Влияние комплексона гидрооксиэтлидендифосфоновой кислоты на Изменеие состава питптельной среды

М. Н. Астраханцева, А. Ю. Крыницкая, В. С. Гамаюрова ВЛИЯНИЕ КОМПЛЕКСОНА ГИДРООКСИЭТЛИДЕНДИФОСФОНОВОЙ КИСЛОТЫ НА ИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ И РОСТ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS

Исследовано влияние ГОЭДФК на процесс подготовки питательной среды с основой из пшеничных отрубей для культивирования бактерий Bacillus subtilis, являющихся основой биологического средства защиты растений. Обнаружено два экстремума в концентрационной зависимости выделения белка от дозы комплексона. Сделано предположение, что, подобный характер зависимости связан с образованием моно - и бискомплексов ГОЭДФК с катионами кальция, участвующими в стабилизации структуры отрубей. Культивирование бактерий Bacillus subtilis на средах с повышенной концентрацией белка, полученных с участием комплексона, приводит к ингибированию роста биомассы. Найдено, что стимуляция роста бактерий происходит при внесении комплексона в готовую питательную среду параллельно с инокулятом в концентрации 2 г/л.

Введение

Интенсивное применение в сельском хозяйстве химических средств защиты растений приводит не только к загрязнению окружающей среды, но и к нарушению экологического равновесия в природе и, как следствие, к появлению новых устойчивых форм патогенов.

Ухудшение экологической обстановки и забота о сохранении здоровья людей требуют поиска новых подходов в системе борьбы с вредителями, болезнями и сорняками агроценозов. Наиболее перспективным представляется использование биологически активных микроорганизмов-антагонистов для защиты растений. Особого внимания заслуживает проблема создания и практического применения препаратов из живых культур аэробных спорообразующих бактерий. В этой связи интерес представляют бактерии рода Bacillus subtilis, которые часто являются основой препаратов для защиты растений.

Теоретическим обоснованием использования эндофитных бактерий из рода Bacillus в защите растений являются:

- нетоксичность для человека и животных;

- широкое распространение в почве и в составе обычной микрофлоры растений;

- высокая антагонистическая активность по отношению к фитопатогенным микроорганизмам;

- выделение физиологически активных веществ фунгицидной природы.

Известно, что поддержание ионного гомеостаза играет важную роль в регуляции

физиологических процессов, происходящих в клетке. В ряде метаболитических процессов значительную роль играет присутствие неорганических ионов, например, кальция, магния и других. Поскольку большей частью эти ионы находятся в организме в форме комплексных соединений, то представляется возможным облегчить их доступ в клетку путем добавления комплексонов. Это может оказать положительное влияние на скорости процессов

метаболизма в клетке и, как следствие, на скорость накопления биомассы, выделения биологически активных веществ[1].

В опубликованной литературе имеется упоминание об интенсификации метаболизма микроорганизмов при использовании комплексных соединений металлов с биологически активными комплексонами [2,3]. По функциональной роли в организме биокомплек-соны металлов могут быть классифицированы как транспортные вещества, активаторы инертных молекул, биокатализаторы [4,5]. Некоторые комплексоны способны выполнять функции катализаторов [6].

Среди множества комплексонов особый интерес представляют бисфосфоновые кислоты [7,8]. Благодаря специфической стереометрии и взаимному влиянию фосфоновых фрагментов дифосфонаты имеют ряд уникальных свойств по сравнению с другими ком-плексонами. Дифосфонаты являются структурными аналогами неорганического пирофосфата, одного из важнейших метаболитов в клетке, участвующего как продукт или субстрат в более чем шестидесяти биохимических реакциях. Обнаружено, что дифосфонаты, и в частности гидрооксиэтилидендифосфоновая кислота (ОЭДФ), являются эффективными регуляторами кальциевого обмена в живых организмах [9].

При промышленном культивировании B. subtilis одним из наиболее экономичных субстратов для роста бактерий являются среды на основе пшеничных отрубей. Подобная среда обеспечивает все потребности бактерий. Кроме того, она содержит необходимые для роста биологически активные вещества, микроэлементы и макроэлементы.

Согласно литературным данным ОЭДФ является эффективным дестабилизатором крахмальных структур растительного сырья, особенно в процессе дополнительной термической обработки [10]. Такой прием позволяет повысить питательную ценность среды для культивирования микроорганизмов, что приводит к улучшению ростовых характеристик процесса ферментации.

Действие комплексообразующих компонентов на среды с применением пшеничных отрубей ранее не исследовалось. В связи с этим целью работы являлось: а) изучение влияния комплексона на состав питательной среды при его внесении на разных этапах ее приготовления; б) исследование роста бактерий Bacillus subtilis на этих средах; в)изучение действия комплексона ОЭДФ на рост B. subtilis при его непосредственном внесении в готовую питательную среду перед засевом инокулята.

В качестве объекта исследования были выбраны бактерии B. subilis штамм Д26. Это грам-положительная, подвижная, аэробная, спорообразующая палочка, изолированная из эндотканей здоровых растений. Хранение и поддержание музейной культуры проводили путем периодического пересева на сплошную агаризованную среду Громыко следующего состава:

Перед началом эксперимента микробную культуру с музейного «косяка» пересевали в чашки Петри с агаризованной средой того же состава. Проращивание проводили в термостате при 3234 °С в течение двух суток.

Далее маточная культура вносилась в жидкую питательную среду на основе пшеничных отрубей в количестве 2%. Жидкую среду готовили следующим образом: 40 г пшеничных отрубей заливали водопроводной водой (1 л), натаивали в течение 40 минут. Далее среда подвергалась завариванию на водяной бане 30 минут и фильтровалась. В качестве буфера добавляли 1% прокален-

Экспериментальная часть

Мясопептонный бульон Сусло пивное неохмеленное Н2О Агар

1л

0,5 л  0,5 л 2 %

ного мела, раствором КаОИ доводили значение рН до 7,0-7,2. Стерилизовали среду при 2 ати в течение 30 минут.

Растворы комплексонов готовили методом последовательных разведений. Добавление хе-латирующего агента в среду проводили на разных стадиях приготовления питательной среды и непосредственно перед началом ферментации. Процесс культивирования проводили на водяных встряхивателях в течение 48 часов при температуре 36°С.

Перед проведением анализов нефильтрованные среды центрифугировали при 4000 об/мин в течение 20 минут. Определение редуцирующих веществ проводили по методу Бертрана [11]. Анализ содержания белка в культуральной жидкости проводили биуретовым методом [12]. Концентрация биомассы определялась турбиметрическим методом. Измерение оптической плотности проводили при длине волны 490 нм [13].

Результаты и их обсуждение

Известно, что пшеничные отруби представляют собой отход производства и состоят, в основном, из зерновых оболочек. Однако часто они содержат также зародыши и алейроновый слой. Из литературных данных известно, что питательные вещества, наиболее ценные в биологическом отношении, сосредоточены в незначительной по массе зародышевой части и в оболочках [14]. Основным компонентом зерновых оболочек является клетчатка и гемицеллюлоза [15]. В алейроновом слое и в зародыше довольно высокая концентрация белка, которая может и составлять до 22% от общего количества белка зерна [9, 16]. Кроме того, минеральные вещества зерна находятся главным образом в периферийных частях зерновки, где они играют стабилизирующую функцию [15, 17].

Таким образом, пшеничные отруби представляют достаточно стойкий комплекс полисахаридов, белков и минеральных веществ, что вызывает необходимость использования дополнительных методов для повышения степени извлечения питательных веществ из отрубей. Принимая во внимание стабилизирующую роль катионов, в частности катионов кальция, нами была исследована возможность использования для этих целей комплексообразующего агента ОЭДФ.

Согласно общепринятой методике приготовления питательных сред на основе зерна и продуктов его переработки предусматривается необходимость таких стадий, как заваривание и автоклавирование. В процессе заваривания происходит набухание белков и полисахаридов сырья, что ведет к клейстеризации замеса. Параллельно, в результате самооса-харивания и кислотного гидролиза, крахмал (в меньшей степени другие гемицеллюлозы -пентозаны, гексозаны) подвергается ферментативному гидролизу.

Процесс автоклавирования имеет своей целью не только стерилизацию питательной среды, но также повышение ее добротности. На этом этапе заканчиваются процессы поглощения воды, набухания и клейстеризации, происходит растворение некоторой части пентозанов, гексозанов, белков и других компонентов [15].

Анализ полученных результатов показал, что изменение содержания редуцирующих веществ и белка в средах на разных стадиях их приготовления происходит неодинаково (рис.1, 2).

Как видно из рис. 1 по окончании стадии заваривания наблюдается два экстремума содержания РВ, соответствующих концентрациям ОЭДФ 2г/л и 5 г/л. В целом характер изменения этого показателя носит синусоидальный характер. Возможно, это связано с особенностями ОЭДФ как хеланта. Установлено, что комплексон может образовывать протонированные и нейротонированные моно- и дикомплексы с ионами щелочноземельных металлов. Составы образуемых комплексов, в значительной степени, зависят от рН среды. Как было показано Матковской Т. А. с соавт. при рН » 7,0 в средах, содержащих

Рис. 1 - Содержание РВ и белка в питательной среде после заваривания в зависимости от концентрации ОЭДФ

катионы Са+2 ,наблюдают комплексы Са2Ц в то время как при снижении рН происходит его вытеснение комплексами СаИЬ [9]. Учитывая, что ионы кальция стабилизируют оболочки зерна, из которых в основном состоят отруби, можно предполагать, что именно процесс удаления этих ионов под действием комплексонов приводит к высвобождению редуцирующих веществ. Причем, вероятно, максимум, наблюдаемый при добавлении комплек-сона в концентрации 2 г/л, связан с образованием протонированного дикомплекса. А снижение рН за счет увеличения концентрации ОЭДФ вызывало образование протонирован-ного комплекса.

Обращает на себя внимание тот факт, что характер изменения содержания белка в зависимости от концентрации хеланта носит прямо противоположный характер (рис.1). Максимумы выделения редуцирующих веществ соответствуют минимумам образования белков. Вероятно, это свидетельствует о том, что имеет место конкуренция белков и полисахаридов за комплексон. Такая ситуация возможна в том случае, если катионы кальция являются центрами связывания как тех, так и других соединений, а также играют роль и в агрегации молекул с одинаковой химической природы.

Интересно отметить, что диапазон изменения концентраций белка в зависимости от дозы используемого комплексона значительно превышает изменение редуцирующих веществ при тех же концентрациях ОЭДФ, то есть комплексон более эффективен в отноше-

Рис. 2 - Содержание РВ и белка в питательной среде после автоклавирования в зависимости от концентрации ОЭДФ

нии высвобождения белков, чем сахаров. Сотниковым В.А. [10] ранее было показано, напротив, повышение концентрации РВ при использовании комплексона. То есть имеется противоречие между результатами, полученными в [10] и нами. Отмеченное противоречие объясняется природой субстрата. В [10] в качестве субстрата использовали размол пшеницы, содержащей до 70-75% крахмала. В то время как в наших экспериментах были использованы пшеничные отруби, содержащие в своем составе из гидролизуемых полимеров в основном белок, а так же, в меньшей степени, гемицеллюлозы. Как известно, гемицеллюлозы значительно труднее подвергаются гидролизу, чем крахмал.

Автоклавирование вызывает более активный процесс гидролиза гемицеллюлоз. Концентрация редуцирующих веществ после этой стадии обработки (рис.2) увеличивается практически в два раза. С другой стороны прослеживается четкая тенденция снижения содержания РВ с увеличением концентрации ОЭДФ. Принимая во внимание, что используемый комплексон является достаточно сильной кислотой [15], можно предположить, что она не только стимулирует процессы гидролиза гемицеллюлоз и декстринов до моно- и дисахаров, но и провоцирует дальнейшей распад гексоз и пентоз до фурфурола и оксиме-тилфурфурола, ведет к карамелизации сахаров [9,15].

Для подтверждения этого предположения был проведен модельный эксперимент. В этом случае в качестве среды использовали раствор глюкозы с концентрацией 3,5% вес, что соответствовало содержанию РВ в питательной среде. Раствор подвергали автоклави-рованию аналогично питательной среде. Результаты представлены на рис.3. Как следовало

Рис. 3 - Содержание РВ в модельном эксперименте

ожидать, с повышением концентрации комплексона содержание редуцирующих веществ падало.

В случае модельного эксперимента снижение содержания РВ в среде происходит более интенсивно, чем в опытах с питательными средами. Как уже отмечалось ранее, в составе пшеничных отрубей содержится незначительное количество легкоокисляемых сахаров, в то время как основной пул приходится на трудногидролизуемые полисахариды. В связи с этим повышение концентрации ОЭДФ не оказывает столь существенного действия при автоклавировании питательной среды на основе пшеничных отрубей в отличие от модельной среды с глюкозой.

Анализируя зависимость изменения содержания белка от концентрации ОЭДФ после автоклавирования (рис.2), можно сделать два вывода. Во-первых, после автоклавирования практически в два раза происходит повышение содержания белка в питательной среде. Во-вторых, профиль зависимости не изменяется при переходе от заваривания к автоклавирова-нию. Следовательно, возрастание концентрации белка в результате автоклавирования во многом связано с интенсификацией гидролитических процессов, под действием ОЭДФ.

Таким образом, комплексон ОЭДФ является эффективным инструментом изменения состава питательной среды в процессе ее приготовления.

Культивирование дрожжей на средах, приготовленных с использованием комплексообразующего агента, показало незначительное отличие достигнутого уровня биомассы по сравнению с контролем (рис.4). Причем при использовании среды, для приготовления которой применяли ОЭДФ в концентрации 0,01 и 1 г/л, наблюдалось повышение концентрации биомассы на 6%. Во всех остальных случаях происходит снижение концентрации биомассы. Сравнивая данные рис.2 и рис.4 можно видеть, что небольшой прирост биомассы наблюдается в средах, содержащих минимальное количество белка. В тоже время увеличение содержания белка приводит к снижению уровня биомассы.

Рис. 4 - Уровень биомассы В. энЬНИз в зависимости от концентрации комплексо-на

Ранее нами была обнаружена преимущественная потребность исследуемой культуры В. БиЫШБ в углеводах, что связано с их высокой сахаролитической активностью [20]. Вместе с тем протеолитическая активность В. БиЫШв незначительна. Вероятно, именно потому рост культуры на средах с высокими концентрациями белка происходит неэффективно.

Следует отметить, что по составу (содержание РВ и белка) среды, полученные с использованием низких концентраций ОЭДФ (0,1 г/л и 0,001 г/л) незначительно отличались от тех, которые были получены при высоких концентрациях (3,4,5 г/л). Для больших концентраций наблюдается резкое ингибирование роста. Очевидно, в этой области происходит объединение действия двух неблагоприятных факторов - высокой концентрации белка в составе питательной среды и непосредственного действия комплексона на микробную клетку.

С целью изучения прямого влияния ОЭДФ на рост В. БиЫШв комплексон вносили в готовую питательную среду стандартного состава параллельно с посевным материалом. Данные представлены на рис. 5. Обнаружен эффект стимуляции при добавлении ком-плексона в концентрации 2 г/л. В целом прослеживается та же тенденция, что и для случая, когда комплексон вносили на стадии приготовления питательных сред: при содержании ОЭДФ ниже 2 г/л концентрация биомассы незначительно отличается от контрольного уровня, а превышение 2 г/л приводит к ингибированию роста культуры. Причем ингибирование при внесении комплексона в готовую среду выражено в меньшей степени.

Рис. 5 - Уровень биомассы B. энЬНИз в зависимости от концентрации комплексо-на ОЭДФ

Таким образом, комплексон ОЭДФ можно рассматривать как эффективное средство воздействия на микробный метаболизм. В зависимости от стадии внесения его воздействие может носить как прямой, так и опосредованный характер. Прямое воздействие реализуется при непосредственном внесении ОЭДФ в готовую питательную среду. Использование ОЭДФ в процессе приготовления питательных сред приводит к опосредованному действию через изменение ее состава. Этот механизм ярко проявляется в диапазоне низких концентраций комплексона. Вместе с тем в этом случае в области высоких концентраций ОЭДФ проявляется его действие также и на клеточном уровне.

Исходя из полученных экспериментальных данных, можно сделать вывод о целесообразности использования ОЭДФ для повышения прироста биомассы В. БиЫШБ. Предлагается вводить комплексообразующий агент в готовую питательную среду параллельно с инокулятом в концентрации 2 г/л.

Литература

1. Комплексоны в биологии и медицине: обзорн. информация. Сер. Реактивы и особо чистые вещества / Н.М. Дятлова, Л.В. Криницкая, Т.А. Матковская и др.- М.: НИИТЕХИМ, 1986.

2. Матковская Т.А. Взаимодействие карбокси- и фосфатсодержащих комплексонов с биологически активными металлами в водных растворах.-М.: ВНИИ Хим. реактивов и особо чистых веществ, 1989.

3. Матковская Т.А., Криницкая Л.В., Дятлова Н.М. // Научн. труды.- М.: ИРЕА. 1987. Вып. 49, С. 83-90.

4. Дятлова Н.М., Темкина В.Я., Попов К.И. Комплексоны и комплексонаты металлов.- М.: Химия, 1988.

5. Догадкина В.Ю., Куликов А.Н., Матковская Т.А, ДятловМ.К. // Хим. фарм. журн. 1988.

6. Ефимов Г.В., Мокашев Ю.А. // Ж. общ. Химии. 1986.

7. Т.А. Матковская, В.В. Зайцев, Б.П. Мищенко, Л.В. Зайцев, Н.М. Дятлова. // Научн. труды -М.: ИРЕА, 1988. Вып. 50, С. 63-68.

8. Юрьева С.Е., Архипова З.И. //. Научн. труды. - М.: ИРЕА, 1985. С. 130-135.

9. Т.А. Матковская, К.И. Попов, Э.А. Юрьева Бифосфонаты. Свойства, строение и применение в медицине - М.: Химия, 2001. -224с.

10. Сотников В.А., Федоров А.Д., Гамаюрова В.С. и др. // Производство спирта и спиртовых изделий. №1. 2002. С. 13-15 .

11. Коренман И.М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений. -М.: Химия, 1975.

12. Методы общей бактериологии / Под ред. Ф. Герхардта. В 3 т. - М.: Мир, 1983.

13. Лабораторный практикум по общей технологии пищевых производств/ А.А. Виноградова, Г.М. Мелькина, Л.А. Фомичева и др. - М.: Агропромиздат, 1991. - 335с.

14. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений. - М.: Наука, 1988.- 304 с.

15. Технология спирта / В.Л. Яровенко, В.А. Мариненко, В.А. Смирнов и др./ Под ред. В.Л. Яровен-ко. - М.: Колос, 2002. - 464 с.

16. П. Рейвн, Р. Эверт, С. Айкхорн. Современная ботаника /В 2 т. -М.: Мир, 1990. Т.2. - 344 с.

17. Малкина В.Д. // Хлебопечение в России. 1998. - №4.

18. А.А. Кухаренко, А.Ю. Бинаров Безазотная биотехнология этилового спирта. - М.: Энергоатом-издат, 2001 - 272с.

19. Пищевая химия / Под.ред. А.П. Нечаева. - С-Пб.: ГИОРД, 2003.

20. Крыницкая А.Ю., Глазырина Ю.В., Гамаюрова В.С.// В сб.: Структура и динамика молекулярных систем. 2003. Вып.ХХ, Ч.2. С. 267-270.

© М. Н. Астраханцева - асс. каф. пищевой биотехнологии КГТУ; А. Ю. Крыницкая - канд. биол. наук, доц. той же кафедры; В. С. Гамаюрова - д-р хим. наук, проф., зав. каф. промышленной биотехнологии КГТУ.