Влияние перфтордекалина на рост актиномицетов и интенсификацию продукции стрептомицина и даунорубицина бактериями рода Streptomyces в технологии их глубинного культивирования

Влияние перфтордекалина на рост актиномицетов и интенсификацию продукции стрептомицина и даунорубицина бактериями рода Streptomyces в технологии их глубинного культивирования

В. М. БАКУЛИН, А. С. ТУМАНОВ, Е. А. МАРТИНСОН, С. Г. ЛИТВИНЕЦ, М. К. БАКУЛИН, В. Б. КАЛИНИНСКИЙ

ФГБОУ ВПО Вятский государственный университет, Киров

Influence of Perfluorodecalin on Growth of Actinomycetes and Intensification of Streptomycin and Daunorubicin Production by the Genus Streptomyces Kind Bacteria in Submerged Culture

V. M. BAKULIN, A. S. TUMANOV, E. A. MARTINSON, S. G. LITVINEC, M. K. BAKULIN, V. B. KALININSKI

Vyatka State University, Kirov

Показано, что добавление перфтордекалина с газотранспортной функцией в жидкую среду при биотехнологическом процессе глубинного культивирования актиномицетов рода Streptomyces приводит к повышению интенсивности и уровня синтеза биомассы и увеличению продукции антибиотиков стрептомицина и даунорубицина. Введение в среду перфтордекалина приводило к тому, что максимальное значение продукции антибиотиков (достигаемое на 120—144-й часы роста) в 2,0—2,3 раза превосходило пики накопления антибиотиков в контрольных опытах.

Ключевые слова: актиномицеты, стрептомицеты, перфтордекалин, стрептомицин, даунорубицин, глубинное культивирование, биомасса, антибиотическая продуктивность.

Addition of perfluorodecalin with gas-transporting function to the liquid medium during submerged cultivation of actinomycetes of the genus Streptomyces resulted in higher intensity and level of the biomass synthesis and increased production of streptomycin and daunorubicin. Addition of perfluorodecalin to the medium provided a 2.0—2.3-fold surpass of the maximum antibiotic production (achieved by the 120th—144th hours of the culture growth) vs. the antibiotic accumulation peaks in the control.

Key words: actinomycetes, streptomycetes, perfluorodecalin, streptomycin, daunorubicin, submerged cultivation, biomass, antibiotic production.

Введение

Продуцентами большинства известных к настоящему времени антибиотиков, синтезируемыгх актиномицетами и нашедших практическое применение, являются различные виды бактерий рода Streptomyces [1]. Стрептомицеты доминируют среди почвенных микроорганизмов по количеству видов описанныгх в качестве эффективных анти-биотикопродуцентов (S.griseus, S.bikiniensis, S.mashuensis, S.fradiae, S.kanamyceticus, S.tenebrar-ius, S.eurocidicus, S.antibioticus, S.ambofaciens, S.nour-sei, S.purpurogeniscleroticus, S.violaceoniger, S.levoris, S.aureofaciens и др.) и широте спектра синтезируемых ими антибиотиков разных химических групп (аминогликозиды, тетрациклины, макролиды, полиены, авермектины, антрациклины и др.).

Классическая технология глубинного выращивания стрептомицетов и получения отечест-

© Коллектив авторов, 2014

Адрес для корреспонденции: E-mail: milevolu@mail.ru

венного стрептомицина, была разработана сотрудниками НИИ эпидемиологии и гигиены Красной Армии (НИИЭГ, ныне — филиал ФГБУ «48 ЦНИИ» МО РФ, г. Киров) в 1946 г, о чём научная общественность узнала спустя полвека из публикации военных микробиологов [2]. В США аналогичные исследования были проведены в это же время под руководством С. Ваксмана — ученого российского происхождения, эмигрировавшего из России в США и возглавившего в 1940 году Рутгеровский университет в Нью-Брунсвике (удостоен Нобелевской премии в 1952 году) [3].

В ходе последующих многолетних исследований было показано, что процесс развития стрепто-мицетов разных видов и многих других микроор-ганизмов-антибиотикопродуцентов в глубинных культурах имеет, как правило, сходный двухфазовый характер и зависит от особенностей штамма и условий выращивания, что позволяет искать общие подходы к совершенствованию технологии получения целевых продуктов [4, 5]. Обобщая эту проблему, зарубежные исследователи отмечают,

что одним из наиболее существенных лимитирующих факторов в промышленном производстве антибиотиков с использованием стрептомицетов является недостаточное количество доступного клеткам кислорода, что обусловлено его плохой растворимостью в культуральной среде, и предлагают два подхода для её практического решения: «...можно, во-первых, изменить конструкцию биореакторов, в которых выращивается культура Streptomyces, а во-вторых, используя методы генной инженерии, создать штаммы, более эффективно использующие кислород.», вплоть до встраивания генов, ответственных за синтез продуктов, подобных гемоглобину эукариотов, в геном стрептомицетов [6]. Оба названные направления решения проблемы снабжения стрептомицетов кислородом имеют свои достоинства и недостатки, в то же время кировские биотехнологи и микробиологи предложили альтернативный способ, заключающийся в использовании при глубинном культивировании стрептомицетов перфторорга-нических соединений (ПФОС), обладающих комплексом практически полезных свойств: высокой химической и биологической устойчивостью, отсутствием токсичности для живых организмов, большой способностью растворять газы и модифицировать мембраны клеток, облегчая транспорт веществ через них, что позволило эффективно использовать ПФОС при конструировании кровезаменителей [7—9]. Следует отметить, что положительные результаты от использования ПФОС были показаны в этих экспериментах при выращивании стрептомицетов в жидкой среде в небольших объёмах — в колбах Эрленмейера на шут-теле [8, 10, 11]. Представлялось целесообразным продолжить эти исследования при аппаратном культивирования стрептомицетов.

Целью настоящей работы являлась экспериментальная оценка перспективности использования перфторорганических соединений с газотранспортной функцией в технологии аппаратного глубинного культивирования культур стрептомицетов.

Материал и методы

В работе использован перфтордекалин (ПФД) — перфто-руглерод (химическая формула C^F^) с молекулярной массой 462 Да, производства ОАО Кирово-Чепецкого химического комбината им. Б. П. Константинова, который добавлялся в экспериментальную среду в количестве 1,0 объёмных % (2,0 % по массе).

В качестве антибиотикопродуцентов использованы штаммы стрептомицетов с типичными родовыми и видовыми свойствами: S.griseus 1723 (продуцент стрептомицина) и S.pur-purogeniscleroticus ВБМ 158 (продуцент даунорубицина) и три тест-штамма бактерий для определения и сравнения антибиотической активности культуральных сред и активности выделяемых антибиотиков: Escherichia coli M-17, Bacillus subtilis 91, Staphylococcus aureus 208 (штаммы использовались в ранее проведённых исследованиях) [9, 10].

Для выращивания стрептомицетов использовали овсяный агар (18Р-3) следующего состава (%): овсяной муки (или хлопьев) - 2,0; агара - 2,5; Ре804 - 0,01; МпС12 - 0,01; 2п804 — 0,01; водопроводной воды до 100 (для приготовления среды овсяную муку (хлопья) варили в 1 литре воды, фильтровали и доводили объём до 1 дм3) [12]. Для глубинного выращивания стрептомицетов использовали жидкую питательную среду с соевой мукой следующего состава (%): крахмала — 3,0; соевой муки — 3,0; (КН4)2С4Щ0б — 0,5; (КН4)2804 — 0,4; СаС03 — 0,8; К2НР04 — 0,02; глюкозы — 1,5 (вводится в стерильную питательную среду); воды водопроводной до 100 [10, 13, 14]. Для выращивания бактериальных тест-культур использовали плотную питательную среду на основе кислотного гидролизата казеина (КГК, производства ФГУП НПО «Питательные среды», Махачкала), имеющую в своём составе (%): КН2Р04 — 0,22; К2НР04 — 0,17; Мв804 — 0,6; N28203 — 0,6; аминного азота — 130 мг%; агара — 2,0; воды до 100 [12, 13].

Культивирование осуществляли при температуре 27—29°С в биологических реакторах БИОР (Йошкар-Ола) или В108ТАТр1ш фирмы 8аг1огшв (Германия) в режиме постоянного перемешивания и принудительной аэрации (расход воздуха: 0,8 объёма воздуха на объем среды в минуту). В первую фазу развития культуры (в тропофазу) рН среды поддерживалось в диапазоне 7,0—7,2, во второй фазе (идиофазе) — 7,5—8,4.

В качестве посевного материала использовали культуры, выросшие на плотной среде 18Р-3, которые смывали физиологическим раствором и засевали в жидкую среду до исходной концентрации 1,0*107 спор/см3.

Через каждые 24 ч культивирования отбирали пробы по 15 см3, в которых оценивали чистоту культуры и её морфологическую типичность путём микроскопии мазков, а также накопление биомассы и концентрацию антибиотиков. Прирост биомассы определяли гравиметрическим методом с использованием бумажных фильтров, доведённых до постоянной массы. Фильтры с биомассой высушивали при 105° в течение 2 ч.

Антибиотическую активность определяли методом диффузии в агар (дисков) при использовании культур бактериальных тест-штаммов; в качестве положительного контроля применяли растворы коммерческих препаратов стрептомицина и даунорубицина. Выращивание тест-культур проводили на плотной среде на основе КГК при (28—30)° в течение 2 сут.

При оценке концентрации даунорубицина, продуцируемого стрептомицетами, проводили гидролиз по следующей методике. В аликвоту культуры вводили 10% раствор трилона Б (0,05% по сухой массе) и выдерживали в течение 30 мин. После этого рН пробы доводили до 3,0+0,2 с помощью 10% раствора щавелевой кислоты, смесь нагревали до (87—89)°, выдерживали при данной температуре 45 мин и быстро охлаждали до 4—10°С. На следующем этапе в пробу вводили КаС1 в количестве 5 мг/мл и рН доводили до 5,5 10% раствором №0Н с целью высаливания белка. При оценке концентрации стрептомицина в культуральной жидкости использовали сорбционный метод с использованием карбоксильных катионитов (ионообменных смол). Содержание антибиотиков в осветлённой центрифугированием культуральной жидкости определяли методом газожидкостной хроматографии на хроматографе 8Ыша(12и — рР 2010 с масс-селективным детектором (химическая ионизация) с использованием в качестве контроля растворов коммерческих препаратов стрептомицина производства СИНТЕЗ ОАО (Россия) и даунорубицина производства Лэнс-Фарм (Россия).

Антибиотическую продуктивность, выражаемую в мкг/мг/ч, вычисляли по модифицированной формуле [1]:

{Л,., л„)-нт

Антибиотическая продуктивность

где Atl и Aj2 — количество антибиотика, определённое в пробах, отобранных во время ti и t2, мкг/см3; Mtl и Ми — количество биомассы, образовавшейся ко времени tj и t2, мг%; ti и t2-время взятия проб, ч.

Статистическую обработку исследований проводили с использованием компьютерных программ Statgraf и Microsoft Exsel, средние арифметические значения, доверительные интервалы и стандартное отклонение рассчитывались при числе повторов не менее 7. Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента (p<0,05).

Результаты и обсуждение

Использованные в качестве антибиотикопро-дуцентов штаммы стрептомицетов S.griseus 1723 (продуцент стрептомицина) и S.purpurogeniscle-roticus ВБМ 158 (продуцент даунорубицина) при выращивании на плотной и в жидких средах обладали типичными видовыми культурально-мор-фологическими свойствами. При глубинном культивировании в реакторах БИОР и BIO-STATplus в жидкой питательной среде с соевой мукой независимо от типа реактора наблюдалась однотипная для каждого штамма интенсивность образования биомассы и антибиотиков, поэтому мы сочли возможным объединить результаты, полученные при культивировании в обоих типах аппаратов. В то же время по уровням продукции биомассы и антибиотиков штаммы существенно отличались между собой (рис. 1, 2).

При стандартных условиях выращивания культур обоих штаммов антибиотикопродуцен-тов отмечалась более высокая интенсивность роста культуры S.griseus 1723, что проявлялось более быстрым повышением концентрации биомассы и достижением более высоких её абсолютных значений в культуральной среде. Максимальные выходы биомассы стрептомицетов S.griseus 1723 наблюдались на 120 ч роста и составляли в среднем 710 мг%, в то время как максимумы выходов биомассы S.purpurogenis-cleroticus ВБМ 158 наблюдались только на 144 ч роста и составляли в среднем только 210 мг% (см. рис. 1, 2).

При внесении в среду культивирования перф-тордекалина отмечалось ускорение роста культур обоих штаммов и увеличение выхода биомассы. Уже через 72 ч роста концентрация биомассы стрептомицетов S.griseus 1723 в культуральной среде достигала максимума и составляла в среднем 830 мг%, превышая содержание биомассы на этот час в контролях (среда без перфтордекалина) в 2,4 раза и в 1,2 раза максимальный выход биомассы продуцента стрептомицина в контрольных экспериментах, достигнутый только на 120 час роста (см. рис. 1). Аналогичные результаты наблюдались при сравнительном выращивании в контрольной и опытной средах культуры S.pur-purogeniscleroticus ВБМ 158. Через 144 ч роста в присутствии перфтордекалина концентрация би-

10110

« 72 ili 120 Ш 1Г>»

Г>|Ч'М ;е цульти рирлшнгнл, ч

Рис. 1. Динамика образования биомассы S.griseus1723 при росте в среде на основе соевой муки: 1 — без перфтордекалина; 2 — с добавлением перфтордекалина.

/ж 72 и<; i2(i in*

(ll» vit кул1лжп1(х>оаиня, ч

Рис. 2. Динамика образования биомассы S.purpuro-дeniscleroticus ВБМ 158 при росте в среде на основе соевой муки: 1 — без перфтордекалина; 2 — с добавлением перфтордекалина.

омассы ВБМ 158 в культу-

ральной среде достигала максимума и составляла в среднем 360 мг%, превышая содержание биомассы на этот час в контроле в 1,7 раза (см. рис. 2).

Особый интерес представляют результаты оценки влияния перфтордекалина при аппаратном культивировании на продукцию стрептоми-цетами стрептомицина и даунорубицина. При изучении образования антибиотиков мы не ставили целью исследовать влияние различных факторов среды на их биосинтез. При прочих равных условиях единственным отличием условий выращивания антибиотикопродуцентов было наличие или отсутствие в жидкой среде перфтордека-лина, обеспечившего существенное повышение интенсивности роста культур обоих штаммов стрептомицетов. При выращивании культуры стрептомицетов S.griseus 1723 стрептомицин в культуральной среде выявлялся в минимальных количествах (в среднем 30 мкг/см3) начиная с 72 часа роста, достигая максимума на 144 ч (в среднем 330 мкг/см3) (рис. 3).

Рис. 3. Динамика концентрации стрептомицина в культуральной среде при росте глубинной культуры Б.дпввив 1723: 1 — без перфтордекалина; 2 — с добавлением перфтордекалина.

В аппаратных культурах с перфтордекалином стрептомицин выявлялся уже на 48 ч роста, а на 72 ч роста концентрация стрептомицина превышала аналогичные показатели контрольной культуры в 2,2 раза, на 144 ч среднее содержание антибиотика в среде достигало 690 мкг/см3, что превышало контрольный показатель на этот час в 2,3 раза.

В контрольной среде роста культуры стреп-томицетов 8.ритриго^^еп15с1ггоИси5 ВБМ 158 дау-норубицин в культуральной среде начинал выявляться в минимальных количествах (в среднем 10 мкг/см3) начиная с 72 часа роста, достигая максимума на 144 ч (в среднем 60 мкг/см3) (рис. 4).

В аппаратных культурах с перфтордекалином на 120 ч роста концентрация даунорубицина превышала аналогичные показатели для контрольной культуры в 2 раза.

Известно, что увеличение интенсивности прироста биомассы и выхода антибиотика не всегда сопровождается повышением антибиотической продуктивности культур актиномицетов. Наблюдаются случаи, когда увеличение выхода антибиотика связано только с простым увеличением количества образовавшейся биомассы. Поэтому при изучении процесса продукции антибиотиков наряду с уровнем выхода целевого продукта, важным фактором, характеризующим процесс биосинтеза, является определение антибиотической продуктивности микробной культуры, которое представляет количество антибиотика в мкг, образованного 1 мг сухих клеток исследуемого микроорганизма за определённый промежуток времени [1]. Результаты оценки антибиотической продуктивности стрептомицетов в период максимумов продукции антибиотиков представлены на рис. 5.

Сравнивая характеристики накопления биомассы и биосинтеза антибиотиков можно отметить, что продуктивность мицелия 1723 в

Рис. 4. Динамика концентрации даунорубицина в культуральной среде при росте глубинной культуры 5.ригригодвп15с!в^1си5 ВБМ 158: 1 — без перфторде-калина; 2 — с добавлением перфтордекалина.

Рис. 5. Антибиотическая продуктивность глубинных культур: а — Б.дпзвиз 1723; б — 5.ригригодвп15с!вгоЦ-сив ВБМ 158 при росте в среде на основе соевой муки (1 —без перфтордекалина; 2 — с добавлением перфтордекалина).

контрольной культуре в периоды с 72 ч по 120 ч и с 120 ч по 168 ч составляла соответственно 0,33 и 0,42 мкг/мг/ч, в то время как в присутствии пер-фтордекалина уровень продуктивности продуцента стрептомицина был на протяжении двух сравниваемых периодов биосинтеза антибиотика был выше в 1,3 и 1,6 раза

соответственно (рис. 5, а). Полученные данные свидетельствуют, что внесение в среду перфтор-декалина способствует возрастанию интенсивности процесса биосинтеза биомассы, антибиотика и росту антибиотической продуктивности стреп-томицета. Менее выраженная разница по антибиотической продуктивности в опытных и контрольных культурах наблюдалась при сравнении характеристик накопления биомассы и биосинтеза антибиотика культурой 8.ритриго^^еп15с1ггоИ-сш ВБМ 158 в периоды с 72 ч по 120 ч, но и в этот период продуктивность стрептомицета в присутствии перфтордекалина была выше (0,66 и 0,71 мкг/мг/ч, рис. 5, б). В следующий период (с 120 ч по 168 ч) антибиотическая продуктивность в обоих случаях резко снизилась — 0,07 и 0 мкг/мг/ч соответственно, что свидетельствует о более быстром истощении мицелия продуцента и, возможно, о разрушении антибиотика самим продуцентом, что происходило более интенсивно в присутствии перфторорганического соединения.

Оценка антимикробной активности культу-ральных сред, а также стрептомицина и дауноруби-цина, выделенных из культуральных сред, методом серийных разведений на плотной питательной среде по подавлению роста тест-культур бактерий в сравнении с коммерческими препаратами показала полное соответствие данных этого анализа результатам определения концентрации антибиотиков методом газожидкостной хроматографии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М.: 2004: 528.

2. Васильев Н.Т., Пименов Е.В., Калининский В. Б., Бакулин М.К Вклад военных медиков в разработку технологий промышленного производства первых отечественных антибиотиков. Антибиотики и химиотер 1996; 41: 4: 3—6.

3. Шлегель Г.Г. История микробиологии: Пер. с нем. М.: 2006; 229.

4. Егоров Н.С. Промышленная микробиология. М.:1989; 688.

5. Воронин Е.С. Биотехнология. СПб.: 2005; 792.

6. Пастернак Дж, Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: 2002; 263—264.

7. Иваницкий Г.Р. Наноконтейнеры на основе перфторуглеродов с функцией переноса оксида азота. Биофизика 2008; 2: 367—377.

8. Иваницкий Г.Р. Биофизика на пороге нового тысячелетия: перф-торуглеродные среды и газотранспортные кровезаменители. Биофизика 2001; 1: 5—33.

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют о несомненной перспективности исследований по использованию перфтордекалина при глубинном культивировании антибиотикопродуцентов рода Streptomyces в связи с положительным влиянием этого ПФОС на процессы интенсификации роста биомассы и антибиотической продуктивности исследуемых культур.

Исходя из того, что культуры использованных штаммов стрептомицетов являются признанными аэробами, поглощающими значительное количество кислорода в период образования биомассы и начальный период образования антибиотиков, можно предположить, что перфтордекалин, признанный по совокупности своих прикладных свойств наиболее перспективным ПФОС с газотранспортной функцией, включённым в состав перфторана, в глубинных культурах выполняет функции аналогичные обеспечиваемым им в крови организма человека: растворение кислорода, осуществление транспорта к клеткам наряду с кислородом компонентов культуральной среды, выполняющих роль сигнальных молекул и регуляторов метаболизма, модификацию клеточных мембран, оптимизацию условий питания и удаления метаболитов, что подтверждают результаты проведённых экспериментов [7, 8].

9. Бакулин М.К., Кучеренко A.C., Бакулина Л.В., Шведов ВВ. Влияние перфторорганических соединений на рост стрептомицетов и биосинтез ими антибиотика даунорубицина. Антибиотики и химиотер 2003; 48:12: 5-8.

10. Бакулин М.К., Грудцына A.C., Плетнева А.Ю., Кучеренко A.C., Бакулина Л.В., Шведов В В. Характеристика антибиотической продуктивности бактерий рода Streptomyces при культивировании в среде с добавлением карбогала и перфторметилдекалина. Биотехнология 2006; 5: 39-44.

11. Бакулин В.М., Мартинсон E.A., Бакулин М.К., Тихонов ИВ. Влияние перфтордекалина на рост и антибиотическую активность культур Streptomyces albus и S.rimosus в жидкой среде. Ветеринар мед 2012; 3-4: 15-17.

12. Нетрусов А.ЖПрактикум по микробиологии. М.: 2005; 608 с.

13. РавиловА.З., ГилъмутдиновР.Я., ХусаиновМ.Ш. Микробиологические среды. Казань: 1999; 398.

14. Семенов С.М.Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. М.: 1990; 240.