СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЕРОЯТНОСТИ ИНФИЦИРОВАНИЯ HELICOBACTER PYLORI
METHOD OF PROBABILITY DETERMINATION OF BECOMING INFECTED WITH HELICOBACTER PYLORI

Назначение: медицина. Может быть использован в области гастроэнтерологии для оптимизации диагностики и прогноза заболеваний верхних отделов желудочно-кишечного тракта, ассоциированных с Helicobacter pylori, а также в научных исследованиях в области хронобиологии, хрономедицины и гелиобиологии.
Сущность изобретения: определяют наличие специфических антигенов (O-антигена, высокомолекулярных белков (ВМБ) и вакуолизирующего цитотоксина (VacA) Helicobacter pylori (Hp) в биологических пробах (копрофильтрат, слюна, циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) сыворотки крови) исследуемого пациента реакцией коагтлютинации (РКА). Вероятность инфицирования и жизнедеятельность Hp в организме (способность к размножению и токсигенность) оценивается с учетом следующих дополнительных признаков и групп признаков: сезонные изменения циркуляции Hp в организме, возраст пациента, вид исследуемого материала, солнечная активность в течение 11-летнего солнечного цикла, наличие клинических симптомов заболевания, с использованием предлагаемой Таблицы и Формулы. Вероятность Hp-инфицирования (ВИ) оценивается по Индексу вероятности инфицирования (ИВИ) выраженному в %. При индексе, равном 1%-9%, Hp-инфицирование считается сомнительным, 10-19%- низким, 20-39% - средним, 40-100% - высоким.
Недавно открытый Hp, как установлено к настоящему времени, является широко распространенным микроорганизмом. Он обнаруживается в 60-100% случаев населения различных регионов Земли. В России инфицированность населения составляет 70-80%. Hp обнаруживается в организме человека с раннего детского возраста и персистирует в течение всей жизни. В ряде случаев Hp оказывается основным патогеническим фактором заболеваний верхних отделов ЖКТ - хронического гастрита, неязвенной диспепсии, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, рака желудка. Решением ВОЗ Нр отнесен к 1 классу (безусловных) факторов риска развития рака желудка. Ведущие инфекционисты относят хеликобактериоз к так называемым «медленным инфекциям» (6.7).
Поскольку большинство исследователей приходит к заключению, что Нр является важнейшим фактором этиологии и патогенеза вышеназванных заболеваний их диагностика представляет собой прежде всего выявление Нр, и именно обнаружение этого микроорганизма у больного с диспептическими жалобами фактически предопределяет дальнейшие лечебные мероприятия и оценку их эффективности.
Известны инвазивные (культуральный, гистологический, бактериоскопический, быстрый уреазный тест) и неинвазивные (серологический, уреазный дыхательный, латекс-агглютинация и др.) методы выявления Нр в организме пациентов. Однако большинство из них трудоемки, требуют дорогостоящего специального оборудования, в силу чего не могут быть использованы для многократных исследований и тем более длительного мониторинга Нр-инфекций.
Разработанные нами неинвазивные иммунологические методы определения антигенов - маркеров Нр (O-антигена, ВМБ и VacA) в биологических субстратах (копрофильтрат, слюна, ЦИК сыворотки крови) реакцией коагглютинации (РКА) (1, 2, 4, 5) отличаются высокой чувствительностью и специфичностью, простотой постановки, безвредностью для пациента, высокой экономичностью и вместе с тем позволяют проводить длительное мониторирование, в том числе у детей и тяжелых больных.
В результате многолетних, начиная с 1999 года, проспективных исследований циркуляции антигенов Нр нами впервые была установлена сезонная изменчивость Нр в организме, его способности к размножению и продукции токсина (3). До последнего времени сезонные изменения жизнедеятельности Нр в организме не исследовались вследствие сложностей методического характера и не учитывались при диагностике Нр-инфекций, прогнозе обострений, оценке эффективности антихеликобактерной терапии.
Разработанные нами методы с учетом полученных данных о сезонных изменениях частоты встречаемости О-антигена, ВМБ и VacA в организме наиболее близки по своей сущности и выбраны нами в качестве аналогов настоящего изобретения.
Известна также зависимость частоты встречаемости Нр от возраста пациента. Считается, что инфицирование Нр происходит в детстве и в последующие годы нарастает. В ходе многолетних исследований на большом фактическом материале от 1700 больных желудочно-кишечными заболеваниями (ЖКЗ) и 14 практически здоровых добровольцев (использовано в общей сложности более 4000 проб) были получены и проанализированы данные по использованию РКА для выявления антигенов-маркеров Нр в организме. Анализ накопленного массива данных позволил определить доминантные и дополнительные признаки, влияющие на Нр-инфицирование: сезонные колебания, возраст пациента, наличие клинических симптомов, солнечная активность в течение 11-летнего солнечного цикла, вид биоматериала. Эти данные и легли в основу настоящего изобретения.
Предложена Таблица - алгоритм диагностики и прогноза Нр-инфицирования и Формула вычисления вероятности Нр-инфицирования с учетом этих признаков.
Целью настоящей работы являлась разработка способа (алгоритма) определения вероятности Нр-инфицирования исследуемого пациента и одновременное определение биологической активности Нр (способности к размножению и токсигенности) с учетом наиболее значимых признаков, влияющих на нее.
Техническим результатом, достигаемым при использовании разработанного способа, являются Таблица - алгоритм и Формула определения Нр-инфицирования с учетом основных доминантных признаков, значительно упрощающие и делающие более эффективным определение вероятности Нр-инфицирования при диагностике, оценке результатов антихеликобактерной терапии, прогнозе обострений Нр-заболеваний и ретроспективных исследованиях. Способ может быть использован также при выборе и назначении профилактических мероприятий, а также при исследованиях в области хронобиологии, хрономедицины и гелиобиологии.
Способ определения O-антигена, ВМБ и VacA Нр реакцией коагглютинации, использование для этих целей Таблицы и Формулы и его апробация представлена в примерах.
ПРИМЕР №1. Частота встречаемости О-антигена, ВМБ и VacA Helicobacter pylori у практически здоровых добровольцев в ходе проспективных исследований.
С 1999 г. проводятся проспективные исследования по выявлению О-антигенов, ВМБ и VacA Нр в пробах биоматериала (более 3000 проб) у 14 практически здоровых добровольцев (не предъявляющих жалоб со стороны ЖКТ) в возрасте от 2-х до 92-х лет. В результате этих исследований впервые была установлена сезонная изменчивость частоты встречаемости антигенов в зависимости от месяца года. Кривые среднемесячных показателей по О-антигену представлены на чертеже.
Как видно из чертежа, отражающего частоту встречаемости О-антигена Helicobacter pylori в пробах слюны и кала у здоровых добровольцев в различные месяцы года наиболее высокие показатели выявления О-антигена Нр отмечаются весной в феврале-марте месяцах и осенью в октябре и ноябре. Высокие показатели обнаруживаются также зимой в декабре и январе. В летние месяцы (июнь, июль, август), иногда в сентябре, частота выявления О-антигена существенно снижается. Интенсивность выявления (титры) О-антигена также наиболее высокая в весенний и осенний периоды года.
Аналогичная кривая сезонных колебаний наблюдается также в отношение VacA Нр, хотя амплитуда этих колебаний выражена меньше, чем у О-антигена. Частота встречаемости ВМБ не претерпевала существенных изменений в течение всего года.
Полученные данные свидетельствуют о высокой биологической активности Нр в организме в весенний и осенний периоды года, когда наблюдается нарастание уровня и частоты встречаемости специфического О-антигена и VacA токсина, отражающих способность Нр к размножению и экспрессии токсинов. Существенное снижение О-антигена в летние месяцы, вероятно, связано с переходом бациллярной формы микроба в кокковую, которая, как известно, утрачивает свои поверхностные структуры. Жизнеспособность микроба, однако, при этом сохранялась, о чем свидетельствует неизменный уровень ВМБ.
Важно подчеркнуть, что уникальный весеннне-осенний подъем жизнедеятельности Нр четко отличался от известного летнего сезонного подъема заболеваемости, а также уровня О-антигенов других возбудителей ЖКЗ, в том числе близкородственного Campylobacter.
ПРИМЕР №2. Возраст.
Анализ частоты встречаемости О-антигена Нр в зависимости от возраста исследованных здоровых добровольцев, а также амбулаторных больных с симптомами ЖКИ (в общей сложности 1700 человек) показал, что значительно более низкий показатель частоты выявления антигена Нр наблюдался лишь у детей до 1 года (12%). У детей до 4-х лет он составлял 22%. У более старших детей и взрослых этот показатель несущественно колебался от 30% до 46%, в среднем 37%.
ПРИМЕР №3. Солнечная активность.
Обнаружение сезонных колебаний уровня антигенов и токсина Нр в организме свидетельствовало о влиянии солнечной активности в течение года. Полученные данные явились основанием для анализа показателей частоты встречаемости антигенов в различные годы 11-летнего ритма солнечной активности. Были сопоставлены среднегодовые показатели частоты встречаемости О-антигена Нр и среднегодовые значения чисел Вольфа, являющихся интегральным показателем солнечной активности. Оказалось, что частота встречаемости О-антигена была наиболее высокой в годы наиболее высоких показателей солнечной активности - 1999 г., 2000 г., 2001 г., и снижалась в годы спада кривой СА в 2002-2006 гг. Эти данные показали, что при диагностике и прогнозировании Нр-инфицирования необходимо учитывать также годы солнечного цикла.
ПРИМЕР №4. Клинические симптомы заболеваний ЖКТ.
Из обширной литературы известно, что частота встречаемости Нр по результатам микроскопических и гистологических исследований биоптатов желудка, быстрого уреазного теста, ИФА, уреазного дыхательного теста зависит от характера заболевания и тяжести клинических симптомов, а также морфологических повреждений при заболеваниях верхних отделов ЖКТ.
Наши исследования показали, что частота встречаемости антигенов Нр также коррелирует с выраженностью клинических, гистологических, бактериоскопический показателей. В таблице №1 представлены показатели частоты выявления О-антигена Нр у практически здоровых и больных различными ЖКЗ.
Эти данные также необходимо учитывать при определении вероятности выявления Нр.
ПРИМЕР №6. Вид биоматериала. Условия проведения реакции коагглютинации с биоматериалом от конкретного пациента и оценка результатов.
Наши исследования показали, что относительная чувствительность РКА при определении О-Нр инфицирования при использовании разных видов биоматериала нарастает в следующей последовательности: копрофильтрат < слюна < ЦИК сыворотки крови. Для установления диагноза Нр-инфицирования достаточно брать для исследования в РКА две пробы биоматериала: кал и слюну или кал и сыворотку крови. В каждой из них определяют О-антиген Нр, в слюне и ЦИК также ВМБ и VacA.
Выбор биоматериала определяется своеобразной кривой циркуляции этих антигенов в различные фазы обострения Нр-инфекции. Так, с первых дней инфекционного процесса О-антиген выявляется сначала в кале, несколькими днями позже также в слюне. (Появление О-антигена в слюне, по-видимому, объясняется поступлением его через поврежденную слизистую оболочку ЖКТ в кровь и затем через слюнные железы в ротовую полость). В составе ЦИК крови О-антиген, ВМБ и VacA обнаруживаются вскоре после появления в сыворотке антител. В период реконвалесценции, а также после эффективной эрадикационной терапии О-антиген сначала прекращает выявляться в кале, затем в слюне; в ЦИК крови он может обнаруживаться до 1-2 месяцев. Примерно те же сроки характерны для ВМБ и VacA.
При анализе и оценке результатов РКА у исследуемого больного обнаружение выявление О-антигена в кале и/или слюне свидетельствует о текущей Нр-инфекции. При этом высокие титры О-антигена (2+ и более) также о размножении возбудителя в организме. Обнаружение О-антигена Нр в составе ЦИК означает появление специфической ответной иммунной реакции организма на чужеродные для него антигены микроба, образование специфических иммунных комплексов и персистенцию их в организме. Положительная реакция на VacA свидетельствует о высокой вирулентности штамма Нр и продукции в организме.
Использование каждого из этих видов биоматериала имеет свои достоинства и ограничения: исследование кала целесообразно проводить с целью ранней диагностики, слюны, кроме того, для верификации обнаружения О-антигена более чувствительной, хотя и более поздней реакцией. Кроме того, слюна может быть использована для выявления ВМБ и VacA, наличие последнего определяет токсигенность (более высокую вирулентность) штамма. Выявление ВМБ и/или VacA верифицирует наличие Нр в организме даже при отрицательной реакции на О-антиген в кале и/или слюне.
Обнаружение О-антигена и/или ВМБ и/или VacA хотя бы в одной из исследованных проб свидетельствует о Нр-инфицировании. Отсутствие этих антигенов во всех биопробах означает, что Нр-инфицирование маловероятно или отрицательно. Для уточнения диагноза необходимо проведение повторного анализа, лучше в ближайший весенний или осенний периоды года.
При окончательной оценке данных РКА у пациента необходимо учитывать не только конкретные данные настоящего исследования, но также закономерные показатели вероятности Нр-инфицирования с учетом основных признаков, влияющих на нее, проведенных в примерах №№ 1-5.
ПРИМЕР №7. Использование Таблицы - алгоритма диагностики вероятности Нр-инфицирования и Формулы ее вычисления.
Для определения вероятности Нр-инфицирования разработана Таблица-алгоритм диагностики вероятности Нр-инфицирования. В Таблице №2 содержатся среднеарифметические значения частоты встречаемости О-антигена Нр в разные месяцы года (в %) у практически здоровых добровольцев, обозначенные признаком «СЕЗОННОСТЬ» (С) и 4 поправочных КОЭФИЦИЕНТА для следующих признаков и групп признаков:
1
2
3
4
К - возраст; К - солнечная активность в течение 11-летнего солнечного цикла; К - клинические симптомы заболевания; К - вид биоматериала.
Обозначения:
С - сезонность, %;
1
K - возраст;
2
K - солнечная активность в годы 11-летнего цикла;
3
К - клинические симптомы заболеваний;
4
К - вид биоматериала;
Н - практически здоровые, без симптомов ЖКЗ;
КИ - больные кишечными инфекциями;
НЯД - больные неязвенной диспепсией;
Хр. г-т - больные хроническим гастритом;
ЯБ - больные язвенной болезнью желудка или двенадцатиперстной кишки;
Атр. г-т - больные атрофическим гастритом.
Формула
Вычисление Индекса вероятности Нр-инфицирования (ИВИ Нр) проводится по Формуле
При ИВИ = 1-9% вероятность Нр-инфицирования оценивается как - сомнительная;
= 10%-19% ВИНр - низкая;
= 20%-39% ВИНр - средняя;
= 40%-100% ВИНр - высокая;
= 0% ВИНр - отрицательная.
Например, необходимо определить вероятность Нр-инфицирования больного А, 24 лет, поступившего 10.10.2006 г., с симптомами неязвенной диспепсии, в качестве биоматериала использована слюна. С помощью Таблицы и Формулы определяем ИВИ - Нр:
ИВИ-Нр=45×1,0×0,6×1,3×0,9=32%
+
+
+
Данные РКА слюны = ОВМБVac.
Заключение: Вероятность Нр-инфицирования - 32%, средней степени; штамм Нр продуцирует в организме VacA.
Таким образом, при окончательной диагностике Нр-инфицирования необходимо учитывать не только фактические результаты определения О, ВМБ антигенов и VacA в биопробах конкретного пациента (пример №6), но также вероятность Нр-инфицирования с учетом основных внешних и внутренних факторов, влияющих на Нр-инфицирование, перечисленных в Примерах №№1-5. В случае несоответствия конкретных фактических данных РКА с показателями вычисления вероятности содержания антигенов Нр по прилагаемой Таблице и Формуле при повторном анализе, возникает подозрение о возможном воздействии на жизнедеятельность Нр других факторов (признаков), влияющих на его персистенцию в организме. Например, имеется наблюдение, что кривая персистенции Нр в организме изменяется при холестатическом варианте вирусных гепатитов.
Определение вероятности Нр-инфицирования может быть использовано не только для оптимизации диагностики Нр инфекций, но также при ретроспективных аналитических исследованиях, а также для прогнозирования обострений Нр-ассоциированных заболеваний.
ПРИМЕР №8. Апробация способа определения вероятности Нр-инфицирования.
Апробация Способа была проведена на группе практически здоровых и больных пациентов с симптомами заболеваний желудочно-кишечного тракта. Исследовано 38 пациентов, взятых от 26 мужчин 12 женщин, из которых 9 человек не имели каких-либо симптомов ЖКЗ; 8 - имели симптомы кишечных инфекций; 10 - хронического гастрита; 7 - язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, подтвержденной эндоскопическими и гистологическими исследованиями; 4 - атрофическим гастритом, подтвержденным эндоскопией, из которых 6 человек исследовались до и после антихеликобактерной терапии. Определяли вероятность Нр-инфицирования с помощью предложенной Таблицы - алгоритма и Формулы в сопоставлении с результатами РКА при определении О-антигена, ВМБ и VacA в кале, слюне и ЦИК крови. Результаты апробации Способа и Формулы представлены в таблице №3.
Из данных, предоставленных в Таблице №3, следует, что вероятность Нр-инфицирования, рассчитанная по предлагаемой Таблице №2 и Формуле и равная 10% и выше (низкая, средняя и высокая), была определена в 32 из 38 исследованных проб (84%±6%), вероятность инфицирования остальных 6 проб (16%) была сомнительной.
Выявление О-антигена Нр в РКА наблюдалось в 37 из 38 проб (97%±6%), ВМБ обнаружены в 29 из 37 проб ЦИК крови (78%), VacA - 26 из 37 проб (70%). В общей сложности Нр-инфицирование на основании обнаружения в РКА О-антигена и/или ВМБ и/или VacA обнаружено в 37 из 38 (97±3%) проб.
Совпадение результатов определения вероятности Нр-инфицирования с помощью предлагаемой Таблицы и Формулы с результатами определения антигенов Нр в РКА составляет также 97±3%. Не совпадали значения Нр-инфицирования при том и другом методах определения лишь в 1 случае (2,7%).
Полученные данные, таким образом, показали высокую эффективность предлагаемого Способа определения вероятности Нр-инфицирования с помощью разработанных Таблицы и Формулы, который наряду с высокой чувствительностью, не уступающей другим методам диагностики Нр-инфицирования. Может быть использован для верификации диагностики, а также для прогноза и ретроспективных исследований хеликобактериоза.
Литература
1. Белая Ю.А., Вахрамеева М.С., Белый Ю.Ф., Белая О.Ф., Петрухин В.Г.
Способ получения тест-систем для определения антигенов цитотоксинассоциированных белков Helicobacter pylori в биологическом материале инфицированных лиц реакцией коагглютинации. Патент №2232989 от 15 октября 2002 г. БИ №20.
2. Белая Ю.А., Белая О.Ф., Петрухин В.Г.
Способ получения диагностикумов для выявления антигенов Helicobacter pylori в реакции коагглютинации. Патент №2186394 от 31 января 2001 г.
3. Белая Ю.А.
Сезонная изменчивость жизнедеятельности Helicobacter pylori в организме. Ж-л «Ремедиум Поволжья». «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней». 2006 г., с 72, Н.Новгород.
4. Белый Ю.Ф., Шеклакова Л.Л., Вахрамеева М.С., Жуховицкий В.Г., Петрухин В.Г., Белая Ю.А. Получение рекомбинантного фрагмента белка VacA Helicobacter pylori и разработка на его основе неинвазивного метода диагностики хеликобактериоза. Молекулярная генетика, микробиологии, вирусологии, 2005 г., №1, с 32-35.
5. Евдокимов В.В., Белая Ю.А.
Неинвазивный способ выявления Helicobacter pylori при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки. Патент №2193203 от 17 февраля 2000 г., БИ №32.
6. Исаков В.А, Домарадский И.В.
Хеликобактериоз. Мед. практика. - М, Москва, 2003 г., 411 с.
7. Harry L.T. Mobley, George L. Mendz and Stuart L. Hazel. Helicobacter pylori. Washington (DC); 2001 г.