Аллельные варианты CYP2C9*2 и CYP2C9*3 гена цитохрома CYP2C9 в популяции Санкт-Петербурга и их клиническое значение при антикоагулянтной терапии варфарином

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ТЕРАПИИ

АЛЛЕЛЬНЫЕ ВАРИАНТЫ CYP2C9*2 И CYP2C9*3 ГЕНА ЦИТОХРОМА CYP2C9 В ПОПУЛЯЦИИ CАНКТ-ПЕТЕРБУРГА И ИХ КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПРИ АНТИКОАГУЛЯНТНОЙ ТЕРАПИИ ВАРФАРИНОМ

Сироткина О.В.1, Улитина А.С.2, Тараскина А.Е.1, Кадинская М.И.2, Вавилова Т.В.2,

Пчелина С.Н.12, Шварц Е.И.1

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН1, Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П. Павлова2

Резюме

Одним из основных препаратов выбора для проведения терапии непрямыми антикоагулянтами, вышедшим в настоящее время на отечественный фармацевтический рынок, является варфарин. Фармакокинетические свойства данного препарата зависят от структурных полиморфизмов гена цитохрома CYP2C9, метаболизирующего варфарин. В настоящем исследовании мы проанализировали: 1) частоты встречаемости двух аллельных вариантов данного гена; 2) зависимость индивидуальной реакции пациентов на прием варфарина от генотипа СУР2С9. В результате было показано следующее: 1) частоты аллельных вариантов гена CYP2C9 в популяции г. Санкт-Петербурга составляют 82,66% (СУР2С9*1), 11,11% (СУР2С9*2) и 6,32% (СУР2С9*3); 2) носители СУР2С9*2 и CYP2C9*3 аллелей быстрее достигают терапевтического уровня гипокоагуляции и требуют достоверно меньшей недельной дозы препарата. На основании полученных результатов мы рекомендуем ввести в клиническую практику определение аллелей CYP2C9*2 и CYP2C9*3 у больных, которым назначается варфарин.

Ключевые слова: антикоагулянтная терапия, варфарин, генетические аспекты.

Тромбозы и тромбоэмболии различной этиологии являются одной из основных причин смертности и инвалидизации населения, что заставляет врачей прибегать к их фармакологической профилактике, в том числе — с помощью антикоагулянтов непрямого действия, в частности, варфарина. Отмечается различная чувствительность пациентов к варфарину и серьезные геморрагические осложнения при его передозировке. Индивидуальная чувствительность к варфарину обусловлена, в первую очередь, полиморфизмом цитохрома Р450 СУР2С9, являющегося ключевым ферментом в окислении, и клиренсе варфари-на [2, 8, 9]. Варфарин представляет собой рацемическую смесь двух активных (Б)- и (Я)-энантиомеров. Фармакологическая активность Б-варфарина в пять раз выше, чем у Я-варфарина. Было показано, что Б-варфарин преимущественно конвертируется в печени с помощью цитохрома СУР2С9 в 7-гидрокси-Б-вар-фарин, который и элиминируется из организма [7]. Таким образом, каталитическая активность СУР2С9 является решающим фактором в определении концентрации варфарина в плазме крови.

К настоящему времени в кодирующей части гена СУР2С9 идентифицировано шесть структурных полиморфизмов [11], два из них характерны для белой расы: нуклеотидная замена С/Т в позиции 416 в третьем экзоне гена, что приводит к замене аргинина на цистеин в белковом продукте в позиции 144

(А^144Сув), и нуклеотидная замена С/А в позиции 1061 в седьмом экзоне гена, что приводит к замене изолейцина на лейцин в 359 позиции белкового продукта (11е359^и). Данные аллельные варианты гена получили названия СУР2С9*1 («дикий» аллель), СУР2С9*2 (А^144Сув) и CYP2C9*3 (I1e359Leu). Каталитические активности фермента, кодируемого аллелями СУР2С9*2 и СУР2С9*3, снижены относительно СУР2С9*1 и составляют 12% и 5%, соответственно [10]. Было показано, что необходимая ежедневная доза варфарина у носителей мутантных аллелей СУР2С9*2 и СУР2С9*3 существенно ниже, чем у лиц с «диким» генотипом [1, 6, 10]. Таким образом, генетические полиморфизмы СУР2С9 детерминируют концентрацию варфарина в плазме и, соответственно, степень гипокоагуляции [7].

Появление на отечественном фармацевтическом рынке варфарина и отсутствие сведений о распределении структурных полиморфизмов гена СУР2С9 и их клиническом значении для российской популяции послужило основанием для настоящего исследования, целью которого явилось определение частот встречаемости наиболее значимых полиморфных вариантов гена СУР2С9 - CYP2C9*2 и CYP2C9*3 в популяции г. Санкт-Петербурга и выявление зависимости индивидуальной чувствительности к варфари-ну от наличия вышеуказанных структурных полиморфизмов гена СУР2С9.

Таблица 1

Распределение генотипов CYP2C9 в популяции г. Санкт-Петербурга

Генотип CYP2C9 Число носи  Частота генотипа, %

телей

фактическая* расчетная

CYP2C9*1/*1 202 68,0 68,3

CYP2C9*1/*2 54 18,2 18,4

CYP2C9*1/*3 33 11,1 10,3

CYP2C9*2/*3 4 1,35 1,4

CYP2C9*2/*2 4 1,35 1,2

CYP2C9*3/*3 0 0 0,4

Примечание: * %2=1,5, df=5, p>0,75 - различия между фактическими и расчетными частотами генотипов статистически незначимы.

Материалы и методы

В исследование были включены 297 человек в возрасте от 15 до 75 лет (средний возраст — 44±2 года), являющиеся жителями г. Санкт-Петербурга, не связанные узами родства. Из них 186 мужчин были здоровы, 57 мужчин и 54 женщины наблюдались в клиниках СПбГМУ им. И.П.Павлова по поводу тромбозов различной локализации или повышенного риска тромбообразования.

Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови стандартным фенол-хлороформным методом.

Определения аллельных вариантов гена CYP2C9 проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и последующего рестрикционного анализа, с использованием эндонуклеаз Kpn I, Ava II и Mph 1103 I («Fermentas», Литва) и олигонуклеотидов («Ли-тех», Москва), как было описано ранее [11].

Из обследованных лиц 62 пациента получали вар-фарин для первичной или вторичной профилактики тромбозов или тромбоэмболических осложнений (ТЭО). Степень гипокоагуляции оценивали по уровню Международного Нормализованного Отношения (МНО). Использовали тромбопластин с индексами чувствительности 1,1 — 1,2 (Ренам, Москва и Технология-Стандарт, Барнаул). Для оценки фармакокине-тики варфарина и индивидуальной чувствительности к препарату использовали два количественных показателя: длительность фазы индукции — сроки достижения терапевтического уровня МНО (количество дней) и недельную дозу варфарина (мг), которая требовалась для поддержания полученного эффекта.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием стандартного пакета программ Statistica 5.0, для оценки соответствия полученного распределения генотипов равновесию Харди-Вайнберга применяли метод %2, для сравнения средних значений числовых показателей в раз-

личных группах использовали непараметрический метод — U-тест Манн-Уитни. Значение p<0,05 принимали за значимый уровень достоверности.

Результаты исследования

Полученное в результате исследования распределение генотипов представлено в табл. 1. Данное распределение генотипов находится в соответствии с равновесием Харди-Вайнберга: %2=1,5, df=5, p>0,75. Частоты аллелей составили: CYP2C9*1 — 82,66%, CYP2C9*2 - 11,11%, CYP2C9*3 - 6,32%, соответственно. Частота носительства CYP2C9*2 или CYP2C9*3 аллеля достигала 32%. Полученные нами частоты аллельных вариантов гена CYP2C9 в популяции г. Санкт-Петербурга соответствуют таковым в европейских популяциях [12]. Необходимо отметить, что нами не было выявлено ни одного носителя CYP2C9*3 аллеля в гомозиготном состоянии.

Анализ индивидуальной чувствительности к вар-фарину показал, что носители CYP2C9*2 и CYP2C9*3 аллелей быстрее достигают терапевтического уровня гипокоагуляции в период индукции и требуют достоверно меньшей недельной дозы препарата для поддержания терапевтического уровня. Причем, среди обследованных нами больных наибольший вклад в эти различия вносил аллель CYP2C9*3 (табл. 2).

Превышение МНО более 4,5 в период индукции на начальном этапе лечения варфарином было отмечено у семи больных. Еще четверо пациентов очень быстро достигли чрезмерной гипокоагуляции: значения МНО составили 4,65, 4,75, 5,28 и 6,08, соответственно, на первые и вторые сутки терапии. Генетическое исследование этих пациентов выявило носи-тельство CYP2C9*2 и CYP2C9*3 аллелей в гетерозиготном состоянии. Кроме того, мы отмечали резкие колебания МНО при малейшем изменении дозы вар-фарина у большинства носителей CYP2C9*2 и CYP2C9*3 аллелей.

Обсуждение

Функционально-значимые полиморфизмы CYP2C9, обуславливающие снижение его ферментативной активности, являются причиной развития побочных реакций для тех лекарств, которые мета-болизируются данным ферментом. Это наглядно проиллюстрировано на примере варфарина: передозировка препарата приводит к серьезным гемо-рагическим осложнениям, причем риск кровотечения при долгосрочной терапии варфарином выше именно у носителей мутантных аллелей [2]. Таким образом, лечение непрямыми антикоагулянтами требует решения двух задач: во-первых, подбор терапевтической дозы препарата при максимально коротком времени индукции без эпизодов чрезмерной гипокоагуляции и, тем более, кровотечения и,

Таблица 2

Зависимость индивидуальной реакции больных к варфарину от наличия аллельных вариантов гена CYP2C9

Генотип CYP2C9 Число носителей (n=62) Длительность фазы индукции, дни Недельная доза варфарина, мг

CYP2C9*1/*1 46 5,40±0,45* 43,65±2,17**

CYP2C9*1/*2 10 4,22±0,64 31,87±2,27

CYP2C9*1/*3 5 2,75±1,03 22,75±3,50

CYP2C9*2/*3 1 2 17,5

Примечание: * - р=0,038 - CYP2C9*1/*1 против остальных генотипов; р=0,32 - CYP2C9*1/*1 против CYP2C9*1/*2; р=0,057 -CYP2C9*1/*1 против CYP2C9*1/*3; ** - р<0,0001 - CYP2C9*1/*1 против остальных генотипов.

во-вторых, поддержание постоянного оптимального уровня гипокоагуляции. Это обуславливает необходимость постоянного мониторинга МНО. Результаты нашего исследования показывают, что внедрение в клиническую практику генетического типи-рования аллельных вариантов гена CYP2C9 может служить важным дополнением к рутинным коагуло-метрическим измерениям при терапии варфарином. Выявленная в настоящей работе зависимость индивидуальной реакции больных на прием варфарина от генотипов CYP2C9 согласуется с литературными данными. Так, начальная доза варфарина для индивидуумов c аллельными вариантами *2 и *3 должна быть в пределах 1-1,5мг по сравнению с обычно используемой 5-10мг [5]. Аналогичные выводы были сделаны и в другом исследовании [8], где под наблюдением находились 153 человека, получавших варфарин в течение 11 месяцев. Данная исследуемая группа включала представителей черной и белой расы (22% и 78%, соответственно). Прежде всего, были выявлены существенные различия в частотах встречаемости полиморфных аллелей гена CYP2C9 между двумя этническими группами — 15,2% и 39,2%, соответственно. Средняя недельная доза варфарина для лиц с аллельными вариантами CYP2C9*2 и CYP2C9*3 была существенно ниже, чем для остальной группы — 30,6±2,5 мг, по сравнению с 40,1 + 1,7 мг (р=0,002). Нестабильность МНО у пациентов — носителей CYP2C9*2 и CYP2C9*3 аллелей — показана не только в нашем исследовании, но и у других авторов [2], которые проводили мониторинг МНО в группе 185 больных, получавших варфарин в течение 10 лет. Из них 58 человек (31,4%) были носителями как минимум одного из полиморфных аллелей CYP2C9. У них статистически достоверно чаще встречались случаи повышения величин МНО, им требовалось больше времени для стабилизации величин МНО с момента старта терапии варфарином, и достоверно чаще случались кро-

вотечения. Все авторы приходят к выводу о высокой значимости типирования аллельных вариантов гена СУР2С9 перед началом терапии варфарином, что согласуется с нашим заключением. При обсуждении результатов нашей работы нельзя не остановиться на следующей проблеме. Цитохром СУР2С9, помимо варфарина, метаболизирует целый ряд лекарственных препаратов самого различного спектра действия — от нестероидных противовоспалительных средств (ибупрофен, диклофенак, пироксикам) — до противоэпилептических (фенитоин) [7, 3]. Уже существуют данные о потенциировании действия одного лекарственного препарата при одновременном приеме другого, также являющегося субстратом для СУР2С9 [4]. Следовательно, определение аллельных вариантов гена СУР2С9 становится особенно актуальным при полимедикации, когда больной вынужден принимать несколько лекарственных препаратов.

Выводы

1. Частоты аллельных вариантов гена СУР2С9 в популяции г. Санкт-Петербурга составляют 82,66% (СУР2С9*1), 11,11% (СУР2С9*2) и 6,32% (CYP2C9*3) и соответствуют таковым в европейских популяциях.

2. Носители CYP2C9*2 и CYP2C9*3 аллелей быстрее достигают терапевтического уровня гипокоагуля-ции при терапии варфарином и требуют достоверно меньшей недельной дозы варфарина.

3. Учитывая высокую частоту носительства СУР2С9*2 и СУР2С9*3 аллелей в популяции - 32%, а также зависимость индивидуальной чувствительности пациентов к варфарину от генотипа CYP2C9, необходимо рекомендовать внедрение в широкую клиническую практику генотипирование пациентов на аллельные варианты СУР2С9*2 и СУР2С9*3 до начала терапии варфарином для оптимизации сроков подбора требуемой дозы препарата и избежания геморрагических осложнений.

Авторы выражают глубокую благодарность коллективу лаборатории генной инженерии и имму но генетики Научно-исследовательского института физико-химической медицины (Москва) за помощь в проведении настоящего исследования.

Литература

1. Aithal G.P., Day C.P., Kesteven P.J.L., Daly A.K. Association of polymorphisms in the cytochrome P450 CYP2C9 with warfarin dose requirement and risk of bleeding complications // Lancet. -1999. - V. 353. P. 717-719.

2. Higashi M.K., Veenstra D.L., Kondo L.M. et al. Association between CYP2C9 genetic variants and anticoagulation-related outcomes during warfarin therapy// JAMA. - 2002. - V. 287. P. 1690-1698.

3. Lee C.R., Goldstein J.A., Pieper J.A. Cytochrome P450 2C9 polymorphisms: a comprehensive review of the in-vitro and human data // Pharmacogenetics. - 2002. - V. 12. P. 251-263.

4. Lim V., Pande I. Leflunomide can potentiate the anticoagulant effect of warfarine. // BMJ. - 2002. - V. 325. - P. 1333-1334.

5. Mannucci P.M. Genetic control of anticoagulation // Lancet. -

1999. - V. 353. - P. 688-689.

6. Margaglione M., Colazzo D., D'Andrea G. et al. Genetic modulation of oral anticoagulation with warfarin // Thromb. Haemost. -

2000. - V. 84. - P. 775-778.

7. Miners J.O., Birkett D.J. Cytochrome P450 2C9: an enzyme of major importance in human drug metabolism // Br. J. Clin. Pharmacol. - 1998. - V. 45. - P. 525-536.

8. Tabrizi A.R., Zehnbauer B.A., Borecki I.B. et al. The frequency and effects of cytochrome P450 (CYP) 2C9 polymorphisms in patients receiving warfarin // J. Am. Coll. Surg. - 2002. - V. 194. - P. 267273.

9. Tassies D., Freire C., Puoan J., Maragall S. Et al. Pharmacogenetics of acenocoumarol: cytochrome P450 CYP2C9 polymorphisms influence dose requirements and stability of anticoagulation // Haematologica. - 2002. - V. 87. - P. 1185-1191.

10. Taube J., Halsell D., Baglin T. Influence of cytochrom P-450 CYP2C9 polymorphisms on warfarin sensitivity and risk of over-anticoagulation in patients on long-term treatment // Blood. -2000. - V. 96. - P. 1816-1819.

11. Yasar U., Eliasson E., Dahl M.-L. et al. Validation of methods for CYP2C9 genotyping: frequencies of mutant alleles in a Swedish population // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1999. - V. 254. - P. 628-631.

12. Young-Ran Yoon, Ji-Hong Shon, Moon-Kyung Kim et al. Frequency of cytochrome P450 2C9 mutant alleles in a Korean population // Br. J. Clin. Pharmacol. - 2001. - V. 51. - P. 277280.

Abstract

One of the leading anticoagulants in Russia is warfarin. Its pharmacokinetics is determined by structural polymorphisms of CYP2C9 cytochrome gene, metabolizing warfarin. In the present study, the authors analyzed: 1) prevalence of two allele variants of this gene; 2) patients' individual reaction to warfarin, according to their CYP2C9 genotype. It was demonstrated that: 1) prevalence of CYP2C9 gene allele variants in St. Petersburg population was 82,66% (CYP2C9*1), 11,11% (CYP2C9*2), and 6,32% (CYP2C9*3); 2) individuals with CYP2C9*2 and CYP2C9*3 alleles reached therapeutic hypoco-agulation faster, and required significantly lower weekly doses of the medication. Routine identification of CYP2C9*2 and CYP2C9*3 alleles is recommended to all patients administered warfarin.

Keywords: Anticoagulant therapy, warfarin, genetic aspects.

Поступила 20/12-2003