Интегральные лабораторные тесты гемостаза в диагностике гиперкоагуляции и оценке риска тромбоза

Интегральные лабораторные тесты гемостаза в диагностике гиперкоагуляции и оценке риска тромбоза

Контакты: Михаил Александрович Пантелеев mapanteleev@yandex.ru

Часть I. Патофизиология гиперкоагуляции и тромбоза

Тромбоз является смертельно опасным нарушением системы гемостаза, возникающим при различных патологиях и состояниях, начиная от беременности и состояния после операции до онкологии, сепсиса и инфаркта. Несмотря на доступность разнообразных антикоагулянтов и большой накопленный клинический опыт, подтверждающий их эффективность, тромбоз остается одной из главных причин смертности и заболеваемости в современном мире. Во многом это объясняется тем, что традиционные лабораторные тесты свертывания крови недостаточно чувствительны к гиперкоагуляции и их сложно использовать для оценки риска тромбоза. Специфические молекулярные маркеры, определяющие процесс свертывания (D-димеры, фибринопептид, тромбин-антитромбиновый комплекс), более эффективны, однако также обладают большим количеством недостатков. Возможным решением является использование интегральных тестов, которые in vitro имитируют большинство физиологических процессов, протекающих в организме в процессе остановки кровотечения. ВI части данной работы обсуждаются биохимические процессы, вызывающие риск тромбоза.

Ключевые слова: интегральные тесты гемостаза, гиперкоагуляция, тромбоз, D-димеры, фибронопептид, антитромбиновый комплекс

DOI: 10.17650/1818-8346-2015-10-3-73-91

Integrated laboratory coagulation tests in hypercoagulation diagnosis and thrombosis risk assessment E.N. Lipets12, F.I. Ataullakhanov1-4, M.A. Panteleev1-4

1 Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitry Rоgachev;

1 Samory Mashela St., Moscow, 117997, Russia; 2 Theoretical Problems Center of Physical and Chemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences;

4Kosygina St., Moscow, 119991, Russia; 3HemaCore Company; 3, 4h 8Marta St., Moscow, 125319, Russia; 4 M.V. Lomonosov Moscow State University; 1 Lеninskie gory St., Moscow, 119991, Russia

cv со

Е.Н. Липец1, 2, Ф.И. Атауллаханов1-4, М.А. Пантелеев1-4

1ФНКЦдетской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева; Россия, 117997, Москва, ул. Саморы Машела, 1; 2 Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН; Россия, 119991, Москва, ул. Косыгина, 4; 3 ООО «Гемакор»; Россия, 125319, Москва, 4-я ул. 8 Марта, 3; 4 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Россия, 119991, Москва, ул. Ленинские горы, 1

es

U

см со

Part I. The pathophysiology of thrombosis and hypercoagulation

Thrombosis is a fatal hemostatic disorders occurring in various conditions ranging from pregnancy and surgery to cancer, sepsis and heart attack. Despite the availability of different anticoagulants and accumulated clinical experience, proving their effectiveness, thrombosis remains a major cause of morbidity and mortality. This is largely due to the fact that conventional laboratory coagulation tests are not sufficiently sensitive to the hypercoagulable state, and they are difficult to use for assessing the risk of thrombosis. Specific molecular markers (D-dimers, fibrinopeptide, thrombin-antithrombin complex) are more effective, but also have a large number of disadvantages. A possible solution is the use of integrated test, which simulate in vitro the majority of the physiological coagulation processes. In the first part of this paper the biochemical processes that cause the risk of thrombosis were discussed.

Key words: integral coagulation tests, hypercoagulation, thrombosis, D-dimers, fibrinopeptide, antithrombin complex

Введение

Тромботические осложнения сопровождают или являются причиной широкого круга патологических и физиологических состояний: атеросклероз, инфаркт, инсульт, беременность, сепсис, состояние после травмы, хирургической операции и т. д. В настоящее время

для их лечения и профилактики разработали множество разнообразных антитромботических препаратов [1], среди которых есть прямые и непрямые ингибиторы факторов свертывания, антагонисты активации тромбоцитов, рецепторов адгезии, сигнальных молекул тромбоцитов.

см со

ев

св u

см со

Однако остаются нерешенными вопросы лабораторной идентификации пациентов с риском тромбоза и проблемы индивидуального подбора и коррекции доз антитромботических препаратов у конкретного пациента. Всегда существует риск развития кровотечений (1—3 % при применении антитромботических препаратов в рекомендуемых дозах), а мозговые кровоизлияния могут привести к не менее фатальным последствиям, чем тромбоз. Традиционные коагуля-ционные тесты нечувствительны и неприменимы для оценки риска тромбоза. Возможным решением является использование интегральных тестов [2—4], которые in vitro имитируют большинство физиологических процессов остановки кровотечения.

Чтобы лучше понять проблему оценки риска тромбоза и прогнозирования его развития с использованием диагностических тестов in vitro, необходимо обсудить биохимические процессы, лежащие в основе формирования тромба.

Венозный тромбоз

Подробный разбор современных представлений о патогенезе венозных тромбозов можно найти в основополагающих работах последних лет [5, 6]. Однако основные его принципы были сформулированы еще Р. Вирховым в 1859 г., описавшим природу тромбоза в знаменитой триаде — теории возникновения тромбофлебита: травма внутренней стенки вен; снижение скорости тока венозной крови; повышение свертываемости крови [7]. Хорошо известно, что венозные тромбы образуются в основном за счет полимеризации фибрина (так называемые красные тромбы, богатые фибрином, в котором застревают эритроциты), а адгезия тромбоцитов играет незначительную роль или вообще не имеет значения. Прикрепление венозного тромба к стенке сосуда также происходит за счет фибрина [8], при этом в большинстве случаев стенка сосуда остается неповрежденной [9]. Наиболее вероятный механизм, запускающий тромбоз, — активация клеток сосудистого эндотелия. При застое кровотока, воспалении и/или гипоксии эндотелиальные клетки секретируют тельца Вайбеля— Палладе, в которых содержится фактор Виллебранда (VWF) и Р-селектин. К ним могут прикрепляться тромбоциты, моноциты, нейтрофилы [10], а также микровезикулы (МВ), образованные перечисленными клетками. Под действием гипоксии, цитокинов и ли-пополисахаридов моноциты экспрессируют тканевой фактор (TF) [11], непосредственно активирующий свертывание. Дополнительным источником TF могут быть МВ, образованные моноцитами, раковыми клетками [12] и, возможно, нейтрофилами [10]. Существенную роль может играть контактная активация ней-трофильными внеклеточными ловушками (neutrophil extracellular traps, NETs) внеклеточного хроматина на гистонах [10]; возможно, определенный вклад вносят тромбоцитарные и эндотелиальные МВ [13]. В за-

висимости от баланса между прокоагулянтными факторами, их ингибиторами и системой фибринолиза активация эндотелия может приводить к формированию тромба.

Артериальный тромбоз

Артериальные тромбозы возникают в основном при разрушении атеросклеротической бляшки. При этом на поверхность выходят коллаген, VWF и TF. Из-за высокой скорости кровотока в артериях основной механизм артериального тромбоза — агрегация тромбоцитов (поток крови размывает факторы свертывания, но зато ускоряет доставку тромбоцитов к месту повреждения), а образование фибрина — вторичный фактор, стабилизирующий тромб [14, 15]. Это подтверждается преобладанием тромбоцитов в таком тромбе (так называемом белом тромбе) и эффективностью препаратов, угнетающих адгезию тромбоцитов [16]. Риск артериального тромбоза повышен при нарушении адгезии и агрегации тромбоцитов вследствие повышения концентрации VWF, снижения металло-протеиназы, которая расщепляет VWF на мелкие, менее прокоагулянтные фрагменты (фермент AD-AMTS13) [17], а также при усиленной агрегации тромбоцитов in vitro в ответ на активацию низкими концентрациями аденозиндифосфата и/или адреналина (синдром липких тромбоцитов) [18].

Однако даже в плазме пациентов, страдающих артериальным тромбозом, есть индикаторы гиперактивности плазменного свертывания: циркулирующие фактор XIa и TF выявляются у пациентов после ише-мических цереброваскулярных событий [19], а также у больных со стабильной стенокардией [20], систолической дисфункцией на фоне ишемической кардио-миопатии [21]. В некоторых экспериментальных моделях артериального тромбоза у животных в тромбах были обнаружены моноцитарные и эндотелиальные МВ [12]. Даже терапия 2 препаратами, угнетающими агрегацию тромбоцитов при остром коронарном синдроме, не способна предотвратить 10 % риска рецидива в течение следующего года, тогда как добавление ривароксабана достоверно снижает этот риск [22]. Эти данные свидетельствуют о том, что в формировании артериального тромбоза нельзя не учитывать значения свертывания крови.

Микрососудистый тромбоз

Первоначально патогенез тромбоза в основном изучали на крупных сосудах. Однако в последнее время больше внимания стало уделяться окклюзии микро-циркуляторного русла [23]. Вероятно, в значительной степени это произошло благодаря развитию видеомикроскопических экспериментальных моделей тромбоза на этом уровне [24]. Развитие микротромбоза, как правило, связано с высвобождением TF различными клетками, разрушением ингибитора пути TF (TFPI) эластазой нейтрофилов и активацией фактора

Причины гиперкоагуляции при различных состояниях

Заболевание или состояние Активирующий материал Повышенный уровень прокоагу-лянтных факторов свертывания Сниженный уровень ингибиторов свертывания Нарушения фибринолиза Другие гемостати-ческие нарушения Тип тромбоза

Рак TF, NETs, MB Раковый прокоагулянт, адгезион- Венозная тромбоэмболия

ные молекулы

Беременность TF, МВ Fg, VII, VIII, X Свободный PS PAI-1, PAI-2 Тромбоцитопе-ния, активация тромбоцитов, VWF Венозная тромбоэмболия, артериальный тромбоз

Прием оральных контрацеп- Fg, II, VII, VIII, X AT-III, PS, TFPI tPA, PAI-1 Венозный тромбоз

тивов

Диабет TF, тромбоцитар-ные, моноцитар-ные, эндотелиаль-ные МВ Fg, II, V, VII, VIII, X AT-III, PC, эндо-телиальный ТМ PAI-1, tPA Увеличена адгезия, агрегация тромбоцитов, активация лейкоцитов, VWFf Артериальный тромбоз, венозная тромбоэмболия

ДВС TF, МВ - AT-III, PC, PS, TFPI PAI-1 Активация тромбоцитов и лейкоцитов эндотоксинами Микрососудистый тромбоз

СМ со

ев

XII NETs [25]. Микрососудистый тромбоз наблюдается при многих заболеваниях (сепсис [26], онкологические заболевания [27], инфаркт [28], тромбоцитопеническая пурпура [29]) и является основным механизмом развития диссеминированного внутрисосудистого свертывания и полиорганной недостаточности [30]. Среди всех типов тромбозов тромбоз микроциркуляторного русла больше всего сопряжен с общим повышением коагуляционного потенциала плазмы, гиперкоагуляцией [31].

Гиперкоагуляционное состояние при конкретных патологиях

Как правило, под термином «гиперкоагуляция» понимают повышенную склонность крови к свертыванию, возникающую под действием различных молекулярных механизмов, перечисленных ниже. Этот термин является наиболее общим и нейтральным. В российской медицинской литературе есть клиническое понятие гиперкоагуляционного синдрома: по определению академика А.И. Воробьева, это «состояние организма, характеризующееся повышенной готовностью крови к свертыванию, но до появления тромбозов не имеющее характерной клинической картины». В международной печати употребляется близкое понятие неявного диссеминированного внутрисо-судистого свертывания (ДВС), или скрытого ДВС (non-overt DIC): состояние напряженного гемостаза, до поры компенсируемого антисвертывающими процессами и не проявляющегося клинически.

Гиперкоагуляция при онкологических заболеваниях, как правило, ассоциируется с экспрессией TF, ра-

кового прокоагулянта и адгезионных молекул. В случае колоректального рака повышение экспрессии TF вызывается K-RAS-онкогеном и инактивацией гена супрессии опухоли p53 [32]. Часть циркулирующего TF находится на МВ [33, 34], которые также ускоряют свертывание за счет содержащегося на их поверхности фосфатидилсерина. Раковый прокоагулянт представляет собой цистеиновую протеазу, активирующую фактор X [35]. Однако не показано, что его наличие создает риск возникновения тромбоза. В модели на мышах M. Demers и D. Wagner показали, что NETs вносят существенный вклад в гиперкоагуляцию при онкологии [36]. Адгезионные молекулы, осуществляющие прямое взаимодействие опухолевых клеток с эндотелием, тромбоцитами и лейкоцитами, могут вызвать формирование тромбоцитарных микротромбов [37].

При нормальной беременности повышается уровень фибриногена (Fg), факторов VII, VIII, X и VWF. Вследствие повышения уровня связывающего протеин S компонента комплемента C4b снижается уровень свободного протеина S. Уровень ингибитора активатора плазминогена 1-го типа (PAI-1) увеличивается в 5 раз [38]. В течение III триместра в плаценте активно синтезируется PAI-2 и его концентрация резко увеличивается [39]. Для некоторых осложнений беременности были зафиксированы повышенные концентрации эндотелиальных МВ и МВ, несущих TF [40, 41].

Гормональные контрацептивы вызывают увеличение концентрации фибриногена, протромбина (фактора II), факторов VII, VIII, X и уменьшение ингибиторов свертывания, таких как антитромбин (AT-III),

ев u

см со

см со

es

es u

см со

протеин Б, ТРР1. Стимулируется также фибринолиз: активность тканевого активатора плазминогена (1РЛ) увеличена, а РЛ1-1 — уменьшена [42].

Диабет ведет к увеличению адгезии и агрегации тромбоцитов, а также к зависящей от тромбоцитов продукции тромбина. Изменения в активационном потенциале тромбоцитов происходят на стадии мега-кариоцитов. Лейкоциты также активированы и экспонируют аминофосфолипиды и Тр экспрессируют адгезионные молекулы, ведущие к образованию тром-боцитарно-лейкоцитарных агрегатов и взаимодействию лейкоцитов с эндотелием. Наблюдается дисфункция эндотелия. Концентрации VWF, фактора VII и Fg повышены, ЛТ-Ш, протеина С (РС), эндотелиально-го тромбомодулина (ТМ) понижены. Тромбоциты, моноциты, эндотелий образуют МВ. Уровень РЛ1-1 и 1РЛ снижен [43].

Заключение

Таким образом, существует несколько непосредственных причин высокого риска системного тромбоза. Во-первых, в крови могут присутствовать непо-

средственные активаторы свертывания — МВ, активирующие свертывание по контактному пути [44], ТF, циркулирующий на клетках или МВ (при раке или диабете), фактор Х1а (ишемические церебро-васкулярные события, стабильная стенокардия), раковый прокоагулянт, бактерии. Другая категория включает механизмы, не активирующие свертывание сами, но ускоряющие рост сгустка, сдвигая баланс свертывания: увеличение концентрации, активности или времени жизни прокоагулянтных факторов (врожденные нарушения, беременность, оральные контрацептивы, такие мутации, как протромбин G20 210Л [45], фактор V Лейдена [46, 47], уменьшенные концентрация или активность противосверты-вающих молекул (наследственный или приобретенный дефицит ЛТ-Ш, РБ, РС [48, 49]), сниженный фибринолиз, ЛВЛМТБ13, повышение VWF [17]. Данные для нескольких протромботических состояний представлены в таблице, в которой сделана попытка соотнести механизмы прокоагулянтных изменений, патологии, вызывающие их, и тип вызываемого ими тромбоза.

ЛИТЕРАТУРА

1. Sinauridze E.I., Panteleev M.A., Ataullakhanov F.I. Anticoagulant therapy: basic principles, classic approaches

and recent developments. Blood Coagul Fibrinolysis 2012;23:482-93.

2. Brummel-Ziedins K.E, Wolberg A.S. Global assays of hemostasis. Curr Opin Hematol 2014;21:395-403.

3. Dargaud Y., Sorensen B., Shima M. et al. Global haemostasis and point of care testing. Haemophilia 2012;18(4):81-8.

4. van Geffen M., van Heerde W.L. Global haemostasis assays, from bench to bedside. Thromb Res 2012;129:681-7.

5. Lopez J.A., Chen J. Pathophysiology of venous thrombosis. Thromb Res 2009;123(4):30-4.

6. Lopez J.A., Kearon C., Lee A.Y. Deep venous thrombosis. Hematol Am Soc Hematol Educ Program 2004;2004:439-56.

7. Virchov R.L.K. Gesammelte Abhandlungen zur wissenschaftlichen Medicin. Frankfurt am Main, 1856.

8. Friedman M.H., Brinkman A.M., Qin J.J., Seed WA. Relation between coronary artery geometry and the distribution of early sudano-philic lesions. Atherosclerosis 1993;98:193-9.

9. Sevitt S. The structure and growth

of valve-pocket thrombi in femoral veins. J Clin Pathol 1974;27:517-28.

10. von Bruhl M.L., Stark K., Steinhart A. et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med 2012;209:819-35.

11. Lawson C.A., Yan S.D., Yan S.F. et al. Monocytes and tissue factor promote thrombosis in a murine model of oxygen deprivation. J Clin Invest 1997;99:1729-38.

12. Lacroix R., Dubois C., Leroyer A.S. et al. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. J Thromb Haemost 2013;11(1):24-35.

13. Van Der Meijden P.E., Van Schilfgaarde M., Van Oerle R. et al. Platelet- and erythrocyte-derived microparticles trigger thrombin generation via factor Xlla. J Thromb Haemost 2012;10:1355-62.

14. Shibeko A.M., Lobanova E.S., Panteleev M.A., Ataullakhanov F.I. Blood flow controls coagulation onset via the positive feedback of factor VII activation by factor Xa. BMC Syst Biol 2010;4:5.

15. Tokarev A.A., Butylin A.A., Ataullakhanov F.I. Platelet adhesion from shear blood flow is controlled by near-wall rebounding collisions with erythrocytes. Biophys J 2011;100:799-808.

16. Davi G., Patrono C. Platelet activation and atherothrombosis. N Engl J Med 2007;357:2482-94.

17. Sonneveld M.A., de Maat M.P., Leebeek F.W. Von Willebrand factor and ADAMTS13 in arterial thrombosis: a systematic review and meta-analysis. Blood Rev 2014;28:167-78.

18. Kubisz P., Ruiz-Arguelles G.J., Stasko J. et al. Sticky platelet syndrome: history

and future perspectives. Semin Thromb Hemost 2014;40:526-34.

19. Undas A., Slowik A., Gissel M. et al. Circulating activated factor XI and active tissue factor as predictors of worse prognosis in patients following ischemic cerebrovascular events. Thromb Res 2011;128:62-6.

20. Zabczyk M., Butenas S., Plicner D. et al. Factors associated with the presence

of circulating active tissue factor and activated factor XI in stable angina patients. Blood Coagul Fibrinolysis 2012;23:189-94.

21. Zabczyk M., Butenas S., Palka I. et al. Active tissue factor and activated factor XI in circulating blood of patients with systolic heart failure due to ischemic cardiomyopathy. Pol Arch Med Wewn 2010;120:334-40.

22. Weitz J.I. Insights into the role

of thrombin in the pathogenesis of recurrent ischaemia after acute coronary syndrome. Thromb Haemost 2014;112:924-31.

23. Kwaan H.C. Microvascular thrombosis: a serious and deadly pathologic process

in multiple diseases. Semin Thromb Hemost 2011;37:961-78.

24. Bellido-Martin L., Chen V., Jasuja R. et al. Imaging fibrin formation and platelet and endothelial cell activation in vivo. Thromb Haemost 2011;105:776-82.

25. Pfeiler S., Massberg S., Engelmann B. Biological basis and pathological relevance of microvascular thrombosis. Thromb Res 2014;133(1):35-7.

26. Levi M., Schultz M., van der Poll T. Sepsis and thrombosis. Semin Thromb Hemost 2013;39:559-66.

27. Langer F., Bokemeyer C. Crosstalk between cancer and haemostasis. Implications

for cancer biology and cancer-associated thrombosis with focus on tissue factor. Hamostaseologie 2012;32:95-104.

28. Barrabes J.A., Inserte J., Agullo L. et al. Microvascular thrombosis: an exciting but elusive therapeutic target in reperfused acute myocardial infarction. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets 2010;10:273-83.

29. Blake-Haskins J.A., Lechleider R.J., Kreitman R.J. Thrombotic microangiopathy with targeted cancer agents. Clin Cancer Res 2011;17:5858-66.

30. Gando S. Microvascular thrombosis

and multiple organ dysfunction syndrome. Crit Care Med 2010;38:35-42.

31. Semeraro N., Ammollo C.T., Semeraro F., Colucci M. Sepsis, thrombosis and organ dysfunction. Thromb Res 2012;129:290-5.

32. Yu J.L., May L., Lhotak V. et al. Oncogenic events regulate tissue factor expression

in colorectal cancer cells: implications for tumor progression and angiogenesis. Blood 2005;105:1734-41.

33. Geddings J.E., Mackman N. Tumor-derived tissue factor-positive microparticles and venous thrombosis in cancer patients. Blood 2013;122:1873-80.

34. Tesselaar M.E., Romijn F.P., Van Der Linden I.K. et al. Microparticle-associated tissue factor activity: a link between cancer and thrombosis? J Thromb Haemost 2007;5:520-7.

35. Levi M. Cancer and thrombosis. Clin Adv Hematol Oncol 2003;1:668-71.

36. Demers M., Wagner D.D. Neutrophil extracellular traps: A new link to cancer-associated thrombosis and potential implications for tumor progression. Oncoimmunology 2013;2:22946.

37. Wahrenbrock M., Borsig L., Le D. et al. Selectin-mucin interactions as a probable molecular explanation for the association of Trousseau syndrome with mucinous adenocarcinomas. J Clin Invest 2003;112: 853-62.

38. Bremme K.A. Haemostatic changes

in pregnancy. Best Pract Res Clin Haematol 2003;16:153-68.

39. Medcalf R.L., Stasinopoulos S.J. The undecided serpin. The ins and outs of plasminogen activator inhibitor type 2. FEBS J 2005;272:4858-67.

40. Alijotas-Reig J., Palacio-Garcia C., Llurba E., Vilardell-Tarres M. Cell-derived microparticles and vascular pregnancy complications: a systematic and comprehensive review. Fertil Steril 2013;99:441-9.

41. Patil R., Ghosh K., Satoskar P., Shetty S. Elevated procoagulant endothelial and tissue factor expressing microparticles in women with recurrent pregnancy loss. PLoS One 2013;8:81407.

42. Sandset P.M. Mechanisms of hormonal therapy related thrombosis. Thromb Res 2013;131(1):4-7.

43. Morel O., Jesel L., Abbas M., Morel N. Prothrombotic changes in diabetes mellitus. Semin Thromb Hemost 2013;39: 477-88.

44. Lipets E., Vlasova O., Urnova E. et al. Circulating contact-pathway-activating microparticles together with factors IXa

and XIa induce spontaneous clotting in plasma of hematology and cardiologic patients. PLoS One 2014;9:87692.

45. Poort S.R., Rosendaal F.R., Reitsma P.H., Bertina R.M. A common genetic variation

in the 3'-untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis. Blood 1996;88:3698-703.

46. Lindahl T.L., Lundahl T.H., Nilsson L., Andersson C.A. APC-resistance is a risk factor for postoperative thromboembolism in elective replacement of the hip or knee — a prospective study. Thromb Haemost 1999;81:18-21.

47. Rosendaal F.R., Koster T., Vandenbroucke J.P., Reitsma P.H. High risk of thrombosis

in patients homozygous for factor V Leiden (activated protein C resistance). Blood 1995;85:1504-8.

48. Koster T., Rosendaal F.R., Briet E. et al. Protein C deficiency in a controlled series of unselected outpatients: an infrequent but clear risk factor for venous thrombosis (Leiden Thrombophilia Study). Blood 1995;85: 2756-61.

49. Lijfering W.M., Brouwer J.L., Veeger N.J. et al. Selective testing for thrombophilia

in patients with first venous thrombosis: results from a retrospective family cohort study on absolute thrombotic risk for currently known thrombophilic defects in 2479 relatives. Blood 2009;113:5314-22.

cv со

cs

es u

см со

Часть II. Чувствительность интегральных тестов к гиперкоагуляционным состояниям

CV со

es

es и

В данной работе представлен обзор существующих данных относительно способности интегральных тестов, как уже введенных в клиническую практику, так и новых (тест генерации тромбина, тромбоэластография, тромбодинамика, перфузионные камеры), оценивать риск тромбоза при различных патологиях. Мы пришли к выводу, что существующие интегральные тесты могут стать важным инструментом в диагностике гиперкоагуляции. Однако имеющийся в настоящее время недостаток стандартизации препятствует их применению: различные тесты и любые их модификации различаются по чувствительности и специфичности для каждого патологического состояния. Кроме того, даже в тех ситуациях, когда тесты могут достоверно выявлять группы пациентов с различной степенью риска тромбоза, их применение в клинической практике для принятия решений часто затруднительно, так как различия между такими группами статистически достоверны, однако диапазоны норм и пациентов значительно перекрываются.

Ключевые слова: интегральные тесты гемостаза, гиперкоагуляция, тромбоз, активированное частичное тромбопластиновое время, тест генерации тромбина, тромбоэластография, тромбодинамика, онкологические заболевания, беременность, сахарный диабет

сч со

Part II. The sensitivity of integral tests to hypercoagulable states

In the second part we present a review of the existing data about ability of integrated tests, as already introduced in clinical practice, and the new (test of thrombin generation, thromboelastography, thrombodynamics, perfusion chamber) to assess the risk of thrombosis in different pathologies. We can conclude that the existing integrated tests can be an important tool in the diagnosis of hypercoagulation. However, lack of standardization prevents their use: various tests and modifications of each test are different in sensitivity and specificity for each pathological condition. Furthermore, even in situations where the tests can reliably identify a group of patients with different degrees of thrombosis risk, their use in clinical practice is often difficult, since the differences between these groups were statistically significant, but the normal range and patients significantly overlap.

Key words: global assays of hemostasis, hypercoagulation, thrombosis, activated partial thromboplastin time, thrombin generation, thromb-elastography, thrombodynamics, cancer, pregnancy, diabetes mellitus

Введение

Природа предрасположенности индивидуума к тромбозу может быть локальной или глобальной. Локальные факторы, такие как повреждение стенки сосуда, формирование атеросклеротической бляшки или замедление тока крови, естественно, остаются за пределами возможностей функциональных лабораторных тестов на свертывание (хотя нельзя исключать возможность косвенно измерить в крови некоторые маркеры воспаления и повреждения сосудов). Другие тромботические события могут быть напрямую связаны с глобальными изменениями в составе крови. Эти систематические прокоагулянтные изменения называют гиперкоагуляцией. Когда тромбоз напрямую связан с гиперкоагуляцией, существует несколько способов ее выявить.

Один способ — определение конкретной причины гиперкоагуляции: изменение концентраций прокоа-гулянтных факторов и ингибиторов, факторов фи-бринолиза, фактора Виллебранда, наличие циркулирующих активных факторов, микровезикул (МВ). Такие исследования, без сомнения, важны, но количество возможных причин очень велико, и некоторые из них (например, пикомолярные концентрации циркулирующих факторов: Х1а и тканевой фактор -TF) крайне сложны для измерений. Кроме того, отдельная информация о специфических причинах не дает представления о способности крови к свертыванию в целом, а значимость изменений отдель-

ных компонентов для полной системы может быть не очевидной, особенно когда есть несколько изменений, отклоняющих баланс системы свертывания в разные стороны.

Другой подход — использование молекулярных маркеров процесса тромбообразования: D-димеры, фибринопептид А, растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК), тромбин-антитромбиновые комплексы (ТАТ), фрагменты активации протромбина F1 + 2. Эта стратегия широко используется и имеет огромную клиническую значимость, но ее главный недостаток в том, что перечисленные маркеры показывают следы уже произошедшего или идущего в настоящий момент свертывания, но не потенциал системы свертывания в ответ на активацию. В случае диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС) может быть очень высокий уровень D-ди-меров одновременно с отсутствием способности крови свернуться в результате исчерпания предшественников прокоагулянтных факторов.

Возможным решением являются интегральные или глобальные тесты гемостаза [1—3], которые имитируют патофизиологические процессы с большей точностью, позволяя оценить потенциал системы гемостаза в целом. В этих тестах обычно используются низкие концентрации активаторов (тест генерации тромбина, тромбоэластография) или активаторы, локализованные на поверхности (тромбодинамика, проточные камеры). Это может делать тесты особенно

Таблица 1. Чувствительность отношения АЧТВ к различным гиперкоагуляционным состояниям

Диапазон значений

Причина гиперкоагуляции Число пациентов Контрольная группа, среднее ± СО, если не подписано иначе Группа с гиперкоагуляцией, среднее ± СО, если не подписано иначе Достоверность Предсказательная сила Ссылка Комментарии

ВТЭ 605; 1290 — контрольная группа Медиана (диапазон) 1,00 (0,721,33) Медиана (диапазон) 0,97 (0,75-1,41) < 0,001 Отношение АЧТВ < 0,87 ОШ 2,4 [9] Ретроспективное исследование

Проспектив-

ное исследо-

вание. Тест

Рецидив после спонтанного ВТЭ 918 с ВТЭ; 101 — с рецидивом 0,97 ± 0,09 0,93 ± 0,09 0,001 Отношение АЧТВ < 0,95 ОР 1,79 [10] проводился через 3 нед после прекращения анти-коагулянтной терапии

Проспектив-

Рецидив после спонтанного ВТЭ 628 с ВТЭ; 71 — с рецидивом - - - Отношение АЧТВ < 0,90 ОР 2,38 относительно отношения АЧТВ > 1,05 [11] ное исследование. Тест проводился через 3-4 нед после прекращения анти-коагулянтной терапии

Сахарный диабет 2-го типа 60; 57— контрольная группа Медиана (диапазон) 0,93 (0,71-1,34) Медиана (диапазон) 1,03 (0,791,27) 0,43 - [19] -

CV со

ев

ев u

см со

чувствительными к низким концентрациям патологических активаторов свертывания в кровотоке.

Цель настоящего обзора — систематизация существующих данных о способности интегральных тестов детектировать гиперкоагуляцию и выявлять риск тромбоза.

Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) и международное нормализованное отношение (МНО): можно ли их отнести к интегральным тестам?

В настоящее время первичную оценку системы гемостаза проводят по тестам: АЧТВ и протромбино-вое время (ПВ). В первую очередь, они чувствительны к дефицитам факторов свертывания, что обычно приводит к их удлинению. Укорочение времени свертывания наблюдается редко и часто объясняется ошибками на преаналитическом этапе (который в целом имеет большое значение в диагностике гиперкоагуляции, так как очень легко вызвать гиперкоагуляцию недостаточно аккуратным обращением с цельной кровью). Хотя в единичных работах 1970—90-х годов встречается упоминание об укорочении ПВ в состояниях с повышенным риском тромбоза [4, 5], в настоящее время применение ПВ (в стандартизированном варианте — МНО) в отношении к тромбозу обычно

ограничивается оценкой эффективности дозы антагонистов витамина К [6].

Некоторые протромботические факторы риска могут быть обнаружены по изменению АЧТВ. А. Mina и соавт. показали, что сокращение АЧТВ достоверно отражает отклонения в концентрации факторов V, VIII, XI, XII, концентрации антигена и коллагенсвя-зывающей активности фактора Виллебранда, содержание прокоагулянтных фосфолипидов, измеренное методом XACT (Xa clotting time) [7]. Сокращение АЧТВ также коррелирует с высоким уровнем маркеров генерации тромбина и образования фибрина: фрагментами протромбина F1 + 2, ТАТ (см. выше) и D-димерами [8]. Сокращение АЧТВ является фактором риска тромбоза глубоких вен. В группе пациентов, имеющих отношение АЧТВ (отношение времени свертывания в исследуемом образце ко времени свертывания в контрольной плазме) меньше 5 проценти-лей от распределения нормальных доноров, отношение шансов (ОШ) для тромбоза глубоких вен было 2,4 и не зависело от наследственных тромбофилий. Медиана отношения АЧТВ для группы пациентов была 0,97 (диапазон 0,75—1,41), для контрольной группы — 1,00 (диапазон: 0,72-1,33) (р < 0,001) [9]. Проспективное исследование группы из 918 пациентов со спон-

cv со

es

es u

СЧ со

танным венозным тромбозом показало, что отношение АЧТВ было достоверно больше у пациентов без рецидива тромбоза (0,97 ± 0,09 против 0,93 ± 0,09; p < 0,001). Относительный риск (ОР) рецидива у пациентов с отношением АЧТВ < 0,95 был 1,7 [10]. C. Legnani и соавт. обнаружили, что риск рецидива венозного тромбоза после отмены антикоагулянтов у пациентов с отношением АЧТВ <0,9 более чем в 2 раза выше относительно контрольной группы (ОР 2,38) [11]. Данные о предсказательной силе АЧТВ представлены в табл. 1.

Важной модификацией метода АЧТВ является так называемый анализ формы сигнала сгустка (clot waveform analysis), в котором анализируется вся кривая изменения оптической плотности, а не только время свертывания. Такую модификацию, в отличие от обычного теста АЧТВ, однозначно относят к глобальным тестам [1—3]. В частности, появление двухфазной кривой в этом методе оказалось чувствительным и специфичным ранним признаком развития ДВС (85 % и 92 % соответственно) [12]. Двухфазная форма объясняется преципитацией C-реактивного белка (СРБ) c липопротеинами очень низкой плотности (ЛПНП) при добавлении Са [13].

Таким образом, сокращение АЧТВ отражает некоторые прокоагулянтные сдвиги в плазме, в первую очередь увеличение концентраций или активности предшественников факторов свертывания. Например, в работе C. Legnani и соавт. повышенный риск рецидива венозного тромбоза исчез после корректировки ОР на концентрации факторов VIII, IX и XI, и сами концентрации факторов обладали большей предсказательной силой риска рецидива (ОР 2,38 для отношения АЧТВ < 0,9; ОР 3,01; 3,06; 2,14 для повышенных концентраций факторов VIII, IX и XI соответственно) [11]. В то же время тром-бофилические факторы риска G1691A — фактор V и G20210A — фактор II достоверно не отличались в группах с нормальным и укороченным АЧТВ [8]. На появление в крови активирующих частиц или факторов АЧТВ, по-видимому, не реагирует. Вероятно, сильная внешняя активация в АЧТВ (и еще более сильная в МНО) не позволяет увидеть более слабую активацию от исходно присутствующих в плазме тканевого фактора (ТБ), фактора XIa или МВ. Путь протеина С (PC) не работает в АЧТВ, если не добавлен активированный протеин С (aPC), но даже тогда тест генерации тромбина, использующий тот же подход, оказывается более чувствительным к нарушениям в пути РС [14]. АЧТВ совсем не учитывает фибринолиз. Вероятно, по перечисленным причинам АЧТВ не имеет предсказательной силы тромботических осложнений у пациентов после операций [15, 16], травм [17], с диабетом [18, 19] и онкологическим заболеванием [20]. Данные в отношении беременности противоречивы [21, 22].

Гиперкоагуляция и тест генерации тромбина

ТГТ — один из 2 наиболее разработанных и изученных интегральных тестов гемостаза. В данном методе по скорости расщепления субстрата к тромбину рассчитывается зависимость концентрации тромбина от времени, имеющая, как правило, характерную ко-локолообразную форму [23]. Наиболее широко используются такие параметры кривой генерации тромбина, как эндогенный тромбиновый потенциал (ЭТП, площадь под кривой генерации тромбина) и пик концентрации тромбина (IIa max), их корреляция с клинической картиной показана в ряде работ. Интересно, что большая часть кривой генерации тромбина регистрируется после образования сгустка. Значение этого факта все еще является предметом обсуждения [24].

В настоящее время существует множество модификаций ТГТ, включая несколько коммерчески доступных и даже встроенных в стандартные многофункциональные коагулометры. Чаще всего для теста выбирают свободную от тромбоцитов плазму с добавлением искусственных фосфолипидов, можно также использовать богатую тромбоцитами плазму. Активируют пикомо-лярными концентрациями TF, хотя могут применяться и другие активаторы. Тест может проводиться с добавлением тромбомодулина (ТМ), активаторов PC или самого aPC для выяснения работы пути PC.

A. Tripodi и соавт. обнаружили, что пациенты с повышенной генерацией тромбина в присутствии ТМ имеют более высокий риск повторной венозной тромбоэмболии (ВТЭ). ОР рецидива венозного тромбоза у пациентов с ЭТП > 960 нМ-мин или IIa max > 193 нм был 3,41 или 4,57 соответственно по сравнению с теми, у которых ЭТП < 563 нМ-мин или IIa max < 115 нм. ОР у пациентов с временем задержки свертывания (лаг-таймом) < 14,5 мин был 3,19 по отношению к пациентам с лаг-таймом > 20,8 мин [25]. Тот же результат был получен M. Besser и соавт.: после корректировки ОР на D-димер, тромбофилии, пол и получения ответа на вопрос — был ли первый тромбоз спровоцирован или нет, высокий ЭТП достоверно предсказывал рецидив с ОР 2,6 [26]. В подобном исследовании G. Hron и соавт. у пациентов без повторного ВТЭ пик генерации тромбина был ниже, чем у пациентов с рецидивом (среднее ± стандартная ошибка, 350 ± 110 против 420 ± 110 соответственно; р < 0,001) [27]. В то же время A. van Hylckama Vlieg и соавт. не обнаружили предсказательной силы риска тромбоза у ТГТ, но, возможно, это связано с использованием другой модификации ТГТ [28]. В работе R. Chaireti и соавт. ЭТП в плазме пациентов сразу после тромбоза было даже несколько ниже в группе, где тромбоз потом повторился. Если же брать кровь через 1—2 мес после отмены антикоагулянтов, ЭТП в этой группе был незначительно повышен [29].

В ряде работ показано повышенное значение ЭТП у пациентов после ишемического инсульта [30]. Повышенный пик значения богатой тромбоцитами плаз-

мы предсказывал появление ишемического инсульта у женщин и не коррелировал с ишемической болезнью сердца (ИБС) (ОР 1,04 для мужчин, 1,7 — для женщин, среднее по группам с инсультом и без не различалось) [31]. ЭТП повышен практически при любых видах тромбофилии, включая полиморфизм G20210A [32], дефицит антитромбина [33], V Leiden [34] (с добавлением aPC), дефицит протеина S [35] (с добавлением aPC), а также при приеме оральных контрацептивов (с добавлением aPC) [36] и онкологических заболеваниях [37]. В работах [38, 39] ЭТП был повышен при беременности, но в [40] ЭТП возрастал в I триместре относительно нормы и далее держался постоянным в течение всего срока беременности, в то время как маркеры активации свертывания D-димеры, F1 + 2 и TAT возрастали. Корреляция между параметрами ЭТП и D-димерами, F1 + 2, TAT, РФМК отсутствовала. Отсутствие корреляции параметров ТГТ с D-димерами, F1 + 2 наблюдали также C. Ay и соавт. [37]. У пациентов, страдающих диабетом, наблюдали достоверно повышенный пик тромбина [18, 19], вероятно, в связи с повышенным уровнем факторов II, V, VII, VIII и X и сниженным уровнем РС [18].

Показано, что есть корреляция пика ТГТ и количества МВ, особенно в постановке без добавления внешних ТF и фосфолипидов (ФЛ) [19]. A. Ollivier и соавт. выявили, что лаг-тайм ТГТ в рекальцифици-рованной плазме является чувствительным параметром для внешнего ТF, в то время как пик ТГТ сильно зависит от концентрации ФЛ и слабо — от концентрации ТЕ Аналогичный результат в плазме больных раком был получен в работе F. Debaugnies и соавт. [41]. Лаг-тайм ТГТ в рекальцифицированной плазме достоверно сокращался при стимуляции крови липополи-сахаридами [42].

Таким образом, в зависимости от постановки ТГТ оказывается чувствительным к разным факторам гиперкоагуляции: к уровню факторов II, V, Fg, AT-III при высокой концентрации ТF (13,6 рМ); к факторам XII, Fg, AT-III, свободному TFPI [43], а также факторам VIII и IX [44] при низкой (1 pM); при добавлении ТМ или активатора PC — к нарушениям в пути PC [45]; при добавлении только ФЛ — к циркулирующему ТF и другим активным факторам; при активации только ТF — к липидам, присутствующим в плазме. Снижение концентрации активатора увеличивает чувствительность теста, но увеличивает и разбросы между донорами. Разница между группами с повышенным риском тромбоза и без в большинстве рассмотренных работ достоверна (табл. 2), но стандартные ошибки в подавляющем большинстве случаев пересекаются, что затрудняет перенос таких результатов в клинические рекомендации. Недостаток стандартизации также ограничивает применение теста, хотя в этом направлении достигнуты существенные успехи [1].

За пределами данного метода остается оценка функции фибринолиза и вклада клеток крови. Хотя

появилась работа по генерации тромбина в цельной крови, данные о ее применимости для клинических исследований пока отсутствуют [46]; также есть попытки одновременно наблюдать за динамикой тромбина и плазмина.

Оценка риска тромбоза с помощью тромбоэластографии

Наиболее прямой способ характеризовать образование сгустка — по реометрии, имеющей дополнительные преимущества независимости от оптических характеристик и легкости применения к цельной крови. Существует ряд реологических подходов, из них наиболее изученный — ТЭГ. Это самый ранний тест гемостаза, в котором оценивают формирование сгустка в цельной крови, используя вынужденную колебательную реометрию.

ТЭГ нашла широкое применение в оценке состояния свертывания у пациентов, подвергшихся операции, как альтернатива АЧТВ и МНО, не чувствительным к гиперкоагуляции в послеоперационный период [15, 47]. Доскональное исследование работ с 1980 по 2008 г. о возможности ТЭГ предсказывать тромбо-тические осложнения после операций было проведено Y. Dai и соавт. [48]. В большинстве проанализированных исследований делали заключение об эффективности ТЭГ. Однако чувствительность и специфичность в разных исследованиях варьировали от 0 до 100 % и от 62 до 92 % соответственно. ОШ варьировало от 1,5 до 27,7 [48]. Разнородность данных не позволила провести метаанализ. Несколько более поздних работ подтверждают предсказательную силу параметра максимальной амплитуды (МА): МА либо G (жесткость сгустка = 5,000 MA/100 — MA) у пациентов после операций является независимым фактором риска повторного ишемического инсульта (ОШ 1,192; p = 0,022) [49], а также других тромботических осложнений, в том числе инфаркта миокарда [50, 51]. Подобные данные имеются для аналога ТЭГ — ROTEM [47]. Параметр МА в основном определяется функцией тромбоцитов и концентрацией фибриногена [52], что объясняет отсутствие корреляции МА с АЧТВ и МНО [49].

ТЭГ показывала гиперкоагуляцию у пациентов с раком предстательной железы, наиболее сильную в группе на стадии рака с метастазами. В этой группе также наблюдали повышенное количество ТБ, содержащих МВ. У 7 из 22 пациентов с гиперкоагуляцион-ной ТЭГ возникли тромботические осложнения, в то время как АЧТВ и МНО показывали норму [20]. ТЭГ также обнаруживала гиперкоагуляционное состояние у пациентов с раком молочной железы и колорек-тальным раком [53], опухолями желудочно-кишечного тракта, органов дыхания и другими опухолями [54], у пациентов после тромбоза глубоких вен (ТГВ) [55], но только не после церебрального венозного тромбоза [56]. ТЭГ была повышена только у 57 % пациентов

CV со

es

es u

см со

Таблица 2. Чувствительность ТГТ к различным гиперкоагуляционным состояниям

Причина гиперкоагуляции Число пациентов Активатор генерации тромбина и добавки относительно базовой постановки Диапазон значений Достоверность Предсказательная сила Ссылка Комментарии

Контрольная группа, среднее + СО, если не подписано иначе Группа с гиперкоагуляцией, среднее + СО, если не подписано иначе

Рецидив после спонтанного втэ 254 с ВТЭ; 34 — с рецидивом 1 пМ ТД 1 мкМ ФЛ ЭТП, нМ-мин 1502 + 446 ЭТП, нМ-мин 1361 +499 0,122 1 тертиль по сравнению с 3 ОР 2,54 [25] Проспективное исследование. Тест проводился через 1 мес после прекращения антикоагулянтной терапии

Ila max, нМ 232 + 82 Ila шах, нМ 187 ±89 0,005 ОР 3,09

Tlag, мин 12 + 6 Tlag, мин 13 ±5 0,319 ОР 2,29

- 1 пМ ТД 1 мкМ ФЛ, 4 нМ ТМ ЭТП, нМ-мин 986 + 422 ЭТП, нМ-мин 763 ± 468 0,009 ОР 3,35 [25] -

Ila шах, нМ 201 + 75 Ila шах, нМ 148 ± 88 <0,001 ОР 4,49

Tlag, мин 17 + 7 Tlag, мин 19 ± 10 0,174 ОР 2,39

Рецидив спонтанного ВТЭ 188 с ВТЭ; 29 — с рецидивом 5 пМ ТБ, 4 мкМ ФЛ - - - ЭТП > 50 процен-тилей ОР 2,9 [26] Проспективное исследование. Тест проводился через 2—3 мес после прекращения антикоагулянтной терапии

- 5 пМ ТБ, 4 мкМ ФЛ, 8 нМ ТМ - - - Недостоверная разница рисков [26] -

Рецидив после спонтанного ВТЭ 914 с ВТЭ; 100 — с рецидивом 72 пМ ТЕ 3,2 мкМ ФЛ Ila max, нМ 349 +108 Ila max, нМ 419 ±110 <0,001 Ila max > 400 нМ ОР = 2,5 [27] Проспективное исследование. Тест проводился после прекращения антикоагулянтной терапии

Причина гиперкоагуляции Число пациентов Активатор генерации тромбина и добавки относительно базовой постановки Диапазон значений Достоверность Предсказательная сила Ссылка Комментарии

Контрольная группа, среднее + СО, если не подписано иначе Группа с гиперкоагуляцией, среднее + СО, если не подписано иначе

Первый и повторный ВТЭ 187 со спонтанным ВТЭ; 404 — контрольная группа 1 /6 разведенная плазма 2,5 пМ ТБ, 4 мкМ ФЛ, 1,2 нМ ТМ Средний ЭТП (95 %ДИ), нМ-мин 1641 (1607-1676) Средний ЭТП (95 %ДИ), нМ-мин 1695 (1639-1750) - ЭТП > 90-го про-центиля распределения контрольной группы ОРВТЭ 1,7 [27] Тест проводился через 3 мес после прекращения антикоагулянтной терапии

173 с первым спровоцированным ВТЭ; 404 — контрольная группа - Средний ЭТП (95 %ДИ), нМ-мин 1641 (1607-1676) Средний ЭТП (95 %ДИ), нМ-мин 1649 (1595-1703) - - [28] -

59 с рецидивом ВТЭ - - - - ОР рецидива 1,1 [28] -

Рецидив после спонтанного ВТЭ 105 с первым ВТЭ; 40 — с рецидивом 5 пМ ТД 4 мкМ ФЛ ЭТП, нМ-мин 1671 + 514 ЭТП, нМ-мин 1491 + 536 0,111 - [29] Проспективное исследование. Анализ проводился после первого тромбоза

Ila max, нМ 302 + 91 Ila шах, нМ 261+ 125 0,058

Tlag, мин 7,2 + 2,2 Tlag, мин 8,7 + 5 <0,001

Острый ишеми-ческий инсульт (мужчины) 42; 408 — контрольная группа 5 пМ ТД 4 мкМ ФЛ Среднее геометрическое ЭТП (диапазон квартиля), нМ-мин 1755 (1620-1940) Среднее геометрическое ЭТП (диапазон квартиля), нМ-мин 1720 (1572-1978) - ОР = 0,88/С0 [31] Проспективное исследование

Ila max, нМ 327,0 (304,9-357,8) Ila шах, нМ 330,2 (301,8-361,4) - ОР= 1,04/С0

Острый ишеми-ческий инсульт (женщины) 45; 666 — контрольная группа 5 пМ ТД 4 мкМ ФЛ ЭТП, нМ-мин 1755(1604-1940) ЭТП, нМ-мин 1863 (1636-1998) - ОР= 1,55/СО [31] Проспективное исследование

Ila шах, нМ 333,6 (311,0-372,4) Ila max, нМ 357,8 (320,5-391,5) - ОР= 1,71/СО

Острый коронарный синдром 186; 1000 — контрольная группа 5 пМ ТД 4 мкМ ФЛ ЭТП, нМ-мин 1765 (1620-1940) ЭТП, нМ-мин 1772 (1604-1939 - ОР= 1,09/С0 [31] Проспективное исследование

Ila max, нМ 333,0 (308,0-365,0) Ila шах, нМ 330,3 (301,9-357,8) - ОР= 1,02/С0 IIa шах

©

<

х За

Ш

г

(D

(D За О

тз ш

5

(D О

г

(D За

о о а тз

(D

г

(D

О

г

а> н ш

ОНКОГЕМATOЛОГИЯ 3 2015 том ш I ONCOGEMAT0L0GY 3 2015 vol. ю

so

ш

Продолжение табл. 2

Причина гиперкоагуляции Число пациентов Активатор генерации тромбина и добавки относительно базовой постановки Диапазон значений Достоверность Предсказательная сила Ссылка Комментарии

Контрольная группа, среднее + СО, если не подписано иначе Группа с гиперкоагуляцией, среднее + СО, если не подписано иначе

Мутация протромбина G20210A 148 гетерозиготы; 111 — контрольная группа 6,8 пМ ТЕ 30 мкМ ФЛ Медиана ЭТП (диапазон квартиля), нМ-мин 1053 (946-1171) Медиана ЭТП (диапазон квартиля), нМ-мин 1358 (1190-1492) Носители по отношению к контрольной группе < 0,001 - [32] -

Ila шах, нМ 292 (267-330) Ila шах, нМ 349 (307-385) <0,001

Tlag, мин 2,54(2,46-2,84) Tlag, мин 2,74 (2,46-3,04) 0,268

3 гомозиготы - ЭТП, нМ-мин 1661 (1451-1976) - - [32] -

Ila max, нМ 466

Tlag, мин 3,06

Наследственный дефицит AT-III 18 Type I-IIRS/PE; 9 — контрольная группа 5 пМ ТЕ 4 мкМ ФЛ ЭТП, нМ-мин 2200 ± 320 ЭТП, нМ-мин 3366 + 668 Достоверно отличались только ЭТП пациентов с Туре ИШЗ/РЕ и контрольной группы - [33] -

Ila max, нМ 377,3 + 49,1 Ila шах, нМ 493,4 ± 75,0

17 -IIHBS гетерозиготы - ЭТП, нМ-мин 2142 ±464

Ila шах, нМ 427,2 ± 98,3

8 - Cambridge II гетерозиготы - ЭТП, нМ-мин 2211 ±268

Ila max, нМ 391,4 ± 46,8

ВТЭ у пациентов с онкологическими заболеваниями 1033 с онкологическими заболеваниями; 77 случаев ВТЭ 71,6 пМ ТЕ 3,2 мкМ ФЛ Медиана (25—75 процентилей) ЭТП, нМ-мин 4386 (3804-4890) Медиана (25—75 процентилей) ЭТП, нМ-мин 4475 (4087-4915) 0,197 Пашах >611 нМ (75 процентилей) ОР = 2,1 [37] Проспективное исследование.

Ila шах, нМ 499 (360-603) Ila шах, нМ 556 (432-677) 0,014

Активатор генера- Диапазон значений

Причина гиперкоагуляции Число пациентов ции тромбина и добавки относительно базовой постановки Контрольная группа, среднее + СО, если не подписано иначе Группа с гиперкоагуляцией, среднее + СО, если не подписано иначе Достоверность Предсказательная сила Ссылка Комментарии

1 пМ ТЕ 1 мкМ ФЛ Медиана (диапазон) ЭТП, нМ-мин 1844(1317-2592) Медиана (диапазон) ЭТП, нМ-мин 1835 (1213-2656) 0,96

Ila max, нМ 264 (97-432) Ila max, нМ 303 (207-434) < 0,001 [19]

52; 60 — контрольная Tlag, мин 7,8(4,7-18,4) Tlag, мин 5,9 (4,5-11,5) < 0,001

Сахарный диабет 2-го типа группа ЭТП, нМ-мин 1301 (535-2381) ЭТП, нМ-мин 1497 (1061-2418) 0,003

1 пМ ТЕ 1 мкМ ФЛ, 4 нМ ТМ Ila шах, нМ 256 (79-433) Ila max, нМ 297 (216-427) 0,001 - [19] -

Tlag, мин 10,4(6.3-25,8) Tlag, мин 7,8 (5,6-13,6) <0,001

ЭТП, нМ-мин 1678 (539-2231) ЭТП, нМ-мин 1781 (288-2598) 0,05

43; 60 — контрольная группа Только Са Ila max, нМ 151 (41-289) Ila max, нМ 202 (128-350) < 0,001 - [19] -

Tlag, мин 12,6(7,0-29,5) Tlag, мин 10,8(7,2-16,1) < 0,001

ЭТП, нМ-мин 1566,4 ±240,7 ЭТП, нМ-мин 1876,5 + 390,0 <0,001

Сахарный диабет 89; 49 - контрольная группа 5 п МП; 4 мкМ ФЛ Ila max, нМ 252,8 + 44,6 Ila max, нМ 308,9 + 39,5 <0,001 - [18] -

Tlag, мин 4,15 + 0,74 Tlag, мин 3,59 + 0,62 < 0,001

©

<

х

]=i ш з

(D

Ф За О

"О

ш

3

го о

го 1а

о о со

"О

го з го

о 3

Q Н

ы

ОННОГЕМАТОЛОГИЯ 3 2015 том ш 0NC0GEMAT0L0GY 3 2015 vol. ю

Окончание табл. 2

11ричина гиперкоагуляции Число пациентов Активатор генерации тромбина и добавки относительно базовой постановки Диапазон значений Достоверность Предсказательная сила Ссылка Комментарии

Контрольная группа, среднее + СО, если не подписано иначе Группа с гиперкоагуляцией, среднее + СО, если не подписано иначе

Нормальная беременность 19 здоровых беременных; 10 - контрольная группа 5 пМ И , 20 мкМ ФЛ, 0,1 мг/млСТ1 ЭТП, нМ-мин 1553 + 567 До беременности, ЭТП, нМ мин 1162 +446 Ila max. нМ 81 + 41 Ранняя беременность, ЭТП, нМ-мин 2157 + 466 Достоверная разница ЭТП до и во время ранней/поздней беременности < 0,001 - [38] -

Ila max, нМ 159 ± 100 Ila шах, нМ 219+ 117 Поздняя беременность, ЭТП, нМ-мин 2410 + 543 Ila max, нМ 336 + 178

I триместр (п = 36) 5пМТЕ 4 мкМ ФЛ ЭТП в нормальной пулированной плазме достоверно ниже, чем у беременных. Точное значение параметров не приведено ЭТП, нМ-мин 2123 + 335 Ila max, нМ 366 + 43 Нет достоверной разницы между триместрами - [40] -

II триместр (п = 42) ЭТП, нМ-мин 2067 + 326 Ila max, нМ 374 + 42

III триместр (и = 23) ЭТП, нМ-мин 1915 + 261 Ila max, нМ 336 + 49

Таблица 3. Чувствительность ТЭГ к различным гиперкоагуляционным состояниям

Причина гинер-коагуляции Число пациентов Версия ТЭГ Диапазон значений Достоверность Предсказательная сила Ссылка Комментарии

Контрольная группа, среднее ± СО, если не подписано иначе Группа с гиперкоагуляцией, среднее + СО, если не подписано иначе

Острый ишемический инсульт 93 неблагоприятных исхода в течение года, оцененные по шкале Rankin; 91 благоприятный исход Нитратная плазма смешиватась с каолином и помещалась в кювету с гепариназой Среднее ± ошибка среднего МА, мм 63,2 ± 0,5 Среднее + ошибка среднего МА. мм 66,1 + 0.6 < 0,001 Предсказание неблагоприятного исхода по верхнему тертилю МА ОШ 1,192 [49] Проспективное исследование

Постоперационные тром-ботические осложнения 240 пациентов после различных операций, 10 тромботических осложнений Цельная кровь в течение 4 мин после забора активировалась цеолитом МА 66 + 9 МА 71+9 - - [51] Проспективное исследование. ТЭГ проводилась сразу после операции

6 инфарктов миокарда МА 66 + 9 МА 74+5 - ОШ 1,16

Постоперационные тром-ботические осложнения 152 пациента в критическом состоянии из хирургического отделения интенсивной терапии; 16 тромботических осложнений Быстрая ТЭГ (г-ТЕС) на цельной крови,активированной каолином, человеческим ре-комбинантным ТБ, с добавлением ФЛ - - - G > 12,4 дин/см ОШ 1,25 [50] -

Нормальная беременность 65/65 Рекальцифициро-ванная цитратная плазма R, мин 7,8 + 2,5 R, мин 6,1 + 1,8 <0,001 - [59] -

К, мин 2,7 t 2,3 К, мин 1,4 + 0,5

Alfa, град. 57,7 t 11,6 Alfa, град. 70,6 + 6,5

МА, мм 61 ± 5,9 МА, мм 71 + 3,8

Ly 30, % 0,8 + 1,7 Ly 30, % 0,3 + 0,7

©

*<

х

ш г

ф

о о

ь

ф

о го

S3

я го э тз

ш

3

ф

о ж о

S

ф

ш о о го

тз ф

з

ф

о

г

U н ш

э

ф

0НК0ГЕМАТ0Л0ГИЯ 3 2015 том ю I ONCOGEMATOLOGY 3 2015 vol. ю

00 -J

сч со

ев

ев u

сч со

с тромбофилией [57]. Отсутствие чувствительности ТЭГ к тромбофилиям подтверждалось также в других работах [56, 58]. ТЭГ выявляет гиперкоагуляцию при беременности, увеличивающуюся в течение всего срока [59—61] по параметрам R, K, alfa, MA.

Подобно ТГТ, ТЭГ выявляет гиперкоагуляцию в группах пациентов с известным повышенным риском тромбоза и в группах пациентов с клинически подтвержденным тромбозом. Область чувствительности ТЭГ отличается от ТГТ: например, ТЭГ лучше работает при беременности, но хуже — при тромбофи-лии. Более широкое применение метода ограничивают те же недостатки: разброс между параметрами ТЭГ для доноров даже больше, чем в ТГТ, что приводит к малому различию в рисках (табл. 3). Также требуется дальнейшая стандартизация.

Новые тесты

Существует несколько новых, пока не имеющих активного применения в клинической практике интегральных тестов гемостаза, которые кажутся перспективными, так как учитывают аспекты свертывания, отсутствующие в рассмотренных ранее методах. Некоторые из них представляют собой модификации уже существующих методов (например, существует множество реологических подходов кроме ТЭГ [62]), в то время как другие используют совершенно новые принципы. Ниже мы обсудим методы, для которых имеются данные о способности выявлять гиперкоагуляцию.

Генерация тромбина и плазмина

Существует несколько вариаций метода одновременной регистрации тромбина и плазмина [63—65]. Усиленное свертывание и подавленный фибринолиз выявлены методом суммарного гемостатического потенциала (overall hemostasis potential) у пациентов, страдающих диабетом с микроциркуляторными осложнениями, у больных с преэклампсией, пожилых женщин с коронарной болезнью сердца [63]. Хотя данные пока очень скудные, метод кажется интересным, так как это единственная альтернатива ТЭГ для оценки функции фибринолиза.

Тромбодинамика

Новая стратегия исследования системы свертывания предложена в отечественном тесте тромбодина-мики, созданном как исследовательский инструмент почти 20 лет назад и ставшем коммерчески доступным в 2012 г. В данном методе по сигналу светорассеяния детектируется распространение в пространстве свертывания, активированного от иммобилизованого на поверхности TF [66]. Существует вариант метода, в котором можно регистрировать зависимость тромбина от времени и расстояния от активатора параллельно с фибрином [67].

Основная идея метода заключается в том, чтобы учесть пространственную неоднородность свертыва-

ния крови; другими словами, активация свертывания и его распространение происходят в пространственно разделенных регионах [68]. Так же как при свертывании in vivo в ране, TF локализован на поверхности, а сгусток растет за счет активации и диффузии факторов свертывания [69]. Важно отметить, что разделение фазы активации и распространения делает тест особенно чувствительным к присутствию активаторов свертывания в плазме, таких как циркулирующий TF [69] или фактор XIa [70]. Скорость роста сгустка отражает общий прокоагулянтный потенциал, а образование независимых от активатора спонтанных центров свертывания показывает наличие МВ и долгоживущих факторов свертывания [70]. Преаналитическая стандартизация данного теста недавно стала доступной [71].

Эти биохимические находки недавно были подтверждены в нескольких поисковых исследованиях. Состояние гиперкоагуляции, выявленное в тесте тромбодинамики у пациентов с сепсисом, подтвердилось в дальнейшем повышением уровня D-димеров и случаями развития тромбозов [72]. Спонтанное свертывание и увеличение скорости роста сгустка наблюдались у пациентов с известным риском тромбоза, страдающих лимфомами, лимфогранулематозом, тромбофилией, гемолитической анемией, острым лейкозом, инфарктом миокарда [70]; то же самое получено в подробном исследовании множественной миеломы [73]. В исследовании клинического случая была показана возможность обнаружения состояния гиперкоагуляции с использованием теста тромбоди-намики при р-талассемии [74]; тромбоз воротной вены развился через несколько недель после того, как у пациента было выявлено ускорение роста сгустка. В некоторых из упомянутых работ проводилось сравнение результатов тромбодинамики с ТГТ и ТЭГ, которые не обнаружили гиперкоагуляции в большинстве случаев.

Таким образом, тест тромбодинамики имеет хорошие перспективы как инструмент выявления гиперкоагуляции и оценки тромботического риска, но необходимы дополнительные клинические исследования для установления надежной связи результатов теста и риска тромбоза.

Проточные камеры

Образование тромбоцитарно-фибринового тромба в проточных камерах, наблюдаемое при помощи микроскопии, является потенциально «окончательным» интегральным тестом, способным одновременно оценивать функционирование тромбоцитов (включая адгезию, агрегацию и прокоагулянтную активность) и системы свертывания. Такие приборы в настоящее время активно разрабатываются и используются в разных приложениях (см. недавний обзор [75]). Обзор этой быстро развивающейся области находится за рамками данной статьи. Следует отметить, что есть публикации о способности проточных

Таблица 4. Эффективность применения интегральных тестов, прошедших значительное количество клинических испытаний, при конкретных патологиях

Причины гиперкоагуляции АЧТВ ТГТ ТЭГ

Рецидив ВТЭ + + -

Онкологические заболевания - + +

Беременность +/- +/- +

Прием оральных контрацептивов - + (с добавлением аРС) -

Сахарный диабет - + -

ДВС + (в варианте c lot waveform analysis) + -

Постоперационные тромботические осложнения - - +

Ишемический инсульт - + (в богатой тромбоцитами плазме) +

CV со

ев

ев u

камер выявлять гиперкоагуляционные изменения в крови [76—78]. Однако клинических исследований крайне мало и метод крайне слабо стандартизован [79]. Хотя из теоретических представлений проточные камеры имеют большой потенциал, пройдет еще немало времени до того, как они войдут в клиническую практику.

Заключение

Первый вывод данного анализа: интегральные тесты в значительной степени способны выявлять гиперкоагуляцию. По сравнению с АЧТВ и МНО чувствительность новых интегральных тестов определенно выше и охватывает больший круг патологий и причин гиперкоагуляции. Скорее всего это объясняется тем, что новые тесты используют меньшие концентрации активаторов, не скрывающие эффект циркулирующих прокоагулянтных факторов или частиц (или активация и распространение свертывания пространственно разнесены).

Однако существуют серьезные проблемы, осложняющие использование интегральных тестов для оценки риска тромбоза. Наиболее важная заключается в том, что вывод о чувствительности теста, как правило, достигается только при рассмотрении больших групп. Стандартные ошибки велики, и разница в средних величинах показателей тестов становится достоверной за счет набора большой статистики (см. табл. 1—3). Другими словами, если мы пытаемся определить границы и отнести пациентов к группам с разным риском тромбоза исходя из результатов теста, разница степени риска между этими группами

в основном невелика. Достаточна ли эта разница, чтобы влиять на решения в клинической практике, неясно. Некоторые новые тесты показали высокую чувствительность, но возможность их применения в клинике требует проверки.

Другая проблема — недостаток стандартизации. Существует множество вариантов каждого теста, в клинических исследованиях часто используют разные подходы, а чувствительность тестов сильно зависит от выбранного протокола. Поэтому может быть сложно воспроизвести и интерпретировать результаты, полученные в перечисленных в данной статье работах. Усилия по стандартизации некоторых наиболее разработанных интегральных тестов (таких как ТГТ [80—82]) позволяют надеяться, что эта проблема может быть решена и интегральные тесты найдут более широкое практическое применение.

На основании рассмотренных работ авторы собрали в табл. 4 свои выводы об эффективности применения интегральных тестов, прошедших многочисленные клинические испытания при различных патологиях.

Благодарность

Мы глубоко признательны Ирине Марченко за организационную и техническую помощь при работе с рукописью. Работа авторов поддержана грантом Президента РФ для молодых ученых МД-6347.2015.4, грантами РФФИ 14-04-00670 и 15-54-45036, а также грантом по Программе фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные исследования для разработки биомедицинских технологий».

сч со

ЛИТЕРАТУРА

CV со

es

es u

см со

1. Brummel-Ziedins K.E., Wolberg A.S. Global assays of hemostasis. Curr Opin Hematol 2014;21:395-403.

2. Dargaud Y., Sorensen B., Shima M. et al. Global haemostasis and point of care testing. Haemophilia 2012;18(4):81-8.

3. van Geffen M., van Heerde W.L. Global haemostasis assays, from bench to bedside. Thromb Res 2012;129:681-7.

4. Miller S.P., Sanchez-Avalos J., Stefanski T., Zuckerman L. Coagulation disorders

in cancer. I. Clinical and laboratory studies. Cancer 1967;20:1452-65.

5. Gordon E.M., Ratnoff O.D., Jones P.K. The role of augmented Hageman factor (factor XII) titers in the cold-promoted activation of factor VII and spontaneous shortening of the prothrombin time

in women using oral contraceptives. J Lab Clin Med 1982;99:363-9.

6. Levy J.H., Szlam F., Wolberg A.S., Winkler A. Clinical use of the activated partial thromboplastin time and prothrombin time for screening: a review of the literature and current guidelines for testing. Clin Lab Med 2014;34:453-77.

7. Mina A., Favaloro E.J., Mohammed S., Koutts J. A laboratory evaluation into the short activated partial thromboplastin time. Blood Coagul Fibrinolysis 2010;21:152-7.

8. Ten Boekel E., Bartels P. Abnormally short activated partial thromboplastin times are related to elevated plasma levels of TAT, F1+2, D-dimer and FVIII:C. Pathophysiol Haemost Thromb 2002;32:137-42.

9. Tripodi A., Chantarangkul V., Martinelli I. et al. A shortened activated partial thromboplastin time is associated with the risk of venous thromboembolism. Blood 2004;104:3631-4.

10. Hron G., Eichinger S., Weltermann A. et al. Prediction of recurrent venous thromboembolism by the activated partial thromboplastin time. J Thromb Haemost 2006;4:752-6.

11. Legnani C., Mattarozzi S., Cini M. et al. Abnormally short activated partial thromboplastin time values are associated with increased risk of recurrence of venous thromboembolism after oral anticoagulation withdrawal. Br J Haematol 2006;134: 227-32.

12. Hussain N., Hodson D., Marcus R. et al. The biphasic transmittance waveform:

an early marker of sepsis in patients with neutropenia. Thromb Haemost 2008;100:146-8.

13. Toh C.H., Samis J., Downey C. et al. Biphasic transmittance waveform in the APTT coagulation assay is due to the formation of a Ca(++)-dependent complex of C-reactive protein with very-low-density lipoprotein and is a novel marker

of impending disseminated intravascular coagulation. Blood 2002;100:2522-9.

14. Curvers J., Thomassen M.C., Nicolaes G.A. et al. Acquired APC resistance and oral contraceptives: differences between two functional tests. Br J Haematol 1999;105:88-94.

15. Park M.S., Martini W.Z., Dubick M.A. et al. Thromboelastography as a better indicator of hypercoagulable state after injury than prothrombin time or activated partial thromboplastin time. J Trauma 2009;67: 266-75.

16. Schreiber M.A., Differding J., Thorborg P. et al. Hypercoagulability is most prevalent early after injury and in female patients.

J Trauma 2005;58:475-80.

17. Kaufmann C.R., Dwyer K.M., Crews J.D. et al. Usefulness of thrombelastography

in assessment of trauma patient coagulation. J Trauma 1997;42:716-20.

18. Kim H.K., Kim J.E., Park S.H. et al. High coagulation factor levels and low protein C levels contribute to enhanced thrombin generation in patients with diabetes who do not have macrovascular complications.

J Diabetes Complications 2014;28:365-9.

19. Tripodi A., Branchi A., Chantarangkul V. et al. Hypercoagulability in patients with type 2 diabetes mellitus detected by a thrombin generation assay. J Thromb Thrombolysis 2011;31:165-72.

20. Toukh M., Siemens D.R., Black A. et al. Thromboelastography identifies hypercoagu-lability and predicts thromboembolic complications in patients with prostate cancer. Thromb Res 2014;133:88-95.

21. Hammerova L., Chabada J., Drobny J., Batorova A. Longitudinal evaluation

of markers of hemostasis in pregnancy. Bratisl Lek Listy 2014;115:140-4.

22. Othman M., Falcon B.J., Kadir R. Global hemostasis in pregnancy: are we using thromboelastography to its full potential? Semin Thromb Hemost 2010;36:738-46.

23. Hemker H.C., Wielders S., Kessels H., Beguin S. Continuous registration of thrombin generation in plasma, its use for the determination of the thrombin potential. Thromb Haemost 1993;70:617-24.

24. Mann K.G., Brummel K., Butenas S. What is all that thrombin for? J Thromb Haemost 2003;1:1504-14.

25. Tripodi A., Legnani C., Chantarangkul V. et al. High thrombin generation measured

in the presence of thrombomodulin is associated with an increased risk of recurrent venous thromboembolism. J Thromb Haemost 2008;6:1327-33.

26. Besser M., Baglin C., Luddington R. et al. High rate of unprovoked recurrent venous thrombosis is associated with high thrombin-generating potential in a prospective cohort study. J Thromb Haemost 2008;6:1720-5.

27. Hron G., Kollars M., Binder B.R. et al. Identification of patients at low risk

for recurrent venous thromboembolism

by measuring thrombin generation. JAMA 2006;296:397-402.

28. van Hylckama Vlieg A., Christiansen S.C., Luddington R. et al. Elevated endogenous thrombin potential is associated with

an increased risk of a first deep venous thrombosis but not with the risk of recurrence. Br J Haematol 2007;138:769-74.

29. Chaireti R., Jennersjo C., Lindahl T.L. Is thrombin generation at the time

of an acute thromboembolic episode a predictor of recurrence? The LInkoping Study on Thrombosis (LIST) - a 7-year follow-up. Thromb Res 2013;131:135-9.

30. Faber C.G., Lodder J., Kessels F., Troost J. Thrombin generation in platelet-rich plasma as a tool for the detection

of hypercoagulability in young stroke patients. Pathophysiol Haemost Thromb 2003;33:52-8.

31. Carcaillon L., Alhenc-Gelas M., Bejot Y. et al. Increased thrombin generation is associated with acute ischemic stroke but not with coronary heart disease in the elderly: the Three-City cohort study. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2011;31:1445-51.

32. Castoldi E., Simioni P., Tormene D.

et al. Differential effects of high prothrombin levels on thrombin generation depending on the cause of the hyperprothrombinemia. J Thromb Haemost 2007;5:971-9.

33. Alhenc-Gelas M., Canonico M., Picard V. Influence of natural SERPINC1 mutations on ex vivo thrombin generation. J Thromb Haemost 2010;8:845-8.

34. Simioni P., Castoldi E., Lunghi B. et al. An underestimated combination of opposites resulting in enhanced thrombotic tendency. Blood 2005;106:2363-5.

35. Castoldi E., Maurissen L.F., Tormene D. et al. Similar hypercoagulable state and thrombosis risk in type I and type III protein S-deficient individuals from families with mixed type I/III protein S deficiency. Haematologica 2010;95:1563-71.

36. Tchaikovski S.N., van Vliet H.A., Thomassen M.C. et al. Effect of oral contraceptives on thrombin generation measured via calibrated automated thrombography. Thromb Haemost 2007;98:1350-6.

37. Ay C., Dunkler D., Simanek R. et al. Prediction of venous thromboembolism in patients with cancer by measuring thrombin generation: results from the Vienna Cancer and Thrombosis Study. J Clin Oncol 2011;29:2099-103.

38. McLean K.C., Bernstein I.M., Brum-mel-Ziedins K.E. Tissue factor-dependent thrombin generation across pregnancy. Am J Obstet Gynecol 2012;207:131-6.

39. Rosenkranz A., Hiden M., Leschnik B. et al. Calibrated automated thrombin generation in normal uncomplicated pregnancy. Thromb Haemost 2008;99: 331-7.

40. Joly B., Barbay V., Borg J.Y.,

Le Cam-Duchez V. Comparison of markers of coagulation activation and thrombin generation test in uncomplicated pregnancies. Thromb Res 2013;132:386-91.

41. Debaugnies F., Azerad M.A., Noubouossie D. et al. Evaluation of the procoagulant activity in the plasma of cancer patients using

a thrombin generation assay. Thromb Res 2010;126:531-5.

42. Ollivier V., Wang J., Manly D. et al. Detection of endogenous tissue factor levels in plasma using the calibrated automated thrombogram assay. Thromb Res 2010;125: 90-6.

43. Dielis A.W., Castoldi E., Spronk H.M. et al. Coagulation factors and the protein C system as determinants of thrombin generation in a normal population. J Thromb Haemost 2008;6:125-31.

44. van Veen J.J., Gatt A., Cooper P.C. et al. Corn trypsin inhibitor in fluorogenic thrombin-generation measurements is only necessary

at low tissue factor concentrations and influences the relationship between factor VIII coagulant activity and thrombogram parameters. Blood Coagul Fibrinolysis 2008;19:183-9.

45. Dargaud Y., Trzeciak M.C., Bordet J.C. et al. Use of calibrated automated thrombinography +/- thrombomodulin

to recognise the prothrombotic phenotype. Thromb Haemost 2006;96:562-7.

46. Ninivaggi M., Apitz-Castro R., Dargaud Y. et al. Whole-blood thrombin generation monitored with a calibrated automated thrombogram-based assay. Clin Chem 2012;58:1252-9.

47. Hincker A., Feit J., Sladen R.N., Wagener G. Rotational thromboelastometry predicts thromboembolic complications after major non-cardiac surgery. Crit Care 2014;18:549.

48. Dai Y., Lee A., Critchley L.A., White P.F. Does thromboelastography predict postoperative thromboembolic events?

A systematic review of the literature. Anesth Analg 2009;108:734-42.

49. Yao X., Dong Q., Song Y.et al. Thrombelastography Maximal Clot Strength Could Predict One-Year Functional Outcome in Patients with Ischemic Stroke. Cerebrovasc Dis 2014;38:182-90.

50. Kashuk J.L., Moore E.E., Sabel A. et al. Rapid thrombelastography (r-TEG) identifies hypercoagulability and predicts thromboembolic events in surgical patients. Surgery 2009;146:764-72.

51. McCrath D.J., Cerboni E., Frumento R.J. et al. Thromboelastography maximum amplitude predicts postoperative thrombotic complications including myocardial infarction. Anesth Analg 2005;100:1576-83.

52. Kang Y.G., Martin D.J., Marquez J. et al. Intraoperative changes in blood coagulation and thrombelastographic monitoring in liver transplantation. Anesth Analg 1985;64:888-96.

53. Francis J.L., Francis DA., Gunathilagan G.J. Assessment of hypercoagulability in patients

with cancer using the Sonoclot Analyzer and thromboelastography. Thromb Res 1994;74:335-46.

54. Akay O.M., Ustuner Z., Canturk Z. et al. Laboratory investigation of hypercoagulability in cancer patients using rotation thrombelastography. Med Oncol 2009;26:358-64.

55. Spiezia L., Marchioro P., Radu C. et al. Whole blood coagulation assessment using rotation thrombelastogram thromboelastometry in patients with acute deep vein thrombosis. Blood Coagul Fibrinolysis 2008;19:355-60.

56. Koopman K., Uyttenboogaart M., Hendriks H.G. et al. Thromboelastography in patients with cerebral venous thrombosis. Thromb Res 2009;124:185-8.

57. O'Donnell J., Riddell A., Owens D. et al. Role of the Thrombelastograph

as an adjunctive test in thrombophilia screening. Blood Coagul Fibrinolysis 2004;15:207-11.

58. Miall F.M., Deol P.S., Barnes T.A. et al. Coagulation status and complications

of pregnancy. Thromb Res 2005;115:461-7.

59. Della Rocca G., Dogareschi T., Cecconet T. et al. Coagulation assessment in normal pregnancy: thrombelastography with citrated non activated samples. Minerva Anestesiol 2012;78:1357-64.

60. Sharma S.K., Philip J., Wiley J. Thromboelastographic changes in healthy parturients and postpartum women. Anesth Analg 1997;85:94-8.

61. Steer P.L., Krantz H.B. Thromboelastography and Sonoclot analysis in the healthy parturient. J Clin Anesth 1993;5:419-24.

62. Evans P.A., Hawkins K., Lawrence M. et al. Rheometry and associated techniques for blood coagulation studies. Med Eng Phys 2008;30:671-9.

63. Antovic A. The overall hemostasis potential: a laboratory tool for the investigation of global hemostasis. Semin Thromb Hemost 2010;36:772-9.

64. Matsumoto T., Nogami K., Shima M. Simultaneous measurement of thrombin and plasmin generation to assess the interplay between coagulation and fibrinolysis. Thromb Haemost 2013;110:761-8.

65. Simpson M.L., Goldenberg N.A., Jacobson L.J. et al. Simultaneous thrombin and plasmin generation capacities in normal and abnormal states of coagulation

and fibrinolysis in children and adults. Thromb Res 2011;127:317-23.

66. Fadeeva O.A., Panteleev M.A., Karamzin S.S. et al. Thromboplastin immobilized

on polystyrene surface exhibits kinetic characteristics close to those for the native protein and activates in vitro blood coagulation similarly to thromboplastin on fibroblasts. Biochemistry (Mosc) 2010;75:734-43.

67. Dashkevich N.M., Ovanesov M.V., Balandina A.N. et al. Thrombin activity propagates in space during blood coagulation as an excitation wave. Biophys J 2012;103:2233-40.

68. Ovanesov M.V., Ananyeva N.M., Panteleev M.A. et al. Initiation and

propagation of coagulation from tissue factor-bearing cell monolayers to plasma: initiator cells do not regulate spatial growth rate. J Thromb Haemost 2005;3:321-31.

69. Panteleev MA., Ovanesov M.V., Kireev D.A. et al. Spatial propagation and localization

of blood coagulation are regulated by intrinsic and protein C pathways, respectively. Biophys J 2006;90:1489-500.

70. Lipets E., Vlasova O., Urnova E. et al. Circulating contact-pathway-activating microparticles together with factors IXa and XIa induce spontaneous clotting in plasma of hematology and car-diologic patients. PLoS One 2014;9:e87692.

71. Dashkevich N.M., Vuimo T.A., Ovsepyan R.A. et al. Effect of pre-analytical conditions on the thrombodynamics assay. Thromb Res 2014;133:472-6.

72. Soshitova N.P., Karamzin S.S., Balandina A.N. et al. Predicting prothrombotic tendencies in sepsis using spatial clot growth dynamics. Blood Coagul Fibrinolysis 2012;23:498-507.

73. Urnova E.S., Pokrovskaia O.S., Gracheva MA. et al. [Hypercoagulation syndrome in multiple myeloma]. Ter Arkh 2014;86:73-9.

74. Seregina EA., Nikulina O.F., Tsvetaeva N.V. et al. Laboratory tests for coagulation system monitoring in a patient with beta-thalassemia. Int J Hematol 2014;99:588-96.

75. Westein E., de Witt S., Lamers M. et al. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets 2012;23:501-9.

76. Gorog D.A., Kovacs I.B. Thrombotic status analyser. Measurement of platelet-rich thrombus formation and lysis in native blood. Thromb Haemost 1995;73:514-20.

77. Shechter M., Merz C.N., Paul-Labrador M.J., Kaul S. Blood glucose and platelet-dependent thrombosis in patients with coronary artery disease. J Am Coll Cardiol 2000;35:300-7.

78. Suades R., Padro T., Vilahur G., Badimon L. Circulating and platelet-derived microparticles in human blood enhance thrombosis on atherosclerotic plaques. Thromb Haemost 2012;108:1208-19.

79. Roest M., Reininger A., Zwaginga J.J. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost 2011;9:2322-4.

80. Dargaud Y., Wolberg A.S., Luddington R. et al. Evaluation of a standardized protocol for thrombin generation measurement using the calibrated automated thrombogram:

an international multicentre study. Thromb Res 2012;130:929-34.

81. Loeffen R., Kleinegris M.C., Loubele S.T. et al. Preanalytic variables of thrombin generation: towards a standard procedure and validation of the method. J Thromb Haemost 2012;10:2544-54.

82. Woodle S.A., Shibeko A.M., Lee T.K., Ovanesov M.V. Determining the impact of instrument variation and automated software algorithms on the TGT in hemophilia and normalized plasma. Thromb Res 2013;132:374-80.

cv со

cs

es u

сч со