Способ прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки экспрессии GnRG и GnRGR в "окно имплантации" в эндометрии женщин бесплодием и неудачными попытками программы эко
METHOD FOR ENDOMETRY RECEIVABILITY PREDICTION BASED ON EVALUATION OF GNRG AND GNRGR EXPRESSION IN "IMPLANTATION WINDOW" FOR WOMEN INFERTILITY ENDOMETRY AND IVF PROGRAM FAILURE ATTEMPTS

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии и патологической анатомии, предназначено для прогнозирования рецептивности эндометрия и наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).
В связи с постоянным ростом проблема бесплодия на сегодняшний день приобретает не только медицинское, но и социально-демографическое значение. Таким образом, все большее распространение получает метод лечения бесплодия путем ЭКО и переноса эмбрионов.
Повышение эффективности методов вспомогательных репродуктивных технологий является актуальной задачей современной репродуктивной медицины, а результативность программ ЭКО во многом зависит не только от качества перенесенных эмбрионов, но и от функционального состояния эндометрия, его зрелости и готовности к имплантации.
Таким образом, в изучении функционального состояния эндометрия особое место занимает исследование маркеров рецептивности для адекватной оценки и разработки лечебно-профилактических мероприятий.
Эндометрий восприимчив для имплантации эмбриона только в течение ограниченного периода, в которое наблюдается максимальная его рецептивность. Это так называемое «окно имплантации», период которого составляет несколько дней - примерно с 20-го по 24-й день нормального менструального цикла, на 6-10 день после пика лютеинизирующего гормона (ЛГ) [1, 2, 3]. Для успешной имплантации необходима синхронизация между эмбрионом и эндометрием. Таким образом, правильная циклическая экспрессия рецепторов играет критическую роль для восприимчивости эндометрия и успешности имплантации [4].
На сегодняшний день имеется широкий спектр иммуногистохимических маркеров рецептивности эндометрия определяемые в окно имплантации, такие как: прогестероновые и эстрогеновые рецепторы, лейкемия ингибирующий фактор и его рецептор, эзрин, интегрины, селектины, простогландины, муцины [5, 6, 7, 8, 9, 10].
В ряде исследований было показано, что гонадотропин - рилизинг гормон (GnRG) и рецептор гонадотропин - рилизинг гормона (GnRGR) присутствуют в эндометрии женщин на протяжении всего менструального цикла в эпителиальных и стромальных клетках с повышением экспрессии рецепторов GnRG в децидуализированных стромальных клетках в ЛФ [11, 12]. Локальная экспрессия GnRG трофобластом и присутствие его рецепторов в децидуализированном эндометрии предположительно играет важную роль в диалоге между бластоцистой и эндометрием на стадии ранней имплантации, путем модуляции баланса между матриксными металлопротеиназами (ММР) и их ингибиторами [12, 13]. Повышается инвазивная способность трофобласта путем специфического ингибирования тканевых ингибиторов металлопротеиназ (TIMP), что способствует более успешной имплантации бластоцисты [12]. Также было показано, что GnRG индуцирует апоптоз в клетках эндометрия in vitro.
У изобретения задачей является способ прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки экспрессии GnRG и GnRGR в «окно имплантации» в эндометрии женщин с бесплодием и неудачными попытками программ ЭКО.
Способ прогнозирования рецептивности эндометрия при бесплодии у женщин с неудачными программами ЭКО включает определение уровней экспрессии GnRG и GnRGR в эндометрии в период «окна имплантации».
Как следствие, последнее приобретает чрезвычайную актуальность в связи с высокой перспективностью для разработки новых подходов к патогенетической профилактике бесплодия и подготовке эндометрия к импланатации в программах ЭКО.
В связи с чем было проведено исследование, целью которого явилось изучение морфологических особенностей эндометрия и экспрессии GnRG и GnRGR в эндометрии пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия и неудачными программами ЭКО.
Материалы и методы
В исследование была включена 41 пациентка с трубно-перитонеальным фактором (ТПФ) бесплодия, в возрасте от 26 до 38 лет, имеющие 1-2 неудачные программы ЭКО в анамнезе (основная группа), и 14 здоровых фертильных женщин аналогичного возраста имеющих в анамнезе здоровых детей (группа контроля). Аспирационная пайпель - биопсия эндометрия проводилась из области дна матки в «окно имплантации» (ЛГ+7) на 7-8 день после овуляции. Материалы биоптатов фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24 ч. Образцы были обработаны по общепринятой стандартной методике и заключены в парафин. Срезы толщиной 4 мкм готовили на роторных микротомах и окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование гистологических препаратов проводилось в световом микроскопе Carl Zeiss Axio Imager A2 при увеличении от ×50 до ×600. Гистологическое датирование эндометрия, оценку процента клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий осуществляли на том же световом микроскопе при увеличении ×400 в 5 полях зрения. Пиноподии оценивались как изобилующие, умеренные и незначительные в зависимости от % занимаемой ими поверхности эндометрия (>40, 20-40 и <20 соответственно).
Иммуногистохимические (ИГХ) реакции проводили на серийных депарафинированных срезах толщиной 3-4 мкм по общепринятым методикам (DAKO protocols).
Экспрессию GnRH выявляли первичными антителами к GnRH (Abcam, 1:400), a GnRHR - первичными антителами к GnRHR (Gene Тех, 1:100).
Результаты ИГХ реакции GnRH и GnRHR оценивали полуколичественным методом в баллах по общепринятой методике: отсутствие иммуноокрашенных клеток (-) - 0 баллов, менее 5% иммуноокрашенных клеток (±) - 0,5 баллов, менее 20% иммуноокрашенных клеток (+) - 2 балла (низкая), от 20 до 40% окрашенных клеток (++) - 4 балла (умеренная), более 40% окрашенных клеток (+++) - 6 баллов (высокая).
По результатам исследования проводили статистический анализ с использованием метода дисперсионного анализа ANOVA (для нескольких групп) и по методу Манна-Уитни.
Для каждого количественного параметра были определены: среднее значение (М), среднеквадратичное отклонение (δ), ошибка среднего (m), медиана (Me), 95% доверительный интервал, для качественных данных - частоты (%).
При нормальном характере распределения данных результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (M±m). При распределении данных, отличных от нормального (значение теста Колмогорова - Смирнова менее 0,05), исследованные количественные показатели представлены в виде Me (L-H), где Me - медиана, L - 25 (нижний) квартиль, H - 75 (верхний) квартиль.
Результаты исследования
У большинства пациенток с ТПФ бесплодия средний возраст составил - 32,1±0,2 года. Длительность бесплодия в среднем составила 5,3±0,4 года, преобладало первичное бесплодие. У всех пациенток с бесплодием в анамнезе имели место 1-2 неудачных попытки ЭКО. Фертильные женщины контрольной группы были аналогичного возраста.
Анализ морфологической структуры эндометрия, показал, что у большинства пациенток исследуемой группы наблюдалась секреторная трансформация эндометрия, при этом ранняя стадия фазы секреции обнаружена у 5 (12,2%), средняя стадия фазы секреции - у 32 (78%) и поздняя стадия фазы секреции - у 4 (9,8%) пациенток основной группы. В группе контроля также превалировал эндометрий средней стадии фазы секреции у 13 (92,9%), ранняя стадия фазы секреции наблюдалась - у 1 (7,1%) женщины (таблица 1).
Результаты морфологического исследования эндометрия показали, что в исследуемой группе зрелые пиноподии наблюдались у 35 (85,4%), регрессирующие у 6 (14,6%) пациенток, тогда как в контрольной группе у всех женщин выявлялись зрелые пиноподии (100%). Количество зрелых пиноподий в исследуемой группе было достоверно ниже (p<0,05), чем в контрольной. При этом медиана количества клеток поверхностного эпителия, содержащих пиноподии в естественном цикле в «окно имплантации», у пациенток основной группы составила 20% (интерквартильный интервал 17-25%), что было существенно ниже, чем в группе фертильных женщин (медиана 30%, интерквартильный интервал 20-35%; р=0,003) (таблица 2).
При ИГХ исследовании GnRH экспрессировался в виде коричневого окрашивания цитоплазмы клеток поверхностного эпителия, эпителия желез и стромы эндометрия.
У пациенток с бесплодием экспрессии GnRG в поверхностном эпителии (медиана 2 и 5 интерквартильный интервал 2-4 и 4-6, р=0,0001), в эпителии желез (медиана 2 и 4 интерквартильный интервал 1-2 и 2,75-4, р=0,0001) и в строме (медиана 1 и 2 интерквартильный интервал 1-2 и 2-4, р=0,0001) была значительно ниже по сравнению с фертильными женщинами (табл. 3).
Таким образом, у пациенток с бесплодием отмечена низкая экспрессия GnRH в поверхностном эпителии и строме. У фертильных женщин уровни экспрессии GnRG были выше в поверхностном эпителии - в 1,75 раза, в эпителии желез - в 1,9 раза и в строме - в 2 раза по сравнению с пациентками с бесплодием (фиг. 1, 2)
ИГХ экспрессию GnRHR в эндометрии оценивали путем исследования иммуноокрашивания цитоплазмы клеток эпителия и стромы эндометрия. GnRH выявлялся в цитоплазме клеток эндометрия в виде коричневого окрашивания.
Уровни экспрессии GnRGR в поверхностном эпителии (медиана 1 и 4, интерквартильный интервал 0,5-1 и 3,2-4, р=0,0001), в эпителии желез (медиана 1 и 3,7, интерквартильный интервал 0,5-1 и 2,5-4, р=0,0001) и строме (медиана 0,75 и 4 интерквартильный интервал 0,5-1 и 2,3-4, р=0,0001) были существенно выше в группе фертильных женщин по сравнению с группой пациенток с бесплодием (таблица 4).
Оценка средних уровней экспрессии GnRGR показала, что в группе пациенток с бесплодием уровни экспрессии GnRHR были низкими в поверхностном эпителии и строме. У фертильных женщин уровни экспрессии GnRGR были выше в поверхностном эпителии - в 4,2 раза, в эпителии желез - в 4,1 раза, в строме - в 4,5 раза в сравнении с пациентками с бесплодием (фиг. 3, 4)
Полученные результаты свидетельствует о нарушении рецептивности эндометрия в «окно имплантации» у исследуемых пациенток с бесплодием.
Приведенные данные свидетельствуют о том, что снижение экспрессии рецепторов GnRH и GnRHR в эндометрии у пациенток с бесплодием отражает нарушение его рецептивности. И, в свою очередь, может явиться неблагоприятным прогностическим признаком для наступления беременности.
Обсуждение
В работе Raga F., 1998, исследовали экспрессию мРНК GnRH и GnRHR в эндометрии фертильных женщин в пременопаузе в динамике менструального цикла [11]. Было показано, что GnRH и GnRHR присутствуют в эндометрии женщин на протяжении всего менструального цикла, как в эпителии, так и в строме, с повышением экспрессии GnRH и GnRHR в секреторную фазу по сравнению с фазой пролиферации [11]. Кроме того, были показаны наиболее высокие уровни мРНК GnRH и GnRH-R в ЛФ в эпителиальных и стромальных клетках.
Таким образом, экспрессия GnRH трофобластом и присутствие его рецепторов в децидуализированном эндометрии, по-видимому, играет важную роль на стадии имплантации и плацентации, как молекулярный аутокринно/паракринный регулятор взаимоотношений эмбрион/эндометрий в период ранней имплантации, изменяя баланс между матриксными металлопротеиназами и их ингибиторами [12, 13].
Результаты нашего исследования показали существенное снижение экспрессии GnRH у пациенток с бесплодием в поверхностном эпителии - в 1,75 раза, в эпителии желез - в 1,9 раза и в строме - в 2 раза, GnRHR в поверхностном эпителии - в 4,2 раза, в эпителии желез - в 4,1 раза, в строме - в 4,5 раза в сравнении с группой фертильных женщин в «окно имплантации» (р=0,0001). Кроме того, в ходе проведенного нами морфологического и ИГХ исследования эндометрия у пациенток с бесплодием было отмечено более низкое количество клеток поверхностного эпителия, содержащих пиноподии (медиана 20% и 30%, р=0,003), и количество зрелых пиноподий (р<0,05).
Таким образом, прогностически благоприятными критериями наступления беременности являются: наличие в период «окна имплантации» более 20% клеток поверхностного эпителия со зрелыми пиноподиями, а также высокий уровень экспрессии GnRH и GnRHR в эндометрии. Эндометрий женщины с бесплодием и неудачными программами ЭКО характеризуется нарушением рецептивности эндометрия, что проявляется отставанием секреторных изменений, более низким количество клеток поверхностного эпителия содержащих зрелые пиноподии, а также низкой экспрессий GnRH и GnRHR.
Определение клинических и молекулярно-биологических факторов рецептивности эндометрия позволяют достоверно прогнозировать наступление беременности как в естественном цикле, так и в программе ЭКО.
Полученные результаты исследования позволяют расширить спектр маркеров рецептивности эндометрия при бесплодии и повторных неудачах программ ЭКО в анамнезе.
Выявленное снижение экспрессии GnRH и GnRHR в эндометрии в «окно имплантации» при бесплодии, открывает перспективы для разработки новых подходов к патогенетической подготовке слизистой тела матки к имплантации бластоцисты.
Клинический пример 1
Больная А., 26 лет, обратилась с жалобами на отсутствие беременности в течение 2 лет в 1 браке. Гинекологический анамнез - отягощен. При гинекологическом осмотре патология не выявлена. В анамнезе 2 неудачные попытки программы ЭКО. Морфологический диагноз (21 день м./цикл.) - эндометрий ранней стадии фазы секреции, зрелые пиноподии определяются на 15% поверхностного эпителия. Методом иммуногистохимии определены уровни экспрессии GnRG и GnRGR в эпителии и строме. Выявлен низкий уровень экспрессии GnRG (2 балла) и GnRGR (1,5 балла) в эпителии и в строме GnRG (2 балла) и GnRGR (1 балл).
Пациентка направлена в программу ЭКО, в результате которой беременность не наступила.
Клинический пример 2
Больная Д., 28 лет, обратилась с жалобами на отсутствие беременности в течение 3 лет в 1 браке. В анамнезе 1 самостоятельные роды после программы ЭКО, без особенностей. Гинекологический анамнез - не отягощен. Морфологический диагноз (22 день м./цикл.) - эндометрий средней стадии фазы секреции и зрелые пиноподии определяются более чем на 45% поверхностного эпителия. Методом иммуногистохимии определены уровни экспрессии GnRG и GnRGR в эпителии и строме. Выявлен высокий уровень экспрессии GnRG (5,5 баллов) и GnRGR (5 баллов) в эпителии и в строме GnRG (4 балла) и GnRGR (4,5 балла).
Пациентка направлена в программу ЭКО, в результате которой была достигнута беременность.
Клинический пример 3
Больная Т., 30 лет, жалобы на отсутствие беременности в течение 6 лет в 1 браке. В анамнезе 1 неудачная программа ЭКО. Гинекологический анамнез - не отягощен. Морфологический диагноз (21 день м./цикл.) - эндометрий ранней стадии фазы секреции и зрелые пиноподии определяются на 20% поверхностного эпителия. Методом иммуногистохимии определены уровни экспрессии GnRG и GnRGR в эпителии и строме. Выявлен низкий уровень экспрессии GnRG (2 балла) и GnRGR (2 балла) в эпителии и в строме GnRG (1 балл) и GnRGR (1,5 балла).
Пациентка направлена в программу ЭКО, в результате которой беременность не наступила.
Список литературы
1. Tavaniotou A., Smitz J., Bourgain С., Devroey P. Ovulation induction disrupts phase function // Ann NY Acad Sci. - 2001; 943:55-63.
2. Lessey B.A. The role of the endometrium during embryo implantation // Hum Reprod. - 2000; 15:39-50.
3. Bourgain C., Devroey P. The endometrium in stimulated cycles for IVF // Hum Reprod Update. - 2003; 9(6): 515-522.
4. Lessey B.A. Two pathways of progesterone action in the human endometrium: implications for implantation and contraception // Steroids. - 2003. - Vol. 68. - P. 809-815.
5. Expression and activation of the membrane-cytoskeleton protein ezrin during normal endometrial cycle / Tan O., Ornek Т., Fadiel A. et al. // Fertility Sterility. - 2012. - Vol. 97. - №1. - P. 192-199.
6. Бурлев B.A., Кузьмичев Л.Н., Онищенко A.C., Ильясова Н.А., Щетинина Н.С. Функциональная активность эндометрия влияет на результаты ЭКО и перенос эмбрионов: молекулярные механизмы регуляции фертильности. Пробл. репрод., 2010; 2:41-52.
7. Garcia Е., Bouchard Р. et al. Use of immunocytochemistry of progesterone and estrogen receptors for endometrial dating // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1988; 67:80-87.
8. Gemzell-Danielsson K., Bygdeman M. Effects of Progestogens on Endometrial Maturation in the Implantation Phase Ernst Schering Res Found Workshop. 2005; (52): 119-38.
9. Johnson P.M., Christmas S.E., Vince G.S. Immunological aspects of implantation and implantation failure // Human Reproduction. - 1999. - Vol. 14. - Suppl. 2. - P. 26-36.
10. Leukaemia inhibitory factor (LIF) gene mutations in women diagnosed with unexplained infertility and endometriosis have a negative impact on the IVF outcome. A pilot study  /  et al. // Folia Biology (Praha). - 2009. - Vol. 55. - P. 92-97.
11. Raga F, Casan EM, Kruessel JS, Wen Y, Huang HY, Nezhat C, Polan ML: Quantitative gonadotropin-releasing hormone gene expression and immunohistochemical localization in human endometrium throughout the menstrual cycle. Biol Reprod – 1998. - Vol. 59. - P. 661-669.
12. Raga F, Casan EM, Wen Y, Huang HY, Bonilla-Musoles F, Polan ML: Independent regulation of matrix metalloproteinase-9, tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIМР-1), and TIMP-3 in human endometrial stromal cells by gonadotropin-releasing hormone: implications in early human implantation. J Clin Endocrinol Metab - 1999 - Vol. 84. - P. 636-642.
13. Chou CS, Tai CJ, MacCalman CD, Leung PC: Dose-dependent effects of gonadotropin releasing hormone on matrix metalloproteinase (MMP)-2, and MMP-9 and tissue specific inhibitor of metalloproteinases-1 messenger ribonucleic acid levels in human decidual Stromal cells in vitro. J Clin Endocrinol Metab. - 2003. - Vol. 88. - P. 680-688.
Фиг. 1. Показатели средних уровней экспрессии GnRH у пациенток с бесплодием и фертильных женщин.
р<0,05 по сравнению с группой с фертильными женщинами (U-критерий Манна-Уитни).
Фиг. 2. Иммуногистохимическое исследование экспрессии GnRH в эндометрии в «окно имплантации» у пациенток с бесплодием и фертильных женщин (иммунопероксидазная реакция) (×200).
а
- основная группа (отсутствие экспрессии);
б - контрольная группа (высокая экспрессия).
Фиг. 3. Показатели средних уровней экспрессии GnRHR у пациенток с бесплодием и фертильных женщин.
р<0,05 по сравнению с группой с фертильными женщинами (U-критерий Манна-Уитни).
Фиг. 4. Иммуногистохимическое исследование экспрессии GnRHR в эндометрии в «окно имплантации» у пациенток с бесплодием и фертильных женщин (иммунопероксидазная реакция) (×400).
а - основная группа (низкая экспрессия);
б - контрольная группа (высокая экспрессия).