Способ диагностики/скрининга колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и М в крови человека на биологическом микрочипе
METHOD FOR COLORECTAL CANCER DIAGNOSIS/SCREENING BASED ON SIMULTANEOUS QUANTIFICATION OF PROTEIN NATURE TUMOUR MARKERS, GLYCANS ANTIBODIES, G, A AND M IMMUNOGLOBULINS IN HUMAN BLOOD ON BIOLOGICAL MICROCHIP

Область техники, к которой относится изобретение
(Technical Field)
Изобретение относится к биохимии и медицине, в частности, к аналитической биохимии и иммунохимическому анализу и касается способа диагностики колоректального рака, основанного на одновременном количественном определении концентрации онкомаркеров белковой природы, уровней антител к онкоассоциированным гликанам, уровней иммуноглобулинов G, А, M в сыворотке крови человека на биологическом микрочипе. Биологический микрочип на основе гидрогелей содержит иммобилизованные антитела к белковым онкомаркерам, иммобилизованные гликаны (в том числе онкоассоциированные), иммобилизованные антитела против иммуноглобулинов человека G, А, М. Предлагаемое изобретение может найти применение в аналитической биохимии, иммунологии и медицине, в частности при диагностике колоректального рака.
Уровень техники
(Background Art)
Колоректальный рак (КРР) стоит на третьем месте по распространенности среди населения индустриальных стран (Claudia Allemani, Hannah К Weir, Helena Carreira, Rhea Harewood, Devon Spika, Xiao-Si Wang, Finían Bannon, Jane V Ahn, Christopher J Johnson, Audrey Bonaventure, Rafael Marcos-Gragera, Charles Stiller, Guiñar Azevedo e Silva, Wan-Qing Chen, Olufemi J Ogun MPC, Group* and the CW. Global surveillance of cancer survival 1995-2009: analysis of individual data for 25 676 887 patients from 279 population-based registries in 67 countries (CONCORD-2). Lancet 2014;(November 26). doi:http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(14)62038-9). Статистика развитых стран мира свидетельствует о неуклонном росте впервые выявленных случаев рака толстой и прямой кишки по сравнению со злокачественными опухолями любой другой локализации, кроме рака легкого. Смертность от КРР также очень высока, например, в США 10% всех онкологических смертей приходится на КРР, для Японии эта цифра 13%.
Россия относится к странам с высоким уровнем заболеваемости КРР и смертности от него. В 2010 г. в нашей стране зарегистрировано более 58 тыс.новых случаев КРР; в структуре онкологической заболеваемости в 2008 г. рак ободочной кишки находился на 4-м месте (6,5% случаев), рак прямой кишки - на 5-м месте (4,9%). Соответственно увеличивается и смертность. Так, в структуре общей смертности доля рака толстой кишки в 2008 г. составила 7,0% (3-е место), а доля рака прямой кишки - 5,8% (4-е место) (Чиссов В.И. и др. Злокачественные новообразования в России в 2010 году: заболеваемость и смертность // ФГБУ МНИОИ им П.А. Грецена. - 2012; 1: 17-136). Главными факторами риска для развития КРР являются генетическая предрасположенность, воспалительные заболевания кишечника, такие как болезнь Крона, язвенный колит, дивертикулит.На ранних этапах, КРР развивается с минимальными клиническими симптомами. В то же время, считается, что смертность от КРР можно снизить с помощью ранней диагностики.
Аденомы считаются наиболее важным предшественником спорадического КРР. Однако было доказано, что у 50% людей с течением жизни будет развиваться колоректальная аденома, но только у 6% она трансформируется в КРР (Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer Statistics, 2012. CA Cancer J Clin 2012;62:10-29). Зубчатые полипы (т.е. зубчатые аденомы и большие гиперпластические полипы) все чаще признаются источником вероятных предраковых поражений. По оценкам 20% - 30% КРР возникают из зубчатых полипов, а не из аденом (Noffsinger АЕ. Serrated polyps and colorectal cancer: new pathway to malignancy. Annu. Rev. Pathol. 2009; 4:343-364).
Зубчатые полипы, как правило, расположены с правой стороны, более распространены среди пожилых людей, и менее заметны эндоскопически, чем аденомы (Groff RJ, Nash R, Ahnen DJ. Significance of serrated polyps of the colon. Curr. Gastroenterol. Rep.2008; 10(5):490-498.). Они растут быстрее, чем аденомы и могут прогрессировать быстрее в КРР (Noffsinger А.Е. Serrated polyps and colorectal cancer: new pathway to malignancy. Annu. Rev. Pathol. 2009; 4:343-364). Развитие зубчатых полипов связывают с BRAF мутациями, которые редко присутствуют при аденомах. До сих пор нет единого критерия, который должен быть использован для идентификации высокого риска развития КРР из зубчатого полипа, кроме, пожалуй, одного критерия - размер полипа свыше 1 см.
Сегодня для обнаружения колоректального рака применяют следующие инвазивные методы - колоноскопию, гибкую сигмоидоскопию, ирригоскопию с двойным контрастированием, компьютерно - томографическую колонографию («виртуальную колоноскопию»).
Гибкая сигмоидоскопия позволяет обследовать внутреннюю поверхность толстой кишки на расстоянии 60 см от анального отверстия. С помощью этого метода можно выявить колоректальные полипы и опухоли. Однако очевидным недостатком этого метода является возможность обследования только левой части толстой кишки, а правая ее часть остается необследованной. В то время как специфичность гибкой сигмоидоскопии очень высока (98-100%), чувствительность в отношении выявления КРР низка от 35% до 70% из-за наличия большого количества правосторонних аденом.
Колоноскопия позволяет выявить и удалить полипы, провести биопсию опухоли, расположенной в толстой кишке. Специфичность и чувствительность выявления полипов и КРР высоки. Пока нет перспективных рандомизированных исследований, в которых бы оценивалось влияние колоноскопии на заболеваемость и уровень смертности. Однако, по данным математического моделирования отдаленные результаты полиэктомии (United States National Polyp Study) показывают почти 90% снижение случаев заболеваемости КРР и смертельных исходов от него (Regula J., Rupinski M., Kraszewska Ε., Polkowski Μ. and other. Colonoscopy in colorectal cancer screening for detection of advanced neoplasia. N. Engl. J. Med. 2006; 355: 1863-1872).
Колоноскопия является «золотым стандартом» выявления КРР, все пациенты с положительным результатом других скрининговых исследований должны быть в последующем направлены на колоноскопию.
Ирригоскопия с двойным контрастированием (ИДК) позволяет исследовать всю толстую кишку, ее чувствительность и специфичность ниже диагностических показателей, получаемых при проведении колоноскопии. Даже при наличии больших полипов и опухолей ИДК обладает существенно более низкой чувствительностью (48%), чем колоноскопия. Кроме того, ИДК дает больше, чем колоноскопия, ложно - положительных результатов (артефакты, определяемые как полипы) (Winawer S.J., Stewart Е.Т., Zauber A.G., Bond J.H., and other. A comparison of colonoscopy and double- contrast barium enema for surveillance after polypectomy. National Polyp Study Work Group.N. Engl. J. Med. 2000; 342: 1766-1772). Пациентам, у которых при ИДК была выявлена патология, в последующем необходимо провести колоноскопию. Несмотря на эти недостатки ИДК широко распространена и тот факт, что с ее помощью можно выявить до 50% больших полипов, обуславливает ее применение при отсутствии возможности проведения более точных исследований.
Компьютерно-томографическая колонография (КТК). Послойной спиральное компьютерно-томографическое сканирование брюшной полости и таза с последующей цифровой обработкой и анализом изображений может создать как дву -, так и трехмерную реконструкцию просвета толстой кишки («виртуальная колоноскопия»). Проведение этого исследования требует инсуфляции воздуха для раздувания кишки до возможного объема, который может перенести пациент.Мета - анализ исследований, в которых КТК использовали для выявления колоректальных полипов и рака, показал высокую чувствительность (93%) и высокую специфичность (97%) при наличии полипов размером в 10 мм или более. Однако, при комбинации полипов больших и средних размеров (свыше 6 мм) чувствительность метода снижалась до 86% и специфичность также до 86%. При исследовании полипов разных размеров разброс показателей чувствительности (от 45% до 97%) и специфичности (от 26% до 97%) становился слишком большим. Серьезным препятствием использования КТК для раннего определения КРР является то, что полипы размерами 6 мм-9 мм и плоские образования в кишке могут быть пропущены (Kim D.H., Pickhardt P.J., Taylor A.J., Leung W.K. and other. CT colonography versus colonoscopy for the detection of advanced neoplasia. The New England journal of medicine. 2007; 357: 1403-1412). Большим недостатком КТК является и то, что для его повторного проведения пациента необходимо подвергнуть повторному воздействию ионизирующего излучения.
Вышеописанные инвазивные методы не подходят для ранней диагностики КРР, т.к. ни одно из перечисленных выше исследований не может охватить полной картины развития и распространения КРР.
Для молекулярной диагностики КРР необходимо контролировать высвобождение опухолевых маркеров на различных стадиях роста опухоли и в различных биологических средах (Ahlquist DA, Harrington JJ, Burgart LJ, Roche PC. Morphometry analysis of the "mucocellular layer" overlying colorectal cancer and normal mucosa: relevance to exfoliation and stool screening. Hum. Pathol. 2000; 31(1):51-57).
К широко распространенным неинвазивным методам определения КРР, используемым в клинике, относятся анализ кала на скрытую кровь, иммунохимическое определение гемоглобина в стуле пациента, определение ДНК маркеров в стуле пациента, определение белковых онкомаркеров в сыворотке крови пациента.
Анализ кала на скрытую кровь основан на определении гемоглобина в стуле пациента (Allison JE, Sakoda LC, Levin TR et al. Screening for colorectal neoplasms with new fecal occult blood tests: update on performance characteristics. J Natl Cancer Inst 2007; 99:1462-1470). Наиболее распространенными являются тесты Hemoccult II (Smith Kline Diagnostics) и Hemoccult II Sensa (Smith Kline Diagnostics). При наличии крови в кале гваяковый тест показывает синее окрашивание. Изменение цвета связано в пероксидазо-подобной активностью гемоглобина в стуле. Для гваякового теста характерна большая доля ложноположительных реакций, низкая специфичность выявления КРР. Ложно-позитивные сигналы могут возникать из-за нарушения диеты при подготовке к анализу, например употребление красного мяса, растительных пероксидаз (некоторые фрукты и овощи), употребление высоких доз витамина С.Наличие геморроя и ангиодисплазий, также могут вызывать ложные положительные результаты. Современные рекомендации по Hemoccult тестированию включают в себя пищевые ограничения (Ransohoff D.F., Lang С.А., Part I: Suggested technique for fecal occult blood testing and interpretation in colorectal cancer screening. Ann Intern Med 1997 126:808).
Из-за низкого уровня диагностической чувствительности, этот тест не позволял выявлять ранние стадии рака (Heresbach D, Manfredi S, D'Halluin Ρ Ν, Bretagne JF, Branger В. Review in depth and meta-analysis of controlled trials on colorectal cancer screening by fecal occult blood test. Eur J Gastroenterol Hepatol 2006; 18(4):427-433).
В основе иммунохимического выявления гемоглобина в стуле пациента лежит взаимодействие гемоглобина со специфическими антителами, с последующей регистрацией сигнала иммунохимическим методом (ИФА). Эти тесты не реагируют с нечеловеческим гемоглобином или пероксидазами растений, что позволяет не соблюдать диетические ограничения (Cole SR, Young GP. Effect of dietary restriction on participation in fecal occult blood test screening for colorectal cancer. Med J Aust 2001; 175(4):195-198). Примерами таких тестов являются HemeSelect (SmithKline Diagnostics, США) и InSure (Enterix Inc., США).
Количественное определение гемоглобина в стуле пациента лежит в основе теста FOB Gold (Sentinel Diagnostics, Италия). Тест FOB Gold позволяет точно определить количественное содержание гемоглобина в стуле без предварительного соблюдения пациентами строгой диеты. Метод основан на реакции агглютинации антиген-антитело между гемоглобином человека и анти-гемоглобин-антителом на латексных частицах. Агглютинация измеряется по абсорбции при 570 нм, увеличение единиц абсорбции пропорционально количеству гемоглобина человека в образце. Данный тест является полностью автоматическим. Специальная пробирка для сбора образцов разработана как контейнер для сбора стула и помещается прямо в биохимический анализатор. К недостаткам метода относится низкая чувствительность выявления КРР.
Метод обнаружения ДНК маркеров в стуле пациента стремительно развивается с начала 2000 г. (Ahlquist DA. Colorectal cancer screening by detection of altered human DNA in stool: Feasibility of a multitarget assay panel. Gastroenterology 2000; 119(5):1219-1227). Целесообразность тестирования стула на наличие ДНК для выявления КРР была впервые продемонстрирована, когда в 1992 г. впервые была обнаружена связь КРР и единственного маркера - мутантного гена KRAS (Sidransky D, Tokino Τ, Hamilton SR, et al. Identification of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumors. Science 1992; 256(5053): 102-105). ДНК-тест позволяет обнаруживать до 52% инвазивных опухолей КРР по сравнению с 13%, обнаруживаемыми с помощью обычного гваякового теста (Р=0,003), с сопоставимым уровнем специфичности. В другом исследовании (Ahlquist DA, Sargent DJ, Loprinzi CL, et al. Stool DNA and occult blood testing for screen detection of colorectal neoplasia. Ann. Intern. Med. 2008; 149(7):441-450), одновременное использование трех маркеров ДНК позволило выявить 46% случаев аденом, в то время как гваяковый тест обнаружил только 10% (Р<0,001), причем специфичность ДНК теста была на 17% выше.
Тем не менее, тест ДНК имеет более низкий уровень чувствительности по сравнению с анализом кала на скрытую кровь (Ahlquist DA, Sargent DJ, Loprinzi CL, et al. Stool DNA and occult blood testing for screen detection of colorectal neoplasia. Ann. Intern. Med. 2008; 149(7):441-450.).
Несмотря на большое разнообразие молекулярных подходов к скринингу колоректального рака, описанных выше, в настоящее время все еще существует необходимость в методе, обладающим высоким диагностическим потенциалом для повышения эффективности скрининга/диагностики КРР и предоставляющим персоналу возможность работать с сывороткой крови пациента.
В клинической практике для диагностики КРР принято определять концентрацию двух белковых онкомаркеров: карциноэмбрионального антигена (РЭА) и карбогидратного антигена СА 19-9 в сыворотке крови пациента методом ИФА (Gold Ρ, Freedman SO. Specific carcinoembryonic antigens of the human digestive system. J. Exp.Med. 1965; 122(3):467-481. Locker GY, Hamilton S, Harris J, et al. ASCO 2006 update of recommendations for the use of tumor markers in gastrointestinal cancer. J. Clin. Oncol. 2006; 24(33):5313-5327), однако чувствительность метода не высока. Традиционно концентрации онкомаркеров в сыворотке крови пациентов определяют методом твердофазного иммуноанализа ИФА. Наиболее распространенные коммерческие тест-системы, основанные на твердофазном ИФА (Fujirebio Diagnostics - CanAg, Швеция, NovaTec, Германия, Abazyme, Needham, США, Biosourse Diagnostics, Бельгия, Alpha Diagnostic Intl., Texas, США; Вектор-Бест, Иммунотех, Амеркард и Хема-Медика, Москва, Россия, Алкор-Био, Санкт-Петербург, Россия), позволяют определять содержание только одного маркера в образце.
Основными направлениями дальнейшего развития и совершенствования методов in vitro диагностики КРР являются их миниатюризация, повышение чувствительностии и возможность проведения одновременного многопараметрического анализа. Множество компании выпускают автоматические анализаторы, которые могут одновременно определеять несколько белковых онкомаркеров в сыворотке крови пациента. Концентрации онкомаркеров автоматически количественно рассчитываются по калибровочным кривым, полученным в ходе проведения иммуноанализа исследуемых растворов и контрольных образцов. Многопараметрическое тестирование образца в данной системе достигается путем одновременного проведения большого количества индивидуальных анализов на каждый онкомаркер.
Например, для определения содержания нескольких онкомаркеров используются автоматические анализаторы, например, фирмы Awareness Technology Inc., США, действующие на основе принципа ИФА, и представляющие собой открытую систему для любых методик и реактивов. Анализатор ChemWell использует стандартные микропланшеты для всех типов реакций и способен проводить несколько параллельных исследований, в том числе иммуноферментный анализ опухолевых маркеров: АФП, РЭА, ПСА, СА125, СА15-3, СА19-9, СА242, ферритина, ХГЧ, НСЕ, тканевого полипептидного антигена, бета 2-микроглобулина в 4-х лунках. Полностью автоматизированный микропланшетный ИФА-анализатор Stat Fax 3200 обеспечивает построение калибровочных кривых, процедуру обсчета результатов, вычитание фона и др., позволяет проводить до 12-и параллельных тестов одновременно. Иммунохемилюминесцентный стриповый анализатор Lumi Stat - CLIA используют для определения 11-и опухолевых маркеров РЭА, ПСАобщ, ПСАсвоб, CAI25, АФП, простатической кислой фосфатазы, CAI 9-9, CAI 5-3, NMP22 (ядерные матриксные белки), бета-2-микроглобулина, цитокератина 18. Прибор Biomerieux mini VIDAS, Франция, представляет собой мультипараметрический автоматический иммуноанализатор, основанный на технологии энзим-связанного иммунофлюоресцентного анализа и предназначен для выполнения "одиночных" тестов. Определение аналитов происходит с высокой чувствительностью (превышающей на несколько порядков чувствительность ИФА), что позволяет значительно снизить время проведения анализа (до 30 мин.). Приборы этого класса представляют собой механическое соединение нескольких анализов, но не одновременный многопараметрический анализ нескольких аналитов в одном образце.
Описано одновременное определение нескольких белковых онкомаркеров с помощью полностью автоматизированных систем Elecsys компании Roche Diagnostics, США/Швейцария, Luminex, США/Нидерланды, и AxSYM компании Abbott, США. Система Elecsys использует принцип гетерогенного иммунохимического анализа на основе электрохемилюминесцентной диагностики - аналитические полоски или микроколонки для аффинной хроматографии. Анализатор Luminex (США) основан на принципе проточной флуориметрии микросфер с иммобилизованными на поверхности лигандами (с использованием различных типов взаимодействия: комплементарное взаимодействие нуклеиновые кислот и оснований, взаимодействие лиганд-рецептор, образование иммунокомплексов, ферментативные реакции), что позволяет проводить одновременный анализ до 100 различных аналитов. Автоматизированные системы AxSYM основаны на иммуноферментном анализе на микрочастицах и/или флюоресцентном поляризационном иммуноферментном анализе. Они обеспечивают быстрое время получения результата (8-30 мин) и высокую производительность (от 80 до 120 тестов в час). Недостатком анализаторов Roche Diagnostics, Luminex и Abbott является то, что они представляют собой «закрытые» системы, состоящие из прибора-анализатора и набора реагентов к нему (используются пробирки, микроколонки, полоски и прочие реагенты только данной фирмы, предназначенные для данной системы или данного конкретного прибора), а также их высокая стоимость (от нескольких десятков до сотен тысяч долларов США), высокие требования к квалификации персонала, что не позволяет их внедрить в широкую клиническую практику. К недостаткам всех анализаторов относится большой объем сыворотки крови, забираемой на анализ (свыше 100 мкл на один онкомаркер).
Диагностика онкозаболеваний по наличию в сыворотке крови человека антител к онкоассоциированным гликанам - перспективная область онкодиагностики, активно развивается с 2010 г. Антитела к онкоассоциированным гликанам (AGA) оказались перспективными маркерами ряда заболеваний, например, рак яичников (Jacob, Francis et al. 2012. "Serum Antiglycan Antibody Detection of Nonmucinous Ovarian Cancers by Using a Printed Glycan Array." International Journal of Cancer 130(1): 138-46).
Учитывая тот факт, что большинство белковых маркеров не являются специфичными по отношению к локализации и типу опухоли, необходимо их объединить в группы в конкретных сочетаниях - так называемые диагностические и прогностические сигнатуры (комбинации белковых онкомаркеров и антител к гликанам), способные решить проблему специфичности, ранней и более точной диагностики КРР.
Поиск и отбор специфичных антител к гликановым структурам при КРР имеет высокую клиническую значимость и открывает новые возможности диагностического сопровождения процесса онкотерапии, определяет стратегию и тактику лечения, ход и возможный исход болезни. Это связано с тем, что антитела к гликанам обнаруживаются в сыворотке крови на ранних стадиях рака (Chapman С, Murray A, Chakrabarti J, et al. Autoantibodies in breast cancer: Their use as an aid to early diagnosis. Ann. Oncol. 2007;18(5):868-873. Chapman CJ, Murray A, McElveen JE, et al. Autoantibodies in lung cancer: possibilities for early detection and subsequent cure. Thorax. 2008; 63(3):228-233).
В настоящее время для проведения масштабных исследований связывания антител AGA с гликанами наиболее часто используется твердофазный иммуноанализ на плашке (Shilova NV, Galanina ОЕ, Pochechueva TV, et al. High molecular weight neoglycoconjugates for solid phase assays. Glycoconj. J. 2005; 22:43-51).
Как и в случае анализа белковых онкомаркеров, для определения антител AGA существует потребность в быстром и автоматическом анализе сыворотки крови пациента. Например, компания SCIEX (США) выпустила автоматический анализатор определения антител AGA с использованием магнитных частиц. К недостаткам этого метода относится возможность определения только AGA к N- гликанам.
В настоящее время задача проведения многопараметрического анализа при минимальном объеме тестируемого образца решается при использовании биологических микрочипов - массивов элементов, содержащих иммобилизованные биологические зонды (ДНК, белки, олигосахариды, олигонуклеотиды и т.д.). Создание биочипов позволило осуществить перенос макроварианта иммунохимического анализа в формат микрочипа и проводить одновременный количественный анализ биологического образца для определения концентраций нескольких анализируемых веществ, что заменяет несколько индивидуальных иммунохимических тестов. Использование технологии микрочипов для проведения лабораторных исследований позволяет миниатюризовать и упростить процедуру анализа, в частности, для анализа белковых онкомаркеров и антител к онкоассоциированным гликанам в сыворотке крови, по сравнению с другими in vitro тестами. Разработка микрочипов для диагностики/скрининга КРР тесно связана с развитием технологии биочипов, позволяющих проводить мультиплексное исследование аналита как на наличие белковых онкомаркеров, так и на наличие антител к гликанам.
Иммунохимический принцип лежит в основе мультиплексного анализа анти-гликановых антител на биочипах, ячейки которых содержат иммобилизованные гликаны. Активность в данной области резко возросла благодаря развитию методологии, которая позволяет наносить на микрочип (размером 25х 75 мм) несколько сот различных гликанов (Blixt, Ola et al. 2004. "Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101(49):17033-38. Jacob, Francis et al. 2012. "Serum Antiglycan Antibody Detection of Nonmucinous Ovarian Cancers by Using a Printed Glycan Array." International Journal of Cancer 130(1):138-46. Pochechueva, Tatiana, Francis Jacob, Andre Fedier, and Viola Heinzelmann-Schwarz. 2012. "Tumor-Associated Glycans and Their Role in Gynecological Cancers: Accelerating Translational Research by Novel High-Throughput Approaches." Metabolites 2(4):913-39. Galanina, О.E., M. Mecklenburg, N.E. Nifantiev, G. V Pazynina, and Ν. V Bovin. 2003. "GlycoChip: Multiarray for the Study of Carbohydrate-Binding Proteins." Lab on a chip 3(4):260-65).
В большинстве работ, посвященных анализу антигликановых антител, иммунохимическое определение антител проводят в сыворотках здоровых доноров, микрочипы являются двумерными, т.е. иммобилизованные гликаны находятся на поверхности носителя (стекла, пластика); при этом гликаны могут быть либо адсорбированы, либо ковалентно связаны с подложкой. Для иммобилизации гликанов используется два основных метода: химическая иммобилизация на твердой поверхности и иммобилизация гликана через спейсер (линкер). В настоящее время существует несколько платформ, которые используют для печати гликановых микрочипов.
Косорциум функциональной гликомики (www. functionalglycomic.org), например, использует NHS-активированные стеклянные слайды для печати гликанов, содержащих аминогруппу. Другие научные группы используют эпоксиактивированные слайды (Роhl NL. Fluorous tags catching on microarrays. Angew Chem Int Ed Engl. 2008; 47:3868-3870.), фторидные слайды (Ko KS, Jaipuri FA, Pohl NL. Fluorous-based carbohydrate microarrays. J Am Chem Soc. 2005;127:13162-13163; Feizi T, Chai W. Oligosaccharide microarrays to decipher the glyco code. Nat Rev Mol Cell Biol. 2004; 5:582-588.), слайды, покрытые нитроцеллюлозой (Feizi Τ, Fazio F, Chai W, et al. Carbohydrate microarrays - a new set of technologies at the frontiers of glycomics. Curr Opin Struct Biol. 2003;13:637-645; Fukui S, Feizi T, Galustian C, et al. Oligosaccharide microarrays for high-throughput detection and specificity assignments of carbohydrate-protein interactions. Nat Biotechnol. 2002;20:1011-1017; Padler-Karavani V, Song X, Yu H, et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 2012; 287:22593-22608.). Причем, для разных условий определения AGA требуются разные платформы для иммобилизации гликанов. Биочипы напечатанные на разных платформах из одинаковых библиотек гликанов часто показывают разные сигналы для гликан связывающих белков, разную специфичность и чувствительность проводимого анализа (Liu Y, Childs RA, Palma AS, et al. Neoglycolipid-based oligosaccharide microarray system: preparation of NGLs and their noncovalent immobilization on nitrocellulose-coated glass slides for microarray analyses. Methods Mol Biol. 2012; 808:117-136.), прямое сравнение сигналов от двух разных платформ часто вводит в заблуждение. Для печати гликанов на нитроцеллюлозной (Edwards HD, Nagappayya SK, Pohl NLB. Probing the limitations of the fluorous content for tag-mediated microarray formation. Chem Commun. 2012; 48:510-512.) и фторидной платформах (Blixt, О., Head, S., Mondala, T., Scanlan, С., Huflejt, M.E., Alvarez, R., Bryan, M.C., Fazio, F., Calarese, D., Stevens, J., Razi, N., Stevens, D.J., Skehel, J.J., van Die, I.,Burton, D.R., Wilson, I.A., Cummings, R., Bovin, N.,Wong, C.H., and Paulson, J.C. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101:17033-17038.) необходима липидная компонента, чтобы гликан мог связываться с GBPs. К преимуществам гликочипов на нитроцеллюлозной мембране можно отнести трехмерное расположение иммобилизованного гликана, но это утверждение спорно, т.к. необходимо следить за влажностью камеры, где хранится гликочип. Пересыхание микрочипа ведет к ложным результатам последующего иммуноанализа GBPs.
В международной патентной заявке Vuskovic M., M. Huflejt (US 2014/0087957 A1) описан способ диагностики и мониторинга нескольких десятков онкологических заболеваний по изменению уровня антигликановых антител nAbs к более чем 500 гликановым структурам в различных биологических жидкостях человека, причем гликаны с любыми спейсерными группами могут быть иммобилизованы на плашке, биочипах или магнитных частицах. Определение уровня антител к гликанам в сыворотке крови проводят методом твердофазного иммуноанализа. В этой патентной заявке не описаны случаи выявления КРР, к недостаткам также относится отсутствие одновременного количественного определения содержания белковых онкомаркеров, уровней иммуноглобулинов G, А, M и антител к гликанам в сыворотке крови пациента.
В международном патенте Blixt О., Head S. (US 2007/0059769 A1) описан биологический микрочип с иммобилизованными гликанами для одновременного анализа антител nAbs к более чем 1000 гликановым структурам и способы иммуноанализа, в которых биочип используется. Описанный в патенте биочип нельзя использовать для количественного анализа антител к гликанам, одновременного проведения количественного анализа белковых онкомаркеров, уровней иммуноглобулинов G, А, М, т.е. для диагностики КРР.
К недостаткам двумерных чипов относятся денатурация биологических образцов на поверхности носителя и на границе раздела фаз, приводящая к потере функциональной активности биологических образцов, недостаточная концентрация активных гликанов в ячейках микрочипа и, вследствие этого, невысокая чувствительность анализа. Более того, к недостаткам технологии двумерных гликочипов следует отнести невозможность одновременной иммобилизации гликанов и белков на одной подложке.
Коммерческие биочиповые тест-систем для определения антигликановых антител на рынке не представлены.
Альтернативой двумерным чипам для определения белковых онкомаркеров и антител к гликанам являются микрочипы на основе гидрогелей.
Технология разрабатывается в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) и основана на одновременном формировании гидрогелевых ячеек с иммобилизацией молекулярных зондов. При этом молекулярные зонды равномерно распределены по всему объему ячейки. За счет развитой поверхности гидрогеля молекулярные зонды иммобилизованы с достаточной плотностью иммобилизации, однако, на значительном удалении друг от друга для нивелирования стерических эффектов. Структура геля предотвращает контакт соединений с гидрофобной подложкой, и обеспечивает нативное водное окружение биологических молекул. Очевидно, что подобный метод иммобилизации замечательно подходит для работы с молекулярными зондами белковой и гликановой природы и по своим характеристикам выгодно отличается от классических методов планарной иммобилизации (Rubina, a Yu et al. Hydrogel-Based Protein Microchips: Manufacturing, Properties, and Applications. BioTechniques. 2003; 34(5):1008-1014; Dyukova V.I., Dementieva E.I., Zubtsov D.A., Galanina O.E., Bovin N.V., Rubina A.Y. Hydrogel glycan microarrays. Anal. Biochem. 2005;347 (1): 94-105).
После завершения процедуры полимеризации молекулярные зонды с достаточной эффективностью ковалентно закреплены в гелевой сетке и распределены по ней равномерно (Зубцова Ж.И., Цыбульская М.В., Савватеева Е.Н., Бутвиловская В.И. и др. Анализ девяти серологических онкомаркеров на гидрогелевом Биочипе. Биоорганическая Химия. 2013; 39(6):693-704).
Недостатки способов диагностики колоректального рака, а так же недостатки микрочипов для анализа белковых онкомаркеров и антигликановых антител, известные из уровня техники, преодолены настоящим изобретением, обеспечивающим способ диагностики колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе.
Раскрытие изобретения
(Disclosure of Invention)
Первым аспектом изобретения является способ диагностики колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе, содержащем гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами к белковым онкомаркерам, гидрогелевые элементы с иммобилизованными гликанами, гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А, М, где изменение уровня анализируемых маркеров по сравнению с уровнем маркеров в сыворотке крови здоровых доноров, свидетельствует о колоректальном раке.
В одном из воплощений способ диагностики колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе, осуществляется в формате сэндвич-иммуноанализа и включает проведение нескольких стадий:
а) инкубацию биологического микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу соединения, для образования иммунных комплексов с иммобилизованными на микрочипе лигандами;
б) детекцию образовавшегося комплекса;
в) количественное определение анализируемого соединения.
В случае сэндвич-иммуноанализа белковых онкомаркеров биологический микрочип содержит иммобилизованные антитела, каждое из которых специфически взаимодействует с тем или иным определяемым аналитом, реакционная среда на стадии а) содержит анализируемое соединение, на данной стадии происходит образование специфического комплекса антиген - иммобилизованное антитело. При необходимости эту стадию проводят в условиях перемешивания, что значительно ускоряет проведение иммуноанализа.
После образования комплекса на стадии б) микрочип проявляют мечеными антителами, специфичными к другому эпитопу анализируемого соединения. Чем выше концентрация анализируемого соединения в образце, тем выше сигнал, регистрируемый с соответствующих гелевых ячеек микрочипа.
В случае сэндвич-иммуноанализа антител к гликанам, биологический микрочип содержит иммобилизованные гликаны против анализируемого соединения, реакционная среда на стадии а) содержит анализируемое соединение, и происходит образование специфического комплекса антитело - иммобилизованный гликан. После образования комплекса микрочип проявляют мечеными антивидовыми антителами, специфичными к другому эпитопу анализируемого антитела. Чем выше концентрация анализируемого соединения в образце, тем выше сигнал, регистрируемый с соответствующих гелевых ячеек микрочипа.
Для количественного определения анализируемых соединений на стадии в) стадии а)-б) проводят со стандартными (эталонными) образцами, содержащими известные концентрации анализируемого соединения и строят калибровочную зависимость регистрируемого сигнала от концентрации анализируемого соединения (калибровочную кривую), по которой определяют содержание анализируемого соединения в образце.
Детекцию результатов иммуноанализа осуществляют флуориметрически. Антитела и другие соединения, используемые для детекции, могут содержать флуоресцентные метки, биотин или являться конъюгатами с белками или другими соединениями, способными участвовать в реакциях, приводящих к излучению света (хеми- или биолюминесценции).
Чувствительность предлагаемого множественного параллельного иммуноанализа соединений на биологическом микрочипе не уступает чувствительности стандартного варианта иммуноанализа, например, в формате микротитровального планшета (Таблица 1)·
Таким образом, способ, предлагаемый в настоящем изобретении, позволяет проводить диагностику колоректального рака, основанную на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе, содержащем гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами к белковым онкомаркерам, гидрогелевые элементы с иммобилизованными гликанами, гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А, М, где изменение концентрации анализируемых маркеров по сравнению с контрольным образцом, полученным от здорового человека, свидетельствует о колоректальном раке.
Вторым аспектом изобретения является биологический микрочип для диагностики колоректального рака. Биологический микрочип представляет собой массив трехмерных гидрогелевых элементов, расположенных на подложке из стекла, пластика металла. Трехмерные гидрогелевые элементы микрочипа ковалентно закреплены на поверхности подложки и отделены друг от друга гидрофобной поверхностью подложки, причем в каждой отдельной ячейке иммобилизовано индивидуальное соединение. В каждом гелевом элементе содержится иммобилизованный лиганд белковой или небелковой природы, который при инкубации микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу соединения, образует специфический иммунный комплекс типа «антиген-антитело». На этой стадии происходит разделение анализируемых соединений из смеси по их способности к специфическому связыванию с иммобилизованными лигандами, что позволяет проводить одновременный, параллельный анализ нескольких объектов на одном микрочипе.
Трехмерные гелевые элементы обладают значительно большей емкостью по сравнению с элементами двумерных микрочипов, что увеличивает чувствительность анализа. Гидрофильное окружение иммобилизованных в структуре гидрогеля лигандов стабилизирует их структуру, что позволяет им полностью сохранять свою биологическую активность.
Лиганды, иммобилизованные в гидрогелевых ячейках биологического микрочипа, выбирают из группы, включающей антитела любого типа и антигены различной природы.
В качестве исследуемых объектов для количественного иммунологического анализа колоректального рака согласно изобретению предпочтительно предлагаются:
- опухолеассоциированные антигены (РЭА, СА 19-9, СА 125, SCCA1 (SPB 3), SCCA2 (SPB 4), ПСА общ., ПСА своб., ХГЧ, АФП, СА 242), являющиеся маркерами онкозаболеваний;
- иммуноглобулины человека классов G, А, М;
n
n
C
Y
A
- антитела к различным гликанам (SiaT, TF, T, Le, Le, SiaLe, Manβ1-4GlcNAc, Galal-4Galβ1-4GlcNAcβ).
Для иммуноанализа опухолеассоциированных антигенов - маркеров колоректального рака в качестве иммобилизованных лигандов используют антитела к указанным опухолеассоциированным антигенам и/или сами опухолеассоциированные антигены. Для иммунологического определения иммуноглобулинов человека классов G, А, М, например, при определении иммунного статуса организма, в качестве иммобилизованных лигандов биологического микрочипа используют антитела против иммуноглобулинов G, А, М, человека и/или иммуноглобулины G, А, М, человека. Для иммуноанализа антител к различным гликанам, иммобилизованными лигандами биологического микрочипа являются гликаны.
Биологический микрочип допускает одновременное и параллельное проведение иммунохимических реакций таких, как одновременное взаимодействие иммобилизованного антитела с белковым онкомаркером, присутствующим в сыворотке крови, взаимодействие иммобилизованного гликана с антителом, присутствующим в том же образце сыворотки крови, одновременное взаимодействие иммобилизованного антитела к иммуноглобулину человека, например, класса G с иммуноглобулином данного класса, находящимся в том же образце сыворотки крови.
В другом воплощении предусмотрено последовательное проведение иммунохимических реакций, например, иммобилизованного антитела с белковым онкомаркером, присутствующим в сыворотке крови на одном кластере биочипа и взаимодействие иммобилизованного гликана с антителом, присутствующим в сыворотке крови, одновременно с взаимодействием иммобилизованного антитела к иммуноглобулину человека, например, класса G с иммуноглобулином, находящимся в же образце сыворотки крови.
Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на фигуры и примеры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.
Осуществление изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает способ диагностики колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов классов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе, содержащем гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами к белковым онкомаркерам, гидрогелевые элементы с иммобилизованными гликанами, гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А, М, где изменение уровня анализируемых маркеров по сравнению с уровнем маркеров в сыворотке крови здоровых доноров, свидетельствует о колоректальном раке.
Способ диагностики/скрининга колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении концентрации онкомаркеров белковой природы, уровней антител к гликанам, уровней иммуноглобулинов G, А, M в сыворотке крови человека на биологическом микрочипе, заключается в проведении иммуноанализа сыворотки крови человека на биологическом микрочипе, и предусматривает:
а) взаимодействие образца сыворотки крови человека с ячейками биочипа в условиях, обеспечивающих образование специфических иммунных комплексов - соединений, иммобилизованных в гидрогелевых ячейках микрочипа, с соединениями, содержащимися в анализируемом образце;
б) детекцию образовавшихся иммунных комплексов;
в) определение уровней белковых онкомаркеров, антител к гликанам и иммуноглобулинов человека класса G, А, М.
г) диагностирование колоректального рака путем сравнения концентрации белковых онкомаркеров, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А, M в анализируемом образце с соответствующими уровнями маркеров в сыворотке крови здоровых доноров.
В качестве реакционной среды, обеспечивающей образование специфических иммунных комплексов, выбирают растворы, которые обычно используются при проведении иммуноанализов различного типа, например, фосфатный буфер, трис-HCl и др. Для уменьшения неспецифических взаимодействий в реакционную среду добавляют поливиниловый спирт, сахарозу, бычий сывороточный альбумин, белки сухого молока и другие соединения, хорошо известные специалистам в данной области.
Общая процедура проведения иммуноанализа с использованием биологических микрочипов описана в примере 1.
Детекцию образовавшихся иммунных комплексов предпочтительно осуществляют флуориметрическим методом. В качестве проявляющих антител используют конъюгаты антител против белковых онкомаркеров, конъюгаты антивидовых антител и конъюгаты антител против иммуноглобулинов человека классов G, А, M с флуоресцентными красителями (Пример 2) или конъюгаты антител против белковых онкомаркеров, конъюгаты антивидовых антител и конъюгаты антител против иммуноглобулинов человека классов G, А, M с биотином и флуоресцентно-меченный авидин (стрептавидин) (Примеры 3, 5). В качестве флуоресцентных красителей используют, например, цианиновый 3 (Су3), цианиновый 5 (Су5), флуоресцеин, Texas Red, но не ограничиваясь ими. Флуоресцентные изображения микрочипов после проведения анализа показаны, например, на Фиг. 2А, Фиг. 2В, Фиг. 2С, Фиг. 2Б. Регистрацию флуоресцентных сигналов с ячеек микрочипа проводят с помощью флуоресцентных микроскопов (Пример 1, Пример 4) или сканирующих микроскопов различных типов (Пример 2), позволяющих регистрировать сигнал с используемой флуоресцентной метки.
В качестве образцов для анализа используются разбавленная или неразбавленная сыворотка крови человека, разбавленная или неразбавленная плазма крови человека.
При определении уровней различных иммуноглобулинов способом настоящего изобретения проводят стадии а) и б) с известными концентрациями анализируемых соединений и строят калибровочные зависимости «сигнал от соответствующих элементов микрочипа - концентрация анализируемого соединения», по которым определяют уровни анализируемых соединений (Фиг. 3А, Фиг. 3В).
При определении концентрации белковых онкомаркеров способом настоящего изобретения проводят стадии а) и б) с известными концентрациями анализируемых соединений и строят калибровочные зависимости «сигнал от соответствующих элементов микрочипа - концентрация анализируемого соединения», по которым определяют уровни анализируемых соединений (Фиг. 4А, Фиг. 4В).
Ниже описан способ диагностики колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и M с использованием биологических микрочипов, являющихся предпочтительными воплощениями настоящего изобретения.
Биологический микрочип, содержащий элементы с иммобилизованными антителами против онкомаркеров белковой природы, гликанами, антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А и М.
Стадия а) При взаимодействии микрочипа с образцом сыворотки крови человека в элементах с иммобилизованными гликанами одновременно происходит образование иммунных комплексов с иммуноглобулинами G, А, М, специфичными к данным гликанам. В это же время, при взаимодействии микрочипа с образцом сыворотки крови человека в элементах с иммобилизованными антителами против белковых онкомаркеров одновременно происходит образование иммунных комплексов с онкомаркерами, из образца сыворотки крови человека специфичными к данным антителам. В это же время, при взаимодействии микрочипа с образцом сыворотки крови человека в элементах с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А, M одновременно происходит образование иммунных комплексов с иммуноглобулинами G, А, M из образца сыворотки крови, специфичными к данным антителам.
Стадия б) При обработке (проявлении) конъюгатами антител с флуоресцентным красителем против каждого из онкомаркеров регистрируют сигналы от элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные антитела против определяемого онкомаркера и эти сигналы флуоресценции используют далее на стадии в) для определения концентрации онкомаркера.
При обработке (проявлении) конъюгатами меченых антител против иммуноглобулинов G, А, M по сигналу с данного элемента микрочипа (с иммобилизованными антителами к иммуноглобулинам G, А, М) определяют уровень иммуноглобулинов G, А, М.
При обработке (проявлении) конъюгатами меченых антител против иммуноглобулинов G, А, M по сигналу с данного элемента микрочипа (с иммобилизованными гликанами) определяют уровень антител к гликанам.
Для одновременного определения уровней онкомаркеров, антител к гликанам и иммуноглобулинов G, А, M проявляющий раствор может включать смесь антител против онкомаркеров, иммуноглобулинов G, А, М, которые являются конъюгатами с флуоресцентными красителями, излучающими свет в разных областях спектра, например, конъюгатами с Су3 и Су5. Одновременное определение онкомаркеров, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А, M возможно также при последовательной обработке микрочипа растворами, содержащими сначала одни меченые антитела, а затем другие меченые антитела, и в этом варианте проявляющие антитела могут содержать как различные, так и одинаковые флуоресцентные метки.
Стадия в) Для построения калибровочных зависимостей биологический микрочип инкубируют с растворами, содержащими известные концентрации онкомаркеров, и строят зависимости «сигнал от соответствующих элементов микрочипа - концентрация анализируемого соединения», по которым с использованием сигналов флуоресценции, полученных на Стадии б) определяют уровни анализируемых онкомаркеров.
Для построения калибровочных зависимостей биологический микрочип инкубируют с растворами, содержащими известные концентрации иммуноглобулинов G, А, M и строят зависимости «сигнал от соответствующих элементов микрочипа - концентрация анализируемого соединения», по которым по которым с использованием сигналов флуоресценции, полученных на Стадии б) определяют концентрацию анализируемых иммуноглобулинов G, А, M и уровни антител к гликанам.
Стадия г) Диагностику колоректального рака (Пример 3) осуществляют методом ROC-анализа, путем сравнения концентрации белковых онкомаркеров, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А, M (Фиг. 6А, 6В) в анализируемом образце с соответствующими уровнями маркеров в сыворотке крови здоровых доноров (Фиг. 5А, 5В).
Результаты определения диагностической эффективности способа выявления колоректального рака, основанного на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе, содержащем гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами к белковым онкомаркерам, гидрогелевые элементы с иммобилизованными гликанами, гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А, M представлены в Таблице 2.
Настоящее изобретение обеспечивает биологический микрочип для диагностики колоректального рака. Микрочип представляет собой массив трехмерных гидрогелевых элементов в форме микрокапель заданного объема, расположенных на подложке из стекла, пластика или металла. Количество и объем элементов массива определяется количеством анализируемых белковых онкомаркеров, гликанов, иммуноглобулинов и аппаратурой, используемой при получении микрочипов (например, размером пина робота, наносящего капли раствора на подложку) и способом регистрации сигналов (флуоресцентный микроскоп, биочип-анализатор, сканер и др.). Биологические микрочипы для иммунологического анализа соединений изготавливают методом полимеризационной иммобилизации по запатентованной технологии (А.Д. Мирзабеков, А.Ю. Рубина, С.В. Паньков, Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления, Патент РФ №2216547 (Б.И.П.М. №32, 20.11.2003). International Application PCT/RU 01/004204, WO 03/033539), которая позволяет получать микрочипы, содержащие иммобилизованные белки, гликаны и другие соединения. Связывание лиганда с гидрогелевой матрицей возможно как напрямую при его иммобилизации в процессе формирования геля, так и опосредованно. В качестве примеров опосредованного связывания лиганда с гидрогелевой матрицей может служить иммобилизация через образование специфических комплексов типа авидин (стрептавидин) - биотин, например, образование связи между иммобилизованным на гидрогелевой матрице авидином и биотинилированным антителом, или иммобилизация через образование специфических комплексов типа металл - хелатор, например, образование связи между иммобилизованной на гидрогелевой матрице нитрилотриуксусной кислотой со связанным с ней координационными связями атомом никеля и рекомбинантным белком, содержащим полигистидиновый фрагмент, и др.
В качестве лигандов, иммобилизованных в гелевых ячейках, могут выступать соединения белковой и небелковой природы, такие как моноклональные антитела, поликлональные антитела, рекомбинантные антитела, различные типы мини антител, в том числе Fab-фрагменты и одноцепочечные антитела (scFv и другие), иммуноглобулины любого типа (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE), антигены различной природы (белки, гликопротеины, полисахариды и др.), низкомолекулярные вещества. Тип используемых при анализе лигандов определяется рядом факторов, например, аффинностью антител по отношению к данному антигену, стабильностью, возможностью иммобилизации антител и введения в них метки (флуоресцентной метки, ферментной метки путем получения конъюгатов и др.), а также способом проведения анализа (прямой, конкурентный, сэндвич-анализ и др.).
Биологический микрочип допускает последовательное проведение реакций различного типа. Например, первой реакцией может быть взаимодействие антигена с антителом с образованием двойного комплекса антиген-антитело или тройного комплекса антитело-антиген-антитело для антигенов белковой природы (иммунологическая реакция). Затем, если антитело или антиген содержит ферментную метку, проводится ферментативная реакция, например, окисление люминола перекисью водорода в присутствии усилителей, катализируемое пероксидазой хрена, в результате которой происходит излучение света (хемилюминесценция). В случае, если антитело или антиген является конъюгатом с биотином, после проведения иммунологической реакции можно проводить связывание с конъюгатом стрептавидина с флуоресцентным красителем непосредственно на микрочипе.
В качестве анализируемых объектов для способа диагностики колоректального рака, основанного на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов классов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе по изобретению предпочтительно предлагаются:
опухолеассоциированные антигены, являющиеся маркерами онкологических заболеваний, в том числе колоректального рака, например:
- альфа-фетопротеин (АФП) - маркер рака печени; простата-специфический антиген (PSA), общий и свободный - маркер рака простаты; раковоэмбриональный антиген (РЭА) - маркер рака желудочно-кишечного тракта; раковый антиген 125 (СА 125) - маркер рака яичника, тела матки; раковый антиген 19-9 (СА 19-9) - маркер рака поджелудочной железы; антиген плоскоклеточной карциномы SCCA 1 (SPB 3)- маркер плоскоклеточного рака шейки матки, рака головы и шеи; антиген плоскоклеточной карциномы SCCA 2 (SPB 4)- маркер плоскоклеточного рака шейки матки, рака головы и шеи; хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) - маркер рака; раковый антиген СА 242- маркер рака кишечника;
- иммуноглобулины человека классов G, А, М;
n
n
C
Y
A
- антитела против гликанов (SiaT, TF, T, Le, Le, SiaLe, Manβ1-4GlcNAc);
Биочип для диагностики колоректального рака может содержать как один кластер, содержащий иммобилизованные антитела к белковым онкомаркерам, гликаны, антитела к иммуноглобулинам человека классов G, А, M для одновременного проведения иммунологической реакции (Пример 3), так и два. Наличие двух кластеров позволяет проводить независимые параллельные иммунологические реакции на одном биочипе (Пример 4, Пример 5).
Иммуноанализ опухолеассоциированных белковых онкомаркеров проводят с использованием биологических микрочипов (Фиг. 1А, 1В), содержащих иммобилизованные антитела против указанных опухолеассоциированных антигенов. При иммунологическом определении иммуноглобулинов человека классов G, А, M в качестве иммобилизованных лигандов биологического микрочипа используют антитела против иммуноглобулинов человека G, А, M (Фиг. 1А, 1В). Для иммуноанализа антител против различных гликанов иммобилизованными лигандами биологического микрочипа являются гликаны (Фиг. 1А, 1В).
Общая процедура проведения иммуноанализа с использованием биологических микрочипов описана в примере 1. Для одновременного иммуноанализа опухолеассоциированных белковых онкомаркеров, в качестве иммобилизованных лигандов биологического микрочипа использовали антитела к указанным опухолеассоциированным белковым онкомаркерам (примеры 4).
В примере 5 описан биологический микрочип для одновременного иммуноанализа уровней антител к гликанам и иммуноглобулинов человека классов G, А, M в образце сыворотки крови с использованием гликанов и антител против иммуноглобулинов G, А, M в качестве иммобилизованных лигандов. Результаты тестирования иммуноглобулинов G, А, M в исследуемых группах пациентов приведены на Фиг. 6А и Фиг. 6В. Результаты определения диагностической эффективности отдельных антител к гликанам приведены на Фиг. 7 и Таблице 3.
Приводимые ниже примеры предназначены не для ограничения притязаний, а исключительно для иллюстрации отдельных воплощений настоящего изобретения.
Пример 1. Иммуноанализ молекулярных маркеров колоректального рака с использованием гидрогелевых микрочипов
Для иммуноанализа использовали микрочипы, структура которых показана на Фиг 1А, Фиг 1В, содержащие элементы с иммобилизованными антителами против белковых онкомаркеров, антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А, М, гликанами. Для уменьшения неспецифических взаимодействий во всех вариантах анализа микрочипы предварительно инкубировали в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,15 M NaCl, 1% поливинилового спирта (ПВС-50) или в том же буфере, содержащем 3% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 4% сахарозы ("блокировочный буфер"), 40 мин. при комнатной температуре. Перед проведением анализа растворы антигена (образца) при необходимости разбавляли 0,01 M фосфатным буфером, рН7,2, содержащим 0,15 M NaCl, 0,15% ПВС-50 и 0,15% поливинилпирролидона 360.
Для сэндвич иммуноанализа, на биочипы наносили 100 мкл раствора антигена. В случае анализа белковых онкомаркеров использовали неразбавленную сыворотку крови, инкубацию проводили при 37°С в течение 20 ч. Для определения антител к гликанам сыворотку крови разбавляли 1/5 0,01 M фосфатным буфером, рН 7,2, содержащим 0,15 M NaCl, 0,15% ПВС-50 и 0,15% поливинилпирролидона 360, инкубацию проводили в течение 2 часов при 37°С.После кратковременной (20 мин.) отмывки в 0,01 M фосфатном буфере, рН7,2, 0,15 M NaCl, 0,1% Твин-20, микрочипы проявляли конъюгатами проявляющих антител с биотином (или флуоресцентно-меченными антителами), специфичными к другому эпитопу антигена (60 мин, при 37°С). После отмывки (0,01 M фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 M NaCl, 0,1% Твин-20, 20 мин, комн. температура) инкубировали с раствором стрептавидина с флуоресцентным красителем (15 мин., 37°С, 0,05 мг/мл) измеряли интенсивность флуоресцентных сигналов. После отмывки (0,01 M фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 M NaCl, 0,1% Твин-20, 15 30 мин, комн. температура) приступали к регистрации флуоресцентных сигналов. Антитела, стрептавидин и антигены белковой природы, меченные флуоресцентными метками (например, Су 5) получали по известным методикам (например, описанным в G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996).
Для измерения флуоресцентных сигналов использовали флуоресцентный микроскоп разработанный в лаборатории биочипов ИМБ РАН (V. Barsky, A. Perov, S. Tokalov, A. Chudinov, Ε. Kreindlin, A. Sharonov, Ε. Kotova, A. Mirzabekov, Fluorescence data analysis on gel-based biochips, J. Biomol. Screening, 2002, 7, 247-257). Микроскоп снабженный CCD камерой и компьютерными программами для визуализации изображения и обработки полученных данных (ИМБ РАН). Микроскоп позволяет одновременно анализировать данные со всех элементов микрочипа и получать двумерное и трехмерное изображения флуоресцентного сигнала с гелевых элементов. Так же возможно использование флуоресцентных сканеров, (например, сканера Genepix 4200 А (Molecular Devices, США)). Величины флуоресцентных сигналов рассчитывали с помощью программного обеспечения Genepix Pro 6.0 (Molecular Devices, США). Для интерпретации результатов использовали интенсивность флуоресценции F635 median, полученную в программе Genepix Pro 6.0.
Для всех вариантов анализа строили график зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации антигена в растворе. Наименьшую определяемую концентрацию антигена рассчитывали как концентрацию, соответствующую интенсивности сигнала, в 3 раза превышающего разброс фонового сигнала.
Пример 2. Количественный иммуноанализ антител к гликанам с использованием гидрогелевых микрочипов
Для одновременного определения уровней антител к гликанам и общих иммуноглобулинов класса G, А, M в образце сыворотки крови человека использовали микрочипы, структура которых показана на Фиг 1А, Фиг 1Б. Перед проведением анализа для уменьшения неспецифических взаимодействий микрочипы инкубировали в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,15 M NaCl, 1% поливинилового спирта («блокировочный раствор»), 40 мин. при комн. температуре.
Микрочипы инкубировали с исследуемым образцом (сывороткой крови) или с калибровочными пробами, содержащими известные концентрации иммуноглобулинов человека классов G, А, М, в течение 2 ч при 37°С.После отмывки в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,15 M NaCl, 1% Tween 20 (20 мин., комнатная температура) микрочипы обрабатывали раствором мышиных антител против человеческих иммуноглобулинов G, А, M с флуоресцентным красителем Су5 (Pierce, USA) (1 ч., 37°С).
После завершения инкубации и отмывки в (0,01 M фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 M NaCl, 0,1% Твин-20, 15 30 мин, комн. температура) от неспецифически связавшихся компонентов регистрировали флуоресцентные сигналы. Для измерения флуоресцентных сигналов использовали микрочиповый сканер Genepix 4200 А (Molecular Devices, США) с программным обеспечением. Флуоресцентное изображение микрочйпа после взаимодействия с сывороткой крови пациента с КРР представлено на Фиг.2 В.
Для повышения достоверности получаемых данных все иммобилизованные гликаны и антитела в составе микрочипа представлены в четырех одинаковых гелевых элементах, и интенсивность флуоресценции рассчитывали как медианный сигнал от четырех одинаковых гелевых элементов.
Строили калибровочную зависимость «интенсивность флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих антитела против иммуноглобулинов G, А, M - концентрация иммуноглобулина G в калибровочной пробе (Фиг. 3 В), по которой определяли уровни гликан- специфических и общих иммуноглобулинов G, А, M в исследуемом образце.
Наименьшую определяемую концентрацию антигена рассчитывали как концентрацию, соответствующую интенсивности сигнала, в 3 раза превышающего разброс фонового сигнала.
Пример 3. Диагностика колоректального рака, основанная на одновременном определении концентрации белковых онкомаркеров, антител к гликанам, иммуноглобулинов классов G, А, M в образце сыворотки крови на биологическом микрочипе.
3.1. Постановка анализа
Для одновременного определения концентрации белковых онкомаркеров, антител к гликанам, иммуноглобулинов классов G, А, M в образце сыворотки крови человека использовали микрочипы, структура которых показана на Фиг 1А. Перед проведением анализа для уменьшения неспецифических взаимодействий микрочипы инкубировали в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,15 M NaCl, 1% поливинилового спирта («блокировочный раствор»), 40 мин. при комн. температуре.
Микрочипы инкубировали с исследуемым образцом (сывороткой крови) или с калибровочными пробами, содержащими известные концентрации белковых онкомаркеров, иммуноглобулинов человека класса G в течение 20 часов при 37°С.После отмывки в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,15 M NaCl, 1% Tween 20 (20 мин., комнатная температура) микрочипы обрабатывали смесью конъюгатов антител против всех онкомаркеров с биотином, конъюгатом антител против иммуноглобулинов человека классов G, А, M с биотином (1 ч., 37°С). После отмывки в 0,01 M фосфатном буфере, рН7,2, содержащем 0,15 M NaCl, 1% Tween 20 (20 мин. при комнатной температуре) микрочипы обрабатывали раствором стрептавидина с флуоресцентным красителем Су5 (Pierce, USA) (15 мин., 37°С). После завершения инкубации и отмывки в (0,01 M фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 M NaCl, 0,1% Твин-20, 15 30 мин, комн. температура) от неспецифически связавшихся компонентов регистрировали флуоресцентные сигналы.
3.2. Обработка данных
Для измерения флуоресцентных сигналов использовали флуоресцентный микроскоп, снабженный CCD-камерой и программным обеспечением для визуализации изображения и обработки полученных данных, разработанный в ИМБ РАН (V. Barsky, А. Perov, S. Tokalov, A. Chudinov, Ε. Kreindlin, Α. Sharonov, Ε. Kotova, A. Mirzabekov, Fluorescence data analysis on gel-based biochips, J. Biomol. Screening, 2002, 7, 247-257) или микрочиповый сканер GenePix 4200A (США). Флуоресцентное изображение микрочипа после анализа сыворотки крови больного КРР представлено на Фиг. 2А, здорового донора - на Фиг. 2С.
Для повышения достоверности получаемых данных все иммобилизованные зонды в составе микрочипа представлены в четырех одинаковых гелевых элементах, и интенсивность флуоресценции рассчитывали как медианный сигнал от четырех одинаковых гелевых элементов.
В качестве положительного контроля работоспособности диагностического инструмента выступают ячейки с иммобилизованным иммуноглобулином G.
Строили калибровочную зависимость «интенсивность флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих антитела против белкового онкомаркера - концентрация белкового онкомаркера в калибровочной пробе (Фиг. 4), по которой определяли концентрацию белкового онкомаркера в исследуемом образце. Результаты определения представлены в Таблице 4.
3.3. Анализ диагностической эффективности сигнатур для диагностики колоректального рака при помощи статистической обработки данных и ROC- анализа.
Статистическая обработка данных анализов (концентрации онкомаркеров, флуоресцентные сигналы от иммобилизованных гликанов и антител к иммуноглобулинам человека классов G, А, М, полученные после проведения иммуноанализа на чипах конструкции Фиг. 1А, 1В проводилась с помощью программ MedCalc Version 15.4. Сравнительный анализ диагностической эффективности разных факторов при мультиплексном анализе на чипах проводился с помощью многопараметрического логрегрессионного анализа (Hosmer DW, Lemeshow S. Applied logistic regression. Wiley Series in probability and statistics, 3rd ed. New York:Wiley-Interscience, 2013. 528 p) и ROC-кривых (Receive Operating Characteristic curve analysis) (Bradley AP. The use of the area under the ROC curve in the evaluation of machine learning algorithms. Pattern Recognition 1997; 30:1145-59; Vuskovic MI, Xu H, Bovin NV, et al. Processing and analysis of serum antibody binding signals from Printed Glycan Arrays for diagnostic and prognostic applications. Int J Bioinform Res Appl 2011; 7:402-26). Чем больше площадь под ROC-кривой, тем выше диагностическая эффективность данного фактора. Метод определения диагноза считается превосходным, если площадь под ROC-кривой AUC=0.9-1.0; очень хорошим при AUC=0.8-0.9; хорошим при AUC=0.7-0.8; удовлетворительным при AUC=0.6-0.7; и неудовлетворительным при AUC=0.5-0.6. Случайное предсказание соответствует AUC=0.5. Также для оценки диагностической эффективности разрабатываемого метода определения колоректального рака (CRC) были использованы число верно предсказанных положительных диагнозов (TP, %) и доля верно классифицированных диагнозов (точность, %).
Рассматривали следующие модели: модель "Oncology" (CRC=1, IBD=0, HD=0); "Disease" (CRC=1, IBD=1, HD=0); и "CRC/IBD" (CRC=1, IBD=0). Модель "Oncology" позволяет выделить случаи CRC; "Disease" позволяет отличить больных пациентов от здоровых; модель "CRC/IBD" отличает случаи CRC от воспалительных заболеваний кишечника.
Доли истинно положительных и ложно положительных примеров рассчитывали по формулам (1) и (2).
Доля истинно положительных примеров TPR (True Positives Rate):
Доля ложно положительных примеров FPR (False Positives Rate):
где TP (True Positives) - верно классифицированные положительные диагнозы;
TN (True Negatives) - верно классифицированные отрицательные диагнозы;
FN (False Negatives) - положительные примеры, ложно классифицированные как
отрицательные (заболевание ошибочно не обнаруживается);
FP (False Positives) - отрицательные примеры, ложно классифицированные как положительные (ложное обнаружение болезни).
Чувствительность и специфичность бинарной модели ROC анализа рассчитывали по формулам (3) и (4).
Чувствительность модели (Sensitivity) - это доля истинно положительных случаев:
Специфичность модели (Specificity) - доля истинно отрицательных случаев, которые были правильно идентифицированы моделью:
Чувствительность и специфичность бинарной модели определения заболевания стремится к 100% (площадь под ROC-кривой стремится к 1), если количество детектируемых моделью ложноотрицательных или ложноположительных диагнозов заболевания стремится к нулю.
В программе MedCalc Version 11.4.2.0 проводили расчет AUC для сигнатур (Фиг. 7, Фиг. 6В., Фиг. 5).
Результаты диагностической эффективности сигнатур для выявления колоректального рака в сыворотках крови пациентов из трех когорт приведены в Таблице 2.
Пример 4. Одновременный анализ нескольких белковых онкомаркеров на одном микрочипе
Были изготовлены микрочипы с иммобилизованными антителами ко всем исследуемым маркерам РЭА, СА 19-9, СА 125, SPB 3, SPB 4, ПСА общ., ПСА св., ХГЧ, АФП, СА 242, (Фиг. 1А, 1В). Для анализа белковых онкомаркеров использовали неразбавленную сыворотку крови, инкубацию проводили при 37оС в течение 20 ч. После кратковременной (20 мин.) отмывки в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,2, 0,15 М NaCl, 0,1% Твин-20, микрочипы проявляли конъюгатами проявляющих антител с биотином (или флуоресцентно-меченными антителами), специфичными к другому эпитопу антигена (60 мин, при 37°С). После отмывки (0,01 М фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl, 0,1% Твин-20, 20 мин, комн. температура) инкубировали с раствором стрептавидина с флуоресцентным красителем (15 мин., 37°С, 0,05 мг/мл). После отмывки (0,01 М фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl, 0,1% Твин-20, 15 30 мин, комн. температура) приступали к регистрации флуоресцентных сигналов.
Как видно из Фиг. 2В, в случае анализа образца больного колоректальным раком, яркие сигналы наблюдались в гелевых ячейках, содержащих специфические антитела (РЭА, СА 19-9, СА242). Пределы обнаружения онкомаркеров в случае их параллельного анализа оказались такие же, как и при определении каждого маркера в отдельности (Таблица 5).
Пример 5. Одновременное определение уровней антител к гликанам и иммуноглобулинов человека классов G, А, M в образце сыворотки крови
Использовали микрочипы, структура которых показана на ФИГ. 1В. Перед проведением анализа микрочипы обрабатывали блокировочным раствором, как описано в Примере 1.
Микрочипы инкубировали с исследуемым образцом сыворотки крови или с калибровочными пробами, содержащими известные концентрации иммуноглобулина G, в течение 2 ч при 37°С; после отмывки (0,01 M фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 M NaCl, 0,1% Твин-20, 20 мин, комн. температура) микрочипы инкубировали с конъюгатом биотинилированных поликлональных антител против иммуноглобулинов G, A, M (1 ч, 37°С). Инкубировали с раствором стрептавидина с флуоресцентным красителем (15 мин., 37°С, 0,05 мг/мл). После отмывки (0,01 M фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 M NaCl, 0,1% Твин-20, 15 30 мин, комн. температура) приступали к регистрации флуоресцентных сигналов, как описано в Примере 1. Флуоресцентное изображение микрочипа после анализа сыворотки крови здорового донора представлено на Фиг. 2D.
Строили калибровочную зависимость интенсивность флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих антитела против иммуноглобулинов G, А, M - концентрация иммуноглобулина G в калибровочной пробе (Фиг. 3В), по которой определяли уровни специфических и общих иммуноглобулинов G в исследуемом образце сыворотки крови.
Краткое описание фигур
Brief Description of Drawings)
Фиг. 1A и Фиг. 1B демонстрируют вид гидрогелевого биологического микрочипа для одновременного количественного определения онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и M в крови человека на биологическом микрочипе. Каждое иммобилизованное соединение представлено в четырех одинаковых элементах.
Фиг. 1А демонстрирует вид однокластерного гидрогелевого биологического микрочипа.
Фиг. 1В демонстрирует вид двухкластерного гидрогелевого биологического микрочипа.
Схема микрочипа для диагностики колоректального рака. Массив гидрогелевых элементов содержит элементы с иммобилизованными гликанами, антителами к белковым онкомаркерам и элементы с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А, М.
Молекулярные зонды:
Антитела к белковым онкомаркерам: 1) Элементы с иммобилизованными антителами против АФП, 2) элементы с иммобилизованными антителами против ХГЧ, 3) элементы с иммобилизованными антителами против РЭА, 4) элементы с иммобилизованными антителами против СА 19-9, 5) элементы с иммобилизованными антителами против СА 125, 6) элементы с иммобилизованными антителами против ПСА, 7) элементы с иммобилизованными антителами против SPB3, 8) элементы с иммобилизованными антителами против SPB4, 9) элементы с иммобилизованными антителами против СА 242;
n
n
A
C
Y
Гликаны: 10) T; 11)SiaT; 12) SiaLe; 13) Le; 14) Le; 15) TF; 16) Manβ1-4GlcNAc;
17) элементы с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов G, А, М,
18) элементы с иммобилизованным иммуноглобулином человека класса G,
19) элементы, не содержащие биоматериала.
Фиг. 2А, Фиг. 2В, Фиг. 2С, Фиг. 2D представляют флуоресцентные изображения биологических микрочипов после проведения анализа сывороток крови пациентов с диагнозом КРР и здорового донора. В сыворотках крови определяли уровни белковых онкомаркеров, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А, М. Микрочипы инкубировали с образцом сыворотки крови и проявляли смесью биотинилированных антител против белковых онкомаркеров, биотинилированными антителами против иммуноглобулинов G, А, M с последующей проявкой стрептавидином, меченным флуоресцентным красителем Су5.
Фиг. 2А. Изображение однокластерного микрочипа, структура которого показана на Фиг. 1 А, после анализа сыворотки пациента с диагнозом колоректальный рак.
Фиг. 2В. Изображение однокластерного микрочипа, структура которого показана на Фиг. 1 В, после анализа сыворотки пациента с диагнозом колоректальный рак.
Фиг. 2С. Изображение двухкластерного микрочипа, структура которого показана на Фиг. 1А, после анализа сыворотки здорового пациента.
Фиг. 2D. Изображение двухкластерного микрочипа, структура которого показана на Фиг. 1 В, после анализа сыворотки здорового пациента.
Фиг. 3А, Фиг. 3В представляют графики зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала, полученные от элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные антитела против иммуноглобулинов классов G, А, M от концентрации иммуноглобулинов G, А, M в растворе. Каждая точка калибровочной зависимости - среднее значение измерений на десяти микрочипах. Вертикальными отрезками показаны величины стандартных отклонений. Калибровочные зависимости строились с использованием кусочно-линейной интерполяции.
Фиг. 3А представляет график зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные антитела против иммуноглобулинов классов G, А, M от концентрации иммуноглобулинов G, А, M в разведениях сыворотки крови пациента с известным содержанием иммуноглобулина G.
Фиг. 3Б представляет график зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные антитела против иммуноглобулинов классов G, А, M от концентрации иммуноглобулина G в растворе.
Фиг. 4А, Фиг. 4В представляют графики зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные антитела против белковых онкомаркеров РЭА и СА 19-9 от концентрации РЭА и СА 19-9 в растворе. Каждая точка калибровочной зависимости - среднее значение измерений на десяти микрочипах. Вертикальными отрезками показаны величины стандартных отклонений. Калибровочные зависимости строились с использованием кусочно-линейной интерполяции.
Фиг. 4А представляет график зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные антитела против белкового онкомаркера РЭА от концентрации РЭА в растворе.
Фиг. 4В представляет график зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные антитела против белкового онкомаркера СА 19-9 от концентрации СА 19-9 в растворе.
Фиг. 5А и Фиг. 5В. демонстрируют результаты статистического анализа (ROC-анализ) диагностической эффективности выявления КРР при одновременном определении молекулярных сигнатур в сыворотке крови. Сигнатура, состоящая из 4х антител к гликанам: Tn, TF, SiaLeA и Manβ1- 4GlcNAc; Сигнатура, состоящая из 6 онкомаркеров: РЭА, СА 19-9, АФП, ХГЧ, СА 125, СА 15-3.
Фиг. 5А. демонстрируют результаты статистического анализа (ROC- анализ) диагностической эффективности выявления КРР при одновременном определении шести онкомакеров в сыворотке крови по сравнению с диагностической эффективностью выявления КРР при одновременном определении концентраций РЭА и С А19-9 в сыворотке крови пациентов с диагнозами КРР (33 шт.), воспалительные заболевания кишечника (27 шт.) и здоровых доноров (69 шт.) (для выявления КРР использовали модель "Oncology" (CRC=1, IBD=0, HD=0)). Построение ROC- кривых, статистическая обработка данных анализов проводилась с помощью программ MedCalc Version 11.4.2.0.
Фиг. 5В. Демонстрирует зависимость диагностической эффективности выявления КРР (площадь под ROC- кривой (AUC)) от состава диагностических сигнатур. Сигнатура, состоящая из 4х антител к гликанам: Tn, TF, SiaLeA и Manβ1- 4GlcNAc; Сигнатура, состоящая из 6 онкомаркеров: РЭА, СА 19-9, АФП, ХГЧ, СА 125, СА 15-3.
Фиг. 6А и Фиг. 6В демонстрируют результаты измерения содержания иммуноглобулинов G, А, M в исследуемых группах пациентов с диагнозами колоректальный рак (CRC), здоровых доноров (HD), с диагнозом воспалительные заболевания кишечника (IBD).
Фиг. 6А представляет Box-and-wiskers диаграмму («ящик с усами») полученных результатов по выявлению уровней иммуноглобулинов G, А, M в сыворотках крови пациентов с диагнозом КРР (CRC), воспалительными заболеваниями кишечника (IBD) и здоровых доноров (HD). Приведено распределение флуоресцентных сигналов, полученных на микрочипах от ячеек, содержащих иммобилизованные антитела к иммуноглобулинам (IgG, IgA, IgM) человека, для трех групп пациентов. Границами ящика служат 25-й и 75-й процентили соответственно, линия в середине ящика - медиана (50-й процентиль). Концы усов - края статистически значимой выборки.
Фиг. 6В демонстрируют результаты ROC-анализа выявления уровня общих иммуноглобулинов G, А, M в сыворотках крови пациентов с диагнозами КРР, воспалительные заболевания кишечника, здоровых доноров в следующих моделях:
А - модель "Oncology" (CRC=1, IBD=0, HD=0), модель позволяет выявить только колоректальный рак;
В - модель «Disease» (CRC=1, IBD=1, HD=0), модель позволяет выявить только здоровых доноров.
Исследование проводили в трех когортах пациентов: пациенты с диагнозами КРР (33 шт.), воспалительными заболеваниями кишечника (27 шт.), здоровые доноров (69 шт.) (Построение ROC-кривых, статистическая обработка данных анализов проводилась с помощью программ MedCalc Version 15.4).
Фиг. 7 демонстрирует результаты статистического анализа (ROC- анализ) диагностической эффективности антител к гликанам для выявления КРР. Изучение проводили в сыворотках крови пациентов с диагнозом КРР (33 сыворотки), воспалительными заболевания кишечника (27 сывороток) и здоровых доноров (69 сывороток) (для выявления КРР использовали модель "Oncology" (CRC=1, IBD=0, HD=0)). Построение ROC-кривых, статистическая обработка данных анализов проводилась с помощью программ MedCalc Version 15.4.