Молекулярное вычислительное устройство на основе существенно-некомплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот с низкой аффинностью друг к другу (варианты)
MOLECULAR COMPUTING DEVICE BASED ON ESSENTIALLY NON-COMPLEMENTARY SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACIDS WITH LOW AFFINITY TO EACH OTHER (OPTIONS)

Описание изобретения
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области молекулярных вычислительных устройств, а именно систем, способных обрабатывать и трансформировать сигналы, представленные в виде различных количественных характеристик наборов (сетов) молекул, согласно различным математическим, алгебраическим, или логическим законам. Индексы рубрики действующей редакции Международной патентной классификации (МПК), к которой относится изобретение: C12Q 1/68, G01N 33/50, H01L 51/00.
Уровень техники
Молекулярные вычислительные устройства (МВУ) могут быть использованы как для вычислительных целей, так и для различных биомедицинских применений: диагностики и терапии заболеваний, а также для реализации интерфейса мозг-компьютер. Например, эти системы могут быть использованы для сложного многофакторного контроля за экспрессии генов (например, системы ДНК-компьютинга) с точки зрения коррекции различных генетических заболеваний, направленной доставки лекарств к клеткам мишеням и т.п.
На данный момент вычислительные системы на основе биомолекул только начинают развиваться. В других областях, таких как медицина, требуются вычислительные системы иного рода. Например, были бы чрезвычайно полезны системы, состоящие из вычислительного модуля, который бы регистрировал присутствие или отсутствие различных сигналов от окружающей среды, а также из действующего модуля, который, в зависимости от результата работы вычислительного модуля мог бы совершать то или иное биологически-осмысленное воздействие, например, убивать раковую клетку в организме. Такие системы требуют передачи информации между вычислительным и действующим модулями. Понятно, что чем больше спектр возможных сигналов вычислительной системы и больше спектр воздействий действующего модуля, тем лучше. Такие воздействия необязательно должны быть обусловлены присутствием каких-либо молекул - это может быть электромагнитное излучение (в т.ч. свет и низкочастотное поле), изменение рН, температура и т.д.
Известен способ (заявка на патент WO 2011116151 (А2) от 22 сентября 2011 г.), в котором используют набор ферментов для проведения биокатализируемой реакции, представляющей собой логическую булеву функцию от полученных «входных» сигналов биомаркеров. При этом генерируется бинарный выходной сигнал, причем сигнал, равный единице означает наличие заболевания или травмы.
Недостатки этого известного способа состоят в том, что:
1) В качестве входных сигналов могут быть использованы только субстраты, кофакторы или продукты действия используемых ферментов. При этом количество комбинаций при использовании ферментов сильно ограничено.
2) В качестве основы логического элемента используют ферменты, множество которых весьма ограниченно.
Известен способ (Патент США 7,745,594 В2, выдан 29 июня 2010 г.), в котором логический элемент представляет собой набор олигонуклеотидов, в котором логические операции совершаются над входными олигонуклеотидами за счет миграции ветви (branch migration) ДНК в составе логического элемента. С помощью различных комбинаций олигонуклеотидов различного строения реализуются различные логические функции.
Недостатки этого известного способа состоят в том, что:
1) Время передачи сигнала чрезвычайно велико за счет низкой скорости вытеснения одним олигонуклеотидом другого по механизму strand displacement (вытеснения цепи), при котором вытесняющий олигонуклеотид (олиг) 1 связывается со свободным концом (toehold) дуплекса ДНК, образованного олигом 2 и олигом 3, за счет своего участка комплементарного олигу 1, постепенно вытесняя олиг 3 из связи с олигом 2.
2) Совместимы с методом вычислений нуклеотидами могут быть только достаточно длинные олигонуклеотиды, как правило, более 15 оснований.
3) Применимость способа для решения задач исключительно булевой алгебры.
Таким образом, требуемый технический результат состоит в создании молекулярного вычислительного устройства, способного производить быстрые вычисления (в течение нескольких минут, а предпочтительнее быстрее 1 минуты); решать больший спектр задач, включающий в себя не только проблемы булевой (цифровой) алгебры, но и различные «аналоговые» алгебраические задачи с непрерывно меняющимся значением переменных, а также оперировать с олигонуклеотидами различной длины, в том числе с короткими олигонуклеотидами менее 10 оснований.
Краткое описание изобретения
Для достижения указанного технического результата предложен молекулярное вычислительное устройство, основанное на неожиданно обнаруженном нами новом механизме хранения информации в нуклеиновых кислотах (ДНК/РНК).
После великого открытия строения надежнейшего из биологических хранилищ информации, ДНК - сложно представить себе какое-то другое более надежное хранилище биомолекулярной информации. За счет высокой специфичности, селективности и аффинности двух комплементарных цепей ДНК, информация упакована надежно с встроенным бэкапом, что позволяет сохранять, считывать и копировать информацию с фантастической точностью недопущения ошибок.
Это надежно упакованная, точно считываемая и копируемая информация, основанная на строгом соответствии (комплементарности) двух цепей ДНК за счет АТГЦ base-pairing и кодонах. Этому посвящено множество исследований - найдены различные системы репарации, отслеживания ошибок и т.п. Настоящее изобретение основывается на открытом нами другом способе хранения информации в ДНК и других молекулах, который с равной эффективностью может реализовываться не на ДНК/РНК, но и на абсолютно любых иных молекулах, т.к. основывается на низкоспецифичных и низкоаффинных взаимодействиях.
А именно, предложено молекулярное вычислительное устройство, включающее в себя, по крайней мере, набор одноцепочечных нуклеиновых кислот, и для которого: численной мерой входных сигналов являются меры, связанные с входными молекулами, численной мерой выходных сигналов являются меры, связанные с выходными молекулами, входные сигналы трансформируются в выходные сигналы в результате взаимодействий между входными молекулами, упомянутыми одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора, и выходными молекулами, отличающееся тем, что упомянутые одноцепочечные нуклеиновые кислоты упомянутого набора имеют низкую аффинность взаимодействия между собой такую, что не менее 0.1% количества каждой из них существует в свободной молекулярной форме, а не входит в состав комплексов с другими молекулами.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, включающее в себя, по крайней мере, набор одноцепочечных нуклеиновых кислот, и для которого: численной мерой входных сигналов являются меры, связанные с входными молекулами, численной мерой выходных сигналов являются меры, связанные с выходными молекулами, входные сигналы трансформируются в выходные сигналы в результате взаимодействий между входными молекулами, упомянутыми одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора, и выходными молекулами, причем, комплексы, образуемые одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора находятся в равновесии (или приходят в равновесие) со свободной молекулярной формой упомянутых одноцепочечных нуклеиновых кислот так, что не менее 0.1% от тотальной концентрации каждой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутого набора находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, предложено молекулярное вычислительное устройство, включающее в себя, по крайней мере, набор одноцепочечных нуклеиновых кислот, и для которого: численной мерой входных сигналов являются меры, связанные с входными молекулами, численной мерой выходных сигналов являются меры, связанные с выходными молекулами, входные сигналы трансформируются в выходные сигналы в результате взаимодействий между входными молекулами, упомянутыми одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора, и выходными молекулами, причем, тотальная концентрация каждой упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты превышает значение константы диссоциации комплексов, образованных данной одноцепочечной нуклеиновой кислотой и другими одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора не более, чем в 100000 раз.
Кроме того, предложено молекулярное вычислительное устройство, включающее в себя, по крайней мере, набор одноцепочечных нуклеиновых кислот, и для которого численной мерой входных сигналов являются меры, связанные с входными молекулами, численной мерой выходных сигналов являются меры, связанные с выходными молекулами, входные сигналы трансформируются в выходные сигналы в результате взаимодействий между входными молекулами, упомянутыми одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора, и выходными молекулами, отличающееся тем, что упомянутые взаимодействия между одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора являются обратимым связыванием не полностью комплементарных между одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора, причем таких, что для любых двух одноцепочечных нуклеиновых кислот упомянутого набора, длина наиболее протяженного связного участка их взаимной комплементарности не превышает 10 оснований.
Кроме того, способ проведения вычислений с помощью вышеописанных молекулярных вычислительного устройств.
Кроме того, способ проведения вычислений с помощью вышеописанных молекулярных вычислительного устройств, включающий в себя следующие шаги: выбор упомянутого набора одноцепочечных нуклеиновых кислот, смешение упомянутого набора с упомянутыми входными молекулами и упомянутыми выходными молекулами, если они не являются частью упомянутого набора, инкубация смеси для обеспечения взаимодействий между входными молекулами, упомянутыми одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора и упомянутыми выходными молекулами и трансформации входных сигналов в выходные в результате упомянутых взаимодействий, регистрация упомянутого выходного сигнала.
Кроме того, предложены фармацевтические формуляции, включающие в себя описанные МВУ для регуляции экспрессии генов.
Словарь
Для облегчения понимания сути данного изобретения, здесь (ранее и далее в этом тексте) используются следующие термины:
Свободная молекулярная форма - состояние молекулы, в котором она не связана (не образует комплекса/не ассоциирована) с другими молекулами. Данное понятие может рассматриваться в статистическом контексте, т.е. наблюдается за ансамблем идентичных молекул данного типа, например, все олигонуклеотиды ACTGTAC. Понятно, что эти молекулы находятся в равновесном процессе образования-распада комплекса с другими олигонуклеотидами. При этом, если есть второй взаимодействующий с первым олигонуклеотид, то, скорее всего, каждая молекула ACTGTAC время от времени периодически будет состоять в комплексе со вторым нуклеотидом. В этом смысле в свободной форме понимается процент молекул ACTGTAC, находящихся в несвязанном состоянии.
Слабая (низкая) аффинность - такая взаимная аффинность двух молекул, при которой молекулы находятся в такой концентрации, что существенная часть этих молекул находится в свободной молекулярной форме (в нашем случае, не менее 0.01% молекул, предпочтительнее 0.02%, предпочтительнее 0.05%, предпочтительнее 0.1%, предпочтительнее 0.2%, предпочтительнее 0.5%, предпочтительнее 1%, предпочтительнее 2%, предпочтительнее 5%, предпочтительнее 10%, предпочтительнее 20%). Как показано далее, количество молекул в свободной молекулярной форме взаимосвязано с концентрациями молекул и константами аффинности с другими молекулами согласно закону действующих масс. Чтобы пояснить общую связь константы аффинности двух молекул А, В и частью этих молекул в свободной молекулярной форме, приведем следующие рассуждения. Согласно закону действующих масс в равновесии:
:
При этом, допустим для простоты, что тотальная (или начальная концентрация молекул А и В при смешивании) одинакова и равна [А]0. Обозначим равновесную концентрацию комплекса АВ как [AB]eq. Тогда равновесная концентрация [A]eq=[B]eq=[A]0-[AB]eq. Решая уравнения, получим, что в молекулярной свободной форме будет следующая часть А:
Обратим внимание, что олигонуклеотиды часто образуют димеры и многочисленные ассоциаты сами с собой. Поэтому перевод значения [А в комплексе, %] (которые, например, приведены в Примерах реализации изобретения) в константу диссоциации должен учитывать и такие многомеры, образованные только молекулами А или только молекулами В. Однако в первом приближении (для определения порядка константы), можно пользоваться и приведенной формулой и таблицей.
-8
-6
-8
-10
-28
-18
Как видно, из Фиг. 1, даже самые неаффинные полиА-полиТ олигонуклеотиды длиной 20 оснований, в случае комплементарности достигают Kd около 10-16 М. Соответственно при стандартных концентрациях, используемых в области ДНК-вычислений (10-10 М), отношение Kd[А]0=10-10, соответственно менее 0.001-0.01% молекул будет присутствовать в свободной молекулярной форме. Более аффинные комплементарные варианты той же длины, например, полиG-полиС -достигают Kd около 10М. Соответственно, чтобы хотя бы 0.001% молекул оставалось в свободной молекулярной форме, концентрация молекул [А]0 должна быть менее 10 М, т.е. 6000 молекул на миллилитр. Удивительно, но даже при такой концентрации, в 1 миллилитре раствора в молекулярной форме не останется ни одной молекулы (6000*0.001%=0.06)!
Паразитная аффинность - такая взаимная аффинность двух молекул, при которой молекулы находятся в такой концентрации, что малая часть этих молекул находится в свободной молекулярной форме (в нашем случае, не более 20%, предпочтительнее 10%, предпочтительнее 5%, предпочтительнее 2%, предпочтительнее 1%, предпочтительнее 0.5%, предпочтительнее 0.2%, предпочтительнее 0.1%, предпочтительнее 0.05%, предпочтительнее 0.02%, предпочтительнее 0.01%, предпочтительнее 0.005%, предпочтительнее 0.002%, предпочтительнее 0.001%). Понятно, что концентрация молекул в свободной молекулярной форме может быть пересчитана в отношение констант диссоциации комплексов молекулы с другими молекулами системы согласно закону действующих масс как показано выше.
Невзаимодействие молекул - в данном случае, подразумевается, что данные молекулы обладают паразитной аффинностью друг к другу.
Существенно-некомплементарные: под существенной-некомплементарностью двух нуклеиновых кислот подразумевается хаотическое (спорадическое и т.п.) несоответствие (с точки зрения комплементарности) нуклеотидов на протяжении их последовательностей. Причем, процент таких некомплементарных оснований существенен по отношению к общей длине нуклеиновой кислоты - 2%, предпочтительнее 5%, предпочтительнее 10% и более. Причем, чем длиннее олигонуклеотиды, тем процент должен быть выше. Понятно, что это существенно отличается от частичной некоплементарности в системах основанных на феномене strand displacement, в которых используются липкие концы (dangling ends) показанные на Фиг. 1, т.е. когда длительная комплементарная последовательность фланкируется длительной некомплементарной последовательностью. Так же, в силу большого процента некомплементарных оснований, это существенно отличается от традиционных однонуклеотидных полиморфизмов SNP (single nucleotide polymorphism).
Пороговое значение выходного сигнала - это такое значение сигнала, которое соответствует границе между значением выхода =1 и значением выхода =0. Оно используется для перевода аналогового сигнала в бинарный цифровой. Так как молекулярные системы являются аналоговыми устройствами (то есть сигнал может непрерывно меняться от малого до большого значения), то для классификации выходного сигнала в качестве булевой Правда или Лжи, и используют пороговое значение (threshold). Для различных применений в качестве такого порогового значения могут использоваться различные стратегии. В качестве порогового значения во всех приведенных примерах, используется среднее значение между максимальным и минимальным выходными сигналами среди всех достигаемых входными комбинациями.
Под формуляциями могут пониматься как вещества, субстанции, молекулы, надмолекулярные агенты, наночастицы, микрочастицы, наноагенты, микроагенты, формуляции, лекарственные формы, и т.п., которые используются как для терапии, так и диагностики различных заболеваний или состояний организма или пациента, в т.ч. включают в себя метки, контрастные агенты, компоненты с контролируемым высвобождением, парамагнитные и магнитные агенты, цитотоксические агенты, и т.п.
«Мера» - под «мерой, связанной с какой-то молекулой», подразумевают какое-либо числовое или иное значение, которое может считаться входом вычислительного устройство, связанное с самой молекулой или ее параметрами. Такое числовое значение входа может непосредственно равнять численному значению параметра (например, концентрации), либо соотносится с ним согласно определенному правилу - например, при превышении определенного порогового значения концентрации, вход считается =1, в противном случае вход =0. В качестве таких параметров может выступать последовательность нуклеиновой кислоты, ее длина, концентрация, масса, параметры ее комплексов с другими молекулами и т.п.
Равновесие со свободной молекулярной формой - имеется в виду равновесие в термодинамическом смысле.
Используемый здесь термин «фармацевтический» относится к композиции, которая полезна при лечении заболевания или симптома заболевания.
Термин «лечение» или «терапия» (treating, treatment, therapy) относятся к любым признакам успеха при лечении или улучшении заболевания, травм, патологии или состояния, включая любые объективные или субъективные параметры, такие как уменьшение; ремиссия; уменьшение симптомов или замедление ухудшения состояния больного, патологии или состояния пациента; замедление темпов дегенерации; что делает финальную стадию заболевания менее мучительной; улучшение физического или психического благополучия пациента. Лечение или улучшение симптомов могут основываться на объективных или субъективных параметрах; включая результаты физического обследования, нейропсихиатрических экзаменов и/или психиатрической оценки. Например, определенные методы, представленные здесь, могут успешно лечить рак, уменьшая заболеваемость раком и вызывая ремиссию рака. Термин «лечение» и его продолжения включают профилактику травмы, патологии, состояния или заболевания.
«Болезнь» или «состояние» относятся к состоянию здоровья пациента или субъекта, подлежащему лечению различными лекарственными средствами, дисперсиями, или другими методами представленными в настоящем документе.
«Пациент» или «нуждающийся в этом субъект» относится к живому организму, страдающему или (возможно) склонному к заболеванию или состоянию, которое можно лечить путем введения лекарства, фармацевтической композиции или агента, как указано в настоящем документе. Неограничивающие примеры включают людей, других млекопитающих, быков, крыс, мышей, собак, обезьян, коз, овец, коров, оленей и других животных, не относящихся к млекопитающим. В частности, пациент может быть человеком.
Необходимо отметить, что приведенные константы взаимодействия различных олигонуклеотидов в рамках Описания и Примеров рассчитаны для взаимодействий при температуре 25 градусов Цельсия.
Следует отметить, что во всей заявке альтернативы записаны в группах Маркуша, например, каждое положение терапевтического агента, может содержать более одного возможного терапевтического агента. В частности, предполагается, что каждый член группы Маркуша следует рассматривать отдельно, тем самым, содержащий другой вариант осуществления, и группа Маркуша не должна читаться как единое целое.
Осуществление изобретения. Подробное описание воплощений изобретения.
Характеристики и преимущества молекулярного вычислительного устройства согласно данному изобретению будут далее проиллюстрированы в следующем подробном описании. Хотя изготовление и использование различных вариантов настоящего изобретения подробно обсуждается ниже, следует понимать, что настоящее изобретение обеспечивает множество применимых изобретательских концепций, которые могут быть воплощены в широком спектре конкретных контекстов. Конкретные варианты осуществления, обсуждаемые здесь, просто иллюстрируют различные способы создания и использования изобретения и не ограничивают объем изобретения. Все содержание приведенных здесь (ранее и далее) включено в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте для всех целей.
Открытие двухцепочечного строения ДНК и генетического кода перевернуло представление биологов о хранении наследственной информации. Высокая специфичность и аффинность взаимодействия двух цепей ДНК друг с другом - удивительный механизм, придуманный природой для передачи данных от одного организма другому. Кодирование генетической информации с помощью линейной последовательности букв АТГЦ в двух цепях, в которых букве А на одной цепи строго соответствует Т на другой, а букве Г - буква Ц, - крайне удобный механизм, предоставляющий возможность крайне эффективно копировать информацию, а также и надежно ее хранить, исправляя случайные ошибки за счет двух версий одной и той же информации в едином неразрывном биомолекулярном комплексе.
Тем не менее, смотря на все загадки ДНК (например, наличие некодирующей ДНК/РНК, в т.ч. малых некодирующих олигонуклеотидов, неожиданная апрегуляция генов малыми РНК) возникает вопрос - при всей мощи ДНК - а не хранит ли ДНК/РНК информацию как либо еще - по какому-то механизму, который пока не известен и не обнаружен, для которого и были бы нужны все эти непонятные нам сущности?
Эта загадка воодушевляет различных исследователей искать альтернативные пути хранения информации в нуклеиновых кислотах и ее обработки. Так, были предложены различные системы, основанные на феноменах вымещения цепи (strand displacement), DNAzymes и т.п. Кроме того, активно идет поиск и ненуклеиновых молекулярных вычислительных систем работы с информацией.
Однако существующие методы рассматривают передачу информации от между молекулами в внутри Парадигмы высокоспецифичных взаимодействий, в рамках которой живые системы представляют как набор молекул, передающих полезную информацию с помощью высокоселективных взаимодействий. В частности, упомянутые системы ДНК компьютинга также базируются на комплементарности двух цепей ДНК - для обеспечения stand displacement реакций и специфичности ДНКзимов (как показано на Фиг. 1 снизу). Более того, выделяют так называемые молекулярные пути (molecular pathways), по которым распространяется сигнал от одной молекулы к другой.
Мы обнаружили принципиально иной и крайне эффективный механизм хранения и обработки информации в молекулярных системах. В обнаруженном механизме молекулы передают информацию наоборот, с помощью слабых аффинных взаимодействий друг с другом.
В принципе, данный механизм обработки информацией может быть реализован любыми молекулами, но он особенно эффективен при реализации с помощью нуклеиновых кислот.
Мы заметили уникальную особенность ДНК/РНК, красота которой долго оставалась незамеченной в тени двойной спирали ДНК. Возьмем одноцепочечный олигонуклеотид X. Обычно, комплементарный ему олигонуклеотид имеет максимальную аффинность среди всех других цепей такой же длины. Но если взять все возможные олигонуклеотиды (с такой же как у X длиной) и отсортировать их по аффинности к X, то мы получим плотно упакованный «континуум аффинностей» (affinity continuum).
Фиг. 2 показывает плотность этого континуума для ДНК длиной 10 оснований, рассчитанную с помощью алгоритма вычисления аффинности двух цепей ДНК NUPACK (unpack.org). Оказывается, что даже для таких коротких ДНК, для любого выбранного значения константы аффинности К можно подобрать олигонуклеотид, который будет иметь константу аффинности к X равную K+- 10% (за исключением 25 минимальных/максимальных значений аффинности).
X
Более того, Фиг. 3 показывает, что столь же плотную упаковку олигонуклеотидов по аффинностям имеет распределение по отношению сразу к двум олигонуклеотидам - X и комплементарному ему , либо же к X и произвольному Y. Видно, что аффинности образуют «многомерный континуум», среди которого может быть выбран олигонуклеотид с желаемой аффинностью сразу ко многим олигонуклеотидам.
Данная особенность ДНК/РНК является ключом к обнаруженному нами новому механизму хранения информации в молекулярных системах.
Посмотрим на то, что происходит в смеси коротких одноцепочечных молекул ДНК, если специально убрать оттуда все комплементарные цепи (т.е. удалить из рассмотрения вообще все «специфичные» взаимодействия - т.е. для каждого рецептора не использовать «специфичный» для него лиганд). В смеси при этом останутся олигонуклеотиды слабоаффинно и обратимо связывающиеся друг с другом согласно закону действующих масс. При этом одновременно будут сосуществовать различных комплексы одной цепи со всеми другими, причем их возможно будет меньше, чем свободных молекул. Такие взаимодействия можно легко встретить на белках переносчиках типа БСА и малых молекул, которые конкурируют за связывание с гидрофобным карманом белка.
Отличие такой системы от традиционной парадигмы хранения информации в специфичных (комплементарных) взаимодействиях показано на Фиг. 4 (ср. с Фиг. 1)
Математически такая система будет описываться системой уравнений взаимодействия молекул ансамбля. В самом простом случае предполагающем, что могут образовываться лишь двухкомпонентные ассоциаты, а также рассматривая термодинамически равновесные системы, мы получим систему уравнений, показанную на Фиг. 4.
Настоящее изобретение показывает возможность создания молекулярных вычислительных устройств (МВУ), функционирующих на основе этой нелинейной системы уравнений. Данные МВУ хранят и обрабатывают информацию вне стандартной парадигмы высокоспецифичных взаимодействий.
В настоящем изобретении предложенные молекулярные вычислительные устройства хранят, обрабатывают информацию с помощью ансамбля молекул, между которыми существует множество слабых низкоаффинных и слабоспецифичных (неспецифичных) взаимодействий, а передача сигнала от входных молекул к выходным передается за счет изменения концентраций (равновесных или неравновесных) свободных компонент ансамбля и их комплексов.
МВУ, реализующие булеву алгебру
Согласно данному изобретению, создание МВУ, имплементирующих компоненты для решения задач булевой алгебры (которая является основой функционирования электронных компьютеров), строится по следующим правилам.
1) Логический вентиль ДА (YES logic gate). Схема реализации показана на Фиг. 5 и экспериментально показана в Примерах 1-6. МВУ состоит из входного олигонуклеотида I, выходного олигонуклеотида S, и единственного олигонуклеотида Q, обрабатывающего передачу сигнала между входом и выходом. Будем считать мерой выхода, количество S в свободной молекулярной форме (т.е. не в состоянии комплекса с другими олигонуклеотидами). Значение входа =1, если I добавляют в систему, и входа =0, если не добавляют.
Для создания МВУ выбирают олигонуклеотиды I,S,Q так, чтобы Q имел слабую аффинность по отношению к I и Q; a S и I взаимодействовали (см. уточнение этого термина в словаре) друг с другом.
Согласно изобретению, выбирают концентрации I, Q, S в районе констант их взаимодействия (чтобы обеспечить необходимые уровни комплексообразования).
При этом система функционирует следующим образом. Для примера, пусть олиги S и Q взаимодействуют таким образом, чтобы в отсутствии других олиг 90% олиги S было связано с Q. Тогда если мы добавим в их систему I, то он начнет оттягивать на себя часть Q, что в свою очередь увеличит количество свободного S (высвободит из комплекса с Q). При этом, если константы приблизительно одинаковы, то существенного оттягивания можно добиться при превышении концентрации I над S. Другими словами, эффективность перераспределения Q - можно менять выбором констант, а также взаимоотношением концентраций олигонуклеотидов.
2) Логический вентиль НЕТ (NOT logic gate). Схема реализации показана на Фиг. 6 и экспериментально показана в Примере 7. МВУ состоит из входного олигонуклеотида I, выходного олигонуклеотида S, и двух олигонуклеотидов Q и М, обрабатывающих передачу сигнала между входом и выходом. Будем считать мерой выхода, количество S в свободной молекулярной форме (т.е. не в состоянии комплекса с другими олигонуклеотидами). Значение входа =1, если I добавляют в систему, и входа =0, если не добавляют.
Для создания МВУ выбирают олигонуклеотиды I, S, Q, M так, чтобы Q имел слабую аффинность по отношению к I и к Q; М - слабую аффинность к Q и к I; а другие пары не взаимодействовали (см. уточнение этого термина в словаре) друг с другом.
Согласно изобретению, выбирают концентрации I, M, Q, S в районе констант их взаимодействия (чтобы обеспечить необходимые уровни комплексообразования).
При этом система функционирует подобно описанному выше. Без I, Q связан больше с М, чем с S. Когда добавляют в их систему I, то он начнет оттягивать на себя часть М, что в свою очередь увеличивает доступность Q для связывания с S. Эффективность перераспределения Q - можно менять выбором констант, а также взаимоотношением концентраций олигонуклеотидов.
3) Логический вентиль ИЛИ (OR logic gate). Схема реализации показана на Фиг. 7 и экспериментально показана в Примере 8. МВУ состоит из входных олигонуклеотидов In (n=1, 2, 3…), выходного олигонуклеотида S, и единственного олигонуклеотида Q, обрабатывающего передачу сигнала между входом и выходом. Будем считать мерой выхода, количество S в свободной молекулярной форме (т.е. не в состоянии комплекса с другими олигонуклеотидами). Значение входа In=1, если In добавляют в систему, и входа =0, если не добавляют.
Для создания МВУ выбирают олигонуклеотиды I, S, Q так, чтобы Q имел слабую аффинность по отношению к In и к Q; a S и I не взаимодействовали (см. уточнение этого термина в словаре) друг с другом.
Согласно изобретению, выбирают концентрации I, Q, S в районе констант их взаимодействия (чтобы обеспечить необходимые уровни комплексообразования).
При этом система функционирует следующим образом. Тогда если мы добавим систему любой из In, то он начнет оттягивать на себя часть Q, что в свою очередь увеличит количество свободного S (высвободит из комплекса с Q). Эффективность перераспределения Q - можно менять выбором констант, а также взаимоотношением концентраций олигонуклеотидов.
4) Логический вентиль И (AND logic gate). Схема реализации показана на рис. 8 и экспериментально показана в Примере 9. МВУ состоит из входных олигонуклеотидов In (n=1, 2, 3…), выходного олигонуклеотида S, и олигонуклеотидов Qn, обрабатывающего передачу сигнала между входом и выходом. Будем считать мерой выхода, количество S в свободной молекулярной форме (т.е. не в состоянии комплекса с другими олигонуклеотидами). Значение входа In=1, если In добавляют в систему, и входа =0, если не добавляют.
Для создания МВУ выбирают олигонуклеотиды In, S, Qn так, чтобы каждый Qn имел слабую аффинность по отношению к In и к Q; а другие пары взаимодействовали (см. уточнение этого термина в словаре) друг с другом.
Согласно изобретению, выбирают концентрации In, Qn, S в районе констант их взаимодействия (чтобы обеспечить необходимые уровни комплексообразования).
При этом система функционирует следующим образом. Для высвобождения S из комплексов со всеми Qn необходимо добавить все In (иначе Qx, для которых нет Ix свяжутся с S). Эффективность перераспределения можно менять выбором констант, а также взаимоотношением концентраций олигонуклеотидов.
Комбинация принципов построения этих гейтов представляет собой функционально полный набор логических функций (т.е. полный базис). Т.е. с помощью него можно имплементировать сложные булевы функции.
Имплементация сложных систем, построенных на основе булевой алгебры
Ячейка памяти и вычисления квадратного корня:
Примеры 10-11 демонстрируют системы, реализующие ячейку памяти (с возможностью хранения, и запуска считывания) и вычисление корня из 4-битного двоичного числа. Фиг. 9. приводит схему построения соответствующих МВУ, реализующих сложную булеву алгебру.
Необходимо подчеркнуть, что Пример 11 показывает преимущества настоящего изобретения над ранее известными системами молекулярных вычислений. А именно, в 2010 г. Qian и Winfree реализовали МВУ, способное решать ту же задачу (вычислять корень из 4-битного числа), но для передачи/обработки сигнала между входами и выходами по принципу strand displacement им потребовалось использовать 137 олигонуклеотидов, а вычисления заняли более 10 часов. Затем, добились уменьшения числа олигонуклеотидов в системе до 37 олигонуклеотидов и вычисления за 1 час за счет добавления в систему фермента.
МВУ согласно данному изобретению позволяет вычислить корень за 5 минут и используя только 17 олигонуклеотидов (4 из которых - входы).
Управление экспрессией генов, выходящее за рамки традиционной парадигмы ДНК-взаимодействий:
Данное изобретение позволяет создать МВУ, способное влиять на экспрессию генов. Более того, позволяет создать такие МВУ, функционирование которых выходят за рамки традиционной (стандартной, обычной) парадигмы ДНК-взаимодействий, и вообще за рамки современных представлений о влиянии малых нуклеиновых кислот на экспрессию генов.
В настоящее время известно большое количество механизмов влияние малых нуклеиновых кислот на экспрессию генов. Например, известен механизм antisense нуклеиновых кислот, которые могут связываться, например с матричной РНК и за счет такого конкурентного связывания понижать экспрессию данного гена. Кроме того, известны silencing РНК, которые задействуют сложный ферментативный каскад для деградации матричной РНК. Однако, известно, что в определенных случаях попытка подавить экспрессию какого-то определенного гена приводит к подавлению и других, так называемых off-target genes. Предсказать подобные побочные эффекты пытаются за счет сравнения последовательности малой нуклеиновой кислоты (которая должна произвести подавление нужного гена) и других последовательностей в геноме, обладающих достаточным сродством к данной малый нуклеиновой кислоте.
Мы показываем, что с помощью данного изобретения, возможно создать МВУ, которое позволяет определенной малой нуклеиновой кислоте влиять на таргетную последовательность определенного гена, имея с ней:
1) ни одного комплементарного основания без учета сдвигов (т.е. абсолютной некомплементарности)
2) непревышающий максимум комплементарности при учете всех возможных относительных сдвигов:
1 вариант сдвига: 1 тетраплет AGGC; 2 варианта сдвига: 1 дуплет GC; 2 вариант сдвига: 1 дуплет CU.
Такое поведение полностью выходит из традиционной парадигмы хранения информации в ДНК, и вообще рассматриваемых ныне ДНК взаимодействий в живых системах.
Пример 19 показывает пример такого экспериментально созданного молекулярного вычислительного устройства, которое реализует логическую функцию ДА, для увеличения экспрессии гена (выход) при появлении входного нуклеотида для следующих последовательностей:
5'-AGGCGCCCUGAC-3' - таргетная последовательность в мРНК GFP:
3'-AGUCGUCCGAGU-5' (5'-UGAGCCUGCUGA-3') - Входной олигонуклеотид.
Видно, что в виду отсутствующей комплементарности, данный входной олигонуклеотид не может регулировать экспрессию гена напрямую ни по одному известному в рамках традиционной парадигмы взаимодействий нуклеиновых кислот -ни по механизму антисмысловой регуляции (antisense), ни по механизму siRNA (в т.ч. в силу своей малой длины), и т.п.
Тем не менее, Пример 19 показывает эффективную ап-регуляцию (upregulation) экспрессию гена при добавление в систему данного входного олига. Это объясняется тем, что в системе Примера 19, входной олигонуклеотид действует не на сам таргетный участок гена, а на другую короткую РНК, которую он оттягивает от мРНК по механизму логического вентиля ДА, продемонстрированного в Примере 6. Данное изобретение впервые раскрывает механизм апрегуляции экспрессии гена малыми РНК. Причем, видно, что это легко достигается при наличии в системе нескольких малых РНК со слабой взаимной комплементарностью, а также комплементарностью некоторых из них к мРНК. Очевидно, что все МВУ по данному изобретению возможно применить к регуляции экспрессии генов, просто за счет использования в качестве сигнального олигонуклеотида не флуоресцентно меченный модельный, а непосредственно мРНК. Таким образом, очевидно, что данные МВУ могут использоваться для терапии и диагностики заболеваний, т.к. представляют совершенно новый и крайне многофункциональный инструмент регуляции генетической информации.
Кроме того, подобный механизм может реализовываться и если входной молекулой будет являться (комплекс входных молекул будет состоять из) мРНК.
500-битный Логический вентиль И (500-bit Logic AND gate)
Данное изобретение позволяет добиться молекулярных вычислительных устройств, которые способны:
1) быть более эффективными в хранении и обработке информации, чем традиционное представление о хранение информации в первичной последовательности ДНК,
2) конкурировать и даже превосходить электронные устройства.
Пусть дана следующая задача. Есть определенный ген, имеющий определенную последовательность из 20 оснований, на которую можно каким-либо образом повлиять с помощью одноцепочечных олигонуклеотидов того же размера (например упомянутые выше antisense олигонуклеотиды, silencing РНК, и т.п.).
20
12
12
608
183
Тогда, в рамках парадигмы комплементарности ДНК, это последовательность длиной в 20 оснований позволяет в полном максимуме 4≈10 возможностей чтобы на нее повлиять, т.е. существует 10 олигонуклеотидов, которые могут либо связаться, либо не связаться с заданной последовательностью (и подавить/или не подавить экспрессию гена - как описано выше). Пример X показывает МВУ, которое способно реализовать 2≈10 возможностей влияния на такой ген в той же самой постановке. Это существенно больше, чем количество элементарных частиц в видимой вселенной по любой опубликованной на данный момент оценке.
А именно, Пример 12 показывает МФУ, реализующее 500-битный логический вентиль И (500-bit AND logic gate). При этом в случае использования в качестве олигонуклеотида S таргетной последовательности определенного гена, выход данного логического вентиля, а именно, количество свободного от комплексов олигонуклеотида S и будет характеризовать экспрессию гена (как описано выше).
Необходимо отметить, что Фигура 11 (снизу) доказывает возможность создания 608-битного логического вентиля И. Действительно, если рассмотреть работу 100-, 200-, 300, и 500-битного вентилей, видно, что экстраполяция максимальных значений выхода для входов типа «единичный вход=0» и пороговых значений (среднее между входами «все входы=0», «все входы=1») достигается при 608-битном вентиле И.
Необходимо отметить, что на данный момент не реализованы электронные компьютеры с подобной битностью, что говорит о колоссальных вычислительных возможностях предложенного принципа построения МВУ и вообще данного неизвестного ранее феномена/принципа хранения информации в нуклеиновых кислотах.
Элементарная алгебра
Данное изобретение позволяет создавать МВУ, способное обрабатывать данные и для решения различных алгебраических уравнений для непрерывно меняющихся значений переменной. Данное изобретение является первым и на данный момент единственным вариантом создания МВУ, способных решать подобные математические задачи.
Примеры 13-18 показывают различные МВУ, решающие математические уравнения с ошибкой не превышающей 2%.
Различные аспекты изобретения
Необходимо отметить, что обнаруженные феномены и данные изобретения основаны на фундаментальном законе действующих масс, определяющим прохождение различных обратимых реакций, и никак не ограниченно нуклеиновыми кислотами (ДНК/РНК).
Мы продемонстрировали реализацию такого процессинга информации на примере нуклеиновых кислот. Однако, мы не пользоваться никакими «особыми» свойствами ДНК (DNA-specific properties), кроме того, что это единственный тип молекул, между которыми на данный момент достаточно точно предсказывается аффинность двухкомпонентных систем (на основании первичной структуры), а также доступен синтез большого количества веществ и это не представляется проблемой. Реализация таких систем на других молекулах - математически будет столь же работоспособной.
В принципе, данный механизм обработки/передачи информации может быть реализован любыми молекулами, но в случае его реализации с помощью ДНК, процессинг может использовать возможность олига связываться не только с ему комплементарным (ну или с его вариантами содержащими одноосновные полиморфизмы SNP - single nucleotide polymorphisms), а с возможностью слабо ассоциировать с многими другими олигами с последовательностью лишь отдаленно напоминающей комплементарную (см. Фиг. 4).
В то время как современная биология увлеченно осваивает высокоаффинные взаимодействия, наше изобретение реализует и показывает мощь слабоаффинных (низкоаффинных) взаимодействий. Данное изобретение является абсолютно новой концепцией биомолекулярных вычислений, и превосходит по скорости и мощности все известные на настоящий момент.
Данное изобретение может быть использовано для совмещения электронных систем с биологическими. Кроме того, т.к. показанный механизм, в основе которого лежат самые основные и базовые законы химических реакций, может быть задействован природой, причем у нее были миллионы лет на оттачивание данного механизма. Поэтому возможность совмещения МВУ с природными системами на том же механизме дает неоспоримые преимущества данным МВУ.
Хранение информации возможно не только в концентрациях свободных олигонуклеотидов (или иных молекул) и/или комплексов. Но также возможно использовать а) скорость изменения концентраций, особенно, если надо оперировать быстро - типа памяти и т.п., б) мы работали в двоичной системе, но также можно создать МВУ, работающие 1) аналогово, 2) реагирующие на самые малые изменения и 3) хранящие (обрабатывающие) информацию с помощью сложных функциональных зависимостей, которые будут способны хранить сверхбольшие массивы данных.
В приведенных примерах хранение и обработка данных осуществлялась с помощью популярных комплексов или свободных олигонуклеотидов. Помимо этого хранение информации возможно в скоростях изменения концентраций, что позволяет достичь еще большей скорости обработки данных. Кроме того, в приведенных примерах с булевой алгеброй, приведено трактование выходов как правда или ложь (0 или 1), Однако, данные примеры можно рассматривать не как цифровой вариант обработки данных, но и как аналоговый. Точно также Природа использует и непрерывные аналоговые процессы и пороговые процессы (threshold-based ones), например, работа нейронов (neuron firing).
По сравнению с другими молекулярными вычислительными методами, которые позволяют проводить сложные вычисления (т.е. не ограничены несколькими булевыми функциями и способны решать не одну конкретную задачу), уникальное преимущество нашего изобретения в практически полном отсутствии каких-либо ограничений на типы и свойства молекул которые совместимы с нашим подходом. Нет никаких ограничений на отношение входных, выходных и обрабатывающих веществ. В случае ДНК или РНК, это могут быть олигонуклеотиды различных размеров (например, в отличие от концепций, основанных на ДНКзимах), они могут быть очень короткими (например, в отличие от концепции вытеснения цепей - strand displacement), они могут быть вообще не нуклеиновыми кислотами (например, в отличие от концепций, основанных на ДНК-зимах).
Кроме того, как показывает пример с решением математических задач элементарной алгебры, видно, что выбор олигонуклеотидов может быть легко подстроен под практически любые входные и выходные олигонуклеотиды. Данное изобретение дает широкую свободу в подборе как входных, так выходных, так и обрабатывающих олигонуклеотидов. Более того, любое МВУ можно организовать практически для любого наборы входных и выходных олигонуклеотидов за счет широкой тонко подстраиваемой системы обрабатывающих олигонуклеотидов, как это показано в примере с задачами элементарной алгебры.
Особые применения МВУ
Уже сейчас понятно, что малые РНК/ДНК - это важный природный инструмент, для малого количества которых нашли смысл (например, siRNA). Есть различные одноцепочечные олигонуклеотиды, которые выполняют различные функции: от регуляции внутриклеточных процессов, до обеспечения межклеточного общения с помощью экзосом.
Наше изобретение полностью меняет ракурс для их анализа. Мы показываем, что недостаточно биоинформатически выявлять комплементарные последовательности, важно и необходимо смотреть на все потенциальные взаимодействия малых (а в идеале, еще и больших) нуклеиновых кислот. Т.к. «первый рубеж» комплементарных олигонуклеотидов, может быть подвластен контролю существенно большему количеству РНК как в продемонстрированных МВУ.
Биомедицинское значение данного феномена может оказаться крайне важным для диагностики и лечения большого количества заболеваний. Этот феномен (и наше изобретение) необходимо и возможно учитывать и использовать при генной терапии (в т.ч. короткими РНК). Кроме того, изобретение возможно использовать для тонкой многофакторной настройки такой терапии. Его использование обеспечит дополнительный контроль над специфичностью и эффективностью терапии, а также позволит минимизировать риски off-target модификаций в геноме.
Обнаруженным нами механизм хранения информации в ДНК и в более общем случае для любых низкоаффинных взаимодействиях между молекулами, и изобретенные на его основе МВУ могут использовать и применяться в различных быстропротекающих процессах (например, кратковременной памяти), или длительных процессах (например, старения или эволюционных систем).
Существование данного феномена существенно усложняет анализ интерактома, т.е. множества межмолекулярных взаимодействий, которые в традиционной парадигме рассматриваются как молекулярные пути взаимодействий (pathways), основанные на высокоаффинных и специфичных взаимодействиях. Хотя, в данном случае, возможно стоит говорить об отдельном понятии «аффинома» (affinome), который рассматривает, наоборот, множество низкоаффинных взаимодействий, влияющих на различные процессы в живых системах. Анализ такого «аффинома» может потребоваться для понимания полной картины и может приоткрыть тайны многих заболеваний, которые ранее были недоступны и не могли быть адресованы в парадигме высокоаффинных и высокоспецифичных лекарств и анализов.
Различные аспекты воплощения изобретения
Таким образом, в настоящем изобретении предложено молекулярное вычислительное устройство (МВУ) (а также способы проведения вычислений с помощью описанных МВУ), включающее в себя, по крайней мере, набор одноцепочечных нуклеиновых кислот, и для которого: численной мерой входных сигналов являются меры, связанные с входными молекулами (в т.ч. входными олигонуклеотидами, входными белками, мРНК и т.п., в т.ч. входящими либо не входящими в упомянутый набор), численной мерой выходных сигналов являются меры, связанные с выходными молекулами (в т.ч. выходными олигонуклеотидами, выходными белками, мРНК и т.п., в т.ч. входящими либо не входящими в упомянутый набор), входные сигналы трансформируются в выходные сигналы в результате взаимодействий между входными молекулами, упомянутыми одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора, и выходными молекулами, отличающееся тем, что упомянутые одноцепочечные нуклеиновые кислоты упомянутого набора имеют низкую аффинность взаимодействия между собой такую, что не менее 0.1% количества каждой из них существует в свободной молекулярной форме, а не входит в состав комплексов с другими молекулами.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, включающее в себя, по крайней мере, набор одноцепочечных нуклеиновых кислот, и для которого: численной мерой входных сигналов являются меры, связанные с входными молекулами, численной мерой выходных сигналов являются меры, связанные с выходными молекулами, входные сигналы трансформируются в выходные сигналы в результате взаимодействий между входными молекулами, упомянутыми одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора, и выходными молекулами.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, отличающееся тем, что упомянутые одноцепочечные нуклеиновые кислоты упомянутого набора имеют низкую аффинность взаимодействия между собой такую, что не менее 0.001% (предпочтительнее 0.003%, предпочтительнее 0.01%, предпочтительнее 0.03%, предпочтительнее 0.1%, предпочтительнее 0.3%, предпочтительнее 0.5%, предпочтительнее 1%, предпочтительнее 2%, предпочтительнее 3%, предпочтительнее 5%, предпочтительнее 10%, предпочтительнее 15%, предпочтительнее 20%, предпочтительнее 30%, предпочтительнее 50%) количества (концентрации, массы) каждой из них существует в свободной молекулярной форме, а не входит в состав комплексов с другими молекулами.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, отличающееся тем, что упомянутые одноцепочечные нуклеиновые кислоты упомянутого набора имеют низкую аффинность взаимодействия между собой такую, что не менее 0.1% количества каждой из них существует в свободной молекулярной форме, а не входит в состав комплексов с другими молекулами.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором комплексы, образуемые одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора находятся в равновесии (термодинамическом) со свободной молекулярной формой упомянутых одноцепочечных нуклеиновых кислот так, что не менее 0.1% от тотальной (полной) концентрации каждой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутого набора находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, отличающееся тем, что для каждой пары упомянутых одноцепочечных нуклеиновых кислот упомянутого набора их взаимная аффинность столь низка, что в отсутствии других одноцепочечных нуклеиновых кислот упомянутого набора, не менее 0.1% от полной концентрации каждой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутой пары находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, отличающееся тем, что упомянутые одноцепочечные нуклеиновые кислоты упомянутого набора столь низкоаффинны между собой, что не менее 0.1% количества каждой из них существует в свободной молекулярной форме, а не входит в состав комплексов с другими молекулами.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, отличающееся тем, что упомянутые одноцепочечные нуклеиновые кислоты упомянутого набора имеют низкую аффинность взаимодействия между собой такую, что не менее 0.1% количества каждой из них существует в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, отличающееся тем, что упомянутые одноцепочечные нуклеиновые кислоты упомянутого набора имеют такую низкую аффинность взаимодействия между собой, что не менее 0.1% количества каждой из них существует в свободной молекулярной форме, а не в составе комплексов с другими молекулами.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, отличающееся тем, что упомянутые одноцепочечные нуклеиновые кислоты упомянутого набора имеют такую низкую попарную аффинность взаимодействия, что не менее 0.1% количества каждой из них существует в свободной молекулярной форме, а не в составе комплексов с другими молекулами.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, отличающееся тем, что для каждой пары упомянутых одноцепочечных нуклеиновых кислот упомянутого набора их взаимная аффинность столь низка, что в отсутствии других одноцепочечных нуклеиновых кислот упомянутого набора, не менее 0.1% от полной концентрации каждой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутой пары находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, включающее в себя, по крайней мере, набор одноцепочечных нуклеиновых кислот, и которое способно: принимать входные сигналы, численной мерой которых являются меры, связанные с добавляемыми к упомянутому устройству входными молекулами, генерировать выходные сигналы, численной мерой которых являются меры, связанные с выходными молекулами, трансформировать входные сигналы в выходные сигналы в результате взаимодействий между выходными молекулами, если они не являются частью упомянутого набора, входными молекулами, и упомянутыми одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, отличающееся тем, что для каждой пары упомянутых одноцепочечных нуклеиновых кислот упомянутого набора их взаимная аффинность столь низка, что в отсутствии других одноцепочечных нуклеиновых кислот упомянутого набора, не менее 0.1% от полной концентрации каждой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутой пары находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, отличающееся тем, что комплексы, образуемые одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора находятся в равновесии со свободной молекулярной формой упомянутых одноцепочечных нуклеиновых кислот так, что не менее 0.1% от полной концентрации каждой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутого набора находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, отличающееся тем, что для каждой пары упомянутых одноцепочечных нуклеиновых кислот упомянутого набора их взаимная аффинность столь низка, что в отсутствии других одноцепочечных нуклеиновых кислот упомянутого набора, не менее 0.1% от полной концентрации каждой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутой пары находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, отличающееся тем, что для каждой пары упомянутых одноцепочечных нуклеиновых кислот упомянутого набора их взаимная аффинность столь низка, что в отсутствии других одноцепочечных нуклеиновых кислот упомянутого набора, не менее 0.1% от полной концентрации каждой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутой пары находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, отличающееся тем, что для каждой пары упомянутых одноцепочечных нуклеиновых кислот упомянутого набора их взаимная аффинность столь низка, что в отсутствии других одноцепочечных нуклеиновых кислот упомянутого набора, не менее не менее 0.001% (предпочтительнее 0.003%), предпочтительнее 0.01%, предпочтительнее 0.03%, предпочтительнее 0.1%, предпочтительнее 0.3%, предпочтительнее 0.5%, предпочтительнее 1%, предпочтительнее 2%, предпочтительнее 3%, предпочтительнее 5%, предпочтительнее 10%, предпочтительнее 15%), предпочтительнее 20%, предпочтительнее 30%, предпочтительнее 50%) от полной концентрации каждой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутой пары находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, отличающееся тем, что упомянутые одноцепочечные нуклеиновые кислоты упомянутого набора столь низкоаффинны между собой, что не менее 0.1% каждой из них существует в свободной молекулярной форме, а не входит в состав комплексов с другими молекулами.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, отличающееся тем, что упомянутые одноцепочечные нуклеиновые кислоты упомянутого набора столь низкоаффинны между собой, что не менее 0.001%) (предпочтительнее 0.003%, предпочтительнее 0.01%, предпочтительнее 0.03%, предпочтительнее 0.1%, предпочтительнее 0.3%, предпочтительнее 0.5%, предпочтительнее 1%, предпочтительнее 2%, предпочтительнее 3%, предпочтительнее 5%, предпочтительнее 10%, предпочтительнее 15%, предпочтительнее 20%, предпочтительнее 30%, предпочтительнее 50%) каждой из них существует в свободной молекулярной форме, а не входит в состав комплексов с другими молекулами.
Кроме того, МВУ, в котором упомянутыми выходными молекулами являются одноцепочечными нуклеиновыми кислотами.
Кроме того, МВУ, в котором упомянутыми выходными молекулами являются дополнительными одноцепочечными нуклеиновыми кислотами, не входящими в упомянутый набор.
Кроме того, МВУ, в котором упомянутыми выходными молекулами являются одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора.
Кроме того, МВУ, в котором упомянутыми выходными молекулами являются мРНК.
Кроме того, МВУ, в котором упомянутая мера выходного сигнала связана с уровнем экспрессии гена, кодируемой упомянутой мРНК.
Кроме того, МВУ, в котором упомянутыми выходными молекулами являются белки.
Кроме того, МВУ, в котором упомянутыми входными молекулами являются одноцепочечными нуклеиновыми кислотами.
Кроме того, МВУ, в котором упомянутыми входными молекулами являются одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора.
Кроме того, МВУ, в котором упомянутыми входными молекулами являются мРНК.
Кроме того, МВУ, в котором упомянутыми входными молекулами являются белки.
Кроме того, МВУ, в котором упомянутые нуклеиновые кислоты упомянутого набора являются ДНК.
Кроме того, МВУ, в котором упомянутые нуклеиновые кислоты упомянутого набора являются РНК.
Кроме того, МВУ, в котором упомянутые нуклеиновые кислоты упомянутого набора являются олигонуклеотидами.
Кроме того, МВУ, в котором численная мера входного сигнала соотносится с тотальной концентрацией входной молекулы.
Кроме того, МВУ, в котором численная мера входного сигнала соотносится с тотальной массой входной молекулы.
Кроме того, МВУ, в котором численная мера выходного сигнала соотносится с тотальной концентрацией выходной молекулы в свободной молекулярной форме.
Кроме того, МВУ, в котором численная мера выходного сигнала соотносится с массой выходной молекулы в свободной молекулярной форме.
Кроме того, МВУ, в котором численная мера выходного сигнала соотносится с концентрацией комплекса, образованного выходной молекулой с нуклеиновыми кислотами упомянутого набора.
Кроме того, МВУ, в котором численная мера выходного сигнала соотносится с концентрацией комплексов, образованных выходными молекулами с нуклеиновыми кислотами упомянутого набора.
Кроме того, МВУ, в котором упомянутая мера выходного сигнала является уровнем экспрессии гена, кодируемого одноцепочечной нуклеиновой кислотой упомянутого набора, являющейся выходной молекулой.
Кроме того, МВУ, в котором упомянутая численная мера выходного сигнала классифицируется как булевое значение «0/1» в результате сравнения с пороговым значением: если сигнал меньше порогового значение, тогда выход равен 0, если больше порогового значения, тогда выход равен 1.
Кроме того, МВУ, в котором трансформация входных сигналов в выходные сигналы происходит в результате смещения равновесия комплексообразования между входными молекулами, упомянутыми одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора и выходными молекулами, в результате чего меняется упомянутая численная мера выходных сигналов.
Кроме того, МВУ, в котором не менее 0.1% от тотальной (полной) концентрации каждой упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутого набора находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, МВУ, в котором не менее 1% от тотальной концентрации каждой упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутого набора находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, МВУ, в котором не менее 5% от тотальной концентрации каждой упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутого набора находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, МВУ, включающее в себя, по крайней мере, набор одноцепочечных нуклеиновых кислот, и для которого: численной мерой входных сигналов являются меры, связанные с входными молекулами, численной мерой выходных сигналов являются меры, связанные с выходными молекулами, входные сигналы трансформируются в выходные сигналы в результате взаимодействий между входными молекулами, упомянутыми одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора, и выходными молекулами, причем, тотальная концентрация каждой упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты превышает значение константы диссоциации комплексов, образованных данной одноцепочечной нуклеиновой кислотой и другими одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора не более, чем в 100000 раз.
Кроме того, МВУ, включающее в себя, по крайней мере, набор одноцепочечных нуклеиновых кислот, и для которого: численной мерой входных сигналов являются меры, связанные с входными молекулами, численной мерой выходных сигналов являются меры, связанные с выходными молекулами, входные сигналы трансформируются в выходные сигналы в результате взаимодействий между входными молекулами, упомянутыми одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора, и выходными молекулами, отличающееся тем, что упомянутые взаимодействия между одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора являются обратимым связыванием не полностью комплементарных между одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора, причем таких, для любых двух одноцепочечных нуклеиновых кислот упомянутого набора, длина наиболее протяженного связного участка их взаимной комплементарности не превышает 10 оснований.
Кроме того, способ проведения вычислений с помощью вышеописанных молекулярных вычислительного устройств.
Кроме того, способ проведения вычислений с помощью вышеописанных молекулярных вычислительного устройств, включающий в себя следующие шаги: выбор упомянутого набора одноцепочечных нуклеиновых кислот, смешение упомянутого набора с упомянутыми входными молекулами и упомянутыми выходными молекулами, если они не являются частью упомянутого набора, инкубация смеси для обеспечения взаимодействий между входными молекулами, упомянутыми одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора и упомянутыми выходными молекулами и трансформации входных сигналов в выходные в результате упомянутых взаимодействий, регистрация упомянутого выходного сигнала.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, включающее в себя, по крайней мере, набор одноцепочечных нуклеиновых кислот, в котором численной мерой входного сигнала является мера, связанная с по крайней мере одной одноцепочечной нуклеиновой кислотой упомянутого набора, численной мерой выходного сигнала является мера, связанная с по крайней мере одной одноцепочечной нуклеиновой кислотой упомянутого набора, входной сигнал трансформируется из в выходной сигнал в результате взаимодействий между одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора, причем, комплексы, образуемые одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора, находятся в равновесии со свободной молекулярной формой упомянутых одноцепочечных нуклеиновых кислот так, что не менее 0.1% от тотальной концентрации каждой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутого набора находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором упомянутые нуклеиновые кислоты являются ДНК.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором упомянутые нуклеиновые кислоты являются РНК.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором упомянутые нуклеиновые кислоты являются ДНК или РНК.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором упомянутые нуклеиновые кислоты являются олигонуклеотидами.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором упомянутая численная мера входного сигнала является тотальной концентрацией упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором упомянутая численная мера входного сигнала является количеством упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором упомянутая численная мера выходного сигнала является концентрация упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором упомянутая численная мера выходного сигнала является концентрация комплексов, образованной упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты с другими нуклеиновыми кислотами упомянутого набора.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором упомянутая численная мера выходного сигнала является концентрация комплексов, образованной упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты с определенными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором упомянутая численная мера выходного сигнала является количество упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором упомянутая численная мера выходного сигнала является количество комплексов, образованной упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты с другими нуклеиновыми кислотами упомянутого набора.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором упомянутая численная мера выходного сигнала является количество комплексов, образованной упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты с определенными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором трансформация входного сигнала в выходной сигнал происходит за счет смещения равновесия комплексообразования между упомянутыми одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора, в результате которого меняется упомянутая численная мера выходного сигнала, связанная с концентрацией по крайней мере одной одноцепочечной нуклеиновой кислотой упомянутого набора.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором не менее 0.2% от тотальной концентрации каждой упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутого набора находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором не менее 0.5% от тотальной концентрации каждой упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутого набора находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором не менее 1% от тотальной концентрации каждой упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутого набора находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором не менее 2% от тотальной концентрации каждой упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутого набора находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором не менее 5% от тотальной концентрации каждой упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутого набора находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором не менее 10% от тотальной концентрации каждой упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутого набора находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором не менее 20% от тотальной концентрации каждой упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты упомянутого набора находится в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, которое трансформирует двоичный входной сигнал в выходной согласно закону булевой алгебры.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, которое трансформирует непрерывный входной сигнал в непрерывный выходной согласно правилу элементарной алгебры.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором упомянутая мера выходного сигнала, являющаяся мерой, связанной с по крайней мере одной одноцепочечной нуклеиновой кислотой упомянутого набора, связана с уровнем экспрессии гена этой нуклеиновой кислоты упомянутого набора.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором упомянутая мера выходного сигнала является уровнем экспрессии гена, кодируемого одноцепочечной нуклеиновой кислотой упомянутого набора.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором входной сигнал преобразуется в выходной согласно правилу логического ДА, и которое состоит из (включает в себя - comprises): выходного олигонуклеотида (т.е. выходной молекулы, являющейся олигонуклетидом, входящем или не входящем в упомянутых набор), входного олигонуклеотида (т.е. входной молекулы, являющейся олигонуклетидом, входящем или не входящем в упомянутых набор) - причем его присутствие соответствует логическому входу равному 1, а отсутствие соответствует логическому входу равному 0, обрабатывающего олигонуклеотида, причем, обрабатывающий олигонуклеотид связывается с выходным олигонуклеотидом в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 0.1% и не более 50% обрабатывающего олигонуклеотида и не менее 0.1% и не более 50% выходного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, для входного олигонуклеотида: обрабатывающий олигонуклеотид связывается с ним в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 0.1% и не более 50% обрабатывающего олигонуклеотида и не менее 0.1% и не более 50% упомянутого входного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, для входного олигонуклеотида: выходной олигонуклеотид связывается с ним в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 90% обрабатывающего олигонуклеотида и не менее 90% упомянутого входного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, при этом, результат вычисления считывают после добавления входных олигонуклеотидов в раствор, содержащий выходной и обрабатывающий олигонуклеотиды, как количество выходного олигонуклеотида в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство для преобразования входного сигнала в выходной согласно правилу логического ДА, и которое состоит из: выходного олигонуклеотида, входного олигонуклеотида, причем его присутствие соответствует логическому входу равному 1, а отсутствие соответствует логическому входу равному 0, обрабатывающего олигонуклеотида, выбранных так, что обрабатывающий олигонуклеотид способен связываться с выходным олигонуклеотидом в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 0.1% и не более 50% обрабатывающего олигонуклеотида и не менее 0.1% и не более 50% выходного олигонуклеотида остается в свободной молекулярной форме, обрабатывающий олигонуклеотид способен связываться с входным олигонуклеотидом в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 0.1% и не более 50% обрабатывающего олигонуклеотида и не менее 0.1% и не более 50% упомянутого входного олигонуклеотида остается в свободной молекулярной форме, выходной олигонуклеотид способен связывается с входным олигонуклеотидом в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 90% обрабатывающего олигонуклеотида и не менее 90% упомянутого входного олигонуклеотида остается в свободной молекулярной форме, и в котором результат вычисления соответствует количеству выходного олигонуклеотида в свободной молекулярной форме после установления равновесия (или после инкубации) после добавления входных олигонуклеотидов в раствор, содержащий выходной и обрабатывающий олигонуклеотиды.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором входной сигнал преобразуется в выходной согласно правилу логического НЕ, и которое состоит из (включает в себя - comprises): выходного олигонуклеотида, входного олигонуклеотида (причем его присутствие соответствует логическому входу равному 1, а отсутствие соответствует логическому входу равному 0), обрабатывающего олигонуклеотида А, обрабатывающего олигонуклеотида В, причем, обрабатывающий олигонуклеотид А связывается с выходным олигонуклеотидом в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 0.1% и не более 50% обрабатывающего олигонуклеотида и не менее 0.1% и не более 50% выходного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, обрабатывающий олигонуклеотид В связывается с обрабатывающим олигонуклеотидом А в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 0.1% и не более 50% обрабатывающего олигонуклеотида А и не менее 0.1% и не более 50% обрабатывающего олигонуклеотида В находится в свободной молекулярной форме, для входного олигонуклеотида: обрабатывающий олигонуклеотид В связывается с ним в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 0.1% и не более 50% обрабатывающего олигонуклеотида В и не менее 0.1% и не более 50% упомянутого входного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, для входного олигонуклеотида: выходной олигонуклеотид связывается с ним в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 90% обрабатывающего олигонуклеотида и не менее 90% упомянутого входного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, для входного олигонуклеотида: обрабатывающий олигонуклеотид А связывается с ним в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 90% обрабатывающего олигонуклеотида А и не менее 90% упомянутого входного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, для обрабатывающего олигонуклеотида В: выходной олигонуклеотид связывается с ним в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 90% обрабатывающего олигонуклеотида В и не менее 90% упомянутого выходного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, при этом, результат вычисления считывают после добавления входных олигонуклеотидов в раствор, содержащий выходной и обрабатывающий нуклеотиды, как количество выходного олигонуклеотида в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство для преобразования входного сигнала в выходной согласно правилу логического НЕ, и которое состоит из: выходного олигонуклеотида, входного олигонуклеотида, причем его присутствие соответствует логическому входу равному 1, а отсутствие соответствует логическому входу равному 0, обрабатывающего олигонуклеотида А, обрабатывающего олигонуклеотида В, выбранных так, что, обрабатывающий олигонуклеотид А способен связываться с выходным олигонуклеотидом в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 0.1% и не более 50% обрабатывающего олигонуклеотида и не менее 0.1% и не более 50% выходного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, обрабатывающий олигонуклеотид В способен связываться с обрабатывающим олигонуклеотидом А в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 0.1% и не более 50% обрабатывающего олигонуклеотида А и не менее 0.1% и не более 50% обрабатывающего олигонуклеотида В находится в свободной молекулярной форме, обрабатывающий олигонуклеотид В связывается с входным олигонуклеотидом в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 0.1% и не более 50% обрабатывающего олигонуклеотида В и не менее 0.1% и не более 50% упомянутого входного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, выходной олигонуклеотид связывается с входным олигонуклеотидом в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 90% обрабатывающего олигонуклеотида и не менее 90% упомянутого входного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, для входного олигонуклеотида: обрабатывающий олигонуклеотид А связывается с ним в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 90% обрабатывающего олигонуклеотида А и не менее 90% упомянутого входного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, для обрабатывающего олигонуклеотида В: выходной олигонуклеотид связывается с ним в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 90% обрабатывающего олигонуклеотида В и не менее 90% упомянутого выходного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, при этом, результат вычисления считывают после добавления входных олигонуклеотидов в раствор, содержащий выходной и обрабатывающий нуклеотиды, как количество выходного олигонуклеотида в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором входной сигнал преобразуется в выходной согласно правилу логического ИЛИ, и которое состоит из (включает в себя - comprises): выходного олигонуклеотида, входных олигонуклеотидов (причем присутствие каждого из которых соответствует логическому входу равному 1, а отсутствие соответствует логическому входу равному 0), обрабатывающего олигонуклеотида, причем, обрабатывающий олигонуклеотид связывается с выходным олигонуклеотидом в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 0.1% и не более 50% обрабатывающего олигонуклеотида и не менее 0.1% и не более 50% выходного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, для каждого входного олигонуклеотида: обрабатывающий олигонуклеотид связывается с ним в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 0.1% и не более 50% обрабатывающего олигонуклеотида и не менее 0.1% и не более 50% упомянутого входного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, для каждого входного олигонуклеотида: выходной олигонуклеотид связывается с ним в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 90% обрабатывающего олигонуклеотида и не менее 90% упомянутого входного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, для каждого входного олигонуклеотида: каждый из остальных входных олигонуклеотидов связывается с ним в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 90% каждого из этих двух олигонуклеотидов находится в свободной молекулярной форме, при этом, результат вычисления считывают после добавления входных олигонуклеотидов в раствор, содержащий выходной и обрабатывающий нуклеотиды, как количество выходного олигонуклеотида в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором входной сигнал преобразуется в выходной согласно правилу логического И, и которое состоит из(включает в себя - comprises): выходного олигонуклеотида, входных олигонуклеотидов {Ix=I1,12…} (причем присутствие каждого из которых соответствует логическому входу равному 1, а отсутствие соответствует логическому входу равному 0), обрабатывающих олигонуклеотидов {Qx=Q1,Q2…}, каждый из которых соответствует одному и только одному входному олигонуклеотиду, причем, каждый обрабатывающий олигонуклеотид связывается с выходным олигонуклеотидом в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 0.1% и не более 50% обрабатывающего олигонуклеотида и не менее 0.1% и не более 50% выходного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, для каждого входного олигонуклеотида: соответствующий ему обрабатывающий олигонуклеотид связывается с ним в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 0.1% и не более 50% обрабатывающего олигонуклеотида и не менее 0.1% и не более 50% упомянутого входного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, для каждого входного олигонуклеотида: выходной олигонуклеотид связывается с ним в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 90% обрабатывающего олигонуклеотида и не менее 90% упомянутого входного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, для каждого входного олигонуклеотида: каждый из остальных входных олигонуклеотидов связывается с ним в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 90% каждого из этих двух олигонуклеотидов находится в свободной молекулярной форме, при этом, результат вычисления считывают после добавления входных олигонуклеотидов в раствор, содержащий выходной и обрабатывающий нуклеотиды, как количество выходного олигонуклеотида в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором входной сигнал преобразуется в выходной согласно функции булевой алгебры F, и которое функционирует за счет комбинации вышеупомянутых молекулярных вычислительных устройств, реализующих соответствующие функций ДА, НЕ, И, ИЛИ, в котором ставят в соответствие выходные олигонуклеотиды одних молекулярных вычислительных устройств упомянутой комбинации входным олигонуклеотидам других молекулярных вычислительных устройств упомянутой комбинации согласно разложению функции F по полной системе функций ДА, НЕ, И, ИЛИ.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором смешивают все упомянутые олигонуклеотиды упомянутой комбинации молекулярных вычислительных устройств в одном растворе, при этом результат вычисления считывают после добавления в упомянутый раствор входных олигонуклеотидов, которые соответствуют аргументам упомянутой функции F, как количество выходного олигонуклеотида, который соответствует внешней функции для функции F, в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором входные сигналы преобразуются в выходной сигнал согласно функции с непрерывно меняющимися аргументами.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, в котором входной сигнал X преобразуется в выходной сигнал Y согласно функции Y=F(x) с непрерывно меняющимся аргументом X, и которое состоит из (включает в себя - comprises): выходного олигонуклеотида, входного олигонуклеотида, причем его тотальная концентрация соответствует значению X, обрабатывающих олигонуклеотидов, причем, обрабатывающие олигонуклеотиды связываются с выходным олигонуклеотидом в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 0.1% и не более 90% выходного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, обрабатывающие олигонуклеотиды связываются с входным олигонуклеотидом в отсутствии других олигонуклеотидов так, что не менее 0.1% и не более 90% входного олигонуклеотида находится в свободной молекулярной форме, при этом, результату вычисления Y ставят в соответствие количество выходного олигонуклеотида в свободной молекулярной форме.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, включающее в себя, по крайней мере, набор одноцепочечных нуклеиновых кислот, в котором численной мерой входного сигнала является мера, связанная с по крайней мере одной одноцепочечной нуклеиновой кислотой упомянутого набора, численной мерой выходного сигнала является мера, связанная с по крайней мере одной одноцепочечной нуклеиновой кислотой упомянутого набора, входной сигнал трансформируется из в выходной сигнал в результате взаимодействий между одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора, причем, тотальная концентрация каждой упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты превышает значение константы диссоциации комплексов, образованных данной одноцепочечной нуклеиновой кислотой и другими одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора не более, чем в 100000 раз (предпочтительнее не более чем в 30000, предпочтительнее не более чем в 10000, предпочтительнее не более чем в 3000, предпочтительнее не более чем в 1000, предпочтительнее не более чем в 300, предпочтительнее не более чем в 100, предпочтительнее не более чем в 30 раз.)
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, включающее в себя, по крайней мере, набор одноцепочечных нуклеиновых кислот, в котором численной мерой входного сигнала является мера, связанная с по крайней мере одной одноцепочечной нуклеиновой кислотой упомянутого набора, численной мерой выходного сигнала является мера, связанная с по крайней мере одной одноцепочечной нуклеиновой кислотой упомянутого набора, входной сигнал трансформируется из в выходной сигнал в результате обратимых взаимодействий некомплементарного комплексообразования между одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора, причем (т.е. отличающийся тем, что), тотальная концентрация каждой упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислоты превышает значение константы диссоциации комплексов, образованных данной одноцепочечной нуклеиновой кислотой и другими одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора не более, чем в 100000 раз.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, которое производит вычисление не дольше, чем за 1 часе, предпочтительнее не дольше 30 мин, предпочтительнее не дольше 10 мин, предпочтительнее не дольше 5 мин, предпочтительнее не дольше 1 мин, предпочтительнее не дольше 10 сек.
Кроме того, молекулярное вычислительное устройство, включающее в себя, по крайней мере, набор одноцепочечных нуклеиновых кислот, в котором численной мерой входного сигнала является мера, связанная с по крайней мере одной одноцепочечной нуклеиновой кислотой упомянутого набора, численной мерой выходного сигнала является мера, связанная с по крайней мере одной одноцепочечной нуклеиновой кислотой упомянутого набора, входной сигнал трансформируется из в выходной сигнал в результате взаимодействий между одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора, отличающееся тем, что упомянутые взаимодействия между одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора являются обратимым связыванием не полностью комплементарных между одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора, причем таких, для любых двух одноцепочечных нуклеиновых кислот упомянутого набора, длина наиболее протяженного связного участка их взаимной комплементарности не превышает 10, предпочтительнее 9, предпочтительнее 8, предпочтительнее 7, предпочтительнее 6, предпочтительнее 5, предпочтительнее 4 оснований. Под связным участком взаимной комплементарности двух олигонуклеотидов имеется в виду участок нуклеотидной цепи одной нуклеиновой кислоты, в котором все основания подряд комплементарны нуклеотидной цепи второй нуклеиновой кислоты (т.е. на протяжении всего участка не встречаются некомплементарные основания). Если участки невелики, то достигается слабая аффинность даны комплексов, которая и позволяет переносить информацию за счет перераспределения нуклеиновых кислот (за счет вытеснения одними молекулами других) в комплексах без необходимости феномена strand displacement, в котором вымещение происходит за счет toe-hold (висящий свободных концов) регионов (как показано на фиг. 1).
Кроме того, способы проведения вычислений с помощью упомянутых МВУ, включающие в себя следующие шаги: выбор упомянутого набора одноцепочечных нуклеиновых кислот, смешение упомянутого набора с упомянутыми входными молекулами и упомянутыми выходными молекулами (если они не являются частью упомянутого набора), инкубация смеси для обеспечения трансформации входных сигналов в выходные в результате взаимодействий между входными молекулами, упомянутыми одноцепочечными нуклеиновыми кислотами упомянутого набора и упомянутыми выходными молекулами, и детекция выходного сигнала (как упомянуто выше связанные с выходными молекулами).
Помимо одноцепочечных нуклеиновых кислот, входящих в упомянутые наборы, молекулярные вычислительные устройства по данному изобретению могут включать в себя и другие молекулы взаимодействующие с данными элементов набора и влияющего на функционирование молекулярного вычислительного устройства. Так, в Примере 23 показано МВУ, которое включают в себя белок лизоцим, взаимодействие которого с набором одноцепочечных нуклеиновых кислот приводит к реализации булевой функции ДА. При этом, такие дополнительные (функциональные) молекулы могут как соответствовать правилам низкоаффинного взаимодействия с элементами упомянутых наборов нуклеиновых кислот, так и быть высокоаффинными к определенным нуклеиновым кислотам наборов. Так, пример 23 показывают вариант молекулярного вычислительного устройства, в котором используется флуоресцентно меченный лизоцим, взаимодействие которого с одноцепочечным ДНК аптамером снижено за счет наличия флуоресцентных меток. При этом функционирование МВУ, похоже на функционирование МВУ, реализованного в примере 1. С другой стороны, в лизоцим может использоваться и в качестве входного сигнала, который является высокоаффинным к упомянутому аптамеру, но при этом позволяет функционировать МВУ за счет описанного перераспределения олигонуклеотидов набора МВУ между комплексами и свободными молекулярными формами.
Кроме того, в определенных случаях молекулярное вычислительное устройство может включать в себя помимо упомянутого набора одноцепочечных нуклеиновых кислот, имеющих между собой низкую аффинность, различные нуклеиновые кислоты которые имеют высокую аффинность к олигонуклеотидам упомянутого набора. Так, например, в качестве входов молекулярного вычислительного устройства могут использоваться и полностью комплементарные олигонуклеотиды к олигонуклеотидам упомянутого набора. С одной стороны, это может улучшить динамический диапазон изменения выходных сигналов, с другой стороны, это усложняет минимизацию паразитной аффинности в наборе.
Вышеописанные молекулы могут быть использованы как входные молекулы, так и выходные. По сути, для каждого приведенного МВУ важна «матрица» аффинностей (т.е. какие молекулы имеют аффинность выше паразитной). При этом, возможно «развернуть» каждый МВУ, поменяв обозначение «входных» и «выходных» молекул, учтя что нужно поменять и взаимные (относительные) концентрации (как правило, концентрация входных молекул должна быть выше, чем выходных). При этом, например, при таком «развороте» МВУ из Примера 23 - белок лизоцим станет входной молекулой, а олигонуклеотид, выполнявший в Примере 23 функцию выходного белка, станет выходной молекулой. Так же можно «развернуть» (обратить, инвертировать) и МВУ в Примере 20. В этом случае мРНК станет входом МВУ, а малая РНК, ранее выполнявшая функцию входа, станет выходной молекулой.
Кроме того, Пример 23 показывает пример использования в МВУ аптамера в качестве одной из нуклеиновых кислот набора МВУ, поэтому понятно, что помимо лизоцима, входными и выходными молекулами может использоваться любые молекулы, с которыми могут взаимодействовать аптамеры - другие белки, малые молекулы, ионы и т.п.
Кроме того, необходимо отметить, что комплект входных молекул может содержать как одну молекулу (функция ДА, НЕТ), так и множество (функции И, ИЛИ).
То же соображение верно и для комплекта выходных молекул: в него может входить как одна молекула (функция ДА), так и множество (ячейка памяти).
Кроме того, упомянутая численная мера входного сигнала может соотносится с тотальной концентрацией индивидуальных упомянутых входных молекул, т.е. например, в случае функции И, численная мера каждого из нескольких входов функции И (0 или 1) ставится в соответствие (является, равняется) тотальная концентрация одного из входной молекулы (например, олигонуклеотида). Однако, в некоторых случаях, в качестве значения одного входа функции с множеством входов имеет целесообразность использоваться и сумму (или разность, или иную численную характеристику) тотальных концентраций нескольких входных молекул.
Примеры
Варианты реализации изобретения разнообразны. Приведем различные примеры. Нижеприведенные примеры даны в качестве иллюстрации данного изобретения и не ограничивают его применения.
Решение задач Булевой алгебры:
Пример 1) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), имплементирующее логическую функцию ДА с ДНК-олигонуклеотидами длиной 10 оснований. Бинарным входом системы является наличие олигонуклеотида I (добавление к раствору I=1; недобавление =0). Бинарной мерой результата вычисления (выход) является концентрация олигонуклеотида S в свободной от комплекса с олигонуклеотидом Q форме. Считывание результата вычисления производится за счет измерения флуоресценции раствора, с учетом того, что S мечен флуоресцентной Су3 меткой, a Q - квернчерной (тушащей) молекулой BHQ2, т.е. при связывании S с Q флуоресценция Су3 тушится, что детектируется флуориметром. МВУ представляет из себя раствор:
92 мкл буфера 100 мМ Трис-HCl; 1М NaCl;
+1 мкл 100 мкМ олигонуклеотида S=5'-Cy3- GCAGTATTCG-3' в воде;
+2 мкл 100 мкМ олигонуклеотида Q=5'-CGAATGCTGC-BHQ2-3' в воде.
Вычисление проводят, добавляя к МВУ:
Вход I=1) 5 мкл 100 мкМ олигонуклеотида I=5'- GCAGCATTCG-3' в воде.
Вход I=0) 5 мкл воды.
Детектируют сигнал флуоресценции метки Су3.
Полученные результаты:
i) ВХОД I=1 - Сигнал 100±4 RFU (относительных единиц флуоресценции),
i) ВХОД I=0 - Сигнал 17±2 RFU (относительных единиц флуоресценции).
Аффинность олигонуклеотидов данного МВУ представлена как концентрация комплекса двух олигонуклеотидов (в мкМ) при их смешении в тотальной концентрации 1 мкМ (рассчитаны с помощью NUPACK при 25°С). При необходимости эти значения могут быть легко переведены в константу диссоциации, как показано в описании выше:
-5
Уровень паразитной аффинности: 0.05 (которое соответствует Kd~10 М, если олигонуклеотиды сами по себе не образуют многомеры).
Пример 2) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), имплементирующее
логическую функцию ДА с ДНК-олигонуклеотидами длиной 7 оснований. Постановка эксперимента та же, что и в Примере 1.
МВУ представляет из себя раствор:
69 мкл буфера 100 мкМ Трис-HCl; 1М NaCl;
+1 мкл 100 мкМ олигонуклеотида S=5'-Cy3- GGCGGGG-3' в воде;
+10 мкл 100 мкМ олигонуклеотида Q=5'-CCCCGGA-BHQ2-3' в воде.
Вычисление проводят, добавляя к МВУ:
Вход I=1) 20 мкл 100 мкМ олигонуклеотида I=5'- TCCGGGG-3' в воде.
Вход I=0) 20 мкл воды.
Детектируют сигнал флуоресценции метки Су3.
Полученные результаты:
i) ВХОД I=1 - Сигнал 100±7 RFU (относительных единиц флуоресценции),
i) ВХОД I=0 - Сигнал 68±2 RFU (относительных единиц флуоресценции).
Аффинность олигонуклеотидов данного МВУ представлена как концентрация комплекса двух олигонуклеотидов (в мкМ) при их смешении в тотальной концентрации 1 мкМ (рассчитаны с помощью NUPACK при 25°С). При необходимости эти значения могут быть легко переведены в константу диссоциации, как показано в описании выше:
Уровень паразитной аффинности: 0.2 (которое соответствует Kd=6E-6 М, если олигонуклеотиды сами по себе не образуют многомеры).
Пример 3) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), имплементирующее логическую функцию ДА с ДНК-олигонуклеотидами длиной 15 оснований.
Постановка эксперимента та же, что и в Примере 1.
МВУ представляет из себя раствор:
92 мкл буфера 100 мМ Трис-HCl; 1M NaCl;
+1 мкл 100 мкМ олигонуклеотида S=5'-Су3-TTGAGTTGGCTATGA-3' в воде;
+2 мкл 100 мкМ олигонуклеотида Q=5'-CCATATCCGACTCAC-BHQ2-3' в воде.
Вычисление проводят, добавляя к МВУ:
Вход I=1) 5 мкл 100 мкМ олигонуклеотида I=5'-GGGAGTCGAATGTGG-3' в воде.
Вход I=0) 5 мкл воды.
Детектируют сигнал флуоресценции метки Су3.
Полученные результаты:
i) ВХОД I=1 - Сигнал 100±3 RFU (относительных единиц флуоресценции),
i) ВХОД I=0 - Сигнал 22±2 RFU (относительных единиц флуоресценции).
Аффинность олигонуклеотидов данного МВУ представлена как концентрация комплекса двух олигонуклеотидов (в мкМ) при их смешении в тотальной концентрации 1 мкМ (рассчитаны с помощью NUPACK при 25°С). При необходимости эти значения могут быть легко переведены в константу диссоциации, как показано в описании выше:
-5
Уровень паразитной аффинности: 0.05 (которое соответствует Kd~10 М, если олигонуклеотиды сами по себе не образуют многомеры).
Пример 4) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), имплементирующее логическую функцию ДА с ДНК-олигонуклеотидами длиной 15 оснований в диапазоне наномолярных концентраций. Постановка эксперимента та же, что и в Примере 1.
МВУ представляет из себя раствор:
92 мкл буфера 100 мМ Трис-HCl; 1М NaCl;
+1 мкл 100 нМ олигонуклеотида S=5'-Cy5-CCATATCCGACTCAC-3' в воде;
+2 мкл 100 нМ олигонуклеотида Q=5'-CTCAGTCGGATATGT-BHQ3-3' в воде.
Вычисление проводят добавляя к МВУ:
Вход I=1) 5 мкл 100 нМ олигонуклеотида I=5'-TCACATCCGACTGAG-3' в воде.
Вход I=0) 5 мкл воды.
Детектируют сигнал флуоресценции метки Су5.
Полученные результаты:
i) ВХОД I=1 - Сигнал 100±15 RFU (относительных единиц флуоресценции),
i) ВХОД I=0 - Сигнал 42±20 RFU (относительных единиц флуоресценции).
Аффинность олигонуклеотидов данного МВУ представлена как концентрация комплекса
двух олигонуклеотидов (в мкМ) при их смешении в тотальной концентрации 1 мкМ (рассчитаны с помощью NUPACK при 25°С). При необходимости эти значения могут быть легко переведены в константу диссоциации, как показано в описании выше:
-5
Уровень паразитной аффинности: 0.05 (которое соответствует Kd~10 М, если олигонуклеотиды сами по себе не образуют многомеры).
Пример 5) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), имплементирующее логическую функцию ДА с ДНК-олигонуклеотидами длиной 20 оснований. Постановка эксперимента та же, что и в Примере 1.
МВУ представляет из себя раствор:
92 мкл буфера 100 мкМ Трис-HCl; 1М NaCl;
+1 мкл 100 мкМ олигонуклеотида S=5'-Cy3-AACTGTGACCACTTGTCAAG-3' в воде;
+2 мкл 100 мкМ олигонуклеотида Q=5'-CTTGACACGTGGGCAAATGA-BHQ2-3' в воде.
Вычисление проводят добавляя к МВУ:
Вход I=1) 5 мкл 100 мкМ олигонуклеотида I=5'-CTTGACAAGTGGTCACAGTT-3' в воде.
Вход I=0) 5 мкл воды.
Детектируют сигнал флуоресценции метки Су3.
Полученные результаты:
i) ВХОД I=1 - Сигнал 100±5 RFU (относительных единиц флуоресценции),
i) ВХОД I=0 - Сигнал 28±4 RFU (относительных единиц флуоресценции).
Аффинность олигонуклеотидов данного МВУ представлена как концентрация комплекса
двух олигонуклеотидов (в мкМ) при их смешении в тотальной концентрации 1 мкМ (рассчитаны с помощью NUPACK при 25°С). При необходимости эти значения могут быть легко переведены в константу диссоциации, как показано в описании выше:
-5
Уровень паразитной аффинности: 0.05 (которое соответствует Kd~10 М, если олигонуклеотиды сами по себе не образуют многомеры).
Пример 6) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), имплементирующее логическую функцию ДА с РНК-олигонуклеотидами. Постановка эксперимента та же, что и в Примере 1.
МВУ представляет из себя раствор:
92 мкл буфера 100 мМ Трис-HCl; 1М NaCl;
+1 мкл 100 мкМ олигонуклеотида S=5'-Cy3-AGGCGCCCUGAC-3' в воде;
+2 мкл 100 мкМ олигонуклеотида Q=5'-UUCAGGGGCUCU-BHQ2-3' в воде.
Вычисление проводят, добавляя к МВУ:
Вход I=1) 5 мкл 100 мкМ олигонуклеотида I=5'-UGAGCCUGCUGA-3' в воде.
Вход I=0) 5 мкл воды.
Детектируют сигнал флуоресценции метки Су3.
Полученные результаты:
i) ВХОД I=1 - Сигнал 100±2 RFU (относительных единиц флуоресценции),
i) ВХОД I=0 - Сигнал 33±3 RFU (относительных единиц флуоресценции).
Аффинность олигонуклеотидов данного МВУ представлена как концентрация комплекса двух олигонуклеотидов (в мкМ) при их смешении в тотальной концентрации 1 мкМ (рассчитаны с помощью NUPACK при 25°С). При необходимости эти значения могут быть легко переведены в константу диссоциации, как показано в описании выше:
-5
Уровень паразитной аффинности: 0.05 (которое соответствует Kd~10 М, если олигонуклеотиды сами по себе не образуют многомеры).
Пример 7) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), имплементирующее логическую функцию НЕТ с ДНК-олигонуклеотидами длиной 15 оснований.
Постановка эксперимента та же, что и в Примере 1.
МВУ представляет из себя раствор:
83 мкл буфера 100 мМ Трис-HCl; 1М NaCl;
+1 мкл 100 мкМ олигонуклеотида S=5'-Су3-TTGAGTTGGCTATGA-3' в воде;
+2 мкл 100 мкМ олигонуклеотида Q=5'-CCATATCCGACTCAC-BHQ2-3' в воде.
+4 мкл 100 мкМ олигонуклеотида М=5'-GGGAGTCGAATGTGG-3' в воде.
Вычисление проводят добавляя к МВУ:
Вход I=1) 10 мкл 100 мкМ олигонуклеотида I=5'-CCAGATTAAACTCCC-3' в воде.
Вход I=0) 10 мкл воды.
Детектируют сигнал флуоресценции метки Су3.
Полученные результаты:
i) ВХОД I=1 - Сигнал 28±4 RFU (относительных единиц флуоресценции),
i) ВХОД I=0 - Сигнал 100±4 RFU (относительных единиц флуоресценции).
Аффинность олигонуклеотидов данного МВУ представлена как концентрация комплекса
двух олигонуклеотидов (в мкМ) при их смешении в тотальной концентрации 1 мкМ (рассчитаны с помощью NUPACK при 25°С). При необходимости эти значения могут быть легко переведены в константу диссоциации как показано в описании выше:
-5
Уровень паразитной аффинности: 0.05 (которое соответствует Kd~10 М, если олигонуклеотиды сами по себе не образуют многомеры).
Пример 8) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), имплементирующее 3-битную логическую функцию ИЛИ. Бинарным входом системы является наличие олигонуклеотидов I1, I2, I3 (добавление к раствору =1; недобавление =0). Бинарной мерой результата вычисления (выход) является концентрация олигонуклеотида S в свободной от комплекса с квенчерным (тушащим) олигонуклеотидом Q форме. Считывание результата вычисления производится за счет измерения флуоресценции раствора, с учетом того, что S мечен флуоресцентной Су3 меткой, а олигонуклеотид Q - квернчерной молекулой BHQ2, т.е. при связывании S с Q флуоресценция Су3 тушится, что детектируется флуориметром.
МВУ представляет из себя раствор:
83 мкл буфера 100 мМ Трис-HCl; 1М NaCl;
+1 мкл 100 мкМ олигонуклеотида S=5'-Cy3-GCAGTATTCG-3' в воде;
+1 мкл 100 мкМ олигонуклеотида Q=5'-CGAAAACTGC-BHQ2-3' в воде.
Вычисление проводят добавляя к МВУ 15 мкл различных комбинаций входов:
Вход I1=1) 5 мкл 100 мкМ олигонуклеотида I1=5'-TCAGTTTTCA-3' в воде.
Вход I2=1) 5 мкл 100 мкМ олигонуклеотида I2=5'-GTAGTTTTCG-3' в воде.
Вход I3=1) 5 мкл 100 мкМ олигонуклеотида I3=5'-ACAGTTTTCC-3' в воде.
Вход In=0) 5 мкл воды - для n=1, 2, 3.
Детектируют сигнал флуоресценции метки Су3.
Полученные результаты:
i) ВХОД: I1=0; I2=0; I3=0 - Сигнал: 10±1 RFU (относительных единиц флуоресценции).
i) ВХОД: I1=0; I2=0; I3=1 - Сигнал: 40±2 RFU (относительных единиц флуоресценции).
i) ВХОД: I1=0; I2=1; I3=0 - Сигнал: 41±1 RFU (относительных единиц флуоресценции).
i) ВХОД: 1I=0; 12=1; 13=1 - Сигнал: 46±1 RFU (относительных единиц флуоресценции).
i) ВХОД: I1=1; I2=0; I3=0 - Сигнал: 39±1 RFU (относительных единиц флуоресценции).
i) ВХОД: I1=1; I2=0; I3=1 - Сигнал: 46±1 RFU (относительных единиц флуоресценции).
i) ВХОД: I1=1; I2=1; I3=0 - Сигнал: 47±1 RFU (относительных единиц флуоресценции).
i) ВХОД: I1=1; I2=1; I3=0 - Сигнал: 50±1 RFU (относительных единиц флуоресценции).
Пороговое значение - среднее между максимальным и минимальным, т.е.
(10+50)/2=30. Поэтому реализована функция ИЛИ.
Аффинность олигонуклеотидов данного МВУ представлена как концентрация комплекса двух олигонуклеотидов (в мкМ) при их смешении в тотальной концентрации 1 мкМ (рассчитаны с помощью NUPACK при 25°С). При необходимости эти значения могут быть легко переведены в константу диссоциации как показано в описании выше:
-5
Уровень паразитной аффинности: 0.05 (которое соответствует Kd~10 М, если олигонуклеотиды сами по себе не образуют многомеры).
Пример 9) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), имплементирующее 3-битную логическую функцию И. Бинарным входом системы является наличие олигонуклеотидов I1, I2, I3 (добавление к раствору =1; недобавление =0). Бинарной мерой результата вычисления (выход) является концентрация олигонуклеотида S в свободной от комплекса с квенчерными олигонуклеотидами Qn (n=1, 2, 3) форме. Считывание результата вычисления производится за счет измерения флуоресценции раствора, с учетом того, что S мечен флуоресцентной Су3 меткой, а олигонуклеотиды Qn - квернчерной молекулой BHQ2, т.е. при связывании S с Qn флуоресценция Су3 тушится, что детектируется флуориметром.
МВУ представляет из себя раствор:
78 мкл буфера 100 мМ Трис-HCl; 1М NaCl;
+1 мкл 100 мкМ олигонуклеотида S=5'-Cy3-GCAGTATTCG-3' в воде;
+2 мкл 100 мкМ олигонуклеотида Q1=5'-CGAAAACTGC-BHQ2-3' в воде.
+2 мкл 100 мкМ олигонуклеотида Q2=5'-CGAATGCTGC-BHQ2-3' в воде.
+2 мкл 100 мкМ олигонуклеотида Q3=5'-CGAATAGTGC-BHQ2-3' в воде.
Вычисление проводят добавляя к МВУ 15 мкл различных комбинаций входов:
Вход I1=1) 5 мкл 100 мкМ олигонуклеотида I1=5'-GCAGTTTTCG-3' в воде.
Вход I2=1) 5 мкл 100 мкМ олигонуклеотида I2=5'-GCAGCATTCG-3' в воде.
Вход I3=1) 5 мкл 100 мкМ олигонуклеотида I3=5'-GCACTATTCG-3' в воде.
Вход In=0) 5 мкл воды - для n=1, 2, 3.
Детектируют сигнал флуоресценции метки Су3.
Полученные результаты:
i) ВХОД: I1=0; I2=0; I3=0 - Сигнал: 10±0.2 RFU (относительных единиц флуоресценции).
i) ВХОД: I1=0; I2=0; I3=1 - Сигнал: 14±0.6 RFU (относительных единиц флуоресценции).
i) ВХОД: I1=0; I2=1; I3=0 - Сигнал: 13±1 RFU (относительных единиц флуоресценции).
i) ВХОД: I1=0; I2=1; I3=1 - Сигнал: 21±0.3 RFU (относительных единиц флуоресценции).
i) ВХОД: I1=1; I2=0; I3=0 - Сигнал: 18±0.6 RFU (относительных единиц флуоресценции).
i) ВХОД: I1=1; I2=0; I3=1 - Сигнал: 33±1 RFU (относительных единиц флуоресценции).
i) ВХОД: I1=1; I2=1; I3=0 - Сигнал: 28±1 RFU (относительных единиц флуоресценции).
i) ВХОД: I1=1; I2=1; I3=0 - Сигнал: 67±0.5 RFU (относительных единиц флуоресценции).
Пороговое значение - среднее между максимальным и минимальным, т.е.
(10+67)/2=38.5. Поэтому реализована функция И.
Аффинность олигонуклеотидов данного МВУ представлена как концентрация комплекса двух олигонуклеотидов (в мкМ) при их смешении в тотальной концентрации 1 мкМ (рассчитаны с помощью NUPACK при 25°С). При необходимости эти значения могут быть легко переведены в константу диссоциации как показано в описании выше:
-6
Уровень паразитной аффинности: 0.3 (которое соответствует Kd~2*10 М, если олигонуклеотиды сами по себе не образуют многомеры).
Пример 10) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), имплементирующее 3-битную ячейку памяти с функцией хранения и считывания. Схема МВУ показана на Фиг. 9. Число, которое необходимо сохранить с помощью МВУ, представляется в виде 3-битного бинарного числа. Каждому разряду числа ставится в соответствие олигонуклеотид In (n=1, 2, 3, добавление к раствору =1; недобавление =0). Затем, данное число подается на вход МВУ путем добавления в раствор. Затем, для считывания результата вычисления, на вход МВУ подается «считывающий» олигонуклеотид, который вызывает увеличение флуоресценции 3 разных по спектру меток согласно записанному в память МВУ числу (если I1=1 - увеличивается/появляется флуоресценция метки Су3, если I12=1 - увеличивается/появляется флуоресценция метки Су5, если I3=1 - увеличивается/появляется флуоресценция метки FAM). Данное МВУ функционирует как 3 параллельных логических функции И с одним общим входом.
МВУ представляет из себя раствор: 61 мкл буфера 100 мМ Трис-HCl; 1M NaCl;
+1 мкл 100 мкМ олигонуклеотида S1=5'-Cy3-AACTGTGACCACTTGTCAAG-3' вводе;
+1 мкл 100 мкМ олигонуклеотида S2=5'-Cy5-CGCTGAGCGCACCGCTCGAC-3' в воде;
+1 мкл 100 мкМ олигонуклеотида S3=5'-FAM-CACTGTGTCAACATCTCACC-3' в воде;
+4 мкл 100 мкМ олигонуклеотида Q1=5'-GGTGAGGAGTGGGCTCAGTG-BHQ2-3' в воде.
+1 мкл 100 мкМ олигонуклеотида Q2=5'-CTTGACCCTTAGTCACAGTT-BHQ2-3' в воде.
+4 мкл 100 мкМ олигонуклеотида Q3=5'-GATTCTGTTTACGCTAACTA-BHQ2-3' в воде.
+1 мкл 100 мкМ олигонуклеотида QR=5'-CGTCAGATGTTAACAAAGTG-BHQ2-3' в воде.
Запись числа в ячейку памяти МВУ производят добавляя к МВУ 15 мкл различных комбинаций входов:
Вход I1) =1: +20 мкл 100 мкМ олигонуклеотида I1=5'-CTTTGTGACTAAGTGTCAAG-3' в воде; =0: +20 мкл воды.
Вход I2) =1: +11 мкл 100 мкМ олигонуклеотида I2=5'-TAGTTAGCGTTAGCAAAATT-3' в воде; =0: +11 мкл воды.
Вход I2) =1: +14 мкл 100 мкМ олигонуклеотида I3=5'-CACTTTGTAACCATGTGACG-3' в воде; =0: +14 мкл воды.
Считывание производят добавляя к МВУ 20 мкл «считывающего» олигонуклеотида
R=5'-CTGTCCCGTCACTACTCACC-3' в воде.
Детектируют сигнал флуоресценции меток FAM, Су3, Су5.
Полученные результаты, подтверждающие корректную работу данного МВУ, показаны на Фиг. 9.
Аффинность олигонуклеотидов данного МВУ представлена как концентрация комплекса
двух олигонуклеотидов (в мкМ) при их смешении в тотальной концентрации 1 мкМ (рассчитаны с помощью NUPACK при 25°С). При необходимости эти значения могут быть легко переведены в константу диссоциации, как показано в описании выше:
-6
Уровень паразитной аффинности: 0.1 (которое соответствует Kd~8*10 М, если олигонуклеотиды сами по себе не образуют многомеры).
Пример 11) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), имплементирующее вычисление квадратного корня из 4-битного бинарного числа. Каждому разряду числа ставится в соответствие олигонуклеотид In (n=1, 2, 3, 4, добавление к раствору =1; недобавление =0), т.е. число записывается как {I1-I2-I3-I4}. Затем, данное число подается на вход МВУ путем добавления в растворы для вычисления каждого из двух разрядов ответа. Ответ, т.е., базу квадратного корня (целое число) вычисляют в виде 2-битного бинарного числа вида XY, в котором разряды X, Y вычисляют согласно булевой алгебре:
Х=I1 ИЛИ I2; Y=HE { [I2 ИЛИ НЕ(I14)] И [I2 ИЛИ НЕ(I3)] И [НЕ(I2) ИЛИ НЕ(I1)}
Бинарной мерой результата вычисления X является концентрация олиигонуклеотида S1 в свободной от комплекса с квенчерным олигонуклеотидом Q1 форме. Считывание результата вычисления производится за счет измерения флуоресценции раствора, с учетом того, что S мечен флуоресцентной Су3 меткой, а олигонуклеотид Q -квернчерной молекулой BHQ2, т.е. при связывании S с Q флуоресценция Су3 тушится, что детектируется флуориметром.
Бинарной мерой результата вычисления Y является концентрация олиигонуклеотида S2 в свободной от комплекса с квенчерным олигонуклеотидом Q2 форме. Считывание результата вычисления производится за счет измерения флуоресценции раствора, с учетом того, что S мечен флуоресцентной Су5 меткой, а олигонуклеотид Q -квернчерной молекулой BHQ3 (т.е. при связывании S с Q флуоресценция Су5 тушится, что детектируется флуориметром.
МВУ представляет из себя два раствор (для вычисления X и Y).
Раствор для вычисления X:
77 мкл буфера 100 мМ Трис-HCl; 1М NaCl;
+1 мкл 100 мкМ олигонуклеотида SX=5'-Cy5-TTGTGATTGGAAACT-3' в воде;
+2 мкл 100 мкМ олигонуклеотида QX=5'-AGGTTCCATGCACAA-BHQ3-3' в воде.
Раствор для вычисления Y:
63 мкл буфера 100 мМ Трис-HCl; 1М NaCl;
Если вход=0, то вместо олигонуклеотида добавляется 5 мкл воды.
Полученные результаты вычислений спустя 5 минут после добавление входов представлены на Фиг. 10 и демонстрируют корректную работу данного МВУ. Отметим, что через 60 мин, значения выходов практически не изменяются, поэтому решение, посчитанное в течение 5 минут (или быстрее) может являться финальным.
Аффинность олигонуклеотидов данного МВУ представлена как концентрация комплекса двух олигонуклеотидов (в мкМ) при их смешении в тотальной концентрации 1 мкМ (рассчитаны с помощью NUPACK при 25°С). При необходимости эти значения могут быть легко переведены в константу диссоциации, как показано в описании выше:
-5
Уровень паразитной аффинности: 0.05 (которое соответствует Kd~10 М, если олигонуклеотиды сами по себе не образуют многомеры).
Другой вариант последовательностей олигонуклеотидов для МВУ №2 для вычисления квадратного корня:
Аффинность олигонуклеотидов данного МВУ представлена как концентрация комплекса двух олигонуклеотидов (в мкМ) при их смешении в тотальной концентрации 1 мкМ (рассчитаны с помощью NUPACK при 25°С). При необходимости эти значения могут быть легко переведены в константу диссоциации, как показано в описании выше:
-6
Уровень паразитной аффинности: 0.1 (которое соответствует Kd~8*10 М, если олигонуклеотиды сами по себе не образуют многомеры).
Пример 12) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), имплементирующее 500-битную логическую функцию И в симуляции NUPACK. Бинарным входом системы является наличие олигонуклеотидов In (n=1-500, добавление в систему =1; недобавление =0). Бинарной мерой результата вычисления (выход) является концентрация олигонуклеотида S в свободной форме. МВУ представляет из себя совокупность олигонуклеотидов в Таблице 1. Вычисление 500-битной логической функции И проводят добавляя к МВУ различные комбинации входов, указанных в Таблице 1.
При этом для выбора олигонуклеотидов были использованы критерии:
[S]=1 мкМ
50 мкМ < [Q] < 100 мкМ, 50 мкМ < [I] < 120 мкМ
и следующие аффинности:
0.4 мкМ < Kd[QS] < 1 мкМ, 0.4нМ < Kd[IQ] < 3 нМ.
По факту в представленном наборе в Таблице 1,
50.5 мкМ <= [Q] <= 89.8 мкМ, 52.7 мкМ <= [I] <= 112 мкМ
0.4 мкМ < Kd[QS] < 0.898 мкМ, 0.415нМ <= Kd[IQ] <= 2.63нМ.
Ввиду колоссального объема данных, в Таблице 1 представлены только концентрации олигонуклеотидов, все другие параметры могут быть вычислены с помощью общедоступного алгоритма NUPACK (unpack.org).
Аффинности между невзаимодействующими олигонуклеотидами (паразитная аффинность) должны были быть Kd > 18 мкМ.
С помощью алгоритма NUPACK вычисляют количество свободного S.
Значение работы без добавления входов (все входы =0) = 4.10Е-05 (доля S в свободной
молекулярной форме).
Фиг. 11 показывает результаты работы МВУ при расчете следующих входных комбинаций:
A) все входы =1
B) все входы кроме In=1; In=0. (для всех n=1..500).
Фиг. 11 показывает, что выход для группы С=0 для всех n. Следовательно, для всех других комбинаций входов (где больше одного входа =0) будет еще меньше, т.е. тоже =0. Следовательно, МВУ действительно реализовывает логическое И.
Элементарная Алгебра
Пример 13) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), вычисляющее значение функции у=Ах для непрерывно меняющегося значения х в симуляции NUPACK.
∧
Значением х является: x=log([I]/[X0), где [I] - концентрация входного олигонуклеотида I в единицах моль/л, [Х0]=10-6 моль/л - произвольно выбранная референсная концентрация сдвига по X.
∧
∧
Значением у является: y=([S]-[Y0])/[C0], где [S] - концентрация свободного выходного олигонуклеотида S в единицах моль/л, [Y0]=5*10-11 моль/л и [С0]=10-11 моль/л - произвольно выбранные референсные концентрации сдвига по Y и коэффициент нормализации, соответственно.
МВУ представляет из себя совокупность олигонуклеотидов: в Таблице 2.
-8
-4
Вычисление значение функции у=х (для -2<х<2) вычисляют, добавляя в систему соответствующее количество входного олигонуклеотида I в пределах: 10 М < [I] < 10 М, где [I] - концентрация входного олигонуклеотида I.
Фигура 12 показывает теоретическое значение функции (сплошная линия) и значение вычисленное МВУ, причем во всех вычисленных и показанных на графике точках, ошибка вычисления значения функции МВУ не превышает 0.96% (по концентрации S).
∧
Пример 14) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), вычисляющее значение функции у=Ах2 для непрерывно меняющегося значения х в симуляции NUPACK.
∧
Значением х является: x=log([I]/[X0), где [I] - концентрация входного олигонуклеотида I в единицах моль/л, [Х0]=10-6 моль/л - произвольно выбранная референсная концентрация сдвига по X.
∧
∧
Значением у является: y=([S]-[Y0])/[C0], где [S] - концентрация свободного выходного олигонуклеотида S в единицах моль/л, [Y0]=5*10-11 моль/л и [С0]=10-11 моль/л - произвольно выбранные референсные концентрации сдвига по Y и коэффициент нормализации, соответственно.
∧
-8
-4
МВУ представляет из себя совокупность олигонуклеотидов: в Таблице 2. Вычисление значение функции у=0.25*х2 (для -2<х<2) вычисляют, добавляя в систему соответствующее количество входного олигонуклеотида I в пределах: 10 М < [I] < 10 М, где [I] - концентрация входного олигонуклеотида I.
Фигура 12 показывает теоретическое значение функции (сплошная линия) и значение вычисленное МВУ, причем во всех вычисленных и показанных на графике точках, ошибка вычисления значения функции МВУ не превышает 0.82% (по концентрации S).
∧
Пример 15) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), вычисляющее значение функции у=Ах3 для непрерывно меняющегося значения х в симуляции NUPACK.
∧
Значением х является: x=log([I]/[X0), где [I] - концентрация входного олигонуклеотида I в единицах моль/л, [Х0]=10-6 моль/л - произвольно выбранная референсная концентрация сдвига по X.
∧
∧
Значением у является: y=([S]-[Y0])/[C0], где [S] - концентрация свободного выходного олигонуклеотида S в единицах моль/л, [Y0]=5*10-11 моль/л и [С0]=10-11 моль/л - произвольно выбранные референсные концентрации сдвига по Y и коэффициент нормализации, соответственно.
∧
-8
-4
МВУ представляет из себя совокупность олигонуклеотидов: в Таблице 2. Вычисление значение функции у=0.125*х3 (для -2<х<2) вычисляют, добавляя в систему соответствующее количество входного олигонуклеотида I в пределах: 10 М < [I] < 10 М, где [I] - концентрация входного олигонуклеотида I.
Фигура 12 показывает теоретическое значение функции (сплошная линия) и значение вычисленное МВУ, причем во всех вычисленных и показанных на графике точках, ошибка вычисления значения функции МВУ не превышает 0.88% (по концентрации S).
Пример 16) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), вычисляющее значение функции y=sqrt(Ax) для непрерывно меняющегося значения х в симуляции NUPACK.
∧
Значением х является: x=log([I]/[X0), где [I] - концентрация входного олигонуклеотида I в единицах моль/л, [Х0]=10-6 моль/л - произвольно выбранная референсная концентрация сдвига по X.
∧
∧
Значением у является: y=([S]-[Y0])/[C0], где [S] - концентрация свободного выходного олигонуклеотида S в единицах моль/л, [Y0]=5*10-11 моль/л и [С0]=10-11 моль/л - произвольно выбранные референсные концентрации сдвига по Y и коэффициент нормализации, соответственно.
-8
-4
МВУ представляет из себя совокупность олигонуклеотидов: в Таблице 2. Вычисление значение функции y=sqrt(x/2) вычисляют, добавляя в систему соответствующее количество входного олигонуклеотида I в пределах: 10 М < [I] < 10 М, где [I] - концентрация входного олигонуклеотида I.
Фигура 12 показывает теоретическое значение функции (сплошная линия) и значение вычисленное МВУ, причем во всех вычисленных и показанных на графике точках, ошибка вычисления значения функции МВУ не превышает 0.88% (по концентрации S).
Пример 17) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), вычисляющее значение функции y=sin(Ax) для непрерывно меняющегося значения х в симуляции NUPACK.
∧
Значением х является: x=log([I]/[X0), где [I] - концентрация входного олигонуклеотида I в единицах моль/л, [Х0]=10-6 моль/л - произвольно выбранная референсная концентрация сдвига по X.
∧
∧
Значением у является: y=([S]-[Y0])/[C0], где [S] - концентрация свободного выходного олигонуклеотида S в единицах моль/л, [Y0]=5*10-11 моль/л и [С0]=10-11 моль/л - произвольно выбранные референсные концентрации сдвига по Y и коэффициент нормализации, соответственно.
-8
-4
МВУ представляет из себя совокупность олигонуклеотидов: в Таблице 2. Вычисление значение функции y=sin(πx/2) вычисляют, добавляя в систему соответствующее количество входного олигонуклеотида I в пределах: 10 М < [I] < 10 М, где [I] - концентрация входного олигонуклеотида I.
Фигура 12 показывает теоретическое значение функции (сплошная линия) и значение вычисленное МВУ, причем во всех вычисленных и показанных на графике точках, ошибка вычисления значения функции МВУ не превышает 0.93% (по концентрации S).
∧
-8
-4
∧
∧
∧
Пример 18) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), решающее уравнение вида Bx2=sin(Ax) для непрерывно меняющегося значения х в симуляции NUPACK. Создают МВУ №1 по Пример Ч и МВУ №2 по Примеру Ч. Варьируют в обоих упомянутых МВУ количество входного олигонуклеотида I в пределах концентрации: 10 М < [I] < 10 М, регистрируют и сравнивают выходы обоих МВУ. Ставят в соответствие количество входного олигонуклеотида I, при котором оба МВУ выдавали одинаковый (в пределах 1% разницы) выход, решению х указанного уравнения. Фиг. 13 показывает решение для уравнения -0.25*x2=sin(πx/2): x1=-1.6 (1=2.5* 10-8М) (ошибка от правильного ответа х=-1.57 составляет 1.8%), х1=0.05 (I=1.13*10-6М), правильный ответ х=0.
МВУ, регулирующее экспрессию генов
Пример 19) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), имплементирующее логическую функцию ДА для контроля экспрессии гена.
Бинарным входом системы является наличие РНК олигонуклеотида I (добавление к раствору I=1; недобавление =0). Бинарной мерой результата вычисления (выход) является количество синтезированного белка в растворе внеклеточной экспрессии. Данный пример показывает работоспособность МВУ для контроля экспрессии GFP, поэтому выходной сигнал регистрируется по флуоресценции GFP. Таргетируемая последовательность мРНК S=AGGCGCCCUGAC.
МВУ представляет из себя раствор:
20 мкл смеси компонент системы внеклеточного синтеза 1-Step Human Coupled IVT Kit - DNA (Thermo Scientific™, США, каталожный номер 88881) с плазмидой, содержащей ген GFP (поставляется в комплекте) согласно рекомендациям производителя (но с разбавлением водой в 2 раза);
+1 мкл 50 мкМ олигонуклеотида Q=5'-UUCAGGGGCUCU-3' в воде;
Вычисление проводят добавляя к МВУ:
Вход I=1) 1 мкл 500 мкМ олигонуклеотида I=5'-UGAGCCUGCUGA-3' в воде.
Вход I=0) 1 мкл воды.
Инкубируют 6 часов при +30 градусах С и детектируют флуоресценцию синтезированного GFP.
Полученные результаты:
i) ВХОД I=1 - Сигнал 100±20 RFU (относительных единиц флуоресценции),
i) ВХОД I=0 - Сигнал 22±10 RFU (относительных единиц флуоресценции).
Таким образом, достигают влияют на экспрессию гена (а именно, повышают его экспрессию) за счет присутствия в смеси олигонуклеотида, имеющего комплементарность по таргетной последовательности всего в два не рядом стоящих основания.
Так же экспрессия увеличивалась при использовании следующих комбинаций Q, I:
Та же таргетная последовательность мРНК S=AGGCGCCCUGAC;
Q=GACAGGACGCCU
I=CGGCGUCCAGUU: максимальная длина последовательно-комплементарных оснований к плазмиде - 5 нуклеотидов (CAGUU), к мРНК - 5 нуклеотидов (UCCAG).
Так же экспрессия увеличивалась при использовании следующих комбинаций Q, I:
Таргетная последовательность мРНК S=TACGGCTTCTACCAC;
Q=GUGGUCGAAUCCGUA
I=UAGAGAUUCGACAGC: максимальная длина последовательно-комплементарных оснований к плазмиде - 5 нуклеотидов (ACAGC), к мРНК - 4 нуклеотида (CAGC).
Так же экспрессия увеличивалась при использовании следующих комбинаций Q, I:
Таргетная последовательность мРНК S=TACGGCTTCTACCAC;
Q=CGGUCUCUAUAUGCG
I=CGUAUAGAGAGACUU: максимальная длина последовательно-комплементарных оснований к плазмиде - 5 нуклеотидов (GACUU), к мРНК - 4 нуклеотида (ACUU).
Пример 20) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), имплементирующее логическую функцию НЕТ для контроля экспрессии гена.
Бинарным входом системы является наличие РНК олигонуклеотида I (добавление к раствору I=1; недобавление =0). Бинарной мерой результата вычисления (выход) является количество синтезированного белка в растворе внеклеточной экспрессии. Данный пример показывает работоспособность МВУ для контроля экспрессии GFP, поэтому выходной сигнал регистрируется по флуоресценции GFP.
МВУ представляет из себя раствор:
20 мкл смеси компонент системы внеклеточного синтеза 1-Step Human Coupled IVT Kit - DNA (Thermo Scientific™, США, каталожный номер 88881) с плазмидой, содержащей ген GFP (поставляется в комплекте) согласно рекомендациям производителя (но с разбавлением водой в 2 раза);
+1 мкл 50 мкМ олигонуклеотида Q=5'-UUCAGGGGCUCU-3' в воде;
+5 мкл 50 мкМ олигонуклеотида М=5'-AGAGACCCUUAA-3' в воде;
Вычисление проводят добавляя к МВУ:
Вход I=1) 2 мкл 500 мкМ олигонуклеотида I=5'-UUAACGGUCUCU-3' в воде.
Вход I=0) 1 мкл воды.
Инкубируют 6 часов при +30 градусах С и детектируют флуоресценцию синтезированного GFP.
Полученные результаты:
i) ВХОД I=1 - Сигнал 60±3 RFU (относительных единиц флуоресценции),
i) ВХОД I=0 - Сигнал 100±2 RFU (относительных единиц флуоресценции).
Таким образом, достигают влияют на экспрессию гена (а именно, понижают его экспрессию) за счет присутствия в смеси олигонуклеотида, имеющего комплементарность по таргетной последовательности всего в два не рядом стоящих основания.
Аффинность олигонуклеотидов данного МВУ представлена как концентрация комплекса
двух олигонуклеотидов (в мкМ) при их смешении в тотальной концентрации 1 мкМ (рассчитаны с помощью NUPACK при 25°С). При необходимости эти значения могут быть легко переведены в константу диссоциации как показано в описании выше (в качестве S для расчетов используется таргетная последовательность мРНК гена -AGGCGCCCTGAC):
-5
Уровень паразитной аффинности: 0.05 (которое соответствует Kd~10 М, если олигонуклеотиды сами по себе не образуют многомеры).
Пример 21) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), имплементирующее логическую функцию И для контроля экспрессии гена.
Бинарным входом системы является наличие РНК олигонуклеотида In (n=1, 2; добавление к раствору In=1; недобавление =0). Бинарной мерой результата вычисления (выход) является количество синтезированного белка в растворе внеклеточной экспрессии. Данный пример показывает работоспособность МВУ для контроля экспрессии GFP, поэтому выходной сигнал регистрируется по флуоресценции GFP. МВУ представляет из себя раствор:
20 мкл смеси компонент системы внеклеточного синтеза 1-Step Human Coupled IVT Kit - DNA (Thermo Scientific™, США, каталожный номер 88881) с плазмидой, содержащей ген GFP (поставляется в комплекте) согласно рекомендациям производителя (но с разбавлением водой в 2 раза);
+1 мкл 25 мкМ олигонуклеотида Q1=5'-UUCAGGGGCUCU-3' в воде;
+1 мкл 25 мкМ олигонуклеотида Q2=5'-UCCAGGUCGCCU-3' в воде;
Вычисление проводят добавляя к МВУ:
Вход I1=1 I2=1) 1 мкл 500 мкМ олигонуклеотида I1=5'-UGAGCCUGCUGA-3' в воде +1 мкл 500 мкМ олигонуклеотида I2=5'-AUGCGACCUCGG-3' в воде. Вход I1=0 I2=1) 1 мкл воды +1 мкл 500 мкМ олигонуклеотида I1 в воде. Вход I1=1 I2=0) 1 мкл 500 мкМ олигонуклеотида I2 в воде +1 мкл воды. Вход I1=0 I2=0) 2 мкл воды.
Инкубируют 6 часов при +30 градусах С и детектируют флуоресценцию синтезированного GFP. Полученные результаты:
i) ВХОД I1=0 I2=0 - Сигнал 42±2 RFU (относительных единиц флуоресценции),
i) ВХОД I1=0 I2=1 - Сигнал 65±4 RFU (относительных единиц флуоресценции).
i) ВХОД I1=1 I2=0 - Сигнал 59±3 RFU (относительных единиц флуоресценции),
i) ВХОД I1=1 I2=1 - Сигнал 100±3 RFU (относительных единиц флуоресценции).
Граница (true/false) = (100+42)=71, поэтому МВУ действительно управляет экспрессией гена согласно логическому И.
Аффинность олигонуклеотидов данного МВУ представлена как концентрация комплекса двух олигонуклеотидов (в мкМ) при их смешении в тотальной концентрации 1 мкМ (рассчитаны с помощью NUPACK при 25°С). При необходимости эти значения могут быть легко переведены в константу диссоциации, как показано в описании выше (в качестве S для расчетов используется таргетная последовательность мРНК гена - AGGCGCCCГGAC):
-5
Уровень паразитной аффинности: 0.05 (которое соответствует Kd~10 М, если олигонуклеотиды сами по себе не образуют многомеры).
Пример 22) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), имплементирующее логическую функцию ИЛИ для контроля экспрессии гена.
Бинарным входом системы является наличие РНК олигонуклеотида In (n=1, 2; добавление к раствору In=1; недобавление =0). Бинарной мерой результата вычисления (выход) является количество синтезированного белка в растворе внеклеточной экспрессии. Данный пример показывает работоспособность МВУ для контроля экспрессии GFP, поэтому выходной сигнал регистрируется по флуоресценции GFP.
МВУ представляет из себя раствор:
20 мкл смеси компонент системы внеклеточного синтеза 1-Step Human Coupled IVT Kit - DNA (Thermo Scientific™, США, каталожный номер 88881) с плазмидой, содержащей ген GFP (поставляется в комплекте) согласно рекомендациям производителя (но с разбавлением водой в 2 раза);
+1 мкл 50 мкМ олигонуклеотида Q1=5'-UUCAGGGGCUCU-3' в воде;
Вычисление проводят добавляя к МВУ:
Вход I1=1 I2=1) 1 мкл 500 мкМ олигонуклеотида I1=5'-UGAGCCUGCUGA-3' в воде +1 мкл 500 мкМ олигонуклеотида I2=5'-AGAGCCAGUGAC-3' в воде. Вход I1=0 I2=1) 1 мкл воды +1 мкл 500 мкМ олигонуклеотида I1 в воде. Вход I1=1 I2=0) 1 мкл 500 мкМ олигонуклеотида I2 в воде +1 мкл воды. Вход I1=0 I2=0) 2 мкл воды.
Инкубируют 6 часов при +30 градусах С и детектируют флуоресценцию синтезированного GFP.
Полученные результаты:
i) ВХОД I1=0 I2=0 - Сигнал 24±4 RFU (относительных единиц флуоресценции),
i) ВХОД I1=0 I2=1 - Сигнал 71±4 RFU (относительных единиц флуоресценции),
i) ВХОД I1=1 I2=0 - Сигнал 75±3 RFU (относительных единиц флуоресценции).
i) ВХОД I1=1 I2=1 - Сигнал 100±4 RFU (относительных единиц флуоресценции).
Граница (true/false)=(100+24)=62, поэтому МВУ действительно управляет экспрессией гена согласно логическому ИЛИ.
Аффинность олигонуклеотидов данного МВУ представлена как концентрация комплекса двух олигонуклеотидов (в мкМ) при их смешении в тотальной концентрации 1 мкМ (рассчитаны с помощью NUPACK при 25°С). При необходимости эти значения могут быть легко переведены в константу диссоциации как показано в описании выше (в качестве S для расчетов используется таргетная последовательность мРНК гена - AGGCGCCCГGAC):
-5
Уровень паразитной аффинности: 0.05 (которое соответствует Kd~10 М если олигонуклеотиды сами по себе не образуют многомеры).
Пример 23) Молекулярное вычислительное устройство (МВУ), имплементирующее логическую функцию ДА, включающее ДНК-аптамер, а также белок. Бинарным входом системы является наличие олигонуклеотида I (добавление к раствору I=1; недобавление =0). Бинарной мерой результата вычисления (выход) является концентрация модельного белка лизоцима в свободной от комплекса с квенчерным олигонуклеотидом - ДНК-аптамером к лизоциму. Считывание результата вычисления производится за счет измерения флуоресценции раствора, с учетом того, что лизоцим мечен флуоресцентной меткой Су3, а аптамер Q - мечен квернчерной молекулой BHQ2, т.е. при связывании Q с белком флуоресценция Су3 тушится, что детектируется флуориметром. В качестве аптамера используется 60-нуклотидный аптамер (см. Iran DT, et al. (2010) Selection and characterization of DNA aptamers for egg white lysozyme. Molecules 15: 1127 - 1140; Zou M et al. (2012) The homogeneous fluorescence anisotropic sensing of salivary lysozyme using the 6-carboxyfluorescein-labled DNA aptamer. Biosens. Bioelectron. 32: 148-154.). Остальные нуклеотиды создаются аффинными к части аптамера: GCGGCTCACAAAACCATT.
МВУ представляет из себя раствор:
92 мкл буфера 25 mM Трис-HCl, 200 mM глицин, 5 мМ K2HPO4, 300 mM NaCl, рН 8.3;
+1 мкл меченного Су3 лизоцима (начальная концентрация 10 мкг/мл)
+1 мкл 100 мкМ аптамера Q, меченного по 5' концу BHQ2 (в воде);
Вычисление проводят добавляя к МВУ:
Вход I=1) 6 мкл 500 мкМ олигонуклеотида I=5'-AATGATTCTGGGTGCCGC -3' в воде.
Вход I=0) 6 мкл воды.
Детектируют сигнал флуоресценции метки Су3.
Полученные результаты:
i) ВХОД I=1 - Сигнал 100±4 RFU (относительных единиц флуоресценции),
i) ВХОД I=0 - Сигнал 67±8 RFU (относительных единиц флуоресценции).
Аффинность олигонуклеотидов данного МВУ представлена как концентрация комплекса двух олигонуклеотидов (в мкМ) при их смешении в тотальной концентрации 1 мкМ (рассчитаны с помощью NUPACK при 25°С): I-Q=0.86. При необходимости это значение могут быть легко переведены в константу диссоциации, как показано в описании выше.
Работа предлагаемого способа иллюстрируется чертежами фиг. 1-13. и таблицами 1-2.
Фиг 1. Традиционная парадигма комплементарных взаимодействий нуклеиновых кислот. Сверху - аффинность комплементарных молекул ДНК в зависимости от длины олигонуклеотидов (рассчитана с помощью алгоритма NUPACK). Снизу - принцип передачи и обработки информации в комплементарных взаимодействий нуклеиновых кислот (в рамках традиционной парадигмы высокоспецифичных взаимодействий).
Фиг. 2. Плотность «континуума» констант диссоциаций для ДНК длиной 10 оснований, рассчитанных с помощью алгоритма вычисления аффинности двух цепей ДНК NUPACK (unpack.org). Гистограмма показывает распределение констант взаимодействий всех 10-членных олигонуклеотидов с произвольно выбранным олигонуклеотидом GCTTATGACG.
Фиг. 3. Распределение по аффинностям 10-членных олигонуклеотидов по отношению к паре олигонуклеотидов: 1 - ниже) GCTTATGACG и комплементарному ему CGTCATAAGC, либо 2) GCTTATGACG и произвольному TAGCGCAGTA. Видно, что аффинности образуют «многомерный континуум», среди которого может быть выбран олигонуклеотид с желаемой аффинностью сразу ко многим олигонуклеотидам.
Фиг. 4. Механизм и принцип передачи и обработки информации посредством существенно-некомплементарных взаимодействий нуклеиновых кислот (в рамках данного изобретения). Система существенно-некомплементарно взаимодействующих олигонуклеотидов описывается системой уравнений взаимодействия молекул ансамбля. В самом простом случае когда могут образовываться лишь двухкомпонентные ассоциаты, а также рассматривая термодинамически равновесные системы, мы получим систему уравнений показанную на Фигуре.
Фиг. 5. Схема МВУ, реализующего логический вентиль ДА. Стрелки показывают олигонуклеотиды, взаимодействующие друг с другом в большей степени, чем остальные (в других парах). Отсутствие стрелок между олигонуклеотидами свидетельствует об аффинности между ними не более сильной, чем паразитная.
Фиг. 6. Схема МВУ, реализующего логический вентиль НЕТ. Стрелки показывают олигонуклеотиды, взаимодействующие друг с другом в большей степени, чем остальные (в других парах). Отсутствие стрелок между олигонуклеотидами свидетельствует об аффинности между ними не более сильной, чем паразитная. В случае флуоресцентного считывания, сигнальный олигонуклеотид мечен флуорофором, обозначенным пустым ромбом; черным ромбом обозначен квенчер (тушащий флуоресценцию при образовании комплекса QS).
Фиг. 7. Схема МВУ, реализующего логический вентиль ИЛИ. Стрелки показывают олигонуклеотиды, взаимодействующие друг с другом в большей степени, чем остальные (в других парах). Отсутствие стрелок между олигонуклеотидами свидетельствует об аффинности между ними не более сильной, чем паразитная. В случае флуоресцентного считывания, сигнальный олигонуклеотид мечен флуорофором, обозначенным пустым ромбом; черным ромбом обозначен квенчер (тушащий флуоресценцию при образовании комплекса QS).
Фиг. 8. Схема МВУ, реализующего логический вентиль И. Стрелки показывают олигонуклеотиды, взаимодействующие друг с другом в большей степени, чем остальные (в других парах). Отсутствие стрелок между олигонуклеотидами свидетельствует об аффинности между ними не более сильной, чем паразитная. В случае флуоресцентного считывания, сигнальный олигонуклеотид мечен флуорофором, обозначенным пустым ромбом; черным ромбом обозначен квенчер (тушащий флуоресценцию при образовании комплекса QS).
Фиг. 9. Схема и результаты работы МВУ, реализующего 3-битную ячейку памяти с функцией хранения и считывания. Стрелки показывают олигонуклеотиды, взаимодействующие друг с другом в большей степени, чем остальные (в других парах). Отсутствие стрелок между олигонуклеотидами свидетельствует об аффинности между ними не более сильной, чем паразитная. В случае флуоресцентного считывания, сигнальный олигонуклеотид мечен флуорофором, обозначенным пустым ромбом; черным ромбом обозначен квенчер (тушащий флуоресценцию при образовании комплекса QS).
Фиг. 10. Схема и результаты работы МВУ, вычисляющего квадратный корень из 4-битного числа. Стрелки показывают олигонуклеотиды, взаимодействующие друг с другом в большей степени, чем остальные (в других парах). Отсутствие стрелок между олигонуклеотидами свидетельствует об аффинности между ними не более сильной, чем паразитная. В случае флуоресцентного считывания, сигнальный олигонуклеотид мечен флуорофором, обозначенным пустым ромбом; черным ромбом обозначен квенчер (тушащий флуоресценцию при образовании комплекса QS).
Фиг. 11. Результаты МВУ, реализующего логический вентиль 500-битный логический вентиль И (сверху) и оценка работоспособности гейта на основании анализа работы 100-, 200-, 300- и 500-битных логических вентилей И. Выходной сигнал - это доля S в свободной молекулярной форме.
Фиг. 12. Результаты вычислений МВУ, решающих задачи элементарной алгебры.
∧
Фиг. 13. Результаты вычислений МВУ, решающее уравнение -0.25*x2=sin(πx/2).
Таблица 1. Список олигонуклеотидов, входящих в состав МВУ, реализующего 500-битный логический вентиль И.
Таблица 2. Список олигонуклеотидов, входящих в состав МВУ, решающих задачи элементарной алгебры.
Молекулярное вычислительное устройство на основе существенно-некомплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот с низкой аффинностью друг к другу (варианты)
Молекулярное вычислительное устройство на основе существенно-некомплементарньгх одноцепочечных нуклеиновых кислот с низкой аффинностью друг к другу (варианты)
Молекулярное вычислительное устройство на основе существенно-некомплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот с низкой аффинностью друг к другу (варианты)
Молекулярное вычислительное устройство на основе существенно-некомплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот с низкой аффинностью друг к другу (варианты)
Молекулярное вычислительное устройство на основе существенно-некомплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот с низкой аффинностью друг к другу (варианты)
Молекулярное вычислительное устройство на основе существенно-некомплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот с низкой аффинностью друг к другу (варианты)