ШТАММ ВИРУСА БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ОНКОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И МЕХАНИЗМОВ ОНКОЛИЗИСА ДЛЯ СОЗДАНИЯ ПРОТОТИПНОГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПРЕПАРАТА
NEWCASTLE DISEASE VIRUS STRAIN FOR STUDYING ONCOLYTIC PROPERTIES AND MECHANISMS OF ONCOLYSIS TO CREATE PROTOTYPE ANTICANCER PREPARATION

Область техники
Настоящее изобретение относится к онколитическим штаммам вируса болезни Ньюкасла и может быть использовано в вирусологии, микробиологии, ветеринарии и онкологии для изучения биологических, вирусологических и онколитических свойств с целью создания прототипного противоракового препарата.
Уровень техники
Согласно данным Всемирной Организации Здравоохранения ежегодно в мире от злокачественных новообразований умирает более пяти миллионов человек и регистрируется около трех миллионов случаев новых заболеваний. По прогнозам ежегодное число смертей от рака будет только расти и к 2030 году достигнет 13 миллионов случаев в год (WHO (World Health Organization) (World Health Statictics, 2012 - 2012. - p. 176. http://www.who.int/gho/publications/world_health_statistics/EN_WHS2012_Part2.pdf) [1].
На сегодняшний день излечиваемость онкологических заболеваний составляет всего 26%. Показатели смертности от онкологии в Новосибирской области одни из самых высоких в Сибири и превышают средний по России уровень. В динамике выявляемости и смертности населения от онкологических болезней по Новосибирску наблюдается неуклонный рост.
Разработка высокоэффективных методов лечения злокачественных новообразований остается актуальной задачей современной медицины. Несмотря на значительные достижения современных методов терапии в этой области возможности по выявлению опухолей на ранних стадиях и избирательному воздействию на них остаются крайне ограниченными.
Основным недостатком используемых в настоящее время методов химио- и радиотерапии является их низкий терапевтический индекс (ТИ). Данный показатель характеризует различие в степени воздействия соответствующего терапевтического агента на опухолевые и нормальные клетки организма (в упрощенном виде, соотношение количества убитых раковых клеток к количеству убитых нормальных клеток). Терапевтический индекс современных химиотерапевтических средств не превышает 6:1.
По принятому в международном научном сообществе мнению ТИ медикаментозных средств, направленно доставляемых бактериальными векторами, и онколитических вирусов может достигать 100000:1, что обусловлено их высокой специфичностью к опухолевым клеткам.
Идея о возможности использования вирусов для терапии опухолей возникла в первой половине 20 века. Однако датой рождения современной «виротерапии» считается 1991 г., когда в журнале "Science" были опубликованы результаты исследования онколитического потенциала генетически модифицированного вируса простого герпеса 1 типа (Martuza R.L. et al. Experimental therapy of human glioma by means of a geneticaly engineered virus mutant // Science. - 1991. - Vol. 252 (5007). - Pages. 854-856) [2]. К настоящему времени в мире, в результате проведения масштабных исследований, получен целый ряд перспективных препаратов на основе различных онколитических вирусов. Тем не менее на сегодняшний день получение таких препаратов связано со сложными манипуляциями на генетическом уровне. Не следует также забывать, что для создания имеющихся противораковых препаратов на вирусной основе были использованы вирусы млекопитающих, которые являются условно патогенными для человека и могут существенно увеличить свою патогенность в ходе эволюции или за счет спонтанного мутагенеза.
Описание аналогов
В настоящее время известно о наличии онколитической активности у вируса болезни Ньюкасла (далее - ВБН). Он способен селективно лизировать раковые клетки, оставаясь при этом безопасным для нормальных клеток тканей млекопитающих. В нескольких исследованиях была продемонстрирована способность данного вируса к специфическому онколизису. Выявлено существенное отличие в скорости репликации вируса в опухолевых и нормальных клетках млекопитающих (Zhan X. et al. Sendai virus recombinant vaccine expressing hPIV-3 HN or F elicits protective immunity and combines with a second recombinant to prevent hPIV-1, hPIV-3 and RSV infections // Vaccine. - 2008. - Vol. 26 (27-28). - Pages. 3480-3488. doi: 10.1016/j.vaccine.2008.04.022.) [3].
Существует предположение, что высокая тропность ВБН к опухолевым клеткам обусловлена нарушением синтеза белков, отвечающих за элиминацию ВБН (Elankumaran S. et al. Newcastle disease virus exerts oncolysis by both intrinsic and extrinsic caspase-dependent pathways of cell death // J Virol. - 2006. - Vol. 80 (15). - P. 7522-7534. doi: 10.1128/JVI.00241-06.) [4].
Существуют аналоги в Америке, однако информация о данных штаммах, их свойствах и возможности применения на настоящий момент не находится в открытом доступе. Тем не менее противоопухолевые препараты на основе ВБН линии PV1703 и Cassell73 проходят первую стадию клинических испытаний (Ravindra P.V. et al. Newcastle disease virus as an oncolytic agent // Indian J Med Res. - 2009. - Vol. 130(5). - Pages. 507-513) [5].
Механизм онколитического действия этого вируса остается до конца не изученным, хотя в последние годы появляются новые работы, описывающие механизмы попадания вируса в клетку (Cantin С, Holguera J., Ferreira L., Villar Ε., Munoz-Barroso I. J. Gen. Virol. 2007. Vol. 88. Pt. 2. P. 559-569) [6], индукции гибели опухолевых клеток в ответ на заражение вирусом (Fabian Ζ., Csatary СМ., Szeberenyi J., Csatary L.K. p53-independent endoplasmic reticulum stress-mediated cytotoxicity of a Newcastle disease virus strain in tumor cell lines // J. Virol. 2007. Vol. 81. N. 6. P. 2817-2830) [7], репликации ВБН (Puhlmann J., Puehler F., Mumberg D., Boukamp P., Beier R. Racl is required for oncolytic NDV replication in human cancer cells and establishes a link between tumorigenesis and sensitivity to oncolytic virus // Oncogene. 2010. Vol. 29. N. 15. P. 2205-2216) [8].
На данный момент некоторые вакцинные аттенуированные селекцией штаммы ВБН прошли несколько фаз клинических испытаний в США, Канаде, Китае и странах Европы (Германия, Венгрия). (Bai F.L., Yu Y.H., Tian Η., Ren G.P., Wang Η., Zhou В., Han X.H., Yu Q.Z., Li D.S. Genetically engineered Newcastle disease virus expressing interleukin-2 and TNF-related apoptosis-inducing ligand for cancer therapy // Cancer Biol. Ther. 2014. Vol. 15. N. 9. P. 1226-1238) [9]; (Zamarin D., Palese P. Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions // Future Microbiol. 2012. Vol. 7. N. 3. P. 347-367) [10].
Они продемонстрировали безопасность исследуемых штаммов для человека и способность подавлять развитие опухолей и продлевать жизнь опухолевых больных. С другой стороны, основываясь на высокой доклинической эффективности онколитических вирусов в отношении культур опухолевых клеток в системах in vitro и in vivo, ученые ожидают от клинических испытаний намного больше результатов.
Таким образом, получение отечественного штамма-продуцента ВБН для создания на его основе препарата, обладающего онколитической активностью, является перспективным. Актуальность этого подтверждает отсутствие в России коммерческих аналогов подобных штаммов.
Задачей изобретения является получение нового штамма вируса болезни Ньюкасла, способного избирательно лизировать раковые клетки млекопитающих, не вызывая при этом инфекционного заболевания и гибели млекопитающих для изучения онколитических свойств и механизмов онколизиса для создания прототипного противоопухолевого препарата.
Решение поставленной задачи достигается путем получения штамма вируса болезни Ньюкасла NDV/Altai/770/2011.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является установление онколитических свойств и механизмов онколизиса полученного нового штамма NDV/Altai/pigeon/770/2011 вируса болезни Ньюкасла в условиях отказа от излишней аттенуации и использование природного типа штамма ВБН с перспективой создания прототипного противоракового препарата, применяемого в вирусологии, микробиологии, ветеринарии и онкологии.
Раскрытие изобретения
Характеристика заявляемого штамма.
Штамм NDV/Altai/pigeon/770/2011 является представителем вируса болезни Ньюкасла, род Avulavirus, семейство Paromyxoviridae. Он относится к группе штаммов голубиного парамиксовируса типа 1 (ГПМВ-1), связанных с инфицированием голубей. Штамм депонирован в Государственную коллекцию вирусов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздрава России под регистрационным номером 2778 (7 июля 2014 г.).
Источник получения. Изолят вируса болезни Ньюкасла изначально был выделен из клоакального смыва клинически здорового сизого голубя (Columba livid). Материал был собран осенью 2011 года в Алтайском крае, Российская Федерация. Изолят вируса болезни Ньюкасла получил название NDV/Altai/pigeon/770/2011.
Выделенный штамм прошел 3 пассажа на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Индикация вируса была проведена в реакции гемагглютинации (РГА) с эритроцитами петуха: показатель гемагглютинирующей активности составил 128 ГАЕ/50 мкл.
Идентификация вируса. Первичная идентификация изолированного вируса болезни Ньюкасла осуществлялась методом ОТ-ПЦР с детекцией результатов в закрытой пробирке в режиме реального времени с использованием праймеров и зонда, специфичных к консервативным участкам М-гена вируса болезни Ньюкасла, согласно (Miller P.J. et al. Newcastle disease: evolution of genotypes and the related diagnostic challenges // Infect. Genet. Evol. 2010. Vol. 10. N. LP. 26-35) [11].
Полногеномное секвенирование и филогенетический анализ позволили отнести штамм ВБН к II классу VIb генотипу (GenBank: KJ920204). Приложение I.
2
Культуральные свойства. Штамм NDV/Altai/pigeon/770/2011 при культивировании на монослое первичной культуры клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) вызывает цитопатическое действие (ЦПД) на 2-3 сутки (температура культивирования 37°C, в атмосфере 5% СО).
Патогенность для человека. Штаммы вируса болезни Ньюкасла не являются патогенными для человека (Cassel W.A., Garrett R.E. Newcastle disease virus as an antineoplastic agent // Cancer. - 1965. - Vol. 18. - P. 863-868) [12], Laurie S.A. et al. A phase 1 clinical study of intravenous administration of PV701, anoncolytic virus, using two-step desensitization // Clin Cancer Res. - 2006. - Vol. 12(8). - P. 2555-2562) [13].
50
Патогенность для птицы. Штаммы вируса болезни Ньюкасла классифицируют на лентогенные (слабопатогенные), мезогенные и велогенные (высокопатогенные) (ΟΙΕ, World Organisation for Animal Health, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Paris, France, 7th edition, 2012, Vol. 1-2, Ch. 2.03.14. available at http://ww.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.03.14_NEWCASTLE_DIS.pdf) [14]. Штамм NDV/Altai/pigeon/770/2011 относится к среднепатогенному (мезогенному) варианту вируса болезни Ньюкасла. Инфекционная активность выделенного вируса составила 7,2±0,09 lg ЭИД/мл.
Патогенность штамма устанавливали согласно стандартным методикам в тестах на определение среднего времени жизни (MDT) SPF-развивающихся куриных эмбрионов и интрацеребрального индекса патогенности суточных цыплят [14].
Среднее время жизни MDT=76 часов. Показатель индекса интрацеребральной патогенности IСРI=0,675.
Патогенность для млекопитающих. Штамм не проявляет патогенности для млекопитающих (Alexander D.J. Newcastle disease virus and other avian paramyxoviruses // Rev Sci Tech. - 2000. - Vol. 19 (2). - P. 443-462) [15].
Для длительного хранения штамм необходимо лиофилизировать с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в соотношении 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение не менее 2 лет при хранении на -70°C.
Для культивирования штамма в культуре клеток используют следующие питательные среды: Игла МЭМ, ДМЭМ, содержащие 2 мкг/мл трипсина, 2 ммоль/л глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 МЕ/мл стрептомицина.
Перечень фигур, чертежей и иных материалов
Рис. 1. Магнитно-резонансная томография. Серии фронтальных срезов на 28 сутки с начала эксперимента in vivo на мышах линии BALB/C. Стрелками указано расположение опухоли. 1. Экспериментальные мыши, получавшие интратуморально инъекции вируса NDV/Altai/pigeon/770/2011 максимальной концентрации в течение 5 дней: 1а - полная регрессия опухоли по сравнению с контрольными животными; 16 - значительная редукция опухоли по сравнению с контрольными животными. 2. Контрольные мыши, получавшие инъекции физиологического раствора: 1а, 2б.
Рис. 2. Фрагмент центральной части опухоли KREBS-2 на 20 сутки после серий интратуморальных инъекций штаммом NDV/Altai/770/2011. Видны обширные поля некрозов опухолевой ткани (стрелки). Окраска гематоксилином и эозином.
Рис. 3. Сегментоядерные нейтрофилы рядом с кровеносным сосудом в небольшом очаге опухолевой ткани KREBS-2.
Рис. 4. Отдельными стрелками указаны активированные макрофаг и лимфоцит. Выделены сегментоядерные нейтрофилы, лимфоцит. Окраска гематоксилином и эозином.
Рис. 5. Островок опухоли KREBS-2 в мышечной ткани. Окраска гематоксилином и эозином.
Рис. 6. Онколитический эффект штамма ВБН NDV/Altai/pigeon/770/2011 на линиях опухолевых клеток человека и нетрансформированных мононуклеарных клетках периферической крови человека в системе in vitro на третьи сутки после инфицирования.
Рис. 7. А. Иммуноокрашивание контрольных не инфицированных вирусом клеток опухолевой линии колоректального рака человека НСТ116. Конфокальная микроскопия, 100х увеличение. Ядра окрашены DAPI. Б. Иммуноокрашивание клеток опухолевой линии колоректального рака человека НСТ116, зараженных штаммом NDV/Altai/pigeon/770/2011 (разведение 8 ГАЕ/10000 клеток). Вторые сутки после инфицирования вирусом. Конфокальная микроскопия, 100х увеличение. Ядра окрашены DAPI, вторичные антитела - Аlеха546.
Примеры использования вируса для изучения возможности создания на его основе прототипного онколитического препарата.
Для выявления онколитических свойств штамма NDV/Altai/pigeon/770/2011 были проведены эксперименты по заражению мышей опухолевыми клетками с последующими интратуморальными инъекциями штамма вируса NDV NDV/Altai/pigeon/770/2011. Результаты данного эксперимента выявили наличие у предлагаемого штамма ВБН способность нейтрализовать опухолевые клетки, препятствуя формированию опухоли. Это может происходить под воздействием иммунной системы, индуцированной наличием вируса, или, что более вероятно, по механизму прямого лизиса предлагаемым авторами штаммом NDV/Altai/pigeon/770/2011 опухолевых клеток. В пользу второй гипотезы говорит то, что при введении штамма NDV/Altai/pigeon/770/2011 в уже сформировавшуюся опухоль, наблюдалось снижение динамики роста опухоли. При морфологическом исследовании было выявлено разрушение опухолевой ткани исследуемым штаммом.
Полученные данные выявляют наличие у штамма NDV/Altai/pigeon/770/2011 способности специфически разрушать новообразования млекопитающих в системе in vivo без предварительной адаптации на культуре опухолевых клеток. Это делает данный штамм перспективным агентом для создания на его основе путем предварительной адаптации противораковых препаратов с широким спектром взаимодействия и высоким терапевтическим индексом.
Пример 1. Изучение онколитических свойств штамма NDV/Altai/pigeon/770/2011 на модели солидной опухоли мышей KREBS-2 при введении вируса в сформировавшуюся опухоль в системе in vivo.
Для оценки влияния ВБН на уже сформировавшуюся опухоль был поставлен следующий пилотный эксперимент. Двум группам иммунокомпетентных мышей линии BALB/C (♂) были привиты внутримышечно в бедро клетки асцитной карциномы KREBS-2 в концентрации 500000 клеток в 100 мкл фосфатного буфера. На третьи сутки после внутримышечной прививки опухолевых клеток в бедрах всех мышей появилось уплотнение, характерное для начала формирования солидного узла опухоли. Через 3 суток после заражения с началом формирования опухоли контрольной группе начали вводить внутримышечно в область локализации опухоли по 100 мкл физиологического раствора, а второй экспериментальной группе - интратуморально вводили по 100 мкл живого вируса NDV/Altai/pigeon/770/2011 в концентрации 256 ГАЕ в 100 мкл. Инъекции физиологического раствора и вируса продолжали ежедневно на протяжении 5-ти суток. В течение этого периода эксперимента трудно говорить об изменениях размеров опухоли, ее развитии или начале регрессии, так как на первых этапах введения вируса в районе опухоли развивается воспалительный процесс, характеризующийся отечностью, что препятствует визуальной оценке возможных изменений. Однако на более поздних этапах опухоли экспериментальных мышей сравнивали с опухолями контрольных мышей. Так на 8-9 день эксперимента визуально стало заметно, что бедро с опухолью контрольных мышей имеет более выраженную шарообразную форму, нежели у экспериментальных. На протяжении эксперимента мыши обеих групп активно потребляли корм и воду. Однако уже на 14-16 день контрольные животные стали менее подвижны. На 28 сутки с начала эксперимента оценивали распространенность внутримышечного опухолевого процесса с помощью метода магнитно-резонансной томографии (МРТ) и проводили забор материала опухолевой ткани от всех мышей.
На рисунке 1 представлены серии фронтальных срезов, полученные при помощи МРТ, на которых опухоль четко визуализируется на фоне здоровых тканей. По полученным изображениям срезов опухолевых участков удалось выявить значительные различия в развитии опухолевого процесса между контрольными и экспериментальными животными. Серии фронтальных срезов опухолевого узла контрольных животных представлены в блоках 1А и 1Б рисунка 1. В случае одной экспериментальной мыши, которая получала интратуморально инъекции вируса NDV/Altai/pigeon/770/2011, наблюдалась практически полная регрессия опухоли по сравнению с размерами опухоли контрольных животных. На блоке срезов 2А видно, что бедро, в которое были привиты опухолевые ткани, не отличается от здорового по размерам и наличие опухолевого узла на серии изображений МРТ не обнаруживаются. Опухоль другой экспериментальной мыши, получавшей инъекции вируса, претерпела значительную редукцию по сравнению с опухолями контрольных животных, получавшими инъекции физиологического раствора. Изображения опухолевого узла в бедре второй экспериментальной мыши представлен на блоке срезов 2Б.
На 28 сутки после заражения был проведен забор биоматериала опухолевой ткани от мышей из каждой группы. Структурный анализ на светооптическом уровне показал наличие многочисленных некрозов в опухолевом узле у мышей, получавших инъекции вируса NDV/Altai/Pigeon/770/2011. На рисунке 2 изображен фрагмент препарата опухолевого узла от экспериментальной мыши. С целью выявления гистологических структур срезы окрашивали по общепринятой методике обзорной окраски гематоксилином-эозином. На 20 сутки после завершения курса инъекций вируса в центральной части опухолевого узла KREBS-2 видны обширные поля некрозов опухолевой ткани, обозначенные стрелками.
В области кровеносных сосудов наблюдаются гранулоциты - сегментоядерные нейтрофилы. Между мышечными волокнами также встречаются лимфоциты и активированные макрофаги (см. рис. 3 и рис. 4). На рисунке 3 представлены сегментоядерные нейтрофилы рядом с кровеносным сосудом в небольшом очаге опухолевой ткани KREBS-2. На рисунке 4 отдельными стрелками указаны активированный макрофаг и лимфоцит. Выделены сегментоядерные нейтрофилы, лимфоцит.
Соединительная капсула плохо выражена, видны малочисленные опухолевые инвазии в подлежащую ткань. Часто встречаются апоптотические тельца.
При морфологическом исследовании опухолевого материала от мыши, у которой наблюдалась почти полная регрессия опухоли по результатам изображения МРТ, было выявлено почти полное разрушение опухоли. Сохранились отдельные опухолевые островки в мышечной ткани, который показан на рисунке 5 (см. рис. 5).
Результаты данного эксперимента показывают наличие у среднепатогенного для птиц штамма ВБН способности нейтрализовать опухолевые клетки млекопитающих и предотвращать формирование опухоли. Этот процесс может происходить под воздействием иммунной системы, индуцированной наличием вируса, или по механизму прямого лизиса вирусными частицами опухолевых клеток. Если считать второе предположение верным, то наличие онколитической активности у патогенного для птиц штамма и отсутствие ее у непатогенного объясняется тем, что апатогенные штаммы ВБН не способны лизировать клетки, в то время как исследуемый штамм, напротив, обладает этой способностью, которая позволяет ему лизировать раковые клетки млекопитающих, предотвращая формирование опухоли.
Пример 2. Оценка жизнеспособности линий опухолевых клеток человека после инфицирования штаммом NDV/Altai/pigeon/770/2011 в системе in vitro.
Для оценки цитопатического эффекта штамма вируса использовали четыре опухолевые линии человека - НСТ116+/+ (линия клеток колоректального рака), MCF7 (линия клеток аденокарциномы молочной железы с отсутствием экспрессии каспазы-3), Η1299 (линия клеток немелкоклеточной карциномы легкого), U87 (линия клеток глиобластомы). Контролем служили мононуклеарные клетки периферической крови человека. Клетки инкубировали с разным разведением вируса от 2 до 16 ГАЕ/10000 клеток. Концентрацию вируса повышали с шагом в 2 раза. Клетки с вирусом инкубировали в течение 1 часа при 37°C. Контрольные опухолевые клетки инкубировали в ростовой среде без вируса в течение 1 часа.
Через 3 суток после заражения клеточных линий штаммами ВБН был проведен анализ жизнеспособности клеток колометрическим методом с помощью коммерчески доступного набора CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, USA). Оптическую плотность измеряли при длине волны 490 нм.
Результаты оценки жизнеспособности клеток опухолевых линий представлены в виде гистограммы на рисунке 6 как средние относительные значения доли живых клеток на третьи сутки после обработки штаммами вируса к доли контрольных не обработанных вирусом клеток с учетом стандартного отклонения (среднее относительное значение ± стандартное отклонение).
Природный штамм - NDV/Altai/pigeon/770/2011 показал высокий онколитический потенциал относительно всех опухолевых клеточных линий человека. Жизнеспособность клеточных линий - колоректального рака НСТ116, глиобластомы U87 и рака легкого Н1299, - варьируется в пределах от 40% до 60%. На третьи сутки инфицирования данным штаммом в культуре колоректального рака остаются жизнеспособны 45% опухолевых клеток, а в культуре клеток глиобластомы - около 40%. Для линии немелкоклеточной карциномы легкого Η1299 это значение составляет 60%. Онколитический эффект штамма относительно клеток аденокарциномы молочной железы MCF7 оказался менее выраженным, так как жизнеспособность данной клеточной линии составила порядка 80%. При этом мононуклеарные клетки периферической крови человека (МНПК) оказались практически не восприимчивы к действию данного штамма. Их жизнеспособность составляет около 100% (см. рис. 6).
Раннее было отмечено, что штаммы голубиного парамиксовируса типа-1, к которым относится NDV/Altai/pigeon/770/2011, обладают хорошо выраженными онколитическими свойствами за счет строения их репликативного комплекса (Dortmans J.C. et al. The viral replication complex is associated with the virulence of Newcastle disease virus // J Virol. - 2010. - Vol. 84 (19). - P. 10113-10120) [16], что подтверждается нашим экспериментом. Безопасности вируса в отношении здоровых клеток млекопитающих были проверены на мононуклеарных клетках периферической крови человека. Результаты оценки жизнеспособности клеток после заражения выбранными нами штаммами ВБН подтвердили литературные данные о том, что ВБН является не патогенным для клеток человека (Schirrmacher V., Fournier P. Newcastle disease virus: a promising vector for viral therapy, immune therapy, and gene therapy of cancer // Gene Therapy of Cancer. - 2009. - Vol. 542. - P. 565-605) [17]; (Zemp F.J. et al. Oncolytic viruses as experimental treatments for malignant gliomas: using a scourge to treat a devil // Cytokine Growth Factor Rev. - 2010. - Vol. 21 (2-3). - P. 103-117) [18].
Наличие вируса в клетках опухолевых линий человека было подтверждено с помощью техники иммуноцитохимического окрашивания флуоресцентными антителами на вторые сутки после инфицирования вирусом с помощью конфокальной микроскопии (увеличение 100х). Иммуноокрашивание не зараженных вирусом контрольных клеток колоректального рака НСТ116 дало отрицательный результат. На полученных изображениях, которые представлены на рисунке 7, хорошо видны ядра клеток, окрашенные DAPI.
На рисунке 7А изображен препарат иммуноцитохимически окрашенных контрольных не инфицированных вирусом клеток опухолевой линии колоректального рака человека НСТ116. Никаких других окрашенных флуоресцентных аккумуляций и агрегаций в цитоплазме и ядрах кроме окрашенных DAPI ядер на препарате контрольных опухолевых клеток не обнаружено. На рисунке 7Б в клетках колоректального рака НСТ116, зараженных штаммом NDV/Altai/pigeon/770/2011 (разведение 8 ГАЕ/10000 клеток), после иммуноцитохимического окрашивания помимо ядер выявляется яркое флуоресцентное окрашивание нитчатых структур, располагающихся в цитоплазме клеток. Эти структуры соответствуют положению вирусных частиц штамма NDV/Altai/pigeon/770/2011 в опухолевых клетках. В клетках колоректального рака НСТ 116, проявляющих чувствительность к онколитическому действию штамма NDV/Altai/pigeon/770/2011, окрашенные вирусные нитчатые структуры выявлены в цитоплазме всех клеток и расположены в основном равномерно по всех цитоплазме.
При заражении штаммом NDV/Altai/pigeon/770/2011 опухолевой клеточной линии НСТ116 наблюдается активная репликация вируса во всех инфицированных клетках. Вероятно, этим объясняется высокая чувствительность данной линии клеток к воздействию вируса. И, как следствие, чем эффективнее происходит инфицирование вирусом опухолевых клеток, тем, соответственно, больше из их числа подвергаются онколизису и гибнут.
Показана уникальная способность штамма NDV/Altai/pigeon/770/2011 проявлять избирательную литическую активность в отношении опухолевых клеток млекопитающих, а также активно реплицироваться и сохраняться в этих клетках на протяжении длительного времени без предварительной адаптации, разрушая новообразование.
Таким образом, уникальные свойства предлагаемого штамма позволяют использовать его для исследования механизмов разрушения раковых клеток млекопитающих на ультраструктурном уровне с помощью методов светооптической и электронной микроскопии. Данные свойства перспективны для фундаментальных и прикладных медицинских исследований.
Данные свойства делают штамм NDV/Altai/pigeon/770/2011 перспективным для дальнейшего исследования онколитической активности и разработки кандидатных противоопухолевых препаратов.
Использованные источники информации
1. World Health Statictics, 2012. 2012. Р. 176. http://www.who.int/gho/publications/world health statistics/EN WHS2012 Part2.pdf
2. Martuza R.L. et al. Experimental therapy of human glioma by means of a geneticaly engineered virus mutant // Science. 1991. Vol. 252. N. 5007. P. 854-856.
3. Zhan X. et al. Sendai virus recombinant vaccine expressing hPIV-3 HN or F elicits protective immunity and combines with a second recombinant to prevent hPIV-1, hPIV-3 and RSV infections // Vaccine. 2008. Vol. 26. N. 27-28. P. 3480-3488.
4. Elankumaran S. et al. Newcastle disease virus exerts oncolysis by both intrinsic and extrinsic caspase-dependent pathways of cell death // J. Virol. 2006. Vol. 80. N. 15. P. 7522-7534.
5. Ravindra P.V. et al. Newcastle disease virus as an oncolytic agent // Indian J Med Res. 2009. Vol. 130. N. 5. P. 507-513.
6. Cantin C, Holguera J., Ferreira L., Villar E., Muñoz-Barroso I. http://www.ncbi.nlm.nih.gOv/pubmed/17251575// J. Gen. Virol. 2007. Vol. 88. Pt. 2. P. 559-569.
7. Fabian Z., Csatary С.М., Szeberenyi J., Csatary L.K. p53-independent endoplasmic reticulum stress-mediated cytotoxicity of a Newcastle disease virus strain in tumor cell lines // J. Virol. 2007. Vol. 81. N. 6. P. 2817-2830.
8. Puhlmann J., Puehler F., Mumberg D., Boukamp P., Beier R. Racl is required for oncolytic NDV replication in human cancer cells and establishes a link between tumorigenesis and sensitivity to oncolytic virus // Oncogene. 2010. Vol. 29. N.15. P. 2205-2216.
9. Bai F.L., Yu Y.H., Tian H., Ren G.P., Wang H., Zhou В., Han X.H., Yu Q.Z., Li D.S. Genetically engineered Newcastle disease virus expressing interleukin-2 and TNF-related apoptosis-inducing ligand for cancer therapy // Cancer Biol. Ther. 2014. Vol. 15. N. 9. P. 1226-1238.
10. Zamarin D., Palese P. Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions // Future Microbiol. 2012. Vol. 7. N. 3. P. 347-367.
11. Miller P.J. et al. Newcastle disease: evolution of genotypes and the related diagnostic challenges // Infect. Genet. Evol. 2010. Vol. 10. N. 1. P. 26-35.
12. Cassel W.A., Garrett R.E. Newcastle disease virus as an antineoplastic agent // Cancer. 1965. Vol. 18. P. 863-868.
13. Laurie S.A. et al. A phase 1 clinical study of intravenous administration of PV701, anoncolytic virus, using two-step desensitization // Clin. Cancer Res. 2006. Vol. 12. N. 8. P. 2555-2562.
14. ΟΙΕ, World Organisation for Animal Health, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Paris, France, 7th edition. 2012. Vol. 1-2. Ch.2.03.14. http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.03.14_NEWCASTLE_DIS.pdf.
15. Alexander D.J. Newcastle disease virus and other avian paramyxoviruses // Rev. Sci. Tech. 2000. Vol. 19. N. 2. P. 443-462.
16. Dortmans J.C. et al. The viral replication complex is associated with the virulence of Newcastle disease virus // J. Virol. 2010. Vol. 84. N. 19. P. 10113-10120.
17. Schirrmacher V., Fournier P. Newcastle disease virus: a promising vector for viral therapy, immune therapy, and gene therapy of cancer // Gene Therapy of Cancer. 2009. Vol. 542. P. 565-605.
18. Zemp F.J. et al. Oncolytic viruses as experimental treatments for malignant gliomas: using a scourge to treat a devil // Cytokine Growth Factor Rev. 2010. Vol. 21. N. 2-3. P. 103-117.
Штамм вируса болезни Ньюкасла NDV/Altai/pigeon/770/2011
для изучения онколитических свойств и механизмов онколизиса
для создания прототипного противоопухолевого препарата
Нуклеотидная последовательность
1 accaaacaga gaatctgtga gttacgataa agggcgaaga agcaatcgaa atcgtacggg
61 tagaaggtgt gaacctcgag tgcgaggccg aagctcaaac tcgagggagc cttctgccgg
121 tatgtcatcc gtctttgacg agtacgagca actccttgct gctcaaaccc gccccaacgg
181 agcccacgga ggaggagaaa aagggagcac cttaaaagtt gaggtcccag tattcactct
241 taacagcgat gatccagaag atagatggaa ttttgcggta ttttgtcttc ggattgctgt
301 tagcgaggac gccaacaaac cactcagaca aggtgctctc atatctctct tatgctccca
361 ttctcaagtg atgagaaatc atgttgccct tgcaggaagg cagaacgagg ccacactggc
421 tgttcttgag atcgatggtt ttaccgacaa tgtgccccag ttcaacaaca ggagcggagt
481 gtctgaagag agggcacaga gattcatggt gatagcaggg tctcttcccc gggcatgcag
541 taacagtact ccattcatta cggctggagt tgaagatgat gcgccagaag atatcactga
601 cactctggaa agaatcctat ctatccaggc tcaggtatgg gtcacggtag caaaggccat
661 gactgcatat gagacagcag atgagtcaga aacaaggagg attaataaat atatgcagca
721 aggtagagtc caaaagaagt atatcctcca ccccgtatgc aggagtgcaa ttcaactcac
781 aatcagacat tccctggcag tccgcatttt cttagttagt gagcttaaga ggggccgcaa
841 tacggcaggt gggagctcta catattacaa cttagttggg gatgtggact catacataag
901 gaacaccggg ctgactgcgt tcttcctgac actcaagtat ggaatcaata ccaagacgtc
961 agcccttgca ctcagcagcc tcacaggtga tatccaaaaa atgaaacagc tcatgcgtct
1021 atatcggatg aaaggagaaa atgcaccgta catgacattg ttaggcgaca gtgaccagat
1081 gagcttcgca ccagctgaat atgcacaact ctattctttt gccatgggca tggcatcggt
1141 attagataag ggaactagta aataccaatt cgccagagac tttatgagca cgtcattttg
1201 gagactcgga gtggagtatg cccaggcgca gggaagtagc atcaatgagg atatggctgc
1261 tgaactgaag ctaactccag cagcaaggag gggcttggca gctgctgccc aacgcgtatc
1321 cgaggaaatt ggcagtgtgg acattcccac tcaacaggct ggggtcctca ctgggctcag
1381 tgacgaaggc ccccgaggct cacagggtgg attaagcaag tcgcagggac aatcggatgc
1441 cggggatgga gaggcccaat tcctggacct gatgagagca gtggcaaaca gcatgcgaga
1501 atcaccaaac tccacacaga gcaccactca ccaggagccc cccccgactc ctgggccaac
1561 ccaagacaac gacatcgact gggggtactg atcaacaaca cccagcctgc ccccgccgag
1621 ccgccccaaa ccctccgccc aaacctcccc caaactcccc aacctaccgc cccacacggc
1681 caaaccggca ggagcacccc cnnnnnnnnn nnnnnncccc cnnnnnnncg atcccgcccg
1741 tccaaggcaa cacaggcgca actcggtcca ccggcaatca gcgcagagcc caaagtatta
1801 gaaaaaaata cgggtagaag agagacacgt agaggtcagg acaattcacc ggggtctcta
1861 ctcttctctc tactcagtgg actagggtga agatggccac ctttacagat gctgagatag
1921 aggatatatt agagaccagt ggaaccgtca ttgacagcat aattacggcc cagggcaaat
1981 cagcagagaa tgtcgggagg agcataaccc cacaaggcaa gaccaaggct ccgaacacgg
2041 cacgagataa acatgggaac acccagccac cagctggcca ggacacctcc gaacaacaag
2101 acaggccaga caaacagcca tccatacctg aacaggcgac ccaatacgac aacctgccga
2161 ccgcatccaa cgaaccgctt cccactcagg ccgcaggtga ggctggcgac acacagctca
2221 agacaggagc aagcaattct cttctgtcta tgcttgacaa gctgagcagt aaatcgtcta
2281 atgctaaaaa ggggccacgg tcaaaccctc aggaaggcca tcatcaacct ctggcccaac
2341 aacacgggag tcagccaagc cgtggaaaca accaggagag accacagcac caggccaaag
2401 ccacccctgg aagccagggc acagacgcga acacagcata tcatggacaa cggaaggagt
2461 cacaaccatc agctggtgca acccctcatg tgccccagtc agggcaaagc caagacagta
2521 ctcctgcatc tgcggatcat gtccaaccac ctgtcgactt tgtgcaagcg atgatgtcta
2581 tgatggaggc attatcacag aaggtaagta aagttgacta tcagttagac ctagtcttaa
2641 agcagacatc ctccatcccc atgatgcgat ctgaaatcca acagcttaaa acatctgtag
2701 cgatcatgga agctaattta ggtatgatga agattctgga ccctggttgt gctaacgttt
2761 catctttgag tgacctacga gcagttgccc gatcccaccc agttttaatt tcgggccccg
2821 gagatccatc tccttatgtg acgcaagggg gtgaaatgat actcaataaa ctctcgcaac
2881 cggtcaagaa cccttctgag tcaatcaaat ctgctatgac gagcggatcc gatatcggag
2941 tggagaagga cacagtccgt gcattaatta cctcacgccc gatgcatcca aactcctcaa
3001 ccaagctcct gaataagctg gatgcagcca agtcgatcga agagatcaga aagatcaaac
3061 gccttgcgct gaatggctga ttaccgtcac aactcacaac aggctcctgc cccattagtg
3121 tcacaaggaa tctttcttga gccttccctc acaaacccat gcttcagcac ctcaagcaac
3181 aattccctcc cttccctccc acttccctga atgacagcac aactgcaatt aatccaacag
3241 cattagagat taagaaaaaa tacgggtaga atcaaagtac cctgactgtg ccaaaatgga
3301 ctcatccaga acaatcgggc tgtactttga ttctgccctc ccctctagca gcctgttagc
3361 attcccgatc gtcttacaag acacaggaga tgggaagaag aaaatcaccc cacaatacag
3421 aatccagcgt cttgactcat ggacagacag taaggaagac tcggtattca tcaccaccta
3481 cggatttatc ttccaaatag ggaatgaaga ggtcactgtc ggtatgatta atgacaatcc
3541 cagacatgag ttactttcct ctgcaatgct ctgcctagga agtgttccaa atgacggaga
3601 tcttgttaaa ttggcgaggg cctgcctcac tatggtaata acttgcaaga agagtgcaac
3661 taatactgag agaatagtct tctcagtaat gcaggcacct caggtgctgc aaagctgtat
3721 ggttgtggca aataagtact cgtcagtgaa tgcagtgaag catgttaaag cacccgagaa
3781 gatccctgga agcggaaccc tagagtataa agtgaacttt gtctctttga ctgtggtgcc
3841 gaggaaggat gtctacaaga tcccaactgc agcattgaaa atatctggct caagcctata
3901 taatctcgca ctcaatgtca ctattgatgt ggaggtagat ccgaagagcc cgctagtcaa
3961 atctctttct aagtctgaca gtggatacta tgctaatctt tttttgcata tcgggcttat
4021 gtccactgta gacaagaagg gaaagaaagt gacatttgac aagatagagg aaaagataag
4081 aagactcaat ctatctgtcg ggctcagtga tgtgctcgga ccttctgtgc ttgtgaaggc
4141 gagaggtgca cggactaagc tactggcacc ttttttctcc agcagcggga cggcctgcta
4201 tcctatagca aatgcctccc ctcaggttgc taagatactc tggagtcaaa ccgcgcacct
4261 gcggagtgta aaggtcatca ttcaagctgg cacccaacgt gctgttgcag tgactgccga
4321 tcatgaagtc acctctacta agatagagaa gaggcacacc attgccaaat acaatccttt
4381 caagaagtaa gctgcatccc tgaaactgcg acccacccac ctctctcaat caccgtgaca
4441 ctagatgatg atctatcttg attgcttatg gttagttcac ctgtctatct aattaagaaa
4501 aacacgggta gaagagtctg gatctcggct agcacattca aggcgcaaca tgagctccaa
4561 atcttccacc aggatcccag cacccttgat gttgatcgcc cgaatcatgc tgatactgag
4621 ctgcattcgt ctgacaagct ctcttgatgg caggcccctc gcagctgcgg ggattgtggt
4681 aacaggagat aaagcagtca acatatacac ctcatctcag acagggtcaa tcataatcaa
4741 gttgctcccg aatatgccca aggataaaga ggcgtgtgca aaagccccgt tagaagcata
4801 caacagaaca ctgactgctt tactcaaccc ccttggtgat tccatccgca agatacaagg
4861 atctgtatcc acaccaggag gaaagagaca gaagcgcttt ataggtgcca ttattggcag
4921 tatagctcta ggggttgcga catcggcaca gataacagca gctgcggccc tgatacaagc
4981 caaccagaat gccgccaaca tcctccggct taaggagagc attgctgcaa ccaatgaagc
5041 tgtgcatgag gtcaccgatg gattatcgca actagcagtg gcagttggga agatgcagca
5101 gttcgttaat gaccaattta ataatacggc acgagaattg gactgtataa aagttacaca
5161 acaagtcggt atagaactca acctatacct aactgaattg actacggtgt tcgggccaca
5221 aatcacttcc cctgccctaa ctcagctgac catccaggcg ctttataatt tagctggtgg
5281 caatatggat tacttattga ccaagttagg tatagggaac aatcagctca gctcattaat
5341 tggtagtggc ttgatcacag gccaccctat attgtatgac tcacagactc aactcctggg
5401 catacaggta aatttacctt cagtcgggaa ccttaataat atgcgtgcca cctatttggg
5461 gactttatct gtaagcacaa ccaaagggtt tgcctcagca cttgtcccga aggtagtgac
5521 acaagtcggc tccgtgatag aagaacttga cacctcacac tgtatagagt ctgatcttga
5581 tttatattgc acaagaatag tgacattccc catgtctcca ggcatttatt cctgtctgag
5641 cggcaacacg tcagcttgca tgtattcaaa gactgcaggt gcactcacca cgccatatat
5701 ggccctcaaa ggctcagtta ttgccaattg caaaataaca acatgtaggt gtgtagaccc
5761 cccgggtatc atatcacaaa actatggaga agctgtatct ctgatagata gacattcatg
5821 caatgtctta tcattagatg ggataactct gaggctcagt ggagagtttg atgtaactta
5881 ccaaaagaat atctcaatac tagattctca agtcatcgtg acaggcaacc ttgatatatc
5941 aaccgagctt ggaaatgtca acaattcaat aagcagtgcc ctggacaggt tagcggaaag
6001 caacaacaag ttagacaaag taaatgtcaa ccttaccagc acacctgctc tcattaccta
6061 tatcgttcta actgtcatat ctcttgtttt cggtgcactt agcctggttt tagcatgcta
6121 cctgatgtat aaacaaaagg cacaacaaaa gactttgata tggcttggga ataataccct
6181 tgatcagatg agagccacta caagaacatg aatgcaggcg agatgcggat gtgtctccag
6241 cggtgacctg tgtgtcaact ttgacaatct gttcaataga agacttaaga aaaaattact
6301 ggatatacgc aacccaaaag caatacacgg gtagaacggt tgaagaagct gtctttcaat
6361 caggaactag gcttcacaac atccgctcta ccacatcacc tacagcagac ctcacccatg
6421 gacagagtag ttcgcagggt tgcgctagag aatgaagaaa gggaagcaaa gaacacatgg
6481 cgtttggttt tccggattgc agttttactt ctagtagtaa tgaccttagc tatctctgcg
6541 gctgtcctgg tgcatagcat gagggccagt acgccgcgcg atattgtaag catatcgacc
6601 gtgatctcaa agacggagga gaagattact tccttactca gttcaaatca agatgtagta
6661 gataggatat ataagcaggt ggctcttgaa tctccgctgg cactgctaaa tactgaatct
6721 ataattatga atgcaataac gtctctatct catcaaatta acggggctgc gaataatagc
6781 ggttgtgggg cacctgttca tgacccagat tatatcgggg ggataggcaa agaactcata
6841 atagacgaca ccagtgatgt cacatcattc tatccatctg catatcaaga acacctgaat
6901 tttatcccgg cgcctactac aggatcaggt tgcactcgga taccctcatt tgacatgagt
6961 gctacccact actgttatac tcacaatgtg atattgtctg gttgcagaga tcactcccac
7021 tcacatcaat acttagcact cggtgtgctt cggatatctg caacaggaag ggtcttcttc
7081 tcgactctgc gttccatcaa tttggatgat acccaaaatc gaaagtcttg cagtgtgagt
7141 gcaactccta tgggttgtga tatactgtgc tccaaagtca cagagactga agaagaggac
7201 tacaagtcaa ttacccccac atcaatggtg cacggaaggt taggttttga cggtcaatat
7261 catgagaagg acttagacgt cacagtctta tttaaggatt gggtggcaaa ttacccggga
7321 gtgggaagtg gatcttttat tgatgaccgt gtatggttcc caatttacgg agggctcaaa
7381 cctaattcgc ctagcgacac cgcacaagaa gggaattatg taatatacaa gcgttataat
7441 aacacatgcc ctgatgaaca aagttatcaa atccggatgg ctaaagcttc gtacaagcct
7501 gggcggttcg gtggaaagcg cgtgcagcag gccatcttat cgatcaaagt gtcaacatct
7561 ttaggtgagg acccggtgtt gaccgttccg cctaatacaa ttacgctcat gggggccgaa
7621 ggcagaattc ttacaatagg gacatctcat ttcttgtatc aacgtggatc ttcatatttc
7681 tctcccgcct tattatatcc tatgacagtc tataataaaa cagctactct tcatagtcct
7741 tatacattta acgctttcac ccggccaggt agtgttcctt gtcaggcatc agcaagatgt
7801 cccaactcat gtatcactgg agtctatact gatccgtacc ccttaatctt ccatagaaac
7861 cacaccttga gaggggtctt cgggacaatg cttgatgata tacaagcaag actcaaccct
7921 gtgtctgcag tattcgacaa tatatcccgc agtcgtgtaa cccgagtaag ttcaagcagc
7981 accaaggcgg catacacgac atcgacatgt tttaaagttg tcaagactaa taaaacttat
8041 tgtcttagca ttgcagaaat atccaatact ctttttggag aattcaggat cgttccttta
8101 ctagttgaga ttcttaaggg tgataaggtt taagaagcca gatctgacca gctgagtcga
8161 acataggatt actcggaaaa tggtgctgtg ccacctatct ctcacaacac caaggatcaa
8221 actagatatc actgcaagcc caactctcat actaccgggc agccacaatc tgacaatgct
8281 aatgtgatca gtctgaattt ttcctatagt agattcattt agaaaaaaca tgaatggtag
8341 caagatataa ggggaaacaa cgtacaggag atagcacggg taggaaatgg cgggctccgg
8401 tcctgaaagg gcagagcatc aaattatcct accagagtca catctatcct cgccattagt
8461 caagcacaaa ttgctctatt actggaaatt aactgggcta ccgctccctg acgaatgcga
8521 ctttgatcac ctcattatca gcaggcaatg gaagaaaata cttgaatctg ccactcctga
8581 cattgagagg atgataaaac ttgggcgggc ggtgcatcag actctcaacc acaattccaa
8641 gataaccgga gtactccatc ccaggtgttt ggaagaacta tctagtattg agatctctga
8701 ttcaactaac aaattccgga agattgaaaa gaagatccag attcacaaca caaggtatgg
8761 agacctgttc gcaaagctgt gtacgcacgt tgaaaagaaa ttgctgggat catccaggtc
8821 taacaatgtc tcacgatcag aggagttcag cagcatccgt acagatccgg cattctggtt
8881 ccactcaaaa tggtccaaag ccaaatttgc atggctccat ataaaacagg cccagaggca
8941 tctgattgta gcagcaagaa caaggtccgc agtcaacaag ttagtgacat tgacccataa
9001 gacaggacaa gtctttgtta ctcctgagct tgtcattgtg acacatacag atgagaacaa
9061 gttcacatgc ctcactcaag aacttgtatt aatgtatgca gatatgatgg agggcagaga
9121 catggtcaac ataatatcat ctacggcgac acatctcaga agtctatcag agaaaattga
9181 tgatattctg cggttaatag atgctctgtc aaaggatttg ggcaatcaag tctatgacgt
9241 tgtatcattg atggagggat ttgcgtacag tgctgttcag ctgcttgaac catcaggtac
9301 atttgcagga gatttctttg cattcaactt acaagaacta aaaaacactc taactgagct
9361 cctcccaaat gatatagccg aatcagtaac tcacgcaatc gcctccatat tctctggttt
9421 agaacagaat caagcagctg agatgttgtg cttactgcgt ttgtggggtc acccattgct
9481 tgagtctcgt agtgcagcaa gggcagtcag gagccagatg tgcgcaccta aaatggtaga
9541 tttcgatatg atcctccaag tattatcttt ctttaaggga acaatcatca atggatacag
9601 gaagaagaac tcaggtgtgt ggccacgagt taaggtagat acgatatacg ggaaagtcat
9661 tgggcagcta cacgctgatt cagcggagat ttcgcatgat atcatgctga gggagtacaa
9721 gagtttatct gcccttgaat tcgagccatg tatagaatat gaccctgtca ccaatctaag
9781 tatgttctta aaggacaagg caattgcaca tccgagagat aactggcttg cttcttttag
9841 gcggaacctt ctctctgagg accagaggaa acaggtaaag gaggcaacct ctactaaccg
9901 cctcttgata gagttcttag aatcaaatga ttttgatccg tataaggaga tggaatattt
9961 gacaaccctt gagtacctaa gagacgacag cgtggcagta tcgtactcac tcaaagagaa
10021 ggaggtgaag gttaatgggc ggatttttgc taagttgaca aagaaattaa ggaactgcca
10081 ggtaatggca gaagggattc tagctgacca gattgcgcct tttttccagg ggaatggggt
10141 cattcaagat agcatatcct tgaccaagag tatgttagcg atgagtcaac tgtcttttaa
10201 cagcaacaag aaacgtatca ctgactgcaa agagagggtt tcctcaaaac gcaatcatga
10261 cttgaagagc aagaatcgtc gaagagttgc tactttcatc acaacggacc tgcaaaagta
10321 ttgtcttaac tggagatacc agacagttaa actcttcgca catgccatca atcagctgat
10381 gggcctacct cacttcttcg aatggattca tcttagactg atggatacta cgatgtttgt
10441 aggagaccct tttaatcctc caagtgaccc gactgactgc gatctatcca gagtcccaaa
10501 tgatgatata tatattgtca gtgctagagg gggcattgag ggattatgcc agaaactatg
10561 gacaatgatc tcaattgctg caattcaact cgctgcagca aggtcgcatt gtcgggttgc
10621 ctgcatggta caaggtgaca atcaagtaat agccgtaaca aaagaagtaa gatcagatga
10681 ctccccagat atggttttga cacaactgca tcaagctagt gataatttct tcaaagaact
10741 gattcacgtt aatcatctga ttggccacaa cctgaaagat cgtgaaacca tcaggtcaga
10801 cacattcttc atatacagca agcggatatt caaagacgga gcaatactca gtcaggtcct
10861 caaaaattca tcaaaattgg tgctaatatc aggcgatctt ggtgaaaata ctgtaatgtc
10921 ctgtgccaac attgcatcca ctgtagcacg gctatgcgag aacgggcttc ctaaagattt
10981 ctgttattat ttaaattacc taatgagctg tgtgcagaca tactttgatt ctgagttttc
11041 tattactcat agctcacaac cagattcaaa ccagccctgg atcgaggaca tttcttttgt
11101 acactcatat gttttgactc ctgctcagct gggaggactg agtaaccttc aatactcaag
11161 gctctacaca aggaatattg gtgacccggg gaccactgct tttgcggagg taaagcgatt
11221 agaaacagtt gggttgctga atcctagcat tatgaccaac atcttgactc ggccacctgg
11281 caatggagac tgggctagcc tatgcaacga tccttattct tttaattttg agactgtcgc
11341 aagcccaaat attgtcctta agaaacatac ccaaaaagtc ttatttgaga cttgttcaaa
11401 ccctctacta tccggagtac atacagagga caatgaggca gaggagaagg cattggctga
11461 attcctactc aatcaagaag cagttcaccc acgtgtcgca catgctatca tggaagcaag
11521 ctctgtaggt aggagaaagc aaattcaagg gcttgttgac actacaaaca ctgtgatcaa
11581 gattgcgctg accaggaggc ccctcggtat caagaggctg acacggataa tcaattactc
11641 gagcatgcat gcaatgctat tcagagatga tgttttcttg tctagtcgat ccaaccaccc
11701 attagtctct tctactatgt gttcactgac actagcagat tatgcccgga acagaagctg
11761 gtcacctttg acagggggta ggaaaatact gggtgtgtct aaccctgata ccatagaact
11821 tgtggaggga gagattctta gtgtcagtgg ggggtgcaca aaatgtgaca gcggagatga
11881 acagtttact tggtttcatc ttccaagcaa tatagagttg actgatgaca ccagcaagaa
11941 tcccccgatg agagtgccgt atctcgggtc aaaaacccaa gagaggaggg ctgcttcgct
12001 tgcaaaaata gctcatatgt cgccacatgt gaaggcagca ctaagagcat catctgtgtt
12061 gatctgggct tatggggaca acgaagtaaa ctggactgct gcacttaaga ttgcacggtc
12121 tcgatgtaat ataagctcag agtatcttcg gctattatca cccctgccca cagctgggaa
12181 tctccaacat agattggatg atggcataac ccagatgaca tttacccctg catctctcta
12241 cagagtatcc ccttatgttc acatatctaa tgattctcaa agactattta ccgaagaagg
12301 agtcaaagag gggaatgttg tttatcaaca aattatgctc ctgggcctat ctctcattga
12361 atcactcttc ccaatgacaa caaccaagac gtatgatgag atcacattac acctccacag
12421 caaatttagc tgctgcatca gggaagcgcc tgttgctgtc cctttcgagc tacttgggtt
12481 ggcaccagaa ctaaggatgg taacctcaaa taagttcatg tatgatccca gccctatatc
12541 agagagagat tttgcaagac ttgacttgac catattcaag agttatgagc tcaatttaga
12601 gtcatactct acaatggagc taatgaacat tctctcaata tctagtggga agttgattgg
12661 ccagtctgtg gtctcctatg atgaagatac ctctataaag aatgatgcca taatagtgta
12721 cgacaacaca cgaaattgga tcagtgaagc ccagaattca gatgtggtcc gcttgttcga
12781 atatgcagca ctcgaggtcc tcctcgactg ttcttatcaa ctctactatc tgagggtaag
12841 aggtctcaac aacattgtcc tatacatgag tgacttatac aagaatatgc cagggattct
12901 actctctaat attgcggcca caatatctca ccccatcatt cactcaaggt tgaatgcagt
12961 gggtctaatc aaccatgatg ggtcacacca gcttgctgac atagatttca tcgaaatgtc
13021 cgcgaagctg ttagtctctt gcactcggcg tgtagtctca ggcttatacg cggggaataa
13081 atacgatctg ttgttccctt ccgttttaga cgacaacctg agtgaaaaga tgcttcagct
13141 gatttcccgg ttatgctgtc tgtatacagt gctttttgct acgacaagag aaatcccaaa
13201 aataaggggc ctatccgcag aagaaaaatg ctcagtactc actgagtacc tactgtcaga
13261 tgctgtgaag ccattgctta ggtctgagca agtgaactct atcacgtctc ccaatataat
13321 tacgttcccg gccaatctat actacatgtc taggaagagc cttaatttaa tcagagaacg
13381 agaggacaga gatactatct tggcgttgtt attcccccag gaaccgctgc ttgagctctg
13441 tccagtacaa gacattggtg ctcgagtgag agatcctttt actcgaaaac ctgcatcatt
13501 catacaagag ttaaatctga gtgctccagc aagatacgac gcatttaccc ttaatgaggc
13561 ttgctttgag catacattgc cgaacccgga agaagattac ctagtacggt atttgtttag
13621 aggaataggg actgcttcat cttcttggta taaggtatct catcttcttt ctgtacctga
13681 ggtcagatgt gcgagacgtg ggaactcctt atacttggca gaggggagtg gagccatcat
13741 gagtcttctt gaactgcata taccacatga gaccatctat tataatacgc ttttctcgaa
13801 tgagatgaac ccaccacaac gacatttcgg acctacccca acacagtttc taaattccgt
13861 agtttatagg aatctacaag cggaagtgcc gtgtaaagac ggatttgtcc aggagttctg
13921 cccactatgg agagagaatt cagaagaaag tgacctgacc tcagataagg cagtgggata
13981 tatcacatct gtggtgccct acaggtctgt atcattacta cattgtgaca ttgaaatccc
14041 tcctgggtcc aaccaaagct tgttagatca actagctact aatttatctt tgattgccat
14101 gcattctgta agggaaggcg gagtggtaat catcaaagta ctgtatgtaa tgggatacta
14161 cttccattta ctcatgaatt tattcactcc atgttccaca aaaggataca ttctctctaa
14221 tggctatgcc tgcagagggg atatggagtg ctacttgata tttgtcatgg gctatttagg
14281 cgggcccaca tttgtgcatg aggtggtgag gatggcaaaa actctaatac aacggcatgg
14341 tacgcttctg tctaaatcag atgagattac gttaactagg ctgtttacct cacaacggca
14401 tcgtgtaata gacatcctgt ctagcccttt accgagacta atgaagttct tgagagaaaa
14461 tattgatgct gcgttgattg aagccggggg acagcctgtc cgtccattct gtgcagagag
14521 tttagtgtgc acactaacag atatgactca gatgactcag attattgcca gccacattga
14581 cacagtcatt cgatctgtga tttatatgga ggctgagggt gacctcgctg acacagtgtt
14641 cttgtttact ccttacaatc tctctgcaga cggtaaaaag aggacatcac ttaaacagtg
14701 tacgaggcag atcctagagg tcacaatact gggtctcaga gtcagagatc tcaataaagt
14761 aggtgacata ataagcttgg tactcagagg tatggtttct ctagaggacc tcatcccact
14821 aaggacatac ctgaagcgca gtacttgccc gaagtacttg aagacagtct tagggattac
14881 taaactcaaa gagatgttca cagatacctc cttgctatac ctgactcgtg ctcaacaaaa
14941 attctacatg aaaaccatag gtaatgcagc caagggatat tacagtaaca atgactccta
15001 aaggcaatca cacattaatg acctatcttc ctaatcaatt gttctctcac tgacttgatt
15061 atactgtatt agaaaaaagt taaattctga ttctttgaaa ctcgtgctcg gattcaatta
15121 attatcctga agcagaattg aacgtagtta tccttaatta tagtcctgtc attcaccaaa
15181 tctttgttt
//