Влияние тритона Х-100 на выделение и свойства холинэстеразы из ганглиев кальмаров

УДК 664.951.014:577.15 Н.Н. Ковалев, Е.В. Михеев, Ю.М. Позднякова

ВЛИЯНИЕ ТРИТОНА Х-100 НА ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ИЗ ГАНГЛИЕВ КАЛЬМАРОВ

Исследовано влияние детергента тритона Х-100 на экстрактивность холинэстеразы из мороженых и сублимированных ганглиев кальмаров. Определена молекулярная масса препарата фермента хо-линэстеразы.

Ключевые слова: тритон Х-100, холинэстераза, субстратная специфичность.

N.N. Kovalev, E.V. Mikheev, J.M. Pozdnyakova

THE INFLUENCE OF TRITON X-100 ON THE ISOLATION AND CHARACTERISTICS OF CHOLINESTERASE FROM THE SQUID GANGLIA

The Triton X-100detergent in fiuence on the cholinesterase extractive capacity from the frozen and dehydrated squid ganglia is researched. The molecular mass of cholinesterase enzyme preparation is determined.

Key words: Triton X-100, cholinesterase, substrate specificity.

Введение. Экстракция мембраносвязанных белков с помощью детергентов - один из широко распространенных приемов в практической биохимии и биотехнологии. В состав детергентов входят липо-фильные цепи, которые, взаимодействуя с гидрофобными поверхностями молекулы белка, вытесняют его из комплекса с мембраной. Одним из наиболее широко применяемых детергентов являются тритоны (в частности, тритон Х-100). Тритоны в большинстве своем неионные детергенты на основе полиэти-ленгликоля. Детергенты способны вытеснять белок, прочно связанный с мембраной гидрофобными взаимодействиями, благодаря тому, что они, во-первых, растворяют мембрану и, во-вторых, замещают компоненты мембраны алифатическими или ароматическими цепями, которые составляют липофиль-ную часть детергента [1].

В литературе есть данные об использовании тритона Х-100 для выделения холинэстеразы (ХЭ) из различных источников [2, 3]. Так, было показано, что обработка осадка голов мух после водной экстракции тритоном Х-100 в концентрациях 0,1 и 1,0 % приводила к переходу в раствор дополнительно от 6 до 10 % общей активности ХЭ [3]. Было установлено, что в концентрации 1 % тритон Х-100 повышает значения Vm для гидролиза АТХ [4]. Также тритон Х-100 в концентрации 1% применялся для солюбилизации ХЭ различного происхождения [5-8].

Цель работы. Исследование влияния детергента тритона Х-100 на экстрактивность холинэстеразы из ганглиев кальмаров, а также влияния тритона Х-100 на свойства препарата фермента ХЭ (активность, чувствительность к фосфорорганическим ингибиторам и субстратную специфичность), полученного с его использованием.

Материалы и методы. В качестве источников фермента использовали сублимированные и мороженые ганглии тихоокеанского кальмара Todarodes pacificus и кальмара Бартрама Ommastrephes bartramii.

В качестве субстратов холинэстераз использовали тиохолиновые эфиры карбоновых кислот - ацетил-, пропионил- и бутирилтиохолин иодиды (ICN, США).

Скорость холинэстеразного гидролиза определяли методом Эллмана [9]. Кинетические параметры ферментативного гидролиза (Vm и Km) - графически по методу Лайнуивера-Берка [10].

В качестве ингибиторов использовали: диизопропилфторфосфат (ДФФ) - [(CH3hCHOhP(O)F; О-этил-Б-(р-этилмеркаптоэтил) метилтиофосфанат (ГД-42) - С 2H5O(CH3)P(O)SC2H4S+(CH3)C2H5. Исследованные фосфорорганические соединения (ФОС) синтезированы в Институте элементорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН [11]. Бимолекулярную константу скорости взаимодействия ХЭ с ФОС рассчитывали по уравнению [12].

Ультрафильтрацию проводили на колонках с мембранами волоконного типа, с пределом пропускания пор 100 кДа (GE Healthcare, США).

Электрофорез ферментных препаратов проводили в 10 %-м (С = 3,2) полиакриламидном геле (ПААГ) [13]. Для выявления ХЭ-активности в гелях использовали тиохолиновый метод [14].

Результаты и обсуждение. Исследования по выделению фермента из различных источников показали, что большинство ХЭ не переходит в раствор без разрушения ткани детергентами или солюбилизиру-ющими агентами.

В связи с этим проведено исследование влияния детергента тритона Х-100 в концентрации 1-3 % от массы сырья на экстрактивность ХЭ из мороженых и сублимированных ганглиев различных видов кальмаров.

Установлено, что обработка 3 %-м тритоном Х-100 мороженых ганглиев тихоокеанского кальмара приводила к переходу в раствор 34 % общей активности в гомогенате ткани, при этом экстракция водой приводила к переходу в раствор 27 % общей активности в гомогенате (рис. 1).

и

0

1

б;

70 80 50 40

зо ^ 20 ю ^ о

Кальмар тихоокеанский

Кальмар Бартрама

Тритон Х-100 1% Тритон Х-100 2% Тритон Х-100 3%

Рис. 1. Влияние различных концентраций тритона Х-100 на экстрактивность ХЭ из мороженых ганглиев кальмаров

В случае кальмара Бартрама экстракция 3 %-м тритоном приводила к переходу в раствор 48 % активности (при использовании тритона в концентрации 1 и 2 % в раствор переходило соответственно 43 и 46 % активности), при этом экстракция водой приводила к переходу в раствор 32 % общей активности фермента.

Таким образом, концентрации тритона Х-100 в интервале 1-3 % для различных видов кальмаров приводили к переходу в раствор от 32 до 48 % активности. По сравнению с водной экстракцией наибольший прирост экстрактивности ХЭ из мороженых ганглиев (16 %) характерен для кальмара Бартрама, наименьший (7 %) - для тихоокеанского кальмара.

В опытах на сублимированных ганглиях тихоокеанского кальмара показано, что тритон Х-100 в концентрациях 0,5 и 1,0 % способствует переходу в раствор 57-60 % активности ХЭ. Увеличение выхода фермента в раствор следует признать незначительным, поскольку при экстракции водой в раствор переходит 50 % активности ХЭ, содержащейся в сырье (рис. 2).

Рис. 2. Влияние различных концентраций тритона Х-100 на экстрактивность ХЭ из сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара

Ранее, на примере сублимированных ганглиев тихоокенскаго кальмара, было показано, что обработка сырья смесью органических растворителей приводит к повышению выхода фермента в раствор при водной экстракции на 17 % [14]. Представляло интерес исследование влияния на экстрактивность ХЭ различных концентраций тритона Х-100 (из обработанных смесью органических растворителей ганглиев кальмаров).

Солюбилизация ХЭ из сублимированных, обработанных органическими растворителями ганглиев кальмара 0,5 %-м тритоном Х-100, как и в случае сублимированных необработанных ганглиев, не приводила к значительному увеличению степени солюбилизации фермента. Обработка сублимированных ганглиев органическими растворителями и последующая экстракция 1 %-м тритоном Х-100 приводит к повышению на 20 % активности фермента в экстракте по сравнению с водной экстракцией из сублимированных ганглиев (рис. 3).

Рис. 3. Влияние тритона Х-100 на экстрактивность ХЭ из сублимированных ганглиев кальмара Бартрама. Гидромодуль 3: 1, время экстракции 15 ч, I - 20±2 0С, рН - 6,8 (за 100 % принята активность

в гомогенате)

Обработка 1 %-м раствором тритона сублимированных ганглиев кальмара Бартрама (рис. 4) приводила к переходу в раствор 57 % активности как сублимированных ганглиев необработанных, так и сублимированных, обработанных смесью органических растворителей. При этом водная экстракция необработанных ганглиев без добавления детергента приводила к переходу в раствор 52 % активности, а водная экстракция сублимированных обработанных ганглиев кальмара Бартрама - 65 % общей активности.

Исследования зависимости экстракции ХЭ тритоном Х-100 из сублимированного сырья показали, что экстракция 0,5 %-м детергентом не оказывала существенного влияния на экстрактивность ХЭ из сублимированных ганглиев (как обработанных, так и необработанных) исследованных видов кальмаров. Использование тритона в 1,0 %-й концентрации при экстракции ХЭ из сублимированных, обработанных смесью органических растворителей ганглиев тихоокеанского кальмара позволило перевести в раствор 71 % общей активности в сырье (солюбилизация ХЭ смесью органических растворителей приводила к переходу в экстракт 67 % активности фермента). В то же время увеличение концентрации детергента не приводило к улучшению экстрактивности фермента из ганглиев кальмара Бартрама различных способов обработки. Исследования по влиянию тритона Х-100 на экстрактивность ХЭ из мороженых ганглиев кальмаров показали, что в раствор переходит не более 48 % общей ферментативной активности (в случае кальмара Бартрама).

Основываясь на описанных выше параметрах процессов, был получен препарат фермента хо-линэстеразы из сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара путем обработки смесью органических растворителей (бутанол : гексан 1,5 : 1,0) с последующей обработкой тритоном Х-100 (1 % массы сырья) и дальнейшей очисткой ультрафильтрацией.

Экстракцию ХЭ из сырья, обработанного смесью органических растворителей, после добавления тритона Х-100 проводили при 18±2 оС при соотношении сырье : вода - 3 : 1.

По окончании процесса экстракции очистку центрифугата от тритона Х-100 проводили с помощью ультрафильтрации на мембранах с пределом пропускания пор 100 кДа, при добавлении 0,1 М №0!.

В концентрате производили отмывку низкомолекулярных компонентов. Полученный препарат был характеризован по величине удельной активности и чувствительности к ФОС (табл.).

Свойства препарата ХЭ из сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара, обработанных смесью органических растворителей и тритоном Х-100

Субстрат V,* (отн),% Удельная активность, мМ АТХ/мин/мг белка Выход, % от экстракта ГД-42 к II 109, М мин-1 ДФФ, к ц-107 М мин-1

АТХ 100

ПТХ 77 11,60±0,03 18 1,90±0,01 1,20±0,01

БТХ 78

Полученный препарат ХЭ катализировал гидролиз всех изученных субстратов, скорость гидролиза уменьшалась при увеличении концентрации субстрата (рис. 4).

20 -19 18 -17 -16 -15 -14

АТХ

гттх

---БТХ

N

2,2

2.4

2.6

3.2

3.4

3.6

3.8

рв

Рис. 4. Зависимость скорости гидролиза (мкМ/мг навески) субстратов от их концентрации (рБ) под действием препарата ХЭ из сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара, полученного

с использованием тритона Х-100

Фермент, полученный с использованием детергента, с наибольшей скоростью гидролизовал АТХ. При этом скорость гидролиза ПТХ и БТХ была одинаковой. Удельная активность препарата составляла 11,6 Е/мг белка, выход препарата - 18 % от активности в сырье (сублимированные ганглии) (см. табл.).

С целью определения фракционного состава и молекулярной массы компонентов препарата был проведен БОБ-электрофорез в полиакриламидном геле (рис. 5).

1

223 кД

1 п

111 кД

/V

РЛолекулдрная масса, кД

А

2Б0

223 иД

250

Молекулярная масса, кД

Б

Рис. 5. Денситограммы препарата ХЭ из сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара, полученного обработкой смесью органических растворителей и последующей экстракцией 1 %-м тритоном Х-100: А - окраска кумасси; Б - окраска по Карновскому

Как видно на рисунке 5, в препарате присутствует два белковых компонента с молекулярной массой 117 и 217 кДа. Специфическая окраска по Карновскому показала, что холинэстеразной активностью обладает белковая фракция с молекулярной массой 223 кДа.

Выводы. Таким образом, проведенное исследование показало возможность получения гомогенного фермента при использовании органических растворителей и 1 %-го тритона Х-100 из сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара, с удельной активностью 11,6 Е/мг белка. Выход по активности составил 18 % от сублимированного сырья.

Литература

1. Скоупс Р. Методы очистки белков. - М.: Мир, 1985. - 358 с.

2. Бресткин А.П., Вяземская М.М., Майзель Е.Б. Влияние тритона Х-100 на свойства ацетилхолинэсте-разы из эритроцитов крови человека // Биохимия. - 1978. - Т. 43, № 1. - С. 94-99.

3. Выделение и каталитические свойства растворимой и мембранной холинэстеразы мозга капустной мухи Delia brassicae / Г.М. Григорьева, Т.И. Краснова, А.Е. Хованских [и др.] // Биохимия. - 1987. -Т. 52, № 7. - С. 1192-1200.

4. Rosenfeld C., Kousba A., Sultatos L.G. Interactions of rat brain acetylcholinesterase with the detergent Triton X-100 and the organophosphate paraoxon // Toxicological Sciences. - 2001. - Vol. 63, Iss 2. - P. 208-213.

5. Molecular properties of acetylcholinesterase in mouse spleen / S. NietoCeron, M.T. MoralNaranjo, E. MunozDelgado [et al.] // Neurochemistry International. - 2004. - Vol. 45, Iss 1. - P. 129-139.

6. Hussein A.S., Grigg M.E., Selkirk M.E. Nippostrongylus brasiliensis: Characterisation of a somatic am-phiphilic acetylcholinesterase with properties distinct from the secreted enzymes // Experimental Parasitology. - 1999. - Vol. 91, Iss 2. - P. 144-150.

7. Purification and characterization of acetylcholinesterase from oriental fruit fly (Bactrocera dorsalis (Hendel)) (Diptera: Tephritidae) / Y.M. Hsiao, J.Y. Lai, H.Y. Liao [et al.] // J. of Agricultural and Food Chemistry. - 2004.

- Vol. 52, Iss 17. - P. 5340-5346

8. Amphiphilic and hydrophilic forms of acetylcholinesterase from sheep platelets / M.R. Marcos, J. Sanchez Yague, A. Hernandez Hernandez [et al.] // Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. - 1998. - Vol. 1415, Iss 1. - P. 163-173.

9. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity / G.L. Ellman, K.D. Courtney, V.Jr. Andres [et al.] // Biochem. Pharmacol. - 1961. - Vol 7, № 1. - Р. 88-95.

10. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. - М.: Мир, 1979. - 280 с.

11. Кабачник М.И. Фосфорорганические физиологически активные вещества // Вестн. АН СССР. - 1964. -№ 40. - С. 60-68.

12. Яковлев В.А. Кинетика ферментативного катализа. - М : Наука, 1965. - 248 с.

13. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. - М.: Наука, 1981. - 286 с.

14. Karnovsky M., Roots L.A. "Direct-colouring" thiocholine method for cholinesterases // Histochem. Cytochem.

- 1964. - Vol. 12. - P. 219-226

15. Михеев Е.В., Ковалев Н.Н. Технологические характеристики ганглиев кальмаров как сырья для получения фермента холинэстеразы // Изв. ТИНРО. - 2012. - Т. 169. - С. 238-245.