СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БАЙКАЛИНА ИЗ КОРНЕВЫХ КУЛЬТУР ШЛЕМНИКА БАЙКАЛЬСКОГО (SCUTELLARIA BAICALENSIS GEORGI)
METHOD FOR ISOLATION AND PURIFICATION OF BAICALIN FROM ROOT CULTURES OF SCUTELLARIA BAICALENSIS GEORGI

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в пищевой и фармацевтической промышленности для получения байкалина высокой степени очистки из корневых культур шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi).
Старение населения является важнейшей медико-социальной демографической проблемой. Процесс характеризуется физиологическими изменениями в организме такими, как нарушение иммунной функции, повреждение белка, митохондриальной дисфункцией, измененной аутофагией, мутацией ДНК, укорочением теломер и другими процессами. Все эти изменения негативно сказываются на функции клеток и приводят к возрастным заболеваниям, нарушениям функций организма и смерти [1]. К распространенным заболеваниям, связанным со старением, относят заболевания сердечно-сосудистой системы, диабет второго типа, многие виды рака, болезнь Альцгеймера и Паркинсона.
Профилактика преждевременного старения - является перспективным подходом, при котором можно использовать различные биологически активные вещества (БАВ), влияющие на ключевые механизмы старения [2].
Из растений, произрастающих в Сибирском федеральном округе (СФО), интерес представляет шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi), который является многолетним растением из семейства Lamiaceae. Традиционно его используют для лечения воспалений, диареи, бессонницы, дизентерии, респираторных заболеваний. Активные фармацевтические соединения, входящие в фотохимический состав растения, обладают различными эффектами: антиоксидантными, противоопухолевыми, антибактериальными, противовирусными и противовоспалительными [3]. В настоящее время вторичные метаболиты шлемника байкальского в основном извлекают из корней дикого растения. Однако эта производственная система имеет различные проблемы такие, как медленные темпы роста растения, низкое и нестабильное содержания в нем веществ. Современные методы биотехнологии позволяют создавать экологически чистое сырье в течение короткого периода времени такое, как корневые культуры, которые включают в свой состав повышенное содержание БАВ. К преимуществам их использования можно также отнести контроль условий выращивания, независимость от экологических и сезонных изменений [4].
Байкалин (байкалеин-7-O-β-D-глюкуронид) является одним из основных активных веществ шлемника байкальского и представляет собой флавоноидный гликозид [5]. Различные исследования показали, что данное полифенольное соединение проявляет терапевтическое действие на многие заболевания. Так было выявлено, что байкалин способен подавлять свободные радикалы, улучшать сопротивление организма различным воспалениям и окислениям. Все больше исследований концентрируется на положительном влиянии байкалина на организм при раке. Показано, что вещество действует, как опухолевый супрессор при различных карциномах, способствует апоптозу раковых клеток поджелудочной железы, влияет на старение раковых клеток толстой кишки, усиливает апоптоз клеток плоскоклеточного рака головы и шеи [6-9]. Кроме этого, показано, что байкалин проявляет антибактериальные, нейропротекторные, гепатопротекторные свойства [10]. Все эти физиологические эффекты демонстрируют о важности выделения данного БАВ для использования его в биологически активных добавках (БАД), направленных на профилактику различных заболеваний, влияющих на старение.
Несмотря на то, что байкалин имеет положительные эффекты при различных заболеваниях, в связи с ограничением в процессе экстракции, биологически активное вещество имеет низкую чистоту и нестабильную эффективность. Поэтому необходимо проводить исследования в области новых технологий для разделения и очистки байкалина. Имеются различные данные по экстрагированию байкалина, в которых процесс осуществляют настаиванием, кипячением, с помощью ультразвука, микроволнового излучения, сверхкритической жидкостью [5]. Все эти методы позволяют получить экстракты, содержащие байкалин в небольших концентрациях с содержанием большого количества примесей. Также эти процессы имеют длительные рабочие циклы и трудные для контроля условия. Поэтому в настоящее время для получения биологически активных веществ с высокой степенью очистки все большее применение находит технология разделения и очистки с помощью препаративной жидкостной хроматографии.
Большинство известных способов извлечения и очистки байкалина основаны на экстракции его различными растворителями, а также применение кислотного осаждения и перекристаллизации.
Из существующего уровня техники известен способ получения суммы флавоноидов из корней астрагала перепончатого, шлемника байкальского и вздутоплодника сибирского (патент РФ №2603465, опубл. 27.11.2016). Способ предусматривает измельчение растительного сбора, содержащего корни астрагала перепончатого, корни шлемника байкальского, корневища и корни вздутоплодника сибирского, его экстрагирования трехкратно 60% этанолом, далее объединенные водно-спиртовые извлечения фильтруют, упаривают, очищают сепарированием, доупаривают, затем высушивают в вакуум-сушильном аппарате при определенных условиях.
К недостатку данного способа следует отнести низкий уровень очистки экстракта и недостаточный выход флавоноидов. В экстракте присутствуют неразделенные флавоноиды, а также свободные аминокислоты.
Известен способ извлечения байкалина (патент CN №1454899, опубл. 12.11.2003), включающий следующие стадии: измельчение корня Scutellaria, в зависимости от веса корня, добавление 3-10 частей кипяченой воды, настаивание в течение 1-3 часов три раза, процеживание, объединение вытяжек Scutellaria, выдерживание для удаления примесей, использование соляной кислоты для регулирования значения рН экстракта до 1-2, поддержание температуры при 70-80°С в течение 30-60 минут. После осуществляют отделение осадка байкалина с использованием кислой воды или воды для промывки осадка байкалина, изолирование и выдерживание более 12 часов при 70-80°С, фильтрование и осаждение. Затем проведение сушки для получения сырого продукта байкалина. Содержание сырого продукта и степень извлечения байкалина превышает 80%.
Недостатком является применение соляной кислоты, которая вызывает проблемы с загрязнением окружающей среды. Также при ее использовании предъявляются определенные требования к оборудованию. Кроме этого, к недостаткам можно отнести длительность процесса и низкую скорость извлечения байкалина. Требуется большое количество энергии при выдерживании экстракта после внесения соляной кислоты.
Известен метод извлечения байкалина из корней шлемника, описанный в патенте CN №1821257, опубл. 28.05.2008. Способ извлечения сырого байкалина включает флокуляцию и осветление водного экстракта шлемника с бентонитом, обладающим избирательной адсорбцией в качестве осветлителя, и последующее кислотное осаждение с получением сырого байкалина.
Недостатком способа является низкая степень очистки байкалина, выход которого составляет 36% относительно порошка и 50% по отношению к водному экстракту.
В патенте CN №102584918, опубл. 18.07.2012 раскрывается способ получения байкалина высокой чистоты из лекарственных трав. Способ включает стадии: экстракцию лекарственного растения водным раствором для получения экстракта, адсорбцию экстракта просеянной макропористой адсорбирующей смолой, элюирование 0-30% водным раствором этанола для удаления примесей, затем элюирование 40-60% водным раствором этанола. После проводят концентрирование элюата при пониженном давлении, сублимационную сушку для получения сырого продукта с содержанием байкалина более 80% и перекристаллизацию сырого продукта системой растворителей этанол/вода/уксусная кислота с получением светло-желтого продукта, чистота которого более 98%.
К недостатку способа относится использование дорогих реагентов и длительность процесса.
Наиболее близким к заявляемому способу (ближайшим аналогом) является способ извлечения байкалина из Scutellaria baicalensis (патент CN №105001285, опубл. 28.10.2015), который включает следующие стадии: измельчение корней Scutellaria baicalensis, смешивание их с этанолом в соотношение 1:4-8, перемешивание в течение 25-40 мин при воздействии ультразвука. Раствор переносят в устройство для экстракции с обратным холодильником и потом его концентрируют. Доводят рН до 2-3 лимонной кислотой, фильтруют и сушат с получением сырого продукта байкалина. Неочищенный продукт затем подвергают колоночной хроматографии на силикагеле, высушенное твердое вещество растворяют в метаноле, а затем проводят перекристаллизацию, фильтрацию и сушку байкалина.
Вышеуказанный способ выделения байкалина является многостадийным и сложным. Также в методе недостаточно описываются параметры процесса очистки байкалина. Кроме того, недостатком является использование дополнительных реагентов для осаждения продукта, а также вредного метилового спирта. В указанном патенте извлечение и очистку байкалина осуществляли из корней дикого растения, следовательно, нет данных по эффективности использования вышеописанного способа при выделении байкалина из корневых культур шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi).
Техническая задача, решаемая использованием разработанного изобретения, состоит в разработке нового способа выделения байкалина высокой степени чистоты из корневых культур шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi).
Техническим результатом, полученным при реализации заявленного способа, является выделение и очистка байкалина из корневой культуры шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi).
Для достижения указанного технического результата предложено использовать способ выделения и очистки байкалина из корневых культур шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi), включающий следующие этапы:
1. Корневые культуры шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi) измельчают, чтобы получить порошок.
2. Экстрагирование порошка с этанолом на водяной бане с обратным холодильником два раза в течение 5 ч, объединение экстрактов.
3. Концентрирование экстракта под вакуумом при температуре, не превышающей 50°С. К упаренному остатку добавляют диэтиловый эфир и обрабатывают трехкратно.
4. Полученные эфирные фракции объединяют и упаривают до сухого остатка с применением роторного испарителя, получают неочищенный байкалин.
5. Полученный сухой остаток растворяют в растворителе, состоящем из н-гексана и ацетона, и фильтруют.
6. Полученная фракция хроматографируется на силикагеле с подвижной фазой в градиенте н-гексан-ацетон (1:0 до 0:1). Выделение фракции флавоноидов.
7. Рехроматография на силикагеле с подвижной фазой н-гексан-хлороформ (1:0 до 0:1). Высушивание элюата для получения байкалина высокой чистоты.
Данный способ предусматривает получение байкалина со степенью чистоты 97,84-99,27%.
Определяющими существенными отличительными признаками заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:
- элюирование осуществляют раствором н-гексан-ацетон, что позволяет получить максимальный эффект отделения байкалина от сопутствующих примесей и родственных флавоноидов;
- проведение доочистки байкалина рехроматографией позволяет добиться получения целевого продукта высокой степени чистоты;
- расширение сырьевой базы источников байкалина, так как в качестве сырья используются корневые культуры шлемника байкальского, выращенные в экологически чистых условиях;
- элюат собирают и упаривают до полного удаления н-гексан-хлороформа, что позволяет исключить возможность наличия остаточного растворителя;
- способ заключается в простоте рабочего процесса, низкой стоимости и простоте реализации.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1. Корневые культуры шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi) измельчают в мельнице и порошок просеивают через сито с размером отверстия 1 мм. Навеску 3,0 г корневой культуры шлемника байкальского, взвешенную с точностью до 0,001 г, помещают в кругло донную колбу объемом 250 мл, добавляют 130 мл 70%-ного этилового спирта, экстрагируют на водяной бане при 35°С с обратным холодильником в течение 5 часов. Экстракцию проводят дважды, вытяжки фильтруют и объединяют.
Экстракт концентрируют при пониженном давлении 0,08 МПа, температуре 45°С до получения сухого остатка. К упаренному остатку добавляют 55 мл диэтилового эфира. Экстрагирование проводят трехкратно. Эфирные фракции объединяют и упаривают до сухого остатка на роторном испарителе. Получают неочищенный байкалин.
Сухой остаток растворяют в смеси н-гексан:ацетон в соотношении 40:60 и фильтруют. Полученная смесь хроматографируется в градиенте (1:0 до 0:1). Смесь закачивается в колонку (12*30 мм), заполненную силикагелем (размер частиц 0,2-0,5 мм (35-70 меш)) с помощью насоса для ввода пробы. Фаза потока элюируется со скоростью 0,5 мл/мин. Элюат упаривают до сухого остатка на роторном испарителе и растворяют в смеси н-гексан : хлороформ в соотношении 50:50. Проводят рехроматографию на силикагеле в градиенте (1:0 до 0:1). Фаза потока элюируется со скоростью 0,5 мл/мин. Собранные целевые компоненты концертируют при 50°С и высушивают, с получением байкалина с чистотой 97,84%. Выход байкалина составил 40,3 мг.
Пример 2. Аналогичен примеру 1, но экстракт шлемника байкальского концентрируют при температуре 50°С и добавляют 70 мл диэтилового эфира.
Пример 3. Аналогичен примеру 2, но сухой остаток растворяют в смеси н-гексан : ацетон в соотношении 50:50.
Пример 4. Аналогичен примеру 3, но хроматография и рехроматография проводится с элюированием фазы потока со скоростью 1 мл/мин.
Байкалин, полученный методами, указанными в примерах 1-4, был проанализирован по таким параметрам, как выход (мг) и степень чистоты (%) (таблица 1). Показано, что максимальные параметры байкалина, выделенного из корневых культур шлемника байкальского, достигались при использовании метода экстракции и очистки по примеру 4. Кроме этого, байкалин из корневых культур шлемника байкальского выделяли по способу, представленному в ближайшем аналоге. Выход байкалина по примеру 4 на 43,75% больше по сравнению с ближайшим аналогом, степень чистоты БАВ -на 0,61%.
Таким образом, заявляемый способ обеспечивает более высокий процент выделения байкалина из корневой культуры шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi). Кроме того, полученный байкалин характеризуется высокой чистотой.
Список литературы:
1. Promising biomarkers of human aging: In search of a multi-omics panel to understand the aging process from a multidimensional perspective / N.A. Rivero-Segura, O.Y. Bello-Chavolla, O.S. Barrera-Vazquez et al. // Ageing Research Reviews. - 2020. - P. 101164.
2. Recent advances and possibilities for the use of plant phenolic compounds to manage ageing-related diseases / H.S. Arrada, I.A. Neri-Numa, L.A. Kido et al. // Journal of Functional Foods. - 2020. - V. 75. - P. 104203.
3. Growth years and post-harvest processing methods have critical roles on the contents of medicinal active ingredients of Scutellaria baicalensis / C. Bai, J. Yang, B. Cao et al. // Industrial Crops and Products. - 2020. - V. 158. - P. 112985.
4. Establishment of adventitious root cultures from leaf explants of Tripterygium wilfordii (thunder god vine) for the production of celastrol / B. Zhang, L. Chen, Y. Huo, et al. // Industrial Crops and Products. - 2020. - V. 155. - P. 112834.
5. Optimization of baicalin water extraction process from Scutellaria baicalensis (a traditional Chinese medicine) by using orthogonal test and HPLC / H. Ni, Z. Wu, I. Muhammad et al. // Revista Brasileira de Farmacognosia. - 2018. - V. 28. - P. 151-155.
6. Huang, Т. Pharmacokinetics and bioavailability enhancement of baicalin: a review / T. Huang, Y. Liu, C. Zhang // European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. - 2019. - V. 44., I. 2. - P. 159-168.
7. Effect of baicalin on proliferation and apoptosis in pancreatic cancer cells / Q. Huang, J. Zhang, J. Peng et al. // American journal of translational research. - 2019. - V. 11., I. 9. - P. 5645.
8. Baicalin induces cellular senescence in human colon cancer cells via upregulation of DEPP and the activation of Ras/Raf/MEK/ERK signaling / Z. Wang, L. Ma, M. Su et al. // Cell death & disease. - 2018. - V. 9., I. 2. - P. 1-17.
9. Ohkoshi, E. Induced overexpression of CD44 associated with resistance to apoptosis on DNA damage response in human head and neck squamous cell carcinoma cells / E. Ohkoshi, N. Umemura // International journal of oncology. - 2017. - V. 50., I. 2. - P. 387-395.
10. Optimization of ultrasound-assisted enzymatic pretreatment for enhanced extraction of baicalein and wogonin from Scutellaria baicalensis roots / C. Yun, S. Wang, Y. Gao et al. // Journal of Chromatography B. - 2021. - P. 123077.