СПОСОБ ИНДИКАЦИИ БАКТЕРИЙ РОДА Lactobacillus
METHOD FOR INDICATION OF BACTERIA OF Lactobacillus FAMILY

Изобретение относится к молекулярной биологии, медицине и промышленной микробиологии, в частности к индикации бактерий рода Lactobacillus на основе специфической амплификации фрагмента гена, кодирующего 16S рРНК.
В течение длительного времени индикация бактерий рода Lactobacillus проводилась с помощью классических микробиологических методов, основанных на энзимоиндикации. Микробиологический метод длителен в исполнении, достаточно трудоемок и экономически затратен. По мере получения новых знаний о последовательности генома лактобацилл стало возможным использование высокочувствительных и быстрых в исполнении методов молекулярной биологии для индикации микроорганизмов этого рода.
Известны следующие способы индикации бактерий рода Lactobacillus на основе генетической детерминанты 16S рРНК:
1. Индикация бактерий рода Lactobacillus с использованием полимеразной цепной реакции на основе пары праймеров Lacto 1 и LOWLAC, специфичных в отношении гена 16S рРНК (Chagnaud P. Rapid PCR-based procedure to identify lactic acid bacteria application to six common Lactobacillus species/ P. Chagnaud/ Journal of Microbiological Methods. - 2001. - Vol.44, P.139-148).
2. Индикация бактерий рода Lactobacillus путем полимеразной цепной реакции с использованием пары праймеров Y1 и Y2 на основе консервативного региона гена 16S рРНК (Ward L.J. Differentiation of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus rhamnosus by polymerase chain reaction/Ward L.J. Timmins M.J. / Letters in Applied Microbiology. - 1999 Vol.29, P.90-92).
Первый из способов позволяет проводить индикацию с получением фрагмента большого размера (996 п.н.), что отрицательно сказывается на эффективности амплификации. Кроме того, анализ выровненных нуклеотидных последовательностей лактобацилл, накопленных на данный момент в базе данных GenBank/ EMBL/ DDBG, позволил сделать выводы о недостаточной специфичности праймера Lacto 1. Концевые триплеты праймера (5' - и 3' - конец) полностью гомологичны соответствующим фрагментам ДНК бактерий рода Bifidobacterium и Streptococcus. Использование этого праймера может приводить к ложноположительным результатам при работе со смешанными культурами.
Праймер Y1 во втором способе имеет в своем составе множественные замены и не полностью комплементарен соответствующим нуклеотидным последовательностям лактобацилл. Этот праймер не подходит для работы с молочнокислыми микроорганизмами, так как изначально он был сконструирован для работы с клубеньковыми бактериями рода Rhizobium.
Цель изобретения - повышение специфичности способа индикации бактерий рода Lactobacillus на основе ПЦР фрагмента генетической детерминанты 16S рРНК.
Сущность изобретения заключается в том, что фрагмент ДНК лактобацилл амплифицируют в однораундовой или двухраундовой ПЦР с использованием предлагаемых нами олигонуклеотидных праймеров следующего состава: FLg: 5'-ATGCAAGTCGAACGCRTRG-3'; RLg I: 5'-AGYCTCAGCGTCAGTWRCAGA-3'; RLg II: 5'-AGTTTCRGATGCACTTCTRCG-3', в которых R означает G или A, Y означает T/U или С, W означает А или T/U. При использовании пары праймеров FLg - RLg I получают фрагмент размером 737 п.н., а при использовании пары праймеров FLg - RLg II получают фрагмент размером 612 п.н. Полученные результаты анализируют с помощью электрофореза в агарозном геле.
Пример 1. Выбор последовательности праймеров
Выбор последовательности праймеров проводят путем сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК бактерий родов Lactobacillus, Carnobacterium, Streptococcus, Lactococcus, Propionibacterium, Leuconostoc и Bifidobacterium, представленных в базе нуклеотидных последовательностей GenBank/EMBL. Для анализа используют нуклеотидные последовательности ДНК 43-х штаммов бактерий молочнокислого брожения указанных родов. Последовательности выравнивают с использованием программ ClustalW, находят регионы нуклеотидной последовательности данного гена, консервативные в рамках рода Lactobacillus, но вариабельные в отношении других родов бактерий молочнокислого брожения. При выборе последовательности нуклеотидов с целью использования в качестве родовых праймеров применяют следующие критерии: последовательность должна быть консервативна у лактобактерий разных видов, но отличаться от соответствующих нуклеотидных последовательностей бактерий молочнокислого брожения других родов. Выбирают участки прямой нуклеотидной последовательности (F) размером 19, 21 и 21 н.о., имеющие следующие последовательности:
5'-ATGCAAGTCGAACGCGTA G-3';
5'-TCTGTAACTGACGCTGAGGCT-3';
5'-CGAAGAAGTGCATCGGAAACT-3'
На следующем этапе выбранные последовательности анализируют с точки зрения их однородности у разных видов рода Lactobacillus, при наличии нуклеотидных замен (вариабельности какого-либо нуклеотида у разных видов) вводят вырожденные основания. Последовательности обратных (R) праймеров устанавливают путем инвертирования прямых (F) последовательностей.
Далее проводят сравнительный анализ с последовательностями гена 16S рРНК 5 штаммов рода Bifidobacteruim, 1 штамма рода Streptococcus, 2 штаммов рода Leuconostoc, 3 штаммов рода Lactococcus, 3 штаммов рода Carnobacterium и 2 штаммов рода Propionibacterium. Устанавливают, что гомология последовательностей в регионе праймеров FLg, RLg I и RLg II с соответствующими последовательностями представителей вышеназванных родов составляет 33-50%, что свидетельствует о теоретической специфичности выбранных олигонуклеотидов.
Пример 2. Индикация бактерий рода Lactobacillus и оценка специфичности сконструированных праймеров
2
Выделение ДНК бактерий, выращенных на жидкой питательной среде, проводят с использованием метода нуклеосорбции (Boom R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R.Boom, C.J.Sol, M.M.Salimans et al. // J. Clin. Vicrobiol. - 1990. - Vol.28, №3. - Р.495-500). ДНК анализируют методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в объеме 25 мкл в термоциклере с активным регулированием «Терцик-МС2» («ДНК-технология», Москва). Для постановки ПЦР готовят реакционную смесь следующего состава: 10 мМ трис-HCl (pH 8.8), 50 mM KCl, 1,5 мМ MgCl, 1,0% Triton X-100, пo 0,2 мМ каждого из дНТФ, 2 е.а. Диа-Так-полимеразы (НПАО «Силекс», Москва), по 0,2 мкМ прямого и обратного праймеров. В отдельной пробирке смешивают 5 мкл ДНК и 20 мкл смеси. Амплификацию фрагмента ДНК проводят в следующем режиме [94°С - 5 минут; (94°С - 30 сек, 55°С - 30 сек, 72°С - 45 сек) Х 35 циклов; 72°С - 5 мин]. Результатом амплификации является специфический фрагмент размером 737 п.н. для пары праймеров FLg-RLgI и фрагмент размером 612 п.н. для пары праймеров FLg-RLgII. Визуализацию продукта амплификации проводят методом электрофореза в 1,5% агарозном геле в присутствии бромида этидия с использованием 0,089 М трис-боратного буферного раствора, pH 8,0, при 110 V на гель в течение 20 минут. Для определения размера фрагмента используют маркер размерности ДНК 100-1000 п.н., производства ЗАО «Sileks».
Для оценки специфичности предложенных праймеров используют референтные штаммы микроорганизмов родов Lactobacillus, Streptococcus и Bifidobacterium: L.acidophilus BKMB 846, L.delbmeckii 78 NCIB, L.fermentum 90-TC-4, B.bifidum 1, В.longum 379, S.thermophilus 17T. Проводят ПЦР с пробами ДНК указанных референтных штаммов. При анализе продуктов амплификации с помощью электрофореза в агарозном геле определяют наличие ампликонов размером 737 п.н. и 612 п.н. Устанавливают, что праймеры FLg, RLg I и RLg II амплифицируют фрагменты генома искомого размера только при работе с микроорганизмами рода Lactobacillus и не дают положительной или неспецифической реакции при анализе ДНК бактерий родов Bifidobacterium и Streptococcus (чертеж А, Б).
Полученные результаты свидетельствуют о специфичности сконструированных праймеров в отношении бактерий рода Lactobacillus, что позволяет использовать их для дифференциальной индикации бактерий данного рода.
Изобретение может быть применено в научных исследованиях для получения новых знаний о биологических свойствах бактерий рода Lactobacillus, для изучения природных биотопов обитания и характера распространения этих бактерий и представляет практический интерес для использования в системе контроля качества продуктов питания, обогащенных лактобациллами, как на предприятиях-изготовителях, так и в учреждениях Роспотребнадзора.
Метод разработан и апробирован на базе лаборатории молекулярной эпидемиологии вирусных инфекций и лаборатории микробиоценозов и конструирования пробиотиков Нижегородского НИИЭМ им. академика И.Н.Блохиной.