Способ выделения хондроцитов
METHOD FOR ISOLATION OF CHONDROCYTES

Изобретение относиться к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, клеточной биологии, цитологии и может быть использовано в регенеративной медицине при изготовлении биомедицинского клеточного продукта.
2
2
2
2
2
Известен способ изоляции и характеристики хондроцитов хрящевой ткани после тотального эндопротезирования коленного сустава человека (Naranda J,  Gorenjak M, Vogrin M, Maver U. Isolation and characterization of human articular chondrocytes from surgical waste after total knee arthroplasty (TKA). Peer J. 2017 Mar 21; 5:e3079. doi: 10.7717/peerj.3079.eCollection 2017.) Хрящевую ткань удаляют на полную толщину хирургическим путем с мыщелка бедренной кости пациентов с остеоартрозом коленного сустава без системных заболеваний во время выполнения операции тотального эндопротезирования. Используют стандартные режущие блоки для резекции бедренной кости, а резекцию выполняют обычным способом. Сразу же после удаления костные отрубы переносят в предварительно стерилизованную стеклянную бутылку емкостью 250 мл заполненную раствором фосфатного буфера (PBS, Sigma-Aldrich, Мюнхен, Германия) и доставляют в лабораторию для изоляции клеток. В лаборатории, в условиях ламинарного шкафа костные отрубы переносят в чашку Петри, заполненную PBS, чтобы предотвратить высыхание ткани. Хрящевую ткань удаляют с поверхности костей, используя лезвие №11, чтобы получить фрагменты хрящевой ткани, размером 2×2 мм. PBS удаляют пипеткой, и чашку Петри заполняют 10 мл раствора 0,25% Трипсина/ЭДТА (Sigma, Франция). Фрагменты хрящевой ткани инкубируют в течение 3 часов в условиях CO инкубатора (CO-инкубатор МСО-19AICUVH-PE, Panasonic, Токио, Япония), при температуре 37°C и 5 мас. % CO. Затем добавляют 20 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle, Advanced DMEM, (Gibco, Grand Island, NY, USA) к суспензии клеток. Суспензию переносят в пробирку типа falcon объемом 50 мл и центрифугируют при 300 g в течение 10 мин. (центрифуга 5804 R, Eppendorf, Гамбург, Германия). Супернатант отбрасывают и осадок клеток повторно суспензируют в 20 мл Advanced DMEM и центрифугируют при 200 × g в течение 5 мин. (центрифуга 5804 R, Эппендорф, Гамбург, Германия). Супернатант снова отбрасывают, и клеточный осадок повторно суспензируют в 10 мл Advanced DMEM, дополненной 100 ME/мл пенициллина, 1 мг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина и 5 вес. % Эмбриональной бычьей сыворотки (FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA) и высевают на 25 см флаконы. Нелизированные фрагменты хрящевой ткани высевают на 25 см флаконы вместе с суспензией первичных хондроцитов. Через 7 суток инкубирования из фрагментов хрящевой ткани хондроциты мигрируют в радиальном направлении. Формирование конфлюэнтного монослоя наблюдают через 14 суток.
Недостатки данного способа заключаются в том, что выделяется низкое количество хондроцитов за счет того, что после забора хрящевую ткань нарезают в чашке Петри, что приводит к получению слишком больших фрагментов хрящевой ткани с низкой площадью поверхности, что снижает скорость и полноту лизирования фрагментов хрящевой ткани ферментами. Также, это приводит к потере биологического материала в процессе механической обработки. Кроме того, выделение низкого количества хондроцитов связано с тем, что обработка фрагментов хрящевой ткани осуществляется одним ферментом (трипсином) который лизирует в основном неколлагеновые белки матрикса хрящевой ткани и обладает крайне низким сродством к основному компоненту межклеточного матрикса - коллагену II типа. Низкий уровень жизнеспособности хондроцитов, выделяемых данным способом, обусловливается тем, что в процессе ферментативной обработки не предусмотрен отбор выделенных клеток. После забора хрящевую ткань нарезают в чашке Петри, как следствие получают фрагменты хрящевой ткани более крупного размера, тем самым снижается площадь соприкосновения фермента и субстрата, что ведет к увеличению времени воздействия и, как следствие, к снижению жизнеспособности хондроцитов. Низкая степень лизирования за счет того, что используется один фермент. Высок риск возникновения контаминации за счет использования одной и той же лабораторной посуды для механической и ферментативной обработки. В последующем будет наблюдаться снижение чистоты эксперимента, который будет проведен на данной культуре хондроцитов в связи с тем, что при использовании данного способа происходит смешивание популяции хондроцитов, выделенных путем ферментативного расщепления фрагментов хрящевой ткани и хондроцитов, мигрирующих из нелизированных фрагментов хрящевой ткани. Это приводит к присутствию в культуре хондроцитов клеток с различным уровнем энергетического и пластического обмена, т.е. клеток с разным функциональным состоянием. Указанные недостатки приводят к увеличению времени подготовки биологического материала и увеличению его количества, следовательно, увеличивают количество используемых ферментов, что увеличивает затраты.
2
Известен способ выделения и культивирования хондроцитов полученных из различных источников (И.И. Ким «Выделение и культивирование хондроцитов полученных из различных источников» журнал «Клеточная трансплантология и тканевая инженерия», №4 [6], 2006 г. Стр. 48-50). В работе использовали хрящевую ткань фетусов человека, хрящевую ткань позвоночников человека, больных идиопатическим сколиозом и межпозвонковые диски новорожденной собаки. Выделение хондроцитов производили механо-ферментативным методом, используя в качестве диспергента следующие реакционные смеси: 1) коллагеназу IV типа в концентрации 0,05%, 0,1%, 0,15%, 2) трипсин в концентрации 0,025%, 3) гиалуронидазу I-S типа в концентрации 0,05% и 4) сочетание ферментов коллагеназы и гиалуронидазы в концентрации 0,05% каждого. Хрящевую ткань, очищенную от окружающих мягких тканей, измельчали до фрагментов размером 1-3 мм. Затем обрабатывали ферментом: фетальную ткань в течение 5-8 часов и 18-20 часов - хрящевую ткань позвоночника больных идиопатическим сколиозом при постоянном помешивании при температуре 37°. После ферментации полученную взвесь клеток пропускали через нейлоновый фильтр и отмывали 2 раза от раствора фермента питательной средой, затем центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут. Процент жизнеспособных хондроцитов подсчитывали с помощью трипанового синего. Индекс пролиферации культуры определяли при каждом пассаже. Клетки культивировали с использованием среды DMEM/F12 (Биолот, Санкт-Петербург) с добавлением 20% сыворотки крови плодов коровы (Биолот, Санкт-Петербург). Клетки с поверхности культурального флакона снимали с помощью смеси растворов 0,02% трипсина-версена (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) в соотношении 5:1. Пассирование проводили 2 раза в неделю. Морфологию культур клеток оценивали с помощью инвертированного микроскопа. Криоконсервацию проводили ступенчатым методом погружения в жидкий азот с помощью внутриклеточного криопротектора DMSO в концентрации 10%. Для статистической обработки данных использовали метод достоверности различий между группами по критерию Стьюдента с определением показателя статистической достоверности (при p<0,05 различия рассматривались как статистически достоверные).
Недостатки данного способа заключаются в том, что выделяется низкое количество хондроцитов за счет того, что после забора хрящевую ткань нарезают в чашке Петри, что приводит к потере биологического материала в процессе механической обработки. Обработка фрагментов хрящевой ткани осуществляется неспецифичными к субстрату ферментами, это приводит к сильному повреждению хондроцитов и, как следствие, к уменьшению их количества. Низкий уровень жизнеспособности хондроцитов, за счет того, что в процессе ферментативной обработки не предусмотрен отбор выделенных хондроцитов. После забора хрящевую ткань нарезают в чашке Петри, как следствие получают фрагменты хрящевой ткани более крупного размера, увеличивается время воздействия или концентрация ферментов на фрагменты хрящевой ткани, тем самым снижая уровень жизнеспособности хондроцитов. Низкая степень лизирования за счет того, что используются не специфичные ферменты к субстрату. Высок риск возникновения контаминации за счет постоянного помешивания и переворачивания лизирующего раствора с хрящевой тканью при температуре 37° в течении 18-20 часов. В последующем будет наблюдаться низкая чистота эксперимента, который будет проведен на данной культуре в связи с тем, что при пассировании хондроцитов в процессе культивирования происходит снижение синтеза белков внеклеточного матрикса (протеогликанов, в частности - агрекана, коллагена II типа). Происходит снижение количества выделенных хондроцитов, за счет того, что используют нейлоновый фильтр, это приводит к невозможности извлечения нелизированных фрагментов хрящевой ткани и дальнейшей ферментативной обработки так же увеличивает общее время процесса выделения хондроцитов. Отсутствие фильтрации способствует попаданию нелизированных фрагментов хрящевой ткани в суспензию хондроцитов, что приводит к увеличению разнородности популяции хондроцитов. Указанные недостатки приводят к увеличению времени подготовки биологического материала и увеличению количества исходного биологического материала, следовательно, увеличивает количество используемых ферментов, что увеличивает затраты.
Известен способ выделения хондроцитов человека (Phenotypic modulation in sub-population of human articular chondrocytes in vitro C.W. Archer, J. McDowel, M.T. Bayliss, M.D. Stephens, G. Bentley. \\ Journal of Cell Science 97, 361-371 (1990), принятый за прототип. В качестве биоматериала используют суставной хрящ больных остеосаркомой и хондросаркомой, полученный в ходе операции по эндопротезированию сустава. Поверхностную зону суставного хряща 15% отделяют от базовой (остальной хрящ на всю глубину 85% с помощью скальпеля. Экспланты хрящевой ткани переносят в чашку Петри. Процедуру нарезки и измельчения хрящевых кусочков проводят после выдерживания эксплантов, как суборганной культуры ночь в среде Хэма F12, содержащей 10% плодной сыворотки теленка (ФТС),  аскорбиновой кислоты и 2% антибиотик/антимикотик для обеспечения стерильности образцов до ферментативной обработки. Далее хрящевую ткань промывают PBS и измельчают на фрагменты. Измельченный хрящ инкубируют раствором проназы  растворенной в среде Хэма F12, содержащей 10% плодной сыворотки теленка (ФТС), 2% антибиотик/антимикотик при 37°C на роллере в течение 1 часа и 15 минут в зависимости от объема материала. Далее хрящевые эксплантаты обрабатывают раствором коллагеназы (Тип 1А) в течение 3-х часов на роллере. Затем клеточную суспензию центрифугируют при 1000g. Клетки промывают и высеивают на чашки Петри диаметром 9 см. на ночь. Затем прикрепившиеся клетки обрабатывают раствором 0,1% трипсина и 0,05% EDTA в PBS, центрифугируют и ресуспензируют в среде. Клетки культивируют на подложке агарозы (Sigma, type V) в среде Хэма F12, содержащей 10% плодной сыворотки теленка (ФТС),  аскорбиновой кислоты, и 2% антибиотик/антимикотик.
Недостатки данного способа заключаются в том, что выделяется низкое количество хондроцитов за счет того, что после забора хрящевую ткань нарезают в чашке Петри, что приводит к потере, биологического материала в процессе механической обработки. Обработка кусочков хрящевой ткани осуществляется неспецифичными ферментами к субстрату, это приводит к сильному повреждению хондроцитов и, как следствие, к низкому количеству выделяемых хондроцитов. Низкий уровень жизнеспособности хондроцитов, за счет того что после забора хрящевую ткань нарезают в чашке Петри как следствие получают фрагменты хрящевой ткани более крупного размера, увеличивается время воздействия или концентрация ферментов на фрагменты хрящевой ткани, тем самым снижая уровень жизнеспособности хондроцитов. Низкая степень лизирования за счет того, что используются не специфичные ферменты к субстрату. Высокий риск возникновения контаминации культуры хондроцитов связанный с выдерживанием эксплантов, как суборганной культуры ночь в среде Хэма F12, содержащей 10% плодной сыворотки теленка (ФТС),  аскорбиновой кислоты и 2% антибиотик/антимикотик. В последующем будет наблюдаться низкая чистота эксперимента, который будет проведен на данной культуре в связи с тем, что при пассировании хондроцитов в процессе культивирования происходит снижение синтеза белков внеклеточного матрикса (протеогликанов, агрекана, коллагена II типа). В последующем будет наблюдаться снижение чистоты эксперимента, который будет проведен на данной культуре хондроцитов в связи с тем, что при использовании данного способа происходит смешивание популяции хондроцитов, выделенных путем ферментативного расщепления фрагментов хрящевой ткани и хондроцитов, мигрирующих из недорасщепленных фрагментов хрящевой ткани. Это приводит к присутствию в культуре хондроцитов с различным уровнем энергетического и пластического обмена, т.е. клеток с разным функциональным состоянием. Отсутствие фильтрации способствует попаданию нелизированных фрагментов хрящевой ткани в суспензию хондроцитов, что приводит к увеличению разнородности популяции хондроцитов. Указанные недостатки приводят к увеличению времени подготовки биологического материала и увеличению количества исходного биологического материала, и, следовательно, увеличивает количество используемых ферментов, что увеличивает затраты.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание способа свободного от выше указанных недостатков.
Указанный технический результат достигается тем, что способ выделения хондроцитов включающий забор материала, срезание хрящевой ткани с кости, нарезание хрящевой ткани на фрагменты, инкубирование в культуральной среде, инкубирование фрагментов хрящевой ткани в растворе коллагеназы, промывание, центрифугирование суспензии клеток и высевание на культуральный пластик, нарезают хрящевую ткань на субхондральной кости глубиной до кости, надрезы через 0,5-1 мм выполняют параллельно во взаимно перпендикулярных направлениях, затем соскребают параллельно костной поверхности, полученные фрагменты хрящевой ткани для одновременной фильтрации и ферментативной обработки помещают в фильтрующее устройство, затем инкубируют в 0,2-0,3% растворе трипсина, при соотношении фрагментов хрящевой ткани к трипсину 1:10 в течение 0,5-1 часа при температуре 37°С в условиях перемешивания, полученную суспензию хондроцитов центрифугируют, супернатант отбрасывают, а образовавшийся осадок хондроцитов промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза, осуществляют отбор первой фракции хондроцитов, затем нелизированные фрагменты хрящевой ткани, находящиеся в фильтрующем устройстве, инкубируют в 0,3-0,8% растворе коллагеназы II типа в течение 1,5-2,5 часа при температуре 37°С в условиях перемешивания, полученный осадок хондроцитов промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза, осуществляют отбор второй фракции хондроцитов, затем первую и вторую фракцию хондроцитов объединяют, далее нелизированные фрагменты хрящевой ткани удаляют из фильтрующего устройства и инкубируют в течении 18-20 часов при температуре 37°С в культуральной среде DMEM/F12 содержащую 15% FBS, 42.19 ед/мл пенициллина, 0.042 мг/мл стрептомицина, 0.053 мг/л амфотерицина В, затем культуральную среду DMEM/F12 содержащую 15% FBS, 42.19 ед/мл пенициллина, 0.042 мг/мл стрептомицина, 0.053 мг/л амфотерицина В отбрасывают и добавляют 0,3-0,8% раствор коллагеназы II типа, полученный после осаждения хондроцитов центрифугированием на втором этапе, инкубируют 1,5-2 часа при температуре 37°С в условиях перемешивания, полученную суспензию хондроцитов центрифугируют, образовавшийся супернатант, содержащий коллагеназу II типа, отбрасывают, а полученный осадок хондроцитов промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза, осуществляют отбор третьей фракции хондроцитов и соединяют ее с первой и второй фракциями хондроцитов, затем полученную суспензию хондроцитов высевают на культуральный пластик для адгезионных культур в среде DMEM/F12 содержащей 15% FBS, 42.19 ед./мл пенициллина, 0.042 мг/мл стрептомицина, 0.053 мг/л амфотерицина В, получая первичную клеточную популяцию нулевого пассажа.
Вариант осуществления способа.
1 этап - Получение первой фракции хондроцитов.
2
Производят забор биологического материала, например, анатомически целостное образование из суставного хряща и субхондральной кости. Далее транспортируют в стерильном контейнере и помещают в ламинарный шкаф. Биологический материал, например, анатомически целостное образование из суставного хряща и субхондральной кости трижды промывают раствором фосфатного буфера PBS с 42.19 ед/мл пенициллина, 0.042 мг/мл стрептомицина, 0.053 мг/л амфотерицина В, в конечных концентрациях. На поверхности суставного хряща через 0,5-1 мм медицинским инструментом, например скальпелем, делают параллельные надрезы глубиной до субхондральной кости во взаимно перпендикулярных направлениях. После этого медицинским инструментом, например скальпелем, параллельно субхондральной кости срезают хрящевую ткань на всю глубину и соскребают в отдельную одноразовую стерильную посуду, например чашку Петри, тем самым получая фрагменты хрящевой ткани. С целью одновременной фильтрации и ферментативной обработки фрагменты хрящевой ткани помещают в фильтрующее устройство, например лабораторную капроновую сетку, сформированную в виде мешка. Затем его переносят в лабораторную посуду, например, бюкс, и добавляют 0,2-0,3% раствора трипсина. Соотношение объема биологического материала, например фрагментов хрящевой ткани к объему 0,2-0,3% раствора трипсина составляет 1:10. Помещают в термостатируемый шейкер, обрабатывают биологический материал, например фрагменты хрящевой ткани 0,2-0,3% раствором трипсина в течение 0,5-1 часа в условиях перемешивания при температуре 37°C и при скорости 100-120 rpm. В результате этого в лабораторной посуде, например бюксе, образуется суспензия хондроцитов в растворе 0,2-0,3% трипсина и не полностью расщепленный биологический материал, например фрагменты хрящевой ткани в фильтрующем устройстве, например лабораторной капроновой сетке, сформированной в виде мешка. С помощью дозирующего устройства, например автоматического дозатора, производят забор суспензии ходроцитов в 0,2-0,3% растворе трипсина из лабораторной посуды, например, бюкса, и осуществляют перенос в центрифужную пробирку, оставив в лабораторной посуде фильтрующее устройство, например лабораторную капроновую сетку, сформированную в виде мешка с биологическим материалом, например фрагментами хрящевой ткани. Затем нелизированный биологический материал, например фрагменты хрящевой ткани, промывают одним объемом культуральной среды, например DMEM/F12, содержащей 15% FBS, 42.19 ед./мл пенициллина, 0.042 мг/мл, 0.053 мг/л амфотерицина В. Затем указанную культуральную среду например DMEM/F12, содержащую 15% FBS, 42.19 ед./мл пенициллина, 0.042 мг/мл, 0.053 мг/л амфотерицина В отбирают из лабораторной посуды с оставшимися в ней нелизированными фрагментами хрящевой ткани с помощью дозирующего устройства, например, автоматического дозатора переносят в центрифужную пробирку, в которой находится суспензия хондроцитов в 0,2-0,3% растворе трипсина для ингибирования фермента. Цикл промывки повторяют дважды. Затем центрифужную пробирку с полученной суспензией хондроцитов и с ингибированным компонентами полной среды 0,2-0,3% раствором трипсина центрифугируют 5-10 минут при 1500 об./мин., супернатант отбрасывают. Полученный в ходе центрифугирования осадок хондроцитов выделенных 0,2-0,3% раствором трипсина промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза, центрифугируют 5-10 минут при 1500 об./мин. и ресуспензируют в той же центрифужной пробирке с 1 мл культуральной среды, например DMEM/F12, содержащей 15% FBS, 42.19 ед/мл пенициллина, 0.042 мг/мл стрептомицина, 0.053 мг/л амфотерицина В и подсчитывают концентрацию хондроцитов в суспензии в камере Горяева и пересчитывают полученный результат по формуле пересчета количества клеток на 1 мл суспензии. Затем суспензию хондроцитов переносят с помощью дозирующего устройства, например, автоматического дозатора, в культуральную посуду для суспензионных культур, например, чашку Петри и помещают в CO-инкубатор с целью сохранения.
2 этап - Получение второй фракции хондроцитов.
2
К фрагментам нелизированного биологического материала, например фрагментам хрящевой ткани, находящимся в фильтрующем устройстве, например капроновой сетке, сформированной в виде мешка, и помещенной в лабораторную посуду, например, бюкс, дозирующим устройством, например, автоматическим дозатором добавляют 0,3-0,8% раствора коллагеназы II типа. Затем лабораторную посуду с фрагментами хрящевой ткани в 0,3-0,8% растворе коллагеназы II типа помещают на 1,5-2,5 часа в термостатируемый шейкер, где получают следующую фракцию хондроцитов при температуре 37°C в условиях перемешивания и при скорости 100-120 rpm. В результате этого образуется суспензия хондроцитов в растворе 0,3-0,8% коллагеназы II типа и не полностью расщепленный биологический материал, например фрагменты хрящевой ткани. Далее с помощью дозирующего устройства, например автоматического дозатора, производят перенос суспензии хондроцитов в растворе 0,3-0,8% коллагеназы II типа в центрифужную пробирку. Центрифугируют в течение 5-10 минут при скорости вращения ротора 1500-1700 об./мин. После центрифугирования образовавшийся супернатант, содержащий 0,3-0,8% раствор коллагеназы II типа из центрифужной пробирки переносят в чистую стерильную пробирку, закрывают и сохраняют 18-20 часов при температуре +4°C. Образовавшийся в ходе центрифугирования осадок хондроцитов, промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза. Далее осадок хондроцитов ресуспензируют в 1 мл культуральной среды DMEM/F12, содержащей 15% FBS, 42.19 ед/мл пенициллина, 0.042 мг/мл, 0.053 мг/л амфотерицина В и подсчитывают концентрацию выделенных хондроцитов в суспензии в камере Горяева и пересчитывают полученный результат по формуле пересчета количества клеток на 1 мл суспензии. Затем полученную суспензию хондроцитов переносят в культуральную посуду для суспензионных культур, например чашку Петри, содержащую суспензию хондроцитов, выделенных раствором 0,2-0,3% трипсина на первом этапе. Таким образом, в одной культуральной посуде, например чашке Петри, через 2-4 часа находится суспензия хондроцитов, выделенных в ходе 1 и 2 этапа: 1 фракция включает в себя суспензию хондроцитов, выделенных раствором 0,2-0,3% трипсина на 1 этапе, вторая - суспензию хондроцитов, выделенных 0,3-0,8% раствором коллагеназы II типа на 2 этапе. Суспензию хондроцитов помещают в CO-инкубатор и инкубируют в течение 18-20 часов.
3 этап - Получение третьей фракции хондроцитов и первичной клеточной популяции нулевого пассажа.
2
2
2
Оставшиеся после 1-2 этапов фрагменты нелизированного биологического материала, например фрагменты хрящевой ткани, находящиеся в фильтрующем устройстве, например лабораторной капроновой сетке и лабораторной посуде, например, бюксе с помощью медицинского инструмента, например, шпателя переносят в одноразовую стерильную посуду для суспензионных культур, например, флакон площадью 25 см, и помещают в CO-инкубатор на 18-20 часов в среду, например, DMEM/F12 содержащую 15% FBS, 42.19 ед/мл пенициллина, 0.042 мг/мл стрептомицина, 0.053 мг/л амфотерицина В. Далее отбирают вместе с культуральной средой, например, DMEM/F12, содержащую 15% FBS, 42.19 ед/мл пенициллина, 0.042 мг/мл стрептомицина, 0.053 мг/л амфотерицина В. Затем нелизированные фрагменты хрящевой ткани из культуральной посуды, например, флакона площадью 25 см, и переносят с помощью дозирующего устройства в лабораторную посуду, например бюкс. После этого дают нелизированным фрагментам хрящевой ткани осесть, отбирают дозирующим устройством, например, автоматическим дозатором культуральную среду, например, DMEM/F12, содержащую 15% FBS, 42.19 ед./мл пенициллина, 0.042 мг/мл стрептомицина, 0.053 мг/л амфотерицина В, и добавляют 0,3-0,8% раствор коллагеназы II типа, хранившейся 18-20 часов при температуре +4° полученной после осаждения суспензии хондроцитов центрифугированием на 2 этапе выделения. Помещают в термостатируемый шейкер и термостатируют в течении двух часов при температуре 37°C в условиях перемешивания и при скорости 100-120 rpm. В результате этого через 1,5-2 часа происходит полное лизирование биологического материала, например фрагментов хрящевой ткани 0,3-0,8% раствором коллагеназы II типа и образуется суспензия хондроцитов. Затем полученную суспензию хондроцитов с помощью дозирующего устройства, например, автоматического дозатора, переносят в центрифужную пробирку. Центрифугируют в течение 5-10 минут при скорости вращения ротора 1500-1700 об./мин. После центрифугирования образовавшийся супернатант, содержащий коллагеназу II типа, отбрасывают. Полученный осадок хондроцитов промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза. Затем полученную в ходе 3 этапа суспензию хондроцитов помещают в центрифугу и собирают центрифугированием в течение 5-10 минут при скорости вращения ротора 1500-1700 об./мин., ресуспендируют и подсчитывают концентрацию выделенных хондроцитов в суспензии в камере Горяева и пересчитывают полученный результат по формуле пересчета количества клеток на 1 мл суспензии. После 3-го этапа суспензию хондроцитов переносят в культуральную посуду для суспензионных культур, например чашку Петри, содержащую суспензию хондроцитов, выделенных на 1-м и 2-м этапе. Затем хондроциты полученные после 3-х этапов высевают на культуральный пластик для адгезионных культур в среде DMEM/F12 («Биолот», Россия) с добавлением 15% сыворотки крови плодов коровы (FBS «Gibco», США), пенициллина - стрептомицина («Биолот»,), и амфотерицина В («Биолот», Россия) тем самым получают первичную клеточную популяцию нулевого пассажа.
В результате подсчета установлено, что на 1-м этапе при обработке фрагментов хрящевой ткани 0,2-0,3% раствором трипсина выделяется от 0,06 до 0,14 миллионов клеток в миллилитре суспензии. На 2-м этапе, при обработке нелизированных фрагментов хрящевой ткани 0,3-0,8% растворе коллагеназы II типа выделяется от 0,48 до 2,25 миллионов клеток в миллилитре суспензии. На 3-м этапе, при обработке нелизированных фрагментов хрящевой ткани 0,3-0,8% растворе коллагеназы II типа выделяется от 0,9 до 2,6 миллионов клеток в миллилитре суспензии. Затем полученные данные после трех этапов складывают. В результате после 3-х этапов обработки установлено, что выделяется от 2,2 до 3,8 миллионов клеток в миллилитре суспензии. Из чего следует, что заявляемый нами способ позволяет достичь максимального выделения жизнеспособных хондроцитов.
После 3-х этапной обработки фрагментов хрящевой ткани полнота лизирования ткани, характеризуемая по массе остатка фрагментов хрящевой ткани при лизировании 1 грамма хрящевой ткани составляет 0,007-0,05 граммов. Из чего следует что у заявляемого нами способа высокая степень лизирования с минимальным остатком субстрата.
После 3-х этапов обработки фрагментов хрящевой ткани с целью определения жизнеспособности хондроцитов используют метод прижизненного окрашивания трипановым синим. В результате использования этого метода установлено, что у большинства хондроцитов наблюдается сохранение бесцветной окраски, тем самым подтверждается целостность клеточной мембраны большинства хондроцитов в суспензии и их жизнеспособность.
Пример клинического применения
Пациентка К., 1953 года рождения поступила в 2017 году в Новосибирский НИИТО для планового оперативного лечения. Анамнез: боли в области коленного сустава с 2013 года. Ранее травма правого коленного сустава. С 2015 года присоединилось ограничение движения в левом коленном суставе. Проводилось консервативное лечение по месту жительства без положительного эффекта. После проведенного комплексного обследования, осмотров специалистов установлен клинический диагноз: Двусторонний посттравматический гонартроз 3 степени справа, 2 степени слева. Варусная деформация правой нижней конечности. Комбинированная контрактура правого коленного сустава. Синдром гоналгии справа. Рекомендовано эндопротезирование левого коленного сустава. Основание для забора биологического материала: решение о плановом оперативном лечении и информированное добровольное согласие пациента на использование для научных работ послеоперационного материала от 13.02.2017. Производят забор биологического материала, например анатомически целостное образование из суставного хряща и субхондральной кости и выполняют 1-й этап в соответствии с предложенным способом. В результате после первого этапа при обработке фрагментов хрящевой ткани 0,2-0,3% раствором трипсина выделилось 0,068 миллионов клеток в миллилитре суспензии. Затем выполняют 2-й этап в соответствии с предложенным способом. В результате после второго этапа при обработке фрагментов хрящевой ткани в 0,3-0,8% растворе коллагеназы II типа выделилось 1,08 миллионов клеток в миллилитре суспензии. Затем полученные фракции суспензию хондроцитов выделенных в ходе 1 и 2 этапа соединяют в культуральном флаконе для суспензионных культур. Затем выполняют 3-й этап в соответствии с предложенным способом. В результате при обработке нелизированных фрагментов хрящевой ткани 0,3-0,8% растворе коллагеназы II типа выделилось 2,59 миллионов клеток мл. После 3-го этапа суспензию хондроцитов переносят в культуральный флакон содержащий суспензию хондроцитов, выделенных на 1-м и 2-м этапе. Затем хондроциты полученные после 3-х этапов высевают на культуральный пластик для адгезионных культур в среде DMEM/F12 («Биолот», Россия) с добавлением 15% сыворотки крови плодов коровы (ФТС) («Gibco», США), 42.19 ед./мл пенициллина, 0.042 мг/мл, 0.053 мг/л амфотерицина В (Биолот, Санкт-Петербург), и амфотерицина В (Биолот, Санкт-Петербург), тем самым получают первичную клеточную популяцию нулевого пассажа.
В результате после 3-х этапов обработки установлено, что выделилось 3,73 миллионов клеток в миллилитре суспензии. Из чего следует, что заявляемый нами способ позволяет достичь максимального выделения жизнеспособных хондроцитов.
С целью определения жизнеспособности хондроцитов используют метод прижизненного окрашивания трипановым синим. В результате, которого было установлено, что у 85-90% хондроцитов наблюдается сохранение бесцветной окраски, тем самым подтверждается целостность клеточной мембраны большинства хондроцитов в суспензии и их жизнеспособность.
После 3-х этапной обработки фрагментов хрящевой ткани путем визуальной оценки было установлено, что в суспензии отсутствуют фрагменты хрящевой ткани. При взвешивании осадка нелизированных фрагментов хрящевой ткани установлено, что их масса ровна 0,015 грамма. Из чего следует что у заявляемого нами способа высокая степень лизирования с минимальным остатком субстрата.
Преимущество предложенного способа по сравнению с существующими заключается в том, что позволяет достичь максимального выделения хондроцитов за счет того, что хрящевую ткань нарезают на субхондральной кости через 0,5-1 мм делают параллельные надрезы глубиной до субхондральной кости во взаимно перпендикулярных направлениях. Срезают хрящевую ткань параллельно субхондральной кости на всю глубину и соскребают. Обработка кусочков хрящевой ткани осуществляется ферментами специфичными к субстрату. Выделение производят последовательно сначала раствором трипсина, а затем каллагенозой II типа. Способ обеспечивает высокий уровень жизнеспособности хондроцитов, за счет того что хрящевую ткань нарезают на субхондральной кости. Получают мелкие фрагменты хрящевой ткани, что увеличивает площадь взаимодействия субстрата и фермента, и как следствие уменьшается время воздействия и концентрация ферментов на фрагменты хрящевой ткани, тем самым повышается уровень жизнеспособности хондроцитов. Осуществляют отбор фракций суспензии хондроцитов после каждого этапа ферментативной обработки. Способ обеспечивает высокую степень лизирования за счет того, что используются специфичные ферменты к компонентам межклеточного матрикса хрящевой ткани, как следствие увеличивается площадь поверхности субстрата в результате поэтапной обработки сначала раствором трипсина, а затем коллагеназой II типа, увеличивается проникновение кислорода в клетки. Низкая степень контаминации за счет того, что после забора биологического материала сразу проводят выделение хондроцитов по предложенному нами способу. Происходит разделение технологичных этапов механической и ферментативной обработки связанных со сменой стерильной лабораторной посуды. В последующем будет наблюдаться высокая чистота эксперимента, который будет проведен на данной культуре в связи с тем, что в результате заявляемого способа получают первичную клеточную популяцию нулевого пассажа с однородным функциональным состоянием хондроцитов. При использовании фильтрующего устройства происходит совмещение двух процессов: процесса ферментативной обработки и процесса фильтрации хондроцитов от фрагментов хрящевой ткани, это позволяет сократить время выделения хондроцитов и увеличить количество выделяемых хондроцитов. Использование фильтрующего устройства позволяет производить отбор суспензии хондроцитов быстро, что важно для непрерывного лизиса и регулярно, что обеспечивает получение более однородной популяции жизнеспособных хондроцитов с одинаковыми свойствами. Указанные достоинства приводят к уменьшению времени подготовки биологического материала и уменьшению количества исходного биологического материала, следовательно, сокращается количество используемых ферментов, что уменьшает затраты.
Способ выделения хондроцитов реализуется на современном оборудовании, с использованием современных технологий и материалов.