СПОСОБ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА К ЛЕЙКОЗУ
METHOD FOR ASSESSMENT OF CATTLE RESISTANCE TO LEUKAEMIA

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано при оценке устойчивости и восприимчивости к лейкозу крупного рогатого скота.
Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, вызываемая ретровирусом и представляющая опасность не только для крупного рогатого скота, но и потенциальную опасность для человека, контактирующего с больными животными или потребляющего необеззараженную продукцию.
Известен способ оценки устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу, заключающийся в оценке быков-производителей по устойчивости потомства к заражению вирусом лейкоза крупного рогатого скота по реакции иммунодиффузии и отборе быков-производителей, дающих устойчивое к инфицированию данным вирусом потомство (патент РФ № 2032336, МПК A01K 67/02, опубл. 10.04.95).
Известен также способ комплексного отбора семейств крупного рогатого скота по устойчивости потомства к лейкозу, туберкулезу и бруцеллезу (патент РФ № 2191506, A01K 67/02, 10.07.1997), заключающийся в выявлении устойчивых к заболеваниям семейств, отборе из этих семейств лучших по продуктивности коров и получении от них племенных быков.
Однако данные способы длительны и сложны в исполнении, поскольку направлены на решение задачи определения генетической устойчивости животных к заболеванию лейкозом.
Наиболее близким к заявляемому является способ прогнозирования восприимчивости крупного рогатого скота к заражению вирусом лейкоза (см. патент РФ №2285260, МПК G01N 33/49, опубл. 10.10.2006), заключающийся в оценке резистентности организма животного по соотношению лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов.
Однако иммунологические показатели не могут однозначно определять потенциальную устойчивость животных к инфекционным заболеваниям. Они зависят от физиологического состояния организма, кормления, условий содержания, не учитывают метаболические процессы. Кроме этого, способ подразумевает неоднозначное толкование результатов из-за того, что отношение лимфоцитов к сегментоядерным нейтрофилам может характеризовать наличие и других инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной этиологии, например маститов, различных абсцессов.
Изобретение направлено на решение задачи создания эффективного и обеспечивающего однозначный результат способа оценки устойчивости организма крупного рогатого скота к лейкозу, отражающего общую метаболическую активность организма.
Для решения поставленной задачи в способе оценки устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу, заключающемся в заборе крови и исследовании физиологических показателей, согласно изобретению формируют группу клинически здоровых животных, исследуют активность кислой фосфатазы, определяют ее среднее значение для этой группы животных, сравнивают значение кислой фосфатазы каждого животного со средней величиной этого же показателя для конкретной группы животных, при понижении активности кислой фосфатазы относительно ее среднего значения судят об устойчивости организма животного к лейкозу.
В случае получения значений кислой фосфатазы, сравнимых со средним для данной группы животных, дополнительно исследуют показатели липидного обмена: значения липазы, триглицеридов и липопротеидов очень низкой плотности, определяют их средние значения для этой же группы животных, сравнивают значения липазы, триглицеридов и липопротеидов очень низкой плотности со средней величиной каждого из показателей и при одновременном понижении всех этих значений относительно среднего значения каждого из показателей судят о восприимчивости организма животного к лейкозу, а при значениях не ниже средних - об устойчивости.
В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано эффективного способа оценки устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу на основе анализа значений кислой фосфатазы плазмы крови здорового животного.
Кислая фосфатаза относится к классу гидролаз, подклассу гидролаз фосфорных моноэфиров. Как и другие фосфатазы катализирует гидролиз ортофосфорных сложных моноэфиров с отщеплением фосфат-иона.
Активность кислой фосфатазы обнаруживается в клетках различных тканей и органов, как в лизосомах, так и вне их. Фермент присутствует в клетках печени, селезенки, почек, в эритроцитах, тромбоцитах, в костном мозге, а также в нейтрофилах и лимфоцитах крови. Довольно высока активность кислой фосфатазы в остеокластах, а также в макрофагах. Активность кислой фосфатазы в макрофагах служит показателем кислороднезависимого киллинга.
В частности, повышение активности кислой фосфатазы наблюдается в нейтрофилах при воспалительных процессах, при туберкулезе, злокачественных опухолях, при иммунизации, при различных аллергических заболеваниях.
Известно использование значений кислой фосфатазы в клетках крови для дифференциации лейкоза крупного рогатого скота (см., например, http://www.ideasandmoney.ru). При этом исследования проводят на больных животных, а кислую фосфатазу определяют, в частности, цитохимическим методом (см., например, http://www.blackpantera.ru).
Кроме этого, активность кислой фосфатазы исследуют и в сыворотке крови. Известно, что активность кислой фосфатазы сыворотки крови в норме связана с выходом фермента из гепатоцитов и клеток крови. При патологии активность кислой фосфатазы сыворотки крови обусловлена повышенной продукцией фермента патологическими клетками (например, при клоновых лейкоцитозах) и выходом фермента в кровь из разрушающихся клеток.
Общеизвестно, что значения кислой фосфатазы в сыворотке крови при исследовании здорового животного в ветеринарии считают нестабильным, малоинформативным параметром. Как правило, значения кислой фосфатазы в сыворотке крови используют только при оценке патологических состояний организма.
В заявляемом способе авторами выявлено новое, неочевидное свойство активности кислой фосфатазы в сыворотке крови здорового животного - она выступает в качестве критерия предрасположенности крупного рогатого скота к лейкозу.
Таким образом, неизвестность использования кислой фосфатазы в качестве критерия оценки устойчивости организма здорового животного к лейкозу позволяет нам сделать вывод о наличии в заявляемом способе «изобретательского уровня».
Активность кислой фосфатазы в сыворотке крови определяли методом количественного определения (см., например, Bodansky, О. Acid phosphatase/ О. Bodansky // Adv. Clin. Chem. - 1972. - V.15. - P.143-147). Кислая фосфатаза катализирует гидролиз 1-нафтилфосфата до 1-нафтола и фосфата. 1-Нафтол дает в реакции с 2-аминотолуолом комплексное соединение - диазокраситель. Изменение окраски пропорционально активности кислой фосфатазы в образце.
Помимо активности кислой фосфатазы, на повышенную чувствительность животных к лейкозу могут указывать значения показателей липидного обмена, таких как активность липазы, концентрация триглицеридов, липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП).
Триглицериды - основная форма депонирования жиров в организме. Представляют собой сложные эфиры глицерола и жирных кислот. Поступают в организм с пищей, перевариваются до жирных кислот и глицерола и всасываются в тонком кишечнике. В клетках эпителия происходит ресинтез триглицеридов. При необходимости они расщепляются в процессе гидролиза до глицерина и жирных кислот, давая вдвое больше калорий на 1 г массы, чем белки и углеводы.
Липазы присутствуют в слюне, желудочном соке, панкреатическом соке, желчи, кишечном соке. Триглицеридлипазы катализируют гидролиз триглицеридов до моноглицеридов и жирных кислот. Моноглицеридлипаза катализируют гидролиз моноглицеридов до глицерина и жирной кислоты. Понижение активности липазы отмечается при раке различной локализации (кроме карциномы поджелудочной железы), а также при избытке триглицеридов в пище.
Таким образом, выявлено нарушение взаимосвязи активности кислой фосфатазы, отражающей, в том числе, и функциональное состояние белых клеток крови, и концентрации ЛПОНП у восприимчивых животных.
Для доказательства того, что исследования проводились на здоровых животных, определяли количество лейкоцитов в крови и лейкоцитарную формулу.
Для проверки устойчивости животных к заражению лейкозом проводили диагностические исследования путем постановки реакции иммунодиффузии (РИД) и с помощью молекулярно-биологической реакции (ПЦР - полимеразной цепной реакции).
Способ осуществляется следующим образом.
1. Формируют группу клинически здоровых животных одной породы, например, по 10 голов симментальской породы в группе.
2. У этих животных берут кровь, стабилизируют гепарином, получают плазму и определяют в ней кислую фосфатазу.
3. Находят среднее арифметическое значение кислой фосфатазы для данной группы животных.
4. Выявляют животных, у которых значение кислой фосфатазы ниже найденного среднего арифметического значения этого показателя для конкретной группы животных. Таких животных считают устойчивыми к заражению лейкозом.
Пример.
Формируют группу из клинически здоровых животных в количестве 14 голов крупного рогатого скота.
Берут у них кровь, стабилизируют гепарином, получают плазму и определяют в ней активность кислой фосфатазы.
Для сравнения и обоснования полученных результатов определяли также липазу, триглицериды, рассчитывали липопротеиды низкой плотности.
Результаты представлены в таблице.
Из таблицы следует, что показатели кислой фосфатазы имеют значения ниже среднего у 7 животных (с №8 по №14), у животного №4 этот показатель сравним со средним значением, у остальных 6 животных он выше среднего значения (с №1 по №3 и с №5 по №7).
Поскольку у животного №4 значение кислой фосфатазы было сравнимо со средним значением, провели дополнительные исследования липидных показателей, также определяя их средние значения по данной группе.
Из таблицы следует, что у животного №4 значения липазы, триглицеридов и липопротеидов очень низкой плотности ниже среднего значения.
Таким образом, по дополнительному критерию отбора считаем животное №4 восприимчивым к заражению лейкозом.
При этом животных, соответствующих основному критерию на устойчивость по кислой фосфатазе (с №8 по №14), анализ на дополнительные критерии (по значениям липазы, триглицеридов и ЛПОНП) не проводим.
Проведенные диагностические исследования по РИД и ПЦР подтвердили, что животные №8-14 устойчивы к заражению туберкулезом, а другие (№1-7) - восприимчивы.
Высокая активность кислой фосфатазы у клинически здоровых животных №1-7 и выявленная у них положительная реакция в тесте РИД и ПЦР может свидетельствовать об увеличении у них количества и/или физиологической активности белых клеток крови. Раздражение лейкоцитарного ростка кроветворения, в свою очередь, является фактором, предрасполагающим к заболеваниям крови.
У коров №8-14 активность кислой фосфатазы была ниже средней по группе в 2,3-2,9 раза. При последующем наблюдении в течении 6 месяцев и проведении диагностических исследований по РИД и ПЦР эти животные лейкозом не заболели.
Проведенные гематологические исследования подтвердили, что все животные, использованные в эксперименте, были здоровы, поскольку их значения лейкоцитов находились в пределах нормы.