Экспрессия некоторых генов энергетического метаболизма в панкреатических островках человека коррелирует с уровнем гликозилированного гемоглобина

стоверно чаще предъявляли диспепсические жалобы, в частности на изжогу и боли в эпигастрии, чем во 2 группе (70 и 41,4% соответственно, р<0,05). В 1 группе с большей частотой при эндоскопическом и гистологическом исследовании выявляли эзофагит А-В степени, чем во 2 группе (35 и 16,7% соответственно, р<0,05), и реже эндоскопически негативную ГЭРБ (28,9 и 42,7% соответственно, р<0,05).

Данный феномен требует дальнейшего анализа, но уже сейчас можно предположить, что назначение больным СД 2 типа инсулина приводит к более частому формированию и неблагоприятному течению ГЭРБ у данных пациентов.

В заключение можно отметить, что поражение пищевода в виде ГЭРБ у больных СД 1 и 2 типа является распространенным явлением. Данная патология часто служит причиной абдоминального болевого и диспепсического синдромов, но у ряда пациентов, особенно с СД 2 типа, она может протекать и бессимптомно. Назначаемая сахароснижающая терапия СД способна влиять на возникновение и течение ГЭРБ при СД. Помнить об этом должны врачи-эндокринологи, гастроэнтерологи, терапевты, работающие с больными СД.

Литература

1. Баранская Е.К. Болезни органов пищеварения при эндокринной патологии - М.: Медицина, 1989.- С. 88.

2. Балаболкин М.И. Сахарный диабет. - М.: Медицина, 1994. - С. 54-76.

3. Вержбицкий Ф.Р., Циммерман Я.С. Интрагастраль-ная рН-метрия и пути повышения ее информативности // Клин. медицина. - 1991. - №10. - С. 100-102.

4. Григорьев П.Я., Яковенко Э.П. Недостаточность кардии и рефлюкс-эзофагит // Российский медицинский журнал. - 1996. - №5. - С. 11-14.

5. Казей Н.А. Диабетическая вегетопатия // Диабет. Образ жизни. - 1997. - № 4. - С. 12-14.

6. Кирилов Д.А. Клинические и функционально-морфологические особенности гастроэзофагеальной реф-люксной болезни при сахарной диабете: автореф. дис. ... канд. мед. наук. - М., 2002.

7. Лазебник Л.Б., Бордин Д.С., Машарова А.А. Современное понимание гастроэзофагеальной рефлюксной болезни: от Генваля к Монреалю // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2007. - №5. - С. 4-11.

8. Федорченко Ю.Л. Хронические гастродуоденальные язвы у больных сахарным диабетом // Проблемы эндокринологии. - 2003. - №1. - С. 7-12.

9. Чернобровый В.Н. Модификация внутрижелудоч-ной рН-метрии у больных язвенной болезнью // Врачебное дело. - 1990. - №1. - С. 17-19.

10. Perdichimi G. Chronic gastritis and ulcer risk in patients with diabetes mellitus // Scand. J. Gastroenterol. -1996. - Vol. 27. - №3. - P. 233-237.

11. Yki-Jarvinen H. Comparison of insulin regimens in patients with non insulin-dependent diabetes mellitus // N. Engl J. Med. - 1999. - Vol. 327. - №10. - P. 1426-1433.

Координаты для связи с авторами: Корнеева Наталья Вячеславовна — очный аспирант 1 года обучения кафедры факультетской терапии ДВГМУ; Федорченко Юрий Леонидович — профессор кафедры факультетской терапии ДВГМУ, тел.: 8-(4212)-22-13-08, e-mail: ufedor@ mail.fesmu.ru.

УДК 576.535 : 575.117.2 : 577.121

В.В. Шаройко, Б.М. Кершенгольц

ЭКСПРЕССИЯ НЕКОТОРЫХ ГЕНОВ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА В ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ ОСТРОВКАХ ЧЕЛОВЕКА КОРРЕЛИРУЕТ С УРОВНЕМ ГЛИКОЗИЛИРОВАННОГО ГЕМОГЛОБИНА

Институт биологических проблем криолитозоны СО РАН,

677891, пр. Ленина, 41, тел.: 8-(4112)-33-58-12, г. Якутск

Молекулярные механизмы, лежащие в основе глюкозостимулированной секреции инсулина в панкреатических Р-клетках, до конца не выяснены. Для исследования метаболических нарушений в Р-клетках, которые ослабляют глюкозостимулированную секрецию инсулина, мы сравнили две клональные линии Р-клеток ГЫ£>-1: глюкозочувствительные (832/13) и глюкозонечувствительные (832/2). Данные клоны были получены из одного родительского клона инсулиномы крысы ГЫ£>-1 путем трансфекции плазмиды, стабильно эспрессирующей мДНК человеческого

инсулина под контролем цитомегаловирусного промотора. Впоследствии были изолированы клоны ГЫ£>-1 832/13 и ГЫ£>-1 832/2 с использованием маркера — гена резистентности к неомицину [1]. С этой целью мы провели в этих клонах сравнительный анализ экспрессии генов, контролирующих энергетический метаболизм клетки. Было обнаружено, что в глюкозонечувствительных клетках 832/2 экспрессия генов гликолитического метаболизма повышена, а митохондриального — снижена, по сравнению с глюкозочувствительными клетками 832/13. Далее мы ис-

следовали, происходят ли подобные метаболические изменения в панкреатических островках человека, которые были обнаружены в клональных Р-клетках.

Материалы и методы

Уровень HbA1c определялся mono-S методом [2]. Клетки линии INS-1 (клоны 832/13 и 832/2) культивировались в инкубаторе при 37°С, во влажной атмосфере воздуха 95% и концентрации СО2 5%, в среде RPMI1640. Среда RPMI 1640 содержала 11 мМ D-глюкозы, 10% эмбриональной сыворотки теленка, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES и 50 мкМ Р-меркапто-этанола [1]. Островки из поджелудочных желез человека были получены от недиабетических умерших доноров (13 женщин, 10 мужчин; ИМТ 17,6-29,0 кг/м2) в возрасте 2673 лет. Степень чистоты островков варьировала от 13 до 90%. Островки культивировались в среде CMRL 1066 с добавлением 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина, 0,25 мкг/мл фунгизона, 20 мкг/мл ципро-флоксацина и 10 мМ никотинамида при 37°С, во влажной атмосфере воздуха 95% и СО2 5%. Затем Р-клетки и островки использовали для выделения РНК.

РНК выделяли и очищали, используя набор реактивов Qiagen RNAeasy RNA purification kit (Hilden, Germany). Обратная транскрипция проводилась с использованием набора реактивов от Fermentas RevertAid™ First-Strand cDNA synthesis kit (Vilnius, Lithuania).

Для скрининга изменений экспрессии генов энергетического метаболизма в Р-клетках использовали ДНК-микрочип от Applied Biosystems (TaqMan LDAs; Foster City, USA), а для панкреатических островков человека использовался ДНК-микрочип от Affymetrix (Inc, Santa Clara, CA, USA).

Секреция инсулина в Р-клетках 832/13 и 832/2, достигших плотности >90%, измерялась в 24-луночных планшетах. Для измерения секреции инсулина клетки в течение 2 ч инкубировались в буфере, содержащем 114 мМ NaCl; 4,7 мМ КО; 1,2 мМ КН2РО4; 1,16 мМ MgSO4; 20 мМ HEPES; 2,5 мМ Са02; 25,5 мМ NaHCO3; 0,2% БСА; рН 7,2 и 2,8 мМ глюкозы. Затем добавлялся буфер того же состава, содержащий 2,8 или 16,7 мМ глюкозы для

Рис. 1. Глюкозостимулированная секреция инсулина в глюкозочувствительных

Резюме

Молекулярные механизмы, лежащие в основе глюкозостимулированной секреции в панкреатических Р-клетках, до конца не выяснены. С целью обнаружения метаболических нарушений, ослабляющих глюкозостимулированную секрецию инсулина, мы провели сравнительный анализ клональных Р-клеток линии INS-1 — глюкозочувствительных (832/13) и глюкозонечувствительных (832/2). Мы проанализировали экспрессию мРНК генов, вовлеченных в энергетический метаболизм клетки. Было обнаружено, что в глюкозонечувствительных клетках 832/2 экспрессия генов гликолитического метаболизма повышена, а митохондри-ального—снижена, по сравнению с глюкозочувствительными клетками 832/13. В человеческих островках экспрессия мРНК генов лактатдегидрогеназы А и гексокиназы I позитивно коррелировала с показателем гомеостаза глюкозы HbA1£, тогда как экспрессия гена S1c2a2 (транспортер глюкозы) негативно коррелировала с уровнем НЪА1с. Таким образом, можно заключить, что сопряженная метаболическая регуляция, усиливающая митохондриальный метаболизм и ограничивающая гликолиз в клетках 832/13, требуется для стабильной глюкозозависимой секреции инсулина. Кроме того, наблюдалась аналогичная картина экспрессии генов, контролирующих гликолиз и митохондриальный метаболизм в клональных Р-клетках и человеческих островках. Из этого можно сделать вывод, что аналогичная приори-тизация митохондриального метаболизма необходима для здоровой человеческой Р-клетки.

Ключевые слова: Р-клетки, островки, метаболизм.

V.V. Sharoyko, B.M Kershengoltz

EXPRESSION OF SOME GENES OF ENERGETIC METABOLISM IN HUMAN PANCREATIC ISLETS CORRELATE WITH GLYCOSILATED HAEMOGLOBIN LEVEL

The Institute of Biological Problems of Cryolithozone, Yakutsk Summary

The molecular mechanisms underlying glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic P-cells are not completely understood. To identify metabolic disturbances in P-cells that impair glucose-stimulated insulin secretion, we compared two INS-1-derived clonal P-cell lines, which are glucose-responsive (832/13) or glucose-unresponsive (832/2). We analyzed mRNA expression of genes involved in cellular energy metabolism. In 832/2 cells mRNA expression of genes for glycolytic enzymes were up-regulated, whereas mitochondria-related genes were down-regulated. In human islets, mRNA expression of genes such as lactate dehydrogenase A and hexokinase I correlated positively with long-term glucose homeostasis reflected by HbA1c levels, while that of S1c2a2 (GLUT) correlated negatively with Hb1Ac. We conclude that tight metabolic regulation enhancing mitochondrial metabolism and restricting glycolysis in 832/13 cells is required for clonal P-cells to secrete insulin robustly in response to glucose. Moreover, a similar expression pattern of genes controlling glycolytic and mitochondrial metabolism in clonal P-cells and human islets was observed, suggesting that a similar prioritization of mitochondrial metabolism is required in healthy human P-cells.

Key words: P-cells, islets, metabolism.

Символ Название гена Номер в генобанке Tagman Ct Разница в экспрессии Р

832/13 кл. 832/2 кл. 832/13 кл./ 832/2 кл.

Ген, ответственный за транспорт глюкозы

S1c2a2 Транспортер глюкозы 2 (GLUT) NM_012879 Rn00563565_m1 22,82 31,08 309 <0,01

Гены гликолитического метаболизма

Gck Глюкокиназа NM_012565 Rn00561265 m1 26,41 29,03 5,56 <0,001

Hk1 Гексокиназа 1 NM_012734 Rn00562436 m1 not detected 29,81 да -

Ldha Лактатдегидрогеназа А NM_017025 Rn00820751 g1 not detected 21,28 да -

Me1 Декарбоксилирующая малатдегидрогеназа 1 NM_012600 Rn00561502_m1 25,49 25,97 1,33 <0,05

Pk1r Пируваткиназа NM_012624 Rn00561764_m1 25,00 26,35 2,35 0,001

Pfkm Фосфофруктокиназа NM_053291 Rn00581848_m1 24,78 25,18 1,27 <0,05

Tri1 Триозофосфат изомераза 1 NM_022922 Rn00821155_g1 23,03 21,79 0,42 <0,01

Гены митохондриального метаболизма

Aco2 Аконитаза 2, митохондриальная NM_024398 Rn00577876_m1 23,44 23,92 1,30 <0,05

Cs Цитрат-синтаза NM_130755 Rn00756225_m1 24,83 24,53 0,77 <0,05

Gpd2 Глицерол-3-фосфат дегидрогеназа 2, митохондриальная NM_012736 Rn00562472_m1 27,17 28,17 2,00 <0,05

Mor1 Малатдегидрогеназа, митохондриальная NM_031151 Rn00579848_m1 23,59 24,09 1,34 <0,01

Рс Пируваткарбоксилаза NM_012744 Rn00562534_m1 26,70 28,58 3,45 <0,001

ATP5e АТФ-синтаза, ^-транспортирующая 8 субъединица, митохондриальный Б1 комплекс NM_019383 Rn00820986_g1 23,05 23,96 1,79 <0,001

Cox4i1 Цитохром с оксидаза субъединица IV, изоформа 1 NM_017202 Rn00567950_m1 26,88 26,22 0,59 <0,05

Ndufa5 МАДН дегидрогеназа 1 а, субкомплекс 5 NM_012985 Rn00820691_g1 25,99 27,75 0,81 <0,05

Nqo1 МАД(Р)Н хинондегидрогеназа 1 NM_017000 Rn00566528_m1 29,43 30,93 2,65 <0,001

Смешанные гены

Acaca Ацетил-КоА карбоксилаза а NM_016987 Rn00672936_g1 26,95 28,55 2,90 <0,05

A1cy АТФ цитратлиаза NM_016987 Rn00566411_m1 22,27 23,93 3,03 <0,001

Cpt1a Карнитин пальмитоил-трансфераза 1 NM_031559 Rn00580702_m1 26,56 26,00 0,65 <0,05

Fasn Синтаза жирных кислот NМ_017332 Rn00569117_m1 25,39 26,16 1,60 <0,05

Glud1 Глутаматдегидрогеназа NM_012570 Rn00561306_m1 24,43 25,20 1,60 <0,05

Mlycd Малонил-КоА декарбоксилаза NM_053477 Rn00585056_m1 28,18 29,47 2,20 <0,01

Pdk2 Киназа пируватдегидрогеназы 2 NM_030872 Rn00578427_m1 27,85 27,04 0,55 <0,01

Примечание. Клетки культивировались 48 ч в присутствии 11 мМ глюкозы, экспрессия генов определялась ДНК-микрочипом методом количественного ПЦР в режиме реального времени. Разница в экспрессии генов рассчитывалась по формуле 2ЛЛа. Данные получены в четырех независимых экспериментах.

измерения глюкозостимулированной секреции инсулина в течение 1 ч. Концентрация инсулина в супернатантах измерялась радиоиммунным методом с использованием набора реактивов Coat-a-Count (DPC, Los Angeles, USA) (3).

Статистическая обработка данных проводилась с вычислением t-критерия Стьюдента и использованием пакета программ Sigma Plot для Windows (версия 7.101 б SPSS, INC), Statistica (версия 5.0, Statsoft, Inc). Корреляционный анализ осуществлялся с использованием непараметрического теста Спирмена. Результаты представлены как среднее ± SE для указанного числа экспериментов. Разницу между средними считали достоверной при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Результаты, представленные на рис. 1, показывают, что глюкозостимулированная секреция инсулина значи-

тельно отличается в двух клонах. Глюкозочувствительные клетки (832/13) в 11,9 раза увеличивают секрецию инсулина при повышении концентрации глюкозы с 2,8 до 16,7 мМ (р<0,01), тогда как глюкозонечувствительные клетки (832/2) не секретируют инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы (рис. 1). С целью выяснения причин нарушения секреции инсулина клетками 832/2 мы провели сравнительный анализ экспрессии мРНК генов, участвующих в клеточном энергетическом метаболизме (гликолиз, цикл трикарбоновых кислот, цепь переноса электронов) в клонах 832/13 и 832/2 соответственно (таблица). Из 46 проанализированных генов 26 экспрессировались различно в клонах 832/13 и 832/2. Уровень мРНК 16 генов был снижен, а 6 генов был повышен в клоне 832/2 по сравнению с клоном 832/13. Следует отметить значительное снижение экспрессии генов 81е2а2, кодирующих

A. 1о^ [экспрессия 81с2а2] в человеческих островках и уровень ИЬЛ1с плазмы

Д. 1о§2 [экспрессия Ldha] в человеческих островках и уровень НЬЛ1с плазмы

Е г=0,47; р<0,05

Б. 1о^ [экспрессия Нк1] в человеческих островках и уровень НЬЛ1с плазмы

Е. 1о^ [экспрессия Об] в человеческих островках и уровень НЬЛ1с плазмы

В. 1о^ [экспрессия Ме1] в человеческих островках и уровень НЬЛ1с плазмы

Г. 1о^ [экспрессия Тп1] в человеческих островках и уровень НЬЛ1с плазмы

Ж. 1о§2 [экспрессия Gpd2] в человеческих островках и уровень НЬЛ1с плазмы

З. 1о^ [экспрессия Лсаса] в человеческих островках и уровень НЬЛ1с плазмы

Рис. 2. Корреляционный анализ значений НЬЛ1с с уровнем экспрессии некоторых генов гликолитического и митохондриального метаболизма в островках человека

белок транспорта глюкозы и глюкозофосфорилирующего фермента с высокой константой Михаэлиса-Ментен (Кт) глюкокиназы (таблица). С другой стороны, ген фермента

с низкой Кт — гексокиназа I — экспрессировался в клоне 832/2 и не детектировался в клоне 832/13. Также ген фермента лактатдегидрогеназы А экспрессировался в кло-

не 832/2, но не в клоне 832/13 (таблица). Выявлено, что отсутствие глюкозостимулированной секреции инсулина в клоне 832/2 коррелировало с увеличением экспрессии генов гликолиза и со снижением экспрессии генов, участвующих в митохондриальном метаболизме. Далее мы проанализировали, происходят ли метаболические изменения в панкреатических островках человека, подобные обнаруженным в клональных Р-клетках. Мы провели корреляционный анализ экспрессии генов энергетического метаболизма, найденных в глюкозонечувствительных клетках, с уровнем НЬА1с. Уровень НЬА1с является надежным индикатором средней гликемии в последующие 2-3 мес. и широко используется в клинической практике.

В человеческих панкреатических островках уровень экспрессии 81с2а2 (транспортер глюкозы) отрицательно коррелировал с НЬАс (рис. 2А), а экспрессия генов, таких как гексокиназа I (рис. 2Б), триозофосфат изомераза 1 (рис. 2Г) и лактатдегидрогена А (рис. 2Д), коррелировала положительно с показателем НЬА1с (НЬА1с отражает содержание глюкозы в крови за последние 1-3 мес.).

Таким образом, можно заключить, что сопряженная метаболическая регуляция, усиливающая митохондриальный метаболизм и ограничивающая гликолиз в клет-

ках 832/13, требуется для стабильной глюкозозависимой секреции инсулина. Кроме того, наблюдалась аналогичная картина экспрессии генов, контролирующих гликолиз и митохондриальный метаболизм в клональных Р-клетках и человеческих островках. В связи с этим можно полагать, что аналогичная характеристика митохондриального метаболизма необходима для здоровой человеческой Р-клетки.

Литература

1. Hohmeier H.E., Mulder H., Chen G. et al. // Diabetes. - 2000. - Vol. 49(3). - P. 424-430.

2. Jeppsson J.O., Kobold U., Barr J. et al. // Clin Chem Lab Med. - 2002. - Vol. 40(1). - P. 78-89.

3. Kelly R. P., Sutton R., Ashcroft, F.M. The Journal of physiology. - 1991. - Vol. 443. - P. 175-192.

Координаты для связи с авторами: Шаройко Владимир Владимирович — научный сотрудник Института биологических проблем криолитозоны СО РАН, тел.: 8-(4112)-33-58-12, e-mail: sharoyko-vv@mail.ru; Кершен-гольц Борис Моисеевич — заведующий лабораторией Института биологических проблем криолитозоны, тел.: 8-(4112)-33-58-12, e-mail: kerschen@asrs.ysn.ru.