ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К КОНЕЧНЫМ ПРОДУКТАМ ГЛУБОКОГО ГЛИКИРОВАНИЯ
DIAGNOSTIC ANTIBODIES TO ADVANCED GLYCATION END PRODUCTS

Уровень техники
[01]
Ink4a
Стареющие клетки представляют собой клетки, которые являются частично функциональными или нефункциональными и находятся в состоянии пролиферативного ареста. Старение является отдельным состоянием клетки и является ассоциированным с биомаркерами, например, с активацией биомаркера p16 и экспрессией β–галактозидазы. Старение начинается с повреждения или стресса (такого как избыточная стимуляция факторами роста) клеток.
[02]
et al
Biochem Biophys Res Commun.
et al.
Diabetes Vascular Disease Research
Ɛ
Конечные продукты глубокого гликирования (AGE; также обозначенные как модифицированные посредством AGE белки, или конечные продукты гликирования) возникают в результате неферментной реакции сахаров с боковыми цепями белков (Ando, K. ., Membrane Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by Advanced Glycation End Products during Aging in the Circulation, , Vol. 258, 123, 125 (1999)). Этот процесс начинается с обратимой реакции между восстанавливающим сахаром и аминогруппой с образованием шиффова основания, которая продолжается с образованием ковалентно связанного продукта перегруппировки Амадори. После образования, продукт перегруппировки Амадори подвергается дальнейшей перегруппировке с образованием AGE. Гипергликемия и окислительный стресс стимулируют эту посттрансляционную модификацию мембранных белков (Lindsey JB, , «Receptor For Advanced Glycation End–Products (RAGE) and soluble RAGE (sRAGE): Cardiovascular Implications», , Vol. 6(1), 7–14, (2009)). AGE могут также быть образованы в других процессах. Например, конечный продукт глубокого гликирования, N–(карбоксиметил)лизин, является продуктом реакций как перекисного окисления липидов, так и гликоокисления. AGE ассоциированы с несколькими патологическими состояниями, включая воспаление, ретинопатию, нефропатию, атеросклероз, инсульт, дисфункцию эндотелиальных клеток и нейродегенеративные нарушения (Bierhaus A, «AGEs and their interaction with AGE–receptors in vascular disease and diabetes mellitus. I. The AGE concept», Cardiovasc Res, Vol. 37(3), 586–600 (1998)).
[03]
et al.
Biochem Biophys Res Commun.
et al
Aging Cells
et al
J. Exp. Med.
et al
Proc. Natl. Acad. Sci. USAI
et al
et al
Модифицированные посредством AGE белки также являются маркером стареющих клеток. Эта ассоциация между конечными продуктами гликирования и старением хорошо известна в данной области. См., например, Gruber, L. (WO 2009/143411, 26 Nov. 2009), Ando, K.  (Membrane Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by Advanced Glycation End Products during Aging in the Circulation, , Vol. 258, 123, 125 (1999)), Ahmed, E.K. . («Protein Modification and Replicative Senescence of WI–38 Human Embryonic Fibroblasts» , vol. 9, 252, 260 (2010)), Vlassara, H. . (Advanced Glycosylation Endproducts on Erythrocyte Cell Surface Induce Receptor–Mediated Phagocytosis by Macrophages, , Vol. 166, 539, 545 (1987)) и Vlassara . («High–affinity–receptor–mediated Uptake and Degradation of Glucose–modified Proteins: A Potential Mechanism for the Removal of Senescent Macromolecules» , Vol. 82, 5588, 5591 (1985)). Кроме того, в Ahmed, E.K. . указано, что конечные продукты гликирования являются «одной из главных причин спонтанного разрушения клеточных и внеклеточных белков» (Ahmed, E.K. ., см. выше, страница 353). Соответственно, накопление конечных продуктов гликирования ассоциировано со старением и потерей функции.
[04]
et al
ε
Повреждение или стресс, вызывающие клеточное старение, также отрицательно влияют на митохондриальную ДНК в клетках, вынуждая их продуцировать свободные радикалы, которые вступают в реакцию с сахарами в клетке с образованием метилглиоксаля (MG). MG, в свою очередь, вступает в реакцию с белками или липидами с получением конечных продуктов глубокого гликирования. В случае компонента белков лизина, MG вступает в реакцию с образованием карбоксиэтиллизина, который является AGE. (Al–Abed, Y. ., «N–Carboxymethyllysine formation by direct addition of glyoxal to lysine during the Maillard reaction», Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 5, No. 18, pp. 2161–2162 (1995)).
[05]
Повреждение или стресс митохондриальной ДНК также вызывает ответ повреждения ДНК, индуцирующий в клетке продукцию белков, блокирующих клеточный цикл. Эти блокирующие белки предотвращают деление клетки. Продолжающееся повреждение или стресс вызывает продукцию mTOR, которая, в свою очередь, активирует синтез белка и инактивирует разрушение белка. Дальнейшая стимуляция клеток приводит к программируемой гибели клетки (апоптоза).
[06]
et al.
Oncogene
Ink4a
p16 представляет собой белок, участвующий в регуляции клеточного цикла посредством ингибирования S–фазы (фазы синтеза). Он может активироваться в ходе старения или в ответ на различные стрессы, такие как повреждение ДНК, окислительный стресс или воздействия лекарственных средств. p16, как правило, считают белком–супрессором опухолей, заставляющим клетки становиться стареющими в ответ на повреждение ДНК и необратимо предотвращает вхождение клеток в гиперпролиферативное состояние. Однако, существует некоторая неясность в этом отношении, поскольку для некоторых опухолей показана сверхэкспрессия p16, в то время как для других показана понижающая регуляция экспрессии. Доказательства позволяют предполагать, что сверхэкспрессия p16 в некоторых опухолях возникает из–за дефектного белка ретинобластомы («Rb»). p16 действует на Rb для ингибирования S–фазы, и Rb осуществляет понижающую регуляцию p16, создавая отрицательную петлю обратной связи. Дефектный Rb не может ни ингибировать S–фазу, ни осуществлять понижающую регуляцию p16, что, таким образом, приводит к сверхэкспрессии p16 в гиперпролиферирующих клетках (Romagosa, C. , p16 overexpression in cancer: a tumor suppressor gene associated with senescence and high–grade tumors, , Vol. 30, 2087–2097 (2011)).
[07]
et al
et al
Стареющие клетки ассоциированы с секрецией многих факторов, вовлеченных в передачу сигналов между клетками, включая провоспалительные факторы; секрецию этих факторов называют ассоциированным со старением секреторным фенотипом или SASP (Freund, A. «Inflammatory networks during cellular senescence: causes and consequences» Trends Mol Med. 2010 May;16(5):238–46). Аутоиммунные заболевания, такие как болезнь Крона и ревматоидный артрит, ассоциированы с хроническим воспалением (Ferraccioli, G. . «Interleukin–1β and Interleukin–6 in Arthritis Animal Models: Roles in the Early Phase of Transition from Acute to Chronic Inflammation and Relevance for Human Rheumatoid Arthritis» Mol Med. 2010 Nov–Dec; 16(11–12): 552–557). Хроническое воспаление можно характеризовать по присутствию провоспалительных факторов на уровнях, более высоких, чем фон, около участка патологии, но более низких, чем уровни, обнаруженные при остром воспалении. Примеры этих факторов включают TNF, IL–1α, IL–1β, IL–5, IL–6, IL–8, IL–12, IL–23, CD2, CD3, CD20, CD22, CD52, CD80, CD86, белок комплемента C5, BAFF, APRIL, IgE, α4β1 и α4β7 интегрин. Стареющие клетки также осуществляют повышающую регуляцию генов, играющих роли в воспалении, включая IL–1β, IL–8, ICAM1, TNFAP3, ESM1 и CCL2 (Burton, D.G.A. ., «Microarray analysis of senescent vascular smooth muscle cells: a link to atherosclerosis and vascular calcification», Experimental Gerontology, Vol. 44, No. 10, pp. 659–665 (October 2009)). Поскольку стареющие клетки продуцируют провоспалительные факторы, только удаление этих клеток вызывает значительное уменьшение воспаления, так же как количества и концентрации провоспалительных факторов.
[08]
Aging Cell
et al.
Int J Cancer
Стареющие клетки секретируют активные формы кислорода («ROS») в качестве части SASP. Считают, что ROS играет важную роль в поддержании старения клеток. Секреция ROS создает эффект свидетеля, когда стареющие клетки индуцируют старение соседних клеток: ROS вызывают собственно клеточное повреждение, как известно, активирующее экспрессию p16, приводящую к старению (Nelson, G., A senescent cell bystander effect: senescence–induced senescence, , Vo. 11, 345–349 (2012)). Путь p16/Rb приводит к индукции ROS, которая, в свою очередь, активирует протеинкиназу C дельта, создавая петлю положительной обратной связи, которая далее увеличивает уровень ROS, помогая поддерживать необратимый арест клеточного цикла; предположили даже, что подвергание клеток злокачественных опухолей воздействию ROS может являться эффективным для лечения злокачественной опухоли посредством индукции ареста клеточной фазы в гиперпролиферирующих клетках (Rayess, H. , Cellular senescence and tumor suppressor gene p16, , Vol. 130, 1715–1725 (2012)).
[09]
et al.
et al.
et al.
Установленаспецифическая корреляцияотносительного уровня стареющих клеток с заболеванием. Стареющие клетки долго ассоциировали с злокачественной опухолью и метастазирующей злокачественной опухолью, и для культуры клеток с 10% стареющих фибробластов показана стимуляция роста (Krtolica, A. , «Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging», Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 98, No. 21, pp. 12072–12077 (2001)). Установлена ассоциация аэробных способностей, показателя биологического старения, с на 37% меньшим количеством стареющих CD4+ и CD8+ T–клеток (Spielmann, G. , «Aerobic fitness is associated with lower proportions of senescent blood T–cells in man», Brain, Behavior and Immunity, Vol. 25, No. 8, pp. 1521–1529 (2011)). Подобным образом, уровень стареющих CD4+ T–клеток увеличивался на 192% у триатлонистов через две недели после 6–месячного периода тренировок для соревнования по триатлону серии Ironman (Cosgrove, C. , «The impact of 6–month training preparation for an Ironman triathlon on the proportions of naïve, memory and senescent T cells in resting blood», European Journal of Applied Physiology, Vol. 112, No. 8, pp. 2989–2998 (2012)).
[10]
et al
N
et al.
et al.
ε
Увеличенные уровни конечных продуктов глубокого гликирования, экспрессированных на поверхности стареющих клеток, выявили в качестве маркеров различных заболеваний, нарушений и патологических состояний. Увеличенные уровни карбоксиметиллизина (CML) обнаружены в сыворотке и мышечной ткани пациентов с фибромиалгией (Rüster, M. ., «Detection of elevated –carboxymethyllysine levels in muscular tissue and in serum of patients with fibromyalgia», Scandinavian Journal of Rheumatology, Vol. 34, No. 6, pp. 460–463 (2005)). Ускоренное старение кожи, такое как более тонкая или морщинистая кожа, явно заметно у пациентов с диабетом (Schmid, D. , «Collage glycation and skin aging», Cosmetics and Toiletries Manufacture Worldwide). Подобным образом, установлена корреляция аутофлуоресценции кожи у пациентов с диабетом с уровнями в ткани пентозидина и CML, и они сильно связаны с коронарной болезнью сердца и прогнозируемой смертностью (Meerwaldt, R. , «Skin autofluorescence is a strong predictor of cardiac mortality in diabetes», Diabetes Care, Vol. 30, No. 1, pp. 107–112 (2007)). Таким образом, увеличенные уровни AGE являются принятым маркером заболеваний, нарушений и патологических состояний, ассоциированных с клеточным старением.
[11]
et al.
Установлена значимая корреляция абсолютного значения AGE в образце с заболеванием. Уровни CML в плазме были на 30 мкг/мл выше у пациентов с раком предстательной железы по сравнению с контролем (Yang, S. , «Impact of oxidative stress biomarkers and carboxymethyllysine (an advanced glycation end product) on prostate cancer: a prospective study», Clinical Genitourinary Cancer, Vol. 13, No. 5, pp. e347–e351 (2015)).
[12]
Подобным образом, установление корреляции между стареющими клетками и старением или связанными с возрастом нарушениями, как описано в WO 2009/143411, привело к тому, что связанные с возрастом маркеры стали мишенями для диагностики. Давно установлена ассоциация теломер с биологическим старением, и короткую длину теломер использовали в качестве показателя раннего начала связанных с возрастом заболеваний, таких как диабет, сердечно–сосудистое заболевание и злокачественная опухоль («Telomere Testing White Paper», Titanovo). Длину теломер можно измерять с использованием анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР) образцов ДНК. Значительным ограничением использования длины теломер для детекции старения и связанных с возрастом нарушений является то, что не все виды старения затрагивают теломеры.
Сущность изобретения
[13]
В первом аспекте изобретение относится к способу диагностики заболевания, нарушения или патологического состояния, ассоциированного с клеточным старением, у пациента, включающему получение образца от пациента; измерение количества клеток, экспонирующих AGE на клеточной поверхности, в образце; и диагностика у пациента заболевания, нарушения или патологического состояния, ассоциированного с клеточным старением когда количество клеток, экспонирующих AGE на клеточной поверхности, в образце больше, чем количество клеток, экспонирующих AGE на клеточной поверхности, в контроле.
[14]
Во втором аспекте изобретение относится к способу определения биологического возраста пациента, включающему получение от пациента образца, содержащего клетки и бесклеточный материал; отделение клеток от бесклеточного материала; измерение количества клеток, экспонирующих AGE на клеточной поверхности, в образце посредством приведения клеток в контакт с антителом против AGE и детекции связывания между AGE на клеточной поверхности и антителом против AGE; измерение количества несвязанных AGE в образце посредством приведения бесклеточного материала в контакт с антителом против AGE и детекции связывания между несвязанными AGE и антителом против AGE; и сравнение соотношения AGE на клеточной поверхности к несвязанным AGE в образце.
[15]
В третьем аспекте изобретение относится к способу диагностики заболевания, нарушения или патологического состояния, ассоциированного с прогрессирующим биологическим старением из–за клеточного старения у пациента, включающему получение от пациента образца, содержащего клетки и бесклеточный материал; отделение клеток от бесклеточного материала; измерение количества клеток, экспонирующих AGE на клеточной поверхности, в образце посредством приведения клеток в контакт с антителом против AGE и детекции связывания между AGE на клеточной поверхности и антителом против AGE; измерение количества несвязанных AGE в образце посредством приведения бесклеточного материала в контакт с антителом против AGE и детекции связывания между несвязанными AGE и антителом против AGE; сравнение соотношения AGE на клеточной поверхности к несвязанным AGE в образце для определения биологического возраста пациента; и диагностику у пациента заболевания, нарушения или патологического состояния, ассоциированного с прогрессирующим биологическим старением из–за клеточного старения, когда биологический возраст пациента превышает хронологический возраст пациента.
[16]
В четвертом аспекте изобретение относится к способу диагностики заболевания, нарушения или патологического состояния, ассоциированного с прогрессирующим биологическим старением, из–за клеточного старения у пациента, включающему получение образца от пациента; измерение количества клеток, экспонирующих AGE на клеточной поверхности, в образце; определение биологического возраста пациента посредством сравнения количества клеток, экспонирующих AGE на клеточной поверхности, в образце с количеством клеток, экспонирующих AGE на клеточной поверхности, в совпадающем по возрасту контроле; и диагностику у пациента заболевания, нарушения или патологического состояния, ассоциированного с прогрессирующим биологическим старением, из–за клеточного старения, когда биологический возраст пациента превышает хронологический возраст пациента.
[17]
in vivo
В пятом аспекте изобретение относится к способу детекции модифицированных посредством AGE клеток у пациента , включающему введение пациенту антитела к AGE, меченного поддающейся детекции меткой.
[18]
В шестом аспекте изобретение относится к набору для детекции клеток, экспрессирующих на поверхности клеток конечные продукты глубокого гликирования, содержащему антитело к AGE, контрольный образец и, необязательно, реагент, связывающийся с антителом против AGE.
[19]
В седьмом аспекте изобретение относится к способу лечения заболевания, нарушения или патологического состояния, ассоциированного с клеточным старением, у пациента, включающему введение терапевтически эффективного количества средства для удаления стареющих клеток нуждающемуся в этом пациенту. Биологический возраст пациента превышает хронологический возраст пациента.
[20] ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[21]
Термин «пептид» обозначает молекулу, состоящую из 2–50 аминокислот.
[22]
Термин «белок» обозначает молекулу, состоящую из более чем 50 аминокислот.
[23]
et al
Термины «конечный продукт глубокого гликирования», «AGE», «модифицированный посредством AGE белок или пептид» и «конечный продукт гликирования» относятся к модифицированным белкам или пептидам, образованным в результате реакции сахаров с боковыми цепями белков, которые подвергаются дальнейшей перегруппировке и образуют необратимые перекрестные связи. Этот процесс начинается с необратимой реакции между восстанавливающим сахаром и аминогруппой с образованием шиффова основания, которая продолжается с образованием ковалентно связанного продукта перегруппировки Амадори. После образования, продукт перегруппировки Амадори подвергается дальнейшей перегруппировке с образованием AGE. Модифицированные посредством AGE белки и антитела к модифицированных посредством AGE белков описаны в U.S. 5702704 от Bucala («Bucala») и U.S. 6380165 от Al–Abed . («Al–Abed»). Гликированные белки или пептиды, не подвергшиеся необходимой перегруппировке для образования AGE, такие как N–дезоксифруктозиллизин, обнаруженный на гликированном альбумине, не являются AGE. AGE можно идентифицировать по присутствию модификаций AGE (также обозначенных как эпитопы AGE или группы AGE), таких как 2–(2–фуроил)–4(5)–(2–фуранил)–1H–имидазол («FFI»); 5–гидроксиметил–1–алкилпиррол–2–карбальдегид («пирралин»); 1–алкил–2–формил–3,4–дигликозилпиррол («AFGP»), нефлуоресцентный модельный AGE; карбоксиметиллизин; карбоксиэтиллизин; и пентозидин. ALI, другой AGE, описан в Al–Abed.
[24]
«Анти–AGE антитело» или «антитело к AGE» обозначает антитело, фрагмент антитела или другой белок или пептид, который связывается с модифицированным посредством AGE белком или пептидом, и предпочтительно включает константную область антитела. Модифицированный посредством AGE белок или пептид может представлять собой белок или пептид, в норме связанный с поверхностью клетки, предпочтительно, клетки млекопитающего, более предпочтительно, клетки человека, кошки, собаки, лошади, верблюдовых (например, верблюда или альпаки), крупного рогатого скота, овцы или козы. Альтернативно, модифицированный посредством AGE белок или пептид могут представлять собой белок или пептид, не связанные с поверхностью клетки (также обозначенные как свободные, не связанные или циркулирующие белки или пептиды). «Анти–AGE антитело» или «антитело к AGE» не включает антитело или другой белок, который связывается с одинаковой специфичностью и избирательностью как с модифицированным посредством AGE белком или пептидом, так и с таким же не модифицированным посредством AGE белком или пептидом (то есть, присутствие модификации AGE не увеличивает связывание). «Анти–AGE антитело» или «антитело к AGE» включает антитела, которые являются конъюгированными, например, с токсином, лекарственным средством, или другим химическим веществом или частицей. Предпочтительно, антитела представляют собой моноклональные антитела, но поликлональные антитела также являются возможными.
[25]
Ink4a
in vivo
in vitro
Термин «стареющая клетка» обозначает клетку, которая находится в состоянии пролиферативного ареста и экспрессирует один или несколько биомаркеров старения, таких как активация p16 или экспрессия ассоциированной со старением β–галактозидазы. Включены также клетки, которые экспрессируют один или несколько биомаркеров старения, не подвергаются пролиферации , но могут подвергаться пролиферации  в определенных условиях, например, некоторые сателлитные клетки, обнаруженные в мышцах пациентов с ALS.
[26]
Термин «сенолитическое средство» обозначает малую молекулу с молекулярной массой менее 900 дальтон, которая разрушает стареющие клетки. Термин «сенолитическое средство» не включает антитела, конъюгаты антител, белки, пептиды или биологические лекарственные средства.
[27]
Термин «средство для удаления стареющих клеток» обозначает вещество, которое разрушает стареющие клетки. Средства для удаления стареющих клеток включают терапевтические антитела к AGE, такие как описанные в Патенте США No. 9161810 и сенолитические средства.
[28]
Термин «вариант» обозначает нуклеотидную, белковую или аминокислотную последовательность, отличающуюся от специфически идентифицированных последовательностей, в которой один или несколько нуклеотидов, остатков белков или аминокислот делетированы, заменены или добавлены. Варианты могут представлять собой природные аллельные варианты или неприродные варианты. Варианты идентифицированных последовательностей могут сохранять некоторые или все из функциональных характеристик идентифицированных последовательностей.
[29]
Термин «процент (%) идентичности последовательности» определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности–кандидате, которые являются идентичными аминокислотным остаткам в эталонной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и внесения пропусков, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и не рассматривая никаких консервативных замен в качестве части идентичности последовательностей. Выравнивание для целей определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно осуществлять различными способами с использованием публично доступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST–2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Предпочтительно, значения % идентичности последовательностей получают с использованием компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN–2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN–2 является публично доступной из Genentech, Inc. (South San Francisco, CA) или может быть скомпилирована из исходного кода, поданного вместе с документацией пользователя в Бюро регистрации авторских прав США и зарегистрированного под номером регистрации авторского права США TXU510087. Программу ALIGN–2 следует компилировать для использования в операционной системе UNIX, включая digital UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей установлены в программе ALIGN–2 и не меняются.
[30]
В ситуациях, когда ALIGN–2 используют для сравнений аминокислотной последовательности, % идентичности последовательности данной аминокислотной последовательности A для, с или по сравнению с данной аминокислотной последовательностью B (что можно альтернативно перефразировать как данная аминокислотная последовательность A, имеющая или содержащая конкретный % идентичности аминокислотной последовательности для, с или по сравнению с данной аминокислотной последовательностью B) рассчитывают следующим образом: 100, умноженное на дробь X/Y, где X представляет собой количество аминокислотных остатков, оцененных как идентичные совпадения посредством программы для выравнивания последовательностей ALIGN–2 при выравнивании этой программой A и B, и где Y представляет собой общее количество аминокислотных остатков в B. Когда длина аминокислотной последовательности A не является равной длине аминокислотной последовательности B, % идентичности аминокислотной последовательности A с B не является равным % идентичности аминокислотной последовательности B с A. Если конкретно не указано иное, все значения % идентичности аминокислотной последовательности, используемые в настоящем описании, получены с использованием компьютерной программы ALIGN–2.
Краткое описание чертежей
[31]
НаФИГ. 1 проиллюстрирован набор для детекции клеток, экспрессирующих на поверхности клеток конечные продукты глубокого гликирования.
[32]
ФИГ. 2 представляет собой график ответа в зависимости от времени в эксперименте связывания антитела.
[33]
ФИГ. 3A представляет собой фотографию клеток из образца при болезни Альцгеймера, показывающую карбоксиметиллизин, окрашенный красным (темно–серым), и фосфорилированный tau, окрашенный зеленым (светло–серым).
[34]
ФИГ. 3B представляет собой фотографию клеток из образца при болезни Альцгеймера, показывающую карбоксиметиллизин, окрашенный красным (темно–серым), и белок–предшественник амилоида, окрашенный зеленым (светло–серым).
[35]
ФИГ. 3C представляет собой фотографию клеток из образца при болезни Паркинсона из черной субстанции, показывающую карбоксиметиллизин, окрашенный красным (темно–серым), и альфа–синуклеин, окрашенный зеленым (светло–серым).
[36]
ФИГ. 3D представляет собой фотографию клеток из образца при болезни Паркинсона из вентральной области покрышки, показывающую карбоксиметиллизин, окрашенный красным (темно–серым), и альфа–синуклеин, окрашенный зеленым (светло–серым).
Подробное описание
[37]
et al.
Распознавание поддающейся количественному определению ассоциации между клеточным старением и различными заболеваниями, нарушениями и патологическими состояниями привело к тому, что стареющие клетки стали диагностической мишенью. Например, CD57 является известным маркером стареющих клеток, включая иммуноциты, такие как клетки естественные киллеры (NK) и T–клетки (Kared, H. , «CD57 in human natural killer cells and T–lymphocytes», Cancer Immunology, Immunotherapy, Vol. 65, No. 4, pp. 441–452 (2016)). Являются коммерчески доступными наборы для выделения CD57, такие как набор для выделения CD8+CD57+ T–клеток от Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany), однако, эти инструменты для количественного измерения предназначены только для исследовательского применения. В информационном листке набора для выделения T–клеток от Miltenyi Biotec прямо указано, что набор не предназначен для диагностического или терапевтического применения.
[38]
Детекцию и количественную оценку конечных продуктов глубокого гликирования проводят с использованием аналитических способов, способных детектировать белки, таких как масс–спектрометрия и высокоэффективная жидкостная хроматография. Однако, эти способы являются трудоемкими и часто основаны на сложном лабораторном оборудовании. Способы практических экспериментов для измерения конечных продуктов глубокого гликирования с использованием антител против AGE, такие как иммуноанализы, значительно проще использовать. Анализы против AGE являются коммерчески доступными, такие как ELISA карбоксиметиллизина (CML), кат. No. KT–32428 от Kamiya Biomedical Company (Seattle, WA, USA). Подобно инструментам для детекции стареющих клеток, эти инструменты для количественного измерения предназначены только для исследовательского применения. В информационном листке ELISA CML от Kamiya Biomedical Company (кат. No. KT–32428) прямо указано, что продукт не предназначен для использования в диагностических способах. Соответственно, использование антител против AGE для диагностических целей не является ни обычным, ни общепринятым.
[39]
Понастоящему изобретению используют антитела, связывающие белки и пептиды, модифицированные конечными продуктами глубокого гликирования, для диагностики и мониторирования ассоциированных со старением заболеваний, нарушений или патологических состояний. Модифицированные посредством AGE белки и пептиды, особенно модифицированные посредством AGE белки и пептиды на поверхности частично функциональных и нефункциональных клеток, являются уникальной мишенью для диагностических способов на основе антител, включая твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), сортировку клеток и подсчет клеток. Например, детекцию связанного с клетками карбоксиметиллизина (CML), хорошо известного конечного продукта глубокого гликирования, можно использовать для определения общего количества, концентрации или соотношения стареющих клеток в образце. Пациентов можно идентифицировать как нуждающихся в лечении, на основании количества клеток, экспонирующих AGE на клеточной поверхности, в образце, по сравнению с количеством клеток, экспонирующих AGE на клеточной поверхности, в контроле, или когда количество клеток, экспонирующих AGE на клеточной поверхности, в образце превышает клинический порог. Альтернативно или дополнительно, сравнение соотношения связанных с клетками AGE и свободных (несвязанных) AGE можно использовать для нормализации количества стареющих клеток в образце и мониторирования прогрессирования заболевания или биологического старения. Большее соотношение связанных с клетками AGE указывает на больший уровень клеточного старения из–за внутренних источников и дисфункции клеток. Диагностические способы на основе антитела к AGE обеспечивают преимущества, являясь минимально инвазивными и простыми для осуществления, что позволяет проводить такие тесты в кабинете врача или в клинике.
[40]
Антитело к AGE можно использовать для детекции присутствия стареющих клеток в образце, поскольку стареющие клетки экспрессируют на поверхности клеток конечные продукты глубокого гликирования. В одном варианте осуществления, получают образец. Образец можно получать от пациента–человека. Затем, присутствие AGE на клеточной поверхности в образце определяют или измеряют посредством приведения образца в контакт с антителом против AGE и детекции связывания между AGE на клеточной поверхности и антителом против AGE. Необязательно, контрольный образец можно получать от пациента или от здорового пациента, в качестве фона для сравнения. Фон для сравнения можно получать также как среднее количество клеток, экспонирующих AGE–модификацию, из группы здорового контроля. Предпочтительно, контрольные образцы получают от здоровых пациентов, имеющих такой же хронологический возраст, как и пациент, от которого получают образец (также известны как «совпадающие по возрасту» или «индексированные по возрасту» контрольные образцы).
[41]
Количество клеток, экспонирующих AGE на клеточных поверхностях, можно определять с использованием качественных или количественных измерений. Измерение предназначено для предоставления информации, которую можно использовать для сравнения со здоровым контролем. Примеры количественных измерений включают измерение общего количества, среднего количества, концентрации, соотношения или процента клеток, экспонирующих AGE на клеточных поверхностях, в образце. Примеры качественных измерений включают анализ образцов тканей с использованием иммуногистохимических или иммуноцитохимических способов. Например, локализация гликирования в образце может являться показателем заболевания, нарушения или патологического состояния, ассоциированного с клеточным старением.
[42]
Измерение стареющих клеток в образце можно использовать для диагностики у пациента заболевания, нарушения или патологического состояния, ассоциированного с клеточным старением, или для идентификации пациента как нуждающегося в лечении. Увеличенный уровень клеточной дисфункции может быть показан, когда общее количество, среднее количество, концентрация, соотношение или процент клеток, экспонирующих AGE на клеточных поверхностях, в образце превышает общее количество, среднее количество, концентрацию, соотношение или процент клеток, экспонирующих AGE на клеточных поверхностях, в контроле. Например, образец, содержащий более 5% стареющих клеток, является показателем увеличенного уровня клеточной дисфункции. У пациента может быть диагностировано заболевание, нарушение или патологическое состояние, ассоциированное с клеточным старением, или он может быть идентифицирован как нуждающийся в лечении, до проявления симптомов или получения клинического диагноза от медицинского работника. Предпочтительно, у пациента уже проявляется по меньшей мере один симптом заболевания, нарушения или патологического состояния, ассоциированного с клеточным старением, до тестирования с целью идентификации заболевания, нарушения или патологического состояния, ассоциированного с клеточным старением. Измерение стареющих клеток в образце можно также использовать в дифференциальной диагностике для установления отличий заболеваний, нарушений или патологических состояний с перекрывающимися или сходными симптомами.
[43]
Увеличенный уровень клеточной дисфункции может также быть показан, когда количество клеток, экспонирующих AGE на клеточной поверхности, в образце превышает клинический порог. Например, у пациента может быть диагностировано заболевание, нарушение или патологическое состояние, ассоциированное с клеточным старением, или он может быть идентифицирован как нуждающийся в лечении, если образец содержит 5% – 50% стареющих клеток, включая по меньшей мере 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 30%, 35%, 40% и 45% стареющих клеток. Клинический порог может быть основан на наивысшем количестве или среднем количестве модифицированных посредством AGE клеток, обнаруженном в коллекции образцов, полученных от здоровых пациентов.
[44]
Измерение стареющих клеток в образце можно также использовать для определения биологического возраста пациента. Поскольку стареющие клетки накапливаются с возрастом, большее количество стареющих клеток в образце по сравнению с совпадающим по возрасту контролем является показателем прогрессирующего биологического возраста. Пациента можно идентифицировать как нуждающегося в лечении, когда биологический возраст пациента превышает хронологический возраст пациента. Например, у пациентки можно диагностировать прогрессирующий биологический возраст, когда ее биологический возраст на 10% – 50% больше, чем ее хронологический возраст, включая по меньшей мере на 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% и 45% больше, чем ее хронологический возраст. Подобным образом, у пациентки можно диагностировать прогрессирующий биологический возраст, когда ее биологический возраст на 5–50 лет больше, чем ее хронологический возраст, включая по меньшей мере на 10 лет, 15 лет, 20 лет, 25 лет, 30 лет, 35 лет, 40 лет и 45 лет больше, чем ее хронологический возраст.
[45]
Антитело к AGE можно также использовать для детекции свободных (несвязанных) AGE и модифицированных посредством AGE белков или пептидов в образце. Свободные AGE могут служить показателем конечных продуктов глубокого гликирования, не ассоциированных с клеточным старением. Количество AGE на клеточных поверхностях в образце можно сравнивать с количеством свободных AGE для нормализации количества стареющих клеток в образце. Например, соотношение AGE на клеточных поверхностях и свободных AGE можно использовать для определения процента AGE, накопленных на клеточной поверхности, где высокое соотношение указывает на увеличение клеточного старения. Процент стареющих клеток в образце можно также использовать в качестве показателя биологического возраста пациента.
[46]
Образец может представлять собой любой материал, полученный от пациента, содержащий клетки, которые могут являться стареющими. Примеры пригодных образцов включают слюну, буккальный мазок, образец крови, образец мочи, образец кожи и биоптат. Образец можно, необязательно, физически перерабатывать, например, посредством центрифугирования, или химически перерабатывать, например, посредством трипсинизации. Переработку образца можно использовать для выделения конкретных частей образца, например, разделения образца крови на сыворотку и плазму.
[47]
Клетки в образце, подвергаемые тестированию по присутствию на клеточной поверхности конечных продуктов глубокого гликирования, могут представлять собой любые клетки, которые могут подвергаться клеточному старению. Примеры пригодных клеток, подлежащих тестированию, включают T–клетки, эритроциты, фибробласты и эпителиальные клетки. T–клетки являются предпочтительными клетками для тестирования.
[48]
Присутствие модифицированных посредством AGE пептидов или белков в образце можно определять способом идентификации на основе антител. Примеры пригодных способов идентификации на основе антител включают иммуноанализы, такие как твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), радиоиммунные анализы (RIA) и количественную иммуно–ПЦР (iqПЦР) с детекцией в реальном времени, сортировку клеток, такую как активированная флуоресценцией сортировка клеток (FACS), проточную цитометрию и магнитную сортировку клеток, подсчет клеток, Вестерн–блоттинг, иммуногистохимию (IHC), иммуноцитохимию (ICC), иммунопреципитацию и иммуноферментный спот–анализ (ELISPOT). Предпочтительно, способом идентификации на основе антител является иммуноанализ.
[49]
et al
Предпочтительным способом детекции стареющих клеток в образцах ткани является иммуногистохимическое (IHC) окрашивание. Гистологический анализ образцов ткани является хорошо разработанным способом идентификации специфических белков в образце ткани. Например, AGE детектированы в образцах ткани из атеросклеротических бляшек и рака поджелудочной железы (Wendel, U. ., «A novel monoclonal antibody targeting carboxymethyllysine, an advanced glycation end product in atherosclerosis and pancreatic cancer», PLoS One, Vol. 13, No. 2, e0191872 (2018)). Иммуногистохимическое окрашивание позволяет детекцию специфических участков гликирования.
[50]
Диагностические способы можно осуществлять в центре, где получен образец. Альтернативно, образец можно посылать в осуществляющую тестирование организацию за пределами центра, например, в лабораторию.
[51]
et al
Антитело к AGE может представлять собой любое антитело, которое связывается с модифицированным посредством AGE белком или пептидом, включая модифицированные посредством AGE белки или пептиды, экспрессированные на поверхности стареющих клеток. Антитела к AGE известны в данной области и являются коммерчески доступными. Примеры включают описанные в U.S. 5702704 (Bucala) и U.S. 6380165 (Al–Abed .). Антитело может связываться с одним или несколькими модифицированными посредством AGE белками или пептидами, имеющими модификацию AGE такими как FFI, пирралин, AFGP, ALI, карбоксиметиллизин (CML), карбоксиэтиллизин (CEL) и пентозидин, и могут представлять собой смеси таких антител. Антитело может являться моноклональным или поликлональным. Предпочтительно, антитело представляет собой моноклональное антитело.
[52]
Предпочтительные антитела к AGE включают антитела, которые связываются с белками или пептидами, имеющими модификацию AGE карбоксиметиллизином или карбоксиэтиллизином. Карбоксиметиллизин (также известный как N(эпсилон)–(карбоксиметил)лизин, N(6)–карбоксиметиллизин или 2–амино–6–(карбоксиметиламино)гексановая кислота), и карбоксиэтиллизин (также известный как N–эпсилон–(карбоксиэтил)лизин), обнаруживают на белках или пептидах и липидах в результате окислительного стресса и химического гликирования. Модифицированные посредством CML и CEL белки или пептиды узнает рецептор RAGE, который экспрессируется на множестве клеток. CML и CEL являются хорошо изученными, и связанные с CML и CEL продукты являются коммерчески доступными. Например, Cell Biolabs, Inc. продает антигены CML–BSA, поликлональные антитела к CML, наборы для иммуноблоттинга CML и наборы для конкурентного ELISA CML (www.cellbiolabs.com/cml–assays), так же как антигены CEL–BSA и наборы для конкурентного ELISA CEL (www.cellbiolabs.com/cel–n–epsilon–carboxyethyl–lysine–assays–and–reagents). Предпочтительным коммерчески доступным антителом против AGE является антитело мыши против конечного продукта гликирования, образованное против карбоксиметиллизина, конъюгированного с гемоцианином морского блюдечка (клон 318003), доступное из R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN; каталожный no. MAB3247).
[53]
Антитело к AGE может иметь или может включать тяжелую цепь, имеющую белковую последовательность из SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, имеющую белковую последовательность из SEQ ID NO: 3. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи показаны в SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, соответственно. Последовательности ДНК и белковые последовательности дополнительных антител против AGE можно обнаружить в WO 2017/143073, публикации Международной патентной заявки No. PCT/US2017/18185, содержание которой приведено в настоящем описании в качестве ссылки.
[54]
Антитело к AGE может, необязательно, представлять собой биспецифическое антитело, представляющее собой антитело, нацеленное на два различных эпитопа. Такие антитела включают вариабельную область (или определяющую комплементарность область) из одного антитела к AGE и вариабельную область (или определяющую комплементарность область) из другого антитела.
[55]
2
2
H
Фрагменты антител можно использовать вместо полноразмерных антител. Например, иммуноглобулин G можно разбивать на более мелкие фрагменты посредством расщепления ферментами. Расщепление папаином расщепляет с N–концевой стороны от дисульфидных мостиков между тяжелыми цепями с получением фрагментов Fab. Фрагменты Fab включают легкую цепь и один из двух N–концевых доменов тяжелой цепи (также известный как фрагмент Fd). Расщепление пепcином расщепляет с C–концевой стороны от дисульфидных мостиков между тяжелыми цепями с получением фрагментов F(ab’). Фрагменты F(ab’) включают обе легкие цепи и два N–концевых домена, связанных дисульфидными мостиками. Расщепление пепcином может также образовывать фрагменты Fv (вариабельный фрагмент) и Fc (способный к кристаллизации фрагмент). Фрагмент Fv содержит два N–концевых вариабельных домена. Фрагмент Fc содержит домены, которые взаимодействуют с рецепторами иммуноглобулинов на клетках и с начальными элементами каскада реакций комплемента. Пепcин может также расщеплять иммуноглобулин G перед третьим константным доменом тяжелой цепи (C3) с получением большого фрагмента F(abc) и малого фрагмента pFc’. Фрагменты антител можно, альтернативно, получать рекомбинантным способом.
[56]
+
+
2
1
Антитела можно получать с использованием хорошо известных способов. Например, образование поликлональных антител (pAb) можно стимулировать у хозяина–млекопитающего посредством одной или нескольких инъекций иммуногена, и если желательно, адъюванта. Как правило, иммуноген (и адъювант) инъецируют млекопитающему посредством подкожной или внутрибрюшинной инъекции. Иммуноген может представлять собой модифицированный посредством AGE белок или пептид клетки, например, AGE–антитромбин III, AGE–кальмодулин, AGE–инсулин, AGE–церулоплазмин, AGE–коллаген, AGE–катепсин B, AGE–альбумин, такой как AGE–бычий сывороточный альбумин (AGE–BSA), AGE–человеческий сывороточный альбумин и овальбумин, AGE–кристаллин, AGE–активатор плазминогена, AGE–белок эндотелиальной плазматической мембраны, AGE–альдегидредуктазу, AGE–трансферрин, AGE–фибрин, AGE–медь/цинк–SOD, AGE–apo B, AGE–фибронектин, AGE–панкреатическую рибозу, AGE–apo A–I и II, AGE–гемоглобин, AGE–Na/K–АТФазу, AGE–плазминоген, AGE–миелин, AGE–лизоцим, AGE–иммуноглобулин, AGE–белок транспорта Glu эритроцитов, AGE–β–N–ацетил–гексокиназу, AGE–apo E, AGE–белок мембраны эритроцитов, AGE–альдозоредуктазу, AGE–ферритин, AGE–спектрин эритроцитов, AGE–алкогольдегидрогеназу, AGE–гаптоглобин, AGE–тубулин, AGE–гормон щитовидной железы, AGE–фибриноген, AGE–β–микроглобулин, AGE–сорбитдегидрогеназу, AGE–α–антитрипсин, AGE–карбонатдегидратазу, AGE–РНКазу, AGE–липопротеин низкой плотности, AGE–гексокиназу, AGE–apo C–I, AGE–РНКаза, AGE–гемоглобин, например, AGE–гемоглобин человека, AGE–липопротеин низкой плотности (AGE–LDL) и AGE–коллаген IV. Модифицированные посредством AGE клетки, такие как модифицированные посредством AGE эритроциты, цельные, лизированные или частично расщепленные, можно также использовать в качестве антигенов AGE. Примеры адъювантов включают полный адъювант Фрейнда, монофосфориллипид A синтетический дикориномиколят трегалозы, гидроксид алюминия (квасцы), белки теплового шока HSP 70 или HSP96, эмульсию сквалена, содержащую монофосфориллипид A, α2–макроглобулин и поверхностно–активные вещества, включая масляные эмульсии, полиолы типа pleuronic, полианионы и динитрофенол. Для улучшения иммунного ответа, иммуноген можно конъюгировать с полипептидом, являющимся иммуногенным для хозяина, таким как гемоцианин морского блюдечка (KLH), сывороточный альбумин, бычий тиреоглобулин, холерный токсин, лабильный энтеротоксин, частицы диоксида кремния или ингибитор трипсина сои. Предпочтительным конъюгатом иммуногена является AGE–KLH. Альтернативно, pAb можно получать у кур, продуцирующих молекулы IgY.
[57]
Моноклональные антитела (mAb) можно получать посредством иммунизации хозяина или лимфоцитов из хозяина, сбора лимфоцитов, секретирующих (или потенциально секретирующих) mAb, слияния этих лимфоцитов с иммортализованными клетками (например, клетками миеломы), и отбора клеток, секретирующих желательные mAb. Можно использовать другие способы, такие как способ EBV–гибридомы. Если желательно, mAb можно очищать из культуральной среды или асцитной жидкости общепринятыми способами, такими как хроматография на сефарозе с белком A, гидроксиапатите, электрофорез в геле, диализ, преципитация сульфатом аммония или аффинная хроматография.
[58]
Антитела к AGE можно использовать для диагностики начала или измерения прогрессирования любого заболевания, нарушения или патологического состояния, характеризующегося клеточным старением. Примеры заболеваний, нарушений и патологических состояний, ассоциированных с клеточным старением, включают болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз (ALS или болезнь Лу Геринга), хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), хорею Гентингтона, идиопатический пульмонарный фиброз, мышечную дистрофию (включая мышечную дистрофию Беккера, Дюшенна, тазово–плечевую мышечную дистрофию и мышечную дистрофию Ямамото), дегенерацию желтого пятна, катаракты, диабетическую ретинопатию, болезнь Паркинсона, прогерию (включая синдром Вернера и прогерию Гетчинсона–Гилфорда), витилиго, кистозный фиброз, атопический дерматит, экзему, артрит (включая остеоартрит, ревматоидный артрит и ювенильный ревматоидный артрит), атеросклероз, злокачественную опухоль и метастазирующую злокачественную опухоль (включая, например, рак молочной железы, трижды отрицательный рак молочной железы, рак легкого, меланому, рак толстого кишечника, почечноклеточный рак, рак предстательной железы, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак прямой кишки, рак пищевода, рак печени, злокачественную опухоль ротовой полости и горла, множественную миелому, рак яичника, рак желудка, рак поджелудочной железы и злокачественные опухоли ретинобластомы), связанную с лечением злокачественных опухолей инвалидность или побочные эффекты терапии злокачественных опухолей, гипертензию, глаукому, остеопороз, саркопению, кахексию, инсульт, инфаркт миокарда, фибрилляцию предсердий, отторжение трансплантата, сахарный диабет – типа I, сахарный диабет – типа II, воздействие радиоактивного облучения, побочные эффекты лечения HIV, воздействие химического оружия, отравление, воспаление, нефропатию, деменцию с тельцами Леви, прионное заболевание (включая губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота, болезнь Крейтцфельда–Якоба, почесуху, хроническую изнуряющую болезнь, куру и смертельную семейную бессонницу), лордокифоз, аутоиммунные нарушения, потерю жировой ткани, псориаз, болезнь Крона, астму, физиологические эффекты старения (включая «косметические» эффекты, такие как морщины, возрастные пятна, потерю волос, уменьшение подкожной жировой ткани и истончение кожи), идиопатическую миопатию (включая, например, идиопатическую воспалительную миопатию, идиопатический воспалительный миозит, полимиозит, дерматомиозит, спорадический миозит с тельцами включения и ювенильный миозит), рассеянный склероз, оптиконейромиелит (NMO, болезнь Девика или синдром Девика), эпилепсию и адренолейкодистрофию (ALD, X–сцепленную адренолейкодистрофию, X–ALD, церебральную ALD или cALD).
[59]
Для любого пациента, у которого может развиться заболевание, нарушение или патологическое состояние, ассоциированное с клеточным старением, можно проводить диагностику способами, описанными в настоящем описании. Пациент может представлять собой млекопитающего. Люди являются предпочтительными пациентами для диагностики. Другие пациенты, для которых можно проводить диагностику, включают мышей, крыс, коз, овец, коров, лошадей, верблюдов и домашних животных, таких как собаки или кошки.
[60]
Пациенту, у которого диагностировано заболевание, нарушение или патологическое состояние, ассоциированное с клеточным старением, или которого идентифицировали как нуждающегося в лечении, можно вводить средство для удаления стареющих клеток для нацеливания на стареющие клетки и их уничтожения. Примеры средств для удаления стареющих клеток включают терапевтические антитела к AGE, антитело к AGE, конъюгированное с токсином, сенолитическое средство, такое как дазатиниб и/или кверцетин, и их комбинации. Стареющие клетки можно также разрушать посредством терапевтического применения ультразвука. Способы разрушения стареющих клеток можно комбинировать для достижения желательного терапевтического исхода. Например, пациенту можно вводить комбинацию дазатиниба и кверцетина, так же как подвергать его воздействию высоко интенсивного сфокусированного ультразвука для избирательного разрушения стареющих клеток, в то же время сохраняя функциональные клетки. Терапевтически эффективное количество средства для удаления стареющих клеток может меняться в зависимости от конкретного использованного средства для удаления стареющих клеток. Например, подходящий уровень дозирования антитела к AGE, обычно может составлять приблизительно от 0,01 до 500 мг/кг массы тела пациента, включая приблизительно от 0,01 до 250 мг/кг, приблизительно от 0,05 до 100 мг/кг и приблизительно от 0,1 до 50 мг/кг. Подобным образом, подходящий уровень дозирования комбинированной терапии дазатинибом и кверцетином, обычно может составлять приблизительно 5 мг/кг массы тела пациента дазатиниба и приблизительно 50 мг/кг массы тела пациента кверцетина. Эффективность лечения можно мониторировать посредством повторяющихся измерений количества клеток, экспонирующих AGE на клеточных поверхностях.
[61]
Показано, чтовведение средства для удаления стареющих клеток является эффективным при лечении саркопении, атеросклероза и метастазирующей злокачественной опухоли. Другие заболевания, нарушения и патологические состояния, ассоциированные с клеточным старением, особенно подходящие для лечения посредством введения средства для удаления стареющих клеток, включают воспаление, аутоиммунные заболевания, остеоартрит, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.
[62]
in vitro
in vivo
in vivo
in vivo
in vivo
В дополнение к диагностическим способам, описанным выше, антитела к AGE можно также использовать в диагностических способах . Диагностические тесты  обеспечивают неинвазивные способы детекции модифицированных посредством AGE белков и пептидов. Диагностические тесты  являются особенно полезными для детекции стареющих клеток, экспрессирующих на клеточной поверхности конечные продукты глубокого гликирования, таких как метастазирующие клетки злокачественных опухолей. (См., например, WO 2017/143073). Антитела к AGE можно метить поддающейся детекции меткой или индикатором и затем вводить пациенту. Меченные антитела к AGE специфически связывают модифицированные посредством AGE белки или пептиды, что позволяет детектировать модифицированные посредством AGE белки или пептиды с использованием любого подходящего устройства, способного детектировать метку. Примеры диагностических способов  включают позитронную эмиссионную томографию (PET) и иммуно–PET, магнитно–резонансную томографию (MRI), однофотонную эмиссионную компьютерную томографию (SPECT), оптическую визуализацию, ультразвук, радиоиммуносцинтиграфию и их комбинации. Можно использовать любую метку, подходящую для данного диагностического способа, такую как радиоактивные метки, флуоресцентные метки, излучатели позитронов, красители с излучением в ближней инфракрасной области спектра (NIR), наночастицы, такие как золото и гадолиний, квантовые точки, суперпарамагнитный оксид железа (SPIO), нанотрубки углерода или микропузырьки, конъюгированные с антителами.
[63]
100
110
120
130
140
150
НаФИГ. 1 проиллюстрирован набор  для детекции клеток, экспрессирующих на поверхности клеток конечные продукты глубокого гликирования. Набор может включать антитело к AGE , контроль  и, необязательно, реагент  для детекции антитела к AGE. Антитело к AGE, контроль и необязательный реагент можно поставлять в любом подходящем контейнере, таком как бутыли, ампулы, упаковки, пробирки, пузырьки, флаконы или шприцы. Антитело к AGE и/или реагент могут, необязательно, являться меченными, например, с использованием флуоресцентной метки, радиоактивной метки или частицы золота. Контроль может представлять собой нормальную сыворотку от животного, у которого получали вторичное антитело, раствор, содержащий известное количество модифицированного посредством AGE белка или пептида, или фиксированные или консервированные клетки, экспонирующие модификацию AGE. Примеры реагентов для детекции антитела к AGE включают вторичные антитела, такие как поликлональное антитело к антител человека, полученное у осла и меченное родамином. Набор может, необязательно, содержаться в контейнере . Набор может, необязательно, включать печатные инструкции . Предпочтительно, содержимое набора является стерильным и готовым к использованию.
[64]
Набор может, необязательно, включать контейнер для содержания ингредиентов набора. Контейнер может быть изготовлен из жесткого, прочного материала, такого как пластик, или может являться гибким, таким как пакет или мягкая коробка.
[65]
Набор может, необязательно, включать инструкции для использования. Инструкции могут быть предоставлены в форме печатных инструкций или в электронном формате, например, на накопителе универсальной последовательной шины (USB), на карте формата secure digital (SD), или могут являться размещенными в сети интернет и доступными посредством двумерного матричного штрих–кода (QR).
[66]
Наборы могут, необязательно, содержать дополнительные диагностические материалы или оборудование, такие как буферы, фиксаторы, блокирующие растворы, ингибиторы протеаз, субстраты для анализа, такие как предметные стекла микроскопа и/или покровные стекла, микропланшеты для титрования и реагенты для экстракции клеток, такие как детергенты и растворы детергентов.
[67] Примеры
[68]
Пример 1: Сбор буккальный эпителиальный клетки
[69]
Пациентка полоскает ротовую полость солевым раствором в течение 30 секунд. Затем она сплевывает раствор в чашку. 1,5 мл солевого раствора из чашки затем переносят в пробирку для центрифугирования с использованием микропипетки. Пробирку для центрифугирования помещают в уравновешенную центрифугу и центрифугируют при 10000–14000 об./мин в течение 2 минут. Центрифугирование можно повторять, пока осадок не станет видимым на дне пробирки для центрифугирования. Затем супернатант отбрасывают посредством декантирования и/или удаления с использованием микропипетки. Осадок содержит выделенные буккальные эпителиальные клетки, которые затем можно тестировать по присутствию AGE на клеточных поверхностях для определения того, являются ли какие–либо из эпителиальных клеток стареющими.
[70]
Пример 2: Диагностика и лечение на основании клеток кожи
[71]
Эпидермальные клетки собирают с использованием способа сбора на клейкую ленту. Адгезивную ленту (Adhesives Research, Glen Rock, PA) изготавливают в форме круглых дисков диаметром приблизительно 17 мм. Ленту наносят на кожу пациента, затем удаляют для сбора эпидермальных клеток из рогового слоя. Сбор на клейкую ленту повторяют еще 3 раза для получения всего 4 эпидермальных образцов. Затем эпидермальные клетки тестируют по присутствию AGE на клеточных поверхностях для определения того, являются ли какие–либо из эпидермальных клеток стареющими.
[72]
Дермальные клетки собирают с использованием бритвенной биопсии. Лезвие скальпеля используют для удаления достаточного количества кожи, чтобы пройти через эпидермис и достигнуть дермы для получения образца. Затем фибробласты в образце тестируют по присутствию AGE на клеточных поверхностях для определения того, являются ли какие–либо из фибробластов стареющими. Присутствие по меньшей мере 5% стареющих клеток в бритвенном биоптате указывает на повреждение кожи и необходимость лечения для уменьшения количества стареющих клеток кожи. Пациенту вводят средство для удаления стареющих клеток для нацеливания на стареющие клетки кожи и их удаления.
[73]
Пример 3: ELISA прямого связывания с использованием антител против AGE
[74]
Связывание мышиных и химерных антител против AGE исследовали посредством ELISA прямого связывания. Антитело к карбоксиметиллизина (CML) (R&D Systems, MAB3247) использовали в качестве контроля. CML конъюгировали с KLH (CML–KLH) и планшет для ELISA покрывали в течение ночи как CML, так и CML–KLH. Антитело козы с HRP против Fc мыши использовали для детекции контрольных и мышиных антител против AGE. Антитело козы с HRP против Fc человека использовали для детекции химерного антитела к AGE.
[75]
Антигены разводили до 1 мкг/мл в 1x фосфатном буфере при pH 6,5. 96–луночный планшет для микротитрования для ELISA покрывали с использованием 100 мкл/лунку разведенного антигена и оставляли оседать при 4ºC в течение ночи. Планшет блокировали с использованием 1x PBS, 2,5% BSA и оставляли оседать в течение 1–2 часов на следующее утро при комнатной температуре. Подготавливали образцы антитела в серийных разведениях с использованием 1x PBS, 1% BSA, с исходной концентрацией 50 мкг/мл. Вторичные антитела разводили 1:5000. По 100 мкл разведений антител вводили в каждую лунку. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 0,5–1 часа в встряхивателе для микропланшетов. Планшет промывали 3 раза с использованием 1x PBS. 100 мкл/лунку разведенного конъюгированного с HRP вторичного антитела козы против Fc человека вводили в лунки. Планшет инкубировали в течение 1 часа в встряхивателе для микропланшетов. Затем планшет промывали 3 раза с использованием 1x PBS. 100 мкл субстрата TMB для HRP добавляли в каждую лунку для проявления планшета. По истечению 3–5 минут, реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1Н HCl. Второй ELISA прямого связывания проводили с покрытием только CML. Оптическую плотность при OD450 считывали с использованием считывателя для микропланшетов.
[76]
Необработанные данные оптической плотности при OD450 для ELISA CML и CML–KLH показаны на схеме планшета ниже. Использовали 48 из 96 лунок планшета. Пустые лунки на схеме планшета показывают неиспользованные лунки.
[77]
Схема планшета для ELISA CML и CML–KLH:
Конц. (мкг/мл)
1
2
3
4
5
6
7
50
0,462
0,092
0,42
1,199
0,142
1,852
16,67
0,312
0,067
0,185
0,31
0,13
0,383
5,56
0,165
0,063
0,123
0,19
0,115
0,425
1,85
0,092
0,063
0,088
0,146
0,099
0,414
0,62
0,083
0,072
0,066
0,108
0,085
0,248
0,21
0,075
0,066
0,09
0,096
0,096
0,12
0,07
0,086
0,086
0,082
0,098
0,096
0,098
0
0,09
0,085
0,12
0,111
0,083
0,582
Положительный контроль из R&D
Исходное антитело к AGE
Химерное антитело к AGE
Положительный контроль из R&D
Исходное антитело к AGE
Химерное антитело к AGE
Покрытие CML–KLH
Покрытие CML–KLH
[78]
Необработанные данные оптической плотности при OD450 для ELISA только CML показаны на схеме планшета ниже. Использовали 24 из 96 лунок планшета. Пустые лунки на схеме планшета показывают неиспользованные лунки.
[79]
Схема планшета для ELISA только CML:
Конц. (мкг/мл)
1
2
3
4
5
6
7
50
1,913
0,165
0,992
16,66667
1,113
0,226
0,541
5,555556
0,549
0,166
0,356
1,851852
0,199
0,078
0,248
0,617284
0,128
0,103
0,159
0,205761
0,116
0,056
0,097
0,068587
0,073
0,055
0,071
0
0,053
0,057
0,06
Положительный контроль из R&D
Исходное антитело к AGE
Химерное антитело к AGE
[80]
Для контрольных и химерных антител против AGE показано связывание как с CML, так и с CML–KLH. Для мышиного (исходного) антитела к AGE показано от очень слабого связывания до отсутствия связывания с любым из CML или CML–KLH. Данные повторного ELISA подтверждают связывание контрольного и химерного антитела к AGE с CML. Для всего контроля с буфером показан отрицательный сигнал.
[81]
Эти данные подтверждают способность антител против AGE связывать AGE и конъюгаты AGE–иммуноген. Доказательство связывания с хорошо известным AGE карбоксиметиллизином поддерживает пригодность антител против AGE для диагностических применений.
[82]
Пример 4: Диагностика и лечение на основании образца крови
[83]
Образец крови отбирают у пациента. Образец крови центрифугируют для выделения сыворотки. CD57+ T–клетки выделяют с использованием набора для выделения CD8+CD57+ T–клеток от Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany). CD57+ T–клетки подсчитывают с использованием гемоцитометра. Затем сыворотку и выделенные CD57+ T–клетки тестируют по связыванию с антителом против CML. Уровень CML в сыворотке меньше или равно 152 мкг/мл, в сочетании с большим или равным 50% связыванием выделенных CD57+ T–клеток с меченным антителом против CML показывает, что пациент нуждается в лечении с использованием средства для удаления стареющих клеток. Пациенту вводят антитело к AGE, которое нацелено на стареющие клетки и удаляет их.
[84]
Пример 5: Диагностика и лечение на основании буккального мазка
[85]
Образец получают от пациента посредством буккального мазка. Буккальные эпителиальные клетки и слюну из мазка разделяют. Буккальные клетки обрабатывают трипсином и смешивают с моноклональным антителом против CML. Затем смесь пропускают через гемоцитометр для подсчета стареющих буккальных клеток. Свободный CML измеряют посредством ELISA слюны. Уровень CML в слюне, меньший или равный 3 мкг/мл, в сочетании с большим или равным 50% связыванием буккальных клеток с антителом против CML показывает, что пациент нуждается в лечении с использованием средства для удаления стареющих клеток. Пациенту вводят антитело к AGE, конъюгированное с токсином, которое нацелено на стареющие клетки и удаляет их.
[86]
Пример 6: Определение биологического возраста
[87]
Образец получают от 50–летней пациентки посредством буккального мазка. Буккальные эпителиальные клетки и слюну из мазка разделяют. Буккальные клетки обрабатывают трипсином и смешивают с моноклональным антителом против CML. Затем смесь пропускают через гемоцитометр для подсчета стареющих буккальных клеток. Свободный CML измеряют посредством ELISA слюны. Соотношение буккальных клеток, экспрессирующих на клеточной поверхности CML, к свободному CML в слюне составляет 5:1. Это соотношение выше, чем можно ожидать для здорового 50–летнего, что показывает, что пациентка имеет биологический возраст, больше, чем ее хронологический возраст. Результаты показывают, что пациентка испытывает раннее начало старения и связанных со старением заболеваний, нарушений или патологических состояний из–за клеточного старения. Эти результаты также показывают, что пациентка нуждается в лечении с использованием средства для удаления стареющих клеток.
[88]
Пример 7: Диагностика и лечение заболевания, нарушения или патологического состояния, ассоциированного с прогрессирующим биологическим старением из–за клеточного старения
[89]
Образец крови получают от 45–летнего пациента. Образец крови центрифугируют для выделения сыворотки. CD57+ T–клетки выделяют с использованием набора для выделения CD8+CD57+ T–клеток от Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany). CD57+ T–клетки подсчитывают с использованием гемоцитометра. Затем сыворотку и выделенные CD57+ T–клетки тестируют по связыванию с антителом против CML. Соотношение клеток, экспрессирующих на клеточной поверхности CML, к свободному CML в сыворотке составляет 10:1. Это соотношение показывает, что пациент имеет биологический возраст 65. Поскольку биологический возраст пациента превышает хронологический возраст пациента, у пациента диагностируют заболевание, нарушение или патологическое состояние, ассоциированное с прогрессирующим биологическим старением из–за клеточного старения. Пациенту вводят антитело к AGE, которое нацелено на стареющие клетки и удаляет их.
[90]
in vivo
Пример 8: Исследование  введения антитела к конечного продукта гликирования
[91]
Для исследования эффектов антитела к конечного продукта гликирования, антитело вводили стареющей мыши CD1(ICR) (Charles River Laboratories), два раза в сутки посредством внутривенной инъекции, один раз в неделю, в течение трех недель (сутки 1, 8 и 15), с последующим свободным от лечения периодом 10 недель. Тестируемое антитело представляло собой коммерчески доступное антитело мыши против конечного продукта гликирования, полученное против карбоксиметиллизина, конъюгированного с гемоцианином морского блюдечка, MAb против карбоксиметиллизина (клон 318003), доступное из R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN; каталожный no. MAB3247). Контрольный эталон – физиологический солевой раствор использовали у контрольных животных.
[92]
Мыши, обозначенные как «молодые», были в возрасте 8 недель, в то время как мыши, обозначенные как «старые», были в возрасте 88 недель (±2 суток). Не отмечено неблагоприятных событий из–за введения антитела. Различные группы животных, использованные в исследовании, показаны в таблице 1.
[93]
Таблица 1: Различные группы животных, использованные в исследовании
<b>No. группы</b>
<b>Тестируемый материал</b>
<b>Мыши</b>
<b>Уровень дозирования (мкг/г/BID/неделю)</b>
<b>Количество животных</b>
<b>Главное исследование</b>
<b>Свободные от лечения </b>
<b>Самки</b>
<b>Самки</b>
1
Солевой раствор
молодые
0
20
–
2
Солевой раствор
старые
0
20
20
3
Антитело
старые
2,5
20
20
4
Нет
старые
0
20
пре
5
Антитело
старые
5,0
20
20
– = Неприменимо, Пре=подгруппа животных, подвергнутых эвтаназии до начала лечения для сбора жировой ткани.
[94]
INK4a
–ΔΔCt
мРНК P16, маркер стареющих клеток, оценивали количественно в жировой ткани в группах посредством qПЦР с детекцией в реальном времени. Результаты показаны в таблице 2. В таблице ΔΔCt=ΔCt средняя в контрольной группе (2) – ΔCt средняя в экспериментальной группе (1 или 3 или 5); Кратность экспрессии=2 .
[95]
INK4a
Таблица 2: мРНК P16, количественно оцененная в жировой ткани
Расчет (без коррекции на группу 4: 5,59)
Группа 2 по сравнению с группой 1
Группа 2 по сравнению с группой 3
Группа 2 по сравнению с группой 5
Группа 2
Группа 1
Группа 2
Группа 3
Группа 2
Группа 5
Средняя ΔCt
5,79
7,14
5,79
6,09
5,79
7,39
ΔΔCt
–1,35
–0,30
–1,60
Кратность экспрессии
<b>2,55</b>
<b>1,23</b>
<b>3,03</b>
[96]
Ink4a
Ink4a
Ink4a
В таблице выше показано, что не подвергнутые лечению старые мыши (контрольная группа 2) экспрессируют в 2,55 раза больше мРНК p16, чем не подвергнутые лечению молодые мыши (контрольная группа 1), как ожидали. Это наблюдали, когда сравнивали не подвергнутых лечению старых мышей группы 2, подвергнутых эвтаназии в конце восстановления на сутки 85, с не подвергнутыми лечению молодыми мышами группы 1, подвергнутыми эвтаназии в конце лечения на сутки 22. Когда результаты для не подвергнутых лечению старых мышей группы 2 сравнивали с результатами для подвергнутых лечению старых мышей группы 3, подвергнутых эвтаназии на сутки 85, наблюдали, что уровень мРНК p16 был в 1,23 раза выше в группе 2, чем в группе 3. Таким образом, уровень экспрессии мРНК p16 был ниже, когда старых мышей подвергали лечению с использованием 2,5 мкг/грамм/BID/неделю антитела.
[97]
Ink4a
Ink4a
Ink4a
Когда результаты для группы 2 (контроль) не подвергнутых лечению старых мышей сравнивали с результатами для группы 5 (5 мкг/грамм) подвергнутых лечению старых мышей, подвергнутых эвтаназии на сутки 22, наблюдали, что уровень p16 мРНК был в 3,03 выше в группе 2 (контроль) чем в группе 5 (5 мкг/грамм). Это сравнение показало, что животные группы 5 имели более низкие уровни экспрессии мРНК p16, когда их подвергали лечению с использованием 5,0 мкг/грамм/BID/неделю, обеспечивая уровни экспрессии мРНК p16, сравнимые с уровнями у не подвергнутых лечению молодых мышей (т.е. группы 1). В отличие от мышей группы 3 (2,5 мкг/грамм), которых подвергали эвтаназии в конце восстановления на сутки 85, мышей группы 5 подвергали эвтаназии в конце лечения на сутки 22.
[98]
Эти результаты показывают, что введение антитела к AGE приводило к уничтожению стареющих клеток.
[99]
Измеряли также массу икроножной мышцы, для определения эффекта введения антитела на саркопению. Результаты представлены в таблице 3. Результаты показывают, что введение антитела увеличивало мышечную массу по сравнению с контролем, но только в более высокой дозе 5,0 мкг/грамм/BID/неделю.
[100]
Таблица 3: Эффект введения антитела на массу икроножной мышцы
Группа
Обобщение информации
Абсолютная масса икроножной мышцы
Масса икроножной мышцы относительно массы тела
1
Среднее
0,3291
1,1037
SD
0,0412
0,1473
N
20
20
2
Среднее
0,3304
0,7671
SD
0,0371
0,1246
N
20
20
3
Среднее
0,3410
0,7706
SD
0,0439
0,0971
N
19
19
5
Среднее
0,4074
0,9480
SD
0,0508
0,2049
N
9
9
[101]
Ink4a
Эти результаты показывают, что введение антител, связывающих AGE в клетке, приводит к уменьшению количества клеток, экспрессирующих p16, биомаркер старения. Данные показывают, что уменьшение количества стареющих клеток приводит непосредственно к увеличению мышечной массы у стареющих мышей. Эти результаты показывают, что потерю мышечной массы, классический признак саркопении, можно лечить посредством введения средств для удаления стареющих клеток, таких как антитела, связывающие AGE в клетке.
[102]
in vivo
Эти данные подтверждают, что антитела к AGE являются способными избирательно связываться с клетками, экспрессирующими на клеточной поверхности модифицированные посредством AGE белки или модифицированные посредством AGE пептиды. Доказательство избирательного связывания поддерживает пригодность антитела к AGE для диагностических применений. Эти данные показывают также, что антитела к AGE являются безопасными для использования .
[103]
Пример 9: Аффинность и кинетика тестируемого антитела
[104]
TM
TM
Аффинность и кинетику тестируемого антитела, используемого в примере 8, анализировали с использованием соли трифторацетата Nα,Nα–бис(карбоксиметил)–L–лизина (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO) в качестве модельного субстрата для модифицированного посредством AGE белка в клетке. Анализ взаимодействия без использования метки проводили на BIACORE T200 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA), с использованием сенсорного чипа CM5 серий S (GE Healthcare, Pittsburgh, PA), с Fc1, установленным в качестве нуля, и Fc2, иммобилизованным с использованием тестируемого антитела (молекулярная масса 150000 Да). Рабочий буфер представлял собой буфер HBS–EP (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА и 0,05% P–20, pH 7,4), при температуре 25 °C. Программное обеспечение представляло собой программное обеспечение для оценки BIACORE T200, версии 2.0. Двойной контроль (инъекцию Fc2–1 и только буфера) использовали в анализе, и данные приводили в соответствие с моделью связывания 1:1 Ленгмюра.
[105]
Таблица 4: Экспериментальные установки анализа аффинности и кинетики
Связывание и диссоциация
Путь протекания
Fc1 и Fc2
Скорость потока (мкл/мин.)
30
Время связывания (с)
300
Время диссоциации (с)
300
Концентрация образца (мкМ)
20–5–1,25 (x2) – 0,3125–0,078–0
[106]
k
k
K
a
d
D
макс.
макс.
3
–3
–6
2
2
График ответа в зависимости от времени проиллюстрирован на ФИГ. 2. Следующие значения определяли из анализа:  (1/Мс)=1,857×10;  (1/с)=6,781×10;  (M)=3,651×10; R (RU)=19,52; и Chi=0,114. Поскольку значение Chi для подбора соответствия составляет менее 10% R, соответствие является значимым.
[107]
in vivo
Пример 10: Исследование введения  антитела к карбоксиметиллизина
[108]
in vivo
Эффект антитела к карбоксиметиллизина карбоксиметил на рост опухоли, метастазирующий потенциал и кахексию. Исследования  проводили у мышей с использованием модели опухоли рака молочной железы на мышах. Самки мышей BALB/c (BALB/cAnNCrl, Charles River) были в возрасте одиннадцати недель на сутки 1 исследования.
[109]
2
Клетки опухолей молочной железы мыши4T1 (ATCC CRL–2539) культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку, 2 мМ глутамин, 25 мкг/мл гентамицин, 100 единиц/мл пенициллина G Na и 100 мкг/мл сульфата стрептомицина. Клетки опухолей поддерживали в культуральных флаконах в увлажненном инкубаторе 37°C в атсмосфере 5% CO и 95% воздуха.
[110]
6
5
3
2
3
3
3
Затем культивированные клетки рака молочной железы имплантировали мышам. Клетки 4T1 собирали во время логарифмической фазы роста и ресуспендировали в фосфатно–солевом буфере (PBS) при концентрации 1×10 клеток/мл на сутки имплантации. Опухоли инициировали посредством подкожной имплантации 1×10 клеток 4T1 (0,1 мл суспензии) в правый бок каждого тестируемого животного. Опухоли мониторировали по объемам, приближаясь к целевому диапазону 80–120 мм. Объем опухоли определяли с использованием формулы: объем опухоли=(ширина опухоли)(длина опухоли)/2. Массу опухоли определяли приблизительно с использованием допущения, что 1 мм объема опухоли имеет массу 1 мг. Через тринадцать суток после имплантации, что обозначено как сутки 1 исследования, мышей сортировали на четыре группы (n=15/группу) с индивидуальными объемами опухолей, лежащими в диапазоне от 108 до 126 мм, и средним объемом опухоли в группе 112 мм. Четыре группы лечения показаны в таблице 5 ниже:
[111]
Таблица 5: Группы лечения
Группа
Описание
Средство
Дозирование (мкг/г)
1
Контроль
фосфатно–солевой буфер (PBS)
N/A
2
Низкая доза
моноклональное антитело к карбоксиметиллизина
5
3
Высокая доза
моноклональное антитело к карбоксиметиллизина
10
4
Только наблюдение
Нет
N/A
[112]
Моноклональное антитело к карбоксиметиллизина использовали в качестве лекарственного средства. 250 мг моноклонального антитела к карбоксиметиллизина получали от R&D Systems (Minneapolis, MN). Растворы для дозирования моноклонального антитела к карбоксиметиллизина получали при 1 и 0,5 мг/мл в носителе (PBS) для получения активных доз 10 и 5 мкг/г, соответственно, в объеме дозирования 10 мл/кг. Растворы для дозирования хранили при 4°C, с защитой от света.
[113]
Все обработки проводили внутривенно (i.v.) дважды в сутки в течение 21 суток, за исключением суток 1 исследования, когда мышам вводили одну дозу. На сутки 19 исследования, i.v. дозирование меняли на внутрибрюшинное (i.p.) дозирование для тех животных, для которых невозможно было дозирование i.v. из–за деградации хвостовой вены. Объем дозирования составлял 0,200 мл на 20 грамм массы тела (10 мл/кг), и был масштабирован по массе тела каждого индивидуального животного.
[114]
Исследование продолжали в течение 23 суток. Опухоли измеряли с использованием штангенциркуля дважды в неделю. Животных взвешивали ежесуточно на сутки 1–5, затем дважды в неделю до завершения исследования. У мышей также наблюдали любые побочные эффекты. Приемлемую токсичность определяли как среднюю потерю массы тела в группе менее 20% в ходе исследования и не более, чем 10% связанных с лечением случаев смерти. Эффективность лечения определяли с использованием данных на последние сутки исследования (сутки 23).
[115]
обработанной
контрольной
Способность антитела к карбоксиметиллизина ингибировать рост опухоли определяли посредством сравнения медианного объема опухоли (MTV) для групп 1–3. Объем опухоли измеряли, как описано выше. Процент ингибирования роста опухоли (%TGI) определяли как различие между MTV контрольной группы (группы 1) и MTV обработанной лекарственным средством группы, выраженное как процент от MTV контрольной группы. %TGI можно рассчитывать в соответствии с формулой: %TGI=(1–MTV/MTV) x 100.
[116]
обработанной
контрольной
Способность антитела к карбоксиметиллизина ингибировать метастазирование злокачественной опухоли определяли посредством сравнения очагов рака легкого для групп 1–3. Процент ингибирования (% ингибирования) определяли как различие между средним количеством очагов метастазирования контрольной группы и средним количеством очагов метастазирования обработанной лекарственным средством группы, выраженное как процент от среднего количества очагов метастазирования контрольной группы. % ингибирования можно рассчитывать в соответствии с формулой: % ингибирования=(1–среднее количество очагов/среднее количество очагов) x 100.
[117]
Способность антитела к карбоксиметиллизина ингибировать кахексию определяли посредством сравнения массы легких и икроножных мышц для групп 1–3. Массы тканей также нормализовали на 100 г массы тела.
[118]
3
3
Эффективность лечения также оценивали по встречаемости и диапазону ответов регрессии, наблюдаемых на протяжении исследования. Обработка может вызывать частичную регрессию (PR) или полную регрессию (CR) опухоли у животного. При ответе PR, объем опухоли составлял 50% или менее ее объема на сутки 1 для трех последовательных измерений в ходе исследования, и был равным или большим, чем 13,5 мм для одного или нескольких из этих трех измерений. При ответе CR, объем опухоли составлял менее 13,5 мм для трех последовательных измерений в ходе исследования.
[119]
U
P=
Статистический анализ проводили с использованием Prism (GraphPad) для Windows 6.07. Статистические анализы различий между средними объемами опухолями (MTV) двух групп на сутки 23 осуществляли с использованием –критерия Манна–Уитни. Сравнения очагов метастазирования оценивали посредством ANOVA–критерия Даннетта. Нормализованные массы тканей сравнивали посредством ANOVA. Двусторонние статистические анализы проводили на уровне значимости 0,05. Результаты классифицировали как статистически значимые или статистически не значимые.
[120]
Результаты исследования показаны ниже в таблице 6:
[121]
Таблица 6: Результаты
Группа
MTV (мм<sup>3</sup>)
%TGI
Очаги в легких
% ингибирования
PR
CR
Масса икроножной мышцы/нормализованная (мг)
Масса легкого/ нормализованная (мг)
1
1800
N/A
70,4
N/A
0
0
353,4/19,68
2799,4/292,98
2
1568
13%
60,3
14%
0
0
330,4/21,62
2388,9/179,75
3
1688
6%
49,0
30%
0
0
398,6/24,91
2191,6/214,90
[122]
<
Все режимы лечения имели приемлемую переносимость в отсутствие связанных с лечением случаев смерти. Единственными случаями смерти животных были не связанные с лечением случаи смерти из–за метастазирования. %TGI проявлял тенденцию к значимости (P > 0,05, критерий Манна–Уитни) для групп лечения 5 мкг/г (группа 2) и 10 мкг/г (группа 3). % ингибирования проявлял тенденцию к значимости (P > 0,05, ANOVA–критерий Даннетта) для группы лечения 5 мкг/г. % ингибирования являлся статистически значимым (P  0,01, ANOVA–критерий Даннетта) для группы лечения 10 мкг/г. Способность антитела к карбоксиметиллизина к лечению кахексии проявляла тенденцию к значимости (P > 0,05, ANOVA), но основании сравнения масс органов для легких и икроножной мышцы между группами лечения и контрольной группой. Результаты показывают, что введение моноклонального антитела к карбоксиметиллизина может уменьшать метастазирование злокачественных опухолей.
[123]
in vivo
Данные подтверждают, что антитела к AGE являются способными избирательно связываться с клетками, экспрессирующими на клеточной поверхности модифицированные посредством AGE белки или модифицированные посредством AGE пептиды. Доказательство избирательного связывания поддерживает пригодность антител против AGE для диагностических применений. Данные также показывают, что антитела к AGE являются безопасными для использования .
[124]
in vitro
Пример 11: Антитела к AGE связывают стареющие хондроциты
[125]
in vitro
Стареющие хондроциты получали из пораженных остеоартритом суставов. Антитела к AGE связывают стареющие хондроциты . Эти результаты подтверждают, что антитела к AGE являются способными связывать стареющие клетки. Результаты подтверждают также пригодность антител против AGE для диагностических применений.
[126]
Пример 12: Иммуногистохимическое исследование
[127]
Образцы получали от пациентов с болезнью Альцгеймера и болезнью Паркинсона. Два образца для болезни Альцгеймера отбирали из гиппокампа. Один образец для болезни Паркинсона отбирали из черной субстанции, и второй образец для болезни Паркинсона отбирали из вентральной области покрышки. Все клетки окрашивали по карбоксиметиллизину (CML) с использованием антитела к AGE, как описано выше. Клетки для болезни Альцгеймера окрашивали по фосфорилированному tau (фосфо–tau) или отдельно по белку–предшественнику амилоида. Клетки для болезни Паркинсона окрашивали по альфа–синуклеину. Окрашивание ядер клеток идентифицировали с использованием контрастного красителя DAPI. (Эксперименты проведены и изображения получены Dr. Diego Mastroeni из Arizona State University.)
[128]
ФИГ. 3A представляет собой фотографию клеток из образца при болезни Альцгеймера, показывающую карбоксиметиллизин, окрашенный красным, и фосфорилированный tau, окрашенный зеленым.
[129]
ФИГ. 3B представляет собой фотографию клеток из образца при болезни Альцгеймера, показывающую карбоксиметиллизин, окрашенный красным, и белок–предшественник амилоида, окрашенный зеленым.
[130]
ФИГ. 3C представляет собой фотографию клеток из образца при болезни Паркинсона из черной субстанции, показывающую карбоксиметиллизин, окрашенный красным, и альфа–синуклеин, окрашенный зеленым.
[131]
ФИГ. 3D представляет собой фотографию клеток из образца при болезни Паркинсона из вентральной области покрышки, показывающую карбоксиметиллизин, окрашенный красным, и альфа–синуклеин, окрашенный зеленым.
[132]
et al
CML, хорошо известный AGE, не имел совместной локализации с установленными патологиями при болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона. Вместо этого, CML был представлен на глиальных клетках. Подозревали иммунореакционную способность CML в образцах при болезни Альцгеймера для микроглии, и иммунореакционную способность CML в образцах при болезни Паркинсона для астроцитов. Результаты показывают присутствие стареющих глиальных клеток при болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона. Можно ожидать, что удаление стареющих глиальных клеток с использованием антитела к AGE может приводить в результате к регенерации глиальных клеток посредством нервных стволовых/клеток–предшественников. (См., например, Leonard, B.W. ., «Subventricular zone neural progenitors from rapid brain autopsies of elderly subjects with and without neurodegenerative disease», The Journal of Comparative Neurology, Vol. 515, pp. 269–294 (2009)).
[133]
Эти данные подтверждают способность антител против AGE связываться с AGE, присутствующими на клетках, в образцах ткани, полученных от пациентов с различными нейродегенеративными заболеваниями. Доказательство дополнительно подтверждает пригодность антител против AGE для диагностических применений.
[134] СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
[135]
et al.
1. Lowe, R. , «Buccals are likely to be a more informative surrogate tissue than blood for epigenome–wide association studies», Epigenetics, Vol. 8, No. 4, pp. 445–454 (2013).
[136]
et al.
2. Kared, H. , «CD57 in human natural killer cells and T–lymphocytes», Cancer Immunology, Immunotherapy, Vol. 65, No. 4, pp. 441–452 (2016).
[137]
et al.
3. Yoon, M–S. , «Characterisation of advanced glycation endproducts in saliva from patients with diabetes mellitus», Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 323, Issue 2, pp. 377–381 (2004).
[138]
et al.
4. Pearce, M.S. , «Childhood growth, IQ and education as predictors of white blood cell telomere length at age 49–51 years: the Newcastle Thousand Families Study», PLoS ONE, Vol. 7, Issue 7, e40116 (2012).
[139]
5. «Telomere Testing White Paper», Titanovo, available online at titanovo.com/telomere–length–testing/ (accessed on April 20, 2017).
[140]
6. «Carboxymethyl Lysine (CML) ELISA Cat. No. KT–32428», Kamiya Biomedical Company, available online at www.kamiyabiomedical.com/pdf/KT–32428.pdf (accessed on April 20, 2017).
[141]
7. «CD8+CD57+ T Cell Isolation Kit Data Sheet», Miltenyi Biotec, available online at www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001600/IM0001652.ashx?force=1 (2008).
[142]
8. «CD8+CD57+ T Cell Isolation Kit, human», Miltenyi Biotec, available online at www.miltenyibiotec.com/en/products–and–services/macs–cell–separation/cell–separation–reagents/t–cells/cd8–cd57–t–cell–isolation–kit–human.aspx (accessed on April 19, 2017).
[143]
9. «Extraction of genomic DNA from buccal epithelial cells», available online at authors.fhcrc.org/591/1/Buccal%20Cell%20DNA%20Isol%20v2.pdf (accessed on April 19, 2017).
[144]
et al.
10. Severin, F.F. , «Advanced glycation of cellular proteins as a possible basic component of the ‘Master Biological Clock’», Biochemistry (Moscow), Vol. 78, No. 9, pp. 1331–1336 (2013).
[145]
11. Wong, R. et al., «Use of RT–PCR and DNA microarrays to characterize RNA recovered by non–invasive tape harvesting of normal and inflamed skin», The Journal of Investigative Dermatology, Vol. 123, pp. 159–167 (2004).
[146]
et al.
12. Yang, S. , «Impact of oxidative stress biomarkers and carboxymethyllysine (an advanced glycation end product) on prostate cancer: a prospective study», Clinical Genitourinary Cancer, Vol. 13, No. 5, pp. e347–e351 (2015).
[147]
et al.
13. Meerwaldt, R. , «Skin autofluorescence is a strong predictor of cardiac mortality in diabetes», Diabetes Care, Vol. 30, No. 1, pp. 107–112 (2007).
[148]
et al.
14. Cosgrove, C. , «The impact of 6–month training preparation for an Ironman triathlon on the proportions of naïve, memory and senescent T cells in resting blood», European Journal of Applied Physiology, Vol. 112, No. 8, pp. 2989–2998 (2012).
[149]
et al.
15. Krtolica, A. , «Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging», Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 98, No. 21, pp. 12072–12077 (2001).
[150]
et al.
16. Schmid, D. , «Collage glycation and skin aging», Cosmetics and Toiletries Manufacture Worldwide, available online at mibellebiochemistry.com/app/uploads/2015/03/GSP–T–for–Skin_Collagen–glycation–and–skin–aging–CT–2002.pdf (accessed on April 27, 2017).
[151]
et al.
17. Spielmann, G. , «Aerobic fitness is associated with lower proportions of senescent blood T–cells in man», Brain, Behavior and Immunity, Vol. 25, No. 8, pp. 1521–1529 (2011).
[152]
et al.
18. Pauwels, E.K.J. , «Radiolabelled monoclonal antibodies: a new diagnostic tool in nuclear medicine», Radiotherapy and Oncology, Vol. 1, No. 4, pp. 333–338 (1984).
[153]
19. U.S. Pat. App. Pub. No. US 2016/0017033.
[154]
et al
20. Khoja, L. ., «A pilot study to explore circulating tumour cells in pancreatic cancer as a novel biomarker», British Journal of Cancer, Vol. 106, No. 3, pp. 508–516 (2012).
[155]
et al
N
ε
21. Rüster, M. ., «Detection of elevated –carboxymethyllysine levels in muscular tissue and in serum of patients with fibromyalgia», Scandinavian Journal of Rheumatology, Vol. 34, No. 6, pp. 460–463 (2005).
[156]
et al
ε
22. Al–Abed, Y. ., «N–Carboxymethyllysine formation by direct addition of glyoxal to lysine during the Maillard reaction», Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 5, No. 18, pp. 2161–2162 (1995).
[157]
et al
In vivo
23. Freise, A.C. ., « imaging with antibodies and engineered fragments», Molecular Immunology, Vol. 67, No. 2, pp. 142–152 (2015).
[158]
et al
24. Wendel, U. ., «A novel monoclonal antibody targeting carboxymethyllysine, an advanced glycation end product in atherosclerosis and pancreatic cancer», PLoS One, Vol. 13, No. 2, e0191872 (2018).