МНОГОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АНАЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХАРАКТЕРИСТИК ОПТИЧЕСКОГО СИГНАЛА КРУГОВОГО ДИХРОИЗМА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО МАТЕРИАЛА
MULTIFUNCTIONAL ANALYTIC SYSTEM FOR DETERMINING CHARACTERISTICS OF CIRCULAR DICHROISM OPTIC SIGNAL FROM BIOLOGICALLY ACTIVE MATERIAL

Настоящее изобретение относится к медицинской технике и биотехнологиям, а более конкретно - к устройствам для определения в анализируемых пробах веществ или соединений, проявляющих круговой дихроизм (далее КД), в том числе, реализующим биосенсорные технологии определения наличия и концентрации биологически активных веществ (далее БАВ) по изменению характеристик оптического сигнала КД биологически активных материалов (далее БАМ) при их взаимодействии с БАВ, и может быть использовано в медицинской и клинической биохимии, а также в молекулярной фармакологии, в пищевой, фармацевтической и биотехнологической промышленности и экологии, наиболее эффективно - в клинической биохимии.
Известны различные устройства, реализующие биосенсорные технологии, основанные на регистрации оптических сигналов биологически активных материалов, проявляющих аномальный круговой дихроизм в анализируемых жидкостях.
-7
Известен спектрополяриметр фирмы Jasco Corporation, Япония (Jasco J-710/720 Spectropolarimeter, Instruction Manual), содержащий источник светового излучения, селектор, поляризатор, модулятор поляризации, ячейку с исследуемой пробой, фотодетектор, синхронный усилитель, усилитель постоянного тока, компьютер, в котором регистрируют величину кругового дихроизма (далее КД), пропорциональную концентрации БАВ в пробе. Однако отсутствие режима накопления сигнала, а значит, недостаточная чувствительность определения БАВ (10 моля), большие вес, габариты и энергопотребление, высокая стоимость прибора, отсутствие мобильности приводят к ограничению области применения указанного спектрополяриметра.
Известны устройство для определения биологически активного вещества в анализируемой жидкости (RU, 2107280, C1) и две его технические реализации в виде полезной модели дихрометра (DE, 10035709, C2) и портативного дихрометра СКД-2 (Успехи физических наук, 2004, т.174, №6, с.686-690), содержащие установленные последовательно источник светового излучения, селектор, поляризатор, модулятор поляризации, ячейку для размещения исследуемой пробы, содержащей биодатчик на основе холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК (далее ХЖКД ДНК) в контакте с анализируемой жидкостью, фотодетектор, синхронный усилитель, средство обработки сигнала, блок управления.
В указанных выше дихрометрах при прохождении через исследуемую пробу, биодатчик в которой проявляет свойства аномального кругового дихроизма, световой поток становится модулированным по интенсивности, благодаря чему на выходе фотодетектора возникает электрический сигнал, переменная составляющая которого на частоте модуляции поляризации излучения пропорциональна величине сигнала КД. Затем сигнал поступает на вход цифровой системы регистрации и после усиления, фильтрации и преобразования в цифровой код поступает в компьютер. Интерфейсная плата на основе микроконтроллера осуществляет необходимое взаимодействие всех узлов прибора, сбор и предварительную обработку сигнала КД, передачу данных в компьютер, а также тестирование параметров всех систем дихрометра.
Управление работой указанных дихрометров осуществляется с помощью программного комплекса, осуществляющего различные режимы работы дихрометра и поддерживающего библиотеку методик для определения различных БАВ, благодаря чему пользователь имеет возможность выбрать из меню то вещество, определение концентрации которого требуется в данный момент, после чего программа в режиме диалога «ведет» исследователя через все действия, предписанные методикой, и выдает результат в виде значения концентрации определяемого соединения в исследуемом образце.
Однако к недостаткам вышеупомянутых устройств можно отнести неоптимальную конструкцию лампового источника светового излучения, приводящую к образованию озона внутри спектрального блока в диапазоне УФ излучения вблизи длин волн 200 нм; недостаточно надежный и сложный в изготовлении и настройке электродинамический привод позиционного типа поворота дифракционной решетки селектора; недостаточную стабильность характеристик и низкую устойчивость фотоэластического модулятора поляризации к внешним воздействиям, а также влияние электронной схемы возбуждения модулятора на другие системы устройства, что понижает чувствительность регистрации КД, и, соответственно, измерения концентрации БАВ. Наличие паразитного сигнала КД из-за напряжений в окнах оптической кюветы с исследуемой пробой и несовершенства узла фиксации ячейки, а также избыточные шумы в канале регистрации КД приводят к недостаточной достоверности и стабильности результатов измерений сигнала КД. Усиление результирующего сигнала КД по постоянному току в тракте синхронного усилителя приводит к температурному дрейфу сигнала, при этом наличие в синхронном усилителе аналогового фильтра низких частот существенно снижает возможности дальнейшей обработки полезного сигнала из-за ограниченного набора постоянных времени фильтра. Наличие селектора длины волны в виде монохроматора и отдельного блока термостатирования ячейки с пробой приводит к излишней громоздкости дихрографа. Важным недостатком аналогов является требование приготовления биодатчика на основе ХЖКД ДНК непосредственно перед контактом его с анализируемой жидкостью, содержащей определяемое БАВ.
Перечисленные выше недостатки устройств для определения БАВ устранены в дихрометре для определения биологически активного вещества в жидкостях, гелях и пленках (RU, 92959, U1) и в дихрометре для определения биологически активного вещества в анализируемой жидкости (RU, 92960, U1). В указанных дихрометрах для достижения более высокой точности определения концентраций определяемых компонентов в любых анализируемых пробах предложены усовершенствованная конструкция лампового источника светового излучения, резко уменьшающая уровень образующегося озона в диапазоне УФ излучения вблизи и ниже 200 нм, технологичный шаговый двигатель поворота дифракционной решетки, усовершенствована конструкция устройства для размещения анализируемой пробы, обеспечивающая возможность скользящего перемещения кюветы с пробой относительно корпуса устройства без появления напряжений в материале стенок кюветы, конструктивное выполнение фотоэластического модулятора поляризации в сочетании со стабилизацией его рабочего тока, обеспечившее высокую стабильность характеристик модулятора и устойчивость его к внешним механическим воздействиям.
Кроме этого, в указанных дихрометрах для определения БАВ реализован принцип модульности, при котором функциональные модули устройства для определения БАВ содержат микроконтроллеры, обеспечивающие управление их функционированием в согласованных режимах и взаимодействие между собой с помощью стандартного интерфейса типа I2C. Управление работой аналитического устройства осуществляется с помощью внешнего или встроенного компьютера, при этом микроконтроллер модуля цифровой системы регистрации обеспечивает выполнение необходимых операций микроконтроллерами других функциональных модулей, первичную обработку сигнала, передачу его по интерфейсу USB в указанный компьютер, прием и передачу команд компьютера другим функциональным модулям.
Указанные технические решения позволили несколько уменьшить габариты дихрометров за счет включения блока термостатирования ячейки с пробой в состав оптического (спектрального) блока.
-9
Использование указанных дихрометров позволяет точнее и с лучшей воспроизводимостью определять величину сигнала КД и концентрацию в пробах различных БАВ, при этом достигается более высокая чувствительность их определения (до 10 М/л) и появляется возможность значительно расширить класс определяемых БАВ.
Кроме технических усовершенствований, в этих дихрометрах возможно определение оптических характеристик биодатчиков, приготовленных в виде гелей или пленок, содержащих иммобилизованные в них наноразмерные частицы жидкокристаллической дисперсии молекулярных конструкций ДНК (далее МК ДНК), в которых молекулы ДНК упорядочены между собой и сшиты между собой различными наномостиками, содержащими хромофорные соединения, проявляющие в составе частиц аномальную оптическую активность кругового дихроизма при облучении циркулярно-поляризованным излучением и сохраняющих свою структуру и аномальную оптическую активность в течение длительного времени до смешивания с анализируемой жидкостью. (Евдокимов Ю.М., Салянов В.И., Семенов С.В., Скуридин С.Г. Жидкокристаллические дисперсии и наноконструкции ДНК, под редакцией Ю.М.Евдокимова - М.: Радиотехника, 294 с., 2008; Евдокимов Ю.М., Салянов В.И., Скуридин С.Г. Наноструктуры и наноконструкции на основе ДНК. Под ред. Ю.М. Евдокимова. М.: САЙНС-ПРЕСС, 2010, 254 с.).
Для указанных МК ДНК характерна не только аномальная оптическая активность, проявляемая в виде интенсивной полосы в спектре КД в области поглощения азотистых оснований ДНК, например, на длине волны ~260-270 нм, но и дополнительная аномальная оптическая активность в области поглощения элементов наномостиков, «сшивающих» МК ДНК, в частности, хромофоров антибиотиков в области длин волн 450-650 нм, например, дауномицина в области 505-525 нм. Величина аномальной оптической активности таких биодатчиков на основе МК ДНК в полосе поглощения антибиотика остается неизменной в течение длительного времени и может уменьшаться (вплоть до полного исчезновения) под действием БАВ, «мишенью» для которых служат структурные элементы наномостиков, являющиеся, по сути, наносенсорами. Наличие и концентрацию БАВ в анализируемой жидкости определяют по изменению величины регистрируемого оптического сигнала КД, обусловленному взаимодействием БАВ с МК ДНК, только в одной, указанной выше полосе в видимом диапазоне спектра, при помощи предварительно записанного калибровочного графика. Гелевые или пленочные биодатчики на основе МК ДНК, характеризующиеся длительным (месяцы) сроком устойчивости своей структуры и присущей им аномальной оптической активности, требуют, тем не менее, после долгого их хранения подтверждения паспортного значения характеристик оптического сигнала КД.
Можно сказать, что гелевые или пленочные биодатчики на основе МК ДНК представляют собой новый тип биологически активных материалов (далее БАМ) стабилизированных форм, оптическую активность КД которых можно искусственно создавать в заданном спектральном интервале и изменять по величине.
Исследование оптических свойств таких БАМ, обладающих определенными заданными характеристиками оптической активности КД на определенных заданных длинах волн, представляет и самостоятельную задачу, поскольку БАМ могут использоваться не только в качестве биодатчиков при определении наличия и концентрации БАВ в анализируемых пробах, но и как стандартные образцы, с помощью которых можно калибровать, например, спектрометры кругового дихроизма (дихрометры), работающие в широком диапазоне длин волн.
Задачу исследования оптических свойств и контроля качества БАМ на основе МК ДНК, в том числе с целью использования их в качестве биодатчиков в биосенсорных аналитических устройствах или для калибровки дихрометров и измерения оптической активности исследуемых с их помощью других объектов, целесообразнее решать с использованием работающих в широком диапазоне длин волн многофункциональных дихрометров. С другой стороны, применяемые на практике многофункциональные дихрометры (спектрополяриметры), сконструированные для решения традиционных исследовательских и аналитических задач, имеют стандартный набор достаточно громоздких конструктивных узлов (мощный ламповый источник излучения, многоэлементный селектор длины волны излучения в виде монохроматора, высокочувствительный детектор излучения на основе фотоэлектронного умножителя) и мало приспособлены для исследования БАМ на основе МК ДНК. Поэтому наряду с главной задачей - исследованием оптических свойств и контролем качества таких БАМ, одновременно должна быть решена задача создания адекватной ей более компактной многофункциональной аналитической системы.
В основу настоящего изобретения была положена задача создания компактной многофункциональной аналитической системы для определения характеристик оптического сигнала кругового дихроизма (далее КД) биологически активных материалов (далее БАМ), содержащих молекулярные конструкции нуклеиновых кислот (МК НК) и обладающих аномальной оптической активностью при облучении циркулярно-поляризованным излучением в ультрафиолетовом диапазоне спектра и/или в видимом диапазоне спектра и способностью изменять характеристики оптической активности при взаимодействии с биологически активными веществами (далее БАВ) в зависимости от концентрации БАВ в исследуемой пробе, что позволит проводить исследования биологической активности БАВ в отношении БАМ по характеру и степени изменений характеристик КД.
При этом система должна была быть приспособлена для работы с БАМ, в качестве которых могут быть использованы как известные биодатчики на основе молекулярных конструкций НК, обладающие определенными известными исходными характеристиками оптического сигнала КД и имеющие в молекулярных конструкциях структурный элемент, являющийся «мишенью» или субстратом для БАВ, так и БАМ с предполагаемой оптической активностью при облучении циркулярно-поляризованным излучением.
-9
При этом была поставлена задача определения указанных характеристик КД без какой-либо потери чувствительности регистрации сигнала КД, с сохранением высокой точности определения концентрации определяемых БАВ, в том числе ультранизкой концентрации (до ~10 моля), в анализируемых пробах, в том числе в биологических жидкостях, таких, как плазма крови, цельная кровь и других.
Дополнительной задачей создания изобретения являлось обеспечение возможности спектрального контроля качества биодатчиков на основе молекулярных конструкций НК (МК НК), включая биодатчики, содержащие наноконструкции НК (НаК НК), путем тестирования их оптической активности перед использованием, а также возможности поверки измерительных характеристик системы при работе системы в ультрафиолетовой области излучений и в видимой области излучений по рабочему эталону (стандарту). При этом в качестве эталона оптической активности для поверки средств измерения КД может быть принята, например, оптическая активность водных растворов химического соединения, например, описанного выше КСК, но может быть использован в качестве эталона и известный биодатчик на основе МК НК (БАМ) с известными характеристиками оптических свойств КД.
Поставленная задача была решена созданием многофункциональной аналитической системы для определения характеристик оптического сигнала кругового дихроизма биологически активного материала, содержащей размещенные в одном корпусе:
- источник светового излучения, снабженный коллимирующей линзой;
- селектор, выполненный в виде узкополосного интерференционного фильтра с возможностью его размещения в потоке света указанного источника излучения после указанной коллимирующей линзы;
- размещенные последовательно на одной оптической оси:
- поляризатор, обеспечивающий формирование линейно поляризованного светового потока;
- спектральную щель, обеспечивающую выделение линейно-поляризованного светового потока с заданным направлением вектора поляризации;
- модулятор поляризации, обеспечивающий преобразование указанного линейно поляризованного светового потока в циркулярно-поляризованный световой поток с периодически изменяющимся направлением вращения вектора поляризации;
- приемное устройство, приспособленное для установки в нем съемной оптически проницаемой кюветы для размещения исследуемой пробы и снабженное устройством термостатирования кюветы;
- по меньшей мере, одну съемную оптически проницаемую кювету, приспособленную для размещения в ней исследуемой пробы и для размещения ее в указанном приемном устройстве;
- фотодетектор, обеспечивающий регистрацию оптических сигналов кругового дихроизма исследуемой пробы и преобразование их в пропорциональный электрический сигнал; и
- систему регистрации, приспособленную для выделения и усиления указанного электрического сигнала и преобразования его в цифровую форму;
- средство управления, включающее средство обработки полученного электрического сигнала исследуемой пробы и контроллер команд,
отличающейся тем, что:
- содержит несколько источников излучения, снабженных коллимирующими линзами, при этом содержит, по меньшей мере, один источник излучения, обеспечивающий излучение в ультрафиолетовой области спектра, и, по меньшей мере, один источник излучения, обеспечивающий излучение в видимой области спектра, и содержит достаточное количество селекторов, выполненных в виде узкополосных интерференционных фильтров, установленных с возможностью их размещения в потоке света соответствующего указанного источника излучения после указанной коллимирующей линзы и приспособленных для формирования совместно с указанными источниками излучения достаточного количества узкополосных излучающих комплексов, обеспечивающих функционирование системы в следующих режимах:
- в первом режиме тестирования системы в ультрафиолетовой области спектра при размещении в съемной кювете тестовой пробы, содержащей эталон оптической активности, проявляющий свойства кругового дихроизма при облучении пробы циркулярно-поляризованным излучением на характерных для кругового дихроизма эталона длинах волн в ультрафиолетовой области спектра;
- во втором режиме тестирования системы в видимой области спектра при размещении в съемной кювете тестовой пробы, содержащей эталон оптической активности, проявляющий свойства кругового дихроизма при облучении его циркулярно-поляризованным излучением на характерных для эталона длинах волн в видимой области спектра;
- в третьем режиме тестирования оптических свойств биологически активного материала, при размещении в съемной кювете исследуемой пробы, содержащей биологически активный материал, предположительно, обладающий оптической активностью кругового дихроизма при облучении циркулярно-поляризованным излучением;
- в четвертом режиме определения скорости диффузии биологически активного вещества в биологически активный материал и/или исследования динамики трансформации молекулярных конструкций ДНК при взаимодействии с биологически активным веществом, при размещении в указанной съемной кювете исследуемой пробы, содержащей биологически активное вещество в контакте с биологически активным материалом, предположительно, являющимся субстратом для указанного биологически активного вещества и проявляющим в исходном состоянии свойства кругового дихроизма при облучении циркулярно-поляризованным излучением на длинах волн, характерных для указанного биологически активного материала, и изменяющим эти свойства по мере взаимодействия с биологически активным веществом в течение заданного времени экспозиции;
- в пятом режиме калибровки оптических свойств биологически активного материала, выполненного в виде биодатчика на основе молекулярных конструкций ДНК, проявляющего в исходном состоянии свойства кругового дихроизма при облучении циркулярно-поляризованным излучением на длинах волн, характерных для биодатчика, и изменяющего их в результате взаимодействия указанного биодатчика с биологически активным веществом, для которого биологически активный материал является субстратом, в течение времени такого взаимодействия, меньшего времени полной диффузии биологически активного вещества в биодатчик, при размещении в указанной съемной кювете одной из N калибровочных проб, содержащих указанный биодатчик в контакте с одним из N калибровочных растворов, содержащих указанное биологически активное вещество в различной известной концентрации;
- в шестом режиме определения наличия и концентрации биологически активного вещества в исследуемой пробе при размещении в съемной кювете исследуемой пробы, содержащей биологически активное вещество, подлежащее определению, в неизвестной концентрации и биологически активный материал, выполненный в виде биодатчика на основе молекулярных конструкций ДНК, являющегося субстратом для определяемого биологически активного вещества и проявляющего в исходном состоянии свойства кругового дихроизма при облучении циркулярно-поляризованным излучением на длинах волн, характерных для биодатчика, и изменяющего их в результате взаимодействия биодатчика с биологически активным веществом, наличие и концентрация которого подлежат определению,
и при этом:
- система снабжена устройством крепления указанных источников излучения и указанных селекторов, обеспечивающим возможность формирования источниками излучения и соответствующими им селекторами указанных излучающих комплексов соответственно выбранному режиму, излучающих на заданных длинах волн, путем направления потока излучения одного из указанных источников излучения через соответствующий один из указанных селекторов по одной оптической оси с указанным поляризатором, спектральной щелью, модулятором, указанной кюветой и фотодетектором в течение времени работы системы в соответствующем режиме.
При этом, согласно изобретению, система может быть приспособлена в третьем режиме для тестирования оптических свойств биологически активного материала в исходном состоянии путем определения характеристик его сигнала кругового дихроизма при облучении циркулярно-поляризованным излучением в ультрафиолетовом диапазоне спектра и/или в видимом диапазоне спектра.
Кроме того, согласно изобретению, система может быть приспособлена в третьем режиме для тестирования оптических свойств биологически активного материала путем определения уровня чувствительности биологически активного материала в отношении биологически активного вещества, для которого указанный биологически активный материал является субстратом, путем определения количества указанного биологически активного вещества, в результате взаимодействия с которым наблюдается достоверное изменение сигнала кругового дихроизма биологически активного материала от максимума сигнала кругового дихроизма в исходном состоянии при облучении в видимом диапазоне спектра и/или в ультрафиолетовом диапазоне спектра.
Кроме того, согласно изобретению, система может быть приспособлена в третьем режиме для тестирования оптических свойств биологически активного материала путем определения его рабочего диапазона в отношении биологически активного вещества, для которого указанный биологически активный материал является субстратом, путем определения количеств указанного биологически активного вещества, в результате взаимодействия с которым наблюдается достоверное изменение величины сигнала кругового дихроизма биологически активного материала от максимума сигнала кругового дихроизма в исходном состоянии до полного исчезновения сигнала кругового дихроизма при облучении в видимом диапазоне спектра и/или в ультрафиолетовом диапазоне спектра.
При этом, согласно изобретению, целесообразно, чтобы средство управления было выполнено с возможностью:
- выбора режима работы системы;
- выбора типа биологически активного материала, предполагаемого к использованию;
- предоставления пользователю данных о наличии в системе источников излучения и селекторов, необходимых для последующего формирования требующихся источников излучения в соответствии с выбранными типом биологически активного материала и режимом работы системы;
- подачи в автоматическом режиме управляющих команд на указанное устройство крепления, обеспечивающих соответствующее выбранному режиму положение источников излучения и селекторов для формирования соответствующего излучающего комплекса;
- подачи управляющих команд на терморегулятор узла термостатирования кюветы;
- подачи команд включения и выключения источников излучения, поляризатора, модулятора, источника питания фотодетектора;
- подачи управляющих команд, обеспечивающих регистрацию оптических сигналов исследуемой пробы через заданные промежутки времени в течение заданного времени экспозиции пробы, достаточной для регистрации фотодетектором значимых изменений оптического сигнала биологически активного материала, и подачи управляющих команд на цифровую систему регистрации и средство обработки;
- сохранения полученных результатов измерений.
При этом, согласно изобретению, целесообразно, чтобы средство обработки было приспособлено для визуализации в заданном графическом или табличном или ином виде результатов регистрации оптических сигналов исследуемой пробы и результатов вычислений, произведенных:
- для определения в первом и втором режимах способности аналитической системы измерять круговой дихроизм оптических сигналов путем выявления соответствия между характеристиками регистрируемого системой оптического сигнала и известными характеристиками кругового дихроизма эталона;
- для определения в третьем режиме оптических свойств биологически активного материала на основе результатов регистрации оптического сигнала кругового дихроизма пробы и путем сравнения результатов измерения характеристик кругового дихроизма исследуемого биологически активного материала с данными известных характеристик, сохраненных ранее, соответствующих биологически активному материалу выбранного типа, путем определения уровня чувствительности известного количества биологически активного материала и диапазона количеств биологически активного вещества, при взаимодействии с которым биологически активный материал изменяет свойства кругового дихроизма;
- для определения в четвертом режиме коэффициента диффузии биологически активного вещества в биологически активный материал и динамики трансформации молекулярных конструкций ДНК при взаимодействии с биологически активным веществом на основе результатов измерения величины регистрируемого сигнала кругового дихроизма биологически активного материала в пробе путем вычисления величины и динамики изменения указанного регистрируемого сигнала в течение времени взаимодействия биологически активного материала с биологически активным веществом;
- для определения в пятом режиме калибровочной зависимости величины изменения амплитуды регистрируемого оптического сигнала кругового дихроизма биодатчика от величины концентрации биологически активного вещества, для которого биодатчик является субстратом, в указанных N калибровочных растворах на основе результатов регистрации величины сигнала кругового дихроизма биодатчика в калибровочных пробах через заданные интервалы времени и путем вычисления величины изменений сигналов кругового дихроизма биодатчика, зарегистрированных через определенный заданный интервал времени и соответствующих разным концентрациям биологически активного вещества;
- для определения в шестом режиме наличия и концентрации определяемого биологически активного вещества на основе результатов регистрации величины сигнала кругового дихроизма биодатчика в исследуемой пробе через заданные интервалы времени путем вычисления величины изменения сигнала кругового дихроизма биодатчика, зарегистрированного через определенный заданный интервал времени, и сравнения этой величины с величинами изменений сигналов кругового дихроизма калибровочной зависимости биодатчика, определенной предварительно для биодатчика выбранного типа, зарегистрированных через такой же интервал времени для разных концентраций биологически активного вещества.
При этом, согласно изобретению, целесообразно, чтобы система в качестве указанного источника излучения в УФ области спектра содержала дейтериевую лампу.
При этом, согласно изобретению, целесообразно, чтобы указанные узкополосные излучающие комплексы, обеспечивающие излучение в видимой области спектра, были выполнены в виде узкополосных диодных излучателей, снабженных коллимирующей линзой и селектором.
При этом, согласно изобретению, целесообразно, чтобы указанное устройство крепления излучающих комплексов было выполнено в виде турели с четырьмя степенями свободы, содержащей диск, установленный с возможностью поворота вокруг своей оси в плоскости, перпендикулярной указанной оптической оси, и приспособленный для размещения на нем источников излучения и/или селекторов, формирующих указанные узкополосные излучающие комплексы, с возможностью одновременной установки одного из источников излучения и соответствующего одного из селекторов на одной оптической оси с указанным поляризатором, спектральной щелью, модулятором, кюветой и фотодетектором в течение времени работы системы в соответствующем режиме.
При этом, согласно изобретению, целесообразно, чтобы указанный диск турели был выполнен съемным.
Кроме того, согласно изобретению, возможно, чтобы указанное устройство крепления излучающих комплексов содержало многопозиционные держатели, приспособленные для установки в них источников излучения и селекторов, необходимых для формирования узкополосных излучающих комплексов в ультрафиолетовой области спектра или в видимой области спектра, и устройств flip-flop с зеркалами, обеспечивающих возможность попеременной установки устройств flip-flop в положение flip, и выходное зеркало, приспособленное для направления излучения излучающих комплексов по одной оптической оси с указанным поляризатором, спектральной щелью, модулятором, кюветой и фотодетектором, и фиксации указанного положения flip в течение заданного времени экспозиции в соответствующем режиме.
При этом, согласно изобретению, целесообразно, чтобы указанные многопозиционные держатели были выполнены съемными.
При этом, согласно изобретению, целесообразно, чтобы указанные источники излучения, указанные селекторы и указанные устройства flip-flop были выполнены съемными.
При этом, согласно изобретению, возможно, чтобы компоновка системы была выполнена в корпусе таким образом, чтобы оптическая ось системы была расположена горизонтально, а указанная съемная кювета была выполнена в виде ячейки, приспособленной для размещения в приемном устройстве при вертикальном расположении в ней пробы перпендикулярно оптической оси системы.
При этом, согласно изобретению, возможно, чтобы съемная кювета была приспособлена для размещения в ней пробы с биологически активным материалом в виде раствора или в виде гелевого или пленочного образца.
Кроме того, согласно изобретению, возможно, чтобы компоновка системы была выполнена в корпусе таким образом, чтобы оптическая ось системы была расположена вертикально, а указанная съемная кювета была выполнена в виде ячейки, приспособленной для ее размещения в приемном устройстве при горизонтальном расположения в ней пробы перпендикулярно оптической оси системы.
Кроме того, согласно изобретению, возможно, чтобы съемная кювета была выполнена в виде микроплаты с лунками, имеющими, по меньшей мере, дно, оптически проницаемое для излучений в ультрафиолетовом и видимом диапазоне спектра, и приспособленной для ее размещения в приемном устройстве при горизонтальном расположении лунок с возможностью перемещения микроплаты в горизонтальной плоскости.
При этом, согласно изобретению, возможно, чтобы съемная кювета была выполнена в виде микроплаты, приспособленной для размещения в лунках пробы, содержащей биологически активный материал в виде гелевого или пленочного образца.
При этом, согласно изобретению, целесообразно, чтобы система была приспособлена для работы в первом режиме с тестовой пробой, содержащей в качестве эталона оптической активности раствор химического соединения, проявляющий свойства кругового дихроизма при облучении его на характерной для него длине волны в ультрафиолетовой области спектра.
При этом, согласно изобретению, возможно, чтобы система была приспособлена для работы в первом режиме с тестовой пробой, содержащей в качестве эталона оптической активности водный раствор n-пропиламмониевой соли d-10 камфорсульфоновой кислоты, проявляющий свойства кругового дихроизма в ультрафиолетовой области спектра с максимумом сигнала на длине волны 290 нм.
При этом, согласно изобретению, целесообразно, чтобы система была приспособлена для работы в первом режиме с тестовой пробой, содержащей в качестве эталона оптической активности биологически активный материал на основе молекулярных конструкций НК, проявляющий в исходном состоянии свойства кругового дихроизма в области поглощения азотистых оснований ДНК с максимумом сигнала при облучении в ультрафиолетовой области спектра.
При этом, согласно изобретению, возможно, чтобы система была приспособлена для работы в первом режиме с тестовой пробой, содержащей в качестве эталона оптической активности дисперсную фазу линейной B-формы двухцепочечных молекул ДНК в водно-солевом растворе, проявляющих в исходном состоянии свойства кругового дихроизма в области поглощения азотистых оснований ДНК в ультрафиолетовой области спектра с максимумом на длине волны 260 нм.
Кроме того, согласно изобретению, возможно, чтобы система была приспособлена для работы в первом режиме с тестовой пробой, содержащей в качестве эталона оптической активности жидкокристаллический биодатчик, представляющий собой распределенную в водно-полимерном матриксе дисперсную фазу линейных двухцепочечных молекул ДНК, сшитых между собой молекулами стеллина В, с максимумом сигнала при облучении в ультрафиолетовой области спектра на длине волны 270 нм.
Кроме того, согласно изобретению, возможно, чтобы система была приспособлена для работы во втором режиме с тестовой пробой, содержащей в качестве эталона оптической активности биологически активный материал на основе молекулярных конструкций НК, проявляющий свойства кругового дихроизма с максимумом оптического сигнала в видимой области спектра.
2+
2+
2+
2+
При этом, согласно изобретению, возможно, чтобы система была приспособлена для работы во втором режиме с тестовой пробой, содержащей в качестве эталона оптической активности биологически активный материал, выполненный в виде интегрального биодатчика, содержащего жидкокристаллическую дисперсию линейных двухцепочечных молекул ДНК, упорядоченных в пространстве и "сшитых" мостиками «антрациклиновый антибиотик-Cu-антрациклиновый антибиотик-Cu-…-Cu-антрациклиновый антибиотик-Cu-антрациклиновый антибиотик» в водно-солевом растворе полиэтиленгликоля, с известными характеристиками кругового дихроизма в видимой области спектра с максимумом сигнала при облучении на длине волны в диапазоне 505-525 нм.
При этом, согласно изобретению, целесообразно, чтобы система была приспособлена для работы в третьем и/или четвертом, и/или пятом, и/или шестом режимах с исследуемыми пробами, содержащими биологически активный материал, проявляющий в исходном состоянии свойства аномального кругового дихроизма при облучении в ультрафиолетовой области спектра и/или кругового дихроизма при облучении в видимой области спектра и изменяющий амплитуду сигналов при облучении в видимой области спектра при его взаимодействии с биологически активным веществом в зависимости от его количества в пробе.
При этом, согласно изобретению, целесообразно, чтобы система была приспособлена для работы в третьем и/или четвертом, и/или пятом, и/или шестом режимах с исследуемыми пробами, содержащими в качестве биологически активного материала жидкокристаллические биодатчики, представляющие собой дисперсную фазу из линейных двухцепочечных молекул НК, сшитых молекулами субстрата для биологически активного вещества, и проявляющие в исходном состоянии свойства кругового дихроизма с максимумом сигнала при облучении в ультрафиолетовой области спектра и с максимумом сигнала при облучении в видимой области спектра и изменяющие амплитуду сигналов при облучении в видимой области спектра при взаимодействии биодатчиков с биологически активным веществом в зависимости от его количества в пробе.
При этом, согласно изобретению, целесообразно, чтобы система была приспособлена для облучения проб в ультрафиолетовом диапазоне последовательно на нескольких длинах волн.
При этом, согласно изобретению, целесообразно, чтобы система была приспособлена для облучения проб в видимом диапазоне последовательно на нескольких длинах волн.
При этом, согласно изобретению, целесообразно, чтобы система была приспособлена для облучения проб излучением на заданных длинах волн в чередующейся последовательности.
При этом, согласно изобретению, целесообразно, чтобы система была приспособлена для облучения проб в третьем и/или четвертом, и/или пятом, и/или шестом режимах излучением видимой области спектра в чередующейся последовательности трех длин волн, из которых одна длина волны соответствует максимуму сигнала в спектре кругового дихроизма биологически активного материала, другая длина волны больше, а третья короче длины волны, соответствующей максимуму указанного сигнала, причем на первой и третьей длинах волн регистрируемый сигнал кругового дихроизма биологически активного материала минимален или близок к фоновому, и при этом была выполнена с возможностью формирования соответствующих трех излучающих комплексов.
При этом, согласно изобретению, возможно, чтобы система была приспособлена для работы в третьем и/или четвертом и/или пятом и/или шестом режимах с пробами, содержащими в качестве биологически активного материала биодатчики на основе лиотропной жидкокристаллической дисперсии комплекса ДНК-поликонидин, проявляющей в исходном состоянии свойства кругового дихроизма при облучении в ультрафиолетовой области спектра в диапазоне длин волн 220-350 нм с появлением отрицательной полосы с максимумом на длине волны ~280 нм при взаимодействии биодатчиков с гепарином.
При этом, согласно изобретению, возможно, чтобы система была приспособлена для работы в третьем и/или четвертом и/или пятом и/или шестом режимах с пробами, содержащими в качестве биологически активного вещества гепарин.
При этом, согласно изобретению, возможно, чтобы система была приспособлена для работы в третьем и/или четвертом, и/или пятом и/или шестом режимах с исследуемыми пробами, содержащими в качестве биологически активного материала биодатчики, имеющие сшитые наномостиками «антибиотик-ион металла-антибиотик-ион металла-…-ион металл-антибиотик-ион металла-антибиотик» частицы лиотропной холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, содержащие в составе наномостиков антибиотики антрациклиновой группы, способные к образованию хелатных комплексов и содержащие атомы кислорода в положениях 5, 6, 11 и 12, ив качестве чувствительного элемента ионы металла, способного к образованию плоских полимерных хелатных комплексов, и характеризующиеся аномальной оптической активностью при облучении в ультрафиолетовой области спектра, проявляемой в виде интенсивной полосы в спектре кругового дихроизма в области поглощения азотистых оснований ДНК на длине волны ~270 нм, и дополнительной аномальной оптической активностью в области поглощения антибиотика в диапазоне 505-525 нм, и чтобы при этом система была приспособлена для облучения пробы в видимой области спектра, по меньшей мере, на трех длинах волн в диапазоне 440-750 нм.
При этом, согласно изобретению, возможно, чтобы система была приспособлена для работы в третьем и/или четвертом, и/или пятом и/или шестом режимах с исследуемыми пробами, содержащими в качестве биологически активного вещества гомоцистеин, гипорамин, митоксантрон или белок.
Кроме того, согласно изобретению, целесообразно, чтобы система была приспособлена для работы в третьем и/или четвертом, и/или пятом и/или шестом режимах с исследуемыми пробами, содержащими в качестве биологически активного материала биодатчики на основе частиц лиотропной холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, в которых молекулы ДНК сшиты наномостиками «антибиотик-ион металла-антибиотик-ион металла-…-ион металл-антибиотик-ион металла-антибиотик», содержащие в составе наномостиков в качестве чувствительного элемента антибиотик антрациклинового ряда, имеющий не менее одной реакционно-способной аминогруппы, связанной с сахарным остатком и обладающей хромофорными свойствами при облучении в видимой области спектра, и ионы металлов, способные к образованию плоских полимерных хелатных комплексов, и характеризующиеся аномальной оптической активностью при облучении в ультрафиолетовой области спектра, проявляемой в виде интенсивной полосы в спектре кругового дихроизма в области поглощения азотистых оснований ДНК на длине волны ~270 нм, и дополнительной аномальной оптической активностью при облучении в видимой области спектра в области поглощения антибиотика в диапазоне 505-525 нм, и чтобы при этом система была приспособлена для облучения пробы в видимой области спектра, по меньшей мере, на трех длинах волн в диапазоне 420-700 нм.
При этом, согласно изобретению, возможно, чтобы система была приспособлена для работы в третьем и/или четвертом, и/или пятом и/или шестом режимах с исследуемыми пробами, содержащими в качестве биологически активного вещества гепарин.
В дальнейшем многофункциональная аналитическая система для определения характеристик оптического сигнала кругового дихроизма биологически активного материала согласно изобретению поясняется примерами ее конструктивного выполнения и применения и прилагаемыми чертежами, на которых:
Фиг.1 - оптическая схема многофункциональной аналитической системы согласно изобретению, вариант А выполнения с горизонтально расположенной оптической осью;
Фиг.1а - узкополосный источник излучения, содержащий узкополосный диодный излучатель в сборе с коллимирующей линзой и интерференционным фильтром, вариант выполнения;
Фиг.2 - оптическая схема многофункциональной аналитической системы согласно изобретению, вариант С выполнения с горизонтально расположенной оптической осью;
Фиг.2а - схема выполнения устройства flip-flop с отражающим зеркалом;
Фиг.3 - характеристика КД БАМ, выполненного в виде жидкокристаллического биодатчика, представляющего собой дисперсную фазу из линейных двухцепочечных молекул ДНК - линейной В-формы ДНК в водно-солевом растворе (кривая 1); характеристика БАМ, выполненного в виде распределенной в водно-полимерном матриксе дисперсной фазы водно-солевого раствора комплекса ДНК-стеллин В из линейных двухцепочных молекул ДНК, сшитых молекулами субстрата для БАВ (кривая 2),
2+
2+
2+
2+
Фиг.4 - характеристика КД БАМ, выполненного в виде интегрального биодатчика, содержащего жидкокристаллическую дисперсию линейных двухцепочечных молекул ДНК, упорядоченных в пространстве и "сшитых" мостиками «антрациклиновый антибиотик-Cu-антрациклиновый антибиотик-Cu-…-Cu-антрациклиновый антибиотик-Cu-антрациклиновый антибиотик» в водно-солевом растворе полиэтиленгликоля при облучении в видимом диапазоне спектра(кривая 3);
2+
2+
2+
2+
Фиг.5 - пример определения характеристик КД БАМ, выполненного в виде интегрального биодатчика, содержащего жидкокристаллическую дисперсию линейных двухцепочечных молекул ДНК, упорядоченных в пространстве и "сшитых" мостиками «антрациклиновый антибиотик-Cu-антрациклиновый антибиотик-Cu-…-Cu-антрациклиновый антибиотик-Cu-антрациклиновый антибиотик» в водно-солевом растворе полиэтиленгликоля при облучении в ультрафиолетовом диапазоне: (кривая 4) и в видимом диапазоне (кривая 5) с изменением величины максимума сигналов КД в видимой области спектра в сторону ее уменьшения при взаимодействии с БАВ (кривая 6);
Фиг.6 - результаты тестирования БАМ, содержащих частицы холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, не сшитой наномостиками:
- кривая 7 - изменение амплитуды сигнала КД при облучении на разных длинах волн видимого диапазона в исходном состоянии БАМ (до контакта указанного БАМ с БАВ);
-3
- кривая 8 - изменение амплитуды сигнала КД БАМ после контакта с БАВ (гепарин в концентрации 2,5×10 мг/мл);
- кривая 9 - изменение амплитуды сигнала КД при облучении в ультрафиолетовом диапазоне спектра в исходном состоянии БАМ (до контакта указанного БАМ с БАВ);
-3
- кривая 10 - неизменность величины амплитуды сигнала КД БАМ при контакте БАМ с БАВ (гепарин в концентрации 2,5×10 мг/мл);
2+
2+
2+
2+
Фиг.7 - результаты измерения величины сигнала КД интегральных биодатчиков, содержащих частицы лиотропной холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, упорядоченной в пространстве и "сшитой" мостиками, содержащими комплекс «ДАУ-Cu-ДАУ-Cu-…-Cu-ДАУ-Cu-ДАУ» в водно-солевом растворе полиэтиленгликоля, при облучении в ультрафиолетовом и видимом спектре:
- кривая 11 - в исходном состоянии БАМ до контакта с БАВ;
- кривая 12 - после взаимодействия БАМ в течение 10 мин с БАВ в виде БСА (водным раствором белка сывороточного альбумина в известной выбранной концентрации 6,0 мкг/мл);
- кривая 13 - после взаимодействия БАМ в течение последующих 50 мин с БАВ в виде БСА;
- кривая 14 - через 80 мин после взаимодействия с БСА (неизменность величины сигнала КД в области поглощения азотистых оснований ДНК);
Фиг.8 - динамика изменения амплитуды сигнала КД БАМ с БАВ (БСА) в различных концентрациях: 1,1 мкг/мл (кривая 15), 3,4 мкг/мл (кривая 16) и 5,7 мкг/мл (кривая 17);
2+
2+
2+
2+
Фиг.9 - результаты калибровки БАМ, выполненных в виде интегральных биодатчиков, содержащих частицы лиотропной холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, упорядоченной в пространстве и "сшитой" мостиками, содержащими комплекс «ДАУ-Cu-ДАУ-Cu-…-Cu-ДАУ-Cu-ДАУ» в водно-солевом растворе полиэтиленгликоля, при взаимодействии с БАВ (гепарин) в различной концентрации гепарина: 1,0 мкг/мл (кривая 18), 2,0 мкг/мл (кривая 19); 4,0 мкг/мл (кривая 20);
Фиг.10 - калибровочные зависимости относительного изменения максимума амплитуды сигнала КД БАМ, выполненного в виде биодатчика, содержащего молекулы ДНК в упорядоченном состоянии, сшитые «мостиками» комплексов «ДАУ-Cu», после обработки водным раствором белка (БСА) в известной концентрации в течение 10 мин (кривая 21) и после обработки водным раствором белка в известной концентрации в течение 60 мин (кривая 22);
Г
Фиг.11 - калибровочная зависимость величины сигнала КД БАМ, выполненного в виде биодатчика, содержащего молекулы ДНК в упорядоченном состоянии, сшитые «мостиками» комплексов «ДАУ-Cu», полученная для биодатчика в исходном состоянии (точка 0) и после 10-минутной обработки биодатчика водным раствором гипорамина в известной концентрации C=0,5 мкг/мл, 1,0 мкг/мл, 2,0 мкг/мл, 3,0 мкг/мл, и 4,0 мкг/мл (кривая 23);
-9
Фиг.12 - калибровочные зависимости относительного изменения максимума амплитуды сигнала КД БАМ, выполненного в виде биодатчика, содержащего молекулы ДНК в упорядоченном состоянии, сшитые «мостиками» комплексов «ДАУ-Cu», полученные для определения БАВ митоксантрона (MX) в области концентраций до 10 моль/мл: при помощи систем А и С согласно изобретению (кривая 24) и с помощью описанного выше в разделе уровня техники дихрографа-прототипа (кривая 25).
Однако представленные примеры выполнения многофункциональной аналитической системы согласно изобретению не ограничивают другие возможности ее выполнения и применения, не выходящие за рамки формулы изобретения.
Многофункциональная аналитическая система для определения характеристик оптического сигнала кругового дихроизма биологически активного материала согласно изобретению показана ниже в двух вариантах ее выполнения.
Многофункциональная аналитическая система для определения характеристик оптического сигнала кругового дихроизма биологически активного материала согласно изобретению, показанная схематично на Фиг.1 в виде системы А первого варианта выполнения или показанная схематично на Фиг.2 в виде системы С второго варианта выполнения, обеспечивает автоматическое формирование излучающих комплексов, обеспечивающих работу систем А и С в шести указанных режимах согласно изобретению, и автоматическую подачу излучения в ультрафиолетовой или видимой области спектра.
При этом системы А и С обеспечивают подачу излучений на тестовую пробу, содержащую эталон оптической активности кругового дихроизма в ультрафиолетовом спектре облучений (первый режим), эталон оптической активности кругового дихроизма в видимом спектре облучения (второй режим), или на исследуемую пробу, содержащую тестируемый биологически активный материал в контакте с биологически активным веществом, вызывающим при взаимодействии с указанным материалом изменение его оптических характеристик (третий режим), или на исследуемую пробу, содержащую биологически активный материал в виде биодатчика, имеющего известные оптические характеристики кругового дихроизма, в контакте с биологически активным веществом, подлежащим определению (четвертый и пятый режимы) или на исследуемую пробу, содержащую биологически активный материал в виде биодатчика, имеющего известные оптические характеристики кругового дихроизма, в контакте с биологически активным веществом, активность которого по скорости разрушения указанного биодатчика подлежит определению (шестой режим).
При этом системы А и С снабжены устройством крепления, обеспечивающим закрепление необходимого для функционирования систем в шести режимах количества источников излучения и селекторов, формирование источниками излучения и соответствующими им селекторами излучающих комплексов, излучающих на требуемой длине волны соответственно выбранному режиму путем направления потока излучения одного из указанных источников излучения через соответствующий один из указанных селекторов оптической оси системы в течение времени работы системы А или С в выбранном режиме.
Кроме того, системы А и С обеспечивают регистрацию оптических сигналов кругового дихроизма, полученных от пробы, их обработку с переводом в цифровую форму и автоматизированную оценку полученных данных для установления оптических свойств исследуемых биологически активных материалов и изменения этих оптических свойств при взаимодействии этих биологически активных материалов с биологически активными веществами, наличие и концентрацию которых в исследуемых пробах подлежит установить, или оценки скорости диффузии исследуемого биологически активного вещества в биологически активный материал, а также визуализацию результатов тестирования, результатов измерений и результатов оценки.
При этом многофункциональные системы согласно изобретению содержат комплект устройств, обеспечивающих формирование излучающих комплексов, обладающих необходимыми параметрами для формирования и подачи излучений в требуемом диапазоне длин волн для обеспечения работы системы в каждом из описанных режимов ее функционирования, и расположение излучающих комплексов на одной оптической оси с устройствами, обеспечивающими необходимую поляризацию излучения, размещение исследуемых проб и регистрацию этого излучения, а также устройств обработки результатов измерений и управления всей системой в целом.
Многофункциональная аналитическая система согласно изобретению, выполненная в первом варианте в виде многофункциональной системы А (Фиг.1), для формирования излучающих комплексов, обладающих необходимыми параметрами излучений в требуемом диапазоне длин волн для обеспечения работы системы в каждом из режимов ее функционирования, и расположения излучающих комплексов на одной оптической оси, содержит:
- источник 1 УФ излучения, обеспечивающий излучение в ультрафиолетовой области спектра, в качестве которого может быть использована, например, дейтериевая лампа;
- зеркало 2, обеспечивающее направление излучения источника 1 по оптической оси 1а системы 1;
- коллимирующую линзу 3, обеспечивающую компенсацию расходимости излучения источника 1 УФ излучения;
- турель 4, выполненную с четырьмя степенями свободы и снабженную диском 5, установленным с возможностью поворота вокруг своей оси в плоскости, перпендикулярной оптической оси 1а системы А;
- селекторы 6-i, где i=1, 2, 3, …, выполненные съемными, установленные на периферии диска 5 в количестве, достаточном для формирования совместно с источником 1 УФ излучения, зеркалом 2 и коллимирующей линзой 3 излучающих комплексов U-i, где i=1, 2, 3, …, обеспечивающих формирование светового потока с требуемой длиной волны в УФ области оптической активности эталонов оптической активности или оптической активности исследуемого биологически активного материала, проявляемой им в спектре его кругового дихроизма в УФ диапазоне;
- источники 7-n видимого излучения, где n=1, 2, 3, …, выполненные съемными, снабженные коллимирующими линзами и селекторами, установленные на периферии диска 5 турели 4 в количестве, достаточном для формирования необходимого количества излучающих комплексов S-n, где n=1, 2, 3, …, обеспечивающих формирование светового потока для облучения проб в указанных шести режимах работы системы на длинах волн в видимом диапазоне спектра, соответствующих областям оптической активности, проявляемой в спектре кругового дихроизма используемых эталонов или исследуемых проб, содержащих БАМ.
В качестве источников 7-n излучения целесообразно использовать миниатюрные светоизлучающие диоды с высокой яркостью излучения, например, диоды S12LB2C-B, S12LG2C-B, NCSU033A и NCSU034A.
Однако источники 7-n излучений могут быть выполнены в виде узкополосного диодного излучателя, показанного на Фиг.1а, содержащего в защитном кожухе 8, снабженном винтами 9 юстировки положения излучателя, источник света в виде светодиода 10, коллимирующую линзу 11 и селектор 12.
При использовании в качестве источников 7-n узкополосного диодного излучателя, показанного на Фиг.1а, наиболее эффективно в качестве селектора 12 для еще большего сужения полосы излучения, если она недостаточно узка, использовать узкополосный интерференционный фильтр с многослойным диэлектрическим покрытием, но возможно использование и других типов спектральных фильтров.
При этом в системе А коллимирующие линзы 3 (Фиг.1) и, если используются в составе узкополосных диодных излучателей, коллимирующие линзы 11 (Фиг.1а) применяются для компенсации расходимости излучения, соответственно, источника 1 УФ излучения и светодиодов 10, и могут быть выполнены любым известным специалисту образом.
Согласно изобретению, в системе А (Фиг.1) указанные селекторы 6-i и указанные источники 7-n видимого излучения установлены на периферии диска 5 турели 4 таким образом, чтобы при управляемом повороте диска 5 вокруг его оси поток УФ излучения от селектора 6-i был направлен по оптической оси 1а системы А, формируя тем самым излучающий комплекс U-i с УФ излучением по оси 1а, или чтобы поток от источника 1-п видимого излучения был направлен по оптической оси 1а системы А, формируя тем самым излучающий комплекс S-n с излучением по оптической оси 1а системы А.
Таким образом, в системе А обеспечена возможность формирования УФ излучающих комплексов U-i, содержащих источник 1 УФ излучения, зеркало 2, коллимирующую линзу 3 и селектор 6-i, и формирования в системе А излучающих комплексов S-n, содержащих источник 7-n видимого излучения.
Многофункциональная система согласно изобретению, выполненная во втором варианте в виде многофункциональной системы С (Фиг.2), для формирования излучающих комплексов, обладающих необходимыми параметрами излучений в требуемом диапазоне длин волн для обеспечения работы системы в каждом из режимов ее функционирования, и расположения излучающих комплексов на одной оптической оси, содержит:
- источник 13 УФ излучения, обеспечивающий излучение в ультрафиолетовой области спектра, в качестве которого может быть использован ламповый источник излучения в кожухе, например, дейтериевая лампа;
- зеркало 14, обеспечивающее направление излучения источника 13 по оптической оси 1c системы С;
- коллимирующую линзу 15; обеспечивающую компенсацию расходимости излучения источника 13 УФ излучения;
- достаточное количество устройств 16-p flip-flop, где p=1, 2, 3, …, с интерференционным фильтром 16a-p, обеспечивающим пропускание длин волн УФ диапазона, соответствующих длинам волн кругового дихроизма используемого эталона оптической активности или оптической активности исследуемого биологически активного материала, проявляемой им в спектре его кругового дихроизма в УФ области спектра, выполненных съемными и последовательно размещенных на оптической оси 1c системы С на первом многопозиционном держателе 16c таким образом, чтобы в рабочем положении устройства 16-p интерференционный фильтр 16a-p был размещен на оптической оси 1c системы С, и обеспечивающих формирование светового потока с длиной волны в УФ области оптической активности используемого эталона оптической активности или оптической активности исследуемого биологически активного материала, проявляемой им в спектре его кругового дихроизма в УФ области спектра, и подачу указанного светового потока по оптической оси 1c системы С;
- достаточное количество источников 17-m видимого излучения, где m=1, 2, 3, …, размещенных на втором многопозиционном держателе 17c и выполненных съемными в виде узкополосных диодных излучателей, снабженных интерференционными фильтрами и обеспечивающих формирование светового потока в шести режимах с длиной волны, соответствующей области оптической активности используемого биологически активного материала, проявляемой им при облучении в видимом диапазоне спектра;
- достаточное количество устройств 18-y flip-flop с отражающим зеркалом 18a-y, где y=1, 2, 3, …, размещенных в третьем многопозиционном держателе 18c напротив соответствующих выходов указанных источников 17-m видимого излучения таким образом, чтобы в рабочем положении устройства 18-y flip-flop их отражающее зеркало 18a-y обеспечивало подачу излучения в направлении оптической оси 1 с системы С;
- устройство 19 flip-flop с отражающим зеркалом 19а, обеспечивающее направление потока излучения от отражающего зеркала 18a-y устройства 18-y flip-flop по оптической оси 1c системы С, выполненное непроницаемым для УФ излучения от устройств 16-p flip-flop;
- поглотитель 20, обеспечивающий поглощение УФ излучения от устройств 16-p flip-flop и имеющий любую форму, минимизирующую поток назад рассеянного излучения.
В качестве источников 17-m видимого излучения целесообразно использовать миниатюрные светоизлучающие диоды с высокой яркостью излучения, например, диоды S12LB2C-B, S12LG2C-B, NCSU033A и NCSU034A.
Однако источники 17-m видимого излучения могут быть выполнены в виде узкополосного диодного излучателя, показанного на Фиг.1а, содержащего в защитном кожухе 8, снабженном винтами 9 юстировки положения излучателя, источник света в виде светодиода 10, коллимирующую линзу 11 и селектор 12.
При использовании в качестве источника 17-m узкополосного диодного излучателя, показанного на Фиг.1а, наиболее эффективно в качестве селектора 12 для еще большего сужения полосы излучения, если она недостаточно узка, использовать узкополосный интерференционный фильтр с многослойным диэлектрическим покрытием, но возможно использование и других типов спектральных фильтров.
В системе С коллимирующая линза 15 (Фиг.2) и, если используются в составе узкополосных диодных излучателей, коллимирующие линзы 11 (Фиг.2а) применяются для компенсации расходимости излучения, соответственно, источника 13 УФ излучения и светодиодов 10, и могут быть выполнены любым известным специалисту образом.
A
C
Устройства 18-y flip-flop и устройство 19 flip-flop могут быть выполнены в виде устройства R flip-flop, показанного на Фиг.2а упрощенно с двумя положениями R и R отражающего зеркала.
Таким образом, в системе С обеспечена возможность формирования УФ излучающих комплексов U-i, содержащих источник 13 УФ излучения, зеркало 14, коллимирующую линзу 15 и устройство 16-p flip-flop, и формирования в системе С излучающих комплексов S-m, содержащих один источник 17-m видимого излучения, одно устройство 18-y flip-flop и устройство 19 flip-flop.
Многофункциональные аналитические системы А и С, согласно изобретению, приспособлены для облучения исследуемых проб в видимом диапазоне поочередно на нескольких длинах волн: например, последовательно на нескольких длинах волн в ультрафиолетовом диапазоне спектра, и последовательно на нескольких длинах волн в видимом диапазоне спектра, и при этом последовательность облучения может чередоваться.
При этом, согласно изобретению, система может быть приспособлена для облучения проб, содержащих известные биодатчики с известными характеристиками КД при их облучении циркулярно-поляризованным излучением видимой области спектра в чередующейся последовательности, по меньшей мере, трех длин волн, из которых одна длина волны соответствует максимуму сигнала в спектре кругового дихроизма биологически активного материала, другая длина волны больше, а третья короче длины волны, соответствующей максимуму указанного сигнала, причем на первой и третьей длинах волн регистрируемый сигнал кругового дихроизма биологически активного материала минимален (близок к фоновому), и при этом была выполнена с возможностью формирования соответствующих трех излучающих комплексов. Введение дополнительных источников излучения незначительно усложняет конструкцию систем А и С, но позволяет учесть вклад фоновых сигналов в измеряемый сигнал КД и существенно повысить точность измерения изменений оптических свойств БАМ.
Например, согласно изобретению, системы А и С могут быть приспособлены для облучения проб поляризованным излучением видимой области спектра поочередно на трех длинах волн, характерных для БАМ: рабочей первой длине волны, соответствующей максимуму сигнала кругового дихроизма, и двух дополнительных второй и третьей длинах волн, из которых вторая длина волны меньше, а третья длина волны больше указанной рабочей первой длины волны, причем на второй и третьей длинах волн регистрируемый сигнал кругового дихроизма биологически активного материала минимален.
Таким образом, системы А и С обеспечивают формирование различных излучающих комплексов УФ излучения: излучающих комплексов U-i в системе А и излучающих комплексов U-k в системе С, соответственно требуемым длинами волн УФ диапазона, и различных излучающих комплексов видимого излучения: излучающих комплексов S-n в системе А и излучающих комплексов S-m в системе С, соответственно требуемым указанным рабочим первым длинам волн и дополнительным, например вторым и третьим, длинам волн видимого диапазона.
При этом, согласно изобретению, в системе А диск 5 турели 4 выполнен съемным, а в системе С многопозиционные держатели выполнены съемными, что обеспечивает возможность смены комплекта размещенных на нем источников излучения и селекторов для расширения ее возможностей, например, в зависимости от специализации системы А и С, и ремонтопригодность систем.
Кроме того, согласно изобретению, указанные источники излучения и указанные селекторы в системах А и С выполнены съемными, что позволяет варьировать комплект источников излучения и селекторов в системах и обеспечивает ремонтопригодность систем.
При этом многофункциональные аналитические системы А (Фиг.1) и С (Фиг.2) содержат размещенные последовательно на указанной одной оптической оси 1а или, соответственно, на указанной одной оптической оси 1c:
1
- линейный поляризатор 21, обеспечивающий формирование линейно поляризованного светового потока с линейным вектором E поляризации;
1
- спектральную щель 22, обеспечивающую выделение из указанного линейно поляризованного светового потока поток с заданным направлением линейного вектора Е поляризации;
2
- модулятор 23 круговой поляризации, обеспечивающий преобразование указанного линейно поляризованного светового потока от линейного поляризатора 21 в циркулярно поляризованный световой поток с периодически изменяющимся направлением вращения вектора Е поляризации;
- оптически проницаемую кювету 24-p при p=1, 2, 3, …, для размещения исследуемой пробы 24a-p, приспособленную для установки в приемном устройстве 25, снабженном устройством 26 термостатирования кюветы;
- фотодетектор 27, обеспечивающий регистрацию оптических сигналов кругового дихроизма тестовой или исследуемой пробы, размещенной в кювете 24-p, и преобразование их в пропорциональный электрический сигнал, с источником 27а питания фотодетектора 27;
- систему 28 регистрации, приспособленную для выделения и усиления указанного электрического сигнала фотодетектора 27 и преобразования его в цифровую форму;
- средство 29 управления, включающее средство обработки сигнала цифровой формы и контроллер управления.
1
При этом линейный поляризатор 21 (Фиг.1, Фиг.2) приспособлен для формирования линейно поляризованного светового потока с вектором E поляризации и может быть призменным (например, из анизотропного кристалла дигидрофосфата калия или ТВО), пленочным (например, типа NPF-S), жидкокристаллическим (например, на основе сегнетоэлектрических жидких кристаллов) или может быть изготовлен любым другим известным специалисту в этой области образом.
1
2
При использовании призменного или пленочного поляризатора 21 преобразование линейно поляризованного светового потока с вектором E поляризации в поляризованный по кругу с периодически меняющимся направлением вращения вектора E поляризации целесообразно осуществлять в электрооптическом модуляторе 23 круговой поляризации фотоэластического типа.
Вместо модулятора 23 фотоэластического типа могут быть использованы и другие типы электрооптических модуляторов, например, комбинация модулятора на основе жидких кристаллов, обеспечивающего попеременное (периодическое) получение на выходе двух взаимно ортогональных линейных поляризаций, и четвертьволновой пластинки (λ/4) из кристаллического кварца, преобразующей линейно поляризованный световой поток в поляризованный по кругу с периодически меняющимся направлением вращения вектора поляризации.
Для лучшего разделения ортогональных поляризаций в случае использования призменного поляризатора 21, изготовленного из анизотропного кристаллического материала, может быть использована спектральная щель 22, которую располагают непосредственно после призменного поляризатора 21 (Фиг.1, Фиг.2) или после электрооптического модулятора 23 круговой поляризации.
В качестве кюветы 24-p целесообразно использовать оптически проницаемую кювету, выполненную, например, в виде отдельной ячейки или в виде микроплаты с лунками, приспособленной для размещения ее в приемном устройстве 25 и термостатирования в устройстве 26 термостатирования, например, выполненном в виде терморегулятора на основе элементов Пельтье с датчиками температуры (на чертеже не показаны), При этом приемное устройство 25 представляет собой светонепроницаемый для посторонних излучений бокс, удобный для размещения и оперативной замены кювет или микроплат 24-p с исследуемыми пробами и обеспечивающий теплоизоляцию для облегчения работы устройства 26 термостатирования, включаемого по командам контроллера управления и поддерживающего температуру проб автоматически.
В качестве кюветы 24-p возможно использовать стандартную микроплату с минимальным остаточным дихроизмом ее прозрачного материала, и при этом лунки (ячейки) микроплаты должны быть приспособлены для размещения в них тестовой или исследуемой пробы с БАМ, например, в виде гелевого или пленочного образца, или исследуемой пробы с БАМ и биологически активным веществом, оптическая активность которого подлежит определению, и для облучения пробы циркулярно-поляризованным светом. Стандартная микроплата с системой ее позиционирования позволяет проводить последовательный анализ всех проб, помещенных в лунках микроплаты.
При этом, согласно изобретению, возможно, чтобы компоновка систем была выполнена в корпусе таким образом, чтобы оптическая ось 1а системы А или оптическая ось 1c системы С была расположена горизонтально (Фиг.1 и Фиг.2), а указанная съемная кювета 24-p была выполнена в виде ячейки, приспособленной для размещения в приемном устройстве 25 при вертикальном расположении в ней пробы перпендикулярно оптической оси системы.
При этом, согласно изобретению, возможно, чтобы съемная кювета 24-p была приспособлена для размещения в ней пробы с биологически активным материалом в виде раствора или гелевого/пленочного образца.
Кроме того, согласно изобретению, возможно, чтобы компоновка систем была выполнена в корпусе таким образом, чтобы оптическая ось 1а системы А или оптическая ось 1c системы С была расположена вертикально (на чертежах не показано), а указанная съемная кювета 24-p была выполнена в виде ячейки, приспособленной для ее размещения в приемном устройстве 25 при горизонтальном расположения в ней пробы перпендикулярно оптической оси системы.
Кроме того, согласно изобретению, возможно, чтобы съемная кювета 24-р была выполнена в виде микроплаты с лунками, имеющими, по меньшей мере, дно, оптически проницаемое для излучений в ультрафиолетовом и видимом диапазоне спектра, и приспособленной для ее размещения в приемном устройстве 25 при горизонтальном расположении лунок с возможностью перемещения микроплаты в горизонтальной плоскости.
При этом, согласно изобретению, возможно, чтобы съемная кювета была выполнена в виде микроплаты, приспособленной для размещения в лунках пробы, содержащей биологически активный материал в виде раствора, гелевого или пленочного образца.
В случае использования микроплат для размещения проб, приемное устройство 25 содержит устройство перемещения микроплаты в горизонтальном положении таким образом, чтобы последовательно пробы в каждой лунке были подвергнуты облучению циркулярно-поляризованным излучением.
Благодаря высокой яркости излучения светодиодов, используемых в качестве источников 7-n видимого излучения в системе А и источников 17-m видимого излучения в системе С, в качестве фотодетектора 27 вместо дорогих фотоэлектронных умножителей (например, HAMAMATSU R1464 или R7400U-04) могут быть использованы известные миниатюрные стандартные фотодиоды, например, производства РФ, например, ФД-24.
Целесообразно, чтобы в цепи фотодетектора 27, преобразующего изменения сигнала КД БАМ под действием БАВ в электрический сигнал, имелась электрическая обратная связь с целью регулирования его чувствительности, устроенная таким образом, что при любом изменении интенсивности поляризованного по кругу светового излучения, облучающего исследуемую пробу, постоянная составляющая электрического напряжения на выходе фотодетектора оставалась неизменной, при этом переменная составляющая электрического напряжения будет пропорциональна величине кругового дихроизма исследуемой пробы. Благодаря такому подходу удается понизить уровень помех, связанных с изменениями интенсивности излучения, и повысить чувствительность системы регистрации и системы в целом.
Желательно для получения устойчивого режима работы фотодетектора 27 использовать стабильный регулируемый источник 27а питания, и конструктивное выполнение фотодетектора 27, обеспечивающее надежное экранирование фотодетектора 27 от внешних электромагнитных полей и паразитной световой засветки.
Система 28 регистрации приспособлена для выделения и усиления указанного электрического сигнала фотодетектора 27 и преобразования его в цифровую форму, и может быть выполнена любым путем, известным специалисту.
Средство 29 управления выполнено с возможностью обеспечения:
- выбора режима работы системы;
- выбора типа биологически активного материала, предполагаемого к использованию;
- предоставления пользователю данных о наличии в системе источников излучения и селекторов, необходимых для последующего формирования требующихся источников излучения в соответствии с выбранным типом биологически активного материала и режимом работы системы;
- предоставления пользователю данных о наличии в памяти системы обработки известных характеристик оптического сигнала БАМ выбранного типа и диапазонов длин волн циркулярно-поляризованного излучения, вызывающих характерные сигналы КД выбранного БАМ;
- подачи управляющих команд на терморегулятор узла термостатирования кюветы 24-р (Фиг.1, Фиг.2);
- индикации наличия в приемном устройстве съемной оптически проницаемой кюветы;
- последовательного формирования и подачи в автоматическом режиме управляющих команд на указанное устройство крепления, обеспечивающих соответствующее выбранному режиму положение источников излучения и селекторов для формирования соответствующего излучающего комплекса: на изменение положения диска 5 турели 4 (система А, Фиг.1), обеспечивающих соответствующее выбранному режиму положение источников 7-n излучения и селекторов 6-i, и на выборочное включение источника 1 УФ излучения для формирования одного из УФ излучающих комплексов U-i и отключение его, или последовательное включение одного из узкополосных источников 7-n видимого излучения для формирования одного из излучающих комплексов S-n видимого излучения и отключение его (система А, Фиг.1), (или на выборочное, соответствующее выбранному режиму и количеству длин волн излучения, включение источника 13 УФ излучения (система С, Фиг.2) и одного из устройств 16-р flip-flop, необходимых для формирования одного из УФ излучающих комплексов U-k и отключение его, или последовательное включение одного из источников 17-m видимого излучения (система С, Фиг.2) и соответствующего ему одного из устройств 18-y flip-flop для формирования одного из излучающих комплексов S-m видимого излучения и отключение его (система С, Фиг.2));
- подачи управляющих команд включения и выключения линейного поляризатора 21, модулятора 22, источника 27а питания фотодетектора 27, обеспечивающих в течение заданного времени экспозиции пробы, достаточного для регистрации фотодетектором значимых изменений оптического сигнала биологически активного материала, регистрацию оптических сигналов исследуемой пробы через заданные промежутки времени;
- подачи управляющих команд на систему 28 регистрации (Фиг.1, Фиг.2) и средство обработки;
- сохранения полученных результатов измерений и вычислений в базе данных с возможностью извлечения сохраненных данных с визуализацией их для пользователя.
Прием и передача команд от средства 29 управления микроконтроллерам функциональных устройств производится через микроконтроллер системы 28 регистрации. Связь между модулями осуществляется посредством стандартного цифрового интерфейса типа I2C. Схемотехническое решение предоставляет возможность использования для управления системой как внешнего, так и встроенного компьютера по интерфейсу USB.
При этом средство 29 управления может быть выполнено в виде компактного персонального компьютера (ноутбука), встроенного микрокомпьютера или иного аналогичного средства с соответствующим программным обеспечением.
При этом программное обеспечение позволяет осуществлять управление режимами работы систем А или С согласно изобретению, визуальное отображение результатов измерения на экране компьютера, сохранение и документирование результатов измерений, выполнение различных действий по обработке экспериментальных результатов (сглаживание, накопление, сравнение с другими результатами), калибровку аппаратной части системы, проведение необходимых вычислений и сравнительных оценок с помощью имеющихся в базах данных или построенных графиков и зависимостей.
При этом средство обработки приспособлено для визуализации в заданном графическом или табличном или ином виде результатов регистрации оптических сигналов исследуемой пробы и результатов вычислений, произведенных:
- для определения в первом и втором режимах способности аналитической системы измерять круговой дихроизм веществ путем выявления соответствия между характеристиками регистрируемого системой оптического сигнала и известными характеристиками кругового дихроизма эталона, имеющимися в базе данных средства обработки;
- для определения в третьем режиме оптических свойств и качества биологически активного материала, содержащего молекулярные конструкции ДНК, на основе результатов регистрации оптического сигнала кругового дихроизма пробы путем сравнения результатов измерения характеристик кругового дихроизма исследуемого биологически активного материала с заданными характеристиками, соответствующими требуемым параметрам оптического сигнала биологически активного материала выбранного типа;
- для определения в четвертом режиме коэффициента диффузии биологически активного вещества в биологически активный материал и динамики трансформации молекулярных конструкций ДНК при взаимодействии с биологически активным веществом на основе результатов измерения величины регистрируемого сигнала кругового дихроизма биологически активного материала в пробе путем вычисления величины и динамики изменения указанного регистрируемого сигнала в течение времени взаимодействия биологически активного материала с биологически активным веществом;
- для определения в пятом режиме калибровочной зависимости величины изменения регистрируемого оптического сигнала кругового дихроизма биодатчика от величины концентрации биологически активного вещества, подлежащего определению, в указанных N калибровочных растворах на основе результатов регистрации величины сигнала кругового дихроизма биодатчика в N калибровочных пробах через заданные интервалы времени путем вычисления величины изменений сигналов кругового дихроизма биодатчика, зарегистрированных через определенный заданный интервал времени и соответствующих разным концентрациям биологически активного вещества;
- для определения в шестом режиме наличия и концентрации определяемого биологически активного вещества на основе результатов регистрации величины сигнала кругового дихроизма биодатчика в исследуемой пробе через заданные интервалы времени путем вычисления величины изменения сигнала кругового дихроизма биодатчика, зарегистрированного через определенный заданный интервал времени, и сравнения этой величины с величинами изменений сигналов кругового дихроизма калибровочной зависимости биодатчика, определенной предварительно для биодатчика выбранного типа в пятом режиме функционирования системы, зарегистрированных через такой же интервал времени для разных концентраций биологически активного вещества.
Контроллер управления системы 29 управления выполнен известным образом и обеспечивает передачу команд включения/выключения узлов системы А или С согласно изобретению.
Многофункциональная аналитическая система А (Фиг.1) и многофункциональная аналитическая система С (Фиг.2) работают следующим образом.
После включения средства 29 управления и выбора режима работы системы и вида используемого БАМ (биодатчика) и БАВ по сигналу средства 29 управления в системах А или С автоматически формируются необходимые излучающие комплексы путем включения источников питания и изменения положения элементов систем А или С.
Например, в системе А: для формирования УФ излучающих комплексов U-i селектор 6-i, размещенный на диске 5 турели 4, соответствующий характерной (или прогнозируемой) для выбранного БАМ длине волны КД, приводят в рабочее положение на оптической оси 1а и включают источник 1 УФ излучения; для формирования излучающих комплексов S-n путем поворота диска 5 турели 4 источник 7-n видимого излучения, соответствующий выбранному режиму и характерной (или прогнозируемой) для выбранного БАМ длине волны КД, приводят в рабочее положение на оптической оси 1а и включают источник 1-п видимого излучения.
Например, в системе С: для формирования УФ излучающих комплексов U-i, приводится в рабочее положение устройство 16-p flip-flop, размещенный на оптической оси 1 с, соответствующий характерной (или прогнозируемой) для выбранного БАМ длине волны КД, и включается источник 13 УФ излучения; для формирования излучающих комплексов S-m включается источник 17-m видимого излучения, соответствующий выбранному режиму и характерной (или прогнозируемой) для выбранного БАМ длине волны КД, и приводится в рабочее положение соответствующее ему устройство 18-y flip-flop, обеспечивающее передачу излучения через устройство 19 flip-flop по оптической оси 1c.
1
2
Излучение УФ диапазона или видимого диапазона, сформированное описанным выше образом, поступает в линейный поляризатор 21, обеспечивающий формирование линейно поляризованного светового потока с линейным вектором E поляризации, после прохождения которого световой поток становится линейно поляризованным. Затем спектральная щель 22 выделяет из потока линейно поляризованного излучения только составляющую, соответствующую вышедшему из линейного поляризатора 21 «обыкновенному» лучу. Прошедшее спектральную щель 22 излучение попадает в модулятор 23 круговой поляризации, обеспечивающий преобразование указанного линейно поляризованного светового потока в циркулярно-поляризованный световой поток с периодически изменяющимся направлением вращения вектора E поляризации. Спектральная щель 22 может располагаться и после модулятора 23 круговой поляризации, обеспечивая пропускание только циркулярно-поляризованного светового потока, полученного путем преобразования в модуляторе 23 линейно поляризованного «обыкновенного» луча.
Пройдя через оптически проницаемую кювету 24-p с размещенной в нем пробой, при наличии в пробе химического эталона оптической активности КД или БАМ, проявляющего свойства КД, световой поток становится модулированным по интенсивности.
R
L
R
L
R
L
Под действием света на выходах фотодетектора 27 возникает электрический сигнал, причем на одном его выходе регистрируется переменная составляющая, пропорциональная величине изменения ΔA амплитуды сигнала, обусловленного аномальной оптической активностью химического или биологического эталона оптической активности или БАМ: ΔA=A-A, где A и A, соответственно, поглощение излучения с правой и левой циркулярной поляризацией, а на втором его выходе - постоянная составляющая, пропорциональная величине сигнала, характеризующего поглощение биоматериала пробы: A≈A≈A, при этом частота переменной составляющей равна частоте модуляции круговой поляризации излучения.
При этом в указанных системах А и С указанная постоянная составляющая поддерживается на постоянном уровне путем регулирования напряжения питания фотодетектора 27, для чего сигнал постоянной составляющей с выхода фотодетектора 27 вводится на вход источника 27а питания фотодетектора, то есть осуществляется режим стабилизации постоянной составляющей с помощью отрицательной обратной связи по постоянной составляющей с одновременным измерением переменной составляющей, что эквивалентно измерению их отношения ΔA/A, а значит, измерению сигнала кругового дихроизма пробы поочередно на выбранных длинах волн.
С первого выхода фотодетектора 27 соответствующий величине КД электрический сигнал поступает на первый вход системы 28 регистрации, на второй вход которой подается опорный сигнал с частотой модуляции круговой поляризации. Система 28 регистрации усиливает сигналы, преобразует их в постоянный ток и подает в средство обработки для обработки по определенному алгоритму. Результирующие сигналы КД проб на используемых длинах волн, рассчитанные с учетом фоновых сигналов КД, сохраняется в памяти средства обработки.
Применение многофункциональной аналитической системы согласно изобретению проиллюстрировано далее на примерах осуществления режимов ее работы с использованием различных БАМ с известными характеристиками их сигналов КД. При этом система А или система С приспособлены для формирования излучающих комплексов, обеспечивающих излучение на длинах волн, соответствующих длинам волн в области кругового дихроизма используемых в системе А или С эталонов оптической активности кругового дихроизма или БАМ, например, биодатчиков, проявляющих свойства КД при облучении излучением в ультрафиолетовой области спектра и/или в видимой области спектра на характерных для них длинах волн.
Первый режим тестирования системы А или системы С может быть осуществлен при размещении в приемном устройстве 25 оптически проницаемой съемной кюветы 24-1 с размещенной в ней тестовой пробой 24а-1, содержащей эталон оптической активности, например, выполненный в виде раствора химического соединения, проявляющего при облучении на характерной для него длине волны свойства кругового дихроизма: например, водного раствора n-пропиламмониевой соли d-10 камфорсульфоновой кислоты (далее КСК), проявляющего свойства кругового дихроизма в УФ области спектра с максимумом сигнала на длине волны 290 нм.
При этом в системе А автоматически формируется излучающий комплекс U-1, излучающий на длине волны 290 нм, с помощью включения источника 1 УФ излучения в виде дейтериевой лампы и установления имеющегося на диска 5 турели 4 селектора 6-1, выполненного в виде узкополосного интерференционного фильтра, формирующего излучение на длине волны 290 нм, на одной оптической оси 1а системы А с зеркалом 2 и коллимирующей линзой 3.
В системе С также автоматически формируется излучающий комплекс U-1, излучающий на длине волны 290 нм, с помощью включения источника 13 УФ излучения в виде дейтериевой лампы и установления интерференционного фильтра 16а-1 устройства 16-1 flip-flop в рабочее положение, обеспечивающее пропускание из спектра излучения, поступающего от источника 13 УФ излучения через зеркало 14 и коллимирующую линзу 15, только излучения с длиной волны 290 нм и направление этого излучения далее по оптической оси 1c системы С.
Первый режим тестирования системы может быть также осуществлен при размещении в приемном устройстве 25 оптически проницаемой съемной кюветы 24-2 с размещенной в ней тестовой пробой 24а-2, содержащей эталон оптической активности, выполненный в виде БАМ, проявляющего свойства кругового дихроизма при облучении на характерных для эталона длинах волн в ультрафиолетовой области спектра.
1
1
2
2
1
2
При этом в качестве такого эталона может быть использован биологически активный материал в виде жидкокристаллического биодатчика, представляющего собой дисперсную фазу из линейных двухцепочечных молекул ДНК - линейной В-формы ДНК в водно-солевом растворе, проявляющих в исходном состоянии свойства КД в области поглощения азотистых оснований ДНК в ультрафиолетовой области спектра с максимумом ΔA на длине волны λ=260 нм (RU, 2032895, С), характеристики КД которого показаны в виде кривой 1 на Фиг.3. Или в качестве эталона могут быть использованы жидкокристаллические биодатчики для определения биологически активных веществ, например, содержащие жидкие кристаллы ДНК холестерического типа, фиксированные в структуре жидкокристаллической дисперсии, полученной путем фазового исключения ДНК из водно-солевых растворов полиэтиленгликоля, и представляющие собой распределенную в водно-полимерном матриксе дисперсную фазу из линейных двухцепочных молекул ДНК, сшитых молекулами субстрата для БАВ, например, водно-солевой раствор комплекса ДНК-стеллин B с максимумом ΔA сигнала при облучении в ультрафиолетовой области спектра на длине волны λ=270 нм (RU, 2032895, С), характеристики КД которого показаны в виде кривой 2 на Фиг.3. При этом для указанных БАМ, имеющих упорядоченное расположение соседних молекул ДНК в структуре жидкокристаллической дисперсии, наличие интенсивной отрицательной полосы КД в ультрафиолетовом спектре с указанными максимумами (кривые 1 и 2, Фиг.3) является характерным, а амплитуды ΔA и ΔA кривых 1 и 2 различны из-за различия конструкции указанных выше жидкокристаллических биодатчиков.
1
2
1
2
В системе А после размещения эталона в съемной кювете 24-2 и выбора оператором первого режима работы системы А для облучения указанной тестовой пробы 24а-2 автоматически формируется излучающий комплекс U-2, излучающий на длине волны λ=260 нм (или, в соответствии с выбранным эталоном, - излучающий комплекс U-3, излучающий на длине волны λ=270 нм) с помощью включения источника 1 УФ излучения в виде дейтериевой лампы и установления имеющегося на диска 5 турели 4 селектора 6-2, выполненного в виде узкополосного интерференционного фильтра, формирующего излучение на длине волны λ=260 нм (или имеющегося на диске 5 селектора 6-3, выполненного в виде узкополосного интерференционного фильтра, формирующего излучение на длине волны λ=270 нм), на одной оптической оси 1а системы А (Фиг.1) с зеркалом 2 и коллимирующей линзой 3.
1
2
2
В системе С после размещения эталона в съемной кювете 24-2 и выбора оператором первого режима работы системы С для облучения указанной тестовой пробы 24а-2 также автоматически формируется излучающий комплекс U-2, излучающий на длине волны λ=260 нм (или, в соответствии с выбранным эталоном, формируется излучающий комплекс U-3, излучающий на длине волны λ=270 нм), с помощью установления интерференционного фильтра 16а-2 устройства 16-2 flip-flop в рабочее положение (или установления соответственно эталону интерференционного фильтра 16а-3 устройства 16-5 flip-flop в рабочее положение), обеспечивающее пропускание из спектра излучения, поступающего от источника 13 УФ излучения через зеркало 14 и коллимирующую линзу 15, только длины волны 260 нм (или только длины волны λ=270 нм, соответственно эталону), включения источника 13 УФ излучения в виде дейтериевой лампы и направление этого излучения далее по оптической оси 1c системы С.
При этом при работе систем А или С в первом режиме в системе A и в системе C при облучении тестовых проб 24а-1 или тестовых проб 24а-2 циркулярно поляризованным УФ излучением регистрируют с помощью фотодетектора 27 оптический сигнал кругового дихроизма, выделяют и усиливают указанный электрический сигнал фотодетектора 27 и преобразуют его в цифровую форму с помощью цифровой системы 28 регистрации. Затем сигнал в цифровой форме поступает в средство 29 управления, в котором с помощью средства 30 обработки выявляют с помощью вычислений соответствие между характеристиками зарегистрированного оптического сигнала и известными характеристиками кругового дихроизма эталона для определения способности аналитической системы А или С измерять круговой дихроизм веществ в ультрафиолетовой области, визуализируют в заданном графическом или табличном виде результат регистрации и результат вычислений, например, в виде графика, как показано на Фиг.3 (м.б., спектрограммы), и делают вывод о работоспособности системы выявлять и регистрировать сигналы кругового дихроизма исследуемых проб, вычислять их характеристики и визуализировать их с достаточной степенью достоверности, или об отсутствии такой способности, например, с помощью индикации различного цвета, что приводит к необходимости настройки или ремонта системы А или С.
Второй режим тестирования системы может быть осуществлен при размещении в приемном устройстве 25 оптически проницаемой съемной кюветы 24-3 с размещенной в ней тестовой пробой 24а-3, содержащей эталон оптической активности в видимом диапазоне спектра, выполненный в виде биологически активного материала, проявляющего при облучении на характерных для эталона длинах волн свойства кругового дихроизма.
2+
2+
2+
2+
3
3
max
Например, режим может быть осуществлен при размещении в кювете тестовой пробы 24а-3, содержащей в качестве эталона оптической активности биологически активный материал, выполненный в виде интегрального биодатчика, содержащего жидкокристаллическую дисперсию линейных двухцепочечных молекул ДНК, упорядоченных в пространстве и "сшитых" мостиками «антрациклиновый антибиотик-Cu-антрациклиновый антибиотик-Cu-…-Cu-антрациклиновый антибиотик-Cu-антрациклиновый антибиотик» в водно-солевом растворе полиэтиленгликоля (RU, 2139933, С), с известными характеристиками кругового дихроизма в видимой области спектра, имеющими вид, показанный в виде кривой 3 на Фиг.4. При этом в известном варианте выполнения при использовании в качестве антрациклинового антибиотика дауномицина (ДАУ) эталон характеризуется проявлением свойств кругового дихроизма с максимумом ΔA излучения при облучении на длине волны λ=505 нм (кривая 3 на Фиг.4), а в других известных вариантах выполнения указанного интегрального биодатчика при использовании в качестве антрациклинового антибиотика адриамицина или 4′-дезоксидоксорубицина, или 4′-дезокси-4′-иододоксорубицина (RU, 2139933, C) характеризуется проявлением свойств КД с максимумом излучения при облучении на длине волны λ=515 нм, 520 нм и 525 нм, соответственно (на Фиг.4 не показаны). Присущие указанным интегральным биодатчикам характеристики сигнала КД при облучении в ультрафиолетовой области спектра в этом режиме считаются известными (измеренными).
3
3
Соответственно, при использовании в качестве эталонов оптической активности вышеуказанных интегральных датчиков, в системе А (или в системе С) автоматически формируется излучающий комплекс S-1 с длиной волны λ=505 нм (или S-2 с длиной волны 515 нм, или S-3 с длиной волны 520 нм, или S-4 с длиной волны 525 нм) видимого излучения путем подачи команд поворота диска 5 турели 4, в результате выполнения которых имеющийся на диске 5 узкополосный источник 7-1 излучения с длиной волны λ=505 нм, выполненный в виде узкополосного диодного излучателя, снабженного коллимирующей линзой и селектором (или источник 7-2 с длиной волны 515 нм, или источник 7-3 с длиной волны 520 нм, или источник 7-4 с длиной волны 525 нм, соответственно), устанавливается в рабочее положение на оптической оси 1а, после чего указанный источник 7-1 излучения (или источник 7-2 или источник 7-3 или источник 7-4) автоматически включается.
3
Аналогично в системе С для формирования излучающего комплекса S-1 с длиной волны λ=505 нм (или S-2 с длиной волны 515 нм, или S-3 с длиной волны 520 нм, или S-4 с длиной волны 525 нм) включается источник 17-1 видимого излучения с длиной волны 505 нм, выполненный в виде узкополосного диодного излучателя, снабженного коллимирующей линзой и селектором (или источник 17-2 с длиной волны 515 нм, или источник 17-3 с длиной волны 520 нм, или источник 17-4 с длиной волны 525 нм, соответственно), и приводится в рабочее положение соответствующее ему устройство 18-1 flip-flop (или 18-2, или 18-3, или 18-4, соответственно), обеспечивающее передачу излучения через устройство 19 flip-flop по оптической оси 1c.
3
При облучении тестовой пробы 24а-3 циркулярно-поляризованным видимым излучением на требуемой длине волны (505 нм или 515 нм или 520 нм или 525 нм) регистрируют с помощью фотодетектора 27 оптический сигнал кругового дихроизма БАМ, выделяют и усиливают электрический сигнал фото детектора 27 и преобразуют его в цифровую форму с помощью цифровой системы 28 регистрации. Затем сигнал в цифровой форме поступает в средство 29 управления, в котором с помощью средства 30 обработки выявляют с помощью вычислений соответствие между характеристиками зарегистрированного системой оптического сигнала и его амплитудой ΔA и известными характеристиками кругового дихроизма эталона для определения способности аналитической системы A или системы C измерять круговой дихроизм веществ в видимом диапазоне спектра, визуализируют в заданном графическом или табличном виде результат регистрации и результат вычислений, и делают вывод о наличии способности системы выявлять, регистрировать и визуализировать сигналы кругового дихроизма в исследуемых пробах с достаточной степенью достоверности, или об отсутствии такой способности, что приводит к необходимости настройки или ремонта системы.
Третий режим тестирования оптических свойств биологически активного материала, согласно изобретению, может быть осуществлен при размещении в в приемном устройстве 25 оптически проницаемой съемной кюветы 24-4 с размещенной в ней исследуемой пробой 24а-4, содержащей тестируемый БАМ в исходном состоянии или в контакте с БАВ, для которого БАМ является субстратом.
При этом, согласно изобретению, система может быть приспособлена в третьем режиме для тестирования оптических свойств БАМ в исходном состоянии путем определения характеристик его сигнала КД при облучении циркулярно-поляризованным излучением в ультрафиолетовом диапазоне спектра и/или в видимом диапазоне спектра.
Кроме того, согласно изобретению, система может быть приспособлена в третьем режиме для тестирования оптических свойств БАМ при облучении в видимом диапазоне спектра или в ультрафиолетовом диапазоне спектра с целью определения уровня чувствительности БАМ в отношении БАВ, для которого указанный БАМ является субстратом, путем определения количества указанного БАВ, в результате взаимодействия с которым наблюдается достоверное изменение величины амплитуды сигнала КД БАМ относительно максимума амплитуды, определенного в исходном состоянии БАМ.
Кроме того, согласно изобретению, система может быть приспособлена в третьем режиме для тестирования оптических свойств БАМ в видимом диапазоне спектра и в ультрафиолетовом диапазоне спектра путем определения его рабочего диапазона в отношении БАВ, для которого указанный БАМ является субстратом, путем определения диапазона количеств указанного БАВ, в результате взаимодействия с которым наблюдается достоверное изменение амплитуды сигнала кругового дихроизма биологически активного материала от максимума амплитуды в исходном состоянии до полного исчезновения сигнала кругового дихроизма при облучении.
При этом могут быть проверены тестированием, например:
1) БАМ, содержащие молекулярные конструкции ДНК в виде молекул ДНК в упорядоченном их расположении, вследствие этого в исходном состоянии проявляющие свойства КД при облучении их циркулярно-поляризованным излучением в ультрафиолетовой области спектра - в области поглощения азотистых оснований ДНК, как описано выше для первого режима с использованием возможных эталонов оптической активности;
2) БАМ, содержащие молекулярные конструкции ДНК в виде молекул ДНК в упорядоченном их расположении, дополнительно сшитых «мостиками», проявляющие в исходном состоянии аномальные свойства КД при облучении их циркулярно-поляризованным излучением в ультрафиолетовой области спектра - в области поглощения азотистых оснований ДНК и аномальные свойства КД при облучении их в видимой области спектра - в области поглощения конструктивных элементов «мостиков»;
3) БАМ, содержащие молекулярные конструкции ДНК с предполагаемыми оптическими свойствами аномального КД в исходном состоянии;
4) БАМ, указанные выше в пп.1, 2, 3, при их контакте с БАВ, предположительно вступающие во взаимодействие с БАМ с изменением характеристик оптического сигнала БАМ.
4
5
7
6
При этом в системах А или С по команде системы 29 управления автоматически последовательно формируются излучающие комплексы U-k, излучающие каждый на дискретной длине волны в ультрафиолетовом диапазоне спектра в течение заданного времени экспозиции, в количестве, достаточном для определения длины волны и значения максимума сигнала кругового дихроизма БАМ в ультрафиолетовом диапазоне: например, как показано Фиг.5 (кривая 4), облучение пробы осуществляют в диапазоне 230-350 нм последовательно на длинах волн λ, λ, λ, λ.
4
5
6
7
Например, в системе А это осуществляется путем подачи системой 29 управления команды включения источника 1 УФ излучения в виде дейтериевой лампы и последовательных команд поворота диска 5 турели 4, достаточного для последовательного формирования излучающих комплексов U-k, излучающих каждый на дискретной длине волны в ультрафиолетовом диапазоне спектра, путем последовательной установки размещенного на диске 5 селектора 6-4, выполненного в виде узкополосного интерференционного фильтра, формирующего излучение на длине волны λ, или размещенного на диске 5 селектора 6-5, формирующего излучение на длине волны λ, или размещенного на диске 5 селектора 6-6, формирующего излучение на длине волны λ, или размещенного на диске 5 селектора 6-7, формирующего излучение на длине волны λ, на одной оптической оси 1а системы А (Фиг.1) с зеркалом 2 и коллимирующей линзой 3.
8
9
10
11
12
Или в системах А или С автоматически последовательно формируются излучающие комплексы S-k, излучающие каждый на дискретной длине волны в видимом диапазоне спектра в течение заданного времени, в количестве, достаточном для определения длины волны и значения максимума сигнала кругового дихроизма БАМ, облучение пробы осуществляют на длинах волн λ, λ, λ, λ, λ.
8
9
10
11
2
Например, в системе А это осуществляется путем подачи системой 29 управления команд включения и выключения размещенных на диске 5 турели 4 узкополосных источников видимого излучения и соответствующих команд поворота диска 5 турели 4, в результате которых имеющийся на диске 5 узкополосный источник 7-8 излучения с длиной волны λ, выполненный в виде узкополосного диодного излучателя, снабженного коллимирующей линзой и селектором, или источник 7-9 с длиной волны λ, или источник 7-10 с длиной волны λ, или источник 7-11 с длиной волны λ или источник 7-12 с длиной волны λ устанавливается в рабочее положение на одной оптической оси 1а системы А (Фиг.1) с зеркалом 2 и коллимирующей линзой 3,.
Например, система может быть приспособлена для работы с пробами, содержащими в качестве тестируемого биологически активного материала, указанного выше в п.2, интегральные биодатчики, содержащие сшитые наномостиками «антибиотик-ион металла-антибиотик-ион металла-…-ион металл-антибиотик-ион металла-антибиотик» частицы лиотропной холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, содержащие в составе наномостиков антибиотики антрациклиновой группы, способные к образованию хелатных комплексов и содержащие атомы кислорода в положениях 5, 6, 11 и 12, и в качестве чувствительного элемента - ионы металла, способного к образованию плоских полимерных хелатных комплексов, и характеризующиеся аномальной оптической активностью при облучении в ультрафиолетовой области спектра, проявляемой в виде интенсивной полосы в спектре КД в области поглощения азотистых оснований ДНК на длине волны в диапазоне 260-270 нм, и дополнительной аномальной оптической активностью в виде интенсивной полосы в спектре КД в области поглощения антибиотика на длине волны в диапазоне 505-525 нм (RU, 2139933, C).
2+
2+
2+
2+
Например, система может быть приспособлена для работы с пробами, содержащими в качестве тестируемого БАМ интегральные биодатчики, содержащие частицы лиотропной холестерической жидкокристаллической дисперсии молекул ДНК, упорядоченных в пространстве и "сшитых" мостиками, содержащими антибиотик дауномицин (ДАУ) и, в качестве субстрата для БАВ, - атомы меди в комплексе «ДАУ-Cu-ДАУ-Cu-…-Cu-ДАУ-Cu-ДАУ» в водно-солевом растворе полиэтиленгликоля, характеризующиеся аномальной оптической активностью при облучении в ультрафиолетовой области спектра, проявляемой в виде интенсивной полосы в спектре КД в области поглощения азотистых оснований ДНК на длине волны 260 нм, и дополнительной аномальной оптической активностью в виде интенсивной полосы в спектре КД в области поглощения антибиотика ДАУ на длине волны 505 нм (RU, 2139933, С).
V max
11
UV max
6
На Фиг.5 показаны результаты обработки измеренных величин аномального оптического сигнала КД этих интегральных биодатчиков в исходном состоянии при облучении в видимой области спектра (кривая 5) с максимумом ΔA на длине волны λ=505 нм, и при облучении в ультрафиолетовой области спектра (кривая 4) с максимумом ΔA на длине волны λ=260 нм, что соответствует их паспортным данным в исходном состоянии. При этом величина оптического сигнала КД биодатчика в ультрафиолетовой области спектра в исходном состоянии значительно (более чем в 10 раз) превышает амплитуду сигнала в видимом диапазоне спектра, что свидетельствует о более высокой чувствительности биодатчика в УФ области.
11
p
pp
p
pp
p
11
pp
При этом, согласно изобретению, целесообразно пробу, содержащую БАМ, облучать в видимом диапазоне спектра излучением, по меньшей мере, на трех длинах волн: например, на трех длинах волн (кривая 5 на Фиг.5), из которых первая длина волны (λ=505 нм) соответствует максимуму сигнала в спектре КД БАМ, вторая длина волны (λ=410 нм) короче, а третья длина волны (λ=700 нм) больше длины волны, соответствующей максимуму указанного сигнала, причем на второй (λ) и третьей (λ) длинах волн регистрируемый сигнал КД БАМ минимален, и при этом система согласно изобретению выполнена с возможностью формирования последовательно соответствующих трех излучающих комплексов S-k, излучающих на длинах волн λ, λ, λ.
Последующее добавление в исследуемую пробу, содержащую указанные выше в п.1, 2, 3 БАМ, известного БАВ, в зависимости от количества БАВ, контактирующего с БАМ в пробе, может привести к частичному или полному разрушению БАМ или показать инертность БАМ к БАВ.
2+
2+
2+
2+
При этом, например, для указанных интегральных биодатчиков, содержащих частицы лиотропной холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, упорядоченной в пространстве и "сшитой" мостиками «ДАУ-Cu-ДАУ-Cu-…-Cu-ДАУ-Cu-ДАУ» (RU, 2139933, C), характеризующихся аномальной оптической активностью при облучении в ультрафиолетовой области спектра, проявляемой в виде интенсивной полосы в спектре кругового дихроизма в области поглощения азотистых оснований ДНК на длине волны λ~260 нм, и дополнительной аномальной оптической активностью в области поглощения антибиотика ДАУ:
V
V max
- взаимодействие мостиков БАМ с БАВ в известной минимальной концентрации, например, с белком сывороточного альбумина, гипорамином, гомоцистеином или митоксантроном, приводит к соответствующему достоверному изменению величины максимума сигналов КД в видимой области спектра в сторону ее уменьшения ΔA<ΔA (Фиг.5, кривая 6), что позволяет определить уровень чувствительности БАМ к этому БАВ;
V
- взаимодействие мостиков БАМ с БАВ в известной концентрации, превышающей уровень чувствительности БАМ, например, с белком сывороточного альбумина, гипорамином, гомоцистеином или митоксантроном, может приводить к исчезновению сигнала КД в видимой области спектра ΔA=0 (Фиг.5), что позволяет определить диапазон рабочих концентраций БАВ для использованного количества БАМ;
UV
- нарушение упорядоченного расположения молекул ДНК в БАМ при его взаимодействии с БАВ, сопровождаемое исчезновением сигнала КД БАМ в ультрафиолетовой области спектра ΔA→0 (Фиг.5, кривая 4), позволяет определить количество БАВ, приводящее к полному разрушению структуры БАМ в использованном количестве БАМ.
- отсутствие подобного описанному выше взаимодействия БАМ с БАВ, выражающееся в отсутствии изменений величины сигнала КД БАМ в исходном состоянии позволяет сделать заключение об инертности БАМ к указанному БАВ.
Полученные оптические характеристики могут служить для определения и оценки уровня чувствительности БАМ, например, указанных выше интегральных биодатчиков, с определением диапазона количеств БАВ, определяемых биодатчиком при использовании биодатчика по назначению.
Результат тестирования, полученный с помощью системы согласно изобретению в третьем режиме ее работы путем регистрации, измерения и обработки характеристик оптического сигнала кругового дихроизма БАМ, может служить «паспортом» биодатчика и в дальнейшем использоваться в качестве исходных характеристик биодатчика этого типа.
Кроме того, полученный результат тестирования может быть использован для аттестации исследуемого биодатчика как биодатчика, соответствующего характеристикам и качеству биодатчиков определенного типа.
-3
Например, тестирование БАМ, представляющего собой биодатчик, содержащий лиотропную жидкокристаллическую дисперсию комплекса «ДНК-поликонидин» в водно-солевом растворе полиэтиленгликоля (RU, 2123008, C1), результаты которого представлены на Фиг.6, показало изменение амплитуды сигнала КД в зависимости от длины волны облучения λ в диапазоне 230-350 нм: кривая 7 - изменение амплитуды сигнала КД в исходном состоянии БАМ с максимумом амплитуды на длине волны 275 нм (до контакта указанного БАМ с БАВ), кривая 8 - изменение амплитуды сигнала КД БАМ после контакта с БАВ с максимумом амплитуды на длине волны 275 нм (гепарин в концентрации 2,5×10 мг/мл).
-3
Тестирование БАМ, содержащих частицы холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК (RU, 2123008, C1), не сшитой наномостиками, результаты которого приведены на Фиг.6, показало изменение амплитуды сигнала КД при длинах волн облучения λ в диапазоне 230-350 нм: кривая 9 - изменение амплитуды сигнала КД в исходном состоянии БАМ с максимумом амплитуды на длине волны 270 нм (до контакта указанного БАМ с БАВ). Однако тестирование этого БАМ при контакте БАМ с БАВ (гепарин в концентрации 2,5×10 мг/мл) не показало изменения величины амплитуды сигнала КД БАМ, положение максимума амплитуды на длине волны 270 нм осталось неизменным (кривая 10 Фиг.6), что позволяет сделать заключение об инертности указанного БАМ - холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК - к указанному БАВ - гепарину.
Четвертый режим определения скорости диффузии БАВ в БАМ и/или исследования динамики трансформации молекулярных конструкций НК при взаимодействии с БАВ, может быть осуществлен при размещении в приемном устройстве 25 оптически проницаемой съемной кюветы 24-5 с исследуемой пробой 24а-5, содержащей указанное БАВ в контакте с указанным БАМ, выполненном в виде биодатчика на основе молекулярных конструкций НК, содержащего субстрат для БАВ и проявляющего в исходном состоянии свойства КД при облучении циркулярно-поляризованным излучением на длинах волн, характерных для указанного биодатчика, и изменяющего эти свойства при взаимодействии с указанным БАВ. При этом биодатчик предварительно подвергают тестированию в системах А или С в третьем режиме в контакте с известной концентрацией БАВ для определения длин волн, на которых оптическая активность КД биодатчика в исходном состоянии максимальна.
Для работы в четвертом режиме системы А и С приспособлены для облучения пробы на характерных длинах волн КД биодатчика и измерения параметров КД биодатчика в контакте с раствором БАВ в известной концентрации, которую выбирают ниже концентрации БАВ, приводящей к полному разрушению биодатчика и исчезновению сигнала КД биодатчика.
При этом обеспечивают формирование и работу излучающих комплексов, излучающих на характерных длинах волн КД биодатчика в течение заданного времени экспозиции, определение характеристик КД биодатчика путем измерения величины максимальной амплитуды ΔA сигнала КД биодатчика до контакта с БАВ и после полного проникновения БАВ в молекулярные структуры биодатчика, при этом фиксируют время прекращения взаимодействия биодатчика с БАВ по моменту прекращения изменения амплитуды сигнала КД пробы.
Кроме того, системы А или С согласно изобретению также приспособлены для измерения изменений амплитуды сигнала КД пробы через определенные промежутки времени ΔT (время экспозиции) после начала контакта раствора БАВ с биодатчиком в пробе, по мере разрушения молекулярных конструкций биодатчика, что позволяет проводить исследования динамики трансформации молекулярных конструкций ДНК БАМ при взаимодействии с БАВ.
Вычисление скорости диффузии БАВ в биодатчик и скорость разрушения биодатчика в зависимости от заданного количества БАВ в пробе производится компьютером средства обработки на основании результатов, полученных при измерении величины изменений сигнала КД, регистрируемого до и после обработки биодатчика водным раствором БАВ, то есть, измеряя ΔA исходной пробы после полного проникновения (полной диффузии) БАВ в биодатчик или через определенные промежутки времени ΔT (время экспозиции) после начала обработки биоматериала раствором БАВ. Результаты предоставляются пользователю в текстовом или графическом виде. Такие возможности системы согласно изобретению позволяют использовать ее также для определения динамики транспорта БАВ в молекулярные конструкции НК.
2+
2+
2+
2+
UV
max
На Фиг.7 показаны результаты измерения величины сигнала КД интегральных биодатчиков, содержащих частицы лиотропной холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, упорядоченной в пространстве и "сшитой" мостиками, содержащими антибиотик дауномицин (ДАУ) и, в качестве субстрата для БАВ, - атомы меди в комплексе «ДАУ-Cu-ДАУ-Cu-…-Cu-ДАУ-Cu-ДАУ» в водно-солевом растворе полиэтиленгликоля (RU, 2139933, С), характеризующихся в исходном состоянии аномальной оптической активностью при облучении в ультрафиолетовой области спектра, проявляемой в виде интенсивной полосы в спектре КД в области поглощения азотистых оснований ДНК на длине волны λ=260 нм (кривая 14), и дополнительной аномальной оптической активностью в виде интенсивной полосы в спектре кругового дихроизма в области поглощения антибиотика на длине волны λ=505 нм (кривая 11), и изменяющих величину сигнала КД при взаимодействии с водным раствором белка сывороточного альбумина (далее БСА) в известной выбранной концентрации 6,0 мкг/мл.
max
p
pp
При этом в системах А или С по команде системы 29 управления в третьем режиме обеспечивается автоматическое поочередное формирование трех излучающих комплексов S-k в видимом диапазоне спектра, излучающих в течение заданного короткого промежутка времени на дискретной длине волны λ=505 нм, соответствующей известной длине волны максимума интенсивной полосы сигнала КД в исходном состоянии биодатчика в области поглощения ДАУ, на длине волны λ=460 нм и на длине λ=680 нм, и чередующееся с ними автоматическое формирование одного излучающего комплекса U-k, излучающего на дискретной длине волны λ=260 нм в ультрафиолетовом диапазоне спектра, а также поочередная регистрация сигнала КД пробы и измерение величины сигнала КД пробы в исходном состоянии и затем - спустя определенный интервал времени после контакта биодатчика с БСА, например, через 10 мин и через 60 мин.
10
60
2+
Амплитуда А отрицательной полосы в спектре КД, отражающей наличие "сшивок" между соседними молекулами ДНК в составе биодатчика в исходном его состоянии (кривая 11 на Фиг.7), при добавлении водного раствора БСА в концентрации, например, 6,0 мкг/мл, резко уменьшается за первые 10 мин. (ΔA, кривая 12 на Фиг.7), медленнее - за последующие 50 мин взаимодействия биодатчика с БСА (ΔA, кривая 13 на Фиг.7), а через 80 мин взаимодействия биодатчика с БСА сигнал КД в видимой области спектра отсутствует. Это означает, что обработка описанного выше биодатчика (RU, 2139933, С) БСА приводит к разрушению "сшивок", что обусловлено образованием в пробе более прочных комплексов ионов Cu с молекулами БСА и, следовательно, "уходом" ионов Си из состава "сшивки". При этом неизменность величины сигнала КД в области поглощения азотистых оснований ДНК (кривая 14 на Фиг.7) свидетельствует о том, что БСА в используемой концентрации не вызвал разрушения собственно молекул ДНК. Изменение величины амплитуды сигнала КД в ультрафиолетовой области спектра или исчезновение этого сигнала будет обусловлено разрушением молекул ДНК биодатчика.
Система обработки приспособлена для обеспечения в четвертом режиме определения коэффициента диффузии БАВ в БАМ и динамики трансформации молекулярных конструкций ДНК при взаимодействии с БАВ на основе результатов измерения величины регистрируемого сигнала КД БАМ пробы и путем вычисления величины и динамики изменения величины регистрируемого сигнала в течение времени взаимодействия БАМ с БАВ.
При этом время определения скорости диффузии БАВ в биодатчик можно существенно сократить, если измерения величины КД БАМ, обработанных раствором БАВ, производить, не дожидаясь осуществления полной диффузии БАВ в биоматериал, а производить их через небольшие одинаковые интервалы времени ΔT, достаточные для проявления характерной зависимости изменения аномального сигнала КД биодатчика во времени при взаимодействии БАВ с чувствительными элементами такого биодатчика.
На Фиг.8 в виде кривых 15, 16 и 17 представлена полученная с помощью системы А или С согласно изобретению динамика изменения амплитуды сигнала КД через равные интервалы времени в течение 80 мин взаимодействия описанного выше интегрального биодатчика с водным раствором БСА в различных концентрациях: 1,1 мкг/мл (кривая 15), 3,4 мкг/мл (кривая 16) и 5,7 мкг/мл (кривая 17).
На Фиг.9 динамика разрушения интегральных биодатчиков, содержащих в водно-солевом растворе полиэтиленгликоля частицы лиотропной холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, упорядоченной в пространстве и "сшитой" мостиками, содержащими в качестве субстрата для гепарина антибиотик дауномицин (ДАУ) в комплексе «ДАУ-Cu», и характеризующихся изменением сигнала КД при взаимодействии биодатчика с БАВ - гепарином, приводящем к образованию в пробе комплексов «ДАУ-гепарин», показана в координатах «относительное изменение ΔΔA максимума оптического сигнала КД проб» от времени взаимодействия заданного количества биодатчиков с водным раствором гепарина в разных концентрациях по сравнению с максимумом амплитуды сигнала КД биодатчика до взаимодействия с гепарином.
При этом на Фиг.9 кривая 18 соответствует концентрации гепарина 1,0 мкг/мл, кривая 19 - концентрации 2,0 мкг/мл, кривая 20 - концентрации 4,0 мкг/мл.
Данные, приведенные на Фиг.7, 8, 9, показывают, что уменьшение величины сигнала в спектре КД описанных выше БАМ при взаимодействии с БАВ, для которого эти БАМ являются субстратом, зависит от концентрации БАВ, и при этом относительные величины изменения сигнала КД характеризуют процессы диффузии и взаимодействия БАМ с БАВ независимо от количества БАМ в пробе.
Пятый режим калибровки оптических свойств биологически активного материала обеспечивает определение в N калибровочных растворах калибровочной зависимости величины изменения регистрируемого оптического сигнала КД биодатчика от величины концентрации БАВ, подлежащего определению в исследуемых растворах, на основе результатов регистрации величины сигналов КД биодатчика в N пробах через заданные интервалы времени и путем вычисления величины изменения этих сигналов КД биодатчика, соответствующих разным концентрациям биологически активного вещества.
Пятый режим калибровки оптических свойств биологически активного материала может быть осуществлен при последовательном размещении в приемном устройстве 25 оптически проницаемых съемных кювет 24-N, содержащих N калибровочных проб, содержащих БАМ, выполненный в виде биодатчика на основе молекулярных конструкций ДНК, содержащего субстрат для БАВ, в отношении которого производится указанная калибровка, и проявляющего в исходном состоянии свойства КД при облучении циркулярно-поляризованным излучением на длинах волн, характерных для биодатчика, и изменяющего их в результате взаимодействия указанного биодатчика с находящимся с ним в контакте указанным БАВ, присутствующим в одном из N калибровочных растворов, содержащих указанное БАВ в различных заданных концентрациях.
При использовании биодатчика с известными паспортными характеристиками, содержащими указание на длины волн диапазона сигнала КД биодатчика в исходном состоянии и длину волны максимума амплитуды сигнала КД, или при использовании биодатчиков с характеристиками, зависящими от времени их изготовления, биодатчики, подлежащие калибровке, могут быть предварительно подвергнуты тестированию в системах А или С по третьему режиму для определения диапазона длин волн его сигнала КД и концентрации БАВ, приводящей к полному разрушению биодатчика.
Для работы в пятом режиме системы А и С приспособлены для облучения калибровочных проб циркулярно-поляризованным излучением в течение заданного времени экспозиции на характерных длинах волн в диапазоне длин волн сигнала КД биодатчика и для измерения параметров КД биодатчика в контакте с раствором БАВ в известной концентрации, которую выбирают ниже концентрации БАВ, приводящей к полному разрушению биодатчика и исчезновению сигнала КД биодатчика.
maxUV
maxV
pUV
ppUV
pV
ppV
При этом в системах А или С обеспечивается автоматически, аналогично описанному выше способу в третьем или четвертом режиме, последовательное формирование излучающих комплексов U-k, излучающих в ультрафиолетовом диапазоне спектра в характерной для биодатчика области поглощения азотистых оснований ДНК, или излучающих комплексов S-k, излучающих в видимом диапазоне спектра в характерной для биодатчика области его аномальной активности. Согласно изобретению, облучение проб целесообразно производить, как минимум, на трех длинах волн, например, соответственно: на длинах волн λ или λ, соответствующих максимуму сигнала КД биодатчика в исходном состоянии, и на длинах волн λ и λ или на длинах волн λ и λ, соответствующих минимальной величине сигнала КД биодатчика в исходном состоянии (для учета фонового уровня сигнала КД).
Работа каждого из указанных излучающих комплексов U-k и S-k производится в течение короткого (меньше минуты) времени экспозиции каждой калибровочной пробы, достаточного для уверенной регистрации величины сигнала КД биодатчика в исходном состоянии, зарегистрированного до контакта с БАВ. Последующие включения и работа указанных излучающих комплексов U-k и S-k для каждой N-й калибровочной пробы производится также в течение короткого времени экспозиции, но спустя определенные заданные интервалы времени после контакта биодатчика с БАВ, меньшие времени полной диффузии БАВ в биодатчик, но достаточные для уверенной регистрации величины изменения ΔA исходного сигнала КД биодатчика, зарегистрированного до контакта с БАВ, в каждой содержащей БАВ калибровочной пробе. При этом в системе А или С для каждой из заданных концентраций БАВ в пробе регистрируются изменения ΔA величины сигнала КД биодатчика, соответствующие определенному одному или нескольким (K) фиксированным интервалам времени после начала взаимодействия биодатчика с БАВ в каждой пробе, содержащей БАВ в известных разных концентрациях, и на основании N·K таких измерений формируются калибровочные графики.
UVmax
UV
pUV
ppUV
Например, при калибровке биодатчика, содержащего лиотропную жидкокристаллическую дисперсию комплекса «ДНК-поликонидин» в водно-солевом растворе полиэтиленгликоля (RU, 2123008, С1), в отношении БАВ, в качестве которого использовали гепарин в водных растворах известной концентрации, в системах А и С для облучения калибровочных проб были автоматически последовательно сформированы три излучающих комплекса U-k, излучающих в ультрафиолетовом диапазоне спектра в характерной для биодатчика области поглощения азотистых оснований ДНК на длине волны λ=275 нм, соответствующей максимуму λ сигнала КД биодатчика в исходном состоянии, и на длинах волн λ=240 нм и λ=350 нм, соответствующих фоновым сигналам КД с минимальной величиной сигнала биодатчика в исходном состоянии. Также в автоматическом режиме после размещения в приемном устройстве каждой кюветы, содержащей указанный биодатчик в контакте с раствором гепарина в известной концентрации, была обеспечена поочередная работа указанных излучающих комплексов U-k, регистрация сигнала КД пробы фотоприемником, и вычисление изменения ΔA величины амплитуды сигнала КД пробы после контакта биодатчика с гепарином.
При этом была обеспечена работа указанных излучающих комплексов U-k и S-k в течение короткого (меньше минуты) времени экспозиции каждой калибровочной пробы и зарегистрированы сигналы КД биодатчика в исходном состоянии, до его контакта с БАВ. Последующие включения и работа указанных излучающих комплексов для каждой калибровочной пробы производились также в течение короткого времени экспозиции, но спустя определенные фиксированные интервалы времени после контакта биодатчика с БАВ (5, 10, 15 и 20 мин.), меньшие времени полной диффузии БАВ в биодатчик, но достаточные для уверенной регистрации величины изменения ΔA исходного сигнала КД биодатчика, зарегистрированного до контакта с БАВ, в каждой содержащей БАВ калибровочной пробе, и на основании 4N таких измерений были сформированы калибровочные графики.
maxV
Результаты, полученные в пятом режиме с помощью системы А при калибровке интегральных биодатчиков, содержащих частицы лиотропной холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, упорядоченных в пространстве и "сшитых" мостиками комплекса «ДАУ-Cu» в водно-солевом растворе полиэтиленгликоля (RU, 2139933, C), показали, что характерная для биодатчика в исходном состоянии величина максимума сигнала в спектре КД в области поглощения ДАУ на длине волны λ=505 нм изменяется в связи с разрушением соответствующего количества мостиков «сшивки» при взаимодействии биодатчиков в калибровочных пробах с водным раствором белка сывороточного альбумина известной выбранной концентрации: 6,0 мкг/мл и 9,0 мкг/мл.
maxV
pV
ppV
x1
x2
x3
При этом в системе А облучение проб производили последовательно на трех длинах волн, одна из которых (λ=505 нм) соответствовала максимуму амплитуды сигнала КД биодатчика в исходном состоянии, а две другие соответствовали минимальным величинам амплитуды сигнала КД и были выбраны в диапазоне длин волн, по величине, соответственно, меньших длины волны максимума (λ=460 нм) и больших длины волн максимума (λ=680 нм) для учета фоновых сигналов КД. Однако может быть использовано дополнительно облучение на других длинах волн диапазона КД, например, на длинах волн λ, λ, λ.
maxV
maxV
pV
ppV
maxV
Величины изменения максимума амплитуды сигналов ΔA на указанных длинах волн λ для заданных одинаковых промежутков времени и для каждой из исследуемых проб с разной концентрацией БАВ, рассчитанные с учетом фоновых сигналов на длинах волн λ и λ, сохраняются в памяти компьютера средства обработки, где затем соотносятся с величинами результирующих сигналов КД всех исходных проб биодатчика, в результате чего формируются зависимости величины ΔΔA=ΔА/ΔA относительного изменения амплитуды сигнала КД, соответствующие времени обработки биодатчика БАВ.
БСА
Например, как показано на Фиг.10, были получены зависимости относительного изменения максимума амплитуды сигнала КД описанного выше биодатчика, содержащего молекулы ДНК в упорядоченном состоянии, сшитые «мостиками» комплексов «ДАУ-Cu» (RU, 2139933, C): после обработки водным раствором белка (БСА) в известной концентрации в течение 10 мин. (кривая 21) и после обработки водным раствором белка в известной концентрации в течение 60 мин. (кривая 22). Полученная пропорциональная зависимость между относительным изменением относительной амплитуды ΔΔA полосы в спектре КД биодатчика и концентрацией C в растворе (Фиг.10) в интервале его концентраций от 0 до 12 мкг/мл позволяет использовать эту зависимость в качестве калибровочной прямой при определении концентрации БСА в растворах с помощью указанного биодатчика.
Калибровочные данные сохраняются в памяти системы обработки для последующего использования.
maxV
pV
ppV
Г
max
max
Г
В пятом режиме при облучении в течение 10 мин в видимой области спектра последовательно на длинах волн λ=505 нм, λ~460 нм и λ~680 нм пяти калибровочных проб, содержащих указанные выше биодатчики (на основе молекул ДНК в упорядоченном состоянии, сшитых «мостиками» комплексов «ДАУ-Cu», RU, 2139933, С) в контакте с водным раствором противовирусного препарата гипорамина в известной концентрации C=0,5 мкг/мл, 1,0 мкг/мл, 2,0 мкг/мл, 3,0 мкг/мл, и 4,0 мкг/мл, была определена, как показано на Фиг.11, калибровочная зависимость относительных изменений ΔА/ΔA величины сигнала КД каждой пробы относительно величины ΔA (прямая 23), измеренной для биодатчика в исходном состоянии (точка 0) и после 10-минутной обработки биодатчика гипорамином в указанных пробах, от указанной концентрации C гипорамина, что позволило получить калибровочную прямую 23 для определения в шестом режиме наличия и содержания гипорамина в исследуемой пробе, предположительно содержащей гипорамин в неизвестной концентрации.
max
max
MX
В результате проведенной с помощью системы А и системы С калибровки биодатчиков, содержащих молекулы ДНК в упорядоченном состоянии, сшитые «мостиками» комплексов «ДАУ-Cu» (RU, 2139933, С), в отношении противоопухолевого препарата митоксантрона (далее MX) была определена калибровочная зависимость относительных изменений ΔA/ΔA величины максимальной амплитуды сигнала КД относительно величины ΔA, на основе измерений характеристик оптического сигнала КД биодатчиков до и после их контакта с водным раствором митоксантрона в известной концентрации C, при облучении проб циркулярно-поляризованным излучением, генерируемым излучающим комплексом S-k на длине волны 680 нм, в исходном состоянии и после 10-минутной обработки пробы водным раствором MX с образованием в пробе комплексов ДНК-МХ, что позволило получить калибровочную прямую 24, показанную на Фиг.12, для определения в шестом режиме наличия и содержания MX в исследуемой пробе, предположительно, содержащей MX в неизвестной концентрации. Аналогичным образом могут быть получены калибровочные кривые и для интервалов времени после обработки БАВ более 10 мин.
-9
Представленная на Фиг.12 аналитическая калибровочная кривая 24, полученная при помощи систем А и С согласно изобретению, позволяет определять MX в широкой области концентраций, в том числе в области концентраций до 10 моль/мл с более высокой (в 2-3 раза) точностью и воспроизводимостью по сравнению с аналитической калибровочной кривой (кривая 25), полученной с помощью описанного выше в разделе уровня техники дихрографа-прототипа (RU, 92960, U1).
При этом благодаря возможностям многофункциональной системы согласно изобретению время исследований оптического сигнала БАМ в третьем, четвертом и пятом режимах можно существенно сократить за счет облучения одной пробы циркулярно-поляризованным излучением на длине волны, соответствующей максимуму оптического сигнала, и на длинах волн, на которых это сигнал минимален (для учета фоновых излучений), сначала одной пробы, содержащей БАМ в исходном состоянии (до контакта с БАВ), затем последовательного добавления в первоначальную пробу БАВ порциями в известной малой концентрации и измерения после каждого добавления БАВ характеристик оптического сигнала пробы после времени ΔT облучения, до исчезновения сигнала КД.
При этом система согласно изобретению позволяет производить одновременную обработку результатов измерений амплитуды оптического сигнала согласно третьему режиму, четвертому режиму и пятому режиму, не дожидаясь осуществления полной диффузии БАВ из содержащих его проб в биоматериал, а измерения производить через небольшие одинаковые промежутки времени ΔT, достаточные для проявления характерной зависимости изменения аномального сигнала КД биодатчика во времени при взаимодействии содержащей БАВ жидкости с чувствительными элементами такого биодатчика.
В шестом режиме определения наличия и концентрации биологически активного вещества в анализируемой жидкости работа системы согласно изобретению осуществляется путем облучения исследуемой пробы, содержащей в контакте с анализируемой жидкостью биодатчик на основе молекулярных конструкций ДНК, содержащий субстрат для определяемого БАВ и проявляющий в исходном состоянии и после взаимодействия указанного биодатчика с БАВ, наличие и концентрация которого подлежат определению, свойства КД при облучении циркулярно-поляризованным излучением на характерных для биодатчика длинах волн, регистрации и обработки сигнала КД биодатчика.
При этом в системе согласно изобретению обеспечивается:
- формирование излучающих комплексов, излучающих на длинах волн, выбранных в известном для выбранного биодатчика диапазоне длин волн, соответствующих сигналу КД биодатчика в исходном состоянии: например, определенных в третьем режиме, в четвертом режиме, в пятом режиме;
- облучение исследуемой пробы в течение времени взаимодействия, меньшего, чем известное для выбранного биодатчика время полной диффузии, определенное в четвертом режиме при диффузии БАВ, подлежащего определению, в известной концентрации в биодатчик;
- регистрация амплитуды сигнала КД через определенный заданный промежуток времени, в случае наличия изменений сигнала КД биодатчика, свидетельствующих о взаимодействии биодатчика с БАВ в пробе;
- вычисление изменения ΔΔA величины амплитуды сигнала КД после взаимодействия БАВ с биодатчиком;
- вычисление относительного изменения ΔΔA величины амплитуды сигнала КД;
- последующее вычисление концентрации БАВ в анализируемой жидкости с помощью сравнения полученной величины ΔΔA с известными из калибровочных характеристик биодатчика величинами ΔΔA, соответствующими сигналам КД биодатчика после его взаимодействия с БАВ в известной концентрации;
- визуализация для пользователя полученных результатов вычислений в графическом или табличном виде и сохранение их в памяти системы.
max
p
pp
x1
x2
x3
p
pp
p
max
pp
max
При этом для учета фоновых сигналов КД облучение исследуемой пробы производят последовательно на нескольких длинах волн, одна из которых λ соответствует максимуму сигнала КД биодатчика в исходном состоянии, а другие длины волн, например длины волн λ, λ, λ, λ, λ, соответствуют другим величинам КД, меньшим, чем максимум. Например, облучение проводят последовательно на длинах волн λ и λ, соответствующих минимальным величинам сигнала КД: на длинах волн, соответственно, меньших (λ), чем длина волны λ максимума и больших (λ), чем длина волны λ максимума оптического сигнала КД.
Работа многофункциональной аналитической системы в шестом режиме далее проиллюстрирована описанием определения концентрации БАВ - противовирусного препарата гипорамина в водном растворе с помощью определения характеристик оптического сигнала биодатчиков, являющихся для гипорамина субстратом -биодатчиков, имеющих сшитые наномостиками «антибиотик-ион металла-антибиотик-ион металла-…-ион металл-антибиотик-ион металла-антибиотик» частицы лиотропной холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, содержащие в составе наномостиков антибиотики антрациклиновой группы, способные к образованию хелатных комплексов и содержащие атомы кислорода в положениях 5, 6, 11 и 12, и в качестве чувствительного элемента ионы металла, способного к образованию плоских полимерных хелатных комплексов, и характеризующиеся аномальной оптической активностью при облучении в ультрафиолетовой области спектра, проявляемой в виде интенсивной полосы в спектре кругового дихроизма в области поглощения азотистых оснований ДНК на длине волны 260-270 нм, и дополнительной аномальной оптической активностью в области поглощения антибиотика в диапазоне 505-525 нм (RU, 2139933, C), например, содержащего в качестве антибиотика дауномицин (ДАУ), а в качестве иона металла - ион меди (Си).
maxV
pV
ppV
maxUV
При этом ранее в третьем режиме работы системы А при облучении пробы, содержащей указанные биодатчики, в видимой области спектра была определена длина волны λ=505 нм, соответствующая максимуму интенсивной отрицательной полосы в спектре КД поглощения чувствительного элемента биодатчика - дауномицина (как показано на Фиг.7), и выявлены длины волн λ~460 нм и λ~680 нм для учета фоновых сигналов КД. Кроме того, в третьем режиме при облучении пробы, содержащей указанные биодатчики, в ультрафиолетовой области спектра была определена длина волны λ=260 нм максимального поглощения азотистых оснований ДНК биодатчика.
maxV
pV
ppV
max
max
При этом ранее в пятом режиме при облучении в течение 10 мин. в видимой области спектра последовательно на длинах волн λ=505 нм, λ~460 нм и λ~680 нм калибровочных проб, содержащих указанные выше биодатчики в контакте с водным раствором гипорамина в известной концентрации, была определена, калибровочная зависимость от концентрации гипорамина относительных изменений ΔA/ΔA величины сигнала КД каждой пробы относительно величины ΔA, измеренной для биодатчика в исходном состоянии, соответствующая 10-минутной обработке гипорамином биодатчика (как показано на Фиг.13), что позволило получить калибровочную прямую для определения наличия и содержания гипорамина в исследуемой пробе, предположительно содержащей гипорамин в неизвестной концентрации.
pV
maxV
ppV
Для определения в шестом режиме наличия и концентрации гипорамина с помощью, например, системы С согласно изобретению в приемном устройстве 25 размещают кювету 24, содержащую исследуемую пробу, предположительно содержащую гипорамин в неизвестной концентрации, включают источник питания системы, в системе 29 управления устанавливают выбранный режим «шесть» для варианта сочетания гипорамина с биодатчиком описанного выше выбранного типа, задают время экспозиции для режима облучения и запускают режим. Система осуществляет в автоматическом режиме нагрев пробы до заданной в режиме температуры, например, 22°C, а затем по команде системы 29 управления в автоматическом режиме производит включение в заданный промежуток времени источника 13 УФ излучения (система С, Фиг.2) и/или последовательное включение в заданный промежуток времени и поочередную работу трех источников 17-m видимого излучения (система С, Фиг.2) и соответствующих им устройств 18-y flip-flop для формирования излучающих комплексов S-m видимого излучения в интервале длин волн 400-720 нм: длины волны λ~460 нм, длины волны λ=505 нм и длины волны λ~680 нм.
При этом поочередное включение источников излучения в шестом режиме в заданный промежуток времени может производиться на короткое время экспозиции пробы (менее минуты) дважды или один раз, в зависимости от того, известна или не известна величина оптического сигнала КД биодатчика в исходном состоянии. Если она неизвестна, включение источников излучения производится дважды: вначале - для регистрации величины сигнала КД биодатчика в исходном состоянии, затем - через заданный интервал времени (например, 10 мин) после обработки биодатчика БАВ, соответствующий интервалу времени, через который производились измерения сигнала КД биодатчика в контакте с калибровочными растворами, содержащими БАВ в известных концентрациях, в пятом режиме работы системы.
Одновременно система 29 управления подает в автоматическом режиме команды включения и выключения линейного поляризатора 21, модулятора 22, источника 27а питания фотодетектора 27, и управляющих команд, обеспечивающих регистрацию оптических сигналов исследуемой пробы фотодетектором и подачу управляющих команд на систему 28 регистрации (Фиг.1, Фиг.2) и средство обработки.
При этом средство обработки визуализирует в заданном графическом или табличном или ином виде результаты регистрации оптических сигналов исследуемой пробы и результаты вычислений, произведенных для определения наличия и концентрации определяемого БАВ на основе результатов регистрации величины сигнала КД биодатчика в исследуемой пробе через заданный интервал времени и вычисления величины изменения сигнала КД биодатчика, зарегистрированного через определенный заданный интервал времени, и сравнения этой величины с величинами изменений сигналов кругового дихроизма калибровочной зависимости биодатчика, определенной предварительно для биодатчика выбранного типа в пятом режиме функционирования системы, зарегистрированных через такой же интервал времени для разных концентраций биологически активного вещества.
6
-6
-6
-2
+
ДНК
ПЭГ
ДАУ
2
2
Cu
pV
maxV
ppV
max
max
В описанном выше варианте выполнения шестого режима в исследуемой пробе, содержащей БАМ в виде биодатчика (ДНК из тимуса крупного рогатого скота («Sigma», США), мол. масса ДНК ~(0,3-0,7)·10 Да, C=19,92 мкг/мл; мол. масса ПЭГ=6000 Да, C=170 мг/мл; C=25,764×10 М (ДАУ «Sigma», США); CuClx·2HO («Aldrich», США), C=9,901×10 М; 0,3 М NaCl+10 М Na- фосфатный буфер, pH ~7,0; температура - 22°C) в контакте с указанным раствором гипорамина, были зарегистрированы сигналы КД через 10-минутный интервал при облучении на трех указанных длинах волн λ=460 нм, λ=505 нм и λ=680 нм, были вычислены величины изменений амплитуды сигнала КД пробы относительно величин амплитуды сигнала КД биодатчика в исходном состоянии (Фиг.7), вычислены относительные изменения амплитуды сигнала КД относительно изменения ΔA с учетом изменения амплитуды фоновых сигналов: ΔΔA=ΔA/ΔA=0,8, что позволило на основании сравнения полученного результата ΔΔA=0,8 с известной калибровочной прямой 24 (Фиг.10) установить концентрацию гипорамина 0,9 мкг/мл.
Аналогично можно определять концентрации и других БАВ путем проведения описанной процедуры облучения пробы, измерения и вычисления параметров сигнала КД соответствующих биодатчиков, как показано выше для третьего, четвертого и пятого режимов работы системы согласно изобретению.
Так, было проведено определение биологически активного вещества гепарина в исследуемой пробе, содержащей в качестве биологически активного материала биодатчики на основе частиц лиотропной холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, в которых молекулы ДНК сшиты наномостиками «антибиотик-ион металла-антибиотик-ион металла-…-ион металл-антибиотик-ион металла-антибиотик», содержащие в составе наномостиков в качестве чувствительного элемента антибиотик антрациклинового ряда, имеющий не менее одной реакционно-способной аминогруппы, связанной с сахарным остатком и обладающей хромофорными свойствами при облучении в видимой области спектра, и ионы металлов, способные к образованию плоских полимерных хелатных комплексов (Евдокимов Ю.М., Салянов В.И., Скуридин С.Г. Наноструктуры и наноконструкции на основе ДНК. Под ред. Ю.М. Евдокимова. М.: САЙНС-ПРЕСС, 2010, 254 с.), характеризующиеся аномальной оптической активностью при облучении в ультрафиолетовой области спектра, проявляемой в виде интенсивной полосы в спектре кругового дихроизма в области поглощения азотистых оснований ДНК на длине волны ~270 нм, и дополнительной аномальной оптической активностью при облучении в видимой области спектра в области поглощения антибиотика в диапазоне 505-525 нм, и при этом биодатчики, содержащие наномостики «ДАУ-Cu» облучали в видимой области спектра на трех длинах волн в диапазоне 420-700 нм: 330, 505 и 710 нм. Регистрировали сигналы КД биодатчиков после контакта с исследуемой жидкостью, получали с помощью аналогичных описанным ранее в пятом режиме последовательности действий и вычислений калибровочные прямые (не показаны), которые позволили определить, что биодатчик взаимодействует с гепарином, и определяемая минимальная концентрация гепарина в исследуемой пробе составляет 0,5 мкг/мл.
В соответствии с составом и физическим состоянием анализируемых проб многофункциональная аналитическая система согласно изобретению позволяет выбирать схему подачи и характеристики светового циркулярно-поляризованного потока, направляемого через световое окно кюветы на пробу, длительность времени экспозиции, схему регистрации параметров оптического сигнала КД пробы, схему обработки полученных результатов, а также производить сравнение полученных результатов с заданными параметрами или статистическими данными. Варианты последовательности действий устройств системы для обеспечения таких потоков могут быть выбраны компьютером системы 29 управления, например, из размещенной в нем библиотеки, с возможностью их корректировки пользователем.
Согласно изобретению, система приспособлена для размещения в портативном корпусе, что обеспечивается размещением плотно наполненных модулей, в том числе оптических устройств, обеспечивающих защиту их от динамических и тепловых воздействий как внешних, так и внутренних между собой.
Многофункциональная аналитическая система согласно изобретению, обеспечивающая высокую точность измерений и регистрации оптических сигналов КД, позволяет в четвертом режиме использовать ее в качестве оптического диффузометра, обеспечивая измерения и регистрацию изменения сигналов кругового дихроизма по мере диффузии одного компонента пробы, например, биологически активного вещества, в другой компонент пробы, например, в чувствительный элемент биодатчика, в динамическом режиме с установленными программой управляющего компьютера временными интервалами.
При этом, как должно быть понятно специалистам в области оптической техники, многофункциональная система согласно изобретению обеспечивает взаимозаменяемость используемых в ней устройств, а также возможность смены источников излучений и смены селекторов для обеспечения требуемого диапазона излучений излучающих комплексов U-k и S-p.
Таким образом, аналитическая система согласно изобретению, благодаря использованию биологически активных материалов (БАМ) на основе молекулярных конструкций (МК) ДНК и новых технических решений, позволяет быстро, точно и с высокой чувствительностью определять в различных жидкостях, в том числе, в биологических жидкостях, например, в крови пациентов, наличие и концентрацию различных биологически активных веществ (противоопухолевые препараты, антибиотики, белки и т.д.), и поможет спасти здоровье и жизнь пациентов в тех случаях, когда другие способы неприменимы или не дают надлежащего эффекта.
Кроме того, настоящее изобретение, предназначенное для исследования оптических свойств и контроля качества БАМ на основе МК ДНК, в том числе с целью использования их в качестве биодатчиков в биосенсорных аналитических устройствах или для калибровки дихрометров и измерения оптической активности исследуемых с их помощью других объектов, позволяет сделать аналитическую систему для определения БАВ в жидкости более многофункциональной, более компактной, более мобильной и более простой в обслуживании без ущерба для ее чувствительности.
Выполнение аналитической системы согласно изобретению позволяет выполнять ее в компактном исполнении в едином корпусе, обеспечить простоту обслуживания и мобильность в различных условиях эксплуатации.
Аналитическую систему согласно изобретению возможно использовать для исследования оптических свойств и контроля качества БАМ на основе МК ДНК, в том числе с целью использования их в качестве биодатчиков в биосенсорных аналитических устройствах или для калибровки дихрометров и измерения оптической активности исследуемых с их помощью других объектов, определения наличия и концентрации практически важных классов БАВ в жидкости и в качестве оптического диффузометра при анализе механизмов транспорта БАВ, разрушающих биодатчик, и определении их коэффициентов диффузии в БАМ.
Многофункциональная аналитическая система для определения характеристик оптического сигнала кругового дихроизма биологически активного материала согласно изобретению позволяет во многих случаях заменить сложное и дорогостоящее оборудование, исключив при этом использование высококвалифицированного персонала, и может быть применено в медицинской и клинической биохимии, в практике онкологии, хирургии, гинекологии, при медико-биологическом скрининге, а также в молекулярной фармакологии при исследовании фармакокинетики значимых биологически активных соединений, в фармацевтической промышленности и экологии. Наиболее эффективно его использование в клинической медицине и биохимии.