METHOD FOR PRODUCING BIOLOGICAL REFERENCE MATERIAL FOR PRODUCING STANDARD BLOOD COMPOSITION SAMPLES CONTAINING TOXIC METAL, AND MATERIAL PREPARED WITH USING THIS METHOD
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО РЕФЕРЕНТНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА СТАНДАРТНЫХ ОБРАЗЦОВ СОСТАВА КРОВИ, СОДЕРЖАЩИХ ТОКСИЧНЫЙ МЕТАЛЛ, И МАТЕРИАЛ, ПОЛУЧЕННЫЙ ЭТИМ СПОСОБОМ

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к способу получения биологического референтного материала для производства стандартных образцов состава крови, содержащих ртуть, кадмий, свинец, а также к материалу, полученному предлагаемым способом, и может быть использовано в токсикологии, медицине, ветеринарии при определении содержания указанных токсичных металлов в крови.
В изобретении используется следующая терминология.
Биоматериал - часть органов, тканей, клеточных или субклеточных структур организма.
Затравка - введение токсичного металла тем или иным способом в организм животного.
Парентерально - введение вещества в организм, при котором оно минует желудочно-кишечный тракт.
Референтный материал - «в качестве материала (вещества) стандартного образца может быть использован референтный материал, т.е. материал (вещество) достаточно однородный и стабильный по отношению к одному или нескольким определенным свойствам, применяемый в соответствии с назначением в измерительном процессе [Р.50.2.056-2007.ГСИ. Образцы материалов и веществ стандартные. Термины и определения; ISO VIM: 1993»].
Стандартный образец (состава) - [термин указан с учетом его определений, приведенных в ГОСТ 8.315-97, а также в международных нормативных документах] образец вещества или материала, химический состав или физические свойства которых:
- типичны для конкретной группы веществ или материалов;
- определены с необходимой точностью;
- отличаются высоким постоянством;
- удостоверены сертификатом.
Токсичный - ядовитый, вызывающий негативные изменения в структурах и/или функциях молекулярных, надмолекулярных, клеточных образований, тканях, органах и организме в целом.
Токсичные металлы (далее - ТМ) - условная группа металлов, не несущих биологической функции в организме, но склонных к бионакоплению, токсичные даже в небольших количествах [Загрязнение Арктики 2002. Программа по мониторингу и оценке окружающей среды Арктики. АМАП. Осло. - 2002. - 110 с.], к которым относят свинец, ртуть, кадмий, мышьяк, таллий, ванадий, никель, хром, уран и иногда другие металлы.
Мультиэлементный - содержащий несколько ТМ, в данном случае ртуть, кадмий и свинец.
Для определения содержания ТМ в различного вида материалах используются методы анализа, в частности, такие как нейтронно-активационный, атомно-эмиссионный с дугой постоянного тока, атомно-эмиссионный с индуктивно-связанной плазмой, масс-спектрометрический с индуктивно-связанной плазмой, атомно-абсорбционный с электротермической атомизацией, атомно-абсорбционный с атомизацией в пламени, инверсионный вольтамперометрический, которые требуют применения соответствующих материалов сравнения - стандартных образцов, содержащих анализируемый ТМ (аналит) в определенных количествах.
Для определения содержания ТМ известно использование стандартных образцов, изготовленных на основе водных растворов солей ТМ [см., например, Государственный Стандартный Образец Растворов Ртути (ГСО РР) - Госреестр №8004-93].
Рассматриваемые стандартные образцы могут обеспечить надежность результатов анализа в тех случаях, когда исследуемый материал также представляет собой водный раствор ТМ или близок к таковому по своим свойствам.
Однако указанные стандартные образцы мало пригодны для анализа биоматериалов, которые далеки по свойствам от водных растворов и имеют сложную матричную структуру.
Крайне важным для получения точных результатов анализа является обеспечение максимально возможного подобия матрицы стандартного образца и исследуемого материала, за счет чего достигается сходство условий (химические связи, валентности, молекулярные структуры и пр.), в которых находится ТМ (аналит) в стандартном образце и в исследуемом материале.
С этой точки зрения более надежными и перспективными являются референтные материалы для стандартных образцов состава крови, изготовленные из цельной крови.
Так, известны биологические референтные материалы [СО состава крови, содержащей свинец, номер в госреестре ГСО 9104 - 2008, номер свидетельства 3677; СО состава крови, содержащей ртуть, номер в госреестре ГСО 9653 - 2010, номер свидетельства 1579], получаемые из крови животного или человека, в которую после отбора добавляют водорастворимые соли ТМ.
Однако введенный в рассматриваемый референтный материал ТМ не проходит естественную ассимиляцию живым организмом, в связи с чем не достигается адекватность матрицы стандартных и исследуемых образцов.
Известны биологические референтные материалы, полученные из крови животного после предварительного алиментарного введения в его организм водорастворимых солей ТМ, таких как ртуть, кадмий, свинец [см., например,  SRM 966 NIST, RU 2431665].
Получаемые из указанных референтных материалов стандартные образцы состава крови имеют матрицу, близкую к матрице исследуемых образцов крови, поскольку ТМ внедрены в референтный материал в результате естественной ассимиляции организмом животного.
В качестве ближайших аналогов заявляемых способа и материала выбраны способ получения биологического референтного материала и референтный материал, описанные в RU 2431665.
Рассматриваемый способ включает алиментарное введение в организм лабораторных крыс водорастворимых солей ртути или кадмия, декапитацию крыс и отбор крови, содержащей указанные токсиканты, а также замораживание отобранной крови и ее лиофилизацию.
Рассматриваемый референтный материал представляет собой бурый кристаллический порошок органоминеральной матрицы (лиофилизат) крови и характеризуется тем, что он получен в соответствии с описанным выше способом.
3
3
Однако для алиментарного введения ТМ в организм животного, обеспечивающего ассимиляцию указанных токсикантов и их бионакопление в крови животного, требуются значительное время и большие трудозатраты. Так, для достижения концентрации ртути 41 мкг/дм в отобранной крови крыс требуется ежесуточная затравка животных указанным токсикантом в течение 30 дней. Такие же трудозатраты и длительность процесса затравки необходимы для достижения в крови крыс концентрации кадмия 39 мкг/дм.
Задачей заявляемой группы изобретений является снижение трудозатрат и сокращение длительности процесса получения биологического референтного материала для приготовления стандартных образцов состава крови и получение указанного референтного материала.
Сущность изобретения заключается в том, что согласно заявляемому способу, включающему введение в организм животного, по меньшей мере, одного токсичного металла в виде его водорастворимой соли, отбор крови животного после анализа на содержание в ней токсичного металла, а также замораживание отобранной крови и ее лиофилизацию, согласно изобретению введение в организм животного токсичного металла в виде его водорастворимой соли осуществляют парентерально путем инъекций животному водного раствора, содержащего водорастворимую соль ртути, или водорастворимую соль кадмия, или водорастворимую соль свинца, или водного раствора, содержащего водорастворимую соль ртути, водорастворимую соль кадмия и водорастворимую соль свинца.
3
3
3
3
3
3
В частном случае реализации способа осуществляют введение токсичного металла в организм животного путем инъекций ему водного раствора, содержащего водорастворимую соль ртути, водорастворимую соль кадмия и водорастворимую соль свинца, а отбор крови осуществляют по достижении содержания в ней ртути от 20 мкг/дм до 60 мкг/дм, кадмия от 10 мкг/дм до 50 мкг/дм, свинца от 150 мкг/дм до 500 мкг/дм.
В частном случае реализации способа в качестве животного используют кролика, при этом применяют прижизненный отбор крови.
Сущность изобретения в отношении биологического референтного материала заключается в том, что он получен заявляемым способом.
3
3
3
3
3
3
В частном случае реализации изобретения биологический референтный материал получен из крови животного при введении в его организм токсичного металла путем инъекций животному водного раствора, содержащего водорастворимую соль ртути, водорастворимую соль кадмия и водорастворимую соль свинца, по достижении в ней содержания ртути от 20 мкг/дм до 60 мкг/дм, кадмия от 10 мкг/дм до 50 мкг/дм, свинца от 150 мкг/дм до 500 мкг/дм, при этом содержание ртути, кадмия и свинца в референтном материале составляет соответственно от 133 мг до 400 мг, от 66,7 мг до 333 мг и от 1000 мг до 3330 мг на один грамм лиофилизата.
В заявляемом способе используемые для приготовления референтного материала ТМ оказываются внедренными в его матрицу в результате естественных метаболических процессов, что обеспечивает высокую степень адекватности матрицы референтного материала и исследуемых образцов крови. При этом достигается естественное многообразие форм внедренных в матрицу референтного материала ТМ, в частности ртути, в которых ТМ может находиться в живом организме.
Принципиально важным в заявляемом способе является то, что предварительное введение в организм животного ТМ осуществляют парентерально путем инъекций животному водного раствора, содержащего водорастворимую соль ртути, или водорастворимую соль кадмия, или водорастворимую соль свинца, или водного раствора, содержащего водорастворимые соли трех указанных ТМ.
Как показали исследования динамики бионакопления ТМ в крови животных, в частности крыс и кроликов, при инъекционном способе введения водорастворимых солей ртути, кадмия, свинца или солей трех указанных ТМ в организм животного происходит очень быстрое (в течение 1-2 дней) увеличение содержания указанных ТМ в крови животного, выход на стабильный уровень концентраций ТМ и сохранение достигнутого стабильного уровня концентраций в течение от 3 до 10 дней.
Таким образом, парентеральное введение животному указанных выше ТМ приводит к достаточно быстрому накоплению, в течение 3-х - 8-ми дней, в его крови ртути, кадмия, свинца. При этом заявляемый способ дает возможность получения референтного материала, содержащего один из указанных ТМ (моноэлеметный материал) или все три указанные ТМ (мультиэлементный материал).
Получаемый по заявляемому способу мультиэлементный референтный материала может быть использован для приготовления стандартных образцов мультиэлементного состава крови, применяемых при проведении наиболее востребованного в современной токсикологии анализа крови на содержание ртути, кадмия и свинца.
В качестве животных - доноров для получения референтного материала в соответствии с заявляемым способом могут быть использованы такие животные, как крысы, кролики, козы и др.
Парентеральное введение указанного инъекционного раствора может осуществляться, в частности, с помощью внутримышечных, внутрибрюшинных инъекций.
Конкретное требуемое содержание ТМ в референтном материале обеспечивается дозированным введением животному инъекционного раствора, содержащего определенное количество ТМ, и отбором крови по достижении содержания в ней ТМ, обеспечивающего требуемую концентрацию ТМ в референтном материале. Содержание ТМ в крови животного определяют путем анализа отбираемой крови.
Таким образом, техническим результатом, достигаемым при реализации изобретения в отношении заявляемого способа, является обеспечение быстрого контролируемого накопления в крови животных указанных выше ТМ, что является необходимым условием получения соответствующих референтных материалов, пригодных для изготовления стандартных образцов крови, содержащих ртуть, кадмии, свинец.
Указанный технический результат обеспечивает значительное сокращение длительности процесса получения биологического референтного материала, уменьшение трудозатрат, поскольку в несколько раз сокращается время работы с животными, снижаются расходы по содержанию животных.
Это особенно существенно при получении референтного материала с относительно большой требуемой концентрацией ТМ.
3
3
3
3
3
3
В случае введения в организм животного водного раствора, содержащего водорастворимые соли ртути, кадмия и свинца, и осуществления отбора крови животного по достижении содержания в ней ртути от 20 мкг/дм до 60 мкг/дм, кадмия от 10 мкг/дм до 50 мкг/дм, свинца от 150 мкг/дм до 500 мкг/дм, заявляемый способ обеспечивает получение мультиэлементного референтного материала с относительно большим содержанием указанных ТМ, пригодного для изготовления стандартных образцов мультиэлементного состава крови, используемых при диагностике интоксикаций ртутью, кадмием и свинцом.
В случае использования в качестве животного кролика удается произвести прижизненный отбор крови, получить ее достаточный объем и использовать кролика в качестве донора многократно. Важно, что кровь кролика близка по свойствам к крови человека, что в большей степени обеспечивает адекватность матрицы референтного материала и исследуемых образцов крови.
Заявляемый биологический референтный материал представляет собой бурый кристаллический порошок органоминеральной матрицы (лиофилизат крови) с внедренным в указанную матрицу ртутью, или кадмием, или свинцом, или тремя указанными ТМ и характеризуется тем, что он получен в соответствии с заявляемым способом.
Заявляемый референтный материал может иметь различное содержание ТМ, которое обеспечивает изготовление стандартных образцов состава крови с требуемой концентрацией ТМ.
Таким образом, техническим результатом, достигаемым при реализации заявляемого изобретения в отношении материала, является получение референтного материала, содержащего ртуть, или кадмий, или свинец, или все три указанные ТМ, предназначенного для приготовления стандартных образцов состава крови, содержащих ТМ.
3
3
3
3
3
3
В случае, когда биологический референтный материал получен из крови животного, в организм которого токсичные металлы введены путем инъекций водного раствора, содержащего водорастворимую соль ртути, водорастворимую соль кадмия и водорастворимую соль свинца, и в которой содержание ртути, кадмия и свинца составляет соответственно от 20 мкг/дм до 60 мкг/дм, от 10 мкг/дм до 50 мкг/дм и от 150 мкг/дм до 500 мкг/дм, обеспечивается относительно высокое содержание ртути, кадмия и свинца в мультиэлементом референтном материале соответственно от 133 мг до 400 мг, от 66,7 мг до 333 мг и от 1000 мг до 3330 мг на один грамм лиофилизата.
Заявляемый способ осуществляют следующим образом.
Проводят подготовку животного к процессу получения биологического референтного материала, выдерживая животное в карантине в течение времени, необходимого для его адаптации к условиям содержания.
Выбирают суточную затравочную дозу - количество вводимого в течение суток ТМ на 1 кг массы животного. При этом величина затравочной дозы должна обеспечить требуемое содержание ТМ в референтном материале и определяется на основании опытных данных по изучению влияния величины дозы на содержание ТМ в крови экспериментального животного.
Готовят инъекционный раствор, содержащий водорастворимую соль ртути, или водорастворимую соль кадмия, или водорастворимую соль свинца, или раствор, содержащий водорастворимые соли всех трех указанных ТМ.
В качестве водорастворимых солей ртути, кадмия, свинца могут быть использованы, в частности, ацетаты или нитраты указанных ТМ, характеризующиеся достаточно высокой стойкостью и растворимостью в воде.
3
Чтобы избежать инфильтрации тканей при инъекции, в качестве основы для инъекционного раствора используют физиологический раствор, в частности раствор, полученный из расчета растворения одной таблетки реактива Рингера-Локка в 100 смтеплой дистиллированной воды (физиологический раствор Рингера-Локка).
3
3
Концентрацию водорастворимой соли ТМ в инъекционном растворе выбирают, исходя из величины суточной затравочной дозы с учетом обеспечения физиологически приемлемого объема инъекционного раствора для одной инъекции. Указанный объем, в частности, для кролика составляет 0,5 см, а для крыс составляет 0,1 см на 1 кг массы животного.
Осуществляют парентеральное введение в организм животного ТМ путем инъекций животному водного раствора, содержащего водорастворимую соль ртути, или водорастворимую соль кадмия, или водорастворимую соль свинца, или водорастворимые соли трех указанных ТМ.
Отбор крови животного осуществляют по достижении в ней требуемой концентрации ТМ, которая определяется путем анализа крови на содержание в ней ТМ.
Отобранную кровь расфасовывают и лиофилизуют.
В результате осуществления способа получают биологический референтный материал, представляющий собой лиофилизат цельной крови животного в виде красно-бурого порошка с требуемым содержанием ртути, или кадмия, или свинца или трех указанных ТМ.
Материал хранят и транспортируют в укупоренной стеклянной таре при температуре +5±2°C.
Ниже приведены примеры осуществления группы изобретений.
Пример 1
Получали биологический мультиэлементный референтный материал для приготовления стандартных образцов состава крови, содержащих свинец, кадмий и ртуть.
В качестве животных использовали кроликов с массой тела от 2 до 3 кг.
Для парентерального введения на основе физиологического раствора Рингера-Локка готовили инъекционный раствор, содержащий водные растворы ацетатов свинца, ртути и кадмия, подкисленные для устойчивости в водной среде уксусной кислотой до рН 3,5-4,5.
3
В течение 3-х дней осуществляли ежесуточное парентеральное введение кролику (внутримышечно) в заднюю лапу из расчета 0,5 см на 1 кг массы животного инъекционного раствора, в котором концентрация свинца составляла 20 мг/мл, концентрация кадмия составляла 2,0 мг/мл и концентрация ртути составляла 0,6 мг/мл, что соответствовало суточной затравочной дозе указанных ТМ соответственно 10,0 мг; 1,0 мг и 0,3 мг на 1 кг массы животного (в пересчете на катион каждого из ТМ).
По окончании 3-х суток с начала процедуры затравки осуществляли отбор крови кролика. При этом предварительно кролика обездвиживали путем внутрибрюшинного введения ему 20-40% раствора уретана в физиологическом растворе Рингера-Локка. Вскрывали сонную артерию кролика и с помощью системы вакуумного забора собирали кровь в подготовленную емкость.
3
3
3
Как показал анализ отобранной крови содержание в ней свинца, кадмия и ртути составляло соответственно 296±26,8 мкг/дм, 43,7±57 мкг/дм, 36,4±3,3 мкг/дм.
Отобранную кровь расфасовывали по 3 мл в стеклянные флаконы, подвергали замораживанию в течение 10 часов при температуре не выше -15°C. Далее проводили лиофилизацию крови при давлении не более 0,200 mBar и температуре ниже -50°C до постоянного веса.
Получили мультиэлементный референтный материал, представляющий собой лиофилизат цельной крови животного в виде красно-бурого порошка с содержанием ртути 247 мкг, кадмия 291 мкг и свинца 1973 мкг на один грамм лиофилизата.
Пример 2
Получали биологический мультиэлементный референтный материал для приготовления стандартных образцов состава крови, содержащих свинец, кадмий и ртуть.
В качестве животных использовали кроликов с массой тела от 2 до 3 кг.
Для парентерального введения на основе физиологического раствора Рингера-Локка готовили инъекционный раствор, содержащий водные растворы нитратов свинца, ртути и кадмия.
3
В течение 3 суток осуществляли ежесуточное парентеральное введение кролику внутримышечно в заднюю лапу по 0,5 см инъекционного раствора, в котором концентрация свинца составляла 50 мг/мл, концентрация кадмия составляла 2 мг/мл и концентрация ртути составляла 0,6 мг/мл, что соответствовало суточной затравочной дозе указанных ТМ соответственно 25 мг; 2,0 мг и 0,3 мг на 1 кг массы животного (в пересчете на катион каждого из ТМ).
По окончании 3 суток с начала процедуры затравки осуществляли отбор крови кролика. При этом предварительно кролика обездвиживали путем внутрибрюшинного введения ему 20-40% раствора уретана в физиологическом растворе Рингера-Локка. Вскрывали сонную артерию кролика и с помощью системы вакуумного забора кровь собирали в подготовленную емкость.
3
3
3
Как показал анализ отобранной крови, содержание в ней свинца, кадмия и ртути составляло соответственно 163±26 мкг/дм, 7,1±1,3 мкг/дм и 25,1±4,1 мкг/дм.
Отобранную кровь расфасовывали по 3 мл в стеклянные флаконы, подвергали замораживанию в течение 10 часов при температуре не выше -15°C. Далее проводили лиофилизацию крови при давлении не более 0,200 mBar и температуре ниже -50°C до постоянного веса.
Получили мультиэлементный референтный материал, представляющий собой лиофилизат цельной крови животного в виде красно-бурого порошка с содержанием свинца - 1087 мкг, кадмия - 47,3 мкг и ртути - 167 мкг  на один грамм лиофилизата.
Пример 3
Получали биологический референтный материал для приготовления стандартных образцов состава крови, содержащих свинец.
В качестве животных-доноров использовали лабораторных белых крыс с массой тела от 180 г до 200 г.
Для парентерального введения на основе физиологического раствора Рингера-Локка готовили инъекционный раствор, включающий водный раствор ацетата свинца.
3
Осуществляли один раз в сутки парентеральное (внутрибрюшинное) введение крысам по 0,1 см инъекционного раствора на килограмм массы животного, в котором концентрация свинца составляла 450 мг/мл, что соответствовало суточной затравочной дозе 45 мг на 1 кг массы животного (в пересчете на катион свинца).
Указанные инъекции проводили в течение 3 суток. На 4 день от начала процедуры затравки животных умерщвляли путем декапитации и осуществляли отбор крови.
3
Как показал анализ отобранной крови, содержание в ней свинца составляло 209 мкг/дм.
Отобранную кровь расфасовывали по 3 мл в стеклянные флаконы, подвергали замораживанию в течение 10 часов при температуре не выше -15°C. Далее проводили лиофилизацию крови при давлении не более 0,200 mBar и температуре ниже -50°C до постоянного веса.
Получили референтный материал, представляющий собой лиофилизат цельной крови животного в виде красно-бурого порошка с содержанием свинца 1393 мкг на один грамм лиофилизата.
Пример 4
Получали биологический референтный материал для приготовления стандартных образцов состава крови, содержащих кадмий.
В качестве животных-доноров использовали лабораторных белых крыс с массой тела от 180 г до 200 г.
Для парентерального введения на основе физиологического раствора Рингера-Локка готовили инъекционный раствор, включающий водный раствор нитрата кадмия.
3
Осуществляли один раз в сутки парентеральное (внутрибрюшинное) введение крысам по 0,1 см инъекционного раствора, в котором концентрация кадмия составляла 3,0 мг/мл, что соответствовало суточной затравочной дозе 0,3 мг на 1 кг массы животного (в пересчете на катион кадмия).
Указанные инъекции проводили в течение 3 суток. На 5 день от начала процедуры затравки животных умерщвляли путем декапитации и осуществляли отбор крови.
3
Как показал анализ отобранной крови, содержание в ней кадмия составляло 15 мкг/дм.
Отобранную кровь расфасовывали по 3 мл в стеклянные флаконы, подвергали замораживанию в течение 10 часов при температуре не выше -15°C. Далее проводили лиофилизацию крови при давлении не более 0,200 mBar и температуре ниже -50°C до постоянного веса.
Получили референтный материал, представляющий собой лиофилизат цельной крови животного в виде красно-бурого порошка с содержанием кадмия 100 мкг на один грамм лиофилизата.
Пример 5
Получали биологический референтный материал для приготовления стандартных образцов состава крови, содержащих ртуть.
В качестве животных-доноров использовали лабораторных белых крыс с массой тела от 180 г до 200 г.
Для парентерального введения на основе физиологического раствора Рингера-Локка готовили инъекционный раствор, включающий водный раствор ацетата ртути,  подкисленный для обеспечения устойчивости в водной среде уксусной кислотой до рН 3,5-4,4.
3
Осуществляли один раз в сутки парентеральное (внутрибрюшинное) введение крысам по 0,1 см инъекционного раствора, в котором концентрация ртути составляла 6,0 мг/мл, что соответствовало суточной затравочной дозе 0,6 мг на 1 кг массы животного (в пересчете на катион ртути).
Указанные инъекции проводили в течение 3 суток. На 4 сутки от начала процедуры затравки животных умерщвляли путем декапитации и осуществляли отбор крови.
3
Как показал анализ отобранной крови, содержание в ней ртути составляло 67 мкг/дм.
Отобранную кровь расфасовывали по 3 мл в стеклянные флаконы, подвергали замораживанию в течение 10 часов при температуре не выше -15°C. Далее проводили лиофилизацию крови при давлении не более 0,200 mBar и температуре ниже -50°C до постоянного веса.
Получили референтный материал, представляющий собой лиофилизат цельной крови животного в виде красно-бурого порошка с содержанием ртути 447 мкг на один грамм лиофилизата.