АНТИТЕЛО ПРОТИВ PD-L1
ANTIBODY AGAINST PD-L1

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к антителу против PD-L1. Более конкретно, настоящее изобретение относится к антителу против PD-1, содержащему вариабельную область, содержащую определяющие комплементарность области (CDR) анти-бычьего антитела против PD-1 крысы, и константную область антитела животного, отличного от крысы.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Белок программируемой гибели клеток 1 (PD-1), иммуноингибирующий рецептор и лиганд белка программируемой гибели клеток 1 (PD-L1) представляют собой молекулы, идентифицированные профессором Tasuku Honjo et al., Kyoto University, как факторы, которые ингибируют избыточный иммунный ответ и глубоко связанные с иммунотолерантностью (непатентный документ № 1: Ishida Y, Agata Y, Shibahara K, Honjo T, The EMBO J., 1992). Недавно было выяснено, что эти молекулы также участвуют в иммуносупрессии опухолей. В области здравоохранения был разработан и внедрен в практику препарат антител, который ингибирует эффект PD-1 (Opdivo™, Ono Pharmaceutical Co., Ltd.).
На сегодняшний день авторы настоящего изобретения разработали иммунотерапию для лечения резистентных болезней животных, нацеленную на PD-1 или PD-L1, и было обнаружено, что эта новая иммунотерапия может использоваться в отношении многочисленных заболеваний и у множества животных. Непатентный документ № 2: Ikebuchi R, Konnai S, Shirai T, Sunden Y, Murata S, Onuma M, Ohashi K. Vet. Res., 42:103; Sep. 2011; Непатентный документ № 3: Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Vet. Res., 44:59; Jul. 22, 2013; Непатентный документ № 4: Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology, 142(4):551-61; Aug. 2014; Непатентный документ № 5: Maekawa N, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Adachi M, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. PLoS One, 9(6):e98415; Jun. 10, 2014; Непатентный документ № 6: Mingala CN, Konnai S, Ikebuchi R, Ohashi K. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 34(1):55-63; Jan. 2011).
Однако антитела, которые были получены авторам настоящего изобретения до настоящего момента, являются антителами крысы, и поэтому их невозможно многократно вводить животным, отличным от крысы.
ЛИТЕРАТУРА УРОВНЯ ТЕХНИКИ
Непатентные документы
Непатентный документ № 1: Ishida Y, Agata Y, Shibahara K, Honjo T. The EMB 11(11):3887-3895; Nov. 1992
Непатентный документ № 2: Ikebuchi R, Konnai S, Shirai T, Sunden Y, Murata S, Onuma M, Ohashi K. Vet. Res., 42:103; Sep. 2011.
Непатентный документ № 3: Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Vet. Res., 44:59; Jul. 22, 2013
Непатентный документ № 4: Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology, 142(4):551-61; Aug. 2014.
Непатентный документ № 5: Maekawa N, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Adachi M, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. PLoS One, 9(6):e98415; Jun. 10, 2014.
Непатентный документ № 6: Mingala CN, Konnai S, Ikebuchi R, Ohashi K. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 34(1):55-63; Jan. 2011.
ЗАДАЧА, РЕШАЕМАЯ ИЗОБРЕТЕНИЕМ
Задачей настоящего изобретения является создание антитела против PD-1, способного к многократному введению животным, отличным от крысы.
СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ
Авторы настоящего изобретения определили вариабельные области крысиного моноклонального антитела (5D2) против бычьего PD-1, способного ингибировать связывание бычьего PD-1 и PD-L1, и затем объединили гены, кодирующие полученные вариабельные области, с генами, кодирующими константные области бычьего иммуноглобулина (бычий IgG1 с мутациями, которые были введены в предполагаемые сайты связывания рецепторов Fcγ в домен СН2 для ингибирования активности ADCC; см. Фиг. 1 и 11, где указаны аминокислотные положения и мутации: 251 E→P, 252 L→V, 253 P→A, 254 G→делеция, 348 A→S, 349 P→S; kebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug; 142(4):551-561) с получением гена химерного антитела. Этот ген был введен в клетки яичника китайского хомяка (клетки СНО). Посредством культивирования/пролиферации полученных клеток авторам настоящего изобретения удалось получить химерное "крысино-бычье" антитело против бычьего PD-L1. Кроме того, авторы настоящего изобретения определили CDR вариабельной области крысиного моноклонального антитела (5D2) против бычьего PD-1. Настоящее изобретение было сделано на основе этих обнаружений.
Сущность настоящего изобретения описана ниже.
(1) Антитело против PD-1, содержащее (а) легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью QSLEYSDGYTY (SEQ ID NO:16), CDR2 с аминокислотной последовательностью GVS и CDR3 с аминокислотной последовательностью FQATHDPDT (SEQ ID NO:17) и константную область легкой цепи антитела животного, отличного от крысы; и (b) тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GFSLTSYY (SEQ ID NO:18), CDR2 с аминокислотной последовательностью IRSGGST (SEQ ID NO:19) и CDR3 с аминокислотной последовательностью ARTSSGYEGGFDY (SEQ ID NO:20) и константную область тяжелой цепи антитела животного, отличного от крысы.
(2) Антитело по (1) выше, в котором вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи получены из крысы.
(3) Антитело по (2) выше, в котором вариабельная область легкой цепи представляет собой вариабельную область легкой цепи крысиного антитела против бычьего PD-1, и вариабельная область тяжелой цепи представляет собой вариабельную область тяжелой цепи крысиного антитела против бычьего PD-1.
(4) Антитело по (3) выше, в котором вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.
(5) Антитело по любому из (1)-(4) выше, в котором константная область легкой цепи антитела животного, отличного от крысы, имеет аминокислотную последовательность константной области лямбда-цепи или каппа-цепи.
(6) Антитело по любому из (1)-(5) выше, в котором константная область тяжелой цепи антитела животного, отличного от крысы, имеет аминокислотную последовательность константной области иммуноглобулина, эквивалентного IgG4 человека или имеет введенные мутации, которые снижают активность ADCC и/или активность CDC.
(7) Антитело по (6) выше, в котором животное, отличное от крысы, является особью крупного рогатого скота; константная область легкой цепи бычьего антитела имеет аминокислотную последовательность константной области лямбда-цепи; и константная область тяжелой цепи бычьего антитела имеет введенные в нее мутации, которые уменьшают активность ADCC и/или активность CDC.
(8) Антитело по (7) выше, в котором константная область легкой цепи бычьего антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, и константная область тяжелой цепи бычьего антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.
(9) Антитело по любому из (1)-(8) выше, которое имеет четырехцепочечную структуру, содержащую две легкие цепи и две тяжелые цепи.
(10) Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из (1) - (9) выше в качестве активного ингредиента.
(11) Композиция по (10) выше для профилактики и/или лечения злокачественных новообразований и/или воспаления.
(12) Композиция по (11) выше, причем злокачественное новообразование и/или воспаление выбраны из группы, состоящей из опухолевых заболеваний, лейкоза, болезни Джона, анаплазмоза, бактериального мастита, микотического мастита, микоплазменных инфекций (таких как микоплазменный мастит, микоплазменная пневмония или тому подобное), туберкулеза, инфекции Theileria orientalis, криптоспоридиоза, кокцидиоза, трипаносомоза и лейшманиоза.
(13) Искусственная генетическая ДНК, содержащая (а') ДНК, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью QSLEYSDGYTY (SEQ ID NO:16), CDR2 с аминокислотной последовательностью GVS и CDR3 с аминокислотной последовательностью FQATHDPDT (SEQ ID NO:17) и константную область легкой цепи антитела животного, отличного от крысы, и (b') ДНК, кодирующую тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GFSLTSYY (SEQ ID NO:18), CDR2 с аминокислотной последовательностью IRSGGST (SEQ ID NO:19) и CDR3 с аминокислотной последовательностью ARTSSGYEGGFDY (SEQ ID NO:20) и константную область тяжелой цепи антитела животного, отличного от крысы.
(14) Вектор, содержащий искусственную генетическую ДНК по (13) выше.
(15) Клетка-хозяин, трансформированная вектором (14) выше.
(16) Способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по (15) выше и сбор антитела против PD-1 из полученной культуры.
(17) ДНК, кодирующая легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью QSLEYSDGYTY (SEQ ID NO:16), CDR2 с аминокислотной последовательностью GVS и CDR3 с аминокислотной последовательностью FQATHDPDT (SEQ ID NO:17), и константную области легкой цепи антитела животного, отличного от крысы.
(18) ДНК, кодирующая тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GFSLTSYY (SEQ ID NO:18), CDR2 с аминокислотной последовательностью IRSGGST (SEQ ID NO:19) и CDR3 c аминокислотной последовательностью ARTSSGYEGGFDY (SEQ ID NO:20), и константную область тяжелой цепи антитела животного, отличного от крысы.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно настоящему изобретению было получено новое антитело против PD-1. Это антитело можно использовать даже в отношении животных, которые не являются крысами.
Настоящее описание охватывает содержание описаний и/или чертежей Японских патентных заявок № 2016-159090 и № 2017-099615, на основании которых по настоящей патентной заявке испрашивается приоритет.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[Фиг.1] Аминокислотная последовательность химерного "крысино-бычьего" антитела ch5D2 против PD-1. Показаны CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи и тяжелой цепи крысиного антитела 5D2 против бычьего PD-1. Кроме того, также показаны аминокислоты, введенные как мутации, в бычий IgG1 (домен CH2) (аминокислотные положения и мутации: 251 E→P, 252 L→V, 253 P→A, 254 G→делеция, 348 A→S, 349 P→S).
[Фиг.2] Схематическое изображение вектора pDN112 и химерного "крысино-бычьего" антитела ch5D2 против бычьего PD-1.
[Фиг.3] Количество и чистота после очистки химерного "крысино-бычьего" антитела ch5D2 против бычьего PD-1.
[Фиг.4] Свойство связывания химерного "крысино-бычьего" антитела ch5D2 против бычьего PD-1.
[Фиг.5] Ингибиторная активность химерного "крысино-бычьего" антитела ch5D2 против бычьего PD-1 в отношении связывания бычьего PD-1/PD-L1.
[Фиг.6] Изменения в концентрации в крови химерного "крысино-бычьего" антитела ch5D2 против PD-1 после введения особи крупного рогатого скота, экспериментально инфицированной BLV.
[Фиг.7] Реакция пролиферации Т-клеток на антиген BLV у особи крупного рогатого скота, экспериментально инфицированного BLV, путем введения химерного "крысино-бычьего" антитела ch5D2 против бычьего PD-1.
[Фиг.8] Изменения провирусной нагрузки BLV у особи крупного рогатого скота, экспериментально инфицированного BLV, при введении химерного "крысино-бычьего" антитела ch5D2 против бычьего PD-1.
[Фиг.9] Перекрестная реактивность крысиного антитела 5D2 против бычьего PD-1 в отношении овечьего PD-1.
[Фиг.10] Перекрестная реактивность крысиного антитела 5D2 против бычьего PD-1 с Т-клетками буйвола.
[Фиг.11] 3D-структура константной области бычьего IgG1 и предполагаемого сайта связывания с рецепторами Fcγ
[Фиг.12] Вектор pDC6
[Фиг.13] Чистота после очистки химерных "крысино-бычьих" антител ch5D2 против бычьего PD-1, IgG1 WT и IgG1 ADCC-.
[Фиг.14] Связывание химерного "крысино-бычьего" антитела ch5D2 против бычьего PD-1, IgG1 WT и IgG1 ADCC- с отдельными бычьими Fcγ-рецепторами.
НАИЛУЧШИЕ СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Ниже настоящее изобретение будет описано подробно.
Настоящее изобретение относится к антителу против PD-1, содержащему (а) легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью QSLEYSDGYTY (SEQ ID NO:16), CDR2 с аминокислотной последовательностью GVS и CDR3 с аминокислотной последовательностью FQATHDPDT (SEQ ID NO:17) и константную область легкой цепи антитела животного, отличного от крысы; и (b) тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GFSLTSYY (SEQ ID NO:18), CDR2 с аминокислотной последовательностью IRSGGST (SEQ ID NO:19) и CDR3 с аминокислотной последовательностью ARTSSGYEGGFDY (SEQ ID NO:20) и константную область тяжелой цепи антитела животного, отличного от крысы.
CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) крысиного антитела 5D2 против бычьего PD-1 (описано ниже) представляют собой область, состоящую из аминокислотной последовательности QSLEYSDGYTY (SEQ ID NO:16), область, состоящую из аминокислотной последовательности GVS, и область, состоящую из аминокислотной последовательности FQATHDPDT (SEQ ID NO:17) (см. фиг.1).
Кроме того, CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) крысиного антитела 5D2 против бычьего PD-1 представляют собой область, состоящую из аминокислотной последовательности GFSLTSYY (SEQ ID NO:18), область, состоящую из аминокислотной последовательности IRSGGST (SEQ ID NO:19), и область, состоящую из аминокислотной последовательности ARTSSGYEGGFDY (SEQ ID NO:20) (см. фиг.1).
В аминокислотных последовательностях QSLEYSDGYTY (SEQ ID NO:16), GVS и FQATHDPDT (SEQ ID NO:17), а также в аминокислотных последовательностях GFSLTSYY (SEQ ID NO:18), IRSGGST (SEQ ID NO:19) и ARTSSGYEGGFDY (SEQ ID NO:20), одна, две, три, четыре или пять аминокислот могут быть удалены, замещены или добавлены. Даже если были введены такие мутации, полученные аминокислотные последовательности способны выполнять функцию CDR в вариабельной области легкой цепи и тяжелой цепи антитела против PD-1.
2
VH, VL
2
2
Как используется в настоящем документе, термин «антитело» представляет собой концепцию, охватывающую не только полноразмерные антитела, но также и антитела меньшего молекулярного размера, такие как Fab, F(ab)', ScFv,диатело,, Sc(Fv), биспецифичный sc(Fv), минитело, мономер scFv-Fc или димер scFv-Fc.
В антителе против PD-1 по настоящему изобретению, VL и VH могут быть крысиными. Например, VL может быть VL крысиного антитела против бычьего PD-1, а VH может быть VH крысиного антитела против бычьего PD-1.
Аминокислотные последовательности VL и аминокислотная последовательность VH крысиного антитела против бычьего PD-1 показаны как SEQ ID NO:1 и 2, соответственно. Аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1 и 2 могут иметь делецию(и), замену(и) или добавление(я) в одной или нескольких (например, до пяти, максимально примерно 10) аминокислот. Даже если были введены такие мутации, полученные аминокислотные последовательности способны выполнять функцию VL или VH антитела PD-1.
VL и VH антитела животного, отличного от крысы, могут быть получены от животного, которое продуцирует PD-1, который перекрестно реагирует с крысиным антителом 5D2 против бычьего PD-1.
Существует два типа легкой цепи иммуноглобулина, которые называются каппа-цепью (κ) и лямбда-цепью (λ). В антителе против PD-1 по настоящему изобретению константная область легкой цепи (CL) антитела животного, отличного от крысы, может иметь аминокислотную последовательность константной области либо каппа-цепи, либо лямбда-цепи. При этом, относительное содержание лямбда-цепи выше у крупного рогатого скота, овец, кошек, собак и лошадей, а каппа-цепи выше у мышей, крыс, людей и свиней. Поскольку цепь с более высоким относительным содержанием считается предпочтительной, то антитело крупного рогатого скота, овцы, кошки, собаки или лошади предпочтительно имеет аминокислотную последовательность константной области лямбда-цепи, а антитело мыши, крысы, человека или свиньи предпочтительно имеет аминокислотную последовательность константной области каппа-цепи.
Константная область тяжелой цепи (СН) антитела животного, отличного от крысы, может иметь аминокислотную последовательность константной области иммуноглобулина, эквивалентного IgG4 человека. Тяжелая цепь иммуноглобулина классифицируется на γ-цепь, μ-цепь, α-цепь, δ-цепь и ε-цепь в зависимости от разницы в константной области. В зависимости от типа присутствующей тяжелой цепи образуются пять классов (изотипов) иммуноглобулина; ими являются IgG, IgM, IgA, IgD и IgE.
Иммуноглобулин G (IgG) составляет 70-75% иммуноглобулинов человека и является наиболее распространенным мономерным антителом в плазме. IgG имеет четырехцепочечную структуру, состоящую из двух легких цепей и двух тяжелых цепей. IgG1, IgG2 и IgG4 человека имеют молекулярную массу приблизительно 146000, тогда как IgG3 человека имеет длинную шарнирную область, которая соединяет Fab-область и Fc-область, и имеет большую молекулярную массу, равную 170000. IgG1 человека составляет около 65%, IgG2 человека - около 25%, IgG3 человека - около 7% и IgG4 человека - около 3% IgG человека. Они равномерно распределены внутри и снаружи кровеносных сосудов. Обладая сильным сродством к рецепторам Fc и факторам комплемента на поверхности эффекторных клеток, IgG1 человека индуцирует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), а также активирует комплемент, индуцируя комплемент-зависимую клеточную цитотоксичность (CDC). IgG2 и IgG4 человека имеют низкую активность ADCC и CDC, поскольку их сродство к Fc-рецепторам и факторам комплемента низкое.
Иммуноглобулин М (IgM), который составляет приблизительно 10% иммуноглобулинов человека, представляет собой пентамерное антитело, состоящее из пяти основных четырехцепочечных структур, соединенных вместе. Он имеет молекулярный вес 970000. Обычно встречающийся только в крови, IgM продуцируется, главным образом, против инфекционных микроорганизмов и отвечает за иммунитет на ранней стадии.
Иммуноглобулин А (IgA) составляет 10-15% иммуноглобулинов человека. Он имеет молекулярный вес 160000. Секретируемый IgA представляет собой димерное антитело, состоящее из двух молекул IgA, соединенных вместе. IgA1 обнаружен в сыворотке, выделениях из носа, слюне и грудном молоке. В большом количестве IgA2 обнаружен в желудочном соке.
Иммуноглобулин D (IgD) представляет собой мономерное антитело, составляющее не более 1% иммуноглобулинов человека. IgD обнаружен на поверхности В-клеток и участвует в индукции продукции антител.
Иммуноглобулин E (IgE) представляет собой мономерное антитело, которое встречается в очень небольшом количестве, составляя лишь 0,001% или менее иммуноглобулинов человека. Считается, что иммуноглобулин Е вовлечен в иммунный ответ на паразитов, но в развитых странах, где паразиты встречаются редко, IgE, главным образом, вовлечен в бронхиальную астму и аллергию, среди прочего.
У собак, последовательности IgG-A (эквивалентен IgG2 человека), IgG-B (эквивалентен IgG1 человека), IgG-C (эквивалентен IgG3 человека) и IgG-D (эквивалентен IgG4 человека) были идентифицированы как тяжелая цепь IgG. В антителе по настоящему изобретению константная область тяжелой цепи IgG, не обладающая ни активностью ADCC, ни активностью CDC, является предпочтительной (IgG4 у человека). В случае, когда константная область иммуноглобулина, эквивалентного IgG4 человека, не была идентифицирована, можно использовать константную область, которая потеряла как активность ADCC, так и активность CDC в результате введения мутаций в соответствующую область иммуноглобулина, эквивалентного IgG4 человека.
У крупного рогатого скота, последовательности IgG1, IgG2 и IgG3 были идентифицированы как тяжелая цепь IgG. В антителе по настоящему изобретению константная область тяжелой цепи IgG, не обладающая ни активностью ADCC, ни активностью CDC, является предпочтительной (IgG4 у человека). Хотя константная область нативного IgG1 человека обладает активностью ADCC и активностью CDC, известно, что эти типы активности можно уменьшить путем введения аминокислотных замен или делеций в конкретные сайты. У крупного рогатого скота константная область иммуноглобулина, эквивалентного IgG4 человека, не была идентифицирована, поэтому в соответствующую область иммуноглобулина, эквивалентную IgG1 человека, можно ввести мутации, а затем использовать полученную константную область. В качестве примера, аминокислотная последовательность СН бычьего антитела (цепь IgG1, GenBank: X62916) с мутациями, введенными в домен СН2, и нуклеотидная последовательность для такой аминокислотной последовательности (после оптимизации кодонов) показаны как SEQ ID NO:4 и 8, соответственно.
Антитело против PD-1 является более предпочтительным, если (i) CL бычьего антитела имеет аминокислотную последовательность константной области лямбда-цепи и (ii) CH бычьего антитело имеет мутации, которые снижают активность ADCC и/или активность CDC.
Антитело против PD-L1 по настоящему изобретению включает химерные "крысино-бычьи" антитела, бовинизированные антитела и полные антитела бычьего типа. Тем не менее, животные не ограничиваются особями крупного рогатого скота, и могут быть представлены людьми, собаками, свиньями, обезьянами, мышами, кошками, лошадьми, козами, овцами, буйволами, кроликами, хомячками, морскими свинками и тому подобное.
Например, антитело против PD-1 по настоящему изобретению может представлять собой антитело против PD-1, в котором CL бычьего антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, и СН бычьего антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.
Аминокислотные последовательности SEQ ID NO:3 и 4 могут иметь делецию(и), замену(и) или добавление(я) в одной или нескольких (например, до пяти, максимально примерно 10) аминокислот. Даже если были введены такие мутации, полученные аминокислотные последовательности способны выполнять функцию СL или СH антитела PD-1.
Антитело против PD-1 по настоящему изобретению может иметь четырехцепочечную структуру, содержащую две легкие цепи и две тяжелые цепи.
Антитело против PD-1 по настоящему изобретению может быть получено, как описано ниже. Вкратце, синтезирован искусственный ген, который содержит (i) идентифицированные последовательности вариабельной области крысиного антитела против бычьего PD-1 и (ii) последовательности константной области антитела животного, отличного от крысы (например, быка) (предпочтительно, иммуноглобулин, эквивалентный IgG1 человека, в котором в соответствующую область введены мутации для снижения активности ADCC и/или активности CDC). Полученный ген встраивают в вектор (например, плазмиду), который затем вводят в клетку-хозяин (например, клетку млекопитающего, такую как клетка CHO). Клетку-хозяин культивирует, и из полученной культуры собирают интересующее антитело.
Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность VL крысиного антитела против бычьего PD-1, идентифицированные авторами изобретения, показаны как SEQ ID NO:1 и 5, соответственно. Кроме того, нуклеотидная последовательность после оптимизации кодонов показана как SEQ ID NO:11.
Аминокислотная последовательность VL и аминокислотная последовательность VH крысиного антитела против бычьего PD-1, идентифицированные авторами изобретения, показаны как SEQ ID NO:2 и 6, соответственно. Кроме того, нуклеотидная последовательность после оптимизации кодонов показана как SEQ ID NO:12.
Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность CL (лямбда-цепь, GenBank: X62917) бычьего антитела показаны как SEQ ID NO:3 и 7, соответственно. Кроме того, нуклеотидная последовательность после оптимизации кодонов показана как SEQ ID NO:13.
Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность (после оптимизации кодонов) CH (цепь IgG1, модифицированная из GenBank: X62916) бычьего антитела показаны как SEQ ID NO:4 и 8, соответственно.
Кроме того, SEQ ID NO:9 показывает аминокислотную последовательность химерной легкой цепи, состоящей из VL крысиного антитела против бычьего PD-1 и CL (лямбда цепь, GenBank: X62917) бычьего антитела. Нуклеотидная последовательность (после оптимизации кодонов) химерной легкой цепи, состоящей из VL крысиного антитела против PD-1 и CL (лямба цепь, GenBank: X62917) бычьего антитела, показана как SEQ ID NO:14.
SEQ ID NO:10 показывает аминокислотную последовательность химерной тяжелой цепи, состоящей из VH крысиного антитела против бычьего PD-1 и CL (IgG1 цепь, модифицированная из GenBank: X62916) бычьего антитела. Нуклеотидная последовательность (после оптимизации кодонов) химерной тяжелой цепи, состоящей из VН крысиного антитела против бычьего PD-1 и CН (IgG1 цепь, модифицированная из GenBank: X62916) бычьего антитела, показана как SEQ ID NO:15.
Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности CL и CH различных животных, отличных от крысы, могут быть получены из известных баз данных для использования в настоящем изобретении.
Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности бычьих CL и CH приведены в таблице ниже.
(Таблица)
Аминокислотные последовательности SEQ ID NO:3, 21-28, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 и 59 могут иметь делецию(и), замену(и) или добавление(я) в одной или нескольких (например, до пяти, максимально примерно 10) аминокислот. Даже если такие мутации были введены, то полученные аминокислотные последовательности способны выполнять функцию константной области тяжелой цепи или легкой цепи Ig.
Хотя константная область нативного IgG1 человека обладает активностью ADCC и активностью CDC, известно, что эти типы активности можно уменьшить путем введения аминокислотных замен и делеций в конкретные сайты. В случае животных, отличных от человека, где константная область иммуноглобулина, эквивалентного IgG4 человека, не была идентифицирована, мутации могут быть введены в соответствующую область иммуноглобулина, эквивалентного IgG1 человека, так что может быть использована полученная константная область с пониженной активностью ADCC и активностью CDC.
Настоящее изобретение относится к искусственной генетической ДНК, содержащей (а') ДНК, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью QSLEYSDGYTY (SEQ ID NO:16), CDR2 с аминокислотной последовательностью GVS и CDR3 с аминокислотной последовательностью FQATHDPDT (SEQ ID NO:17) и константную область легкой цепи антитела животного, отличного от крысы, и (b') ДНК, кодирующую тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GFSLTSYY (SEQ ID NO:18), CDR2 с аминокислотной последовательностью IRSGGST (SEQ ID NO:19) и CDR3 с аминокислотной последовательностью ARTSSGYEGGFDY (SEQ ID NO:20) и константную область тяжелой цепи антитела животного, отличного от крысы. Настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью QSLEYSDGYTY (SEQ ID NO:16), CDR2 с аминокислотной последовательностью GVS и CDR3 с аминокислотной последовательностью FQATHDPDT (SEQ ID NO:17), и константную области легкой цепи антитела животного, отличного от крысы. Также настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GFSLTSYY (SEQ ID NO:18), CDR2 с аминокислотной последовательностью IRSGGST (SEQ ID NO:19) и CDR3 c аминокислотной последовательностью ARTSSGYEGGFDY (SEQ ID NO:20), и константную область тяжелой цепи антитела животного, отличного от крысы.
В случае (а) легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью QSLEYSDGYTY (SEQ ID NO:16), CDR2 с аминокислотной последовательностью GVS и CDR3 с аминокислотной последовательностью FQATHDPDT (SEQ ID NO:17) и константную область легкой цепи антитела животного, отличного от крысы; и (b) тяжелой цепь, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GFSLTSYY (SEQ ID NO:18), CDR2 с аминокислотной последовательностью IRSGGST (SEQ ID NO:19) и CDR3 с аминокислотной последовательностью ARTSSGYEGGFDY (SEQ ID NO:20) и константную область тяжелой цепи антитела животного, отличного крысы, следует ссылаться на предшествующее описание. ДНК (а') представляет собой ДНК (ген), кодирующую легкую цепь (а); и ДНК (b') представляет собой ДНК (ген), кодирующую тяжелую цепь (b). Искусственная генетическая ДНК, содержащая ДНК (a') и ДНК (b'), может быть синтезирована на коммерческом синтезаторе. К искусственной генетической ДНК могут быть добавлены cайты распознавания ферментов рестрикции, последовательности KOZAK, последовательность сигнала присоединения поли-А, последовательности промоторов, последовательности интронов и тому подобное.
Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему вышеуказанную искусственную генетическую ДНК.
В качестве вектора можно использовать плазмиды на основе Escherichia coli (например, pBR322, pBR325, pUC12 или pUC13); плазмиды на основе Bacillus subtilis (например, pUB110, pTP5 или pC194), плазмиды на основе дрожжей (например, pSH19 или pSH15); бактериофаги, такие как фаг λ; вирусы животных, такие как ретровирус или вирус коровьей оспы; или вирусы патогенов насекомых, такие как бакуловирус. В описанных ниже примерах использовали pDN112 (Marzi A, Yoshida R, Miyamoto H, Ishijima M, Suzuki Y, Higuchi M, Matsuyama Y, Igarashi M, Nakayama E, Kuroda M, Saijo M, Feldmann F, Brining D, Feldmann H, Takada A. PLoS One, 7:e36192, Apr. 27, 2012; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology, 142(4):551-561, Aug. 2014).
Вектор также может содержать промоторы, энхансеры, сигналы сплайсинга, сигналы присоединения поли-А, последовательности интронов, маркеры селекции, точки начала репликации SV40 и так далее.
Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, трансформированной указанным выше вектором. Можно получить антитело против PD-1 по изобретению путем культивирования клетки-хозяина и сбора представляющего интерес антитела из полученной культуры. Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу получения антитела, включающему культивирование описанной выше клетки-хозяина и сбор антитела против PD-1 по изобретению из культуры. В способе по настоящему изобретению для получения антитела вектор, содержащий искусственную генетическую ДНК, содержащую ДНК, кодирующую легкую цепь, и ДНК, кодирующую тяжелую цепь, может быть трансфицирован в клетку-хозяина. Альтернативно, вектор, в который введена ДНК, кодирующая легкую цепь, и вектор, в который введена ДНК, кодирующая тяжелую цепь, могут быть совместно трансфицированы в клетку-хозяина.
-
-
Примеры клеток-хозяев включают, но не ограничиваются, бактериальные клетки (такие как бактерии Escherichia, бактерии Bacillus или Bacillus subtilis), клетки грибов (такие как дрожжи или Aspergillus), клетки насекомых (такие как клетки S2 или клетки Sf), клетки животных (такие как клетки CHO, клетки COS, клетки HeLa, клетки C127, клетки 3T3, клетки BHK или клетки HEK 293) и клетки растений. Среди них предпочтительной является клетка CHO-DG44 (CHO-DG44 (dfhr/)), которая является клеткой с дефицитом дигидрофолатредуктазы.
Введение рекомбинантного вектора в клетку-хозяина может быть осуществлено способами, раскрытыми в Molecular Cloning 2nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989 (например, метод на основе фосфата кальция, метод с DEAE-декстраном, трансфекция, микроинъекция, липофекция, электропорация, трансдукция, введение при соскабливании, метод дробовика и тому подобное) или путем инфекции.
Полученный трансформант может быть культивирован в среде с последующим сбором антитела против PD-1 по настоящему изобретению из культуры. Если антитело секретируется в среду, то среда может быть восстановлена с последующим выделением и очисткой антитела из среды. Если антитело продуцируется внутри трансформированных клеток, то клетки можно лизировать с последующим выделением и очисткой антитела из клеточного лизата.
Примеры сред включают, но не ограничиваются, среду OptiCHO, среду Dynamis, среду CD CHO, среду ActiCHO, среду FortiCHO, среду Ex-Cell CD CHO, среду BalanCD CHO, среду ProCHO 5 и среду Cellvento CHO-100.
рН среды изменяется в зависимости от культивируемой клетки. Обычно используется диапазон рН от 6,8 до 7,6; в основном, подходит диапазон рН от 7,0 до 7,4.
2
Если культивируемая клетка представляет собой клетки СНО, то культивирование может быть выполнено способами, известными специалистам в данной области. Например, обычно можно проводить культивирование в газофазной атмосфере с концентрацией CO, равной 0-40%, предпочтительно 2-10%, при 30-39°C, предпочтительно при приблизительно 37°C.
Подходящий период культивирования обычно составляет от одного дня до трех месяцев, предпочтительно от одного дня до трех недель.
Выделение и очистка антитела могут быть выполнены известными способами. Известные способы выделения/очистки, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются, способы, использующие разницу в растворимости (такие как высаливание или осаждение растворителем); методы с использованием различий в молекулярной массе (такие как диализ, ультрафильтрация, гель-фильтрация или электрофорез в SDS-полиакриламидном геле); методы, использующие разницу в электрическом заряде (такие как ионообменная хроматография); методы с использованием специфической аффинности (такие как аффинная хроматография); методы, использующие различия в гидрофобности (такие как высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой); и методы, использующие различие в изоэлектрической точке (например, изоэлектрическое фокусирование).
Антитело против PD-1 по настоящему изобретению можно использовать в качестве лекарственного средства для животных или человека. Следовательно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вышеописанное антитело против PD-1 в качестве активного ингредиента.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть использована для профилактики и/или лечения злокачественных новообразований и/или инфекций. Примеры злокачественных новообразований и/или воспаления включают, но ими не ограничены, опухолевые заболевания (например, меланому, рак легкого, рак желудка, рак почек, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, рак яичников и тому подобное), лейкоз, болезнь Джона, анаплазмоз, бактериальный мастит, микотический мастит, микоплазменные инфекции (такие как микоплазменный мастит, микоплазменная пневмония или тому подобное), туберкулез, инфекцию Theileria orientalis, криптоспоридиоз, кокцидиоз, трипаносомоз и лейшманиоз.
Антитело против PD-1 по настоящему изобретению может быть растворено в буферах, таких как PBS, физиологический солевой раствор или стерильная вода, необязательно, фильтр-стерилизованная с помощью фильтра или тому подобного, а затем введено животным (включая человека) путем инъекции. К раствору антитела могут быть добавлены добавки (такие как красящие агенты, эмульгаторы, суспендирующие агенты, поверхностно-активные вещества, солюбилизаторы, стабилизаторы, консерванты, антиоксиданты, буферы, изотонизирующие агенты, регуляторы рН и тому подобное). В качестве путей введения могут быть выбраны внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное, подкожное или внутрикожное введение и тому подобное. Трансназальное или пероральное введение также может быть использовано.
Доза, количество и частота введения антитела против PD-1 по настоящему изобретению могут изменяться в зависимости от симптомов, возраста и массы тела животного, способа введения, лекарственной формы и тому подобное. Например, 0,1-100 мг/кг массы тела, предпочтительно 1-10 мг/кг массы тела, на взрослое животное обычно можно вводить по меньшей мере один раз с такой частотой, которая позволяет подтвердить желаемый эффект.
Хотя фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать самостоятельно, ее можно применять и в комбинации с хирургическими операциями, лучевой терапией, другими иммунотерапевтическими средствами, такими как противораковая вакцина, или лекарственными средствами с молекулярной мишенью. При таких комбинациях можно ожидать синергетический эффект.
ПРИМЕРЫ
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Однако настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.
[Пример 1] Получение химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего PD-1
Введение
Белок программируемой гибели клеток 1 (PD-1), иммуноингибирующий рецептор и лиганд белка программируемой гибели клеток 1 (PD-L1) представляют собой молекулы, идентифицированные профессором Tasuku Honjo et al., Kyoto University, как факторы, которые ингибируют избыточный иммунный ответ и глубоко связанные с иммунотолерантностью. Недавно было выяснено, что эти молекулы также участвуют в иммуносупрессии опухолей. В этом примере с целью получения нового средства для лечения инфекций у крупного рогатого скота получали ген химерного антитела, в котором гены вариабельных областей крысиного моноклонального антитела 5D2 против бычьего PD-1, способного ингибировать связывание бычьего PD-1 и PD-L1, и затем объединили гены, кодирующие полученные вариабельные области, с генами, кодирующими константные области бычьего иммуноглобулина (бычий IgG1 с мутациями, которые были введены в предполагаемые сайты связывания рецепторов Fcγ в домен СН2 для ингибирования активности ADCC; см. Фиг. 1 и 11, где указаны аминокислотные положения и мутации: 250 E→P, 251 L→V, 252 P→A, 253 G→делеция, 347 A→S, 348 P→S; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 142(4):551-561, Aug. 2014). Полученный ген химерного антитела вводили в клетки яичника китайского хомяка (клетки СНО), которые культивировали и пролиферировали с получением химерного "крысино-бычьего" антитела ch5D2 против бычьего PD-1. Эффект этого химерного антитела был подтвержден in vitro и in vivo.
Материалы, методы и экспериментальные результаты.
2.1 Конструирование клеток, экспрессирующих бычий PD-1 и PD-L1
Были определены нуклеотидные последовательности полноразмерных кДНК гена бычьего PD-1 (номер доступа в GenBank AB510901; Ikebuchi R, Konnai S, Sunden Y, Onuma M, Ohashi K. Microbiol. Immunol., 54(5):291-298; May 2010) и ген бычьего PD-L1 (номер доступа GenBank AB510902; Ikebuchi R, Konnai S, Shirai T, Sunden Y, Murata S, Onuma M, Ohashi K. Vet. Res., 42:103, Sep. 26, 2011). На основании полученной генетической информации были получены клетки, экспрессирующие бычий PD-1 и бычий PD-L1. Сначала для получения плазмиды, экспрессирующей бычий PD-1 или бычий PD-L1, осуществляли ПЦР, используя синтезированную кДНК, полученную из клеток периферической крови (PBMC) крупного рогатого скота, в качестве матрицы и обработанные ферментами праймеры с сайтами распознавания NotI и HindIII (бычий PD-1) или сайтами распознавания NheI и XhoI (бычий PD-1) на 5' конце (boPD-1-myc F и R; boPD-L1-EGFP F и R). Продукты ПЦР расщепляли NotI (Takara) и HindIII (Takara; бычий PD-1), NheI (Takara) и XhoI (Takara; бычий PD-L1), очищали с помощью набора FastGene Gel/PCR Extraction (NIPPON Genetics) и клонировали в вектор pCMV-Tag1 (Agilent Technologies; бычий PD-1) или в вектор pEGFP-N2 (Clontech; бычий PD-L1), обработанный фрагментами рестрикции таким же образом. Интересующую полученную плазмиду экспрессии экстрагировали набором QIAGEN Plasmid Midi (Qiagen) и хранили при -30°C перед использованием в экспериментах. В настоящем документе полученная таким образом плазмида экспрессии обозначена как pCMV-Tag1-boPD-1 или pEGFP-N2-boPD-L1.
Праймер (boPD-1-myc F): ATATGCGGCCGCATGGGGACCCCGCGGGCGCT (SEQ ID NO:61)
Праймер (boPD-1-myc R): GCGCAAGCTTTCAGAGGGGCCAGGAGCAGT (SEQ ID NO:62)
Праймер (boPD-L1-EGFP F): CTAGCTAGCACCATGAGGATATATAGTGTCTTAAC (SEQ ID NO:63)
Праймер (boPD-L1-EGFP R): CAATCTCGAGTTACAGACAGAAGATGACTGC (SEQ ID NO:64)
6
Клетки, экспрессирующие бычий PD-1, получали в соответствии с методиками, описанными ниже. Сначала 2,5 мкг pCMV-Tag1-boPD-1 вводили в 4×10 клеток CHO-DG44 с помощью Lipofectamine LTX (Invitrogen). Через сорок восемь часов среду заменяли средой CD DG44 (Life Technologies), содержащей 800 мкг/мл G418 (Enzo Life Science), 20 мл/л добавки GlutaMAX (Life Technologies) и 18 мл/л 10% Pluronic F-68 (Life Technologies), а затем проводили селекцию. Полученные в результате экспрессирующие клетки взаимодействовали с крысиным антителом против бычьего PD-1 5D2 при комнатной температуре. После промывки клетки дополнительно взаимодействовали с антителом против крысиного IgG, меченного микрогранулами (Miltenyi Biotec), при комнатной температуре. Клетки, экспрессирующие бычий PD-1 на высоких уровнях, выделяли с помощью Auto MACS (Miltenyi Biotec). Затем проводили повторное выделение тем же образом и получали еще более высокую чистоту. Полученные экспрессирующие клетки подвергали клонированию путем лимитирования разведения, тем самым получая клон клеток CHO DG44, экспрессирующий бычий PD-1 на высоком уровне (экспрессирующие бычьи PD-1 клетки).
6
Клетки, экспрессирующие на мембране бычий PD-L1, получали в соответствии с методиками, описанными ниже. Сначала 2,5 мкг pEGFP-N2-boPD-L1 или pEGFP-N2 (негативный контроль) вводили в 4×10клеток CHO-DG44, используя Lipofectamine LTX (Invitrogen). Через сорок восемь часов среду заменяли средой CD DG44 (Life Technologies), содержащей 800 мкг/мл G418 (Enzo Life Science), 20 мл/л добавки GlutaMAX (Life Technologies) и 18 мл/л 10% Pluronic F-68 (Life Technologies), а затем проводили селекцию и клонирование с помощью лимитированного разведения (клон клеток, эксперссирующих бычий PD-L1). Для подтверждения экспрессии бычьего PD-1 в полученном, таким образом, клон клеток, внутриклеточную локализацию EGFP визуализировали с помощью инвертированного конфокального лазерного микроскопа LSM700 (ZEISS).
2.2 Конструирование растворимого бычьего PD-1
Плазмиду, экспрессирующую бычий PD-1-Ig, конструировали в соответствии с методиками, описанными ниже. Вкратце, сигнальный пептид и внеклеточная область бычьего PD-1 (номер доступа в GenBank AB510901) связывали с константной областью известного бычьего IgG1 (номер доступа GenBank X62916) с получением последовательности гена. После того, как кодоны были оптимизированы для клеток CHO, синтез генов осуществляли таким образом, чтобы последовательность распознавания NotI, последовательность KOZAK, последовательность сигнального пептида бычьего PD-1, последовательность внеклеточной области гена бычьего PD-1, последовательность Fc-области бычьего IgG1 и последовательность распознавания XbaI находились в указанном порядке. Cледует отметить, что бычий IgG1 был мутирован для ингибирования активности ADCC; более конкретно, мутации были введены в предполагаемые сайты связывания домена CH2 Fcγ-рецепторов (сайты мутаций: 185 E→P, 186 L→V, 187 P→A, 189 G→делеция, 281 A→S, 282 P→S; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 142(4):551-561; Aug. 204; аминокислотная последовательность PD-1-Ig и сайты мутации раскрыты на фиг.2 в этой статей). Цепь синтезированного гена расщепляли с помощью NotI (Takara) и XbaI (Takara), очищали с помощью набора FastGene Gel/PCR Extraction (NIPPON Genetics) и встраивали в сайт клонирования (последовательности ферментов рестрикции NotI и XbaI ниже PCMV и между INRBG и PABGH) вектора экспрессии pDN11 (любезно предоставлен профессором S.Suzuki, Hokkaido University Research Center for Zoonosis Control), обработанного ферментами рестрикции таким же образом получая вектор, экспрессирующий PD-1-Ig. Плазмиду экспрессии очищали набором QIAGEN Plasmid Midi (Qiagen) и хранили при -30°C до использования в экспериментах. В настоящем документе полученная таким образом плазмида экспрессии обозначена как pDN11-boPD-1-Ig.
Плазмиду, экспрессирующую бычий PD-1-His, конструировали в соответствии с методиками, описанными ниже. Вкратце, для амплификации сигнального пептида и внеклеточной области бычьего PD-1 (инвентарный номер GenBank AB510901) были сконструированы праймеры с сайтами распознавания NotI и XhoI на 5' конце (boPD-1-His F и R). Генетическая последовательность, кодирующая метку 6xHis, была добавлена к обратному праймеру. ПЦР проводили с использованием синтезированной кДНК, полученной из бычьих PBMC, в качестве матрицы. Соответствующие продукты ПЦР расщепляли NotI (Takara) и XhoI (Takara), очищали с помощью набора FastGene Gel/PCR Extraction (NIPPON Genetics) и клонировали в вектор pCXN2.1(+) (Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Gene, 108(2):193-199; Dec. 15, 1991; предоставлен доктором T. Yokomizo, Juntendo University Graduate School of Medicine), обработанный ферментами рестрикции аналогичным образом. Полученные плазмиды экспрессии очищали с использованием набора FastGene Xpress Plasmid PLUS (NIPPON Genetics) и хранили при -30°C перед применением в экспериментах. В настоящем документе полученная таким образом плазмида экспрессии обозначена как pCXN2.1-boPD-1-His.
Праймер (boPD-1-His F): ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGGGGACCCCGCGGGCGCT (SEQ ID NO:65)
Праймер (boPD-1-His R): GCCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGATGGTGGATGACCAGGCTCTGCATCT (SEQ ID NO:66)
6
Клетки, экспрессирующие на растворимый бычий PD-1-Ig, получали в соответствии с методиками, описанными ниже. Вкраце, 2,5 мкг pDN11-boPD-1-Ig вводили в 4 ×10 клеток CHO-DG44 с помощью Lipofectamine LTX (Invitrogen). Через сорок восемь часов среду заменяли средой СD OptiCHO (Life Technologies), содержащей 800 мкг/мл G418 (Enzo Life Science) и 20 мл/л добавки GlutaMAX (Life Technologies). После культивирования в течение 3 недель клетки подвергали селекции. Вкратце, концентрации рекомбинантного Fc-слитого белка в культуральных супернатантах полученных клонов клеток измеряли с помощью ELISA с использованием кроличьего поликлонального антитела против бычьего IgG F(c) (Rockland), чтобы тем самым отбрая те клеточные клоны, которые экспрессируют рекомбинантный Fc-слитый белок на высоком уровне. Полученный высокоэкспрессирующий клеточный клон переносили в среду, не содержащую G418, и культивировали при встряхивании в течение 14 дней с последующим сбором культурального супернатанта. Культуральный супернатант, содержащий рекомбинантный Fc-слитый белок, подвергали ультрафильтрации с Centricon Plus-70 (Millipore). Затем рекомбинантный Fc-слитый белок очищали с помощью Ab-Capcher Extra (ProteNova). После очистки буфер заменяли на забуференный фосфатом физиологический солевой раствор (PBS; pH 7,4), используя обессоливающую колонку PD-10 (GE Healthcare). Полученный белок хранили при -30°С перед использованием в экспериментах (бычий PD-1-Ig). Концентрацию очищенного бычьего PD-1-Ig измеряли с помощью ELISA с использованием кроличьих IgG F(c) поликлональных антител (Rockland). Для каждой операции промывки в ELISA использовали Auto Plаte Washer BIO WASHER 50 (DS Pharma Biomedical). Поглощение измеряли с помощью микропланшетного ридера MTP-650FA (Corona Electric).
7
Клетки, экспрессирующие на растворимый бычий PD-1-His, получали в соответствии с методиками, описанными ниже. Вкратце, 30 мкг pCXN2.1-boPD-1-His вводили в 7,5×10 клеток Expi293F (Life Technologies), используя Expifectamine (Life Technologies). После 7-и дневного культивирования при встряхивании культуральный супернатант собирали. Представляющий интерес рекомбинантный белок очищали от культурального супернатанта с использованием аффинной смолы TALON Metal (Clontech; бычий PD-1-His). После очистки буфер меняли на PBS (pH 7,4), используя обессоливающую колонку PD-10 (GE Healthcare). Полученный белок хранили при -30°С перед использованием в экспериментах (бычий PD-1-His). Концентрацию очищенного бычьего PD-1-His количественно определяли по поглощению (280 нм), измеренному на спектрофотометре Nanodrop8000 (Thermo Fisher Scientific).
2.3 Получение клеток, продуцирующих крысиные моноклональные антитела против бычьих PD-1
Крысу иммунизировали в лапку бычьим PD-1-Ig (описано выше). Гибридомы получали из подвздошных лимфатических узлов, получая, таким образом, гибридому 5D2, продуцирующую крысиные моноклональные антитела против бычьих PD-1. Что касается способа получения крысиного моноклонального антитела бычьего PD-1, то подобное описание приведено в следующем непатентном документе (Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Vet. Res. 44:59; Jul. 22, 2013).
2.4 Получение вектора, экспрессирующего химерное "крысино-бычьего" антитело против PD-1
Химерное "крысино-бычьего" антитело ch5D2 против PD-1 было получено путем слияния константных областей антитела бычьего IgG1 и Igλ с крысиным антителом против бычьего PD-1 5D2, используемым в качестве вариабельной области антитела.
Сначала, гены вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи были идентифицированы с помощью RACE-способа в гибридоме, которая продуцирует крысиное антитело 5D2 против бычьего PD-1. Затем была получена последовательность гена, в которой вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи крысиного антитела 5D2 против бычьего PD-1, и связана с известными константными областями бычьего IgG1 (тяжелая цепь, модифицированная; номер доступа в GenBank X62916) и бычий Igλ (легкая цепь; номер доступа в GenBank X62917), соответственно. Затем проводили оптимизацию кодонов (SEQ ID NO:9 и 10 (аминокислотные последовательности); SEQ ID NO:14 и 15 (нуклеотидные последовательности после оптимизации кодонов)). Следует отметить, что бычий IgG1 имел мутации, добавленные к предполагаемым сайтам связывания рецепторов Fcγ в домене CH2 для подавления активности ADCC (см. фиг. 1 и 11, где указаны аминокислотные положения и мутации: 251 E→P, 252 L→V, 253 P→A, 254 G→делеция, 348 A→S, 349 P→S; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 142(4):551-561; Aug. 2014). Затем ген был искусственно синтезирован таким образом, что последовательность распознавания NotI, последовательность KOZAK, последовательность легкой цепи химерного антитела, последовательность сигнала присоединения поли-A (PABGH), последовательность промотора (PCMV), последовательность распознавания SacI, последовательность интрона (INRBG), последовательность KOZAK, последовательность тяжелой цепи химерного антитела и последовательность распознавания XbaI были расположены в указанном порядке. Синтезированную цепь гена расщепляли с помощью NotI (Takara) и XbaI (Takara), очищали с помощью набора FastGene Gel/PCR Extraction (NIPPON Genetics) и клонировали в сайт клонирования (последовательности распознавания ферментами NotI и XbaI ниже PCMV и между INRBG и PABGH) плазмиды экспрессии pDN112 (любезно предоставлен профессором S. Suzuki, Hokkaido University Research Center for Zoonosis Control), обработанной фрагментами рестрикции таким же образом (фиг. 2). Интересующую полученную плазмиду экстрагировали набором QIAGEN Plasmid Midi (Qiagen) и хранили при -30°C перед использованием в экспериментах. В настоящем документе полученная таким образом плазмида экспрессии обозначена как pDN112-boPD-1ch5D2.
2.5 Экспрессия химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего PD-1 (фиг.3)
-
-
2
Полученную выше pDN112-boPD-1ch5D2 трансфицировали в клетки CHO-DG44 (CHO-DG44 (dfhr/)), которые представляли собой клетки с дефицитом дигидрофолатредуктазы. Через сорок восемь часов среду заменяли средой CD OptiCHO (Life Technologies), содержащей 2 мМ добавки GlutaMAX (Life Technologies) и 800 мкг/мл сульфат G418 (Enzo Life Science). После культивирования в течение 3 недель экспрессирующие клетки подвергали селекции и клонированию с помощью лимитирующего разведения. Затем концентрации химерного антитела в культуральных супернатантах измеряли методом дот-блоттинга и ELISA с использованием кроличьего поликлонального антитела против бычьего IgG F(c) (Rockland), проводя таким образом селекцию клонов с высокой экспрессией. Кроме того, отобранные клоны с высоким уровнем экспрессии химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего PD-1 подвергали генной амплификации путем добавления нагрузки с 60 нМ метотрексат (Mtx; Wako)-содержащей средой. Полученный таким образом клон клеток, стабильно экспрессирующий химерное "крысино-бычьего" антитело против бычьего PD-1, переносили в среду CD Opti-CHO без Mtx и культивировали при встряхивании в течение 14 дней (125 об/мин, 37°C, 5% CO). Продукцию химерных антител в культуральном супернатанте измеряли с помощью ELISA с использованием поликлональных антител кролика против бычьего IgG F(c) (Rockland). Для каждой операции промывки в ELISA использовали Auto Plаte Washer BIO WASHER 50 (DS Pharma Biomedical). Поглощение измеряли с помощью микропланшетного ридера MTP-650FA (Corona Electric). Культуральный супернатант на 14-й день центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 минут для удаления клеток, и супернатант пропускали через фильтр с размером пор 0,22 мкм Steritop-GP (Millipore) для стерилизации и затем хранили при 4°С перед очисткой.
Результаты показаны на фиг.3А. Среди клонов клеток, экспрессирующих химерное "крысино-бычье" антитело против PD-1, наиболее продуктивный клон секретировал 91,7 мг/л химерного антитела в культуральный супернатант в течение 14-дневной культуры при встряхивании.
2.6 Очистка химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего PD-1
Из культурального супернатанта, полученного, как описано выше, каждое химерное антитело очищали с использованием Ab Capcher Extra (ProteNova). Для связывания со смолой использовали способ с открытой колонкой; 1,5 M глицин/3 M NaCl (pH 8.0) использовали в качестве уравновешивающего буфера и промывочного буфера. В качестве элюирующего буфера использовали 0,1 М глицин-HCl (рН 2,8). В качестве нейтрализующего буфера использовали 1М Трис (рН 9,0). В очищенном антителе заменяли буфер на PBS (pH 7,4), используя обессоливающую колонки PD-10 (GE Healthcare) и концентрировали с использованием Amicon Ultra-15 (50 кДа, Millipore). Очищенное таким образом химерное антитело пропускали через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм (Pall Life Sciences) для стерилизации и хранили при 4°С перед применением в экспериментах.
2.7 Подтверждение чистоты очищенного химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего PD-1 (фиг.3).
Чтобы подтвердить чистоту очищенного химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего PD-1, белки антител обнаруживали с помощью SDS-PAGE и окрашивания CBB. Очищенное химерное "крысино-бычье" антитело ch5D2 против бычьего PDC-1 суспендировали в буфере для образцов Laemmli Sample Buffer (Bio-Rad) и денатурировали при 95°C в течение 5 минут в восстанавливающих условиях (восстановление 2-меркаптоэтанолом; Sigma-Aldrich) или в невосстанавливающих условиях. Подготовленные таким образом образцы подвергали электрофорезу с использованием 10% полиакриламидного геля. В качестве маркеров молекулярной массы использовали Precision Plus Protein All Blue Standards (Bio-Rad). После электрофореза гель окрашивали набором Quick-CBB (Wako) и затем обесцвечивали в дистиллированной воде.
Результаты показаны на фиг.3В. Полосы химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего PD-1 наблюдали в спрогнозированных положениях, то есть при 25 кДа (легкая цепь) и 50 кДа (тяжелая цепь) в восстанавливающих условиях и при 150 кДа в невосстанавливающих условиях.
2.8 Специфичность связывания химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего PD-1 (фиг.4).
С помощью проточной цитометрии было подтверждено, что химерное "крысино-бычьего" антитело против бычьего PD-1 специфически связывается с клетками, экспрессирующими бычье PD-1 (описано выше). Сначала крысиное антитело 5D2 против бычьего PD-1 или химерное "крысино-бычьего" антитело ch5D2 против PD-1 подвергали взаимодействию с клетками, экспрессирующими бычий PD-1, при комнатной температуре в течение 30 минут. После промывки аллофикоцианин (APC)-меченное козлиное антитело против крысиного Ig (Southern Biotech) или Alexa Fluor 647-меченый козлиный F(ab')2 против бычьего IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch) взаимодействовали при комнатной температуре в течение 30 мин. В качестве отрицательного контрольного антитела использовали контроль с изотипом IgG2a (κ) крысы (BD Bioscience) или бычьим антителом IgG1 (Bethyl). После промывки каждое крысиное антитело или химерное "крысино-бычьего" антитело, связанное с клеточными поверхностями, детектировали с помощью FACS Verse (BD Biosciences). Для каждой операции промывки и разбавления антител использовали PBS с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich).
Экспериментальные результаты приведены на фиг. 4. Было обнаружено, что химерное "крысино-бычьего" ch5D2 антитело против бычьего PD-1 связывается с клетками экспрессирующими бычьими PD-1 так же как и крысиное антитело 5D2 против бычьего PD-1.
2.9. PD-1 связывающая авидность химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего PD-1
Авидность связывания с бычьим PD-1 крысиного антитела 5D2 против бычьего PD-1 и химерного "крысино-бычьего" антитела ch5D2 против бычьего PD5-1 измеряли с помощью поверхностного плазмонного резонанса с использованием анализатора биомолекулярного взаимодействия (Biacore X100). Вкратце, бычий PD-1-His (описанный выше) иммобилизовали на сенсорном чипе CM5 (GE Healthcare) в качестве лиганда. Затем крысиное антитело 5D2 против бычьего PD-1 или химерное "крысино-бычье" антитело ch5D2 против бычьего PD-1 подвергали реакции в качестве аналита с последующим анализом единственной кинетики. Эксперимент был повторен 3 раза в тех же условиях. Константу связывания (значение kd) и константа диссоциации (значение ka) определяли в каждом эксперименте, и получали авидность связывания (значение KD).
Результаты эксперимента показаны в таблице ниже. Авидность связывания химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего PD-1 с белком PD-1 была сходна авидности крысиного антитела 5D2 против бычьего антитела PD-1, статистической разницы не наблюдалось (p>0,05; t-критерий Уэлча).
Антитело против бычьего PD-L1
ka (1/мс)
кд (1/с)
KD (M)
5D2
1,84×10<sup>4</sup>±0,27
2,15×10<sup>-4</sup>±0,44
1,22×10<sup>-8</sup>±0,39
ch5D2
2,07×10<sup>4</sup>±0,06
2,16×10<sup>-4</sup>±1,12
1,05×10<sup>-8</sup>±0,58
2.10. Блокада связывания бычьего PD-1/PD-L1 под действием химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего PD-1 (фиг.5)
5
Используя клетки, экспрессирующие бычьи PD-L1 (как описано выше) и бычий PD-1-Ig (как описано выше), тестировали ингибирование связывания PD-1/PD-L1 с помощью антитела против бычьего PD-1. Сначала, крысиное антитело 5D2 против бычьего PD-1 или химерное "крысино-бычье" антитело ch5D2 против PD-1 (конечная концентрация: 0, 0,39, 0,78, 1,56, 3,12, 6,25, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) и бычий PD-1-Ig (конечная концентрация: 5 мкг/мл), меченный биотином, используя набор Lightning-Link Type A Biotin Labeling (Innova Biosciences), добавляли в 96-луночные планшеты, а затем проводили реакцию при 37°C в течение 30 минут. Полученную смесь подвергали взаимодействию с 1×10 клеток, экспрессирующих бычий PD-1, при 37°C в течение 30 минут. После промывки реакционную смесь подвергали взаимодействию с меченным APC стрептавидином (BioLegend) при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы тем самым детектируя бычий PD-1-Ig, связанный с клеточными поверхностями. Для анализа использовали FACS Verse (BD Biosciences). Для каждой операции промывки и разбавления антител использовали PBS с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich). Принимая долю клеток, связанных с бычьим PD-1-Ig без добавления антител, за 100%, доля клеток, связанных с бычьим PD-1-Ig, для каждой концентрации антител была показана как относительная величина.
Экспериментальные результаты приведены на фиг. 5. Химерное "крысино-бычье" антитело ch5D2 против бычьего PD-1 ингибировало связывание PD-1-Ig с клетками, экспрессирующими PD-L1, в той же степени, что и крысиное антитело 5D2 против бычьего PD-1.
2.11 Анализ CDR крысиного антитела против бычьего PD-1
Определяющие комплементарность области (CDR) крысиного антитела 5D2 против бычьего PD-1 определяли с использованием NCBI IGBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/). Результаты показаны на фиг.1.
2.12. Тест с инокуляцией крупного рогатого скота химерным "крысино-бычьего" антитела против бычьего PD-1
Полученное химерное "крысино-бычье" антитело ch5D против PD-1 (14 мг; 0,08 мг/кг) вводили внутривенно теленку, экспериментально инфицированному BLV (самец голштинской породы, 4 месяца, 173,5 кг). Образцы крови собирали в хронологическом порядке у зараженного теленка с последующим сбором крови (с использованием гепарина натрия (Ajinomoto), используемого в качестве антикоагулянта) и сыворотки. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из крови центрифугированием в градиенте плотности с использованием Percoll (GE Healthcare).
2.13. Кинетика введенного химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего PD-1 в крови (фиг.6)
Бычий PD-1-His (описанный выше) иммобилизовали на планшетах для ELISA (тип H, Sumitomo Bakelite) в конечной концентрации 10 мкг/мл при 4°C в течение ночи. Затем каждую лунку пять раз промывали 200 мкл 0,05% Трис-забуференного физиологического раствора с добавкой Твин-20 (TBS-T) с последующим блокированием 1% TBS-T с добавлением обезжиренного молока при комнатной температуре в течение 1 часа. Еще одну промывку проводили аналогичным образом. В каждую лунку добавляли сыворотку, собранную у тестируемого теленка, и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки меченные пероксидазой хрена кроличьи поликлональные антитела IgG F(c) (Rockland) взаимодействовали при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лунку снова промывали и затем добавляли субстрат TMB One Component Substrate (Bethyl) для окрашивания. Ферментативную реакцию останавливали с помощью 0,18 М разбавленной серной кислоты. Поглощение (450 нм) измеряли с помощью микропланшетного ридера MTP-650FA (Corona Electric). Для каждой стадии промывки планшета использовали Auto Plаte Washer BIO WASHER 50 (DS Pharma Biomedical).
Экспериментальные результаты приведены на фиг. 6. Химерное "крысино-бычье" антитело против бычьего PD-1 обнаруживали в сыворотке тестируемого теленка до 70-ого дня после введения (в конце клинического испытания). Антитело сохраняло особенно высокие концентрации в течение одной недели после введения.
2.14 Реакция пролиферации клеток Т-клеток на антиген BLV (фиг. 7)
6
low
2
Бычьи РВМС суспендировали в PBS и взаимодействовали с сукцинимидиловым эфиром карбоксифлуоресцеина (CFSE; Invitrogen) при комнатной температуре в течение 20 минут для мечения. После двухкратной промывки средой RPMI 1640 (Sigma-Aldrich), содержащей 10% инактивированную фетальную бычью сыворотку (Cell Culture Technologies), пенициллин 200 Ед/мл, стрептомицин 200 мкг/мл и 0,01% L-глютамин (Life Technologies), концентрацию клеток доводили до 4×10 клеток/мл, используя ту же среду. К PBMC добавляли культуральный супернатант 2% фетальных клеток почки ягненка, инфицильтрированных BLV (FLK-BLV), культуральный супернатант фетальных клеток почки ягненка (FLK), 2% неинфильтрированных BLV, или смесь пептидов gp51 BLV 0,1 мкг/мл или 1 мкг/мл, а затем культивировали в течение 6-и дней при 37°С в атмосфере 5% СО. Через 6 дней PBMC восстанавливали и проводили реакцию с мышиным антителом против бычьего CD4, меченным Alexa Fluor 647 (CC30, AbD Serotec), комплексом перидинин-хлорофилл-белок/меченное цианином 5.5 мышиное антитело против бычьего CD8 (CC63, AbD Serotec) и R-фикоэритрин/меченное цианином 7 (PE/Cy7) мышиное антитело против бычьего IgM (IL-A30, AbD Serotec) при 4°С в течение 20 мин. Для мечения антител использовали наборы Zenon Mouse IgG1 Labeling (Life Technologies) или Lightning-Link (Innova Biosciences). Для анализа использовали FACS Verse (BD Biosciences). Для каждой операции промывки и разбавления антител использовали PBS с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich). Что касается доли пролиферированных Т-клеток (клетки CFSE), статистический тест проводили с использованием метода Даннетта.
+
Экспериментальные результаты приведены на фиг. 7. При введении химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего PD-1, пролиферативный ответ BLV-специфических клеток в CD4 T-клетках показал статистически значимое повышение сразу после введения по сравнению с ответом перед введением.
2.15. Переход в провирусную нагрузку BLV (рис.8)
ДНК выделяли из выделенных бычьих РВМС с использованием набора для очистки Wizard DNA Purification (Promega). Концентрацию экстрагированной ДНК определяли количественно по оптической плотности (260 нм), измеренной на спектрофотометре Nanodrop 8000 (Thermo Fisher Scientific). Для измерения провирусной нагрузки BLV в РВМС, проводили ПЦР в реальном времени с использованием Cycleave PCR Reaction Mix SP (Takare) и зонд/праймер/положительный контроль (Takara) для обнаружения вируса лейкоза крупного рогатого скота. Для измерения использовали Light Cycler 480 System II (Roche Diagnosis). Что касается измеренной провирусной нагрузки, то статистический тест проводили по методу Даннета.
Экспериментальные результаты приведены на фиг. 8. При введении химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего PD-1, пролиферативный ответ BLV-специфических клеток в PBMC показал статистически значимое повышение сразу после введения по сравнению с ответом перед введением. Провирусная нагрузка BLV оставалась на низком уровне до конца клинического теста (70-ый день).
[Пример 2] Применение антитела против PD-1 у других видов животных
1. Материалы, методы и экспериментальные результаты.
1.1 Идентификация генов овечьего и буйволиного PD-1
Для определения полноразмерных кодирующих последовательностей (CDS) кДНК овечьего и буйволиного PD-1 сначала были сконструированы праймеры для амплификации полноразмерных CDS (ovPD-1 CDS F and R; buPD-1 CDS F1, R1, F2 и R2) на основе нуклеотидных последовательностей генов овечьего и буйволиного PD-1 (номер доступа в GenBank BC123854 и XM_012176227), а затем проводили ПЦР с использованием в качестве матрицы синтезированной кДНК, полученной из овечьих или буйволиных PBMC. Для полученных амплифицированных продуктов нуклеотидные последовательности определяли с помощью капиллярного секвенатора в соответствии с общепринятыми методами (Mingala CN, Konnai S, Ikebuchi R, Ohashi K. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 34(1):55-63; Jan. 2011; в этой статье был идентифицирован ген PD-1 буйвола).
Праймер (ovPD-1 CDS F): ATGGGGACCCCGCGGGCGCC (SEQ ID NO:67)
Праймер (ovPD-1 CDS R): TCAGAGGGGCCAGGAGCAGTGTCCA (SEQ ID NO:68)
Праймер (buPD-1 CDS F1): ATGGGGACCCCGCGGGCGCT (SEQ ID NO:69)
Праймер (buPD-1 CDS R1): GATGACCAGGCTCTGCATCT (SEQ ID NO:70)
Праймер (buPD-1 CDS F2): AATGACAGCGGCGTCTACTT (SEQ ID NO:71)
Праймер (buPD-1 CDS R2): TCAGAGGGGCCAGGAGCAGT (SEQ ID NO:72)
1.2. Конструирование клеток COS-7, экспрессирующих овечьих PD-1
Для получения плазмиды, экспрессирующей овечий PD-1, проводили ПЦР, используя в качестве матрицы синтезированную кДНК, полученную из овечьих PBMC, и праймеров, сконструированных путем добавления сайтов распознавания BglII и SmaI на 5' конце (ovPD-1-EGFP F и R). Полученные продукты ПЦР расщепляли с помощью BglII (Takara) и SmaI (Takara), очищали набором FastGene Gel/PCR Extraction (NIPPON Genetics) и клонировали в вектор pEGFP-N2 (Clontech), обработанный ферментами рестрикции аналогичным образом. Интересующую плазмиду экспрессии экстрагировали с использованием набора FastGene Xpress Plasmid PLUS (NIPPON Genetics) и хранили при -30°C перед применением в экспериментах. В настоящем документе полученная таким образом плазмида обозначена как pEGFP-N2-ovPD-1.
Праймер (ovPD-1-EGFP F): GAAGATCTATGGGGACCCCGCGGGCGCCG (SEQ ID NO:73)
Праймер (ovPD-1-EGFP R): GACCCGGGGAGGGGCCAGGAGCAGTGTCC (SEQ ID NO:74)
5
2
2
2
Клетки COS-7 субкультивировали с плотностью ×104клеток/см в 6-луночных планшетах, а затем культивировали в течение ночи в среде RPMI 1640, содержащей 10% инактивированную фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen) и 0,01% L-глютамин (Life Technologies) при 37°С в присутствии 5% СО. pEGFP-N2-ovPD-1 или pEGFP-N2 (отрицательный контроль) вводили в клетки COS-7 при 0,4 мкг/см, используя Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Клетки культивировали в течение 48 часов (ovPD-1-EGFP экспрессирующие клетки). Для подтверждения экспрессии овечьего PD-1 в полученных таким образом экспрессирующих клетках, внутриклеточную локализацию EGFP визуализировали с помощью универсального флуоресцентного микроскопа BZ-9000 (KEYENCE).
1.3. Реакционная способность крысиного антитела 5D2 против бычьего PD-1 в отношении овечьего PD-1 (фиг.9)
Методом проточной цитометрии было подтверждено, что крысиное моноклональное антитело против PD-L1 перекрестно реагирует с овечьим PD-1. Клетки COS-7, экспрессирующие овечье PD-L1-EGFP, блокировали PBS с добавлением 10% инактивированной козьей сыворотки (Invitrogen) при комнатной температуре в течение 15 минут и проводили реакцию с 10 мкг/мл крысиного антитела 5D2 против бычьего PD-1 при комнатной температуре в течение 30 минут. После промывки клетки взаимодействовали с меченным APC козьим антителом против крысиного Ig (Beckman Coulter) при комнатной температуре в течение 30 мин. В качестве отрицательного контрольного антитела использовали контроль с изотипом IgG2a (κ) крысы (BD Bioscience). Для анализа использовали FACS Verse (BD Bioscience). Для каждой операции промывки и разбавления антител использовали PBS с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich).
Экспериментальные результаты приведены на фиг. 9. Было подтверждено, что крысиное антитело 5D2 против бычьего PD-1 связывается с клетками, экспрессирующими овечий PD-1.
1.4. Реакционная способность крысиного антитела 5D2 против бычьего PD-1 с лимфоцитами буффало (фиг. 10)
6
2
Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из периферической крови буйвола (Bubalus ubalis; азиатский буйвол) путем центрифугирования в градиенте плотности с использованием Percoll (GE Healthcare). Выделенные PBMC буйвола суспендировали в среде RPMI 1640 (Sigma-Aldrich), содержащей 10% инактивированную фетальную бычью сыворотку (Cell Culture Technologies), пенициллин 200 Ед/мл, стрептомицин 200 мкг/мл) и 0,01% L-глютамина (Life Technologies). Плотность клеток доводили до 2×10 клеток/мл. К этим PBMC добавляли 20 нг/мл форбол-12-миристат ацетата (PMA) и 1 мкг/мл йономицина (Sigma-Aldrich), а затем культивировали 2 дня при 37°C в атмосфере 5% CO. Культивированные РВМС собирали и блокировали с помощью PBS с добавление 10% инактивированной козьей сыворотки (Invitrogen) при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем крысиное антитело 5D2 против PD-1 и мышиное антитело бычьего CD8 (38,65, AbD Serotec) реагировали при комнатной температуре в течение 30 минут. В качестве отрицательного контроля использовали контроль с изотипом IgG2a (κ) крысы (BD Bioscience). После промывки проводили реакцию с меченным АРС козлиным антителом против крысиного Ig (Beckman Coulter) и с меченным PE козьим антителом против мышиного IgG (Beckman Coulter) при комнатной температуре в течение 30 минут. После дополнительной промывки, мышиное антитело против бычьего CD4, меченное Alexa Flour488 (CC30, AbD Serotec), и мышиное антитело против IgM, меченное PE/Cy7 (IL-A30, AbD Serotec) взаимодействовали при комнатной температуре в течение 30 минут. Для мечения антител использовали наборы Zenon Mouse IgG1 Labeling (Life Technologies) или Lightning-Link (Innova Biosciences). Для анализа использовали FACS Verse (BD Biosciences). Для каждой операции промывки и разбавления антител использовали PBS с добавлением 10% инактивированной козьей сывороткой (Invitrogen).
+
-
+
+
-
+
Экспериментальные результаты приведены на фиг. 10. Крысиное антитело 5D2 против бычьего PD-1 прочно связывалось с CD4 T-клетками буйвола (IgMCD4) и CD8 T-клетками (IgMCD8), которые были активированы стимуляцией PMA/йономицином.
[Пример 3] Связывание с бычьими Fcγ-рецепторами химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего PD-1 с нативным или мутированным бычьим IgG1
Введение
Авторы настоящего изобретения создали химерное "крысино-бычье" антитело против бычьего PD-1 в примере 1 с целью создания нового средства для лечения инфекций крупного рогатого скота. При этом были сделаны мутации в предполагаемых сайтах связывания рецепторов Fcγ в домене CH2 для подавления активности ADCC, опосредованной химерном антителом (фиг. 1 и 11). В этом примере с целью изучения влияния этих аминокислотных мутаций авторы настоящего изобретения получили химерные "крысино-бычьи" антитела против бычьего PD-1 с мутированным бычьим IgG1 («IgG1 ADCC-», описанное выше) и нативным бычьим IgG1 («IgG1 WT») соответственно и подтвердили их связывание с известными бычьими Fcγ-рецепторами.
Материалы, методы и экспериментальные результаты.
2.1 Получение вектора, экспрессирующего химерное "крысино-бычьего" антитело против PD-1
Было получено химерное "крысино-бычье" антитело ch5D2 против бычьего PD-1 с нативным IgG1 (IgG1 WT) или мутированный бычий IgG1 (IgG1 ADCC - как описано выше).
В соответствии с методиками, описанными в примере 1, получали экспрессионную плазмида, кодирующая химерное "крысино-бычье" антитело ch5D2 против PDC-1 с мутированным бычьим IgG1 (IgG1 ADCC-) (SEQ ID NO:9 и 10 (аминокислотные последовательности), SEQ ID NO:14 и 15 (нуклеотидные последовательности после оптимизации кодонов). Следует отметить, что для подавления активности ADCC у бычьего IgG1, использованного в ch5D2 IgG1 ADCC-, были добавлены мутации в предполагаемые сайты связывания рецепторов Fcγ в домене CH2 (см. фиг. 1 и 11, где указаны аминокислотные положения и мутации: 251 E→P, 252 L→V, 253 P→A, 254 G→делеция, 348 A→S, 349 P→S; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 142(4):551-561; Aug. 2014). В настоящем документе полученная таким образом плазмида обозначена как pDN112-boPD-1ch5D2 IgG1 ADCC-.
Экспрессирующаую плазмиду, кодирующую химерное "крысино-бычье" антитело ch5D2 против бычьего PD-1 с нативным IgG1 (IgG1 WT), получали в соответствии с процедурами, описанными ниже. Сначала, для амплификации гена, кодирующего константную область нативного бычьего IgG1 (номер доступа GenBank X62916), проводили ПЦР, используя в качестве матрицы синтезированную кДНК, полученной из PBMC крупного рогатого скота, и конструировали праймеры с добавлением сайтов распознавания NheI и XbaI на 5' конце (boIgG1 CH1 F и boIgG1 CH3 R). Цепь амплифицированного гена расщепляли с помощью NheI (Takara) и XbaI (Takara), очищали с помощью набора FastGene Gel/PCR Extraction (NIPPON Genetics) и клонировали в pDN112-boPD-1ch5D2 IgG1 ADCC-, который обрабатывали рестриктазами аналогичным образом. Кроме того, полученную плазмиду очищали с помощью набора QIAGEN Plasmid Midi (Qiagen) и расщепляли NotI (Takara) и XbaI (Takara), получая, таким образом, кассету экспрессии легкой цепи ch5D2 (SEQ ID NO:9 (аминокислотная последовательность), SEQ ID NO:14 (нуклеотидная последовательность)) и тяжелой цепи (IgG1 WT) (SEQ ID NO:75 (аминокислотная последовательность), SEQ ID NO:76 (нуклеотидная последовательность)). Этот фрагмент гена очищали с помощью набора для экстракции FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics) и клонировали в сайт клонирования (последовательности распознавания ферментов рестрикции NotI и XbaI ниже PCMV и между INRBG и PABGH) вектора экспрессии pDC6 (любезно предоставлен профессором S.Suzuki, Hokkaido University Research Center for Zoonosis Control (фиг.12). Интересующую полученную плазмиду экспрессии экстрагировали набором QIAGEN Plasmid Midi (Qiagen) и хранили при -30°C перед использованием в экспериментах. В настоящем документе полученная таким образом плазмида экспрессии обозначена как pDC6-boPD-1ch5D2 IgG1 WT.
Праймер (boIgG1 CH1 F): CTAGCTAGCACCACAGCCCCGAAAGTCT (SEQ ID NO:77)
Праймер (boIgG1 CH3 R): TGCTCTAGATTATTTACCCGCAGACTTAGA (SEQ ID NO:78)
2.2 Экспрессия и очистка химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего PD-1
7
Тридцать микрограммов pDC6-boPD-1ch5D2 IgG1 WT или pDN112-boPD-1ch5D2 IgG1 ADCC- вводили в 7,5×10 клетки Expi293F (Life Technologies), используя экспифектамин (Life Technologies), а затем трансфицированные клетки культивировали при встряхивании в течение 5-7 дней, собирая затем культуральный супернатант. Каждое химерное антитело очищали от культурального супернатанта с использованием Ab Capcher Extra (ProteNova). Для связывания со смолой использовали способ с открытой колонкой; 1,5 M глицин/3 M NaCl (pH 8.0) использовали в качестве уравновешивающего буфера и промывочного буфера. В качестве элюирующего буфера использовали 0,1 М глицин-HCl (рН 2,8). В качестве нейтрализующего буфера использовали 1М Трис (рН 9,0). В очищенном антителе заменяли буфер на PBS (pH 7,4), используя обессоливающую колонки PD-10 (GE Healthcare) и концентрировали с использованием Amicon Ultra-15 (50 кДа, Millipore). Очищенное таким образом химерное антитело пропускали через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм (Pall Life Science) для стерилизации и хранили при 4°С перед применением в экспериментах. Концентрацию каждого очищенного химерного антитела и количественно определяли по поглощению (280 нм), измеренному на спектрофотометре Nanodrop8000 (Thermo Fisher Scientific).
2.3 Подтверждение чистоты очищенного химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего PD-1 (фиг.13).
Чтобы подтвердить чистоту очищенного химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего PD-1 (ch5D2 IgG1 WT и ch5D2 IgG1 ADCC-), белки антител обнаруживали с помощью SDS-PAGE и окрашивания CBB. Каждое химерное антитело суспендировали в буфере для образцов Laemmli Sample Buffer (Bio-Rad) и денатурировали при 95°C в течение 5 минут в восстанавливающих условиях (восстановление 2-меркаптоэтанолом; Sigma-Aldrich) или в невосстанавливающих условиях. Полученные таким образом образцы подвергали электрофорезу с использованием SuperSep Ace 5%-20% градиентного полиакриламидного геля. В качестве маркеров молекулярной массы использовали Precision Plus Protein All Blue Standards (Bio-Rad). После электрофореза гель окрашивали набором Quick-CBB (Wako) и обесцвечивали в дистиллированной воде.
Результаты показаны на фиг.13. Полосы ch5D2IgG1 WT и ch5D2 IgG1 ADCC- наблюдали в спрогнозированных положениях, то есть при 25 кДа (легкая цепь) и 50 кДа (тяжелая цепь) в восстанавливающих условиях и при 150 кДа в невосстанавливающих условиях.
2.4. Конструирование растворимых бычьих Fcγ-рецепторов (FcγRs)
Плазмиды, экспрессирующие FcγRI-His, FcγRII-His, FcγRIII-His и Fcγ2R-His, были получены в соответствии с методиками, описанными ниже. Для амплификации сигнальный пептид и внеклеточную область бычьих FcγRI, FcγRII, FcγRIII и Fcγ2R (номер доступа GenBank NM_174538, NM_174539, NM_001077402 и NM_001001138), праймеры обрабатывали, которые содержали сайты распознавания NotI и XhoI на 5' конце (boFcγRI-His F и R; boFcγRIII-His F и R или boFcγ2R-His F и R) или сайты распознавания NheI и EcoRV, добавленные на 5' конце (boFcγRIII-His F и R). Последовательность гена, кодирующая метку 6xHis, была добавлена к обратному праймеру. ПЦР проводили с использованием синтезированной кДНК, полученной из бычьих PBMC, в качестве матрицы. Соответствующие продукты ПЦР расщепляли NotI (Takara) и XhoI (Takara) (FcγRI-His, FcγRIII-His и Fcγ2R-His) или NheI (Takara) и EcoRV (Takara) (FcγRII-His), очищали с помощью набора FastGene Gel/PCR Extraction (NIPPON Genetics) и клонировали в вектор pCXN2.1(+) (Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Gene, 108(2):193-199; Dec. 15, 1991; предоставлен доктором T. Yokomizo, Juntendo University Graduate School of Medicine). Полученные плазмиды экспрессии очищали с использованием набора FastGene Xpress Plasmid PLUS (NIPPON Genetics) и хранили при -30°C перед применением в экспериментах. В настоящем документе полученная таким образом плазмида экспрессии обозначена как pCXN2.1-boFcγRI-His, pCXN2.1-boFcγRII-His, pCXN2.1-boFcγRIII-His или pCXN2.1-boFcγ2R-His.
Праймер (boFcγRI-His F):
ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGTGGCTCATAATAGCTCT (SEQ ID NO:79)
Праймер (boFcγRI-His R):
GCCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGATGGTGAGGAGTTGTTGACTGGAGGC (SEQ ID NO:80)
Праймер (boFcγRII-His F):
ATAAGAATGCTAGCCACCATGGGGATCCCCTCATTCCT (SEQ ID NO:81)
Праймер (boFcγRII-His R):
GCCGATATCTTAATGGTGATGGTGATGGTGCGATGAGGGGCCGCTCGAGC (SEQ ID NO:82)
Праймер (boFcγRIII-His F):
ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGTGGCAACTGCTACCACC (SEQ ID NO:83)
Праймер (boFcγRIII-His R):
GCCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGATGGTGGTGCCAAGGTAGAAAGAATG (SEQ ID NO:84)
Праймер (boFcγ2R-His F):
ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGGCCCCCACCCTCCCTGCCTTGCTCT (SEQ ID NO:85)
Праймер (boFcγ2R-His R):
GCCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGATGGTGATTCTGCATCGTGTAGTCTG (SEQ ID NO:86)
7
Клетки, экспрессирующие растворимые бычьи FcγRI-His, FcγRII-His, FcγRIII-His и Fcγ2R-His, были получены в соответствии с методиками, описанными ниже. Вкраце, 30 мкг pCXN2.1-boFcγRI-His, pCXN2.1-boFcγRII-His, pCXN2.1-boFcγRIII-His или pCXN2.1-boFcγ2R-His вводили в 7,5×10 клетки Expi293F (Life Technologies), используя экспифектамин (Life Technologies), а затем трансфицированные клетки культивировали при встряхивании в течение 5-7 дней, собирая затем культуральный супернатант. Рекомбинантные белки очищали из культурального супернатанта, используя полимер TALON Metal Affinity Resin (Clontech). После очистки буфер заменяли PBS (pH 7,4), используя Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit (10 кДа, Millipore) и рекомбинантные белки хранили при -30°C до использования в экспериментах (бычий PD-1-His). Концентрацию очищенных бычьих FcγRI-His, FcγRII-His, FcγRIII-His и Fcγ2R-His количественно определяли по поглощению (280 нм), измеренному на спектрофотометре Nanodrop8000 (Thermo Fisher Scientific).
2.5. Связывание с бычьим FcγR химерного "крысино-бычьего" антитела PD5 бычьего PD-1 IgG1 WT и IgG1 ADCC- (фиг.14)
Крысиное химерное "крысино-бычье" антитело ch5D2 против бычьего PD-1 IgG1 WT или IgG1 ADCC- иммобилизовали на планшетах для ELISA Nunc MaxiSorp (Nunc) с конечной концентрацией 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12 или 1,5610 нМ при 37°C в течение 2 часов. Затем каждую лунку пять раз промывали 200 мкл 0,05% PBS (PBS-T) с добавлением Tween 20, а затем блокировали блокирующим буфером SuperBlock (PBS) (Thermo Fisher Scientific) при 37°C в течение 30 минут. Каждую лунку снова промывали аналогичным образом. Затем в каждую лунку добавляли бычий FcγRI-His, FcγRII-His, FcγRIII-His или Fcγ2R-His в конечной концентрации 10 мкг/мл и проводили реакцию при 37°C в течение 1 часа. После отмывки моноклональное антитело мыши против антигистидиновой метки (Abcam) взаимодействовало при 37°C в течение 30 минут. Затем каждую лунку промывали, и меченное пероксидазой хрена козье поликлональное антитело против мышиного IgG (MP Biomedicals) взаимодействовало при 37°C в течение 30 минут. Каждую лунку снова промывали и затем добавляли TMB One Component Substrate (Bethyl) для окрашивания. После этого ферментативную реакцию останавливали с помощью 0,18 М разбавленной серной кислоты и измеряли поглощение (450 нм) с помощью Microplate Reader MTP-900 (Corona Electric). Для каждой стадии промывки планшета использовали Auto Plаte Washer BIO WASHER 50 (DS Pharma Biomedical).
Экспериментальные результаты приведены на фиг. 14. IgG1 WT прочно связывается с бычьим FcγRI-His и слабо связывается c бычьим FcγRII-His. С другой стороны, IgG1 ADCC- не связывался с бычьим FcγRI-His или FcγRII-His. Ни IgG1 WT, ни IgG1 ADCC- не связывались с бычьим FcγRIII-His или Fcγ2R-His.
Все публикации, патенты и заявки на патент, которые приводятся в данном документе, тем самым включены в своем полном объеме посредством ссылки.
Промышленная применимость
Антитело против PD-1 по настоящему изобретению можно использовать для профилактики и/или лечения злокачественного новообразования и инфекций у животных.