ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ IN VITRO

1. Способ для исследования in vitro действия веществ в процессах in vivo, который предусматривает следующую последовательность стадий способа:
а) выделение клеток,
b) первичную инкубацию клеток с исследуемым веществом,
с) получение супернатанта или смеси из клеток и супернатанта первичной инкубации,
d) вторичную инкубацию клеток-мишеней с супернатантом или смесью из клеток и супернатанта,
е) анализ клеток-мишеней.
2. Способ по п.1, в котором в случае выделенных клеток речь идет о первичной инкубации эффекторных клеток иммунной системы.
3. Способ по п.1 или 2, в котором в случае клеток-мишеней вторичной инкубации речь идет о клетках человека или клетках высших млекопитающих.
4. Способ по п.1, по одному из предыдущих пунктов, в котором проводят стадии способа 1d) и 1е) с кровью, сывороткой или плазмой пациента.
5. Способ по п.1, по одному из предыдущих пунктов, в котором в случае исследуемых веществ речь идет об иммуномодулирующих, а также индуцирующих апоптоз или некроз соединениях.
6. Способ обнаружения in vitro, который пригоден для идентификации иммуномодулирующих соединений и/или обнаружения действия иммуномодулирующих соединений, а также идентификации вызывающих апоптоз и/или некроз соединений при помощи иммунной системы в процессах in vivo, который предусматривает:
а) первичную инкубацию эффекторных клеток иммунной системы с исследуемым на иммуномодулирующее действие или индуцирующим апоптоз или некроз веществом, с последующим
b) получением супернатанта или смеси из клеток и супернатанта первичной инкубации и с последующей
с) вторичной инкубацией клеток-мишеней с супернатантом или смесью из клеток и супернатанта первичной инкубации и после этого
d) анализ иммуномодулирующего и/или индуцирующего апоптоз и/или некроз действия при помощи подходящего способа обнаружения.
7. Способ по п.6, в котором клетки для первичной инкубации предварительно выделяют в стадии способа 1а).
8. Способ по п.6 или 7, в котором в случае эффекторных клеток иммунной системы для первичной инкубации речь идет предпочтительно о периферических мононуклеарных клетках из крови, клетках селезенки или подвергнутых FACS- или MACS-сортингу субпопуляциях смесей клеток, таких как, например, В-, Т- или NK-клетки, моноциты или дентритные клетки.
9. Способ по п.6, в котором в случае клеток для первичной инкубации и клеток-мишеней для вторичной инкубации речь идет о клетках человека или клетках высших млекопитающих.
10. Способ по п.6, в котором проводят стадии способа 6с) и 6d) с кровью, сывороткой или плазмой пациента.
11. Способ по любому из пп.1 или 6, в котором в случае клеток-мишеней для вторичной инкубации речь идет об опухолевых клетках человека или клеточных линиях онкогенетического происхождения.
12. Способ по любому из пп.1 или 6, в котором в случае иммуномодулирующих соединений, действие которых исследуется, речь идет о СрG-содержащих олигодезоксинуклеотидах или частично двухцепочечных ДНК-конструкциях, по меньшей мере, с одним CpG-основанием в одноцепочечной области.
13. Способ по любому из пп.1 или 6, в котором в случае индуцирующих апоптоз и/или некроз соединений, действие которых исследуется, речь идет предпочтительно об антисмысловых олигодезоксинуклеотидах, коротких интерферирующих РНК (siRNA), антителах или химиотерапевтических веществах.
14. Способ по любому из пп.1 или 6, в котором в качестве исследуемого вещества в первичной инкубации используют цельную кровь, клетки крови, субпопуляции клеток крови, сыворотку крови или плазму крови до, во время и/или после лечения.
15. Способ по любому из пп.1 или 6, в котором инкубация происходит в термостате.
16. Способ по любому из пп.1 или 6, в котором супернатанты получают центрифугированием.
17. Способ по любому из пп.1 или 6, в котором для анализа клеток-мишеней исследуют экспрессию специфических белков.
18. Способ по любому из пп.1 или 6, в котором для анализа клеток-мишеней исследуют экспрессию определенных генов.
19. Способ по любому из пп.1 или 6, в котором клетки-мишени для анализа окрашивают, в частности, аннексином V, или проводят окрашивание иодидом пропидия.
20. Способ по любому из пп.1 или 6, в котором для анализа клеток-мишеней проводят способы обнаружения апоптоза и/или некроза.
21. Способ по любому из пп.1 или 6, в котором проводят анализы клеточного цикла.
22. Способ по любому из пп.1 или 6, в котором при первичной инкубации с исследуемым веществом добавляют антитела или другие конкурирующие вещества.
23. Набор для проведения способа обнаружения in vitro, который пригоден для идентификации иммуномодулирующих соединений и/или обнаружения действия иммуномодулирующих соединений, а также идентификации индуцирующих апоптоз и/или некроз соединений при помощи иммунной системы в in vivo-процессах, имеющий, по меньшей мере, следующие компоненты:
пригодные для хранения приготовленных аликвоты эффекторных клеток иммунной системы, а также
средства для проведения первичной и вторичной инкубации, а также
для обнаружения мессенджеров, которые высвобождаются в виде реакции инкубации клеток первичной инкубации с исследуемым соединением, многолуночные планшеты с количеством лунок 24-96, у которых поверхности этих лунок покрыты антителом, и/или
для исследования изменений экспрессии поверхностных молекул на основе вызываемого исследуемым соединением иммунной реакции средства для проведения ОТ-ПЦР, причем этот набор содержит праймеры для амплификации мРНК поверхностных молекул, ферменты для амплификации и необходимые буферы, и/или средства для FACS-анализа, для которого этот набор содержит подходящие флуоресцентно меченые антитела, которые направлены на поверхностные антигены, а также средства для обработки клеток-мишеней, такие как буферы и химикалии.
24. Набор для изображения in vitro действия иммуномодулирующих соединений, а также индуцирующих апоптоз и/или некроз соединений посредством иммунной системы в in vivo-процессах до, во время и/или после введения подобных соединений, имеющий, по меньшей мере, следующие компоненты:
пригодные для хранения приготовленных аликвоты клеток-мишеней для инкубации с кровью, сывороткой или плазмой, а также
средства для проведения вторичной инкубации, а также
для обнаружения мессенджеров, которые высвобождаются в виде реакции инкубации клеток первичной инкубации с исследуемым соединением, многолуночные планшеты с количеством лунок 24-96, у которых поверхности этих лунок покрыты антителом, и/или
для исследования изменений экспрессии поверхностных молекул на основе индуцируемой исследуемым соединением иммунной реакции средства для проведения ОТ-ПЦР, причем этот набор содержит праймеры для амплификации мРНК поверхностных молекул, ферменты для амплификации и необходимые буферы, и/или средства для FACS-анализа, где этот набор содержит подходящие флуоресцентно меченые антитела, которые направлены на поверхностные антигены, а также, кроме того, средства для обработки клеток-мишеней, такие как буферы и химикаты.
25. Набор по п.24, в котором в случае содержащихся клеток-мишеней речь идет об опухолевых клетках или клеточных линиях онкогенетического происхождения.