Влияние поликомпонентных пробиотиков на состав микробиоценоза толстого кишечника при экспериментальном дисбиозе

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015

А.В.Агейченко, П.В.Калуцкий, О.А.Медведева, В.А.Королев

ВЛИЯНИЕ ПОЛИКОМПОНЕНТНЫХ ПРОБИОТИКОВ НА СОСТАВ МИКРОБИОЦЕНОЗА ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ДИСБИОЗЕ

Курский государственный медицинский университет

Цель. Изучить влияние пробиотиков «РиоФлора Иммуно Нео» и «Бифиформ» на состав микрофлоры толстого кишечника в условиях экспериментального дисбиоза у мышей. Материалы и методы. Животным моделировали лекарственный дисбиоз введением ген-тамицина, по окончанию формирования дисбиоза интрагастрально вводили пробиотики. Количественное и качественное исследование мукозной микрофлоры толстой кишки мышей проводили бактериологическим методом. Результаты. Коррекция дисбиоза про-биотиками привела к коррекции состава кишечной микрофлоры, более выраженном при применении «РиоФлора Иммуно Нео». Заключение. Результаты исследования позволяют рекомендовать использование данных препаратов для избирательной коррекции дисбио-за толстого кишечника.

Журн. микробиол., 2015, № 4, С. 80-84

Ключевые слова: мукозная микрофлора толстого кишечника, дисбиоз, «РиоФлора Иммуно Нео», «Бифиформ»

A.V.Ageichenko, P.V.Kalutsky, O.A.Medvedeva, V.A.Korolev

EFFECT OF POLYCOMPONENT PROBIOTICS ON THE COMPOSITION OF COLON MICROBIOCENOSIS DURING EXPERIMENTAL DYSBIOSIS

Kursk State Medical University, Russia

Aim. Study the effect of RioFlora Immuno Neo and Bifiform probiotics on the colon microflora composition under the conditions of experimental dysbiosis in mice. Materials and methods. Medicinal dysbiosis was modelled in animals by gentamicin administration, probiotics were administered intragastrally by the end of dysbiosis formation. Quantitative and qualitative study of mucous microflora of mice colon was carried out by a bacteriological method. Results. Correction of dysbiosis by probiotics has resulted in correction of the intestine microflora composition, and more pronounced when RioFlora Immuno Neo was used. Conclusion. The results of the study allow to recommend the use of these preparations for selective correction of colon dysbiosis.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 4, P. 80-84

Key words: mucous colon microflora, dysbiosis, RioFlora Immuno Neo, Bifiform ВВЕДЕНИЕ

Микроэкологическая система организма — это сложный филогенетически сложившийся динамичный комплекс, включающий в себя разнообразные по количественному и качественному составу ассоциации микроорганизмов и продукты их биохимической активности в определенных условиях среды обитания [8, 11, 15]. Нормофлора человека выполняет различные жизненно важные функции, в том числе обеспечивает процессы переваривания и всасывания, синтез витаминов, ферментов, аминокислот, оказывает подавляющее действие на патогенную микрофлору, обеспечивает антиинфекционную защиту и иммунорегулирующую функцию, принимает участие в синтезе иммуноглобулинов и в морфогенезе иммунной системы [14, 16, 19].

Микрофлора толстого кишечника считается биогенным фактором, в значительной степени определяющим состояние организма [20]. По-прежнему актуальными остаются

вопросы изменений количественного и качественного состава кишечной микрофлоры, причинами которых является воздействие на организм различных факторов экзогенного и эндогенного характера (возраста, образа жизни, сезона года, характера питания, в том числе и продолжительный неконтролируемый прием антибиотиков широкого спектра действия) [3, 18].

Многочисленные клинико-лабораторные исследования, направленные на изучение качественных и количественных характеристик изменений состава микрофлоры толстого кишечника при дисбиозе, позволили выдвинуть концепцию, согласно которой сообщество микроорганизмов в толстом кишечнике человека определяется индивидуальными характеристиками его организма, что фактически обусловливает индивидуализацию создания и применения лекарственных и профилактических препаратов для коррекции дисбиоза [1, 2, 7, 9, 17].

Для коррекции состава микрофлоры кишечника применяются пробиотики, в частности, такие как «РиоФлора Иммуно Нео», содержащий в своем составе Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Lactobacillus salivarium, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, и «Бифиформ», в состав которого входят Bifidobacterium longum и Enterococcus faecium.

Целью исследования была оценка влияния пробиотиков «РиоФлора Иммуно Нео» и «Бифиформ» на качественный и количественный состав мукозной микрофлоры толстого кишечника при экспериментальном дисбиозе у мышей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на 80 мышах линии BALB/c массой 18 — 20 грамм, которых содержали на обычном пищевом рационе в условиях вивария. Все животные были разделены на четыре группы по 20 особей в каждой. Первая (контрольная) группа состояла из интактных мышей. Во вторую группу входили животные, у которых моделировали лекарственный дисбиоз путем внутрибрюшинного введения в течение 5 дней раствора гентамицина в концентрации 80 мкг/мл в пересчете на массу тела животного (0,02 мл) [10]. Мышам третьей группы по окончанию введения антибиотика интрагастрально вводили пробиотик «РиоФлора Иммуно Нео» по 0,02 мл в течение 21 дня. Мыши четвертой группы после формирования дисбиоза интрагастрально получали пробиотик «Бифиформ» по 0,03 мл в течение 21 дня.

У мышей контрольной группы, а также экспериментальных групп после окончания введения гентамицина (вторая группа) или пробиотиков (третья и четвертая группы) производили изучение состава мукозной микрофлоры толстого кишечника. Количественное и качественное исследование мукозной микрофлоры толстого кишечника мышей проводилось по [6]. Биоптаты слизистой оболочки толстого кишечника освобождались от химуса и взвешивались в асептических условиях. После этого материал помещался в стерильный раствор фосфатного буфера в соотношении 1:10 и выдерживался в нем 2 часа для разжижения муцина. Затем готовились разведения материала до концентраций 10-2 — 10-4. По 0,1 мл каждого разведения взвеси засевали газоном на поверхность питательных сред (Эндо, Сабуро, SSA-агар, ЦПХ-агар, кровяной агар, желточно-солевой агар, висмут-сульфит агар, лактоагар, бифидоагар) и инкубировали при температуре 37°C в аэробных и анаэробных условиях. Идентификацию микроорганизмов проводили с помощью микробиологического анализатора «Multiskan-Ascent» с использованием тест-систем ЭНТЕРОтест-16, СТАФИтест-16, Стрептотест-16, Эн-КОККУСтест-16, API 50 CHL для идентификации лактобацилл и бифидобактерий. Количество микроорганизмов в 1 г материала рассчитывали, исходя из числа выросших колоний микроорганизмов — КОЕ при посеве из максимального разведения, где отмечался рост не менее 10 колоний, учитывая при этом объем посевного материала. Для расчета использовали формулу: к=е/к^-п, где К — колониеобразующая единица, Е — общее количество бактерий, к — количество внесенного материала, v — количество чашек Петри, n — разведение. Удельное содержание микроорганизмов вычисляли как количество микроорганизмов, выделенных из биопроб, и выражали в lg КОЕ/г массы биологического материала [4, 5, 12].

Статистическую значимость различий средних величин вычисляли по t-критерию

6. ЖМЭИ 4 № 14-2015

81

Стьюдента после проверки нормальности распределения изучаемых параметров с помощью программы Statistica 6.0 [13].

РЕЗУЛ ЬТАТЫ

При исследовании количественного и качественного состав мукозной нормофлоры толстого кишечника интактных животных было установлено, что в составе мукозной микрофлоры преобладали бифидобактерии (7,93+0,93), в несколько меньшем количестве обнаруживались E. coli c нормальной ферментативной активностью (6,77+0,78) и лакто-бациллы (6,15+0,70) (табл.).

Кроме того, в составе микрофлоры обнаруживались представители рода Salmonella (5,65+0,66), а содержание кишечных палочек со сниженной ферментативной активностью и бактерий родов Enterobacter, Citrobacter, Enterococcus составило 2,74+0,60; 4,47+0,79; 4,37+0,92 и 3,42+0,90 соответственно. Несколько ниже было число коагулазоотрицатель-ных стафилококков (2,74+0,60) и бактерий рода Streptococcus (2,93+0,60), а грибы рода Candida присутствовали в незначительном количестве (1,26+0,32). При этом в составе мукозной микрофлоры интактных мышей не определялись золотистые стафилококки и микроорганизмы рода Proteus.

Экспериментальный дисбиоз кишечника, обусловленный введением гентамицина, характеризовался уменьшением численности доминантных представителей микрофлоры здоровых животных — содержание бифидобактерий снизилось в 1,9 раза, а кишечных палочек с нормальной ферментативной активностью и лактобактерий — в 1,7 раза. При этом число эшерихий со сниженной ферментативной активностью увеличилось в 1,6 раза, а стрептококков в 2,1 раза по отношению к контролю. Содержание энтеробактерий уменьшилось в 1,9 раза и составило 2,37+0,56. В составе кишечного биоценоза данной экспериментальной группы не выявлялось микроорганизмов рода Citrobacter и Enterococcus, тогда как отмечалось появление золотистых стафилококков и бактерий рода Proteus (3,40+0,62 и 4,01+0,66 соответственно). На фоне применения гентамицина в составе микробиоценоза толстого кишечника мышей количество грибов рода Candida увеличилось в 3,9 раза. Что касается коагулазотрицательных стафилококков и сальмонелл, то изменения их численности были недостоверны по отношению к контролю.

Применение «РиоФлора Иммуно Нео» оказало достоверное воздействие на содержание 10 из 13 определяемых в составе мукозной микрофлоры толстого кишечника мышей микроорганизмов. При этом использование пробиотика привело к увеличению численности бифидобактерий, лактобацилл, эшерихий с нормальной ферментативной активно-

Влияние пробиотиков «РиоФлора Иммуно Нео» и «Бифиформ» на состав мукозной микрофлоры толстого кишечника мышей

Количество микроорганизмов, lg KOE/г

Выделенные микроорганизмы Группы животных

контроль дисбиоз «РиоФлора Иммуно Нео» «Бифиформ»

E.coli c норм. фермент. акт. 6,77+0,78 3,95+0,53** 7,20+0,66™ 6,51+0,64хх

E.coli со сниж. фермент. акт. 4,37+0,76 7,03+0,95* 2,67+0,61™ 2,38+0,64™

Enterobacter spp. 4,47+0,79 2,37+0,56* 5,92+0,74™ 6,42+0,94™

Salmonella spp. 5,65+0,66 6,44+0,86 3,97+0,81х 2,97+0,44™***

Citrobacter spp. 4,37+0,92 0+0*** 3,78+0,79™ 3,21+0,63™

Enterococcus spp. 3,42+0,90 0+0*** 4,71+0,79™ 5,14+0,69™

Streptococcus spp. 2,93+0,60 6,17+1,09* 3,48+0,49х 3,10+0,48х

Staphylococcus (коагулазоотр.) 2,74+0,60 4,10+0,75 3,02+0,70 2,91+0,56

Staphylococcus aureus 0 3,40+0,62*** 2,31+0,62*** 1,80+0,31х***

Proteus spp. 0 4,01+0,66*** 2,60+0,58*** 2,13+0,54х***

Candida spp. 1,26+0,32 4,94+0,74*** 1,06+0,38™ 0+0ххх***

Lactobacillus spp. 6,15+0,70 3,73+0,77* 6,43+0,90х 6,16+0,78х

Bifidobacterium spp. 7,93+0,93 4,24+0,72** 8,20+1,22хх 9,12+0,94™

Примечание. * р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001 по сравнению с контрольной группой; х р<0,05,

хх р<0,01, ххх р<0,001 по сравнению с группой «дисбиоз».

стью и микроорганизмов рода Enterobacter, появлению представителей родов Citrobacter и Enterococcus, в результате чего их содержание достигло значений у интактных мышей. Количество кишечных палочек со сниженной ферментативной активностью, сальмонелл, стрептококков и грибов рода Candida на фоне терапии снизилось, в результате чего эти показатели нормализовались. Достоверных изменений содержания коагулазоотрицатель-ных и золотистых стафилококков, а также бактерий рода Proteus зарегистрировано не было, однако в результате применения пробиотика число коагулазоотрицательных стафилококков не отличалось от значений контрольной группы.

В группе животных, получавших пробиотик «Бифиформ», количество эшерихий с нормальной и сниженной ферментативной активностью, бифидобактерий и лактобацилл достигло значений контрольной группы. Также нормализовалось содержание стрептококков и коагулазоотрицательных стафилококков. Микроорганизмы рода Citrobacter и Enterococcus, которые отсутствовали в группе мышей с экспериментальным дисбиозом, определялись в количестве 3,21+0,63 и 5,14+0,69 соответственно и не отличались от значений контроля. Стафилококки и бактерии рода Proteus по-прежнему определялись в составе мукозной микрофлоры животных. Число представителей рода Enterobacter достоверно увеличилось и превысило значение в контрольной группе, а сальмонелл — уменьшилось ниже значений контроля, грибы рода Candida не выявлялись.

ОБСУЖДЕНИЕ

Таким образом, при коррекции гентамицинового дисбиоза пробиотиками «РиоФлора Иммуно Нео» и «Бифиформ» отмечена коррекция содержания представителей мукозно-го микробиоценоза толстой кишки. При этом применение «Бифиформа» приводило к нормализации содержания 7 из 11 разбалансированных в результате применения гента-мицина представителей микрофлоры (бифидобактерий, лактобацилл, кишечных палочек с нормальной и сниженной ферментативной активностью, энтерококков, стрептококков и бактерий рода Citrobacter). Использование пробиотика «РиоФлора Иммуно Нео» нормализовало 10 из 11 разбалансированных представителей микрофлоры (кроме выше перечисленных еще и бактерий рода Enterobacter, сальмонелл и грибов рода Candida). Выявленные различия в нормализации количественного состава микробиоты толстого кишечника, по нашему мнению, связаны с видовым составом микроорганизмов использованных пробиотиков. Это позволяет рекомендовать в клинической практике применение данных препаратов для избирательной коррекции дисбиоза после исследования качественного и количественного состава микробиоценоза толстого кишечника.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бекбосынова Б.А. Рациональная терапия дисбактериоза. Здоровье и болезнь. 2012, 6 (108): 2428.

2. Бойцов А.Г., Нилова Л.Ю., Оришак Е.А. Дисбиотические нарушения микрофлоры толстого кишечника: проблемы диагностики и коррекции. Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова. 2008, 3 (28): 120-123.

3. Бредихин В.Н., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Лещенко А.А., Лазыкин А.Г. Мкроэкологические изменения в кишечнике при дисбактериозе: экспериментальное обоснование возможности коррекции дисбиотических изменений пребиотиком стимбифид. Кишечная микрофлора: взгляд изнутри. Инновационный сборник научных статей. 2013, 2: 102-103.

4. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Богданова Е.А., Корнеев М.Л. Исследование пристеночной микрофлоры кишечника крыс. Журн. микробиол. 2005, 3: 61-65.

5. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Богданова Е.А., Корнеев М.Л. Особенности микробиоценоза пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта крыс. Журн. микробиол. 2005, 6: 3-7.

6. Ефимов Б.А., Кафарская Л.И., Коршунов В.М. Современные методы оценки качественных и количественных показателей микрофлоры кишечника и влагалища. Журн. микробиол. 2002, 4: 72-78.

7. Завгородняя Е.Ф. Дисбактериоз кишечника (обзор). Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2010, 16: 131-141.

8. Иванова Е.В. Биологические свойства бифидобактерий и их взаимодействие с микросимбионтами кишечной микрофлоры человека: Автореф. дис. канд. мед. наук. Оренбург, 2010.

9. Каширская Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной микрофлоры. Рус. мед. журн. 2008, 4: 64-66.

10. Кашкин К.П., Караев З.О. Иммунная реактивность организма и антибиотическая терапия. Л., Медицина, 1984.

11. Медведева ОА., Калуцкий П.В., Беседин A.ß., Жиляева Л.В., Остап E.ß., Иванов A.ß., Медведева С.К. Изучение состояния пристеночной микрофлоры и стенки толстой кишки мышей под воздействием аномального магнитного поля. Журн. микробиол. 2012, 1: 49-54.

12. Несвижский Ю.В., Богданова E.A., Зверев В.В., Воробьев A.A. Микробиоценоз пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта крыс с индуцированным дисбиозом. Журн. микробиол.

2007, 3: 57-б0.

13. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета программ Statistica М., МедиаСфера, 200б.

14. Соловьева И.В., Белова И.В., Точилина A.E, Eфимов E.H, Пожидаева A.Q Формирование микрофлоры толстой кишки у детей. Вестник Нижегородского университета. 2012, 2-3: 93-99.

15. Урсова Н.И. Особенности формирования микробиоценоза у грудных детей и дисбактериоз кишечника. Педиатрия. Приложение к журналу Consilium medicum. 2005, 2: 5б-59.

16. Хавкин АИ. Микробиоценоз кишечника и иммунитет. Рус. мед. журн. 2003, 11 (3): 122-12б.

17. Костюкевич О.И. Современное представление о микробиоценозе кишечника. Дисбактериоз и его коррекция. Рус. мед. журн. 2007, 28: 217б-2182.

18. Завгородняя E^., Сташкевич ЛА. Особенности микробиологической характеристики дисбио-зов кишечника в современных условиях. Дальневосточный журнал инфекционной патологии.

2008, 12: 1б1-1б2.

19. Geraldine O. et al. Bacteria in the Intestine, helpful residents or enemies from within? Infect. Immun. 2008, 7б (8): 33б0-3373.

20. Xiao-Zhong Huang, Li-Bin Zhu, Zhong-Rong Li, Jing Lin. Bacterial colonization and intestinal mucosal barrier. Develop. World J. Clin. Pediatr. 2013, 2 (4): 4б-53.

Контактная информация: Aгейченко A^.,

305041, Курск, ул. Карла Маркса, 3, р.т. (4712)58-81-32

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015

А.В.Агейченко, П.В.Калуцкий, О.А.Медведева, В.А.Королев

ИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА МИКРОБИОЦЕНОЗА ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА И АНТИ-ОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ КОЛОНОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДИСБИОЗА И ПРОФИЛАКТИКИ ЭМОКСИПИНОМ

Курский государственный медицинский университет

Цель. Изучение состава микробиоценоза толстого кишечника и антиоксидантных свойств колоноцитов в условиях экспериментального дисбиоза и профилактического применения эмоксипина. Материалы и методы. Животным, у которых формировали лекарственный дисбиоз внутрибрюшинным введением гентамицина, с целью профилактики вводили антиоксидант эмоксипин. Количественное и качественное исследование мукозной микрофлоры толстой кишки мышей проводили бактериологическим методом. О состоянии системы перекисного окисления липидов судили по содержанию ацилгидроперекисей и малонового диальдегида, системы антиоксидантной защиты по активности ферментов (каталаза и супероксиддисмутаза). Результаты. Экспериментальный дисбиоз кишечника проявился изменениями в составе мукозной микрофлоры животных и антиоксидантных свойств колоноцитов. Профилактика дисбиоза эмокси-пином привела к нормализации активности ферментов антиоксидантной защиты и продуктов перекисного окисления липидов в ткани кишечника. Заключение. Результаты исследования позволяют полагать, что использование эмоксипина приводит к повышению адаптивно-компенсаторных возможностей макроорганизма при экспериментальном дисбиозе.

Журн. микробиол., 2015, № 4, С. 84-88

Ключевые слова: микрофлора толстого кишечника, дисбиоз, перекисное окисление липидов, антиоксидантная система, эмоксипин