СИНТЕЗ ЛИРАГЛУТИДА
LIRAGLUTIDE SYNTHESIS

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к эффективному твердофазному синтезу лираглутида, представленного Формулой-I.
Лираглутид (VICTOZA) представляет собой агонист рецептора глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1), рекомендуемый в качестве дополнения к рациону и физическим упражнениям для улучшения гликемического контроля у взрослых с сахарным диабетом 2 типа.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Лираглутид представляет собой длительно действующий аналог встречающегося в природе человеческого глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1(7-37)), у которого лизин в положении 34 замещен аргинином и пальмитоиловая группа присоединена посредством глутамоил-спейсера к лизину в положении 26.
Лираглутид (VICTOZA), разработанный Novo Nordisk, получил первоначальное одобрение в США в 2010 году в виде подкожной инъекции.
34
α
t
В патенте США №6268343 раскрыт лираглутид и способ его получения. Где в получении Arg-ГПП-1(7-37)-ОН используют технологии генной инженерии с последующей реакцией с N-гексадеканоил-Glu(ONSu)-OBu.
34
В США 7273921 В2 и США 6451974 В1 раскрыт способ ацилирования Arg-ГПП-1(7-37)-ОН с получением лираглутида.
В США 9260474 В2 раскрыт твердофазный синтез лираглутида, отличающийся тем, что включает а) последовательное связывание аминокислот с N-концевой защитой и защитой боковых цепей на основе последовательности пептидного остова лираглутида, где для лизина используется Fmoc-Lys(Alloc)-OH;
b) снятие Alloc-защиты на боковой цепи лизина;
t
c) связывание пальмитоил-Glu-OBu или последовательное связывание глутаминовой кислоты и пальмитоил-хлорида с боковой цепью лизина;
d) удаление защитных групп и расщепление смолы с получением неочищенного лираглутида.
В WO 2014/199397 А2 раскрыт твердофазный синтез лираглутида с использованием подхода на основе последовательного связывания и фрагментного подхода, где для лизина используется Fmoc-Lys(dde)-OH.
34
В WO 2016/059609 А1 раскрыт способ ацилирования Arg-ГПП-1(7-37)-ОН с использованием агента на основе меди с получением лираглутида.
3)4
Предыдущие способы получения лираглутида имеют недостатки. Данные способы не подходят для крупномасштабного производства лираглутида вследствие сложных методик и высоких затрат; в способах, где Alloc используется в качестве защитной группы боковой цепи лизина, снятие Alloc-защиты требует катализаторов на основе металлов, таких как Pd(PPh, которые являются довольно дорогими. Кроме того, катализатор является влагочувствительным, реакцию нужно проводить в контролируемых условиях и должно рассматриваться содержание тяжелых металлов в конечном продукте. Следовательно, данные способы не являются коммерчески целесообразными или продолжают существовать проблемы осуществления.
Во время твердофазного синтеза наблюдается устойчивая тенденция к агрегации пептидов в используемых условиях. Это происходит по следующим причинам:
a) растущая пептидная последовательность чувствительна к образованию β-листового типа структур, что приводит к разрушению пептидильной смолы, и
b) присутствие гидрофобных аминокислот, которые приводят к появлению свернутой пептидной цепи.
В таких условиях дисперсия реагентов в пептидильную смолу ограничена, реакции связывания и снятия защиты будут медленными и неполными, приводя, таким образом, к образованию примесей пептидов, приводя к сложностям в очистки и приводя в результате к низкому выходу. Следовательно, остается потребность в обеспечении эффективного способа получения лираглутида, который имел бы высокий выход, был масштабируемым, экономически эффективным, экологически безвредным и коммерчески целесообразным в результате избегания повторных трудоемких и продолжительных стадий очистки.
ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Цель настоящего изобретения заключается в разработке простого, надежного и коммерчески целесообразного последовательного способа получения лираглутида Формулы I с помощью неорганических солей, новых и эффективных условия связывания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1: Схема последовательности операций способа твердофазного синтеза лираглутида (Формула-I) согласно настоящему изобретению.
На Фиг. 2: проиллюстрирована ВЭЖХ (высоко-эффективная жидкостная хроматография)-хроматограмма лираглутида
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Воплощение настоящего изобретения включает способ синтеза для получения лираглутида, включающий следующие стадии:
a) Загрузка С-концевого глицина на твердофазную подложку на основе смолы в присутствии связующего агента.
b) Последовательное связывание Nα-защищенных аминокислот и аминокислот с защищенными боковыми цепями с получением остова лираглутида в присутствии связующего агента и неорганической соли.
c) Снятие защитной группы боковой цепи лизина.
d) Связывание γ-глутаминовой кислоты и пальмитиновой кислоты последовательным образом с боковой цепью лизина в присутствии связующего агента и неорганической соли.
e) Неочищенный лираглутид получают посредством удаления защитных групп и отщепления пептида от смолы.
f) Очистка неочищенного лираглутида.
Схематическое описание способа представляет собой такое, как показано на Фиг. 1.
Используемый подход представляет собой твердофазный синтез лираглутида посредством последовательного подхода и предусматривает неорганические соли во время связывания совместно с обычными связующими агентами и добавками. Согласно способу предложено завершение реакций связывания и снятия защиты и уменьшение рацемизации и, вследствие этого, контроль изомерных примесей, которые очень близки к целевой молекуле, и, в свою очередь, облегчение способа очистки данного пептида.
Для дополнительного улучшения настоящего изобретения на указанной стадии-А) смолу Ванга используют в качестве твердофазной подложки на основе смолы и связывают с Fmoc-Gly-OH с использованием DIC (N,N'-диизопропилкарбодиимид) в качестве связующего агента и MDC (дихлорметан) в качестве растворителя.
Применение 2-хлортритильной смолы (СТС) в качестве твердофазной подложки было ограничено, поскольку реакции связывания были медленными и не протекали до завершения после последовательности 15 аминокислот, и при этом пептид, присоединенный к СТС смоле, являлся лабильным и имеет тенденцию к экстрагированию в мягких кислотных условиях, используемых во время циклов связывания/промывки. Так как синтез лираглутида является многостадийным, на каждой стадии происходит частичное экстрагирование, приводящее к уменьшению общего выхода.
Для дополнительного улучшения настоящего изобретения, на указанной стадии-В), способ включает следующие стадии:
B1) снятие защитной группы Fmoc с Fmoc-Gly-смолы с использованием смеси Пиперидин/DMF (N,N'-Диметилформамид) или Пиперидин, DBU (1,8-Диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен), DMF с получением H-Gly-смолы.
B2) промывка загруженной смолы.
B3) связывание Fmoc-Arg(Pbf)-OH с H-Gly-смолой в присутствии связующего агента, связующей добавки, неорганической соли и основания.
B4) посредством повторения стадий В1, В2 и В3З синтезируют остов лираглутида, где на стадии-В3 защищенные аминокислоты последовательно связываются с получением остова лираглутида.
Для дополнительного улучшения настоящего изобретения, на указанной стадии-В) и D), связующий агент был выбран из группы, состоящей из HBTU (О-Бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат), COMU (1-Циано-2-этокси-2-оксоэтилиденаминоокси)диметиламино-морфолино-карбения гексафторфосфат), DEPBT (3-(Диэтоксифосфорилокси)-1,2,3-бензотриазин-4(3H)-он) или DIC.
Связующие добавки были выбраны их группы, состоящей из чистого оксима или HOBt (N-Гидроксибензотриазол), основание было выбрано из DIPEA (Диизопропилэтиламин), NMM (N-метилморфолин) или ТМР (2,4,6-Триметилпиридин), и неорганическая соль, была выбрана из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида цинка или хлорида меди.
Как сказано на стадии-В2), загруженную смолу промывали 0,01-0,1 М HOBt в DMF или изопропаноле.
Для дополнительного улучшения настоящего изобретения, как сказано на стадии-В), Mtt использовали в качестве защитной группы для лизина, и, как сказано на стадии-С), защитную группу Mtt с боковой цепи лизина удаляли посредством использования TFA (трифторуксусная кислота)/MDC или HFIP (1,1,1,3,3,3-Гексафтор-2-пропанол)/TES (Триэтилсилан)/TFE (Трифторэтанол)/MDC.
Для дополнительного улучшения настоящего изобретения, на указанной стадии-D), боковую цепь пальмитоил-глутаминовой кислоты (Pal-Glu) связывали в присутствии связующего агента, выбранного из группы, состоящей из HBTU, COMU, DEPBT или DIC; связующей добавки, выбранной из группы, состоящей из чистого оксима или HOBt; основания, выбранного из DIPEA, NMM или ТМР, и неорганической соли, выбранной из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида цинка или хлорида меди.
Другое воплощение настоящего изобретения включает способ синтеза для получения лираглутида, включающий следующие стадии:
A) Связывание Na-Fmoc-защищенного глицина (Fmoc-Gly-OH) с твердофазной подложкой на основе смолы в присутствии связующего агента.
B) Последовательное связывание Nα-защищенных аминокислот и аминокислот с защищенными боковыми цепями с получением остова лираглутида, в присутствии связующего агента и неорганической соли.
C) Снятие защитной группы боковой цепи лизина.
D) Связывание боковой цепи пальмитоил-глутаминовой кислотой (Pal-Glu) с боковой цепью лизина в присутствии связующего агента и неорганической соли.
E) Неочищенный лираглутид получают посредством удаления защитных групп и отщепления пептида от смолы.
F) Очистка неочищенного лираглутида.
Для дополнительного улучшения настоящего изобретения, на указанной стадии-D), боковую цепь пальмитоил-глутаминовой кислоты (Pal-Glu) связывали в присутствии связующего агента, выбранного из группы, состоящей из HBTU, COMU, DEPBT или DIC; связующей добавки, выбранной из группы, состоящей из чистого оксима или HOBt; основания, выбранного из DIPEA, NMM или ТМР, и неорганической соли, выбранной из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида цинка или хлорида меди.
Еще одно воплощение настоящего изобретения включает способ синтеза для получения лираглутида, включающий следующие стадии:
i) Связывание Na-Fmoc-защищенного глицина (Fmoc-Gly-OH) с твердофазной подложкой на основе смолы в присутствии связующего агента.
ii) Последовательное связывание Nα-защищенных аминокислот и аминокислот с защищенными боковыми цепями с получением остова лираглутида в присутствии связующего агента и неорганической соли.
iii) Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты с использованием пиперидина в DMF или смеси Пиперидин/DBU/DMF.
iv) После каждой стадии снятия Fmoc-защиты стадия промывки с использованием HOBt в DMF.
v) Снятие защитной группы боковой цепи лизина.
vi) Связывание боковой цепи пальмитоил-глутаминовой кислоты (Pal-Glu) с боковой цепью лизина в присутствии связующего агента и неорганической соли.
vii) Неочищенный лираглутид получают посредством удаления защитных групп и отщепления пептида от смолы. Очистка неочищенного лираглутида.
9
10
11
12
13
Дополнительно в качестве улучшений к указанным выше воплощениям аминокислоты под номером 9-13 [то есть Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu)] связывают при повышенной температуре примерно 30-45°С с образованием остова лираглутида.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к эффективному способу получения лираглутида посредством последовательного связывания с использованием твердофазного подхода. Он включает последовательное связывание защищенных аминокислот с получением остова лираглутида, и при завершении линейной последовательности синтез продолжали с боковой цепи лизина посредством добавления γ-глутаминовой кислоты и пальмитиновой кислоты с последующим удалением защитных групп, отщеплением пептида с твердой подложки и очисткой полученного неочищенного лираглутида. Настоящее изобретение также включает применение неорганических солей во время связывания, промывку HOBt в растворе DMF после стадии снятия Fmoc-защиты для подавления агрегации пептидов и обеспечения того, чтобы реакции протекали с завершением, и таким образом избегания делеции последовательностей и улучшения выхода способа.
Сокращения:
ACN: Ацетонитрил
Boc: трет-Бутилоксикарбонил
COMU: 1-Циано-2-этокси-2-оксоэтилиденаминоокси)диметиламино-морфолино-карбения гексафторфосфат
2
CuCl: хлорид меди
DBU: 1,8-Диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен
DEPBT: 3-(Диэтоксифосфорилокси)-1,2,3-бензотриазин-4(3H)-он
DIC: N,N'-диизопропилкарбодиимид
DMAP: Диметиламинопиридин
DMF: N,N'-Диметилформамид
DIPEA: Диизопропилэтиламин
Fmoc: 9-флуоренилметоксикарбонил
HBTU: O-Бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат
HOBt: N-Гидроксибензотриазол
HFIP: 1,1,1,3,3,3-Гексафтор-2-пропанол
Mtt: Метилтритил
МеОН: Метанол
2
MgCl: Хлорид магния
NMM: N-метилморфолин
NMP: N-Метил-2-пирролидон
TES: Триэтилсилан
TFE: Трифторэтанол
TFA: Трифторуксусная кислота
Pbf: 2,2,4,6,7-Пентаметилдигидробензофуран
3
4
Pd(PPh): Тетракис(трифенилфосфин)палладий (0)
КТ: Комнатная температура
t
Bu: трет-Бутил
TIS: Триизопропилсилан
Trt: Тритил
ТМР: 2,4,6-Триметилпиридин
2
ZnCl: Хлорид цинка
Изобретение представлено следующими примерами. Данные примеры предназначены только для иллюстрации и, следовательно, их не следует истолковывать как ограничение объема изобретения.
2
Пример 1: Синтез лираглутида с использованием MgCl
Смолу Ванга (0,3-0,6 ммоль/г, емкость загрузки) загружали в сосуд для синтеза пептида, дважды промывали 10 об. MDC, декантировали промывные воды, добавляли 10 об. MDC и выдерживали для набухания в течение 1 ч. Fmoc-Gly-OH (3,0-5,0 экв.) растворяли в MDC, добавляли минимальное количество DMF для получения прозрачного раствора и смесь переносили в реакционный сосуд. Добавляли DIPC (3,0-6,0 экв.) с последующим добавлением в реакционный сосуд DMAP (0,01-0,1 экв.) и перемешивали в течение 1,0-3,0 ч, при кт. Реакционную массу сушили и смолу, загруженную аминокислотами, дважды промывали MDC с последующей промывкой DMF. Кэппирование непрореагировавших функциональных сайтов проводили с использованием уксусного ангидрида и DIPEA.
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Arg(Pbf)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв.), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного Тестом Кайзера, избыточное количество реагентов высушивали и промывали пептидил-смолу 3 х 10 об. DMF.
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF.
2
2
2
Осуществляли связывание Fmoc-Gly-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв.) и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Arg(Pbf)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв.), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
2
2
v) Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Val-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Leu-OH (2,0-4,0 экв.), используя связующие агенты, такие как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистый оксим, HOBt, предпочтительно чистый оксим (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв.), и смесь DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Trp(Boc)-OH (2,0-4,0 экв.) используя связующие агенты, такие как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистый оксим, HOBt, предпочтительно чистый оксим (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смесь DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Ala-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загружаемой аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Ile-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Phe-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
t
2
2
2
xi) Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Glu(OBu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Lys(Mtt)-OH (2,0-4,0 экв.), используя связующие агенты, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистый оксим, HOBt, предпочтительно чистый оксим (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смесь DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Ala-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загружаемой аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Ala-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Gln(Trt)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Gly-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
t
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загружаемой аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Glu(OBu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т.При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Leu-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
t
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Tyr(Bu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
t
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Ser(Bu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
t
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Ser(Bu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т.При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Val-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
t
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Asp(OBu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
t
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Ser(Bu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
t
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загружаемой аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Thr(Bu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и при повышенной температуре примерно 30-45°С. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Phe-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и при повышенной температуре примерно 30-45°С. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
t
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Thr(Bu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя.
Реакцию проводили в атмосфере азота и при повышенной температуре примерно 30-45°С. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Gly-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и при повышенной температуре примерно 30-45°С. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
t
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Glu(OBu)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и при повышенной температуре примерно 30-45°С. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Ala-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загружаемой аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание Boc-His(Trt)-OH (2,0-4,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-4,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
26
t
2
2
2
Разветвление пептида проводили посредством удаления защитной группы Mtt боковой цепи Lys посредством обработки 0,5-2,0% TFA в MDC, 15-20 циклов х 10 об. Пептидил-смолу промывали MDC 2 х 10 об., 2 х 10 об., 2 x 10 об. DMF, и 5-10,0% DIPEA в DMF. Осуществляли связывание Fmoc-Glu-OBu (2,0-5,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-5,0 экв.) и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-5,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-10,0 экв.) и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т.При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
2
2
Снятие Fmoc-защиты загруженной аминокислоты проводили посредством промывки смолы с использованием 15-25% пиперидина в DMF два раза в течение 5 и 10 мин. с последующей промывкой смолы 3-5*8 об. 0,01-0,1 М HOBt в DMF. Осуществляли связывание гексадекановой кислоты (2,0-5,0 экв.) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DIC (2,0-5,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-4,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-8,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и MDC в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
2
Загруженную пептидил-смолу промывали DMF 2 х 10 об., MDC 2 х 10 об., МеОН 2 х 10 об. и МТВЕ (метил-трет-бутиловый эфир) 3 х 10 об. Общее отщепление пептида проводили с использованием коктейльной смеси TFA, фенола, TIS, HO, тиоанизола. Коктейль пептид-TFA концентрировали и добавляли к охлажденному МТВЕ 5-15 об. Осажденное соединение выделяли посредством центрифугирования и/или фильтрования и сушили в VTD и направляли на очистку (выход способа 18,25%, чистота 51,3%).
2
Пример 2: Синтез лираглутида с использованием CuCl
2
2
Способ является таким же, как описано в примере 1, и единственным изменением является то, что в качестве катализатора во время последовательного связывания всех отдельных аминокислот вместо MgCl используют CuCl (выход способа 17,84%, чистота 51,16%).
Пример 3: Синтез лираглутида с использованием коктейля HFIP-TES-TFE для снятия защитной группы Mtt
26
Способ является таким же, как описано в примере 1, и единственное изменение заключается в удалении Lys(Mtt), при котором использовали 5,0-40,0% HFIP, TES 2,0-10,0%, TFE 5,0-10% в MDC 10-30 об., и смесь перемешивали в течение 2-6 ч (фактический выход способа 21,23%, чистота 51,7%).
Пример 4: Синтез лираглутида
Способ является таким же, как описано в примере 1, и единственное изменение заключается в том, что во время связывания не используют неорганические соли (выход способа 6,79%, чистота 34,4%).
Пример 5: Синтез лираглутида без использования неорганической соли
Способ является таким же, как описано в примере 1, и единственное изменение заключается в том, что неорганические соли не используют во время связывания и промывки IPA (изопропиловый спирт), проводимой вместо 0,1 М HOBt в DMF (выход способа 8,62%, чистота 39,1%).
Пример 6: Синтез лираглутида с использованием связывания боковой цепи Pal-Glu-OtBu
26
2
2
2
Разветвление пептида проводили посредством удаления защитной группы Mtt боковой цепи Lys посредством обработки 0,5-2,0% TFA в MDC, 15-20 циклов х 10 об. Пептидил-смолу промывали MDC 2 х 10 об., 2 х 10 об., 2 х 10 об. DMF, и 5-10,0% DIPEA в DMF. Осуществляли связывание боковой цепи Pal-Glu-OtBu (2,0-5,0 экв., представлено на Фиг. II) с использованием связующих агентов, таких как HBTU, COMU, DEPBT и DIC, предпочтительно DEPBT (2,0-5,0 экв.), и чистого оксима, HOBt, предпочтительно чистого оксима (2,0-5,0 экв.), и DIPEA, NMM, ТМР, предпочтительно DIPEA (5,0-10,0 экв.), и MgCl, ZnCl, предпочтительно MgCl (0,01-0,1 экв), и смеси DMF/NMP в качестве растворителя. Реакцию проводили в атмосфере азота и к.т. При завершении связывания аминокислоты, подтвержденного тестом Кайзера, избыток реагентов высушивали и пептидил-смолу промывали 3 х 10 об. DMF.
Пример 7: Синтез лираглутида
Способ является таким же, как описано в примере 1, и удаление Mtt проводили, как описано в примере 3. Дополнительную промывку 0,01-0,1 М HOBt/DMF проводили после каждой стадии снятия Fmoc-защиты для обеспечения полного удаления пиперидина, а также избегания агрегации линейного пептида во время синтеза (фактический выход способа 27,0%, чистота выше 60,0%).
Пример 8: Очистка лираглутида
Неочищенный лираглутид растворяли в разбавленном растворе карбоната аммония, содержащем 5-40% ACN в концентрации 5-75 мг/мл и загружали на предварительно уравновешенную колонку 100-10-С8 (10 мм × 250 мм). За этим следовало 0,2 CV (объем колонки) разбавителя. Связанный лираглутид элюировали с использованием ступенчатого градиента подвижной фазы (А: 0,1% TFA в воде; Б: 0,1% TFA в ACN: IPA). Фракции, имеющие чистоту выше 92%, концентрировали под вакуумом с последующим осаждением в изоэлектрической точке. Осадок выделяли посредством центрифугирования. Выделенный осадок еще раз подвергали действию другой стадии ОФ-ВЭЖХ (обращенно-фазовая высоко-эффективная жидкостная хроматография) на колонке 100-10-С8 (10 мм × 250 мм). Связанный лираглутид элюировали с использованием градиентного элюирования подвижной фазы, а именно состоящей из следующих компонентов: А: разбавленный ацетат аммония; В: ACN. Фракции больше 98,5% объединяли, концентрировали под вакуумом, осаждали в изоэлектрической точке и, наконец, лиофилизировали.
Пример 9: Очистка лираглутида
Неочищенный лираглутид растворяли в разбавленном растворе аммония в концентрации 10-75 мг/мл и подвергали стадии ОФ-ВЭЖХ-1 на колонке 100-10-С8 (10 мм × 250 мм). За этим следовало 0,2 CV разбавителя. Связанный лираглутид элюировали с использованием ступенчатого градиента подвижной фазы (А: 0,1% TFA в воде; Б: 0,1% TFA в ACN: IPA). Фракции, имеющие чистоту выше 90%, концентрировали под вакуумом с последующим осаждением в изоэлектрической точке. Осадок выделяли посредством центрифугирования. Выделенный осадок еще раз подвергали стадии ОФ-ВЭЖХ-2 на колонке 100-10-С8 (10 мм × 250 мм). Связанный лираглутид элюировали с использованием градиентного элюирования подвижной фазы, а именно состоящей из: A: TFA в воде; В: TFA в метаноле. Данная стадия помогала уменьшить специфическую примесь. Фракции выше 93% объединяли, разбавляли ацетатом аммония и загружали на стадии ОФ-ВЭЖХ-3 на колонку 100-10-С8 (10 мм × 250 мм). Связанный лираглутид элюировали с использованием градиентного элюирования подвижной фазы, а именно состоящей из следующих компонентов: А: ацетат аммония; В: ACN. Фракции больше 98,5% объединяли, концентрировали под вакуумом, осаждали при изоэлектрической точке и, наконец, лиофилизировали.