СПОСОБ ЭФФЕКТИВНОЙ ОЧИСТКИ НЕЙТРАЛЬНЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО МОЛОКА (ОЧМ), ПОЛУЧАЕМЫХ ПРИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ, КОНЦЕНТРАТ ОЧМ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
PROCESS FOR EFFICIENT PURIFICATION OF NEUTRAL HUMAN MILK OLIGOSACCHARIDES (HMO) FROM MICROBIAL FERMENTATION, HMO CONCENTRATE AND USE THEREOF

Настоящее изобретение относится к простому способу очистки нейтральных олигосахаридов человеческого молока (сокращенно "ОЧМ"), получаемых при микробиологической ферментации. Способ включает комбинацию обработки в катионном ионообменном устройстве, обработки в анионном ионообменном устройстве и этапа нанофильтрации и/или электродиализа, что позволяет производить эффективную очистку больших количеств нейтральных ОЧМ, достигая высокой степени чистоты. В отличие от применяемых в настоящее время при ферментативном получении способов очистки нейтральных ОЧМ, предлагаемый способ позволяет получать ОЧМ без хроматографического разделения. Очищенные таким образом ОЧМ могут быть получены после проведения распылительной сушки в твердом состоянии в виде кристаллического материала, или же в виде стерильного фильтрованного концентрата. Полученные ОЧМ не содержат белков и рекомбинантного материала, образуемого используемыми рекомбинантными микробными штаммами, и, таким образом, очень хорошо подходят для использования при получении пищевых продуктов, медицинских пищевых продуктов и корма (например, корма для домашних животных).
Человеческое молоко представляет собой сложную смесь углеводов, жиров, белков, витаминов, минералов и микроэлементов. Наиболее преобладающая фракция представлена углеводами, которые могут быть дополнительно разделены на лактозу и более сложные олигосахариды. В то время как лактоза используется организмом младенца как источник энергии, сложные олигосахариды не подвергаются метаболизму. Фракция сложных олигосахаридов достигает 1/10 части от общего количества фракции углеводов и, вероятно, состоит из более чем 150 различных олигосахаридов. Наличие и концентрации этих сложных олигосахаридов специфичны для человека, и, таким образом, их нельзя найти в больших количествах в молоке других млекопитающих, таких, как, например, одомашненный молочный скот.
Присутствие таких сложных олигосахаридов в человеческом молоке уже давно известно, и их физиологические функции уже много лет являются предметом медицинских исследований (Gura, Т. (2014) Nature’s first functional food ("Первая функциональная природная пища"). Science 345(6198) 747-749). Для некоторых более распространенных олигосахаридов человеческого молока уже были идентифицированы их конкретные функции (Bode, L. (2012) Human milk oligosaccharides: every baby needs a sugar mama ("Олигосахариды человеческого молока: каждому младенцу нужна сахарная мама"). Glycobiology 22(9), 1147-1162.; Bode, L, Jantscher-Krenn, E. (2012) Structure-function relationships of human milk oligosaccharides ("Структурно-функциональные отношения олигосахаридов человеческого молока"). Adv. Nutr. 3(3) 383S-391S; Morrow A.L., Ruiz-Palacios G.M., Altaye M., Jiang X., Guerrero M.L., Meinzen-Derr J.K., Farkas Т., Chaturvedi P., Pickering L.K., Newburg D.S. (2004) Human milk oligosaccharides are associated with protection against diarrhea in breast-fed infants ("Связь олигосахаридов человеческого молока с защитой от диареи младенцев, вскармливаемых материнским молоком"). J. Pediatr. 145(3) 297-303).
Ограниченные запасы и сложности при получении чистых фракций индивидуальных олигосахаридов человеческого молока привели к созданию химических путей получения некоторых из этих сложных молекул. Однако синтез олигосахаридов человеческого молока химическим способом, ферментативным способом или брожением оказался затруднительным. По крайней мере, крупномасштабный синтез в количествах и с качеством, достаточным для пищевого употребления, не был возможен вплоть до наших дней. В частности, химические схемы, применяемые для синтеза олигосахаридов человеческого молока (например, 2'-фукозиллактозы; см. WO 2010/115935 А1) включают использование некоторых ядовитых химических веществ, которые могут загрязнять готовый продукт.
С учетом сложностей, связанных с химическим синтезом олигосахаридов человеческого молока, были созданы несколько ферментативных способов и ферментативных подходов (Miyazaki et al., (2010) Methods in Enzymol. 480, 511-524; Murata et al., (1999) Glycoconj. J. 16, 189-195; Baumgartner, F. et al., (2013) Microb. Cell Fact. 12, 40; Lee et al., (2012) Microb. Cell Fact. 11, 48; US 7521212 B1 или Albermann et al., (2001) Carbohydr. Res. 334(2) p 97-103). Однако в этих способах получают сложные смеси олигосахаридов, т.е. целевой продукт оказывается загрязненным исходным материалом, таким как лактоза, промежуточными соединениями биосинтеза и субстратами, таким как индивидуальные моносахариды и полипептиды и т.д.
Существующие в данной области техники способы выделения индивидуальных олигосахаридных продуктов из этих сложных смесей технически затруднены, а также экономически невыгодны для применения в пищевой промышленности. Для выделения дисахаридов лактозы или сахарозы из сложных смесей, таких как молочная сыворотка или патока, были разработаны промышленные способы, которые включают множество этапов кристаллизации. Недостатками указанных способов являются высокая сложность и низкие выходы.
Для очистки сложных олигосахаридов, получаемых в результате микробиологической ферментации, таких как некоторые олигосахариды человеческого молока, в настоящее время часто выбирают гель-проникающую (гель-фильтрационную) хроматографию. Недостатком гель-проникающей хроматографии является то, что масштаб этого способа нельзя с успехом увеличить, и, кроме того, он не подходит для непрерывной работы. Таким образом, гель-проникающая хроматография не является экономически выгодной и не позволяет получать определенные олигосахариды человеческого молока - такие как 2'-фукозиллактоза или лакто-N-тетраоза - в достаточных количествах и с качеством, необходимым для их добавления в пищу человека или для другого применения, такого как корм для животных (например, корм для домашних животных). Применение в качестве корма для животных или корма для домашних животных основано на том, что в молоке других млекопитающих имеются те же или аналогичные нейтральные сложные олигосахариды, что и в молоке человека (например, 2'-фукозиллактоза также обнаружена в молоке собак, свиней, шимпанзе) (Castanys-Munzo, Е., Martin, J.M & Prieto, Р.А. (2013) 2'-fucosyllactose: an abundant, genetically determined soluble glycan present in human milk ("2'-фукозиллактоза: распространенный, генетически определенный растворимый гликан, присутствующий в человеческом молоке"). Nutr. Rev. 71(12) 773-789).
Другая проблема заключается в использовании рекомбинантных штаммов (рекомбинантных бактериальных штаммов или штаммов дрожжей) в микробиологической ферментации, следствием чего является загрязнение продукта ферментации рекомбинантным материалом. Однако загрязнение рекомбинантной ДНК или белками в настоящее время является неприемлемым как для регулирующих органов, так и для потребителей. В частности, пределы обнаружения рекомбинантных ДНК молекул очень низки. В случае, если применяют обнаружение с использованием количественной ПЦР (полимеразная цепная реакция), которое в настоящее время считается золотым стандартом среди методик обнаружения, могут быть обнаружены даже единичные молекулы ДНК. Кроме того, присутствие белков означает риск развития аллергических реакций, и, таким образом, их следует эффективно удалять из целевого олигосахаридного продукта.
Электродиализ (ЭД) представляет собой методику, сочетающую диализ и электролиз, и может быть применен для разделения или концентрирования ионов в растворах с помощью их селективной миграции в электрическом поле через полупроницаемые мембраны. Первым промышленным применением электродиализа в начале 1960 годов была деминерализация сырной сыворотки для ее включения в смесь для детского питания. Последующие применения электродиализа включают регулирование рН таких напитков, как вино, виноградное сусло, яблочный сок и апельсиновый сок.
В настоящее время основными направлениям применения электродиализа являются обессоливание воды, непригодной для питья, с целью получения питьевой воды и деминерализация молочной сыворотки для производства детского питания.
Основной элемент электродиализа представляет собой электролитическую ячейку, состоящую из пары соединенных с генератором постоянного тока электродов, погруженных в электролит, в котором перемещаются ионы. Электрод, соединенный с положительным полюсом генератора постоянного тока, является анодом, а электрод, соединенный с отрицательным полюсом, называется катодом. Ток протекает через раствор электролита, что приводит к перемещению отрицательно и положительно заряженных ионов, соответственно, к аноду и катоду. Мембраны, применяемые в электродиализе, по существу представляют собой листы из пористых ионообменных смол, имеющих отрицательно или положительно заряженные группы, и, таким образом, называются катионными или анионными мембранами, соответственно. Ионообменные мембраны обычно изготавливают из полистирола, содержащего подходящую функциональную группу (такую как группа сульфоновой кислоты или четвертичная аммониевая группа для катионных или анионных мембран, соответственно), сшитого дивинилбензолом. В качестве электролита может быть использован хлорид натрия или ацетат натрия, пропионат натрия и т.д. Затем собирают пакет для электродиализа, в котором анионные и катионные мембраны располагаются параллельно, как в фильтр-прессе, между двумя электродными блоками, так что поток, из которого удаляют ионы, надежно отделен от потока, обогащаемого ионами (эти два раствора также называются разбавленным раствором (поток, из которого удаляют ионы) и концентрированным раствором (поток, обогащаемый ионами). Основной частью способа электродиализа является пакет мембран, который состоит из нескольких анионообменных и катионообменных мембран, разделенных спейсерами и установленных между двумя электродами. При приложении постоянного электрического тока анионы и катионы мигрируют через мембраны по направлению к электродам, в результате чего образуется разбавленный (обессоленный) и концентрированный поток.
Обычно размер пор используемых мембран достаточно мал, что препятствует диффузии продукта из разбавленного раствора в поток концентрированного раствора под действием большой разности концентраций между двумя этими потоками. После отделения продукта от биомассы, белки и, в особенности, рекомбинантные молекулы ДНК (в размере полных геномов) должны быть количественно отделены от целевого продукта. Электродиализ таких крупных молекул (по сравнению с размером молекул ОЧМ), если он вообще возможен, требовал бы больших затрат времени и обязательно сопровождался бы значительным уносом целевого продукта из разбавленного раствора в концентрированный раствор.
Диафильтрация представляет собой способ, который включает добавление к раствору свежей воды для "вымывания" или удаления компонентов, способных проникать через мембрану. Таким образом, диафильтрация может быть применена для разделения компонентов в соответствии с их молекулярным размером с помощью подходящих мембран, на которых один или более видов молекул эффективно удерживается, а другие способны проникать через мембрану. В частности, диафильтрация с помощью нанофильтрационой мембраны подходит для отделения низкомолекулярных соединений от солей. В общем, у нанофильтрационных мембран имеется диапазон пропускания по молекулярной массе, составляющий от 150 до 300 Дальтон. В настоящее время нанофильтрацию (НФ) широко используют в молочной промышленности для концентрации и деминерализации молочной сыворотки. Нанофильтрацию уже применяют для обогащения фракции олигосахаридов человеческого молока, получаемых из человеческого молока. При таком подходе нанофильтрацию применяют в комбинации с ферментативным разложением лактозы с целью отделения фракции ОЧМ от лактозы молока (Sarney D.B., Hale, С., Frankel, G. & Vulfson, E.N. (2000) A novel approach to the recovery of biological active oligosaccharides from milk using a combination of enzymatic treatment and nanofiltration ("Новый подход к извлечению биологически активных олигосахаридов из молока с помощью комбинации ферментативной обработки и нанофильтрации"). Biotechnol. Bioeng. 69, 461-467.
В разработанном способе эффективной очистки до пищевой чистоты олигосахаридов человеческого молока, получаемых в результате микробиологической ферментации, нанофильтрацию применяют для концентрации целевого продукта, а также для удаления солей, способных проникать через мембрану.
Исходя из предшествующего уровня техники, техническая задача состоит в создании нового способа получения больших количеств нейтральных ОЧМ высокой чистоты с высокими выходами.
Техническая задача решается посредством способа согласно п. 1, олигосахарида человеческого молока (ОЧМ) по п. 15 и применения ОЧМ по п. 19 формулы изобретения. В зависимых пунктах формулы изобретения раскрыты предпочтительные воплощения.
Настоящее изобретение относится к осуществляемому в периодическом режиме или в непрерывном режиме способу очистки нейтральных олигосахаридов человеческого молока (ОЧМ) от ферментативного бульона, полученного при микробиологической ферментации, с получением очищенного раствора, включающего нейтральный ОЧМ с чистотой ≥80%. Ферментативный бульон содержит нейтральный ОЧМ, биомассу, компоненты среды и загрязняющие вещества. Чистота нейтрального ОЧМ в ферментативном бульоне составляет <80%.
При осуществлении способа ферментативный бульон подвергают следующим этапам очистки:
i) отделение биомассы от ферментативного бульона,
ii) обработку в катионном ионообменном устройстве для удаления положительно заряженного материала,
iii) обработку в анионном ионообменном устройстве для удаления отрицательно заряженного материала,
iv) этап нанофильтрации (включающий или состоящий из концентрирования и/или диафильтрации нейтрального ОЧМ) и/или этап электродиализа (в частности, для удаления солей и других низкомолекулярных соединений).
Загрязняющие вещества, присутствующие в не содержащем клеток ферментативном бульоне, представляют собой, например, другие олигосахариды, отличные от целевого нейтрального ОЧМ, такие как одновалентные и двухвалентные соли, аминокислоты, полипептиды, белки, органические кислоты, нуклеиновые кислоты и т.д. Чистота целевого нейтрального ОЧМ в очищенном растворе может составлять ≥80%.
Заявителем было обнаружено, что способ очистки согласно изобретению позволяет производить эффективную очистку нейтральных ОЧМ, получаемых при микробиологической ферментации, в результате чего получают ОЧМ с чистотой, достаточной для использования при изготовлении пищевых продуктов и кормов. Кроме того, способ отличается высокой экономичностью, поскольку не включает этапа хроматографического разделения. Кроме того, было обнаружено, что чистота ≥80% достигается независимо от того, применяют ли при выполнении этапа (iv) операцию электродиализа или операцию нанофильтрации или выполняют обе эти операции последовательно.
Одним из преимуществ способа согласно настоящему изобретению является то, что получаемые целевые нейтральные ОЧМ не содержат ДНК и белков рекомбинантного штамма, используемого для микробиологической ферментации. В особенности обработка в катионном ионообменном устройстве (этап ii) позволяет удалять положительно заряженный материал, такой, как, например, положительно заряженные белки. Следовательно, способ согласно изобретению позволяет получать ОЧМ, содержащие меньше положительно заряженных загрязняющих веществ по сравнению с традиционными схемами очистки, известными в уровне техники, в которых не применяют катионообменную обработку. Также было обнаружено, что после пропускания ферментативного бульона, отделенного от биомассы (предпочтительно ультрафильтрацией), через катионное ионообменное устройство (в протонированной форме), получают стабильный раствор, который можно хранить при комнатной температуре или при охлаждении в течение нескольких недель. Кроме того, полученный нейтральный ОЧМ не содержит рекомбинантного материала, как было показано количественной ПЦР с проведением до 50 амплификационных циклов. Кроме того, продукт, полученный способом согласно изобретению, отличается низким содержанием или отсутствием белков.
Кроме того, очистка нейтральных ОЧМ согласно изобретению является высокоэффективной и позволяет получать ранее недостижимые выходы >70% (возможно >75%) очищенного ОЧМ (рассчитываемые, начиная от этапа получения не содержащей клеток среды для ферментации до концентрата ОЧМ).
Таким образом, предложен гибридный способ, включающий этапы отделения биомассы, ионного обмена и этап нанофильтрации и/или электродиализа, и предпочтительно дополнительно включающий обработку активированным углем, предназначенный для эффективного выделения нейтральных ОЧМ высокой чистоты, не содержащих рекомбинантного генетического материала, эндотоксинов и белков, из процессов ферментации с использованием рекомбинантных ферментационных штаммов. Способ согласно изобретению позволяет удобным и экономичным образом получать большие количества высококачественных олигосахаридов человеческого молока.
Нейтральные ОЧМ могут быть очищены от ферментативного бульона, полученного при микробиологической ферментации с использованием рекомбинантного микроорганизма, предпочтительно бактерий или дрожжей, более предпочтительно рекомбинантного микроорганизма, выращенного в среде с определенным химическим составом. Возможно, биомассу, отделенную в этапе (i), направляют рециклом в этап микробиологической ферментации.
В другом предпочтительном воплощении способа согласно изобретению чистота нейтрального ОЧМ в ферментативном бульоне составляет ≤70%, ≤60%, ≤50%, ≤40%, ≤30%, ≤20%, ≤10% или ≤5%, и/или очищенный раствор содержит нейтральный ОЧМ с чистотой ≥85%, предпочтительно ≥90%.
В другом предпочтительном воплощении способа согласно изобретению выход нейтрального ОЧМ составляет >70% (возможно >75%), и/или очищенный раствор не содержит ДНК, белков и/или рекомбинантного генетического материала.
В другом предпочтительном воплощении способа согласно изобретению нейтральный ОЧМ выбран из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, 2',3-дифукозиллактозы, лакто-N-триозы II, лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-фукопентаозы I, лакто-N-неофукопентаозы, лакто-N-фукопентаозы II, лакто-N-фукопентаозы III, лакто-N-фукопентаозы V, лакто-N-неофукопентаозы V, лакто-N-дифукогексаозы I, лакто-N-дифукогексаозы II, 6'-галактозиллактозы, 3'-галактозиллактозы, лакто-N-гексаозы и лакто-N-неогексаозы.
В особенно предпочтительном воплощении способа согласно изобретению, нейтральный ОЧМ представляет собой 2'-фукозиллактозу.
В другом предпочтительном воплощении способа согласно изобретению отделение биомассы от ферментативного бульона производят
a) ультрафильтрацией, предпочтительно отделением биомассы и материалов с молекулярной массой >500 кДа, более предпочтительно >150 кДа; и/или
b) фильтрованием через перекрестноточный фильтр, предпочтительно имеющий границу пропускания ≤100 кДа, более предпочтительно границу пропускания ≤10 кДа, еще более предпочтительно границу пропускания ≤5 кДа;
причем этап а) предпочтительно выполняют перед этапом b).
В другом предпочтительном воплощении способа согласно изобретению по меньшей мере один из этапов очистки (ii)-(v) способа согласно изобретению повторяют по меньшей мере один раз при осуществлении способа.
В другом предпочтительном воплощении способа согласно изобретению ферментативный бульон по меньшей мере один раз подвергают обработке активированным углем после проведения по меньшей мере одного из этапов очистки (i)-(iv) для адсорбции на активированном угле окрашивающего материала и более крупных олигосахаридов. С помощью этого дополнительного этапа очистки ферментативного бульона, из ферментативного бульона могут быть удалены окрашивающие материалы и более крупные олигосахариды.
Способ согласно изобретению может характеризоваться тем, что
a) после проведения по меньшей мере одного из этапов очистки (i)-(iv); или
b) после проведения по меньшей мере одной обработки активированным углем для адсорбции придающего цвет материала и более крупных олигосахаридов активированным углем; или
c) перед проведением этапа концентрации, который выполняют после проведения по меньшей мере одного из этапов очистки (i)-(iv);
раствор, включающий нейтральный олигосахарид человеческого молока, подвергают диафильтрации и/или концентрированию. Предпочтительно, указанный раствор подвергают диафильтрации и/или концентрированию с помощью нанофильтрационной мембраны, более предпочтительно помощью нанофильтрационной мембраны, имеющей ограничение по размерам ≤20 А. Наиболее предпочтительно, раствор подвергают диафильтрации до тех пор, пока его проводимость не составит ≤15 мСм/см, предпочтительно ≤10 мСм/см, более предпочтительно ≤5 мСм/см.
Было обнаружено, что диафильтрация с использованием нанофильтрации является эффективной предварительной обработкой, которая позволяет удалять значительные количества загрязняющих веществ перед проведением электродиализа раствора, содержащего ОЧМ. Кроме того, также было обнаружено, что после проведения этапа ультрафильтрации нанофильтрационная обработка позволяет эффективно удалять низкомолекулярные загрязняющие вещества, причем указанное удаление благоприятствует концентрированию и деминерализации раствора ОЧМ перед проведением ионообменной обработки. Применение нанофильтрационных мембран для концентрации и диафильтрации при очистке олигосахаридов человеческого молока приводит к снижению затрачиваемой энергии и к снижению технологических затрат, а также к более высокому качеству продукта, обусловленному пониженным воздействием высоких температур, которое может приводить к протеканию реакций Майяра (Maillard) и альдольных реакций.
Перед этапом i) может быть выполнен этап обработки ферментативного бульона глюкозидазой, предпочтительно обработки β-глюкозидазой, где указанную обработку предпочтительно выполняют следующим образом:
a) добавлением штамма микроорганизма, способного экспрессировать один или более фермент(ов) гликозидаза, подходящих для разложения нежелательных промежуточных соединений, субстратов и/или побочных продуктов синтеза олигосахарида; и/или
b) применением ферментационного штамма, который экспрессирует один или более фермент(ов) гликозидаза, предпочтительно добавлением в ферментативный бульон индуцирующего агента и/или изменением температуры ферментативного бульона; и/или
c) добавлением одной или более гликозидаз(ы), предпочтительно по меньшей мере β-глюкозидазы, в ферментативный бульон в виде неочищенного фермента или в виде очищенного фермента.
В другом предпочтительном воплощении способа согласно изобретению после проведения по меньшей мере одного из этапов очистки (i)-(iv), предпочтительно после проведения этапа очистки (iv), ферментативный бульон концентрируют вакуумным испарением или с помощью обратного осмоса или нанофильтрации (например, нанофильтрации на нанофильтрационной мембране, имеющей ограничение по размерам ≤20 )
a) до концентрации ≥100 г/л, предпочтительно ≥200 г/л, более предпочтительно ≥300 г/л; и/или
b) при температуре <80°C, предпочтительно <50°C, более предпочтительно от 20°C до 50°C, еще более предпочтительно от 30°C до 45°C, наиболее предпочтительно от 35°C до 45°C (особенно подходящей для вакуумного испарения или обратного осмоса); и/или
с) при температуре <80°C, предпочтительно <50°C, более предпочтительно от 4°C до 40°C (особенно подходящей для нанофильтрации).
В другом предпочтительном воплощении способа согласно изобретению очищенный раствор подвергают фильтрованию в стерильных условиях, и/или из раствора удаляют эндотоксины, предпочтительно фильтрованием очищенного раствора через фильтр с ограничением по массе, составляющим 3 кДа.
В другом предпочтительном воплощении способа согласно изобретению раствор, содержащий нейтральный ОЧМ, подвергают электродиализу для дополнительного удаления заряженных материалов, таких как соли одно- и двухвалентных ионов.
В другом предпочтительном воплощении способа согласно изобретению очищенный раствор концентрируют до концентрации >1,5 М и охлаждают до температуры <25°, более предпочтительно <8°C, получая кристаллический нейтральный ОЧМ.
В другом предпочтительном воплощении способа согласно изобретению очищенный раствор подвергают распылительной сушке, в частности, подвергают распылительной сушке при концентрации нейтрального ОЧМ, составляющей от 20 до 60 (масс/об.), предпочтительно от 30 до 50 (масс/об.), более предпочтительно от 35 до 45 (масс/об.), при температуре сопла, составляющей от 110 до 150°C, предпочтительно от 120 до 140°C, более предпочтительно от 125 до 135°C, и/или при температуре выпускного отверстия, составляющей от 60 до 80°C, предпочтительно от 65 до 70°C.
Кроме того, настоящее изобретение относится к нейтральному олигосахариду человеческого молока (ОЧМ), который может быть получен способом согласно изобретению.
В одном из предпочтительных воплощений ОЧМ присутствует в стерильном фильтрованном концентрате, например, стерильном концентрате, содержащим полученный нейтральный ОЧМ, концентрация которого составляет >30% (масс/об.), более предпочтительно >40% (масс/об.).
В другом предпочтительном воплощении, ОЧМ подвергнут распылительной сушке или кристаллизации.
В другом предпочтительном воплощении, ОЧМ выбран из группы, состоящей из 2-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, 2',3-дифукозиллактозы, лакто-N1-триозы II, лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-фукопентаозы I, лакто-N-неофукопентаозы, лакто-N-фукопентаозы II, лакто-N-фукопентаозы III, лакто-N-фукопентаозы V, лакто-N-неофукопентаозы V, лакто-N-дифукогексаозы I, лакто-N-дифукогексаозы II, 6'-галактозиллактозы, 3'-галактозиллактозы, лакто-N-гексаозы и лакто-N-неогексаозы.
В особенно предпочтительном воплощении ОЧМ представляет собой 2'-фукозиллактозу.
В другом предпочтительном воплощении ОЧМ
a) имеет проводимость 300 г/л раствора, составляющую менее 1 мСм/см;
b) не содержит рекомбинантного материала ДНК, возможно не содержит никакой ДНК; и/или
c) не содержит белков, полученных из рекомбинантных микроорганизмов, возможно не содержит никаких белков.
Другое предпочтительное воплощение относится к применению ОЧМ в медицине, предпочтительно к применению в профилактике или лечении желудочно-кишечного расстройства.
Кроме того, настоящее изобретение включает применение ОЧМ согласно изобретению в качестве добавки к пище, предпочтительно в качестве добавки к пище человека и/или к корму для домашних животных, более предпочтительно в качестве добавки к пище младенцев.
Предмет изобретения более подробно рассмотрен ниже в описании примеров, сопровождаемом прилагаемыми графическими материалами; однако указанный предмет изобретения не ограничен рассмотренными конкретными воплощениями.
На Фиг. 1 представлена схема предпочтительного воплощения способа согласно настоящему изобретению для очистки 2’-фукозиллактозы от ферментативного бульона, который включает следующие этапы: ультрафильтрацию, обработку в катионном и анионном ионообменном устройстве, обработку активированным углем, нанофильтрацию, электродиализ и концентрирование.
На Фиг. 2 представлена схема другого предпочтительного воплощения способа согласно настоящему изобретению для очистки 2'-фукозиллактозы от ферментативного бульона, который включает следующие этапы: ультрафильтрацию, нанофильтрацию, обработку в катионном и анионном ионообменном устройстве, обработку активированным углем, электродиализ и концентрирование.
На Фиг. 3 представлена схема другого предпочтительного воплощения способа согласно настоящему изобретению для очистки 2'-фукозиллактозы от ферментативного бульона, который включает следующие этапы: ультрафильтрацию, обработку в катионном и анионном ионообменном устройстве, нанофильтрацию, обработку активированным углем, электродиализ и концентрирование.
Пример 1
Очистка 2'-фукозиллактозы, полученной при Ферментации с использованием рекомбинантного микробного продуктивного штамма I
4
2
4
2
4
2
4
В среде, содержащей определенные соли, проводили ферментационное получение 2'-фукозиллактозы при периодической загрузке питательного материала, применяя рекомбинантный штамм Е. coli, синтезирующий 2'-фукозиллактозу (E. coli BL21(DE3) ΔlacZ), содержащий интегрированную в геном 2-фукозилтрансферазу, кодируемую геном wbgL (см ЕР 111151571.4), и имеющий дополнительную копию Е. coli lacY, manВ, manС, gmd и fcl, под контролем сильного конститутивного активатора тетрациклина, содержащего функциональный оперон gal, включающий гены galM, galK, galT и galE. Среда, содержащая определенные соли, включала 7 г/л NHHPO, 7 г/л КНРО, 2 г/л КОН, 0,37 г/л лимонной кислоты, 1 мл/л антивспенивателя (Struktol J673, Schill + Seilacher), 1 мМ CaCl, 4 мМ MgSO, микроэлементы и 2% глицерина, который являлся источником углерода.
2
2
2
2
2
2
4
2
2
4
2
2
3
4
2
Микроэлементы состояли из 0,101 г/л нитрилтриуксусной кислоты, рН 6,5, 0,056 г/л цитрата аммония-железа (III), 0,01 г/л MnCl⋅4HO, 0,002 г/л CoCl⋅6HO, 0,001 г/л CuCl⋅2HO, 0,002 г/л борной кислоты, 0,009 г/л ZnSO⋅7HO, 0,001 г/л NaMoO⋅2HO, 0,002 г/л NaSeO, 0,002 г/л NiSO⋅6HO.
4
Загрузка глицерина состояла из 800 г/л глицерина, 2,64 г/л MgSO и 4 мл/л раствора микроэлементов. Для образования 2'-фукозиллактозы добавляли 216 г/л лактозы. Величину рН регулировали добавлением аммиачного раствора (25% об./об.). Партию ферментируемой смеси культур провал и при 30°C при постоянной подаче воздуха и перемешивании в течение 90 часов. Спустя 90 часов после начала ферментации основная часть добавленной лактозы была превращена в 2'-фукозиллактозу. Для удаления лактозы, все еще присутствующей в жидкости над ферментационным осадком, спустя 90 часов после начала ферментации, в емкость для ферментации добавляли второй бактериальный штамм.
Добавляемый второй бактериальный штамм был генетически идентичен первому используемому бактериальному штамму, но при этом отличался лишь экспрессией интегрированной в геном бета-галактозидазы. Инкубация с добавленным вторым бактериальным штаммом приводила к исчезновению остаточной лактозы в течение 5 часов. На 1 литр ферментативного бульона добавляли приблизительно 10 мл исходной культуры второго бактериального штамма, экспрессирующего бета-галактозидазу.
Затем биомассу отделяли от ферментативной среды ультрафильтрацией на перекрестноточном фильтре с ограничением по массе 10 кДа (Microdyn Nardir).
3
+
Получали приблизительно 1 м не содержащей клеток ферментативной среды, которая содержала 42 г/л 2'-фукозиллактозы. Для удаления положительно заряженных загрязняющих веществ не содержащую клеток ферментативную среду затем пропускали через ионообменное устройство, содержащее сильную катионообменную смолу (Lewatit S 6368 A (Lanxess) в Н форме, объем ионообменного слоя составлял 100 л). Затем величину рН полученного раствора доводили до рН=7 добавлением 2 М раствора гидроксида натрия.
-
Затем (без промедления) раствор пропускали через ионообменную колонку с анионообменной смолой (объем ионообменного слоя составлял 100 л). Используемая сильная анионообменная смола Lewatit S 2568 (Lanxess) находилась в хлоридной (Cl) форме. Полученный раствор вновь нейтрализовали до рН=7. Полученный таким образом раствор затем подвергали диафильтрации с использованием нанофильтрационной мембраны Alfa-Laval NF99HF и шести объемов стерильной деионизированной воды. Раствор дополнительно концентрировали с помощью нанофильтрационной мембраны, получая раствор 2'-фукозиллактозы концентрацией 200 г/л с проводимостью 7 мСм/см.
Затем концентрированный раствор 2'-фукозиллактозы обрабатывали активированным углем для удаления окрашивающего материала, такого как продукты реакции Майяра и продукты альдольной реакции. В качестве активированного угля применяли 20 г Norit GAC EN на 1 л концентрированного раствора 2-фукозиллактозы, получая практически обесцвеченный раствор.
Полученный таким образом концентрированный раствор 2'-фукозиллактозы затем подвергали электродиализу до достижения величины 0,3 мСм/см, применяя устройство для электродиализа PC-Cell BED 1-3 (PC-Cell, Heusweiler, Германия), снабженное пакетом мембран PC-Cell Е200. Указанный пакет содержал следующие мембраны: катионообменную мембрану СЕМ: PC SK и анионообменную мембрану АЕМ: PcAcid60, имеющие ограничение по массе, составляющее 60 Да. В способе электродиализа в качестве электролита использовали 0,025 М раствор сульфаминовой кислоты (амидосульфоновой кислоты).
+
-
Полученный раствор концентрировали в вакууме при 40°C, получая 45%-ный раствор 2-фукозиллактозы. Концентрированный раствор затем снова обрабатывали на ионообменной смоле Lewatit S 6368 A (Lanxess) в Na форме (объем слоя применяемого ионообменного устройства составил 10 л) и затем нейтрализовали на анионообменной смоле Lewatit S 2568 (Lanxess), находящейся в Cl форме (объем слоя применяемого ионообменного устройства составил 10 л).
Полученный раствор 2-фукозиллактозы затем обрабатывали активированным углем (Norit DX1 Ultra). На 1 л 45%-ного раствора 2'-фукозиллактозы брали 30 г активированного угля.
Затем раствор вновь подвергали электродиализу до достижения проводимости менее 0,3 мСм/см.
Затем раствор подвергали стерильному фильтрованию пропусканием его через фильтр с ограничением по массе, составляющим 3 кДа (модуль для ультрафильтрации из полого волокна Pall Microza SEP-2013, Pall Corporation, Dreieich).
Часть полученного раствора 2'-фукозиллактозы подвергали распылительной сушке для последующего анализа.
6
13
Для регистрации ЯМР спектров высушенный распылительной сушкой продукт растворяли в гексадейтеродиметилсульфоксиде (ДМСО-d). В протонных и С спектрах наблюдали следующие характеристические химические сдвиги:
1
6
Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) δ 6,63 (d, J=6,5 Гц, 1Н), 6,28 (d, J=4,7 Гц, 1Н), 5,21 (d, J=2,4 Гц, 1Н), 5,19 (d, J=2,4 Гц, 1Н), 5,01 (d, J=2,2, 2Н), 4,92 (d, J=5,0 Гц, 1Н), 4,89 (dd, J=4,6, 1,3 Гц, 2Н), 4,78 (d, J=5,3 Гц, 1Н), 4,74 (d, J=5,1 Гц, 1Н), 4,63 (m, 6Н), 4,53 (t, d, J=5,5, 1H), 4,46 (d, J=5,2 Гц, 1H), 4,44 (d, J=5,0 Гц, 1H), 4,38-4,26 (m, 5H), 4,23 (d, J=0,9, 1H), 4,05 (d, J=0,9, 1H), 4,00 (quin, J=3,3, 1H), 3,68-3,60 (m, 7H), 3,59-3,50 (m, 13H), 3,50-3,37 (m, 6H), 3,24 (dt, J=8,8, 2,2 Гц, 1H), 3,14 (m, 2H), 2,96 (td, J=8,4, 4,7 Гц, 1H), 1,04 (d, J=6,1 Гц, 3H), 1,03 (d, J=6,1 Гц, 3H),
13
6
C ЯМР (126 МГц, ДМСОО-d) δ 100,99, 100,85, 100,35, 100,25, 96,59, 92,02, 78,13, 77,78, 77,16, 77,01, 75,27 75,05, 74,67, 73,70, 72,33, 71,62, 71,56, 70,91, 69,90, 69,64, 68,75, 68,16, 66,33, 60,17, 59,82, 59,67, 16,37, 16,36.
Было обнаружено, что полученные значения химических сдвигов согласуются со структурой 2'-фукозиллактозы.
Следуя данному протоколу, можно получить 45%-ный концентрат 2'-фукозиллактозы с чистотой 94,5% (по данным ВЭЖХ анализа). Основными загрязняющими веществами были 3'-фукозиллактоза (1,8%), дифукозиллактоза (2,9%) и лактоза (0,3%).
Выход после очистки составил приблизительно 70%.
Важно отметить, что в 10 г замороженного материала даже при проведении 50 циклов количественной ПЦР не было обнаружено никакого рекомбинантного материала. Количество белка в лиофилизированном полученном материале определяли с помощью наноанализа Брэдфорда (Roth, Karlsruhe, Германия), и оно составило <50 мкг/г. Согласно данным анализов, общее количество золы составило 0,19%. Концентрация тяжелых металлов (мышьяк, кадмий, свинец и ртуть) составила менее 0,1 мкг/г материала. Согласно данным анализов, концентрации эндотоксинов составили <0,005 ЕЭ/мл концентрата 2'-фукозиллактозы.
Пример 2
Очистка 2'-фукозиллактозы, полученной при ферментации с использованием рекомбинантного микробного продуктивного штамма II
3
1 м среды, полученной в результате микробиологической ферментации и содержащей 2-фукозиллактозу в концентрации 47 г/л, фильтровали через перекрестноточный фильтр с ограничением по массе, составляющим 100 кДа (Microdyn Nadir), получая не содержащую клеток ферментативную среду.
В качестве ферментативной среды использовали следующую среду:
4
2
4
2
4
4
2
основные компоненты среды: 30 г/л глицерина, 7 г/л NHHPO, 7 г/л KHPO, 0,3 г/л цитрата, 2 г/л КОН, 2 г/л MgSO⋅7HO;
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
4
2
4
2
2
3
микроэлементы: 20 мг/л CaCl⋅6НО, 101 мг/л нитрилтриуксусной кислоты, 56 мг/л цитрата аммония-железа, 9,8 мг/л MnCl⋅4НО, 1,6 мг/л CoCl⋅6HO, 1 мг/л CuCl⋅2HO, 1,6 мг/л HBO, 9 мг/л ZnSO⋅7HO, 1,2 мг/л Na2MoO⋅2HO, 1,2 мг/л NaSeO;
питательные вещества: глицерин и лактоза.
+
-
Для удаления положительно заряженных загрязняющих веществ, не содержащую клеток ферментативную среду затем пропускали через ионообменное устройство, содержащее катионообменную смолу (Lewatit S 6368 A (Lanxess)) в Н форме (объем ионообменного слоя составлял 100 л). Затем величину рН полученного раствора доводили до рН=7 добавлением 2 М раствора гидроксида натрия. Затем раствор без промедления пропускали через ионообменную колонку (объем ионообменного слоя составлял 100 л) с сильной анионообменной смолой Lewatit S 2568 (Lanxess) в хлоридной (Cl) форме. Полученный раствор вновь нейтрализовали до рН=7. Полученный таким образом раствор затем подвергали диафильтрации (с использованием 10 объемов стерильной деионизированной воды) и концентрировали с помощью нанофильтрационной мембраны (Alfa-Laval NF99HF), получая раствор 2'-фукозиллактозы с концентрацией 200 г/л и с проводимостью 7 мСм/см.
Концентрированный раствор 2'-фукозиллактозы затем обрабатывали активированным углем, используя 20 г Norit GAC EN на 1 л концентрированного раствора 2'-фукозиллактозы. К профильтрованному раствору 2'-фукозиллактозы добавляли 40 г/л активированного угля Norit DX1 Ultra. Затем раствор выдерживали с активированным углем при 4°C в течение приблизительно 18 часов. Спустя 18 часов активированный уголь удаляли из раствора 2-фукозиллактозы фильтрованием.
Затем раствор подвергали электродиализу до достижения проводимости 0,3 мСм/см, применяя устройство для электродиализа PC-Cell BED 1-3 (PC-Cell, Heusweiler, Германия), снабженное пакетом мембран PC-Cell Е200. Указанный пакет содержал следующие мембраны: катионообменную мембрану СЕМ: PC SK и анионообменную мембрану АЕМ: PcAcid60, имеющие ограничение по массе, составляющее 60 Да. В способе электродиализа в качестве электролита использовали 0,025 М раствор сульфаминовой кислоты (амидосульфоновой кислоты).
-
Затем полученный раствор концентрировали, получая 40%-ный раствор 2'-фукозиллактозы. Полученный раствор 2'-фукозиллактозы затем пропускали через ионообменную смолу Lewatit S 2568 (Lanxess) в Cl форме (объем слоя 10 л) и обрабатывали активированным углем (Norit DX1 Ultra) при 8°C в течение 18 часов. Затем раствор подвергали стерильному фильтрованию пропусканием его через фильтр с ограничением по массе, составляющим 3 кДа (модуль для ультрафильтрации из полого волокна Pall Microza SEP-2013, Pall Corporation, Dreieich), и подвергали распылительной сушке с помощью сушилки для распылительной сушки NUBILOSA LTC-GMP (NUBILOSA, Konstanz, Германия).
Следуя имеющемуся протоколу, можно получить 2'-фукозиллактозу с чистотой 94% (по данным ВЭЖХ анализа). Основными загрязняющими веществами были 3'-фукозиллактоза (1,8%), дифукозиллактоза (3,2%) и лактоза (0,2%). Выход после очистки составил приблизительно 70%.