ВАКЦИНА ПРОТИВ МАНХЕЙМИОЗА, БИБЕРШТЕЙНИОЗА И ПАСТЕРЕЛЛЁЗА КРУПНОГО И МЕЛКОГО РОГАТОГО СКОТА АССОЦИИРОВАННАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ, СПОСОБ ЕЁ ПОЛУЧЕНИЯ
VACCINE AGAINST MANCHEMIOSIS, BIBERSHTEINIOSIS AND PASTERELOSIS OF LARGE AND SMALL CATTLE ASSOCIATED INACTIVATED, METHOD FOR ITS PREPARATION

Группа изобретений относится к области ветеринарии, ветеринарной микробиологии и биотехнологии, и может быть использована ветеринарными специалистами в скотоводстве, овцеводстве и козоводстве для специфической профилактики инфекционных патологий, вызванных бактериями видов Mannheimia haemolytica, Bibersteinia trehalosi и Pasteurella multocida.
Этиологическое значение бактерий семейства Pasteurellaceae, в развитии респираторных инфекций у крупного и мелкого рогатого скота признается ветеринарными специалистами всего мира, как наиболее острая проблема, влекущая за собой огромные экономические потери. Так, в соответствии с современной эпизоотической ситуацией на территории Российской Федерации, из респираторных инфекций пастереллезной и пастереллез-подобной этиологии, наибольшую роль имеют Mannheimia haemolytica, Bibersteinia trehalosi и Pasteurella multocida, соответственно вызывающие манхеймиоз, биберштейниоз и пастереллез. Данные инфекции распространены не только в РФ, но и за ее пределами [Шегидевич, Э.А. Состояние и перспективы изучения пастереллезов сельскохозяйственных животных / Э.А. Шегидевич // Актуальные проблемы ветеринарии в промышленном животноводстве. Сборник научных трудов. ВИЭВ. - М.: - 1984. - Т.60. - С. 58-63; Kann, О. Frequency and antibiotic susceptibility of Pasteurella multocida and Mannheimia haemolytica isolates from nasal cavities of cattle. / O. Kann, S. Kahya, K. Tayfun // Turk. J. Vet. Anim. Sci. - 2010. - 34(1). - P. 91-94; Biberstein, E.L. Serological types of Pasteurella haemolytica. / E.L. Biberstein, M. Gills, H. Knight // Cornell Vet. - 1960. - P. 283-300].
Манхеймиоз - это пастереллез-подобная инфекционная болезнь, преимущественно животных жвачных видов, вызванная возбудителем Mannheimia haemolytica, сопровождающаяся сепсисом, обширным поражением респираторной системы у крупного и мелкого рогатого скота [Jaramillo, А.С. Mannheimiosis bovina: etiologia, prevencion у control. / AC. Jaramillo, T.F. Trigo, F.  // Vet. Мех. - 2009. - 40. - P. 293-314]. Манхеймиоз проявляется как оппортунистическая инфекция с неспецифичной клинико-морфологической картиной и сложной лабораторной диагностикой.
При изучении эпизоотического состояния неблагополучных сельскохозяйственных предприятий по респираторных заболеваниям в различных регионах РФ, была установлена важная этиологическая роль Mannheimia haemolytica, которая в структуре пастереллезной патологии составляет 9,5% (по состоянию на 2018 год). Установлено, что к манхеймиозу наиболее восприимчивы телята в возрасте до 6 месяцев, ягнята до 3 месяцев. Взрослые животные также подвержены заболеванию, но болезнь обычно не приводит к их гибели, а переходит в хроническую форму, при которой животные остаются бактерионосителями. Основными клиническими проявлениями болезни являются: лихорадка, сухой кашель, постепенно переходящий во влажный, обильные слизистые и серозно-слизистые выделения из носовых ходов, иногда признаки катарального энтерита, кератоконъюнктивита у ягнят. При проведении патологоанатомического вскрытия у молодняка установлены превалирующие признаки: лобулярная фибринозная бронхопневмония или крупозная пневмония; интерстициальный отек легких; серозно-фибринозный плеврит, серозно-фибринозный перикардит, бронхиальный лимфаденит, застойная гиперемия сосудов трахеи с множественными кровоизлияниями. У взрослых животных отмечается воспаление надвымянных и бронхиальных лимфоузлов. Для лактирующих животных свойственным признаком является снижение молочности [Лаишевцев, А.И. Клинико-эпизоотологическое обоснование вакцинопрофилактики и разработка вакцины против манхеймиоза крупного и мелкого рогатого скота, Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук / Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко РАН. Москва, 2018, 155 стр]. У овец и коз встречается маститная форма манхеймиоза. При этом патологический процесс чаще всего охватывает одну долю молочной железы, в продолжение чего возникают некротические процессы, что вызывает ряд общих системных поражений - лихорадка, анорексия, угнетение, снижение аппетита, адинамия. Форма заболевания, при которой поражаются молочная железа, имеет синонимичное название - «синее вымя» [Лаишевцев, А.И. Манхеймиоз рогатого скота ("синее вымя") / А.И. Лаишевцев // Ветеринария и кормление. 2019. №6. С. 32-34].
В соответствии с актуальной таксономией род Mannheimia имеет пять видов: М. haemolytica, М. glucosida, М. granulomatis, М. raminalis и М. varigena. Разделение М. haemolytica на биотипы основано на ферментации Сахаров: биотип А способен ферментировать арабинозу, а Т - трегалозу [Smith, G.R., The characteristics of two types of Pasteurella haemolytica associated with different pathological conditions of sheep / G.R. Smith // J. Pathol. Bacteriol. 81 (1961) 431 440]. В последующем биовар T был классифицирован как Pasteurella trehalosi, а еще позднее получил название Bibersteinia trehalosi. В настоящее время вид Mannheimia haemolytica включает 12 серотипов А (А1, А2, А5, А6, А7, А8, А9, А12, А13, А14, А16 и А17), серотип Mannheimia haemolytica A11 считается видом Mannheimia glucosida. Наибольшую распространенность и эпидемиологическую значимость имеют серотипы А1 и А2 [Binham, D.P.; Moore, R. and Richards, A.B. Comparison of DNA: DNA homology and enzymatic activity between Pasteurella haemolytica and related species / D.P. Binham, R. Moore, A.B. Richards // Am. J. Vet. Res. 51: 1161-1166, 1990; Kapustin, A.V. Pasteurellosis of cattle caused by Mannheimia haemolytica / A.V. Kapustin, A.I. Laishevtcev // Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. 2016. №4(52). C. 3-12].
Биберштейниоз - пастереллез подобное заболевание крупного и мелкого рогатого скота, проявляющиеся поражением респираторной системы и сепсисом [Bowersock, TL. Efficacy of a multivalent modified-live virus vaccine containing a Mannheimia haemolytica toxoid in calves challenge exposed with Bibersteinia trehalosi / T.L. Bowersock, B.E. Sobecki, S.J. Terrill, N.C. Martinon, T.R. Meinert, R.D. Leyh // Am J Vet Res 2014 №75 P. 770-776].
Известно, что возбудитель заболевания относится к представителям микрофлоры конъюнктивы, носоглотки и миндалин клинически здоровых животных, но при этом способен вовлекаться в патологический процесс как вторичный агент. Существует две основные формы проявления биберштейниоза, а именно септическая и респираторная. Септическая форма инфекции сопровождается высокой смертностью среди молодняка доходящей от 3 до 70%, в зависимости от эффективности используемых лечебно-профилактических мер. Основные клинические признаки заключаются в повышении температуры, снижение активности, появлении пенистых выделений из рта и носовых ходов, одышку. Смерть наступает в течении 6-8 часов. При вскрытии павших животных отмечают кровоизлияния на плевре, эпикарде, эндокарде, сердечных клапанах, висцеральной брюшине, брыжеечных лимфатических узлах, селезенке. В плевральной и брюшной полости наблюдается большое количестве прозрачного экссудата с кровяным оттенком. Известны случаи развития фибринозного перикардита, очагового геморрагического некроза печени [Szeredi, L. Immunohistochemical detection of Bibersteinia (Pasteurella) trehalosi in a lamb died of acute systemic infection Bibersteinia (Pasteurella) trehalosi kimutatasa immunhisztokemiai modszerrel heveny, szisztemas fertoozes kovetkezteben elhullott baranybol / L. Szeredi, T. Csabai, L. Makrai, S. Janosi // Magyar Allatorvosok Lapja 2008, 130(11) P. 658-662]. Респираторная форма биберштейниоза проявляется пролиферативной и экссудативной пневмонией у животных всех возрастных групп. У крупного рогатого скота может встречаться гнойная эмфизематозная пневмония с фибринозным плевритом, увеличение бронхиальных лимфатических узлов, некротический ларингит. Клинические признаки данной формы включают кашель и одышку усиливающиеся при физической нагрузке. Слизисто-гнойные выделения из носовых ходов. У взрослых животных заболевание проявляется внезапным развитием гипертермии, токсемии и тахипноэ, что свидетельствует о развитии эндотоксемии [Gilmour, N.J.L. Clinical and pathological findings in an outbreak of pneumonia in sheep / N.J.L. Gilmour, J.G.F. Brotherston // Journal of Comparative Pathology and Therapeutics 1963, 73(3) P. 329-333; Stamp, J.T. Pneumonia of sheep / J.T. Stamp, D.I. Nisbet // Journal of Comparative Pathology and Therapeutics 1963, 73(3) P.319; Collins, R.L. Bibersteinia trehalosi in cattle - another component of the bovine respiratory disease complex? / R.L. Collins // Cattle Practice 2011, 19(1). P.9-12]. Серотиповой состав Bibersteinia trehalosi представлен 4 серотипами - Т3, T4, Т10, Т15.
Пастереллез контагиозная болезнь большинства видов животных и птиц, вызываемая бактериями рода Pasteurella. При остром течении заболевания развиваются септические процессы, крупозное воспаление легких, плевриты и отеки различной локализации. Подострое и хроническое течение болезни характеризуется гнойно-некротизирующими пневмониями, поражениями суставов, молочных желез, органов зрения и геморрагическим энтеритом. К пастереллезу подвержены все возрастные и физиологические группы животных, но наибольшая смертность наблюдается среди молодняка [Kapustin, A.V. Pasteurellosis of cattle caused by Mannheimia haemolytica / A.V. Kapustin, A.I. Laishevtcev // Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. 2016. №4(52). C. 3-12].
Типичным представителем рода является вид Pasteurella multocida, имеющий обширную зону распространения и высокую эпизоотическую значимость. Вид подразделяется на три подвида: P. multocida subspecies gallicida, P. multocida subspecies multocida, P. multocida subspecies septica [Laishevtcev, A.I. Specific identification of Pasteurella bacteria on the basis of biochemical properties in accordance with modern classification // A.I. Laishevtcev, A.V. Kapustin, N.V. Pimenov // Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. 2017. №1(61). C. 320-328]. Согласно «Руководства по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных» МЭБ существует три отдельных нозологических единицы, вызываемых возбудителем вида Pasteurella multocida: геморрагическая септицемия крупного рогатого скота, атрофический ринит свиней и холера птиц. Остальные виды рода Pasteurella spp.имеют меньшую эпизоотическую значимость [Капустин, А.В. Диагностика пастереллеза сельскохозяйственных животных, птиц и пушных зверей / А.В. Капустин, А.И. Лаишевцев, И.Ю. Ездакова, В.Н. Скворцов., Т.В. Степанова, М.И. Гулюкин // Москва, 2016.].
Для пастереллеза рогатого скота типичны 4 типа течения заболевания - сверхострое, острое, подострое и хроническое. К формам пастереллеза относятся: септическая, отечная, грудная и кишечная. Основными клиническими проявлениями болезни являются: повышение температуры тела до 40-42°С; нарушение сердечной деятельности; развитие отека легких и острого гастроэнтерита; отказ от корма и вялость; отеки в различных тканях организма; фибринозная, гнойно-фибринозная, серозно-катаральная или крупозная пневмония или плевропневмония; обильные пенистые или слизисто-гнойные выделения из носовых ходов; кератиты, риниты, конъюнктивиты; диарея и истощение организма; поражение суставов.
Основными патологоанатомическими изменениями при пастереллезе рогатого скота являются: кровоизлияния на серозных и слизистых оболочках паренхиматозных органов и грудной полости; слизистые оболочки носовой полости имеют сильно кровенаполненные сосуды; в подкожной клетчатке и межмышечных тканях обнаруживаются воспалительные отеки совместно со студенистой инфильтрацией; легкие отечны или с фибринозным воспалением; некротизированные инкапсулированные очаги в легких; трахея и бронхи содержат пенистую жидкость; надгортанник, трахея и катаральная плевра гиперемированы с точечными кровоизлияниями; в лимфатических узлах головы, шеи и грудной полости отмечаются признаки серозного, геморрагического или серозно-гнойного воспаления, характеризующееся уменьшением количества лимфоцитов; селезенка имеет дряблую консистенцию; признаки зернистой дистрофии в печени, почках и миокарде; паренхиматозная ткань печени, легких, селезенки и почек содержит кровоизлияния и некротические очаги; катаральное или геморрагическое воспаление сычуга и тонкого кишечника; воспаление селезенки, при котором увеличивается содержание полинуклеаров и эозинофилов в красной пульпе; краевые и центральные синусы лимфатических узлов расщеплены и содержат серозный выпот с лейкоцитами [Капустин, А.В. Диагностика пастереллеза сельскохозяйственных животных, птиц и пушных зверей / А.В. Капустин, А.И. Лаишевцев, И.Ю. Ездакова, В.Н. Скворцов., Т.В. Степанова, М.И. Гулюкин // Москва, 2016.].
В Российской Федерации наиболее распространены три типа пастерелл: А, В и D.
Тип А чаще всего вызывает пастереллезную инфекцию птиц, кроликов и пушных зверей, а также способствует развитию подострого или хронического течения энзоотической пневмонии у телят и поросят; тип В вызывает геморрагическую септицемию крупного рогатого скота и диких жвачных животных; тип D - пастереллез свиней.
Изоляты P. multocida типов E и F на территории РФ не распространены, при этом являются возбудителями геморрагической септицемии крупного рогатого скота и диких жвачных животных в ряде зарубежных стран.
Подробная этиологическая значимость серотипов пастерелл по классификации Картера-Хедлестоуна приведена в таблице №1.
Уровень техники
Специфическая профилактика инфекционных болезней сельскохозяйственных животных является наиболее эффективным средством предотвращения случаев массового заболевания и гибели животных.
В настоящее время в Российской Федерации зарегистрированы следующие ветеринарные препараты для профилактики пастереллеза и манхеймиоза крупного и мелкого рогатого скота (компонент Bibersteinia trehalosi в зарегистрированных и коммерчески реализуемых вакцинах отсутствует):
Препараты для крупного рогатого скота:
- Вакцина против пастереллеза крупного рогатого скота инактивированная эмульгированная (Пастервакарм) производства ФКП "Армавирская биофабрика". Препарат предназначен для специфической профилактики пастереллеза крупного рогатого скота в неблагополучных и угрожаемых по респираторной патологии скотоводческих хозяйствах. Вакцина включает в себя штаммы Pasteurella multocida серотипа А и Mannheimia (Pasteurella) haemolytica серогруппы А1, инактивированные формалином до концентрации формальдегидом (0,3%) и заключенные в водно-масляную эмульсию.
- Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной болезни, вирусной диареи и пастереллеза крупного рогатого скота (КОМБОВАК-Р) - производства - ООО "Ветбиохим". Препарат предназначен для иммунизации стельных коров и телят. Вакцина включает в себя антигены инактивированные формалином 4 производственных штаммов вирусов: инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вируса диареи, респираторно-синцитиальный и вирусной диареи крупного рогатого скота, а также антигены штаммов пастерелл Pasteurella multocida серогрупп А, В, Д, и Mannheimia haemolytica серотипа А1 с гидроокисью алюминия в качестве адъюванта.
- Вакцина против пастереллеза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная производства ФГБУ "ВНИИЗЖ". Препарат предназначен для профилактики пастереллеза у крупного рогатого скота в неблагополучных и угрожаемых по данному заболеванию хозяйствах. Вакцина включает в себя инактивированные формальдегидом бактериальные клетки Mannheimia haemolytica серотипа А:1, штамм №1412, Pasteurella multocida серогруппы А, штамм №1414 и анатоксина Mannheimia haemolytica, штамм №1412 с добавлением масляного адъюванта - Montanide ISA 70 (70%) и фосфатно-буферного раствора (до 30%).
- Вакцина против пастереллеза крупного рогатого скота и буйволов инактивированная (Бовирет) - производства ФКП "Ставропольская биофабрика". Препарат предназначен для профилактики пастереллеза крупного рогатого скота и буйволов. Вакцина включает в себя антигены штаммов Pasteurella multocida серогруппы В инактивированные формалином, сорбированные на геле гидрата окиси алюминия на основе фосфатного буфера.
- Вакцина для профилактики клостридиозов и пастереллеза крупного рогатого скота инактивированная (ВанШотУльтра 8) - производства "Zoetis Inc.". Препарат предназначен для профилактики клостридиозов и пастереллеза крупного рогатого скота. Вакцина включает в себя культуру бактерий Mannheimia (Pasteurella) haemolytica серотип А1, инактивированная формалином; культуры бактерий Clostridium chauvoei, Cl. septicum, Cl. haemolyticum, Cl. novyi, Cl. sordellii, Cl. perfringens тип С и D, инактивированные формалином с добавлением сапонина, сульфата калия, алюминия и воды для инъекций.
- Вакцина против парагриппа-3, респираторно-синцитиальной инфекции и пастереллеза крупного рогатого скота, инактивированная (Бовилис Бовипаст RSP) - производства "Intervet International B.V.". Препарат предназначен для профилактики парагриппа-3, респираторно-синцитиальной инфекции и пастереллеза крупного рогатого скота в угрожаемых и стационарно неблагополучных хозяйствах. Вакцина включает в себя культуральную жидкости перевиваемой линии клеток MDBK, инфицированных вирусами парагриппа-3 и респираторно-синцитиальным, и антигены бактерий Pasteurella haemolytica серотипы А1 и А6, инактивированных формальдегидом, с добавлением адъювантов (гидроксид алюминия 37,5 мг, сапонин - 0,625 мг), стабилизатора (натрия тимерфонат - 0,05 мг), пеногасителя (байсилон EBZ - 0,0625 мг), фосфатно-буферного раствора до 5 мл.
Препараты для крупного рогатого скота и овец:
- Вакцина против пастереллеза жвачных животных инактивированная эмульгированная (Пульмовак) - производства ФКП "Ставропольская биофабрика". Препарат предназначен для специфической профилактики пастереллезов овец и крупного рогатого скота в угрожаемых и неблагополучных по пастереллезу хозяйствах. Вакцина включает в себя инактивированные микробные клетки Pasteurella multocida серогруппы А, В, D и Mannheimia (Pasteurella) haemolytica серотипа А1, с добавлением в качестве консерванта формальдегида (0,3%) и масляного адъюванта Монтанид ISA 70 (SEPPIC) в соотношении 51:49.
- Вакцина эмульгированная против пастереллеза крупного рогатого скота, буйволов и овец производства ООО "АГРОВЕТ". Препарат предназначен для иммунизации крупного рогатого скота, буйволов и овец. Вакцина включает в себя инактивированные формалином концентрированную культуру Pasteurella multocida и водно-масляную эмульсию, эмульгатор.
Препараты для овец:
- Вакцина против пастереллеза овец и свиней инактивированная (Пастос) - производства ФКП "Ставропольская биофабрика". Препарат предназначен для профилактики свиней и овец против пастереллеза. Вакцина включает в себя антигены штаммов Pasteurella multocida серогруппы В, инактивированных формалином и преципитированные алюмокалиевыми квасцами.
Препараты для крупного рогатого скота, овец и коз:
- Формолвакцина против пастереллеза жвачных гидроокисьалюминиевая - производства - ФКП "Армавирская биофабрика". Препарат предназначен для специфической профилактики пастереллеза крупного и мелкого рогатого скота, а также северных оленей. Вакцина включает в себя антигены штаммов Pasteurella multocida серогрупп А, В, D, инактивированные формалином с добавлением адъюванта гидрата окиси алюминия.
Приведенные препараты широко применяются в скотоводческой и овцеводческой отрасли, но тем не менее имеют ряд недостатков, в частности:
- не все препараты одновременно предназначены для вакцинации крупного рогатого скота, овец и коз, т.е. имеет ограничения по применению;
- не все препараты содержат в своем составе комбинацию компонентов Pasteurella multocida и Mannheimia haemolytica;
- ни один из препаратов не содержит в составе компонент Mannheimia haemolytica серотипа А2;
- ни один из препаратов не содержит в составе антигены Bibersteinia trehalosi.
Помимо зарегистрированных на территории РФ коммерческих препаратов известны следующие разработки:
Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной болезни, вирусной диареи и пастереллеза крупного рогатого скота [патент RU 2403061 С1 опубл. 2010.11.10]. Недостатком приведенного изобретения является ограниченный антигенный состав в отношении возбудителей пастереллезной этиологии и узкое видовое предназначение препарата. Так, приведенный в изобретении, антигенный состав ориентирован исключительно на крупный рогатый скот, но не на овец и коз. Кроме того, препарат не содержит в своем составе антигенов Mannheimia haemolytica серотипа А2 и Bibersteinia trehalosi. Ввиду того, что этиологическая роль возбудителей инфекционных патологий животных меняется, то вновь предлагаемая вакцина больше соответствует эпизоотической ситуации в РФ.
- Вакцина против пастереллеза животных [патент RU 2311199 С1 опубл. 2006.07.06]; а также - Вакцина против пастереллеза животных [патент RU 2414929 С1 опубл. 2011.03.27]. Недостатком данных изобретений, по отношению к вновь предлагаемому является необоснованный антигенный состав препарата для рогатого скота. Сведений об широком распространение Pasteurella multocida типов А и D в скотоводстве, овцеводстве и козоводстве нет. Типы А и D более свойственны для птицеводства и свиноводства. В это же время рассматриваемая вакцина не содержит антигены Mannheimia haemolytica и Bibersteinia trehalosi, что может негативно влиять на эпизоотическую ситуацию.
- Перекрестная защита крупного рогатого скота от инфекции, вызванной Bibersteinia trehalosi, поливалентной вакциной (Cross-protection of bovines against b. trehalosi infection by a multi-valent vaccine) [патент CA 2907098 A1 опубл. 25.09.2014]. Недостатком препарата является возможность узкого видового применения препарата, так как средство не предназначено для вакцинации мелкого рогатого скота. Кроме того, рассматриваемое изобретение ориентировано на разработку иммунобиологического средства против манхеймиоза и биберштейниоза, но не пастереллеза, вызванного Pasteurella multocida, что говорит об ограниченном антигенном составе препарата. Поскольку на территории РФ, одновременно циркулируют Bibersteinia trehalosi, Mannheimia haemolytica и Pasteurella multocida, рассматриваемый препарата ограничен по антигенному составу и не соответствует современным эпизоотическим данным.
- Двухвалентная инактивированная вакцина против болезней, вызванных Pasteurella multocida и Mannheimia haemolytica, и способ ее получения (Ox pasteurella multocida disease, Mannheimia haemolytica disease bivalent inactivated vaccine and preparation method thereof) [патент CN 109847060 A опубл. 07.06.2019]. Отличием рассматриваемого изобретения стоит считать тот факт, что в Китае превалирующим серотипом Mannheimia haemolytica является А6, тогда как на территории РФ преимущественно циркулируют серотипы А1 и А2. Таким образом, предложенный антигенный состав вакцины не способен полностью обеспечить протективную защиту от пастереллезов в нашей стране. Вторым недостатком рассматриваемого препарата является его ограниченное видовое предназначение, так средство не ориентировано на мелкий рогатый скот.
Помимо вакцин известны следующие способы их получения:
- Способ приготовления противопастереллезной вакцины [авторское свидетельство SU 1839092 А1 опубл. 1993.12.20]. Суть данного изобретения сводится к повышению иммуногенности препаратов, снижения их вязкости и реактогенности. Поставленная задача решается за счет использования определенного соотношения масляной основы -полиэтилсилоксановая жидкость, и эмульгатора, во время компоновки серии препарата. Недостатком предложенного способа стоит считать последовательность его реализации, так согласно изобретению, концентрация водородных ионов определяется непосредственно после окончания культивирования пастерелл, а не контролируется во время его проведения. В случае поддержания определенного значения уровня рН во время культивирования, удается получить большую концентрацию бактериальных клеток, чем в неконтролируемых условиях. Следующим недостатком приведенного способа стоит считать то, что инактивация проводиться после концентрирования антигенов, а не до. Концентрирование не инактивированной культуральной жидкости имеет свои риски, в частности - контаминация оборудования, риски инфицирования человека, риски попадания не инактивированных клеток пастерелл и ее токсинов в канализацию, риски контаминации антигенного сырья, и т.д.
- Способ изготовления вакцины против пастереллеза сельскохозяйственных животных и птиц [патент RU 2129015 С1 опубл. 1999.04.20]. Недостатком данного способа является большой расход питательных сред при проведении непрерывно-проточного культивирования пастерелл. Помимо этого, в данной разработке отсутствует этап концентрирования пастереллезных антигенов, необходимый для получения инактивированных вакцин, в следствии чего в препарат с необходимыми бактериальными антигенами попадают белки самой питательной среды. В случае перорального или аэрозольного использования живых пастереллезных вакцин, наличие в них балластных остатков питательных сред, чаще всего не способствует каким-либо реактогенным реакциям. В случае же инъекционного использования данных препаратов, содержащих остатки питательных веществ, это может сказаться как на безвредности, так и на уровне антигенного ответа, поскольку вещества, входящие в состав питательных сред - белки, на которые будут образовываться антитела.
- Способ изготовления вакцин против пастереллеза животных и птиц [патент RU 2129440 С1 опубл. 1999.04.27]. Данный способ ориентирован на использование сухого белкового гидролизата из отходов мясного производства, с целью замены полноценного пищевого мясного сырья. Недостатком такого способа стоит считать то, что для культивирования штаммов пастерелл рекомендуется конкретная среда, в то время как существует ряд питательных сред, обладающих лучшими ростообеспечивающими свойствами, например, сердечно-мозговой бульон, триптон-соевый бульон, эугоник бульон и т.д. Кроме того, питательную среду, изготовленную из отходов мясного производства, сложнее стандартизировать, чем изготовленную из стандартного сырья.
- Способ изготовления формол-квасцовой вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота, овец и свиней [авторское свидетельство SU 94044 А1 опубл. 1952.01.01]. Недостатком приведенного способа является, то, что он не может быть реализован в современных условиях промышленного производства биопрепаратов, в соответствии с требованиями надлежащих производственных практик, GMP (англ. Goodmanufacturing practice). В соответствии с требованиями GMP состав препарата не может меняться от серии к серии, ввиду чего использование 7-8 культур пастерелл для производства формол-квасцовой вакцины является недопустимым, так как рецептура должна быть точной. Кроме того, недостатком приведенного препарата является ограниченная продолжительность иммунитета - 5-6 месяцев.
- Глубинный способ изготовления вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота, овец и свиней в танкере [авторское свидетельство SU 127365 А1 опубл. 1960.10.10]. Недостатком данного изобретения является его несоответствие требованиям GMP. Так стандартизовать производство биопрепаратов, антигены которых были получены при совместном культивировании нельзя.
- Способ получения вакцины против пастереллеза животных [патент RU 2405567 С1 опубл. 2010.12.10]; а также Способ получения вакцины против пастереллеза животных [патент RU 2310473 С1 опубл. 2007.11.20]. Недостатком предложенных композиций и способов их получения является излишний антигенный состав, для разных видов животных. Как уже было обозначено ранее, рогатый скот подвержен инфицированию пастереллами типа В, в меньшей степени типа А, ввиду чего использование антигенов других типов пастерелл является необоснованным и удорожает стоимость вакцины. В свою очередь применение препарата, изготовленного предложенным способом для свиней, также не является обоснованным, ввиду того что нет доказательной базы подверженности свиней Mannheimia haemolytica. Кроме того, наличие в препарате излишнего количества антигенов могут неблагоприятно влиять на уровень иммунитета.
Способ изготовления ассоциированной концентрат-вакцины против эмфизематозного карбункула, злокачественного отека и пастереллеза крупного рогатого скота [авторское свидетельство SU 122251 А1 опубл. 1959.01.01]. Недостатком приведенного способа стоит считать узкую видовую предназначенность вакцины, так как средство предназначено исключительно для КРС. Кроме того, к недостатку можно отнести отсутствие в технологии аспектов касающихся производства антигенов Mannheimia haemolytica и Bibersteinia trehalosi.
3
Согласно вышеприведенным характеристикам, на существующие и/или ранее используемые на территории РФ вакцины: Формолвакцина против пастереллеза жвачных гидроокисьалюминиевая [ссылка в сети «Интернет» http://www.armbio.info/catalog/item36.html], является наиболее близким аналогом (прототипом), предлагаемой вакцине. В качестве основных действующих компонентов вакцина содержит антигены штаммов Pasteurella multocida 796 (серогруппа В), Pasteurella multocida 1231 (серогруппа А) и Pasteurella multocida Т-80 (серогруппа Д) инактивированные формалином (в концентрации до 0,3%), с добавлением адъюванта - 6% гидрата окиси алюминия в количестве 25% к объему вакцины. В 1 см вакцины содержится не менее 5 млрд, микробных клеток пастерелл каждого штамма. Вакцина вызывает формирование иммунного ответа у привитых животных к возбудителям пастереллеза через 14 суток после двукратного введения вакцины, который сохраняется 12 месяцев, при последующей ревакцинации через 6 месяцев после второй иммунизации. Вакцина предназначена для специфической профилактики пастереллеза крупного и мелкого рогатого скота, а также северных оленей в хозяйствах угрожаемых и неблагополучных по пастереллезу. Тем не менее, приведенный препарат имеет существенные недостатки, в частности, он не содержит в своем составе антигены, необходимые для профилактики манхеймиоза и биберштейниоза. Ограниченный антигенный состав препарата снижает протективную эффективность средства, так как пастереллез, вызванный Pasteurella multocida различных типов может протекать в ассоциированном виде с Mannheimia haemolytica и Bibersteinia trehalosi [Лаишевцев, А.И. Клинико-эпизоотологическое обоснование вакцинопрофилактики и разработка вакцины против манхеймиоза крупного и мелкого рогатого скота / А.И. Лаишевцев // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук / Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко РАН. Москва, 2018].
3
Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемому способу получения вакцины против манхеймиоза, биберштейниоза и пастереллеза крупного и мелкого рогатого скота ассоциированная инактивированная является способ получения вакцины против пастереллеза животных [патент RU 2405567 С1 опубл. 2010.12.10]. Сущность прототипа подразумевает индивидуальное глубинное культивирование штаммов Pasteurella multocida тип А, В, D и Mannheimia haemolytica. Культивирование проводится путем внесения в реактор 10% матровой бактериальной культуры, с последующим выращиванием при температуре 37°С, до достижения максимального накопления растворимых поверхностных антигенов. Последующим этапом получения вакцины является инактивация культуральной жидкости добавлением 0,3% формалина (содержащего не менее 37% формальдегида) в течении 24 часов при температуре 37±1°С. После инактивации бактериальную массу каждого штамма смешивают в равных соотношениях, центрифугируют при 6-8 тыс. об/мин. Полученный после центрифугирования осадок ресуспендируют в 0,1-0,2 М фосфатном буфере с рН 7,2-7,4 доводя концентрацию до 40-100 млрд. мк. кл. см. В последующем полученную бактериальную массу прогревают в течении 30-60 минут при 56-60°С, а затем центрифугируют при 10-15 тыс. об/мин для отделения супернатанта. Полученный супернатант в последующем концентрируется в 3-5 раз, после чего определяют активность поверхностных растворимых антигенов в РПГА. При достижении активности поверхностных растворимых антигенов Pasteurella multocida серологических вариантов А, В, D и Pasteurella haemolytica соответственно 1:2048-4096, 1:4096-5120, 1:2048-8192 и 1:16-64 получают вакцину.
Способ приготовления вакцины, являющийся прототипом препарата, не раскрывает схему производства антигенов Bibersteinia trehalosi. Кроме того, принцип концентрирования антигена после смешивания культуральной жидкости, осложняет процесс контроля и стандартизации готовой вакцины. Так, целесообразнее проводить концентрирование культуральной жидкости каждого штамма по отдельности, т.е. не проводить их смешивание, так как при культивировании, различных штаммов активность поверхностного растворимого антигена (ПРА) на практике существенно отличается. Кроме того, обозначенный диапазон возможной концентрации ПРА не соответствует требованиям надлежащих производственных практик GMP, которые направлены на производство стандартизированной продукции, т.е. содержащей в своем составе антигены и добавки в определенных концентрациях и соотношениях. Следующим существенным отличием прототипа от предлагаемого изобретения является то, что в качестве антигена используется цельноклеточный протективный антиген, а не поверхностный растворимый антиген.
Таким образом, предлагаемое изобретение в полной мере реализуется в рамках следующих положений «Стратегии предупреждения распространения антимикробной резистентности в Российской Федерации на период до 2030 года», утвержденной распоряжением Правительства РФ от 25.09.17 г. No 2045-р, Стратегии национальной безопасности Российской Федерации, утв. Указом Президента РФ от 31.12.15 г. No 683 "О Стратегии национальной безопасности Российской Федерации", и Основ государственной политики в области обеспечения химической и биологической безопасности Российской Федерации на период до 2025 года и дальнейшую перспективу, утв. Президентом РФ от 01.11.13 г. № Пр-2573, а также положений Политической декларации заседания высокого уровня Генеральной Ассамблеи по проблеме устойчивости к противомикробным препаратам, принятой на 71-ой сессии Генеральной Ассамблеи ООН (резолюция A/RES/71/3 от 05.10.16 г.), и Глобального плана действий по борьбе с устойчивостью к противомикробным препаратам, принятого на 68-ой сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения (резолюция WHA68.7 от 26.05.15 г.), определяющих комплексный и межсекторальный подход для отраслей, где используются противомикробные препараты (здравоохранение, сельское хозяйство, в том числе растениеводство, животноводство, разведение аквакультуры, а также производство пищевой продукции и очистка воды).
Технической проблемой, на решение которой направлена данная группа изобретений, является необходимость создания безопасной вакцины против манхеймиоза, биберштейниоза и пастереллеза крупного и мелкого рогатого скота, на основе сбалансированного антигенного состава, содержащего наиболее распространенные на территории РФ серотипы бактерий видов Mannheimia haemolytica, Bibersteinia trehalosi, Pasteurella multocida и необходимость в расширении арсенала поливалентных инактивированных вакцин, направленных на специфическую профилактику инфекционных болезней крупного рогатого скота, овец и коз.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом предлагаемой группы изобретений является повышение стабильности, безопасности, антигенной и иммуногенной активности вакцины, обеспечивающих продолжительный и напряженный иммунитет у вакцинированных животных (крупного рогатого скота, овец и коз) против манхеймиоза, биберштейниоза и пастереллеза, расширении арсенала поливалентных инактивированных вакцин, направленных на специфическую профилактику инфекционных болезней сельскохозяйственных животных, создание вакцины с повышенной стабильностью, антигенной и иммуногенной активностью, расширении подходов и способов изготовления поливалентных инактивированных вакцин направленных на специфическую профилактику инфекционных болезней сельскохозяйственных животных.
Вакцина против манхеймиоза, биберштейниоза и пастереллеза крупного и мелкого рогатого скота ассоциированная инактивированная
3
3
3
Заявляемая поливалентная вакцина против манхеймиоза, биберштейниоза и пастереллеза крупного и мелкого рогатого скота содержит в своем составе следующие компоненты из расчета на 1 см препарата: инактивированный формалином протективный антиген штамма Mannheimia haemolytica №822-ВИЭВ серотип А1 - 2 млрд. мкр. кл.; Mannheimia haemolytica №1050-ВИЭВ серотип А2 2 млрд. мкр. кл.; Bibersteinia trehalosi №984-ВИЭВ - 2 млрд. мкр. кл.; Pasteurella multocida №1042-ВИЭВ тип А - 2 млрд. мкр. кл.; Pasteurella multocida №163-ВИЭВ тип В - 2 млрд. мкр. кл., а также фармацевтически приемлемые целевые добавки. Иммунизирующая доза, рекомендованная к однократному применению, составляет 3 см для взрослого крупного рогатого скота и 2 см для телят и мелкого рогатого скота.
В качестве фармацевтически приемлемых целевых добавок вакцина, помимо антигенов, содержит:
- Инактивант, необходимый для обеззараживания бактериальных антигенов и их токсинов. В качестве данного средства используется формалин из расчета 0,3% к объему бульонной культуры, содержащий не менее 37% формальдегида;
- Консервант, необходимый для производства многодозовых фасовок препарата. В качестве стандартного консерванта используется водный раствор мертиолята натрия 10%, вводимый в препарат из расчета 1:10000;
- Разбавитель, необходимый для разведения концентрированного бактериального антигена до требуемой концентрации. В качестве стандартных растворителей могут быть использованы стерильный физиологический раствор, стерильный PBS - фосфатно буферный солевой раствор, вода для инъекций;
- Адъювант, необходимый для осаждения бактериальных компонентов в вакцине и для неспецифического усиления иммунного ответа к антигенам. В качестве целевой добавки предлагаемая вакцинная композиция может содержать ГОА (гидроокись алюминия 3% раствор) в объеме 10% от компонуемой серии препарата; масляный адъювант (например, Montanide ISA 50, Montanide ISA 61, Montanide ISA 70) в объеме 50% от компонуемой серии препарата и т.д.; Карбомер 971р 2%-ный раствор в PBS в объеме 10% от компонуемой серии препарата;
Дополнительно, с целью нормализации уровня водородных ионов в препарате, необходимо использование 10% гидроксида натрия (едкого натра). Оптимальным уровнем рН препарата стоит считать 7,0-7,6 для варианта вакцины, выполненной на ГОА и Карбомере 971р. Уровень рН препарата, выполненного на масляном адъюванте, дополнительно не регулируется.
В зависимости от используемого адъюванта, внешний вид вакцины может иметь следующие вариации:
- При использовании ГОА и карбомера 971р - по внешнему виду вакцина представляет собой суспензию светло-серого цвета с серо-белым осадком, легко разбивающимся при взбалтывании в гомогенную взвесь.
- При использовании масляных адъювантов - по внешнему виду вакцина представляет собой эмульсию белого цвета, иногда с желтоватым оттенком. При длительном хранении возможно незначительное расслоение препарата, которое при встряхивании переходит в первоначальное состояние гомогенной эмульсии.
Срок годности вакцины 12 месяцев с даты выпуска, вне зависимости от используемого адъюванта, при соблюдении соответствующих условий хранения при температуре 2-8°С.
Вакцина предназначена для профилактики манхеймиоза, биберштейниоза и пастереллеза крупного и мелкого рогатого скота всех возрастных групп в хозяйствах, неблагополучных по указанным заболеваниям. Вакцина вызывает формирование иммунитета к Mannheimia haemolytica, Bibersteinia trehalosi, Pasteurella multocida через 14 дней после повторного введения, который сохраняется не менее 12 месяцев. Колостральный иммунитет у молодняка, полученного от иммунизированных животных, сохраняется в течении 21 дня.
Входящие в состав вакцины бактериальные штаммы Mannheimia haemolytica №822-ВИЭВ, Mannheimia haemolytica №1050-ВИЭВ, Bibersteinia trehalosi №984-ВИЭВ, Pasteurella multocida №1042-ВИЭВ, Pasteurella multocida №163-ВИЭВ являются новыми производственными культурами и впервые используются в составе вакцинных препаратов для широкого применения. Ранее, на этапе доклинических и клинических испытаний, была подтверждена пригодность данных культур для использования в качестве производственных штаммов микроорганизмов.
Все вновь предложенные штаммы бактерий депонированы во Всероссийской коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ Федеральный научный центр - всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук. Все культуры идентифицированы на базе лаборатории микробиологии с музеем типовых культур ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН и на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, посредством изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств и определением нуклеотидной последовательности гена 16 S rRNA.
Характеристика производственных штаммов Mannheimia haemolytica, Bibersteinia trehalosi, Pasteurella multocida
1) Производственный штамм Mannheimia haemolytica №822-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1300
Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизм ами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактерии Mannheimia haemolytica не относятся ни одной из четырех групп патогенности.
Дата, источник и место выделения: из легких павшего теленка. Скотоводческое предприятие республики Мари-Эл. 2018 год.
Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии с музеем типовых культур ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН и на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.
Методы идентификации: посредством изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств и определением нуклеотидной последовательности гена 16S rRNA.
Морфологические признаки: мелкие грамотрицательные, овоидные палочки, расположенные изолированно, парами и/или цепочками, неподвижные, спор не образуют. В мазках из крови и органов окрашиваются биполярно, иногда с выраженной капсулой. Нити и другие инволюционные формы отсутствуют.
Культуральные особенности: на кровяном агаре колонии гладкие, полупрозрачные, блестящие в диаметре 1-2 мл с проявлением зоны β-гемолиза в размере 1-1,5 мм вокруг всей колонии. На агаре МакКонки рост в виде мелких полупрозрачных колоний. На мясопептонном агаре бактерии демонстрируют скудный рост мелких выпуклых, полупрозрачных колоний размерами 0,5-1 мм, легко снимающихся бактериальной петлей или пастеровской пипеткой. На среде для культивирования гемофилюсов и актинобациллюсов Haemophilus test medium HTM base производства Oxoid, Mannheimia haemolytica демонстрирует обильный рост гладких, прозрачных, блестящих колоний размером 1-1,5 мм. В бульонных средах, т.е. мясопептонном бульоне, триптон-соевом бульоне, бульоне Хоттингера, Эугоник бульоне, а также в сердечно-мозговом бульоне, наблюдается равномерное помутнение среды уже спустя 12 часов культивирования. Рост в полужидком агаре проявлялся только по ходу укола петлей.
Биохимические свойства: штамм Mannheimia haemolytica №822-ВИЭВ ферментирует с образованием кислоты глюкозу, арабинозу, декстрин, фруктозу, галактозу, глицерол, лактозу, мальтозу, маннитол, раффинозу, сорбитол, сахарозу, ксилозу; не ферментирует адонитол, арбутин, целлобиозу, дульцитол, инулин, маннозу, мелицитозу, мелибиозу, рамнозу, салицин, сорбозу, трегалозу. Штамм восстанавливает нитрат. Лизиндекарбоксилаза, орнитиндекарбоксилаза и аргининдекарбоксилаза демонстрируют отрицательный результат.
Серологические свойства: тип А1.
50
8
Вирулентность для лабораторных животных: величина LD - 4,3×10 мкр. кл. для белых мышей, предварительно подвергнувшихся иммуносупрессии дексаметазоном, при внутрибрюшинном заражении.
Условия культивирования: растет на большинстве бульонных питательных сред, используемых в биопроизводстве, в частности: сердечно-мозговом, триптон-соевом бульоне, бульоне Хоттингера и т.д., а также агаризированных средах (МПА, Хоттингера, М-144 (HiMedia) с добавлением 10% стерильной дефибринированной крови барана, при рН-7,2 и температуре 37°С в течении 18-24 часов.
2) Производственный штамм Mannheimia haemolytica №1050-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1301
Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактерии Mannheimia haemolytica не относятся ни одной из четырех групп патогенности.
Дата, источник и место выделения: из легких павшей овцы. Овцеводческое предприятие Курской области. 2018 г.
Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии с музеем типовых культур ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН и на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского.
Методы идентификации: посредством изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств и определением нуклеотидной последовательности гена 16S rRNA.
Морфологические признаки: мелкие грамотрицательные, овоидные палочки, расположенные изолированно, парами и/или цепочками, неподвижные, спор не образуют. В мазках из крови и органов окрашиваются биполярно, иногда с выраженной капсулой. Нити и другие инволюционные формы отсутствуют.
Культуральные особенности: на кровяном агаре колонии гладкие, полупрозрачные, блестящие в диаметре 1-2 мм с проявлением зоны β-гемолиза в размере 1-1,5 мм вокруг всей колонии. На агаре МакКонки рост в виде мелких полупрозрачных колоний. На мясопептонном агаре бактерии демонстрируют скудный рост мелких выпуклых, полупрозрачных колоний размерами 0,5-1 мм, легко снимающихся бактериальной петлей или пастеровской пипеткой. На среде для культивирования гемофилюсов и актинобациллюсов Haemophilus test medium HTM base производства Oxoid, бактерии образуют обильный рост гладких, прозрачных, блестящих колоний размером 1-1,5 мм. В бульонных средах, т.е. мясопептонном бульоне, триптон-соевом бульоне, бульоне Хоттингера, Эугоник бульоне, а также в сердечно-мозговом бульоне, наблюдается равномерное помутнение среды уже спустя 12 часов культивирования. Рост в полужидком агаре проявлялся только по ходу укола петлей.
Биохимические свойства: штамм Mannheimia haemolytica №1050-ВИЭВ ферментирует с образованием кислоты глюкозу, арабинозу, декстрин, фруктозу, галактозу, глицерол, лактозу, мальтозу, маннитол, раффинозу, сорбитол, сахарозу, ксилозу; не ферментирует адонитол, арбутин, целлобиозу, дульцитол, инулин, маннозу, мелицитозу, мелибиозу, рамнозу, салицин, сорбозу, трегалозу. Микроорганизм восстанавливает нитрат. Лизиндекарбоксилаза, орнитиндекарбоксилаза и аргининдекарбоксилаза демонстрируют отрицательный результат.
Серологические свойства: тип А2.
50
9
Вирулентность для лабораторных животных: величина LD - 1,28×10 мкр. кл. для белых мышей, предварительно подвергнувшихся иммуносупрессии дексаметазоном, при внутрибрюшинном заражении.
Условия культивирования: растет на большинстве бульонных питательных сред, используемых в биопроизводстве, в частности: сердечно-мозговом, триптон-соевом бульоне, бульоне Хоттингера и т.д., а также агаризированных средах (МПА, Хоттингера, М-144 (HiMedia) с добавлением 10% стерильной дефибринированной крови барана, при рН-7,2 и температуре 37°С в течении 18-24 часов.
3) Производственный штамм Bibersteinia trehalosi №984-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1302
Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактерии Bibersteinia trehalosi не относятся ни одной из четырех групп патогенности.
Дата, источник и место выделения: из легких павшего козленка. Козоводческое предприятие Тверской области. 2018 год.
Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии с музеем типовых культур ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН и на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского.
Методы идентификации: посредством изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств и определением нуклеотидной последовательности гена 16S rRNA.
Морфологические признаки: мелкие грамотрицательные, овоидные палочки, расположенные изолированно, парами и/или цепочками, неподвижные, спор не образуют. Нити и другие инволюционные формы отсутствуют.
Культуральные особенности: на кровяном агаре колонии гладкие, полупрозрачные, блестящие в диаметре 1-2 мм с проявлением зоны β-гемолиза в размере 1-1,5 мм вокруг всей колонии. На агаре МакКонки рост в виде мелких полупрозрачных колоний. На мясопептонном агаре бактерии демонстрируют скудный рост мелких выпуклых, полупрозрачных колоний размерами 0,5-1 мм, легко снимающихся бактериальной петлей или пастеровской пипеткой. На среде для культивирования гемофилюсов и актинобациллюсов Haemophilus test medium HTM base производства Oxoid, бактерии образуют обильный рост гладких, прозрачных, блестящих колоний размером 1-1,5 мм. В бульонных средах, т.е. мясопептонном бульоне, триптон-соевом бульоне, бульоне Хоттингера, Эугоник бульоне, а также в сердечно-мозговом бульоне наблюдается равномерное помутнение среды уже спустя 12 часов культивирования. Рост в полужидком агаре проявлялся только по ходу укола петлей.
Биохимические свойства: штамм Bibersteinia trehalosi №984-ВИЭВ ферментирует с образованием кислоты глюкозу, маннит, сорбит, маннозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, эскулин и салицин. Не ферментируют арабинозу, ксилозу, дульцитол, галактозу. Микроорганизм восстанавливает нитрат.
Серологические свойства: не определен.
50
8
Вирулентность для лабораторных животных: величина LD - 1,42×10 мкр. кл. для белых мышей, при внутрибрюшинном заражении.
Условия культивирования: растет на большинстве бульонных питательных сред, используемых в биопроизводстве, в частности: сердечно-мозговом, триптон-соевом бульоне, бульоне Хоттингера и т.д., а также агаризированных средах (МПА, Хоттингера, М-144 (HiMedia) с добавлением 10% стерильной дефибринированной крови барана, при рН-7,2 и температуре 37°С в течении 18-24 часов.
4) Производственный штамм Pasteurella multocida №1042-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1303
Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактерии вида Pasteurella multocida относятся к третьей группе опасности.
Дата, источник и место выделения: из легких павшей овцы. Овцеводческое предприятие Курской области. 2018 г.
Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии с музеем типовых культур ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН и на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.
Методы идентификации: посредством изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств и определением нуклеотидной последовательности гена 16S rRNA.
Морфологические признаки: мелкие грамотрицательные, часто овоидные палочки, располагаются изолированно, иногда парами и реже цепочками, неподвижные, спор не образуют. В мазках из крови и органов окрашиваются биполярно, иногда с выраженной капсулой. Нити и другие инволюционные формы отсутствуют.
Культуральные особенности: образуют в бульоне Хоттингера равномерное помутнение среды; на агаре Хоттингера в чашках Петри через 18-24 часа культивирования мелкие, круглые, выпуклые, полупрозрачные, с гладкой поверхностью и ровными краями колонии - «S»-форма. На ПЖА - рост по уколу.
Биохимические свойства: свойственны для Pasteurella multocida. Штамм ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, сахарозу, галактозу, манит, сорбит. Не ферментирует дульцит, арабинозу, мальтозу, раффинозу, лактозу. Оксидазо, - и каталазоположительная культура. Не свертывают молоко и не разжижают желатин. Образуют индол и сероводород.
Серологические свойства: тип А.
50
Вирулентность для лабораторных животных: величина LD - 20 мкр. кл. для белых мышей, при внутрибрюшинном заражении.
Условия культивирования: микроорганизм растет на большинстве бульонных питательных сред, используемых в биопроизводстве, в частности на бульоне Хоттингера, сердечно-мозговом бульоне, триптон соевом бульоне и т.д. МПБ, МПА, бульон и агар Хоттингера с добавлением 5%-10% стерильной дефибринированной крови барана, М-144 (HiMedia) при рН-7,2 с температурой 37°С в течении 18-24 часов.
5) Производственный штамм Pasteurella multocida №163-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1304
Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактерии вида Pasteurella multocida относятся к третьей группе опасности.
Дата, источник и место выделения: из легких павшего теленка. Московская область, 2017 год.
Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии с музеем типовых культур ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН и на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.
Методы идентификации: посредством изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств и определением нуклеотидной последовательности гена 16S rRNA.
Морфологические признаки: мелкие грамотрицательные, часто овоидные палочки, располагаются изолированно, иногда парами и реже цепочками, неподвижные, спор не образуют. В мазках из крови и органов окрашиваются биполярно, иногда с выраженной капсулой. Нити и другие инволюционные формы отсутствуют.
Культуралытые особенности: образуют в бульоне Хоттингера равномерное помутнение среды; на агаре Хоттингера в чашках Петри через 18-24 часа культивирования - мелкие, круглые, выпуклые, полупрозрачные, с гладкой поверхностью и ровными краями колонии - «S»-форма. На ПЖА - рост по уколу.
Биохимические свойства: свойственны для Pasteurella multocida. Штамм ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, сахарозу, галактозу, манит, сорбит. Не ферментирует дульцит, арабинозу, мальтозу, раффинозу, лактозу. Оксидазо, - и каталазоположительная культура. Не свертывают молоко и не разжижают желатин. Образуют индол и сероводород.
Серологические свойства: тип В.
50
Вирулентность для лабораторных животных: величина LD - 10 мкр. кл. для белых мышей, при внутрибрюшинном заражении.
Условия культивирования: микроорганизм растет на большинстве бульонных питательных сред, используемых в биопроизводстве, в частности на бульоне Хоттингера, сердечно-мозговом бульоне, триптон соевом бульоне и т.д. МПБ, МПА, бульон и агар Хоттингера с добавлением 5%-10% стерильной дефибринированной крови барана, М-144 (HiMedia) при рН-7,2 с температурой 37°С в течении 18-24 часов.
Способ получения вакцины против манхеймиоза, биберштейниоза и пастереллеза крупного и мелкого рогатого скота.
Получение заявляемого препарата подразумевает реализацию следующих последовательных этапов:
1) Культивирование производственных штаммов глубинным методом;
2) Инактивацию культуральной жидкости;
3) Концентрирование антигенов;
4) Определение полноты инактивации антигенов;
5) Составление серии вакцины;
6) Контроль стерильности вакцины;
7) Оценка безвредности вакцины;
8) Определение иммуногенной активности вакцины.
Для глубинного культивирования бактерий видов Mannheimia haemolytica, Bibersteinia trehalosi и Pasteurella multocida при производстве вакцины, могут быть использованы триптиказо-соевый бульон, триптон-соевый бульон, эугоник бульон, сердечно-мозговой бульон, бульон Хоттингера, и иные среды, обладающих необходимые ростобеспечивающие свойства.
Последовательность подготовки маточной расплодки штаммов Mannheimia haemolytica, Bibersteinia trehalosi и Pasteurella multocida из MSB (Master Seed Bacteria - главного посевного материала):
- в первый день проводится подготовка первой генерации производственных штаммов путем ресуспендирования лиофилизированной культуры MSB в пробирке с последующим посевом на питательный агар. Подготовка каждого штамма производится по отдельности. Культивирование первой генерации продолжается в течение 18-24 часов в аэробных условиях при температуре 37°С;
- на второй день проводиться контроль первой генерации на типичность культуры по морфологическим, тинкториальным и ростовым свойствам, а также на отсутствие посторонней микрофлоры, как на чашке Петри, так и в пробирке. В случае соответствия первой генерации всем обозначенным свойствам, производится получение второй генерации. Для этого, с чашки Петри, отдельные колонии засеваются в пробирки со свежей питательной средой. Полученные посевы культивируют в течении 18-24 часов в аэробных условиях при температуре 37°С. Для получения максимального накопления бактериальных клеток в бульонной среде, пробирки размещают на шейкере, для постоянного помешивания.
На данном этапе работы, из полученной агаровой культуры производственного штамма бактерий возможно приготовление WSB (Working Seed bacteria - рабочего посевного бактериосодержащего материала). Для этого, с чашек Петри, отбираются отдельные колонии производственного штамма и засеваются в ПЖА (полужидкий агар), с последующим культивированием в течении 18-24 часов в аэробных условиях при температуре 37°С. Затем полученную культуру стерильно расфасовывают по пипеткам и запаивают их для последующего использования. В запаянном виде производственные культуры Mannheimia haemolytica, Bibersteinia trehalosi и Pasteurella multocida сохраняют свои свойства в течении 2-3 недель, после чего повторяется подготовка WSB из MSB. Использование WSB значительно сокращает временные затраты на подготовительный этап производства серийных препаратов;
- на третий день проводиться контроль второй генерации на типичность культуры по морфологическим, тинкториальным и ростовым свойствам, а также на отсутствие посторонней микрофлоры, как на чашке Петри, так и в пробирке. В случае соответствия второй генерации всем обозначенным свойствам, производится получение третьей генерации. Для этого, бульонную культуру из пробирок пересевают во флаконы со свежей питательной средой (не менее 100 мл). Полученные посевы культивируют в течении 18-24 часов в аэробных условиях при температуре 37°С. Для получения максимального накопления бактериальных клеток в бульонной среде, флаконы размещают на шейкере, при 50-150 оборотах в минуту, для постоянного помешивания;
- на четвертый день, после предварительного контроля расплодки, производится пересев всего объема флакона в бутыли с питательной средой, которые в последующем будут использоваться для засева в реакторы. Маточную культуру готовят из расчета 10% к объему питательной среды в реакторе. Культивирование проводят в течении 18-24 часов в аэробных условиях при температуре 37°С.
- на пятый день, производится непосредственное культивирование производственных штаммов в реакторе. Культивирование штаммов Mannheimia haemolytica и Bibersteinia trehalosi производят при значении рН среды 7,2-7,8, a Pasteurella multocida при рН 7,0-7,8, при температурном режиме 37°С. Для достижения максимального накопления бактериальных клеток, в питательную среду дополнительно вносится 5%-дрожжевого экстракта, 3-5% сыворотки крови крупного рогатого скота. При культивировании штаммов Mannheimia haemolytica в среду дополнительно включают гемин и никотинамид-аденин-динуклеотид из расчета 5-10 мг на литр питательной среды.
Для поддержания необходимого уровня питательных веществ в среде проводится добавление 40%-ного раствора глюкозы из расчета 0,5-1 литр глюкозы, на 100 литров питательной среды 1 раз в час, в зависимости от интенсивности роста культуры. Уровень рН во время культивирования поддерживается 10%-ным раствором щелочи (NaOH).
Последовательность подготовки маточной расплодки штаммов Mannheimia haemolytica, Bibersteinia trehalosi и Pasteurella multocida из WSB (Working Seed bacteria - рабочего посевного бактериосодержащего материала):
- в первый день проводится подготовка первой генерации производственных штаммов путем внесения культуры WSB во флаконы с бульонной средой и с последующим высевом на питательный агар. Подготовка каждого штамма производится по отдельности. Культивирование первой генерации продолжается в течение 18-24 часов в аэробных условиях при температуре 37°С. Для получения максимального накопления бактериальных клеток в бульонной среде, флаконы размещают на шейкере, при 50-150 оборотах в минуту, для постоянного помешивания;
- на второй день после предварительного контроля расплодки, производится пересев всего объема флакона в бутыли с питательной средой, которые в последующем будут использоваться для засева в реакторы. Маточную культуру готовят из расчета 10% к объему питательной среды в реакторе. Культивирование проводят в течении 18-24 часов в аэробных условиях при температуре 37°С;
- на третий день, производится непосредственное культивирование производственных штаммов в реакторе. Культивирование штаммов Mannheimia haemolytica и Bibersteinia trehalosi производят при значении рН среды 7,2-7,8, a Pasteurella multocida при рН 7,0-7,8, при температурном режиме 37°С. Для достижения максимального накопления бактериальных клеток, в питательную среду дополнительно вносится 5%-дрожжевого экстракта, 5% сыворотки крови крупного рогатого скота. Для поддержания необходимого уровня питательных веществ в среде проводится добавление 40%-ного раствора глюкозы из расчета 0,5-1 литр глюкозы, на 100 литров питательной среды 1 раз в час, в зависимости от интенсивности роста культуры. Уровень рН во время культивирования поддерживается 10%-ным раствором щелочи (NaOH).
Инактивацию культуральной жидкости, содержащей клетки Mannheimia haemolytica, Bibersteinia trehalosi и Pasteurella multocida, проводят путем добавления формалина (содержащего не менее 37% формальдегида) в объеме 0,3% к объему инактивируемой жидкости, в течении 3 суток, при комнатной температуре и постоянном перемешивании.
Концентрирование культур проводят центрифугированием при 2-10 тыс. об. мин. в течение 0,5-3 часов или сепарированием при 5-15 тысячах оборотах в зависимости от типа используемого оборудования.
3
3
Полноту инактивации оценивают по отсутствию жизнеспособных клеток в концентрированном антигене и скомпонованном препарате путем посева на ростобеспечивающие питательные среды. Кроме того, оценка полноты инактивации проводится по безвредности инактивированной бактериальной массы для белых мышах массой 16-18 гр. Для этого подопытным животным внутрибрюшинно вводится, предварительно разведенных до 6 млрд. мкр. кл. см, антиген в объеме 0,5 см. Для оценки безвредности каждой серии антигена используется по пять подопытных мышей. Наблюдение за опытными животными продолжается в течение 14 суток. Препарат считается инактивированным в случае отсутствия роста культур Mannheimia haemolytica, Bibersteinia trehalosi и Pasteurella multocida и иных микроорганизмов на питательных средах, а также отсутствию каких-либо местных и системных реакций, в том числе гибели, у подопытных животных.
Составление серии вакцины.
Для производства предлагаемой вакцины могут быть использованы различные адъюванты, ввиду этого, этапы составления серии вакцины могут варьировать. Варианты составления серии, приведены ниже. Приведены расчеты производства серии вакцины объемом 300 литров (100 тысяч доз вакцины).
Вариант №1. - компоновка вакцины с использованием гидроокиси алюминия и карбомера 971р.
3
3
В стерильном реакторе проводиться смешивание инактивированных бактериальных антигенов пяти производственных культур (в ранее установленной концентрации) с разбавителем, адъювантом (10%) и мертиолятом натрия, таким образом, чтобы концентрация бактериальных антигенов была равной 10 млрд. мкр. кл./см (по 2 млрд. мкр. кл./см каждого производственного штамма). При постоянном помешивании получают однородную суспензию, устанавливают требуемый уровень водородных ионов (7,0-7,6). Пропись состава вакцины при использовании данного варианта компоновки приведена в таблице №2.
Вариант №2. компоновка вакцины с использованием масляного адъюванта (например, Montanide ISA 50, Montanide ISA 61, Montanide ISA 70).
3
3
В стерильном реакторе проводиться смешивание инактивированных бактериальных антигенов пяти производственных культур в ранее установленной концентрации с разбавителем, адъювантом (50%), и мертиолятом натрия, таким образом чтобы получить концентрацию бактериальных антигенов равной 10 млрд. мкр. кл. см (по 2 млрд. мкр. кл./см антигена каждого производственного штамма). Получение гомогенной эмульсии проводят при помощи диспергирующей машины при 6000-8000 об/мин. Полученная данным образом серия вакцины имеет среднее значение рН - 6,0. Пропись состава вакцины при использовании данного варианта компоновки, приведена в таблице №3.
Контроль стерильности вакцины выполняется в соответствии с ГОСТ 28085-2013 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения».
3
Оценка безвредности вакцины проводится в биопробе на лабораторных белых мышах массой 16-18 гр. при однократном внутримышечном введении препарата, в дозе 0,5 см. Для оценки безвредности каждой серии вакцины используется по пять подопытных животных. Наблюдение за мышами продолжается в течение 14 суток. Вакцину считают безвредной, если все животные остаются живыми в течении срока наблюдения.
Определение иммуногенной активности всех компонентов вакцины проводится на белых мышах. Для контроля иммуногенной активности манхеймиозного компонента вакцины предложены контрольные штаммы Mannheimia haemolytica №1540-ВИЭВ серотип А1 и №1494-ВИЭВ серотип А2 соответственно. Для контроля иммуногенной активности компонента Bibersteinia trehalosi в вакцине предложен контрольный штамм Bibersteinia trehalosi №1586-ВИЭВ. С целью контроля иммуногенной активности пастереллезного компонента вакцины, по типу А, предусмотрено использование хорошо изученного и распространенного штамма Pasteurella multocida №1231 тип А (депонированного во Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГБУ «ВГНКИ»), применяемого при изготовлении пастереллезных вакцин и лечебных сывороток [Вакцина против пастереллеза животных. RU 2414929 С1 опубл. 2011.03.27]. Для контроля пастереллезного компонента вакцины по типу В предложено использование известного штамма Pasteurella multocida №656 тип В (депонированного во Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГБУ «ВГНКИ»), применяемого при изготовлении пастереллезных вакцин и лечебных сывороток [Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной болезни, вирусной диареи и пастереллеза крупного рогатого скота. RU 2403061 С1 опубл. 2010.11.10].
Для реализации поставленной цели формируется десять групп по 10 мышей в каждой, массой 18-20 гр. Пять групп являются опытными (на каждый заражающий штамм), и пять контрольных групп (на каждый заражающий штамм). Например: опытная группа №1 и контрольная группа №1 предназначены для контроля манхеймиозного компонента по серотипу А1 и подвергаются заражению штаммом Mannheimia haemolytica №1540-ВИЭВ серотип А1; опытная группа №2 и контрольная группа №2 предназначены для контроля манхеймиозного компонента по серотипу А2 и подвергаются заражению штаммом Mannheimia haemolytica №1494-ВИЭВ серотип А2; опытная группа №3 и контрольная группа №3 предназначены для контроля активности компонента Bibersteinia trehalosi и подвергаются заражению штаммом Bibersteinia trehalosi №1586-ВИЭВ; опытная группа №4 и контрольная группа №4 предназначены для контроля активности пастереллезного компонента по типу А и подвергаются заражению штаммом Pasteurella multocida №1231; опытная группа №5 и контрольная группа №5 предназначены для контроля активности пастереллезного компонента по типу В и подвергаются заражению штаммом Pasteurella multocida №656 (принцип формирования групп может отличаться от приведенной).
3
50
50
Оценку иммуногенной активности манхеймиозного компонента проводят, методом предварительной иммуносупрессии дексаметазоном, остальные компоненты контролируются методом прямого заражения. Так, при оценке иммуногенной активности манхеймиозного компонента препарата, мышей опытных и контрольных групп №1 и №2, предварительно вакцинируют, двукратно с интервалом 14-16 дней, в дозе 1 см. Спустя 10 дней после последней вакцинации, данных животным внутримышечно вводится 0,01 мл 0,4%-ного раствора дексаметазона из расчета 0,5 мл действующего вещества на 1 введение. Данную манипуляцию повторяют 4 раза, т.е. на 10, 11, 12, 13 сутки после второй вакцинации. На 14 день после второй вакцинации обозначенные опытные и контрольные группы животных подвергаются внутрибрюшинному инфицированию соответствующим штаммом Mannheimia haemolytica в дозе 5LD. Оценку иммуногенной активности остальных компонентов вакцины проводят методом прямого внутрибрюшинного заражения на 14 день после второй вакцинации в дозе 5LD.
Предложенный препарат обладает высокой иммуногенной активностью, так как обеспечивает 80-100%-ную сохранность среди животных опытной группы (после их заражения), в то время как смертность в контрольной группе составляет не менее 80-100%.
Характеристика контрольных штаммов Mannheimia haemolytica, Bibersteinia trehalosi
1) Контрольный штамм Mannheimia haemolytica №1540-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1306
Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактерии Mannheimia haemolytica не относятся ни одной из четырех групп патогенности.
Дата, источник и место выделения: из молока коровы с клиническим проявлением мастита. Московская область - 2018 год.
Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии с музеем типовых культур ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН и на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.
Методы идентификации: посредством изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств и определением нуклеотидной последовательности гена 16S rRNA.
Морфологические признаки: мелкие грамотрицательные, овоидные палочки, расположенные изолированно, парами и/или цепочками, неподвижные, спор не образуют. В мазках из крови и органов окрашиваются биполярно, иногда с выраженной капсулой. Нити и другие инволюционные формы отсутствуют.
Культуралытые особенности: на кровяном агаре колонии гладкие, полупрозрачные, блестящие в диаметре 1-2 мм с проявлением зоны β-гемолиза в размере 1-1,5 мм вокруг всей колонии. На агаре МакКонки рост в виде мелких полупрозрачных колоний. На мясопептонном агаре бактерии демонстрируют скудный рост мелких выпуклых, полупрозрачных колоний размерами 0,5-1 мм, легко снимающихся бактериальной петлей или пастеровской пипеткой. На среде для культивирования гемофилюсов и актинобациллюсов Haemophilus test medium HTM base производства Oxoid бактерий образовывают обильный рост гладких, прозрачных, блестящих колоний размером 1-1,5 мм. В бульонных средах, т.е. мясопептонном бульоне, триптон-соевом бульоне, бульоне Хоттингера, Эугоник бульоне, а также в сердечно-мозговом бульоне наблюдается равномерное помутнение среды уже спустя 12 часов культивирования. Рост в полужидком агаре проявлялся только по ходу укола петлей.
Биохимические свойства: штамм Mannheimia haemolytica №1540-ВИЭВ ферментирует с образованием кислоты глюкозу, арабинозу, декстрин, фруктозу, галактозу, глицерол, лактозу, мальтозу, маннитол, раффинозу, сорбитол, сахарозу, ксилозу; не ферментирует адонитол, арбутин, целлобиозу, дульцитол, инулин, маннозу, мелицитозу, мелибиозу, рамнозу, салицин, сорбозу, трегалозу. Микроорганизм восстанавливает нитрат. Лизиндекарбоксилаза, орнитиндекарбоксилаза и аргининдекарбоксилаза демонстрируют отрицательный результат.
Серологические свойства: тип А1.
50
Вирулентность для лабораторных животных: величина LD - 2,42×10 мкр. кл. для белых мышей, предварительно подвергнувшихся иммуносупрессии дексаметазоном при внутрибрюшинном заражении.
Условия культивирования: растет на большинстве бульонных питательных сред, используемых в биопроизводстве, в частности: сердечно-мозговом, триптон-соевом бульоне, бульоне Хоттингера и т.д., а также агаризированных средах (МПА, Хоттингера, М-144 (HiMedia) с добавлением 5% стерильной дефибринированной крови барана, при рН-7,2 и температуре 37°С в течении 18-24 часов.
2) Контрольный штамм Mannheimia haemolytica №1494-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1305
Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактерии Mannheimia haemolytica не относятся ни одной из четырех групп патогенности.
Дата, источник и место выделения: из легких павшего ягненка. Овцеводческое предприятие Смоленской области. 2018 год.
Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии с музеем типовых культур ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН и на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.
Методы идентификации: посредством изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств и определением нуклеотидной последовательности гена 16S rRNA.
Морфологические признаки: мелкие грамотрицательные, овоидные палочки, расположенные изолированно, парами и/или цепочками, неподвижные, спор не образуют. В мазках из крови и органов окрашиваются биполярно, иногда с выраженной капсулой. Нити и другие инволюционные формы отсутствуют.
Культуралытые особенности: на кровяном агаре колонии гладкие, полупрозрачные, блестящие в диаметре 1-2 мм с проявлением зоны β-гемолиза в размере 1-1,5 мм вокруг всей колонии. На агаре МакКонки рост в виде мелких полупрозрачных колоний. На мясопептонном агаре бактерии демонстрируют скудный рост мелких выпуклых, полупрозрачных колоний размерами 0,5-1 мм, легко снимающихся бактериальной петлей или пастеровской пипеткой. На среде для культивирования гемофилюсов и актинобациллюсов Haemophilus test medium HTM base производства Oxoid, бактерии образуют обильный рост гладких, прозрачных, блестящих колоний размером 1-1,5 мм. В бульонных средах, т.е. мясопептонном бульоне, триптон-соевом бульоне, бульоне Хоттингера, Эугоник бульоне, а также в сердечно-мозговом бульоне наблюдается равномерное помутнение среды уже спустя 12 часов культивирования. Рост в полужидком агаре проявлялся только по ходу укола петлей.
Биохимические свойства: штамм Mannheimia haemolytica №1494-ВИЭВ ферментирует с образованием кислоты глюкозу, арабинозу, декстрин, фруктозу, галактозу, глицерол, лактозу, мальтозу, маннитол, раффинозу, сорбитол, сахарозу, ксилозу; не ферментирует адонитол, арбутин, целлобиозу, дульцитол, инулин, маннозу, мелицитозу, мелибиозу, рамнозу, салицин, сорбозу, трегалозу. Микроорганизм восстанавливает нитрат. Лизиндекарбоксилаза, орнитиндекарбоксилаза и аргининдекарбоксилаза демонстрируют отрицательный результат.
Серологические свойства: тип А2.
50
8
Вирулентность для лабораторных животных: величина LD - 1,61×10 мкр. кл. для белых мышей, предварительно подвергнувшихся иммуносупрессии дексаметазоном, при внутрибрюшинном заражении.
Условия культивирования: растет на большинстве бульонных питательных сред, используемых в биопроизводстве, в частности: сердечно-мозговом, триптон-соевом бульоне, бульоне Хоттингера и т.д., а также агаризированных средах (МПА, Хоттингера, М-144 (HiMedia) с добавлением 10% стерильной дефибринированной крови барана, при рН-7,2 и температуре 37°С в течении 18-24 часов.
3) Контрольный штамм Bibersteinia trehalosi №1586-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1307
Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактерии Bibersteinia trehalosi не относятся ни одной из четырех групп патогенности.
Дата, источник и место выделения: из легких павшего ягненка. Козоводческое предприятие Республики Мари-Эл. 2018 год.
Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии с музеем типовых культур ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН и на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.
Методы идентификации: посредством изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств и определением нуклеотидной последовательности гена 16S rRNA.
Морфологические признаки: мелкие грамотрицательные, овоидные палочки, расположенные изолированно, парами и/или цепочками, неподвижные, спор не образуют. Нити и другие инволюционные формы отсутствуют.
Культуралытые особенности: на кровяном агаре колонии гладкие, полупрозрачные, блестящие в диаметре 1-2 мм с проявлением зоны β-гемолиза в размере 1-1,5 мм вокруг всей колонии. На агаре МакКонки рост в виде мелких полупрозрачных колоний. На мясопептонном агаре бактерии демонстрируют скудный рост мелких выпуклых, полупрозрачных колоний размерами 0,5-1 мм, легко снимающихся бактериальной петлей или пастеровской пипеткой. На среде для культивирования гемофилюсов и актинобациллюсов Haemophilus test medium HTM base производства Oxoid, бактерии образуют обильный рост гладких, прозрачных, блестящих колоний размером 1-1,5 мм. В бульонных средах, т.е. мясопептонном бульоне, триптон-соевом бульоне, бульоне Хоттингера, Эугоник бульоне, а также в сердечно-мозговом бульоне наблюдается равномерное помутнение среды уже спустя 12 часов культивирования. Рост в полужидком агаре проявлялся только по ходу укола петлей.
Биохимические свойства: штамм Bibersteinia trehalosi №1586-ВИЭВ ферментирует с образованием кислоты манит, сорбит, глюкозу, маннозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, эскулин и салицин. Не ферментируют арабинозу, ксилозу, дульцитол, галактозу. Микроорганизм восстанавливает нитрат.
Серологические свойства: не определен.
50
8
Вирулентность для лабораторных животных: величина LD - 3,66×10 мкр. кл. для белых мышей, при внутрибрюшинном инфицировании.
Условия культивирования: растет на большинстве бульонных питательных сред, используемых в биопроизводстве, в частности: сердечно-мозговом, триптон-соевом бульоне, бульоне Хоттингера и т.д., а также агаризированных средах (МПА, Хоттингера, М-144 (HiMedia) с добавлением 10% стерильной дефибринированной крови барана, при рН-7,2 и температуре 37°С в течении 18-24 часов.
Произведенные таким образом серии вакцины были апробированы в условиях вивария ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН, а также на скотоводческих и козоводческих предприятиях, неблагополучных по манхеймиозу, биберштейниозу и пастереллезу. В рамках апробации подтверждена безвредность препарата и его протективная эффективность.
При использовании вакцины не допускается проведение вакцинации животных позже, чем за две недели до отела или окота.
3
3
3
Вакцину вводят подкожно в область средней трети шеи или внутримышечно в область крупа, нетелям и коровам в дозе 3 см, телятам по 2 см. Овцам и козам всех возвратных групп препарат вводится подкожно или внутримышечно в область внутренней поверхности бедра в дозе 2 см.
Схема вакцинации животных может быть следующими:
№1. Коров и телок случного возраста прививают дважды с интервалом 21-24 дня за 4 и 1 неделю до осеменения, а затем ревакцинируют перед отелом дважды согласно схеме №2.
№2. Стельных коров и нетелей вакцинируют дважды: первый раз не позднее чем за 45 дней до отела, вторая вакцинация проводится спустя 21-24 дня после первой вакцинации, но не позднее чем за 14 дней до отела.
№3. Телят, полученных от ранее вакцинированных животных, и от не вакцинированных, прививают на 7-10 день жизни двукратно с интервалом 21-24 дня. Ревакцинация телят проводится однократно в возрасте 6 месяцев.
№4. Суягных овец и коз вакцинируют дважды: первый раз не позднее чем за 45 дней до окота, вторая вакцинация проводится спустя 21-24 дня после первой, но не позднее чем за 14 дней до окота. Приплод, полученный от ранее вакцинированных животных и от не вакцинированного поголовья, прививают на 7-10 день жизни двукратно с интервалом 21-24 дня. Ревакцинация молодняка проводится однократно в возрасте 6 месяцев установленной инструкцией дозой.
№5. Все поголовье мелкого рогатого скота старше года вакцинируют каждые 6 месяцев двукратно с интервалом 21 день.
Осуществление изобретения
Приведенные ниже примеры являются иллюстративными и тем самым не ограничивают рамки настоящего изобретения.
Пример №1. Дифференциация P. multocida по чувствительности к гиалуронидазе, для подтверждения свойств контрольно-производственных штаммов.
Бульонную суточную культуру P. multocida бактериологической петлей высевают на чашки Петри с агаром Хоттингера. Посев проводят, не отрывая петли от поверхности агара, параллельными штрихами на расстоянии 7-10 мм один от другого. Затем перпендикулярно посеву культуры пастерелл бактериологической петлей одним штрихом по диаметру чашки высевают суточную бульонную культуру Staphylococcus aureus.
Чашки с посевами инкубируют при 37°С, результаты теста учитывают через 18-24 ч. Штаммы, образующие вблизи (до 5 мм) от линии роста стафилококка, более мелкие колонии, чем на удалении от этой линии, относят к серотипу А.
Пример №2. Дифференциация серотипов P. multocida с помощью акрифлавиновой пробы, для подтверждения свойств контрольно-производственных штаммов.
3
Бульонную суточную культуру P. multocida центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость сливают, бактериальные клетки ресуспендируют в той же пробирке остатками надосадочной жидкости до получения гомогенной суспензии. К полученной суспензии добавляют 0,5 см водного свежеприготовленного раствора акрифлавина 1:1000 и тщательно перемешивают.
Штаммы, относящиеся к серотипу D, в течение 10-15 мин после добавления раствора акрифлавина образуют крупнохлопчатый, неразбивающийся при встряхивании флокулят. Штаммы, не прошедшие тест с гиалуронидазой и акрифлавином, относятся к типу В.
Пример №3. Определение серотиповой принадлежности штаммов Mannheimia haemolytica.
Поскольку на территории РФ преимущественно циркулируют два серотипа манхемий, а именно А1 и А2, именно эти два серотипа включены в антигенный состав предлагаемой вакцины [Лаишевцев, А.И. Клинико-эпизоотологическое обоснование вакцинопрофилактики и разработка вакцины против манхеймиоза крупного и мелкого рогатого скота Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук / Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко РАН. Москва, 2018, 155 стр]. При изучении эпизоотической ситуации по манхеймиозу крупного и мелкого рогатого скота, огромной проблемой является отсутствие на Российском рынке коммерческих диагностических сывороток. В этой связи серотипизацию полевых изолятов проводят путем сравнения их гомологичности между собой и со штаммами известных серотипов. Так, известен штамм коллекции АТСС №33396, относящийся к серотипу А2, и производственно-контрольные штаммы №169 и КМИЭВ-В158, относящиеся к серотипу А1.
Для получения антисывороток к известным серотипам манхемий используются по четыре морские свинки массой 350-450 гр. на каждый штамм. Дополнительно две морские свинки используются для контроля выживаемости при гипериммунизации.
Капсульный тип антигенов манхемий был определен следующим методом:
3
1) гипериммунизация животных с использованием полных микробных антигенов Mannheimia haemolytica. Для реализации данного этапа исследования от животных, используемых в опыте, была получена сыворотка крови в качестве отрицательного контроля. Затем животным 1 раз в 7 дней подкожно вводили инактивированную суспензию бактериальных клеток соответствующего штамма в концентрации 6 млрд. мкр. кл. в 1 см. Объем вводимой разовой дозы составлял 2 мл, т.е. конечная концентрация антигена составила 12 млрд. мкр. кл. Для каждой группы животных процедура была проделана 7 раз в течение 42 дней. Отбор крови для получения сыворотки производился спустя 14 дней после последней инъекции. Сыворотки соответствующих групп свинок объединялись;
2) получение капсульного антигена Mannheimia haemolytica для постановки реакции непрямой гемагглютинации было выполнено с использованием суточной культуры, выращенной на триптон-соевом бульоне. Бульонную культуру подвергали термической инактивации при 60°С продолжительностью 30 минут. С целью получения супернатанта инактивированная нагреванием бактериальная масса была центрифугирована при 3000 об\мин в течение 30 минут, после чего надосадочную жидкость отбирали в стерильную пробирку типа Falkon и использовали в последующем в качестве капсульного антигена при постановке реакции непрямой гемагглютинации;
3) получение эритроцитов крови крупного рогатого скота было выполнено по следующей схеме. Для постановки реакции непрямой гемагглютинации необходимым условием являлось наличие эритроцитов восприимчивых видов животных. Для этого от молодого бычка была получена дефибринированная кровь в объеме 250 мл. Затем дефибринированную кровь, для осаждения тяжелых форменных элементов, подвергали центрифугированию при 2500 об./мин., общей продолжительностью 5 минут, после чего эритроциты дважды подвергались промывке солевым раствором фосфатного буфера с последующим повторным центрифугированием при аналогичном режиме до получения прозрачной надосадочной жидкости;
3
3
4) адсорбция капсульных антигенов на поверхности эритроцитов. Эритроциты крупного рогатого скота в объеме 0,2 мл смешивали с 20 см капсульного антигена каждого штамма. С целью прочной фиксации адсорбированных антигенов на эритроцитах в смесь было добавлено 200 мкл глутаральдегида. Инкубировали при 37°С в течение 1 часа при плавном помешивании. В результате выполнения данной процедуры были получены адсорбированные эритроцитами антигены в низкой концентрации, для их концентрирования смесь была подвергнута двойному центрифугированию при 2500 об. /мин. в течение 5 минут с промывкой PBS. После окончания второго центрифугирования и удаления супернатанта оставшийся объем эритроцитов был суспендирован в 20 см PBS для достижения конечной концентрации эритроцитов равной 1%;
5) постановка реакции непрямой гемагглютинации (РИГА). Для выполнения данного этапа используются одноразовые стерильные 96-луночные планшеты с U-образным дном, в которых получают разведение сыворотки от 1:2 до 1:1024. В результате проведенного исследования штаммы Mannheimia haemolytica №822-ВИЭВ и №1540-ВИЭВ относятся к серотипу серотип А1, и демонстрируют агглютинацию в разведении 1:64-1:128. Штаммы Mannheimia haemolytica №1050-ВИЭВ и №1494-ВИЭВ относятся к серотипу А2, и демонстрируют агглютинацию в разведении 1:64-1:128.
Пример №4. Культивирование штамма Mannheimia haemolytica, Bibersteinia trehalosi и Pasteurella multocida глубинным методом.
Культивирование штаммов Mannheimia haemolytica, Bibersteinia trehalosi и Pasteurella multocida проводили с использованием реактора Sartorius BIOSTAT-A на триптон-соевом, сердечно-мозговом и эугоник бульонах (каждый штамм последовательно культивировался на всех приведенных средах). Подготовка главного посевного материала проводилась по следующей методике: в первый день проводили получение первой генерации производственных штаммов путем ресуспендирования лиофилизированной культуры MSB в пробирке с последующим посевом на питательный агар. Подготовка каждого штамма проводилась по отдельности. Культивирование первой генерации культур продолжалось в течении 18 часов в аэробных условиях при температуре 37°С; на второй день, после подтверждения свойств производственных культур, отдельные колонии с чашек Петри пересевались в пробирки с питательным бульоном (по 10 мл), для последующего культивирования в течении 18 часов в аэробных условиях при температуре 37°С, при постоянном помешивании на шейкере (100 об./мин); на третий день, после контроля свойств выращенных культур, бульонная культура из пробирок пересевалась во флаконы с сердечно-мозговой и/или триптон-соевым бульоном (1 пробирка на 250 мл среды). Полученные посевы культивировали в течении 18 часов в аэробных условиях при температуре 37°С, при постоянном помешивании на шейкере (100 об./мин); на четвертый день, после предварительного контроля расплодки, производился пересев всего объема флакона в реактор Sartorius BIOSTAT-A содержащий 5 литров питательной среды. При этом количество матровой расплодки для реакторного культивирования, составляло 10% от 5 л., т.е. 500 мл. Культивирование штаммов Mannheimia haemolytica и Bibersteinia trehalosi проводили при значении рН среды 7,2-7,8, a Pasteurella multocida при рН 7,0-7,8, при температурном режиме 37°С. Для достижения максимального накопления бактериальных клеток производственных штаммов Mannheimia haemolytica, Bibersteinia trehalosi и Pasteurella multocida, в питательную среду дополнительно было внесено 5%-дрожжевого экстракта и 5% сыворотки крови крупного рогатого скота. Для поддержания необходимого уровня питательных веществ в среде проводилось добавление 40%-ного раствора глюкозы из расчета 10 мл глюкозы, на 1 литр питательной среды 1 раз в час, в зависимости от интенсивности роста культуры. При культивировании штаммов Mannheimia haemolytica в среду дополнительно включали гемин и никотинамид-аденин-динуклеотид из расчета 10 мг на литр питательной среды. Уровень рН во время культивирования поддерживается 10%-ным раствором щелочи (NaOH).
В результате проведенных культивирований на различных питательных средах, были получены результаты, отраженные в таблице №4.
Отраженные в таблице №4 результаты свидетельствуют о взаимозаменяемости питательных сред для глубинного культивирования штаммов Mannheimia haemolytica, Bibersteinia trehalosi и Pasteurella multocida.
Во всех случаях бульонные культуры производственных штаммов представляли собой типичные для вида по морфологии клетки, и не содержали посторонней микрофлоры.
Пример №5. Инактивация культуральной жидкости
Инактивацию бульонных культур штаммов Mannheimia haemolytica, Bibersteinia trehalosi и Pasteurella multocida (пример №4) проводили путем добавления к ним формалина (содержащего не менее 37% формальдегида), в количестве 0,3%, от объема культуральной жидкости. Так, к объему 5800 мл, культуральной жидкости, вносилось 17,4 мл формалина. Инактивацию производили в течении 72 часов при температуре 21-22°С.
Пример №6. Концентрирование культуральной жидкости
Концентрирование полученной бульонной культуры после инактивации (пример №5) проводили путем центрифугирования на оборудовании MPW-380R в течении 1 часа при 3 тысячах оборотах, RCF - 1861. После центрифугирования и отделения надосадочной жидкости (фугата), бактериальная масса собиралась в отдельную стерильную емкость (флакон) для дальнейшего использования. На данном этапе проводили определение концентрации бактериальной массы и ее объема. Определение концентрации суспензии проводили с использованием стандартов мутности - набор ОСО мутности бактериальных взвесей ГКПМ ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России. Результаты концентрирования отражены в таблице №5.
Согласно данным, отраженным в таблице №5, культуральная жидкость была сконцентрирована в среднем в 10 раз.
Пример №7. Определение полноты инактивации антигенов
Полноту инактивации антигенов оценивали по отсутствию жизнеспособных клеток в бактериальной массе путем посева образцов на ростобеспечивающие питательные среды в соответствии с ГОСТ 28085-2013 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности».
3
3
Также полноту инактивации антигенов оценивали по безвредности инактивированной бактериальной массы на лабораторных мышах массой 16-18 гр. при внутрибрюшинном введении 0,5 см. Перед введением антигена животным, его предварительно разводят до концентрации 6 млрд. мкр. кл. см. Для оценки безвредности каждой серии антигена использовалось по пять подопытных мышей. Все антигены, используемые для компоновки трех серий вакцин, были стерильными и не вызывали гибель лабораторных животных в течении 14 дней наблюдения.
Пример №8. Составление серии №1 вакцины против манхеймиоза, биберштейниоза и пастереллеза крупного и мелкого рогатого скота с использованием физиологического раствора в качестве разбавителя и ГОА в качестве адъюванта
3
3
При составлении серии вакцины, в стерильной емкости проводили смешивание инактивированных бактериальных антигенов пяти производственных культур с разбавителем (физиологический раствор), адъювантом (3%-ный раствор гидроокиси алюминия) и консервантом (мертиолят натрия), устанавливая концентрацию бактериальных антигенов 10 млрд. мкр. кл./см (по 2 млрд. мкр. кл./см каждого). Компоненты перемешивали до получения однородной суспензии, устанавливали рН серии вакцины на уровне 7,4. Пропись состава вакцины при таком варианте компоновки, приведена в таблице №6. Состав приведен из расчета объема выпускаемой серии 1 тысячи доз (3 литра препарата).
Полученная таким образом вакцина по внешнему виду представляет собой суспензию светло-серого цвета с серо-белым осадком, легко разбивающимся при взбалтывании в гомогенную взвесь.
Пример №9. Составление серии №2 вакцины против манхеймиоза, биберштейниоза и пастереллеза крупного и мелкого рогатого скота с использованием воды для инъекций в качестве разбавителя и карбомера 971Р в качестве адъюванта
3
3
При составлении серии вакцины, в стерильной емкости проводили смешивание инактивированных бактериальных антигенов пяти производственных культур с водой для инъекций в качестве разбавителя, 2%-ного раствора карбомера 971Р в качестве адъюванта, и мертиолятом натрия в качестве консерванта, устанавливая концентрацию бактериальных антигенов 10 млрд. мкр. кл./см (по 2 млрд. мкр. кл./см каждого). Компоненты перемешивали до получения однородной суспензии, после чего устанавливали рН серии вакцины на уровне 7,4. Пропись состава вакцины при использовании данного варианта компоновки, приведена в таблице №7. Состав приведен из расчета объема выпускаемой серии 1 тысячи доз (3 литра препарата).
Полученная таким образом вакцина по внешнему виду представляет собой суспензию светло-серого цвета с серо-белым осадком, легко разбивающимся при взбалтывании в гомогенную взвесь.
Пример №10. Составление серии №3 вакцины против манхеймиоза, биберштейниоза и пастереллеза крупного и мелкого рогатого скота с использованием фосфатно-буферного раствора в качестве разбавителя и масляного адъюванта Montanide IS А 70 в качестве адъюванта
3
3
В стерильной емкости проводится подготовка предэмульсии. Для этого в смесителе при постоянном помешивании (250 об/мин. в течении 1,5 часов) проводили смешивание инактивированных бактериальных антигенов пяти производственных культур на основе PBS - буфера в качестве разбавителя, Montanide ISA 70 в качестве адъюванта, мертиолята натрия в качестве консерванта, таким образом, чтобы получить концентрацию бактериальных антигенов равной 10 млрд. мкр. кл./см (по 2 млрд. мкр. кл./см каждого штамма). Для получения финального варианта вакцины использовали гомогенизатор типа «Silverson L5M-A». Эмульгирование проводится в течении 3 часов при 6 тыс. об/мин. Пропись состава вакцины при использовании данного варианта компоновки, приведена в таблице №8. Состав приведен из расчета объема выпускаемой серии 1 тысячи доз (3 литров препарата).
Полученная таким образом вакцина по внешнему виду представляет собой эмульсию белого цвета, иногда с желтоватым оттенком. При длительном хранении наблюдалось незначительное расслоение препарата, которое при встряхивании переходит в первоначальное состояние гомогенной эмульсии.
Пример №11. Определение стерильности вакцины
3
3
3
Контроль стерильности вакцины проводили согласно ГОСТ 28085-2013 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности». Так, трех флаконов каждой серии препарата готовят объединенную пробу, после чего из нее проводят посев на жидкие питательные среды Сабуро, МПБ и МППБ (среда Китт-Тароцци) и на твердые питательные среды Сабуро и МПА. На посев из каждого флакона использовалось по три пробирки и две чашки с питательной средой. При посеве на среду Китт-Тароцци высев делали на две пробирки и два флакона. Для выявления аэробных микроорганизмов и факультативно-анаэробных микроорганизмов высевали по 0,5 см посевного материала в одну пробирку и 1-2 см в один флакон, а для выявления анаэробных микроорганизмов - соответственно по 1 и 5 см. Пробирки и флаконы с посевами на всех средах, кроме среды Сабуро, выдерживали в термостате при температуре (37±1)°С, на среде Сабуро - при температуре (22,5±2,5)°С, в течение 7 сут (для анаэробов - 14 сут). По истечении указанного срока делали пересев, за исключением посевов на МПА. Пересевали пробы на те же питательные среды и в тех же объемах, что и при посеве. Вторичные посевы также выдерживали 7 сут (для анаэробов - 14 сут). В результате проведенного контроля трех серий препарата была установлена их стерильность. Ни на одной из используемых сред роста посторонней микрофлоры не выявлено.
Пример №12. Оценка безвредности вакцины
Исследование трех серий препарата проводили на белых мышах массой 16-18 гр. Для испытания каждой серии вакцины использовалось по 5 голов мышей, которым внутримышечно вводили по 0,5 мл вакцины. Наблюдение за опытными животными продолжалось в течение 14 суток. Все три серии препарата оказались безвредными, так как не спровоцировали у животных каких-либо местных и системных реакций, в том числе не привели к их гибели.
Пример №13. Определение иммуногенной активности вакцины на лабораторных животных (белых мышах массой 18-20 гр.)
Для реализации поставленной цели было сформировано десять групп по 10 мышей в каждой, массой 18-20 гр. Пять групп являлись опытными (на каждый заражающий штамм), и пять контрольных групп (на каждый заражающий штамм). Опытная группа №1 и контрольная группа №1 были предназначены для контроля манхеймиозного компонента по серотипу А1 и подвергались заражению штаммом Mannheimia haemolytica №1540-ВИЭВ серотип А1; опытная группа №2 и контрольная группа №2 были предназначены для контроля манхеймиозного компонента по серотипу А2 и подвергались заражению штаммом Mannheimia haemolytica №1494-ВИЭВ серотип А2; опытная группа №3 и контрольная группа №3 были предназначены для контроля активности компонента Bibersteinia trehalosi и подвергались заражению штаммом Bibersteinia trehalosi №1586-ВИЭВ; опытная группа №4 и контрольная группа №4 были предназначены для контроля активности пастереллезного компонента по типу А и подвергались заражению штаммом Pasteurella multocida №1231; опытная группа №5 и контрольная группа №5 были предназначены для контроля активности пастереллезного компонента по типу В и подвергались заражению штаммом Pasteurella multocida №656.
3
50
Оценку иммуногенной активности манхеймиозного компонента проводили методом предварительной иммуносупрессии дексаметазоном, остальные компоненты контролировались методом прямого заражения. Так, при оценке иммуногенной активности манхеймиозного компонента предлагаемого средства, мышей опытных и контрольных групп №1 и №2, предварительно вакцинировали, двукратно с интервалом 14-16 дней, в дозе 1 см. Спустя 10 дней после последней вакцинации, данных животным внутримышечно вводили 0,01 мл 0,4%-ного раствора дексаметазона из расчета 0,5 мл действующего вещества на 1 введение. Данную манипуляцию повторяли 4 раза, т.е. на 10, 11, 12, 13 сутки после второй вакцинации. На 14 день после второй вакцинации обозначенные опытные и контрольные группы животных подвергались внутрибрюшинному инфицированию соответствующим штаммом Mannheimia haemolytica в дозе 5LD.
50
Оценку иммуногенной активности остальных компонентов вакцины проводят методом прямого внутрибрюшинного заражения на 14 день после второй вакцинации в дозе 5LD.
50
Значение показателя 5LD, для контрольных штаммов было следующее:
9
Mannheimia haemolytica №1540-ВИЭВ - 1,21×10 мкр. кл.;
8
Mannheimia haemolytica №1494-ВИЭВ - 8,05×10 мкр. кл.;
9
Bibersteinia trehalosi №1586-ВИЭВ - 1,83×10 мкр. кл.;
9
Pasteurella multocida №1231 - 1,99×10 мкр. кл.;
9
Pasteurella multocida №656 - 2,41×10 мкр. кл.
Результаты определения иммуногенной активности трех серий предлагаемой вакцины, приведены в таблице №9.
При проведении данного исследования были получены результаты, свидетельствующие, что выживаемость животных опытных групп вне зависимости от использованной серии препарата, составила 90%, в то время как 90% (указано минимальное значение по трем группам) животных контрольных групп погибли в течение 1-2 суток после инфицирования, что говорит о высоком уровне иммуногенной активности вакцины.
Пример №14. Определение безопасности и эффективности вакцины серии №1 на овцах
3
Испытания вакцины серии №1 проводили в овцеводческом предприятии Тверской области, неблагополучном по манхеймиозу, биберштейниозу и пастереллезу, что предварительно было подтверждено лабораторно-диагностическими исследованиями. На предприятии было сформировано две группы овцематок по 40 голов в каждой, опытная группа животных была иммунизирована предложенным препаратов, в то время как контрольная группа вакцинирована не была. Вакцинацию животных проводили по схеме №4, т.е. суягных овец вакцинировали дважды: первый раз за 45 дней до окота, второй раз спустя 21 день, т.е. за 24 дня до окота. Вакцинальная доза для однократного применения составили 2 см. Инъекцию производили внутримышечно в область внутренней поверхности бедра. Полученный от вакцинированных животных приплод, также подвергли двукратной вакцинации в 7 и 28 дневном возрасте, аналогичной дозой и способом введения.
В результате проведенных исследований было установлено, что препарат является безвредным при однократном и двукратном использовании как на суягных животных, так и на молодняке. Внутримышечное использование средства не провоцировало каких-либо системных или местных реакций. Подвижность, аппетит, температура тела у животных опытной группы не отличалась от таковой в контрольной.
Результаты оценки сохранности молодняка опытной и контрольной группы после вакцинации проводили на период достижения ими 5 месячного возраста. Так, от 40 голов опытной группы было получено 64 ягненка, в то время как от контрольной группы было получено 71 ягненок. По достижению 5 месячного возраста сохранность ягнят полученных от опытной группы овцематок составила 90,6%, в то время как данное значение в контрольной группе было 77,46%. Кроме того, с целью обеспечения сохранности животных контрольной группы молодняку назначался курс антибактериальной терапии. Опытной группе антибиотики не назначались, ввиду отсутствия необходимости.
Таким образом были получены результаты свидетельствуют о безвредности предлагаемого средства и его эффективности в условиях овцеводческого предприятия.
Пример №15. Определение безопасности и эффективности вакцины серии №3 на крупном рогатом скоте
3
3
Испытания вакцины серии №3 проводили в скотоводческом предприятии Московской области, неблагополучном по манхеймиозу и пастереллезу, что предварительно было подтверждено лабораторно-диагностическими исследованиями. На предприятии было сформировано две группы коров по 55 голов в каждой, опытная группа животных была иммунизирована предложенным препаратов, в то время как контрольная группа вакцинирована не была. Вакцинацию животных проводили по схеме №2, т.е. стельных коров вакцинировали дважды: первый раз за 45 дней до отела, второй раз спустя 21 день, т.е. за 24 дня до отела. Вакцинальная доза для однократного применения составили 3 см. Инъекцию производили подкожно в область средней трети шеи. Полученный от вакцинированных животных приплод, вакцинировали по схеме №2. Так, вакцинация была проведена на 10 и 21 день жизни, подкожно, в дозе 2 см.
В результате проведенных исследований было установлено, что препарат является безвредным при однократном и двукратном использовании как на стельных коровах, так и на молодняке от них полученных. Подкожное использование средства не провоцировало каких-либо системных или местных реакций. Подвижность, аппетит, температура тела у животных опытной группы не отличалась от таковой в контрольной.
Результаты оценки сохранности молодняка опытной и контрольной группы после вакцинации проводили на период достижения ими 6 месячного возраста. Так, от 55 голов опытной группы было получено 57 телят, в то время как от контрольной группы 59 теленка соответственно. По достижению 6 месячного возраста сохранность телят полученных от опытной группы коров составила 94,7%, в то время как данное значение в контрольной группе было 81,35%. Кроме того, с целью обеспечения сохранности животных контрольной группы молодняку назначался курс антибактериальной терапии. Опытной группе антибиотики не назначались, ввиду отсутствия необходимости.
Таким образом были получены результаты свидетельствуют о безвредности предлагаемого средства и его эффективности в условиях скотоводческого предприятия.