The Effect of Herbicides on Hydrogen Peroxide Generation in Isolated Vacuoles of Red Beet Root (Beta vulgaris L.)

Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 11 No. 4 2015, pp. 100-112 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2015 by Pradedova, Nimaeva, Karpova and Salyaev

ORIGINAL ARTICLE

The Effect of Herbicides on Hydrogen Peroxide Generation in Isolated Vacuoles of Red Beet Root

E.V. Pradedova, O.D. Nimaeva, A.B. Karpova, R.K. Salyaev

Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, SB RAS, Irkutsk, Russia *E-Mail: nraded@sifibr.irk.ru

Received November 25, 2015

Influence of herbicides on the hydrogen peroxide generation in vacuolar extracts of red beet root (Beta vulgaris L.) was investigated. Belonging to different chemical classes of herbicide compounds have been used. Herbicides differ from each other in the mechanism of effects on plants. Clopyralid (aromatic acid herbicide, derivative of picolinic acid) and 2.4-D (phenoxyacetic herbicide), characterized by hormone-like effects, contributed to the formation of H2O2 in vacuolar extracts. Fluorodifen (nitrophenyl ether herbicide) and diuron (urea herbicide) also have increased contents H2O2. These compounds inhibit the electron transport, photosynthesis, and photorespiration in sensitive plants. Herbicidal effect of glyphosate (organophosphorus herbicide) is due to the inhibition of amino acid synthesis in plant cells. Glyphosate did not affect the content of H2O2 in vacuolar extracts. Herbicide dependent H2O2-generation did not occur with oxidoreductase inhibitors, potassium cyanide and sodium azide. The results suggest that the formation of ROS in the vacuoles due to activity of oxidoreductases, which could interact with herbicides.

Key words: Beta vulgaris L., vacuole, clopyralid, diuron, 2.4-D, fluorodifen, glyphosate,

hydrogen peroxide, peroxidase

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

101

The Effect of Herbicides on Hydrogen Peroxide Generation...

Интенсивное образование активных форм восстанавливает H2O2 до H2O, но и генерирует 02^-

кислорода (АФК), называемое окислительным (Lamb and Dixon,1997; Bolwell et al., 1999).

взрывом, у растений происходит при действии Дисмутацию 202^, в результате которой

многих факторов окружающей среды. В образуется H2O2 значительно ускоряет SOD

растительных клетках АФК образуются в (Baranenko, 2006). Таким образом, оба фермента,

клеточных структурах, т.е. локально. В нормальных относимые к антиоксидантам, в действительности

условиях этот процесс является регулируемым, он могут быть активными генераторами АФК.

протекает, как правило, при одновременной В вакуолярном компартменте, также как и в

активации систем, синтезирующих АФК, и любом другом компартменте клетки, где существует

антиоксидантных систем (Lamb, Dixon, 1997). тандем POX и SOD, образуется H2O2. Однако до

Благодаря тесной взаимосвязи между АФК- сих пор не установлено, какие условия или

генерирующими и -утилизирующими процессами, факторы среды являются триггером для АФК-

осуществляется контроль над интенсивностью генерации в вакуолях. Имеются единичные работы,

окислительных реакций в клеточных в которых показано образование АФК в

компартментах. вакуолярном содержимом. Например, у растений

Локальные АФК-генерирующие редокс- гороха (Pisum sativum L.), обработанных кадмием,

системы растительных клеток достаточно активно отмечали многократное повышение H2O2 и 02^

исследуются у таких клеточных структур, как возле вакуолярной мембраны в клетках обкладки

хлоропласты, митохондрии, пероксисомы, сосудистых пучков. Если H202 накапливалась

клеточные стенки и ядра (Poleskaja, 2007). В то же главным образом с цитоплазматической стороны

время у центральной вакуоли эти системы тонопласта, то 02^- был сосредоточен в

остаются малоизученными, хотя этот компартмент вакуолярном содержимом (Romero-Puertas et al.,

растительной клетки содержит редокс-ферменты и 2004). Следовательно условием для АФК-

редокс-активные низкомолекулярные соединения, генерации в вакуолях мог служить токсический

которые могут быть потенциальными источниками эффект тяжелых металлов. Возможно, токсическое

АФК (Ferreres et at, 2011). На сегодня в действие гербицидов тоже будет одним из таких

вакуолярном содержимом растений выявлены условий. Следует отметить, что гербициды

такие редокс-ферменты, как: фенольная определенных классов являются субстратами для

пероксидаза (POX, EC 1.11.1.7) и Cu,Zn- оксидаз (фенолоксидаз, POX и др.). Например,

супероксиддисмутаза (Cu,Zn-SOD, EC 1.15.1.1) POX кукурузы инактивировала некоторые

(Deepesh, 2000; Baranenko, 2006). Известно, что триазины, которые при окислении или

POX, в зависимости от условий, определяющих гидроксилировании теряли гербицидную

редкс-состояние кофермента (гемина), не только активность (Gruzdev, 1987). А POX из хрена

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

Pradedova et al.

102

взаимодействовала с гербицидом 2.4-Д (Rogozhin, свойств гербицидов разных классов, многие

2004). Лакказы грибов и бактерий участвовали в аспекты их токсикологического действия до сих

биохимической трансформации гербицида пор остаются неизученными. Возможно,

диурона (Vieira et al., 2015). Известно, что после чрезмерное образование АФК в субклеточных

окислительного преобразования оксидазами структурах, вызываемое определенными

некоторые соединения, вступая в реакцию с гербицидами, является одним из факторов,

молекулярным кислородом, способствуют ослабляющим защитные системы клеток у

образованию АФК, т.е. играют роль вторичных чувствительных растений. В связи с этим

генераторов. Например, гербициды дипиридилы, в выявление эффекта гербицидов на генерацию

результате вторичного окисления кислородом, H2O2 в вакуолях клеток растений явилось основной

служили источником гидроперекисных радикалов задачей настоящего исследования.

(Gruzdev, 1987). Очевидно, что сами гербициды MATERIALS AND METHODS

или продукты их химического преобразования Объектом исследования служили вакуоли,

могут быть первичными или вторичными изолированные из клеток корнеплодов столовой

генераторами АФК. Ранее установили, что свеклы (Beta vulgaris L.) сорта Бордо.

некоторые из них действительно вызывали у Использовали модифицированный

растений окислительный взрыв (Romero-Puertas et макрообъемный метод выделения вакуолей

al., 2004). Например, интенсивная генерация АФК (Salyaev et al., 1981).

в хлоропластах происходила при обработке Изолированные вакуоли разрушали и

растений гербицидом паракватом (N^-диметил- получали вакуолярные экстракты. Для этого

4,4-дипиридилия дихлорид) (Fuerst et al., 1985). органеллы подвергали осмотическому шоку в

Источником АФК служил радикал гербицида, гипотоническом растворе (50 мМ трис/HCl, рН 6.5).

который являлся продуктом реакции Полученный лизат центрифугировали при 13500 g

восстановления параквата дегидрогеназами 10 мин.

(Gruzdev, 1987). Активное образование H2O2 и О^- В вакуолярных экстрактах определяли

наблюдали у растений гороха, после обработки Н2О2 при помощи FOX-метода, основанного на

гербицидом 2.4-Д (Romero-Puertas et al., 2004). изменении окраски ксиленолового оранжевого (o-

Эти исследования и ряд других позволили прийти к cresolsulfonephthalein-3'-3'-bis-[methyliminodiacetic

заключению, что в основе механизма, с помощью acid sodium salt]) (Galletti et al., 2008). Общие

которого упомянутые гербициды проявляют свою детали эксперимента состояли в следующем.

активность, лежит АФК-генерация, приводящая к Аликвоту вакуолярного экстракта инкубировали в

развитию окислительного стресса. Несмотря на среде инкубации (25 мМ трис-пропан/HCl, рН 5.5

активное исследование физиолого-биохимических или pH 8.0) в течение 15 мин. В среду инкубации с

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

103

The Effect of Herbicides on Hydrogen Peroxide Generation...

вакуолярным экстрактом вносили испытуемые соединения. В том случае, когда выявляли АФК-генерирующую активность вакуолей, использовали среды инкубации с pH 8.0 (Bolwell et al., 2001). В каждый опытный вариант добавляли одно или несколько ниже указанных соединений (их сочетание в пробе можно увидеть в описании результатов). Конечная концентрация в среде инкубации каждого исследуемого соединения составила: 10 мкМ NADH; 5 у.е. SOD быка; 1 мкг/мл каталазы из бычьей сыворотки; 50 мкМ салициловой кислоты. Если исследовали влияние гербицидов на АФК-генерацию, то использовали среды с pH 5.5, т.к. слабо кислые условия близки к физиологическим условиям вакуолярной среды. В среды инкубации каждого опытного варианта добавляли одно из перечисленных соединений в конечной концентрации: 10 мкМ 2.4-Д (2.4-

дихлорфеноксиуксусной); 10 мкМ глифосата (N-(фосфонометил)-глицин); 10 мкМ диурона (3-[3,4-дихлорофенил]-1,1-диметилмочевина); 10 мкМ фтородифена (4-нитрофенил-2'-нитро-а,а,а-

трифтор-п-толиловый эфир); 10 мкМ клопиралида (3,6-дихлорпиридин-2-карбоновая кислота). В том случае, когда определяли эффект ингибиторов оксидоредуктаз, готовили отдельные варианты с выше перечисленными гербицидами, в которые вносили KCN (10 мкМ) и NaN3 (50 мкМ). Известно, что цианид, азид и глифосат взаимодействуют с ионами железа. Для вариантов с этими соединениями, а также для вариантов с другими испытуемыми соединениями, готовили

контрольный вариант, который отличался тем, что

не содержал вакуолярный экстракт. Это давало возможность учитывать влияние соединений на реагент ксиленолового оранжевого.

После 15-мин инкубации при 25°С в реакционную среду вносили охлажденный ацетон (1 : 2, среда : ацетон), выдерживали на холоде 10 мин, затем центрифугировали в течение 15 мин при 13500 g. Таким образом удаляли белок. Образцы переносили в чистые пробирки и добавляли реагент (в соотношении 1 : 1), содержащий: 0,5 мМ сульфата аммония железа (FeH8N2O8S2^6H2O); 50 мМ H2SO4; 100 мМ сорбита; 250 мкМ

ксиленолового оранжевого. После 45-мин инкубации прореагировавшую смесь

центрифугировали 5 мин при 13500 g. Затем смесь вносили в лунки планшета и проводили измерение оптической плотности на микропланшетном фотометре (ImmunoChem-2100, USA) при длине волны 595 нм (Jiang et al., 1990; Garcia et al., 2000).

Количество пероксида водорода рассчитывали по калибровочной кривой, построенной для H2O2. Содержание выражали в мкмолях Н2О2 на мг белка, последний определяли в экстрактах по методу Bradford (1976).

При сравнении результатов сопоставляли процентное соотношение концентраций Н2О2 опытных образцов. За 100% брали содержание Н2О2 в варианте с вакуолярным экстрактом, не содержащим каких-либо испытуемых соединений.

Проводили модельный эксперимент с пероксидазой хрена, с целью установить вклад пероксидаз в генерацию H2O2. Для этого готовили раствор пероксидазы из корней хрена

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

Pradedova et al.

104

в среде, содержащей 25 мМ трис/HCl (рН 6.5). Ход анализа и варианты опыта соответствовали опыту с вакуолярным экстрактом.

Эксперименты были выполнены в 4-5 биологических повторностях. На гистограммах представлены средние арифметические значения и средние квадратичные отклонения величин, отражающих процентное содержание Н2О2.

В работе использовали реактивы производства Sigma (США).

RESULTS

На первом этапе исследования необходимо было установить, может ли H2O2 образовываться в вакуолярном содержимом клеток корнеплодов столовой свеклы. Ранее интенсивная генерация H2O2 при наличии NADH была показана на экстрактах апопласта клеток фасоли (Phaseolus vulgaris L.). Обязательным условием для АФК-генерирующих реакций были относительно высокие значения pH среды, несмотря на то, что pH апопласта в среднем близок к 5.5. Высказывалось предположение о ведущей роли POX апопласта в продукции АФК (Bolwell et al., 1999, 2002). Образование H2O2 в апопласте у ряда растений наблюдали и при взаимодействии POX с салициловой кислотой (SA). Согласно полученным результатам, основными продуктами такого взаимодействия являлись 02^ и радикал SA (Kawano, Muto 2000).

Если к вакуолярному экстракту добавляли NADH и SA, то происходило слабое увеличение содержания H2O2, в среднем на 20% (Рис. 1). В

среды инкубации кроме этих соединений в отдельные варианты вносили SOD - фермент, катализирующий реакцию дисмутации 20^-, в результате которой образуется H2O2. А также добавляли каталазу - фермент, который разлагает H2O2 до H2O. В вариантах с SOD и NADH концентрация H2O2 повышалась на 40%, а в вариантах с SOD и SA - на 50%, от значений контрольного варианта. При наличии каталазы в среде с NADH содержание H2O2 снижалась на 60% от значений опытного варианта или на 10-20% от значений контрольного варианта. А в варианте с салициловой кислотой каталаза оказалась не эффективной, видимо из-за того, что SA является ингибитором фермента. Этот эксперимент позволил оценить чувствительность используемого метода и его эффективность для нашего объекта исследования, который представлял вакуолярное содержимое в буферном растворе на основе триса.

Следует отметить, что особенность используемого нами метода заключалась в окислении Fe2+ до Fe3+ пероксидом водорода в присутствии сорбита. Окисленный ион Fe3+ формировал комплекс с ксиленоловым оранжевым, изменяя цвет и спектр поглощения реагента. Полагают, что в целом этот метод достаточно специфичный, однако хелатирующие белки и агенты, восстанавливающие или окисляющие ионы железа, могут влиять на развитие реакции. По этой причине некоторые исследователи для определения специфичности реакции в своих экспериментах применяли каталазу (Jiang et al.,

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

105

The Effect of Herbicides on Hydrogen Peroxide Generation...

1990; Garcia et al., 2000). Проверка специфичности 40% от контрольных значений, вызывали такие

окраски в наших образцах показала, что с гербициды, как диурон, фтородифен и

каталазой снижение концентрации Н2О2 в клопиралид. В том случае, когда в среды

контроле было не столь значительным, как можно инкубации наряду с гербицидом вносили каталазу,

было бы ожидать. Оно составило 20-25% от содержание H2O2 снижалось. Никакого повышения

значений контрольного варианта (варианта, H2O2 не происходило и при наличии одного из

содержащего только вакуолярный экстракт) (Рис. ингибиторов KCN или NaN3. Известно, что оба

1). Возможно, каталаза, обладающая низким соединения угнетают активность оксидоредуктаз,

сродством к Н2О2 и активно функционирующая при содержащих в активном центре железо и медь, в

его высоких концентрациях, была том числе POX, фенолоксидаз, Cu,Zn-SOD и др.

малоэффективной в условиях нашего Обращало на себя внимание то, что не все из

эксперимента. Хотя повышение концентрации Н2О2 исследуемых гербицидов оказывали выраженный

с NADH и SOD, и резкое ее снижение на фоне стимулирующий эффект на образование H2O2.

каталазы, свидетельствовало в пользу Например, на фоне 2.4-Д концентрация H2O2

специфичности наблюдаемых реакций и повышалась в среднем на 20%, а при наличии

эффективности каталазы. Поскольку в наших глифосата достоверного повышения H2O2 не

образцах, как и в любых других образцах происходило (Рис. 2).

растительного происхождения, присутствовали Подавление синтеза пероксида водорода KCN

низкомолекулярные соединения, которые могли и NaN3 указывало на участие в этом процессе

взаимодействовать с агентами реакционной среды, каталитических белков - по всей видимости, гем-

можно было допустить наличие неспецифичных содержащих оксидоредуктаз. На сегодня в

взаимодействий, которые следовало учитывать при вакуолярном содержимом клеток растений из

интерпретации результатов последующих гемсодержащих ферментов, потенциальных

экспериментов. В целом, полученные данные претендентов на участие в АФК-генерации,

позволили заключить, что в вакуолях может выявлена POX. Вакуолярная POX представлена

образовываться Н2О2, т.е. органеллы содержат многочисленными изоформами, субстратная

системы, способные синтезировать это специфичность которых до сих пор мало изучена

соединение при определенных условиях. (Ferreres et al., 2011). Учитывая широкую

В дальнейших экспериментах, когда к субстратную специфичность изопероксидаз,

вакуолярному содержимому добавляли различные можно предположить, что гербициды служили

гербициды, в отдельных случаях наблюдали субстратами для POX вакуолей. На данном этапе

заметное повышение концентрации H2O2 (Рис. 2). работы проверить это предположение можно было

Увеличение концентрации H2O2, в среднем на 30- с помощью модельного эксперимента с POX из

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

Pradedova et al.

106

корней хрена. Однако известно, что POX разного происхождения могут сильно отличаться по субстратной специфичности. Тем ни менее эффект некоторых гербицидов можно было наблюдать и в эксперименте с POX хрена (Рис. 3). При наличии в среде инкубации фтородифена концентрация H2O2 возрастала на 60-80% по сравнению с контролем, не содержащим гербицид. А в опытных

вариантах с 2.4-Д, как и в эксперименте с вакуолярным экстрактом, повышение

концентрации H2O2 было не таким выраженным и соответствовало 20-30%. В то же время, глифосат, диурон и клопиралид в случае с POX хрена оказались неэффективными, хотя два последних гербицида в вакуолярных экстрактах стимулировали образование H2O2 (Рис. 2, 3).

160

140

£ 120 Я 100

к

£ 80 а

60

<и

40

о

20

0

г-  контроль  SOD И cat

контроль NADH SA

Figure 1. Содержание пероксида водорода в вакуолярных экстрактах при наличии соединений: NADH;

салициловая кислота (SA); супероксиддисмутаза (SOD); каталаза (cat).

контроль 2.4-Д глифосат диурон фтородифен клопиралид

Figure 2. Содержание H2O2 в вакуолярных экстрактах при наличии в реакционной среде гербицидов (2.4-Д, глифосат, диурон, фтородифен и клопиралид), каталазы (cat), SOD и ингибиторов оксидоредуктаз (KCN и NaN3).

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

107

The Effect of Herbicides on Hydrogen Peroxide Generation...

Figure 3. Образование H2O2 в среде, содержащей POX из корней хрена, а также гербициды (2.4Д, глифосат, диурон, фтородифен и клопиралид), каталазу (cat), SOD и ингибиторы оксидоредуктаз (KCN и №N3).

DISCUSSION

Основным объектом исследования служил вакуолярный экстракт, который получали в результате разрушения вакуолей в гипотоническом буферном растворе. Мы не использовали интактные изолированные вакуоли по причине неодинаковой проницаемости гербицидов через клеточные мембраны. Известно, что проникновение ксенобиотиков в клетки регулируется в основном их липофильностью. Чем выше липофильность гербицидов, тем быстрее они преодолевают мембранный барьер. Однако для соединений, подобных клопиралиду, т.е. являющихся слабыми кислотами, поглощение и удержание в клетке требует целостности мембран и высокого мембранного градиента H+, который формируют АТФ-зависимые насосы (Devine et al.,1987). Тогда как для гербицидов 2.4-Д и глифосата характерно опосредованное поглощение посредством переносчиков (Devine et a/.,1987). Учитывая эти обстоятельства для того, чтобы создать равные

реакционные условия, одним из которых являлось определенное время инкубации, гербициды добавляли сразу к вакуолярному содержимому.

В работе использовали гербициды различной химической природы и разного механизма действия на растения. Несмотря на то, что токсическое действие гербицидов определяется их химической природой, соединения разных классов гербицидов, различающихся по структуре, иногда могут оказывать одинаковый эффект. Например, клопиралид и 2.4-Д. Клопиралид является пиридиновым соединением, синтезированным на основе пиколиновой кислоты, а 2.4-Д -

представитель класса арилоксиалканкарбоновых кислот. Клопиралид и 2.4-Д по механизму действия относят к гербицидам ауксинового типа. Оба соединения воздействуют на удлинение клеток, подобно ауксину стимулируют синтез этилена, который в чрезмерных количествах приводит к торможению роста у активно растущих растений (Hall et a/., 1985). Следует отметить, что растения

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

Pradedova et al.

108

свеклы обладают устойчивостью к клопиралиду, но указывало на активное взаимодействие гербицида

чувствительны к 2.4-Д, при этом эффект с оксидоредуктазами вакуолей. Ранее

последнего зависит от дозы и фазы развития высказывали предположение, что дипиридилы, к

растения (Zaharichev, 2007). Благодаря которым относится клопиралид, могут окисляться

дозозависимому эффекту, а также сходству с молекулярным кислородом и служить вторичными

ауксинами, 2.4-Д находит широкое применение в генераторами АФК (Gruzdev, 1987). По всей

лабораторных исследованиях (Romero-Puertas et видимости, клопиралид «распознается» как

al., 2004). В отличие от других гербицидов, для субстрат ферментативными системами вакуолей

которых установлены определенные клеток корнеплодов свеклы. 2.4-Д тоже мог

«биохимические мишени» в клетках, служить субстратом для оксидоредуктаз вакуолей.

специфичность действия 2.4-Д до сих пор мало На сегодняшний день установлены разные пути

изучена, несмотря на то, что в течение последних детоксикации 2.4-Д в растениях. Наряду с

десятилетий был выявлен целый ряд эффектов декарбоксилированием и этерификацией,

гербицида на клетки растений. Например таких, осуществляется его окисление и

как: снижение содержания углеводов; стимуляция гидроксилирование с последующей конъюгацией с

фотодыхания; ингибирование активности глутатионом, аминокислотами, углеводами и т.д.

фотосистемы II; ингибирование фиксации СО2; (Karuppanapandian et al., 2011). Окисление и

активация синтеза этилена; стимулирование гидроксилирование предполагает взаимодействие

активности ферментов (фосфолипазы А2, гербицида с оксидоредуктазами. Полученные нами

цитохрома Р-450, НАДН-оксидазы, гидроксилаз) и результаты могут служить косвенным тому

др. При этом неоднократно отмечали, что подтверждением.

применение ауксинподобных гербицидов Следует отметить, что свекла не обладает

приводило к гибели клеток из-за развития устойчивостью к глифосату. Возможно поэтому не

окислительного стресса, вызванного интенсивным выявлен стимулирующий эффект этого гербицида

образованием АФК. Например, на растениях на образование H2O2 в вакуолях клеток

гороха показано резкое увеличение концентрации корнеплодов свеклы. Не исключено, что

H2O2 после обработки 2.4-Д, однако источник АФК соединение не взаимодействует с

не был установлен (Romero-Puertas et al., 2004). В окидоредуктазами вакуолей в тех условиях, при

наших исследованиях гербициды ауксинового которых проводился эксперимент. Среди

ряда, 2.4-Д и клопиралид, способствовали фосфорорганических соединений глифосат

образованию АФК в вакуолярном содержимом. является наиболее важным системным гербицидом

Повышение концентрации H2O2 при добавлении сплошного действия, применяемым для борьбы с

клопиралида и ее снижение на фоне ингибиторов, глубокоукореняющимися и многолетними

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

109

The Effect of Herbicides on Hydrogen Peroxide Generation...

сорняками в период вегетации. У чувствительных то же время, другой гербицид, диурон,

растений глифосат подавляет синтез некоторых стимулирующий образование АФК в вакуолярном

жизненно важных аминокислот. Он действует экстракте, оказался неэффективным в опыте с

только как контактный гербицид, его пероксидазой хрена. Следует отметить, что оба

эффективность в почве резко снижается из-за соединения, диурон и фтородифен, обладают

образования устойчивых хелатов с ионами тяжелых схожим токсическим действием, они подавляют

металлов, особенно с железом (Gruzdev, 1987; электронный транспорт, ингибируют фотосинтез и

Zaharichev, 2007). Мы учли эту особенность фотодыхание. Несмотря на то, что эти соединения,

глифосата при определении пероксида водорода как и большинство гербицидов, являются

FOX-методом, в котором главными реагентами галjгенсодержащими, по химической структуре они

являлись ионы железа. Несмотря на то, что заметно различаются. Диурон является

молярная концентрация гербицида в конечных производным мочевины и относится к классу

растворах ацетона была в несколько раз меньше фениламидов и подклассу производных

молярной концентрации соли железа в реагенте, фенилмочевины (Vieira et a/., 2015). Соединения

введение дополнительного контрольного варианта, этого класса применяются как системные

содержащего только реакционный раствор и гербициды широкого спектра действия. Они

гербицид, было необходимым условием. обладают высокой биологической активностью,

Дополнительный контроль позволял учитывать избирательностью и стойкостью в биологических

неспецифическое взаимодействие гербицида. средах, что обуславливает их широкое применение

Особый интерес вызывал гербицид в сельском хозяйстве. Однако некоторые из них, в

фтородифен. Ранее, исследуя том числе диурон, на сегодня используются в

глутатионтрансферазную активность вакуолей и основном в научных исследованиях как модельные

тканевого экстракта мы установили, что это соединения. Например, с помощью диурона

соединение может служить субстратом для исследуются процессы переноса электронов у

глутатион^-трансфераз (GST) корнеплодов фотосинтезирующих организмов. Он подавляет

столовой свеклы (данные не приводятся). По всей фотосинтез, предотвращает производство

видимости, с гербицидом как с субстратом могут кислорода, блокируя перенос электронов на уровне

взаимодействовать не только GST, но и Фотосистемы II (Vieira et a/., 2015). Полагают, что

оксидоредуктазы вакуолей. Более того, для основными модификаторами диурона в растении и

пероксидазы корней хрена фтородифен тоже окружающей среде могут быть лакказы

служил субстратом. В опытных вариантах, которые (фенолоксидазы). На сегодняшний день в нашей

содержали фтородифен, увеличение стране диурон практически не используется в

концентрации H2O2 было одно из самых высоких. В качестве гербицида, зато его аналоги из группы

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

Pradedova et al.

110

гербицидов производных сулфонилмочивины находят широкое применение. Следует отметить, что к некоторым из них свекла устойчива даже на стадии ранних всходов (Gruzdev, 1987). Что же касается фтородифена, то это соединение является производным нитродифенила и относится к классу гербицидов дифениловых эфиров (Del Buono et al., 2011). Действие диариловых эфиров на растения связано с нарушением транспорта электронов и реакции фосфорилирования. Однако не все растения одинаково чувствительны к гербицидам этого класса. Фтородифен, например, в зависимости от дозы, может угнетать процессы жизнедеятельности у свеклы и ряда других культурных растений, но не приводить к их гибели (Maksoud et al., 1981). Как показали прежние исследования, при фотохимическом разложении диариловых эфиров в водных растворах может происходить отщепление заместителей в ароматическом ядре, а также замена галогенов на гидроксильную группу (Zacharenko, 1990). Возможно, в нашем исследовании оксидоредуктазы вакуолей и пероксидаза хрена взаимодействовали с гидроксилированной в водном растворе формой фтородифена. Чтобы подтвердить это, требуются дополнительные исследования.

В целом полученные нами результаты позволяют сделать вывод о том, что в вакуолях могут протекать активные окислительные процессы, сопровождающиеся генерацией АФК. Вакуоли клеток корнеплодов столовой свеклы содержат ферментативные системы, способные

взаимодействовать с токсичными ксенобиотиками такими, как гербициды. Возможно, вакуолярный компартмент вносит весомый вклад в детоксикацию ксенобиотических соединений в клетках растений.

ACKNOWLEDGMENT

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Правительства Иркутской области, проект № 14-4404059 р_сибирь_а.

REFERENCES

Baranenko V.V. (2006) Superoxide dismutase in plant cell. Tsitologiia, 48, 465-474.

Bradford M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of protein utilising the principal of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72, 248254.

Bolwell G.P., Blee K.A., Butt V.S., Davies D.R., Gardiner S.L., Gerrish C., Minibaeva F., Rowntree E.G. and Wojtaszek P. (1999) Recent advances in understanding the origin of the apoplastic oxidative burst in plant cells. Free Rad. Res., 31, 137-145.

Bolwell G.P., Bindschedler L.V., Blee K.A., Butt V.S., Davies D.R., Gardiner S.L., Gerrish C. and Minibaeva F. (2001) The apoplastic oxidative burst in response to biotic stress in plants: a three component system. J. Exp. Botany., 53, 1367-1376.

Deepesh N.De. (2000) Plant Cell Vacuoles: An Introduction. Csiro Publishing, 288 p.

Del Buono D., Ioli G., Nasini L. and Proietti P.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

111

The Effect of Herbicides on Hydrogen Peroxide Generation...

A comparative study on the interference of two herbicides in wheat and italian ryegrass and on their antioxidant activities and detoxification rates. J Agric Food Chem., 59, 12109-12115.

Devine M.D., Bestman H.D. and Vanden Born W.H. (1987) Uptake and accumulation of the herbicides chlorsulfuron and clopyralid in excised pea root Tissue. Plant Physiol., 85, 8286.

Ferreres F., Figueiredo R., Bettencourt S., Carqueijeiro I., Oliveira J., Gil-Izquierdo A., Pereira D.M., Valentao P., Andrade P.B., Duarte P., Barcelo A.R. and Sottomayor M. (2011) Identification of phenolic compounds in isolated vacuoles of the medicinal plant Catharanthus roseus and their interaction with vacuolar class III peroxidase: an H2O2 affair? J. Exp. Botany., 62, 2841-2854.

Fuerst P.E., Nakatani H.Y., Dodge A.D., Penner D. and Arntzen C.J. (1985) Paraquat resistance in Conyza. Plant Physiol., 77, 984-989.

Galletti R., Denoux C., Gambetta S., Dewdney J., Ausubel F.M., De Lorenzo G. and Ferrari S. (2008) The AtrbohD-mediated oxidative burst elicited by oligogalacturonides in Arabidopsis is dispensable for the activation of defense responses effective against Botrytis cinerea. Plant Physiol., 148, 1695-1706.

Garcia R., Kaid N., Vignaud C. and Nicolas J. (2000) Purification and some properties of catalase from wheat germ (Triticum aestivum L.). J. Agric. Food Chem., 48, 1050-1057.

Gruzdev G.S. (1987) Chemical protection of plants. In Gruzdev,G.S. (ed). M.: Agropromizdat, 415 p.

Hall J.C., Bassi P.K., Spencer M.S. and Vanden Born W.H. (1985) An evaluation of the role of ethylene in herbicidal injury induced by picloram or clopyralid in rapeseed and sunflower plants. Plant Physiol., 79, 18-23

Jiang Z.-Y., Woollard A.C.S. and Wolff S.P. (1990) Hydrogen peroxide production during experimental protein glycation. FEBS, 268, 6971.

Kawano T. and Muto S. (2000) Mechanism of peroxidase actions for salicylic acid-induced generation of active oxygen species and an increase in cytosolic calcium in tobacco cell suspension culture. J. Exp. Botany., 51, 685693.

Karuppanapandian T., Wang H.W., Prabakaran N., Jeyalakshmi K., Kwone M., Manoharan K. and Kim W. (2011) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid-induced leaf senescence in mung bean (Vigna radiata L. Wilczek) and senescence inhibition by co-treatment with silver nanoparticles. Plant Physiol. Biochem., 49, 168-177.

Lamb C. and Dixon R.A. (1997). The oxidative burst in plant disease resistance. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48, 251-275.

Maksoud M.A., Rizk T.Y., El-Oksh I., Fayed T. and Ibrahim H. (1981) Chemical and mechanical weed control in transplanted tomatoes. J. Annals of Agricultural Science, 26. 307-321.

Rogozhin V.V., Verkhoturov V.V. and Rogozhina T.V.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

Pradedova et al.

112

(2004) Peroksidaza: stroenie i mekhanizm deistviya (Peroxidase: structure and mechanism of action). Irkutsk: Irkutsk. Gos. Tech. Univ., 200 p.

Romero-Puertas M.C., Rodriguez-Serrano M., Corpas F.J., Gomez M., Del Rio L.A. and Sandalio L.M. (2004) Cadmium-induced subcellular accumulation of O2- and H2O2 in pea leaves. Plant, Cell and Environment, 27, 1122-1134.

Salyaev R.K., Kuzevanov V.Y., Khaptogaev S.B. and Kopytchuk V.N. (1981) Isolation and purification of vacuoles and vacuolar membranes from plant cells. Russ. J. Plant Physiol., 25, 1295-1305.

Vieira A.C., Marschalk C., Biavatti D.C., Lorscheider C.A., Peralta R.M. and Seixas V.F. (2015) Modeling based structural insights into biodegradation of the herbicide diuron by laccase-1 from Ceriporiopsis subvermispora. Bioinformation, 11, 224-228.

Zaharenko V.A. (1990) Gerbicidi. M.: Agropromizdat, 240 p.

Zaharichev V.V. (2007) Gerbicidi i regulatori rosta rastenii. Osnovi biohimii i primeneniya. M.: RHTU. im. D.I. Mendeleeva. 204 p.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015