Биспецифическое антитело и его применение

1. Биспецифическое антитело, в котором молекула состоит из двух идентичных полипептидных цепей, ковалентно связанных с образованием четырехвалентного гомодимера, каждая из полипептидных цепей содержит первый одноцепочечный Fv, специфически связывающийся с опухолевым антигеном ВСМА, второй одноцепочечный Fv, специфически связывающийся с антигеном эффекторной клетки CD3, Fc-фрагмент, где первый одноцепочечный Fv и второй одноцепочечный Fv соединены связывающим пептидом, а указанные второй одноцепочечный Fv и Fc- фрагмент соединены напрямую или связывающим пептидом.
2. Биспецифическое антитело по п. 1, отличающееся тем, что Fc-фрагмент не имеет эффекторных функций CDC, ADCC и ADCP.
n
3. Биспецифическое антитело по п. 1, отличающееся тем, что первый одноцепочечный Fv содержит домен VH и домен VL, соединенные связывающим пептидом, аминокислотная последовательность связывающего пептида представляет собой (GGGGX), где, в X содержатся Ser или Ala, n - натуральное число от 1 до 5; X предпочтительно представляет собой Ser, n предпочтительно равно 3.
4. Биспецифическое антитело по п. 1, отличающееся тем, что первый одноцепочечный Fv содержит:
(1) домен VH, содержащий HCDR1, HCDR2 и HCDR3, показанную в SEQ ID NO: 1, 2 и 3 соответственно, последовательность, имеющую не менее 80% сходства с вышеуказанными последовательностями или имеющую одну или несколько замен консервативных аминокислотных последовательностей; а также
(2) домен VL, содержащий LCDR1, LCDR2 и LCDR3, показанную в SEQ ID NO: 4, 5 и 6 соответственно, последовательность, имеющую не менее 80% сходства с вышеуказанными последовательностями или имеющую одну или несколько замен консервативных аминокислотных последовательностей.
5. Биспецифическое антитело по п. 1 или 4, отличающееся тем, что первый одноцепочечный Fv содержит:
(1) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 7, или последовательность, имеющую не менее 80% сходства с вышеуказанной последовательностью или имеющую одну или несколько замен консервативных аминокислотных последовательностей; а также
(2) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 8, или последовательность, имеющую не менее 80% сходства с вышеуказанной последовательностью или имеющую одну или несколько замен консервативных аминокислотных последовательностей.
n
6. Биспецифическое антитело по п. 1, отличающееся тем, что домен VH и домен VL, содержащиеся во втором одноцепочечном Fv, соединены связывающим пептидом, аминокислотная последовательность связывающего пептида представляет собой (GGGGX), где, Х включает Ser или Ala, n - натуральное число от 1 до 5; X предпочтительно представляет собой Ser, n предпочтительно равно 3.
7. Биспецифическое антитело по п. 1, отличающееся тем, что второй одноцепочечный Fv содержит:
(1) домен VH, содержащий HCDR1, HCDR2 и HCDR3, показанную в SEQ ID NO: 11, 12 и
13 соответственно, последовательность, имеющую не менее 80% сходства с вышеуказанными последовательностями или имеющую одну или несколько замен консервативных аминокислотных последовательностей; а также
(2) домен VL, содержащий LCDR1, LCDR2 и LCDR3, показанную в SEQ ID NO: 14, 15 и 16 соответственно, последовательность, имеющую не менее 80% сходства с вышеуказанными последовательностями или имеющую одну или несколько замен консервативных аминокислотных последовательностей.
8. Биспецифическое антитело по п. 1 или 7, отличающееся тем, что второй одноцепочечный Fv содержит:
1) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 17, или последовательность, имеющую не менее 80% сходства с вышеуказанной последовательностью или имеющую одну или несколько замен консервативных аминокислотных последовательностей; а также
2) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 18, или последовательность, имеющую не менее 80% сходства с вышеуказанной последовательностью или имеющую одну или несколько замен консервативных аминокислотных последовательностей.
9. Биспецифическое антитело по п. 1 или 7, отличающееся тем, что второй одноцепочечный FV способен специфически связываться с CD3 человека, макака-крабоеда или макака-резуса.
x
y
z
10. Биспецифическое антитело по п. 1, отличающееся тем, что связывающий пептид, связывающий первый одноцепочечный Fv и второй одноцепочечный Fv, состоит из гибкого пептида и жесткого пептида; и гибкий пептид содержит 2 или более аминокислот и предпочтительно состоит из любой комбинации двух или более из следующих аминокислот: Gly (G), Ser (S), Ala (А) и Thr (T); более предпочтительно гибкий пептид содержит остатки G и S; Еще более предпочтительно общая структурная формула аминокислот гибкого пептида представляет собой GS(GGGGS), где, х, у и z являются целыми числами, большими или равными 0, и x + y + z ≥ 1; указанный жесткий пептид происходит из полноразмерной последовательности, состоящей из аминокислот в положениях от 118 до 145 на карбоксильном конце β-субъединицы природного хорионического гонадотропина человека или ее укороченного фрагмента; и предпочтительно жесткий пептид содержит аминокислотную последовательность SSSSKAPPPS.
11. Биспецифическое антитело по п. 10, отличающееся тем, что связывающий пептид содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10.
n
12. Биспецифическое антитело по п. 1, отличающееся тем, что связывающий пептид, связывающий Fc-фрагмент и второй одноцепочечный Fv, содержит 1-20 аминокислот и предпочтительно состоит из любой повторяющейся комбинации следующих аминокислот: Gly (G), Сер (S), Ala (А) и Thr (Т); более предпочтительно состоит из любой повторяющейся комбинации Gly (G) и Ser (S); еще более предпочтительно связывающий пептид состоит из (GGGGS), где n = 1, 2, 3 или 4.
13. Биспецифическое антитело по п. 1, отличающееся тем, что Fc-фрагмент содержит шарнирную область, домены СН2 и СН3, происходящие из константной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека; предпочтительно, Fc-фрагмент состоит из константных областей тяжелой цепи человеческих клеток IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE; предпочтительно, Fc-фрагмент состоит из константных областей тяжелой цепи человеческих клеток IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4; и более предпочтительно Fc-фрагмент состоит из константной области тяжелой цепи человеческих клеток IgG1 или IgG4.
14. Биспецифическое антитело по п. 13, отличающееся тем, что Fc-фрагмент содержит замену, делецию или добавление одной или более аминокислот по сравнению с его исходной природной последовательностью.
15. Биспецифическое антитело по п. 13, отличающееся тем, что Fc-фрагмент содержит аминокислотные замены, делеции или добавления с уменьшенными или устраненными эффекторными функциями.
16. Биспецифическое антитело по п. 15, отличающееся тем, что Fc-фрагмент содержит аминокислотные замены L234A / L235A / P331S, определенные в соответствии со схемой нумерации EU.
17. Биспецифическое антитело по п. 15 или 16, отличающееся тем, что Fc-фрагмент также содержит замены, делеции или добавления аминокислот, обладающих одним или несколькими из следующих свойств:
(1) повышенная аффинность связывания с неонатальным рецептором FcRn;
(2) уменьшенное или устраненное гликозилирование;
(3) уменьшение или устранение неоднородности заряда.
18. Биспецифическое антитело по п. 17, отличающееся тем, что Fc-фрагмент дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен, делеций или добавлений, указанных ниже:
(1) аминокислотные замены M428L, T250Q / M428L, M428L/ N434S или M252Y / S254T / Т256Е, определенные в соответствии со схемой нумерации ЕС; и/или
(2) аминокислотные замены N297A, определенные в соответствии со схемой нумерации ЕС; и/или
(3) делеции аминокислоты К447, определенные в соответствии со схемой нумерации ЕС.
19. Биспецифическое антитело по п. 17, отличающееся тем, что Fc-фрагмент содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 19, по сравнению с его исходной природной последовательностью, имеющую смещения или замены следующих 6 аминокислот, нижеуказанных определенных в соответствии с ЕС: L234A / L235A / N297A / P331S / T250Q / M428L; обусловленных отсутствием или удалением K447, определенных в соответствии со схемой нумерации ЕС.
20. Биспецифическое антитело по п. 1, отличающееся тем, что оно связывается с ВСМА и CD3 человечества, содержит следующие аминокислотные последовательности:
(1) последовательности, показанные в SEQ ID NO: 20; или же
(2) последовательности, имеющие одну или несколько замен, делеций или добавлений по сравнению с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 20; или же
(3) последовательности, имеющие не менее 80%, не менее 85%, не менее 90%, не менее 91%, не менее 92%, не менее 93%, не менее 94%, не менее 95%, не менее 96%, не менее, 97%, не менее 98%, не менее, 99% или 100% идентичности с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 20.
21. Молекула ДНК, отличающаяся тем, что она кодирует биспецифическое антитело по любому из пп. 1-20 в формуле изобретения.
22. Молекула ДНК по п. 21, отличающаяся тем, что она имеет нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 21.
23. Вектор экспрессии, отличающийся тем, что он имеет молекулу ДНК, кодирующую аминокислоту по п. 21 или молекулу ДНК по п. 22.
24. Клетка-хозяин, отличающаяся тем, что она трансформирована вектором экспрессии по п. 23, предпочтительно клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку или дрожжевую клетку или клетку млекопитающего, более предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, а еще более предпочтительно клетка млекопитающего представляют собой клетки СНО или клетки NS0.
25. Фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело по любому из пп. 1-20 и фармацевтически приемлемый наполнитель, и/или носитель, и/или разбавитель.
26. Способ получения биспецифического антитела по любому из пп. 1-20, отличающийся тем, что он содержит:
(а) получение слитого гена биспецифического антитела и конструирование вектора экспрессии биспецифического антитела;
(б) трансфекцию вышеуказанного вектора экспрессии в клетку хозяина способом генной инженерии;
(в) культивирование вышеуказанной клетки хозяина в условиях, позволяющих продуцировать биспецифическое антитело;
(г) отделение и очистка антитела.
27. Применение биспецифического антитела по любому из пп. 1-20 в лекарственном средстве, предназначенного для лечения или облегчения симптомов нарушений плазматических клеток и других нарушений В-клеток и аутоиммунных заболеваний, связанных с экспрессией ВСМА, где нарушения плазматических клеток включают, но не ограничиваются ими: множественная миелома, плазмоцитома, лейкоз плазматических клеток, макроглобулинемия, амилоидоз, макроглобулинемия Вальденстрема, плазмоцитома солитарной кости, экстрамедуллярная плазмоцитома, остеосклеротическая миелома, болезнь тяжелых цепей, моноклональная гаммопатия неопределенного значения и тлеющая множественная миелома.
28. Комбинированный продукт для лечения заболевания, как оно определено в п. 27, в котором биспецифическое антитело представляет собой АР163.