БИОЧИП ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОК

Полезная модель относится к области медицины, но также может быть использована в ветеринарии и биологии.
Известен биочип, позволяющий определять поверхностные антигены клеток (см. А.В.Шишкин, И.И.Шмырев, С.А.Кузнецова, Н.Г.Овчинина, А.А.Бутылин, Ф.И.Атауллаханов, А.И.Воробьев «Иммунологические биочипы для исследования эритроцитов человека» «Биологические мембраны». - 2008. - том 25 - №4 - С.267-276.), взятый в качестве прототипа. Биочип, представляет собой твердую, плоскую и прозрачную подложку, на которой в строго определенных тестовых участках (пятнах) иммобилизованы антитела, специфичные к поверхностным антигенам клеток. Пятна биочипа отделены друг от друга фоновыми участками, в которых иммобилизованные антитела отсутствуют.
Недостатком данного биочипа является невозможность выполнения без использования проточной камеры его инкубации с клеточной суспензией в условиях подачи ее потока с заданной скоростью, а также выполнения отмывки от не связавшихся клеток потоком жидкости с заданной скоростью. Закрепление биочипа в проточной камере требует выполнения точных манипуляций. При неаккуратном их осуществлении возможно повреждение поверхности биочипа.
Задачей заявленной полезной модели является возможность выполнения без использования проточной камеры исследований, требующих подачи потока жидкостей с заданной скоростью, а также исключение риска повреждения поверхности биочипа.
Поставленная задача решается за счет того, у биочипа для исследования клеток, содержащего подложку, на которой размещены тестовые участки с иммобилизованными молекулами веществ, способных связываться с поверхностными молекулами клеток, подложка представляет собой капилляр, на внутренней поверхности стенки которого расположены тестовые участки.
Капилляр состоит из секций, герметично соединяемых между собой.
Биочип снабжен приводящей трубкой.
Биочип снабжен отводящей трубкой.
Капилляр имеет, по крайней мере, одну плоскую стенку, на которой расположены тестовые участки.
Биочип снабжен платформой, к которой крепится капилляр.
Платформа является съемной
Биочип содержит контрольный участок, обеспечивающий прочность связывания клеток, заведомо меньшую, чем прочность их специфического связывания в области любого из тестовых участков, но заведомо большую, чем прочность неспецифического связывания клеток с подложкой.
Биочип имеет разметку.
Биочип снабжен приспособлением для улавливания пузырей воздуха
Использование полезной модели позволяет без использования проточной камеры осуществлять проведение исследований, требующих подачи потока жидкостей с заданной скоростью. При этом исключается риск повреждения поверхности биочипа. Благодаря наличию дополнительного контрольного участка, позволяющего определить максимально допустимую скорость потока отмывающей жидкости, повышается точность анализа и исключаются возможные ошибки. Наличие разметки облегчает нахождение и идентификацию тестовых участков при неавтоматизированной оценке качества отмывки и результатов анализа. Разметка также может указывать на порядок считывания результата. Наличие приспособления для улавливания пузырей воздуха исключает попадание последних в капилляр.
Заявленная полезная модель поясняется чертежом, где:
на фиг.1 представлен биочип (вид сверху)
на фиг.2 представлен разрез А-А на фиг.1
на фиг.3 представлен биочип, закрепленный на платформе (вид сверху)
на фиг.4 представлен разрез В-В на фиг.3.
Биочип содержит подложку 1 (фиг.1), которая может состоять из одного материала, образующего один слой, либо из нескольких материалов, образующих несколько слоев. Подложка биочипа представляет собой капилляр 2 (фиг.2), состоящий из секций 3 и 4 герметично соединенных друг с другом. Секции 3 и 4 изготовлены из прозрачного материала. На поверхности секции 3, обращенной в просвет капилляра 2, расположены тестовые участки 5 (пятна биочипа) (фиг.1, 2), где иммобилизованы молекулы веществ, способных связываться с молекулами, находящимися на поверхности исследуемых клеток, например, антитела, способные связываться с поверхностными антигенами клеток. При этом в разных тестовых участках 5 биочипа находятся молекулы веществ, способные связываться с разными типами молекул, находящихся на поверхности клеток. Но в каждом отдельно взятом тестовом участке 5 иммобилизованы молекулы, способные связываться с каким-либо одним определенным видом молекул, находящихся на поверхности клеток. Часть тестовых участков 5 может дублироваться, кроме того, могут присутствовать один или несколько контрольных тестовых участков. Поверхность секции 3 (фиг.2), на которой расположены тестовые участки 5, имеет покрытие 6, обеспечивающее высокую прочность иммобилизации молекул за счет ковалентного или неко валентного связывания. Тестовые участки 5 (фиг.1) отделены друг от друга фоновыми участками 7, не содержащими иммобилизованных молекул, способных специфически связываться с поверхностными молекулами исследуемых клеток. Поверхность фоновых участков 7 может быть покрыта иммобилизованными молекулами одного или нескольких веществ, блокирующих сайты неспецифического связывания. Эти молекулы, могут быть иммобилизованы на подложке биочипа при его изготовлении, либо могут наноситься уже в процессе проведения анализа на этапе, предшествующем инкубации биочипа с клеточной суспензией. Для этих целей может быть использован, например, бычий сывороточный альбумин или обезжиренное сухое молоко.
На поверхности секции 3, обращенной в просвет капилляра 2, расположен контрольный участок 8, обеспечивающий прочность связывания клеток заведомо меньшую, чем прочность специфического связывания в любом из тестовых участков 5, но большую, чем прочность неспецифического связывания клеток с подложкой в области фоновых участков 7. В случае, если биочип предназначен для исследования лейкоцитов, в контрольном участке 8 могут быть иммобилизованы, например, антитела, специфичные к антигену CD45, присутствующему на поверхности всех лейкоцитов. При этом для обеспечения низкой прочности связывания клеток в участке 8 количество молекул антител, иммобилизованных на единице площади поверхности должно быть малым, либо должны использоваться антитела с низкой аффинностью. Контрольный участок 8 также отделен от тестовых участков 5 фоновым участком 7.
На стенке капилляра 2 (фиг.2), образованной секцией 3, нанесены линии разметки 9, обозначающие границы тестовых участков 5 и контрольного участка 8. Там же имеется участок 10 (фиг.1), указывающий на порядок считывания результата.
Биочип имеет капилляр 2 прямоугольного сечения (фиг.2). Возможно исполнение биочипа с другой формой сечения капилляра 2. Но для того, чтобы можно было осуществлять микроскопическое исследование связавшихся клеток, стенка капилляра 2, на которой расположены участки 5, 8 (фиг.1) должна быть плоской.
Биочип снабжен съемными секциями 11 и 12, которые герметично крепятся к капилляру 2. Внутренняя поверхность секций 11 и 12 имеет герметизирующее покрытие (на чертеже не показано). К съемным секциям 11 и 12 крепятся соответственно отводящая трубка 13 и приводящая трубка 14. Биочип крепится на съемной платформе 15 (фиг.3), обеспечивающей его горизонтальное расположение на предметном столике микроскопа при выполнении микроскопического исследования, а также облегчающей выполнение других манипуляций. Крепление биочипа на платформе 15 также исключает случайное отсоединение съемных секций 11 и 12. Платформа 15 снабжена поворотными прижимающими планками 16, закрепленными на осях 17, а также имеет сквозное отверстие 18 (фиг.4), находящееся в проекции капилляра 2 биочипа. Приводящая трубка 14 биочипа соединена с приспособлением 19, предназначенным для улавливания пузырей воздуха. Оно представляет собой емкость, закрытую эластичной резиновой пробкой 20.
Биочип может быть снабжен зажимами или кранами (на чертеже не показаны), устанавливаемыми на приводящую трубку 14 и отводящую трубку 13.
Анализ с помощью биочипа осуществляют следующим образом. Капилляр 2 биочипа соединяют со съемными секциями 11 и 12, которые соединяют соответственно с отводящей трубкой 13 и приводящей трубкой 14. Биочип размещают на платформе 15 и фиксируют прижимающими планками 16. Отводящую трубку 13 соединяют со шприцевым насосом, работающим на всасывание. Приводящую трубку 14 соединяют с емкостью, в которой находится необходимая жидкость. При этом в процессе анализа используют разные жидкости, для чего приводящую трубку 14 соединяют с разными емкостями. В процессе проведения исследования поток всех растворов через капилляр 2 создается шприцевым насосом.
Биочип заполняют жидкостью следующим образом. Создавая шприцевым насосом разряжение, заполняют жидкостью капилляр 2, секции 11 и 12 и трубки 13 и 14 биочипа. Через пробку 20 в емкость приспособления 19, предназначенного для улавливания пузырей воздуха, вводят иглу шприца. С помощью данного шприца создают разряжение. В результате происходит полное заполнение приспособления 19 жидкостью. При этом приводящую трубку 14 пережимают на участке между капилляром 2 и приспособлением для улавливания пузырей воздуха 19. После удаления воздуха из приспособления 19 использованный для этого шприц удаляют, а проходимость приводящей трубки 14 для жидкости восстанавливают.
В процессе проведения анализа в приспособлении 19 будут задерживаться пузыри воздуха, которые могут попадать в трубку 14 при ее соединении с различными емкостями с жидкостями. В случае накопления значительного количества воздуха, он может быть удален таким же образом.
Если этого не было выполнено на этапе изготовления, биочип инкубируют с раствором вещества, блокирующего сайты неспецифического связывания на подложке 1. Для этого через биочип пропускают раствор данного вещества. Затем осуществляют отмывку, для чего через биочип пропускают раствор детергента. Затем устраняют детергент путем подачи потока буферного раствора. Далее заполняют биочип клеточной суспензией и осуществляют инкубацию. При этом возможна инкубация при пропускании потока клеточной суспензии с небольшой скоростью. Инкубация также может осуществляться без подачи потока. В этом случае капилляр заполняют клеточной суспензией, после чего поток жидкости останавливают на определенное время. В процессе инкубации происходит специфическое связывание в области тестовых участков 5 клеток, имеющих на своей поверхности определяемые молекулы. Клетки, не имеющие соответствующих молекул, неспецифически связываются с подложкой биочипа 1. Прочность неспецифического связывания клеток значительно меньше, чем прочность их специфического связывания.
Затем осуществляют отмывку биочипа от клеток, неспецифически связавшихся с подложкой. Для этого через биочип пропускают поток изотонического буферного раствора. При этом скорость подаваемого потока жидкости постепенно увеличивают до тех пор, пока не начнется отрыв связавшихся клеток из контрольного участка 8. В результате отмывки происходит устранение неспецифически связавшихся клеток из фоновых участков 7. В тестовых участках 5 остаются только специфически связавшиеся клетки. Контроль качества отмывки осуществляют с помощью микроскопического исследования в проходящем свете, для чего платформу 15 с закрепленным в ней биочипом устанавливают а предметном столике микроскопа.
Далее путем микроскопического исследования осуществляют оценку результата. Наличие разметки 9 и участка 10 облегчает нахождение и идентификацию тестовых участков 5.
Может быть выполнено микрофотографирование тестовых участков 5 и проведена обработка полученных изображений.
Все этапы работы могут быть автоматизированы.
В дальнейшем биочип может быть подвергнут различным видам дополнительных исследований. При этом в случае необходимости секция 4 может быть отделена от секции 3.