СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АТЕРОГЕННОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
METHOD TO DETERMINE ATHEROGENICITY OF HUMAN BLOOD

Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано в лабораторной диагностике для определения атерогенности крови по уровню содержания модифицированных липопротеинов низкой плотности (мЛПНП) в сыворотке или плазме крови человека.
Атеросклероз представляет собой хроническое заболевание, которое вызывает утолщение внутреннего слоя (интимы) крупных артерий и артерий среднего размера. Это снижает ток крови и может вызвать ишемию и разрушение ткани в органах, снабжающихся кровью через поврежденный сосуд. Атеросклероз является главной причиной сердечно-сосудистого заболевания, включая инфаркт миокарда, инсульт и заболевание периферических артерий. Он является основной причиной смерти на Западе и, как предсказывается, станет лидирующей причиной смерти во всем мире в пределах двух десятилетий.
Заболевание начинается с накопления липопротеинов, в первую очередь, липопротеина низкой плотности (ЛПНП), во внеклеточном матриксе сосуда. Данные частицы ЛПНП агрегируют и подвергаются модификации в результате окисления. мЛПНП является токсичным и вызывает повреждение сосудов. Во многих отношениях атеросклероз представляет собой ответ на повреждение, включающий воспаление и фиброз [12].
Наиболее убедительные доказательства участия мЛПНП в развитии атеросклероза подтверждаются следующими данными:
1) мЛПНП обнаружены в атеросклеротической бляшке, но не в нормальных артериях [11];
2) аутоантитела, образованные против неоэпитопов мЛПНП, присутствуют в крови и титр этих антител коррилирует с тяжестью атеросклероза, и является маркером заболевания [6, 14];
3) исследования на животных моделях атеросклероза показали протективный эффект антиоксидантов (витамин Е, пробукол, аналоги пробукола и KoQ), хотя клинические испытания на людях с использованием витамина Е потерпели неудачу [17];
4) генетический нокаут различных скавенджер-рецепторов на мышах приводит к значительному подавлению развития атеросклероза [8-10, 16], подтверждая роль этих рецепторов и их лигандов (мЛПНП) в развитии повреждения артерий;
5) истощение 12/15-липооксигеназы, который является физиологическим окисляющим агентом ЛПНП, замедляет развитие атеросклероза [4], в то время как его повышенная экспрессия ускоряет атеросклероз [3], показывая тем самым роль окислительной модификации ЛПНП;
6) исследования Като и соавт. (2009) у апоЕ-дефицитных мышей показали, что повышение плазменного уровня окисленных ЛПНП наблюдается до развития повреждений артерий [7];
7) показано, что специфическое снижение плазменного уровня мЛПНП путем экспрессии скавенджер-рецептора (LOX-1) в печени предотвращает прогрессирование атеросклеротического повреждения у апоЕ-дефицитных мышей даже при наличии тяжелой гиперхолестеролемии [5].
Таким образом, учитывая важную патогенетическую роль оЛПНП при атеросклерозе, остается актуальной разработка простых, доступных для клинических лабораторных исследований способов определения мЛПНП.
В настоящее время в клинической лабораторной практике отсутствуют доступные для рутинных исследований реагенты и методы определения содержания атерогенных, модифицированных липопротеинов низкой плотности в сыворотке крови человека.
Известен способ определения атерогенности сыворотки крови по ее способности вызывать накопление холестерина в культивируемых клетках [13]. Недостатком этого способа являются трудоемкость, высокая себестоимость, сложность и длительность проведения исследования.
Наиболее интенсивно разрабатываемыми методами определения мЛПНП являются иммуноферментные тесты с использованием моноклональных антител к in vitro модифицированным ЛПНП [15]. Многостадийность, трудоемкость и длительность иммуноферментного теста, выявление только эпитопов, характерных для искусственно модифицированных липопротеинах низкой плотности (неспецифичность), а также высокая себестоимость реагентов затрудняет использование их в рутинных исследованиях.
Наиболее близким техническим решением является определение множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности (ммЛПНП) в плазме крови человека путем обработки ее буфером, содержащим поливинилпирролидон (ПВП) 12600±2700 (ООО АК «Синтвита», Россия), и последующей визуальной регистрацией помутнения по сравнению с контрольной пробой. Наличие помутнения, обусловленной агрегацией ммЛПНП, свидетельствует об атерогенности крови [2]. Для инструментального подтверждения наличия атеросклероза были проведены исследования импульсно-волновым доплеровским сканированием сонных артерий у относительно здоровых молодых людей с повышенным уровнем ммЛПНП в возрасте до 40 лет с нормальным уровнем холестерина и триглицеридов. В результате ультразвукового исследования у 57% было выявлено утолщение интимо-медиального слоя сонных артерий и подтвержден инструментально диагноз атеросклероз брахиоцефальных артерий. У остальных (43%) данные параметры оставались в пределах нормальных величин и свидетельствовали о том, что повышение уровня ммЛПНП предшествует морфологическим изменениям (утолщению) интимо-медиального слоя в обследованных артериях [1].
Недостатком разработанного ранее метода является то, что способ выявляет только ммЛПНП, которые быстро элиминируются из кровотока при взаимодействии со скавенджер-рецепторами. А также ммЛПНП связываются с аутоантителами к ним с образованием иммунных комплексов, которые при условиях 8,9% ПВП не агрегируют и у некоторых больных с тяжелым атеросклерозом данный тест дает отрицательный результат.
Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала реагентов для определения атерогенности крови по агрегации мЛПНП, маркера как раннего атеросклероза, так и атеросклероза, характеризующегося повышенным уровнем аутоантител к ммЛПНП и наличием клиники атеросклероза у больных, подтвержденых инструментальными методами исследования.
Поставленная задача решается путем добавления к сыворотке крови человека буферного раствора, содержащего поливинилпирролидон 35000±5000, определения степени помутнения турбидиметрическим методом и расчета содержания мЛПНП по приведенной ниже формуле.
Техническим результатом, получаемым при реализации изобретения, является расширение арсенала реагентов для определения атерогенности крови с целью ранней биохимической диагностики субклинического атеросклероза, а также контроля эффективности терапии клинического атеросклероза.
Этот результат достигается тем, что определение атерогенности сыворотки или плазмы крови человека проводят путем обработки ее буфером, содержащим поливинилпирролидон (ПВП)-35000±5000, инкубирования пробы в течение 10 мин при комнатной температуре, измерения светопоглощения в опытной и контрольной пробах, вычисления разности между ними, при этом при величине разности более 15 ЕД, констатируют атерогенность крови за счет повышенного уровня мЛПНП.
Определение атерогенности крови человека по агрегации модифицированных липопротеинов низкой плотности (мЛПНП) с использованием ПВП 35000±5000 (ООО «АК Синтвита», Россия).
Буфер-1 для агрегации мЛПНП готовят растворением 10 г ПВП 35000 в 100 мл 0,01 М Трис-HCl-буфера, pH 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. Буфер-К, в отличие от Буфера-1, не содержит ПВП. К Буферу-1 добавляют сыворотку или плазму крови, тщательно перемешивают, инкубируют, измеряют степень помутнения спектрофотометрически и рассчитывают уровень содержания [мЛПНП] по формуле:
О
К
[мЛПНП], ЕД=[Е-Е]×100,
где:
[мЛПНП]
- уровень содержания модифицированных липопротеинов низкой плотности в опытной пробе в единицах (ЕД);
Е<sub>О</sub>
- оптическая плотность опытной пробы, сыворотки с соответствующим количеством Буфера-1, при длине волны 450 нм, ед. опт. пл.;
Е<sub>К</sub>
- оптическая плотность контрольной пробы при длине волны 450 нм, сыворотки с соответствующим количеством Буфера-К, ед. опт. пл.;
100
- коэффициент перерасчета в единицы ЕД.
Пример 1. Определение оптимальной концентрации ПВП 35000±5000 (ООО «АК Синтвита», Россия) для агрегации мЛПНП в пулированной сыворотке крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. К 50 мкл пулированной сыворотки крови от 10 больных сердечно-сосудистыми заболеваниями добавляют 100-900 мкл Буфера-1, тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин в 9 луночных кюветах биохимического анализатора FP-901 ("Labsystem", Финляндия). Степень помутнения определяют турбидиметрически при длине волны 450 нм. Полученные результаты приведены в таблице 1.
Как видно из данных, представленных в таблице 1, с увеличением концентрации ПВП 35000±5000 в инкубационной системе с 6,7% до 9,1% и при концентрации сыворотки от 33,3% до 9,1%, соответственно, наблюдается агрегация мЛПНП и помутнение раствора в пулированной сыворотке больных с атеросклерозом коронарных артерий. Максимальная агрегация мЛПНП достигается при концентрациях ПВП и сыворотки равной 9,1%, т.е. при объемном соотношении сыворотка : Буфер-1 (1:10). При дальнейшем увеличении концентрации ПВП свыше 9,1% наблюдается уменьшение агрегации мЛПНП из-за дефицита тестируемой сыворотки при избытке ПВП.
Пример 2. Определение специфичности агрегации мЛПНП в зависимости от времени инкубации и концентрации ПВП 35000±5000 (ООО «АК Синтвита», Россия) в пулированной сыворотке крови больных с коронарным атеросклерозом, подтвержденным инструментальными методами. Для подтверждения специфической агрегации мЛПНП в пулированной сыворотке крови больных атеросклерозом коронарных артерий в зависимости от концентраций ПВП 35000 было исследовано агрегация мЛПНП во времени при условиях, описанных выше. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Как видно из данных, представленных в таблице 2, максимальная агрегация мЛПНП наблюдается в течение первой минуты и завершается к 10 мин инкубации. Максимальная агрегация наблюдается также при концентрациях ПВП и сыворотка в системе равной 9,1% в течение первой минуты инкубации. При концентрации ПВП 9,2% и выше в системе дальнейшая инкубация вызывает агрегацию нативных ЛПНП, которая продолжается в течение 60 мин. При концентрациях ПВП 9,1% и ниже в системе оптическая плотность раствора сыворотки практически не меняется. Полученные данные свидетельствуют о том, что при концентрации ПВП 35000±5000 9,1% и ниже в системе (от 6,7% до 9,1%) в пулированной сыворотке крови больных атеросклерозом коронарных артерий агрегации нативных липопротеинов низкой и очень низкой плотности практически не наблюдается (отсутствие изменения оптической плотности смеси ПВП-сыворотка после 10 мин инкубации).
Пример 3. Определение содержания холестерина, триацилглицеридов (ТАГ) и общих белков в ПВП-преципитатах. Для подтверждения наличия мЛПНП в ПВП-преципитатах были проведены следующие эксперименты. Из 0,5 мл пулированной сыворотки больных ИБС и контрольных здоровых доноров были приготовлены ПВП-преципитаты в условиях 9,1% ПВП 35000±5000. Агрегированные мЛПНП осаждали путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 10 мин при 23°C. Супернатант тщательно декантировали, ПВП-преципитат 2 раза отмывали 9,1% раствором ПВП и ресуспендировали в 0,5 мл 0,01 М Трис-HCl-буфера, pH 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. В полученных ПВП-преципитатах определяли содержание холестерина, ТАГ и общих белков с использованием реактивов фирмы «ЭКОлаб», Россия. Полученные результаты представлены в таблице 3.
Как видно из данных, представленных в таблице 3, в ПВП-преципитате пулированной сыворотки больных ИБС содержание холестерина в 5,3 раз, а ТАГ - в 16 раз больше, чем в ПВП-преципитате из сыворотки здоровых доноров. Содержание общего белка в 1,3 раза выше в ПВП-преципитате больных.
Таким образом, наличие холестерина, ТАГ и белка в ПВП-преципитатах из сывороток свидетельствует о липопротеиновой природе агрегатов, образующихся в присутствии 9,1% ПВП 35000±5000. Повышенный уровень ПВП-преципитата, содержащего мЛПНП у больных с ИБС, подтверждает патологическую роль мЛПНП при атеросклеротическом процессе.
2+
2+
405
Пример 4. Определение связывания комплемента морской свинки преципитатами мЛПНП в зависимости от концентрации. К 10-160 мкл раствора ПВП-преципитата (4,3 мг/мл по белку), приготовленного из пулированной сыворотки больных с ИБС и разбавленного в соотношении 1:99 буфером VBS, добавляли 20 мкл раствора, разбавленного 1:19, комплемента морской свинки. Общий объем доводили до 0,3 мл буфером VBS и инкубировали 20 мин при 37°C. После предварительной инкубации добавляли 200 мкл эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика (ЕА) и инкубировали 30 мин при 37°C. После инкубации в каждую пробу добавляли по 2,5 мл холодного раствора 0,15 М NaCl, центрифугировали и определяли величину А супернатанта. Контрольная проба не содержала ПВП-преципитата. Пониженный гемолиз в опытных пробах по сравнению с контролем свидетельствовал о наличии связывания комплемента. Степень лизиса эритроцитов (У) определяли по формуле:
У(%)=[(X-R)/(H-R)×100],
412
где Н, R и Х-величины оптической плотности A в гемолитических системах контрольной пробы, в контроле спонтанного лизиса ЕА и в опытной пробе, соответственно. Степень связывания комплемента (ССК) определяли по формуле:
ССК(%)=100-У
Данные о степени связывания комплемента при разных концентрациях ПВП-преципитата приведены в таблице 4.
Как видно из данных, представленных в таблице 4, мЛПНП, преципитированные в растворе 9,1% ПВП 35000±5000, обладают комплемент-связывающей способностью, причем эффект является дозо-зависимым. При увеличении концентрации ПВП выше 9,1% в системе при увеличении количества преципитированного холестерина, ТАГ, белков, комплемент связывающая активность ПВП преципитатов не меняется (данные не приведены). Полученные результаты свидетельствуют о преципитации нативных ЛПНП при концентрации ПВП свыше 9,1%, которые не связывают и, соответственно, не активируют систему комплемента.
Пример 5. Определение уровня содержания мЛПНП в сыворотке крови у больных с атеросклерозом каротидных артерий, подтвержденных инструментальными методами. Проведены исследования содержания мЛПНП предлагаемым способом и прототипом в сыворотке 60 неврологических больных с атеросклерозом каротидных артерий, подтвержденных инструментальными методами. По предлагаемому способу к 50 мкл исследуемой сыворотки добавляли 500 мкл Буфера-1, тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин в 9-ти луночных кюветах биохимического анализатора FP-901 (Labsystem, Финляндия). В прототипе использовали 10% ПВП 12600±2700 (ООО «АК Синтвита», Россия) в 0,01 М Трис-HCl-буфере, содержащем 0,15 М NaCl, pH 7,4, как описано в работе [2]. Степень помутнения определяли турбидиметрически при длине волны 450 нм. В качестве бланка использовали пробы сыворотки с соответствующим количеством Буфера-К. Рассчитывали уровень содержания мЛПНП и ммЛПНП по формуле, приведенной выше. Полученные результаты по определению мЛПНП и ммЛПНП приведены в таблице 5.
Таким образом, из приведенных в таблице 5 данных видно, что только у 43% обследованных больных с атеросклерозом каротидных артерий, подтвержденных инструментальными методами, выявлен повышенный уровень ммЛПНП с использованием ПВП 12600±2700. В то время как определение атерогенности крови путем агрегации мЛПНП в условиях 9,1% ПВП 35000±5000 у этих же больных в 100% случаев дает положительный результат. Сравнительное исследование содержания мЛПНП в сыворотке и в плазме крови показало, что мЛПНП агрегируют как из сыворотки, так и из плазмы больных, что свидетельствует о специфичности процесса агрегации мЛПНП. Причем процент выявления мЛПНП как в сыворотке, так и в плазме крови одинаков, соответственно по 100% (таблица 5).
Предлагаемый способ отличается простотой, включает всего 2 операции: смешивание сыворотки или плазмы крови человека с раствором ПВП и регистрацию мутности. Для приготовления среды необходимы широко распространенные реактивы: ПВП, NaCl и трис-HCl. Способ позволяет регистрировать наличие мЛПНП непосредственно как в сыворотке, так и в плазме крови без предварительного ее фракционирования. Способ быстр (10 мин на 1 анализ), легко может быть адаптирован для биохимических автоматических анализаторов. Использование простого и быстрого в осуществлении способа определения атерогенности крови позволяет проводить скрининговые обследования с целью выявления наличия атеросклеротического процесса на доклинической стадии и диспансеризации населения. Формирование группы риска по атеросклерозу (повышенный уровень атерогенных мЛПНП) позволит установить индивидуальную причину патологического процесса и проводить этиотропную терапию. Исследования уровня содержания мЛПНП в крови больных с атеросклерозом в условиях клиники позволит контролировать эффективность проводимой терапии.
Литература
1. Шойбонов Б.Б. Экспресс-определение модифицированных липопротеинов // Кардиология Беларуси. - 2011. - Т.5, №18. - С.49-50.
2. Шойбонов Б.Б., Баронец В.Ю., Панченко Л.Ф., Кубатиев А.А. Способ экспресс-определения атерогенности крови // Патент РФ №2437098 от 20.12.2011 г. Бюл. №35.
3. Harats D., Shaish A., Geoege J., at al. Overexpression of 15-lipooxygenase in vascular endothelium accelerates early atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2000. - V.20. - P.2100-2105.
4. Huo Y., Zhao L., Hyman M.C., at al. Critical role of macrophage 12/15-lipooxygenese for atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice // Circulation. - 2004. - V.110. - P.2024-2031.
5. Ishigaki Y., Katagiri H., Gao J., at al. Impact of plasma oxidized low-density lipoprotein removal on atherosclerosis // Circulation. - 2008. - V.118. - P.75-83.
6. Itabe H., Mori M., Higashi Y., and Takano T. Minimally modified LDL is an oxidized LDL enriched with oxidized phosphatidylcholines // J Biochem. - 2003. - V.134. - P.459-465.
7. Kato R., Mori C., Kitazato K., at al. Transient increase in plasma oxidized LDL during the progression of atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2009. - V.29. - P.33-39.
8. Kuchibhotia S., Vanegas D., Kennedy D.J., at al. Absence of CD36 protects against atherosclerosis in ApoE knock-aut mice with no additional protection provided by absence of scavenger receptor AI/II // Cardiovasc Res. - 2008. - V.78. - P.185-196.
9. Manning-Tobin J.J., Moore K.J., Seimon T.A., at al. Loss of SA-A and CD36 activity reduces atherosclerotic lesion complexity without abrogating foam cell formation in hyperlipidemic mice // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2009. - V.29. - P.19-26.
10. Mehta J.L., Sanada N., Hu C.P., at al. Deletion of LOX-1 reduces atherogenesis in LDLR knockout mice fed high cholesterol diet // Circ Res. - 2007. - V.100. - P.1634-1642.
11. Rosenfeld M.E., Palinski W., Yla-Herttuala S. et al. Distribution of oxidation specific lipid-protein adducts and apolipoprotein В in atherosclerotic lesions of varying severity from WHHL rabbits // Atherosclerosis. - 1990. - V.10. - P.336-349.
12. Steinberg D. The LDL modification hypothesis of atherogenesis: an update // J. Lipid Res. - 2009. - V.50. - P.S 376-S381.
13. Tertov V.V., Orekhov A.N., Nikitina N.A. et al. Peritoneal macrophages: a model for detecting atherogenic potential in patiens' blood serum // Ann. Med. - 1989. - V.21(6). - P.455-459.
14. Tsimikas S. Oxidative biomarkers in the diagnosis and prognosis of cardiovascular disease // Am J Cardiol. - 2006. - V.98. - P.9P-17P.
15. Virella G., Derrick M.B., Pate V. et al. Development of capture assay for different modification of human low-density lipoprotein // Clinical and Diagnostic Lab. Immunol. - 2005. - V.12, №1. - P.68-75.
16. de Winther M.P.J., van Dijk K.W., Havekes L.M., and Hofker M.H. Macrophage scavenger receptor Class A: A multifunctional receptor in a Atherosclerosis // Artherioscler Thromb Vase Biol. - 2000. - V.20. - P.290-297.
17. Witztum J.L. and Steinberg D. The oxidative modification hypothesis of atherosclerosis: Does it hold for humans? // Trends Cardiovasc Med. - 2001. - V.11. - P.93-102.
Таблица 1
Влияние ПВП 35000±5000 на агрегацию мЛПНП в пулированной сыворотке крови больных с атеросклерозом коронарных сосудов в зависимости от концентрации
№
Сыв., мкл
10% ПВП, мкл
% ПВП в системе
% сыв. в системе
А<sub>450</sub>
1
50
100
6,7
33,3
0,176
2
50
200
8,0
20,0
0,298
3
50
300
8,6
14,3
0,426
4
50
400
8,9
11,1
0,569
5
50
500
9,1
9,1
0,58
6
50
600
9,2
7,7
0,513
7
50
700
9,3
6,7
0,501
8
50
800
9,4
5,9
0,356
9
50
900
9,5
5,3
0,358
Таблица 2
Агрегация мЛПНП в зависимости от времени инкубации и концентрации ПВП 35000±5000 в пулированной сыворотке крови больных с коронарным атеросклерозом
№
Сыв., мкл
10% ПВП, мкл
% ПВП в системе
А<sub>450</sub>
1 мин
10 мин
20 мин
30 мин
60 мин
1
50
100
6,7
0,133
0,176
0,170
0,169
0,170
2
50
200
8,0
0,184
0,298
0,22
0,218
0,214
3
50
300
8,6
0,236
0,426
0,295
0,285
0,281
4
50
400
8,9
0,313
0,569
0,428
0,411
0,411
5
50
500
9,1
0,386
0,58
0,584
0,579
0,593
6
50
600
9,2
0,369
0,513
0,63
0,638
0,68
7
50
700
9,3
0,248
0,501
0,707
0,687
0,83
8
50
800
9,4
0,246
0,356
0,600
0,730
0,846
9
50
900
9,5
0,180
0,358
0,575
0,680
0,816
Таблица 3
Содержание холестерина, ТАГ и общих белков в ПВП-преципитатах, приготовленных из сыворотки крови больных ИБС и здоровых доноров
Холестерин, мг/дл
ТАГ, мкМ/л
Белок, мг/мл
ПВП-преципитат из сыворотки больных ИБС
24,6
117
4,3
25,1
117
4,5
25,2
116
4,2
M±m
25,0±0,3
116,7±0,6
4,3±0,2
ПВП-преципитат из сыворотки доноров
5,0
7
3,4
4,2
10
2,9
4,5
5
3,2
M±m
4.7±0,4
7,3±2,5
3,2±0,3
Таблица 4
Степень связывания комплемента мЛПНП в ПВП-преципитате в зависимости от концентрации
ПВП-преципитат, мкл
0
10
20
40
80
160
сек, %
0
27
57
83
97
100
Таблица 5
Определение уровня ммЛПНП и мЛПНП в сыворотке или в плазме крови больных с инструментально подтвержденным атеросклерозом каротидных артерий
Сыворотки
n
ммЛПНП (>10ЕД)
мЛПНП, (>15ЕД)
больных с атеросклерозом каротидных артерий
60
26
60
Плазма крови больных с атеросклерозом каротидных артерий
20
8
20