35S промотор вируса мозаики норичника (p-fmv) - новая мишень для анализа на содержание генетически модифицированных организмов

УДК 573.6

35S ПРОМОТОР ВИРУСА МОЗАИКИ НОРИЧНИКА (P-FMV) — НОВАЯ МИШЕНЬ ДЛЯ АНАЛИЗА НА СОДЕРЖАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ

Я.И. АЛЕКСЕЕВ12, Т.В. ХОТЯИНЦЕВА2, С.В. БОРОВСКАЯ12,

О.С. КОЛОБОВА12, Д.А. ВАРЛАМОВ12, П.Н. ХАРЧЕНКО1

(1 Всероссийский НИИ сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии;

2 ЗАО «Синтол»)

Законодательство Российской Федерации устанавливает порог содержания генетически модифицированных организмов (ГМО) в пищевых продуктах и кормах, после которого требуется их обязательная маркировка, как 0,9%. В поточном анализе наиболее распространенным способом выявления ДНК ГМО является скрининг методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). В данной работе нами показано, что выбранная для анализа комбинация стандартного набора мишеней — 35S промотора вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S) и терминатора NOS Agrobacterium tumefaciens — является недостаточной для эффективного выявления широкого спектра линий ГМО. Нами были разработаны две новые тест-системы, обеспечивающие возможность выявления ДНК 35S-промотора вируса мозаики норичника (P-FMV) в качестве дополнительной мишени для скрининга.

Ключевые слова: анализ генетически модифицированных организмов, промотор вируса мозаики норичника, полимеразная цепная реакция в реальном времени.

Благодаря развитию технологий генетической инженерии в мире ежегодно появляются новые линии генетически модифицированных организмов (ГМО). Объем выращиваемых трансгенных культур неуклонно растет, несмотря на опасения, вызванные недостаточной изученностью влияния ГМО на здоровье людей и окружающую природу. В настоящее время во многих странах, в т.ч. в России, введена обязательная маркировка пищевой продукции, гарантирующая потребителю выбор между продукцией, содержащей и не содержащей ГМО.

Тест-системы для скрининга ДНК ГМО-методом ПЦР-РВ, распространенные на сегодняшний день, выявляют ДНК стандартного набора мишеней — 358-промотора вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S) и терминатора NOS Agrobacterium tumefaciens [1, 2]. Однако в последнее время в мире начали промышленно выращивать линии ГМ-растений, не содержащие этих регуляторных элементов. Для выявления ДНК таких ГМ-растений имеющиеся тест-системы необходимо усовершенствовать [6].

По состоянию на 2011 г., в России разрешены к использованию 17 линий трансгенных растений [7]. Регуляторные последовательности и гены трансгенных вставок этих линий перечислены в таблице.

Как видно из таблицы, две из разрешенных линий, а именно соя MON89788 и сахарная свекла H7-1, не содержат ни промотора CaMV 35S, ни терминатора NOS, но содержат промотор вируса мозаики норичника (P-FMV). Кроме того, этот же промотор содержится в линиях ГМ-картофеля Луговской 1210 amk и Елизавета 2904/1 kgs, а также в следующих промышленно выращиваемых ГМО: рапсе линии

Регуляторные последовательности и гены трансгенных вставок линий, разрешенных для применения в пищевых продуктах и кормах на территории Российской Федерации

Растение Линия Производитель Промотор Ген Терминатор

GTS4032 Monsanto, США CaMV E35S CP4EPSPS NOS

Соя A2704-12 Bayer CropScience, Германия CaMV 35S Pat CaMV 35S

A5547-127 Bayer CropScience, Германия CaMV 35S Pat CaMV 35S

MON89788 Monsanto, США P-FMV/ TSF1 CP4EPEPS T-E9

MON810 Monsanto, США CaMV E35S Cry1Ab —

MON863 Monsanto, США 4AS1, CaMV E35S Cry3Bb1, nptII tahsp17, NOS

NK603 Monsanto, США CaMV35S, ract CP4EPEPS NOS

MON88017 Monsanto, США CaMV35S, ract CP4 EPEPS, Cry3Bb1 NOS, tahsp 17

GA21 Monsanto, США ract mEPSPS NOS

Кукуруза BT11 Syngenta Crop Protection AG, Швейцария CaMV35S Cry1Ab, pat NOS

MIR604 Syngenta Crop Protection AG, Швейцария MTL ZmUbilnt mCry3A, mpi NOS

T25 Bayer CropScience, Германия CaMV 35S pat CaMV 35S

3272 Syngenta Seeds Inc, США GZein ZmUbiInt taa, mpi CaMV 35S, NOS

Карто- Луговской 1210 amk Центр Биоинженерии РАН P-FMV Cry3A E9, NOS

фель Елизавета 2904/1 kgs Центр Биоинженерии РАН P-FMV Cry3A E9, NOS

Рис LLRICE62 Bayer CropScience, Германия CaMV 35S bar CaMV 35S

Сахарная свекла H7-1 Monsanto, США P-FMV CP4EPSPS rbcS E9

GT73, картофеле линии RBMT21-129, RBMT21-350, RBMT22-082; RBMT15-101, SEMT1502, SEMT1515, сахарной свекле линии GTSB77; томате линии CGN-89322-3 (8338), кукурузе линии M0N89034; хлопке линии MON-1445-2, MON88913.

Вирус мозаики норичника является каулимовирусом из группы параретровирусов и подобен вирусу мозаики цветной капусты (cauliflower mosaic virus, CaMV). В 1989 г. было проведено клонирование последовательности Р-FMV-промотора, аналогичной последовательности 35S CaMV-промотора. Была подтверждена конститу-

тивность промотора Р-FMV во всех растительных тканях [1]. Было показано, что его сила равна, а в некоторых случаях превышает таковую промотора CaMV 35S и значительно превышает силу промотора NOS. Промотор P-FMV содержит два энхансера, элиминация одного из которых снижает его активность на 75% [2]. Эффективность промотора была доказана в экспериментах по трансформации табака, картофеля, сои, петунии, хлопка, рапса, люцерны и других растений. В настоящее время промотор P-FMV является широко используемой альтернативой промотору CaMV 35S в генной инженерии с.-х. культур [3-5].

Материалы и методы

Так как регуляторные последовательности, используемые в генной инженерии, часто подвергаются модификациям, было проведено сравнение нуклеотидных последовательностей трансгенных линий, содержащих промотор P-FMV. Были подобраны праймеры и зонд для ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), специфичные общему для линий рапса GT73, кукурузы MON89034 и сои MON89788 фрагменту ДНК-промотора (рис. 1).

В качестве матрицы для проведения ПЦР-РВ анализа была использована ДНК, выделенная с помощью набора « Сорб-ГМО-Б» (ГНУ ВНИИСБ, Россельхозакадемии) из стандартного образца, содержащего более 994,4 г/кг ГМ-сои линии MON89788 производства компании AOCS, США.

Результаты

На рисунке 2 показаны результаты ПЦР-РВ-анализа серии 10-кратных разведений образца этой ДНК, выделенной из стандартного образца ГМ-сои линии MON89788.

GT73 GGAACTCCCATCCTCAAAGGTTTGTAAGGAAGAATTCTCAGTCCAAAGCCTCAACAAGGT

MON8 9034 GGAACTCCCATCCTCAAAGGTTTGTAAGGAAGAATTCTCAGTCCAAAGCCTCAACAAGGT

MON8 97 8 8 -----------------GCTCGAGTGGAAGCTAATTCTCAGTCCAAAGCCTCAACAAGGT

************************************* GT73 CAGGGTACAGAGTCTCCAAACCATTAGCCAAAAGCTACAGGAGATCAATGAAGAATCTTC

MON8 9034 CAGGGTACAGAGTCTCCAAACCATTAGCCAAAAGCTACAGGAGATCAATGAAGAATCTTC

MON8 97 8 8 CAGGGTACAGAGTCTCCAAACCATTAGCCAAAAGCTACAGGAGATCAATGAAGAATCTTC

************************************************************ GT73 AATCAAAGTAAACTACTGTTCCAGCACATGCATCATGGTCAGTAAGTTTCAGAAAAAGAC

MON8 9034 AATCAAAGTAAACTACTGTTCCAGCACATGCATCATGGTCAGTAAGTTTCAGAAAAAGAC

MON8 97 8 8 AATCAAAGTAAACTACTGTTCCAGCACATGCATCATGGTCAGTAAGTTTCAGAAAAAGAC

************************************************************ GT73 ATCCACCGAAGACTTAAAGTTAGTGGGCATCTTTGAAAGTAATCTTGTCAACATCGAGCA

MON8 9034 ATCCACCGAAGACTTAAAGTTAGTGGGCATCTTTGAAAGTAATCTTGTCAACATCGAGCA

MON8 97 8 8 ATCCACCGAAGACTTAAAGTTAGTGGGCATCTTTGAAAGTAATCTTGTCAACATCGAGCA

************************************************************ GT73 GCTGGCTTGTGGGGACCAGACAAAAAAGGAATGGTGCAGAATTGTTAGGCGCACCTACCA

MON8 9034 GCTGGCTTGTGGGGACCAGACAAAAAAGGAATGGTGCAGAATTGTTAGGCGCACCTACCA

MON8 97 8 8 GCTGGCTTGTGGGGACCAGACAAAAAAGGAATGGTGCAGAATTGTTAGGCGCACCTACCA

************************************************************

GT73 AAAGCATCTTTGCCTTTATTGCAAAGATAAAGC---------------------------

MON8 9034 AAAGCATCTTTGCCTTTATTGCAAAGATAAAGCAGATTCCTCTAGTACAAGTGGGGAACA

MON8 97 8 8 AAAGCATCTTTGCCTTTATTGCAAAGATAAAGCAGATTCCTCTAGTACAAGTGGGGAACA

Рис. 1. Последовательности фрагментов промотора P-FMV общие для линий рапса GT73,

кукурузы MON89034 и сои MON89788.

Рис. 2. Кинетические кривые серии 10-кратных разведений ДНК ГМ-линии сои МОЫ89788, полученные на приборе для ПЦР-РВ АНК-З2

Специфичность подобранных праймеров и зонда была исследована методом ПЦР-РВ на образцах ДНК, выделенных из ГМ-линий сои (А2704-12, А5547-35, 0Т84032, М0Ш9788), кукурузы (Т25, БШ, М0Ш63, 1ЧК603, 0А21, М1Я604, М0К88017, М0К810) и риса (ЬЬЫСЕ62). Возрастание сигнала флуоресценции наблюдалось только в реакции с образцом ДНК, выделенной из сои линии М0К89788, содержащей промотор Р-БМУ. Для всех остальных образцов возрастание сигнала флуоресценции не наблюдалось, что подтверждает высокую специфичность подобранных праймеров и зонда для ПЦР-РВ.

Ранее нами были разработаны тест-системы «Растение/358/К08/ВПК» и «Соя/358/К08/ВПК» для скрининга ГМО методом мультиплексной ПЦР-РВ. Данные тест-системы позволяют одновременно выявлять 4 различные ДНК-мишени в образце. Для расширения спектра выявляемых ГМО к имеющимся была добавлена реакция на пятую мишень — ДНК-фрагмент промотора Р-БМУ. Необходимо было изучить, скажется ли введение этой реакции на эффективность мультиплексной ПЦР-РВ. Для этого было проведено сравнение эффективности реакций в мультиплексной ПЦР-РВ с дополнительной реакцией детекции промотора Р-БМУ и без нее. Рассчитанные значения эффективностей реакций по каналу детекции промотора Р-БМУ составили 99% в случае тетраплексной ПЦР-РВ и 98% в случае пента-плексной ПЦР-РВ. При этом наблюдалось уменьшение значений пороговых циклов (ДО=1) по этому каналу.

Полученные результаты позволили создать две новые тест-системы для расширенного скрининга ГМО. В обеих тест-системах по каналу Я0Х проводится одновременная детекция двух мишеней: фрагментов ДНК СаМУ 358-промотора и Р-БМУ-промотора. Кроме того, в тест-системе «Растение/358+РМУЖ08-ВПК» по каналу

FAM детектируется наличие в анализируемом образце ДНК-терминатора NOS, по каналу RôG-фрагмента гена NADH-дегидрогеназы (референсная реакция для определения содержания растительной ДНК в образце), по каналу Cy5 — реакция внутреннего положительного контроля (ВПК), позволяющая избежать ложноотрицательных результатов анализа. Аналогичный состав имеет тест-система «Соя/35S+FMV/NOS-ВПК», за исключением того, что по каналу R6G детектируется наличие в образце ДНК-фрагмента гена лектина сои.

На рисунке 3 приведен пример работы тест-системы «C^35S+FMV/NOS-BnK» на серии 10-кратных разведений смеси ДНК сои линии MON89788 и сои линии GTS4032 по 4 каналам детекции. Для анализа кинетических кривых ПЦР применяли аппроксимацию рекурсивными функциями [8], что позволяет повысить точность количественного анализа. Зависимость значения порогового цикла от логарифма концентрации хорошо описывается линейной функцией, при этом рассчитанный с помощью метода наименьших квадратов коэффициент корреляции R2 составил 0,9998. Предел детекции тест-систем составляет 10 копий ДНК мишени в реакционной смеси, что соответствует менее чем 0,01% содержания ДНК ГМО в образце.

Рис. 3. Результат ПЦР-РВ-анализа серии 10-кратных разведений смеси ДНК сои линии MON89788 и сои линии GTS4032 с помощью тест-системы «Соя/35S+FMV/NOS-ВПК»

Разработанные тест-системы «PacreHHe/35S+FMV/NOS-BnK» и «Соя/358+FMV/ NOS-ВПК» позволяют обнаруживать все линии ГМО, разрешенные для применения в пищевых продуктах и кормах в России, а также существенно расширяют спектр обнаруживаемых линий ГМО, запрещенных к использованию на ее территории, но промышленно выращиваемых в мире.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках выполнения ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлением развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» ГК № 16.552.11.7032 от 29 апреля 2011 г. на оборудовании ЦКП «ВНИИСБ».

Библиографический список

1. Bahrdt C., Krech A.B., Wurz A., Wulff D. // J Biotechnol., 2011. Mar 10; 152 (1-2):58-62.

2. Dorries H.H., Remus I., Gronewald A., Gronewald C., Berghof-Jager K. // Anal. Bioanal Chem., 2010. Mar; 396(6):2043-54.

3. Ranjan R., Patro S., Kumari S., Kumar D., Dey N., Maiti I.B. // Anal. Bioanal. Chem., 2010. Mar.; 396 (6):2103-12.

4. Samac D.A., Tesfaye M., Dornbusch M., Saruul P., Temple S.J. Transgenic Res., 2004. Aug;13(4):349-61.

5. Sanger M., Daubert S., Goodman R.M. // Plant Mol. Biol., 1990. 14:433 443.

6. Waiblinger H.-U., Grohmann L., Mankertz J., Engelbert D., Pietsch K. // Anal. Bioanal Chem., 2010. 396:2065-2072.

7. http://fp.crc.ru/gosregfr/ Реестр продукции, прошедшей государственную регистрацию (выданные Федеральной службой, включая Управления).

8. Сочивко Д.Г., Фёдоров А.А., Лавров В.В., Варламов Д.А., Курочкин В.Е., Петров Р.В. ДАН, 2011. 439(5): 696-699.

Рецензент — д. б. н. Г.И. Карлов

SUMMARY

Russian Federation regulations based on precautionary principle require any food containing more than 0.9% genetically modified organisms (GMO) to be specially labeled. In routine analysis, screening methods based on multiplex real-time PCR are most commonly used for the detection of GM plant material in food and feed. In this article, it is shown that the combination of two target sequences (CaMV 35S promoter and Agrobacterium tumefaciens NOS terminator) can not be used as a universal screening approach. Two GMO detection kits were designed, using 35S figwort mosaic virus promoter P-FMV as an additional target sequence.

Key words: genetically modified organisms detection, figwort mosaic virus promoter, real time polymerase chain reaction.

Алексеев Яков Игоревич — зав. лабораторией анализа ГМО ВНИИСБ, руководитель ЦКП ВНИИСБ, научный директор ЗАО «Синтол». Тел. (499) 977-74-55.

Эл. почта: jalex@iab.ac.ru.

Хотяинцева Татьяна Владимировна — научный сотрудник ЗАО «Синтол».

Эл. почта: Tatiana.khot@gmail.com.

Боровская Светлана Викторовна — научный сотрудник ВНИИСБ, научный сотрудник ЗАО «Синтол».

Колобова Ольга Сергеевна — старший научный сотрудник ВНИИСБ, научный сотрудник ЗАО «Синтол».

Варламов Дмитрий Александрович — старший научный сотрудник ВНИИСБ, ведущий научный сотрудник ЗАО «Синтол».

Харченко Петр Николаевич — чл.-корр. Россельхозакадемии, д.б.н., профессор, директор вНиисб.