Препарат для очистки почв и воды от нефти и нефтепродуктов
PREPARATION FOR SOIL AND WATER PURUFICATION FROM OIL AND OIL PRODUCTS

Изобретение относится к биотехнологии, а именно препаратам для очистки почв и воды от нефти и нефтепродуктов.
В настоящее время загрязнение природной среды нефтяными углеводородами (УВ) является актуальным экологическим вопросом. Проблема реабилитации нарушенных территорий после аварийных нефтеразливов особенно актуальна для районов Крайнего Севера, где эксплуатируются основные нефтегазоносные месторождения Российской Федерации. Будучи высокоорганизованной субстанцией, нефть самостоятельно деградирует очень медленно, процессы окисления одних структур ингибируются другими структурами, трансформация отдельных соединений происходит по пути приобретения устойчивых трудноокисляемых форм (см. Гриценко А.И., Акопова Г.С., Максимов В.М. Экология. Нефть и газ. – М.: Наука, 1997. – 557 с.). Без применения дополнительных мер по реабилитации нарушенных земель процесс самовосстановления нефтезагрязненных почв в регионах с благоприятными климатическими условиями занимает 10-25 лет, в то время как деструкция нефти и ее производных в условиях Севера может длиться до 50 лет и более (см. Пиковский Ю.И. Трансформация техногенных потоков нефти в почвенных экосистемах // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. – М.: Наука, 1988. – С. 7-31; Оборин A.A., Калачникова И.Г., Масливец Т.А., Базенкова Е.И., Плещева О.В., Оглоблина А.И. // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. — М.: Наука, 1988. С. 140-159; Foght J.M., Westlike D.W.S. Bioremediation of oil spills // Spill Technol. Newsiett., 1992. – V. 17. – P. 1-10).
Из известных решений, которые позволяют эффективно очистить от нефти почвы северных регионов, экологически наиболее оправданными считаются биологические способы, основанные на интенсификации микробиологической деградации нефтяных УВ (см. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Ильинский В.В. и др. Интродукция бактерий рода Rhodococcus в тундровую почву, загрязненную нефтью // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. №2. С. 198-201).
Хорошую эффективность в очистке почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами показал биопрепарат, в котором используют консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов в составе: Pseudomonas putida ПИ Ко-1,  Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ky-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении 3-12 масс. % каждого микроорганизма (см. RU №2191643, МПК B09C 1/10, C12N 1/20, C12N 1/20, C12R 1/01, опубл. 27.10.2002).
2
При этом для эффективной очистки почв от нефтезагрязнений совместно с суспензией биопрепарата в загрязненную среду вводят ризоторфин (землеудобрительный препарат азотфиксирующих микроорганизмов) в количестве 30-120 г/м, что усложняет процесс обработки нефтезагрязненного субстрата.
Известен биопрепарат «Путидойл» (см. SU №1076446, МПК C02F 3/34, B09C 1/10, C12N 1/20 C02F 3/34, C02F 101/32, C12N 1/20, C12R 1/40, опубл. 28.02.1984), используемый для очистки почвы от нефтяных загрязнений. Биопрепарат создан на основе монокультуры бактерий Pseudomonas putida 36 (см. Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Гашев С.Н. и др. О биологической рекультивации нефтезагрязненных песочных почв Среднего Приобья//Почвоведение. - 1990, № 9. - С.148-151).
3
Недостатком известного решения является сложная технология приготовления препарата, которая предусматривает распылительную сушку живой культуры бактерий, что вызывает травмирование бактерий и, как следствие, их гибель или потерю необходимой активности вследствие инактивации клеток под действием высоких температур (+60°С). Для восстановления жизнедеятельности бактерий авторы применяют сложный комплекс мер: подогрев большого количества воды (5 м) до +18…+28°С, перемешивание, аэрирование, и все это в течение длительного времени (16-24 ч), что в полевых условиях выполнить довольно сложно.
Известен способ очистки почвы с использованием биопрепарата «Деворойл», содержащего консорциум углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus maris, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas stutzeri, Yarrowia lipolytica (см. RU № 2114071, МПК C02F 3/34, B09C 1/10, C12N 1/20, C12N 1/26, C12Q 1/02, опубл. 27.06.1998). Этот способ предусматривает при хранении суспензии микроорганизмов использование NaCl, биологически активных веществ (витамины) и осмопротекторов (бетаин).
Недостатком известного способа является то, что, несмотря на добавление к бактериальной суспензии защитных веществ, численность микроорганизмов снижается независимо от температуры хранения.
3
Известен способ очистки почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с использованием олеофильного биопрепарата на основе ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов – Rhodococcus  erythropolis ИЭГМ 708 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 327 и биосурфактанта - Rhodococcus, отличающийся тем, что производят первоначальную обработку сильнозагрязненной почвы/грунта до достижения уровня остаточных нефтепродуктов 5-10 вес. % и последующее добавление органического разрыхлителя, олеофильный биопрепарат вносят в количестве не менее 10 л на 0,5-1,0 мпочвы/грунта по меньшей мере один раз в неделю в течение первого месяца и в дальнейшем по меньшей мере один раз в месяц до окончания цикла биоремедиации в сочетании с периодическим рыхлением и увлажнением и дополнительно производят фиторемедиацию – засев многолетними травами (см. RU № 2193464, МПК B09C 1/10, C12N 1/26, C12N 1/26, C12R 1/01, опубл. 27.11.2002).
Недостатком изобретения является сложная технология применения способа, предполагающего использование твердожидкофазного биореактора и/или аэрируемых почвенных площадок в качестве первоначальной обработки сильнозагрязненной почвы. Такой метод снижения уровня загрязнения трудоемок и предполагает нарушение плодородного слоя почвы (гумусированной части почвенного профиля), что не применимо при авариях и разливах нефти и нефтепродуктов в условиях Крайнего Севера (в том числе в зоне тундры). Поскольку обязательным условием очистки и восстановления нефтезагрязненных мерзлотных почв является сохранение плодородного слоя почвы. Это объясняется тем, что на месте снятия почвенного покрова в мерзлотных условиях возможно образование термокарстовой оттайки с образованием воронок, провалов или аласов, что в свою очередь приводит к развитию термоэрозии и наносит большой ущерб ранимой и трудно восстанавливаемой почвенной экосистеме Крайнего Севера.
Известен биопрепарат «Нафтокс», технология получения и применения которого сравнительно проста. Биопрепарат позволяет эффективно очистить почву и воду от нефти и нефтепродуктов (см. RU №2053206, МПК С02F 3/34, C09K 3/32, B09C 1/10, B09C 101/00, опубл. 27.01.1996).
Недостатком «Нафтокса» является малый срок хранения биопрепарата – не более 1 месяца, а также неспособность его применения в условиях пониженных положительных температур (+5°С).
Известен биопрепарат, представляющий собой водную суспензию высокоэффективных бактерий, способных очищать воду и почвы от нефти и нефтепродуктов (см. RU №2428469, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, C09K 3/32, B09C 1/10, опубл. 10.09.2011).
Его недостатком является то, что бактерии препарата утилизируют только нормальные парафины нефти (С12-С18). Другим недостатком данного изобретения является неспособность биопрепарата работать в условиях пониженных положительных температур (+5°С). Третьим недостатком данного изобретения является получение только жидкой формы препарата, что сокращает сроки хранения биопрепарата.
Известен способ очистки почв от нефти штаммом бактерий Bacillus subtilis, выращенным на мясопептонном агаре при температуре +37°С. Способ позволяет в течение 3 месяцев летнего периода снизить концентрацию нефти в почве до 0,48 % (см. RU № 2446900, МПК B09C 1/10, опубл. 10.04.2012).
Недостатком известного способа является применение только жидкой формы биопрепарата, что снижает сроки сохранения жизнеспособности бактерий, а также то, что штамм осуществляет деградацию только нефти и только в почве и не способен утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), в том числе в условиях широкого диапазона температур от +5 до +40°С.
Известен биопрепарат, состоящий из аэробных нефтеокисляющих бактерий, иммобилизованных на твердых субстратах-носителях (см. RU № 2404138, МПК C02F 3/34, C12N 1/26, опубл. 20.11.2010). Биопрепарат обладает высокой активностью по отношению к нефтезагрязнению. При этом биопрепарат предусматривает только очистку морской воды и не позволяет оценить деструктирующую способность биопрепарата по отношению к почве. Кроме того, штамм бактерий Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, составляющий основу биопрепарата, не способен развиваться при пониженных положительных температурах (от +5°С), что делает его неперспективным для проведения нефтеочистки почвы в районах с коротким тепловым периодом (см. RU № 2268934, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, опубл. 27.01.2006).
9
Наиболее близким к заявляемому техническому решению является бактериальный препарат, состоящий из высокоактивных живых аэробных нефтеокисляющих бактерий (Mycobacterium, Pseudomonas и др.), выращенных на твердых субстратах-носителях с титрами 2,5-7,0·10 кл./г. (см. RU № 2053205, МПК C02F 3/34, C09K 3/32, B09C 1/10, B09C 101/00, опубл. 27.01.1996). В качестве субстрата-носителя для иммобилизации микроорганизмов используют гамма-стерильный торф с рН 6,8-7,0 в количестве 40-45 масс. % и воду в количестве 58,95-53,25 масс. %. С целью поддержания нефтеокисляющей активности в процессе хранения в препарат дополнительно вводят питательные субстраты: аммоний щавелевокислый (0,05-1,0 масс. %) и нормальные парафины (1,0-1,5 масс. %).
Недостатком данного биопрепарата является то, что бактерии биопрепарата утилизируют только нормальные парафины нефти (С12-С18), а это 10-20% от состава нефти. В состав же нефти входят, кроме нормальных парафинов, нафтены, ароматические, полиароматические, непредельные, предельные, изопреноидные и другие углеводороды, все они более токсичны для живой природы, чем нормальные углеводороды, и без их биодеструкции очистка от нефтезагрязнений будет незначительная. Кроме того, биопрепарат содержит нефтеокисляющие бактерии, для поддержания жизнедеятельности которых требуется рН среды 6,8-7,0 и большое количество воды (около 60% воды), что снижает его эффективность во времени.
Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, выражается в устранении указанных недостатков и заключается в расширении номенклатуры препаратов для очистки почв и воды от нефти и нефтепродуктов в широком диапазоне температур, от +5 до +40°С.
Технический эффект, получаемый при решении поставленной задачи, выражается в получении препарата для очистки почв и воды от нефти и нефтепродуктов.
Для решения поставленной задачи препарат для очистки почв и воды от нефти и нефтепродуктов, содержащий, в масс. %: нефть - 0,1; биомассу бактерий-биодеструкторов нефти и нефтепродуктов - 1,0; связующий компонент 1,0 и органоминеральный субстрат-носитель для биодеструкторов - до 100,0. При этом в качестве биодеструкторов нефти и нефтепродуктов препарат содержит углеводородокисляющие бактерии Bacillus subtilis СНБС-1. В качестве связующего компонента - натрийкарбоксиметилцеллюлозу. В качестве органоминерального субстрата-носителя содержит композиционную смесь клиноптилолита, подготовленных древесных опилок и перегноя в соотношении, масс. %: клиноптилолит - 10,0; подготовленные опилки древесные - 10,0; перегной - 80,0.
Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».
Препарат отличается от аналога тем, что в качестве биодеструкторов нефти и нефтепродуков содержит бактерии Bacillus subtilis СНБС-1, способные развиваться и деструктировать нефть и нефтепродукты в условиях широкого диапазона температур (от +5 до +40°С); в качестве твердого субстрата-носителя для биодеструкторов содержит органоминеральную композицию на основе клиноптилолита, подготовленных опилок древесных и перегноя. В качестве связующего компонента содержит натрийкарбоксиметилцеллюлозу.
Характеристика штамма, используемого для получения препарата.
Предлагаемый штамм бактерий Bacillus subtilis СНБС-1 выделен 16 февраля 2015 года из мерзлых почвенных образцов, загрязненных дизельным топливом (соляркой), отобранных возле емкостей Момского РЭС ОАО «Сахаэнерго», Северо-Восток Якутии, Момский район, село Хонуу.
Штамм идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП «ГосНИИгенетика», 117545, Москва, 1-й Дорожный пр-д, 1, с присвоением регистрационного номера ВКПМ В-12239.
Первичный скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам: Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus.
По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК (99%), а также ПЦР анализа с использованием видоспецифических праймеров тестируемый штамм отнесен к виду Bacillus subtilis.
Полученный штамм характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки
Грамположительные споровые палочки, расположенные беспорядочными скоплениями.
Культуральные признаки
На мясопептонном агаре (МПА) (масс. %): ферментативный пептон – 1,0; натрий хлористый – 0,5; агар – 1,0; вода мясная - остальное, рН 7,0-7,2, формирует желтые  округлой формы колонии диаметром до 5 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются.
На питательном агаре на основе гидролизата рыбной муки (масс. %): гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; рН 7,1 - 7,5, формирует желтые округлой формы колонии диаметром до 1-3 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются.
На среде Сабуро (масс. %): гидролизат рыбной муки – 1,0; панкреатический гидролизат казеина – 1,0; дрожжевой экстракт – 0,2; натрия фосфат однозамещенный – 0,2; D-глюкоза – 4,0; агар – 1,0; вода дистиллированная – остальное; рН 6,0±3, формирует непрозрачные желтоватые  колонии диаметром 1-5 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности среды, легко размазываются.
В мясопептонном бульоне (масс. %): ферментативный пептон – 1,0, натрий хлористый – 0,5, вода мясная – остальное; рН 7,0-7,2, образуют муть и пленку на поверхности бульона.
3
4
2
2
4
2
4
На минеральной среде Мюнца (см. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки. - Микробиология, 1963, №5. - С.1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, бензин) следующего состава: (масс. %) KNO– 0,4; MgSO·7HO– 0,08; NaCl – 0,1; KHPO– 0,14; KHPO– 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты – 1,0; вода дистиллированная – остальное, рН – 7,2, растет в виде серовато-желтых выпуклых колоний диаметром 1 мм.
Физиолого-биохимические признаки
Штамм аэроб, растет при температуре от +5 до +40°С, более интенсивно растет при + 16…+37°С. Растет при рН 5,5–9,0. Оптимум рН 6,0–8,0. Растет в солевом бульоне с добавлением 0,1-2,0% NaCl.
Используемые источники углерода: сорбит.
Проверенные неиспользуемые источники углерода: лактоза, глюкоза, цитрат натрия, малонат натрия. Штамм индол-отрицателен. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная. Фенилаланиндезоксаминаза отрицательная. Не ферментирует бета-галактозидазу. Утилизирует инозит. Продукт, синтезируемый штаммом: поверхностно-активные вещества, способные деструктировать нефть. Использует в качестве источника энергии углеводороды нефти и нефтепродуктов.
Штамм не токсичен по отношению к высшим растениям. Биотестирование проведено на семенах овса обыкновенного и редьки масличной.
Штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в запаянных ампулах и в пробирках на скошенном мясопептонном агаре при температуре +4°С.
Характеристика сырья, используемого для приготовления органоминерального субстрата-носителя для иммобилизации бактерий
Для приготовления твердого субстрата-носителя для иммобилизации штамма Bacillus subtilis СНБС-1 применяется композиционная смесь клиноптилолита, подготовленных древесных опилок и перегноя на основе отходов животноводства (коровьего навоза).
Основные преимущества органоминерального субстрата-носителя  заключаются в повышении почвенного плодородия, улучшении структуры грунтов, активации биологической деструкции нефтезагрязнений, снижении кислотности почвенной среды при одновременном сокращении количества применяемых традиционных минеральных удобрений до 90%. Органоминеральный субстрат-носитель обладает высокой биологической активностью благодаря присутствию гуминовых и фульвокислот, что существенно повышает поступление в растение питательных веществ, активизирует почвенную микрофлору, синтез белков и углеводов, хлорофилла и витаминов, повышает устойчивость растений к воздействию повышенных доз агрохимикатов и нефтяных углеводородов.
Адсорбционные и ионообменные свойства клиноптилолита, входящего в состав органоминеральной композиции, а также содержание в них значительного количества элементов питания растений, определяют их применение в качестве сырья для производства субстратов. Кристаллическая решетка клиноптилолитов сформирована тетраидами с хорошо развитой внутренней поверхностью, что обеспечивает сорбционную способность минералу, позволяя сорбировать нефть, нефтепродукты и другие механические загрязнители не только поверхностью носителя, но и оставаться сорбированным веществам внутри кристаллической решетки.
2
2
2
3
2
3
2
2
2
2
5
При изготовлении композиционной смеси применяется предварительно измельченный клиноптилолит месторождения Хонгуруу (Сунтарский район, Западная Якутия) с содержанием цеолита 60…95 % и с химическим составом SiO 65,01-70,45%; TiO 0,16-0,18%; AlO 10,99-12,00%; FeO 0,70-0,99%; MnO 0-0,02%; MgO 0,77-3,76%; CaO 0,52-3,73%; SrО 0,14-0,24%; NaO 0,44-3,87%; KO 0,9-11,63%; HO 12,96-11,34%; PO 0,01-0,21% (см. ТУ 2163-001-5248924-2006. Цеолитовый туф (месторождение Хонгуруу). Технические условия).
В качестве примеси хонгуринский клиноптилолит может содержать (масс. %): Cd – 0,00422; Pb – 0,00280; V – 0,00190; Cu – 0,00065; Mo - 0,00020;  Co – 0,00010; Ве – 0,00003; As – 0,00000; F – 0,00000;  Hg – 0,00000; Sb – 0,00000; Sn – 0,00000; Zn – 0,00000 (см. Технологический паспорт на цеолиты месторождения Хонгуруу (хонгурин). Добавка к рациону крупного рогатого скота, свиньям и птице. Министерство сельского хозяйства и продовольствия Республики Саха (Якутия), Якутск: Фирма «Хонгурин», 1993. – С. 3-4).
При отсутствии клиноптилолита месторождения Хонгуруу допускается использование природного цеолитового сырья других месторождений, близкого по химическому составу.
В составе композиционной смеси использованы опилки древесные, получаемые при пилении хвойных пород деревьев на раскройном оборудовании, предварительно подготовленные в соответствии со стандартом (см. ГОСТ 18320-78 Опилки древесные технологические для гидролиза. Технические условия), и перегной, полученный из коровьего навоза в соответствии со стандартами (см. ГОСТ Р 53117-2008 Удобрения органические на основе отходов животноводства. Технические условия; ГОСТ 26074-84 (СТ СЭВ 2705-80). Навоз жидкий. Ветеринарно-санитарные требования к обработке, хранению, транспортированию и использованию).
Навоз коровий (Cow Manure) – является средством улучшения структуры почвы и улучшения способности почвы удерживать питательные вещества в виде, доступном для растений.
По физико-химическим показателям навоз коровий должен соответствовать значениям таблицы 1.
В качестве связующего компонента и средства для капсулирования субстрата-носителя применяется 0,9-1,0 % водный раствор натрийкарбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) (см. ТУ 6-55-39-90. Натрийкарбоксиметилцеллюлоза  очищенная).
6
7
2
3
2
КМЦ - порошкообразный или волокнистый не токсичный продукт белого цвета, с химической формулой [СHO(OH)-x(OCHCOOH)x]n. Растворяется как в холодной, так и в горячей воде, образуя золь. Водный раствор КМЦ обладает псевдопластичностью.
Санитарно-гигиенические показатели сырья должны находится в пределах допустимых норм, установленных требованиями (см. Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) (утв. 28.05.10 г. № 299, глава II, раздел 19)).
Технология приготовления препарата
Технология получения препарата включает основные стадии:
1) термообработка и измельчение компонентов для получения субстрата-носителя;
2) приготовление водного раствора натрийкарбометилцеллюлозы;
3) смешивание компонентов;
4) получение биомассы бактерий  Bacillus subtilis СНБС-1;
5) иммобилизация бактерий Bacillus subtilis СНБС-1 на субстрат-носитель;
6) прессование полученной смеси с удалением избыточной влаги и гранулирование с размером гранул 0,5-0,8 см с последующей их сушкой до достижения остаточной влажности 3-5 %;
7) расфасовка препарата.
Получение  биомассы бактерий Bacillus subtilis СНБС-1
Для получения биомассы для иммобилизации твердого субстрата-носителя используют агаровые культуры штамма Bacillus subtilis СНБС-1.
9
3
Культуры Bacillus subtilis СНБС-1, выращенные на скошенном ГРМ-агаре промышленного производства, основой которого является гидролизат рыбной муки либо мясопептонный агар (МПА) промышленного производства, смывают стерильной водой, готовят в необходимом количестве суспензию. Концентрация клеток в суспензии должна составлять 1⋅10 кл/см по оптическому стандарту ГИСК им. А.М. Тарасевича. Эта суспензия является посевным материалом, используемым для засева в ферментер для увеличения объема до количества, необходимого для получения препарата.
Приготовление посевного материала состоит из следующих стадий:
1. Получение культуры Bacillus subtilis СНБС-1 на скошенном агаре.
2. Выращивание культуры Bacillus subtilis СНБС-1 в малом посевном аппарате.
3. Выращивание культуры Bacillus subtilis СНБС-1 в большом посевном аппарате.
4. Накопление культуры культуры Bacillus subtilis СНБС-1 в малом ферментере.
Передачу чистых культур Bacillus subtilis СНБС-1 из одного аппарата в другой осуществляют в конце логарифмической фазы роста. Качество полученного посевного материала контролируют путем микроскопирования.
Ферментация культуры Bacillus subtilis СНБС-1
Для ферментации культуры Bacillus subtilis СНБС-1 применяют ферментер типа Ф-300В производства ЗАО «НПС «Элита-Комплекс» (см. Сертификат соответствия № C RU АИ 16. А. 08334 от 15.03.2012 г. ООО Уральский центр сертификации и испытаний «Уралсертификат»).
3
4
2
2
4
2
4
Вначале в ферментере готовят минеральную питательную среду. Для чего в ферментер заливают 240 л чистой профильтрованной воды комнатной температуры, вносят питательные элементы следующего состава (масс. % к воде): KNO – 0,4; MgSO·7HO – 0,08; NaCl – 0,1; KHPO – 0,14; KHPO – 0,06.
В качестве энергетического субстрата добавляют сырую нефть не менее 1 % (по объему). Закрывают крышку ферментера и включают перемешивание. Затем корректируется рН среды. Для этого через канат посредством шприца отбирают пробу питательной среды, измеряют рН и через этот же канал вводят дозы (по 10-20 мл) либо 10% водного раствора кислоты (HCl), либо раствора щелочи (NaOH).
После чего в ферментер вводят посевной материал в объеме 10% от объема питательной среды, включают насос и открывают кран. В процессе культивирования контролируют работу ферментера, заданные значения температуры, степень аэрации и пенообразования, состояние систем обеспечения.
При необходимости в ферментер через кран вводят химический пеногаситель (солярку), отбирают пробы культуральной жидкости для контроля.
По окончании процесса культивирования наработанную биомассу бактерий Bacillus subtilis СНБС-1 сливают в стерильные емкости и используют для иммобилизации твердого субстрата–носителя.
Иммобилизация Bacillus subtilis  СНБС-1 на субстрат—носитель
В качестве субстрата-носителя для иммобилизации биомассы клеток Bacillus subtilis СНБС-1 используют заранее подготовленную органоминеральную композицию на основе клиноптилолита, древесных опилок и перегноя в соотношении, масс. %: клиноптилолит – 10,0; подготовленные опилки древесные  - 10,0; перегной – 80,0.
Для иммобилизации используют жидкую биомассу клеток Bacillus subtilis СНБС-1, полученную методом ферментации, в объеме 10% от объема субстрата-носителя. Подготовленные компоненты смешивают в смесительном устройстве типа БС-180 при 50-60 оборотах в минуту. После смешивания и пропитки субстрата–носителя биомассой клеток Bacillus subtilis СНБС-1 его высушивают контактным способом при температуре 37°С до постоянной массы или при комнатной температуре в течение 2-х суток. После чего препарат готов к использованию. Сухой препарат помещают в кеги или двухслойные полиэтиленовые мешки и запаивают.
Параметры препарата должны соответствовать значениям таблицы 2.
Применение препарата актуально в следующих направлениях:
- интродукция активно деградирующих нефть селектированных штаммов УОБ (в загрязненную экосистему) и управление данным процессом;
- стимуляция естественной углеводородокисляющей микрофлоры нефтезагрязненных субстратов, участвующей в биодеградации нефтяных загрязнений;
- оптимизация процессов биологической деградации нефтезагрязнений с целью достижения высокого эффекта в очистке и доочистке нефтезагрязненных субстратов.
Указания по применению препарата
Для очистки почв от нефтезагрязнений
При использовании препарата необходимо учитывать содержание микроэлементов в почве (местный геохимический фон) согласно нормативам (см. ГН 2.1.7.2041. Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в почве).
Препарат вносят в почву без предварительной подготовки (в том виде, в котором он поступил на объект) с помощью
- специальной техники (сеялки, навозоразбрасыватели, машины для внесения удобрений и др.) при больших объемах работ;
- вручную при небольших площадях нефтезагрязнений.
Препарат рекомендуется вносить при среднесуточных температурах почвы +5…+40°С. Допустимый уровень кислотности рН 4,5-9,0. Влажность почвы в пределах 40-60%. Рекомендуемый временной интервал между внесениями биопрепарата в почву – 30-45 суток. Нормы расхода препарата представлены в таблице 3.
Через 30-45 суток проводится повторный отбор почвенных проб на содержание остаточного количества нефти и нефтепродуктов. Данный анализ позволит определить необходимость проведения повторной обработки.
Качество очистки почв от нефтезагрязнений контролируется гравиметрическим методом (см. РД 52.18.647-2003 Определение массовой доли нефтепродуктов в почвах. Методика выполнения измерений гравиметрическим методом).
Для очистки водных объектов от нефтезагрязнений
Препарат вносят в водные объекты без предварительной подготовки (в том виде, в котором он поступил на объект) с помощью:
- специальной техники (сеялки, навозоразбрасыватели, машины для внесения удобрений и др.) при больших объемах работ;
- вручную при небольших площадях нефтезагрязнений, из расчета 1 кг препарата на 0,1 куб.м воды.
Препарат рекомендуется вносить при среднесуточных температурах воды выше +5…+37°С. Допустимый уровень кислотности рН 4,5-9,0. Рекомендуемый временной интервал между внесениями биопрепарата 30-45 суток.
Через 30-45 суток проводится повторный отбор проб воды на содержание остаточного количества нефти и нефтепродуктов. Данный анализ позволит определить необходимость проведения повторной обработки.
Качество очистки воды от нефтезагрязнений контролируется ИК-фотометрическим методом (см. ФР.1.31.2010.07127 МВИ01.02.161 «Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера нефтепродуктов ИКН-025»; РД 52.24.476-2007 Массовая концентрация нефтепродуктов в водах. Методика выполнения измерений ИК-фотометрическим методом).
Утилизация
Утилизация некондиционных отходов и отсевов сырья осуществляется в соответствии с указаниями СанПиН 2.1.7.1322-03, требованиями по защите окружающей среды и действующего законодательства, а также органов местной власти (см. СанПиН 2.1.7.1322-03 Гигиенические требования к размещению и обезвреживанию отходов производства и потребления). По возможности следует избегать образования отходов или минимизировать их количество. Утилизация неотработанного препарата проводится по требованиям, предъявляемым к веществам 4 класса опасности.
Требования к условиям производства и техники безопасности
Помещения для работы с микроорганизмами должны отвечать Санитарно-эпидемиологическим правилам (см. СП 1.3.2322-08 Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней).
Изобретение поясняется следующими примерами
Пример 1. Очистка почвы от нефтезагрязнений с применением препарата.
Опыты с применением препарата проведены на супесчанной почве, загрязненной нефтью. Исходное содержание нефтепродуктов (НП) в почве до внесения препарата составило от 2780 до 2960 мг/кг (см. таблицу 4).
Эффективность применения препарата оценивали по степени деградации нефтезагрязнения согласно инструкции (см. РД 39-0177098-015-90 «Инструкция по контролю за состоянием почв на объектах предприятий  Миннефтепрома»).
Для этого образцы почвы до и после  обработки биопрепаратом подвергались экстракции в аппарате Сокслета четыреххлористым углеродом, после чего экстрагент удаляли перегонкой с дефлегматором, доводя остаток до постоянного веса. Определение влажности образцов проводили общепринятым  методом (см. ГОСТ 28268-89 «Почвы. Методы определения влажности, максимальной гигроскопической влажности»), после чего производили перерасчет содержания нефтепродуктов на сухую почву.
Установлено, что степень биодеградации нефти и нефтепродуктов в опытных образцах через 45 суток после однократной обработки почв полученным препаратом составила при температуре +5±1°С – 28,1-29,0%; при температуре +20±1°С – 71,9-72,2%; при температуре +30±1°С – 72,2-73,4%; при температуре +40±1°С – 63,6-65,2% (см. таблицу 4).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об эффективности препарата для очистки почв от нефтезагрязнений.
Пример 2. Очистка воды от нефтезагрязнений с применением препарата
3
3
3
3
3
Для опыта в эксикатор объемом 5,0 дм вносили 3,0 дм водопроводной воды отстоявшейся в течение суток, и 0,03 л препарата. Для создания нефтяной пленки в емкости добавили 2880 мг/дмнефти и нефтепродуктов. В качестве контроля использовали воду в количестве 3,0 дм с добавлением 2880 мг/дмнефти и без внесения препарата.
Эксперимент проводили в течение 45 суток, поддерживая температуру воды в интервале +15…+20°С. Полученные результаты показали, что деструкция нефти за 45 суток под действием препарата составила 59,0% для варианта с нефтью; 62,1% - с соляркой; 64,6% - с керосином; 65,3% - с маслом моторным; 61,8% - с маслом гидравлическим (см. таблицу 5).
Таким образом, преимуществом препарата является то, что он благодаря совокупности уникальных свойств органоминерального субстрата-носителя и иммобилизованного на него штамма бактерий Bacillus subtilis СНБС-1 обладает способностью стимулировать в почвах и воде биологическую деградацию нефтезагрязнений.
Способ приготовления и использования предлагаемого препарата экономически выгоден, так как для своего осуществления не требует сложного технологического оборудования, а составные компоненты субстрата-носителя являются одновременно и доступным, и дешевым сырьем.
Таблица 1
Физико-химические показатели коровьего навоза
Наименование показателя
Норматив
Консистенция (фазовое состояние), визуальный осмотр
Сыпучее
Массовая доля сухого вещества, %, не менее
85
Массовая доля органического вещества, на сухое вещество, не менее
50
рН
6,0-8,5
Азот общий, с исходной влажностью, не менее
0,6
Фосфор общий (в пересчете на Р<sub>2</sub>О<sub>5</sub>), с исходной влажностью
0,5
Калий общий (в пересчете на K<sub>2</sub>О), с исходной влажностью
0,6
Содержание тяжелых металлов, мг/кг сухого вещества:- свинца- мышьяка- кадмия- ртути
130,010,02,02,1
Санитарно-показательные микроорганизмы, клеток/г:- колиформы- энтеробактерии- индекс патогенных микроорганизмов- цисты кишечных патогенных простейших, экз/100 г
1-91-9ОтсутствуютОтсутствуют
Таблица 2
Биологические и физико-химические свойства препарата
Номенклатура испытаний
Норматив
Внешний вид, цвет
Гранулы  от коричневого до черного цвета с включениями желтого (от древесных опилок) и светло-зеленого цвета (от клиноптилолита)
Размер гранул, мм
0,5-0,8
Соотношение компонентов, %:- цеолит- опилки- карбоксиметилцеллюлоза- биомасса биодеструкторов- навоз (помет)
101011остальное
Сорбционная емкость, кг/кг
2-3
Влажность сорбента, %
3-5
Санитарно-бактериологические показатели:- индекс  бактерий группы кишечных палочек- индекс энтерококков- индекс патогенных микроорганизмов- цисты кишечных патогенных простейших, экз/100 г
1-91-9ОтсутствуютОтсутствуют
Нефтеокисляющая активность, % не менее
Таблица 3
Нормы расхода препарата
Концентрация нефтяного загрязнения в почве
Расход препарата, л/кг почвы
%
мг/кг
кг/1 кг почвы
кг/10 кг почвы
кг/100 кг почвы
кг/1000 кг почвы
1-5
10 000 - 50 000
0,01 – 0,05
0,1-0,5
1,0-5,0
10,0-50,0
5-10
50 000 - 100 000
0,05 – 0,1
0,5-1,0
5,0-10,0
50,0-100,0
10-30
10 000 - 300 000
0,1 – 0,3
1,0-3,0
10,0-30,0
100,0-300,0
30-100
300 000 – 1000 000
0,3 – 1,0
3,0-10,0
30,0-100,0
300,0-1000,0
Таблица 4
Деструкция нефтепродуктов в почве под влиянием препарата
Схема опыта
Содержание НП, мг/кг
Деградация НП,%
до очистки
после очистки
Температура+5±1°С
Почва+нефть
2960
2940
0,7
Почва+нефть+B.subtilis  СНБС-1
2960
2720
8,1
Почва+нефть+органоминеральный субстрат
2960
2520
14,8
Почва+нефть+препарат
2960
2100
29,0
Почва+солярка
2920
2900
0,7
Почва+солярка+B.subtilis  СНБС-1
2920
2640
10,6
Почва+солярка+органоминеральный субстрат
2920
2520
13,7
Почва+солярка+препарат
2920
2100
28,1
Температура+20±1°С
Почва+нефть
2920
2820
2,0
Почва+нефть+B.subtilis  СНБС-1
2920
1300
53,9
Почва+нефть+органоминеральный субстрат
2920
2480
15,1
Почва+нефть+препарат
2920
820
71,9
Почва+солярка
2880
2820
3,4
Почва+солярка+B.subtilis  СНБС-1
2880
1300
8,1
Почва+солярка+органоминеральный субстрат
2880
2390
17,0
Почва+солярка+препарат
2880
800
72,2
Температура+30±1°С
Почва+нефть
2860
2794
2,3
Почва+нефть+B.subtilis  СНБС-1
2860
1150
53,8
Почва+нефть+органоминеральный субстрат
2860
2490
12,9
Почва+нефть+препарат
2860
780
72,7
Почва+солярка
2860
2800
2,06
Почва+солярка+B.subtilis  СНБС-1
2860
1220
56,4
Почва+солярка+органоминеральный субстрат
2860
2440
14,7
Почва+солярка+препарат
2860
760
73,4
Температура+40±1°С
Почва+нефть
2800
2760
1,42
Почва+нефть+B.subtilis  СНБС-1
2800
1270
53,9
Почва+нефть+органоминеральный субстрат
2800
2460
12,1
Почва+нефть+препарат
2800
1020
63,6
Почва+солярка
2760
2700
1,1
Почва+солярка+B.subtilis  СНБС-1
2760
1240
54,9
Почва+солярка+органоминеральный субстрат
2760
2400
13,0
Почва+солярка+препарат
2760
960
65,2
Таблица 5
Динамика деструкции нефти в воде после внесения препарата
Вариант опыта
Содержание НП, мг/дм<sup>3</sup>
Деструкция НП,%
до опыта
после опыта
Контроль (вода+нефть)
2880
2740
4,86
Вода+нефть+Препарат
2880
1180
59,0
Вода+солярка+Препарат
2880
1090
62,1
Вода+керосин+Препарат
2880
1020
64,6
Вода+газовый конденсат+Препарат
2880
1000
65,3
Вода+масло моторное+Препарат
2880
1000
65,3
Вода+масло гидравлическое+Препарат
2880
1100
61,8