СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВ, СОДЕРЖАЩИХСЯ В ЖИДКИХ СРЕДАХ (В ТОМ ЧИСЛЕ НАНОЧАСТИЦ)
METHOD OF BIOASSAY OF SUBSTANCES CONTAINED IN FLUID MEDIUMS (INCLUDING NANOPARTICLES)

Изобретение относится к биологии и медицине, может быть использовано в экологии, фармакологии и ветеринарии.
Известен оперативный способ определения качества воды и токсичности растворенных в ней веществ (см. заявку № CN 101131384, опубл. 27.02.08 и патент № UA 24287, опубл 25.06.07) биотестированием с помощью люминометрии, который реализован в отечественном приборе «Биотоке-10». При использовании этого способа в исследуемую пробу помещаются специальные люминесцирующие морские бактерии или трансгенные бактерии кишечной палочки, обладающие способностью к люминесценции. Воздействие токсикантов исследуемой пробы на бактерии в процессе их инкубирования в этой пробе приводит к изменению интенсивности люминесценции. Сравнение измеренной интенсивности с интенсивностью люминесценции тех же бактерий в контрольной пробе жидкости (например, дистиллированной воде) позволяет определить степень токсичности анализируемой пробы. При необходимости в исследуемую и контрольную пробы могут добавляться вспомогательные вещества, необходимые для создания оптимальных условий для тестовых бактерий и для сравнения проб - в частности, поваренная соль и соляная кислота, выравнивающая рН для сравниваемых жидкостей.
Известен также оперативный способ определения биологической активности воды (патенты РФ №2377562, опубл. 27.12.09 и №2377563, опубл. 27.12.09) биотестированием с помощью стимуляции электрическими импульсами препарата нервных клеток в физрастворе. Здесь у тестовых нервных клеток в процессе инкубирования регистрируют постсинаптические потенциалы, которые могут быть разными при различной биологической активности воды, использованной для приготовления физраствора.
Недостатками указанных известных способов являются дефицитность и ограниченный выбор тестовых объектов. Для получения объективных заключений о потенциальной токсичности и биологической активности анализируемых проб для биосферы необходимы сведения об их воздействии на разные виды тестовых клеток, включая растительные и животные, что невозможно для данных способов. Кроме того, второй из указанных способов сложен для исполнения и поэтому имеет ограниченную применимость.
Известен способ оценки биологической активности наночастиц по степени их влияния на скорость реакции окисления биологических структур и молекул, определяемую по интенсивности хемилюминесценции, волюмометрически, барометрически и т.п. (Радилов А.С., Глушкова А.В., Дулов С.А. Экспериментальная оценка токсичности и опасности наноразмерных материалов, журнал «Нанотехнологии и охрана здоровья», 2009 г., том 1, №3(1), с.48; Мелихов И.В., Тенденции развития нанохимии, «Российский химический журнал», 2002 г., том XL VI, №5, с.7-14.). Первый из указанных вариантов технической реализации этого способа подобен рассмотренной выше люминометрии бактерий, его недостатком является то, что способностью к люминесценции обладают лишь очень немногие структуры и молекулы, т.е возможности его применения ограничены.
Наиболее близким и принятым за прототип является способ определения качества воды (патент РФ 2123692, опубл. 20.12.98) биотестированием с помощью микроэлектрофореза культуры растительных клеток, в качестве которых используются водоросли. В процессе инкубирования воздействие растворенных токсикантов анализируемой пробы на эти клетки приводит к изменениям их электрического заряда и дзета-потенциала. При помещении пробы с клетками в электрофоретическую камеру на них накладывается переменное электрическое поле, в котором клетки совершают колебания с амплитудами, пропорциональными их зарядам. Качество и уровень токсичности воды (или, конкретнее, токсичности растворенных в ней веществ) определяют сравнением средней амплитуды колебаний клеточных популяций в контрольной (дистиллированная вода) и анализируемой пробах.
Недостатком данного способа является нестабильный уровень амплитуды колебаний клеток в контрольной пробе - дистиллированной воде, который зависит от партии используемых клеток и, возможно, от режима их высушивания у изготовителя. Эта нестабильность затрудняет однозначную оценку результата анализа. Недостатками также являются длительный период ручных измерений амплитуд колебаний клеток (5-7 мин), в течение которого их заряды могут изменяться и без воздействия токсикантов, и ограниченность получаемой при этом статистической выборки (10-15 клеток), что влияет на точность и достоверность результата. Кроме того, объективность анализа с помощью данного метода для биосферы в целом ограничена из-за ограниченности выбора тестовых клеток (сушеные водоросли) и недостаточной информативности (одна измеряемая величина), что может быть важно при сравнении качественно различных токсикантов, воздействующих на разные звенья клеточного метаболизма.
Задачей заявленного изобретения является создание способа, повышающего достоверность и точность анализа, а также его применимость по отношению к разным токсикантам, наночастицам и разным типам живых клеток на единой инструментально-методической основе.
Поставленная задача решается тем, что для определения биологической активности веществ, растворенных в жидкости (в частности, для определения качества воды), и диспергированных в ней наночастиц (например, наночастиц серебра) используется нижеописанным образом метод клеточного электрофореза, реализованный, например, в приборном комплексе «Цито-Эксперт». В ходе анализа выбранный вид живых тестовых клеток (растительные, животные, клетки обитателей водоемов, микроорганизмы и т.д.) помещают в анализируемую жидкость и для сравнения в дистиллированную воду, добавляя в содержащие их сосуды при необходимости минимальные количества вспомогательных веществ (например, для клеток человеческой крови - сахарозу или соли фосфорной кислоты в определенной коцентрации) для обеспечения стабильной жизнедеятельности тестовых клеток в процессе их инкубирования и анализа. Затем воздействуют на них переменным электрическим полем в электрофоретической камере комплекса, измеряют амплитуду их колебаний под действием поля и долю подвижных клеток относительно их общего числа, определяют их адаптацию и выживаемость совокупно как по зависимости амплитуд их колебаний и доли подвижных клеток от концентрации веществ в анализируемой жидкой среде, так и по зависимости тех же параметров от времени инкубирования клеток в жидкой среде, при этом для сравнения амплитуд используют показатель токсичности, однозначно учитывающий уровни амплитуд колебаний клеток в дистиллированной воде и анализируемой пробе, который вычисляется по формуле:
где Т - показатель токсичности;
к
А - амплитуда колебаний клеток в дистиллированной воде;
п
А - амплитуда колебаний клеток в анализируемой среде.
Далее по показателю токсичности определяют биологическую активность анализируемых веществ.
Значения Т в диапазоне 0-20 единиц характеризуют малую степень биологической активности содержащихся в жидкости веществ, в диапазоне 20-60 ед. - среднюю степень, и 60-100 ед. - высокую, при этом значению Т=100 соответствует полное отсутствие колебаний клеток в электрическом поле, т.е. обнуление их заряда, что может означать их гибель или переход в сублетальное состояние.
Также при необходимости для большей информативности анализа при разных концентрациях растворенных веществ и временах инкубирования клеток в жидкости дополнительно измеряют силу тока, протекающего через анализируемую среду, и сравнивают с той же величиной для дистиллированной воды.
Предлагаемый способ, во-первых, обладает более широкими возможностями по спектру анализируемых объектов, который включает как ионы либо молекулы растворенных веществ, так и наночастицы различного происхождения. Хотя механизмы воздействия этих объектов на тестовые клетки могут существенно различаться, заряд клеток служит интегральным маркером такого воздействия.
Во-вторых, предлагаемый способ представляет возможность проведения оперативного анализа каждого вида анализируемых объектов на нескольких существенно различных видах клеток (например, на микроводорослях и клетках крови человека и животных), и с определением нескольких количественных показателей для каждого вида клеток, обеспечивая таким образом максимальную информативность анализа, позволяющую дифференцировать разные виды токсикантов и удовлетворяя основному правилу биотестирования - использованию нескольких видов тестовых объектов для получения адекватного вывода о степени токсичности и биологической активности анализируемой среды по отношению к биосфере. Если анализируемая среда угнетает тестовые клетки, показатель токсичности (Т) положителен, если стимулирует - отрицателен. Показатель токсичности (Т) и доля подвижных клеток характеризуют биологическое воздействие анализируемой среды, а сила протекающего тока - ее физико-химическое состояние.
Сочетание оперативности, информативности, технической простоты исполнения и малой затратности способа обеспечивают ему преимущества по сравнению с используемыми в данный момент на практике методами контроля биологической активности жидких сред, в том числе общей токсичности вод и биологической активности суспензий наночастиц.
Предлагаемый способ может быть реализован с помощью автоматизированного приборного комплекса «Цито-Эксперт», структурная схема которого показана на фиг.1.
4
2
2
7
На фиг.2.1 и 2.2 изображена зависимость показателя токсичности (Т) от концентрации для водных растворов токсикантов ZnSO и KCrO (для сравнения там же показана токсичность этих растворов для трансгенных бактерий кишечной палочки, измеренная методом люминометрии на приборе «Биотоке-10»).
На фиг.3 показана зависимость Т и доли подвижных клеток от концентрации для водной суспензии наночастиц серебра (размер наночастиц 11±4 нм).
На фиг.4.1 и 4.2 - зависимость Т и доли подвижных клеток от времени для двух концентраций наночастиц серебра.
Способ определения биологической активности веществ, содержащихся в жидкости в виде ионов, молекул, либо диспергированных в ней наночастиц выполняется следующим образом. В пробирку с анализируемой средой (пробой воды или суспензией наночастиц) помещается необходимое количество тестовых клеток, например, микроводорослей спирулина, хлорелла, либо клеток крови. (В последнем случае в анализируемую среду предварительно вносится сахароза до получения изотонического раствора с весовой концентрацией сахарозы 10,3%). Количество тестовых клеток в пробирке должно быть достаточным для проведения статистического анализа видеозаписей микроэлектрофореза, а именно, в поле зрения микроскопа должно наблюдаться 60-250 клеток. Аналогичные операции производятся с контрольной пробиркой, содержащей дистиллированную воду. Полученные смеси перемешиваются и инкубируются определенное время, затем поочередно 35-40 мкл каждой из них помещаются в электрофоретическую камеру, которая устанавливается под объектив лабораторного микроскопа. На электроды камеры от исполнительного блока подается напряжение в пределах 10-30 В, тестовые клетки подвергаются воздействию электрического поля и совершают колебательные движения, амплитуда которых пропорциональна их зарядам. Приспособительные и защитные реакции клеток на воздействие анализируемой среды приводят к изменениям зарядов клеток, что отражается на их перемещениях. Движения клеток записываются видеокамерой, например, MYscope 130 в память компьютера за 10-20 с и хранятся там до обработки. Анализ производится через заданные промежутки времени, полученные видеофайлы затем обрабатываются автоматической программой с выдачей всех вышеуказанных параметров и построением указанных зависимостей. Например, доля подвижных клеток - отношение числа подвижных в электрическом поле клеток к их общему числу, умноженное на 100% - определяется автоматически при компьютерном анализе изображений клеток на видеозаписи процесса микроэлектрофореза. Использование этого показателя позволяет обеспечить максимальную точность анализа, особенно, когда временной или концентрационный ход основного показателя Т может быть истолкован неоднозначно. Затем, при необходимости, анализ повторяют, разбавив анализируемую жидкость дистиллированной водой в нужное количество раз и поместив туда тестовые клетки. После выполнения анализов, на основании их результатов делаются выводы о степени токсичности и биологической активности веществ, содержащихся в анализируемой жидкости. При анализе результатов исследований следует учитывать, что адаптация тестовых клеток в данный момент описывается текущим значением показателя токсичности (Т), их выживаемость изменением Т с течением времени и с ростом концентрации анализируемого вещества. Поскольку измеряемая амплитуда и определяемый ею показатель Т проявляют естественную вариативность с течением времени (см. иллюстрацию на Фиг.4), связанную с известным чередованием фаз угнетения и восстановления показателей физиологического состояния разных живых объектов при токсическом воздействии, совокупная оценка этих показателей позволяет обеспечить необходимую достоверность результатов анализа. При необходимости для большей информативности анализа дополнительно измеряют силу тока, протекающего через анализируемую среду и сравнивают с той же величиной для дистиллированной воды. Силу тока измеряют для обеспечения разносторонности оценки биологической активности применительно к кинетике процесса воздействия токсиканта на клетки. При этом воздействии возможно постепенное отделение от клеток адсорбированных на их мембранах белков, ферментов и других контаминантов. Кроме того, при сублетальных концентрациях токсиканта начинается распад отдельных (самых слабых) клеток с разрывом клеточной мембраны и смешиванием клеточной цитоплазмы с раствором. Все это приводит к естественному изменению физико-химических характеристик раствора, в частности - его проводимости. Измерение силы тока позволяет получить информацию об этих деталях процесса токсического воздействия и повысить достоверность результатов анализа.
Например, по графикам зависимости Т от концентрации для двух традиционных модельных токсикантов (Фиг.2.1 и 2.2) можно видеть, что для хлореллы они оба малотоксичны до концентрации примерно 1,5 мг/л, а при концентрациях 1,5-2,5 мг/л обладают средней степенью токсичности - от 20 до 40 единиц. Для спирулины средней степенью токсичности обладает только сульфат цинка в том же диапазоне концентраций, а вот бихромат калия оказывает на нее небольшое стимулирующее воздействие при концентрациях 0,6-0,8 мг/л, воздействие средней степени - при концентрациях 0,8-1,7 мг/л, и вызывает сильную стимуляцию при концентрациях 1,7-2,0 мг/л. Ход кривых при сравнительных измерениях для трансгенных бактерий качественно подобен кривым для хлореллы. Из этого примера видна важная роль использования нескольких тестовых объектов для получения достоверных данных при анализе биологической активности токсических веществ.
-8
-4
-6
-4
Далее, на Фиг.3 показаны зависимости доли подвижных клеток хлореллы и средней амплитуды их колебаний от концентрации наночастиц серебра в дистиллированной воде. Эти наночастицы малотоксичны для клеток при концентрациях ниже 2·10 М и обладают средней токсичностью при более высоких концентрациях вплоть до 10 М, что вполне согласуется с данными других исследований. При этом значение Т почти не меняется в диапазоне концентраций от 10 до 10 М, т.е. при увеличении концентрации в 100 раз (!), из чего мог бы быть сделан ложный вывод о том, что в этом диапазоне чувствительность клеток к возрастанию концентрации токсиканта практически теряется. Однако кривая для доли подвижных клеток, измеренной одновременно с амплитудой, показывает, что эта доля непрерывно падает с ростом концентрации в указанном диапазоне, что подтверждает сохранение чувствительности клеток и адекватность анализа. Отсюда видна важность совокупного сопоставления изменений разных клеточных показателей под воздействием биологически активного вещества.
-4
На Фиг.4.1 и 4.2 приведены зависимости тех же показателей хлореллы в зависимости от времени инкубирования с наночастицами для двух разных концентраций. Воздействие наночастиц на клетки, судя по всему, разделяется на несколько стадий, начинающихся с осаждения наночастиц на поверхность клеток через некоторое время после смешивания клеточной среды с анализируемой жидкостью. В процессе воздействия возникают защитные и приспособительные реакции клеток, что отражается на измеряемых характеристиках. По графикам видно, что в целом токсичность наночастиц для данных клеток и в самом деле остается преимущественно в пределах среднего уровня, однако в некоторые моменты она может достигать и более высокого уровня, особенно при высокой концентрации наночастиц (10 М) с 10-й по 16-ю и с 23-й по 26-ю мин после смешивания. Этот факт детализирует и уточняет вывод, сделанный после анализа Фиг.3. Он также демонстрирует возможность применения заявленного способа для контроля протекания клеточных процессов при токсическом воздействии анализируемых веществ на тестовые клетки. При этом поведение доли подвижных клеток, изменяющейся на Фиг.4.1 и 4.2 в противофазе со средней амплитудой их колебаний, подтверждает сделанные выводы о биологической активности наночастиц серебра и расширяет информативность анализа.
При необходимости максимального ускорения анализа возможно смешивание двух-трех видов тестовых клеток для одновременной видеофиксации воздействия на них анализируемой жидкости, соответственно с двух-трехкратной последующей обработкой полученного видеофайла. Например, может использоваться смесь суспензий клеток крови и хлореллы, в этом случае для обеспечения жизнедеятельности клеток крови, как уже указывалось выше, в жидкость предварительно добавляется сахароза или соли фосфорной кислоты, присутствие которых нормально переносится клетками хлореллы.
В зависимости от постановки аналитической задачи возможно также определение биологической активности веществ, содержащихся в других жидкостях, обеспечивающих стабильное существование тестовых клеток на период инкубации и анализа - например, в глицерине, маннитоле, их смесях с водой и т.д.
Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает точную количественную оценку биологической активности практически любого растворимого вещества или находящегося в суспензии при его воздействии на разные виды природных живых клеток. Ближайшие аналоги не позволяют получить точную оценку. Для практической токсикологии данное изобретение дает возможность оперативно, объективно и в деталях определять степень воздействия на биосферу как растворенных токсикантов, так и пылевидных, а также коллоидных наноматериалов на единой инструментально-методической основе, что может эффективно способствовать стандартизации анализов на токсичность и оперативному созданию относительно недорогого оборудования и технологий для экологического и производственного контроля.