СМЕННЫЙ МИКРОФЛЮИДНЫЙ МОДУЛЬ ДЛЯ АВТОМАТИЗИРОВАННОГО ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ И СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
REPLACEABLE MICROFLUID MODULE FOR AUTOMATED RECOVERY AND PURIFICATION OF NUCLEIC ACIDS FROM BIOLOGICAL SAMPLES AND METHOD FOR RECOVERY AND PURIFICATION NUCLEIC ACIDS WITH USING THEREOF

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к молекулярной биологии, микробиологии и медицине и касается сменного микрофлюидного модуля для выделения и очистки нуклеиновых кислот (НК) из биологических образцов, в котором в автоматическом режиме осуществляются все стадии выделения и очистки нуклеиновых кислот, и способа выделения и очистки НК из клеток микроорганизмов и/или вирусных частиц с использованием микрофлюидного модуля.
Уровень техники
Анализ НК необходим как для проведения широкого круга исследований в разных областях науки, так и для использования в клинической диагностике, фармакологии, медицине, биотехнологии, охране окружающей среды и др. Выделение НК (ДНК и/или РНК), как правило, является первой стадией ряда молекулярно-генетических исследований, включающих также амплификацию НК (ПЦР и другие методы), клонирование и секвенирование фрагментов генома, конструирование кДНК-библиотек и т.д. В связи с этим получение препаратов НК высокой степени очистки остается актуальной задачей. Для выделения НК используют как биологический материал (животные и растительные клетки, ткани, физиологические жидкости (кровь, слюна и др.)), так и образцы почвы, воды, пищевых продуктов. Современные требования к лабораторным методам выделения НК включают универсальность протокола для получения очищенной ДНК и РНК из различных биологических образцов, быстроту, эффективность и безопасность выполнения процедуры для персонала. Возрастают требования к чистоте получаемых препаратов и воспроизводимости процедуры.
Для концентрирования клеток микроорганизмов из биологических образцов используются следующие методики: фильтрация образца (Icuta, К., Maruo, S., Fujisawa, Т., Yamada, A. Micro Concentrator with OptoSense Micro Reactor for Biochemical IC Chip Family - 3D Composite Structure and Experimental Verification Proc. of 12th IEEE International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS'99), Orlando, 1999: p.376-381), электрокинетическая фокусировка (C.R.Cabrera, P.Yager, Continuous concentration of bacteria in a microfluidic flow cell using electrokinetic techniques. Electrophoresis, 2001, v.22, p.355-362), микродиализ (F.Xiang, Y. Lin, J.Wen, D.W.Matson, R.D.Smith. An integrated microfabricated device for dual microdialysis and on-line ESI-ion trap mass spectrometry for analysis of complex biological samples. Anal Chem., 1999, v.71, p.1485-1490), аффинная хроматография с целью концентрирования клеток и последующей твердофазной экстракции НК (С.Yu, M.H.Davey, F.Svec, J.M.Frechet, Monolithic porous polymer for on-chip solid-phase extraction and preconcentration prepared by photoinitiated in situ polymerization within a microfluidic device. Anal Chem., 2001, v.73, p.5088-5096).
Наиболее предпочтительной является процедура фильтрации клеток через специализированную мембрану благодаря простоте, экспрессности и возможности реализации в миниатюрном устройстве. Более того, сконцентрированные клетки могут быть подвергнуты лизису непосредственно на мембране после фильтрации.
В качестве мембран для фильтрации могут быть использованы фильтры из боросиликатного стекла, целлюлозные мембраны, PTFE фильтры, мембраны из поливинилидендифторида. Однако ряд материалов является непригодным для использования в качестве фильтрующих материалов:
- фильтры из боросиликатного стекловолокна могут содержать остаточное количество воды (растворов) после окончания фильтрации, а также обладают сильным ингибирующим эффектом в отношении ПЦР;
- целлюлозные мембраны являются хрупкими и также ингибируют ПЦР;
- PTFE фильтры, в силу гидрофобных свойств, являются неприменимыми для фильтрации водных растворов.
Наиболее предпочтительными являются фильтры на основе поливинилидендифторида (PVDF фильтры). Благодаря своей гидрофильной структуре, химической инертности, механической прочности, легкости в обработке и отсутствием ингибирующего эффекта на ПЦР данный тип фильтров может быть использован для осуществления механического концентрирования и химического лизиса клеток в формате миниатюрного закрытого устройства (микрофлюидного модуля).
Основным недостатком известных методик лизиса клеток и вирусных частиц является то, что в процессе выполнения процедуры наряду с целевыми нуклеиновыми кислотами экстрагируется множество субстанций, способных к ингибированию ПЦР.
Среди основных методик физического разрушения клеток, таких как метод замораживания-оттаивания (C.R.Kuske, K.L.Banton, D.L.Adorada, P.C.Stark, K.K.Hill, P.J.Jackson, Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Appl Environ Microbiol, 1998, v.64, p.2463-2472), метод суспендированной гомогенизации (W.Liesack, E.Stackebrandt, Occurrence of novel groups of the domain Bacteria as revealed by analysis of genetic material isolated from an Australian terrestrial environment. J Bacteriol., 1992, v.174, p.5072-5078), метод облучения ультразвуком (Т.С.Marentis, В.Kusler, G.G.Yaralioglu, S.Liu, E.O.Haeggstrom, B.T.Khuri-Yakub. Microfluidic sonicator for real-time disruption of eukaryotic cells and bacterial spores for DNA analysis. Ultrasound Med Biol., 2005, v.31, p.1265-1277), метод растирания в жидком азоте (R.A.Hurt, X.Qiu, L.Wu, Y.Roh, A.V.Palumbo, J.M.Tiedje, J.Zhou, Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. Appl Environ Microbiol., 2001, v.67, p.4495-4503), наиболее используемыми являются методы замораживания-оттаивания и суспендированной гомогенизации. Однако такие подходы ограниченно реализуемы в миниатюрных микрофлюидных системах.
Химические методы лизиса используют различные солюбилизирующие и дестабилизирующие агенты, такие как поверхностно-активные вещества, например SDS (J.B.Herrick, D.N.Miller, E.L.Madsen, W.C.Ghiorse, Extraction, purification, and amplification of microbial DNA from sediments and soils. In: J.F.Burke (ed.), PCR: essential techniques. John Wiley & Sons, N.Y., 1996, p.130-133), Triton X-100, саркозил и др. (W.E.Holben, Isolation and purification of bacterial community DNA from environmental samples. In: C.J.Hurst, G.R.Knudsen, M.J.McInerney, L.D.Stetzenbach, M.V.Walter (ed.), Manual of methods in environmental microbiology. American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1997, p.431-436), хаотропные агенты типа гуанидинтиоцианата (гидрохлорида) и перхлората натрия. Помимо этого химический лизис включает стадию высокотемпературной инкубации (60°С и более).
Ряд лизирующих процедур также основывается на использовании ферментов для разрушения клеточных стенок и мембран, таких как лизоцим, субтилизин, протеиназа К (Р.А.Rochelle, J.C.Fry, R.J.Parkes, A.J.Weightman, DNA extraction for 16S rRNA gene analysis to determine genetic diversity in deep sediment communities. FEMS Microbiol. Lett, 1992, v.100. p.59-66).
2
Для выделения НК разработан целый ряд методов экстракции и очистки (см., например, J.Sambrook, D.W.Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, N.Y., v. 1, ch. 1, 2, 6, 7; Short protocols in molecular biology, Wiley, 1995). Широко известные методы выделения плазмидной и геномной ДНК включают разрушение (лизис) клеток различными методами и последующую экстракцию НК фенолом, смесью фенола с хлороформом, осаждение НК этанолом. Используют также центрифугирование в градиенте CsCl. Для очистки НК применяют хроматографические методы. Для выделения мРНК из клеток и тканей используют экстракцию образца смесью фенол - гуанидинтиоцианат - хлороформ. Недостатками таких методов являются длительность выделения НК (не менее 3,5 ч), многостадийность процесса, необходимость применения органических растворителей, а также малый выход продукта (не более 50%, для РНК - около 7%).
Для экстракции НК из лизатов клеток микроорганизмов и/или вирусных частиц применяют гель-фильтрацию на смолах типа Sepharose/Sephadex и твердофазную экстракцию НК на кремниевых сорбентах. Твердофазная экстракция НК является предпочтительным методом, так как, помимо простоты и скорости выполнения методики, данный принцип выделения нуклеиновых кислот легко адаптируется в формат микрофлюидной системы.
В настоящее время для экстракции НК используют следующие типы сорбентов:
- силикагели;
- стекловолокнистые фильтры;
- химически модифицированное стекло.
Известен способ выделения ДНК из клинических образцов с использованием силикатного сорбента (Short protocols in molecular biology, Wiley, 1995), а также мелкодисперсного (стандартизованного по размеру) стекла (М.Beld, С.Sol, J.Goudsmit, R. Boom, Fractionation of nucleic acids into single-stranded and double-stranded forms. Nucl. Acids Res., 1996, v.24. p.2618-2619). Способ заключается в адсорбции ДНК на силикатном сорбенте в присутствии гуанидинтиоцианата с последующей промывкой и элюцией. Силикатный сорбент обладает низкой емкостью (на 1 мг мелкодисперсного стекла: адсорбируется 0,5 мкг ДНК). Данный способ позволяет выделять ДНК длиной более 40000 п.н., при этом удается элюировать с силикатного сорбента не более 50% ДНК в связи с тем, что от 50 до 60% адсорбированной ДНК необратимо связывается с мелкодисперсным стеклом. Таким образом, выход ДНК длиной не менее 40000 п.н. составляет от 40 до 50%.
Описаны методы твердофазной очистки ДНК, которые могут быть осуществлены на специализированном микрочипе или реализованы в микрожидкостном формате (Nucleic acid purification using silica gel and glass particles, патент США 5808041. Методы основаны на сорбции ДНК на частицах кварца или в системе золь-гель в присутствии хаотропных солей, с последующим удалением примесей при промывке водно-спиртовой смесью и элюированием ДНК буферным раствором, в котором можно проводить ПЦР (К.А.Wolfe, М.С.Breadmore, J.P.Ferrance, M.E.Power, J.F.Conroy, P.M.Norris, J.P.Landers, Toward a microchip-based solid-phase extraction method for isolation of nucleic acids. Electrophoresis, 2002, v.23, p.727-733). Сорбенты на основе микрочастиц кремния (сорбция в присутствии хаотропных агентов) используются также для выделения РНК из биологических образцов, содержащих ДНК и РНК (Process and kit for isolating and purifying RNA from biological sources, патент США 5155018). Известен способ выделения и очистки РНК, включающий адсорбцию на аэросиле в среде хаотропного агента, отделение сорбента и связанной с ним НК, элюцию НК с аэросила и очистку целевого продукта. (О.Г.Грибанов, А.В.Щербаков, Н.А.Перевозчикова, В.В.Дрыгин, А.А.Гусев. Простой метод выделения и очистки РНК. Биоорг.химия, 1997, т.23, с.763-765). Недостатками данных способов являются длительность, трудоемкость и недостаточно высокий выход целевого продукта (НК) (не более 50%).
Для выделения и очистки НК описано также применение гель-фильтрации (Method for separating long-chain nucleic acids, патент США 5057426) и ионообменных матриц (рН dependent ion exchange matrix and method of use in the isolation of nucleic acids, патент США 6310199; Method and system for RNA analysis by matched ion polynucleotide chromatography, патент США 6475388).
Описаны способы выделения НК с использованием металлических магнитных частиц, таких как частицы железа, цинка и др., содержащие носители, которые способны специфически сорбировать НК. Магнитные частицы с адсорбированной НК осаждаются под действием магнитного поля. Увеличение сорбционной емкости частиц достигается путем модификации их поверхности (Magnetic particles for purifying nucleic acids, патент США 6919444; Particles having a magnetic core and outer glass layer for separating biological material, патент США 6255477).
Компанией Qiagene запатентован метод последовательного выделения ДНК и РНК из одного и того же образца (Method for sequentially isolating DNA and RNA from the same nucleic acid-containing sample, WO 2004/108925), включающий добавление к образцу хаотропного агента, осаждение НК спиртом, взаимодействие с функциональной НК-связывающей поверхностью и последовательную элюцию ДНК и РНК. Метод основан на различии в кинетике связывания и элюции ДНК и РНК. Связывающей поверхностью могут являться, например, стеклянные шарики или магнитные частицы.
Все вышеописанные способы представляют собой последовательность процедур, проводимых вручную. Этапу очистки ДНК обязательно предшествует лизис клеток и осаждение белков и нерастворимых частиц, поэтому большинство процедур выделения НК включает несколько последовательных стадий центрифугирования, что приводит к увеличению времени выделения НК, увеличению стоимости процедуры, уменьшению выхода НК за счет потерь при отборе супернатанта, содержащего НК, после центрифугирования. Основными недостатками всех ручных процедур являются трудоемкость и недостаточная эффективность (недостаточно высокий выход НК). Кроме того, в некоторых методах выделения используются токсичные органические растворители (фенол и др.), что накладывает дополнительные требования к организации помещений и квалификации персонала.
В настоящее время рядом компаний разработаны автоматизированные устройства, выполняющие обработку клинических образцов и выделение из них НК. Система COBAS AmpliPrep фирмы Roche Diagnostics (США/Швейцария) предназначена для автоматического выделения ДНК и РНК из биологических жидкостей, таких как сыворотка и плазма крови, на основе технологии, использующей магнитные частицы. В сочетании с набором реагентов COBAS TaqMan Assays система проводит быстрый автоматический ПЦР в реальном времени с полученной ДНК для детекции вирусов гепатита С, гепатита В и ВИЧ.
Автоматизированное устройство фирмы Thermo Electron (США) Thermo's KingFisher производит очистку ДНК, РНК и белков на основе перемещения магнитных частиц. Для анализа используются образцы физиологических жидкостей (кровь, плазма, моча, слюна) объемом 20-200 мкл. Аппарат рассчитан на одновременную обработку 24 образцов.
Компания Qiagen (Германия) выпускает прибор QIAsymphony SP для одновременной автоматической очистки НК из 96 образцов, например, для выделения вирусных НК или геномной ДНК из образцов крови. Технология выделения основана на применении колонок с магнитными частицами, поверхность которых содержит конъюгат никеля с агарозой. Система состоит из картриджей, заполненных необходимыми реагентами, из которых дозированно подаются растворы и ферменты для обработки клинического образца в процессе выделения НК. Картриджи в процессе выделения открываются автоматически, что сводит к минимуму риск заражения или контаминации.
Рабочая станция BioRobot MDx (Qiagen, Германия) включает 8 каналов (колонок) со сменными фильтрами. Ввод и дальнейшее продвижение образца осуществляется вакуумными насосами, стадия центрифугирования отсутствует. Вся процедура полностью управляется компьютером согласно соответствующему протоколу для выделения геномной ДНК из крови или вирусной ДНК и/или РНК из сыворотки и плазмы.
Настольная рабочая станция 'X-tractor GeneTM System' (Corbett Technologies, Австралия) представляет собой роботизированную систему, предназначенную для автоматической экстракции НК из образцов объемом до 200 мкл, полностью воспроизводящую ручное выделение НК.
Компанией Bioneer Corp. заявлено устройство для автоматической очистки ДНК (Automatic DNA purification apparatus, WO/2001/025482), состоящее из многочисленных контейнеров для растворов, каналов для прохождения жидкостей, регулируемых клапанами, вакуумного блока, штативов, шприцов для точного количественного введения и отсасывания жидкостей. Устройство также воспроизводит ручную процедуру выделения ДНК, но в автоматическом режиме.
Описана автоматизированная система-робот для идентификации биологически опасных агентов (Automatic identification of bioagents, WO/2005/009202), Isis Pharmaceuticals, США. Система состоит из двух блоков, разделенных воздушным шлюзом, в первом из которых проводится выделение и очистка ДНК, а во втором - ПЦР для идентификации агента. Для защиты от контаминации давление в первом блоке поддерживается выше, чем внешнее атмосферное давление, а во втором блоке - ниже. Система полностью автоматизирована.
Все существующие в настоящее время полностью автоматизированные устройства по подготовке клинических образцов являются сложными конструкциями, основанными на применении робототехники, что определяет их громоздкость, высокую стоимость (более 70 тыс.долл. США) и дороговизну проведения анализов и эксплуатации. Эти устройства, в основном, воспроизводят ручные способы выделения НК, но с использованием роботов: перемещение пробирок, многоканальное дозирование реактивов. Они являются закрытыми системами, не допускающими вмешательство оператора в ход процесса. При эксплуатации таких систем необходимы постоянные закупки реагентов данной фирмы, которые предназначены для данного конкретного прибора.
Из-за вышеуказанных недостатков роботизированных систем обработки образцов существует тенденция перехода от громоздких полностью интегрированных систем к небольшим гибким устройствам, которые осуществляют манипуляции с исследуемыми образцами, позволяя пользователю модифицировать компоненты устройства и регулировать процесс в соответствии со специфическими требованиями.
Существуют относительно простые и дешевые устройства для обработки образцов, содержащих НК, которые позволяют полностью и частично автоматизировать процесс. Фирмой Millipore Corporation запатентовано устройство для выделения НК из клеток, вирусных частиц и микоплазмы, состоящее из системы фильтрующих элементов (пористых мембран), через которые последовательно пропускают образец (Filter device for the isolation of a nucleic acid, EP 183242 A2). На первой пористой мембране, изготовленной из полисахарида или полиэфирсульфона, выполняется лизис клеток; полученный лизат поступает на стекловолоконный фильтр для последующей очистки и элюции НК. Фильтрующие мембраны соединены системой клапанов. Устройство может быть как одноразового, так и многоразового использования. Для одновременной обработки нескольких образцов несколько фильтрующих устройств могут быть собраны в кассету. Недостатками данного устройства являются необходимость ручного введения реагентов и наличие стадий центрифугирования.
Описан метод очистки НК путем прохождения образца через систему статических смесителей, на которых происходит лизис клеток, осаждение клеточного дебриса, осаждение НК из лизата, с последующими центрифугированием и очисткой методом ионообменной хроматографии (Methods for purifying nucleic acids, WO/2000/005358, фирма Valentis, США). К недостаткам данного способа, так же как и предыдущего, относится необходимость проведения центрифугирования.
Запатентовано устройство для выделения НК (Nucleic acid isolation, WO/2005/012521, Inivitrogen Corp., США), представляющее собой картридж, состоящий из пробирки, соединенной с фильтрующим элементом и далее с колонкой для очистки НК. Фильтрующий элемент содержит несколько слоев фильтров, колонка включает носитель, способный связывать НК, например носитель с переменным зарядом. Манипуляции с образцом осуществляются с помощью шприца или насоса. Недостатком данного метода является необходимость предварительной обработки образца перед введением его в картридж: проведение лизиса клеток, разбавление сыворотки крови и т.п.
В последние 10 лет получили распространение устройства для обработки биологических образцов и выделения НК на основе микрофлюидных или микрожидкостных систем, содержащих сеть микроканалов диаметром 100 мкм и менее, через которые пропускаются биологические образцы и растворы реагентов, а также резервуары, в которых проводится разделение компонентов, очистка, концентрирование и другие процедуры. В состав микрофлюидных систем входят также перемешивающие устройства, микродозаторы, микронасосы, фильтры и др. Описан ряд микрофлюидных устройств для получения очищенных нуклеиновых кислот, которые используют для различных целей, например для проведения ПЦР. Предложены простые микрофлюидные устройства, в которых выделение НК проводится в одну или несколько стадий, а также сложные управляемые компьютером системы, состоящие из многочисленных микроканалов, клапанов и резервуаров.
Примерами достаточно простых устройств являются микрофлюидное устройство для очистки ДНК при взаимодействии образца с диатомитом (Purification and amplification of nucleic acids in a microfluidic device, WO/2008/002725, Bio-Rad, США); микрофлюидное устройство для выделение геномной ДНК из лейкоцитов человека, в котором ДНК из образца связывается с поверхностью канала, модифицированного ДНК-связывающим реагентом (DNA purification and analysis on nanoengineered surfaces, WO/2006/081324); микрочип, в котором очистка ДНК происходит путем последовательного прохождения через серию хроматографических микроколонок, селективно сорбирующих примесные вещества, такие как белки, пептиды, липиды, пектины и др., а последняя колонка селективно связывает ДНК (DNA purification in a multi-stage, multi-phase microchip, WO/2008/058204). Недостатками таких устройств являются низкий выход НК, а также необходимость ручного введения реагентов на разных стадиях выделения и очистки.
Описано микрофлюидное устройство и метод концентрирования и очистки НК из биологических образцов (Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and concentration step, WO/2005/068627, 3M Innovative Properties company, США), включающее резервуар для загрузки образца и камеры для обработки и перемешивания, соединенные каналами и клапанами. Образец после загрузки подвергается действию лизирующего раствора, переходит далее в камеру для обработки, где проходит несколько стадий концентрирования и разбавления, а также дополнительный лизис и удаление раствора, содержащего ингибиторы, которые мешают проведению ПЦР с полученной ДНК. Недостатком данной системы является возможность лишь частичной очистки НК, в основном, от ингибиторов ПЦР.
Описан микрофлюидный картридж для проведения дифференцированного лизиса клеток различных типов, включающего обработку ультразвуком и лизис с использованием химических агентов, и дальнейшей частичной очистки ДНК (Microfluidic differential extraction cartridge, WO/2005/028635, Microfluidic systems, США). Данный микрофлюидик предназначен, в основном, для лизиса клеток, и с его помощью осуществляется лишь частичная очистка НК.
Предложено монолитное микрофлюидное устройство для экстракции ДНК и РНК, в основном из образцов крови (Nucleic acid purification chip, WO/2005/066343, Сингапур), состоящее из субстрата на основе кремния, входных и выходных отверстий для введения и выведения образца крови, а также буферов для обработки образца в объеме нескольких микролитров, микромешалки, камеры для лизиса, камеры, содержащей ДНК-связывающий материал и систему клапанов. Описан также метод изготовления монолитного устройства, содержащего вышеуказанные компоненты. Данное устройство позволяет выделять НК только из образца определенного типа (кровь).
Для защиты выделенной с помощью микрофлюидных систем ДНК от контаминации предложено устройство для автоматического выделения НК из биологических образцов (Automated nucleic acid isolation, WO/I 997/047967, Sarnoff Corp., Франция), состоящее из кассеты, в которой проводится химическая обработка образца, и съемного запечатанного контейнера для хранения полученной НК.
Примером более сложной микрофлюидной системы является устройство, представляющее собой совокупность модулей, в первом из которых происходит связывание и очистка целевого продукта (НК), а второй модуль является собственно микрофлюидным устройством, осуществляющим детекцию и анализ полученного продукта (Microfluidic devices, WO/2008/030631, фирма Microchip biotechnologies, США). Лизис клеток осуществляется обработкой ультразвуком в проточном режиме. Очистка ДНК осуществляется путем взаимодействия с магнитными частицами, содержащими аффинный носитель. Магнитное поле создается вращающимся магнитным блоком.
Фирмой Siemens (Германия) предложен плоский картридж (карта) для автоматического анализа ДНК или белков, содержащий систему микроканалов и микрополостей, формирующих емкости для содержащихся в них сухих реагентов, а также способ его изготовления методом литья под давлением (Arrangement for integrated and automated DNA or protein analysis in a single-use cartridge, method for producing such a cartridge and operating method for DNA or protein analysis using such a cartridge, WO/2006/042838). Сухие реагенты вносятся в открытые каналы, которые после этого заклеиваются пленкой. Картридж является одноразовым устройством. Образец вносится в готовый к анализу картридж, и результаты получают в полностью автоматическом режиме при помещении картриджа в считывающее устройство.
Описан также ряд микрофлюидных аппаратов, в которых одновременно производится выделение ДНК и ее амплификация, а в ряде устройств - и последующая детекция. Примером такой системы может служить устройство для выделения и амплификации ДНК из биологических жидкостей фирмы Micronics (США) (Method and system for microfluidic manipulation, amplification and analysis of fluids, for example, bacteria assays and antiglobulin testing, WO/2004/065010, патент США 7416892). Устройство представляет собой одноразовую микрофлюидную карту и предназначено для анализа бактерий в биологических жидкостях и диагностики некоторых заболеваний. Карта имеет встроенную фильтрующую мембрану, на которой задерживаются клетки, которые далее подвергаются лизису. Через мембрану последовательно пропускают серию растворов: растворы для отмывки, растворы, содержащие ферменты, растворы для амплификации и детекции. Проводится ПЦР-амплификация полученной ДНК в соответствующем температурном режиме, а далее ПЦР-продукт смывается с мембраны и передается на детектирующий элемент с прозрачным окошком для визуальной детекции.
Описана микрофлюидная система («лаборатория-на-чипе») для детекции некоторых возбудителей инфекционных заболеваний (Университет Пенсильвании, США). В состав системы входит коллектор образца (слюны), одноразовая пластиковая кассета (микрофлюидный чип) для обработки образца, включающая систему для проведения лизиса, экстракции НК, ПЦР, мечения ПЦР-продукта, платформа-контроллер для управления подачей реагентов, температурой, клапанами, а также лазерный сканер для считывания результатов (Z.Chen, M.G.Mauk, J.Wang, W.R.Abrams, P.L.Corstjens, R.S.Niedbala, D.Malamud, H.H.Bau, A microfluidic system for saliva-based detection of infectious diseases. Ann. N.Y.Acad. Sci., 2007, v.1098, p.429-436).
Фирмой Canon U.S. Life Sciences, США предложено устройство для анализа геномной ДНК, состоящее из картриджа, в котором проводится выделение ДНК, инжектора, с помощью которого ДНК передается на микрофлюидный чип, включающий зону для ПЦР-амплификации, зону для детекции и зону для анализа ДНК (Method and molecular diagnostic device for detection, analysis and identification of genomic DNA, WO 2007028084). Выделение ДНК происходит в реакционной камере с использованием магнитных частиц или материалов, меняющих свойства под действием электрического заряда.
Предложен полностью автоматизированный портативный микрофлюидный чип для обнаружения патогенных микроорганизмов методом ПЦР с детекцией в реальном времени (Real-time PCR detection of microorganisms using an integrated microfluidics platform, WO/2006/085948, Cornell Research Foundation, США). Микрочип включает модуль для очистки ДНК, который с помощью микроканалов соединен с модулем для ПЦР-детекции. Лизис клеток проводится в растворе, содержащем хаотропные соли; далее проводится отмывка водно-спиртовым раствором для удаления белков и липидов. Автоматическая система детекции состоит из интегрированного микропроцессора, системы клапанов и насосов, устройств для термоциклирования и флуоресцентной детекции. Детекция осуществляется методом ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентного красителя. Устройство можно использовать как в лабораториях, так и в полевых условиях.
Компанией CombiMatrix Corp., США, разработано миниатюрное микрофлюидное устройство, состоящее из ДНК-микрочипа, содержащего 12000 зондов, и микрофлюидного картриджа, имеющего в своем составе микрофлюидные насосы, мешалки, клапаны, микроканалы, микрорезервуары для реагентов. На чипе осуществляется электрохимический синтез олигонуклеотидных зондов. Перемешивание жидкостей в картридже осуществляется пропусканием микропузырьков, генерируемых электрохимическими микронасосами. Электрохимические насосы также используются для перекачивания жидкостей внутри картриджа. После внесения образца проводится ПЦР и гибридизация на микрочипе. Устройство полностью автономно, т.е. не требуется никаких внешних источников реагентов, насосов и т.п., что устраняет возможность контаминации образца. Устройство использовали для идентификации субтипов вируса гриппа А генотипированием участков генов гемагглютинина и нейраминидазы (R.H.Liu, M.J.Lodes, Т.Nguyen, Т.Siuda, M.Slota, H.S.Fuji, A.McShea, Validation of a fully integrated microfluidic array device for influenza A subtype identification and sequencing. Anal. Chem., 2006, v.78, p.4184-4193), а также для исследования экспрессии генов клеток лейкемии человека (R.H.Liu, Т.Nguyen, К.Schwarzkopf, H.S.Fuji, A.Petrova, T.Siuda, К.Peyvan, M.Bizak, D.Danley, A.McShea, Fully integrated miniature device for automated gene expression DNA microarray processing. Anal. Chem., 2006, v.78, p.1980-1986).
Анализ научной и патентной литературы позволяет сделать вывод, что в настоящее время существует множество способов выделения и очистки НК, некоторые из которых позволяют осуществлять автоматизацию процесса. Однако, несмотря на то что разработан ряд устройств для автоматического получения НК, не существует универсального устройства, которое позволяет быстро, воспроизводимо и с высоким выходом выделять НК из биологических образцов в полностью автоматическом режиме. Существующие автоматические роботизированные системы дороги, громоздки и сложны в использовании, а более простые системы осуществляют либо неполную очистку НК, либо выход НК недостаточен, либо они предназначены для выделения ДНК из образца определенного типа, например только из крови, слюны и др., либо проводят анализ образца на наличие одного конкретного заболевания.
В лабораториях РФ в настоящее время все процедуры выделения и очистки нуклеиновых кислот из клинического материала производятся вручную. Отсутствие недорогой и надежной аппаратуры, позволяющей автоматизировать процедуру обработки клинических образцов, создает условия повышенного риска заражения инфекционным материалом, а также приводит к возникновению ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Последнее неизбежно сказывается на профилактике здоровья населения и эффективности лечения больных.
Таким образом, в данной области существует острая потребность в разработке устройства для автоматизированного выделения НК, которое бы выгодно отличалось от известных из уровня техники решений простотой проведения анализа, эффективностью выделения (высоким выходом) НК, а также невысокой стоимостью.
Раскрытие изобретения
Первый аспект изобретения относится к сменному микрофлюидному модулю для автоматизированного выделения и очистки нуклеиновых кислот из биологических образцов, содержащему резервуары для реагентов и реакционные объемы, микроканалы и клапана, необходимые для перемещения жидкостей внутри модуля. Микрофлюидный модуль включает:
а) приемную камеру для ввода образца;
б) резервуар для лизиса, содержащий мембрану для задерживания на ней клеток микроорганизмов и/или вирусных частиц;
в) резервуары для растворов лизирующего буфера, содержащего реагенты для эффективного разрушения клеточной стенки и/или вирусного капсида;
г) микроколонку, содержащую твердофазный сорбент для связывания нуклеиновых кислот;
д) резервуары для промывочного буфера и этанола для промывки микроколонки с целью удаления остаточных белков и кристаллов соли;
е) резервуар для элюирующего буфера для растворения нуклеиновых кислот, связанных на твердофазном сорбенте в микроколонке;
ж) выходной порт, совместимый со стандартной микропробиркой;
з) резервуар для сбора отходов реакций.
В одном из своих воплощений сменный микрофлюидный модуль характеризуется тем, что он содержит только пневматические клапана, осуществляющие коммутацию газожидкостных потоков, в то время как все необходимые электромагнитные компоненты, осуществляющие подачу давления, нагрев, перемешивание в индивидуальных резервуарах модуля, размещены в управляющей установке-контроллере.
В своем следующем воплощении микрофлюидный модуль характеризуется тем, что в резервуаре для лизиса модуль содержит металлический стержень в инертной оболочке, необходимый для осуществления перемешивания на стадии лизиса.
Наконец, еще в одном своем воплощении микрофлюидный модуль характеризуется тем, что модуль выполнен из материалов, инертных по отношению к используемым реагентам и не сорбирующих НК. Могут быть использованы материалы, такие как, например, полипропилен, оргстекло, латекс, силикон, но не ограничиваясь ими.
Другим аспектом изобретения является способ автоматизированного выделения и очистки нуклеиновых кислот из биологических образцов с использованием сменного микрофлюидного модуля, содержащего набор реагентов, необходимых для осуществления процедуры выделения НК.
Способ характеризуется тем, что все манипуляции по выделению и очистке НК выполняются внутри сменного микрофлюидного модуля, изолирующего образец от внешней среды.
Способ предусматривает следующие последовательные стадии, выполняемые в автоматическом режиме, после ввода исследуемого образца в приемную камеру микрофлюидного модуля:
а) фильтрация биологического образца через мембрану, задерживающую клетки микроорганизмов и/или вирусы;
б) лизис задержанных на мембране клеток микроорганизмов и/или вирусов;
в) связывание нуклеиновых кислот на микроколонке, содержащей твердофазный сорбент;
г) отмывка нуклеиновых кислот от белков и кристаллов соли на колонке с твердофазным сорбентом;
д) элюция нуклеиновых кислот с микроколонки в отдельную пробирку.
В одном из воплощений способ характеризуется тем, что на стадии (а) фильтрацию биологического образца осуществляют через мембрану с целью задерживания на ней микроорганизмов и вирусов. Мембрану для фильтрации выбирают из группы мембран, включающей мембраны из поливинилидендифторида, боросиликатного стекла, целлюлозные мембраны, но не ограничиваясь ими.
В своем следующем воплощении способ характеризуется тем, что лизис микроорганизмов и вирусов на мембране на стадии (б) осуществляется путем последовательной обработки реагентами, разрушающими клеточные стенки бактерий и/или оболочки вирусных частиц. В качестве ферментов для разрушения клеточных стенок и мембран используют лизоцим, субтилизин, протеиназу К и другие ферменты. Далее добавляют лизирующий буфер, содержащий хаотропный агент в высокой концентрации (3-6 моль/л). Хаотропные реагенты выбирают из группы солей гуанидина, например гуанидинтиоцианат или гуанидингидрохлорид, но не ограничиваясь ими.
В своем следующем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии (в) осуществляют сорбцию НК на твердофазном сорбенте в присутствии раствора хаотропного агента в высокой концентрации (3-6 моль/л) путем пропускания лизата через микроколонку, содержащую твердофазный сорбент. Твердофазный сорбент выбирают из группы сорбентов, включающей силикагели, стекловолоконные фильтры, химически модифицированное стекло.
В еще одном из воплощений способ характеризуется тем, что на стадии (г) отмывку от белков и кристаллов соли проводят путем последовательного пропускания через микроколонку, содержащую связанные на твердофазном сорбенте НК, растворов промывочного буфера и этанола из соответствующих резервуаров сменного модуля, а смыв НК с микроколонки осуществляют путем пропускания элюирующего буфера, подаваемого из соответствующего резервуара микрофлюидного модуля, через микроколонку в отдельную микропробирку.
В еще одном своем воплощении способ характеризуется тем, что стадии (а)-(д) выполняются последовательно в автоматическом режиме в сменном микрофлюидном модуле, который помещается в установку-контроллер, управляемый программным обеспечением, реализующим алгоритм управления клапанами, осуществляющими перемещение растворов биологического образца и реагентов в резервуарах сменного модуля.
В качестве биологического образца для выделения и очистки НК могут быть использованы образцы сыворотки крови, плазмы крови или культуральные жидкости, содержащие клетки микроорганизмов и/или вирусные частицы.
Другие аспекты настоящего изобретения будут ясны из прилагаемых фигур, подробного описания и формулы изобретения.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими фигурами, на которых:
Фиг.1 представляет схему селективной экстракции НК из лизата клеток и/или вирусных частиц на микроколонке, содержащей твердофазный сорбент.
Фиг.2 представляет принципиальную схему (конфигурацию) сменного модуля с обозначением резервуаров с необходимыми реагентами, а также объемов, в которых осуществляется лизис бактериальных клеток/вирусных частиц и экстракция НК.
Обозначения: к1, к2а, к2б, к3, к4, к4а, к5 - жидкостные/воздушные клапана.
Фиг.3 представляет конструктивные элементы сменного модуля. Обозначения:
1 - основная рабочая платформа, формирующая резервуары (оргстекло);
2 - эластичная мембрана (нитрил);
3 - полукорпус (оргстекло);
4 - вставка каналообразующая, самогерметизирующаяся, с пробками, прокалываемыми для заправки модуля (латекс);
5 - верхняя крышка (оргстекло);
6 - стержень стальной в тефлоновой оболочке (мешальник);
7 - кольцо уплотнительное (латекс);
8 -мембрана (фильтр) для концентрирования клеток;
9 - цилиндр с суспензией силикагеля (микроколонка);
10 - фиксирующие клипсы.
Фиг.4А представляет фотографию сменного модуля с заправленными реагентами в сборе.
Фиг.4Б представляет элементы сменного модуля (рабочая платформа и полукорпус).
Фиг.5 представляет фотографию управляющей установки-контроллера (вид сверху) с подсоединенным сменным модулем.
Обозначения:
1 - электроклапаны;
2 - форсунки.
Фиг.6 представляет схему устройства пневмоклапанов и резервуаров для хранения растворов сменного модуля для выделения НК.
Обозначения:
1 - резервуар с раствором;
2 - каналы для перетекания растворов;
3 - отверстия для подачи воздуха;
4 - клапан;
5 - мембрана.
Фиг.7 (А-В) представляет принцип перемещения растворов из резервуара в резервуар через пневмоклапан в сменном модуле для выделения НК.
Фиг.8 представляет принцип управления направлением перетекания растворов в резервуарах сменного модуля для выделения НК.
Обозначения:
1 - клапан 1;
2 - клапан 2.
Фиг.9 представляет принцип перемешивания растворов в резервуаре сменного модуля для выделения НК.
Фиг.10 представляет диалоговое окно клиентской части программного обеспечения для управления процессом выделения НК в сменном модуле.
Фиг.11 представляет результат выделения НК из грамотрицательных бактериальных клеток (Escherichia coli и Salmonella typhimurium) при использовании автоматизированного способа выделения на основе сменного микрофлюидного модуля и стандартного метода выделения. Электрофорез в 1% агарозном геле. Дорожки:
1 - Молекулярный маркер λ/Hind III;
9
2 - НК, выделенные из культуры E.coli (~10 кл/мл) стандартным методом;
9
3 - НК, выделенные из культуры S.typhimurium (~10 кл/мл) в микрофлюидном модуле;
9
4 - НК, выделенные из культуры E.coli (~10 кл/мл) в микрофлюидном модуле.
9
Фиг.12 представляет результат выделения НК из грамположительных бактериальных клеток (Bacillus thuringiensis, ~10 кл/мл) при использовании автоматизированного способа выделения на основе сменного микрофлюидного модуля и стандартного метода выделения. Электрофорез в 1% агарозном геле. Дорожки:
1 - НК, выделенные стандартным методом;
2 - НК, выделенные с использованием микрофлюидного модуля;
3 - НК, выделенные с использованием микрофлюидного модуля без добавления лизоцима;
4 - молекулярный маркер λ/Hind III.
8
1
Фиг.13 представляет результаты проведения ПЦР с ДНК вируса гепатита B в качестве матрицы, выделенной с использованием микрофлюидного модуля из различных разведений образца плазмы крови (10-10 вирусных частиц в образце исходно).
Обозначения:
'К-' - отрицательный контроль реакции;
'М' - молекулярный маркер '100 bp Ладдер' (Силекс, Россия).
8
2
Фиг.14А представляет результаты проведения ПЦР с ДНК E.coli в качестве матрицы, выделенной из различных разведений клеток (10-10 в 1 мл исходного образца) с использованием автоматизированной процедуры на основе сменного микрофлюидного модуля. Обозначения:
'К-' - отрицательный контроль реакции;
'К+' - положительный контроль реакции (в качестве матрицы использована ДНК, выделенная стандартным методом);
'М' - молекулярный маркер 'PUC/MSP I' (Силекс, Россия).
8
2
Фиг.14Б представляет результаты проведения ПЦР с ДНК В.thuringiensis в качестве матрицы, выделенной из различных разведений клеток (10-10 в 1 мл исходного образца) с использованием автоматизированной процедуры на основе сменного микрофлюидного модуля.
'К-' - отрицательный контроль реакции;
'К+' - положительный контроль реакции (в качестве матрицы использована ДНК, выделенная стандартным методом);
'М' - молекулярный маркер 'PUC/MSP I' (Силекс, Россия).
Осуществление изобретения
Целью настоящего изобретения является создание сменного микрофлюидного модуля для автоматизированного выделения и очистки нуклеиновых кислот из биологических образцов и способа автоматизированного выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов с использованием микрофлюидного модуля.
Сменный микрофлюидный модуль для автоматизированного выделения и очистки нуклеиновых кислот из биологических образцов содержит:
а) приемную камеру для ввода биологического образца;
б) резервуар для лизиса, содержащий мембрану для задерживания на ней клеток микроорганизмов и/или вирусных частиц;
в) резервуары для растворов лизирующего буфера, содержащего реагенты для эффективного разрушения клеточной стенки и/или вирусного капсида;
г) микроколонку, содержащую твердофазный сорбент для связывания нуклеиновых кислот;
д) резервуары для промывочного буфера и этанола для промывки микроколонки с целью удаления остаточных белков и кристаллов соли;
е) резервуар для элюирующего буфера для растворения нуклеиновых кислот, связанных на твердофазном сорбенте в микроколонке;
ж) выходной порт, совместимый со стандартной микропробиркой;
з) резервуар для сбора отходов реакций.
В процессе выделения и очистки НК внутри сменного микрофлюидного модуля происходит фильтрация биологического образца через мембрану, лизис микроорганизмов и вирусов, задержанных на мембране, пропускание лизата через микроколонку, содержащую твердофазный сорбент, связывание нуклеиновых кислот с сорбентом в присутствии хаотропного агента в высокой концентрации с последующей отмывкой от белков и кристаллов соли и элюция нуклеиновых кислот с микроколонки в отдельную пробирку.
Биологический образец вводится в приемную камеру микрофлюидного модуля. Раствор образца далее пропускают через мембрану из поливинилидендифторида, боросиликатного стекла, целлюлозы или других материалов, задерживающую микроорганизмы и/или вирусы. Лизис задержанных на мембране микроорганизмов и вирусов проводится непосредственно на мембране.
Процесс разрушения клеточной стенки микроорганизмов и/или вирусной оболочки происходит посредством комбинированного химического и энзиматического лизиса, где задержанные на мембране клетки и/или вирусные частицы последовательно обрабатывают сначала раствором фермента для разрушения клеточных стенок и мембран (например, лизоцим), затем лизирующим буфером, содержащим хаотропный агент (гуанидинтиоцианат в концентрации 5 моль/л) и детергент (Triton Х-100). Хаотропный агент (гуанидинтиоцианат) используется с целью солюбилизации клеточных белков и удаления остатков клеточных стенок. Кроме того, в присутствии хаотропного агента нуклеиновые кислоты легко сорбируются на силикатных поверхностях, что позволило удалить стадию экстракции нуклеиновых кислот смесью фенол-хлороформ, а также адаптировать метод к формату микрофлюидного модуля.
Разрушение клеток с последующей твердофазной сорбцией-десорбцией позволяет получить выход НК, эквивалентный стандартной методике с использованием экстракции смесью фенол-хлороформ и последующим переосаждением этанолом (Примеры №4-8).
Выделение и очистка НК с помощью твердофазной сорбции основаны на их необратимой (по отношению к растворению в том же буфере) адсорбции на твердой фазе; далее проводится промывка и элюция. В процессе сорбции происходит удаление примесей, ингибирующих ферментативные реакции. Для связывания НК со структурой сорбента доступно только около 20% всей площади поверхности частиц сорбента. Однако остальная поверхность, в том числе внутренняя поверхность пор, остается свободной для связывания мелких примесей, таких как гем - небелковая часть гемоглобина, хорошо известный ингибитор ПЦР. Наличие этой дополнительной площади связывания для мелких примесей очень важно для всей колонки, т.к. оно предотвращает «конкуренцию» молекул мелких примесей и ДНК за места связывания.
Принцип метода выделения НК посредством сорбции-десорбции на сорбенте заключается в следующем (Фиг.1). Раствор НК, совместно с другим компонентами клеток микроорганизмов и/или вирусных частиц в лизирующем/сорбционном буфере, пропускается через микроколонку, заполненную сорбционным веществом (твердофазным сорбентом). Благодаря специфическому составу лизирующего/сорбционного буфера нуклеиновые кислоты связываются с сорбентом, в то время как другие компоненты (белки, углеводы, полисахариды, липиды и др.) сорбции не подвергаются. По окончании сорбции осуществляется процедура промывки колонки промывочными буферами, содержащими этанол, благодаря чему происходит отмывка колонки от солевых кристаллов и других низкомолекулярных соединений, неспецифически сорбировавшихся на сорбенте; при этом в силу нерастворимости НК в спирте ДНК и РНК остаются на колонке. После просушки колонки потоком воздуха, НК элюируют низкосолевым буфером (ТЕ буфер) или водой, свободной от нуклеаз. Таким образом, очистка НК при использовании описанной процедуры занимает не более 15 минут.
Таким образом, при выделении и очистке НК с использованием микрофлюидного модуля используются следующие реагенты и буферы:
на стадии лизиса - раствор ферментов для разрушения клеточных стенок и мембран, таких как лизоцим, субтилизин, протеиназа К и др., и Лизирующий буфер (ЛБ), содержащий хаотропный агент в высокой концентрации (3-6 моль/л). В качестве хаотропных агентов можно использовать, например, соли гуанидина (гуанидинтиоцианат, гуанидингидрохлорид и др.);
на стадии экстракции НК в микроколонке, содержащей твердофазный носитель (силикагели, стекловолоконные фильтры, химически модифицированное стекло и др.), - промывочный буфер (ПБ), содержащий хаотропный агент, а также раствор 70% этанола;
на стадии элюции НК с сорбента - раствор буфера для элюции, например буфер ТЕ.
В заявленном изобретении предложен сменный микрофлюидный модуль, в котором последовательно осуществляются все стадии выделения НК. Модуль содержит резервуары, микроканалы и клапаны, осуществляющие перемещение реакционных жидкостных объемов в процессе выделения НК, и выполнен из материалов, инертных по отношению к используемым реагентам и не сорбирующих НК.
Принципиальная схема сменного микрофлюидного модуля представлена на Фиг.2.
Биологический образец вводится в резервуар 'Проба', объем которого составляет 500 мкл. Объем резервуара 'Лизоцим' составляет 100 мкл, что вполне достаточно при используемой рабочей концентрации фермента. Объем резервуара, содержащего Лизирующий буфер (ЛБ), составляет 500 мкл. Задерживание клеток и/или вирусных частиц на мембране осуществляется путем фильтрации образца из резервуара 'Проба' через резервуар 'Фильтр. Резервуар для лизиса' в сосуд 'Резервуар для отходов реакций', объем которого составляет 2 мл. В силу того что в сосуде 'Фильтр. Резервуар для лизиса' осуществляется последовательная обработка клеток сначала лизоцимом, затем лизирующим буфером, суммарный объем данного сосуда составляет 700 мкл.
По достижении необходимого состава лизирующей смеси, она пропускается через микроколонку, содержащую силикагель в качестве агента, сорбирующего НК. Объем данного резервуара определяется объемом суспензии силикагеля и составляет 50 мкл. На стадии проектирования объем резервуара для Промывочного буфера (ПБ) составляет 500 мкл. Объем резервуара 'Этанол', используемого в сменном модуле, соответствует 400 мкл. Наконец, с целью концентрирования препарата НК, сорбированного в микроколонке, объем элюирующего буфера (ТЕ) составляет 100 мкл. Таким образом, на этапе проектирования сменного модуля суммарный объем всех сосудов и микроканалов оказывается менее 10 мл.
Температурный оптимум работы лизоцима составляет 37°С. Соответственно, данная температура обеспечивается в резервуарах 'Лизоцим' и 'Фильтр. Резервуар для лизиса' при достижении данной стадии выделения НК.
Лизирующий буфер содержит хаотропный агент, например гуанидинтиоцианат (ГТЦ), в концентрации выше 3 моль/л. При этом раствор ГТЦ в такой концентрации способен к образованию кристаллов при температурах 37°С и ниже. Данное обстоятельство может препятствовать перемещению растворов через каналы сменного модуля, а также уменьшать концентрацию хаотропного агента в целом, негативно отражаясь на лизисе и последующей сорбции НК на микроколонке. В связи с вышеизложенным в сосуде 'Фильтр. Резервуар для лизиса' на стадии добавления Лизирующего буфера обеспечивается температура 60°С.
С целью эффективного и равномерного лизиса в данном резервуаре предусмотрено перемешивание растворов на стадиях обработки ферментом для разрушения клеточных стенок и мембран и лизирующим буфером. Аналогичные требования по температуре предъявляются также к резервуару 'Пром. буфер', содержащему раствор, в состав которого входит гуанидинтиоцианат в высокой концентрации. Термостатирование растворов может быть осуществлено, например, при использовании элементов Пельтье, размещенных в управляющем устройстве непосредственно под указанными резервуарами микрофлюидного модуля. Перемешивание в объеме 'Фильтр. Резервуар для лизиса' может быть осуществлено помещением в резервуар стального стержня в тефлоновой оболочке (мешальника) диаметром, не превышающим диаметр резервуара, и размещением источника электромагнитного поля в управляющем устройстве.
С целью возможной модификации способа выделения НК для его применения в отношении сложных объектов для выделения НК, таких как бактериальные споры, в сменном модуле предусмотрен резервный сосуд ('R' на Фиг.2) объемом 500 мкл для введения дополнительных реактивов, необходимых на стадии лизиса.
На основании проведенного выше проектирования сменного модуля и адаптации способа выделения НК предложена последовательность операций, необходимая для проведения процедуры выделения и очистки НК в сменном модуле с использованием разработанного способа. Названия клапанов даны в соответствии с их обозначением на Фиг.2.
1. Ввод биологического образца в резервуар 'Проба' сменного модуля. Все необходимые растворы, входящие в состав НК-протокола, подготовлены и заправлены в соответствующие резервуары сменного модуля.
2. Активация клапана к1. Подача внешнего давления на резервуар 'Проба'. Фильтрация биологического образца из сосуда 'Проба' через мембрану в резервуаре 'Фильтр. Резервуар для лизиса' в сосуд 'Резервуар для отходов реакций'. Закрытие клапана к1.
3. Активация клапана к2а. Нагрев резервуаров 'Лизоцим' и 'Фильтр. Резервуар для лизиса' до 37°С. Добавление раствора фермента из резервуара 'Лизоцим' к клеткам на фильтре в сосуде 'Фильтр. Резервуар для лизиса'. Включение перемешивающего устройства. Закрытие клапана к2а. Инкубация клеток с лизоцимом в сосуде 'Фильтр. Резервуар для лизиса' в течение 5 минут.
4. Активация клапана к2б. Нагрев резервуара 'Фильтр. Резервуар для лизиса' до 60°С. Добавление раствора ЛБ из резервуара 'Лиз. Буфер (ЛБ)' к реакционной смеси в сосуде 'Фильтр. Резервуар для лизиса'. Закрытие клапана к2б. Инкубация реакционной смеси в сосуде 'Фильтр. Резервуар для лизиса' в течение 5 минут.
5. Выключение нагревательного элемента и перемешивающего устройства в сосуде 'Фильтр. Резервуар для лизиса'. Активация клапанов к3 и к4. Прохождение реакционной смеси из резервуара "Фильтр. Резервуар для лизиса' через микроколонку с твердофазным сорбентом 'Микроколонка' в сосуд 'Резервуар для отходов реакций'. Закрытие клапанов к3 и к4.
6. Нагрев резервуара 'Пром. буфер' до 55°С. Подача внешнего давления в резервуар 'Пром. буфер'. Активация клапанов к4а и к4. Прохождение раствора из резервуара 'Пром. буфер' через микроколонку с сорбирующим агентом 'Микроколонка' в сосуд 'Резервуар для отходов реакций'. Закрытие клапанов к4а и к4. Выключение нагрева в резервуаре 'Пром. буфер'.
7. Подача внешнего давления в резервуар 'Этанол'. Активация клапана к4. Прохождение раствора из резервуара 'Этанол' через микроколонку с сорбирующим агентом 'Микроколонка' в сосуд 'Резервуар для отходов реакций'. Закрытие клапана к4а.
8. Подача внешнего давления в резервуар 'ТЕ'. Активация клапана к5. Прохождение раствора из резервуара 'ТЕ' через микроколонку с сорбирующим агентом 'Микроколонка' в сосуд 'Резервуар для НК'. Закрытие клапана к5.
9. Предложенный алгоритм реализации способа выделения НК в сменном модуле, а также требования к объемам и нагреву элементов модуля используются для разработки жидкостных и воздушных клапанов, создания сменного модуля и управляющей установки-контроллера, а также программного обеспечения, осуществляющего управление процедурой выделения НК.
Далее изобретение проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.
Примеры
Пример 1. Конструктивные элементы микрофлюидного модуля для выделения ПК и управляющей установки-контроллера.
На Фиг.3 представлены конструктивные элементы сменного модуля для выделения НК.
Сборка модуля осуществляется в следующем порядке:
1. Устанавливают эластичную мембрану 2 в рабочую платформу 1.
2. Помещают мешальник 6 в соответствующий резервуар 'Фильтр. Резервуар для лизиса'.
3. Вставляют полукорпус 3 в соответствующие посадочные отверстия рабочей платформы 1.
4. Плотно прижав полукорпус и рабочую платформу друг к другу, проводят предварительное скрепление их фиксирующими клипсами 10 в угловых точках.
5. Вставляют 2 уплотнительных кольца 7 в соответствующие элементы полукорпуса 3.
6. Устанавливают мембрану для концентрирования клеток 8 в соответствующий резервуар 'Фильтр. Резервуар для лизиса'.
7. Устанавливают цилиндр с суспензией силикагеля в резервуар 'Микроколонка'.
8. Вставляют каналобразующую вставку с прокалываемыми пробками 4 для заправки реагентов в модуле в посадочное место в верхней крышке 5.
9. Вставляют элементы, собранные в п.5.1.8 (верхняя крышка и каналообразующая мембрана) в соответствующие посадочные места в полукорпусе 3 и фиксируют клипсами 10.
В качестве материала для изготовления рабочей платформы, полукорпуса и верхней крышки использовано оргстекло. Резервуары и технологические отверстия изготовлены сверлением с последующей полировкой для удаления стеклянной пыли, а также возможных микротрещин и микровыступов, способных к неспецифической сорбции НК в присутствии хаотропного агента в высокой концентрации. Аналогичные требования предъявлялись к материалам для изготовления эластичной мембраны и каналообразующей вставки. Для изготовления данных элементов были использованы латекс и нитрил, предварительно проверенные на отсутствие сорбирующих эффектов в отношении НК.
Фиг.4 демонстрирует фотографии рабочих макетов сменного модуля. На Фиг.4А представлена фотография заправленного модуля в сборе, готового к проведению анализа. На Фиг.4Б представлены элементы модуля - рабочая платформа 1 и полукорпус 3.
Головной прибор состоит из набора электроклапанов и форсунок, микрокомпрессора, нагревательных элементов, блока питания, электронной схемы для соединения установки-контроллера с компьютером.
Элетроклапана предназначены для регулирования работы пневмоклапанов, расположенных в сменном модуле. Элетроклапан представляет собой соленоид постоянного тока. Шток соленоида перекрывает через инертную мембрану капиллярное соединение входного и выходного отверстия. Шток изначально подпружинен, и клапан закрыт.При подаче постоянного напряжения на электромагнит, шток втягивается, давая возможность давлению воздуха, созданному микрокомпрессором, приподнять мембрану и открыть клапан.
Блок форсунок предназначен для обеспечения возможности регулирования давления, подаваемого в воздушные магистрали сменного модуля (давление для запирания штоков клапанов и давление для перемещения жидкостей). Для обеспечения возможности регулировать давление в системе, форсунки управлялись постоянным напряжением с широтно-импульсной модуляцией.
Микрокомпрессор предназначен для создания потока воздуха. Микрокомпрессор представляет собой мембранный либо плунжерный насос, способный создавать избыточное давление воздуха до 2 атм. Также для устранения кавитаций после компрессора перед модулем располагали демпфер.
Нагревание соответствующих резервуаров осуществляли элементами Пельтье, расположенными под гнездом установки сменного модуля в блоке контроллера. Для общего управления элементами Пельтье, клапанами и форсунками был разработан единый микропроцессорный блок.
На Фиг.5 представлена фотография (вид сверху) установки-контроллера. Установка содержит 16 электроклапанов и 2 форсунки, обеспечивающие управление пневмоклапанами. Сменный модуль помещен в специальное гнездо установки контроллера. Сопряжение модуля с установкой-контроллером осуществляется за счет точного позиционирования штоков штуцеров контроллера с приемными отверстиями сменного модуля. Элементы Пельтье и магнитная мешалка располагаются под гнездом сменного модуля. Блоки управления и питания, а также микрокомпрессор являются выносными. Управление макетом осуществляется по интерфейсам USB2.0 или IEEE802.3i с помощью разработанного программного обеспечения.
Пример 2. Реализация управлением перемещения газожидкостных потоков, а также перемешивания растворов в сменном модуле для выделения НК.
При изготовлении сменного микрофлюидного модуля были сформулированы и реализованы следующие принципы управления и перемещения жидкостных и воздушных потоков.
- Движущая сила перекачивания жидкостей и запирания клапанов (пневмоклапанов) - давление сжатого воздуха.
- Отсутствие контакта веществ, находящихся в резервуарах, как с атмосферой, так и со сжатым воздухом, за счет наличия упругих мембранных проставок.
В начальный момент все клапаны являются закрытыми, за счет натяжения мембраны клапана на его патрубки, т.к. конструктивно сила натяжения мембраны клапана много больше силы натяжения мембраны резервуара (например, в силу большей толщины мембраны клапана) (см. Фиг.6). Перекачивание растворов осуществляется подачей давления на мембрану резервуара с раствором, при этом подачи давления на соответствующий клапан, через который происходит перетекание жидкости, осуществляться не должно (Фиг.7, А-В). В объем под мембраной того резервуара, из которого необходимо перекачать раствор, следует подать избыточное давление, способное преодолеть сопротивление клапана. Регулировка скорости течения жидкости осуществляется за счет увеличения/уменьшения подаваемого давления и/или изменением диаметра отверстия.
Управление направлением перетекания раствора осуществляется по следующей схеме (Фиг.8). При подаче одинакового давления в объем под мембраной резервуара с раствором и в объем под мембраной клапана 1 перетекания раствора через клапан 1 не будет (клапан 1 полностью закрыт). Весь раствор потечет через правый клапан 2, т.к. в этом случае раствору необходимо преодолеть только сопротивление натянутой мембраны клапана.
Для осуществления перемешивания в сосуде модуля 'Фильтр. Резервуар для лизиса' при обработке ферментом для разрушения клеточных стенок и мембран и лизирующим буфером, в основании резервуара была сконструирована ниша для магнитной мешалки (Фиг.9). Данное решение позволяет избежать сразу двух критических вопросов - целостность мембраны и отсутствие дополнительных мертвых объемов, обусловленных объемом мешалки. Генерирование внешнего переменного электромагнитного поля осуществляется с помощью системы активных электромагнитов, смонтированных в установке-контроллере, управление которыми происходит с помощью микропроцессорного блока.
Пример 3. Алгоритм управления клапанами, осуществляющими перемещение растворов реагентов и биологического образца в резервуарах сменного модуля.
На Фиг.10 представлен интерфейс клиентской части программного обеспечения (ПО), управляющего работой установки-контроллера со сменным модулем для выделения НК.
Клиентская часть ПО предназначена для манипулирования электроклапанами (а1-а7) и пневмоклапанами (к1-к5) (открытие/закрытие) посредством нажатия на пиктограмму соответствующего клапана, а также для задания температуры инкубации реакционной смеси в соответствующих резервуарах.
Инициализация обмена данными по интерфейсам USB2.0 или Ethernet осуществляется кнопкой 'Connect'. Остановка программы или экстренное прерывание производится при помощи кнопки 'STOP!'
Реализация открытия/закрытия электроклапанов осуществляется путем подачи напряжения 12 В на соответствующий выход электрической части клапана и контролируется специальной микропрограммой, загруженной в микропроцессор. Регулировка производится одновременно по 15 каналам, рассчитанным на управление 14 клапанами и перемешивающим устройством в объеме 'Фильтр. Резервуар для лизиса'.
Перемещение растворов реагентов и биологического образца в сменном модуле в процессе выделения НК осуществляется по следующему алгоритму.
Стадия 1. Ввод биологического образца в приемную камеру (Резервуар 'Проба') модуля.
- нажать на пиктограмму 'Connect' (инициализация обмена данных по портам ввода-вывода, сброс всех клапанов в закрытое состояние).
Стадия 2. Фильтрация биологического образца через фильтр в резервуаре для лизиса.
- открыть электроклапан а1.
- открыть пневмоклапан k1.
- открыть пневмоклапан k4.
- визуально проконтролировать перетекание образца в жидкой фазе из резервуара 'Проба' в объем 'Фильтр. Резервуар для лизиса' и далее в объем 'Резервуар для отходов реакции'. Биологический материал (клетки) остаются на фильтре.
- закрыть пневмоклапан k1.
- закрыть пневмоклапан k4.
- закрыть электроклапан а1.
Стадия 3. Обработка биологического материала (клеток/вирусных частиц) лизоцимом.
- установить температуру резервуара 'Лизоцим' на 37°С.
- установить температуру резервуара 'Фильтр. Резервуар для лизиса' на 37°С.
- подождать 1 мин.
- открыть электроклапан а3.
- открыть пневмоклапан k2a.
- визуально проконтролировать перетекание реагента из резервуара 'Лизоцим' в объем 'Фильтр. Резервуар для лизиса'.
- закрыть пневмоклапан k2a.
- закрыть электроклапан а3.
- включить перемешивающее устройство в резервуаре 'Фильтр. Резервуар для лизиса'.
- выключить нагрев резервуара 'Лизоцим.'
- подождать 2 мин.
Стадия 4. Окончательный лизис биологического материала (клеток микроорганизмов/вирусных частиц) с использованием Лизирующего буфера.
- установить температуру резервуара 'Фильтр. Резервуар для лизиса' на 60°С.
- подождать 1 мин.
- открыть электроклапан а4.
- открыть пневмоклапан k2б.
- визуально проконтролировать перетекание реагента из резервуара 'Лиз. буфер' в объем 'Фильтр. Резервуар для лизиса'.
- закрыть пневмоклапан k2б.
- закрыть электроклапан а4.
- подождать 4 мин.
Стадия 5. Сорбция нуклеиновых кислот на микроколонке.
- выключить перемешивающее устройство в резервуаре 'Фильтр. Резервуар для лизиса'.
- выключить нагрев резервуара 'Фильтр. Резервуар для лизиса'.
- открыть электроклапан а2.
- открыть пневмоклапан k3.
- открыть пневмоклапан k4.
- визуально проконтролировать перетекание образца в жидкой фазе из резервуара 'Фильтр. Резервуар для лизиса' через компонент 'Микроколонка' в объем 'Резервуар для отходов реакции'.
- закрыть пневмоклапан k3.
- закрыть пневмоклапан k4.
- закрыть электроклапан а2.
Стадия 6. Промывка нуклеиновых кислот на микроколонке с использованием промывочного буфера.
- установить температуру резервуара 'Пром. буфер' на 55°С.
- подождать 1 мин.
- открыть электроклапан а5.
- открыть пневмоклапан k4a.
- открыть пневмоклапан k4.
- визуально проконтролировать перетекание реагента из резервуара 'Пром. буфер' через компонент 'Микроколонка' в объем 'Резервуар для отходов реакции'.
- закрыть пневмоклапан k4.
- закрыть электроклапан а5.
- выключить нагрев резервуара 'Пром. буфер'
Стадия 7. Промывка нуклеиновых кислот на микроколонке с использованием Этанола.
- открыть электроклапан а7.
- открыть пневмоклапан k4.
- - визуально проконтролировать перетекание реагента из резервуара 'Этанол' через компонент 'Микроколонка' в объем 'Резервуар для отходов реакции'.
- закрыть пневмоклапан k4.
- закрыть электроклапан а7.
Стадия 8. Элюция НК с микроколонки с использованием буфера ТЕ.
- открыть электроклапан а6.
- открыть пневмоклапан k5.
- визуально проконтролировать перетекание реагента из резервуара 'ТЕ' через компонент 'Микроколонка' в объем 'Резервуар для препарата НК'.
- закрыть пневмоклапан k5.
- закрыть электроклапан а6.
Стадия 9. Сброс параметров программы в исходное состояние
- нажать пиктограмму 'STOP!'
- отсоединить от сменного модуля микропробирку с раствором выделенных НК.
Пример 4. Выделение НК из грамотрицательных клеток с использованием микрофлюидного модуля.
Сборку сменного микрофлюидного модуля проводили, как описано в Примере 1. Растворы реагентов и буферов были заправлены в соответствующие резервуары сменного модуля в следующих композициях:
Лизирующий буфер (ЛБ): 5 моль/л ГТЦ (Sigma, США), 0,15 моль/л Трис, 0,05 моль/л EDTA и 4,9% Triton Х-100 (Sigma, США), деионизованная вода.
Промывочный буфер (ПБ): 5 моль/л ГТЦ (Sigma, США), 0,15 моль/л Трис, 0,05 моль/л EDTA, деионизованная вода.
Раствор лизоцима (Лизоцим): 10 мг/мл лизоцима, 0,15 моль/л Трис рН 8.0, 0,05 моль/л EDTA, деионизованная вода.
Этанол: 70% этанол (ректификат).
Буфер для элюции (ТЕ): 0,15 моль/л Трис рН 7.0, 0,05 моль/л EDTA, деионизованная вода.
С целью подготовки микроколонки сменного модуля в полипропиленовый цилиндр высотой 8 мм, диаметром 1,5 мм, объемом 10 мкл наносили 5 мкл водной суспензии силикагеля G60 Merck (Германия).
0,5 мл культуры грамотрицательных клеток Escherichia coli и Salmonella typhimurium добавляли в приемную камеру сменного модуля, после чего камеру закрывали, модуль подсоединяли к установке-контроллеру, запускали программное обеспечение и проводили выделение НК по алгоритму, описанному в Примере 3.
В качестве метода сравнения использовали стандартную процедуру лизиса с последующей фенол-хлороформной экстракцией и переосаждением НК этанолом (центрифугирование при 13 тыс.об/мин, общее время выполнения процедуры - более 3 часов). Оценку эффективности выделения НК осуществляли по электрофоретической картине в 1% агарозном геле, путем визуального сравнения интенсивности полос в дорожках, содержащих НК, выделенные с использованием сменного микрофлюидного модуля и с использованием стандартного метода выделения
Результаты выделения НК из грамотрицательных клеток с использованием сменного микрофлюидного модуля и стандартного метода выделения представлены на Фиг.11.
Как свидетельствуют результаты, представленные на Фиг.11, применение автоматизированной процедуры на основе микрофлюидного модуля позволяет эффективно выделять как ДНК, так и РНК из грамотрицательных клеток.
Пример 5. Выделение НК из грамположительных клеток с использованием микрофлюидного модуля.
Сборку сменного микрофлюидного модуля проводили, как описано в Примере 1. Растворы реагентов и буферов были заправлены в соответствующие резервуары сменного модуля в следующих композициях:
Лизирующий буфер (ЛБ): 5 моль/л ГТЦ (Sigma, США), 0,15 моль/л Трис, 0,05 моль/л EDTA и 4,9% Triton Х-100 (Sigma, США), деионизованная вода.
Промывочный буфер (ПБ): 5 моль/л ГТЦ (Sigma, США), 0,15 моль/л Трис, 0,05 моль/л EDTA, деионизованная вода.
Раствор лизоцима (Лизоцим): 10 мг/мл лизоцима, 0,15 моль/л Трис рН 8.0, 0,05 моль/л EDTA, деионизованная вода.
Этанол: 70% этанол (ректификат).
Буфер для элюции (ТЕ): 0,15 моль/л Трис рН 7.0, 0,05 моль/л EDTA, деионизованная вода.
С целью подготовки микроколонки сменного модуля в полипропиленовый цилиндр высотой 8 мм, диаметром 1,5 мм, объемом 10 мкл наносили 5 мкл водной суспензии силикагеля G60 Merck (Германия).
В один из сменных модулей в резервуар 'Лизоцим' вместо раствора лизоцима добавляли буфер ТЕ.
0,5 мл культуры грамположительных клеток Bacillus thuringiensis добавляли в приемную камеру сменного модуля, после чего камеру закрывали, модуль подсоединяли к установке-контроллеру, запускали программное обеспечение и проводили выделение НК по алгоритму, описанному в Примере 3. Выделение проводили в сменном модуле, содержащем раствор лизоцима в соответствующем резервуаре, и в модуле, содержащем буфер ТЕ вместо лизоцима в соответствующем объеме.
В качестве метода сравнения использовали стандартную процедуру лизиса с последующей фенол-хлороформной экстракцией и переосаждением НК этанолом (центрифугирование при 13 тыс.об/мин, общее время выполнения процедуры - более 3 часов). Оценку эффективности выделения НК осуществляли по электрофоретической картине в 1% агарозном геле, путем визуального сравнения интенсивности полос в дорожках, содержащих НК, выделенные с использованием сменного микрофлюидного модуля и с использованием стандартного метода выделения.
Результаты выделения НК из клеток В.thuringiensis с использованием сменного микрофлюидного модуля и стандартного метода выделения представлены на Фиг.12.
Как свидетельствуют результаты, представленные на Фиг.12, добавление лизоцима кардинально влияет на эффективность выделения как РНК, так и ДНК. В случае отсутствия лизоцима (Дорожка 3) в составе реагентов для лизиса в сменном модуле наблюдается лишь частичный лизис бактерий, что приводит к практически полной потере НК. Таким образом, стадия обработки клеток лизоцимом является необходимым компонентом автоматизированной процедуры с использованием сменного модуля. Разработанная процедура позволяет выделять НК из грамположительных клеток с эффективностью, сравнимой со стандартным методом выделения.
Пример 6. Оценка эффективности выделения вирусной ДНК из образцов плазмы крови с использованием автоматизированной процедуры на основе сменного микрофлюидного модуля.
Сборку сменного микрофлюидного модуля проводили, как описано в Примере 1. Растворы реагентов и буферов были заправлены в соответствующие резервуары сменного модуля в следующих композициях:
Лизирующий буфер (ЛБ): 5 моль/л ГТЦ (Sigma, США), 0,15 моль/л Трис, 0,05 моль/л EDTA и 4,9% Triton Х-100 (Sigma, США), деионизованная вода.
Промывочный буфер (ПБ): 5 моль/л ГТЦ (Sigma, США), 0,15 моль/л Трис, 0,05 моль/л EDTA, деионизованная вода.
Раствор лизоцима (Лизоцим): 10 мг/мл лизоцима, 0,15 моль/л Трис рН 8.0, 0,05 моль/л EDTA, деионизованная вода.
Этанол: 70% этанол (ректификат).
Буфер для элюции (ТЕ): 0,15 моль/л Трис рН 7.0, 0,05 моль/л EDTA, деионизованная вода.
С целью подготовки микроколонки сменного модуля в полипропиленовый цилиндр высотой 8 мм, диаметром 1,5 мм, объемом 10 мкл наносили 5 мкл водной суспензии силикагеля G60 Merck (Германия).
Образцы плазмы крови (200 мкл), содержащей вирус гепатита В в различных концентрациях, добавляли в приемную камеру сменного модуля, после чего камеру закрывали, модуль подсоединяли к установке-контроллеру, запускали программное обеспечение и проводили выделение НК по алгоритму, описанному в Примере 3.
В качестве стандартной методики проводили выделение вирусной ДНК из плазмы крови с использованием коммерческого набора QIAamp DSP Virus Kit (Кат №60704, Qiagen, Германия).
С целью оценки эффективности процедуры, проводили ПЦР с выделенной ДНК в качестве матрицы и с праймерами, специфичными к геному вируса гепатита В (ген X). Результаты представлены на Фиг.13.
2
Как показывают результаты, представленные на Фиг.13, разработанная автоматизированная процедура на основе микрофлюидного модуля позволяет эффективно выделять вирусную ДНК из образцов плазмы крови до 10 частиц в исследуемом образце. При этом полученный препарат ДНК может быть использован непосредственно в ПЦР.
2
8
Пример 7. Оценка эффективности выделения НК из бактериальных клеток (E.coli и B.thuringiensis) в диапазоне 10-10 клеток в 1 мл исходного образца с использованием автоматизированной процедуры на основе сменного микрофлюидного модуля.
Сборку сменных микрофлюидных модулей проводили, как описано в Примере 1. Растворы реагентов и буферов были заправлены в соответствующие резервуары сменного модуля в следующих композициях:
Лизирующий буфер (ЛБ): 5 моль/л ГТЦ (Sigma, США), 0,15 моль/л Трис, 0,05 моль/л EDTA и 4,9% Triton Х-100 (Sigma, США), деионизованная вода.
Промывочный буфер (ПБ): 5 моль/л ГТЦ (Sigma, США), 0,15 моль/л Трис, 0,05 моль/л EDTA, деионизованная вода.
Раствор лизоцима (Лизоцим): 10 мг/мл лизоцима, 0,15 моль/л Трис рН 8.0, 0,05 моль/л EDTA, деионизованная вода.
Этанол: 70% этанол (ректификат).
Буфер для элюции (ТЕ): 0,15 моль/л Трис рН 7.0, 0,05 моль/л EDTA, деионизованная вода.
С целью подготовки микроколонки сменного модуля в полипропиленовый цилиндр высотой 8 мм, диаметром 1,5 мм, объемом 10 мкл наносили 5 мкл водной суспензии силикагеля G60 Merck (Германия).
2
8
0,5 мл культуры E.coli и B.thuringiensis в разведениях в диапазоне 10-10 клеток в 1 мл добавляли в приемную камеру сменного модуля, после чего камеру закрывали, модуль подсоединяли к установке-контроллеру, запускали программное обеспечение и проводили выделение НК по алгоритму, описанному в Примере 3.
В качестве метода сравнения использовали стандартную процедуру лизиса с последующей фенол-хлороформной экстракцией и переосаждением НК этанолом (центрифугирование при 13 тыс.об/мин, общее время выполнения процедуры - более 3 часов). Оценку эффективности выделения НК осуществляли путем проведения ПЦР с выделенной ДНК в качестве матрицы и с праймерами, специфичными к геномам E.coli и B.thuringiensis (ген gyrA), с последующим электрофоретическим разделением продуктов ПЦР в 2% агарозном геле.
2
8
На Фиг.14 представлены результаты проведения ПЦР с ДНК, выделенной с использованием автоматизированной процедуры на основе сменных микрофлюидных модулей из разведений культур E.coli (А) и B.thuringiensis (В) в диапазоне 10-10 клеток в 1 мл исходного образца. Как свидетельствуют представленные результаты, заявляемый способ автоматизированного выделения НК с использованием сменных микрофлюидных модулей позволяет проводить анализ в широком диапазоне концентраций бактериальных клеток в биологическом образце.
Пример 8. Оценка суммарных потерь при выделении НК с использованием автоматизированной процедуры на основе сменного микрофлюидного модуля.
Подготовку сменных модулей и выделение НК из культур клеток E.coli и B.thuringiensis осуществляли, как описано в Примерах 3-7.
Оценку суммарных потерь при выделении НК на этапе лабораторных испытаний проводили путем проведения стадий выделения НК с использованием автоматизированной процедуры на основе сменных микрофлюидных модулей и стандартной методики выделения НК с последующим измерением концентраций ДНК на спектрофотометре. Процедуру выделения выполняли в трех повторностях. Результаты представлены в Таблице 1.
Таблица 1
Определение концентраций ДНК, выделенной из клеток E.coli и B.thuringiensis с использованием автоматизированной процедуры на основе микрофлюидных модулей и стандартной процедуры выделения
Концентрации ДНК, выделенной из клеток E.coli стандартным методом
Концентрации ДНК, выделенной из клеток E.coli с использованием микрофлюидного модуля
Концентрации ДНК, выделенной из клеток B.thuringiensis стандартным методом
Концентрации ДНК, выделенной из клеток B.thuringiensis с использованием микрофлюидного модуля
12,2 нг/мкл
10,8±0,4 нг/мкл
14,1 нг/мкл
13,6±0,5 нг/мкл
1,01 нг/мкл
0,9±0,1 нг/мкл
1,01 нг/мкл
0,866±0,05 нг/мкл
Представленные в Таблице 1 результаты свидетельствуют, что во всех экспериментах концентрация нуклеиновых кислот, выделенных с использованием заявленной автоматизированной процедуры НК, измеренная по поглощению на спектрофотометре, отличалась от концентрации НК, выделенных стандартным методом, не более чем на 20%, что демонстрирует высокую эффективность разработанной автоматизированной процедуры.
Таким образом, представленное изобретение позволяет проводить выделение и очистку нуклеиновых кислот бактерий и/или вирусов из биологических образцов (кровь, плазма, культуральные жидкости) с использованием сменного микрофлюидного модуля, в котором в автоматическом режиме осуществляются все стадии выделения и очистки нуклеиновых кислот. Способ включает стадии концентрирования (задерживания) клеток возбудителя на мембране, лизис и последующую экстракцию НК путем пропускания полученного лизата через твердофазный носитель с одновременной сорбцией на нем НК, промывку сорбента и связанной с ним НК, элюцию НК. Изобретение позволяет проводить выделение нуклеиновых кислот клеток микроорганизмов и/или вирусов из биологических образцов в автоматическом режиме с низкими потерями (не более 20%), низкой себестоимостью, малым временем, необходимым для получения результата. Способ не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала. Полученный препарат НК может быть использован без дополнительной очистки непосредственно в амплификации или гибридизации НК с целью непосредственной идентификации инфекционного агента в исследуемом образце или для проведения дальнейшего молекулярно-генетического анализа.
Все патенты, публикации, научные статьи и другие документы и материалы, цитируемые или упоминаемые здесь, включены в настоящее описание путем отсылки в такой степени, как если бы каждый из этих документов был включен путем отсылки индивидуально или приведен здесь в его полном виде.
Хотя предпочтительные воплощения настоящего изобретения и их преимущества были подробно описаны выше, специалист в данной области сможет внести различные изменения, дополнения, не выходя при этом за рамки данного изобретения, которые определяются прилагаемой ниже формулой изобретения.