ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ИНДУЦИРОВАНИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ОТВЕТА У ЖИВОТНОГО
VACCINE COMPOSITION AND METHOD OF IMMUNE RESPONSE INDUCTION IN ANIMALS

Данная заявка претендует на приоритет относительно US Provisional App. No.60/490345 от 24 июля 2003 г., содержание которой включено путем ссылки во всей полноте.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение касается эмульсий типа «масло в воде», их применения в качестве адъювантов и содержащих их фармацевтических, иммунологических или вакцинных композиций.
Уровень техники
Применение адъювантов в вакцинах хорошо известно. Адъювант - это соединение, которое, в сочетании с антигеном вакцины, повышает иммунный ответ на вакцинный антиген по сравнению с ответом, вызванным одним только антигеном. Среди подходов, усиливающих иммуногенность антигенов, есть такие, при которых вакцинные антигены становятся корпускулярными, при которых вакцинные антигены подвергаются полимеризации или эмульгированию, к ним также относятся методы инкапсулирования вакцинных антигенов, способы повышения присущих организму реакций цитокинов и способы доставки вакцинных антигенов на антиген-презентирующие клетки (Nossal, 1999, In: Fundamental Immunology. Paul (Ed.), Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa.; Vogel and Powell, 1995, In: Vaccine Design. The Subunit and Adjuvant Approach. Powell and Newman (Eds.), Plenum Press, NY, N.Y., p.141). Поскольку адъюванты играют важную роль в усилении иммуногенности вакцинных антигенов, применение адъювантов при составлении вакцин стало фактически повсеместным (Nossal, 1999, supra; Vogel and Powell, 1995, supra; см. также РСТ publication WO 97/18837, основные положения которой включены в настоящее изобретение путем ссылки). Традиционные адъюванты, хорошо известные в данной области, разнообразны по природе. Например, они могут состоять из водонерастворимых неорганических солей, липосом, мицелл или эмульсий, как адъювант Фрейнда. Другие адъюванты можно найти в работе Vogel and Powell, 1995, приведенной выше. Несмотря на то, что единого механизма действия адъювантов не существует, основной характеристикой является их способность к значительному усилению иммунного ответа на антиген вакцины по сравнению с ответом, вызванным одним только антигеном (Nossal, 1999, supra; Vogel and Powell, 1995, supra). В этом отношении некоторые адъюванты более эффективно усиливают гуморальные иммунные ответы, другие адъюванты более эффективно повышают клеточные иммунные ответы (Vogel and Powell, 1995, supra), а еще одна группа адъювантов повышает как гуморальные, так и клеточные иммунные ответы на вакцинные антигены (Vogel and Powell, 1995, supra).
Обычно используемые в составе вакцин эмульсии включают смесь из масла, водного раствора и детергентов. Некоторые эмульсии содержат липофильный детергент типа Span 80 и гидрофильный детергент типа Tween 80. Эти эмульсии могут содержать и такие соединения, как лецитин или сапонин, которые, как известно, обладают свойствами ионных детергентов.
Однако с эмульсиями, используемыми в качестве адъювантов, могут наблюдаться проблемы стабильности, в частности, при хранении или транспортировке. Это особенно верно в том случае, когда эти композиции содержат концентрированные иммуногены, в особенности неочищенные концентрированные иммуногены. Как правило, это случается с адъювантами, используемыми в инактивированных (убитых) вакцинах. Эта проблема еще более значительна для мультивалентных вакцинных композиций, так как в них иммуногены более сконцентрированы в том же объеме разбавителя.
Другая проблема применения адъювантов связана с риском неблагоприятных случаев, таких как токсичность или местное воспаление на месте инъекции. Например, после инъекции может возникнуть местная воспалительная реакция и/или гранулема. Для того чтобы ограничить такие неблагоприятные реакции, можно уменьшить содержание детергентов и других компонентов в эмульсии, однако такое уменьшение может привести к снижению стабильности вакцинной композиции. Следовательно, существует потребность в новых адъювантах и вакцинных композициях, содержащих такие адъюванты, обладающих повышенной безопасностью и устойчивостью.
Сущность изобретения
В первом воплощении настоящее изобретение предусматривает новые эмульсии типа «масло в воде» (М/В) с повышенной устойчивостью в присутствии бактериальных или вирусных суспензий, особенно концентрированных и неочищенных, или слабо очищенных.
Другое воплощение настоящего изобретения предусматривает устойчивые, безопасные и легко вводимые, в частности, пригодные для инъекций эмульсии типа М/В, действующие как носители для доставки фармацевтической композиции, включающей, по меньшей мере, один активный ингредиент, которым, в частности, может быть иммуноген.
Следующее воплощение настоящего изобретения предусматривает устойчивые, безопасные и пригодные для инъекций эмульсии типа М/В, действующие как адъюванты, для повышения иммунного ответа, вызванного иммуногеном. В частности, настоящее изобретение предусматривает новые адъюванты, которые при использовании их в вакцинной композиции, содержащей иммуноген, повышают у вакцинированных клеточный иммунный ответ, гуморальный иммунный ответ или, предпочтительно, оба ответа на иммуноген.
Следующее воплощение настоящего изобретения предусматривает устойчивые, безопасные и иммуногенные композиции или вакцины, включающие эмульсию М/В.
Следующее воплощение настоящего изобретения предусматривает способ получения вакцинной композиции с использованием адъюванта настоящего изобретения; полученную при этом вакцинную композицию; и способы ее применения.
Следующее воплощение настоящего изобретения предусматривает набор, включающий иммуноген или иной фармацевтический продукт в первом флаконе, и адъювант, полученный в соответствии с настоящим изобретением, во втором флаконе, причем адъювант должен быть смешан с иммуногеном или иным вакцинным продуктом перед применением.
В одном предпочтительном воплощении настоящее изобретение предусматривает эмульсию для инъекций типа «масло в воде» (М/В), включающую:
(1) водный раствор, содержащий иммуноген;
(2) минеральное масло;
(3) неионный липофильный детергент;
(4) неионный гидрофильный детергент с низким значением гидрофильно-липофильного баланса (HLB, hydrophilic-lipophilic balance), который включает этоксилированные жирнокислотные диэфиры сорбита (обычно имеющие значение HLB между 11 и 13).
В следующем предпочтительном воплощении настоящее изобретение предусматривает эмульсию для инъекций типа «масло в воде» (М/В), включающую:
(1) водный раствор, содержащий иммуноген;
(2) неионный гидрофильный детергент с высоким значением HLB - больше 13 и меньше 40, в особенности HLB≥13,5 и предпочтительно HLB≥14;
(3) минеральное масло;
(4) неионный липофильный детергент;
(5) неионный гидрофильный детергент с низким значением HLB (значение HLB от 9 до 13).
В следующем предпочтительном воплощении настоящее изобретение предусматривает вакцинную композицию, включающую новую эмульсию, содержащую, по меньшей мере, один иммуноген, пригодный для запуска иммунологической реакции у вакцинированных. Изобретение также предусматривает такие композиции, в которых эмульсия действует как адъювант для повышения иммунного ответа, вызванного иммуногеном, в частности, для повышения клеточного ответа, гуморального ответа или, предпочтительно, обоих ответов.
В следующем предпочтительном воплощении настоящее изобретение предусматривает вакцинную композицию, в которой иммуноген, в особенности иммуноген в лиофилизованном виде или в водном растворе, смешивают с адъювантом по настоящему изобретению. Иммуноген можно выбрать из группы, состоящей из инактивированных патогенов, ослабленных патогенов, субъединичных антигенов, рекомбинантных экспрессионных векторов, в том числе плазмид, и т.п. Патоген может иметь бактериальное, вирусное, протозойное или грибковое происхождение, либо же иммуноген может представлять собой антитоксин.
В следующем предпочтительном воплощении настоящее изобретение предусматривает способ индуцирования иммунного ответа у вакцинированных против патогена, который включает введение вакцинной композиции настоящего изобретения вакцинируемым.
В следующем предпочтительном воплощении настоящее изобретение предусматривает наборы, включающие, по меньшей мере, два флакона, причем в первом флаконе содержится иммуноген, в особенности иммуноген в лиофилизованном виде или в растворе в водной среде, а во втором флаконе - адъювант или эмульсия по настоящему изобретению.
Следует отметить, что в данном описании, в частности, в формуле изобретения, такие термины, как «включает», «включающий» и им подобные могут иметь значение, придаваемое таким терминам в патентном законодательстве США, например, они могут означать «включает в себя», «заключает в себе» и т.п.; а такие термины, как «состоящий в основном из» и «состоит в основном из» имеют значение, приписываемое им в патентном законодательстве США, например, они разрешают элементы, не указанные явным образом, но исключают элементы, входящие в предшествующий уровень техники или затрагивающие фундаментальную или новую особенность изобретения.
Эти и другие воплощения изобретения раскрыты в или вытекают из и охвачены нижеследующим подробным описанием.
Краткое описание фигур
Полное и всестороннее раскрытие настоящего изобретения, включая наилучший способ его осуществления, для рядовых специалистов в этой области изложено более конкретно в остальной части описания, в том числе с привлечением прилагаемых чертежей.
На фиг.1 представлены показатели повреждения легких у поросят, которым делали провоцирующую пробу через 28 дней после вакцинации в соответствии с Примером 3. Среднее значение указано крестиком, нижняя квартиль (зона, где расположено менее 25% наблюдаемых значений переменной) и верхняя квартиль - рамкой, статистическая медиана - горизонтальной линией в рамке, размах от минимального до максимального значения - вертикальной линией.
На фиг.2 представлены показатели повреждения легких у поросят, которым делали провоцирующую пробу через 20 недель после вакцинации в соответствии с Примером 4. Среднее значение указано крестиком, нижняя квартиль и верхняя квартиль - рамкой, статистическая медиана - горизонтальной линией в рамке, размах от минимального до максимального значения - вертикальной линией.
На фиг.3 представлен график, отображающий прогрессирование клинического заболевания по клиническому показателю после провоцирующей пробы в соответствии с Примером 6.
На фиг.4 представлены результаты полевого испытания эффективности, в котором поросята (n=889), рожденные от свиноматок, вакцинированных однократно до опороса вакцинной композицией, полученной в соответствии с настоящим изобретением, проявляли значительное снижение смертности (на 75%) от мультисистемного синдрома истощения после отлучения (PMWS, postweaning multisystem wasting syndrome) no сравнению с контрольными поросятами (n=713), рожденными от не вакцинированных свиноматок.
Осуществимость изобретения
Другие задачи, особенности и аспекты настоящего изобретения раскрыты в или вытекают из следующего подробного описания. Рядовой специалист в этой области должен понимать, что настоящее описание является всего лишь описанием типичных воплощений и не имеет целью ограничение более широких аспектов настоящего изобретения, которые воплощены в типичной конструкции. В самом деле, специалистам в этой области должно быть ясно, что в настоящем изобретении можно производить различные модификации и разновидности, не выходящие за рамки или не отходящие от духа изобретения. Например, особенности, раскрытые или описанные как часть одного воплощения, могут быть использованы в другом воплощении для получения еще одного воплощения. Подразумевается, что настоящее изобретение охватывает такие модификации и разновидности как входящие в область действия прилагаемой формулы и ее эквивалентов. Содержание всех ссылок, опубликованных патентов и патентов, цитируемых в настоящей заявке, включены в настоящее изобретение путем ссылки во всей полноте.
Для удобства определенные термины, применяемые в описании, примерах и прилагаемой формуле изобретения, собраны в одном месте.
В настоящем изобретении термин «животное» включает всех позвоночных животных, в том числе человека. Он также включает индивидуальных животных на всех стадиях развития, включая эмбриональные и зародышевые стадии. В частности, термин «позвоночное животное» включает, не ограничиваясь этим, человека, собачьих (например, собак), кошачьих (например, кошек), лошадиных (например, лошадей), коровьих (например, крупный рогатый скот), свиных (например, свиней), а также птиц. Термин «птицы» в настоящем изобретении относится к любым видам или подвидам таксономического класса Aves, таким как куры (бридеры, бройлеры и несушки), индейки, утки, гуси, перепелки, фазаны, попугаи, зяблики, ястребы, вороны и бескилевые, в том числе страусы, эму и казуары, но не ограничивается этим.
В настоящем изобретении термин «свинья» или «поросенок» означает животное из числа свиных, тогда как «свиноматка» означает самку репродуктивного возраста и способности.
В настоящем изобретении термин «вирулентный» означает изолят, сохраняющий способность к заражению животного-реципиента.
В настоящем изобретении термин «инактивированная вакцина» означает вакцинную композицию, содержащую заразный организм или патоген, который больше не способен к репликации или росту. Патоген может иметь бактериальное, вирусное, протозойное или грибковое происхождение. Инактивация может осуществляться различными методами, включая замораживание-оттаивание, химическую обработку (например, обработку тимеросалом или формалином), обработку ультразвуком, облучение, нагревание или любой другой общепринятый способ, достаточный для прекращения репликации или роста организма с сохранением его иммуногенности.
В настоящем изобретении термин «иммуногенность» означает способность вызвать иммунный ответ у животного-реципиента против антигена или антигенов. Такой иммунный ответ лежит в основе защитного иммунитета, индуцируемого вакциной против конкретного заразного организма.
В настоящем изобретении термин «иммунный ответ» означает ответ, вызванный у животного. Иммунный ответ может относиться к клеточному иммунитету, гуморальному иммунитету либо, или он может включать обе разновидности. Настоящее изобретение также предусматривает ответ, ограничивающийся лишь частью иммунной системы. Например, вакцинная композиция настоящего изобретения может специфически индуцировать повышение ответа γ-интерферона.
В настоящем изобретении термин «антиген» или «иммуноген» означает вещество, вызывающее специфический иммунный ответ у животного-реципиента. Антиген может включать целый организм, убитый, ослабленный или живой; субъединицу или часть организма; рекомбинантный вектор, содержащий вставку с иммуногенными свойствами; часть или фрагмент ДНК, способный вызвать иммунный ответ после презентации животному-реципиенту; белок, полипептид, пептид, эпитоп, гаптен или любую их комбинацию. С другой стороны, иммуноген или антиген может включать токсин или антитоксин.
В настоящем изобретении термин «мультивалентная» означает вакцину, содержащую более одного антигена как из одного и того же вида (например, различных изолятов Mycoplasma hyopneumoniae), так из разных видов (например, изолятов Pasteurella hemolytica и Pasteurella multocida), или же вакцину, содержащую комбинацию антигенов из разных родов (например, вакцину, включающую антигены из Pasteurella multocida, Salmonella, Escherichia coli, Haemophilus somnus и Clostridium).
В настоящем изобретении термин «адъювант» означает вещество, добавляемое в вакцину для повышения ее иммуногенности. Механизм того, как действует адъювант, не вполне известен. Полагают, что некоторые адъюванты усиливают иммунный ответ путем медленного выделения антиген, тогда как другие адъюванты сильно иммуногены сами по себе и действуют синергически. К известным вакцинным адъювантам относятся, не ограничиваясь этим, эмульсии из масла и воды (например, полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда), Corynebacterium parvum, бацилла Calmette-Guerin (БЦЖ), гидроокись алюминия, глюкан, декстрансульфат, окись железа, альгинат натрия, адъювант Bacto, определенные синтетические полимеры типа полиаминокислот и сополимеры аминокислот, сапонин, «Regressin» (Vetrepharm, Athens, Ga.), «Avridine» [N,N-диоктадецил-N′,N′-бис(2-гидроксиэтил)пропандиамин], парафиновое масло, мурамиловый дипептид и др.
В настоящем изобретении термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к жидкому носителю для содержания вакцинных антигенов, который можно вводить реципиенту без вредных эффектов. К подходящим фармацевтически приемлемым носителям, известным в этой области, относятся, не ограничиваясь этим, стерильная вода, физраствор, глюкоза, декстроза или буферные растворы. Носители могут включать вспомогательные вещества, в том числе, но не ограничиваясь этим, разбавители, стабилизаторы (например, сахара и аминокислоты), консерванты, смачивающие вещества, эмульгирующие вещества, рН-буферы, добавки, повышающие вязкость, красители и др.
В настоящем изобретении термин «вакцинная композиция» включает, по меньшей мере, один антиген или иммуноген в фармацевтически приемлемом носителе, применимом для индуцирования иммунного ответа у реципиента. Вакцинные композиции можно вводить в таких дозах и такими способами, которые хорошо известны специалистам в области медицины или ветеринарии, с учетом таких факторов, как возраст, пол, вес, биологический вид и состояние животного-реципиента, а также способ применения. Способ применения может быть через кожу, через слизистые оболочки (например, перорально, назально, анально, вагинально) или парентерально (интрадермально, внутримышечно, подкожно, внутривенно или внутрибрюшинно). Вакцинные композиции могут вводиться по отдельности либо совместно или поочередно с другими средствами терапии. Лекарственные формы могут включать суспензии, сиропы или эликсиры, препараты для парентерального, подкожного, интрадермального или внутривенного введения (например, путем инъекции) типа стерильных суспензий или эмульсий. Вакцинные композиции могут вводиться в виде аэрозоля или вместе с пищей и/или водой, либо вводиться в смеси с соответствующим носителем, разбавителем или наполнителем типа стерильной воды, физиологического раствора, глюкозы и т.п. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие вещества, рН-буферы, адъюванты, желатинизирующие или повышающие вязкость добавки, консерванты, ароматизаторы, красители и др., в зависимости от способа применения и требуемого препарата. Для получения соответствующих препаратов без излишнего экспериментирования можно обратиться к стандартным пособиям по фармацевтике, таким как «Remington′s Pharmaceutical Sciences», 1990.
Настоящее изобретение предусматривает новый адьювант или эмульсию типа «масло в воде» (М/В), включающую:
(1) водный раствор, содержащий вакцинный антиген или иммуноген, способный вызвать иммунный ответ у реципиента;
(2) неионный гидрофильный детергент со значением гидрофильно-липофильного баланса (HLB) больше 13 и меньше 40 (HLB≥13, в особенности HLB≥13,5 и предпочтительно HLB≥14);
(3) минеральное масло;
(4) неионный липофильный детергент; и
(5) неионный гидрофильный детергент с низким значением HLB (значение HLB между 9 и 13).
Эмульсии, полученные по настоящему изобретению, основываются на комбинации, по меньшей мере, из 3 детергентов, выбранных из представителей трех разных групп детергентов, причем можно использовать один или несколько детергентов, принадлежащих к одной группе.
В предпочтительном воплощении концентрация неионного гидрофильного детергента (5) в эмульсии (в настоящем описании это означает конечную эмульсию, включающую все ингредиенты, если не указано иначе) составляет от 1% до 8%, в частности от 1,5% до 6%, предпочтительно от 2% до 5%, более предпочтительно от 2,5% до 4% при выражении в процентах по массе на объем эмульсии («мас.%» или «% мас.» при перечислении значений).
Данная группа детергентов включает неионные гидрофильные детергенты с низким значением HLB (значение HLB между 9 и 13). К этой группе относятся, не ограничиваясь этим, этоксилированные жирнокислотные моноэфиры сорбита (в особенности 5 этоксигрупп) (например, этоксилированный моноолеат сорбита типа Tween 80), этоксилированные жирнокислотные диэфиры сорбита, этоксилированные жирнокислотные триэфиры сорбита (в особенности 20 этоксигрупп) (например, этоксилированный триолеат сорбита типа Tween 85, этоксилированный тристеарат сорбита типа Tween 65), этоксилированные жирные спирты (в особенности 5-10 этоксигрупп) (например, Brij 76, Brij 56, Brij 96), этоксилированные жирные кислоты (в особенности 5-10 этоксигрупп) (например, Simulsol 2599, Myrj 45), этоксилированное касторовое масло (в особенности 25-35 этоксигрупп) (например, Arlatone 650, Arlatone G) и их комбинации.
Предпочтительны этоксилированные жирнокислотные диэфиры сорбита и этоксилированные жирнокислотные триэфиры сорбита, а также комбинации из обеих разновидностей. Жирную кислоту предпочтительно выбирают из группы, состоящей из олеата, пальмитата, стеарата, изостеарата, лаурата и их комбинаций. К предпочтительным этоксилированным жирнокислотным триэфирам сорбита относятся этоксилированный триолеат сорбита типа Tween 85 или этоксилированный тристеарат сорбита типа Tween 65.
В предпочтительном воплощении концентрация неионного гидрофильного детергента (2) обычно составляет от 0,1% до 1,5%, в частности от 0,2% до 1,4%, предпочтительно от 0,3% до 1,3%, более предпочтительно от 0,4% до 1,2% при выражении в процентах по массе на объем эмульсии (мас.%).
Данная вторая группа детергентов включает неионные гидрофильные детергенты с высоким значением HLB (HLB>13, в особенности HLB≥13,5 и предпочтительно HLB≥14). К этой группе относятся этоксилированные жирнокислотные моноэфиры сорбита (в особенности 20 этоксигрупп) (например, этоксилированный монолаурат сорбита типа Tween 20, этоксилированный монопальмитат сорбита типа Tween 40, этоксилированный моностеарат сорбита типа Tween 60, этоксилированный моноолеат сорбита типа Tween 80), этоксилированные жирные спирты (в особенности 15-30 этоксигрупп) (например, Brij 78, Brij 98, Brij 721), этоксилированные жирные кислоты (в особенности 15-30 этоксигрупп) (например, Myrj 49, Myrj 51, Myrj 52, Myrj 53), неионные блок-сополимеры [например, сополимер полиоксиэтилен/полиоксипропилен (РОЕ/РОР) типа Lutrol F127, Lutrol F68] и их комбинации.
Для неионных блок-сополимеров содержание может быть ниже, в частности от 0,1% до 0,5%, более предпочтительно от 0,2% до 0,4% мас.
К предпочтительным детергентам (2) относятся этоксилированные жирнокислотные моноэфиры сорбита типа тех, которые описаны выше.
В предпочтительном воплощении концентрация неионного липофильного детергента (4) составляет от 0,1% до 2,5%, в частности от 0,2% до 2%, предпочтительно от 0,2% до 1,5%, более предпочтительно от 0,2% до 1,2% при выражении в процентах по массе на объем эмульсии (мас.%).
Данная группа детергентов включает жирнокислотные эфиры сорбита (например, монолаурат сорбита типа Span 20, монопальмитат сорбита типа Span 40, моностеарат сорбита типа Span 60, тристеарат сорбита типа Span 65, моноолеат сорбита типа Span 80, триолеат сорбита типа Span 85, моноизостеарат сорбита типа Arlacel 987, изостеарат сорбита типа Crill 6), жирнокислотные эфиры маннита (например, Montanide 80, моноолеат маннита типа Arlacel А, диолеат маннита, триолеат маннита, тетраолеат маннита), этоксилированные жирнокислотные эфиры маннита (2, 3 или 4 этоксигруппы) (например, Montanide 888, Montanide 103, этоксилированный моноолеат маннита, этоксилированный диолеат маннита, этоксилированный триолеат маннита, этоксилированный тетраолеат маннита) и их комбинации.
Жирную кислоту предпочтительно выбирают из группы, состоящей из олеата, пальмитата, стеарата, изостеарата, лаурата и их комбинаций.
К предпочтительным детергентам (4) относятся жирнокислотные эфиры сорбита, в частности те, что описаны выше, и их комбинации.
У детергентов по изобретению жирные кислоты могут иметь животное или растительное происхождение. Замена одного источника другим (например, животного Tween 80 на растительный Tween 80) может осуществляться всего лишь с небольшим изменением состава эмульсии.
В эмульсии по изобретению общая концентрация детергентов может составлять, по массе на объем эмульсии, от 1,2% до 10%, в частности от 2% до 8%, предпочтительно от 3% до 7%, более предпочтительно от 4% до 6%.
В общем случае у эмульсии по изобретению температура инверсии фаз (PIT, phase inversion temperature) может составлять ≥33°С, в частности от 33°С до 65°С, в особенности от 36°С до 60°С, предпочтительно от 37°С до 55°С, более предпочтительно от 38°С до 50°С.
Температура инверсии фаз (PIT) - это температура, при которой эмульсия типа «вода в масле» превращается в эмульсию типа «масло в воде», т.е. дефазирует (распад эмульсии и разделение на две фазы). Значение PIT можно измерить различными способами, к примеру, по внешнему виду (например, см. Пример 2) или по электропроводимости. Эмульсию помещают на водяную баню при температуре ниже значения PIT эмульсии, к примеру, при 25°С. Температуру постепенно повышают. Наблюдают за изменением внешнего вида эмульсии по сравнению с контрольной эмульсией, отмечая текучесть, вязкость, разделение на две фазы, изменение состояния поверхности вследствие выхода масляной фазы на поверхность. Температура, при которой наблюдается это изменение внешнего вида эмульсии, и дает значение PIT эмульсии. В качестве альтернативы значение PIT определяют по быстрому переходу от значения электропроводимости около 5-8 миллисименсов/сантиметр (мСм/см) (эмульсия типа «масло в воде») до значения около 0 мСм/см (эмульсия типа «вода в масле») при измерении зондом, помещенным в эмульсию вблизи от поверхности. Температура, при которой наблюдается этот переход, и дает значение PIT эмульсии. Рядовой специалист в этой области в состоянии определить комбинации детергентов и масла, включая их концентрации, для получения эмульсий по изобретению, в частности эмульсий со значением PIT в указанных выше пределах, без излишнего экспериментирования.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения, описанные в нем эмульсии, не содержат каких-либо ионных детергентов или соединений, обладающих свойствами ионных детергентов, таких как лецитин или сапонин. В общем случае эмульсии по настоящему изобретению могут содержать, по объему на объем эмульсии, от 3% до 55% масла, в частности от 5% до 50% масла, предпочтительно от 10% до 40% масла, более предпочтительно от 20% до 40% масла. По определению интервалы значений в настоящем описании всегда включают границы интервала, если не указано иначе.
Используемое масло может представлять собой минеральное масло, включая, но не ограничиваясь этим, парафиновое масло типа изопарафинового масла и/или нафтенового масла, сквалан, пристан, полиизобутеновое масло, гидрогенированное полиизобутеновое масло, полидеценовое масло, полиизопреновое масло, полиизопропеновое масло и др. Одно из предпочтительных минеральных масел, применимых в настоящем изобретении, может включать масло, содержащее линейную или разветвленную углеродную цепь с числом атомов углерода более 15, предпочтительно от 15 до 32, и свободное от ароматических соединений. К таким маслам можно отнести, к примеру, масла, выпускаемые под маркой «Marcol 52» или «Marcol 82» (фирмы Esso, Франция) либо «Drakeol 6VR» (фирмы Penreco, США).
Масло может представлять собой и смесь масел, включающую, по меньшей мере, 2 масла, выбранные из описанных выше масел, и в любой пропорции. Смесь масел также может включать, по меньшей мере, одно масло, выбранное из описанных выше масел, и, по меньшей мере, одно растительное масло, причем это растительное масло составляет от 0,1% до 33% масляной фазы, предпочтительно от 10 до 25 об.% Такие растительные масла представляют собой ненасыщенные масла, богатые олеиновой кислотой, которые подвержены биодеградации и предпочтительно жидкие при температуре хранения (около +4°С) или, по крайней мере, дают возможность получить эмульсии, которые будут жидкими при этой температуре. Например, растительное масло может представлять собой арахисовое масло, ореховое масло, подсолнечное масло, сафлоровое масло, соевое масло, онагровое масло и др.
В предпочтительном воплощении гидрофильные детергенты (2) и (5) предпочтительно включают детергенты, имеющие одинаковую гидрофильную часть молекулы. Например, применяются этоксилированные жирнокислотные эфиры сорбита для каждого из гидрофильных детергентов (2) и (5). Так, если в качестве неионного гидрофильного детергента с низким значением HLB выбран Tween 85, то неионный гидрофильный детергент с высоким значением HLB должен будет иметь гидрофильную часть, в состав которой входит этоксилированный сорбит типа Tween 80.
В общем случае, настоящее изобретение предусматривает использование водных растворов, включающих подходящий ветеринарный или фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель, в том числе, но не ограничиваясь этим, стерильную воду, физиологический раствор, глюкозу, буфер и т.п. Носитель, наполнитель или разбавитель может также включать полиоли, глюкозиды и рН-буферные вещества. Носитель, наполнитель или разбавитель, к примеру, может также включать аминокислоты, пептиды, антиоксиданты, бактерицидные и бактериостатические соединения. Водный раствор добавляют в масло и детергенты в таком количестве, чтобы получить 100% объема эмульсии по изобретению.
Гидрофильно-липофильный баланс (HLB) эмульсии позволяет оценить гидрофильность или липофильность детергента. Значение HLB амфифильной молекулы обычно рассчитывают следующим образом:
Значение HLB может колебаться от 0 (для наиболее липофильных молекул) до 20 (для наиболее гидрофильных молекул). В соответствии с химическим составом детергента (к примеру, добавлением этоксигрупп или алкеноксидов) эта оценка может меняться, и область значений HLB может возрасти (например, у Lutrol F68 значение HLB равно 29). Для смеси детергентов значение HLB смеси определяется сложением значений HLB каждого из детергентов, нормализованных по массе:
В одном воплощении эмульсии согласно настоящему изобретению конечное значение HLB эмульсии составляет от 9 до 12, предпочтительно от 9,5 до 11,5, более предпочтительно от 10 до 11,5.
Настоящее изобретение предусматривает эмульсию, включающую парафиновое масло (в частности, в концентрации от 10% до 40%, предпочтительно от 20% до 40% при выражении по объему на объем эмульсии - «об.%» или «% об.» при перечислении значений); жирнокислотный моноэфир сорбита (в качестве неионного липофильного детергента); этоксилированный жирнокислотный триэфир сорбита (в качестве неионного гидрофильного детергента с низким значением HLB); и этоксилированный жирнокислотный моноэфир сорбита (в качестве неионного гидрофильного детергента с высоким значением HLB). В частности, жирнокислотный моноэфир сорбита представляет собой моноолеат сорбита (в частности, в концентрации от 0,2% до 1,5%, предпочтительно от 0,2% до 1,2% при выражении по массе на объем эмульсии - мас.%); этоксилированный жирнокислотный триэфир сорбита представляет собой этоксилированный триолеат сорбита (в частности, в концентрации от 2% до 5%, предпочтительно от 2,5% до 4 мас.%); и этоксилированный жирнокислотный моноэфир сорбита представляет собой этоксилированный моноолеат сорбита (в частности, в концентрации от 0,3% до 1,3%, предпочтительно от 0,4% до 1,2 мас.%). Например, эмульсия включает парафиновое масло в количестве 29,3% по объему на объем эмульсии, моноолеат сорбита в количестве 0,6% по массе на объем эмульсии, этоксилированный триолеат сорбита в количестве 3,4% по массе на объем эмульсии и этоксилированный моноолеат сорбита в количестве 0,75% по массе на объем эмульсии.
Во втором воплощении, в соответствии с настоящим изобретением эмульсия включает парафиновое масло (в частности, в концентрации от 10% до 40%, предпочтительно от 20% до 40 об.%); жирнокислотный моноэфир сорбита (в качестве неионного липофильного детергента); этоксилированный жирнокислотный триэфир сорбита (в качестве неионного гидрофильного детергента с низким значением HLB); и неионный блок-сополимер (в качестве неионного гидрофильного детергента с высоким значением HLB). В частности, жирнокислотный моноэфир сорбита представляет собой моноолеат сорбита (в частности, в концентрации от 0,2% до 1,5%, предпочтительно от 0,2% до 1,2 мас.%); этоксилированный жирнокислотный триэфир сорбита представляет собой этоксилированный триолеат сорбита (в частности, в концентрации от 2% до 5%, предпочтительно от 2,5% до 4 мас.%); и неионный блок-сополимер представляет собой полимер полиоксиэтилен/полиоксипропилен (РОЕ-РОР) (в частности, в концентрации от 0,1% до 0,5%, предпочтительно от 0,2% до 0,4 мас.%). Например, эмульсия включает парафиновое масло в количестве 29,3 об.%, моноолеат сорбита в количестве 0,6 мас.%, этоксилированный триолеат сорбита в количестве 3,4 мас.% и этоксилированный моноолеат сорбита в количестве 0,25 мас.%.
В предпочтительном воплощении изобретение предусматривает эмульсию для инъекций типа «масло в воде» (М/В), включающую:
(1) водный раствор, содержащий активный ингредиент типа лекарственного препарата или иммуногена, предпочтительно иммуноген;
(2) минеральное масло;
(3) неионный липофильный детергент; и
(4) неионный гидрофильный детергент с низким значением HLB, который включает этоксилированный жирнокислотный диэфир сорбита (который может обладать значением HLB между 11 и 13).
Эмульсия по этому воплощению включает этоксилированные жирнокислотные диэфиры сорбита, которые могут содержать до 20 этоксигрупп. Жирные кислоты могут иметь животное или растительное происхождение, и они могут быть выбраны из группы, состоящей из олеата, пальмитата, стеарата, изостеарата, лаурата и их комбинаций. В одном воплощении этоксилированная жирная кислота предпочтительно представляет собой олеат. Остальные ингредиенты, а также общие свойства эмульсии, такие как PIT, могут иметь такие же характеристики, как у тех, что описаны выше.
Предпочтительно детергент (4) включает этоксилированные жирнокислотные диэфиры сорбита, такие как этоксилированный диолеат сорбита, этоксилированный дистеарат сорбита или этоксилированный диизостеарат сорбита, этоксилированный дипальмитат сорбита, этоксилированный дилаурат сорбита и их комбинации.
Необязательно в эмульсию можно добавлять и другие соединения в качестве коадъювантов, в том числе, но не ограничиваясь этим, квасцы, олигонуклеотиды CpG (ODN), в частности ODN 2006, 2007, 2059 или 2135 (Pontarollo R.A. et al., Vet. Immunol. Immunopath., 2002, 84: 43-59; Weraette C.M. et al., Vet. Immunol. Immunopath., 2002, 84: 223-236; Mutwiri G. et al., Vet. Immunol. Immunopath., 2003, 91: 89-103), полиА-полиU («Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach», edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6:03), диметилдиоктадециламмоний бромид (DDA) («Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach», edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6:157), N,N-диоктадецил-N′,N′-бис(2-гидроксиэтил)пропандиамин типа Avridine (ibid, p.148), карбомер, хитозан (к примеру, см. US Patent Serial No. 5980912).
Настоящее изобретение также предусматривает способ получения вакцинной композиции или иммунологической композиции, включающей, по меньшей мере, один антиген или иммуноген и адъювант или эмульсию, полученную согласно настоящему изобретению. Иммуноген может быть включен в состав при образовании эмульсии либо, в альтернативном воплощении, иммуноген может быть добавлен в эмульсию позже, например, непосредственно перед применением.
Все количество используемого водного раствора может находиться в эмульсии с самого начала. Или же только часть этого водного раствора используется для получения эмульсии, а остальное количество водного раствора добавляется после внесения иммуногена. Иммуноген или антиген может находиться в лиофилизованном виде или в каком-либо ином надлежащем твердом виде, а затем его смешивают с эмульсией или, альтернативно, антиген может находиться в растворе, в частности в водном растворе, и этот раствор смешивают с эмульсией.
Детергенты предпочтительно добавляют либо в масло, либо в водный раствор в соответствии с их растворимостью. Например, неионные липофильные детергенты добавляют в масло по изобретению, тогда как неионные гидрофильные детергенты с высоким значением HLB добавляют в водный раствор.
Эмульгирование может осуществляться традиционными методами, известными рядовым специалистам в этой области. Например, в одном воплощении настоящего изобретения эмульсию получают при температуре ниже значения PIT эмульсии, в частности, при комнатной температуре, например, примерно при 25°С. Водную фазу и масляную фазу смешивают вместе путем механического воздействия, например, с помощью турбины, оснащенной ротором-статором, способным создавать высокое режущее усилие. Предпочтительно перемешивание начинается при низкой скорости вращения и медленно повышается по мере постепенного добавления, как правило, водного раствора в масло. Предпочтительно водный раствор постепенно добавляют в масло. Соотношение масло/водный раствор можно подобрать таким образом, чтобы получить эмульсию типа «вода в масле» (В/М), например, при концентрации от 40 до 55 об.% масла. При прекращении перемешивания эмульсия постепенно превращается в эмульсию типа М/В (инверсия фаз). После инверсии и при необходимости эмульсию разбавляют добавлением водного раствора, чтобы получить нужную концентрацию масла в конечной эмульсии. Эмульсия может храниться примерно при 5°С.
В другом воплощении эмульсию можно получить при температуре выше значения PIT эмульсии. На первой стадии водную фазу и масляную фазу смешивают вместе при температуре выше значения PIT эмульсии. Предпочтительно водный раствор постепенно добавляют в масло. Соотношение масло/водный раствор можно подобрать таким образом, чтобы получить эмульсию типа «вода в масле» (В/М), например, при концентрации от 40 до 55 об.% масла. Эмульгирование может осуществляться путем перемешивания при низком режущем усилии или в его отсутствие, например, с помощью статической мешалки или шнека, либо с помощью турбины при очень низкой скорости вращения. Полученная эмульсия представляет собой эмульсию типа «вода в масле» (В/М). На второй стадии эмульсию постепенно охлаждают ниже значения PIT. На этой стадии эмульсия превращается в эмульсию типа М/В (инверсия фаз). После инверсии и при необходимости эмульсию разбавляют добавлением водного раствора, чтобы получить нужную концентрацию масла в конечной эмульсии. Эмульсия может храниться примерно при 5°С.
Размер капель в эмульсии может колебаться от 100 нм до 500 нм. Эмульсию можно использовать, к примеру, в качестве адъюванта для составления вакцинной композиции или фармацевтической композиции. Эмульсию можно использовать и в качестве растворителя для растворения сухого препарата, в особенности лиофилизованного препарата, содержащего, к примеру, ослабленные микроорганизмы или живые рекомбинантные векторы.
В предпочтительном воплощении получают предварительную эмульсию (пре-эмульсию), используя только часть водного раствора. Такую пре-эмульсию можно разбавить добавлением суспензии активного ингредиента типа лекарственного препарата или иммуногена, предпочтительно иммуногена, для получения конечной композиции. В качестве альтернативы можно разбавить водным раствором и использовать для растворения сухого препарата, к примеру, лиофилизованного препарата.
Иммуноген или антиген, пригодный для применения в настоящем изобретении, может быть выбран из группы, состоящей из инактивированных патогенов, ослабленных патогенов, иммуногенных субъединиц (например, белков, полипептидов, пептидов, эпитопов, гаптенов) или рекомбинантных экспрессионных векторов, в том числе плазмид с иммуногенными вставками. В одном воплощении настоящего изобретения иммуноген представляет собой инактивированный или убитый микроорганизм. В другом воплощении изобретения вакцинная композиция включает иммуноген, выбранный из группы патогенов птиц, включая, но не ограничиваясь этим. Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, вирус инфекционного бронхита (IBV), вирус болезни Ньюкасл (NDV), вирус синдрома снижения яйценоскости (EDS, egg drop syndrome) или вирус инфекционного бурсита (IBDV), вирус птичьего гриппа и др., а также их комбинаций.
Альтернативно, вакцинная композиция включает иммуноген, выбранный из кошачьих патогенов, таких как (но не ограничиваясь этим) герпесвирус кошек (FHV), каликивирус кошек (FCV, feline calicivirus), вирус лейкемии кошек (FeLV), вирус иммунодефицита кошек (FIV), вирус бешенства и др., а также их комбинаций.
В следующем воплощении вакцинная композиция настоящего изобретения включает иммуноген, выбранный из собачьих патогенов, включая, но не ограничиваясь этим, вирус бешенства, герпесвирус собак (CHV), парвовирус собак (CPV), коронавирус собак, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorragiae, Leptospira grippotyphosa, Borrelia burgdorferi, Bordetella broncniseptica и др., а также их комбинаций.
В следующем воплощении изобретения композиция включает иммуноген, выбранный из лошадиных патогенов, таких как герпесвирус лошадей (1 или 4 типа), вирус лошадиного гриппа, столбняка, вирус Западного Нила и др. или их комбинаций.
В следующем воплощении изобретения композиция включает иммуноген, выбранный из бычьих патогенов, таких как вирус бешенства, бычий ротавирус, вирус бычьего парагриппа 3 типа (bPIV-3), бычий коронавирус, вирус бычьей вирусной диареи (BVDV), вирус ящура (FMDV), бычий респираторно-синцитиальный вирус (BRSV), вирус бычьего инфекционного ринотрахеита (IBR), Escherichia coli, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica и др., а также их комбинаций.
В следующем воплощении настоящего изобретения композиция включает иммуноген, выбранный из патогенов свиней, таких как (но не ограничиваясь этим) вирус свиного гриппа (SIV), цирковирус свиней 2 типа (PCV-2), вирус свиного репродуктивно-респираторного синдрома (PRRS), вирус псевдобешенства (PRV), парвовирус свиней (PPV), FMDV, Mycoplasma hyopneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli и др., а также их комбинаций.
Предпочтительное воплощение изобретения предусматривает вакцинные композиции, включающие, по меньшей мере, один иммуноген и эмульсию в фармацевтически приемлемом носителе. Иммуногены, содержащие вирусы, бактерии, грибки и др., могут быть получены методами культивирования in vitro, используя соответствующие культуральные среды или клеточные линии и стандартные методы, хорошо известные в этой области. Например, PRRS можно культивировать в соответствующей линии клеток типа клеточной линии МА-104 (см. US Patent Serial Nos. 5587164; 5866401; 5840563; 6251404, среди прочих). Аналогичным образом PCV-2 можно культивировать в клетках линии РК-15 (см. US Patent Serial No.6391314); SIV можно культивировать в яйцах (US Patent Serial No.6048537); и Mycoplasma hyopneumoniae можно культивировать в соответствующей культуральной среде (US Patent Serial Nos. 5968525; 5338543; Ross R.F. et al. Am. J. Vet. Res., 1984, 45: 1899-1905).
Для того чтобы получить инактивированную иммунологическую или вакцинную композицию, патоген предпочтительно подвергают инактивации после выделения и необязательно подвергают осветлению при помощи химической обработки, используя, к примеру, формалин или формальдегид, β-пропиолактон, этиленимин, бинарный этиленимин (BEI), тимеросал и др., и/или физической обработки (например, нагревания или обработки ультразвуком). Методы инактивации хорошо известны в этой области. Например, вирус PRRS можно инактивировать при обработке β-пропиолактоном (Plana-Duran et al., Vet. Microbiol., 1997, 55: 361-370) или при обработке BEI (US Patent Serial No. 5587164); инактивацию вируса PCV-2 можно осуществить с помощью обработки этиленимином или обработки β-пропиолактоном (US Patent Serial No. 6391314); вирус гриппа свиней можно инактивировать с помощью детергента типа Triton или при обработке формальдегидом (US Patent Serial No. 6048537); бактерии Mycoplasma hyopneumoniae можно инактивировать при обработке формальдегидом (Ross R.F., supra), этиленимином или BEI (см. WO 91/18627), либо при обработке тимеросалом (US Patent Serial Nos. 5968525 и 5338543).
Инактивированный патоген можно сконцентрировать стандартными методами концентрирования, в частности методом ультрафильтрации, и/или подвергнуть очистке стандартными методами очистки, в частности методами хроматографии, включая, не ограничиваясь этим, гель-фильтрацию, ультрацентрифугированием в градиенте сахарозы или избирательным осаждением, в частности, в присутствии полиэтиленгликоля (PEG).
К иммуногенам, применимым в вакцинных композициях по настоящему изобретению, относятся и экспрессионные векторы. К таким векторам относятся, не ограничиваясь этим, рекомбинантные векторы для экспрессии in vivo, такие как полинуклеотидные векторы или плазмиды (ЕР-А2-1001025; Chaudhuri P., Res. Vet. Sci. 2001, 70: 255-256), вирусные векторы, такие как (не ограничиваясь этим) аденовирусные векторы, поксвирусные векторы типа векторов на основе вируса оспы птиц (US Patent Serial Nos. 5174993; 5505941 и 5766599) или поксвируса канареек (US Patent Serial No. 5756103), либо бактериальные векторы (Escherichia coli или Salmonella sp.).
Настоящее изобретение также охватывает составление мультивалентных композиций или комбинированных вакцинных композиций. Например, к антигенам, применимым в комбинированных бычьих бактериальных вакцинах в соответствии с настоящим изобретением, относятся, не ограничиваясь этим, Mycoplasma bovis, Pasteurella sp., в частности Р. multocida и Р. haemolytica, Haemophilus sp., в частности Н. somnus, Clostridium sp., Salmonella, Corynebacterium, Streptococcus, Staphylococcus, Moraxella, E. coli и др.
Настоящее изобретение также предусматривает способы индукции иммунного ответа у реципиента, например животного, которые включают введение реципиенту иммунологической композиции или вакцинной композиции по изобретению. Иммунные ответы, вызванные таким образом, представляют собой антитело и/или клеточные иммунные ответы, в частности ответ γ-интерферона.
В частности, настоящее изобретение предусматривает способы иммунизации против, либо предупреждения или уменьшения симптомов, вызванных заражением животного патогенным организмом (например, заражение вирусом, бактерией, грибком или протозойным паразитом). Способ настоящего изобретения применим для позвоночных животных, включая, но не ограничиваясь этим, человека, собачьих (например, собак), кошачьих (например, кошек), лошадиных (например, лошадей), коровьих (например, крупного рогатого скота) и свиных (например, свиней) животных, а также у птиц, включая, но не ограничиваясь этим, кур, индеек, уток, гусей, перепелок, фазанов, попугаев, зябликов, ястребов, ворон и бескилевых (страусов, эму, казуаров и др.).
В предпочтительном аспекте изобретения эти способы заключаются в вакцинации беременных самок в дородовый период путем введения вакцинной композиции, полученной в соответствии с изобретением. Эти способы дополнительно включают индукцию защитных антител, вырабатываемых вследствие вакцинирования, и передачу этих защитных антител от вакцинированных беременных самок их потомству. Передача таких материнских антител впоследствии защищает потомство от заболевания.
50
Дозировка вакцинной композиции, полученной в соответствии с настоящим изобретением, зависит от вида, породы, возраста, размера, предыдущих вакцинаций и состояния здоровья вакцинируемого животного. Другие факторы типа концентрации антигена, дополнительных компонентов вакцины и способа применения (подкожное, интрадермальное, внутримышечное или внутривенное введение) также влияют на эффективную дозу. Дозировка вводимой вакцины легко определяется на основании концентрации антигена в вакцине, способа введения и возраста и состояния вакцинируемого животного. Каждую партию антигена можно откалибровать индивидуально. С другой стороны, можно использовать систематические испытания иммуногенности при различных дозах, а также исследования LD и другие процедуры скрининга для определения эффективной дозировки вакцинной композиции в соответствии с настоящим изобретением без излишнего экспериментирования. Из приведенных ниже примеров можно легко установить, какая приблизительно доза и какой приблизительно объем будут правильными для применения описанной нами вакцинной композиции. Критическим фактором является то, чтобы дозировка обеспечивала по крайней мере частичный защитный эффект против настоящей инфекции, о котором судят по снижению смертности и заболеваемости в связи с настоящей инфекцией. Рядовой специалист в этой области также легко установит надлежащий объем. Например, для разных видов птиц объем дозы может составлять от 0,1 мл до 0,5 мл, предпочтительно от 0,3 мл до 0,5 мл. Для разных видов кошек, собак и лошадей объем дозы может составлять от 0,2 мл до 3,0 мл, предпочтительно от 0,3 мл до 2,0 мл, более предпочтительно от 0,5 мл до 1,0 мл. Для разных видов крупного рогатого скота и свиней объем дозы может составлять от 0,2 мл до 5,0 мл, предпочтительно от 0,3 мл до 3,0 мл, более предпочтительно от 0,5 мл до 2,0 мл.
Могут быть предпочтительны повторные вакцинации через периодические интервалы для усиления первоначального иммунного ответа или по прошествии длительного времени после последней дозы. В одном воплощении настоящего изобретения вакцинная композиция вводится в виде парентеральной инъекции (подкожно, интрадермально или внутримышечно). Композицию можно вводить в виде одной дозы или, в других воплощениях, в повторных дозах от двух до пяти доз с интервалом от двух до шести недель, предпочтительно от двух до пяти недель. Однако специалисты в этой области должны понимать, что количество доз и промежуток времени между вакцинациями зависят от ряда факторов, включая, но не ограничиваясь этим, возраст вакцинируемого животного, состояние животного, способ иммунизации, содержание антигена в дозе и др. Для первичной вакцинации промежуток обычно составляет больше недели, предпочтительно от двух до пяти недель. Для ранее вакцинированных животных может проводиться повторная вакцинация (бустер), до или во время беременности, с годичным интервалом.
Настоящее изобретение также предусматривает введение вакцинной композиции с помощью безигольного инъектора типа Pigjet, Avijet, Dermojet или Biojector (Bioject, Oregon, США). Рядовой специалист в данной области сможет подобрать технические характеристики инъектора соответственно требованиям в отношении таких факторов, как вид вакцинируемого животного, возраст и вес животного и так далее без излишнего экспериментирования.
В одном воплощении настоящего изобретения способ включает однократное введение вакцинной композиции, составленной с эмульсией по изобретению. Например, в одном воплощении вакцинная композиция представляет собой инактивированную вакцину против Mycoplasma hyopneumoniae, тогда как другое воплощение предусматривает вакцину, содержащую композицию с инактивированным вирусом PCV2. Для применения по однократной схеме пригодны и другие иммунологические композиции или вакцины, включая, но не ограничиваясь этим, инактивированные PRRS и SIV. В частности, в случае вакцинной композиции против Mycoplasma hyopneumoniae однократную дозу можно вводить между рождением и забоем свиньи, в частности, в возрасте от 3 до 56 дней, предпочтительно в возрасте от 10 до 35 дней, более предпочтительно в возрасте от 15 до 30 дней. Вакцину можно вводить и при наличии уже существующих антител.
Изобретение также касается способов лечения реципиента, например животного, включающих введение реципиенту фармацевтической композиции, полученной по изобретению и включающей, по меньшей мере, один иммуноген, выбранный из группы, состоящей из белков или пептидов, антител, аллергенов, олигонуклеотидов CpG-ODN, факторов роста, цитокинов или антибиотиков, в частности CpG-ODN или цитокины.
Такие фармацевтические композиции можно использовать для улучшения показателей роста у таких животных, как куры, свиньи или коровы.
Настоящее изобретение также касается набора, включающего один флакон, который содержит такой ингредиент, как иммуноген или фармацевтическая композиция, а второй флакон - эмульсию согласно настоящему изобретению. Иммуноген может находиться в лиофилизованном виде, сухом виде или в водном растворе, как описано в настоящем изобретении.
Далее изобретение будет описано более подробно на следующих не ограничивающих примерах.
Пример 1. Способ приготовления эмульсии
Эмульсию получали в две стадии, как описано ниже.
Первая стадия. Для получения составов использовали эмульгатор Silverson типа ротор-статор с высоким режущим усилием (марки L4RT с распыляющей насадкой диаметром 10 мм). Для получения эмульсии один объем масляной фазы эмульгировали при 25°С вместе с одним объемом водной фазы №1. Водную фазу добавляли в масляную фазу с перемешиванием при 5000 об/мин в течение 1 мин. Скорость вращения постепенно повышали по мере возрастания объема до 8300 об/мин за 1 мин. На этой стадии эмульсия представляла собой эмульсию типа «вода в масле». Для эмульсии TS6 фазы имели следующий состав:
Масляная фаза (120 мл)
Моноолеат сорбита (Span 80)
1,8%
Триолеат сорбита (20 ОЕ)(Tween 85)
10,2
Парафиновое масло (Marcol 82)
88%
Водная фаза №1 (120 мл)
20% раствор моноолеата сорбита (20 ОЕ)(Tween 80)
11,25%
0,02М изотонический буфер Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>/KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> (pH 7,8)
85,75%
1% меркуротиолат натрия (Thiomersal<sup></sup>) в воде
1,5%
2
4
2
4
Моноолеат сорбита (Span 80) и триолеат сорбита (20 ОЕ) (Tween 85) вносили в масляную фазу. Моноолеат сорбита (20 ОЕ) (Tween 80) не смешивался с парафиновым маслом. 20% раствор Tween 80 готовили в том же буфере, что и вакцину, например, в 0,02М изотоническом фосфатном буфере NaHPO/KHPO (pH 7,8). Меркуротиолат натрия действует в качестве консерванта и не обязателен для эмульсии.
При прекращении перемешивания эмульсия превратилась в эмульсию типа «масло в воде». Эмульсию ставили в холодную комнату при 5°С как минимум на 4 часа. На этой стадии эмульсия представляла собой пре-эмульсию, содержащую 50% масляной фазы.
2
4
2
4
Вторая стадия. Водную фазу №2 готовили на 120 мл 0,02М изотонического фосфатного буфера NaHPO/KHPO рН 7,8 с иммуногенами (инактивированный иммуноген Mycoplasma hyopneumoniae либо иммуноген PCV-2, как описано ниже). Полученную на первой стадии пре-эмульсию охлаждали примерно до 5°С, разбавляли добавлением половинного объема водной фазы №2 при той же температуре и перемешивали на магнитной мешалке в течение 1 мин. Конечная концентрация детергента в эмульсии TS6 составила 4,75%.
При таком способе получения вакцины TS6 устойчивы, по крайней мере, один год при 5°С. Таким же способом можно получить и другие эмульсии, как описано ниже.
Эмульсия TS7
2
4
2
4
2
4
2
4
Эмульсия TS7 представляет собой эмульсию типа «масло в воде», содержащую 33% масляной фазы. Масляная фаза (120 мл) содержит 88% Marcol 82, 1,8% Span 80 и 10,2% Tween 85. Водная фаза №1 (120 мл) содержит 97,75% 0,02М изотонического фосфатного буфера NaHPO/KHPO (рН 7,8), 1,5% 1%-го раствора Thiomersal в воде и 0,75% Lutrol F127. Водная фаза №2 (120 мл) состоит из 0,02М изотонического фосфатного буфера NaHPO/KHPO (рН 7,8), необязательно содержащего иммуногены. Конечная концентрация детергента в эмульсии TS7 составляет 4,25%.
Эмульсия TS8
2
4
2
4
Эмульсия TS8 представляет собой эмульсию типа «масло в воде», содержащую 50% масляной фазы. Масляная фаза (160 мл) содержит 92% Marcol 82, 1,8% Span 85 и 6,2% Brij 96, Водная фаза №1 (160 мл) содержит 98,5% 0,02М изотонического фосфатного буфера NaHPO/KHPO (рН 7,8), 1,0% 1%-го раствора Thiomersal в воде и 0,5% Lutrol F127 и необязательно содержит иммуногены. Конечная концентрация детергента в эмульсии TS8 составляет 4,25%.
Эмульсия TS9
2
4
2
4
2
4
2
4
Эмульсия TS9 представляет собой эмульсию типа «масло в воде», содержащую 10% масляной фазы. Масляная фаза (120 мл) содержит 60% Marcol 82, 17,2% Span 40 и 22,8% Arlatone 650. Водная фаза №1 (120 мл) содержит 97,75% 0,02М изотонического фосфатного буфера NaHPO/KHPO (рН 7,8) и 2,5% Tween 20. Водную фазу №2 готовили на 400 мл 0,02М изотонического фосфатного буфера NaHPO/KHPO рН 7,8, необязательно содержащего иммуногены. 100 мл пре-эмульсии разбавляли 400 мл водной фазы №2, получая эмульсию TS9. Конечная концентрация детергента в эмульсии TS9 составляет 4,25%.
Пример 2. Определение температуры инверсии фаз (PIT) эмульсии
В стеклянную пробирку вносили 10 мл эмульсии TS6, на водяной бане при температуре около 25°С. Эмульсия TS6 представляла собой белую гомогенную эмульсию. Температуру водяной бани постепенно повышали. За изменениями эмульсии наблюдали визуально - эмульсия разделялась на две фазы, что приводило к подъему желто-коричневой масляной фазы на поверхность. Такое изменение характерно для распада эмульсии. Температура, при которой наблюдается это изменение, и дает значение PIT эмульсии. Значение PIT для эмульсии TS6 составило 40-45°С, а для эмульсии TS7 - 44-49°С.
Пример 3. Вакцинная композиция и гетерологическая проба на Mycoplasma hyopneumoniae
Материалы и методы. Была составлена вакцинная композиция, содержащая эмульсию TS6, полученную как описано в Примере 1, и инактивированный штамм BQ14 Mycoplasma hyopneumoniae (Kobisch et al., Ann. Inst. Pasteur Immunol., 1987, 138, 693-705) в концентрации 8,7 log10 CCU (единиц изменения окраски) на 1 мл вакцины. Поросят (22 шт.) 3-недельного возраста и имеющих материнские антитела (рожденных от свиноматок, сероположительных по Mycoplasma hyopneumoniae) разделяли случайным образом на две группы. Одну группу из 10 поросят вакцинировали в день 0 с помощью 2 мл вакцинной композиции путем внутримышечной инъекции, тогда как контрольную группу из 12 поросят не вакцинировали.
Через определенные интервалы во время эксперимента (0, 27, 42 и 56 дней) брали мазки из ноздрей поросят в обеих группах и определяли секреторные антитела против BQ14 методом ELISA. Через 27 дней у поросят брали кровь и выделяли одноядерные клетки периферической крови (PBMN) для определения уровня IFNγ в периферической крови. Через 28 дней всем поросятам делали провоцирующую пробу путем интраназального введения раствора, содержащего приблизительно 6,6 log10 CCU/мл Mycoplasma hyopneumoniae штамма Мр88с (штамм был выделен из больной свиньи в Дании и культивирован как описано в Kobisch and Friis, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1996, 15: 1569-1605), причем в каждую ноздрю вводили примерно 5 мл. Введение повторяли через 24 часа. Свиней забивали и выделяли легкие при вскрытии. Определяли показатели легких в баллах путем оценки площади (в процентах от площади всей доли легкого) поврежденной поверхности по каждой из семи долей легкого. Баллы определяли следующим образом (см. табл.1).
Таблица 1
Площадь повреждения доли легкого
Количество баллов
0%
0
1-25%
1
26-50%
2
51-75%
3
>75%
4
Рассчитывали итоговый балл путем сложения баллов, полученных по отдельным долям каждого легкого, что давало максимальное число баллов у животного, равное 28.
5
Результаты. Свиньи, вакцинированные вакцинной композицией с TS6, проявляли сильный клеточный ответ, который был значительно выше, чем у контрольной группы, о чем свидетельствует число IFNγ-секретирующих пятен (spots) из 5×10 одноядерных клеток периферической крови (PBMN). У свиней из вакцинированной группы в среднем было 139 пятен (стандартное отклонение 25) по сравнению с 11 (стандартное отклонение 5) в контрольной не вакцинированной группе (см. табл.2).
Таблица 2.
Группа
Число пятен из 5×10<sup>5</sup> клеток PBMNs
Вакцинная композиция TS6
139 (25)
Не вакцинированный контроль
11 (5)
Уровни секреторных антител против BQ14 у вакцинированных и контрольных животных приведены в следующей таблице 3, результаты которой показывают, что у вакцинированных свиней уровень секреторных антител был значительно выше через две-три недели после провоцирующей пробы по сравнению с не вакцинированным контролем.
Таблица 3.
Группа
Секреторные антитела против BQ14 (по оптической плотности, OD)
Д0 (до вакцинации)
Д27 (до провоцирующей пробы)
Д42 (через 14 дней после пробы)
Д56 (через 28 дней после пробы)
TS6
0,026±0,001
0,033±0,002
0,201±0,089
0,264±0,043
Контроль
0,030±0,001
0,031±0,001
0,107±0,028
0,075±0,011
Как видно из фиг.1, животные, вакцинированные вакцинной композицией TS6, проявляли средний показатель легких в 2,1±1,9 балла (среднее значение ± стандартное отклонение) по сравнению с не вакцинированным контролем, у которого средний показатель легких составил 7,8±4,1 баллов. Эти результаты свидетельствуют о значительном уменьшении повреждений легких у свиней, вакцинированных вакцинной композицией, по сравнению с не вакцинированным контролем.
Пример 4. Продолжительность защиты от введения гетерологической Mycoplasma hyopneumoniae
Материалы и методы. Поросят (38 шт.) 3-недельного возраста с материнскими антителами (рожденных от свиноматок, сероположительных по Mycoplasma hyopneumoniae) разделяли случайным образом на три группы следующим образом.
Группа 1 (12 поросят): вакцинировали внутримышечно в день 0 с помощью 2 мл вакцинной композиции, описанной в Примере 3.
Группа 2 (12 поросят): вакцинировали в день 0 внутримышечно с помощью 2 мл коммерческой инактивированной вакцины от Mycoplasma hyopneumoniae.
Группа 3 (14 поросят): служила в качестве не вакцинированного контроля.
Всем поросятам через 20 недель после вакцинации вводили интраназально в ноздри примерно по 5 мл провоцирующего штамма Мр88с Mycoplasma hyopneumoniae (6,6 log10 CCU/мл), как описано выше. Введение повторяли через 24 часа. Во всех группах брали кровь и выделяли одноядерные клетки периферической крови (PBMN) для определения уровня IFNγ, как описано выше. В сыворотке определяли антитела типа IgA и IgGI против BQ14 через 138 дней во всех группах. После вскрытия рассчитывали показатели легких в баллах (среднее значение ± стандартное отклонение), как описано выше в Примере 3.
Результаты. Как видно из фиг.1, поросята из группы 1, вакцинированные вакцинной композицией TS6, проявляли средний показатель легких в 0,4±0,9 балла, что представляет статистически значимое уменьшение показателя повреждения легких по сравнению с коммерческой вакциной (4,0±5,1) или не вакцинированным контролем (6,1±5,8).
Средние результаты (± стандартное отклонение) по уровню антител типа IgA и IgG1 против BQ14 в сыворотке крови по каждой группе через 138 дней представлены следующим образом (см. табл.4).
Таблица 4
Группа
IgG против BQ14 (титр)
IgA против BQ14 (титр)
Вакцина TS6
4,38±0,14
0,56±0,06
Коммерческая вакцина
3,09±0,11
0,09±0,01
Контроль
2,73±0,08
0,09±0,01
5
В следующей таблице 5 приведены средние результаты (± стандартное отклонение) по числу пятен, секретирующих γ-интерферон (IFNγ) в периферическую кровь, из 5×10одноядерных клеток периферической крови (PBMN).
Таблица 5.
Группа
Д28
Д138
Д152
Вакцина TS6
81±20
9±2
28±7
Коммерческая вакцина
5±2
3±1
6±1
Контроль
6±3
2±2
11±8<sup>∗</sup>
*Если исключить поросенка с аномально высоким числом пятен (109), то среднее значение контрольной группы составит 4±1.
Как и следовало ожидать при использовании инактивированной вакцины, встречаемость IFNγ-секретирующих Т-клеток против BQ14 через 138 дней после вакцинации была значительно ниже, чем через 28 дней. Интересно, что большинство свиней, вакцинированных TS6, все еще давали положительную реакцию через 138 дней, свидетельствуя, что клеточный ответ сохранялся в этой группе. Встречаемость IFNγ-секретирующих Т-клеток против BQ14 в крови через 152 дня (через 13 дней после провоцирующей пробы) сильно отличалась между тремя группами. В группе, вакцинированной TS6, возник очень сильный клеточный ответ, в отличие от остальных групп. Этот результат свидетельствует, что провоцирующая проба эффективно воспроизводит иммунную память, индуцированную вакциной TS6.
Пример 5. Результаты серологии после введения одной дозы вакцины против PCV-2 с адъювантом из эмульсии TS6
50
Материалы и методы. Свободных от определенных патогенов поросят (SPF) в возрасте 2-3 месяцев разделяли случайным образом на 2 группы. Одну группу из 5 поросят вакцинировали внутримышечно (в день 0) с помощью 2 мл вакцины, содержащей инактивированный PCV-2 (штамм impl010) в количестве 6,8 log10 CCID на дозу (вакцинированная группа). Контрольную группу из 5 поросят не вакцинировали. Брали образцы крови через 0, 7, 14, 21 и 28 дней после вакцинации для определения титра антител ORF2 против PCV-2 методом ELISA.
Результаты. Как видно из следующей таблицы 6, все вакцинированные проявляли значительный ответ антител ORF2 против PCV-2 через 7-40 дней после вакцинации.
Таблица 6
Группа
ELISA (log10)
Д0
Д7
Д14
Д21
Д28
Вакцинированная
Среднее
1,00
2,53
3,50
3,45
3,88
Станд. отклон
0,00
0,89
0,79
0,84
0,37
Контрольная
Среднее
1,00
1,00
1,00
1,00
1,27
Станд. отклон
0,00
0,00
0,00
0,00
1,24
Пример 6. Защита от провоцирующей пробы, оказываемая вакциной против PCV-2 с адъювантом из эмульсии TS6
50
50
Материалы и методы. Поросят SPP (16 шт.) в возрасте 4-5 дней разделяли случайным образом на 2 группы следующим образом: одну группу из 8 поросят вакцинировали дважды в дни 0 и 21 путем внутримышечной инъекции 2 мл вакцины, содержащей инактивированный PCV-2 (штамм imp1010) в количестве 7,55 log10 CCID на дозу (вакцинированная группа), тогда как контрольную группу из 8 поросят не вакцинировали. Всем поросятам в день 35 вводили интраназально штамм PCV-2 hnp1011-48285 (хранится в ЕСАСС под номером доступа V98011608), содержащий около 5,5 log10 CCID/мл, причем в каждую ноздрю вводили примерно 5 мл. Проводили исследование методами ELISA и серонейтрализации (SN) и определяли клинические показатели в баллах у каждого поросенка следующим образом (см. табл.7).
Таблица 7.
Количество баллов
0
1
2
Прострация
нет
средняя
сильная
Одышка
нет
средняя
сильная
Анемия (цвет кожи)
розовый
белый
желтый
Кашель
нет
да
Анорексия
нет
да
Рвота
нет
да
Ректальная температура
t<40°C
39,9°C<t<41°С
t>40,9°C
Привес за неделю «п» превышает привес за неделю «n-1»
да
нет, но >100 г/день
нет, но <101 г/день
Смертность
нет
да*
<sup>∗</sup>В случае смерти используется показатель, соответствующий дню накануне смерти
После вскрытия рассчитывали показатель повреждения следующим образом (см. табл.8).
Таблица 8.
Количество баллов
0
1
2
3
Упитанность
нормальная
тощая
очень тощая
рахитическая
Внешний вид тушки
нормальная
белая
желтая
Слизистая оболочка
нормальная
белая
желтая
Подкожная соединительная ткань
нормальная
белая
желтая
Поверхностные лимфатические узлы
нормальные
1 жирный и/или белый и/или застойный
>1 жирный и/или белый и/или астойный
> 1 очень жирный и/или белый и/или застойный
Отделяемое грудной полости
нет
яркая грудная полость
видимое присутствие
Сердце
нет поврежд.
есть поврежд.
Легкие
нет поврежд.
есть поврежд.
Плевра
нет поврежд.
мелкие повреждения
крупные повреждения
Медиастинальные лимфатические узлы
нормальные
1 жирный и/или белый и/или застойный
>1 жирный и/или белый и/или застойный
>1 очень жирный и/или белый и/или застойный
Брюшная полость
нормальная
яркая
отмечена асцитная жидкость
Брюшина
нет поврежд.
есть поврежд.
Желудок
нет поврежд.
есть поврежд.
язва
Тонкая кишка
нет поврежд.
есть поврежд.
Кишечник
нет поврежд.
есть поврежд.
Брыжеечные лимфатические узлы
нормальные
1 жирный и/или белый и/или застойный
>1 жирный и/или белый и/или застойный
>1 очень жирный и/или белый и/или застойный
Бляшки Пейерса
не отмечены
отмечены только в одном сегменте кишечника
отмечены в нескольких сегментах кишечника
отмечены в нескольких сегментах кишечника и очень значительны
Печень
нет поврежд.
есть поврежд.
Почки
нет поврежд.
есть поврежд.
Мочевой пузырь
нет поврежд.
есть поврежд.
Результаты. Результаты по серологии методом ELISA и титры нейтрализующих антител в сыворотке через 30 дней и 63 дня показывают более высокие уровни у вакцинированных поросят, чем у не вакцинированных контрольных животных. В нижеследующей таблице 9 приведены результаты по выделению вируса PCV-2 из фекальных мазков и ткани лимфатических узлов, а также средние клинические показатели и показатели повреждения у вакцинированной и контрольной группы. Результаты показывают более высокие уровни циркулирующих антител и титров SN у вакцинированных по сравнению с контрольными животными. Клинические показатели и повреждения легких также значительно меньше у вакцинированных поросят. Эволюция клинических показателей после провоцирующей пробы представлена на фиг.3.
Таблица 9
Группа
Вакцинированная
Контрольная
Серология по ELISA через 30 дней (log10)
4,1±0,70
2,8±0,50
Серология по ELISA через 63 дня (log10)
5,2±0,28
3,4±0,67
Серология по SN через 30 дней (log10)
3,4±0,25
1,6±0,23
Серология по SN через 63 дня (log10)
3,7±0,31
2,2±0,53
PCV-2 в кале (% положительных)
40
61
PCV-2 в медиастинальных лимфоузлах (% положительных)
25
100
Клинический показатель
14
31
Показатель повреждений
9,8
18,8
Пример 7. Результаты полевого испытания эффективности после вакцинации одной дозой инактивированной вакцины PCV-2 с адъювантом TS6
Вакцинная композиция. Адъювант TS6 готовили, как описано в Примере 1. Вирус PCV-2 культивировали в клетках РК/15, и размножение вируса проводили, как описано в US Patent Serial No.6517843 (Ellis et al.), содержание которого включено в настоящее изобретение во всей полноте. Вкратце, по окончании культивирования зараженные вирусом клетки собирали, лизировали и полученный вирус инактивировали стандартными методами. Например, инактивацию можно осуществить с помощью 0,1% этиленимина за 18 час при +37°С; с помощью 0,5% β-пропиолактона за 24 часа при +28°С; либо с помощью 0,2% и 0,1% β-пропиолактона за 24 часа при +4°С. Если титр вируса перед инактивацией оказывался неадекватным, то вирусную суспензию концентрировали путем ультрафильтрации, используя мембрану с пределом исключения в 150-300 кДа. Инактивированную вирусную суспензию хранили при +5°С до составления вакцины. Содержание антигена в вакцине устанавливали на уровне 2,1 log10 единиц антигена на дозу. В соответствии с таким содержанием активность вакцины при определении активного ингредиента в конечном продукте методом ELISA условно принимали равной как минимум 100 ед. ELISA на дозу.
Методика вакцинации. Для проверки эффективности вакцинной композиции в полевых условиях была выбрана ферма, которая обычно проявляет вспышки мультисистемного синдрома истощения после отлучения (PMWS, postweaning multisystemic wasting syndrome), вызванного заражением PCV-2 поросят. Свиноматок разделяли на две группы, при этом вакцинированные получали внутримышечно одну инъекцию (доза в 2 мл) инактивированной вакцины PCV-2 с адъювантом TS6 за 2-3 недели до опороса. Вторая группа не была вакцинирована и служила в качестве контроля. Свиноматкам давали разродиться, а поросят от вакцинированных (n=889) и контрольных свиноматок (n=713) наблюдали на смертность вплоть до возраста забоя.
Результаты. На фиг.4 представлена диаграмма, отображающая процент случаев PMWS у поросят к моменту забоя. Как видно из графика, наблюдалось снижение числа случаев PMWS у поросят, рожденных от вакцинированных свиноматок, по сравнению с числом случаев у поросят от не вакцинированных контрольных свиноматок. Эти результаты показывают значительное снижение клинической заболеваемости при заражении PCV-2 и показывают полезность вакцинирования свиноматок незадолго до опороса с помощью инактивированной вакцины PCV-2 с адъювантом TS6 для предотвращения смертности и заболеваемости в связи с заражением PCV-2 у поросят. Эти результаты также показывают, что можно достичь значительного уменьшения PMWS среди поросят в настоящих полевых условиях при использовании всего лишь одной дозы вакцинной композиции по настоящему изобретению.
Пример 8. Эмульсия LF2
2
4
2
4
2
4
2
4
Способом, описанным выше в Примере 1, была получена эмульсия типа «масло в воде» (М/В), содержащая 10% масляной фазы и обозначенная LF2. Масляная фаза (100 мл) содержала 88% Marcol 82, 1,8% Span 80 и 10,2% Tween 85. Водная фаза №1 (100 мл) содержала 88,5% 0,02М изотонического фосфатного буфера NaHPO/KHPO (pH 7,8) и 11,5% 20%-го раствора Tween 80. Водная фаза №2 (400 мл) состояла из 0,02М изотонического фосфатного буфера NaHPO/KHPO (pH 7,8), необязательно содержащего иммуногены. 100 мл пре-эмульсии разбавляли 400 мл водной фазы №2, получая эмульсию LF2. Конечная концентрация детергента в эмульсии LF2 составила 1,43%. Значение PIT эмульсии LF2 было >45°С при определении по электропроводимости.
Пример 9. Серологический анализ после введения вакцины против гриппа свиней с адъювантом из эмульсии LF2
50
50
Материалы и методы. Поросят (15 шт.) в возрасте примерно 10 недель разделяли случайным образом на 3 группы. Первую группу (вакцинированную) из 5 поросят вакцинировали дважды (в день 0 и день 28) с помощью 2 мл рекомбинантной вакцины против гриппа свиней в количестве 7,7 log10 CCID на дозу путем внутримышечной инъекции. Эта вакцина на основе рекомбинантного экспрессионного вектора содержала вектор на основе оспенного вируса канареек, кодирующий и экспрессирующий нуклеопротеид (NP) и гемагглютинин (НА) вируса гриппа свиней H1N1. Вторую группу из 5 поросят вакцинировали дважды (путем внутримышечной инъекции в день 0 и день 28) с помощью 2 мл рекомбинантной вакцины против гриппа свиней (в количестве 7,7 log10 CCID на дозу) с адъювантом из эмульсии LF2 (LF2-вакцинированная группа). Пять поросят не подвергали вакцинации (контрольная группа). Брали образцы крови через 0, 7, 14, 28, 42 и 56 дней после вакцинации для определения титров ингибирования гемагглютинации (HI).
Результаты. Как видно из следующей таблицы 10, все вакцинированные проявляли значительный ответ антител против гриппа свиней через 42-56 дней после вакцинации (ANOVA, р<0,0001) по сравнению с не вакцинированным контролем. Однако свиньи, вакцинированные вакциной с адъювантом LF2, проявляли значительное увеличение ответа антител через 42-56 дней после вакцинации по сравнению со свиньями, получавшими рекомбинантную вакцину без адъюванта (ANOVA, р<0,0001).
Таблица 10
Группа
HI (log10)
Д0
Д14
Д28
Д42
Д56
Вакцинированная
СреднееСтанд. отклон.
0,90,00
0,90,00
0,90,00
1,20,37
1,20,21
LF2-вакци-нированная
СреднееСтанд. отклон.
0,90,00
0,90,00
0,90,00
2,040,33
1,920,16
Контрольная
СреднееСтанд. отклон.
0,90,00
0,90,00
0,90,00
0,90,00
0,90,00
Как свидетельствуют эти результаты, адъювантный эффект эмульсии LF2 позволяет вакцине индуцировать более сильный ответ антител против вируса гриппа свиней по сравнению с вакциной без адъюванта.
Пример 10. Защита, оказываемая вакциной против Mannheimia haemolytica с адъювантом из эмульсии LF2
Материалы и методы. Телят (20 шт.) в возрасте пяти месяцев, отрицательных или с низким титром антител к лейкотоксину Mannheimia haemolytica, разделяли случайным образом на две группы по 10 телят. Эмульсию LF2 получали, как описано выше в Примере 8, и составляли вакцину, содержащую инактивированные Mannheimia haemolytica (штамм А1) в количестве приблизительно от 60 до 70 единиц ELISA (что соответствует примерно от 0,34 мл до 1,1 мл неочищенной неконцентрированной культуры бактерий) на дозу вакцины, вместе с адъювантом из эмульсии LF2. Одну группу из 10 телят вакцинировали в день 0 с помощью 2 мл вакцинной композиции LF2 путем подкожной инъекции, а контрольную группу из 10 телят не подвергали вакцинации. Со дня вакцинации (D0) до дня провоцирующей пробы (D20) всех вакцинированных телят регулярно подвергали осмотру на общие и местные реакции на вакцинацию. Клинический осмотр включал оценку системных реакций (таких как апатия, анорексия, учащенное дыхание, слюноотделение, дрожание), запись ректальной температуры и измерение местной реакции по месту инъекции. Ни один теленок не проявлял каких-либо системных реакций на вакцинацию. Ректальная температура (в °С, среднее значение ± стандартное отклонение), приведенная в следующей таблице 11, свидетельствовала о кратковременной и слабой фазе гипертермии, наблюдавшейся в вакцинированной группе, с пиком в течение 24 часов после вакцинации.
Таблица 11
Д0
Д0+4ч
Д1
Д2
Д3
Д7
Д14
Д20
Вакцин.
39,3±0,3
39,6±0,4
39,5±0,3
39,2±0,3
39,0±0,2
39,0±0,2
39,1±0,3
38,7±0,3
Контроль
39,3±0,2
39,3±0,2
39,1±0,2
39,1±0,2
38,9±0,2
39,0±0,2
38,9±0,1
38,7±0,3
2
2
Местные реакции у вакцинированных телят (измеренные как площадь поверхности в см, среднее значение ± стандартное отклонение) свидетельствовали о сильной местной реакции, которая наступала приблизительно через 24-48 часов после вакцинации у всех вакцинированных животных, а затем быстро уменьшалась в размерах примерно до 3 см на 14-й день. Эти реакции почти полностью прошли через 20 дней. Реакции представлены следующим образом (см. табл.12).
Таблица 12
Д0
Д0+4ч
Д1
Д2
Д3
Д7
Д14
Д20
Вакцинир.
0,9±0,4
9,2±12,4
71,3±25,8
72,5±29,3
56,9±18,0
15,9±8,0
2,6±2,6
2,0±1,2
Брали образцы крови у всех животных через различные промежутки времени (0 7, 14, 20 и 28 дней) и определяли уровень антител против лейкотоксина Al Mannheimia haemolytica методом ELISA (титр в log10 OD50). Результаты показали, что все телята были отрицательны до вакцинации. Через 20 дней после однократной вакцинации у 8 из 10 вакцинированных произошла сероконверсия, тогда как все контрольные телята оставались отрицательными от 0 до 20 дня. Результаты ELISA представлены следующим образом (см. табл.13).
Таблица 13
Группа
ELISA (log10)
Д0
Д7
Д14
Д21
Д28
Вакцинированная
СреднееСтанд. отклон.
<0,780,00
1,110,65
1,700,90
1,860,84
4,000,26
Контрольная
СреднееСтанд. отклон.
<0,780,00
<0,780,00
<0,780,00
<0,780,00
1,391,00
Провоцирующая проба. Всех телят подвергали провоцирующей пробе в день 20 путем внутритрахеального введения 30 мл раствора, содержащего 9,2 log10 к.о.е./мл (колониеобразующих единиц на мл) штамма A1 Mannheimia haemolytica. Введение повторяли через 24 часа. Со дня проведения пробы до окончания исследования всех телят подвергали ежедневному осмотру на общие клинические симптомы, включая дыхательную недостаточность. Наблюдаемые симптомы включали общее состояние, анорексию, ректальную температуру, выделения из ноздрей, кашель, частоту дыхания и одышку. Рассчитывали общие клинические показатели в баллах по следующей формуле и частные показатели, приведенные в таблице 14.
Таблица 14
0
1
2
Коэффициент
Общее состояние
нормальное
угнетенное
прострация
×2
Питание
нормальное
пониженное
анорексия
×3
Кашель
нет
сильный, редкий
слабый, частый
×1
Выделения из ноздрей
нет
серозные
слизе-гнойные
×2
Частота дыхания
<35/мин
35-50/мин
>50/мин
×3
Ректальная температура
<39,5°С
39,5°С-40,5°С
>40,5°С
×3
Для мертвых животных максимальный индивидуальный ежедневный клинический показатель принимали равным 2 баллам.
Также определяли показатель повреждения легких (в процентах) для каждого теленка по следующей формуле:
где LRM означает относительную массу легкого (lung relative mass), которая принимает значения:
0,11 для правой краниальной доли и правой медиальной краниальной доли
0,07 для правой медиальной каудальной доли
0,35 для правой каудальной доли
0,05 для левой краниальной доли
0,06 для левой медиальной доли
0,32 для левой каудальной доли и
0,04 для непарной доли.
Результаты провоцирующей пробы. Общие клинические показатели для каждой группы, приведенные в следующей таблице 15, показали, что вакцинированная группа проявляет значительное снижение общего клинического показателя по сравнению с не вакцинированным контролем (р=0,046, ANOVA).
Таблица 15
Д20
Д21
Д22
Д23
Д24
Д25
Д26
Д27
Кумул балл
Вакци-нир.
Среднее
0,0
0,7
0,7
0,6
0,6
0,5
0,5
0,5
4,0
Станд. отклон.
0,1
0,4
0,5
0,5
0,8
0,8
0,8
0,8
4,5
Контроль
Среднее
0,1
0,9
1,1
1,0
1,1
1,2
1,2
1,3
8,0
Станд. отклон.
0,1
0,5
0,6
0,8
0,9
0,8
0,8
0,7
4,5
У всех животных, погибших от провоцирующей пробы, было поражено 60% легких или больше. Наблюдалась статистическая тенденция (р=0,08) у вакцинированных животных к меньшему числу повреждений легких, чем у контрольной группы. Число животных в группе, у которых было поражено более одной трети легких, составило 2/10 (20%) у вакцинированных и 7/10 (70%) у контрольных животных. Число животных, у которых было поражено более одной трети легких, было значительно меньше (р=0,03, точный критерий Фишера, односторонний) в вакцинированной группе. Результаты по показателям повреждения легких представлены в следующей таблице 16.
Таблица 16
Индивидуальные показатели повреждения легких у вакцинированных животных
74,8<sup>∗</sup>
Индивидуальные показатели повреждения легких у контрольных животных
64,5<sup>∗</sup>
10,6
7,0
10,1
78,6<sup>∗</sup>
10,5
63,1<sup>∗</sup>
66,4<sup>∗</sup>
44,7
6,2
60,9
6,9
48,2
32,9
0,8
25,4
59,5<sup>∗</sup>
8,0
32,9
Среднее ± станд. отклонение
25,2±25,5
Среднее ± станд. отклонение
46,0±25,5
<sup>∗</sup> Животные, погибшие от провоцирующей пробы
2
Наблюдалась очень значительная (р<0,001) и сильная корреляция (R=0,86) между общим клиническим показателем и процентом повреждения легких. Хотя все вакцинированные животные проявляли небольшую гипертермию после вакцинации, никакой другой общей реакции на вакцинацию не наблюдалось. Наблюдалась сильная местная реакция после вакцинации, но она быстро уменьшалась до приемлемого размера, а значительные повреждения наблюдались при вскрытии. Эти результаты свидетельствуют о безопасности вакцины с адъювантом из эмульсии LF2.
Результаты данного эксперимента, показывающие, что усредненные клинические показатели и показатели повреждения легких значительно уменьшались у вакцинированных по сравнению с контрольными животными, свидетельствуют, что однократное введение вакцины против Mannheimia haemolytica с адъювантом из эмульсии LF2 защищает наивных телят от повторного введения Mannheimia haemolytica.
Итак, после подробного описания предпочтительных воплощений настоящего изобретения следует иметь в виду, что определенное выше изобретение не должно ограничиваться конкретными деталями, изложенными в вышеприведенном описании, так как возможны многие его варианты, не отходящие от духа и не выходящие за рамки настоящего изобретения.