Аминокислотное производное декагидро-клозо-декаборатного аниона и его противовирусная активность в отношении вируса гриппа А
AMINO-ACID DERIVATIVE OF THE DECAHYDRO-CLOSO-DECABORATE ANION AND ITS ANTIVIRAL ACTIVITY AGAINST INFLUENZA A VIRUS

2
10
9
2
2
2
2
Изобретение относится к вирусологии и медицине, в нем представлено новое синтетическое соединение, а именно: аминокислотное производное декагидро-клозо-декаборатного аниона (Na[BHOCHCHCHCHCO-His-ОМе]), которое может быть использовано для создания нового противовирусного препарата против вируса гриппа А с целью применения как в виде самостоятельного лекарственного средства, так и в составе комплексного препарата для терапии гриппозной инфекции, этиологически связанной с вирусом гриппа типа А.
Грипп является инфекционным заболеванием дыхательной системы, этиологически связанным с вирусом гриппа, который принадлежит к семейству Ortomyxoviridae и представлен 5 родами, три из которых составляют вирусы гриппа А, В и С. Вирус гриппа А на протяжении последнего столетия был причиной как пандемий (1918 г. - «испанка», 1957 г. - «азиатский грипп», 1968 г. - «гонконгский грипп» и 2009 г. - «мексиканский грипп»), так и эпидемий высокой интенсивности (1977 г. - «русский» грипп).
Значение вируса гриппа типа А определяется также наличием природного резервуара, поддерживаемого птицами водного и околоводного пространства. Крайне редко, но именно вирусы гриппа птиц могут быть причиной тяжелых форм гриппозной инфекции у людей и инфицировать некоторые виды млекопитающих, среди них такие подтипы, как A(H5N1), A(H5N6), A(H7N9), A(H9N2).
Белковый ионный канал М2 (виропорин М2) в оболочке вируса гриппа необходим для инфицирования клетки [1-4]. В клетку-хозяина, вирус попадает заключенным в эндосомы (мембранные структуры). Через этот ионный канал, избирательно нагнетаются ионы водорода из клетки внутрь вируса. При низком значении рН среды протеиновый насос М2 (pump М2) активируется и начинает перекачивать ионы водорода, понижая рН внутри вирусной частицы, тем самым вызывая ее распад. Таким образом, высвобождается генетический материал вируса в цитоплазму клетки-хозяина [5]. Недавно предложенная этими авторами [5] модель протонной помпы была установлена с помощью методов ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
3
+
Детальная структура белка М2 позволила расширить понимание молекулярного механизма, обеспечивающего работу виропорина М2 по перекачке ионов водорода. Движущая сила этой протонной помпы сосредоточена в трансмембранной области белка и представляет собой имидазольное сопряжение из аминокислотных остатков гистидина в 37 положении (His37). Источником ионов водорода служат ионы гидроксония НО [6].
Остатки триптофана в 41-ом положении (Trp41) в трансмембранной области закрывают пору канала с внутренней части. Когда три или все четыре имидазола His37 протонированы, возникает электростатическое отталкивание между имидазолами [7, 8]. Это в свою очередь нарушает винтовую упаковку цепей тетрамерного канала М2 и открывает портал из индолов Trp41 для прохода протонов во внутрь вирусной частицы. Нарушение этого механизма, по нашему мнению, открывает возможности для создания эффективного препарата против вируса гриппа, даже тех его штаммов, которые приобрели устойчивость к воздействию существующих препаратов, например римантадина, амантадина, озельтамивира и др.
50
Поэтому виропорины М2 являются привлекательной терапевтической мишенью для создания препаратов - блокаторов ионных каналов. Ингибиторы функции белка М2 вируса гриппа А, как правило, состоят из гидрофобной части молекулы (в препаратах амантадин и римантадин - адамантан), соединенной с полярной функциональной группой. Как было показано ранее [9-11], адамантильный остаток может быть заменен на другие гидрофобные группы, в том числе на производные терпенов, конденсированные ароматические системы и другие углеводороды. Кластерные анионы бора, в качестве носителей, по нашему мнению, являются наиболее перспективными каркасными заместителями для присоединения к ним функционально активных групп ввиду их низкой токсичности (СТ>250 мкг/мл) и хорошей растворимости в воде.
Конденсирование биомолекул с кластерными анионами бора приводит к резкому изменению гидрофильных и липофильных свойств. Клозо-декаборатные и клозо-додекаборатные анионы проявляют гидрофильные свойства, тогда как дикарбододекаборан проявляет ярко выраженный гидрофобный характер, что даст возможность карборансодержащим биомолекулам эффективно связываться с гидрофобными областями протеинов, в частности рецепторов [12]. Создание биомолекул, содержащих кластерные анионы бора, позволило добиться in vitro повышенной стабильности полученных соединений. Существует несколько общих подходов к созданию биологически активных соединений на основе кластеров бора. В первом методе кластер используется в качестве заместителя, при этом основной каркас биомолекулы остается неизменным. Второй подход основан на создании аналогов биологически активных веществ, в которых структурный элемент исходного соединения, в частности адамантильный остаток, заменяется на борный кластер.
Известно большое количество карборановых аналогов разнообразных стероидных соединений. Как было уже указано, введение в биомолекулу карборанового фрагмента позволяет сильно увеличивать ее гидрофобность, что приводит к усилению биологической активности таких соединений. В настоящее время синтезированы боросодержащие аналоги 17-эстрадиола, 4,5-2Н-дигидротестостерона и холестерина [13].
Еще одной областью применения соединений на основе кластерных анионов бора является создание биоконъюгатов на основе карбоборанильных фосфонатов [14]. Существует два подхода к синтезу подобных биомолекул: создание соединений, в которых фосфонатная группа напрямую связана с карборановым кластером или отделена от кластера спейсерной группой. Основная перспектива для применения карбоборанильных фосфонатов заключается в создании препаратов для борнейтрон-захватной терапии, особенно при лечении рака костей, из-за способности селективно накапливаться в богатых кальцием опухолевых тканях. Также карбоборанильные фосфонаты проявляют высокую антихолинэстеразную активность.
Таким образом, есть все предпосылки полагать, что синтетические производные кластерных соединений бора с остатками аминокислот и пептидов, ввиду их значительной активности и низкой токсичности, могут быть основой для создания новых противовирусных препаратов против циркулирующих штаммов гриппа А.
2
4
2
10
9
2
4
Сущность изобретения заключается в создании нового синтетического соединения метил-2-{[пентаноил]амино}-3-(1Н-имидазол-5-ил)пропанат-нонагидро-клозо-декаборат натрия, являющегося производными клозо-декаборатного аниона с остатком метилового эфира гистидина в качестве пендантного заместителя, отделенного от борного кластера спейсером -O(СН)СО-. Предлагаемое соединение Na[BH-O(CH)CO-His-OMe] имеет следующую структурную формулу анионной части:
2
10
9
2
4
2
10
9
2
4
Для получения соединения Na[BH-O(CH)CO-His-OMe] могут быть использованы различные подходы. Один из способов получения соединения Na[BH-(CH)CO-His-OMe] представлен на схеме 1 (Фиг. 1). Однако предложенный метод синтеза не должен рассматриваться как некое ограничение объема настоящего изобретения во всех отношениях.
10
14
При синтезе соединений использовали декаборан(14) (ВНн) (АО «Авиабор)», дихлоргидрат метилового эфира L-гистидина (фирмы «Sigma-Aldrich» (США)), Тетрагидрофуран (HPLC), цианид натрия (KCN) (ООО «Химмед» РФ), 1-гидроксибензотриазол (НОВТ), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC), 4-диметиламинопиридин (DMAP), тетрафенилборат натрия («Merck», Германия).
11
1
11
13
3
3
Все используемые для реакции растворители предварительно очищали и перегоняли по стандартным методикам. Полнота прохождения реакций на каждой стадии контролировалась с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), В ЯМР-спектроскопии и инфракрасной спектроскопии (ИК). ИК спектры соединений записывали на ИК Фурье - спектрофотометре Инфралюм ФТ-08 (НПФ АП «Люмекс», РФ) в виде суспензии в вазелиновом масле или таблеток бромида калия. ЯМР H, В, С спектры растворов исследуемых веществ в CDCN записывали на импульсном Фурье-спектрометре Bruker MSL-300 (Германия). Масс-спектры растворов исследуемых веществ в CHCN записывали на спектрометре API 3200 Qtrap (AppliedBiosysteM, USA). Условия ионизации: турбоионное распыление, ионное распыление, напряжение ±4500 В, декластеризации ±12 В, скорость потока 2-20 мкл/мин. Средняя аналитическая концентрация образцов 0.5-1.0 мг/л.
2
10
9
2
4
Соединение Na[BH-O(CH)CO-His-OMe] обладают низким токсическим эффектом на монослой перевиваемой линии клеток почки эмбриона собак (MDCK).
Технический результат - получено новое малотоксичное соединение, которое ингибирует репродукцию вируса гриппа А, т.е. обладает противовирусной активностью.
Краткое описание чертежей
Для более ясного понимания сути заявленного изобретения, которое отражено в формуле изобретения, а также для демонстрации ее особенностей и преимуществ далее приводится подробное описание со ссылками на фигуры чертежей.
2
10
9
2
4
10
9
4
8
4
2
10
9
4
2
10
9
4
8
4
2
10
9
2
4
2
10
9
2
4
На фиг. 1 представлена схема постадийного синтеза Na[BH-O(CH)CO-His-OMe]. Общая схема синтеза включает три основных стадии модикации аниона [2-ВНОСН]-. На первой стадии (а) осуществляли нуклеофильное раскрытие циклического оксониевого заместителя в соединении (BuN)[BH-THF] действием цианида калия. Полученное производное (BuN)[2-BHOCHCN] затем гидролизовали в щелочной среде (b) для присоединения пендантной карбоксильной группы. На заключительной стадии синтеза (с) с использованием методологии пептидного синтеза (в качестве конденсирующего реагента использовали смесь EDC/HOBT/DMAP) получали производное гистидина. Для проведения биологических испытаний целевое соединение синтезировали в виде натриевой соли с использованием метода метатезиса катионов. В водно-спиртовом растворе тетрабутиламмониевая соль производного клозо-декаборатного аниона (BuN)[BH-O(CH)CO-His-OMe] обрабатывали тетрафенилборатом натрия с образованием Na[BH-O(CH)CO-His-OMe].
2
10
9
2
4
На фиг. 2 в виде таблицы 1 представлены данные влияния двух концентраций соединения Na[BH-O(CH)CO-His-OMe] на репродукцию вируса гриппа человека A/IIV-Moscow/1/2009(H1N1)swl в культуре клеток собачьей почки Мадин-Дарби (Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)) при добавлении вещества одномоментно с вирусом.
На фиг. 3 представлены в виде таблицы данные цитотоксического действия предлагаемого соединения на монослой клеток MDCK.
Вирусологические исследования проведены с использованием пандемического штамма вируса гриппа A/IIV-Moscow/1/2009(H1N1)swl, резистентного к действия препаратов адамантанового ряда. Инфекционный титр вируса гриппа исследовали на перевиваемой линии клеток MDCK. В работе использовали трехдневный монослой клеточной линии MDCK, выращенный на среде Игла MEM (Minimum Essential Medium) фирмы ПанЭко (Россия) с добавлением 10%-ой эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) HyClon (США), L-глутамина и антибиотиков - 150 ед/мл пенициллина и 150 ед/мл стрептомицина. Контроль культуральных клеток проводили с помощью светооптического микроскопа.
Настоящее изобретение проиллюстрировано нижеследующими примерами. Однако эти примеры не должны рассматриваться как некое ограничение объема настоящего изобретения во всех отношениях.
2
10
9
2
4
2
Пример 1. Синтез Na[BH-(CH)CO-His-OMe] Nal.
4
10
9
4
8
4
2
10
10
4
2
10
9
4
8
4
2
10
9
4
8
Синтез (BuN)[2-BHO(CH)] из (BuN)[ВН] осуществляли по известной методике [15]. Раскрытие циклического заместителя проводили с использованием KCN по методике [16] с образованием (BuN)[2-BHOCHCN], а затем путем гидролиз последнего получали (BuN)[2-BHOCHCOOH]. На заключительной стадии синтеза с использованием методологии пептидного синтеза (в качестве конденсирующего реагента использовали смесь EDC/HOBT/DMAP) получали производное гистидина.
4
10
9
4
8
4
10
9
2
4
Готовили раствор (BuN)[2-BHOCHCOOH] (2,00 г; 2,8 ммоль) в 30,0 мл 1,2-дихлороэтана и охлаждали до 0°С, затем прибавляли к реакционной смеси НОВТ (80% масс., 0,71 г; 4,2 ммоль), EDC*HC1 (0,65 г; 4,2 ммоль) и DMAP (1,22 г; 10,0 ммоль). Полученную реакционную массу перемешивали в течение получаса в атмосфере сухого аргона. Затем добавляли к смеси гидрохлорид метилового эфира L-гистидина (1,02 г; 4,2 ммоль). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение суток. Выпавший осадок гидрохлорида диметиламинопиридина отфильтровывали, маточный раствор концентрировали на роторном испарителе. Сухой остаток обрабатывали водой и экстрагировали дихлорметаном. Органическую фракции последовательно промывали 0,1 М HCl и водой, затем сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали на роторном испарителе. Продукт сушили в вакууме масляного насоса. Получено 2,25 г (BuN)[BH-(CH)CO-His-OMe] (92%).
11
11
-
11
-1
-1
-1
10
9
4
8
4
2
10
9
4
8
Контроль за процессом на каждой из стадий проводили с помощью В ЯМР спектроскопии и ТСХ. Так, в В ЯМР спектре аниона [2-ВНОСН] наблюдали три группы сигналов - от замещенного атома бора (В2) при 3.2 м.д., от апикальных атомов бора при -0.9 м.д. (В10) и -7.4 м.д. (В1), и группа сигналов от незамещенных экваториальных атомов при -23.5, -25.3 м.д. В(3,5) + В(6,9) и при - 31.3, -32.4 м.д. В(4)+В(7,8). В В ЯМР спектре продукта раскрытия оксониевого цикла отмечены существенные изменения. Сигнал от замещенного атома бора смещается в сильное поле и наблюдается при -1.4 м.д., сигналы апикальных атомов - при -2.7 и -5.1 м.д. соответственно. Незамещенные экваториальные атомы бора представлены тремя сигналами с интегральными интенсивностями 4:2:1 при -23.3, -28.8, -33.6 м.д., что соответствует вершинам борного полиэдра В(3,5,6,9), В(7,8) и В(4). Гидролиз циано-группы контролировали также по данным ИК спектров поглощения. Так, в ИК спектре соединения (BuN)[2-BHOCHCOOH] исчезает малоинтенсивная полоса поглощения валентных колебаний связи ν C≡N при 2105 см и отмечают полосы поглощения валентных колебаний карбоксильной группы - ν О-Н при 3622 см и ν С=O при 1703 см.
11
1
4
2
10
9
2
4
2
Строение замещенного клозо-декабората с пептидной функциональной группой устанавливали с помощью мультиядерной ЯМР спектроскопии и ИК-спектроскопии. Введение в кластерный остов пептидной группы не сказывается на виде В ЯМР спектра. В спектре H ЯМР соединения (BuN)[BH-(CH)CO-His-OMe] наряду с сигналами от тетрабутиламмониевого катиона выявлены три группы сигналов - от гистидинового остатка - синглеты при 8.01 и 7.48 м.д. от протонов гетероцикла, синглет метоксильной группы при 3.84 м.д., мультиплет при 4.82 м.д. от альфа-атома водорода аминокислотного остатка, мультиплет при 2.86 м.д. от метиленовой группы; от алкоксильного экзо-полиэдрического заместителя - триплет при 3.41 м.д., два мультиплета при 2.30 и 1.51 м.д. соответственно и триплет при 1.12 м.д.; от гидридных атомов водорода кластера - уширенный мультиплет в диапазоне 1.7… -0.3 м.д. Натриевую соль соединения NaI получали по обменной реакции с эквимолярным количеством тетрафенилбората натрия.
2
10
9
2
4
Пример 2. Исследование противовирусной активности Na[BH-O(CH)CO-His-OMe].
Изучение противовирусной активности синтетического соединения проводили на 96-луночных панелях со сформировавшимся монослоем клеток культуры ткани MDCK. Одномоментно с инфицированием в монослой клеток вносили созданное соединение в концентрациях 5,0 и 10,0 мкг/мл. Панели инкубировали 24 часа при 37°С, а затем останавливали реакцию фиксированием клеток 80%-ным ацетоном на фосфатном буфере. Постановку метода клеточного иммуноферментного анализа (ИФА) проводили согласно методике, описанной ранее [17, 18]. Процент ингибирования вирусной активности соединения определяли по формуле (1):
опыт
кл.к
450
вир.к.
450
где ОП - оптическая плотность опытной лунки (с соединением) при (450 нм), ОП - ОП клеточного контроля, ОП - ОП вирусного контроля.
2
10
9
2
4
50
2
10
9
2
4
Обнаружено, что синтетическое соединение Na[BH-(CH)CO-His-OMe] показало высокую степень ингибирования репродукции штамма вируса гриппа А, резистентного к действию препаратов адамантана (фиг. 2). ИД для соединения Na[BH-(CH)CO-His-OMe] составило менее 5,0 мкг/мл или 0,0135 мкМ.
Пример 3. Определение цитотоксического действия
2
2
50
Цитотоксическое действие соединения изучали колориметрическим тестом для оценки метаболической активности клеток (МТТ-тест). В ячейки 96-луночного планшета на сформировавшейся монослой клеток культуры MDCK вносят исследуемое соединение в концентрации 10,0; 20,0; 40,0; 80,0 и 160,0 мкг/мл (по 8 ячеек для каждого разведения) на питательной среде Игла MEM с L-глутамином, с двойным набором аминокислот. Планшеты инкубировали в термостате с подачей CO при температуре 37°С в течение 48 часов с визуальным контролем через каждые сутки под электронным микроскопом. Далее среду удаляли и в каждую лунку вносилось по 20,0 мкл раствора тетразолиевого красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромида (МТТ) в концентрации 5,0 мг/мл (т.е. по 100,0 мкг МТТ). Инкубировали панели в термостате с подачей СО при 37°С в течение 2 часов, после чего наблюдали изменение цвета среды в лунках с образовались темно-синих кристаллов формазана в клетках. Затем из лунок планшета с помощью многоканальной пипетки аккуратно удаляли среду, при этом слой клеток с кристаллами формазана в виде синего налета остается на дне планшета. В каждую ячейку вносили 150,0 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Для эффективного растворения формазана в диметилсульфоксиде (ДМСО) планшет встряхивали на шейкере в течение 5 минут. Измеряли оптическую плотность раствора в каждой лунке, при длине волны 490 нм (длина волны сравнения - 620 нм), с помощью планшетного флуориметра "Synergy НТ" (BioTek Instruments, США) (фиг. 3). В результате эксперимента не был достигнут предел токсичности соединения. Соединение можно считать малотоксичным по отношению к монослою клеток MDCK, цитотоксическая доза составила более 160,0 мкг/мл (ЦТ>160,0 мкг/мл).
50
50
2
10
9
2
4
Таким образом, исходя из данных таблицы 2 (фиг. 3) следует, что химиотерапевтический индекс (ХТИ=ИД/ЦТ) для соединения Na[BH-O(CH)CO-His-OMe] составил >32.
50
50
Предлагаемое соединение в виду его высокой активности (ИД менее 5,0 мкг/мл) и низкой токсичности (ЦТ более 160,0 мкг/мл), а также экономической и синтетической доступности может быть рекомендовано в качестве кандидата на доклинические и клинические испытания с целью получения этиотропного противовирусного препарата на его основе. Полученное соединение может быть использовано для терапии заболеваний, вызванных современными штаммами вирусов гриппа А, как самостоятельное средство, так и в составе композиций для терапии вируса гриппа А в том числе штаммов резистентных к препаратам адамантанового ряда.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Liang R, Swanson JMJ, Madsen JJ, Hong M, DeGrado WF, Voth GA. Acid activation mechanism of the influenza A M2 proton channel. PNAS 2016; 113(45): E6955-E6964.
2. Duong-Ly KC, Nanda V, Degrado WF, Howard KP. The conformation of the pore region of the M2 proton channel depends on lipid bilayer environment. Protein Science 2005; 14: 856-61.
3. Krejcova L, Michalek P, Hynek D, Adam V, Kizek R. Structure of influenza viruses, connected with influenza life cycle. J Metallomics Nanotechnol. 2015; 1: 13-19.
4. Hay AJ, Wolstenholme AJ, Skehel JJ, Smith MH. The molecular basis of the specific anti-influenza action of amantadine. EMBO 1985; 4: 3021-4.
5. Nieto-Torres JL, Verdia-Baguena C, Castano-Rodriguez C, Aguilella VM. Enjuanes L. Relevance of Viroporin Ion Channel Activity on Viral Replication and Pathogenesis. Viruses. 2015; 7: 3552-73.
6. Wang C, Takeuchi K, Pinto LH, Lamb RA. Ion channel activity of influenza A virus M2 protein: characterization of the amantadine block. J Virol. 1993; 67: 5585-94.
7. Miao Y., Fu R., Zhou H.X., et. al. Dynamic Short Hydrogen Bonds in Histidine Tetrad of Full-Length M2 Proton Channel Reveal Tetrameric Structural Heterogeneity and Functional Mechanism. Structure. 2015; 23(12): 2300-2308.
8. Wei C., Pohorille A. M2 proton channel: toward a model of a primitive proton pump.// Orig Life Evol. Biosph. 2015: 45(2); 241-248.
9. Shibnev V.A., Deryabin P.G., Garaev T.M., Finogenova M.P., Botikov A.G., Mishin D.V., Peptide Carbocyclic Derivatives as Inhibitors of the Viroporin Function of RNA-Containing Viruses. Russian Journal of Bioorganic Chemistry. 2017: 43(5); 517-525.
10. Шибнев B.A., Дерябин П.Г., Бурцева Е.И., Гараев Т.М., Финогенова М.П., Кириллова Е.С., Ботиков А.Г. Аминокислотные производные 2-норборнануксусной кислоты и их противогриппозная активность. Патент РФ RU 2676699 С1 приоритет от 14.12.2017. (Опубликовано: 14.12.2018).
11. Шибнев В.А., Дерябин П.Г., Бурцева Е.И., Гараев Т.М., Финогенова М.П., Кириллова Е.С., Ботиков А.Г. Производные 2-хинальдинкарбоновой кислоты и их противовирусная активность. Патент РФ RU 2624906 С1 приоритет от 22.12.2015. (Опубликовано: 10.07.2017).
12.  J.,  M., Horinek D., Havlas Z., Hobza P. Interaction of carboranes with biomolecules: formation of dihydrogen bonds. ChemPhysChem. 2006; 7: 1100-1005.
13. Thiruinamagal B.T.S., Zhao X.B., Bandyopadhyaya A.K., et al., Receptor-Targeted Liposomal Delivery of Boron-Containing Cholesterol Mimics for Boron Neutron Capture Therapy (BNCT). Bioconjugate Chan. 2006; 17: 1141-1150.
14. Lesnikowski Z.J., Shi J., Schinaz R. F. Nucleic acids and nucleosides containing carboranes. J. Organomet. Chem. 1999; 581: 156-159.
15. Жижин К.Ю., Мустяца B.H., Малинина E.A., Вотинова Н.А., Матвеев Е.Ю., Гоева Л.В., Полякова И.Н. Кузнецов Н.Т. Взаимодействие ундекагидродекаборатного аниона В10Н11- с циклическими простыми эфирами Журнал Неорганической Химии 2004; 49: 188-90.
16. Prikaznov A.V., Shmalko A.V., Sivaev LB, Petrovskii P.V., Bragin V.I, Kisin A.V., Bregadze V.V. Synthesis of carboxylic acids based on the closo-decaborate anion Polyhedron. 2011; 30: 1494-501.
17. Логинова С.Я., Борисевич С.В., Максимов В.А., Бондарев В.П. Оценка токсичности неспецифических медицинских противовирусных средств, предназначенных для профилактики и лечения опасных и особо опасных вирусных инфекций. // Антибиотики и химиотерапия. 2009; 54: 11-14.
18. Ленева И.А., Фадеева Н.И., Федякина И.Т. и др. Применение иммуноферментной индикации вирусспецифических антигенов в изучении нового противовирусного препарата. Хим.-фарм. журнал. 1994; 9: 4-15.