Способ получения пептидного средства, обладающего антилитогенным действием
PROCESS FOR PREPARATION OF A PEPTIDE AGENT WITH ANTILITHOGENIC EFFECT

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, урологии, нефрологии, и может быть использовано для получения пептидного средства, обладающего антилитогенным действием.
Средства, обладающие антилитогенным действием, используются для лечения мочекаменной болезни. Мочекаменная болезнь - широко распространенное заболевание. В среднем 10-12% населения в Российской Федерации страдают мочекаменной болезнью (МКБ).
Проблема эффективного лечения МКБ на настоящий момент далека от эффективного решения, в связи с чем крайне актуальна. Основной метод лечения МКБ сегодня - литотрипсия. Данный метод малоэффективен и опасен для здоровья человека. При этом арсенал эффективных и безопасных лекарственных средств для лечения МКБ весьма ограничен.
Известны лекарственные средства для лечения мочекаменной болезни на основе природного сырья, а именно: уролесан, келлин, экстракт марены красильной сухой, ависан, трава горца птичьего, фитолизин, канаферон, пролит, урисан, цистон и др. (Вощула В.И. - Мн.: ВЭВЭР, 2006. - 268 с.). Эти средства улучшают показатели обмена веществ, состояния почек и верхних мочевых путей, ускоряют отхождение камней, а также их фрагментов и песка после успешного разрушения методом дистанционной литотрипсии. Они улучшают показатели обмена веществ, состояния почек и верхних мочевых путей, ускоряют отхождение камней, а также их фрагментов и песка после успешного разрушения методом дистанционной литотрипсии.
Известные лекарственные средства широко применяют в терапии мочекаменной болезни, однако известен ряд существенных недостатков, ограничивающих их применение, в связи с чем противопоказаниями для препаратов данной группы являются гломерулонефрит, нарушение мочеотделения, инфицированная моча, гепатит, язвенная болезнь желудка (Вощула В.И. - Мн.: ВЭВЭР, 2006. - 268 c.; Тиктинский О.Л. - Питер, 2000. - С.53-67).
Наиболее близким по достигаемому результату прототипом является средство, обладающее антилитогенным действием, Антилитал (Патент №2484834).
Сущность известного средства заключается в том, что средство Антилитал, полученное путем лиофильного высушивания свежезамороженных свиных почек, оказывает антилитогенное действие при мочекаменной болезни за счет уменьшения пересыщения мочи, снижения активности маркерных ферментов повреждения нефроцитов, ослабления оксидативного стресса и усиления антиоксидантной защиты в почках, а также снижения количества и размеров кальциевых депозитов.
Недостатками известного средства являются: сложность дозирования, неустойчивость к контаминации микрофлорой, неприятные органолептические свойства, невозможность использования для производства технологически более совершенных лекарственных форм, таких как капсулы, таблетки.
Авторы предлагают способ получения пептидного средства, обладающего антилитогенным действием, позволяющий расширить ассортимент средств для лечения мочекаменной болезни.
Техническим результатом заявляемого изобретения является расширение ассортимента средств для лечения мочекаменной болезни и создание технологически более совершенной формы экстракционного препарата (пептидный экстракт) из свиных почек.
Технический результат достигается тем, что лиофильно высушенный гомогенат свиных почек экстрагируют 0,1 Н уксусной кислоты в соотношении 1:10 в течение 24 ч при t=5°C с периодическим перемешиванием. По окончании экстракции замораживают при t=-20°С, а затем сразу оттаивают и профильтровывают последовательно через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Затем проводят осаждение пептидов при помощи ацетона. Для этого полученный первичный экстракт заливают ацетоном в соотношении экстракт-ацетон 1:6 и выдерживают при t=5°C в течении 18 ч. Затем отделяют осадок декантацией и центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Далее собирают осадок, растворяют его в 100 мл дистиллированной воды. Отделяют осадок примесей во вторичном экстракте фильтрованием. Далее выпаривают супернатант и досушивают в течение 48 часов при t=60°C.
Фармакологические свойства пептидного средства, обладающего антилитогенным действием, найдены экспериментальным путем.
Эксперименты по изучению эффективности пептидного средства, обладающего антилитогенным действием в отношении мочекаменной болезни, были проведены на 30 самцах крыс Wistar массой 180-220 г. На протяжении эксперимента животные находились в индивидуальных клетках, приспособленных для сбора мочи, в условиях стандартного лабораторного рациона. По условиям эксперимента крысы были разбиты на 2 группы по 15 животных в каждой. В первой (контрольная группа) с целью моделирования экспериментальной мочекаменной болезни на протяжении 6 недель крысам предоставлялся в качестве питья в свободном доступе 1%-ный раствор этиленгликоля. Во второй (подопытная группа) крысы также 6 недель получали в свободном доступе 1%-ный раствор этиленгликоля, но при этом, начиная с 4-й недели, вплоть до конца эксперимента им ежедневно вводилось внутрь пептидное средство в дозе 15 мг.
По окончании эксперимента крыс подвергали эвтаназии и морфометрически оценивали картину нефролитиаза в почках экспериментальных животных.
Статистическую обработку проводили с помощью программы «Statistica for Windows 6.0». Рассчитывали среднее значение, стандартную ошибку, для выявления достоверности различий использовали критерий Манна-Уитни.
Результаты исследований представлены в примерах 1 и 2.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Пример 1. Установлено, что в результате проведенных экспериментов в контрольной группе у крыс, длительного употреблявших в качестве питья раствор этиленгликоля, происходит развитие экспериментальной мочекаменной болезни. При окрашивании метенамин-серебром базальные мембраны канальцев утолщены. В цитоплазмах клеток эпителия канальцев в различном количестве поодиночке или группами определяются кристаллы депозитов камней коричневато-черного цвета различной формы и размера. Также видны крупные образования в просветах канальцев (фиг. 1). Определяется формирование крупных камней из более мелких непосредственно в цитоплазме клеток и выход конкрементов в просвет канальца (фиг. 2). Число депозитов в просветах канальцев варьирует от 1 до 4 и в среднем составляет 2,6±0,5 в поле зрения при увеличении ×1000. При проведении компьютерной морфометрии площадь депозитов камней составляет от 0,95 мкм до 41,8 мкм и в среднем составляет 11,5±1,7 мкм. При более детальном анализе распределения камней в зависимости от их площади выявлено, что число депозитов площадью от 0,2 мкм до 1,45 мкм составило 20%, количество депозитов площадью от 1,46 мкм до 3,0 мкм составило 14% и содержание депозитов площадью более 3,0 мкм и более составило 66%. Гистограмма распределения депозитов камней сдвинута вправо и имеет пик распределения в области площади камней 3,1 мкм и более (до 66%), что свидетельствует об активном камнеобразовании (фиг. 3).
2
2
2
2
2
2
2
Пример 2. У животных, получавших пептидное средство, почечная ткань находиться в состоянии гистологической нормы. При окрашивании метенамин-серебром базальные мембраны канальцев содержат единичные очаговые утолщения. В цитоплазмах клеток эпителия канальцев в различном количестве содержится «пылевидная» зернистость состоящая из мелких округлых кристаллов депозитов камней коричневато-черного цвета. Крупных депозитов в просветах канальцев не определяется (фиг. 4). Площадь депозитов камней составляет от 0,45 мкм до 1,6 мкм и в среднем составляет 0,96±0,05 мкм, что в 12,6 раза меньше, чем в контроле заболевания (р<0,001). При более детальном анализе распределения камней в зависимости от их площади выявлено, что 100% депозитов камней имеют площадь от 0,2 мкм до 1,45 мкм, а депозиты с площадью от 1,46 мкм до более 3 мкм отсутствуют, что свидетельствует об отсутствии процесса камнеобразования либо о крайне низкой его активности в данной группе исследования (фиг. 5).
Заявляемое пептидное средство в эксперименте проявило выраженное терапевтическое действие при мочекаменной болезни, проявившееся в 100%-ном разрушении крупных и средних камней в почках.