МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ФАКТОР IX, А ТАКЖЕ КОМПОЗИЦИИ, СПОСОБЫ И ВАРИАНТЫ ПРИМЕНЕНИЯ ПЕРЕНОСА ГЕНОВ В КЛЕТКИ, ОРГАНЫ И ТКАНИ

1. Рекомбинантный вектор AAV для лечения гемофилии B, содержащий капсид и ДНК-геном, где указанный капсид содержит белок VP1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; а указанный геном является одноцепочечным и содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок человеческого фактора IX, имеющего такую же аминокислотную последовательность, которая кодируется SEQ ID NO: 10, по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 10 и необязательно прервана интроном.
2. Рекомбинантный вектор AAV по п.1, в котором указанный геном содержит следующие элементы в направлении от 5'-конца к 3'-концу:
(a) первый ITR AAV2,
(b) энхансер ApoE HCR-1,
(c) промотор AAT,
(d) указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий фактор IX,
(e) нуклеотидная последовательность полиаденилирования; и
(f) второй ITR AAV2.
3. Рекомбинантный вектор AAV по п.1, в котором указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий фактор IX, не содержит динуклеотиды CpG.
4. Вектор rAAV по п.2, где
(a) нуклеотидная последовательность первого ITR AAV2 состоит из нуклеотидов 12-141 последовательности SEQ ID NO: 26,
(b) нуклеотидная последовательность указанного энхансера ApoE HCR-1 состоит из нуклеотидов 152-472 последовательности SEQ ID NO: 12,
(с) нуклеотидная последовательность указанного промотора АТТ состоит из нуклеотидов 482-878 последовательности SEQ ID NO: 12,
(d) нуклеотидная последовательность указанной нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант человеческого фактора IX Padua, состоит из нуклеотидов 908-3731 последовательности SEQ ID NO: 12,
(e) нуклеотидная последовательность указанной последовательности полиаденилирования состоит из нуклеотидов 3820-4047 последовательности SEQ ID NO: 12; и
(f) нуклеотидная последовательность указанного второго ITR AAV2 состоит из нуклеотидов 3557-3686 последовательности SEQ ID NO: 26.
5. Вектор rAAV по п.4, где геном содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую нуклеотидам 1-4204 последовательности SEQ ID NO: 12.
6. Способ лечения человека, страдающего от гемофилии В, включающий введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества вектора rAAV по любому из пп.1-4.
7. Способ по п.6, где индивидуум страдает от тяжелой гемофилии В, и где указанное лечение приводит к эффективному уменьшению симптомов гемофилии от тяжелой до умеренной или легкой формы гемофилии B.
8. Способ по п.6, где указанное лечение является эффективным в отношении достижения уровня активности FIX в плазме, составляющего по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% или 50% от нормальной активности FIX.
9. Способ по п.8, где указанное лечение является эффективным в отношении достижения уровня активности FIX в плазме в течение продолжительного периода времени, составляющего по меньшей мере 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 13 месяцев, 14 месяцев, 15 месяцев, 16 месяцев, 17 месяцев, 1,5 года, 2 года, 2,5 года, 3 года, 3,5 года, 4 года, 4,5 года или 5 лет.
10. Способ по п.9, где указанное лечение является эффективным для достижения по меньшей мере 1% активности FIX в плазме в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или 5 лет.
11. Способ по п.9, где указанное лечение является эффективным для достижения по меньшей мере 5% активности FIX в плазме в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или 5 лет.
12. Способ по п.9, где указанное лечение является эффективным для достижения по меньшей мере 10% активности FIX в плазме в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или 5 лет.
13. Способ по п.9, где указанное лечение является эффективным для достижения по меньшей мере 20% активности FIX в плазме в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или 5 лет.
14. Способ по п.9, где указанное лечение является эффективным для достижения по меньшей мере 30% активности FIX в плазме в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или 5 лет.
15. Способ по п.9, где указанное лечение является эффективным для достижения по меньшей мере 40% активности FIX в плазме в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или 5 лет.
16. Способ по п.9, где указанное лечение является эффективным для достижения по меньшей мере 20% активности FIX в плазме в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 6 месяцев.
11
17. Способ по п.16, где терапевтически эффективное количество указанного вектора AAV составляет примерно 5,0⋅10 вг/кг.
18. Способ по п.6, где лечение приводит к эффективному уменьшению частоты, с которой среднему человеку с тяжелой гемофилией B требуется заместительная терапия белком FIX для поддержания адекватного гемостаза, примерно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.
19. Способ по п.6, где лечение эффективно уменьшает частоту спонтанных кровотечений в суставах человека с тяжелой гемофилией В примерно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% по сравнению со средним человеком с тяжелой гемофилией B, не получающим лечение.
20. Способ по п.6, где указанный вектор AAV индуцирует титр антител против капсида, который не превышает 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15 или 1:20 при определении, по меньшей мере, через 4 недели после введения.
21. Способ по п.6, где указанный вектор AAV индуцирует Т-клеточный иммунный ответ против капсида, который при измерении с помощью анализа ELISPOT соответствует не более 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 пятнообразующим единицам на 1 млн РВМС, если анализ проводят не менее чем через 4 недели после введения.
22. Способ по п.6, где указанный вектор AAV индуцирует повышение уровня фермента печени не более чем на 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 100%, 200%, 300%, 400% или 500% от верхнего предела нормального (ULN) значения для фермента.
23. Способ по п.22, где указанный фермент представляет собой аланинаминотрансферазу (ALT), аспартатаминотрансферазу (AST) или лактатдегидрогеназу (LDH).
24. Способ по п.6, где указанное лечение является эффективным для достижения средней активности FIX в плазме, которая составляет по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 20%, 30% или 40% от нормальной, со стандартным отклонением менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1, при измерении по меньшей мере через 8 недель после введения вектора.
25. Способ по любому из пп. 6-24, где указанный вектор AAV вводят в составе фармацевтической композиции, содержащей пустые капсиды, где указанные пустые капсиды содержат белок VP1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
26. Способ по п.25, где отношение пустых капсидов к указанному вектору AAV составляет примерно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 или 10:1.
27. Клетка-хозяин, содержащая непрерывную нуклеиновую кислоту, включающую нуклеотидную последовательность, идентичную нуклеотидной последовательности, состоящей из нуклеотидов 142-4096 SEQ ID NO: 12.
28. Клетка-хозяин по п.27, дополнительно содержащая белок rep AAV, капсидный белок AAV и аденовирусный хелперный белок (белки).
29. Клетка-хозяин по п.28, где капсидный белок AAV содержит последовательность SEQ ID NO: 4, или последовательность, идентичную ей на 90% или более.
30. Клетка-хозяин по п.28, где клетка-хозяин экспрессирует белок FIX Padua.
31. Способ получения вектора AAV, содержащего нуклеиновую кислоту, включающую нуклеотидную последовательность 142-4096 SEQ ID NO: 12, который включает культивирование клетки-хозяина по п.28 в условиях, обеспечивающих упаковку указанной нуклеиновой кислоты в частицы AAV, с получением вектора AAV.
32. Способ по п.31, дополнительно включающий очистку или выделение полученного таким образом вектора AAV.
33. Вектор AAV, полученный способом по п.31.
34. Выделенный или очищенный вектор AAV, полученный способом по п.32.