Влияние водорастворимых полисахаридов девясила на продукцию no и экспрессию ангиназы макрофагами мыши

СИБИРСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ № 32008

ВЖ больше в 2,8 раз; фагоцитарная способность нейтрофилов в 1,8 раз больше; степень деструкции вагинального эпителия в 4,8 раз больше контроля.

У пациенток с БВ лактобактерии и аэробная УПМ отсутствовали, выявлялись анаэробы и гарднереллы. Активность миелопероксидазы лейкоцитов при БВ на 49,5% ниже контроля и на 37,1% меньше этого показателя при НВ. Активность каталазы ВЖ при БВ в 1,7 раз ниже контроля и в 4,9 раз меньше, чем при НВ. Показатели НСТ-теста при БВ в 1,7 раз меньше контроля и в 3 раза меньше, чем при НВ. Степень деструкции эпителиальных клеток в 9,6 раз выше контроля и в 2 раза больше, чем при НВ.

Пероксидазы (миелопероксидаза нейтрофилов, каталаза ВЖ) и перекись водорода лактобактерий - компоненты, определяющие кислородзависимую бактерицидность ВЖ. Генерированные лактоба-циллами активные формы кислорода препятствуют росту анаэробных микроорганизмов. В результате жизнедеятельности аэробных микроорганизмов образуется гидроксильный анионрадикал, который инициирует процессы пероксидации макромолекул, в том числе и липопротеинов клеточных мембран эпителия. В целях антиокси-дантной защиты от аутоповреждения аэробные микроорганизмы синтезируют каталазу, которая разрушает супероксиданионрадикал и перекись водорода. Многие авторы указывают, что при БВ увеличивается активность протеолитических ферментов и происходит деградация белковых макромолекул. В результате происходит активация процессов клеточной дезинтеграции и, как следствие, избыточная десквамация эпителиальных клеток.

Заключение. Таким образом, при НВ индигенная микрофлора влагалища (лактобактерии) обнаруживалась в меньшем количестве, а аэробная УПМ - в значительно большем титре, чем у здоровых женщин. При этом заболевании отмечалась активация фагоцитоза (выражающаяся в показателях НСТ-теста), активность миелопе-роксидазы нейтрофилов была меньше, чем в контроле. Более низкие значения миелопероксидазы могли быть обусловлены некоторым «истощением» ее активности в результате стимуляции фагоцитоза. Активность каталазы ВЖ была при НВ больше контроля. Это может быть обусловлено синтезом этого фермента аэробной УПМ для защиты от аутоповреждения и высвобождением каталазы из поврежденных эпителиоцитов слизистой оболочки влагалища.

При БВ отмечались более выраженные (в сравнении с контролем и НВ) нарушения микробиоценоза влагалища с полным исчезновением индигенной микрофлоры, отсутствием аэробной УПМ, наличие только анаэробов. При этом заболевании обнаружены наиболее низкие показатели активности миелопероксидазы нейтрофилов и каталазы ВЖ, характеризующие кислородзависимую бактерицидность ВЖ. Также при этой патологии значительно угнетен фагоцитоз; степень деструкции вагинального эпителия имеет максимальные значения.

В.О. Ткачев, Н.Н. Вольский, О.Т. Кудаева, О.П. Колесникова МЕТАБОЛИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ МАКРОФАГОВ ОПРЕДЕЛЯЕТ ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ РТПХ

ГУ нии клинической иммунологии сО рАМн, г новосибирск

Цель исследования: исследовать метаболическое состояние макрофагов в динамике развития хронической реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) с учетом ее клинических вариантов (Th1- и ^2-зависимого).

Материал и методы. Хроническая РТПХ индуцировалась переносом лимфоидных клеток в полуаллогенной системе DBA/2 ^ (C57B16 x DBA/2)F1 (BDF1) в дозе 65х106 клеток двукратно с интервалом 6 дней. О частоте развития ^2-зависимого варианта хронической РТПХ судили по развитию аутоиммунного иммуноком-плексного гломерулонефрита, характеризующегося стойкой проте-инурией (> 3,5 мг/мл).

Для изучения влияния дегидроэпиандростерона сульфата (DHEA-S) на пути метаболизма аргинина в опытах in vivo гормон вводили подкожно в дозе 37,5 мкг/кг веса интактным мышам BDF1, а в опытах in vitro добавляли к клеточным культурам в конечной концентрации 0,2 мг/мл.

Исследование продукции оксида азота и активности макрофа-гальной аргиназы проводилось в культурах резидентных перитоне-альных макрофагов, полученных стандартным способом.

Продукция оксида азота оценивалась с помощью реактива Грис-са по содержанию нитритов в супернатантах клеточных культур макрофагов, спустя 48 часов культивирования. Для активации NO-синтазы использовали LPS (E. Coli B5:055 10 мкг/мл) и супернатант смешанной культуры лимфоцитов, содержащий IFN-y.

Активность аргиназы в макрофагах оценивали по скорости образования мочевины, количественно определяемой при помощи

альфа-изонитрозопропиофенона, при инкубации лизата клеток с аргинином.

Результаты. Установлено, что на ранних сроках после индукции хронической РТПХ (первые две недели после индукции) не происходит значимого изменения активности макрофагальной аргиназы. Продукция оксида азота имеет тенденцию к увеличению на третьи сутки после первого переноса. На девятые сутки (третьи сутки после второго переноса) достоверно увеличивается спонтанная и LPS/IFN-у-стимулированная продукция NO.

На поздних сроках особенности метаболизма аргинина зависят от варианта течения хронической РТПХ. При ^2-зависимом варианте преобладают макрофаги, отличающиеся более высокой активностью аргиназы (на 83%), а при Thl-зависимом варианте - более высоким уровнем продукции NO, стимулированной LPS или LPS в сочетании с IFN-y (на 46%) в сравнении с клетками мышей с оппозитным вариантом течения РТПХ.

В опытах in vitro показано, что DHEA-S существенно угнетает активность аргиназы (на 63%) и одновременно несколько снижает LPS/IFN-у-стимулированную продукцию NO (на 19%), что приводит к сдвигу баланса в сторону преобладания NO-синтазы.

Вводимый интактным мышам BDF1 DHEA-S существенно увеличивает LPS-стимулированную продукцию оксида азота (в 5,6 раза через 12 часов и в 7,2 раза - через 24 часа после введения гормона), при этом не оказывая влияния на LPS/IFN-у-стимулированную продукцию и не меняя активность аргиназы в клетках.

Введение DHEA-S четырехкратно в той же дозе на этапе индукции РТПХ приводит к преимущественному развитию Thl-зависи-мого варианта хронической РТПХ, уменьшая долю мышей с аутоиммунным поражением почек более чем в два раза.

Заключение. Полученные данные позволяют сделать вывод о важной роли метаболического состояния макрофагов в патогенезе иммунопатологических состояний при Thl- и ^2-зависимых вариантах хронической РТПХ. Влияние DHEA-S на NO-синтаза/ар-гиназный баланс in vivo и in vitro, по всей видимости, тесно связано с его способностью направлять иммунные реакции в Thl-сторону. Таким образом, пути метаболизма аргинина макрофагов могут являться важной точкой приложения терапевтического воздействия при коррекции нарушений иммунитета, связанных с изменением Thl/ ^2-баланса.

Е.Г. Учасова, А.А. Лигачева, М.Г. Данилец, Н.В. Бельская, Ю.П. Бельский, Е.С. Трофимова, А.М. Гурьев*, М.В. Белоусов*, Р.Р. Ахмеджанов*, М.С. Юсубов*, В.И. Агафонов ВЛИЯНИЕ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ ДЕВЯСИЛА НА ПРОДУКЦИЮ N0 И ЭКСПРЕССИЮ АРГИНАЗЫ МАКРОФАГАМИ МЫШИ нии фармакологии сО рАМн, Томск; *ГОу ВпО сибирский государственный медицинский университет росздрава, г Томск

Известно, что Thl и Th2 цитокины активируют макрофаги (Мф) классическим или альтернативным путем, поляризуя их в М1 или М2 клетки [Goerdt S., 1999; Mills C.D., 2000; Mantovani A., 2002; Mosser D.M., 2003; Kreider T., 2007]. Ml (провоспалительные Мф) интегрированы в Thl иммунный ответ (секретируют TNF-a, IL-12, IL-lß, IL-6, IL-23, участвуют в деструкции экстрацеллюлярного ма-трикса, стимулируют апоптоз) [Goerdt S., 1999; Mantovani A., 2004; Mantovani A., 2006]. M2 противодействуют воспалению и поддерживают Th2 тип ответа (вырабатывают IL-10, IL-1ra, TGF-ß, участвуют в ангиогенезе и восстановлении поврежденной ткани, ремоделировании, поддерживают пролиферацию клеток) [Gratchev A., 2001; Gordon S., 2003; Mosser D.M., 2003; Mantovani A., 2004; Kreider T., 2007]. Поляризованные Мф обладают особым состоянием метаболизма аргинина: у М1 он является субстратом для iNOS и преобразовывается в оксид азота, а у М2 - для аргиназы (Arg) с выходом полиаминов и орнитина [Munder M., 1998; Kreider T., 2007]. В свою очередь, клетки моноцитарно-макрофагального ряда (в том числе и Мф) в значительной степени определяют направление поляризации Т-хелперов, продуцируя соответствующие цитокины (ИЛ-12 или ИЛ-10) в раннюю фазу взаимодействия организма с антигеном [Macatonia S.E., 1995]. Учитывая роль Мф в определении качества иммунного ответа, представляется актуальным выявить вещества, способные регулировать функциональное состояние Мф. Свое внимание мы сосредоточили на полисахаридах (ПС), поскольку показано, что они могут взаимодействовать с различными рецепторами Мф, вызывая при этом появление у клеток воспалительных или противовоспалительных свойств [Schepetkin I.A., 2006].

МАТЕРИАЛЫ.

Цель исследования: изучить in vitro действие водорастворимых ПС, выделенных из девясила, на NO-продуцирующую активность Мф и экспрессию ими аргиназы.

Материал и методы. Использованы мыши линии BAlb/cY. Водорастворимые ПС были выделены из фармакопейного сырья девясила на каф. химии СибГМУ по стандартной методике. Мф из суспензии перитонеальных клеток получали методом прилипания к пластику, затем культивировали в 96-луночных планшетах и оценивали активность iNOS и Arg по продуктам - нитритам (в супернатанте с использованием реактива Грейса) и мочевине (в клетках при помощи коммерческой тест-системы). Иммунный ответ Th2 типа моделировали общепринятым способом с помощью овальбумина (OVA) [Laitinen T, 2004]. Содержание IgG1 и IgE в сыворотке крови животных определяли иммуноферментным методом с использованием коммерческих тест-систем. Th1 иммунный ответ вызывали парентеральным введением эритроцитов барана [Yokozeki Н., 2000], затем определяли число антителообразующих клеток (АОК) и величину реакции ГЗТ традиционными методами [Хаитов Р.М., 1999].

Результаты. Изучение влияния ПС девясила на иммунную систему показало, что под действием ПС происходит усиление реакции ГЗТ, но число АОК не меняется; кроме того, ПС девясила уменьшают летальность мышей в результате анафилактического шока, подавляют продукцию IgE и IgG 1. Следовательно, исследуемое вещество стимулирует Th1 и подавляет Th2 иммунный ответ. При оценке действия ПС на продукцию NO перитонеальными клетками был использован широкий диапазон доз (2,5-1000 мкг/мл), что позволило выявить оптимальную концентрацию - не более 20 мкг/мл. Сравнение действия ПС девясила и ЛПС (серотип О111:В4) на Мф показало, что ПС стимулировали продукцию NO макрофагами слабее, чем ЛПС. Эксперименты с полимиксином В (антагонист ЛПС [Lynn W.A., 1992]) подтвердили, что NO-стимулирующая активность ПС девясила не связана с загрязнением исследуемого вещества эндотоксином. ПС девясила увеличивали также ЛПС-стимулированную продукцию NO макрофагами. На фоне NO-активирующего действия ПС наблюдалось также увеличение экспрессии аргиназы как в отсутствии ЛПС, так и в его присутствии. При культивировании Мф с добавлением ПС девясила и ингибитора сигнальной молекулы р38 (SB203580) не происходило увеличение продукции NO, что свидетельствует о полной зависимости NO-активирующего эффекта ПС девясила от р38. При этом стимулирующее действие ПС в отношении Arg сохранялось, т.е. ПС не вовлекают р38 в активацию аргиназы. При исследовании участия PI3K в механизмах влияния ПС девясила на Мф с использованием ингибитора LY294002 было обнаружено, что в его присутствии NO-стимулирующее действие ПС полностью исчезает. При этом ингибитор PI3K лишь снижал, но не отменял полностью активирующее влияние ПС девясила в отношении аргиназы.

Заключение. Таким образом, ПС девясила активируют Th1 и подавляют Th2 иммунный ответ, стимулируют iNOS макрофагов, вовлекая в этот процесс сигнальные молекулы р38 и PI3K, а также увеличивают экспрессию макрофагами Arg, не затрагивая при этом р38 и частично используя PI3K.

Ю.А. Фефелова, В.Г. Николаев, Л.А. Нагирная*, С.Ю. Скобелева*

активность ферментов разных метаболических

ПУТЕЙ В КЛЕТКАХ ИММУННоЙ СИСТЕМЫ У ДЕВУШЕК

различных соматотипов

ГОу ВпО красГМА им. проф. В.М. Войно-Ясенецкого росздрава;

* ГУ нии медицинских проблем севера сО рАМн, г красноярск Цель исследования:проведение сравнительного анализа активности ферментов различных метаболических путей в клетках иммунной системы у девушек разных соматотипов.

Материал и методы. Обследовано 386 практически здоровых девушек юношеского возраста - студенток Красноярской медицинской академии (возраст обследованных составил 16-20 лет). Антропометрические измерения девушек с последующим соматотипирова-нием проводились по методике, описанной в пособии В.В. Бунака «Антропометрия» (1941). Конституциональный тип девушек определялся по схеме соматотипирования В.П. Чтецова с соавт. (1979), с использованием классификации и терминологии И.Б. Галанта. Активность дегидрогеназ лимфоцитов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) осуществляли по методу А.А. Савченко, Л.Н. Сунцовой (1989). Активность сукцинатдегидроге-назы (СДГ) определяли по методике Р.П. Нарциссова (1969).

Результаты. Самыми распространенными среди обследованных нами были девушки с эурипластическим (26,1%), субатлетическим

(22%), атлетическим (19,2%) и стенопластическим (9,2%) соматоти-пами, что согласуется с данными литературных источников (Николаев В.Г. с соавт., 2001). Остальные соматотипы встречались с низкой частотой. Для дальнейшего исследования были выбраны девушки, относящиеся к 4 наиболее часто встречающимся соматотипам: атлетическому, субатлетическому, эурипластическому и стенопластиче-скому. Представители эурипластического соматотипа характеризовались самыми высокими габаритными показателями (рост -167,01 ±0,61 см, масса - 71,60± 1,07 кг), а также максимальными показателями жирового (29,36±0,81 кг, который составил 40,84±0,71% от массы тела); костного (9,89±0,11 кг, который составил 13,89±0,19%) и мышечного (27,57±0,53 кг, который составил 38,58±0,59%) компонентов тела. Наиболее низкие габаритные показатели (рост

- 157,38±0,51 см и масса - 48,80±0,99 кг) и показатели, характеризующие компонентный состав тела (жировой компонент -14,92±0,81 кг, составляющий 30,23±1,25% от общей массы тела; костный - 7,54±0,10 кг, что составило 15,54±0,22%; мышечный

- 20,53±0,50 кг, составляющий 42,17±0,85%) выявлены у девушек стенопластического соматотипа. У субатлетического соматотипа, несмотря на статистически значимо более высокие рост и массу тела, выявилось сходное со стенопластическим соматотипом соотношение процентных показателей тканевых компонентов тела (жировой компонент составил 33,63±1,10% от массы тела; костный

- 15,99±0,15%, мышечный составил 41,68±0,86%). Активность СДГ в лимфоцитах крови практически не отличалась у девушек разных соматотипов. Более высокие показатели активности ЛДГ в лимфоцитах крови были у девушек стенопластического и субатлетического соматотипов, но статистически достоверных отличий между сравниваемыми соматотипами не выявлено. Активность Г6ФДГ также была более высокой у девушек стенопластического и субатлетического соматотипов по сравнению с другими соматотипами. Причем разница в активности Г6ФДГ была статистически достоверна между девушками субатлетического и эурипластического соматотипов (р<0,05).

Заключение. Известно, что в клетке функционируют три основных метаболических пути превращения субстратов: цикл Кребса, гликолиз и пентозный шунт. Одним из важнейших ферментов, достаточно полно характеризующих работу цикла Кребса, является СДГ. Активность СДГ в лимфоцитах крови незначительно отличалась у девушек всех обследованных соматотипов. Деятельность гликолиза и пентозного шунта тесно связана между собой. У девушек субатлетического и стенопластического соматотипов активность ферментов, характеризующих работу и гликолиза (ЛДГ), и пентозного шунта (Г6ФДГ) была более высокой по сравнению с другими соматотипами. Одинаковая направленность уровня активности ферментов гликолиза и пентозного шунта у девушек этих соматотипов может носить не случайный характер, если учесть, что представители субатлетического и стенопластического соматотипов имеют близкие характеристики компонентного состава тела. известно, что активность ферментов лимфоцитов является объективным критерием оценки функционального состояния этих клеток (Нарциссов Р.П., 1984; Захарова Л.Б., с соавт., 1986, 1999; Робинсон М.В.,1994; Тру-факин в.А. с соавт., 1997; Савченко А.А. с соавт., 2006). выявленные особенности метаболических параметров клеток иммунной системы могут сказываться на функциональных возможностях иммунных клеток у девушек разных соматотипов.

Н.А. Хонина, Е.Г. Романова, М.А. Тихонова, Н.М. Пасман, Е.Р. черных

индукция иммуносупрессии методом аллоиммунизации лимфоцитами партнера при бесплодии неясного генеза

Гу нии клинической иммунологии сО рАМн, г новосибирск

Одним из важных факторов успешной имплантации оплодотворенной яйцеклетки и физиологического течения беременности является супрессорная перестройка иммунной системы. Низкий иммунный ответ из-за сходства по отдельным НLA-локусам препятствует адекватному распознаванию аллоантигенов и продукции IgG антител (блокирующие факторы, БФ), предохраняющих плод от воздействия иммунной системы матери. При этом дефицит БФ часто ассоциируется с бесплодием.

Цель исследования: провести клинико-иммунологический анализ эффективности аллоиммунизации лимфоцитами партнера у женщин с бесплодием неясного генеза.

Материал и методы. В исследование были включены 169 женщин с бесплодием неясного генеза в возрасте от 19 до 42 лет (36,5±3,5),