Иммуномодулятор «Иммуномакс» активирует дендритные клетки

трипептида грамотрицательных бактерий. Иммунология. 2013; 34(2): 72-6.

Поступила 25.02.15

references

1. Beutler B. Inferences, questions and possibilities in Toll-like receptor signalling. Nature. 2004; 430: 257-63.

2. Girardin S. E., Travassos L. H., Herve M. et al. Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nod1 and Nod2. J. Biol. Chem. 2003; 278: 41702-8.

3. Kim J. Y., Omori E., Matsumoto K. et al. TAK1 is a central mediator of NOD2 signaling in epidermal cells. J. Biol. Chem. 2008; 283: 137-44.

4. Yasuda K., Richez C., Uccellini M. B. et al. Requirement for DNA CpG content in TLR9-dependent dendritic cell activation induced by DNA-containing immune complexes. J. Immunol. 2009; 183: 3109-17.

5. Hedl M., Abraham C. Distinct roles for Nod2 protein and autocrine interleukin-lbeta in muramyl dipeptide-induced mitogen-activated protein kinase activation and cytokine secretion in human macrophages. J. Biol. Chem. 2011; 286: 26440-9.

6. Pashenkov M. V., Popilyuk S. F., Alkhazova B. I. et al. Muropeptides trigger distinct activation profiles in macrophages and dendritic cells. Int. Immunopharmacol. 2010; 10: 875-82.

7. Pashchenkov M. V., Alkhazova B. I., L'vov V. L., Pinegin B. V. Peculiarities induction of proinflammatory genes in dendritic cells and macrophages under the action of glucosaminilmuramildipeptide gram-negative bacteria. Immunologiya. 2013; 34

8. Fortin C. F., Mayer T. Z., Cloutier A., McDonald P. P. Translational control of human eutrophil responses by MNK1. J. Leukoc. Biol. 2013; 94: 693-703.

Received 25.02.15

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК615.276.2/.4.015.44

Пичугин А.В., Багаев А.В., Чулкина М.М., Бержицкая Д.А., Шишкова Н.М., Атауллаханов Р.И.

иммуномодулятор «иммуномакс» активирует дендритные клетки

ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства России, 115478, г Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2

Раннее сообщалось, что иммуномодулятор «Иммуномакс» активирует моноциты, макрофаги и NK-клетки. В данной работе впервые изучено действие иммуномакса на дендритные клетки мыши и человека. Исследованы первичные дендритные клетки, выделенные методом клеточной сортировки из селезенки мыши или периферической крови человека, а также искусственно полученные дендритные клетки, дифференцированные in vitro с помощью GM-CSF из костного мозга мыши или моноцитов человека. Установлено, что иммуномакс повышает экспрессию ко-активационных молекул CD40, CD80, CD86, MHC-II на поверхности дендритных клеток, стимулирует выработку провоспалительных, регуляторных цитокинов и хемокинов (IL-1, TNFa, IL-10, lL-12, IL-8, MCP-1, MIP-1, RANTES). Доказано, что активация иммуномаксом NK-клеток опосредована дендритными клетками. Обнаруженные эффекты свидетельствуют, что иммуномакс активирует основные физиологические функции дендритных клеток такие, как презентация антигена Т-клеткам, активация антигенспецифических Т-клеток, привлечение других типов клеток в очаг воспаления. Предполагается, что терапевтический эффект иммуномакса у больных различными вирусными, бактериальными и грибковыми инфекциями, а также при онкопатологии может быть обусловлен влиянием на дендритные клетки.

Ключевые слова: иммуномакс; дендритные клетки; ко-активационные молекулы; секреция цитокинов; NK-клетки.

Для цитирования: Иммунология. 2015; 36(4): 200-205. Pichugin A.V., Bagaev A.V., Chulkina M. M., Berzhitskaya D. A., Shishkova N. M., Ataullakhanov R. I. IMMUNOMODULATOR «IMMUNOMAX» ACTIVATES DENDRITIC CELLS «Institute of immunology, Federal medical-biological Agency of Russia, 115478, Moscow

Earlier it was reported that immunomodulator «Immunomax» activates monocytes, macrophages and NK cells. In this work, we first studied the effect of Immunomax on dendritic cells of mouse and human. Researched primary dendritic cells isolated by cell sorting from mouse spleen or human peripheral blood, as well as artificially derived dendritic cells differentiated in vitro with GM-CSF from bone marrow of the mouse or human monocytes. It is established that the Immunomax increases the expression of co-activation molecules CD40, CD80, CD86, MHC-II on the surface of dendritic cells, stimulates the production of proinflammatory and regulatory cytokines and chemokines (IL-1, TNFa, IL-10, IL-12, IL-8, MCP-1, MIP-1, RANTES). It is proved that the activation of Immunomax NK cells is mediated by dendritic cells. Discovered effects suggest that the Immunomax activates the main physiological functions of dendritic cells such as antigen presentation T cells, activation of antigen-specific T cells, the involvement of other cell types in the inflammatory focus. It is assumed that the therapeutic effect of Immunomax in patients with various viral, bacterial and fungal infections, and cancer pathology may be due to the influence of dendritic cells.

Keywords: Immunomax; dendritic cells; co-activation molecules; secretion of cytokines; NK cells.

Citation: Immunologiya. 2015; 36

Введение

Иммуномодулятор «Иммуномакс» (Р N001919/02-171011) выделен из растений, успешно применяется для лечения мно-

Для корреспонденции: Пичугин Алексей Васильевич, pichal-vas@gmail.com

For correspondence: Pichugin Aleksey Vasil'evich, pichalvas@ gmail.com

гих хронических заболеваний, связанных со снижением защитных сил организма против вирусных [1-4], бактериальных [5, 6] инфекций, после лучевой терапии [7]. В работе [8] изучены многие аспекты воздействия Иммуномакса на клетки и реакции иммунной системы: адъювантное действие по повышению выработки антител на растворимые и корпускулярные антигены, активация моноцитов и макрофагов по выработке окислительных радикалов и провоспалительных цитокинов, активация ПК-клеток и повышение их противоопухолевой активности.

В данной работе мы исследовали влияние Иммуномакса на дендритные клетки. Хорошо известно, что дендритные клетки играют ключевую роль в управлении иммунным ответом, они поглощают чужеродные антигены и формируют специфические Т-клеточные реакции, от них зависят результаты вакцинации и ответ иммунной системы на инфекции, они активируют противоопухолевую защиту [9, 10]. Действие большого числа иммуномодуляторов и адъювантов реализуется через дендритные клетки [11].

Мы изучили влияние иммуномакса на первичные дендритные клетки мыши и человека, а также на искусственно полученные дендритные клетки, дифференцированные in vitro с помощью GM-CSF. Чтобы исключить возможное влияние Иммуномакса на дендритные клетки опосредованно через другие клетки мы выделяли высокоочищенные популяции дендритных клеток человека и мыши методом клеточной сортировки. В результате проведенных экспериментов на высокоочищенных дендритных клетках установлено, что иммуномакс повышает экспрессию ко-активационных молекул CD40, CD80, CD86, MHC-II, стимулирует выработку провоспалительных, регуляторных цитокинов и хемокинов: IL-1, TNFa, IL-10, IL-12, IL-8, MCP-1, MIP-1, RANTES. Доказано, что активация Иммуномаксом NK-клеток опосредована дендритными клетками.

Материал и методы

В работе использовали мышей BALB/c, самок, массой 18-20 г из питомника лабораторных животных «Столбовая». Фиколл 1,09 г/см3, среда DMEM с 20 мМ HEPES, среда RPMI-1640, L-глутамин, ß-меркаптоэтанол, пируват натрия, 0,9% изотонический раствор натрия хлорида (физ.раствор), раствор DPBS, раствор Хэнкса, HEPES-буфер, раствор Версена, пенициллин/стрептомицин - все от фирмы ПанЭко. Эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС) фирмы PAA Laboratories GmbH. Рекомбинантный мышиный GM-CSF и рекомбинант-ные человеческие GM-CSF и IL-4 фирмы GIBCO. Глюкоза и азид натрия фирмы Sigma. ODN CpG 2006 - агонист TLR9 фирмы InVivoGen.

Полная культуральная среда состояла из DMEM, дополненной 10% ЭТС, 2 мМ L-глутамина, заменимыми аминокислотами, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ ß-меркаптоэтанола, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 ЕД/мл стрептомицина. PBS (без магния и кальция) - солевой буфер, содержащий 10 мМ фосфата натрия, 137 мМ хлористого натрия, 2,7 мМ хлористого калия, рН 7,3-7,5 (Amresco). Буфер для отмывки клеток (PBS-cell) - PBS без магния и кальция с добавкой 10 мМ HEPES, 0,5% БСА, 1% глюкозы, рН 7,4. Буфер цитометриче-ский (PBS-cyto) - PBS без магния и кальция с добавкой 10 мМ HEPES, 0,5% БСА, 0,01% азида натрия, 0,35 мМ EDTA, рН 7,4 применяли для отмывки клеток и инкубации с антителами.

Брефельдин А - ингибитор транспорта белков фирмы Biolegend. Набор для фиксации и пермебиализации клеток Cytofix/Cytoperm, состоящий из раствора для фиксации клеток PermFix и буфера для отмывки клеток PermWash фирмы BD Biosciences. Набор для определения растворимых цитокинов CBA Flex фирмы BD Biosciences. Наборы для выделения NK-клеток человека Human NK Cell Enrichment Set-DM (BD Biosciences) и мыши EasySep™ Mouse NK Cell Enrichment Kit (STEMCELL Technologies).

Антитела: Lin1-FITC

Костномозговые дендритные клетки мыши получали по методу [12]. Костный мозг вымывали раствором PBS-cell из бедренных и больших берцовых костей задних конечностей мыши шприцем с иглой G25. Эритроциты лизировали осмотическим шоком. Клетки костного мозга (10 млн клеток в 10

мл полной среды с добавлением 10 нг/мл GM-CSF) культивировали в 90-миллиметровых чашках Петри в течение 7 дней. Замену ПС с добавлением GM-CSF производили на 3-4-й день инкубации. Через 7 дней после начала собирали фракцию неадгезионных клеток, в которой содержалось до 80% дендритных клеток, определенных по экспрессии CD11c и 1-Аа/1-Еа-методом проточной цитометрии. Высокоочищенные дендритные клетки с чистотой 99% получали путем клеточной сортировки. Для этого суспензию клеток окрашивали антителами CD11c-PerCP, MHC class II (I-Ad/I-Ed)-PE и сортировали положительные по этим маркерам клетки на проточном лазерном сортировщике FACS Aria II (BD Biosciences).

Искусственно дифференцированные дендритные клетки человека получали по методу [13] с небольшой модификацией, а именно: из периферической крови здоровых доноров выделяли на фиколле мононуклеарную фракцию, помещали в чашки Петри в концентрации 10 млн/мл в полной среде

Рис. 1. Иммуномакс повышает экспрессию активационных и костимуляторных молекул на поверхности дендритных клеток, полученных дифференцировкой in vitro с помощью GM-CSF из клеток костного мозга мыши (а) и моноцитов человека (б). Пунктирная линия - изотипический контроль, серая гистограмма -инкубация в среде (контроль), сплошная черная линия - инкубация с иммуномаксом, 10 мкг/мл

Усиление экспрессии активационных рецепторов после воздействия на дендритные клетки Иммуномаксом.

Клеточный Уровень экспрессии

среда Иммуномакс индекс активации

Дендритные клетки мыши, дифференцированные из костного мозга

I-Ad/I-Ed 29 700 58 300 2,0

CD86 1 181 3 102 2,6

CD80 169 259 1,5

CD40 1 505 4 225 2,8

Дендритные клетки человека, дифференцированные из моноцитов

HLA-DR 3 835 9 399 2,5

CD86 1 325 13 300 10,0

RPMI-1640. Затем адгезией на пластике выделяли моноциты, и инкубировали их в полной среде RPMI-1640, содержащей 100 нг/мл GM-CSF и 50 нг/мл IL-4 в течение 5 сут. Смывали неадгезионные клетки и созревание моноцитов в дендритные клетки определяли по снижению экспрессии CD14 и повышению экспрессии CD86 [13].

Первичные дендритные клетки мыши получали из селезенки. Мононуклеарные клетки селезенки выделяли на фи-колле плотностью 1,09 г/см3 (1500 об/мин, при 15°С, 25 мин), дважды отмывали раствором PBS-cell (1200 об/мин, при 4°С, 10 мин) и окрашивали смесью антител CD19-FITC, CD11c-PerCP, MHC class II (I-Ad/I-Ed)-PE. Дендритные клетки сортировали как CD19neg, CD11cpos, MHC class IIpos с помощью FASC Aria II по 40 000 клеток в 96-луночный планшет для культивирования клеток. Чистота популяции сортированных ДК составляла 97-99%.

Первичные дендритные клетки человека получали из периферической крови здоровых доноров методом клеточной сортировки на FASC Aria II. Фракцию монону-клеарных клеток крови, выделенную на фиколле 1,077 г/ см3, окрашивали смесью антител Lin1-FITC (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56), CD123-PE, HLA-DR-APC-H7, CD11c-V450. Миелоидные дендритные клетки выделяли как

Lin1negCD11chighCD123negHLA-DRhigh и плазмацитоидные - как Lin1negCD11cneg CD123high HLA-DRhigh. Чистота выделенных популяций составляла 97-99%. Сортировали по 500 клеток на лунку 96-луночного планшета (триплеты идентичных лунок) в 100 мкл среды RPMI-1640.

NK-клетки мыши получали из суспензии ядросодержащих клеток селезенки путем отрицательной селекции на магнитных шариках EasySep™ Mouse NK Cell Enrichment Kit по протоколу фирмы STEMCELL™ Technologies. Чистота обогащенной популяции NK-клеток мыши, определенная методом проточной цитометрии после окрашивания DX5-APC, составляла 75-85%, NC-клетки человека получали из мононуклеарной фракции периферической крови путем отрицательной селекции на магнитных шариках Human NK Cell Enrichment Set-DM по протоколу фирмы BD Biosciences. Чистота обогащенной популяции NK человека, определенная методом проточной цитометрии после окрашивания CD56-PE, составляла 75-85%.

Определение секретируемых цитокинов IL-1, TNFa, IL-10, IL-12, MCP-1, MIP-1, RANTES проводили с помощью наборов CBA Flex фирмы BD Biosciences на приборе FACS Aria II по протоколу фирмы.

Определение внутриклеточного IL-12 проводили по методике [14] с небольшими модификациями. Клетки инкубировали 18 ч с индукторами, затем еще 6 ч с добавлением брефельдина A в конечной концентрации 5 мкМ. Суспензию клеток переносили в пробирки объемом 1,2 мл, клетки осаждали центрифугированием, к клеточному осадку приливали 100 мкл раствора FixPerm, отмывали раствором PermWash. Осадок клеток ресуспензировали в 50 мкл PermWash, добавляли меченое флуорохромом антитело IL-12-PE, инкубировали 30 мин, затем дважды отмывали раствором PermWash. Ресуспензировали в 200 мкл PBS-cyto и анализировали на проточном цитофлуориметре FACS Aria II.

Определение мРНК цитокинов человека IL-1, IL-8, TNFa проводили методом РТ-ПЦР на детектирующем амплифика-торе DTprime (ДНК-Технология). Выделение нуклеиновых кислот проводили по стандартной методике коммерческими наборами Проба-НК (ДНК-Технология). Для нормировки значений уровня мРНК использовали ген рецептора гормона роста. Данные рассчитывали в виде относительной экспрессии мРНК цитокинов, полученной путем деления соответствующего значения нормированной экспрессии мРНК цитокина на нормированный уровень этой мРНК в нестиму-лированных клетках того же типа.

Рис. 2. Иммуномакс активирует секрецию цитокинов дендритными клетками, полученными дифференцировкой in vitro с помощью GM-CSF из клеток костного мозга мыши.

Дендритные клетки получали инкубированием в течение 7 дней, затем очищали до 99% чистоты путем клеточной сортировки (а) на FACS Aria II и инкубировали по 40 000 клеток (в триплетах) в лунках 96-луночного планшета в течение 18 ч, собирали надосадочную жидкость и определяли концентрацию секретированных цитокинов (б) с помощью наборов CBA Flex на FACS Aria II. По оси ординат - концентрация цитокинов, пг/мл. Приведены средние значения и стандартные отклонения. Черные столбики - инкубация клеток в присутствии иммуномакса (10 мкг/мл), серые столбики - инкубация без иммуномакса.

Рис. 3. Иммуномакс активирует выработку цитокина IL-12 дендритными клетками. Первичные дендритные клетки из селезенки получали путем клеточной сортировки на FACS Aria II как CD19ne8CD11cposI/Apos (стратегия выделения - а). Искусственно дифференцированные дендритные клетки получали культивированием клеток костного мозга мыши с GM-CSF (10 нг/ мл) в течение 7 дней, затем очищали до 99% чистоты методом клеточной сортировки на FACS Aria II. Дендритные клетки инкубировали по 40 000 клеток (в триплетах) в лунках 96-луночного планшета в течение 18 ч c добавлением иммуномакса (10 мкг/мл) или без него. После инкубации определяли внутриклеточное содержание IL-12 (б), как описано в раздере Материал и методы. Приведены средние значения и стандартные отклонения продукции IL-12 первичными дендритными клетками, выделенными из селезенки интактной мыши (в), или дендритными клетками, полученными дифференцировкой in vitro из клеток костного мозга мыши (г). Достоверность отличия * - p<0,05, ** - p<0,01.

Определение уровня относительной экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов человека IL-1, IL-8, TNFa проводили методом ПЦР-РВ с предварительной реакцией обратной транскрипции на детектирующем амплификаторе DT-96 (ДНК-Технология). Выделение нуклеиновых кислот и реакцию обратной транскрипции проводили по стандартной методике коммерческими наборами (ДНК-Технология). ПЦР проводили в триплетах, для расчетов использовали среднее значение порогового цикла (Cp). Для нормировки значений уровня экспрессии мРНК использовали значение Cp гена рецептора гормона роста ghr. Экспрессию мРНК цитокинов вычисляли по стандартной формуле 2ACp. Относитель-

ную экспрессию мРНК рассчитывали путем деления среднего нормированного значения экспрессии мРНК в стимулированных клетках к среднему нормированному значению мРНК этого же гена в идентичных не стимулированных клетках.

результаты и обсуждение

Дендритные клетки мыши, дифференцированные in vitro. Экспрессия ко-активационных молекул

Дендритные клетки, дифференцированные in vitro с помощью GM-CSF, широко используются для изучения влияния препаратов. При работе с дендритными клетками мыши распространен подход получения ДК из клеток костного мозга, позволяющий за 7-9 дней получить миллионы ДК с достаточной чистотой 7090% [12]. В случае ДК человека наиболее распространен подход дифференцировки из моноцитов периферической крови человека [13], позволяющий за 3-5 суток получать миллионы ДК с чистотой до 90%.

Мы исследовали влияние Иммуномакса на экспрессию ко-активационных молекул на поверхности ДК мыши и человека, дифференцированных in vitro с помощью GM-CSF (рис. 1; см. таблицу). Полученные данные свидетельствуют, что 18-часовая инкубация ДК в присутствии 10 мкг/мл Иммуномакса приводит к существенному и достоверному увеличению экспрессии молекул CD40, CD80, CD86, MHC-II на поверхности клеток.

Дендритные клетки мыши, дифференцированные in vitro. Продукция цитокинов

Мы исследовали влияние Иммуномакса на выработку цитокинов дендритными клетками, полученными из костного мозга мыши. После 7-дневного культивирования клеток костного мозга в присутствии GM-CSF содержание ДК составляет от 70 до 80%. Такая степень обогащения ДК достаточна для анализа экспрессии поверхностных молекул, поскольку на цитофлуориметре мы можем отличать ДК по поверхностным маркерам. В случае исследования секрети-руемых цитокинов даже 90% чистота клеточной популяции не достаточна. Поэтому мы доводили чистоту популяции ДК до 99% методом клеточной сортировки на приборе FASC Aria II. Полученные из костного мозга ДК мыши окрашивали смесью антител к CD11c и MHC-II, и сортировали позитивные клетки. Результаты исследования продукции цитокинов сортированными ДК костного мозга мыши до и после активации Иммуномаксом представлены на рис. 2. Из приведенных данных видно, что инкубация высокоочищенных дендритных клеток в присутствии Иммуномакса повышает практически на 2 порядка выработку следующих цитокинов: IL-1, TNFa, IL-10, IL-12, MCP-1, MIP-1, RANTES.

сравнение ДК, искусственно дифференцированных из клеток костного мозга мыши, и первичных ДК из селезенки интактной мыши

Применение дифференцированных in vitro дендритных клеток находит широкое применение для изучения механизмов регуляции процессов их активации при воздействии различными лигандами. Интересно, в какой мере эти данные на искусственно полученных ДК соответствуют действию тех же лигандов на первичные (естественные) ДК. Мы сравнили ответ на Иммуномакс дендритных клеток, дифференцированных in vitro из клеток костного мозга мыши с помощью GM-CSF (КМ-ДК), и первичных дендритных клеток из селезенки интактной мыши (С-ДК). По выработке IL-12 мы сравнили ответ на Иммуномакс КМ-ДК и С-ДК. И те, и другие дендритные клетки мы сортировали до чистоты 97-99% с помощью FACS Aria II. Клетки инкубировали 18 ч в культуральной среде в присутствии иммуномакса или без него. Затем добавляли брефельдин - ингибитор секреции белков и инкубировали еще 5 часов, после чего клетки

Влияние Иммуномакса на первичные дендритные клетки из периферической крови человека.

Выше описано влияние Иммуномакса на ДК мыши и человека, искусственно дифференцированные in vitro, а также на первичные ДК из селезенки мыши. Полученные нами результаты позволяют с большой вероятностью полагать, что многие клинические эффекты Иммуномакса опосредованы действием на ДК в организме человека. В дополнение мы исследовали прямое действие Иммуномак-са на циркулирующие ДК, выделенные из периферической крови человека.

Известны два типа ДК в периферической крови человека - миелоидные (мДК) и плазмацитоидные (пДК) [15]. В крови этих клеток мало, около 0,1% от всех лейкоцитов, что усложняет изучение прямого действия препаратов на эти типы клеток. Мы применили метод клеточной сортировки на приборе FASC Aria II, позволивший получить чистые (97-99%) популяции данных редких типов клеток. Миелоидные дендритные клетки выделяли как Lm1negCD11chighCD123negHLA-DRhigl1 и плазмацитоидные - как Lin1negCD11cneg CD123high HLA-DRhigh. ДК в количестве 500 клеток сортировали в триплетах в лунки 96-луночного планшета, инкубировали в течение 3 ч в присутствии одного из лигандов - Иммуномакс (5 мкг/мл) или ODN CpG2006 (5 мкг/мл) - или в питательной среде без лигандов (контроль). После инкубации содержимое лунок заливали реактивом для выделения нуклеиновых кислот, и методом РТ-ПЦР определяли содержание мРНК провоспали-тельных цитокинов.

Данные рис. 4 показывают, что пДК отвечают выработкой мРНК TNFa на ODN CpG2006, но не отвечают на Иммуномакс. Напротив, мДК отвечают продукцией мРНК TNFa на Иммуномакс, но не отвечают на ODN CpG2006. Эти данные полностью соответствуют тому факту, что Иммуномакс распознается рецепторами TLR4, а ODN CpG2006 - рецепторами TLR9. Как известно, мДК и пДК существенно различаются репертуаром рецепторов TLR, представленных на этих типах клеток. Миелоидные ДК располагают широким спектром рецепторов - TLR1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, в то время как пДК экспрессируют только TLR7 и TLR9 [15, 16]. Действуя на мДК, Иммуномакс активирует не только продукцию TNFa, но и IL-1 и IL-8.

Иммуномакс активирует NK-клетки опосредованно через дендритные клетки

В работе [8] было показано, что при действии Иммуномак-сом на клетки периферической крови человека происходит значительная активация NK-клеток. Хорошо известно, что активация NK-клеток часто может происходить при посредстве ДК [17, 18]. Используя очищенные популяции клеток, мы исследовали роль дендритных клеток в активирующем действии Иммуномакса на NK-клетки человека и мыши.

NK-клетки периферической крови условно здоровых доноров в условиях 18-часовой культуры клеток in vitro массово активируются в ответ на воздействие Иммуномаксом. Об активации NK-клеток судили по экспрессии на их поверхности активационных молекул CD69. Под влиянием Иммуномакса в цельной не фракционированной крови активировалось около 60% NK-клеток (рис. 5). Напротив, в тех же условиях культивирования очищенная популяция NK-клеток, выделенная из периферической крови тех же доноров, практически не активируется под влиянием иммуномакса. Следовательно, Имму-номакс не оказывает прямого активирующего действия на NK-клетки, но вызывает активацию этих клеток опосредованно, при участии каких-то дополнительных факторов или клеток, имеющихся в цельной крови человека. В последующих экспериментах на высокоочищенных популяциях NK и дендритных клеток мыши мы установили, что активация NK-клеток иммуномаксом происходит при участии дендритных клеток.

На рис. 5 представлены данные по влиянию Иммуномакса на очищенную популяцию NK-клеток при добавлении сортированных дендритных клеток или без них. В монокультуре NK-клетки, очищенные из селезенки мыши, после активации Иммуномаксом в течение 18 ч не проявляли признаков

Рис. 4. Иммуномакс активирует выработку цитокинов в миелоидных дендритных клетках человека. Миелоидные и плазмацитоидные дендритные клетки получали из фракции мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров методом клеточной сортировки на FASC Aria II как Lin1ne8CD11chiehCD123ne8HLA-DRhieh и Lin1"e8CD11cnee CD123high HLA-DRhigh соответственно (стратегия выделения - а). Чистота выделенных популяций составляла 9799%. Клетки сортировали в триплетах по 500 штук в лунки 96-луночного планшета с 100 мкл среды RPMI-1640 и инкубировали 3чвприсутствиииммуномакса(5мкг/мл)илиODNCpG2006(5мкг/мл), и определяли содержание мРНК цитокинов методом ПЦР-РВ (б, в). По оси ординат - содержание мРНК, нормированное на значение в контрольных пробах без добавления активаторов. Приведены средние значения и стандартные отклонения по 7 независимым опытам, достоверность отличия * - p< 0,05.

Рис. 5. Иммуномакс активирует NK-клетки опосредованно, через дендритные клетки.

Очищенные NK-клетки из крови человека или из селезенки мыши инкубировали 18 часов в культуральной среде с добавлением иммуномакса (10 мкг/мл) или без него.

а — очищенные NK-клетки человека (черные столбики) сравнивали с суспензией неразделенных клеток периферической крови (серые столбики), б — монокультуры очищенных NK-клеток из селезенки мыши (черные столбики) сравнивали с совместными культурами очищенных NK-клеток селезенки и сортированных дендритных клеток (серые столбики). По оси ординат - содержание активированных NK-клеток, определенное методом проточной цитометрии как процент клеток, экспрессирующих на поверхности активационные молекулы CD69. Приведены средние значения и стандартные отклонения, достоверность отличия: * - p<0,05, ** - p<0,01.

фиксировали, пермеабилизировали и окрашивали на внутриклеточное содержание ГЬ-12. Результаты, представленные на рис. 3, доказывают, что Иммуномакс достоверно повышает выработку ГЬ-12 как в КМ-ДК, так и С-ДК.

активации. Добавление сортированных ДК в культуру очищенных NK-клеток приводило к экспрессии активационных молекул CD69 на 40% NK-клеток. Внесение иммуномакса в совместную культуру ДК- и NK-клеток приводило к экспрессии активационных молекул CD69 на 75% NK-клеток (см. рис. 5). Следовательно, дендритные клетки оказывают активирующее влияние на NK даже без дополнительной стимуляции. Это стимулирующее действие дендритных клеток на NK-клетки существенно возрастает, если ДК активированы Иммуномаксом.

В целом представленные в данной работе данные вместе с ранее опубликованными исследованиями свидетельствуют, что Иммуномакс активирует основные физиологические функции дендритных клеток. В частности, препарат повышает экспрессию ко-активационных молекул CD40, CD80, CD86 и MHC-II, индуцирует транскрипцию и усиленную продукцию иммуностимулирующих цитокинов IL-1, TNFa и IL-12, иммунорегуляторного цитокина IL-10, а также хемо-кинов MCP-1, MlP-1, RANTES. Дендритные клетки, усиленно экспрессирующие ко-активационные молекулы и секрети-рующие иммуностимулирующие цитокины имеют высокую эффективность в активации ответов антигенреактивных Т-клеток. Причем цитокин IL-12 обеспечивает поляризацию реагирующих Т-клеток в направлении Th1, что очень полезно для защиты от многих инфекций и опухолей.

Продукция активированными дендритными клетками хемокинов позволяет рекрутировать дополнительные типы клеток в зону воспаления. Хемокин MCP-1 (CCL-2) является главным фактором, привлекающим моноциты, которые, оказавшись в ткани, превращаются в макрофаги. Хемокин MIP-1 (имеет две мажорные формы CCL-3 и CCL4) известен как один из эффективных провоспалительных цитокинов. Этот фактор активирует адгезию моноцитов к эндотелию сосудов, что является начальной стадией выхода клеток из кровотока в зону воспаления. Кроме того, MIP-1 стимулирует продукцию клетками других провоспалительных и иммуностимулирующих цитокинов, в частности TNFa, IL1, IL6. Хемокин RANTES (CCL-5) привлекает Т-клетки в зону воспаления, а также может активировать превращение NK-клеток в особый тип клеток-киллеров, которые называют CHAK (CC-chemokine activated killer cells). Активированные RANTES киллеры могут иметь большое значение в иммунной защите от вирусов и опухолей [19].

литература

1. Новиков А.Г., Логунова З.В., Потекаев Н.Н. Опыт применения иммуномодулятора «Иммуномакс» при лечении па-пилломавирусной инфекции. Русский медицинский журнал. 2004; 12, 13(213): 819-20.

2. Горпинченко И.И., Гурженко Ю.Н. Исследование клинической эффективности комплексной терапии генитального герпеса у мужчин с применением иммунотропного препарата «Иммуномакс». Здоровье мужчины. 2009; 1: 188-91.

4. Сафонова О.А., Пичугин А.В., Кожемякина Е.Ш., Малышев Н.А., Атауллаханов Р.И. Иммунотерапия острой респираторной инфекции и ее осложнений. Иммунология. 2009; 30(1): 30-49.

5. Чадаев А.П., Нурписов A.M., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Иммуномодуляторы Иммуномакс и Гепон в комплексном лечении больных острой гнойной хирургической инфекцией. Русский медицинский журнал. 2004; 12(24): 1427-33.

6. Баткаев Э.А., Рюмин Д.В., Топоровский Л.М., Урпин М.В. Терапевтическая эффективность препарата «Иммуномакс» при комплексном лечении урогенитального хламидиоза, осложненного хроническим простатитом в стадии обострения. Вестник последипломного медицинского образования. 2005; 1: 56-9.

7. Бардычев М.С., Пасов В.В., Курпешева А.К., Лукьянова Е.Ю. Эффективность применения иммуномодулятора Иммуномакс при лечении местных лучевых повреждений. Медлайн-Экспресс. 2005; 181(5): 42.

8. Атауллаханов Р.И., Пичугин А.В., Шишкова Н.М., Мастер-нак Т.Б., Малкина Е.Ю., Ульянова Л.И., Стеценко О.Н. Кле-

точные механизмы иммуномодулирующего действия препарата Иммуномакса. Иммунология. 2005; 26(2): 111-20.

Поступила 18.09.14

references

1. Novikov A.G., Logunov Z.V., Potekaev N.N. Experience with the use of immunomodulator «Immunimax» in the treatment of human papillomavirus infection. Russkiy meditsinskiy zhurnal. 2004; 213

2. Gorpinchenko I.I., Gurzhenko Yu. N. A study of cmplex therapy of genital herpes in men with the use of immunostimulant «Immunomax». Zdorov'e muzhchiny. 2009; 1: 188-91.

3. Ataullakhanov R., Tishchenko A.L., Bauer H.W., Grigoryan V., Shpot E., Esche U.V.D. et al. Immunomax therapy to obtain relief in papilloma virus infections, prostatitis and prostate carcinoma. J. Mens Hlth. 2010; 7(4): 396-405.

4. Safonova O.A., Pichugin A.V., Kozhemyakina E.Sh., Malyshev N.A., Ataukkakhanov R.I. Immunotherapy of acute respiratory infection and its complications. Immunologiya. 2009; 30

5. Chadaev A.P., Nurpisov A.M., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I. Immunomodulators the Immunomax and Gepon in the complex treatment of patients with acute purulent surgical infection. Russkiy meditsinskiy zhurnal. 2004; 12

6. Batkaev E.A., Ryumin D.V., Toporovskiy L.M., Urpin M.V. Therapeutic efficacy of the drug «Immunomax» in complex treatment of urogenital Chlamydia infection, a complication of chronic prostatitis in the acute stage. Vestnik poslidiplomnogo meditsinskogo obrazovaniya. 2005; 1: 56-9.

7. Bardichev M.S., Pasov V. V., Kurpesheva A.K., Luk'yanova E.Yu. Efficacy of the immunomodulator Immunomax for the treatment of local radiation injuries. Medlayn-Expess. 2005; 181

8. Ataullakhanov R.I., Pichugin A.V., Shishkova N.M., Masternak T.B., Malkina E.Yu., Ul'yanova L.I., Stetsenko O.N. Cellular mechanisms of immunomodulating action of the drug of Immunomax. Immunologiya. 2005; 26

9. Banchereau J., Steinman R.M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 1998; 392: 245-52.

10. Howard C.J., Charleston B., Stephens S.A., Sopp P., Hope J.C. The role of dendritic cells in shaping the immune response. Anim. Hlth Res. Rev. 2004; 5(2): 191-5.

11. Mohty M., Gaugler B., Mami N.B., Olive D. Regulation of dendritic cell function with immunomodulatory drugs. Curr. Med. Chem. Anti-Inflamm. Anti-Allergy Agents. 2005; 4(2): 169-75.

12. Inaba K., Inaba M., Romani N., Aya H., Deguchi M., Ikehara S. et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/ macrophage colony-stimulating factor. J.Exp. Med. 1992, 176: 1693-702.

13. Tedder T.F., Jansen P. J. Isolation and generation of human dendritic cells. Curr. Protoc. Immunol. 2001; 7:Unit 7.32. doi: 10.1002/0471142735.im0732s23.

14. Prussin, C. and D. Metcalfe. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cy-tokine antibodies. J. Immunol. Meth. 1995; 188: 117-28.

15. Kadowaki N. The divergence and interplay between pDC and mDC in humans. Front. Biosci. (LandmarkEd). 2009; 1: 14:808-17.

16. Schreibelt G., Tel J., Sliepen K.H., Benitez-Ribas D., Figdor C.G., Adema G.J., de Vries I.J. Toll-like receptor expression and function in human dendritic cell subsets: implications for dendritic cell-based anti-cancer immunotherapy. Cancer Immunol. Immunother. 2010; 59(10): 1573-82.

17. Andoniou C.E. et al. Interaction between conventional dendritic cells and natural killer cells is integral to the activation of effective antiviral immunity. Nature Immunol. 2005; 6: 1011-9.

18. Fernandez N.C., Flament C., Crepineau F. et al. Dendritic cells (DC) promote natural killer (NK) cell functions: dynamics of the human DC/NK cell cross talk. Eur. Cytokine Netw. 2002; 13: 17-27.

19. Maghazachi A. A. Role of chemokines in the biology of natural killer cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2010; 341: 37-58.

Received 18.09.14