Штамм бактерий Escherichia Coli - продуцент рекомбинантного внеклеточного домена белка GP
BACTERIAL STRAIN ESCHERICHIA COLI - PRODUCER OF RECOMBINANT EXTRACELLULAR DOMAIN OF PROTEIN GP

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к штаммам микроорганизмов, в частности, к штамму бактерий Escherichia Coli – продуценту рекомбинантного внеклеточного домена белка GP вируса Эбола.
Вирус Эбола содержит одноцепочечную РНК отрицательной полярности, заключенную в липидную мембрану, и вызывает тяжелую геморрагическую лихорадку у людей и высших приматов с летальностью 50-90% [1]. Гликопротеин (GP) вируса Эбола– единственный белок, экспрессирующийся на поверхности вируса, и, соответственно, отвечающий за взаимодействие, слияние и проникновение в клетку-мишень [2]. GP вируса Эбола – основная мишень для дизайна вакцин и специфичных противовирусных препаратов. Также гликопротеин вируса Эбола является основным антигеном для диагностики заболевания.
Ген GP достаточно консервативен среди различных штаммов и кодирует два белка GP1 и GP2. Продукт гена GP разрезается протеазой фурином на две субъединицы – Cys53 GP1 и Cys609 GP2, которые остаются связаны дисульфидной связью [3, 4]. GP1 массой 74,5 кДа состоит из 676 аминокислотных остатков и трех доменов внутриклеточного, трансмембранного и внеклеточного. Для получения диагностических антител достаточно внеклеточного домена.
Известен штамм дрожжевых клеток, при помощи которого получали тример GP вируса Эбола [5]. Данное изобретение относится к области биотехнологии. Целью изобретения являлось предоставление способа получения тримера GP вируса Эбола, имеющего пост-трансляционные модификации, в т.ч. гликозилирование, близкие к таковым в клетках человека. Выбор дрожжей в качестве платформы был обусловлен необходимостью получить белок, наиболее подходящий для использования его в качестве вакцины: такой белок должен быть максимально похож на белок GP вируса Эбола, появляющийся в клетках во время заражения, для обеспечения адекватного иммунного ответа. Также преимуществом дрожжевого белка будет отсутствие бактериального эндотоксина.
Вышеприведенное изобретение является наиболее близким к заявляемому и было принято за прототип. Недостатком прототипа являются минусы дрожжевой платформы, такие как более длительное, по сравнению с бактериями, время наработки: деление бактерий происходит раз в 20-30 минут, дрожжей – раз в 1,5-2 часа, нередко наблюдающееся гипергликозилирование или отличный от необходимого паттерн гликозилирования, высокая частота рекомбинации.
Техническая проблема заключалась в необходимости разработки дешевого и быстрого способа получения большого количества GP вируса Эбола для целей диагностики: для иммунизации мышей и последующего получения диагностических антител и для создания калибровочного стандарта для диагностики. В настоящем изобретении использована бактериальная платформа для получения рекомбинантного белка, так как пострансляционные модификации и тримеризация GP для вышеобозначенных целей не существенны, а диагностические антитела с высокой афинностью к белку вируса могут быть получены при иммунизации животных бактериальным рекомбинантным белком, т.к. выбор таких антител осуществляется из большой панели.
Технический результат заключается в получении бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего высокий выход рекомбинантного внеклеточного домена белка GP, подходящего для диагностики вирусной инфекции, вызываемой вирусом Эбола.
Полученный штамм E.coli BL21[DE3]pET30b(+)eGP депонирован в Биоресурсном Центре – Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» – ГосНИИгенетика под № В-13347 и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физико-биохимическими свойствами.
Культурально-морфологические особенности штамма: грамотрицательные прямые палочки, размером 1,1-1,5×2,0-3,0 мкм, одиночные, спор и капсул не образуют. Каталазоположительные. Оксидазоотрицательные. Факультативные анаэробы. Клетки хорошо растут на простых питательных средах, содержащих и не содержащих канамицин, например, на среде LB. На агаризованной среде – колонии гладкие, круглые, слабо выпуклые, с ровным краем. В жидких средах образуют равномерную светорассеивающую суспензию, при хранении без перемешивания оседают на дно. Клетки растут в интервале температур от 8°C до 43°C, интервал для культивирования – 28-38°C, оптимум роста при 37°C. Интервал pH 5-7. Катализируют D-глюкозу и некоторые другие углеводы с образованием кислоты и газа, не сбраживают галактозу. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, не образуют H2S, гидролизуют мочевину.
Характеристики полезного вещества, синтезируемого штаммом: рекомбинантный белок – внеклеточный домен GP вируса Эбола, длиной 623 аминокислотных остатков, состоящий из внеклеточного домена GP вируса Эбола (617 аминокислот) и гистидиновой метки (6 аминоксилот). Белок биологически не активен, ввиду отсутствия гликозилирования и отсутствия возможности формирования тримера, но может быть использован для получения антител и в исследовательских целях.
Продуктивность штамма – рекомбинантный GP вируса Эбола составляет не менее 25% белка клеточного лизата при культивировании в условиях индукции.
Криоконсервацию осуществляют в запаянных ампулах, штамм, лиофильно-высушенный в среде, содержащей на 30 мл воды - 5 г сахарозы, 1,5 г желатина, хранится при комнатной температуре в течении 20 лет.
Культивирование штамма проводят при температуре 28-38°С в термостате или качалке, в жидкой LB-среде. Селективные условия - добавление 50 мкг/мл канамицина.
Ферментацию ведут в жидкой среде PYP-5052, содержащей 0,2% лактозы, с добавлением 50 мкг/мл канамицина, при перемешивании и аэрировании, при температуре 28-38°С в течение 18 часов.
Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами использования штамма Е.coli ВКПМ В-13347.
Пример 1. Создание генетической конструкции, обеспечивающей синтез рекомбинантного внеклеточного домена белка GP в клетках Е.coli.
In silico была проведена оптимизация кодонов для E.Coli, синтез полученной оптимизированной последовательности (SEQ ID NO: 1) был заказан в компании Евроген (Российская Федерация). Клонирование в экспрессионный вектор осуществлялось по сайтам рестрикции NdeI и XhoI: фрагмент ДНК и вектор подвергались рестрикции обозначенными ферментами, рестрикционные смеси очищались набором Cleanup (Евроген, РФ), смешивалась лигазная смесь. Лигирование производилось при +4С в течении 16 часов, затем лигазной смесью, трансформировались клетки Escherichia coli Dh5alpha. Позитивные по данным ПЦР колонии были пересеяны в ночные культуры, из ночных культур выделена плазмидная ДНК для верификации последовательности секвенированием и дальнейшей работы.
Плазмида pET30b+eGP обеспечивает синтез в клетках Escherichia coli внеклеточного домена белка GP, содержащего с C-конца участок, состоящий из 6-ти остатков гистидина -гистидиновой метки, предназначенной для последующей очистки рекомбинантного  внеклеточного домена белка GP c помощью металлохелатной хроматографии.
Пример 2. Получение штамма-продуцента рекомбинантного внеклеточного домена белка GP и исследование его продуктивности.
Полученной плазмидой pET30b+eGP были трансформированы клетки Escherichia coli штамма Е.coli BL21-Codon-Plus(DE3)-RIPL, содержащие в своем геноме ген, кодирующий полимеразу фага Т7 под контролем бактериального промотора, индуцируемого лактозой. Кроме того, они не содержат протеазу Lon и несут мутацию в гене, кодирующем протеазу OmpT. Отсутствие этих двух протеаз уменьшает деградацию гетерологичных белков. Данный штамм содержит также мутацию в гене rne, кодирующий рибонуклеазу Е, что приводит к увеличению стабильности мРНК в клетке и, как следствие, к повышению продукции клетками данного штамма рекомбинантного белка.
В результате был получен штамм E.coli ВКПМ № В-13347  - продуцент бактериального белка eGP.
Для поддержания полученного штамма-продуцента белка eGP использовали плотную агаризованную LB-среду, содержащую 50 мкг/мл канамицина.
Продуктивность полученного штамма-продуцента изучали путем культивирования клеток в среде LB с 0,1 mM IPTG, в термостатированной качалке орбитального типа при температуре 37°С, скорости вращения платформы 250 об/мин в течение 3 часов. Оптическая плотность (ОП600) культуры после окончания культивирования составила 4 О.Е. В качестве контроля использовали неиндуцированную культуру (без добавления IPTG). Образцы биомассы клеток лизировали и анализировали методом электрофореза в ПААГе в денатурирующих условиях. На Фиг. приведена электрофореграмма лизатов клеток Escherichia coli ВКПМ № В-13347  при культивировании в условиях индукции синтеза белка IPTG и без индукции, где 1 – лизат клеток Е.coli BL21-Codon-Plus(DE3)-RIPL  не трансформированных плазмидой, 2 - лизат ночной культуры клеток штамма Е.coli ВКПМ № В-13347  3 и 4 - лизат клеток штамма Е.coli ВКПМ № В-13347  без индукции экспрессии 0,2 mM IPTG 5 - белковый маркер молекулярного веса, кДа; 6 и 7- лизат клеток штамма Е.coli ВКПМ № В-13347 с индукцией экспрессии 0,1 mM IPTG. Также на электрофореграмме указаны молекулярные массы некоторых бендов маркера молекулярных весов.
В результате выявлено, что индукция IPTG культуры клеток E.coli ВКПМ № В-13347 приводит к синтезу белка с молекулярным весом примерно 69 кДа, что соответствует ожидаемому молекулярному весу для рекомбинантного внеклеточного домена белка GP с гистидиновой меткой. Количество рекомбинантного внеклеточного домена GP вируса Эбола составило не менее 25% белка клеточного лизата при культивировании в условиях индукции.
Пример 3. Очистка рекомбинантного внеклеточного домена GP вируса Эбола.
Рекомбинантный внеклеточный домен GP вируса Эбола (SEQ ID NO: 2) очищали из клеточных лизатов методом металлохелатной хроматографии с последующим диализом.
Влажную биомассу ресуспендировали в буфере PBS из расчета 5 мл буфера на 1 г биомассы. К суспензии добавляли 10% раствор Тритона Х-114 до конечной концентрации 0.1% и 100 мМ раствор PMSF до конечной концентрации 1 мМ. Клетки разрушали, обрабатывая суспензию ультразвуком на ледяной бане 5 раз по 1 минуте с перерывами в 2 минуты. Лизат центрифугировали при +4С в течение 1 часа с ускорением 13000 g. Супернатант отбрасывали, осадок ресуспендировали в буфере PBS, содержащем 0.01% Твин 20. Суспензию центрифугировали при +4С в течение 1 часа с ускорением 13000 g, супернатант отбрасывали. Осадок телец включения ресуспендировали в стартовом буфере с добавлением PMSF до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с интенсивным перемешиванием. Раствор фильтровали через фильтр с диаметром пор 0.45 мкм. Хроматографическую колонку для металл-аффинной хроматографии уравновешивали 5 объемами стартового буфера, вносили раствор телец включения, отмывали колонку 10 объемами стартового буфера и элюировали целевой белок 10 объемами элюирующего буфера. Мониторинг оптической плотности элюата осуществляли на длине волны 280 нм. Фракции общим объемом 20 мл, содержащие белок, объединяли, добавляли 500 мМ раствор ЭДТА до конечной концентрации 1 мМ и хранили при +4С. Стартовый буфер состоял из 50 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, 20 мМ имидазол, 6 М мочевина, pH = 7.80. Элюирующий буфер состоял из 50 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, 500 мМ имидазол, 6 М мочевина, pH = 7.80. Хроматографическая колонка - HisTrap HP 5 мл, использовалась скорость потока 2 мл/мин.
Затем проводили рефолдинг полученного белка. Буфер для рефолдинга (20 мМ фосфат натрия, 1 М L-аргинин, pH 7.80) охлаждали до +4С. Далее, 3 мл раствора очищенного белка, добавляли по каплям в 60 мл буфера для рефолдинга при активном перемешивании на магнитной мешалке. Полученный раствор инкубировали в течение 12 часов при +4С. Далее, раствор диализовали против буфера PBS, содержащего 1 мМ ЭДТА в течение 12 часов при +4С и концентрировали при помощи концентратора Vivaspin Turbo 15 до конечного объема 4 мл. Концентрация белка определяли по методу Лоури. Выход рекомбинантного GP составил 38 мг с литра бактериальной культуры без учета потерь при очистке и рефолдинге. Чистота выделенного белка GP составила не менее 95% по результатам электрофореза в полиакриламидном геле.
Список источников
1. Sanchez A, Geisbert TW, Feldmann H. Filoviridae: Marburg and Ebola viruses. In: Knipe DM, Howley PM, Griffin DE, et al., editors. Fields Virology. Lippincott Williams and Wilkins; Philadelphia, PA, USA: 2007. pp. 1409–1448. Comprehensive review of Filoviruses.
2. Chan, S. Y., Ma, M. C. & Goldsmith, M. A. (2000a). Differential induction of cellular detachment by envelope glycoproteins of Marburg and Ebola (Zaire) viruses. J Gen Virol 81, 2155–2159
3. Jeffers SA, Sanders DA, Sanchez A. Covalent modifications of the Ebola virus glycoprotein. J Virol. 2002;76(24):12463–12472.
4. Volchkov VE, Feldmann H, Volchkova VA, Klenk HD. Processing of the Ebola virus glycoprotein by the proprotein convertase furin. Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95(10):5762–5767.
5. Method used for preparing trimer Ebola virus glycoprotein mutant using yeast: патент № 106868025, Китай, заявка № CN20171145936, заявл. 13.03.2017, опубл. 20.06.2017.