ШТАММ RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM CCM 32 (ВКПМ В-12661) - РИЗОБИАЛЬНЫЙ КОМПОНЕНТ МИКРОБНОГО БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ПРЕДПОСЕВНОЙ ОБРАБОТКИ ГОРОХА
RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM CCM 32 (RNCIM B-12661) STRAIN - RISOBIAL COMPONENT OF MICROBIC BIOLOGIC DRUG FOR PRESOWING TREATMENT OF PEA

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и касается нового штамма клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum ССМ 32 для получения микробиологического удобрения, повышающего урожайность гороха.
Для повышения урожайности бобовых культур используют бактериальные удобрения, изготовляемые на основе азотфиксирующих клубеньковых бактерий, как в формате монокомпонентного препарата, так и в составе консорциумов полезных почвенных микроорганизмов. На настоящий момент действуют только два патента РФ на штаммы рода Rhizobium различных видов. Один из них предполагает промышленное использование культуры в качестве продуцента биополимеров (RU 2604495 С2), во втором штаммы рода Rhizobium предложены в качестве основы для биопрепарата под лядвенец рогатый (RU 2592677 С2). Патентов на штаммы азотфиксирующих бактерий под горох не выявлено.
Задачей изобретения является выявление нового штамма бактерий с высокой азотфиксирующей активностью, пригодного для использования в сельском хозяйстве с целью повышения урожайности гороха. Указанная задача решается за счет того, что для биоудобрения под горох используется штамм клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum ССМ 32.
До сих пор при разработке микробных биопрепаратов под бобовые культуры остается нерешенным вопрос стабильности и эффективности таких биопрепаратов на практике. Главным образом, это обусловлено созданием так называемых "универсальных биопрепаратов", при разработке которых не учитывается зависимость растительно-микробного симбиоза от ряда параметров: сорт-штаммовой специфичности, влияния почвенной микробиоты, агроклиматических условий возделывания бобовой культуры и агрофона, на котором проводилась селекция используемых сортов растений. И самое главное - зачастую не проводится оценка влияния компонентов таких биопрепаратов на почвенный биоценоз, оценка остаточного эффекта интродуцированных штаммов-инокулятов на местные популяции клубеньковых бактерий, в том числе сохранность их после первого года вегетации растений-хозяев. Поэтому для создания эффективного симбиоза так важен принцип "комплементарности пар", базирующийся на знаниях биоразнообразия партнеров.
Бобово-ризобиальные взаимодействия между растениями трибы Vicieae: горох (Pisum), бобы (Vicia fabae), чина (Lathyrus), чечевица (Lens) - Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Rlv) считаются одними из наиболее специфичных. Штаммы внутри данного биовара способны к перекрестной инокуляции представленных растений-хозяев, так называемой группы перекрестной инокуляции (ГПИ). Эффективность штаммов R. leguminosarum bv. viciae варьируется в широких пределах. Это обусловлено генетическими различиями симбиотических генов и генов «домашнего хозяйства» штаммов-инокулятов. Авторами настоящей заявки ранее был разработан способ идентификации и дифференциации прокариотических организмов (патент РФ на изобретение №2486251) по хромосомному hin-регион маркеру, в том числе клубеньковых бактерий рода Rhizobium.
Так биоразнообразие микросимбионтов растений ГПИ по данному маркеру представлено 3 генетически удаленными группами штаммов: R. leguminosarum I/A - штаммы, более эффективные во взаимодействии с горохом (Pisum), R. leguminosarum I/B - штаммы, более эффективные во взаимодействии с кормовыми бобами (Vicia fabae) и R. pisi.
Реализация принципа «комплементарности пар» основана на коэволюции штаммов определенных групп с сортами растений-хозяев, обусловленной агрофоном, на котором проводилась селекция используемых сортов растений и агроклиматическими условиями возделывания. Предложенный штамм R. leguminosarum ССМ 32 представляет собой быстрорастущие клубеньковые бактерии, обладающие большей эффективностью на современных сортах гороха отечественной селекции по сравнению с применяемыми ранее штаммами, в том числе R. leguminosarum 245а.
Краткое описание чертежей
На чертеже представлено филогенетическое дерево, построенное на основе данных сравнительного анализа последовательностей hin-региона Rhizobium sp. - симбионтов гороха и бобов с использованием алгоритма NJ. Масштаб соответствует 1 замене на 100 пар оснований. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления (в %), определенная с помощью «bootstrap»-анализа (1000 реплик). Значения «bootstrap» ниже 70% не показаны. Rlv - Rhizobium leguminosarum bv. viciae.
Данный штамм был получен Н.З. Толкачевым в 2003 г. методом аналитической селекции. Характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками: клетки 3-суточной культуры имеют палочковидную форму размером 2,6-2,8×0,7-0,8 мкм, подвижные. Штамм ССМ 32 - грамотрицательный, спор не образует, облигатный аэроб. Относится к быстрорастущим клубеньковым бактериям. На гороховой агаризованной среде на третьи сутки образует выпуклые, блестящие, слизистые колонии до 2-3 мм диаметром и активно накапливает полисахаридную слизь. Штамм усваивает сахарозу, глюкозу, фруктозу, арабинозу, рафинозу, ксилозу, рамнозу, мальтозу, маннит, сорбит, дульцит. В качестве источника азота использует аммонийный, нитратный, амидный азот. На средах с органическим азотом (МПА) штамм не растет. Молоко с лакмусом подкисляет, вызывает осаждение казеина и формирование прозрачной зоны (1,0-1,5 см) в верхней части среды. Желатин не разжижает, не имеет протеолитического фермента желатиназы, не гидролизует крахмал, казеин, агар, не имеет амилазной и оксидазной активностей, характеризуется денитрифицирующей способностью, уреазной и каталазной активностью. Штамм имеет активную нитратредуктазу и восстанавливает нитраты. Флуоресцирующих и феназиновых пигментов не образует. Температурный интервал роста штамма на плотных и в жидких средах составляет 18-37°C, а температурный оптимум - 25-28°C, штамм отнесен к мезофилам. Рост бактерий наблюдается в диапазоне pH 4,5-8,5, оптимальной для развития клеток штамма является близкая к нейтральной реакция среды pH 6,5-7,5, штамм отнесен к нейтрофилам. Признаки штамма устойчивы. Культуру хранят на маннито-дрожжевом или бобовом агаре с сахарозой при температуре 4-5°C, пересевают один раз в 6 месяцев. Вместо сахарозы можно использовать смесь маннита и глюкозы. Штамм образует активные клубеньки с сортами гороха (Pisum sativum L.), вики (Vicia sativa L.), чины (Lathyrus L.), чечевицы (Lens Mill.). На сое, фасоли, нуте, эспарцете, люцерне данный штамм клубеньков не образует.
2
4
4
3
Для хранения и культивирования штамма ССМ 32 используют агаризованную среду следующего состава: гороховый отвар (100 г гороха / 1 л воды), сахароза - 20 г/л, KHPO - 0,5 г/л, MgSO - 0,2 г/л, CaCO - 1 г/л, агар - 20 г/л, pH 6,8-7,0, смесь микроэлементов по Федорову - 1 мл/л. Хранение штамма при 4-6°C. Пересев 1 раз в полгода.
2
4
4
3
Для производственного культивирования штамма ССМ 32 применяют среду следующего состава: гороховый отвар (100 г гороха / 1 л воды), сахароза - 20 г/л, KHPO - 0,5 г/л, MgSO - 0,2 г/л, CaCO - 1 г/л, pH 6,8-7,0, смесь микроэлементов по Федорову - 1 мл/л. Посевная доза - 5% от объема питательной среды. Культивирование осуществляют при 28°C в течение 3 суток.
Способность бактерий заявленного штамма R. leguminosarum ССМ 32 образовывать на корнях растений активные клубеньки подтверждается полевыми опытами, проведенными на опытной базе ФГБУН «Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма».
Схема проведенных опытов предполагала сравнение влияния предложенного R. leguminosarum ССМ 32 с применяемым технологичным штаммом 245а, показавшим лучшие результаты по исследуемым показателям при предыдущих селекциях, на различных сортах гороха. Из таблицы 1 видно, что предложенный штамм R. leguminosarum ССМ 32 в вегетационном опыте активно образует азотфиксирующие клубеньки на корнях гороха и обеспечивает повышение эффективности бобово-ризобиального симбиоза, что приводит к увеличению фитомассы растений.
В результате проведенных испытаний в полевом опыте было показано, что предложенный в настоящей заявке штамм R. leguminosarum ССМ 32 обеспечивает максимальную прибавку урожайности на сорте Беркут - 38,2%, на сорте Восток - 35,2%. При этом наблюдается повышение содержания белка в семенах данных сортов гороха до 2,2% в сравнении с контролем (без микробной обработки). Таким образом, при обработке семян гороха современных производственных сортов эффективность биоудобрений, полученных на основе указанного штамма R. leguminosarum ССМ 32, превышала на 6,8-11,6% по показателю урожайности семян, а прибавка по содержанию белка в семенах достигала 1,1% относительно аналогичных показателей производственного штамма R. leguminosarum 245а (таблица 2).
Примечание: *Н.А. - нитрогеназная активность
Все изложенное указывает на возможность использования штамма клубеньковых бактерий R. leguminosarum ССМ 032 для изготовления препаратов - удобрений для предпосевной обработки семян гороха в виде концентрата бактериальной суспензии с титром не менее 10; КОЕ/мл.