Эффекты ДСИП на фоне дисфункции моноаминергических систем в структурах мозга крыс линий Вистар и Август

УДК 612.8.015; 612.822

Вестник СПбГУ. Сер. 3, 2007, вып. 3

Е. Л. Доведова, Д. А. Хрусталев, Н. Д. Ещенко ЭФФЕКТЫ ДСИП НА ФОНЕ ДИСФУНКЦИИ

МОНОАМИНЕРГИЧЕСКИХ СИСТЕМ В СТРУКТУРАХ МОЗГА КРЫС ЛИНИЙ ВИСТАР И АВГУСТ

К настоящему времени идентифицировано и охарактеризовано значительное число (несколько сотен) биологически активных пептидов, выполняющих различные регуля-торные функции в организме. Среди них особенно привлекает внимание дельта-сон индуцирующий пептид (ДСИП), структура этого нанопептида - WAGGD ASGQ.

Несмотря на то, что ДСИП был выделен группой швейцарских нейрохимиков из венозной крови мозга кроликов еще в 1977 г. [15], а также на многочисленные работы, посвященные исследованию его свойств (см. [10]), до сих пор эндогенное происхождение и механизмы, лежащие в основе его биологической активности, остаются неясными. Не удалось идентифицировать ни белок-предшественник, из которого выщепляется ДСИП, ни рецептор этого пептида, ни ген, кодирующий рецептор.

В первых работах, посвященных физиологическим эффектам ДСИП, показано, что введение его животным индуцирует появление дельта-волн на электроэнцефалограмме [18]. Однако последующие более углубленные исследования поставили под сомнение гип-ногенное действие как основной эффект нанопептида [6,13], и сейчас ДСИП рассматривают как пептидный регулятор полифункционального действия. Большое значение придается его антистрессорной и адаптогенной активности. Многочисленные биохимические и физиологические данные указывают на регулирующее действие ДСИП при различных патологических состояниях: гипоксия, холодовой и эмоциональный стресс, алкогольная мотивация и др. [1,2,8]. В то же время многие исследователи подчеркивают, что действие ДСИП в значительной мере определяется исходным состоянием животного. Так, введение пептида при агрессивно-оборонительной реакции животных приводило к изменению функциональной активности ряда подкорковых структур, участвующих в регуляции сна, в то время как на фоне психомоторного возбуждения (после введения животным L-Д О ФА) ДСИП вызывал нормализацию поведения и показателей ЭЭГ [4].

Целью данной работы было изучения действия ДСИП на состояние моноаминергических медиаторных систем в условиях нарушения их функций после введения амфетамина. Этот психостимулирующий препарат часто используется в экспериментальной практике при моделировании шизофреноподобных состояний. Для того чтобы выявить особенности эффектов нанопептида ДСИП, мы проводили исследования на структурах мозга двух линий крыс (Вис-тар и Август), существенно отличающихся по устойчивости к эмоциональному стрессу.

Материалы и методы исследования. Эксперименты проводили на половозрелых крысах-самцах линий Вистар и Август массой 170-200 г с соблюдением всех условий, предусмотренных правилами гуманного обращения с животными.

Амфетамин (Sigma) в дозе 1.0 мг/кг вводили ежедневно в течение 21 дня. За это время у животных развивалась дисфункция моноаминергических систем, которая выражалась в характерных двигательно-эмоциональных изменениях (фенаминовая стереотипия). За 30 мин до использования животных в опыте им вводили препарат ДСИП1 в дозе 60 мкг/кг. Контрольной

© Е. Л. Доведова, Д. А. Хрусталев, Н, Д. Ещенко, 2007

'Использованный в работе препарат ДСИП синтезирован в Институте биоорганической химии им. А. А, Овчинникова и М. М. Шемякина РАН сотрудниками И. И. Михалевой и И. А. Прудченко, за что приносим им благодарность.

группе животных вводили эквивалентный объем 0.9%-ного раствора NaCl. Во всех случаях использовали внутрибрюшинные инъекции.

После декапитации животных под легким эфирным наркозом на холоде извлекали головной мозг, промывали его в 0.32 М растворе сахарозы и выделяли исследуемые структуры - сенсомо-торную кору и хвостатое ядро. Ткань гомогенизировали в среде выделения (0.32 М сахароза, содержащая 0.001 М ЭДТАи0.01 МТрис-HCl, рН7.4). Из 10%-ного гомогената методом дифференциального центрифугирования [3] после удаления фракции ядер при 1000 g (10 мин) изолировали субклеточные фракции при 10 000 g (20 мин) - для определения активности моноамино-оксидаз; при 20 000 g (15 мин) - для определения активности тирозингидроксилазы и при 50 000 g (25 мин) - для анализа активности триптофангидроксилазы.

Активность моноаминооксидазы типа А (МАОа, КФ 1.4.3.4) определяли спектрофотометри-чески, используя серотонин-креатинсульфат (Sigma) в качестве субстрата [16] и выражали в условных единицах ДЕ250/мг белка за 60 мин. Для определения активности моноаминооксидазы типа Б (М АОб, КФ 1.4.3,4) пользовались нашей модификацией [12] метода Горкина и соавторов; субстратом служил пара-нитрофенилэтиламин. Активность МАОБ выражали в условных единицах АЕ450/мгбелказа60мин.

Активность тирозингидроксилазы (ТирГД, КФ 1.14.18.1) определяли спектрофотометриче-ски [9], используя L-тирозин (Sigma) как субстрат и выражали в Е335/мг белка за 60 мин. Флуорометрический метод [14] применяли для анализа активности триптофангидроксилазы (ТрпГД, КФ 1.13.11.11) с L-триптофаном (Sigma) в качестве субстрата; активность ТрпГД выражали в наномолях на 1мг за 60 мин.

Содержание дигидроксифенилаланина (ДОФА) определяли спектрофотометрически [17] и выражали в наномолях на 1 мг белка. Количество белка в пробах определяли по Лоури. Статистическую обработку данных проводили, используя параметрический критерий Стьюдента и непараметрический критерий Манна-Уитни; различия между выборками считали достоверными прир<0.05.

Результаты исследований и их обсуждение. Использованные в данной работе две линии крыс (Вистар и Август), как известно, заметно различаются по ряду физиологических и поведенческих характеристик. Для крыс линии Август характерна предрасположенность к эмоциональному стрессу, у них в большей мере, чем у животных линии Вистар, преобладают реакции страха, и мозг менее устойчив к стрессорным повреждениям [11]. На биохимическом уровне эти различия подтверждаются при сравнении показателей метаболизма катехоламинов и серотонина в структурах мозга контрольных групп животных (табл. 1 и 2). В сенсомоторной коре и хвостатом ядре крыс Август активность ферментов синтеза и окисления этих нейромедиаторов несколько ниже, чем у крыс Вистар. При сравнении двух медиаторных систем более выраженными были отличия по показателям метаболизма серотонина, а при сопоставлении исследованных структур мозга более резкие отличия обнаружены в хвостатом ядре, чем в сенсомоторной коре. Так, активность ключевого фермента синтеза серотонина, триптофангидроксилазы, в хвостатом ядре крыс Август на 58-60% ниже, в то время как в сенсомоторной коре - лишь на 20%, чем в аналогичных структурах у крыс Вистар.

Длительное введение амфетамина приводило к выраженной дисфункции моноамино-ергических медиаторных систем, причем в структурах мозга крыс разных линий изменения показателей носили во многих случаях противоположный характер. Это особенно заметно на примере ферментов метаболизма серотонина (см. табл. 1). Так, у крыс линии Август в сенсомоторной коре активность триптофангидроксилазы возрастала на 37%, а активность МАОа оставалась близкой к контролю. В хвостатом ядре активность гидро-ксилазы имела тенденцию к возрастанию, но значительно снижалась активность МАОа, окисляющей медиатор. Эти изменения активности ферментов биосинтеза и окисления серотонина указывают на то, что при длительном введении амфетамина возможно повышение концентрации нейромедиатора в обеих структурах мозга крыс Август, т. е. можно говорить об активации серотонинергической системы.

Таблица 1. Активность ферментов синтеза и окисления серотонина в структурах мозга крыс в норме и после введения ДСИП на фоне длительного действия амфетамина

Показатели

Триптофангидроксилаза

МАОд

Сенсомоторная кора

Крысы Вистар Контроль -«- Амфетамин

-«- Амфетамин + ДСИП

Крысы Август Контроль -«- Амфетамин

-«- Амфетамин + ДСИП

Крысы Вистар Контроль -«- Амфетамин

-«- Амфетамин + ДСИП

Крысы Август Контроль -«- Амфетамин

-«- Амфетамин + ДСИП

Хвостатое ядро

1.07 ±0.21 0.73+0.22 1.24 ±0.20 0.87 ±0.15 1.19 ± 0.17* 0.97 ±0.11

4.03 ±0.59 3.11 ±0.36* 4.44 ± 0.48 2.55 ±0.38 2.90 ±0.41 2.52 ±0.43

0.25 ±0.05 0.15 ±0.03 0.30 ±0.05 0.19 ±0.06 0.18 ±0.05 0.23 ±0.06

0.45 ±0.07 0.28 ±0.04 0.60 ±0.05* 0.26 ± 0.04 0.17 ±0.04* 0.30 ±0.06

Примечание. Активность триптофангидроксилазьт выражена в нмоль/мг белка за 60 мин; активность МАОа - в Е230/мг белка за 60 мин; * - статистически достоверные различия (р<0.05) по отношению к контролю.

Таблица 2. Показатели метаболизма дофамина в структурах мозга крыс в норме и после введения ДСИП на фоне длительного действия амфетамина

Показатели

Тирозингидроксилаза

ДОФА

МАО к

Крысы Вистар Контроль -«- Амфетамин

-«- Амфетамин + ДСИП Крысы Август Контроль -«- Амфетамин

-«- Амфетамин + ДСИП

Крысы Вистар Контроль -«- Амфетамин

-«- Амфетамин + ДСИП Крысы Август Контроль -«- Амфетамин

-«- Амфетамин + ДСИП

Сенсомоторная кора 1.20 ±0.19 1.32 ± 0.14 1.61 ± 0.18 1.46 ± 0.10 1.17 ± 0.12* 1.27 ±0.16 Хвостатое ядро 2.10 ±0.26 2.50 ±0.26 2.29 ± 0.27 1.46 ±0.13 1.38 ±0.16 1.44 ±0.19

0.82 ±0.11 1.07 ± 0.11* 1.11 ±0.15* 0.67 ±0.10 0.62 ±0.10 0.65 ±0.10

0.87 ±0.13 1.11 ±0,17* 0.88 ±0.12 0.74 ±0.11 0.50 ±0.08* 0.71 ±0.12

0.48 ±0.08 0.56 ±0.08 0.51 ±0.06 0.42 ± 0.06 0.49 ±0.07 0.31 ±0.04

0.50 ±0.07 0.52 ±0.06 0.52 ±0.07 0.50 ±0.07 0.55 ±0.06 0.38 ±0.05*

Примечание. Активность тирозингидроксилазы выражена в Е335/мг белка за 60 мин; содержание ДОФА - в нмоль/мг белка; активность МАОБ - в Е450/мг белка за 60 мин; * - статистически достоверные различия (р<0.05) по отношению к контролю.

Напротив, в структурах мозга крыс Вистар обнаружено (см. табл. 1) как замедление синтеза серотонина (активность триптофангидроксилазы составляла 68% от контроля в коре и 77% - в хвостатом ядре), так и выраженное торможение окисления медиатора - активность МАОа снижалась на 38-40%, что указывает на возможное ослаблении серотонинергической системы.

Установленные нами изменения активности ферментов метаболизма серотонина согласуются со сдвигами в работе дофаминергической системы. Известно, что дофамин способен оказывать модулирующее тормозное влияние на серотонинергические нейроны. Это наглядно демонстрируют результаты, полученные нами при исследовании мозга крыс Вистар (см. табл. 2). В структурах мозга животных этой линии после введения амфетамина активность тирозингидроксилазы имела тенденцию к повышению, а активность М АОБ либо оставалась близкой к контрольным значениям (хвостатое ядро), либо также несколько возрастала (сенсомоторная кора). В результате в обеих структурах мозга отмечено статистически достоверное накопление ДОФА - непосредственного предшественника дофамина, которое сопровождалось отмеченным выше ослаблением работы серотонинергической системы (судя по активности ферментов синтеза и окисления этого медиатора).

В отличие от крыс Вистар, у животных линии Август (см. табл. 2) введение амфетамина приводило к снижению активности тирозингидроксилазы в сенсомоторной коре, однако не вызывало изменений в уровне ДОФА. Содержание этого предшественника дофамина уменьшалось на 35% в хвостатом ядре крыс Август, что согласуется с некоторой активацией серотонинергической системы и, по-видимому, отражает своеобразные взаимоотношения медиаторных систем в мозге животных данной линии. Обнаруженные нами отличия в реакции нейромедиаторных систем на длительное введение амфетамина у крыс разных линий хорошо согласуются с имеющимися в литературе сведениями об индивидуальных особенностях ответа моноаминергических систем на стресс, выявленными как у животных, так и у людей [5].

Однократное введение животным нейропептида ДСИП на фоне длительного действия амфетамина в целом оказывало нормализующее действие на исследуемые показатели (см. табл. 1 и 2). У крыс линии Август активность триптофангидроксилазы снижалась, приближаясь к контрольным значениям, а активность МАОа, которая в хвостатом ядре под влиянием амфетамина была на 35% ниже контроля, под действием ДСИП, напротив, повышалась, также приближаясь к контрольным значениям. Возрастание активности ферментов метаболизма серотонина, заметно заторможенных под действием амфетамина, обнаружено и в мозге крыс Вистар после введения им ДСИП (см. табл. 1), причем в случае МАОа в хвостатом ядре активность фермента увеличивалась до значений, превышающих на 33% уровень контроля.

Нормализующий эффект ДСИП проявлялся и в отношении показателей, характеризующих состояние дофаминергической системы (см. табл. 2). Относительно небольшие, но противоположно направленные изменения активности ферментов синтеза и окисления дофамина под влиянием ДСИП практически возвращают концентрацию ДОФА к контрольным значениям в обеих структурах мозга крыс Август и в хвостатом ядре крыс Вистар. Однако в сенсомоторной коре крыс Вистар активность тирозингидроксилазы и уровень ДОФА после введения ДСИП оставались несколько выше контрольных значений.

Можно отметить также, что у крыс линии Август нормализация обеих нейромедиаторных систем под влиянием ДСИП происходила, главным образом, в результате изменения активности моноаминооксидаз, окисляющих медиаторы, а не гидроксилаз, участвующих в их синтезе. Напротив, у крыс Вистар и в сенсомоторной коре, и в хвостатом ядре под действием ДСИП в большей мере менялась активность тирозингидроксилазы, тогда как активность МАОБ оставалась практически постоянной. Реакция ферментов серотонинергической системы у животных этой линии также отличалась своеобразием: введение крысам Вистар нейропептида нормализовало метаболизм серотонина за счет одновременного повышения активности как МАОд, так и триптофангидроксилазы. Подобные отличия в реакциях нейромедиаторных систем при действии нейропептидов у животных с разным уровнем тревожности отмечены и другими исследователями [7].

Следует отметить и еще один интересный факт, а именно высокую эффективность Д СИП в сравнительно низкой концентрации (60 мкг/кг массы тела). Как установлено, ДСИП способен корректировать стойкие нарушения в функционировании исследованных нейроме-диаторных систем, вызванные длительным действием амфетамина. Более того, обращает на себя внимание то, что уже через некоторе время после инъекции (30 мин) нейропептид оказался способным нивелировать влияние амфетамина путем изменения активности ферментов синтеза или окисления медиаторов.

Таким образом, полученные нами данные позволяют сделать заключение, что однократная инъекция ДСИП на фоне длительной дисфункции моноаминергических нейро-медиаторных систем нивелирует действие амфетамина и способствует нормализации многих параметров обмена дофамина и серотонина, причем конкретные механизмы нормализации исследованных показателей различаются в стриокортикальных структурах мозга крыс линий Август и Вистар. Эти результаты подчеркивают значение данного нейропеп-тида как активного природного адаптогена.

Summary

Dovedova Е. L., Khrustalyov D. A., Eschenko N. D. The effects of delta-sleep inducing peptide on monoaminergic systems in conditions of their disfunctions in Wistar and August rats.

The effects of DSIP on the monoaminoergic system state after long-term amphetamine action were investigated in a cortex and caudate nucleus of Wistar or August rats. The results demonstrated diverse respons reactionse of neurotransmitters metabolism in August and Wistar rats on amphetamine injections. A single DSIP injection after amphetamine administration led to normalization in the activities of dophamine and Serotonine metabolizing enzymes.

Литература

1. АльперовичД. В., Лысенко А. В., Менджерицкий А. М., Мационис А. Э. Роль нейропептидов в механизмах адаптации к экстремальным состояниям. Ростов-на-Дону, 1999. 2. Агимарин И. П., Каменская М. А. Нейропептиды в синаптической передаче // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. Физиология человека и животных. 1989. Т. 34. 3. Бизольд Д. Распределение гексокиназы в субклеточных фракциях мозговой ткани // Биохимия и функция нервной системы. Л. 1967. С. 115-122. 4. Боголепов Н. Я., Доведова Е. Л., Герштейн Л. М. Морфохимическая пластичность мозга: эффект пептида дельта-сна на фоне ведения L-ДОФА // Нейрохимия. 2004. Т. 21. №2. С. 147—151.5. Гуревич К. Г. Индивидуальные особенности реакции катехолергической системы на стресс // Нейрохимия. 2002. Т. 19. №2. С. 93-97. 6. Ковальзон В. И. Гипногенные свойства аналогов пептида DSIP: структурно-функциональные взаимоотношения // Изв. АН. Сер. биол. 2001. № 4. С. 467-474. 7. Лысенко А. В., Менджерицкий А. М., Волошина Г. Л., Михалева И. И. Нейрохимические механизмы влияния киоторфина на развитие адаптационных реакций крыс с высоким уровнем тревожности // Нейрохимия. 2004. Т. 21. № 3. С. 217-224.8. Минеева-ВялыхМ. Ф. Метод прямого спектрофотометрического определения скорости тирозингидроксилазной реакции // Вопр. мед. химии. 1976. Т. 22. №2. С. 274- 279.9. Менджерицкий А. М., Мационис А. Э., АльперовичД. В. Некоторые биохимические механизмы нейропротекторного эффекта ДСИП при гипоксии // Hypoxia Medical J. 1997. Т. 5. N4. С. 3-7. 10. Стрекалова Т. В. Дельта-сон индуцирующий пептид (ДСИП): проблемы эндогенного происхождения и биологической активности // Нейрохимия 1998. Т. 15. №3. С. 227-239.11. Пшенникова М. Г., Попкова Е. В.,Хоменко И. П. и др. Устойчивость к нейродегенеративным и стрессорным повреждениям мозга у крыс линии Август и Вистар // Тез. Всерос. конфер. по нейрохимии. М., 2005. С. 136-137.12. Хрусталев Д. А. Активность ферментов обмена нейромедиаторов в образованиях мозга крыс с различными поведенческими характеристиками // Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 2004. Т. 90. №8. С. 285-287.13. BjartellA. Delta Sleep-Inducing Peptide: A Mammalian Regulatory Peptide. Lund. 1990.14. Friedman P., Kapplman H.,

Hau/man S. Partial purification and characterization of triptophan hydroxylase from rabbit hindbrain//J. Biol. Chem. 1972. Vol. 274. H. 4165-4173.15. MonnierM., DudlerL., GachterR. Transport of the synthetic DSIP through the blood-brain barrier in rabbit // Experiental. 1977. Vol. 33. P. 1609-1610. 16. Popov N., Rosler V., Thieman V. Eine empfindliche Methode zur Bestimmung der Monoaminoxidase - Aktivität im gewebe durch Aldehydsemikarbazonmessung // Acta Biol. Med. Germ. 1971. Bd 26. S. 239-245.17. Shiman R., Akino M., Kaufman S, Solubilization and purification of tyrosine hydroxylase from bovine adrenal medulla //J. Biol. Chem. 1971. Vol. 246. P. 1330-1341. 18. Schoenberger G, A. Characterisation, properties and multivariate functions of delta-sleep-inducing peptide (DSIP) // Eur. Neurol. 1984. Vol. 23 P. 321-345.

Статья принята к печати 19 февраля 2007 г.