СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ
METHOD OF INCREASING ANTI-TUMOUR RESISTANCE

Изобретение относится к медицине, а именно к способам профилактики развития опухолей.
Известно, что различные вакцины оказывают профилактическое и лечебное действие в отношении опухолей [1-5]. В частности, вакцина БЦЖ, приготовленная из туберкулезных микобактерий, оказалась эффективной в отношении рака мочевого пузыря [1, 6]. Однако она отнесена к препаратам, потерявшим актуальность, поскольку оказалась эффективной, в основном, при внутрипузырном введении [7]. Туляремийная живая вакцина предназначена для комплексного лечения больных раком тела матки и рака легкого [2]. В качестве средства, ограничивающего опухолевый рост, предложено использовать коревую вакцину [3]. Вакцина, приготовленная из вируса папилломы человека, с успехом используется для профилактики развития рака шейки матки [4, 5, 8]. Несмотря на выраженный специфический профилактический эффект этого препарата в отношении рака шейки матки, он не может быть применен для профилактики других видов доброкачественных и злокачественных опухолей, поскольку нет сведений о его способности повышать неспецифическую противоопухолевую резистентность. Надо отметить, что ни в одном из рассмотренных примеров нет данных о влиянии вакцин на радиационно-индуцированный онкогенез, тогда как появление опухолей после облучения в малых дозах общеизвестно [9].
1
1
3
2
Значительно более перспективным в качестве препарата двойного назначения (противоинфекционного и противоопухолевого) является гриппозная вакцина - вакцина массового применения. Гриппом ежегодно болеют сотни миллионов человек, а десятки и сотни миллионов подвергаются вакцинации против гриппа. В настоящее время для профилактики гриппа в Российской Федерации наиболее широко используется вакцина «Гриппол» [10]. Вакцина содержит поверхностные гликопротеины (гемагглютинин и нейраминидаза), выделенные из очищенных вирусов гриппа типа А и В, и кроме того, имеет в своем составе водорастворимый высокомолекулярный иммуностимулятор-N-оксидированное производное поли-1, 4-этиленпиперазина (полиоксидоний). Одна иммунизирующая доза вакцины «Гриппол» для подкожного введения человеку (0,5 мл) содержит, согласно инструкции по применению, по 5 мкг гемагглютинина штаммов вируса гриппа типа А (подтипы H N и H N), 11 мкг гемагглютинина штаммов вируса гриппа типа В и 500 мкг полиоксидония. Вакцина «Гриппол» свободна от примесей невирионного происхождения и является высокоочищенным, эффективным и безопасным препаратом. Она разработана ГНЦ - Институтом иммунологии ФМБА России. Вакцина «Гриппол» широко используется в качестве средства для профилактики заболевания гриппом. В настоящее время ею иммунизировано более 100 млн. человек. Наблюдения за результатами вакцинации населения свидетельствуют о безвредности, хорошей переносимости и высокой профилактической эффективности препарата, поэтому вакцина «Гриппол» разрешена к широкому применению в эпидемиологической практике для профилактической иммунизации детей, начиная с возраста 6 месяцев, и взрослых [11]. Ее применение показано для групп населения с высоким риском заболевания гриппом.
Ранее было доказано, что вакцина «Гриппол» обладает противолучевым действием [12], однако, до настоящего времени оставался неизученным вопрос о противоопухолевой эффективности вакцины «Гриппол», что, безусловно, является актуальным и имеет не только научный, но и практический интерес.
Целью изобретения является разработка нового способа повышения противоопухолевой резистентности с помощью вакцины «Гриппол», широко используемой при вакцинации населения против гриппа.
В результате экспериментальных исследований установлено, что введение лабораторным животным противогриппозной вакцины «Гриппол» подкожно до инокуляции перевивной опухоли или до облучения в канцерогенной дозе значительно повышает противоопухолевую резистентность организма. Способ прост и удобен в применении.
1
Для достижения поставленной цели было изучено противоопухолевое действие вакцины «Гриппол» на мышах гибридах (СВА×С57B1)F самцах, с массой тела 18-20 г на модели солидной формы карциномы Эрлиха штамм ELD [13]. Опытных мышей иммунизировали вакциной «Гриппол» в объеме 0,2 мл подкожно в правую заднюю лапу. Контрольным животным вводили стерильный 0,9% раствор хлорида натрия. Клетки асцитной карциномы Эрлиха в дозе 1000 клеток в объеме 0,1 мл раствора Хенкса перевивали в голень левой задней лапы мышей через 14 дней после иммунизации. Наблюдение за подопытными животными проводили в течение 30-ти суток после инокуляции опухолевых клеток. Рандомизацию контрольных и опытных групп осуществляли по массе тела. Эксперимент выполнен на 48 мышах (26 - иммунизированных и 22 - неиммунизированных). В течение 30-ти суток после инокуляции ежедневно проводили измерение трех взаимно перпендикулярных диаметров опухоли, и, принимая форму опухоли за эллипсоид, рассчитывали ее объем по формуле:
1
2
3
V=(π/6)·d·d·d,
3
1
2
3
где V - объем опухоли, см, d, d, d - линейные размеры трех взаимно перпендикулярных диаметров опухоли, см.
В процессе проведения эксперимента оценивали:
1. Число животных с развившимися опухолями к моменту окончания наблюдения - к 30-м суткам после инокуляции. Начало роста опухоли определили по достижению одного из диаметров опухоли 0,2 см.
2. Объем опухоли на каждый срок обследования.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием различных методик [14], применяя соответствующие программы: STATISTICA 6; SPSS v. 9,0 и EpiCalc2000.
В ходе исследований обнаружено у вакцины «Гриппол» новое свойство, проявляющееся в повышении резистентности мышей к приживлению и росту перевиваемой опухоли.
Влияние иммунизации вакциной «Гриппол» на приживаемость клеток карциномы Эрлиха показано в таблице 1.
Таблица 1
Влияние иммунизации вакциной «Гриппол» за 14 суток до инокуляции опухолевых клеток на число животных с развившейся солидной формой карциномы Эрлиха
Группа
Число животных
Выход опухолей за 30 суток
Точный критерий Фишера односторонний (p)
абс.
%
Иммунизированные
26
7
27
0,049
Неиммунизированные
22
12
54
Данные таблицы 1 позволяют сделать вывод, что иммунизация, проведенная за 14 дней до инокуляции опухолевых клеток, в 2 раза снижает выход опухолей при 30-ти суточном наблюдении.
Влияние иммунизации вакциной «Гриппол» на динамику роста солидной формы перевивной карциномы Эрлиха у мышей показано на чертеже.
Данные, представленные на чертеже, позволяют сделать вывод о том, что иммунизация животных, проведенная за 14 дней до инокуляции опухолевых клеток существенно замедляет скорость роста перевивной опухоли у мышей.
Таким образом, полученные данные убедительно доказывают, что вакцина «Гриппол» обладает способностью повышать противоопухолевую резистентность на модели перевивной опухоли.
137
Помимо указанного эксперимента для достижения поставленной цели были выполнены исследования на крысах по изучению влияния вакцины «Гриппол» на спонтанное и радиационно-индуцированное возникновение опухолей молочных желез. Эксперименты были проведены на белых беспородных крысах-самках с исходной массой тела 175±20 г. Животных подвергали на установке «ИГУР» тотальному равномерному воздействию γ-излучения Cs в дозе 2,5 Гр (мощность дозы 1,138 Гр/мин, длительность облучения 2 мин 12 сек). Животных разделили на 4 группы. Первая группа была подвергнута внешнему облучению и иммунизации вакциной «Гриппол», вторая - только иммунизирована, третья - только облучена, четвертая - биоконтроль. Были выполнены две серии экспериментов, различающиеся по схеме иммунизации. В первой серии крыс иммунизировали однократно подкожно в дозе 0,2 мл за две недели до облучения. Во второй серии крыс иммунизировали трехкратно: за две недели до облучения, через две недели и через 6 мес. после облучения. Во всех случаях использовали вакцину «Гриппол» производства ФГУП «НПО Микроген» МЗСР РФ. Животных обследовали ежемесячно в течение 22-х месяцев с момента облучения. Опухоли молочных желез определяли пальпаторным методом - без морфологического исследования. Под наблюдением находилось 350 крыс (8 групп), по 35-50 животных в экспериментальной группе.
Критерием оценки бластомогенной эффективности внешнего облучения и противоопухолевой активности вакцины, так же, как и развития спонтанных опухолей, служил латентный период - срок появления опухолей молочных желез.
Наблюдение за развитием опухолей осуществляли в течение 22-х месяцев. Появление первой опухоли у иммунизированных облученных животных в I варианте эксперимента было отмечено через 8 месяцев после облучения, тогда как у контрольных животных опухоли появились раньше - через 5 месяцев после облучения. Аналогичная закономерность отмечалась и во II варианте эксперимента: у иммунизированных облученных крыс первая опухоль появилась на 7-ом месяце, тогда как у контрольных (облученных, неиммунизированных) значительно раньше - на 2-ом месяце после облучения.
Наблюдение за развитием опухолей молочных желез у необлученных крыс дало следующие результаты. Появление первой опухоли в I варианте эксперимента отмечено у иммунизированных животных через 14 месяцев, у неиммунизированных раньше - через 12 месяцев. Во II варианте опытов у иммунизированных животных первая опухоль появилась через 20 месяцев, у неиммунизированных - уже через 17 месяцев. Иммунизация молодых крыс вакциной «Гриппол» приводит к увеличению латентного периода выхода спонтанных опухолей молочных желез, появляющихся у стареющих животных.
Состояние повышенной противоопухолевой резистентности под влиянием иммунизации является временным и к моменту окончания эксперимента выход опухолей у вакцинированных и не вакцинированных животных сравнивается.
Дополнительно для оценки качества жизни крыс в ходе эксперимента исследовали массу тела. Стабильное повышение массы тела крыс с увеличением возраста служит признаком здоровья, тогда как раковая кахексия - неблагоприятный прогностический признак.
Масса тела животных на протяжении всего эксперимента увеличивалась. Различия между группами были незначительными (таблица 2), однако, средняя масса тела иммунизированных животных была несколько выше, чем у неиммунизированных.
Таблица 2
Средняя масса тела крыс к 19-му месяцу наблюдения в эксперименте с трехкратной иммунизацией.
Группа
Средняя масса тела (г)
1. Необлученные, неиммунизированные
320,6
2. Необлученные, иммунизированные
342,4
3. Облученные, неиммунизированные
306,4
4. Облученные, иммунизированные
350,0
Представленные данные доказывают, что вакцина «Гриппол» повышает противоопухолевую резистентность в отношении спонтанно развивающихся и радиационно-индуцированных опухолей молочных желез.
Таким образом, полученные данные убедительно доказывают, что вакцина «Гриппол» обладает противоопухолевым действием - повышает устойчивость организма к развитию опухолей. Она снижает выход перевивных опухолей и существенно снижает вероятность развития солидной формы карциномы Эрлиха, кроме того, вакцина «Гриппол» существенно увеличивает величину латентного периода появления спонтанных и радиационно-индуцированных опухолей молочных желез. Полученные данные свидетельствуют о возможности применения вакцины «Гриппол» в качестве препарата двойного действия: антигриппозного и противоопухолевого. Она может быть использована для повышения противоопухолевой резистентности различных контингентов лиц с повышенным риском онкологических заболеваний, например, профессионалов, контактирующих с источниками ионизирующего излучения.
На чертеже представлены графики, демонстрирующие влияние вакцины «Гриппол» на динамику роста карциномы Эрлиха у мышей.
Приведенные ниже экспериментальные примеры иллюстрируют, но не ограничивают притязаний заявителя.
Пример №1.
1
Противоопухолевое действие вакцины «Гриппол» испытывают на мышах-гибридах (СВА×C57B1)F. Используются самцы массой тела 18-20 г. Вакцину «Гриппол» вводят мышам в качестве противоопухолевого средства однократно подкожно в дозе 0,2 мл за 14 суток до инокуляции опухолевых клеток. Клетки асцитной карциномы Эрлиха штамм ELD в количестве 1000 клеток в объеме 0,1 мл раствора Хенкса перевивают в голень задней лапы мышей через 14 дней после иммунизации. В группе иммунизированных животных наблюдают 14 мышей, в группе неиммунизированных - 12 мышей. Через 30 суток после инокуляции развитие солидной опухоли отмечено у 5-ти иммунизированных мышей (36%) и у 11 неиммунизированных животных (92%). Различие между показателями в сравниваемых группах статистически значимы (критерий Фишера односторонний - 0,005).
Пример №2.
Действие вакцины «Гриппол» на выход спонтанных опухолей испытывают на беспородных белых крысах самках с исходной массой тела 175±20 г. Вакцину «Гриппол» вводят в дозе 0,2 мл подкожно однократно (I вариант) или трехкратно, интервал между 1-ой и 2-ой инъекцией - 4 недели, а между 2-ой и 3-ей - 5,5 месяцев (II вариант). Контрольным животным вводят 0,9% раствор хлорида натрия в дозе 0,2 мл. Наблюдение за развитием опухолей осуществляют в течение 22 месяцев. В каждой группе наблюдают по 35-50 животных.
Результаты, характеризующие латентный период - срок появления первой опухоли молочных желез у необлученных крыс, представлены в таблице 3.
Таблица 3
Срок появления первой спонтанной опухоли молочных желез в эксперименте на необлученных крысах.
Вариант опыта
Группа
Срок появления первой опухоли (мес.)
I
1. Необлученные, неиммунизированные
12
2. Необлученные, иммунизированные
14
II
1. Необлученные, неиммунизированные
17
2. Необлученные, иммунизированные
20
Представленные в таблице 3 данные показывают, что иммунизация крыс увеличивает латентный период - срок появления первой спонтанной опухоли молочных желез.
Пример №3.
137
Действие вакцины «Гриппол» на радиационно-индуцированный онкогенез испытывают на беспородных белых крысах - самках. Животных подвергают тотальному равномерному воздействию γ-излучения Cs в дозе 2,5 Гр (при мощности дозы 1,1 Гр/мин). Вакцину «Гриппол» в качестве противоопухолевого средства вводят в дозе 0,2 мл подкожно однократно за 14 дней до облучения (I вариант опыта) или трехкратно за 14 дней до облучения (1-я инъекция), через 14 дней после облучения (2-я инъекция) и через 6 месяцев после облучения (3-я инъекция) (II вариант опыта). Контрольным животным вводят 0,9% раствор хлорида натрия в дозе 0,2 мл. В каждой группе наблюдается по 35-50 животных.
В таблице 4 представлены результаты, характеризующие латентный период - срок появления первой опухоли молочных желез у облученных крыс. Приведенные в таблице 4 данные показывают, что иммунизация вакциной «Гриппол» облученных крыс увеличивает латентный период - срок появления первой опухоли молочных желез. Причем применение II схемы иммунизации дает ощутимо лучший результат.
Таблица 4
Срок появления первой индуцированной облучением опухоли молочных желез в эксперименте на облученных крысах.
Вариант опыта
Группа
Срок появления первой опухоли (мес.)
I
1. Облученные, неиммунизированные
5
2. Облученные, иммунизированные
8
II
1. Облученные, неиммунизированные
2
2. Облученные, иммунизированные
7
Источники информации
1. Патент РФ №22350338.
2. Патент РФ №2092186.
3. Патент США 7393527.
4. Патент РФ №2180593.
5. Патент РФ №2196568.
6. Вакцина БЦЖ для иммунотерапии рака мочевого пузыря сухая (вакцина Имурон). В кн.: Регистр лекарственных средств России, 2008 г.
7. Быков А.С., Воробьев А.А., Зверев В.В. В кн.: Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. //Медицинское информационное агентство. - Москва. - 2008. - 244 с.
8. Киселев Ф.Л., Боренская С.А. Вакцина против рака - первые успехи. // Природа. - 2007. - №3. - С.25-34.
9. Радиационная медицина. Под ред. Л.А.Ильина. Т.1. Теоретические основы радиационной медицины. - М.: Издат, 2004 г. С.788-836.
10. Инструкция по применению вакцины гриппозной тривалентной полимерсубъединичной жидкой «Гриппол». Регистрационное удостоверение №96.309.23. Утверждена Главным Государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 22.06.2001 г.
11. Хаитов P.M., Некрасов А.В., Горбунов М.В. Вакцинация «Грипполом» детей. //Вакцинация. - 2001. - Т.17. - №5. - С.1-5.
12. Патент РФ №2312675.
13. Забежинский М.А., Попович И.Т., Штылик А.В., Коваленко А.Л., Анисимов В.Н. Влияние циклоферона на рост прививаемых опухолей у крыс и мышей. // Вопросы онкологии. - 1998. - Т.44. - №4. - С.427-431.
14. Kaplan E.L., Meier P. Nonparametric estimation from incomplete observations. // J. Am. Statist. Association. 1958. V.53. P.457-481.