Исследование молекулярной филогеографии волка (Canis lupus L. ) Алтая методом микросателлитных маркеров

УДК 574

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ФИТОГЕОГРАФИИ ВОЛКА (CANIS LUPUS L.) АЛТАЯ МЕТОДОМ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ

Е.А. Воробьевская1, С.Н. Балдина2

(1кафедра биогеографии географического факультета МГУ;

2Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова, г. Москва;

e-mail: nature13@yandex.ru)

Таксономический статус, происхождение и родственные связи различных форм алтайского волка остаются дискуссионными. Нами была разработана и протестирована методика проведения микросателлитного анализа, который является одним из основных инструментов филогеографических исследований. Было проанализировано 97 экземпляров волка (Canis lupus) из равнинно-степных, предгорных лесостепных и горно-таежных популяций Алтайского края и Республики Алтай. Микросателлитные локусы, выбранные в качестве генетических маркеров, показали высокую эффективность. Согласно нашим исследованиям, которые также подтверждаются литературными данными, лесостепная популяция волка Алтая является частью горно-таежной популяции (Canis lupus altaicus).

Ключевые слова: Canis lupus, Алтай, микросателлитные маркеры, филогеография.

Значительная неоднородность природных условий территории Алтая во многом определяет высокое разнообразие форм алтайского волка, таксономический статус, происхождение и родственные связи которых остаются дискуссионными [1]. С целью исследования этих сложных вопросов была разработана и протестирована методика микроса-теллитного анализа, являющаяся одним из основных инструментов в исследованиях молекулярной филогеографии.

Материалы и методы

В работе было проанализировано 97 фрагментов недубленых шкур и засушенных внутренних органов волка из равнинных степных, предгорных лесостепных и горно-таежных популяций Алтайского края и Республики Алтай. Равнинная степная популяция в нашем исследовании содержит 40 особей из трех граничащих друг с другом районов Алтайского края: Угловского, Михайловского и Егорьевского. Считается, что в пределах этой территории обитает степной подвид волка (Canis lupus campest-ris) [1, 2]. Предгорная лесостепная популяция представлена 36 особями из семи районов Алтайского края: Курьинского, Чарышского, Солонешенского и Алтайского, расположенных в предгорьях Алтая, а также Тогульского, Ельцовского и Заринского, расположенных в пределах Салаирского кряжа. Волки данной территории большинством ученых относятся к лесной форме Canis lupus altaicus, что, впрочем, является дискуссионным [1, 2]. Данная популяция обитает в переходной зоне и имеет возможность сообщения с горно-таежной и степной

популяциями Алтая. Горно-таежная популяция представлена 21 экземпляром алтайского горно-таежного волка Canis lupus altaicus из пяти районов Республики Алтай: Усть-Канского, Чойского, Чемаль-ского, Онгудайского и Кош-Агачинского [2].

ДНК выделялась с помощью наборов Diatom DNAPrep и Chelex. Анализ генетического полиморфизма проводился с помощью микросателлитных маркеров — кодоминантных ядерных локусов, содержащих короткие тандемные повторяющиеся последовательности [3]. Разделение аллелей, полученных в ходе полимеразной цепной реакции (далее — ПЦР), содержащих разное число повторов, велось с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Среди разработанных ранее для собак микросател-литных локусов [4] нами были отобраны один пента-(2119) и пять тетрануклеотидных локусов (2054, 2062, 2137, 2140 и 2201), которые показали устойчивую ПЦР-амплификацию на образцах алтайского волка. Выбранные праймеры имеют одинаковую температуру отжига (равную 58°) и близкий диапазон длин ПЦР-продукта (от 136 до 187 п.о.), что позволяет использовать их вместе при проведении ПЦР и облегчает электрофоретическое разделение ПЦР-про-дуктов на среднеформатных гелях.

Статистическая обработка материала велась с помощью программы GenAlEx6, анализ главных компонент проводился в программе STATISTICA 6.0.

Результаты и обсуждение

При анализе молекулярной филогеографии алтайского волка все локусы показали высокое аллель-ное разнообразие (5—18 аллелей на локус) и высокую

оценена степень сходства генетическом структуры всех исследованных популяций [3]. Минимальное значение этого коэффициента (указывающее на максимальную близость популяций) в нашем исследовании наблюдается при сравнении предгорной лесостепной популяции с горно-таежной (Б^ = 0,109). По показателю генетической подразделенности (/§т) также отмечены минимальные из имеющихся у нас значения — 1,3%. Оба показателя указывают на высокую долю сходства предгорной и горной популяций волка Алтая. Максимальные различия при сравнении популяций по обоим показателям отмечены для равнинных и горно-таежных популяций (Б^ = 0,327 и = 3,9%).

Многомерный анализ генетической дифференциации показал, что при ор-динации выборок в пространстве двух первых главных координат они кластеризуются в целом в соответствии с географическим происхождением.

Частоты аллелей локуса 2054

гетерозиготность. Для локуса 2137 отмечено максимальное среднее значение наблюдаемой гетерози-готности (0,835). При анализе графического отображения значений частот аллелей для каждого локуса в отдельности отмечается сходство лесостепной предгорной и горно-таежной популяций. Для них характерна общность аллельного состава и также общие или крайне близкие друг другу значения частот по этим аллелям (рисунок).

Несмотря на различия в количественном объеме выборок равнинных степных и горно-таежных популяций (почти вдвое), среднее значение эффективного числа аллелей всех локусов для этих популяций крайне близко. Средние показатели наблюдаемой гетерозиготности (НО) для всех популяций меньше, чем ожидаемые (НЕ), но довольно высоки (от 0,658 до 0,806).

Максимальные значения микросателлитной гете-розиготности отмечены для предгорной лесостепной (0,819), а минимальные — для равнинной степной популяции (0,770). По показателю числа "приватных" (т.е. специфичных для отдельных популяций, обнаруженных только в них) аллелей (private alleles) горно-таежная популяция имеет самое высокое значение (0,833), тогда как равнинные степные и предгорные лесостепные популяции имеют абсолютно одинаковые значения (0,667).

Одними из важнейших показателей нашего анализа являются генетические коэффициенты дистанций по Неи (Dn) и по F^-p. На основании коэффициентов генетических дистанций может быть

Выводы

Таким образом, выбранные в качестве генетических маркеров микросателлитные локусы показали высокую эффективность в исследовании генетического полиморфизма географически близких, но различающихся с позиций экотопов популяций волка и большой потенциал подобных исследований с увеличением количества и объема выборок популяций с расширением охвата ареала вида. Лесостепные популяции волка Алтая чрезвычайно близки к горно-таежным и не продемонстрировали таких значений популяционно-генетических показателей, которые могли бы дать основание для более серьезного рассмотрения вопроса их таксономического статуса. Дифференциация популяций алтайского волка по генетическим показателям выявила, что большое значение имеет фактор географического происхождения.

Автор выражает благодарность Д.В. Политову (лаб. популяционной генетики Института общей генетики РАН) за предоставленную возможность проведения лабораторных исследований и ценные консультации, А.Я. Бондареву (Центр защиты леса по Алтайскому краю) за предоставленные образцы тканей волка и О.А. Леонтьевой (географический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова).

* * *

Работа поддержана ФЦП "Научно-педагогические кадры инновационной России".

6 ВМУ, биология, № 2

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Соколов В.Е., Россолимо О.Л. Систематика и изменчивость волка // Волк / Под ред. Д.И. Бибикова. М.: Наука, 1985. С. 21-51.

2. Суворов А.П., Смирнов М.Н. О подвидовом положении алтайского горно-таежного волка (Canis lupus altai-cus) // Горные экосистемы Южной Сибири: изучение, охрана, рациональное природопользование / Под ред. П.В. Голикова. Барнаул: Алтайские страницы, 2005. С. 347—351.

3. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях. М.: ИКЦ Академкнига, 2003. 431 с.

4. Francisco L.V., Langston A.A., Mellersh C.S., Neal C.L., Ostrander E.A. A class of highly polymorphic tetranucleotide repeats for canine genetic mapping // Mammalian Genome. 1996. N 7. P. 359—362.

Поступила в редакцию 01.06.10

PHYLOGEOGRAPHY RESEARCH OF A GREY WOLF

OF ALTAI USING THE METHOD OF MICROSATELLITE MARKERS

E.A. Vorobyevskaya, S.N. Baldina

The taxonomic status, origin and sib connections of various forms of the Altai grey wolf remain debatable. We had been developed and tested the technique of the microsatellite analysis which is one of the basic tools in phylogeography researches. 97 samples of grey wolf (Canis lupus) have been analyzed, extracted from the populations occupying flat steppe, foothill forest-steppe and mountain-taiga ecotopes of Altai Krai and Altai Republic. The microsatellite loci chosen as genetic markers have shown high efficiency. Forest-steppe populations of Altai grey wolf according to our data supported with references are a part of mountain-taiga populations Canis lupus altaicus.

Key words: grey wolf, microsatellite markers, phylogeography.

Сведения об авторах

Воробъевская Екатерина Андреевна — студентка 5-го курса кафедры биогеографии географического факультета МГУ. Тел.: (916) 323-71-57; e-mail: nature13@yandex.ru

Балдина Светлана Николаевна — мл. науч. сотр. Института общей генетики им. Н.И. Вавилова, г. Москва. Тел.: (499) 135-50-67; e-mail: svetlananik@yandex.ru