Влияние цитокинов фолликулярной жидкости на качество ооцитов у женщин с длительным бесплодием

АКУШЕРСТВО

Влияние цитокинов фолликулярной жидкости на качество ооцитов у женщин с длительным бесплодием

Э.В.Вартанян1, К.А.Цатурова1, И.В.Айзикович2

1Клиника вспомогательных репродуктивных технологий «Дети из пробирки», Москва

Проведена оценка уровня 17 цитокинов в фолликулярной жидкости у женщин, страдающих длительным бесплодием различной этиологии. Показано, что концентрации цитокинов IL-2, IL-4, IL-7, IL-8 в определенных диапазонах имеют высокую диагностическую ценность в отношении отрицательного прогноза развития беременности при использовании вспомогательных репродуктивных технологий у этой категории бесплодных женщин. Нарушение баланса цитокинов следует рассматривать как важное патогенетическое звено в развитии длительного бесплодия независимо от этиологического фактора, лежащего в основе данной патологии. Качество продуцируемых ооцитов зависит от цито-кинового профиля фолликулярной жидкости.

Ключевые слова: бесплодие, цитокины, фолликулярная жидкость, вспомогательные репродуктивные технологии

Influence of follicular fluid cytokines in the quality of oocytes in women with prolonged infertility

E.V.Vartanyan1, K.A.Tsaturova1, I.V.Ayzikovich2

Clinic of Assisted Reproductive Technology «Children of the Tubes», Moscow

The assessment of the level of 17 cytokines in the follicular fluid in women with prolonged infertility of various etiologies has been under study. It is shown that the concentrations of IL-2, IL-4, IL-7, IL-8 cytokines in certain bands have a high diagnostic value for the negative prognosis of pregnancy using assisted reproductive technologies in this category of infertile women. Imbalance of cytokines should be considered as an important pathogenetic link in the development of long-term infertility, regardless of the etiological factor underlying this pathology. The quality of oocytes produced depends on the cytokine profile of follicular fluid.

Key words: infertility, cytokines, follicular liquid, assisted reproductive technologies

Проблема бесплодия не имеет тенденции к разрешению и, напротив, носит нарастающий характер. Частота бесплодия в супружеских парах составляет от 12 до 30%. Развитие и совершенствование методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) позволили сделать значительные шаги в решении этой проблемы, однако эффективность ВРТ в последние годы значительно не меняется: частота успешных беременностей не превышает 30% [1-4]. В настоящее время на первый план выходит поиск прогностических критериев вынашивания беременности, что,

Для корреспонденции:

Вартанян Эмма Врамовна, кандидат медицинских наук, директор клиники вспомогательных репродуктивных технологий «Дети из пробирки» Адрес: 129327, Москва, ул. Ленская, 15, корп. 1 Телефон: (495) 471-4514 E-mail: info@baby-inf.ru

Статья поступила 04.06.2011 г., принята к печати 26.10.2011 г.

в частности, подтвердили многочисленные данные, представленные на конференции Европейского общества репро-дуктологов и эмбриологов, проходившей в июле 2011 г. в Стокгольме. Перспективным направлением в этой области является изучение роли цитокинов в регуляции репродуктивной функции. По современным представлениям, этапы созревания яйцеклетки, имплантации и развития эмбриона являются цитокинзависимыми процессами и контролируются иммунной системой [5-8]. Всестороннее изучение цитоки-новой регуляции начальных этапов репродуктивного процесса представляет несомненный интерес в плане разработки прогностических критериев эффективности экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Ранний прогноз высокого риска неэффективного цикла ЭКО имеет большое значение, поскольку позволяет изменить тактику лечения и повысить результативность ВРТ. Анализ уровня цитокинов и биологической активности регуляторных факторов в фолликуляр-

Э.В.Вартанян и др. / Вестник РГМУ, 2011, №6, с. 45-48

ной жидкости может послужить основой для поиска надежных лабораторных маркеров качества ооцитов и прогноза вынашивания беременности при проведении ЭКО.

Цель работы - определить влияние цитокинов фолликулярной жидкости на качество ооцитов у женщин с длительным бесплодием, выявить наиболее информативные показатели, эффективные в прогнозе результативности лечения бесплодия с помощью ЭКО.

Пациенты и методы

Были обследованы 323 женщины, которым проводили лечение бесплодия методом ЭКО в клинике «Дети из пробирки». Пациентки были разделены на пять групп в зависимости от этиологии бесплодия (табл. 1). Возраст пациенток составлял от 19 до 39 лет (средний возраст -29,4 ± 7,1 года), статистически значимых различий между группами по этому показателю не было. Первичное бесплодие было диагностировано у 38,6% пациенток, в основном 2-й и 3-й групп, вторичным бесплодием страдали 44,6% всех обследованных, в основном вошедших в 1-ю группу.

Индукцию суперовуляции в цикле ЭКО осуществляли по стандартной схеме [9]. Трансвагинальную пункцию фолликулов проводили под ультразвуковым контролем, осложнений не отмечено. После подсчета количества полученных ооцитов и оценки их качества по общепринятой балльной шкале (нормальные ооциты - 4-5 баллов, измененные - менее 4 баллов) ооциты культивировали в 6-луночных планшетах в среде IVF при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2. При трансвагинальной пункции фолликулов получали также образцы фолликулярной жидкости для дальнейшего определения в ней содержания цитокинов.

Для определения концентраций цитокинов в фолликулярной жидкости использовали метод проточной флюоримет-рии на двухлучевом лазерном автоматизированном анализаторе Bio-Plex Protein Assay System. При этом применяли коммерческие тест-системы 17-Plex. Диапазон чувствительности составлял 2-32000 пг/мл. При статистической обработке результатов концентрации цитокинов, выходящие за нижнюю границу чувствительности метода (< 2 пг/мл), принимали за 1 пг/мл. Определяли содержание следующих цитокинов: IL-1 р, -2, -4, -5, -6, -7, -8, -10, -12 (p70), -13, -17, TNF-a, IFN-y, G-CSF, GM-CSF, MIP-1 в, MCP-1. Следует отметить, что исследуемые цитокины относятся к группам, ответственным за определенные функциональные проявления: иммуносупрессорные - TM-цитокины (IFN-y, TNF-a, IL-2, -12) и ТИ2-цитокины (IL-4, -5, -6, -10, -13); провоспали-тельные - IL-1 в, TNF-a, IL-12 (p70), IL-17; факторы роста -IL-7, G-CSF, GM-CSF; хемокины - IL-8, MIP-1 в [9].

Таблица 1. Этиологическая структура бесплодия у обследо-

ванных пациенток и длительность бесплодия

Этиологические факторы бесплодия Число пациенток Число пациенток с длительностью бесплодия 5-10 лет и более, %

1. Трубно-перитонеальное бесплодие 87 50

2. Эндокринное бесплодие 57 54

3. Эндометриоз 79 62

4. Сочетанные факторы 28 30

5. Здоровые пациентки, состоящие в бесплодном браке (контрольная группа) 72

Для изучения взаимосвязи между цитокиновым профилем фолликулярной жидкости и качеством созревающих ооцитов были выделены две группы женщин: в одной группе все полученные ооциты были высокого качества (4-5 баллов), в другой доля качественных ооцитов не превышала 60%.

Все исследования выполняли в соответствии с «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными приказом Минздрава РФ от 19 июня 2003 г. №266, а также в соответствии с Хельсинской декларацией «Этические принципы научных и медицинских исследований с участием человека» в редакции 2000 г., под контролем локального этического комитета. Исследования выполнялись после получения информированного согласия обследуемых женщин.

Лечебные мероприятия проводили в соответствии с приказом Минздрава РФ от 26 февраля 2003 г. №67 «О применении вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в терапии женского и мужского бесплодия».

Математическую обработку полученных результатов проводили методами описательной, параметрической и непараметрической статистики с использованием программы 6.0», достоверность различий оценивали с использованием критерия Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

Все определяемые цитокины присутствовали в образцах фолликулярной жидкости исследуемых пациенток. Концентрации TNF-a, 11_-4, -5, -6, -7, -8, -10, -12 (р70), -17 были относительно низкими и не превышали 20 пг/мл в каждой из групп. Уровни 1Ь1р, IFN-Y, 1Ь2, 11.-13, G-CSF, GM-CSF были более высокими и достигали 157-166 пг/мл (табл. 2). Наиболее высокие концентрации указанных цитокинов отмечены в группах пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием, эндометриозом, сочетанными факторами бесплодия (1-я, 3-я и 4-я группы). Все женщины с повышенным уровнем указанных цитокинов имели в анамнезе 3 и более безуспешных попыток ЭКО.

Из полученных результатов следует, что, хотя определяемые в фолликулярной жидкости цитокины имеют разный

Таблица 2. Клинически значимые концентрации цитокинов в различных группах пациенток

Группа обследованных пациенток IFN-y IL-2 Цитокинь IL-13 IL-1 р G-CSF GM-CSF

1-я 55,0 ± 4,5 26,0 ± 3,3* 24,3 ± 2,1 26,5 ± 4,1 157,0 ± 15,6* 164,0 ± 11,5*

2-я 45,4 ± 5,2 20,1 ± 1,5 19,0 ± 2,2 24,0 ± 3,3 100,0 ± 9,8 110,0 ± 16,7

3-я 56,5 ± 5,5 27,0 ± 1,5* 27,7 ± 2,1* 28,0 ± 2,6 158,5 ± 15,6* 166,0 ± 12,3*

4-я 45,6 ± 6,1 24,4 ± 2,2 25,0 ± 1,5 22,0 ± 2,2 148,5 ± 14,9 136,3 ± 14,4

5-я 48,5 ± 2,1 20,3 ± 1,7 18,8 ± 1,1 18,0 ± 2,1 124,0 ± 10,1 110,0 ± 11,1

'различия с соответствующим значением 5-й (контрольной) группы достоверны (p < 0,05).

Влияние цитокинов фолликулярной жидкости на качество ооцитов у женщин с длительным бесплодием

Таблица 3. Концентрация цитокинов (пг/мл) в фолликулярной жидкости у пациенток с различным качеством ооцитов

Цитокины Здоровые доноры Пациентки со 100% Пациентки с долей ооцитов (контроль, качественных качественных

средние значения) ооцитов ооцитов 60% и ниже

IFN-Y 55 56,0 ± 8,7 7,5 ± 4,6**

11-2 25 20,5 ± 2,8 1,6 ± 0,4**

11-4 9,6 7,6 ± 1,0 1,2 ± 0,2**

11-5 2,7 2,3 ± 0,1 1,2 ± 0,1

11-6 13 42,6 ± 19,5 5,7 ± 3,1**

11-10 10 10,4 ± 0,9 3,8 ± 1,3**

11-13 24 47,5 ± 23,0 37,6 ± 18

11-1 в 23 27,3 ± 2,2 16,2 ± 3,0*

TNF-a 10 12,8 ± 2,1 4,3 ± 1,6**

11-12 (р70) 12 15,0 ± 2,9 6,2 ± 2,0**

11-17 16 25,7 ± 5,8 3,0 ± 2,0**

11-7 11 8,7 ± 0,9 1,2 ± 0,1**

G-CSF 166 144 ± 17 10,5 ± 6,8**

GM-CSF 136 222 ± 40 336 ± 201

11-8 21 50,6 ± 34,7 27,5 ± 5,0

М1Р-1 в 75 125 ± 23 48,7 ± 9,8*

*р < 0,05;" р < 0,01 при сравнении оппозитных групп пациенток.

функциональный профиль, суммарный биологический эффект фолликулярных факторов определяют в основном цитокины, обладающие иммуносупрессорной и противовоспалительной активностью.

Достоверные различия в концентрациях исследуемых цитокинов в фолликулярной жидкости у пациенток выбранных групп послужили основой для анализа клинической и прогностической значимости их определения.

Анализ уровня цитокинов в фолликулярной жидкости в зависимости от качественного состава ооцитов показал, что в группе пациенток со 100% содержанием качественных ооцитов (4-5 баллов) базальная секреция цитокинов находится на уровне таковой у здоровых доноров. В группе пациенток, где выход яйцеклеток высокого качества был ниже практически в 2 раза, обнаружили принципиально иную картину. Концентрация большинства определяемых цитокинов находилась на нижней границе чувствительности метода. При этом регистрировали глубокий дефицит ТМ-цитокинов ^N-7, 11_-2), ТИ2-цитокинов (11_-4, -6, -10), провоспалительных (1Ь-1р, TNF-a, 11_-12, -17, -6) и противовоспалительных (11_-10) медиаторов, ростовых факторов (11_-7, G-CSF) и хемокина М1Р-1 в (табл. 3).

Математический анализ содержания цитокинов в фолликулярной жидкости у женщин с множественными неудачными попытками экстракорпорального оплодотворения показал, что у этой категории пациенток уровни некоторых цито-кинов были изменены до определенных воспроизводимых величин (табл. 4).

Таким образом, для созревания ооцитов в морфологически качественные яйцеклетки необходимы наличие и поддержание в микроокружении фолликула определенного баланса цитокинов, относящихся к различным функционально значимым группам. Циклические изменения гормонов во время физиологического менструального цикла и на фоне стимуляции гиперовуляции сопровождаются изменениями показателей иммунитета, и прежде всего концентрации цитокинов в фолликулярной жидкости и в сыворотке крови [10]. В настоящем исследовании были получены данные о том, что на пике овуляции цитокиновый профиль сдвигается в сторону доминирования регуляторных факторов с иммуносупрессорной/противовоспалительной актив-

ностью. Появление супрессорной активности на ранних стадиях беременности обнаружено в сыворотке крови, а также характерно для децидуальных клеток эндометрия. Полученные нами результаты согласуются с данными литературы о снижении концентрации 11_-2 и ^N-7 и увеличении TGF-p1 на пике овуляции [11]. Доминирование противовоспалительной активности может быть также связано со снижением уровня 11_-8 при переходе из фолликулярной в лю-теиновую фазу.

У женщин с бесплодием идентифицировали цитокины с ТМ/провоспалительной активностью (И-2, ^N-7, TNF-a, !1_-1р, 11_-12, И-17), ТИ2/противовоспалительной активностью (11.-4, -5, -6, -10, -13), хемокины (!1_-8, МСР-1р, М!Р-1а) и ростовые факторы (GM-CSF, G-CSF, 11_-7). Следует отметить, что медианные значения указанных цитокинов, несмотря на выраженный разброс индивидуальных значений, соответствовали таковым у доноров ооцитов. Ряд авторов обращают внимание на селективный характер продукции цитокинов в фолликулярной жидкости, поскольку концентрации только некоторых из них существенно превышают концентрации соответствующих цито-кинов в периферической крови (например, 11.-8, 11_-6, M-CSF и G-CSF) [12]. Выявленная генерация естественных супрессорных клеток также может быть задействована в соответствующей перестройке иммунной системы на пике овуляции. Суммарный биологический эффект цитокинов фолликулярной жидкости, определяемых в ходе нашего исследования, проявлялся в виде иммуносупрес-сорной и противовоспалительной активности. Существует мнение, что именно благодаря супрессорной активности соответствующих цитокинов (sIL-2R, TGF-p1, TGF-p, 11.-10) не происходит отторжения чужеродных сперматозоидов и доимплантационного эмбриона, а также возможна сама имплантация эмбриона. В момент овуляции супрессорная активность может нарастать за счет увеличения противовоспалительных цитокинов [13].

Согласно данным литературы, созревание фолликулов опосредуется провоспалительными цитокинами (I1, 1.-6, TNF-a), хемокинами (1.-8, MCP-1), ростовыми факторами (M-CSF, G-CSF), которые в совокупности с TGF-p и LIF во многом определяют качество яйцеклеток [14]. Однако прямые доказательства представлены только в отношении M-CSF (CSF-1), отсутствие которого приводит к снижению количества фолликулов и их овуляции. Участие других цито-кинов в регуляции процессов фолликулогенеза и овуляции остается открытым вопросом.

Вместе с тем повышенную провоспалительную активность, в том числе повышенный уровень 1.-8, рассматривают как один из факторов идиопатического бесплодия [15]. Индуцированное 1.-8 значимое повышение провоспалитель-

Таблица 4. Диагностически значимые показатели цитокинов в фолликулярной жидкости у пациенток со множественными неудачными попытками ЭКО

Цитокины Критические SN, % SP, % ДК

концентрации, пг/мл

1.-7 <6 -13 55 91,7 -8,0

1.-4 <2 -14 66 87,5 -7,2

1.-2 <7 -12 70 83,4 -6,1

1.-8 >25 -3,6 40 83,4 -4,3

Э.В.Вартанян и др. / Вестник РГМУ, 2011, №6, с. 4Б-48

ной активности может способствовать усилению цитотокси-ческой функции макрофагов, Т- и NK-клеток, способных оказывать повреждающее действие на имплантированный эмбрион [16].

В условиях сниженного содержания цитокинов наблюдается двукратное уменьшение выхода яйцеклеток высокого качества и снижение эффективности последующего оплодотворения (индекс оплодотворения составляет 39% против 67-91%, р < 0,01). Полученные результаты свидетельствуют о том, что сбалансированность цитокин-опосредованных регуляторных воздействий в микроокружении фолликула служит ключевым фактором, определяющим количество и качество созревающих ооцитов и, как следствие, - эффективность оплодотворения полученных яйцеклеток.

Выводы

1. Дисбаланс цитокинов в фолликулярной жидкости является патогенетическим звеном бесплодия и может быть причиной неэффективных циклов экстракорпорального оплодотворения.

2. У женщин с неудавшимися попытками экстракорпорального оплодотворения в овуляторный период менструального цикла снижается концентрация в фолликулярной жидкости IL-2, IL-4, IL-7 и IL-8, что свидетельствует о сопряженности цитокин-опосредованных и клеточно-опосредо-ванных механизмов регуляции фолликулогенеза. На основании математического анализа выделены диагностически значимые диапазоны показателей цитокинового статуса, которые обладают высокой информативностью в раннем прогнозе эффективности лечения супружеского бесплодия с помощью программ вспомогательных репродуктивных технологий.

3. Фолликулогенез и процесс созревания ооцитов в полноценные яйцеклетки находится в тесной взаимосвязи с ре-гуляторной цитокиновой системой. Доминирующим вектором такой регуляции является сдвиг баланса в сторону цитокинов с иммуносупрессорной и противовоспалительной активностью, которые проявляют свой суммарный биологический эффект как на системном уровне, так и в микроокружении фолликула.

4. Качество продуцируемых ооцитов зависит от цитокинового профиля фолликулярной жидкости.

Литература

1. Кулаков В.И. Репродуктивное здоровье населения России // Consilium medicum. 2007. №2. С.26-29.

2. Романова Н.В., Смольникова В.Ю., Кузьмичев Л.Н. Повторные неудачи имплантации и применение ПГД для оптимизации программ ВРТ (обзор литературы) // Пробл. репродукции. 2010. №1. С.21-26.

3. Diedrich K., Fauser B.C., Devroey P., Griesinger G. The role of the endometrium and embryo in human implantation // Hum. Reprod. Update. 2007. V.13. №4. P.365-377.

4. Охтырская Т.А., Яворовская К.А., Шуршалина А.В., Назаренко Г.А. Имплантационные потери в программах ЭКО: роль наследственной и приобретенной тромбофилии (обзор литературы) // Пробл. репродукции. 2010. №2. С.21-25.

5. Келлэт Е.П., Шуршалина А.В., Корнеева И.Е. и др. Морфофункциональная характеристика эндометрия у женщин с бесплодием неясного генеза // Пробл. репродукции. 2011. №3. С.31-35.

6. Амирова А.А., Назаренко Т.А., Мишиева Н.Г. Факторы, влияющие на исходы ЭКО (обзор литературы) // Пробл. репродукции. 2010. №1. С.34-37.

7. Jones R.L., Hannan N.J., Kaituu T.J. et al. Identification of chemokines important for leukocyte recruitment to the human endometrium at the times of embryo implantation and menstruation // J. Clin. Endocrin. Metab. 2004. V.89. P.6155-6167.

8. Хонина Н.А., Айзикович И.В., Шевела Е.Я. и др. Регуляторные факторы и цитокины в сыворотке и фолликулярной жидкости у женщин при контролируемой овариальной гиперстимуляции // Цитокины и воспаление. 2005. Т.4. №2. С.38-44.

9. Айзикович Б.И., Айзикович И.В., Останин А.А., Черных Е.Р. Прогностическая модель оценки эффективности лечения бесплодия с помощью ЭКО // Пробл. репродукции. 2006. №4. С.63-69.

10. Fornari M.C., Sarto A., Berardi V.E. Effect of ovaric hyper-stimulation on blood lymphocyte subpopulations, cytokines, leptin and nitrite among patients with unexplained infertility // Am. J. Reprod. Immunol. 2002. V.48 (6). P.394-403.

11. Бондарев Д.А., Скорова Н.Е., Курносова Т.Р. Иммунологический аспект вспомогательных репродуктивных технологий // Андрол. и генит. хир. 2000. №2. С.30-39.

12. Al-Harthi L., Wright D.J., Anderson D. The impact of the ovulatory cycle on cytokine production: evaluation of systemic, cervicovaginal and salivary compartments // J. Interferon Cytokine Res. 2000. V.20 (8). P.719-724.

13. Gargiulo A.R., Fichorova R.N., Politch J.A. et al. Detection of implantation-related cytokines in cervicovaginal secretions and peripheral blood of fertile women during ovulatory menstrual cycles // Fertil. Steril. 2004. V.82. P.1226-1234.

14. Machelon V., Emilie D., Lefevre A. IL-6 biosynthesis in human preovulatory follicles: some of its potential roles at ovulation // J. Clin. Endocrin. Metab. 1994. V.79. P.633-642.

15. Хонина Н.А., Пасман Н.М., Черных Е.Р. Иммунная дисфункция при бесплодии неясного генеза (обзор литературы) // Пробл. репродукции. 2010. №1. С.16-20.

16. Hedger M.P., Meinhardt A. Cytokines and the immune-testicular axis // J. Reproduct. Immunol. 2003. V.58. P.1-26.

Информация об авторах:

Цатурова Кристина Ашотовна, кандидат медицинских наук, врач-ординатор Клиники вспомогательных репродуктивных технологий «Дети из пробирки»

Адрес: 129327, Москва, ул. Ленская, 15, корп. 1 Телефон: (495) 471-4514

Айзикович Ирина Валентиновна, кандидат медицинских наук,

заведующая отделением экстракорпорального оплодотворения

Медицинского центра «Авиценна»

Адрес: 630007, Новосибирск, ул. Октябрьская, 2/1

Телефон: (383) 363-3003

E-mail: dr_ayzikovich@mail.ru