Способ диагностики классической чумы свиней непрямым иммуногистохимическим анализом на основании моноклональных антител
METHOD FOR DIAGNOSIS OF CLASSICAL SWINE FEVER BY INDIRECT IMMUNOHISTOCHEMICAL ANALYSIS BASED ON MONOCLONAL ANTIBODIES

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях и ветеринарных лабораториях для диагностики классической чумы свиней в гистологических срезах восприимчивых органов путем выявления антигена вируса на поверхности и в цитоплазме инфицированных клеток при иммуногистохимическом исследовании на основе моноклональных антител.
Уровень техники
Для диагностики КЧС используют разнообразные лабораторные методы, направленные на выделение вируса, обнаружение его антигена или нуклеотидной последовательности. Среди исследований, направленных на достижение данной цели, применяют выделение вируса в клеточных культурах, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), иммуноферментный анализ (ИФА), флуоресцентную гибридизацию in situ и иммуногистохимическое исследование (ИГХИ) [Стаффорд В.В., Стрельцова Я.Б. Иммуногистохимия и гибридизация insitu в диагностике классической чумы свиней. Ветеринария и кормление. №6. - 2018. - С. 14-16., Интернет -сайт World organization for animal health (OIE) «Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals» (Глава 3.9.3) [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.oie.int/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/].
Иностранные специалисты, для ИГХА органов и тканей от зараженных КЧС свиней, несмотря на большое количество модификаций метода, придерживаются протокола опубликованного в сборнике Всемирной организации здоровья животных (МЭБ) «Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals» (Глава 3.9.3). Методика заключается в следующем. В качестве патологического материала у свиней отбирают миндалины, селезенку, лимфатические узлы и т.д., которые фиксируют холодом и хранят при температуре -70°С. Из органов после размораживания иссекают необходимые для исследования участки и с помощью криотома изготавливают нативные гистопрепараты. Гистологические срезы, приготовленные таким методом можно использовать через 20 минут после высыхания, либо дополнительно профиксировать ацетоном, что позволяет хранить стекла со срезами без порчи в течение 2-3 лет при температуре -70°С. Высушенные свежеприготовленные срезы органов фиксируют в ацетоне в течение 10 минут при температуре -20°С, после чего срезы повторно высушивают в потоке воздуха. Далее готовят рабочее разведение моноклональных антител, специфичных к антигену возбудителя с добавлением фосфатно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,6, 0,01% Твина 80 и 5% лошадиной сыворотки. Перед нанесением рабочего раствора антител, срезы ополаскивают в ФСБ, затем удаляют излишки жидкости, наносят раствор антител и инкубируют срезы во влажной камере в течение 30 минут при температуре 37°С. После инкубации срезы промывают в ФСБ 6 раз по 10 секунд в каждом при комнатной температуре. Промытые срезы окрашивают свежеприготовленным раствором хромоген-субстрата в течение 15 минут при комнатной температуре. Для изготовления раствора к 19 мл 0,05М ацетата натрия (рН 5,0) добавляют 1 мл смеси из 0,4% 3-амино-9-этилкарбазола и N,N-диметилформамида, активацию раствора осуществляют добавлением 10 мкл 30% раствора перекиси водорода. После срезы ополаскивают в 0,05М ацетате натрия рН 5,0, затем в дистиллированной воде и закрывают монтирующей средой. Данный протокол используют при выполнении прямого метода ИГХА с меченными пероксидазой хрена антителами. Если применяют непрямой метод реакции, то после инкубации срезов с первичными, специфичными к антигену вируса антителами (без метки) их ополаскивают и после наносят вторичные антитела, меченные пероксидазой хрена. Добавляя данный этап, время проведения анализа увеличивается, но его специфичность значительно возрастает. Остальные этапы ИГХА по исполнению не отличаются как в прямом, так и в непрямом варианте исследования [Интернет - сайт World organization for animal health (OIE) «Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals» (Глава 3.9.3) [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.oie.int/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/1. Данную разработку мы взяли за прототип.
На территории Российской Федерации, для диагностики классической чумы свиней, используют биопробу, полимеразную цепную реакцию, реакцию иммунофлюоресценции, реакцию нейтрализации и иммуноферментный анализ [Стаффорд В.В., Стрельцова Я.Б. Иммуногистохимия и гибридизация insitu в диагностике классической чумы свиней. Ветеринария и кормление. №6. - 2018. - С. 14-16., Методические указания по лабораторной диагностике классической чумы свиней // Утв. Минсельхозпродом России 30.12.1996 N 13-4-2/809.].
Технической проблемой является необходимость разработки эффективного и доступного способа диагностики классической чумы свиней, для обнаружения антигена вируса в тканях и органах свиней, просто выполнимого в условиях гистологических лабораторий без использования дорогостоящих расходных материалов, расширения арсенала способов диагностики классической чумы свиней.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом является определение антигена вируса классической чумы свиней в восприимчивых клетках органов, расширения арсенала способов диагностики классической чумы свиней.
Данный способ позволяет определить локализацию антигена в организме, а также сопоставить наличие антигена с патогистологическими изменениями, тем самым подтвердить патологическое влияние вируса на зараженные ткани и органы. Использование данного способа важно для патоморфологических исследований и способствует точной дифференциальной диагностике, изучению патогенеза иммунного ответа у больного животного.
Предложенный способ заключается в следующем.
Для выполнения ИГХА на нативных гистологических срезах из органов свиней применяют первичные моноклональные антитела мыши клона 3с3 специфичные к рекомбинантному белку Е2 (rE2) вируса классической чумы свиней и вторичные антитела осла против антител мыши, меченные пероксидазой хрена. Первичные антитела мыши, специфичные к антигену вируса были получены в институте вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Вторичные антитела осла против антител мыши производства фирмы SIGMA (США). Получение и характеристика моноклональных антител (МКАТ).
Для иммунизации использовали самок мышей линии BALB/c. В качестве антигенов брали рекомбинантный белок Е2 (rE2) штамма «Ши-Мынь» ВКЧС, полученный в культуре клеток SF-21 с бакуловирусом в качестве вектора. Мышей иммунизировали очищенным rE2 ВКЧС с адъювантом Фрейнда (Difco, США) 4-кратно с интервалом 2 недели в концентрации 50 мкг/на мышь. После получали спленоциты от иммунизированных мышей, которые гибридизировали с перевиваемой клеточной линией мышиной миеломы Sp2/0, не продуцирующей собственные иммуноглобулины. Для слияния использовали PEG/DMSO Solution (Sigma, США). Гибридизацию проводили по методу G. Kohler. Через 10-12 дней, клетки, выросшие в 96-луночных планшетах, тестировали непрямым тИФА. Положительные гибридомные клетки клонировали.
Для получения асцитной жидкости с МКАТ, самкам мышей линии BALB/c, обработанным пристанном (Sigma, США), внутрибрюшинно вводили по 5-10 млн гибридных клеток. Полученные из асцитной жидкости МКАТ очищали осаждением белков с помощью каприловой кислоты (Sigma, США). Концентрацию антител после очистки измеряли на спектрофотометре при длине волны 280 нм. Оценку иммунологической активности МКАТ проводили с применением непрямого тИФА. [Костина Л.В., Непоклонов Е.А., Забережный А.Д и др. Получение и характеристика моноклональных антител к белку Е2 (GP 55) вируса классической чумы свиней. Вопросы вирусологии. №5 Т 53. - 2008. - С. 36-40].
Выполнение ИГХИ с полученными МКАТ мыши к антигену вируса классической чумы свиней:
В качестве патологического материала для определения локализации антигена вируса классической чумы свиней от павших животных берут миндалины и селезенку. Нативный патологический материал охлаждают в течение 6 часов в холодильной камере при температуре 4°С. Транспортировку проб выполняют в сумке-холодильнике с хладоэлементами, поддерживающими температуру +2-4°С на всем этапе перевозки. Затем для длительного хранения материал помещают в низкотемпературную камеру и хранят при температуре -70°С. Непосредственно перед исследованием пробы размораживают. Далее из отобранных органов иссекают необходимые образцы размером 1-2 см в длину и ширину и 0,5 см в толщину. Иссеченные участки органов фиксируют на столиках для криотомии, заполняя область между столиком и тканью специальным криогелем. Столики с объектами помещают в камеру криотома при температуре -34°С на 40-60 минут. Из готового блока нарезают срезы толщиной 5 мкм и наклеивают на поляризированные стекла. Подсушенные стекла со срезами погружают в смесь изопропилового спирта 30 мл и физиологического раствора 70 мл на 60 минут при температуре +4°С. Обработанные срезы 40 минут сушат в потоке воздуха. Высушенные срезы ополаскивают в 3 порциях фосфатно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,4 по 5 минут в каждой при комнатной температуре. Далее для удаления эндогенной пероксидазы на срезы наносят 3% раствор перекиси водорода 300 мкл на 40 минут при комнатной температуре. После повторяют ополаскивание срезов в 3 порциях ФСБ рН 7,4 по 5 минут в каждой при комнатной температуре. Затем готовят блокирующий раствор 5% обезжиренного сухого молока на ФСБ рН 7,4 из расчета 200 мкл на одно стекло. Раствор на срезах инкубируют в термостате 40 минут при температуре 37°С. После инкубации срезы промывают в 3 порциях ФСБ рН 7,4 по 5 минут в каждой при комнатной температуре. Параллельно процессу ополаскивания срезов готовят рабочий раствор первичных антител (AT) специфичных к антигену вируса классической чумы свиней. Для этого к AT добавляли ФСБ рН 7,4. Концентрацию антител подбирают опытным путем в зависимости от их чувствительности. Разведение AT составляет от 1:200 до 1:400. Далее на срезы наносят по 200 мкл раствора первичных антител, создают условия влажной камеры и помещают в термостат на 80 минут при температуре 37°С. После, срезы промывают в 3 порциях ФСБ рН 7,4 по 5 минут в каждой при комнатной температуре. Одновременно с процессом промывания срезов готовят рабочий раствор вторичных AT, меченных пероксидазой хрена. Раствор AT делают в ФСБ рН 7,4 с добавлением 5% сухого обезжиренного молока, для предотвращения неспецифического связывания AT. Разведение вторичных AT составляет 1:200. На срезы наносят по 200 мкл раствора вторичных AT, создают условия влажной камеры и помещают в термостат при температуре 37°С на 60 минут. Далее срезы промывают в 3 порциях ФСБ рН 7,4 по 5 минут в каждой при комнатной температуре. Затем готовят рабочий раствор субстрата на Na-фосфатном буфере для специфического окрашивания пероксидазной метки. Рабочий раствор готовят непосредственно перед использованием и наносят в количестве 200 мкл на одно стекло, после, стекла помещают во влажную камеру в термостат при 37°С на 30 минут.
Маточный раствор хромогена: 0,02 г 3-амино-9-этилкарбазола растворяли в 3 мл диметилформамида. Работу необходимо выполнять в перчатках и в вытяжном шкафу, так как раствор обладает канцерогенными свойствами (хранится при температуре +4°С).
Рабочий раствор готовят на 0,02 М Na-фосфатном буфере, рН 5,0 -5 мл, с добавлением 300 мкл маточного раствора и 1 мкл 3% раствора перекиси водорода (срок годности 12 часов).
Далее на срезы наносят по 300 мкл рабочего раствора хромогена, создают условия влажной камеры и оставляют на 20-40 минут при комнатной температуре. Затем срезы промывают в 3 порциях ФСБ рН 7,4 по 5 минут в каждой при комнатной температуре. После, для дифференциальной окраски структурных элементов клеток и тканей на срезы наносят гематоксилин Майера на 5-10 минут при комнатной температуре. Окрашенные срезы ополаскивают в дистиллированной воде, наносят монтирующую глицериновую среду и закрывают покровным стеклом.
Данный способ применим для непрямого иммуногистохимического анализа нативных криосрезов миндалин, селезенки, лимфатических узлов и других органов с использованием моноклональных антител мыши клона 3с3 к антигену вируса классической чумы свиней, а также вторичных антител осла против антител мыши, меченных пероксидазой хрена. Детекция антигена вируса происходит на поверхности и в цитоплазме восприимчивых клеток зараженных органов путем образования конгломератов антиген-антитело и окрашивания метки пероксидазы хрена в красно-коричневый цвет, которая хорошо заметна в микроскопе как в препаратах без дополнительного окрашивания структурных элементов ткани, так и в препаратах, ядра которых окрашивали гематоксилином Майера. При использовании предложенного способа визуализируются ядра клеток, окрашенные в синий цвет, а положительная реакция на наличие антигена вируса классической чумы свиней регистрируется в виде конгломератов хромогена красно-коричневого цвета на поверхности и в цитоплазме восприимчивых клеток (фиг. 1-2).
Предложенный способ обладает высокой специфичностью и чувствительностью к антигену вируса классической чумы свиней и позволяет с точностью выявлять локализацию антигена вируса, а также проводить дифференциальную диагностику КЧС от других возбудителей инфекций свиней со схожей клинической картиной.
Сектор патоморфологии ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН успешно апробировал вышеуказанный способ диагностики классической чумы свиней в научной и практической деятельности. Согласно результатам испытаний, данный способ исследования может быть рекомендован для применения в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях.
Осуществление изобретения иллюстрируется следующим примером:
Пример №1
От 20 павших свиней был отобран свежий материал для исследования (миндалины и селезенка), так как отсутствовала возможность сразу доставить материал в лабораторию, он охлаждался в камере бытового холодильника в течение 6 часов, затем был помещен в морозильную камеру при температуре -20 градусов для полного промерзания. После заморозки материал был направлен в лабораторию в термосумке с хладоэлементами. В лаборатории материал разморозили, иссекли образцы размером 2 см на 2 см из каждого органа, приморозили к криотомным столикам в камере криостата и нарезали по 2 среза на стекло из каждого органа. Срезы толщиной 5 микрон, поместили их на поли-L-лизиновые стекла, высушили. Подсушенные стекла со срезами погружали в смесь изопропилового спирта 30 мл и физиологического раствора 70 мл на 60 минут при температуре +4°С. Обработанные срезы 40 минут высушивали в потоке воздуха. Высушенные срезы ополаскивали в 3 порциях фосфатно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,4 по 5 минут в каждой при комнатной температуре. Далее для удаления эндогенной пероксидазы на срезы наносили 3% раствор перекиси водорода 300 мкл на 40 минут при комнатной температуре. После, ополаскивали срезы в 3 порциях ФСБ рН 7,4 по 5 минут в каждой при комнатной температуре. Затем готовили блокирующий раствор с 5% обезжиренного сухого молока на ФСБ рН 7,4 из расчета 200 мкл на одно стекло. Срезы с раствором инкубировали в термостате 40 минут при температуре 37°С. После инкубации срезы промывали в 3 порциях ФСБ рН 7,4 по 5 минут в каждой при комнатной температуре.
Параллельно процессу ополаскивания срезов готовили рабочий раствор первичных моноклональных антител (AT) мыши клона 3с3 специфичных к рекомбинантному белку Е2 (rE2), специфичных к антигену вируса классической чумы свиней. Для этого к AT добавляли ФСБ рН 7,4. Концентрацию антител подбирали опытным путем в зависимости от их чувствительности. В нашем случае разведение AT составляло от 1:200 до 1:400. Далее на срезы нанесли по 200 мкл раствора первичных антител, создавали условия влажной камеры и помещали в термостат на 80 минут при температуре 37°С. После, срезы промывали в 3 порциях ФСБ рН 7,4 по 5 минут в каждой при комнатной температуре. Одновременно с процессом промывания срезов готовили рабочий раствор вторичных AT осла специфичных к первичным, меченных пероксидазой хрена. Раствор AT делали в ФСБ рН 7,4 с добавлением 5% сухого обезжиренного молока, для предотвращения неспецифического связывания AT. Разведение вторичных AT составляло 1:200. На срезы наносили по 200 мкл раствора вторичных AT, снова создавали условия влажной камеры и помещали в термостат при температуре 37°С на 60 минут. Далее срезы промывали в 3 порциях ФСБ рН 7,4 по 5 минут в каждой при комнатной температуре. Затем готовили рабочий раствор субстрата на Na-фосфатном буфере для окрашивания пероксидазной метки. Рабочий раствор готовили непосредственно перед использованием и наносили в количестве 200 мкл на одно стекло, после, стекла помещали во влажную камеру в термостат при 37°С на 30 минут.
Маточный раствор хромогена: 0,02 г 3-амино-9-этилкарбазола растворяли в 3 мл диметилформамида. Работу выполняли в перчатках и в вытяжном шкафу, так как раствор обладает канцерогенными свойствами (хранится при температуре +4°С).
Рабочий раствор готовили на 0,02 М Na-фосфатном буфере, рН 5,0-5 мл, с добавлением 300 мкл маточного раствора и 1 мкл 3% раствора перекиси водорода.
Далее на срезы наносили по 300 мкл рабочего раствора хромогена, создавали условия влажной камеры и оставляли на 20-40 минут при комнатной температуре. Затем срезы промывали в 3 порциях ФСБ рН 7,4 по 5 минут в каждой при комнатной температуре. После, для дифференциальной окраски структурных элементов клеток и тканей на срезы наносили гематоксилин Майера на 10 минут при комнатной температуре. Окрашенные срезы ополаскивали в дистиллированной воде, наносили монтирующую глицериновую среду и закрывали покровным стеклом.
В результате исследования материала, было выявлено, что 18 свиней было инфицированы классической чумой свиней.
Положительный результат реакции на антиген вируса классической чумы свиней продемонстрирован на фигурах 1 и 2, где четко визуализируется окрашивание хромогена в красно-коричневый цвет на поверхности и цитоплазме восприимчивых клеток. При получении отрицательного результата исследования на наличие антигена вируса красно-коричневое окрашивание клеток отсутствует, что наглядно показано на фигурах 3 и 4.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - Селезенка. Положительный результат ИГХА с образованием конгломератов хромогена на поверхности и в цитоплазме восприимчивых клеток. С докраской гематоксилином Майера. Ув. 630х.
Фиг. 2 - Миндалина. Положительный результат ИГХА с образованием конгломератов хромогена на поверхности и в цитоплазме восприимчивых клеток. С докраской гематоксилином Майера. Ув. 630х.
Фиг. 3 - Селезенка. Отрицательный результат ИГХА, конгломераты хромогена отсутствуют. С докраской гематоксилином Майера. У в. 630х.
Фиг. 4 - Миндалина. Отрицательный результат ИГХА, конгломераты хромогена отсутствуют. С докраской гематоксилином Майера. У в. 630х.