ВЛИЯНИЕ ЛЕТУЧИХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ, СИНТЕЗИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ, НА ЭКСПРЕССИЮ С ПРОМОТОРОВ ГЕНОВ ZNTA, COPA И ARSR, ИНДУЦИРУЕМЫХ В ОТВЕТ НА ДЕЙСТВИЕ МЕДИ, ЦИНКА И МЫШЬЯКА

https://doi.org/10.17116/molgen202038031128

Влияние летучих органических соединений, синтезируемых бактериями, на экспрессию с промоторов генов zntA, cop A и arsR, индуцируемых в ответ на действие меди, цинка и мышьяка

© В.А. ПЛЮТА1, Д.Е. СИДОРОВА1, Г.Б. ЗАВИЛЬГЕЛЬСКИЙ2, В.Ю. КОТОВА2, И.А. ХМЕЛЬ1

'ФГБУ «Институт молекулярной генетики Национального исследовательского центра "Курчатовский институт"», Москва, Россия; 2ФГБУ «ГосНИИгенетика» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», Москва, Россия

РЕЗЮМЕ

Введение. Тяжелые металлы и мышьяк, попадая в окружающую среду, вызывают ее загрязнение, негативно влияют на здоровье человека. Летучие органические соединения (ЛОС), синтезируемые бактериями, способны модулировать рост и метаболизм про- и эукариот, функционировать в качестве сигналов дистанционной коммуникации между организмами и влиять на действие различных стрессовых агентов.

Материал и методы. Исследовано влияние серосодержащего диметилдисульфида (ДМДС) и кетонов (2-ундеканона, 2-нона-нона, 2-гептанона, 2-пентанона и 2-пропанона) на экспрессию с промоторов генов copA, zntA и arsR (PcopA, PzntA и ParsR), отвечающих на стрессы, вызванные действием тяжелых металлов и мышьяка. Были использованы /их-биосенсоры, содержащие индуцируемые промоторы указанных генов и /их-оперон в качестве репортера. Степень экспрессии с соответствующих промоторов определялась по интенсивности биолюминесценции.

Результаты. Действие 2-ундеканона, 2-нонанона, 2-гептанона и ДМДС приводило к снижению экспрессии /их-оперона, находящегося под контролем PcopA и ParsR. Предварительная обработка биосенсоров этими ЛОС вызывала снижение индукции экспрессии с PzntA и ParsR при действии ZnSO4 и NaAsO2, соответственно; в присутствии CuSO4 этот эффект был выражен только для 2-ундеканона. При действии 2-пентанона происходило увеличение экспрессии /их-репортера с PcopA и PzntA. Предобработка 2-пентаноном приводила к увеличению экспрессии /их-репортера с PzntA в присутствии ZnSO4 на 80% по сравнению с действием ZnSO4 без 2-пентанона.

Заключение. Влияние ЛОС на экспрессию с промоторов генов, отвечающих на стрессы, вызванные действием меди, цинка и мышьяка, разнонаправленно и зависит от структуры ЛОС.

Ключевые слова: летучие органические соединения, тяжелые металлы, мышьяк, /их-биосенсоры, гены copA, zntA, arsR ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:

Плюта В.А. — https://orcid.org/0000-0002-3127-4114; e-mail: plyutaba@gmail.com Сидорова Д.Е. — https://orcid.org/0000-0002-4038-1253; e-mail: misenok1@gmail.com Завильгельский Г.Б. — https://orcid.org/0000-0003-3995-6205; e-mail: zavilgel@genetika.ru Котова В.Ю. — e-mail: v-kotova@mail.ru

Хмель И.А. — https://orcid.org/0000-0002-3079-7845; e-mail: khmel@img.ras.ru Автор, ответственный за переписку: Плюта В.А. — e-mail: plyutaba@gmail.com

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Плюта В.А., Сидорова Д.Е., Завильгельский Г.Б., Котова В.Ю., Хмель И.А. Влияние летучих органических соединений, синтезируемых бактериями, на экспрессию с промоторов генов zntA, copA и aroR, индуцируемых в ответ на действие меди, цинка и мышьяка. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2020;38(3):128—135. https://doi.org/10.17116/molgen202038031128

The effect of volatile organic compounds synthesized by bacteria on the expression from promoters of zntA, cop.A, and arsR genes induced in response to the action of copper, zinc and arsenic

© V.A. PLYUTA1, D.E. SIDOROVA1, G.B. ZAVILGELSKY2, V.Yu. KOTOVA2, I.A. KHMEL1 institute of Molecular Genetics of National Research Center «Kurchatov Institute», Moscow, Russia;

2State Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms of the National Research Center «Kurchatov Institute», Moscow, Russia

ABSTRACT

Introduction. Heavy metals and arsenic, getting into the environment, cause its pollution, negatively affect human health. Volatile organic compounds (VOCs) synthesized by bacteria are able to modulate the growth and metabolism of pro- and eukaryotes, function as signals for distance communication between organisms, and influence the action of various stress agents. Material and methods. The effect of sulfur-containing dimethyl disulfide (DMDS) and ketones (2-undecanone, 2-nonanone, 2-hep-tanone, 2-pentanone and 2-propanone) on the expression from promoters of copA, zntA and arsR genes (PcopA, PzntA and ParsR) responding to stresses caused by the action of heavy metal ions and arsenic was studied. /их-Biosensors containing inducible promoters of the listed genes and the /их-operon as reporter were used. The degree of expression from the corresponding promoters was determined by the intensity of bioluminescence.

Results. The action of 2-undecanone, 2-nonanone, 2-heptanone, and DMDS led to decreased expression of /их-operon, which is controlled by PcopA and ParsR. Pretreatment of biosensors with these VOCs caused a decrease in the induction of expression

with PzntA and ParsR under the action of ZnSO4 and NaAsO2, respectively; in the presence of CuSO4, this effect was expressed only for 2-undecanone. Under the action of 2-pentanone there was an increase in expression of the /ux-reporter from PcopA and PzntA. Pretreatment with 2-pentanone led to an increase of the expression of the /ux-reporter from PzntA by 80%, compared with the action of ZnSO4 without 2-pentanone.

Conclusion. The effect of VOCs on the expression from promoters of genes that respond to stresses caused by copper, zinc, and arsenic is multidirectional and depends on the structure of VOCs.

Keywords: vo/ati/e organic compounds, heavy meta/s, arsenic, /ux-biosensors, copA, zntA, arsR genes. INFORMATION ABOUT THE AUTHORS:

Plyuta V.A. — https://orcid.org/0000-0002-3127-4114; e-mail: plyutaba@gmail.com Sidorova D.E. — https://orcid.org/0000-0002-4038-1253; e-mail: misenok1@gmail.com Zavilgelsky G.B. — https://orcid.org/0000-0003-3995-6205; e-mail: zavilgel@genetika.ru Kotova V.Yu. — e-mail: v-kotova@mail.ru

Khmel I.A. — https://orcid.org/0000-0002-3079-7845; e-mail: khmel@img.ras.ru Corresponding author: Plyuta V.A. — e-mail: plyutaba@gmail.com

TO CITE THIS ARTICLE:

Plyuta VA, Sidorova DE, Zavilgelsky GB, Kotova VYu, Khmel IA. The effect of volatile organic compounds synthesized by bacteria on the expression from promoters of zntA, copA, and arsR genes induced in response to the action of copper, zinc and arsenic. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2020;38(3):128—135. (In Russ.). https://doi. org/10.17116/molgen202038031128

Введение

Глобальная индустриализация создает проблему загрязнения окружающей среды различными токсичными веществами, включая тяжелые металлы. Тяжелые металлы входят в пищевую цепь и негативно влияют на здоровье человека, они могут быть канцерогенами. Кроме того, накопление тяжелых металлов в воде, осадках и почвах приводит к серьезным экологическим проблемам. К высокотоксичным веществам, загрязняющим окружающую среду, относится также мышьяк. В определенных концентрациях медь и цинк, как и ряд других тяжелых металлов, необходимы для поддержания клеточного метаболизма, они участвуют в большом количестве клеточных процессов [1, 2]. Но в более высоких концентрациях они токсичны для организмов. В ходе эволюции бактерии, обитая в различных экологических нишах, выработали механизмы для реагирования на изменения концентраций тяжелых металлов и мышьяка в окружающей среде. В связи с важностью биологических функций тяжелых металлов и мышьяка представляет большой интерес изучение их взаимодействия с биологически активными соединениями, которые могли бы модулировать их действие на клеточные процессы.

Микроорганизмы способны синтезировать летучие органические соединения (ЛОС) различной химической природы (рис. 1). Изучение природы, функциональной и экологической роли, механизмов действия и биосинтеза ЛОС — это новое актуальное направление, имеющее важное фундаментальное и прикладное значение, открывающее малоизученные аспекты конкурентных отношений между микроорганизмами и закономерности их взаимодействия с высшими организмами.

Недавно была опубликована база данных идентифицированных ЛОС, продуцируемых бактериями и грибами [3]. ЛОС способны модулировать рост и метаболизм про- и эукариот, функционировать в качестве сигналов дистанционной коммуникации нового типа между различными организмами. ЛОС могут также влиять на действие различных стрессовых факторов [4—6].

Например, в присутствии индола у Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Salmonella enterica усиливается резистентность к антибиотикам, у E. coli снижается устойчивость к кислотам [4]. В транскриптом-ных и протеомных исследованиях было определено большое количество генов, влияющих на устойчивость клеток Pseudomonasputida к действию бензола, толуола, бутанола и др. [7].

Из ЛОС, образуемых бактериями, была исследована генетика стресса, вызванного действием бутанола. Было показано, что толерантность к этому соединению определяется мультифакторным процессом, который включает широкий диапазон генетических и физиологических изменений для защиты клеток от его токсического действия [8, 9]. Также обнаружено, что в ответ на присутствие в среде бутанола в клетках Pseudomonas и Clostridium, толерантных к этому соединению, индуцируется синтез шаперонов, в том числе шаперонов GroES, IbpA и ClpP, участвующих в рефолдинге белков [10, 11]. Ранее мы продемонстрировали способность ЛОС (кетонов 2-ундеканона, 2-нонанона, 2-гептанона) влиять на рефолдинг белков в клетках E. coli и роль шаперона IbpB, который способствует рефолдингу термически инактивирован-ных люцифераз, защищая их от действия кетонов. Наблюдаемый эффект можно объяснить взаимодействием ЛОС с гидрофобными участками фермента и конкуренцией с шаперонами IbpAB [12].

Рис. 1. Химические формулы ЛОС, синтезируемых бактериями, в том числе относящимися к родам Pseudomonas (449; В-4117) и Serratia (IC1270; 94) [17].

С помощью методов транскриптомики было показано, что у E. coli экспрессия генов различных функциональных категорий, например тех, которые относятся к биогенезу белков (характеризующихся наличием железосерных (Fe/S) кластеров), транспортных и отвечающих на окислительный стресс белков, чувствительна к действию ЛОС с различной химической структурой в концентрациях, не ингиби-рующих рост бактерий. Некоторые из этих генов относятся к общим ответам на стрессовые факторы (например, на действие окислителей, антибиотиков, низкий уровень питательных веществ в окружающей среде, УФ-излучение и др.) [13].

Однако исследования, посвященные изучению генетических детерминантов, участвующих в регуляции действия ЛОС различной химической природы, выяснению контроля их стрессового действия, сравнению с другими известными стрессорами, в основном носят описательный характер и не рассматривают детально молекулярные механизмы действия ЛОС.

Цель работы — исследовать влияние ЛОС, выделяемых бактериями, на экспрессию генов, отвечающих на стрессы, вызванные действием ионов тяжелых металлов и мышьяка.

Предполагалось определить действие серосодержащего ЛОС диметилдисульфида (ДМДС) и кето-нов (2-ундеканона, 2-нонанона, 2-гептанона, 2-пен-танона и 2-пропанона) на экспрессию генов copA, zntA и araR, индуцируемых в клетке в ответ на наличие в среде солей CuSO4, ZnSO4 и NaAsO2 (продукты этих генов участвуют в защите клеток от токсичных концентраций указанных соединений). В работе было проведено 2 типа экспериментов по изучению: 1) действия ЛОС на экспрессию с промоторов генов copA, zntA и araR в нормальных условиях роста и 2) действия ЛОС на уровень экспрессии с промоторов указанных генов в условиях их индукции при добавлении растворов солей CuSO4, ZnSO4 и NaAsO2.

Материал и методы

Бактерии, условия выращивания, реактивы

Бактерии выращивали на жидкой среде LB (Miller Luria Bertani Broth): бактотриптон — Bacto Tryp-tone (Amresco, USA) — 10 г/л; дрожжевой экстракт — Yeast Extract (Sigma-Aldrich Chimie GmbH, Steinheim, Germany) — 5 г/л; хлорид натрия — NaCl («Реахим», Россия) — 10 г/л, и агаризованной среде LA (LB с 1,5% агара — Thermo Scientific Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK) при 30 °C и перемешивании (110 об./ мин). Ампициллин добавляли в среду в концентрации 100 мкг/мл (ОАО «Биохимик», Россия).

В качестве тестируемых ЛОС были использованы индивидуальные ЛОС в жидкой форме: диметил-дисульфид (ДМДС, >99% чистоты), 2-ундеканон (98%), 2-нонанон (>99%); 2-гептанон (>99%) 2-пен-танон (>99%), 2-пропанон (ацетон, >99%). Все ЛОС приобретены у фирмы Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Штайнхайм, Германия).

Биосенсоры для детекции меди, цинка и мышьяка

В работе были использованы высокочувствительные специфические lux-биосенсоры — E. coli с гибридными плазмидами (pCopA'::lux, pZntA'::/ux и pArsR'::lux), содержащими в качестве репортеров /ux-оперон (luxCDABE) из Photorhabdus luminescens, а в качестве регулируемых элементов — индуцируемые промоторы генов copA, zntA, и arsR (PcopA, PzntA и ParsR); lux-оперон транскрибировался с промоторов перечисленных генов. В присутствии в среде ионов меди, цинка и мышьяка клетки биосенсоров начинают люминесцировать. Степень экспрессии с соответствующих промоторов определялась по интенсивности биолюминесценции [14—16]. Измерения проводили на приборе Modulus microplate Multimode Reader (Turner Bio Systems inc., США).

1) Биосенсор E. coli JM83/pCopA'::lux. Транскрипцию гена copA (кодирует АТФ-зависимый белок — транспортер ионов меди и серебра) регулирует активатор CueR. При взаимодействии ионов меди Cu2+ с CueR данный белок активирует транскрипцию гена copA, а в биосенсоре — генов репортера lux-оперона, расположенных под индуцируемым промотором гена copA (PcopA).

2) Биосенсор E. coli JM83/pZntA'::lux. Транскрипцию гена zntA (кодирует АТФ-зависимый интегральный мембранный белок-транспортер ионов цинка, кадмия и свинца) регулирует активатор ZntR. При взаимодействии белка ZntR с ионами цинка данный белок активирует транскрипцию гена zntA, а в биосенсоре — транскрипцию генов lux-оперона с индуцируемого промотора гена zntA (PzntA).

3) Биосенсор E. coli JM83/pArsR'::lux. Ген arsR кодирует белок-репрессор ars-оперона (ars-оперон

определяет резистентность бактерий к ионам мышьяка и сурьмы). ArsR-белок формирует комплекс не с отдельным ионом мышьяка, а с оксианионом мышьяка (AsO2-), в котором именно трехвалентный атом мышьяка формирует связи с цистеиновыми остатками в полипептидной цепи белка ArsR. После этого происходит транскрипция генов ars-оперона, а в биосенсоре — транскрипция /их-оперона, расположенного под контролем индуцируемого промотора гена arsR (ParsR).

В качестве источников тяжелых металлов (Cu2+; Zn2+) и мышьяка (AsO2-) использовали водные растворы солей: CuSO4 (при конечной концентрации 8,85 мкг/мл); ZnSO4 (150 мкг/мл); NaAsO2 (4,5 мкг/мл). Все химические реактивы были аналитической чистоты.

Измерение экспрессии с промоторов генов copA,

zntA и arsR при действии ЛОС

Биосенсоры растили в течение 17—18 ч на среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, при 30 °С и перемешивании на качалке. Ночную культуру биосенсоров разводили в 100 раз (до концентрации ~107 клеток/мл) в свежей среде LB без антибиотиков и доращивали при 30 °С и перемешивании (110 об./мин) в течение 2 ч. Далее культуру разливали по 7 мл в пробирки объемом 15 мл. В каждом случае в качестве фона использовали пробу без добавления ЛОС и солей CuSO4, ZnSO4 или NaAsO2. Для оценки специфического влияния ЛОС на экспрессию с промоторов генов copA, zntA или arsR, ЛОС добавляли непосредственно в жидкую культуру в количествах, которые не подавляли или слабо подавляли рост клеток биосенсора. После добавления ЛОС в пробы пробирки плотно заматывали парафильмом (4 слоя, «Para-filmM» Pechiney Plastic Packaging Company», Чикаго, США) для предотвращения потерь летучих веществ.

К пробам, содержащим ЛОС, добавляли водные растворы указанных солей в случаях, когда требовалось оценить действие ЛОС на экспрессию с промоторов генов copA, zntA и arsR в условиях их индукции. Предобработка культуры ЛОС длилась в течение 30 мин с перемешиванием (300 об./мин) при комнатной температуре. В качестве положительного контроля были использованы пробы, содержащие клетки биосенсоров и водные растворы CuSO4, ZnSO4 и NaAsO2.

Все пробы герметизировали парафильмом и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре и перемешивании (300 об./мин). Затем измеряли интенсивность биолюминесценции в 96-луноч-ном планшете (8 лунок на каждый вариант пробы в объеме пробы, равном 200 мкл).

В каждом варианте все эксперименты повторяли не менее 3 раз.

Для определения количества клеток биосенсоров (КОЕ/мл) клетки высевали из соответствующих разведений на среду LA.

Результаты и обсуждение

Влияние ЛОС на экспрессию с промоторов генов

copA, arsR и zntA

Значение биолюминесценции сенсора E. coli JM83/pCopA'::lux в контроле при действии CuSO4 в отсутствие ЛОС в среднем было равно 4 000 000 относительных световых единиц (отн. ед.) (свечение сенсора возрастало ~в 26 раз по сравнению с фоновым уровнем) (рис. 2, а). Количество клеток lux-биосенсора без добавления ЛОС и CuSO4 в среднем было равно 30 107 КОЕ/мл, а при действии CuSO4 снижалось ~на 30%.

Значение биолюминесценции E. coli JM83/ pZntA'::lux при действии ZnSO4 в отсутствие ЛОС в среднем было равно 500 000 отн. ед. (свечение сенсора возрастало ~в 6,5 раз по сравнению с фоном) (см. рис. 2, б); количество клеток lux-биосенсора без добавления ЛОС и ZnSO4 в среднем было равно 30 107 КОЕ/мл, а при действии ZnSO4 оно снижалось ~на 10%.

Значение биолюминесценции E. coli JM83/ pArsR'::lux при действии NaAsO2 в отсутствие ЛОС в среднем было равно 400 000 отн. ед. (свечение сенсора возрастало ~в 8 раз по сравнению с фоном) (см. рис. 2, в). Количество клеток lux-биосенсора без добавления ЛОС и NaAsO2 в среднем было равно 25 1 07 КОЕ/мл, при действии NaAsO2 оно снижалось на 30—40%.

Из результатов, представленных на рис. 2, а и в, можно видеть, что 2-ундеканон (в количестве 30 мкмоль), 2-нонанон (10 мкмоль), 2-гептанон (20 мк-моль) и ДМДС (25 мкмоль) непосредственно не вызывают увеличения уровня биолюминесценции; напротив, имеется тенденция к ее небольшому снижению. Следовательно, действие этих ЛОС не приводит к активации экспрессии lux-оперона, находящегося под контролем промотора гена copA или arsR.

При действии указанных ЛОС на штамм JM83/ pZntA'::lux не наблюдается заметного влияния на биолюминесценцию. Только в случае действия 2-пентанона (60 мкмоль) на этот биосенсор можно видеть некоторое увеличение экспрессии lux-репортера — уровень свечения сенсора возрастает приблизительно в 2 раза по сравнению с фоновым значением (см. рис. 2, б). Такая же тенденция наблюдается при действии 2-пентанона на биосенсор E. coli JM83/pCopA'::lux (см. рис. 2, а).

Влияние совместного действия ЛОС с CuSO,

ZnSO4 и NaAsO2 на экспрессию с промоторов генов

copA, arsR и zntA

Добавление CuSO4 к культуре E. coli JM83/ pCopA'::lux приводило к значительному увеличению экспрессии репортера /их-оперона, находящегося под

s 80

о

£

ä 40 2

а/а

— "  " "  " 1 г+1 _

Контроль 2-Ундеканон 2-Нонанон 2-Гептанон 2-Пентанон 2-Пропанон ДМДС CUS04

б/Ь

so

so

2 40

20

£

; 40 2

rh n п

Фон Контроль 2-Уиаеканон 2-Нонанон 2-Гёптанон 2-Пентанон 2-Г1ропанон ДМДС CuS04

в/с

г-н . rh_d=L

Рис. 2. Действие ЛОС на биолюминесценцию биосенсора: а) E. coli JM83/pCopA'::lux; б) E. coli JM83/pZntA'::lux; в) E. coli JM83/pArsR'::lux.

Здесь и на рис. 3: столбцы показывают уровень биолюминесценции репортерного штамма (относительные световые единицы) в % от контроля. ЛОС: 2-ундеканон — 30 мкмоль, 2-нонанон — 10 мкмоль, 2-гептанон — 20 мкмоль, 2-пентанона — 60 мкмоль, 2-пропа-нона — 200 мкмоль и ДМДС 25 мкмоль.

Рис. 3. Действие ЛОС с CuSO4, ZnSO4 и NaAsO2 на биолюминесценцию биосенсора: а) E. coli JM83/pCopA'::lux; б) E. coli JM83/pZntA'::lux; в) E. coli JM83/pArsR'::lux.

контролем индуцируемого промотора гена copA (см. рис. 2, а, рис. 3, а). Было показано, что при совместном действии CuSO4 и ЛОС выживаемость клеток биосенсора снижается в том же диапазоне, что и при действии только CuSO4 (~на 30%). Таким образом, исследованные ЛОС не влияли на устойчивость клеток сенсора к последующему действию токсичных концентраций CuSO4.

При действии 2-пропанона (200 мкмоль) совместно с CuSO4 не наблюдалось изменений в уровне биолюминесценции по сравнению с контролем (см. рис. 3, а). Присутствие в культуре сенсора 2-пен-танона (60 мкмоль) приводило к некоторому увеличению биолюминесценции.

При действии 2-ундеканона (30 мкмоль) совместно с CuSO4, биолюминесценция штамма E. coli JM83/ pCopA'::lux уменьшалась ~на 50%, по сравнению с контролем (действие CuSO4 без ЛОС) (см. рис. 3, а).

При совместном действии ДМДС (25 мкмоль), 2-гептанона (20 мкмоль) и 2-нонанона (10 мкмоль) с CuSO4 биолюминесценция штамма E. coli JM83/ pCopA'::lux уменьшалась ~на 40, 30 и 15% соответственно по сравнению с контролем (действие CuSO4 без ЛОС) (см. рис. 3, а).

Добавление ZnSO4 к культуре E. coli JM83/ pCopA'::lux приводило к значительному увеличению экспрессии люциферазных генов, находящихся под контролем индуцируемого промотора гена zntA (см. рис. 2, б, 3, б).

При действии ЛОС совместно с ZnSO4 биолюминесценция штамма E. coli JM83/pZntA'::lux уменьшалась ~на 60% (2-ундеканон), 35% (2-нона-нон) и 25% (2-гептанон и ДМДС) по сравнению с контролем (действие ZnSO4 без ЛОС) (см. рис. 3, б). Таким образом, после предварительной обработки культуры биосенсора этими ЛОС подавляется активация экспрессии генов lMx-оперона, находящегося под контролем промотора гена zntA, при действии ZnSO4.

Следует отметить, что при совместном действии 2-пентанона (60 мкмоль) с ZnSO4, биолюминесценция штамма увеличивается на 80% по сравнению с действием ZnSO4 без ЛОС. При совместном действии 2-пропанона (200 мкмоль) с ZnSO4 не наблюдается изменений в уровне биолюминесценции по сравнению с контролем (см. рис. 3, б).

При действии ZnSO4 и совместном действии 2-пентанона и 2-ундеканона с ZnSO4 выживаемость клеток сенсора оставалась на уровне фона (контроль без добавления ЛОС и ZnSO4) (данные не приводятся).

Полученные данные демонстрируют возможность специфического влияния 2-пентанона и 2-ун-деканона — усиление или подавление активации транскрипции lwx-оперона, находящегося под контролем промотора гена zntA, в ответ на последующее действие ZnSO4.

Добавление NaAsO2 к культуре E. coli JM83/ pArsR'::lux приводило к значительному увеличению экспрессии генов /ux-оперона, находящихся под контролем индуцируемого промотора гена arsR (см. рис. 2, в, рис. 3, в).

При действии 2-ундеканона (30 мкмоль), 2-нонанона (10 мкмоль), 2-гептанона (20 мкмоль) или ДМДС (25 мкмоль) совместно с NaAsO2 биолюминесценция штамма E. coli JM83/pArsR'::lux уменьшалась на 40—50% по сравнению с контролем (действие NaAsO2 без ЛОС). Интересно отметить, что при совместном действии 2-пентанона (60 мкмоль) или 2-пропанона (200 мкмоль) с NaAsO2 не наблюдалось изменений в уровне биолюминесценции по сравнению с контролем (см. рис. 3, в).

Таким образом, в настоящей работе мы впервые исследовали влияние ЛОС на экспрессию с промоторов генов copA, zntA и arsR, отвечающих на стрессы, вызванные действием меди, цинка и мышьяка.

Используя специфические lux-биосенсоры, мы показали, что влияние ЛОС, синтезируемых бактериями, на экспрессию с промоторов генов copA, arsR и zntA разнонаправленно и зависит от их структуры. Большинство исследованных ЛОС в нормальных условиях роста не активирует экспрессию lux-репортера и, следовательно, экспрессию указанных генов. Из всех исследованных ЛОС только действие 2-пентанона (60 мкмоль) усиливало экспрессию lux-репортера, находящегося под контролем индуцируемого промотора гена zntA.

Наряду с этим совместное действие некоторых из исследуемых ЛОС с солями меди, цинка или мышьяка может приводить к модулированию (ин-гибированию или стимулированию) экспрессии с промоторов генов cop.A, zntA и arsR. Для ряда исследуемых ЛОС удалось показать, что данный эффект, по-видимому, специфичен, и не связан с непосредственным действием этих ЛОС на активность фермента люциферазы (данные не приводятся) и выживаемость клеток lux-биосенсоров. Так, например, при совместном действии 2-пентанона (60 мкмоль) с ZnSO4 наблюдается синергиче-ский эффект их действия на экспрессию генов lux-оперона. Следовательно, действие этого ЛОС может приводить к усилению активации в клетке экспрессии гена zntA, отвечающего за системы защиты клеток от токсичных концентраций цинка, кадмия и свинца. Чем объясняется эффект, наблюдаемый при действии 2-пентанона, отличающийся от эффектов при влиянии других ЛОС кетонов, в настоящее время неясно.

При действии других ЛОС экспрессия с промоторов генов zntA и arsR в присутствии солей ZnSO4 и NaAsO2 соответственно снижалась. Снижение экспрессии lux-оперона с промотора гена copA наблюдалось при действии 2-ундеканона в присутствии CuSO,.

Заключение

В настоящее время мы не можем однозначно объяснить, какие механизмы обусловливают эти эффекты. Можно предположить, что: 1) ЛОС действуют на регуляторные белки СиеЯ, А^Я и /МЯ, повреждая и/или изменяя их структуру, что ведет к изменению регуляции экспрессии контролируемых ими генов, в результате, например, изменения способности металл-связывающего домена этих белков взаимодействовать с соответствующими ионами; 2) ЛОС могут изменять проницаемость мембран клетки и/или влиять на белки-транспортеры ионов, таким образом приводя к повышению

AMTEPATYPA/REFERENCES

1. Hazrat Ali, Ezzat Khan, and Ikram Ilahi. Environmental Chemistry and Ecotoxicology of Hazardous Heavy Metals: Environmental Persistence, Toxicity, and Bioaccumulation. Journal of Chemistry. 2019;1-14. Article ID 6730305.

https://doi.org/10.1155/2019/6730305

2. Rahman Z, Singh VP. The relative impact of toxic heavy metals (THMs) (arsenic (As), cadmium (Cd), chromium (Cr)(VI), mercury (Hg), and lead (Pb)) on the total environment: an overview. Environ Monit Assess. 2019;191(7):419.

https://doi.org/10.1007/s10661-019-7528-7

3. Lemfack MC, Gohlke BO, Toguem SMT, Preissner S, Piechulla B, Preiss-ner R. mVOC 2.0: a database of microbial volatiles. Nucl Acids Res. 2018;46(1):1261-1265. https://doi.org/10.1093/nar/gkx1016

4. Audrain B, Farag MA, Ryu CM, Ghigo JM. Role of bacterial volatile compounds in bacterial biology. FEMS Microbiol Rev. 2015;39:222-233. https://doi.org/10.1093/femsre/fuu013

5. Schulz-Bohm K, Martín-Sánchez L, Garbeva P. Microbial volatiles: small molecules with an important role in intra- and inter-kingdom interactions. Front Microbiol. 2017;8:2484. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.02484

6. Veselova MA, Plyuta VA, Khmel IA. Volatile Compounds of Bacterial Origin: Structure, Biosynthesis, and Biological Activity. Microbiology. 2019;88(3):261-274.

https://doi.org/10.1134/S0026261719030160

7. Ramos JL, Sol Cuenca M, Molina-Santiago C, Segura A, Duque E, Gómez-García MR, et al. Mechanisms of solvent resistance mediated by interplay of cellular factors in Pseudomonas putida. FEMS Microbiol Rev. 2015;39(4):555-566. https://doi.org/10.1093/femsre/fuv006

8. Reyes LH, Abdelaal AS, Kao KC. Genetic determinants for n-butanol tolerance in evolved Escherichia coli mutants: cross adaptation and antagonistic pleiotropy between n-butanol and other stressors. Appl Environ Microbi-ol. 2013;79(17):5313-5320. https://doi.org/10.1128/aem.01703-13

9. Segura A, Molina L, Fillet S, Krell T, Bernal P, Munoz-Rojas J, et al. Solvent tolerance in Gram-negative bacteria. Current opinion in biotechnology. 2012;23(3):415-421.

https://doi.org/10.1016/j.copbio.2011.11.015

или понижению внутриклеточных концентраций токсичных соединений. Это в свою очередь может вызвать модуляцию экспрессии генов, отвечающих за системы защиты клеток от токсичных концентраций этих соединений. Дальнейшие эксперименты необходимы для более детального понимания молекулярных механизмов биологического действия ЛОС.

Финансирование. Работа частично финансировалась грантом РФФИ№18-34-00396-мол_а.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

10. Mao S, Luo Y, Zhang T, Li J, Bao G, Zhu Y, et al. Proteome reference map and comparative proteomic analysis between a wild type Clostridium aceto-butylicum DSM 1731 and its mutant with enhanced butanol tolerance and butanol yield. J Proteome Res. 2009;9(6):3046-3061. https://doi.org/10.1021/pr9012078

11. Segura A, Godoy P, van Dillewijn P, Hurtado A, Arroyo N, Santacruz S, et al. Proteomic analysis reveals the participation of energy- and stress-related proteins in the response of Pseudomonas putida DOT-T1E to toluene. J Bac-teriol. 2005;187(17):5937-5945. https://doi.org/10.1128/jb.187.17.5937-5945.2005

12. Melkina OE, Khmel IA, Plyuta VA, Koksharova OA, Zavilgelsky GB. Ketones 2-heptanone, 2-nonanone, and 2-undecanone inhibit DnaK-depen-dent refolding of heat-inactivated bacterial luciferases in Escherichia coli cells lacking small chaperon IbpB. Appl Microbiol Biotechnol. 2017;101(14):5765-5771. https://doi.org/10.1007/s00253-017-8350-1

13. Yung PY, Grasso LL, Mohidin AF, Acerbi E, Hinks J, Seviour T, et al. Global transcriptomic responses of Escherichia coli K-12 to volatile organic compounds. Scientific Reports. 2016;6:19899. https://doi.org/10.1038/srep19899

14. Завильгельский Г.Б., Котова В.Ю., Манухов И.В. Сенсорные биолюминесцентные системы на основе lux-оперонов для детекции токсичных веществ. Химическая физика. 2012;31(10):15-20.

Zavilgelsky GB, Kotova VYu, Manukhov IV. Sensory bioluminescent systems based on lux-operons for the detection of toxic substances. Chemical physics. 2012;31(10):15-20. (In Russ.).

https://elibrary.ru/download/elibrary_17994195_47457559.pdf

15. Riether KB, Dollard MA, Billard P. Assessment of heavy metal bioavailability using Escherichia coli zntAp::lux and copAp::lux-based biosensors. Appl Microbiol Biotechnol. 2001;57(5-6):712-716. https://doi.org/10.1007/s00253-001-0852-0

16. Cheng Vollmer A, Van Dyk TK. Stress responsive bacteria: biosensors as environmental monitors. Adv Microb Physiol. 2004;49:131-174. https://doi.org/10.1016/S0065-2911(04)49003-1

17. Popova AA, Koksharova OA, Lipasova VA, Zaitseva JV, Katkova-Zhukots-kaya OA, Eremina SIu, et al. Inhibitory and toxic effects of volatiles emitted by strains of Pseudomonas and Serratia on growth and survival of selected microorganisms, Caenorhabditis elegans, and Drosophila melanogaster. Biomed Res Int. 2014;125704. https://doi.org/10.1155/2014/125704

Поступила в редакцию 13.09.2019

Received 13.09.2019

После доработки 18.10.2019

Revised 18.10.2019

Принята к публикации 13.11.2019

Accepted 13.11.2019