СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ
SENSOR SYSTEMS

Перекрестная ссылка на родственную заявку
[0001] Данная заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США с порядковым номером 62/783951, поданной 21 декабря 2018 года, содержание которой полностью включено сюда по ссылке.
Предпосылки изобретения
[0002] Разнообразные протоколы в биологическом или химическом исследованиях включают выполнение большого числа контролируемых реакций на локальных опорных поверхностях или в заранее заданных реакционных камерах. Предусмотренные реакции затем можно наблюдать или обнаруживать, а последующий анализ может помочь идентифицировать или выявить свойства химических веществ, участвующих в реакции. В некоторых примерах, контролируемые реакции создают люминесценцию, и в силу этого для обнаружения может использоваться оптическая система. В других примерах контролируемые реакции изменяют заряд, проводимость или некоторое другое электрическое свойство, и в силу этого для обнаружения может использоваться электронная система.
Введение
[0003] Первый раскрытый здесь аспект представляет сенсорную систему, содержащую датчик заряда, включающий в себя: два электрода и электропроводящий канал, соединяющий два электрода; заряженную молекулу, присоединенную к электропроводящему каналу, причем заряженная молекула: включает в себя сайт распознавания для обратимого связывания метки меченого нуклеотида, имеет несвязанную предпочтительную конформацию, ассоциированную с конфигурацией несвязанного заряда, и имеет предпочтительную конформацию, ассоциированную с конфигурацией заряда, когда сайт распознавания связан с меткой, при этом конфигурация заряда отличается от конфигурации несвязанного заряда; и полимеразу, присоединенную к электропроводящему каналу или к заряженной молекуле.
[0004] В примере этого первого аспекта заряженная молекула представляет собой заряженный аптамер. В этом примере заряженный аптамер выбран из группы, состоящей из ДНК-аптамера, РНК-аптамера и их аналога.
[0005] В примере этого первого аспекта заряженная молекула выбрана из группы, состоящей из заряженного белка и заряженного пептида.
[0006] В примере этого первого аспекта заряженная молекула: дополнительно включает в себя второй сайт распознавания для обратимого связывания второй метки второго меченого нуклеотида и имеет вторую предпочтительную конформацию, ассоциированную со второй конфигурацией заряда, когда второй сайт распознавания связан со второй меткой; дополнительно включает в себя третий сайт распознавания для обратимого связывания третьей метки третьего меченого нуклеотида и имеет третью предпочтительную конформацию, ассоциированную с третьей конфигурацией заряда, когда третий сайт распознавания связан с третьей меткой; и дополнительно включает в себя четвертый сайт распознавания для обратимого связывания четвертой метки четвертого меченого нуклеотида и имеет четвертую предпочтительную конформацию, ассоциированную с четвертой конфигурацией заряда, когда четвертый сайт распознавания связан с четвертой меткой; и несвязанная предпочтительная конформация, ассоциированная с конфигурацией несвязанного заряда, возникает, когда каждый из упомянутых сайта распознавания, второго сайта распознавания, третьего сайта распознавания и четвертого сайта распознавания является несвязанным.
[0007] В примере этого первого аспекта сенсорная система дополнительно содержит вторую заряженную молекулу, присоединенную к электропроводящему каналу, причем вторая заряженная молекула: включает в себя второй сайт распознавания для обратимого связывания второй метки второго меченого нуклеотида; имеет несвязанную предпочтительную конформацию второй заряженной молекулы, ассоциированную с конфигурацией несвязанного заряда второй заряженной молекулы; и имеет предпочтительную конформацию второй заряженной молекулы, ассоциированную с конфигурацией заряда второй заряженной молекулы, когда второй сайт распознавания связан со второй меткой. В этом примере сенсорная система также дополнительно может содержать третью заряженную молекулу, присоединенную к электропроводящему каналу, причем третья заряженная молекула: включает в себя третий сайт распознавания для обратимого связывания третьей метки третьего меченого нуклеотида; имеет несвязанную предпочтительную конформацию третьей заряженной молекулы, ассоциированную с конфигурацией несвязанного заряда третьей заряженной молекулы; и имеет предпочтительную конформацию третьей заряженной молекулы, ассоциированную с конфигурацией заряда третьей заряженной молекулы, когда третий сайт распознавания связан с третьей меткой; и четвертую заряженную молекулу, присоединенную к электропроводящему каналу, причем четвертая заряженная молекула: включает в себя четвертый сайт распознавания для обратимого связывания четвертой метки четвертого меченого нуклеотида; имеет несвязанную предпочтительную конформацию четвертой заряженной молекулы, ассоциированную с конфигурацией несвязанного заряда четвертой заряженной молекулы; и имеет предпочтительную конформацию четвертой заряженной молекулы, ассоциированную с конфигурацией заряда четвертой заряженной молекулы, когда четвертый сайт распознавания связан с четвертой меткой.
[0008] В примере этого первого аспекта заряженная молекула дополнительно включает в себя второй сайт распознавания для обратимого связывания второй метки второго меченого нуклеотида и имеет вторую предпочтительную конформацию, ассоциированную со второй конфигурацией заряда, когда второй сайт распознавания связан со второй меткой; и сенсорная система дополнительно содержит вторую заряженную молекулу, присоединенную к электропроводящему каналу, причем вторая заряженная молекула: включает в себя третий сайт распознавания для обратимого связывания третьей метки третьего меченого нуклеотида и четвертый сайт распознавания для обратимого связывания четвертой метки четвертого меченого нуклеотида; имеет несвязанную предпочтительную конформацию второй заряженной молекулы, ассоциированную с конфигурацией несвязанного заряда второй заряженной молекулы; имеет третью предпочтительную конформацию, ассоциированную с третьей конфигурацией заряда, когда третий сайт распознавания связан с третьей меткой; и имеет четвертую предпочтительную конформацию, ассоциированную с четвертой конфигурацией заряда, когда четвертый сайт распознавания связан с четвертой меткой.
[0009] В примере этого первого аспекта заряженная молекула дополнительно включает в себя второй сайт распознавания для обратимого связывания второй метки меченого нуклеотида.
[0010] Следует понимать, что любые признаки раскрытой здесь сенсорной системы могут комбинироваться между собой любым желательным образом и/или в любой желательной конфигурации.
[0011] Второй раскрытый здесь аспект представляет сенсорное устройство, содержащее проточную ячейку и сенсорную систему, интегрированную в проточную ячейку, причем сенсорная система включает в себя датчик заряда, включающий в себя электропроводящий канал; заряженную молекулу, присоединенную к электропроводящему каналу, при этом заряженная молекула: имеет несвязанную предпочтительную конформацию, ассоциированную с конфигурацией несвязанного заряда; и имеет предпочтительную конформацию, ассоциированную с конфигурацией заряда, когда сайт распознавания заряженной молекулы связан с меткой меченого нуклеотида, при этом конфигурация заряда отличается от конфигурации несвязанного заряда; и полимеразу, присоединенную к электропроводящему каналу или к заряженной молекуле.
[0012] В примере этого второго аспекта сенсорное устройство дополнительно содержит систему доставки реагентов для избирательного введения реагента во вход проточной ячейки. В некоторых примерах реагент находится в контейнере для образца, причем реагент включает в себя меченый нуклеотид, который включает в себя: нуклеотид; связывающую молекулу, присоединенную к фосфатной группе нуклеотида; и специфичную к сайту распознавания метку, присоединенную к связывающей молекуле.
[0013] В примере этого второго аспекта сенсорное устройство дополнительно содержит детектор для обнаружения отклика из датчика заряда.
[0014] Следует понимать, что любые признаки сенсорного устройства могут комбинироваться между собой любым желательным образом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков сенсорной системы и/или сенсорного устройства может использоваться совместно и/или комбинироваться с любым из раскрытых здесь примеров.
[0015] Третий раскрытый здесь аспект представляет способ, содержащий введение матричной полинуклеотидной цепи в сенсорную систему, включающую в себя: датчик заряда, включающий в себя два электрода и электропроводящий канал, соединяющий два электрода; заряженную молекулу, присоединенную к электропроводящему каналу, причем заряженная молекула включает в себя сайт распознавания; и полимеразу, присоединенную к электропроводящему каналу или к заряженной молекуле; введение реагентов, включая меченые нуклеотиды, в сенсорную систему, при этом нуклеотид одного из меченых нуклеотидов связывается с полимеразой, а специфичная к сайту распознавания метка одного из меченых нуклеотидов связывается с сайтом распознавания, вызывая конформационное изменение заряженной молекулы; и обнаружение отклика датчика заряда в ответ на конформационное изменение заряженной молекулы.
[0016] В примере этого третьего аспекта способ дополнительно содержит ассоциирование отклика датчика заряда со связанной специфичной к сайту распознавания меткой; и идентификацию нуклеотида одного из меченых нуклеотидов на основе связанной специфичной к сайту распознавания метки.
[0017] В примере этого третьего аспекта заряженная молекула включает в себя множество различных сайтов распознавания, каждый из которых должен обратимо связывать различную метку различного меченого нуклеотида с разной скоростью. В некоторых примерах способ дополнительно содержит обнаружение множества откликов датчика заряда в ответ на различные конформационные изменения заряженной молекулы, когда различные меченые нуклеотиды соответственно связываются с полимеразами, а различные специфичные к сайту распознавания метки различных меченых нуклеотидов соответственно связываются с одним из множества различных сайтов распознавания; и идентификацию соответственно связанных различных меченых нуклеотидов по разным скоростям.
[0018] В примере этого третьего аспекта сайт распознавания должен обратимо связывать множество различных меток множества различных меченых нуклеотидов со множеством разных скоростей, и при этом способ дополнительно содержит: обнаружение множества откликов датчика заряда в ответ на различные конформационные изменения заряженной молекулы, когда по меньшей мере некоторые из различных меченых нуклеотидов соответственно связываются с полимеразой, а по меньшей мере некоторые из различных меток соответственно связываются с сайтом распознавания; и идентификацию соответственно связанных различных меченых нуклеотидов по разным скоростям.
[0019] В примере этого третьего аспекта сайт распознавания должен обратимо связывать вплоть до четырех различных меченых нуклеотидов, и при этом способ дополнительно содержит: обнаружение вплоть до четырех различных откликов датчика заряда в ответ на различные конформационные изменения заряженной молекулы, когда вплоть до четырех различных меченых нуклеотидов соответственно связываются с полимеразой и сайтом распознавания, при этом каждый из вплоть до четырех различных откликов имеет разную величину; и идентификацию соответственно связанных различных меченых нуклеотидов по разным величинам.
[0020] Следует понимать, что любые признаки способа могут комбинироваться между собой любым желательным образом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков способа и/или сенсорной системы и/или сенсорного устройства может использоваться совместно и/или комбинироваться с любым из раскрытых здесь примеров.
[0021] Четвертый раскрытый здесь аспект представляет сенсорную систему, содержащую датчик заряда, включающий в себя: два электрода и электропроводящий канал, соединяющий два электрода; заряженную молекулу, присоединенную к электропроводящему каналу, причем заряженная молекула: включает в себя сайт распознавания для обратимого связывания метки меченого нуклеотида; имеет несвязанную предпочтительную конформацию, ассоциированную с конфигурацией несвязанного заряда; и имеет предпочтительную конформацию, ассоциированную с конфигурацией заряда, когда сайт распознавания связан с меткой, при этом конфигурация заряда отличается от конфигурации несвязанного заряда; и полимеразу, присоединенную к по меньшей мере одному из двух электродов или к подложке, на которой расположен датчик заряда.
[0022] В одном примере четвертого аспекта подложка представляет собой структурированную подложку, при этом датчик заряда расположен в углублении структурированной подложки, и при этом полимераза присоединена к поверхности углубления.
[0023] Следует понимать, что любые признаки этой сенсорной системы могут комбинироваться между собой любым желательным образом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков этой сенсорной системы и/или способа и/или другой сенсорной системы и/или сенсорного устройства может использоваться совместно и/или комбинироваться с любым из раскрытых здесь примеров.
[0024] Пятый раскрытый здесь аспект представляет сенсорное устройство, содержащее проточную ячейку; и сенсорную систему, интегрированную в проточную ячейку, причем сенсорная система включает в себя: датчик заряда, включающий в себя электропроводящий канал; заряженную молекулу, присоединенную к электропроводящему каналу, при этом заряженная молекула: имеет несвязанную предпочтительную конформацию, ассоциированную с конфигурацией несвязанного заряда; и имеет предпочтительную конформацию, ассоциированную с конфигурацией заряда, когда сайт распознавания заряженной молекулы связан с меткой меченого нуклеотида, при этом конфигурация заряда отличается от конфигурации несвязанного заряда; и полимеразу, присоединенную к по меньшей мере одному из двух электродов или подложке проточной ячейки.
[0025] В одном примере пятого аспекта подложка представляет собой структурированную подложку, при этом датчик заряда расположен в углублении структурированной подложки, и при этом полимераза присоединена к поверхности углубления.
[0026] Следует понимать, что любые признаки этого сенсорного устройства могут комбинироваться между собой любым желательным образом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков этого сенсорного устройства и/или способа и/или сенсорных систем и/или другого сенсорного устройства может использоваться совместно и/или комбинироваться с любым из раскрытых здесь примеров.
[0027] Еще дополнительно следует понимать, что любые признаки любого из способов и/или любой из сенсорных систем и/или любого из сенсорных устройств могут комбинироваться между собой любым желательным образом и/или могут комбинироваться с любым из раскрытых здесь примеров.
Краткое описание чертежей
[0028] Признаки примеров настоящего раскрытия станут очевидными при обращении к нижеприведенному подробному описанию и чертежам, на которых аналогичные ссылочные номера соответствуют аналогичным, хотя возможно и не идентичным, компонентам. Для краткости, ссылочные номера или признаки с вышеописанной функцией могут быть или не быть описаны в связи с другими чертежами, на которых они появляются.
[0029] Фиг. 1A, схематичный рисунок примера раскрытого здесь датчика, когда заряженная молекула находится и в несвязанной предпочтительной конформации (показана на «(i)»), и в ее предпочтительной конформации (показана на «(ii)»);
[0030] Фиг. 1B, схематичный рисунок другого примера раскрытого здесь датчика, когда заряженная молекула находится и в несвязанной предпочтительной конформации (показана на «(i)»), и в ее предпочтительной конформации (показана на «(ii)»);
[0031] Фиг. 2, схематичный рисунок другого примера раскрытого здесь датчика;
[0032] Фиг. 3A-3E, схематичные рисунки, иллюстрирующие другой пример датчика, содержащего заряженную молекулу с четырьмя различными сайтами распознавания;
[0033] Фиг. 4, схематичный рисунок в перспективе примера сенсорной системы, включающей в себя проточную ячейку и пример раскрытого здесь датчика;
[0034] Фиг. 5 схематично иллюстрирует пример раскрытого здесь способа;
[0035] Фиг. 6A и 6B, графики, иллюстрирующие потенциальные отклики раскрытых здесь датчиков;
[0036] Фиг. 7A, вид сверху другого примера проточной ячейки; и
[0037] Фиг. 7B, укрупненный вид в частичном разрезе примера датчиков, расположенных в архитектуре проточной ячейки по фиг. 7A.
Подробное описание изобретения
[0038] В данном документе раскрыта сенсорная система, которая может использоваться для обнаружения одиночных молекул в процедурах секвенирования нуклеиновых кислот. Сенсорная система включает в себя заряженный фрагмент молекулы, присоединенный к электропроводящему каналу датчика заряда. Заряженный фрагмент молекулы присоединяется к электропроводящему каналу таким образом, что он не обнаруживается до тех пор, пока не произойдет событие (например, связывание целевой метки), которое переконфигурирует заряженный фрагмент молекулы так, что он становится обнаруживаемым датчиком заряда. Более конкретно, заряженный фрагмент молекулы способен претерпевать обратимое связывание с целевой меткой, которая присоединена к нуклеотиду, который способен встраиваться посредством полимеразы. В результате связывания целевой метки с заряженным фрагментом молекулы, связанный заряженный фрагмент молекулы претерпевает конформационное изменение, которое изменяет пространственное распределение зарядов. Вследствие близости заряженного фрагмента молекулы к электропроводящему каналу в датчике заряда, датчик заряда отвечает на по-новому представленные заряды и выдает обнаруживаемый сигнал. Обнаруживаемый сигнал выдается даже при биологически релевантных или физиологических концентрациях ионов соли, при которых длины дебаевского экранирования типично составляют менее 1 нм. В качестве примеров, конформация, которая перемещает отрицательно заряженный фрагмент молекулы ближе к электропроводящему каналу, может снижать активную межэлектродную проводимость, в то время как конформация, которая перемещает отрицательно заряженный фрагмент молекулы дальше от электропроводящего канала, может увеличивать активную межэлектродную проводимость. По сути, различные конформации заряженного фрагмента молекулы приводят к разным обнаруживаемым сигналам. Поскольку обнаруживаемые заряды размещаются на заряженном фрагменте молекулы, заряды не должны размещаться на целевой метке, что может быть преимущественным.
[0039] В раскрытых здесь примерах целевая метка может быть настроена на конкретный нуклеотид, который способен встраиваться посредством полимеразы. Поскольку целевая метка вызывает требуемое конформационное изменение в заряженном фрагменте молекулы, результирующий сигнал может использоваться для идентификации конкретного нуклеотида. Кроме того, помимо абсолютной величины заряда, скорости ассоциации и диссоциации между целевыми метками и одним или более заряженных фрагментов молекулы могут использоваться для того, чтобы создавать уникальные сигналы - «отпечатки пальцев», которые проявляются уникальными частотами, которые могут использоваться для того, чтобы идентифицировать соответствующие нуклеотиды, связанные с целевыми метками.
[0040] Обращаясь теперь к фиг. 1A и 1B, там соответственно показаны два примера сенсорной системы 10, 10'. Каждая из сенсорных систем 10, 10' включает в себя датчик 11, 11' заряда, который включает в себя два электрода 12, 14 и электропроводящий канал 16, соединяющий два электрода 12, 14. Сенсорные системы 10, 10' также включают в себя заряженную молекулу 18 или 18', присоединенную к электропроводящему каналу 16 датчика 11, 11' заряда, и полимеразу 20, присоединенную к электропроводящему каналу 16 (фиг. 1A) или к заряженной молекуле 18' (фиг. 1B).
[0041] В других примерах сенсорной системы полимераза 20 может быть присоединена к другим компонентам сенсорной системы 10, 10' (например, к электроду 12 или 14) и/или к другим компонентам проточной ячейки, в которой интегрирована сенсорная система 10, 10'. Полимераза 20 может быть присоединена к любой зоне, смежной с датчиком 11, 11' заряда, при условии, что метка нуклеотида, встраиваемого посредством полимеразы 20, может быть обратимо связана с заряженной молекулой 18 или 18'. В некоторых примерах полимераза 20 присоединена в пределах расстояния от примерно 5 нм до примерно 50 нм относительно заряженной молекулы 18 или 18'.
2
[0042] Датчик 11, 11' заряда может представлять собой полевой транзистор (FET), такой как FET на основе углеродных нанотрубок (УНТ), FET на основе одностенных углеродных нанотрубок (ОСУНТ), FET на основе кремниевых нанопроводов (SiNW), FET на основе кремниевых нанотрубок, FET на основе полимерных нанопроводов, FET на основе графеновых нанолент (и относящиеся к ним FET на основе нанолент, изготовленные из двухмерных материалов, таких как MoS, силицен и т.д.), FET со структурой «металл-оксид-полупроводник» (полевой МОП-транзистор, или MOSFET), туннельный FET (TFET) или любой другой прибор с проводимостью, которая может модулироваться внешним полем, например, металлической УНТ или многостенной УНТ. В FET электроды 12, 14 являются выводами истока и стока, а электропроводящий канал 16 - выводом затвора. Полевой транзистор может представлять собой p-канальный МОП-транзистор (PMOS), или МОП-транзистор с каналом p-типа, имеющий выводы истока и стока p-типа в подложке n-типа, либо n-канальный МОП-транзистор (NMOS), или МОП-транзистор с каналом n-типа, имеющий выводы истока и стока n-типа в подложке р-типа.
[0043] Электроды 12, 14 могут содержать любой подходящий проводящий материал. Примеры подходящих материалов истока и стока включают кобальт, силицид кобальта, никель, силицид никеля, алюминий, вольфрам, медь, титан, молибден, оксид индия-олова (ITO), оксид индия-цинка, золото, платину, углерод и т.д.
[0044] Электропроводящий канал 16 может представлять собой наноструктуру, которая имеет по меньшей мере один размер в наномасштабе (в пределах от 1 нм до менее 1 мкм). В одном примере упомянутый по меньшей мере один размер относится к наибольшему размеру.
2
[0045] Электропроводящий канал 16 также может иметь любую подходящую геометрическую форму, такую как трубчатая структура, нитевидная структура, планарная структура и т.д., и может быть любым подходящим полупроводящим или проводящим материалом. В качестве примеров, электропроводящий канал 16 может быть выбран из группы, состоящей из полупроводящей наноструктуры, графеновой наноструктуры, металлической наноструктуры, проводящей полимерной наноструктуры или молекулярного провода (молекулярной нити). В некоторых примерах наноструктура может представлять собой много- или одностенную нанотрубку, нанопровод (нанонить), наноленту и т.д. В качестве конкретных примеров, наноструктура может представлять собой углеродную нанотрубку, одностенную углеродную нанотрубку, кремниевую нанонить, кремниевую нанотрубку, полимерную нанонить, графеновую наноленту, наноленту из MoS, кремниевую наноленту и т.д.
[0046] В системе 10, 10' заряженная молекула 18, 18' присоединяется, ковалентно или нековалентно, к электропроводящему каналу 16 датчика 11, 11' заряда. Заряженная молекула 18, 18' может быть непосредственно связана с электропроводящим каналом 16, или же может быть опосредованно (не напрямую) связана с электропроводящим каналом 16 через привязку. Прикрепление заряженной молекулы 18, 18' поддерживает заряженную молекулу 18, 18' в окрестности, например, в пределах нескольких дебаевских длин, от электропроводящего канала 16. Может использоваться любая подходящая заряженная молекула 18, 18', которая может претерпевать обратимое связывание с целевой меткой 24 меченого нуклеотида 26. Более конкретно, заряженная молекула 18, 18' включает в себя сайт 28 распознавания, который способен обратимо связываться с меткой 24, имеет несвязанную предпочтительную конформацию A, ассоциированную с конфигурацией несвязанного заряда (см. верхнюю часть (помечена (i)) на каждой из фиг. 1A и фиг. 1B), и имеет предпочтительную конформацию B, ассоциированную с конфигурацией заряда, когда сайт 28 распознавания связан с меткой 24 (см. нижнюю часть (помечена (ii) на каждой из фиг. 1A и фиг. 1B)).
[0047] Термин «несвязанная предпочтительная конформация» означает одну пространственную компоновку, которая предпочтительно проявляется заряженной молекулой 18, 18', когда метка 24 не связана с ней. Заряженная молекула 18, 18' может динамически переходить между несколькими различными конформациями, когда метка 24 не связана. Тем не менее, заряженная молекула 18, 18' имеет предпочтительную пространственную компоновку, которая проявляется чаще других пространственных компоновок, когда целевая метка 24 не связана. В этом примере, эта предпочтительная пространственная компоновка (или предпочтительно проявляемая пространственная компоновка) является наиболее вероятной компоновкой, например, вследствие стабильности молекулы и/или ее нахождения в своем самом низком энергетическом состоянии, а значит, представляет собой несвязанную предпочтительную конформацию A. Несвязанная предпочтительная конформация A, в некоторых случаях, может быть самой стабильной конформацией и/или самой низкоэнергетической конформацией.
[0048] Несвязанная предпочтительная конформация A ассоциирована с конфигурацией несвязанного заряда. Конфигурация несвязанного заряда представляет собой распределение зарядов заряженной молекулы 18, 18', когда она находится в своей несвязанной предпочтительной конформации A.
[0049] Термин «предпочтительная конформация» означает одну пространственную компоновку, которая предпочтительно проявляется заряженной молекулой 18, 18', когда метка 24 обратимо связана с ней. Предпочтительная конформация B заряженной молекулы 18, 18' отличается от несвязанной предпочтительной конформации A. Когда целевая молекула связывается с заряженной молекулой 18, 18', заряженная молекула 18, 18' переходит в предпочтительную пространственную компоновку, которая проявляется чаще других пространственных компоновок, когда целевая метка связана. В этом примере, эта предпочтительная пространственная компоновка является наиболее вероятной компоновкой, например, вследствие стабильности молекулы, когда целевая метка связана, а значит, представляет собой предпочтительную конформацию. В одном примере заряженная молекула 18, 18' имеет множественные конформации в равновесии, и метка 24 способна стабилизировать одну из этих конформаций.
[0050] Предпочтительная конформация B ассоциирована с конфигурацией заряда. Конфигурация заряда представляет собой распределение зарядов заряженной молекулы 18, 18', когда она находится в своей предпочтительной конформации B. Конфигурация заряда, ассоциированная с предпочтительной конформацией B, обнаруживаемо отличается от конфигурации несвязанного заряда. Конфигурация заряда может быть обнаруживаемой (датчиком заряда) в виде повышенной или пониженной абсолютной величины или изменения частоты, и т.д.
[0051] Как упомянуто выше, метка 24 меченого нуклеотида 26 способна обратимо связываться с сайтом 28 распознавания. По сути, сайт 28 распознавания представляет собой временный рецептор для метки 24.
18A
18
A
18A
18
A
[0052] Верхние части (помечены (i)) фиг. 1A и фиг. 1B показывают заряженную молекулу 18, 18' в несвязанной предпочтительной конформации A. Как упомянуто здесь, несвязанная предпочтительная конформация A означает предпочтительную ориентацию или пространственную компоновку заряженной молекулы 18, 18', когда сайт 28 распознавания не имеет связанной с ним метки 24. Несвязанная конформация (показана в (i) на фиг. 1A и фиг. 1B) ассоциирована с конфигурацией несвязанного заряда. Конфигурация несвязанного заряда представляет собой распределение зарядов заряженной молекулы 18, 18', когда она находится в своей несвязанной предпочтительной конформации A. На фиг. 1A и фиг. 1B центроид распределения заряда показан точкой «•», а расстояние между центроидом заряда и поверхностью электропроводящего канала 16 показано как «δ» (фиг. 1A) и «δ'» (фиг. 1B). Как проиллюстрировано на этих фигурах, распределение заряда, центроид и расстояние δ, δ' отличаются для каждой заряженной молекулы 18, 18' и могут изменяться, когда заряженная молекула 18, 18' связывается с целевой меткой 24.
18B
18A
18
B
18
A
[0053] Нижние части (помечены (ii)) фиг. 1A и фиг. 1B показывают заряженную молекулу 18, 18' в предпочтительной конформации B, т.е. когда целевая метка 24 связана с сайтом 28 распознавания. Как упомянуто здесь, предпочтительная конформация B (показана в (ii) на фиг. 1A и фиг. 1B) означает предпочтительную ориентацию или пространственную компоновку заряженной молекулы 18, 18', когда метка 24 связана с сайтом 28 распознавания. Предпочтительная конформация B ассоциирована с конфигурацией заряда. Конфигурация заряда представляет собой распределение зарядов заряженной молекулы 18, 18', когда она находится в своей предпочтительной конформации B. На фиг. 1A(ii) предпочтительная конформация B заряженной молекулы 18 перемещает заряженную молекулу 18 ближе к поверхности электропроводящего канала 16 по сравнению с несвязанной предпочтительной конформацией A. В этом примере предпочтительной конформации B, δменьше δ, и отрицательные или положительные заряды заряженной молекулы 18 находятся ближе, в непосредственной близости от электропроводящего канала 16. На фиг. 1B(ii) предпочтительная конформация B заряженной молекулы 18' перемещает заряженную молекулу 18' дальше от поверхности электропроводящего канала 16 по сравнению с несвязанной предпочтительной конформацией A. В этом примере предпочтительной конформации B, δ'больше δ', и отрицательные или положительные заряды заряженной молекулы 18 находятся еще дальше от электропроводящего канала 16. Проводимость электропроводящего канала 16 изменяется в ответ на движение заряда заряженной молекулы 18, 18'. В раскрытых здесь примерах знак изменения в двух направлениях движения является противоположным относительно друг друга; и фактический знак зависит от природы сенсорной системы 10, 10'. В качестве примеров, знак отклика и отталкивания или притягивания зависит от того, является ли датчик 11, 11' заряда полевым транзистором (FET), и если он представляет собой FET, то от того, находится ли FET в режиме обеднения или инверсии, и если носители в канале являются электронами и дырками.
[0054] Заряженная молекула 18, 18' может представлять собой заряженный аптамер, заряженный белок или заряженный пептид. При использовании здесь термин «заряженный аптамер» означает структурированную и заряженную нуклеиновую кислоту, способную на: 1) обратимое связывание с меткой и 2) изменение своей предпочтительной конформации, а за счет этого и распределения зарядов, при обратимом связывании с меткой; термин «заряженный белок» означает структурированную и заряженную макромолекулу, способную на: 1) обратимое связывание с меткой и 2) изменение своей предпочтительной конформации, за счет этого и распределения зарядов, при обратимом связывании с меткой; и термин «заряженный пептид» означает структурированную и заряженную короткую цепь аминокислотных мономеров, связанных пептидными (амидными) связями, способную на: 1) обратимое связывание с меткой и 2) изменение своей предпочтительной конформации, а за счет этого и распределения зарядов, при обратимом связывании с меткой.
[0055] В некоторых примерах заряженная молекула 18, 18' заряжена отрицательно. Примеры подходящих отрицательно заряженных молекул 18, 18' включают отрицательно заряженные аптамеры, отрицательно заряженные белки, отрицательно заряженные пептиды и другие отрицательно заряженные молекулы. Некоторые конкретные примеры отрицательно заряженных аптамеров включают ДНК-аптамеры, РНК-аптамеры либо их аналоги. Некоторые конкретные примеры отрицательно заряженных белков включают HSF1 (-17), SHFM1 (-21), NFKBIA (-25), RBBP4 (-26), APP (-55), PJA2 (-87) и многие другие. Примеры отрицательно заряженных пептидов включают полиглютамат и полиаспартат7нгщ, а также более структурированные пептиды, такие как суперспирали с отрицательно заряженными поверхностями.
[0056] В некоторых примерах заряженная молекула заряжена положительно. Примеры подходящих положительно заряженных молекул 18, 18' включают положительно заряженные аптамеры, положительно заряженные белки, положительно заряженные пептиды и другие положительно заряженные молекулы. Некоторые конкретные примеры положительно заряженных белков включают H2AFX (+17), PARP1 (+21), ELN (+40), TERT (+98) и многие другие. Примеры положительно заряженных пептидов включают полилизин и полиаргинин, а также более структурированные пептиды, такие как суперспирали с положительно заряженными поверхностями.
[0057] В одном примере заряженная молекула 18, 18' не является полимеразой.
[0058] Заряженная молекула 18, 18' может присоединяться к электропроводящему каналу 16 датчика 11, 11' заряда непосредственно или опосредованно, и/или через ковалентное связывание или нековалентное связывание. Тип связи, образовавшейся между заряженной молекулой 18, 18' и электропроводящим каналом 16, будет зависеть от используемых молекулы 18, 18' и канала 16. Когда в качестве заряженной молекулы 18, 18' используется аптамер, электропроводящий канал 16 может быть силанизирован с образованием силанов с концевыми амино группами, которые могут связываться с тиолированными аптамерами. Другие примеры подходящего химического состава поверхностей, которые могут использоваться для того, чтобы связывать заряженную молекулу 18, 18', могут включать (гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида) (EDC), диарилциклооктин (DBCO), азиды, которые могут вступать в катализируемую медью клик-реакцию, и т.д. В других примерах может быть использована привязка для того, чтобы присоединять заряженную молекулу 18, 18' к электропроводящему каналу 16. Эта привязка может представлять собой любой из примеров, описанных здесь для привязки 22.
[0059] В примере, показанном на фиг. 1A, полимераза 20 иммобилизована на электропроводящем канале 16 датчика 11, 11' заряда. В примере, показанном на фиг. 1B, полимераза 20 иммобилизована на заряженной молекуле 18'. В других примерах полимераза 20 иммобилизована на одном из электродов 12 или 14 (см. фиг. 7B). В еще одних других примерах полимераза 20 иммобилизована на подложке, например, которая служит опорой датчику 11, 11' заряда (см. фиг. 7B). В любом случае, полимераза 20 может быть иммобилизована через привязку 22. Привязка 22 используется в качестве анкера для полимеразы 20. Пример подходящей привязки 22 включает полиэтиленгликоль (PEG). В некоторых примерах привязка 22 удерживает полимеразу 20 на расстоянии по меньшей мере 10 нм от электропроводящего канала 16 или от заряженной молекулы 18. Это может быть желательным, например, тем, что конформные изменения полимеразы 20, зарядов полимеразы 20 и/или зарядов целевой/матричной полинуклеотидной цепи, удерживаемой полимеразой 20, не создают помех операции восприятия заряда датчиком 11, 11' заряда.
[0060] Может использоваться любая подходящая полимераза 20. Примеры включают полимеразы из семейства A, такие как Bsu-полимераза, Bst-полимераза, Taq-полимераза, T7-полимераза и многие другие; полимеразы из семейства B, такие как Phi29-полимераза, Pfu-полимераза, KOD-полимераза и многие другие; полимеразы из семейства C, такие как ДНК-полимераза III типа кишечной палочки (Escherichia coli) и многие другие; полимеразы из семейства D, такие как ДНК-полимераза II типа Pyrococcus furiosus и многие другие; полимеразы из семейства X, такие как ДНК-полимераза μ, ДНК-полимераза β, ДНК-полимераза σ и многие другие.
[0061] Следует понимать, что полимераза 20 не высвобождается в результате связывания целевой метки 24 с заряженной молекулой 18, 18'. Наоборот, полимераза 20 остается привязанной, например, к каналу 16 или к заряженной молекуле 18, 18', или к некоторому другому компоненту проточной ячейки, когда происходит событие связывания и после того, как происходит событие связывания.
[0062] В некоторых раскрытых здесь примерах заряженная молекула 18, 18' и полимераза 20 представляют собой различные (отдельные и разные) объекты, имеющие различные роли/функции, которые вместе обеспечивают возможность восприятия одиночных молекул. В примере восприятия одиночной молекулы сигнал обнаруживается на датчике 11, 11' заряда по мере того, как нуклеотид встраивается в образующуюся цепь, которая формируется вдоль матричной цепи. В течение одного примерного события встраивания нуклеотида полимераза 20 удерживает матричную полинуклеотидную цепь и встраивает один нуклеотид в образующуюся цепь, которая является комплементарной нуклеотиду вдоль матрицы, при этом заряженная молекула 18, 18' обратимо связывает метку (которая присоединена к встраиваемому нуклеотиду) и претерпевает конформационное изменение, которое приводит к идентифицируемому сигналу на датчике 11, 11' заряда. Как упомянуто здесь, в некоторых примерах, может быть желательным конфигурировать полимеразу 20 (например, регулированием длины привязки 22) так, что любые конформационные изменения полимеразы 20 не создают помех сигналу, генерируемому посредством конформационного изменения заряженной молекулы 18, 18'.
[0063] Как показано на фиг. 1A(ii) и 1B(ii), меченый нуклеотид 26 вводится в сенсорную систему 10, 10'. Меченый нуклеотид 26 включает в себя нуклеотид 30, связывающую молекулу 32, присоединенную к фосфатной группе нуклеотида 30, и специфичную к сайту распознавания метку 24 (также называемую просто меткой 24 или целевой меткой 24), присоединенной к связывающей молекуле 32. Меченый нуклеотид 26 может считаться ненатуральным или синтетическим нуклеотидом, поскольку он структурно или химически отличается от природного.
[0064] Нуклеотид 30 меченого нуклеотида 26 может представлять собой природный нуклеотид. Природные нуклеотиды включают азотсодержащее гетероциклическое основание, сахар и одну или более фосфатных групп. Примеры природных нуклеотидов включают, например, рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. В рибонуклеотиде сахаром является рибоза, а в дезоксирибонуклеотиде сахаром является дезоксирибоза (т.е. сахар с отсутствующей гидроксильной группой, которая присутствует в 2'-положении в рибозе). В одном примере нуклеотид 30 присутствует в форме полифосфата, поскольку он включает в себя несколько фосфатных групп (например, трифосфат (т.е. гамма-фосфат), тетрафосфат, пентафосфат, гексафосфат (как показано на фиг. 5) и т.д.). Гетероциклическое основание (т.е. нуклеооснование) может представлять собой пуриновое основание или пиримидиновое основание, или любой другой аналог нуклеооснования. Пуриновые основания включают аденин (A) и гуанин (G) и их модифицированные производные или аналоги. Пиримидиновые основания включают цитозин (C), тимин (T) и урацил (U) и их модифицированные производные или аналоги. Атом C-1 дезоксирибозы связан с N-1 пиримидина или N-9 пурина.
[0065] Меченый нуклеотид 26 также включает в себя связывающую молекулу 32. Связывающая молекула 32 может представлять собой любую длинноцепочечную молекулу, которая может химически связываться, на одном конце, с фосфатной(ыми) группой(ами) нуклеотида 30 и которая может химически связываться, на другом конце, с меткой 24. Связывающая молекула 32 также может выбираться таким образом, что она не будет взаимодействовать с полимеразой 20. Связывающая молекула 32 выбирается таким образом, что она является достаточно длинной для того, чтобы позволить метке 24 связаться с сайтом 28 распознавания заряженной молекулы 18, 18', пока, например, нуклеотид 30 удерживается полимеразой 20.
[0066] В качестве примеров, связывающая молекула 32 может включать в себя алкильную цепь, поли(этиленгликольную) цепь, амидогруппу, фосфатную группу, гетероцикл, такой как триазол, нуклеотиды либо их комбинации. Примеры алкильной цепи могут включать по меньшей мере 6 атомов углерода, а примеры поли(этиленгликольной) цепи могут включать по меньшей мере 3 этиленгликольных звена.
[0067] Следующий пример иллюстрирует пример меченого нуклеотида 26, в котором связывающая молекула 32 содержит алкильную цепь, амидную группу, поли(этиленгликольную) цепь и триазол:
Следующий пример иллюстрирует другой пример меченого нуклеотида 26, в котором связывающая молекула 32 содержит алкильные цепи, амидную группу, поли(этиленгликольные) цепи, триазол и фосфатную группу:
Следующий пример иллюстрирует еще один другой пример меченого нуклеотида 26, в котором связывающая молекула 32 содержит алкильные цепи, амидные группы, поли(этиленгликольные) цепи, триазол и фосфатную группу:
Следующий пример иллюстрирует еще один дополнительный пример меченого нуклеотида 26, в котором связывающая молекула 32 содержит алкильные цепи, амидную группу, поли(этиленгликольные) цепи, триазол, фосфатную группу и полинуклеотидную цепь:
[0068] Хотя было описано несколько примерных связывающих молекул 32, следует понимать, что могут использоваться другие связывающие молекулы 32.
[0069] Специфичная к сайту распознавания метка 24 представляет собой молекулу, которая может распознаваться заряженной молекулой 18, 18' и которая может обратимо связываться с заряженной молекулой 18, 18' на сайте 28 распознавания. Примеры подходящих специфичных к сайту распознавания меток 24 включают антибиотики, такие как канамицин, ливидомицин, тобрамицин, неомицин, виомицин, стрептомицин и другие; ферментные кофакторы, такие как FMN, NAD, витамин B12, ксантен и другие; аминокислоты, такие как аргинин, цитруллин, аргининамид, валин, изолейцин, триптофан и другие; и многие разнообразные малые молекулы, такие как теофиллин, дофамин, сульфородамин, целлобиоза и другие.
[0070] Фиг. 1A и фиг. 1B иллюстрируют примеры заряженной молекулы 18, 18', которая способна связываться с одной целевой меткой 24 одного меченого нуклеотида 26. В других примерах один меченый нуклеотид 26 может включать в себя несколько меток 24, которые могут связываться с одной единственной заряженной молекулой 18, 18' (фиг. 2), или одна заряженная молекула 18, 18' может включать в себя несколько сайтов 28 распознавания, каждый из которых может связываться с соответствующей меткой 24 соответствующего нуклеотида (фиг. 3A-3E).
[0071] На фиг. 2 заряженная молекула 18' включает в себя первый сайт 28A распознавания, который должен обратимо присоединять первую метку 24 меченого нуклеотида 26', и дополнительно включает в себя второй сайт 28B распознавания, который должен обратимо присоединять вторую метку 24' меченого нуклеотида 26'. Этот пример включает в себя три различных конформационных изменения: одно - когда связана только одна первая метка 24, другое - когда связана только одна вторая метка 24', и еще одно - когда обе метки 24, 24' связаны одновременно. На фиг. 2 специфичное конформационное изменение заряженной молекулы 18' достигается посредством связывания двух различных меток 24, 24' с двумя различными сайтами 28A, 28B распознавания. Как проиллюстрировано, один меченый нуклеотид 26' включает в себя обе метки 24 и 24', и эти метки 24, 24' присоединяются к одному нуклеотиду 30 соответствующими связывающими молекулами 32 и 32'. Любые примеры меток 24 и связывающих молекул 32 могут использоваться в этом примере меченого нуклеотида 26', при условии, что метки 24 и 24' отличаются друг от друга и могут быть распознаны сайтами 28A и 28B распознавания заряженной молекулы 18', либо по отдельности, либо одновременно. В показанном примере, когда обе метки 24, 24' являются связанными, заряженная молекула 18' находится в одной из своих модифицированных конформаций B, и в результате получается обнаруживаемый сигнал.
[0072] Хотя на фиг. 2 показана заряженная молекула 18' с присоединенной к ней полимеразой 20, следует понимать, что в показанном на фиг. 2 примере могут использоваться заряженная молекула 18 и отдельно присоединенная полимераза 20.
[0073] В еще одном другом примере, не показанном на чертежах, заряженная молекула 18, 18' включает в себя два сайта распознавания (например, 28A, 28B), любой из которых может связываться с одной меткой 24, которая присоединена к нуклеотиду 30. Этот пример включает в себя два различных предпочтительных конформационных изменения: одно - когда метка 24 связывается с первым сайтом 28A распознавания, а другое - когда метка 24 связывается со вторым сайтом 28B распознавания.
[0074] На фиг. 3A-3E заряженная молекула 18' включает в себя четыре различных сайта 28A, 28B, 28C, 28D распознавания, каждый из которых способен обратимо связываться с различной целевой меткой 24A, 24B, 24C, 24D различных меченых нуклеотидов 26A, 26B, 26C, 26D. Хотя на фиг. 3A-3E показана заряженная молекула 18' с присоединенной к ней полимеразой 20, следует понимать, что в показанном на фиг. 3A-3E примере могут использоваться заряженная молекула 18 и отдельно присоединенная полимераза 20.
1
2
3
4
[0075] В этом примере, как показано на фиг. 3A, заряженная молекула 18' включает в себя первый сайт 28A распознавания для того, чтобы обратимо присоединять первую метку 24A первого меченого нуклеотида 26A, и имеет первую предпочтительную конформацию B, ассоциированную с первой конфигурацией заряда, когда первый сайт 28A распознавания связан с первой меткой 24A. Как показано на фиг. 3B, заряженная молекула 18' дополнительно включает в себя второй сайт 28B распознавания для того, чтобы обратимо присоединять вторую метку 24B второго меченого нуклеотида 26B, и имеет вторую предпочтительную конформацию B, ассоциированную со второй конфигурацией заряда, когда второй сайт 28B распознавания связан со второй меткой 24B. Как показано на фиг. 3C, заряженная молекула 18' дополнительно включает в себя третий сайт 28C распознавания для того, чтобы обратимо присоединять третью метку 24C третьего меченого нуклеотида 26C, и имеет третью предпочтительную конформацию B, ассоциированную с третьей конфигурацией заряда, когда третий сайт 28C распознавания связан с третьей меткой 24C. Как показано на фиг. 3D, заряженная молекула 18' дополнительно включает в себя четвертый сайт 28D распознавания для того, чтобы обратимо присоединять четвертую метку 24D четвертого меченого нуклеотида 26D, и имеет четвертую предпочтительную конформацию B, ассоциированную с четвертой конфигурацией заряда, когда четвертый сайт 28D распознавания связан с четвертой меткой 24D.
0
0
[0076] Несвязанная предпочтительная конформация A заряженной молекулы 18' показана на фиг. 3E. Как изображено, несвязанная предпочтительная конформация A этого примера (которая ассоциирована с конфигурацией несвязанного заряда) возникает, когда каждый из первого сайта 28A распознавания, второго сайта 28B распознавания, третьего сайта 28C распознавания и четвертого сайта 28C распознавания является несвязанным (т.е. меченые нуклеотиды 26A-26D не связаны с сайтами 28A-28D). Центроид распределения заряда для несвязанной предпочтительной конформации A имеет заданное расстояние δ от поверхности электропроводящего канала 16. Это расстояние δ изменяется в зависимости от того меченого нуклеотида 26A-26D, который обратимо связывается с заряженной молекулой 18'.
0
++
[0077] В примере, показанном на фиг. 3A, меченый нуклеотид 26A включает в себя полифосфат гуанина в качестве нуклеотида 30A, линкер (связывающую молекулу) 32A и уникальную метку 24A. Когда полимераза 20 встраивает нуклеотид 30A, эффективная концентрация метки 24A фактически увеличивается поблизости от заряженной молекулы 18' (которая имеет сайт 24A распознавания для метки 24A), заставляя заряженную молекулу 18' связывать метку 24A. В примере, показанном на фиг. 3A, это связывание приводит к тому, что расстояние δ между центроидом заряда и поверхностью канала увеличивается, как обозначено символом «δ».
0
.
++
+
++
+
[0078] В примере, показанном на фиг. 3B, меченый нуклеотид 26B включает в себя полифосфат аденина в качестве нуклеотида 30B, линкер 32B и уникальную метку 24B. Когда полимераза 20 встраивает нуклеотид 30B, эффективная концентрация метки 24B фактически увеличивается поблизости от заряженной молекулы 18' (которая имеет сайт 24B распознавания для метки 24A), заставляя заряженную молекулу 18' связывать метку 24B. В примере, показанном на фиг. 3B, это связывание приводит к тому, что расстояние δ между центроидом заряда и поверхностью канала увеличивается, как обозначено символом «δ+» Хотя предпочтительные конформационные изменения, показанные на фиг. 3A и фиг. 3B, оба приводят к увеличенным расстояниям δ и δ, расстояния δ и δ отличаются и поэтому приведут к разным измеримым сигналам.
0
-
[0079] В примере, показанном на фиг. 3C, меченый нуклеотид 26C включает в себя полифосфат цитозина в качестве нуклеотида 30C, линкер 32C и уникальную метку 24C. Когда полимераза 20 встраивает нуклеотид 30C, эффективная концентрация метки 24C фактически увеличивается поблизости от заряженной молекулы 18' (которая имеет сайт 24C распознавания для метки 24C), заставляя заряженную молекулу 18' связывать метку 24C. В примере, показанном на фиг. 3C, это связывание приводит к тому, что расстояние δ между центроидом заряда и поверхностью канала снижается, как обозначено символом «δ».
0
--
.
-
--
-
--
[0080] В примере, показанном на фиг. 3D, меченый нуклеотид 26D включает в себя полифосфат тимина в качестве нуклеотида 30D, линкер 32D и уникальную метку 24D. Когда полимераза 20 встраивает нуклеотид 30D, эффективная концентрация метки 24D фактически увеличивается поблизости от заряженной молекулы 18' (которая имеет сайт 24D распознавания для метки 24D), заставляя заряженную молекулу 18' связывать метку 24D. В примере, показанном на фиг. 3D, это связывание приводит к тому, что расстояние δ между центроидом заряда и поверхностью канала снижается, как обозначено символом «δ» Хотя предпочтительные конформационные изменения, показанные на фиг. 3C и фиг. 3D, оба приводят к сниженным расстояниям δ и δ, расстояния δ и δ отличаются и поэтому приведут к разным измеримым сигналам.
[0081] В примере, показанном на фиг. 3A-3E, одна заряженная молекула 18' имеет четыре различных сайта 28A-28D распознавания и в силу этого имеет четыре различных модифицированных конфигурации, которые приводят к четырем различным и разным (отличающимся) измеримым сигналам. Эти различные и разные сигналы обеспечивают возможность идентификации четырех различных нуклеотидов 30A-30D по мере того, как они соответственно встраиваются в матричную цепь.
1
2
3
4
[0082] Также предусмотрены другие вариации заряженной молекулы с множественными сайтами распознавания. Например, две заряженных молекулы 18, 18', имеющие два различных сайта 28 распознавания, могут быть присоединены к электропроводящему каналу 16 датчика 11, 11' заряда. Для каждой из этих заряженных молекул 18, 18' несвязанная предпочтительная конформация A проявлялась бы тогда, когда два различных сайта распознавания остаются несвязанными. В этом примере первая из двух заряженных молекул 18, 18' включает в себя первый сайт распознавания (например, 28A на фиг. 3A) для того, чтобы обратимо присоединять первую метку (например, 24A на фиг. 3A) первого меченого нуклеотида (например, 26A на фиг. 3A), и имеет первую предпочтительную конформацию (например, B на фиг. 3A), ассоциированную с первой конфигурацией заряда, когда первый сайт распознавания связан с первой меткой, и дополнительно включает в себя второй сайт распознавания (например, 28B на фиг. 3B) для того, чтобы обратимо присоединять вторую метку (например, 28B на фиг. 3A-3E) второго меченого нуклеотида (например, 26B на фиг. 3A-3E), и имеет вторую предпочтительную конформацию (например, B на фиг. 3B), ассоциированную со второй конфигурацией заряда, когда второй сайт распознавания связан со второй меткой. В этом примере вторая из двух заряженных молекул 18, 18' включает в себя третий сайт распознавания (например, 28C на фиг. 3C) для того, чтобы обратимо присоединять третью метку (например, 24C на фиг. 3C) третьего меченого нуклеотида (например, 26C на фиг. 3C), и четвертый сайт распознавания (например, 28D на фиг. 3D) для того, чтобы обратимо присоединять четвертую метку (например, 24D на фиг. 3D) четвертого меченого нуклеотида (например, 26D на фиг. 3D), и также имеет третью предпочтительную конформацию (например, B на фиг. 3C), ассоциированную с третьей конфигурацией заряда, когда третий сайт распознавания связан с третьей меткой, и имеет четвертую предпочтительную конформацию (например, B на фиг. 3D), ассоциированную с четвертой конфигурацией заряда, когда четвертый сайт распознавания связан с четвертой меткой. В этом примере две различных заряженных молекулы 18, 18' могут использоваться для идентификации четырех различных меченых нуклеотидов 26A-26D.
[0083] В еще одних других примерах сенсорная система 10, 10' может включать в себя несколько заряженных молекул 18, 18', присоединенных к электропроводящему каналу 16 датчика 11, 11' заряда. В одном примере каждая из заряженных молекул 18, 18' способна обратимо связываться с различным меченым нуклеотидом 26. Пример этой сенсорной системы 10'' показан на фиг. 4.
[0084] В этом примере четыре различных заряженных молекулы 18A, 18B, 18C, 18D присоединены к электропроводящему каналу 16 датчика 11'' заряда. В этом примере каждая из заряженных молекул 18A, 18B, 18C, 18D имеет свои собственные сайт распознавания, несвязанную предпочтительную конформацию и предпочтительную конформацию (во время связывания метки), которые являются независимыми от каждой из других заряженных молекул 18A, 18B, 18C, 18D. Более конкретно, первая заряженная молекула 18A, присоединенная к электропроводящему каналу 16, включает в себя первый сайт распознавания для обратимого связывания первой метки первого меченого нуклеотида, несвязанную предпочтительную конформацию, когда первый сайт распознавания является несвязанным, и предпочтительную конформацию с конфигурацией заряда, когда первый сайт распознавания связан с первой меткой. В этом примере вторая заряженная молекула 18B, присоединенная к электропроводящему каналу 16, включает в себя второй сайт распознавания для обратимого связывания второй метки второго меченого нуклеотида, несвязанную предпочтительную конформацию второй заряженной молекулы и предпочтительную конформацию второй заряженной молекулы с конфигурацией заряда второй заряженной молекулы, когда второй сайт распознавания связан со второй меткой. Также в этом примере третья заряженная молекула 18C, присоединенная к электропроводящему каналу 16, включает в себя третий сайт распознавания для обратимого связывания третьей метки третьего меченого нуклеотида, несвязанную предпочтительную конформацию третьей заряженной молекулы и предпочтительную конформацию третьей заряженной молекулы с конфигурацией заряда третьей заряженной молекулы, когда третий сайт распознавания связан с третьей меткой. Также в этом примере четвертая заряженная молекула 18D, присоединенная к электропроводящему каналу 16, включает в себя четвертый сайт распознавания для обратимого связывания четвертой метки четвертого меченого нуклеотида, несвязанную предпочтительную конформацию четвертой заряженной молекулы и предпочтительную конформацию четвертой заряженной молекулы с конфигурацией заряда четвертой заряженной молекулы, когда четвертый сайт распознавания связан с четвертой меткой.
[0085] Как показано на фиг. 4, с электропроводящим каналом 16 может быть связана одна полимераза 20. В этом примере длина каждой связывающей молекулы 32 соответствующих меченых нуклеотидов 26 может выбираться таким образом, что когда соответствующий нуклеотид 30 удерживается полимеразой 20, соответствующая метка 24 может связываться с соответствующей ей заряженной молекулой 18A, 18B, 18C, 18D, а не со смежной заряженной молекулой 18A, 18B, 18C, 18D.
[0086] Фиг. 4 также иллюстрирует пример сенсорного устройства 40. Пример сенсорного устройства 40, показанный на фиг. 4, включает в себя проточную ячейку 41 и сенсорную систему 10'', интегрированную в проточную ячейку 41. Следует понимать, что в сенсорном устройстве 40 может использоваться любой пример сенсорной системы 10, 10', 10''.
[0087] Проточная ячейка 41 представляет собой сосуд, который содержит сенсорную систему 10''. Следует понимать, что и другие сосуды, такие как лунка, трубка, канал, кювета, чашка Петри, бутылка или т.п., могут альтернативно содержать сенсорную систему 10''. Циклические процессы, такие как реакции секвенирования нуклеиновых кислот, особенно хорошо подходят для проточных ячеек 41.
[0088] Примерные проточные ячейки 41 включают в себя подложку/опору 13 и крышку 43, непосредственно или опосредованно связанную с ней или выполненную заодно с ней. Проточная ячейка 41 может включать в себя впуск 45 текучей среды и выпуск 47 текучей среды, которые обеспечивают доставку объемных реагентов к одной сенсорной системе 10'' или к массиву сенсорных систем 10'', содержащихся в проточной ячейке 41. Любая отдельная проточная ячейка 41 может включать в себя десятки, сотни, тысячи, миллионы или даже миллиарды индивидуально адресуемых и считываемых сенсорных систем 10, 10', 10''.
[0089] Пример, показанный на фиг. 7A и 7B, является одним примером проточной ячейки 41', которая включает в себя массив сенсорных систем 10, 10', 10''. Этот массив может включать в себя несколько сенсорных систем 10, 10', 10'', каждая из которых расположена на подложке и выполнена с электронной схемой таким образом, что она является индивидуально адресуемой и считываемой. В одном примере каждая сенсорная система 10, 10', 10'' массива может быть расположена на подложке в отдельном углублении. Углубления физически разделяют каждую из сенсорных систем 10, 10', 10''.
[0090] В примере по фиг. 7A проточная ячейка 41' включает в себя проточные каналы 52. Хотя показаны несколько проточных каналов 52, следует понимать, что в состав проточной ячейки 41' может входить любое число каналов 52 (например, один канал 52, четыре канала 52 и т.д.). Каждый проточный канал 52 представляет собой зону, образованную между двумя скрепленными компонентами (например, подложкой и крышкой либо двумя подложками), которая могут иметь вводимые в нее и удаляемые из нее текучие среды (например, описанные здесь). Каждый проточный канал 52 может быть изолирован от другого проточного канала 52, так что текучая среда, введенная в любой конкретный проточный канал 52, не протекает ни в один смежный проточный канал 52. Некоторые примеры введенных в проточные каналы 52 текучих сред могут вводить компоненты реакции (например, меченые нуклеотиды 26 и т.д.), промывные растворы и т.д.
[0091] Пример архитектуры в проточных каналах 52 проточной ячейки 41' показан на фиг. 7B. В примере, показанном на фиг. 7B, проточная ячейка 41' включает в себя подложку 13, включающую в себя опору 54 и структурированный материал 56, расположенный на опоре 54. Структурированный материал 56 образует углубления 58, отделенные промежуточными областями 60. В этом примере поверхность опоры 54 открыта в каждом из углублений 58, и в каждом углублении 58 расположена сенсорная система 10, 10', 10''.
2
3
4
5
x
2
[0092] Опора 54 на фиг. 7B обеспечивает опору для других компонентов проточной ячейки 41'. Опора 54 является в общем жесткой и является нерастворимой в водной жидкости. Примеры подходящих опор 54 включают эпоксидный силоксан, стекло, модифицированное стекло, пластмассу, нейлон, керамику/керамические оксиды, кремнезем (диоксид кремния (SiO)), плавленый кварц, материалы на основе диоксида кремния, силикат алюминия, кремний, модифицированный кремний (например, легированный бором p+ кремний), нитрид кремния (SiN), пентоксид тантала (TaO) или другой(-ие) оксид(-ы) тантала (TaO), оксид гафния (HfO), неорганические стекла или т.п. Некоторые примеры подходящей пластмассы для опоры 54 включают акриловые полимеры, полистирол, сополимеры стирола и других материалов, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретаны, политетрафторэтилен (такой как TEFLON или Тефлон компании Chemours), циклические олефины/циклоолефиновые полимеры (COP) (такие как ZEONOR компании Zeon), полиимиды и т.д. Опора 54 также может представлять собой стекло или кремний, со слоем покрытия из оксида тантала или другого керамического оксида на поверхности.
[0093] Формой опоры 54 может быть пластина, панель, прямоугольный лист, кристалл или любая другая подходящая конфигурация. В одном примере опора 54 может представлять собой круглую пластину или панель, имеющую диаметр в пределах от примерно 2 мм до примерно 300 мм. В качестве более конкретного примера, опора 54 представляет собой пластину, имеющей диаметр в пределах от примерно 200 мм до примерно 300 мм. В другом примере опора 54 может представлять собой прямоугольный лист или панель с его или ее наибольшим размером вплоть до примерно 10 футов (~3 метров). В качестве конкретного примера, опора 54 представляет собой кристалл, имеющий ширину в пределах от примерно 0,1 мм до примерно 10 мм. Хотя представлены примерные размеры, следует понимать, что может использоваться опора 54 с любыми подходящими размерами.
[0094] В примере, показанном на фиг. 7B, структурированный материал 56 расположен на опоре 54. Следует понимать, что для структурированного материала 56 может использоваться любой материал, который может быть избирательно осажден либо осажден и структурирован с образованием узора из углублений 58 и промежуточных областей 60.
2
5
2
3
2
2
[0095] В качестве одного примера, на опору 66 может быть избирательно нанесен неорганический оксид методом осаждения из паровой фазы, аэрозольной печати или струйной печати. Примеры подходящих неорганических оксидов включают оксид тантала (например, TaO), оксид алюминия (например, AlO), оксид кремния (например, SiO), оксид гафния (например, HfO) и т.д.
[0096] В качестве другого примера, на опору 54 может быть нанесена и затем структурирована смола. Подходящие методы осаждения включают в себя химическое осаждение из паровой фазы, нанесение покрытия погружением, нанесение покрытия окунанием, нанесение покрытия центрифугированием, нанесение покрытия распылением, распределение разливом, нанесение покрытия ультразвуковым распылением, нанесение покрытия ножевым устройством, аэрозольную печать, трафаретную печать, микроконтактную печать и т.д. Подходящие методы структурирования (формирования узора) включают в себя фотолитографию, наноимпринтную литографию (NIL), методы штамповки, методы тиснения, методы формования, методы микротравления, методы печати и т.д. Некоторые примеры подходящих смол включают смолу на основе полиэдрических олигомерных силсесквиоксанов (POSS), эпоксидную смолу не на основе POSS, поли(этиленгликольную) смолу, полиэфирную смолу (например, эпоксиды с раскрытием кольца), акриловую смолу, акрилатную смолу, метакрилатную смолу, аморфную фторполимерную смолу (например, CYTOP компании Bellex) и их комбинации.
1,5
2
2
3/2
n
8
1
8
[0097] Используемый здесь термин «полиэдрический олигомерный силсесквиоксан (POSS)» означает химический состав, который представляет собой гибридное промежуточное соединение (например, RSiO) между диоксидом кремния (SiO) и силиконом (RSiO). Примером POSS может быть POSS, описанный в работе Kehagias и др., Microelectronic Engineering, 86 (2009), стр. 776-778, которая полностью включена сюда по ссылке. В одном примере этот состав представляет собой кремнийорганическое соединение с химической формулой [RSiO], в котором R-группы могут быть идентичными или отличающимися. Примерные R-группы для POSS включают эпокси, азид/азидо, тиол, поли(этиленгликоль), норборнен, тетразин, акрилаты и/или метакрилаты или, дополнительно, например, алкильные, арильные, алкоксильные и/или галогеналкильные группы. Раскрытый здесь состав смолы может содержать одну или более различных каркасных или сердцевинных структур в качестве мономерных звеньев. Полиэдрическая структура может быть структурой T, такой как: , и представлена так: . Это мономерное звено типично имеет восемь ответвлений функциональных групп R-R.
10
12
6
14
16
[0098] Мономерное звено может иметь каркасную структуру с 10 атомами кремния и 10 R-группами, называемую T, такую как: , либо может иметь каркасную структуру с 12 атомами кремния и 12 R-группами, называемую T, такую как: . Материал на основе POSS может альтернативно включать в себя каркасные структуры T, T или T. Среднее содержание каркасной структуры можно скорректировать во время синтеза и/или регулировать способами очистки, и в раскрытых здесь примерах может использоваться некоторое распределение размеров каркаса мономерного(ых) звена(ьев).
[0099] Как показано на фиг. 7B, структурированный материал 56 включает образованные в нем углубления 58 и промежуточные области 60, разделяющие смежные углубления 58. Может быть предусмотрено множество различных схем размещения углублений 58, включая правильные, повторяющиеся и неправильные узоры. В одном примере углубления 58 расположены шестиугольной решеткой для плотной упаковки и повышенной плотности. Другие схемы размещения могут включать в себя, например, прямолинейные (прямоугольные) схемы размещения, треугольные схемы размещения и т.д. В некоторых примерах схема размещения или узор может представлять собой x-y формат углублений 58, которые упорядочены в строки и столбцы. В некоторых других примерах схема размещения или узор может представлять собой повторяющееся расположение углублений 58 и/или промежуточных областей 60. В еще одних других примерах схема размещения или узор может представлять собой случайное расположение углублений 58 и/или промежуточных областей 60. Узор может включать в себя точки, подушки, лунки, столбики, полоски, завитки, линии, треугольники, прямоугольники, круги, дуги, галочки, клеточки, диагонали, стрелки, квадраты и/или штриховки.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
[00100] Схема размещения или узор углублений 58 может характеризоваться плотностью углублений 58 (числом углублений 58) на заданной площади. Например, углубления 58 могут присутствовать с плотностью приблизительно 2 миллиона на мм. Плотность может быть настроена на различные плотности, включая, например, плотность примерно 100 на мм, примерно 1000 на мм, примерно 0,1 миллиона на мм, примерно 1 миллион на мм, примерно 2 миллиона на мм, примерно 5 миллионов на мм, примерно 10 миллионов на мм, примерно 50 миллионов на мм, либо больше или меньше. Дополнительно следует понимать, что плотность углублений 58 в структурированном материале 56 может находиться между одним из нижних значений и одним из верхних значений, выбранных из вышеприведенных диапазонов. В качестве примера, массив высокой плотности может характеризоваться как имеющий углубления 58, разделенные менее чем примерно 100 нм, массив средней плотности может характеризоваться как имеющий углубления 58, разделенные от примерно 400 нм до примерно 1 мкм, и массив низкой плотности может характеризоваться как имеющий углубления 58, разделенные более чем примерно 1 мкм. Хотя представлены примерные плотности, следует понимать, что могут использоваться любые подходящие плотности.
[00101] Схема размещения или узор углублений 58 может также или альтернативно характеризоваться с точки зрения среднего шага или расстояния от центра углубления 58 до центра смежного углубления 58 (межцентрового расстояния) или от края одного углубления 58 до края смежного углубления 58 (межкраевого расстояния). Узор может быть регулярным, так что коэффициент отклонения вокруг среднего шага является небольшим, или узор может быть нерегулярным, причем в этом случае коэффициент отклонения может быть относительно большим. В любом случае, средний шаг, например, может составлять примерно 50 нм, примерно 0,1 мкм, примерно 0,5 мкм, примерно 1 мкм, примерно 5 мкм, примерно 10 мкм, примерно 100 мкм, либо больше или меньше. Средний шаг для конкретного узора углублений 58 может находиться между одним из нижних значений и одним из верхних значений, выбранных из вышеприведенных диапазонов. В одном примере углубления 58 имеют шаг (межцентровое расстояние) примерно 1,5 мкм. Хотя представлены примерные значения среднего шага, следует понимать, что могут использоваться другие значения среднего шага.
[00102] Размер каждого углубления 58 может характеризоваться посредством его объема, глубины и/или диаметра.
-3
3
-2
3
3
3
3
3
4
3
3
3
3
3
3
3
[00103] Каждое углубление 58 может иметь любой объем, который способен удерживать текучую среду. Минимальный или максимальный объем может выбираться, например, для приспосабливания к пропускной способности (например, мультиплексируемости), разрешению, меченым нуклеотидам 26 или реакционной способности аналита, ожидаемым для последующих применений проточной ячейки 41'. Например, объем может составлять по меньшей мере примерно 1×10 мкм, по меньшей мере примерно 1×10 мкм, по меньшей мере примерно 0,1 мкм, по меньшей мере примерно 1 мкм, по меньшей мере примерно 10 мкм, по меньшей мере примерно 100 мкм или больше. Альтернативно или дополнительно, объем может составлять самое большее примерно 1×10 мкм, самое большее примерно 1×10 мкм, самое большее примерно 100 мкм, самое большее примерно 10 мкм, самое большее примерно 1 мкм, самое большее примерно 0,1 мкм или меньше.
3
[00104] Глубина каждого углубления 58 может быть достаточно большой для того, чтобы разместить одну сенсорную систему 10, 10', 10''. В одном примере глубина может составлять по меньшей мере примерно 1 мкм, по меньшей мере примерно 10 мкм, по меньшей мере примерно 100 мкм или больше. Альтернативно или дополнительно, глубина может составлять самое большее примерно 1×10мкм, самое большее примерно 100 мкм, самое большее примерно 10 мкм или меньше. Глубина каждого углубления 58 может быть больше, меньше или между указанными выше значениями.
3
[00105] В некоторых случаях, диаметр или длина и ширина каждого углубления 58 могут составлять по меньшей мере примерно 50 нм, по меньшей мере примерно 0,1 мкм, по меньшей мере примерно 0,5 мкм, по меньшей мере примерно 1 мкм, по меньшей мере примерно 10 мкм, по меньшей мере примерно 100 мкм или больше. Альтернативно или дополнительно, диаметр или длина и ширина могут составлять самое большее примерно 1×10мкм, самое большее примерно 100 мкм, самое большее примерно 10 мкм, самое большее примерно 1 мкм, самое большее примерно 0,5 мкм, самое большее примерно 0,1 мкм или меньше (например, примерно 50 нм). Диаметр или длина и ширина каждого углубления 58 могут быть больше, меньше или между указанными выше значениями.
[00106] Как проиллюстрировано на фиг. 7B, каждое из углублений 58 в массиве включает в себя соответствующий датчик 11, 11', 11'' заряда. Желательно, чтобы каждый датчик 11, 11', 11'' заряда в каждом углублении 58 имел одну заряженную молекулу 18, 18', присоединенную к нему, и имел одну полимеразу 20, присоединенную поблизости от нее. В некоторых примерах каждое углубление 58 имеет внутри себя один датчик 11, 11', 11'' заряда, одну заряженную молекулу 18, 18 и одну полимеразу 20. В других примерах некоторые углубления 58 имеют внутри себя один датчик 11, 11', 11'' заряда, одну заряженную молекулу 18, 18 и одну полимеразу 20; в то время как другие углубления 58 имеют внутри себя один датчик 11, 11', 11'' заряда, одну заряженную молекулу 18, 18 и более одной полимеразы 20; и еще другие углубления 58 имеют внутри себя один датчик 11, 11', 11'' заряда, одну заряженную молекулу 18, 18 и ни одной полимеразы 20. В этих примерах число полимераз 20, которые становятся присоединенными в любом данном углублении 58, может быть случайным и определяться распределением Пуассона.
[00107] В некоторых примерах датчик 11, 11', 11'' заряда с присоединенной к нему заряженной молекулой 18, 18' может быть заранее собран (смонтирован) в углублениях 58. Чтобы присоединять полимеразы 20 в соответствующих углублениях 58, текучая среда, содержащая полимеразу 20, может вводиться в каждую дорожку 52 проточной ячейки 41'. Полимераза 20 может включать в себя привязку 22, которая присоединяется в углублении 58, или же линкер 22 может быть предварительно присоединен в углублении 58, а полимераза 20 может присоединяться к линкеру 22. Текучей среде может быть предоставлена возможность инкубироваться в течение требуемого времени и при требуемой температуре, чтобы позволить присоединиться полимеразам 20.
[00108] Как проиллюстрировано на фиг. 7B, полимераза 20 может присоединяться к любому компоненту и/или любой поверхности в проточной ячейке 41'. В некоторых примерах, полимераза 20 присоединяется к электроду 12 или 14, к поверхности подложки 13 (например, дну углубления 58, боковой стенке углубления 58 и т.д.), на электропроводящем канале 16, на заряженной молекуле 18, 18' и т.д.
[00109] Каждый из датчиков 11, 11', 11'' заряда является индивидуально (отдельно) электрически адресуемым и считываемым. По сути, сигналы, получающиеся в результате возникновения конформационных изменений заряженной молекулы в каждом углублении 58, могут быть обнаружены и проанализированы отдельно.
[00110] Любые примеры сенсорного устройства 40 также могут включать в себя систему 49 доставки реагентов, чтобы избирательно вводить реагент в вход (например, впуск(и) 45 текучей среды) проточной ячейки 41 или дорожки 52 проточной ячейки 41', поверх сенсорных(ой) систем(ы) 10, 10', 10'' и затем из выпуска 47 текучей среды. Система 49 доставки реагентов может включать в себя патрубки или другие жидкостные системы, которые могут постоянно или съемно присоединяться к впуску 45 текучей среды. Система 49 доставки реагентов может включать в себя контейнер 51 для образца. Реагент (включая любой пример меченого нуклеотида 26, подлежащий введению в сенсорную систему 10'') может храниться в контейнере для образца либо может быть приготовлен и введен в контейнер для образца сразу перед использованием. Система 49 доставки реагентов также может включать в себя насос или другое подходящее оборудование для того, чтобы извлекать реагент из контейнера 51 для образца и доставлять его ко впуску 45 текучей среды. В других примерах контейнер 51 для образца расположен так, что реагент может протекать за счет силы тяжести ко впуску 45 текучей среды, по сенсорной системе 10'' и из выпуска 47 текучей среды.
[00111] Датчик 11, 11', 11'' заряда в проточной ячейке 41, 41' также может быть функционально соединен с детектором 15 для обнаружения изменений проводимости датчика 11, 11', 11'' заряда, когда сенсорная система 10, 10', 10'' и сенсорное устройство 40 используются.
[00112] Раскрытые здесь сенсорные системы 10, 10', 10'' могут использоваться в способе измерения. Пример этого способа схематично показан на фиг. 5. Способ включает:
- введение матричной полинуклеотидной цепи 48 в сенсорную систему 10, 10', 10'', включающую в себя: датчик 11, 11', 11'' заряда, включающий в себя два электрода 12, 14 и электропроводящий канал 16, соединяющий два электрода 12, 14; заряженную молекулу 18, 18', присоединенную к электропроводящему каналу 16, причем заряженная молекула 18, 18' включает в себя сайт 28 распознавания; и полимеразу 20, присоединенную к электропроводящему каналу 16 или к заряженной молекуле 18, 18';
- введение реагентов, включая меченые нуклеотиды 26, в сенсорную систему 10, 10', 10'', при этом нуклеотид 30 одного из меченых нуклеотидов 26 связывается с полимеразой 20, и специфичная к сайту распознавания метка 24 одного из меченых нуклеотидов 26 связывается с сайтом 28 распознавания, вызывая конформационное изменение заряженной молекулы 18, 18'; и
- обнаружение отклика датчика 11, 11', 11'' заряда в ответ на конформационное изменение заряженной молекулы 18, 18'.
[00113] Матричная полинуклеотидная цепь 48 может представлять собой любой образец, который должен секвенироваться, и может состоять из ДНК, РНК либо их аналогов (например, пептидных нуклеиновых кислот). Источником матричной (или целевой) полинуклеотидной цепи 48 может быть геномная ДНК, информационная РНК либо другие нуклеиновые кислоты из нативных источников. В некоторых случаях матричная полинуклеотидная цепь 48, которая извлечена из таких источников, может амплифицироваться перед использованием в изложенных здесь способе или системе 40. Может использоваться любой из множества самых разнообразных известных методов амплификации, включая, но не ограничиваясь ими, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), амплификацию по типу катящегося кольца (RCA), амплификацию со множественным замещением (MDA) или рекомбиназную полимеразную амплификацию (RPA). Следует понимать, что амплификация матричной полинуклеотидной цепи 48 перед использованием в изложенных здесь способе или системе 40 является необязательной. По сути, в некоторых примерах матричная полинуклеотидная цепь 48 не будет амплифицироваться до использования. Матричные/целевые полинуклеотидные цепи 48 могут необязательно извлекаться из синтетических библиотек. Синтетические нуклеиновые кислоты могут иметь нативные составы ДНК или РНК либо могут быть их аналогами.
Arabidopsis thaliana
Chlamydomonas reinhardtii
Caenorhabditis elegans
Drosophila melanogaster
Xenopus laevis
dictyostelium discoideum
pneumocystis carinii
Takifugu rubripes
Saccharamoyces cerevisiae
Schizosaccharomyces pombe
plasmodium falciparum
Escherichia coli
staphylococci
mycoplasma pneumoniae
[00114] Биологические образцы, из которых может извлекаться матричная полинуклеотидная цепь 48, включают в себя, например, биологические образцы из млекопитающего, такого как грызун, мышь, крыса, кролик, морская свинка, копытное животное, лошадь, овца, свинья, коза, корова, кошка, собака, примат, человеческий или нечеловеческий примат; растения, такого как арабидопсис (), кукуруза, сорго, овес, пшеница, рис, канола или соя; водорослей, таких как хламидомонада Рейнгардта (); нематода, такая как ; насекомого, такого как дрозофила фруктовая (), москит, плодовая мушка, медоносная пчела или паук; рыбы, такой как данио-рерио; рептилии; амфибии, такой как лягушка или гладкая шпорцевая лягушка (); диктиостелиума (); грибов, таких как пневмоцистоза (), бурый скалозуб (), дрожжи, пекарские дрожжи () или обыкновенные делящиеся дрожжи (); или плазмодии (). Матричные полинуклеотидные цепи 48 также могут извлекаться из прокариотов, таких как бактерия, эштерихия Коли (), стафилококки () или микоплазма пневмонии (); археи; вируса, такого как вирус гепатита С, вирус Эбола или вирус иммунодефицита человека; или вироида. Матричные полинуклеотидные цепи 48 могут извлекаться из гомогенной культуры или популяции вышеуказанных организмов либо, альтернативно, из совокупности нескольких различных организмов, например, в сообществе или экосистеме.
[00115] Кроме того, матричные полинуклеотидные цепи 48 могут не извлекаться из природных источников, а вместо этого могут синтезироваться с использованием известных методов. Например, в изложенных здесь примерах могут синтезироваться и использоваться зонды экспрессии генов или зонды генотипирования.
[00116] В некоторых примерах матричные полинуклеотидные цепи 48 могут быть получены в качестве фрагментов одной или бóльших нуклеиновых кислот. Фрагментация может быть осуществлена с использованием любых из множества самых разнообразных методов, известных в данной области техники, включая, например, небулизацию, соникацию, химическое расщепление, ферментативное расщепление или физическое разрезание. Фрагментация также может получаться в результате использования конкретного метода амплификации, который дает ампликоны посредством копирования только части цепи большей нуклеиновой кислоты. Например, ПЦР-амплификация производит фрагменты, имеющие размер, заданный длиной нуклеотидной последовательности в исходной матрице, которая находится между местоположениями, в которых фланкирующие праймеры гибридизируются во время амплификации. Длина матричной полинуклеотидной цепи 48 может задаваться с точки зрения числа нуклеотидов или с точки зрения метрической длины (например, нанометров).
[00117] Популяция матричных/целевых полинуклеотидных цепей 48 либо их ампликонов может иметь среднюю длину цепи, которая является желательной или подходящей для конкретного применения изложенных здесь способов или системы 40. Например, средняя длина цепи может составлять менее примерно 100000 нуклеотидов, примерно 50000 нуклеотидов, примерно 10000 нуклеотидов, примерно 5000 нуклеотидов, примерно 1000 нуклеотидов, примерно 500 нуклеотидов, примерно 100 нуклеотидов или примерно 50 нуклеотидов. Альтернативно или дополнительно, средняя длина цепи может составлять более примерно 10 нуклеотидов, примерно 50 нуклеотидов, примерно 100 нуклеотидов, примерно 500 нуклеотидов, примерно 1000 нуклеотидов, примерно 5000 нуклеотидов, примерно 10000 нуклеотидов, примерно 50000 нуклеотидов или примерно 100000 нуклеотидов. Средняя длина цепи для популяции целевых полинуклеотидных цепей 48 либо их ампликонов может составлять в диапазоне между максимальным и минимальным значениями, изложенными выше.
[00118] В некоторых случаях, популяция матричных/целевых полинуклеотидных цепей 48 может быть произведена при условиях либо иным образом выполнена имеющей максимальную длину для своих элементов. Например, максимальная длина для элементов может составлять менее примерно 100000 нуклеотидов, примерно 50000 нуклеотидов, примерно 10000 нуклеотидов, примерно 5000 нуклеотидов, примерно 1000 нуклеотидов, примерно 500 нуклеотидов, примерно 100 нуклеотидов или примерно 50 нуклеотидов. Альтернативно или дополнительно, популяция матричных полинуклеотидных цепей 48 либо их ампликонов может быть произведена при условиях либо иным образом выполнена имеющей минимальную длину для своих элементов. Например, минимальная длина для элементов может составлять более примерно 10 нуклеотидов, примерно 50 нуклеотидов, примерно 100 нуклеотидов, примерно 500 нуклеотидов, примерно 1000 нуклеотидов, примерно 5000 нуклеотидов, примерно 10000 нуклеотидов, примерно 50000 нуклеотидов или примерно 100000 нуклеотидов. Максимальная и минимальная длина цепи для матричных полинуклеотидных цепей 48 в популяции может составлять в диапазоне между максимальным и минимальным значениями, изложенными выше.
2+
[00119] Как показано на фиг. 5, матричная полинуклеотидная цепь 48, введенная в сенсорную систему 10 (или 10', 10''), может удерживаться на месте полимеразой 20, которая, в этом примере, привязана к электропроводящему каналу 16. Матричная полинуклеотидная цепь 48, показанная на фиг. 5, представляет собой матричную цепь ДНК. Матричная полинуклеотидная цепь 48 может вводиться в биологически стабильном растворе, наряду с реагентами, такими как меченые нуклеотиды 26. Биологически стабильный раствор может представлять собой любой буфер, подходящий для полимеразных реакций встраивания основания, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) или линейная амплификация. В качестве примера, биологически стабильный раствор может включать в себя буфер, имеющий pH около 7, концентрацию солей выше нескольких миллимолей и ионы Mg в миллимолярной концентрации.
[00120] Как тоже показано на фиг. 5, меченый нуклеотид 26 может включать в себя основание, комплементарное целевой нуклеиновой кислоте матричной полинуклеотидной цепи 48. Меченый нуклеотид 26 будет удерживаться на месте, отчасти, полимеразой 20, которая также связывается с матричной полинуклеотидной цепью 48. В качестве примера, полимераза 20 может встраивать конкретный нуклеотид 30, причем этот нуклеотид 30 может удерживаться в течение периода времени в пределах от нескольких (например, 2) миллисекунд до нескольких сотен миллисекунд.
[00121] Взаимодействие между меченым нуклеотидом 26 и полимеразой 20 и длина связывающей молекулы 32 позволяют целевой метке 24 ассоциироваться поблизости от заряженной молекулы 18. Когда сенсорные системы 10, 10', 10'' присутствуют в массиве и включают в себя индивидуально адресуемые и индивидуально считываемые датчики 11, 11', 11'' заряда, следует понимать, что длина связывающей молекулы 32 также может мешать ассоциированию любой отдельной целевой метке 24 со смежной сенсорной системой 10, 10', 10'', как только меченый нуклеотид 26 взаимодействует с полимеразой 20 конкретной сенсорной системы 10, 10', 10''.
[00122] В некоторых примерах ассоциирование целевой метки 24 приводит к тому, что эффективная концентрация метки 24 увеличивается, заставляя заряженную молекулу 18 связываться с целевой меткой 24. Заряженная молекула 18 может динамически изменять свою конформацию в равновесии и, при отсутствии целевой метки 24, может проводить большую часть времени в одной конкретной конформации (т.е. несвязанной предпочтительной конформации). Связывание целевой метки 24 приведет к тому, что заряженная молекула 18 переходит в другую предпочтительную конформацию (из несвязанной предпочтительной конформации). Предпочтительная конформация во время связывания отличается от несвязанной предпочтительной конформации (например, конформации, наиболее демонстрируемой заряженной молекулой 18 при отсутствии связанной метки 24). Распределение заряда в несвязанной предпочтительной конформации отличается от распределения заряда в предпочтительной конформации (например, когда заряженная молекула 18 связана с меткой 24). Изменение распределения заряда заряженной молекулы 18, в свою очередь, изменяет проводимость в канале 16.
[00123] Отклик датчика 11, 11', 11'' заряда может указывать на встроенное основание меченого нуклеотида 26, поскольку целевая метка 24 является специфичной к нуклеотиду (т.е. специфичная метка 24 выбирается для конкретного основания), и поскольку сайт 28 распознавания заряженной молекулы 18 является специфичным к метке. По сути, способ также может включать ассоциирование отклика датчика 11, 11', 11'' заряда с ассоциированной специфичной к сайту распознавания меткой 24 (т.е. той меткой 24, которая изменила конформацию заряженной молекулы 18) и, на основе ассоциированной специфичной к сайту распознавания метки 24, идентификацию нуклеотида (например, основания) ассоциированного меченого нуклеотида 26 (т.е. того меченого нуклеотида 26, который ассоциировался с полимеразой 20 и сайтом 28 распознавания).
[00124] Следует понимать, что скорости ассоциации и диссоциации между заряженной(-ыми) молекулой(-ами) 18, 18' и меткой(-ами) 24 могут регулироваться таким образом, что генерируются уникальные сигналы - «отпечатки пальцев».
[00125] Для меток 24 с низкими скоростями диссоциации, метка 24 будет оставаться связанной в течение значительной длительности, например, в течение всего цикла встраивания нуклеотида. Это длительное связывание будет давать изменения уровня постоянного тока, проходящего через канал 16 датчика 11, 11' заряда. Это проиллюстрировано схематично на фиг. 6A, где использованы различные метки 24 с низкими скоростями диссоциации для четырех различных нуклеотидов, приводя к четырем различным и отличающимся обнаруживаемым сигналам. Эти сигналы могут обнаруживаться посредством одной заряженной молекулы 18, 18' с четырьмя различными сайтами 28 распознавания, либо посредством вплоть до четырех различных заряженных молекул 18, 18', каждая со специфичным к метке сайтом 28 распознавания, либо посредством одной заряженной молекулы 18, 18' с одним сайтом 28 распознавания, который может связывать вплоть до четырех различных нуклеотидов с разными низкими скоростями диссоциации.
[00126] Для меток 24 с высокими скоростями ассоциации и диссоциации, метка 24 может ассоциироваться с/диссоциироваться от заряженной молекулы 18, 18' несколько раз в течение всего цикла встраивания нуклеотида. Это быстрое связывание с ассоциацией и диссоциацией будет давать дрожащие сигналы (например, уровень, амплитуду, частоту, уровни в процентилях, характерное распределение постоянного тока и т.д.) от датчика 11, 11' заряда. Это проиллюстрировано схематично на фиг. 6B, где использованы различные метки 24 с высокими скоростями ассоциации и диссоциации для четырех различных нуклеотидов, приводя к четырем различным и отличающимся обнаруживаемым сигналам. Эти сигналы могут обнаруживаться посредством одной заряженной молекулы 18, 18' с четырьмя различными сайтами 28 распознавания, либо посредством вплоть до четырех различных заряженных молекул 18, 18', каждая со специфичным к метке сайтом 28 распознавания, либо посредством одной заряженной молекулы 18, 18' с одним сайтом 28 распознавания, который может связывать от одного до четырех различных нуклеотидов с разными скоростями ассоциации и диссоциации.
[00127] Также может быть отслежена частота, с которой изменяется конформационное состояние заряженной молекулы 18, 18'.
[00128] Абсолютная величина откликов датчика заряда также может быть разной. В некоторых примерах сайт 28 распознавания должен обратимо связывать вплоть до четырех различных меченых нуклеотидов 26. Когда один из этих четырех различных меченых нуклеотидов 26 ассоциирован с полимеразой 20 и сайтом 28 распознавания, отклик датчика 11, 11', 11'' заряда имеет отличающуюся абсолютную величину, которая может использоваться для того, чтобы идентифицировать этот один из четырех различных меченых нуклеотидов 26. Каждый из четырех различных меченых нуклеотидов 26 также может иметь отличающуюся абсолютную величину (например, абсолютную величину, которая отличается от абсолютных величин, ассоциированных с каждым из других четырех различных меченых нуклеотидов 26).
[00129] В других примерах модальности с фиг. 6A и 6B могут быть скомбинированы в некоторой форме. Например, во множестве меченых нуклеотидов 26, подвергавшихся воздействию сенсорной системы 10, 10', 10'', могут использоваться некоторые метки 24, которые имеют низкие скорости ассоциации и диссоциации, и могут использоваться другие метки 24, которые имеют высокие скорости ассоциации и диссоциации.
[00130] В результате описанного здесь цикла встраивания, основание ассоциированного меченого нуклеотида 26 будет встраиваться в образующуюся цепь 50, которая гибридизируется с матричной полинуклеотидной цепью 48. Когда основание полностью встроено и сахарный скелет образующейся цепи 50 продлен, линкер 32 между нуклеотидом 30 и меткой 24 естественно расщепляется. Это приводит к уменьшению эффективной концентрации метки 24 обратно до фоновых уровней. Целевая метка 24 диссоциируется, и измененная молекула 18, 18' возвращается в свою несвязанную конформацию (иногда называемую «дикого типа»), где она преимещественно демонстрирует предпочтительную несвязанную конформацию.
[00131] Раскрытый здесь способ может быть повторен для требуемого числа циклов секвенирования.
[00132] Меченые нуклеотиды 26 и сенсорные системы 10, 10', 10'', раскрытые здесь, могут использоваться для любых из множества самых разнообразных применений. Как описано со ссылкой на фиг. 5, конкретной полезной применение - это секвенирование нуклеиновых кислот, такое как секвенирование с помощью синтеза (SBS). При SBS удлинение праймера для секвенирования нуклеиновых кислот вдоль матричной нуклеиновой кислоты 48 отслеживается для того, чтобы определить последовательность нуклеотидов в матрице. Базовый химический процесс может представлять собой полимеризацию (например, катализируемую ферментом полимеразой 20, как описано здесь). В конкретном примере SBS на основе полимеразы, нуклеотиды (например, основания) добавляются к праймеру для секвенирования (тем самым удлиняя праймер для секвенирования) зависимым от матрицы образом, так что обнаружение порядка и типа нуклеотидов, добавляемых к праймеру для формирования образующейся цепи, может использоваться для того, чтобы определять последовательность матрицы. Методу SBS может быть подвергнуто множество различных матриц 48 на различных сенсорных системах 10, 10', 10'' массива. События, происходящие на различных матрицах 48, можно различать, отчасти, вследствие местоположения конкретной сенсорной системы 10, 10', 10'' в массиве. Датчики 11, 11' заряда каждой сенсорной системы 10, 10', 10'' в массиве могут быть отдельно адресуемыми и считываемыми, и в силу этого могут обнаруживаться сигналы на каждом датчике 11, 11'.
[00133] Другие подходящие применения для раскрытых здесь меченых нуклеотидов 26 и сенсорных систем 10, 10', 10'' включают секвенирование лигированием и секвенирование путем гибридизации.
[00134] Следует принимать во внимание, что все комбинации вышеприведенных принципов и дополнительных принципов, подробнее поясненных ниже (при условии, что такие принципы не являются взаимно несовместимыми), считаются частью объекта изобретения, раскрытого здесь. В частности, все комбинации заявленного изобретения, указанного в конце этого раскрытия, считаются частью объекта изобретения, раскрытого здесь. Также следует принимать во внимание, что используемая здесь в явном виде терминология, которая также может встречаться в любом раскрытии, включенном сюда по ссылке, должны соответствовать смысловому значению, наиболее согласующемуся с конкретными принципами, раскрытыми здесь.
[00135] Ссылка по всему подробному описанию на «один пример», «другой пример», «пример» и т.д. означает то, что конкретный элемент (например, признак, структура и/или характеристика), описанный в связи с этим примером, включается в по меньшей мере один пример, описанный здесь, и может присутствовать или не присутствовать в других примерах. Помимо этого, следует понимать, что описанные для любого примера элементы могут комбинироваться любым подходящим образом в разнообразных примерах, если контекст явно не предписывает иное.
[00136] Термины «практически» и «примерно», используемые по всему этому раскрытию, включая формулу изобретения, используются для того, чтобы описать и учесть небольшие флуктуации, к примеру, вследствие варьирований обработки. Например, они могут относиться к флуктуациям, меньшим или равным ±5%, таким как меньшие или равные ±2%, таким как меньшие или равные ±1%, таким как меньшие или равные ±0,5%, таким как меньшие или равные ±0,2%, таким как меньшие или равные ±0,1%, таким как меньшие или равные ±0,05%.
[00137] Кроме того, следует понимать, что приведенные здесь диапазоны включают в себя указанный диапазон и любое значение или поддиапазон в пределах указанного диапазона, как если бы они были указаны в явном виде. Например, диапазон, представленный как от 1 нм до менее 1 мкм, должен интерпретироваться как включающий не только явно указанные пределы от 1 нм до менее 1 мкм, но и как включающий отдельные значения, такие как примерно 15 нм, 22,5 нм, 45 нм и т.д., и поддиапазоны, такие как от примерно 20 нм до примерно 48 нм, и т.д.
[00138] Хотя выше было подробно описано несколько примеров, следует понимать, что раскрытые примеры могут быть модифицированы. Следовательно, вышеприведенное описание следует считать неограничивающим.