Средство для подавления экспрессии генов, связанных с накоплением холестерина макрофагами человека
AGENT FOR INHIBITING THE EXPRESSION OF GENES ASSOCIATED WITH ACCUMULATION OF CHOLESTEROL BY HUMAN MACROPHAGES

Изобретение относится к области медицины, кардиологии и генной терапии и может быть использовано для лечения атеросклероза путем регуляции генной экспрессии. Изобретение представляет собой композицию для подавления экспрессии генов посредством механизма интерференции РНК,- состоящую из наночастиц Curdlan для адресной доставки siRNA в макрофаги человека и собственно siRNA. Изобретение обеспечивает создание малотоксичной композиции, подавляющей экспрессию генов, тесно связанных с накоплением холестерина макрофагами человека.
Атеросклероз представляет собой патологическое ремоделирование артерий, которое является основной причиной заболеваемости и смертности в развитых странах; эта патология лежит в основе инфаркта миокарда, инсульта и заболевания периферических артерий. На сегодняшний день терапия атеросклероза включает применение лекарственных и хирургических воздействий, имеющих многочисленные недостатки и требующих дальнейшего совершенствования (Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза. Российские рекомендации, IV пересмотр. / Москва, 2009 г. - 80 с.; Blumenthal R.S., Kapur N.K. Can a potent statin actually regress coronary atherosclerosis? // JAMA. - 2006. - Vol. 295. - P. 1583-1584; Blumenthal R.S., Michos E.D. The HALTS Trial - Halting Atherosclerosis or Halted Too Early? // N. Engl J. Med. 2009. - Vol. 361. - P. 2178-2180; Ibanez В., Badimon J.J., Garcia M.J. Diagnosis of Atherosclerosis by Imaging. // Am. J. Med. - 2009. - Vol. 22, Issue 1. - Supplement: S15-S25.; Klein L.W. Atherosclerosis Regression, Vascular Remodeling, and Plaque Stabilization. // J. Am. Coll. Cardiol. - 2007. - Vol. 49. - P. 271-273; Gustafsen C. et al. The Hypercholesterolemia-Risk Gene SORT1 Facilitates PCSK9 Secretion. // Cell Metabolism. - 2014 - Vol. 19, Issue 2, p. 310-318.).
Многие антиатеросклеротические препараты (например, статины) снижают проявления симптомов атеросклероза и являются достаточными для лечения некоторой части пациентов, но они не воздействуют на первопричины патогенетических звеньев заболевания. Таким образом, разработка новых подходов к лечению и профилактике атеросклероза остается актуальной задачей.
Недавнее открытие явления интерференции РНК (РНК-и) как одного из основных механизмов посттранскрипционной регуляции генов дало возможность использовать этот феномен для создания новых лекарственных средств, способных эффективно и безопасно подавлять экспрессию генов-мишеней. РНК-и позволяет специфически «выключать» экспрессию генов-мишеней с помощью молекул siRNA (small interfering RNA). Для эффективной доставки siRNA в клетки-мишени применяют специальные молекулы-носители, формирующие комплексы с siRNA. Комплексование приводит к компактизации молекул РНК, их защите от деградации клеточными РНКазами, что позволяет им эффективно проникать внутрь клетки и достигать нужной мишени.
Главными преимуществами использования препаратов на основе РНК-и являются высокая специфичность подавления экспрессии генов, вовлеченных в патогенез, а также высокая эффективность их подавления (до 90%), т.к. вводимые siRNA способны действовать в крайне низких концентрациях. Кроме того, привлекательной является сравнительная дешевизна методики. Синтез олигонуклеотидов в настоящее время вполне доступен и прост в масштабировании. Этот факт дает препаратам, созданным на базе siRNA, важное конкурентное преимущество, например, по сравнению с моноклональными антителами. Открытие РНК-интерференции дало новые возможности для регуляции экспрессии патогенетически значимых генов, в том числе и генов, вовлеченных в инициацию и развитие атеросклероза. РНК-и активируется молекулами siRNA, которые имеют нуклеотидную последовательность, комплементарную гену-мишени. Несмотря на сравнительно недавнее открытие РНК-и, уже имеются изобретения по применению данного подхода к терапии болезни Хантингтона, онкологических заболеваний, начались клинические исследования метода лечения дистрофии желтого пятна сетчатки с помощью siRNA.
Авторами настоящего изобретения обнаружено (неопубликованные данные), что атерогенез приводит к изменению параметров (активности, экспрессии) генов, которые могут быть определены в образцах крови человека. При проведении транскриптомного анализа макрофагов (одного из важнейших клеточных типов, участвующих в атерогенезе) были выявлены гены, активность которых существенно изменяется при взаимодействии клеток с модифицированными липопротеидами низкой плотности. С помощью методов биоинформатики эти гены, тесно связанные с накоплением холестерина макрофагами человека, идентифицированы как IL7R, IL7, TIGIT, CXCL8, F2RL1, EIF2AK3, TSPYL2, ANXA1,DUSP1 и IL15.
Таким образом, идентифицированные гены (маркеры, мастер-регуляторы), ответственные за накопление холестерина макрофагами человека, представляют значительный интерес для генотерапии атеросклероза с помощью РНК-интерференции.
Аналогом заявляемого изобретения является патент на изобретение №: 2563989 «Композиция для подавления экспрессии гена цитокина интерлейкина-4» (сентябрь 27, 2015), представляющая собой композицию, состоящую из катионного дендримерного пептида - LTP и двух молекул siRNA против гена IL-4 для подавления аллергического воспаления путем блокировки экспрессии гена провоспалительного цитокина IL-4.
Задачей предлагаемого изобретения является создание средства для лечения атеросклероза..
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание малотоксичной композиции, подавляющей экспрессию генов IL7R, IL7, TIGIT, CXCL8, F2RL1, EIF2AK3, TSPYL2, ANXA1, DUSP1 и IL15.
Указанная задача решается, а технический результат достигается за счет того, что композиция для подавления экспрессии указанных генов посредством механизма интерференции РНК состоит из носителя (наночастиц Curdlan) и siRNA, поставляемых компанией Ambion (ThermoFisher). Выбор оптимальных молекул siRNA для композиции соответствует методу, описанному в статье (Lu Z.J. and Mathews D.H., 2008).
В свою очередь, получение наночастиц Curdlan осуществляли следующим образом (Ganbold Т, Baigude Н. Design of Mannose-Functionalized Curdlan Nanoparticles for Macrophage-Targeted siRNA Delivery. ACS Appl Mater Interfaces. 2018 May 2;10(17):14463-14474; Han J, Caia J, Borjihan W, Ganbolda T, Rana TM, Baigude H. Preparation of Novel Curdlan Nanoparticles for Intracellular siRNA Delivery. Carbohydrate polymers. 2015; 117:324-330). 6-Амино-6-дехсоид-кундлан (80 мг, 6AC-100) растворяли в 3 мл натрий-фосфатного буфера (PBS) (рН=9;0) и добавляли 1 мл раствора диэтилсульфоксида 4-изотиоцианатофенил. Добавляли альфа-Д-маннопиранозид (18,7 мг) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем добавляли смесь гидрохлорид имидазол-4-уксусной кислоты (31,5 мг) и гидрохлорид 1-этил-3-карбодиимида (22,1 мг) в 0,1 М буфере MES (рН=6,0). Перемешивание продолжалось при комнатной температуре в течение 6 часов. После продукт чистили путем диализа (размер пор 3500) против деионизированной воды в течение 2 дней, обессоливающая колонка PD-10 (GE Healthcare) использовалась для дальнейшей очистки конечного продукта, который был получен при помощи сублимационной сушки.
Полученный конечный продукт (1 мкг) смешивается с siRNA (25 мкМ), готовая композиция вводится в кровь пациентов из расчета 25 мг/кг. В предварительных экспериментах на лабораторных животных и пациентах-добровольцах показано, что заявляемое изобретение - малотоксичная композиция, подавляющая экспрессию генов IL7R, IL7, TIGIT, CXCL8, F2RL1, EIF2AK3, TSPYL2, ANXA1, DUSP1 и IL15, может применяться как отдельно, так и в составе лекарственных препаратов для лечения атеросклероза. Средство для лечения атеросклероза, представляющее собой композицию для подавления экспрессии генов IL7R, IL7, TIGIT, CXCL8, F2RL1, EIF2AK3, TSPYL2, ANXA1, DUSP1 и IL15, тесно связанных с накоплением холестерина макрофагами человека, за счет интерференции РНК, состоящую из наночастиц Curdlan, выступающих в качестве носителя, и siRNA, специфичных по отношению к указанным генам.