Ремедиация среды от хлорароматических гербицидов культурой аrthrobacter globiformis

Ремедиация среды от хлорароматических гербицидов культурой Arthrobacter globiformis*

В.В. Коробов, к.б.н., Е.Ю. Журенко, к.б.н.,

Т.В. Маркушева, к.б.н.,

Институт биологии УНЦ РАН

Известно, что присутствие в окружающей среде хлорированных ароматических производных, обладающих токсичными и канцерогенными свойствами, представляет собой существенную опасность для агроэкосистем [1, 2]. К настоящему времени сформулировано понимание того, что микроорганизмы, способные вовлекать хлор-ароматические соединения в обмен веществ, могут быть применены в качестве действующих элементов эффективных технологий конверсии ксенобиотиков, включая случаи целевой утилизации неиспользованных коммерческих препаратов феноксигербицидов. Поэтому современный этап исследований биологического воздействия на хлорированные фенолы характеризуется выраженным практическим интересом к изучению их деструкторов. Вместе с тем число изученных бактериальных культур ограничено. Данные, раскрывающие особенности биологической конверсии экотоксикантов, чаще всего касаются представителей рода Pseudomonas, несколько меньше известно о представителях родов Bacillus и Rhodococcus.

Цель и методика исследований. Целью данной работы было выделение нового природного штамма-деструктора хлорфеноксиуксусных кислот (2,4-Д и 2,4,5-Т) и определение возможности его применения.

Морфологию и морфометрические характеристики клеток исследовали в режиме контактной съёмки с использованием сканирующего зон-дового микроскопа Solver PRO-M «NT—MDT» (Россия).

Посевной материал бактерий получали выращиванием в разбавленном мясопептонном бульоне (1МПБ:7Н2О) при температуре 30°С. Культуры засевали в количестве 0,01% от объёма в жидкую питательную среду следующего состава, в г/л: NH4Cl - 1; K2HPO4 - 5; MgSO4  7H2O -0,05; FeSO4  7H2O - 0,005; CuSO4  5H2O - 0,001; ZnSO4 - 0,008; pH - 6,8-7,0. В данную среду в качестве источника углерода вносили 2,4-Д или

2,4,5-Т до конечной концентрации 100 мг/л. Инкубацию осуществляли в термостатированных орбитальных встряхивателях УВМТ-12-250 при 115-120 об/мин. Рост контролировали по показателям оптической плотности клеточной

суспензии при длине волны 590 нм на фотоколориметре КФК-2.

Количество 2,4-Д и 2,4,5-Т в культуральной жидкости измеряли согласно руководству по определению микроколичеств хлорфеноксиуксусных кислот с небольшими модификациями [3]. Для анализов отбирали 10 мл культуральной жидкости, которую освобождали от клеток микробов центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 мин. Далее жидкость подкисляли 1н соляной кислотой до рН2. Затем проводили 3-кратную экстракцию гербицидов равными объёмами хлороформа. После отгонки растворителя на вакуумном роторном испарителе экстракты метилировали, переводили в гексан и фракционировали методом тонкослойной хроматографии на пластинах Силуфол ЦУ-254. Образцы сканировали при длине волны 260—280 нм в камере Хромоскана (Тоисе^оеЫ). Содержание 2,4-Д и 2,4,5-Т определяли по калибровочным графикам для чистого стандарта.

Результаты исследований. Из образцов почвенной биоты на селективных средах был выделен штамм-деструктор 2,4-Д и 2,4,5-Т. Клетки штамма имели значительные изменения в форме на протяжении ростового цикла: молодые колонии состояли из длинных палочек (0,2—0,3 мкм) неправильной формы, старые (от трёх суток), содержали кокковидные формы. На сложных питательных средах бактерии проявили полиморф-ность. Окраска клеток по Граму положительная. Штамм обладал метаболизмом окислительного типа, ферментировал глюкозу, лактозу, мальтозу, был способен использовать минеральный азот, глицин и тиамин. При разложении глюкозы образовывал небольшое количество кислоты. Клетки обладали каталазной, казеиназной активностью, осуществляли гидролиз желатины. Оптимальный рост деструктора хлорфеноксикислот наблюдался в пределах от 22 до 37°С, при значениях рН 7—8, в аэробных условиях. По совокупности культурально-морфологических и физио-лого-биохимических признаков штамм был идентифицирован как Arthrobacter globiformis 178 [4].

Проведено исследование утилизации хлор-феноксикислот A. globiformis 178 в условиях их использования в качестве источника углерода и энергии.

На рисунке 1 представлены графики, демонстрирующие динамику изменения показателей количества 2,4-Д и значений оптической плот-

* Работа выполнена при поддержке гранта программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Живая природа: современное состояние и проблемы развития»

0,6 0,5 0,4 - 0,3 0,2 - -0,1 0

Время культивирования, сут.

2,4-Д

100

-- 90 -- 80 70 60 50 40 -- 30 20 -- 10 0

£

0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0* 0

5 10 15

Время культивирования, сут.

OD

-2,4,5-T

100

90

B0

70

60

50

40

30

20

10

0

20

Рис. 1 - Графики зависимости изменений показателей оптической плотности и значений концентрации 2,4-Д от времени инкубации культуры А gloЫformis 17Б

Рис. 2 - Графики зависимости изменения показателей оптической плотности и значений концентрации 2,4,5-Т от времени инкубации культуры А gloЫformis 17Б

OD

ности клеточной суспензии периодической культуры A. globiformis 178.

По рисунку 1 видно, что показатель плотности достигал максимального значения к пятым-шестым суткам (0,52 ОЕ), при этом содержание субстрата снижалось к четвёртым сут. на 30% и впоследствии, к десятым суткам культивирования, на 41% от контроля.

Результаты исследования зависимости значений оптической плотности клеточной суспензии OD590 и динамики изменения концентрации

2.4.5-Т в среде культивирования A. globiformis 178 представлены на рисунке 2. При использовании

2.4.5-Т в качестве источника углерода и энергии оптическая плотность клеточной суспензии достигала максимального значения (0,47 ОЕ) к 15-м суткам культивирования после продолжительной лаг-фазы. Далее, после невыраженной стационарной фазы, наблюдалось снижение значения показателя ОD590. Содержание 2,4,5-Т уменьшалось к 5-м суткам на 63%, остаточное количество субстрата к 20-м суткам составляло 33% от начального уровня.

Таким образом, результаты исследований показали, что штамм A. globiformis 178 способен использовать в качестве источника углерода и энергии молекулы 2,4-Д и 2,4,5-Т.

Следует отметить, что согласно имеющимся публикациям среди представителей рода

Arthrobacter выявлено несколько штаммов-деструкторов 2,4-Д: Arthrobacter sp. [5], Arthrobacter sp. [6], а также установлены этапы метаболизма 2,4-Д Arthrobacter sp. [7]. Однако утилизация 2,4,5-Т для представителей штаммов рода Arthrobacter не была обнаружена.

Выводы и рекомендации. Из образцов смешанных популяций микроорганизмов техногенной экосистемы выделен штамм-деструктор 2,4-Д и 2,4,5-Т. В соответствии с культурально-морфологическими, физиолого-био-химическими критериями систематики штамм отнесён к роду Arthrobacter. Способность штамма Arthrobacter globiformis 17S к ассимиляции 2,4-Д и 2,4,5-Т позволяет рекомендовать его к использованию в области разработки технологий ремедиации среды от феноксигербицидов.

Литература

1. Майер-Боде Г. Гербициды и их остатки / под ред. Н.Н. Мельникова. М., 1972. 560 с.

2. Мельников Н.Н., Белан С.Р. Органические соединения хлора в окружающей среде // Агрохимия. 1998. № 10. C. 83—93.

3. Методы определения микроколичеств пестицидов / под ред. М.А. Клисенко. М., 1984. 256 с.

4. Определитель бактерий Берджи / под ред. Дж. Хоулта [и др.]. М., 1997. 799 с.

5. Tiedje J.M., Alexander M. Enzymatic cleavage of the ether bond of 2.4-D // Agr. Food Chem. 1969. V. 17. P. 1080-1084.

6. Bollag J.-M., Helling C.S., Alexander M. 2,4-D metabolism. Enzymatic hydroxylation of chlorinated phenols // Agr. Food Chem. 1968. V. 16. P. 826-828.

7. Sandman E.R.I.C., Loos M.A. Aromatic metabolism by a 2.4-D degrading Arthrobacter sp. // Can. J. Microbiol. 1988. V. 34. P. 125-130.