Рекомбинантная плазмида pVNV-GL-RBDind, обеспечивающая синтез и секрецию рекомбинантного рецептор-связывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2 линии B.1.617 в клетках млекопитающих
RECOMBINANT PLASMID PVNV-GL-RBDIND, PROVIDING SYNTHESIS AND SECRETION OF RECOMBINANT RECEPTOR-BINDING DOMAIN (RBD) OF SARS-COV-2 CORONAVIRUS LINE B.1.617 IN MAMMALIAN CELLS

Область техники
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения белка RBD (с англ.: receptor-binding-domain) - рекомбинантного структурного домена гликопротеина spike сарбековируса SARS-CoV-2 линии B.1.617. Получаемый белок RBD предназначен для непосредственного производства вакцинного препарата против SARS-CoV-2 линии B.1.617 (Yang et al., 2020; Min, Sun 2021). Способ включает дизайн генетических конструкций, методы трансфекции клеточных линий, очистки и оценки экспрессии целевого белка.
Уровень техники
Рецептор-связывающий домен RBD является частью субъединицы S1 белка S (spike). Использование рекомбинантного структурного домена RBD в качестве антигена при производстве вакцинных препаратов против SARS-CoV-2 имеет ряд преимуществ, связанных с выработкой большого числа нейтрализующих антител в ответ на введение антигена (Zhou et al., 2019; Shang et al., 2020; Song et al., 2018; Yang et al., 2020; Min, Sun 2021; Yang, Du, 2011), что было продемонстрировано рядом научных исследований, а также высокой консервативностью региона. На данный момент известно 13 кандидатных вакцин, основанных на использовании домена RBD (https://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines).
В связи с высоким молекулярно-генетическим полиморфизмом вируса SARS-CoV-2 и появлением новых линий с мутациями, ассоциированными с повышенной трансмиссивностью и тяжестью течения инфекционного заболевания (https://www.ecdc.europa.eu/en/covid-19/variants-concern; https://www.gisaid.org), а также вероятностью снижения эффективности ранее разработанных вакцин, в изобретении использован вариант антигена RBD линии B.1.617 коронавируса SARS-CoV-2.
Известен патент «Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение» (RU 2723008 C9, https://patents.google.com/patent/RU2723008C9), однако основным назначением получаемого рекомбинантного белка - применение для диагностических целей, а не для использования в составе вакцинных препаратов. К недостаткам данного способа также следует отнести относительно низкий уровень экспрессии целевого белка (до 10 мг/л), что связано, прежде всего, с особенностями проведённого дизайна молекулярно-генетической векторной конструкции.
Наиболее близким по сущности к заявленному изобретению является изобретение «SARS-CoV-2-RBD eucaryotic protein expression vector and its preparation method and use» (CN 112831523 A, https://patents.google.com/patent/CN112831523A), где для экспрессии белка использован вектор pcDNA3.1, содержащий сигнальный пептид tPA. Экспрессия осуществляется в клетках 293F. Отличием является использование другой экспрессионной системы. К недостаткам данного способа следует отнести используемый дизайн ДНК, кодирующей последовательность RBD, не учитывающий современные представления о молекулярно-генетическом полиморфизме вируса SARS-CoV-2.
Также известен патент «SARS-CoV-2N/S1(RBD) recombinant protein and its preparation method and application» (CN 111607003 A, https://patents.google.com/patent/CN111607003A), в котором приводится способ получения и применение рекомбинантных белков нуклеокапсида (N) и RBD. К недостаткам данного изобретения относится выбранная экспрессионная система (прокариотическая), не позволяющая проводить полноценные посттрансляционные преобразования (фолдинг, гликозилирование и пр.). К недостаткам также следует отнести используемый дизайн фрагмента RBD, не учитывающий современные представления о молекулярно-генетическом полиморфизме вируса SARS-CoV-2.
Раскрытие изобретения
Задачей
настоящего изобретения являлась разработка экспрессионной системы и структуры антигена для получения рекомбинантного белка RBD, соответствующего линии B.1.617 коронавируса SARS-CoV-2.
Техническим результатом изобретения является получение экспрессионной генетической конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность домена RBD с оптимизированными кодонами и обеспечивающей экспрессию белка RBD линии B.1.617 SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих.
Поставленная техническая проблема решается получением кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательности, имеющей последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующей белок RBD SARS-CoV-2, а также тем, что получена генетическая конструкция pVNV-GL-RBDind (фиг. 1), содержащая оптимизированную нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2 и обеспечивающая экспрессию белка RBD в клетках млекопитающих.
Поставленная техническая проблема решается также тем, что разработан способ получения белка RBD с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, включающий культивирование клеток эукариот и экспрессию целевого белка, выделение белка с помощью аффинной хроматографии и скрининг экспрессии.
Изобретение имеет ряд преимуществ по сравнению с близкими по сущности аналогами. Использование белка RBD, характерного для линии B.1.617 коронавируса SARS-CoV-2, позволит его использовать для создания эффективных вакцинных препаратов, действующих в том числе против высокопатогенной и высококонтагиозной линии B.1.617 (включая B.1.617.1 и B.1.617.2). Проведенная оптимизация кодонов фрагмента ДНК, кодирующего белок RBD, обеспечивает высокий уровень экспрессии белка. Экспрессия белка в эукариотических системах позволяет получать белок с необходимыми посттрансляционными модификациями. Использование в составе продуцируемого белка последовательности HisTag делает возможным оптимизацию способа выделения и очистки белка RBD.
Краткое описание фигур
Вектор pVNV-GL-RBDind проиллюстрирован на фиг. 1, где показаны основные структурно-функциональные регионы:
- cat promoter (76-178);
- участок начала репликации ori (1018-1644);
- CMV энхансер (2035-2414);
- IR/DR-L (1760-2024);
- Chimeric intron (2693-3701) - предназначен для усиления экспрессии целевого гена;
- Chicken β-actin promoter (2417-2692);
- Chimeric intron (2693-3701);
- лидерный пептид GL (3773-3823), обеспечивающий экспорт белка из клетки;
- нуклеотидная последовательность гена RBD (SEQ ID NO:1) (3827-4528);
- последовательность 6His - предназначен для последующего выделения и очистки рекомбинантного белка с помощью аффинной хроматографии (4529-4546);
- последовательность NeoR/KanR (5679-6473);
- SV40 poly(A) signal - необходим для полиаденилирования (6647-6768);
- последовательность IR/DR-R (6802-7097);
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Ниже приведены примеры 1-3 конкретного осуществления изобретения.
Осуществление изобретения
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pVNV-GL-RBDind для синтеза RBDind SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих
Последовательность гена, кодирующего домен RBDind (308V - 541F) коронавируса SARS-CoV-2 (GenBank MZ149976) заимствовали из базы данных GenBank и проводили оптимизацию частот встречаемости кодонов для млекопитающих при помощи сервиса JCat (http://www.jcat.de/), при этом индекс адаптации кодонов CAI достиг 0,83.
На основе вектора pVNV получали конструкцию pVNV-GL-RBDind (фиг. 1), содержащую нуклеотидную последовательность RBDind (SEQ ID NO:1), последовательность 6His и лидерный пептид GL белка люциферазы гауссии (MGVKVLFALICIAVAEA).
Psp
Eco
Нуклеотидную последовательность сигнального пептида GL, 6His и сайтов рестрикции CI и ICRI вводили в последовательность RBDind одновременно с помощью ПЦР. Использовались пары праймеров F_RBDind_ PspCI и R_RBDH_EcoICRI (таблица 1).
Таблица 1
Нуклеотидные последовательности праймеров
-
Название праймера
Нуклеотидная последовательность 5'-3'
F_RBDind_ PspCI
5ˋ-aaaaaacacgtgggaagccctggccccggccgccaccATGGGAGTGAA-3ˋ
R_RBDH_EcoICRI
5ˋ-ACTTCCATCACCACCATCATCACTAAGTCGACCGAGctcaaaaaa-3ˋ
Пример 2. Создание ДНК-конструкции (pVNV-GL-RBDind).
2.1. Амплификация методом ПЦР нуклеотидной последовательности,
кодирующей
RBDind SARS-CoV-2
Амплификацию фрагментов проводили по стандартному протоколу. Реакционная смесь, объемом 50 мкл содержала 10×буфер, 25 мМ dNTP, олигонуклеотидные праймеры (таблица 1) в количестве 10 пмоль каждого, 5 ед. а Pfu-полимеразы, 1 мкл раствора плазмидной ДНК. Реакцию проводили в амплификаторе Veriti™ 96-Well Thermal Cycler. Температурно-временной профиль ПЦР: плавление - 95°С - 5 мин. (1 цикл). 95°С - 30 секунд. Отжиг - 58°С - 30 секунд, элонгация - 72°С - 30 секунд (30 циклов).
2.2. Выделение ДНК из агарозного геля
После визуализации под УФ-излучением фрагменты ДНК необходимой длины, разделенные в агарозном геле, вырезали из геля и элюировали при помощи набора «Евроген» Cleanup Standard (Россия) в соответствии с рекомендациями производителя.
2.3. Ферментативный гидролиз вектора pVNV и ПЦР-продукта (последовательность участка генома SARS-CoV-2, кодирующей RBDind)
Psp
Eco
Для клонирования гена RBDind SARS-CoV-2 в составе вектора pVNV были использованы эндонуклеазы рестрикции CI и ICRI (фирма «Сибэнзим», Россия) с прилагаемыми к ним буферами. Реакционную смесь готовили в соответствии с активностью фермента (2-5 е.а. на 1 мкг ДНК) и концентрации плазмидной ДНК. Условия реакции: температура, состав буфера и длительность проведения ферментативного гидролиза ДНК подбирали в соответствии с инструкциями производителя “Сибэнзим”.
2.4. Лигирование ПЦР-продукта (последовательность участка генома SARS-CoV-2, кодирующей RBDind) и вектора pVNV
E. coli
Реакцию лигирования проводили в течение 30 мин. при комнатной температуре, используя смесь из 2 мкг ампликонов с ДНК-матрицы, 1 мкг векторной плазмиды и 20 е.а. ДНК-лигазы фага Т4 в прилагаемом к коммерческому набору реакционном буфере. Полученную лигазную смесь использовали для трансформирования культуры компетентных клеток  штамм Neb Stable.
2.5. Heat-shock трансформация
E. coli
К «компетентным» клеткам  штамм Neb Stable добавляли 10 мкл лигазной смеси (отношение 1:10), инкубировали на льду в течение 30 мин. После этого клетки подвергали «температурному шоку» при 42°С в течение 45 сек. Охлаждали клетки на льду в течение 2 мин, затем добавляли 200 мкл среды SOB и инкубировали при 37°С в течение 60 мин. По окончании инкубации трансформированные клетки высевали на чашку Петри с твёрдой питательной средой LB, содержащей антибиотик.
2.6. Отбор клонов для рестрикционного анализа
E. coli
Клетки  штамма Neb Stable, трансформированные ДНК-вакцинной конструкцией селективно культивировали в 10 мл жидкой питательной среды LB с добавлением антибиотика в рабочей концентрации 25 мкг/мл.
2.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
Секвенирование проводили по методу Сэнгера. Использовался набор CEQ2000Dye Terminator Cycle Sequencing Kit и 16-капилярный автоматический секвенатор ABI 3130xl.
Пример 3. Трансфекция клеточной линии CHO-K1, рекомбинантной плазмидой pVNV-GL-RBDind
2
Клетки CHO-K1 культивировали в CO-инкубаторе при содержании углекислого газа 5% и влажности 80%. Трансфекцию проводили при достижении плотности монослоя 80%.
При достижении 80% плотности монослоя проводили трансфекцию клеток плазмидой pVNV-GL-RBDind с помощью реагента Lipofectamine 3000 (ThermoFisher).
Пример 4. Получение рекомбинантного белка RBDind
Клетки CHO-K1, трансфецированные плазмидой pVNV-GL-RBDind, культивировали на роллерных установках и собирали культуральную среду. Наличие целевого белка определяли с помощью ДСН-ПААГ и иммуноблоттинга с использованием сывороток переболевших COVID-19.
Культуральную жидкость центрифугировали, фильтровали с использованием фильтров с диаметром пор 0,22 мкм. Рекомбинантный белок выделяли с помощью аффинной хроматографии с использованием коммерческого набора Ni Sepharose 6 Fast Flow (Cytiva, США) по протоколу, рекомендованному производителем.
Полученные фракции анализировали с помощью вертикального гель-электрофореза в денатурирующих условиях, при условии, что целевой белок имеет молекулярный вес около 36 кДа. Фракции с целевым белком диализовали против фосфатно-солевого буфера, далее проводили стерилизующую фильтрацию. Концентрация белка, определенная спектрофотометрически, составила 5-10 мг на литр культуральной среды.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Общество с ограниченной ответственностью «Эс Джи»
<120> Рекомбинантная плазмида pVNV-GL-RBDind, обеспечивающая синтез и
секрецию рекомбинантного рецептор-связывающего домена (RBD)
коронавируса SARS-CoV-2 линии B.1.617 в клетках млекопитающих
<212> RNA
Homo sapiens
<213>
<223> Кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность RBDind
<210> 1
<211> 702
<400>
1   GTGGAAAAGG GCATCTACCA GACCAGCAAC TTCCGGGTGC AGCCCACCGA ATCCATCGTG CGGTTCCCCA
61  ATATCACCAA TCTGTGCCCC TTCGGCGAGG TGTTCAATGC CACCAGATTC GCCTCTGTGT ACGCCTGGAA
121 CCGGAAGCGG ATCAGCAATT GCGTGGCCGA CTACTCCGTG CTGTACAACT CCGCCAGCTT CAGCACCTTC
181 AAGTGCTACG GCGTGTCCCC TACCAAGCTG AACGACCTGT GCTTCACAAA CGTGTACGCC GACAGCTTCG
241 TGATCCGGGG AGATGAAGTG CGGCAGATTG CCCCTGGACA GACAGGCAAG ATCGCCGACT ACAACTACAA
301 GCTGCCCGAC GACTTCACCG GCTGTGTGAT TGCCTGGAAC AGCAACAACC TGGACTCCAA AGTCGGCGGC
361 AACTACAATT ACCGGTACCG GCTGTTCCGG AAGTCCAATC TGAAGCCCTT CGAGCGGGAC ATCTCCACCG
421 AGATCTATCA GGCCGGCAGC ACCCCTTGTA ACGGCGTGCA GGGCTTCAAC TGCTACTTCC CACTGCAGTC
481 CTACGGCTTT CAGCCCACAA ATGGCGTGGG CTATCAGCCC TACAGAGTGG TGGTGCTGAG CTTCGAACTG
541 CTGCATGCCC CTGCCACAGT GTGCGGCCCT AAGAAAAGCA CCAATCTCGT GAAGAACAAA TGCGTGAACT TC
<223> Нуклеотидная последовательность вектора pVNV-GL-RBDind
<210> 2
<211> 7110
<400> TCAATACTGA CCATTTAAAT CATACCTGAC CTCCATAGCA GAAAGTCAAA AGCCTCCGAC
CGGAGGCTTT TGACTTGATC GGCACGTAAG AGGTTCCAAC TTTCACCATA ATGAAATAAG ATCACTACCG
GGCGTATTTT TTGAGTTATC GAGATTTTCA GGAGCTAAGG AAGCTAAAAT GAGCCATATT CAACGGGAAA
CGTCTTGCTC GAGGCCGCGA TTAAATTCCA ACATGGATGC TGATTTATAT GGGTATAAAT GGGCTCGCGA
TAATGTCGGG CAATCAGGTG CGACAATCTA TCGATTGTAT GGGAAGCCCG ATGCGCCAGA GTTGTTTCTG
AAACATGGCA AAGGTAGCGT TGCCAATGAT GTTACAGATG AGATGGTCAG GCTAAACTGG CTGACGGAAT
TTATGCCTCT TCCGACCATC AAGCATTTTA TCCGTACTCC TGATGATGCA TGGTTACTCA CCACTGCGAT
CCCAGGGAAA ACAGCATTCC AGGTATTAGA AGAATATCCT GATTCAGGTG AAAATATTGT TGATGCGCTG
GCAGTGTTCC TGCGCCGGTT GCATTCGATT CCTGTTTGTA ATTGTCCTTT TAACGGCGAT CGCGTATTTC
GTCTGGCTCA GGCGCAATCA CGAATGAATA ACGGTTTGGT TGGTGCGAGT GATTTTGATG ACGAGCGTAA
TGGCTGGCCT GTTGAACAAG TCTGGAAAGA AATGCATAAG CTTTTGCCAT TCTCACCGGA TTCAGTCGTC
ACTCATGGTG ATTTCTCACT TGATAACCTT ATTTTTGACG AGGGGAAATT AATAGGTTGT ATTGATGTTG
GACGAGTCGG AATCGCAGAC CGATACCAGG ATCTTGCCAT CCTATGGAAC TGCCTCGGTG AGTTTTCTCC
TTCATTACAG AAACGGCTTT TTCAAAAATA TGGTATTGAT AATCCTGATA TGAATAAATT GCAGTTTCAC
TTGATGCTCG ATGAGTTTTT CTAATGAGGG CCCAAATGTA ATCACCTGGC TCACCTTCGG GTGGGCCTTT
CTGCGTTGCT GGCGTTTTTC CATAGGCTCC GCCCCCCTGA CGAGCATCAC AAAAATCGAT GCTCAAGTCA
GAGGTGGCGA AACCCGACAG GACTATAAAG ATACCAGGCG TTTCCCCCTG GAAGCTCCCT CGTGCGCTCT
CCTGTTCCGA CCCTGCCGCT TACCGGATAC CTGTCCGCCT TTCTCCCTTC GGGAAGCGTG GCGCTTTCTC
ATAGCTCACG CTGTAGGTAT CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG TGCACGAACC
CCCCGTTCAG CCCGACCGCT GCGCCTTATC CGGTAACTAT CGTCTTGAGT CCAACCCGGT AAGACACGAC
TTATCGCCAC TGGCAGCAGC CACTGGTAAC AGGATTAGCA GAGCGAGGTA TGTAGGCGGT GCTACAGAGT
TCTTGAAGTG GTGGCCTAAC TACGGCTACA CTAGAAGAAC AGTATTTGGT ATCTGCGCTC TGCTGAAGCC
AGTTACCTCG GAAAAAGAGT TGGTAGCTCT TGATCCGGCA AACAAACCAC CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT
TTGTTTGCAA GCAGCAGATT ACGCGCAGAA AAAAAGGATC TCAAGAAGAT CCTTTGATTT TCTACCGAAG
AAAGGCCCAC CCGTGAAGGT GAGCCAGTGA GTTGATTGCA GTCCAGTTAC GCTGGAGTCT GAGGCTCGTC
CTGAATGGAT GGAAGTTTAC ATACACTTAA GTTGGAGTCA TTAAAACTCG TTTTTCAACT ACTCCACAAA
TTTCTTGTTA ACAAACAATA GTTTTGGCAA GTCAGTTAGG ACATCTACTT TGTGCATGAC ACAAGTCATT
TTTCCAACAA TTGTTTACAG ACAGATTATT TCACTTATAA TTCACTGTAT CACAATTCCA GTGGGTCAGA
AGTTTACATA CACTAAGTTG ACTGTGCCTT TAAACAGCTT GGAAAATTCC AGAAAATGAT GTCATGGCTT
TAGAAGCTTC ATTGGACATT GATTATTGAC TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT
AGCCCATATA TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC
CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA
ATGGGTGGAC TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC AAGTACGCCC
CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC
CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA TCGCTATTAC CATGGGTCGA GGTGAGCCCC ACGTTCTGCT
TCACTCTCCC CATCTCCCCC CCCTCCCCAC CCCCAATTTT GTATTTATTT ATTTTTTAAT TATTTTGTGC
AGCGATGGGG GCGGGGGGGG GGGGGGCGCG CGCCAGGCGG GGCGGGGCGG GGCGAGGGGC GGGGCGGGGC
GAGGCGGAGA GGTGCGGCGG CAGCCAATCA GAGCGGCGCG CTCCGAAAGT TTCCTTTTAT GGCGAGGCGG
CGGCGGCGGC GGCCCTATAA AAAGCGAAGC GCGCGGCGGG CGGGAGTCGC TGCGTTGCCT TCGCCCCGTG
CCCCGCTCCG CGCCGCCTCG CGCCGCCCGC CCCGGCTCTG ACTGACCGCG TTACTCCCAC AGGTGAGCGG
GCGGGACGGC CCTTCTCCTC CGGGCTGTAA TTAGCGCTTG GTTTAATGAC GGCTCGTTTC TTTTCTGTGG
CTGCGTGAAA GCCTTAAAGG GCTCCGGGAG GGCCCTTTGT GCGGGGGGGA GCGGCTCGGG GGGTGCGTGC
GTGTGTGTGT GCGTGGGGAG CGCCGCGTGC GGCCCGCGCT GCCCGGCGGC TGTGAGCGCT GCGGGCGCGG
CGCGGGGCTT TGTGCGCTCC GCGTGTGCGC GAGGGGAGCG CGGCCGGGGG CGGTGCCCCG CGGTGCGGGG
GGGCTGCGAG GGGAACAAAG GCTGCGTGCG GGGTGTGTGC GTGGGGGGGT GAGCAGGGGG TGTGGGCGCG
GCGGTCGGGC TGTAACCCCC CCCTGCACCC CCCTCCCCGA GTTGCTGAGC ACGGCCCGGC TTCGGGTGCG
GGGCTCCGTG CGGGGCGTGG CGCGGGGCTC GCCGTGCCGG GCGGGGGGTG GCGGCAGGTG GGGGTGCCGG
GCGGGGCGGG GCCGCCTCGG GCCGGGGAGG GCTCGGGGGA GGGGCGCGGC GGCCCCGGAG CGCCGGCGGC
TGTCGAGGCG CGGCGAGCCG CAGCCATTGC CTTTTATGGT AATCGTGCGA GAGGGCGCAG GGACTTCCTT
TGTCCCAAAT CTGGCGGAGC CGAAATCTGG GAGGCGCCGC CGCACCCCCT CTAGCGGGCG CGGGCGAAGC
GGTGCGGCGC CGGCAGGAAG GAAATGGGCG GGGAGGGCCT TCGTGCGTCG CCGCGCCGCC GTCCCCTTCT
CCATCTCCAG CCTCGGGGCT GCCGCAGGGG GACGGCTGCC TTCGGGGGGG ACGGGGCAGG GCGGGGTTCG
GCTTCTGGCG TGTGACCGGC GGCTCTAGAG CCTCTGCTAA CCATGTTCAT GCCTTCTTCT TTTTCCTACA
GCTCCTGGGC AACGTTAGCC TCGAGAATTC GTCCTGCTGC GCACGTGGGA AGCCCTGGCC CCGGCCGCCA
CCATGGGAGT GAAGGTGCTG TTCGCCCTGA TCTGTATTGC CGTGGCCGAA GCTTCTGTGG AAAAGGGCAT
CTACCAGACC AGCAACTTCC GGGTGCAGCC CACCGAATCC ATCGTGCGGT TCCCCAATAT CACCAATCTG
TGCCCCTTCG GCGAGGTGTT CAATGCCACC AGATTCGCCT CTGTGTACGC CTGGAACCGG AAGCGGATCA
GCAATTGCGT GGCCGACTAC TCCGTGCTGT ACAACTCCGC CAGCTTCAGC ACCTTCAAGT GCTACGGCGT
GTCCCCTACC AAGCTGAACG ACCTGTGCTT CACAAACGTG TACGCCGACA GCTTCGTGAT CCGGGGAGAT
GAAGTGCGGC AGATTGCCCC TGGACAGACA GGCAAGATCG CCGACTACAA CTACAAGCTG CCCGACGACT
TCACCGGCTG TGTGATTGCC TGGAACAGCA ACAACCTGGA CTCCAAAGTC GGCGGCAACT ACAATTACCG
GTACCGGCTG TTCCGGAAGT CCAATCTGAA GCCCTTCGAG CGGGACATCT CCACCGAGAT CTATCAGGCC
GGCAGCACCC CTTGTAACGG CGTGCAGGGC TTCAACTGCT ACTTCCCACT GCAGTCCTAC GGCTTTCAGC
CCACAAATGG CGTGGGCTAT CAGCCCTACA GAGTGGTGGT GCTGAGCTTC GAACTGCTGC ATGCCCCTGC
CACAGTGTGC GGCCCTAAGA AAAGCACCAA TCTCGTGAAG AACAAATGCG TGAACTTCCA TCACCACCAT
CATCACTAAG TCGACCGAGC TCAGCCTCGA CTGTGCCTTC TAGTTGCCAG CCATCTGTTG TTTGCCCCTC
CCCCGTGCCT TCCTTGACCC TGGAAGGTGC CACTCCCACT GTCCTTTCCT AATAAAATGA GGAAATTGCA
TCGCATTGTC TGAGTAGGTG TCATTCTATT CTGGGGGGTG GGGTGGGGCA GGACAGCAAG GGGGAGGATT
GGGAAGACAA TAGCAGGCAT GCTGGGGATG CGGTGGGCTC TATGGCTTCT GAGGCGGAAA GAACCAGCTG
GGGCTCTAGG GGGTATCCCC ACGCGCCCTG TAGCGGCGCA TTAAGCGCGG CGGGTGTGGT GGTTACGCGC
AGCGTGACCG CTACACTTGC CAGCGCCCTA GCGCCCGCTC CTTTCGCTTT CTTCCCTTCC TTTCTCGCCA
CGTTCGCCGG CTTTCCCCGT CAAGCTCTAA ATCGGGGGCT CCCTTTAGGG TTCCGATTTA GTGCTTTACG
GCACCTCGAC CCCAAAAAAC TTGATTAGGG TGATGGTTCA CGTAGTGGGC CATCGCCCTG ATAGACGGTT
TTTCGCCCTT TGACGTTGGA GTCCACGTTC TTTAATAGTG GACTCTTGTT CCAAACTGGA ACAACACTCA
ACCCTATCTC GGTCTATTCT TTTGATTTAT AAGGGATTTT GCCGATTTCG GCCTATTGGT TAAAAAATGA
GCTGATTTAA CAAAAATTTA ACGCGAATTA ATTCTGTGGA ATGTGTGTCA GTTAGGGTGT GGAAAGTCCC
CAGGCTCCCC AGCAGGCAGA AGTATGCAAA GCATGCATCT CAATTAGTCA GCAACCAGGT GTGGAAAGTC
CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA GAAGTATGCA AAGCATGCAT CTCAATTAGT CAGCAACCAT AGTCCCGCCC
CTAACTCCGC CCATCCCGCC CCTAACTCCG CCCAGTTCCG CCCATTCTCC GCCCCATGGC TGACTAATTT
TTTTTATTTA TGCAGAGGCC GAGGCCGCCT CTGCCTCTGA GCTATTCCAG AAGTAGTGAG GAGGCTTTTT
TGGAGGCCTA GGCTTTTGCA AAAAGCTCCC GGGAGCTTGT ATATCCATTT TCGGATCTGA TCAAGAGACA
GGATGAGGAT CGTTTCGCAT GATTGAACAA GATGGATTGC ACGCAGGTTC TCCGGCCGCT TGGGTGGAGA
GGCTATTCGG CTATGACTGG GCACAACAGA CAATCGGCTG CTCTGATGCC GCCGTGTTCC GGCTGTCAGC
GCAGGGGCGC CCGGTTCTTT TTGTCAAGAC CGACCTGTCC GGTGCCCTGA ATGAACTGCA GGACGAGGCA
GCGCGGCTAT CGTGGCTGGC CACGACGGGC GTTCCTTGCG CAGCTGTGCT CGACGTTGTC ACTGAAGCGG
GAAGGGACTG GCTGCTATTG GGCGAAGTGC CGGGGCAGGA TCTCCTGTCA TCTCACCTTG CTCCTGCCGA
GAAAGTATCC ATCATGGCTG ATGCAATGCG GCGGCTGCAT ACGCTTGATC CGGCTACCTG CCCATTCGAC
CACCAAGCGA AACATCGCAT CGAGCGAGCA CGTACTCGGA TGGAAGCCGG TCTTGTCGAT CAGGATGATC
TGGACGAAGA GCATCAGGGG CTCGCGCCAG CCGAACTGTT CGCCAGGCTC AAGGCGCGCA TGCCCGACGG
CGAGGATCTC GTCGTGACCC ATGGCGATGC CTGCTTGCCG AATATCATGG TGGAAAATGG CCGCTTTTCT
GGATTCATCG ACTGTGGCCG GCTGGGTGTG GCGGACCGCT ATCAGGACAT AGCGTTGGCT ACCCGTGATA
TTGCTGAAGA GCTTGGCGGC GAATGGGCTG ACCGCTTCCT CGTGCTTTAC GGTATCGCCG CTCCCGATTC
GCAGCGCATC GCCTTCTATC GCCTTCTTGA CGAGTTCTTC TGAGCGGGAC TCTGGGGTTC GAAATGACCG
ACCAAGCGAC GCCCAACCTG CCATCACGAG ATTTCGATTC CACCGCCGCC TTCTATGAAA GGTTGGGCTT
CGGAATCGTT TTCCGGGACG CCGGCTGGAT GATCCTCCAG CGCGGGGATC TCATGCTGGA GTTCTTCGCC
CACCCCAACT TGTTTATTGC AGCTTATAAT GGTTACAAAT AAAGCAATAG CATCACAAAT TTCACAAATA
AAGCATTTTT TTCACTGCAT TCTAGTTGTG GTTTGTCCAA ACTCATTAAT GTATCTTATC ATGTCTGTAT
ACCGTCGACC TCTAGCTGCT TGTGGAAGGC TACTCGAAAT GTTTGACCCA AGTTAAACAA TTTAAAGGCA
ATGCTACCAA ATACTAATTG AGTGTATGTA AACTTCTGAC CCACTGGGAA TGTGATGAAA GAAATAAAAG
CTGAAATGAA TCATTCTCTC TACTATTATT CTGATATTTC ACATTCTTAA AATAAAGTGG TGATCCTAAC
TGACCTAAGA CAGGGAATTT TTACTAGGAT TAAATGTCAG GAATTGTGAA AAAGTGAGTT TAAATGTATT
TGGCTAAGGT GTATGTAAAC TTCCGACTTC AACTGTATAG GGTTCCTCTA
<223> Аминокислотная последовательность RBDind
<210> 3
<211> 234
<400>
1 VEKGIYQTSN FRVQPTESIVR FPNITNLCPFG EVFNATRFAS VYAWNRKRIS
61 NCVADYSVLY NSASFSTFKCY GVSPTKLNDL CFTNVYADSF VIRGDEVRQI
121 APGQTGKIAD YNYKLPDDFT GCVIAWNSNN LDSKVGGNYN YRYRLFRKSN
241 LKPFERDISTE IYQAGSTPCN GVQGFNCYFP LQSYGFQPTN GVGYQPYRV
301 VVLSFELLHA PATVCGPKKS TNLVKNKCVN F
<---