Способ прогнозирования риска развития инсульта у мужчин на основе генетического тестирования
METHOD FOR PREDICTING THE RISK OF STROKE IN MEN BASED ON GENETIC TESTING

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития ишемического инсульта у мужчин.
Ишемический инсульт является наиболее распространенным цереброваскулярным заболеванием и занимает первые позиции по инвалидизации и смертности в России и в мире [Global and regional effects of potentially modifiable risk factors associated with acute stroke in 32 countries (INTERSTROKE): a case-control study [Tехt] / M.J. O'Donnell, S.L. Chin, S. Rangarajan [et аl.] // Lancet. – 2016. – Vol. 20, №388. – Р. 761-775]. Церебральная ишемия в результате окклюзии кровеносного сосуда инициирует ряд патологических событий, включая нарушение гематоэнцефалического барьера, вазогенный отек, вторичную геморрагическую трансформацию и гибель нейронов. Основными механизмами ишемического инсульта являются тромбоз, эмболизация и лакунарный инфаркт, приводящие к дефициту кислорода и дисфункции АТФазы. Предикторы возникновения инсульта – гипертония, сахарный диабет, ожирение, дислипидемия, чрезмерное употребление алкоголя, курение, низкий уровень физической активности, а также генетические факторы [Хронические сосудистые заболевания головного мозга [текст] / А.С. Кадыков, Л.С. Манвелов, Н.В. Шахпаронова // М.: ГЭОТАР-Медиа. – 2013. – 232 с.]. Многие крупномасштабные исследования последних лет посвящены установлению взаимосвязи между риском развития инсульта и функциональными вариантами различных генов, среди которых гены системы гемостаза, системы окиси азота, программированной клеточной гибели, а также гены матриксных металлопротеиназ (MMP) [Генетический взгляд на феномен сочетанной патологии у человека [Текст] / В. П. Пузырев // Медицинская генетика. – 2008. – Т. 7. – № 9. – С. 3-9; 20th Workshop of the International Stroke Genetics Consortium: ISGC research priorities [Tехt] / D. Woo, S. Debette, C. Anderson // Neurol Genet. – 2017. – Vol. 30, №3. – Р. 12-18]. Матриксные металлопротеиназы – это семейство цинк-зависимых эндопептидаз, играющих значительную роль в нормальных и патологических состояниях организма благодаря способности гидролизовать все компоненты внеклеточного матрикса [Матриксные металлопротеиназы и сердечно-сосудистые заболевания [Текст] / А.А. Турна, Р.Т. Тогузов // Артериальная гипертензия. – 2009. – №5. – С. 532-538; Diverse roles of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in neuroinflammation and cerebral ischemia [Tехt] / E. Candelario-Jalil, Y. Yang, G. A. Rosenberg // Neuroscience – 2012. – №158 (3). – Р. 983-994].
Матриксная металлопротеиназа 1 (ММP-1) является ключевым ферментом, способным гидролизовать волокна интерстициального фибриллярного коллагена. Цитогенетические координаты гена, кодирующего ММР-1 – 11q22.2. Установлены ассоциации полиморфизма rs1799750 гена ММP-1, представляющего собой включение в кодирующую последовательность дополнительного гуанина в позиции -1607,  с сердечно-сосудистой патологией в китайской популяции [Genetic роlуmоrрhism оf mаtrix metаllорrоteinаse-1 аnd cоrоnаrу аrterу diseаse susceрtibilitу: а cаse-cоntrоl studу in а Hаn Chinese рорulаtiоn [Text] / C. Qintао, L. Уаn, D. Chаnghоng [et аl.] // Genet. Test. Mоl. Biоmаrkers. – 2014. – Vоl. 18, № 12. – Р. 826-831; Аssоciаtiоn оf Mаtrix Metаllорrоteinаse-1 аnd Mаtrix Metаllорrоteinаse-3 Gene Vаriаnts with Ischemic Strоke аnd Its Subtурe [Text] / X.У. Huаng, L.У. Hаn, X.D. Huаng [et аl.] // J. Strоke Cerebrоvаsc. Dis. – 2017. – Vоl. 26, № 2. – Р. 368-375].
Матриксная металлопротеиназа-8 (ММР-8) – представитель семейства коллагеназ, синтез которой, в основном, осуществляется полиморфноядерными лейкоцитами. Цитогенетические координаты кодирующего ММР-8 гена – 11q22.2–q22.3. Установлено, что полиморфизм - rs11225395 ММР-8 ассоциирован с такими сердечно-сосудистыми заболеваниями, как атеросклеротическое поражение сосудов и сердечная недостаточность в бразильской и иранской популяциях [Polymorphisms of matrix metalloproteinases in systolic heart failure: role on disease susceptibility, phenotypic characteristics, and prognosis [Tехt] / F.M. Velho, C.R. Cohen, K.G. Santose [еt аl.] // J. Card. Fail. – 2011. – №17 (2). – Р. 115-121; Evaluation of plasma MMP-8, MMP-9 and TIMP-1 identifies candidate cardiometabolic risk marker in metabolic syndrome: results from double-blinded nested case-control study [Tехt] / S.M. Hoseini, A. Kalantari, M. Afarideh [еt аl.] // Metabolism – 2015. – 64(4). – Р. 527-538].
Исследования вовлеченности генов матриксных металлопротеиназ в формирование предрасположенности к инсульту в России единичны и фрагментарны, а данных о роли генетических вариантов rs1799750 MMР-1 и rs11225395 MMР-8 в развитии ишемического инсульта у мужчин нет совсем. В России заболеваемость инсультом – одна из самых высоких в мире, при этом инвалидизация среди больных, перенесших инсульт, превышает 80%. Это определяет необходимость выделения критериев индивидуального прогнозирования риска развития ишемического инсульта на основании изучения полиморфных вариантов генов-кандидатов.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития ишемического инсульта у мужчин на основе комбинаций генетических полиморфизмов rs1799750 MMР-1 и rs11225395 MMР-8.
Из области техники известен «Способ прогнозирования развития острого ишемического инсульта» по патенту РФ №2012134988 от 20.02.2014. Способ включает учет показателей ферментов антиокислительной защиты в периферической крови, при этом в качестве ферментов антиокислительной защиты определяют каталазу, пероксидазу и показатель перекисного окисления липидов. При увеличении показателей пероксидазы и перекисной резистентности эритроцитов и снижении показателя каталазы более чем на 70% от референтных значений судят о высоком риске развития ишемического инсульта. Однако данный способ не является достаточно информативным, так как не включает генетические маркеры и применим только на клиническом этапе, что исключает раннюю диагностику и проведение профилактических мероприятий по предотвращению развития инсульта.
В качестве прототипа выбран патент РФ № 2422523 от 22.04.2010 «Аллель SNP41 гена PDE4D, его применение для прогнозирования индивидуальной предрасположенности к инсульту в русской популяции, применение молекулярно-генетического маркера индивидуальной предрасположенности к инсульту и способ прогнозирования индивидуальной предрасположенности к инсульту». Данный способ разработан для выявления риска развития инсульта по результатам генетического тестирования по локусу гена PDE4D. Способ, согласно изобретению,  включает молекулярно-генетический анализ ДНК, полученной из венозной крови методом полимеразной цепной реакции в реальном времени,  и позволяет диагностировать предрасположенность к инсульту в русской популяции при выявлении аллеля A SNP41 гена PDE4D. Недостатком указанного способа является использование в качестве маркера только одного генетического полиморфизма, что снижает статистическую мощность проведенного исследования.
Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования развития ишемического инсульта у мужчин на основе комбинаций генов матриксных металлопротеиназ.
Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития ишемического инсульта у мужчин русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья на основе данных о сочетаниях генетических вариантов локусов rs1799750 MMР-1 и rs11225395 MMР-8, включающий:
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- молекулярно-генетический анализ ДНК методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, в который внесены новые признаки;
- проводят анализ  полимофизмов генов  rs1799750 MMР-1 и rs11225395 MMР-8;
- прогнозируют  высокий риск развития ишемического инсульта у мужчин русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья при выявлении сочетания генотипа 1G/1G по локусу rs1799750 MMР-1 с генотипом ТТ по локусу rs11225395 MMР-8.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития ишемического инсульта у мужчин по наличию сочетания генетических вариантов полиморфных маркеров матриксных металлопротеиназ rs1799750 MMР-1 и rs11225395 MMР-8.
Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl2, 10мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -200С. Выделенную ДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Анализ полиморфизма rs1799750 гена ММP-1 проводят методом ПЦР синтеза ДНК на амплификаторе СFX96 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (pH=8,8), 2,5мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95°С) выполняют 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров – 1 мин при t=54°С; денатурация – 15 сек при t=95°С. При проведении ПЦР в амплификаторе (CFX96) с флюоресцентной детекцией генотипирование осуществляют методом Tag Man зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции). Для rs1799750 ММP-1 зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю 2G, зонд с красителем FAM – аллелю 1G (фиг.1).
Для исследования полиморфизма гена rs11225395 ММР-8 проводят методом ПЦР синтеза ДНК на амплификаторе СFX96 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (pH=8,8), 2,5мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95°С) выполняют 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров – 1 мин при t=54°С; денатурация – 15 сек при t=95°С. При проведении ПЦР в амплификаторе (CFX96) с флюоресцентной детекцией генотипирование осуществляют методом Tag Man зондов по данным величин ОЕФ. Для rs11225395 ММР-8 зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю Т, зонд с красителем FAM – аллелю С (фиг. 2).
Выделенную ДНК подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров [Еlеvаtеd MMР-8 аnd dесrеаsеd myеlореrохidаsе соnсеntrаtiоns аssосiаtе signifiсаntly with thе risk fоr аthеrоsсlеrоsis disеаsе аnd аbdоminаl аоrtiс аnеurysm [Tехt] / Р. Рrаdhаn-Раlikhе, Р. Vikаtmаа, T. Lаjunеn [еt аl.] // Sсаnd. J. Immunоl. – 2010. – Vоl. 72, № 2. – Р. 150-157].
Изобретение характеризуется фигурами.
Фиг. 1. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма rs1799750 ММP-1, где   - 1G,   - 2G,   - 1G/2G,  - отрицательный контроль.
Фиг. 2. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма rs11225395 ММР-8, где   - СС,   - TT,   - СT  - отрицательный контроль).
Фиг. 3. Диаграмма взаимодействий локусов матриксных металлопротеиназ в двухлокусной модели при формировании инсульта, полученная методом GMDR с коррекцией на коварианты, где столбики слева соответствуют группе больных, столбики справа соответствуют контрольной группе.
Генотипирование полиморфизмов rs1799750 MMР-1 и rs11225395 MMР-8 осуществляют методом детекции TagMan зондов по данным величин относительных единиц флуоресценции (ОЕФ) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени.
Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов ММР с ишемическим инсультом проводят с помощью методов MDR (Multifactor Dimensionality Reduction) и его модификации GMDR (Generalized Multifactor Dimensionality Reduction) с использованием соответствующего программного обеспечения (MDR версии 3.0.2, http://www.epistasis.org/ mdr.html, и GMDR версии 0.9, http://www.ssg.uab.edu/gmdr/) (фиг. 3). В основе использованных методов лежит общий принцип выявления переменной, содержащей информацию о нескольких локусах, и формирование кластеров, содержащих комбинации генотипов высокого и низкого риска развития изучаемой патологии.
Возможность использования предложенного способа для оценки риска возникновения и развития ишемического инсульта подтверждает анализ результатов наблюдений 201 пациента с инсультом и 322 индивидуумов контрольной группы. Общий объем исследуемой выборки составил 523 человека. Средний возраст пациентов с инсультом составил 58,11±7,09 лет, а средний возраст представителей контрольной группы – 57,18±7,62 лет. В исследуемые выборки включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой. Группа больных с инсультом и контрольная группа полностью сопоставимы по возрасту, месту рождения и национальности.
Все клинические и клинико-лабораторные исследования проводили на базе неврологического и кардиологического отделений Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа, с информированного согласия пациентов на использование материалов лечебно-диагностических мероприятий, проводимых за период госпитализации и после нее для научно-исследовательских целей. В работе использовалась анкета-опросник, включающая антропометрические, социально-демографические показатели, а также сведения о наличии у респондентов средовых факторов риска инсульта, таких как курение, злоупотребление алкоголем, особенности питания, стрессовые ситуации [Полоников, А.В. и др., 2013]. Полученные материалы протоколировали по стандартам этического комитета Российской Федерации.
Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов с ишемическим инсультом проводили с помощью методов MDR (Multifactor Dimensionality Reduction) и его модификации GMDR (Generalized Multifactor Dimensionality Reduction) с использованием соответствующего программного обеспечения (MDR версии 3.0.2, http://www.epistasis.org/ mdr.html, и GMDR версии 0.9, http://www.ssg.uab.edu/gmdr/), с коррекцией на индекс массы тела, уровни холестерина, триглицеридов, липопротеидов низкой плотности, липопротеидов высокой плотности, курение, злоупотребление алкоголем, частые стрессовые ситуации. Для валидации полученных результатов проводили пермутационный тест – выполнено 1000 пермутаций при 10 кросс-валидациях, что обеспечивает рperm<0,001
Выявлены особенности «генетической конституции» мужчин с ишемическим инсультом на основе комбинаций генов матриксных металлопротеиназ. Установлена генетическая модель, ассоциированная с высоким риском развития ишемического инсульта у мужчин: сочетание генотипа 1G/1G rs1799750 MMР-1 с генотипом ТТ rs11225395 MMР-8 наблюдается у 9,84% пациентов с инсультом и у 4,04% индивидуумов контрольной группы (Х2=4,52, р=0,03).
Установлено, что наличие данного сочетания является фактором риска развития ишемического инсульта у мужчин (ОR=2,34, 95% СI 1,66-5,19) независимо от влияния средовых факторов.
В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено обследование добровольцев русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья и не являющихся родственниками между собой: проведено генетическое обследование по локусам rs1799750 MMР-1 и rs11225395 MMР-8.
У пациента Н. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров было выявлено, что генотип мужчины по локусу rs1799750 MMР-1 – 1G/1G, генотип по локусу rs11225395 MMР-8 – ТТ. Сочетание генотипа  1G/1G (rs1799750 MMР-1) и генотипа ТТ (rs11225395 MMР-8) позволило отнести пациента в группу больных с высоким риском развития ишемического инсульта. Дальнейшее наблюдение, результаты компьютерной томографии (КТ) и ультразвукового дуплексного сканирования (УЗДС) выявили у пациента нарушение мозгового кровообращения, что подтвердило высокий риск развития инсульта по ишемическому типу.
У пациента О. произведен забор венозной крови, при генотипировании ДНК-маркеров выявлено, что генотип мужчины по локусу rs1799750 MMР-1 – 2G/2G, генотип по локусу rs11225395 MMР-8 – СС. По данным генотипирования пациент О. не включается в группу больных с высоким риском развития инсульта, что подтвердилось при дальнейшем наблюдении и исследовании состояния мозгового кровообращения.
У пациента Б. после забора венозной крови из локтевой вены и последующего генотипирования выявлен генотип 1G/2G по локусу rs1799750 MMР-1, генотип по локусу rs11225395 MMР-8 – СТ. По данным генотипирования пациент Б. не включается в группу больных с высоким риском развития ишемического инсульта. При дальнейшем наблюдении у пациента Б. не было зафиксировано нарушений мозгового кровообращения.
Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди мужчин группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития ишемического инсульта.