СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ, РЕГЕНЕРАТИВНОЙ, ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ, ДЕТОКСИКАЦИОННОЙ, АДАПТОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ И СПОСОБНОГО РЕГУЛИРОВАТЬ МЕТАБОЛИЗМ
METHOD OF PRODUCING AGENT POSSESSING ANTI-INFLAMMATORY, REGENERATIVE, IMMUNOMODULATING, DETOXIFICATION, ADAPTOGENIC ACTIVITY AND CAPABLE OF REGULATING METABOLISM

Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, фармацевтике, медицине и ветеринарии, в частности к клеточной биотехнологии и терапии, и может быть использовано для получения средства, стимулирующего регенеративные процессы в организме человека или животного, для иммунокоррекции, коррекции нарушений обмена веществ, для детоксикации организма при инфекционных заболеваниях, пищевых или химических отправлениях, воспалительных процессах в организме человека или животного, а также для адаптации к смене условий обитания.
Уровень техники
В настоящее время активно развивается отрасль регенеративной медицины, задача которой - восстановление поврежденных структур организма за счет собственных ресурсов. В области регенеративной медицины известен ряд изобретений. В частности, полученные химическим синтезом пептиды общей формулы (относительно короткие (по 11, 12, 13 и 14 аминокислотных остатков) фрагменты интерлейкина-2 человека) являются индукторами и/или потенциаторами ростстимулирующей активности макрофагов in vitro и обладают регенеративно-репаративным действием in vivo (заявка на изобретение RU 94023808/04). Данные пептиды могут применяться в медицине для лечения ряда заболеваний, сопровождающихся генерализованной активацией макрофагов (поражения печени, кожные раны, ожоги, политравма, диабет и др.). Подобные пептиды, получаемые синтетически, имеют более низкую аффинность, а как следствие, и активность, по сравнению с соединениями, извлекаемыми из биологических систем при помощи биотехнологии.
6
Среди биотехнологических методов известен способ получения кондиционной среды, обладающей колониестимулирующей активностью, путем выделения селезенки интактной мыши CBA/CaLac, ее гомогенизации в жидкой среде, фильтрации, отмывания центрифугированием, доведения конечной концентрации до 2×10 спленоцитов/мл, культивирования взвеси в течение 6 суток при 37°С и хранении надосадка при температуре минус 20°С не более 1 месяца. Недостатком данного способа является применение дифференцированных клеток, которые обладают узкой направленностью действия (иммуномодулирующее), а также могут отторгаться в организме реципиента.
В настоящее время разрабатывается ряд средств и способов в области регенеративной медицины, основанных на применении мезенхимальных стволовых клеток. Данный объект имеет более широкий спектр действия, а также практически не несет риска отторжения.
Известно изобретение, в котором изложены способы и композиции для применения в клеточной терапии (патент RU 2610427). В описываемом изобретении мезенхимальные стволовые клетки применены отдельно, либо в сочетании с различными антигенами путем одновременного или последовательного введения в лимфатическую систему при иммуноопосредованных воспалительных заболеваниях.
o
Также известна кондиционная среда (патент RU 2292212), обладающая лечебным эффектом при термических ожогах на основе мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека и среды для их культивирования. Указанную среду получают путем сбора на стадии стационарного роста культуры стабильной клеточной линии мезенхимальных стволовых клеток, находящихся в G периоде клеточного цикла.
На основе различных клеток разработано средство для изменения скорости роста или репродукции клеток, которое стимулирует заживление ран и ожогов, позволяет корректировать косметический дефект, а также ингибирования старения кожи и способ стимуляции роста волос (патент RU 2280459). Композиции кондиционированной клеточной среды настоящего изобретения могут состоять из любой известной определенной или неопределенной среды и могут быть кондиционированы с использованием любых эукариотических клеток (стромальными клетками, паренхимными клетками, мезенхимными стволовыми клетками, резервными клетками печени, стволовыми нервными клетками, стволовыми клетками поджелудочной железы и/или эмбриональными стволовыми клетками). Также кондиционированная среда может быть обработана для выделения и очистки продукта, например, в целях удаления нежелательных протеаз (гель-хроматография (с использованием матриц, таких как сефадекс), ионообменная хроматография, аффинная хроматография на хелате металла с нерастворимой матрицей, такой как перекрестно-сшитая агароза, ВЭЖХ-очистка и гидрофобная хроматография). Альтернативно, может оказаться необходимой стерилизация, и она может быть осуществлена методами, позволяющими обеспечить сохранение нужной биологической активности.
Следует отметить, что для описанных выше изобретений характерна крайне узкая направленность действия, в то время как мезенхимальные стволовые клетки (МСК) способны обладать комплексным действием. Средство на их основе способно решить весь комплекс проблем, связанных с воспалением и повреждением тканей, нарушением функций иммунной системы, нарушениями обмена веществ, а также для адаптации организма к транспортному стрессу и стрессу при смене условий обитания.
Недостатки описанных изобретений во многом решены в комплексном средстве «иммуномодулятор - метаболик - детоксикант - адаптоген - радиопротектор» (патент RU 2194502). В указанном средстве содержатся по крайней мере один экстракт плаценты, одно производное нуклеиновой кислоты и дополнительно хотя бы один витамин. Главным преимуществом описанного изобретения является комплексность действия. Вместе с тем, применение клеток плаценты несет некоторые риски, связанные с возможной малигнизацией клеток. Дополнение композиции производными нуклеиновых кислот и витаминов не способствуют стабилизации фармацевтической композиции, могут антагонистически влиять на основное действующее вещество.
В качестве прототипа заявленного изобретения предлагается способ получения регенеративного ветеринарного препарата (патент RU 2662172), который включает культивирование выделенных de novo или деконсервированных мезенхимальных стволовых клеток, получаемых из жировой ткани или костного мозга животного, в жидкой питательной среде с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, получение кондиционной среды с содержанием интерлейкинов: ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6 и ИЛ-10 в концентрациях не менее 2; 2; 10 и 2 пг/мл, добавление экстракта МСК, добавление глицина, стерилизующую фильтрацию и лиофилизацию. В данном способе применены мезенхимальные стволовые клетки, которые обеспечивают регенеративную активность. Однако, мезенхимальные стволовые клетки способны обеспечить гораздо более широкий спектр терапевтического действия, которые не исследованы в приведенном изобретении. Подтверждение регенеративной активности по определению концентрации четырех интерлейкинов, значения которых находятся в пределах порога обнаружения большинства современных биохимических методов представляется сложным и дорогостоящим.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение ставит перед собой задачу разработки способа получения комплексного средства для человека или животного, которое через воздействие на ствологенные элементы тканей обеспечивает замещение поврежденных клеточных элементов, что приводит к восстановлению поврежденной структуры и нарушенных функций органов и систем.
Подобный подход позволит получить безопасное средство, практически не обладающее побочными действиями, но вместе с тем проявляющее целый ряд фармакологических активностей: регенеративная (восстановление печени, органов опорно-двигательной системы, кожи и ее производных), иммуномодулирующая (профилактика и лечение инфекционных заболеваний, профилактика иммунодефицитов у животных и их потомства), детоксикационная (устранение последствий интоксикации различной этиологии), адаптогенная (снижение стресса и укрепление иммунитета при смене места обитания).
Технический результат достигается путем разработки способа получения средства для человека или животного на основе кондиционной среды, получаемой при культивировании видоспецифичных мезенхимальных стволовых клеток, содержащей комплекс биологически активных веществ белково-пептидной природы, обеспечивающих перечисленные виды фармакологической активности. При разработке описываемого способа применена биологическая стандартизация.
Мезенхимальные стволовые клетки обладают способностью секретировать широкий спектр хемокинов и ростовых факторов, быстро реагировать на изменение гомеостаза ткани модификацией профиля их секреции, что обеспечивает природный механизм регенерации тканей. Показано, что основной вклад в регенерацию тканей вносит не замещение поврежденных клеток вводимыми клетками, а стимуляция собственного ствологенного потенциала организма. Указанный факт применен при создании описываемого способа получения фармакологического средства.
Описываемое изобретение представляет собой способ получения средства, состоящего из кондиционной среды от культивирования видоспецифичных мезенхимальных стволовых клеток человека или животного, может содержать экстракт мезенхимальных стволовых клеток, стабилизатор (глицин, сахароза или иной стабилизатор), консервант (хлорбутанолгидрат, фенол, хлороформ, нипагин или иной консервант), обладающее регенеративной, иммуномодулирующей, детоксикационной, адаптогенной активностью, способно регулировать метаболизм. Применение видоспецифичных мезенхимальных стволовых клеток позволяет минимизировать риски от применения средства, полученного заявляемым способом, связанные с возникновением аллергических реакций, непереносимостью препарата целевым организмом, а также онкогенностью.
Основу терапевтической активности средства, получаемого заявляемым способом, обеспечивают низкомолекулярные пептиды массой до 10 кДа. Это позволяет при необходимости применять очистку продукции методом ультрафильтрации, отсекая высокомолекулярные белковые фракции.
Описываемый способ выполняется в следующие этапы:
2
Накопление клеточной массы и формирование кондиционной среды. На данном этапе могут применяться как свежевыделенные видоспецифичные мезенхимальные стволовые клетки человека или животного, так и клетки после криогенного хранения. В качестве источника получения мезенхимальных стволовых клеток применяют жировую ткань или костный мозг. Культивирование производят в жидкой питательной среде (DMEM, среда Игла, 199 или другая пригодная для этих целей среда) с добавлением сыворотки фетальной КРС в концентрации от 10±5% при температуре 37±2°С, содержании СО 5±0,2%. Накопление клеток проводится с целью сбора кондиционной среды, пригодность которой оценивают биологическим методом по обеспечению регенеративной активности на модели дермальных фибробластов мыши. Полученная кондиционная среда представляет собой активную фармацевтическую субстанцию.
Приготовление средства на основе кондиционной среды. Полученную кондиционную среду подвергают стерилизации (стерилизующая фильтрация с применением фильтра с диаметром пор не более 0,45 мкм или иной приемлемый метод), после чего асептически разливают и укупоривают. Дополнительно могут быть предусмотрены этапы сведения с экстрактом мезенхимальных стволовых клеток КРС (экстракт получают путем разрушения клеток физическими - замораживание-оттаивание, ультразвуковые волны - или иными методами), добавление стабилизатора (глицин, сахароза или иной приемлемый стабилизатор), добавление консерванта (хлорбутанолгидрат, фенол, хлороформ, нипагин или иной приемлемый консервант), а также сублимационное высушивание.
Краткое описание иллюстративного материала
Изобретение поясняется таблицами.
Таблица 1. Регенеративная активность фракций кондиционной среды.
Таблица 2. Данные биохимических показателей крови крыс.
Таблица 3. Данные по ранозаживляющей активности.
Таблица 4. Данные по иммуномодулирующим свойствам средства, получаемого заявляемым способом.
Таблица 5. Данные по содержанию гормонов - индикаторов стресса.
Таблица 6. Данные биохимических показателей крови при детоксикации.
Возможность осуществления изобретения и эффективность его применения поясняется примерами.
Пример 1. Описание получения средства заявляемым способом.
3
3
Мезенхимальные стволовые клетки получали из подкожной жировой ткани человека: под местной анестезией делали кожный разрез длиной 2-4 см, из места разреза отбирали кусок подкожного жира объемом 0,5-1,0 см, помещали в пробирку с буферным раствором (Biowest, USA), содержащим гентамицин (80 мкг/см, Биолот, Россия). Жировую ткань фрагментировали до однородной массы и проводили ферментативную обработку с добавлением антибиотика и антимикотика, а также фермента трипсина (Biowest, USA), выдерживали 20±10 минут при температуре 37±2°С и постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Повторяли описанную операцию дважды со снижением времени инкубации до 20±5 минут. Клеточную суспензию очищали от остатков тканей путем центрифугирования, клетки высевали в культуральные флаконы в ростовую среду, содержащую 90% питательной среды DMEM (ПанЭко, Россия) и 10% сыворотки фетальной, культивировали при температуре 37±2°С и концентрации углекислого газа 5,0±0,2%.
После 24 часов культивирования производили замену среды. В дальнейшем замену среды выполняли раз в 3-4 суток. По достижении конфлюентности монослоя (контролируется визуально при помощи инвертированного микроскопа) не менее 85% его дезагрегировали диспергирующим раствором (0,05-0,1% трипсина (Biowest, USA) в растворе Версена (ПанЭко, Россия)) и проводили посев в новые культуральные флаконы с коэффициентом пересева от 1:3 до 1:6.
3
2
Для получения кондиционной среды культуру перевивали в течение не менее 3-4 пассажей, после чего выполняли посев в культуральные флаконы из расчета 5 - 20 × 10 клеток на 1 см площади ростовой поверхности и культивировали в описанных выше условиях. Качество кондиционной среды оценивали биологическим методом по обеспечению регенеративной активности на модели дермальных фибробластов мыши.
Полученная кондиционная среда может использоваться непосредственно по назначению для получения средства или храниться в течение продолжительного времени в определенных условиях (до семи суток - при температуре 5±3°С, более длительно хранение требует температуры не выше минус 18°С).
3
2
После сбора кондиционной среды, получали экстракт МСК: клеточный монослой дезагрегировали указанным выше диспергирующим раствором добавляли 0,9%-й раствор хлорида натрия (5-10 см на 25 см площади ростовой среды), подвергали замораживанию при температуре минус 20±2°С, после чего выполняли оттаивание при комнатной температуре. Полученный экстракт очищали от остатков клеток путем центрифугирования в течение 10 минут и добавляли в кондиционную среду.
3
При получении средства производилась добавление глицина в концентрации 22,5±2,5 мг/см, стерилизующая фильтрация через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, асептический розлив и укупорка.
3
Оставшаяся кондиционная среда была разделена на три части: первая часть подвергалась стерилизующей фильтрации без предварительных воздействий, для второй части перед стерилизующей фильтрацией выполняли ультрафильтрацию на мембране с рейтингом пор 50 кДа, третью часть фильтровали на мембране с порами, отсекающими вещества массой свыше 10кДа. Затем во все три полученные фракции добавляли глицин в концентрации 22,5±2,5 мг/см, после чего они подвергались по отдельности стерилизующей фильтрации через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, после чего асептически разливались и лиофильно высушивались.
Таким образом, получали средство в виде двух лекарственных форм - раствор для инъекций и лиофилизат для приготовления раствора для инъекций.
Пример 2. Определение фракции, содержащей действующее вещество средства, получаемого заявляемым способом.
Для исследования фракции кондиционной среды, содержащей действующее вещество, была проведена ультрафильтрация через мембраны с рейтингом пор 1, 10 и 50 кДа. Полученные фракции исследовали биологическим методом на модели дермальных фибробластов мыши с целью установить биологическую активность. Контроль - ростовая среда, нормой активности считали не менее 10% зарастания нанесенного на клеточный монослой повреждения.
Было установлено (таблица 1), что в контроле и ультрафильтрате, содержащем вещества менее 1 кДа активность ниже нормы. Фракции цельной кондиционной среды, ультрафильтраты, содержащие фракции менее 10 и менее 50 кДа обладают активностью. Статистически значимых различий между ними не выявлено. Из изложенного можно заключить, что активные компоненты кондиционной среды обладают массой от 1 до 10 кДа.
Пример 3. Коррекция патологии печени при помощи средства, получаемого заявляемым способом.
Применение средства для коррекции патологии печени исследовалось на модели острого поражении печени (МОПП) крыс. Модель острого поражения печени была выполнена путем однократного введения крысам в желудок через зонд парацетамола (N-(4-гидроксифенил)ацетамида) в виде суспензии в дозе 700 мг на 1 кг массы тела. В исследовании были три группы животных:
- интактные животные (не моделировали патологию);
3
- опытные животные (моделировали патологию, проводили терапию заявляемым средством; курс внутримышечного введения на 0, 3 и 5 сутки по 0,5 см на 100 г массы тела);
3
- контрольные животные (моделировали патологию, не проводили терапию, вводили по 1,0 см физиологического раствора).
За животными производили наблюдение в течение 10 дней, после чего животных выводили из эксперимента путем декапитации под легким эфирным наркозом. У животных отбирали кровь, в которой производилось биохимическое исследование. Перед забоем проводили исследование детоксикационной функции печени при помощи гексеналовой пробы.
В сыворотке крови определяли концентрацию общего белка (биуретовый метод), таких ферментов, как щелочная фосфатаза, аспартат-(АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлАТ), а также общий и конъюгированный билирубин. Исследованные биохимические параметры отражают функциональное состояние печени. Ферменты АсАТ и АлАТ присутствуют в значительных количествах в печени, почках и сердце, поэтому в норме концентрации АсАТ и АлАТ в крови невелики. При повреждении гепатоцитов происходит потеря ферментов АсАТ и АлАТ, и концентрация этих биохимических маркеров в крови возрастает.
Результаты исследования приведены в таблице 2. Полученные результаты свидетельствуют о следующем. Модель патологии сработала, так как в контрольной группе все исследованные показатели отличаются от показателей в группе интактных животных (время гексаналового сна и концентрации ферментов превышают, а концентрация белка сильно снижена). Так как исследованные показатели в группе опытных животных не отличаются от группы интактных животных, что указывает на исправление смоделированной патологии, можно заключить, что средство возможно применить для коррекции патологии печени.
Пример 4. Коррекция заболеваний кожи и ее производных при помощи средства, получаемого заявляемым способом.
Была исследована эффективность применения средства, получаемого заявляемым способом для лечения заболеваний кожи на модели инфицированной раны у крыс.
Процесс ранозаживления оценивали по изучению процента деструкции лимфоцитов и процента завершенного фагоцитоза в течение 14 суток. В таблице 3 приведены данные по указанным показателям. В опытной группе (крысам применяли средство, полученное заявляемым способом) процент деструкции лимфоцитов статистически значимо снижался на третьи, а процент завершенного фагоцитоза статистически значимо повышался на пятые сутки по сравнению с контролем. Уже на седьмые сутки в опытной группе лимфоцитов, подвергшихся деструкции, было менее 1%, при этом в контроле подобного показателя не было достигнуто до конца наблюдений (14 сутки). Была показана эффективность применения средства, получен
Пример 5. Коррекция заболеваний опорно-двигательной системы при помощи средства, получаемого заявляемым способом.
Была исследована эффективность применения средства, получаемого заявляемым способом, при заболевании опорно-двигательной системы у крупного рогатого скота (заболевания суставов - артрит, артроз, бурсит; заболевания костей - перелом, остеомаляция у телят).
Были отобраны животные с указанными заболеваниями - в контрольную и опытную группы. В контрольной группе применяли консервативное лечение, обычными для данного ветеринарного хозяйства средствами, в опытной группе - заявляемое средство в виде курса внутримышечных инъекций. Было показано сокращение сроков выздоровления (в среднем на 42,3%), более полное излечение заболевания, восстановление структуры и функций кости и сустава. В опытной группе, в отличие от контрольной, не наблюдалось рецидивов.
Пример 6. Иммуномодулирующие свойства средства, получаемого заявляемым способом.
Было исследовано влияние средства, получаемого заявляемым способом, на гуморальное звено иммунитета крыс. Было сформировано три группы животных: контрольная группа, опытная группа животных, которым вводили средство, получаемое заявляемым способом без ультрафильтрации, а также опытная группа животных, которым вводили средство, получаемое заявляемым способом, включая этап ультрафильтрации на мембране с рейтингом пор 50 кДа.
В соответствии с полученными данными (таблица 4) препарат стимулировал повышении концентрации антитело-образующих клеток (АОК) в 4 раза, что наблюдалось во все дни наблюдения после введения средства, получаемого заявляемым способом. Различий по данному показателю между средством, содержащим цельную фракцию кондиционной среды, и средством, профильтованным через мембрану в 50 кДа не обнаружено.
Пример 7. Применение средства, получаемого заявляемым способом, в качестве адаптогена.
Была исследована эффективность средства, получаемого заявляемым способом, в качестве адаптогена на модели социального стресса. В эксперименте использовано две группы животных - контрольная (не вводили никаких лекарственных средств) и опытная (применяли средство, получаемое заявляемым способом).
Полученные данные (таблица 5) свидетельствуют о статистически значимом снижении концентрации гормонов - индикаторов стресса (адреналин и кортизол) во время и после воздействия стресс-фактора у животных опытной группы. Наблюдение за животными показало более высокую двигательную и познавательную активность у животных опытной группы.
Пример 8. Применение средства, получаемого заявляемым способом, в качестве детоксиканта.
Была исследована детоксикационная активность средства, получаемого заявляемым способом. Средство применялось для КРС, поэтому при его изготовлении использованы мезенхимальные стволовые клетки коровы. В опыт отбирался крупный рогатый скот с атонией преджелудков различной этиологии, у которых наблюдалась выраженная картина интоксикации.
Животных с указанным заболеванием разделяли на контрольную и опытную группы. Для животных контрольной группы применяли консервативное лечение, для животных опытно группы его дополняли курсом внутримышечного введения заявляемого средства.
После 5 дней наблюдения животные контрольной группы начинали проявлять интерес к корму и воде, наблюдалась слабая руминация. В то же время, животные опытной группы проявляли интерес к корму и воде, наблюдалась руминация и повышение активности уже к концу третьих суток, а на пятые сутки были полностью здоровы.
Биохимические исследования крови, проведенные с целью изучения детоксикационной функции печени, показали, что у животных контрольной группы клиническая картина интоксикации подтверждается биохимическими маркерами (таблица 6). У животных опытной группы исследованные биохимические показатели были в норме уже на пятые сутки наблюдения.
Иллюстрации к изобретению
Примечание
* - здесь и далее статистически значимые различия на уровне р<0,05 по сравнению с контрольной труппой;
** - здесь и далее статистически значимые различия на уровне р<0,01 по сравнению с контрольной группой