Биосинтез молочной кислоты на основе продуктов автогидролиза соломы пшеницы

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ И ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ / PHYSICO-CHEMICAL AND GENERAL BIOLOGY Оригинальная статья / Original article УДК 663.18

DOI: 10.21285/2227-2925-2016-6-3-36-41

БИОСИНТЕЗ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ НА ОСНОВЕ ПРОДУКТОВ АВТОГИДРОЛИЗА СОЛОМЫ ПШЕНИЦЫ

© Е.В. Верхотурова, Т.С. Лозовая, С.Н. Евстафьев

Иркутский национальный исследовательский технический университет

Молочная кислота широко используется в пищевой, химической, фармацевтической и других отраслях промышленности. Получение ее из химически чистых углеводов - дорогостоящий процесс. В качестве альтернативного сырья возможно применение углеводов, выделенных из лигноцеллюлозы. В работе изучена возможность использования в качестве субстрата для молочнокислого брожения фракции жидких продуктов субкритического автогидролиза соломы пшеницы, характеризующихся высоким содержанием сахаров. Продуцентом целевого продукта являлась культура Lactobacillus plantarum BKMB-578. Установлено, что выделенные из соломы пшеницы в субкритических условиях углеводы можно рассматривать в качестве сырья для биосинтеза молочной кислоты. Однако состав как исходных фракций, так и их гидролизатов, оказывает ингибирующее действие на процесс брожения и выход молочной кислоты при использовании их в качестве единственного источника углерода. Наибольшее количество образовавшейся молочной кислоты в условиях эксперимента оказалось равным 2,4 г/л, что составляет 21% от теоретического выхода. Поэтому необходимо выявить ингибиторы брожения и минимизировать их влияние, а также подобрать оптимальные параметры процесса, включающие дозировку фракций и условия брожения.

Ключевые слова: солома пшеницы, субкритический автогидролиз, молочнокислое брожение, молочная кислота, Lactobacillus plantarum BKMB-578.

Формат цитирования: Верхотурова Е.В., Лозовая Т.С., Евстафьев С.Н. Биосинтез молочной кислоты на основе продуктов автогидролиза соломы пшеницы // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2016. Т. 6, N 3. С. 36-41. DOI: 10.21285/2227-2925-2016-6-3-36-41

BIOSYNTHESIS OF LACTIC ACID VIA FERMENTATION OF WHEAT STRAW AUTOHYDROLYSIS PRODUCTS

E.V. Verkhoturova, T.S. Lozovaya, S.N. Evstafev

Irkutsk National Research Technical University

Lactic acid is commonly used in food, chemical, pharmaceutical industry and other fields. It is expensive to produce it from chemically pure carbohydrates. The sugars isolated from lignocellulosic material could be an attractive alternative primary product to obtain lactic acid. In this study, the feasibility of wheat straw autohy-drolysis products as a substrate for lactic fermentation was evaluated so far as they are characterized by high content of sugars. We used Lactobacillus plantarum VKM B-578 as the lactic acid producer. The sugars isolated from wheat straw under the subcritical conditions could be used as a substrate for lactic acid biosynthesis. Both initial fraction and their hydrolyzates inhibited fermentation and lactic acid yield when used as the only source of carbon. The largest yield of lactic acid was found to be 2.4 g/l or 21% of theoretically possible under the experiment condition. Therefore the fermentation inhibitors should be detected and theirs effect should be minimized, in addition, optimal conditions including the fraction dosage and the fermentation parameters should be ascertained.

Keywords: wheat straw, subcritical autohydrolysis, lactic fermentation, lactic acid, Lactobacillus plantarum BKMB-578

For citation: Verkhoturova E.V., Lozovaya T.S., Evstafev S.N. Lactic acid production from wheat straw products autohidrolysis. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Biotekhnologiya [Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology]. 2016, vol. 6, no 3, pp. 36-41. DOI: 10.21285/2227-2925-2016-6-3-36-41

ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПРИКЛАДНАЯ ХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ Том 6 N 3 2016

ВВЕДЕНИЕ

Отходы сельскохозяйственного производства, в том числе солома пшеницы, представляют собой богатый источник полисахаридов, которые могут быть использованы в качестве сырья для получения различных продуктов, в том числе молочной кислоты. Но для их извлечения необходима предварительная обработка сырья сцелью разрушения лигноцеллюлозного комплекса.

На сегодняшний день имеется достаточно обширный выбор методов предподготовки и их различных комбинаций, основанных на физическом, химическом, физико-химическом и биологическом воздействии на компоненты растительной биомассы [1]. Обработка лигноцеллю-лозного сырья водой в субкритических условиях позволяет практически полностью гидролизо-вать гемицеллюлозы и, частично, - целлюлозу с образованием смеси олиго- и моносахаридов [2], которые могут служить сырьем для микробиологического синтеза.

Молочную кислоту используют в пищевой, химической, фармацевтической и других отраслях промышленности. Одним из современных перспективных направлений применения молочной кислоты является получение на ее основе биоразлагаемых полимеров [3].

Цель работы заключалась в изучении возможности использования углеводов, выделенных из соломы пшеницы в условиях субкритического автогидролиза, в качестве субстрата для получения молочной кислоты.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Автогидролиз соломы осуществляли в динамических условиях на лабораторной экстракционной установке субкритической водой при температуре 200 оС, давлении 30 МПа и продолжительности 60 мин [4]. Жидкие продукты автогидролиза после отгона воды фракционировали по схеме, изображенной на рис. 1. В качестве субстратов для молочнокислого брожения использовали фракции НВР и ЭНП.

В качестве продуцента молочной кислоты использовали культуру бактерий Lactobacillus plantarum BKMB-578, полученную из Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Чистую культуру бактерий поддерживали на питательной среде следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт - 5; мясной экстракт - 1,2; глюкоза - 2,5; цитрат аммония - 2; ацетат натрия - 5; твин-80 - 1; K2HPO4 - 2; MgSO4?H2O - 0,2; MnSO4x4H2O - 0,05. рН - 6,0-6,5. Пересев культуры осуществляли 1 раз в месяц.

Культивирование бактерий в процессе эксперимента осуществляли в анаэробных условиях в жидкой питательной среде МРС [5] при температуре 30 оС в течение 72 ч. Состав среды МРС, г/л: дрожжевой экстракт - 5; мясной экстракт - 10; пептон - 10; источник углерода -20; цитрат аммония - 2; ацетат натрия - 5; твин-80 - 1; K2HPO4 - 2; MgSO4x7H2O - 0,2; MnSO44H2O - 0,05. рН среды доводили до 6,26,6. В качестве источника углерода использовали: глюкозу; смесь химически чистых моносахаридов (глюкоза, галактоза, манноза, рамноза,

жидкие продукты

}

экстракция гексаном

I

экстракция этанолом

I

экстракция водой

I

остаток

нерастворимые в воде соединения при 20 °°С

J

гексановый экстракт

этанолнерастворимые продукты

низкомолекулярные водорастворимые соединения

Рис. 1. Схема фракционирования жидких продуктов автогидролиза

ксилоза, фруктоза и арабиноза); исходную фракцию НВР; гидролизаты фракций НВР и ЭНП.

Питательные среды стерилизовали при 111 оС в течение 20 мин, рН сред после стерилизации при необходимости корректировали стерильными 0,1 н растворами NaOH или HCl.

Теоретический выход молочной кислоты при сбраживании глюкозы рассчитывали согласно гомоферментативному механизму, а при сбраживании смесей моносахаридов и фракций НВР и ЭНП - согласно гетероферментативно-му, без учета образования углекислого газа.

Кислотный гидролиз фракций проводили 2М раствором трифторуксусной кислоты [3]. Кислоту добавляли в количестве 1 см3 на 0,1 г сухой фракции. После охлаждения до комнатной температуры кислоту нейтрализовали, а фракции лиофильно высушивали.

Количество молочной и уксусной кислот определяли методом ГХ-МС на газовом хроматографе 7820 А с селективным масс-спек-трометрическим детектором НР 5975 фирмы «Agilent Technologies». Энергия ионизации -70 эВ. Температура сепаратора - 280 оС, ионного источника - 230 оС. Кварцевая колонка 30 000 х 0,25 мм со стационарной фазой (95% диметил-5% дифенилполисилоксан). Условия анализа: изотермический режим при 100 оС. В качестве внутреннего стандарта использовали ацетонитрил. Идентификацию компонентов осуществляли с использованием библиотеки масс-спектров «NIST 11». Количественное содержание молочной и уксусной кислот вычисляли методом внутренней нормализации по площадям пиков с учетом корректирующих коэффициентов чувствительности.

Все эксперименты проводились в трех по-вторностях и обрабатывались статистически.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Состав фракций после автогидролиза соломы и выбор продуцента. Выход сахаров из биомассы соломы пшеницы при автогидролизе в интервале температур 150-290 оС (30 МПа, 60 мин) проходит через максимум при 200 оС и составляет 29,7% на а.с.м. соломы [2].

По данным ГХ-МС гидролизаты фракций ЭНП и НВР, полученные при температуре 200 оС, на 63-77% представлены углеводами. Основными компонентами фракции НВР являются моносахариды, представленные ксилозой, арабинозой, глюкозой, галактозой, фруктозой, маннозой и рамнозой, а компонентами фракции ЭНП - оли-госахариды, на долю которых приходится более 60% (табл. 1). В составе исходных фракций и их гидролизатов доминирующими моносахаридами являются пентозы с относительным содержанием до 50%. В соответствии с особенностями моноса-харидного состава исследуемых фракций необходимо было выбрать культуру молочнокислых

бактерий, способную усваивать как гексозы, так и пентозы. Подходящим объектом является вид Lactobacillus plantarum: он способен сбраживать гексозы (глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу) по гликолитическому пути с образованием преимущественно молочной кислоты и пентозы (ара-бинозу, ксилозу) по пентозофосфатому пути с образованием молочной и уксусной кислот [5]. Известен пример сбраживания сульфитных щелоков культурой L. plantarum с получением молочной и уксусной кислот с примерно одинаковым выходом [6]. В другой работе иммобилизованные в альгинат-Са клетки L. plantarum ETH В-4258 оказались лучшим биокатализатором для переработ-

1

ки гидролизатов древесины .

В связи с вышесказанным выбор культуры Lactobacillus plantarum для сбраживания продуктов субкритического автогидролиза, содержащих как пентозы, так и гексозы, является обоснованным.

По данным метода ГХ-МС, кроме моно- и олигосахаридов, в составе фракций НВР и ЭНП присутствуют и другие компоненты, представленные алканами, аминокислотами, многоатомными спиртами, одно-, двух- и трехосновными карбоно-выми кислотами, гидроксикислотами, лактонами, а также ароматическими соединениями (табл. 2). Обнаруженные в составе гидролизатов аминокислоты треонин, валин, серин и глутаминовая кислота относятся к необходимым элементам питательной среды, так как могут стимулировать рост и развитие культур молочнокислых бактерий.

Идентифицированные в составе фракций многоатомные спирты можно рассматривать в качестве дополнительных питательных элементов. В преобладающих количествах обнаружен глицерин. Его доля во фракции НВР составляет около 50%, а во фракции ЭНП - более 96% от суммы идентифицированных спиртов. А вот сорбит и инозитол не усваиваются данной культурой молочнокислых бактерий. И если содержание сорбита составляет всего 3,7% от суммы спиртов фракции ЭНП, то во фракции НВР его более 50%.

По потребности в питательных веществах молочнокислые бактерии относятся к наиболее требовательным микроорганизмам. В качестве источника углерода, кроме моно- и дисахаридов, они могут использовать органические кислоты. Так, например, рост молочнокислых бактерий могут стимулировать уксусная и олеиновая кислоты, а также лимонная кислота 2. Уксусная и олеиновая кислоты были обнаружены только в составе фракции ЭНП в количестве 16 и 40%, cоответст-

Воробьева Л.И. Промышленная микробиология: учеб. пособие. М.: МГУ, 1989. 294 с.

Аркадьева З.А., Безбородов А.М., Блохина И.Н. Промышленная микробиология: учеб. пособие для вузов по спец. «Микробиология» и «Биология» / Под ред. Н.С. Егорова. М.: Высш. шк., 1989. 688 с.

Таблица 1

Моносахаридный состав исходных фракций НВР и ЭНП и их гидролизатов, в % масс.

Ara Xyl Man Gal Gle Fru Rha Сумма

Фракция НВР: исходная 15,0 13,0 0,3 2,8 19,9 10,0 0,3 61,3

гидролизат 14,2 35,1 0,3 3,9 20,4 2,0 1,1 77,0

Фракция ЭНП: исходная 0,8 0,7 0,0 0,1 0,9 0,2 0,0 2,7

гидролизат 16,8 26,9 0,2 3,0 14,6 1,9 0,0 63,4

Таблица 2

Компонентный состав гидролизатов фракций, в % отн.

Наименование компонента Фракция

ЭНП НВР

Алканы 1,75 0,79

Аминокислоты 1,22 1,57

Спирты 42,22 30,98

Карбоновые кислоты:

одноосновные 2,19 0

двухосновные 1,22 13,47

трехосновные 22,64 2,58

Гидроксикислоты 27,97 38,83

Ароматические соединения 0 10,44

Лактоны 0,79 1,35

венно, от суммы одноосновных карбоновых кислот (или 0,3 и 0,9% от суммы идентифицированных соединений). Количество лимонной кислоты в составе фракции ЭНП значительно выше, чем во фракции НВР, и составляло 22,6%. Однако стимулирующий эффект возможен лишь при условии низкой концентрации перечисленных кислот в питательной среде, от 0,01 до 0,2%, редко до 5%, и зависит от культуры молочнокислых бактерий [7]. Содержание перечисленных органических кислот в составе фракций определено не количественно, поэтому пока нельзя определить, как именно они влияют на развитие данного штамма Lactobacillus plantarum.

Ароматические соединения, обнаруженные только в составе фракции НВР в количестве 10,4%, являются нежелательными компонентами, так как они могут оказывать ингибирующий эффект на развитие микроорганизмов и ход брожения в целом. К таким соединениям также можно отнести лактон триоксибутановой кислоты, но его содержание в составе фракций мало и составляет 0,8-1,4%.

Брожение с использованием химически чистых источников углерода. Далее исследовали образование молочной кислоты на среде МРС с использованием в качестве источника углерода химически чистых соединений, таких как:

- глюкоза;

- смеси сахаров (соответствующих по составу моносахаридам исходной фракции НВР (СМ-1) и гидролизатам фракций НВР (сМ-2) и ЭНП (СМ-3).

Состав смесей был рассчитан таким образом, чтобы суммарное содержание моносахаридов в них составляло 20 г/л. Образование молочной кислоты при сбраживании химически чистых моносахаридов представлено на рис. 2.

При сбраживании глюкозы через 72 ч количество молочной кислоты достигло 17,8 г/л, что составило 89% от теоретического выхода. При сбраживании искусственных смесей моносахаридов СМ-1, СМ-2 и СМ-3 образование молочной кислоты было ниже 8,1, 9,1 и 8,6 г/л соответственно. Это составило 74-80% от теоретического выхода. В составе продуктов брожения смесей моносахаридов была обнаружена уксусная кислота в количестве 2,6, 4,1 и 3,8 г/л.

Скорость образования молочной кислоты при сбраживании химически чистых моносахаридов также оказалась различной. Через 24 ч сбраживания глюкозы образовалось более 80% молочной кислоты, а при сбраживании смесей моносахаридов за этот же период - менее 60%, что свидетельствует о более медленном процессе усвоения пентоз выбранной культурой в сравнении с гексозами.

Брожение с использованием фракций ЭНП и НВР в качестве источников углерода. Далее исследовали образование молочной кислоты на среде МРС с использованием в качестве единственного источника углерода исследуемые фракции и их гидролизаты. Результаты экспериментов представлены в табл. 3. Исходную фракцию ЭНП не использовали для брожения, так как она в основном состоит из олигосахаридов, которые

20

5 15 ц

о

10

т

О Ц

о s

CI о

X

m

10

20

30 40 50 Продолжительность брожения, ч

Глюкоза ——СМ-1 -О-СМ-2

т-60

-г-

70

-CM-3

п 80

Рис. 2. Образование молочной кислоты в зависимости от природы источника углерода и продолжительности брожения

Выход молочной и уксусной кислот в результате сбраживания фракций

Таблица 3

Источник углерода Выход кислоты, г/л

молочная уксусная

Фракция НВР: исходная гидролизат 1,6 ± 0,1 (15)* 2,4 ± 0,2 (21) 0,58 ± 0,05 1,03 ± 0,02

Фракция ЭНП: гидролизат 1,9 ± 0,1 (17) 0,65 ± 0,07

Примечание: * в скобках указан процент выхода молочной кислоты от теоретического выхода.

используемая культура бактерий не способна усваивать.

Из табл. 3 видно, что выход молочной кислоты оказался в 3-4 раза меньше в сравнении с брожением на искусственных смесях моносахаридов. Причиной этого, вероятно, является наличие неизвестных ингибиторов процесса брожения, присутствующих во фракциях НВР и ЭНП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований показано, что продукты гидролиза полисахаридов, выделенные из соломы пшеницы в субкритических условиях автогидролиза, могут быть исполь-

зованы в качестве сырья для биосинтеза молочной кислоты.

Максимальный выход молочной кислоты в условиях эксперимента наблюдался при сбраживании гидролизата фракции НВР и составил 2,4 г/л или 21% от теоретического выхода.

В связи с низким практическим выходом молочной кислоты требуются дополнительные исследования в направлении выявления ингибиторов брожения и минимизации их влияния, а также подбор оптимальных параметров процесса, включающих дозировку фракций и условия брожения.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИИ СПИСОК

1. Agbor V.B., Cicek N., Sparling R., Berlin A., Levin D.B. Biomass pretreatment: Fundamentals toward application // Biotechnology Advances. 2011. Vol. 29, N 6. P. 675-685. DOI:10.1016/j.biotechadv. 2011.05.005

2. Евстафьев С.Н., Чечикова Е.В. Превращения полисахаридов соломы пшеницы в динамических условиях процесса субкритического автогидролиза // Химия растительного сырья. 2015. N 1. С.41-49.

3. Wang Y., Tashiro Y., Sonomoto K. Fermentative production of lactic acid from re-newable materials: Recent achievements, prospects, and limits. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2015. Vol. 119, N 1. P. 10-18. DO I:10.1016/j .jbiosc.2014.06.003

4. Евстафьев С.Н., Фомина Е.С., Привалова Е.А. Этанолиз пшеничной соломы в условиях дои сверхкритической экстракции // Химия растительного сырья. 2011. N 4. С. 15-18.

5. Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молоч-

5

0

0

нокислые бактерии и пути их применения. М.: Наука, 1975. 384 с.

6. Мосичев М.С., Складнев А.А., Котов В.Б. Общая технология микробиологических произ-

водств. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. 264 с.

7. Бурьян Н.И. Практическая микробиология виноделия. Симферополь: Таврида, 2003. 560 с.

REFERENCES

1. Agbor V.B., Cicek N., Sparling R., Berlin A., Levin D.B. Biomass pretreatment: Fundamentals toward application. Biotechnology Advances. 2011, vol. 29, no. 6, pp. 675-685. doi:10.1016/j.biote-chadv.2011.05.005

2. Evstafev S.N., Chechikova E.V. Transformations of wheat straw polysaccharides in dynamic conditions of subcritical autohydrolysis. Khimiya ras-titel'nogo syr"ya [Chemistry of plant raw material]. 2015, no. 1, pp. 41-49.

3. Wang Y., Tashiro Y., Sonomoto K. Fermentative production of lactic acid from re-newable materials: Recent achievements, prospects, and limits. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2015, no. 1, vol. 119, pp. 10-18. doi:10.1016j.jbi osc2014.06.003

4. Evstafev S.N., Fomina E.S., Privalova E.A.

Ethanolysis of wheat straw at the conditions of sub-and supercritical extraction. Khimiya rastitel'nogo syr"ya [Chemistry of plant raw material]. 2011, no. 4, pp. 15-18.

5. Kvasnikov E. I., Nesterenko O. A. Mo-lochnokislye bakterii i puti ikh primeneniya [Lactic acid bacteria and ways of their application]. Moscow, Nauka Publ., 1975, 384 p.

6. Mosichev M. S., Skladnee A. A., Kotov V. B. Obshchaya tekhnologiya mikrobiologicheskikh pro-izvodstv [General technology of microbiological productions]. Moscow, Legkaya i pishchevaya pro-myshlennost' Publ., 1982, 264 p.

7. Bur'yan N.I. Prakticheskaya mikrobiologiya vinodeliya [Practical microbiology of winemaking]. Simferopol', Tavrida Publ., 2003. 560 p.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Принадлежность к организации

Елена В. Верхотурова

Иркутский национальный исследовательский

технический университет

664074, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 83

Аспирант

vev.irkutsk@gmail.com Татьяна С. Лозовая

Иркутский национальный исследовательский

технический университет

664074, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 83

К.б.н., доцент

tnike75@mail.ru

Сергей Н. Евстафьев

Иркутский национальный исследовательский

технический университет

664074, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 83

Д.х.н., профессор

esn@istu.edu

Поступила 25.05.2016

AUTHORS' INDEX Affiliations

Elena V. Verkhoturova

Irkutsk National Research Technical University 83, Lermontov St., Irkutsk, 664074, Russia Postgraduate student vev.irkutsk@gmail.com

Tatyana S. Lozovaya

Irkutsk National Research Technical University 83, Lermontov St., Irkutsk, 664074, Russia PhD of Biology, Associated professor tnike75@mail.ru

Sergei N. Evstaf'ev

Irkutsk National Research Technical University 83, Lermontov St., Irkutsk, 664074, Russia Doctor of Chemistry, Professor esn@istu.edu

Received 25.05.2016