Способ моделирования ушиба головного мозга лёгкой степени
METHOD FOR SIMULATING BRAIN CONTUSION OF MILD DEGREE

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к нейрохирургии, и может быть использовано для воспроизведения клинически значимого ушиба головного мозга легкой степени у взрослых крыс с целью разработки новых методов диагностики и терапии посттравматических изменений головного мозга у человека.
Проблема диагностики и лечения легкой черепно-мозговой травмы (ЧМТ) является актуальной и социально значимой, так как она распространена преимущественно среди населения трудоспособного возраста. Диагностика такого типа ЧМТ с помощью нейровизуализации затруднена и ее наличие проявляется только общемозговыми симптомами. Экспериментальное моделирование ушиба головного мозга легкой степени позволяет изучать патогенез с целью разработки новых методов диагностики и терапии.
Известен способ моделирования тяжелой черепно-мозговой травмы (1. Тихобазова О.П., Балябин А.В, Мухина И.В. Авт. св. №2641569, G09B 23/28 2006.01), где предлагается однократное ударное воздействие свободно падающим грузом через трепанационное окно в лобно-теменной части на интактную твердую мозговую оболочку животных. При этом в качестве лабораторных животных используют 8-10-недельных аутбренных мышей-самцов линии C57BL/6 с массой тела 20-22 г. Воздействие осуществляют с помощью груза массой 4 г с высоты 80 см. Диаметр ударной части груза соответствует диаметру трепанационного окна. Способ позволяет моделирование в эксперименте тяжелой черепно-мозговой травмы с грубым стойким неврологическим дефицитом.
Известен способ моделирования очагового повреждения головного мозга (2. Ступак В.В., Половников Е.В., Васильев И.А., Самохин А.Г. Авт св. №2486602, G09B 23/28 (2006.01). Для этого осуществляют однократное ударное воздействие на интактную твердую мозговую оболочку (контролируемое корковое повреждение) через трепанационное окно в лобно-теменно-височной области с энергией удара не менее 0,06 Дж и не более 0,09 Дж. При энергии ударного воздействия на эту область происходит разрыв твердой мозговой оболочки иповреждение мозгового вещества на глубину до 1 мм в зоне коркового представительства двигательных функций конечностей. Возникающее в данных корковых представительствах тяжелое очаговое повреждение приводит к разрушению нейронов коры головного мозга, формированию грубого глиального рубца и к развитию стойкого и длительного неврологического дефицита. Данный метод разработан на крысах линии Вистар с массой тела 250-270 г.
Известен способ моделирования диффузного аксонального повреждения (ДАП) у крыс (3. Marmarou, A. A new model of diffuse brain injuryinrats. Part I: Pathophysiology and biomechanics. / A. Marmarou // Journal of neurosurgery. - 1994. - Vol. 80. - №. 2. - P. 291-300).
Имитация ДАП на крысах была описана A.Marmarou в 1994 году и получила широкую известность как «модель ударного ускорения». Травматическое устройство состоит из свободно падающего груза, массой 450 грамм с высоты 2 метра через направляющую трубу. Животное располагается на поролоновой подушке и в результате удара по голове отскакивает вниз. Для того чтобы предотвратить перелом черепа, удар осуществляется по прикрепленному к нему на костный цемент металлическому диску («шлему»). Свободное падение животного после контактного воздействия приводит к диффузному повреждению аксонов в базальных ядрах и стволе мозга и повышению внутричерепного давления. Авторы сообщают, что груз, массой 450 г, падающий с высоты 2 м, привел к смерти 44% животных, переломы черепа выявлены в 12,5% случаев.
Все вышеописанные способы моделирования ЧМТ приводят к обширным повреждениям коры головного мозга животных и сопровождаются высокой летальностью, что делает невозможным изучение ушиба головного мозга легкой степени. Методы контролируемого коркового повреждения, при котором в момент травмы голова животного фиксирована, не в полной мере соответствует биомеханике ушиба головного мозга в естественных условиях, когда за ударом по голове следует свободное падение с ускорением, вращение и действие на голову сил ускорения/замедления.
Наиболее близким к заявляемому техническому решению является метод моделирования легкой ЧМТ у взрослых мышей и ювенильных крыс (4. Mychasiuk, R. А novel model of mild traumatic brain injury for juvenile rats / R. Mychasiuk // Journal of Visualized Experiments. - 2014; (94):51820. Published 2014 Dec 8. doi:10.3791/51820). Также известен похожий способ моделирования легкой повторной ЧМТ у мышей (5. Kanea М. А mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury // J. Neuroscience Methods, 2012, vol. 203, Is. 1, pp. 41-49). Для нанесения травмы используется установка, включающая штатив с трубой для направления падения груза и резервуар, на дно которого помещена поролоновая губка. Для исключения сопротивления при ударе, поверхность резервуара укрывается перфорированной фольгой таким образом, чтобы она могла выдержать вес мыши. Для нанесения травмы используется груз с плоским основанием, диаметром 20 мм и весом 150 г, при высоте падения груза - 50 см. После удара по голове фольга легко разрывается и животное с ускорением падает вниз. Высота падения животного составляет 12 см. Дальнейшее движение груза ограничено до 1 см ниже поверхности головы для исключения повторной травмы. Ускорение и падение, вызванное ударом, включает горизонтальное вращение тела животного на 180°.
Недостатком указанных способов является невозможность воспроизведения ушиба головного мозга легкой степени у взрослых крыс.
2
В отличие от указанных методов моделирования ЧМТ (1,2,3,4,5) в заявляемом нами способе используется груз массой 200 грамм, с высотой конуса 1 см, площадью бойка 3,14 мм, изготовленный из латуни, который падает с высоты одного 1 метра на затылочную область голову крысы. При этом одномоментно с ударом происходит свободное падение животного в резервуар 40×30×30 см на поролоновую подушку с высоты 30 см.
Критерии «новизна» и «изобретательский уровень» предлагаемого способа заключаются в техническом решении условий моделирования ушиба головного мозга легкой степени на взрослых лабораторных животных массой 240-300 грамм. Установка для моделирования включает резервуар для падения животных высотой 40 см, шириной 30 см, длиной 40 см. На дно резервуара укладывается подушка из поролона высотой 10 см для смягчения удара при падении, таким образом, высота падения составляет 30 см.
Из фольги, толщиной 0,010 мм, вырезается лист размерами 50×40 см. На фольге острым лезвием намечается срединная линия разрыва, затем фольга плотно фиксируется к резервуару с нахлестом 10 см по бокам. Для успешного выполнения опыта требуется как плотное натяжение фольги, так и отсутствие ее самопроизвольного разрыва. Для нанесения ударной травмы устанавливается штатив с направляющей трубкой (диаметр 2,2 см, высота 1,5 м). Действие ударной силы воспроизводится при помощи груза цилиндрической формы, имеющего следующие параметры: материал - латунь, вес 200 г, диаметр 2 см, наконечник в виде конуса, высотой 1 см, площадь ударной части бойка 3,14 мм. К грузу через отверстие в верхней части трубке подвязывается леска, устойчивая к растяжению, плотно зафиксированная к штативу. Высота падения груза составляет 1 метр. На этом уровне в трубке, установленной на 2,5 см над листом фольги, производится отверстие для фиксации груза. Для предотвращения повторных травм, груз предварительно устанавливается таким образом, чтобы боек выходил из направляющей трубы при ударе не более чем на 1,5 см.
Моделирование ушиба головного мозга легкой степени производится под общей анестезией. Анестезия считается достаточной, когда животное перестает реагировать на раздражение лапы и хвоста. Способ осуществляется следующим образом: крыса укладывается в положении на животе на поверхность фольги, натянутой между краями  резервуара, таким образом, чтобы голова лежала максимально к переднему краю фольги. Направляющая трубка с грузом на штативе устанавливается по средней линии головы животного в проекции межполушарной щели в сагиттальной плоскости и срединной области дорсолатеральной поверхности во фронтальной плоскости, соответствующей наиболее широкой части полушарий. Наносится удар грузом по голове. В момент удара, алюминиевая фольга, расположенная под телом животного, разрывается по намеченной линии, и животное падает в резервуар. Падение животного после удара ограничивает и значительно смягчает прямое воздействие бойка и предотвращает повторные травмы. После нанесения травмы животное переносится в отдельную клетку для наблюдения, измеряется время выхода животного из наркоза непосредственно после получения травмы.
В эксперименте воспроизводятся наиболее часто возникающие травмы головы у человека, которые сопровождаются ушибом головного мозга легкой степени, что является техническим результатом заявленного способа. После эксперимента производится комплексная оценка степени повреждения головного мозга.
Пример использования изобретения.
Перед экспериментом была проведена анестезия животного раствором изофлурана. При отсутствии реакции на раздражение лапы и хвоста наркотизация считается достаточной. Животное переносится в заранее подготовленную установку и укладывается на живот таким образом, чтобы направляющая трубка находилась над головой животного по средней линии в проекции межполушарной щели в сагиттальной плоскости и срединной области дорсолатеральной поверхности во фронтальной плоскости, соответствующей наиболее широкой части полушарий. Наносится удар грузом по голове. После нанесения ушиба головного мозга легкой степени, животное падает в резервуар на поролоновую подушку. Сразу после падения животное переносится в специально подготовленную клетку и осматривается. При осмотре головы перелома черепа или кровотечения в области удара бойком не выявлено. Замеряется время выхода животного из наркоза: переворот на задние лапы через 46,9 секунд, ходьба через 2 минуты 50 секунд после ушиба головного мозга. Оценивается неврологический статус сразу после травмы по шкале mNSS (Modified Neurological Severity Scores https://journals.plos.org/plosone/article/file?type=supplementary&id=info:doi/10.1371/journal.pone.0137211.s004). mNSS = 1 балл: зажимание края балки при ходьбе, в остальном - без патологии (0 баллов). После проведения исследования животное переносится в жилую клетку для дальнейшего изучения. Специальный уход за животным не требуется.Нами оценивался комплекс экстракраниальных и интракраниальных повреждений мягких тканей головы и головного мозга (рис. 1). Вероятность возникновения поверхностной травмы случайна и является известной погрешностью метода падающего груза. По частоте повреждения распределяются следующим образом: ушиб мягких тканей, кровоизлияние в апоневроз, непроникающий перелом черепа. Степень интенсивности травмы головы не коррелирует с неврологическими симптомами, при макроскопической оценке поверхности головного мозга и на вскрытии при проведении гистологического анализа очаги ушиба мозга не выявляются. При исследовании цереброспинальной жидкости, характеристики так же не отличаются от контрольной группы. В неврологическом статусе у животных после травмы отсутствуют очаговые симптомы, преобладают нарушения координации движения, поведения и памяти. Для изучаемой черепно-мозговой травмы характерно отсутствие макроскопических очагов в месте удара и травматического субарахноидального или вентрикулярного кровоизлияния. При микроскопическом исследовании парафиновых срезов головного мозга имеется отчетливая картина развития перецилюлярного отека глии и нейронов в виде гиперхромии ядер глиальных клеток, набухания ядрышек нейронов, гиперхромии дендритов нейронов в наружном зернистом слое и пролиферации глиальных клеток в ответ на травму на 14 сутки.
Чтобы более точно интерпретировать поведенческие изменения животных после нанесения ушиба головного мозга, исследован уровень тревожности на приподнятом крестообразном лабиринте через 2 и 14 суток после травмы. Через 2 сут после травмы, 2 из 5 животных посещали открытые рукава, среднее время пребывания составило 164,5 секунд, выявлены свешивания с рукавов, что говорит об отсутствии страха высоты. Нарастание уровня тревожности отмечалось через 14 дней после травмы, все крысы полностью игнорировали посещение открытых рукавов. Среднее время их нахождения в закрытых рукавах повысилось с 101,2 сек (2 сут) до 157 сек (14 дней). Среднее количество заходов в закрытые рукава так же выросло с 1,6 до 2,6 соответственно (таблица 1). Уровень тревожности у животных на 14 сут после травмы ассоциировался с резким увеличением латентного периода до 26 сек и сопровождалось нарушением кратковременной памяти. Таким образом, изменение времени продолжительности латентного периода обусловлено беспокойным поведением и увеличением двигательной активности животных после нанесения ушиба головного мозга.
.
Достоверность статистической оценки изучаемых показателей оценивалась с помощью критерия Стьюдента: Р (1-2-3 гр.)<0,05
Источники информации:
1.Зиновьев С.В., Целуйко С.С., Селиверстов С.С., и др. Способ количественной цитохимической оценки хромаффинной реакции эритроцитов крыс при общем охлаждении организма. Патент на изобретение RUS 2617201 09.03.2016
2. Ступак В.В., Половников Е.В., Васильев И.А., Самохин А.Г. Патент RU №2641569
3. Тихобазова О.П., Балябин А.В, Мухина И.В. Патент RU №2641569,
4. Kanea, М. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury // Journal of Neuroscience Methods. - 2012. - Vol. 203. - Is. 1. - P. 41-49.
5. Mychasiuk, R.A Novel Model of Mild Traumatic Brain Injury for Juvenile Rats. / R. Mychasiuk // Journal of Visualized Experiments. - 2014. DOI: doi: 10.3791/51820