СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОНКОАНТИГЕНОВ PSA И СЕА
METHOD OF SIMULTANEOUS IMMUNOCHROMATOGRAPHY ANALYSIS OF PSA AND CEA ONCOANTIGENS

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ одновременного иммунохроматографического определения онкоантигенов PSA и СЕА в сыворотке крови с использованием тест-полоски.
Для реализации способа предлагается иммунохроматографическая тест-полоска, состоящая из частей А, В и С (фиг.1а), монтируемых на подложке D таким образом, что часть А на 1-2 мм перекрывает часть В. При этом А представляет собой инертный пористый носитель из стекловолокна (ПЭД) с нанесенной на его поверхность реакционной зоной 1 (с нанесенным конъюгатом мышиных моноклональных антител против PSA с наноколлоидным золотом), и реакционной зоной 2 (с нанесенным конъюгатом мышиных моноклональных антител против СЕА, меченных наноколлоидным золотом). Конъюгаты нанесены в реакционной зоне параллельными полосами в центральной области ПЭД перпендикулярно току жидкости на расстоянии 2 мм друг от друга. Часть В тест-полоски представляет собой нитроцеллюлозу, иммобилизованную на полимерное основание, на поверхность которой нанесена тест-зона 6, тест-зона 7 и контрольная зона 10. Тест-зона 6 представляет зону с нанесенными полосой перпендикулярно длинной стороне тест-полоски в 2 мм от середины нитроцеллюлозы мышиными моноклональными антителами против эпитопа PSA, отличного от эпитопа, к которому специфичны антитела, локализованные в реакционной зоне 1. Тест зона 7 представляет собой зону с нанесенными полосой перпендикулярно длинной стороне тест-полоски в 2 мм от середины нитроцеллюлозы мышиными моноклональными антителами против эпитопа СЕА, отличного от эпитопа, к которому специфичны антитела, локализование в реакционной зоне 2. Контрольная зона 10 представляет зону с нанесенными параллельной полосой на 3 мм от середины ближе с отсасывающему фильтру С кроличьими моноспецифическими антителами против иммуноглобулинов мыши 9. При этом В имеет капиллярную связь с реакционной зоной носителя А. С - отсасывающий фильтр для поглощения непрореагировавших реагентов. Решение о наличии PSA и/или СЕА принимают по наличию окраски тест-зон 6 и 7. Окраска зоны 6 указывает на наличие повышенного количества онкоантигена PSA в образце, окраска зоны 7 - на наличие повышенного количества онкоантигена СЕА, одновременная окраска зон 6 и 7 указывает на наличие в образце обоих антигенов. Отсутствие окраски в зонах 6 и 7 указывает на нормальное содержание этих онкоантигенов. Окраска контрольной зоны свидетельствует о работоспособности тест-полоски. Использование изобретения обеспечивает одновременное выявление онкоантигенов PSA и СЕА для целей скрининга мужчин из группы риска, позволяющее выявлять пациентов с подозрением на онкологические заболевания предстательной железы и некоторых других нозологий.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к иммунологии, биотехнологии и онкологии. Разработан метод одновременной экспресс-диагностики наличия онкомаркеров PSA и СЕА в сыворотке крови, основанный на иммунохроматографическом (ИХ) определении наличия этих антигенов в образцах. Сущность изобретения состоит в использовании трехслойного иммунохроматографического анализа с использованием моноклональных антител. Моноклональные антитела (МАТ) к PSA и СЕА, иммобилизованные соответственно в тест-зонах 6 и 7 ИХ-стрипа на нитроцеллюлозной мембране, реагируют с соответствующими антигенами (АГ) в образце сыворотки в процессе тангенциального перемещения материала образца по ИХ-стрипу. Одновременно происходит связывание конъюгата (КГ) МАТ против других эпитопов PSA и СЕА с наноколлоидным золотом (НКЗ) с АГ PSA и АГ СЕА соответственно. В результате при наличие в образце АГ PSA в тест-зоне 6 иммунохроматографического стрипа образуется комплекс КГ PSА-АГ PSA-AT PSA. При наличие в образце АГ СЕА в тест-зоне 7 образуется комплекс КГ СЕА-АГ СЕА-АТ СЕА. В контрольной зоне образуется комплекс AT против иммуноглобулинов мыши с несвязавшимися КГ PSA и КГ СЕА. Образовавшийся комплекс позволяет визуализировать наличие АГ PSA и АГ СЕА в сыворотке крови, а комплекс в тест-зоне - визуализирует сохранность стрипа. Это позволяет проводить скрининговую диагностику наличия пациентов с раком предстательной железы и другими онкологическими заболеваниями в группах риска.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Простатоспецифический АГ (PSA) представляет собой гликопротеин, вырабатываемый секреторными эпителиями простаты и обеспечивающий разжижение эякулята. Концентрация PSA в сыворотке крови доноров - не более 4 нг/мл. Известно, что повышение уровня PSA при опухолях является механическое давление гиперплазированной ткани на неизмененную ткань, что имеет место в том числе и при раке предстательной железы. Повышение концентрации PSA более 4 нг/мл в возрасте до 60 лет и до 8 нг/мл в возрасте после 60 лет у мужчин считают диагностическим признаком нарушений предстательной железы, в том числе ее озлокачествления. В России летальность на первом году жизни после установления диагноза составляет более 30%, что связано с диагностикой рака простаты на 3 и 4 стадии в подавляющем большинстве случаев. Раннее обнаружение пациентов с повышением PSA в крови пожилых мужчин - одна из наиболее эффективных возможностей сокращения смертности от рака простаты, который является одной из наиболее часто встречающихся злокачественных патологий пожилых мужчин. Иммунохроматографические тесты - один из наиболее пригодных для скрининговой диагностики метод, который может широко внедряться как медицинский тест, так и в качестве домашнего теста. Эти тесты не требуют квалифицированного персонала и специальной аппаратуры для своей постановки.
Известна тест-кассета для быстрого определения специфического АГ предстательной железы (ПСА) фирмы «Асоп Biotech Со, Ltd», КНР. Недостатком данного экспресс-теста является недостаточная чувствительность и специфичность в силу определения одного антигена, повышение уровня которого незначительно на ранних стадиях рака простаты. Кроме того, его диагностическую ценность снижает повышение уровня PSA при доброкачественных опухолях и воспалительных заболеваниях простаты. Аналогичные недостатки присущи аналогичным тестам фирмы «Syntron» США, «Нuman» Франция и ООО «Хема-Медика» Россия («Биоорганическая химия» 2007, 33(5): 550-554).
Ракоэмбриональный АГ (СБА) - онкофетальный белок, формируемый при эмбриональном (внутриутробном) развитии. У взрослых людей СЕА продуцируется в очень ограниченном количестве и его концентрация не превышает 2,5-5 Е/мл у некурящих и 7-10 Е/мл у курящих. Повышение концентрации СЕА выше этой нормы обычно свидетельствует о наличие злокачественных заболеваний различной этиологии (рак простаты, рак желудочно-кишечного тракта, рак молочной железы, рак легкого и некоторых других). Чувствительность определения повышения СЕА в сыворотке крови для различных онкологических заболеваний составляет 20-60%. Экспесс-тесты на этот АГ производятся фирмой «Syntron» США. Недостатком теста является низкая специфичность и предсказательная ценность для выявления рака предстательной железы.
Нами предложен способ одновременного выявления PSA и СЕА, позволяющий повысить его чувствительность по отношению к пациентам с раком предстательной железы и одновременным значительным увеличением скрининговой ценности за счет обнаружения других злокачественных заболеваний путем выявления повышения концентрации СЕА.
Соответственно, требуемый при реализации устройства технический результат состоит в устранении недостатков, присущих аналогам.
Чертежи
Фиг. 1. Принципиальная схема устройства иммунохроматографической тест-полоски, реализующей предлагаемый способ иммунохроматографического определения антигенов PSA и СЕА.
а) Тест-полоска до начала нанесения образца.
б) Тест-полоска после окончания реакции в отсутствии антигенов.
Фиг. 2. Схема иммунохроматографической реакции при наличии антигена PSA в образце.
а) Тест-полоска до начала нанесения образца.
б) Тест-полоска после окончания реакции.
Фиг. 3. Схема иммунохроматографической реакции при наличии антигена СЕА в образце.
а) Тест-полоска до начала нанесения образца.
б) Тест-полоска после окончания реакции.
Фиг. 4. Схема иммунохроматографической реакции при наличии антигенов PSA и СЕА в образце.
а) Тест-полоска до начала нанесения образца.
б) Тест-полоска после окончания реакции,
где использованы следующие обозначения составных элементов указанного устройства и обозначены основные этапы его функционирования:
A. ПЭД.
B. Нитроцеллюлозная мембрана.
C. Отсасывающий фильтр.
D. Монтирующая подложка.
1. Зона нанесения конъюгата (КГ) мышиных моноклональных антител против PSА.
2. Зона нанесения конъюгата (КГ) мышиных моноклональных антител против СЕА.
3. Конъюгат мышиных моноклональных антител против PSA.
4. Конъюгат мышиных моноклональных антител против СЕА.
5. Мышиные моноклональные антитела против PSA.
6. Тест-зона РSА (опытная зона).
7. Тест-зона СЕА (опытная зона).
8. Мышиные моноклональные антитела против СЕА.
9. Кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши.
10. Контрольная зона.
11. Образец.
12. Несвязавшиеся продукты реакции.
13. Комплекс антител против иммуноглобулинов мыши с несвязавшимися конъюгатами.
14. Антиген PSA.
15. Комплекс КГ PSA-PSA.
16. Комплекс AT PSA-PSA-КГ PSA.
17. Антиген СЕА.
18. Комплекс КГ СЕА-СЕА.
19. Комплекс AT СЕА-СЕА-КГ СЕА.
На фиг.1 схематично показана последовательность расположения реакционной зоны, состоящей из областей 1 и 2, а также тест-зон, контрольной зоны и отсасывающего фильтра на поверхности монтирующей подложки D (подразумевается прилегание зон А, В, С к D). Также показано распределение реагентов 3, 4, 5, 8 и 9 в областях 1, 2, 6, 7, 10. На фиг.1а представлена общая схема предлагаемой тест-полоски до начала реакции. При добавлении к зоне А образца 11, не содержащего испытуемых антигенов (фиг.1б), происходит реакция, заканчивающаяся образованием комплекса 13 и визуализацией зоны 10, что соответствует отрицательной реакции (образование одной окрашенной полосы в контрольной зоне).
На фиг.2 показано образование комплекса 15 (фиг.2а) при добавлении образца, содержащего антиген PSA, вымывание комплекса и несвязавшихся конъюгатов 3 и 4 и образование комплексов 16 и 13 (фиг.2б) в зонах 6 и 10 соответственно. Образование конъюгата 16 приводит к визуализации полосы в зоне 6, что свидетельствует о наличии в образце АГ PSA, а образование комплекса в зоне 10 визуализует контрольную полосу, что свидетельствует о пригодности теста и полноте прохождения реакции.
На фиг.3 показано образование комплекса 18 (фиг.3а) при добавлении образца, содержащего антиген СЕА, вымывание комплекса и несвязавшихся конъюгатов 3 и 4 и образование комплексов 19 и 13 (фиг.3б) в зонах 7 и 10 соответственно. Образование конъюгата 19 приводит к визуализации полосы в зоне 7, что свидетельствует о наличии в образце АГ СЕА, а образование комплекса в зоне 10 визуализует контрольную полосу, что свидетельствует о пригодности теста и полноте прохождения реакции.
На фиг.4 показано образование комплексов 15 и 18 (фиг.4а) при добавлении образца, содержащего антиген СЕА и антиген PSA, вымывание комплекса и несвязавшихся конъюгатов 3 и 4 и образование комплексов 16, 19 и 13 (фиг.4б) в зонах 6, 7 и 10 соответственно. Образование конъюгата 19 приводит к визуализации полосы в зоне 7, что свидетельствует о наличии в образце АГ СЕА, что свидетельствует о пригодности теста и полноте прохождения реакции. Образование конъюгата 16 приводит к визуализации полосы в зоне 6, что свидетельствует о наличии в образце АГ PSA, что свидетельствует о пригодности теста и полноте прохождения реакции.
Непрореагировавшие реагенты 12 (3 и 4) поглощаются в зоне С.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для устранения недостатков известного технического решения, в связи с тем, что одновременное выявление двух маркеров онкологических заболеваний повышает ценность такого определения для целей скрининга благодаря большей вероятности обнаружения как рака предстательной железы, так и одновременного обнаружения раков других нозологии, разработан способ одновременного иммунохроматографического определения антигенов СЕА и PSA в сыворотке крови, состоящий в том, что образец тестируемой сыворотки наносят на входной конец тест-полоски, перемещают фронт жидкой среды за счет капиллярных сил через реакционную зону, состоящую из областей 1, содержащей конъюгат моноклональных антител к специфическому эпитопу PSA с наноколлоидным золотом, и 2, содержащей конъюгат моноклональных антител к специфическому эпитопу СЕА с наноколлодным золотом, далее перемещают фронт жидкости через тест-зону 6, содержащую иммобилизованные моноклональные антитела к другому эпитопу PSA, затем к зоне 7, содержащей иммобилизованные моноклональные антитела к другому эпитопу СЕА, и далее к контрольной зоне 10 с растворением в перемещаемой жидкости реагентов, отвечающих за связывание антигенов PSA и СЕА и за их маркерные свойства, при этом комплекс 16, состоящий из антигена PSA, аффинно соответствующего ему реагента 5 и маркера 15, иммобилизуют в тест-зоне 6, а комплекс 19, содержащий реагент, аффинно соответствующий антигену СЕА, и маркерный реагент 4, иммобилизуют в тест-зоне 7, несвязавшиеся маркерные раегенты 3 и 4 иммобилизуют в контрольной зоне 13, а избыток реагентов за контрольной зоной поглощают отсасывающим фильтром С, причем в качестве маркерного реагента 3 используют конъюгат частиц коллоидного золота с моноклональным антителом против специфического эпитопа PSA, а в качестве маркерного реагента 4 используют конъюгат частиц коллоидного золота с моноклональным антителом против специфического эпитопа СЕА, по окраске тест-зон 6 и 7 принимают решение о наличии или отсутствии антигенов PSA и СЕА в исследуемой пробе, а по окраске контрольной зоны 10 принимают решение о работоспособности тест-полоски.
Кроме того, в качестве биохимического реагента контрольной зоны 7 используют кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши.
Кроме того, в качестве пористого носителя реагентной зоны используют ПЭД А (инертный пористый носитель из стекловолокна), а в качестве пористого носителя для тест-зон 6 и 7 и контрольной зоны 10 используют слой В - микропористую нитроцелюлозу, нанесенную на лавсановое основание и имеющую капиллярную связь с пористым носителем реагентной зоны (ПЭД). Все элементы А, В, С монтируются на подложке D внахлест, как показано на фиг.1а.
Работа предлагаемого способа основана на связывании конъюгированных и неконъюгированных моноклональных антител с различными эпитопами антигенов PSA и СЕА и иммобилизации полученных комплексов в тест-зоне на нитроцеллюлозе. А затем комплексы визуализируются посредством локального накопления комплексов, содержащих окрашенные частицы наноколлоидного золота.
В процессе реакции выявления наличия антигенов PSA и СЕА исследуемый образец сыворотки крови пациента наносят в зону ПЭДа А. Он растворяет конъюгаты 3 и 4, и в процессе растворения образуется комплекс этих конъюгатов с присутствующими в образцах антигенами 14 и 17 соответственно. Под действием капиллярных сил происходит тангенциальная миграция комплекса в тест-зоны 6 и 7, где предварительно иммобилизируют антитела к антигенам PSA и СЕА соответственно. В случае наличия в образце исследуемого антигена PSA в тест-зоне 6 образуется комплекс 16, а в случае наличия в образце исследуемого антигена СЕА в тест-зоне 7 образуется комплекс 19. Наличие в составе комплексов наноколлоидного золота позволяет визуализировать тест-зоны в случае наличия в образце соответствующих антигенов, что дает возможность бесприборного обнаружения исследуемых антигенов PSA и СЕА в исследуемом образце воды. Комплексы, не содержащие исследуемых антигенов, но содержащие конъюгаты, мигрируют в контрольную зону 10, окрашивая ее и подтверждая тем самым работоспособность тест-полоски. Излишки несвязавшегося конъюгата и антигена мигрируют в отсасывающий фильтр С.
Таким образом, появление окрашенной полосы в зоне 6 после проведения реакции свидетельствует о наличии в образце антигена PSA, появление окрашенной полосы в зоне 7 - о наличии в образце антигена СЕА, одновременное окрашивание зон 6 и 7 свидетельствует о наличии в образце одновременно антигенов СЕА и PSA, а отсутствие окрашивания в обеих зонах при окраске контрольной зоны - об отсутствии изучаемых антигенов в образце.
ПРИМЕР 1. Конъюгацию моноклональных антител к PSA и СЕА с наноколлоидным золотом с диаметром частиц 30 нм (BioCell) проводили, как описано в патенте Fuchs et. all (US patent 5968758, Oct. 19, 1999). Конъюгаты наносили параллельными полосами в центральной области ПЭДа перпендикулярно току жидкости на расстоянии 2 мм друг от друга (КГ PSA в зону 1, КГ СЕА в зону 2 и после высушивания монтировали на одной из клеящих зон ИХ-блока CNPF-PD31-L2-P25 (MDI Индия), включающего нитроцеллюлозу с диаметром пор 20 мкм, таким образом, чтобы ПЭД на 1-2 мм перекрывал нитроцеллюлозу. На противоположную клеящую зону блока внахлест монтировали фильтровальную бумагу. В 2 мм от середины нитроцеллюлозы параллельно длинной стороне блока наносили полосы моноклональных антител к другим эпитопам PSA (в зону 6) и СЕА (в зону 7), а в зону 10 наносили моноспецифические антитела к иммуноглобулинам мыши (контрольная зона). После высушивания поверх ПЭДа и отсасывающего фильтра монтировали защитную пленку, разрезали блок на тест-полоски шириной 5 мм и запаивали в водонепроницаемые пакеты с осушителем. Полученные тест-полоски использовали для анализа.
Технический результат. С помощью полученных тест-полосок исследовали сыворотку пациента К. с верифицированным диагнозом «рак простаты». Схематически исследования представлены на фиг.2. Время реакции от внесения образца в зону А до учета реакции составляло 10 минут. Наличие антигена PSA в концентрации, большей чем 10 нг в мл в данном образце, было выявлено методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы фирмы «DRG» (Германия). ПЭД погружали на 2 мм в исследуемый образец. Жидкость образца растворяла конъюгаты, высушенные в ПЭД, и образовавшийся комплекс 15 мигрировал к тест-зоне, где образовывался комплекс 16, который визуализировал наличие АГ PSA в образце. Несвязавшиейся конъюгат мигрировали в контрольную зону, где образовывали комплекс 13. Этот комплекс визуализировал пригодность тест-полоски к работе. Все остальные несвязавшиеся компоненты реакции поглощались отсасывающим фильтром. Пятикратное испытание сыворотки с помощью полученной тест-полоски дало единообразный результат - окрашивание зон 6 и 10.
ПРИМЕР 2. Изготавливали полоску так же, как в примере 1. Исследовали сыворотку пациента П. с верифицированным раком предстательной железы (схематически исследования представлены на фиг.4), содержащую антиген PSA в концентрации, большей чем 10 нг в мл, и антиген СЕА в концентрации, большей чем 15 ед. в мл. Реакцию проводили так же, как в примере 1, в результате чего образовывались комплексы 16 в зоне 6, 19 в зоне 7 и 13 в зоне 10. Эти комплексы визуализировали зоны 6, 7 и 10, что свидетельствовало о наличии антигенов PSA и СЕА в образце и пригодности тест-полоски для анализа. Пятикратное испытание сыворотки с помощью полученной тест-полоски дало единообразный результат - окрашивание зон 6, 7 и 10.
ПРИМЕР 3. Изготавливали полоску так же, как в примере 1. Исследовали сыворотку пациента Ф. с верифицированным колоректальным раком, содержащую антиген СЕА (схематически исследования представлены на фиг.3) в концентрации, большей чем 15 ед. в мл. Реакцию проводили так же, как в примере 1, в результате чего образовывались комплексы 19 в зоне 7 и 13 в зоне 10. Эти комплексы визуализировали зоны 7 и 10, что свидетельствовало о наличии антигена СЕА в образце и пригодности тест-полоски для анализа. Пятикратное испытание сыворотки с помощью полученной тест-полоски дало единообразный результат - окрашивание зон 7 и 10.
ПРИМЕР 4. Изготавливали полоску так же, как в примере 1. Исследовали сыворотку пациента Д. с верифицированным раком предстательной железы (схематически исследования представлены на фиг.3), содержащую антиген СЕА в концентрации, большей чем 15 ед. в мл, но не содержащую антиген PSA. Реакцию проводили так же, как в примере 1, в результате чего образовывались комплексы 19 в зоне 7 и 13 в зоне 10. Эти комплексы визуализировали зоны 7 и 10, что свидетельствовало о наличии антигена СЕА в образце и пригодности тест-полоски для анализа. Пятикратное испытание сыворотки с помощью полученной тест-полоски дало единообразный результат - окрашивание зон 7 и 10.
ПРИМЕР 5. Изготавливали полоску так же, как в примере 1. Исследовали сыворотку пациента А. с верифицированным раком поджелудочной железы (схематически исследования представлены на фиг.3), содержащую антиген СЕА в концентрации, большей чем 15 ед. в мл. Реакцию проводили так же, как в примере 1, в результате чего образовывались комплексы 19 в зоне 7 и 13 в зоне 10. Эти комплексы визуализировали зоны 7 и 10, что свидетельствовало о наличии антигена СЕА в образце и пригодности тест-полоски для анализа. Пятикратное испытание сыворотки с помощью полученной тест-полоски дало единообразный результат - окрашивание зон 7 и 10.
ПРИМЕР 6. Изготавливали полоску так же, как в примере 1. Исследовали сыворотку пациента Л. без клинических патологий и с содержанием антигенов PSA менее 1 нг/мл и СЕА менее 5 ед/мл (схематически исследования представлены на фиг.1). Реакцию проводили так же, как в примере 1, в результате чего образовывался комплекс 13 в зоне 10, а зоны 6 и 7 оставались неокрашенными. Это свидетельствовало об отсутствии патологического количества антигенов PSA и СЕА в образце и пригодности тест-полоски для анализа. Пятикратное испытание сыворотки с помощью полученной тест-полоски дало единообразный результат - окрашивание зоны 10.
Далее покажем, что именно благодаря существенным отличиям предлагаемого способа обеспечивается требуемый технический результат.
То, что тест позволяет определять различные онкологические нозологии повышает его чувствительность при скрининговых исследованиях, что видно из примеров 2-5.
То, что тест выявляет наличие онкологической патологии при раке предстательной железы в отсутствие патологических концентраций антигена PSA (пример 4) также повышает его чувствительность и предсказательную ценность.
То, что в качестве пористого носителя реагентной зоны используют ПЭД (инертный пористый носитель из стекловолокна), а в качестве пористого носителя контрольной зоны используют слой нитроцелюлозы, нанесенный на лавсановое основание и имеющий капиллярную связь с пористым носителем реагентной зоны (ПЭД), также позволяет обеспечить необходимый технический результат.
Достигаемый при этом технический результат также состоит в экономии дорогостоящих реагентов и снижении временных затрат по сравнению с традиционными способами аналогичного назначения, в улучшении его экономических параметров.
Таким образом, показано, что требуемый технический результат, действительно, достигается за счет существенных отличий предлагаемого способа. Проведенные эксперименты показали реализуемость предлагаемого изобретения.