Распределение аллельных вариантов генов ферментов фолатного цикла и уровень гомоцистеина у пациентов с врожденными пороками сердца с функционально единственным желудочком

Распределение аллельных вариантов генов ферментов фолатного цикла и уровень гомоцистеина у пациентов с врожденными пороками сердца с функционально единственным желудочком

ЮГ. Лугачева, И.В. Кулагина, И.А. Ковалев, Е.В. Кривощеков, О.С. Янулевич, И.В. Плотникова, О.В. Мусатова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт кардиологии», Томск; ОСП «Научно-исследовательский клинический институт педиатрии» им. акад. Ю.Е. Вельтищева РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва

The distribution of allelic variants in the folate cycle enzyme genes and the level of homocysteine in patients with congenital heart disease and functional single ventricle

Yu.G. Lugacheva, I.V. Kulagina, I.A. Kovalev, E.V. Krivoshchekov, O.S. Yanulevich, I.V. Plotnikova, O.V. Musatova

Research Institute of Cardiology, Tomsk; Acad. Yu.E. Veltishchev Research Clinical Institute of Pediatrics, N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Health of Russia, Moscow

Целью исследования явился анализ распределения генотипов и аллельных вариантов генов ферментов фолатного цикла у 102 детей с врожденным пороком сердца с функционально единственным желудочком и 89 здоровых детей. У 58 (56,9%) детей с пороком сердца выявлялся «дикий» тип 677СС гена MTHFR, у 37 (36,3%) — гетерозиготный вариант 677СТ, у 7 (6,9%) — гомозиготный вариант 677ТТ. У 45 (44,1%) детей с пороками сердца отмечалось носительство «дикого» типа 1298АА гена MTHFR, у 53 (52,0%) - гетерозиготного 1298АС, у 4 (3,9%) - гомозиготного 1298СС. Полиморфизм в гене MTR A2756G распределился у детей с пороками сердца следующим образом: у 58 (56,9%) — «дикий» тип (АА), у 40 (39,2%) — гетерозиготный (AG), у 4 (3,9%) — гомозиготный генотип (GG). При исследовании полиморфизма A66G гена MTRR у 19 (18,6%) пациентов определялся «дикий» тип 66AA, у 58 (56,9%) — гетерозиготный 66AG, у 25 (24,5%) — гомозиготный генотип 66GG. Распределение генотипов не отличалось от такового у здоровых детей. В группе детей с врожденными пороками сердца независимо от носительства полиморфизма генов ферментов фолатного цикла прослеживалась тенденция к повышению уровня гомоцистеина в плазме крови. Средний уровень гомоцистеина у носителей генотипа ТТ гена MTHFR был достоверно выше по сравнению с детьми-носителями генотипа СС: 9,0 и 6,3 мкмоль/л соответственно (р=0,02).

Ключевые слова: дети, врожденный порок сердца, полиморфизм генов, MTHFR, MTR, MTRR, ферменты фолатного цикла, гомоцистеин.

The purpose of the investigation was to analyze the distribution of genotypes and allelic variants of the folate cycle enzyme genes in 102 children with congenital heart disease and functional single ventricle and in 89 healthy children. Wild-type MTHFR 677CC was found in 58 (56.9%) children with heart disease, the MTHFR 677CT heterozygous variant was present in 37 (36.3%), the MTHFR 677TT homozygous variant was in 7 (6.9%). Carriage of wild-type MTHFR 1298AA was observed in 45 (44.1%) patients with heart disease; that of the MTHFR 1298AC heterozygous variant was noted in 53 (52.0%) and the MTHFR 1298CC homozygous variant was seen in 4 (3.9%). MTR A27556G gene polymorphism in children with heart disease was distributed as follows: wild-type (AA) in 58 (56.9%) children; the heterozygous (AG) genotype in 40 (39.2%), and the homozygous (GG) genotype in 4 (3.9%). Examination of MTRR A66G gene polymorphism revealed wide-type 66AA in 19 (18.6%) patients, the heterozygous 66AG genotype in 58 (56.9%), and the homozygous 66GG genotype in 12 (24.5%). The genotype distribution did not differ from that in the healthy children. Regardless of the carriage of folate cycle enzyme gene polymorphisms, the plasma homocysteine level tended to increase in the group of patients with congenital heart disease. The mean homocysteine level was significantly higher in the carriers of the MTHFR genotype TT than in the children carrying the genotype CC: 9.0 and 6.3 ^mol/l, respectively (p=0.02).

Key words: children, congenital heart disease, gene polymorphisms, MTHFR, MTR, MTRR, folate cycle enzymes, homocysteine.

Фолатный цикл — каскадный процесс, контролируемый ферментами, которые в качестве ко-ферментов имеют производные фолиевой кислоты. Ключевым этапом в данном процессе является синтез метионина из гомоцистеина. Это достигается в процессе превращения фолатов: восстановления 5,10-метилен-

© Коллектив авторов, 2015

Ros Vestn Perinatol Pediat 2015; 6:55-59

Адрес для корреспонденции: Лугачева Юлия Геннадьевна — врач клинико-диагностической лаборатории НИИ кардиологии Кулагина Ирина Владимировна — к.м.н, зав. той же лабораторией Мусатова Ольга Валерьевна — к.м.н., врач той же лаборатории Кривощеков Евгений Владимирович — д.м.н, вед. научн. сотр. отделения сердечно-сосудистой хирургии, зав. кардиохирургическим отделением 2 указанного учреждения

тетрагидрофолата до 5-метилтетращцрофолата, несущего метильную группу, которая необходима для превращения гомоцистеина в метионин. Восстановление фолатов происходит при участии фермента метиленте-трагидрофолатредуктазы (MTHFR). Метильная группа переносится на витамин В12, который затем отдает ее

Янулевич Ольга Сергеевна — к.м.н., врач-детский кардиолог того же отделения

Плотникова Ирина Владимировна — д.м.н., и.о. рук. отделения детской кардиологии того же учреждения 2634012 Томск, ул. Киевская, д. 111-а

Ковалев Игорь Александрович — д.м.н., проф., зав. отделом детской кардиологии и аритмологии Научно-исследовательского клинического института педиатрии им. акад. Ю.Е. Вельтищева РНИМУ им. Н.И. Пирогова 125412 Москва, ул. Талдомская, д. 2

гомоцистеину, образуя метионин с помощью фермента метионинсинтазы (MTR). Показано, что в некоторых случаях витамин В12 может окисляться, что сопровождается подавлением метионинсинтазы. Для восстановления активности фермента необходимо метилирование с помощью фермента метионинсинтаза-редуктазы (MTRR) [1-3].

Нарушение фолатного цикла приводит к накоплению гомоцистеина в клетках и повышению его уровня в плазме. Гомоцистеин оказывает выраженное токсическое, атерогенное и тромбофилическое действие, что обусловливает повышенный риск развития ряда патологических процессов [2, 4-6]. В последние годы особый интерес представляют исследования уровня гомоцистеина в популяциях. Ряд авторов считает, что гипергомоцистеинемия является независимым предиктором риска развития артериальных и венозных тромбозов, а также атеросклеротического поражения коронарных, мозговых и периферических сосудов [7].

Одной из важных проблем остается развитие обширных венозных тромбозов после гемодинами-ческих коррекций функционально единственного желудочка сердца в раннем и позднем послеоперационном периодах. Особенно часто развитие тромбозов отмечается у пациентов с перерывом нижней полой вены в связи с низкой скоростью кровотока в печеночных венах, в том числе и на фоне приема антикоагулянтной терапии [8]. Венозные тромбозы и тромбоэмболии приводят к развитию ишемических инсультов, хилоторакса, фибрилляции предсердий. В 25% случаев тромбозы и тромбоэмболии являются причиной летального исхода у пациентов с функционально единственным желудочком [9, 10].

Несмотря на достижения последних десятилетий в области кардиохирургии врожденных пороков сердца, интервенционной кардиологии и терапии сердечно-сосудистых заболеваний у детей, профилактика и лечение тромбозов и тромбоэмболий остается серьезной проблемой в решении которой имеется значительный ресурс снижения смертности от сердечнососудистых заболеваний в детском возрасте.

Характеристика детей и методы исследования

Проанализированы данные изучения аллельных вариантов генов ферментов фолатного цикла у 191 ребенка в возрасте от периода новорожденности до 14 лет, в том числе у 102 пациентов с врожденным пороком сердца с функционально единственным желудочком и 89 здоровых детей. Группы детей были сопоставимы по возрасту: средний возраст детей в группе с врожденными пороками сердца составил 3,3 (0,6; 5,0) года; в группе здоровых детей — 2,6 (1,25;7,0) года.

Материалом исследования являлась цельная стабилизированная кровь. Образцы ДНК пациентов были исследованы на наличие однонуклеотидных полиморфизмов в генах ферментов фолатного цикла: MTHFR: 677 C>T и 1298 A>C; MTR: 2756 A>G, MTRR: 66 A>G.

Генотип определяли методом полимеразной цепной реакции с использованием коммерческих наборов реагентов (ДНК-Технология, Россия).

Уровень гомоцистеина в плазме крови определили у 44 пациентов с врожденными пороками сердца. За нормальные значения принимали следующие показатели: менее 5 мкмоль/л у детей в возрасте до 10 лет, менее 10 мкмоль/л у детей 10—15 лет, менее 15 мкмоль/л у детей старше 15 лет [11]. Содержание в плазме крови гомоцистеина оценивалось методом иммуноферментного анализа с использованием реагентов фирмы AXIS-SHIELD Diagnostics Limited (Соединненое Королевство).

Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета программ SPSS 20.0. При описании количественных данных использовались следующие расчетные показатели: Ме (IQR), где Me — медиана, IQR (Interquartile range) — интерквар-тильный размах между значениями 25-75-го пер-центиля (при распределении данных, отличающихся от нормального). Показатели, характеризующие качественные признаки, выражали в абсолютных числах и относительных величинах в процентах.

Сравнения частот аллелей и генотипов между исследованными выборками проводили, используя критерий 2 и точный критерий Фишера. Различия считали статистически достоверными при достижении уровня значимости ^<0,005.

Для данных, имеющих распределение, отличное от нормального, использовался критерий Краске-ла-Уоллиса, в случае попарных сравнений — критерий Манна—Уитни. С целью преодоления проблемы множественных сравнений применялась поправка Бонферрони.

Результаты и обсуждение

Результаты молекулярно-генетических исследований изучаемых генов ферментов фолатного цикла у обследованных пациентов представлены в табл. 1. Гетерозиготное носительство СТ гена фермента ме-тилентетрагидрофолатредуктазы в группе пациентов с функционально единственным желудочком сердца выявлено в 36,3% случаев, в группе здоровых детей — в 37,1%. Гомозиготное носительство генотипа TT гена фермента метилентетрагидрофолатредуктазы наблюдалось в 6,9 и 14,6% случаев соответственно, что согласуется с частотой встречаемости данной мутации в европейской популяции (5—15%).

Полиморфный вариант C677T гена MTHFR наследуется по аутосомно-рецессивному типу и изменение активности метилентетрагидрофолатредуктазы наиболее выражено у лиц с генотипом ТТ. У гомозигот по полиморфному аллелю активность фермента снижена на 70%, а у гетерозигот — на 35%. Уменьшение активности фермента метилентетрагидрофолатредуктазы приводит к легкой или умеренной гипергомоцистеине-мии, которая обусловливает нарушения в свертываю-

Лугачева ЮГ. и соавт. Распределение аллельных вариантов генов ферментов фолатного цикла и уровень гомоцистеина

Таблица 1. Распределение и частота встречаемости аллельных вариантов генов ферментов фолатного цикла у обследованных пациентов

Ген Полиморфизм Генотип Группа детей с врожденными пороками сердца (п=102) Группа здоровых детей (п=89) Критерий

распределение генотипа,% частота аллеля распределение генотипа, % частота аллеля Фишера/х2

MTHFR C677T СС ст п 56,9 36,3 6,9 С=0,75 T=0,25 48,3 37,1 14,6 С=0,67 T=0,33 Х2=3,387 р=0,177

MTHFR А1298С АА АС СС 44,1 52,0 3,9 А=0,70 С=0,30 50,6 44,9 4,5 А=0,73 С=0,27 F=1,003 р=0,629

MTR А2756G АА AG GG 56,9 39,2 3,9 А=0,76 G=0,24 57,3 36,0 6,7 А=0,75 G=0,25 F=0,876 р=0,671

MTRR А66G АА AG GG 18,6 56,9 24,5 А=0,47 G=0,53 24.7 52.8 22,5 А=0,51 G=0,49 Х2=1,047 р=0,621

Примечание: Сравнение контрольных и опытных частот проводилось с помощью критерия х2 на непрерывность при условии, что все значения частот сравниваемых признаков больше 5. При частотах меньше 5 сравнение проводилось с использованием точного критерия Фишера. п — количество обследованных пациентов.

Таблица 2. Уровень гомоцистеина крови в группе обследованных пациентов (п=44) в зависимости от носительства аллель-ных вариантов генов ферментов фолатного цикла

Полиморфизм Генотип Уровень Гомоцистеина, мкмоль/л Ме (IQR) Критерий Краскела—Уоллиса Критерий Манна—Уитни

СС 6,3 (4,8;7,3) Х2=7,8 р=0,002 ^=0,479

MTHFR C677T CT 7,0 (5,3;7,8) рьз=0,02

TT 9,0 (8,6;9,2) р2-3=0,06

MTHFR А1298С АА 7,4 (5,7;8,6) Х2=4,5 р=0,104 р1-2=0,039

АС 6,1 (4,5;7,4) р1-3=0,353

СС 6,2 (5,3;7,0) р2-3=0,957

АА 7,5 (5,7;8,6) Х2=5,1 р=0,080 р1-2=0,101

MTR А2756G AG 6,7 (4,7;7,3) р1-3=0,060

GG 4,8 (4,7;4,8) р2-3=0,303

АА 8,9 (6,9;11,7) Х2=3,05 р=0,217 р1-2=0,095

MTRR А66G AG 6,5 (5,0;7,5) рь=0,427

GG 7,4 (5,3;8,2) р2-3=0,405

Примечание: Ме — медиана; IQR — интерквартильная широта (25 — 75-й процентиль); р — уровень значимости различий (критерий Манна— Уитни); критерий множественных сравнений Краскела—Уоллиса с поправкой Бонферрони; р — уровень значимости различий между: 1 — «дикий» тип, 2 — гетерозигота, 3 — гомозигота.

щей системе крови. Описана взаимосвязь полиморфизма С677Т с венозными и артериальными тромбозами, риск развития которых особенно возрастает у гомозиготных носителей по мутантному аллелю [2, 12, 13]. В нашем исследовании в группе пациентов с врожденными пороками сердца независимо от носительства полиморфизма прослеживалась тенденция повышенного

уровня гомоцистеина в плазме крови. Средний уровень гомоцистеина у носителей генотипа ТТ был значимо выше по сравнению с детьми-носителями генотипа СС: 9,0 и 6,3 мкмоль/л соответственно, р=0,02 (табл. 2).

Вторым распространенным полиморфизмом в гене MTHFR является транзиция А1298С. В нашем исследовании в группе пациентов с функционально

единственным желудочком гетерозиготный генотип АС диагностирован в 52,0% случаев, в группе здоровых детей — в 44,9%; гомозиготный генотип СС — в 3,9 и 4,5% случаев соответственно. Полиморфизм А1298С гена MTHFR менее изучен, частота встречаемости генотипов А/С, С/С составляет 20—30% [2, 13, 14]. В работе Е.А. Трифоновой и соавт. [15] гетерозиготный генотип АС диагностирован в 48,0% случаев, гомозиготный генотип СС — в 12%. Увеличение количества гетерозигот связывают с небольшим объемом выборки, а также спецификой по-пуляционно-генетических процессов в популяции, которая может быть связана как с характеристиками генетико-демографической структуры популяции, так и со сцеплением с функционально значимым локусом. При наличии аллеля 1298С также снижается активность фермента, хотя и не так значительно, как при полиморфизме аллеля 677Т. У лиц, гомозиготных по мутации А1298С, отмечается снижение активности метилентетрагидрофолатредук-тазы примерно до 60% от нормы, однако повышения уровня гомоцистеина в крови не наблюдается [2, 13]. В нашей группе у детей с функционально единственным желудочком средний уровень гомо-цистеина у носителей генотипа АА был повышен и равен 7,4 мкмоль/л, у детей с генотипом АС он составил 6,1 мкмоль/л и генотипом СС — 4,8 мкмоль/л (см. табл. 2). Достоверных различий уровня гомоци-стеина между носителями генотипов полиморфизма А1298С гена MTHFR выявлено не было.

В гене MTR гетерозиготное носительство генотипа АG в группе пациентов с функционально единственным желудочком выявлено в 39,2% случаев, в группе здоровых детей — в 36,0%. Гомозиготное носитель-ство генотипа GG гена MTR наблюдалось в 3,9 и 6,7% случаев соответственно. Частота встречаемости генотипов А/G, G/G составляет 20—30% в европейской популяции. Снижение функциональной активности В12-зависимой метионинсинтазы сопровождается повышением уровня гомоцистеина в крови, повышением риска развития синдрома Дауна у потомства и неза-ращения нервной трубки [1, 2, 16, 17].

Клиническое значение мутантных генов фолатного цикла существенно различается у людей, проживающих в европейской, американской и азиатской частях света. В ряде регионов (жители Италии, Китая) «патологический» аллель 2756 GG гена MTR проявляет протективный эффект в отношении развития артериального тромбоза [18, 19]. В исследовании О.А. Львовой и соавт. [20] у пациентов с нормальным вариантом

2756 АА гена MTR отмечался более высокий уровень гомоцистеина, чем в случае носительства аллелей 2756 AG и 2756 GG. В нашем исследовании у детей с функционально единственным желудочком сердца, являющихся носителями генотипа АА, средний уровень гомоцистеина был равен 7,5 мкмоль/л и не отличался от такового у детей с генотипами AG и GG — 6,7 и 6,2 мкмоль/л соответственно (см. табл. 2).

При исследовании полиморфизма гена MTRR гетерозиготное носительство генотипа AG в группе пациентов с функционально единственным желудочком сердца выявлено в 56,9% случаев, в группе здоровых детей — в 52,8%. Гомозиготное носительство генотипа GG данного гена наблюдалось в 24,5 и 22,5% случаев соответственно. Полиморфизм гена влечет за собой нарушение метаболизма гомоцистеина, повышение его концентрации в крови и усиливает патологический эффект, ассоциированный с полиморфизмами генов MTHFR и MTR. Частота встречаемости генотипов А/G, G/G в европейской популяции — 40—50% [14, 21]. В группе детей с врожденным пороком сердца средний уровень гомоцистеина у носителей генотипа АА был повышен и составлял 8,9 мкмоль/л, у детей с генотипом AG он составил 6,5 мкмоль/л и генотипом GG — 7,4 мкмоль/л (см. табл. 2). Достоверных различий уровня гомоцистеина между носителями полиморфизма A66G гена фермента MTRR выявлено не было.

Заключение

В работе проанализирована частота встречаемости аллельных вариантов генов ферментов фо-латного цикла у пациентов с врожденным пороком сердца c функционально единственным желудочком и у здоровых детей. Распределение вариантов генов ферментов фолатного цикла у детей с функционально единственным желудочком сердца не отличалось от такового в группе здоровых детей. Наследственные нарушения ферментов фолатного цикла могут обусловливать повышенный уровень гомоцистеина. Полученные данные указывают на взаимосвязь аллель ТТ гена MTHFR и уровня гомоцистеина в плазме крови у пациентов с врожденными пороками сердца. Гипергомоцистеинемия является существенным предиктором развития венозных и артериальных тромбозов в сочетании с факторами риска, обусловленными особенностями гемодинамики после выполнения тотального кавапульмонального соединения и разделения кругов кровообращения у детей с функционально единственным желудочком сердца.

ЛИТЕРАТУРА

1. Миктадова А.В. Полиморфизм генов фолатного цикла и предрасположенность к сердечно-сосудистым заболеваниям. Главный врач юга России 2011; 4: 27: 16—18. (Miktadova A.V. Polimorfizm of genes of a folatny cycle

and predisposition to cardiovascular diseases. Glavnyj vrach yuga Rossii 2011; 4: 27: 16-18.) 2. Фетисова И.Н. Полиморфизм генов фолатного обмена и болезни человека. Вестн новых мед технол 2007; 10: 1:

Лугачева Ю.Г. и соавт. Распределение аллельных вариантов генов ферментов фолатного цикла и уровень гомоцистеина.

91—96.

3. Durmazlar S.P. Hyperhomocysteinemia in patients with stasis dermatitis and ulcer: a novel finding with important therapeutic implications. J Dermatolog Treat 2009; 20: 6: 336-339.

4. Akbulut S. Increased levels of homocysteine in patients with ulcerative colitis. World J Gastroenterol 2010; 16: 19: 24112416.

5. Di Minno M.N. Homocysteine and arterial thrombosis: Challenge and opportunity. Thromb Haemost 2010; 103: 5: 942961.

6. Miyaki K. Genetic polymorphisms in homocysteine metabolism and response to folate intake: a comprehensive strategy to elucidate useful genetic information. J Epidemiol 2010; 20: 4: 266-270.

7. Brattstrom L. Common methylenetetrahydrofolate reductase gene mutation leads to hyperhomocysteinemia but not to vascular disease. The result of a metaanalysis. Circulation 1998; 98: 2520-2526.

8. Konstantinov I.E., Puga F.J., Alexi-Meskishvili V.V. Thrombosis of intra and extracardiac conduits after modified Fontan operation in patients with azygous continuation of the inferior vena cava. Ann Thorac Surg 2001; 72: 5:1641-1644.

9. Airan B., Sharma R., Chowdhury U.K. et al. Univentricular repair: is routine fenestration justified? Ann Thorac Surg 2000; 69: 1900-1906.

10. Az,akie A., McCrindle B.W., Arsdell G.V. et al. Extracardiac versus lateral tunnel cavopulmonary connections at a single institution: impact on outcomes. J Thorac Cardiovasc Surg 2000; 122: 1219-1228.

11. Шевченко О.П., Олефиренко Г.А., Червякова Н.В. Гомо-цистеин. М.: Реафарм, 2002; 48.

12. Баркаган З.С. Гипергомоцистеинемия как самостоятельный фактор риска поражения и тромбирования кровеносных сосудов. Ангиол и сосуд хирургия 2002; 1: 65-71.

13. Friso S. A1298C methylenetetrahydrofolate reductase muta-

tion and coronary artery disease: relationships with C677T polymorphism and homocysteine/folate metabolism. Clin Exp Med 2002; 2: 7-12.

14. Гречанина Е.Я. Распространенность полиморфизмов С677Т MTHFR и A66G MTRR генов системы фолатного цикла в популяции Восточной Украины. Акт пробл акуш и гинекол, клин иммунол и мед генетики 2010; 2: 91-97.

15. Трифонова Е.А. Генетическое разнообразие и неравновесие по сцеплению в локусе метилентетрагидрофолатре-дуктазы. Генетика 2008; 44: 10: 1410-1419.

16. Гречанина Е.Я. Наследственные нарушения обмена серосодержащих аминокислот. Рос вестн перинатол и педиатр 2009; 1: 53-61.

17. Ozer I. Retrospective Approach to Methylenetetrahydrofolate Reductase Mutations in Children. Pediatric Neurology 2011; 45: 34-38.

18. De Marco P., Calevo M.G., Moroni A. et al. Study of MTHFR and MS polymorphisms as risk factors for NTD in the Italian population. J Hum Genet 2002; 47: 6: 319-324.

19. Zhang G., Dai C. Gene polymorphisms of homocysteine metabolism, related enzymes in Chinese patients with occlusive coronary artery or cerebral vascular diseases. Thromb Res 2001; 104: 3: 187-195.

20. Львова О.А. Генетически детерминированные нарушения гемокоагуляции как причина ишемических инсультов у детей. Журн неврол и психиатр 2011; 12: 3-9.

21. Zetterberg H. No association between the MTHFR A1298C and transcobalamin C776G genetic polymorphisms and hy-perhomocysteinemia in thrombotic disease. Thromb Res 2002; 108: 127-131.

Поступила 16.07.15