Гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (Fab) против шига-токсинов первого и/или второго типов (варианты), композиция для лечения токсических состояний, вызванных энтерогеморрагической кишечной палочкой, содержащая указанные антитела и/или Fab
HUMANISED ANTIBODY OR ITS ANTIGEN-BINDING FRAGMENT (FAB) AGAINST FIRST AND/OR SECOND TYPE SHIGA LIKE TOXINS (EMBODIMENTS), COMPOSITION FOR TREATING ENTEROHAEMORRHAGIC ESCHERICHIA COLI TOXIC CONDITIONS, CONTAINING SAID ANTIBODIES AND/OR FAB

Область техники
Настоящее изобретение относится к антителам, в частности к гуманизированным антителам или их антигенсвязывающим фрагментам (Fab), связывающих шига-токсины Stx1 и/или Stx2 и нейтрализующие их. Также настоящее изобретение относится к композиции, содержащей указанные антитела или их Fab, для лечения токсических состояний, вызванных энтерогеморрагической кишечной палочкой.
Предшествующий уровень техники
Ежегодно в мире, в том числе в экономически благополучных странах почти 3 млн. человек инфицируются энтерогеморрагической кишечной палочкой Escherichia coli, продуцирующей шигаподобные токсины первого и/или второго типов (Stx1 и Stx2, соответственно). У 10% инфицированных развивается гемолитико-уремический синдром (ГУС), зачастую приводящий к инвалидности или смерти. Причиной возникновения ГУС является воздействие шигаподобных токсинов на клетки эпителия сосудов почечных канальцев и мозга. Связываясь с рецептором gb3, молекулы Stx проникают в цитоплазму эпителиальных клеток и инактивируют рибосомы, что приводит к остановке белкового синтеза и клеточной гибели. В результате повреждения сосудов развиваются угрожающие жизни токсические состояния, такие как острая почечная недостаточность и токсическая энцефалопатия. В настоящее время пациентам с гемолитико-уремическим синдромом доступно лишь симптоматическое лечение, не всегда приводящее к полному выздоровлению. При гемолитико-уремическом синдроме применяют гемодиализ, а в тяжелых случаях пересадку почек, эти меры позволяют лишь смягчить проявления ГУС, но не остановить его развитие. Более специфическим методом воздействия на развитие ГУС является применение препарата Soliris (eculizumab) - моноклонального антитела против С5 компонента комплемента (Patheon Italia, Италия; Patheon Manufacturing Services, США; WO 2016094834 A2). Однако этот препарат позволяет воздействовать лишь на одну из составляющих ГУС - неадекватное развитие реакций системы комплемента. Кроме того, его использование сильно ограничено высокой ценой.
На настоящий момент известен ряд патентных документов, описывающих различные варианты антител против шига-токсинов.
WO9932645 A1 описывает получение и использование биологически и иммунологически активных гуманизированных моноклональных антител к токсину Шига, токсину, связанному с HC, и потенциально опасным для жизни HUS, передаваемому штаммами патогенных бактерий. В частности, описаны человеческие моноклональные антитела, полученные из мышиных моноклональных антител 13C4 и 11E10, которые специфически реагируют со Stxl и Stx2 соответственно. Одним из аспектов изобретения является гуманизированное моноклональное антитело, которое связывает токсин Шига, где константные области являются IG1-каппа, а вариабельные области являются мышиными по происхождению.
WO2007143004 A2 включает способы, композиции и наборы для лечения субъекта, имеющего ассоциированное с шига токсином заболевание, химерными антителами против ShigaToxin 1 (caStxl) и анти-ShigaToxin 2 (caStx2), где указанные химерные анти-Stxl и химерные анти- Stx2 антитела вводятся совместно. Препарат, содержащий смесь этих двух антител известен под названием ShigamAbs (Thallion Pharmaceuticals Inc., Канада).
WO2007124133 A2 относится к способам получения антител против Stxl, специфичных к эпитопу 13C4 белка Stxl. Кроме того, изобретение относится к способам лечения субъекта, имеющего или подверженного риску развития, связанного с шига-токсином (например, синдрома гемолитической уремии и заболеваний, связанных с инфекцией E. coli и S. dysenteriae) с полипептидом, который включает эпитоп 13C4 или с антителом против Stxl, разработанным с использованием способов по изобретению.
WO2014191904 A1 относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически связывают B-субъединицу токсина Шига, при условии, что он содержит CDR3 последовательности NLRGXaaNY (SEQIDNO: 6), где Xaa представляет собой S, T или A. Также раскрыты фармацевтические композиции, включающие антитела или антигенсвязывающие фрагменты, способ получения антител и антигенсвязывающих фрагментов и способ лечения гемолитически-уремического синдрома (HUS) у субъекта.
В патенте US 9310368 B1 описаны высокоаффинные моноклональные антитела против Stx2 и гибридомы, которые продуцируют такие антитела. Антитела могут быть использованы в наборе для обнаружения Stx2 и его вариантов в образце, а также в нейтрализации шига-токсина in vivo.
Патент CN 101570574 B относится к антителу против I типа шига-токсина. Антитело обладает эффектами нейтрализации токсина шига и эффективного ингибирования токсичности шига-токсина, может быть использовано в качестве перорального антитоксина для профилактики и лечения осложнений, вызванных токсино-продуцирующей шигеллой, энтерогеморрагической кишечной палочкой O157, холерным вибрионом и т.п. и может применяться одновременно для выявления и диагностики инфекции шига-токсина I типа и его патогена.
Патент CN 101357942 B относится к технологической области биоинженерной медицины, более конкретно к моноклональным антителам, нейтрализующим энтерогеморрагические эшерихические колиты O157: H7 shiga toxinII, последовательности Fab-антител и применение. Моноклональное антитело получают штаммами гибридомных клеток с сохранением количества CCTCC: C200822. Антитело можно использовать для приготовления лекарств для диагностики и лечения инфекций EHECO157 и их осложняющих заболеваний.
Патент CN103319593 B раскрывает анти-StxII моноклональное антитело, которое имеет аминокислотную последовательность тяжелой цепи, представленную таблицей последовательностей SEQ ID NO.2, и аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную таблицей последовательностей SEQ ID NO.4, где аминокислотные последовательности комплементарных определяющих областей CDR1, CDR2 и CDR3 в последовательности вариабельной области тяжелой цепи соответственно представлены таблицами последовательностей SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 и аминокислотными последовательностями комплементарных определяющих областей CDR1, CDR2 и CDR3 в последовательности вариабельной области легкой цепи соответственно представлены в таблицах последовательностей SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10.
Также известен препарат Urtoxazumab (Creative Biolabs, США), представляющий собой рекомбинантное антитело только против Stx2 (Lopez E.L. и др., Safety and Pharmacokinetics of Urtoxazumab, a Humanized Monoclonal Antibody, against Shiga-Like Toxin 2 in Healthy Adults and in Pediatric Patients Infected with Shiga-Like Toxin-Producing Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother. 2010 Jan; 54(1): 239-243).
Ни в одном из указанных выше документов не раскрыто кросс-реактивное антитело против Stx1 и Stx2.
Отсутствие в настоящее время эффективных средств для предотвращения и купирования гемолитико-уремического синдрома (ГУС) является серьёзной проблемой, и поэтому разработка нового лекарственного средства для лечения токсических состояний, вызванных энтерогеморрагической кишечной палочкой, является крайне актуальной задачей.
Краткое описание изобретения
Целью настоящего изобретения является получение антител, в частности гуманизированных антител или их антигенсвязывающих фрагментов (Fab), связывающих шига-токсины Stx1 и/или Stx2 и нейтрализующие их. Также настоящее изобретение относится к композиции, содержащей указанные антитела или их Fab, для лечения токсических состояний, вызванных энтерогеморрагической кишечной палочкой.
Указанная цель была достигнута путём выделения двух мышиных антител, одно из которых является кросс-реактивным и обладает способностью к эффективному связыванию шига-токсинов как первого, так и второго типов (Stx1 и Stx2), а второе обладает способностью к эффективному связыванию шига-токсина второго типа, определения последовательности вариабельных участков указанных антител и получения на их основе двух гуманизированных антител, связывающих шига-токсины Stx1 и/или Stx2 и нейтрализующие их. Полученные антитела использовали для создания композиции для лечения токсических состояний, вызванных энтерогеморрагической кишечной палочкой.
,
Таким образом, настоящее изобретение представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (Fab), селективно связывающееся(ийся) с шигаподобными токсинами первого и второго типов и нейтрализующее(ий) их содержащее(ий) CDR1 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 1, CDR2 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 2, и CDR3 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 3 тяжёлой цепи, и CDR1 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 4, CDR2 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:5 , и CDR3 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 6 лёгкой цепи.
Также настоящее изобретение представляет собой гуманизированное антитело, описанное выше, содержащее последовательность аминокислот SEQ ID NO: 7 тяжёлой цепи, содержащей вариабельный домен и константную область IgG1 человека, и последовательность аминокислот SEQ ID NO: 8 лёгкой цепи, содержащей вариабельный домен и константную область C-kappa человека.
,
Также настоящее изобретение представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (Fab), селективно связывающееся(ийся) с шигаподобным токсином второго типа и нейтрализующее(ий) его содержащее(ий) CDR1 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 11, CDR2 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 12, и CDR3 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 13 тяжёлой цепи, и CDR1 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 14, CDR2 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 15, и CDR3 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 16 лёгкой цепи.
Также настоящее изобретение представляет собой гуманизированное антитело, описанное выше, содержащее последовательность аминокислот SEQ ID NO: 15 тяжёлой цепи, содержащей вариабельный домен и константную область IgG1 человека, и последовательность аминокислот SEQ ID NO: 16 лёгкой цепи, содержащей вариабельный домен и константную область C-kappa человека.
Также настоящее изобретение представляет собой композицию для лечения токсических состояний, вызванных энтерогеморрагической кишечной палочкой, содержащую смесь указанных выше гуманизированных антител или их Fab.
Краткое описание рисунков
На Фиг. 1 показаны результаты иммуноферментного анализа по связыванию гуманизированных антител Н8-hum и Н4-hum с шига-токсином Stx2 в сравнении с контрольным гуманизированным антителом против гликопротеина вируса бешенства.
На Фиг. 2 показаны результаты иммуноферментного анализа по связыванию гуманизированных антител Н8-hum и Н4-hum с шига-токсином Stx1 в сравнении с контрольным гуманизированным антителом против гликопротеина вируса бешенства.
На Фиг. 3 показаны результаты нейтрализация in vitro токсического действия шига-токсина Stx1 гуманизированными антителами Н8-hum и Н4-hum.
На Фиг. 4 показаны результаты нейтрализация in vitro токсического действия шига-токсина Stx2 гуманизированными антителами Н8-hum и Н4-hum.
В Таб. 1 приведены показатели эффективности композиции нейтрализующих антител против Stx1 и Stx2 in vivo.
Подробное описание настоящего изобретения
Для предотвращения или купирования токсических состояний у пациентов, инфицированных энтерогеморрагической кишечной палочкой, необходима нейтрализация действия проникающих в кровоток шигаподобных токсинов. Специфических антидотов шига- подобных токсинов в клинической практике нет.
Нейтрализующие антитела против Stx способны предотвратить или купировать развитие ГУС. Для наиболее эффективной нейтрализации требуется не менее двух полноразмерных антител, направленных к разным эпитопам Stx. Вводимые антитела должны быть гуманизированы во избежание нежелательных иммунных реакций организма пациента. В связи с высокой мутационной изменчивостью шигаподобных токсинов, главным образом Stx2, важной задачей является поиск универсального нейтрализующего антитела, реагирующего с консервативными эпитопами токсинов. Для клинических целей предпочтительным является использование смеси нескольких антител, связывающихся с консервативными эпитопами токсинов различных типов.
В рамках настоящего изобретения удалось получить два таких моноклональных мышиных антитела, обладающих высокой степенью связывания с нейтрализующими эпитопами токсинов и эффективно нейтрализующих их: одно кросс-реактивное антитело против шига-токсинов как первого, так и второго типов, второе - против шига-токсинов второго типа.
Затем авторы настоящего изобретения клонировали гены, кодирующие вариабельные домены тяжёлой и лёгкой цепей мышиных антител против шигоподобных токсинов Stx1 и/или Stx2, и определили их последовательности.
После этого были осуществлены дизайн и гуманизация указанных мышиных антител против шига-токсинов Stx1 и/или Stx2 с получением гуманизированных антител, тяжёлая цепи которых содержит вариабельный домен и константную область IgG1 человека, а лёгкая цепи - вариабельный домен и константную область C-kappa человека.
На основе полученных гуманизированных антител была создана композиция для лечения токсических состояний, вызванных энтерогеморрагической кишечной палочкой. На модели с использованием мышей линии Balb/c показана высокая эффективность указанной композиции от токсического действия шига-токсина второго типа.
Так было выполнено настоящее изобретение.
Антитела обычно состоят из двух тяжёлых цепей, связанных между собой дисульфидными связями, и лёгких цепей, ассоциированных с N-концом каждой из тяжёлых цепей. Каждая тяжёлая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Каждая лёгкая цепь также содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом. Вариабельные домены каждой пары лёгкой и тяжёлой цепей образуют антигенсвязывающий фрагмент (Fab). Вариабельные домены лёгкой и тяжёлой цепей обладают похожей общей структурой, и каждый домен включает каркас из четырёх участков, последовательности которых являются относительно консервативными, связанных посредством трёх участков, определяющих комплементарность (complementarity determining regions, CDRs).
Термин “CDR” или “участок, определяющий комплементарность” относится к тем частям тяжелой и легкой цепи антитела, которые расположены в непосредственной близости друг от друга в трехмерном пространстве и формируют антиген-связывающую поверхность антитела.
Четыре каркасных участка формируют конформацию типа бета-складчатого слоя, а CDRs образуют петли, связывающие конструкцию из бета-складчатого слоя. Участки CDRs расположены в непосредственной близости друг от друга благодаря каркасным участкам и вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка. Участки CDRs и каркасные участки антител могут быть определены путём ссылки на нумерационную систему Кабата (Kabat numbering system, Kabat et al., (1987) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office) в сочетании in conjunction with x-ray crystallography, as set forth in WO91/09967.
Для получения антитела, которое может связываться с каким-либо специфическим антигеном, обычно используют методику Kohler и Milstein (Kohler et al., (1976) Nature 256:495-497), получившую название гибридόмной технологии. Суть метода сводится к получению культуры «бессмертных» гибридов (гибридόм) путём слияния В-лимфоцита, продуцирующего антитела, и опухолевой клетки (миеломы или плазмоцитомы). Полученная гибридόма способна продуцировать моноклональные антитела (как В-клетка) и при этом бесконечно делится (как опухолевая клетка), что позволяет достаточно долгое время секретировать in vitro или in vivo антитело, специфическое для целевого антигена.
Слияние клеток происходит под действием полиэтиленгликоля, изолецитина или вируса Сендай. На следующем этапе необходимо отобрать неслившиеся с лимфоцитами миеломные клетки (неслившиеся лимфоциты убирать не нужно: через недолгое время они погибнут сами). В процессе такой селекции гибридόмные клетки высаживают на среды, содержащие вещества, блокирующие синтез нуклеотидов миеломными клетками. Для этого выведены специальные мутантные миеломные клеточные линии, дефектные по некоторым ферментам, участвующим в синтезе нуклеотидов.
Отбор гибридόм, секретирующих нужные антитела, проводится путём проверки среды, в которой росли клетки, на предмет наличия в ней антител нужной специфичности.
Таким образом отбирают клетки, секретирующие антитела стабильно и в достаточном количестве. Большой объём антител нарабатывают или in vitro, или путём введения гибридом в перитонеальную полость мышей для получения асцита (Свешников, П.Г. Введение в молекулярную иммунологию и гибридомную технологию / П.Г. Свешников, В.В. Малайцев, И.М. Богданова, О.Н. Солопова, изд. МГУ, М., 2006).
Получение материала, использующегося в качестве антигена, для инъекций животных включают в себя методики, хорошо известные из уровня техники, например, использование полноразмерного белка, использование пептида, выбранного из иммуногенных участков белка, модифицирование антигена такими способами как, например, связывание с динитрофенолом, связывание с арсаниловой кислотой, денатурация антигена, связывание антигена с белком-переносчиком, таким как, например, гемоцианин улитки, с пептидами, содержащими участки связывания с рецепторами Т-клеток класса II, с бусинами, а также любыми другими методами, известными из уровня техники. Смотри, например, Harlow и др. Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1988.
.
Авторами настоящего изобретения были получены два гуманизированных антитела, Н8 и Н4, обладающих способностью к специфическому связыванию шига-токсинов Stx1 и/или Stx2 и их эффективной нейтрализации, причем первое антитело Н8 является кросс-реактивным и обладает способностью к специфическому связыванию шига-токсинов как первого, так и второго типов, а второе антитело Н4 обладает способностью к специфическому эффективному связыванию шига-токсинов второго типа
Антитело против шига-токсинов как первого, так и второго типов согласно настоящему изобретению содержит CDR1 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 1, CDR2 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 2, и CDR3 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 3 тяжёлой цепи, и CDR1 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 4, CDR2 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 5, и CDR3 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 6 лёгкой цепи.
Антитело против шига-токсинов второго типов согласно настоящему изобретению содержит CDR1 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 11, CDR2 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 12, и CDR3 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 13 тяжёлой цепи, и CDR1 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 14, CDR2 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 15, и CDR3 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 16 лёгкой цепи.
Указанные выше антитела предпочтительно являются гуманизированными.
В частности, конкретным вариантом воплощения указанного гуманизированного антитела против шига-токсинов как первого, так и второго типов является антитело Н8, содержащее вариабельный домен тяжёлой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 7, и вариабельный домен лёгкой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 9.
Конкретным вариантом воплощения указанного гуманизированного антитела против шига-токсинов второго типа является антитело Н4, содержащее вариабельный домен тяжёлой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 17, и вариабельный домен лёгкой цепи, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 19.
Последовательности нуклеотидов, кодирующие тяжёлые и лёгкие цепи указанных гуманизированных антител Н8 и Н4, приведены в последовательностях SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, соответственно.
Указанные гуманизированные антитела против шига-токсинов как первого, так и второго типов могут быть получены на основании указанных последовательности нуклеотидов методами, хорошо известными специалисту в данной области техники, например с использованием технологий рекомбинантных ДНК и гибридомных технологий.
Методы получения плазмидной ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, подбора олигонуклеотидов в качестве праймеров, и подобные методы могут быть стандартными методами, хорошо известными специалисту в данной области техники. Эти методы описаны, например в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., (“Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
В настоящем изобретении фраза “антитело или Fab, обладающие способностью к связыванию шига-токсинов Stx1 и/или Stx2 и их нейтрализации” означает молекулу, которая связывается с шига-токсином Stx1 и/или Stx2, образует стабильный комплекс и ингибирует активность указанного шига-токсина. Стабильным комплексом является комплекс, в котором связывание между партнёрами происходит на период времени, достаточный для того, чтобы произвести детектирование указанного комплекса с использованием описанных здесь методов. Термин “селективно связывается с шига-токсином Stx1 и/или Stx2” означает способность указанной молекулы предпочтительно связываться с шига-токсином Stx1 и/или Stx2 в отличие от связывания с белками, не имеющими отношения к шига-токсинам Stx1 и/или Stx2, или связывания с небелковыми компонентами, присутствующими в образце или организме. Антитело или Fab, которые предпочтительно связываются с шига-токсином Stx1 и/или Stx2, являются антитело или Fab, которые связываются с шига-токсином Stx1 и/или Stx2, но не связываются в существенной степени с другими молекулами или компонентами, которые присутствуют в образце или организме.
Способность антитела или Fab к связыванию с антигеном может быть определена специалистом в данной области с использованием методов, включающих, но не ограничивающихся методом ELISA и равновесным диализом. Методы определения аффинности и силы связывания хорошо известны специалисту в данной области техники, подробно описаны Janeway и др. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).
Антитела и Fab моноклональных мышиных антител в соответствии с настоящим изобретением, которые селективно связываются с шига-токсинами первого и/или второго типов и нейтрализуют их, также могут быть получены с использованием подходящей гибридόмы. Гибридόмы могут быть выращены в питательной среде, и накопленные антитела могут быть выделены. Здесь и далее термин "выращиваемые клетки" относится к гибридόмам или другим линиям клеток, которые производят антитела. Способы получения и проверки таких выращиваемых клеток описаны Harlow и др. (см. выше). Методы получения антигенного материала для инъекций в животное включают в себя методы, известные из уровня техники, например, использование полноразмерного белка, пептидов, выбранных из иммуногенного участка этого белка, модифицирование антигена такими способами как, например, связывание с динитрофенолом, связывание с арсаниловой кислотой, денатурация антигена, связывание антигена с белком-переносчиком, таким как, например, гемоцианин улитки, с пептидами, содержащими участки связывания с рецепторами Т-клеток класса II, с бусинами, а также любыми другими методами, известными из уровня техники. Смотри Harlow и др. (см. выше).
Антитела и Fab, связывающиеся с шига-токсином Stx1 и/или Stx2 и нейтрализующие их, согласно настоящему изобретению, могут включать в себя многофункциональные молекулы, например, бифункциональные молекулы, содержащие, по крайней мере, одну функциональную часть, которая специфически связывается с шига-токсином Stx1 и/или Stx2 и нейтрализует его. Такие многофункциональные молекулы могут включать в себя, например, химерные молекулы, включающие в себя молекулу, которая связывается с шига-токсином Stx1 и/или Stx2 и нейтрализует его, и вторую часть, которая даёт возможность данной химерной молекуле связываться с субстратом или позволяет детектировать её способом, при котором связывание с шига-токсином Stx1 и/или Stx2 и его нейтрализация не ухудшаются. Примерами таких вторых частей являются, но не ограничиваются ими, фрагменты молекулы иммуноглобулина, флуоресцентный белок или фермент. Также антитела и Fab согласно настоящему изобретению, связывающиеся шига-токсином Stx1 и/или Stx2 и нейтрализующие его, могут быть модифицированы полиэтиленгликолем, т.е. пегилированы.
Термин "взаимодействие", использованный здесь, означает введение, добавление образца, предположительно содержащего шига-токсином Stx1 и/или Stx2, к антителу или Fab, связывающему шига-токсином Stx1 и/или Stx2, например, путём объединения или смешения образца с указанным антителом или Fab. В случае, если шига-токсин Stx1 и/или Stx2 присутствует в образце, образуется комплекс антитела или Fab с шига-токсином Stx1 и/или Stx2; образование такого комплекса означает способность Fab селективно связываться с шига-токсином Stx1 и/или Stx2 с образованием стабильного комплекса, который может быть детектирован. Детектирование может быть качественным, количественным или полуколичественным. Связывание шига-токсина Stx1 и/или Stx2 из образца с антителом или Fab происходит в условиях, подходящих для формирования комплекса. Такие условия (например, подходящие концентрации, буферы, температура, время реакции), а также методы оптимизации таких условий хорошо известны специалисту в данной области техники. Связывание может быть обнаружено и измерено с использованием множества методов, являющихся стандартными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, ферментативные методы иммунохимии (например, ELISA), иммунопреципитации, методы иммуноблотинга и другие методы иммунохимии, описанные, например, Sambrook и др. ((“Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) и Harlow и др. (см. выше). Эти ссылки также описывают примеры условий, в которых образуется комплекс.
Фразы «нейтрализует шига-токсин Stx1 и/или Stx2», «ингибирует активность шига-токсина Stx1 и/или Stx2» означают, что указанное антитело или Fab связывается с шига-токсином Stx1 и/или Stx2 таким образом, что нейтрализует его, то есть ингибирует активность шига-токсина Stx1 и/или Stx2 и блокирует его. Способность антитела или Fab к нейтрализации (ингибированию) шига-токсина Stx1 и/или Stx2 может быть определена, например, методом, описанным в Примере 3.
Ещё одним объектом настоящего изобретения является композиция для лечения токсических состояний, вызванных энтерогеморрагической кишечной палочкой, содержащая смесь гуманизированных антител или их Fab, описанных выше.
Предпочтительной является композиция, содержащая смесь двух гуманизированных антител, одно из которых содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 7 тяжёлой цепи и последовательность аминокислот SEQ ID NO: 9 лёгкой цепи, а второе содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 17 тяжёлой цепи и последовательность аминокислот SEQ ID NO: 19 лёгкой цепи.
Указанная композиция также может содержать необходимые фармацевтически приемлемые вспомогательные компоненты, такие как носители, наполнители, консерванты и прочие компоненты, хорошо известные специалистам в данной области техники и необходимые для хранения и введения указанной композиции субъекту, нуждающемуся в лечении.
Выражение «фармацевтически приемлемый носитель» принято в данной области техники и включает фармацевтически приемлемый материал, композицию или носитель, подходящий для введения млекопитающим, в частности, человеку. Носители включают наполнитель, разбавитель, растворитель, задействованный в переносе или транспортировке агента из одного органа, или части тела, в другой орган, или часть тела. Каждый носитель должен быть «приемлемым» в том смысле, что он должен быть совместимым с другими ингредиентами композиции и безопасным для пациента.
Термин «наполнитель» относится к агенту, который может быть добавлен к композиции для обеспечения желаемой консистенции, например, изменения объемных характеристик, для увеличения стабильности и/или для регулирования осмотической концентрации раствора.
Так, например, для инъецируемых препаратов, фармацевтически приемлемый носитель может включать буферные агенты, консерванты, аналгетики, солюбилизаторы, изотонические агенты и стабилизаторы. Для препаратов, вводимых посредством инъекции, указанная композиция может быть выполнена в виде разовой лекарственной формы, такой как флакон, содержащий лекарственные средства для многократного приема, или ампула для введения одной дозы.
Термин «буферный агент» относится к забуференному раствору, который является устойчивым к изменениям pH благодаря действию кислотно-основных соединенных компонентов. Буферы дял фармацевтических композиций обычно имеют pH в диапазоне от приблизительно 4 до приблизительно 8; предпочтительно от приблизительно 4,5 до приблизительно 7 и наиболее предпочтительно имеют pH в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,5. Примеры буферов, которые будут контролировать pH в этом диапазоне, включают фосфатный, ацетатный (например, натрийацетатный), сукцинатный (например, натрийсукцинатный), глюконатный, глютаматный, гистидиновый, цитратный, а также буферы, включающие другие органические кислоты. В одном варианте осуществления буфером, подходящим для применения в композиции согласно настоящему изобретению, является цитратный и фосфатный буфер.
С другой стороны, примерами носителей, наполнителей и разбавителей, подходящих для приготовления фармацевтических препаратов, являются лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, ксилит, эритритол, мальтит, крахмал, аравийская камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлоза, метилцеллюлоза, поливинилпирролидон, вода, минеральные масла.
Одним из вариантов композиции согласно настоящему изобретению, представленным исключительно в иллюстративных целях, является композиция, описанная в Примере 4.
Дозы действующих веществ, способы и режимы их введения определяются практикующим врачом, осуществляющим лечение в зависимости от состояния субъекта, нуждающегося в лечении, степени тяжести заболевания, пути введения композиции, массы тела, пола, возраста и рациона указанного субъекта, общего состояния здоровья, реакции организма субъекта на указанное лечение, продолжительности лечения и других факторов, известных специалистам в данной области и учитываемых при лечении.
Последующие примеры приведены для целей объяснения и не ограничивают каким-либо образом объём настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Получение мышиных антител против шига-токсинов первого и/или второго типов
Для получения антител мышей линии BALB/c иммунизировали дважды с интервалом в 2 недели в подушечки задних лап раствором иммуногена в полном (для первой иммунизации) или неполном (для второй иммунизации) адъюванте Фрейнда. В качестве иммуногена использовали нетоксичный аналог шигаподобного токсина 2 типа (Stx2a), предоставленный Юрием Васильевичем Козловым, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) (Loukianov EV, Zacharova LA, Khasanova OS, Khasanov FK, Kozlov YV. Immunization with non-toxic variants of Shiga toxin type 2 (Stx2) generates high titers of protective antibodies. Dokl Biochem Biophys. 2015; 460:23-5. doi: 10.1134/S160767291501007X. Epub 2015 Mar 13). Для каждого раунда иммунизации использовали 25 мкг иммуногена. Гибридизацию клеток подколенных лимфоузлов иммунных мышей с клетками миеломы линии sp2/0 проводили по стандартной методике с использованием полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000 (Monoclonal Antibody Production. National Research Council (US) Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies. Washington (DC): National Academies Press (US); 1999.)
Скрининг супернатантов гибридных клеток на наличие антител против шига-токсинов проводили через три дня после второго раунда иммунизации методом непрямого иммуноферментного анализа (Engvall E, Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G., Immunochemistry. 1971, 8(9): P.871-4).
В результате было получено 20 клонов против шига-токсинов, в том числе клоны Н8 и Н4.
6
Антитела нарабатывали в асцитных жидкостях мышей, для этого мышам, предварительно праймированных пристаном, вводили внутрибрюшинно по 10 клеток каждого клона. Очистку антител из асцитных жидкостей проводили аффинной хроматографией на колонке с белок-G сефарозой по стандартной методике (Jungbauer, A. и др. Comparison of protein A, protein G and copolymerized hydroxyapatite for the purification of human monoclonal antibodies, J. Chromatogr. 1989, 476: 257-268). Чистоту выделенных антител контролировали при помощи SDS-ПААГ электрофореза в 12% полиакриламидном геле в присутствии SDS и DTT в ступенчатой буферной системе Лэмлли, используя Mini PROTEAN 3 Electrophoresis System BIO-RAD, Catalog N 165-3301 (Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 1970, 227: 680-685). Чистота всех полученных антител составила не менее 95%.
Пример 2. Получение гуманизированных антител против шига-токсинов первого и/или второго типов
Затем авторы настоящего изобретения клонировали гены, кодирующие вариабельные домены тяжелой и легкой цепей мышиных антител против шига-токсинов Stx1 и Stx2, и определили их последовательности.
Были определены границы каркасных участков согласно Kabat, E.A., Wu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, H.M. and Gottesman, K.S. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, (1987) U.S. Department of Health and Human Services, NIH, Bethesda, MD), установлены последовательности CDR.
Кросс-реактивное антитело Н8 против шига-токсинов как первого, так и второго типов содержит CDR1 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 1, CDR2 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 2, и CDR3 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 3 тяжёлой цепи, и CDR1 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 4, CDR2 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 5, и CDR3 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 6 лёгкой цепи.
Антитело Н4 против шига-токсинов второго типов содержит CDR1 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 11, CDR2 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 12, и CDR3 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 13 тяжёлой цепи, и CDR1 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 14, CDR2 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 15, и CDR3 с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 16 лёгкой цепи.
После этого были осуществлены дизайн и гуманизация мышиных антител Н8 и H4 против шига-токсинов Stx1 и Stx2.
Окончательные последовательности гуманизированных вариабельных доменов антитела против шига-токсинов Stx1 и Stx2 были составлены преимущественно из последовательностей каркасных участков выбранных генов вариабельных доменов антител человека и последовательностей мышиных CDR.
Нумерация приведена в соответствии с номенклатурой Kabat (Kabat numbering system, Kabat et al., 1987 “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office).
Антитело Н4
Для сохранения аффинности мышиного антитела H4 в гуманизированном варианте в основном был использован метод Queen и др. (Queen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029 (1989) and U.S. Pat. Nos. 5,585,089 and 5,693,762). Выбор источника последовательностей каркасных областей для гуманизированного антитела может быть критичным для сохранения аффинности антитела. В принципе, последовательности каркасных областей любого человеческого антитела могут служить в качестве матрицы для пересадки CDR-областей. Однако, было показано, что простая замена CDR-областей в таком человеческом антителе может приводить к значительному снижению аффинности по отношению к антигену (Tempest et al., Biotechnology 9:266 (1992)). Чем выше гомология между последовательностями человеческого и мышиного антитела, тем меньше вероятность внесения человеческими каркасными областями искажений в структуру CDR-последовательностей, приводящих к снижению аффинности.
κ
H
С использованием базы данных IgBlast из последовательностей функциональных вариабельных областей антител зародышевой линии человека были выбраны последовательности с наибольшей степенью гомологии по отношению к аминокислотным последовательностям вариабельных доменов мышиного антитела H4 - IGHV4-4*08 - IGHJ6*01 и IGKV1-39*01- IGKJ4*01 для тяжёлой и лёгкой цепей, соответственно. На основании литературных данных и анализа пространственной модели вариабельных фрагментов лёгкой и тяжёлой цепей мышиного антитела H4, полученных с помощью сервера Rosetta (Rosetta antibody modeling server), были выбраны аминокислотные остатки в последовательностях человеческих каркасных областей тяжелой цепи, обратная замена которых на соответствующие остатки мышиного антитела H4 вероятно приведёт к восстановлению аффинности гуманизированного антитела H4-hum. В результате проверки нескольких вариантов обратных замен были получены последовательности вариабельных доменов гуманизированного антитела H4-hum, содержащие 7 обратных замен в тяжёлой цепи: V67L, T68S, V71K, T73N, N76S, F78V и S79F. Гены вариабельных доменов лёгких и тяжёлых цепей гуманизированного антитела Н4-hum синтезировали из набора перекрывающихся олигонуклеотидов с помощью ПЦР. Фрагменты ДНК, кодирующие гены вариабельных доменов лёгких и тяжёлых цепей гуманизированного антитела Н4, были объединены методом ПЦР с перекрывающимися областями с генами константного домена легкой цепи человека каппа С и константного домена тяжелой цепи IgG1 человека C1, соответственно.
Последовательности нуклеотидов, кодирующие тяжёлые и лёгкие цепи указанных гуманизированного антитела Н4-hum, приведены в последовательностях SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20, соответственно.
Антитело Н8
Процедуру гуманизиции антитела H8 проводили так же, как и для антитела.
С использованием базы данных IgBlast из последовательностей функциональных вариабельных областей антител зародышевой линии человека были выбраны последовательности с наибольшей степенью гомологии по отношению к аминокислотным последовательностям вариабельных доменов мышиного антитела H8 - IGHV1-3*01 - IGHJ4*03 и IGKV1-33*01 - IGKJ2*01 для тяжелой и легкой цепи, соответственно.
В итоговую последовательность была введена обратная замена R71V в вариабельном домене тяжелой цепи гуманизированного антитела H8-hum.
Последовательности нуклеотидов, кодирующие тяжёлые и лёгкие цепи указанных гуманизированного антитела Н8-hum, приведены в последовательностях SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 10, соответственно.
Пример 3. Изучение свойств гуманизированных антител против шига-токсинов первого и/или второго типов
.
Иммуноферментный анализ
Шига-токсины 1 и 2 типов (Stx1 и Stx2, соответственно) вносили в лунки 96-луночного планшета для ИФА в 0,1М фосфатном буфере рН 7,4 (ФСБ), инкубировали при 4°С в течение ночи. Планшеты трижды отмывали ФСБ с добавлением 0,05% Tween20 (ФСБ-Т), затем добавляли серийные разведения антител в ФСБ-Т с добавлением 0,2% бычьего альбумина (ФСБ-АТ). Каждое разведение антител брали в четырех повторах. Инкубировали 1 час при 37°С. Планшеты отмывали, в лунки добавляли раствор моноклональных антител против каппа-легкой цепи иммуноглобулинов человека, конъюгированных с пероксидазой (4G7-ПХ), в разведении 1:75 тысяч в ФСБ-АТ. Планшеты отмывали, в лунки добавляли раствор ТМБ с перекисью водорода, инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре до развития цветной реакции. Реакцию останавливали добавлением 0,5 М раствора серной кислоты. Оптическую плотность (ОП) в лунках измеряли при длине волны 450 нм. Находили средние значения по повторам, по этим значениям строили диаграмму зависимости средней ОП от концентрации антител. Результаты представлены на Фиг. 1 и 2.
Вывод: антитело Н8 является кросс-реактивным антителом и способно связывать шига-токсины обоих типов, а антитело Н4 способно эффективно связывать шига-токсины второго типа.
Нейтрализация шигаподобных токсинов
Анализ проводили на линии клеток Vero.
2
2
2
Клетки высевали в лунки 96-луночного культурального планшета в концентрации 5 тысяч клеток в лунку в полной ростовой среде DMEM с добавлением телячьей сыворотки до конечной концентрации 4%. Культивировали 24 часа при 37°С в атмосфере 5% СО. Затем супернатанты отбрасывали и в лунки добавляли смесь шига-токсинов Stx1 и Stx2 и гуманизированных антител H8-hum и H4-hum в полной ростовой среде. Культивировали 3 суток при 37°С в атмосфере 5% СО. К супернатантам добавляли раствор МТТ до конечной концентрации 0,5%, инкубировали 4 часа при 37°С и 5% СО. Супернатанты удаляли, в лунки добавляли по 100 мкл ДМСО. Оптическую плотность в лунках измеряли при длине волны 560 нм, считали средние значения по 4 повторам. Нейтрализацию оценивали в процентах по формуле:
i
0
%нейтрализации = A/A x 100%,
i
где A - среднее значение оптической плотности в лунках с i-той концентрацией антитела;
0
А - среднее значение оптической плотности в лунках без токсина.
Результаты приведены на Фиг. 3 и 4.
Вывод: антитело Н8 эффективно нейтрализует шига-токсины обоих типов, а антитело Н4 эффективно нейтрализует шига-токсины второго типа.
Пример 4. Исследование эффективности композиции для лечения энтерогеморрагической инфекции, вызванной Escherichia coli
На основе полученных гуманизированных антител Н4-hum и Н8-hum была получена композиция против шига-токсинов (готовая лекарственная форма, ГЛФ), предназначенная для лечения энтерогеморрагической инфекции, вызванной Escherichia coli.
Использовали композицию следующего состава:
Действующие вещества:
Антитело Н4 (рекомбинантное гуманизированное антитело против шигаподобного токсина второго типа Stx2) - 0,75 мг;
Антитело Н8 (рекомбинантное гуманизированное антитело против шигаподобных токсинов первого и второго типов, Stxl и Stx2 соответственно) - 2,25 мг.
Вспомогательные вещества:
Натрия цитрата дигидрат 2,05 мг;
Полисорбат 80 - 2,1 мг;
Натрия хлорид - 27,0 мг;
Декстран [ср. мол. масса 40 000] 35-45 кДа, - 24,0 мг;
Вода для инъекций - до 3,0 мл.
Исследование выполнено на базе вивария ОАО «Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения» и лаборатории биотехнологии ОАО «Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения» (117149, г. Москва, Симферопольский бульвар, д. 8).
В качестве контрольного раствора использовали буфер для ГЛФ, представляющий собой композицию вспомогательных веществ в тех же концентрациях, что и в готовой лекарственной форме. По этическим соображениям контроль использовали лишь в тех экспериментах, где дозировки вводимых токсинов не превышали летальные дозы ЛД99.
Препарат сравнения не использовали, поскольку на рынке отсутствуют лекарственные средства, нейтрализующие действие шига-токсинов.
Исследования проводили на готовой лекарственной форме (1х ГЛФ) и 10- кратной ГЛФ (10х ГЛФ).
В качестве препарата сравнения использовали буфер для ГЛФ, представляющий собой композицию вспомогательных веществ в тех же концентрациях, что и в готовой лекарственной форме.
Для моделирования токсических состояний у животных использовали шигаподобный токсин второго типа в различных дозировках в физиологическом растворе:
Шигаподобный токсин 2 типа (полный токсин, холотоксин), подтип Stx2a,
(Toxin variant designation Stx2a-O157-EDL933, GenBank accession No. X07865).
Готовую лекарственную форму (ГЛФ) для введения экспериментальным животным получали путём разведения концентрата раствора препарата (концентрация по действующему веществу 1,0 мг/мл) буфером для ГЛФ до концентрации в 1,3 мг/кг или 13 мг/кг по действующему веществу, что соответствует дозировкам для человека 0,1 мг/кг и 1 мк/кг соответственно, согласно Таблице пересчета доз (Руководство по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ. Ред. кол. Р.У. Хабриев и др.- Москва: Медицина, 2005, стр. 49). Препарат вводили внутривенно в хвостовую вену в объеме 0,25 мл.
Дозирование токсинов экспериментальным животным осуществляли в нанограммах или микрограммах действующего вещества на килограмм массы тела экспериментальных животных. Перед введением рассчитывали объем препарата, который должен быть введен каждому конкретному животному в зависимости от его массы тела. Токсины вводили внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл.
Вид животных: мыши линии Balb/c самцы возраста 7-8 недель. Происхождение: питомник "Столбовая" Федерального государственного бюджетного учреждения науки "Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства"
Вес к началу исследования: 20-25 г.
Способ идентификации: окраска шерсти фукорцином.
Животные содержались в конвенциальных условиях при свободном доступе к воде и корму. Основные правила содержания и ухода соответствовали нормативным документам. Все процедуры по рутинному уходу за животными выполнялись в соответствии с СОП ОАО «ВНЦМДЛ».
Размещение: животные были размещены в поликарбонатных клетках с подстилом, по 6-8 особей в клетках 26x17x12 см. Клетки оборудованы стальными решетчатыми крышками с кормовым углублением, стальными разделителями для корма и стальными держателями этикеток.
Корм: комбикорм полнорационный для содержания мелких лабораторных грызунов апатогенный автоклавируемый производства ООО «Ассортимент-Агро».
Карантин: не менее 14 суток.
Ежедневно фиксировали следующие параметры:
- выживаемость;
- масса тела;
- наличие/отсутствие диареи;
- двигательная активность;
- состояние шерсти и кожных покровов.
Предварительно были определены дозировки токсина Stx2, вызывающие гибель 50% животных (ЛД50), и 99% животных (ЛД99). Для определения этих показателей использовали экспресс-метод по Прозоровскому (Прозоровский, В. Б. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки / В. Б. Прозоровский, М. П. Прозоровская, В. М. Демченко // Фармакология и токсикология. - 1978. - T. 41, № 4. C. 497 - 501), (Прозоровский, В.Б. Статистическая обработка результатов фармакологических исследований / В. Б. Прозоровский // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т. 7, № 3-4. С 2090-2120) и пробит-анализ по Блиссу (Bliss, C. I. The method of probits. / C. I. Bliss // Science. 1934. - 12 Jan: Vol. 79, Issue 2037, pp. 38-39.).
Для экспериментов по определению эффективности ГЛФ in vivo использовали дозировки, кратные ЛД50.
Токсин вводили внутрибрюшинно либо одновременно с препаратом (временной интервал между введением токсина и препарата менее 10 минут), либо за 24 часа до введения препарата (отсроченное лечение).
Мышей наблюдали до их гибели, либо в течение 14 дней.
Выводы
При внутривенном, внутрибрюшинном и подкожном введении Stx2 последовательное увеличение дозы всегда приводит к смерти животных. Летальный исход наступает через 3-6 дней после введения токсина.
Для внутрибрюшинного пути введения токсина Stx2 показатели ЛД50 и ЛД99 составили 83±8 нг/кг и 186 нг/кг, соответственно.
При введении сублетальных доз шига-токсинов наблюдаются внешние и внутренние признаки интоксикации, выраженность которых хорошо коррелирует с потерей массы тела животных.
Было исследовано действие на организм мышей шига-токсина второго типа в широком диапазоне дозировок, вплоть до значений, соответствующих 100-кратной ЛД50 или 44,6-кратной ЛД99. При введении токсина одновременно с введением препарата никаких существенных признаков интоксикации у мышей обнаружено не было, как и не было зафиксировано летальных исходов. Следовательно, препарат практически полностью защищает организм от действия токсина.
Было исследовано действие на организм мышей шига-токсинов при отсроченном на 24 часа лечении исследуемым препаратом. Установлено, что эффективность защиты при отсроченном лечении ниже, чем при своевременном.
Были вычислены показатели эффективности композиции при отсроченном лечении: выживаемость, индекс защиты (ИЗ), антидотная мощность (АМ) и индекс гарантированной защиты (ИГЗ).
Результаты эксперимента приведены в Таблице 1.
Таблица 1. Основные количественные показатели эффективности композиции
Выживаемость при ЛД50
Выживаемость при ЛД99
ИЗ
АМ
ИГЗ
одновременное введение токсина и препарата
ГЛФ
100%
100%
>100
>44,6
>44,6
10хГЛФ
100%
100%
>100
>44,6
>44,6
введение препарата через 24 часа после введения токсина
ГЛФ
95,8%
52%
2,29
1,022
0,553
10хГЛФ
95,2%
25%
1,777
0,793
0,508
Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на предпочтительные варианты его осуществления, для специалиста в данной области техники ясно, что могут быть сделаны различные замены и применены эквиваленты, которые не выходят за рамки настоящего изобретения.
Все процитированные в настоящем описании документы являются частью настоящей заявки и в полном объёме включены в настоящее описание посредством ссылки.
--->
Перечень последовательностей
<110> Открытое акционерное общество "Всероссийский научный Центр
молекулярной диагностики и лечения" (ОАО ВНЦМДЛ)
<120> Гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент (Fab)
против шига-токсинов первого и/или второго типов (варианты),
композиция для лечения токсических состояний, вызванных
энтерогеморрагической кишечной палочкой, содержащая указанные
антитела и/или Fab.
<130> mAbs against Stx1 and Stx2
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 VH of humanized mAb against Stx1 and Stx2
<400> 1
Glu Tyr Thr Met His
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 VH of humanized mAb against Stx1 and Stx2
<400> 2
Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 VH of humanized mAb against Stx1 and Stx2
<400> 3
Val Tyr Ser Lys Ala Trp Phe Ala Tyr
15
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 VL of humanized mAb against Stx1 and Stx2
<400> 4
Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Val Val Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 VL of humanized mAb against Stx1 and Stx2
<400> 5
Phe Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 VL of humanized mAb against Stx1 and Stx2
<400> 6
Gln His Asp Tyr Arg Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain of humanized mAb against Stx1 and Stx2
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Ser Lys Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 8
<211> 1344
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF encoding VH of H8 mAb against Stx1 and Stx2
<400> 8
caggtccagc ttgtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcact gaatacacca tgcactgggt gcgccaggcc 120
cccggacaaa ggcttgagtg gatgggaggt attaatccta acaatggtgg tactagctac 180
aaccagaagt tcaagggcag agtcaccatt accgtagaca catccgcgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaagac acggctgtgt attactgtgc gagagtctac 300
agtaaggcct ggtttgctta ctggggccaa gggaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc 360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 660
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1080
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200
tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320
agcctctccc tgtctccggg taaa 1344
<210> 9
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light chain of humanized mAb against Stx1 and Stx2
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Val
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Asp Tyr Arg Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 10
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF encoding VL of H8 mAb against Stx1 and Stx2
<400> 10
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aggccagtca gagtgtgagt aatgttgtag cttggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctacttt gcatccaatc gctacactgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatattg caacatatta ctgtcagcac gattataggt ctccgtacac gtttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa acggactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 VH of humanized mAb against Stx2
<400> 11
Thr Tyr Gly Val His
1 5
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 VH of humanized mAb against Stx2
<400> 12
Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser
1 5 10 15
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 VH of humanized mAb against Stx2
<400> 13
Gly Gly Arg Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 VL of humanized mAb against Stx2
<400> 14
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 VL of humanized mAb against Stx2
<400> 15
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 VL of humanized mAb against Stx2
<400> 16
Gln His His Tyr Leu Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 17
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain of humanized mAb against Stx2
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Arg Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 18
<211> 1341
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF encoding VH of H4 mAb against Stx2
<400> 18
caggtgcagc tgcaggagtc gggaccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt acctatggtg tacactggat tcggcagccc 120
ccagggaagg gactggagtg gattggggta atatgggctg gtggaagcac aaattataat 180
tcggctctca tgtcccgact gagcatcagc aaagacaact ccaagagcca agttttcctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcagacacg gccgtgtatt actgtgcgag agggggccgt 300
tactatgcta tggactactg ggggcaaggg accacggtca ccgtctcctc agcctccacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtaa a 1341
<210> 19
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light chain of humanized mAb against Stx2
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Leu Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 20
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF encoding VL of H4 mAb against Stx2
<400> 20
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gagcaagtga gaatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctataat gcaaaaacct tagcagaagg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacat cattatctta ctccgtggac gttcggcgga 300
gggaccaagg tggaaatcaa acggactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<---