СОЕДИНЕНИЕ, СВЯЗЫВАЮЩЕЕ АДРЕНОМЕДУЛЛИН (ADM), ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ТЕРАПИИ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ СИМПТОМОВ ЗАБОЛЕВАНИЯ
COMPOUND BINDING ADRENOMEDULLIN (ADM) FOR USE FOR THERAPY OR PREVENTION OF DISEASE SYMPTOMS

Настоящее изобретение относится к антителу против адреномедуллина (ADM), или фрагменту антитела против адреномедуллина, или не-Ig каркасу против ADM для применения для терапии или профилактики симптомов заболевания и/или для применения для терапии или профилактики заболеваний, характеризующихся указанными симптомами. Симптомы заболевания могут быть выбраны из группы, состоящей из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты у индивидуума, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас могут связываться с аминокислотами 1-52 ADM (SEQ ID NO:1) или с фрагментами этой последовательности.
Уровень техники
Разнообразные заболевания или патологии могут иметь общие частично неспецифические симптомы, которые могут находиться в диапазоне от неприятных до непереносимых для индивидуума, страдающего ими. Довольно часто индивидуумы, имеющие более одного симптома, должны принимать несколько лекарственных средств для смягчения этих симптомов. Существует постоянная потребность в новых формах терапии или предупреждения симптомов, ассоциированных с различными обуславливающими их заболеваниями или патологиями. В частности, было бы полезным предоставление медикаментов или лекарственных средств, которые можно использовать для терапии или профилактики более одного симптома, ассоциированного с заболеванием или патологией, лежащими в их основе. Настоящее изобретение направлено на эту потребность.
Kitamura K. et al. 1993. Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 192 (2): 553-560
Editorial, Takahashi K. 2001. Peptides 22:1691) и (Eto T. 2001. Peptides 22: 1693-1711
Hinson et al. 2000. Endocrine Reviews 21(2):138-167
Kitamura K. et al. 1998. Biochem. Biophys. Res. Commun. 244(2):551-555
Pio R. et al. 2001. The Journal of Biological Chemistry 276(15):12292-12300
Пептид адреномедуллин (ADM) был впервые описан в 1993 году () в качестве нового гипотензивного пептида, содержащего 52 аминокислоты, который был выделен из феохромоцитомы человека. В том же году также была описана кДНК, кодирующая пептид-предшественник, содержащий 185 аминокислот, и полная аминокислотная последовательность этого пептида-предшественника. Пептид-предшественник, который содержит, среди прочего, сигнальную последовательность из 21 аминокислоты на N-конце, также называют "препроадреномедуллином" (пре-проADM). В настоящем описании все указанные положения аминокислот обычно относится к пре-проADM, который содержит 185 аминокислот. Пептид адреномедуллин (ADM) представляет собой пептид, который содержит 52 аминокислоты (SEQ ID NO:1) и который содержит аминокислоты 95-146 пре-проADM, из которого он образуется посредством протеолитического расщепления. На сегодняшний день только несколько фрагментов пептидных фрагментов, образующихся при расщеплении пре-проADM, являются более точно охарактеризованными, в частности, физиологически активные пептиды адреномедуллин (ADM) и "PAMP", пептид, содержащий 20 аминокислот (22-41), который следует после 21 аминокислот сигнального пептида в пре-проADM. Открытие и охарактеризация ADM в 1993 году запустили интенсивную исследовательскую активность, результаты которой обобщенно представлены в различных обзорных статьях, в контексте настоящего описания ссылка приводится, в частности, на статьи, в выпуске "Пептиды", посвященном, в частности, ADM (). Другим обзором является (). В научных исследованиях, проведенных на сегодняшний день, было обнаружено, среди прочего, что ADM может считаться полифункциональным регуляторным пептидом. Он высвобождается в кровоток в неактивной форме, удлиненной на глицин (). Также существует связывающий белок (), который является специфичным к ADM, и, возможно, аналогично модулирует эффект ADM. Эти физиологические эффекты ADM, а также PAMP, которые имеют основную важность в исследованиях на сегодняшний день, представляли собой эффекты, влияющие на кровяное давление.
ADM является эффективным сосудорасширяющим веществом и является возможным установление ассоциации гипотензивного эффекта с конкретными сегментами пептидов на C-концевой части ADM. Более того, было обнаружено, что вышеупомянутый физиологически активный пептид PAMP, образовавшийся из пре-проADM, аналогично демонстрирует гипотензивный эффект, даже несмотря на то, что оказалось, что он имеет механизм действия, отличный от ADM.
Hirata et al. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1996. 81(4): 1449-1453; Ehlenz K. et al. 1997. Exp Clin Endocrinol Diabetes 105: 156-162); Tomoda Y. et al. 2001. Peptides 22: 1783-1794; Ueda S. et al. 1999. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160: 132-136; и Wang P. Peptides 2001. 22: 1835-1840
Более того, было обнаружено, что концентрации ADM, которые можно определять в крови и других биологических жидкостях при ряде патологических состояний, значительно превышают концентрации у здоровых контрольных индивидуумов. Таким образом, уровень ADM у пациентов с застойной сердечной недостаточностью, инфарктом миокарда, заболеваниями почек, гипертензивными нарушениями, сахарным диабетом в острой фазе шока и при сепсисе и септическом шоке значительно возрастает, хотя и в различной степени. Концентрации PAMP также возрастают при некоторых из указанных патологических состояний, однако уровни в плазме являются более низкими относительно ADM ((Eto, T., выше). Более того, известно, что необычно высокие концентрации ADM наблюдаются при сепсисе и наиболее высокие концентрации наблюдаются при септическом шоке (см (Eto, T., выше) и ().
Petersen et al. 2008. Cephalalgia 29: 23-30
Akcali A. 2016. Medical Science and Discovery 3(4): 153-158
Kis et al. 2003. Hypertens Res 26 (Suppl): S61-S70
Существует только ограниченная информация о роли адреномедуллина при мигрени. Поскольку адреномедуллин имеет сосудорасширяющие эффекты в кровотоке головного мозга, предположительно, он вовлечен в мигрень. С одной стороны, проведение внутривенной инфузии ADM человека пациентам, страдающим от мигрени, не индуцировало значительно более сильную головную боль или мигрень по сравнению с плацебо (). Более того, Akcali et al. сообщили о низких уровнях адреномедуллина в плазме при естественном течении мигрени у пациентов (). С другой стороны, Kis et al. утверждали, что существует потребность в разработке новых, эффективных, специфических и возможно непептидных антагонистов рецепторов в качестве потенциальных терапевтических инструментов для подавления ADM-опосредуемых пролиферативных эффектов в качестве лекарственных средств против мигрени ().
Определения
Перед подробным описанием изобретения является целесообразным предоставление определений определенных технических терминов, используемых на протяжении настоящего описания. Хотя настоящее изобретение описано в отношении конкретных вариантов осуществления, настоящее описание не следует истолковывать как ограничивающее. Перед подробным описанием иллюстративных вариантов осуществления настоящего изобретения приводятся определения, важные для понимания настоящего изобретения.
Как используют в настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения, форма единственного числа также включает соответствующую форму множественного числа, если контекст явно не указывает на иное.
В контексте настоящего изобретения, термины "приблизительно" и "примерно" обозначают интервал точности, который, как понятно специалисту в данной области, все еще обеспечивает технический эффект рассматриваемого признака. Термин как правило, указывает на отклонение от числовой величины ±20%, предпочтительно ±15%, более предпочтительно ±10% и еще более предпочтительно ±5%.
Следует понимать, что термин "содержащий" является не ограничивающим. Для целей настоящего изобретения термин "состоящий из" считается предпочтительным вариантом осуществления термина "содержащий". Если далее определено, что группа содержит по меньшей мере определенное количество вариантов осуществления, это подразумевает, что она также охватывает группу, которая предпочтительно состоит только из этих вариантов осуществления.
Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем описании, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который ограничивается только прилагаемой формулой изобретения.
Metz A. 2017. Australian Family Physician Vol. 36 (9): 688-692
Как используют в рамках изобретения, термин "тошнота" относится к ощущению тяжести и дискомфорта в верхнем отделе желудка с непроизвольным позывом к рвоте (). Он может предшествовать рвоте, однако индивидуум может иметь тошноту без рвоты. Когда она является длительной, она является истощающим симптомом. Тошнота является неспецифическим симптомом, что означает, что она имеет множество возможных причин. Некоторыми частыми причинами тошноты являются укачивание в транспорте, головокружение, мигрень, слабость, низкий уровень саха в крови, гастроэнтерит (желудочная инфекция) или пищевое отравление. Тошнота является побочным эффектом множества лекарственных средств, включая химиотерапию, или раннего токсикоза беременности. Тошнота также может быть вызвана тревожностью, брезгливостью и депрессией.
Waldman et al. 2014. J Yoga Phys Ther 2014, 4:1
Как используют в рамках изобретения, термин "головная боль" является симптомом боли где-либо в области головы или шеи. Она возникает при мигрени (острая или пульсирующая боль), головной боли напряжения и кластерных головных болях (). Также у индивидуумов с тяжелой головной болью существует увеличенный риск депрессии. Головная боль может возникать в результате многих состояний, как тяжелых, так и не тяжелых. Существует ряд различных систем классификации головных болей. Является общепризнанным, что причины головных болей могут включать усталость, недосып, стресс, эффекты лекарственных средств, эффекты психоактивных веществ, вирусные инфекции, громкий шум, простуду, травму головы, быстрое употребление очень холодной пищи или напитка, и проблемы с зубами или пазухами.
Oleson 2005. Functional Neurology 20(2): 61-68
Головные боли широко подразделяют на "первичные" или "вторичные" (). Первичные головные боли представляют собой доброкачественные рецидивирующие головные боли, которые не вызваны обуславливающим заболеванием или структурными проблемами. Например, мигрень является типом первичной головной боли. В то время как первичные головные боли могут вызывать значительную ежедневную боль, они не являются опасными. Четыре категории первичной головной боли представляют собой: мигрень, головная боль напряжения (TTH), кластерная головная боль и другие автономные цефалгии тройничного нерва, и другие первичные головные боли.
Diener et al. 2012. Nat Rev Neurol. 8(3):162-71
Вторичные головные боли, которые имеют органическое, метаболическое или индуцированное лекарственными средствами происхождение, вызываются обуславливающим заболеванием, таким как инфекция, травма головного мозга, сосудистые нарушения, кровоизлияние в головной мозг и опухоли. Вторичные головные боли могут быть безвредными или опасными. Мигрень представляет собой первичное нарушение, обуславливаемое головной болью, характеризующееся рецидивирующей головной болью от умеренной до тяжелой (для обзора см.: ). Как правило, головные боли поражают одну половину головы, имеют пульсирующий характер и длятся от двух до 72 часов. Ассоциированные с ней симптомы могут включать тошноту, рвоту и чувствительность к свету, звуку или запаху. Боль, как правило, усиливается при физической активности. Вплоть до одной трети людей имеют ауру: обычно короткий период нарушения зрения, который сигнализирует, что скоро возникнет головная боль. Иногда аура может возникнуть с небольшой головной болью после нее или ее отсутствием.
Kyriakides et al. 2013. European Journal of Neurology 20: 997-1005
Как используют в рамках изобретения, термины "ломота в мышцах" или "мышечная боль", также называемая "миалгией", относятся к симптому многих заболеваний и нарушений (для обзора см.: ). Наиболее частыми причинами являются перегрузка или перерастяжение мышцы или группы мышц. Миалгия без травмы в анамнезе часто является результатом вирусных инфекций. Длительные миалгии могут указывать на метаболическую миопатию, дефицит некоторых питательных веществ или синдром хронической усталости.
Cohen et al. 2008. BMJ. 337:a2718
Как используют в рамках изобретения, термин "боль в спине" относится к болезненным ощущением в любой части спины. Эпизоды боли в спине могут быть острыми, подострыми или хроническими в зависимости от длительности. Боль может быть охарактеризована как ноющая боль, стреляющая или колющая боль, или ощущение жжения. Боль может иррадиировать в плечи и руки, а также в ноги и ступни, и может включать парестезию (покалывание без видимой причины), слабость или онемение в ногах и руках. Анатомическая классификация боли в спине соответствует сегментам спины: боль в шее (цервикальная), боль в среднем отделе спины (торакальная), боль в нижнем отделе спины (поясничная) или кокцигодиния (боль в области копчика или крестцовая боль) причем наиболее частой является боль в поясничной области позвоночника. Источником боли могут быть мышцы, нервы, кости, суставы или другие структуры позвоночного столба (позвоночника), однако также указанную боль в спине могут вызывать внутренние структуры, такие как желчный пузырь и поджелудочная железа ().
Как используют в рамках изобретения, термин "дрожь" (также называемая "дрожанием") представляет собой функцию организма в ответ на предшествующую гипотермию или просто ощущение холода у теплокровных животных. Когда центральная температура тела снижается, запускается рефлекс дрожания для поддержания гомеостаза. Скелетные мышцы начинают трястись мелкими движениями, генерируя тепло посредством расходуемой энергии. Дрожание также может быть ответом на лихорадку, поскольку индивидуум может ощущать холод. В ходе лихорадки заданная гипоталамусом величина температуры возрастает. Увеличенная заданная температура вызывает повышение температуры организма (пирексия), но также приводит к тому, что пациент чувствует, что ему холодно, до тех пор, пока не будет достигнута новая заданная температура. Тяжелую дрожь с сильным дрожанием называют ознобом. Озноб может быть результатом того, что организм пациента дрожит в физиологической попытке увеличить температуру тела до новой заданной точки. Дрожание также может появляться после хирургической операции, что известно как постанестетическое дрожание.
Metz A. 2017. Australian Family Physician Vol. 36 (9): 688-692
Как используют в рамках изобретения, термин "рвота", также известный как рвотные позывы и срыгивание, среди других терминов, представляет собой непроизвольное резкое изгнание содержимое желудка индивидуума через рот и иногда через нос (). Рвота может вызываться широким множеством состояний; она может проявляться в качестве специфического ответа на заболевание, такое как гастрит или отравление, или в качестве неспецифического следствия нарушений, лежащих в диапазоне от опухолей головного мозга и повышенного внутричерепного давления до чрезмерного воздействия ионизирующей радиации.
Как используют в рамках изобретения, симптомы недомоганий или заболеваний у пациента, нуждающегося в терапии и/или предупреждении таких симптомов, выбирают из групп показаний, включающих воспалительные состояния, аутоиммунные заболевания, метаболические заболевания, заболевания головного мозга, сердечно-сосудистые заболевания и индуцируемые лекарственными средствами заболевания.
Ниже предоставлены типы симптомов и заболеваний, ассоциированных с ними, в форме неограничивающего перечня. Следует отметить, что описанная в настоящем описании терапия или профилактика могут быть направлены на более чем один тип симптома. Кроме того, следует отметить, что данное медицинское показание, недомогание или заболевание может быть ассоциировано более чем с одним из симптомов.
Симптом "тошнота" может быть ассоциирован с заболеваниями живота, например, обструктивными нарушениями (например, пилорическая обструкция, обструкция тонкого кишечника, обструкция толстого кишечника, синдром верхней брыжеечной артерии), кишечными инфекциями (например, вирусная или бактериальная инфекция), воспалительными заболеваниями (такими как холецистит, панкреатит, аппендицит, гепатит), сенсорно-двигательной дисфункцией (например, гастропарез, псевдообструкция кишечника, желудочно-пищеводный рефлюкс, хроническая идиопатическая тошнота, функциональная рвота, синдром циклической рвоты, синдром срыгивания) или желчной коликой; заболеваниями вне живота, например, сердечно-легочным нарушением (таким как кардиомиопатия, инфаркт миокарда), заболеваниями внутреннего уха (такими как укачивание в транспорте, лабиринтит, злокачественные опухоли), внутримозговыми нарушениями (например кровоизлияние в мозг, абсцесс, гидроцефалия, злокачественные опухоли), психиатрическими заболеваниями (например, анорексия и нервная булимия, депрессия), послеоперационной рвотой, тошнотой, ассоциированной со способами терапии и лекарственными средствами (например, химиотерапия и биологическая терапия, антибиотики, средства против аритмии, дигоксин, пероральные гипогликемические средства, пероральные контрацептивы), тошнотой, ассоциированной с эндокринными/метаболическими заболеваниями (такими как беременность, уремия, кетоацидоз и заболевание паращитовидной железы, недостаточность надпочечников), тошнотой вследствие интоксикации в результате печеночной недостаточности, злоупотреблением алкоголем и т.д.
Симптом "боль в спине" может быть ассоциирован с заболеваниями вследствие воспаления, особенно в острой фазе, которая, как правило, длится от двух недель до трех месяцев, и он может быть ассоциирован с люмбаго, травмой, повреждением, инфекциями, злокачественной опухолью (особенно злокачественными опухолями, о которых известно, что они распространяются в позвоночник, такими как рак молочной железы, легкого и предстательной железы) и т.д.
Симптом "миалгия" или "боль в мышцах" может быть ассоциирован с повреждением или травмой, включая растяжение, гематому или перенапряжение, когда мышца используется чрезмерно, слишком часто, в том числе при защите от отдельного повреждения, хроническое напряжение, мышечную боль вследствие рабдомиолиза, ассоциированного, например, с вирусными инфекциями, компрессионной травмой, он может быть связан с лекарственными средствами, например, вследствие фибратов и статинов, ингибиторов ACE, кокаина, некоторых антиретровирусных лекарственных средств, тяжелого дефицита калия, фибромиалгии, синдрома Эхлерса-Данлоса, аутоиммунных нарушений (включая, например, смешанное заболевание соединительной ткани, системную красную волчанку, ревматическую полимиалгию, миозит, такой как полимиозит, дерматомиозит и миозит с тельцами включения, рассеянный склероз, миалгический энцефаломиелит (синдром хронической усталости), семейную средиземноморскую лихорадку, узелковый полиартериит, болезнь Девика, кольцевидную склеродермию, саркоидоз), метаболических заболеваний (таких как дефицит карнитинпальмитоилтрансферазы II, синдром Конна, недостаточность надпочечников, гипертиреоидизм, гипотиреоз, диабет, гипогонадизм), а также каналопатий, синдрома Стиклера, гипокалиемии, гипотонии (низкий тонус мышц), непереносимости физической нагрузки, мастоцитоза, периферической невропатии, синдрома эозинофилии-миалгии, лихорадки Барку, герпеса, гемохроматоза, также известного как перегрузка железом, синдрома отсроченной мышечной болезненности, СПИД, ВИЧ-инфекций, индуцируемой опухолью остеомаляции, гиповитаминоза D, инфаркта миокарда.
Helicobacter pylori
Симптом "головная боль" может быть ассоциирован с первичными головными болями. 90% всех головных болей представляют собой первичные головные боли. Первичные головные боли обычно впервые начинаются у человека в возрасте от 20 до 40 лет. Наиболее распространенными типами первичных головных болей являются мигрени и головные боли напряжения. Они имеют различные характеристики. Мигрени, как правило, проявляются как пульсирующая боль в голове, тошнота, светобоязнь (чувствительность к свету) и фонофобия (чувствительность к звукам). Головные боли напряжения обычно проявляются как не пульсирующее "опоясывающее" давление с обеих сторон головы, не сопровождающееся другими симптомами. Другие очень редкие типы первичных головных болей включают: кластерные головные боли: короткие эпизоды (15-180 минут) тяжелой боли, обычно вокруг одного глаза, с автономными симптомами (слезотечение, покраснение глаз, заложенность носа), которые возникают в одно и то же время каждый день. Кластерные головные боли можно лечить триптанами и предупреждать преднизоном, эрготамином или литием. Кроме того, они включают невралгию тройничного нерва или затылочную невралгию, характеризующуюся стреляющей болью в лице, продолжительной гемикранией, т.е. непрерывной односторонней болью с эпизодами тяжелой боли; первичные стреляющие головные боли, например, рецидивирующие эпизоды стреляющей "боли от ледокола" или "толчков и ударов" в течение от 1 секунды до нескольких минут без автономных симптомов (слезотечение, покраснение глаз, заложенность носа); первичную головную боль при кашле, которая начинается внезапно и длится несколько минут после кашля, чихания или напряжения (что-либо, что может повысить давление в голове). Серьезные причины (см. важный раздел о вторичных головных болях) должны быть исключены перед постановкой диагноза "доброкачественная" первичная головная боль при кашле; первичная головная боль при физической нагрузке характеризуется ритмичной пульсирующей болью, которая начинается в ходе или после физической нагрузки, длящаяся в течение от 5 минут до 24 часов, механизм этих головных болей неясен, возможно вследствие того, что напряжение вызывает расширение вен головы, вызывая боль; первичные головные боли при половом акте характеризуются тупой двухсторонней головной болью, которая начинается в ходе половой активности и значительно ухудшается во время оргазма; гипнагогическую головную боль; вторичные головные боли, которые могут вызваться проблемами где-либо в голове или шее. Некоторые из них не являются вредоносными, такие как цервикогенная головная боль (боль, происходящая от мышц шеи), головная боль, вызванная чрезмерным использованием лекарственных средств у индивидуумов, применяющих чрезмерное количество болеутоляющих средств против головной боли, боль при менингите, характеризующаяся воспалением менингиальных оболочек, которое проявляется лихорадкой и менингиальными признаками, или ригидностью шеи; боль при кровоизлиянии в мозг (внутричерепное кровоизлияние); субарахноидальном кровоизлиянии (острая тяжелая головная боль, ригидность шеи без лихорадки); боль при разрыве аневризмы, артериовенозной мальформации, интрапаренхиматозном кровоизлиянии; височном артериите, т.е. воспалительном заболевании артерий, часто встречающемся у пожилых (средний возраст 70), ревматическую полимиалгию; боль при острой закрытоугольной глаукоме (увеличенном давлении в глазном яблоке); головные боли после эпилептического припадка, которые возникают после судорог или припадка другого типа в качестве части периода после припадка (состояние после припадка); желудочно-кишечные нарушения могут вызывать головные боли, включая инфекцию , целиакию, не обусловленную целиакией чувствительность к глютену, синдром раздраженной кишки, воспалительное заболевание кишечника, гастропарез и гепатобилиарные нарушения. Лечение желудочно-кишечных нарушений может приводить к ремиссии или уменьшению головных болей.
Термин "головная боль" определяет как первичную или вторичную головную боль. Первичную головную боль определяют как мигрень, головную боль напряжения (TTH), кластерную головную боль и другие автономные цефалгии тройничного нерва, и другие первичные головные боли.
Goadsby et al., N. Engl. J. Med. 346:257-270, 2002
Диагностика или оценка головной боли является твердо устоявшейся в данной области. Оценку можно проводить, исходя из субъективных показателей, таких как охараткеризация симптомов пациентом. Например, мигрень можно диагностировать, исходя из следующих критериев: 1) эпизодические атаки головной боли, длящиеся от 4 до 72 часов; 2) с двумя из следующих симптомов: односторонняя боль, пульсирующая, усиливающаяся при движении, и боль умеренной или высокой тяжести; и 3) с одним из следующих симптомов: тошнота или рвота, и светобоязнь или фонофобия ().
Симптом "дрожание" может быть ассоциирован с лихорадкой, чувствительностью к холоду, менопаузой, панической атакой, тревожностью, бактериальной инфекцией, риккетсиальной инфекцией, вирусной инфекцией, отменой лекарственного средства и т.д.
Симптом "рвота" может быть ассоциирован с гастритом (воспаление стенки желудка), гастроэнтеритом, желудочно-кишечным рефлюксом, целиакией, не обусловленной целиакией чувствительностью к глютену, пилоростенозом, обструкцией кишечника, перегревом, острым животом и/или перитонитом, кишечной непроходимостью, пищевой аллергией (часто совместно с крапивницей или отеком); холециститом, панкреатитом, аппендицитом, гепатитом; пищевым отравлением, аллергической реакцией на белки коровьего молока, например, аллергией на молоко или непереносимостью лактозы; укачиванием в транспорте, болезнью Меньера, сотрясением мозга, кровоизлиянием в мозг, мигренью, опухолями головного мозга, доброкачественной внутричерепной гипертензией и гидроцефалией, метаболическими нарушениями, такими как гиперкальцемия, уремия, недостаточность надпочечников, гипогликемия, гипергликемия, реакцией на лекарственное средство, алкогольной интоксикацией, употреблением опиоидов, селективными ингибиторами обратного захвата серотонина; применением химиотерапевтических лекарственных средств; воспалением желудка, вызванного рядом вирусов и бактерий, например, норовирусом, вирусом гриппа; или психиатрическими/поведенческими заболеваниями, такими как нервная булимия и диарея.
Подробное описание вариантов осуществления изобретения
Ниже приведены варианты осуществления изобретения. Следует отметить, что, как правило, варианты осуществления можно комбинировать с любыми другими вариантами осуществления той же категории (продукт, процесс, применение, способ).
Один вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM антитело или фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения для лечения или предупреждения симптомов заболевания или для применения в терапии или предупреждения заболеваний, характеризующихся такими симптомами. Симптомы могут быть выбраны из группы, состоящей из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты у пациента. Указанное антитело, или фрагмент, или каркас связывается со зрелым ADM, например, с аминокислотами 1-52 ADM (SEQ ID NO:1), или фрагментами зрелого ADM, например, ADM средней области (MR-ADM) (SEQ ID NO:3), или с N-концевым ADM (SEQ ID NO:4), как подробно указано ниже.
Таким образом, другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас связывается со зрелым ADM, например, с аминокислотами 1-52 ADM (SEQ ID NO:1) или с его фрагментами, как упоминалось выше.
Следующий вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся симптомами, такими как тошнота, головная боль, мышечная боль, боль в спине, дрожание, рвота у пациента, и где указанное антитело, или фрагмент, или каркас связывается со зрелым ADM, например, с аминокислотами 1-52 ADM (SEQ ID NO:1), или с его фрагментами, как определено выше.
В следующих вариантах осуществления, изобретение относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике заболеваний у пациента, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас связывается со зрелым ADM, например, с аминокислотами 1-52 ADM (SEQ ID NO:1), или с его фрагментами, как определено выше, и где заболевания выбраны из показаний, где количество C-реактивного белка (CRP) в образце составляет ≥ 10 мг/л, и/или где количество TNF в образце составляет ≥ 50 пг/мл, и/или где количество био-ADM в образце составляет ≥ 43 пг/мл, и/или где среднее артериальное давление является сниженным.
В следующем варианте осуществления изобретение относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике заболеваний у пациента, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас связывается со зрелым ADM, например, с аминокислотами 1-52 ADM (SEQ ID NO:1), или с его фрагментами, как определено выше, и где заболевание представляет собой мигрень.
В следующем варианте осуществления изобретение относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике заболеваний у пациента, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас связывается со зрелым ADM, например, с аминокислотами 1-52 ADM (SEQ ID NO:1), или с его фрагментами, как определено выше, и где заболевание представляет собой мигрень, где индивидуум, нуждающийся в этом, имеет количество C-реактивного белка (CRP) в образце ≥ 10 мг/л, и/или где количество TNF в образце составляет ≥ 50 пг/мл, и/или где количество био-ADM в образце составляет ≥ 43 пг/мл, и/или где среднее артериальное давление является сниженным.
В следующем варианте осуществления изобретение относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике заболеваний у пациента, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас связывается со зрелым ADM, например, с аминокислотами 1-52 ADM (SEQ ID NO:1), или с его фрагментами, как определено выше, и где заболевание представляет собой мигрень, где индивидуум, нуждающийся в этом, имеет количество C-реактивного белка (CRP) в образце ≥ 10 мг/л, и/или где количество TNF в образце составляет ≥ 50 пг/мл, и/или где количество био-ADM в образце составляет ≥ 43 пг/мл, и/или где среднее артериальное давление является сниженным, и где индивидуум, нуждающийся в этом, имеет по меньшей мере один из следующих симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, рвоты, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты.
В одном варианте осуществления изобретения образец выбран из группы, включающей цельную кровь, плазму и сыворотку.
Среднее артериальное давление (MAP) определяют как среднее давление в артериях пациента за один сердечный цикл. Оно считается индикатором перфузии в жизненно-важные органы. Полагают, что MAP, превышающее 70 мм. рт. ст., является достаточным для поддержания органов среднего индивидуума. В контексте настоящего изобретения термин "среднее артериальное давление является сниженным" означает MAP ниже 75 мм. рт. ст.
2
2
Зрелый пептид адреномедуллина представляет собой амидированный пептид (ADM-NH), который содержит 52 аминокислоты (SEQ ID NO:1) и который содержит аминокислоты 95-146 пре-проADM 1-146, из которого он образуется посредством протеолитического расщепления. Зрелый ADM, био-ADM и ADM-NHиспользуют в настоящем описании в качестве синонимов, и он означает молекулу согласно SEQ ID NO:1.
Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты, или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у пациента, в соответствии с предшествующим вариантом осуществления, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас связывается c N-концевой частью (а.к. 1-21) ADM:
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID NO:4).
Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM, или фрагменту антитела против ADM, связывающемуся с ADM, или к не-Ig каркасу против ADM, связывающемуся с ADM, для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у пациента, в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления в зависимости от ситуации, характеризующемуся тем, что указанное антитело, фрагмент антитела или не-Ig каркас связывается с частью средней области, а.к.21-42, адреномедуллина:
CTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA (SEQ ID NO:3)
Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты, или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у пациента, в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанное антитело, или фрагмент антитела, или не-Ig каркас является моноспецифическим, в частности, моноклональным.
-7
Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты, или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у пациента, в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас демонстрирует аффинность связывания с ADM по меньшей мере 10 M посредством поверхностного плазмонного резонанса без мечения с использованием системы Biacore 2000.
Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM, или фрагменту антитела против ADM, или не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты, или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у пациента, в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас не является ADM-связывающим белком 1 (фактор комплемента H).
Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты, или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у пациента, в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас распознает и связывает N-конец (а.к. 1) ADM.
1/2
Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты, или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у пациента, в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас представляет собой ADM-стабилизирующее антитело, или фрагмент, или каркас, которые повышают время полужизни (половинное время нахождения t) ADM в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на > 50%, наиболее предпочтительно на > 100%.
Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у пациента, в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас блокирует биологическую активность ADM не более чем на 80%, предпочтительно не более чем на 50%, при использовании hADM 22-52 в качестве эталонного антагониста в клетках CHO-K1, экспрессирующих рекомбинантный рецептор ADM человека.
Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, у индивидуума в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанный индивидуум, нуждающийся в этом, выбран из группы индивидуумов, страдающих от заболевания, выбранного из группы, включающей мигрень, вирусные инфекции, индуцированные лекарственным средством симптомы заболевания (например, индуцированные химиотерапией или индуцированные лечением биологическими средствами, антибиотиками, противовирусными соединениям и т.д.). В конкретном варианте осуществления заболевание или патология (эти термины могут использоваться взаимозаменяемо) представляет собой мигрень.
Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты, у индивидуума в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанные индивидуумы проходят терапию злокачественной опухоли (химиотерапию).
Химиотерапия представляет собой категория терапии злокачественной опухоли, в которой используется одно или несколько лекарственных средств против злокачественной опухоли (химиотерапевтических средств) в качестве части стандартизированного режима химиотерапии. Химиотерапевтические лекарственные средства могут включать следующие категории лекарственных средств: алкилирующие средства, ингибиторы киназ, алкалоиды барвинка, антрациклины, антиметаболиты, ингибиторы ароматаз, ингибиторы топоизомераз, сконструированные средства против злокачественной опухоли, такие как моноклональные антитела, цитокины, векторы генной терапии, антисмысловые и пептидные молекулы.
Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM, для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у индивидуума в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанное антитело или фрагмент представляет собой моноклональное антитело человека или фрагмент, которые связываются с N-концевой областью (а.к. 1-21) ADM (SEQ ID NO:4), или фрагмент этого антитела, где тяжелая цепь содержит последовательности:
CDR1: SEQ ID NO:5
GYTFSRYW
CDR2: SEQ ID NO:6
ILPGSGST
CDR3: SEQ ID NO:7
TEGYEYDGFDY
и где легкая цепь содержит последовательности:
CDR1: SEQ ID NO:8
QSIVYSNGNTY
CDR2:
RVS
CDR3: SEQ ID NO:9
FQGSHIPYT.
Другой вариант осуществления изобретения относится к моноклональному антителу человека или фрагменту, которые связываются с ADM, или к их антительному фрагменту для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у индивидуума в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанное антитело или фрагмент содержит последовательность, выбранную из группы, включающей область VH:
SEQ ID NO:10 (AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:11 (AM-VH1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:12 (AM-VH2-E40)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:13 (AM-VH3-T26-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:14 (AM-VH4-T26-E40-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
и содержит следующую последовательность в качестве области VL:
SEQ ID NO:15 (AM-VL-C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:16 (AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:17 (AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Другой вариант осуществления изобретения относится к моноклональному антителу человека или его фрагменту, которые связываются с ADM, или к их антительному фрагменту для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у индивидуума в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанное антитело или фрагмент содержит следующую последовательность в качестве тяжелой цепи:
SEQ ID NO:22
c
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGSTNYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
и содержит следующую последовательность в качестве легкой цепи:
SEQ ID NO:23
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
В конкретном варианте осуществления изобретения антитело содержит следующую последовательность в качестве тяжелой цепи:
SEQ ID NO:22
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGSTNYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
или последовательность, которая на > 95% идентична ей, предпочтительно > 98%, предпочтительно > 99% и содержит следующую последовательность в качестве легкой цепи:
SEQ ID NO:23
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
или последовательность, которая на > 95% идентична ей, предпочтительно на > 98%, предпочтительно на > 99%.
Для оценки идентичности между двумя аминокислотными последовательностями проводят попарное выравнивание. Идентичность определяет процент аминокислот с прямым соответствием при выравнивании.
Фармацевтическая композиция, содержащая антитело, как описано выше
Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у пациента, в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления для применения в комбинации с известными лекарственными средствами против тошноты.
Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у пациента, в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления для применения в комбинации с известными лекарственными средствами против головной боли.
Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у пациента, в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления для применения в комбинации с известными лекарственными средствами против миалгии.
Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у пациента, в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления для применения в комбинации с известными лекарственными средствами против дрожания.
Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у пациента, в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления для применения в комбинации с известными лекарственными средствами против рвоты.
Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу против ADM, или к фрагменту антитела против ADM, или к не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у пациента, в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления для применения в комбинации с известными лекарственными средствами против боли в спине.
Другой вариант осуществления изобретения относится к фармацевтическому составу для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у пациента, содержащему антитело, или фрагмент, или каркас в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления.
Другой вариант осуществления изобретения относится к фармацевтическому составу для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у пациента, в соответствии с предшествующим вариантом осуществления, где указанный фармацевтический состав представляет собой раствор, предпочтительно, готовый для применения раствор.
Другой вариант осуществления изобретения относится к фармацевтическому составу для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у индивидуума в соответствии с предшествующим вариантом осуществления, где указанный фармацевтический состав находится в лиофилизированном состоянии.
Другой вариант осуществления изобретения относится к фармацевтическому составу для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у пациента, в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, касающихся таких составов, где указанный фармацевтический состав вводят внутримышечно.
Другой вариант осуществления изобретения относится к фармацевтическому составу для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у пациента, в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, касающихся таких составов, где указанный фармацевтический состав вводят внутрисосудистым путем.
Другой вариант осуществления изобретения относится к фармацевтическому составу для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у индивидуума в соответствии с предшествующим вариантом осуществления, где указанный фармацевтический состав вводят посредством инфузии.
Другой вариант осуществления изобретения относится к фармацевтическому составу для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания, выбранных из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания, рвоты или для применения в терапии или профилактике заболеваний, характеризующихся такими симптомами, таких как мигрень, у индивидуума в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, касающихся таких составов, где указанный фармацевтический состав подлежит системному введению.
Как используют в рамках изобретения, определение "индекс заболевания" относится к индуцируемым LPS клиническим симптомам, включающим тошноту, головную боль, мышечные боли, боль в спине, дрожание и рвоту. Эти симптомы были объединены в одном индексе (= индекс заболевания): в качестве примера каждый симптом оценивают по шкале от 0 до 5, за исключением рвоты (либо 0, либо 3, в зависимости от наличия рвоты за последние 30 минут). Индекс заболевания представляет собой сумму всех симптомов (теоретический диапазон от 0 до 28).
Необходимо подчеркнуть, что подразумевается, что описанные в настоящем описании варианты осуществления, касающиеся антитела против ADM, или фрагмента антитела против ADM, или не-Ig каркаса против ADM, будут применяться для терапии или профилактики симптомов, ассоциированных с заболеванием и, таким образом, они не обязательно предназначены для каких-либо способов первичного лечения или лечения первой линии самого острого заболевания или острого состояния, которое считается основным заболеванием(ями). Это означает, что настоящее изобретение не относится к терапии для излечения/устранения, например, злокачественной опухоли, сепсиса, септического шока, COPD, застойного заболевания сердца (острая сердечная недостаточность).
Более того, в некоторых вариантах осуществления изобретения антитело против ADM, или фрагмент антитела против ADM, или не-Ig каркас против ADM является моноспецифическим. Моноспецифическое антитело против ADM, или моноспецифический фрагмент антитела против ADM, или моноспецифический не-Ig каркас против ADM означает, что указанное антитело, или фрагмент антитела, или не-Ig каркас связывается с одной конкретной областью, охватывающей по меньшей мере 5 аминокислот в ADM-мишени. Моноспецифическое антитело против ADM, или моноспецифический фрагмент антитела против ADM, или моноспецифический не-Ig каркас против ADM представляют собой антитела против ADM, или фрагменты антител против ADM, или не-Ig каркасы против ADM, все из которых обладают аффинностью в отношении одного и того же антигена.
В конкретном и предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к моноспецифическому антителу против ADM, или моноспецифическому фрагменту антитела против ADM, или моноспецифическому не-Ig каркасу против ADM, отличающемуся тем, что указанное антитело, или фрагмент антитела, или не-Ig каркас связывается с одной конкретной областью, охватывающей по меньшей мере 4 аминокислоты в ADM-мишени. В другом конкретном варианте осуществления антитело против ADM или фрагмент антитела, связывающийся с ADM, представляет собой моноспецифическое антитело. "Моноспецифический" означает, что указанное антитело или фрагмент антитела связывается с одной конкретной областью, охватывающей предпочтительно по меньшей мере 4, или по меньшей мере 5 аминокислот в ADM-мишени. Все из моноспецифических антител или фрагментов представляют собой антитела или фрагменты, все из которых обладают аффинностью в отношении одного и того же антигена. Моноклональные антитела являются моноспецифическими, однако моноспецифические антитела также можно получать способами, отличными от продуцирования их из общей зародышевой клетки.
2
Антитело в соответствии с настоящим изобретением представляет собой белок, включающий один или несколько полипептидов, по существу кодируемых генами иммуноглобулинов, который специфически связывает антиген. Распознаваемые гены иммуноглобулинов включают гены константной области каппа, лямбда, альфа (IgA), гамма (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), дельта (IgD), эпсилон (IgE) и мю (IgM), а также множество генов вариабельных областей иммуноглобулинов. Полноразмерные легкие цепи иммуноглобулинов, как правило, имеют массу приблизительно 25 кДа или длину приблизительно 214 аминокислот. Полноразмерные тяжелые цепи иммуноглобулинов, как правило, имеют массу приблизительно 50 кДа или длину приблизительно 446 аминокислот. Легкие цепи кодируются геном вариабельной области на NH-конце (приблизительно 110 аминокислот в длину) и геном константной области каппа или лямбда на COOH--конце. Тяжелые цепи аналогично кодируются геном вариабельной области (приблизительно 116 аминокислот в длину) и одним из других генов константной области.
Lanzavecchia et al. 1987. Eur. J. Immunol. 17: 105; Huston et al 1988. PNAS 85:5879-5883; Bird et al. 1988. Science 242:423-426; Hood et al. 1984. Immunology, Benjamin, N.Y., 2nd ed.; Hunkapiller and Hood, 1986. Nature 323: 15-16
Основной структурной единицей антитела обычно является тетрамер, который состоит из двух идентичных пар цепей иммуноглобулинов, причем каждая пара имеет одну легкую и одну тяжелую цепь. В каждой паре вариабельные области легкой и тяжелой цепи связываются с антигеном, и константные области опосредуют эффекторные функции. Иммуноглобулины также существуют в различных других формах, включая, например, Fv, Fab и (Fab')2, а также бифункциональные гибридные антитела и единичные цепи (например, ). Вариабельная область легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина включает каркасную область, прерываемую тремя гипервариабельными областями, также называемыми определяющими комплементарность областями (CDR) (см., Sequences of Proteins of Immunological Interest, E. Kabat et al, U.S. Department of Health and Human Services, 1983). Как отмечалось выше, CDR в основном ответственны за связывание с эпитопом антигена. Иммунный комплекс представляет собой антитело, такое как моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека, или функциональный фрагмент антитела, специфически связывающийся с антигеном.
Химерные антитела представляют собой антитела, гены легких и тяжелых цепей которых являются сконструированными, как правило, способами генной инженерии, из генов вариабельных и константных областей иммуноглобулинов, принадлежащих различным видам. Например, вариабельные сегменты генов из моноклонального антитела мыши можно связывать с константными сегментами человека, такими как каппа и гамма 1 или гамма 3. В одном примере терапевтическое химерное антитело, таким образом, представляет собой гибридный белок, состоящий из вариабельного или антигенсвязывающего домена из антитела мыши и константного или эффекторного домена из антитела человека, хотя можно использовать другие виды млекопитающих, или вариабельную область можно получать молекулярными способами. Способы получения химерных антител хорошо известны в данной области, например, см. патент США № 5807715. "Гуманизированный" иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин, включающий каркасную область человека и одну или несколько CDR из иммуноглобулина, не являющегося человеческим (такого как мыши, крысы или синтетический). Не являющийся человеческим иммуноглобулин, предоставляющий CDR, называют "донорным", и иммуноглобулин человека, предоставляющий каркасную область, называют "акцепторным". В одном варианте осуществления в гуманизированном иммуноглобулине все CDR происходят из донорного иммуноглобулина. Константные области не обязательно должны присутствовать, однако если они присутствуют, они должны быть по существу идентичными константным областям иммуноглобулинов человека, т.е. по меньшей мере приблизительно на 85-90%, например, приблизительно на 95% или более идентичными. Таким образом, все части гуманизированного иммуноглобулина, за исключением, возможно, CDR, являются по существу идентичными соответствующим частям природных последовательностей иммуноглобулинов человека. "Гуманизированное антитело" представляет собой антитело, содержащее гуманизированную легкую цепь и гуманизированную тяжелую цепь. Гуманизированное антитело связывается с тем же антигеном, что и донорное антитело, которое предоставляет CDR. Акцепторная каркасная область гуманизированного иммуноглобулина или антитела может иметь ограниченное количество замен на аминокислоты, взятые из донорной каркасной области. Гуманизированные или другие моноклональные антитела могут иметь дополнительные консервативные аминокислотные замены, которые по существу не обладают эффектом на связывание антигена или другие функции иммуноглобулина. Иллюстративные консервативные замены представляют собой замены, такие как gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; и phe, tyr. Гуманизированные иммуноглобулины можно конструировать способами генной инженерии (например, см. патент США № 5585089). Антитело человека представляет собой антитело, где гены легкой и тяжелой цепей происходят из человека. Антитела человека можно получать с использованием способов, известных в данной области. Антитела человека можно получать посредством иммортализации B-клетки человека, секретирующей представляющее интерес антитело. Иммортализацию можно проводить, например, посредством инфицирования EBV или путем слияния B-клеток человека с миеломной или гибридомной клеткой для получения триомной клетки. Антитела человека также можно получать способами фагового дисплея (см., например, Dower et al., публикация PCT № WO 91/17271; McCafferty et al., публикация PCT № WO92/001047; и Winter, публикация PCT № WO 92/20791), или выбирать из комбинаторных библиотек моноклональных антител человека (см. web-сайт Morphosys). Антитела человека также можно получать с использованием трансгенных животных, содержащих ген иммуноглобулина человека (например, см. публикацию PCT № WO 93/12227; и публикацию PCT № WO 91/10741).

Таким образом, антитело против ADM может иметь форматы, известные в данной области. Примерами являются антитела человека, моноклональные антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, антитела с трансплантированными CDR. В предпочтительном варианте осуществления антитела в соответствии с настоящим изобретением представляют собой полученные рекомбинантными способами антитела, такие как IgG, типичный полноразмерный иммуноглобулин, или фрагменты антитела, содержащие по меньшей мере F-вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, например, такие как химически связанные антитела (антигенсвязывающий фрагмент фрагмент), включая, но не ограничиваясь ими, Fab-фрагменты, включая Fab миниантитела, одноцепочечное Fab-антитело, одновалентное Fab-антитело с эпитопными метками, например Fab-V5Sx2; двухвалентный Fab (миниантитело), димеризованный с CH3-доменом; двухвалентный Fab или поливалентный Fab, например, полученный путем мультимеризации с помощью гетерологичного домена, например, посредством димеризации доменов dHLX, например, Fab-dHLX-FSx2; F(ab')2-фрагменты, scFv-фрагменты, мультимеризованные одновалентные или/и полиспецифические scFv-фрагменты, двухвалентные и/или биспецифические диантитела, BITE (привлекающий T-клетки биспецифический активатор), трифункциональные антитела, поливалентные антитела, например, из класса, отличного от G; однодоменные антитела, например, наноантитела, происходящие из иммуноглобулинов животных семейства верблюжьих или рыб, и многочисленные другие.
В дополнение к антителам против ADM, в данной области хорошо известны биополимерные каркасы, которые образуют комплекс с молекулой-мишенью, и их используют для получения в высокой степени специфичных к мишени биополимеров. Примерами являются аптамеры, шпигельмеры, антикалины и конотоксины. Для иллюстрации форматов антител, см. фиг.la, lb и lc в WO 2013/072513.
Фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением представляет собой антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением.
В предпочтительном варианте осуществления формат антитела против ADM выбран из группы, включающей Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, Fab-фрагмент, scFab-фрагмент, (Fab)2-фрагмент и слитый белок scFv-Fc. В другом предпочтительном варианте осуществления формат антитела выбран из группы, включающей scFab-фрагмент, Fab-фрагмент, scFv-фрагмент и их конъюгаты с оптимизированной биодоступностью, такие как пегилированные фрагменты. Одним из наиболее предпочтительных форматов является scFab-формат.
Не-Ig каркасы могут представлять собой белковые каркасы и могут использоваться в качестве миметиков антител, поскольку они способны связываться с лигандами или антигенами. Не-Ig каркасы могут быть выбраны из группы, включающей не-Ig каркасы на основе тетранектина (например, описанные в US 2010/0028995), каркасы на основе фибронектина (например, описанные в EP 1266 025; каркасы на основе липокалина ((например, описанные в WO 201 1/154420); каркасы на основе убиквитина (например, описанные в WO 2011/073214), каркасы на основе трансферрина (например, описанные в US 2004/0023334), каркасы на основе белка A (например, описанные в EP 2231860), каркасы на основе анкириновых повторов (например, описанные в WO 2010/060748), каркасы на основе микробелков, предпочтительно микробелков, образующих цистиновый узел) (например описанные в EP 2314308), каркасы на основе SH3-домена Fyn (например, описанные в WO 2011/023685), каркасы на основе A-домен EGFR (например, описанные в WO 2005/040229) и каркасы на основе домена Куница (например, описанные в EP 1941867).
Lane, R.D. 1985. J. Immunol. Meth. 81: 223-228; Ziegler B. et al. l996. Horm. Metab. Res. 28: 11-15
В одном варианте осуществления изобретения антитела в соответствии с настоящим изобретением можно получать следующим образом: мышь Balb/c иммунизировали 100 мкг конъюгата ADM-пептид-BSA на 0 и 14 сутки (эмульгированного в 100 мкл полного адъюванта Фрейнда) и 50 мкг на 21 и 28 сутки (в 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда). За трое суток до проведения эксперимента по слиянию животному вводили 50 мкг конъюгата, растворенного в 100 мкл солевого раствора, вводимого в качестве одной внутрибрюшинной и одной внутривенной инъекции. Спленоциты из иммунизированной мыши и клетки миеломной клеточной линии SP2/0 подвергали слиянию с 1 мл 50% полиэтиленгликоля в течение 30 с при 37°C. После промывания клетки высевали в 96-луночные планшеты для культивирования клеток. Гибридные клоны отбирали путем выращивания в среде HAT (культуральная среда RPMI 1640, дополненная 20% эмбриональной телячьей сывороткой и добавкой HAT). Через две недели среду HAT заменяли средой HT на три пассажа, а затем возвращали нормальную среду для культивирования клеток. Супернатанты клеточных структур сначала подвергали скринингу в отношении антигенспецифических IgG-антител через три недели после слияния. Микрокультуры с положительными результатами тестирования переносили в 24-луночные планшеты для увеличения в количестве. После повторного тестирования отобранные культуры клонировали и повторно клонировали с использованием способа лимитирующих разведений и определяли изотипы (также см. ).
E.coli
Антитела также можно получать способом фагового дисплея по следующей методике: библиотеки генов наивных антител человека HAL7/8 использовали для выделения рекомбинантных одноцепочечных F-вариабельных доменов (scFv) против пептида ADM. Библиотеки генов антител подвергали скринингу с использованием стратегии пэннинга, включающей применение пептидов, содержащих биотиновую метку, связанных через два различных спейсера с последовательностью пептида ADM. Комбинацию раундов пэннинга, в которой использовался неспецифических связанный антиген и связанный со стрептавидином антиген, использовали для минимизации фонового уровня неспецифических связывающих молекул. Элюированные пассажи после третьего раунда пэннинга использовали для получения штаммов , экспрессирующих моноклональный scFv. Супернатанты после культивирования этих клональных штаммов прямо использовали для тестирования с использованием ELISA с антигеном (см. ссылки, цитированные в WO 2013/072513, включенной в настоящее описание в полном объеме).
Almagro and Fransson 2008. Front Biosci. 13: 1619-33
Гуманизацию антител мыши можно проводить по следующей методике: для гуманизации антитела, происходящего из мыши, последовательность антитела анализируют в отношении структурного взаимодействия каркасных областей (FR) с определяющими комплементарность областями (CDR) и антигеном. На основе структурного моделирования выбирают подходящую FR, происходящую из человека, и последовательности CDR мыши трансплантируют в FR человека. Можно вносить изменения в аминокислотную последовательность CDR или FR для восстановления структурных взаимодействий, которые устранились в результате видового переключения последовательностей FR. Это восстановление структурных взаимодействий можно осуществлять с помощью случайного подхода с использованием библиотек фагового дисплея или с помощью направленного подхода с использованием молекулярного моделирования () в предпочтительном варианте осуществления формат антитела против ADM выбран из группы, включающий Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, Fab-фрагмент, scFab-фрагмент, F(ab)2-фрагмент и слитый белок scFv-Fc. В другом предпочтительном варианте осуществления формат антитела выбран из группы, включающей scFab-фрагмент, Fab-фрагмент, scFv-фрагмент и его конъюгаты с оптимизированной биодоступностью, такие как пегилированные фрагменты. Одним из наиболее предпочтительных форматов является формат scFab. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело против ADM, фрагмент антитела против ADM или не-Ig каркас против ADM представляет собой полноразмерное антитело, фрагмент антитела или не-Ig каркас.
В предпочтительном варианте осуществления антитело против ADM, или фрагмент антитела против ADM, или не-Ig каркас против ADM направлены на и могут связываться с эпитопом длиной по меньшей мере 5 аминокислот, находящимся в ADM.
В другом предпочтительном варианте осуществления антитело против ADM, или фрагмент антитела против ADM, или не-Ig каркас против ADM направлены на и могут связываться с эпитопом длиной по меньшей мере 4 аминокислоты, находящимся в ADM.
В одном конкретном варианте осуществления изобретения антитело против ADM или фрагмент антитела против ADM, связывающийся с ADM, или не-Ig каркас против ADM, связывающийся с ADM, предоставляют для применения в терапии острого заболевания или острого состояния пациента, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас не является ADM-связывающим белком 1 (фактор комплемента H). Острое заболевание или острое состояние может представлять собой мигрень.
В одном конкретном варианте осуществления изобретения антитело против ADM или фрагмент антитела против ADM, связывающийся с ADM, или не-Ig каркас против ADM, связывающийся с ADM, предоставлен для применения в терапии острого заболевания или острого состояния пациента, где указанное антитело, или фрагмент антитела, или не-Ig каркас связывается с областью из предпочтительно по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 аминокислот в последовательности а.к.1-42 зрелого ADM человека.
Описанное выше острое заболевание или острое состояние может представлять собой головную боль, предпочтительно первичную головную боль, наиболее предпочтительно мигрень.
В одном конкретном варианте осуществления изобретения антитело против ADM или фрагмент антитела против ADM, связывающийся с ADM, или не-Ig каркас против ADM, связывающийся с ADM, предоставлен для применения в терапии острого заболевания или острого состояния пациента, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас связывается с областью предпочтительно из по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 аминокислот в последовательности а.к.1-21 зрелого ADM человека:
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID NO:: 4).
Описанное выше острое заболевание или острое состояние может представлять собой мигрень.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанное антитело против ADM, или фрагмент антитела против ADM, или не-Ig каркас против ADM связывается с областью ADM, которая расположена на N-конце (аминокислоты 1-21) ADM.
В другом предпочтительном варианте осуществления указанное антитело против ADM, или фрагмент антитела против ADM, или не-Ig каркас против ADM распознает и связывает N-конец (а.к. 1) ADM.
N-конец означает, что аминокислота 1, которая представляет собой "Y" SEQ ID NO:1 или 4, является обязательной для связывания антитела. Указанное антитело, или фрагмент, или не-Ig каркас не связывают ни удлиненный на N-конце, ни модифицированный на N-конце ADM, ни ADM с разрушенным N-концом.
В предпочтительном варианте осуществления антитело против ADM, или фрагмент антитела против ADM, или не-Ig каркас против ADM направлены на и могут связываться с эпитопом длиной по меньшей мере 5 аминокислот, содержащимся в ADM, предпочтительно в ADM человека.
В предпочтительном варианте осуществления антитело против ADM, или фрагмент антитела против ADM, или не-Ig каркас против ADM направлены на и могут связываться с эпитопом длиной по меньшей мере 4 аминокислоты, находящемся в ADM, предпочтительно в ADM человека.
1/2
В одном конкретном варианте осуществления предпочтительно использовать антитело против ADM, или фрагмент антитела против ADM, или не-Ig каркас против ADM в соответствии с настоящим изобретением, где указанное антитело против ADM или указанный фрагмент антитела против ADM, или не-Ig каркас против ADM представляет собой стабилизирующее ADM антитело, или стабилизирующий ADM фрагмент антитела, или стабилизирующий ADM не-Ig каркас, который увеличивает время полужизни (t; половинное время нахождения) ADM в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100%. Время полужизни (половинное время нахождения) ADM можно определять в плазме человека в отсутствии и в присутствии стабилизирующего ADM антитела, или стабилизирующего ADM фрагмента, или стабилизирующего ADM не-Ig каркаса, соответственно, с использованием иммуноанализа для количественного определения ADM.
Можно проводить следующие стадии:
- ADM можно разбавлять в цитратной плазме человека в отсутствии и в присутствии стабилизирующего ADM антитела, или стабилизирующего ADM фрагмента антитела, или стабилизирующего ADM не-IG каркаса, соответственно, и можно инкубировать при 24°C;
- Проводят взятие аликвот в выбранные моменты времени (например, в течение 24 часов), и деградацию ADM можно останавливать в указанных аликвотах замораживанием при -20°C;
- Количество ADM можно определять с использованием иммуноанализа на hADM прямо, если стабилизирующее антитело не влияет на выбранный анализ. Альтернативно аликвоту можно обрабатывать денатурирующими агентами (такими как HCI) и после очистки образца (например, центрифугированием) pH можно нейтрализовывать и проводит количественное определение ADM с использованием иммуноанализа на ADM. Альтернативно для количественного определения ADM можно использовать технологии не иммуноанализа (например, ОФ-ВЭЖХ).
- Время полужизни ADM вычисляют для ADM, инкубированного в отсутствии и в присутствии стабилизирующего ADM антитела, или стабилизирующего ADM фрагмента антитела, или стабилизирующего ADM не-IG каркаса, соответственно.
- Вычисляют увеличение времени полужизни для стабилизированного ADM по сравнению с ADM, который инкубировали в отсутствии стабилизирующего ADM антитела, или стабилизирующего ADM фрагмента антитела, или стабилизирующего ADM не-Ig каркаса.
Двукратное увеличение времени полужизни ADM представляет собой увеличение времени полужизни на 100%.
Время полужизни (половинное время нахождения) определяют как период, требуемый для снижения концентрации определенного химического вещества или лекарственного средства до половины исходной концентрации в указанной жидкости или крови.
В конкретном варианте осуществления указанное антитело против ADM, фрагмент антитела против ADM или не-Ig каркас против ADM представляет собой не нейтрализующее антитело, фрагмент или не-Ig каркас. Нейтрализующее антитело против ADM, фрагмент антитела против ADM или не-Ig каркас против ADM может блокировать биологическую активность ADM практически на 100%, по меньшей мере более чем на 90%, предпочтительно по меньшей мере более чем на 95%.
Напротив, не нейтрализующее антитело против ADM, или фрагмент антитела против ADM, или не-Ig каркас против ADM блокирует биологическую активность ADM менее чем на 100%, предпочтительно менее чем на 95%, предпочтительно менее чем на 90%, более предпочтительно менее чем на 80% и еще более предпочтительно менее чем на 50%. Это означает, что остаточная биологическая активность ADM, связанного с не нейтрализующим антителом против ADM, или фрагментом антитела против ADM или не-Ig каркасом против ADM, может составлять более 0%, предпочтительно более 5%, предпочтительно более 10%, более предпочтительно более 20%, более предпочтительно более 50%. В этом контексте молекула(ы), представляющая собой антитело, или фрагмент антитела или не-Ig каркас с "не нейтрализующей активностью против ADM", в совокупности для простоты называемая в настоящем описании "не нейтрализующим" антителом против ADM, фрагментом антитела или не-Ig каркасом, которые, например, блокируют биологическую активность ADM менее чем на 80%, определяют как молекулу или молекулы, связывающиеся с ADM, которые при добавлении в культуру эукариотической клеточной линии, которая экспрессирует функциональный рекомбинантный рецептор ADM человека, состоящий из CRLR (рецептор, подобный рецептору кальцитонина) и RAMP3 (белок 3, модифицирующий активность рецептора), снижают количество cAMP, продуцированного клеточной линией, посредством действия при добавлении параллельно добавленного синтетического пептида ADM человека, где указанный добавленный синтетический ADM человека добавляют в количестве, которое в отсутствии не нейтрализующего антитела, подлежащего анализу, приводит к полумаксимальной стимуляции синтеза cAMP, где снижение cAMP посредством указанной молекулы(молекул), связывающейся с ADM, происходит в степени, которая не превышает 80%, даже когда не нейтрализующую молекулу(ы), связывающуюся с ADM, подлежащим анализу, добавляют в количестве, которое в 10 раз превышает количество, требуемое для достижения максимального снижения синтеза cAMP, достигаемого с использованием не нейтрализующего антитела, подлежащего анализу. То же определение применимо к другим диапазонам; 95%, 90%, 50% и т.д.
В конкретном варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением используют антитело против ADM или фрагмент антитела против ADM или не-Ig каркас против ADM, где указанное антитело, или фрагмент антитела, или не-Ig каркас блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50% (от исходных величин). Это означает блокирование циркулирующего ADM не более чем на 80% или не более чем на 50%, соответственно. Понятно, что указанное ограниченное блокирование биологической активности ADM происходит даже при избытке концентрации антитела, фрагмента антитела или не-Ig каркаса, что означает избыток антитела, фрагмент антитела или не-Ig каркаса относительно ADM. Указанное лимитированное блокирование является свойством, присущим самому связывающему ADM соединению. Это означает, что указанное антитело, фрагмент антитела или не-Ig каркас имеет максимальное ингибирование 80% или 50%, соответственно. Как следствие, это означает, что остается 20% или 50% остаточная биологическая активность ADM, хотя вводят надлежащие количества или избыточные количества антитела, фрагмента антитела или не-Ig каркаса, соответственно.
in vivo
in vitro
В предпочтительном варианте осуществления указанное антитело против ADM, фрагмент антитела против ADM или не-Ig каркас против ADM может блокировать биологическую активность ADM по меньшей мере на 5%. Как следствие, это означает, что остается остаточная 95% биологическая активность циркулирующего ADM. Это является нижней пороговой величиной биологической активности, оставшейся после введения указанного антитела против ADM, фрагмента антитела против ADM или не-Ig каркаса против ADM. Биологическую активность определяют как эффект, которое вещество оказывает на живой организм, или ткань, или орган, или функциональную единицу  или  (например, в анализе) после его взаимодействия. В случае биологической активности ADM это может представлять собой эффект ADM в функциональном анализе с cAMP с рекомбинантным рецептором ADM человека. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением биологическую активность определяют посредством функционального анализа cAMP с рецептором ADM. Следующие стадии можно проводить для определения биологической активности ADM в таком анализе:
- Кривые доза-эффект строят с использованием ADM в указанном функциональном анализе cAMP с рекомбинантным рецептором ADM человека.
- Можно вычислять концентрацию ADM при полумаксимальной стимуляции cAMP.
- При постоянных полумаксимальных cAMP-стимулирующих концентрациях ADM строят кривые доза-эффект (вплоть до конечной концентрации 100 мкл) посредством стабилизирующего ADM антитела или стабилизирующего ADM фрагмента антитела или стабилизирующего ADM не-Ig каркаса, соответственно.
Максимальное (при максимальной дозе) ингибирование посредством указанного стабилизирующего ADM антитела, составляющее 50%, означает, что указанное антитело против ADM, или указанный фрагмент антитела против ADM, или указанный не-Ig каркас против ADM, соответственно, блокирует биологическую активность на 50% от исходных величин. Максимальное ингибирование в указанном биологическом анализе ADM 80% означает, что указанное антитело против ADM, или указанный фрагмент антитела против ADM, или указанный не-Ig каркас против ADM, соответственно, блокирует биологическую активность ADM на 80%. Это означает блокирование биологической активности ADM не более чем на 80%.
in vivo
В предпочтительном варианте осуществления используют модулирующее антитело против ADM, или модулирующий фрагмент антитела против ADM, или модулирующий не-Ig каркас против ADM. "Модулирующее" антитело против ADM, или модулирующий фрагмент антитела против ADM, или модулирующий не-Ig каркас против ADM представляет собой антитело, или фрагмент антитела против ADM, или не-Ig каркас, который повышает время полужизни (половинное время нахождения t) ADM в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100%, и блокирует биологическую активность ADM на менее чем 80%, предпочтительно менее чем 50% и где указанное антитело против ADM, фрагмент антитела против ADM или не-Ig каркас против ADM может блокировать биологическую активность ADM по меньшей мере на 5%. Эти величины, связанные с временем полужизни и блокированием биологической активности, необходимо воспринимать применительно к вышеупомянутым способам анализа для определения этих величин. Это означает блокирование циркулирующего ADM не более чем на 80% или не более чем на 50%, соответственно. Это означает, что остается 20% остаточная биологическая активность ADM, или остается 50% остаточная биологическая активность ADM, соответственно. Такое модулирующее антитело против ADM, или модулирующий фрагмент антитела против ADM, или модулирующий не-Ig каркас против ADM обеспечивает преимущество, состоящее в том, что облегчается дозирование при введении. Комбинирование частичного блокирования или частичного снижения биологической активности ADM и увеличения времени полужизни  (увеличение биологической активности ADM) приводит к полезной простоте дозирования антитела против ADM или фрагмента антитела против ADM, или не-Ig каркаса против ADM. В случае избытка эндогенного ADM эффект снижения активности является основным действием антитела, или фрагмента, или каркаса, ограничивающим (отрицательный) эффект ADM. В случае низких или нормальных концентраций эндогенного ADM, биологический эффект антитела против ADM, или фрагмента антитела против ADM, или не-Ig каркаса против ADM, представляет собой комбинацию снижения (посредством частичного блокирования) и увеличения путем повышения времени полужизни ADM. Таким образом, не нейтрализующее и модулирующее антитело против ADM, или фрагмент антитела против ADM, или не-Ig каркас против ADM действует подобно буферу биологической активности ADM для сохранения биологической активности ADM в определенном физиологическом диапазоне.
-7
-8
-9
-10
Антитело против ADM, или фрагмент антитела против ADM, или не-Ig каркас против ADM в соответствии с настоящим изобретением демонстрирует аффинность в отношении ADM человека, которая демонстрирует константу аффинности более 10 M, предпочтительно 10 M, предпочтительно выше 10 M, наиболее предпочтительный выше 10 M. Специалисту в данной области известно, что более низкую аффинность можно компенсировать более высокой дозой соединения, и что эта мера не выходит за пределы объема изобретения. Константы аффинности можно определять способом, описанным в примере 1 WO 2013/072513.
Необходимо подчеркнуть, что термин "ADM-связывающий белок" включает ADM-связывающий белок 1 (фактор комплемента H). Однако указанный связывающий ADM белок по изобретению не является как не нейтрализующим антителом/фрагментом антитела/не-Ig каркасом против ADM, так и модулирующим антителом/фрагментом антитела/не-Ig каркасом против ADM. Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу против ADM, или фрагменту антитела против ADM, или не-Ig каркасу против ADM для применения в терапии острого заболевания или острого состояния у пациента в соответствии с настоящим изобретением, где указанное антитело, или фрагмент антитела, или не-Ig каркас можно использовать в комбинации с дополнительными активными ингредиентами.
Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическому составу, содержащему антитело против ADM, или фрагмент антитела против ADM, или не-Ig каркас против ADM в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическому составу по настоящему изобретению, где указанный фармацевтический состав представляет собой раствор, предпочтительно готовый для применения раствор. В другом варианте осуществления настоящее изобретение, кроме того, относится к фармацевтическому составу в соответствии с настоящим изобретением, где указанный фармацевтический состав находится в высушенном состоянии для восстановления перед применением. Указанный фармацевтический состав можно вводить внутримышечным путем. Указанный фармацевтический состав можно вводить внутрисосудистым путем. Указанный фармацевтический состав можно вводить посредством инфузии. В другом варианте осуществления настоящее изобретение, кроме того, относится к фармацевтическому составу в соответствии с настоящим изобретением, где указанный фармацевтический состав находится в лиофилизированном состоянии.
В другом более предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтическому составу, содержащему антитело против ADM или фрагмент антитела против ADM, связывающийся с ADM, или не-Ig каркас против ADM, связывающийся с ADM, для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания у пациента, где указанный фармацевтический состав вводят пациенту, нуждающемуся в этом.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтический состав в соответствии с настоящим изобретением вводят пациенту для лечения и/или предупреждения симптомов, ассоциированных с заболеванием, как определено выше, при условии, что указанный пациент нуждается в таком лечении.
В одном варианте осуществления антитело против ADM, или фрагмент антитела против ADM, или не-IG каркас против ADM по изобретению представляет собой не нейтрализующее антитело против ADM или не нейтрализующий фрагмент антитела против ADM, или не нейтрализующий не-Ig каркас против ADM.
Как используют в настоящем описании, формат антитела выбран из группы, включающей Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, Fab-фрагмент, scFab-фрагмент, (Fab)2-фрагмент и слитый белок scFv-Fc.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело против ADM, или фрагмент антитела против ADM или не-Ig каркас в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления применяют для лечения пациента, нуждающегося в этом, где указанное антитело или фрагмент можно вводить в дозе по меньшей мере 0,5 мг/кг массы тела, в частности, по меньшей мере 1,0 мг/кг массы тела, более конкретно, от 1,0 до 20,0 мг/кг массы тела, например, от 2,0 до 10 мг/кг массы тела, от 2,0 до 8,0 мг/кг массы тела, или от 2,0 до 5,0 мг/кг массы тела.
В вариантах осуществления настоящего изобретения симптомы заболевания, упоминаемого в настоящем описании, не ассоциированы с каким-либо из заболеваний, выбранных из группы, включающей сепсис, диабет, злокачественную опухоль, сердечную недостаточность (острую сердечную недостаточность) и септический шок.
В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения симптомы заболевания, которые лечат или предупреждают с использованием любого из антитела против ADM, или фрагмента антитела против ADM, или не-Ig каркаса по любому из предшествующих вариантов осуществления ассоциированы с мигренью.
В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения симптомы заболевания, которые лечат или предупреждают с использованием любого из антитела против ADM, или фрагмента антитела против ADM, или не-Ig каркаса по любому из предшествующих вариантов осуществления, ассоциированы с вирусными инфекциями, где указанные вирусы выбраны из группы, включающей hepadnaviridae, adenoviridae, herpesviridae, вирусы гриппа, arenaviridae, filoviridae, togaviridae, норовирусы, flaviviridae, retroviridae, вирус кори, reoviridae, enteroviridae, picornaviridae, caliciviridae, и т.д.
В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения симптомы заболевания, которые лечат или предупреждают с использованием любого из антитела против ADM, или фрагмента антитела против ADM, или не-Ig каркаса по любому из предшествующих вариантов осуществления, ассоциированы с медикаментозным лечением первичных заболеваний, таким как химиотерапия, терапия биологическими средствами (например, антитела или их фрагменты), антибиотиками или любыми медикаментами, вызывающими любые из вышеупомянутых симптомов заболевания.
Следующие предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения относится к способам терапии (например, лечение, излечение, смягчение, улучшение, ослабление и т.д.) или предупреждения симптомов, как определено в любом из вышеуказанных вариантов осуществления, включающим введение индивидууму, нуждающемуся в этом, антитела против ADM, или фрагмента антитела против ADM, или не-Ig каркаса согласно любому из предшествующих вариантов осуществления. Предпочтительно индивидуумом является человек.
Введение антитела против ADM, или фрагмента антитела против ADM, или не-Ig каркаса можно проводить любым из способов, известных в данной области, включая: пероральный, внутривенный, подкожный, внутриартериальный, внутримышечный, интракардиальный, внутрипозвооночный, интраторакальный, внутрибрюшинный, внутрижелудочковый, сублингвальный, трансдермальный и/или ингаляционный. Введение может быть системным, например, внутривенным или локализованным.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения головной боли, предпочтительно первичной головной боли, более предпочтительно мигрени у индивидуума, включающему введение индивидууму эффективного количества антитела против ADM, или фрагмента антитела против ADM или не-Ig каркаса.
В следующем варианте осуществления изобретение относится к способам смягчения, контроля, уменьшения частоты или замедления развития или прогрессирования головной боли, предпочтительно первичной головной боли, более предпочтительно мигрени у индивидуума, включающим введение индивидууму эффективного количества антитела против ADM, или фрагмента антитела против ADM, или не-Ig каркаса.
Антитело против ADM, или фрагмент антитела против ADM, или не-Ig каркас можно вводить до, в ходе и/или после головной боли. В некоторых вариантах осуществления антитело против ADM, или фрагмент антитела против ADM, или не-Ig каркас вводят до атаки головной боли.
В некоторых вариантах осуществления антитело против ADM, или фрагмент антитела против ADM, или не-Ig каркас можно вводить совместно с другим средством, таким как другое средство для лечения головной боли.
"Развитие" или "прогрессирование" головной боли означает первоначальные проявления и/или последующее прогрессирование нарушения. Развитие головной боли можно определять и оценивать с использованием стандартных клинических способов, хорошо известных в данной области. Однако развитие также относится к прогрессированию, которое может быть не поддающимся обнаружению. Для цели настоящего изобретения развитие или прогрессирование относится к биологическому течению симптомов. "Развитие" включает возникновение, рецидив и манифистацию. Как используют в рамках изобретения "манифистация" или "возникновение" головной боли включает первоначальную манифестацию и/или рецидив.
Как используют в рамках изобретения, "эффективная дозировка" или "эффективное количество" лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для достижения полезных или желаемых результатов. Для профилактического применения полезные или желаемые результаты включают результаты, такие как устранение или снижение риска, уменьшение тяжести или замедление возникновения заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, присутствующие в ходе развития заболевания. Для терапевтического применения полезные или желаемые результаты включают клинические результаты, такие как уменьшение интенсивности боли, длительности или частоты приступов головной боли и снижение одного или нескольких симптомов в результате головной боли (биохимических, гистологических и/или поведенческих), включая ее осложнения и промежуточные патологические фенотипы, проявляющиеся в ходе развития заболевания, повышение качества жизни страдающих от заболевания, снижение дозы других лекарственных средств, требуемых для лечения заболевания, усиление эффекта другого лекарственного средства и/или замедление прогрессирования заболевания у пациентов. Эффективную дозировку можно вводить за одно или нескольких введений. Для целей настоящего изобретения эффективная дозировка лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для проведения профилактического или терапевтического лечения либо прямо, либо непрямо. Как понятно в клиническом контексте, эффективная дозировка лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции может достигаться или может не достигаться совместно с другим лекарственным средством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, "эффективную дозировку" можно рассматривать в контексте введения одного или нескольких терапевтических средств, и введение единственного средства можно считать вводимым в эффективном количестве, если совместно с одним или несколькими другими средствами может быть достигнут или достигается желаемый результат.
Настоящее изобретение включает следующие варианты осуществления:
1. Антитело против адреномедуллина (ADM), или фрагмент антитела против адреномедуллина, или не-Ig каркас против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания или для применения в терапии или профилактике заболевания, характеризующегося такими симптомами, у пациента, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас связывается с ADM (1-52; SEQ ID NO:1) или его фрагментом.
2. Антитело против адреномедуллина (ADM), или фрагмент антитела против адреномедуллина, или не-Ig каркас против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания или для применения в терапии или профилактике заболевания, характеризующегося такими симптомами, у пациента, в соответствии с положением 1, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас связывается с N-концевой частью (а.к.1-21) ADM:
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID NO:4).
3. Антитело против адреномедуллина (ADM), или фрагмент антитела против ADM, связывающийся с ADM, или не-Ig каркас против ADM, связывающийся с адреномедуллином, для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания или для применения в терапии или профилактике заболевания, характеризующегося такими симптомами, у пациента, согласно любому из положений 1-2, характеризующиеся тем, что указанное антитело, фрагмент антитела, или не-Ig каркас связывается с часть средней области (MR) ADM, состоящей из а.к. 21-42 ADM:
CTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA (SEQ ID NO:3).
4. Антитело против адреномедуллина (ADM), или фрагмент антитела против ADM, связывающийся с ADM, или не-Ig каркас против ADM, связывающийся с адреномедуллином, для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания или для применения в терапии или профилактике заболевания, характеризующегося такими симптомами, у пациента, в соответствии с любым из положений 1-3, где симптомы заболевания выбраны из группы из тошноты, головной боли, мышечных болей, боли в спине, дрожания и/или рвоты.
5. Антитело против адреномедуллина (ADM), или фрагмент антитела против ADM, связывающийся с ADM, или не-Ig каркас против ADM, связывающийся с адреномедуллином, для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания или для применения в терапии или профилактике заболевания, характеризующегося такими симптомами, в соответствии с любым из положений 1-4, где заболевание характеризуется количеством C-реактивного белка (CRP) в образце, которое составляет ≥ 10 мг/л, и/или где количество TNF в образце составляет ≥ 50 пг/мл, и/или где количество био-ADM в образце составляет ≥ 43 пг/мл, и/или где среднее артериальное давление у указанного индивидуума, нуждающегося в этом, является сниженным.
6. Антитело против адреномедуллина (ADM), или фрагмент антитела против ADM, связывающийся с ADM, или не-Ig каркас против ADM, связывающийся с адреномедуллином, для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания или для применения в терапии или профилактике заболевания, характеризующегося такими симптомами, у пациента, в соответствии с любым из положений 1-5, где заболевание у пациента, нуждающегося в терапии и/или предупреждении таких симптомов или заболеваний, выбраны из группы показаний, включающих воспалительные состояния, аутоиммунные заболевания, метаболические заболевания, заболевания головного мозга, сердечно-сосудистые заболевания и индуцируемые лекарственными средствами заболевания.
7. Антитело против адреномедуллина (ADM), или фрагмент антитела против ADM, связывающийся с ADM, или не-Ig каркас против ADM, связывающийся с адреномедуллином, для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания или для применения в терапии или профилактике заболевания, характеризующегося такими симптомами, у пациента, в соответствии с любым из положений 1-5, где заболевание представляет собой мигрень.
8. Антитело против адреномедуллина (ADM), или фрагмент антитела против адреномедуллина, или не-Ig каркас против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания или для применения в терапии или профилактике заболевания, характеризующегося такими симптомами, у пациента, в соответствии с любым из положений 1-7, где указанное антитело, или фрагмент антитела, или не-Ig каркас являются моноспецифическими.
-7
9. Антитело против адреномедуллина (ADM), или фрагмент антитела против адреномедуллина, или не-Ig каркас против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания или для применения в терапии или профилактике заболевания, характеризующегося такими симптомами, у пациента, в соответствии с любым из положений 1-8, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас, демонстрирует аффинность связывания с ADM по меньшей мере 10 M посредством поверхностного плазмонного резонанса без метки с использованием системы Biacore 2000.
10. Антитело против адреномедуллина (ADM), или фрагмент антитела против адреномедуллина, или не-Ig каркас против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания или для применения в терапии или профилактике заболевания, характеризующегося такими симптомами, у пациента, в соответствии с любым из положений 1-9, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас не является ADM-связывающим белком 1 (фактор комплемента H).
11. Антитело против адреномедуллина (ADM), или фрагмент антитела против адреномедуллина, или не-Ig каркас против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания или для применения в терапии или профилактике заболевания, характеризующегося такими симптомами, у пациента, по любому из предшествующих пунктов, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас распознает и связывает N-конец (а.к. 1) ADM.
12. Антитело против адреномедуллина (ADM), или фрагмент антитела против адреномедуллина, или не-Ig каркас против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания или для применения в терапии или профилактике заболевания, характеризующегося такими симптомами, у пациента, по любому из предшествующих пунктов, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас представляет собой стабилизирующее ADM антитело, или фрагмент, или каркас, которые повышают время полужизни (половинное время нахождения t1/2) ADM в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на > 50%, наиболее предпочтительно на > 100%.
13. Антитело против адреномедуллина (ADM), или фрагмент антитела против адреномедуллина, или не-Ig каркас против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания или для применения в терапии или профилактике заболевания, характеризующегося такими симптомами, у пациента, в соответствии с любым из предшествующих положений, где указанное антитело, или фрагмент, или каркас блокирует биологическую активность ADM не более чем на 80%, предпочтительно не более чем на 50% с использованием hADM 22-52 в качестве эталонного антагониста в клетках CHO-K1, экспрессирующих рекомбинантный рецептор ADM человека.
14. Антитело против адреномедуллина (ADM), или фрагмент антитела против адреномедуллина, или не-Ig каркас против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания или для применения в терапии или профилактике заболевания, характеризующегося такими симптомами, у пациента, в соответствии с любым из предшествующих положений, где указанный индивидуум проходит химиотерапию, лечение биологическими средствами, антибиотиками или лечение противовирусными соединениям.
15. Антитело против адреномедуллина (ADM), или фрагмент антитела против адреномедуллина, или не-Ig каркас против ADM для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания или для применения в терапии или профилактике заболевания, характеризующегося такими симптомами, у пациента, в соответствии с любым из предшествующих положений, где указанное антитело или фрагмент представляет собой моноклональное антитело человека или фрагмент, который связывается с ADM, или их фрагмент, где тяжелая цепь содержит последовательности:
CDR1: SEQ ID NO:5
GYTFSRYW
CDR2: SEQ ID NO:6
ILPGSGST
CDR3: SEQ ID NO:7
TEGYEYDGFDY
и где легкая цепь содержит последовательности:
CDR1: SEQ ID NO:8
QSIVYSNGNTY
CDR2:
RVS
CDR3: SEQ ID NO:9
FQGSHIPYT.
16. Моноклональное антитело человека или фрагмент, которые связываются с ADM, или их антительный фрагмент, для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания или для применения в терапии или профилактике заболевания, характеризующегося такими симптомами, у индивидуума согласно положению 15, где указанное антитело или фрагмент содержит последовательность, выбранную из группы, включающей в качестве области VH:
SEQ ID NO:10 (AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:11 (AM-VH1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:12 (AM-VH2-E40)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:13 (AM-VH3-T26-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:14 (AM-VH4-T26-E40-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
и содержит последовательность, выбранную из группы, содержащую следующую последовательность в качестве области VL:
SEQ ID NO:15 (AM-VL-C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:16 (AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:17 (AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
17. Моноклональное антитело человека или фрагмент, которые связываются с ADM, или их антительный фрагмент, для применения в терапии или профилактике симптомов заболевания или для применения в терапии или профилактике заболевания, характеризующегося такими симптомами, у индивидуума согласно положению 15, где указанное антитело или фрагмент содержит следующую последовательность в качестве тяжелой цепи:
SEQ ID NO:22
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGSTNYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
или последовательность, которая на > 95% идентична ей,
и содержит следующую последовательность в качестве легкой цепи:
SEQ ID NO:23
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
или последовательность, которая на > 95% идентична ей.
18. Фармацевтический состав для применения в терапии, или предупреждении симптомов заболевания, или для применения в терапии или профилактике заболевания, характеризующегося такими симптомами, у пациента, содержащий антитело, или фрагмент, или каркас в соответствии с любым из положений 1-17.
19. Антитело, содержащее следующие последовательности в качестве тяжелой цепи:
SEQ ID NO:22
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGSTNYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
или последовательность, которая на > 95% идентична ей, предпочтительно на > 98%, и содержит следующую последовательность в качестве легкой цепи:
SEQ ID NO:23
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
или последовательность, которая на > 95% идентична ей, предпочтительно > 98%.
20. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело согласно положению 19.
Примеры
Получение антител и определение их констант аффинности
Получали несколько антител человека и мыши и определяли их константы аффинности (см. таблицу 1).
Пептиды/конъюгаты для иммунизации:
Синтезировали пептиды для иммунизации, см. таблицу 1, (JPT Technologies, Berlin, Германия) с дополнительным N-концевым остатком цистеина (если цистеин не присутствует в выбранной последовательности ADM) для конъюгации пептидов с бычьим сывороточным альбумином (BSA). Пептиды ковалентно связывали с BSA с использованием средства для присоединения Sulfolink (Perbio Science, Bonn, Германия). Процедуру присоединения проводили в соответствии с руководством от Perbio.
Антитела мыши получали в соответствии со следующим способом:
Мышь Balb/c иммунизировали посредством 100 мкг конъюгата пептид-BSA на 0 и 14 сутки (эмульгированного в 100 мкл полного адъюванта Фрейнда) и 50 мкг на 21 и 28 сутки (в 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда). За трое суток до проведения эксперимента по слиянию животному вводили 50 мкг конъюгата, растворенного в 100 мкл солевого раствора, вводимого в качестве одной внутрибрюшинной и одной внутривенной инъекции.
Спленоциты из иммунизированной мыши и клетки миеломной клеточной линии SP2/0 подвергали слиянию с 1 мл 50% полиэтиленгликоля в течение 30 с при 37°C. После промывания клетки высевали в 96-луночне планшеты для культивирования клеток. Селекцию гибридных клонов проводили путем выращивания в среде HAT (культуральная среда RPMI 1640, дополненная 20% эмбриональной телячьей сыворотка и добавкой HAT). Через две недели среду HAT заменяли средой HT на три пассажа, а потом возвращались к нормальной среде для клеток клеток.
Lane, R.D. 1985. J. Immunol. Meth. 81: 223-228; Ziegler B. et al. l996. Horm. Metab. Res. 28: 11-15
Супернатанты клеточных структур сначала подвергали скринингу в отношении антигенспецифических IgG-антител через три недели после слияния. Микрокультуры с положительными результатами тестирования переносили в 24-луночные планшеты для увеличения в количестве. После повторного тестирования отобранные культуры клонировали и повторно клонировали с использованием способа лимитирующих разведений и определяли изотипы (также см. ).
Продуцирование моноклональных антител:
Marx et al, 1997. Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 121
Антитела получали стандартными способами продуцирования антител () и очищали с использованием белка A. Чистота антител составляла > 95% на основе анализа с использованием SDS гель-электрофореза.
Антитела человека:
Антитела человека способом фагового дисплея по следующей методике:
E.coli
Hust et al. 2011. Journal of Biotechnology 152, 159-170; Schütte et al. 2009. PLoS One 4, e6625
библиотеки генов наивных антител человека HAL7/8 использовали для выделения рекомбинантных одноцепочечных F-вариабельных доменов (scFv) против пептида ADM. Библиотеки генов антител подвергали скринингу с использованием стратегии пэннинга, включающей применение пептидов, содержащих биотиновую метку, связанную через два различных спейсера с последовательностью пептида ADM. Комбинацию раундов пэннинга, в которой использовался неспецифических связанный антиген и связанный со стрептавидином антиген, использовали для минимизации фонового уровня неспецифических связывающих молекул. Элюированные пассажи после третьего раунда пэннинга использовали для получения штаммов , экспрессирующих моноклональный scFv. Супернатанты после культивирования этих клональных штаммов прямо использовали для тестирования с использованием ELISA с антигеном (также см. ).
Hust et al. 2011. Journal of Biotechnology 152, 159-170
Положительные клоны отбирали на основе положительного сигнала ELISA для антигена и отрицательного для покрытых стрептавидинов планшетов для микротитрования. Для дальнейших охарактеризаций открытую рамку считывания scFv клонировали в экспрессирующую плазмиду pOPE107 (), извлекали из культурального супернатанта посредством аффинной хроматографии с иммобилизованным ионом металла и очищали эксклюзионной хроматографией.
Константы аффинности:
Lorenz et al. 2011. Antimicrob Agents Chemother. 55(1): 165-173
Для определения аффинности антител в отношении ADM определяли кинетику связывания ADM с иммобилизованным антителом посредством поверхностного плазменного резонанса без метки с использованием системы Biacore 2000 (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Германия). Обратимую иммобилизацию антител проводили с использованием антитела против Fc мыши, ковалентно связанного в высокой плотности с сенсорной поверхностью CM5 в соответствии с инструкциями изготовителя (набор для улавливания антител; GE Healthcare) ().
Моноклональные антитела индуцировали против описанных ниже областей ADM человека и мыши, соответственно. В приведенной ниже таблице представлен набор полученных антител, использованных для дальнейших экспериментов. Выбор был основан на области-мишени:
Таблица 1:
Номер последовательности
Антиген/иммуноген
Область ADM
Обозначение
Константы аффинности Kd (M)
SEQ ID: 4
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
1-21
NT-H
5,9×10<sup>-9</sup>
SEQ ID: 21
CTVQKLAHQIYQ
21-32
MR-H
2×10<sup>-9</sup>
Амидированная SEQ ID: 2 (с дополнительным цистеином на N-конце
C-APRSKISPQGY-NH<sub>2</sub>
C-42-52
CT-H
1,1×10<sup>-9</sup>
SEQ ID: 18
YRQSMNQGSRSNGCRFGTC
1-19
NT-M
3,9×10<sup>-9</sup>
SEQ ID: 19
CTFQKLAHQIYQ
19-31
MR-M
4,5×10<sup>-10</sup>
Амидированная SEQ ID: 20 (с дополнительным цистеином на N-конце
C-APRNKISPQGY-NH<sub>2</sub>
C-40-50
CT-M
9×10<sup>-9</sup>
Получение фрагментов антител посредством ферментативного расщепления:
Получение Fab- и F(ab)2-фрагментов проводили посредством ферментативного расщепления зрелого полноразмерного антитела NT-M. Антитело NT-M расщепляли с использованием a) набора для получения F(ab)2 на основе пепсина (Pierce 44988) и b) набора для получения Fab на основе папаина (Pierce 44985). Методики фрагментации проводили в соответствии с инструкциями, предоставленными поставщиком. В случае F(ab)2-фрагментации расщепление проводили в течение 8 ч 37°C. Расщепление в случае Fab-фрагментации проводили в течение 16 ч, соответственно.
Методика получения и очистки Fab:
Coulter and Harris 1983. J. Immunol. Meth. 59, 199-203.; Lindner et al. 2010. Cancer Res. 70, 277-87; Kaufmann et al. 2010. PNAS. 107, 18950-5.; Chen et al. 2010. PNAS. 107, 14727-32; Uysal et al. 2009 J. Exp. Med. 206, 449-62; Thomas et al. 2009. J. Exp. Med. 206, 1913-27; Kong et al. 2009 J. Cell Biol. 185, 1275-840
Иммобилизованный папаин уравновешивали промыванием смолы 0,5 мл буфером для расщепления и центрифугированием колонки при 5000×g в течение 1 минуты. После этого буфер выбрасывали. Колонку для обессоливания подготавливали удалением буфера для хранения и промывания его буфером для расщепления, центрифугируя его каждый раз при 1000×g в течение 2 минут. Добавляли 0,5 мл приготовленного образца IgG добавляли в пробирку-колонку для центрифугирования, содержавшую уравновешенный иммобилизованный папаин. Инкубацию реакционной смеси для расщепления проводили в течение 16 ч на настольном устройстве для качания при 37°C. Колонку центрифугировали при 5000×g в течение 1 минуты для отделения расщепленного продукта от иммобилизованного папаина. После этого смолу промывали 0,5 мл PBS и центрифугировали при 5000×g в течение 1 минуты. Промывочную фракцию добавляли к расщепленному антителу до общего объема образца 1,0 мл. Колонку NAb с белком A уравновешивали PBS и буфером для элюирования IgG при комнатной температуре. Колонку центрифугировали в течение 1 минуты для удаления раствора для хранения (содержит 0,02% азид натрия) и уравновешивали добавлением 2 мл PBS, центрифугировали вновь в течение 1 минуты и элюат выбрасывали. Образец наносили на колонку и ресуспендировали переворачиванием. Инкубацию проводили при комнатной температуре с перемешиванием путем переворачивания в течение 10 минут. Колонку центрифугировали в течение 1 минуты, оставляя элюат с Fab-фрагментами. (Ссылки: ).
Методика получения и очистки F(ab')2-фрагментов:
Mariani et al. 1991. Mol. Immunol. 28: 69-77; Beale 1987. Exp Comp Immunol 11:287-96; Ellerson et al. 1972. FEBS Letters 24(3):318-22; Kerbel and Elliot 1983. Meth Enzymol 93:113-147; Kulkarni et al. 1985. Cancer Immunol Immunotherapy 19:211-4; Lamoyi 1986. Meth Enzymol 121:652-663; Parham et al. 1982. J Immunol Meth 53:133-73; Raychaudhuri et al. 1985. Mol Immunol 22(9):1009-19; Rousseaux et al. 1980. Mol Immunol 17:469-82; Rousseaux et al. 1983. J Immunol Meth 64:141-6; Wilson et al. 1991. J Immunol Meth 138:111-9
Иммобилизованный пепсин уравновешивали промыванием смолы 0,5 мл буфером для расщепления и центрифугированием колонки при 5000×g в течение 1 минуты. После этого буфер выбрасывали. Колонку для обессоливания подготавливали удалением буфера для хранения и промывания его буфером для расщепления, центрифугируя его каждый раз при 1000×g в течение 2 минут. Добавляли 0,5 мл приготовленного образца IgG добавляли в пробирку-колонку для центрифугирования, содержавшую уравновешенный иммобилизованный пепсин. Инкубацию реакционной смеси для расщепления проводили в течение 16 ч на настольном устройстве для качания при 37°C. Колонку центрифугировали при 5000×g в течение 1 минуты для отделения расщепленного продукта от иммобилизованного пепсина. После этого смолу промывали 0,5 мл PBS и центрифугировали при 5000×g в течение 1 минуты. Промывочную фракцию добавляли к расщепленному антителу до общего объема образца 1,0 мл. Колонку NAb с белком A уравновешивали PBS и буфером для элюирования IgG при комнатной температуре. Колонку центрифугировали в течение 1 минуты для удаления раствора для хранения (содержит 0,02% азид натрия) и уравновешивали добавлением 2 мл PBS, центрифугировали вновь в течение 1 минуты и элюат выбрасывали. Образец наносили на колонку и ресуспендировали переворачиванием. Инкубацию проводили при комнатной температуре с перемешиванием путем переворачивания в течение 10 минут. Колонку центрифугировали в течение 1 минуты, оставляя элюат с Fab-фрагментами. (ссылки: ).
Гуманизация фрагментов антител NT-H:
Jones et al. 1986. Nature 321, 522-525
Фрагмент антитела гуманизировали способом пересадки CDR ().
Для получения гуманизированной последовательности выполняли следующие стадии:
- Экстракция тотальной РНК: тотальную РНК экстрагировали из гибридом NT-H с использованием набора Qiagen.
- Первый раунд ОТ-ПЦР: использовали QIAGEN OneStep RT-PCR Kit (Cat No. 210210). ОТ-ПЦР проводили с набором праймеров, специфичных к тяжелым и легким цепям. Для каждого образца РНК проводили 12 индивидуальных реакций ОТ-ПЦР для тяжелой цепи и 11 индивидуальных реакций ОТ-ПЦР для легкой цепи с использованием смесей вырожденных прямых праймеров, охватывающих лидерные последовательности вариабельных областей. Обратные праймеры расположены в константных областях тяжелых и легких цепей. В праймеры не было встроено участков рестрикции.
- Схема реакции: 5× буфер QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer 5,0 мкл, смесь dNTP (содержащая каждый dNTP в концентрации 10 мМ) 0,8 мкл, набор праймеров 0,5 мкл, смесь ферментов QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix 0,8 мкл, матричную РНК 2,0 мкл, свободную от РНК-азы воду до 20,0 мкл, общий объем 20,0 мкл. Условия ПЦР: обратная транскрипция: 50°C, 30 мин; первоначальная активация ПЦР: 95°C, 15 мин, циклирование: 20 циклов при 94°C, 25 с; 54°C, 30 с; 72°C, 30 с; конечное удлинение: 72°C, 10 мин. Второй раунд полугнездовой ПЦР: продукты реакций ОТ-ПЦР первого раунда далее амплифицировали в ПЦР второго раунда. 12 индивидуальных реакций ОТ-ПЦР для тяжелой цепи и 11 индивидуальных реакций ОТ-ПЦР для легкой цепи проводили с использованием наборов праймеров для полугнездовой ПЦР, специфичных к вариабельным областям антитела.
- Схема реакции: 2x смесь для ПЦР, 10 мкл; набор праймеров, 2 мкл; продукт ПЦР первого раунда 8 мкл; общий объем 20 мкл; условия из отчета о клонирования гибридомных антител посредством ПЦР: первоначальная денатурация 5 мин при 95°C; 25 циклов из 95°C в течение 25 с, 57°C в течение 30 с, 68°C в течение 30 с; конечное удлинение составляет 10 мин при 68°C.
Padlan 1991. Mol. Immunol. 28, 489-498; Harris and Bajorath.1995. Protein Sci. 4, 306-310
- После завершения ПЦР разделение образцов ПЦР на агарозном геле для визуализации амплифицированных фрагментов ДНК. После секвенирования более 15 клонированных фрагментов ДНК, амплифицированных посредством гнездовой ОТ-ПЦР, клонировали несколько тяжелых и легких цепей антител мыши, и они оказались правильными. Выравнивание белковых последовательностей и анализ CDR идентифицировал одну тяжелую цепь и одну легкую цепь. Поскольку аминокислоты в положениях 26, 40 и 55 в вариабельной области тяжелой цепи и аминокислота в положении 40 вариабельной области ключевой цепи являются ключевыми для свойства связывания, они могут быть обратно преобразованы в исходную последовательность мыши. Полученные кандидаты представлены ниже. ().
Аннотация для последовательностей фрагментов антител (SEQ ID NO:10-17): выделены полужирным шрифтом и подчеркнуты CDR 1, 2, 3 в нумерационном порядке от N-конца к C-концу; курсивом выделены константные области; шарнирные области выделены полужирными подчеркнутыми буквами и гистидиновая метка на C-конце выделена полужирным шрифтом и курсивом.
SEQ ID NO:10 (AM-VH-C)
GYTFSRYW
ILPGSGST
TE GYEYDGFDY
EPK
HHHHHH
NTAYMQLSSLTSEDSAVYYC
WGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKRV
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATIEWVKQRPGHGL EWIGENYNEKFKGKATITADTSS
SEQ ID NO:11 (AM-VH1)
GYTFSRYW
ILPGSGST
T  EGYEYDGFDY
EPK
HHHHHH
STSTAYMELSSLRSEDTAVYYC
WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKRV
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASISWVRQAPGQGL EWMGRNYAQKFQGRVTITADE
SEQ ID NO:12 (AM-VH2-E40)
GYTFSRYW
ILPGSGST
T EGYEYDGFDY
EPK
HHHHHH
STSTAYMELSSLRSEDTAVYYC
WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKRV
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASIEWVRQAPGQGL EWMGRNYAQKFQGRVTITADE
SEQ ID NO:13 (AM-VH3-T26-E55)
GYTFSRYW
ILPGSGST
T EGYEYDGFDY
EPK
HHHHHH
STSTAYMELSSLRSEDTAVYYC
WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKRV
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATISWVRQAPGQGL EWMGENYAQKFQGRVTITADE
SEQ ID NO:14 (AM-VH4-T26-E40-E55)
GYTFSRYW
ILPGSGST
T EGYEYDGFDY
EPK
HHHHHH
STSTAYMELSSLRSEDTAVYYC
WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKRV
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATIEWVRQAPGQGL EWMGENYAQKFQGRVTITADE
SEQ ID NO:15 (AM-VL-C)
QSIVYSNGNTY
RVS
FQGSHIPYT
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSLEWYLQKPGQSPKLLIYNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:16 (AM-VL1)
QSIVYSNGNTY
RVS
FQGSHIPYT
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSLNWFQQRPGQSPRRLIYNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:17 (AM-VL2-E40)
QSIVYSNGNTY
RVS
FQGSHIPYT
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSLEWFQQRPGQSPRRLIYNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:22 (тяжелая цепь адрецизумаба)
GYTFSRYW
ILPGSGST
TEGYEYDGFDY
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASIEWVRQAPGQGLEWIGENYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:23 (легкая цепь адрецизумаба)
QSIVYSNGNTY
RVS
FQGSHIPYT
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSLEWYLQRPGQSPRLLIYNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Пример 2 - Рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое испытание фазы I в отношении безопасности, переносимости и фармакокинетики/-динамики возрастающих однократны внутривенных доз антитела против ADM (АДРЕЦИЗУМАБ) (HAM8101) у здоровых мужчин в ходе экспериментальной эндотоксемии.
Общая схема испытания
Kiers et al. 2017. Scientific Reports 7: 40149
Проводили рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое испытание фазы I у здоровых добровольцев мужского пола в ходе экспериментальной эндотоксемии с однократным возрастающими по группам дозами адрецизумаба, вводимого посредством в/в инфузии в течение 1 часа. Использовали модель с непрерывным введением LPS (липополисахарид) для индукции экспериментальной эндотоксемии; введение LPS в качестве первоначального болюса 1 нг/кг с последующей непрерывной инфузией в дозе 1 нг/кг/ч в течение 3 часов. Индивидууму проводят один курс введения исследуемого лекарственного средства (адрецизумаб или плацебо), через 1 час после начала введения LPS. Модель системного воспаления недавно была описана ().
Адрецизумаб вводили в качестве однократной инфузии на протяжении 1 часа в дозе 0,5 мг/кг, и дозу увеличивали вплоть до 2,0 и 8,0 мг/кг в последующих группах введения (см. таблицу 2).
Таблица 2: В исследуемых группах из 8 индивидуумов проводили лечение посредством инфузии в течение 1 часа
<b>Группа</b>
<b>Лечение</b>
Группа 1
0,5 мг/кг HAM8101 (n=6)
Плацебо (n=2)
Группа 2
2,0 мг/кг HAM8101 (n=6)
Плацебо (n=2)
Группа 3
8,0 мг/кг HAM8101 (n=6)
Плацебо (n=2)
Отбор выборки для испытания
Исследуемая выборка состояла из здоровых молодых добровольцев мужского пола. Для включения в испытание индивидуумы должны были удовлетворять всем критериям включения и не удовлетворять ни одному из критериев исключения.
Критерии включения
1. Письменное информированное согласие на участие в этом испытании перед какой-либо предписываемой исследованием процедурой.
2. Мужчины в возрасте от 18 до 35 лет включительно.
3. Индивидуумы должны были согласиться на надежный способ контрацепции с их партнерами от начала исследования до 3 месяцев после введения исследуемого лекарственного средства.
2
4. BMI между 18 и 30 кг/м, причем нижний предел массы тела составляет 50 кг и верхний предел массы тела составляет 100 кг.
5. Здоровые при определении по медицинскому анамнезу, физикальному обследованию, основным показателям жизнедеятельности, электрокардиограмме в 12 отведениях, и клиническим лабораторным параметрам.
Критерии исключения
1. Нежелание воздерживаться от какого-либо лекарственного средства, психоактивных веществ или антиоксидантных витаминных добавок в ходе испытания и в пределах 7 суток перед днем лечения.
2. Нежелание воздерживаться от курения или алкоголя в пределах 1 суток перед днем введения.
3. Предшествующее участие в испытании, где вводили LPS.
4. Хирургическая операция или травма со значительной кровопотерей или донорство крови в пределах 3 месяцев перед днем введения.
5. Анамнез, признаки или симптомы сердечно-сосудистого заболевания, в частности:
- Частый вазовагальный коллапс или ортостатическая гипотензия в анамнезе
- Пульс в покое ≤45 или ≥100 ударов/мин
- Гипертензия (систолическое RR >160 или диастолическое RR >90 мм. рт. ст.)
- Гипотензия (систолическое RR <100 или диастолическое RR <50 мм. рт. ст.)
- Нарушения проводимости на ЭКГ, состоящие из предсердно-желудочной блокады 1-й степени и комплексной блокады пучка Гиса
- Любые хронические сердечные аритмии в (за исключением PAC, PVC)
6. Почечное нарушение: креатинин в плазме >120 мкмоль/л
7. Тесты функции печени (щелочная фосфатаза, AST, ALT и/или γ-GT) выше 2x верхней границы нормы.
8. Астма в анамнезе
9. Атопическая конституция
10. CRP выше 2x верхней границы нормы, или клинически значимое острое заболевание, включая инфекции, в пределах 2 недель до дня введения.
11. Лечение проходящими испытание лекарственными средствами или участие в каком-либо другом клиническом испытании в пределах 30 суток перед днем введения.
12. Известная или предполагаемая неспособность следовать протоколу испытания.
13. Известная гиперчувствительность к каким-либо эксципиентам используемых лекарственных составов.
14. Неспособность персонально предоставить письменное информированное согласие (например, по лингвистическим или психическим причинам) и/или принять участие в испытании.
Липополисахарид (LPS) из Escherichia coli типа O113
Для достижения контролируемого воспалительного состояния индивидуума вводили липополисахарид (LPS, эталонный эндотоксин США [Escherichia coli O:113, List Biological Laboratories Inc., Campbell, California, US]) внутривенно.
Структура испытания и временные окна
Взятие образцов до введения дозыпроводили в T=0 (исходный уровень). Основные показатели жизнедеятельности определяли после 5 мин в покое в положении на спине или полусупинированном положении. Схема взятия образцов и контрольных посещений (см. таблицу 2 для более подробной информации):
- В день введения (0 сутки), образцы крови должны были быть взяты в запланированное время ± 5 мин.
- Через 24 часа (1 сутки), посещение для наблюдения и взятие крови должно было быть запланировано через ± 1 час после введения IMP.
- На 7 сутки, посещение для наблюдения могло быть запланировано на любое время ± 1 сутки.
- На 14 и 28 сутки посещение для наблюдения могло быть запланировано на любое время ±2 суток.
- На 60 и 90 сутки посещение для наблюдения могло быть запланировано на любое время ± 3 суток.
Лабораторный мониторинг
Анализировали следующие параметры гематологии: гемоглобин, гематокрит, RBC, MCV, MCH, MCHC, WBC, тромбоциты, дифференциальный подсчет лейкоцитов.
Взятие образцов крови проводили в пробирки для отделения сыворотки и анализировали следующие биохимические параметры: CRP, AF, ALT, AST, γ-GT, креатинкиназа, LDH, мочевина-N, креатинин, натрий, калий, PT и APTT.
Первичные конечные переменные представляют собой: неблагоприятные явления; основные показатели жизнедеятельности в течение первых 10 часов после введения адрецизумаба и в период наблюдения (T=24 часов, T=7 суток, T=14 суток, T=28 суток, T=60 суток, T=90 суток), например, частота сердцебиений, кровяное давление, насыщение кислородом, температура; локальная переносимость в области в/в инфузии; лабораторные параметры безопасности (Hb, Ht, лейкоциты, тромбоциты, дифференциальный подсчет лейкоцитов, натрий, калий, креатинин, мочевина, щелочная фосфатаза, ALT, AST, GGT, CK, CRP, PT, APTT); электрокардиограмма в 12 отведениях (ЭКГ), через 2 и 8 часов после введения адрецизумаба.
Вторичные конечные результаты представляют собой:фармакокинетика адрецизумаба в ходе экспериментальной эндотоксемии (включая AUC, Cmax, терминальное T1/2, Cl, V); уровни медиаторов воспаления в плазме в день эндотоксемии (включая, но не ограничиваясь ими, TNFα, IL-6, IL-8, IL-10); индекс симптомов заболевания; необязательно: маркеры повреждения почек (включая, но не ограничиваясь ими, клиренс креатинина, про-энкефалин и KIM-1).
Таблица 3: исходные характеристики на группу (среднее значение ± SD)
Плацебо
0,5 мг/кг
2,0 мг/кг
8,0 мг/кг
Значение P*
Возраст
22,0 ± 1,1
22,0 ± 2,8
23,3 ± 2,5
22,5 ± 2,7
0,745
BMI
23,7 ± 1,3
23,3 ± 1,5
24,7 ± 1,9
25,6 ± 3,0
0,263
* Протестированные с использованием одностороннего ANOVA
Не наблюдалось серьезных неблагоприятных явлений (SAE) или подозреваемых непредвиденных серьезных неблагоприятных реакций (SUSAR) в ходе всей продолжительности испытания, включая период наблюдения 90 суток.
Результаты
Индекс заболевания снижается быстрее при введении адрецизумабаа по сравнению с плацебо.
Как 2, так и 8 мг/кг имеют значительно более низкий индекс заболевания, чем плацебо, между моментами времени от 210 мин (T210) до 450 мин (T450) (p=0,011 и 0,005, соответственно; повторные показатели GLM) (фиг.1).
На фиг.2 представлено распределение показателей заболевания по группам введения в момент времени T270 (момент времени 270 мин) и T300 (момент времени 300 мин), соответственно (фиг.2A) и B)), подтверждающее неожиданно благоприятный эффект антитела по настоящему изобретению.
Вклад единичных компонентов индекса заболевания в эффект проиллюстрирован на фиг.3: A) тошнота, B) головная боль, C) мышечные боли, D) боль в спине и E) дрожание. Все представленные симптомы вносят значительный вклад в эффект. Рвота возникала только у двух пациентов по одному разу в каждом случае и не могла быть проанализирована.
На фиг.4 представлена альтернативная оценка. Здесь оценивали другой показатель, индекс тошноты, с использованием одного вопроса, касающегося тошноты в целом, по шкале от 0 до 10. Вновь, индекс тошноты снижался быстрее у пациентов, которым вводили антитело против ADM (адрецизумаб).
Введение NT-H здоровым людям
Испытание проводили на здоровых индивидуумах мужского пола в качестве рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого испытания с однократными возрастающими дозами антитела NT-H, вводимого в качестве внутривенной (в/в) инфузии в 3 последовательных группах из 8 здоровых индивидуумов мужского пола в каждой (1-я группа 0,5 мг/кг, 2-я группа 2 мг/кг, 3-я группа мг/кг) здоровых индивидуумов мужского пола (n=6 активное вещество, n=2 плацебо для каждой группы).
Основными критериями включения были письменное информированное согласие, возраст 18-35 лет, согласие применять надежный способ контрацепции и BMI между 18 и 30 кг/м².
Индивидуумам вводили однократную в/в дозу антитела NT-H (0,5 мг/кг; 2 мг/кг; 8 мг/кг) или плацебо посредством медленной инфузии на протяжении периода, составлявшего 1 час, в научно-исследовательском отделении.
Исходные уровни ADM в 4 группах не различались. Срединные уровни ADM составляли 7,1 пг/мл в группе плацебо, 6,8 пг/мл в первой группе лечения (0,5 мг/кг), 5,5 пг/мл во второй группе лечения (2 мг/кг) и 7,1 пг/мл в третьей группе лечения (8 мг/мл).
Результаты демонстрируют, что уровни ADM быстро возрастали в течение первых 1,5 часа после введения антитела NT-H у здоровых людей, а затем достигали плато и медленно снижались (фиг.5).
Два индивидуума в группе плацебо и 3 индивидуума всего из групп введения сообщали о симптомах мигрени перед введением однократной дозы плацебо и антитела NT-H, соответственно. После каждого момента времени вновь задавались вопросы о симптомах. Индивидуумы, которым вводили антитело NT-H, не сообщали ни о каких симптомах мигрени через 4 часа после введения, в то время как два индивидуума, которым вводили плацебо, все еще страдали от симптомов мигрени, как и до инфузии.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  AdrenoMed AG
<120>  СОЕДИНЕНИЕ, СВЯЗЫВАЮЩЕЕ АДРЕНОМЕДУЛЛИН (ADM), ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ
ДЛЯ ТЕРАПИИ ИЛИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ СИМПТОМОВ ЗАБОЛЕВАНИЯ
<130>  A75176WO
<150>  EP17192999.5
<151>  2017-09-25
<150>  EP17203370.6
<151>  2017-11-23
<160>  23
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  52
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
20                  25                  30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser
35                  40                  45
Pro Gln Gly Tyr
50
<210>  2
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr
1               5                   10
<210>  3
<211>  22
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys
1               5                   10                  15
Asp Lys Asp Asn Val Ala
20
<210>  4
<211>  21
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  4
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Phe Gly Thr Cys
20
<210>  5
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  5
Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr Trp
1               5
<210>  6
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  6
Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr
1               5
<210>  7
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  7
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  8
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  8
Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1               5                   10
<210>  9
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  9
Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Tyr Thr
1               5
<210>  10
<211>  225
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<400>  10
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys His His His His His
210                 215                 220
His
225
<210>  11
<211>  225
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<400>  11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys His His His His His
210                 215                 220
His
225
<210>  12
<211>  225
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<400>  12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys His His His His His
210                 215                 220
His
225
<210>  13
<211>  225
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<400>  13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys His His His His His
210                 215                 220
His
225
<210>  14
<211>  225
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<400>  14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys His His His His His
210                 215                 220
His
225
<210>  15
<211>  219
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<400>  15
Asp Val Leu Leu Ser Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  16
<211>  219
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<400>  16
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  17
<211>  219
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<400>  17
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  18
<211>  19
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  18
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe
1               5                   10                  15
Gly Thr Cys
<210>  19
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  19
Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
1               5                   10
<210>  20
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  20
Ala Pro Arg Asn Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr
1               5                   10
<210>  21
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  21
Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
1               5                   10
<210>  22
<211>  448
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь антитела человека с трансплантированными CDR мыши
<400>  22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210                 215                 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
<210>  23
<211>  219
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь антитела человека с трансплантированными CDR мыши
<400>  23
Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<---