ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ КАПИЛЛЯРНОЙ АРТЕРИОПАТИИ
PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR TREATING CAPILLARY ARTERIOPATHY

Данное изобретение относится к применению производных спорыньи или эрголинов, в частности лизурида и тергурида, для профилактики и лечения констриктивной капиллярной артериопатии. Констриктивная капиллярная артериопатия относится к заболеваниям легочной артериальной гипертензии, эндогенно или экзогенно индуцированному гломерулосклерозу, а также вторичному синдрому или феномену Рейно.
Констриктивная капиллярная артериопатия является патологической характеристикой в медицине человека для диффузных констриктивных поражений артерий, включая реконфигурацию сосудистых стенок, которые ведут к необратимому стенозу в месте блокирования артериол. В качестве функциональных последствий можно наблюдать увеличение капиллярного давления и увеличение сосудистого сопротивления.
Констриктивная капиллярная артериопатия различной этиологии проявляется в капиллярном ложе многих видов тканей. В данном изобретении в контексте капиллярной артериопатии основное внимание уделяется органоспецифичным изменениям, которые приводят к увеличению долгосрочного давления в артериолах и характеризуются увеличением сосудистого сопротивления, отягчающим вазоспазмом и преципитирующимися структурными частицами. Таким образом, используемый здесь термин "капиллярная артериопатия" и, в частности, "Констриктивная капиллярная артериопатия" означает признаки гломулосклероза и вторичного феномена и/или синдрома Рейно.
Задачей данного изобретения является обеспечение дальнейшего применения производных спорыньи и, в частности, лизурида и тергурида.
Задача решается путем применения, описанным в пункте 1 формулы изобретения. Другие предпочтительные варианты изложены в зависимых пунктах формулы изобретения, примерах и описания.
Неожиданно было установлено, что производные спорыньи и эрголины, и в частности лизурид и тергурид, подходят для профилактики и лечения (констриктивной) капиллярной артериопатии.
Таким образом, данное изобретение относится к применению соединений, имеющих общую формулу (I),
где
2
3
6
7
8
43
8
43
8
43
8
43
8
43
8
43
R и R независимо друг от друга представляют собой -R, -R, линейный или разветвленный, насыщенный или ненасыщенный алкильный остаток с 1-10 атомами углерода, которые могут быть замещены одним или более остатками R-R; линейный или разветвленный, насыщенный или ненасыщенный -СО-алкильный остаток с 1-10 атомами углерода, которые могут быть замещены одним или более остатками R-R; линейный или разветвленный, насыщенный или ненасыщенный -NH-CO-алкильный остаток с 1-10 атомами углерода, которые могут быть замещены одним или более остатками R-R; линейный или разветвленный, насыщенный или ненасыщенный -NH-CO-NH алкильный остаток или -NH-CO-N (диалкильный остаток) с алкильными остатками с 1-10 углеродными атомами, которые могут быть замещены одним или более остатками R-R; арильный остаток или циклоалкильный остаток или бициклическое или трициклическое карбоциклическое соединение, которое может быть замещено одним или несколькими остатками R-R; гетероарильный остаток или гетероциклический остаток или бициклическое или трициклическое насыщенное или ненасыщенное гетероциклическое соединение, которое может быть замещено одним или более остатками R-R;
5
2
R представляет собой один из остатков -Н, -F, -Cl, -Br, -I, -CN или -NO;
Х представляет собой одинарную или двойную связь;
n представляет собой целое число от 1 до 10; а также
к солям, энантиомерам, смесям энантиомеров, диастереомерам, смесям диастереомеров, гидратам, сольватам и рацематам вышеупомянутых соединений для изготовления фармацевтической композиции для лечения и профилактики констриктивной капиллярной артериопатии, т.е. легочной артериальной гипертензии, эндогенно или экзогенно индуцированного гломерулосклероза или вторичного синдрома Рейно.
Соединения общей формулы (I) являются щелочами или солями присоединения кислоты, которые можно получить путем добавления органических или неорганических кислот. Кислоты, образующие соли присоединения кислоты соединения формулы (I), включают серную кислоту, сульфоновую кислоту, фосфорную кислоту, азотную кислоту, азотистую кислоту, хлорную кислоту, бромистоводородную кислоту, соляную кислоту, муравьиную кислоту, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, янтарную кислоту, щавелевую кислоту, глюконовую кислоту (гликоновую кислоту, декстроновую кислоту), молочную кислоту, яблочную кислоту, винную кислоту, тартроновую кислоту (гидроксималоновую кислоту, гидрокси пропандиоловую кислоту), фумаровую кислоту, лимонную кислоту, аскорбиновую кислоту, малеиновую кислоту, малоновую кислоту, гидроксималеиновую кислоту, пировиноградную кислоту, фенилуксусную кислоту (орто-, мета-, пара-) толуиловую кислоту, бензойную кислоту, парааминобензойную кислоту, парагидроксибензойную кислоту, салициловую кислоту, парааминосалициловую кислоту, метансульфокислоту, этансульфокислоту, гидроксиэтансульфокислоту, этиленсульфокислоту, паратолуолсульфокислоту, нафтилсульфокислоту, нафтиламиносульфокислоту, сульфаниловую кислоту, камфорсульфоновую кислоту, хинную кислоту (хининовую кислоту), орто-метилминдальную кислоту, гидробензолсульфоновую кислоту, пикриновую кислоту (2,4,6-тринитрофенол), адипиновую кислоту, D-орто-толил-винную кислоту, аминокислоты, такие как метионин, триптофан, аргинин и в частности кислые аминокислоты, такие как глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту.
Если присутствуют кислотные группы, то также могут быть сформированы соли присоединения основания, например соли щелочных металлов, а также соли аминов. Таким образом, могут быть образованы соли щелочных металлов, такие как соль натрия, соль калия, соль лития или соль магния, соль кальция, соль алкиламина или соли аминокислот, например щелочных аминокислот, таких как лизин.
Общая формула (I) также включает стереоизомеры, энантиомеры, смеси энантиомеров, диастереомеры и смеси диастереомеров, где предпочтительными будут хиральные соединения следующих формул (II)-(IIE):
3
3
2
Кроме того, предпочтительно, если R представляет собой водород. Кроме того, во всех формулах, раскрытых здесь, является предпочтительным, если R имеет конфигурацию, показанную в формулах (II), (IIA) и (IIB), которая проецируется в плоскости, и в которой R соответственно лежит за плоскостью. Таким образом, предпочтительными являются 8-α-эрголины. В случае, когда Х представляет собой одинарную связь, предпочтительно транс-положение двух атомов водорода в С-5 и С-10, как показано в общих формулах (III)-(IIIE).
где
1
43
остатки R-R имеют значения, указанные выше.
1
4
3
R и/или R предпочтительно представляют собой водород или алкильный остаток с 1-8 атомами углерода. R предпочтительно представляет собой карбонильную группу, к которой присоединен моноциклический, бициклический или трициклический гетероцикл.
6
43
6
43
В формулах (IID) и (IIID) R* является одним из остатков R-R, который может быть присоединен к атому азота. В частности, R* представляет собой линейную или разветвленную, насыщенную и ненасыщенную ацильную группу с 1-20 атомами углерода, которая в углеродной цепи также может содержать углеродные циклы, гетероциклы и ароматические кольца, и чья углеродная цепь также может быть замещена одним или более остатками R-R.
6
43
6
43
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
3
2
5
3
7
3
2
3
3
4
9
2
3
2
3
2
5
5
11
6
13
7
15
8
17
3
5
4
7
5
9
6
11
2
3
2
2
2
3
2
3
2
4
2
3
2
3
2
R** в формулах (IIE) и (IIIE) представляет собой один из остатков R-R и предпочтительно аминогруппу, алкиламиногруппу или диалкиламиногруппу, где алкильная группа или алкильные группы содержат от 1 до 20 атомов углерода, где алкильные группы также включают или содержат карбоциклические соединения, гетероциклические соединения и ароматические системы и где алкильные группы могут быть разветвленными и неразветвленными и насыщенными или ненасыщенными и заменяют один или более остатков R-R. Особенно предпочтительными для R** являются CHF, CHCHF, CHCHF, CHCF, CHCHCl, CH-CHBr, СН-CHI, СН, CH, СН, СН(СН), -С(СН), СН, СНСН(СН), СН(СН)СН, СН, CH, СН, CH, -цикло-СН, -цикло-CH, -цикло-СН, -цикло-СН, Ph, CH-Ph, CPh, -СН=СН, СН-СН=СН, -С(СН)=СН, -СН=-СН-СН, -СН-СН=СН, -СН=С(СН), С≡СН, С≡С-СН и СН-С≡СН.
Особенно предпочтительными являются следующие соединения формулы (I): 8-α-эрголины, 8-α-1,6-диметилэрголины, 8-α-1-метилэрголины, 8-α-6-метилэрголины, 8-α-10-метоксиэрголины, лизурид (CAS-№: 18016-80-3, 3-(9,10-дидегидро-6-метилэрголин-8альфа-ил)-1,1-диэтилмочевина), D-изолизергиновая кислота, амид D-изолизергиновой кислоты, диэтиламид D-изолизергиновой кислоты, протергурид и тергурид ((+)-1,1-диэтил-3-(6-метил-8α-эрголинил)-мочевина). Особенно предпочтительным является применение тергурида (транс-дигидролизурида) и лизурида.
Указанные вещества и соединения общих формул (I)-(IIIE) пригодны, в частности, для профилактики и лечения легочной артериальной гипертензии, эндогенно или экзогенно индуцированного гломерулосклероза или вторичного феномена или синдрома Рейно.
Тот факт, что соединения в соответствии с общей формулой (I) подходят для профилактики и лечения констриктивной капиллярной артериопатии, был неожиданным, поскольку специалисты в данной области не рассматривали такие соединения с этой точки зрения, т.к. именно эти показания упоминаются как побочные эффекты соединений общей формулы (I) или 8-α-эрголинов. Компания Schering AG, например, упоминает в своей вкладке в упаковку медикамента Teluron, который содержит тергурид и 8-α-эрголин, что, например, может возникнуть феномен или синдром Рейно. Кроме того, из литературы известно, что алкалоиды спорыньи, которые также содержат 8-α-эрголин, могут вызывать фиброзные изменения. Специалистам в данной области известны феномен Рейно, вазоспазм, диплопия, ретроперитонеальный фиброз, плевральный выпот и фиброз сердечных клапанов. Эти негативные выводы воздерживали специалистов в данной области от применения соединений формулы (I) для профилактики и лечения указанных выше признаков.
Таким образом, специалисты в данной области не используют соединения в соответствии с общей формулой (I), и в частности лизурдин и тергурид, для профилактики и лечения констриктивной капиллярной артериопатии, характерной для заболеваний легочной артериальной гипертензии, эндогенно или экзогенно индуцированного гломерулосклероза и вторичного синдрома Рейно. В частности, специалисты в данной области вообще не рассматривают показания феномен или синдром Рейно и легочную гипертензию, поскольку они прямо упомянуты как побочные эффекты 8-α-эрголиновых активных агентов. В частности, упоминание таких побочных эффектов во вкладке в упаковку фармацевтического средства из группы 8-α-эрголиновых активных агентов конкретно внушает специалисту в данной области, что были проведены интенсивное клиническое исследование активного агента. Таким образом, для специалистов в данной области нет причин ставить под сомнение информацию и заявления на вкладке в упаковку фармацевтического средства.
Постуральная гипертензия известна как побочный эффект дофаминергических производных спорыньи, включая лизурид и тергурид. Поскольку введение эрголинов и производных спорыньи влечет за собой усиление желудочно-кишечных побочных эффектов, таких как, например, тошнота и отвращение к пище, то терапевтическая польза в принципе частично оспаривается.
Поэтому было тем более удивительно, когда обнаружили, что тергурид и лизурдин имеют терапевтический эффект и не являются, как и следовало ожидать, противопоказанными в случае заболеваний легочной артериальной гипертензии (РАН, pulmonary arterial hypertension), эндогенно или экзогенно индуцированного гломерулосклероза и вторичного феномена или синдрома Рейно, которые в данном документе в совокупности называются констриктивной капиллярной артериопатией.
Гипертензия является медицинским термином для повышенного кровяного давления. Термин "кровяное давление" означает давление, которое создается, когда кровь циркулирует вдоль внутренней сосудистой стенки артерий. Как правило, кровяное давление обозначается двумя числами, а именно артериальным давлением, когда сердце сокращается между отдельными сердечными ударами и расслабляется снова (систолическое и диастолическое давление).
Кровяное давление, как правило, изменяется в течение дня и, как правило, увеличивается с возрастом. Кроме того, на кровяное давление влияет физическая деятельность. Кровяное давление возрастает в связи с физическим и психологическим напряжением. Пациенты с гипертензией имеют повышенное кровяное давление (в основном выше 140/90 мм рт.ст.) также в состоянии покоя. Нелеченная гипертензия влияет на сердце, а также артерии, которые могут подвергаться большему напряжению, что может привести к повреждению тканей. В свою очередь, это является фактором риска и может привести к повреждениям сердца, инфаркту миокарда (миокардиальному инфаркту) и инсульту.
Наоборот, легочная гипертензия или гломерулосклероз, например, приводят к локальному изменению вазореактивности, что приводит к локальному повышению кровяного давления без обнаруживаемого увеличения системного кровяного давления.
Например, высокое кровяное давление проявляется в легочном кровообращении в случае легочной гипертензии. Наоборот, кровяное давление, например, в руках или в остальной части тела находится в норме и снижено. Таким образом, легочная гипертензия значительно отличается от (общей) гипертензии. Как правило, легочная гипертензия является результатом заболевания сердца и/или легких. Легочная гипертензия возникает в тот момент, когда давление в легочных артериях превышает нормальное системное кровяное давление, которое должно быть обусловлено локальными изменениями вазореактивности и структурой малых артерий, так называемых артериол. Это приводит к перегрузке правой стороны сердца. Легочная гипертония является серьезной проблемой. Она проявляется такими симптомами, как затрудненное дыхание после небольшого напряжения, чувство усталости, обмороки и грудные боли. Эти симптомы, как правило, ограничивают физические упражнения и деятельность.
Разница в этиологии, а также разные подходы применительно к лечению гипертензии (также называемой эссенциальной или общей гипертонией) и легочной гипертензии делает ясным значительное различие между этими двумя заболеваниями. Хотя для лечения гипертензии используются ингибиторы АПФ, такие как, например, каптоприл, диуретики, такие как, например, фуросемид, блокаторы рецепторов ангиотензина-2, такие как, например, лозартан, альфа- и бета-блокаторы, такие как, например, празозин и пропанолол, прямые вазодилятаторы, такие как, например, миноксидил, или центрально действующие вещества, такие как, например, клонидин, ни одно из этих активных веществ не пригодно для лечения легочной гипертензии, и они не используются для этой цели.
Таким образом, при положительном влиянии тергурида или лизурдина на легочную артериальную гипертензию не может быть получено никакого положительного влияния на гипертензию, или наоборот.
Кроме того, данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, изготовленным с использованием по меньшей мере одного соединения в соответствии с формулой (I) или его соли и, в частности, с использованием лизурида или тергурида.
Эти фармацевтические композиции содержат по меньшей мере одно соединение общей формулы (I), и в частности лизурид или тергурид в концентрации активных веществ от 0,1 до 10 мг на одну дозу вместе, по меньшей мере с одним фармацевтически совместимым носителем, вспомогательным веществом и растворителем.
Фармацевтические композиции предпочтительно предлагаются в виде таблеток, слоистых таблеток, пилюль, капсул, микрокапсул, оральных ретард-лекарств (с замедленным высвобождением лекарства), трансдермальных систем, суппозиторий, микросоставов, наносоставов, липосомальных составов, капель, назальных капель, назальных спреев, аэрозолей, ампул, растворов, эмульсий, дисперсий, порошков, ингаляционных порошков, микрокристаллических составов или ингаляционных спреев и подходят, в частности, для орального, сублингвального, парентеральныго, кожного, буккального, чрескожного, ингаляционного или назального введения.
В качестве фармацевтически совместимого носителя могут быть использованы лактоза, крахмал, сорбит, сахароза, целлюлоза, стеарат магния, гидрофосфат кальция, сульфат кальция, тальк, маннит, этиловый спирт и т.п. Порошок, а также таблетки, могут состоять на 5-95% из такого носителя.
Кроме того, в качестве связующих агентов могут быть использованы крахмал, желатин, природные сахара, как натуральные, так и синтетические каучуки, такие как, например, аравийская камедь или гуаровая камедь, альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза, полиэтиленгликоль и воски. В качестве смазочных материалов могут выступать борная кислота, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и т.п.
Кроме того, в фармацевтические композиции могут быть добавлены дезинтегрирующие агенты, окрашивающие агенты, ароматизирующие агенты и/или связующие агенты.
Жидкие составы включают растворы, суспензии, спреи и эмульсии. Например, инъекционные растворы на водной или водно-пропиленгликолевой основе для парентеральной инъекции.
Для изготовления суппозиториев предпочтительно использовать легкоплавкие вески, жирные кислоты, сложные эфиры и глицериды.
Капсулы производят, например, из метилцеллюлозы, поливиниловых спиртов или денатурированного желатина или крахмала.
В качестве дезинтегрирующих агентов могут быть использованы крахмал, натриевая соль карбоксиметилкрахмала, натуральные и синтетические каучуки, такие как камедь рожкового дерева, камедь карайи, трагакант и агар, а также производные целлюлозы, такие как метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза натрия, микрокристаллическая целлюлоза, а также альгинаты, алюминаты и бентониты. Эти составляющие можно использовать в количестве от 2 до 30%.
В качестве связующих агентов могут быть добавлены сахар, крахмал из зерновых, риса или картофеля, натуральные каучуки, такие как аравийская камедь, желатин, трагакант, альгиновая кислота, альгинат натрия, альгинат аммония и кальция, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза натрия, гидроксипропилметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, а также неорганические соединения, такие как силикаты магния алюминия. Связующие агенты могут быть добавлены в количестве от 1 до 30% по весу.
В качестве смазочных материалов можно использовать стеараты, такие как стеарат магния, стеарат кальция, стеарат калия, стеариновую кислоту, тугоплавкие воски и водорастворимые смазки, такие как хлорид натрия, бензоат натрия, ацетат натрия, олеат натрия, полиэтиленгликоль и аминокислоты, такие как лейцин. Такие смазочные материалы могут быть использованы в количестве от 0,05 до 15% по весу.
Далее в качестве предпочитительных составов нужно упомянуть подкожные составы и трансдермальные системы. Такие подкожные составы и трансдермальные системы предпочтительно состоят из матрицы, в частности полимерной матрицы, поддающейся природному разложению, в которую вставлено по меньшей мере одно соединение в соответствии с формулой (I), предпочтительно лизурдин или тергурид. Предпочтительно для создания этой матрицы используются биоразлагающиеся полимеры.
Далее в качестве примеров биоразлагающихся полимеров можно упомянуть: поливалеролактоны, поли-ε-декалактоны, полилактиды, полигликолиды, сополимеры полилктидов и полигликолидов, поли-ε-капролактон, полигидроксибутировую кислоту, полигидроксибутираты, полигидроксивалераты, сополимеры полигидроксибутирата и валерата, поли(1,4-диоксан-2,3-дионы), поли(1,3-диоксан-2-оны), поли-парадиоксаноны, полиангидриды, такие как ангидриды полималеиновой кислоты, полигидроксиметакрилаты, фибрин, полицианоакрилаты, поликапролактонедиметилакрилаты, поли-b-малеиновую кислоту, поликапролактонебутилакрилаты, мультиблоковые полимеры, такие как, например, из олигокапролактонедиолов и олигодиоксанонедиолов, мультиблоковые полимеры простых и сложных эфиров, такие как, например, ПЭГ и поли(бутилентерефталат). Полипивотолактоны, триметилкарбонаты полигликолевой кислоты, поликапролактонгликолиды, поли(g-этилглутамат), поли(DTH-иминокрабонат), поли(DTE-со-DT-карбонат), поли(бисфенол А-иминокарбонат), полиортоэфир, триметилкарбонаты полигликолевой кислоты, политриметилкарбонаты, полииминокарбонаты, поли(N-винил)-пиролидон, поливиниловые спирты, полиэфирамиды, гликолированный полиэфир, полифосфоэфиры, полифосфазены, поли[п-карбоксифеноксипропан] полигидроксипентановую кислоту, полиангидриды, оксид полиэтилена-оксид пропилена, мягкие полиуретаны, полиуретаны с аминокислотными остатками в остове, поли(простые эфиры)(сложные эфиры), такие как оксид полиэтилена, полиалкилен-оксалаты, полиортоэфиры, а также их сополимеры, каррагинаны, фибриноген, крахмал, коллаген, полимеры на протеинвой основе, полиаминокислоты, синтетические полиаминокислоты, зеин, модифицированный зеин, полигидроксиалканоаты, пектиновую кислоту, актиничную кислоту, модифицированный и немодифицированный фибрин и казеин, карбоксиметилсульфат, альбумин, а также гиалуроновую кислоту, гепарансульфаты, гепарин, хондроитин сульфат, декстран, b-циклодекстрины, сополимеры ПЭГ и полипропиленгликоля, гуммиарабик, гуар, желатин, коллаген, коллаген-N-гидроксисукцинимид, модификации и сополимеры и/или смеси этих веществ.
Предпочтительными являются биологические полимеры, такие как крахмал и денатурированный крахмал, целлюлоза, гликозаминогликаны и коллаген, а также полусинтетические и синтетические полимеры, такие как силиконы, силиконовые эластомеры, полидиметилсилоксаны, полидиметилсилоксаны, содержащие диоксид кремния, полидиметилсилоксаны, содержащие полиалкиленоксид (Gelest), политетрафторэтилен (Tefton), полилактиды, полигликолиды, полиэтиленгликоль, сополимеры полилактида и полигликолида, полиангидриды, полимеры этиленовинилацетата, поли(метилметакрилат), простой этиловый эфир целлюлозы, поли(этилакрилат), поли(триметиламмонийметил-метакрилаты), полидиметилсиоксаны, гидроксиэтил-полиметакрилаты, полиуретаны и сополимеры полистирола и бутадиена.
Кроме того, такие трансдермальные системы также могут состоять из микросферических частиц или наночастиц или микрокристаллов, которые содержат по меньшей мере одно соединение в соответствии с общей формулой (I). Кроме того, такие частицы можно ввести в гель и применять в этой форме.
Кроме того, также можно использовать микрочастицы из биосовместимых керамических материалов, таких как гидроксиапатит, к которым присоединяют или в которые вводят соединения в соответствии с формулой (I).
Описание графических материалов
Фиг.1 показывает, что в присутствии повышенной концентрации серотонина, серотонин как фактор роста приводит к пролиферации гладкомышечных клеток. В присутствии соединения в соответствии с общей формулой (I), такого как лизурид или тергурид, эта клеточная пролиферация значительно уменьшается благодаря антагонистическому действию этих веществ (на серотониновые 5-НТ2 рецепторы). С помощью этой модели in vitro можно сделать вывод о том, что в данных условиях, которые приводят к увеличению серотонина, высвобождающегося локально или системно, вышеуказанные вещества могут ингибировать избыточную пролиферацию гладкомышечных клеток в кровеносных сосудах во время процесса заживления.
Фиг.2 демонстрирует химическую структуру лизурида.
Фиг.3 демонстрирует химическую структуру тергурида.
Фиг.4 демонстрирует влияние серотонина и тергурида на экспрессию CoI1 А2 в гладкомышечных клетках легочных артерий.
Примеры
Пример 1: Антипролиферативное действие
4
Человеческие легочные гладкомышечные клетки (PromoCell) культивировали до внесения в шестилуночные планшеты в культуральной среде PromoCell в соответствии с рекомендациями изготовителя. Легочные гладкомышечные клетки сеяли в 24-луночные планшеты на культуральную среду PromoCell с клеточной плотностью 5×10 клеток на лунку. После адгезии клеток культуральную среду заменяли и осуществляли остановку роста путем культивирования в среде с 0,2% фетальной телячьей сыворотки в течение 48 часов.
-8
В целях изучения антипролиферативного эффекта этого вещества, клетки вначале проинкубировали с 10 мкмоль/л активных агентов. Характер роста клеток затем стимулировали серотонином (10 моль/л). Для измерения клеточной пролиферации к культурам добавляли [3Н]-тимидин (Amersham) и инкубировали в течение 24 часов. Вначале клетки инкубировали дважды в ледяном фосфатно-солевом буферном растворе, а затем в ледяной 10% трихлоруксусной кислоте в течение 30 минут при температуре 4°С. Клетки разбавляли 0,1 молярным раствором гидроксида натрия (0,5 мл/лунка). После нейтрализации уксусной кислотой включение [3h]-тимидина определяли с помощью жидкостных сцинтилляционных счетчиков. Определение проводили трижды. Средние величины для каждого случая показаны на фиг.1.
Пример 2: Изготовление состава для орального применения тергурида
25,0 г микронизированного тергурида смешивали во вращающейся мешалке в течение 5 минут, например при 162 об/мин, с 4035,0 г лактозы, 1800,0 микрокристаллической целлюлозы и 120,0 г кроскармеллозы натрия после предварительного просеивания вспомогательных агентов. Эту предварительную смесь затем переливали в сито с размером ячейки 0,8 мм. Добавляли 20,0 г стеарата магния и вновь перемешивали в течение 1 минуты. Прессованную форму получали с помощью подходящего таблеточного пресса (например, ротационного пресса), формируя 50000 таблеток (теоретический выход) диаметром 7 мм и весом таблетки 120 мг, что соответствует дозе 0,5 мг тергурида/таблетка. Изготовленные таким образом таблетки при помещении их в воду быстро высвобождают активный агент, максимум в течение 60 минут, почти полностью.
Пример 3: Изготовление состава для орального применения лизурдина с замедленным высвобождением.
2,0 г микронизированного гидрогенмалеата лизурида смешивали во вращающейся мешалке в течение 5 минут, например при 180 об/мин, с 750,0 г гидроксиэтилцеллюлозы (тилозы Н) и 243,0 г микрокристаллической целлюлозы после предварительного просеивания вспомогательных агентов. Эту предварительную смесь затем переливали в сито с размером ячейки 0,8 мм. Добавляли 5,0 г стеарата магния и вновь перемешивали в течение 1 минуты. Прессованную форму получали с помощью подходящего таблеточного пресса (например, ротационного пресса), формируя 10000 таблеток (теоретический выход) диаметром 6 мм и весом таблетки 100 мг, что соответствует дозе 0,2 мг гидрогенмалеата лизурида/таблетка. Изготовленные таким образом таблетки при помещении их в воду высвобождают активный агент замедленным образом, так, что 60-70% дозы состава высвобождается приблизительно в течение двух часов.
Пример 4: Изготовление стерильного лиофилизата с гидрогенмалеатом лизурида для инъекций после растворения
2,0 г гидрогенмалеата лизурида растворяли вместе с 20,0 г моногидрата лактозы, 0,4 г моногидрата лимонной кислоты и 1,0 г дигидроцитрата натрия в 976,6 воды для инъекционного использования. Полученный раствор от бесцветного до слегка желтоватого цвета имеел рН между 4,5 и 5,4. Этот раствор предварительно фильтровали через мембранный фильтр, а затем фильтровали стерильно в асептических условиях через другой мембранный фильтр (0,2 мкм). Соответственно, 1,0 г полученного таким образом раствора вносили в стерильные, снабженные резиновой пробкой флаконы объемом 6 мл для последующего процесса сушки путем замораживания, и замораживали при температуре от -40°С до -50°С в лиофилизаторе. Затем в условиях вакуума осуществляли процесс высушивания или повторного высушивания, получая брикет высушенного вещества. Эти флаконы запечатывали и закручивали в асептических условиях. Таким образом производили, соответственно, 1000 ампул (теоретический выход) с 2 мг лиофилизованного гидрогенмалеата лизурида. Лиофилизат восстанавливали путем растворения в стерильном физиологическом растворе и получали готовый к использованию стерильный раствор для инъекций или инфузий для немедленного применения.
Пример 5: Изготовление матрицы пластыря с тергуридом для трансдермального применения
2
2
2
2,5 г тергурида добавляли к 2,13 г ацетона и 51,54 г раствора щелочного сополимера бутилметакрилата (раствор Eudragit 100). К раствору добавляли 5,0 поливиниловых пирролидонов (Povidone 25), 2,5 г пропиленгликоля, 5,0 г додецил-N,N-диметиламиноацетата (альтернативно 5,0 г 1-додеканола), 1,0 г Foral E 105 и 0,65 г антиоксиданта (например бутилгидроксианизола). Полученный таким образом покрывающий раствор равномерно распределяли по полимерному листу полиэтилена в подходящих для процесса условиях в машине для нанесения покрытия (коатере) и затем сушили для формирования базисного веса 50 мг/10 см (±5%) покрытой поверхности. Полученную таким образом клеющуюся матрицу ламинировали полимерным листом, силиконизированным с одной стороны, и следующим шагом перфорировали для формирования пластырей размера, подходящего для терапевтического применения (например, 20 см), и упаковывали в алюминиевые пакетики. Изготовленный таким образом пластырь с тергуридом высвобождает активный агент непрерывно в течение нескольких дней из расчета от 0,1 до 0,5 мкг/см/час в системную циркуляцию после нанесения на неповрежденную кожу, лишенную волос.
Пример 6: Изготовление мембраны пластыря с лизуридом для трансдермального применения
2
С помощью лабораторных коатеров мембрану микропористого полиэтилена (Solupor 10P05A), а также контрольную мембрану (или, альтернативно, сополимер этилена с винилацетатом (EVA, Cotran 3M 9728)), покрывали совместимым с кожей силиконовым клеем (BioPSA7-4202) (альтернативно полиизобутиленовым клеем, Oppanol), сушили при базисном весе около 10-25 мг/см и затем ламинировали наружным слоем (полиэтиленом), силиконизированным с одной стороны.
В подходящей упаковочной машине полученный таким образом ламинат упаковывали в форме кольца в теплочувствительный полиэтилен, оставляя небольшое отверстие, и сдавливали. Через оставшееся отверстие в созданную полость с помощью соответствующего инъецирующего устройства вводили примерно 0,5 мл 1% раствора лизурида в 2-пропаноле, гидроксипропиловой целлюлозе (Klucel LF) и токофероле, а затем запечатывали полностью.
После уравновешивания и снятия наружного слоя мембрану пластыря прикрепляли к неповрежденной и лишенной волосяного покрова коже, что приводило к высвобождению лизурдина непрерывно и в постоянной дозе. Доза может быть установлена на пластыри различного размера.
Пример 7: Изготовление стерильного состава с тергуридом для подкожного применения.
2
2
50 г микронизированного тергурида однородно смешивали с 50 г полидиметилсилоксана и придавали основной матрице форму нити стандартными способами, предпочтительно путем экструзии. Нить разрезали на части длиной 30 мм. В соответствии с таким же процессом производили центральную часть из активных агентов без экструдата, имеющую идентичные размеры. На втором этапе изготавливали мембраны в форме трубок с толщиной стенки например 0,2 мм из коммерчески доступного полидиметилсилоксана, содержащего диоксид кремния, или например из полидиметилсилоксана, содержащего Pt-катализируемый сшитый (сетчатый) полиалкилен азота (Gelest). Мембраны разрезали на части длиной 60 мм и оставляли разбухать в циклогексане. Затем вставляли центральную матрицу, содержащую активное вещество, а экструдат без активного агента вставляли с обеих сторон трубчатой мембраны, например таким образом, чтобы заполненное воздухом пространство шириной примерно 1-3 мм создавалось по обе стороны между содержащей активный агент центральной частью и экструдатом без активного агента. Затем циклогексан удаляли путем испарения, состав разрезали на части общей длиной 50 мм, так что закрытие создавалось по обе стороны состава с помощью центрального материала без активного агента. Состав подвергали газовой стерилизации стандартным способом (этиленоксид, HO). Нахождение состава в месте применения можно выявить в любой момент путем ультразвуковой детекции из-за закрытого воздуха.
Пример 8: Легочная гипертензия
Описание эксперимента
1 монокроталин (60 мг/кг; Sigma) вводили крысам в день эксперимента. Для этой цели вещество растворяли в 0,5 молярной соляной кислоте и корректировали рН до 7,4 с помощью 0,5 молярного раствора гидроксида натрия. Раствор вводили самцам крыс Sprague-Dawley в виде однократной подкожной инъекции в дозе 60 мг/кг. Такой же объем изотонического физиологического раствора вводили контрольным животным.
В 14-28 дни эксперимента в группе из 6 животных, которым в первый день был введен монокроталин, ежденевно вводили через пищеводную трубку либо 0,25 мг/кг лизурдина, либо 2,5 мг/кг тергурида. Дозирующие характеристики в данном случае взяты относительно вещества в виде свободного основания. Были использованы такие вещества как соль гидрогенмалеат или свободное основание. Их вносили в дистиллированную воду в присутствии следов аскорбиновой кислоты и вводили через пищеводную трубку утром и вечером в объеме 2 мл. Такое же количество воды вводили контрольным животным.
-1
На 28 день эксперимента, через 2 часа после последнего введения вещества, животным проводили общую анестезию с помощью фенобарбитала. Затем животным проводили трахеостомию и респирацию с 10 мл/кг и с частотой 60 с (SAR830A/P; IITC). Анестезию сохраняли путем ингаляции изофлурана.
Было определено среднее артериальное давление и систолическое кровяное давление в правом желудочке. Системное артериальное давление измеряли в левой сонной артерии с помощью катетера Миллара. Катетер Миллара с датчиком давления (Millar instruments, модель SPR-534) вводили через правую яремную вену, продвигали до правого желудочка сердца и измеряли давление в правом желудочке (RVSP). Сигнал усиливался с помощью прибора HSE coupler серии 500 и поставлялся в регистрационный блок для оценки.
После того, как было проведено измерение давления, крыс перфузировали физиологическим раствором. Правое легкое удаляли, подвергали глубокой заморозке и обрабатывали для определения содержания коллагена. С этой целью ткань вначале гомогенизировали и анализировали в соответствии со способом Берга (Meths Enzymol. 82, 372 (1982)). Сначала гидролиз образца проводили в 6-молярной соляной кислоте в течение 16 часов при температуре 116°С. Гидроксипролин впоследствии окислялся до пиррола, после чего образовывал комплекс с п-диметиламинобензальдегидом. Полученный цветной комплекс измеряли фотометрически при 560 нм и содержание гидроксипролина в образцах определяли с помощью калибровочной кривой. Результаты даны в мкг/г белка в легочной ткани.
Результаты:
а) Влияние обработки лизуридом или тергуридом в 15-28 дни эксперимента на систолическое давление в правом желудочке (ПЖДсис, RVPsys) и системное артериальное давление (САД, SAP).
ПЖДсис [мм рт.ст.]
САД [мм рт.ст.]
Контроль
23±4
118±5
Монокроталин
55±5
114±7
Монокроталин + 0,25 мг/кг лизурида 2 раза в день
43±7
109±9
Монокроталин + 2,5 мг/кг тергурида 2 раза в день
39±3
111±7
Результаты представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего (N=6).
б) Влияние обработки лизуридом или тергуридом в 15-28 дни эксперимента на содержание гидроксипролина в легких.
Гидроксипролин [мкг/г белка]
Контроль
1,2±0,2
Монокроталин
4,2±1,1
Монокроталин + 0,25 мг/кг лизурида 2 раза в день
3,3±0,8
Монокроталин + 2,5 мг/кг тергурида 2 раза в день
2,7±1,2
Результаты представлены в виде среднего±стандартная ошибка среднего (N=6).
Оценка результатов эксперимента
Эндотелиальное повреждение легких, которое влечет за собой избыточную продукцию соединительной ткани и развитие легочной гипертензии, наблюдается у крыс после введения монокроталина. Накопление коллагена, измеряемое как содержание гидропролина в легочной ткани, а также увеличение систолического давления в правом желудочке отражает эти структурные и функциональные изменения. На этой модели легочной гипертензии были рассмотрены возможные терапевтические эффекты обработки лизуридом или тергуридом. В соответствии с условиями эксперимента терапия не начиналась во время введения монокроталина, то есть ни в момент возникновения повреждения, ни в течение 14 дней после этого. В соответствии с литературой в этот момент проявляются значительные изменения в сосудах и увеличение давления. При непрямом измерении легочной гипертензии выявляется терапевтически желательный эффект от терапии лизурдином или тергуридом в виде снижения увеличения давления в правом желудочке.
Сокращение содержания гидроксипролина увеличивается монокроталином из-за структурной корреляции, учитывая, что в ходе терапии двумя веществами была отмечена "обратная перестройка". На этой созданной животной модели лизурид и тергурид проявляют свойства эффективности, которые делают успешным их терапевтическое применение у пациентов с легочной гипертензией.
Описанный экспериментальный пример демонстрирует успешное применение эрголинов для лечения легочной гипертензии на примере лизурдина и тергурида.
Пример 9: Легочная гипертония
Описание эксперимента
1 монокроталин (60 мг/кг; Sigma) вводили крысам в день эксперимента. Для этой цели вещество растворяли в 0,5 молярной соляной кислоте и корректировали рН до 7,4 с помощью 0,5 молярного раствора гидроксида натрия. Раствор вводили самцам крыс Sprague-Dawley в виде однократной подкожной инъекции в дозе 60 мг/кг. Контрольным животным вводили такой же объем изотонического физиологического раствора.
Индукция легочной артериальной гипертензии
В 1-28 дни эксперимента в группе из 4 животных, которым в первый день был введен монокроталин, дважды в день вводили интраперитонеально 1,2 мг/кг тергурида. Тергурид вносили в дистиллированную воду в присутствии следов аскорбиновой кислоты и вводили через пищеводную трубку утром и вечером в объеме 2 мл. Контрольным животным вводили такое же количество физиологического раствора.
-1
На 28 день эксперимента, через 2 часа после последнего введения вещества, животным проводили общую анестезию с помощью фенобарбитала. Затем животным проводили трахеостомию и респирацию с 10 мл/кг и с частотой 60 с (SAR830A/P; IITC). Анестезию сохраняли путем ингаляции изофлурана.
Определение систолического давления в правом желудочке (RVSP) и САД (систолического артериального давления)
Было определено среднее артериальное давление и систолическое кровяное давление в правом желудочке. Системное артериальное давление измеряли с помощью катетера Миллара в левой сонной артерии. Катетер Миллара с датчиком давления (Millar Instruments, модель SPR-534) вводили через правую яремную вену, продвигали до правого желудочка сердца и измеряли давление в правом желудочке (RVSP). Сигнал усиливался с помощью прибора HSE coupler серии 500 и поставлялся в регистрационный блок для оценки.
Определение гипертрофии правого желудочка
После того, как было проведено измерение давления, крыс перфузировали физиологическим раствором. Сердце выделяли и отсекали правый желудочек, перегородку, а также левый желудочек каждого сердца. Препараты ткани подвергали высушиванию путем замораживания и определяли сухой вес путем взвешивания. Для каждого отдельного животного в качестве меры гипертрофии правого желудочка был определен фактор: вес правого желудочка/вес левого желудочка и перегородки (RV/LV+S) этого животного.
Определение мускуляризации артериальных капиллярных сосудов легких
Легкие выделяли, фиксировали в формалине и заливали в парафин. Были получены парафиновые срезы и проведено двойное иммуногистохимическое окрашивание в соответствии со стандартными протоколами. Гладкомышечные клетки сосудов окрашивали антителами против актина, а эндотелий окрашивали с помощью антител против фактора Виллебранда. Для оценки использовали более 80 интраацинальных артерий, имеющих диаметр более 50 мкм. Эти сосуды были разделены на 3 категории: немускулизированные сосуды с 20%, частично мускулизированные сосуды с более 20%, но менее 70%, и полностью мускулизированные сосуды с более 70% выстилки сечения сосуда гладкомышечными клетками.
Результаты:
а) Влияние обработки тергуридом в 1-28 дни эксперимента на систолическое давление в правом желудочке (RVSP) и системное артериальное давление (SAP)
ПЖДсис [мм рт.ст.]
САД [мм рт.ст.]
Контроль
31,0±3,6
104,0±13,3
Монокроталин
64,4±14,5
93,7±19,4
Монокроталин
36,4±3,6
97,5±15,2
+ 0,4 мг/кг тергурида два раза в день
Результаты представлены в виде среднего±стандартная ошибка среднего (N=4)
b) Влияние обработки тергуридом в 1-28 дни эксперимента на гипертрофию правого желудочка, измеряемую как соотношение: вес правого желудочка к весу левого желудочка и перегородки
RV/LV+S
Контроль
0,31±0,06
Монокроталин
0,74±0,14
Монокроталин + 0,4 мг/кг тергурида два раза в день
0,33±0,08
Результаты представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего (N=4).
с) Влияние обработки тергуридом в 1-28 дни эксперимента на мускуляризацию артериальных капиллярных сосудов (диаметром 20-50 мкм) в легких.
Часть немускулизированных сосудов [%]
Часть частично мускулизированных сосудов [%]
Часть полностью мускулизированных сосудов [%]
Контроль
57,8±14,6
3,2±2,3
14,8±6,2
Монокроталин
40,4±16,0
42,3±4,4
64,0±7,7
Монокроталин + 0,4 мг/кг тергурида два раза в день
1б9±1,6
57,8±14,6
21,3±12,6
Результаты представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего (N=4).
Оценка результатов эксперимента
У крыс после введения монокроталина наблюдается эндотелиальное повреждение легких, которое влечет за собой избыточную пролиферацию гладкомышечных клеток в артериальных капиллярных сосудах легких и развитие легочной гипертензии. Увеличение систолического давления в правом желудочке при постоянном системном артериальном давлении, а также гипертрофия правого желудочка отражают эти структурные и функциональные изменения.
Возможные терапевтические эффекты обработки тергуридом были рассмотрены на этой модели легочной гипертензии. В соответствии с условиями эксперимента терапия была начата сразу же после введения монокроталина. В ходе терапии тергуридом увеличение давления в правом желудочке как косвенный признак легочной гипертензии практически всегда подавлялось. В соответствии с условиями эксперимента системное артериальное давление обнаруживаемым образом не изменялось.
Также во время терапии происходит полное подавление вызванной монокроталином гипертрофии правого желудочка. В качестве терапевтического эффекта в ходе терапии было отмечено сокращение вызванной монокроталином мускуляризации артериальных капиллярных сосудов. На этой созданной животной модели тергурид обладает такими качествами эффективности по отношению к легочной гипертензии по всем соответствующим функциональным и структурным параметрам, которые делают успешным использование его у пациентов с легочной гипертензией.
Пример 10: Ингибирование экспрессии CoI IA2 в гладкомышечных клетках легочных артерий
В эксперименте исследовали возможное стимулирующее влияние серотонина на экспрессию CoI A2, а также ингибирующее действие тергурида. Исследования проводились на человеческих легочных гладкомышечных клетках (Cambrex). Клетки культивировали в среде СС-3182 (Cambrex) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Добавляли 5% серотонин-истощенную фетальную телячью сыворотку (FCS) (HyClone), очищенную с помощью активированного угля.
После получения сливающегося газона клеток клетки культивировали еще в течение 2 дней в 5% FCS. Для эксперимента использовали среду с добавлением 0,5% FCS. Далее клетки культивировали в течение 48 часов после добавления серотонина (100 нмоль/л) и/или тергурида (100 нмоль/л). Инкубации проводили в трех параллелях.
Общую РНК получали с использованием набора Rneas Kit (Qiagen) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Обратную транскрипцию в кДНК осуществляли с помощью праймеров oligo-dT Primer (Roche).
Затем экспрессию гена количественно оценивали с помощью ПЦР в масштабе реального времени SYBR Green на системе определения последовательности ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) в соответствии со стандартными протоколами. В качестве пары специфичных праймеров в анализе ПЦР для человечского CoI1 А2 использовали прямой праймер 5'-GGTCAGCACCA-CCGATGTC-3' и обратный праймер 5'-CACGCCTG-CCCTTCCTT-3'.
Для стандартизации различий в общем количестве РНК в отдельных образцах экспрессию CoI1 А2 нормализировали по экспрессии фермента глицеринальдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), который постоянно экспрессируется в клетках. Для этой цели использовали следующие праймеры: прямой праймер 5'-CAATGC-CTCCTGCACCACCAAC-3' и обратный праймер: AGGGGCCATCCACAGTCTTCT-3'.
Наличие экспрессии CoI1 А2 и GAPDH в отдельных образцах определяли с помощью стандартных способов оценки и количественно подсчитывали как отношение CoI1 A2/GAPDH.
Результаты представлены в виде Box-диаграмм (диаграмм типа «прямоугольник с усиками»).
Как видно из рисунка, экспрессия CoI1 А2 в человеческих гладкомышечных клетках легочных артерий значительно стимулируется в присутствии 100 нмоль/л серотонина по сравнению с контрольной группой. Это свидетельствует о трофическом действии серотонина. Избыточное отложение коллагена наряду с пролиферацией гладкомышечных клеток участвует в патофизиологии легочного артериального высокого давления.
Экспрессия CoI1 А2 ингибируется в присутствии тергурида, ингибирующее действие которого более выражено в присутствии серотонина. Таким образом, из описанных здесь качеств эффективности можно сделать вывод о возможном терапевтическом преимуществе тергурида в лечении пациентов с легочной артериальной гипертензией.