ПЛОТНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПАТОГЕННЫХ МИКОБАКТЕРИЙ И НОКАРДИОФОРМНЫХ АКТИНОМИЦЕТОВ
DENSE GROWTH MEDIUM FOR CULTIVATION OF PATHOGENIC MYCOBACTERIA AND NOCARDIOFORM RAY FUNGI

Изобретение относится к микробиологическим исследованиям, касается питательной среды для культивирования микобактерий и нокардиоформных актиномицетов и может быть использовано для характеристики микобактерий по их биологической активности.
Известны плотные питательные среды для выращивания первичных культур микобактерий, состоящие из яичной массы и солевой основы: Левенштейна-Йенсена, Гельберга, Петраньяни, среды Финн-2 и Мордовского /1/. Приготовленные по прописям яичные среды разливают по пробиркам по 4-5 мл, помещают в аппарат для свертывания или в аппарат Коха в наклонном положении и стерилизуют при 85°С в течение 2 дней по 40 минут или однократно при 90°С в течение 1 часа.
Цель изобретения - плотная питательная среда для культивирования микобактерий и нокардиоформных актиномицетов, простая в получении и использовании.
Поставленная цель достигается тем, что питательная среда, содержащая солевую основу и яичную основу, содержит в качестве солевой основы L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит и дистиллированную воду, а в качестве яичной основы сваренный вкрутую желток куриного яйца при следующем соотношении компонентов:
L-аспарагин
4,0 г
калий фосфорнокислый двузамещенный
0,5 г
сернокислый магний
0,5 г
лимонная кислота
2,0 г
лимоннокислое аммиачное железо
0,05 г
пируват натрия
0,5 г
глицерин
40,0 г
агар
15,0 г
гумивит
90,0-95,0 мл
сваренный желток куриного яйца
250,0 г
дистиллированная вода
до 1000,0 мл
Гумивит - щелочной гидролизат низинных сортов торфа (выпускается ООО Агропром), представляет собой высокодисперсный золь натриевых солей комплекса гумусных кислот - гуминовых, гуматомелановых и фульво-кислот 121. Раствор солей гумусных кислот состоит из длинных фрагментарных цепочек с различными функциональными группами, важнейшими из которых являются карбоксильные (СООН) и фенольные (ОН), способные образовывать хелатные комплексы с микроэлементами, что обеспечивает их высокую обменную емкость и транспорт в клетку микроорганизмов /3, 4/. Гумивит - жидкость от темно-коричневого до черного цвета со специфическим сладковатым запахом, благодаря чему готовая среда имеет интенсивно коричневый цвет, на фоне которого хорошо видны даже мелкие колонии в начальной фазе роста.
Сущность способа поясняется примерами.
Пример 1. Для приготовления среды в химически чистую стерильную колбу емкостью 2,0 л наливали 300,0 мл дистиллированной воды, прогревали на водяной бане до 75-85°С. В воде растворяли последовательно 2,0 г лимонной кислоты, 4,0 г L-аспарагина, 0,5 г сернокислого магния, 0,5 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа, 0,5 г пирувата натрия, 40,0 г глицерина и 90,0 мл гумивита. Каждый компонент добавляли после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов общий объем доводили до 750,0 мл стерильной дистиллированной водой. Устанавливали pH=7,1-7,2 добавлением 1 н. NaOH или 1 н. HCl. Свежие куриные яйца хорошо промывали в проточной воде, отваривали вкрутую, извлекали желтки. Расчетное количество сваренного вкрутую желтка (250 г) растирали в ступке в полученном солевом растворе до получения однородной массы, в которую добавляли 15 г агара, перемешивали, доводили объем до 1000 мл и нагревали на водяной бане до расплавления агара. Полученную среду автоклавировали в течение 30 минут при 1 атм. Приготовленную питательную среду хранили в холодильнике при температуре +4°С и использовали по мере надобности, для чего ее расплавляли, разливали по пробиркам и сквашивали.
Пример 2. В таблице 1 приведены варианты плотной питательной среды в соответствии с изобретением.
Таблица 1
Состав разных вариантов плотных питательных сред
Состав
Вариант новой среды
1-й
2-й
3-й
4-й
L-аспарагин, г
4,0
4,0
4,0
4,0
Калий фосфорнокислый двузамещенный, г
0,5
0,5
0,5
0,5
Сернокислый магний, г
0,5
0,5
0,5
0,5
Лимонная кислота, г
2,0
2,0
2,0
2,0
Лимоннокислое аммиачное железо, г
0,05
0,05
0,05
0,05
Пируват натрия, г
0,5
0,5
0,5
0,5
Глицерин, г
40,0
40,0
40,0
40,0
Агар, г
15,0
15,0
15,0
15,0
Гумивит, мл
85,0
90,0
95,0
100,0
Сваренный вкрутую желток куриного яйца, г
50,0
250,0
250,0
250,0
Дистиллированная вода, мл
до 1000,0
до 1000,0
до 1000,0
до 1000,0
Пример 3. Для определения эффективности плотной питательной среды для культивирования микобактерий использовали референс-штаммы микобактерий M.bovis (шт.Vallee и BCG), M.tuberculosis (шт. Academia) и M.avium (шт. ГИСК, 44, 659). Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Посевы культур производили нанесением одной капли суспензии микобактерий, содержавшей 30-60КОЕ при посеве на среду Левенштейна-Йенсена, и на все сравниваемые варианты среды в соответствии с изобретением. Посев каждого штамма проводили на 3-5 пробирок. При оценке роста культур учитывали сроки появления первичных колоний, интенсивность роста (± слабый, + средний, ++ обильный) и изучали культурально-морфологические свойства. Контроль - плотная питательная среда Левенштейна-Йенсена. Полученные результаты (таблицы 2 и 3) показали, что оптимальными являются варианты 2 и 3 плотной питательной среды в соответствии с изобретением, обеспечивавшие более ранние сроки появления первичных колоний и более высокую интенсивность роста относительно варианта 1 и сравнимые с таковыми на среде Левенштейна-Йенсена. Повышение количества гумивита (вариант 4 плотной питательной среды в соответствии с изобретением) не сокращало сроки появления роста и не повышало его интенсивность, поэтому было нецелесообразным. Культурально-морфологические свойства и цвет выросших колоний штаммов не отличались от таковых на исходной среде.
Таблица 2
Сроки появления первичного роста патогенных микобактерий на средах разных вариантов
Штаммы
Сроки появления роста, сут
Среда в соответствии с изобретением
Среда Левенштейна-Йенсена
Вариант 1
Вариант 2
Вариант 3
Вариант 4
M.bovis (шт. Vallee)
15
13
12
12
14
M.bovis (шт. BCG)
15
15
15
15
15
M.tuberculosis (шт. Academia)
15
11
10
10
10
M.avium (шт. ГИСК)
9
7
7
7
7
M.avium (шт. 44)
12
10
9
9
7
M.avium (шт. 659)
11
10
10
10
8
Таблица 3
Массивность роста патогенных микобактерий на средах разных вариантов
Среда
Штаммы микобактерий
M.bovis Vallee
M.bovis BCG
M.tub. H<sub>37</sub>Ra
M.tub. Acad.
M.avium ГИСК
M.avium 44
M.avium 659
Массивность роста
3 недели роста
в соответствии с изобретением
Вариант 1
±
±
+
±
±
±
±
Вариант 2
+
+
++
+
+
+
+
Вариант 3
+
+
++
+
++
+
++
Вариант 4
+
+
++
+
++
+
++
Среда Левенштейна-Йенсена
+
+
++
+
++
+
++
Пример 4. Для определения эффективности среды для культивирования нокардиоформных актиномицетов использовали референс-штамм Corynebacterium pseudotuberculosis и четыре штамма родококков, выделенные от свиней и идентифицированные в лабораторных условиях. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Посевы культур и учет результатов проводили, как в примере 3. Контроль - традиционно применяемая среда Левенштейна-Иенсена. Результаты представлены в таблицах 4 и 5.
Таблица 4
Сроки появления первичного роста нокардиоформных актиномицетов на средах разных вариантов
Штаммы
Сроки появления роста, сут
Среда в соответствии с изобретением
Среда Левенштейна-Иенсена
Вариант 1
Вариант 2
Вариант 3
Вариант 4
Rhodococcus equi, шт.12
3
2
2
2
2
Rhodococcus equi, шт.13
4
2
2
2
2
Rhodococcus equi, шт.5
3
2
2
2
2
Rhodococcus equi, шт.6
3
3
2
2
2
Corynebacterium pseudotuberculosis
3
2
2
2
2
Таблица 5:
Массивность роста нокардиоформных актиномицетов на средах разных вариантов
Среда
Штаммы нокардиоформных актиномицетов
Rhodococcu sequi 12
Rhodococcu sequi 13
Rhodococcusequi 14
Rhodococcus equi 15
Corynebacterium pseudotuberculosis
Массивность роста
в соответствии с изобретением
Вариант 1
±
+
+
+
±
Вариант 2
+
++
++
++
+
Вариант 3
++
++
++
++
+
Вариант 4
++
++
++
++
+
Среда Левенштейна-Йенсена
++
++
++
++
+
Пример 5. Для сравнительного изучения информативности среды в соответствии с изобретением (вариант 2) и сред Левенштейна-Йенсена, Финн-2, Гельберга, ФАСТ-3Л и Петраньяни использовали референс-штаммы микобактерий M.bovis (шт. Vallee, Ravenal, БЦЖ), М.avium (шт. ГИСК и 659), полевые штаммы, выделенные от положительно реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота неблагополучных по туберкулезу хозяйств с характерными поражениями в органах и лимфатических узлах и клинические штаммы M.tuberculosis, выделенные от больных туберкулезом. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Посевы культур производили нанесением одной капли суспензии микобактерий, содержавшей 30-60 КОЕ при посеве на известные среды и на среду в соответствии с изобретением. Посев каждого штамма проводили на 3-5 пробирок. При оценке роста культур учитывали сроки появления первичных колоний и изучали культурально-морфологические свойства. Интенсивность роста изучали при посеве культуры М.bovis (шт.Vallee) на все анализируемые среды. Результаты представлены в таблицах 6 и 7.
Таблица 7
Интенсивность роста М.bovis (шт.Vallee) на плотных питательных средах
Питательная среда
Сутки
7
9
10
11
12
13
14
15
16
24
Левенштейна-Йенсена
-
-
-
-
-
+
+
++
++
+++
Финн-2
-
-
-
-
-
+
+
++
++
+++
Гельберга
-
-
-
-
-
-
++
++
++
+++
ФАСТ-ЗЛ
-
-
-
-
-
-
+
++
+++
+++
Петраньяни
-
-
=
=
-
-
+
++
+++
+++
Заявленная среда
-
-
-
+
++
++
++
+++
+++
++++
Примечание: + - единичные колонии; ++ - 10-20 колоний: +++ - 21-50 колоний; ++++ - сплошной рост
Проведенные исследования подтвердили эффективность плотной питательной среды в соответствии с изобретением для культивирования микобактерий и нокардиоформных актиномецитов (сроки появления первичного роста и интенсивность роста сравнимы с таковыми на традиционно применяемых средах). Обратимость среды позволяет использовать ее в качестве наслаиваемого компонента двухслойной питательной среды при изучении биологических свойств микобактерий.
Заявляемая плотная питательная среда отличается дешевизной и технологичностью приготовления, а ее использование упрощает проведение бактериологических исследований благодаря визуализации начального роста колоний.
Источники информации
1. Васильев В.Н. Микобактериозы и микозы легких. - София, 1971. - С.146-175.
2. Гришин Г.И., Слинина К.Н. Дар природы - гумивит // Практик. - 2004. - №3-4. - С.80-82.
3. Левинский Б.В. Все о гуматах. - Иркутск: ИП Марков С.Е., 1999. - 198 с.
4. Сорокина Н.Ф. Физиология активности продуктов окисления торфа // Новые процессы и продукты переработки торфа. - Минск: Наука, 1982. - С.109-115.