Влияние природных гиполипидемических соединений на формирование биоплёнок штаммами рода Pseudomonas

Влияние природных гиполипидемических соединений на формирование биоплёнок штаммами рода Pseudomonas

Т. О. ПУЖЕВСКАЯ1, М. В. БИБИКОВА1, Н. Э. ГРАММАТИКОВА1, Н. А. МИХАЙЛОВА2, А. В. КАТЛИНСКИЙ3

' Государственный научный центр по антибиотикам, Москва

2 Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И. И. Мечникова, Москва

3 Московская медицинская академия им. М. И. Сеченова, Москва

Influence of Natural Hypolipidemic Compounds on Formation of Pseudomonas biofilms

T. O. PUZHEVSKAYA, M. V. BIBIKOVA, N. E. GRAMMATIKOVA, N. A. MIKHAILOVA, A. V. KATLINSKY

National Research Centre of Antibiotics, Moscow, I. I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow M. I. Sechenov Moskow Medical Academy, Moscow

Отобраны природные соединения, проявляющие значительный ингибирующий эффект на образование биопленок Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Установлен синергидный эффект отобранных соединений с гентамицином как по ингибированию образования биопленок, так и в проявлении антибиотической активности гентамицина.

Ключевые слова: биоплёнки, Pseudomonas aeruginosa, гентамицин.

Natural compounds showing considerable inhibitory effect on formation of biofilms by P.aeruginosa were selected. Synergism of the compounds with gentamicin with respect to both the inhibition of the biofilm formation and the gentamicin antibacterial effect was stated.

Key words: biofilms, Pseudomonas aeruginosa, gentamycin.

Большинство возбудителей инфекционных заболеваний способны образовывать биоплёнки — ассоциации микроорганизмов с высокой устойчивостью к антибактериальным препаратам и к воздействию защитных иммунных механизмов макроорганизма. Минимальная подавляющая концентрация (МПК) антибиотиков в отношении возбудителей, находящихся в биоплёнках в 10—1000 раз превышает МПК для этих же бактерий в планктонном состоянии [1]. Отмечается ряд факторов, определяющих резистентность бактерий в биоплёнках: медленный рост, связанный, в частности, с низким содержанием в биоплёнках кислорода [2], повышенная возможность обмена плазмидами, содержащими гены резистентности [3] и т. д. Важным моментом, обыясняющим рецидивы инфекций после проведенной терапии, является наличие перси-стирующих форм бактерий, находящихся в биоплёнках [4]. Более того, с наличием возбудителей в составе биоплёнок связывают течение многих хронических воспалительных процессов. Способность Pseudomonas aeruginosa образовывать биоплёнки на бронхах может приводить к летальному исходу при муковисцидозе. Показано, что при муковисцидозе

© Коллектив авторов, 2009

Адрес для корреспонденции: 117105 Москва, Нагатинская ул., д. 3а. ГНЦА

у P.aeruginosa функционируют различные факторы адгезии (пили, алыгинат, гемагглютинин, экзоэнзим 8, жгутик), за счет которыж бактерии связыша-ются с соответствующими рецепторами на поверхности клеток макроорганизма, содержащих лактозные и сиалозные остатки. P.aeruginosa способна легко прикреплятыся к различным поверхностям, в том числе к полимерным поверхностям с последующим формированием биоплёнки. Это свойство имеет основное значение для развития ка-тетер-ассоциированных инфекций [5—7].

Бактерии в биоплёнке окружены продуцируемым ими полимерным матриксом. Среди различных молекул, обнаруженных в составе матрикса, особое внимание привлекают липиды и внеклеточная ДНК [8, 9]. Показано, что обработка ДНКазой разрушает сформированные биоплёнки или приводит к уменышению ее массы в момент образования. Установлен синергидный эффект при совместном действии ДНКазы и антибиотиков [10]. Представляет несомненный интерес оценка возможности воздействия на формирование биоплёнок различных гиполипидемических соединений.

Материал и методы

Штаммы. В работе быи исполызован штамм P.aeruginosa АТСС 27853, полученный из коллекции кулытур микроорганизмов ГНЦА.

Таблица 1. Влияние комплексных экстрактов и фракций на формирование биоплёнок штаммом P.aeruginosa ATCC 27853

Проба Плотность биоплёнки в ЕД оптической плотности* Плотность биоплёнки в % по отношению к контролю

Контроль 0,692 100

Комплексный препарат № 169 0,963 139

Жирные кислоты комплекса № 169 1,205 174

Фракция 11 комплекса №169 0,623 90

Комплексный препарат № 162 1,019 147

Жирные кислоты комплекса № 162 1,267 183

Комплексный препарат № 59 1,107 159

Комплексный препарат № 7 1,152 167

Фракция 1 комплекса № 7 0,554 82

Фракция 3 комплекса № 7 0,484 70

Примечание. * — среднее по результатам трех опытов.

Питательные среды. Среда БТН № 1 (Биотехновация), агар Мюллера-Хинтон (БюМепеих 8. А.), булыон Мюллера-Хинтон (БюМепеих 8. А.).

Антибиотики: Полимиксин В (Рйгег, США), гентамицин (РФ).

Эксперимент. Биоплёнки получали в пластиковыгх 96-лу-ночных планшетах (Медполимер, РФ). В лунки вносили по 0,1 мл 24-часовой булыонной кулытуры бактерий, разведённой до конечной концентрации 5х107 КОЕ/мл, инкубировали 24 часа при температуре 37°С, после чего добавляли испытуемые соединения и инкубировали в последующие 24 ч. Для контроля чистоты препаратов, их вносили в среду кулытивирования без тест-организма и кулытивировали параллелыно. После инкубации удаляли остатки среды с планктонными клетками, образовавшиеся биоплёнки трёхкратно отмышали фосфатным буфером (рН 7,4) и окрашивали кристаллвиолетом (0,1%) в течение 10 мин. Для извлечения остатков красителя лунки несколыко раз промывали тем же буфером, затем добавляли раствор, содержащий ацетон:этанол в соотношении (20:80), для извлечения красителя из биоплёнок. Интенсивность окраски экстрагента (оптическую плотносты) определяли спектрофотометрически при 540 нм. Плотносты биоплёнок, полученных при наличии иссле-дуемыгх веществ и/или антибиотиков, оценивали по отношению к интактному контролю, принятому за 100%.

Минималыную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотиков определяли в жидкой питателыной среде методом серийных разведений.

Жизнеспособность бактерий оценивали по оптической плотности раствора после флуоресцентного окрашивания [11, 12]. В качестве флуоресцентного красителя исполызовали диацетат флуоресцеин (ФДА). Для проведения опыта готовили 0,1% раствор ФДА в ацетоне, непосредственно перед работой готовили водныш раствор красителя в соотношении 1:10. В стерилыные пробирки с 5 мл стерилыной воды добавляли по 100 мкл суспензии клеток P.aeruginosa. Затем в каждую пробирку вносили по 0,5 мл разведенного ФДА и перемешивали. Выщерживали в термостате 60—90 мин до зеленого окрашивания раствора в контролы-ных пробирках. Биомассу отделяли центрифугированием при 3000 об/мин и оценивали интенсивносты окраски нативного раствора спектрофотометрически при длине волны 490 нм.

Определение антибактериалыной активности исследуемых образцов в отношении P.aemgmosa АТСС 27853 определяли методом диффузии в агар [13]. При определении антимикробной активности концентраты комплексных соединений вносили в количестве 200 мкл в лунки, выгрезанные в агаре, зараженном тест-кулытурой P.aeruginosa АТСС 27853. О величине МПК каждого исследуемого образца судили по диаметру зон подавления роста тест-организма.

Результаты и обсуждение

Штамм P.aeruginosa АТСС 27853 демонстрировал способность к формированию биоплёнок, ко-

торую можно было зарегистрировать через 24 ч культивирования. В последующие сутки плотность плёнки увеличивалась. Нами бышо установлено, что МПК гентамицина и полимиксина для планктонной культуры этого штамма составили 2 мкг/мл.

Как гентамицин, так и полимиксин, внесенные в среду через 24 ч культивирования в концентрациях, соответствующих МПК — 2 мкг/мл для планктонной культуры Р.агги^пот АТСС 27853, не оказывали ингибирующего эффекта на формирование биоплёнок при последующем культивировании в течение суток. Добавление гентамицина в концентрации 64 мкг/мл к 24 часовой культуре снижало уровень образования биоплёнки тест-культурой на 27—30%. Полученные результаты подтверждают, что антибактериальные препараты, активные в отношении синегнойной палочки, проявляют активность только в отношении планктонной культуры и почти не влияют на бактериальные биоплёнки. Из литературных данных известно, что в условиях эксперимента, подобных нашему, контрольное вещество фуранон 56 в дозе 10 мкг/мл ингибировало образование биоплёнки штаммом Р.аггщто&а РА01 на 13% [14]. Природные изоляты, полученные нами при скрининге проявляли более высокую ингибирующую способность.

Ранее авторами исследования быш проведен скрининг природных гиполипидемических соединений, в результате которого бытли отобраны микроорганизмы, экстракты из мицелия которыж ингибировали синтез холестерина, триглицеридов, снижали содержание ЛПНП и повышали содержание ЛПВП в крови кроликов [15]. Выделенные вещества не обладали антибактериальным действием, но представляло интерес оценить их способность воздействовать на способность ингибировать биоплёнки, в состав которыж входят липидсодержащие полисахариды. Бышо исследовано 4 экстракта и ряд хроматографически очищенных фракций этих экстрактов.

В табл. 1 представлены результаты оценки влияния комплексных экстрактов и их фракций на формирование биопленок Р.агги&поза АТСС

Таблица 2. Влияние совместного применения гентамицина и фракций препарата № 7 на выживаемость P.aeruginosa ATCC 27853

Оптическая плотность (ОП) раствора после флуоресцентного окрашивания диацетатом флуоресцеина

Проба

Контролы

Гентамицин 1 мкг/мл

Гентамицин 1 мкг/мл + фракция 1

л

5 80 о

Гентамицин

0 Фракция 1 препарата № 7 + гента

1 Фракция 3 препарата № 7 + гента

Усиление инигибирующего действия гентамицина (64 мкг/мл) фракциями 1 и 3 препарата № 7 (9 мкг/мл) на формирование биоплёнки P.aeruginosa ATCC 27853.

27853. Препараты вносили в среду при кулытиви-ровании в концентрации 9 мкг/мл.

Способносты ингибироваты рост биоплёнки P.aeruginosa АТСС 27853 установлена у фракции 11 препарата №169, выделенной из комплексного препарата, полученного из мицелия гриба Lecanicillium 8р. №169, а также у фракций 1 и 3, выщеленныгх из мицелия Beauveria 8р. № 7. Фракция 11 препарата №169 в концентрации 9 мкг/мл снижала уровены образования биоплёнок тест-кулытурой на 10%, фракции 1 и 3, выщеленныге из кулытуры № 7, в той же концентрации — на 18% и 30% соответственно.

Комплексные экстракты и их фракции, содержащие жирные кислоты, усиливали интенсив-носты образования биоплёнок, возможно, за счет исполызования этих веществ и/или их компонентов кулытурами в качестве питателыного субстрата, что приводило к экранизации проявления ингибирующей активности отобранных фракций.

Как показано выше, гентамицин способен ин-гибироваты образование биоплёнок P.aeruginosa

1,260

1,206

0,472

0,064

АТСС 27853 в концентрации 64 мкг/мл. Нами установлен синергизм по ингибированию формирования биоплёнок тест-кулытурой гентамицина (64 мкг/мл) с отобранными фракциями (по 9 мкг/мл). Максималыное снижение формирования биоплёнок наблюдалосы при совместном воздействии гентамицина и фракции № 3, выщеленной из комплексного препарата Beauveria 8р. № 7 (рисунок).

Отобранные фракции в концентрации 1—100 мкг/мл не ингибировали рост планктонной тест-кулытуры, однако добавленные в питателыную среду при засеве одновременно с гентамицином, дозозависимо усиливали действие антибиотика. В этом случае жизнеспособносты бактерий в присутствии препаратов и гентамицина оценивали по оптической плотности раствора после флуоресцентного окрашивания. Совместное применение фракций № 1 и 3 (10 мкг/мл) и гентамици-на (1 мкг/мл — субингибирующая концентрация) приводило к значителыному снижению числа жизнеспособных микробных клеток (табл. 2).

Таким образом, в резулытате исследований отобраны соединения, ингибирующие образование биоплёнок штаммом P.aeruginosa АТСС 27853. Установлен синергизм этих соединений с гентамицином как по ингибированию формирования биоплёнок, так и в воздействии на планктонную кулытуру.

Заключение

Способносты к формированию биоплёнки P.aeruginosa затрудняет терапию антибактериалы-ными препаратами при лечении заболеваний, вызванных этим возбудителем. Предполагается, что около 80% всех заболеваний связано с образованием биоплёнок [16].

Учитывая, что формирование биоплёнок в настоящее время рассматривается как важнейший элемент патогенеза инфекционных заболеваний при которых антимикробная терапия не эффективна, необходим поиск новых соединений, как воздействующих непосредственно на биоплёнки, так и усиливающие действие существующих анти-бактериалыных препаратов.

В резулытате проведённых нами исследований было установлено, что природные соединения, полученные в резулытате скрининга, проявили способ-носты к ингибированию образования биоплёнок.

Выживаемость бактерий в биоплёнках при совместном применении отобранных препаратов и гентамицина значительно уменьшалась. Наблюдалось потенцирование действия антибиотика в отношении тест-культуры P.aeruginosa ATCC 27853 (МПК снижалось в 2—3 раза).

ЛИТЕРАТУРА

1. Costerton J. W, Lewandowski Z., Caldwell D. E. et al. Microbial biofilms. Annu Rev Microbial 1995; 49: 711—745.

2. Costerton J. W, Stewart P. S., Greenberg E. P. Bacterial biofilms: a common cause ofpersistent infections. Science 1999; 284: 1318—1322.

3. Roberts S. K., Bass C, Brading M. H. et al. Biofilm formation and structure: what's new? BioLine 1999; 15—35.

4. Lewis K Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother 2001; 4: 999—1007.

5. Ефименко H. А., Гучев И. А., Сидоренко С. В. Инфекции в хирургии. Фармакотерапия и профилактика. Смоленск, 2004; 296.

6. Hoiby N. Prospects for the prevention and control of Pseudomonal infection in children with cystic fibrosis. Pediatr Drugs 2000; 2: 6: 451.

7. Juhas M, Eberl L, Tummler B. Quorum sensing: the power of cooperation in the world of Pseudomonas. Environ Microbiol 2005; 7: 459—471.

8. Тец Г. В. Роль внеклеточной ДНК и липидов матрикса во взаимодействии бактерий биоплёнок с антибиотиками: Автореф дисс канд мед наук. Санкт-Петербург, 2007.

Таким образом, отобранные природные препараты ингибируют формирование биоплёнок у P.aeruginosa и усиливают антимикробное действие гентамицина, что свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения этих препаратов.

9. Мошкевич И. Р. Микробные биоплёнки при смешанных инфекциях: Автореф дисс канд мед наук. Санкт-Петербург, 2007.

10. Тец Г. В., Артеменко К. Л. Совместное действие антибиотиков и дезоксирибонуклеазы на бактерии. Антибиотики и химиотер 2006; 6: 11—14.

11. Paton A. M., Jones S. H. The observation and enumeration of microorganisms in fluids using membrane filtration and incident fluorescence microscope. J Appl Bact 1975; 38: 199—200.

12. Joux F., Lebaron Р. Use of fluorescent probes to assess physiological functions of bacteria at single-cell level. Microbes and Infection. 2000; 2: 1523—1535.

13. ЕгоровH. С. Основы учения об антибиотиках. М.: 2004; 528.

14. Hu J.-F., Garo E., Goering G. Bacterial biofilm inhibitors from Diospyros dendo. J Nat Prod 2006; 69: 118—120.

15. Чмелъ Я. В., Бибикова М. В., Спиридонова И. А. и др. Скрининг природных соединений с гиполипидемической активностью. Антибиотики и химиотер 2004; 8—9: 8—12.

16. Spoering A. L., Lewis K. Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials. J Bacteriol 2001; 183: 6746—6751.