Способ выявления воспалительного компонента, способствующего опухолевому росту при начальной меланоме хориоидеи
METHOD FOR DETECTING AN INFLAMMATORY COMPONENT THAT PROMOTES TUMOR GROWTH IN INITIAL CHOROIDAL MELANOMA

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и предназначено для выявления воспалительного компонента, способствующего опухолевому росту при начальной меланоме хориоидеи, основанного на определении уровня хемокинов в слезной жидкости.
Меланома хориоидеи (MX) - злокачественное новообразование с высоким метастатическим потенциалом, патогенез которой активно исследуется [Саакян С.В., Балацкая Н.В., Катаргина Л.А., Куликова И.Г., Мякошина Е.Б. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови при увеальной меланоме // Медицинская иммунология, 2019. Т. 21, №4. С. 765-772. doi: 10.15789/1563-0625-2019-4-765-772; Саакян С.В., Захарова Г.П., Мякошина Е.Б. Тучные клетки в микроокружении увеальной меланомы. Архив патологии. 2019;81(6):63-70.https://doi.org/10.17116/patol20198106163]. Возникновение и развитие опухолей регулируются молекулярными механизмами организма человека, в частности, системой медиаторов жидкостных сред, хемоаттрактных белков [Карагодин В.П., Мельниченко А.А., Орехов А.Н. Белки-хемокины: роль в канцерогенезе и воспалении. Патогенез.2015:13(4):28-33]. Воспаление является одним из компонентов существования опухоли [Colotta F, Allavena Р, Sica A, Garlanda С, Mantovani А. Cancer-related inflammation, the seventh hallmark of cancer: links to genetic instability. Carcinogenesis 2009; 30: 1073-1081].
Еще в 2000 г. D. Hanahan и Weinberg, R.A. предложили 6 основных концепций роста злокачественной опухоли (поддержание пролиферативной передачи сигналов, уклонение от влияния антиростовых факторов, сопротивление апоптозу, безграничный репликативный потенциал, индукция ангиогенеза, активация инвазивного роста и метастазирования) [D. Hanahan, & Weinberg, R.A. (2000) The Hallmarks of Cancer, Cell, Vol. 100, pp. 57-70. DOI: 10.1016/s0092-8674(00)81683-9], которые почти через 10 лет были дополнены Colotta F с соавт. седьмым симптомом - наличием воспалительного микроокружения [Colotta F, Allavena Р, Sica A, Garlanda С, Mantovani A. Cancer-related inflammation, the seventh hallmark of cancer: links to genetic instability. Carcinogenesis. 2009;30:1073-1081. doi: 10.1093/carcin/bgp127].
Роль воспаления в развитии злокачественной опухоли нельзя переоценить. Ранее предполагалось, что наличие воспалительных клеток в опухоли отражают противоопухолевую реакцию организма. Однако в последние годы появляется все больше доказательств того, что воспаление играет важную роль в начальной фазе малигнизации и влияет на прогрессирование опухоли. Воспаление может способствовать ангиогенезу, метастазированию, противоопухолевым иммунным реакциям и реакциям на химиотерапевтические агенты и лучевую терапию [I Н G Bronkhorstl and М J Jagerl Inflammation in uveal melanoma Eye (Lond). 2013 Feb; 27(2): 217-223. doi: 10.1038/eye.2012.253].
Воспаление характеризуется лейкоцитарной инфильтрацией и наличием растворимых медиаторов, таких как цитокины и хемокины [Mantovani A, Allavena Р, Sica A, Balkwill F. Cancer-related inflammation. Nature. 2008;454:436-444.] Иммунные клетки организма человека способны разрушать опухолевые клетки in vitro, однако могут быть ингибированы in vivo в микроокружении новообразования и тем самым препятствовать гибели злокачественных опухолей [Flavell RA, Sanjabi S, Wrzesinski SH, Licona-Limon P. The polarization of immune cells in the tumour environment by TGFbeta. Nat Rev Immunol. 2010;10:554-567.].
Хемокины - растворимые белки, являющиеся веществами, вызывающими миграцию лейкоцитов в очаг воспаления и обладающие гомеостатическим и провоспалительным действием [Mantovani А. Chemokines in neoplastic progression. Semin.Cancer. Biol. 2004; 14: 147-148.]. В зависимости от расположения консервативных цистеинов в белковой молекуле классифицируют четыре семейства хемокинов: СХС, СС, СХ3С и С [Bacon K., Baggiolini М., Broxmeyer Н., Horuk R., Lindley I., Mantovani A., Maysushima K., Murphy P., Nomiyama H., Oppenheim J., Rot A., Schall Т., Tsang M., Thorpe R., van Damme J., Wadhwa M., Yoshie O., Zlotnik A., Zoon K. Chemokine/chemokine receptor nomenclature. J. Interferon Cytokine Res., 2002, Vol. 22, pp. 1067-1068.].
Было доказано, что хемокины играют ключевую роль не только в воспалительном ответе [Арсентьева Н.А., Семенов А.В., Жебрун Д.А., Е.В. Васильева, Тотолян Арег А. Роль хемокинового рецептора CXCR3 и его лигандов при некоторых иммунопатологических состояниях. Медицинская иммунология, 2019; 21(4): 617-632. doi: 10.15789/1563-0625-2019-4-617-632], но и в усилении ангиогенеза, инвазивности опухолей, увеличении пролиферативного потенциала и метастазировании [Лихванцева В.Г. Нарушение продукции интерлейкина-8 у пациентов с увеальной меланомой. Медицинская иммунология. 2000;2(3):305-310; Ejaeidi А.А., Craft B.S., Puneky L.V., Lewis R.E., Cruse J.M. Hormone receptor-independent CXCL10 production is associated with the regulation of cellular factors linked to breast cancer progression and metastasis. Exp.Mol. Pathol., 2015, Vol.99, no. 1, pp. 163-172.]. Хемокины продуцируются как опухолевыми клетками, так и макрофагами, ассоциированными с опухолью [Gratchev A., Kzhyshkowska J., Utikal J., Goerdt S. Interleukin-4 and dexamethasone counterregulate extracellular matrix remodeling and phagocytosis in type-2 macrophages. Scand. J. Immunol. 2005; 61: 10-17].
Лишь немногочисленные исследования в отечественной и зарубежной литературе описывают роль хемокинов, которые регулируют миграцию клеток увеальной меланомы, способствуя опухолевому росту [Nagarkatti-Gude N, Bronkhorst IH, van Duinen SG, et al. Cytokines and chemokines in the vitreous fluid of eyes with uveal melanoma. Invest Ophthalmol Vis Sci 2012;53:6748-55]. В работе Лихванцевой В.Г. в 35,9% нарушения в клеточном звене иммунитета выявляли уже на ранних стадиях увеальной меланомы [Лихванцева В.Г. Роль цитокинов в патогенезе и прогнозе увеальной меланомы. Цитокины и воспаление. 2002; 1(4): 27-33].
Исследование Lattanzio et al. показало, что IL-8 может быть активирован микроокружением меланомы и способствовать активному ангиогенезу [Lattanzio L, Tonissi F, Torta I, et al. Role of IL-8 induced angiogenesis in uveal melanoma. Invest New Drugs 2013;31:1107-14]. Повышение уровня IP-10 коррелировало с увеличением инфильтрации Treg [Jager MJ, Ly LV, El Filali M, et al. Macrophages in uveal melanoma and in experimental ocular tumor models: friends or foes? Prog Retinal Eye Res 2011;30.T29-46.].
Хемокин MCP-1 направляет опухолеассоциированные макрофаги из циркулирующих моноцитов в ткань меланомы [Lee CS, Jun IH, Kim TI, et al. Expression of 12 cytokines in aqueous humour of uveal melanoma before and after combined Ruthenium-106 brachytherapy and transpupillary thermotherapy. Acta Ophthalmol 2012;90:e314-20]. Некоторые исследователи обнаружили значительное повышение МСР-1, что коррелировало с опухолеассоциированными макрофагами [Ly LV, Bronkhorst IH, van Beelen E, et al. Inflammatory cytokines in eyes with uveal melanoma and relation with macrophage infiltration. Invest Ophthalmol Vis Sci 2010;51:5445-51]. Кроме того, доказана роль МСР-1 в усилении ангиогенеза на модели мышей [Koga М, Kai Н, Egami К, et al. Mutant МСР-1 therapy inhibits tumor angiogenesis and growth of malignant melanoma in mice. Biochem Biophys Res Commun 2008;365:279-84].
Известен способ прогнозирования течения меланомы хориоидеи по уровню показателей в слезной жидкости: фактора некроза опухоли альфа, также являющимся активным участником воспалительных реакций организма и обладающим провоспалительным действием (RU 2146823, 20.03.2000). Данный способ принят за ближайший аналог. Однако анализ фактора некроза опухоли альфа в слезной жидкости не в полной мере показывает процесс ранней миграции воспалительных клеток в зону опухолевого роста, их адгезию и активацию.
В основе предлагаемого нами изобретения лежит идея определения уровня хемоаттрактантных белков СС (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL5/RANTES, CCL11/Eotaxin) и СХС (CXCL1/GRO-α, CXCL8/IL-8, CXCL10/IP-10, CXCL12/SDF-1α) в слезной жидкости больного и парного глаза у пациентов с начальной меланомой хориоидеи для выявления воспалительного компонента, способствующего опухолевому росту при УМ.
Задачей настоящего изобретения является выявление воспалительного компонента, способствующего опухолевому росту при начальной меланоме хориоидеи, основанного на определении уровня хемокинов в слезной жидкости.
Техническим результатом предлагаемого способа является выбор своевременной, адекватной тактики лечения начальной MX.
Технический результат достигается за счет определения в СЖ больного и парного глаза у пациентов с начальной MX уровня хемокинов СС - (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α) и СХС (CXCL12/SDF-1α) - классов.
В исследование было включено 32 пациента с начальной MX в возрасте в среднем 53,7±12,2 года.
Пациентам с меланомой проведены МРТ органов брюшной полости с контрастированием и рентгенография органов грудной полости. Метастатическая болезнь на момент обследования исключена. Всем больным выполнены общеофтальмологические методы с включением офтальмоскопии, ультразвуковых исследований и оптической когерентной томографии.
В группу контроля вошло 38 практически здоровых донора, сопоставимых по возрасту (средний возраст 55,7±12,7 лет) и полу с пациентами основных групп без признаков офтальмопатологии.
В каждой тест-пробе слезной жидкости больного и парного глаза определяли хемокины класса СС (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL5/RANTES, CCL11/Eotaxin) и СХС (CXCL1/GRO- α, CXCL8AL-8, CXCL10/IP-10, CXCL12/SDF-1α). В результате проведенного мультиплексного анализа выявлено повышение в разной степени всех указанных молекулярных белков в слезной жидкости. Отобраны значительные изменения касались трех из них, у которых хемокины оказались повышены в слезной жидкости в 4 раза и более, а именно хемокины класса СС: CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α и СХС: CXCL12/SDF-1α.
Больным с MX проводили органосохранное лечение, выбранное в зависимости от размеров опухоли (разрушающую лазерную коагуляцию, транспупиллярную термотерапию), после которого в течение первых 3 месяцев оценивали воспалительную реакцию, проявляющуюся макулярным отеком, отслойкой нейроэпителия в фовеа после лазерного лечения.
Количественное содержание хемокинов класса СС (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α) и СХС (CXCL12/SDF-1α) в слезной жидкости до лечения исследовали для выявления воспалительного компонента, способствующего опухолевому росту при начальной меланоме хориоидеи, основанного на определении уровня хемокинов в слезной жидкости до операции для разработки схемы противовоспалительной терапии.
До лечения уровень хемокинов класса СС (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α) и СХС (CXCL12/SDF-1α) в слезной жидкости оказался повышенным в 4 раза у 31 (96,9%) из 32 пациентов.
В течение первые 3 месяцев после проведенного лечения у этих пациентов отмечали макулярный отек, отслойку нейроэпителия после лазерного лечения, что потребовало дополнительного противовоспалительного лечения.
Способ осуществляют следующим образом.
В слезной жидкости обоих глаз определяют уровень хемокинов классов СС: CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α и СХС: CXCL12/SDF-1α и при их увеличении в каждом из глаз более чем в 4 раза прогнозируют неблагоприятное течение.
Определение хемоаттрактантных медиаторов проводили методом мультиплексного анализа по технологии хМАР (Luminex, CIIlA) в программе Xponent 3.1 с помощью магнитных флюоресцирующих микросфер и набора для определения концентрации хемокинов Procarta Plex (eBioscience, Австрия). Пробы хранились при температуре -70°С.
В каждой тест-пробе слезной жидкости определяли хемокины класса СС (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL5/RANTES, CCL11/Eotaxin) и СХС (CXCL1/GRO-α, CXCL8/IL-8, СХСЕ10/IP-10, CXCL12/SDF-1α). Оценку результатов проводили с учетом чувствительности теста.
В зависимости от концентрации хемокинов класса СС (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α) и СХС (CXCL12/SDF-1α) в слезной жидкости, взятой до лечения у пациентов с начальной MX, выявляли воспалительный компонент, способствующий опухолевому росту при начальной меланоме хориоидеи.
Пример 1. Пациент П., 48 лет обратился с жалобами на снижение зрения правого глаза.
Проведенные офтальмологические исследования:
Визометрия: Visus OD - 0,6 н.к.,
Visus OS - 1,0.
Тонометрия: ВГД OD - 16 мм рт.ст., OS - 16 мм рт.ст.
Биомикроскопия: OU - спокоен, среды прозрачны,
Прямая офтальмоскопия:
OD - На глазном дне - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. На средней периферии по меридианам с 7 до 9 часов определяется проминирующее образование серого цвета, с нечеткими, неровными границами, неровной поверхностью. На поверхности опухоли поля оранжевого пигмента.
OS - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В макулярной зоне - рефлекс четкий. На периферии очаговой патологии не выявлено.
Эхография:
OD - «+» - ткань с проминенцией 2,0 мм, диаметром основания 8 мм,
OS - «+» - ткань не определяется.
Определение хемоаттрактантных медиаторов проводили методом мультиплексного анализа по технологии хМАР (Luminex, США) в программе Xponent 3.1 с помощью магнитных флюорсцирующих микросфер и набора для определения концентрации хемокинов Procarta Plex (eBioscience, Австрия).
В каждой тест-пробе слезной жидкости определяли хемокины класса СС (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL5/RANTES, CCL11/Eotaxin) и СХС (CXCL1/GRO-α, CXCL8/IL-8, CXCL10/IP-10, CXCL12/SDF-1α). Оценку результатов проводили с учетом чувствительности теста.
В слезной жидкости концентрации хемокинов составили:
CCL2/MCP-1=107,7 пкг/мл - в больном и 109,01 пкг/мл - в парном глазу (норма - 36,6 пкг/мл),
CCL3/MIP-1α=17,3 пкг/мл - в больном и 16,3 пкг/мл - в парном глазу (норма - 6,2 пкг/мл),
CCL5/RANTES=33,05 пкг/мл - в больном и 38,6 пкг/мл - в парном глазу (норма - 17,8 пкг/мл),
CCL11/Eotaxin=27,4 пкг/мл - в больном и 27,5 пкг/мл- в парном глазу (норма - 12,8 пкг/мл),
CXCL1/GRO- α=315 пкг/мл - в больном и 355,7 пкг/мл- в парном глазу (норма - 152,9 пкг/мл),
CXCL8/IL-8=376,1 пкг/мл - в больном и 374,7 пкг/мл- в парном глазу (норма - 152,9 пкг/мл),
CXCL10/IP-10=728,9 пкг/мл - в больном и 771,5 пкг/мл - в парном глазу (норма - 236,6 пкг/мл),
CXCL12/SDF-1α=720,3 пкг/мл - в больном и 717,8 пкг/мл - в парном глазу (норма -240 пкг/мл).
Таким образом, отмечено увеличение хемокинов классов СС (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α) и СХС (CXCL12/SDF-1α) в СЖ больного и парного глаза менее чем в 4 раза по сравнению с его содержанием у здоровых доноров.
Такие значения показателей позволили прогнозировать ослабленное течение воспалительной реакции после лечения.
Проведена транспупиллярная термотерапия, сразу после которой в первый день назначали местную инстилляционную терапию противовоспалительными каплями.
Через 2 месяца наблюдения отмечали признаки формирования хориоретинального рубца, отсутствие макулярного отека, отслойки нейэроэпителия, сохранения зрительных функций, что подтверждало правильность назначенной терапии при минимальном уровне хемокинов классов СС (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α) и СХС (CXCL12/SDF-1α) в СЖ больного и парного глаза у больных с начальной меланомой хориоидеи.
Пример 2. Пациентка Р., 51 год обратилась с жалобами на снижение зрения левого глаза.
Проведенные офтальмологические исследования:
Визометрия: Visus OS - 0,4 н.к.,
Visus OD - 1,0.
Тонометрия: ВГД OD - 17 мм рт.ст., OS - 17 мм рт.ст.
Биомикроскопия: OU - спокоен, среды прозрачны,
Прямая офтальмоскопия:
OD - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В макулярной зоне - рефлекс четкий. На периферии очаговой патологии не выявлено.
OS - На глазном дне - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. На средней периферии по меридианам с 1 до 3 часов определяется проминирующее образование аспидного цвета, с нечеткими, неровными границами, гладкой поверхностью.
Эхография:
OD - «+» - ткань не определяется,
OS - «+» - ткань с проминенцией 1,9 мм, диаметром основания 7 мм.
Определение хемоаттрактантных медиаторов проводили методом мультиплексного анализа по технологии хМАР (Luminex, CIIIA) в программе Xponent 3.1 с помощью магнитных флюорсцирующих микросфер и набора для определения концентрации хемокинов Procarta Plex (eBioscience, Австрия). В каждой тест-пробе слезной жидкости определяли хемокины класса СС (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL5/RANTES, CCL11/Eotaxin) и СХС (CXCL1/GRO-α, CXCL8AL-8, CXCL10/IP-10, CXCL12/SDF-1α). Оценку результатов проводили с учетом чувствительности теста.
В СЖ уровень хемокинов составил:
CCL2/MCP-1=407,7 пкг/мл - в больном и 386,01 пкг/мл - в парном глазу (норма - 36,6 пкг/мл),
CCL3/MIP-1α=27,3 пкг/мл - в больном и 26,3 пкг/мл - в парном глазу (норма - 6,2 пкг/мл),
CCL5/RANTES=33,05 пкг/мл - в больном и 38,6 пкг/мл - в парном глазу (норма - 17,8 пкг/мл),
CCL1l/Eotaxin=27,4 пкг/мл - в больном и 27,5 пкг/мл- в парном глазу (норма - 12,8 пкг/мл).
CXCL1/GRO- α=315 пкг/мл - в больном и 355,7 пкг/мл- в парном глазу (норма - 152,9 пкг/мл),
CXCL8/IL-8=376,1 пкг/мл - в больном и 374,7 пкг/мл - в парном глазу (норма - 152,9 пкг/мл),
CXCL10/IP-10=728,9 пкг/мл- в больном и 771,5 пкг/мл - в парном глазу (норма -236,6 пкг/мл),
CXCL12/SDF-1α=1192,3 пкг/мл - в больном и 1199,8 пкг/мл - в парном глазу (норма - 240 пкг/мл).
Таким образом, концентрации в СЖ больного и парного глаза хемокинов классов СС (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α) и СХС (CXCL12/SDF-1α) были более чем в 4 раза выше по сравнению со здоровыми донорами.
Полученные результаты позволили прогнозировать активацию воспалительной реакции, способствующей опухолевому росту при начальной MX.
Проведена транспупиллярная термотерапия, сразу после которой в первый день назначали местную инсталляционную терапию противовоспалительными каплями.
Через 2 месяца наблюдения отмечали признаки формирования хориоретинального рубца, наличие макулярного отека, отслойки нейэроэпителия, снижения зрения, что потребовало проведения ретробульбарных, внутримышечных инъекций противовоспалительных препаратов.
Пример 3. Пациентка Р., 45 год обратилась с жалобами на снижение зрения левого глаза.
Проведенные офтальмологические исследования:
Визометрия: Visus OS - 0,6 н.к.,
Visus OD - 1,0.
Тонометрия: ВГД OD - 17 мм рт.ст., OS - 17 мм рт.ст.
Биомикроскопия: OU - спокоен, среды прозрачны, Прямая офтальмоскопия:
OD - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В макулярной зоне - рефлекс четкий. На периферии очаговой патологии не выявлено.
OS - На глазном дне - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. На средней периферии по меридианам с 3 до 5 часов определяется проминирующее образование аспидного цвета, с нечеткими, неровными границами, гладкой поверхностью.
Эхография:
OD - «+» - ткань не определяется,
OS - «+» - ткань с проминенцией 2,1 мм, диаметром основания 9 мм.
Определение хемоаттрактантных медиаторов проводили методом мультиплексного анализа по технологии хМАР (Luminex, CIIIA) в программе Xponent 3.1 с помощью магнитных флюорсцирующих микросфер и набора для определения концентрации хемокинов Procarta Plex (eBioscience, Австрия). В каждой тест-пробе слезной жидкости определяли хемокины класса СС (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL5/RANTES, CCL11/Eotaxin) и СХС (CXCL1/GRO-α, CXCL8AL-8, CXCL10/IP-10, CXCL12/SDF-1α). Оценку результатов проводили с учетом чувствительности теста.
В СЖ концентрации хемокинов составили:
CCL2/MCP-1=408,9 пкг/мл - в больном и 3962,01 пкг/мл - в парном глазу (норма - 36,6 пкг/мл),
CCL3/MIP-1α=28,4 пкг/мл - в больном и 27,2 пкг/мл - в парном глазу (норма - 6,2 пкг/мл),
CCL5/RANTES=32,05 пкг/мл - в больном и 37,8 пкг/мл - в парном глазу (норма - 17,8 пкг/мл),
CCL11/Eotaxin=28,1 пкг/мл - в больном и 29,6 пкг/мл- в парном глазу (норма - 12,8 пкг/мл),
CXCL1/GRO- α=317 пкг/мл - в больном и 356,8 пкг/мл- в парном глазу (норма - 152,9 пкг/мл),
CXCL8/IL-8=379,1 пкг/мл - в больном и 378,7 пкг/мл - в парном глазу (норма - 152,9 пкг/мл),
CXCL10/IP-10=730,9 пкг/мл- в больном и 774,5 пкг/мл - в парном глазу (норма - 236,6 пкг/мл),
CXCL12/SDF-1α=l 196,3 пкг/мл - в больном и 1200,8 пкг/мл - в парном глазу (норма - 240 пкг/мл).
Таким образом, содержание хемокинов классов СС (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α) и СХС (CXCL12/SDF-1α) в СЖ больного и парного глаза было более чем в 4 раза выше по сравнению со здоровыми донорами, что предполагало активацию воспалительной реакции, способствующей опухолевому росту при начальной MX.
Проведена транспупиллярная термотерапия, сразу после которой в первый день назначали местную инсталляционную терапию противовоспалительными каплями в сочетании с ретробульбарными, внутримышечными инъекциями противовоспалительных препаратов.
Через 2 месяца наблюдения отмечали признаки формирования хориоретинального рубца, отсутствие макулярного отека, отслойки нейэроэпителия, сохранение зрения.
Таким образом, определение уровня хемокинов классов СС (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α) и СХС (CXCL12/SDF-1α) в СЖ больного и парного глаза дает возможность адекватно назначать противовоспалительную терапию у пациентов с начальной MX.