применяться (59) в терапии, в особенности в терапии у человека, для замедления или остановки прогрессии ассоциированного с Tau-белком заболевания, нарушения или состояния.
Связывающие пептиды и антитела согласно любому из предыдущих вариантов осуществления могут дополнительно применяться (60) в терапии, в особенности в терапии у человека, для улучшения или устранения симптомов, связанных с заболеваниями, нарушениями или состояниями, ассоциированными с Tau-белком, такими как, например, ухудшение или потеря когнитивных функций, включая мышление, ситуативное суждение, памать, способность к обучение, ориентация и т.д.
В одном варианте осуществления (61) изобретение относится к связывающим пептидам и антителам согласно любому из предыдущих вариантов осуществления для применения в терапии, в особенности для применения в лечении таупатий, группы ассоциированных с Tau-белком заболеваний и нарушений, или для устранения симптомов, связанных с таупатиями.
В одном варианте осуществления (62) изобретение относится к связывающим пептидам и антителам согласно любому из предыдущих вариантов осуществления для сохранения или увеличения когнитивной функции и способности к запоминанию у млекопитающего, страдающего таупатией.
В определенном варианте осуществления (63) изобретения, связывающие пептиды и антитела, включающие по меньшей мере один или все CDR легкой цепи антител ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-3A8-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab2, приведенные в SEQ ID NO: 25, 26, 27 и SEQ ID NO: 21, 22, 23, соответственно, и/или по меньшей мере один или все CDR тяжелой цепи антител ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-3A8-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab2, приведенные в SEQ ID NO: 12, 13, 14, применяются в терапии, в особенности в терапии у человека, для улучшения или устранения симптомов, связанных с заболеваниями, нарушениями или состояниями, ассоциированными с Tau-белком, такими как, например, ухудшение или потеря когнитивных функций, включая мышление, ситуативное суждение, память, способность к обучению, ориентацию и т.д.
В другом определенном варианте осуществления (64) изобретения, антитела, включающие легкую цепь антител ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-3A8-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab2, приведенную в SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 6, 7, соответственно, и/или тяжелую цепь антител ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab12, ACI-36-3A8-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab2, приведенную в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, соответственно, применяются в терапии, в особенности в терапии у человека, для улучшения или устранения симптомов, связанных с заболеваниями, нарушениями или состояниями, ассоциированными с Tau-белком, такими как, например, ухудшение или потеря когнитивных функций, включая мышление, ситуативное суждение, память, способность к обучению, ориентацию и т.д.
В другом определенном варианте осуществления (65) изобретения, связывающие пептиды и антитела, включающие по меньшей мере один или все CDR легкой цепи антител ACI-33-6C10-Ab1 и ACI-33-6C10-Ab2, приведенные в SEQ ID NO: 29, 30, 31, и/или по меньшей мере один или все CDR тяжелой цепи антител ACI-33-6C10-Ab1 и ACI-33-6C10-A2, приведенные в SEQ ID NO: 15, 16, 17, применяются в терапии, в особенности в терапии у человека, для улучшения или устранения симптомов, связанных с заболеваниями, нарушениями или состояниями, ассоциированными с Tau-белком, такими как, например, ухудшение или потеря когнитивных функций, включая мышление, ситуативное суждение, память, способность к обучению, ориентацию и т.д.
В другом определенном варианте осуществления (66) изобретения, связывающие пептиды и антитела, включающие по меньшей мере один или все CDR легкой цепи антител ACI-41-7C2-Ab1 и ACI-41-7C2-Ab2, приведенные в SEQ ID NO: 32, 33, 34, и/или по меньшей мере один или все CDR тяжелой цепи антител ACI-41-7C2-Ab1 и ACI-41-7C2-Ab2, приведенные в SEQ ID NO: 18, 19, 20, применяются в терапии, в особенности в терапии у человека, для улучшения или устранения симптомов, связанных с заболеваниями, нарушениями или состояниями, ассоциированными с Tau-белком, такими как, например, ухудшение или потеря когнитивных функций, включая мышление, ситуативное суждение, память, способность к обучению, ориентацию и т.д.
в другом определенном варианте осуществления (67) изобретения, связывающие пептиды и антитела, включающие по меньшей мере один или все CDR легкой цепи антител ACI-35-2A1-Ab1; ACI-35-2A1-Ab2; ACI-35-4A6-Ab1; ACI-35-4A6-Ab2; ACI-35-1D2-Ab1; ACI-35-2G5-Ab1; приведенные в SEQ ID NO: 73-75, 81-83, 93-95, 101-103, 106-108, и/или по меньшей мере один или все CDR тяжелой цепи антител ACI-35-2A1-Ab1; ACI-35-2A1-Ab2; ACI-35-4A6-Ab1; ACI-35-4A6-Ab2; ACI-35-1 D2-Ab1; ACI-35-2G5-Ab1; приведенные в SEQ ID NO: 70-72, 78-80, 89-91, 98-100, применяются в терапии, в особенности в терапии у человека, для улучшения или устранения симптомов, связанных с заболеваниями, нарушениями или состояниями, ассоциированными с Tau-белком, такими как, например, ухудшение или потеря когнитивных функций, включая мышление, ситуативное суждение, память, способность к обучению, ориентацию и т.д.
В другом определенном варианте осуществления (68) изобретения, связывающие пептиды и антитела, включающие по меньшей мере один или все CDR легкой цепи антител ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3, приведенные в SEQ ID NO: 106-108, и/или по меньшей мере один или все CDR тяжелой цепи антител ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3; приведенные в SEQ ID NO: 89, 115 и 91, применяются в терапии, в особенности в терапии у человека, для улучшения или устранения симптомов, связанных с заболеваниями, нарушениями или состояниями, ассоциированными с Tau-белком, такими как, например, ухудшение или потеря когнитивных функций, включая мышление, ситуативное суждение, память, способность к обучению, ориентацию и т.д.
Связывание пептидов или антител согласно предыдущим вариантам осуществления с Tau-клубками и pTau на мозге может быть определено с применением анализов иммунореактивности белков выбранных срезов мозга и Вестерн-блоттинга гомогенатов мозга, соответственно, как описано в Примерах.
В другом варианте осуществления (69) настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, включающая связывающий пептид или его функциональную часть, в особенности антитело, в особенности моноклональное антитело или его функциональную часть, или полинуклеотид, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, или комбинацию перечисленного, в терапевтически эффективном количестве вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
В одном варианте осуществления (70) связывающий пептид или его функциональная часть, в особенности антитело, в особенности моноклональное антитело или его функциональная часть, или полинуклеотид, или фармацевтическая композиция, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, или комбинация перечисленного, применяются в терапии, в особенности в терапии у человека, для лечения или устранения симптомов заболеваний или нарушений, ассоциированных с Tau-белком, включая нейродегенеративные нарушения, такие как таупатии.
Связывающие пептиды, антитела и/или фармацевтические композиции согласно любому из предыдущих вариантов осуществления могут, таким образом, применяться (71) для замедления или остановки прогрессии заболевания, нарушения или состояния, ассоциированных с Tau-белком, при введении указанных связывающих пептидов, антител и/или фармацевтических композиций животному, в особенности млекопитающему, в особенности человеку, страдающему таким заболеванием или состоянием.
Связывающие пептиды, антитела и/или фармацевтические композиции согласно любому из предыдущих вариантов осуществления могут дополнительно применяться (72) для улучшения или устранения симптомов, связанных с заболеваниями, нарушениями или состояниями, ассоциированными с Tau-белком, такими как, например, ухудшение или потеря когнитивных функций, включая мышление, ситуативное суждение, память, способность к обучению, ориентацию и т.д, при введении указанных связывающих пептидов, антител и/или фармацевтических композиций животному, в особенности млекопитающему, в особенности человеку, страдающему таким заболеванием или состоянием.
В одном варианте осуществления (73) связывающий пептид или его функциональная часть, в особенности антитело, в особенности моноклональное антитело или его функциональная часть, или полинуклеотид или фармацевтическая композиция, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, или комбинация перечисленного, применяются в лечении заболеваний и нарушений, которые вызваны или связаны с формированием нейрофибриллярных поражений, преобладающей мозговой патологии при таупатии, включающей смешанную группу нейродегенеративных заболеваний или нарушений, включая заболевания или нарушения, которые демонстрируют одновременное присутствие Tau и амилоидных патологий, включая, без ограничения, болезнь Альцгеймера, болезнь Крейтцфельда-Якоба, деменцию боксеров, синдром Дауна, синдром Герстмана-Штраусслера-Шейнкера, миозит с тельцами включения и прионную церебральную амилоидную ангиопатию, травматическое повреждение головного мозга, а также другие заболевания или нарушения, которые не демонстрируют выраженной амилоидной патологии, включая, без ограничения, Гуамский комплекс бокового амиотрофического склероза/паркинсонизма-деменции, болезнь моторных нейронов не Гуамского типа с нейрофибриллярными клубками, деменцию с аргирофильными включениями, кортикобазальную дегенерацию, диффузные нейрофибриллярные клубки с кальцификацией, лобно-височную деменцию с паркинсонизмом, сцепленную с хромосомой 17, болезнь Галлервордена-Шпатца, мультисистемную атрофию, болезнь Ниманна-Пика типа C, паллидо-понто-нигральную дегенерацию, болезнь Пика, прогрессирующий субкортикальный глиоз, прогрессирующий супрануклеарный паралич, подострый склерозирующий панэнцефалит, деменцию только с клубками, постэнцефалитический паркинсонизм, миотоническую дистрофию.
В одном варианте осуществления (74) связывающий пептид или его функциональна часть, в особенности антитело, в особенности моноклональное антитело или его функциональная часть, или полинуклеотид или фармацевтическая композиция, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, или комбинация перечисленного, применяются в лечении болезни Альцгеймера.
В одном варианте осуществления (75) изобретения предложен способ модуляции уровней растворимого и/или нерастворимого Tau, в особенности в мозге, в особенности в коре головного мозга и/или гиппокампе, животного, в особенности млекопитающего или человека, включающий введение указанному животному, в особенности указанному млекопитающему или человеку, связывающего пептида или его функциональной части, в особенности антитела, в особенности моноклонального антитела или его функциональной части, или полинуклеотида или фармацевтической композиции, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, или комбинации перечисленного.
В одном аспекте модуляция относится к снижению уровней растворимого Tau-белка, в особенности растворимого фосфорилированного Tau-белка, в мозге, в особенности в коре головного мозга и/или гиппокампе, животного, в особенности млекопитающего или человека, содержащих повышенные уровни растворимого Tau-белка и/или растворимого фосфорилированного Tau-белка.
В одном варианте осуществления (76) изобретения предлжен способ снижения уровней нерастворимого Tau-белка, в особенности парных спиральных филаментов, содержащих гиперфосфорилированный Tau-белок (pTau PHF), в мозге, в особенности в коре головного мозга и/или гиппокампе, животного, в особенности млекопитающего или человека, содержащих повышенные уровни нерастворимого Tau-белка, в особенности pTau парных спиральных филаментов (pTau PHF), включающий введение указанному животному, в особенности указанному млекопитающему или человеку, связывающего пептида или его функциональной части, в особенности антитела, в особенности моноклонального антитела или его функциональной части, или полинуклеотида или фармацевтической композиции, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, или комбинации перечисленного.
В одном варианте осуществления (77) настоящее изобретение относится к способу замедления или остановки прогрессии заболевания, нарушения или состояния, ассоциированных с Tau-белком, у животного, в особенности млекопитающего или человека, включающему введение указанному животному, в особенности указанному млекопитающему или человеку, страдающему таким заболеванием или состоянием, связывающего пептида или его функциональной части, в особенности антитела, в особенности моноклонального антитела или его функциональной части, или полинуклеотида или фармацевтической композиции, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, или комбинации перечисленного.
В одном варианте осуществления (78) настоящее изобретение относится к способу улучшения или устранения симптомов, связанных с заболеваниями, нарушениями или состояниями, ассоциированными с Tau-белком, такими как, например, ухудшение или потеря когнитивных функций, включая мышление, ситуативное суждение, память, способность к обучению, ориентацию и т.д., у животного, в особенности млекопитающего или человека, включающему введение указанному животному, в особенности указанному млекопитающему или человеку, страдающему таким заболеванием или состоянием, связывающего пептида или его функциональной части, в особенности антитела, в особенности моноклонального антитела или его функциональной части, или полинуклеотида или фармацевтической композиции, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, или комбинации перечисленного.
В одном варианте осуществления (79) настоящее изобретение относится к способу сохранения или повышения когнитивной функции и способности к запоминанию у млекопитающего, страдающего таупатией.
В еще одном варианте осуществления (80) изобретения предложен способ лечения заболевания или нарушения, ассоциированных с Tau-белком, включающих нейродегенеративное заболевание или нарушение, такое как таупатия, включающий введение животному, в особенности млекопитающему, но, прежде всего, человеку, страдающему таким заболеванием или нарушением, связывающего пептида или его функциональной части, в особенности антитела, в особенности моноклонального антитела или его функциональной части, или полинуклеотида или фармацевтической композиции, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, или комбинации перечисленного.
В одном варианте осуществления (81) изобретения предложен способ лечения заболеваний и нарушений, которые вызваны или связаны с формированием нейрофибриллярных поражений, преобладающей мозговой патологии при таупатии, включающей смешанную группу нейродегенеративных заболеваний или нарушений, включая заболевания или нарушения, которые демонстрируют одновременное присутствие Tau и амилоидных патологий, включая, без ограничения, болезнь Альцгеймера, болезнь Крейтцфельда-Якоба, деменцию боксеров, синдром Дауна, синдром Герстмана-Штраусслера-Шейнкера, миозит с тельцами включения и прионную церебральную амилоидную ангиопатию, травматическое повреждение головного мозга, а также другие заболевания или нарушения, которые не демонстрируют выраженной амилоидной патологии, включая, без ограничения, Гуамский комплекс бокового амиотрофического склероза/паркинсонизма-деменции, болезнь моторных нейронов не Гуамского типа с нейрофибриллярными клубками, деменцию с аргирофильными включениями, кортикобазальную дегенерацию, диффузные нейрофибриллярные клубки с кальцификацией, лобно-височную деменцию с паркинсонизмом, сцепленную с хромосомой 17, болезнь Галлервордена-Шпатца, мультисистемную атрофию, болезнь Ниманна-Пика типа C, паллидо-понто-нигральную дегенерацию, болезнь Пика, прогрессирующий субкортикальный глиоз, прогрессирующий супрануклеарный паралич, подострый склерозирующий панэнцефалит, деменцию только с клубками, постэнцефалитический паркинсонизм, миотоническую дистрофию, где указанный способ включает введение животному, в особенности млекопитающему, но, прежде всего, человеку, страдающему таким заболеванием или нарушением, связывающего пептида или его функциональной части, в особенности антитела, в особенности моноклонального антитела или его функциональной части, или полинуклеотида или фармацевтической композиции согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, или комбинации перечисленного.
В другом варианте осуществления (82) изобретения предложен способ индукции пассивного иммунного ответа у животного, в особенности млекопитающего или человека, страдающего нейродегенеративным нарушением, таким как таупатия, путем введения указанному животному или человеку связывающего пептида или его функциональной части, в особенности антитела, в особенности моноклонального антитела или его функциональной части, или полинуклеотида, или фармацевтической композиции, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, или комбинации перечисленного.
В еще одном варианте осуществления (83) изобретения предложен способ диагностики у пациента заболевания, нарушения или состояния, ассоциированного с Tau-белком, включающий обнаружение связывания иммуноспецифичного связывающего пептида или его активного фрагмента, в особенности антитела, в особенности моноклонального антитела или его функциональной части, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, с эпитопом Tau-белка в образце или in situ, который включает следующие этапы:
a. контакт образца или определенной части тела, или области тела, подозреваемых на присутствие в них Tau-белка, со связывающим пептидом или его фрагментом, в особенности антителом, в особенности моноклональным антителом или его функциональной частью, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где указанный связывающий пептид или антитело, или их фрагмент связывают эпитоп Tau-белка;
b. обеспечение связывания указанного связывающего пептида, в особенности указанного антитела, в особенности указанного моноклонального антитела или его функциональной части, с Tau-белком, с образованием иммунологического комплекса;
c. обнаружение образования иммунологического комплекса; и
d. соотнесение присутствия или отсутствия иммунологического комплекса с присутствием или отсутствием Tau-белка в образце или определенной части или области тела.
В еще одном варианте осуществления (84) изобретения предложен способ диагностики предрасположенности к заболеванию, нарушению или состоянию, ассоциированному с Tau-белком, у пациента, включающий обнаружение связывания иммуноспецифичного связывающего пептида или его активного фрагмента, в особенности антитела, в особенности моноклонального антитела или его функциональной части, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, с эпитопом Tau-белка в образце или in situ, который включает следующие этапы:
a. контакт образца или определенной части тела, или области тела, подозреваемых на присутствие в них Tau-антигена, со связывающим пептидом или его активным фрагментом, в особенности антителом, в особенности моноклональным антителом или его функциональной частью, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где указанный пептид или его фрагмент связывают эпитоп Tau-белка;
b. обеспечение связывания указанного связывающего пептида, в особенности указанного антитела, в особенности указанного моноклонального антитела или его функциональной части, с Tau-антигеном, с образованием иммунологического комплекса;
c. обнаружение образования иммунологического комплекса; и
d. соотнесение присутствия или отсутствия иммунологического комплекса с присутствием или отсутствием Tau-антигена в образце или определенной части или области тела;
e. сравнение количества указанного иммунологического комплекса с нормальным контрольным значением;
где увеличение количества указанного агрегата по сравнению с нормальным контрольным значением указывает, что указанный пациент страдает или подвергается риску развития заболевания или состояния, ассоциированного с Tau-белком.
В одном варианте осуществления (85) изобретения предложен способ контроля минимального остаточного заболевания у пациента после лечения связывающим пептидом или его функциональной частью, в особенности антителом, в особенности моноклональным антителом или его функциональной частью, или полинуклеотидом, или фармацевтической композицией, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где указанный способ включает:
a. контакт образца или определенной части тела, или области тела, подозреваемых на присутствие в них Tau-антигена, со связывающим пептидом или его функциональной частью, в особенности антителом, в особенности моноклональным антителом или его функциональной частью, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где указанный пептид или его фрагмент связываются с эпитопом Tau-белка;
b. обеспечение связывания указанного связывающего пептида, в особенности указанного антитела, в особенности указанного моноклонального антитела или его функциональной части, с Tau-антигеном, с образованием иммунологического комплекса;
c. обнаружение образования иммунологического комплекса; и
d. соотнесение присутствия или отсутствия иммунологического комплекса с присутствием или отсутствием Tau-антигена в образце или определенной части или области тела,
e. сравнение количества указанного иммунологического комплекса с нормальным контрольным значением, где увеличение количества указанного агрегата по сравнению с нормальным контрольным значением указывает, что указанный пациент все еще страдает минимальным остаточным заболеванием.
В одном варианте осуществления (86) предложен способ прогнозирования чувствительности пациента, проходящего лечение связывающим пептидом или его функциональной частью, в особенности антителом, в особенности моноклональным антителом или его функциональной частью, или полинуклеотидом, или фармацевтической композицией, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, включающий:
a. контакт образца или определенной части тела, или области тела, подозреваемых на присутствие в них Tau-антигена, со связывающим пептидом или его активным фрагментом, в особенности антителом, в особенности моноклональным антителом или его функциональной частью согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, где указанный пептид или его фрагмент связываются с эпитопом Tau-белка;
b. обеспечение связывания указанного связывающего пептида, в особенности указанного антитела, в особенности указанного моноклонального антитела или его функциональной части, с Tau-антигеном, с образованием иммунологического комплекса;
c. обнаружение образования иммунологического комплекса; и
d. соотнесение присутствия или отсутствия иммунологического комплекса с присутствием или отсутствием Tau-антигена в образце или определенной части или области тела,
e. сравнение количества указанного иммунологического комплекса до и после начала лечения,
где уменьшение количества указанного агрегата указывает, что указанный пациент с высокой вероятностью чувствителен к лечению.
В другом варианте осуществления (87) изобретение относится к тест-набору, предназначенному для обнаружения и диагностики заболеваний, нарушений или состояний, ассоциированных с Tau-белком, включающему связывающий пептид или его активный фрагмент, в особенности антитело, в особенности моноклональное антитело или его функциональную часть, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления.
В одном варианте осуществления (88) указанный набор для анализа включает контейнер, содержащий один или более связывающих пептидов или их активных фрагментов, в особенности антитело, в особенности моноклональное антитело или его функциональную часть, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, и инструкции по применению связывающих пептидов или антител в целях связывания с Tau-антигеном, с образованием иммунологического комплекса, и обнаружения образования иммунологического комплекса, при этом присутствие или отсутствие иммунологического комплекса соотносят с присутствием или отсутствием Tau-антигена.
В еще одном варианте осуществления (89) настоящее изобретение относится к эпитопу, выбранному из группы, состоящей из Tau а/к 15-20 Tau-белка человека, показанного в SEQ ID NO: 67, включающих фосфорилированный Tyr в положении 18 (Y18), Tau а/к 405-412, включающих фосфорилированный Ser в положении 409 (pS409), Tau а/к 405-411, включающих фосфорилированный Ser в положении 409 (pS409), и Tau а/к 208-218, включающих фосфорилированный Thr в положении 212 (pT212) и фосфорилированный Ser в положении 214 (pS214).
В одном варианте осуществления (90) указанный эпитоп состоит из Tau а/к 15-20 с фосфорилированным Tyr в положении 18 (Y18).
В одном варианте осуществления (91) указанный эпитоп состоит из Tau а/к 405-412 с фосфорилированным Ser в положении 409 (pS409).
В одном варианте осуществления (92) указанный эпитоп состоит из Tau а/к 405-411 с фосфорилированным Ser в положении 409 (pS409).
В другом варианте осуществления (93) изобретение относится к линии клеток, продуцирующей связывающий пептид или его активный фрагмент, в особенности антитело, в особенности моноклональное антитело или его функциональную часть согласно любому из предыдущих вариантов осуществления.
В одном варианте осуществления (94) изобретение относится к линии клеток, которая является линией клеток гибридомы 6C10F9C12A11, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3079.
В одном варианте осуществления (95) изобретение относится к линии клеток, которая является линией клеток гибридомы 6C10E5E9C12, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3081.
В одном варианте осуществления (96) изобретение относится к линии клеток, которая является линией клеток гибридомы 6H1A11C11, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3080.
В одном варианте осуществления (97) изобретение относится к линии клеток, которая является линией клеток гибридомы 6H1G6E6, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3088.
В одном варианте осуществления (98) изобретение относится к линии клеток, которая является линией клеток гибридомы 2B6A10C11, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3084.
В одном варианте осуществления (99) изобретение относится к линии клеток, которая является линией клеток гибридомы 2B6G7A12, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3087.
В одном варианте осуществления (100) изобретение относится к линии клеток, которая является линией клеток гибридомы 3A8A12G7, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3086.
В одном варианте осуществления (101) изобретение относится к линии клеток, которая является линией клеток гибридомы 3A8E12H8, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3085.
В одном варианте осуществления (102) изобретение относится к линии клеток, которая является линией клеток гибридомы 7C2(1)F10C10D3, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3082.
В одном варианте осуществления (103) изобретение относится к линии клеток, которая является линией клеток гибридомы 7C2(2)B9F11D5, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3083.
В одном варианте осуществления (103a) изобретение относится к линии клеток, которая является линией клеток гибридомы A4-4A6-48, депонированной 30 августа 2011 года как DSM ACC3136.
В одном варианте осуществления (103b) изобретение относится к линии клеток, которая является линией клеток гибридомы A6-2G5-30, депонированной 30 августа 2011 года как DSM ACC3137.
В одном варианте осуществления (103c) изобретение относится к линии клеток, которая является линией клеток гибридомы A6-2G5-41, депонированной 30 августа 2011 года как DSM ACC3138.
В одном варианте осуществления(103d) изобретение относится к линии клеток, которая является линией клеток гибридомы A4-2A-18, депонированной 30 августа 2011 года как DSM ACC3139.
В одном варианте осуществления (103e) изобретение относится к линии клеток, которая является линией клеток гибридомы A4-2A1-40, депонированной 30 августа 2011 года как DSM ACC3140.
В одном варианте осуществления (103e) изобретение относится к линии клеток, которая является линией клеток гибридомы A6-1 D2-12, депонированной 6 сентября 2011 года как DSM ACC3141.
В одном варианте осуществления (104) изобретение относится к моноклональному антителу или его функциональной части, включающим домен легкой цепи (VL) и/или тяжелой цепи (VH), который кодируется полинуклеотидом, расположенным на нуклеотидном фрагменте, который может быть получен с помощью ПЦР-амплификации ДНК линии клеток гибридомы 6C10F9C12A11, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3079, с применением:
a. пары праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 54 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 51 для амплификации первого связывающего домена; и/или
b. смеси праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 47 для амплификации второго связывающего домена.
В одном варианте осуществления (105) изобретение относится к моноклональному антителу или его функциональной части, включающим домен легкой цепи (VL) и/или тяжелой цепи (VH), который кодируется полинуклеотидом, расположенным на нуклеотидном фрагменте, который может быть получен с помощью ПЦР-амплификации ДНК линии клеток гибридомы 6C10E5E9C12, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3081, с применением:
a. смеси праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 51 для амплификации первого связывающего домена; и/или
b. смеси праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 47 для амплификации второго связывающего домена.
В одном варианте осуществления (106) изобретение относится к моноклональному антителу или его функциональной части, включающим домен легкой цепи (VL) и/или тяжелой цепи (VH), который кодируется полинуклеотидом, расположенным на нуклеотидном фрагменте, который может быть получен с помощью ПЦР-амплификации ДНК линии клеток гибридомы 6H1 A11 C11, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3080, с применением:
a. пары праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 50 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 51 для амплификации первого связывающего домена; и/или
b. пары праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 46 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 47 для амплификации второго связывающего домена.
В одном варианте осуществления (107) изобретение относится к моноклональному антителу или его функциональной части, включающим домен легкой цепи (VL) и/или тяжелой цепи (VH), который кодируется полинуклеотидом, расположенным на нуклеотидном фрагменте, который может быть получен с помощью ПЦР-амплификации ДНК линии клеток гибридомы 6H1 G6E6, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3088, с применением:
a. пары праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 50 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 51 для амплификации первого связывающего домена; и/или
b. пары праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 46 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 47 для амплификации второго связывающего домена.
В одном варианте осуществления (108) изобретение относится к моноклональному антителу или его функциональной части, включающим домен легкой цепи (VL) и/или тяжелой цепи (VH), который кодируется полинуклеотидом, расположенным на нуклеотидном фрагменте, который может быть получен с помощью ПЦР-амплификации ДНК линии клеток гибридомы 2B6A10C11, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3084, с применением:
a. пары праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 50 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 51 для амплификации первого связывающего домена; и/или
b. смеси праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 52 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 47 для амплификации второго связывающего домена.
В одном варианте осуществления (109) изобретение относится к моноклональному антителу или его функциональной части, включающим домен легкой цепи (VL) и/или тяжелой цепи (VH), который кодируется полинуклеотидом, расположенным на нуклеотидном фрагменте, который может быть получен с помощью ПЦР-амплификации ДНК линии клеток гибридомы 2B6G7A12, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3087, с применением:
a. пары праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 50 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 51 для амплификации первого связывающего домена; и/или
b. смеси праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 52 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 47 для амплификации второго связывающего домена.
В одном варианте осуществления (110) изобретение относится к моноклональному антителу или его функциональной части, включающим домен легкой цепи (VL) и/или тяжелой цепи (VH), который кодируется полинуклеотидом, расположенным на нуклеотидном фрагменте, который может быть получен с помощью ПЦР-амплификации ДНК линии клеток гибридомы 3A8A12G7, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3086, с применением:
1
a. смеси праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 51 для амплификации первого связывающего домена; или
2
a. пары праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 50 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 51 для амплификации первого связывающего домена; и/или
b. пары праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 46 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 47 для амплификации второго связывающего домена.
В одном варианте осуществления (111) изобретение относится к моноклональному антителу или его функциональной части, включающим домен легкой цепи (VL) и/или тяжелой цепи (VH), который кодируется полинуклеотидом, расположенным на нуклеотидном фрагменте, который может быть получен с помощью ПЦР-амплификации ДНК линии клеток гибридомы 3A8E12H8, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3085, с применением:
1
a. смеси праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 51 для амплификации первого связывающего домена; или
2
a. пары праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 50 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 51 для амплификации первого связывающего домена; и/или
b. пары праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 46 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 47 для амплификации второго связывающего домена.
В одном варианте осуществления (112) изобретение относится к моноклональному антителу или его функциональной части, включающим домен легкой цепи (VL) и/или тяжелой цепи (VH), который кодируется полинуклеотидом, расположенным на нуклеотидном фрагменте, который может быть получен с помощью ПЦР-амплификации ДНК линии клеток гибридомы 7C2(1)F10C10D3, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3082, с применением:
a. смеси праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 51 для амплификации первого связывающего домена;
b. смеси праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 55 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 47 для амплификации второго связывающего домена.
В одном варианте осуществления (113) изобретение относится к моноклональному антителу или его функциональной части, включающим домен легкой цепи (VL) и/или тяжелой цепи (VH), который кодируется полинуклеотидом, расположенным на нуклеотидном фрагменте, который может быть получен с помощью ПЦР-амплификации ДНК линии клеток гибридомы 7C2(2)B9F11D5, депонированной 25 августа 2010 года как DSM ACC3083, с применением:
a. пары праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 57 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 51 для амплификации первого связывающего домена;
b. смесь праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 55 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 47 для амплификации второго связывающего домена.
В одном варианте осуществления (114) изобретение относится к моноклональному антителу или его функциональной части, включающим домен легкой цепи (VL) и/или тяжелой цепи (VH), который кодируется полинуклеотидом, расположенным на нуклеотидном фрагменте, который может быть получен с помощью ПЦР-амплификации ДНК линии клеток гибридомы A4-2A1-18, депонированной 30 августа 2011 года как DSM ACC3139, с применением:
a. пары праймеров, включающей 5'-праймер согласно SEQ ID NO: 149 и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 51 для амплификации первого связывающего домена; и/или
b. смеси праймеров, включающей 5'-праймер, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 120, 123, 124, 136, 137, 138, 139 и 140, и 3'-праймер, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 131, 134 и 141-148, для амплификации второго связывающего домена.
В одном варианте осуществления (115) изобретение относится к моноклональному антителу или его функциональной части, включающим домен легкой цепи (VL) и/или тяжелой цепи (VH), который кодируется полинуклеотидом, расположенным на нуклеотидном фрагменте, который может быть получен с помощью ПЦР-амплификации ДНК линии клеток гибридомы A6-2G5-30, депонированной 30 августа 2011 года как DSM ACC3137, с применением:
a. смеси праймеров, включающей 5'-праймер, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 51 и 169-174, и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 51, для амплификации первого связывающего домена; и/или
b. смеси праймеров, включающей 5'-праймер, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 124, 127 и 150-158, и 3'-праймер, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 130 и 159-168, для амплификации второго связывающего домена.
В одном варианте осуществления (116) изобретение относится к моноклональному антителу или его функциональной части, включающим домен легкой цепи (VL) и/или тяжелой цепи (VH), который кодируется полинуклеотидом, расположенным на нуклеотидном фрагменте, который может быть получен с помощью ПЦР-амплификации ДНК линии клеток гибридомы A4-2A1-40, депонированной 30 августа 2011 года как DSM ACC3140, с применением:
a. смеси праймеров, включающей 5'-праймер, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 178, 179 и 80, и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 51, для амплификации первого связывающего домена; и/или
b. смеси праймеров, включающей 5'-праймер, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 121, 127, 139, 154, 155 и 175, и 3'-праймер, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 128, 129, 147, 176 и 177, для амплификации второго связывающего домена.
В одном варианте осуществления (117) изобретение относится к моноклональному антителу или его функциональной части, включающим домен легкой цепи (VL) и/или тяжелой цепи (VH), который кодируется полинуклеотидом, расположенным на нуклеотидном фрагменте, который может быть получен с помощью ПЦР-амплификации ДНК линии клеток гибридомы A6-2G5-41, депонированной 30 августа 2011 года как DSM ACC3138, с применением:
a. смеси праймеров, включающей 5'-праймер, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 51 и 188-192, и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 51, для амплификации первого связывающего домена; и/или
b. смеси праймеров, включающей 5'-праймер, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 120, 124, 126, 181, 182 и 183, и 3'-праймер, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 144, 145 и 184-187, для амплификации второго связывающего домена.
В одном варианте осуществления (118) изобретение относится к моноклональному антителу или его функциональной части, включающим домен легкой цепи (VL) и/или тяжелой цепи (VH), который кодируется полинуклеотидом, расположенным на нуклеотидном фрагменте, который может быть получен с помощью ПЦР-амплификации ДНК линии клеток гибридомы A4-4A6-48, депонированной 30 августа 2011 года как DSM ACC3136, с применением:
a. смеси праймеров, включающей 5'-праймер, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50 и 201-204, и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 51, для амплификации первого связывающего домена; и/или
b. смеси праймеров, включающей 5'-праймер, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 121, 137, 151 и 193-197, и 3'-праймер, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 131, 141, 144, 166, 198, 199 и 200, для амплификации второго связывающего домена.
В одном варианте осуществления (119) изобретение относится к моноклональному антителу или его функциональной части, включающим домен легкой цепи (VL) и/или тяжелой цепи (VH), который кодируется полинуклеотидом, расположенным на нуклеотидном фрагменте, который может быть получен с помощью ПЦР-амплификации ДНК линии клеток гибридомы A6-1 D2-12, депонированной 6 сентября 2011 года как DSM ACC3141, с применением:
a. смеси праймеров, включающей 5'-праймер, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 209-214 и 219-221, и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 215, для амплификации первого связывающего домена; и/или
b. смеси праймеров, включающей 5'-праймер, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 216, 217 и 218, и 3'-праймер согласно SEQ ID NO: 208, для амплификации второго связывающего домена.
В одном варианте осуществления (120) антитело согласно любому из предыдущих вариантов осуществления может быть поликлональным антителом, моноклональным антителом, химерным антителом, гуманизированным антителом, человеческим антителом, антителом верблюдовых, диателом или модифицированным или сконструированным антителом.
2
В одном варианте осуществления (121) связывающий пептид или его функциональная часть могут быть фрагментом, включающим тяжелую цепь и/или легкую цепь, в особенности тяжелую цепь, показанную в SEQ ID NO: 1-5, и/или легкую цепь, показанную в SEQ ID NO: 6-11, в особенности Fab или F(ab') фрагментом.
В определенном варианте осуществления (122) изобретение относится к тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO: 1-5.
В другом определенном варианте осуществления (123) изобретение относится к легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 6-11.
В одном варианте осуществления (124) изобретения предложен способ получения связывающих пептидов или антител согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, включающий этап культивирования линии клеток согласно любому из предыдущих вариантов осуществления в подходящей среде культивирования и, необязательно, очистку связывающих пептидов или антитела из линии клеток или среды культивирования.
Краткое описание фигур и последовательностей
ФИГУРЫ
На Фигуре 1 показано связывание антитела с фосфо-Tau в срезах мозга мышей biGT (Tau бигенных) с использованием TAUPIR.
На Фигуре 2 показано связывание антитела с фосфо-Tau в срезах мозга пациентов с БА и таупатией, с использованием TAUPIR с применением антитела ACI-36-3A8-Ab1.
На Фигуре 3 показан эффект введения антитела против Tau через 1 неделю in vivo исследования на эпитопе pTau pT231 с использованием MSD.
На Фигуре 4 показана диаграмма, демонстрирующая, как обрабатывали мозг с получением растворимой и нерастворимой в саркозиле (SinT) фракции Tau-белка.
На Фигуре 5 показаны результаты Вестерн-блоттинга эпитопа pTau после введения антитела против Tau в течение 1 месяца (Фигуры 5A, 5B, 5C, 5G, 5H, 5I) или 3 месяцев in vivo исследования (Фигуры 5D, 5E, 5F).
На Фигуре 6 показаны результаты Вестерн-блоттинга эпитопа pTau после введения антитела против Tau в течение 3 месяцев in vivo исследования с использованием бигенных мышей biGT.
На Фигуре 7 показан IHC после введения антитела против Tau ACI-36-2B6-Ab1 через 3 месяца in vivo исследования.
На Фигуре 8 показан IHC после введения антитела против Tau ACI-36-3A8-Ab1 через 3 месяца in vivo исследования.
На Фигуре 9 показаны результаты теста в водном лабиринте Морриса после терапии антителом против Tau ACI-36-2B6-Ab1 через 3 месяца in vivo исследования.
На Фигуре 10 показаны результаты теста в водном лабиринте Морриса после терапии антителом против Tau ACI-36-3A8-Ab1 через 3 месяца in vivo исследования.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
В SEQ ID NO: 1 показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-36-3A8-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы 3A8A12G7.
В SEQ ID NO: 2 показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-36-2B6-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы 2B6A10C11.
В SEQ ID NO: 3 показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-36-6H1-Ab1 и ACI-36-6H1-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 6H1A11C11 и 6H1G6E6, соответственно.
В SEQ ID NO: 4 показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-33-6C10-Ab2 и ACI-33-6C10-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы 6C10E5E9C12 и 6C10F9C12A11, соответственно.
В SEQ ID NO: 5 показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-41-7C2-Ab1 и ACI-41-7C2-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 7C2(1)F10C10D3 и 7C2(2)B9F11D5, соответственно.
VK-AD
VK-AD
В SEQ ID NO: 6 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-36-3A8-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 3A8A12G7 и 3A8E12H8, соответственно.
VK-G
VK-G
В SEQ ID NO: 7 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-36-3A8-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 3A8A12G7 и 3A8E12H8, соответственно.
В SEQ ID NO: 8 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-36-2B6-Ab1 и ACI-36-2B6-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 2B6A10C11 и 2B6G7A12, соответственно.
В SEQ ID NO: 9 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-36-6H1-Ab1 и ACI-36-6H1-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 6H1A11C11 и 6H1G6E6, соответственно.
В SEQ ID NO: 10 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-33-6C10-Ab2 и ACI-33-6C10-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы 6C10E5E9C12 и 6C10F9C12A11, соответственно.
В SEQ ID NO: 11 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-41-7C2-Ab1 и ACI-41-7C2-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 7C2(1)F10C10D3 и 7C2(2)B9F11 D5, соответственно.
В SEQ ID NO: 12 показана аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-36-3A8-Ab1, ACI-36-3A8-Ab2, ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-6H1-Ab1 и ACI-36-6H1-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 3A8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11, 2B6G7A12, 6H1A11C11 и 6H1G6E6, соответственно.
В SEQ ID NO: 13 показана аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-36-3A8-Ab1, ACI-36-3A8-Ab2, ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-6H1-Ab1 и ACI-36-6H1-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 3A8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11, 2B6G7A12, 6H1A11C11 и 6H1G6E6, соответственно.
В SEQ ID NO: 14 показана аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-36-3A8-Ab1, ACI-36-3A8-Ab2, ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-6H1-Ab1 и ACI-36-6H1-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 3A8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11, 2B6G7A12, 6H1A11C11 и 6H1G6E6, соответственно.
В SEQ ID NO: 15 показана аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-33-6C10-Ab2 и ACI-33-6C10-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы 6C10E5E9C12 и 6C10F9C12A11, соответственно.
В SEQ ID NO: 16 показана аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-33-6C10-Ab2 и ACI-33-6C10-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы 6C10E5E9C12 и 6C10F9C12A11, соответственно.
В SEQ ID NO: 17 показана аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-33-6C10-Ab2 и ACI-33-6C10-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы 6C10E5E9C12 и 6C10F9C12A11, соответственно.
В SEQ ID NO: 18 показана аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-41-7C2-Ab1 и ACI-41-7C2-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 7C2(1)F10C10D3 и 7C2(2)B9F11D5, соответственно.
В SEQ ID NO: 19 показана аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-41-7C2-Ab1 и ACI-41-7C2-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 7C2(1)F10C10D3 и 7C2(2)B9F11D5, соответственно.
В SEQ ID NO: 20 показана аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-41-7C2-Ab1 и ACI-41-7C2-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 7C2(1)F10C10D3 и 7C2(2)B9F11D5, соответственно.
VK-AD
VK-AD
В SEQ ID NO: 21 показана аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-36-3A8-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 3A8A12G7 и 3A8E12H8, соответственно.
VK-AD
VK-AD
В SEQ ID NO: 22 показана аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-36-3A8-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 3A8A12G7 и 3A8E12H8, соответственно.
VK-AD
VK-AD
В SEQ ID NO: 23 показана аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-36-3A8-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 3A8A12G7 и 3A8E12H8, соответственно.
VK-G
В SEQ ID NO: 24 показана аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-36-3A8-Ab1V-G и ACI-36-3A8-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 3A8A12G7 и 3A8E12H8, соответственно.
VK-G
VK-G
В SEQ ID NO: 25 показана аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-36-3A8-Ab1, ACI-36-3A8-Ab2, ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-6H1-Ab1 и ACI-36-6H1-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 3A8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11, 2B6G7A12, 6H1A11C11 и 6H1G6E6, соответственно.
VK-G
VK-G
В SEQ ID NO: 26 показана аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-36-3A8-Ab1, ACI-36-3A8-Ab2, ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-6H1-Ab1 и ACI-36-6H1-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 3A8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11, 2B6G7A12, 6H1A11C11 и 6H1G6E6, соответственно.
В SEQ ID NO: 27 показана аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-36-2B6-Ab1 и ACI-36-2B6-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 2B6A10C11 и 2B6G7A12, соответственно.
В SEQ ID NO: 28 показана аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-36-6H1-Ab1 и ACI-36-6H1-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 6H1A11C11 и 6H1G6E6, соответственно.
В SEQ ID NO: 29 показана аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-33-6C10-Ab2 и ACI-33-6C10-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы 6C10E5E9C12 и 6C10F9C12A11, соответственно.
В SEQ ID NO: 30 показана аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-33-6C10-Ab2 и ACI-33-6C10-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы 6C10E5E9C12 и 6C10F9C12A11, соответственно.
В SEQ ID NO: 31 показана аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-33-6C10-Ab2 и ACI-33-6C10-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы 6C10E5E9C12 и 6C10F9C12A11, соответственно.
В SEQ ID NO: 32 показана аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-41-7C2-Ab1 и ACI-41-7C2-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 7C2(1)F10C10D3 и 7C2(2)B9F11D5, соответственно.
В SEQ ID NO: 33 показана аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-41-7C2-Ab1 и ACI-41-7C2-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 7C2(1)F10C10D3 и 7C2(2)B9F11D5, соответственно.
В SEQ ID NO: 34 показана аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-41-7C2-Ab1 и ACI-41-7C2-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 7C2(1)F10C10D3 и 7C2(2)B9F11D5, соответственно.
В SEQ ID NO: 35 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-36-3A8-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 3A8A12G7 и 3A8E12H8, соответственно.
В SEQ ID NO: 36 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-36-2B6-Ab1 и ACI-36-2B6-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 2B6A10C11 и 2B6G7A12, соответственно.
В SEQ ID NO: 37 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-36-6H1-Ab1 и ACI-36-6H1-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 6H1A11C11 и 6H1G6E6, соответственно.
В SEQ ID NO: 38 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-33-6C10-Ab2 и ACI-33-6C10-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы 6C10E5E9C12 и 6C10F9C12A11, соответственно.
В SEQ ID NO: 39 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-41-7C2-Ab1 и ACI-41-7C2-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 7C2(1)F10C10D3 и 7C2(2)B9F11D5, соответственно.
В SEQ ID NO: 40 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-36-3A8-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 3A8A12G7 и 3A8E12H8, соответственно.
В SEQ ID NO: 41 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-36-3A8-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 3A8A12G7 и 3A8E12H8, соответственно.
В SEQ ID NO: 42 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-36-2B6-Ab1 и ACI-36-2B6-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 2B6A10C11 и 2B6G7A12, соответственно.
В SEQ ID NO: 43 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-36-6H1-Ab1 и ACI-36-6H1-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 6H1A11C11 и 6H1G6E6, соответственно.
В SEQ ID NO: 44 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-33-6C10-Ab2 и ACI-33-6C10-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы 6C10E5E9C12 и 6C10F9C12A11, соответственно.
В SEQ ID NO: 45 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-41-7C2-Ab1 и ACI-41-7C2-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы 7C2(1)F10C10D3 и 7C2(2)B9F11D5, соответственно.
В SEQ ID NO: 46-57 показаны нуклеотидные последовательности VH/VK прямых и обратных праймеров.
В SEQ ID NO: 58 показана аминокислотная последовательность Tau 379-408 [pS396, pS404]
В SEQ ID NO: 59 показана аминокислотная последовательность Tau 5-20 [pY18].
В SEQ ID NO: 60 показана аминокислотная последовательность Tau 206-221 [pT212, pS214].
В SEQ ID NO: 61 показана аминокислотная последовательность Tau 196-211 [pS202, pT205].
В SEQ ID NO: 62 показана аминокислотная последовательность Tau 393-408 [pS396, pS404].
В SEQ ID NO: 63 показана аминокислотная последовательность Tau 401-418 [pS404, pS409].
В SEQ ID NO: 64 показана аминокислотная последовательность Tau 200-216 [pS202 + pT205 и pT212+pS214].
В SEQ ID NO: 65 показана аминокислотная последовательность Tau 407-418 [pS409].
В SEQ ID NO: 66 показана аминокислотная последовательность Tau 399-408 [pS404].
В SEQ ID NO: 67 показана аминокислотная последовательность наиболее длинной изоформы человеческого Tau (441 а/к), также называемой Tau40.
В SEQ ID NO: 68 показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-4A6-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы A4-4A6-18.
В SEQ ID NO: 69 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-4A6-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы A4-4A6-18.
SEQ ID NO: 70 показана аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-4A6-Ab1.
В SEQ ID NO: 71 показана аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-4A6-Ab1.
В SEQ ID NO: 72 показана аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-4A6-Ab1.
В SEQ ID NO: 73 показана аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-4A6-Ab1.
В SEQ ID NO: 74 показана аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-4A6-Ab1..
В SEQ ID NO: 75 показана аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-4A6-Ab1.
В SEQ ID NO: 76 показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-1D2-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы A6-1D2-12.
В SEQ ID NO: 77 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-1D2-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы A6-1D2-12.
В SEQ ID NO: 78 показана аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-1D2-Ab1.
В SEQ ID NO: 79 показана аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-1D2-Ab1.
В SEQ ID NO: 80 показана аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-1D2-Ab1.
В SEQ ID NO: 81 показана аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-1D2-Ab1.
В SEQ ID NO: 82 показана аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-1D2-Ab1.
В SEQ ID NO: 83 показана аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-1D2-Ab1.
В SEQ ID NO: 84 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-4A6-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы A4-4A6-18.
В SEQ ID NO: 85 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-4A6-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы A4-4A6-18.
В SEQ ID NO: 86 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-1D2-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы A6-1D2-12.
В SEQ ID NO: 87 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-1D2-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы A6-1D2-12.
В SEQ ID NO: 88 показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2 и ACI-35-4A6-Ab2, соответственно, продуцируемого линией клеток гибридомы A4-2A1-18, A4-2A1-40 и A4-4A6-48, соответственно.
В SEQ ID NO: 89 показана аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, ACI-35-4A6-Ab2, ACI-35-2G5-AB2 и ACI-35-2G5-AB3, соответственно.
В SEQ ID NO: 90 показана аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2 и ACI-35-4A6-Ab2, соответственно.
В SEQ ID NO: 91 показана аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, ACI-35-4A6-Ab2, ACI-35-2G5-AB2 и ACI-35-2G5-AB3, соответственно.
В SEQ ID NO: 92 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-2A1-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы A4-2A1-40
В SEQ ID NO: 93 показана аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-2A1-Ab2.
В SEQ ID NO: 94 показана аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-2A1-Ab2.
В SEQ ID NO: 95 показана аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-2A1-Ab2.
В SEQ ID NO: 96 показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-2G5-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы A6-2G5-08.
В SEQ ID NO: 97 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-2G5-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы A6-2G5-08.
В SEQ ID NO: 98 показана аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-2G5-Ab1.
В SEQ ID NO: 99 показана аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-2G5-Ab1.
В SEQ ID NO: 100 показана аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-2G5-Ab1.
В SEQ ID NO: 101 показана аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-2G5-Ab1.
В SEQ ID NO: 102 показана аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-2G5-Ab1.
В SEQ ID NO: 103 показана аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-2G5-Ab1.
В SEQ ID NO: 104 показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-2G5-AB2 и ACI-35-2G5-AB3, соответственно, продуцируемого линией клеток гибридомы A6-2G5-30 и A6-2G5-41, соответственно.
В SEQ ID NO: 105 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-2G5-AB2 и ACI-35-2G5-AB3, соответственно, продуцируемого линией клеток гибридомы A6-2G5-30 и A6-2G5-41, соответственно.
В SEQ ID NO: 106 показана аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-2G5-AB2 и ACI-35-2G5-AB3, соответственно.
В SEQ ID NO: 107 показана аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-2G5-AB2 и ACI-35-2G5-AB3, соответственно.
В SEQ ID NO: 108 показана аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-2G5-AB2 и ACI-35-2G5-AB3, соответственно.
В SEQ ID NO: 109 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2 и ACI-35-4A6-Ab2, соответственно, продуцируемого линией клеток гибридомы A4-2A1-18, A4-2A1-40 и A4-4A6-48, соответственно.
В SEQ ID NO: 110 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-2A1-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы A4-2A1-40.
В SEQ ID NO: 111 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-2G5-AB1, продуцируемого линией клеток гибридомы A6-2G5-08.
В SEQ ID NO: 112 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-2G5-AB1, продуцируемого линией клеток гибридомы A6-2G5-08.
В SEQ ID NO: 113 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-2G5-AB2 и ACI-35-2G5-AB3, соответственно, продуцируемого линией клеток гибридомы A6-2G5-30 и A6-2G5-41, соответственно.
В SEQ ID NO: 114 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-2G5-AB2 и ACI-35-2G5-AB3, соответственно, продуцируемого линией клеток гибридомы A6-2G5-30 и A6-2G5-41, соответственно.
В SEQ ID NO: 115 показана аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела ACI-35-2G5-AB2 и ACI-35-2G5-AB3.
В SEQ ID NO: 116 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-2A1-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы A4-2A1-18.
В SEQ ID NO: 117 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-2A1-Ab1, продуцируемого линией клеток гибридомы A4-2A1-18.
В SEQ ID NO: 118 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-4A6-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы A4-4A6-48.
В SEQ ID NO: 119 показана нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи (VK) моноклонального антитела ACI-35-4A6-Ab2, продуцируемого линией клеток гибридомы A4-4A6-48.
В SEQ ID NO: 120-221 показаны нуклеотидные последовательности VH/VK прямых и обратных праймеров.
Определение терминов
Термины "полипептид", "пептид" и "белок", используемые в настоящем описании, являются взаимозаменяемыми и означают биомолекулу, состоящую из аминокислот, связанных пептидной связью.
Термин "пептиды" или "связывающий пептид" используются в настоящем описании попеременно и относятся к цепям аминокислот (обычно L-аминокислот), альфа-углерод которых связан через пептидные связи, образованные в результате реакции конденсации между карбоксильной группой альфа-углерода одной аминокислоты и аминогруппы альфа-углерода другой аминокислоты. Концевая аминокислота на одном конце цепи (то есть на N-конце) имеет свободную аминогруппу, тогда как концевая аминокислота на другом конце цепи (то есть C-конце) имеет свободную карбоксильную группу. Таким образом, термин "N-конец" относится к свободной альфа-аминогруппе аминокислоты на N-конце пептида, или к альфа-аминогруппе (иминогруппе, при участии в пептидной связи) аминокислоты в любом другом положении в пептиде. Аналогичным образом, термин "C-конец" относится к свободной карбоксильной группе аминокислоты на C-конце пептида или к карбоксильной группе аминокислоты в любом другом положении в пептиде. Связывающий пептид может входить в состав антител, таких как поликлональные или моноклональные антитела, человеческие или гуманизированные антитела, диатела, антитела верблюдовых и т.д., или их функциональные части, как определено в настоящей заявке.
Термины "его фрагмент" или "фрагмент", используемые в настоящем описании, относятся к функциональному фрагменту пептида, который обладает по существу такой же (биологической) активностью, как и пептиды, определенные в настоящей заявке (например, показанные в SEQ ID NO: 59-66 в Таблице 1, соответственно), то есть указанные фрагменты все еще способны вызывать очень специфичный, в особенности конформационно специфичный, иммунный ответ в организме, но прежде всего у животного, в особенности млекопитающего или человека, являющийся очень эффективным и способным предотвращать или устранять таупатию, или симптомы, связанные с таупатиями. В частности, указанные фрагменты все еще содержат специфичный патологический фосфо-эпитоп или -эпитопы Tau-пептида, используемого и определенного в настоящем описании.
Как правило, аминокислоты, составляющие пептид, пронумерованы в порядке начиная с N-конца и с увеличением в направлении C-конца пептида. Таким образом, когда одна аминокислота, как говорят, расположена "после" другой, данная аминокислота располагается ближе к C-концу пептида, чем предыдущая аминокислота.
Термин "остаток", используемый в настоящем описании, относится к аминокислоте, которая включена в пептид посредством амидной связи. Таким образом, аминокислота может быть природной аминокислотой или, если нет иных ограничений, может охватывать известные аналоги природных аминокислот, которые функционируют аналогично природным аминокислотам (то есть миметики аминокислот). Кроме того, миметик амидной связи включает модификации пептидного скелета, известные квалифицированным специалистам.
Фраза "состоящий по существу из" используется в настоящем описании для исключения любых элементов, которые могли бы существенно изменять основные свойства пептидов, к которым относится фраза. Таким образом, описание пептида, "состоящего по существу из…", исключает любые аминокислотные замены, присоединения или делеции, которые могут существенно изменять биологическую активность данного пептида.
Кроме того, специалисту в данной области известно, что, как указано выше, индивидуальные замены, делеции или присоединения, которые заключаются в изменении, добавлении или удалении одной аминокислоты или небольшого процента аминокислот (обычно меньше 5%, как правило, меньше 1%) в кодируемой последовательности, являются консервативно модифицированными вариациями, когда изменения приводят к замене аминокислоты химически подобной аминокислотой. Таблицы консервативных замен, в которых приведены функционально сходные аминокислоты, известны в уровне техники. Каждая из следующих шести групп содержит аминокислоты, которые являются консервативными заменами относительно друг друга:
1) Аланин (A), Серин (S), Треонин (T);
2) Аспарагиновая кислота (D), Глутаминовая кислота (E);
3) Аспарагин (N), Глутамин (Q);
4) Аргинин (R), Лизин (K);
5) Изолейцин (I), Лейцин (L), Метионин (M), Валин (V); и
6) Фенилаланин (F), Тирозин (Y), Триптофан (W).
Фразы "выделенный" или "биологически чистый" относятся к материалу, который по существу или практически не содержит компонентов, которые обычно сопровождают его в его нативном состоянии. Таким образом, пептиды, описанные в настоящей заявке, не содержат материалы, обычно связанные с их in situ окружением. Как правило, выделенные, иммуногенные пептиды, описанные в настоящей заявке, являются чистыми по меньшей мере на приблизительно 80%, обычно по меньшей мере на приблизительно 90% и предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 95%, согласно измерению по интенсивности полосы на геле, окрашенном серебром.
Чистота или гомогенность белка могут быть определены с помощью ряда методов, известных из уровня техники, таких как электрофорез образца белка в полиакриламидном геле, с последующей визуализацией после окрашивания. В некоторых случаях требуется высокое разрешение и для очистки используют ВЭЖХ или подобные методы.
В тех случаях, когда иммуногенные пептиды имеют относительно малую длину (то есть меньше чем приблизительно 50 аминокислот), их часто синтезируют с использованием стандартных химических методов синтеза пептидов.
Твердофазный синтез, в котором C-концевую аминокислоту последовательности присоединяют к нерастворимой подложке, с последующим последовательным присоединением остальных аминокислот в последовательности, является предпочтительным методом химического синтеза иммуногенных пептидов, описанных в настоящей заявке. Методы твердофазного синтеза известны квалифицированным специалистам.
В альтернативе, иммуногенные пептиды, описанные в настоящей заявке, синтезируют при использовании технологии рекомбинантных нуклеиновых кислот. Обычно это включает создание последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептид, введение нуклеиновой кислоты в кассету экспрессии под контроль конкретного промотора, экспрессию пептида в организме-хозяине, выделение экспрессированного пептида или полипептида и, если необходимо, ренатурацию пептида. Методики, достаточные для проведения таких процедур специалистом, можно найти в литературе.
После экспрессии, рекомбинантные пептиды могут быть очищены согласно стандартным методикам, включая осаждение сульфатом аммония, аффинные колонки, колоночную хроматографию, гель-электрофорез и т.п. По существу чистые композиции с приблизительно 50%-95% гомогенностью предпочтительны, и 80%-95% или большей гомогенности наиболее предпочтительны для применения в качестве терапевтических средств.
Специалисту в данной области известно, что после химического синтеза, биологической экспрессии или очистки, иммуногенные пептиды могут обладать конформацией, которая существенно отличается от нативных конформаций составляющих пептидов. В данном случае часто требуется денатурировать и восстанавливать антипролиферативный пептид, а затем проводить рефолдинг пептида в предпочтительную конформацию. Методы восстановления и денатурации белков и рефолдинга известны специалистам в данной области.
Антигенные свойства очищенного белка можно подтвердить, например, с помощью реакции с иммунной сывороткой или с антисыворотками, полученными непосредственно против самого белка.
Термины "a", "an" и "the", используемые в оригинальном тексте описания, означают "один или более" и включают множественное число, если это не противоречит контексту.
Термины "обнаружение" или "обнаруженный", используемые в настоящем описании, означают использование известных методов для обнаружения биологических молекул, таких как иммунохимические или гистологические методы, и относятся к качественному или количественному определению присутствия или концентрации биомолекулы при исследовании.
Под "выделенным" понимается биологическая молекула, свободная, по меньшей мере, от некоторых компонентов, с которыми она существует в естественном состоянии.
Термины "антитело", "антитела" или "их функциональные части", используемые в настоящем описании, являются известным в уровне техники термином и, как следует понимать, относятся к молекулам или активным фрагментам молекул, которые связываются с известными антигенами, в особенности с молекулами иммуноглобулина и с иммунологически активными частями молекул иммуноглобулина, то есть молекул, которые содержат связывающий сайт, который иммуноспецифично связывает антиген. Иммуноглобулин согласно изобретению может относиться к любому типу (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA и IgY) или классу (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2), или подклассу молекулы иммуноглобулина.
2
"Антитела", как предполагается в рамках настоящего изобретения, включают моноклональные антитела, поликлональные, химерные, одноцепочечные, биспецифичные, симианизированные, человеческие и гуманизированные антитела, антитела верблюдовых, диатела, а также их функциональные части или активные фрагменты. Примеры активных фрагментов молекул, которые связываются с известными антигенами, включают Fab и F(ab') фрагменты, включая продукты экспрессионной библиотеки Fab-фрагментов иммуноглобулинов и эпитоп-связывающих фрагментов любого из указанных выше антител и фрагментов. Такие активные фрагменты могут быть получены из антитела настоящего изобретения множеством методов. Например, очищенные моноклональные антитела могут быть расщеплены ферментом, таким как пепсин, и подвергнуты ВЭЖХ-гель-фильтрации. Соответствующая фракция, содержащая Fab-фрагменты, затем может быть собрана и сконцентрирована с помощью фильтрации через мембрану и т.п. Дополнительное описание общих методик выделения активных фрагментов антител, см., например, в Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med. 23: 1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121: 663-69, Academic Press, (1986).
"Гуманизированное антитело" относится к типу сконструированного антитела, в котором CDR получены из не являющегося человеческим донорного иммуноглобулина, а остальные полученные из иммуноглобулинов части получают из одного (или нескольких) иммуноглобулина(ов) человека.
Гуманизированное антитело может также относиться к антителу, имеющему вариабельную область, в которой одна или более ее каркасных областей содержат аминокислоты примата или человека. Кроме того, поддерживающие каркасные остатки могут быть изменены с целью сохранения аффинности связывания. Методы получения "гуманизированных антител" известны специалистам, квалифицированным в данной области (см., например, Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technoloy, 9: 421 (1991)).
"Гуманизированное антитело" также может быть получено с помощью нового метода генной инженерии, который позволяет получать подобные человеческим поликлональные антитела с созревшей аффинностью в крупных животных, таких как, например, кролики (http://www.rctech.com/bioventures/therapeutic.php).
Термин "полностью человеческое антитело" или "человеческое" антитело относится к антителу, полученному из трансгенных мышей, несущих гены антитела человека, или из клеток человека. Для человеческой иммунной системы, впрочем, различие между "полностью человеческими", "человеческими" и "гуманизированными" антителами может быть незначительным или несущественным, и таким образом все три типа могут обладать равной эффективностью и безопасностью.
Термин "моноклональное антитело" также хорошо известен в данной области и относится к антителу, которое массово получают в лаборатории из индивидуального клона и которое узнает только один антиген. Моноклональные антитела, как правило, создают путем слияния короткоживущей в обычном состоянии антителопродуцирующей В-клетки с быстро растущей клеткой, такой как раковая клетка (иногда называемая "иммортализованной" клеткой). Получаемая в результате гибридная клетка, или гибридома, быстро размножается, создавая клон, который продуцирует большие количества антитела.
Термин "антиген" относится к единице, или ее фрагменту, которая может индуцировать иммунный ответ в организме, в особенности в организме животного, более конкретно млекопитающего, включая человека. Термин включает иммуногены и области, ответственные за антигенность, или антигенные детерминанты.
Используемый в настоящем описании термин "растворимый" означает частично или полностью растворимый в водном растворе.
Также используемый в настоящем описании термин "иммуногенный" относится к веществам, которые вызывают или усиливают продукцию антител, Т-клеток и других реактивных иммунных клеток, направленных против иммуногенного агента и участвующих в иммунном ответе у человека или животных.
Иммунный ответ наблюдается, когда у отдельного лица продуцируется достаточное количество антител, Т-клеток и других реактивных иммунных клеток против введенных иммуногенных композиций настоящего изобретения, для ослабления или устранения подлежащего лечению нарушения.
Термин "гибридома" известен в данной области и знаком средним специалистам в данной области и относится к клетке, полученной слиянием антителопродуцирующей клетки и иммортализованной клетки, например клетки множественной миеломы. Такая гибридная клетка способна непрерывно продуцировать антитело. См. определение "моноклонального антитела" выше, а также Примеры ниже, в которых приведено более подробное описание метода слияния.
Термин "носитель", используемый в настоящем описании, означает структуру, в которую может быть встроен или с которой может быть связан антигенный пептид или надмолекулярная конструкция, с осуществлением презентации или обеспечением доступности антигенных пептидов или фрагмента пептида для иммунной системы человека или животного. Любая частица, которую можно применять для терапии у животных или человека, такая как, например, везикула, частица или состоящее из частиц тело, можно применять в качестве носителя в рамках настоящего изобретения.
Термин "носитель" дополнительно включает методы доставки, в которых композиции надмолекулярных антигенных конструкций, включающих антигенный пептид, можно транспортировать в требуемые участки с помощью механизмов доставки. Одним из примеров такой системы доставки является система, в которой используются коллоидные металлы, такие как коллоидное золото.
Белки-носители, которые могут применяться в композициях надмолекулярных антигенных конструкций согласно настоящему изобретению, включают, без ограничения, мальтозосвязывающий пептид, "МВР"; бычий сывороточный альбумин "BSA"; гемоцианин лимфы улитки "KLH"; овальбумин; флагеллин; тироглобулин; сывороточный альбумин любых видов; гамма-глобулин любых видов; сингенные клетки; сингенные клетки, несущие la антигены; а также полимеры D- и/или L-аминокислот.
Кроме того, термин "терапевтически эффективное количество" или "фармацевтически эффективное количество" относится к количеству связывающего пептида, которое при введении человеку или животному является достаточным для обеспечения терапевтического эффекта у указанного человека или животного. Эффективное количество легко может быть определено средним специалистом в данной области с помощью стандартных методик.
"pTau PHF", "PHF" и "парные спиральные филаменты" используются в настоящем описании синонимично и относятся к парам приблизительно 10 нм филаментов, скрученных в спирали с периодичностью 160 нм, видимые с помощью электронной микроскопии. Ширина изменяется в пределах 10-22 нм. PHF являются преобладающими структурами в нейрофибриллярных клубках при болезни Альцгеймера (БА) и в нейропильных нитях. PHF также могут наблюдаться в некоторых, но не во всех, дистрофических аксонах, ассоциированных с нейритическими бляшками. Главным компонентом PHF является гиперфосфорилированная форма ассоциированного с микротрубочками Tau-белка. PHF состоят из связанных дисульфидными мостиками антипараллельных гиперфосфорилированных Tau-белков. PHF Tau может быть усечен по C-концу на 20 аминокислотных остатков. Механизмы, лежащие в основе формирования PHF, неясны, однако гиперфосфорилирование Tau может приводить к его высвобождению из микротрубочек, увеличивая пул растворимого Tau.
В рамках настоящего изобретения было продемонстрировано, что индуцированный гуморальный иммунный ответ на антигенную композицию согласно изобретению в значительной степени является T-клеточно независимым. В этом отношении использовали модель на голых мышах, при этом голых мышей вакцинировали и измеряли гуморальный иммунные ответы для оценки Αβ-специфичного гуморального ответа, индуцированного антигенной композицией согласно изобретению у иммунизированных голых мышей. Голые мыши несут мутацию Foxn1nu, вследствие чего у них снижена функция T-клеток из-за отсутствия нормального тимуса.
"Фармацевтически эффективное количество", используемое в настоящем описании, относится к дозе активного компонента в фармацевтической композиции, которая достаточна для излечения или, по меньшей мере, частичного устранения, симптомов заболевания, нарушения или состояния, подвергаемого лечению, или любых осложнений связанных с ними.
В настоящем изобретении предложены связывающие пептиды, узнающие и связывающиеся с главными патологическими фосфо-эпитопами Tau-белка. В частности в настоящем изобретении предложены специфичные антитела против линейных и конформационных, простых и сложных фосфо-эпитопов на Tau-белке, которые, как предполагают, ответственны за синапто- и нейротоксичность при таупатиях, включая БА.
Таким образом, настоящее изобретение в одном варианте осуществления относится к связывающему пептиду или его функциональной части, в особенности к антителу, в особенности моноклональному антителу или его функциональной части, где указанный связывающий пептид или антитело узнают и специфично связываются с фосфо-эпитопом на Tau-белке млекопитающего, в особенности на Tau-белке человека или на его фрагменте, в особенности с патологическим конформером Tau-белка, но, в одном варианте осуществления, не связываются с соответствующим нефосфорилированным эпитопом и/или с другими эпитопами, где указанный связывающий пептид или антитело обладают высокой аффинностью связывания с константой диссоциации по меньшей мере 10 нМ, в частности по меньшей мере 8 нМ, в частности по меньшей мере 5 нМ, в частности по меньшей мере 2 нМ, в частности по меньшей мере 1 нМ, в частности по меньшей мере 500 пМ, в частности по меньшей мере 400 пМ, в частности по меньшей мере 300 пМ, в частности по меньшей мере 200 пМ, в частности по меньшей мере 100 пМ, в частности по меньшей мере 50 пМ.
"Растворимый Tau" белок, используемый в настоящем описании, относится к белкам, состоящим из полностью растворимых мономеров Tau-белка/пептида или из Tau-подобных пептидов/белков, или модифицированных, или усеченных Tau пептидов/белков, или других производных мономеров Tau пептидов/белков и олигомеров Tau-белка. "Растворимый Tau" исключает в частности нейрофибриллярные клубки (NFT).
"Нерастворимый Tau", используемый в настоящем описании, относится к множеству агрегированных мономеров Tau-пептидов или белков, или Tau-подобных пептидов/белков, или модифицированных или усеченных Tau пептидов/белков, или других производных Tau пептидов/белков, формирующих олигомерные или полимерные структуры, которые являются нерастворимыми как в водной среде in vitro, так и in vivo в организме млекопитающего или человека, более конкретно в мозге, но, прежде всего, к множеству агрегированных мономеров Tau или модифицированных или усеченных Tau пептидов/белков, или их производных, которые являются нерастворимыми в организме млекопитающего или человека, более конкретно в мозге, соответственно. "Нерастворимый Tau" в частности включает нейрофибриллярные клубки (NFT).
"Мономерный Tau" или "Tau мономер", используемый в настоящем описании, относится к полностью растворимым Tau-белкам без агрегированных комплексов в водной среде.
"Агрегированный Tau", "олигомерный Tau" и "Tau олигомер" относятся к множеству агрегированных мономеров Tau-пептидов или белков, или Tau-подобных пептидов/белков, или модифицированных или усеченных Tau пептидов/белков, или других производных Tau пептидов/белков, формирующих олигомерные или полимерные структуры, которые являются нерастворимыми или растворимыми как in vitro в водной среде, так и in vivo в организме млекопитающего или человека, более конкретно в мозге, но, прежде всего, к множеству агрегированных мономеров Tau или модифицированных или усеченных Tau пептидов/белков, или их производных, которые являются нерастворимыми или растворимыми в организме млекопитающего или человека, более конкретно в мозге, соответственно.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, включающая связывающий пептид или его функциональную часть, в особенности антитело, в особенности моноклональное антитело или его функциональную часть, или полинуклеотид, включающий последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие указанный связывающий пептид или антитело, согласно любому из вариантов осуществления, описанных и заявленных в настоящей заявке, или комбинации перечисленного, в терапевтически эффективном количестве вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
Подходящие фармацевтические носители, разбавители и/или вспомогательные вещества известны в уровне техники и включают, например, фосфатно-солевые буферные растворы, воду, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода, различные типы смачивающих веществ, стерильные растворы и т.д.
Связывающие пептиды согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела и их активные фрагменты, могут быть приготовлены в физиологически приемлемой лекарственной форме и могут включать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или вспомогательное вещество, с использованием известных методов. Например, связывающие пептиды согласно изобретению и, как описано в настоящей заявке, включающие любые функционально эквивалентные связывающие пептиды или их функциональные части, в частности моноклональные антитела изобретения, включая любые функционально эквивалентные антитела или их функциональные части, объединяют с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем и/или вспомогательным веществом, с получением терапевтической композиции. Подходящие фармацевтические носители, разбавители и/или вспомогательные вещества известны в уровне техники и включают, например, фосфатно-солевые буферные растворы, воду, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода, различные типы смачивающих веществ, стерильных растворы и т.д.
Приготовление лекарственной формы фармацевтической композиции согласно изобретению может быть выполнено согласно стандартной методике, известной средним специалистам в данной области техники.
Композиции настоящего изобретения можно вводить субъекту в твердой форме, в форме жидкости или аэрозоля, в подходящей, фармацевтически эффективной дозе. Примеры твердых композиций включают пилюли, кремы и имплантируемые дозирующие устройства. Пилюли можно вводить перорально. Терапевтические кремы можно применять местно. Имплантируемые дозирующие устройства можно вводить локально, например, на участке локализации опухоли, или можно вживлять для систематического дозирования терапевтической композиции, например, подкожно. Примеры жидких композиций включают лекарственные формы, подходящие для внутримышечной, подкожной, внутривенной, внутриартериальной инъекции, и лекарственные формы для местного и внутриглазного введения. Примеры аэрозольных форм включают ингаляционные формы для введения в легкие.
Композиции можно вводить стандартными путями введения. В большинстве случаев композиция может быть введена местным, пероральным, ректальным, назальным, внутрикожным, внутрибрюшинным или парентеральным (например, внутривенным, подкожным или внутримышечным) путями.
Кроме того, композиция может быть включена в матрицы с длительным высвобождением, такие как биоразлагаемые полимеры, полимеры, имплантируемые вблизи участка, в который требуется осуществить доставку, например, в участке локализации опухоли. Способ включает введение одной дозы, введение повторных доз через установленные промежутки времени, и длительное введение в течение заданного периода времени.
Матрица с длительным высвобождением, используемая в настоящем описании, является матрицей, изготовленной из материалов, обычно полимеров, которые способны к разложению в результате ферментативного или кислотного/основного гидролиза, или растворения. После введения в тело, на матрицу действуют ферменты и жидкости тела. Матрицу с длительным высвобождением предпочтительно выбирают из биосовместимых материалов, таких как липосомы, полилактиды (полимолочная кислота), полигликолид (полимер гликолевой кислоты), сополимер полилактида-гликолида (сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты), полиангидриды, поли(орто)эфиры, полипептиды, гиалуроновая кислота, коллаген, хондроитина сульфат, карбоновые кислоты, жирные кислоты, фосфолипиды, полисахариды, нуклеиновые кислоты, полиаминокислоты, аминокислоты, такие как фенилаланин, тирозин, изолейцин, полинуклеотиды, поливинилпропилен, поливинилпирролидон и силикон. Предпочтительной биоразлагаемой матрицей является матрица из одного из полилактида, полигликолида или сополимера полилактида-гликолида (сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты).
Средним специалистам в данной области известно, что дозировка композиции будет зависеть от различных факторов, таких как, например, состояние, подвергаемое лечению, конкретная применяемая композиция, и другие клинические факторы, такие как вес, размер, пол и общее состояние здоровья пациента, площадь поверхности тела, конкретное вводимое соединение или композиция, другие одновременно применяемые лекарственные средства и путь введения.
Композицию согласно изобретению можно вводить в комбинации с другими композициями, включающими биологически активное вещество или соединение, такое как, например, известное соединение, применяемое в лечении таупатий и/или амилоидозов, группы заболеваний и нарушений, связанных с амилоидным или амилоид-подобным белком, таким как β-амилоидный белок, включенный в болезнь Альцгеймера.
Другое биологически активное вещество или соединение может проявлять свое биологическое действие посредством такого же или подобного механизма, что и терапевтическая вакцина согласно изобретению, или обладать совершенно иным механизмом действия или сочетанием сходных и/или различных механизмов действия.
Как правило, другое биологически активное соединение может представлять собой усилители нейротрансмиссии, психотерапевтические лекарственные средства, ингибиторы ацетилхолинэстеразы, блокаторы кальциевых каналов, биогенные амины, бензодиазепиновые транквилизаторы, стимуляторы синтеза, накопления или высвобождения ацетилхолина, агонисты постсинаптических рецепторов ацетилхолина, ингибиторы моноаминоксидазы-А или -В, антагонисты рецептора N-метил-D-аспартатглутамата, нестероидные противовоспалительные средства, антиоксиданты и антагонисты серотонинергических рецепторов.
В частности биологически активное средство или соединение могут включать по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, включающей соединения против окислительного стресса, антиапоптозные соединения, хелатирующие агенты, ингибиторы репарации ДНК, такие как пирензепин и метаболиты, 3-амино-1-пропансульфоновую кислоту (3APS), 1,3-пропандисульфонат (1,3PDS), активаторы секретаз, ингибиторы бета- и 7-секретазы, тау-белки, нейромедиатор, агенты, нарушающие β-складчатую конформацию, противовоспалительные молекулы или "атипичные нейролептики", такие как, например, клозапин, зипрасидон, рисперидон, арипипразол или оланзапин, или ингибиторы холинэстеразы (ChEI), такие как такрин, ривастигмин, донепизил и/или галантамин, а также другие лекарственные средства и пищевые добавки, такие как, например, витамин В12, цистеин, предшественник ацетилхолина, лецитин, холин, Гинкго двулопастный, ацетил-L-карнитин, идебенон, пропентофиллин или производное ксантина, в сочетании со связывающим пептидом согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела и их активные фрагменты, и, необязательно, с фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем, и/или вспомогательным веществом, а также инструкциями для лечения заболеваний.
В другом варианте осуществления композиция согласно изобретению может включать ниацин или мемантин в сочетании со связывающим пептидом согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела и их активные фрагменты, и, необязательно, фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем, и/или вспомогательным веществом.
В еще одном варианте осуществления изобретения предложены композиции, которые включают "атипичные нейролептики", такие как, например, зипрасидон, рисперидон, арипипразол или оланзапин, предназначенные для лечения позитивных или негативных психотических симптомов, включая галлюцинации, бред, нарушения мышления (проявляющиеся в выраженной непоследовательности действий, психическом расстройстве, расстройстве ассоциативного мышления) и необычное или неорганизованное поведение, а также ангедонию, пониженную эмоциональную реакцию, апатию и социальную самоизоляцию, в сочетании со связывающим пептидом согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела и их активные фрагменты, и, необязательно фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем, и/или вспомогательным веществом.
Другие соединения, которые можно применять в композициях в дополнение к связывающему пептиду согласно изобретению, описаны, например, в WO 2004/058258 (см. прежде всего стр. 16 и 17), включая мишени терапевтических лекарственных средств (стр. 36-39), алкансульфоновые кислоты и алкансерную кислоту (стр. 39-51), ингибиторы холинэстеразы (стр. 51-56), антагонисты NMDA-рецептора (стр. 56-58), эстрогены (стр. 58-59), нестероидные противовоспалительные средства (стр. 60-61), антиоксиданты (стр. 61-62), агонисты рецепторов, активируемых пероксисомальными пролифераторами (PPAR) (стр. 63-67), средства, понижающие уровень холестерина (стр. 68-75); ингибиторы амилоида (стр. 75-77), ингибиторы образования амилоида (стр. 77-78), металлохелатирующие агенты (стр. 78-79), нейролептики и антидепрессанты (стр. 80-82), пищевые добавки (стр. 83-89) и соединения, повышающие доступность биологически активных веществ в головном мозге (см. стр. 89-93), и пролекарства (стр. 93 и 94), где указанный документ включен в настоящее описание посредством отсылки, но особенно соединения, упоминаемые на указанных выше страницах.
Белковое фармацевтически активное вещество может присутствовать в количествах от 1 нг до 10 мг в дозе. Обычно схема введения должна находиться в пределах от 0,1 пг до 10 мг антитела согласно изобретению, в частности в пределах от 1,0 пг до 1,0 мг, и более конкретно в пределах от 1,0 пг до 100 пг, при этом все индивидуальные числа, находящиеся в пределах указанных диапазонов, также являются частью изобретения. Если введение осуществляют путем непрерывной инфузии, более подходящая дозировка может находиться в пределах от 0,01 пг до 10 мг на килограмм массы тела в час, при этом все индивидуальные числа, находящиеся в пределах указанных диапазонов, также являются частью изобретения.
Введение обычно производят парентерально, например внутривенно. Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Неводные растворители включают, без ограничения, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, и подходящие для инъекций органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные растворители могут быть выбраны из группы, состоящей из воды, для спиртовых/водных растворов, эмульсий или суспензий, включая солевой раствор и буферизированные среды. Среды для парентерального введения включают раствор хлорида натрия, раствор Рингера с декстрозой, раствор декстрозы и хлорида натрия, раствор Рингера с лактатом или нелетучие масла. Среды для внутривенного введения включают жидкие и питательные растворы, растворы, восполняющие электролитный состав (такие как растворы на основе раствора Рингера с декстрозой), и другие. Также могут присутствовать консерванты, такие как, например, противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие агенты, инертные газы и т.д.
Фармацевтическая композиция может дополнительно включать белковые носители, такие как, например, сывороточный альбумин или иммуноглобулин, в особенности человеческого происхождения. В фармацевтической композиции изобретения могут присутствовать другие биологически активные агенты, в зависимости от предполагаемого применения.
Когда мишень связывания расположена в мозге, в некоторых вариантах осуществления изобретения предложен связывающий пептид согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела и их активные фрагменты, для пересечения гематоэнцефалического барьера. Некоторые нейродегенеративные заболевания связаны с увеличением проницаемости гематоэнцефалического барьера, в результате чего связывающий пептид согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела или их активный фрагмент, может быть с легкостью введен в мозг. Если гематоэнцефалический барьер остается интактным, существует несколько известных в уровне техники подходов для транспортировки молекул через него, включая, без ограничения, физические методы, методы на основе липидов и методы на основе рецепторов и каналов.
Физические методы транспортировки связывающего пептида согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела или их активный фрагмент, через гематоэнцефалический барьер включают, без ограничения, полный обход гематоэнцефалического барьера или создание пор в гематоэнцефалическом барьере. Методы обхода включают, без ограничения, прямую инъекцию в мозг (см., например, Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)) и имплантацию устройства доставки в мозг (см., например, Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); а также Gliadel Wafers(TM), Guildford Pharmaceutical). Методы создания пор в барьере включают, без ограничения, ультразвук (см., например, патентную публикацию США 2002/0038086), осмотическое давление (например, путем введения гипертонического раствора маннита (Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N. Y. (1989)), пермеабилизацию, например, с помощью брадикинина или пермеабилизатора A-7 (см., например, патенты США 5112596, 5268164, 5506206 и 5686416), и трансфекцию нейронов, изолированных гематоэнцефалическим барьером, векторами, содержащими гены, кодирующие связывающий пептид или антигенсвязывающий фрагмент (см., например, патентную публикацию США 2003/0083299).
Основанные на липидах методы транспортировки связывающего пептида согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела или их активный фрагмент, через гематоэнцефалический барьер включают, без ограничения, инкапсулирование связывающего пептида согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела или их активный фрагмент, в липосомах, которые связаны с активными фрагментами, которые связываются с рецепторами на эндотелии сосудов гематоэнцефалического барьера (см., например, опубликованную заявку на патент США 20020025313), и покрытие связывающим пептидом согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела или их активный фрагмент, частиц липопротеинов низкой плотности (см., например, опубликованную заявку на патент США 20040204354) или аполипопротеина E (см., например, опубликованную заявку на патент США 20040131692).
Методы на основе рецепторов и каналов для транспортировки связывающего пептида согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела или их активный фрагмент, через гематоэнцефалический барьер включают, без ограничения, применение блокаторов глюкокортикоидов для повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера (см., например, опубликованные заявки на патент 2002/0065259, 2003/0162695 и 2005/0124533); активацию калиевых каналов (см., например, опубликованную заявку на патент США 2005/0089473), ингибирование ABC-транспортеров лекарственных средств (см., например, опубликованную заявку на патент США 2003/0073713); покрытие антител трансферрином и модулирование активности одного или нескольких трансферриновых рецепторов (см., например, опубликованную заявку на патент США 2003/0129186), а также катионизацию антител (см., например, патент США 5004697).
Разовое или многократное введение связывающего пептида согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела или их активный фрагмент, или фармацевтической композиции согласно изобретению субъекту можно осуществлять в течение длительного периода времени. Продолжительность введения может составлять от 1 недели и до 12 месяцев или больше. В течение этого времени связывающий пептид, антитело или фармацевтическую композицию можно вводить один раз в неделю, один раз каждые две недели, три недели, четыре недели и т.д., или с более высокой или более низкой частотой в зависимости от потребностей субъекта, подвергаемого лечению.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложены способы и наборы для обнаружения и диагностики ассоциированных с Tau-белком заболеваний, нарушений или состояний, включая нейродегенеративные заболевания или нарушения, такие как таупатии, включающие смешанную группу нейродегенеративных заболеваний или нарушений, включая заболевания или нарушения, которые демонстрируют одновременное присутствие Tau и амилоидных патологий, включая, без ограничения, болезнь Альцгеймера, болезнь Крейтцфельда-Якоба, деменцию боксеров, синдром Дауна, синдром Герстмана-Штраусслера-Шейнкера, миозит с тельцами включения и прионную церебральную амилоидную ангиопатию, травматическое повреждение головного мозга, а также другие заболевания или нарушения, которые не демонстрируют выраженной амилоидной патологии, включая, без ограничения, Гуамский комплекс бокового амиотрофического склероза/паркинсонизма-деменции, болезнь моторных нейронов не Гуамского типа с нейрофибриллярными клубками, деменцию с аргирофильными включениями, кортикобазальную дегенерацию, диффузные нейрофибриллярные клубки с кальцификацией, лобно-височную деменцию с паркинсонизмом, сцепленную с хромосомой 17, болезнь Галлервордена-Шпатца, мультисистемную атрофию, болезнь Ниманна-Пика типа C, паллидо-понто-нигральную дегенерацию, болезнь Пика, прогрессирующий субкортикальный глиоз, прогрессирующий супрануклеарный паралич, подострый склерозирующий панэнцефалит, деменцию только с клубками, постэнцефалитический паркинсонизм, миотоническую дистрофию. Патологические нарушения могут быть вызваны или связаны с формированием нейрофибриллярных поражений, преобладающей патологией мозга при таупатии.
Кроме того, в настоящем изобретении предложены способы и наборы для диагностики предрасположенности к ассоциированным с Tau-белком заболеваниям, нарушениям или состояниям, включая нейродегенеративные заболевания или нарушения, такие как таупатии, включающие смешанную группу нейродегенеративных заболеваний или нарушений, включая заболевания или нарушения, которые демонстрируют одновременное присутствие Tau и амилоидных патологий, или для контроля минимального остаточного заболевания у пациента, или для прогнозирования чувствительности пациента к лечению связывающим пептидом согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела и их активные фрагменты, или композицией согласно изобретению, и как описано в настоящей заявке. Указанные способы включают известные иммунологические методы, обычно используемые для обнаружения или количественного определения веществ в биологических образцах или в условиях in situ.
Диагностика ассоциированных с Tau-белком заболеваний или состояний, или предрасположенности к ассоциированному с Tau-белком заболеванию или состоянию у субъекта, испытывающего в этом потребность, в особенности млекопитающего, более конкретно человека, включая нейродегенеративные заболевания или нарушения, такие как таупатии, включающие смешанную группу нейродегенеративных заболеваний или нарушений, включая заболевания или нарушения, которые демонстрируют одновременное присутствие Tau и амилоидных патологий, может быть выполнена посредством обнаружения иммуноспецифичного связывания связывающего пептида изобретения, в особенности антитела, в особенности моноклонального антитела или его активного фрагмента, с эпитопом Tau-белка в образце или in situ, которое включает контакт образца или определенной части тела, или области тела, подозреваемой на присутствие Tau-белка, с антителом, которое связывает эпитоп Tau-белка, связывание антитела с Tau-белком, с образованием иммунологического комплекса, обнаружение образования иммунологического комплекса и соотнесение присутствия или отсутствия иммунологического комплекса с присутствием или отсутствием Tau-белка в образце или в определенной части или области тела, с необязательным сравнением количества иммунологического комплекса с нормальным контрольным значением, где увеличение количества иммунологического комплекса по сравнению с нормальным контрольным значением указывает, что субъект страдает или подвергается риску развития ассоциированного с Tau-белком заболевания или состояния.
Контроль минимального остаточного заболевания у субъекта, в особенности млекопитающего, более конкретно человека, после лечения связывающим пептидом согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела и их активные фрагменты, или композицией согласно изобретению, может быть выполнен посредством обнаружения иммуноспецифичного связывания связывающего пептида изобретения, в особенности антитела, в особенности моноклонального антитела или его активного фрагмента, с эпитопом Tau-белка в образце или in situ, которое включает контакт образца или определенной части тела, или области тела, подозреваемой на присутствие Tau-белка, со связывающим пептидом согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела и их активные фрагменты, который связывает эпитоп Tau-белка, связывание связывающего пептида согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела и их активные фрагменты, с Tau-белком, с образованием иммунологического комплекса, обнаружение образования иммунологического комплекса и соотнесение присутствия или отсутствия иммунологического комплекса с присутствием или отсутствием Tau-белка в образце или в определенной части или области тела, с необязательным сравнением количества указанного иммунологического комплекса с нормальным контрольным значением, где увеличение количества указанного иммунологического комплекса по сравнению с нормальным контрольным значением указывает, что субъект все еще может страдать минимальным остаточным заболеванием.
Прогнозирование чувствительности субъекта, в особенности млекопитающего, более конкретно человека, к лечению связывающим пептидом согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела и их активные фрагменты, или композицией согласно изобретению может быть выполнено посредством обнаружения иммуноспецифичного связывания связывающего пептида, в особенности моноклонального антитела или его активного фрагмента, с эпитопом Tau-белка в образце или in situ, которое включает контакт образца или определенной части тела, или области тела, подозреваемой на присутствие Tau-белка, со связывающим пептидом согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела и их активные фрагменты, который связывает эпитоп Tau-белка, связывание связывающего пептида согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела и их активные фрагменты, с Tau-белком, с образованием иммунологического комплекса, обнаружение образования иммунологического комплекса и соотнесение присутствия или отсутствия иммунологического комплекса с присутствием или отсутствием Tau-белка в образце или в определенной части, или области тела, с необязательным сравнением количества указанного иммунологического комплекса до и после начала лечения, где уменьшение количества указанного иммунологического комплекса указывает, что указанный пациент с высокой вероятностью чувствителен к лечению.
Биологические образцы, которые могут применяться в диагностике ассоциированного с Tau-белком заболевания или состояния, для диагностики предрасположенности к ассоциированному с Tau-белком заболеванию или состоянию, включая нейродегенеративные заболевания или нарушения, такие как таупатии, включающие смешанную группу нейродегенеративных заболеваний или нарушений, включая заболевания или нарушения, которые демонстрируют одновременное существование Tau и амилоидной патологий, или для контроля минимального остаточного заболевания у пациента, или для прогнозирования чувствительности пациента к лечению связывающим пептидом согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела и их активные фрагменты, или композицией согласно изобретению, и как описано в настоящей заявке, являются, например, жидкостями, такими как сыворотка, плазма, слюна, желудочные секреты, слизь, спинномозговая жидкость, лимфатическая жидкость и т.п., или образцами ткани или клеток, полученными из организма, такими как нервная, мозговая, сердечная или сосудистая ткань. Для определения присутствия или отсутствия Tau-белка в образце может использоваться любой иммуноанализ, известный средним специалистам в данной области, такой как, например, анализ, в котором используются косвенные методы обнаружения с применением вторичных реактивов для детектирования, анализ ELISA и реакции иммунопреципитации и агглютинации. Подробное описание указанных анализов приведено, например, в Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612, WO96/13590 (Maertens and Stuyver), Zrein et al. (1998) и WO 96/29605.
Для диагностики in situ, связывающий пептид согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела и их активные фрагменты, или их любую активную и функциональную часть, можно вводить в организм, который подвергают диагностике, с применением методов, известных в уровне техники, таких как, например, внутривенная, внутриназальная, внутрибрюшинная, внутримозговая, внутриартериальная инъекция, в результате чего может происходить специфичное связывание антитела согласно изобретению с эпитопной областью на амилоидном белке. Комплекс связывающего пептида/антигена можно удобно обнаружить посредством метки, присоединенной к связывающему пептиду согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела или их функциональный фрагмент, или с помощью любого другого известного в уровне техники метода обнаружения.
Иммуноанализы, применяемые в диагностических целях или для диагностики предрасположенности к ассоциированному с Tau-белком заболеванию или состоянию, включая нейродегенеративные заболевания или нарушения, такие как таупатии, включающие смешанную группу нейродегенеративных заболеваний или нарушений, включая заболевания или нарушения, которые демонстрируют одновременное присутствие Tau и амилоидной патологий, или для контроля минимального остаточного заболевания у пациента, или для прогнозирования чувствительности пациента к лечению связывающим пептидом согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела и их активные фрагменты, или композицией согласно изобретению, и как описано в настоящей заявке, обычно основаны на применении меченых антигенов, связывающих пептидов или вторичных реактивов для детектирования. Указанные белки или реактивы могут быть помечены соединениями, широко известными средним специалистам в данной области, включая ферменты, радиоизотопы и флуоресцентные, люминесцентные и хромогенные вещества, включая, без ограничения, цветные частицы, такие как коллоидное золото и латексные гранулы. Из указанного, радиоизотопное мечение может использоваться почти для всех типов анализов и с большинством вариаций. Конъюгированные с ферментами метки особенно предпочтительны, если необходимо избежать радиоактивности или когда требуется быстро получить результаты. Флуорохромы, хотя и требуют дорогостоящего оборудования для их использования, обеспечивают очень чувствительный метод детектирования. Связывающие пептиды, применяемые в данном анализе, раскрыты и заявлены в настоящей заявке, включая антитела, в особенности моноклональные антитела, поликлональные антитела и аффинно-очищенные поликлональные антитела.
В альтернативе, связывающий пептид согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела и их активные фрагменты, может быть помечен опосредованно, с помощью реакции с мечеными веществами, которые обладают аффинностью к иммуноглобулину, такими как протеин A или G, или вторичные антитела. Связывающий пептид согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела и их активные фрагменты, может быть конъюгирован со вторым веществом и детектирован меченым третьим веществом, которое обладает аффинностью ко второму веществу, конъюгированному с антителом. Например, связывающий пептид согласно изобретению, включая антитела, в особенности моноклональные антитела и их активные фрагменты, может быть конъюгирован с биотином, и конъюгат связывающего пептида/биотина детектируют с использованием меченого авидина или стрептавидина. Аналогичным образом связывающий пептид может быть конъюгирован с гаптеном, и конъюгат связывающего пептида/гаптена детектируют с использованием меченого анти-гаптенсвязывающего пептида.
Средние специалисты в данной области будут осведомлены о таких и других подходящих метках, которые могут применяться в соответствии с настоящим изобретением. Связывание указанных меток со связывающими пептидами или их фрагментами может быть достигнуто при использовании стандартных методов, хорошо известных средним специалистам в данной области. Типичные методики описаны в Kennedy, J. H., et al., 1976 (Clin. Chim. Acta 70: 1-31) и Schurs, A. H. W. M., et al., 1977 (Clin. Chim Acta 57: 1-40). Методами сшивания, указанными ниже, являются глутаральдегидный метод, периодатный метод, дималеимидный метод и другие, которые включены в настоящее описание посредством отсылки.
В существующих иммуноанализах для обнаружения присутствия аналита используют метод двойных антител, в котором антитело метят косвенно, благодаря наличию реактивности со вторым антителом, меченным детектируемой меткой. Второе антитело предпочтительно является таким антителом, которое связывается с антителами животного, из которого получено моноклональное антитело. Другими словами, если моноклональное антитело является антителом мыши, то меченое вторичное антитело является антимышиным антителом. В отношении антитела, используемого в анализе, описанном в настоящей заявке, данная метка предпочтительно является покрытой антителом гранулой, в особенности магнитной гранулой. Что касается антитела, применяемого в иммуноанализе, описанном в настоящей заявке, метка предпочтительно является детектируемой молекулой, такой как радиоактивное, флуоресцентное или электрохемилюминесцентное вещество.
Альтернативная система двойных антител, часто называемая системой быстрого формата, потому что она приспособлена к быстрому определению присутствия аналита, также может применяться в рамках настоящего изобретения. Система требует высокой аффинности между антителом и аналитом. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, присутствие амилоидного белка определяют с помощью пары антител, каждое из которых специфично к амилоидному белку. Одно антитело из указанных пар антител именуется в настоящей заявке как "детекторное антитело", а другое антитело из указанной пары антител именуется в настоящей заявке как "захватывающее антитело". Моноклональное антитело настоящего изобретения может применяться либо как захватывающее антитело, либо как детекторное антитело. Моноклональное антитело настоящего изобретения также может применяться и как захватывающее, и как детекторное антитело одновременно в одном анализе. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения для обнаружения амилоидного белка в образце биологической жидкости применяется сэндвич-метод двойных антител. В данном методе аналит (амилоидный белок) располагается между детекторным антителом и захватывающим антителом, при этом захватывающее антитело необратимо иммобилизовано на твердой подложке. Детекторное антитело содержит детектируемую метку, позволяющую определять присутствие сэндвич-комплекса антитела-аналита и, таким образом, присутствие аналита.
Примерные материалы твердой фазы включают, без ограничения, микротитровальные планшеты, полистирольные пробирки, магнитные, полимерные или стеклянные гранулы и предметные стекла, известные в области радиоиммуноанализа и ферментного иммуноанализа. Методы сшивания антител с твердыми фазами также известны средним специалистам в данной области. В последнее время, в качестве твердых подложек использовали множество пористых материалов, таких как нейлон, нитроцеллюлоза, ацетат целлюлозы, стекловолокно и другие пористые полимеры.
Настоящее изобретение также относится к диагностическому набору для обнаружения Tau-белка в биологическом образце, включающему композицию, определенную выше. Кроме того, настоящее изобретение относится к последнему диагностическому набору, который, в дополнение к композиции, определенной выше, также включает детектирующий реактив, определенный выше. Термин "диагностический набор" относится, в общем, к любому диагностическому набору, известному в уровне техники. Более конкретно, последний термин относится к диагностическому набору, описанному в Zrein et al. (1998).
Еще одна цель настоящего изобретения состоит в обеспечении новых иммунозондов и тест-наборов для обнаружения и диагностики ассоциированных с Tau-белком заболеваний и состояний, включающих связывающие пептиды согласно настоящему изобретению. В отношении иммунозондов, связывающие пептиды прямо или опосредованно присоединяют к подходящей репортерной молекуле, например, ферменту или радионуклиду. Тест-набор включает контейнер, содержащий один или более связывающих пептидов согласно настоящему изобретению и инструкции по применению связывающих пептидов с целью связывания с Tau-антигеном, с образованием иммунологического комплекса, и обнаружения образования иммунологического комплекса, после чего присутствие или отсутствие иммунологического комплекса соотносят с присутствием или отсутствием Tau-белка.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1: Получение и скрининг гибридом и антител
Цель данного исследования состояла в получении и скрининге моноклональных антител против Tau (anti-Tau mAb). Гибридомы получали путем слияния спленоцитов мышей, иммунизированных Tau вакциной, с линией клеток миеломы. Гибридомы оценивали по реактивности против фосфорилированного и нефосфорилированного полноразмерного Tau-белка, а также фосфорилированных и нефосфорилированных антигенных Tau-пептидов, используемых при получении вакцины. Скрининг гибридом также проводили по реактивности супернатанта гибридом в отношении Tau клубков, используя иммунохимию на срезах мозга Tau трансгенных мышей.
1.1 Методы
1.1.1 Слияние
6
Для получения гибридомы использовали мышь C57BL/6 дикого типа, вакцинированную ACI-33 (Tau5-20 [pY18]). Мышь иммунизировали вакциной ACI-33 в день 0, затем повторно в день 4, и в день 7 проводили слияние. 173×10 (ACI-33) спленоцитов от иммунизированной мыши сливали с клетками миеломы SP2-O-Ag14 в соотношении 5 спленоцитов/1 клетка миеломы.
7
7
Для получения гибридомы использовали мышь C57BL/6 дикого типа, вакцинированную ACI-35 (Tau393-408 [pS396, pS404]). Мышь иммунизировали вакциной ACI-35 в день 0, затем повторно в день 4, и проводили слияние в день 6×10 (ACI-35) спленоцитов от иммунизированной мыши сливали с 2×10 клеток миеломы SP2-O-Ag14 в соотношении 3 спленоцита/1 клетка миеломы.
6
Для получения гибридомы использовали мышь C57BL/6 дикого типа, вакцинированную ACI-36 (Tau401-418 [pS404/S409]). Мышь иммунизировали вакциной ACI-36 в день 0, затем повторно в день 4, и в день 7 проводили слияние. 84×10 спленоцитов от иммунизированной мыши сливали с клетками миеломы SP2-O-Ag14 в соотношении 5 спленоцитов/1 клетка миеломы.
6
Для получения гибридомы использовали мышь C57BL/6 дикого типа, вакцинированную ACI-41 (смесь Tau206-221 [pT212/pS214] и Tau196-211 [pS202/pT205]). Мышь иммунизировали вакциной ACI-41 в день 0, затем повторно в день 4, и в день 8 проводили слияние. 162×10 спленоцитов от иммунизированной мыши сливали с клетками миеломы SP2-O-Ag14 в соотношении 5 спленоцитов/1 клетка миеломы.
Указанные четыре слияния дали 8×96-луночных планшета, и клоны называли в соответствии с номером планшета (1-8), а затем ряда (A-G) и, наконец, колонки (1-12).
1.1.2 Способ скрининга для отбора клонов
8×96-луночных планшета сначала дважды подвергали скринингу на экспрессию IgG. Положительные экспрессирующие клоны затем переносили в 24-луночные планшеты, и супернатанты культур (=клонов) растущих клеток тестировали в Tau ELISA скрининге и иммуногистохимическом скрининге TAUPIR. Супернатанты, положительные согласно ELISA и/или TAUPIR, переносили во флаконы T25 и клоны снова скринировали на экспрессию IgG в Tau ELISA ELISA и TAUPIR скрининге.
1.1.3 Скрининг IgG
Планшеты Elisa покрывали 50 мкл/лунка антителом против мышиного IgG (CER Groupe, Marloie, Belgium) в буфере для нанесения в течение 16 часов при 4ºC. После промывки планшетов PBS/Tween, наносили 100 мкл/лунка блокирующего раствора на 1 ч при КТ. 50 мкл неразведенного супернатанта гибридомы инкубировали в течение 1 ч при КТ. После этапа промывки смесь конъюгата с пероксидазой хрена (HRP) против мышиных IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3 (Ab Serotec, Raleigh, NC, USA) наносили на планшеты на 1 ч при КТ. После окончательной промывки проводили детектирование с использованием TMB (3,3',5,5'-тетраметилбензидина), фосфатазного субстрата для HRP, и планшеты сканировали при 405 нм, используя ридер для микропланшетов ELISA. Результаты выражены как O.D. (оптическая плотность).
1.1.4 Tau ELISA скрининг гибридом
ELISA скрининг гибридом проводили по pTau-пептиду (ACI-33, T1.5: Tau5-20 [pY18]; ACI-35, T3.5: Tau393-408 [pS396/pS404]; ACI-36, T4.5: Tau401-418 [pS404/S409]; ACI-41, T8.5: Tau206-221 [pT212/pS214] и T9.5: Tau196-211 [pS202/pT205] PolyPeptide Laboratories, Hilierød, Denmark), соответствующему Tau-пептиду (ACI-33, T1.6: Tau5-20; ACI-36, T4.6: Tau401-4; ACI-41, T8.6: Tau206-221 и T9.6: Tau196-211, PolyPeptide Laboratories, Hilierød, Denmark), фосфорилированному полноразмерному (441 ак) Tau-белку (pTau белок, Vandebroek et al., 2005) и полноразмерному (441 ак) Tau-белку (Tau-белок, SignalChem, Richmond, Canada). В завершение бычий сывороточный альбумин (BSA) использовали в качестве отрицательного контроля.
Планшеты покрывали 10 мкг/мл соответствующего Tau-пептида и 1 мкг/мл соответствующего Tau-белка в течение ночи при 4°C. После промывки каждой лунки PBS-0,05% Tween 20 и блокирования 1% BSA в PBS-0,05% Tween 20, неразведенный супернатант гибридомы или отрицательный контроль (среда) добавляли в планшеты и инкубировали при 37ºC в течение 2 часов. После промывки планшеты инкубировали с конъюгированным со щелочной фосфатазой (AP) антителом против общего мышиного IgG (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) в течение 2 часов при 37°C. После промывки планшеты инкубировали с pNPP (пара-нитрофенилфосфатом), фосфатазным субстратом для AP, и сканировали при 405 нм, используя ридер для микропланшетов ELISA. Результаты выражены как O.D. (оптическая плотность).
1.1.5 IHC скрининг гибридом: Связывание антител против Tau с клубками в срезах мозга трансгенных мышей (TAUPIR)
Эксперименты TAUPIR проводили согласно методике из ПРИМЕРА 3.1.2.
1.1.6 Скрининг IgG во флаконах T25
2
Планшеты Elisa покрывали 5 мкг/мл специфичного антитела против F(ab') фрагмента мышиного IgG (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) в карбонат-бикарбонатном буфера для нанесения, pH 9,6 (Sigma, Buchs, Switzerland) в течение ночи при 4°C. После промывки планшетов, неразведенный супернатант гибридом, антитело IgG1 для положительного контроля (6E10 при 1 мкг/мл: Covance, Emeryville, CA, USA) или отрицательный контроль (чистая среда для культивирования) инкубировали в течение 1 ч при КТ. После этапа промывки вторичное AP-конъюгированное специфичное антитело козы против Fcγ-фрагмента мышиного IgG (субклассы 1+2a+2b+3) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, USA) инкубировали в планшетах в течение 2 ч при 37°C. После окончательной промывки детектирование выполняли с pNPP (пара-нитрофенилфосфатом), фосфатазным субстратом для AP, и сканировали планшеты при 405 нм, используя ридер для микропланшетов ELISA. Результаты выражены как O.D. (оптическая плотность).
1.2 Результаты
1.2.1 Гибридомы ACI-33
Клеточные супернатанты из 8×96-луночные планшеты, полученные в результате слияния, подвергали скринингу на предмет продукции IgG. Из протестированных 768 лунок (8×96 лунок) 277 лунок были положительными по экспрессии IgG и их переносили в 24-луночные планшеты. В 24-луночных планшетах росли 79 клонов, супернатанты этих клеток анализировали. Положительные клоны затем переносили во флаконы T25 и супернатанты подвергали скринингу на предмет продукции IgG, ELISA и TAUPIR (Таблица 2).
Клон 6C10 оказался единственным положительным в 3 скринингах и был выбран для субклонирования.
1.2.2 Гибридомы ACI-36
Клеточные супернатанты из 8×96-луночных планшетов, полученные в результате слияния, подвергали скринингу на предмет продукции IgG. Из протестированных 768 лунок (8×96 лунок) 333 лунки были положительными по экспрессии IgG и их переносили в 24-луночные планшеты. В 24-луночных планшетах росли 75 клонов, супернатанты этих клеток анализировали. Положительные клоны затем переносили во флаконы T25 и супернатанты подвергали скринингу на предмет продукции IgG, ELISA и TAUPIR (Таблица 3).
Для отбора клонов в следующих этапах, выполняли ранжирование всех супернатантов положительных скринов IgG/ELISA/TAUPIR по результатам TAUPIR и ELISA. Ранжирование результатов ELISA и TAUPIR выполняли, как описано в разделе методы. Окрашивание TAUPIR было почти идентичным для пяти первых клонов, и это соответствовало результатам ELISA. 4C12 отбросили, поскольку его обнаружили в том же планшете, что и 4C1, что увеличивало вероятность того, что 2 клона являются одинаковыми (узнают один и тот же эпитоп). Лучшими отобранными 4 клонами были 3A8, 2B6, 4C1 и 6H1. Другие 6 клонов (4C12, 2G1, 2F9, 7D6, 3B9, 4E12) были сохранены в качестве резерва.
Ранжирование 10 клонов, которые оказались положительными в скрининге ELISA и TAUPIR, проводили для отбора лучших клонов (Таблица 4). Серым выделены лучшие 5 клонов.
1.2.3 Гибридомы ACI-41
Клеточные супернатанты из 8×96-луночных планшетов, полученные в результате слияния, подвергали скринингу на предмет продукции IgG. Из протестированных 768 лунок (8×96 лунок) 215 лунок были положительными по экспрессии IgG и их переносили в 24-луночные планшеты. В 24-луночных планшетах рос 81 клон, супернатанты этих клеток анализировали. Положительные клоны затем переносили во флаконы T25 и супернатанты подвергали скринингу на предмет продукции IgG, ELISA и TAUPIR (Таблица 5).
Клоны 5D10 и 7C2 оказались единственными положительными в 3 скринингах и были выбраны для субклонирования. Клон 5D10 связывает только пептид T8.5, тогда как клон 7C2 связывается с двумя пептидами вакцины ACI-41 (T8.5 и T9.5) (см. Фигуру 10 в PCT заявке PCT/EP2010/054418).
Субклон 5D10A4, полученный из 5D10, был специфичен к pTau-пептиду.
1.3. Заключение
Полученные антитела показали высокую специфичность в отношении pTau-пептидов лишь с предельно низким связыванием с нефосфорилированными пептидами.
Из указанных 4 слияний (ACI-33, ACI-36, ACI-35 и ACI-41), в общей сложности 16 клонов депонировали в DSMZ (Таблица 1) и выбрали для последующего субклонирования.
Указанные выше положительные исходные клоны культивировали далее в 96-луночных планшетах, затем в 24-луночных планшетах и, наконец, во флаконах T25. На каждой стадии супернатанты клонов гибридом подвергали скринингу с помощью ELISA, TAUPIR и Вестерн-блоттинга.
ПРИМЕР 2: Клонирование вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи антитела
Гены вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи антитела из клеток гибридом клонировали и определяли последовательности ДНК и положение гипервариабельных областей (CDR), а также связывающие свойства антител.
6
Суммарную РНК выделяли из 3×10 клеток гибридомы (1 флакон) с использованием набора Qiagen RNeasy mini kit (номер по кат.: 74104). РНК элюировали в 50 мл воды и анализировали на 1,2% агарозном геле.
H
K
H
K

V и V кДНК получали с использованием обратной транскриптазы с праймерами к IgG и каппа константной области. Первую цепь кДНК амплифицировали с помощью ПЦР с использованием большого набора праймеров к сигнальной последовательности. Амплифицированные ДНК очищали в геле и клонировали в вектор pGemT Easy (Promega). Полученные V и V клоны скринировали на наличие вставок ожидаемого размера. Последовательность ДНК отобранных клонов определяли в обоих направлениях с помощью автоматизированного секвенирования ДНК. Положения гипервариабельных областей (CDR) в последовательностях определяли по отношению к другим последовательностям антитела (Kabat EA et al., 1991).
ПРИМЕР 3: Исследования связывания I
Задача состояла в том, чтобы измерить связывание фосфо-Tau (pTau) антител, продуцируемых субклонированными гибридомами, полученными из мышей, иммунизированных с Tau липосомными вакцинами. Чтобы проверить это, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) использовали для измерения связывания очищенных антител с фосфорилированным и с нефосфорилированным полноразмерным Tau-белком, а также с фосфорилированными и нефосфорилированными антигенными Tau-пептидами, используемыми для получения липосомных вакцин.
Скрининг выполняли с помощью двух других методов. Делали иммуногистохимию (IHC) на срезах мозга Tau трансгенного животного (TAUPIR) с использованием антитела против Tau в качестве первичного антитела. Дополнительно, выполняли Вестерн-блот анализ (WB) белковых гомогенатов мозга Tau трансгенных мышей, используя антитело против Tau в качестве детектирующего антитела.
3.1 Методы
3.1.1 Анализ связывания фосфо-Tau
Антитела против фосфо-Tau (мышиные, изотип IgG3) получали в мышах, вакцинированных липосомной Tau вакциной. Липосомные вакцины представляли собой фосфорилированные препараты фосфо-Tau (pTau) пептида. Субклоны гибридом, продуцирующие антитела против Tau, отбирали методом серийного разведения из исходных клонов. Изотипирование выполняли, чтобы показать присутствие клона одного изотипа. Антитела получали в роллер-флаконах, очищали с помощью аффинной хроматографии, стерилизовали фильтрованием через 0,22 мкм фильтры и определяли количество. Для проверки связывания антитела с Tau и pTau использовали анализ ELISA. Вкратце, 96-луночные планшеты Nunc MaxiSorp (Nunc, Roskilde, Denmark) покрывали 1 мкг/мл полноразмерного (441 ак) Tau-белка (SignalChem, Richmond, Canada) или фосфорилированного полноразмерного (441 ак) Tau-белка (Vandebroek et al., 2005). Дополнительно, планшеты покрывали 10 мкг/мл Tau-производного пептида. Для анализа перекрестной реактивности с последовательностями Tau и pTau, которые не использовались при получении вакцины, планшеты покрывали 10 мкг/мл следующих пептидов: Tau5-20 (фосфорилированный или нет по Y18), Tau393-408 (фосфорилированный или нет по S396 и S404), Tau401-418 (фосфорилированный или нет по S404 и S409), Tau206-221 (фосфорилированный или нет по T212 и S214), и Tau196-211 (фосфорилированный или нет по S202 и T205). Покрытие проводили в течение ночи в фосфатно-солевом буфере (PBS) при 4°C. Планшеты тщательно промывали 0,5% Tween20/PBS, а затем блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в 0,5% Tween20/PBS в течение 1 ч при 37°C. Затем тестируемое антитело добавляли в 8 или 16 двукратных серийных разведений от 20 до 0 мкг/мл и оставляли на 2 ч при 37°C. Затем планшеты промывали, как описано ранее, и добавляли AP-конъюгированное вторичное антитело против мышиного IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Suffolk, England) в разведении 1/6000 в 0,5% Tween20/PBS на 2 ч при 37°C. После промывки планшеты инкубировали с раствором фосфатазного субстрата, гексагидрата п-нитрофенилфосфата динатрия (pNPP; Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland), и сканировали при 405 нм после 2 или 16 ч инкубирования, используя ридер для микропланшетов ELISA. Результаты выражены как оптическая плотность (O.D.).
3.1.2 Связывание антитела против Tau с Tau-клубками в срезах мозга Tau трансгенного животного (TAUPIR)
2
2
2
2
Используемые срезы мозга получали от старых (возрастом >18 месяцев) двойных трансгенных biGT (трансгенные мыши GSK-3β, скрещенные с мышами TPLH, содержащие наиболее длинную изоформу (441 ак) человеческого Tau с мутацией P301L) мышей. Дополнительно также использовали срезы мышей с нокаутом Tau (TKO; 6 месяцев). Срезы мозга промывали в течение 5 минут в PBS, затем инкубировали в течение 15 минут при КТ в 1,5% HO в PBS:MeOH (1:1) для блокирования активности эндогенной пероксидазы. После промывки срезов 3 раза в PBST (PBS/0,1% Triton X100), их инкубировали в течение 30 минут при КТ в PBST+10% FCS (эмбриональная сыворотка теленка) блокирующем растворе. Инкубирование с тестируемым антителом против Tau проводили в течение ночи при 4°C при указанных разведениях в PBST/10% FCS. Затем срезы промывали 3 раза в PBST перед инкубированием с HRP-конъюгированным козьим антимышиным (полученным от Dako, Glostrup, Denmark) вторичным антителом в PBST/10% FCS в течение 1 часа при КТ. Перед детектированием срезы 3 раза промывали PBST и инкубировали в 50 мМ Трис/HCl, pH7,6, в течение 5 мин. Детектирование проводили при инкубировании срезов в течение 3 минут в диаминобензидине (DAB: 1 таблетка в 10 мл 50 мМ Трис HCl + 3 мкл 30% HO; MP Biomedicals, Solon, OH, USA). Реакцию останавливали с помощью промывки срезов 3 раза в PBST. Затем срезы переносили на силанизированные стеклянные чашки и сушили воздухом на теплой плитке при 50°C в течение 2 часов. Контрастное окрашивание выполняли при инкубировании с гематоксилином Майера (Fluka Chemie, Buchs, Switzerland) в течение 1 минуты, с последующей стадией промывки в течение 4 минут в проточной водопроводной воде. Срезы дегидратировали при погружении в ванну с 50%, 70%, 90% и дважды со 100% этанолом, а затем в ксилол 2 раза на 1 мин. В завершение срезы заключали в среду DePeX (BDH Chemicals Ltd., Poole, England) под покровными стеклами.
Дополнительно, супернатанты гибридом при разведении 1/10 (все полученные с ACI-35 антителом, показанные в Таблице 1) использовали для блоттинга мембран, содержащих белки гомогената мозга, разделенные с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, Tau трансгенных мышей, мышей дикого типа или Tau нокаутных мышей.
3.1.3. Связывание антитела против Tau с Tau клубками в срезах мозга пациентов с БА и таупатией (TAUPIR)
2
2
2
2
Анализ иммунной реакции антитела против pTau ACI-36-3A8-Ab1 с pTau в мозге человека проводили с помощью TAUPIR. Срезы мозга в парафине депарафинировали при погружении в ксилол 2 раза на 5 мин и 2 раза на 1 мин в 100% EtOH, с последующей промывкой в течение 1 мин в 90%, 70% и 50% EtOH и дистиллированной воде, а затем 2-кратной промывкой в течение 5 мин в PBS. Для демаскирования антигенов, срезы обрабатывали при нагревании в течение 10 минут в 0,01 М растворе лимонной кислоты в воде (pH 6,0) и охлаждали 20 мин. Срезы инкубировали в течение 15 мин при КТ в 1,5% HO в PBS:MeOH (1:1) для блокирования активности эндогенной пероксидазы. После промывки срезов 3 раза в PBST (PBS/0,05% Tween-20), их инкубировали в течение 30 мин при КТ в PBST + 10% эмбриональной сыворотки теленка (FCS) в качестве блокирующего раствора. Инкубирование с первичным антителом ACI-36-3A8-Ab1 против pTau (410 нг/мл в блокирующем буфере) проводили в течение ночи при 4°C. Затем срезы промывали 3 раза в PBST перед инкубированием с HRP-конъюгированным антимышиным вторичным антителом козы (Dako, Glostrup, Denmark), разведенным 1/500 в PBST/10% FCS, в течение 1 часа при КТ. Перед детектированием срезы промывали 3 раза PBS и инкубировали 5 мин в 50 мМ Трис/HCl, pH 7,6. Детектирование проводили при инкубировании срезов в течение 3 мин в диаминобензидине (DAB: 1 таблетка в 10 мл 50 мМ Трис-HCl + 3 мкл 30% HO; MP Biomedicals, Solon, OH, USA). Реакцию останавливали путем промывки срезов 3 раза в PBS. Контрастное окрашивание выполняли при инкубировании с гематоксилином Майера (Fluka Chemie, Buchs, Switzerland) в течение 1 мин, с последующей промывкой в течение 4 мин в проточной водопроводной воде. Срезы дегидратировали при погружении в ванну с 50%, 70%, 90% и дважды со 100% этанолом, а затем в ксилол 2 раза на 1 мин.
В завершение срезы заключали в DePeX (BDH Chemicals Ltd., Poole, England) под покровные стекла. Окрашенные срезы исследовали с помощью оптической микроскопии и получали цифровые изображения с помощью камеры 3CCD (Leica, Wetzlar, Germany). Изображения регистрировали и анализировали с помощью специализированной программы (IM500, Leica). Изображения показаны при увеличении 20×1,6.
3.1.4. Вестерн-блоттинг (WB)
3
4
4
2
7
Связывание тестируемого антитела с pTau в экстракте мозга трансгенного животного проводили с помощью WB. Гомогенизацию мозга мышей дикого типа FVB, TPLH, biGT и TKO выполняли в следующем буфере: 25 мМ Трис/HCl pH7,6, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 30 мМ NaF, 0,2 мМ NaVO, 1 нМ окадаиковой кислоты, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), 5 мМ NaPO, 1 таблетка смеси ингибиторов протеаз (CPIC) в полном объеме 12 мл. Для получения полного гомогената мозга, мозг гомогенизировали на льду в 1 объеме/массу полушария (мл/г) с помощью гомогенизатора с электроприводом (по типу гомогенизатора Поттера) в стеклянной пробирке с тефлоновым пестиком при 700 об/мин. Полные гомогенаты мозга разбавляли на половину 1 объемом буфера для образцов (125 мМ Трис/HCl pH 6,8, 4% (в/об) додецилсульфата натрия (ДСН), 20% глицерина, 0,01% бромфенолового синего и 5% бета-меркапто-этанола), затем быстро нагревали до 95°C. Образцы выдерживали 5 мин, разбавляли ¼ в буфере для образцов, снова нагревали до 95°C и затем охлаждали и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 5 минут для удаления нерастворенного дебриса. Супернатанты отбирали и наносили на ДСН-ПААГ гель. Перенос на нитроцеллюлозную мембрану (Hybond-ECL) выполняли в буфере для переноса (25 мМ Трис, pH 8,6, 190 мМ глицина, 20% метанола). Мембраны переносили в блокирующий раствор (0,1% Tween в TBS (50 мМ Трис HCl, pH 7,6, 150 мМ NaCl и 5% сухого молока) перед ночным инкубированием при 4°C с тестируемым антителом, разведенным в блокирующем растворе. Инкубирование с вторичным HRP-конъюгированным антимышиным антителом козы (Dako, Glostrup, Denmark), разведенным 1/10000 в блокирующем растворе, проводили при КТ в течение 1 часа. Детектирование выполняли с использованием реактивов ECL Western Blotting Detection Reagents производства GE Healthcare.
3.2 Результаты
3.2.1 Анализы ELISA и TAUPIR с использованием срезов мозга Tau трансгенных мышей, имеющих клубки
Оценивали связывание антител с фосфорилированным Tau-пептидом, используемым в качестве иммуногена, и с фосфорилированным полноразмерным Tau-белком человека. Это - наиболее длинная изоформа Tau-белка человека, состоящая из 441 аминокислоты. Также были включены соответствующий нефосфорилированный пептид и полноразмерный Tau-белок человека. Как указано в Таблице 6, антитела демонстрировали сильное связывание с фосфорилированным Tau-пептидом при наличии лишь ограниченного или при отсутствии связывания с фосфорилированным полноразмерным Tau-белком человека. Связывания с соответствующим нефосфорилированным Tau-пептидом или с нефосфорилированным полноразмерным Tau-белком человека не наблюдали. Это демонстрирует сильное связывание антител против Tau с фосфорилированными Tau-пептидами человека.
Для анализа неспецифичного связывания с другими последовательностями фосфорилированного и нефосфорилированного Tau, антитело тестировали на связывание с пятью фосфо и нефосфо Tau-пептидами, один из которых использовали в качестве последовательности антигенного пептида. Какой-либо перекрестной реактивности в отношении фосфо или нефосфо Tau-пептидов, кроме пептида, используемого в вакцине, не наблюдали, даже при высоких концентрациях пептида.
Связывание антител против Tau с pTau в мозге трансгенных мышей Tau оценивали с помощью TAUPIR окрашивания (Фигура 1) и WB (Фигура 1). Антитела демонстрировали связывание с Tau клубками и нейропильными нитями, присутствующими в коре и гиппокампе мозга Tau трансгенных (biGT) мышей. Разведения антитела, используемые для TAUPIR, изменялись в пределах от 0,05 до 0,0033 мкг/мл. Антитела к Tau также использовали в качестве первичного антитела в WB, используя полные гомогенаты мозга мышей дикого типа FVB, TPLH, biGT и TKO, которые разделяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ. В качестве контрольных использовали два коммерческих антитела против pTau, MC1 и Tau5. Все антитела против Tau связывались с pTau, присутствующим в мозге Tau трансгенных мышей.
Блоттинг
На мембранах, содержащих разделенные с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, белковые гомогенаты Tau трансгенных мышей, мышей дикого типа и Tau нокаутных мышей, все антитела ACI-35 (раскрытые в Таблице 1), связывались c полосами белка, имеющими идентичную электрофоретическую подвижность, 46 кДа, как Tau и pTau (данные не показаны).
3.2.2 Анализ TAUPIR на срезах мозга пациентов с БА и таупатией
Способность антитела ACI-36-3A8-Ab1 связываться с Tau-агрегатами, содержащимися в срезах человеческого мозга субъектов с диагностированными таупатиями, включая БА, СБА, AGD, FTDP-17, CBD и PSP, исследовали с помощью иммуногистохимии TAUPIR (Фигура 2). Антитело против pTau ACI-36-3A8-Ab1 связывалось с содержащими pTau нейрофибриллярными клубками (NFT), нейропильными нитями в срезах мозга человека и другими формами pTau, присутствующими в нейронах и в глиальных клетках. Более конкретно, ACI-36-3A8-Ab1 четко окрашивало NFT, нейропильные нити и дистрофические аксоны, окружающие амилоидные бляшки в БА мозге, что было легко заметно у субъектов с диагнозом БА и СБА. В срезах мозга при AGD, ACI-36-3A8-Ab1 окрашивало и NFT, и нейропильные нити, при этом четко наблюдались множественные аргирофильные зерна/гранулы (Фигура 2). Окрашивание срезов мозга при PSP антителом ACI-36-3A8-Ab1 показало NFT, нейропильные нити и дистрофические аксоны. Дополнительно, были хорошо заметны включения наподобие телец Пика и пучковые pTau-положительные астроциты, являющиеся характерным признаком при PSP, когда окрашивание pTau распространяется на всю клетку, охватывая дистальные процессы. При FTDP-17, характер окрашивания также иллюстрировал известную гетерогенность заболевания, с детектированием не только NFT, но и ахроматических "баллонных" нейронов. Антитело ACI-36-3A8-Ab1 также окрашивало раздутые ахроматические нейроны, которые были слабо Tau-положительными, что является главной особенностью CBD. Другую заметную патологическую особенность CBD, то есть олигодендроглиальные включения, называемые спиральными тельцами, также хорошо обнаруживало антитело ACI-36-3A8-Ab1. Окрашивания не обнаруживали у AT8-отрицательного контрольного субъекта, тогда как у AT8-положительного контрольного субъекта идентифицировали слабое окрашивание.
При использовании TAUPIR на срезах человеческого мозга субъектов, у которых ранее диагностировали различные формы таупатии, антитело против pTau ACI-36-3A8-Ab1 демонстрировало хорошее связывание с различными известными pTau-богатыми патологическими структурами, присутствующими в мозге указанных субъектов.
ПРИМЕР 4: Исследование связывания II
Цель исследования состояла в определении аффинности связывания между антителами против Tau и фосфо-Tau пептидом с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Фосфо-Tau пептид соответствует пептидной последовательности, используемой в препарате вакцины для получения антитела против Tau. Для изучения этого взаимодействия, фосфопептиды иммобилизировали на поверхности сенсорного чипа, и отслеживали связывание в режиме реального времени с использованием SPR при пропускании антитела над чипом.
4.1 Методы
4.1.1 SPR анализ связывания
Все эксперименты SPR выполняли на приборе Biacore X (GE Healthcare). Реактивы для иммобилизации (EDC, NHS и этаноламин), сенсорный чип CMS (карбоксиметилдекстран), а также рабочий буфер HBS-EP приобретали у GE Healthcare. Фосфо-Tau пептид солюбилизировали в PBS/натрий ацетатном буфере (10 мМ, pH 5,0) в соотношении 1:1 (об/об), с получением конечной концентрации пептида 250 мкг/мл. Данный раствор пептида затем сшивали на проточной ячейке (fc) 2 сенсорного чипа CM5, который предварительно активировали, используя EDC/NHS. После сшивания этаноламин пропускали над поверхностью с получением конечного уровня иммобилизации 218 RU (условных единиц). Пять концентраций антител против Tau анализировали с последовательным разведением, используя рабочий буфер. Инъекции выполняли, начиная с самой низкой концентрации, и пропускали над fc 1 и 2 при расходе 30 мкл/мин в течение 180 с. Проточная ячейка 1 не была дериватизирована и ее сигнал вычитали из сигнала fc 2 для внесения поправки на шум прибора и изменение полного отражения. После завершения инъекции, поверхности сразу промывали рабочим буфером в течение 300 с. Для удаления оставшегося связанного антитела с чипа выполняли регенерацию поверхности при помощи импульсного введения (типично 3 мкл) 8 мМ NaOH в воде, содержащей 1 М NaCl. Кинетический анализ выполняли при использовании алгоритмов числовой интеграции и глобального анализа, используя BIAevaluation 3.0. Сенсограммы, полученные для инъекций антитела при различных концентрациях, подвергали наложению, и базовые линии приводили к нулю. Для аппроксимации кривой, все данные приводили одновременно к гомогенной модели 1:1 (Ленгмюра).
В альтернативе, иммобилизованный биотинилированный пептид T3 (T3.30) иммобилизировали на чипе Streptavidin Biacore SA (GE Healthcare) с использованием прибора Biacore X. Антитела разводили в HBS-EP рабочем буфере (GE Healthcare) и вводили при 50 мкл/мин в течение 120 сек с последующей диссоциацией в течение 100 сек. Регенерацию поверхности проводили с использованием импульса (1-3 мкл) 16 мМ NaOH. Аппроксимацию выполняли, используя BIAevaluation и принимая связывающее взаимодействие согласно 1:1 Ленгмюра.
Используемые пептиды
Т1.5
H-K(Ac)K(Ac)-RQEFEVMEDHAGTY[PO3H2]GL-K(Ac)K(Ac)-NH2
партия AW11309D
Т4.5
H-K(Ac)K(Ac)-GDTS[PO3H2]PRHLS[PO3H2]NVSSTGSID-K(Ac)K(Ac)-NH2
партия CF09168
Т3.30
Биотин-LC линкер-GVYKS[P03H2]PWSGDTS[PO3H2]PRHL-NH2
партия MI89P9-P12-2
4.2 Результаты
a
d
D
D
5
-1
-1
-3
-1
Связывание антител против Tau с фосфорилированным Tau-пептидом отслеживали в режиме реального времени, используя SPR. Анализы фаз ассоциации и диссоциации связывания антитела можно было использовать для определения константы скорости ассоциации (k), константы скорости диссоциации (k), а также константы диссоциации K. Антитело ACI-33-6C10-Ab1 специфично связывается с пептидом T1.5 на поверхности недериватизированного карбоксиметилдекстрана в пределах 3,7 → 367 нМ антитела. Кинетические анализы сенсограммы выявили высокую константу скорости ассоциации 9,46 × 10 Мс и константу скорости диссоциации 3,27 × 10 с (Таблица 7). Константа диссоциации K в результате составила 3,46 нМ, указывая на то, что антитело узнает фосфопептид T1.5 с очень высокой аффинностью. Все протестированные антитела показали высокую аффинность в отношении своих соответствующих фосфопептидов, используемых для иммунизации и получения гибридом, но при этом они продемонстрировали низкую аффинность в отношении нефосфо-пептидов.
ПРИМЕР 5: Картирование эпитопов антител против pTau
5.1 Методы
Картирование эпитопов мышиных моноклональных антител против фосфо Tau выполняли с помощью ELISA при использовании различных фосфо- и нефосфо-пептидных библиотек. Аминокислотные последовательности используемых пептидных библиотек показаны в Таблице 8. Каждая библиотека состояла из коротких биотинилированных пептидов, охватывающих фосфо- и нефосфо-последовательности, присутствующие в пептидной вакцине. Пептидные библиотеки приобретали у ANAWA Trading SA. Картирование эпитопов выполняли согласно инструкциям производителя (Mimotopes). Вкратце, покрытые стрептавидином планшеты (NUNC) блокировали 0,1% BSA в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение ночи при 4°C. После промывки PBS-0,05% Tween 20, планшеты покрывали в течение 1 ч при КТ различными пептидами из каждой библиотеки, разведенными в 0,1% BSA, 0,1% азида натрия в PBS до конечной концентрации 10 мкΜ. После промывки планшеты инкубировали в течение 1 ч при КТ с тестируемым антителом, разведенным до 40 нг/мл в 2% BSA и 0,1% азида натрия в PBS. Планшеты снова промывали и инкубировали с AP-конъюгированным вторичным антителом против мышиного IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Suffolk, England) в разведении 1/6000 в течение 1 ч при КТ. После окончательной промывки планшеты инкубировали с раствором гексагидрата п-нитрофенилфосфата динатрия (pNPP; Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland), фосфатазным субстратом, и сканировали при 405 нм после 2 ч инкубирования, используя ридер для микропланшетов ELISA. Связывание считали положительным, если оптическая плотность (O.D.) была по меньшей мере в 2 раза выше фоновой O.D.
5.2 Результаты
В результате экспериментов картирования эпитопов, можно было идентифицировать эпитопы, включающие необходимый фосфорилированный аминокислотный остаток (см. Таблицу 9), с которым специфично связывались антитела, раскрытые в настоящей заявке.
- Tau а/к 15-20, с необходимостью присутствия pY18 (6C10F9C12A11; 6C10E5E9C12)
- Tau а/к 405-412, с необходимостью присутствия pS409 (6H 1A11 C11; 6H1G6E6)
- Tau а/к 405-411, с необходимостью присутствия pS409 (2B6A10C11; 2B6G7A12; 3A8A12G7; 3A8E12H8)
- Tau а/к 208-218, с необходимостью присутствия pT212 и pS214 (7C2(1)F10C10D3)
- Tau а/к 393-401, с необходимостью присутствия pS396 (A4-2A1-18; A4-2A1-40)
- Tau а/к 396-401, с необходимостью присутствия pS396 (A4-4A6-18)
- Tau а/к 394-400, с необходимостью присутствия pS396 (A6-1D2-12)
- Tau а/к 402-406, с необходимостью присутствия pS404 (A6-2G5-08)
- Tau а/к 393-400, с необходимостью присутствия p396 (A6-2G5-30; A6-2G5-41)
ПРИМЕР 6: Пассивная иммунизация Tau трансгенных мышей в течение 1 недели
6.1. Методы
Во всех in vivo исследованиях использовали Tau трансгенных мышей и вводили терапевтические антитела, показанные в Таблице ниже.
Трансгенные мыши и антитела, используемые в in vivo исследованиях
Исследование
Tau трансгенная модель
Возраст мышей на начало исследований(месяцы)
Продолжительность исследования (недели)
Вводимые антитела
Дозы (мг/кг)
Кол-вов/бвведений
Получение результатов
1
TMHT(hTau<sup>V337M/R406W</sup>)
6,3
1
ACI-36-2B6-Ab1
0*, 3 или 10
2
MSD, IHC, WB
ACI-36-3A8-Ab1
0 или 3
2
TMHT(hTau<sup>V337M/R406W</sup>)
4,2
4
ACI-36-2B6-Ab1илиACI-36-3A8-Ab1
0, 1 или 3
4
MSD,IHC, WB,MWM
3
TMHT (hTau<sup>V337M/R406W</sup>)
3,0
12
ACI-36-2B6-Ab1илиACI-36-3A8-Ab1
0, 1 или 3
13
MSD,IHC, WB,MWM
4
biGT(hTau<sup>P301L</sup>×hGSK3β)
4,5
12
ACI-36-2B6-Ab1илиACI-36-3A8-Ab1
0, 1 или 3
13
WB
*контроль во всех исследованиях - среда; внутрибрюшинно (в/б)
6.1.1 Мыши и обработки
Самки и самцы Tg мышей возрастом 6,3 месяцев (±3 дня), оверэкспрессирующие человеческий полноразмерный Tau-белок изоформы TAU441, несущий миссенс-мутации V337M и R406W, под контролем мышиного промотора Thy-1 (мыши TMHT), использовались в Исследовании 1 (см. Таблицу выше). Через 1 день после последнего введения мышей усыпляли с целью определения TAU патологии в мозге.
6.1.2 Идентификация животных и их содержание

В процессе среза кончика хвоста для генотипирования, животных последовательно нумеровали путем классического мечения уха. Всех животных повторно генотипировали перед началом исследования. Мышей содержали согласно Стандартным рабочим процедурам JSW, основанным на международных стандартах. Животных содержали в индивидуальных проветриваемых клетках на стандартных подстилках для грызунов, поставляемых Rettenmaier. Температуру поддерживали на уровне приблизительно 24°C, а относительную влажность поддерживали в пределах 40-70%. Животных содержали в условиях постоянного светового цикла (12 часов света/темноты). Сухой, гранулированный стандартный корм для грызунов (Altromin) и обычная водопроводная вода были доступны для животных без ограничения. Каждое отдельное животное регулярно обследовали на предмет любых клинических признаков, которые отмечали в индивидуальной карте животного.
6.1.3 Забор крови in vivo
За семь дней до первой иммунизации забор крови in vivo выполняли посредством нижнечелюстного прокола из лицевой вены/артерии. Образцы крови являлись смесью венозной и артериальной крови. Для получения плазмы кровь собирали в пробирки с гепарином и центрифугировали (1000×g, 10 минут, комнатная температура). Плазму замораживали в двух аликвотах до использования.
6.1.4. Иммуногистохимический (IHC) количественный анализ
Анализировали все крио-замороженные полушария мозга. Делали 15 сагиттальных крио-срезов на уровень (в целом 5 уровней) толщиной по 10 мкм (3050S СМ Leica). Уровни мозга выбирали согласно анатомическому атласу "Мозг мыши" (The Mouse Brain, Paxinos and Franklin, 2-е издание). Нарезку пяти уровней начинали со случайного среза, затем материал продолжали забирать равномерно и систематически, всегда сохраняя 15 срезов каждого уровня последовательно и отбрасывая по 150 мкм между уровнями. Для определения TAU патологии в гиппокампе и миндалевидном теле по 5 срезов (1 из каждого уровня) каждой области мозга и каждого животного окрашивали с использованием антител AT180 (# MN1040, Thermo Scientific) и HT7 (# MN1000, Thermo Scientific). Первичные антитела визуализировали вторичным Cy-3-конъюгированным антителом (Jackson Laboratories) и затем иммунореактивную область оценивали с использованием программы Image Pro Plus (v6.2).
2
2
Иммунореактивные объекты измеряли при превышении ограничения по размеру (30 мкм в миндалевидном теле, 7 мкм в гиппокампе) и превышении порога динамической интенсивности. Полная площадь и интенсивность объектов, и индивидуальный порог вводились автоматически. В случае использования, динамический порог определяли как "средняя интенсивность в пределах AOI плюс фактор, умноженный на стандартное отклонение пиксельных интенсивностей в пределах AOI". В любом случае, значения должны были превышать минимальный установленный порог. Точные пороговые уровни приведены в Таблице ниже.
Пороги
Минимум
Динамический фактор
AT180 Миндалевидное тело
25
2
AT180 Гиппокамп
28
-
HT7 Миндалевидное тело
35
2
HT7 Гиппокамп
25
0,5
Размер области измеряли с помощью ручного выделения гиппокампа и миндалевидного тела. Данные по IR площади HT7 и AT180 нормализовали по размеру областей.
Все данные, относящиеся к IHC, с n>4 соответствовали Гауссовскому распределению согласно критерию нормальности Колмогорова-Смирнова и представлены как среднее +SEM. Для контрольной группы, состоящей из четырех животных, которым вводили только среду, то есть слишком мало для применения критерия нормальности, было принято Гауссовское распределение. Различия между группами вычисляли посредством параметрического однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), с последующим вычислением апостериорного критерия Ньюмена-Кейлса с использованием программы GraphPadPrism. Уровень альфа ошибки установили со значением 0,05.
TAU патологию мозга определяли в гиппокампе и миндалевидном теле с помощью иммуногистохимического (IHC) количественного анализа с использованием антител AT180 (против pTau) и HT7 (против Tau). Кроме того, эффекты обработки в отношении растворимых pTau и Tau в коре головного мозга и гиппокампе определяли в растворимой фракции гомогената, используя дуплексную технологию MesoScale Discovery (MSD) для анализа pTau и общего Tau.
Ни одно из антител, используемых в анализах IHC или MSD, не имело эпитопа, который перекрывался двумя терапевтическими антителами, используемыми в данном исследовании.
6.1.5. Получение фракции для количественного определения уровня растворимого Tau-белка в растворимых фракциях мозга Tg мышей
3
4
Мышей, обработанных согласно методу 6.1.1., усыпляли через 1 день после второго введения, для определения Tau патологии в мозге. Вкратце, растворимые образцы из коры одного полушария мозга гомогенизировали в 100-200 мкл холодного буфера для экстракции (25 мМ Трис-HCl, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 10 мМ β-глицерофосфата, 30 мМ NaF, 2 мМ NaVO, смесь ингибиторов протеаз и фосфатаз). Гомогенаты центрифугировали (74 200×g в течение 15 мин при 4°C) и супернатанты использовали для анализа растворимого Tau. Концентрацию суммарного белка в растворимых фракциях образцов коры определяли с помощью количественного BCA анализа белка (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA).
6.1.6. Анализ присутствия pTau с помощью Вестерн-блоттинга
Для исследования иммунореактивности в мозге мышей, которым вводили ACI-36-2B6-Ab2 и ACI-36-3A8-Ab2, в Вестерн-блот (WB) анализе использовали два антитела, которые, как сообщалось, связывают эпитопы pTau PHF (Greenberg et al., 1992; Reig et al., 1995; Hoffmann et al., 1997). Растворимые фракции из коры головного мозга растворяли, добавляя равный объем буфера для образцов (125 мМ Трис-HCl, pH 6,8, 4% [в/об] додецилсульфата натрия [ДСН], 20% глицерина, 0,01% бромфенолового синего, 5% β-меркаптоэтанола), и нагревали образцы до 95°C 10 мин. 30 мкг образца наносили на 4-12% Бис-Трис гель (Invitrogen, Basel, Switzerland) и проводили электрофорез в MOPS ДСН буфере (Invitrogen). Белки переносили на 0,45 мкм PVDF мембрану в буфере для переноса (25 мМ Трис, pH 8,6, 190 мМ глицина, 20% метанола). Для проверки переноса белка мембраны окрашивали Ponceau S в течение 5 минут, промывали и блокировали в течение 1 часа в блокирующем буфере (5% BSA в TBS [50 мМ Трис-HCl, pH 7,6, 150 мМ NaCl]). Мембраны окрашивали в течение ночи при 4°C первичными антителами в блокирующем буфере и 0,1% Tween. В WB анализах использовали следующие два первичных антитела, специфичных к pTau PHF: антитело к pS396 (эпитоп PHF-13; AbCam, Cambridge, UK; используемое в концентрации 3 мкг/мл), специфичное к фосфорилированному Ser396 (pS396) человеческого или мышиного pTau (Hoffmann et al., 1997), и AD2 (эпитоп PHF-1; BioRad, Reinach, Switzerland; используемое в концентрации 0,4 мкг/мл), специфичное к человеческому и мышиному pS396 и фосфорилированному Ser404 (pS404; Reig et al., 1995). Для WB анализов общего Tau использовали антитело Tau5 (0,5 мкг/мл), которое связывает и человеческий, и мышиный Tau (BD Biosciences, Allschwil, Switzerland). После инкубирования с первичным антителом, мембраны промывали 0,1% Tween в TBS и инкубировали с вторичными антителами: козьим антимышиным IRDye800-конъюгатом или козьим антикроличьим IRDye680-конъюгатом (производства Li-Cor Biosciences, NE, USA), разведенными 1:15000 в BB и 0,1% Tween. Затем мембраны инкубировали 1 час при комнатной температуре с защитой от света, 3 раза промывали 15 мин 0,1% Tween в TBS, и 2 раза 5 мин TBS, и проводили количественный анализ полос, используя систему БИК-визуализации Li-Cor Odyssey (Li-Cor). Полосы нормализовали по экспрессии β-актина (AbCam; использовали в концентрации 0,4 мкг/мл). Для подтверждения идентификации полос человеческого трансгенного в сравнении с мышиным эндогенным Tau, блоты обрабатывали антителом, специфичным к человеческому общему Tau (Tau13, AbCam; не показано). Дополнительно, мембраны обрабатывали антимышиным первичным антителом с целью проверки, что терапевтические антитела, ACI-36-2B6-Ab2 и ACI-36-3A8-Ab2, не присутствовали в денатурированных тестируемых образцах в достаточном количестве, чтобы нарушать связывание антитела к pS396 или AD2. В образцах, используемых в данном исследовании, интактных или денатурированных терапевтических антител не обнаружили (результаты не показаны).
6.1.7. Статистический анализ
Данные анализировали, используя непараметрическую статистику суммы рангов Краскел-Уоллиса, и, при значимости на уровне P<0,05, использовали апостериорный критерий Данна, сравнивая все группы (GraphPad Prism, GraphPad Software, CA, USA). Результаты представлены как индивидуальные точки данных, соответствующие среднему ± SEM. Различия при P<0,05 считали статистически значимыми.
6.2 Результаты
6.2.1. TAU патология в мозге в иммуногистохимическом (IHC) количественном анализе
Две в/б инъекции ACI-36-2B6-Ab2 и ACI-36-3A8-Ab2 не вызывали каких-либо существенных нежелательных эффектов в течение периода исследования. Окрашивание pT231 и pS235 с использованием AT180 методом IHC показало увеличенную иммунореактивную площадь (IR) в миндалевидном теле после обработки ACI-36-3A8-Ab (). Мыши, которым вводили 3 мг/кг ACI-36-2B6-Ab2, имели значительно меньшую AT180 IR площадь в гиппокампе ().
Обработка ACI-36-3A8-AB2 увеличивала AT180 IR pTau по сравнению с группой PBS в миндалевидном теле. В гиппокампе обработка ACI-36-2B6-AB2 уменьшала pTau. AT180 специфично метило pTau. Частота AT180 IR клеток была уменьшена у мышей, обработанных ACI-36-2B6-AB2. Данный эффект был более выражен в группе низкой дозы (3 мг/кг) (ACI-36-2B6-AB2 LD). Соматический профиль окрашивания между группами не отличается.
При более высокой дозе 10 мг/кг наблюдали тенденцию отсутствия значимости для меньшей AT180 IR в гиппокампе для ACI-36-2B6-Ab2 и для ACI-36-3A8-Ab2 при сравнении с мышами, которым вводили контрольную среду. Качественно, обработанные ACI-36-2B6-Ab2 животные показали более низкое число гиппокампальных нейронов с очень интенсивным AT180 мечением.
6.2.2. Снижение уровня общего Tau во фракции мозга после пассивной иммунизации
Действие обработок на pTau и TAU во фракции мозга, содержащей растворимые белки, измеряли, используя дуплексный анализ MSD. Уровни общего растворимого TAU в коре были значительно снижены у мышей, обработанных ACI-36-2B6-Ab2 и ACI-36-3A8-Ab2 (p<0,01; Фигура 3, верхняя панель). Уровни растворимого pTau были также значительно снижены (p<0,05; Фигура 3, нижняя панель), при дозе 3 мг/кг ACI-36-2B6-Ab2 демонстрировало максимальное снижение (p<0,01). Отношение pTau к общему TAU оставалось неизменным. Уровни растворимого TAU и pTau в образцах из гиппокампа не изменялись (не показано).
6.2.3. Влияние введения ACI-36-2B6-Ab2 и ACI-36-3A8-Ab2 на присутствие эпитопов фосфо-Tau, присутствующих в парных спиральных филаментах (PHF)
Структурно, нейрофибриллярные клубки (NFT) состоят из парных спиральных филаментов (PHF), состоящих из ассоциированного с микротрубочками Tau-белка, обнаруживаемого, прежде всего, в гиперфосфорилированном состоянии (Alonso et al., 1997). Цель данного исследования состояла в применении антител, которые узнают pTau PHF, для связывания и количественного анализа указанных эпитопов pTau PHF в мозге Tau трансгенных мышей после введения ACI-36-2B6-Ab2 и ACI-36-3A8-Ab2.
Для оценки влияния двух введений ACI-36-2B6-Ab2 или ACI-36-3A8-Ab2 на количестве четко задокументированных фосфоэпитопов Tau PHF, растворимые фракции коры головного мозга обработанных Tau Tg мышей подвергали связыванию с антителом AD2 (эпитоп PHF-1, pS396/pS404) и антителом против pS396 (эпитоп PHF-13, pS396) при использовании WB анализов. Иммунореактивность определяли количественно, используя систему инфракрасной визуализации. Влияние ACI-36-3A8-AB2 и ACI-36-2B6-AB2 обработки на AD2 PHF иммунореактивность в коре Tau Tg мышей определяли, используя AD2, которое связывается с pS396 и pS404, двумя ранее описанными PHF фосфо-остатками Tau (Greenberg et al., 1992; Reig et al., 1995).
Полосы, соответствующие человеческому и мышиному pTau, фосфорилированному по S396 и S404, анализировали количественно при использовании антитела AD2 (PHF-1) с помощью системы инфракрасной визуализации Li-Cor. Определяли значения для индивидуальных мышей, а также среднее ±SEM.
Тенденцию отсутствия значимости наблюдали относительно снижения AD-2-положительной pTau, иммунореактивность наблюдали для полосы, соответствующей трансгенному человеческому pTau. Впрочем, значимое уменьшение количества мышиного AD2-положительного pTau наблюдали у мышей, обработанных 3 мг/кг ACI-36-2B6-Ab2, и отсутствие значимости при обработке 10 мг/кг ACI-36-2B6-Ab2 или ACI-36-3A8-Ab2.
При использовании для окрашивания другого антитела, которое специфично узнает pTau pS396 (Hoffmann et al., 1997), наблюдали еще больший эффект. Мыши, обработанные 3 мг/кг ACI-36-2B6-Ab2, имели значительно меньше pS396-положительного трансгенного человеческого и мышиного эндогенного pTau, с тенденцией к снижению при обработке 10 мг/кг ACI-36-2B6-Ab2 или ACI-36-3A8-Ab2. Для оценки действия на общий человеческий и мышиный Tau, который включает нефосфорилированный и весь pTau, блоты обрабатывали антителом Tau5. По сравнению с контрольной средой, ACI-36-2B6-Ab2 или ACI-36-3A8-Ab2, которые вводили при дозировке 10 мг/кг, не модулировали общий Tau, однако тенденцию к снижению общего Tau наблюдали для мышей, которым вводили ACI-36-2B6-Ab2 в дозе 3 мг/кг.
6.2.4 Заключение
Два периферических введения Tau Tg мышам антитела против pTau, ACI-36-3A8-Ab2, вызывали значительное снижение растворимого TAU и растворимого pTau в коре головного мозга. Два периферических введения Tau Tg мышам антитела против pTau, ACI-36-2B6-Ab2, вызывали значительное снижение растворимого TAU и растворимого pTau в коре головного мозга. Дополнительно, ACI-36-2B6-Ab2 значительно снижало pTau иммунореактивность в гиппокампе. Данные результаты демонстрируют способность пассивной иммунизации против pTau с применением антител ACI-36-2B6-Ab2 и ACI-36-3A8-Ab2 уменьшать таупатию.
Два периферических введения ACI-36-2B6-Ab2 в дозе 3 мг/кг Tau Tg мышам уменьшали присутствие эпитопов pTau PHF в коре головного мозга согласно измерению с помощью Вестерн-блоттинга. При более высокой дозе 10 мг/кг, ACI-36-2B6-Ab2 и ACI-36-3A8-Ab2 показали тенденцию к уменьшению иммунореактивности эпитопов pTau PHF. Данные результаты показывают, что антитела ACI-36-2B6-Ab2 и ACI-36-3A8-Ab2 могут соответственно применяться в пассивной иммунотерапии против таупатии, такой как болезнь Альцгеймера.
ПРИМЕР 7: Обработка мышей, оверэкспрессирующих человеческий Tau, в течение 1 месяца
7.1 Методы
7.1.1 Мыши и обработки
Использовали Tau трансгенных мышей, которым вводили терапевтические антитела, как показано в Таблице в Методе 6.1. (исследование 2).
7.1.2. Поведенческое тестирование - задача водного лабиринта Морриса (MWM)
После последнего введения проводили тест водного лабиринта (MWM) для проверки эффективности пространственной памяти у мышей, которых обрабатывали согласно 6.1.1. MWM тестирование проводили со всеми включенными животными на 4 неделе после начала. MWM состоял из белого круглого бассейна диаметром 100 см, наполненного водопроводной водой при температуре 21±2°C. Бассейн по существу был разделен на четыре сектора. Прозрачную платформу (диаметром 8 см) помещали приблизительно на 0,5 см ниже поверхности воды. Во время всех сеансов тестирования платформа была расположена в юго-восточном секторе бассейна. Каждая мышь должна была выполнить три испытания в каждый из четырех последующих дней. Каждый анализ продолжался в течение максимум одной минуты. За это время мышь имела возможность найти скрытую, прозрачную цель. После каждого испытания мышь могла отдохнуть на платформе в течение 10-15 секунд, чтобы сориентироваться в окружающей обстановке. По меньшей мере через час после последнего испытания, в день 4, мыши должны были выполнить так называемое пробное испытание (PT). В ходе PT платформу удаляли из бассейна, и число пересечений над прежним положением цели экспериментатор регистрировал вместе с нахождением в данном секторе. Для определения периода времени, затрачиваемого на спасение (время [секунды], которое требуется мыши, чтобы найти скрытую платформу и, таким образом, спастись из воды), пути (длина траектории [метр] до цели), пересечений целевой зоны и нахождения в целевом секторе в PT использовали компьютерную систему слежения (Biobserve Software). В последний день все животные должны были выполнить зрительный тест после PT, чтобы исключить влияние недостаточной зрительной способности на результаты поведенческого тестирования.
7.1.3. Определение Tau патологии в мозге с помощью иммуногистохимического (IHC) количественного анализа
Мышей усыпляли через 1 день после MWM (через 1 неделю после последнего введения) для определения Tau патологии в мозге. Tau патологию в мозге определяли в гиппокампе и миндалевидном теле с помощью иммуногистохимического (IHC) количественного анализа с использованием антител AT180 (против pTau, pT231/pS235) и HT7 (специфичного к Tau человека). Кроме того, эффекты обработки на растворимый pTau и растворимый Tau в коре головного мозга и гиппокампе измеряли во фракции гомогената с использованием дуплексной технологии MesoScale Discovery (MSD), связывая pTau (pT231) и общий Tau. Ни одно из антител, используемых в IHC или в MSD анализах, не имело эпитопа, который перекрывался с терапевтическим антителом, используемым в данном исследовании.
7.1.4. Приготовление образцов для анализа растворимого Tau в коре и гиппокампе
3
4
Мышей усыпляли для сбора тканей через одну неделю после последнего терапевтического введения. Кору головного мозга и гиппокамп гомогенизировали в 100-200 мкл холодного буфера для экстракции 1 (25 мМ Трис HCl, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 10 мМ β-глицерофосфата, 30 мМ NaF, 2 мМ NaVO, смеси ингибиторов протеаз и фосфатаз). Гомогенаты центрифугировали (74200×g в течение 15 мин при 4°C) и супернатанты использовали для анализа растворимого Tau в коре и гиппокампе (Фигура 4-1). Осадки ресуспендировали в 100-200 мкл буфера для экстракции 2 (10 мМ Трис HCl, pH 7,4, 800 мМ NaCl, 300 мМ сахарозы, 1 мМ ЭГТА, смеси ингибиторов протеаз и фосфатаз) и переносили в пробирку объемом 1,5 мл. Растворы центрифугировали (4000×g в течение 20 мин при 4°C) и супернатанты переносили в пробирки для ультрацентрифугирования. Затем добавляли саркозил (30% водный раствор) до конечной концентрации 1% и инкубировали в течение 1,5 часов при комнатной температуре. После центрифугирования (74200×g в течение 30 мин при 4°C) супернатанты отбирали, а осадки ресуспендировали в 100 мкл буфера 3 (50 мМ Трис-HCl, pH 7,4). Ресуспендированные осадки использовали как нерастворимый в саркозиле (SinT) Tau коры головного мозга и гиппокампа. Концентрацию суммарного белка в образцах растворимых и SinT фракций определяли с помощью количественного BCA анализа белка (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA).
7.1.5. Вестерн-блот анализы pTau PHF и Tau
Для оценки эффекта введения ACI-36-2B6-Ab1 на присутствие pTau PHF в коре головного мозга и гиппокампе, два антитела, которые, как сообщалось, связывали эпитопы pTau PHF (Greenberg et al., 1992; Reig et al., 1995; Hoffmann et al., 1997), использовали в Вестерн-блот (WB) анализе. Растворимые и SinT фракции из коры головного мозга и гиппокампа растворяли при добавлении равного объема буфера для образцов (125 мМ Трис-HCl, pH 6,8, 4% [в/об] додецилсульфата натрия [ДСН], 20% глицерина, 0,01% бромфенолового синего, 5% β-меркаптоэтанола), после чего образцы нагревали до 95°C 10 мин, 30 мкг образца наносили на 4-12% Бис-Трис гель (Invitrogen, Basel, Switzerland) и проводили электрофорез в MOPS ДСН буфере (Invitrogen). Белки переносили на 0,45 мкм PVDF мембрану в буфере для переноса (25 мМ Трис, pH 8,6, 190 мМ глицина, 20% метанола). Для проверки переноса белков, мембраны окрашивали Ponceau S в течение 5 мин. Затем мембраны промывали и блокировали в течение 1 часа в блокирующем буфере (5% BSA в TBS [50 мМ Трис-HCl, pH 7,6, 150 мМ NaCl]). Мембраны оставляли для блоттинга на ночь при 4°C с первичными антителами в блокирующем буфере и 0,1% Tween.
Два pTau PHF-специфичных первичных антитела, используемые в WB анализах, были следующими: антитело к pS396 (эпитоп PHF-13; AbCam, Cambridge, UK; используемое в концентрации 3 мкг/мл), специфичное к фосфорилированному Ser396 (pS396) человеческого или мышиного pTau (Hoffmann et al., 1997), и AD2 (эпитоп PHF-1; BioRad, Reinach, Switzerland; используемое в концентрации 0,4 мкг/мл), специфичное к человеческому и мышиному pS396 и фосфорилированному Ser404 (pS404; Reig et al., 1995). Для обнаружения целевых эффектов, ACI-36-2B6-Ab1 использовали для блоттинга в концентрации 1,6 мкг/мл. Для WB анализов общего Tau, антитело Tau5, которое связывает и человеческий, и мышиный Tau (BD Biosciences, Allschwil, Switzerland), использовали в концентрации 0,5 мкг/мл. На всех мембранах дополнительно детектировали β-актин (AbCam; используемый в концентрации 0,4 мкг/мл) для нормализации концентрации нанесенного белка.
После инкубирования с первичным антителом мембраны промывали 0,1% Tween в TBS и инкубировали с вторичными антителами: козьим антимышиным IRDye800-конъюгатом или козьим антикроличьим IRDye680-конъюгатом (производства Li-Cor Biosciences, NE, USA), разведенными 1:15000 в BB и 0,1% Tween. Затем мембраны инкубировали 1 час при комнатной температуре с защитой от света, промывали 15 мин 3 раза 0,1% Tween в TBS, и 5 мин 2 раза TBS, и проводили количественный анализ полос, используя систему БИК-визуализации Li-Cor Odyssey (Li-Cor). Целевые полосы нормализовали по экспрессии β-актина. Для проверки идентификации полосы человеческого трансгенного Tau в сравнении с полосой мышиного эндогенного Tau, блоты метили антителом, специфичным к общему Tau человека, не обладающим перекрестной реактивностью с мышиным Tau (Tau13, AbCam; не показано). Дополнительно, мембраны метили антимышиным первичным антителом для подтверждения того, что терапевтическое антитело не присутствовало в денатурированных тестируемых образцах в достаточном количестве, чтобы препятствовать связыванию первичных детектирующих антител. В образцах, используемых в данном исследовании, интактных или денатурированных терапевтических антител не обнаруживали (результаты не показаны). Значения представлены в виде условной иммунореактивности (IR) с коррекцией по β-актину.
7.1.6. Статистический анализ
Данные анализировали, используя однофакторный ANOVA, с последующим апостериорным тестом множественного сравнения Даннета (GraphPad Prism, GraphPad Software, CA, USA), сравнивая каждую обработку с контрольно обработанными Tg мышами. Результаты представлены как индивидуальные точки данных, соответствующие среднему ± SEM. Различия с p<0,05 считали статистически значимыми. Одиночные значения, которые идентифицировали как значимые (p<0,05) выбросы согласно критерию предельного стьюдентизированного отклонения Граббса, исключали.
7.2 Результаты
7.2.1. Поведенческое тестирование - задача водного лабиринта Морриса (MWM) после пассивной иммунизации
Четыре в/б инъекции ACI-36-2B6-Ab1, которые делали еженедельно при дозе 3 мг/кг или 1 мг/кг в течение четырех недель, не вызывали каких-либо существенных нежелательных эффектов.
В течение последней недели обработки у животных оценивали обучение и запоминание при ориентации в пространстве. Животные должны были пройти обучение в течение 4 дней с 3 испытаниями в каждый день, с последующим прохождением одного пробного испытания и зрительного теста. Оценивали время, затрачиваемое на спасение (время [секунды], которое требовалось мыши для нахождения скрытой платформы и, таким образом, спасения из воды), путь (длина траектории [метр] до цели), скорость плавания (вычисленное отношение пути и времени до спасения), число пересечений цели и нахождение в целевом секторе.
Tg (группа A), а также nTg (F) контрольные животные, которым вводили среду, показали ожидаемые кривые обучения при оценке времени до спасения и длины проплытого пути, потребовавшихся, чтобы достичь платформы, за четыре дня испытания. Контрольные Tg (A) животные показали существенное ухудшение способности к обучению, что подтверждали более пологие кривые обучения в показателях времени до спасения и проплытого пути по сравнению с nTg контрольными животными (F). Время до спасения и проплытый путь были значительно (двухфакторный ANOVA) больше в дни обучения 3 и 4 (p<0,001; апостериорный критерий Бонферрони). Обработка ACI-36-2B6-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab1 при низкой или высокой дозе (группы B и C и D и E, соответственно) не приводила к существенному улучшению способностей к обучению при ориентации в пространстве по сравнению с контрольными Tg животными (группа A), и показала подобные кривые обучения. При коррекции результатов дня 1 в каждой группе до 100% и выражения результата всех последующих дней в процентах от дня 1, улучшение можно было наблюдать у мышей, обработанных ACI-36-3A8-Ab1 (обе дозировки). Эффект достигал статистической значимости для длины проплытого пути в день 3 (p<0,01 группа D, и p<0,05, группа E) и день 4 (p<0,05, группа D).
Для мышей, обработанных ACI-36-2B6-Ab1 (обе дозировки), небольшое улучшение можно было наблюдать по длине проплытого пути, хотя без статистической значимости.
По показателям скорости плавания никаких различий между группами обработки не обнаруживали за все четыре дня обучения.
Результаты теста MWM демонстрировали тенденции к улучшению обучения при ориентации в пространстве у мышей, обработанных ACI-36-2B6-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab1.
7.2.2. TAU патология в мозге в иммуногистохимическом (IHC) количественном анализе
Антитело AT180 окрашивает эндогенный и человеческий pTau (фосфорилированный по двум положениям, Thr231 и Ser235).
Определяли AT180 IR в миндалевидном теле и гиппокампе после иммунизации ACI-36-2B6-AB1 и ACI-36-3A8-AB1. Измеряли процент AT180 IR площади в миндалевидном теле и гиппокампе.
Количество внутрисоматического pTau у nTg контрольных животных было значительно ниже по сравнению с Tg группами (p<0,001). В миндалевидном теле тенденцию к увеличению соматического pTau наблюдали при обработке ACI-36-2B6-Ab1 в дозе 3 мг/кг. Напротив, обе дозировки ACI-36-2B6-Ab1 имели тенденцию к снижению pTau в гиппокампе по сравнению с животными, обработанными средой. Средние интенсивности окрашивания были сопоставимы во всех трансгенных группах.
Обработка ACI-36-3A8-Ab1 не изменяла уровни соматического pTau в гиппокампе и миндалевидном теле, и уровни нейронного pTau в миндалевидном теле и гиппокампе существенно не отличались между обработанными трансгенными группами. Средние и суммарные интенсивности окрашивания были сопоставимы во всех трансгенных группах.
Поскольку антитело HT7 специфично к человеческому Tau, лишь слабый сигнал измеряли у nTg контрольных животных, что было вызвано автофлуоресценцией точек липофусцина размером более семи пикселей. Обработка ACI-36-2B6-Ab1 не изменяла соматической HT7 положительной IR площади в гиппокампе по сравнению с контролем (PBS). В миндалевидном теле у мышей, получавших низкую дозу ACI-36-2B6-Ab1, наблюдали тенденцию к присутствию более высоких уровней общего человеческого Tau (T-критерий: p = 0,0954) в показателях IR площади. Данное увеличение было также качественно заметно как увеличение площади окрашивания и интенсивности окрашивания в телах индивидуальных нейронов. Статистически значимых, вызванных обработкой, различий в нейронах гиппокампа на наблюдали.
Обработка ACI-36-3A8-Ab1 не приводила к существенному изменению соматической HT7 положительной IR области в миндалевидном теле и гиппокампе по сравнению с контролем (PBS). Средние и суммарные интенсивности окрашивания были сопоставимы во всех трансгенных группах (данные не показаны).
Tau патология в мозге не показывала изменения уровней общего Tau или pTau в растворимой фракции мозга, однако иммунное окрашивание срезов мозга продемонстрировало снижение pTau в гиппокампе мышей, обработанных ACI-36-2B6-Ab1.
7.2.3. Влияние введения антитела против Tau на эпитопы фосфо-Tau, присутствующие в парных спиральных филаментах (PHF)
Болезнь Альцгеймера (БА) нейропатологически характеризуется нейрофибриллярными клубками (NFT; Braak, Braak, & Bohl, 1993). Структурно NFT состоят из парных спиральных филаментов (PHF), состоящих из ассоциированного с микротрубочками Tau-белка, обнаруживаемого, прежде всего, в гиперфосфорилированном состоянии (Alonso et al., 1997). Цель данного исследования состояла в уменьшении указанных эпитопов pTau PHF в мозге Tau трансгенных мышей с помощью четырех введений антитела против pTau: ACI-36-2B6-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab1.
Для измерения влияния четырех введений ACI-36-2B6-Ab1 на количество хорошо задокументированных Tau PHF фосфо-эпитопов, растворимые и SinT фракции коры головного мозга и гиппокампа обработанных Tau Tg мышей подвергали мечению антителом AD2 (эпитоп PHF-1, pS396/pS404) и антителом против pS396 (эпитоп PHF-13, pS396) с использованием WB анализов. В качестве маркеров Tau PHF ранее было описано присутствие pS396/pS404 (Greenberg et al., 1992; Reig et al., 1995), более конкретно сайт pS396 (Hoffmann et al., 1997). У Tau Tg мышей, Tau экспрессируется как эндогенный мышиный Tau и как человеческий Tau трансген, с различием по молекулярной массе, которое можно четко идентифицировать при WB анализах, когда детектирующее антитело связывает Tau из обоих видов, и когда Tau экспрессируется с двух различных транскриптов в достаточных количествах. Поэтому, по возможности, полосы эндогенного мышиного и человеческого трансгенного Tau идентифицировали для каждого детектирующего антитела и проводили количественный анализ отдельно. Для проверки подвижности указанных полос Tau в данных WB анализах, антитело против Tau, которое связывается с общим Tau, но обладает специфичностью к человеческому белку (Tau13) и поэтому показывает присутствие только человеческого трансгена в мозге Tau Tg мышей, использовали для контрольных Tau Tg образцов с целью проверки подвижности человеческого и мышиного Tau у Tau трансгенных мышей. Дополнительно, все количественно анализируемые полосы нормализовали по β-актину.
Присутствие эпитопов PHF, исследуемых в растворимой фракции коры головного мозга, снижалось у мышей, обработанных ACI-36-2B6-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab1. Это было существенно как в случае мышиной, так и в случае человеческой полос, при использовании антитела к pS396 (PHF-13) в WB анализах (Фигура 5A и B).
При использовании антитела AD2 (PHF-1, pS396/pS404) в WB анализе экстрактов мышей, обработанных ACI-36-2B6-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab1, наблюдали существенное снижение (Фигура 5C).
Следует отметить, что несмотря на то, что два PHF-специфичных антитела, которые использовали в этих WB анализах, имеют аналогичные эпитопы и хорошую специфичность к своей фосфорилированной мишени(ям), антитело к pS396 (PHF-13), по-видимому, обладало лучшим отношением сигнала к шуму и являлось в целом лучшим антителом в указанных WB анализах.
Прямой целевой эффект терапевтического антитела исследовали в коре головного мозга, используя ACI-36-2B6-Ab1 и ACI-36-2B6-Ab1, соответственно, в качестве детектирующего антитела. Указанное антитело против pTau связывается с тем же фосфо-Tau эпитопом, что и терапевтическое антитело, используемое в данном исследовании. Блоты предварительно детектировали только вторичным антителом против мышиного IgG.
Полосы анализировали количественно, используя систему ИК-визуализации. Определяли значения для индивидуальных мышей, а также среднее + SEM.
Сигнала, превышающего фон, не обнаруживали, подтвердив отсутствие блокирующих эффектов или взаимодействия терапевтического антитела в указанных образцах (данные не показаны).
У мышей, обработанных ACI-36-2B6-Ab1, наблюдали тенденцию к уменьшению сигнала до уровня контрольных nTg мышей, что указывает на прямой целевой эффект (Фигура 5G). У мышей, обработанных ACI-36-3A8-Ab1, не наблюдали никаких существенных эффектов терапии (Фигура 5G).
Существенное влияние терапии ACI-36-2B6-Ab1 на общий Tau в растворимой фракции коры головного мозга Tau Tg мышей наблюдали при использовании антитела Tau5 для блоттинга, которое связывало как эндогенный мышиный Tau, так и трансгенный человеческий Tau (Фигура 5H и 5I). Значительное снижение общего Tau наблюдали в растворимой фракции коры головного мозга и в отношении эндогенного мышиного Tau, и в отношении трансгенного человеческого Tau.
Полосы, соответствующие мышиному A) и человеческому B) общему Tau (Tau5), анализировали количественно, используя систему ИК-визуализации. Определяли значения для индивидуальных мышей, а также среднее ± SEM.
Присутствие эпитопов PHF в нерастворимой в детергенте фракции Tau определяли с помощью приготовления нерастворимых в саркозиле (SinT) фракций мозга.
Полосы анализировали количественно, используя систему ИК-визуализации. Определяли значения для индивидуальных мышей, а также среднее ± SEM.
В этой фракции присутствовало намного меньше Tau по сравнению с фракцией растворимого Tau, как в коре головного мозга, так и в гиппокампе. Это может быть обусловлено возрастом Tau Tg мышей, используемых в данном исследовании, которые в возрасте 4 месяцев, возможно, не накапливали существенного количества нерастворимого и агрегированного Tau в гиппокампе и коре головного мозга. Таким образом, при исследовании эпитопов PHF во фракции SinT, только антитело AD2 (PHF-1, pS396/pS404) давало сигнал, достаточный для надежной количественной интерпретации полос.
Мыши, обработанные 1 мг/кг ACI-36-2B6-Ab1 и 1 мг/кг ACI-36-3A8-Ab1, соответственно, имели существенное снижение эпитопа PHF-1 в полосах, представляющих эндогенный мышиный Tau (Фигура 5C). Сигналы, наблюдаемые для полосы трансгенного человеческого Tau, не были достаточно интенсивными для достоверной количественной оценки.
Гиппокамп также исследовали, используя те же антитела и фракции, как и в случае коры головного мозга. По сравнению с фракциями из коры, во фракциях из гиппокампа регистрировали более слабые сигналы для всех детектирующих антител.
Определяли влияние обработки ACI-36-2B6-AB1 и ACI-36-3A8-AB1 на pS396 (PHF-13) иммунореактивность в растворимом гиппокампе Tau Tg мышей. Полосы, соответствующие эпитопам мышиного A) и человеческого B) pTau pS396 (PHF-13), оценивали количественно, используя систему ИК-визуализации. Определяли значения для индивидуальных мышей, а также среднее ± SEM.
Обработка ACI-36-2B6-Ab1 не приводила к существенному изменению присутствия эпитопа pS396 (PHF-13) во фракции растворимого мышиного Tau гиппокампа, с малой тенденцией к снижению в человеческой трансгенной полосе.
Обработка ACI-36-3A8-Ab1 показала тенденции к снижению в присутствии эпитопа pS396 (PHF-13) во фракции растворимого мышиного Tau гиппокампа и в человеческой трансгенной полосе.
Аналогично тому, что наблюдали для pS396 (PHF-13) WB анализов, тенденцию к снижению сигнала обнаруживали в обоих экстрактах мышей, обработанных ACI-36-2B6-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab1, для общего Tau во фракции растворимого человеческого Tau гиппокампа.
Подобно SinT образцам из коры головного мозга, фракция SinT из гиппокампа содержала очень низкие уровни pTau. Мыши, обработанные ACI-36-2B6-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab1, соответственно, не имели изменения в эпитопе PHF-1 (pS396/pS404) в полосах, соответствующих эндогенному мышиному Tau.
Сигналы, наблюдаемые для трансгенной человеческой полосы, не были достаточно интенсивными для достоверной количественной интерпретации.
7.2.4 Заключение
Исследование указывает, что пассивная иммунизация с использованием четырех введений фосфо-сайтспецифичных антител против pTau, ACI-36-2B6-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab1, улучшает обучение при ориентации в пространстве и уменьшает pTau патологию в мозге.
Четыре периферических введения антитела против pTau, ACI-36-2B6-Ab1, в дозе 1 и 3 мг/кг Tau Tg мышам уменьшали присутствие эпитопов pTau PHF в коре головного мозга согласно измерению с помощью Вестерн-блоттинга. Тенденцию к снижению наблюдали в гиппокампе. Аналогичным образом, также наблюдали снижение общего Tau. Существенное снижение pTau PHF-1 иммунореактивности наблюдали в нерастворимой фракции коры головного мозга, а также наблюдали тенденцию, которая указывала на прямые целевые эффекты от обработки антителами. Указанные результаты дополнительно подтверждают антитела против pTau ACI-36-2B6-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab1 в пассивной иммунотерапии против таупатии, такой как болезнь Альцгеймера.
ПРИМЕР 8: Обработка мышей с оверэкспрессией человеческого Tau в течение 3 месяцев
8.1 Методы
8.1.1 Мыши и терапии
Использовали Tau трансгенных мышей, которым вводили терапевтические антитела, как показано в Таблице в Методе 6.1. (исследование 3), при этом мышей распределяли в 4 различные группы терапии, как описано в Таблице ниже.
Группа
Линия мышей
Генотип
Возраст на начало
Пол
n
Терапия
A
TMHT
Tg
3 месяца (±2 недели)
смешанный
15+1
PBS (контроль)
в/б, 10 мкл/г веса
раз в неделю
В
TMHT
Tg
3 месяца (±2 недели)
смешанный
15+1
ACI-36-2B6-Ab1 (1 мг/кг)
в/б, 10 мкл/г веса
раз в неделю
С
TMHT
Tg
3 месяца (±2 недели)
смешанный
15+1
ACI-36-2B6-Ab1 (3 мг/кг)
в/б, 10 мкл/г веса
раз в неделю
F
TMHT
nTg
3 месяца (±2 недели)
смешанный
15+1
PBS (контроль)
в/б, 10 мкл/г веса
раз в неделю
В общей сложности 45 Tg мышам, плюс 3 в резерве, которых определяли в группы терапии A - C, и 15 nTg мышам, плюс 1 в резерве (группа F), в день 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77 и 84 делали в/б инъекцию либо среды PBS (контроль), либо антитела против pTau, ACI-36-2B6-Ab1 или ACI-36-3A8-Ab1. Животных рандомизировано распределяли в 5 различных стартовых групп (шкал), включающих животных всех групп терапии. Число животных в шкале было ограничено, чтобы гарантировать одинаковый возраст и единообразную терапию. После 12-го введения выполняли тест водного лабиринта (MWM) для проверки эффективности пространственной памяти. После MWM мышам дополнительно вводили тестируемый продукт еще один раз (13-ая инъекция) перед их усыплением через 24 часа для определения Tau патологии. Tau патологию в мозге определяли в гиппокампе и миндалевидном теле с помощью иммуногистохимического (IHC) количественного анализа с использованием антитела AT180 (против pTau, pT231/pS235). Кроме того, влияние обработки на растворимый и нерастворимый в саркозиле Tau и pTau в коре головного мозга и гиппокампе измеряли с использованием технологии MesoScale Discovery (MSD), исследуя pTau (pT231 и pS396) и общий Tau.
8.12. Поведенческое тестирование - тест водного лабиринта Морриса (MWM)
Данный эксперимент проводили согласно методике, описанной в Примере 7.1.2. В неделе 12 в водном лабиринте Морриса (MWM) тестировали ориентацию в пространстве с целью оценки способности к обучению и запоминанию.
8.1.3. Молекулярная биология
Общий TAU и Tau, фосфорилированный по Thr231 и pS396, анализировали количественно в гомогенатах мозга Tg животных при использовании иммуносорбентного анализа от MesoScale Discovery (MSD).
8.1.4. Определение Tau патологии в мозге с помощью иммуногистохимического (IHC) количественного анализа
Данный эксперимент проводили согласно методике, описанной в Примере 7.1.3. TAU патологию определяли по иммунореактивности AT180 в гиппокампе и миндалевидном теле 8 животных в группе.
8.1.5. Эффекты от трехмесячного введения антитела против Tau на эпитопы фосфо-Tau, присутствующие в парных спиральных филаментах (PHF)
Данный эксперимент проводили согласно методикам, описанным в 7.1.4., 7.1.5. и 7.1.6. Для измерения эффектов четырех введений ACI-36-2B6-Ab1 и ACI-36-3A8-Ab1 на количество хорошо задокументированных фосфо-эпитопов Tau PHF, растворимые и SinT фракции коры головного мозга и гиппокампа обработанных Tau Tg мышей исследовали антителом AD2 (эпитоп PHF-1, pS396/pS404), антителом к pS396 (эпитоп PHF-13, pS396) и антителом AT180 (pT231/pS235) с помощью WB анализов.
8.1.6. Эффект 3-месячного введения антитела против Tau на фосфо-Tau эпитопы при использовании Tau бигенных мышей biGT
Исследование 4 проводили с использованием Tau бигенных мышей, как показано в Методе 6.1. Образцы коры головного мозга приготавливали, как показано на Фигурах 4-2, используя суммарный гомогенат (TH) или растворимую фракцию (S1) для Вестерн-блоттинга. Мембраны исследовали на pTau или общий Tau с использованием следующих детектирующих антител:
- HT-7 (26 нг/мл), специфичное к общему человеческому Tau
- PHF-13 (pS396) в разведении 1/7500
- AT180 (pT231) в концентрации 2,47 мкг/мл
- AT8 (pS202) в концентрации 3 мкг/мл
- pS404 в разведении 1:5000
- pS400 в разведении 1:5000
Все количественные анализы нормализовали по β-актину.
8.2 Результаты для антитела ACI-36-2B6-Ab1
Тринадцать в/б инъекций ACI-36-2B6-Ab1, которые делали еженедельно в дозе 1 или 3 мг/кг в течение двенадцати недель исследования, не показывали каких-либо существенных нежелательных эффектов.
8.2.1 Результаты поведенческого тестирования - водный лабиринт Морриса
Результаты теста MWM продемонстрировали сильные тенденции к улучшению способности к обучению при ориентации в пространстве у мышей, обработанных ACI-36-2B6-Ab1 (Фигура 9).
В течение последней недели терапии у животных оценивали способность к обучению и запоминанию при ориентации в пространстве. Животные должны были пройти 4 дня обучения с 3 испытаниями в день, с последующим выполнением одного пробного испытания и зрительного теста. Оценивали время, затрачиваемое на спасение (время [секунды], которое требовалось мыши, чтобы найти скрытую платформу и, таким образом, спастись из воды), путь (длина траектории [метр] до цели), скорость плавания (вычисленное отношение пути и времени до спасения), число пересечений цели и нахождение в целевом секторе. Получавшие среду Tg (группа A) и nTg (группа F) контрольные животные показали ожидаемые кривые обучения в показателях времени до спасения и длины проплытого пути для достижения платформы за четыре дня испытания. Контрольные Tg (A) животные показали существенное ухудшение способностей к обучению, что выражалось в более пологих кривых обучения в показателях времени до спасения и длины проплытого пути по сравнению с nTg контрольными животными (группа F). Время до спасения и длина проплытого пути значительно (двухфакторный ANOVA) отличались в дни обучения 3 (p<0,01, затраченное время; p<0,001, длина; апостериорный критерий Бонферрони) и 4 (p<0,01; апостериорный критерий Бонферрони). Обработка ACI-36-2B6-Ab1 в низкой или высокой дозе (B и C) не приводила к существенному улучшению способностей к обучению при ориентации в пространстве по сравнению с контрольными Tg животными (A). Приняв показатели каждой группы за 100% в день обучения 1, а во все последующие дни как процент от дня 1, у мышей, обработанных ACI-36-2B6-Ab1 (низкая и высокая дозировка), можно было отметить небольшое улучшение по длине проплытого пути, хотя без статистической значимости. Различий между группами терапии при вычислении скорости плавания во все четыре дня обучения не обнаруживали. В пробном испытании (PT) регистрировали нахождение в целевом секторе (юго-западный сектор), а также пересечения целевой зоны. Контрольные nTg животные (группа F) провели больше времени в целевом секторе и пересекали целевую зону чаще, чем контрольные Tg животные (группа A), но без статистической значимости.
Обработка ни низкой, ни высокой дозой не приводила к улучшению способностей к обучению при ориентации в пространстве по сравнению с контрольными Tg мышами согласно оценке в PT.
8.2.2 Молекулярная биология
8.2.2.1 TAU в растворимой фракции гомогенатов коры головного мозга
Общий Tau, p231TAU, p396TAU и отношения pTau к общему TAU оценивали в растворимой фракции гомогенатов коры головного мозга n=16 животных из группы A (контрольная Tg группа; среда PBS), B (Tg, ACI-36-2B6-Ab1, 1 мг/кг) и C (Tg, ACI-36-2B6-Ab1, 3 мг/кг). Обработка ACI-36-2B6-Ab1 не оказывала значительного влияния на общий TAU и pTau в растворимых гомогенатах коры головного мозга. Однако небольшое увеличение (без значимости) среднего общего TAU, p231TAU и p396TAU наблюдали при обработке ACI-36-2B6-Ab1. Фосфорилирование TAU, оцениваемое как отношение pTau к общему TAU, не было затронуто.
8.2.2.2 TAU в нерастворимой в саркозиле фракции гомогенатов коры головного мозга
Общий TAU, p231TAU, p396TAU и отношения pTau к общему TAU оценивали в нерастворимых в саркозиле фракциях гомогенатов коры головного мозга у n=16 животных из группы A (контрольная Tg группа; среда PBS), B (Tg, ACI-36-2B6-Ab1, 1 мг/кг) и C (Tg, ACI-36-2B6-Ab1, 3 мг/кг). Обработка ACI-36-2B6-Ab1 не оказывала значительного влияния на общий TAU и pTau в нерастворимых в саркозиле гомогенатах коры головного мозга. Небольшое уменьшение (без значимости) среднего общего TAU и p231TAU наблюдали при обработке ACI-36-2B6-Ab1. Фосфорилирование TAU, оцениваемое как отношение pTau к общему TAU, не было затронуто.
8.2.2.3 TAU в растворимой фракции гомогенатов гиппокампа
Общий TAU, p231TAU, p396TAU и отношения pTau к общему TAU оценивали в растворимой фракции гомогенатов гиппокампа у n=16 животных из группы A (контрольная Tg группа; среда PBS), B (Tg, ACI-36-2B6-Ab1, 1 мг/кг) и C (Tg, ACI-36-2B6-Ab1, 3 мг/кг). Обработка ACI-36-2B6-Ab1 не оказывала значительного влияния на общий TAU и pTau в растворимых гомогенатах гиппокампа. Небольшое уменьшение (без значимости) фосфорилирования TAU, оцениваемого как отношение pTau к общему TAU, наблюдали при обработке ACI-36-2B6-Ab1.
8.2.2.4 TAU в нерастворимой в саркозиле фракции гомогенатов гиппокампа
Общий TAU, p231TAU, p396TAU и отношения pTau к общему TAU оценивали в нерастворимых в саркозиле фракциях гомогенатов гиппокампа у n=16 животных из группы A (контрольная Tg группа; среда PBS), B (Tg, ACI-36-2B6-Ab1, 1 мг/кг) и C (Tg, ACI-36-2B6-Ab1, 3 мг/кг). Обработка ACI-36-2B6-Ab1 не оказывала значительного влияния на общий TAU и pTau в нерастворимых в саркозиле гомогенатах гиппокамп. Обработка дозой 3 мг/кг увеличивала средний общий TAU, p231TAU, а также p396TAU, хотя и без достижения значимости, тогда как небольшое снижение среднего общего TAU, p231TAU, а также p396TAU наблюдали после обработки дозой 1 мг/кг. Фосфорилирование TAU, оцениваемое как отношение pTau к общему TAU, немного увеличивалось после обработки ACI-36-2B6-Ab1 в дозе 3 мг/кг.
8.2.2.5. Вестерн-блоты растворимой фракции коры головного мозга
Обработка ACI-36-2B6-Ab1 дозозависимо уменьшала присутствие и pS396/pS404 (Фигура 5D), и pT181 (Фигура 5E и 5F) эпитопов pTau в растворимой фракции коры головного мозга, со значимым эффектом при дозе 3 мг/кг.
8.2.2.6 TAU у Tau бигенных мышей biGT
У мышей biGT, обрабатываемых ACI-36-2B6-Ab1 в течение 3 месяцев, значительно снижался общий Tau в растворимой фракции коры головного мозга (Фигура 6A и 6B). Существенное снижение наблюдали для pTau эпитопов pT231/AT180 (Фигура 6C и 6D), pS202/AT8 (Фигура 6E) и pS396 (Фигура 6F и 6G). Существенное снижение также наблюдали в суммарных гомогенатах (TH) для pTau эпитопа pS400 (Фигуры 6H и 6I) и pS404 (Фигуры 6L и 6M). Кроме того, существенное снижение также наблюдали в растворимой фракции pTau эпитопов pS400 (Фигура 6J и 6K) и тенденцию к снижению pTau эпитопа pS404 (Фигура 6N и 6O).
8.2.3 Гистология
8.2.3.1 Морфометрия - определение площади областей
2
2
Измеренные площади областей гиппокампа и миндалевидного тела значительно не отличались в мозге всех исследованных животных, что исключает отрицательное воздействие на ткань в процессе препарирования и IHC или окрашивания (например, заметное сморщивание, получение разных срезов) и, до известной степени, атрофию, вызванную терапией. Индивидуальные срезы могут отличаться от средних у индивидов и в группах, например, из-за складывания ткани или потери частей среза в процессе выполнения методики мечения. Таким образом, общую иммунореактивную площадь [в мкм] любого мечения нормализовывали до индивидуальной площади области среза [в мм], вычисляя процент от меченой площади в пределах площади области [меченая площадь/(площадь области * 10000)].
8.2.3.2 Результаты AT180 IH
Антитело AT180 детектирует эндогенный и человеческий pTau (фосфорилированный по двум положениям, Thr231 и Ser235). Количество внутрисоматического pTau у контрольных nTg животных было значительно ниже по сравнению с группами Tg (p<0,01 и p<0,001). В миндалевидном теле более высокая доза ACI-36-2B6-Ab1 (3 мг/кг - группа C) значительно снижала соматический pTau по сравнению с контрольными животными, обработанными средой (Фигура 7, слева). Более низкая доза (1 мг/кг - группа C) показала такую же тенденцию, но не достигала значимости. Аналогичный эффект обнаруживали в гиппокампе, где ACI-36-2B6-Ab1 снижало pTau дозозависимо, со значимостью при более высокой дозе и тенденцией для низкой (Фигура 7, справа). Такое снижение было также качественно заметно как уменьшение площади окрашивания и интенсивности окрашивания в телах индивидуальных нейронов. Результаты суммарной интенсивности окрашивания, нормализованной по AOI размеру измеренной AT180 IR в телах нейронов, были сопоставимы с процентом площади измеренной AT180 IR, включая существенную зависимость от дозы более сильного эффекта при более высокой дозе в миндалевидном теле. В гиппокампе апостериорные сравнения не достигали уровня значимости.
8.2.4 Заключение
Tau патология в мозге согласно измерению MSD не показывала существенного изменения, однако иммунное окрашивание срезов мозга демонстрировало дозозависимое, до 60%, снижение при AT180 (pT231/pS235) иммунном окрашивании в телах нейронов.
Исследование показывает, что пассивная иммунизация при использовании тринадцати введений фосфо-сайтспецифичного антитела против pTau, ACI-36-2B6-Ab1, может улучшать способность к обучению при ориентации в пространстве и значительно уменьшает pTau патологию в мозге.
8.3 Результаты антитела ACI-36-3A8-Ab1
Тринадцать в/б инъекций ACI-36-3A8-Ab1, которые водили еженедельно при дозе 1 или 3 мг/кг в течение двенадцати недель исследования, не показывали каких-либо существенных нежелательных эффектов.
8.3.1 Результаты поведенческого тестирования - водный лабиринт Морриса
Результаты теста MWM демонстрировали существенный эффект улучшения обучения при ориентации в пространстве у мышей, обработанных ACI-36-3A8-Ab1 при дозе 3 мг/кг (Фигура 10).
Обработанные средой Tg (группа A) и nTg (группа F) контрольные животные показали ожидаемые кривые обучения по показателям времени до спасения и длины проплытого пути до достижения платформы за четыре дня испытания. Контрольные Tg (A) животные показали существенное ухудшение способностей к обучению, что выражалось в более пологих кривых обучения по показателям времени до спасения и проплытого пути по сравнению с nTg контрольными животными (группа F). Время до спасения и проплытый путь значительно (двухфакторный ANOVA) отличались в дни обучения 3 (p<0,01, затраченное время; p<0,001, длина; апостериорный критерий Бонферрони) и 4 (p<0,01; апостериорный критерий Бонферрони). Обработка ACI-36-3A8-Ab1 при низкой или высокой дозе (D и E) не приводила к значительному улучшению способностей к обучению при ориентации в пространстве по сравнению с Tg контрольными животными (A), когда проанализировали абсолютные значения. Приняв показатели каждой группы за 100% в день обучения 1, а во все последующие дни в процентах от дня 1, улучшение способностей к обучению и запоминанию может быть отмечено при обработке ACI-36-3A8-Ab1 (низкая и высокая дозировка). Животные, обработанные низкой дозой ACI-36-3A8-Ab1 (группа D), выполняли тест MWM лишь немного лучше по сравнению с контрольными Tg животными (группа A). Эффект еженедельной обработки ACI-36-3A8-Ab1 в дозе 3 мг/кг (группа E) был намного более выражен и почти восстанавливал показатели nTg животных. По сравнению с контрольными Tg животными (A) эффект ACI-36-3A8-Ab1 при дозе 3 мг/кг был статистически значимым в отношении длины проплытого пути в день 3 и день 4 (p<0,05). Никаких различий между группами терапии при вычислении скорости плавания во все четыре дня обучения не обнаруживали.
В пробном испытании (PT) регистрировали нахождение в целевом секторе (юго-западный сектор), а также пересечения целевой зоны. Контрольные nTg животные (группа F) провели больше времени в целевом секторе и пересекали целевую зону чаще, чем контрольные Tg животные (группа A), но без статистической значимости. Обработка ни в низкой, ни в высокой дозе не приводила к статистически значимому улучшению по сравнению с контрольными Tg мышами при оценке в PT. Однако животные, обработанные ACI-36-3A8-Ab1, чаще, хотя и без статистической значимости, пересекали целевую зону по сравнению с контрольными Tg животными, что соответствует результату по длине проплытого пути за 4 дня обучения.
8.3.2 Молекулярная биология
8.3.2.1 TAU в растворимой фракции гомогенатов коры головного мозга
Общий TAU, p231TAU, p396TAU и отношения pTau к общему TAU оценивали в растворимой фракции гомогенатов коры головного мозга у n=16 животных из группы A (контрольная Tg группа; среда PBS) и D (Tg, ACI-36-3A8-Ab1, 1 мг/кг), и у n=15 животных из группы E (Tg, ACI-36-3A8-Ab1, 3 мг/кг). Обработка ACI-36-3A8-Ab1 не оказывала значительного влияния на общий TAU и pTau в растворимых гомогенатах коры головного мозга. Однако небольшое увеличение (без значимости) среднего общего TAU, p231TAU и p396TAU наблюдали при обработке ACI-36-3A8-Ab1. Фосфорилирование TAU по положению 231, оцениваемое как отношение p231TAU к общему TAU, немного снижалось после обработки ACI-36-3A8-AB1 в дозе 3 мг/кг.
8.3.2.2 TAU в нерастворимой в саркозиле фракции гомогенатов коры головного мозга
Общий TAU, p231TAU, p396TAU и отношения pTau к общему TAU оценивали в нерастворимых в саркозиле фракциях гомогенатов коры головного мозга у n=16 животных из группы A (контрольная Tg группа; среда PBS) и D (Tg, ACI-36-3A8-Ab1, 1 мг/кг), и у n=15 животных из группы E (Tg, ACI-36-3A8-Ab1, 3 мг/кг). Обработка ACI-36-3A8-Ab1 не оказывала значительного влияния на общий TAU и pTau в нерастворимых в саркозиле гомогенатах коры головного мозга.
Небольшое снижение (без значимости) среднего общего TAU, p231TAU и p396TAU наблюдали при обработке 1 мг/кг ACI-36-3A8-Ab1. Кроме того, отношения p231TAU к общему TAU у животных, обработанных 1 мг/кг ACI-36-3A8-Ab1, показали немного более низкую вариацию по сравнению с контрольными животными, обработанными средой (но без значимости в F-тесте: p=0,184), без изменения средних отношений p231TAU к общему TAU в двух группах. В группах, обработанных ACI-36-3A8-Ab1 при дозе 3 мг/кг и 1 мг/кг, наблюдали небольшое увеличение p396TAU фосфорилирования.
8.3.2.3 TAU в растворимой фракции гомогенатов гиппокампа
Общий TAU, p231TAU, p396TAU и отношения pTau к общему TAU оценивали в растворимой фракции гомогенатов гиппокампа у n=16 животных из группы A (контрольная Tg группа; среда PBS) и D (Tg, ACI-36-3A8-Ab1, 1 мг/кг), и у n=15 животных из группы E (Tg, ACI-36-3A8-Ab1, 3 мг/кг). Уровни TAU и pTau в растворимых фракциях гиппокампа IRN6301 (группа D) были выбросами и были исключены. Обработка ACI-36-3A8-Ab1 не оказывала значительного влияния на общий TAU и pTau в растворимых гомогенатах гиппокампа. Небольшое уменьшение (без значимости) фосфорилирования TAU по 231 положению, оцениваемое как отношение p231TAU к общему TAU, наблюдали при обработке ACI-36-3A8-Ab1.
8.3.2.4 TAU в нерастворимой в саркозиле фракции гомогенатов гиппокампа
Общий TAU, p231TAU, p396TAU и отношения pTau к общему TAU оценивали в нерастворимых в саркозиле фракциях гомогенатов гиппокампа у n=16 животных из группы A (контрольная Tg группа; среда PBS), B (Tg, ACI-36-3A8-Ab1, 1 мг/кг), и C (Tg, ACI-36-3A8-Ab1, 3 мг/кг). Обработка ACI-36-3A8-Ab1 не оказывала значительного влияния на общий TAU и pTau в нерастворимых в саркозиле гомогенатах гиппокампа. Небольшое увеличение (без значимости) среднего общего TAU, p231TAU, а также p396TAU наблюдали при обработке ACI-36-3A8-Ab1. Фосфорилирование TAU, оцениваемое как отношение p231TAU к общему TAU, не было затронуто, при этом обработка ACI-36-3A8-Ab1 при дозе 1 мг/кг немного уменьшала отношение p396TAU к общему TAU.
8.3.2.5. Вестерн-блоты растворимой фракции коры головного мозга
Существенное снижение pS396/pS404 pTau эпитопа в растворимой фракции коры головного мозга наблюдали у мышей, обработанных ACI-36-3A8-Ab1 в дозах 1 или 3 мг/кг (Фигура 5D). Присутствие человеческого/трансгенного pT181 pTau эпитопа было уменьшено в растворимой фракции коры головного мозга, со значимым эффектом у мышей, обработанных 1 мг/кг, и тенденцией у мышей, обработанных 3 мг/кг (Фигура 5E). Наблюдали тенденцию к снижению количества эндогенного pT181 pTau (Фигура 5F).
8.3.2.6 TAU у Tau бигенных мышей biGT
У мышей biGT, обрабатываемых ACl-36-3A8-Ab1 в течение 3 месяцев, значительно снижался общий Tau в растворимой фракции коры головного мозга (Фигура 6A и 6B). Существенное снижение наблюдали для pTau эпитопов pT231/AT180 (Фигура 6C и 6D), pS202/AT8 (Фигура 6E) и pS396 (Фигура 6F и 6G). Существенное снижение также наблюдали в суммарном гомогенате (TH) для pTau эпитопа pS400 (Фигуры 6H и 6I) и pS404 (Фигуры 6L и 6M). Кроме того, существенное снижение также наблюдали в растворимой фракции для pTau эпитопов pS400 (Фигура 6J и 6K) и тенденцию к снижению для pTau эпитопа pS404 (Фигура 6N и 6О).
8.3.3 Гистология
8.3.3.1 Морфометрия - определение площади областей
См. Пример 8.2.3.1
8.3.3.2 Результаты AT180 IH
Антитело AT180 детектирует эндогенный и человеческий pTau (фосфорилированный по двум положениям, Thr231 и Ser235). Количество внутрисоматического pTau у контрольных nTg животных было значительно ниже по сравнению с Tg группами (p<0,001). В миндалевидном теле обе дозы ACI-36-3A8-Ab1 [1 мг/кг (группа D) и 3 мг/кг (группа E)] вызывали значительное снижение соматического pTau по сравнению с контрольными животными, обработанными средой (Фигура 8, слева). Аналогичный эффект обнаруживали в гиппокампе, где более низкая дозировка ACI-36-3A8-Ab1 снижала pTau, однако в данном случае более высокая доза была менее эффективна и приводила только к тенденциозному снижению (Фигура 8, справа). Данное снижение также качественно наблюдали как уменьшение площади окрашивания и интенсивности окрашивания в телах индивидуальных нейронов. Результаты нормализованной суммы интенсивностей измеренной AT180 IR в телах нейронов были сопоставимы в миндалевидном теле с измеренным процентом AT180 IR площади, но достигали значимости только при более высокой дозе. В гиппокампе результат был полностью сопоставимым с процентом IR площади.
8.3.4 Заключение
Tau патология в мозге согласно измерению MSD не показывала существенного изменения, однако иммунное окрашивание срезов мозга демонстрировало дозозависимое, с 40% снижением, AT180 (pT231/pS235) иммунное окрашивание в телах нейронов.
Исследование показывает, что пассивная иммунизация с использованием тринадцати введений фосфо-сайтспецифичного антитела против pTau, ACI-36-3A8-Ab1, улучшает обучение при ориентации в пространстве и значительно уменьшает pTau патологию в мозге.
Депонирование:
Следующие линии клеток гибридом депонировали от лица AC Immune SA, PSE-EPFL Building B, 1015 Lausanne, Switzerland и Katholieke Universiteit Leuven, Minderbroedersstraat 8a - Box 5105, B-3000 Leuven, с Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), в Брауншвейге, Inhoffenstrasse 7 B, 38124 Braunschweig, согласно условиям Будапештского соглашения:
Название гибридомы
Номер депозита
Дата депонирования
6C10F9C12A11
DSM ACC3079
25 августа 2010 года
6C10E5E9C12
DSM ACC3081
25 августа 2010 года
6H1A11C11
DSM ACC3080
25 августа 2010 года
6H1G6E6
DSM ACC3088
25 августа 2010 года
2B6A10C11
DSM ACC3084
25 августа 2010 года
2B6G7A12
DSM ACC3087
25 августа 2010 года
3A8A12G7
DSM ACC3086
25 августа 2010 года
3A8E12H8
DSM ACC3085
25 августа 2010 года
7C2(1)F10C10D3
DSM ACC3082
25 августа 2010 года
7C2(2)B9F11D5
DSM ACC3083
25 августа 2010 года
A4-4A6-48
DSMACC3136
30 августа 2011 года
A6-2G5-30
DSMACC3137
30 августа 2011 года
A6-2G5-41
DSMACC3138
30 августа 2011 года
A4-2A1-18
DSMACC3139
30 августа 2011 года
A4-2A1-40
DSMACC3140
30 августа 2011 года
A6-1D2-12
DSMACC3141
6 сентября 2011 года
Таблица 1Последовательность Tau, вакцина и описание антител
Описание
Вакцина
Последовательность*, длина (n), ID номер последовательности
Гибридомы
Антитела
T1: Tau 5-20 [pY18]
ACI-33
RQEFEVMEDHAGTY(p)GL (n=16) (SEQ ID NO: 59)
6C10F9C12A11
ACI-33-6C10-Ab1
6C10E5E9C12
ACI-33-6C10-Ab2
T8: Tau 206-221 [pT212, pS214]T9: Tau 196-211 [pS202, PT205]
ACI-41
PGSRSRT(p)PS(p)LPTPPTR (n=16) (SEQ ID NO: 60) GYSSPGS(p)PGT(p)PGSRSR (n=16) (SEQ ID NO: 61)
7C2(1)F10C10D3
ACI-41-7C2-Ab1
7C2(2)B9F11D5
ACI-41-7С2-Ab1
T4: Tau 401-418 [pS404, pS409]
ACI-36
GDTS(p)PRHLS(p)NVSSTGSID (n=18) (SEQ ID NO: 63)
6H1A11C11
ACI-36-6H1-Ab1
6H1G6E6
ACI-36-6H1-Ab2
2B6A10C11
АС1-36-2В6-Ab1
2B6G7A12
АС1-36-2В6-АЬ2
3A8A12G7
АС1-36-ЗА8-Ab1
3A8E12H8
ACI-36-3A8-Ab2
T3: Tau 393-408 [pS396, pS404]
ACI-35
VYKS(p)PWSGDTS(p)PRHL (n=16) (SEQ ID NO: 62)
A4-4A6-48
ACI-35-4A6-Ab2
A6-2G5-30
ACI-35-2G5-Ab2
A6-2G5-41
ACI-35-2G5-Ab3
A4-2A1-18
ACI-35-2A1-Ab1
A4-2A1-40
ACI-35-2A1-Ab2
A6-1D2-12
ACI-35-1D2-Ab1
T5: Контрольная последовательность: Tau 379-408 [pS396, pS404]
ACI-37
RENAKAKTDHGAEIVYKS(p)PVVSGDTS(p)PRHL (n=30) (SEQ ID NO: 58)
T8: Tau 206-221 [pT212, PS214]
ACI-39
PGSRSRT(p)PS(p)LPTPPTR (n=16) (SEQ ID NO: 60)
T9: Tau 196-211 [pS202, РТ205]
ACI-40
GYSSPGS(p)PGT(p)PGSRSR (n=16) (SEQ ID NO: 61)
T2: Tau 200-216 [pS202+ PT205 & pT212+pS214]
ACI-34
PGS(p)PGT(p)PGSRSRT(p)PS(p)LP (n=17) (SEQ ID NO: 64)
T10: Tau 407-418 [pS409]
ACI-42
HLS(p)NVSSTGSID (n=12) (SEQ ID NO: 65)
T11: Tau 399-408 [pS404]
ACI-43
VSGDTS(p)PRHL (n=10) (SEQ ID NO: 66)
*На основе самой длинной изоформы Tau человека (Tau441). p обозначает фосфорилированный остаток.
Таблица 2Результаты скрининга ACI-33 гибридом
Скрининг в 24-луночных планшетах
Скрининг во флаконах T25
Положительный в ELISA
Положительный в TAUPIR
Положительный в IgG скрининге
Положительный в ELISA
Положительный в TAUPIR
1A7
1A7
1A11
1C11
1C11
2C9
2C9
3C3
3C3
3C3
3C5
3C5
3E8
3E8
3G10
3G10
3G10
3G10
6C10
6C10
6C10
6C10
6C10
6F3
6F3
6F8
6F8
Таблица 3Результаты скрининга ACI-36 гибридом
Скрининг в 24-луночных планшетах
Скрининг во флаконах T25
Положительный в ELISA
Положительный в TAUPIR
Положительный в IgG скрининге
Положительный в ELISA
Положительный в TAUPIR
2B6
2B6
2B6
2B6
2B6
2F9
2F9
2F9
2F9
2F9
2G1
2G1
2G1
2G1
3A8
3A8
3A8
3A8
3A8
3B9
3B9
3B9
3B9
3F11
3F11
3F11
3F11
4A3
4A3
4C1
4C1
4C1
4C1
4C12
4C12
4C12
4C12
4E12
4E12
4E12
4E12
5E10
5E10
5E10
5F5
5F5
5F5
7D6
7D6
7D6
7D6
7D6
6H1
6H1
6H1
6H1
Таблица 4Ранжирование положительных клонов в ELISA и TAUPIR анализе ACI-36
Ранжирование для ELISA
Ранжирование для TAUPIR
3A8
6H1
2B6
4C1
4C1
3A8
6H1
4C12
4C12
2B6
2G1
2F9
2F9
3B9
7D6
2G1
3B9
7D6
4E12
4E12
Таблица 5Результаты скрининга ACI-41 гибридом
Скрининг в 24-луночных планшетах
Скрининг во флаконах T25
Положительный в ELISA
Положительный в TAUPIR
Положительный в IgG скрининге
Положительный в ELISA
Положительный в TAUPIR
3D11
3D11
3D11
4H6
4H6
4H6
5D10
5D10
5D10
5D10
5D10
5E6
5E6
5F10
5F10
6B7
6B7
6B7
7C2
7C2
7C2
7C2
7C2
8G8
8G8
8H8
8H8
8H8
Таблица 6Скрининг гибридом на связывание с мишенью
Гибридомы
Антитела
ELISA
TAUPIR
Вестерн-блоттинг
Tau p-пептид
Tau пептид
Полно-размерный pTau
Полно-размерный Tau
6C10F9C12A11
ACI-33-6C10-Ab1
+
-
+/-
-
+
-
6C10E5E9C12
ACI-33-6C10-Ab2
+
-
+/-
-
+
-
6H1A11C11
ACI-36-6Н1-Ab1
+
-
+
-
+
+
6H1G6E6
ACI-36-6H1-Ab2
+
-
+
-
+
+
2B6A10C11
ACI-36-2В6-Ab1
+
-
+
-
+
+
2B6G7A12
ACI-36-2B6-Ab2
+
-
+
-
+
+
3A8A12G7
ACI-36-ЗА8-Ab1
+
-
+
-
+
+
3A8E12H8
ACI-36-3A8-Ab2
+
-
+
-/+
+
+
7C2(1)F10C1OD3
ACI-41-7С2-Ab1
+
-
+
-
+
-
7C2(2)B9F11D5
ACI-41-7C2-Ab2
+
-
+
-
+
-
A4-2A1-18
ACI-35-2A1-Ab1
+
-
+
-
A4-2A1-40
ACI-35-2A1-Ab2
+
-
+
-
A4-4A6-18
ACI-35-4А6-Ab1
+
-
-
+
A4-4A6-48
ACi-35-4A6-Ab2
A6-1D2-12
ACI-35-1D2-Ab1
+
-
+
-
A6-2G5-08
ACI-35-2G5-Ab1
+
-
-
-
A6-2G5-30
ACI-35-2G5-Ab2
+
-
+
-
A6-2G5-41
ACI-35-2G5-Ab3
+
-
+
-
Таблица 7Аффинность связывания антител против Tau
Гибридомы
Антитела
Константа скорости ассоциации (k<sub>a</sub>) (1/Мс)
Константа скорости диссоциации (k<sub>d</sub>) (1/с)
Константа диссоциации (K<sub>D</sub>) (нМ)
6C10F9C12A11
АС1-33-6С10-Ab1
9,46×10<sup>5</sup>
3,27×10<sup>-3</sup>
3,46
6H1A11C11
АС1-36-6Н1-Ab1
3,53×10<sup>4</sup>
6,80×10<sup>-5</sup>
1,93
6H1G6E6
ACI-36-6H1-Ab2
9,99×10<sup>4</sup>
9,58×10<sup>-5</sup>
0,96
2B6A10C11
АС1-36-2В6-Ab1
6,90×10<sup>5</sup>
1,63×10<sup>-4</sup>
0,24
2B6G7A12
ACI-36-2B6-Ab2
9,11×10<sup>5</sup>
1,11×10<sup>-4</sup>
0,12
3A8A12G7
АС1-36-3А8-Ab1
1,01×10<sup>6</sup>
1,09×10<sup>-4</sup>
0,11
3A8E12H8
ACI-36-3A8-Ab2
8,43×10<sup>5</sup>
1,43×10<sup>-4</sup>
0,17
A4-4A6-18
ACI-35-4A6-Ab1
2,00×10<sup>5</sup>
3,10×10<sup>-3</sup>
16
A6-1D2-12
ACI-35-1D2-Ab1
1,60×10<sup>3</sup>
9,30×10<sup>-6</sup>
≤6
A6-2G5-08
ACI-35-2G5-Ab1
4,80×10<sup>5</sup>
5,30×10<sup>-3</sup>
10
Таблица 9Аминокислоты и фосфо-остатки Tau, требуемые для связывания с антителом.
Вакцина
Гибридома
Эпитоп*
ACI-33
6C10F9C12A11
Tau а/к 15-20, с необходимостью присутствия pY18
ACI-33
6C10E5E9C12
Tau а/к 15-20, с необходимостью присутствия pY18
ACI-36
6H1A11C11
Tau а/к 405-412, с необходимостью присутствия pS409
ACI-36
6H1G6E6
Tau а/к 405-412, с необходимостью присутствия pS409
ACI-36
2B6A10C11
Tau а/к 405-411, с необходимостью присутствия pS409
ACI-36
2B6G7A12
Tau а/к 405-411, с необходимостью присутствия pS409
ACI-36
3A8A12G7
Tau а/к 405-411, с необходимостью присутствия pS409
ACI-36
3A8E12H8
Tau а/к 405-411, с необходимостью присутствия pS409
ACI-41
7C2(1)F10C10D3
Tau а/к 208-218, с необходимостью присутствия pT212 и pS214
ACI-35
A4-2A1-18
Tau а/к 393-401, с необходимостью присутствия pS396
ACI-35
A4-2A1-40
Tau а/к 393-401, с необходимостью присутствия pS396
ACI-35
A4-4A6-18
Tau а/к 396-401, с необходимостью присутствия pS396
ACI-35
A6-1D2-12
Tau а/к 394-400, с необходимостью присутствия pS396
ACI-35
A6-2G5-08
Tau а/к 402-406, с необходимостью присутствия pS404
ACI-35
A6-2G5-30
Tau а/к 393-400, с необходимостью присутствия pS396
ACI-35
A6-2G5-41
Tau а/к 393-400, с необходимостью присутствия pS396
*На основе самой длинной изоформы Tau человека (Tau441)
Таблица 13Наиболее длинная изоформа Tau человека (441 ак), также называемая Tau40
<img file="00000026.tif" he="84" wi="164" img-content="undefined" img-format="tif" />
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Alonso A.D., et al. (1997), Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.. 94, 298-303
Alving et al.,(1992) Infect. Immun. 60: 2438-2444
Asuni et al., (2007) J Neurosc. 27 (34), 9115-29
Braak H., et al. (1993), Eur.Neurol., 33. 403-408
Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003)
Greenberq S.G., et al. (1992), J Biol.Chem., 267, 564-569.
Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612
Hodgson et al., (1991 ) Bio/Technoloy, 9: 421
Hoffmann R., et al (1997), Biochemistry. 36. 8114-8124.
Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foelier C. Sequences of proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, 1991
Kennedy, J. H., et al., 1976 (Clin. Chim. Acta 70: 1-31)
Khaw, B. A. et al. (1982) J. Nucl. Med. 23: 1011-1019
Lewis et al., (2000) Nature Genetics, 25: 402-405
Masliah et al., (2005) Neuron, 46(6), 857-68
Masliah et al., (2011) PLoS ONE, Volume 6(4), e19338, pp-1-17
Muhs et al., (2007) Proc Natl Acad Sci USA, 104(23), 9810-5
Muvllaert et al, (2006) Rev Neurol, 162(10), 903-907
Muyllaert et al, (2008) Genes Brain Behav., Suppl. 1, 57-66
Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N. Y. (1989))
Nicolau et. al. (2002) Proc Natl. Acad. Sci USA 99, 2332-2337
Nicoll et al., (2003) Nature Med, 9, 448-452
Oddo et al., (2004) Neuron, 43, 321-332
Queen et al.,(1989) Proc. Natl Acad Sci USA, 86: 10029-10032
Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)
Reig S., et al. (1995), Acta Neuropathol., 90, 441-447
Ribe et al., (2005) Neurobiol Dis, 20(3), 814-22
Roberson et al, (2007) Science, 316 (5825), 750-4
Rosenmann et al., (2006) Arch Neurol, 63(10), 1459-67
Rousseaux et al. Methods Enzymology, (1986), Academic Press 121:663-69
Schurs, A. H. W. M., et al. 1977 {Clin. Chim Acta 57:1-40
Terwel et al., (2006) J Biol Chem, 280, 3963-3973
Terwel et al, (2008) Am J pathol., 172(3), 786-98
Urushitiani et al., (2007) Proc. Natl Acad Sci USA, 104(79, 2495-500
Vandebroek et al., "Phosphorylation and Aggregation of Protein Tau in Humanized Yeast Cells and in Transgenic Mouse Brain"; 7th International Conference on Alzheimer's and Parkinson's Disease, Sorrento, Italy, March 9-13, 2005, pp 15-19
Wagner et al (2002) Journal of Liposome Research Vol 12(3), pp 259-270
WO 2004/058258
WO 96/13590
WO 96/29605
U.S. Patent Publication No. 2002/0038086
U.S. Patent Publication No. 2003/0083299
U.S. Patent Publication No. 2002/0025313
U.S. Patent Publication No 2004/0204354
U.S. Patent Publication No 2004/0131692
U.S. Patent Publication No 2002/0065259
U.S. Patent Publication No 2003/0162695
U.S. Patent Publication No 2005/0124533
U.S. Patent Publication No 2005/0089473
U.S. Patent Publication No 2003/0073713
U.S. Patent Publication No 2003/0129186
U.S. Patent No. 5112596,
U.S. Patent No. 5268164,
U.S. Patent No. 5506206,
U.S. Patent No. 5686416
U.S. Patent No. 5004697