Способ получения фумаровой кислоты
METHOD FOR PRODUCING FUMARIC ACID

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению гидролизатов измельченных клубней топинамбура путем ферментативного гидролиза под действием комплекса ферментов целлюлаз совместно с экзоинулиназой для полного гидролиза целлюлозной и инулиновой матриц биомассы топинамбура, с последующим превращением гидролизата в фумаровую кислоту под действием иммобилизованного биокатализатора, содержащего клетки мицелиального гриба Rhizopus oryzae F1032. Способ обеспечивает совместное проведение различных стадий процесса биодеградации измельченной биомассы топинамбура до глюкозы и фруктозы, с последующим превращением в фумаровую кислоту.
Топинамбур (Helianthus tuberosus) является перспективной сельскохозяйственной культурой по ряду показателей. При высокой урожайности по выходу углеводов топинамбур в два раза превосходит сахарную свеклу и другие культуры. Ценность топинамбура обусловлена биохимическим составом. Его клубни и наземная часть содержат большое количество пектина, инулина, олигофруктоз, пищевых волокон, белка, аминокислот, в том числе, незаменимых, витаминов, микро- и макроэлементов, азотистых веществ и пр. [Гулюк Н.Г., Лукин Н.Д., Пучкова Т.С., Пихало Д.М., Гулакова В.А. Об очистке экстракта из инулинсодержащего сырья. // Пищевая промышленность. - 2017. - №2. - С. 24-26]. Таким образом, использование нетрадиционного растительного сырья, такого как топинамбур, для получения полезных продуктов является актуальной задачей.
Фумаровая кислота является коммерчески значимым продуктом, широко востребованным в различных отраслях промышленности, агропромышленном комплексе, в производстве биоразлагаемых полимеров [Xu, Q., Li, S., Huang, Н., & Wen, J. Key technologies for the industrial production of fumaric acid by fermentation // Biotechnology advances. - 2012. - T. 30. - №. 6. - C. 1685-1696. Gold R., Linker R. A., Stangel M. Fumaric acid and its esters: an emerging treatment for multiple sclerosis with antioxidative mechanism of action // Clinical Immunology. - 2012. - T. 142. - №. 1. - C. 44-48].
Биотехнологический способ получения фумаровой кислоты характеризуется многими преимуществами перед традиционно используемым химическим синтезом, так как подразумевает низкую экологическую нагрузку, возможность использования возобновляемых источников сырья с низкой себестоимостью, мягкие условия реализации (низкие температуры), возможность переработки отходов и решение экологических задач.
Помимо генномодифицированных микроорганизмов, требующих специальных условий культивирования и поддержания [Song C.W., Kim D.I., Choi S, Jang J.W., Lee S.Y. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of fumaric acid. // Biotechnol Bioeng., 2013, 110(7):2025-34, Xu G., Zou W., Chen X., Xu N., Liu L., Chen J. Fumaric acid production in Saccharomyces cerevisiae by in silico aided metabolic engineering. // PLoS One. 2012;7(12):e52086, Huang D., Wang R., Du W., Wang G., Xia M. Activation of glycerol metabolic pathway by evolutionary engineering of Rhizopus oryzae to strengthen the fumaric acid biosynthesis from crude glycerol. // Bioresour Technol. 2015;196:263-72], клетки мицелиального гриба рода Rhizopus являются единственными природными биокатализаторами процесса синтеза фумаровой кислоты из потребляемых клетками углеводов, содержащихся в гидролизатах растительного сырья [Ghosh, В., & Ray, R. R. (2011). Current commercial perspective of Rhizopus oryzae: a review. J Appl Sci, 11(14), 2470-2486. Xu, Q., Li, S., Huang, H., & Wen, J. Key technologies for the industrial production of fumaric acid by fermentation // Biotechnology advances. - 2012. - T. 30. - №. 6. - C. 1685-1696. Engel, C. A. R., Straathof, A. J., Zijlmans, T. W., van Gulik, W. M., & van der Wielen, L. A. Fumaric acid production by fermentation // Applied microbiology and biotechnology. - 2008. - T. 78. - №. 3. - C. 379-389].
Большинство известных на сегодняшний день способов получения фумаровой кислоты подразумевают использование в качестве исходного сырья простых сахаров (глюкозы, ксилозы) [Engel, С.A. R., Straathof, A. J., Zijlmans, Т. W., van Gulik, W. М., & van der Wielen, L. A. Fumaric acid production by fermentation // Applied microbiology and biotechnology. - 2008. -T. 78. - №. 3. - C. 379-389] или полисахаридов на основе глюкозы (крахмал) [Moresi, М., Parente, Е., Petruccioli, М., & Federici, F. Fumaric acid production from hydrolysates of starch - based substrates // Journal of chemical technology and biotechnology. - 1992. - T. 54. - №. 3. - C. 283-290. Huang H, Li S, Xiong Q, Xu Q, Gu S. A method to control fungi morphology of the fermentation process. Chinese Patent CN 201110114771.X. 2011 May 5] в чистом виде.
Более привлекательными являются способы биотрансформации углеводсодержащего возобновляемого сырья сложного состава, отличающегося невысокой себестоимостью и доступностью, в ряде случаев это могут быть также отходы каких-либо производств. Среди таких субстратов для получения ФК предлагаются в основном лигноцеллюлозосодержащие и крахмалосодержащие субстраты растительного происхождения: кукурузная солома [Xu Q., Li S., Fu Y., Tai C, Huang H. Two-stage utilization of corn straw by Rhizopus oryzae for fumaric acid production // Bioresource technology. - 2010. - T. 101. - №. 15. - C. 6262-6264.], пшеничная солома и осиновые опилки [Сенько О.В., Степанов Н.А., Маслова О.В., Лягин И.В., Ефременко Е.Н. Ресурсосберегающая биотехнология получения фумаровой кислоты из возобновляемого растительного сырья // Вестник КузГТУ. 2013. №1], кукурузная мука, картофель, жом маниоки [Carta, F. S., Soccol, C. R., Ramos, L. P., & Fontana, J. D. Production of fumaric acid by fermentation of enzymatic hydrolysates derived from cassava bagasse //Bioresource Technology. - 1999. - T. 68. - №. 1. - C. 23-28.], древесина эвкалипта [ Fermentative production of fumaric acid from Eucalyptus globulus wood hydrolyzates //Journal of Chemical Technology and Biotechnology. - 2012. - T. 87. - №. 7. - C. 1036-1040.], а также навоз, содержащий включения целлюлозосодержащего сырья [Liao, W., Liu, Y., Frear, С, & Chen, S.Coproduction of fumaric acid and chitin from a nitrogen-rich lignocellulosic material-dairy manure-using a pelletized filamentous fungus Rhizopus oryzae ATCC 20344 // Bioresource technology. - 2008. - T. 99. - №. 13. - C. 5859-5866].
Несмотря на то, что инулин - биополимер, который в отличие от крахмала и целлюлозы, состоит в основном из фруктозы с малыми примесями глюкозы, и клетки грибов рода Rhizopus могут выступать в качестве биокатализаторов процесса получения фумаровой кислоты не только из глюкозы, но и из ряда других моно- и дисахаров, в том числе фруктозы [ Investigation of sugar metabolism in Rhizopus oryzae: дис.- MIDDLE EAST TECHNICAL UNIVERSITY, 2007. Rehms, H., & Barz, W. (1995). Degradation of stachyose, raffinose, melibiose and sucrose by different tempe-producing Rhizopus fungi. Applied microbiology and biotechnology, 44(1-2), 47-52], способов получения фумаровой кислоты из перспективного растительного сырья топинамбура - не существует.
Основными ограничениями возможности практического использования альтернативных субстратов сложного состава, к которым относится возобновляемое сырье растительного происхождения, для получения фумаровой кислоты являются низкие значения следующих основных параметров процесса:
- продуктивности процесса на стадии биосинтеза фумаровой кислоты;
- конечной концентрации продукта на стадии биосинтеза;
- степени конверсии единицы субстрата в продукт;
- длительности эффективного использования биокатализаторов в процессе получения ФК;
- высокая длительность процесса на стадии предобработки сырья.
Грибной биокатализатор, обладающий рядом собственных гидролитических активностей [Ghosh, В., & Ray, R. R. (2011). Current commercial perspective of Rhizopus oryzae: a review. J Appl Sci, 77(14), 2470-2486], не в состоянии обеспечить полную глубокую биотрансформацию сложных углеводсодержащих субстратов в фумаровую кислоту. В качестве решения данной проблемы предлагается проведение предварительной предобработки исходного сырья с получением гидролизатов топинамбура - углеводов менее сложного состава, включающей ферментативную предварительную обработку или предобработку.
Химическая предобработка не обеспечивает полного разложения полисахаридов сложного состава и характеризуется наличием отходов производства, утилизация которых представляет довольно серьезную проблему. Подобная обработка приводит к накоплению в гидролизатах различных токсичных для клеток микроорганизмов веществ: фурфурола, оксиметилфурфурола, муравьиной кислоты [Nichols N.N., Sharma L.N., Mowery R.A., Chambliss C.K., Van Walsum G.P., Dien B.S., Iten L.B. Fungal metabolism of fermentation inhibitors present in corn stover dilute acid hydrolysate // Enzyme and Microbial Technology. - 2008. - T. 42. - №. 7. - C. 624-630].
2
2
2
Большое развитие получили методы предобработки, основанные на взрывной дефибрации сырья по декомпрессионному принципу (паровой взрыв) [De Ban I., Nanna F., Braccio G. (2007) SO-catalyzed steam fractionation of aspen chips for bioethahnol production: Optimization of the catalyst impregnation // Ind Eng Chem Res., V. 46, P. 7711-7720]. Исходное сырье подвергают кратковременному воздействию перегретого пара под давлением в присутствии или в отсутствие SO или СО и далее давление сбрасывают, что вызывает паровой взрыв материала. При таких условиях лигнин плавится, частично разрушается и выходит из структуры целлюлозы, кроме того, под действием парового взрыва происходит частичная дезинтеграция целлюлозы, а также гидролиз гемицеллюлоз. Однако недостатком такого метода является, с одной стороны, большой расход энергии и пара, а, с другой - образование трудно утилизируемых отходов (модифицированного лигнина).
Поэтому в биокаталитических процессах большее предпочтение отдается методам, основанным на измельчении исходного сырья с использованием различных видов мельниц или блендеров и его последующая предобработка ферментными препаратами. Для ферментативной обработки чаще всего используются коммерческие препараты гидролитических ферментов: с β-глюкозидазной, амилоглюкозидазной, α-амилазной и целлюлазной активностью [Carta, F. S., Soccol, С.R., Ramos, L. P., & Fontana, J. D. Production of fumaric acid by fermentation of enzymatic hydrolysates derived from cassava bagasse // Bioresource Technology. - 1999. - T. 68. - №. 1. - C. 23-28, Liao, W., Liu, Y., Wen, Z., Frear, C, & Chen, S. (2008). Kinetic modeling of enzymatic hydrolysis of cellulose in differently pretreated fibers from dairy manure. Biotechnology and bioengineering, 101(3), 441-451, Yan, L., Zhang, H., Chen, J., Lin, Z., Jin, Q., Jia, H., & Huang, H. (2009). Dilute sulfuric acid cycle spray flow-through pretreatment of corn stover for enhancement of sugar recovery. Bioresource technology, 100(5), 1803 -1808].
Доказано, что в процессах получения органических кислот, эффективнее использовать иммобилизованные продуценты, поскольку они толерантны к низким значениям рН среды, высоким концентрациям накапливающихся в культуральной жидкости органических кислот, присутствию прочих токсичных компонентов в окружающей среде, а также технологически привлекательны [Maslova, О. V., Sen'ko, О. V., Stepanov, N. A., Efremenko, Е. N. Lactic acid production using free cells of bacteria and filamentous fungi and cells immobilized in polyvinyl alcohol cryogel: A comparative analysis of the characteristics of biocatalysts and processes // Catalysis in Industry. - 2016. - T. 8. - №. 3. - C. 280-285. Efremenko E.N., Spiricheva O.V., Lozinsky V.I., Varfolomeev S.D. Rhizopus oryzae fungus cells producing L(+)-lactic acid: kinetic and metabolic parameters of free and PVA-cryogel-entrapped mycelium. // Appl. Microb. Biotech., V.72, 2006, p.480-485]. Использование биокатализаторов в иммобилизованном виде позволяет существенно увеличивать период его полуинактивации, повышать продуктивность процесса и получать более высокие конечные концентрации продукта.
Известен способ получения фумаровой кислоты из возобновляемого растительного сырья, основанный на биотрансформации ферментативно предобработанных целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства и деревообрабатывающей промышленности с использованием иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток мицелиальных гриба Rhizopus oryzae F-1032 [Сенько О.В., Степанов Н.А., Маслова О.В., Лягин И.В., Ефременко Е.Н. Ресурсосберегающая биотехнология получения фумаровой кислоты из возобновляемого растительного сырья // Вестник КузГТУ. 2013. №1, Сенько О.В. Биокатализаторы в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток мицелиальных грибов в процессах получения органических кислот, биоэтанола, гидролитических ферментов и разложения фосфорорганических пестицидов: диссертация кандидата химических наук: 03.01.06 / Сенько Ольга Витальевна; Место защиты: Моск. гос. ун-т им. М.В. Ломоносова. Хим. фак. - Москва, 2013. - 170 с.], который по основным характеристикам процесса: степени конверсии единицы субстрата в фумаровую кислоту (до 0,35 гФК/г исх. субстрата) и длительности применения биокатализатора в периодических условиях на стадии биоконверсии компонентов ферментолизатов в фумаровую кислоту (до 480 ч), соизмерим или превосходит все известные способы получения фумаровой кислоты из возобновляемого растительного сырья [Liao, W., Liu, Y., Frear, С, & Chen, S.Co-production of fumaric acid and chitin from a nitrogen-rich lignocellulosic material-dairy manure-using a pelletized filamentous fungus Rhizopus oryzae ATCC 20344 // Bioresource technology. - 2008. - T. 99. - №. 13. - C. 5859-5866. B=Xu Q., Li S., Fu Y., Tai C, Huang H. Two-stage utilization of corn straw by Rhizopus oryzae for fumaric acid production // Bioresource technology. - 2010. - T. 101. - №. 15. - C. 6262-6264. C=Rodriguez - C. Fermentative production of fumaric acid from Eucalyptus globulus wood hydrolyzates // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. - 2012. - T. 87. - №. 7. - C. 1036-1040. Carta, F. S., Soccol, C. R., Ramos, L. P., & Fontana, J. D.Production of fumaric acid by fermentation of enzymatic hydrolysates derived from cassava bagasse // Bioresource Technology. - 1999. - T. 68. - №. 1. - C. 23-28]. Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому способу получения фумаровой кислоты из возобновляемого растительного сырья, предусматривающему измельчение, ферментативную предобработку сырья и последующую биотрансформацию компонентов ферментолизатов в фумаровую кислоту под действием иммобилизованного в криогель поливинилового спирта мицелия гриба Rhizopus oryzae F1032, можно считать наиболее близким по стадиям реализации и показателям эффективности к предложенному.
К недостаткам прототипа относятся низкие значения показателей процесса:
- продуктивности процесса - до 0,73 г/л/ч;
- конечной концентрации продукта на стадии биосинтеза - до 35 г/л;
- степени конверсии единицы субстрата в продукт - до 0,35 гФК/г сух. субстрата;
- длительности эффективного использования биокатализаторов в процессе получения ФК - до 480 ч;
- длительности проведения стадии механической и ферментативной предобработки сырья - до 48 ч.
Техническая задача, на решение которой направлено данное изобретение, является способ сбраживания гидролизатов топинамбура с последующим получением фумаровой кислоты, включающий механическую и ферментативную предобработку растительной биомассы топинамбура и последующую биотрансформацию гидролизатов в фумаровую кислоту под действием грибного иммобилизованного биокатализатора.
В заявляемом техническом решении ферментативная обработка биомассы топинамбура ведется лиофилизованной культуральной жидкостью грибного штамма Penicillium verruculosum PVERINU18 BКПMF-1291, в которой присутствует гетерологичная экзоинулиназная активность для специфического расщепления инулинсодержащего биополимера клубневой биомассы топинамбура и комплекс ферментов для расщепления целлюлозы и гемицеллюлозы вегетативной части топинамбура [Рекомбинантный штамм (варианты) мицелиального гриба Penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата с его использованием (Патент RU 2646136 01.03.2018)].
Технический результат состоит в том, что способ обеспечивает сокращение длительности стадии ферментативной предобработки, повышение показателей продуктивности процесса и конечной концентрации продукта на стадии биоконверсии гидролизатов биомассы топинамбура в фумаровую кислоту, повышение удельного выхода фумаровой кислоты на единицу субстрата, а также увеличение длительности эффективного использования грибного биокатализатора. Изобретение может быть использовано в пищевой, косметической фармацевтической промышленности, агропромышленном комплексе, в производстве биоразлагаемых полимеров.
Преимуществом предлагаемого изобретения является повышение конечной концентрации продукта на стадии биосинтеза и степени конверсии единицы субстрата, а также снижение длительности стадии предобработки исходного сырья и увеличение длительности эффективного использования единицы биокатализатора, что в совокупности косвенно свидетельствует о снижении себестоимости единицы продукта.
Сущность изобретения заключается в получении гидролизатов топинамбура путем их предварительного измельчения на волчке до размера частиц 20÷80 мкм, проведением ферментативной обработки в присутствии смеси гидролитических ферментов ферментным препаратом на основе грибного штамма Penicillium verruculosum PVERINU18 ВКПМ F-1291 в течение 3 ч при 50±5°С. Затем температуру среды снижают до 31±3°С и инициируют 42÷110 часовой процесс получения фумаровой кислоты введением в среду гранул криогеля поливинилового спирта (10% по объему), содержащих иммобилизованные клетки гриба Rhizopus oryzae.
Указанный технический результат достигается в результате реализации следующих необходимых условий, выявленных экспериментально: использование в качестве растительного возобновляемого сырья измельченной биомассы клубней топинамбура, предобработанных в две стадии, в которых за предварительной инкубацией биомассы клубней топинамбура в 0,1 М натрий-ацетатном буфере с последующим доведение рН среды до 5,0 1М соляной кислотой следует дальнейшая ферментативная обработка под действием ферментного препарата рекомбинантного штамма мицелиального гриба Penicillium verruculosum PVERINU18 (ВКПМ F-1291), содержащего экзоинулиназу и базовые целлюлазы при 50°С в течение 3 ч. Последующая биотрансформация компонентов гидролизатов в фумаровую кислоту проводится под действием биокатализатора в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток гриба Rhizopus oryzae F1032, при этом проращивание грибных спор с целью повышения фруктокиназной (кетогексокиназной) активности грибного мицелия проводится в фруктозосодержащей питательной среде. Оказалось, что такое, ранее неизвестное, сочетание технологических операций, позволяет достигать лучших, чем у прототипа, конечных характеристик процесса.
В заявляемом техническом решении, как и в прототипе, проводят измельчение и предварительную ферментативную предобработку растительного сырья. Это необходимо для снижения показателя вязкости среды и накопления в среде начальной концентрации сахаров, обеспечивающей условия, необходимые для начала функционирования клеток грибного биокатализатора в нужном направлении - биоконверсии сахаров, в частности фруктозы и глюкозы, в фумаровую кислоту. В случае высокой вязкости среды, сопровождающейся снижением степени аэрации клеток, отсутствии в среде углеводов и введения в нее клеток гриба Rhizopus oryzae последние оказываются лимитированы по наличию в среде биодоступного субстрата и кислорода, будучи склонными к изменению направления биокаталитического действия в неблагоприятных условиях культивирования, клетки переходят из активного метаболического состояния - биоконверсии компонентов среды в фумаровой кислоты, к сдвигу метаболических процессов в сторону образования другого продукта - этанола. Таким образом, перед внесением клеток в среду с растительным сырьем и ферментами, необходимо обеспечить наличие в среде субстрата и доступ кислорода для клеток. С этой целью проводят предварительную предобработку сырья в присутствии смеси ферментов при температуре 50°С, являющейся оптимальной для действия ферментов.
В отличие от прототипа в заявляемом техническом решении в качестве растительного сырья используется биомасса клубней топинамбура и предназначенные для гидролиза инулинсодержащего сырья ферментные препараты рекомбинантных штаммов мицелиального гриба Penicillium verruculosum, содержащих экзо-, эндоинулиназы и целлюлазы, в частности, ферментный препарат на основе грибного штамма Penicillium verruculosum PVERINU18 BКПMF-1291. Ферментативную предобработку биомассы топинамбура проводят не 48 ч, а 3 ч в тех же условиях, что и в прототипе.
Снижение длительности этой стадии оказывается возможным за счет предлагаемого в заявляемом техническом решении использования биомассы топинамбура, которая предварительно инкубируется в 0,1 М натрий-ацетатном буфере в течение 1 часа при 40°С для разрыхления углеводной матрицы, что увеличивает доступ гидролитических ферментов к субстрату, с последующей доводкой рН биомассы до 5,0 путем добавления 1М соляной кислоты, что является оптимальным значением рН действия гидролитического комплекса ферментов. Использование ферментативных препаратов, более эффективных с точки зрения эффективности трансформации крупных полимерных молекул инулинсодержащего сырья до углеводов менее сложного строения, в том числе фруктозы и глюкозы, также способствует повышению эффективности получения сбраживаемых сахаров как базиса для микробиологической конверсии их в фумаровую кислоту. Длительность предварительной ферментативной обработки сырья в заявляемом способе определяется только гидролизуемой частью биомассы топинамбура (вегетативная - листья, стебли - 6 ч, или подземная - клубни - 3 ч). Состав ферментов в используемом ферментном препарате в заявляемом техническом решении, отличается от прототипа тем, что помимо целлюлаз, включает экзоинулиназу. Использование данного ферментного препарата позволяет осуществлять более глубокую и быструю предобработку биомассы топинамбура.
В заявляемом техническом решении, как и в прототипе, в среду, содержащую гидролизат топинамбура (частично предобработанное возобновляемое растительное сырье и гидролитические ферменты), вводят гранулы криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками грибного биокатализатора, которые предварительно формируют методом замораживания-оттаивания суспензии спор растворе ПВС. В техническом решении, как и в прототипе, используются для иммобилизации в криогель ПВС споры гриба Rhizopus oryzae F1032. Для формирования гранул нужной формы и размера готовят суспензию спор в растворе полимера, распределяют полученную суспензию в виде аликвот в емкости нужной формы и размера, которые далее помещают в морозильную камеру при -20°С, замораживают, выдерживают при этой температуре в течение 24 ч и размораживают при +8°С. Полученные в результате такой операции гранулы с иммобилизованными в криогель ПВС спорами помещают в питательную среду и проращивают их для получения иммобилизованного мицелия, который далее погружают в ферментолизаты растительного сырья и используют для биотрансформации компонентов в фумаровую кислоту. В отличие от прототипа, в заявляемом техническом решении в ходе проращивания мицелия используют питательную среду, повышающую фруктокиназную (кетогексокиназную) активность иммобилизованных клеток, и содержащую фруктозу в концентрации 50-80 г/л.
Гранулы с иммобилизованными клетками гриба помещают, как и в прототипе, в той же концентрации в среду с предобработанной смесью ферментов растительной биомассой, которую предварительно охлаждают до 32°С.
При той же длительности процесса, что и в прототипе (48 ч), заявляемое техническое решение позволяет улучшить технологические показатели процесса, в частности, поднять конечную концентрацию фумаровой кислоты, накапливающуюся в среде на стадии биосинтеза, и продуктивность процесса биосинтеза на 15-23% в зависимости от частей топинамбура, используемых в качестве сырья (см. Примеры).
Заявляемое техническое решение, обеспечивающее создание для грибного биокатализатора более эффективных условий его использования для получения фумаровой кислоты, обеспечивает возможность более длительного использования биокатализатора в периодических условиях (до 576-720 ч), чем в прототипе (до 480 ч).
К условиям, позволяющим получить такой результат, относится использование в качестве исходного растительного сырья предобработанной биомассы топинамбура, и проведение ферментативной предобработки сырья с помощью ферментного препарата рекомбинантного штамма мицелиального гриба Penicillium verruculosum PVERINU18, содержащего экзоинулиназу и целлюлазы, а также использование на стадии биосинтеза фумаровой кислоты иммобилизованного грибного биокатализатора с высокой фруктокиназной (кетогексокиназную) активностью, активированной за счет проращивания спор в фруктозосодержащей питательной среде. Использование топинамбура в качестве исходного растительного сырья и биокатализатора с высокой фруктокиназной (кетогексокиназной) активностью позволяют по сравнению с прототипом сократить процесс биосинтеза минимум на 1 стадию (Схема 1), так как процесс биоконверсии фруктозы в фумаровую кислоту на 1 стадию короче, чем гликолиз.
Таким образом, в результате выполнения предлагаемой последовательности действий при заявляемых условиях реализуется биотехнологический способ сбраживания гидролизатов топинамбура с последующим получением фумаровой кислоты путем биоконверсии компонентов гидролизатов под действием иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток гриба Rhizopus oryzae, в котором, в сравнении с прототипом:
1. Сокращена длительность ферментативной предобработки биомассы растительного сырья с 48 ч до 4 ч за счет использования измельченной биомассы топинамбура и ферментного препарата на основе рекомбинантного штамма мицелиального гриба Penicillium verruculosum PVERINU18 BКПMF-1291, содержащего экзо-, эндоинулиназы и целлюлазы;
2. Улучшены показатели процесса: продуктивности, конечной концентрации фумаровой кислоты, степени конверсии единицы субстрата в продукт, длительности эффективного использования грибного биокатализатора за счет оптимизированного состава ферментолизатов и использования биокатализатора в виде иммобилизованного грибного мицелия с повышенной фруктокиназную (кетогексокиназную) активностью.
Достижение в виде увеличенного срока эффективного использования иммобилизованных клеток на 20% и выше, отличающее заявляемое техническое решение от прототипа, позволяет решить важную экологическую и экономическую проблему, связанную с необходимостью утилизации отработанных иммобилизованных биокатализаторов за счет их более длительного использования.
Контроль накопления метаболитов в среде осуществляют известными методами (хроматографическими и спектрофотометрическими) с привлечением стандартного аналитического оборудования.
Приведенные примеры не охватывают все возможные варианты реализации заявляемого Технического решения для получения фумаровой кислоты, но всегда включают 2 основные стадии: предобработка биомассы топинамбура при использовании ферментных препаратов рекомбинантных штаммов мицелиального гриба Penicillium verruculosum с получением гидролизатов и последующая биоконверсия компонентов гидролизатов в фумаровую кислоту при использовании иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток гриба Rhizopus oryzae F1032.
Грибной биокатализатор может быть многократно использован в длительном биотехнологическом периодическом процессе. Так, например, после завершения одного рабочего цикла на стадии биосинтеза, среду, содержащую фумаровую кислоту, сливают через сетчатый фильтр, установленный в ферментере традиционной конфигурации, далее ее используют для выделения конечного продукта, а в ферментер вносят свежую порцию ферментолизатов, и осуществляют следующий рабочий цикл с использованием того же иммобилизованного грибного биокатализатора в тех же условиях.
Таким образом, заявляемый Способ обеспечивает получение технического результата, который, в сравнении с прототипом, состоит в улучшении показателей процесса получения фумаровой кислоты из растительного сырья: сокращении длительности ферментативной предобработки сырья как минимум в 4 раза, увеличении продуктивности процесса на стадии биосинтеза, увеличении конечной концентрации фумаровой кислоты, получаемой за один цикл в периодическом процессе до 23%, увеличение степени конверсии единицы субстрата в фумаровоую кислоту до 43%, увеличении длительности эффективного использования грибного биокатализатора на стадии биосинтеза более чем в 1,6 раз.
Следует отметить, что углеводный состав различных частей топинамбура неодинаков, так, в клубнях углеводы составляют 78±2% от сухого вещества, в зеленой части - 20±1% [М.А. ЯЩУК, Е.В. СОЛОВЬЕВА ТОПИНАМБУР - СЫРЬЕ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА КОМБИКОРМОВ // ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПИЩЕВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ, №4, 2007. 57-58]. Согласно биохимическим реакциям, которые сопровождают процесс биотрансформации углеводов в фумаровую кислоту под действием клеток грибного биокатализатора, максимальное значение теоретически возможной степени конверсии единицы глюкозы в фумаровую кислоту составляет 0,63. Таким образом, кажущиеся на первый взгляд незначительными улучшения технических результатов, достигаемые при реализации заявляемого способа получения фумаровой кислоты по сравнению с прототипом, являются существенными, так как обеспечивают как минимум 70%-ную степень конверсии углеводов, содержащихся в исходном растительном сырье, в фумаровую кислоту от теоретически возможного уровня.
Краткое описание чертежей
Рис. 1. Биохимические стадии получения фумаровой кислоты из простых сахаров.
Рис. 2. Состав гидролизатов измельченных клубней топинамбура под действием ферментного препарата Penicillium verruculosum PVERINU18 в различных дозировках. Дозирование ферментного препарата по белку: 1-5 мг/г сухого веса субстрата, 2-10 мг/г сухого веса субстрата. Время реакции - 3 ч, 50°С, рН 5,0 (без дополнительного внесения буфера). Концентрация субстрата - 100 г/л.
Ниже приводятся конкретные примеры, иллюстрирующие заявляемое техническое решение.
В Таблице 1 приведены примеры возможной реализации заявляемого Способа сбраживания гидролизатов топинамбура с последующим получением фумаровой кислоты при использовании ферментных препаратов рекомбинантных штаммов мицелиального гриба Penicillium verruculosum PVERINU18 и биокатализатора в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток гриба Rhizopus oryzae F1032.
Пример 1. Получение гидролизатов топинамбура.
Эксперимент проводили в термостатируемой при заданной температуре ячейке, помещенной в шейкер "INNOVA 40 Thermo Shaker" (США). На первой стадии, в сухую, чистую тару объемом 50 мл помещают измельченную биомассу топинамбура и добавляют 1 М натрий-ацетатный буфер рН 5,0 так, чтобы конечная концентрация субстрата составила 100 г/л в пересчете на сухой вес субстрата, и концентрация буфера в смеси составила 0,1 М. Эксперимент проводили при постоянном перемешивании (250 об/мин). Через час инкубации при 40°С в образце определяли рН и доводили его до рН 5,0 раствором 1М соляной кислоты.
На следующей стадии проводили гидролиз под действием ферментного препарата инулиназ и целлюлаз Penicillium verruculosum PVERINU18 при 50°С. Для этого в реактор, содержащий подготовленную биомассу топинамбура, загружают ферментный препарат из расчета 5 и 10 мг белка ферментного препарата/г субстрата в пересчете на сухой вес субстрата. Гидролиз проводят в течение 3 часов, рН 5,0. По окончании процесса гидролизат отделяют от негидролизованной биомассы с помощью пресса. Состав продуктов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Основными продуктами гидролиза клубней топинамбура являлись фруктоза, с небольшим выходом глюкозы.
Состав гидролизатов измельченных клубней топинамбура под действием ферментного препарата Penicillium verruculosum PVERINU18 в различных дозировках представлен на рисунке 1.
Пример 2. Способ получения фумаровой кислоты путем сбраживания (биоконверсии) гидролизатов топинамбура сорта Скороспелка в фумаровую кислоту под действием иммобилизованных в криогель ПВС клеток гриба Rhizopus oryzae 1032
Получают иммобилизованные в криогель ПВС споры мицелиального гриба R. oryzae F-1032. Для иммобилизации используют предварительно простерилизованный при 0,5 атм 12%-ый раствор ПВС в водопроводной воде. Суспензию спор, в физиологическом растворе смешивают с раствором ПВС так, чтобы ее содержание составляло 10% в итоговой смеси. Полученную суспензию спор мицелиального гриба R. oryzae F-1032 в растворе полимера заливают в дозирующее устройство и разливают в приемные устройства, которые далее охлаждают до -20°С в морозильной камере и выдерживают в замороженном состоянии не менее 16 ч. Гранулы с иммобилизованными в криогеле поливинилового спирта спорами размораживают при +8°С в течение 3-4 ч. Далее осуществляют проращивание спор путем погружения гранул в питательную среду, содержащую 70 г/л фруктозы, при 28°С в аэробных условиях в течение 48 ч. Сформированный иммобилизованный мицелий отделяют от культуральной жидкости фильтрованием.
Получение фумаровой кислоты осуществляется под действием иммобилизованных клеток мицелиального гриба в концентрации 65 г сух. в-в/л в аэробном реакторе с рабочим объемом 1 л, заполненным гидролизатом клубней топинамбура в количестве 0,3 л, полученном по примеру 1. При необходимости гидролизат предварительно разбавляют дистиллированной водой до достижения значения исходной концентрации восстанавливающих сахаров 70-100 г/л.
Культивирование проводят аэробно при 32°С и перемешивании 200 об/мин в течение 48 ч. После завершения процесса жидкую фазу, содержащую фумаровую кислоту, отделяют от грибного биокатализатора и осадка фильтрованием. Гранулы грибного иммобилизованного биокатализатора и некоторые частицы субстрата в виде осадка оставляют в реакторе. Далее к нему добавляют новую порцию ферментолизата, и стадию биосинтеза получения фумаровой кислоты повторяют.
Конечная концентрация фумаровой кислоты и продуктивность процесса на стадии биосинтеза составляет- 43 г/л и 0,9 г/л/ч, что превышает уровень прототипа на 23%. Общая длительность последовательного использования грибного мицелия, иммобилизованного в криогель поливинилового спирта, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием клубней топинамбура в качестве исходного сырья составляет 720 ч, что в 1,5 раза превосходит аналогичную характеристику прототипа.
Отделенную из рабочего реактора жидкую фазу, содержащую фумаровую кислоту, подтитровывают 1 М NaOH до рН 7÷8 и направляют на колонну АОН с анионообменным носителем АВ-17-8-чс.
Перед проведением процедуры очистки и выделения фумаровой кислоты готовят раствор элюента, содержащий 1 М NaCl. Перед помещением в колонну анионит АВ-17-8-чс два раза промывают двумя объемами дистиллированной воды, после чего его оставляют набухать в двух объемах 1 М раствора NaOH в течение 15-20 ч. Через 15-20 ч раствор щелочи заменяют на аналогичный и смесь интенсивно перемешивают. После такой обработки носитель промывают два раза двумя объемами дистиллированной воды. Для загрузки колонны анионитом к нему добавляют равный объем дистиллированной воды и полученную смесь заливают в колонну. Лишнее количество дистиллированной воды сливают.
Фильтрат культуральной жидкости пропускают через колонну со скоростью 0,03 м/ч, после чего промывают колонну двумя объемами дистиллированной воды с той же скоростью. В элюате ферментативным способом определяют количество фумаровой кислоты. Затем через колонну пропускают два объема раствора элюента со скоростью 0,03-0,60 м/ч. После элюирования фумаровой кислоты через колонну пропускают два объема дистиллированной воды. Каждые 10 циклов через колонну также пропускают один объем 1 М NaOH или два объема 0,5 М, после чего промывают колонну двумя объемами дистиллированной воды.
Полученный раствор фумаровой кислоты подкисляют 0,1 М HCl и выдерживают при 4°С в течение 24 ч, а затем фильтруют. Полученную кристаллическую форму фумаровой кислоты сушат в сушильной установке при 100-120°С.
Полученный продукт - фумаровую кислоту, расфасовывают в полипропиленовые или бумажные мешки и отправляют на хранение.
Получение фумаровой кислоты при использовании заявленного технического решения может также осуществляться и в других условиях, указанных в Таблице 1, аналогично тому, как это описано в Примере 1.