Способ идентификации ДНК бактерии Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени
METHOD OF IDENTIFYING DNA OF UREAPLASMA DIVERSUM BACTERIA IN BOVINE SEMEN BY REAL-TIME PCR

Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной микробиологии и генетической инженерии и может применяться для выявления микроорганизма Ureaplasma diversion в различном биологическом материале, в том числе в сперме быков, используемой для искусственного осеменения.
Ureaplasma diversion - уреаплазма крупного рогатого скота, впервые выделенная в 1969 году. Первоначально этот микроорганизм был определен как непатогенный, но было показано, что он вызывает повреждение клеток и тканей крупного рогатого скота. U. diversion часто встречается в половых путях крупного рогатого скота и ассоциируется с основными расстройствами репродуктивной системы у этих животных. У коров, инфицированных U. diversion, наблюдается бесплодие, плацентит, альвеолит плода, аборты или рождение слабых телят. У быков U. diversion может вызывать снижение подвижности сперматозоидов, семенной везикулит и эпидидимит. U. diversion может обнаруживаться внутри клеток или прикрепляться к их поверхностям. Считается, что U. diversion обладает способностью как активировать, так и ингибировать апоптотические сигнальные пути, влияя на запрограммированную гибель клеток-хозяев. Инвазия U. diversion в сперматозоиды крупного рогатого скота приводит к низкой жизнеспособности сперматозоидов. Выделение U. diversion от больных животных происходит с молоком, мочой, влагалищными выделениями. Также есть данные о передаче микроорганизма как при естественном, так и при искусственном осеменении зараженной спермой. Таким образом важной задачей является исследование спермы на наличие U. diversion перед осеменением.
Лабораторный способ идентификации U. diversum чрезвычайно необходим, поскольку отсутствие явных клинических симптомов не позволяет идентифицировать возбудитель и провести его дифференциацию от других представителей Mollicutes, а значит принять своевременные меры по ограничению распространения заболевания.
В настоящее время для детекции Ureaplasma diversum в основном используются культуральные методы. Однако методы, основанные на использовании полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» являются более быстрыми и чувствительными, а также позволяют проводить специфичную идентификацию U. diversum даже в присутствии других патогенных бактерий. В России разработаны два диагностикума для выявления U. diversum на основе ПЦР: тест-система «Уреаплазмоз (Ureaplasma spp.)» (ООО «Фрактал Био», Россия) и диагностическая система «Ureaplasma diversum Amp» (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера). Однако система «Уреаплазмоз (Ureaplasma spp.)» (ООО «Фрактал Био», Россия) не позволяет определять вид микроорганизма Ureaplasma spp. Ближайшим аналогом является ПЦР-тест-система «Ureaplasma diversum Amp» (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера), она предназначена для анализа смывов и органов КРС, но не пригодна для детекции Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота.
Целью настоящего изобретения является разработка способа получения достоверной диагностики уреаплазмоза на основе выявления ДНК бактерии-возбудителя Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота.
3
3
Технический результат - выявление ДНК Ureaplasma diversum в спермопродукции, предназначенной для искусственного осеменения крупного рогатого скота с высокой специфичностью и чувствительностью. Достигается разработкой методики обработки спермы и выделения из нее ДНК, а также использованием набора специфичных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда для идентификации ДНК Ureaplasma diversum при применении метода ПНР в режиме реального времени. Аналитическая чувствительность методики идентификации и детекции ДНК U. diversum составляет 3,45×10 коп/см в образцах спермы КРС. Специфичность способа идентификации и детекции ДНК U. diversum при исследовании бактериальных культур контрольной панели составляет 100%.
Был проведен сбор и анализ нуклеотидных последовательностей геномов микроорганизмов семейства Mycoplasmataceae, представленных в базе данных GenBank. В качестве гена-мишени был выбран ген 16S рРНК. При подборе праймеров и зонда рассчитывали температуру отжига, возможность формирования димеров и вторичной структуры олигонуклеотидов. Технический результат достигается высокой степенью гомологии выбранных олигонуклеотидов с фрагментом гена 16S рРНК U. diversum и значительным отличием от нуклеотидных последовательностей других представителей семейства Mycoplasmataceae, а также отсутствием формирования шпилек с температурой плавления выше комнатной температуры. Выбранные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:
Udv_F 5'-CATTTACTTGCATGAGTGAATG-3'
Udv_R 5'-AGCTACGCGTCAATGAC-3';
Udv_Z 5'-(ROX)-TGGATGAGGGTGCGACGTATCATCC-(BHQ)-3'
Оптимизированы условия амплификации: концентрации праймеров и зонда, концентрация ионов магния в реакционной смеси, температура отжига праймеров и длительность основных стадий амплификации.
Идентификацию ДНК бактерии Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота осуществляют следующим способом:
Поверхность соломины спермодозы крупного рогатого скота тщательно протирают обеззараживающим раствором 0,015% САНИВАП-Р, затем - раствором 70% этанола. Соломину опускают нижним концом в одноразовую пробирку-эппендорф и стерильными ножницами обрезают верхний конец, после чего соломину переворачивают и опять опускают в пробирку. Обрезают конец и, таким образом, переливают сперму в пробирку.
3
Полученный образец смешивают в соотношении 1:3 по объему с раствором натрия хлорида изотонического 0,9%. Перемешивают на вортексе. Для экстракции ДНК используют 100 мм полученной смеси.
3
3
3
3
3
3
3
Выделение ДНК проводят с использованием приципитационного метода (наборы «Рибо-преп», ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора). Проводят ПЦР в конечном объеме 25 мм со следующим составом реакционной смеси: 10 мм ДНК-матрицы, 10 мм ПЦР-смеси-1 (6 пмоль специфических праймеров Udv_F и Udv_R, 3 пмоль специфического зонда Udv_Z, 2,5 мм раствора дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 1,76 ммоль/дм (Синтол, Россия), деионизованная вода), 0,5 мм Taq-F полимеразы, 5 мм ПЦР-буфера-Flu (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора).
Выявление ДНК U. diversum проводится на приборах RotorGene 6000 (Corbett Research, Австралия) или RotorGene Q (Qiagen, Германия) по следующему температурному протоколу: 15 мин при 95°С; 10 с при 95°С, 20 с при 60 С, 10 с при 72 С (5 циклов без детекции флуоресцентного сигнала); 10 с при 95°С, 20 с при 55 С, 10 с при 72 С (35 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала). Детектирование результата амплификации ДНК U. diversum проводится на канале ROX/Orange. Результаты амплификации в режиме реального времени оценивают с помощью программного обеспечения, при этом результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линией.
Пример 1. Проверка специфичности способа детекции ДНК бактерии Ureaplasma diversum.
С целью подтверждения специфичности ПНР, реакцию проводили с ДНК/кДНК различных микроорганизмов и вирусов, вызывающих инфекционные заболевания КРС, а также геномной ДНК крупного рогатого скота (табл. 1).
Данный пример демонстрирует высокую специфичность (100%) настоящей разработки, т.к. набор выбранных праймеров амплифицирует только фрагмент генома микроорганизмов Ureaplasma diversum и не амплифицирует фрагменты генома других микроорганизмов, вирусов и геномную ДНК крупного рогатого скота.
Пример 2. Оценка аналитической чувствительности способа идентификации и детекции ДНК Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота
Для определения аналитической чувствительности способа идентификации ДНК Ureaplasma diversum в сперме КРС использовали положительный контрольный образец (ПКО) - рекомбинантную плазмиду, представляющую собой плазмиду pAL2-TA, содержащую целевую вставку с фрагментом гена 16S рРНК Ureaplasma diversum. Структуру положительного контрольного образца подтверждали методом секвенирования по Сенгеру. Секвенирование фрагментов амплификации выполняли методом "cycle sequence" с набором ABI PRISM Big Dye v. 1.1 («Applied Biosystems», USA), согласно инструкции изготовителя с использованием капиллярного автоматического секвенатора ABI-3100 PRISM Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Капиллярный электрофорез проводили на генетическом анализаторе ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer после очистки образцов от избытка дидезоксинуклеотидов и солей.
5
3
5
3
2
3
Определение аналитической чувствительности ПЦР проводили способом последовательного разбавления ПКО U. diversum с известной концентрацией плазмидной ДНК (3,45×10 копий/см). Использовали серии десятикратных разведений ПКО U. diversum в отрицательных образцах спермы КРС с концентрациями от 3,45×10 копий/см до 3,45×10 копий/см. Амплификацию проводили на приборе Rotor Gene Q (Qiagen, Германия). Эксперимент проводили в разные дни, разные исполнители на разных приборах. Результаты представлены на фиг. 1.
Фиг. 1. Оценка аналитической чувствительности набора олигонуклеотидов и способа идентификации и детекции ДНК Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота.
За аналитическую чувствительность принимали наименьшую концентрацию ПКО, для которой получен положительный результат ПЦР (значения Ct<30).
3
3
Аналитическая чувствительность способа идентификации и детекции ДНК Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота составляет 3,45×10 коп/см.