Способ оценки индуцирующего действия обострения цитомегаловирусной инфекции на содержание 7-дегидрохолестерина в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты на третьем триместре гестации
METHOD FOR ASSESSMENT OF ACUTE CYTOMEGALOVIRUS INFECTION UNDICING ACTIVITY IN RESPONSE TO 7-DEHYDROCHOLESTEROL CONTENT IN PLACENTA VILLI SYNCYTIOTROPHOBLAST IN THE THIRD TRIMESTER OF GESTATION

1. Цель изобретения - оценить характер влияния цитомегаловирусной инфекции на содержание 7-дегидрохолестерина в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты на третьем триместре гестации, что приводит к угрозе формирования фетоплацентарной недостаточности.
2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа определения содержания 7-дегидрохолестерина в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре беременности.
3. Раскрытие изобретения
В период беременности синцитиотрофобласт плаценты становится источником синтеза холестерина, из которого образуются стероидные гормоны, оказывающие незаменимое влияние на формирование тканевого гистогенеза плода и в случае их недостатка возникают нарушения в фетоплацентарной системе [1, 5]. Ключевыми этапами синтеза холестерина принято считать образование мевалоната, сквалена и 7-дегидрохолестерина. 7-дегидрохолестерин является прямым предшественником холестерина [4]. Уменьшение количества прекурсоров на этапах образования стероида прогнозируемо приводит к снижению содержания стероидных гормонов, оказывающих влияние на формирование фетоплацентарной системы [3, 5].
4. В доступной литературе исследователи не касались изучения синтеза холестерина в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты и роли в этом процессе 7-дегидрохолестерина, а также влияния цитомегаловирусной инфекции на содержание 7-дегидрохолестерина в плаценте. Содержание 7-дегидрохолестерина выявляют методом газовой хроматографии с применением пламенно-ионизационного детектора в плазме крови [6]; методом с использованием в качестве меченого стабильного индикатора - дейтерия и проведением высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием масс-спектрометрии в различных тканях человека [7, 8]. Недостатком вышеупомянутых методов является длительное время анализа, необходимость дорогостоящей специальной аппаратуры и реактивов, а также трудоемкость выполнения исследования. Кроме этого, биохимические методы не дают представления о месте локализации искомого вещества.
2
В отличие от вышеприведенных прототипов в данной работе имеются существенные отличия: 1. Анализ содержания 7-дегидрохолестерина проводится с помощью гистохимической реакции с последующим цитофотометрическим измерением, позволяющим определять содержание продукта реакции в синцитиотрофобласте в пикселях/мкм. 2. Изменения содержания 7-дегидрохолестерина в плаценте происходят под влиянием обострения цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре беременности.
5. Новая техническая задача
Разработать гистохимический метод определения содержания 7-дегидрохолестерина в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты и показать влияние обострения цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации на его синтез.
6. Осуществление изобретения
6.1. Обследованы 37 беременных женщин 18-25 лет с обострением хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, контрольную группу составили 30 беременных женщин с хронической цитомегаловирусной инфекцией в латентной стадии. У беременных женщин симптоматически цитомегаловирусная инфекция проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз (обострение хронической цитомегаловирусной инфекции) устанавливается по результатам комплексного исследования периферической крови на наличие ДНК цитомегаловируса (ЦМВ), JgM или увеличение титра антител JgG в парных сыворотках (в 4 раза и более) в динамике через 10 суток, а также индекса авидности (более 65%). Исследования проводят с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.
6.2. Верификацию ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществляют методами ИФА на спектрофотометре «Stat Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), ДНК ЦМВ выявляют методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).
+
6.3. Содержание 7-дегидрохолестерина в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты определяли путем реакции на 7-дегидрохолестериндегидрогеназу на криостатных срезах свежезамороженной нефиксированной ткани следующим методом. Метод основан на восстановлении соли тетразолия в формазан электронами, акцептируемыми от субстрата через кофермент НАДФ [2]. Субстратом служит 2 мМ раствор 7-дегидрохолестерина «SERVA» (Германия). Для его приготовления 6 мг 7-дегидрохолестерина растворяют в 10 мл N,N-диметилформамида. Инкубационный раствор готовится на основе 0,1М фосфатного буфера рН 7,2-7,4 с добавлением нитросинего тетразолия фирмы «ICN Biomedicals)) (США) в конечной концентрации 5 мМ, НАДФ фирмы «Applichem» (Германия) - 1 мМ.
Состав инкубационной среды:
0,1 М фосфатный буфер рН 7,2-7,4
1 мл
нитросиний тетразолий
1 мг
НАДФ<sup>+</sup>
1 мг
2 мМ раствор 7-дегидрохолестерина
0,1 мл
В 1 мл инкубационного раствора помещают свежеприготовленные срезы ткани. Инкубацию проводят при 37°С в течение 30 мин. По окончании инкубации срезы промывают дистиллированной водой, фиксируют в 10%-ном нейтральном формалине при комнатной температуре, вновь промывают дистиллированной водой, подсушивают и заключают в глицерин-желатин. Контрольные срезы инкубировали в среде, содержащей вместо раствора 7-дегидрохолестерина адекватное количество фосфатного буфера. Полученные гистологические препараты изучают цитофотометрическим компьютерным методом с помощью программы Scion (США) на цифровом микроскопе (Япония).
1
2
6.4. Статистический анализ и обработка данных проводится с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Характеристика вариационных рядов: средняя арифметическая (М), стандартная ошибка (m), коэффициент вариации 95%, доверительный интервал для средних значений М±m, где t определялось по таблице граничных значений критерия Стьюдента при доверительном уровне 95% и числе степеней свободы F=n+n-2. Для определения достоверности различий используется непарный параметрический критерий Стьюдента. Принимаются во внимание р<0,05; 0,01; 0,001. Для определения достоверности различий в случае негауссовых распределений - непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни.
7. Полученные данные
2
2
В процессе исследования получены следующие результаты. На гистохимически выполненных препаратах плаценты беременных, перенесших обострение хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, при регистрации роста титра антител класса G к цитомегаловирусу до 1:1600 отмечается снижение активности реакции, отражающей содержание 7-дегидрохолестерина в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты до 29,3±2,79 пикселей/мкм(фиг. 1). В контроле интенсивность гистохимической реакции на 7-дегидрохолестериндегидрогеназу составила 41,2±3,12 пикселей/мкм (фиг. 2).
Таким образом, обострение цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации при нарастании титра антител класса G к цитомегаловирусу 1:1600 приводит к уменьшению содержания 7-дегидрохолестерина в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты, что снижает синтез плацентарных стероидных гормонов и создает угрозу формирования фетоплацентарной недостаточности.
8. Литература
1. Баграмян Э.Р., Голубев В.П., Соколова З.П. Значение гормональных исследований в диагностике фето-плацентарной недостаточности // Акушерство и гинекология. 1984. №10. С. 3-6.
2. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы: пер. с англ. - М.: Мир, 1982. 272 с.
3. Пустотина О.А. Плацентарная недостаточность и угроза прерывания беременности - обоснование применения препаратов прогестерона // Российский вестник акушера-гинеколога. 2006. №2. С. 51-54.
4. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. и др. Основы биохимии: В 3 т. - М.: Мир, 1981. Т. 2. 617 с.
5. Albrecht E.D., Рере G.J. Central integrative role of oestrogen in modulating the communication between the placenta and fetus that results in primate fetal-placental development // Placenta. 1999. Vol. 20, Is. 2. P. 129-139.
6. Gelzo M., Clericuzio S., Barone R., D’Apolito O., Dello Russo A., Corso G. A routine method for cholesterol and 7-dehydrocholesterol analysis in dried blood spot by GC-FID to diagnose the Smith-Lemli-Opitz syndrome // J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2012. Vol. 907 / P. 154-158.
7. Liu W., Xu L., Lamberson C., Haas D., Korade Z., Porter N.A. A highly sensitive method for analysis of 7-dehydrocholesterol for the study of Smith-Lemli-Opitz syndrome. J Lipid Res. // 2014. Vol. 55, №2. P. 329-337.
8. Liu W., Xu L., Lamberson C.R., Merkens L.S., Steiner R.D., Elias E.R., Haas D., Porter N.A. Assays of plasma dehydrocholesteryl esters and oxysterols from Smith-Lemli-Opitz syndrome patients // J. Lipid. Res. 2013. Vol. 54, №1. P. 244-253.