СПОСОБ УПРАВЛЯЕМОЙ ЛАЗЕРНОЙ ЛОКАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕРМИИ КЛЕТОК ИЛИ МИКРООРГАНИЗМОВ
METHOD OF CONTROLLED LASER LOCAL HYPERTHERMIA OF CELLS OR MICROORGANISMS

Изобретение относится к области биомедицинских клеточных технологий, в частности к созданию способа управляемой локальной импульсной лазерной гипертермии плазматических мембран клеток и микроорганизмов на основе наносекундного резонансного нагрева золотых нанозвезд, нечувствительных к пространственной ориентации наночастиц на поверхности мембран клеток, вызывающих неинвазивную локальную гипертермию и трансфекцию плазматической мембраны клеток.
Известен способ лазерной локальной гипертермии клеток и селективного разрушения раковых клеток при импульсном лазерном облучении (Pitsillides C.M., Joe E.K., Wei X., Anderson R.R., Lin C.P. Selective cell targeting with light-absorbing microparticles and nanoparticles // Biophys J. 2003. V. 84. P. 4023-4032). Способ включает введение в кровь внутривенно золотых сферических наночастиц, которые накапливаются в опухоли вследствие большой концентрации кровеносных сосудов в опухоли, облучение опухоли лазерным пучком с длиной волны, совпадающей с максимумом поглощения наночастиц, при этом наночастицы нагреваются лазерными наносекундными импульсами.
Однако данный способ обладает следующими недостатками. Золотые наносферы диаметром от единиц до сотен нанометров имеют плазмонный резонанс с максимумом поглощения от 520 нм до 560 нм, совпадающий с максимумами поглощения гемоглобина крови, при этом лазерное излучение будет поглощаться не только наночастицами, но и эритроцитами крови, поэтому лазерный фототермолиз может осуществляться только для поверхностных опухолей, так как невозможно доставить лазерное излучение на глубину более сотни микрон в биотканях. Кроме того, для лазерного излучения в этой спектральной области будет происходить поглощение излучения гемоглобином эритроцитов и их разрушение вследствие фототермолиза.
Известен также способ лазерной локальной гипертермии клеток или микроорганизмов, включающий использование золотых нанопалочек на мембранной поверхности клеток или микроорганизмов и облучение линейно-поляризованным лазерным излучением этого ансамбля клеток для их необратимого повреждения или локальной гипертермии как непрерывным, так и импульсным излучением, при этом длина волны лазера выбирается в области плазмонного резонанса золотых нанопалочек в ближней ИК области спектра (Dykman L. A., Khlebtsov N.G. Gold nanoparticles in biomedical applications. Boca Raton : Taylor & Francis, 2017. LCCN 2017035815| ISBN 9781138560741).
Однако этот способ обладает существенным недостатком, связанным с тем, что лазерное излучение, создаваемое в оптических резонаторах, как правило, имеет линейную поляризацию выходного излучения. При этом температура нагрева нанопалочки будет существенно зависеть от взаимной ориентации вектора электрической компоненты поля электромагнитной волны и большой оси нанопалочки (Dykman L. A., Khlebtsov N.G. Gold nanoparticles in biomedical applications. Boca Raton: Taylor & Francis, 2017. LCCN 2017035815| ISBN 9781138560741). Если они совпадают, то коэффициент поглощения лазерного излучения достигает максимума, а при ортогональной ориентации - минимума. При этом разница в коэффициентах поглощения достигает трех порядков и, соответственно, этот поляризационный эффект отражается на величине температуры нагрева нанопалочек, т.е. разница в температурах нагрева плазмонно-резонансных золотых нанопалочек будет отличаться в тысячу раз. Таким образом, при лазерном облучении часть нанопалочек будет оставаться холодными, в то время как другие могут оплавляться. В ансамбле нанопалочек при их осаждении на мембраны клеток ориентация палочек между собой будет случайной и соответственно случайна будет величина локальной гипертермии клеток, вызванная наночастицами при резонансном лазерном облучении и, соответственно, осуществить управляемый нагрев или локальную гипертермию клеток или микроорганизмов практически невозможно.
Chem. Mater.
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ лазерной локальной гипертермии клеток или микроорганизмов, включающий использование золотых нанозвезд на поверхности клеток или микроорганизмов, который, в отличие от нанопалочек, не чувствителен к поляризации лазерного излучения. Способ включает синтез золотых нанозвезд, введение определенного объема коллоидного раствора золотых нанозвезд в стандартные лунки биологического пластикового планшета определенного диаметра, центрифугирование планшета для осаждения нанозвезд на поверхность лунок планшета, введение и культивирование клеток или микроорганизмов на поверхности лунок с наночастицами, облучение клеток или микроорганизмов лазерным излучением с длиной волны, совпадающей с максимумом плазмонного резонанса золотых нанозвезд (Timofey Pylaev, Ekaterina Vanzha, Elena Avdeeva, Boris Khlebtsov, Nikolai Khlebtsov. A novel cell transfection platform based on laser optoporation mediated by Au nanostar layers. J. Biophotonics. 2019;12: e201800166. DOI: 10.1002/jbio.201800166 ; Yaojuan Hu, Xiaoyan Liu, Zhewei Cai, Hui Zhang, Han Gao,Wenjing He, Ping Wu, Chenxin Cai, Jun-Jie Zhu, and Zijie YanEnhancing the Plasmon Resonance Absorption of Multibranched Gold Nanoparticles in the Near-Infrared Region for Photothermal Cancer Therapy: Theoretical Predictions and Experimental Verification. Chemistry of Materials., Just Accepted Manuscript • DOI: 10.1021/acs.chemmater.8b04299).
2
2
При этом плотность энергии в лазерном пучке соответствует 30 Дж/см , т.е. при плотности лазерной мощности 1 Вт/см облучение производят в течении 30 секунд. Такой уровень плотности лазерной энергии должен вызывать, соответственно, изменение средней температуры ансамбля клеток на 25 градусов и температура клеток должна достигнуть 48°С, что соответствует точке фазового перехода в липидных мембранах клеток. Температура клеток определялась контактным методом с помощью термопары с площадью поверхности зонда в десятки тысяч раз, превышающего площадь поверхности клетки.
Основным недостатком данного метода является отсутствие контролируемого локального нагрева клеток, несмотря на то, что источником поглощения резонансного лазерного излучения является ансамбль нанозвезд.
В настоящее время не существует метода определения температуры отдельной нанозвезды, а средняя температура, определяемая пространственно-усредненным термодатчиком типа термопары, позволяет оценивать только среднюю термодинамическую температуру <Т> в пределах миллиметровых размеров. При этом локальная температура нанозвезд может сильно превышать измеренную среднюю. Локальная температура δТ для ансамбля металлических наносфер может отличатся от средней температуры <Т>, которую можно определить из соотношения
2
δТ/ <Т> =1/(Dd N).  (1)
Xplore
где d размер наносферы, D-сферическая область усреднения, N -концентрация наночастиц в D. (Yu. A. Avetisyan ; A. N. Yakunin ; A. A. Bykov ; V. V. Tuchin. The modeling of local distribution of the temperature photoinduced by ensemble of nanoparticles. 2016, P. S2-48, 2016 International Conference Laser Optics (LO) Date of Conference: 27 June-1 July 2016 , Date Added to IEEE : 25 August 2016ISBN Information: INSPEC Accession Number: 16263353,DOI: 10.1109/LO.2016.7550015)
В соответствие с соотношением (1), если в облучаемую область D попадает одна клетка или бактерия размером 1-3 микрона, то при характерном диаметре наночастицы 0.1 микрона, а в области усреднения D содержится 1-2 наночастицы, то отличия δТ от средней температуры может составлять несколько раз. При этом, чем больше наночастиц приходится на клетку, тем, соответственно, меньше перепады температуры нагрева наночастицы и средней измеряемой температуры.
Технической проблемой заявляемого изобретения является обеспечение контролируемого нагрева клеток и микроорганизмов при повышении локальности области гипертермии.
Технический результат - обеспечение управления локальной гипертермией клеток и микроорганизмов независимо от поляризации лазерного излучения.
max
1/2
max
1/2
L
2
Техническая проблема и заявляемый технический результат достигаются тем, что в способе лазерной локальной гипертермии клеток или микроорганизмов, включающем использование золотых нанозвезд, облучение клеток или микроорганизмов линейно-поляризованным лазерным излучением, согласно изобретению, золотые нанозвезды осаждают на поверхность клетки или микроорганизмов из коллоидного раствора, облучение осуществляют импульсным излучением из диапазона длин волн 500-1200 нм, контролируют положение максимума и спектральную ширину плазмонного резонанса с помощью измерения спектральной зависимости коэффициента пропускания коллоидного раствора нанозвезд в видимом и ближнем ИК диапазоне, определяют добротность плазмонного резонанса Q = λ / Δλ, как отношение длины волны λ, соответствующей максимуму плазмонного резонанса к его спектральной ширине Δ λ, соответствующей уменьшению плазмонного резонанса вдвое, при этом если добротность плазмонного резонанса Q больше 8, то облучение осуществляют на длине волны, соответствующей максимуму плазмонного резонанса, если добротность плазмонного резонанса Q лежит в диапазоне 2-8, то облучение осуществляют двумя соосными лазерными пучками с длинами волн больше и меньше максимума плазмонного резонанса со спектральным расстоянием между ними Δλ большим, чем ширина плазмонного резонанса относительно его максимума, концентрацию коллоидного раствора нанозвезд выбирают из условия, чтобы на поверхности каждой клетки или микроорганизма располагалась от одной до сотен нанозвезд, при этом длительность лазерного импульса выбирают в наносекундном диапазоне не более 10 нс, а плотность мощности регулируют в диапазоне, не превышающем 1 МВт/см в лазерном импульсе.
Таким образом, осуществляется возможность управления локальной зоной гипертермии, составляющей десятки нанометров на поверхности плазматической мембраны клеток и микроорганизмов и регулирования числа таких нанозон локального нагрева, через которые может осуществляться трансфекция или оптопорация клеток на основе наносекундного лазерного плазмонно-резонансного облучения золотых нанозвезд с лазерным излучением с двумя длинами волн, выбранных в зависимости от добротности плазмонного резонанса в видимом или ближнем ИК диапазоне. Локальная область определяется расстоянием между тремя ближайшими лучами в нанозвезде, составляющими типичную область в диаметре не более 10-30 нанометров на поверхности плазматических мембран клеток и микроорганизмов от каждой нанозвезды.
Изобретение поясняется чертежами, где представлены:
на фиг. 1 - экспериментальная зависимость коэффициента экстинкции, равного коэффициенту поглощения и коэффициенту рассеяния золотых наночастиц от длины волны (нм) в видимом и ближнем инфракрасном диапазоне: (a) - золотые нанопалочки; (б) золотые нанозвезды; в верхней части графиков представлены электронные изображения, полученные с помощью электронного просвечивающего микроскопа ТЕМ, масштабная метка 50 нм;
на фиг. 2 - типичная 3D топограмма поверхности золотой нанозвезды, используемой для конечно-элементного моделирования оптических процессов поглощения, рассеяния, нагрева и расчета спектральных, поляризационных и температурных характеристик для лазерной локальной гипертермии;
на фиг. 3, фиг. 4. и фиг. 5 - поляризационные зависимости сечения поглощения золотой нанопалочки (фиг. 3), симметричной золотой нанозвезды (одинаковые по размерам лучи) (фиг. 4) и асимметричной ( различные длины лучей в одной звезде) (фиг. 5) от двух поляризационных углов- полярного ϴ и азимутального φ;
на фиг. 6 - спектральные зависимости сечения экстинкции (поглощения и рассеяния) нанозвезд для различных значений длин лучей в диапазоне от 10 (кривая слева) до 20 (кривая справа) нм с шагом 1 нм при диаметре ядра 25 нм;
на фиг. 7 - спектральные зависимости сечения экстинкции ансамбля нанозвезд (результирующая кривая построена с учетом нормального распределения длин лучей в диапазоне 15 ± 5 нм);
на фиг. 8 - влияние длины лучей на сечение поглощения нанозвезд в коллоидном растворе для двух длин волн облучающего лазера, равных 808 нм и 1064 нм, типичных для экспериментов по лазерной гипертермии;
2
2
2
на фиг. 9 - зависимости максимального температурного нагрева нанозвезд за лазерный импульс при варьировании длины лучей в исследуемом диапазоне L=10-20 нм, для трех длин волн лазерного излучения в одноволновом режиме; для обеспечения одинакового нагрева на 50 К нанозвезды с длиной лучей L=15 необходимы различающиеся интенсивности I лазерного пучка: для λ=532 нм - I=1.03 МВт/см; для λ=808 нм - I=0.07 МВт/см; для λ=1064 нм - I=6.89 МВт/см;
на фиг. 10 - зависимости максимального температурного нагрева нанозвезд за лазерный импульс при разных длинах лучей в диапазоне L=10-20 нм при двухволновом и трех волновом 4-х наносекундном импульсном лазерном облучении с двумя длинами волн λ=532 нм и λ=1064 нм и тремя λ=532 нм, λ=808 нм и λ=1064 нм;
на фиг. 11 - топограммы локального распределение температуры в конце 4-х нс лазерного импульса на внутренней поверхности мембраны клетки;
на фиг. 12 - пространственное распределение температуры в конце лазерного импульса на длине 20 нм на внутренней поверхности мембраны под тремя контактирующими с клеткой лучами нанозвезды;
на фиг. 13 - кинетики нагрева внутренней поверхности мембраны при воздействии 4 нс импульса поглощенной мощности для различных по размерам лучей нанозвезд при воздействии определенной одинаковой мощности;
2
на фиг. 14 - флуоресцентное изображение суспензии клеток, инкубированных с золотыми нанозвездами: а - необлученные, б, в - облученные пространственно сканирующим лазерным пучком на квадрате 4 на 4 мм; длина волны излучения лазера 1064 нм, длительность каждого импульса 4 нс, интенсивность излучения 1 МВт/см.
Способ осуществляется следующим образом:
max
1/2
max
ext
max
1/2
ext
max
По известным протоколам (Yuan H, Khoury C G, Hwang H, Wilson Ch M, Grant G A and Vo-Dinh T. 2012. Gold nanostars: surfactant-free synthesis, 3D modelling, and two-photon photoluminescence imaging Nanotechnology 23 075102 ) синтезируют коллоидный раствор золотых нанозвезд. С помощью спектрофотометра видимого и ближнего ИК диапазона измеряют спектральную зависимость коэффициента пропускания коллоидного раствора золотых нанозвезд в кювете фиксированной толщины. Из экспериментальных спектров пропускания коллоидного раствора нанозвезд в видимом и ближнем ИК диапазоне определяют положение максимума и спектральную ширину коэффициента поглощения плазмонного резонанса. Рассчитывают из измеренных спектров пропускания величину добротности плазмонного резонанса Q = λ / Δ λ, как отношение длины волны λ, соответствующей максимуму плазмонного резонанса (коэффициента экстинкции C (λ)) к его спектральной ширине Δ λ, соответствующей уменьшению плазмонного резонанса вдвое (C (λ)/2).
L
1/2
При этом, если добротность плазмонного резонанса Q больше 8, то облучение осуществляют на длине волны, соответствующей максимуму плазмонного резонанса, если добротность плазмонного резонанса Q лежит в диапазоне 2-8, то облучение осуществляют двумя соосными лазерными пучками с длинами волн излучения больше и меньше максимума плазмонного резонанса со спектральным расстоянием между ними Δλ большим, чем ширина плазмонного резонанса Δ λ, если меньше 2, то технический результат не достигается.
2
С помощью оптического микроскопа (поляризационного, темнопольного или конфокального) определяют количество клеток и микроорганизмов на облучаемой поверхности. Исходя из количества клеток, которые будут подвергнуты лазерной трансфекции, приготавливают концентрацию коллоидного раствора нанозвезд и его объем из условия, чтобы на поверхности каждой клетки или микроорганизма располагалась от одной до сотен нанозвезд. Осаждают наночастицы из коллоидного раствора на поверхность клеток или микроорганизмов с помощью центрифугирования или естественного (гравитационного) оседания. Облучают ансамбль клеток или микроорганизмов лазерным пучком с шириной, соизмеримой с размером площади поверхности, на которой расположены культивированные клетки. Выбирают импульсный лазер с одной или двумя длинами волн в зависимости от измеренной добротности плазмонного резонанса ансамбля нанозвезд, выбирают лазеры с длительностью оптического импульса не более 10 нс, устанавливают и регулируют плотность лазерной мощности в диапазоне, не превышающем 1 МВт/см.
,
,
. C
Существование разброса геометрических параметров лучей при технологии химического синтеза нанозвезд вследствие трудности пространственного контроля процесса самоорганизации приводит, как было показано в многочисленных экспериментальных и теоретических работах, к малой добротности плазмонных резонансов золотых нанозвезд при измерении спектральных коэффициентов пропускания, как показано на Фиг. 1 (Trigari, S.; Rindi, A.; Margheri, G.; Sottini, S.; Dellepianebc, G; Giorgettiac, E.; Synthesis and modelling of gold nanostars with tunable morphology and extinction spectrumJ. Mater. Chem.21 6531-6540 (2011) [doi:10.1039/c0jm04519e] ; Atta, S.; Tsoulos, T.V.; Fabris L. Shaping Gold Nanostar Electric Fields for Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Enhancement via Silica Coating and Selective Etching. J. Phys. Chem, 12037, 20749-20758, (2016) [doi:10.1021/acs.jpcc.6b01949]; Tsoulos, T. V.; Han, L.; Weir, J.; Xinb, H. L.; Fabris, L. A closer look at the physical and optical properties of gold nanostars: an experimental and computational study Nanoscale, 9, 3766-3773 (2017) [doi:10.1039/c6nr09091e].
Как показывают электродинамические численные расчеты на основе метода конечных элементов (COMSOL MultyPhysics 5.1) сечения поглощения и рассеяния симметричных нанозвезд, представленных на фиг. 4., реализуется абсолютная ориентационная нечувствительность таких нанозвезд (неизменность коэффициента поглощения и, соответственно, температуры нанозвезд от азимутальных и полярных углов) к поляризации лазерного излучения по сравнению с нанопалочками, где она достигает трех порядков. В реальной ситуации, основанной на исследовании морфологии изображения асимметричных нанозвезд, полученных с помощью электронного микроскопа, показано, что при разбросе длин лучей в асимметричной звезде наблюдается незначительная ориентационная анизотропия, не превышающая 30% и показанная на фиг. 5.
ext
2
Результаты численного моделирования спектральной зависимости сечения экстинкции C(суммы сечения поглощения и сечения рассеяния) симметричных нанозвезд для различных длин лучей от 10 до 20 нм в звезде при одинаковом размере ядра 25 нм представлены на фиг. 6. Видно, что кривые сечения поглощения для каждого варианта геометрии нанозвезды имеют форму, типичную для описания резких резонансов. Ширина каждой из кривых на половинной высоте составляет от 40 нм для нанозвезд с минимальной длиной лучей L =10 нм до 60 нм для нанозвезд с максимальной длиной лучей L =20 нм. Максимумы сечения поглощения для этих нанозвезд также отличаются приблизительно в два раза - от 7000 до 17000 нм. Нетрудно видеть, что с ростом длины лучей происходит линейное увеличение поглощения, при этом добротность плазмонного резонанса составляет 15-16 и практически не меняется от длины лучей.
Если бы удалось контролировать процесс синтеза нанозвезд и соответственно создавать звезды с такой добротностью, то для технологии управляемой лазерной гипертермии необходимо настраиваться лазерным излучением в максимум плазмонного резонанса. Для существующих в настоящее время технологий синтеза нанозвезд экспериментально измеренная добротность плазмонного резонанса составляет 2-3.
Опыт экспериментальных исследований TEM фотографий конфигураций нанозвезд показывает, что с большой долей вероятности распределение длины лучей в синтезированных ансамблях может быть аппроксимировано нормальным законом:
(2)
L
где  - длина луча каждой из фракций,  - средняя по ансамблю длина лучей,  - отклонение длины лучей от среднего значения .
Тогда с учетом вклада каждой из размерных фракций нанозвезд ансамбля расчетная интегральная спектральная кривая экстинкции будет иметь вид, показанный на фиг. 7. Оценки показывают, что добротность интегрального плазмонного резонанса составляет приблизительно 4, а форма близка к экспериментальным спектральным зависимостям коэффициентов поглощения.
Представленная модель интегрального плазмонного резонанса позволяет оценить вклад в коэффициент поглощения каждой фракции звезд при облучении на типичных длинах волн излучения, используемых в лазерной гипертермии 808 и 1064 нм. Эти результаты представлены на фиг. 8. Нетрудно видеть, что на длине волны 808, близкой к интегральному плазмонному резонансу, наблюдается резонансный характер поглощения звезд от длины лучей, а для более инфракрасной длины волны на краю интегрального плазмонного резонанса наблюдается линейная зависимость поглощения в логарифмической шкале или соответственно экспоненциальная в линейной. Такая нелинейная зависимость коэффициента поглощения ансамбля звезд приводит к сложной нелинейной зависимости рассчитанных температурных полей ансамбля нанозвезд с разными длинами лучей при одноволновом облучении на трех характерных длинах волн меньше, больше и в максимуме интегрального плазмонного резонанса. Сказанное представлено на фиг. 9. Эти зависимости показывают сильную нелинейную чувствительность к уровню облучающей лазерной мощности, используемой для управления температурой ансамбля нанозвезд. Однако, если использовать двухволновый режим, то для ансамбля нанозвезд с добротностью плазмонного резонанса порядка 2-4 и выше и выбора длин волн, больших ширины плазмонного резонанса, можно добиться относительно равномерного нагрева звезд с разными длинами лучей с разбросом и таким образом управлять гипертермией независимо от морфологии звезд и их пространственной ориентации на мембране клеток и микроорганизмов. Использование трехволнового режима увеличивает эффективность лазерного нагрева ансамбля нанозвезд, однако не повышает равномерность нагрева звезд с разной длиной лучей, но при этом технически сильно усложняет метод (фиг. 10).
Интегральный спектральный отклик от ансамбля разновеликих наночастиц сглаживает реальные кривые поглощения индивидуальных нанозвезд. Эти процессы синтеза нанозвезд отражаются на экспериментальных спектральных кривых поглощения золотых нанозвезд, представленных на фиг. 1. Однако процессы локальной гипертермии и трансфекции клеток при импульсном облучении интенсивными лазерными пучками определяются именно уровнем поглощения индивидуальных нанозвезд и их индивидуального взаимодействия с оболочкой клетки. В этом отношении известная технология низкоинтенсивной лазерной гипертермии с использованием плазмонных наночастиц, используемая в прототипе, принципиально отличается по степени локализации температурного поля от заявляемой технологической платформы управляемой нанолокальной гипертермии клеток и микроорганизмов. В прототипе степень пространственной локализации температурного поля имеет совершенно иной масштаб, отличный от наноразмерного (на несколько порядков). Определяющим параметром является концентрация плазмонных наночастиц, при этом свойства отдельных наночастиц имеют второстепенное значение. Расчет температурных полей, обусловленных локальным поглощением лазерного излучения нанозвезд, позволил построить топограммы локального распределение температуры в конце четырех- наносекундного лазерного импульса на внутренней поверхности мембраны клетки толщиной 7 нм. Результаты представлены на фиг. 11. Размер этой локальной нанообласти гипертермии и степень пространственной неоднородности температуры можно оценить из результатов, представленных на фиг. 12.
Пространственное распределение температуры в конце лазерного импульса на длине 20 нм на внутренней поверхности мембраны под тремя контактирующими с клеткой лучами нанозвезд не превышает градуса. Результаты расчета кинетики нагрева внутренней поверхности мембраны при воздействии 4 нс импульса поглощенной мощности позволяют определить временные процессы плазмонно-резонансного лазерного нагрева нанозвезды и плазматической мембраны, представленных на фиг. 13 и определиться с длительностями лазерных импульсов.
9
12
2
При концентрации наночастиц в коллоидном растворе порядка 10 в одном мл среднее расстояние между наночастицами равно 10 микронам, а при концентрации наночастиц 10среднее расстояние между частицами в объеме составляет один микрон. Поэтому, если клетки или микроорганизмы с продольным размером порядка микрона расположены на поверхности площадью 1 см, то при объеме коллоидного раствора нанозвезд сто микролитров на каждой микронной клетке или микроорганизме может находиться порядка сотни наночастиц. Таким образом, в зависимости от числа клеток выбором концентрации можно регулировать число нанозвезд на клетке и число локальных зон трансфекции в каждой клетке или микроорганизме.
Для тестирования лазерной оптопорации клеток (управляемой проницаемости мембраны клеток) проводились эксперименты, в ходе которых определяли зависимость степени проницаемости мембраны клеток, инкубированных с наночастицами до и после лазерного облучения. Клетки линии HeLa выращивали (80% монослоя) в 96-луночном планшете при 37°С в темноте, во влажной атмосфере c содержанием 5% СО2. Клетки окрашивали красителем - йодистым пропидием (PI, 6 мкМ). При повреждении плазматической мембраны клетки краситель проникает внутрь клетки и при возбуждении сине-фиолетовым светом флуоресцирует в красной области, что и наблюдается во флуоресцентном микроскопе. Результаты измерений представлены на фиг. 14.
При лазерном облучении клеток или микроорганизмов между лучами каждой из звезд на поверхности мембраны клетки или микроорганизма создавалась пространственная область трансфекции со средним диаметром не более 20 нм.
o
Режимы лазерного облучения соответствуют изменению импульсной локальной температуры на поверхности клетки не более 50C, при которой вероятность необратимого повреждения мембраны клетки достигает верхнего предела, равного единице на один лазерный импульс, как установлено в расчетах, представленных на фиг. 13.
Таким образом, параметры лазерного импульсного воздействия определялись экспериментально на клетках линии HeLa. Временные и энергетические параметры лазерных импульсов показали, что рассчитанная плотность оптической мощности определялась условием, указанным в формуле изобретения для осуществления управляемой локальной гипертермией и трансфекцией клеток.