ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

1. Способ генерирования популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 60% клеток в популяции совместно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1, дифференцированием популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, где способ включает:
a) обработку популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, фактором роста фибробластов человека;
b) обработку популяции клеток со стадии a) циклопамином-KAAD и ретиноевой кислотой; и
c) обработку популяции клеток со стадии b) активатором протеинкиназы C,
где маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, выбирают из группы, состоящей из SOX17, GATA4, HNF3 бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix- подобный гомеобоксный белок, FGF4, CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99, и OTX2; и
где маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, выбирают из группы, состоящей из PDX1, NKX6.1, HNF1 бета, PTF1 альфа, HNF6, HNF4 альфа, SOX9, HB9 и PROX1.
2. Способ по п. 1, где стадия a) включает обработку популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы FGF7.
3. Способ по п. 1, где стадия c) включает обработку популяции клеток со стадии b) активатором протеинкиназы C, фактором, способным ингибировать BMP, и ингибитором сигнального каскада рецепторов TGFβ.
4. Способ по п. 3, где фактор, способный ингибировать BMP, представляет собой Ноггин.
5. Способ по п. 3, где ингибитор сигнального каскада рецептора TGFβ представляет собой ингибитор ALK5.
6. Способ по п. 5, где ингибитор ALK5 представляет собой ингибитор ALK5 II.
7. Способ по п. 1, где стадия c) включает обработку популяции клеток со стадии b) активатором протеинкиназы C, фактором, способным ингибировать BMP.
8. Способ по п. 7, где фактор, способный ингибировать BMP, представляет собой Ноггин.
9. Способ по п. 8, где Ноггин применяют в концентрации от примерно 50 нг/мл до примерно 500 мкг/мл.
10. Способ по п. 9, где Ноггин применяют в концентрации примерно 100 нг/мл.
11. Способ по п. 1, где стадия c) включает обработку популяции клеток со стадии b) активатором протеинкиназы C и ингибитор сигнального каскада рецептора TGFβ.
12. Способ по п. 11, где ингибитор сигнального каскада рецептора TGFβ представляет собой ингибитор ALK5.
13. Способ по п. 12, где ингибитор ALK5 представляет собой ингибитор ALK5 II.
14. Способ по п. 13, где ингибитор ALK5 II применяют в концентрации от примерно 0.1 мкM до примерно 10 мкM.
15. Способ по п. 14, где ингибитор ALK5 II применяют в концентрации примерно 1 мкM.
16. Способ по п. 1, где стадия b), стадия c), или как стадия b) так и стадия c) включает обработку DMEM с высоким содержанием глюкозы.
17. Способ по п. 1, где стадия b) включает обработку популяции клеток со стадии a) циклопамином-KAAD, ретиноевой кислотой и фактором роста фибробластов человека.
18. Способ по п. 17, где фактор роста фибробластов человека представляет собой FGF7.
19. Способ по п. 17, где стадия c) включает обработку популяции клеток со стадии b) активатором протеинкиназы C и фактором, выбранным из группы, состоящей из фактора, способного ингибировать BMP, ингибитора сигнального каскада рецептора TGFβ и фактора роста фибробластов человека.
20. Способ по п. 19, где стадия c) включает обработку популяции клеток со стадии b) активатором протеинкиназы C и фактором роста фибробластов человека.
21. Способ по п. 20, где фактор роста фибробластов человека представляет собой FGF-7 или FGF-10.
22. Способ по п. 21, где фактор роста фибробластов человека может быть применен в концентрации от примерно 50 пг/мл до примерно 50мкг/мл.
23. Способ по п. 1, где более чем 70% клеток в популяции совместно экспрессируют PDX1 и NKX6.1.
24. Способ по п. 1, где более чем 80% клеток в популяции совместно экспрессируют PDX1 и NKX6.1.
25. Способ по п. 1, где более чем 90% клеток в популяции совместно экспрессируют PDX1 и NKX6.1.
26. Способ по п. 1, где клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы являются клетки дефинитивной энтодермы.
27. Способ по п. 1, где клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, являются клетки панкреатической энтодермы.
28. Способ лечения диабета, включающий имплантацию популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные способом по п. 1.
29. Способ лечения диабета, включающий:
a) обработку популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, фактором роста фибробластов человека;
b) обработку популяции клеток со стадии a) циклопамином-KAAD, ретиноевой кислотой и Ноггин;
c) обработку популяции клеток со стадии b) активатором протеинкиназы C, Ноггин и ингибитор ALK5 с получением популяции клеток экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы;
d) имплантацию популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы;
где маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, выбирают из группы, состоящей из SOX17, GATA4, HNF3 бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix- подобный гомеобоксный белок, FGF4, CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99, и OTX2; и
где маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, выбирают из группы, состоящей из PDX1, NKX6.1, HNF1 бета, PTF1 альфа, HNF6, HNF4 альфа, SOX9, HB9 и PROX1.
30. Способ по п. 29, где ингибитор ALK5 представляет собой ингибитор ALK5 II.
31. Способ по любому из пп. 1-30, где активатор протеинкиназы С выбрают из группы, состоящей из (2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактама, индолактама V, форбол-12-миристат-13-ацетата и форбол-12,13-дибутирата.
32. Способ по п. 31, где активатор протеинкиназы С представляет собой индолактам V, форбол-12-миристат-13-ацетат или форбол-12,13-дибутират.
33. Способ по п. 31, где активатор протеинкиназы С представляет собой (2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактам.