МЕТОД ПРОГНОЗА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИММУНОТЕРАПИИ НА ОСНОВАНИИ ОЦЕНКИ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ МРНК ЦИТОКИНОВ В ТКАНИ РАКА ПОЧКИ
METHOD OF PREDICTING EFFICIENCY OF IMMUNOTHERAPY BASING ON ESTIMATION OF LEVEL OF EXPRESSION OF CYTOKINE MRNK IN KIDNEY CANCER TISSUE

1. ОБЛАСТЬ НАУКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Использование изобретения планируется в области практического здравоохранения, в частности в онкологической практике, с целью определения прогноза эффективности иммунотерапии у больных раком почки.
2. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Иммунотерапия рака почки, в частности с использованием IFN-α и IL-2, характеризуется рядом клинических особенностей, таких как высокая токсичность, достаточно умеренная эффективность в отношении увеличения периода ремиссии и периода безрецидивной выживаемости, выраженный клинический ответ достигается у 5-27% больных (Results of treatment of 255 patients with metastatic renal cell carcinoma who received high-dose recombinant interleukin-2 therapy, 1995), (Overall survival and updated results for sunitinib compared with interferon alfa in patients with metastatic renal cell carcinoma, 2009), (Randomized phase III trial of high-dose interleukin-2 versus subcutaneous interleukin-2 and interferon in patients with metastatic renal cell carcinoma, 2005). В ряде исследований была продемонстрирована низкая прогностическая точность оценки морфологических особенностей опухоли, состояния пациента в отношении прогноза эффективности иммунотерапии (Regression of established pulmonary metastases and subcutaneous tumor mediated by the systemic administration of high-dose recombinant interleukin 2, 1985), (Randomized phase III trial of high-dose interleukin-2 versus subcutaneous interleukin-2 and interferon in patients with metastatic renal cell carcinoma, 2005), (Randomized study of high-dose and low-dose interleukin-2 in patients with metastatic renal cancer, 2003). С другой стороны, у ряда больных с рецидивом рака почки или в случае нерезектабельной опухоли, эксперты Всеобщей онкологической сети США (NCCN) (http://www.nccn.org) считают высокодозную иммунотерапию методом выбора. Одновременно, эксперты отмечают, что при назначении лечения необходимо учитывать такие факторы как состояние пациента, наличие сопутствующих заболеваний, морфологию опухоли (превалирование светлоклеточного компонента), оценку по шкале Онкологического центра Мемориал Слоун Кеттеринг (MSKCC) (Prognostic Factors for Survival of Patients with Stage IV Renal Cell Carcinoma, 2004) или SANI (Survival After Nephrectomy and Immunotherapy - Выживаемость после нефрэктомии и иммунотерапии) (Scoring algorithm to predict survival after nephrectomy and immunotherapy in patients with metastatic renal cell carcinoma: a stratification tool for prospective clinical trials, 2003). Согласно MSKCC выделено 5 факторов неблагоприятного прогноза:
1) общий статус по шкале Карновского ≤70;
2) гемоглобин (Hb) <N;
3) лактатдегидрогиназа (ЛДГ) >1,5×N;
4) кальций >2,5 ммоль/л;
5) время до прогрессирования после хирургического лечения - менее 1 года.
Наличие у больного минимум трех из этих факторов является неблагоприятным фактором прогноза общей выживаемости у больных, получавших IFN-α иммунотерапию.
Прогностическая модель SANI разработана с целью стратификации больных метастатическим раком почки на группы высокого, умеренного и низкого риска в отношении общей выживаемости. Согласно модели, наличие метастазов в лимфатических узлах, общее состояние больного, наличие саркоматозного компонента в опухоли, уровень ТТГ (тиреотропного гормона) коррелирует с выживаемостью больных метастатическим раком почки, получивших лечение в объеме нефрэктомии и иммунотерапии IL-2. Ни одна из предложенных моделей не оценивает непосредственно эффективность иммунотерапии, а скорее определяет прогноз выживаемости больных раком почки при стечении определенных обстоятельств, факторов прогноза, в частности, иммунотерапии. Таким образом, предложенные модели не могут быть использованы в качестве показаний для проведения иммунотерапии. По мнению экспертов NCCN (http://www.nccn.org) и ASCO (http://www.asco.com) единственным показанием для назначения иммунотерапии при раке почки является удовлетворительное общее состояние больного с последующим включением пациента в клиническое исследование. Отсутствие четких показаний для назначения иммунотерапии в данном случае исключает возможность последующей оценки эффективности лечения.
3. НЕДОСТАТКИ ИЗВЕСТНОГО СПОСОБА: субъективность, отсутствие непосредственной прогностической оценки эффективности иммунотерапии у больных раком почки.
4. СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей данного изобретения является разработка способа определения прогноза эффективности иммунотерапии при раке почки.
Поставленная задача решается следующим образом. Больному с верифицированным диагнозом рак почки перед операцией производится забор крови из вены для анализа иммунного статуса (1-ый контроль эффективности иммунотерапии).
После хирургического этапа производится забор морфологического материала (опухолевой ткани и окружающей нормальной ткани почки) для определения уровня экспрессии мРНК цитокинов (прогностическая модель оценки эффективности). Проводилась сравнительная оценка уровня экспрессии цитокинов в ткани опухоли и нормальной окружающей ткани почки.
Принцип метода основан на использовании процесса обратной транскрипции РНК и последующей амплификации кДНК, заключающейся в повторяющихся циклах: температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройкой полинуклеотидных цепей с этих праймеров Taq-полимеразой.
В реакционную смесь для проведения ПЦР вводятся ДНК-зонды, каждый из которых несет флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции. При образовании специфичного продукта ДНК-зонд разрушается, действие гасителя на флуоресцентную метку прекращается, что ведет к возрастанию уровня флуоресценции. Количество разрушенных зондов (а, следовательно, и уровень флуоресценции) пропорционально количеству образовавшихся специфических ампликонов и измеряется на каждом цикле амплификации в режиме "реального времени". Для анализа продуктов ПЦР используют детектирующий амплификатор. ДНК-зонды, использующиеся для детекции продуктов амплификации искомой кДНК, помечены флуоресцентными метками FAM.
Исследование с использованием набора реагентов производства ЗАО «ДНК технология» состоит из следующих этапов:
выделение нуклеиновых кислот (пробоподготовка),
реакция обратной транскрипции,
ПЦР амплификация кДНК и нормировочного гена в режиме "реального времени".
Количественная оценка уровня экспрессии цитокинов осуществляется относительно гена «домашнего хозяйства» HPRT1. Экспрессия HPRT1 связана обменом пуринов и осуществляется во всех типах клеток. Использование HPRT1 позволяет провести нормирование («выровнять») на количество материала, и провести сравнение уровня экспрессии цитокинов в исследуемых образцах.
В основе такой оценки лежит метод сравнения индикаторных циклов исследуемого цитокина и нормировочного гена (метод дельта Си-пи (ΔCp)). Экспрессия мРНК цитокинов измеряется в относительных единицах и отражает соотношение уровня представленности транскрипта в сравнении с нормировочным геном.
Для повышения чувствительности и специфичности реакции предусмотрено применение «горячего» старта, который обеспечивается методикой приготовления реакционной смеси, состоящей из двух слоев, разделенных прослойкой из парафина. Смешивание слоев и превращение их в реакционную смесь происходит только при плавлении парафина, что исключает неспецифический отжиг праймеров на ДНК-мишени при начальном прогреве пробирки.
Результаты сравнительного анализа экспрессии цитокинов в ткани опухоли и окружающей нормальной ткани почки легли в основу прогностической модели оценки эффективности планируемой иммунотерапии.
В послеопреационном периоде больным проводится адъювантная иммунотерапия препаратом Интрон-А по 3 млн. Ед 1 раз в день внутримышечно через день N5. Через 2 недели после проведения иммунотерапии проводится повторный забор крови из вены для анализа иммунного статуса (2-ой контроль эффективности иммунотерапии).
После проведения иммунотерапии у ряда больных иммунный статус (контроль 2) нормализуется (при сравнении с контроль 1), тогда как у других больных данных изменений не наблюдалось. Результаты определения иммунного статуса значимо коррелируют с уровнем экспрессии цитокинов (прогностическая модель оценки эффективности), при этом факторами прогноза, определяющими необходимость назначения иммунотерапии, можно считать например повышение экспрессии IL-4 в ткани рака почки по сравнению с уровнем в нормальной паренхиме в 2,5 раза, повышение экспрессии IL-6 в 9,5 раз, IL10 в 45 раз и TGFβ в 12 раз.
5. СУЩЕСТВЕННЫМ ОТЛИЧИЕМ ЗАЯВЛЯЕМОГО РЕШЕНИЯ ОТ ИЗВЕСТНОГО ЯВЛЯЕТСЯ возможность с использованием изобретения оценки прогноза эффективности планируемой иммунотерапии у больных раком почки, тогда как другие модели определяют прогноз выживаемости больных, которым иммунотерапия была уже проведена. Изобретение дает возможность прецизионного назначения иммунотерапии с учетом уровня экспрессии цитокинов в ткани опухоли и иммунного статуса пациента.
6. СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ.
Возможность осуществления изобретения определяет наше исследование подтверждающие то, что прогностическим отрицательным фактором, требующим проведения иммунотерапии является экспрессия IL-4, IL-6, IL-10, TGFβ.
Пример
В основу работы положены результаты обследования и лечения 11 больных почечно-клеточным раком. Из них мужчин было - 9, женщин - 2. Средний возраст больных составил 52 года. Всем пациентам было проведено хирургическое лечение в объеме нефрэктомии. За 3 дня до операции всем больным осуществлялся забор крови с целью оценки иммунного статуса. Во всех 15-ти случаях осуществлялся забор опухолевой ткани для определения уровня экспрессии цитокинов. На 10-е сутки после операции всем больным назначалась иммунотерапия препаратами интерферонового ряда в стандартной дозировке. Затем осуществлялся повторный контроль иммунного статуса на 3-е сутки после завершения курса иммунотерапии.
Экспрессия мРНК цитокинов в ткани опухоли и нормальной окружающей ткани почки определялась методом ОТ-ПЦР с помощью наборов для количественного ПЦР фирмы «ДНК Технология», при этом использовались следующие мишени: IL4, IL6, IL10, TGFβ. Сравнивалась экспрессия в ткани опухоли почки и нормальной ткани почки. Результаты нормировали по уровню экспрессии HPRT. Осуществляли дополнительный контроль ДНК (GHR).
Результаты:
Были выявлены следующие изменения экспрессии мРНК цитокинов (приводятся средние значения соотношения опухолевая ткань/нормальная ткань почки для всех пациентов): IL4 - 2,94; IL6 - 13,18; IL10 - 116.9; TGFβ - 15,4. Сравнение зависимости изменения уровня экспрессии с результатами последующей иммунотерапии позволили сформулировать следующие Выводы:
Положительными молекулярными факторами прогноза, определяющими необходимость назначения иммунотерапии, можно считать повышение экспрессии IL-4, IL-6, IL10, TGFβ в ткани рака почки по сравнению с уровнем в нормальной паренхиме.