Транскрипционные регуляторы дифференцировки Т-лимфоцитов и паттернраспознающие рецепторы - экспрессия лимфоцитами кишечника при оксазолоновом колите у крыс и после введения ингибитора 3-гидрокси-3-метилглутарил коэнзим А-редуктазы и антагониста рецепторов интерлейкина-1

frequencies in the Dutch Caucasian population. Hum. Immunol. 2006; 67: 756-63.

52. Rajalingam R., Ge P., Reed E.F. A sequencing-based typing method for HLA-DQA1 alleles. Hum. Immunol. 2004; 65: 373-9.

53. Dunn P.P., Day S., Williams S., Bendukidze N. HLA-DQB1 sequencing-based typing using newly identified conserved nucleotide sequences in introns 1 and 2. Tissue Antigens. 2005; 66: 99-106.

54. Kruskal J.B. Nonmetric multidimensional scaling: a numerical method. Psychometrika. 1964; 29: 115-29.

55. Johansson A., Ingman M., Mack S.J., Erlich H., Gyllensten U. Genetic origin of the Swedish Sami inferred from HLA class I and class II allele frequencies. Eur. J. Hum. Genet. 2008; 16(11): 1341-9.

56. Marsh S.G.E., Albert E.D., Bodmer W.F. et al. Nomenclature for factors of the HLA system, 2010. Tissue Antigens. 2010; 75: 291-455.

57. Kuranov A.B., Mukhamedyarov D.A., Momynaliev K.T. Identification of new HLA-DRB1 alleles in Kazakh individuals. Tissue Antigens. 2011; 77(3): 263-4.

58. Acland A., Agarwala R., Barrett T. et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Res. 2014; 42: 7-17.

59. Jinam T.A., Saitou N., Edo J., Mahmood A., Phipps M.E. Molecular analysis of HLA Class I and Class II genes in four indigenous Malaysian populations. Tissue Antigens. 2010; 75 (2): 151-8.

60. Boldyreva M.N. HLA

61. Berezina G. M., Svyatova G. S., Makhmutova Zh. "The analysis of the genetic structure of the Kazakh population as estimated from mitochondrial DNA polymorphism. Med. Hlth Sci. J. (MHSJ). 2011; 6: 2-6.

62. Balanovsky O., Rootsi S., Pshenichnov A., Kivisild T., Churn-osov M. et al. Two sources of the Russian patrilineal heritage in their Eurasian context. Am. J. Hum. Genet. 2008; 82: 236-50.

63. Dulik M.C., Osipova L.P., Schurr T.G. Y-chromosome variation in Altaian kazakhs reveals a common paternal gene pool for Kazakhs and the influence of mongolian expansions. PLoS One. 2011; 6: e17548.

64. Derenko M.V., Malyarchuk B.A., Voznyak M., Denisova G.A., Dambueva I.K. et al. Distribution of Genghis Khan descendants of male lineage in the northern Eurasian populations. Genetika. 2007; 43

65. Derenko M., Malyarchuk B., Grzybowski T., Denisova G., Rogalla U. et al. Origin and post-glacial dispersal of mitochondrial DNA haplogroups C and D in northern Asia. PLoS One. 2010; 5(12): e15214.

66. Alexeev L.P. Petranji G. HLA in eight ethnic groups from the former USSR. In: Proceedings of the 11-th International Histo-compability Workshop and Conference .Oxford: Oxford University Press; 1991; vol. 1: 666- 73.

67. Chen R.B., Ye G.Y., Geng Z.C. et al. HLA polymorphism of the principal minority nationalities in mainland China. In: Tsuji K., Aizawa M., Sasazuki T., eds. HLA 1991: Proceedings of the 11th International Histocompatibility Workshop Conference. Oxford: Oxford University Press: 1992; vol 1: 676-9.

68. Shen C.M., Zhu B.F., Deng Y.J., Ye S.H., Yan J.W. et al. Allele polymorphism and haplotype diversity of HLA-A, -B and -DRB1 loci in sequence-based typing for Chinese Uyghur ethnic group. PLoS One. 2010; 5(11): e13458.

Received 05.10.14

клеточная иммунология

© ЖЕРЕБЯтьЕБ а. с., КАМЫшнЫЙ а. М., 2015 УдК 616.34-002-018.1-092:612.017.1]-085.275.4-092.9

Жеребятьев А. С., Камышный А. М.

ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ ДИФФЕРЕНЦИРОБКИ Т-ЛИМФОЦИТОБ И ПАТТЕРН-РАСПОЗНАЮЩИЕ РЕЦЕПТОРЫ — ЭКСПРЕССИЯ ЛИМФОЦИТАМИ КИШЕЧНИКА ПРИ ОКСАЗОЛОНОБОМ КОЛИТЕ У КРЫС И ПОСЛЕ ББЕДЕНИЯ ИНГИБИТОРА 3-ГИДРОКСИ-3-МЕТИЛГЛУТАРИЛ КОЭНЗИМ А-РЕДУКТАЗЫ И АНТАГОНИСТА РЕЦЕПТОРОБ ИНТЕРЛЕЙКИНА-1

Запорожский государственный медицинский университет, 69035, Запорожье, Украина

Мы изучили возможность применения симвастатина и антагониста рецепторов интерлейкина-1 (АРИЛ-1)для коррекции экспериментального колита у крыс с акцентом на исследование экспрессии TLR2, TLR4, NOD2, RIG-I и транскрипционных факторов T-bet, GATA-3, RORyt и Foxp3 лимфоцитами толстой кишки. Иммунопозитив-ные лимфоциты были идентифицированы с помощью метода прямой и непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител крысы. Симвастатин и АРИЛ-1 благоприятно влияют на исход и течение оксазолониндуцированного колита через модулирование экспрессии образраспознающих рецепторов на лимфоцитах и баланса между различными субпопуляциями Т-хелперов толстой кишки.

Ключевые слова: копит; образраспознающие рецепторы; антагонист рецепторов интерлейкина-1 (АРИЛ-1); симвастатин.

Для цитирования: Иммунология. 2015; 36(3): 139-144.

Для корреспонденции: Жеребятьев Александр Сергеевич, Gerya2009@yandex.ru For correspondence: Zherebiatiev Aleksandr Sergeevich, Gerya2009@yandex.ru

Zherebiatiev A. S., Kamyshnyi A. M.

TRANSCRIPTIONAL REGULATORS OF T-LYMPHOCYTE DIFFERENTIATION AND PATTERN RECOGNITION RECEPTORS — EXPRESSION BY LYMPHOCYTES IN THE INTESTINE IN EXPERIMENTAL OXAZOLONE-INDUCED COLITIS IN RATS AND AFTER ADMINISTRATION OF INHIBITOR OF 3-HYDROXY-3-METHYLGLUTARYL COENZYME A REDUCTASE AND ANTAGONIST OF RECEPTORS OF INTERLEUKIN-1

Zaporozhye State Medical University, 69035, Zaporozhye, Ukraine

We studied the possibility of simvastatin and antagonist of receptors of interleukin-1 for correction of experimental colitis in rats with a focus on the expression studies of TLR2, TLR4, NOD2, RIG-I and transcription factors T-bet, GATA-3, RORYt and Foxp3 with lymphocytes of colon. The immunopositive lymphocytes were determined using a direct and indirect immunofluorescence technique with using a monoclonal rat antibody. Simvastatin and antagonist of receptors of interleukin-1 seemed to be beneficial in oxazolone-induced rat colitis model through modulate pattern recognition receptors expression on lymphocytes and balance between different T-helper cell subsets of colon.

Keywords: colitis; pattern recognition receptors; antagonist of receptors of interleukin-1 (ARIL-1); simvastatin.

citation: Immunologiya. 2015; 36

введение. Результаты эпидемиологических исследований свидетельствуют о прогрессивном росте уровя заболеваемости воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК) в разных стран мира, точные механизмы развития этих заболеваний остаются предметом дискуссии [1]. Кишечный барьер состоит из бактериальной биопленки, слизи, клеток эпителия и кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани (КАЛТ). Дисфункция этого комплекса создает предпосылки развития воспалительного процесса в кишечнике. В этом ведущую роль играют образраспознающие рецепторы (РЯЯ), которые распознают патогенассоциированные молекулярные образы микроорганизмов (РАМР). К ним относятся мембранные и эндосомальные ТоП-Нке-рецепторы (ТЬЯ), цитоплаз-матические NOD-Hke-рецепторы и сенсоры вирусных РНК — ЯЮ-Нке-рецепторы, сигнализация через которые закономерно приводит к активации адаптивной иммунной системы. Результаты многочисленных работ показывают, что в большинстве случаях воспаление слизистой оболочки кишечника связано с дисбалансом различных субпопуляций Т-хелперов (1Ъ) [2], из которых определенную роль в патофизиологии воспаления кишечника играют № типов 1 (ТЫ), 2 (ТЬ2) и 17 (ТЫ7), а также Т-регуляторные лимфоциты (Т^), основными регуляторами дифференцировки которых являются соответственно транскрипционные факторы Т-Ье^ GATA-3, RORyt и Foxp3 [3].

Химически индуцированные модели воспаления кишечника — наиболее часто применяющиеся модели ВЗК у животных. Хотя у них есть, как и у всех других моделей, в том числе и у генетических, свои ограничения, в целом они сходны по некоторым важным иммунологическим и гистологическим аспектам с ВЗК у человека. Интраректальное введение тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBS) или оксазолона является широкоизвестным способом индукции колита у животных [4-7]. TNBS и оксазолон рассматривают в качестве гаптенов, способных связываться с эндогенными протеинами в слизистой оболочке кишечника и вызывать местную иммунологическую реакцию, опосредованную активацией макрофагов, дендритных клеток и Т-лимфоцитов. Однако TNBS-индуцированный колит связан с преимущественной активацией ТЫ-опосредованного иммунного ответа, гиперпродукцией зависимых от № цитокинов интерлейкина (ТЬ) 12, фактора некроза опухоли а и и интерферона- у (ШМу), которые приводят к инфильтрации и трансмуральному воспалению. Данная модель по своим клинико-морфологическим проявлениям соотносится с болезнью Крона у человека. В отличие от TNBS оксазолон вызывает колит, связанный с ТЬ2- и ШКТ-поляризованным типом Т-клеточного ответа и характеризуется повышенной выработкой ГЬ-4 и ГЬ-5, но нормальным уровнем ШМу. Оксазолоновый колит ограничивается дистальной частью толстой кишки в отличие от TNBS-колита, который характеризуется как панколит. Таким образом, на основании гистопатологических особенностей изменений в дистальном отделе толстой кишки оксазолоновый колит у грызунов имитирует язвенный колит у человека [4].

Важной задачей является поиск методов патогенетически обоснованной терапии ВЗК, в связи с этим вызывает особый интерес использование таких препаратов, как статины, иммуномодулирующие холестериннезависимые эффекты которых открыты совсем недавно. К ним относятся подавление экспрессии MHC II антиген-представляющими клетками, изменение активности Th и баланса продуцируемых ими цитокинов. Lee и соавт. продемонстрировали, что сим-вастатин подавляет экспрессию провоспалительных генов, блокируя передачу сигналов через NF-kB и ослабляет DSS-индуцированный острый колит у мышей. Некоторые авторы показали, что статины способствуют уменьшению воспаления при экспериментальной патологии как у животных [5], так и у пациентов с хроническим колитом [6]. В свою очередь применение антагонистов основных системных провоспали-тельных цитокинов IL-1a та ГЬ-ф оказалось эффективным при некоторых хронических воспалительных заболеваниях, а человеческий рекомбинантный IL-1ra (Anakinra) был одобрен в США для лечения ревматоидного артрита [7], однако высокая стоимость ограничивает широкое применение этого препарата и побуждает к поиску и изучению более дешевых аналогов. Поэтому мы обратили внимание на возможность применения антагониста рецепторов IL-1 (АРИЛ-1).

Цель исследования - изучить динамику распределения T-bet+, GATA-3+, RORyt+ и Foxp3+-клеток (Treg), а также особенностей экспрессии PRR — TLR2, TLR4, NOD2 и RIG-I - лимфоцитами толстой кишки как важных параметров иммунной системы, определяющих направление развития им-мунопатофизиологического процесса при экспериментальном колите у крыс, а также на фоне введения симвастатина и АРИЛ-1.

Материалы и методы

Исследования провоили на 40 самцах-крысах линии Ви-стар массой 110-1б0 г. Экспериментальную часть работы выполняли в соответствии с положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которых используют для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986). Животных разделили по 10 на четыре группы: 1-я группа - контроль; 2-я - с экспериментальной патологией - оксазолониндуцированным колитом (ОИК); 3-я - с ОИК, которым вводили симвастатин; 4-я - с ОИК, которым вводили АРИЛ-1 (производство ОАО «РЭСБИО», Санкт-Петербург, Россия). ОИК индуцировали на 7-е сутки после предварительной сенсибилизации однократным вну-триректальным введением 0,1 % раствора оксазолона (Sigma, США) в дозе 10 мг на 1 животное под кетаминовым наркозом. Предварительную сенсибилизацию осуществляли нанесением на предварительно выбритый участок кожи животного 0,2 мл 3% сенсибилизирующего раствора, состоящего из смеси ацетона, оливкового масла и оксазолона [8]. Симвастатин вводили внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг через 24 ч после индукции колита в течение 5 дней. АРИЛ-1 вводили подкожно в дозе 3 мг/кг через 24 ч после индукции колита в течение

5 дней. Животных выводили из эксперимента декапитирова-нием под наркозом. Изымали участки толстой кишки и на 20 ч погружали в фиксатор Буэна.

Структуру популяции T-bet, -GATA-3, -Foxp3, -RORyt, -TLR2, -TLR4, -NOD2 и RIGI иммунопозитивных лимфоцитов (T-bet+, GATA-3+, Foxp3+, RORyt+, TLR2+, TLR4+, NOD2+, RIGI+) - изучали на основании анализа серийных гистологических срезов и данных их морфометрических и денситоме-трических характеристик. Для проведения данного исследования на ротационном микротоме MICROM HR-360 (Microm, Германия) делали 5-микронные серийные срезы кишечника, которые затем депарафинировали в ксилоле, проводили ре-гидратацию в нисходящих концентрациях этанола (100, 96, 70%), отмывали в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) и инкубировали с первичными моноклональными антителами (АТ) к T-bet, GATA-3, Foxp3, ROR, NOD2 или RIGI (SantaCrusBio-tech, США). После этого срезы инкубировали с вторичными АТ, конъюгированными с флюоресцеином изотиоционатом (FITC) в течение 18 ч во влажной камере при t 4°С. Либо инкубировали срезы с АТ к TLR-2 и TLR-4 (HycultBiotech, Нидерланды), конъюгированными с FITC в течение 18 ч во влажной камере при t 4оС. После инкубации все срезы промывали 0,1 М фосфатным буфером и помещали в смеси глицерина и фосфатного буфера (1:9) для последующей люминесцентной микроскопии. Обработанные гистологические срезы изучали с помощью компьютерной программы ImageJ (NIH, США). Изображение, получаемое на микроскопе Primo Star (Zeiss, Германия) в ультрафиолетовом спектре возбуждения 390 нм (FITC) с помощью высокочувствительной камеры Axio Cam 5c (ZEISS, Германия), и пакета программ для получения, архивирования и подготовки изображений к публикации Axio Vision 4.7.2 (ZEISS, Германия) немедленно вводили в компьютер. При этом в автоматическом режиме определяли области со статистически значимой флюоресценцией, характерной для лимфоидных клеток, которые экспрессиру-ют рецепторы. Вычисляли морфометрические и денситоме-трические характеристики иммунопозитивных клеток. При окраске АТ исследовали иммунопозитивные лимфоциты, расположенные в собственной пластинке слизистой оболочки (LAM PR) и подслизистой основе (TELA SUBM) толстой кишки. Окрашенные гематоксилином и эозином срезы использовали для морфологической верификации колита с использованием критериев, специально описанных S. Wirtz и соавт. [8] для химически индуцированных ВЗК (табл. 1). При этом для всех исследований срезы делали как с дистального отдела толстой кишки (зона локализации патологического процесса), так и с проксимального отдела, расположенного вдалеке от очага.

Все полученные экспериментальные данные обрабатывали на персональном компьютере с помощью пакета прикладных и статистических программ Excel из пакета MS Office 2010 (Microsoft Corp., США), Statistica 6.0 (Stat-Soft, 2001). Для всех показателей рассчитывали значение средней арифметической выборки (М), ее дисперсии и ошибки средней (m). Для выявления достоверности различий результатов исследований в опытных и контрольных группах животных устанавливали t-коэффициент Стьюдента, после чего определяли возможность разницы выборок (р) и доверительный интервал средней. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение. Развитие колита сопровождается макроскопическими изменениями в толстой кишке: отеком, гиперемией, множественными эрозиями и язвами. При гистологическом исследовании тканей, окрашенных гематоксилином и эозином, мы наблюдали признаки воспаления с инфильтрацией мононуклеарними клетками, в первую очередь лимфоцитами, моноцитами и плазматическими клетками, а также нейтрофилами и эозинофилами. Патологические изменения также включали гибель эпителиоцитов, укорочение и исчезновение кишечных крипт, утолщение стенки кишечника, уменьшение количества бокаловидных клеток и плотности желез. Воспаление располагалось в/под

Таблица 1

Балльная система подсчета гистологических изменений, ассоциированных с воспалением в толстой кишке

Балл

Гистологические изменения

0 Нет признаков воспаления

1 Низкий уровень воспаления с очаговой инфильтрацией мононуклеарными клетками

2 Умеренное воспаление с множественными очагами

3 Тяжелое воспаление с увеличением количества сосудов и явным утолщением стенки

4 Максимальная тяжесть воспаления с трансмуральной лейкоцитарной инфильтрацией и потерей бокаловидных клеток

Таблица 2

Результаты гистологических изменений, ассоциированных с воспалением в толстой кишке

Параметр Контроль

Балл 1,7 ± 0,2 2,7 ± 0,3 1,5 ± 0,2* 1,3 ± 0,2*

*p < 0,05.

эпителиальным слоем слизистой, хотя в некоторых случаях мышечный слой был инфильтрирован воспалительным клетками. Тяжесть этих повреждений уменьшилась у животных, получавших симвастатин и АРИЛ-1 (табл. 2).

Развитие ОИК сопровождалось изменением количества всех изучаемых иммунопозитивных клеток в дистальном отделе толстой кишки, за исключением количества NOD2+-лимфоцитов. Так, снизилось содержание RIGI+-лимфоцитов (в LAM PR на 17%; р < 0,05), T-bet+-лимфоцитов (в LAM PR на 23%; р < 0,05) и Foxp3+-лимфоцитов (в LAM PR на 16%, в TELA SUBM на 23%; р < 0,05), при этом повысился уровень ^К2+-лимфоцитов (в LAM PR на 39%, в TELA SUBM на 87%; р < 0,05), TLR4+-лимфоцитов (в LAM PR на 30%, в TELA SUBM на 52%; р < 0,05), RORyt+-лимфоцитов (в LAM PR на 25%, в TELA SUBM на 30%; р < 0,05) и GATA-3+-лимфоцитов (в LAM PR на 38%, в TELA SUBM на 31%; р < 0,05) по сравнению с таковым у животных контрольной группы (см. рисунок б).

Иную ситуацию наблюдали при изучении распределения клеток в проксимальном отделе толстой кишки, вдалеке от очага патологического процесса, а именно однонаправленную тенденцию к снижению количества изучаемых иммунопозитивных клеток, за исключением количества RORyt+-лимфоцитов, которое не изменилось. Так, плотность популяции ^К2+-лимфоцитов уменьшилась на 26-31% (р < 0,05), TLR4+-лимфоцитов - на 20-25% (р < 0,05), аналогичным образом снижалось количество клеток, экспресси-рующих цитоплазматические ПРР RIGI и NOD2 и транскрипционные регуляторы дифференцировки Т-хелперов (см. рисунок а). Данные изменения мы можем объяснить тем, что, как указано выше, в патологический процесс при оксазоло-новом колите вовлекается преимущественно дистальный отдел толстой кишки, а также возможным перераспределением и миграцией Т-лимфоцитов из проксимального в дистальный отдел толстой кишки при развитии ОИК.

Значение изменений уровня экспрессии TLR в развитии ВЗК показано в целом ряде исследований. В частности, K. Tanaka [9] при изучении экспрессии TLR в слизистой оболочке кишечника у пациентов с ВЗК обнаружил повышение уровня TLR-2 и TLR-4 в подвздошной кишке по сравнению с таковым у здоровых волонтеров. E. Cario [10] установила, что TLR-2 играет ключевую роль в поддержании целостности слизистой оболочки в модели повреждения эпителиального барьера кишечника у мышей. Между тем большинство работ, касающихся изменения экспрессии PRR в условиях

COLON DIST б

TLR2 TLR4 RIG1 NOD2 Tbet GATA3 ROR Foxp3 Щ\ Колит

COLON PR, LAM PR 6

TLR2 TLR4 RIG1 NOD2 Tbet GATA3 ROR Foxp3

COLON DIST, LAM PR д

TLR2 TLR4 RIG1 NOD2 Tbet GATA3 ROR Foxp3 Контроль

COLON PR, TELA SUBM 3

TLR2 TLR4 RIG1 NOD2 Tbet GATA3 ROR Foxp3

COLON DIST, TELA SUBM e

TLR2 TLR4 RIG1 NOD2 Tbet GATA3 ROR Foxp3 K^J Колит+симв. астатин

TLR2 TLR4 RIG1 NOD2 Tbet GATA3 ROR Foxp3 I Колит+АРИЛ-1 - Колит

Суммарная плотность (количество на 1мм2) TLR2+, TLR4+, NOD2+, RIGI+, T-bet+, GATA-3+, RORyt+, Foxp3+ - клеток в собственной пластинке слизистой оболочки проксимального отдела толстого кишечника (COLON PR, LAM PR) и подслизистой основе проксимального отдела толстого кишечника (COLON PR, TELA SUBM) при развитии колита (а) и после введения симвастатина и АРИЛ-1 (в, г) экспериментальным животным; собственной пластинке слизистой оболочки дистального отдела толстого кишечника (COLON DIST, LAM PR); подслизистой основе дистального отдела толстого кишечника (COLON DIST, TELA SUBM) при развитии колита (б) и после введения симвастатина и АРИЛ-1, (д, е) эксперементальным животным.

ВЗК, касаются в основном эпителиального компартмента, а не лимфоидных клеток. В то же время прямая экспрессия PRR лимфоцитами влияет на их активацию, пролиферацию, выживание и продукцию цитокинов. Экспрессия практически всех известных TLR на CD4+ Т-клетках идентифицирована на уровне мРНК, а Myd88"'" CD4+ Т-клетки показали пониженную пролиферацию в ответ на активацию TLR, не смогли

продуцировать провоспалительные цитокины (IL-6, IL-17) и были не способны индуцировать колит. Стимуляция аго-нистами TLR2 способствует дифференцировке Th17 in vitro и приводит к пролиферации и продукции ^П-зависимых цитокинов, а сигнализация через TLR-4 влияет на функциональную активность Treg - введение LPS вызывает усиление их пролиферации и выживания in vitro и in vivo, а супрес-

сивная активность Treg повышается в 10 раз [11]. Поэтому обнаруженные нами изменения уровня экспрессии TLR-2- и TLR-4-лимфоцитами при ОИК может напрямую влиять на их функциональную активность. Также известно, что нарушение экспрессии цитоплазматических сенсоров РНК RIG-I приводит к серьезным повреждениям и воспалительной инфильтрации в слизистой оболочке кишки [12]. Увеличение экспрессии RLR в структурах КАЛТ может спровоцировать избыточную продукцию IFNy, что в свою очередь является одним из факторов риска развития ВЗК. Кроме того, изменение уровня экспрессии RLR способно оказывать влияние на баланс субпопуляций Th, воздействуя на уровень образования провоспалительных Th17- и ТЫ-клеток [13].

Довольно показательными оказались результаты изучения распределения исследуемых клеток в дистальном отделе толстой кишки при введении симвастатина и АРИЛ-1 экспериментальным животным. Мы наблюдали однонаправленную тенденцию к снижению количества изучаемых иммунопози-тивных клеток, при этом эффекты АРИЛ-1 были более выражены в отношении TLR2+-, TLR4+- и Foxp3+-лимфоцитов, а симвастатин более интенсивно снижал численность T-bet+- и ОАТА-3+-лимфоцитов (см. рисунок д, е).

Введение симвастатина животным с колитом привело к снижению в проксимальном отделе толстой кишки количества TLR2+-лимфоцитов (в LAM PR на 34%, в TELA SUBM на 30%; р < 0,05), TLR4+-лимфоцитов (в LAM PR на 28%, в TELA SUBM на 30%; р < 0,05), RORyt+-лимфоцитов (в LAM PR на 29%, в TELA SUBM на 20%; р < 0,05) и повышению уровня RIGI+-лимфоцитов (в LAM PR на 33%, в TELA SUBM на 21%;р < 0,05), T-bet+-лимфоцитов (в TELA SUBM на 33%; р < 0,05)), RORyt+-лимфоцитов (в LAM PR на 29%, в TELA SUBM на 20%; (р < 0,05) (см. рисунок в, г). Введение АРИЛ-1 животным с колитом привело к снижению количества TLR2+-лимфоцитов (в LAM PR на 30%; р < 0,05), TLR4+-лимфоцитов (в LAM PR на 18%, в TELA SUBM на 20%; р < 0,05), NOD2+-лимфоцитов (в LAM PR на 21%, в TELA SUBM на 42%; р < 0,05), GATA-3+-лимфоцитов (в LAM PR на 27%; р < 0,05), RORyt+-лимфоцитов (в LAM PR на 47%, в TELA SUBM на 36%; р < 0,05) и повышению содержания T-bet+-лимфоцитов (в TELA SUBM на 33%;р < 0,05) (см. рисунок в, г).

Участие различных субпопуляций Th в иммунопатогене-зе ВЗК показано во многих исследованиях. Так, M. Neurath и соавт. [14] продемонстрировали аккумуляцию Т-клеток, экспрессирующих T-bet в собственной пластинке кишечника у пациентов с болезнью Крона, а также более высокую экспрессию T-bet в этих клетках. Перемещение дифференцированных Th17 в организм мышей с лимфопенией приводит к развитию колита. Эти данные доказывают, что ^П-клетки играют важную роль в патогенезе ВЗК, что подтверждается и нашими результатами по увеличению их количества. J. Dambacher и соавт. [15] показали, что пациенты с болезнью Крона имеют повышенный уровень IL-17A в слизистой оболочке кишечника, собственная пластинка содержит повышенное количество Th17, а фактор транскрипции RORyt экспрессирован на более высоких уровнях. K. Ohtani и соавт. [16] обнаружили значительное усиление экспрессии GATA-3 в слизистой оболочке кишечника у детей с этими заболеваниями, а F. Heller и соавт. [17] показали, что развитие оксазоло-нового колита ассоциировано со значительным увеличением экспрессии мРНК IL-5 и IL-13 - цитокинов Th2, в лимфоцитах кишечника.

Также следует отметить, что изучаемые нами транскрипционные факторы могут экспрессироваться помимо классических № и так называемыми врожденными лимфоидными клетками (innate lymphoid cells - ILCs), играющими важную роль в регулировании и поддержании кишечного гомеостаза [18]. ILCs могут быть сгруппированы c учетом их селективной зависимости от специфических факторов транскрипции, необходимых для их развития и функционирования, в настоящее время выделяют три их основные группы: T-bet+ ILCs (1-я группа), GATA3+ ILCs (2-я группа) и RORyt+ ILCs (3-я группа). ILCs играют важную роль в развитии и созре-

вании КАЛТ, формировании изолированных лимфоидных фолликулов (ILF) [19]. Интересно, что этот процесс зависит от наличия синантропных бактерий в кишечнике, предполагают, что полученные от бактерий сигналы способствуют ILC-опосредованному образованию и созреванию вторичных лимфоидных структур в кишечнике. Кроме того, 3-я группа ILCs также способствует восстановлению архитектоники вторичных лимфоидных органов вследствие нарушения го-меостаза иммунных клеток вирусными или патогенными бактериальными инфекциями. Секреция ILCs3-клетками IL-22 играет роль в снижении проницаемости кишечного эпителия и анатомическом сдерживании конкретных видов синантропных бактерий, а срыв этого пути приводит к транслокации и распространению бактерий в периферических тканях и началу провоспалительного ответа с участием клеток адаптивной иммунной системы [20]. Показано снижение уровня IL-22-продуцирующих NCR+RORyt+ ILCs3-клеток и реципрокное увеличение количества IFNy-продуцирующих ILCl-клеток в толстой и подвздошной кишке у пациентов с болезнью Крона относительно аналогичных показателей у здоровых пациентов контрольной группы [21], предопределяя гипотезу, что баланс между lFNy-продуцирующими и ILCs22-продуцирующими ILC-клетками может влиять на тяжесть воспаления кишечника, оказывая воздействие на проницаемость кишечника и его репарацию. Powrie и соавт. (2011) установили увеличение экспрессии генов Th17-ассоциированных цитокинов IL17A и IL17F в CD3--клетках кишечной ткани у пациентов с болезнью Крона [22]. Результаты этих исследований подчеркивают необходимость лучшего понимания того, как ILcs регулируют адаптивный иммунитет с целью разработки новых терапевтических стратегий, направленных на лечение заболеваний, которые обусловлены неадекватными воспалительными реакциями на синан-тропную микрофлору, аллергены или аутоантигены. Таким образом, развитие и прогрессирование ВЗК могут быть связаны не только с изменением уровня экспрессии PRR и дисбалансом адаптивных субпопуляций Th1, Th2, Th17 и Treg, но и с распределением в КАЛТ врожденных T-bet+, GATA3+ и RORyt+ -лимфоцитов.

F. Heller и соавт. в своем исследовании описывают окса-золоновую модель колита как опосредованную Th2- и NKT-клетками, которые продуцируют IL-13. Секреция IL-13 мо-нонуклеарными клетками собственной пластинки слизистой оболочки кишечника повышается при оксазолоновом колите и имеет большое значение в индукции патологии [23]. Это наблюдали также и в других экспериментальных моделях воспаления, опосредованного Th2 [24]. Мыши, обработанные IL-13Ra2-Fc (АТ, нейтрализующие IL-13), были защищены от индукции оксазолонового колита [25]. Кроме того, цито-кин IL-13, а также IL-4 могут привести к нарушению плотных контактов между эпителиальными клетками, что в свою очередь способствует инвазии бактерий. Таким образом, воспаление при язвенном колите, как правило, начинается в дис-тальных отделах толстой кишки, где бактериальная нагрузка является наиболее высокой и где нарушение регуляции иммунного ответа может привести к стимуляции NNKT-клеток антигенпрезентирующими клетками, экспрессирующими CD1d. IL-13 секретируется активированными NKT- клетками и может способствовать распространению воспаления на соседние ткани, вызывая повреждение эпителиального барьера в этом регионе. Эти данные показывают, что CD4+ NKT-клетки, продуцирующие IL-13, наряду с Th2 способствуют прогрессированию колита, который напоминает язвенный колит у человека. Эта модель воспаления может быть эффективно заблокирована нейтрализацией IL-13, истощением или ингибированием активации NKT-клеток через CD1d, что может представлять возможный вариант лечения данного заболевания. Характерно, что наши результаты демонстрируют увеличение численности GATA-3+-лимфоцитов при развитии ОИК, что подтверждает его №2-зависимый генез. Кроме того, транскрипционный фактор GATA-3 в процессе своей дифференцировки могут экспрессировать и NKT-клетки.

Тем не менее одновременное увеличение субпопуляции про-воспалительных RORyt+-лимфоцитов и снижение супрессор-ных РохрЗ-клеток могут свидетельствовать также и о важной роли дисбаланса содержания Th17/Treg в механизмах развития колита. Снижение уровня провоспалительной сигнализации в кишечнике с помощью АРИЛ-1 и симвастатина дает положительный эффект на характер прогрессии ОИК.

выводы. 1. При развитии экспериментального ОИК колита увеличивается количество лимфоцитов, экспрессирую-щих мембранные ПРР TLR2 и TLR4, что приводит к накоплению в собственной пластинке слизистой оболочки и подсли-зистой основе дистального отдела толстой кишки RORyt+- и GATA-3+-лимфоцитов, при этом плотность RIGI+-, T-bet+- и супрессорных Рохр3+-лимфоцитов снижается.

2. Введение симвастатина и АРИЛ-1 на фоне развития колита снижало уровень активации как мембранных, так и ци-топлазматических рецепторов врожденного иммунитета, что закономерно уменьшало аккумуляцию Th в толстой кишке.

литература

1. Sartor R. Mechanisms of disease: pathogenesis of Crohn's disease and ulcerative colitis. Nat. Clin. Pract. Gastroenterol. Hepatol. 2006; 3 (7): 390-407.

2. Chao K., Zhong B., Zhang S., Gong X., Yao J., Chen M. Imbalance of CD4(+) T cell subgroups in ulcerative colitis. Zhonghua. Yi Xue Za Zhi. 2011; 91(23): 1605-8.

3. Izcue A., Coombes J., Powrie F. Regulatory T cells suppress systemic and mucosal immune activation to control intestinal inflammation. Immunol. Rev. 2006; 212: 256-71.

4. Randhawa P., Singh K., Singh N., Jaggi A. A review on chemical-induced inflammatory bowel disease models in rodents. Korean J. Physiol. Pharmacol. 2014; 18 (4): 279-88.

5. Leung B., Sattar N., Crilly A., Prach M., McCarey D., Payne H. et al. A novel anti-inflammatory role for simvastatin in inflammatory arthritis. J. Immunol. 2003; 170 (3): 1524-30.

6. Grip O., Janciauskiene S. Atorvastatin reduces plasma levels of chemokine (CXCL10) in patients with Crohn's disease. PLoS One. 2009; 4 (5): 5263.

7. Thompson R., Dripps D., Eisenberg S. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra) as a probe and as a treatment for IL-1 mediated disease. Int. J. Immunopharmacol. 1992; 14 (3): 475-80.

8. Wirtz S. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat. Protocols. 2007; 2(3): 541-6.

9. Tanaka K. Expression of Toll-like receptors in the intestinal mucosa of patients with inflammatory bowel disease. Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2008; 2(2): 193-6.

10. Cario E. Barrier-protective function of intestinal epithelial Tolllike receptor 2. Mucosal Immunol. 2008; 1: 62-6.

11. Reynolds J., Pappu B., Peng J., Martinez G., Zhang Y., Chung Y. et al. Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease. Immunity. 2010; 32(5): 692-702.

12. Wang X., Li M., Zheng H., Muster T., Palese P., Beg A. et al. Influenza A virus NS1 protein prevents activation of NF-kappaB and induction of alpha/beta interferon. J. Virol. 2000; 74(24): 11566-73.

13. Negishi H., Yanai H., Nakajima A., Koshiba R., Atarashi K., Matsuda A. et al. Cross-interference of RLR and TLR signaling pathways modulates antibacterial T cell responses. Nat. Immunol. 2012; 13(7): 659-66.

14. Neurath M., Weigmann B., Finotto S., Glickman J., Nieuwenhuis E., Iijima H. et al. The transcription factor T-bet regulates mucosal T cell activation in experimental colitis and Crohn's disease. J. Exp. Med. 2002; 195(9): 1129-43.

15. Dambacher J., Beigel F., Zitzmann K., De Toni E., Göke B., Diepolder H. et al. The role of the novel Th17 cytokine IL-26 in intestinal inflammation. Gut. 2009; 58(9): 1207-17.

16. Ohtani K., Ohtsuka Y., Ikuse T., Baba Y., Yamakawa Y., Aoyagi Y. et al. Increased mucosal expression of GATA-3 and STAT-4 in pediatric ulcerative colitis. Pediatr. Int. 2010; 52(4): 584-9.

17. Heller F., Fuss I., Nieuwenhuis E., Blumberg R. Oxazolone colitis, a Th2 colitis model resembling ulcerative colitis, is mediated by IL-13-producing NK-T cells. Immunity. 2002; 17: 629-38.

18. Spits H., Cupedo T. Innate lymphoid cells: emerging insights in development, lineage relationships, and function. Annu. Rev. Immunol. 2012; 30: 647-75.

19. Eberl G. Inducible lymphoid tissues in the adult gut: recapitulation of a fetal developmental pathway? Nat. Rev. Immunol. 2005; 5(5): 413-20.

20. Sonnenberg G., Monticelli L., Alenghat T., Fung T. Innate lymphoid cells promote anatomical containment of lymphoid-resident commensal bacteria. Science. 2012; 336 (6086): 1321-5.

21. Ciccia F., Accardo-Palumbo A., Alessandro R., Rizzo A., Principe S., Peralta S. et al. Interleukin-22 and interleukin-22-producing NKp44+ natural killer cells in subclinical gut inflammation in ankylosing spondylitis. Arthr. and Rheum. 2012; 64(6): 1869-78.

22. Geremia A., Arancibia-Carcamo C., Fleming M., Rust N., Singh B., Mortensen N. et al. IL-23-responsive innate lymphoid cells are increased in inflammatory bowel disease. J. Exp. Med. 2011; 208(6): 1127-33.

23. Heller F., Fuss I., Nieuwenhuis E., Blumberg R., Strober W. Oxazolone colitis, a Th2 colitis model resembling ulcerative colitis, is mediated by IL-13-producing NK-T cells. Immunity. 2002; 17(5): 629-38.

24. Minty A., Asselin S., Bensussan A., Shire D., Vita N., Vyakarnam A. et al. The related cytokines interleukin-13 and interleukin-4 are distinguished by differential production and differential effects on T lymphocytes. Eur. Cytokine Netw. 1997; 8(2): 203-13.

25. Donaldson D., Whitters M., Fitz L., Neben T., Finnerty H., Henderson S. et al. The murine IL-13 receptor alpha 2: molecular cloning, characterization, and comparison with murine IL-13 receptor alpha 1. J. Immunol. 1998; 161(5): 2317-24.

Поступила 18.11.14 Received 18.11.14