СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ КАРОТИНОИДОВ В ПЛОДАХ ДЕРЕЗЫ КИТАЙСКОЙ
METHOD FOR QUANTITATIVE ESTIMATION OF THE AMOUNT OF CAROTENOIDS IN CHINESE BOXTHORN FRUITS

Изобретение относится к пищевой, химико-фармацевтической и косметической отраслям промышленности и может быть использовано при проведении стандартизации сырья дерезы китайской и фармацевтических субстанции на их основе, а также для проведения НИР в ВУЗах.
Действующая система контроля качества лекарственных препаратов требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений (БАС) с использованием современных методов анализа и актуальных данных об их физико-химических, спектральных и фармакологических свойствах, позволяющих объективно и селективно определять содержание целевых веществ (1).
Lycium chinense
Дереза китайская ( Mill.) является малоизученным растением. В настоящее время сырье дерезы китайской используется в пищевой и фармацевтической (при производстве БАДов) промышленности, но не является лекарственным растительным сырьем. Согласно литературным данным плоды дерезы китайской регулируют метаболические процессы, снижают уровень сахара и холестерина, стабилизируют почечную активность за счет антиоксидантных свойств. Дереза китайская применяется при комплексной терапии атеросклероза, заболеваниях печени и почек, климактерическом синдроме, благотворно влияют на иммунную, кроветворную, сердечно-сосудистую, дыхательную и нервную систему, предотвращают преждевременное старение (1,2).
Плоды дерезы китайской обладают уникальным химическим составом, содержат широкий набор биологически активных веществ: углеводы, белки, жиры, пищевые волокна, минералы (кальций, железо, калий, цинк, магний, медь, марганец, фосфор, йод, селен, германий) и витамины (В1, В2, B6, Е, РР, С), холин, каротиноиды (β-каротин, неоксантин, β-криптоксантин), терпены, алкалоиды, фитостеролы (2). На наш взгляд, с точки зрения химической стандартизации наибольший интерес представляет β- каротин. Контроль над суммарным содержанием каротиноидов принято осуществлять с помощью спектрофотометрии (3-6), так как данные соединения имеют электронные спектры поглощения с максимумами при 422-428, 444-450, 472-484 нм.
Известен способ количественного определения суммы каротиноидов в экстрактах семян растений методом прямой спектрофотометрии. Данная методика включает использование петролейного эфира и тетрогидрофурана, капроновую мембрану (7).
Недостатком данного способа является длительность и трудоемкость методики, а также использование веществ из списка прекурсоров (список IV).
Наиболее близким к заявленному способу является способ количественного определения каротиноидов спектрофотометрическим методом (8), взятый за прототип. Данная методика включает в себя трехкратную экстракцию измельченного сырья, использование делительной воронки и тонкослойной хроматографии.
Как видно из описания, этот способ многостадиен, трудоемок. В связи с этим целью изобретения является разработка способа определения суммы каротиноидов сырья дерезы китайской.
Техническим результатом является создание способа количественного определения суммы каротиноидов в плодах дерезы в пересчете на β-каротин. Технический результат достигается тем, что экстракцию сырья осуществляют однократно, в качестве экстрагента используют гексан в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:5, количественное определение суммы каротиноидов в плодах дерезы проводят при длине волны 450±2 нм в пересчете на β-каротин; ентр
Содержание суммы каротиноидов в сырье дерезы китайской (Х) в пересчете на β-каротин в мг%  рассчитывали по формуле:
,
где D1 – оптическая плотность испытуемого раствора;
D0 - оптическая плотность раствора СО калия бихромата;
0,00208 - количество β-каротина, мг, в растворе, соответствующем по окраске раствору СО калия бихромата;
m - навеска сырья, г.
При изучении спектральных характеристик было выявлено, что именно β-каротин определяет характер кривой поглощения гексанового извлечения из плодов дерезы китайской (фигура 1).
Изучение УФ-спектров фиг. 1 показало, что максимум собственного поглощения каротиноидов гексановых экстрактов из плодов дерезы китайской наблюдался при 450±2 нм. Раствор СО β-каротина имеет максимум поглощения при 450±2 нм. Ввиду близкого расположения максимумов поглощения исследуемого извлечения из сырья дерезы китайской и вещества-стандарта β-каротин, одним из целесообразных вариантов стандартизации является прямая спектрофотометрия.
Данный факт позволяет проводить спектрофотометрическое определение суммы каротиноидов в плодах дерезы китайской при аналитической длине волны 450±2 нм. Также нами было изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. В таблице 1 представлена зависимость выхода каротиноидов плодов дерезы китайской от природы экстрагента. При этом гексан был выбран в качестве оптимального экстрагента.
Таблица 1.
С целью разработки методики количественного определения суммы каротиноидов определены оптимальные условия экстракции каротиноидов: экстрагент - гексан; соотношение «сырье - экстрагент» - 1:5; время экстракции - в течение 90 минут; степень измельченности сырья - 0,5 мм.
Экстрагент
Соотношение «сырье - экстрагент»
Степень измельченности, мм
Время экстракции, мин
Содержание суммы каротиноидов в пересчете на β-каротин
Влияние экстрагента
гексан
1:5
1
90
34,08
ацетон
1:5
1
90
5,91
гексан + ацетон (1:2)
1:5
1
90
17,45
Спирт 95%
1:5
1
90
2,45
Петролейный эфир
1:5
1
90
32,85
Этилацетат
1:5
1
90
17,74
Влияние соотношения «сырье - экстрагент»
гексан
1:2
1
90
26,02±0,76
гексан
1:20
1
90
30,27±0,75
гексан
1:50
1
90
25,12±0,97
Влияние степени измельченности
гексан
1:5
0,2
90
32,01±1,19
гексан
1:5
0,5
90
35,43±0,46
гексан
1:5
2
90
33,91±0,89
гексан
1:5
3
90
31,21±1,12
Влияние времени экстрагирования
гексан
1:5
0,5
30
22,07±0,34
гексан
1:5
0,5
60
27,65±0,64
гексан
1:5
0,5
90
35,43±0,46
гексан
1:5
0,5
120
32,22±0,61
Учитывая, что увеличение числа операций на стадии пробоподготовки ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.
Таким образом, было определено, что оптимальными параметрами экстракции являются: однократное извлечение гексаном в течение 90 минут в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:5 при комнатной температуре.
Принимая по внимание тот факт, что специфическим для дерезы китайской плодов является β-каротин, а максимумы поглощения раствора β-каротина и экстрактов дерезы китайской плодов находятся в области - 450±2 нм (максимум), целесообразным является определение содержания суммы каротиноидов в пересчете на β-каротин при длине волны 450±2 нм.
Способ реализуется следующим образом.
Аналитическую пробу сырья дерезы китайской измельчают до размера частиц 0,5 мм. Около 5 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, приливали 25 мл экстрагента гексана, экстрагировали в течение 90 минут при комнатной температуре. Полученные извлечения фильтровали через бумажный фильтр, отбрасывая первые 10 мл фильтрата (раствор А). Затем в мерную колбу вместимостью 25 мл помещали 1,0 мл полученного фильтрата и доводили объём экстрагентом до метки (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряли на спектрофотометре при длине волны 450±2 нм. Параллельно относительно воды очищенной измеряли оптическую плотность раствора СО калия бихромата (0,04%). В качестве раствора сравнения использовали воду очищенную.
Содержание суммы каротиноидов в сырье дерезы китайской (Х) в пересчете на β-каротин в мг%  рассчитывали по формуле:
,
где D1 – оптическая плотность испытуемого раствора;
D0 - оптическая плотность раствора СО калия бихромата;
0,00208 - количество β-каротина, мг, в растворе, соответствующем по окраске раствору СО калия бихромата;
m - навеска сырья, г.
Предлагаемый способ поясняется следующим примером.
Аналитическую пробу сырья дерезы китайской измельчают до размера частиц 0,5 мм. Около 5 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, приливали 25 мл экстрагента гексана, экстрагировали в течение 90 минут при комнатной температуре. После полученные извлечения фильтровали через бумажный фильтр (красная полоса), отбрасывая первые 10 мл фильтрата (раствор А).
Испытуемый раствор для анализа суммы каротиноидов готовят следующим образом: 1,0 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора до метки гексаном (испытуемый раствор). Параллельно относительно воды очищенной измеряли оптическую плотность раствора СО калия бихромата (0,04%). В качестве раствора сравнения использовали воду очищенную.
После измерения оптической плотности извлечения из плодов дерезы китайской при длине волны 450±2 нм, содержание суммы каротиноидов в сырье дерезы китайской (Х) в пересчете на β-каротин в мг%  рассчитывали по формуле:
,
где D1 – оптическая плотность испытуемого раствора;
0,7111 - оптическая плотность раствора СО калия бихромата;
0,00208 - количество β-каротина, мг, в растворе, соответствующем по окраске раствору СО калия бихромата;
m - навеска сырья, г.
Содержание суммы каротиноидов, в пересчете на β-каротин, составило 35,43%.
Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила ±3,49%.
Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы каротиноидов в пересчете на β-каротин в дерезе китайской плодах с использованием прямой спектрофотометрии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:
1. Разработанный метод является более специфичным и селективным, а также позволяет проводить экстракцию сырья однократно гексаном, позволяющий исчерпывающе извлекать целевые вещества (каротиноиды).
2. Ошибка единичного определения предлагаемого способа составляет ±3,49%, что свидетельствует об объективности разработанного способа и высокой точности.
Lycium chinense
Этот способ можно применять в центрах контроля качества лекарственных средств, на фармацевтических предприятиях и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного анализа дерезы китайской плодов ( Mill).
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
Lycium chinense
1. Семенова Е.Ф., Апенкина Т.В., Азизова Л.М., Курдюков Е.Е., Бегутова Е.В. Фармакогностическое исследование листьев и плодов дерезы китайской  Mill. - интродуцента Среднего Поволжья // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Естественные науки. 2015. № 4 (12). С. 68-76.
2. Николаева Ю. Ягоды Годжи. Плоды долголетия и суперздоровья, Энтрасттрейдинг, 2015.  128 с.
3. Первушкин С.В., Куркин В.А., Воронин А.В. и др. Методики идентификации различных пигментов и количественного спектрофотометрического определения суммарного содержания каротиноидов и белка в фитомассе S.platensis (Nords.) Geilt. // Растительные ресурсы. 2002. № 1. С. 112-119.
4. Писарев Д.И., Новиков О.О., Романова Т.А. Разработка экспресс-метода определения каротиноидов в сырье растительного происхождения // Научные ведомости БелГУ. 2010. № 22. С. 119-122.
5. Рыбакова О.В., Сафонова Е.Ф., Сливкин А.И., Оголь Г.А. Определение суммы каротиноидов в растительных маслах и маслянх экстрактах // Тезисы доклада 3-ей Всероссийской Научно-методической конференции «Фармобразование-2007», Часть первая. Воронеж, 2007. С. 306-308.
6. Ульяновский Н.В., Косяков Д.С., Боголицын К.Г. Разработка экспрессных методов аналитической экстракции каротиноидов из растительного сырья // Химия растительного сырья. 2012. № 4. С. 147-152.
7. Булда О.В., Рассадина В.В., Алексейчук Г.Н., Ламан Н.А. Спектрофотометрический метод определения содержания каротинов, ксантофиллов и хлорофиллов в экстрактах семян растений // Физиология растений. 2008. Т.55. №.4. С.604-611.
8. Курегян А.Г. Изучение каротиноидов тыквы методами спектрофотометрии и тонкослойной хроматографии // Современные проблемы науки и образования. 2015. № 1-2. URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=19732 (дата обращения: 10.01.2021).