Бифункциональные цитотоксические агенты, содержащие CTI фармакофор
BIFUNCTION CYTOTOXIC AGENTS CONTAINING PHARMACOPHORE CTI

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к новым бифункциональным CTI-CTI и CBI-CTI димерам, полезным для лечения пролиферативных заболеваний. Димеры по изобретению могут функционировать как автономные лекарственные средства, полезные нагрузки в конъюгатах антитело-лекарственное средство (ADC) и в соединениях линкер-полезная нагрузка, полезных в связи с производством или введением таких ADC. Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим вышеупомянутые димеры, соединения линкер-полезная нагрузка и ADC, и к способам использования этих димеров, соединений линкер-полезная нагрузка и ADC для лечения патологических состояний, в том числе рака.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Бифункциональные аналоги, которые содержат два активных мотива алкилирования ДНК (т.е. CBI или CPI), содержат два мотива алкилирования (например, два CPI мотива), слитые вместе. Благодаря присутствию двух реакционноспособных мотивов алкилирования эти соединения являются активными кросс-линкерами ДНК, тогда как соединения только с одним мотивом алкилирования (например, дуокармицины) являются моно-алкилаторами ДНК.
Соединения, показанные выше, являются репрезентативными примерами из литературы и, как сообщается, являются мощными цитотоксинами: A ("Glycosidic Prodrugs of Highly Potent Bifunctional Duocarmycin Derivatives for Selective Treatment of Cancer", Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 7336-7339; "Duocarmycin Analogues Target Aldehyde Dehydrogenase 1 in Lung Cancer cells", Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 2874-2877; "Bifunctional prodrugs and drugs", WO 2011/054837, DE 10 2009 051 799; "The Two Faces of Potent Antitumor Duocarmycin-Based Drugs: A Structural Dissection Reveals Disparate Motifs for DNA versus Aldehyde Dehydrogenase 1 Affinity", Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 1-6); В ("Interstrand DNA Cross-linking with Dimers of the Spirocyclopripyl Alkylating Moiety of CC-1065", J. Am. Chem. SOC. 1989, 11 1, 6428-6429; "CC-1065 analogs having two CPI subunits useful as antitumor agents and ultraviolet light absorbers", Eur. Pat. Appl. (1990), EP 359454, также для соединений С и D); С ("Synthesis and DNA Cross-Linking by a Rigid CPI Dimer", J. Am. Chem. SOC. 1991, 113, 8994-8995; "Nucleotide Preferences for DNA Interstrand Cross-Linking Induced by the Cyclopropylpyrroloindol Analogue U-77,779", Biochemistry 1993, 32, 2592-2600; "Determination of the Structural Role of the Internal Guanine-Cytosine Base Pair in Recognition of a Seven-Base-Pair Sequence Cross-Linked by Bizelesin", Biochemistry 1995, 34, 11005-11016; "Analysis of the Monoalkylation and Cross-Linking Sequence Specificty of Bizelesin, a Bifunctional Alkylating Agent Related to (+)-CC-1065", J. Am. Chem. SOC. 1993, 115, 5925-5933; "Mapping of DNA Alkylating Sites Induced by Adozelesin and Bizelesin in Human Cells by Ligation-Mediated Polymerase Chain Reaction", Biochemistry 1994, 33, 6024-6030; "DNA Interstrand Cross-Links Induced by the Cyclopropylpyrroloindol Antitumor Agent Bizelesin Are Reversible upon Exposure to Alkali", Biochemistry 1993, 32, 9108-9114; "Replacement of the Bizelesin Ureadiyl Linkage by a Guanidinium Moiety Retards Translocation from Monoalkylation to Cross-Linking Sites on DNA", J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 3434-3442; "DNA interstrand cross-linking, DNA sequence specifity, and induced conformational changes produced by a dimeric analog of (+)-CC-1065", Anti-Cancer Drug Design (1991), 6, 427-452; "A phase I study of bizelesin, a highly potent and selective DNA interactive agent, in patients with advanced solid malignancies", Ann Oncol. 2003 May; 14(5):775-782; "A Phase I study of bizelesin (NSC 615291) in patients with advanced solid tumors", Clin Cancer Res. 2002, 3, 712-717; "Solution conformation of a bizelesin A-tract duplex adduct: DNA-DNA cross-linking of an A-tract straightens out bent DNA", J Mol Biol. 1995, 252, 86-101; "Preclinical pharmacology of bizelesin, a potent bifunctional analog of the DNA-binding antibiotic CC-1065", Cancer Chemother Pharmacol. 1994, 34, 317-322); и D ("CC-1065 analogs having two CPI subunits useful as antitumor agents and ultraviolet light absorbers", Eur. Pat. Appl. (1990), EP 359454). Активный мотив алкилирования ДНК в принципе может существовать либо в форме пролекарства, которое превращается в активное лекарственное средство в биологической среде, либо в его активном состоянии, которое не требует дальнейшего превращения. Превращение пролекарства в активное лекарственное средство для бифункциональных кросс-линкеров иллюстрируется на примере CBI димера ниже:
Соответствующее превращение происходит со всеми бифункциональными кросс-линкерами, которые существуют в их пролекарственных состояниях.
Известны другие бифункциональные кросс-линкеры ("Chemical and Biological Explorations of the Family of CC-1065 and the Duocarmycin Natural Products", Current Topics in Medicinal Chemistry, 2009, 9, 1494-1524; "DNA interstrand cross-linking agents and their chemotherapeutic potential", Curr Med Chem. 2012, 19, 364-385; "Design and Synthesis a Novel DNA-DNA Interstrand Adenine-Guanine Cross-Linking Agent", J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 4865-4866; "Effect of base sequence on the DNA cross-linking properties of pyrrolobenzodiazepine (PBD) dimers", Nucleic Acids Res. 2011, 39, 5800-5812; "Sequence-selective recognition of duplex DNA through covalent interstrand cross-linking: kinetic and molecular modeling studies with pyrrolobenzodiazepine dimers", Biochemistry, 2003, 42, 8232-8239; "Bifunctional alkylating agents derived from duocarmycin SA: potent antitumor activity with altered sequence selectivity", Bioorg Med Chem Lett. 2000, 10, 495-498; "Design, Syntesis and Cytotoxicity Evaluation of 1-Chloromethyl-5-hydroxy-1,2-dihydro-3H-benz[e]indole (seco-CBI) Dimers", Biojrganic & Medicinal Chemistry 2000, 8, 1607-1617).
Стратегия фосфатных пролекарств для мономерных seco-CBI содержащих цитотоксинов описана Zhao et al. ("Synthesis and biological evaluation of antibody conjugates of phosphate prodrugs of cytotoxic DNA alkylators for the targeted treatment of cancer", J. Med. Chem. 2012, 55, 766-782) и Zhang et al. ("Immunoconjugates containing phosphate-prodrugged DNA minor groove binding agents, compositions containing them, and methods of making them и their use for treating cancer", WO 2012/162482).
Некоторые CBI димеры ранее были описаны как полезные в качестве полезных нагрузок в ADC ("1-Chloromethyl-2,3-Dhydro-1H-Benzo[e]indole Dimer Antibody-Drug Conjugate Compounds, and Methods of Use and Treatment", WO 2015/023355).
При конъюгировании лекарственных средств с антителами, либо напрямую, либо посредством линкеров, учитываются различные факторы, включающие идентичность и местоположение химической группы для конъюгирования лекарственного средства, механизм высвобождения лекарственного средства, структурные элементы, обеспечивающие высвобождение лекарственного средства, и структурную модификацию высвобожденного свободного лекарственного средства. Кроме того, если нужно, чтобы лекарственное средство высвобождалось после интернализации антитела, то механизм высвобождения лекарственного средства должен быть совместимым с внутриклеточным транспортом конъюгата.
Хотя для доставки антителами было испытано большое количество лекарственных средств разных классов, лекарственные средства только нескольких классов в виде конъюгатов антитело-лекарственное средство оказались эффективными и одновременно сохраняющими подходящий профиль токсичности. Одним таким классом являются ауристатины, производные природного продукта доластатина 10. Репрезентативные ауристатины включают (N-метилвалин-валин-долаизолейцин-долапроин-норэфедрин) и (N-метилвалин-валин-долаизолейцин-долапроин-фенилаланин). Другие родственные тубулинсвязывающие агенты включают майтанзины (смотри, например, "Cell-binding agent-maytansinoid conjugates linked via a noncleavable linker, preparation methods, and methods using them for targeting specific cell populations", опубликованный как WO 2005/037992). Другие цитотоксические лекарственные средства, которые были использованы в связывании с антителами, включают ДНК-связывающие лекарственные средства, такие как калихеамицин, который вызывает последовательность-специфическое расщепление двухнитевой ДНК. Еще один класс ДНК-связывающих цитотоксических лекарственных средств, использованных в ADC, включает в себя димерные пирролобензодиазепины (смотри, например, "Preparation of unsymmetrical pyrriolobenzodiazepines dimers for inclusion in targeted conjugates", опубликованный как WO 2013/041606). Еще одним таким классом лекарственных средств, которые испытывали с целью доставки антителом, являются ДНК-связывающие алкилирующие агенты, такие как аналог дуокармицина СС-1065 (смотри "Preparation СС-1065 analogs and their conjugates for treatment of cancer", опубликованный как WO 2010/062171) и родственные соединения (смотри "Antibody-drug peptide conjugates for use as cytotoxins in cancer treatment", опубликованный как WO 2007/038658, и "Immunoconjugates containing phosphate-prodrugged DNA minor groove binding agents, compositions comprising them, and methods of making them and their use for treating cancer", опубликованный как WO 2012/162482). Однако все эти лекарственные средства имеют ограничения, связанные с симптомами заболевания и профилем лечения, и поэтому остается потребность в дополнительных лекарственных средствах с улучшенными свойствами, доставляемых посредством конъюгирования с антителом. Соответственно, согласно настоящему изобретению предложены новые ADC с димерами в качестве полезных нагрузок.
Другой гетероцикл, который известен как мощный ДНК-алкилирующий мотив, представлен группой "CTI" (CTI: 1,2,8,8а-тетрагидро-4Н-циклопропа[с]тиено[3,2-е]индол-4-он, "Fundamental relationships between structure, reactivity, and biological activity for the duocarmycins and CC-1065", J. Med. Chem. 2009, 52(19), 5771-5780, "Rational Design, Synthesis, and Evaluation of Key Analogues of CC-1065 and the Duocarmycins", J. AM. CHEM. SOC. 2007, 129, 14092-14099). CTI-содержащие мономеры дуокармицина были описаны как полезные нагрузки в ADC ("Synthesis functionalized thieno-indole derivs. optionally containing a peptidic residue for the treatment of cancer and their use in the preparation of conjugates", WO 2013/149946; "Preparation of new functionalized alkylating agents containing a thieno-indole moiety linked to a DNA-binding moiety for treating cancers and their use in the prepn. of conjugates", WO 2013/149948). Структурные различия между "CBI", "CPI и "CTI" показаны на следующих изображениях:
CBI, CPI и CTI отличаются друг от друга первым ароматическим кольцом, причем CBI имеет фенильный гетероцикл, CPI имеет пиррольный гетероцикл, и CTI имеет тиофеновый гетероцикл соответственно. На изображениях также показаны пролекарства-хлориды. Эти пролекарства превращаются в активное лекарственное средство в биологической среде в результате потери гидрохлорида. Следовательно, пролекарство-хлорид и активное циклопропильное соединение следует считать эквивалентами с точки зрения их биологической активности. Концепция хлоридных пролекарств для CBI, CPI и родственных групп хорошо задокументирована в литературе ("Design, Synthesis, and Evaluation of Duocarmycin O-Amino Phenol Prodrugs Subject", J. Med. Chem. 2010, 53, 7731-7738, и ссылка 8 там).
Что касается CTI группы, особенно интересны два структурных варианта, а именно группы Me-CTI и изо-Ме-CTI, показанные на следующих изображениях:
Обе группы Me-CTI и изо-Me-CTI были описаны применительно к дуокармицинам ("Chemical and biological explorations of the family of CC-1065 and the duocarmycin natural products", Curr Top Med Chem. 2009, 9(16), 1494-1524).
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение характеризует новые структурные димерные аналоги на основе CTI мотива. Изобретение также характеризует спейсерные элементы для соответствующих CTI димеров и CBI-CTI смешанных структур. Термины CBI и CTI использованы в отношении как варианта хлоридного пролекарства, так и активного циклопропильного соединения. Кроме того, описано замещение линкером этих димерных соединений, а также получение конъюгатов антитело-лекарственное средство.
Димеры, содержащие CTI мотив, неизвестны, и использование CTI димеров в настоящем изобретении приводит к значительным изменениям химической реакционной способности и биологических свойств по сравнению с ранее описанными димерными веществами. Следовательно, димеры, полученные с CTI, представляют собой отличающиеся лекарственные средства. В данном изобретении авторами охарактеризованы новые димеры, которые содержат либо две CTI группы, либо гибриды, которые несут на себе одну CBI группу и одну CTI группу. Кроме того, авторы описывают, как эти димерные вещества связаны с подходящими линкерными молекулами для присоединения к антителам.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к цитотоксическим димерам, содержащим димеры на основе CTI/CTI и/или на основе CTI/CBI (включая seco-формы CBI и CTI, которые подробно описаны в данном документе), к конъюгатам антитело-лекарственное средство, содержащим такие димеры, и к способам использования таковых для лечения рака и других показаний. Обе структуры CTI и CBI могут быть представлены их seco-формой и могут быть замещены и дериватизированы, как подробно изложено в данном документе. Кроме того, фенольная функциональная группа в seco-формах может быть дериватизирована ацетатными группами. Фенольные ацетатные функциональные группы функционально эквивалентны фенолу, так как ацетатные группы легко гидролизуются в биологической среде с образованием свободных фенолов.
Таким образом, настоящее изобретение относится к соединениям и фармацевтическим композициям, содержащим их, к их получению и к применению этих соединений в первую очередь, но не исключительно, в качестве противораковых агентов. Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к являющемуся "полезной нагрузкой" соединению формулы I:
или его фармацевтически приемлемой(ому) соли или сольвату, где:
1
2
каждый из F и F независимо выбран из кольцевых систем А, В, С, D, Е, F, G и Н:
где:
присутствует по меньшей мере одна из кольцевых систем А, В, С и D;
1
20
2
6
2
6
2
1
8
1
8
2
2
6
14
6
14
6
14
6
14
1
10
1
10
1
10
2
1
8
1
8
2
1
10
1
8
2
1
3
2
1
10
каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -С-Салкила, -С-Салкенила, -С-Салкинила, галогена, дейтерия, гидроксила, алкокси, -NH, групп -NH(С-Салкил), -N(С-Салкил), -NO, -С-Сарила и -С-Сгетероарила, где два или более R возможно соединены с образованием кольца или колец, и где указанные -С-Сарил и -С-Сгетероарил возможно замещены 1-5 заместителями, независимо выбранными из -C-Салкила, -C-Салкокси, -галогена, -C-Салкилтио, -трифторметила, -NH, групп -NH(C-Салкил), -N(С-Салкил), -С-С-алкил-N(С-Салкил), -С-Салкилтио, -NO или -C-Сгетероциклила, для каждой кольцевой системы, в которой имеется R;
1
1
каждый V независимо представляет собой связь, О, N(R) или S для каждой кольцевой системы, в которой имеется V;
2
2
каждый V независимо представляет собой О, N(R) или S для каждой кольцевой системы, в которой имеется V;
1
2
1
2
1
5
2
2
каждый из W и W независимо представляет собой Н, -С-Салкил, -фенил, -C(O)OR, -C(O)SR, -C(O)NHN(R) или -C(O)N(R) для каждой кольцевой системы, в которой имеются W и W;
каждый X независимо представляет собой -ОН, -О-ацил, азидо, галоген, цианат, тиоцианат, изоцианат, тиоизоцианат или  для каждой кольцевой системы, в которой имеется X;
1
6
2
2
2
2
2
1
20
1
8
6
14
1
10
3
8
1
20
2
1
20
1
8
6
14
1
10
3
8
1
20
2
A
A
A
A
A
A
A
A
A
каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из Н, групп -C-Салкил-R, -C(O)R, -C(S)R, -C(O)OR, -S(O)OR, -C(O)N(R), -C(S)N(R), гликозила, -NO, -PO(OR), аминокислоты и пептида, для каждой кольцевой системы, в которой имеется Y, где каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -С-Салкила, -С-Сгетероалкила, -С-Сарила, аралкила, -C-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила и группы -C-СалкилN(R), где указанные -С-Салкил, -С-Сгетероалкил, -С-Сарил, аралкил, -C-Сгетероциклил, -С-Скарбоциклил и -С-СалкилN(R) возможно замещены 1-3 заместителями, независимо выбранными из R;
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
1
8
1
8
2
2
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
1
8
1
8
2
2
каждый Z независимо выбран из группы, состоящей из Н, -C-Салкила, -С-Сгетероалкила, -С-Сарила, -аралкила, -C-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила, групп -С(O)ОС-Салкил, -С(O)N(С-Салкил), -С(O)ОН, -C(O)NHNH и -С(O)-галоген, и где указанные C-Салкил, -С-Сгетероалкил, -С-Сарил, -аралкил, -C-Cгетероциклил, -С-Скарбоциклил, -C(O)OC-Салкил, -С(O)N(С-Салкил), -С(O)ОН, -C(O)NHNH и -С(O)-галоген, каждый, возможно замещены 1-3 заместителями, независимо выбранными из R, для каждой кольцевой системы, в которой имеется Z;
1
2
1
2
каждый из L и L независимо выбран из прямой связи, карбонильной или карбонильной ацильной группы, связанной с F или F по ацильной группировке, где карбонильная ацильная группа выбрана из группы, состоящей из:
и  где
1
3
3
2
2
3
U выбран из Н, -СН, -ОН, -ОСН, -NO, -NH, -NHNHAc, -NHNHC(O)CH, группы -NHC(O)фенил или -галогена,
2
3
U представляет собой Н, -ОН или -ОСН,
3
3
2
5
U представляет собой Н, -СН или -СН,
4
3
U представляет собой Н или CHS-,
5
6
1
4
1
3
1
6
2
1
10
2
2
3
каждый из U и U независимо выбран из Н, -галогена, -С-Салкила, -С-Салкокси, -C-Сдиалкиламино, -NO, группы -NHC(O)С-Салкил, -ОН, -NH, -NHC(O)NH, -NHC(O)CH или -NHC(O)фенил,
1
Q представляет собой -О-, -S- или -NH-, и
2
3
каждый из Q и Q независимо представляет собой -СН- или -N-;
Т выбран из:
-NHC(O)-,
-C(O)NH-,
-С(O)O-,
-ОС(О)-,
B
1
C
B
C
B
C
1
1
1
8
2
2-3
2
n
-NR-Т-NR-, где каждый из R и R независимо представляет собой Н или -С-Салкил, или вместе R и R соединены с образованием кольца и вместе представляют собой (СН), где Т выбран из группы, состоящей из -С(О)-, -С(O)(СН)C(O)-, где n означает целое число от 0 до 50, и -C(O)PhC(O)-, где Ph означает 1,3- или 1,4-фенилен, и где Т возможно замещен 1-2 R,
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
2
2
D
E
-C(O)hetC(O)-, где het означает моно-, би- или трициклический гетероарил из 5-12 членов, содержащий один, два или три гетероатома, независимо выбранные из О, N, S, Р и В, где het возможно замещен 1-8 заместителями, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из -С-Салкила, -С-Сгетероалкила, -С-Сарила, аралкила, -C-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила, -NH, -NHR и -NO, и указанные возможные заместители на het возможно замещены R,
D
E
1
8
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
1
8
1
8
2
где каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -С-Салкила, группы -С(O)-С-Салкил, -С-Сгетероалкила, -С-Сарила, -аралкила, -С-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила, групп -С(O)ОС-Салкил, -С(O)N(С-Салкил) и -С(O)-галоген, возможно замещенных R,
E
E
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
1
8
1
8
2
где каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -C-Салкила, -С-Сгетероалкила, -С-Сарила, -аралкила, -C-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила, групп -С(O)OC-Салкил, -С(O)N(С-Салкил) и -С(O)-галоген, и где каждый R возможно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из R,
1
1
2
1
1
2
-С(А)Х-Т-XC(В)-, где Т представляет собой:
1
E
1
1
1
2
3
4
E
1
2
3
4
1
2
3
4
1
3
2
4
1
3
2
4
где каждый X независимо представляет собой связь, -NR-, -О- или -S-, где каждый из А и В независимо представляет собой =O или =S, где каждый из R, R, R и R независимо представляет собой R, или R и R образуют кольцевую систему, или R и R образуют кольцевую систему, или как R и R, так и R и R, каждые независимо, образуют кольцевые системы, или R и R образуют кольцевую систему, или R и R образуют кольцевую систему, или как R и R, так и R и R, каждые независимо, образуют кольцевые системы,
1
10
3
8
1
8
6
14
6
14
1
8
1
10
3
8
1
8
6
14
6
14
1
8
1
10
3
8
2
1
2
3
4
E
E
E
E
E
E
где указанные кольцевые системы независимо выбраны из -С-Сгетероциклила или -С-Скарбоциклила, или каждый из R, R, R и R представляет собой связь с разными атомами углерода на D, где каждый из g и j независимо означает целое число от 0 до 50, и m означает целое число от 1 до 50, и где D представляет собой связь или выбран из группы, состоящей из групп -S-, -С-Салкилен-, -С-Сарилен-, -С-Сгетероарилен-, -С-Сгетероалкилен-, -аралкилен, -C-Сгетероцикло и -С-Скарбоцикло, где указанные -С-Салкилен-, -С-Сарилен-, -С-Сгетероарилен-, -С-Сгетероалкилен-, -аралкилен, -C-Cгетероцикло и -С-Скарбоцикло возможно замещены -R, -C(O)R, -C(O)OR, -N(R), -N(R)C(O)R или -N(R)C(O)OR, и D дополнительно возможно замещен 1-2 R, и
1
2
2
1
2
1
1
2
-G-Т-G-, где каждый из G и G независимо представляет собой -S(O)X- или -S(O)X-.
В воплощениях изобретения переменная n означает число от 0 до 50, предпочтительно от 0 до 25, предпочтительно от 0 до 10 и предпочтительно от 1 до 5. Предпочтительно, переменная n может означать число 0, 1, 2, 3, 4 или 5.
A
A
A
A
2
2
1
20
1
20
2
В других воплощениях изобретения переменная -Y- представляет собой C(O)N(R) или C(S)N(R), где один R представляет собой водород или -С-Салкил, а другой R представляет собой -С-Салкил-N(R), так что образуется структура:
,
где А представляет собой кислород или серу.
1
2
3
4
Как указано выше, воплощения настоящего изобретения включают те соединения, где каждый из R, R, R и R представляет собой связь с разными атомами углерода на D. Когда D представляет собой 6-членное карбоциклическое кольцо (изображенное ниже жирными линиями), тогда это воплощение может принимать форму кубана:
Другие формы кубанов (например, замещенные формы, как указано в данном документе) и формы, не являющиеся кубанами, также возможны и входят в объем изобретения.
Согласно другому аспекту изобретения предложено соединение "линкер-полезная нагрузка" формулы IIA:
или его фармацевтически приемлемая(ый) соль или сольват, где:
Р представляет собой:
1
1
2
2
F-L-T-L-F,
где:
1
2
каждый из F и F независимо выбран из кольцевых систем А, В, С, D, Е, F, G и Н:
где:
присутствует по меньшей мере одна из кольцевых систем А, В, С и D;
1
20
2
6
2
6
2
1
8
1
8
2
2
6
14
6
14
6
14
6
14
1
10
1
10
1
10
2
1
8
1
8
2
1
10
1
8
2
1
3
2
1
10
каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -C-Салкила, -С-Салкенил, -С-Салкинила, галогена, дейтерия, гидроксила, алкокси, -NH, групп -NH(С-Салкил), -N(C-Салкил), -NO, -С-Сарила и -С-Сгетероарила, где два или более R возможно соединены с образованием кольца или колец, и где указанные -С-Сарил и -С-Сгетероарил возможно замещены 1-5 заместителями, независимо выбранными из -C-Салкила, -C-Салкокси, -галогена, -C-Салкилтио, -трифторметила, -NH, групп -NH(C-Салкил), -N(С-Салкил), -С-Салкил-N(С-Салкил), -C-Салкилтио, -NO или -С-Сгетероциклил, для каждой кольцевой системы, в которой имеется R;
1
1
каждый V независимо представляет собой связь, О, N(R) или S для каждой кольцевой системы, в которой имеется V;
2
2
каждый V независимо представляет О, N(R) или S для каждой кольцевой системы, в которой имеется V;
1
2
1
2
1
5
2
2
каждый из W и W независимо представляет собой Н, -С-Салкил, -фенил, -C(O)OR, -C(O)SR, -C(O)NHN(R) или -C(O)N(R) для каждой кольцевой системы, в которой имеются W и W;
каждый X независимо выбран из -ОН, группы -О-ацил, азидо, галогена, цианата, тиоцианата, изоцианата, тиоизоцианата или  для каждой кольцевой системы, в которой имеется X;
A
A
A
A
A
A
A
A
F
A
2
2
2
2
2
1
20
1
8
6
14
1
10
3
8
1
20
2
1
20
1
8
6
14
1
10
3
8
1
20
каждый Y независимо выбран из связи, Н, -C(O)R, -C(S)R, -C(O)OR, -S(O)OR, -C(O)N(R), -C(S)N(R), углевода, такого как гликозил, -NO, -P(O)(OR), аминокислоты и пептида (в частности, пептида, который расщепляется протеазами, такими как катепсины и матриксные металлопротеиназы) для каждой кольцевой системы, в которой имеется Y, где каждый R независимо выбран из Н, -С-Салкила, -С-Сгетероалкила, -С-Сарила, аралкила, -C-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила, групп -C-CaлкилN(R), -С-Салкилен, -C-Сгетероалкилен, -С-Сарилен, аралкилен, -C-Сгетероцикло, -С-Скарбоцикло и C-СалкилN(R)-, и R, где указанный R возможно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из R, и где один Y является двухвалентным и связан с L,
F
6
5
5
5
6
5
6
5
6
5
6
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
1
10
6
14
1
10
6
14
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
R представляет собой -N(R)QN(R)C(O)- и связан с L по карбонилу, расположенному рядом с N(R), где каждый из R и R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -C-Салкила, -С-Сгетероалкила, -С-Сарила, -аралкила, -C-Сгетероциклила и -С-Скарбоциклила, или R или R соединен с замещенным атомом углерода на Q с образованием -С-Сгетероциклического или -С-Сгетероарильного кольца, или R или R соединены вместе с образованием -C-Сгетероциклической или -С-Сгетероарильной кольцевой системы, и где Q представляет собой -C-Салкилен-, -С-Сгетероалкилен-, -С-Сарилен-, -аралкилен-, -С-Сгетероцикло- или -С-Скарбоцикло-, где каждый из Q, R и R независимо возможно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из R;
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
1
8
1
8
2
2
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
1
8
1
8
2
2
каждый Z независимо выбран из группы, состоящей из Н, -С-Салкила, -C-Сгетероалкила, -С-Сарила, -аралкила, -C-Cгетероциклила, -С-Скарбоциклила, групп -С(O)ОС-Салкил, -С(O)N(С-Салкил), -С(O)ОН, -C(O)NHNH и -С(O)-галоген, и где указанные C-Салкил, -С-Сгетероалкил, -С-Сарил, -аралкил, -C-Сгетероциклил, -С-Скарбоциклил, -С(O)ОС-Салкил, -С(O)N(С-Салкил), -С(O)ОН, -C(O)NHNH и -С(O)-галоген, каждый, возможно замещены 1-3 заместителями, независимо выбранными из R, для каждой кольцевой системы, в которой имеется Z;
1
2
1
2
каждый из L и L независимо выбран из прямой связи, карбонила или карбонильной ацильной группы, связанной с F или F по ацильной группировке, где карбонильная ацильная группа выбрана из группы, состоящей из:
и  где
1
3
3
2
2
3
U выбран из Н, -СН, -ОН, -ОСН, -NO, -NH, -NHNHAc, -NHNHC(O)CH, группы -NHC(O)фенил или -галогена,
2
3
U представляет собой Н, -ОН или -ОСН,
3
3
2
5
U представляет собой Н, -СН или -СН,
4
3
U представляет собой Н или CHS-,
5
6
1
4
1
3
1
6
2
1
10
2
2
3
каждый из U и U независимо выбран из Н, -галогена, -С-Салкила, -С-Салкокси, -C-Сдиалкиламино, -NO, группы -NHC(O)С-Салкил, -ОН, -NH, -NHC(O)NH, -NHC(O)CH или -NHC(O)фенил,
1
Q представляет собой -О-, -S- или -NH-, и
2
3
каждый из Q и Q независимо представляет собой -СН- или -N-;
Т выбран из:
-NHC(O)-,
-C(O)NH-,
-С(O)O-,
-ОС(О)-,
B
1
C
B
C
B
C
1
1
1
8
2
2-3
2
n
-NR-T-NR-, где каждый из R и R независимо представляет собой Н или -С-Салкил, или вместе R и R соединены с образованием кольца и вместе представляют собой (СН), где Т выбран из группы, состоящей из -С(О)-, -С(O)(СН)C(O)-, где n означает целое число от 0 до 50, и -C(O)PhC(O)-, где Ph означает 1,3- или 1,4-фенилен, и где Т возможно замещен 1-2 R,
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
2
2
D
E
-C(O)hetC(O)-, где het означает моно-, би- или трициклический гетероарил из 5-12 членов, содержащий один, два или три гетероатома, независимо выбранные из О, N, S, Р и В, где het возможно замещен 1-8 заместителями, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из -С-Салкила, -С-Сгетероалкила, -С-Сарила, аралкила, -С-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила, -NH, -NHR и -NO, и указанные возможные заместители на het возможно замещены R,
D
E
1
8
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
1
8
1
8
2
где каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -С-Салкила, группы -С(O)-С-Салкил, -С-Сгетероалкила, -С-Сарила, -аралкила, -С-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила, групп -С(O)ОС-Салкил, -С(O)N(С-Салкил) и -С(O)-галоген, возможно замещенных R,
E
E
1
8
1
8
1
10
3
8
1
8
1
8
2
где каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -C-Салкила, -С-Сгетероалкила, -арила, -аралкила, -С-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила, -С(O)ОС-Салкила, групп -С(O)N(С-Салкил) и -С(O)-галоген, и где каждый R возможно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из R,
1
1
2
1
1
2
-С(А)Х-Т-XC(В)-, где Т представляет собой:
1
E
1
1
1
2
3
4
E
1
2
3
4
1
2
3
4
1
3
2
4
1
3
2
4
1
2
3
4
E
E
E
E
E
E
1
10
3
8
1
8
6
14
6
14
1
8
1
10
3
8
1
8
6
14
6
14
1
8
1
10
3
8
2
где каждый X независимо представляет собой связь, -NR-, -О- или -S-, где каждый из А и В независимо представляет собой =O или =S, где каждый из R, R, R и R независимо представляет собой R или R и R образуют кольцевую систему, или R и R образуют кольцевую систему, или как R и R, так и R и R, каждые независимо, образуют кольцевые системы, или R и R образуют кольцевую систему, или R и R образуют кольцевую систему, или как R и R, так и R и R, каждые независимо, образуют кольцевые системы, где указанные кольцевые системы независимо выбраны из -C-Сгетероциклила или -С-Скарбоциклила, или каждый из R, R, R и R представляет собой связь с разными атомами углерода на D, где каждый из g и j независимо означает целое число от 0 до 50, и m означает целое число от 1 до 50, и где D представляет собой связь или выбран из группы, состоящей из групп -S-, -C-Салкилен-, -С-Сарилен-, -С-Сгетероарилен-, -С-Сгетероалкилен-, -аралкилен, -C-Сгетероцикло и -С-Скарбоцикло, где указанные -С-Салкилен-, -С-Сарилен-, -С-Сгетероарилен-, -С-Сгетероалкилен-, -аралкилен, -C-Сгетероцикло и -С-Скарбоцикло возможно замещены -R, -C(O)R, -C(O)OR, -N(R), -N(R)C(O)R или -N(R)C(O)OR, и D дополнительно возможно замещен 1-2 R, и
1
2
2
1
2
1
1
2
-G-Т-G-, где каждый из G и G независимо представляет собой -S(O)X- или -S(O)X-;
A
B
C
A
1-3
2
2
2
2
2
2
2
L представляет собой L-L-(L), где L выбран из группы, состоящей из -галогена, -N(R), -CON(R), группы -S-арил, возможно замещенной -NO или -CON(R), группы -S-гетероарил, возможно замещенной -NO, групп алкил-SO-гетероарил, арил-SO-гетероарил-,  и
B
B1
B2
B3
B1
1
6
1
6
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
2
2
1-6
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
2
1
6
2
2
1-6
2
1
6
1-6
1
6
1
6
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
1-4
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
1
6
1
6
2
2
1-20
L представляет собой L-L-L, где L отсутствует или представляет собой один или более чем один компонент, выбранный из группы, состоящей из групп -С(О)-, -C(S)-, -C(O)NR-, -С(O)С-Салкил-, -С(O)NRC-Салкил-, -С-Салкил(ОСНСН)-, -С(O)С-СалкилNRC(O)-, -С(O)С-Салкил(ОСНСН)-, -С-Салкил(ОСНСН)-С(О)-, -С-Салкил-S-S-С-СалкилNRC(O)СН-, -C-Салкил(ОСНСН)NRC(O)СН-, -С(O)С-Салкил-NRC(O)Салкил-, -N=CR-фенил-О-С-Салкил-, -N=СР-фенил-O-С-Салкил-С(O)-, -C(O)-C-Салкил(ОСНСН)NRC(O)-, -С(O)С-Салкил-фенил(NR-С(O)С-Салкил)-, -С(O)С-Салкил(ОСНСН)-NRC(O)С-Салкил-, -C-Салкил-, -S-, -С(О)-СН(NR-С(O)С-Салкил)-С-Салкил- и (-СН-СН-О-),
B2
15
15
0-12
o
p
где L представляет собой АА, где АА представляет собой природную аминокислоту, неприродную аминокислоту или -(CR)-S-S-(CR), где каждый из о и р независимо означает целое число от 1 до 20,
B3
2
n
L представляет собой -РАВА-, -РАВС-, -С(O)(СН)C(O)- или отсутствует;
C
1
6
3
8
3
8
1
6
1
6
2
1-4
2
1-4
1
6
1
6
2
1
6
1
6
1
6
1
6
L отсутствует или независимо выбран из группы, состоящей из групп -C-Салкилен-, -NRC-С-гетероциклилNR-, -NRC-С-карбоциклилNR-, -NRC-СалкилNR-, -NRC-Салкилен-, -S-, -NR-, -NRNR-, -O(CR)S-S(CR)N(R)-, -NRC-C-aлкилeнфeнилeнNR-, -NRC-СалкиленфениленSONR-, -OC-CaлкилS-SC-CaлкилC(COOR)NR-, -NRC(COOR)C-CaлкилS-SC-CaлкилO-,
и
где
А
Х представляет собой CR или N,
B
2
1-3
2
1-3
2
1-3
2
1-3
2
1-3
2
2
1-3
2
1-3
X представляет собой СН, CR(C(R))NR, CR(C(R))O, CR(C(R))C(O)NR, CR-(C(R))C(O)NRNR, CR(C(R))SONR, CR(C(R))NRNR, CR(C(R))NRC(O) или N,
C
каждый X представляет собой R,
D
2
1-5
каждый X представляет собой -(СН) - или отсутствует;
E
2
2
1-3
2
X представляет собой О, S, C(R), C(R)(C(R))-NR или NR, и
F
2
1-3
2
2
1-3
каждый X представляет собой (C(R))-NR или C(R)-(C(R))-O.
A
A
A
A
2
2
1
20
1
20
В других воплощениях изобретения переменная -Y- представляет собой C(O)N(R) или C(S)N(R), где один R представляет собой водород или -С-Салкил, а другой R представляет собой -С-Салкил-N(R)-, так что образуется структура:
где каждый А независимо представляет кислород или серу.
Согласно еще одному аспекту изобретения предложено соединение, представляющее собой конъюгат антитело-лекарственное средство, формулы IIIA:
или его фармацевтически приемлемая(ый) соль или сольват, где:
АВ представляет собой антитело;
Р представляет собой:
1
1
2
2
F-L-T-L-F,
где:
1
2
каждый из F и F независимо выбран из кольцевых систем А, В, С, D, Е, F, G и Н:
где:
присутствует по меньшей мере одна из кольцевых систем А, В, С и D;
1
20
2
6
2
6
2
1
8
1
8
2
2
6
14
6
14
6
14
6
14
1
10
1
10
1
10
2
1
8
1
8
2
1
10
1
8
2
1
3
2
1
10
каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -С-Салкила, -С-Салкенила, -С-Салкинила, галогена, дейтерия, гидроксила, алкокси, -NH, групп -NH(С-Салкил), -N(С-Салкил), -NO, -С-Сарила и -С-Сгетероарила, где два или более R возможно соединены с образованием кольца или колец, и где указанные -С-Сарил и -С-Сгетероарил возможно замещены 1-5 заместителями, независимо выбранными из -C-Салкила, -С-Салкокси, -галогена, -C-Салкилтио, -трифторметила, -NH, группы -NH(C-Салкил), -N(С-Салкил), -С-Салкил-N(С-Салкил), -С-Салкилтио, -NO или -С-Сгетероциклил, для каждой кольцевой системы, в которой имеется R;
1
1
каждый V независимо представляет собой связь, О, N(R) или S, для каждой кольцевой системы, в которой имеется V;
2
2
каждый V независимо представляет О, N(R) или S для каждой кольцевой системы, в которой имеется V;
1
2
1
2
1
5
2
2
каждый из W и W независимо представляет собой Н, -С-Салкил, -фенил, -C(O)OR, -C(O)SR, -C(O)NHN(R) или -C(O)N(R) для каждой кольцевой системы, в которой имеются W и W;
каждый X независимо выбран из -ОН, группы -О-ацил, азидо, галогена, цианата, тиоцианата, изоцианата, тиоизоцианата или  для каждой кольцевой системы, в которой имеется X;
A
A
A
A
A
A
A
A
F
A
2
2
2
2
2
1
20
1
8
6
14
1
10
3
8
1
20
2
1
20
1
8
6
14
1
10
3
8
1
20
каждый Y независимо выбран из связи, Н, -C(O)R, -C(S)R, -C(O)OR, -S(O)OR, -C(O)N(R), -C(S)N(R), углевода, такого как гликозил, -NO, -P(O)(OR), аминокислоты и пептида (в частности, пептида, который расщепляется протеазами, такими как катепсины и металлопротеиназы) для каждой кольцевой системы, в которой имеется Y, где каждый R независимо выбран из Н, -С-Салкила, -С-Сгетероалкила, -С-Сарила, аралкила, -C-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила, групп -С-СалкилN(R), -С-Салкилен, -С-Сгетероалкилен, -С-Сарилен, аралкилен, -C-Сгетероцикло, -С-Скарбоцикло и -С-СалкилN(R)-, и R, где указанный R возможно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из R, и где один Y является двухвалентным и связан с L,
F
6
5
5
5
6
5
6
5
6
5
6
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
1
10
6
14
1
10
6
14
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
R представляет собой -N(R)QN(R)C(O)- и связан с L по карбонилу, расположенному рядом с N(R), где каждый из R и R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -С-Салкила, -С-Сгетероалкила, -С-Сарила, -аралкила, -C-Сгетероциклила и -С-Скарбоциклила, или R или R соединен с замещенным атомом углерода на Q с образованием -C-Сгетероциклического или -С-Сгетероарильного кольца, или R и R соединены вместе с образованием -C-Сгетероциклической или -С-Сгетероарильной кольцевой системы, и где Q представляет собой -С-Салкилен-, -С-Сгетероалкилен-, -С-Сарилен-, -аралкилен-, -C-Сгетероцикло- или -С-Скарбоцикло-, где каждый из Q, R и R независимо возможно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из R;
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
1
8
1
8
2
2
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
1
8
1
8
2
2
каждый Z независимо выбран из группы, состоящей из Н, -С-Салкила, -С-Сгетероалкила, -С-Сарила, -аралкила, -C-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила, групп -С(O)ОС-Салкил, -С(O)N(С-Салкил), -С(O)ОН, -C(O)NHNH и -С(O)-галоген, и где указанные C-Салкил, -С-Сгетероалкил, -С-Сарил, -аралкил, -C-Сгетероциклил, -С-Скарбоциклил, -С(O)ОС-Салкил, -С(O)N(С-Салкил), -С(O)ОН, -C(O)NHNH и -С(O)-галоген, каждый, возможно замещены 1-3 заместителями, независимо выбранными из R, для каждой кольцевой системы, в которой имеется Z;
1
2
1
2
каждый из L и L независимо выбран из прямой связи, карбонила или карбонильной ацильной группы, связанной с F или F по ацильной группировке, где карбонильная ацильная группа выбрана из группы, состоящей из:
и  где
1
3
3
2
2
3
U выбран из Н, -СН, -ОН, -ОСН, -NO, -NH, -NHNHAc, -NHNHC(O)CH, группы -NHC(O)фенил или -галогена,
2
3
U представляет собой Н, -ОН или -ОСН,
3
3
2
5
U представляет собой Н, -СН или -СН,
4
3
U представляет собой Н или CHS-,
5
6
1
4
1
3
1
6
2
1
10
2
2
3
каждый из U и U независимо выбран из Н, -галогена, -С-Салкила, -C-Салкокси, -С-Сдиалкиламино, -NO, группы -NHC(O)С-Салкил, -ОН, -NH, -NHC(O)NH, -NHC(O)CH или -NHC(O)фенил,
1
Q представляет собой -О-, -S- или -NH-, и
2
3
каждый из Q и Q независимо представляет собой -СН- или -N-;
Т выбран из:
-NHC(O)-,
-C(O)NH-,
-С(O)O-,
-ОС(О)-,
B
1
C
B
C
B
C
1
1
1
8
2
2-3
2
n
-NR-T-NR-, где каждый из R и R независимо представляет собой Н или -С-Салкил, или вместе R и R соединены с образованием кольца и вместе представляют собой (СН), где Т выбран из группы, состоящей из -С(О)-, -С(O)(СН)C(O)-, где n означает целое число от 0 до 50, и -C(O)PhC(O)-, где Ph означает 1,3- или 1,4-фенилен, и где Т возможно замещен 1-2 R,
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
2
2
D
E
-C(O)hetC(O)-, где het означает моно-, би- или трициклический гетероарил из 5-12 членов, содержащий один, два или три гетероатома, независимо выбранные из О, N, S, Р и В, где het возможно замещен 1-8 заместителями, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из -С-Салкила, -С-Сгетероалкила, -С-Сарила, аралкила, -С-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила, -NH, -NHR и -NO, и указанные возможные заместители на het возможно замещены R,
D
E
1
8
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
1
8
1
8
2
где каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -C-Салкила, группы -С(O)-С-Салкил, -С-Сгетероалкила, -С-Сарила, -аралкила, -С-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила, групп -С(O)ОС-Салкил, -С(O)N(С-Салкил) и -С(O)-галоген, возможно замещенных R,
E
E
1
8
1
8
1
10
3
8
1
8
1
8
2
где каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -C-Салкила, -С-Сгетероалкила, -арила, -аралкила, -C-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила, групп -С(O)ОС-Салкил, -С(O)N(С-Салкил) и -С(O)-галоген, и где каждый R возможно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из R,
1
1
2
1
1
2
-С(А)Х-Т-XC(В)-, где Т представляет собой:
1
E
1
1
1
2
3
4
E
1
2
3
4
1
2
3
4
1
3
2
4
1
3
2
4
1
2
3
4
E
E
E
E
E
E
1
10
3
8
1
8
6
14
6
14
1
8
1
10
3
8
1
8
6
14
6
14
1
8
1
10
3
8
2
где каждый X независимо представляет собой связь, -NR-, -О- или -S-, где каждый из А и В независимо представляет собой =O или =S, где каждый из R, R, R и R независимо представляет собой R, или R и R образуют кольцевую систему, или R и R образуют кольцевую систему, или как R и R, так и R и R, каждые независимо, образуют кольцевые системы, или R и R образуют кольцевую систему, или R и R образуют кольцевую систему, или как R и R, так и R и R, каждые независимо, образуют кольцевые системы, где указанные кольцевые системы независимо выбраны из -C-Сгетероциклила или -С-Скарбоциклила, или каждый из R, R, R и R представляет собой связь с разными атомами углерода на D, где каждый из g и j независимо означает целое число от 0 до 50, и m означает целое число от 1 до 50, и где D представляет собой связь или выбран из группы, состоящей из групп -S-, -C-Салкилен-, -С-Сарилен-, -С-Сгетероарилен-, -С-Сгетероалкилен-, -аралкилен, -С-Сгетероцикло и -С-Скарбоцикло, где указанные -C-Салкилен-, -С-Сарилен-, -С-Сгетероарилен-, -C-Сгетероалкилен-, -аралкилен, -С-Сгетероцикло и -С-Скарбоцикло возможно замещены -R, -C(O)R, -C(O)OR, -N(R), -N(R)C(O)R или -N(R)C(O)OR, и D дополнительно возможно замещен 1-2 R, и
1
2
2
1
2
1
1
2
-G-Т-G-, где каждый из G и G независимо представляет собой -S(O)X- или -S(O)X-;
A
B
C
1-3
L представляет собой L-L-(L);
A
L выбран из следующего: связь с АВ, -NR-(связь с АВ), -гетероарил-(связь с АВ),
и
B
B1
B2
B3
L представляет собой L-L-L,
B1
1
6
1
6
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
2
2
1-6
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
2
1
6
2
2
1-6
2
1
6
1-6
1
6
1
6
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
1-4
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
1
6
1
6
2
2
1-20
где L отсутствует или представляет собой один или более чем один компонент, выбранный из группы, состоящей из групп -С(О)-, -C(S)-, -C(O)NR-, -C(O)C-Салкил-, -C(O)NRC-Cалкил-, -С-Салкил(ОСНСН)-, -C(O)C-СалкилNRC(O)-, -С(O)С-Салкил(ОСНСН)-, -С-Салкил(ОСНСН)-С(O)-, -С-Салкил-S-S-С-СалкилNRC(O)СН-, -C-Cалкил(OCHCH)NRC(O)CH-, -С(O)С-Салкил-NRC(O)Салкил-, -N=CR-фенил-O-C-Салкил-, -N=CR-фенил-O-С-Салкил-С(O)-, -C(O)-C-Cалкил(OCHCH)NRC(O)-, -С(O)С-Салкил-фенил(NR-C(O)C-Cалкил)-, -С(O)С-Салкил(ОСНСН)-NRC(O)C-Салкил-, -С-Салкил-, -S-, -C(O)-CH(NR-C(O)C-Cалкил)-C-Салкил- и (-CH-CH-O-),
B2
15
15
0-12
o
p
где L представляет собой АА, где АА представляет собой природную аминокислоту, неприродную аминокислоту или -(CR)-S-S-(CR), где каждый из о и р независимо означает целое число от 1 до 20,
B3
2
n
L представляет собой -РАВА-, -РАВС-, -С(O)(СН)C(O)- или отсутствует;
C
1
6
3
8
3
8
1
6
1
6
2
1-4
2
1-4
1
6
1
6
2
1
6
1
6
1
6
1
6
L отсутствует или независимо выбран из группы, состоящей из групп -С-Салкилен-, -NRC-С-гетероциклилNR-, -NRC-С-карбоциклилNR-, -NRC-CaлкилNR-, -NRC-Салкилен-, -S-, -NR-, -NRNR-, -O(CR)S-S(CR)N(R)-, -NRC-С-алкиленфениленNR-, -NRC-CaлкилeнфeнилeнSONR-, -ОС-CaлкилS-SC-CaлкилC(COOR)NR-, -NRC(COOR)C-CaлкилS-SC-CaлкилO-,
и
где
А
Х представляет собой CR или N,
B
2
1-3
2
1-3
2
1-3
2
1-3
2
1-3
2
2
1-3
2
1-3
X представляет собой СН, CR(C(R))NR, CR(C(R))O, CR(C(R))C(O)NR, CR-(C(R))C(O)NRNR, CR(C(R))SONR, CR(C(R))NRNR, CR(C(R))NRC(O) или N,
C
каждый X представляет собой R;
D
2
1-5
каждый X представляет собой -(CH)- или отсутствует;
E
2
2
1-3
2
X представляет собой О, S, C(R), C(R)(C(R))-NR или NR, и
F
2
1-3
2
2
1-3
каждый X представляет собой (C(R))-NR или C(R)-(C(R))-O.
Согласно другому аспекту изобретения предложено соединение "линкер-полезная нагрузка" формулы IIВ:
или его фармацевтически приемлемая(ый) соль или сольват, где:
1
2
каждый из F и F независимо выбран из кольцевых систем А, В, С, D, Е, F, G и Н:
где:
присутствует по меньшей мере одна из кольцевых систем А, В, С и D;
1
20
2
6
2
6
2
1
8
1
8
2
2
6
14
6
14
6
14
6
14
1
10
1
10
1
10
2
1
8
1
8
2
1
10
1
8
2
1
3
2
1
10
каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -С-Салкила, -С-Салкенила, -С-Салкинила, галогена, дейтерия, гидроксила, алкокси, -NH, групп -NH(С-Салкил), -N(С-Салкил), -NO, -С-Сарила и -С-Сгетероарила, где два или более R возможно соединены с образованием кольца или колец, и где указанные -С-Сарил и -С-Сгетероарил возможно замещены 1-5 заместителями, независимо выбранными из -C-Салкила, -C-Салкокси, -галогена, -C-Салкилтио, -трифторметила, -NH, групп -NH(C-Салкил), -N(С-Салкил), -С-Салкил-N(С-Салкил), -С-Салкилтио, -NO или -С-Сгетероциклила, для каждой кольцевой системы, в которой имеется R;
1
1
каждый V независимо представляет собой связь, О, N(R) или S для каждой кольцевой системы, в которой имеется V;
2
2
каждый V независимо представляет О, N(R) или S, для каждой кольцевой системы, в которой имеется V;
1
2
1
2
1
5
2
2
каждый из W и W независимо представляет собой Н, -С-Салкил, -фенил, -C(O)OR, -C(O)SR, -C(O)NHN(R) или -C(O)N(R) для каждой кольцевой системы, в которой имеются W и W;
каждый X независимо представляет -ОН, -О-ацил, азидо, галоген, цианат, тиоцианат, изоцианат, тиоизоцианат или  для каждой кольцевой системы, в которой имеется X;
1
6
2
2
2
2
2
1
20
1
8
6
14
1
10
3
8
1
20
2
1
20
1
8
6
14
1
10
3
8
1
20
2
A
A
A
A
A
A
A
A
A
каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из Н, групп -C-Салкил-R -C(O)R, -C(S)R, -C(O)OR, -S(O)OR -C(O)N(R), -C(S)N(R), углевода, такого как гликозил, -NO, -PO(OR), аминокислоты и пептида (в частности, пептида, который расщепляется протеазами, такими как катепсины и металлопротеиназы), для каждой кольцевой системы, в которой имеется Y, где каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -С-Салкила, -С-Сгетероалкила, -С-Сарила, аралкила, -C-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила и -С-СалкилN(R), где указанные -С-Салкил, -C-Сгетероалкил, -С-Сарил, аралкил, -С-Сгетероциклил, -С-Скарбоциклил и -С-СалкилN(R) возможно замещены 1-3 заместителями, независимо выбранными из R;
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
1
8
1
8
2
2
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
1
8
1
8
2
2
каждый Z независимо выбран из группы, состоящей из Н, -С-Салкила, -C-Сгетероалкила, -С-Сарила, -аралкила, -C-Cгетероциклила, -С-Скарбоциклила, групп -С(О)OC-Салкил, -С(O)N(С-Салкил), -С(O)ОН, -C(O)NHNH и -С(O)-галоген, и где указанные С-Салкил, -С-Сгетероалкил, -С-Сарил, -аралкил, -С-Сгетероциклил, -С-Скарбоциклил, -C(O)OC-Салкил, -С(O)N(С-Салкил), -С(O)ОН, -C(O)NHNH и -С(O)-галоген, каждый, возможно замещены 1-3 заместителями, независимо выбранными из R, для каждой кольцевой системы, в которой имеется Z;
1
2
1
2
каждый из L и L независимо выбран из прямой связи, карбонила или карбонильной ацильной группы, связанной с F или F по ацильной группировке, где карбонильная ацильная группа выбрана из группы, состоящей из:
и  где
1
3
3
2
2
3
U выбран из Н, -СН, -ОН, -ОСН, -NO, -NH, -NHNHAc, -NHNHC(O)CH, группы -NH-С(O)фенил или -галогена,
2
3
U представляет собой Н, -ОН или -ОСН,
3
3
2
5
U представляет собой Н, -СН или -СН,
4
3
U представляет собой Н или CHS-,
5
6
1
4
1
3
1
6
2
1
10
2
2
3
каждый из U и U независимо выбран из Н, -галогена, -С-Cалкила, -C-Салкокси, -C-Сдиалкиламино, -NO, группы -NHC(O)С-Салкил, -ОН, -NH, -NHC(O)NH, -NHC(O)CH или -NHC(O)фенил,
1
Q представляет собой -О-, -S- или -NH-, и
2
3
каждый из Q и Q независимо представляют собой -СН- или -N-;
Т выбран из:
1
1
2
1
1
2
-С(А)Х-Т-XC(В)-, где Т представляет собой:
1
E
1
1
1
2
3
4
E
1
2
3
4
1
2
3
4
1
3
2
4
1
3
2
4
1
2
3
4
E
1
10
3
8
1
8
6
14
6
14
1
8
1
10
3
8
1
8
6
14
6
14
1
8
1
10
3
8
где каждый X независимо представляет собой связь, -NR-, -О- или -S-, где каждый из А и В независимо представляет собой =O или =S, где каждый из R, R, R и R независимо представляет собой R, или R и R образуют кольцевую систему, или R и R образуют кольцевую систему, или как R и R, так и R и R, каждые независимо, образуют кольцевые системы, или R и R образуют кольцевую систему, или R и R образуют кольцевую систему, или как R и R, так и R и R, каждые независимо, образуют кольцевые системы, где кольцевые системы независимо выбраны из -C-Сгетероциклила или -С-Скарбоциклила, или каждый из R, R, R и R представляет собой связь с разными атомами углерода на D, где каждый из g и j независимо означает целое число от 0 до 50, и m означает целое число от 1 до 50, и где D выбран из группы, состоящей из групп -С-Салкилен-, -С-Сарилен-, -С-Сгетероарилен-, -С-Сгетероалкилен-, -аралкилен, -C-Сгетероцикло и -С-Скарбоцикло, где указанные -С-Салкилен-, -С-Сарилен-, -С-Сгетероарилен-, -С-Сгетероалкилен-, -аралкилен, -С-Сгетероцикло и -С-Скарбоцикло замещены одним членом группы, выбранным из N(R)C(O)-, где карбонил связан с L, и -С(О)-, где карбонил связан с L, и дополнительно возможно замещены 1-2 R;
E
E
1
8
1
8
1
10
3
8
1
8
1
8
2
где каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -С-Салкила, -С-Сгетероалкила, -арила, -аралкила, -С-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила, групп -С(О)OC-Салкил, -С(O)N(С-Салкил) и -С(O)-галоген, и где каждый R возможно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из R;
A
B
C
1-3
L представляет собой L-L-(L);
A
2
2
2
2
2
2
2
L выбран из -галогена, -N(R), -CON(R), группы -S-арил, возможно замещенной -NO или -CONR, группы -S-гетероарил, возможно замещенной -NO, групп алкил-SO-гетероарил, арилSO-гетероарил-,
и
B
B1
B2
B3
L представляет собой L-L-L,
B1
1
6
1
6
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
2
2
1-6
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
2
1
6
2
2
1-6
2
1
6
1-6
1
6
1
6
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
1-4
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
1
6
1
6
2
2
1-20
где L отсутствует или представляет собой один или более чем один компонент, выбранный из группы, состоящей из групп -С(О)-, -C(S)-, -C(O)NR-, -С(O)С-Салкил-, -С(O)NRC-Салкил-, -С-Салкил(ОСНСН)-, -С(O)С-CaлкилNRC(O)-, -С(O)С-Салкил(ОСНСН)-, -С-Салкил(ОСНСН)-С(О)-, -C-Салкил-S-S-C-CaлкилNRC(O)CH-, -C-Салкил(OCHCH)NRC(O)CH-, -C(O)C-Салкил-NRC(O)Cалкил-, -N=CR-фенил-О-С-Салкил-, -N=CR-фенил-O-С-Салкил-С(O)-, -C(O)-C-Салкил(OCHCH)NRC(O)-, -C(O)C-Салкил-фенил(NR-C(O)C-Салкил)-, -С(O)С-Салкил(ОСНСН)-NRC(O)С-Салкил-, -С-Салкил-, -S-, -С(O)-СН(NR-С(O)С-Салкил)-С-Салкил- и (-CH-CH-O-);
B2
15
15
0-12
o
p
L представляет собой АА, где АА представляет собой природную аминокислоту, неприродную аминокислоту или -(CR)-S-S-(CR) где каждый из о и р независимо означает целое число от 1 до 20,
B3
2
n
L представляет собой -РАВА-, -РАВС-, -C(O)(CH)C(O)- или отсутствует;
C
1
6
3
8
3
8
1
6
1
6
2
1-4
2
1-4
1
6
1
6
2
1
6
1
6
1
6
1
6
L отсутствует или независимо выбран из группы, состоящей из групп -C-Салкилен-, -NRC-С-гетероциклилNR-, -NRC-С-карбоциклилNR-, -NRC-СалкилNR-, -NRC-Салкилен-, -S-, -NR-, -NRNR-, -O(CR)S-S(CR)N(R)-, -NRC-C-aлкилeнфeнилeнNR-, -NRC-CaлкилeнфeнилeнSONR-, -ОС-CaлкилS-SC-CaлкилC(COOR)NR-, -NRC(COOR)C-CaлкилS-SC-CaлкилO-,
и
где
А
Х представляет собой CR или N,
B
2
1-3
2
1-3
2
1-3
2
1-3
2
1-3
2
2
1-3
2
1-3
X представляет собой СН, CR(C(R))NR, CR(C(R))O, CR(C(R))C(O)NR, CR-(C(R))C(O)NRNR, CR(C(R))SONR, CR(C(R))NRNR, CR(C(R))NRC(O) или N;
C
каждый X представляет собой R;
D
2
1-5
каждый X представляет собой -(CH)-- или отсутствует;
E
2
2
1-3
2
X представляет собой О, S, C(R), C(R)(C(R))-NR или NR, и
F
2
1-3
2
2
1-3
каждый X представляет собой (C(R))-NR или C(R)-(C(R))-O.
Согласно еще одному аспекту изобретения предложено соединение, представляющее собой конъюгат антитело-лекарственное средство, формулы IIIB:
или его фармацевтически приемлемая(ый) соль или сольват, где:
АВ представляет собой антитело;
1
2
каждый из F и F независимо выбран из кольцевых систем А, В, С, D, Е, F, G и Н:
где:
присутствует по меньшей мере одна из кольцевых систем А, В, С и D;
1
20
2
6
2
6
2
1
8
1
8
2
2
6
14
6
14
6
14
6
14
1
10
1
10
1
10
2
1
8
1
8
2
1
10
1
8
2
1
3
2
1
10
каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -С-Салкила, -С-Салкенила, -С-Салкинила, галогена, дейтерия, гидроксила, алкокси, -NH, групп -NH(С-Салкил), -N(С-Салкил), -NO, -С-Сарила и -С-Сгетероарила, где два или более R возможно соединены с образованием кольца или колец, и где указанные -С-Сарил и -С-Сгетероарил возможно замещены 1-5 заместителями, независимо выбранными из -C-Салкила, -С-Салкокси, -галогена, -C-Салкилтио, -трифторметила, -NH, групп -NH(C-Салкил), -N(С-Салкил), -С-Салкил-N(С-Салкил), -C-Салкилтио, -NO или -C-Сгетероциклила, для каждой кольцевой системы, в которой имеется R;
1
1
каждый V независимо представляет собой связь, О, N(R) или S для каждой кольцевой системы, в которой имеется V;
2
2
каждый V независимо представляет О, N(R) или S для каждой кольцевой системы, в которой имеется V;
1
2
1
2
1
5
2
2
каждый из W и W независимо представляет собой Н, -C-Салкил, -фенил, -C(O)OR, -C(O)SR, -C(O)NHN(R) или -C(O)N(R) для каждой кольцевой системы, в которой имеются W и W;
каждый X независимо представляет -ОН, -О-ацил, азидо, галоген, цианат, тиоцианат, изоцианат, тиоизоцианат или  для каждой кольцевой системы, в которой имеется X;
1
6
2
2
2
2
1
20
1
8
6
14
1
10
3
8
1
20
2
1
20
1
8
6
14
1
10
3
8
1
20
2
A
A
A
A
A
A
A
A
A
каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из Н, групп -C-Салкил-R, -C(O)R, -C(S)R, -C(O)OR, -S(O)OR, -C(O)N(R), -C(S)N(R), углевода, такого как гликозил, -NO, -PO(OR), аминокислоты и пептида (в частности, пептида, который расщепляется протеазами, такими как катепсины и металлопротеиназы), для каждой кольцевой системы, в которой имеется Y, где каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -С-Салкила, -C-Сгетероалкила, -С-Сарила, аралкила, -C-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила и группы -С-СалкилN(R), где указанные -С-Салкил, -C-Сгетероалкил, -С-Сарил, аралкил, -С-Сгетероциклил, -С-Скарбоциклил и -С-СалкилN(R) возможно замещены 1-3 заместителями, независимо выбранными из R;
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
1
8
1
8
2
2
1
8
1
8
6
14
1
10
3
8
1
8
1
8
2
2
каждый Z независимо выбран из группы, состоящей из Н, -С-Салкила, -С-Сгетероалкила, -С-Сарила, -аралкила, -C-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила, групп -С(O)ОС-Салкил, -С(O)N(С-Салкил), -С(O)ОН, -C(O)NHNH и -С(O)-галоген, и где указанные -С-Салкил, -С-Сгетероалкил, -С-Сарил, -аралкил, -C-Сгетероциклил, -С-Скарбоциклил, -С(O)ОС-Салкил, -С(O)N(С-Салкил), -С(O)ОН, -C(O)NHNH и -С(O)-галоген, каждый, возможно замещены 1-3 заместителями, независимо выбранными из R, для каждой кольцевой системы, в которой имеется Z;
1
2
1
2
каждый из L и L независимо выбран из прямой связи, карбонила или карбонильной ацильной группы, связанной с F или F по ацильной группировке, где карбонильная ацильная группа выбрана из группы, состоящей из:
и  где
1
3
3
2
2
3
U выбран из Н, -СН, -ОН, -ОСН, -NO, -NH, -NHNHAc, -NHNHC(O)CH, группы -NH-С(O)фенил или -галогена,
2
3
U представляет собой Н, -ОН или -ОСН,
3
3
2
5
U представляет собой Н, -СН или -СН,
4
3
U представляет собой Н или CHS-,
5
6
1
4
1
3
1
6
2
1
10
2
2
3
каждый из U и U независимо выбран из Н, -галогена, -С-Салкила, -С-Салкокси, -C-Сдиалкиламино, -NO, группы -NHC(O)С-Салкил, -ОН, -NH, -NHC(O)NH, -NHC(O)CH или -NHC(O)фенил,
1
Q представляет собой -О-, -S- или -NH-, и
2
3
каждый из Q и Q независимо представляет собой -СН- или -N-;
Т выбран из:
1
1
2
1
1
2
-С(А)Х-Т-XC(В)-, где Т представляет собой:
1
E
1
1
1
2
3
4
E
1
2
3
4
1
2
3
4
1
3
2
4
1
3
2
4
1
2
3
4
E
1
10
3
8
1
8
6
14
6
14
1
8
1
10
3
8
1
8
6
14
6
14
1
8
1
10
3
8
где каждый X независимо представляет собой связь, -NR-, -О- или -S-, где каждый из А и В независимо представляет собой =O или =S, где каждый из R, R, R и R независимо представляет собой R, или R и R образуют кольцевую систему, или R и R образуют кольцевую систему, или как R и R, так и R и R, каждые независимо, образуют кольцевые системы, или R и R образуют кольцевую систему, или R и R образуют кольцевую систему, или как R и R, так и R и R, каждые независимо, образуют кольцевые системы, где кольцевые системы независимо выбраны из -C-Cгетероциклила или -С-Скарбоциклила, или каждый из R, R, R и R представляет собой связь с разными атомами углерода на D, где каждый из g и j независимо означает целое число от 0 до 50, и m означает целое число от 1 до 50, и где D выбран из группы, состоящей из групп -C-Салкилен-, -С-Сарилен-, -С-Сгетероарилен-, -С-Сгетероалкилен-, -аралкилен, -C-Сгетероцикло и -С-Скарбоцикло, где указанные -С-Салкилен-, -С-Сарилен-, -С-Сгетероарилен-, -C-Сгетероалкилен-, -аралкилен, -C-Сгетероцикло и -С-Скарбоцикло замещены одним членом группы, выбранным из N(R)C(O)-, где карбонил связан с L, и -С(О)-, где карбонил связан с L, и дополнительно возможно замещены 1-2 R;
E
E
1
8
1
8
1
10
3
8
1
8
1
8
2
где каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -C-Салкила, -C-Сгетероалкила, -арила, -аралкила, -С-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила, групп -С(O)ОС-Салкил, -С(O)N(С-Салкил) и -С(O)-галоген, и где каждый R возможно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из R;
A
B
C
1-3
L представляет собой L-L-(L);
A
L выбран из следующего: связь с АВ, -NR-(связь с АВ), -гетероарил-(связь с АВ),
и
B
B1
B2
B3
L представляет собой L-L-L,
B1
1
6
1
6
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
2
2
1-6
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
2
1
6
2
2
1-6
2
1
6
1-6
1
6
1
6
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
1-4
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
1
6
1
6
2
2
1-20
где L отсутствует или представляет собой один или более чем один компонент, выбранный из группы, состоящей из групп -С(О)-, -C(S)-, -C(O)NR-, -С(O)С-Салкил-; -С(О)NRC-Салкил-, -С-Салкил(ОСНСН)-, -С(O)С-СалкилNRС(O)-, -С(O)С-Салкил(ОСНСН)-, -С-Салкил(ОСНСН)-С(O)-, -C-Салкил-S-S-C-CaлкилNRC(O)CH-, -C-Салкил(OCHCH)NRC(O)CH-, -C(O)C-Салкил-NRC(O)Cалкил-, -N=CR-фенил-O-C-Салкил-, -N=CR-фенил-O-С-Салкил-С(O)-, -C(O)-C-Салкил(OCHCH)NRC(O)-, -C(O)C-Салкил-фенил(NR-С(O)С-Салкил)-, -С(O)С-Салкил(ОСНСН)-NRC(O)C-Салкил-, -C-Салкил-, -S-, -С(O)-СН(NR-C(O)С-Салкил)-С-Салкил- и (-CH-CH-O-);
B2
15
15
0-12
o
p
L представляет собой АА, где АА представляет собой природную аминокислоту, неприродную аминокислоту или -(CR)-S-S-(CR), где каждый из о и р независимо означает целое число от 1 до 20,
B3
2
n
L представляет собой -РАВА-, -РАВС-, -С(O)(СН)C(O)- или отсутствует;
C
1
6
3
8
3
8
1
6
1
6
2
1-4
2
1-4
1
6
1
6
2
1
6
1
6
1
6
1
6
L отсутствует или независимо выбран из группы, состоящей из групп -C-Салкилен-, -NRC-C-гетероциклилNR-, -NRC-С-карбоциклилNR-, -NRC-СалкилNR-, -NRC-Салкилен-, -S-, -NR-, -NRNR-, -O(CR)S-S(CR)N(R)-, -NRC-СалкиленфениленNR-, -NRC-СалкиленфениленSONR-, -ОС-СалкилS-SС-СалкилС(СООR)NR-, -NRC(COOR)C-СалкилS-SС-СалкилО-,
и
где
A
Х представляет собой CR или N,
B
2
1-3
2
1-3
2
1-3
2
1-3
2
1-3
2
2
1-3
2
1-3
X представляет собой СН, CR(C(R))NR, CR(C(R))O, CR(C(R))C(O)NR, CR-(C(R))C(O)NRNR, CR(C(R))SONR, CR(C(R))NRNR, CR(C(R))NRC(O) или N;
C
каждый X представляет собой R;
D
2
1-5
каждый X представляет собой -(CH)- или отсутствует;
E
2
2
1-3
2
X представляет собой О, S, C(R), C(R)(C(R))-NR или NR, и
F
2
1-3
2
2
1-3
каждый X представляет собой (C(R))-NR или C(R)-(C(R))-O.
Дополнительные аспекты изобретения включают соединения, такие как соединения, упомянутые в данном документе, где
1
20
2
каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, дейтерия, -С-Салкила и -NH;
1
1
каждый V независимо представляет О или N(R) для каждой кольцевой системы, в которой имеется V;
2
2
каждый V независимо представляет О или N(R) для каждой кольцевой системы, в которой имеется V;
1
2
1
2
1
5
2
каждый из W и W независимо представляет собой Н, -С-Салкил, -C(O)OR или -C(O)NR для каждой кольцевой системы, в которой имеются W и W;
каждый X независимо представляет галоген для каждой кольцевой системы, в которой имеется X;
A
A
A
A
2
2
2
1
20
1
8
3
8
1
20
2
1
20
1
8
3
8
1
20
2
каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из Н, -C(O)R, -C(O)N(R), углевода, такого как гликозил, -NO, -PO(OR) и аминокислоты (например, пептида, в частности пептида, который расщепляется протеазами, такими как катепсины и матриксные металлопротеиназы) для каждой кольцевой системы, в которой имеется Y, где каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -С-Салкила, -С-Сгетероалкила, -С-Скарбоциклила и группы -С-СалкилN(R), где указанные -С-Салкил, -С-Сгетероалкил, -С-Скарбоциклил и -С-СалкилN(R) возможно замещены 1-3 заместителями, независимо выбранными из R;
1
2
каждый из L и L независимо выбран из прямой связи и карбонила; и
Т выбран из:
B
1
C
B
C
1
8
-NR-Т-NR-, где каждый из R и R независимо представляет собой Н или -С-Салкил,
1
8
2
2
1
8
-C(O)hetC(O)-, где het означает моноциклический гетероарил из 5-12 членов, содержащий один или два гетероатома, независимо выбранные из О, N и S, где het возможно замещен 1-8 заместителями, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из -С-Салкила, -NH и -NH, и указанные возможные заместители на het возможно замещены -С-Салкилом, и
1
1
2
1
1
2
-С(А)Х-Т-XC(В)-, где Т представляет собой:
1
1
1
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
3
2
4
1
3
2
4
1
10
3
8
1
8
6
14
6
14
1
10
3
8
1
8
6
14
6
14
1
10
3
8
2
где каждый X представляет собой связь, где каждый из А и В независимо представляет собой =O, где каждый из R, R, R и R независимо представляет собой Н, или R и R образуют кольцевую систему, или R и R образуют кольцевую систему, или как R и R, так и R и R, каждые независимо образуют кольцевые системы, или R и R образуют кольцевую систему, или R и R образуют кольцевую систему, или как R и R, так и R и R, каждые независимо, образуют кольцевые системы, где указанные кольцевые системы независимо выбраны из -C-Сгетероциклила или -С-Скарбоциклила, и где D представляет собой связь или выбран из группы, состоящей из групп -S-, -C-Салкилен-, -С-Сарилен-, -С-Сгетероарилен-, -C-Сгетероцикло и -С-Скарбоцикло, где указанные -С-Салкилен-, -С-Сарилен-, -С-Сгетероарилен-, -C-Сгетероцикло и -С-Скарбоцикло возможно замещены -NH, -N(R)C(O)H или -N(R)C(O)OH.
Дополнительные аспекты изобретения включают соединения, такие как соединения, упомянутые в данном документе, где два или более R возможно соединены с образованием кольца или колец.
Дополнительные аспекты изобретения включают соединения, такие как соединения, упомянутые в данном документе, где
1
20
2
каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, дейтерия, -С-Салкила и -NH;
1
1
каждый V независимо представляет О или N(R) для каждой кольцевой системы, в которой имеется V;
2
2
каждый V независимо представляет О или N(R) для каждой кольцевой системы, в которой имеется V;
1
2
1
2
1
5
2
каждый из W и W независимо представляет собой Н, -С-Салкил, -C(O)OR или -C(O)NR для каждой кольцевой системы, в которой имеются W и W;
каждый X независимо представляет галоген для каждой кольцевой системы, в которой имеется X;
A
A
A
A
A
A
A
A
F
A
2
2
2
2
2
1
20
1
8
6
14
1
10
3
8
1
20
2
1
20
1
8
6
14
1
10
3
8
1
20
каждый Y независимо выбран из связи, Н, -C(O)R -C(S)R, -C(O)OR, -S(O)OR, -C(O)N(R), -C(S)N(R), углевода, такого как гликозил, -NO, -P(O)(OR), аминокислоты и пептида (в частности, пептида, который расщепляется протеазами, такими как катепсины и металлопротеиназы), для каждой кольцевой системы, в которой имеется Y, где каждый R независимо выбран из Н, -С-Салкила, -С-Сгетероалкила, -С-Сарила, аралкила, -С-Сгетероциклила, -С-Скарбоциклила, группы -С-СалкилN(R), -C-Салкилена, -С-Сгетероалкилена, -С-Сарилена, аралкилена, -С-Сгетероцикло, -С-Скарбоцикло и -С-СалкилN(R)-, и R, где указанный R возможно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из R, и где один Y является двухвалентным и связан с L,
F
6
5
5
5
6
5
6
5
6
5
6
1
8
1
8
1
10
6
14
1
10
6
14
1
8
6
14
3
8
R представляет собой -N(R)QN(R)C(O)- и связан с L по карбонилу, расположенному рядом с N(R), где каждый из R и R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -С-Салкила и -С-Сгетероалкила, или R или R соединен с замещенным атомом углерода на Q с образованием -C-Сгетероциклического или -С-Сгетероарильного кольца, или R и R соединены вместе с образованием -С-С гетероциклической или -С-Сгетероарильной кольцевой системы, и где Q представляет собой -С-Салкилен-, -С-Сарилен- или -С-Скарбоцикло-, где каждый из Q, R и R независимо возможно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из R;
1
2
каждый из L и L независимо выбран из прямой связи и карбонила;
и Т выбран из:
B
1
C
B
C
1
8
-NR-Т-NR-, где каждый из R и R независимо представляет собой Н или -С-Салкил,
1
8
2
2
1
8
-C(O)hetC(O)-, где het означает моноциклический гетероарил из 5-12 членов, содержащий один или два гетероатома, независимо выбранные из О, N и S, где het возможно замещен 1-8 заместителями, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из -С-Салкила, -NH и -NH, и указанные возможные заместители на het возможно замещены -С-Салкилом, и
1
1
2
1
1
2
-С(А)Х-Т-XC(В)-, где Т представляет собой:
1
1
1
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
3
2
4
1
3
2
4
1
10
3
8
1
8
6
14
6
14
1
10
3
8
1
8
6
14
6
14
1
10
3
8
2
где каждый X представляет собой связь, где каждый из А и В независимо представляет собой =O, где каждый из R, R, R и R независимо представляет собой Н, или R и R образуют кольцевую систему, или R и R образуют кольцевую систему, или как R и R, так и R и R, каждые независимо, образуют кольцевые системы, или R и R образуют кольцевую систему, или R и R образуют кольцевую систему, или как R и R, так и R и R, каждые независимо, образуют кольцевые системы, где указанные кольцевые системы независимо выбраны из -C-Сгетероциклила или -С-Скарбоциклила, и где D представляет собой связь или выбран из группы, состоящей из групп -S-, -С-Салкилен-, -С-Сарилен-, -С-Сгетероарилен-, -C-Сгетероцикло и -С-Скарбоцикло, где указанные -С-Салкилен-, -С-Сарилен-, -С-Сгетероарилен-, -С-Сгетероцикло и -С-Скарбоцикло возможно замещены -NH, -N(R)C(O)H или -N(R)C(O)OH.
Дополнительные аспекты изобретения включают соединения, такие как соединения, упомянутые в данном документе, где
1
20
2
каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, дейтерия, -C-Салкила и -NH;
1
1
каждый V независимо представляет О или N(R) для каждой кольцевой системы, в которой имеется V;
2
2
каждый V независимо представляет О или N(R) для каждой кольцевой системы, в которой имеется V;
1
2
1
2
1
5
2
каждый из W и W независимо представляет собой Н, -С-Салкил, -C(O)OR или -C(O)NR для каждой кольцевой системы, в которой имеются W и W;
каждый X независимо представляет галоген для каждой кольцевой системы, в которой имеется X;
A
A
A
A
2
2
2
1
20
1
8
3
8
1
20
2
1
20
1
8
3
8
1
20
2
каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из Н, -C(O)R, -C(O)N(R), углевода, такого как гликозил, -NO, -PO(OR), аминокислоты и пептида (в частности, пептида, который расщепляется протеазами, такими как катепсины и металлопротеиназы), для каждой кольцевой системы, в которой имеется Y, где каждый R независимо выбран из группы, состоящей из Н, -С-Салкила, -С-Сгетероалкила, -С-Скарбоциклила и группы -С-СалкилN(R), где указанные -C-Салкил, -C-Сгетероалкил, -С-Скарбоциклил и -С-СалкилN(R) возможно замещены 1-3 заместителями, независимо выбранными из R;
1
2
каждый из L и L независимо выбран из прямой связи и карбонила; и
1
1
2
1
1
2
Т представляет собой -С(А)Х-Т-ХС(В)-, где Т представляет собой:
1
1
1
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
3
2
4
1
3
2
4
1
10
3
8
1
8
6
14
6
14
1
10
3
8
1
8
6
14
6
14
1
10
3
8
2
где каждый X представляет собой связь, где каждый из А и В независимо представляет собой =O, где каждый из R, R, R и R независимо представляет собой Н, или R и R образуют кольцевую систему, или R и R образуют кольцевую систему, или как R и R, так и R и R, каждые независимо, образуют кольцевые системы, или R и R образуют кольцевую систему, или R и R образуют кольцевую систему, или как R и R, так и R и R, каждые независимо, образуют кольцевые системы, где указанные кольцевые системы независимо выбраны из -C-Сгетероциклила или -С-Скарбоциклила, и где D представляет собой связь или выбран из группы, состоящей из групп -S-, -С-Салкилен-, -С-Сарилен-, -С-Сгетероарилен-, -C-Сгетероцикло и -С-Скарбоцикло, где указанные -С-Салкилен-, -С-Сарилен-, -С-Сгетероарилен-, -C-Cгетероцикло и -С-Скарбоцикло возможно замещены -NH, -N(R)C(O)H или -N(R)C(O)OH.
Дополнительные аспекты изобретения включают соединения, такие как соединения, упомянутые в данном документе, где
A
2
2
2
2
2
2
2
L выбран из группы, состоящей из -галогена, -N(R), -CON(R), группы -S-арил, возможно замещенной -NO или -CON(R), группы -S-гетероарил, возможно замещенной -NO, групп алкил-SO-гетероарил, арилSO-гетероарил- и
B
B1
B2
B3
B1
B2
15
B3
1
6
1
6
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
2
2
1-6
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
2
1
6
2
2
1-6
2
1
6
1-6
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
1-4
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
1
6
1
6
2
2
1-20
0-12
15
o
p
2
n
L представляет собой L-L-L, где L отсутствует или представляет собой один или более чем один компонент, выбранный из группы, состоящей из групп -C(O)-, -C(S)-, -C(O)NR-, -C(O)С-Салкил-, -С(O)NRС-Салкил-, -C-Салкил(ОСНСН)-, -C(O)C-СалкилNRC(O)-, -C(O)С-Салкил(ОСНСН)-, -С-Салкил(ОСНСН)-C(O)-, -С-Салкил-S-S-С-СалкилNRC(O)CH-, -С-Салкил(ОСНСН)NRC(O)СН-, -C(O)C-Cалкил-NRC(O)Салкил-, -C(O)-C-Салкил(OCHCH)NRC(O)-, -C(O)C-Caлкил-фeнил(NR-C(O)C-Caлкил)-, -C(O)C-Caлкил(OCHCH)-NRC(O)C-Caлкил-, -С-Салкил-, -S-, -C(O)-CH(NR-C(O)С-Салкил)-С-Салкил- и (-CH-CH-O-), где L представляет собой АА, где АА представляет собой природную аминокислоту, неприродную аминокислоту или -(CR)-S-S-(CR) где каждый из о и p независимо означает целое число от 1 до 20, и L представляет собой -РАВА-, -РАВС-, -C(O)(CH)C(O)- или отсутствует; и
C
L отсутствует.
A
Дополнительные аспекты изобретения включают конъюгаты антитело-лекарственное средство, такие как те, которые упомянуты в данном документе, где L выбран из следующего: связь с АВ, -NR-(связь с АВ), -гетероарил-(связь с АВ),
и
B
B1
B2
B3
B1
B2
15
15
B3
1
6
1
6
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
2
2
1-6
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
2
1
6
2
2
1-6
2
1
6
1
6
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
1-4
1
6
2
2
1-6
1
6
1
6
1
6
1
6
2
2
1-20
0-12
o
p
2
n
L представляет собой L-L-L, где L отсутствует или представляет собой один или более чем один компонент, выбранный из группы, состоящей из групп -С(О)-, -C(S)-, -C(O)NR-, -C(O)С-Салкил-, -С(O)NRC-Салкил-, -С-Салкил(ОСНСН)-, -С(O)С-СалкилNRC(O)-, -C(O)С-Салкил(ОСНСН)-, -С-Салкил(OCHCH)-С(О)-, -C-Caлкил-S-S-C-CaлкилNRC(O)CH-, -С-Сaлкил(OCHCH)NRC(O)CH-, -C(O)С-Салкил-NRC(O)С-Салкил-, -C(O)-С-Салкил(OCHCH)NRC(O)-, -C(O)С-Салкил-фенил(NR-C(O)С-Салкил)-, -С(O)С-Салкил(ОСНСН)-NRC(O)С-Салкил-, -С-Салкил-, -S-, -С(О)-СН(NR-C(O)С-Салкил)-С-Салкил- и (-CH-CH-O-), где L представляет собой АА, где АА представляет собой природную аминокислоту, неприродную аминокислоту или -(CR)-S-S-(CR) где каждый из о и p независимо означает целое число от 1 до 20, и L представляет собой -РАВА-, -РАВС-, -C(O)(CH)C(O)- или отсутствует.
F
Дополнительные аспекты изобретения включают соединения, такие как соединения, упомянутые в данном документе, где R выбран из:
и
D
D
где q означает 1-10, и каждый b независимо представляет CR, N, NR, О или S.
1
3
Дополнительные аспекты изобретения включают соединения, такие как соединения, упомянутые в данном документе, где один или более W представляют собой C-Cалкил.
Дополнительные аспекты изобретения включают соединения, такие как соединения, упомянутые в данном документе, где X представляет собой хлор.
1
10
Дополнительные аспекты изобретения включают соединения, такие как соединения, упомянутые в данном документе, где один Y представляет собой Н или -C(O)С-Cалкил.
Дополнительные аспекты изобретения включают соединения, такие как соединения, упомянутые в данном документе, где один или более Z представляют собой Н.
Дополнительные аспекты изобретения включают соединения, такие как соединения, упомянутые в данном документе, где Т выбран из амида или амино-связывающая группировка-амино формулы -NH-C(O)-NH- или -NH-C(O)-het-C(O)-NH-.
Дополнительные аспекты изобретения включают соединения, такие как соединения, упомянутые в данном документе, где амид представляет собой -C(O)NH- или -NHC(O)-.
Дополнительные аспекты изобретения включают соединения, такие как соединения, упомянутые в данном документе, где het означает гетероарил, выбранный из пиррол-2,5-диила-, фур-2,5-диила-, индол-2,5-диила, бензофуран-2,5-диила и 3,6-дигидробензо[1,2-b:4,3-b]дипиррол-2,7-диила.
1
10
Дополнительными аспектами изобретения являются те соединения, которые перечислены в данном документе, где применимо одно или более из следующего: W представляет собой метил; X представляет собой галоген; Y представляет собой водород или -COR, где R представляет собой C-Cалкил; и Z представляет собой водород.
Изобретение также охватывает соединение, как оно описано в данном документе, где Т выбран из амида (т.е. -C(O)NH- или -NHC(O)-); или амино-связывающая группировка-амино формулы -NH-T'-NH, где Т' представляет собой карбонил или -C-(O)-het-C(O)-. Если Т представляет собой амино-связывающая группировка-амино формулы NH-T'-NH, то Т' может представлять собой карбонил (т.е. -С-(О)-) или -C(O)-het-C(O)-, где het представляет собой гетероарил, выбранный из пиррол-2-,5-диила-, фур-2,5-диила-, индол-2,5-диила, бензофуран-2,5-диила или 3,6-дигидробензо[1,2-b:4,3-b]дипиррол-2,7-диила.
1
2
Воплощениями изобретения также охвачены те соединения, которые описаны в данном документе, где L и L выбраны из 2-карбонилиндол-5-ила, 2-карбонил-6-гидрокси-7-метоксииндол-5-ила, 2-карбонил-1,2,3,6-тетрагидробензо[1,2-b:4,3-b]дипиррол-7-ила, 2-карбонил-4-гидрокси-5-метокси-1,2,3,6-тетрагидробензо[1,2-b:4,3-b']дипиррол-7-ила и 2-карбонил-4-гидрокси-5-метокси-1,2,3,6-тетрагидробензо[1,2-b:4,3-b']дипиррол-7-ила.
A
Еще один аспект изобретения охватывает соединения, которые описаны в данном документе, где L представляет собой
Изобретение также охватывает соединения линкер-полезная нагрузка или конъюгаты антитело-лекарственное средство, содержащие радикал являющихся полезной нагрузкой соединений, описанных в данном документе.
Более того, изобретение охватывает фармацевтические композиции соединений и любых их фармацевтически приемлемых солей или сольватов, описанных в данном документе, где фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый эксципиент.
Изобретение также относится к способам лечения рака, включающим введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества одного или более соединений, описанных в данном документе, или фармацевтической композиции или композиций, содержащих одно или более этих соединений.
Некоторые соединения, включая полезные нагрузки, соединения линкер-полезная нагрузка и ADC, изображенные в данном документе, показаны в конкретной стереоизомерной форме. Однако предусматривается, что изобретение охватывает все стереоизомерные формы этих соединений. Например, соединение с двумя стереоизомерными центрами может быть изображено как R,S форма соединения, но изобретение охватывает все стереоизомерные формы, например, R,R; R,S; S,R и S,S.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение относится к цитотоксическим бифункциональным соединениям, к конъюгатам антитело-лекарственное средство (ADC), содержащим указанные цитотоксические бифункциональные соединения, и к способам использования таковых для лечения рака и других патологических состояний. Изобретение также относится к способам использования таких соединений и/или конъюгатов in vitro, in situ и in vivo для обнаружения, диагностики или лечения клеток млекопитающих или ассоциированных патологических состояний.
Определения и сокращения
Если не указано иное, использованные в данном документе термины и фразы имеют указанные ниже значения. При использовании в данном документе торговых наименований эти торговые наименования включают состав продукта, непатентованное лекарственное средство и активный(ые) фармацевтический(ие) ингредиент(ы) продукта под этим торговым наименованием, если из контекста не следует иное.
Термин "антитело" (или "Ab") использован в самом широком смысле и конкретно охватывает интактные моноклональное антитела, поликлональные антитела, моноспецифические антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, которые проявляют желаемую биологическую активность. Интактное антитело имеет, прежде всего, две области: вариабельную область и константную область. Вариабельная область связывается и взаимодействует с антигеном-мишенью. Вариабельная область включает в себя область, определяющую комплементарность (CDR), которая распознает и связывается с сайтом специфического связывания на конкретном антигене. Константная область может распознаваться иммунной системой и взаимодействовать с ней (смотри, например, Janeway et al., 2001, Immuno. Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York). Антитело может быть любого типа или класса (например, IgG, IgE, IgM, IgD и IgA) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2). Антитело может иметь происхождение из любого подходящего вида. В некоторых воплощениях антитело имеет человеческое или мышиное происхождение. Антитело может быть, например, человеческим, гуманизированным или химерным.
7
-1
Термины "специфически связывается" и "специфическое связывание" относятся к связыванию антитела с предопределенным антигеном. В типичных случаях антитело связывается с аффинностью по меньшей мере 1×10 М, и связывается с предопределенным антигеном с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза больше, чем его аффинность к связыванию с неспецифическим антигеном (например, BSA (бычий сывороточный альбумин), казеин), иным чем предопределенный антиген или близкородственный антиген.
Термин "моноклональное антитело" в данном документе относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, идентичны, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими, направленными против единственного антигенного сайта. Определение "моноклональное" указывает на природу антитела как полученного из по существу гомогенной популяции антител, и его не следует толковать как требующее продуцирования каким-либо конкретным способом.
Термин "моноклональные антитела" конкретно охватывает "химерные" антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной с соответствующей последовательностью антител из конкретного вида или антител, принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, а остальная часть цепи(ей) является идентичной или гомологичной с соответствующими последовательностями антител из других видов или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, если они проявляют желаемую биологическую активность.
L
H1
H2
H3
H4
"Интактное антитело" представляет собой антитело, которое содержит антигенсвязывающую вариабельную область, а также константный домен легкой цепи (C) и константные домены тяжелой цепи, C, C, C и C, в зависимости от ситуации для данного класса антител. Константные домены могут представлять собой константные домены нативной последовательности (например, константные домены нативной последовательности человека) или варианты их аминокислотных последовательностей.
Интактное антитело может иметь одну или более "эффекторных функций", которые относятся к тем биологическим активностям, которые присущи Fc-области (например, Fc-области нативной последовательности или Fc-области варианта аминокислотной последовательности) антитела. Примеры эффекторных функций антител включают комплемент-зависимую цитотоксичность, антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и антитело-зависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз.
2
"Фрагмент антитела" содержит часть интактного антитела, предпочтительно содержащую его антигенсвязывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab') и Fv, диатела, триатела, тетратела, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител, scFv, scFv-Fc, мультиспецифические фрагменты антител, образованные из фрагмента(ов) антитела (антител), фрагмент(ы), продуцированный(ые) с помощью библиотеки экспрессии Fab, или эпитопсвязывающие фрагменты любого из вышеуказанных, которые иммуноспецифически связываются с антигеном-мишенью (например, антигеном раковых клеток, вирусным антигеном или микробным антигеном).
Термин "вариабельный" применительно к антителу относится к некоторым участкам вариабельных доменов антитела, которые в значительной степени различаются по последовательности и используются в связывании, и специфичности каждого конкретного антитела к его конкретному антигену. Эта вариабельность сконцентрирована в трех участках, называемых "гипервариабельными областями" в вариабельных доменах легкой цепи и тяжелой цепи. Более высококонсервативные участки вариабельных доменов называются каркасными областями (FR). Вариабельные домены нативных тяжелых и легких цепей, каждый, содержат четыре FR, соединенные тремя гипервариабельными областями.
Термин "гипервариабельная область" в данном документе относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание с антигеном. Гипервариабельная область обычно содержит аминокислотные остатки из "области, определяющей комплементарность", или "CDR", (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (L3) в вариабельном домене тяжелой цепи (Kabat et al. Sequencies of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))) и/или остатки из "гипервариабельной петли" (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (142) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи (Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917)). Остатки FR представляют собой остатки вариабельных доменов, иные, чем остатки гипервариабельной области, как она определена здесь.
H
L
H
L
"Одноцепочечный Fv" или "scFv" фрагмент антитела содержит домены V и V антитела, где эти домены присутствуют в единственной полипептидной цепи. В типичных случаях полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами V и V, который позволяет scFv образовывать желаемую структуру для связывания с антигеном. Обзор по scFv смотри в Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
H
L
Термин "диатело" относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, и эти фрагменты содержат вариабельный тяжелый домен (V), связанный с вариабельным легким доменом (V) в одной и той же полипептидной цепи. За счет линкера, который является слишком коротким, чтобы обеспечивать спаривание двух доменов на одной и той же цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать антигенсвязывающие сайты. Диатела описаны более полно, например, в ЕР 0404097; WO 93/11161; и Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448.
"Гуманизированные" формы антител, не являющихся человеческими (например, антител грызунов), являются химерными антителами, которые содержат минимальную последовательность из иммуноглобулина, не являющегося человеческим. По большей части, гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменены остатками из гипервариабельной области у видов, не являющихся человеком (антитело-донор), таких как мышь, крыса, кролик или примат, не являющийся человеком, имеющими желаемую специфичность, аффинность и способность. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками, не являющимися человеческими. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаруживаются в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Эти модификации производят для дополнительного улучшения характеристик антител. Как правило, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют гипервариабельным петлям иммуноглобулина, не являющегося человеческим, и все или по существу все FR являются каркасными областями последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело возможно будет содержать также по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно человеческого иммуноглобулина. Более подробную информацию смотри в Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329; и Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.
В данном документе "выделенный" означает отделенный от других компонентов (а) природного источника, такого как клетка или клеточная культура растения или животного, или (б) синтетическая органическая химическая реакционная смесь. В данном документе "очищенный" означает, что после выделения изолят содержит по меньшей мере 95% и в другом аспекте по меньшей мере 98% соединения (например, конъюгата) от массы изолята.
"Выделенное" антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и отделено от и/или извлечено из компонента его природного окружения. Примесными компонентами его природного окружения являются вещества, которые могут мешать диагностическим или терапевтическим применениям антитела и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных воплощениях антитело будут очищать (1) до свыше 95% масс. антитела при определении методом Лоури (Lowry) и наиболее предпочтительно более 99% масс., (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности, с использованием секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности по результатам SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием красителя Кумасси синего или, предпочтительно, серебряного красителя. Выделенное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один компонент природного окружения антитела не будет присутствовать. Однако обычно выделенное антитело будут получать путем проведения по меньшей мере одной стадии очистки.
Антитело, которое "индуцирует апоптоз", представляет собой антитело, которое индуцирует запрограммированную гибель клетки, которую определяют по связыванию аннексина V, фрагментации ДНК, сжатию клетки, расширению эндоплазматического ретикулума, клеточной фрагментации и/или образованию мембранных везикул (именуемых апоптическими тельцами). Клетка представляет собой клетку опухоли, например молочной железы, яичника, желудка, эндометрия, слюнной железы, легкого, почки, ободочной кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы или мочевого пузыря. Для оценки клеточных событий, ассоциированных с апоптозом, доступны различные методы. Например, транслокация фосфатидилсерина (PS) может быть измерена по связыванию аннексина; фрагментация ДНК может быть оценена посредством лэддеринга ДНК; и нуклеарная/хроматиновая конденсация наряду с фрагментацией ДНК может быть оценена по любому увеличению гиподиплоидных клеток.
Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству лекарственного средства, эффективному для лечения заболевания или расстройства у млекопитающего. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарственного средства может уменьшать число раковых клеток; сокращать размер опухоли; ингибировать (т.е. замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать (т.е. замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) метастазирование опухоли; ингибировать до некоторой степени рост опухоли; и/или ослаблять до некоторой степени один или более симптомов, ассоциированных с раковым заболеванием. В той степени, в какой лекарственное средство может ингибировать рост существующих раковых клеток и/или уничтожать их, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. Для терапии рака эффективность может быть измерена, например, путем оценки времени до прогрессирования заболевания (ТТР) и/или определения частоты реагирования (RR).
Термин "значительное количество" относится к большой части, т.е. более 50% популяции, смеси или образца.
Термин "внутриклеточный метаболит" относится к соединению, образующемуся в результате метаболического процесса или реакции внутри клетки на конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC). Метаболический процесс или реакция может представлять собой ферментативный процесс, такой как протеолитическое расщепление пептидного линкера ADC. Внутриклеточные метаболиты включают, без ограничения, антитела и свободное лекарственное средство, которые подверглись внутриклеточному расщеплению после вхождения, диффузии, захвата или транспорта в клетку.
Термины "внутриклеточно расщепленный" и "внутриклеточное расщепление" относятся к метаболическому процессу или реакции внутри клетки на ADC или т.п., посредством чего ковалентное присоединение, например линкера, между группировкой лекарственного средства и антителом разрушается с образованием в результате свободного лекарственного средства или другого метаболита конъюгата, диссоциировавшего из антитела внутри клетки. Таким образом, отщепленные группировки ADC являются внутриклеточными метаболитами.
Термин "биодоступность" относится к системной доступности (т.е. к уровням в крови/плазме крови) заданного количества лекарственного средства, введенного пациенту. Биодоступность является абсолютным термином, который означает показатель как времени (скорость), так и суммарного количества (степень) лекарственного средства, которое достигает общего кровотока из введенной лекарственной формы.
50
Термин "цитотоксическая активность" относится к уничтожающему клетки, цитостатическому или антипролиферативному эффекту ADC или внутриклеточного метаболита указанного ADC. Цитотоксическая активность может быть выражена в виде значения IC, которое представляет собой концентрацию (молярную или массовую) на единицу объема, при которой выживает половина клеток.
"Расстройство" представляет собой любое состояние, которое может получать пользу от лечения лекарственным средством или конъюгатом антитело-лекарственное средство. Этот термин охватывает хронические и острые расстройства или заболевания, в том числе те патологические состояния, которые предрасполагают животного к рассматриваемому расстройству. Не являющиеся ограничивающими примеры расстройств, подлежащих лечению, здесь включают доброкачественные и злокачественные виды рака, лейкоз и лимфоидные злокачественные заболевания, нейрональные, глиальные, астроцитальные, гипоталамические и другие гландулярные, макрофагальные, эпителиальные, стромальные и бластоцельные расстройства, и воспалительные, ангиогенные и иммунологические расстройства.
Термины "рак" и "раковые" относятся к физиологическому состоянию или расстройству у млекопитающего, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток, или описывают его. "Опухоль" содержит одну или более раковых клеток.
Примеры "пациента" включают, без ограничения, человека, крысу, мышь, морскую свинку, обезьяну, свинью, козу, корову, лошадь, собаку, кошку, птицу и домашнюю птицу. В иллюстративном воплощении пациентом является человек.
Термины "лечить" или "лечение" относятся, если из контекста не следует иное, к терапевтическому лечению и профилактическим мерам для предупреждения рецидива, задачей которых является ингибирование или замедление (сокращение) нежелательного физиологического изменения или расстройства, такого как развитие или распространение рака. Для целей данного изобретения благотворные или желательные клинические результаты включают, без ограничения, ослабление симптомов, снижение до минимума степени заболевания, стабилизацию (т.е. не ухудшение) состояния заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, ослабление или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию (частичную или полную), обнаружимую или необнаружимую. "Лечение" может также означать прологирование выживания по сравнению с ожидаемым выживанием без лечения. Пациенты, нуждающиеся в лечении, включают пациентов, которые уже имеют состояние или расстройство, а также тех пациентов, которые предрасположены к данному состоянию или расстройству.
Применительно к раку термин "лечение" охватывает любое или все из следующего: ингибирование роста опухолевых клеток, раковых клеток или опухоли, ингибирование репликации опухолевых клеток или раковых клеток, сокращение общей массы опухоли или уменьшение числа раковых клеток и ослабление одного или более симптомов, ассоциированных с заболеванием.
Применительно к аутоиммунному заболеванию термин "лечение" охватывает любое или все из следующего: ингибирование репликации клеток, ассоциированной с аутоиммунным болезненным состоянием, включая, без ограничения, клетки, которые продуцируют аутоиммунное антитело, сокращение аутоиммунного антительного бремени и ослабление одного или более симптомов аутоиммунного заболевания.
Применительно к инфекционному заболеванию термин "лечение" охватывает любое или все из следующего: ингибирование роста, размножения или репликации патогена, который вызывает инфекционное заболевание, и ослабление одного или более симптомов инфекционного заболевания.
Термин "вкладыш в упаковку" здесь относится к инструкциям, обычно вкладываемым в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показании(ях), употреблении, дозировке, введении, противопоказаниям и/или предостережениям, касающимся применения таких терапевтических продуктов.
В данном документе термины "клетка", "линия клеток" и "культура клеток" использованы взаимозаменяемым образом, и все такие указания включают потомство. Слова "трансформанты" и "трансформированные клетки" охватывают первичную клетку субъекта и культуры или потомство, получаемую(ое) из них независимо от количества переносов. Понятно также, что все потомство не может быть точно идентичным по контенту ДНК вследствие неслучайных или случайных мутаций. Охвачено мутантное потомство, которое имеет такую же функцию или биологическую активность, как при скрининге первоначально трансформированной клетки. Если предполагаются отличающиеся определения, то это будет ясно из контекста.
В данном документе CBI относится к 1,2,9,9а-тетрагидро-4Н-бензо[е]циклопропа[с]индол-4-ону или его замещенной или дериватизированной форме. CBI может также относится к seco-форме CBI, или seco-CBI, которая также известна как 1-(хлорметил)-2,3-дигидро-1Н-бензо[е]индол-5-ол, или ее замещенной или дериватизированной форме (или формам).
В данном документе CPI относится к 1,2,8,8а-тетрагидроциклопропа[с]пирроло[3,2-е]индол-4(5Н)-ону или его замещенной или дериватизированной форме. CPI может также относиться к seco-форме CPI, или seco-CPI, которая также известна как 8-(хлорметил)-1-метил-3,6,7,8-тетрагидропирроло[3,2-е]индол-4-ол, или ее замещенной или дериватизированной форме (или формам).
1
8
1
8
1
8
2
8
Если не указано иное, термин "алкил", сам по себе или как часть другого термина, относится к насыщенному углеводороду с прямой или разветвленной цепью, имеющему указанное количество атомов углерода (например, "С-Салкил" относится к алкильной группе, имеющей от 1 до 8 атомов углерода). Алкильные группы обычно содержат от 1 до 20 атомов углерода, предпочтительно от 1 до 8 атомов углерода и более предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода. Когда количество атомов углерода не указано, алкильная группа имеет от 1 до 8 атомов углерода. Репрезентативные прямоцепочечные С-Салкилы включают, без ограничения, метил, этил, н-пропил, н-бутил, н-пентил, н-гексил, н-гептил и н-октил; разветвленные С-Салкилы включают, без ограничения, -изопропил, -втор-бутил, -изобутил, -трет-бутил, -изопентил и -2-метилбутил; ненасыщенные С-Салкилы включают, без ограничения, винил, аллил, 1-бутенил, 2-бутенил, изобутенил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-1-бутенил, 2-метил-2-бутенил, 2,3-диметил-2-бутенил, 1-гексил, 2-гексил, 3-гексил, ацетиленил, пропининил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентенил, 2-пентенил и 3-метил-1-бутинил. Ссылка на "алкил" в данном документе относится к незамещенным и замещенным группировкам, как описано выше.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
1
10
2
1-10
1
10
Если не указано иное, "алкилен", сам по себе или как часть другого термина, относится к насыщенному, разветвленному или прямоцепочечному или циклическому углеводородному радикалу с указанным количеством атомов углерода, обычно с 1-18 атомами углерода, и имеющему два одновалентных центра радикала, получаемому путем удаления двух атомов водорода с одного и того же или двух разных атомов углерода родительского алкана). Алкиленовые группы обычно содержат от 1 до 18 атомов углерода, предпочтительно от 1 до 10 атомов углерода, более предпочтительно от 1 до 8 атомов углерода и наиболее предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода. Типичные алкиленовые радикалы включают, без ограничения, метилен (-СН-), 1,2-этилен (-СНСН-), 1,3-пропилен (-СНСНСН-), 1,4-бутилен (-СНСНСНСН-) и т.п. "C-С" прямоцепочечный алкилен представляет собой прямоцепочечную насыщенную углеводородную группу формулы -(CH)-. Примеры C-Салкилена включают метилен, этилен, пропилен, бутилен, пентилен, гексилен, гептилен, октилен, нонилен и декален. Ссылка на "алкилен" в данном документе относится к незамещенным и замещенным группировкам, как указано выше.
Если не указано иное, термин "гетероалкил", сам по себе или в сочетании с другим термином, означает, если не указано иное, стабильный углеводород с прямой или разветвленной цепью или комбинацией прямой и разветвленной цепей, полностью насыщенный или содержащий от 1 до 3 степеней ненасыщения, состоящий из указанного количества атомов углерода и от одного до трех гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из О, N, Si и S, и где атомы азота и серы возможно могут быть окисленными, и гетероатом азота возможно может быть кватернизированным. Гетероатомы О, N и S могут располагаться в любом внутреннем положении гетероалкильной группы. Гетероатом Si может находиться в любом положении гетероалкильной группы, включая положение, по которому алкильная группа присоединена к остальной части молекулы. Вплоть до двух гетероатомов могут быть соседними. Гетероалкильные группы обычно содержат от 1 до 15 атомов углерода, предпочтительно от 1 до 12 атомов углерода, более предпочтительно от 1 до 8 атомов углерода и наиболее предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода. Ссылка на "гетероалкил" здесь относится к незамещенным и замещенным группировкам, как описано выше.
Если не указано иное, термин "гетероалкилен", сам по себе или как часть другого заместителя, означает двухвалентную группу, получаемую из гетероалкила (который обсуждается выше). Для гетероалкиленовых групп гетероатомы также могут занимать любой или оба конца цепи. Ссылка на "гетероалкилен" здесь относится к незамещенным и замещенным группировкам, как описано выше.
Термин "Н", или "водород", в данном документе обычно относится к атому водорода, содержащему один единственный протон и ни одного нейтрона, но также охватывает изотоп водорода, известный как дейтерий, который содержит один единственный протон и один единственный нейтрон.
1
8
1
8
2
2
2
3
2
2
1
8
2
2
2
9
9
9
9
9
9
9
9
Если не указано иное, "арил", сам по себе или как часть другого термина, означает замещенный или незамещенный одновалентный карбоциклический ароматический углеводородный радикал с 5-20, предпочтительно 5-14 или 6-14 атомами углерода, получаемый путем удаления одного атома водорода с единственного атома углерода родительской кольцевой системы. Типичные арильные группы включают, без ограничения, радикалы бензола, замещенного бензола, нафталина, антрацена, бифенила и т.п. Замещенная карбоциклическая ароматическая группа (например, арильная группа) может быть замещена одной или более, предпочтительно 1-5, из следующих групп: C-Салкил, -O-(С-Салкил), -C(O)R, -OC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NH, -C(O)NHR', -C(O)N(R'), -NHC(O)R', -S(O)R', -S(O)R', -ОН, галоген, -N, -NH, -NH(R), -N(R) и -CN; где каждый R независимо выбран из -Н, С-Салкила и незамещенного арила. В некоторых воплощениях замещенная карбоциклическая ароматическая группа может также содержать один или более из: -NHC(=NH)NH, -NHCONH, -S(=O)R и -SR. "Арилен" представляет собой соответствующую двухвалентную группировку.
10
10
10
-
10
10
10
10
10
10
10
-
10
10
10
10
10
10
2-
10
10
10
-
10
10
10
10
10
10
10
10
2
3
3
2
2
3
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
1
20
1
20
6
20
1
10
"Замещенный алкил" (или "замещенный алкилен", "замещенный гетероалкил" или "замещенный гетероалкилен") означает релевантную алкильную алкил-содержащую группу или радикал, как обсуждается выше, в которой(ом) один или более атомов водорода, каждый независимо, заменены заместителем. Типичные заместители включают, без ограничения, -X, -R, -О-, -OR, -SR, -S, -NR, -NR, =NR, -CX, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO, =N, -N, -NRC(=O)RR, -C(=O)NR, -SO, -SOH, -S(=O)R, -OS(=O)OR, -S(=O)NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR), -P(=O)(OR), -PO, POH, -AsOH, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -COR, -CO, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR, -C(=S)NR или -C(=NR)NR, где каждый X независимо представляет галоген: -F, -Cl, -Br или -I; и каждый R независимо представляет -Н, С-Салкил, С-Сгетероалкил, С-Сарил, C-Сгетероциклил, защитную группа или пролекарственную группировку. Арильные, алкиленовые и гетероалкиленовые группы, как описано выше, также могут быть замещенными аналогичным образом.
Если не указано иное, "аралкил", сам по себе или как часть другого термина, означает алкильную группу, как определено выше, замещенную арильной группой, как определено выше.
3
10
2
10
2
10
1
8
1
8
2
2
2
3
2
2
1
8
1
8
2
2
2
2
10
2
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
Если не указано иное, "С-Сгетероциклил", сам по себе или как часть другого термина, относится к одновалентной замещенной или незамещенной ароматической или неароматической моноциклической, бициклической или трициклической кольцевой системе, имеющей от 2 до 10, от 2 до 14 или 2-20 атомов углерода, предпочтительно от 3 до 8 атомов углерода (которые также упоминаются как члены кольца) и от одного до четырех гетероатомов в качестве членов кольца, независимо выбранных из N, О, Р или S и получаемых в результате удаления одного атома водорода с кольцевого атома родительской кольцевой системы. Один или более атомов N, С или S в гетероциклиле могут быть окисленными. Кольцо, которое содержит гетероатом, может быть ароматическим или неароматическим. Ароматические гетероциклы иногда здесь упоминаются как гетероарилы. Если не указано иное, гетероциклил присоединен к его боковой группе по любому гетероатому или атому углерода, который приводит к стабильной структуре. Репрезентативные примеры С-Сгетероциклила включают, без ограничения, тетрагидрофуранил, оксетанил, пиранил, пирролидинил, пиперидинил, пиперазинил, бензофуранил, бензотиофен, бензотиазолил, индолил, бензопиразолил, пирролил, тиофенил (тиофен), фуранил, тиазолил, имидазолил, пиразолил, триазолил, хинолинил включая такие группировки, как 1,2,3,4-тетрагидрохинолинил, пиримидинил, пиридинил, пиридонил, пиразинил, пиридазинил, изотиазолил, изоксазолил, тетразолил, эпоксид, оксетан и BODIPY (бор-дипиррометен) (замещенные или незамещенные). С-СГетероциклил может быть замещен группами в количестве вплоть до семи, включающими, без ограничения, С-Салкил, С-Сгетероалкил, -OR, арил, -C(O)R, -OC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NH, -C(O)NHR, -C(O)N(R), -NHC(O)R, -S(=O)R, -S(O)R, галоген, -N, -NH, -NH(R), -N(R) и -CN, где каждый R независимо выбран из -Н, С-Салкила, С-Сгетероалкила и арила. В некоторых воплощениях замещенный гетероциклил может также содержать одно или более из следующих: -NHC(=NH)NH, -NHCONH, -S(=O)R и -SR. Гетероцикло или С-Сгетероцикло представляет собой соответствующую двухвалентную группировку. Двухвалентные ароматические гетероциклы иногда упоминаются в данном документе как гетероарилен или С-Сгетероарилен.
h
h
h
-
h
h
h
h
h
h
-
h
h
h
h
h
h
2-
h
h
h
-
h
h
h
h
h
h
h
2
3
3
2
2
3
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
1
20
6
20
3
8
1
6
1
10
Как отмечено выше, ароматические гетероциклы иногда упоминаются в данном документе как гетероарилы и предпочтительно содержат 5-14, 6-14 или 6-20 атомов углерода в дополнение к гетероатомам. Гетероарилы могут представлять собой моноциклические, бициклические или трициклические кольцевые системы. Репрезентативные гетероарилы включают, без ограничения, триазолил, тетразолил, оксадиазолил, пиридил, фурил, бензофуранил, тиофенил, бензотиофенил, хинолинил, пирролил, индолил, оксазолил, бензоксазолил, имидазолил, бензимидазолил, тиазолил, бензотиазолил, изоксазолил, пиразолил, изотиазолил, пиридазинил, пиримидинил, пиразинил, триазинил, циннолинил, фталазинил, хиназолинил, пиримидил, азепинил, оксепинил и хиноксалинил. Гетероарилы возможно замещены. Типичные заместители включают, без ограничения, -X, -R, -О-, -OR, -SR, -S, -NR, -NR, =NR, -CX, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO, =N, -N, -NRC(=O)R, -C(=O)NR, -SO, -SOH, -S(=O)R, -OS(=O)OR, -S(=O)NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR), -P(=O)(OR), -PO, POH, -AsOH, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -COR, -CO, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR, -C(=S)NR, -C(=NR)NR, С-Сгетероалкил, С-Сарил, C-Сгетероциклил, защитную группу или пролекарственную группировку, где каждый X независимо представляет галоген: -F, -Cl, -Br или -I; и каждый R независимо представляет -Н или С-Салкил. Двухвалентные ароматические гетероциклы иногда упоминаются в данном документе как гетероарилены или C-Сгетероарилены.
Если не указано иное, "гетероаралкил", сам по себе или как часть другого термина, означает алкильную группу, как определено выше, замещенную ароматической гетероциклильной группой, как определено выше. Гетероаралкило представляет собой соответствующую двухвалентную группировку.
3
8
3
8
3
8
1
8
1
8
2
2
2
3
2
2
1
8
1
8
3
8
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
Если не указано иное, "С-Скарбоциклил", сам по себе или как часть другого термина, представляет собой 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-членное одновалентное, замещенное или незамещенное, насыщенное или ненасыщенное неароматическое моноциклическое или бициклическое карбоциклическое кольцо, получаемое в результате удаления одного атома водорода с кольцевого атома родительской кольцевой системы. Репрезентативные С-Скарбоциклильные группы включают, без ограничения, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентадиенил, циклогексил, циклогексенил, 1,3-циклогексадиенил, 1,4-циклогексадиенил, циклогептил, 1,3-циклогептадиенил, 1,3,5-циклогептадиенил, циклооктил, циклооктадиенил, бицикло(1.1.1.)пентан и бицикло(2.2.2.)октан. С-Скарбоциклильная группа может быть незамещенной или замещенной группами в количестве вплоть до семи, включающими, без ограничения, С-Салкил, С-Сгетероалкил, -OR, арил, -C(O)R, -OC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NH, -C(O)NHR, -C(O)N(R), -NHC(O)R, -S(=O)R, -S(=O)R, -ОН, -галоген, -N, -NH, -NH(R), -N(R) и -CN, где каждый R независимо выбран из -Н, С-Салкила, С-Сгетероалкила и арила. "С-Скарбоцикло" представляет собой соответствующую двухвалентную группировку.
В данном документе заместитель азидо относится к -N=N=N; заместитель цианат относится к -O-CN; заместитель тиоцианат относится к -S-CN; заместитель изоцианат относится к -N=C=O; и заместитель тиоизоцианат относится к -S-N=C=O.
Термин "хиральные" относится к молекулам, которые не совмещаются с их зеркальным отражением, а термин "ахиральный" относится к молекулам, которые совмещаются с их зеркальным отражением.
Термин "стереоизомеры" относится к соединениям, которые имеют идентичное химическое строение, но отличаются расположением атомов или групп в пространстве.
"Диастереомер" относится к стереоизомеру с двумя или более центрами хиральности, чьи молекулы являются зеркальными отражениями друг друга. Диастереомеры имеют разные физические свойства, например точки плавления, точки кипения, спектральные свойства и реакционную способность. Смеси диастереомеров могут быть разделены аналитическими методами высокого разрешения, такими как электрофорез и хроматография.
"Гликозил" относится к структуре:
или замещенным формам этой структуры, включающим, например, структуры, замещенные с образованием таких структур, как:
и  и многие другие.
Стереохимические определения и конвенции, использованные в данном документе, обычно соответствуют S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms, McGraw-Hill Book Company, New York (1984); и Eliel and Wilen, Stereochemistry of Organic Compounds, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994). Многие органические соединения существуют в оптически активных формах, т.е. они обладают способностью вращать плоскость плоскополяризованного света. При описании оптически активных соединений префиксы D и L или R и S использованы для обозначения абсолютной конфигурации молекулы вокруг ее хирального(ых) центра(ов). Префиксы d и l или (+) и (-) использованы для обозначения знака вращения плоскости плоскополяризованного света соединением, при этом (-) или l означают, что соединение является левовращающим. Соединение с префиксом (+) или d является правовращающим. Для данной химической структуры эти стереоизомеры являются идентичными за исключением того, что они являются зеркальными отражениями друг друга. Конкретный стереоизомер может также упоминаться как энантиомер, и смесь таких изомеров часто называется энантиомерной смесью. Смесь энантиомеров 50:50 называется рацемической смесью или рацематом, который может иметь место в тех случаях, когда в ходе химической реакции или процесса отсутствует стереоселективность или стереоспецифичность. Термины "рацемическая смесь" и "рацемат" относятся к эквимолярной смеси двух энантиомерных веществ, лишенной оптической активности.
В данном документе "-РАВА-", или "РАВА", относится к пара-аминобензойной кислоте и группировкам, производным от нее, например к структуре:
или ее вариантам.
В данном документе "-РАВС-", или "РАВС", относится к пара-аминобензилоксикарбонилу и группировкам, производным от него, например к структуре:
или ее вариантам.
"Производное" аминокислоты охватывает аминокислоту, имеющую замещения или модификации посредством ковалентного присоединения к родительской аминокислоте, такого как, например, алкилирование, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.п. Этим определением "производного" также охвачены, например, один или более аналогов аминокислоты с замещенными связями, а также другие модификации, известные в данной области.
"Природная аминокислота" относится к аргинину, глутамину, фенилаланину, тирозину, триптофану, лизину, глицину, аланину, гистидину, серину, пролину, глутаминовой кислоте, аспаргиновой кислоте, треонину, цистеину, метионину, лейцину, аспарагину, изолейцину и валину, если из контекста не следует иное.
"Защитная группа" относится к группировке, которая, когда она присоединена к реакционноспособной группе в молекуле, маскирует, снижает или предотвращает эту реакционную способность. Примеры защитных групп можно найти в Т. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons, New York, 1999, и Harrison and Harrison et al., Compendium of Synthetic Organic Methods, Vols. 1-8 (John Wiley and Sons, 1971-1996), которые во всей их полноте включены в данное описание посредством ссылки. Репрезентативные защитные группы для гидроксигруппы включают ацильные группы, бензиловые и тритиловые простые эфиры, тетрагидропираниловые простые эфиры, триалкилсилиловые простые эфиры и аллиловые простые эфиры. Репрезентативные защитные группы для аминогруппы включают формил, ацетил, трифторацетил, бензил, бензилоксикарбонил (CBZ), трет-бутоксикарбонил (Boc), триметилсилил (TMS), 2-триметилсилил-этансульфонил (SES), тритил и замещенные тритильные группы, аллилоксикарбонил, 9-флуоренилметилоксикарбонил (FMOC), нитро-вератрилоксикарбонил (NVOC) и т.п.
Примеры "защитной группы гидроксила" включают, без ограничения, метоксиметиловый простой эфир, 2-метоксиэтоксиметиловый простой эфир, тетрагидропираниловый простой эфир, бензиловый простой эфир, пара-метоксибензиловый простой эфир, триметилсилиловый простой эфир, триэтилсилиловый простой эфир, триизопропилсилиловый простой эфир, трет-бутилдиметилсилиловый простой эфир, трифенилметилсилиловый простой эфир, ацетатный сложный эфир, замещенные ацетатные сложные эфиры, пивалоат, бензоат, метансульфонат и пара-толуолсульфонат.
"Уходящая группа" относится к функциональной группе, которая может быть замещена другой функциональной группой. Такие уходящие группы известны в данной области, и их примеры включают, без ограничения, галогенид (например, хлорид, бромид, йодид), метансульфонил (мезил), пара-толуолсульфонил (тозил), трифторметилсульфонил (трифлат) и трифторметилсульфонат.
Фраза "фармацевтически приемлемая соль" в данном документе относится к фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим солям соединения. Соединение обычно содержит по меньшей мере одну аминогруппу, и, соответственно, соли присоединения кислоты могут быть образованы с этой аминогруппой. Иллюстративные соли включают, без ограничения, соли сульфат, цитрат, ацетат, оксалат, хлорид, бромид, йодид, нитрат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, изоникотинат, лактат, салицилат, кислый цитрат, тартрат, олеат, таннат, пантотенат, битартрат, аскорбат, сукцинат, малеат, малат, гентизинат, фумарат, глюконат, глюкуронат, сахарат, формиат, бензоат, глутамат, метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, пара-толуолсульфонат и памоат (т.е. 1,1'-метилен-бис-(2-гидрокси-3-нафтоат)). Фармацевтически приемлемая соль может подразумевать включение другой молекулы, такой как ацетатный ион, сукцинатный ион или другой противоион. Противоионом может быть любая органическая или неорганическая группировка, которая стабилизирует заряд на родительском соединении. Кроме того, фармацевтически приемлемая соль может иметь больше, чем один заряженный атом в ее структуре. Примеры, где множественные заряженные атомы являются частью фармацевтически приемлемой соли, могут иметь множество противоионов. Следовательно, фармацевтически приемлемая соль может иметь один или более заряженных атомов и/или один или более противоионов.
"Фармацевтически приемлемый сольват" или "сольват" относятся к ассоциации одной или более молекул растворителя с соединением или конъюгатом по изобретению. Примеры растворителей, которые образуют фармацевтически приемлемые сольваты, включают, без ограничения, воду, изопропанол, этанол, метанол, DMSO, этилацетат, уксусную кислоту и этаноламин.
Термины "нагрузка", или "лекарственная нагрузка", или "полезная нагрузка" означают или относятся к среднему количеству полезных нагрузок ("полезная нагрузка" и "полезные нагрузки" используются взаимозаменяемым образом в данном документе с "лекарственным средством" и "лекарственными средствами") на антитело в молекуле ADC. Лекарственная нагрузка может составлять от 1 до 20 лекарственных средств на антитело. Иногда это называется DAR, или соотношением лекарственного средства и антитела. Композиции ADC, описанных в данном документе, обычно имеют значения DAR 1-20 и в некоторых воплощениях 1-8, 2-8, 2-6, 2-5 и 2-4. Типичные значения DAR равны 2, 4, 6 и 8. Среднее количество лекарственных средств на антитело, или значение DAR, может быть определено традиционными методами, такими как UV-vis спектроскопия (спектроскопия в ультрафиолетовом и видимом диапазонах), масс-спектрометрия, анализ ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) и HPLC. Количественное значение DAR также может быть определено. В некоторых случаях выделение, очистка и определение характеристик гомогенных ADC, имеющих конкретное значение DAR, может быть осуществлено такими методами, как обращенно-фазовая HPLC или электрофорез. Значение DAR может быть ограничено количеством сайтов присоединения на антителе. Например, если сайтом присоединения является тиол цистеина, то антитело может иметь только одну или несколько тиольных групп цистеинов, или может иметь только одну или несколько достаточно реакционноспособных тиольных групп, по которым может быть присоединена линкерная единица. В некоторых воплощениях тиол цистеина представляет собой тиольную группу цистеинового остатка, которая образует межцепочечную дисульфидную связь. В некоторых воплощениях тиол цистеина представляет собой тиольную группу цистеинового остатка, которая не образует межцепочечную дисульфидную связь. Обычно в ходе реакции конъюгирования меньше теоретического максимума группировок лекарственных средств конъюгируется с антителом. Антитело может содержать, например, много остатков лизина, которые не взаимодействуют с линкером или линкерным промежуточным. Только наиболее реакционноспособные группы лизина могут взаимодействовать с реакционноспособным линкерным реагентом.
Как правило, антитела, если и содержат, то не содержат много свободных и реакционноспособных тиольных групп цистеинов, которые могут быть связаны с лекарственным средством посредством линкера. Большинство цистеиновых тиольных остатков в антителах существуют в виде дисульфидных мостиков и должны быть восстанавлены восстановителем, таким как дитиотрейтол (DTT). Антитело может быть подвергнуто воздействию денатурирующих условий для обнажения реакционноспособных нуклеофильных групп, таких как лизин или цистеин. Нагрузку (соотношение лекарственное средство/антитело) ADC можно контролировать несколькими разными способами, включающими: (1) ограничение молярного избытка соединения лекарственное средство-линкер относительно антитела, (2) ограничение времени реакции конъюгирования или температуры, и (3) частичное или ограничение восстановительных условий для модификации цистеиновых тиолов. В тех случаях, когда более чем одна нуклеофильная группа взаимодействует с соединением лекарственное средство-линкер, тогда полученный в результате продукт представляет собой смесь ADC с распределением одной или более группировок лекарственных средств на антитело. Среднее количество лекарственных средств на антитело может быть определено в смеси посредством, например, дуального ELISA анализа антитела, специфичного к антителу и специфичного к лекарственному средству. Индивидуальные ADC могут быть идентифицированы в смеси масс-спектроскопией и выделены HPLC, например хроматографией гидрофобного взаимодействия.
Ниже приведен список сокращений и определений, которые в этой заявке не могут быть определены или описаны иным образом: DMSO (означает диметилсульфоксид), HRMS (означает масс-спектрометрия высокого разрешения), DAD (означает детектирование детектором на диодной матрице), TFA (означает 2,2,2-трифторуксусная кислота или трифторуксусная кислота), TFF (означает фильтрация в тангенциальном потоке), EtOH (означает этанол), М.м. (означает молекулярная масса), HPLC (означает высокоэффективная жидкостная хроматография), преп. HPLC (означает препаративная высокоэффективная жидкостная хроматография), "и т.д." (означает "и так далее"), тритил (означает 1,1',1''-этан-1,1,1-триилтрибензол), THF (означает тетрагидрофуран), NHS (означает 1-гидрокси-2,5-пирролидиндион), Cbz (означает карбоксибензил), экв. (означает эквивалент), n-BuLi (означает н-бутиллитий), ОАс (означает ацетат), МеОН (означает метанол), i-Pr (означает изопропил или пропан-2-ил), NMM (означает 4-метилморфолин), и "-" (в таблице означает "нет данных, доступных в данное время").
B1
1
6
1
6
1
6
Двухвалентные группировки и заместители в данном документе относятся к указанным группировкам или заместителям, связанным или соединенным в любом направлении или в обоих направлениях. К примеру, группировка -C(O)NR- (в определении L и где-либо еще) означает -C(O)NR-, а также -NRC(O)-, группировка -С(O)С-Салкил- означает -C(O)C-Cалкил-, а также -C-CалкилC(O)-, и так далее. В более общем смысле, описание несимметричной двухвалентной группировки, связанной с ее "левой" стороны и с ее "правой" стороны, означает как группировку, как она представлена (левая сторона группировки, связанной с левой стороны, как написано, правая сторона группировки, связанной с правой стороны, как написано), так и группировку в обратном направлении, как представлено (левая сторона группировки, связанной с правой стороны, как написано, правая сторона группировки, связанной с левой стороны, как написано).
B2
B1
B3
B1
B2
A
B3
2
Термины "связь" и "отсутствуют" оба использованы для описания переменной, которая не содержит атом или атомы. Так, если двухвалентная переменная "отсутствует", то понятно, что соседние группировки связаны друг с другом. Например, если L отсутствует, то имеется в виду, что L может быть связан с L; или если L и L оба отсутствуют, то имеется в виду, что L может быть связан с L. Аналогично, если двухвалентная переменная определена как представляющая собой "связь", то это означает, что нет никаких присутствующих атомов, и соседние группировки связаны друг с другом. Так, например, если переменная "D" определена как представляющая собой связь, то понятно, что атомы углерода, соседние с D (в структуре, определяющей Т), связаны друг с другом. Отсутствующая одновалентная переменная понимается как водород или электронная пара, способная к дальнейшему ковалентному связыванию.
Антительная единица (A, Ab или АВ)
Как отмечено выше, термин "антитело" (или "А", "Ab" или "АВ") в данном документе использован в самом широком смысле и конкретно охватывает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, моноспецифические антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, которые проявляют желаемую биологическую активность. Кроме того, хотя некоторые аспекты изобретения, описанные в данном документе, относятся к конъюгатам антитело-лекарственное средство, дополнительно предусмотрено, что антительная часть конъюгата может быть заменена чем-либо, что специфически связывается или ассоциируется в результате реакции или образует комплекс с рецептором, антигеном или другой рецептивной группировкой, ассоциированной с популяцией данных клеток-мишеней. Например, вместо антитела конъюгаты по изобретению могут содержать нацеливающую молекулу, которая связывается, образует комплекс или взаимодействует с рецептором, антигеном или другой рецептивной группировкой популяции клеток, которые требуется терапевтически или иным образом биологически модифицировать. Примеры таких молекул включают белки меньшей молекулярной массы, полипептиды или пептиды, лектины, гликобелки, непептиды, витамины, молекулы, осуществляющие транспорт питательных веществ (такие как, без ограничения, трансферрин) или любые другие связывающиеся с клетками молекулы или вещества. В некоторых аспектах антитело или другая такая нацеливающая молекула действует, доставляя лекарственное средство в конкретную популяцию клеток-мишеней, с которой антитело или другая нацеливающая молекула взаимодействует.
v
3
В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединению, представляющему собой конъюгат антитело-лекарственное средство формулы IIIA или IIIB, где антитело АВ выбрано из трастузумаба, трастузумаба мутантов (например, трастузумаба мутантов, описанных в данном документе или в международной патентной заявке PCT/IB 2012/056234), ореговомаба, эдреколомаба, цетуксимаба, гуманизированного моноклонального антитела к рецептору витронектина (αβ), алемтузумаба, анти-HLA-DR антитела, в том числе гуманизированного анти-HLA-DR антитела для лечения неходжкинской лимфомы, 131I Lym-1, анти-HLA-Dr10 антитела, в том числе мышиного анти-HLA-Dr10 антитела для лечения неходжкинской лимфомы, анти-cd33 антитела, анти-cd22 антитела, в том числе гуманизированного анти-CD22 mAb для лечения ходжкинского заболевания или неходжкинской лимфомы, лабетузумаба, бевацизумаба, ибритумомаба тиуксетана, офатумумаба, панитумумаба, ритуксимаба, тоситумомаба, ипилимумаба и гемтузумаба.
Гетероатомы, которые могут присутствовать на антителе, включают серу (в одном воплощении из сульфгидрильной группы антитела), кислород (в одном воплощении из карбонильной, карбоксильной или гидроксильной группы антитела) и азот (в одном воплощении из первичной или вторичной аминогруппы антитела). Эти гетероатомы могут присутствовать на антителе в природном состоянии антитела, например во встречающемся в природе антителе, или могут быть введены в антитело посредством химической модификации.
В одном воплощении антительная единица имеет сульфгидрильную группу, и эта антительная единица связывается посредством атома серы сульфгидрильной группы.
В другом воплощении антитело имеет остатки лизина, которые могут взаимодействовать с активированными сложными эфирами (такие сложные эфиры включают, без ограничения, сложные эфиры N-гидроксисукцинимида, пентафторфенильные и пара-нитрофенильные сложные эфиры) и поэтому образуют амидную связь, состоящую из атома азота антительной единицы и карбонила.
В еще одном аспекте антительная единица имеет один или более остатков лизина, которые могут быть химически модифицированы для встраивания одной или более сульфгидрильных групп. Реагенты, которые могут быть использованы для модификации лизинов, включают, без ограничения, N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат (SATA) и гидрохлорид 2-иминотиолана (реагент Трота).
В другом воплощении антительная единица может иметь одну или более углеводных групп, которые могут быть химически модифицированы, чтобы иметь одну или более сульфгидрильных групп.
В еще одном другом воплощении антительная единица может иметь одну или более углеводных групп, которые могут быть окислены с получением альдегидной группы (смотри, например, Laguzza, et al., 1989, J. Med. Chem. 32(3):548-55). Соответствующий альдегид может образовывать связь с реакционноспособным сайтом, таким как, например, гидразин и гидроксиламин. Другие протоколы для модифицирования белков для присоединения или ассоциации лекарственных средств описаны в Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, vol. 2, John Wiley & Sons (2002) (этот источник информации включен в данное описание посредством ссылки).
Когда конъюгаты содержат неиммунореактивные белковые, полипептидные или пептидные единицы вместо антитела, тогда полезные неиммунореактивные белковые, полипептидные или пептидные единицы включают, без ограничения, трансферрин, эпидермальные факторы роста ("EGF"), бомбензин, гастрин, гастринвысвобождающий пептид, тромбоцитарный фактор роста, IL-2, IL-6, трансформирующие факторы роста ("ТОР"), такие как TGF-α и TGF-β, вакциниевый фактор роста ("VGF"), инсулин и инсулиноподобные факторы роста I и II, соматостатин, лектины и апопротеин из липопротеина низкой плотности.
Полезными поликлональными антителами являются гетерогенные популяции молекул антител из сыворотки иммунизированных животных. Полезными моноклональными антителами являются гомогенные популяции антител к конкретной антигенной детерминанте (например, антиген раковых клеток, вирусный антиген, микробный антиген, белок, пептид, углевод, химическое вещество, нуклеиновая кислота или их фрагменты). Моноклональное антитело (mAb) к интересующему антигену может быть получено с использованием методов, известных в данной области, которые обеспечивают продуцирование молекул антитела непрерывными линиями клеток в культуре.
Полезные моноклональные антитела включают, без ограничения, человеческие моноклональное антитела, гуманизированные моноклональные антитела, фрагменты антител или химерные моноклональное антитела. Человеческие моноклональные антитела могут быть получены любым из методов, известных в данной области (например, Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72-79; и Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16).
Антитело может представлять собой также биспецифические антитело. Методы получения биспецифических антител известны в данной области и обсуждаются ниже.
Антитело может представлять собой функционально активный фрагмент, производное или аналог антитела, которое иммуноспецифически связывается с клетками-мишенями (например, антигенами раковых клеток, вирусными антигенами или микробными антигенами), или другие антитела, которые связываются с опухолевыми клетками или матриксом. В этом отношении "функционально активные" означает, что фрагмент, производное или аналог способны выявлять антитела анти-анти-идиотипа, которые распознают один и тот же антиген, что и антитело, из которого получен фрагмент, производное или аналог. Конкретно, в иллюстративном воплощении антигенность идиотипа молекулы иммуноглобулина может быть усилена путем делеции последовательностей каркасной области и CDR, которые являются C-концевыми по отношению к последовательности CDR, которая специфически распознает антиген. Чтобы определить, какие последовательности CDR связывают антиген, синтетические пептиды, содержащие последовательности CDR, могут быть использованы в анализах связывания с антигеном любым методом анализа связывания, известным в данной области (например, анализом BIACore) (информацию о местоположении последовательностей CDR смотри, например, в Kabat et al., 1991, Sequencies of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md.; Kabat E et al., 1980, J. Immunology 125(3):961-969).
2
Другие полезные антитела включают фрагменты антител, такие как, без ограничения, F(ab') фрагменты, Fab фрагменты, Fvs, одноцепочечные антитела, диатела, триатела, тетратела, scFv, scFv-FV или любая другая молекула с такой же специфичностью, как и антитело.
Дополнительно, полезными антителами являются рекомбинантные антитела, такие как химерные и гуманизированные моноклональное антитела, содержащие как человеческие, так и не являющие человеческими участки, которые могут быть получены с использованием стандартных методов рекомбинантных ДНК. Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой разные участки имеют происхождение из разных видов животных, например антитела, имеющие вариабельную область из мышиного моноклонального антитела и человеческие константные области (смотри, например, патент США №4816567 и патент США №4816397, которые во всей их полноте включены в данное описание посредством ссылки). Гуманизированные антитела представляют собой молекулы антител из вида, не являющегося человеком, имеющие одну или более областей, определяющих комплементарность (CDR), из вида, не являющегося человеком, и каркасную область из человеческой молекулы иммуноглобулина (смотри, например, патент США №5585089, который во всей его полноте включен в данное описание посредством ссылки). Такие химерные и гуманизированные моноклональные антитела могут быть получены методами рекомбинантных ДНК, известными в данной области, например с использованием методов, описанных в публикации Международной патентной заявки WO 87/02671; публикации Европейского патента №0184187; публикации Европейского патента №0171496; публикации Европейского патента №0173494; публикации Международной патентной заявки WO 86/01533; патенте США №4816567; публикации Европейского патента №012023; Berter et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Cancer. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314:446-449; Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; патенте США №5225539; Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al., 1988, Science 239:1534; и Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060; каждый из которых во всей его полноте включен в данное описание посредством ссылки.
Полностью человеческие антитела являются особенно желательными и могут быть получены с использованием трансгенных мышей, которые не способны экспрессировать гены тяжелых и легких цепей эндогенного иммуноглобулина, но которые могут экспрессировать гены тяжелой и легкой цепи человека. Трансгенных мышей обычным способом подвергают иммунизации выбранным антигеном, например всем или частью полипептида по изобретению. Моноклональные антитела, направленные против антигена, могут быть получены с использованием стандартной гибридомной технологии. Трансгены человеческого ммуноглобулина, находящиеся в трансгенных мышах, перестраиваются во время дифференцировки В-клеток и затем подвергаются переключению класса и соматической мутации. Таким образом, используя такой метод, можно продуцировать терапевтически полезные IgG, IgA, IgM и IgE антитела. Обзор по технологии продуцирования человеческих антител смотри в Lonberg and Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93. Подробное обсуждение этой технологии продуцирования человеческих антител и человеческих моноклональных антител и протоколы продуцирования таких антител смотри, например, в патентах США №№5625126, 5633425, 5569825, 5661016, 5545806, каждый из которых во всей его полноте включен в данное описание посредством ссылки. Другие человеческие антитела могут быть получены из коммерческих источников, например, Abgenix, Inc. (теперь Amgen, Freemont, Calif.) и Medarex (Princeton, N.J.).
Полностью человеческие антитела, которые распознают выбранный эпитоп, могут быть созданы с использованием технологии, называемой "управляемая селекция". В этом подходе выбранное не являющееся человеческим моноклональное антитело, например мышиное антитело, используют, чтобы управлять селекцией полностью человеческого антитела, распознающего тот же эпитоп (смотри, например, Jespers et al., 1994, Biotechnology 12:899-903). Человеческие антитела могут быть продуцированы также с использованием различных методов, известных в данной области, включая библиотеки фагового дисплея (смотри, например, Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Quan and Carter, 2002, The rise of monoclonal antibodies as therapeutics, In Anti-IgE and Allergic Disease, Jardieu and Fick, eds., Marcel Dekker, New York, N.Y., Chapter 20, pp.427-469).
В других воплощениях антитело представляет собой слитый белок антитела или его функционально активный фрагмент, например в котором антитело слито посредством ковалентной связи (например, пептидной связи), по N-концу или по С-концу с аминокислотной последовательностью другого белка (или его части, предпочтительно части белка из по меньшей мере 10, 20 или 50 аминокислот), который не из антитела. Предпочтительно, антитело или его фрагмент ковалентно связан(о) с другим белком по N-концу константного домена.
Антитела включают аналоги и производные, которые либо модифицированы, например ковалентным присоединением любого типа молекулы, если только такое ковалентное присоединение позволяет антителу сохранять его антигенсвязывающую иммуноспецифичность. Например, но без ограничения, производные и аналоги антител включают те из них, которые были модифицированы, например посредством гликозилирования, ацетилирования, пэгилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации известными защитными/блокирующими группами, протеолитического расщепления, связывания с клеточной антительной единицей или другим белком и т.д. Любые многочисленные модификации могут быть осуществлены известными методами, включающими, без ограничения, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез в присутствии туникамицина и т.д. Дополнительно, аналог или производное может содержать одну или более неприродных аминокислот.
Антитела могут иметь модификации (например, замены, делеции или присоединения) аминокислотных остатков, которые взаимодействуют с Fc рецепторами. В частности, антитела могут иметь модификации аминокислотных остатков, которые идентифицированы как участвующие во взаимодействии между анти-Fc доменом и FcRn рецептором (смотри, например, публикацию Международной патентной заявки WO 97/34631, которая во всей ее полноте включена в данное описание посредством ссылки).
Антитела, иммуноспецифические по отношению к антигену раковых клеток, могут быть получены из коммерческих источников или могут быть продуцированы любым способом, известным специалисту в данной области, таким как, например, химический синтез или рекомбинантные экспрессионные технологии. Нуклеотидная последовательность, кодирующая антитела, иммуноспецифические по отношению к антигену раковых клеток, могут быть получены, например, из базы данных GenBank или базы данных, подобной этой базе данных, литературных публикаций или рутинным клонированием и секвенированием.
2a
1
В конкретном воплощении могут быть использованы известные антитела для лечения рака. Антитела, иммуноспецифические по отношению к антигену раковых клеток, могут быть получены из коммерческих источников или могут быть продуцированы любым способом, известным специалисту в данной области, таким как, например, рекомбинантные экспрессионные технологии. Нуклеотидная последовательность, кодирующая антитела, иммуноспецифические по отношению к антигену раковых клеток, могут быть получены, например, из базы данных GenBank или базы данных, подобной этой базе данных, литературных публикаций или рутинным клонированием и секвенированием. Примеры антител, доступных для лечения рака включают, без ограничения, OVAREX, которое представляет собой мышиное антитело для лечения рака яичника; PANOREX (Glaxo Wellcome, NC), которое представляет собой мышиное IgG антитело для лечения колоректального рака; цетуксимаб ERBITUX (Imclone Systems Inc., NY), которое представляет собой анти-EGFR IgG химерные антитело для лечения эпидермальный фактор роста-пололожительных видов рака, таких как рак в области головы и шеи; Vitaxin (, Inc., MD), которое представляет собой гуманизированное антитело для лечения саркомы; CAMPATH I/H (Leukosite, MA), которое представляет собой гуманизированное IgG антитело для лечения хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL); SMART ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA), которое представляет собой гуманизированное анти-HLA-DR антитело для лечения неходжкинской лимфомы; ONCOLYM (Techniclone, Inc., CA), которое представляет собой радиомеченое мышиное анти-HLA-Dr10 антитело для лечения неходжкинской лимфомы; ALLOMUNE (BioTransplant, CA), которое представляет собой гуманизированное анти-CD2 mAb для лечения ходжкинского заболевания или неходжкинской лимфомы; и CEACIDE (Immunomedics, NJ), которое представляет собой гуманизированное анти-СЕА антитело для лечения колоректального рака.
Пытаясь выявить эффективные клеточные мишени для диагностики и терапии рака, исследователи стремились идентифицировать трансмембранные или иные опухоль-ассоциированные полипептиды, которые специфически экспрессируются на поверхности одного или более конкретных типов раковой клетки по сравнению с одной или более нормальными нераковыми клетками. Часто такие опухоль-ассоциированные полипептиды в большем избытке экспрессируются на поверхности раковых клеток по сравнению с нераковыми клетками. Идентификация таких опухоль-ассоциированных клеточных поверхностных антигенных полипептидов дает возможность специфически уничтожать раковые клетки посредством терапий, основанных на антителах.
Линкерная единица (L)
Линкер (иногда упоминаемый как "[линкер]" в данном документе) представляет собой бифункциональные соединение, которое может быть использовано для связывания лекарственного средства и антитела с образованием конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC). Такие конъюгаты полезны, например, в образовании иммуноконъюгатов, направленных против опухоль-ассоциированных антигенов. Такие конъюгаты обеспечивают направленную доставку цитотоксических лекарственных средств в клетки опухоли.
В ADC линкер служит для присоединения полезной нагрузки к антителу.
В одном аспекте предусмотрен второй участок линкерной единицы, который имеет второй реакционноспособный сайт, например электрофильную группу, которая взаимодействует с нуклеофильной группой, присутствующей на антительной единице (например, антителе). Полезные нуклеофильные группы на антителе включают, без ограничения, сульфгидрильные, гидроксильные и аминогруппы. Гетероатом нуклеофильной группы антитела взаимодействует с электрофильной группой на линкерной единице и образует ковалентную связь с линкерной единицей. Полезные электрофильные группы включают, без ограничения, малеимидные и галогенацетамидные группы. Электрофильная группа обеспечивает удобный сайт для присоединения антитела.
В другом воплощении линкерная единица имеет реакционноспособный сайт, который имеет нуклеофильную группу, которая взаимодействует с электрофильной группой, присутствующей на антителе. Полезные электрофильные группы на антителе включают, без ограничения, альдегидные и кетонные карбонильные группы. Гетероатом нуклеофильной группы линкерной единицы может взаимодействовать с электрофильной группой на антителе и образовывать ковалентную связь с антителом. Полезные нуклеофильные группы на линкерной единице включают, без ограничения, гидразид, оксим, амино, гидразин, тиосемикарбазон, гидразин-карбоксилат и арилгидразид. Электрофильная группа на антителе обеспечивает удобный сайт для присоединения клинкерной единице.
Функциональные аминогруппы также являются полезными реакционноспособными сайтами для линкерной единицы, поскольку они могут взаимодействовать с карбоновой кислотой или активированными сложными эфирами соединений с образованием амидной связи. Обычно пептидные соединения по изобретению могут быть получены за счет образования пептидной связи между двумя или более аминокислотами и/или пептидными фрагментами. Такие пептидные связи могут быть получены, например, посредством жидкофазного способа синтеза (смотри, например, Schroder and Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press), который общеизвестен в области пептидной химии.
1
2
2
2
2
3
3
1-6
1-6
A
B
C
В контексте данного изобретения конкретно, но без ограничения, применительно к линкерным компонентам, таким как L, L (включая L, L и L) и L, фраза "выбранный из одного или более" или "один или более" указывает на то, что несколько компонентов, которые могут быть одинаковыми или разными, расположены или могут быть расположены последовательно. Так, например, L может представлять собой -Салкил-, -NR- или другие индивидуально перечисленные компоненты, но также может представлять собой -Салкил-NR- или любую другую комбинацию 2 или более перечисленных компонентов.
В другом воплощении линкерная единица имеет реакционноспособный сайт, который может взаимодействовать с нуклеофилами антител, такими как цистеины. Реакционноспособный сайт состоит из гетероцикла, который замещен сульфоном. Сульфон затем замещают нуклеофилом антитела (т.е. цистеином), и вновь образовавшаяся связь между антителом и гетероциклом соединяет антитело с линкером (смотри WO 2014/144878).
Синтез соединений и их конъюгатов антитело-лекарственное средство
Соединения и конъюгаты по изобретению могут быть получены с использованием методик синтеза, изложенных ниже в разделе "Примеры". Как описано более подробно ниже, соединения и конъюгаты по изобретению могут быть получены с использованием участка линкерной единицы, имеющего реакционноспособный сайт для связывания с соединением. В одном аспекте предусмотрен второй участок линкерной единицы, который имеет второй реакционноспособный сайт, например электрофильную группу, которая взаимодействует с нуклеофильной группой, присутствующей на антительной единице (например, антителе). Полезные нуклеофильные группы на антителе включают, без ограничения, сульфгидрильные, гидроксильные и аминогруппы. Гетероатом нуклеофильной группы антитела взаимодействует с электрофильной группой на линкерной единице и образует ковалентную связь с линкерной единицей. Полезные электрофильные группы включают, без ограничения, малеимидные и галогенацетамидные группы. Электрофильная группа обеспечивает удобный сайт для присоединения антитела.
В другом воплощении линкерная единица имеет реакционноспособный сайт, который имеет нуклеофильную группу, которая взаимодействует с электрофильной группой, присутствующей на антителе. Полезные электрофильные группы на антителе включают, без ограничения, альдегидные и кетонные карбонильные группы. Гетероатом нуклеофильной группы линкерной единицы может взаимодействовать с электрофильной группой на антителе и образовывать ковалентную связь с антителом. Полезные нуклеофильные группы на линкерной единице включают, без ограничения, гидразид, оксим, амино, гидразин, тиосемикарбазон, гидразин-карбоксилат и арилгидразид. Электрофильная группа на антителе обеспечивает удобный для присоединения линкерной единицы.
Функциональные аминогруппы также являются полезными реакционноспособными сайтами для линкерной единицы, поскольку они могут взаимодействовать с карбоновой кислотой или активированными сложными эфирами соединений с образованием амидной связи. Обычно пептидные соединения по изобретению могут быть получены за счет образования пептидной связи между двумя или более аминокислотами и/или пептидными фрагментами. Такие пептидные связи могут быть получены, например, посредством жидкофазного способа синтеза (смотри, например, Schroder and Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press), который общеизвестен в области пептидной химии.
Как описано более подробно ниже, конъюгаты могут быть получены, используя участок линкера, имеющий реакционноспособный сайт для связывания с соединением по изобретению, и другой участок линкерной единицы, имеющий реакционноспособный сайт для антитела. В одном аспекте линкерная единица имеет реакционноспособный сайт, который имеет электрофильную группу, которая взаимодействует с нуклеофильной группой, присутствующей на антительной единице, такой как антитело. Электрофильная группа обеспечивает удобный сайт для присоединения антитела. Полезные нуклеофильные группы на антителе включают, без ограничения, сульфгидрильные, гидроксильные и аминогруппы. Гетероатом нуклеофильной группы антитела взаимодействует с электрофильной группой на линкерной единице и образует ковалентную связь с линкерной единицей. Полезные электрофильные группы включают, без ограничения, малеимидные и галогенацетамидные группы.
В другом воплощении линкерная единица имеет реакционноспособный сайт, который имеет нуклеофильную группу, которая взаимодействует с электрофильной группой, присутствующей на антительной единице. Электрофильная группа на антителе обеспечивает удобный сайт для присоединения к линкерной единице. Полезные электрофильные группы на антителе включают, без ограничения, альдегидные и кетонные карбонильные группы. Гетероатом нуклеофильной группы линкерной единицы может взаимодействовать с электрофильной группой на антителе и образовывать ковалентную связь с антителом. Полезные нуклеофильные группы на линкерной единице включают, без ограничения, гидразид, оксим, амино, гидразин, тиосемикарбазон, гидразин-карбоксилат и арилгидразид.
В другом воплощении изобретения для связи по настоящему изобретению используется сконструированный полипептид константного домена антитела, или его часть, где сконструированный константный домен содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену для встраивания цистеинового остатка, полезного для конъюгирования, и где полипептид константного домена представляет собой сконструированный полипептид константного домена тяжелой цепи IgG человека (Су), или его часть, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из K246, D249, D265, S267, D270, N276, Y278, Е283, R292, Е293, Е294, Y300, V302, V303, L314, N315, Е318, K320, I332, Е333, K334, 1336, Е345, Q347, S354, R355, М358, K360, Q362, K370, Y373, D376, А378, Е380, Е382, Q386, Е388, N390, K392, Т393, D401, F404, Т411, D413, K414, R416, Q418, Q419, N421, М428, А431, L432, Т437, Q438, K439, L443 и S444 согласно указателю EU Kabat.
В другом воплощении изобретения для связи по настоящему изобретению используется сконструированный полипептид константного домена антитела, или его часть, где сконструированный константный домен содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену для встраивания цистеинового остатка, полезного для конъюгирования, и где полипептид константного домена представляет собой сконструированный полипептид константного домена легкой цепи лямбда человека (СА), или его часть, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из K110, А111, L125, K149С, V155, G158, Т161, Q185, S188, Н189, S191, Т197, V205, Е206, K207, Т208 и А210 согласно нумерации Kabat.
В еще одном воплощении изобретения для связи по настоящему изобретению используется сконструированный полипептид константного домена антитела, или его часть, где сконструированный константный домен содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену для встраивания цистеинового остатка, полезного для конъюгирования, и где полипептид константного домена представляет собой сконструированный полипептид константного домена легкой цепи каппа человека (CK), или его часть, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из А111, K183, и N210 согласно нумерации Kabat.
В еще одном воплощении изобретения для связи по настоящему изобретению используется сконструированный полипептид константного домена антитела, или его часть, где сконструированный константный домен содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену для встраивания цистеинового остатка, полезного для конъюгирования, и где полипептид константного домена представляет собой сконструированный полипептид Су, или его часть, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 97-100, 102, 104, 107-127 и 129-163, как раскрыто в публикации международной заявки WO 2013/093809, которая во всей ее полноте включена в данное описание посредством ссылки.
В еще одном воплощении изобретения для связи по настоящему изобретению используется сконструированный полипептид константного домена антитела, или его часть, где сконструированный константный домен содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену для встраивания цистеинового остатка, полезного для конъюгирования, и где полипептид константного домена представляет собой сконструированный полипептид CK, или его часть, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 90, 92, 95, 164, 166 и 169, как раскрыто в публикации международной заявки WO 2013/093809, которая во всей ее полноте включена в данное описание посредством ссылки.
В еще одном воплощении изобретения для связи по настоящему изобретению используется сконструированный полипептид константного домена антитела, или его часть, где сконструированный константный домен содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену для встраивания цистеинового остатка, полезного для конъюгирования, и где полипептид константного домена представляет собой сконструированный полипептид СА, или его часть, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 172-186, как раскрыто в публикации международной заявки WO 2013/093809, которая во всей ее полноте включена в данное описание посредством ссылки.
В другом воплощении изобретения сконструированный полипептид Су, упомянутый выше, дополнительно содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из мутаций по положению аминокислот 284, 287, А327, N384, L398 и V422 согласно указателю EU Kabat.
Конъюгирование с трансглутаминазой
2
В некоторых воплощениях соединение по изобретению может быть ковалентно перекрестно связано с Fc-содержащим или Fab-содержащим полипептидом, сконструированным с являющейся донором ацила глутаминсодержащей меткой (например, с Gln-содержащими пептидными метками или Q-метками) или являющимся донором ацила эндогенным глутамином, сделанным реакционноспособным (т.е. способным образовывать ковалентную связь в качестве донора ацила в присутствии амина и трансглутаминазы) путем конструирования полипептида (например, посредством аминокислотной делеции, вставки, замены, мутации или любой их комбинации на полипептиде), в присутствии трансглутаминазы при условии, что соединение по изобретению содержит агент-донор амина (например, небольшую молекулу, содержащую реакционноспособный амин или присоединенную к реакционноспособному амину), тем самым образуя стабильную и гомогенную популяцию конъюгата сконструированного Fc-содержащего полипептида с агентом-донором амина, являющегося сайт-специфически конъюгированным с Fc-содержащим или Fab-содержащим полипептидом посредством являющейся донором ацила глутамин-содержащей метки или являющегося донором ацила экспонированного/доступного/реакционноспособного эндогенного глутамина. Например, соединения по изобретению могут быть конъюгированы, как описано в Международной патентной заявке PCT/IB 2011/054899, полное содержание которой включено в данное описание посредством ссылки. В некоторых воплощениях для облегчения конъюгирования соединение по изобретению с Fc-содержащим или Fab-содержащим полипептидом, сконструированным с являющейся донором ацила глутаминсодержащей меткой или эндогенным глутамином, сделанным реакционноспособным путем конструирования полипептида в присутствии трансглутаминазы, Z представляет собой NH.
Конъюгирование с константной областью домена легкой цепи каппа человека
188
188
7
2
3
В некоторых воплощениях соединение по изобретению может быть ковалентно присоединено к боковой цепи K константной области домена легкой цепи каппа (CLκ) человека (нумерация полноразмерной легкой цепи согласно Kabat). Например, соединения по изобретению могут быть конъюгированы, как описано в заявке на патент США серийный номер 13/180,204, полное содержание которой включено в данное описание посредством ссылки. В некоторых воплощениях для облегчения конъюгирования с K CLκ Z представляет собой  R независимо для каждого случая выбран из группы, состоящей из F, Cl, I, Br, NO, CN и CF; и h означает 1, 2, 3, 4 или 5.
В некоторых воплощениях согласно изобретению предложена композиция, содержащая соединение по изобретению, ковалентно конъюгированное с антителом (или его антигенсвязывающим участком), где по меньшей мере примерно 50%, или по меньшей мере примерно 60%, или по меньшей мере примерно 70%, или по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 90% соединения по изобретению в композиции конъюгировано с антителом или его антигенсвязывающим участком по K188 CLκ.
В некоторых воплощениях соединения по изобретению могут быть конъюгированы с сайтом связывания каталитического антитела, такого как антитела против альдолазы, или его антигенсвязывающим участком. Антитела против альдолазы содержат участки сайта связывания, которые, когда они не обременены (например конъюгированием), катализируют реакцию альдольного присоединения между алифатическим кетонным донором и альдегидным акцептором. Содержание публикации заявки на патент США №2006/205670 включено в данное описание посредством ссылки, в частности страницы 78-118, где описаны линкеры, и параграфы [0153]-[0233], где описаны антитела, их полезные фрагменты, варианты и модификации, h38C2, сайты связывания и области, определяющие комплементарность (CDR), и связанная с этим технология. Термин "сайт связывания" охватывает CDR и соседние остатки каркасной области, которые участвуют в связывании антигена.
Композиции и способы введения
В других воплощениях еще один аспект изобретения относится к фармацевтическим композициям, содержащим эффективное количество соединения по изобретению и/или его конъюгата антитело-лекарственное средство и фармацевтически приемлемые носитель или разбавитель. В некоторых воплощениях композиции пригодны для ветеринарии и для введения человеку.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть в любой форме, которая позволяет вводить композицию пациенту. Например, композиция может быть в твердой или жидкой форме. Типичные пути введения включают, без ограничения, парентеральный путь, в глаз и в опухоль. Парентеральное введение включает подкожную инъекцию, внутривенную, внутримышечную и интрастернальную инъекцию или инфузию. В одном аспекте композиции вводят парентерально. В конкретной воплощении данные композиции вводят внутривенно.
Фармацевтические композиции могут быть приготовлены таким образом, чтобы соединение по изобретению и/или его конъюгат антитело-лекарственное средство было биодоступным при введении композиции пациенту. Композиции могут принимать форму одной или более дозировочных единиц, где, например, таблетка может представлять собой однократную дозировочную единицу, а контейнер для соединения по изобретению и/или его конъюгата антитело-лекарственное средство в жидкой форме может вмещать в себя множество дозировочных единиц.
Вещества, используемые в приготовлении фармацевтических композиций, должны быть нетоксичными в используемых количествах. Для специалиста в данной области будет очевидно, что оптимальная дозировка активного(ых) ингредиента(ов) в фармацевтической композиции будет зависеть от целого ряда факторов. Релевантные факторы включают, без ограничения, тип животного (например, человек), конкретную форму соединения по изобретению и/или его конъюгата антитело-лекарственное средство, способ введения и используемую композицию.
Фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель может представлять собой твердое вещество или дисперсное вещество, так что композиции находятся, например, в форме таблетки или порошка. Носитель(и) может быть жидким. Кроме того, носители(и) может быть дисперсным.
Композиция может быть в форме жидкости, например раствора, эмульсии или суспензии. В состав композиций для введения инъекциями могут быть также включены одно или более чем одно поверностно-активное вещество, один или более чем один консервант, увлажняющий агент, диспергирующий агент, суспендирующий агент, буфер, стабилизатор и изотонический агент.
В состав жидких композиций, будь то растворы, суспензии или другие подобные формы, могут входить также одно или более из следующего: стерильные разбавители, такие как вода для инъекций, солевой раствор, предпочтительно физиологический раствор, раствор Рингера, изотонический хлорид натрия, нелетучие масла, такие как синтетические моно- или диглицериды, которые могут служить в качестве растворителя или суспендирующей среды, полиэтиленгликоли, глицерин, циклодекстрин, пропиленгликоль или другие растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабен; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты, фосфаты или аминокислоты, и агенты для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Парентеральная композиция может быть заключена в ампуле, одноразовом шприце или многодозовом флаконе, изготовленном из стекла, пластика или другого материала. Физиологический раствор является типичным вспомогательным веществом. Инъекционная композиция предпочтительно является стерильной.
Количество соединения по изобретению и/или его конъюгата антитело-лекарственное средство, которое является эффективным в лечении конкретного расстройства или состояния, будет зависеть от природы расстройства или состояния, и оно может быть определено стандартными клиническими методами. Кроме того, анализы in vitro или in vivo возможно могут быть использованы для идентификации оптимальных диапазонов дозировок. Точная доза, которую следует использовать в композициях, также будет зависеть от пути введения и тяжести заболевания или расстройства и будет находиться на усмотрении практикующего специалиста, и будет зависеть от обстоятельств каждого пациента.
Композиции содержат эффективное количество соединения по изобретению и/или его конъюгата антитело-лекарственное средство, основываясь на том, что будет получена подходящая дозировка. Обычно это количество составляет по меньшей мере примерно 0,01% соединения по изобретению и/или его конъюгата антитело-лекарственное средство от массы композиции. В иллюстративном воплощении получают такие фармацевтические композиции, чтобы парентеральная дозировочная единица содержала от примерно 0,01% до примерно 2% масс. соединения по изобретению и/или его конъюгата антитело-лекарственное средство.
Для внутривенного введения композиция может содержать от примерно 0,01 до примерно 100 мг соединения по изобретению и/или его конъюгата антитело-лекарственное средство на кг массы тела пациента. В одном аспекте композиция может содержать от примерно 1 до примерно 100 мг соединения по изобретению и/или его конъюгата антитело-лекарственное средство на кг массы тела пациента. В другом аспекте вводимое количество будет находиться в диапазоне от примерно 0,1 до примерно 25 мг/кг массы тела соединения по изобретению и/или его конъюгата антитело-лекарственное средство.
Как правило, доза соединения по изобретению и/или его конъюгата антитело-лекарственное средство, вводимая пациенту, составляет типично от примерно 0,01 мг/кг до примерно 20 мг/кг массы тела пациента. В одном аспекте доза, вводимая пациенту, составляет от примерно 0,01 мг/кг до примерно 10 мг/кг массы тела пациента. В другом аспекте доза, вводимая пациенту, составляет от примерно 0,1 мг/кг до примерно 10 мг/кг массы тела пациента. В еще одном аспекте доза, вводимая пациенту, составляет от примерно 0,1 мг/кг и до примерно 5 мг/кг массы тела пациента. В еще одном аспекте вводимая доза составляет от примерно 0,1 мг/кг до примерно 3 мг/кг массы тела пациента. В еще одном аспекте вводимая доза составляет от примерно 1 мг/кг до примерно 3 мг/кг массы тела пациента.
Соединение по изобретению и/или его конъюгат антитело-лекарственное средство можно вводить любым удобным путем, например инфузией или болюсной инъекцией. Введение может быть системным или местным. Известны различные системы доставки, например инкапсулирование в липосомах, микрочастицах, микрокапсулах, капсулах и т.д., и они могут быть использованы для введения соединения по изобретению и/или его конъюгата антитело-лекарственное средство. В некоторых воплощениях пациенту вводят больше одного соединения по изобретению и/или его конъюгата антитело-лекарственное средство.
В конкретных воплощениях желательным может быть введение одного или более соединений по изобретению и/или их конъюгатов антитело-лекарственное средство местно в область, нуждающуюся в лечении. Это достигается, например, и без ограничения, путем местной инфузии во время хирургической операции; наружного нанесения, например в сочетании с наложением повязки на рану после хирургической операции; иъекцией; посредством катетера; или посредством имплантата, причем имплантата из пористого, непористого или гелеобразного материала, включая мембраны, такие как силастиковые мембраны, или волокна. В одном воплощении введение можно осуществлять путем прямой инъекции в место (или прежнее место) рака, опухоли или неопластической или пре-неопластической ткани. В другом воплощении введение можно осуществлять путем прямой инъекции в место (или прежнее место) проявления аутоиммунного заболевания.
В еще одном воплощении соединение по изобретению и/или его конъюгат антитело-лекарственное средство можно доставлять в системе контролируемого высвобождения, такой как, без ограничения, насос, или могут быть использованы различные полимерные материалы. В еще одном воплощении система контролируемого высвобождения может быть размещена вблизи мишени соединения по изобретению и/или его конъюгата антитело-лекарственное средство, например печени, и при этом требуется только доля системной дозы (смотри, например, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Другие системы контролируемого высвобождения, которые могут быть использованы, обсуждались в обзоре, опубликованном в Langer, Science 249:1527-1533 (1990).
Термин "носитель" относится к разбавителю, вспомогательному веществу или эксципиенту, с которым вводят соединение или его конъюгат антитело-лекарственное средство. Такие фармацевтические носители могут представлять собой жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения. Носителями могут быть физиологический раствор и т.п. Кроме того, могут быть использованы вспомогательные, стабилизирующие и другие агенты. В одном воплощении при введении пациенту соединение или конъюгат и фармацевтически приемлемые носители являются стерильными. Вода является примером носителя, когда соединение или конъюгат вводят внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидких носителей, в частности для инъекционных растворов. Композиции по настоящему изобретению могут также содержать, при необходимости, незначительные количества увлажняющих или эмульгирующих агентов или рН буферных агентов.
Композиции по настоящему изобретению могут принимать форму растворов, пеллет, порошков, препаратов пролонгированного высвобождения или любой другой формы, подходящей для использования. Другие примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin.
В одном из воплощений соединение по изобретению и/или его конъюгат антитело-лекарственное средство получают в соответствии с рутинными методиками в виде фармацевтической композиции, пригодной для внутривенного введения животным, в частности людям. Обычно носители или наполнители для внутривенного введения представляют собой стерильные изотонические водные буферные растворы. Если необходимо, композиции могут также содержать солюбилизирующий агент. Композиции для внутривенного введения возможно могут содержать местный анестетик, такой как лигнокаин, для ослабления боли в месте инъекции. Как правило, ингредиенты доставляют либо отдельно, либо смешанными вместе в стандартной лекарственной форме, например в виде сухого лиофилизированного порошка или не содержащего воду концентрата в герметичном контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного агента. В тех случаях, когда соединение по изобретению и/или его конъюгат антитело-лекарственное средство нужно вводить инфузией, тогда его можно дозировать, например, с использованием инфузионного флакона, содержащего стерильную фармацевтического сорта воду или физиологический раствор. Если соединение по изобретению и/или его конъюгат антитело-лекарственное средство вводят инъекциями, то может быть предоставлена ампула со стерильной водой для инъекций или физиологическим раствором, чтобы ингредиенты могли быть смешаны перед введением.
Композиция может содержать различные вещества, которые модифицируют физическую форму твердой или жидкой дозировочной единицы. Например, композиция может содержать вещества, которые образуют оболочку, покрывающую активные ингредиенты. Вещества, которые образуют покрывающую оболочку, обычно являются инертными и могут быть выбраны, например, из сахара, шеллака и других энтеросолюбильных покровных агентов. Альтернативно, активные ингредиенты могут быть инкапсулированы в желатиновой капсуле.
Композиции по настоящему изобретению в твердой или в жидкой форме могут содержать фармакологический агент, используемый в лечении рака.
Терапевтические применения соединений и их конъюгатов антитело-лекарственное средство
Еще один аспект изобретения относится к способу использования соединений по изобретению и их конъюгатов антитело-лекарственное средство для лечения рака.
Соединения по изобретению и/или их конъюгаты антитело-лекарственное средство полезны в ингибировании размножения опухолевых клеток или раковых клеток, вызывая апоптоз в опухолевой или раковой клетке, или для лечения рака у пациента. Соответственно, соединения по изобретению и/или их конъюгаты антитело-лекарственное средство можно использовать в различных условиях для лечения рака у животных. Указанные конъюгаты могут быть использованы для доставки соединения по изобретению в опухолевую клетку или раковую клетку. Без какой-либо связи с теорией, в одном воплощении антитело конъюгата связывается с или ассоциируется с антигеном, ассоциированным с раковой клеткой или опухолевой клеткой, и конъюгат может захватываться (интернализоваться) внутрь опухолевой клетки или раковой клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза или другого механизма интернализации. Антиген может быть присоединен к опухолевой клетке или раковой клетке или может представлять собой внеклеточный матриксный белок, ассоциированный с опухолевой клеткой или раковой клеткой. В некоторых воплощениях после проникновения в клетку одна или более специфических пептидных последовательностей ферментативно или гидролитически расщепляется одной или более протеазами, ассоциированными с опухолевыми клетками или раковыми клетками, что приводит к высвобождению соединения по изобретению из конъюгата. Высвобожденное соединение по изобретению затем свободно может мигрировать в клетке и индуцировать цитотоксическую или цитостатическую активность. Конъюгат также может расщепляться внутриклеточной протеазой с высвобождением соединения по изобретению. В альтернативном воплощении соединение по изобретению отщепляется от конъюгата вне опухолевой клетки или раковой клетки, и соединение по изобретению после этого проникает в клетку.
В некоторых воплощениях конъюгаты обеспечивают конъюгация-специфическое нацеливание лекарственного средства на опухоль или рак, таким образом снижая общую токсичность соединений по изобретению.
В другом воплощении антительная единица связывается с опухолевой клеткой или раковой клеткой.
В другом воплощении антительная единица связывается с антигеном опухолевой клетки или раковой клетки, который находится на поверхности опухолевой клетки или раковой клетки.
В другом воплощении антительная единица связывается с антигеном опухолевой клетки или раковой клетки, который представляет собой внеклеточный матриксный белок, ассоциированный с опухолевой клеткой или раковой клеткой.
Специфичность антительной единицы по отношению к конкретной опухолевой клетке или раковой клетке может быть важна для определения тех опухолей или видов рака, которые лечатся наиболее эффективно.
Конкретные типы рака, которые можно лечить соединением по изобретению и/или его конъюгатом антитело-лекарственное средство, включают, без ограничения, карциномы мочевого пузыря, молочной железы, шейки матки, ободочной кишки, эндометрия, почки, легкого, пищевода, яичника, предстательной железы, поджелудочной железы, кожи, желудка и яичек; и типы рака гемопоэтического происхождения, включающие, без ограничения, лейкозы и лимфомы.
Комплексная терапия рака. Виды рака, включая, без ограничения, опухоль, метастазирование или другое заболевание или расстройство, характеризующееся неконтролируемым ростом клеток, можно лечить или тормозить путем введения соединения по изобретению и/или его конъюгата антитело-лекарственное средство.
В других воплощениях предложены способы лечения рака, включающие введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества соединения по изобретению и/или его конъюгата антитело-лекарственное средство и химиотерапевтического агента. В одном воплощении химиотерапевтическим агентом является агент, резистентность к которому не обнаружена. В другом воплощении, химиотерапевтическим агентом является агент, резистентность к которому обнаружена. Соединение по изобретению и/или его конъюгат антитело-лекарственное средство можно вводить пациенту, который перенес хирургическую операцию в качестве лечения рака.
В некоторых воплощениях пациент также получает дополнительное лечение, такое как лучевая терапия. В конкретном воплощении соединение по изобретению и/или его конъюгат антитело-лекарственное средство вводят параллельно с химиотерапевтическим агентом или с лучевой терапией. В другом конкретном воплощении химиотерапевтический агент или лучевую терапию назначают до или после введения соединения по изобретению и/или его конъюгата антитело-лекарственное средство.
Химиотерапевтический агент можно вводить на протяжении серии курсов. Можно вводить любой один или комбинацию химиотерапевтических агентов, таких как химиотерапевтический(е) агент(ы) стандартного лечения.
Дополнительно, предложены способы лечения рака соединением по изобретению и/или его конъюгатом антитело-лекарственное средство в качестве альтернативы химиотерапии или лучевой терапии, где химиотерапия или лучевая терапия оказалась или может оказаться слишком токсичной, например приводит к неприемлемым или непереносимым побочным эффектам, для субъекта, которого лечат. Пациента, подлежащего лечению, можно лечить другим способом лечения рака, таким как хирургическая операция, лучевая терапия или химиотерапия, в зависимости от того, какое лечение установлено как приемлемое или переносимое.
Соединения по изобретению и/или их конъюгаты антитело-лекарственное средство можно также использовать в in vitro или ex vivo моделях, таких как для лечения некоторых типов рака, включая, без ограничения, лейкозы и лимфомы, предусматривающего использование трансплантатов стволовых клеток. Это лечение может представлять собой многостадийный процесс, при котором аутологичные гематопоэтические стволовые клетки животного собирают и очищают из всех раковых клеток, остающуюся популяцию клеток костного мозга животного затем уничтожают посредством введения высокой дозы соединения по изобретению и/или его конъюгата антитело-лекарственное средство с сопутствующей лучевой терапией или без сопутствующей лучевой терапии, и трансплантат стволовых клеток вводят инфузией назад животному. Затем обеспечивают поддерживающее лечение по мере того, как функция костного мозга восстанавливается, и пациент выздоравливает.
Изобретение дополнительно описано приведенными ниже примерами, которые не ограничивают объем изобретения.
Общие способы
Экспериментальные методики синтеза:
Эксперименты обычно проводили в инертной атмосфере (азот или аргон), особенно в случаях, когда использовали кислородочувствительные или влагочувствительные реагенты или промежуточные соединения. Как правило, коммерческие растворители и реагенты использовали без дополнительной очистки, в том числе безводные растворители в соответствующих случаях (обычно Sure-Seal™ продукты от Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin). Масс-спектрометрические данные получены либо жидкостной хроматографией/масс-спектрометрией (LC-MS), либо с использованием химической ионизации при атмосферном давлении (APCI). Химические сдвиги для данных ядерного магнитного резонанса (ЯМР) выражены в миллионных долях (м.д., δ) относительно резидуальных пиков от использованных дейтерированных растворителей.
Что касается методик синтеза, упоминающихся в других Примерах или Методах, реакционный протокол (длительность реакции и температура) может варьировать. Как правило, реакционные смеси подвергали тонкослойной хроматографии, LC-MS или HPLC и подвергали обработке в тех случаях, когда это было нужно. Очистка может варьировать от эксперимента к эксперименту: обычно использованные растворители и соотношения растворителей, использованные для элюентов/градиентов, выбирали с целью получения соответствующих времен удерживания. Если конкретно не указано иное, фракции обращенно-фазовой HPLC концентрировали посредством лиофилизации/сублимационной сушки. Промежуточные и конечные соединения хранили при 0°С или при комнатной температуре в закрытых пробирках или колбах под азотом. Названия соединениям были присвоены с использованием программного обеспечения ACD Labs.
Сокращения для растворителей и/или реагентов основаны на руководствах Американского химического общества и приведены ниже:
Ас = ацетил
Boc = N-трет-бутоксикарбонил
CDI = N,N'-карбонилдиимидазол
DCC = 1,3-дициклогексилкарбодиимид
DCE = дихлорэтан
DCM = дихлорметан
DEA = N,N-диэтиламин
DEAD = диэтилазодикарбоксилат
DIAD = диизопропилазодикарбоксилат
DIBAL-H = гидрид диизобутилалюминия
DIPEA (или) основание Хюнига = N,N-диизопропилэтиламин
DMA = диметилацетамид
DMAP = 4-диметиламинопиридин
DME = диметоксиэтан
DMF = N,N-диметилформамид
DMSO = диметилсульфоксид
DPPA = дифенилфосфорилазид
EDCI = 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид
EtOAc = этилацетат
Fmoc = флуоренилметилоксикарбонил
ч = час
HATU = гексафторфосфат о-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония
HBTU = гексафторфосфат N,N,N',N'-тетраметил-O-(1Н-бензотриазол-1-ил)урония
НОАс = уксусная кислота
HOAt = 1-гидрокси-7-азабензотриазол
HOBt = гидрат 1-гидроксибензотриазола
LDA = диизопропиламид лития
Me = метил
МС = молекулярные сита
МТВЕ = метил-трет-бутиловый эфир
n-BuLi = н-бутиллитий
NBS = N-бромсукцинимид
NMM = N-метилморфолин
Ph = фенил
PPTS = пара-толуолсульфонат пиридиния
p-TsOH = пара-толуолсульфоновая кислота
к.т. = комнатная температура
TBAI = йодид тетрабутиламмония
TEA = триэтиламин
Tf = трифторметансульфонат
TFA = TFA (трифторуксусная кислота)
THF = тетрагидрофуран
TPTU = тетрафторборат O-(2-оксо-1(2H)пиридил)-N,N,N,'N'-тетраметилурония
Условия HPLC и LC-MS, использованные для анализа
Протокол А: Колонка: Waters Acquity UPLC HSS Т3, 2,1 мм × 50 мм, С18, 1,7 мкм; Подвижная фаза А: 0,1% муравьиной кислоты в воде (об./об.); Подвижная фаза В: 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (об./об.); Градиент: 5% В в течение 0,1 минуты, от 5% до 95% В за 2,5 минуты, 95% В в течение 0,35 минуты; Скорость потока: 1,25 мл/минута; Температура: 60°С; Детектирование: 200-450 нм; Диапазон MS (+) (масс-спектрометрия с регистрацией положительных ионов) 100-2000 Дальтон; Впрыскиваемый объем: 5 мкл; Прибор: Waters Acquity.
Протокол В: Колонка: Waters Acquity UPLC HSS Т3, С18, 2,1×50 мм, 1,7 мкм; Подвижная фаза А: 0,1% муравьиной кислоты в воде (об./об.); Подвижная фаза В: 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (об./об.); Градиент: 5% В в течение 0,1 минуты, от 5% до 95% В за 1,5 минуты, 95% В в течение 0,35 минуты; Скорость потока: 1,25 мл/минута. Температура: 60°С; Детектирование: 200-450 нм; Диапазон MS (+) 100-2000 Дальтон; Впрыскиваемый объем: 5 мкл; Прибор: Waters Acquity.
Условия HPLC, использованные для очистки
Метод А: Колонка: Phenomenex Luna Phenylhexyl 150×21,2 мм, 5 мкм;
Подвижная фаза А: 0,02% TFA в воде (об./об.); Подвижная фаза В: 0,02% TFA в ацетонитриле (об./об.); Градиент: 20% В в течение 1,5 минут, от 20% В до 100% В за 8,5 минут, затем 100% В в течение 2,0 минут; Скорость потока: 27 мл/минута. Температура: не контролировали; Детектирование: DAD (детектор на диодной матрице) 210-360 нм; Диапазон MS (+) 150-2000 Дальтон; Прибор: 305 RP Waters Fractional Lynx LCMS.
Метод В: Колонка: Phenomenex Luna С18, 100×30 мм, 5 мкм; Подвижная фаза А: 0,02% TFA в воде (об./об.); Подвижная фаза В: 0,02% TFA в ацетонитриле (об./об.); Градиент: 20% В в течение 1,5 минут, от 20% В до 100% В за 8,5 минут, затем 95% В в течение 2,0 минут; Скорость потока: 30 мл/минута. Температура: не контролировали; Детектирование: UV (УФ) 215 нм; Прибор: Gilson.
Метод С: Phenomenex Luna С18, 100×30 мм, 5 мкм; Подвижная фаза А: 0,02% TFA в воде (об./об.); Подвижная фаза В: 0,02% TFA в ацетонитриле (об./об.); Градиент: переменный, градиентное увеличение В в А в течение 10-20 минут; Скорость потока: от 27 до 30 мл/минута; Температура: не контролировали; Детектирование: UV 215 нм; Прибор: Gilson.
Общие методики:
Общая методика А: В перемешиваемый раствор моно или дикислоты в THF, дихлорметане или их смеси при 0°С добавляли оксалилхлорид (1-2,5 экв.), затем добавляли каталитическое количество DMF. Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение нескольких минут, после чего оставляли нагреваться до комнатной температуры и затем перемешивали при комнатной температуре в течение периода времени от 30 минут до нескольких часов. Реакционную смесь затем концентрировали в вакууме. В некоторых случаях неочищенное вещество затем подвергали азеотропной перегонке от одного до нескольких раз с гептаном или другим релевантным растворителем или растворителями. Неочищенное вещество затем сушили в глубоком вакууме и после этого использовали на следующей стадии.
Общая методика В: В перемешиваемый раствор амина (2-2,5 экв.) в THF, дихлорметане или их смеси при 0°С (или в некоторых случаях другом релевантном растворителе или растворителях) добавляли хлорангидрид кислоты или хлорангидрид дикислоты, затем добавляли пиридин (3-6 экв.), триэтиламин (3-6 экв.) или другое релевантное основание (3-6 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение периода времени от нескольких секунд до нескольких минут, после чего оставляли нагреваться до комнатной температуры и затем перемешивали при комнатной температуре в течение периода времени от 10 минут до нескольких часов. Реакционную смесь затем концентрировали в вакууме. В некоторых случаях неочищенное вещество затем подвергали азеотропной перегонке от одного до нескольких раз с гептаном или другим релевантным растворителем или растворителями. В большинстве случаев неочищенное вещество затем очищали описанным методом, таким как хроматография на диоксиде кремния или обращенно-фазовая С18 хроматография среднего давления.
Примеры:
Получение (S)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-илацетата (4)
Стадия 1: Синтез трет-бутил-(S)-8-(хлорметил)-4-гидрокси-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-карбоксилата (2): В перемешиваемый раствор трет-бутил-(8S)-4-(бензилокси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-карбоксилата (1) [полученного, как описано в J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 14092-14099] (100 мг, 0,225 ммоль) в THF (1,5 мл) добавляли 10% Pd/C (33 мг), после чего добавляли 25% водный раствор формиата аммония (0,15 мл). Раствор перемешивали в течение 2 ч. Раствор разбавляли диэтиловым эфиром (6 мл) и добавляли сульфат натрия. Смесь фильтровали через Celite, и растворитель удаляли в вакууме с получением целевого продукта 2 в виде белого твердого вещества (79 мг, 100%).
2
2
Стадия 2: Синтез трет-бутил-(S)-4-ацетокси-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-карбоксилата (3): трет-Бутил-(S)-8-(хлорметил)-4-гидрокси-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-карбоксилат (2,69 мг, 0,19 ммоль) растворяли в CHCl (2 мл). Добавляли пиридин (46 мг, 0,585 ммоль). Добавляли ацетилхлорид (16 мл, 0,234 ммоль), и реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч. Растворитель удаляли в вакууме. Неочищенный остаток очищали флэш-хроматографией (0-100% EtOAc/гептан) с получением целевого продукта (45 мг, 58%).
Стадия 3: Синтез (S)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-илацетата (4): трет-Бутил-(S)-4-ацетокси-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-карбоксилат (3) (45 мг, 0,11 ммоль) абсорбировали в диоксане (1 мл). Добавляли 4 н. HCl в диоксане (1 мл), и раствор перемешивали в течение 2 ч. Растворитель удаляли с получением неочищенного целевого вещества с количественным выходом, и это вещество сразу использовали как есть.
Получение хлорангидрида бицикло[1.1.1]-1,3-дикарбоновой кислоты (6)
Бицикло[1.1.1]пентан-1,3-дикарбоновую кислоту (50 мг) помещали в пробирку и абсорбировали в THF (1 мл), и добавляли каплю DMF. Медленно добавляли оксалилдихлорид (122 мг, 0,961 ммоль, 0,0825 мл), и раствор быстро барботировали. Через 2 ч растворитель удаляли, и хлорангидрид дикислоты 6 использовали как есть в последующих реакциях.
Получение (8S,8'S)-(бицикло[1.1.1]пентан-1,3-дикарбонил)бис(8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6,4-диил)-диацетата (7)
+
Стадия 1: (8S,8'S)-(Бицикло[1.1.1]пентан-1,3-дикарбонил)бис(8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6,4-диил)-диацетат (7). Указанное в заголовке соединение получали по общей методике В, используя соединение 4 (20,0 мг, 0,060 ммоль), соединение 6 (5,81 мг, 0,0301 ммоль, 0,0301 мл, 1М в THF), пиридин (14,3 0,181 ммоль) и THF (1,0 мл) и очистку. Вещество очищали обращенно-фазовой С18 хроматографией (градиент: от 0% до 80% ацетонитрила в воде с 0,02% TFA в каждой фазе) с получением целевого продукта 7 (8,0 мг, 20%). LC-MS (Протокол В): m/z 711,3 [М+Н], время удерживания = 1,12 минуты.
Получение (R)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил-ацетата (11)
Стадия 1: Синтез трет-бутил-(R)-8-(хлорметил)-4-гидрокси-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-карбоксилата (9): В перемешиваемый раствор трет-бутил-(8R)-4-(бензилокси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-карбоксилата (8) [полученного, как описано в J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 14092-14099] (100 мг, 0,225 ммоль) в THF (1,5 мл) добавляли 10% Pd/C (33 мг), после чего добавляли 25% водный раствор формиата аммония (0,15 мл). Раствор перемешивали в течение 2 ч. Раствор разбавляли диэтиловым эфиром (6 мл) и добавляли сульфат натрия. Смесь фильтровали через Celite, и растворитель удаляли в вакууме с получением целевого продукта 9 в виде белого твердого вещества (79 мг, 100%).
2
2
Стадия 2: Синтез трет-бутил-(R)-4-ацетокси-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-карбоксилата (10): трет-Бутил-(R)-8-(хлорметил)-4-гидрокси-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-карбоксилат (2) (69 мг, 0,19 ммоль) растворяли в CHCl (2 мл). Добавляли пиридин (46 мг, 0,585 ммоль). Добавляли ацетилхлорид (16 мл, 0,234 ммоль), и реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч. Растворитель удаляли в вакууме. Неочищенный остаток очищали флэш-хроматографией (0-100% EtOAc/гептан) с получением целевого продукта 10 (53 мг, 69%).
Стадия 3: Синтез (R)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил-ацетата (11): трет-Бутил-(R)-4-ацетокси-8-(хлорметил)-1-Метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-карбоксилат (10) (53 мг, 0,13 ммоль) абсорбировали в диоксане (1 мл). Добавляли 4 н. HCl в диоксане (1 мл), и раствор перемешивали в течение 2 ч. Растворитель удаляли с получением неочищенного целевого вещества с количественным выходом, и это вещество сразу использовали как есть. Получение (8R,8'R)-(бицикло[1.1.1]пентан-1,3-дикарбонил)бис(8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6,4-ил)-диацетата (11).
Получение (8R,8'R)-(бицикло[1.1.1]пентан-1,3-дикарбонил)бис(8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6,4-диил)-диацетата (12)
+
Стадия 1: Синтез (8R,8'R)-(бицикло[1.1.1]пентан-1,3-дикарбонил)бис(8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6,4-ил)-диацетата (12): Указанное в заголовке соединение получали по общей методике В, используя соединение 11 (20,0 мг, 0,060 ммоль) и соединение 6 (5,81 мг, 0,0301 ммоль, 0,0301 мл, 1М в THF), пиридин (14,3 0,181 ммоль) и THF (1,0 мл), и очищали обращенно-фазовой С18 хроматографией среднего давления (градиент: от 0% до 80% ацетонитрила в воде с 0,02% TFA в каждой фазе) с получением целевого продукта 12 (5,9 мг, 14%). LC-MS (Протокол В): m/z 711,2 [M+H], время удерживания = 1,12 минут.
Получение (S)-8-(хлорметил)-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-4-ил-ацетата (16):
2
4
Стадия 1: Синтез трет-бутил-(S)-8-(хлорметил)-4-гидрокси-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-6-карбоксилата (14): трет-Бутил-(S)-4-(бензилокси)-8-(хлорметил)-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-6-карбоксилат (13) [полученный, как описано в J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 14092-14099] (250 мг, 0,563 ммоль) абсорбировали в THF (5,63 мл). Добавляли 10% Pd/C (80 мг). Добавляли свежеприготовленный 25% водный раствор аммониевой соли муравьиной кислоты (500 мг, 2 ммоль, 0,5 мл), и эту реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин. Реакционную смесь разбавляли диэтиловым эфиром (15 мл) и добавляли NaSO. Раствор фильтровали через Celite, и растворитель удаляли в вакууме с получением указанного в заголовке соединения 14 (191 мг, 95%).
2
2
Стадия 2: Синтез трет-бутил-(S)-4-ацетокси-8-(хлорметил)-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-6-карбоксилата (15): трет-Бутил-(S)-8-(хлорметил)-4-гидрокси-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-6-карбоксилат (14, 171 мг, 0,483 ммоль) растворяли в CHCl (5,0 мл). Добавляли пиридин (213 мг, 2,69 ммоль), после чего добавляли ацетилхлорид (114 мг, 1,45 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи, и раствор становился оранжевым/коричневым. Растворитель удаляли в вакууме с получением в остатке неочищенного оранжевого твердого вещества. Неочищенный остаток очищали флэш-хроматографией (0-100% EtOAc/гептан) с получением после удаления растворителя целевого продукта 15 (171,0 мг, 89,4%).
Стадия 3: Синтез (S)-8-(хлорметил)-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-4-ил-ацетата (16): трет-Бутил-(S)-4-ацетокси-8-(хлорметил)-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-6-карбоксилат (15, 20 мг, 0,051 ммоль) абсорбировали в 4 н. растворе HCl в диоксане (1 мл). Реакционную смесь оставляли стоять в течение ночи, и растворитель удаляли с получением неочищенного целевого вещества 16 с количественным выходом, и это вещество сразу использовали.
Получение бицикло[1.1.1]пентан-1,3-диилбис[карбонил(8S)-8-(хлорметил)-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-6,4-диил]-диацетата (17)
Стадия 1: Синтез бицикло[1.1.1]пентан-1,3-диилбис[карбонил(8S)-8-(хлорметил)-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-6,4-диил]-диацетата (17): Указанное в заголовке соединение получали по общей методике В, используя соединение 16, (17 мг, 0,051) и соединение 6 (4,94 мг, 0,026 ммоль, 0,0301 мл, 1М в THF), пиридин (14,3 0,181 ммоль) и THF (1,0 мл), и очищали обращенно-фазовой С18 хроматографией среднего давления (градиент: от 0% до 80% ацетонитрила в воде с 0,02% TFA в каждой фазе) с получением целевого продукта 17 (10,0 мг, 27%). LC-MS (Протокол В): m/z 711,1 [M+H], время удерживания = 1,12 минут.
Получение (R)-8-(хлорметил)-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-4-ил-ацетата (21)
2
4
Стадия 1: Синтез трет-бутил-(R)-8-(хлорметил)-4-гидрокси-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-6-карбоксилата (19): трет-Бутил-(R)-4-(бензилокси)-8-(хлорметил)-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-6-карбоксилат (18) [полученный, как описано в J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 14092-14099] (250 мг, 0,563 ммоль) абсорбировали в THF (5,63 мл). Добавляли 10% Pd/C (80 мг). Добавляли свежеприготовленный 25% водный раствор аммониевой соли муравьиной кислоты (500 мг, 2 ммоль, 0,5 мл), и эту реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин. Реакционную смесь разбавляли диэтиловым эфиром (15 мл) и добавляли NaSO. Раствор фильтровали через Celite, и растворитель удаляли в вакууме с получением в остатке неочищенного белого твердого вещества 19 (156 мг, 78%).
Стадия 2: Синтез трет-бутил-(R)-4-ацетокси-8-(хлорметил)-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-6-карбоксилата (20): трет-Бутил-(R)-8-(хлорметил)-4-гидрокси-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-6-карбоксилат (19, 136 мг, 0,384 ммоль) растворяли в DCM (5,0 мл). Добавляли пиридин (213 мг, 2,69 ммоль), после чего добавляли ацетилхлорид (114 мг, 1,45 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи, и раствор становился оранжевым/коричневым. Растворитель удаляли в вакууме с получением в остатке оранжевого твердого вещества. Этот неочищенный остаток очищали флэш-хроматографией (0-100% EtOAc/гептан) с получением, после удаления растворителя целевого продукта 20 (113,0 мг, 74%).
Стадия 3: Синтез (R)-8-(хлорметил)-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-4-ил-ацетата (21): трет-Бутил-(R)-4-ацетокси-8-(хлорметил)-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-6-карбоксилат (20, 25 мг, 0,051 ммоль) абсорбировали в 4 н. растворе HCl в диоксане (1 мл). Реакционную смесь оставляли стоять в течение ночи, и растворитель удаляли с получением неочищенного целевого вещества 21 с количественным выходом. Это вещество использовали немедленно.
Получение бицикло[1.1,1]пентан-1,3-диилбис[карбонил(8R)-8-(хлорметил)-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-6,4-диил]-диацетата (22)
+
Стадия 1: Синтез бицикло[1.1.1]пентан-1,3-диилбис[карбонил(8R)-8-(хлорметил)-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-6,4-диил]-диацетата (22); Указанное в заголовке соединение получали по общей методике В, используя соединение 21 (17 мг, 0,051 ммоль) и соединение 6 (4,94 мг, 0,026 ммоль, 0,0301 мл, 1М в THF), пиридин (14,3 0,181 ммоль) и THF (1,0 мл), и очищали обращенно-фазовой С18 хроматографией среднего давления (градиент: от 0% до 80% ацетонитрила в воде с 0,02% TFA в каждой фазе) с получением целевого продукта 22 (8,6 мг, 19%). LC-MS (Протокол В): m/z 711,1 [М+Н], время удерживания = 1,12 минут.
Получение (8S,8'S)-глутароилбис(8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6,4-ил)-диацетата (24)
+
Стадия 1: Синтез (8S,8'S)-глутароилбис(8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6,4-ил)-диацетата (24): Раствор соединения 3 (10 мг, 0,025 ммоль) обрабатывали 4М HCl (0,5 мл в диоксане) при к.т. в течение 1 ч и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в THF (2 мл) и добавляли глутарилхлорид (2,13 мг, 0,0125 ммоль), после чего добавляли DIPEA (13 мкл, 0,074 ммоль). Полученную смесь перемешивали при к.т. в течение 30 мин. Реакционную смесь концентрировали, и остаток очищали хроматографией на силикагеле, используя MeOH/DCM (0-10%), с получением продукта в виде не совсем белого твердого вещества, которое обрабатывали МеОН и фильтровали с получением продукта 24 в виде не совсем белого твердого вещества (6 мг, 70%). LC-MS (Протокол В): m/z 687,1 [М+Н], время удерживания = 1,11 минут.
1
3
H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ =8.24 (s, 2H), 7.13 (s, 2H), 4.36 (d, J=10.5 Гц, 2H), 4.17 (m, 2H), 4.06 (m, 2H), 3.74 (d, J=10.9 Гц, 2H), 3.39 (t, J=10.9 Гц, 2H), 2.80 (m, 2H), 2.66 (m, 2H), 2.55 (s, 6H), 2.37 (s, 6H), 2.22 (m, 2H).
Получение (8R,8'R)-глутароилбис(8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6,4-ил)-диацетата (25):
+
Стадия 1: Синтез (8R,8'R)-глутароилбис(8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6,4-ил)-диацетата (25): Раствор соединения 10 (10 мг, 0,025 ммоль) обрабатывали 4М HCl (0,5 мл в диоксане) при к.т. в течение 1 ч и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в THF (2 мл) и добавляли глутарилхлорид (2,13 мг, 0,0125 ммоль), после чего добавляли пиридин (12 мг, 0,15 ммоль). Полученную смесь перемешивали при к.т. в течение 4 ч, концентрировали в вакууме, и остаток очищали обращенно-фазовой HPLC (Метод С) с получением продукта 25 в виде не совсем белого твердого вещества (1,5 мг, 17%). LC-MS (Протокол В): m/z 687,1 [М+Н], время удерживания = 1,11.
1
3
H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ=8.24 (s, 2H), 7.13 (s, 2H), 4.37 (d, J=10.5 Гц, 2H), 4.18 (m, 2H), 4.06 (m, 2H), 3.73 (d, J=10.9 Гц, 2H), 3.39 (t, J=10.9 Гц, 2H), 2.77 (m, 2H), 2.66 (m, 2H), 2.55 (s, 6H), 2.37 (s, 6H), 2.22 (m, 2H).
Получение (8S,8'S)-глутароилбис(8-(хлорметил)-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-6,4-ил)-диацетата (26)
+
Стадия 1: (8S,8'S)-Глутароилбис(8-(хлорметил)-2-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[2,3-е]индол-6,4-ил)-диацетат (25): Раствор соединения 15 (12 мг, 0,03 ммоль) обрабатывали 4М HCl (0,5 мл в диоксане) при к.т. в течение 1 ч и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в THF (2 мл) и добавляли глутарилхлорид (2,5 мг, 0,015 ммоль), после чего добавляли DIPEA (16 мкл, 0,09 ммоль). Полученную смесь перемешивали при к.т. в течение 30 минут и концентрировали в вакууме, и остаток очищали ISCO, используя MeOH/DCM (0-10%) с получением продукта 26 в виде не совсем белого твердого вещества (6 мг, 60%): LC-MS (Протокол В): m/z 687,1 [M+H], время удерживания = 1,11.
1
3
H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ=8.12 (s, 2H), 6.84 (s, 2H), 4.32 (m, 2H), 4.2 (m, 2H), 4.05 (d, J=10.9 Гц, 2H), 3.93 (m, 2H), 3.62 (m, 2H), 2.68 (br. s., 4H), 2.56 (s, 6H), 2.37 (s, 6H), 2.19 (br. s., 2H).
Получение (8S)-8-(хлорметил)-6-[(3-{[(8S)-8-(хлорметил)-1-метил-4-(фоссроноокси)-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил]карбонил}бицикло[1.1.1]пент-1-ил)карбонил]-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил-4-нитрофенил-карбоната (33)
Стадия 1: Синтез трет-бутил-(8S)-8-(хлорметил)-4-гидрокси-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-карбоксилата (2): В перемешиваемый раствор трет-бутил-(8S)-4-(бензилокси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-карбоксилата 1 [полученного, как описано в J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 14092-14099] (575 мг, 1.30 ммоль) в 18 мл THF при 0°C добавляли палладий 10 масс. % на угле (250 мг), после чего медленно по каплям добавляли 2,0 мл 25% раствора формиата аммония в воде. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение ~90 минут. Реакционную смесь разбавляли диэтиловым эфиром, после чего добавляли сульфат натрия. Реакционную смесь фильтровали через тонкий слой целита, который затем дважды промывали диэтиловым эфиром. Органические фазы объединяли и затем концентрировали в вакууме с получением соединения 2 (458 мг, количественный выход) в виде не совсем белого твердого вещества. LC-MS (Протокол А): m/z 352,2 [М-Н], время удерживания = 1,96 минут.
+
Стадия 2: Синтез (8S)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил-ацетата (4): В перемешиваемый раствор соединения 2 (209 мг, 0,591 ммоль) в 8 мл дихлорметана при 0°С добавляли ацетилхлорид (0,0462 мл, 0,650 ммоль), затем сразу добавляли пиридин (0,0714 мл, 0,886 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение ~10 минут. Реакционную смесь наносили на диоксид кремния. Затем осуществляли хроматографию на диоксиде кремния (градиент: 0%-15% ацетона в гептанах). Содержимое соответствующих пробирок концентрировали и помещали в глубокий вакуум с получением белого твердого вещества. К этому белому твердому веществу добавляли 4М HCl в диоксане (10 мл, 40 ммоль), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ~90 минут. Реакционную смесь разбавляли гептаном, концентрировали в вакууме и помещали в глубокий вакуум с получением соединения 4 (170 мг, выход 80%, за 2 стадии) в виде светло-оранжевого твердого вещества. LC-MS (Протокол А): m/z. 296,1 [М+H], время удерживания = 1,56 минут.
1
6
H ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 7.53 (s, 1Н), 7.05 (s, 1H), 4.27-4.19 (m, 1H), 3.93-3.86 (m, 1H), 3.80-3.75 (m, 1H), 3.72-3.64 (m, 2H), 2.54 (s, 3H), 2.37 (s, 3H).
Стадия 3: Синтез метил-3-(хлоркарбонил)бицикло[1.1.1]пентан-1-карбоксилата (28): По общей методике А, используя 3-(метоксикарбонил)бицикло[1.1.1]пентан-1-карбоновую кислоту 27 (86,8 мг, 0,510 ммоль), оксалилхлорид (0,0525 мл, 0,612 ммоль), THF (6 мл) и 1 каплю DMF, было получено соединение 28 в виде белого твердого вещества (97 мг, колич. выход). Это неочищененое соединение 28 использовали как есть без дополнительной очистки.
+
Стадия 4: Синтез дибензил-(8S)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил-фосфата (29): В перемешиваемый раствор соединения 2 (4,5 г, 13,4 ммоль) в 8 мл THF и 8 мл ацетонитрила добавляли тетрахлорид углерода (0,997 мл, 10,3 ммоль), после чего добавляли основание Хюнига (0,512 мл, 2,94 ммоль), дибензилфосфит (0,974 мл, 4,41 ммоль) и DMAP (18 мг, 0,147 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ~10 минут. Реакционную смесь наносили на диоксид кремния. Затем осуществляли хроматографию на диоксиде кремния (градиент: 0%-25% ацетона в гептанах). Содержимое соответствующих пробирок концентрировали и помещали в глубокий вакуум с получением белого твердого вещества. Это неочищенное вещество растворяли в 5 мл дихлорметана, после чего добавляли трифторуксусную кислоту (5 мл, 70 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 60 секунд, сразу концентрировали в вакууме и затем помещали в глубокий вакуум с получением соединения 29 (321 мг, выход 70%, за 2 стадии) в виде белой и прозрачной смеси масла и твердого вещества. LC-MS (Протокол А): m/z. 514,1 [М+H], время удерживания = 2,14 минут.
+
Стадия 5: Синтез 3-{[(8S)-4-{[бис(бензилокси)фосфорил]окси}-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил]карбонил}-бицикло[1.1.1]пентан-1-карбоновой кислоты (30) осуществляли по общей методике В, используя соединение 29 (315 мг, 0,502 ммоль), соединение 28 (94,6 мг, 0,502 ммоль), триэтиламин (0,210 мл, 1,50 ммоль) и THF (20 мл) и очистку хроматографией на силикагеле (градиент: от 0% до 35% ацетона в гептане). Содержимое соответствующих пробирок объединяли и концентрировали в вакууме с получением белого твердого вещества. Это вещество растворяли в THF (10 мл), после чего добавляли гидроксид лития, растворенный в 2,5 мл воды. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ~45 минут. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и гасили добавлением 1 н. HCl (водн.). Реакционную смесь переносили в делительную воронку. Органический слой отделяли, и водный слой дважды промывали дихлорметаном. Органические слои объединяли, промывали один раз рассолом, промывали один раз водой, сушили над сульфатом натрия, фильтровали, концентрировали в вакууме и затем помещали в глубокий вакуум с получением соединения 30 (178 мг, выход 57%, за 2 стадии). LC-MS (Протокол A): m/z 652,2 [М+Н], время удерживания = 1,97 минут.
Стадия 6: Синтез дибензил-(8S)-6-{[3-(хлоркарбонил)бицикло[1.1.1]пент-1-ил]карбонил}-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил-фосфата (31): По общей методике А, используя соединение 30 (174 мг, 0,267 ммоль), оксалилхлорид (0,0298 мл, 0,347 ммоль), THF (5 мл), дихлорметан (1 мл) и 1 каплю DMF, соединение 31 было получено в виде белого твердого вещества (182 мг, количественный выход). Это неочищенное соединение 31 использовали как есть без дополнительной очистки.
+
Стадия 7: Синтез (8S)-6-[(3-{[(8S)-4-{[бис(бензилокси)фосфорил]окси}-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил]карбонил}-бицикло[1.1.1]пент-1-ил)карбонил]-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил-ацетата (32) осуществляли по общей методике В, используя соединение 31 (167 мг, 0,249 ммоль), соединение 4 (99,3 мг, 0,299 ммоль), триэтиламин (0,104 мл, 0,747 ммоль) и THF (20 мл) и очистку хроматографией на силикагеле (градиент: от 0% до 50% ацетона в гептане). Содержимое соответствующих пробирок объединяли и концентрировали в вакууме с получением соединения 32 (103 мг, 45%) в виде белого твердого вещества. LC-MS (Протокол A): m/z 929,3 [М+Н], время удерживания = 2,44 минут.
1
6
H ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 8.37 (s, 1Н), 8.09 (s, 1H), 7.54-7.50 (m, 2H), 7.39-7.33 (m, 10Н), 5.23-5.14 (m, 4H), 4.53-4.46 (m, 2H), 4.38-4.25 (m, 4H), 4.02-3.95 (m, 2H), 3.78-3.69 (m, 2H), 2.63 (s, 6H), 2.57-2.53 (m, 6H), 2.39 (s, 3H).
+
Стадия 8: Синтез (8S)-8-(хлорметил)-6-[(3-{[(8S)-8-(хлорметил)-1-метил-4-(фосфоноокси)-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил]карбонил}-бицикло[1.1.1]пент-1-ил)карбонил]-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил-4-нитрофенил-карбоната (33): В перемешиваемый раствор соединения 32 (99 мг, 0,11 ммоль) в 6 мл метанола добавляли 4М HCl в диоксане (6,0 мл, 20 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ~15 минут. Реакционную смесь упаривали и затем помещали в глубокий вакуум. В перемешиваемый раствор неочищенного вещества в 6 мл дихлорметана и 6 мл THF при 0°С добавляли пара-нитрофенилхлорформиат (38,6 мг, 0,192 ммоль), затем сразу добавляли триэтиламин (0,0742 мл, 0,532 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение ~5 минут и затем оставляли нагреваться до комнатной температуры при перемешивании. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ~10 минут. Реакционную смесь концентрировали. В перемешиваемый раствор этого неочищенного вещества в 3 мл дихлорметана добавляли раствор соединения TFA (3,0 мл, 39 ммоль) в 3 мл дихлорметана, после чего добавляли тиофенол (0,109 мл, 1,06 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ~6 часов. Реакционную смесь концентрировали. Неочищенное вещество разбавляли несколькими миллилитрами DMSO и затем впрыскивали на 25 г С18 предколонку (которая предварительно была уравновешена ацетонитрилом и затем водой с 0,02% TFA в каждой фазе). Вещество очищали обращенно-фазовой С18 хроматографией (градиент: от 20% до 65% ацетонитрила в воде с 0,02% TFA в каждой фазе). Содержимое соответствующих пробирок концентрировали с использованием Genevac с получением соединения 33 (37 мг, 40%, за 3 стадии) в виде белого твердого вещества. LC-MS (Протокол A): m/z 872,3 [M+H], время удерживания = 1,86 минут.
1
6
H ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 8.44 (s, 1H), 8.40-8.33 (m, 3H), 7.78-7.72 (m, 2H), 7.59 (m, 1H), 7.47 (m, 1H), 4.53-4.44 (m, 2H), 4.38-4.22 (m, 4H), 4.04-3.94 (m, 2H), 3.81-3.75 (m, 1H), 3.72-3.65 (m, 1H), 2.62 (s, 6H), 2.58 (s, 3H), 2.54 (s, 3H).
Получение N-[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-21-оксо-3,6,9,12,15,18-гексаоксагеникозан-21-ил]-1-валил-N~5~-карбамоил-N-{4-[({метил[2-(метиламино)этил]карбамоил}окси)метил]фенил}-L-орнитинамида (40)
+
Стадия 1: Синтез N-[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-21-оксо-3,6,9,12,15,18-гексаоксагеникозан-21-ил]-L-валил-N~5~-карбамоил-N-[4-(гидроксиметил)фенил]-L-орнитинамида (36): В круглодонную колбу, содержащую 1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,6,9,12,15,18-гексаоксагеникозан-21-овую кислоту 34 (628 мг, 1,45 ммоль), 20 мл дихлорметана, 2 мл DMF, HATU (501 мг, 1,32 ммоль), добавляли основание Хюнига (0,92 мл, 5,3 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 минут, затем добавляли L-валил-N~5~-карбамоил-N-[4-(гидроксиметил)фенил]-L-орнитинамид 35 (500 мг, 1,32 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ~90 минут, затем гасили добавлением TFA. Реакционную смесь концентрировали до меньшего объема, разбавляли несколькими миллилитрами DMSO и затем впрыскивали на 25 г С18 предколонку (которая предварительно была уравновешена ацетонитрилом и затем водой с 0,02% TFA в каждой фазе). Вещество очищали обращенно-фазовой С18 хроматографией (градиент: от 5% до 40% ацетонитрила в воде с 0,02% TFA в каждой фазе), и содержимое соответствующих пробирок концентрировали с использованием Genevac с получением соединения 36 (514 мг, 49%) в виде прозрачного твердого вещества. LC-MS (Протокол A): m/z 795,5 [М+Н], время удерживания = 1,01 минут.
+
Стадия 2: Синтез N-[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-21-оксо-3,6,9,12,15,18-гексаоксагеникозан-21-ил]-L-валил-N~5~-карбамоил-N-[4-({[(4-нитрофенокси)карбонил]окси}метил)фенил]-L-орнитинамида (37): В перемешиваемый раствор соединения 36 (210 мг, 0,264 ммоль) и бис(4-нитрофенил)карбоната (161 мг, 0,528 ммоль) в 4 мл DMF добавляли основание Хюнига (0,096 мл, 0,554 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ~2 часов. Реакционную смесь впрыскивали на 25 г С18 предколонку (которая предварительно была уравновешена ацетонитрилом и затем водой с 0,02% TFA в каждой фазе). Вещество очищали обращенно-фазовой С18 хроматографией (градиент: от 5% до 55% ацетонитрила в воде с 0,02% TFA в каждой фазе), и содержимое соответствующих пробирок концентрировали с использованием Genevac с получением соединения 37 (180 мг, 71%) в виде твердого вещества. LC-MS (Протокол А): m/z 960,5 [М+Н], время удерживания = 1,48 минут.
+
Стадия 3: Синтез N-[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-21-оксо-3,6,9,12,15,18-гексаоксагеникозан-21-ил]-L-валил-N~5~-карбамоил-N-[4-(4,7,10,10-тетраметил-3,8-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундец-1-ил)фенил]-L-орнитинамида (39): В перемешиваемый раствор соединения 37 (640 мг, 0.667 ммоль) и соединения 38 [полученного, как описано в J. Med. Chem. 1992, 33, 559-567] (127 мг, 0,674 ммоль) в 6 мл DMA добавляли 2,6-лутидин (0,154 мл, 1,33 ммоль), после чего добавляли основание Хюнига (0,232 мл, 1,33 ммоль) и НОАТ (9,1 мг, 0,67 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ~15 минут. Реакционную смесь впрыскивали на 25 г С18 предколонку (которая предварительно была уравновешена ацетонитрилом и затем водой с 0,02% TFA в каждой фазе). Вещество очищали обращенно-фазовой С18 хроматографией (градиент: от 5% до 40% ацетонитрила в воде с 0,02% TFA в каждой фазе), и содержимое соответствующих пробирок концентрировали с использованием Genevac с получением соединения 39 (564 мг, 84%) в виде воскообразного белого твердого вещества. LC-MS (Протокол А): m/z 1009,7 [М+Н], время удерживания = 1,43 минут.
+
Стадия 4: Синтез N-[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-21-оксо-3,6,9,12,15,18-гексаоксагеникозан-21-ил]-L-валил-N~5~-карбамоил-N-{4-[({метил[2-(метиламино)этил]карбамоил}окси)метил]фенил}-L-орнитинамида (40): В перемешиваемую смесь соединения 39 (470 мг, 0,466 ммоль) в 6 мл дихлорметана добавляли TFA (3,0 мл, 40 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ~10 минут. Реакционную смесь концентрировали. Остаток очищали обращенно-фазовой С18 хроматографией (градиент: от 5% до 30% ацетонитрила в воде с 0,02% TFA в каждой фазе), и содержимое соответствующих пробирок концентрировали с использованием Genevac с получением соединения 40 (326 мг, 68%) в виде белой смеси масла/твердого вещества. LC-MS (Протокол А): m/z 909,8 [М+Н], время удерживания = 0,91 минут.
Получение N[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-21-оксо-3,6,9,12,15,18-гексаоксагеникозан-21-ил]-L-валил-N~5~-карбамоил-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(хлорметил)-6-[(3-{[(8S)-8-(хлорметил)-1-метил-4-(фосфоноокси)-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил]карбонил}бицикло[1.1.1]пент-1-ил)карбонил]-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил}окси)-карбонил](метил)амино}этил)(метил)карбамоил]окси}метил)фенил]-L-орнитинамида (41)
Стадия 1: Синтез N-[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-21-оксо-3,6,9,12,15,18-гексаоксагеникозан-21-ил]-L-валил-N~5~-карбамоил-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(хлорметил)-6-[(3-{[(8S)-8-(хлорметил)-1-метил-4-(фосфоноокси)-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил]карбонил}бицикло[1.1.1]пент-1-ил)карбонил]-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил}окси)карбонил]-(метил)амино}этил)(метил)карбамоил]окси}метил)фенил]-L-орнитинамида (41):
+
В пробирку вместимостью 2 драхмы (~7,8 г), содержащую соединение 33 (8,0 мг, 0,0092 ммоль) и соединение 40 (10,3 мг, 0,0101 ммоль), добавляли 1,0 мл DMA, после чего добавляли основание Хюнига (0,00639 мл, 0,0367 ммоль), 2,6-лутидин (0,00425 мл, 0,0367 ммоль) и HOAT (1,25 мг, 0,0367 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ~5 минут. Неочищенную реакционную смесь впрыскивали на 4 г С18 предколонку (которая предварительно была уравновешена ацетонитрилом и затем водой с 0,02% TFA в каждой фазе). Вещество очищали обращенно-фазовой С18 хроматографией (градиент: от 15% до 50% ацетонитрила в воде с 0,02% TFA в каждой фазе) с последующей второй очисткой Методом А, и содержимое соответствующих пробирок концентрировали с использованием Genevac с получением соединения 41 (8,9 мг, 59%) в виде белого твердого вещества. LC-MS (Протокол A): m/z 1642,9 [М+2Н], время удерживания = 1,61 минут.
Получение LP: (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(((S)-8-(хлорметил)-6-(5-((S)-8-(хлорметил)-4-(((2-((((4-((23S,26S)-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-23-изопропил-21,24-диоксо-26-(3-уреидопропил)-3,6,9,12,15,18-гексаокса-22,25-диазагептакозан-27-амидо)бензил)окси)карбонил)(метил)-амино)этил)(метил)карбамоил)окси)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2Н-пиран-2-карбоновой кислоты (49)
Стадия 1: Синтез трет-бутил-5-хлор-5-оксопентаноата (44): В раствор 5-(трет-бутокси)-5-оксопентановой кислоты (110 мг, 0,58 ммоль) в THF (3 мл) добавляли оксалилхлорид (0,58 мл, 1,2 ммоль, 2М в DCM) при 0°C, после чего добавляли 1 каплю DMF. Эту смесь перемешивали при 0°C в течение 30 минут и концентрировали в вакууме с получением соответствующего хлорангидрида кислоты 44 в виде белого твердого вещества.
3
2
Стадия 2: Синтез (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((S)-6-(трет-бутоксикарбонил)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2Н-пиран-3,4,5-триил-триацетата (43): В раствор соединения 2 (226 мг, 0,64 ммоль) в DCM (23 мл) добавляли 4A МС (1,17 г, порошок, <5 микрон, активированный), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. В реакционную смесь добавляли альфа-D-глюкуронида метиловый эфир 2,3,4-триацетат 1-2,2,2-трихлорэтанимидат (42, 367 мг, 0,77 ммоль), и смесь охлаждали до -25°С. Медленно добавляли раствор BF⋅EtO (0,13 мл, 0,32 ммоль) в DCM (10 мл), и смесь перемешивали при температуре ниже -20°С в течение 1 ч. Реакционную смесь фильтровали, и раствор концентрировали в вакууме. Остаток очищали хроматографией на силикагеле, используя градиент 0-60% EtOAc в гептанах, с получением продукта 43 в виде желтого твердого вещества 261 мг (61%). LC-MS (Протокол В): m/z 692,1 (M+Na), время удерживания = 1,09 мин.
1
H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ =7.29 (s, 1H), 7.13 (s, 1H), 5.40 (br. s., 3Н), 4.30 (d, J=7.4 Гц, 2H), 4.06-3.92 (m, 2H), 3.85-3.73 (m, 4H), 3.69 (d, J=10.5 Гц, 1H), 3.36 (t, J=10.5 Гц, 1H), 2.56 (s, 3Н), 2.10 (s, 6H), 2.08 (s, 3Н), 1.62 (s, 9H).
Стадия 2: Синтез (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((S)-6-(5-(трет-бутокси)-5-оксопентаноил)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2Н-пиран-3,4,5-триил-триацетата (45):
+
Раствор соединения 43 (261 мг, 0,39 ммоль) обрабатывали 4М HCl в диоксане (3 мл) в течение 1 ч, концентрировали в вакууме, остаток растворяли в THF (3,0 мл) и добавляли раствор хлорангидрида кислоты 44 (0,58 ммоль) в THF (3,0 мл), после чего добавляли TEA (0,163 мл, 1,2 ммоль). Смесь перемешивали при 0°С в течение 30 мин. Смесь концентрировали, и остаток очищали хроматографией на силикагеле, используя градиент EtOAc (0-70%) в гептанах, с получением продукта в виде не совсем белого твердого вещества 224 мг (78%). LC-MS (Протокол В): m/z 740,2 [М+Н], время удерживания = 1,07 минут.
1
H ЯМР (400 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) δ=8.26 (br. s., 1H), 7.13 (s, 1H), 5.45-5.25 (m, 4H), 4.32 (d, J=9.0 Гц, 2H), 4.12 (t, J=8.8 Гц, 1H), 4.05 (d, J=8.6 Гц, 1H), 3.79-3.66 (m, 5H), 3.33 (t, J=10.9 Гц, 1H), 2.63 (d, J=7.0 Гц, 1H), 2.58-2.47 (m, 4H), 2.45-2.35 (m, 2H), 2.06 (m, 11H), 1.47 (s, 9H).
Стадия 3. Синтез (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((S)-8-(хлорметил)-6-(5-((S)-8-(хлорметил)-4-гидрокси-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2Н-пиран-3,4,5-триил-триацетата (46): Раствор соединения 45 (116 мг, 0,16 ммоль) обрабатывали DCM (1,5 мл) и TFA (1 мл) при к.т. в течение 1 ч, концентрировали в вакууме, остаток растворяли в THF при 0°С и добавляли оксалилхлорид (0,16 мл, 0,32 ммоль, 2М в DCM) и DMF (1 капля). Смесь перемешивали при 0°С в течение 30 минут и концентрировали в вакууме с получением соответствующего хлорангидрида кислоты.
3
+
В отдельной пробирке соединение 2 (83 мг, 0,24 ммоль) обрабатывали 4М HCl (2 мл) в диоксане при к.т. в течение 1 ч, концентрировали в вакууме, остаток растворяли в THF (5 мл) при 0°С и добавляли EtN (100 мкл, 0,78 ммоль), после чего добавляли раствор вышеуказанного хлорангидрида кислоты в THF (5 мл). Смесь перемешивали при 0°С в течение 20 мин. Смесь концентрировали, и остаток очищали хроматографией на силикагеле, используя градиент EtOAc (0-100%) в гептанах, с получением продукта 46 в виде не совсем белого твердого вещества 114 мг (79%). LC-MS (Протокол В): m/z 919,1 [М+Н], время удерживания = 1,05 минут.
1
H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ =10.41 (s, 1Н), 8.22 (s, 1Н), 7.93 (s, 1H), 7.47 (s, 1Н), 7.38 (s, 1Н), 5.81-5.70 (m, 4H), 5.63-5.52 (m, 1Н), 5.19 (t, J=8.6 Гц, 1Н), 5.12 (t, J=9.8 Гц, 1Н), 4.76 (d, J=9.8 Гц, 1Н), 4.30-4.16 (m, 3H), 3.86 (m, 2H), 3.68 (s, 3H), 3.64-3.51 (m, 2H), 2.73 (br. s., 1Н), 2.62 (m, 2H), 2.50 (s, 6H), 2.10 -2.02 (m, 12H).
4
Стадия 4. Синтез (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((S)-6-(5-((S)-4-(((2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этил)(метил)карбамоил)окси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2Н-пиран-3,4,5-триил-триацетата (47): В раствор соединения 46 (50 мг, 0,054 ммоль) в THF (3 мл) при 0°С добавляли раствор 4-нитрофенилхлорформиата (22 мг, 0,10 ммоль) в DCM (0,5 мл), после чего добавляли DIPEA (57 мкл, 0,33 ммоль), и смесь перемешивали при 0°С в течение 1 ч. В вышеуказанную смесь добавляли раствор соединения 38 [полученного, как описано в J. Med. Chem. 1992, 33, 559-567] (31 мг, 0,16 ммоль) в THF (0,5 мл), и смесь перемешивали при 0°С в течение 30 минут и концентрировали в вакууме, и остаток очищали хроматографией на силикагеле, используя градиентEtOAc (0-100%) в гептанах, с получением продукта 47 в виде белого твердого вещества 56 мг (91%). LC-MS (Протокол В): m/z 1150,2 [M+NH], время удерживания = 1,14 минут
2
Стадия 5: Синтез (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(((S)-6-(5-((S)-4-(((2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этил)(метил)карбамоил)окси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2Н-пиран-2-карбоновой кислоты (48): В раствор соединения 47 (56 мг, 0,049 ммоль) в THF/МеОН (1/1, 6 мл) при 0°С добавляли раствор LiOH⋅HO (21 мг, 0,49 ммоль) в воде (0,5 мл). Смесь перемешивали при 0°С в течение 1 ч. Добавляли уксусную кислоту (50 мг), и реакционную смесь концентрировали в вакууме с получением неочищенного продукта 48 в виде белого твердого вещества 45 мг (90%). LC-MS (Протокол В): m/z 1014,9 [M+Na], время удерживания = 1,0 минут
+
+
Стадия 6: Синтез (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(((S)-8-(хлорметил)-6-(5-((S)-8-(хлорметил)-4-(((2-((((4-((23S,26S)-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-23-изопропил-21,24-диоксо-26-(3-уреидопропил)-3,6,9,12,15,18-гексаокса-22,25-диазагептакозан-27-амидо)бензил)окси)карбонил)(метил)амино)этил)(метил)-карбамоил)окси)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2Н-пиран-2-карбоновой кислоты (49) и (8S)-8-(хлорметил)-6-{5-[(8S)-8-(хлорметил)-4-гидрокси-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил]-5-оксопентаноил}-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил-бета-D-глюкопирансидуроновой кислоты (57): Соединение 48 (23 мг, 0,02 ммоль) обрабатывали предварительно охлажденной TFA (1 мл) при 0°С в течение 5 минут и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в DMF (2 мл) и добавляли соединение 37(19 мг, 0,02 ммоль), лутидин (14 мкл, 0,12 ммоль), DIPEA (21 мкл, 0,12 ммоль) и HOAt (2,7 мг, 0,02 ммоль), и смесь перемешивали при 30°С в течение 1 ч. Смесь очищали обращенно-фазовой HPLC (Метод С) с получением соединения 49 в виде не совсем белого твердого вещества (8 мг, 20%). LC-MS (Протокол В): m/z 1714,6 [М+Н], время удерживания = 0,89 минут; и соединения 57 в виде смолы (7 мг, 50%): LC-MS (Протокол В): m/z 779,1 [М+Н], время удерживания = 0,90 минут.
Получение (S)-8-(хлорметил)-6-(5-((S)-8-(хлорметил)-1-метил-4-(фосфоноокси)-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил-(4-((23S,26S)-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-23-изопропил-21,24-диоксо-26-(3-уреидопропил)-3,6,9,12,15,18-гексаокса-22,25-диазагептакозан-27-амидо)бензил)этан-1,2-диил-бис(метилкарбамата) (56)
Стадия 1: Синтез метил-5-хлор-5-оксопентаноата (51): 5-Метокси-5-оксопентановую кислоту (128 мг, 0,88 ммоль) растворяли в THF (5 мл) при 0°С и добавляли оксалилхлорид (0,9 мл, 1,8 ммоль, 2М в DCM) и DMF (1 каплю), и смесь перемешивали при 0°С в течение 30 мин. Смесь концентрировали в вакууме с получением соответствующего хлорангидрида кислоты 51 в виде белого твердого вещества, которое использовали без дополнительной очистки.
4
+
Стадия 2: Синтез трет-бутил-(S)-4-((бис(бензилокси)фосфорил)окси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-карбоксилата (50): В раствор соединения 2 (260 мг, 0,74 ммоль) в ACN (8 мл) и THF (8 мл) добавляли CCl (1 мл), DIPEA (0,52 мл, 2,94 ммоль), дибензилфосфит (1,03 мл, 4,41 ммоль) и DMAP (18 мг). Смесь перемешивали при к.т. в течение 15 минут, концентрировали в вакууме, остаток очищали хроматографией на силикагеле, используя градиент (0-60%) EtOAc в гептанах, с получением продукта 50 в виде бесцветного масла (365 мг, 81%). LC-MS (Протокол В): m/z 631,2 [М+Н], время удерживания = 1,18 минут
3
+
Стадия 3: Синтез метил-(S)-5-(4-((бис(бензилокси)фосфорил)окси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноата (52): В раствор соединения 50 (365 мг, 0,58 ммоль) в DCM (3 мл) добавляли TFA (3 мл), и смесь перемешивали при к.т. в течение 2 минут и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в THF (5,0 мл) и добавляли раствор хлорангидрида кислоты 51 (0,88 ммоль) в THF (5,0 мл), после чего добавляли EtN (0,37 мл, 0,24 ммоль), и смесь перемешивали при 0°С в течение 30 мин. Реакционную смесь концентрировали, и остаток очищали хроматографией на силикагеле, используя градиент (0-80%) EtOAc в гептанах, с получением продукта 52 в виде бесцветного масла (240 мг, 64%). LC-MS (Протокол В): m/z 642,1 [М+Н] время удерживания = 1,09 минут.
2
4
+
Стадия 4: Синтез (S)-5-(4-((бис(бензилокси)фосфорил)окси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентановой кислоты (53): В раствор соединения 52 (235 мг, 0.37 ммоль) в THF (10 мл) при 0°С добавляли раствор LiOH/HO (155 мг, 3,7 ммоль) в воде (2,5 мл), и смесь перемешивали при 0°С в течение 1 ч. Смесь разбавляли DCM, подкисляли 1М HCl, органический слой отделяли, и водную фазу экстрагировали DCM два раза. Объединенные органические фазы сушили над MgSO. Смесь концентрировали в вакууме, и остаток очищали обращенно-фазовой HPLC (Метод С) с получением продукта 53 в виде не совсем белой пены (27 мг, 12%). LC-MS (Протокол В): m/z 628,1 [М+Н], время удерживания = 1,01 минут.
Стадия 5: Синтез дибензил-((S)-8-(хлорметил)-6-(5-((S)-8-(хлорметил)-4-гидрокси-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)фосфата (54): В раствор соединения 53 (27 мг, 0.043 ммоль) в THF (5 мл) при 0°С добавляли оксалилхлорид (0,043 мл, 0,086 ммоль, 2М в DCM) и DMF (1 каплю). Смесь перемешивали при 0°С в течение 30 минут и концентрировали в вакууме с получением соответствующего хлорангидрида кислоты в виде желтой пены.
3
+
В отдельной пробирке соединение 2 (23 мг, 0,064 ммоль) обрабатывали 4М HCl (1 мл) при к.т. в течение 1 ч и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в THF (5 мл), охлаждали до 0°С и добавляли в раствор вышеуказанного хлорангидрида кислоты в THF (5 мл) и EtN (0,018 мл, 0,13 ммоль). Смесь концентрировали в вакууме, и остаток очищали обращенно-фазовой HPLC (Метод С) с получением продукта 54 в виде не совсем белого твердого вещества (28 мг, 75%). LC-MS (Протокол В): m/z 863,2 [М+Н], время удерживания = 1,16 минут.
+
+
Стадия 6: Синтез (S)-8-(хлорметил)-6-(5-((S)-8-(хлорметил)-1-метил-4-(фосфоноокси)-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил-(4-нитрофенил)карбоната (55) и (8S)-8-(хлорметил)-6-{5-[(8S)-8-(хлорметил)-4-гидрокси-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил]-5-оксопентаноил}-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил-дигидрофосфата (61): В раствор соединения 54 (40 мг, 0,046 ммоль) в THF (5 мл) при 0°С добавляли раствор 4-нитрофенилхлорформиата (19,4 мг, 0,092 ммоль) в DCM (0,5 мл) и DIPEA (0,049 мл, 0,28 ммоль). Смесь перемешивали при 0°С в течение 30 мин. Реакционную смесь концентрировали в вакууме, и остаток очищали хроматографией на силикагеле, используя градиент (0-60%) ацетона в гептанах, с получением промежуточного PNP-карбоната в виде белого твердого вещества (48 мг). Его растворяли в DCM (2 мл) и добавляли TFA (2 мл) и тиофенол (0,047 мл, 0,46 ммоль), и смесь перемешивали при к.т. в течение 3 ч. Реакционную смесь концентрировали в вакууме, и остаток очищали обращенно-фазовой HPLC (Метод С) с получением 17,8 мг (46%) продукта 55 в виде белого твердого вещества (17,8 мг, 46%), LC-MS (Протокол В): m/z 848,2 [М+Н], время удерживания = 1,09 минут; и 5,2 мг (17%) продукта 61 в виде смолы, LC-MS (Протокол В): m/z 683,2 [М+Н], время удерживания = 0,93 минут.
+
Стадия 7: Синтез (S)-8-(хлорметил)-6-(5-((S)-8-(хлорметил)-1-метил-4-(фосфоноокси)-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-метил-7,8-дигидро-6H-тиено[3,2-e]индол-4-ил-(4-((23S,26S)-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-23-изопропил-21,24-диоксо-26-(3-уреидопропил)-3,6,9,12,15,18-гексаокса-22,25-диазагептакозан-27-амидо)бензил)этан-1,2-диил-бис(метилкарбамата) (56): В раствор соединения 55 (10,5 мг, 0,012 ммоль) в DMF (1 мл) добавляли соединение 40 (13,9 мг, 0,014 ммоль), лутидин (0,009 мл, 0,074 ммоль), DIPEA (0,013 мл, 0,074 ммоль) и HOAt (1,7 мг, 0,012 ммоль). Смесь перемешивали при к.т. в течение 20 минут, концентрировали в вакууме, и остаток очищали обращенно-фазовой HPLC (Метод С) с получением продукта 56 в виде белой пены (12 мг, 60%). LC-MS (Протокол В): m/z 1619,6 [M+2H], время удерживания = 0,95 минут.
~
~
~
~
~
~
Получение пентацикло[4.2.0.02,5.03,8.04,7]октан-1,4-диил-бис[карбонил(8S)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6,4-диил]диацетата (60)
~
~
~
~
~
~
Стадия 1: Синтез пентацикло[4.2.0.02,5.03,8.04,7]октан-1,4-диилбис[карбонил(8S)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6,4-диил]диацетата (60): Раствор соединения 3 (47 мг, 0,12 ммоль) обрабатывали 4М HCl (1,5 мл в диоксане) при к.т. в течение 90 минут и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в DCM (4 мл) и TEA (0,025 мл) и добавляли в раствор 1,4-кубандикарбоновой кислоты (11,5 мг, 0,06 ммоль, 72) в 1 мл безводного дихлорметана, после чего добавляли HATU (47 мг, 0,12 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Смесь очищали обращенно-фазовой HPLC (колонка: Phenomenex Column Luna С18 5 мкм 150×21,5 мм, градиент 20%-90% AcCN/вода (с 0,02% АсОН в каждом) за 20 минут (плюс начальное 6-минутное изократическое время при 20% AcCN/вода) с 0,02% с получением 3,1 мг соединения 60 в виде белого твердого вещества (7%). LC-MS (Протокол A): m/z: 747,1 (М+Н)+, время удерживания = 2,39 мин.
Получение (S)-8-(хлорметил)-6-(5-((S)-1-(хлорметил)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-1,2-дигидро-3H-бензо[е]индол-3-ил)-5-оксопентаноил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил-дигидрофосфата (62)
Стадия 1: Синтез (S)-4-(бензилокси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индола (63): В перемешиваемый раствор соединения 1 (300 мг, 0,676 ммоль) в сухом DCM (5 мл) по каплям добавляли 4,ОМ HCl в EtOAc (5 мл) при 0°С. После добавления смесь перемешивали при к.т. в течение 1,5 ч. Смесь концентрировали в вакууме, затем выпаривали совместно с DCM один раз с получением продукта 63 (260 мг, 100%), и его как таковой использовали на следующей стадии.
Стадия 2: Синтез трет-бутил-(S)-5-(4-(бензилокси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноата (63): В круглодонную колбу, содержащую трет-бутил-(S)-4-(бензилокси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-карбоксилат (1) (500 мг, 1,13 ммоль) добавляли 25% TFA в DCM (10 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин. Реакционную смесь концентрировали и помещали в вакуум на 30 минут с получением лишенного группы Boc остатка 63, который абсорбировали в 5 мл DCM и использовали на следующей стадии.
2
+
В круглодонную колбу, продутую N, содержащую 5-(трет-бутокси)-5-оксопентановую кислоту (212 мг, 1,13 ммоль) в 5 мл безводного DCM, добавляли оксалилхлорид (0,101 мл, 1,13 ммоль). В этот раствор добавляли 1 каплю DMF, и систему перемешивали в течение 3 часов. Сразу начиналось значительное газообразование. Реакционную смесь концентрировали в вакууме с получением неочищенного хлорангидрида кислоты 44, который абсорбировали в DCM и добавляли в круглодонную колбу, содержащую вышеописанный лишенный защитной группы остаток 63 и TEA (0,144 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Неочищенную реакционную смесь концентрировали в вакууме, абсорбировали в 25 мл DCM и переносили в делительную воронку. Органический слой промывали 1М HCl (3х), водой (3х) и рассолом (2х). Органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали, и фильтрат концентрировали до неочищенного твердого вещества. Неочищенные продукты очищали хроматографией на силикагеле (градиент: от 0% до 10% МеОН в DCM) с получением соединения 64 в виде желтого твердого вещества (525 мг, 90%). LC-MS (Протокол A): m/z 514 [М+Н] время удерживания = 2,43 минуты.
+
Стадия 3: Синтез трет-бутил-(S)-5-((S)-2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропанамидо)-1-(хлорметил)-1,2-дигидро-3H-бензо[е]индол-3-карбоксилата (66): В круглодонную колбу в трет-бутил-(S)-5-амино-1-(хлорметил)-1,2-дигидро-3H-бензо[е]индол-3-карбоксилат (1000 мг, 3,0 ммоль, 65) (полученный, как описано в WO 2015023355) в 15 мл DCM добавляли (9Н-флуорен-9-ил)метил-(S)-(1-хлор-1-оксопропан-2-ил)карбамат (991 мг, 3,0 ммоль), после чего добавляли 1,2 мл основания Хюнига. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа и концентрировали до неочищенного стекловидного вещества. Неочищенную реакционную смесь очищали хроматографией на силикагеле (градиент: от 0% до 10% МеОН в DCM) с получением соединения 66 в виде белого твердого вещества (1529 мг, 80%). LC-MS (Протокол A): m/z 626 [М+Н], время удерживания = 2,32 минуты.
Стадия 4: Синтез (9Н-флуорен-9-ил)метил-((S)-1-(((S)-3-(5-((S)-4-(бензилокси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-(хлорметил)-2,3-дигидро-1Н-бензо[е]индол-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)карбамата (67): В перемешиваемый раствор трет-бутил-(S)-5-(4-(бензилокси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноата (500 мг, 0,973 ммоль, 64) в 10 мл DCM добавляли 2,5 мл TFA, и реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов. После окончания реакционную смесь концентрировали в вакууме до бледного белого твердого вещества. Это твердое вещество затем абсорбировали в 5 мл безводного DCM и добавляли оксалилхлорид (0,32 мл, 0,93 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов и концентрировали в вакууме до белого твердого вещества.
+
трет-Бутил-(S)-5-((S)-2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-пропанамидо)-1-(хлорметил)-1,2-дигидро-3H-бензо[е]индол-3-карбоксилат (0,973 ммоль, 66) абсорбировали в 25% TFA в DCM (5 мл) и перемешивали в течение 30 мин. Реакционную смесь концентрировали в вакууме и опять абсорбировали в 5 мл DCM. Добавляли основание Хюнига (0,32 мл), после чего добавляли вышеописанный хлорангидрид кислоты. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов. После завершения реакции смесь концентрировали в вакууме. Неочищенные продукты очищали хроматографией на силикагеле (градиент: от 0% до 10% МеОН в DCM) с получением соединения 67 в виде белого твердого вещества (510 мг, 54%). LC-MS (Протокол А): m/z 965 [М+Н], время удерживания = 2,61 минуты.
+
Стадия 5: Синтез трет-бутил-((S)-1-(((S)-1-(((S)-3-(5-((S)-4-(бензилокси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-(хлорметил)-2,3-дигидро-1Н-бензо[е]индол-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамата (68): В перемешиваемый раствор (9Н-флуорен-9-ил)метил-((S)-1-(((S)-3-(5-((S)-4-(бензилокси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-(хлорметил)-2,3-дигидро-1Н-бензо[е]индол-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)карбамата (500 мг, 0,518 ммоль, 67) в 5 мл DCM добавляли 5 мл диэтиламина. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов и концентрировали в вакууме до желтого твердого вещества. Это желтое твердое вещество абсорбировали в 10 мл безводного THF, после чего добавляли 2,5-диоксопирролидин-1-ил-(трет-бутоксикарбонил)-L-валинат (163 мг, 0,518 ммоль), затем TEA (0,2 мл). Реакционную смесь перемешивали при 70 градусах Цельсия в течение 4 часов. После завершения реакции смесь концентрировали в вакууме. Неочищенные продукты очищали хроматографией на силикагеле (градиент: от 0% до 10% МеОН в DCM) с получением соединения 68 в виде белого твердого вещества (198 мг, 40%). LC-MS (Протокол A): m/z 942 [М+Н], время удерживания = 2,49 минут.
+
Стадия 6: Синтез трет-бутил-((S)-1-(((S)-1-(((S)-1-(хлорметил)-3-(5-((S)-8-(хлорметил)-4-гидрокси-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-2,3-дигидро-1Н-бензо[е]индол-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамата (69): Перемешиваемый раствор трет-бутил-((S)-1-(((S)-1-(((S)-3-(5-((S)-4-(бензилокси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-(хлорметил)-2,3-дигидро-1Н-бензо[е]индол-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамата (325 мг, 0,345 ммоль, 68) в 7 мл THF под азотом охлаждали до 0°С, используя ледяную баню. Затем добавляли 10 масс. % палладий на активированном угле (10 мг), после чего медленно по каплям добавляли 0,5 мл 25% раствора формиата аммония в воде. Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 1 часа. После завершения реакции смесь фильтровали через слой целлита, и фильтрат концентрировали в вакууме. Неочищенные продукты очищали хроматографией на силикагеле (градиент: от 0% до 10% МеОН в DCM) с получением соединения 69 в виде желтого твердого вещества (181 мг, 61%). LC-MS (Протокол А): m/z 852 [М+Н], время удерживания = 2,18 минут.
-
Стадия 7: Синтез трет-бутил-((S)-1-(((S)-1-(((S)-3-(5-((S)-4-((бис(бензилокси)фосфорил)окси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-(хлорметил)-2,3-дигидро-1Н-бензо[е]индол-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамата (70): В перемешиваемый раствор трет-бутил-((S)-1-(((S)-1-(((S)-1-(хлорметил)-3-(5-((S)-8-(хлорметил)-4-гидрокси-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-2,3-дигидро-1Н-бензо[е]индол-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамата (165 мг, 0,193 ммоль, 69) в 10 мл THF и 10 мл AcCN добавляли тетрахлорид углерода (2,04 мл, 21,0 ммоль), после чего добавляли основание Хюнига (1,12 мл, 6,45 ммоль), дибензилфосфит (320 мг, 1,16 ммоль) и DMAP (каталитическое количество). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут. Реакционную смесь концентрировали до неочищенного стекловидного вещества. Неочищенную реакционную смесь очищали хроматографией на силикагеле (градиент: от 0% до 10% МеОН в DCM) с получением соединения 70 в виде белого стекловидного вещества (51 мг, 24%). LC-MS (Протокол A): m/z 1113 [М-Н], время удерживания = 2,50 минут.
+
Стадия 8: Синтез (S)-8-(хлорметил)-6-(5-((S)-1-(хлорметил)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-1,2-дигидро-3H-бензо[е]индол-3-ил)-5-оксопентаноил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил-дигидрофосфата (62): В круглодонной колбе, оснащенной мешалкой, трет-бутил-((S)-1-(((S)-1-(((S)-3-(5-((S)-4-((бис(бензилокси)фосфорил)окси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-(хлорметил)-2,3-дигидро-1Н-бензо[е]индол-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат (40 мг, 0,036 ммоль, 70) абсорбировали в 5 мл DCM. Добавляли TFA (2,5 мл) и 2 капли тиофенола, и реакционную смесь перемешивали в течение 6 часов. Неочищенное вещество концентрировали в вакууме. Неочищенный остаток абсорбировали в 3 мл DMF и добавляли пентафторфенил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноат (71) (13,6 мг, 0,036 ммоль), после чего добавляли TEA (0,036 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа. Реакционную смесь концентрировали в вакууме и очищали методом HPLC с получением соединения 62 в виде белого твердого вещества (25 мг, 68%), время удерживания = 7,115 минут. LC-MS (Протокол A): m/z 1025 [М+Н], время удерживания=2,01 минут.
Получение N~2~-ацетил-N~6~-[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-лизил-L-валил-N~5~-карбамоил-N-{4-[({метил[2-(метиламино)этил]-карбамоил}окси)метил]фенил}-L-орнитинамида (74):
2
Стадия 1: Синтез N~2~-ацетил-N~6~-[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-лизил-L-валил-N~5~-карбамоил-N-[4-(4,7,10,10-тетраметил-3,8-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундец-1-ил)фенил]-L-орнитинамида (72А): В перемешиваемый раствор N~2~-ацетил-N~6~-[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-лизил-L-валил-N~5~-карбамоил-N-[4-({[(4-нитрофенокси)карбонил]окси}метил)фенил]-L-орнитинамида (72) (полученного, как описано в US 9169264) (1,00 г, 1,07 ммоль) в DMF (20 мл) добавляли соединение 38 [полученное, как описано в J. Med. Chem. 1992, 33, 559-567] (241 мг, 1,28 ммоль) при 0°С под N. Полученную смесь перемешивали при 0°С в течение 30 мин. Смесь вливали в ТВМЕ (200 мл). Полученную белую суспензию фильтровали и промывали ТВМЕ (200 мл) с получением указанного в заголовке соединения 72А (750 мг, 71,3%) в виде желтого твердого вещества.
Стадия 2: Синтез N~2~-ацетил-N~6~-[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-лизил-L-валил-N~5~-карбамоил-N-{4-[({метил[2-(метиламино)этил]карбамоил}окси)метил]фенил}-L-орнитинамида (74): В перемешиваемую суспензию соединения 72А (10,00 г, 10,1 ммоль) в DCM (60,0 мл) добавляли TFA (50,0 мл) при 0°С. Полученный раствор перемешивали при 0°С в течение 40 мин. Полученную суспензию фильтровали. Остаток на фильтре промывали ТВМЕ (200 мл) и сушили в вакууме досуха с получением неочищенного продукта. Этот неочищенный продукт очищали препаративной HPLC (колонка: Phenomenex Synergi Max-RP 250Х50 мм, 10 мкм, градиент: от 25% до 55% ацетонитрила в воде с 0,1% TFA в каждой фазе за 17,5 мин и выдержка в течение 8 мин при 100% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% TFA, скорость потока: 80 мл/мин) с получением указанного в заголовке соединения 74 (5,2 г, выход 51,3%) в виде белого твердого вещества.
1
H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) 10.03 (s, 1H), 8.47 (br. s., 2H), 8.10 (d, J=7.0 Гц, 1H), 8.03 (d, J=7.8 Гц, 1H), 7.89 (d, J=7.5 Гц, 2H), 7.69 (d, J=7.3 Гц, 3Н), 7.60 (d, J=8.5 Гц, 2H), 7.45-7.38 (m, 2H), 7.36-7.29 (m, 4H), 7.26 (t, J=5.4 Гц, 1H), 6.02 (br. s., 1H), 5.01 (s, 2H), 4.43-4.33 (m, 1H), 4.32-4.16 (m, 5H), 3.49 (t, J=6.0 Гц, 2H), 3.06-2.92 (m., 6H) 2.86 (s, 3Н), 2.62-2.53 (m, 3Н), 1.99 (dd, J=6.5, 13.3 Гц, 1H), 1.85 (s, 3Н), 1.76-1.27 (m, 10Н), 0.83 (d, J=6.8 Гц, 3Н), 0.86 (d, J=6.8 Гц, 3Н)
Получение LP: (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(((S)-6-(5-((S)-4-(((2-((((4-((S)-2-((S)-2-((5)-2-ацетамидо-6-аминогексанамидо)-3-метилбутанамидо)-S-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)(метил)амино)этил)(метил)-карбамоил)окси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2Н-пиран-2-карбоновой кислоты (76)
3
Стадия 1: Синтез (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((S)-8-(хлорметил)-6-(5-((S)-8-(хлорметил)-1-метил-4-(((4-нитрофенокси)карбонил)окси)-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2Н-пиран-3,4,5-триил-триацетата (73): В раствор соединения 46 (120 мг, 0,13 ммоль) в THF (5 мл) при 0°С добавляли раствор 4-нитрофенилхлорформиата (55 мг, 0,26 ммоль) в DCM (0,5 мл), после чего добавляли EtN (109 мкл, 0,78 ммоль), и смесь перемешивали при 0°С в течение 30 мин. Смесь концентрировали в вакууме, и остаток очищали обращенно-фазовой HPLC (Метод С) с получением продукта 73 в виде белого твердого вещества (109 мг, 77%). LC-MS (Протокол В): m/z 1086,5 (m+H), время удерживания = 1,24 мин.
Стадия 2: Синтез (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((S)-6-(5-((S)-4-(((2-((((4-((9S,12S,15S)-9-ацетамидо-1-(9Н-флуорен-9-ил)-12-изопропил-3,10,13-триоксо-15-(3-уреидопропил)-2-окса-4,11,14-триазагексадекан-16-амидо)бензил)окси)-карбонил)(метил)амино)этил)(метил)карбамоил)окси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)-6-(метоксикарбонил)-тетрагидро-2Н-пиран-3,4,5-триил-триацетата (75): Соединение 73 (50 мг, 0,046 ммоль) растворяли в DMF (2 мл), и в него добавляли 4-((9S,12S,15S)-9-ацетамидо-1-(9Н-флуорен-9-ил)-12-изопропил-3,10,13-триоксо-15-(3-уреидопропил)-2-окса-4,11,14-триазагексадекан-16-амидо)бензил-метил(2-(метиламино)этил)карбамат (74, 55 мг, 0,055 ммоль), лутидин (0,021 мл, 0,18 ммоль), DIPEA (0,032 мл, 0,18 ммоль) и HOAt (6 мг, 0,046 ммоль). Смесь перемешивали при к.т. в течение 1 ч. Смесь концентрировали в вакууме, и остаток очищали обращенно-фазовой HPLC (Метод С) с получением продукта 75 в виде белого порошка после сублимационной сушки (72 мг, 85%). LC-MS (Протокол В): m/z 1833,3 (M+H) время удерживания = 1,17 мин.
1
H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ=10.02 (br. s., 1H), 8.22 (s, 1H), 8.19-8.13 (m, 1H), 8.10 (d, J=6.6 Гц, 1H), 8.02 (d, J=7.8 Гц, 1H), 7.89 (d, J=7.4 Гц, 2Н), 7.69 (d, J=7.0 Гц, 3Н), 7.57 (d, J=7.0 Гц, 2Н), 7.54-7.38 (m, 5H), 7.37-7.30 (m, 3Н), 7.26 (br. s., 3Н), 5.99 (br. s., 1H), 5.74 (d, J=7.0 Гц, 1H), 5.64-5.49 (m, 1H), 5.20 (t, J=8.8 Гц, 1H), 5.13 (t, J=9.6 Гц, 1H), 5.04 (br. s., 1H), 5.00 (br. s., 1H), 4.81-4.70 (m, 1H), 4.39 (br. s., 2Н), 4.32-4.11 (m, 14H), 3.95-3.80 (m, 3Н), 3.62 (br. s., 1H), 3.56 (br. s., 1H), 3.48 (br. s., 2Н), 3.12 (br. s., 1H), 3.03 (br. s., 2Н), 3.00-2.91 (m, 6H), 2.88 (br. s., 3Н), 2.82-2.67 (m, 4H), 2.67-2.55 (m, 7H), 2.10 (s, 1H), 2.08-1.91 (m, 14H), 1.85 (s, 3Н), 1.79-1.64 (m, 2Н), 1.61 (br. s., 2H), 1.54-1.32 (m, 5H), 1.31-1.23 (m, 2Н), 1.23-1.12 (m, 2Н), 0.84 (d, J=6.6 Гц, 3Н), 0.87 (d, J=6.6 Гц, 3Н).
Стадия 3: Получение LP: (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(((S)-6-(5-((S)-4-(((2-((((4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-ацетамидо-6-аминогексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)(метил)амино)этил)(метил)-карбамоил)окси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2Н-пиран-2-карбоновой кислоты (76)
2
+
Соединение 75 (44 мг, 0,024 ммоль) растворяли в DMF (1 мл) и THF (5 мл) и МеОН (1 мл), охлаждали до 0°С, добавляли LiOH⋅HO (10 мг, 0,24 ммоль), и смесь перемешивали при 0°С в течение 60 мин. Смесь подкисляли добавлением НОАс (30 мкл) и концентрировали в вакууме. Остаток очищали обращенно-фазовой HPLC (Метод С) с получением 25,0 мг (66%) продукта 76 в виде белого порошка. LC-MS (Протокол В): m/z 1471,1 (М+2Н) время удерживания = 0,75 мин.
1
H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ=8.09 (br. s, 2H), 7.97 (d, J=8.1 Гц, 1Н), 7.68 (br. s., 2H), 7.48 (d, J=7.6 Гц, 1Н), 7.44-7.39 (m, 1Н), 7.39-7.31 (m, 2H), 7.22-7.12 (m, 1Н), 5.97 (br. s., 1Н), 5.45-5.32 (m, 2H), 5.18 (br. s., 1Н), 5.06 (d, J=5.6 Гц, 1Н), 4.98 (br. s., 1Н), 4.92 (br. s., 1Н), 4.31 (br. s., 1Н), 4.26-4.05 (m, 8H), 3.82 (d, J=10.0 Гц, 1Н), 3.76 (d, J=10.5 Гц, 1Н), 3.70 (d, J=7.6 Гц, 1Н), 3.66-3.57 (m, 1Н), 3.57-3.44 (m, 5H), 3.43-3.36 (m, 2H), 3.36-3.28 (m, 3H), 3.12-3.07 (m, 2H), 3.05 (br. s., 1Н), 3.00-2.91 (m, 2H), 2.88 (d, J=9.8 Гц, 3H), 2.80 (s, 2H), 2.72-2.59 (m, 4H), 2.59-2.37 (m, 22H), 2.02 (s, 2H), 1.97-1.83 (m, 3H), 1.78 (s, 3H), 1.69 (td, J=3.2, 6.4 Гц, 2H), 1.66-1.48 (m, 3H), 1.47-1.32 (m, 4H), 1.32-1.14 (m, 4H), 0.76 (d, J=6.4 Гц, 3H), 0.79(d, J=5.9 Гц, 3Н).
Получение 4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-ацетамидо-6-аминогексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-((S)-8-(хлорметил)-6-(5-((S)-8-(хлорметил)-1-метил-4-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)этан-1,2-диилбис(метилкарбамата) (77)
3
2
Стадия 1: Синтез (2R,3S,4S,5R,6S)-2-(ацетоксиметил)-6-(((S)-6-(трет-бутоксикарбонил)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)тетрагидро-2Н-пиран-3,4,5-триил-триацетата (78): Соединение 2 (300 мг, 0,85 ммоль) растворяли в DCM (30 мл), добавляли 4А МС (1,5 г, порошкообразные, <5 микрон, активированные), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. В эту реакционную смесь добавляли альфа-D-галактопанозы 2,3,4,6-тетраацетат 1-2,2,2-трихлорэтанимидат (449 мг, 93%, 0,85 ммоль). Смесь охлаждали до -15°С, медленно добавляли раствор BF⋅EtO (0,052 мл, 0,42 ммоль) в DCM (5 мл), и реакционную смесь перемешивали при температуре от -15°С до -20°С в течение 1 ч. Реакционную смесь фильтровали через слой Celite, промывали ацетоном и концентрировали с получением остатка. Этот остаток обрабатывали МеОН и концентрировали в вакууме с получением 580 мг (100%) продукта 78 в виде не совсем белого твердого вещества. LC-MS (Протокол В): m/z: 706,4 (M+Na), время удерживания = 1,09 мин.
Стадия 2: Синтез (2R,3S,4S,5R,6S)-2-(ацетоксиметил)-6-(((S)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)тетрагидро-2Н-пиран-3,4,5-триил-триацетата (79): Соединение 78 (580 мг, 0,85 ммоль) обрабатывали 4М раствором HCl в диоксане (5 мл) в течение 30 минут, и смесь концентрировали в вакууме с получением неочищенного продукта 79 в виде зеленого твердого вещества, которое использовали без дополнительной очистки. LC-MS (Протокол В): m/z 584,3 (М+Н), время удерживания = 0,94 мин.
1Н ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ=7.53 (s, 1H), 7.22 (s, 1H), 5.57-5.46 (m, 3H), 5.34 (dd, J=2.0, 9.0 Гц, 1H), 4.53 (d, J=6.6 Гц, 2Н), 4.42 (t, J=6.4 Гц, 1H), 4.25 (dt, J=6.4, 11.2 Гц, 2Н), 4.18-4.01 (m, 5H), 3.74 (dd, J=8.6, 11.7 Гц, 2Н), 3.69 (s, 14H), 2.68-2.58 (m, 4H), 2.23 (s, 3H), 2.19-2.14 (m, 2Н), 2.14-2.07 (m, 7H), 2.07-1.94(m, 6H), 1.33(s, 3H).
3
Стадия 3: Синтез (2R,3S,4S,5R,6S)-2-(ацетоксиметил)-6-(((S)-6-(5-(трет-бутокси)-5-оксопентаноил)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)тетрагидро-2Н-пиран-3,4,5-триил-триацетата (80): Раствор 5-(трет-бутокси)-5-оксопентановой кислоты (44, 191 мг, 1,02 ммоль) в THF (10 мл) охлаждали до 0°С и добавляли оксалилхлорид (1,02 мл, 2М в DCM), после чего добавляли 1 каплю DMF. Смесь перемешивали при 0°С в течение 30 минут и концентрировали в вакууме с получением соответствующего хлорангидрида кислоты в виде воска. Его растворяли в THF (10 мл) и добавляли в раствор соединения 79 (526 мг, 0,85 ммоль) в THF (10 мл), и после этого добавляли EtN (0,354 мл, 2,54 ммоль). Смесь перемешивали при 0°С в течение 30 мин. Смесь концентрировали, и остаток очищали хроматографией на силикагеле, используя градиент от 0% до 70% этилацетата в гептанах, с получением 448 мг (70%) продукта 80 в виде не совсем белого твердого вещества. LC-MS (Протокол В): m/z 754,4 (М+Н), время удерживания = 1,06 мин.
Стадия 4: Синтез (2R,3S,4S,5R,6S)-2-(ацетоксиметил)-6-(((S)-8-(хлорметил)-6-(5-((S)-8-(хлорметил)-4-гидрокси-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)тетрагидро-2Н-пиран-3,4,5-триил-триацетата (84): Раствор соединения 80 (448 мг, 0,59 ммоль) обрабатывали DCM (3 мл) и TFA (2 мл) при к.т. в течение 1 ч, и смесь концентрировали в вакууме с получением свободной кислоты 81 в виде зеленого твердого вещества (212 мг). Кислоту 81 (167 мг, 0,24 ммоль) растворяли в THF (5 мл), раствор охлаждали до 0°С и добавляли оксалилхлорид (0,24 мл, 2М в DCM), после чего добавляли DMF (1 каплю). Смесь перемешивали при 0°С в течение 30 минут и концентрировали в вакууме с получением соответствующего хлорангидрида кислоты 82, который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
Раствор соединения 2 (102 мг, 0,28 ммоль) в 4М HCl (2 мл) в диоксане перемешивали при к.т. в течение 1 ч, и смесь концентрировали в вакууме с получением соединения 83 в виде зеленого твердого вещества, которое растворяли в THF (5 мл) и охлаждали до 0°С. Добавляли TEA (0,2 мл, 1,44 ммоль), после чего добавляли раствор неочищенного хлорангидрида кислоты 82 в THF (5 мл), и смесь перемешивали при 0°С в течение 20 мин. Смесь концентрировали, и остаток очищали хроматографией на силикагеле, используя градиент от 0% до 70% ацетона в гептанах, с получением 196 мг (88%) продукта 84 в виде желтого твердого вещества. LC-MS (Протокол В): m/z 933,5 (М+Н), время удерживания = 1,05 мин.
1
H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ=8.26 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.39 (s, 1H), 5.51 (d, J=7.8 Гц, 1H), 5.42-5.26 (m, 3H), 4.59-4.46 (m, 1H), 4.33-4.23 (m, 2H), 4.23-4.15 (m, 4H), 4.15-4.07 (m, 2H), 4.04 (s, 4H), 3.87 (dd, J=10.5, 18.0 Гц, 2H), 3.67 (t, J=9.8 Гц, 1H), 3.57 (t, J=10.1 Гц, 1H), 3.33 (s, 1H), 3.31 (s, 1H), 2.83-2.67 (m, 2H), 2.60 (dd, J=6.4, 16.2 Гц, 3H), 2.19 (s, 3H), 2.15-2.09 (m, 4H), 2.07 (s, 4H), 1.97(s, 6H).
3
Стадия 5: Синтез (2R,3S,4S,5R,6S)-2-(ацетоксиметил)-6-(((S)-8-(хлорметил)-6-(5-((S)-8-(хлорметил)-1-метил-4-(((4-нитрофенокси)карбонил)окси)-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)тетрагидро-2Н-пиран-3,4,5-триил-триацетата (85): В раствор соединения 84 (100 мг, 0,107 ммоль) в THF (5 мл) при 0°С добавляли 4-нитрофенилхлорформиат (45 мг, 0,21 ммоль), после чего добавляли EtN (0,060 мл, 0,43 ммоль). Смесь перемешивали при 0°С в течение 60 мин. Смесь концентрировали в вакууме с получением неочищенного продукта в виде желтой пены (142 мг), который очищали обращенно-фазовой HPLC (Метод С) с получением 50 мг (43%) продукта 85 в виде не совсем белого твердого вещества. LC-MS (Протокол В): m/z 1098,5 (М+Н), время удерживания = 1,05 мин.
Стадия 6: Синтез (2S,3R,4S,5S,6R)-2-(((S)-6-(5-((S)-4-(((2-((((4-((9S,12S,15S)-9-ацетамидо-1-(9Н-флуорен-9-ил)-12-изопропил-3,10,13-триоксо-15-(3-уреидопропил)-2-окса-4,11,14-триазагексадекан-16-амидо)бензил)окси)-карбонил)(метил)амино)этил)(метил)карбамоил)окси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)-6-(ацетоксиметил)-тетрагидро-2Н-пиран-3,4,5-триил-триацетата (86): В раствор соединения 85 (50 мг, 0,045 ммоль) в DMF (2 мл) добавляли 4-((9S,12S,15S)-9-ацетамидо-1-(9Н-флуорен-9-ил)-12-изопропил-3,10,13-триоксо-15-(3-уреидопропил)-2-окса-4,11,14-триазагексадекан-16-амидо)бензил-метил(2-(метиламино)этил)-карбамат (7445 мг, 0,045 ммоль) и DIPEA (0,024 мл, 0,136 ммоль). Смесь перемешивали при к.т. в течение 60 минут и очищали обращенно-фазовой HPLC (Метод С) с получением 26 мг (31%) продукта 86 в виде белого твердого вещества: LC-MS (Протокол В): m/z 1847,1 (М+Н), время удерживания = 1,06 мин.
1
H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ=10.01 (br. s., 1H), 8.25 (s, 1H), 8.20-8.12 (m, 1H), 8.09 (d, J=6.6 Гц, 1Н), 8.02 (d, J=8.2 Гц, 1Н), 7.89 (d, J=7.8 Гц, 2Н), 7.69 (d, J=7.0 Гц, 3H), 7.57 (d, J=7.4 Гц, 2Н), 7.47-7.37 (m, 4H), 7.37-7.30 (m, 3H), 7.26 (br. s., 3H), 5.98 (br. s., 1H), 5.50 (d, J=7.0 Гц, 1H), 5.46-5.27 (m, 5H), 5.02 (d, J=19.1 Гц, 2Н), 4.52 (br. s., 1H), 4.39 (br. s., 1H), 4.32-4.14 (m, 13H), 4.14-4.03 (m, 1H), 3.95-3.81 (m, 2Н), 3.75-3.59 (m, 6H), 3.56 (br. s., 2Н), 3.48 (br. s., 2Н), 3.12 (br. s., 1H), 3.03 (br. s., 2Н), 2.94 (s, 3H), 2.97 (s, 2Н), 2.87 (br. s., 2Н), 2.83-2.67 (m, 3H), 2.66-2.54 (m, 7H), 2.19 (s, 4H), 2.12 (s, 3H), 2.09-2.03 (m, 4H), 2.03-1.90 (m, 7H), 1.85 (s, 3H), 1.78 (t, J=6.4 Гц, 1H), 1.68 (d, J=7.8 Гц, 1H), 1.61 (br. s., 2Н), 1.53-1.33 (m, 5H), 1.32-1.18 (m, 2Н), 0.84 (d, J=7.0 Гц, 3H), 0.87 (d, J=6.6 Гц, 3Н).
+
Стадия 7: Синтез LP: 4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-ацетамидо-6-аминогексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-((S)-8-(хлорметил)-6-(5-((S)-8-(хлорметил)-1-метил-4-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)этан-1,2-диилбис(метилкарбамата) (77): В раствор соединения 86 (24 мг, 0,013 ммоль) в THF (2 мл) и МеОН (2 мл) при 0°С добавляли раствор LiOH (1M, 0,26 мл, 0,26 ммоль) в воде, и смесь перемешивали при температуре от 0°С до комнатной температуры в течение 2 ч. Добавляли уксусную кислоту (20 мкл), смесь концентрировали, и остаток очищали обращенно-фазовой HPLC (Метод С) с получением 14 мг (69%) продукта 77 в виде белой пены: LC-MS (Протокол В): m/z 1456,9 (М+2Н), время удерживания = 0,75 мин.
1
H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ=10.07-9.96 (m, 1H), 8.29-8.18 (m, 1H), 8.18-8.09 (m, 2H), 8.06 (d, J=8.1 Гц, 1H), 7.73 (d, J=8.6 Гц, 1H), 7.66 (br. s., 3H), 7.56 (d, J=7.8 Гц, 2H), 7.50 (d, J=9.3 Гц, 1H), 7.47-7.39 (m, 2H), 7.35 (d, J=7.6 Гц, 1H), 7.32-7.25 (m, 2H), 6.04 (br. s., 1H), 5.11 (d, J=6.4 Гц, 1H), 5.05 (br. s., 1H), 5.01 (br. s., 1H), 4.40 (br. s., 1H), 4.36-4.16 (m, 10H), 4.10 (d, J=11.7 Гц, 3H), 4.00 (br. s., 3H), 3.96-3.80 (m, 10H), 3.77 (br. s., 4H), 3.73-3.55 (m, 11H), 3.52 (br. s., 1H), 3.48 (br. s., 3H), 3.12 (br. s., 1H), 3.05 (br. s., 2H), 3.01-2.91 (m, 4H), 2.88 (br. s., 2H), 2.86-2.72 (m, 4H), 2.72-2.53 (m, 13H), 2.45 (t, J=7.5 Гц, 1H), 2.06-1.92 (m, 3H), 1.86 (s, 4H), 1.71-1.56 (m, 3H), 1.56-1.42 (m, 4H), 1.42-1.23 (m, 4H), 0.85 (dd, J=6.6, 14.7 Гц, 6Н).
Получение 4-((S)-2-((S)-2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)-амино)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-метил(2-(метиламино)этил)карбамата (96)
Стадия 1: Синтез 2,5-диоксопирролидин-1-ил-(((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)-L-валината (88): В раствор соединения 87 (150 г, 0,442 моль) и HOSu (56 г, 0,487 моль) в THF (1800 мл) порциями добавляли DCC (100 г, 0,487 моль) в ледяной бане. После добавления реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до -5°С, фильтровали и промывали холодным THF, фильтрат концентрировали в вакууме, и остаток подвергали перекристаллизации из МТВЕ с получением соединения 88 в виде белого твердого вещества (175 г, 91%).
3
2
3
Стадия 2: Синтез (S)-2-((S)-2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)-амино)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентановой кислоты (90): В раствор соединения 89 (40,14 г, 0,229 моль) и NaHCO (19,23 г, 0,229 моль) в воде (750 мл) по каплям добавляли раствор соединения 88 (100 г, 0,229 моль) в DME (750 мл) в ледяной бане. Во время добавления образовывалась белая суспензия. Добавляли дополнительное количество THF (400 мл) для улучшения растворимости. После добавления раствор перемешивали при 25-30°С в течение 2 суток. В реакционную смесь добавляли насыщенный водный раствор KCO до рН 8-9, затем экстрагировали EtOAc (500 мл × 5). Водный слой доводили до рН 3-4 водной лимонной кислотой. Образовалось гелеобразное вещество, и его фильтровали. Влажный остаток на фильтре растворяли в THF (1,5 л). Добавляли метанол до растворения твердого вещества. Раствор концентрировали в вакууме для удаления 30% растворителя и затем охлаждали до комнатной температуры. В раствор добавляли ТВМЕ (2 л), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь фильтровали, и влажный остаток на фильтре сушили в вакууме с получением соединения 90 в виде белого твердого вещества (60 г, 53%).
Стадия 3: Синтез (9Н-флуорен-9-ил)метил-((S)-1-(((S)-1-((4-(гидроксиметил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамата (92): В суспензию соединения 90 (70 г, 0,141 моль) в DCM/MeOH (1 л/500 мл) добавляли соединение 91 (34,7 г, 0,282 моль), после чего добавляли EEDQ (69,7 г, 0,282 моль). Смесь перемешивали при 40°С в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали, и влажный остаток на фильтре суспендировали в EtOAc/ТВМЕ (500 мл/200 мл) и перемешивали в течение 30 минут, затем фильтровали. Твердое вещество промывали смесью EtOAc/ТВМЕ с получением соединения 92 в виде не совсем белого твердого вещества (65 г, 77%).
1
H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ=9.98 (s, 1H), 8.11 (d, 1H), 7.87 (d, 2H), 7.77 (m, 2H), 7.52 (d, 2H), 7.39 (m, 3Н), 7.30 (m, 2H), 7.21 (d, 2H), 5.97 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.10 (m, 1H), 4.42 (m, 3Н), 4.22 (m, 3Н), 3.90 (m, 1H), 2.93 (m, 2H), 1.98 (m, 1H), 1.50 (m, 2H), 1.30 (m, 2H), 0.84 (m, 6H).
2
2
Стадия 4: Синтез (9Н-флуорен-9-ил)метил-((S)-3-метил-1-(((S)-1-((4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-1-оксобутан-2-ил)карбамата (94): В раствор (9Н-флуорен-9-ил)метил-((S)-1-(((S)-1-((4-(гидроксиметил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамата (3,74 г, 8,31 ммоль, 92) в безводном DMF (120 мл) добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (3,78 г, 12,4 ммоль, 93) порциями, после чего по каплям добавляли DIPEA (1,21 г, 9,32 ммоль) при 0°С. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. TLC (MeOH: CHCl = 1:10) показала, что реакция завершилась. Реакционную смесь по каплям добавляли в МТВЕ (2,5 л) при перемешивании. Неочищенный продукт собирали фильтрованием. Остаток на фильтре промывали МТВЕ и сушили в глубоком вакууме с получением соединения 94 в виде коричневого твердого вещества (2,7 г, 57%).
Стадия 5: Синтез 4-((S)-2-((S)-2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)-бензил-трет-бутил-этан-1,2-диил-бис(метилкарбамата) (95): В раствор соединения 94 (1,7 г, 2,217 ммоль) в DMA (15 мл) добавляли НОАТ (332 мг, 2,44 ммоль) и 2,6-лутидин (950 мг, 8,87 ммоль) при 0°С. Смесь перемешивали при 0°С в течение 5 минут. Затем в смесь добавляли трет-бутил-метил(2-(метиламино)этил)карбамат (38, 459 мг, 2,44 ммоль) при 0°С и после этого добавляли DIPEA (860 мг, 6,65 ммоль) при 0°С. Смесь перемешивали при к.т. в течение 1 ч, вливали в ТВМЕ (800 мл), и смесь перемешивали в течение 30 минут, фильтровали. Остаток на фильтре концентрировали в вакууме с получением неочищенного продукта (1,06 г) в виде желтого твердого вещества. Этот неочищенный продукт очищали хроматографией на силикагеле (градиент: DCM:MeOH = 100:1-10:1) с получением продукта 95 в виде белого твердого вещества (600 мг, 33%).
Стадия 6: Синтез 4-((S)-2-((S)-2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-метил(2-(метиламино)этил)карбамата (96): В перемешиваемый раствор соединения 95 (600 мг, 0,735 ммоль) в сухом DCM (10 мл) добавляли TFA (5 мл) при 0°С, и смесь перемешивали при 0°С в течение 1 ч. Смесь концентрировали в вакууме с получением указанного в заголовке соединения 96 в виде белого твердого вещества (550 мг, 100%).
1
H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ=10.09 (br, 1H), 8.40 (s, 2H), 8.14 (d, 1H), 7.90 (d, 2H), 7.74 (m, 2H), 7.61 (d, 2H), 7.43 (m, 3Н), 7.33 (m, 4H), 6.00 (s, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.02 (s, 2H), 4.42-4.23 (m, 4H), 3.93 (m, 1H), 3.50 (m, 2H), 3.08-2.94 (m, 4H), 2.88 (s, 3Н), 2.59 (m, 3Н), 1.99 (m, 1H), 1.69-1.59 (m, 2H), 1.46-1.39 (m, 2H), 0.90-0.85 (m, 6H).
Альтернативное получение (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(((S)-8-(хлорметил)-6-(5-((S)-8-(хлорметил)-4-(((2-((((4-((23S,26S)-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-23-изопропил-21,24-диоксо-26-(3-уреидопропил)-3,6,9,12,15,18-гексаокса-22,25-диазагептакозан-27-амидо)бензил)окси)-карбонил)(метил)амино)-этил)(метил)карбамоил)окси)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2Н-пиран-2-карбоновой кислоты (49)
Стадия 1: Синтез (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((S)-6-(5-((S)-4-(((2-((((4-((S)-2-((S)-2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)(метил)амино)этил)(метил)-карбамоил)окси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2Н-пиран-3,4,5-триил-триацетата (97): В раствор соединения 73 (26 мг, 0,024 ммоль) в DMF (1,5 мл) добавляли линкер Fmoc-VCPABC-DMEA 96 (24 мг, 0,029 ммоль), 2,6-лутидин (0,0167 мл, 0,14 ммоль), DIPEA (0,0253 мл, 0,14 ммоль) и HOAt (3,3 мг, 0,024 ммоль). Смесь перемешивали при к.т. в течение 30 минут и концентрировали в вакууме с получением остатка. Этот неочищенный остаток подвергали очистке методом HPLC (Метод С) с получением продукта 97 в виде белого твердого вещества (33 мг, 83%). LC-MS (Протокол В): m/z 1660,9 (М+Н), время удерживания = 1,11 мин.
2
Стадия 2: Синтез (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(((S)-6-(5-((S)-4-(((2-((((4-((S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)-карбонил)(метил)амино)-этил)(метил)карбамоил)окси)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-8-(хлорметил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2Н-пиран-2-карбоновой кислоты (98); В раствор соединения 97 (46 мг, 0,028 ммоль) в THF (3 мл) и МеОН (3 мл), охлажденный до 0°С, добавляли раствор LiOH⋅HO (12 мг, 0,28 ммоль) в воде (0,5 мл). Смесь перемешивали при 0°С в течение 1 ч. Добавляли АсОН (0,03 мл) для нейтрализации смеси и концентрировали в вакууме с получением белого твердого остатка. Его очищали методом HPLC (Метод С) с получением продукта 98 в виде не совсем белого твердого вещества (28 мг, 72%). LC-MS (Протокол В): m/z 1300,6 (М+Н), время удерживания = 0,78 мин.
1
H ЯМР (400 МГц, DMF) δ=10.33-10.21 (m, 1H), 8.84 (d, J=7.4 Гц, 1Н), 8.63 (br. s., 3Н), 8.41-8.28 (m, 2H), 8.05 (s, 1H), 7.81-7.63 (m, 2H), 7.57-7.41 (m, 3Н), 7.38 (br. s., 2H), 6.52 (br. s., 1H), 5.39 (d, J=6.6 Гц, 1H), 5.17 (br. s., 1H), 5.12 (br. s., 1H), 4.74 (br. s., 1H), 4.48-4.28 (m, 5H), 4.24 (br. s., 1H), 4.09 (s, 4H), 4.04-3.89 (m, 2H), 3.84-3.67 (m, 6H), 3.67-3.52 (m, 4H), 3.32 (s, 9H), 3.26 (br. s., 2H), 3.19 (br. s., 1H), 3.14-3.04 (m, 4H), 3.00 (s, 2H), 2.94 (br. s., 2H), 2.85 (br. s., 2H), 2.79-2.68 (m, 5H), 2.62 (s, 4H), 2.64 (s, 3Н), 2.42-2.29 (m, 1H), 2.23-2.05 (m, 11H), 1.92 (br. s., 1H), 1.78 (br. s., 1H), 1.60 (br. s., 2H), 1.15 (br. S., 6H).
Стадия 3: Синтез (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(((S)-8-(хлорметил)-6-(5-((S)-8-(хлорметил)-4-(((2-((((4-((23S,26S)-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-23-изопропил-21,24-диоксо-26-(3-уреидопропил)-3,6,9,12,15,18-гексаокса-22,25-диазагептакозан-27-амидо)бензил)окси)карбонил)(метил)амино)этил)(метил)-карбамоил)окси)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)окси)-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2Н-пиран-2-карбоновой кислоты (49): В раствор соединения 98 (10 мг, 0,007 ммоль) в DMF (1 мл) добавляли перфторсренил-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,6,9,12,15,18-гексаоксагеникозан-21-оат (5,6 мг, 0,009 ммоль, 99) и DIPEA (0,007 мл, 0,042 ммоль). Смесь перемешивали при к.т. в течение 30 мин. Смесь очищали методом HPLC (Метод С) с получением продукта 49 в виде белой пены (10 мг, 82%). LC-MS (Протокол В): m/z 1715,7 (М+Н), время удерживания = 0,89 мин.
1
H ЯМР (400 МГц, АЦЕТОНИТРИЛ-d3) δ=8.21 (br. s., 2H), 7.56 (d, J=7.4 Гц, 1H), 7.31-7.10 (m, 4H), 6.78 (s, 2H), 5.25 (br. S., 1H), 5.11 (br. s., 1H), 5.02 (br. s., 1H), 4.50 (br. S., 1H), 4.18 (br. s., 2H), 3.77 (br. s., 2H), 3.71 (br. s., 3Н), 3.66-3.42 (m), 3.37-3.24 (m, 4H), 3.16 (br. s., 1H), 3.12-2.95 (m, 4H), 2.93 (s, 2H), 2.77-2.47 (m, H), 2.22-2.02 (m, 4H), 1.51 (br. s., 2H), 0.95 (br. S., 6H).
Получение 4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-ацетамидо-6-аминогексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-((S)-8-(хлорметил)-6-(5-((S)-8-(хлорметил)-1-метил-4-(фосфоноокси)-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)этан-1,2-диилбис(метилкарбамата) (100)
Стадия 1: Синтез 4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-ацетамидо-6-аминогексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил ((S)-8-(хлорметил)-6-(5-((S)-8-(хлорметил)-1-метил-4-(фосфоноокси)-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-6-ил)-5-оксопентаноил)-1-метил-7,8-дигидро-6Н-тиено[3,2-е]индол-4-ил)этан-1,2-диилбис(метилкарбамата) (100): В раствор соединения 55 (35 мг, 0,041 ммоль) в DMF (3 мл) добавляли соединение 74 (45 мг, 0,045 ммоль), лутидин (0,019 мл, 0,16 ммоль), DIPEA (0,029 мл, 0,16 ммоль) и HOAt (5,6 мг, 0,041 ммоль). Смесь перемешивали при к.т. в течение 3 ч. В полученную смесь добавляли пиперидин (0,3 мл, 3 ммоль) и перемешивали смесь при к.т. в течение 20 мин. Смесь концентрировали в вакууме, и остаток очищали методом HPLC (Метод С) с получением продукта 100 в виде белого порошка после сублимационной сушки (35 мг, 62%). LC-MS (Протокол В): m/z 1374,8 (М+Н), время удерживания = 0,92 мин.
1
H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ=8.45 (d, J=13.7 Гц, 1Н), 8.14 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 8.05 (d, J=7.4 Гц, 1H), 7.76 (br. s., 3H), 7.58 (d, J=8.2 Гц, 1H), 7.52-7.39 (m, 2H), 7.30-7.16 (m, 1H), 6.09 (br. s., 1H), 5.15-4.94 (m, 2H), 4.40 (br. s., 1H), 4.35-4.08 (m, 8H), 3.95-3.79 (m, 2H), 3.69 (br. s., 1H), 3.60 (d, J=10.5 Гц, 3H), 3.49 (br. s., 3H), 3.13 (br. s., 1H), 3.06 (br. s., 1H), 3.03-2.91 (m, 4H), 2.88 (s, 2H), 2.76 (br. s., 4H), 2.61 (d, J=6.6 Гц, 2H), 2.56 (s, 6H), 1.98 (m, 3H), 1.86 (s, 3H), 1.65 (m, 3H), 1.58-1.49 (m, 3H), 1.46 (m, 2H), 1.40-1.20 (m, 3H), 0.85 (m, 6H).
Как указано в данном документе, соединения, охарактеризованные в Таблицах 1 и 2, могут существовать в их ацетатной или фенольной пролекарственной форме, которые обе быстро превращаются в бис-циклопропильное активное лекарственное средство. Это превращение быстро происходит в аналитической среде. Следовательно, все три формы соединений являются функционально эквивалентными, и анализы пролиферации раковых клеток показывают одинаковые значения ингибирования роста. Таким образом, описание соединений как "бис-ацетатов" также подразумевает описание в виде их функционально эквивалентных фенол- и бис-циклопропильных форм.
Были получены указанные ниже полезные нагрузки. Все полезные нагрузки были получены либо по общим методикам А и В, либо указанными способами.
(ID = идентификационный номер)
3
2
В вышеуказанных примерах соединений переменная Pg представляет собой Н, ацил, фосфат РОН, углевод, аминокислоту или пептид (в частности, пептид, который расщепляется протеазами, такими как катепсины и матриксные металлопротеиназы).
Были получены следующие соединения линкер/полезная нагрузка:
Таблица 4: По методике, описанной выше для получения аналогов линкер/полезная нагрузка, показанных в Таблице 3, получены следующие соединения линкер/полезная нагрузка:
Структуры линкеров для Таблицы 4
и
где
Р представляет собой точку присоединения к указанный полезной нагрузке,
7
1
20
каждый R независимо представляет Н или -С-Салкил,
8
1
20
6
14
6
14
R представляет собой -С-Салкил, -С-Сарил или -С-Сгетероарил,
n = 0-20, и
m = 0-20.
Таблица 4. Дополнительные соединения Линкер/Полезная нагрузка
Точки присоединения вышеуказанных структур линкеров указаны и находятся на феноле полезной нагрузки.
3
2
В Таблице 4 Pg представляет собой Н, ацил, фосфат РОН, углевод, аминокислоту или пептид (в частности, пептид, который расщепляется протеазами, такими как катепсины и матриксные металлопротеиназы).
Структуры линкеров для таблицы 5
и
где
Р представляет собой точку присоединения к указанной полезной нагрузке,
7
1
20
каждый R независимо представляет Н или -С-Салкил,
8
1
20
6
14
6
14
R представляет собой -С-Салкил, -С-Сарил или -С-Сгетероарил,
n = 0-20, и
m = 0-20.
Таблица 5. Дополнительные соединения Линкер-Полезная нагрузка
Точки присоединения вышеуказанных структур линкеров находятся на N функциональной группы анилина.
3
В таблице 5 Pg представляет собой Н, ацил, фосфат РОН, углевод, аминокислоту или пептид (в частности, пептид, который расщепляется протеазами, такими как катепсины и матриксные металлопротеиназы).
Экспериментальные методики биологической оценки полезных нагрузок и конъюгатов антитело-лекарственное средство
Линии клеток для анализов полезных нагрузок в отношении жизнеспособности
2
Линии раковых клеток были получены из АТСС (Американская коллекция типовых культур) (Manassas, VA). N87 (человеческая карцинома желудка, полученная из метастатического участка печени), HL60 (лейкоз) и MDA-MB-361 DYT2 (человеческая карцинома молочной железы MDA-MB-361) выращивали в среде RPMI 1640. Все среды были дополнены 10% сыворотки плода коровы, 1% пирувата натрия и 1% L-глутамина (Invitrogen, Grand Island, NY). Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) были получены от Lonza (Allendale, NJ) и поддерживались в среде EGM2, дополненной EGM-2 SingleQuots (Lonza # CC-4176). Все клетки содержали в увлажненном инкубаторе (37°С, 5% CO).
Методика анализа цитотоксичности для полезных нагрузок

50
Клетки в 100 мкл среды культивировали в 96-луночном планшете. Линии раковых клеток обрабатывали указанными соединениями путем добавления 50 мкл 3Х исходных растворов в двух повторах в 10 концентрациях. Клетки инкубировали с соединениями в течение четырех суток, затем к клеткам добавляли 30 мкл реагента CellTiter 96 AQeous One MTS Solution (Promega, номер по каталогу G3582), инкубировали 1,5 ч при 37°С, затем измеряли поглощение при 490 нм на планшет-ридере Victor (Perkin Elmer, Waltham, MA). Относительную жизнеспособность клеток определяли в виде процента от необработанных контрольных лунок. Значения IC вычисляли, используя четырехпараметрическую логистическую модель #203 с XLfit v4.2 (IDBS, Guildford, Surry, UK).
Методика анализа цитотоксичности для анти-IL-13Rα2 ADC
Использовали следующие линии клеток: А375 (меланома), РС3ММ2 (предстательная железа), РС3 (предстательная железа).
50
Клетки высевали в 96-луночный планшет на ночь и затем подвергали воздействию возрастающих концентраций анти-IL13Rα2 ADC или контрольных ADC. Через четверо суток жизнеспособность каждой культуры оценивали относительно контрольных клеток. Значения IC вычисляли методом логистической нелинейной регрессии.
Методика анализа цитотоксичности для анти-CD33 ADC
Линии клеток AML человека (HL60, NB4, HEL92.1.7 и Raji) были получены из Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA). Клетки выращивали в среде RPMI, дополненной 10% FBS (сыворотка плода коровы), 1% смеси пенициллина/стрептомицина и L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES и 0,27% глюкозы (Life Technology, Carlsbad, CA). Линии клеток тестировали в отношении их уровней эндогенной активности Р-гликопротеина, белка множественной лекарственной резистентности, и белок резистентности рака молочной железы определяли, используя коммерческий проточный цитометрический набор (eFLUXX-ID; ENZO Life Sciences, Plymouth Meeting, PA).
50
50
Для анализов цитотоксичности клетки высевали в 96-луночные непрозрачные планшеты (Corning) и обрабатывали варьирующими концентрациями соединений в течение 4 суток. Жизнеспособность определяли с использованием набора для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter Glo (Promega, Madison, Wl) и измерения проводили с использованием планшет-ридера Victor Х3 (Perkin Elmer Waltham, MA). Данные нормировали по отношению к контрольной группе (DMSO или PBS). Значения IC определяли в виде концентрации, которая вызывает 50%-ое ингибирование роста. Значения IC вычисляли, используя логистическую нелинейную регрессию, модель №203 с XL fit v4.2 (IDBS, Guldford, Surry, UK). Все экспериментальные точки были расположены в двух дублирующих лунках, и анализы выполняли независимо в двух повторах.
Анализы цитотоксичности для анти-трастузумаб ADC

ueous
50
Клетки-мишени, экспрессирующие N87 (рак желудка), MDA-MB-361-DYT2 (рак молочной железы) или не экспрессирующие (НТ-29) клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты на 24 часа, после чего обрабатывали. Клетки обрабатывали 3-кратными последовательными разведениями конъюгатов антитело-лекарственное средство. Жизнеспособность клеток определяли с использованием набора CellTiter 96 AQOne Solution Cell Proliferation MTS Assay (Promega, Madison Wl) через 96 часов после обработки. Относительную жизнеспособность клеток определяли в виде процента от необработанного контроля. Значения IC вычисляли, используя четырехпараметрическую логистическую модель #203 с XLfit v4. 2 (IDBS, Guildford, Surry, UK).
Результаты по цитотоксичности полезных нагрузок и ADC показаны в Таблицах 6 и 10.
Примеры конъюгатов антитело-лекарственное средство
Способ D: Общая методика конъюгирования антитела с соединением линкер-полезная нагрузка посредством внутренних дисульфидов
Раствор терапевтического антитела в забуференном фосфатами физиологическом растворе Дульбекко (PBS, Lonza, pH 7,4) восстанавливали добавлением 3,0-3,5 эквивалентов гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР, 5 мМ раствор в PBS). Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 1-2 ч и затем оставляли охлаждаться до температуры окружающей среды. Конъюгирование осуществляли путем добавления 7 эквивалентов соединения линкер-полезная нагрузка [10 мМ раствор в N,N-диметилацетамиде (DMA)]. Дополнительное количество DMA добавляли в реакционную смесь до достижения 15% (об./об.) суммарного количества органического растворителя в конечной реакционной смеси. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при температуре окружающей среды. После 1 ч при температуре окружающей среды неочищенную реакционную смесь либо подвергали замене буфера PBS через десольватирующие колонки GE Sephadex, либо избыток соединения линкер-полезная нагрузка гасили добавлением 10 эквивалентов цистеина (20 мМ раствор в PBS). В любом случае неочищенное вещество затем очищали эксклюзионной хроматографией (SEC, Протокол С). Мономерные фракции собирали и концентрировали при необходимости с получением ADC.
Способ Е: Сайт-специфическое конъюгирование соединений линкер-полезная нагрузка с антителом трастузумабом, содержащим сконструированные цистеиновые остатки
Раствор терапевтического антитела, содержащего сконструированный цистеиновый остаток (нумерация согласно Kabat, смотри WO 2013093809), готовили в 50 мМ фосфатном буфере, pH 7,4. Добавляли PBS, EDTA (0,5М исходный раствор) и ТСЕР (0,5М исходный раствор), чтобы конечная концентрация белка составляла ~10 мг/мл, конечная концентрация EDTA составляла ~20 мМ и конечная концентрация ТСЕР составляла приблизительно ~6,6 мМ (100 молярных экв.). Реакционную смесь оставляли стоять при к.т. в течение 2-48 ч и затем осуществляли замену буфера на PBS, используя колонки GE PD-10 Sephadex G25, по инструкциям производителя. Альтернативные методы, такие как диафильтрация или диализ, также используют в особых случаях. Полученный в результате раствор обрабатывали приблизительно 50 эквивалентами дегидроаскорбата (50 мМ исходный раствор в смеси 1:1 EtOH/вода). Антитело оставляли стоять при 4°С в течение ночи и после этого осуществляли замену буфера на PBS, используя колонки GE PD-10 Sephadex G25, по инструкция производителя. И снова, альтернативные методы, такие как диафильтрация или диализ, также используют в особых случаях.
Конъюгирование с антителом, приготовленным таким образом, осуществляли путем добавления 10 эквивалентов соединения линкер-полезная нагрузка [10 мМ раствор в N,N-диметилацетамиде (DMA)]. Дополнительное количество DMA добавляли в реакционную смесь до достижения 15% (об./об.) суммарного компонента органического растворителя в конечной реакционной смеси. В некоторых случаях дополнительно добавляли PBS до достижения конечной суммарной концентрации антитела в реакционной смеси 5-10 мг/мл. После 1-2 ч при комнатной температуре реакционную смесь подвергали замене буфера на PBS (как указано выше) и очищали эксклюзионной хроматографией (SEC, Протокол D). Мономерные фракции собирали и концентрировали при необходимости с получением ADC. В некоторых случаях ADC затем инкубировали после очистки методом SEC с 0,5-1,0 г адсорбента Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad) при 23-37°С в течение 4-18 ч, фильтровали и затем концентрировали, если это требовалось.
Способ F: Опосредованное ферментом конъюгирование с антителом, несущим на себе реакционноспособные остатки глутамина
Терапевтическое антитело, несущее на себе остатки глутамина, реагирующего с ферментом трансглутаминазой, подвергали диализу в стерильную воду (Lonza). Трансглутаминаза-опосредованное конъюгирование проводили путем смешивания 5,0-15 мг/мл антитела, содержащего реагирующий с трансглутаминазой глутамин, в воде с 30 мМ концентрата среды растворения фосфат калия рН 7,4 DILUT-IT (J.T. Baker), 150 мМ хлорида натрия (NaCl), 15,0-20,0-кратным молярным избытком несущей аминоалкильный линкер полезной нагрузки (10-30 мМ раствор в DMSO) и 30-60 мг/мл порошка фермента трансглутаминазы (Ajinomoto Activa TI). Дополнительно, в реакционную смесь добавляли DMSO до достижения 5-10% (об./об.) суммарного компонента органического растворителя в конечной смеси. В некоторых случая дополнительно добавляли воду до достижения конечной общей концентрации антитела в реакционной смеси 5-10 мг/мл. Полученную смесь инкубировали при температуре окружающей среды в течение 5-6 часов. Затем добавляли еще 30-60 мг/мл твердой трансглутаминазы, и смесь дополнительно инкубировали при температуре окружающей среды в течение еще 18 часов. После ночи неочищенную реакционную смесь подвергали замене буфера на забуференный фосфатами физиологический раствор Дульбекко (PBS, pH 7,4, Lonza), используя колонки для замены буфера GE Healthcare Sephadex, по инструкциям производителя. Неочищенное вещество очищали либо эксклюзионной хроматографией (SEC, Протокол D), либо хроматографией гидрофобного взаимодействия (HIC, Протокол G). После очистки мономерные фракции собирали и концентрировали при необходимости с получением ADC. В Примерах, где ADC очищали методом HIC, собранные фракции затем подвергали замене буфера на забуференный фосфатами физиологический раствор Дульбекко (PBS, рН 7,4, Lonza), используя колонки для замены буфера GE Healthcare Sephadex, по инструкциям производителя. В некоторых случаях ADC после очистки методом SEC затем инкубировали с 0,5-1,0 г адсорбента Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad) при 23-37°С в течение 4-18 ч, фильтровали и затем концентрировали, если это требовалось.
ADC характеризовали эксклюзионной хроматографией (SEC) и хроматографией гидрофобного взаимодействия (HIC) для определения чистоты, и жидкостной хроматографией/тандемной масс-спектрометрией с электрораспылительной ионизацией (LC-ESI MS) для вычисления соотношения лекарственное средство-антитело (DAR, нагрузка).
Протокол С: Колонка: Agilent Poroshell 300SB-C8, 75×2,1 мм, 2,6 мкм; Подвижная фаза А: 0,1% муравьиной кислоты в воде (об./об.); Подвижная фаза В: 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (об./об.); Градиент: начальные условия: от 20% В до 45% В за 4 минуты; Скорость потока: 1,0 мл/минута. Температура: 60°С; Детектирование: 220 нм; диапазон MS (+)4 00-2000 Да; Впрыскиваемый объем: 10 мкл; Прибор: Agilent 1100 LC, Waters MicromassZQ MS. Деконволюцию выполняли с использованием MaxEnt1.
Протокол D: Колонка: GE Superdex 200 (10/300 GL); Подвижная фаза: забуференный фосфатами физиологический раствор (PBS, 1X, рН 7,4); Изократический; Скорость потока: 1,0 мл/минута. Температура: комнатная температура; Прибор: GE Akta Explorer.
Протокол Е: Колонка = Waters BEH300-C4, 2,1×100 мм (P/N = 186004496); Прибор = Acquity UPLC с детектором масс-спектрометра SQD2; Скорость потока = 0,7 мл/мин; Температура = 80°С; Буфер А = вода + 0,1% муравьиной кислоты; Буфер В = ацетонитрил + 0,1% муравьиной кислоты. Градиент: от 3%В до 95%В за 2 минуты, выдержка при 95%В в течение 0,75 мин и затем повторное уравновешивание при 3% В. Образец восстанавливают ТСЕР или DTT непосредственно перед впрыскиванием. Элюат контролируют LCMS (400-2000 Да), и деконволюцию пика белка осуществляют с использованием MaxEnt1. DAR регистрируют в виде массовой средней нагрузки, как было ранее описано.
Протокол F: Колонка: TSKGel Butyl NPR, 4, 6 мм × 3,5 см (P/N = S0557-835); Буфер А = 1,5М сульфат аммония аммония, содержащий 10 мМ фосфата, рН 7; Буфер В = 10 мМ фосфат, рН 7+20% изопропилового спирта; Скорость потока = 0,8 мл/мин; Температура = температура окружающей среды; Градиент = от 0%В до 100%В за 12 минут, выдержка при 100%В в течение 2 минут, затем повторное уравновешивание при 100%А; Прибор: Agilent 1100 HPLC.
Протокол G: Колонка: GE HiTrap Butyl HP, 5 мл; Подвижные фазы: 1М фосфат калия, 50 мМ Tris-HCl, pH 7 (Буфер А); 50 мМ Tris-HCl, pH 7 (Буфер В); Градиентное элюирование: 0-100% Буфера В за 10-20 колоночных объемов; Скорость потока: 5,0 мл/минута. Температура: комнатная температура; Прибор: GE Akta Explorer.
Х = В приведенной выше Таблице "X" означает антитело, использованное для конъюгирования, как обозначено в Таблице 5.
Таблица 10: Данные по цитотоксичности in vitro для ADC#1-6 в антиген+ve (антиген-положительных) и антиген -ve (антиген-отрицательных) линиях клеток
Получены следующие ADC, содержащие соединения линкер/полезная нагрузка, показанные в Таблицах 4 и 5, конъюгированные с представляющими интерес антителами с использованием подходящего способа конъюгирования:
и