Способ снижения уровней экспрессии генов LRNN3, GRAP, VAMP5
METHOD FOR REDUCING THE EXPRESSION LEVELS OF LRNN3, GRAP, VAMP 5 GENES

Способ снижения уровней экспрессии генов LRNN3, GRAP, VAMP5.
Изобретение относится к области геронтологии, а именно к возможности влияния на профиль экспрессии определенных генов, ассоциированных с биологическим старением, в плазме крови человека посредством приема экстракта амаранта, загруженного в аутологичные экзосомы, что позволит использовать данную форму экстракта в качестве защитного средства от действия определенных генетических факторов, задействованных в процессах биологического старения организма, в плазме крови человека.
Из уровня техники известен следующий метод применения экстракта амаранта «Применение активных ингредиентов амаранта (amaranthus hypochondriacus) для приготовления средства для защиты митохондрий» [WO2008145850 А2, 27.04.2007, Франция], предполагающий использование активного ингредиента, полученного из амаранта, в составе косметической или фармацевтической субстанции как защитного фактора от механизмов старения посредством обеспечения защиты митохондрий и активации аконитазы для поверхностного использования в области кожи.
Недостатками данного метода являются форма доставки, не предполагающая высокое сродство доставляемой молекулярной субстанции к клеткам реципиента, и отсутствие эффекта на уровень экспрессии генов LRNN3, GRAP, VAMP5, ассоциированных со старением организма.
Техническим результатом заявленного способа является возможность снижения уровней экспрессии генов LRNN3, GRAP, VAMP5, уровни экспрессии которых возрастают с увеличением биологического возраста организма, с помощью аутологичных экзосом, загруженных экстрактом амаранта.
Вышеприведенный технический результат достигается благодаря тому, что способ включает последовательное выполнение следующих стадий: получение аутологичных экзосом; получение экстракта амаранта (или берется покупной экстракт амаранта); загрузка полученного экстракта амаранта в аутологичные экзосомы; прием полученных загруженных экзосом per os, разведенных 1:10 физиологическим раствором, из расчета 15 мл на 10 кг веса.
Аутологичные экзосомы получают из периферической венозной крови реципиента, которую забирают в пробирку с антикоагулянтом в объеме 40 мл, после чего подвергают центрифугированию в течение 20 мин при 3000 g, далее забирают супернатант и проводят центрифугирование при 100000 g в течение 90 минут. По окончании ультрацентрифугирования забирают сформировавшийся осадок, содержащий экзосомы.
Экстракт амаранта получают из зерен растения семейства амарантовых методом водной или спиртовой экстракции или используют покупной (эксперименты показали, что при использовании покупного экстракта также достигается вышеприведенный технический результат - особой разницы нет) и загружают в полученные аутогенные экзосомы методом ультразвуковой порации.
Загруженные экстрактом амаранта аутогенные экзосомы разводят 1:10 в физиологическом растворен назначают реципиенту per os в объеме 10 мл / на 10 кг.
Заявляемый способ может быть проиллюстрирован следующими примерами.
Пример. «Ингибирование экспрессии генов, определяемых в крови человека, уровень экспрессии которых увеличивается с возрастанием биологического возраста, при приеме per os аутологичных экзосом, загруженных экстрактом амаранта».
Мужчина 55 лет 82 кг и женщина 43 лет и 75 кг получали аутологичные экзосомы, загруженные экстрактом амаранта, разведенные в физиологическом растворе 1:10 в объеме 82 мл и 75 мл соответственно каждый день в течение 28 дней. Уровень экспрессии генов, уровень экспрессии которых возрастает с увеличением биологического возраста организма, определяли на 1-й и на 28-й день приема аутогенных экзосом, загруженных экстрактом амаранта.
Экстракт амаранта был получен из семян растения рода амарант методом этанольной экстр акции с последующим вакуумным высушиванием. В результате из 100 г измельченных семян было получено 8 г экстракта, который затем растворили в 80 мл физиологического раствора.
Аутологичные экзосомы из 40 мл периферической венозной крови были получены следующим образом: полученную кровь подвергали центрифугированию при 3000 g в течение 20 минут с последующим забором супернатанта; затем проводили центрифугирование в режиме 2000 g в течение 20 минут при комнатной температуре с последующим забором супернатанта; далее проводили центрифугирование в режиме 10000 g в течение 30 минут при комнатной температуре с последующим забором супернатанта. Последним этапом проводили ультрацентрифугирование (центрифуга Avanti 301, ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 90 минут при +4°С с последующим забором осадка. Полученный осадок растворяли в 2 мл натрий-фосфатного буфера.
8 г экстракта амаранта, растворенные в 80 мл натрий-фосфатного буфера, были загружены в полученные экзосомы методом ультразвуковой порации (сонопоратор QsonicaSonicatorQ700 (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA)) в следующем режиме: 500 V, 2 kHz, 20% power, 6 циклов 4 с пульс / 2 с пауза, затем охлаждение на льду в течение 2 минут и повторение цикла.
Для оценки уровня экспрессии генов, уровень экспрессии которых повышается при увеличении биологического возраста, проводили выделение тотальной РНК из клеток периферической венозной крови (5 мл крови, собрана в вакуумную пробирку с антикоагулянтом) на наборах RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) с последующей очисткой мРНК на наборах Oligotex mRNA Mini Kit (Qiagen, Германия), кДНК синтезировалась с помощью набора QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Германия). Далее проводили постановку ПЦР в реальном времени со специфическими праймерами для генов LRNN3, GRAP, VAMP5, уровень экспрессии которых возрастает при увеличении биологического возраста. Для оценки изменения уровней экспрессии генов использовали гены домашнего хозяйства TUBA 1А, А СРВ, GAPDH, В2М, уровень экспрессии которых в различных клетках относительно стабилен в течение времени.
Полученные изменения уровней экспрессии генов, повышение уровня экспрессии которых ассоциировано с увеличением биологического возраста, на фоне приема экстракта амаранта в аутологичных экзосомах отражены в таблице.
На фоне приема экстракта амаранта, загруженного в аутологичные экзосомы, снизился уровень экспрессии генов LRNN3, GRAP, VAMP5, экспрессия которых повышается с увеличением биологического возраста, снизилась у мужчины и женщины для гена LRNN3 с 23,1 до 20, 1 и с 20,6 до 18,0 соответственно; для гена GRAP с 13,3 до 10,9 и с 17,2 до 14,7; для гена VAMP5 с 4,9 до 3,2 и с 5,8 до 4,1.