Штамм Streptomyces sp., выделенный из байкальских эндемичных амфипод - продуцент антибиотика актифенола
STREPTOMYCES SPECIES STRAIN RECOVERED FROM BAIKAL ENDEMIC AMPHIPODS - PRODUCER OF ACTIOPHENOL ANTIBIOTIC

Предполагаемое изобретение относится к микробиологии, в частности – к биотехнологии. Изобретение касается выделения нового штамма (вида) микроорганизма – продуцента актифенола. Выделенный штамм проявляет  антагонистическую активность к грамотрицательным и грамположительным бактериям, а также грибам. Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для разработки лекарственных препаратов.
Ряд научных исследований посвящен проблеме антибиотикорезистентности патогенных микроорганизмов и поиску новых штаммов. Перспективным направлением для поиска новых штаммов бактерий, синтезирующих как известные, так и новые биологически активные вещества, являются уникальные и древние экосистемы и их обитатели.
Одним из наиболее перспективных мест поиска нетривиальных микроорганизмов является экосистема оз. Байкал.
Актифенол (CRC-код HKQ20-W) – антибиотик, проявляющий свою активность в отношении грибов. Обладает противоопухолевой активностью. Токсичен. Относится к группе глутаримидных антибиотиков (Gottlieb D., Shaw P. D. Antibiotics: Volume I Mechanism of Action. – Springer, 2013). Данный антибиотик характеризуется молекулярной массой 275.1158 m/z и максимальными пиками светопоглощения в УФ спектре при 216, 260, 342 нм.
Примеры ранее обнаруженных бактерий, выделенных из различных источников, в том числе и нетривиальных, и синтезирующих актифенол, приведены в ряде научных публикаций:
– Известен штамм-продуцент антибиотика актифенола, относящийся к роду  Streptomyces (Wardecki T., Brötz E., De Ford C., von Loewenich F. D., Rebets Y., Tokovenko B., Merfort, I. (2015). Endophytic Streptomyces in the traditional medicinal plant Arnica montana L.: secondary metabolites and biological activity. Antonie van Leeuwenhoek, 108(2): 391-402). Данный штамм был выделен из многолетнего растения Arnica montana L., произрастающего в горах Вогезы (Франция). Авторами отмечается, что этилацетатный экстракт штамма, содержащий актинофенол, подавляет рост бактерии Staphylococcus aureus, грибов Candida parapsilosis и Fusarium verticillioides.
– Выделен штамм S. anulatus (Sun W., Zhang F., He L., Karthik L., Li Z. (2015). Actinomycetes from the South China Sea sponges: isolation, diversity, and potential for aromatic polyketides discovery. Frontiers in microbiology, 6) из морской губки Aplysina aerophoba, собранной на острове Вуди (Китай). Данный штамм является продуцентом антибиотика актифенола.
– Показано, что этилацетатный экстракт и фильтрат штамма Streptomyces sp. AcM11 – проявляют антибиотическую активность против грамположительных и грамотрицательных бактерий. Зоны ингибирования роста фильтрата для всех тест-культур составляли 2,6-7,5 мм. Зоны ингибирования роста Е. сoli составили 12,6-24,0 мм. Штамм Streptomyces sp. AcM11 выделен из эктомикоризы дерева Picea abies, растущем в Германии (Schrey et al., 2012).
– Выделен штамм Streptomyces sp. K03-0132 из почвы горы Тайсецудзан (Япония). В исследовании показана антибиотическая активность этилацетатного экстракта выделенного штамма по отношению к  Candida albicans (KF-1). Выделенный экстракт был нанесен на диски в объеме 10, 25 и 50 мкг / диск (d = 8мм), соответственно. Зона ингибирования роста отмечалась при нанесении экстракта в объеме 50 мкг на диск и составила 16 мм. Ингибирующая активность данного экстракта в объеме 10 мкг на диск не проявилась к ряду бактерий и грибов, а именно: Bacillus subtilis PCI 219, Staphylococcus aureus FDA 209, Micrococcus luteus PCI 1001, Mycobacterium smegmatis ATCC 607, Escherichia coli NIHJ,  Pseudomonas aeruginosa P-3, Xanthomonas oryzae KB 88, Bacteroides fragilis ATCC 23745, Acholeplasma laidlawii PG 8, Pyricularia oryzae KF 180, Aspergillus niger ATCC 6275, Mucor racemosus IFO 4581, Candida albicans ATCC 64548, Saccharomyces cerevisiae (Takashi Fukuda et al, 2005).
Таким образом, в России отсутствует штамм-продуцент актифенола. Все упоминания, касающиеся актифенола, носят исключительно научный характер, а разработки не доведены до получения патента и производства данного вещества.
Задачей заявляемого изобретения является выделение нового штамма-продуцента антибиотика актифенола.
Штамм Streptomyces sp. выделен из эндемичных амфипод рода Brandtia sp. оз. Байкал. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук под регистрационным номером ВКМ Ac-2736D, дата депонирования 07.06.2016 г.
Штамм Streptomyces sp. под номером ВКМ Ac-2736D характеризуется следующими свойствами:
Согласно молекулярно-генетическому анализу выделенный штамм Streptomyces sp. ВКМ Ac-2736D относится к домену бактерии, классу – актинобактерии. Анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК (номер в Genbank - KX161762) установил, что выделенный штамм принадлежит к роду Streptomyces (Kumar et al., 2016).
Культурально-морфологические свойства.
Штамм Streptomyces sp. ВКМ Ac-2736D имеет хорошо развитый воздушный мицелий серовато-желтоватого цвета на минеральных средах Гаузе (минеральный агар 1; овсяный агар; глицерин-нитратный агар), желто-кремового цвета на солодово-дрожжевом агаре (ISP2). Субстратный мицелий на минеральном и глицерин-нитратном агарах коричневато-красной окраски; растворимый пигмент не образуется (пигмент не диффундирует в агар). На овсяном агаре и среде ISP2 штамм образует зеленовато-бурый субстратный мицелий и растворимый пигмент (Shirling et al.,1966; Гаузе и др., 1983).
На органическом агаре 2 Гаузе штамм Streptomyces sp. ВКМ Ac-2736D образует морщинистые колонии светло-коричневой окраски (субстратный мицелий) со слабо выраженным воздушным мицелием белого цвета; слабый растворимый пигмент светло-коричневатого оттенка.
Меланоидные пигменты не образует (среда ISP6). Цепочки спор прямые, поверхность оболочки спор гладкая (Фиг.1).
Биохимические и хемотаксономические свойства.
Грамположительный аэроб. Мезофил. Культивируется при 28°С. Разжижает желатин, инвертирует сахарозу, гидролизует крахмал. Растет на клетчатке. Восстанавливает нитраты до нитритов. Отношение к углеводам: хорошо использует инозит, маннит, фруктозу, глюкозу; умеренно – арабинозу, рафинозу, лактозу; слабо - рамнозу, ксилозу, галактозу и целлюлозу.
Хемотаксономические свойства оценены с применением МАЛДИ масс-спектрометрического анализа. МАЛДИ масс-спектрометрический анализ (проведен во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН) с использованием базы «Bruker Daltonics» выявил высокий уровень сходства  масс-спектров штамма Streptomyces sp.  ВКМ Ac-2736D  с масс-спектрами близких видов филогенетического кластера “Streptomyces griseus” (Streptomyces griseus  B261 UFL  и Streptomyces badius B192 UFL) (Присяжная и др. 2012).
По последовательностям гена 16S рРНК (KX 161762) штамм Streptomyces sp.  ВКМ Ac-2736D наиболее близок (99,55-99,47 % сходства согласно EzTaxon-e;  99,3-99,1 % по Blast) к видам Streptomyces pratensis, Streptomyces anulatus, Streptomyces griseoplanus, Streptomyces microflavus, Streptomyces cinereorectus, Streptomyces griseorubiginosus, Streptomyces rubiginosohelvolus, Streptomyces cyaneofuscatus, Streptomyces fulvissimus, Streptomyces pluricolorescens, Streptomyces fulvorobeus, Streptomyces globisporus, Streptomyces griseus subsp. griseus, Streptomyces setonii (Kim et al., 2012; Kumar et al., 2016).
Уровни сходства между Streptomyces sp. ВКМ Ac-2736D и типовыми штаммами ближайших видов ниже, чем сходство близкородственных видов между собой (до 99,9-100 %).
Штамм Streptomyces sp. ВКМ Ac-2736D не может быть отнесен ни к одному из валидно описанных видов рода Streptomyces spp. (http://www.bacterio.net/streptomyces.html). С высокой степенью вероятности штамм Streptomyces sp. ВКМ Ac-2736D является представителем нового вида рода Streptomyces spp.
Возможность использования предлагаемого штамма иллюстрируется примерами:
Пример 1.
-2
-7
Выделение штамма. Штамм Streptomyces sp. ВКМ Ac-2736D выделен из байкальских эндемичных амфипод рода Brandtia sp., собранных в пос. Листвянка оз. Байкал. Образцы амфипод Brandtia sp. были доставлены в лабораторию, где в стерильных условиях исследуемые объекты подвергались многократному очищению наружных покровов в дистиллированной и стерильной воде. Очищенные образцы были гомогенизированы в 10 % стерильном глицероле в объеме 1 мл. Штамм (Фиг.2) выделен путем посева 100 мкл гомогенизированной суспензии амфипод в разбавлении 10– 10 на среде MS (состав: соевая мука – 20 г.; D-маннитол – 20 г.; агар бактериологический – 20 г.; pH 6.8.) при температуре 28°С. Штамм выделен при добавлении к среде антибиотиков циклогексимида в концентрации 50 мкг/мл и фосфомицина в концентрации 100 мкг/мл.
На Фиг.2 показан штамм Streptomyces sp. ВКМ Ac-2736D, выделенный из байкальских эндемичных амфипод Brandtia sp.
Пример 2.
Культивирование штамма Streptomyces sp. ВКМ Ac-2736D и выделение антибиотика актифенола. Для выделения актифенола готовили маточную культуру штамма Streptomyces sp. ВКМ Ac-2736D в жидкой среде TSB (Cat. 22092 Sigma-Aldrich). Параметры культивирования: время культивирования - 24 часа, температура - 28°С, колбы конические, объемом 1000 мл, объем среды в колбах – 100 мл (10 % от объема). В колбы добавляли 10 стеклянных шариков, диаметром 5 мм. Культивирование проводили при постоянном перемешивании 180 об/мин в орбитальном шейкер–инкубаторе BioSan ES-20 (Латвия).
2
3
2
Для получения основной культуры, содержащей в своем составе актифенол и другие метаболиты, маточную культуру в количестве 2 мл вносили в конические колбы с дефлекторами со стерильной жидкой средой SG (состав – на 1 л. HO дист.: глюкоза–20 г; сойтон – 10 г; CaCO – 2 г; CoCl – 1 мг; рН – 7,2). Параметры культивирования: время культивирования –  168 часов, температура – 28°С, колбы конические, объемом 1000 мл, объем среды в колбах – 100 мл (10 % от объема). Количество колб для получения 1 л культуры – 10 шт. В колбы добавляли 10 стеклянных шариков, диаметром 5 мм. Культивирование проводили при постоянном перемешивании 180 об/мин в орбитальном шейкер–инкубаторе BioSan ES-20 (Латвия).
По окончанию культивирования штамма Streptomyces sp. ВКМ Ac-2736D  супернатант культуральной жидкости был отделен от клеточной биомассы путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 минут в центрифуге LMC-3000, Biosan (Латвия).
Для экстракции метаболитов из биомассы бактерий, полученной в результате культивирования 1 л клеточной суспензии, к осажденным клеткам добавляли 50 мл смеси ацетон–метанол (1:1). Экстракцию соединений проводили на мешалке при интенсивном встряхивании (480-720 об/мин) при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего клеточную массу осаждали центрифугированием в центрифуге LMC-3000 Biosan (Латвия) при 3000 об/мин в течение 5 минут. Полученный супернатант испаряли на роторном испарителе IKA-RV8 (Германия) до сухого вещества, после чего растворяли содержимое колбы в 2 мл метанола (ХЧ). Полученный экстракт наносили на целлюлозные диски (d = 5мм) в количестве 25 мкл (35 мг) для анализа антимикробной активности.
Для выделения метаболитов из супернатанта культуральной жидкости к супернатанту добавляли этилацетат (Kat.№ W241407, Sigma) в соотношении (1:1), т.е. 1 л этилацетата на 1 л среды. Экстракцию соединений проводили на мешалке при интенсивном встряхивании (480-720 об/мин) при комнатной температуре в течение 1 часа. Далее смесь этилацетата и культуральной жидкости переносили в делительную воронку, с помощью которой отделяли верхнюю фракцию и переносили в колбу роторного испарителя IKA-RV8 (Германия) и испаряли до сухого вещества, после чего растворяли содержимое колбы в 40 мл метанола (ХЧ). Полученный экстракт наносили на целлюлозные диски (d= 5 мм) в количестве 25 мкл (5 мг).
Культивирование микробных тест-культур проводили в среде LB (состав: 25 г/л LB – media, pH – 7,5; Difco Кат.244620) для бактерий и в среде YPD (Состав: дрожжевой экстракт – 10 г; пептон – 20 г; декстроза – 20 г; агар бактериологический – 15 г; pH – 6,5) – для грибов в шейкер-инкубаторе BioSan ES-20 в течение 12 ч при 37°С и 30°С соответственно.
В качестве тест-культур для определения антибиотической активности соединений были использованы следующие штаммы: Staphylococcus carnosus ATCC 51365; Pseudomonas putida KT 2440; Escherichia coli ATCC25922; Saccharomyces cerevisiae BY4742; Candida albicans DSM1665.
Анализ антибиотической активности экстрактов штамма проводился диск-диффузионными тестами целлюлозных дисков,  а также методом штрих-диффузии исследуемого штамма Streptomyces sp. ВКМ Ac-2736D. Сухие диски, пропитанные экстрактами в количестве 25 мкл, укладывались на чашки Петри с предварительно засеянными, но не выросшими газонами тест-культур. При оценке антибиотической активности методом штрих-диффузии штамм Streptomyces sp. ВКМ Ac-2736D был культивирован на твердой питательной среде SG в течение 7 суток. Затем на поверхность чашки Петри была произведена инокуляция бактериальных и грибных штаммов в средах описанного выше состава с содержанием агара бактериального в количестве 0,7 % (мягкий агар).
Наличие активности экстрактов и штриха исследуемого штамма оценивали по наличию зон ингибирования роста. Зоны ингибирования роста тест культур (Б – биомасса/ К – культуральная жидкость) составили 10/10 мм для S. carnosus, 11/10 мм для E. coli, 11/10 мм для P.putida, 29/45 мм для S. cerevisae и 13/10 мм для C. albicans.
На Фиг.3 показана антагонистическая активность экстрактов биомассы и культуральной жидкости штамма Streptomyces sp. ВКМ Ac-2736D (диск-диффузионный метод) против тест-культур: S. carnosus ATCC 51365; E. coli ATCC25922; P. putida KT 2440; S. cerevisiae BY4742; где К – экстракт культуральной жидкости, Б – экстракт биомассы.
На Фиг. 4 представлены зоны ингибирования роста бактерий при посеве штрихом (штрих-диффузионный метод). Зоны подавления роста тест-культур составили 12 мм для S. carnosus, 10 мм для E. coli, 10 мм для P. putida, 15 мм для S. cerevisae и 5 мм для C. albicans.
Таким образом, результаты изобретения подтверждают наличие у штамма Streptomyces sp. ВКМ Ac-2736D ингибирующей активности в отношении тестируемых бактериальных и грибных культур.
Пример 3.
Анализ продуцируемых соединений штаммом Streptomyces sp. ВКМ Ac-2736D с применением метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, сопряженной масс-спектрометрией.
Экстракты, содержащие в своем составе биологически активные соединения, в том числе актифенол, были проанализированы с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения с использованием системы LC-QTOF System maXis II (Bruker, Billerica, USA). Данные проанализированы с помощью пакета программ Brucker Compass Data Analysis, version 4.1 (Bruker, Billerica, USA). Скрининг известных веществ был выполнен с использованием базы данных Dictionary of Natural Products version 6.1 (CRC Press, Boca Raton, USA) с применением следующих параметров для поиска: точная молекулярная масса, спектр светопоглощения и источник выделения соединений (Whittle et al. 2003). Соединения считали идентичными, если разница в точной массе составляла менее 0,01 и спектры поглощения были схожи.
В экстракте культуральной жидкости штамма Streptomyces sp. ВКМ Ac-2736D обнаружено 59 основных соединений, а в экстракте биомассы – 57 основных соединений. Актифенол при этом присутствовал в обоих типах экстрактов. Из экстракта биомассы, полученной от культивирования в 1 л, возможно получить 2,7 мг актифенола. Содержание актифенола в экстракте биомассы составляет 0,8 %. Из 1 литра экстракта культуральной жидкости возможно получить 3,9 мг актифенола/литр культуральной среды.  Содержание актифенола в экстракте культуральной жидкости составляет 1,8 %. Таким образом, суммарно возможно получение 6,6 мг актифенола.
Выделенный антибиотик характеризуется молекулярной массой 275,1149 m/z (Разница с зарегистрированным коммерческим антибиотиком – Д = 0,0009 m/z), максимальными пиками светопоглощения в УФ спектре при 216 (Д = 0 нм), 262 (Д = 2нм), 348 нм (Д = 7 нм). На хроматограмме масс (Фиг. 5) обнаружены аддукты [M+H],[M+Na],[2M+H] и наиболее часто встречаемые фрагменты масс.
А - Хроматограмма масс экстрактов биомассы (черный цвет линии) и культуральной жидкости (серый цвет линии) штамма Streptomyces sp. ВКМ Ac-2736D;
Б – УФ-спектр актифенола;
В, Г – Масса актифенола и его аддукты.
Таким образом, заявляемый штамм Streptomyces sp. ВКМ Ac-2736D подавляет рост грамположительных и грамотрицательных бактерий и грибов и может выступать в качестве эффективного продуцента антибиотика актифенола.
Перечень последовательностей:
Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК, депонированная в системе Genbank, номер KX161762. Секвенирована с праймеров 8F (AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG) и 1510R(TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T)
Штамм обладает выраженными антибиотическими свойствами против бактерий и грибов.
Техническим результатом настоящего изобретения является выделение нового штамма (вида) – продуцента антибиотика актифенола.