СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ДОЗЫ АЛЛЕРГЕНА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ АЛЛЕРГОПРОБЫ IN VITRO
METHOD FOR FINDING INDIVIDUAL DOSE OF ALLERGEN FOR ALLERGIC TEST IN VITRO

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и используется, в частности, для определения сенсибилизации пациента к известным лекарственным формам in vitro.
В терапии и оперативной хирургии большого круга заболеваний и повреждений используются целый спектр современных лекарственных средств. Развитие аллергической реакции в ответ на их применение может привести к тяжелым и даже необратимым последствиям (Клиническая аллергология. Под ред. академика РАМН, проф. Р.М.Хаитова [Текст] / М.: «МЕДпресс-информ», 2002. - 623 с.). Актуальным является определение сенсибилизации пациента к лекарствам на этапе подготовки к их использованию, особенно в случаях с известной иммунокомпрометированностью пациента.
Существует большое количество тестов, позволяющих определять I, II, III, IV типы чувствительности (Новик Г.А. Механизмы аллергических реакций и методы аллергообследования в клинической практике. Учебно-методическое пособие составлено под редакцией заслуженного деятеля науки РФ, д.м.н., профессора И.М.Воронцова. - СПб.: Издание ГПМА, 2004. - 76 с.
Медицинские стандарты иммунологического обследования больных с аллергическими заболеваниями и нарушениями иммунной системы (Проект) [Текст] / под ред. И.С.Фрейдлин, А.А.Тотоляна // Мед. иммунология. - СПб.: «Нормед-Издат», 2002. - Т.4. - №2. - С.379-395. Требования к постановке экспериментальных исследований по обоснованию ПДК промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы. Методические указания 1.1.578-96. Минздрав России. - М., 1997. - 16 с.; Дуева Л.А. Промышленные аллергены [Текст] / Л.А.Дуева, В.Ю.Коган, С.В.Суворов, Р.Я.Штеренгарц // М. Центр Международных Проектов. - Госкомприроды СССР. - М., 1989. - 203 с.). Однако всегда при постановке лабораторных аллергологических исследований in vitro, с определенным лекарственным препаратом встает вопрос: какую концентрацию вещества взять в работу, поскольку известно, что от величины этой дозы может зависеть результат теста. Установлено, что существуют индивидуумы, у которых аллергическая реакция может развиваться на крайне малые концентрации вводимого вещества, так же как и встречаются другие, у которых реакция может проявиться только в том случае, когда вводится максимально допустимая доза препарата одномоментно, что обусловлено особенностями фармакокинетики.
Известен способ диагностики лекарственной аллергии выявлением специфических иммунных комплексов (Патент РФ №2301423), согласно которому для выявления лекарственной аллергии к сыворотке крови пациента добавляют равное количество лекарственного препарата, концентрация которого равна половине терапевтической дозы, в контрольную пробу добавляют такое же количество физиологического раствора и далее проводят реакцию с полиэтиленгликолем и учет реакции. Недостатком данного метода является сложность определения концентрации лекарства, которое необходимо использовать для реакции (терапевтическая доза определяется как отношение массы лекарственного вещества к массе тела больного - остается непонятным вопрос, как эту величину соотнести с объемом крови в реакции), отсутствие индивидуального определения дозы вещества (в зависимости от пола и массы тела больного), спорным остается исследование только одной дозы аллергена, в то время, как известно, что возможна реакция как на высокие, так и на низкие дозы средства, предложение проведения реакции с сывороткой крови, хотя известно, что аллергические реакции разных типов бывают опосредованы и клеточными взаимодействиями.
Другим известным способом определения дозы аллергена является способ, описанный в нормативном документе «Требования к постановке экспериментальных исследований по обоснованию предельно допустимых концентраций промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы. Методические указания. МУ 1.1.578-96 (Утв. Госкомсанэпиднадзором РФ 21.10.1996». Согласно п.5.3. «Подбор рабочих доз вещества для постановки специфических аллерготестов с клетками крови животных», процедура выполняется следующим образом: специфические аллерготесты с клетками крови, как правило, выполняют с 0,1-0,01%-ными растворами (на физиологическом растворе). Рабочие дозы (концентрации растворов) испытуемых веществ подбирают путем постановки теста с кровью интактных животных, используя несколько разведений. Для выявления сенсибилизации выбирают максимальную концентрацию раствора, не вызывающую увеличения лизиса или других соответствующих тесту изменений клеток крови по сравнению с контрольной пробой с добавлением только антикоагулянта.
В п.5.4. указано, что рабочие концентрации химических аллергенов не должны вызывать лизис более 9% лейкоцитов интактных животных и наиболее часто соответствуют 0,5-0,05%-ным разведениям на физиологическом растворе; более высокого разведения требуют вещества, обладающие выраженным раздражающим, а следовательно, цитотоксическим действием на клетки крови.
В п.5.5. говорится, что при проведении реакции специфического повреждения нейтрофилов, рабочая концентрация не должна вызывать повреждение более чем 4% и 7% нейтрофилов интактных животных для разных вариантов теста.
Недостатками данного способа являются необходимость использования экспериментальной группы лабораторных животных для определения приемлемой концентрации аллергена, трудности в установлении точной дозы аллергена, «размытые рамки» границ нормы, отсутствие возможности индивидуального подбора дозы в зависимости от пола больного и массы тела.
Наиболее близким к предлагаемому является способ, описанный в работе Бердюгиной О.В. (Бердюгина О.В. Возможности использования лабораторного теста антигенной клеточной стимуляции в диагностике лекарственной аллергии [Текст] / О.В.Бердюгина // Вестник уральской медицинской академической науки. - Екатеринбург: Издательство Среднеуральского научного центра РАМН, 2011. - №2 (35). - T.1. - С.101-102), согласно которого при проведении теста антигенной стимуляции использовали концентрацию аллергена, рассчитанную из максимальной суточной дозы (далее по тексту как высокую), а также дополнительную, полученную путем пятикратного разведения последней (низкую), что было обусловлено особенностями реагирования разных пациентов. Для проведения исследования использовали реагенты CAST-2000 ELISA (фирма  Германия), включающие набор для проведения иммуноферментного (ИФА) определения концентрации сульфидолейкотриенов и реактивы для антигенной стимуляции клеток in vitro. Выделение взвеси лейкоцитов проводилось при инкубировании крови с раствором декстрана в условиях комнатной температуры. После отмывания полученной лейковзвеси, ее ресуспендировали в стимулирующем буфере, содержащем IL-3. Следующим этапом проводилось инкубирование лейкоцитов с растворами аллергенов, часть из которых были фабричного производства (фирма BŰHLMANN, Германия), а другая часть - использовалась в виде растворов нативных лекарственных форм в фосфатно-солевом буфере (pH 6.8-7.2). После получения супернатанта переходили к последнему этапу реакции - ИФА определению концентрации лейкотриенов для чего использовали прибор PersonalLab (Adaltis, Italia). Исследование включало инкубацию супернатанта с ферментной меткой и антителами и последующее добавление паранитрофенилфосфата. Постаналитический этап был представлен расчетом величины стимуляции аллергена, что соответствовало объему продукции лейкотриенов с последующим принятием решения о риске развития аллергической реакции I типа или псевдоаллергической реакции.
Согласно инструкции к использованному набору (информация опубликована на сайте www.buhlmannlabs.ch/2-1-5-Allergens.php.), поставляемые дополнительно к набору CAST-аллергены перед использованием должны быть разведены буфером для стимуляции до концентрации, указанной в ней, а также дополнительно еще в 5 раз для получения дополнительной (низкой) дозы аллергена. Ограничением данных наборов становится крайне узкий спектр предлагаемых готовых аллергенов. Вместе с тем, согласно инструкции, пользователям предоставляется возможность использовать собственные аллергены (лекарственные средства) с небольшими ограничениями: отсутствие в них сульфолейкотриенов, консервантов, стабилизаторов и наличия связанного матрикса, что применимо к большому количеству лекарственных препаратов, находящихся на отечественном рынке фармацевтики. Исходя из вышеизложенного, с учетом потребностей в проведении исследований с большим количеством лекарственных препаратов нами была предложена формула определения концентрации аллергена для проведения аллергопробы in vitro в условиях лаборатории.
Технический результат - определение точной дозы аллергена для проведения индивидуальной аллергопробы in vitro достигается следующим образом: до проведения реакции на основании данных о массе тела пациента, выраженной в кг, гендерной принадлежности, максимальной суточной дозе лекарства (мг) и концентрации препатата, указанной на флаконе (мг/мл или %) определяется объем аллергена, который должен быть использован для определения сенсибилизации пациента к данному веществу в условиях лабораторного исследования. Для определения сенсибилизации к низким дозам вещества полученную концентрацию необходимо снизить в пять раз и провести еще одно дополнительное исследование.
Нами определены дозы более чем двухсот лекарственных средств, с просьбой об определении сенсибилизации к которым обращались пациенты на приеме у аллерголога. Использование данных формул позволяет очень быстро и просто рассчитать дозу вещества для реакции, что улучшает качество и точность диагностики патологического процесса.
Способ осуществляется следующим образом: до постановки реакции определения сенсибилизации пациента к лекарственному препарату, устанавливается максимальная суточная доза назначаемого препарата в мг, концентрация действующего вещества (мг/мл или %), гендерная принадлежность, а также масса пациента (кг) и на основании полученных данных с использованием прилагаемых формул проводится расчет рабочей концентрации растворов по следующей формуле:
где k=1,3 - для женщин и k=1,5 - для мужчин.
В том случае, если препарат ампульный и имеет концентрацию действующего вещества, выраженную в %, уравнение приобретает следующий вид.
В ситуации, когда препарат лиофилизирован и представляет собой порошок, можно приготовить раствор любой удобной концентрации на фосфатно-солевом буфере (pH 6.8-7.2) или физиологическом растворе и провести расчет дозы аллергена по вышеприведенным формулам.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
1. Определение рабочей концентрации нетромицина (нетилмицина) проводилось следующим образом: максимальная суточная доза назначаемого препарата - 525 мг, концентрация действующего вещества - 100 мг/мл, масса пациента - 100 кг, пол - мужской:
=0,0007 мл нетромицина на 1 мл крови (высокая доза).
Расчет низкой дозы: 0,0007 мл нетромицина/5=0,00014 мл на 1 мл крови.
2. Определение рабочей концентрации авелокса (моксифлоксацина) проводилось следующим образом: максимальная суточная доза назначаемого препарата - 400 мг, концентрация действующего вещества - 426 мг/250 мл, масса пациента - 100 кг, пол - мужской:
=0,00003 мл авелокса на 1 мл крови (высокая доза).
Расчет низкой дозы: 0,00003 мл авелокса/5=0,0000063 мл на 1 мл крови.
3. Определение рабочей концентрации этоксиклерола проводилось следующим образом: максимальная суточная доза назначаемого препарата - 140 мг, концентрация действующего вещества - 3%, масса пациента - 100 кг, пол - мужской:
=0,0006 мл этоксиклерола на 1 мл крови (высокая доза).
Расчет низкой дозы: 0,0006 мл этоксиклерола/5=0,00012 мл на 1 мл крови.
4. Определение рабочей концентрации аксетина (сухое вещество) проводилось следующим образом: максимальная суточная доза назначаемого препарата - 6 г (6000 мг), концентрация действующего вещества - готовили 1% раствор (10 мг/1 мл фосфатно-солевого буфера, pH 6.8-7.2), масса пациента - 75 кг, пол - женский:
Расчет низкой дозы: 0,123 мл аксетина/5=0,025 мл на 1 мл крови.
Достоверность и информативность способа доказана авторами на биологическом материале (венозная кровь) 140 больных специализированного аллергологического приема и при обследовании пациентов из аллергологического отделения Государственного учреждения здравоохранения «Свердловская областная клиническая больница №1».
Формулы были получены следующим образом.
Для определения концентрации лекарственного средства необходимо:
1. Рассчитать объем аллергена на 1 мл цельной крови больного
2. Определить коэффициент разведения (К)
3. Рассчитать стимулирующую дозу (СД)
4. Установить объем циркулирующей крови (ОЦК)
что соответствует
ОЦК (л)=0,065*m тела (кг)*
ОЦК (л)=0,05*k*m тела (кг)
где k=1,3 - для женщин
для женщин
и k=1,5 - для мужчин
ОЦК (л)=0,075*m тела (кг)*
для мужчин
* - Шустер X.П. Шок [Текст] / X.П.Шустер, X.Шенборн, X.Лауэр. - М.: Медицина, 1981. - 254 с.
5. После подстановки неизвестных компонентов и упрощения формулы получаем уравнение для расчета рабочей концентрации растворов в реакции определения сенсибилизации к лекарственным формам.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАБОЧЕЙ КОНЦЕНТРАЦИИ РАСТВОРОВ
В том случае, если препарат ампульный и имеет концентрацию действующего вещества, выраженную в %, уравнение приобретает следующий вид
Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет определять индивидуальную дозу аллергена для проведения аллергопробы in vitro, что дает возможность повышать точность определения сенсибилизации пациента к лекарствам, и, как следствие, улучшает диагностику, предотвращая негативное действие лекарств на организм пациента. Способ точен, понятен, прост в исполнении, не требует никаких материальных затрат, вместе с тем его использование позволит существенно улучшить исходы лечения больных с риском развития аллергической реакции.