СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ АССОЦИИРОВАННОЙ ПРОТИВ СТРЕПТОКОККОЗА И СТАФИЛОКОККОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
METHOD OF PRODUCING ASSOCIATED VACCINE AGAINST STREPTOCOCCOSIS AND STAPHYLOCOCCOSIS OF CATTLE

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к способу изготовления вакцин, и может быть использовано в научно-исследовательских и производственных учреждениях, занимающихся конструированием биопрепаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.
Известен способ получения ассоциированной вакцины для профилактики инфекций, вызываемых условно-патогенными бактериями (патент РФ на изобретение №2035189 от 02.01.86, МКИ А61К 39/125, 39/135). Данный способ включает раздельное выделение протективных антигенов, из штамма Staphylococcus aureus №Б - 243 выделяют цитоплазматический антиген, из токсинопродуцирующего штамма Pseudomonas aeruginosa НИИЭМ №PA - 7 получают анатоксин синегнойной палочки, из клинических штаммов Proteus mirabilis №6, 8, 40, 508, 1115, 4641 выделяют растворимые антигены путем контролируемого протеолиза, полученные антигены смешивают в физрастворе из расчета содержания их в 1 мл вакцины 0,15-0,2 мг белка, 15-30 мкг белка, 10-20 мкг белка соответственно и в смесь дополнительно добавляют коммерческий стафилококковый анатоксин и гидроокись алюминия в количестве 5-10 ЕС и 1-2 мг соответственно. Технология получения вакцины очень сложная.
Известен способ получения поликомпонентной вакцины для иммунотерапии заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами (патент РФ на изобретение №2083223 от 27.05.94, МКИ A61K 39/116, 39/02, 39/085, 39/108). Данный способ предусматривает раздельное культивирование штаммов Klebsiella pneumoniae ГИСК №204 на среде Ворфель-Фергрюссона, Proteus vulgaris ГИСК №177, Escherichia coli К-100 №147 с последующим экстрагированием антигенов гидроксиламином, а из клеток Staphylococcus aureus №5 и №9 водной экстракцией и полученные антигены смешивают в соотношении 0,6, 0,6, 0,6 и 0,8 мг соответственно на 1 мл дистиллированной воды. Технология получения вакцины очень сложная.
3
Известен способ изготовления ассоциированной вакцины против стрептококкоза и энтерококковой инфекции нутрий (патент РФ на изобретение №2301076 от 20.06.07, МКИ А61К 39/116, А61К 39/09). Данный способ предусматривает отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей, раздельно выращивают культуры Streptococcus pneumoniae и Streptococcus faecalis в мясо-пептонном бульоне с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,6%-ной концентрации, выдерживают при температуре 37°C в течение 72-96 часов, смешивают культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 15% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают. Данная вакцина применяется для профилактики стрептококкоза и энтерококковой инфекции нутрий, крупному рогатому скоту не применяют.
Техническим решением задачи изобретения является устранение перечисленных недостатков, в частности повышение специфичности, эффективности способа изготовления вакцины против стрептококкоза и стафилококкоза у крупного рогатого скота путем введения новых чистых культур возбудителей, компонентов, исключая отрицательного и побочного влияния.
3
Решение задачи достигается тем, что способ изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза и стафилококкоза крупного рогатого скота, включающий получение антигенов, инактивацию, внесение адъюванта, отличающийся тем, что проводят отбор пораженных органов от павшего крупного рогатого скота из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры и раздельно выращивают возбудителей стрептококкоза Streptococcus bovis и стафилококкоза Staphylococcus aureus в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°C в течение 72-96 часов, смешивают культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.
3
3
3
Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что в отличие от известных способов проводят отбор пораженных органов от павшего крупного рогатого скота в период их заболевания и гибели от стрептококкоза и стафилококкоза, приготавливают суспензию из патологического материала, выделяют чистые культуры возбудителей посевом на дифференциально-диагностические среды. Используют при раздельном выращивании чистых культур Str. bovis и Staph. aureus мясо-пептонный бульон с добавлением глюкозы до 0,2% и получают концентрацию микробных клеток не менее 4-5 млрд в 1 см. Инактивируют формалином до 0,4-0,6%-ной конечной концентрации при температуре 37°C в течение 72-96 часов и смешивают чистые культуры в равных соотношениях, что позволяет полностью подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность против стрептококкоза и стафилококкоза. Добавление гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему культуры позволяет через 12-15 суток после внутримышечно или подкожно двукратного введения с интервалом 7-14 дней в дозе коровам по 5,0 см, телятам в возрасте 1,0-1,5 месяца - в дозе 1,5-2,0 см у привитых животных обеспечить формирование напряженного иммунитета против двух инфекционных болезней. Способ обеспечивает получение безвредной, высокоиммуногенной, специфичной вакцины для защиты крупного рогатого скота от стрептококкоза и стафилококкоза.
По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.
Что касается критерия «промышленная применимость», то компоненты, входящие в состав вакцины, известны и широко применяются в ветеринарной практике при изготовлении инактивированных вакцин: ассоциированная вакцина против сальмонеллеза, пастереллеза и энтерококковой инфекции поросят ТУ 10.09-62-90, утверждено 01.08.90 г., инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины утверждена Главным управлением ветеринарии 16.07.90 г.; вакцина против энтерококковой инфекции телят, ягнят и поросят ТУ 10.09-91-90, утверждено 15.12.90 г.
Методы выделения и характеристика стрептококков и стафилококков описаны в справочнике «Определитель зоопатогенных микроорганизмов» под редакцией профессора Сидорова М.А., Москва. - Колос, 1995, стр.90-95; в «Практикуме по ветеринарной микробиологии и иммунологии» авторы: Костенко Т.С., Родионова В.Б., Скородумов Д.И., М.: «Колос», 2001, на стр.165-171; в справочнике «Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных» авторы: Скородумов Д.И., Субботин В.В., Сидоров М.А., Костенко Т.С., М.: «ИзограФъ», 2005, на стр.246-257; в «Методических указаниях по лабораторной диагностике стрептококкоза животных», утвержденных 25.09.1990 г., Главным управлением ветеринарии с государственной инспекцией при Государственной комиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам.
3
Сущность предлагаемого способа заключается в том, что проводят отбор пораженных органов от павшего крупного рогатого скота из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры и раздельно выращивают культуры возбудителей стрептококкоза Str. bovis и стафилококкоза Staph. aureus в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°C в течение 72-96 часов, смешивают культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.
Пример конкретного осуществления способа изготовления вакцины.
Для изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза и стафилококкоза крупного рогатого скота проводят отбор пораженных органов от павшего в период заболевания их стрептококкозом и стафилококкозом, из которых приготавливают суспензию и проводят бактериологические исследования с целью выделения чистых культур возбудителей.
Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя стафилококкоза готовят мазки-отпечатки из пораженных органов павших животных, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают шаровидной формы синего цвета, расположенные группами кокки, характерные для рода Staphylococcus.
Для определения культуральных свойств возбудителя стафилококкоза делают посевы выделенной культуры из патологического материала в мясо-пептонный бульон (МПБ), на дифференциально-диагностические среды (солевой МПА, МПБ с 8-10% хлорида натрия, желточно-солевой агар с добавлением 0,1%-ного кристаллвиолета - на этой среде колонии оранжевого цвета), на мясо-пептонный агар (МПА) и инкубируют в термостате при 37°C в течение 18-24 часов. На чашках Петри с МПА вырастают гладкие, прозрачные, бесцветные колонии с ровными краями. В пробирках с МПБ наблюдают интенсивное помутнение питательной среды с образованием осадка. В чашках Петри вырастают колонии с гладкой поверхностью, ровными краями золотистого цвета, что характерно для рода Staphylococcus.
Выделенная чистая культура возбудителя стафилококкоза Staph. aureus образует капсулы, выделяет гемолизин, фибринолизин, желатиназу, лецитиназу.
Патогенность и специфичность чистой выделенной культуры определяют путем внутрибрюшинного заражения белых мышей массой 14-18 г. Через 2-4 суток наблюдения все зараженные лабораторные животные погибают при 100% сохранности в контроле. Для подтверждения специфичности гибели белых мышей из паренхиматозных органов павших мышей готовят мазки-отпечатки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании под иммерсионной системой микроскопа наблюдают тонкие палочки красного цвета, расположенные одиночно, характерные для Staph. aureus.
Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя стрептококкоза готовят мазки-отпечатки из пораженных органов павших нутрий, окрашивают их по методу Грама. При микроскопии препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают мелкие кокки в виде цепочек, окрашенные в фиолетовый цвет, характерные для рода Streptococcus. Для определения культуральных свойств возбудителя делают посевы выделенной культуры из патматериала в мясо-пептонный бульон с добавлением глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 10% инактивированной сыворотки лошади (МПБ), в чашки Петри с мясо-пептонным агаром (МПА) с добавлением глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 5% дефибринированной крови кролика. Через 18-20 часов инкубирования в термостате при температуре 37°C наблюдают в МПБ рост с равномерным помутнением среды. В чашках Петри на глюкозо-кровяном МПА наблюдают рост круглых, полупрозрачных, плоских, с приподнятым центром и краями колонии, с зоной гемолиза типа «альфа», что характерно для Str. bovis.
Для дифференциации стрептококков от стафилококков используют каталазную пробу. При постановке каталазной пробы на предметное стекло наносят каплю свежеприготовленного 3%-ного раствора перекиси водорода. Бактериологической петлей снимают одну колонию исследуемой культуры и растирают ее в капле перекиси водорода. Стафилококки в отличие от стрептококков образуют каталазу и вызывают пенообразование. Для предварительной идентификации стрептококков и энтерококков баккультуру высевают в пробирки с 10%, 40% желчи, с 6,5% хлористого натрия, с углеводами (раффинозой, сорбитом, маннитом), учитывают рост в жидкой среде и гемолиз на МПА с кровью.
В результате в пробирках с желчью наблюдают диффузный рост баккультуры, отмечают ферментацию маннита. На МПА с кровью наблюдают неполный гемолиз эритроцитов с образованием вокруг колоний зеленоватой зоны, что характерно для стрептококков.
Для установления серогрупповой принадлежности стрептококков используют стрептококковые групповые преципитирующие сыворотки. Серогрупповую принадлежность стрептококков определяют в реакции преципитации (РП) в капиллярах. Патогенность подтверждают биопробой на молодых белых мышках.
Выделенные таким образом чистые культуры возбудителей стафилококкоза Staph. aureus и стрептококкоза Str. bovis используют для получения вакцины.
3
3
3
Выращивание чистых культур проводят раздельно в мясо-пептонном бульоне. Для заражения берут 5 см свежей чистой культуры возбудителя стафилококкоза Staph. aureus на 1000 см мясо-пептонной питательной среды и выращивают при 37°C в течение 18-24 часов. Концентрацию микробных клеток в бактериальной массе определяют по стандарту мутности и разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 4-5 млрд в 1 см. Инактивацию полученного баксырья проводят внесением формалина 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°C в течение 72-96 часов при периодическом перемешивании.
3
3
3
Для заражения берут 5 см чистой культуры возбудителя стрептококкоза Str. bovis на 1000 см жидкой питательной среды с добавлением 0,2% глюкозы и выращивают при 37°C в течение 12-14 часов. Концентрацию микробных клеток в бактериальной массе определяют по стандарту и разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 4-5 млрд в 1 см. Инактивацию баксырья проводят раздельно внесением формалина 0,4-0,5% -ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°C в течение 72-96 часов при периодическом перемешивании, смешивают инактивированные баккультуры в равных соотношениях. Затем к смеси баккультур добавляют раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему и тщательно перемешивают, фасуют и укупоривают.
3
3
3
Таким образом, использование для изготовления вакцины, ассоциированной против стрептококкоза и стафилококкоза крупного рогатого скота чистых культур возбудителей стрептококкоза Str. bovis и стафилококкоза Staph. aureus, выделенных из местного эпизоотического очага, позволяет получать специфичную, высокоиммуногенную ассоциированную вакцину для защиты от этих двух инфекционных болезней: стрептококкоза и стафилококкоза Staphylococcus aureus крупного рогатого скота. Раздельное выращивание позволяет получать концентрацию бактериальных клеток не менее 4 млрд в 1 см в течение 12-14 часов инкубирования. Использование формалина для инактивации в 0,4-0,5%-ной конечной концентрации позволяет в течение 72-96 часов при температуре 37°C подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность в течение 12 месяцев хранения. Адсорбирование двух антигенов на гидроокиси алюминия позволяет через 12-15 суток после внутримышечно или подкожно двукратного введения с интервалом 7-14 дней в дозе коровам по 5,0 см, телятам в возрасте 1,0-1,5 месяца - в дозе 1,5-2,0 см у привитых животных обеспечить формирование напряженного иммунитета против двух инфекционных болезней продолжительностью не менее 12 месяцев (таблица).
Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.
Сравнительная характеристика изготовления вакцины по предлагаемому способу и прототипу
№ п/п
Отличительные признаки
Прототип
Предлагаемый способ
1.
Возбудители
Штаммы Streptococcus pneumoniae и Streptococcus faecalis, выделенные из местного эпизоотического очага
Чистые баккультуры возбудителей стрептококкоза Streptococcus bovis и стафилококкоза Staphylococcus aureus, выделенные из местного эпизоотического очага
2.
Выделение растворимых антигенов
Используются все полные антигены
Используются все полные антигены
3.
Инактивация бактериальной массы
0,4-0,5%-ной концентрации формалина в течение 72-96 часов при температуре 37°C
0,4-0,5%-ной концентрации формалина в течение 72-96 часов при температуре 37°C
4.
Компоненты
гидроокись алюминия 15% к объему
гидроокись алюминия 20% к объему
5.
Длительность иммунитета
9 мес
12 мес
Таким образом, данные таблицы показывают преимущества предлагаемого способа изготовления вакцины, ассоциированной против стрептококкоза и стафилококкоза крупного рогатого скота по сравнению с имеющимся прототипом.