СПОСОБЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПОДСЛАСТИТЕЛЕЙ ВЫСОКОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ

1. Способ получения Соединения 1, имеющего структуру:
(1),
включающий:
контактирование могрозида IIIE с рекомбинантной клеткой-хозяином, которая содержит первый фермент, способный катализировать образование Соединения 1 из могрозида IIIE, при этом рекомбинантная клетка-хозяин содержит:
1. цитохром P450, который включает аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 80% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1025, 1027, 1029, 1031, 1033, 1035, 1037, 1039, 1041, 1043, 1045, 1047 и 1049; и/или
2. цитохром P450, который кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая, по меньшей мере, на 80% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1024, 1026, 1028, 1030, 1032, 1034, 1036, 1038, 1040, 1042, 1044, 1046 и 1048; и/или
3. гликозилирующий фермент, который включает аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 80% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1051, 1053, 1055, 1057, 1059, 1061, 1063, 1065, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1078, 1080, 1082, 1084, 1086, 1088, 1090, 1092 и 1094-1149; и/или
4. гликозилирующий фермент, который кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая, по меньшей мере, на 80% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1062, 1064, 1066, 1068, 1070, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091 и 1093; и/или
5. эпоксидгидролазу, которая включает аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 1073; и/или
6. эпоксидгидролазу, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая, по меньшей мере, на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 1072.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что рекомбинантная клетка-хозяин включает первый ген, кодирующий первый фермент.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что могрозид IIIE присутствует в рекомбинантной клетке-хозяине и/или продуцируется ею.
4. Способ по любому из пп. 1-3, включающий культивирование рекомбинантной клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, в которых экспрессируется первый фермент.
5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что первый фермент представляет собой один или несколько ферментов из числа UDP-гликозилтрансфераз, цикломальтодекстрин-глюканотрансфераз (ЦГТ), гликотрансфераз, декстрансахараз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз и декстраназ.
6. Способ по любому из пп. 1-5, включающий контактирование могрозида IIA с рекомбинантной клеткой-хозяином для получения могрозида IIIE, отличающийся тем, что рекомбинантная клетка-хозяин содержит второй фермент, способный катализировать образование могрозида IIIE из могрозида IIA.
7. Способ по любому из пп. 1-6, включающий контактирование могрола с рекомбинантной клеткой-хозяином, отличающийся тем, что рекомбинантная клетка-хозяин содержит один или несколько ферментов, способных катализировать образование могрозида IIE и/или IIIE из могрола.
8. Способ по любому из пп. 1-7, включающий контактирование могрозида IA1 с рекомбинантной клеткой-хозяином, отличающийся тем, что рекомбинантная клетка-хозяин содержит ген, кодирующий фермент UGT98 или UGT SK98, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 9, 407, 16 или 306.
9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, включает контактирование 11-гидрокси-24,25 эпоксикукурбитадиенола с рекомбинантной клеткой-хозяином, при этом рекомбинантная клетка-хозяин содержит третий ген, кодирующий эпоксидгидролазу.
10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что включает контактирование 11-гидрокси-кукурбитадиенола с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит четвертый ген, кодирующий цитохром P450 или эпоксидгидролазу.
11. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что включает контактирование 3, 24, 25-тригидроксикукурбитадиенола с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит пятый ген, кодирующий цитохром P450.
12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что включает контактирование кукурбитадиенола с рекомбинантной клеткой-хозяином.
13. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что включает контактирование одного или нескольких соединений, выбранных из 2,3-оксидосквалена, диоксидосквалена и диэпоксисквалена с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит седьмой ген, кодирующий полипептид, имеющий активность кукурбитадиенолсинтазы.
14. Рекомбинантная клетка, содержащая: Соединение 1, имеющее структуру:
(1),
ген, кодирующий фермент, способный катализировать образование Соединения 1 из могрозида IIIE, и один или несколько соединений, выбранных из:
1. цитохрома P450, который включает аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 80% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1025, 1027, 1029, 1031, 1033, 1035, 1037, 1039, 1041, 1043, 1045, 1047 и 1049; и/или
2. цитохрома P450, который кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая, по меньшей мере, на 80% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1024, 1026, 1028, 1030, 1032, 1034, 1036, 1038, 1040, 1042, 1044, 1046 и 1048; и/или
3. гликозилирующего фермента, который включает аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 80% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1051, 1053, 1055, 1057, 1059, 1061, 1063, 1065, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1078, 1080, 1082, 1084, 1086, 1088, 1090, 1092 и 1094-1149; и/или
4. гликозилирующего фермента, который кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая, по меньшей мере, на 80% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1062, 1064, 1066, 1068, 1070, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091 и 1093; и/или
5. эпоксидгидролазы, которая включает аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 1073; и/или
6. эпоксидгидролазы, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая, по меньшей мере, на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 1072.
15. Рекомбинантная клетка, содержащая первый ген, кодирующий первый фермент, способный катализировать образование Соединения 1, имеющего структуру:
(1)
из могрозида IIIE, и одно или несколько соединений, выбранных из:
1. цитохрома P450, который включает аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 80% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1025, 1027, 1029, 1031, 1033, 1035, 1037, 1039, 1041, 1043, 1045, 1047 и 1049; и/или
2. цитохрома P450, который кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая, по меньшей мере, на 80% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1024, 1026, 1028, 1030, 1032, 1034, 1036, 1038, 1040, 1042, 1044, 1046 и 1048; и/или
3. гликозилирующего фермента, который включает аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 80% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1051, 1053, 1055, 1057, 1059, 1061, 1063, 1065, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1078, 1080, 1082, 1084, 1086, 1088, 1090, 1092 и 1094-1149; и/или
4. гликозилирующего фермента, который кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая, по меньшей мере, на 80% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1062, 1064, 1066, 1068, 1070, 1075, 1077, 1079, 1081, 1083, 1085, 1087, 1089, 1091 и 1093; и/или
5. эпоксидгидролазы, которая включает аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 1073; и/или
6. эпоксидгидролазы, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая, по меньшей мере, на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 1072.