Изучение активности ферментных систем плесневых грибов

УДК 637.353:579

Т.Н. Садовая

ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМ ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ

В статье приведены результаты исследования активности ферментных систем плесневых грибов. Приведены данные о ферментных системах исследуемых видов плесневых грибов. Представлены значения активности ферментных систем в мицелии плесневых грибов рода Pénicillium. Установлена активность окислительных ферментов в мицелии плесневых грибов в оптимальных условиях. Представлены данные об изменении протео-литической активности ферментных систем плесневых грибов в зависимости от относительной влажности воздуха. Изучено влияние активной кислотности среды на стабильность протеолитической активности плесневых грибов рода Penicillium. Показана зависимость протеолитической активности ферментных систем плесневых грибов от температуры.

Сыр, белая и голубая плесень, ферментные системы плесневых грибов.

Введение

С развитием знаний в области механизма формирования органолептических и физико-химических свойств сыров все более очевидной становится роль протеолитических, липолитических и других окислительно-восстановительных процессов, осуществляемых ферментными системами микроорганизмов, которые участвуют в формировании их качественных показателей и биологической ценности как пищевых продуктов.

Как считают ученые, управление процессами созревания сыров наряду со знанием физиологобиохимических свойств микроорганизмов во многом построено на активности входящих в состав микрофлоры заквасок. При этом знание свойств, специфичности и активности используемых ферментных препаратов, а также нативных ферментных систем молока наряду с оценкой их роли в формировании специфического вкусового букета позволяет достигнуть требуемых показателей качества [1, 2].

Протеолитические и липолитические процессы наряду с гидролизом лактозы относятся к ряду ключевых биохимических реакций в созревающем сыре. Липазы, входящие в состав молокосвертывающих ферментных препаратов, также принимают активное участие в созревании сыра. Активизация липолити-ческих и протеолитических процессов в сырах способствует интенсификации их созревания [3].

Протеолиз и липолиз в сырах были предметом активных исследований в последние десятилетия, а благодаря совершенствованию аналитических методов, используемых для мониторинга указанных процессов и моделей, во многих видах сыров в настоящее время эти процессы достаточно подробно исследованы [1-3]. Тем не менее, как показывают результаты работ отечественных и зарубежных исследователей, большинство бактерий, используемых в сыроделии, обладают комплексом протеолитиче-ской и липолитической активности, а применительно к сырам, созревающим с использованием плесневых грибов, результаты этих исследовании пока широко не представлены. В связи с этим дальнейшие исследования посвящены изучению ферментных систем плесневых грибов рода Penicillium.

Материалы и методы

Определение общего азота проводили с помощью анализатора белка RAPID N ELEMENTAR в соответствии с европейскими стандартами. Принцип метода заключается в определении азота за счет сжигания анализируемого вещества известной массы в условиях высокой температуры (около 900 °C) камеры в присутствии кислорода, что приводит к высвобождению углекислого газа, воды и азота, массовая доля которого детектируется прибором.

Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при А280. Удельную активность определяли спектрофотометрически при 290 нм на спектрофотометре DU 800 (Beckman Coulter).

Результаты и их обсуждение

В табл. 1 приведены данные о ферментных системах исследуемых видов плесневых грибов. Судя по представленным данным, можно предположить, что плесневые грибы рода Pénicillium оказывают глубокое воздействие на белки, которые трансформируются в пептиды с высокой и низкой молекулярной массой, а также аминокислоты. Внеклеточная протеолитическая система Penicillium состоит из двух пептидаз: одной кислой протеиназы - аспар-татпротеиназы (оптимальный уровень рН 3,5-4,0; но сохраняет активность в диапазоне рН 3,5-6,0) и одной металлопротеазы (оптимальный уровень рН 5,5-6,0). Синтезируемые плесневыми грибами внеклеточные пептидазы осуществляют глубокое расщепление а- и ß-казеинов. Кислая протеиназа атакует главным образом три следующие связи: Lus29-Ile30; Lus97-Val96; Lus99-Glui00, выделяя пептиды Ile30-Val29; Val98-Val209; Glu100-Val209, которые в больших количествах обнаруживаются в зрелых сырах. Ме-таллопротеаза также расщепляет ß-казеин, в частности, наблюдалось расщепление связей Lus28-Lus29; Pr090-Glu9i; Glui00-Aki0i.

В сырах доминирует активность кислой протеи-назы Penicillium. Количество пептидов, образуемых кислой протеазой, увеличивается, несмотря на то, что величина показателя рН мало способствует его активности. В асептическом сгустке, не содержащем микрофлоры, кислая протеиназа Penicillium вызывает большое увеличение содержания растворимого

ISSN2074-9414. Техника и технология пищевых производств. 2011. № 1 при рН 4,6 азота и небольшое - свободных амино- кислот.

Таблица 1

Ферментные системы плесневых грибов PemciПium

№ п/п Название Оптимум действия Объект действия фермента Продукты гидролиза

Внеклеточные протеазы

1 Кислая протеаза рН 3,5-4,0; сохраняет активность при рН 3,5-6,0 оці, р-казеин, связи: Lus29- 11езо; Lus97-V аІ96; L11S99-Glu00 Пептиды: С1иі00^а1209; Val98-Val209; О'Ь-ііоо- ^Ьо9

2 Металлопротеаза рН 5,5-6,0 Р-казеин, связи: Lus28-Lys29; рг°90-О1и9і; 0-1иіоо-А1аіоі -

Внутриклеточные пептидазы

3 Кислая карбоксипеп-тидаза рН 3,5-4,0 Пептиды Низкомолекулярные пептиды, аминокислоты, амины, аммиак

4 Щелочная аминопеп-тидаза рН 7,5-8,0, по другим сведениям рН 5,5-6,5 Пептиды Низкомолекулярные пептиды, аминокислоты

5 Щелочная карбокси-пептидаза Присутствует не во всех штаммах

Внеклеточные липазы

6 Кислая липаза рН 6,0-6,5 Трикапроин Свободные жирные кислоты, в большей степени капроновая

7 Щелочная липаза рН 7,5-8,0 Трибутирин Свободные жирные кислоты, в большей степени масляная

Внутриклеточные пептидазы пенициллов исследованы недостаточно. Как полагают, в зависимости от штамма PemciПium может синтезировать кислую и щелочную карбоксипептидазу, щелочные амино-пептидазы. Внутриклеточные пептидазы, выделяемые этими плесневыми грибами, осуществляют глубокое расщепление присутствующих пептидов и лежат в основе образования значительных количеств аминокислот, аминов и аммиака, обнаруживаемых в сырах с плесенью.

Внутриклеточные пептидазы, обнаруживаемые во всех штаммах PemciПium, представлены одной

карбоксипептидазой (оптимальный рН 3,5-4,0) и аминопептидазой (оптимальный рН 7,5-8,0). Таким образом, протеолитические системы PemciПium отличаются большим разнообразием в отношении синтезируемых ферментов и играют определяющую роль в протеолизе, который обеспечивает образование важных слагаемых аромата сыров с плесенью.

В табл. 2 представлены значения активности ферментных систем в мицелии плесневых грибов рода Pe-mciПium.

Таблица 2

Активность протеолитических и липолитических ферментов в мицелии плесневых грибов рода PemciUшm

Фермент Активность ферментных систем, мкМ (субстрата) / / мг (белка) • ч

P. roqueforti P. camemberti P. caseicolum

Кислая протеаза і,345±0,08і і,045±0,063 і,і89±0,07і

Металлопротеаза і, і54±0,008 і,030±0,0,62 і,і20±0,067

Кислая карбоксипептидаза і,39і±0,069 і,і29±0,068 і,і50±0,079

Щелочная аминопептидаза і,489±0,089 і,042±0,0і3 і,і46±0,069

Кислая липаза і, і40±0,069 і,008±0,063 і,059±0,064

¡Щелочная липаза | 1,696±0,101 | 1,262±0,079 | 1,432±0,089

Данные, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что наибольшее значение активности ферментных систем у рассматриваемых плесневых грибов наблюдается у P. roqueforti и составляет максимальное значение 1,696 мкМ(субстрата)/

/ мг(белка)  ч

для щелочной липазы, минимальное значение 1,140 мкМ (субстрата)/ для кислой липазы.

/ мг(белка)  ч

Наименьшие показатели характерны для P. camem-berti, при этом значение активности кислой протеи-назы меньше в 1,29 раза, для металлопротеазы - в 1,19 раза, для кислой карбоксипептидазы -

в 1,23 раза, для щелочной протеиназы - 1,43 раза, для кислой липазы - в 1,13 раза и для щелочной липазы - в 1,34 раза. Полученные данные могут быть использованы при разработке технологии получения сыров, созревающих при использовании плесневых грибов, поскольку это позволяет регулировать процессы протеолиза и липолиза в сырах, вырабатываемых по соответствующей технологии.

В табл. 3 показана активность окислительных ферментов в мицелии плесневых грибов в оптимальных условиях.

Таблица 3

Активность окислительных ферментов в мицелии плесневых грибов

Фермент Активность окислительных ферментов, мкМ (субстрата)/ / мг(белка)  ч

P. roqueforti P. camemberti P. caseicolum

Лактатдегидрогеназа 0,257±0,014 0,199±0,010 0,236±0,013

Малатдегидрогеназа 0,154±0,008 0,131±0,011 0,145±0,008

Сукцинатдегидрогеназа 0,191±0,010 0,159±0,008 0,180±0,009

Г лутаматдегидрогеназа 0,256±0,013 0,145±0,013 0,245±0,012

Г люкозо-6-фосфатдегидрогеназа 0,148±0,007 0,097±0,006 0,129±0,006

Г люкозооксидаза 0,173±0,009 0,112±0,007 0,154±0,009

Аскорбатоксидаза 0,097±0,005 0,045±0,003 0,067±0,003

Сопоставляя приведенные в табл. 3 данные и результаты исследований, опубликованных в литературных источниках, можно констатировать, что активность окислительных ферментов у плесневых грибов достаточно высока. Тем не менее обнаружены весьма существенные различия показателей активности в зависимости от конкретного изучаемого объекта, а также более высокие значения исследуемого параметра, характерного для P. roqueforti, при минимальных показателях у P. camemberti.

Так, если сравнивать максимальные и минимальные значения активности, то установлено, что для лактатдегидрогеназы различия между максимальными (^ roqueforti) и минимальными значениями (^ camemberti) составили 1,3 раза; для ма-латдегидрогеназы - 1,2 раза; сукцинатдегидрогена-зы - 1,2 раза; глутаматдегидрогеназы - 1,8 раза; глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы - 1,5 раза; глюко-зооксидазы и аскорбатоксидазы - 1,6 и 2,2 раза соответственно.

Эти данные не только объясняют высокую про-теолитическую и липолитическую активность исследуемых микроорганизмов, но и позволяют обосновать параметры технологического процесса производства сыров, созревающих с использованием плесневых грибов рода PemciПium.

Известно, что при ферментации казеина плесневыми грибами образуется разнообразный набор продуктов протеолиза. В теоретическом плане данная проблема изучена еще недостаточно. Тем не менее большинство исследователей склонны считать, что при оценке протеолитических свойств плесневых грибов следует проводить исследования на системе модельного сыра при соответствующем контроле.

Однако в связи с определенными сложностями, связанными с проведением таких экспериментов, большинство исследований проводится на обезжиренном молоке в качестве субстрата.

Развитие плесневых грибов при выработке сыра происходит в присутствии сычужного фермента, используемого для коагуляции молока и получения сырного зерна. Сычужный фермент наряду со специфичной реакцией отщепления гликомакропептида от к-казеина на участке Фал105-Мет106 при свертывании молока в процессе созревания сыра гидролизует (а81- и р-казеины). В результате действия сычужного фермента на казеин образуются в основном (около 50 %) полипептиды с молекулярной массой менее 16 000 Дальтон и немного (около 5 %) пептидов с молекулярной массой менее 3000 Дальтон. Эта реакция неспецифичного протеолиза, по мнению многих исследователей, важна в сыре с плесневыми грибами с точки зрения получения необходимой консистенции и вкуса, а также с точки зрения подготовки субстрата для действия протеолитических ферментов плесневых грибов рода PemciПium.

В сыроделии давно бытуют понятия «глубина» и «ширина» протеолиза. Под «глубиной» понимается степень гидролиза белка до свободных аминокислот, а под «шириной» - общие масштабы протеоли-тических процессов. И «глубина» и «ширина» про-теолиза оказывают существенное влияние на органолептические показатели зрелых сыров. Эти факты свидетельствуют о необходимости оценки протео-литической активности культур плесневых грибов по нескольким показателям.

В табл. 4 представлены данные об изменении протеолитической активности ферментных систем

плесневых грибов в зависимости от относительной измеряли при активной кислотности, равной 7,5, и

влажности воздуха. Протеолитическую активность температуре 30±1 °С.

Таблица 4

Зависимость протеолитической активности ферментных систем плесневых грибов от относительной влажности воздуха

Культура плесневых грибов Протеолитическая активность, усл-е, при относительной влажности воздуха, %

60±5 70±5 80±5 90±5 95±5

Г. roqueforti 67 400±3375 70 100±3510 73 400±3690 77 500±4650 75 700±4555

Г. camemberti 37 500±1880 41 200±2075 45 200±2712 48 400±2904 45 200±2712

?. caseicolum 57 400±2870 61 400±3095 65 100±3910 67 800±4068 65 300±3918

Данные, представленные в табл. 4, свидетельствуют о том, что наибольшая протеолитическая активность у всех рассматриваемых плесневых грибов рода PemciПium наблюдается при относительной влажности воздуха 90±5 %. При этом для плесеней вида P. roqueforti это значение составляет

77 500 усл.ед/, для P. camemberti - 48 400, для P.

/г

caseicolum - 67 800. Наименьшая протеолитическая активность у всех рассматриваемых плесневых грибов рода PemciПium наблюдается при относитель-

ной влажности воздуха 60±5 %. Данный факт, очевидно, связан с деятельностью самого микроорганизма в условиях различной влажности, а именно обводненностью и доступностью субстратов, проницаемостью клеточных оболочек и рядом других факторов.

В дальнейших исследованиях изучали влияние активной кислотности среды на стабильность протеолитической активности плесневых грибов рода PemciПium (табл. 5).

Таблица 5

Зависимость протеолитической активности ферментных систем плесневых грибов от активной кислотности среды

Культура плесневых грибов Протеолитическая активность, усл.ед/, при активной кислотности среды / г

3,00±0,05 4,50±0,05 6,00±0,05 7,50±0,05

P. roqueforti 78 700±4722 76 900±4615 76 200±4585 77 500±4650

P. camemberti 48 600±2924 50 300±3025 46 700±2812 48 400±2904

P. caseicolum 65 300±3920 68 000±4090 67 500±4050 67 800±4068

Анализ данных, представленных в табл. 5, показал, что наибольшая протеолитическая активность для P. roqueforti наблюдается при активной кислотности, равной 3,00, для P. сamemberti - 4,50 и для P. сaseicolum - 4,50 и составляет 78 700; 50 300 и 68 000 усл.ед/ соответственно. Наименьшая протео-

/г

литическая активность для P. roqueforti, P. сamem-berti, P. сaseicolum наблюдается при активной кислотности 7,50 и составляет 75 700; 45 200 и 65 300 усл.ед/

соответственно. Следует отметить достаточно высокую активность плесневых грибов во всем диапазоне исследуемых значений активной кислотности.

В табл. 6 показана зависимость протеолитической активности ферментных систем плесневых грибов от температуры. Температурный фактор варьировали в пределах рабочих температур для указанных видов микроорганизмов, учитывая, однако, температурные параметры выработки сыров указанной группы.

Таблица 6

Зависимость протеолитической активности ферментных систем плесневых грибов от температуры

Культура плесневых грибов Протеолитическая активность, усл.ед /, при температуре, 0С /г

10,0±0,20 20,0±0,20 30,0±0,20 40,0±0,20 50,0±0,20

P. roqueforti 52 300±3145 65 400±3930 78 900±4738 82 300±4938 78 700±4730

P. camemberti 47 800±2875 51 300±3080 45 600±2740 38 300±2305 32 400±1944

P. caseicolum 44 300±2580 58 500±3510 67 400±4045 55 600±3345 48 900±2935

Данные, представленные в табл. 6, свидетельст-

вуют о том, что наибольшая протеолитическая ак-

тивность плесневых грибов вида P. roqueforti наблюдается при температуре 40,0 oC. Для плесневых грибов P. caseicolum максимальная протеолитическая активность плесневых грибов отмечается при температуре i0,0 °С и составляет 51 300 усл.ед/.

/ г

Дальнейшее увеличение температуры сопровождается снижением протеолитической активности плесневых грибов данного вида. Как показали проведенные эксперименты, P. camemberti по сравнению с другими пенициллами обладает максимальной протеолитической активностью при температуре 30 °С и составляет б7 400 усл.ед/.

/ г

Для более детальной оценки роли протеолитиче-ских процессов в формировании пептидного профиля сыров, созревающих при участии плесневых грибов, нами проведена дополнительная серия экспериментов, связанная с установлением качественного и количественного состава веществ, образующихся при ферментации.

Сопоставляя результаты исследований, представленных в табл. 4, 5 и б, можно обнаружить корреляцию между установленными значениями проте-олитической активности ферментных систем и значениями технологических факторов.

Известно, что ферментативные реакции являются основой протекания процессов, лежащих в основе формирования органолептических характеристик сы-

тивных реакций наибольшее значение по праву играют протеолитические и липолитические процессы.

Таким образом, результаты исследований активности ферментных систем плесневых грибов Penicil-lium позволили установить значения наиболее важных ферментных систем, участвующих в созревании сыров. Изучены особенности протекания ферментных реакций в мицелии грибов PemciПium в зависимости от температуры, активной кислотности и относительной влажности воздуха при различных условиях культивирования. Установлены значения активности кислых и щелочных протеаз и липаз, окислительных ферментов (лактатдегидрогеназы, малат-дегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы, глутамат-дегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогена-зы, глюкозооксидазы, аскорбатоксидазы).

Показана возможность регулирования активности ферментных систем плесневых грибов в условиях варьирования технологических факторов (температуры, активной кислотности и влажности среды). Оптимум рН для P. roqueforti, P. camemberti, P. ca-seicolum составляет: 3,0; 4,5; 4,5; оптимум температуры - 8, 10, 12 0С; оптимум относительной влажности воздуха - 95, 90, 90 % соответственно.

Установлена более высокая активность ферментных систем P. roqueforti по сравнению с другими исследуемыми видами PemciПium. Показана предпочтительная возможность атаки на белковых молекулах-субстратах по месту отдельных связей.

ров. Из большого числа локальных актов фермента-

Список литературы

1. Горбатова, К.К. Биохимия молока и молочных продуктов / К.К. Горбатова. - М.: Легкая и пищевая промышленность, і984. - 344 с.

2. Диланян, З.Х. Сыроделие / З.Х. Диланян. - М.: Легкая и пищевая промышленность, і984. - 280 с.

3. Крусь, Г.Н. Технология молока и молочных продуктов / Г.Н. Крусь, А.Г. Храмцова, З.В. Волокитина, С.В. Карны-чев; под ред. А.М. Шалыгиной. - М.: КолосС, 2004. - 455 с.

ЗАО фирма «Калория», 353720, Россия, Краснодарский край, Каневский район, ст. Стародеревянковская, ул. Украинская, 100.

Тел./факс: (861-64) 7-15-31 e-mail: sales@kalorya.ru

SUMMARY T.N. Sadovaya Айіуйу of mold fungi ferment systems

The results of researches on the activity of mold fungi ferment systems are considered. Presented are the data on ferment systems of investigated kinds of mold fungi. The activity values of ferment systems in the myceliums of mold fungi of the genus of Penicillium are presented. The activity of oxidizing enzymes in the mycelium of mold fungi in optimum conditions has been established. The data on the change of proteolytic activity of mold fungi ferment systems depending on relative humidity are presented. The influence of the medium active acidity on the proteolytic activity stability of mold fungi of the genus of Penicillium has been studied. The dependence of proteolytic activity of mold fungi ferment systems from temperature has been shown.

Cheese, white and blue mold, ferment systems of mold fungi.

«Kaloriya» Firm 100 Ukrainskaya Str., st. Starodereviankovskaya, Kanevskoy district, Krasnodar Region, Russia, 353720 Phone/Fax: 7 (8б1б4) 7-15-31

е-таП: sales@kalorya.ru

_ _