СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА ФОРМИРОВАНИЯ МИОМЫ МАТКИ
METHOD FOR PREDICTING RISK OF HYSTEROMYOMA

Изобретение относится к области медицинской диагностики, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования риска формирования изолированной миомы матки.
Проблема миомы матки у женщин всех возрастных периодов является одной из актуальных в современной гинекологии. Обусловлено это тем, что миома матки - наиболее распространенная доброкачественная опухоль женских половых органов не только в перименопаузальном периоде, когда она встречается более чем у 50% женщин, но и в репродуктивном возрасте. Чаще всего миома матки выявляется у женщин в возрасте 35 лет, на возраст 35-55 лет приходится до 90% общего числа заболеваний, и редко миома матки встречается у женщин моложе 20 и старше 70 лет. Миома матки является причиной нарушений менструального цикла, анемии, хронических тазовых болей. От 60 до 95% всех оперативных вмешательств у женщин репродуктивного периода с миомой матки приходится на радикальные операции, приводящие к потере репродуктивной и менструальной функции и к выраженным вегетососудистым и психоэмоциональным нарушениям. Раннее выявление миомы матки позволит более эффективно провести консервативное лечение и тем самым снизить риск оперативного вмешательства [Сидорова И.С. Миома матки (современные проблемы этиологии, патогенеза, диагностики и лечения). - М., 2003].
Особая роль в механизмах опухолевого роста отводится процессам апоптоза. Рост опухоли складывается из динамического баланса между пролиферацией и гибелью клеток. Таким образом, рост может быть связан как с избыточной пролиферацией, так и с низким индексом гибели клеток. Сравнительно недавно были получены данные о том, что клетка способна получать сигналы как к делению, так и к смерти, запуская каскад сложных процессов, приводящий к фрагментации клетки с образованием окруженных мембраной так называемых апоптозных телец. Этот процесс называется апоптозом, т.е. запрограммированной гибелью клеток. Важное значение в механизмах апоптоза отводится интерлейкинам. В настоящее время идентифицировано более двух десятков интерлейкинов (интерлейкин-1, интерлейкин-2 и т.д.). Они регулируют межклеточные и межсистемные взаимодействия, определяют выживаемость клеток, стимуляцию или подавление их роста, дифференциацию, функциональную активность и апоптоз, а также обеспечивают согласованность действия иммунной, эндокринной и нервной системы на клеточном уровне в нормальных условиях и в ответ на патологические воздействия [Голубева О.В. Генетические факторы предрасположенности к аденомиозу / О.В. Голубева, Т.Э. Иващенко, В.С. Баранов, Э.К. Айламазян // Журнал акушерство и женские болезни. 2007. - Т. 1. - №2. - С. 25-38].
В патенте РФ №2355319, опубл. 20.08.2012 по заявке на №2007137713/14 от 11.10.2007 (Кулагина Н.В., Козлов В.В.) предложен способ прогнозирования течения миомы матки с развитием клинической симптоматики, включающий определение возраста менархе, наличия медицинских абортов до первых родов, наличия воспалительных осложнений медицинских абортов, наличия артериальной гипертензии во время предшествующих беременностей, наличия аномалий родовой деятельности, индекса массы тела, наличия гипертонической болезни и наличия хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта и расчет показателей прогноза клинического течения миомы матки. На основании его значения прогнозируют течение миомы матки с развитием клинической симптоматики. Способ не дает возможности спрогнозировать формирование изолированной миомы матки.
За прототип выбран патент РФ №2340897, опубл. 10.12.2008 по заявке №2007126877/15 от 16.07.2007 «Способ прогнозирования быстрого роста лейомиомы матки» (Сотникова Н.Ю. (RU), Соснина А.Е. (RU), Бойко О.М. (RU)), где предложен способ прогнозирования быстрого роста лейомиомы матки, включающий забор и исследование периферической венозной крови, определение в периферической крови женщин с лейомиомой матки относительного количества IL-8+ моноцитов и в случае, если значения этого показателя равны или превышают 63%, прогноз быстрого роста лейомиомы в течение года.
Недостаток прототипа заключается в том, что предложенный метод позволяет спрогнозировать рост лейомиомы матки, но не дает возможности спрогнозировать формирование изолированной миомы матки.
Задачей настоящего изобретения является создание способа прогнозирования формирования изолированной формы миомы матки по данным сочетаниям генетических полиморфизмов: -889 ТТ IL-1 совместно с -703 С IL-5.
Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска формирования изолированной миомы матки у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования формирования изолированной миомы матки, включающий:
- забор и исследование периферической венозной крови;
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- типирование генетических полиморфизмов генов интерлейкинов (-889 С/Т IL-1 и -703 С/Т IL-5);
- анализ сочетаний полиморфизмов гена интерлейкина-1 (-889 ТТ IL-1) и интерлейкина-5 (-703 С IL-5);
- прогнозирование высокого риска развития изолированной миомы матки у больных в случае выявления сочетания аллеля -889 ТТ IL-1 и аллеля -703 С IL-5.
Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники неизвестна возможность прогноза развития изолированной миомы матки по наличию сочетаний аллеля -889 ТТ гена интерлейкина-1 и аллеля -703 С интерлейкина-5 у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России.
Изобретение характеризуют следующие графические изображения.
Фиг. 1. Электрофоретическое разделение продуктов рестрикции гена -703 С/Т IL-5., где 1, 3-8, 12, 15 - гомозиготы -703 СС; 10, 11, 13, 14 - гетерозиготы -703 СТ; 2, 9 - гомозиготы -703 ТТ.
Фиг. 2. Электрофоретическое разделение продуктов рестрикции гена -889 С/Т IL 1A., где 2, 3, 4 - гомозиготы -889 ТТ; 5, 6, 10 - гомозигота -889 СС, 1, 7-9, 11-14 - гетерозиготы -889 СТ.
Способ осуществляют следующим образом.
2
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных с пролиферативными заболеваниями матки (миома матки с эндометриозом, гиперпластическими процессами эндометрия) методом фенольно-хлороформной экстракции в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl, 10 мМ трис-HCl (pH 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°C, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (pH 8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы K (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°C в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -200°C.
Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1).
Молекулярно-генетический анализ проводят методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК. ПЦР осуществляют на амплификаторе ТП4-ПЦР-01-«ТЕРЦИК». Анализ полиморфизма генов -889 С/Т IL-1A, -703 С/Т IL-5 осуществляют методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров по методике, указанной в источнике [Hulkkonen, J. Inflammotory cytokines and cytokine gene polymorphisms in chronic lymphocytic leukaemia, in primary Sjögren′s Syndrome and Haelthy Subjects: [acad. diss.] / J. Hulkkonen; University of Tampere, Medical School Tampere University Hospital. - Tampere, 2002. - 81 p.].
2
Реакцию проводят в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-НСl (pH 8,8), 1,25 мМ MgCl, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации выполняют 32 цикла амплификации по схеме: денатурация, отжиг праймеров и элонгация. Затем пробы выдерживают 5 мин при 72°C и охлаждают. Продукты амплификации анализируют в 2%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, в течение 30 минут при 160 V. В качестве электрофорезного буфера используют 1×TAE (трис-ацетатный буфер). Затем пробы идентифицируют в проходящем УФ-свете.
Генотипирование ДНК-маркеров (локусы -889 С/Т IL-1А, -703 С/Т IL-5) производят методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) продуктов ПЦР-амплификации специфических участков генома с использованием соответствующих ферментов рестрикции производства фирмы «Сибэнзим» (Новосибирск).
После инкубации рестрикционной смеси в течение 16 часов при температуре 37°C проводят разделение фрагментов ДНК с помощью горизонтального электрофореза на электрофоретических ячейках производства фирмы «Хеликон» (Россия). В зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК используют агарозный гель 2-3% концентрации, приготовленный на основе ТВЕ-буфера, окрашенный раствором бромистого этидия (0,01%). Результаты визуализации фореграмм, осуществленных в темном боксе с трансиллюминатором фирмы UVP (Швеция), представлены на Фиг. 1 и Фиг. 2.
Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0» [Боровиков, В. Statistica: искусство анализа данных на компьютере / В. Боровиков. - 2-е изд. - СПб.: Питер, 2003. - 688 с.: ил. - (Для профессионалов)].
Изучение роли комбинаций генетических вариантов полиморфных маркеров генов интерлейкинов в формировании изолированной миомы матки проведено с помощью программного обеспечения APSampler [http:sources.redhat.com/cygwin/], использующего метод Монте-Карло марковских цепей и байесовсовскую непараметрическую статистику.
Оценку уровня статистической значимости полученных результатов проводили с использованием поправки Бонферрони (pcor), т.е. поправки, минимизирующей вероятность получения ложноположительных результатов [Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета программ Statistica / О.Ю. Реброва // М.: МедиаСфера. - 2006 г. - 312 с.].
Возможность использования предложенного способа для оценки повышенного риска развития изолированной миомы матки подтверждает анализ результатов наблюдений 713 больных с пролиферативными процессами репродуктивной системы, а также 500 человек популяционного контроля. Среди 713 обследуемых женщин изолированная миома матки выявлена у 117 пациенток. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических, лабораторно-инструментальных методов обследования и подтвержденного результата гистологического исследования.
В исследуемую группу включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой.
Установлено, что комбинация из двух генетических вариантов -889 TT IL-1А и -703 С IL-5 в группе пациенток с изолированной миомой матки встречается (14,47%) существенно чаще (в 6,8 раза), чем в контрольной группе (2,12%, p=0,0001, pcor=0,02). Эти данные свидетельствуют о значимом вкладе сочетаний полиморфных вариантов генов -889 С/Т IL-1A и -703 С/Т IL-5 в формирование изолированной формы миомы матки (OR=7,78, 95% CI 2,61-23,21).
Конкретный пример использования предложенного способа
Пациентке X русской национальности, уроженке Центрального Черноземья России, были проведены забор и исследование периферической венозной крови, выделение ДНК из периферической венозной крови; типирование генетических полиморфизмов генов интерлейкинов -889 С/Т IL-1 и -703 С/Т IL-5 и - анализ сочетаний полиморфизмов -889 ТТ IL-1 и -703 С IL-5. Результаты представлены на фиг. 1 и фиг. 2.
Выявлено, что в связи с наличием сочетания молекулярно-генетических маркеров аллеля -889 ТТ IL-1A и аллеля -703 С IL-5 женщину можно отнести в группу риска формирования изолированной миомы матки и подобрать индивидуальную тактику ведения для проведения консервативного лечения и снижения риска оперативного вмешательства.
Таким образом, предложенный способ решает поставленную задачу и обеспечивает достижение технического результата - получение критериев оценки риска формирования изолированной миомы матки по сочетанию молекулярно-генетических маркеров -889 ТТ IL-1A и -703 С IL-5 (OR=7,78).
Применение данного способа позволит идентифицировать группу риска по развитию изолированной миомы матки у пациенток русской национальности, уроженок Центрального Черноземья России, и подобрать индивидуальную тактику ведения, предпринять лечебные мероприятия для проведения консервативного лечения и снизить риск оперативного вмешательства.