Способ оценки состояния микробиоты кишечника
METHOD FOR ASSESSING OF INTESTINAL MICROBIOTA STATE

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к биохимии, и может быть использовано для оценки состояния микробиоценоза кишечника и прогнозирования воспалительного процесса в нем.
Известно, что основой воспалительного процесса в кишечнике являются продукты жизнедеятельности микрофлоры. Дисбактериоз кишечника рассматривается как клинико-лабораторный синдром, возникающий при ряде заболеваний и клинических ситуаций и характеризующийся изменением качественного и/или количественного состава нормальных микроорганизмов, их избыточным или недостаточным ростом, следствием чего являются метаболические, иммунологические нарушения и различные клинические проявления.
Известен способ оценки воспалительного процесса путем определения С - реактивного белка (СРБ) в сыворотке крови. Определение СРБ основано на его способности образовывать иммунные комплексы с антителами, содержащимися в специфической сыворотке. Это приводит к увеличению абсорбции раствора, которую измеряют на спектрофотометре при длине волны 340 нм. (Камышников B.C. - Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной технике М.: МЕДпресс-информ., - 2004. - с. 208).
В норме содержание СРБ в сыворотке крови составляет 0,06-5,0 мг/л. Уровень 5-10 мг/л - признак вялотекущего воспалительного процесса, связанного с высоким риском сердечно-сосудистых заболеваний и их осложнений, таких как инфаркт миокарда, инсульт (Дати Ф., Метцманн Э. Белки. Лабораторные тесты и клиническое применение. М.: Лабо-ра, 2007. - с 63-64).
Недостатком данного способа является отсутствие специфичности СРБ, т.к. он повышается при инфекциях, травмах, опухолях, ожогах, активном ревматоидном процессе и не отражает состояние микробиоценоза кишечника. Следует так же учитывать, что высокая вариабельность СРБ зависит от многих факторов, как в сторону увеличения - ожирение, понижение уровня ЛПВП, повышение уровня триглицеридов, курение, так и уменьшения - снижение массы тела, прием лекарственных препаратов - аспирина, производных никотиновой кислоты, статинов, фибратов.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является определение метаболических нарушений в организме больного при эндогенной интоксикации путем определения окисленных метаболитов триптофана - токсических продуктов, которые вызывают глубокие, вплоть до поражения различных органов и систем, изменения (Пат. 2249219 Российская Федерация, МПК G01N 33/68, G01N 30/90. Способ определения окисленных метаболитов триптофана при эндогенной интоксикации / Горохова В.Г., Кузнецова Э.Э., Горохов А.Г., Рунович А.А.; заявитель и патентообладатель НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН. - №2003107548/15; заявл. 19.03.2003; опубл. 27.03.2005, Бюл. №9).
Известный способ осуществляют следующим образом. У пациента берут пробу венозной крови, которую центрифугируют, супернатант наносят на бумажный фильтр и высушивают. Затем фильтр погружают в раствор, содержащий ароматический альдегид, ацетон и концентрированную соляную кислоту, взятые в соотношении 70:5:1, выдерживают в течение 2-3 минут. После чего повторно высушивают и по интенсивности и цветовым оттенкам определяют качественное и полуколичественное содержание окисленных метаболитов триптофана.
К недостаткам известного способа, как и аналогичного, следует отнести невозможность определения состояния микробиоценоза кишечника, т.к. окисленные продукты триптофана являются не только продуктами жизнедеятельности кишечной микрофлоры, но и промежуточными, а также и конечными продуктами нарушения обменных процессов в организме.
Кроме этого известный способ не достаточно точен, т.к. позволяет определить только качественный и полуколичественный состав метаболитов триптофана в пробе.
Задачей заявляемого технического решения является разработка способа оценки состояния микробиоты кишечника, основанного на определении основных продуктов ферментативной жизнедеятельности микрофлоры - деконъюгированных желчных кислот (ДЖК).
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности и специфичности оценки состояния микробиоценоза кишечника за счет определения в крови количественного содержания деконъюгированных желчных кислот - маркеров дисбаланса состава кишечной микрофлоры.
Технический результат достигается тем, что способ оценки состояния микробиоты кишечника включает взятие пробы крови и ее центрифугирование.
К отличительным приемам заявляемого способа относят то, что центрифугирование проводят при 1500 об/мин в течение 15 минут. Затем на пластинку Сорбфил ПТСХ-АХ-В-УФ отдельно наносят 2 пробы: 0,1 мкл плазмы крови и 1,0 мкл стандартной смеси деконъюгированных желчных кислот, после чего пластинку помещают в камеру с концентрированной уксусной кислотой. По окончанию элюирования пластинку вынимают и вентилируют в течение 20 мин при 100°С. Далее пластинку обрабатывают водным аэрозолем и выдерживают до появления белых пятен на прозрачном фоне пластинки. По длине пробега пятна пробы, в сравнении с длиной пробега пятна стандартной смеси, идентифицируют наличие деконьюгированных желчных кислот в пробе. Контуры пятен обрисовывают и рассчитывают их площади, по величинам которых устанавливают количественное содержание деконьюгированных желчных кислот в пробе. При их величине равной и менее 15,8±1,56 нг/л состояние микробиоты кишечника оценивают сбалансированным. При содержании дегидроксилированых желчных кислот в пробе более 15,8±1,56 нг/л устанавливают нарушение микробиоценоза кишечника.
Проведенный сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемый способ отличается от известного вышеперечисленными приемами и, следовательно, соответствует критерию изобретения «новизна».
Анализ патентной и специальной литературы выявил, что предлагаемый способ имеет признаки, отличающие его не только от прототипа, но и от других технических решений в данной и смежных областях биохимии и медицины. В доступной литературе авторами предлагаемого технического решения не установлено способа оценки состояния микробиоты кишечника вышеприведенными приемами.
12
Известно, что в основе воспалительного процесса в кишечнике лежит нарушение его микробиоценоза и накопление таких аминокислот, как глицин и таурин, которые являются продуктами жизнедеятельности микроорганизмов. При этом глицин и таурин являются составной частью первичных (конъюгированных) желчных кислот. Благодаря действию ферментов кишечной микрофлоры, связанному с отщеплением от молекулы первичных желчных кислот глицина и таурина, а также дегидроксилированию, образуются вторичные желчные кислоты (деконъюгированные). Последние медленнее всасываются в кишечнике, угнетают развитие полезной микробиоты, приводя к нарушению образования мицелл и всасыванию жира, витамина В. Это провоцирует избыточный бактериальный рост грамположительных анаэробных палочек семейства Lactobacilleae. Процесс сопровождается увеличением содержания деконъюгированных желчных кислот в биосредах организма (Джулай Г.С, Щелоченков С.В.. Микробиота желудочно-кишечного тракта в развитии неалкогольной жировой болезни печени // Верхневолжский медицинский журнал. - 2015. - Т. 14, - вып. 3. - с. 36-41).
Для определения содержания деконъюгированных желчных кислот авторы предлагаемого способа предложено использовать высокоэффективную тонкослойную хроматографию на пластинках Сорбфил ПТСХ-АХ-В-УФ, применяя в качестве элюента концентрированную уксусную кислоту. Появление белых пятен на прозрачном фоне пластинки свидетельствует о наличии деконъюгированных желчных кислот в плазме, идентификация которых была проведена авторами и химическими методами: экстракцией, хроматографией, УФ и ИК-спектроскопиями. Это позволило установить содержание деконъюгированных желчных кислот в крови.
На основании проведенных исследований авторами установлено, что у клинически здоровых людей количество ДЖК в плазме крови составляет 15,8±1,56 нг/л и менее, что свидетельствует о сбалансированном микробиоценозе кишечника. Так же авторами установлено, что увеличение содержания ДЖК указывает на нарушение состояния микробиоценоза кишечника.
Следовательно, отличительные приемы заявляемого способа обеспечивают возможность получения указанного технического результата - повышение точности и специфичности оценки состояния микробиоценоза кишечника. Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию « изобретательский уровень».
Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине, а именно в биохимии, физиологии, микробиологии. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами, следовательно, предлагаемое решение соответствует критерию «промышленная применимость».
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Утром (натощак) у пациента забирают кровь из локтевой вены в пробирку, содержащую 3,8% раствор цитрата натрия, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 минут, получают плазму. На пластинку Сорбфил ПТСХ-АХ-В-УФ микропипеткой отдельно наносят 0,1 мкл плазмы больного и 1,0 мкл стандартной смеси деконъюгированных желчных кислот. Пластинку помещают в камеру с концентрированной уксусной кислотой на 10-15 мин под контролем за финишем элюента (примерно 1 см от верхнего края пластинки). После окончания элюирования пластинку вынимают, просушивают, вентилируют в течение 20 мин при 100°С. Далее пластинку обрабатывают водным аэрозолем и выдерживают до появления белых пятен на прозрачном фоне пластинки. Появление белых пятен на прозрачном фоне пластинки относят к фракции деконъюгированных желчных кислот. Контуры пятен обрисовывают и рассчитывают их площади, по величинам которых устанавливают количественное содержание ДЖК в пробе. При величине равной и менее 15,8±1,56 нг/л состояние микро-биоценоза кишечника оценивают сбалансированным. Среднее время анализа составляет около 1,5 часов.
Предлагаемый способ оценки состояния микробиоты кишечника поясняется примерами конкретного выполнения.
Пример 1. Клинически здоровый пациент - донор. Утром у пациента-донора (натощак) была забрана кровь из локтевой вены. Кровь была забрана в пробирку, содержащую 3,8% раствор цитрата натрия. Плазму крови от форменных элементов отделили центрифугированием в течение 15 минут при 1500 об/мин. На пластинку Сорбфил ПТСХ-АХ-В-УФ микропипеткой нанесли 0,1 мкл плазмы крови и 1,0 мкл стандартной смеси деконъюгированных желчных кислот. Затем пластинку поместили в камеру с концентрированным раствором уксусной кислоты.
2
2
После окончания элюирования - при финише элюента примерно 1 см от верхнего края пластинки, пластинку вынули из этой камеры и вентилировали в течение 20 минут при 100°С. После чего пластинку осторожно обработали водным аэрозолем. Появление белых пятен на прозрачном фоне пластинки было отнесено к фракции ДЖК. Контуры пятен были обрисованы и проведен расчет их площадей. Площадь пятна стандартной смеси деконъюгированных кислот составила 3,15 мм, содержание ДЖК - 2,17 нг/л; площадь пятна пациента-донора - 21,7 мм, что составило 14,9 нг/л. Это свидетельствовало о сбалансированном состоянии микрофлоры кишечника.
Пример. 2. Больной А., Диагноз: язвенный колит впервые выявленный, острая атака.
При поступлении пациента А. в стационар содержание ДЖК было определено по предлагаемому способу и составило 48 нг/л, что в 3,03 раза превысило их уровень у клинически здоровых людей, что указывало на нарушение микробиоты кишечника, сопровождающееся тяжестью клинического состояния больного: температура тела 38,0, боли в животе, неоформленный стул с примесью крови, частота стула 5-7 раз в сутки, уменьшение массы тела, выраженная общая слабость. Эндоскопически установлено: отек слизистой оболочки, гиперемия, наличие эрозий, контактная кровоточивость, фибринозный налет на стенке кишечника. Бактериологический анализ слизистой оболочки биоптата толстой кишки показал преобладание анаэробной микрофлоры над аэробной (12:6, при норме 1:10), снижение содержания бифидобактерий до 10%, лактобацилл до 6%, бактероидов до 8%, нарастание условно-патогенной микрофлоры до 70%, появление энтеротоксической E. Coli и клостридий.
После проведенной стандартной терапии состояние больного улучшилось. Содержание ДЖК составило 28 нг/л. Микробный пейзаж также изменился: увеличилось содержание бифидобактерий до 19%, лактобацилл до 13%, бактероидов до 17%, снизилось содержание условно-патогенной флоры.
Следовательно, определение уровня ДЖК позволило провести лабораторный мониторинг состояния микрофлоры кишечника и подтвердить эффективность проводимой терапии.
Пример 3. Больная В., диагноз: распространенный гнойный перитонит. Содержание ДЖК в плазме крови при поступлении составило 42 нг/л, что в 2,6 раза выше, чем в контроле. Это указывало на избыточный бактериальный рост и нарушение микробиоценоза кишечника и сопровождалось тяжелым клиническим состоянием больной.
Авторами предлагаемого способа было исследовано 50 образцов крови пациентов, проходивших лечение в Иркутской ОКБ, из них: 20 пациентов с распространенным гнойным перитонитом, панкреонекрозом - 15, воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК) - 15. Группу клинически здоровых людей (контроль) составили 15 человек. Полученные данные представлены в таблице.
Представленные патологии проявляются дисбиотическими нарушениями, которые характеризуются изменением соотношения между аэробной и анаэробной флорой, снижением содержания бифидобактерий, лактобацилл. бактероидов, энтеротоксических штаммов, увеличением численности условно-патогенных бактерий.
Авторами предлагаемого способа на основании проведенных исследований установлено, что у клинически здоровых людей содержание деконъюгированных желчных кислот составляет 15,8±1,56 нг/л, что свидетельствует о сбалансированном состоянии микробиоты кишечника. Так же авторами установлено, что увеличение уровня ДЖК указывает на избыточный бактериальный рост микрофлоры в кишечнике.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет с более высокой точностью и специфичностью оценить состояние микробиоценоза кишечника. Повышенное содержание деконьюгированных желчных кислот служит маркером дисбаланса состава кишечной микрофлоры и приводит к развитию разных патологий.