СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОК ИЗ ЗУБНОЙ ПУЛЬПЫ

1. Способ получения клеток, полученных из пульпы зуба, обогащенных плюрипотентными стволовыми клетками, включающий
стадию (а) гидролиза пульпы зуба протеазой для приготовления суспензии пульпы зуба;
стадию (b) культивирования суспензии для пролиферации плюрипотентных стволовых клеток, содержащихся в суспензии;
стадию (c) замораживания пролиферированных плюрипотентных стволовых клеток в состоянии, в котором плюрипотентные стволовые клетки суспендированы в первой жидкости для криоконсервации;
стадию (d) размораживания замороженных плюрипотентных стволовых клеток;
стадию (е) культивирования размороженных плюрипотентных стволовых клеток в состоянии, в котором плюрипотентные стволовые клетки прикреплены к поверхностям частиц носителя для пролиферации плюрипотентных стволовых клеток на поверхности частиц носителя;
стадию (f) приведения частиц носителя в контакт с протеазой для отделения плюрипотентных стволовых клеток, прикрепленных к поверхностям частиц носителя, от частиц носителя; и
стадию (g) приготовления суспензии отделенных плюрипотентных стволовых клеток.
2. Способ получения по п. 1, отличающийся тем, что качественные тесты плюрипотентных стволовых клеток выполняются на стадии (c) или (d).
3. Способ получения по п. 2, отличающийся тем, что качественные тесты выполняются на клетках, фракционированных из клеток перед суспендированием в первой жидкости для криоконсервации, на субкультивированных клетках, которые были фракционированы из клеток перед суспендированием в первой жидкости для криоконсервации, на предварительно замороженных клетках, которые были суспендированы в первой жидкости для криоконсервации фракционированы, на клетках непосредственно после оттаивания, которые были фракционированы и заморожены, и/или на клетках, полученных фракционированием, замораживанием, оттаиванием и культивированием.
4. Способ получения по п. 3, отличающийся тем, что качественные тесты выполняются для одного или более из следующих качественных тестов a-j:
Качественный тест a, который проверяет, что доля числа клеток, показывающих по существу веретеновидную форму во всех клетках при наблюдении под оптическим микроскопом, больше или равна 99%, больше или равна 99,5%, больше или равна до 99,9%, или больше или равно 99,95%,
Качественный тест b, который проверяет, что жизнеспособность клеток больше или равна 50%, больше или равна 60%, больше или равна 70%, больше или равна 80%, больше или равна 90%, или больше или равна 95%,
Качественный тест c, который проверяет, что клетки являются положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34 и CD45 в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, или проверяет, что клетки положительны, по меньшей мере, по одному из CD73 и CD90 и отрицательны по CD34 в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности,
Качественный тест d, который проверяет, что клетки отрицательны по CD40, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, или проверяет, что клетки отрицательны, по меньшей мере, по одному из числа CD40, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности,
Качественный тест е, который проверяет, что клетки остаются отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и становятся положительными по антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, когда клетки стимулируются интерфероном-γ, или проверяет, что по меньшей мере, любая из клеток отрицательна по CD40, отрицательна по CD80, отрицательна по CD86 или положительна по антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, когда клетки стимулируются интерфероном-γ,
Качественный тест f, который проверяет, что клетки экспрессируют простагландин E2 и/или фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), и уровень экспрессии простагландина E2 увеличивается за счет стимуляции клеток TNF-α,
Качественный тест g, который проверяет, что уровень экспрессии аггрекана увеличивается при культивировании клеток в среде, содержащей вещество, которое индуцирует дифференцировку в хондроциты,
Качественный тест h, который подтверждает, что количество кальция, накопленного в клетках, увеличивается, когда клетки культивируются в среде, содержащей вещество, которое вызывает дифференцировку в остеоциты,
Качественный тест i, который подтверждает, что клетки обладают способностью делиться, по меньшей мере, 10, 14 или 15 раз в планшете для культивирования клеток, и
Качественный тест j, который проверяет, что среднее время удвоения клеток в планшете для культивирования клеток составляет 96 часов, 84 часа, 72 часа, 48 часов или 36 часов в течение периода качественного теста i.
5. Способ получения по любому из пп. 1-4, дополнительно включающий загрузку суспензии на фильтрующую мембрану для сбора клеток, прошедших стадию (g).
6. Способ получения по п. 5, отличающийся тем, что фильтрующая мембрана имеет диаметр пор от 20 мкм до 80 мкм.
7. Способ получения по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что пульпу зуба получают из постоянных или временных зубов человека.
8. Способ получения по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что протеаза, используемая на стадии (а), включает сериновую протеазу, металлопротеазу или их смесь.
9. Способ получения по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что протеаза, используемая на стадии (а), включает металлопротеиназу.
10. Способ получения по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что протеаза, используемая на стадии (а), включает матриксную металлопротеиназу, нейтральную металлопротеиназу или их смесь.
11. Способ получения по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что протеаза, используемая на стадии (а), включает коллагеназу и нейтральную металлопротеиназу.
12. Способ получения по п. 11, отличающийся тем, что коллагеназа включает коллагеназу I, коллагеназу II или их смесь.
13. Способ получения по п. 10 или 11, отличающийся тем, что нейтральная металлопротеиназа включает термолизин, диспазу или их смесь.
14. Способ получения по любому из пп. 1-13, отличающийся тем, что первая жидкость для криоконсервации, используемая на стадии (с), включает бикарбонатный раствор Рингера, человеческий сывороточный альбумин и DMSO.
15. Способ получения по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что частицы носителя, используемые на стадии (е), имеют по существу сферическую форму, имеющую диаметр от 80 до 300 мкм в набухшем состоянии.
16. Способ получения по п. 15, отличающийся тем, что частицы носителя представляют собой пористые частицы носителя, имеющие поры диаметром от 3 до 40 мкм, которые открыты на поверхности частиц носителя в набухшем состоянии.
17. Способ получения по любому из пп. 1-16, отличающийся тем, что частицы носителя содержат желатин.
18. Способ получения по любому из пп. 1-17, отличающийся тем, что протеаза, используемая на стадии (f), включает сериновую протеазу, металлопротеазу или их смесь.
19. Способ получения по любому из пп. 1-17, отличающийся тем, что протеаза, используемая на стадии (f), включает трипсин.
20. Способ получения по любому из пп. 1-19, дополнительно включающий стадию (h) замораживания суспензии, полученной на стадии (g), в состоянии, в котором суспензия суспендирована во второй жидкости для криоконсервации.
21. Способ получения по п. 20, отличающийся тем, что вторая жидкость для криоконсервации, используемая на стадии (h), включает бикарбонатный раствор Рингера, человеческий сывороточный альбумин и DMSO.
22. Способ получения по любому из пп. 1-19, отличающийся тем, что качественные тесты плюрипотентных стволовых клеток проводят на стадии (g).
23. Способ получения по п. 20 или 21, отличающийся тем, что качественные тесты плюрипотентных стволовых клеток проводят на стадии (g) или (h).
24. Способ получения по п. 22 или 23, отличающийся тем, что качественные тесты проводят на клетках, фракционированных из клеток перед суспендированием во второй жидкости для криоконсервации, на субкультивированных клетках, которые были фракционированы из клеток перед суспендированием во второй жидкости для криоконсервации, на предварительно замороженных клетках, которые были суспендированы во второй жидкости для криоконсервации и фракционированы, на клетках сразу после оттаивания, которые были фракционированы и заморожены, и/или на клетках, полученных фракционированием, замораживанием, оттаиванием и культивированием.
25. Способ получения по п. 22 или 24, отличающийся тем, что качественные тесты выполняются для одного или более из следующих качественных тестов a-j:
Качественный тест a’, который проверяет, что доля числа клеток, показывающих по существу веретеновидную форму во всех клетках при наблюдении под оптическим микроскопом, больше или равна 99%, больше или равна 99,5%, больше или равна равно 99,9% или больше или равна 99,95%,
Качественный тест b’, который проверяет, что жизнеспособность клетки больше или равна 50%, больше или равна 60%, больше или равна 70%, больше или равна 80%, больше или равна 90% , или больше или равна 95%,
Качественный тест c’, который проверяет, что клетки являются положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34 и CD45 в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, или проверяет, что клетки положительны, по меньшей мере, по одному из CD73 и CD90 и отрицательны по CD34 в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности,
Качественный тест d’, который проверяет, что клетки отрицательны по CD40, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, или проверяет, что клетки отрицательны, по меньшей мере, по одному из числа CD40, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности,
Качественный тест е’, который проверяет, что клетки остаются отрицательными по CD40, CD80 и CD86 и становятся положительными по антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, когда клетки стимулируются интерфероном-γ, или проверяет, что по меньшей мере, любая из клеток отрицательна по CD40, отрицательна по CD80, отрицательна по CD86 или положительна по антигену MHC-класса II в профилях экспрессии маркеров антигенов клеточной поверхности, когда клетки стимулируются интерфероном-γ,
Качественный тест f, который проверяет, что клетки экспрессируют простагландин E2 и/или фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), и уровень экспрессии простагландина E2 увеличивается за счет стимуляции клеток TNF-α,
Качественный тест g’, который проверяет, что уровень экспрессии аггрекана увеличивается при культивировании клеток в среде, содержащей вещество, которое индуцирует дифференцировку в хондроциты,
Качественный тест h’, который проверяет, что количество кальция, накопленного в клетках, увеличивается при культивировании клеток в среде, содержащей вещество, которое индуцирует дифференцировку в остеоциты,
Качественный тест i’, который проверяет способность клеток делиться, по меньшей мере, 3, 4 или 5 раз в планшете для культивирования клеток, и
Качественный тест j’, который проверяет, что среднее время удвоения клеток в планшете для культивирования клеток составляет 96 часов, 84 часа, 72 часа, 48 часов или 36 часов в течение периода качественного теста i’.
26. Способ получения по любому из пп. 22-25, отличающийся тем, что показатель положительности CD107b в плюрипотентных стволовых клетках, используемых в качественных тестах на стадии (g) или (h), выше, чем соответствующий показатель положительности для плюрипотентных стволовых клеток, используемых в качественных тестах на стадии (c) или (d).
27. Способ получения по любому из пп. 22-26, отличающийся тем, что показатель положительности, по меньшей мере, одного из CD39, CD49a, CD61, CD107a, CD107b и CD143 в плюрипотентных стволовых клетках, используемых в качественных тестах на стадии (g) или (h), выше, чем соответствующий показатель положительности в плюрипотентных стволовых клетках, используемых в качественных тестах на стадии (c) или (d), и где показатель положительности CD146 в плюрипотентных стволовых клетках, используемых в качественных тестах на стадии (g) или (h), ниже, чем соответствующий показатель положительности в плюрипотентных стволовых клетках, используемых в качественных тестах на стадии (c) или (d).
28. Способ получения по любому из пп. 22-27, отличающийся тем, что уровень экспрессии, по меньшей мере, одного из IL-6, HGF, IGFBP-4, IL-11, TIMP-3 и TIMP-2 в используемых плюрипотентных стволовых клетках в качественных тестах на стадии (g) или (h), выше, чем соответствующий уровень экспрессии в плюрипотентных стволовых клетках, используемых в качественных тестах на стадии (c) или (d).
29. Клетки, полученные способом получения по любому из пп. 1-28.
30. Клетки по п. 29, которые являются положительными по CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34 и CD45.
31. Клетки по п. 30, которые отрицательны по CD40, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II.
32. Клетки по п. 31, которые становятся положительными по антигену MHC-класса II, когда клетки стимулируются интерфероном-γ.
33. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, имеющие, по меньшей мере, одну характеристику, показанную в пунктах (1)-(4) ниже.
(1) клетки положительны по CD73, CD90, CD105 и CD166
и отрицательны по CD34, CD40, CD45, CD80, CD86 и антигену MHC-класса II
становятся положительными по антигену MHC-класса II, когда клетки стимулируются интерфероном-γ, и экспрессируют простагландин E2 и/или фактор роста эндотелия сосудов, и уровень экспрессии простагландина E2 увеличивается, когда клетки стимулируются TNF-α,
(2) клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному из числа CD73, CD90, CD105 и CD166 и отрицательными по CD34 и CD45,
(3) клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному из числа CD47, CD81 и CD147 и отрицательными, по меньшей мере, по одному из числа CD19, CD34 и CD206, и
(4) клетки являются положительными, по меньшей мере, по одному из числа CD47, CD81 и CD147 и отрицательными, по меньшей мере, по одному из числа CD19, CD31, CD33, CD34, CD38, CD45, CD206, CD235a и SSEA-1.
34. Клетки по п. 33, которые обладают способностью дифференцироваться в остеоциты и хондроциты.
35. Клетки по п. 33 или 34, отличающиеся тем, что средний диаметр клеток в состоянии, в котором клетки приготовлены так, что они плавают в среде, составляет от 16 до 20 мкм.
36. Клетки по любому из пп. 33-35, которые обладают способностью делиться, по меньшей мере, 3 раза в среде in vitro, где среднее время удвоения находится в диапазоне 96 часов.
37. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, по любому из пп. 33-35, которые имеют следующие характеристики: клетки делятся, по меньшей мере, в 10, 15, 16 или 17 раз в среде in vitro, и среднее время деления клеток находится в диапазоне 48 часов, и клетки обладают способностью делиться, по меньшей мере, 10, 14 или 15 раз в среде in vitro, и среднее время деления клеток находится в диапазоне 96 часов, 84 часов, 72 часов, 48 часов или 36 часов.
38. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, по любому из пп. 33-35, которые имеют следующие характеристики: клетки делятся, по меньшей мере, в 16, 21, 22 или 23 раза в среде in vitro, и клетки обладают способностью делиться, по меньшей мере, 3, 4 или 5 раз в среде in vitro, и среднее время деления клеток находится в диапазоне 96 часов, 84 часов, 72 часов, 48 часов или 36 часов.
39. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, по любому из пп. 33-38, которые являются отрицательными, по меньшей мере, по одному из числа CD19, CD26, CD106, CD117 и CD271.
40. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, по любому из пп. 33-39, которые являются положительными, по меньшей мере, по одному из числа CD140b и HLA-A, -B и -C.
41. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, по любому из пп. 33-40, которые являются отрицательными, по меньшей мере, по одному из числа CD56 и CD146.
42. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, по любому из пп. 33-41, которые являются положительными, по меньшей мере, по одному из числа CD49e и CD95.
43. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, по любому из пп. 33-42, которые являются положительными, по меньшей мере, по одному из числа CD10, CD46, CD47, CD55, CD58 и CD59.
44. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, по любому из пп. 33-43, которые экспрессируют, по меньшей мере, один из числа ММР-2, IGFBP-4, цистатина С, IL-6, IL-11, MCP-1, IL-8, HGF, VEGF, TIMP-1, TIMP-2, и TIMP-3.
45. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, по любому из пп. 33-44, которые экспрессируют, по меньшей мере, один из числа GROα, VCAM-I и IP-10.
46. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, по любому из пп. 33-45, которые экспрессируют IL-6 и в которых уровень его экспрессии повышен за счет стимуляции TNF-α и стимуляции интерфероном-γ.
47. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, по любому из пп. 33-46, которые экспрессируют IL-11 и в которых уровень его экспрессии повышен за счет стимуляции TNF-α и стимуляции интерфероном-γ.
48. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, по любому из пп. 33-47, которые экспрессируют IP-10 и в которых уровень его экспрессии повышен за счет стимуляции TNF-α и стимуляции интерфероном-γ.
49. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, по любому из пп. 33-48, которые экспрессируют МСР-1 и в которых уровень его экспрессии повышен за счет стимуляции TNF-α и стимуляции интерфероном-γ.
50. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, по любому из пп. 33-49, отличающиеся тем, что экспрессия GM-CSF индуцируется стимуляцией TNF-α.
51. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, по любому из пп. 33-50, которые экспрессируют HGF и в которых уровень его экспрессии снижен за счет стимуляции TNF-α и повышен за счет стимуляции интерфероном-γ.
52. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, по любому из пп. 33-51, которые экспрессируют IL-8 и в которых уровень его экспрессии повышен за счет стимуляции TNF-α.
53. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, по любому из пп. 33-52, в которых пульпа зуба получена из постоянных или временных зубов человека.
54. Композиция, содержащая плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, по любому из пп. 33-53, суспендированные в бикарбонатном растворе Рингера, содержащем человеческий сывороточный альбумин и диметилсульфоксид.
55. Композиция, содержащая плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, по любому из пп. 33-53, суспендированные в растворе, содержащем ионы натрия, ионы калия, ионы кальция, ионы магния, ионы гидрокарбоната, ионы цитрата, человеческий сывороточный альбумин и диметилсульфоксид.
56. Композиция по п. 55, отличающаяся тем, что ионы натрия, ионы калия, ионы кальция, ионы магния, ионы гидрокарбоната, ионы цитрата, человеческий сывороточный альбумин и диметилсульфоксид содержатся соответственно в концентрациях от 91 до 113 мМ, от 2,52 до 3,08 мМ, от 0,95 до 1,16 мМ, от 0,315 до 0,385 мМ, от 15,6 до 19,2 мМ, от 1,04 до 1,28 мМ, от 46 до 56 г/л и от 9% до 11% (об./об.).
57. Композиция по любому из пп. 54-56, дополнительно содержащая ацетилтриптофан или его соль; и каприловую кислоту или ее соль.
6
7
58. Композиция по любому из пп. 54-57, отличающаяся тем, что плюрипотентные стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, содержатся при плотности от 5×10 до 8×10 клеток/мл.
59. Композиция по любому из пп. 54-58, инкапсулированная в контейнере в количестве от 1 до 20 мл.
60. Композиция по п. 59, отличающаяся тем, что контейнер изготовлен из стекла или пластика.
61. Композиция по любому из пп. 54-60, которая находится в замороженном состоянии.
62. Фармацевтическая композиция, содержащая композицию по любому из пп. 54-61.
63. Фармацевтическая композиция по п. 62, которая представляет собой терапевтический агент для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания, ревматоидного артрита, болезни Крона, хронического воспалительного заболевания кишечника, инфаркта миокарда, инфаркта головного мозга (включая хронический церебральный инфаркт и острый инфаркт головного мозга), хронического воспалительного демиелинизирующего полиневрита, рассеянного склероза, системной красной волчанки, цирроза печени (включая декомпенсированный цирроз печени), сепсиса, остеоартрита, псориаза и отторжения трансплантата органа.
64. Фармацевтическая композиция по п. 62 для применения при лечении заболевания, выбранного из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания, ревматоидного артрита, болезни Крона, хронического воспалительного заболевания кишечника, инфаркта миокарда, инфаркта головного мозга (включая хронический инфаркт мозга и острый инфаркт мозга), хронического воспалительного демиелинизирующего полиневрита, рассеянного склероза, системной красной волчанки, цирроза печени (включая декомпенсированный цирроз печени), сепсиса, остеоартрита, псориаза и отторжения трансплантата органа.