АППАРАТ ДЛЯ СОВМЕЩЕННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Полезная модель относится к биотехнологии, а точнее к оборудованию для культивирования микроорганизмов с использованием твердых субстратов, в том числе таких, как мицелиальные грибы, которые чувствительны к механическим воздействиям, возникающим при интенсификации массообмена, и может быть использовано в микробиологической, медицинской, пищевой промышленности и исследовательской практике.
Известен «Аппарат для суспензионного культивирования клеток тканей и микроорганизмов», патент RU 2270245 С1, дата публикации 20.06.2006. Аппарат содержит ферментационную емкость с крышкой и патрубками соответственно для подачи аэрирующего газа и отвода газообразной среды и устройство для аэрации и перемешивания культуральной среды, включающее контур аэрирующего газа и экран для образования газовой подушки, а также средство создания колебаний газовой подушки для перемешивания культуральной среды. Экран размещен в полости аппарата и при реализации ферментационных процессов погружен в культуральную среду.
Известно, что аэрация и перемешивание культуральной среды в ферментационных аппаратах, являются одним из важнейших факторов, влияющих на производительность и качество синтезируемых продуктов. Примененное в аппарате устройство для аэрации и перемешивания культуральной среды перемешивание осуществляется за счет возвратно-поступательного перемещения жидкости из полости экрана в полость ферментационной емкости и обратно, а газообмен осуществляется через суммарную площадь поверхностного раздела среды газ - жидкость, который образуется на границе газовой подушки переменного объема, возростающего при подаче газов под экран с последующим уменьшением при отводе газов под давлением жидкой фазы культуральной среды.
Требуемые значения интенсивности газообмена между жидкой и газовой фазами культуральной среды достигаются наращиванием количества экранов, погруженных в культуральную среду.
К недостаткам конструкции аппарата можно отнести то, что многослойное размещение экранов в полости ферментационной емкости приводит к уменьшению рабочего объема аппарата и, как следствие, к снижению его производительности. Экраны, закрепленные в полости ферментационной емкости, требуют автономного управления газовыми потоками, что существенно усложняет конструкцию и обслуживание аппарата.
Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является аппарат для культивирования клеток и микроорганизмов (RU №69518, U1, опублик. 27.12.2007). Аппарат включает две ферментационные емкости с крышкой и патрубками соответственно для подачи аэрирующего газа и отвода газовой среды, которые снабжены матриксами, свободно размещенными в полости каждой емкости, а емкости сообщены между собой трубопроводом нижнего слива и соединены трубопроводами с управляемыми клапанами с патрубком для подачи аэрирующего газа, а также содержит насос для ввода в первую ферментационную емкость питательных растворов и инокулюма посевной культуры, буферную емкость, соединенную трубопроводом с патрубком отвода газовой среды и трубопроводами с встроенными управляемыми клапанами с ферментационными емкостями и с шлюзовой камерой, при этом шлюзовая камера соединена трубопроводами с встроенными управляемыми клапанами со второй ферментационной емкостью и с патрубками слива и сбора получаемых продуктов. Внутри ферментационных емкостей могут быть размещены матриксы, например, в виде свернутой в спираль металлической сетки в межвитковое пространство которых может быть помещен твердый субстрат.
Жидкофазный и твердофазный режимы культивирования реализуются в аппарате с использованием процесса перетока жидкой фазы культуральной среды из первой ферментационной емкости во вторую ферментационную емкость и обратно.
Недостатком данного аппарата является невозможность обеспечить непрерывность процесса ферментации, так как чтобы извлечь отработанный твердый субстрат и нерастворимые продукты ферментации, например, микробную биомассу, нужно останавливать процесс, открыть оба ферментационных модуля, извлечь матриксы и выгрузить продукт. После процесса выгрузки и очистки ферментационные модули собираются и проводится стерилизация всего оборудования и твердого субстрата. Это существенно снижает производительность процесса и затрудняет эксплуатацию аппарата при больших объемах переработки твердых субстратов.
Технический результат заключается в обеспечении непрерывного (отъемно-загрузочного) процесса культивирования при использовании твердых субстратов.
Технический результат достигается тем, что аппарат для совмещенного культивирования микроорганизмов, включающий две горизонтально расположенные ферментационные емкости с боковыми крышками, матриксами для твердого субстрата, размещенными во внутренних полостях емкостей, снабженные патрубками соответственно для подачи аэрирующего газа и отвода газовой среды и патрубками для подачи и отвода жидкой фазы из ферментационных емкостей, трубопроводы с управляемыми клапанами, соответственно, в каналах подачи в верхнюю полость ферментационных емкостей аэрирующего газа и отвода газовой среды из ферментационных емкостей, буферную емкость, соединенную трубопроводами с управляемыми клапанами соответственно с каналами слива и сбора жидкого продукта и устройство управления и снабжен, по крайней мере, еще одной ферментационной емкостью, оснащенной аналогично первым двум ферментационным емкостям и устройством коммутации гидравлических потоков, входы которого соединены трубопроводами с управляемыми клапанами с буферной емкостью и с внешними устройствами подачи жидких питательных сред и инокулята, а выходы соединены трубопроводами с управляемыми клапанами с патрубками ферментационных емкостей для подачи и отвода жидкой фазы, а каналы подачи аэрирующего газа в ферментационные емкости снабжены стерилизационными фильтрами, а каналы отвода газов из ферментационных емкостей снабжены стерилизационными фильтрами и каплеотделителями, выходы возврата жидкости последних через трубопроводы с управляемыми клапанами сообщены с полостью соответствующей ферментационной емкости.
Полезная модель поясняется, но не ограничивается чертежом.
На фиг.1 представлена схема аппарата для совмещенного культивирования микроорганизмов.
Аппарат для совмещенного культивирования микроорганизмов включает три горизонтально расположенные ферментационные емкости 1, 2, 3 с боковыми крышками 4, 5, 6, служащими для загрузки-выгрузки матриксов и крышками 7, 8, 9, на которых расположены штуцеры (на фиг.1 не обозначены) ввода аэрирующего газа в верхнюю полость ферментационных емкостей, к которым присоединены управляемые клапаны 10, 11, 12, для подачи газа в ферментационные емкости, поступающего через входные фильтры 13, 14, 15, обеспечивающие стерильность газового потока. Выход метаболитных газов из верхней полости ферментационных емкостей 1, 2, 3 осуществляется через управляемые клапаны 16, 17, 18, каплеотделители 19, 20, 21, фильтры 22, 23, 24, соответственно, обеспечивающие стерильность отводящихся газов, в трубопровод «Отходящие газы» через нормально открытые клапаны 25, 26, 27.
Внутри ферментационных емкостей 1, 2, 3 размещены матриксы 28, 29, 30. Матриксы представляют собой свернутое в спираль сетчатое полотно. Сетчатое полотно может быть выполнено из нержавеющей стали или полимера. Внутрь матрикса размещают твердый растительный субстрат, содержащий нерастворимые компоненты лигноцеллюлозы. Субстрат перед загрузкой в матриксы 28, 29, 30 подготавливают к использованию исходя из специфических особенностей самого субстрата, например, измельчают, очищают от ингибирующих компонентов, повышают его реакционную способность различными методами, а также особенностей реализуемых ферментационных процессов.
Ферментационные емкости 1, 2, 3 для обеспечения требуемых температурных режимов снабжены термостатирующими рубашками 31, 32, 33.
Подача стерильных питательных сред и инокулюма в ферментационные емкости 1, 2, 3 осуществляется через клапаны 34, 35, 36, устройство коммутации гидравлических потоков 37 и открывании открытые, соответственно, клапаны 38 или 39.
Дозированный отбор жидких продуктов культивирования осуществляется через устройство коммутации гидравлических потоков 37 в буферную емкость 40 при открытом клапане 41. При открытом клапане 42, под действием давления аэрирующего воздуха, доза жидких продуктов культивирования из буферной емкости 40 через открытый клапан 43 подается во внешние системы.
Стерилизация буферной емкости 40 проточным паром осуществляется при открывании клапанов 44 и 45, слив конденсата осуществляется в трубопровод «Слив».
Слив жидкости, накопившейся в каплеотделителях 19, 20, 21 осуществляется по заданной программе в ферментационные емкости 1, 2, 3 через управляемые клапаны 46, 47 и 48.
Слив жидкости, скопившейся в фильтрах 13, 14, 15 осуществляется через открытые управляемые клапаны 49, 50, 51.
Через управляемые клапаны 52, 53, 54, 55, 56, 57 осуществляется подвод проточного пара к фильтрам 13, 14, 15 и 22, 23, 24.
Проточный пар осуществляет стерилизацию аппарата для совмещенного культивирования микроорганизмов, фильтры отделяют асептическую зону проведения процессов культивирования микроорганизмов в аппарате от его нестерильной зоны. Стерилизации может быть подвергнут полностью весь аппарат или стерилизоваться может каждая ферментационная емкость отдельно, причем асептические условия в подвергнутой стерилизации емкости сохраняются независимо от режимов работы других емкостей. Для автономной стерилизации каждой из ферментационных емкостей 1-3 ее штуцеры нижнего слива соединены через нормально закрытые клапаны соответственно 58, 59, 60 с каналом «Слив».
Подача аэрирующего воздуха на вход фильтров 13, 14, 15 по каналу «Аэрация» осуществляется через управляемые клапаны 61, 62, 63.
Управление работой аппарата для совмещенного культивирования микроорганизмов осуществляется устройством управления 64.
Функционирование аппарата для совмещенного (жидкофазного и твердофазного) культивирования микроорганизмов происходит следующим образом.
Вначале осуществляется загрузка матриксов 28, 29 и 30 с твердым субстратом в ферментационные емкости 1, 2, 3, закрываются крышки 4, 5, 6 и выполняются известные процедуры герметизации, а затем проводится стерилизация субстрата и элементов стерильной зоны аппарата. Последовательность проведения стерилизации всего аппарата может быть следующей.
Устройством управления 64, в соответствии с программой, закрываются клапаны 10, 11, 12, 16, 17, 18, 61, 62, 63 и открываются клапаны 25, 26, 27, 42, 49, 50, 51, а также клапаны подачи пара 44, 52, 53, 54 и 55, 56, 57 и выполняет стерилизацию фильтров аэрирующего воздуха 13, 14, 15 и отходящих газов 22, 23, 24. По окончании процедуры стерилизации фильтров 13-15, 22-24 устройство управления 64 закрывает клапаны 25-27, 42, 44, 48-52 и открывает клапаны 10-12, 16-18, 46-48 и 34-36, а также клапаны 41 и 45. Поток пара направляется на стерилизацию ферментационных емкостей 1-3, матриксов 28-30, устройства коммутации потоков 37 и буферной емкости 40 и через трубопровод в канал «Слив», куда сливается конденсат. По окончании стерилизации оборудования стерильной зоны и матриксов устройство управления 64 закрывает клапаны подачи пара 52-54 и 55-57, клапаны 10-12, клапан 41, открывает клапаны 25-27 и аппарат переводится в режим охлаждения. Кроме того, к каналам «Стерильная среда» и «Инокулят» подключаются внешние источники стерильных питательных сред и инокулята соответственно, а также открывается клапан 44 для окончательной стерилизации буферной емкости 40 и подготовки ее к приему жидких продуктов ферментации. По окончании стерилизации буферной емкости клапаны 44 и 45 закрывается, емкость охлаждается и в ней создается вакуум. По окончании охлаждения ферментационных емкостей 1-3 с матриксами 28-30 подачей теплоносителя требуемой температуры в термостатирующие рубашки 31, 32, 33 устанавливается заданный температурный режим, открываются клапаны 49-51 на время слива конденсата из фильтров 13-15 и открываются клапаны 61-63 для подачи аэрирующего воздуха из канала «Аэрация», после этого аппарат подготовлен для проведения процесса культивирования микроорганизмов.
Процесс культивирования начинается с заполнения ферментационной емкости 1 питательной средой и подачи инокулята, которые поступают в емкость 1 через устройство коммутации гидравлических потоков 37 при открывании клапанов 38, 34 и клапанов 39 и 34. Вносимые жидкая фаза питательной среды и инокулят должены заполнять объем ферментационной емкости, 1 свободный от матрикса с загруженной в него твердой фазой. Твердая фаза культуральной среды оказывается погруженной в жидкую фазу, т.е. режим культивирования в ферментационной емкости 1 начинается как жидкофазный процесс. Далее устройство управления 64 включает режим аэрации, перемешивания и отвода метаболитных газов, для этого закрывается клапан 16 и открывается клапан 10 подачи аэрирующего воздуха в емкость 1 через стерилизующий фильтр 13 и клапан 61. Одновременно устройство управления 64 открывает клапаны 34, 35, при этом клапан 17 остается открытым. Культуральная жидкость из ферментационной емкости 1 под давлением аэрирующего воздуха перетекает в ферментационную емкость 2 через устройство коммутации гидравлических потоков 37. Находящийся в ферментационной емкости 2 воздух, вытесняется через клапан 17, каплеотделитель 20, фильтр 23 и клапан 26 в канал «Отходящие газы». Процесс культивирования в ферментационной емкости 1 переходит в режим твердофазного культивирования, а в ферментационной емкости 2 проходит режим жидкофазного культивирования. Затем устройство управления 64 закрывает клапаны 10, 17, и открывает клапаны 11 и 16. При этом осуществляется обратный переток жидкой фазы культуральной среды из емкости 2 в ферментационную емкость 1. Процесс культивирования в ферментационной емкости 1 переходит в режим жидкофазного культивирования, а в ферментационной емкости 2 в режим твердофазного культивирования. Процесс перетока жидкой фазы культуральной среды между ферментационными емкостями 1 и 2 может продолжаться заданное время, ферментационная емкость 3 при этом находится в подготовленном к ферментационному процессу состоянии. Эффективность такого процесса культивирования определяется тем, что на элементах конструкции ферментационной емкости 1 (2), на их матриксах 28 или 29 и на частицах твердого субстрата при перетоке жидкой фазы культуральной среды в ферментационную емкость 2 (1) образуются стекающие пленки, большая площадь которых обеспечивает интенсивный перенос кислорода из газовой фазы в жидкую пленку и отвод из нее метаболитных газов и этим определяется высокая скорость роста микроорганизмов и интенсивность ферментационных процессов в твердой фазе. При жидкофазном процессе в ферментационной емкости 2 (1), протекающем одновременно с твердофазным процессом в емкости 1 (2), обеспечивается подвод питательных сред по всему объему твердой фазы, отводятся жидкие продукты ферментации от биомассы твердого субстрата и избыточное тепло. В процессе культивирования осуществляется дозированный отбор жидкой фазы культуральной среды, которая представляет собой жидкий продукт биотехнологического процесса, проводимого в аппарате, и подача питательных сред.
Отбор культуральной среды, например, из ферментационной емкости 1 устройством управления 64 осуществляется в три такта, в первом такте при открытом клапане 34 открывается клапан 41 и предварительно вакууммированная буферная емкость 40 наполняется культуральной средой и клапан 41 закрывается. Во втором такте открывается клапаны 42 и 43, в результате культуральная среда из емкости 40 давлением аэрирующего воздуха подается в нестерильную зону в канал «Продукт жидкий» и клапаны 42 и 43 закрываются. В третьем такте открываются клапаны 44 и 45 и буферная емкость стерилизуется проточным паром, после чего клапаны 44 и 45 закрываются и при охлаждении буферной емкости в ней снова образуется вакуум и она подготовлена для приема очередной дозы.
Вслед за описанной процедурой отбора жидкой фазы культуральной среды из ферментационной емкости 1 для восполнения ее объема в емкость 1 через клапан 34 и устройство коммутации гидравлических потоков 37 подается питательная среда по каналу «Стерильная среда» при открывании клапана 38.
До достижения заданной стадии процесса в ферментационной емкости 1 или 2 (достижение заданного количества циклов перетока, получение требуемого количества биомассы или продуктов ферментации, истощение твердого субстрата) описанные циклы с перетоком жидкой фазы культуральной среды продолжаются
При наступлении этого события, например, в ферментационной емкости 1, аппарат позволяет вывести ферментационную емкость 1 из процесса культивирования, при этом после последнего цикла опорожнения емкости 1 и поступления жидкой фазы в ферментационную емкость 2 клапаны 10, 16, 25, 34, 46 и 61 закрываются и ферментационная емкость 1 оказывается отключенной от стерильной зоны аппарата, в котором продолжается процесс совмещенного (жидкофазного и твердофазного) культивирования, но переток жидкой фазы культуральной среды происходит между ферментационными емкостями 2 и 3, причем алгоритм управления перетоком аналогичен описанному.
Для выгрузки из ферментационной емкости 1 твердого нерастворимого продукта (компоненты твердого субстрата, микробная биомасса), получаемого в результате биотехнологического процесса, проводимого в аппарате, открывается крышка 4 и матрикс 28 с остатками твердой фазы культуральной среды, нерастворимые продукты ферментации, биомасса выгружаются и направляются на дальнейшую переработку. В освободившуюся ферментационную емкость 1 загружается матрикс с новой порцией твердого субстрата, крышка 4 закрывается и емкость 1 герметизируется. Устройство управления 64 включает процедуру стерилизации одной ферментационной емкости 1 с матриксом и новой порцией субстрата. Для этого открываются клапаны 10, 16, 46, 58 и включается подача пара через открытые клапаны 52 и 55. Пар и образующийся конденсат через ферментационную емкость 1 и клапан 58 отводятся через трубопровод в канал «Слив». По окончании стерилизации ферментационной емкости 1 клапаны 52, 55, 46, 58 закрываются, и ферментационная емкость 1 подготовлена для включения ее в стерильную зону аппарата для продолжения процесса культивирования микроорганизмов с новой порцией твердого субстрата.
По завершении процесса в ферментационной емкости 2 она аналогичным образом выводится из стерильной зоны аппарата. Из ферментационной емкости 3 отбирается жидкая фаза культуральной по описанной выше процедуре дозированного отбора жидкой фазы через буферную емкость, а в емкость 1 в соответствии с описными выше процедурами подается питательная среда и инокулят по каналам «Стерильная среда» и «Инокулят». В ферментационной емкости 1 начинается жидкофазная стадия совмещенного процесса культивирования в режиме перетока с ферментационной емкостью 3, который осуществляется в соответствии с описанным выше алгоритмом. Из ферментационной емкости 2 выгружается матрикс, нерастворимые продукты ферментации и ферментационная емкость 2, по описанным выше процедурам для ферментационной емкости 1, готовится для продолжения процесса совмещенного культивирования микроорганизмов с новой порцией твердого субстрата.
Таким образом, предложенный аппарата для совмещенного (жидкофазного и твердофазного) культивирования микроорганизмов позволяет реализовать до настоящего времени неизвестный непрерывный, отъемно-загрузочный процесс культивирования микроорганизмов с использованием твердых субстратов. Аппарат позволяет существенно повысить производительность совмещенных процессов культивирования микроорганизмов и проводить их в стерильных условиях.