ШТАММ LACTOBACILLUS PARACASEI И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
LACTOBACILLUS PARACASEI STRAIN AND ITS USE

Область техники
[1] Настоящее изобретение относится к штаммам Lactobacillus paracasei и к их применению. Конкретнее, настоящее изобретение относится к композиции функциональной оздоровительной продукции для облегчения аллергии, улучшения иммунорегуляции, облегчения симптомов воспаления, облегчения атопического дерматита и улучшения состояния кишечника; и фармацевтической композиции для лечения или профилактики аллергических заболеваний, аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний, атопического дерматита и/или заболеваний кишечника, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного компонента из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382, штамма Lactobacillus paracasei KBL384, штамма Lactobacillus paracasei KBL385, клеток микроорганизмов указанного штамма, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[2]
Уровень техники
[3] Пробиотики относятся к микроорганизмам и полученным из них продуктам, обладающим антибактериальной активностью и ферментативной активностью, помогающими соблюдать равновесие микроорганизмов кишечника. Кроме того, пробиотики по определению представляют собой живые бактерии в виде одного или нескольких штаммов, улучшающих кишечную микрофлору при введении человеку или животным в виде сухих клеток или продуктов ферментации. Пробиотики должны населять кишечник человека, являться непатогенными и нетоксичными и выживать в течение достаточно продолжительного времени до поступления в кишечник. Кроме того, пробиотики должны поддерживать жизнеспособность и активность до потребления с продуктами питания, являться чувствительными к антибиотикам, используемым для профилактики инфекций, а также не содержать плазмид устойчивости к антибиотикам. Кроме того, пробиотики должны быть устойчивы к кислотам, ферментам и желчи в среде, присутствующей в кишечнике.
[4] Такие пробиотики могут включать, например, Bacillus sp., обладающие замечательной способностью продуцировать гидролизующие ферменты, например, амилазу, протеазу, липазу, целлюлазу и фосфатазу, Lactobacillus sp., продуцирующие молочную кислоту, и фотосинтезирующие бактерии, предотвращающие появление неприятного запаха за счет использования неприятно пахнущих веществ (например, аммиака, сероводорода и аминов), присутствующих в фекалиях скота, в процессах метаболизма.
[5] В частности, известно, что Bacillus sp. и Lactobacillus sp. являются крайне полезными пробиотиками, поскольку они включают штаммы, продуцирующие различные антибактериальные вещества. Эти молочнокислые бактерии продуцируют антимикробные пептиды под названием бактериоцины, обладающие антибактериальным механизмом действия, не имеющим отношения к механизмам устойчивости к антибиотикам. Бактериоцины обладают полиморфными характеристиками, их молекулярная масса, биохимические свойства и диапазоны и механизмы антимикробного действия по отношению к хозяину варьируют в значительной степени. Klaenhammer определяет бактериоцин как белок или белковый комплекс, обладающий прямой антибактериальной активностью против видов микроорганизмов, близких к бактериям, продуцирующим бактериоцин.
[6] При этом синдром раздраженного кишечника (IBS) представляет собой симптом, характеризующийся болью в брюшной полости и/или раздражением, ассоциированным с изменениями перистальтики кишечника или стула, причем такие симптомы невозможно объяснить анатомическими или биохимическими патологиями. Распространенные симптомы IBS также включают императивные позывы к мочеиспусканию, вздутие живота и чувство неполной дефекации. Соответственно, IBS можно классифицировать как функциональные желудочно-кишечные расстройства, включающие такие состояния, как функциональное вздутие живота, некардиогенную боль в грудной клетке, неязвенную диспепсию и хронический запор или диарею. В частности, поскольку связанные с IBS симптомы влияют как на самочувствие, так и на функциональные аспекты состояния пациентов, данное заболевание оказывает выраженное воздействие на заболеваемость и качество жизни, даже не учитывая боли и дискомфорта в брюшной полости.
[7] Воспалительное заболевание кишечника (IBD) - это состояние, при котором развивается и рецидивирует хроническое воспаление в кишечнике, включающее все воспалительные кишечные заболевания, например, болезнь Крона, язвенный колит или болезнь Бехчета, но не ограничивающееся ими. Многие исследователи работают в области разработки лекарственных средств для лечения IBS и IBD. В связи с этим широко используются различные антидепрессанты, несмотря на то, что их эффективность в клинических исследованиях является умеренной, а клиническая применимость - ограниченной вследствие значительных побочных эффектов. Кроме того, показано, что серотогенные лекарственных средства эффективно купируют общие симптомы IBS. Однако применение этих лекарственных средств ограничивается различным образом ввиду некоторых проблем с их безопасностью. Соответственно, имеет место растущий интерес к разработке нового терапевтического агента для лечения IBS.
[8] Аллергия является биохимическим явлением, характеризующимся уникальным искаженным ответом на чужеродное вещество (антиген, аллерген). Чужеродное вещество, вызывающее симптомы, называют аллергеном, а заболевания, при которых развиваются эти симптомы, называют аллергическими заболеваниями. Аллергия представляет собой патологический процесс в организме, причиной которого является реакция «антиген-антитело». В целом существует четыре типа аллергии в зависимости от периода времени, в течение которого возникает реакция, и вовлеченности комплемента. Аллергия 1 типа представляет собой реакцию анафилактического (немедленного) типа, при которой органами-мишенями в основном являются органы пищеварительной системы, кожа и легкие, а распространенные симптомы включают желудочно-кишечную аллергию, крапивницу, атрофический дерматит, аллергический ринит, бронхиальную астму и т.д. Известно, что патологические механизмы аллергии 1 типа развиваются следующим образом: при контакте антигенов с антителами IgE, присоединенными к поверхности тучных клеток и базофилов, клетки-мишени активируются и секретируют химические медиаторы, например, гистамин, лейкотриены и PAF с последующим сокращением кровеносных сосудов и гладких мышц. Такой механизм часто может наблюдаться в комбинации с аллергией 4 (замедленного) типа. Другими словами, такая анафилактическая и аллергическая реакция может возникать вследствие различных изменений в тучных клетках и т.д. Активация тучных клеток, ведущая к их дегрануляции, обусловлена связыванием антигена, антитела против IgE, лектина и т.д. с Fc-рецепторами, стимуляцией посредством анафилотоксина и т.д. или других лекарственных средств, например, кальциевого ионофора, соединения 48/80, кодеина и синтетического адренокортикотропина.
[9] Известно, что тучные клетки и базофилы крови являются основным клетками организма, вызывающими различные аллергические заболевания, например, аллергический ринит, аллергический дерматит, астму, пищевую аллергию и анафилактический шок. Эти клетки содержат на своей поверхности рецепторы (FcRI) для IgE, которые представляют собой антитела, вызывающие аллергию; данные клетки стимулируются веществами, вызывающими аллергию (антигенами, аллергенами), и секретируют собственные вещества, вызывающие аллергию (Kim K et al, Eur J Pharmacol, 581:191-203, 2008).
[10] Среди аллергических заболеваний широко известен атопический дерматит, представляющий собой хроническое рецидивирующее кожное заболевание, которое возникает у новорожденных или детей и может сохраняться до зрелого возраста. Как и астма или аллергический ринит, атопический дерматит представляет собой воспалительное заболевание кожи, ассоциированное с местной инфильтрацией Т-лимфоцитов, продуцирующих ИЛ-4 и ИЛ-5. ИЛ-4 контролирует развитие T-хелперов 2 фенотипа (Th2), что приводит к избыточной продукции иммуноглобулинов (Ig) и эозинофилии, а таже увеличению уровня IgE в сыворотке. Атопический дерматит обнаруживается у 80-90% субъектов с положительными результатами кожной пробы на пищевые и ингаляционные аллергены.
[11] Существуют различные средства для лечения или профилактики аллергических заболеваний, включая атопический дерматит, однако эффективный способ лечения пока не найден. Известны некоторые варианты медикаментозной терапии, однако даже кратковременное применение лекарственного средства может привести к развитию устойчивости, а долговременное применение может вызвать серьезные побочные эффекты, и поэтому в последнее время таких вариантов медикаментозной терапии аллергических заболеваний избегают. В данных обстоятельствах при отсутствии вариантов лечения, обеспечивающих абсолютный очевидный эффект, попытки улучшения симптомов раздражения, например, зуда и гиперемии при аллергии часто не дают эффекта.
[12] В заявках WO 96/29083 и EP 554418 описаны два типа штаммов Lactobacillus, образующие колонии в кишечнике, т.е. Lactobacillus plantarum 299v (DSM 6595) и Lactobacillus casei ssp. rhamnosus 271 (DSM 6594), и т.д. В заявке EP 415941 описан способ получения композиции питательных веществ, включающий обработку овсяной каши ферментами с последующим смешиванием с лактобациллами. В патенте США № 7195906 описан штамм Bifidobacterium, выделенный из удаленного при резекции и промытого желудочно-кишечного тракта человека, для лечения воспалительных заболеваний, особенно воспаления желудочно-кишечного тракта, например, IBD и IBS.
[13] В то же время до сих пор не найдено ни одного штамма, обладающего исключительными свойствами в отношении улучшения состояния кишечника, например, лечения IBD и IBS, и в отношении облегчения симптомов аллергии, и над поиском штаммов с такими свойствами работают многие исследовательские учреждения.
[14] В этих обстоятельствах авторы настоящего изобретения выполнили скрининг различных штаммов на основании того, что оздоровительный эффект пробиотиков не является общим родовым и видовым свойством и скорее специфичен для штамма (Отчет объединенной рабочей группы ФАО/ВОЗ по подготовке руководств по оценке пробиотиков в продуктах питания, Лондон, Онтарио, Канада, 2002), и выявили новый штамм, обладающий исключительным действием по отношению к иммунорегуляции, облегчению аллергии, улучшению состояния кишечника и лечению кишечных заболеваний, а также противовоспалительной активностью, Затем выполнили настоящее изобретение, подтвердив превосходные свойства этих штаммов.
[15]
[16] Сущность изобретения
[17] Цель настоящего изобретения - предложить новый штамм, который можно применять для улучшения состояния кишечника, лечения или профилактики заболеваний кишечника, улучшения иммунорегуляции, лечения или профилактики аутоиммунных заболеваний, облегчения симптомов аллергии, облегчения симптомов воспаления, облегчения и лечения атопического дерматита.
[18] Для достижения указанной цели в настоящем изобретении предложен штамм Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамм Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамм Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP).
[19] Кроме того, в настоящем изобретении предложена пищевая композиция или композиция пищевой добавки, содержащая эффективное количество по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[20] Кроме того, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для лечения или профилактики заболеваний кишечника, содержащая эффективное количество по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[21] Кроме того, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для лечения или профилактики аллергических заболеваний, содержащая эффективное количество по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[22] Кроме того, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для лечения или профилактики аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний, содержащая эффективное количество по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[23] Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ лечения заболеваний кишечника, включающий введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма в организм субъекта, нуждающегося в этом.
[24] Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ лечения аллергических заболеваний, включающий введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма в организм субъекта, нуждающегося в этом.
[25] Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ лечения аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний, включающий введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма в организм субъекта, нуждающегося в этом.
[26] Кроме того, в настоящем изобретении предложена композиция для применения при профилактике или лечении заболеваний кишечника, содержащая по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[27] Кроме того, в настоящем изобретении предложена композиция для применения при профилактике или лечении аллергических заболеваний, содержащая по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[28] Кроме того, в настоящем изобретении предложена композиция для применения при профилактике или лечении аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний, содержащая по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[29] Кроме того, в настоящем изобретении предложено применение композиции, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения заболеваний кишечника.
[30] Кроме того, в настоящем изобретении предложено применение композиции, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения аллергических заболеваний.
[31] Кроме того, в настоящем изобретении предложено применение композиции, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний.
[32]
Краткое описание чертежей
[33] На фиг. 1 показан результат, подтверждающий эффект контроля воспалительных цитокинов штаммом KBL382, штаммом KBL384 и штаммом KBL385 согласно настоящему изобретению в МПК.
[34] На фиг. 2 показан результат, подтверждающий эффект контроля экспрессии генов маркеров дифференцировки Т-клеток штаммом KBL382, штаммом KBL384 и штаммом KBL385 согласно настоящему изобретению в МПК.
[35] На фиг. 3 показан результат наблюдения за изменением уровня экспрессии цитокинов, (A) ИЛ-2, (B) ИФН-γ, (C) ИЛ-4, (D) ИЛ-13, (E) ИЛ-17A и ( F) ИЛ-10, в соответствии с введением штамма KBL382, штамма KBL384 и штамма KBL385 согласно настоящему изобретению, в линиях клеток МПК при активации Т-клеток посредством добавления антитела против CD3.
[36] На фиг. 4 показан результат, подтверждающий влияние на облегчение энтерита посредством (A) изменения массы тела, (B) изменения длины толстой кишки, (C) изменения длины толстой кишки и изменения веса слепой кишки, (D) H&E-окрашивания тканей толстой кишки и (E) изменения уровня МПО (миелопероксидазы) в тканях толстой кишки после введения каждого из штамма KBL382, штамма KBL384 и штамма KBL385 согласно настоящему изобретению мышиным моделям с индуцированным энтеритом.
[37] На фиг. 5 показан результат наблюдения за эффектом усиления плотных контактов при использовании штамма KBL382 и штамма KBL385 согласно настоящему изобретению посредством изменения уровня экспрессии генов, связанных с плотными контактами стенки кишечного тракта, (A) ZO1, (B) клаудина 3 и (C) MUC4.
[38] На фиг. 6 показан результат сравнения эффектов (A) восстановления длины толстой кишки и (B) улучшения потери массы тела при использовании штамма KBL382 согласно настоящему изобретению и инфликсимаба, антитела для лечения энтерита, доступного в продаже, для подтверждения эффекта облегчения энтерита при использовании штамма KBL382 согласно настоящему изобретению.
[39] На фиг. 7 показан результат наблюдения за (A) измерением балльной оценки дерматита, (B) эффектом облегчения зуда, (C) эффектом уменьшения толщины кожи и (D) эффектом снижения концентрации IgE в крови при введении штамма KBL382 согласно настоящему изобретению животным моделям с индуцированным атопическим дерматитом с целью подтверждения эффекта облегчения симптомов атопического дерматита при использовании штамма KBL382.
[40]
[41] Подробное описание изобретения и наилучших способов реализации изобретения
[42] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют значение, совпадающее ч общепринятым среди специалистов в данной области техники. В целом номенклатура, используемая в настоящей заявке, хорошо известна и широко используется в данной области техники.
[43]
[44] Настоящее изобретение подтвердило иммунорегуляторный эффект микроорганизмов, полученных из организма человека, и обнаружило, что штаммы Lactobacillus paracasei, обладающие превосходным иммунорегуляторным эффектом, т.е. KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) и штамм KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP). Анализ рДНК 16s указанного штамма демонстрирует, что указанный штамм является новым штаммом, который никогда не был известен общественности.
[45]
[46] В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к новому пробиотическому штамму Lactobacillus paracasei KBL382, Lactobacillus paracasei KBL384 или Lactobacillus paracasei KBL385, и указанные штаммы характеризуются наличием последовательностей 16s рДНК SEQ ID NO: 1-3, соответственно, как показано ниже.
[47] <SEQ ID NO: 1> Последовательность 16s рДНК штамма Lactobacillus paracasei KBL382
[48] <SEQ ID NO: 2> Последовательность 16s рДНК штамма Lactobacillus paracasei KBL384
[49] <SEQ ID NO: 3> Последовательность 16s рДНК штамма Lactobacillus paracasei KBL385
[50] Настоящее изобретение также подтвердило, что каждый из штамма KBL382, штамма KBL384 и штамма KBL385 обладает укрепляющим действием на плотные контакты стенки кишечного тракта в дополнение к противовоспалительному и иммунорегуляторному эффектам, и что введение штамма KBL382, штамма KBL384 и штамма KBL385 животным моделям с индуцированным энтеритом значительно ослабило потерю массы тела и уменьшение длины толстой кишки вследствие энтерита. Кроме того, подтверждено, что введение штамма KBL382, среди вышеперечисленных штаммов, животным моделям с индуцированным атопическим дерматитом значительно улучшало балльную оценку дерматита, облегчало симптомы зуда, уменьшало толщину кожи и заметно улучшало концентрацию IgE в крови при аллергической реакции.
[51]
[52] Соответственно, в другом варианте реализации настоящее изобретение относится к пищевой композиции или композиции пищевой добавки, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из клеток микроорганизмов штамма KBL382, штамма KBL384 или штамма KBL385, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[53] Указанную пищевую композицию или композицию пищевой добавки можно применять в качестве продукта питания, эффективно улучшающего состояние кишечника и способствующего профилактике кишечных заболеваний, например, в качестве основного или второстепенных ингредиентов продуктов питания, пищевых добавок, композиции функциональной оздоровительной продукции или функциональных напитков, но не ограничиваясь ими.
[54] Указанную пищевую композицию или композицию пищевой добавки можно применять в качестве продукта питания, эффективно облегчающего симптомы аллергии, например, в качестве основного или второстепенных ингредиентов продуктов питания, пищевых добавок, композиции функциональной оздоровительной продукции или функциональных напитков, но не ограничиваясь ими.
[55] Кроме того, указанную пищевую композицию или композицию пищевой добавки можно применять в качестве продукта питания, эффективно облегчающего аутоиммунные заболевания или воспалительные заболевания, например, в качестве основного или второстепенных ингредиентов продуктов питания, пищевых добавок, композиции функциональной оздоровительной продукции или функциональных напитков, но не ограничиваясь ими.
[56] Термин «продукт питания» относится к натуральному или искусственному продукту, содержащему по меньшей мере одно питательное вещество, и, более предпочтительно, относится к продукту, который стал съедобным в результате определенной обработки, и обычно охватывает все продукты питания, пищевые добавки, функциональную оздоровительную продукцию и функциональные напитки.
[57] Продукт питания, который может содержать указанную пищевую композицию согласно настоящему изобретению в качестве добавки, может включать, например, различные типы продуктов питания, напитков, жевательной резинки, чая, витаминного комплекса и функциональных продуктов питания. Кроме того, продукты питания согласно настоящему изобретению включают специальные обогащенные продукты питания (например, модифицированное молоко, детское питание), переработанные мясные продукты, рыбные продукты, тофу, мук, лапшу (например, лапшу-рамен, азиатскую лапшу), хлебобулочные изделия, биологически активные пищевые добавки, приправы (например, соевый соус, соевую пасту, пасту из красного перца, смешанную пасту), соусы, кондитерские изделия (например, закусочные продукты), конфеты, шоколад, жевательные резинки, мороженое, молочные продукты (например, ферментированное молоко, сыр), другие обработанные пищевые продукты, кимчхи, соленые продукты (например, различные виды кимчхи, маринованные продукты), напитки (например, фруктовый сок, овощной сок, соевое молоко, напитки, получаемые при брожении) и натуральные приправы ( например, бульонный порошок для лапши-рамен), но не ограничиваясь ими. Указанные продукты питания, напитки или пищевые добавки можно получать обычными способами.
[58] Термин «функциональная оздоровительная продукция» представляет собой группу продуктов питания, эффективность которых повышается за счет возможности проявления и выражения их функции для заранее определенной цели с использованием физических, биохимических или биоинженерных методик, или обработанные пищевые продукты, разработанные с учетом того, чтобы регулирующие функции соответствующей пищевой композиции in vivo, например, функция регулировки ритма дефекации при профилактике заболевания и выздоровлении, проявлялись в достаточной степени. Такой функциональный продукт питания может содержать пищевые добавки, приемлемые с точки зрения диетологии, и может дополнительно содержать подходящие носители, вспомогательные вещества и разбавители, обычно используемые при их производстве.
[59] В настоящем изобретении термин «функциональные напитки» в совокупности относится к напиткам, предназначенным для утоления жажды или для наслаждения вкусом. Конкретные ограничения данного термина отсутствуют, за исключением того, что указанные напитки содержат композицию для улучшения или профилактики указанных симптомов заболевания кишечника в качестве основных ингредиентов в указанном соотношении, а также, как и обычные напитки, могут содержать различные вкусоароматические добавки или натуральные углеводы в качестве дополнительных ингредиентов.
[60] В дополнение к вышесказанному, продукт питания, содержащий пищевую композицию согласно настоящему изобретению для улучшения симптомов указанного заболевания кишечника или его профилактики, может содержать различные питательные вещества, витамины, минералы (электролиты), вкусоароматические добавки, например, синтетические и натуральные вкусоароматические добавки, красители и наполнители (сыр, шоколад и т.д.), пектиновую кислоту и ее соли, альгиновую кислоту и ее соли, органические кислоты, коллоидные загустители, агенты для регулирования pH, стабилизирующие агенты, консерванты, глицерин, спирт, агенты для карбонизации, используемые в газированных напитках, и т.п., причем каждый из вышеуказанных ингредиентов можно использовать отдельно или в комбинации друг с другом.
[61] Продукт питания, содержащий пищевую композицию согласно настоящему изобретению, может содержать композицию согласно настоящему изобретению в количестве от 0,001 масс.% до 100 масс.%, предпочтительно от 1 масс.% до 99 масс.% в пересчете на общую массу продукта питания; в случае напитков оно может составлять от 0,001 г до 10 г, предпочтительно от 0,01 г до 1 г из расчета на 100 мл. Однако при длительном приеме в оздоровительных или гигиенических целях или в целях поддержания состояния здоровья количество продукта может быть ниже вышеуказанного диапазона; и поскольку у эффективных ингредиентов нет проблем с точки зрения профиля безопасности, их можно использовать в количестве, превышающем указанный диапазон, и их количество не ограничивается вышеуказанным диапазоном.
[62] Пищевая композиция согласно настоящему изобретению может содержать штамм KBL382, штамм KBL384 или штамм KBL385 по отдельности или в комбинации с приемлемым носителем, или может быть изготовлена в форме композиции, подходящей для употребления человеком или животными. Таким образом, указанную композицию можно добавлять к продукту питания, не содержащему пробиотических бактерий или пары пробиотических бактерий. Например, микроорганизмы, которые можно применять в комбинации со штаммом согласно настоящему изобретению при получении продуктов питания согласно настоящему изобретению, должны подходить для употребления человеком или животными и обладать пробиотической активностью в отношении подавления патогенных, вредных бактерий или улучшения баланса микрофлоры в кишечном тракте млекопитающих при приеме внутрь, но не ограничиваются этим. Такие пробиотические микроорганизмы могут включать, например, дрожжи, например, Saccharomyces, Candida, Pichia и Torulopsis, грибы, например, Aspergillus, Rhizopus, Mucor и Penicillium, и бактерии родов Lactobacillus, Bifidobacterium, Leuconostoc, Lactococcus, Bacillus, Streptococcus, Propionibacterium, Enterococcus и Pediococcus. Подходящие конкретные пробиотические микроорганизмы могут включать, например, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbruckii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sakei, Lactococcus lactis или Pediococcus acidilactici. Пищевая композиция согласно настоящему изобретению предпочтительно может дополнительно содержать смесь пробиотических микроорганизмов, обладающих выраженной пробиотической активностью и превосходным действием в отношении усиления иммунитета, дополнительно усиливающим их эффекты. Носители, которые можно включать в пищевую композицию согласно настоящему изобретению, могут включать, например, наполнители, добавки с высоким содержанием клетчатки, инкапсулирующие агенты и липиды, широко известные в данной области техники. Штамм Lactobacillus paracasei согласно настоящему изобретению может находиться в лиофилизированной или инкапсулированной форме, либо в форме суспензий или сухих порошков культуры.
[63]
[64] Композиция согласно настоящему изобретению также может быть представлена в форме кормовой добавки или корма, содержащих указанный штамм.
[65] Кормовая добавка согласно настоящему изобретению может находиться в форме сухого или жидкого состава и, кроме того, содержать другие непатогенные микроорганизмы в дополнение к указанному штамму KBL382, KBL384 или KBL385. Микроорганизмы, которые можно добавлять к кормовой добавке, могут включать, например, Bacillus subtilis, которая может продуцировать протеазу, липазу и ферменты, преобразующие углеводы, штамм Lactobacillus, обладающий физиологической активностью и способностью к разложению органических соединений в анаэробных условиях, например, в желудке коровы, мицелиальные грибы, например, Aspergillus oryzae, демонстрирующие влияние на увеличение массы тела скота, надоев и усвояемость корма (Slyter, L. L. J. Animal Sci.1976, 43. 910-926), и дрожжи, например, Saccharomyces cerevisiae (Johnson, D. E et al. J. Anim. Sci.,1983, 56, 735-739 ; Williams, P. E. V. et al,1990, 211).
[66] Кормовая добавка согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере один ферментативный агент в дополнение к указанному штамму Lactobacillus paracasei KBL382, штамму Lactobacillus paracasei KBL384 или штамму Lactobacillus paracasei KBL385. Дополнительные ферментативные агенты могут находиться в сухой или жидкой форме и могут включать, например, стеатолитические ферменты, например, липазу, фитазу, образующую фосфат и инозитфосфат при разложении фитиновой кислоты, амилазу, т.е. фермент для гидролиза α-1,4-гликозидной связи в составе, например, крахмала и гликогена, фосфатазу, т.е. фермент для гидролиза сложного органического эфира фосфорной кислоты, карбоксиметилцеллюлазу для разложения целлюлозы, ксилазу для разложения ксилозы, мальтазу для гидролиза мальтозы на две молекулы глюкозы и ферменты, продуцирующие углеводы, например, инвертазу, образующую смесь глюкозы и фруктозы при гидролизе сахарозы.
[67] При использовании штамма Lactobacillus paracasei KBL382, штамма Lactobacillus paracasei KBL384 или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 согласно настоящему изобретению в качестве кормовых добавок можно применять кормовое сырье, например, арахис, горох, свеклу, жмых, продукты переработки зерна, порошок кишок животных и рыбную муку, а также различные зерновые и соевый белок. Они могут быть обработанными или необработанными, и их можно использовать без ограничений. Обработка может включать такой процесс, при котором кормовое сырье загружают и продавливают под давлением через заданное отверстие, а для белков предпочтительно можно использовать экструзию, при которой белки подвергают дегенерации для увеличения их доступности. Экструзия позволяет денатурировать белки за счет термической обработки и разрушения антиферментных факторов. Кроме того, перевариваемость белков сои можно улучшить путем экструзии с целью инактивации веществ, снижающих питательность корма, например, ингибитора трипсина, одного из ингибиторов протеаз, присутствующего в сое. Кроме того, экструзия может способствовать улучшению гидролизуемости под действием протеаз, что повышает питательную ценность белков сои.
[68]
[69] В еще одном варианте реализации настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения или профилактики заболеваний кишечника, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из клеток микроорганизмов штамма Lactobacillus paracasei KBL382, штамма Lactobacillus paracasei KBL384 или штамма Lactobacillus paracasei KBL385, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[70] В еще одном варианте реализации настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения или профилактики аллергических заболеваний, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из клеток микроорганизмов штамма Lactobacillus paracasei KBL382, штамма Lactobacillus paracasei KBL384 или штамма Lactobacillus paracasei KBL385, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[71] В еще одном варианте реализации настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения или профилактики аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из клеток микроорганизмов штамма Lactobacillus paracasei KBL382, штамма Lactobacillus paracasei KBL384 или штамма Lactobacillus paracasei KBL385, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[72] Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть представлена в форме живых бактерий, сухого штамма, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма или композиции в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем или средой. Носители или среды, которые можно использовать в настоящем изобретении, могут включать растворитель, диспергатор, покрытие, усилитель, состав с контролируемым высвобождением (т.е. состав с замедленным высвобождением) или по меньшей мере одно инертное вспомогательное вещество, в том числе крахмал, полиол, гранулы, мелкодисперсную целлюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, например, Celphere, гранулы Celphere, разбавитель, смазывающее вещество, связующее, разрыхлитель и т.п. На таблетку из вышеуказанной композиции можно при желании нанести покрытие с использованием стандартной водной или неводной методики. Примеры фармацевтически приемлемого носителя и вспомогательного вещества для применения в качестве фармацевтически приемлемого инертного носителя и указанных дополнительных ингредиентов могут включать, например, связующее вещество, наполнитель, разрыхлитель, смазывающее вещество, противомикробный агент и агент для получения покрытия, но не ограничиваются ими.
[73] Настоящее изобретение может характеризоваться тем, что указанные заболевания кишечника выбраны из группы, состоящей из метеоризма, дискомфорта в области живота, инфекционной диареи, вызванной патогенными микроорганизмами, гастроэнтерита, воспалительных заболеваний кишечника, неврогенного кишечного синдрома, синдрома раздраженного кишечника, избыточного роста микроорганизмов тонкого кишечника и кишечной пищевой диареи, и указанные заболевания также включают заболевания, вызванные нарушением барьерной функции кишечника.
[74] Воспалительное заболевание кишечника (IBD) может включать болезнь Крона, поражения кишечника, сопровождающееся болезнью Бехчета, язвенный колит, геморрагическую язву прямой кишки и резервуарный илеит и относится к группе заболеваний, включающих болезнь Крона и язвенный колит. Язвенный колит поражает только толстую кишку. Воспаление и язвы при язвенном колите ограничиваются двумя внутренними слоями (слизистой и подслизистой) из четырех слоев толстой кишки. Воспаление и язвы при болезни Крона могут распространяться через все слои стенки как тонкой, так и толстой кишки.
[75] Синдром раздраженного кишечника представляет собой хроническое состояние, сопровождающееся не только стойким рецидивирующим дискомфортом и болью в брюшной полости, например, вздутием живота, но и изменениями стула, например, диареей или запором. Эти симптомы могут осложняться психологическими факторами или стрессовыми социальными обстоятельствами.
[76] В настоящем изобретении аллергические заболевания могут включать атопический дерматит, крапивницу, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит, астму, пищевую аллергию и анафилактический шок, но не ограничиваются ими.
[77] В настоящем изобретении аутоиммунные заболевания могут включать, например, ревматоидный артрит, волчанку, системную склеродермию, атопический дерматит, псориаз, псориатический артрит, астму, синдром Гийена-Барре, миастению гравис, дерматомиозит, полимиозит, рассеянный склероз, аутоиммунный энцефаломиелит, узелковый периартериит, тиреоидит Хашимото, рассеянный склероз, височный артериит, юношеский диабет, очаговую алопецию, пузырчатку, афтозный стоматит, аутоиммунную гемолитическую анемию, гранулематоз Вегенера, синдром Шегрена, болезнь Аддисона, болезно Крона и болезнь Бехчета, но не ограничиваются ими.
[78] Кроме того, воспалительные заболевания согласно настоящему изобретению в совокупности относятся к состояниям, при которых воспаление является основным патологическим изменением, и могут включать, например, отек, конъюнктивит, пародонтит, ринит, отит среднего уха, хронический синусит, фаринголарингит, тонзиллит, бронхит, пневмонию, язву желудка, гастрит, колит, подагру, экзему, угри, атопический дерматит, контактный дерматит, себорейный дерматит, анкилозирующий спондилит, ревматизм, фибромиалгию, остеоартрит, псориатический артрит, ревматоидный артрит, периартрит плечевого сустава, тендинит, тендосиновит, миозит, гепатит, цистит, нефрит, синдром Шегрена, миастению гравис, сепсис, васкулит, бурсит, височный артериит и рассеянный склероз, но не ограничиваются ими.
[79] Известно, что профилактика или лечение аутоиммунных заболеваний могут быть основаны на активации регуляторных Т-клеток (Treg) или дифференцировке в Т-клетки. Treg, разновидность CD4+ T-клеток, играют роль в регуляции иммунной системы и контроле аутоиммунных заболеваний за счет поддержания толерантности к аутоантигенам. Фактор транскрипции под названием Foxp3 в особенности вовлечен в развитие, поддержание и функцию регуляторных Т-клеток, регулирующих иммунный ответ путем секреции иммуносупрессивных цитокинов ИЛ-10 и ТФР-β.
[80] Кроме того, известно, что если частота дифференцировки T-клеток в Th1-клетки, Th2-клетки и Th17-клетки является низкой, а частота дифференцировки T-клеток в Treg-клетки - высокой, воспалительный ответ можно эффективно подавить.
[81] Известно, что Th1-клетки, Th2-клетки и Th17-клетки, дифференцированные из T-клеток селезенки, ассоциированы с экспрессией следующих факторов транскрипции и цитокинов: В случае Th1-клеток - T-bet, ИФН-γ и ИЛ-12; в случае клеток Th2 - GATA3 и ИЛ-5; в случае Th17-клеток - RORγt, ИЛ-17.
[82]
[83] Настоящее изобретение может характеризоваться тем, что эффекты облегчения, лечения или профилактики аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний, обусловленные штаммом согласно настоящему изобретению, можно индуцировать посредством по меньшей мере одного механизма, выбранного из:
[84] i) супрессии или экспрессии по меньшей мере одного фактора, выбранного из группы, состоящей из воспалительных цитокинов ИЛ-6, ФНО, ИЛ-1b, ИЛ-8, ИЛ-2, ИФН-γ, ИЛ-4, ИЛ-13 и ИЛ-17A;
[85] ii) увеличения экспрессии или секреции противовоспалительного и иммунорегуляторного цитокина ИЛ-10; и
[86] iii) увеличения экспрессии Treg, вовлеченных в противовоспалительную активность и иммунорегуляцию.
[87]
[88] Термин «лечение», относится к купированию или облегчению заболеваний или состояний, используемых вместе с указанным термином, или одного или более из их симптомов, подавлению их прогрессирования или их профилактике, если он не употребляется в ином смысле. Термин «терапия» в настоящем изобретении относится к акту «лечения», определение которого приведено выше. Соответственно, схемы лечения или терапии заболеваний кишечника, аллергических заболеваний, аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний у млекопитающих могут включать одно или более из следующего:
[89] (1) Подавление развития заболеваний кишечника, аллергических заболеваний, аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний,
[90] (2) Профилактику распространения заболеваний кишечника, аллергических заболеваний, аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний,
[91] (3) Облегчение заболеваний кишечника, аллергических заболеваний, аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний,
[92] (4) Профилактику рецидива заболеваний кишечника, аллергических заболеваний, аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний, и
[93] (5) Паллиативное лечение симптомов заболеваний кишечника, аллергических заболеваний, аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний
[94]
[95] Композиция согласно настоящему изобретению для профилактики или лечения заболеваний кишечника, аллергических заболеваний, аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний может содержать фармацевтически эффективное количество штамма Lactobacillus paracasei KBL382, штамма Lactobacillus paracasei KBL384, штамма Lactobacillus paracasei KBL385 по отдельности или в комбинации с по меньшей мере одним из фармацевтически приемлемых носителей, вспомогательных веществ или разбавителей.
[96] В настоящем изобретении термин «эффективное количество» означает количество, достаточно высокое для вызывания желательного эффекта, но достаточно низкое для предотвращения серьезных побочных эффектов, согласно оценкам медиков. Количество микроорганизмов, вводимых в организм с композицией согласно настоящему изобретению, можно корректировать соответственно пути введения и цели введения.
[97] Композицию согласно настоящему изобретению можно вводить субъекту один или более раз в день. Лекарственная форма означает физически дискретную единицу, подходящую для стандартного введения субъектам-людям и другим млекопитающим, причем каждая единица содержит подходящий фармацевтический носитель и заранее определенное количество микроорганизмов согласно настоящему изобретению, обеспечивающее терапевтический эффект. Лекарственная форма для перорального введения взрослому пациенту предпочтительно содержит 0,001 г или более микроорганизма согласно настоящему изобретению, и дозировка композиции согласно настоящему изобретению для перорального применения составляет о 0,001 г до 10 г, предпочтительно от 0,01 г до 5 г на дозу. Фармацевтически эффективное количество микроорганизма согласно настоящему изобретению составляет от 0,01 г до 10 г/день. В то же время дозировка зависит от тяжести заболевания пациента, микроорганизма и совместно используемых вспомогательных эффективных ингредиентов. Кроме того, общую суточную дозировку можно разделить в несколько раз и постоянно вводить по мере необходимости. Соответственно, вышеуказанные диапазоны дозировок никоим образом не ограничивают рамки настоящего изобретения.
[98] Кроме того, используемый выше термин «фармацевтически приемлемый» относится к композиции, которая является физиологически приемлемой и не вызывает аллергической реакции, например, желудочно-кишечного расстройства, головокружения или аналогичной реакции при введении человеку.
[99] Композицию согласно настоящему изобретению можно составить с использованием способов, известных в данной области техники, обеспечивающих быстрое, замедленное или отсроченное высвобождение активных ингредиентов после введения млекопитающему. Лекарственные формы могут представлять собой порошки, гранулы, таблетки, эмульсии, сиропы, аэрозоли, мягкие или твердые желатиновые капсулы, стерильные растворы для инъекций или стерильные порошки. Кроме того, композицию согласно настоящему изобретению для профилактики или лечения заболеваний кишечника можно вводить различными путями, включая пероральное, трансдермальное, подкожное, внутривенное или внутримышечное введение. Дозировку активных ингредиентов можно выбирать в зависимости от различных факторов, например, пути введения, возраста, пола, массы тела пациента и тяжести его состояния. Композицию согласно настоящему изобретению для профилактики или лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта можно вводить в комбинации с известным соединением, способным предотвращать или лечить симптомы заболеваний кишечника.
2
4
[100] Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть представлена, в частности, в виде лекарственной формы для перорального применения в составе с кишечнорастворимым покрытием. В настоящем документе термин «кишечнорастворимое покрытие» включает любое фармацевтически приемлемое покрытие, которое может сохраняться в желудке, не поддаваясь разрушению под действием кислого желудочного сока, и может в достаточной степени разрушаться в кишечнике, высвобождая там активные ингредиенты. «Кишечнорастворимое покрытие» согласно настоящему изобретению относится к покрытию, которое может сохраняться в течение 2 часов или более при контакте с искусственным желудочным соком, например, раствором HCl с pH 1 при 36-38°C, и в дальнейшем может разрушаться, предпочтительно в искусственном кишечном соке, например, буферном растворе KHPO с pH 6.8 в течение 30 минут.
rd
th
th
[101] Кишечнорастворимое покрытие согласно настоящему изобретению наносят на одно ядро в количестве от приблизительно 16 мг до 30 мг, предпочтительно от 16 мг до 20 мг или 25 мг или менее. При толщине кишечнорастворимого покрытия согласно настоящему изобретению от 5 мкм до 100 мкм, предпочтительно от 20 мкм до 80 мкм можно получить удовлетворительные результаты. Материал кишечнорастворимого покрытия можно выбрать из известных полимерных материалов. Подходящие полимерные материалы перечислены в ряде известных документов [L. Lachman et al., The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 3 ed., 1986, pp. 365~373; H. Sucker et al., Pharmazeutische Technologie, Thieme, 1991, pp. 355-359; Hagers Handbuchder pharmazeutischen Praxis, 4 ed., Vol. 7, pp. 739 ~ 742, and 766 ~ 778, (SpringerVerlag, 1971); and Remington's Pharmaceutical Sciences, 13 ed., pp. 1689 ~ 1691 (Mack Publ., Co., 1970)], и в них можно включать производные сложных эфиров целлюлозы, простые эфиры целлюлозы, сополимер акриловой смолы и метилакрилата и сополимер малеиновой кислоты и производных фталевой кислоты.
2
2
[102] Кишечнорастворимое покрытие согласно настоящему изобретению можно получить с использованием общепринятого способа нанесения кишечнорастворимого покрытия, при котором раствор кишечнорастворимого покрытия напыляют на ядро. Подходящие растворители, используемые в процессе получения кишечнорастворимого покрытия, представляют собой спирты, например, этанол, кетоны, например, ацетон, галогенированные углеводородные растворители, например, дихлорметан (CHCl), и смеси этих растворителей. Пластификатор, например, ди-n-бутилфталат или триацетилглицерин, добавляют к раствору покрытия в соотношении от приблизительно 1 : 0,05 до приблизительно 1 : 0,3 (материал покрытия : пластификатор) Допустимо выполнять процесс напыления непрерывно, и можно регулировать распыляемое количество с учетом условий нанесения покрытия. Давление распыления можно регулировать различным образом, и в общем случае удовлетворительные результаты можно получить при давлении распыления от приблизительно 1 бар до приблизительно 1,5 бар.
[103] В еще одном варианте реализации настоящее изобретение относится к применению указанного штамма или композиции для профилактики или лечения заболеваний кишечника, аллергических заболеваний, аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний и применению указанного штамма или композиции для получения терапевтического агента для лечения заболеваний кишечника, аллергических заболеваний, аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний.
[104] Конкретно, настоящее изобретение относится к композиции для применения при профилактике или лечении заболеваний кишечника, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[105] Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции для применения при профилактике или лечении аллергических заболеваний, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[106] Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции для применения при профилактике или лечении аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[107] Кроме того, настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения заболеваний кишечника.
[108] Кроме того, настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения аллергических заболеваний.
[109] Кроме того, настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний.
[110] В настоящем документе термин «профилактика» связан с предотвращением, задержкой, препятствованием или замедлением заболеваний с целью ослабления их влияния.
[111] В настоящем документе термин «лечение» связан с уходом за субъектом, страдающим от заболеваний, с целью облегчения, излечивания или ослабления симптомов заболеваний или ослабления или остановки прогрессирования заболеваний.
[112]
[113] В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложен способ профилактики или лечения заболеваний кишечника, аллергических заболеваний, аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний, включающий введение фармацевтически эффективного количества указанного штамма или указанной композиции в организм субъекта, нуждающегося в профилактике или лечении указанных заболеваний или в смягчении состояния кишечника, аллергических реакций, снижения иммунитета или воспалительных реакций.
[114] Конкретно, в настоящем изобретении предложен способ лечения заболеваний кишечника, включающий введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма в организм субъекта, нуждающегося в этом.
[115] Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ лечения аллергических заболеваний, включающий введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма в организм субъекта, нуждающегося в этом.
[116] Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ лечения аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний, включающий введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из штамма Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), штамма Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) или штамма Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP), культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма в организм субъекта, нуждающегося в этом.
[117] Поскольку фармацевтическая композиция, применяемая в способе профилактики или лечения заболеваний кишечника, аллергических заболеваний, аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний, а также способ ее введения описаны выше, перекрывающиеся элементы композиции и способа не будут включены в настоящий документ во избежание избыточной сложности настоящего описания.
[118] Указанный субъект, которому можно вводить композицию для профилактики или лечения указанных заболеваний кишечника, аллергических заболеваний, аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний, включает всех животных, в том числе человека. Например, субъект может представлять собой животное, например, собаку, кошку или мышь.
[119]
[120] Настоящее изобретение будет подробно описано далее в настоящем документе посредством примеров. Эти примеры приведены исключительно в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и для специалистов в данной области техники очевидно, что не следует считать, что сущность настоящего изобретения ограничивается этими примерами.
[121]
[122] Пример 1. Скрининг пробиотических штаммов, обладающих иммунорегуляторной функцией
[123] Скрининг пробиотических штаииов, обладающих иммунорегуляторной функцией, выполняли с использованием линии клеток моноцитарного лейкоза THP-1 и мононуклеарных клеток периферической крови (МПК). Штаммы, полученные из кишечника или влагалища человека, соответственно, высевали в указанные две линии клеток так, что соотношение «линия клеток : штамм» составляло 1:100, и измеряли соотношение ИЛ-10, основного цитокина, указывающего на контроль воспаления, к ИЛ-6, основному цитокину, указывающему на воспалительную реакцию (ИЛ-10/ИЛ-6), и соотношение ИЛ-10 к ИФН-γ, основному цитокину, указывающему на аутоиммунную реакцию (ИЛ-10/ИФН-γ). В общей сложности для скрининга использовали 23 следующих штамма: два штамма Lactobacillus gasseri, один штамм Lactobacillus reuteri, пять штаммов Lactobacillus rhamnosus, два штамма Lactobacillus fermentum, четыре штамма Lactobacillus paracasei, четыре штамма Lactobacillus salivarius, один штамм Lactobacilus plantarum, два штамма Lactobacillus acidophilus и два штамма Lactococcus lactis.
[124] В результате скрининга максимальные значения ИЛ-10/ИЛ-6 были продемонстрированы для трех штаммов Lactobacillus paracasei KBL382, KBL384 и KBL385. В частности, среди указанных трех штаммов Lactobacillus paracasei, KBL382 характеризовался максимальным значением ИЛ-10/ИЛ-6, равным 2,22 в линии клеток THP-1, а значение ИЛ-10/ИФН-γ в мононуклеарных клетках периферической крови составляло 9, что указывало на крайне высокий иммунорегуляторный эффект. Ниже в таблице 1 показаны полученные значения ИЛ-10/ИЛ-6 и ИЛ-10/ИФН-γ, измеренные для трех штаммов Lactobacillus paracasei из двадцати трех пробиотических штаммов, использованных при скрининге в рамках настоящего изобретения. Соответственно, согласно прогнозу, три штамма Lactobacillus paracasei KBL382, KBL384 и KBL385 обладали выраженным эффектом в отношении улучшения состояния кишечника, и дальнейшие эксперименты выполняли с использованием этих штаммов.
[125]
[126] [Таблица 1]
[127]
[128] Пример 2. Проверка влияния штаммов Lactobacillus paracasei KBL382, KBL384 и KBL385 на экспрессию воспалительных цитокинов и регуляцию дифференцировки T-клеток (тест in vitro)
[129] Для проверки иммунорегуляторного эффекта указанных штаммов Lactobacillus paracasei KBL382, KBL384 и KBL385 подтверждали способность к генерации цитокинов, вовлеченных в регуляцию иммунной системы, у клеток линии THP-1, обработанной штаммами Lactobacillus paracasei KBL382, KBL384 и KBL385, в то время как наличие экспрессии маркерного гена дифференцировки T-клеток подтверждали у МПК, обработанных штаммами Lactobacillus paracasei KBL382 и KBL385.
5
7
[130] Во-первых, клетки линии THP-1 высевали в каждую лунку 24-луночного планшета в количестве 1 × 10 клеток, дифференцировали в зрелые макрофаги, после чего заменяли раствор культуральной среды. Через 3 часа одну лунку обрабатывали LPS в концентрации 1 мкг/мл в качестве положительного контроля, а другие лунки обрабатывали штаммами Lactobacillus paracasei KBL382, KBL384 или KBL385, по 1 × 10 клеток на основании количества жизнеспособных бактерий; через 24 часа собирали раствор культуральной среды и измеряли количество каждого цитокина с использованием набора для диагностики воспаления у человека BD Cytometric Bead Array (CBA) (№ по каталогу 551811) в соответствии с инструкциями производителя. В качестве отрицательного контроля (Cont) использовали лунку, обработанную буфером PBS согласно той же экспериментальной процедуре. В результате, как показано на фиг. 1, измерение продемонстрировало, что группа клеток линии THP-1, обработанных штаммами Lactobacillus paracasei KBL382 и KBL385, характеризовалась значительно более низким количеством воспалительных цитокинов ИЛ-6, ФНО, ИЛ-1b и ИЛ-8 по сравнению с группой, обработанной LPS. В случае обработки штаммом KBL384 подтвердили, что количество ИЛ-6 было значительно более низким по сравнению с экспериментальной группой, обработанной LPS, однако значимые отличия уровней ФНО, ИЛ-1b и ИЛ-8 по сравнению с группой, обработанной LPS, отсутствовали. В группах, обработанных KBL382, KBL384 и KBL385, не наблюдали значимого увеличения или снижения ИЛ-10 по сравнению с группой, обработанной LPS, однако наблюдали индукцию общего увеличения уровня ИЛ-10 по сравнению с группой отрицательного контроля. Таким образом, сделали вывод, что штаммы Lactobacillus paracasei KBL382 и KBL385 эффективно и значимо подавляли образование воспалительных цитокинов в клетках THP-1, и дальнейшие эксперименты выполняли с целью проверки картины дифференцировки T-клеток.
5
6
6
[131] Для подтверждения влияния штаммов KBL382 и KBL385 на дифференцировку T-клеток клетки МПК высевали в каждую лунку 24-луночного планшета по 5 × 10 клеток, а затем добавляли штамм Lactobacillus paracasei KBL382 или KBL385 по 5 × 10 клеток. В качестве контроля в каждую лунку добавляли E.coli (E.coli 0157 EC4115) по 5 × 10 клеток на основании количества жизнеспособных клеток или добавляли LPS в концентрации 500 нг/мл. Известно, что E.coli увеличивает экспрессию генов T-bet, GATA3 и RORγt, которые представляют собой маркеры эффекторных Т-клеток, имеющих отношение к воспалительной реакции, в то время как LPS увеличивает экспрессию гена FOXP3, маркера Treg-клеток, имеющих отношение к регуляции воспаления. Экспериментальную группу МПК, полученную при вышеуказанных условиях, инкубировали в течение 5 дней, а затем получали и собирали клетки. С целью подтверждения уровня экспрессии генов вначале использовали набор для выделения общей РНК без ДНК easy-spin™ (DNA free) Total RNA Extraction Kit (Intron) с целью выделения РНК, а затем использовали набор для получения кДНК из РНК High Capacity RNA-to-cDNA Kit (ThermoFisher) для синтеза кДНК. На синтезированной кДНК выполняли ПЦР в реальном времени с использованием набора для ПЦР Rotor-Gene SYBR Green (Qiagen) и оборудования Rotor-Gene Q (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя и измеряли экспрессию мРНК T-bet, являющегося маркерным геном Th1 (маркером эффекторных клеток), GATA3, являющегося маркерным геном Th2, RORγt, являющегося маркерным геном Th17, и FOXP3, являющегося маркерным геном Treg-клеток. При этом измеряли уровни экспрессии генов B2M в качестве внутреннего контроля для внесения поправок на относительный уровень экспрессии генов между экспериментальными группами. Последовательность оснований праймера, использованного для подтверждения экспрессии каждого гена, приведена ниже.
[132]
[133] B2M
[134] Прямой: 5′-CCA GCA GAG AAT GGA AAG TC-3′'(SEQ ID NO. 4)
[135] Обратный: 5′-GAT GCT TCT TAC ATG TCT CG-3′ (SEQ ID NO. 5)
[136]
[137] T-bet
[138] Прямой: 5′-CCC CAA GGA ATT GAC AGT TG-3′ (SEQ ID NO. 6)
[139] Обратный) 5′-GGG AAA CTA AAG CTC ACA AAC-3′(SEQ ID NO. 7)
[140]
[141] GATA3
[142] Прямой: 5′-CTG CAA TGC CTG TGG GCT C-3′(SEQ ID NO. 8)
[143] Обратный: 5′-GAC TGC AGG GAC TCT CGC T-3′ (SEQ ID NO. 9)
[144]
[145] RORγt
[146] Прямой: 5′-AAG ACT CAT CGC CAA AGC AT-3′(SEQ ID NO. 10)
[147] Обратный: 5′-TCC ACA TGC TGG CTA CAC A-3′(SEQ ID NO. 11)
[148]
[149] FOXP3
[150] Прямой: 5′-TCA AGC ACT GCC AGG CG-3′ (SEQ ID NO. 12)
[151] Обратный: 5′-CAG GAG CCC TTG TCG GAT-3′ (SEQ ID NO. 13)
[152]
[153] В результате, как показано на фиг. 2, подтвердили, что штаммы Lactobacillus paracasei KBL382 и KBL385, в отличие от E.coli, поддерживали экспрессию генов T-bet, GATA3 и RORγt, являющихся маркерами эффекторных воспалительных T-клеток, на значимо низком уровне, однако значимо увеличивали количество мРНК FOXP3, маркера Treg-клеток, поддерживая иммунный гомеостаз аналогично LPS.
[154]
[155] Пример 3. Проверка влияния штаммов Lactobacillus paracasei KBL382, KBL384 и KBL385 на иммунорегуляцию T-клеток (тест in vitro)
[156] С целью проверки иммунорегуляторного эффекта T-клеток за счет штаммов Lactobacillus paracasei KBL382, KBL384 и KBL385 проверяли уровень экспрессии воспалительных цитокинов при активации T-клеток в составе МПК с последующей обработкой указанными штаммами Lactobacillus paracasei KBL382, KBL384 и KBL385.
5
7
7
[157] Клетки МПК высевали в каждую лунку 96-луночного планшета по 2 × 10 клеток с антителом против CD3 (1 мкг/мл, ebioscience) с целью активации T-клеток, а затем добавляли штамм Lactobacillus paracasei KBL382, KBL384 или KBL385 по 1 × 10 клеток из расчета соотношения “бактерии : МПК = 50 : 1” на основании количества жизнеспособных клеток. В качестве контроля в каждую лунку добавляли Escherichia coli K12 (ATCC 10798) по 1 × 10 клеток на основании количества жизнеспособных клеток. После инкубирования экспериментальной группы МПК с активированными T-клетками, полученной в вышеуказанных условиях, в течение 3 дней собирали супернатант и измеряли количество каждого цитокина с использованием набора для диагностики воспаления у человека BD cytometric Bead Array (CBA) (№ по каталогу 551811) в соответствии с инструкциями производителя.
[158] В результате, как показано на фиг. 3, в линиях клеток МПК с T-клетками, активированными добавлением антитела против CD3, все штаммы Lactobacillus paracasei KBL382, KBL384 и KBL385 значимо снижали экспрессию ИЛ-2, являющегося цитокином Th1, ИЛ-4 и ИЛ-13, являющихся цитокинами ИФНγ и Th2, соответственно, и ИЛ-17A, являющегося цитокином Th17, по сравнению с экспериментальной группой, обработанной только добавлением штамма E.coli и PBS, в то время как уровень противовоспалительного цитокина ИЛ-10 заметно повышался при использовании всех трех штаммов Lactobacillus paracasei, использованных в эксперименте, по сравнению с экспериментальной группой, обработанной только PBS; эксперимент подтвердил, что штамм KBL 382 среди трех штаммов в особенности значительно увеличивал уровень ИЛ-10 по сравнению с группой с добавлением E.coli. Вышеуказанные результаты эксперимента позволили сделать вывод, что все штаммы Lactobacillus paracasei KBL382, KBL384 и KBL385 значимо снижали уровень воспалительных цитокинов T-клеток и повышали уровень противовоспалительных цитокинов.
[159]
[160] Пример 4. Проверка влияния штаммов Lactobacillus paracasei KBL382, KBL384 и KBL385 на смягчение энтерита (тест in vivo)
10
9
[161] Настоящий пример должен был подтвердить наличие эффектов, обеспечивающих улучшение функции кишечника, у штаммов Lactobacillus paracasei KBL382, KBL384 и KBL385, в том числе in vivo. С этой целью мышей C57BL/6 разделили на группы по 10 мышей, а затем давали им водопроводную воду с 2% раствором DSS в течение 9 дней, тем самым вызывая у них энтерит. В то же время мышам в контрольной группе перорально вводили 200 мкл PBS раз в день, а мышам в экспериментальной группе перорально вводили раз в день 200 мкл каждого из штаммов Lactobacillus paracasei KBL382, KBL384 или KBL385, разбавленного PBS до концентрации 2 × 10 КОЕ/мл, так что ежедневно вводимое количество можно было задать как 4 × 10 КОЕ. Затем в течение 9 дней, когда происходила индукция энтерита за счет DSS, ежедневно измеряли изменения массы тела мышей в контрольной группе и экспериментальной группе, а на 9 день после подачи DSS мышей подвергали аутопсии с целью измерения длины толстой кишки.
[162] В результате, как показано на фиг. 4, по отношению к изменениям массы тела подтвердилось, что все группы, обработанные штаммами KBL382, KBL384 и KBL385, демонстрировали значимый эффект по отношению к смягчению потери массы тела по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения; по отношению к изменениям длины толстой кишки во всех группах, получавших три штамма, отмечено значимое улучшение степени уменьшения длины толстой кишки по сравнению с мышами в контрольной группе.
[163] Кроме того, выполнили H&E-окрашивание с целью измерения степени воспаления в экспериментальных группах штаммов KBL382 и KBL385 и измеряли уровни миелопероксидазы (MPO) в тканях. После аутопсии для оценки поражения толстой кишки посредством H&E-окрашивания дистальную часть толстой кишки фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина, а затем получали образцы парафинизированной ткани толщиной 5 мкм, окрашенные гематоксилином и эозином, и осматривали их под оптическим микроскопом. Затем для измерения MPO ткань толстой кишки вначале помещали в буфер RIPA, в который добавляли ингибитор протеазы, а затем измельчали с помощью гомогенизатора. После центрифугирования разрушенной ткани при 4°C и 15000 × g в течение 10 минут измеряли MPO в супернатанте в соответствии с протоколом набора для твердофазного ИФА Hycult Biotech, MPO мыши, № по каталогу HK210-02).
[164] В результате, как показано на фиг. 4, эксперимент с H&E-окрашиванием подтвердил, что экспериментальные группы, получавшие два штамма KBL382 и KBL385, характеризовались смягчением воспаления по сравнению с контрольной группой, а уровень MPO был незначительно снижен в экспериментальной группе KBL385 и значимо снижен в экспериментальной группе KBL382. Полученные таким образом ткани толстой кишки использовали для подтверждения эффекта укрепления плотных контактов в стенке кишечного тракта.
[165]
[166] Пример 5. Влияние штаммов Lactobacillus paracasei KBL382 и KBL385 на укрепление плотных контактов стенки кишечного тракта
[167] С целью проверки влияние штаммов Lactobacillus paracasei KBL382 и KBL385 на укрепление плотных контактов стенки кишечного тракта выполнили сравнение и измерение уровней экспрессии мРНК генов, вовлеченных в плотные контакты стенки кишечного тракта в клетках, выделенных из ткани толстой кишки мыши в примере 4. С целью количественной проверки экспрессии генов вначале из тканей выделяли РНК с использованием набора для выделения общей РНК без ДНК easy-spin™ (DNA free) Total RNA Extraction Kit (Intron), а затем синтезировали кДНК с помощью набора для получения кДНК из РНК High Capacity RNA-to-cDNA Kit (ThermoFisher). Для измерения in vivo уровня экспрессии мРНК плотного контакта-1 (ZO-1), клаудина-3 и MUC-4, являющихся маркерными белками плотных контактов стенки кишечного тракта, использовали набор для ПЦР Rotor-gene SYBR green (Qiagen) и Rotor-Gene Q (Qiagen). В качестве контроля для нормировки по относительному уровню экспрессии генов между экспериментальными группами измеряли уровень экспрессии гена гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (HPRT). Праймер, использованный для подтверждения экспрессии, предусматривал возможность специфичного связывания с каждым геном следующим образом.
[168]
[169] Zo-1
[170] Прямой: 5'-ACC CGA AAC TGA TGC TGT GGA TAG-3' (SEQ ID No. 14)
[171] Обратный: 5'-AAA TGG CCG GGC AGA ACT TGT GTA-3' (SEQ ID No. 15)
[172]
[173] Клаудин-3
[174] Прямой: 5'-CAG ACG TCC GTC AGT TTT CG-3' (SEQ ID No. 16)
[175] Обратный: 5'-CAT GGC TGC TGG ACT TGA AC-3' (SEQ ID No. 17)
[176]
[177] MUC-4
[178] Прямой: 5'-GTC TCC CAT CAC GGT TCA GT-3' (SEQ ID No. 18)
[179] Обратный: 5'-TGT CAT TCC ACA CTC CCA GA-3' (SEQ ID No. 19)
[180]
[181] HPRT
[182] Прямой: 5′-TTA TGG ACA GGA CTG AAA GAC-3′' (SEQ ID No. 20)
[183] Обратный: 5′-GCT TTA ATG TAA TCC AGC AGG T-3′' (SEQ ID No. 21)
[184]
[185] В результате, как показано на фиг. 5, обнаружено, что уровни трех генов, измеренных у мышей, получавших штаммы KBL382 и KBL385, были повышены по сравнению с контрольной группой, получавшей только PBS, за счет чего восстанавливались плотные контакты стенки кишечного тракта; соответственно, указанные штаммы можно применять для лечения таких заболеваний, как IBD и IBS.
[186]
[187] Пример 6. Сравнение эффектов терапевтического антитела для лечения энтерита и KBL382 в отношении смягчения энтерита
[188] Инфликсимаб (название продукта Remicade) представляет собой лекарственное средство на основе терапевтического рекомбинантного антитела, используемый в виде инъекций при таких аутоиммунных заболеваниях, как ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит, язвенный колит, болезнь Крона у детей, псориаз и псориатический артрит. Цель настоящего исследования заключалась в подтверждении различий в эффекте смягчения симптомов заболевания кишечника in vivo между штаммом KBL 382 и инфликсимабом.
10
9
[189] Для сравнения этих эффектов после разделения мышей C57BL/6 на группы по восемь мышей им давали водопроводную воду с 2% раствором DSS в течение 9 дней, вызывая у них энтерит. В то же время мышам в контрольной группе раз в день перорально вводили 200 мкл PBS, в то время как мышам в экспериментальной группе раз в день перорально вводили 200 мкл штамма KBL382, разбавленного PBS до концентрации 2 × 10 КОЕ/мл, так что ежедневно вводимое количество можно было задать как 4 × 10 КОЕ. В группе, получавшей терапевтическое антитело, в 3 день однократно вводили антитело инфликсимаб в дозе 5 мг/кг на мышь.
[190] Затем в течение 9 дней, когда происходила индукция энтерита за счет DSS, ежедневно измеряли изменения массы тела мышей в контрольной группе и экспериментальной группе, а на 9 день после подачи DSS мышей подвергали аутопсии с целью измерения длины толстой кишки.
[191] В результате, как показано на фиг. 6(А), в отношении изменения длины толстой кишки подтвердили значительное улучшение степени уменьшения длины толстой кишки в группах, получавших штамм KBL382 и инфликсимаб, по сравнению с мышами в контрольной группе. Эксперимент подтвердил, что эффект улучшения длины толстой кишки в группе, получавшей штамм KBL382, был аналогичным или даже более высоким, чем в группе, получавшей инфликсимаб.
[192] Как показано на фиг. 6(В), в отношении изменения массы тела подтвердили значительное улучшение влияния на снижение массы тела в группах, получавших штамм KBL382 и инфликсимаб, по сравнению с мышами в контрольной группе, не получавшими лечения. Исследование подтвердило, что эффект смягчения потери массы тела в течение пяти дней после введения был выше в группе, получавшей инфликсимаб, по сравнению с группой, получавшей штамм KBL382, однако в дальнейшем благоприятный эффект инфликсимаба снижался, в то время как эффект в отношении потери массы тела в группе, получавшей штамм KBL382, увеличивался, демонстрируя аналогичные эффекты между двумя группами вплоть до 9 дня. Соответственно, в отношении применения указанного штамма для лечения воспалительных заболеваний кишечника и синдрома раздраженного кишечника исследование подтвердило возможность получения эффекта, аналогичного действию доступных для приобретения терапевтических антител.
[193]
[194] Пример 7. Влияние KBL382 на смягчение атопических состояний
[195] С целью проверки смягчающего влияния штамма KBL382 на атопические состояния использовали мышей NC/Nga - модель атопического заболевания кожи у животных.
9
[196] После разделения мышей NC/Nga на группы по девять мышей на спине каждой мыши от нижней части уха до верхней части хвоста удаляли шерсть и оставляли мышей на 24 часа. Затем на участок с удаленной шерстью раз или два в неделю в течение семи недель наносили мазь, содержащую экстракт Dermatophagoides farinae (DFE), антиген клеща домашней пыли (HDM), так что каждая мышь могла получить 100 мг DFE, тем самым вызывая у них атопический дерматит. С третьей недели индукции дерматита мышам в контрольной группе раз в день перорально вводили 200 мкл PBS; мышам в экспериментальной группе раз в день перорально вводили каждый из штаммов KBL382 и Lactobacillus rhamnosus KBL365, разбавленный 200 мкл PBS до концентрации по меньшей мере 1 × 10 КОЕ/мышь, в количестве 200 мкл. Затем в течение четырех недель введения бактерий еженедельно измеряли балльный показатель дерматита у мышей в контрольной и экспериментальной группе, и на 4 неделе после введения бактерий измеряли время почесывания мышей, толщину кожи и концентрацию IgE в крови после выполнения аутопсии.
[197]
[198] 7-1. Выполнение балльной оценки дерматита
[199] Для оценки поражений кожи, вызванных DFE, измеряли балльный показатель дерматита следующим образом. Состояние кожи отслеживали, получая снимки в течение 4 недель с недельным интервалом, начиная с 3 недели после введения штамма. Проверяли четыре показателя - сухость, отек, эритему/кровотечение и эрозию/отделение кожи. Общий балльный показатель оценивали как 0 баллов при отсутствии очагов, 1 балл при легком, 2 балла при умеренном и 3 балла при тяжелом поражении.
[200] В результате, как показано на фиг. 7(A), балльный показатель дерматита значимо снижался в группе, получавшей штамм KBL382, по сравнению с контрольной группой (отрицательный контроль), где индуцировали атопический дерматит, и группой, получавшей штамм KBL365. В результате подтвердили влияние приема штамма KBL382 на балльный показатель смягчения атопического дерматита.
[201]
[202] 7-2 Влияние на смягчение симптомов зуда
[203] С целью проверки смягчающего влияния на зуд при введении штамма KBL382 мышиным моделям, страдающим атопическим дерматитом, вызванным DFE, измеряли количество почесываний мыши в течение 10 минут через 4 недели после введения штамма.
[204] В результате, как можно видеть на фиг. 7(B), оказалось, что количество почесываний значимо снизилось в экспериментальной группе, получавшей KBL382, по сравнению с группой, получавшей PBS, что подтвердило смягчение симптомов зуда при атопическом дерматите за счет введения штамма KBL382.
[205]
[206] 7-3. Уменьшение толщины кожи
[207] С целью проверки эффекта уменьшения толщины кожи после введения KBL382 мышиным моделям, страдающим атопическим дерматитом, вызванным DFE, штангенциркулем измеряли толщину уха мыши и толщину кожи на спине через четыре недели после введения штамма и наблюдали снижение симптомов отека вследствие атопического дерматита. В результате, как можно видеть на фиг. 7(C), в экспериментальной группе, получавшей KBL382, наблюдали значимое уменьшение толщины уха и кожи по сравнению с контрольной группой и группой, получавшей KBL365.
[208]
[209] 7-4. Уменьшение концентрации IgE в крови
[210] Обнаружено, что концентрация IgE у пациентов с атопическим дерматитом в основном увеличивалась с увеличением клинической тяжести атопического дерматита (Matsumoto M, J. Immunol. 1999). Поэтому концентрацию IgE, типичного гематологического фактора, появляющегося при атопическом дерматите, измеряли путем сбора крови через три недели после введения штамма, отделяя сыворотку и используя набор для твердофазного ИФА IgE мыши (№ по каталогу 555248, BD OptEIA™). В результате, как показано на фиг. 7(D), обнаружили, что концентрация IgE в крови значимо снижалась в экспериментальной группе, перорально получавшей KBL382, что указывало на эффект лечения атопического дерматита после приема KBL382.
[211]
[212] Специфические аспекты настоящего изобретения подробно описаны выше, и для специалистов в данной области техники очевидно, что эти специфические аспекты являются лишь конкретными вариантами реализации, которые не ограничивают рамки настоящего изобретения. Напротив, рамки настоящего изобретения в значительной степени определяются следующей формулой изобретения с эквивалентами пунктов формулы изобретения.
[213]
[214] Название депонирующей организации: Корейский исследовательский институт биологических наук и биотехнологии (Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology)
[215] Идентификационный номер: KCTC13509BP
[216] Дата доступа: 20180417
[217]
[218] Название депонирующей организации: Корейский исследовательский институт биологических наук и биотехнологии (Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology)
[219] Идентификационный номер: KCTC13510BP
[220] Дата доступа: 20180417
[221]
[222] Название депонирующей организации: Корейский исследовательский институт биологических наук и биотехнологии (Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology)
[223] Идентификационный номер: KCTC13511BP
[224] Дата доступа: 20180417
[225]
Возможность промышленного применения
[226] Штаммы Lactobacillus paracasei KBL382 (идентификационный номер KCTC13509BP), Lactobacillus paracasei KBL384 (идентификационный номер KCTC13510BP) и Lactobacillus paracasei KBL385 (идентификационный номер KCTC13511BP) согласно настоящему изобретению обладают превосходными противовоспалительными и иммуномодулирующими функциями, оказывают выраженный укрепляющий эффект на плотные контакты стенки кишечного тракта, подавляют потерю массы тела и уменьшение длины толстой кишки, вызванные энтеритом, тем самым проявляя терапевтический эффект в отношении энтерита, ослабляют аллергическую клеточную реакцию и значимо смягчают симптомы атопического дерматита, тем самым обеспечивая улучшение при аллергических заболеваниях. Таким образом, одиночный штамм может обеспечивать усиление противовоспалительных эффектов, укрепление иммунитета, улучшение состояния здоровья кишечника и смягчение аллергических заболеваний и, таким образом, его можно применять в качестве материала-пробиотика.
[227]
Текст списка последовательностей
[228] Электронный файл списка последовательностей прилагается
--->
<110>    Ko BioLabs, Inc.
< 120> Штамм Lactobacillus paracasei и его применение
<130>    PP-B2198
<150>    KR 10-2018-0053279
<151>  19.05.2018
<160>    21
<170>    KoPatentIn 3.0
<210>    1
<211>    1472
<212>    ДНК
<213>    Lactobacillus paracasei
<400>    1
gcaggtggcg ggtgctatac atgcagtcga cgagttctcg ttgatgatcg gtgcttgcac         60
cgagattcaa catggaacga gtggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgccctta        120
agtgggggat aacatttgga aacagatgct aataccgcat agatccaaga accgcatggt        180
tcttggctga aagatggcgt aagctatcgc ttttggatgg acccgcggcg tattagctag        240
ttggtgaggt aatggctcac caaggcgatg atacgtagcc gaactgagag gttgatcggc        300
cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca        360
caatggacgc aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggcttt cgggtcgtaa        420
aactctgttg ttggagaaga atggtcggca gagtaactgt tgtcggcgtg acggtatcca        480
accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt        540
tatccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc        600
cctcggctta accgaggaag cgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag        660
tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg        720
cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcga acaggattag        780
ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg aatgctaggt gttggagggt ttccgccctt        840
cagtgccgca gctaacgcat taagcattcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac        900
tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac        960
gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatctt ttgatcacct gagagatcag gtttcccctt       1020
cgggggcaaa atgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt       1080
taagtcccgc aacgagcgca acccttatga ctagttgcca gcatttagtt gggcactcta       1140
gtaagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct       1200
tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga gaccgcgagg       1260
tcaagctaat ctcttaaagc cattctcagt tcggactgta ggctgcaact cgcctacacg       1320
aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt       1380
gtacacaccg cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc gaagccggtg gcgtaaccct       1440
ttagggagcg agcgtctaag tggctcacgc ct                                     1472
<210>    2
<211>    1479
<212>    ДНК
<213>    Lactobacillus paracasei
<400>    2
gccagtgggg ggggtgctat acatgcagtc gaacgagttc tcgttgatga tcggtgcttg         60
caccgagatt caacatggaa cgagtggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgccc        120
ttaagtgggg gataacattt ggaaacagat gctaataccg catagatcca agaaccgcat        180
ggttcttggc tgaaagatgg cgtaagctat cgcttttgga tggacccgcg gcgtattagc        240
tagttggtga ggtaatggct caccaaggcg atgatacgta gccgaactga gaggttgatc        300
ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt        360
ccacaatgga cgcaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggc tttcgggtcg        420
taaaactctg ttgttggaga agaatggtcg gcagagtaac tgttgtcggc gtgacggtat        480
ccaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag        540
cgttatccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa        600
agccctcggc ttaaccgagg aagcgcatcg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga        660
cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga        720
aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa gcatgggtag cgaacaggat        780
tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg atgaatgcta ggtgttggag ggtttccgcc        840
cttcagtgcc gcagctaacg cattaagcat tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga        900
aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc        960
aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cttttgatca cctgagagat caggtttccc       1020
cttcgggggc aaaatgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg       1080
ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tgactagttg ccagcattta gttgggcact       1140
ctagtaagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc       1200
ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta caacgagttg cgagaccgcg       1260
aggtcaagct aatctcttaa agccattctc agttcggact gtaggctgca actcgcctac       1320
acgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcacgccg cggtgaatac gttcccgggc       1380
cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gtttgtaaca cccgaagccg gtggcgtaac       1440
cctttaggga gcgagccgtc taaggtgaac caaagtttg                              1479
<210>    3
<211>    1473
<212>    ДНК
<213>    Lactobacillus paracasei
<400>    3
gcagttgggg gggagctata catgcagtcg acgagttctc gttgatgatc ggtgcttgca         60
ccgagattca acatggaacg agtggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgccctt        120
aagtggggga taacatttgg aaacagatgc taataccgca tagatccaag aaccgcatgg        180
ttcttggctg aaagatggcg taagctatcg cttttggatg gacccgcggc gtattagcta        240
gttggtgagg taatggctca ccaaggcgat gatacgtagc cgaactgaga ggttgatcgg        300
ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc        360
acaatggacg caagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggctt tcgggtcgta        420
aaactctgtt gttggagaag aatggtcggc agagtaactg ttgccggcgt gacggtatcc        480
aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg        540
ttatccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag        600
ccctcggctt aaccgaggaa gcgcatcgga aactgggaaa cttgagtgca gaagaggaca        660
gtggaactcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag        720
gcggctgtct ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg aacaggatta        780
gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgat gaatgctagg tgttggaggg tttccgccct        840
tcagtgccgc agctaacgca ttaagcattc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa        900
ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa        960
cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatct tttgatcacc tgagagatca ggtttcccct       1020
tcgggggcaa aatgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg       1080
ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatg actagttgcc agcatttagt tgggcactct       1140
agtaagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc       1200
ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggatggtaca acgagttgcg agaccgcgag       1260
gtcaagctaa tctcttaaag ccattctcag ttcggactgt aggctgcaac tcgcctacac       1320
gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct       1380
tgtacacacc gcccgtcaca ccatgagagt ttgtaacacc cgaagccggt ggcgtaaccc       1440
tttagggagc gagccgtcta agtgtacaaa gtt                                    1473
<210>    4
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    4
ccagcagaga atggaaagtc                                                     20
<210>    5
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    5
gatgcttctt acatgtctcg                                                     20
<210>    6
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    6
ccccaaggaa ttgacagttg                                                     20
<210>    7
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    7
gggaaactaa agctcacaaa c                                                   21
<210>    8
<211>    19
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    8
ctgcaatgcc tgtgggctc                                                      19
<210>    9
<211>    19
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    9
gactgcaggg actctcgct                                                      19
<210>    10
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    10
aagactcatc gccaaagcat                                                     20
<210>    11
<211>    19
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    11
tccacatgct ggctacaca                                                      19
<210>    12
<211>    17
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    12
tcaagcactg ccaggcg                                                        17
<210>    13
<211>    18
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    13
caggagccct tgtcggat                                                       18
<210>    14
<211>    24
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    14
acccgaaact gatgctgtgg atag                                                24
<210>    15
<211>    24
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    15
aaatggccgg gcagaacttg tgta                                                24
<210>    16
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    16
cagacgtccg tcagttttcg                                                     20
<210>    17
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    17
catggctgct ggacttgaac                                                     20
<210>    18
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    18
gtctcccatc acggttcagt                                                     20
<210>    19
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    19
tgtcattcca cactcccaga                                                     20
<210>    20
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    20
ttatggacag gactgaaaga c                                                   21
<210>    21
<211>    22
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    21
gctttaatgt aatccagcag gt                                                  22
<---