СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ МЕДИЦИНСКИХ ЦЕЛЕЙ
METHOD FOR MAKING MEDICAL PREPARATIONS

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано при восстановлении и корректировке функций поврежденных тканей путем их обработки в процессе лечения лиофилизированными биологически активными веществами диплоидных клеток.
Использование клеточных культур аллофибробластов (АФБ) является основой метода лечения поражений кожных и слизистых покровов и травм. В настоящее время клеточные культуры широко используются в ряде стран в основном для лечения поверхностных поражений кожи и слизистых оболочек, в частности тяжелых ожогов, трофических язв и других поверхностных поражений кожных и слизистых покровов. Биотехнологические клеточные системы составляют центральный элемент клеточных терапевтических технологий, которые создаются для использования в кардиологии, неврологии, гематологии, гепатологии, комбустиологии, стоматологии, эндокринологии и для целей ревитализации.
Известен способ лечения ожоговых ран путем трансплантации живых клеток фибробластов, выращенных на гидрофильном основании, покрытых коллагеном и подвергнутых многократному пассированию (патент РФ № 1699047, МПК А61К 35/48, 1989).
Известный способ позволяет сократить срок заживления ран на 5-7 дней и обеспечить эпителизацию по всей пораженной поверхности. Вместе с тем, сам клеточный трансплантат пригоден для использования в течение небольшого срока годности, что затрудняет его транспортировку и соответственно широкое использование.
Известен также для лечения болезней кожи и травм от воздействия внешних причин способ приготовления препарата, который представляет собой клеточный трансплантат из фетальных тканей. Препарат получают путем выделения и накопления клеток, последние суспендируют, отбирают суспензии с повышенным содержанием региональных стволовых клеток с определенными характеристиками, культивируют, добавляют частично дифференцированные клетки, специализированные клетки и биологически активные вещества, находящиеся в фетальных тканях. Клеточный трансплантат может содержать дополнения, в том числе специфичные белки и/или антиоксиданты и/или ростовые факторы и т.п. (патент РФ № 2160112, МПК А61К 35/48, 2000).
Получаемый препарат можно хранить только в жидком азоте, что затруднительно для обычной транспортировки. Несмотря на то что известный препарат допускает лиофильную сушку, последняя проводится в отношении осадка или супернатанта с целью концентрации материала и не позволяет получить препарат длительного срока хранения в отсутствие жидкого азота. Кроме того, сырьевая база для получения препарата ограничена, а сам процесс его получения требует значительных временных затрат, что также делает затруднительным его широкое использование.
Известна также клеточная культура для заместительной терапии, в качестве которой используют штамм диплоидных клеток ЛЭЧ-4 (81) (Патент РФ № 2213775 МПК C12N 5/08; A61R 35/12; C12N 5/08 C12R 1:91, 2003).
Использование культивированных фибробластов показало высокую эффективность в заместительной терапии, не требует дорогостоящих питательных сред, стимуляторов роста, что сокращает себестоимость, а также позволяет существенно сократить сроки получения трансплантатов, готовых к использованию в клиниках. Вместе с тем, препарат имеет малый срок годности и пригоден для хранения только в жидком азоте, требует индивидуального приготовления образца и немедленного его использования, что делает затруднительным его транспортировку и широкое применение.
Известен способ получения штамма диплоидных клеток, который может быть использован в заместительной терапии для лечения кожных поражений. (Заявка на изобретение РФ № 2007104923, МПК C12N 5/08, 2008). Способ включает использование предварительно измельченной эмбриональной ткани, которую промывают ферментным раствором при температуре 25-37°С, с последующей трипсинизацией не менее трех, но не более пяти раз путем обработки кусочков ткани раствором трипсина с протеолитической активностью в пределах 65-80 Ед при перемешивании, сливы отделившихся клеток обрабатывают питательной средой и центрифугируют, образовавшийся осадок ресуспендируют и культивируют в монослое в ростовой среде на основе среды Игла, инкубируют с последующим пассированием не менее пяти раз, целевой продукт обрабатывают ферментным раствором с целью его съема с поверхности матраса, полученную клеточную взвесь центрифугируют, а затем целевой продукт подвергают криоконсервации при температуре жидкого азота.
Известный способ позволяет повысить эффективность процесса получения штаммов диплоидных клеток млекопитающих, который характеризуется повышенной стабильностью и является эффективным при лечении поражений кожи. Однако, полученный продукт не пригоден для длительного хранения в условиях отсутствия жидкого азота и не подлежит транспортировке в отсутствие специального оборудования, что затрудняет его масштабное использование.
Известен также способ получения сухого препарата путем выделения целевого вещества - альфа-фетопротеина из сыворотки крови, с последующим фракционированием белков, очисткой с помощью двойной аффинной хроматографии на сефарозе, стерилизирующей фильтрацией и лиофилизацией (патент РФ № 2283131, МПК А61К 38/17, А61Р 37/02, 2006 г.).
Получаемый препарат хранится при +4°С, обладает выраженными иммуносупрессорными свойствами, используется для снижения реакций трансплантационного иммунитета при пересадке органов и тканей. Вместе с тем, процесс получения препарата трудоемок, требует значительного количества реагентов, тогда как выход целевого продукта составляет 75%, и, кроме того, целевой продукт не обладает собственным выраженным действием при лечении заболеваний кожи.
Наиболее близким к предлагаемому является способ получения лиофилизированного инсулина путем стерильного извлечения поджелудочной железы эмбрионов, их измельчения на фрагменты, культивированием in vitro в питательной среде Игла с добавлением 10% сыворотки крови человека в ротационной установке, центрифугированием для удаления шлаков, отделением супернатанта с последующим его замораживанием, размораживанием, повторным центрифугированием с последующей лиофилизацией замороженных супернатантов (Авторское свидетельство SU № 1806751, МПК А61Л 37/26, 35/39, 1993 г.).
Получаемый препарат не обладает собственным выраженным действием при лечении поражений кожных и слизистых покровов.
Задачей настоящего изобретения является получение высокоэффективного препарата для лечения поражений кожных и слизистых покровов, с длительным сроком хранения при температуре +4°С при одновременном обеспечении безотходного процесса его получения.
Поставленная задача решается тем, что предлагается способ получения клеточных препаратов для лечения поражений кожных и слизистых покровов путем лиофилизации клеточных культур, где в качестве сырья используют восстановленные после криоконсервации диплоидные клеточные культуры, при этом до лиофилизации клеточных культур проводят операцию восстановления и накопления клеточной культуры путем ее пропагации в монослое в ростовой среде на основе среды Игла, кондиционированную ростовую среду отделяют от образовавшегося клеточного пласта путем ее стерильного слива во флаконы, а клеточный пласт снимают, отмывают центрифугированием, доводят до требуемой концентрации и полученную клеточную взвесь стерильно сливают во флаконы, флаконы с кондиционированной ростовой средой и флаконы с клеточной взвесью последовательно подвергают однократному замораживанию до температуры не ниже -20°С и оттаиванию при температуре не выше +25°С с последующим стерильным розливом во флаконы, кондиционированную ростовую среду и клеточную взвесь подвергают замораживанию в открытых флаконах при температуре не выше минус 50°С, выдерживают в замороженном состоянии не менее 48 часов с последующей лиофилизацией в две стадии, на первой стадии в течение не менее 20 часов ведут десорбцию при температуре минус 50°С÷0°С, а на второй стадии ведут сублимацию в течение не менее 20 часов при температуре 0°С÷30°С, флаконы с клеточной культурой стерильно закрывают.
В качестве исходного сырья используют криоконсервированные диплоидные клеточные культуры согласно нормативной документации («Выделение, культивирование и контроль штаммов диплоидных клеток». Методические указания. Министерство здравоохранения СССР, М., 1979 г., с.16-22). В качестве исходного сырья могут быть использованы клеточные культуры, полученные из эмбриональной ткани млекопитающих, преимущественно ткани эмбрионов свиньи, овцы. Для проведения заявленного способа наиболее предпочтительными являются эмбриональные ткани первой половины срока беременности (4-6 недель). Клетки, полученные из эмбриональной ткани такого раннего возраста, менее дифференцированы, что положительно влияет на качество и количество конечного продукта. В качестве источника эмбриональной ткани могут быть использованы эмбрионы второй половины срока беременности (10-12 недель), однако в этом случае качество клеток ухудшается, а время эффективного культивирования существенно уменьшается.
Приготовление клеточной культуры включает использование предварительно измельченной эмбриональной ткани млекопитающего, промытой ферментным раствором при температуре 25-37°С, с последующей трипсинизацией ткани путем многократной обработки кусочков ткани при перемешивании раствором трипсина, сливы отделившихся клеток обрабатывают питательной средой и центрифугируют, образовавшийся осадок ресуспендируют и культивируют в монослое в ростовой среде на основе среды Игла, инкубируют с последующим пассированием в течение не менее пяти раз, целевой продукт обрабатывают ферментным раствором с целью съема с поверхности матраса, полученную взвесь центрифугируют, а полученную клеточную массу используют для получения заявляемого препарата после ее криоконсервации.
Заявляемый способ может быть реализован для получения целевых препаратов с использованием любой другой разрешенной к использованию клеточной культуры.
В заявляемом способе для культивирования в монослое используется ростовая среда на основе среды Игла, в качестве которой может быть использована среда, состоящая предпочтительно из равных количеств среда роста Игла MEM и 0,5% раствор гидролизата лактальбумина (ГЛА) с 10% эмбриональной сыворотки телят (ЭТС) или смесь среды роста Игла MEM и среды 199 или иные известные ростовые среды, содержащие среду роста Игла. Использование указанных сред обеспечивает сохранение жизнеспособности клеточных культур и их максимальный выход.
Съем клеток производят смесью растворов 0,25% трипсина и 0,02% Версена с последующим добавлением среды Игла или ГЛА. Режим съема клеток обеспечивает максимальное количество и качество снимаемой клеточной суспензии, а последующее центрифугирование - качественное осаждение клеточной массы.
Согласно заявляемому способу исходную клеточную культуру используют после ее криоконсервации. Получение сухого препарата осуществляют путем лиофилизации предварительно обработанной клеточной культуры. Обработку клеточной культуры ведут следующим образом. Восстановленную клеточную культуру культивируют в монослое в вышеуказанной ростовой среде на основе среды Игла, предпочтительно, в течение 4-5 суток, после чего производят съем клеточной культуры и ее отделение от кондиционированной ростовой среды. Последнюю отбирают во флаконы, а снятый клеточный пласт отмывают центрифугированием, полученную клеточную взвесь доводят до требуемой концентрации и разливают во флаконы. Пробы на стерильность берут из флаконов с кондиционированной ростовой средой и из флаконов с клеточной взвесью. Флаконы с кондиционированной ростовой средой и флаконы с клеточной взвесью подвергают сначала замораживанию до температуры не ниже -20°С, а потом оттаиванию при температуре +20°С ÷ +25°С. Замороженные флаконы с клеточной взвесью и кондиционированной ростовой средой хранят до проведения бактериологических анализов, но не более 3-х недель. После оттаивания содержимое флаконов стерильно разливают во флаконы для лекарственных средств, после чего замораживают в открытых флаконах в стерильных кассетах для лиофильной сушки при температуре не выше минус 50°С, выдерживают в замороженном состоянии не менее 48 часов с последующей лиофилизацией в две стадии, на первой стадии ведут десорбцию в течение не менее 20 часов при температуре минус 50°С÷0°С, а на второй стадии ведут сублимацию в течение не менее 20 часов при температуре 0°С÷30°С при давлении не выше 15 Па, флаконы с сухим целевым продуктом стерильно закрывают.
Целевой продукт представляет собой:
- лиофилизированный препарат на основе кондиционированной ростовой среды - (ЛС);
- лиофилизированный препарат на основе клеточной культуры - клетки - (ЛК).
Получаемые препараты могут храниться при температуре +4°С ÷ +6°С не менее 12 месяцев, что делает их удобными для транспортировки и широкого использования.
Проведенными исследованиями было установлено, что получаемые лиофилизированные препараты показали эффективность при лечении глубоких обширных ожоговых ран, при отморожениях, при субдермальных ожогах III (а, б) и IV степени в ранние сроки после поступления больного, при лечении слизистых оболочек ротовой полости и полости носоглотки.
Заявляемый способ обеспечивает безотходную технологию получения препаратов для лечения кожных поражений из клеточных культур, выход целевого продукта превышает 90%.
Сравнение заявляемого способа с известным позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна», т.к. для получения сухого препарата использована криоконсервированная клеточная культура, а ее лиофилизация сопровождается специальной предварительной обработкой, в результате которой целевой продукт получают как из самой клеточной культуры, так и из кондиционированной ростовой среды, в которой эта клеточная культура тиражировалась.
В науке и технике известны способы сублимационной сушки различных веществ, в том числе способы сушки тканевых клеточных культур. Известны также способы культивирования клеточных культур в монослое в ростовой среде на основе среды Игла. В заявляемом способе совокупность использованных приемов позволила получить новый технический результат, выражающийся в сохранении качества клеточных культур, обеспечении возможности использования кондиционированной ростовой среды с получением целевого продукта (ЛС), что привело к созданию безотходного производства с максимальным выходом целевого продукта, пригодного для длительного хранения и масштабного использования. Вышеизложенное позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого способа критерию «изобретательский уровень».
Заявляемое изобретение может быть использовано в медицине для лечения поражений кожных и слизистых покровов по известным методикам, целевой продукт способен к промышленному производству, при его приготовлении используются известные в медицине препараты. Вышеизложенное позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «промышленная применимость».
Заявляемый способ иллюстрируется схемой, представленной на чертеже.
3
1
2
Для реализации заявленного способа были приготовлены клеточные культуры согласно следующей методики. В качестве исходного сырья используют криоконсервированную клеточную культуру, которую полученную трипсинизацией однородных тканей от млекопитающего животного - донора, 4-6-недельные эмбрионы свиньи. Отобранную ткань трехкратно промывают стерильным раствором Хенкса или 0,25%-ным раствором трипсина или 0,02%-ным раствором химопсина с гентамицином при температуре 25-37°С, собирают в стерильную колбу, отмывают до возможно полного обескровливания и измельчают скальпелем на кусочки величиной 2-3 мм. Отмытые кусочки ткани помещают в стерильную колбу для проведения процесса трипсинизации на магнитной мешалке. Трипсинизацию ведут путем добавления в колбу 0,25% раствора трипсина, предпочтительно с протеолитической активностью в пределах 65-80 Ед при температуре 32-37°С. Цикл трипсинизации повторяют не менее 3-х раз. Для ослабления переваривающей активности трипсина в сливаемые порции взвеси клеток до / объема добавляют 0,5% раствор гидролизата лактальбумина (ГЛА). После каждого цикла трипсинизации взвесь клеток помещают в предварительно охлажденные до температуры не более +6°С стерильные центрифужные стаканы и заливают средой Игла или смесью питательных сред Игла и 0,5% ГЛА. Центрифугирование отобранной взвеси клеток проводят при 1200-1500 об/мин в течение 10 минут в охлаждаемой центрифуге при температуре +4-+6°С. Полученный осадок ресуспендируют в 0,5% растворе ГЛА и клеточную взвесь тщательно пипетируют. Отбирают пробу и проводят контрольный подсчет клеток в камере Горяева. Пипетированную клеточную взвесь готовят в концентрации 300 тыс. клеток /мл в среде Игла MEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (ЭСКРС) и разливают в стерильные одноразовые пластиковые матрасы. Инкубирование ведут в термостате при 37°С.Через 1 сутки проводят смену ростовой среды для удаления детрита. Монослой клеток формируется на 5-е сутки. Пересев проводят по стандартной методике в соотношении 1:2. На втором и третьем пассажах клетки пересевают на 5 сутки независимо от плотности монослоя. С 4-го пассажа формируется плотный монослой с ориентированными зонами роста униморфных фибробластоподобных клеток с четкими границами. Съем клеточного пласта при пассировании ведут 0,25% раствором трипсина или 0,02% раствором версена или их смесью при соотношении 1:1 при температуре около 37°С в течение 0,5-1,0, минуты с добавлением среды Игла MEM или ГЛА с последующим центрифугированием при 1000-1200 об/мин в течение 10-15 минут.
Количественный кариологический анализ полученной культуры клеток показал, что относительное число клеток с хромосомным набором, соответствующим набору хромосом животного-донора, составляет 95-97%. Становление культуры происходит в процессе 1-5 пассажей, накопление полученных диплоидных штаммов клеток ведут с 6 по 20 пассажи. Рост установившейся культуры диплоидных штаммов клеток надлежащего качества происходит не менее чем до 45 пассажа.
Криоконсервацию установившейся клеточной культуры проводят по стандартной методике в среде роста с добавлением 10% глицерина в программном замораживателе по стандартному режиму с последующим помещением в низкотемпературный холодильник (не менее - 86°С) или в жидкий азот (-196°С). Контрольное восстановление полученных клеток показало, что жизнеспособность восстановленной культуры составляет 85-95%.
Пробы установившейся клеточной культуры, не подвергшиеся криоконсервации, продолжают пассировать до начала проявления в монослое признаков неспецифической дегенерации или заметных изменений морфологических показателей.
При получении клеток фибробластов эмбрионов свиньи из легкого эмбрионов свиньи (ЛЭС) вышеописанным способом средний выход клеток с 1 г ткани составляет 30-40 миллионов клеток.
Для приготовления препаратов заявляемым способом для лечения поражений кожных и слизистых покровов берут восстановленные после криоконсервации клеточные культуры, полученные из эмбриональной ткани млекопитающих и приготовленные преимущественно вышеописанным способом.
Контроль на бактериологическую и вирусологическую стерильность осуществляют по утвержденным методикам МУК 1/4.2.588-96 методом прямого посева; методом окраски ДНК-флуорохромами по РД 42-28-10-89 или методом электронной микроскопии в соответствии с МУ МЗ СССР, М., 1979; реакцией гемадсорбции с эритроцитами морской свинки по МУК 1/4.2.588-96. Подготовку препаратов для определения кариологических параметров культуры проводят согласно требованиям РД 42-28-10-89, контроль кариологических параметров ведут по известным методикам (см., например, «Выделение, культивирование и контроль штаммов диплоидных клеток». Методические указания. Министерство здравоохранения СССР, М., 1979 г., с.16-22).
Криоконсервированную клеточную культуру восстанавливают по известным методикам в течение 14-18 дней. Восстановленные криоконсервированные клеточные культуры культивируют в монослое в ростовой среде на основе среды Игла, в качестве которой используют, мас.%: питательная среда Игла MEM - 45, 0,5%-ный раствор гидролизата лактальбумина - 45 (ГЛА) и эмбриональная сыворотка телят - 10 (ЭТС). Культивирование ведут в течение 4-5 суток, после чего производят съем клеточного пласта и отделение от кондиционированной ростовой среды путем ее слива. Съем клеточного пласта ведут по вышеописанной методике. Кондиционированную ростовую среду отбирают во флаконы для кровезаменителей объемом 250 мл или 500 мл и из каждого флакона берут пробу для определения бактериологической и вирусологической стерильности. Снятый клеточный пласт отмывают центрифугированием в течение 10 минут при 1500 об/мин. Образовавшуюся клеточную взвесь доводят до концентрации около 200 тыс. кл./мл и разливают во флаконы. Пробы на бактериологическую и вирусологическую стерильность берут из флаконов с кондиционированной ростовой средой и из флаконов с клеточной культурой. Флаконы с кондиционированной ростовой средой и флаконы с клеточной культурой подвергают сначала замораживанию до температуры не ниже минус 20°С, предпочтительно -16°С ÷ -18°С, а потом проводят оттаивание при температуре +20°С ÷ +25°С. Замороженные флаконы с клеточной культурой и отработанной ростовой средой хранят до проведения бактериологических анализов, но не более 3-х недель. Оттаивание флаконов ведут по получению данных бактериологических исследований. После оттаивания содержимое флаконов стерильно разливают по 5 мл во флаконы для лекарственных средств объемом 10 мл, после чего замораживают в открытых флаконах в стерильных кассетах для лиофильной сушки при температуре не выше минус 50°С, оптимально минус 70°С, выдерживают в замороженном состоянии не менее 48 часов. Лиофильную сушку препаратов проводят в аппарате LZ-9.2 при давлении не выше 15 Па в две стадии, сначала проводят стадию десорбции в интервале температур минус 50°С÷0°С в течение не менее 20 часов, а затем стадию сублимации в интервале температур 0°С ÷ +30°С. Скорость повышения температуры - 5°С в час. Общая продолжительность цикла сушки составляет 40-42 часа. По окончании сушки полученные препараты ЛС и ЛК укупоривают, стерильно закрывая пробками и закатывая алюминиевыми колпачками.
Препараты, полученные вышеописанным способом, были исследованы на сохранение исходных свойств и испытаны для лечения ожогов. Полученные данные представлены в таблицах.
Для определения заживления ожоговых ран II, III (А. Б) степени были использованы лиофилизированные препараты, полученные из клеток криоконсервированного диплоидного штамма, полученного вышеописанным способом. Клинические исследования влияния препаратов были проведены на группах пациентов в возрасте от 6 месяцев до 15 лет с ожогами раны II, III (А, Б) степени (1 группа - контрольная, получающая лечение консервативными методами с использованием мазей, 2 группа, получающая лечение ЛС, 3-я группа, получающая лечение ЛК). Заявляемые препараты готовили к использованию разведением в 5 мл воды для инъекций или в физиологически стерильном растворе. Обработку поражений кожи вели путем орошения или накладыванием повязки, пропитанной разведенным препаратом. Сроки полной эпителизации, формирование струпа и тип эпителизации оценивали визуально; болевые ощущения оценивали путем опроса, по реакции в процессе обработки; экссудацию определяли морфологически. Полученные данные представлены в таблице 1, таблице 2 и таблице 3.
Как видно из представленных данных, использование препаратов, как из кондиционированной ростовой среды (ЛС), так и из клеточной культуры (ЛК), полученных заявляемым способом, позволяет повысить эффективность лечения поражений кожи и его качество, позволяя снизить болевые ощущения и не допуская протекания гнойных процессов и образование рубцов.
Из представленных данных также видно, что эффективность ЛК выше, чем эффективность ЛС. Использование препарата ЛК показано для лечения больных с сильными поражениями кожи (например, обширные глубокие ожоги III и IV степени), тогда как лечение менее сильных поражений кожи (например, ожогов II и III степени), а также лечение слизистых покровов может быть эффективно проведено с использованием препарата ЛС.
Таблица 1
Заживление ожоговых ран II, III (А, Б) степени под влиянием обработки лиофилизированным препаратом
Параметры
Способ лечения
Контроль (консервативный метод)
Лиофилизированная ростовая среда (ЛС)
Лиофилицированная клеточная культура (ЛК)
Возраст
8 мес. - 15 лет
6 мес. - 14 лет
1 год - 14 лет
Сроки полной эпителизации (сутки)
14,3±1,9
9,3±1,2
8,5±1,1
Формирование струпа (%)
100
10-11
7-9
Гнойные осложнения (%)
5
нет
нет
Тип эпителизации
с образованием рубца
безрубцовый
безрубцовый
Таблица №2
Переносимость препарата пациентами при ожогах III (А, Б) степени
Группы пациентов
Болевые ощущения
Длительность болевой реакции
Реакции
1 группа (контроль)
++
++
-
2 группа (ЛС)
+
+
-
3 группа (ЛК)
+
+
-
где: + - ощутимые; ++ - выраженные.
Таблица №3
Влияние препарата на раневой процесс при ожогах III (А, Б) степени
Группы пациентов
Экссудация
Эпителизация (дни)
Температурная реакция
Лейкоцитоз n×10<sup>9</sup>
1 группа (контроль)
+++
13,6±/-1,6
N
10,3±/-1,2
2 группа (ЛС)
++
12,1±/-1,3
N
10,9±/-1,7
3 группа (ЛК)
++
10,5±/1,7
N
10,4±/1,4
где: +++ - выражена сильно; ++ - выражена слабо.
Наблюдения за годностью препаратов в течение 12 месяцев показали, что при хранении препаратов ЛС и ЛК в условиях +4°С - +6°С препараты сохраняют свои исходные свойства. Получение заявляемых препаратов, годных к использованию в течение не менее 12 месяцев и не требующих специальных низкотемпературных условий для хранения, позволяет расширить возможности их применения для лечения кожных поражений.