Способ применения маркерных белков для оценки экологического состояния окружающей среды
METHOD OF APPLICATION OF MARKER PROTEINS FOR ESTIMATION OF ECOLOGICAL STATE OF THE ENVIRONMENT

Изобретение относится к области физики в целом и к области биологии, используется в области экологического мониторинга, оценки экологического состояния окружающей среды и природоохранных мер.
Результативность природоохранных мер зависит от своевременного получения достоверных данных экологического мониторинга для оценки и диагностики, т.е. распознавания причин имеющегося на дату исследования экологического состояния окружающей среды.
Как известно, оценку экологического состояния окружающей среды выполняют различными способами, с использованием различных репрезентативных показателей среды, например - физических, химических, биологических, геологических.
Известно, что одним из высокоинформативных способов оценки экологической обстановки является способ биоиндикации, то есть выявление реакции живых организмов на изменение условий среды их обитания, например - загрязнение или очищение среды обитания.
Далее в тексте используется термин  Согласно [ru.wikipedia.org/…/]  - это живое тело, обладающее совокупностью свойств, отличающих его от неживой материи, в том числе обменом веществ, самоподдерживанием своего строения и организации, способностью воспроизводить их при размножении, сохраняя наследственные признаки.
Из исследованного уровня техники заявителем выявлен источник [Sladechek V. System of water quality from the biological point of view (Система оценки качества воды…) Arch. Hydrobiol. Ergeb. Limnol, 1973. - P. 179-191] [1]. Краткой сущностью известного технического решения является заключение об экологическом состоянии окружающей среды, которое делают на основе изучения обитающих в исследуемой среде живых организмов (видов-индикаторов), определяемых визуально и путем вручную выполняемых манипуляций.
Недостатком известного технического решения является высокая трудоемкость и сложность определения видов-индикаторов с одновременным использованием оптических приборов, справочников-определителей, необходимость привлечения специалистов высокой квалификации.
Из исследованного уровня техники заявителем выявлен источник [Определитель пресноводных беспозвоночных России и сопредельных территорий / под ред. С.Я. Цалолихина. - СПб.: Изд. «Наука», 1994. - 394 с.] [2]. Сущностью известного технического решения является способ идентификации вида-индикатора на основе выявления и анализа морфологических признаков индикаторного организма.
Недостатками известного способа являются существенная времязатратность осуществления идентификации вида-индикатора и зависимость результатов оценки по морфологическим признакам от квалификации и субъективности эксперта. Кроме того, известный способ обладает недостаточной разрешающей способностью и достоверностью результатов из-за существования видов-двойников, имеющих схожее внешнее строение и существующего в природе гетероморфного жизненного цикла некоторых живых организмов, то есть происходящего в течение жизни изменения внешнего вида определяемого организма.
Из исследованного уровня техники заявителем выявлен источник [Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA). Суть, принцип метода и этапы исследования. Анализ на антитела, классы антител, иммунный комплекс. http://www.polismed.com/articles-immunofermentnyjj-analiz-ifa-elisa-sut-princip-metoda-i-ehtapy-issledovanija.html] [3]. Сущностью известного технического решения является метод иммуноферментного анализа (ИФА), который используют для определения наличия антигенов возбудителей различных инфекций в растениях, животных, человеке и других материалах путем выявления свойственных этим возбудителям уникальных антигенов к маркерным белкам.
Недостатком известного технического решения является то, что известный метод не используют для оценки экологического состояния окружающей среды.
Наиболее близким к заявленному техническому решению по совпадающим признакам и назначению, выбранным заявителем в качестве прототипа, является изобретение по патенту RU №2451084 «Способ оценки экологического состояния водоемов» [4]. Сущностью прототипа является способ оценки экологического состояния водоемов, включающий отбор проб обитающих в водоеме планктонных организмов, определение уровня загрязнения окружающей среды путем их (планктонных организмов) анализа и оценку результатов анализа, характеризующийся тем, что определение уровня загрязнения осуществляют путем определения последовательностей любого консервативного и любого вариабельного генов планктонного организма из пробы с последующим молекулярным филогенетическим анализом для выявления эволюционных отношений исследуемого организма с сапробионтами, и оценку результатов выполняют следующим образом:
при высоком (более или равно 70%) значении бутстреп-поддержки кластера (полученного в результате филогенетического анализа консервативного гена), включающего исследуемый планктонный организм и устойчивые сапробионты, делают выводы:
- при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов ксено- или ксеноолигосапробных водоемов определяют, что водоем и окружающая его среда находятся в благополучном экологическом состоянии и угроза негативного, в том числе антропогенного, воздействия отсутствует;
- при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов олиго- или олигомезосапробных водоемов определяют, что водоем и окружающая его среда находятся в нестабильном (в переходном от благополучного к неблагополучному состоянию) экологическом состоянии, имеется несущественная негативная, в том числе антропогенная нагрузка, при этом природное сообщество обладает способностью или сохраняет способность к самовосстановлению и не нуждается в осуществлении дополнительных природоохранных мероприятий;
- при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов мезо- и/или мезополисапробных водоемов определяют, что водоем и окружающая его среда находятся в неблагополучном состоянии, испытывают существенную негативную, в том числе антропогенную нагрузку, при этом естественной способности природного сообщества к самовосстановлению недостаточно и исследуемая среда нуждается в осуществлении природоохранных мероприятий;
- при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов полисапробных водоемов делают вывод о наличии локальной экологической катастрофы и предпринимают безотлагательные восстановительные меры;
- при низком (менее 70%) значении бутстреп-поддержки кластера, полученного в результате молекулярного филогенетического анализа консервативного гена, выполняют молекулярный филогенетический анализ вариабельного гена и анализируют кластер, включающий исследуемый планктонный организм и устойчивые сапробионты, и делают выводы:
- при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов ксено- или ксеноолигосапробных водоемов определяют, что водоем и окружающая его среда находятся в благополучном экологическом состоянии и угроза негативного, в том числе антропогенного, воздействия отсутствует;
- при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов олиго- или олигомезосапробных водоемов определяют, что водоем и окружающая его среда находятся в нестабильном (в переходном от благополучного к неблагополучному состоянию) экологическом состоянии, имеется несущественная негативная, в том числе антропогенная нагрузка, при этом природное сообщество обладает способностью или сохраняет способность к самовосстановлению и не нуждается в осуществлении дополнительных природоохранных мероприятий;
- при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов мезо- и/или мезополисапробных водоемов определяют, что водоем и окружающая его среда находятся в неблагополучном состоянии, испытывают существенную негативную, в том числе антропогенную нагрузку, при этом естественной способности природного сообщества к самовосстановлению недостаточно и исследуемая среда нуждается в осуществлении природоохранных мероприятий.
- при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов полисапробных водоемов делают вывод о наличии локальной экологической катастрофы и предпринимают безотлагательные восстановительные меры.
Недостатками прототипа являются:
- используемый видовой состав организмов в пробе определяют визуально (с использованием микроскопа), на основе выявления морфологических (внешних) признаков, вследствие чего результат определения вида существенно зависит от субъективных факторов, например - остроты зрения, цветоощущения, квалификации, опыта, эмоционального состояния, степени усталости исследователя - эксперта. Кроме того, визуальный метод (работа с микроскопом) определения видового состава организмов в пробе является весьма трудозатратным, времязатратным процессом, сопровождается усталостью органов зрения эксперта со снижением внимательности, отрицательно влияющей на качество результатов наблюдения. Результат определения видового состава организмов в пробе по прототипу в немалой степени зависит от индивидуальности эксперта, и, как следствие, является субъективным. Субъективность результатов определения видов организмов в пробе снижает достоверность оценки экологической обстановки, сопровождается неумышленными ошибками, что нередко приводит к необходимости повторной биоиндикации с дополнительной затратой времени, с привлечением высококвалифицированных специалистов - биологов, химиков, врачей, дорогостоящего оборудования и реактивов. Как следствие, происходит нерациональная затрата времени - с увеличением количества анализов, возрастанием времени для достоверной диагностики экологической обстановки и принятия правильного решения для проведения оздоровительных мероприятий. В итоге природоохранные мероприятия выполняются со значительным запаздыванием;
- необходимость исследования генов для каждого организма, взятого из пробы, что существенно повышает трудоемкость процесса. Увеличение объема работ сопровождается возрастанием вероятности случайных ошибок. Ошибки сказываются на точности и достоверности результатов оценки экологического состояния исследуемой окружающей среды;
- прототип применим для оценки экологического состояния окружающей среды только при наличии водоемов в оцениваемой среде, то есть прототип применим ограниченно.
Целью заявленного технического решения является повышение точности и достоверности результатов экологического мониторинга, оценки экологического состояния окружающей среды и природоохранных мер посредством замены материалов локальных аналитических исследований с субъективными результатами оценки специалистов (людей) на результаты объективных инструментальных исследований, обеспечение возможности выполнения оценки экологического состояния окружающей среды менее квалифицированными специалистами, уменьшение трудоемкости работ, повышение производительности труда, сокращение сроков оценки уровня загрязнения и качества диагностики состояния окружающей среды - повышение качества факторов, в совокупности способствующих повышению результативности природоохранной деятельности и сохранению благоприятной среды обитания.
Техническим результатом заявленного технического решения является способ применения маркерных белков для оценки экологического состояния окружающей среды путем замены материалов локальных аналитических исследований с субъективными результатами оценки специалистов (людей) на результаты объективных инструментальных исследований.
Цели и технический результат достигают способом применения маркерных белков для оценки экологического состояния окружающей среды, включающий отбор из оцениваемой среды проб организмов с последующим анализом этих проб, характеризующимся тем, что при анализе идентификацию видового состава организмов из пробы осуществляют с применением маркерных белков живых организмов, обитающих в водной среде, а оценку экологического состояния окружающей среды производят в соответствии с идентифицированным видовым составом индикаторных организмов и их соотношением в пробе, то есть иммуноферментным анализом определяют количество маркерных белков каждого из индикаторных организмов в пробе, к которым получены антитела, суммируют количество маркерных белков, содержащихся в пробе индикаторных организмов, рассчитывают частоту встречаемости индикаторных организмов в пробе путем деления количества маркерного белка каждого организма на суммарное количество маркерных белков всех организмов в пробе, последующего суммирования произведений частоты встречаемости каждого индикаторного организма на его индикаторный вес и получают суммарный индикаторный вес (СИВ) организмов в пробе, по которому оценивают экологическое состояние окружающей среды; при СИВ менее 0,5 окружающую среду оценивают предельно чистой и благополучной; при СИВ от 0,5 до 1,5 окружающую среду оценивают чистой и благополучной, не нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий; при СИВ от 1,5 до 2,5 окружающую среду оценивают слабозагрязненной, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий по мере возможности; при СИВ от 2,5 до 3,5 окружающую среду оценивают умеренно загрязненной, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий, направленных на устранение отдельных видов загрязнителей и последствий их действия; при СИВ от 3,5 и более окружающую среду оценивают грязной и неблагополучной, нуждающейся в срочном выполнении комплексных природоохранных мероприятий.
Ниже заявителем приведены предварительные пояснения к Примерам конкретного осуществления заявленного технического решения.
Заявители ограничились Примерами с преимущественным использованием обитателей водной среды - планктона и зообентоса потому, что экологическое состояние находящегося на местности водоема безоговорочно, достоверно, в необходимом для восстановления нарушенного состояния окружающей среды объеме, отражает и характеризует экологическое состояние окружающей водоем неводной среды - прибрежной и примыкающей к ней почвы, растительности и обитателей почвы, окружающего воздуха и обитателей воздушной и наземно-воздушной среды. Характеризует потому, что водоем на местности является местом сбора атмосферных осадков (например - несущих информацию о воздушной среде дождей, снега, пыли, частиц воды в тумане), стоков талых и иных стекающих в водоем вод, опадающей листвы растений, смытых или сбитых насекомых - всех поступлений в водоем, несущих с собой (в водоем) влияющие на окружающую среду вещества. Все эти поступления (дождь, пыль, стоки, оседающий на водоем туман, талые воды и т.д.) из окружающей водоем среды сначала впитывают характеризующую отдельные составляющие окружающей среды информацию, например - в виде наличия (или отсутствия) неблагополучия среды. Затем, стекая, опадая, оседая в водоем, влияют на содержание водной среды и естественно - влияют на обитателей этой водной среды. По этой причине водоем является местом сбора и наиболее полной концентрации всей информации об окружающей водоем среде. А обитатели водоема, например - планктонные организмы, являются наиболее удобными модельными объектами исследования, оптимальным образом и полно характеризующими экологическое состояние окружающей среды. Руководствуясь этим бесспорным фактором, заявители ограничились количеством примеров и привели в качестве Примеров использование планктонных организмов - вездесущих обитателей водоемов.
Использование в качестве индикаторных организмов обитателей водной среды имеет информативное преимущество по сравнению с использованием обитателей других сред, которые отражают состояние только воздушной или только почвенной составляющей окружающей среды. Таким образом, использование индикаторных организмов - обитателей неводной среды менее информативно, а результаты оценки менее достоверны по сравнению с оценкой экологического состояния окружающей среды с использованием обитателей водоема. Например, использование муравьев позволяет оценить экологическое состояние преимущественно суши, использование пчел - преимущественно экологическое состояние суши и воздушной среды. Но использованием муравьев и пчел невозможно оценить экологическое состояние водной составляющей окружающей природной среды. Обитатели водной среды несут наиболее полную и достоверную информацию об экологическом состоянии окружающей среды. Поэтому заявитель ограничился Примерами с использованием индикаторных организмов из приоритетной водной среды. При использовании обитателей неводных сред, например - почв, водно-воздушной и наземно-воздушной, порядок действий аналогичен действиям, описанным в Примерах 1, 2, 3, 4, 5.
При отсутствии в регионе водоемов пробу составляют из организмов - обитателей этого региона, например, приспособившихся к самым суровым местным условиям постоянных обитателей пустынь - ящериц, змей, скорпионов, насекомых, растительности. Полное отсутствие индикаторных организмов для использования в качестве пробы на исследуемой местности, например - на вершинах гор высотой более 7 км, интерпретируют как полное отсутствие природных условий жизни на местности, не представляющее интерес как место обитания живых существ.
При этом применение иных, кроме обитателей водоема, видов индикаторных организмов - обитателей окружающей среды, например - почвенной, воздушно-водной, воздушно - наземной сред, как в отдельности, так и в любом их сочетании также позволяет оценивать экологическое состояние окружающей среды по заявленному техническому решению.
Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг. 1 - Фиг 4.
На Фиг. 1 приведена Таблица 1, в которой показан суммарный индикаторный вес зоопланктонных организмов (СИВ) по белку CO1.
На Фиг. 2 приведена Таблица 2, в которой показан суммарный индикаторный вес зоопланктонных организмов (СИВ) из озера Малое Глубокое по белку CO1.
На Фиг. 3 приведена Таблица 3, в которой показан суммарный индикаторный вес зообентосных организмов (СИВ) по белку CO1.
На Фиг. 4 приведена Таблица 4, в которой показан суммарный индикаторный вес фитопланктонных организмов (СИВ) по белку rbcL.
Далее заявителем приведены примеры конкретного осуществления заявленного технического решения.
Пример 1 с использованием присутствующих в международной базе данных аминокислотных последовательностей маркерных белков CO1 зоопланктонных организмов.
1.1 Для оценки экологического состояния окружающей среды в исследуемом регионе из расположенного там (в регионе) водоема известным способом [Винберг Г.Г. Методические рекомендации по сбору и обработке материалов при гидробиологических исследованиях на пресноводных водоемах. Зоопланктон и его продукция / Ред. Г.Г. Винберг, Г.М. Лаврентьева // Л.: ГосНИОРХ, ЗИН АН СССР, 1982. - 33 с.] [5], например - с использованием марлевого сачка - вылавливают и отбирают пробу зоопланктонных организмов. Пробу размещают в центрифугируемой пробирке, например - емкостью 50 мл, подвергают центрифугированию (например, на центрифуге СМ-6МТ), планктон отделяют от воды и анализируют, как описано ниже.
Следует отметить, что количество и разнообразие попавших в пробу видов зоопланктонных организмов на достоверность результата не влияет. Полное отсутствие зоопланктонных организмов в пробе интерпретируют как свершившуюся экологическую катастрофу. Этот случай в Примере 1 не рассматривают.
1.2 С применением маркерных белков определяют видовой состав зоопланктонных организмов в пробе, например - по фрагменту вариабельного митохондриального белка цитохром с оксидаза субъединица 1 (CO1).
1.2.1 Создают выборку аминокислотных последовательностей вариабельного митохондриального белка цитохром с оксидаза субъединица 1 (CO1) из международной базы данных, например - TrEMBL/SwissProt на сайте UniProt (http://www.uniprot.org/), для индикаторных видов зоопланктонных организмов, например - из списка В. Сладечека [1].
Случай, когда аминокислотные последовательности маркерных белков индикаторных видов зоопланктонных организмов отсутствуют в международной базе данных, например - TrEMBL/SwissProt, рассмотрен в Примере 2.
1.2.2 Осуществляют множественное выравнивание, например - с помощью программы Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), маркерных белков, например - цитохром с оксидаза субъединица 1 (CO1) и идентифицируют вариабельные участки аминокислотных последовательностей маркерного белка каждого вида индикаторных организмов, например - для белка цитохром с оксидаза субъединица 1 (CO1) один участок, например - длиной 10-20 аминокислотных остатков (далее по тексту - а.о.), например - а.о. в позиции 30-45 (NVIMDEQIYNMMVTAP) для Dissotrocha macrostyla gi|557477094| (индикаторный вес = 1,0), а.о. в позиции 152-162 (MGNLRTFGMTG) для Macrocyclops albidus gi|490344166| (индикаторный вес = 2,0), а.о. в позиции 157-170 (VSYVLSLEYLTLFS) для Rotaria neptunia gi|109892318| (индикаторный вес = 3,8). Индикаторный вес определяют по Сладечеку [1].
1.2.3 Получают антитела, специфически распознающие вариабельные участки маркерного белка каждого вида из организмов в пробе, например - для белка цитохром с оксидаза субъединица 1 (далее - CO1), например - для индикаторного организма Dissotrocha macrostyla (индикаторный вес = 1,0) - вариабельный участок NVIMDEQIYNMMVTAP, для Macrocyclops albidus (индикаторный вес = 2,0) - участок MGNLRTFGMTG, для Rotaria neptunia (индикаторный вес = 3,8) - участок VSYVLSLEYLTLFS. Для применения с удовлетворяющей практику достоверностью результатов оценки достаточно использование не менее трех индикаторных организмов, к маркерным белкам которых получают антитела - по одному организму, однозначно характеризующему зону сапробности водоема, например - олиго-, бетамезо-, поли- сапробный. К выбранному полипептидному участку маркерного белка CO1 зоопланктонного организма, например - NVIMDEQIYNMMVTAP для Dissotrocha macrostyla (олигосапробный), получают антитело по методике производителя антител, например - фирмы ООО Биалекса (Россия). Антитела получают с использованием стандартных моделей исследования животных, например - кролика (http://www.bialexa.ru/).
1.2.4 Полученные антитела накапливают в хранилище, например - в холодильнике при температуре минус 30°С, хранят и создают базу данных антител к маркерным белкам организмов. Базу данных используют для оценки экологической ситуации, причем - без потребности выполнения работ по пунктам 1.2.1-1.2.3. Созданная база данных маркерных белков зоопланктонных организмов применима для многократного использования при оценке экологического состояния среды в любом регионе мира. Таким образом, уменьшение объема обязательно выполняемых работ способствует повышению производительности труда при оценке экологического состояния окружающей среды в любом регионе мира.
1.2.5 Полученную пробу зоопланктонных организмов гомогенизируют в дистиллированной воде при соотношении вода : проба по объему 1:1 (один к одному), например - путем растирания (организмов) в ступе с чистым толченым стеклом, и получают гомогенат. Далее выполняют центрифугирование содержимого емкости с полученным гомогенатом, например - в течение 5 мин при скорости 14000 оборотов в минуту, и получают супернатант (надосадок). Супернатант помещают в новую чистую пробирку, и дальнейшие процедуры проводят с ним (супернатантом). Действия, описанные далее, выполняют раздельно для каждого антитела к маркерному белку организма, полученного на этапе 1.2.3.
1.2.6 Далее известным методом иммуноферментного анализа (ИФА) [Van Weemen B.K., Schuurs А.Н. (1971). "Immunoassay using antigen-enzyme conjugates". FEBS Letters 15 (3): 232-236. doi:10.1016/0014-5793(71)80319-8. PMID 11945853] [6] определяют количество (в нанограммах - нг) маркерных белков индикаторных зоопланктонных организмов в пробе, к которым были получены антитела, например - белок CO1 Dissotrocha macrostyla - 0,40 нг; белок CO1 Macrocyclops albidus - 0,05 нг; белок CO1 Rotaria neptunia - 0,05 нг. Суммарное Σ количество маркерных белков содержащихся в пробе индикаторных зоопланктонных организмов Σ=(0,40+0,05+0,05) нг=0,50 нг.
1.2.7 Рассчитывают частоту f встречаемости того или иного индикаторного зоопланктонного организма в пробе. Для расчета (частоты встречаемости) количество маркерного белка каждого зоопланктонного организма делят на суммарное количество маркерных белков всех зоопланктонных организмов в пробе.
1.2.8 Например - частота встречаемости Dissotrocha macrostyla f=0,40/(0,40+0,05+0,05)=0,40/0,50=0,80=0,8; частота встречаемости Macrocyclops albidus f=0,05/(0,40+0,05+0,05)=0,05/0,50=0,10; частота встречаемости Rotaria neptunia f=0,05/0,50=0,10=0,1.
1.3 Осуществляют оценку сапробности водоема путем суммирования произведений частоты встречаемости каждого индикаторного зоопланктонного организма на его индикаторный вес [1] и получают суммарный индикаторный вес зоопланктонных организмов в пробе, указывающий на сапробность водоема - например, у приведенных в Таблице 1 на Фиг. 1 видов зоопланктонных организмов суммарный индикаторный вес (далее СИВ) организмов в пробе равен:
СИВ=0,80×1,00+0,10×2,00+0,10×3,80=0,80+0,20+0,38=1,38.
1.4 Оценивают экологическое состояние окружающей среды (водоема или исследуемого объекта) по рассчитанному значению суммарного индикаторного веса зоопланктонных организмов в пробе СИВ=1,38 (Таблица 1). Суммарный индикаторный вес организмов в пробе СИВ=1,38 (в диапазоне 0,5<СИВ<1,5) соответствует о-b (олиго-бета) сапробности водоема [1], то есть водоем находится в состоянии переходном от чистого к умеренно-загрязненному. По состоянию водоема окружающую (водоем) среду характеризуют (оценивают) чистой и благополучной, в настоящее время не нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий.
ПРИМЕР 2 с использованием отсутствующих в международной базе данных аминокислотных последовательностей маркерных белков CO1 индикаторных видов зоопланктонных организмов.
2.1 Рассматривают случай, когда аминокислотные последовательности маркерных белков организмов, например - зоопланктонных, отсутствуют в базе данных, например -международной базе данных TrEMBL/SwissProt (http://www.uniprot.org/). То есть необходимо экспериментально получить нуклеотидные последовательности гена CO1 организмов с последующей трансляцией их в аминокислотные последовательности маркерного белка CO1 организмов.
2.2 Для оценки экологического состояния из исследуемого водоема известным способом [5], например - с использованием марлевого сачка, вылавливают и отбирают пробу зоопланктонных организмов. В качестве емкости для помещения пробы используют центрифугируемую пробирку, например - емкостью 50 мл. Количество и разнообразие попавших в пробу видов планктонных организмов на достоверность результата не влияет. Полное отсутствие планктонных организмов в пробе в определенной ситуации интерпретируют как свершившуюся экологическую катастрофу. Этот случай в Примере 2 не рассматривают.
2.3 Определяют видовой состав зоопланктонных организмов в пробе - например, по вариабельному митохондриалъному гену цитохром с оксидаза субъединица 1 (далее по тексту - CO1).
2.3.1 Для этого пробу зоопланктонных организмов просматривают при увеличении, например - под микроскопом Axio Lab.A1 (Carl Zeiss) и бинокуляром МБС-10, выделяют отдельный организм.
2.3.2 Описанные далее действия выполняют раздельно для каждого организма в пробе. Каждый отдельный организм помещают в отдельную емкость, например - пробирку, содержащую, например - 50 микролитров 7% водного раствора ионообменной смолы Chelex и инкубируют, например - в течение 20 мин при температуре не менее плюс 90°С, например - при плюс 99°С. Получают очищенную ДНК в водном растворе. Далее выполняют центрифугирование содержимого емкости с отобранным организмом, например - в течение 5 мин при скорости 14000 оборотов в минуту, получают ДНК-содержащий супернатант (надосадок). Супернатант помещают в новую чистую пробирку, и дальнейшие процедуры проводят с ним (супернатантом).
2.3.3 Осуществляют полимеразную цепную реакцию (далее по тексту - ПЦР) с использованием супернатанта в качестве матрицы. ПЦР проводят, например - в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 5-кратную реакционную смесь qPCRmix-HS (фирмы Евроген, Россия), бидистиллированную воду, 0,4 мМ прямого и обратного праймеров, например - 5'-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3' и 5'-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3'. Амплификацию осуществляют, например, 35-кратным повторением стадий в следующей последовательности: денатурация (при плюс 95°С, 30 секунд), отжиг (+59°С, 30 сек) и элонгация (полимеризация при +72°С, 120 сек), - используя известную комбинацию праймеров - 5'-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3' и 5'-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3' [Folmer О. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome с oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates / O. Folmer, M. Black, W. Hoeh, R. Lutz, R. Vrijenhoek // Mol. Mar. Biol. Biotechnol. - 1994. - V. 3. - P. 294-299] [7]. Таким образом получают достаточное для дальнейших процедур количество определенного (конкретного) фрагмента ДНК митохондриального гена цитохром с оксидаза субъединица 1 (CO1). Фрагмент ДНК, например - CO1, является уникальным (единственным в своем роде) вариабельным фрагментом гена, свойственным каждому виду среди всех видов живых организмов, что обеспечивает высокодостоверное, с точностью 99,9%, определение конкретного организма до вида. При этом для практического применения достаточно определение организма с точностью не менее 90%, то есть определение организма по вариабельным фрагментам гена в полной мере обеспечивает потребную для промышленного применения достоверность результатов.
2.3.4 Продукты ПЦР детектируют и очищают, например - электрофорезом в горизонтальном 1% агарозном геле. В качестве электродного буферного раствора для электрофореза используют, например, однократный раствор 2-амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диола уксусной кислоты и этилендиаминтетраацетатной кислоты с pH 8,1 (далее по тексту - ТАЕ). Для нанесения проб используют буферный красящий раствор, например - состава: 10 тМ Трис-HCl, рН 7,8, 50 тМ ЭДТА, 0,03% бромфенолового синего, 0,03% ксилен цианолового, 15% глицерина. Пробу с красителем смешивают в соотношении 4:1 (8:2 мкл). Электрофорез проводят, например - при силе тока 50 мА, гель просматривают в ультрафиолетовом свете, например - на трансиллюминаторе Vilber Lourmat (Франция). Проявляют ДНК (полученную в результате ПЦР, пункт 1.2.1), добавляя в агарозу флуоресцирующий в ультрафиолетовом свете бромистый этидий в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Проявленная ДНК становится видимой в ультрафиолетовом свете, что подтверждает наличие ДНК в пробе.
2.3.5 Продукты ПЦР-амплификации выделяют из агарозного геля, например - с помощью набора реактивов фирмы Eurogen (Новосибирск, РФ) по методике производителя, путем добавления в 200 мкл лизирующего раствора (из набора) 200 мкг агарозного геля, содержащего определенный фрагмент ДНК, например - митохондриальный ген цитохром с оксидаза субъединица 1 (CO1). Смесь лизирующего раствора и агарозного геля инкубируют в водяной бане при температуре плюс 55°С до полного растворения геля. Полученный раствор переносят в фильтрующую колонку, вставленную в собирательную колонку (из набора Eurogen, Новосибирск, РФ), и инкубируют при комнатной температуре в течение 120 сек. После этого раствор центрифугируют 60 сек при скорости вращения 5000 об/мин и сливают содержимое собирательной колонки. После центрифугирования в фильтрующей колонке остается смесь фрагмента ДНК с посторонними веществами. Смесь (остаток) промывают буферным раствором, например - известным Wash buffer.
2.3.6 Для промывания смеси фильтрующую колонку вставляют обратно в собирательную колонку, затем в фильтрующую колонку добавляют 50 мкл промывочного раствора и центрифугируют, например - в течение 60 сек при 8000 об/мин. Процедуру промывки повторяют не менее двух раз, до получения чистой ДНК. После промывания чистая ДНК остается на мембране фильтрующей колонки. Использованную собирательную колонку заменяют на чистую пробирку емкостью 1,5 мл. Фильтрующую колонку с чистой ДНК вставляют в чистую пробирку. Затем ДНК элюируют добавлением 30 мкл буферного раствора (из набора) для элюции в фильтрующую колонку и буферным раствором смывают ДНК в пробирку. После выполнения всех вышеописанных процедур в пробирке получают раствор, содержащий определенный фрагмент ДНК отдельного организма, например - митохондриальный ген цитохром с оксидаза субъединица 1 (CO1).
2.3.7 Далее с помощью операции секвенирования определяют нуклеотидную последовательность (порядок расположения нуклеотидов) фрагмента ДНК. Операцию проводят, например, в 20 мкл реакционной смеси, содержащей воду, ДНК, 5-кратный буферный раствор TMS, 2,5-кратный Ready Reaction Premix и 3.3 мМ праймеры. Операцию секвенирования осуществляют, например, 35-кратным повторением. Результат расшифровывают, например - с помощью автоматического генетического анализатора ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) согласно инструкциям производителя [Watts D. Automated fluorescent DNA sequencing on the ABI PRISM 310 Genetic Analyzer / D. Watts, J.R. MacBeath // Methods Mol Biol. 2001. - P. 167, 153-170] [8]. Получают сиквенсные хроматограммы.
2.3.8 Результаты секвенирования обрабатывают, например - программным пакетом Lasergene 5.03 (DNA STAR, Inc., США) и программным пакетом SeqMan для анализа сиквенсных хроматограмм, получают нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК отдельного организма, например - митохондриального гена цитохром с оксидаза субъединица 1 (CO1).
2.3.9 Затем проводят конвертацию (трансляцию) полученной нуклеотидной последовательности, например - гена CO1 зоопланктонного организма, в аминокислотную последовательность белка, например - белка CO1 зоопланктонного организма, с использованием стандартного генетического кода специализированной компьютерной программы, например - ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf).
2.3.10 Далее проводят такие же действия, как в Примере 1: п.п. 1.2.2-1.2.7; 1.3; 1.4, и оценивают экологическое состояние окружающей среды (водоема или исследуемого объекта) по рассчитанному значению суммарного индикаторного веса (СИВ) организмов в пробе.
Пример 3 с результатом сопоставления заявленного технического решения с результатами экспертной оценки экологического состояния водоема - озера Малое Глубокое и окружающей озеро природной среды. Оценка состояния озера и окружающей природной среды по материалам [Экология города Казани. - Казань: Изд-во АН РТ, 2005. - 527 с.] [9, Табл. 19, С. 126] - Благополучное (умеренно-загрязненное).
По заявленному способу с применением маркерных белков для определения видов индикаторных организмов, выполнена оценка экологического состояния озера Малое Глубокое, расположенного на территории г. Казани Республики Татарстан и окружающей озеро природной среды. Результат оценки по заявленному способу (с использованием маркерных белков) летом 2014 г. сопоставлен с оценкой экспертов-экологов, выполненной известным способом, где виды индикаторных организмов определены визуально, под микроскопом. Последовательность действий:
3.1 Отбирают пробы организмов из находящегося в оцениваемой окружающей среде озера Малое Глубокое.
3.2 Действуя вышеописанным путем (Пример 1), определяют индикаторные виды зоопланктона с применением маркерных белков CO1, рассчитывают частотное содержание и суммарный индикаторный вес (СИВ) индикаторных видов зоопланктона в пробе, см. Таблицу 2 на Фиг. 2.
3.3 Сначала оценивают экологическое состояние водоема на этой местности - озера Малое Глубокое по рассчитанному значению суммарного индикаторного веса организмов в пробе СИВ=1,39 (Таблица 2 на Фиг. 2). Суммарный индикаторный вес организмов в пробе СИВ=1,39 (в диапазоне 0,5<СИВ<1,5) соответствует о-b (олиго-бета) сапробности водоема [1], то есть водоем находится в состоянии переходном от чистого к умеренно-загрязненному. По состоянию водоема окружающую (водоем) среду характеризуют чистой и благополучной, не нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий, что полностью совпадает с экспертной оценкой и подтверждается тем, что местность является популярным местом отдыха.
ПРИМЕР 4 с использованием других (отличных от зоопланктона) индикаторных организмов - зообентоса.
Зообентос - совокупность донных животных, обитающих на грунте и в грунте морских и континентальных водоемов.
4.1. Для оценки экологического состояния региона из расположенного там (в регионе) водоема известным способом [Методические рекомендации по сбору и обработке материалов при гидробиологических исследованиях на пресноводных водоемах. Зообентос и его продукция. / Ред. Г.Г. Винберг, Г.М. Лаврентьева. - Л.: ГосНИОРХ, ЗИН АН СССР. - 51 с.] [10], например - с использованием дночерпателя - отбирают пробу зообентосных организмов. Пробу размещают в центрифугируемой пробирке, например -емкостью 50 мл. Количество и разнообразие попавших в пробу видов зообентосных организмов на достоверность результата не влияет. Полное отсутствие зообентосных организмов в пробе интерпретируют как свершившуюся экологическую катастрофу. Случай отсутствия зообентосных организмов в пробе в Примере 4 не рассматривают.
4.2 С применением маркерных белков определяют видовой состав зообентосных организмов в пробе, например - по фрагменту вариабельного митохондриального белка цитохром с оксидаза субъединица 1 (далее по тексту - CO1).
4.2.1 Создают выборку аминокислотных последовательностей вариабельного митохондриального белка CO1 из международной базы данных, например -TrEMBL/SwissProt на сайте UniProt (http://www.uniprot.org/), для индикаторных видов зообентосных организмов, например - из списка В. Сладечека [1].
4.2.2 Осуществляют множественное выравнивание, например - с помощью программы Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), маркерных белков, например - CO1 и идентифицируют вариабельные участки аминокислотных последовательностей маркерного белка каждого вида индикаторных зообентосных организмов, например - для белка CO1 один участок, например - длиной 10-20 аминокислотных остатков (далее по тексту - а.о.), например - а.о. в позиции 177…192 (FGMSLDRIPLFVWAVV) для Camptocercus rectirostris АВС42000 (индикаторный вес = 1,2), а.о. в позиции 117…139 (GSAFVEQGVGTGWTVYPPLAGIQ) для Ephydatia fluviatilis АЕА11208 (индикаторный вес = 2,0), а.о. в позиции 136…149 (AASIAHSGPSVDLG) для Asellus aquaticus AJD09438 (индикаторный вес = 2,8). Индикаторный вес определяют по Сладечеку [1].
4.2.3 Получают антитела, специфически распознающие вариабельные участки маркерного белка каждого вида из зообентосных организмов в пробе, например - для белка CO1, например - для индикаторного организма Camptocercus rectirostris (индикаторный вес = 1,2) - вариабельный участок FGMSLDRIPLFVWAVV, для Ephydatia fluviatilis (индикаторный вес = 2,0) - участок GSAFVEQGVGTGWTVYPPLAGIQ, для Asellus aquaticus (индикаторный вес = 2,8) - участок AASIAHSGPSVDLG. Для практического применения достаточно использование не менее трех индикаторных организмов, к маркерным белкам которых получают антитела - по одному организму, однозначно характеризующему зону сапробности водоема, например - олиго- или бетамезо-, или полисапробный. К выбранному полипептидному участку маркерного белка CO1 зообентосного организма, например - FGMSLDRIPLFVWAVV для Camptocercus rectirostris (олигосапробный), получают антитело по методике производителя антител, например - фирмы ООО Биалекса (Россия). Антитела индикаторных организмов получают с использованием стандартных моделей исследования (http://www.bialexa.ru/).
4.2.4 Полученные антитела накапливают в хранилище, например - в холодильнике при температуре минус 30°С, создают базу данных антител к маркерным белкам зообентосных организмов. Базу данных используют для оценки экологической ситуации. Созданная база данных применима для многократного использования при оценке экологического состояния окружающей среды в любом регионе мира. При этом становится ненужным многотрудное, требующее особо высокой квалификации определение видов индикаторных организмов в отобранных пробах, что существенно ускоряет, упрощает и удешевляет процесс оценки экологического состояния окружающей среды. Таким образом, уменьшение объема обязательно выполняемых работ способствует повышению производительности труда по оценке экологического состояния среды.
4.2.5 Полученную пробу зообентосных организмов гомогенизируют в дистиллированной воде при соотношении вода : проба по объему 1:1 (один к одному), например - путем растирания (организмов) в ступе с чистым толченым стеклом, и получают гомогенат. Далее выполняют центрифугирование содержимого емкости с полученным гомогенатом, например - в течение 5 мин при скорости 14000 оборотов в минуту, и получают супернатант (надосадок). Супернатант помещают в новую чистую пробирку, и дальнейшие процедуры проводят с ним (супернатантом). Далее действия выполняют раздельно для каждого антитела к маркерному белку организма, полученного на этапе 1.2.3.
4.2.6 Известным методом иммуноферментного анализа (далее по тексту - ИФА) [8] определяют количество (в нанограммах - нг) маркерных белков индикаторных организмов в пробе, к которым (белкам) были получены антитела, например - белок CO1 Camptocercus rectirostris - 0,10 нг; белок CO1 Ephydatia fluviatilis - 0,20 нг; белок CO1 Asellus aquaticus - 0,40 нг. Определяют суммарное Σ количество содержащихся в пробе индикаторных организмов маркерных белков Σ=(0,10+0,20+0,40) нг=0,70 нг.
4.2.7 Рассчитывают частоту f встречаемости того или иного индикаторного организма в пробе. Для расчета количество маркерного белка каждого организма делят на суммарное Σ количество маркерных белков всех организмов в пробе и получают частоту f встречаемости конкретного организма в пробе. Так, например - частота встречаемости f Camptocercus rectirostris f=0,10/0,70=0,14; частота встречаемости Ephydatia fluviatilis f=0,20/0,70=0,29; частота встречаемости Asellus aquaticus f=0,40/0,70=0,57 то есть частоты встречаемости индикаторных организмов в пробе соотносятся как 0,14:0,29:0,57.
4.3 Осуществляют оценку сапробности водоема путем суммирования произведений частоты f встречаемости каждого индикаторного организма на его индикаторный вес [1] и получают суммарный индикаторный вес организмов в пробе. Суммарный индикаторный вес организмов в пробе указывает сапробность водоема - например, у приведенных в Таблице 3 на Фиг. 3 видов организмов суммарный индикаторный вес (далее по тексту - СИВ) зообентосных организмов в пробе равен:
СИВ=0,14×1,2+0,29×2,0+0,57×2,8=0,17+0,58+1,62=2,37
4.4 По рассчитанному значению суммарного индикаторного веса организмов в пробе СИВ=2,37 (Табл. 3) оценивают экологическое состояние окружающей среды, например - водоема (и/или исследуемого объекта). Суммарный индикаторный вес организмов в пробе СИВ=2,37 по [1] соответствует b - Мезосапробному (бета-мезосапробному) водоему. В соответствии с эколого-санитарной классификацией качества поверхностных вод суши по гидробиологическим показателям [Жукинский В.Н., Оксиюк О.П., Олейник Г.Н., Кошелева С.И. Принципы и опыт построения экологической классификации качества поверхностных вод суши // Гидробиол. журн. - 1981. - 17, №2. - С. 38-49] [11], b - мезосапробная зона по индексу загрязненности 2,37 (в диапазоне 1,5<СИВ<2,5) соответствует третьему классу качества воды - «Удовлетворительной чистоты», т.е. водоем находится в состоянии слабо-загрязненном. В соответствии с состоянием водоема окружающую водоем среду оценивают слабозагрязненной, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий по мере возможности.
ПРИМЕР 5 с использованием другого (отличного от CO1) маркерного белка - rbcL других (отличных от зоопланктона) индикаторных организмов - фитопланктона.
Фитопланктон - совокупность свободно дрейфующих в толще воды морских и континентальных водоемов организмов, которые могут осуществлять процесс фотосинтеза; фитопланктон является первичным продуцентом органического вещества в водоеме и служит пищей для зоопланктона и зообентоса.
5.1 Для оценки экологического состояния региона из расположенного там (в регионе) водоема известным способом [Абакумов В.А. (ред.) Руководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и донных отложений. Л.: Гидрометеоиздат, 1983. - 240 с.] [12], например - с использованием батометра - отбирают пробу фитопланктонных организмов. Пробу размещают в центрифугируемой пробирке, например - емкостью 50 мл. Количество и разнообразие попавших в пробу видов фитопланктонных организмов на достоверность результата не влияет. Отсутствие фитопланктонных организмов в пробе интерпретируют как свершившуюся экологическую катастрофу. Этот случай в Примере не рассматривают.5.2 С применением маркерных белков определяют видовой состав фитопланктонных организмов в пробе, например - по фрагменту хлоропластного продукта гена (белка) ribulose 1-5 bifosfaat carboxylase Large subunit (rbcL).
5.2.1 Создают выборку аминокислотных последовательностей хлоропластного белка rbcL из международной базы данных, например - TrEMBL/SwissProt на сайте UniProt (http://www.uniprot.org/), для индикаторных видов фитопланктонных организмов, например - из списка В. Сладечека [1].
5.2.2 Осуществляют множественное выравнивание, например - с помощью программы Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), маркерных белков, например - rbcL и идентифицируют уникальные вариабельные участки аминокислотных последовательностей маркерного белка каждого вида индикаторных организмов, например - для белка rbcL один участок, например - длиной 10…20 аминокислотных остатков (далее по тексту - а.о.), например - а.о. в позиции 128…141 (XLGFKXVSALRLEN) для Gomphonema capitatum ААТ78574 (индикаторный вес = 1,0), а.о. в позиции 354…373 (ETKLDINLPQGLFFEMDWAA) для Vaucheria geminata AAN86809 (индикаторный вес = 2,0), а.о. в позиции 54…79 (LYRAKAYRVDPVPGAADQYFAYIAYE) для Cryptomonas ovate BAF80668 (индикаторный вес = 3,0). Индикаторный вес определяют по Сладечеку [1].
5.2.3 Получают антитела, специфически распознающие вариабельные участки маркерного белка каждого вида фитопланктона из организмов в пробе, например - для белка rbcL, например - для индикаторного организма Gomphonema capitatum (индикаторный вес = 1,0) - вариабельный участок XLGFKXVSALRLEN, для Vaucheria geminata (индикаторный вес = 2,0) - участок ETKLDINLPQGLFFEMDWAA, для Cryptomonas ovate (индикаторный вес = 3,0) - участок LYRAKAYRVDPVPGAADQYFAYIAYE. Для практического применения достаточно использование не менее трех индикаторных организмов, к маркерным белкам которых получают антитела - по одному организму, однозначно характеризующему зону сапробности водоема, например - олиго-, бетамезо-, полисапробный. К выбранному полипептидному участку маркерного белка rbcL организма, например - XLGFKXVSALRLEN для Gomphonema capitatum (олигосапробный), получают антитело по методике производителя антител, например - фирмы ООО Биалекса (Россия). Антитела получают с использованием стандартных моделей исследования животных, например - кролика (http://www.bialexa.ru/).
5.2.4 Полученные антитела накапливают в хранилище, например - в холодильнике при температуре минус 30°С, создают базу данных антител к маркерным белкам организмов. Эту базу данных используют для оценки экологической ситуации. Созданная база данных универсальна и применима для многократного использования при оценке экологического состояния окружающей среды в любом регионе мира. Универсальность базы данных способствует уменьшению объема обязательно выполняемых работ, например - от каждый раз выполняемого с использованием микроскопа определения видов индикаторных организмов в пробе, способствует повышению производительности труда и достоверности результатов при оценке экологического состояния окружающей среды.
5.2.5 Полученную пробу фитопланктонных организмов гомогенизируют в дистиллированной воде при соотношении вода : проба по объему 1:1 (один к одному), например - путем растирания (организмов) в ступе с чистым толченым стеклом, и получают гомогенат. Далее выполняют центрифугирование содержимого емкости с полученным гомогенатом, например - в течение 5 мин при скорости 14000 оборотов в минуту, и получают супернатант (надосадок). Супернатант помещают в новую чистую пробирку, и дальнейшие процедуры проводят с ним (супернатантом). Действия, описанные далее, выполняют раздельно для каждого антитела к маркерному белку организма, полученного на этапе 1.2.3.
5.2.6 Далее известным методом иммуноферментного анализа (ИФА) [6] определяют количество (в нанограммах - нг) маркерных белков индикаторных организмов в пробе, к которым были получены антитела, например - белок rbcL организма Gomphonema capitatum - 0,05 нг; белок rbcL организма Vaucheria geminata - 0,15 нг; белок rbcL организма Cryptomonas ovate - 0,50 нг.
Суммарное Σ количество маркерных белков содержащихся в пробе индикаторных фитопланктонных организмов Σ=(0,05+0,15+0,50)=0,70 нг.
5.2.7 Рассчитывают частоту встречаемости того или иного индикаторного организма в пробе - подобно приведенному в Примере 4: количество маркерного белка каждого организма делят на суммарное количество маркерных белков всех организмов в пробе, например - частота f встречаемости организма Gomphonema capitatum f=0,05/0,70=0,07; частота встречаемости организма Vaucheria geminata f=0,15/0,70=0,21; частота встречаемости организма Cryptomonas ovate f=0,50/0,70=0,72.
5.3. Осуществляют оценку сапробности водоема путем суммирования произведений частоты f встречаемости каждого индикаторного организма на его индикаторный вес [1] и получают суммарный индикаторный вес организмов в пробе, указывающий на сапробность водоема - например, у приведенных в Таблице 4 на Фиг. 4 видов организмов суммарный индикаторный вес (далее СИВ) организмов в пробе равен:
СИВ=0,07×1,0+0,21×2,0+0,72×3,0=0,07+0,42+2,16=2,65
5.4 По рассчитанному значению суммарного индикаторного веса организмов в пробе СИВ=2,65 (Таблица 4 на Фиг. 4) оценивают экологическое состояние окружающей среды, например - (водоема или исследуемого объекта). Суммарный индикаторный вес организмов в пробе СИВ=2,65 (в диапазоне 2,5<СИВ<3,5) соответствует [1] α-мезосапробной зоне качества воды водоема. В соответствии с эколого-санитарной классификацией качества поверхностных вод суши по гидробиологическим показателям [11], α-мезосапробная зона по индексу загрязненности 2,65 соответствует четвертому классу качества воды - «загрязненная», т.е. водоем находится в умеренно загрязненном состоянии. В соответствии с состоянием водоема окружающую водоем среду оценивают умеренно загрязненной, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий, направленных на устранение отдельных видов загрязнителей и последствий их действия.
Из результатов, приведенных в Примере 3, следует, что с применением прототипа оценка экологического состояния окружающей озеро Малое Глубокое природной среды выполнена с участием 2-х специалистов, один из которых - особо высококвалифицированный специалист в области определения видов организмов по морфологическим признакам. Благодаря участию высококвалифицированного специалиста достоверный результат получен с затратой 42 человеко-часов.
Результат оценки по прототипу: по уровню загрязнения водоем соответствует o-b - мезосапробной зоне, вода относится ко второму классу качества - умеренно-загрязненная. По состоянию водоема окружающую (водоем) среду характеризуют умеренно-загрязненной, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий, направленных на устранение отдельных видов загрязнителей и последствий их действия.
По заявленному техническому решению, оценка экологического состояния окружающей водоем среды выполнена через биоиндикацию водоема - того же озера Малое Глубокое с применением маркерных белков. Оценка выполнена также двумя специалистами, осваивающими заявленный способ и имеющими существенно менее высокую (по сравнению с экспертом по прототипу) квалификацию, с затратой 42 человеко-часов рабочего времени.
Результат оценки с применением маркерных белков: по уровню загрязнения озеро Малое Глубокое соответствует о-b - мезосапробной зоне, вода относится ко второму классу качества - умеренно-загрязненная [13]. По состоянию водоема окружающую (водоем) среду характеризуют умеренно-загрязненной, что полностью совпадает с экспертной оценкой. По факту, расположенные в лесном массиве озеро и окружающая территория являются умеренно-загрязненными, местом редкого пребывания людей. То есть, результат оценки экологического состояния окружающей среды, выполненной с применением маркерных белков, без привлечения специалистов высокой квалификации, совпадает с результатом работы высококвалифицированных специалистов.
Таким образом, результат оценки с использованием заявленного способа применения маркерных белков является высокодостоверным, не противоречит результатам оценки по известному способу, визуально осуществленному с привлечением специалистов особо высокой квалификации. Осуществленная менее квалифицированными специалистами оценка качества воды в озере МАЛОЕ ГЛУБОКОЕ с применением маркерных белков достоверно совпадает с результатом определения видов по прототипу, визуально выполненным высококвалифицированными специалистами. То есть, оценка экологического состояния окружающей среды путем применения маркерных белков для биоиндикации находящегося на местности водоема и окружающей среды, выполненная менее квалифицированными (по сравнению с прототипом) работниками по упрощенной процедуре, не снижает достоверности оценки экологического состояния озера и соответственно - достоверности оценки окружающей среды. Совпадение результатов оценки менее квалифицированных специалистов с результатом оценки высококвалифицированных специалистов позволяет считать высокодостоверным результат работы и менее квалифицированных исследователей. Обеспечиваемая применением заявленного технического решения возможность замены труда редких специалистов высокой квалификации трудом более распространенных (по сравнению со специалистами высокой квалификации) специалистов менее высокой квалификации, причем - без утраты достоверности результатов работы, делает возможным выполнение массовых исследований экологического состояния окружающей среды для выявления нарушений природоохранных законов. Уменьшение, по сравнению с прототипом, трудоемкости оценочных работ, их упрощение, способствуют повышению производительности труда, сокращению сроков оценки уровня загрязнения и диагностики состояния окружающей среды. Все это в совокупности способствует своевременному выявлению нарушений экологического состояния окружающей среды, со знанием дела выполненному планированию и осуществлению природоохранных работ, а текущий контроль в ходе этих работ способствует повышению их результативности. Способ применения маркерных белков для оценки экологического состояния окружающей среды позволяет менее квалифицированным специалистам выполнять работу по оценке экологической обстановки с качеством результатов оценки на уровне высококвалифицированного специалиста.
Возможность замены высококвалифицированного специалиста менее квалифицированными работниками позволяет без ущерба для качества, с высокой достоверностью результатов, выполнить массовые исследования экологического состояния окружающей среды, и по результатам исследований - своевременно (не запоздало, как часто бывает при использовании известных способов определения экологической обстановки) спланировать и выполнить природоохранные работы с высоким качеством. То есть, применение заявляемого технического решения повышает качество результатов работы (оценки экологического состояния окружающей среды) при массовых исследованиях, которые, как правило, выполняются в условиях нехватки специалистов высококвалифицированных - ввиду их малочисленности, ограничивающей их привлечение к массовым исследованиям.
Созданную и пополняемую базу данных антител к маркерным белкам организмов в дальнейшем используют для оценки экологической ситуации, причем - уже без проведения ранее обязательно выполняемых работ, например - по пунктам 1.2.1-1.2.3. База данных востребована и применима при оценке экологического состояния окружающей среды в любом регионе мира, вне зависимости от географического местоположения оцениваемой территории. Таким образом, применение заявляемого технического решения, уменьшающего (по сравнению с прототипом) объем ранее обязательно выполняемых долговременных работ, способствует повышению производительности труда по оценке экологического состояния окружающей среды.
Оценку экологического состояния окружающей среды с использованием приведенных в примерах видов организмов не ограничивает область применения заявляемого технического решения. Аналогично ПРИМЕРАМ 1, 2, 3, 4, 5 оценку экологического состояния окружающей среды по заявленному техническому решению, с применением маркерных белков, выполняют с использованием иных, кроме приведенных в примерах, любых индикаторных организмов, например, обитающих в наземно-воздушно-водной среде организмов:
- рыб [1], например - вида Scardinius erythrophthalmus (L.) (Красноперка), с использованием фрагментов белков CO1 - GenPept: AIC75815 [Международная база данных аминокислотных последовательностей GenPept - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein] [14];
- водных высших растений [1], например - вида Ceratophyllum demersum (Роголистник темно-зеленый) с использованием фрагментов белков CO1 - GenPept: AAG60239 [14];
- зообентоса [1], например - вида Bosmina longirostris (Вид водной блохи) с использованием фрагментов белков CO1 - GenPept: ACD86052 [14];
- фитопланктона [1], например - вида Navicula cryptocephala (Диатомовые водоросли) с использованием фрагментов белков CO1 - GenPept: ADP04043 [14];
- простейших [1], например - вида Bodo saltans с использованием фрагментов белков CO1 - GenPept: ААС38978 [14];
- пчел [Бондарева Н.В. Использование медоносных пчел как биоиндикаторов загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами // Фундаментальные исследования №10, 2005. - С. 76] [15], например - вида Lasioglossum hybodinum, с использованием фрагментов белков CO1 - GenPept: AAF14175 [14];
- муравьев М.И. [Сарапий М.И. Муравьи - биологические индикаторы состояния окружающей среды в городских экосистемах // Вестник Российской военно-медицинской академии. 2008. №3 (23). Приложение 2. - С. 55] [16], например - вида Lasius californicus, с использованием фрагментов белков CO1 - GenPept: ADB92700 [14];
- растений [http://ru.scribd.com/doc/67587174/]. например - вида Plantago major (Подорожник большой), с использованием фрагментов белков CO1 - GenPept: ACD44443 [14].
Заявленный способ не ограничивается использованием маркерных белков только пресноводных организмов, например - зоопланктона. Выше приведены примеры (четвертый и пятый) с использованием в качестве индикаторных иных, отличных от зоопланктона, организмов, например - зообентоса (совокупности донных животных, обитающих на грунте и в грунте морских и континентальных водоемов) и растений в виде фитопланктона (являющегося пищей, в том числе морских млекопитающих - китов), как наиболее доступных и информативных объектов исследования, а также пример другого, отличного от COI, маркерного белка - rbcL [http://www.dnabarcoding101.org/files/using-dna-barcodes.pdf: стр. 4, последний абзац].
Кроме того, могут быть использованы и иные маркерные белки для других индикаторных организмов, например - продукт гена matK - для наземных растений; trnH-psbA - для водных растений; [Peter М. Hollingsworth, Sean W. Graham, Damon P. Little Choosing and Using a Plant DNA Barcode // PLoS ONE: e19254, V. 6 (5), 2011]; ITS - для грибов [http://www.dnabarcoding101.org/files/using-dna-barcodes.pdf: стр. 4, последний абзац].
Признак «маркерный белок» обобщен заявителем с учетом возможности использования для достижения заявленных целей технического решения (применение маркерных белков для оценки экологического состояния окружающей среды) маркерных белков, извлекаемых из широкого перечня обитающих в окружающей природной среде организмов - обитателей земной, водной, воздушной, земно-водной, земно-воздушной, водно-воздушной сред.
В прототипе видовой состав, используемых для оценки экологического состояния среды индикаторных организмов, определяют визуально, причем каждый раз - с локальным (на конкретном объекте) отбором проб и анализом морфологических признаков индикаторного организма. При этом результаты идентификации индикаторных организмов различными экспертами (субъектами) могут быть несовпадающими вследствие субъективных факторов, например - из-за несовпадающей интерпретации одного и того же морфологического признака, например - окраски, конфигурации тела. То есть, оценка по прототипу экологического состояния среды существенно зависит от субъекта-эксперта, в силу чего является субъективной. Основываясь на изложенном оценка от различных экспертов может быть несовпадающей, неоднозначной, а значит -сомнительной достоверности, в зависимости от субъективных характеристик экспертов, например - их цветоощущения или эмоционального состояния или степени усталости.
При этом, следует обратить внимание на то, что по прототипу требуется индивидуальное выделение и определение каждого из видов индикаторных организмов из пробы.
При осуществлении заявленного технического решения не требуется определение каждого организма из пробы, достаточно иметь в пробе легко доступную «кашицу» из организмов, не затрудняя себя определением отдельных видов организмов в пробе.
Таким образом, использование заявленного технического решения обеспечивает возможность работы не с визуально выделяемыми отдельными индикаторными организмами, а с совокупностью организмов в пробе, при этом следует акцентировать внимание на то, что заявленное техническое решение не требует затрат времени и средств на весьма трудозатратную визуальную идентификацию организмов по отдельности. Наличие такой возможности существенно ускоряет аналитическую работу экспертов, повышает производительность труда исполнителей.
Заявленное применение маркерных белков индикаторных организмов осуществляется специалистом инструментально (то есть - без влияния индивидуальных характеристик организма эксперта, не субъективно), не зависит от индивидуальности специалиста, например - его эмоционального состояния, наличия высшей квалификации, от особенностей состояния его здоровья, зрения, степени усталости. Поэтому результат применения маркерных белков для оценки экологической обстановки свободен от субъективности оценок эксперта, то есть - объективен и достоверен.
Маркерные белки индикаторных организмов и антитела заносят в банк данных, хранят и накапливают для общего пользования. Занесенные в банк данных антитела к маркерным белкам индикаторных организмов доступны для применения всем пользователям, в том числе - оценивающим экологическую обстановку экспертам. Эта информация воспринимается, интерпретируется и используется одинаково (однозначно) различными специалистами, вне зависимости от их местонахождения и субъективного влияния эксперта - специалиста. Использование инструментально полученной, единой для всех экспертов мира базы данных антител к маркерным белкам по видам организмов делает оценку экологического состояния окружающей среды независимой от субъективности оценок того или иного эксперта, то есть результат оценки всегда носит объективный, достоверный характер, чем выгодно отличается от носящих субъективный характер оценок с использованием прототипа.
Заявленный способ применения маркерных белков для оценки экологического состояния окружающей среды - существенно расширяет возможности достоверного определения состояния окружающей среды, например - степени загрязнения среды. Причем оценка при наличии навыков выполняется с затратой существенно меньшего (в десятки раз), по сравнению с прототипом, времени, что способствует своевременному (не запоздалому) принятию мер по сохранению среды обитания всего живого, повышению результативности природоохранной деятельности.
Преимущество заявленного способа оценки экологического состояния окружающей среды с применением маркерных белков индикаторных организмов состоит в устранении влияющих на результат экспертного анализа субъективных факторов, повышении достоверности результатов анализа. Кроме того, более высокая (по сравнению с прототипом) достоверность результата анализа по заявленному способу влечет отсутствие потребности в повторной оценке, что позволяет сократить временные и иные затраты, которые существенны при массовых исследованиях состояния окружающей среды и/или ограничивают масштаб исследований.
Необходимые для осуществления заявленного способа продукты гена (белки), например - цитохром с оксидаза субъединица 1 (CO1), присущи всем организмам вне зависимости от географического местоположения подвергаемой биомониторингу местности. Это позволяет применять заявляемый способ без ограничений в географическом пространстве, в любой местности.
При отсутствии в регионе водоемов пробу составляют из организмов - обитателей этого региона, например, приспособившихся к самым суровым местным условиям постоянных обитателей пустынь - ящериц, змей, скорпионов, насекомых, растительности. Полное отсутствие индикаторных организмов для использования в качестве пробы на исследуемой местности, например - на вершинах гор высотой более 7 км, интерпретируют как полное отсутствие природных условий жизни на местности, не представляющее интерес как место обитания живых существ.
Новизна предлагаемого способа оценки экологического состояния окружающей среды заключается в применении маркерных белков в определении видов организмов для оценки степени загрязнения среды и соответственно - экологического состояния окружающей среды. Заявленный способ позволяет определить состояние среды путем использования инструментально выявленных уникальных вариабельных участков белков организмов-индикаторов независимо от географического расположения (территориального местоположения) исследуемого региона. Использование заявленного способа делает результат инструментальной оценки экологического состояния окружающей среды объективным, не зависящим от субъективности оценок экспертов.
Достоверность результата осуществления заявленного способа зависит только от инструментально определенных маркерных белков индикаторных организмов в пробе. Поэтому заявленный способ оценки экологического состояния среды с применением маркерных белков - универсален, не зависит от географического местонахождения объекта, обладает надежностью на уровне высших достижений молекулярной генетики и биоинформатики, а результаты применения способа - более достоверны по сравнению с изобретениями, известными из уровня техники на дату подачи заявки.
В целом из вышеизложенного можно сделать вывод, что заявителем достигнуты заявленные цели и технический результат, а именно - обеспечено повышение точности, достоверности результатов экологического мониторинга, оценки экологического состояния окружающей среды и природоохранных мер посредством замены материалов локальных аналитических исследований с субъективными результатами оценки специалистов (людей) на результаты объективных инструментальных исследований, при этом обеспечена возможность выполнения оценки экологического состояния окружающей среды менее квалифицированными специалистами, уменьшена трудоемкость работ, повышена производительность труда, сокращены сроки оценки уровня загрязнения и качества диагностики состояния окружающей среды - повышено качество факторов, в совокупности способствующих повышению результативности природоохранной деятельности и сохранению благоприятной среды обитания.
Заявленное техническое решение позволяет с высокой достоверностью отслеживать влияние на окружающую среду как антропогенных факторов, так и естественных природных изменений. Способ позволяет своевременно и качественно принимать решения по улучшению состояния природных сообществ, например -экологических систем, в том числе - водоемов, оценивать результаты принятых природоохранных мероприятий, корректировать процесс выполнения таких работ для получения оптимального результата природоохранных мероприятий.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, т.к. так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, представленным в независимом пункте формулы изобретения, включая характеристику назначения.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, т.к. может быть реализовано в промышленных масштабах для природоохранной, сельскохозяйственной, рекреационной деятельности (организации отдыха), деятельности организаций здравоохранения, причем - посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования.
Использованные источники
1. Sladechek V. System of water quality from the biological point of view. Arch. Hydrobiol. Ergeb. Limnol, 1973. - P. 179-191.
2. Определитель пресноводных беспозвоночных России и сопредельных территорий/ под ред. С.Я. Цалолихина. - СПб.: Изд. «Наука», 1994. - 394 с.
3. Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA). Суть, принцип метода и этапы исследования. Анализ на антитела, классы антител, иммунный комплекс.http://www.polismed.com/articles-immunofermentnyjj-analiz-ifa-elisa-sut-princip-metoda-i-ehtapy-issledovanija.html
4. Фролова Л.Л., Барабанщиков Б.И., Фирсова С.С. Патент RU 2451084. Способ оценки экологического состояния окружающей среды. Описание изобретения к патенту. Опубл. 20.05.2012, приоритет от 01.02.2010.
5. Винберг Г.Г. Методические рекомендации по сбору и обработке материалов при гидробиологических исследованиях на пресноводных водоемах. Зоопланктон и его продукция / Ред. Г.Г. Винберг, Г.М. Лаврентьева // Л.: ГосНИОРХ, ЗИН АН СССР, 1982. - 33 с.
6. Van Weemen B.K., Schuurs А.Н. (1971). "Immunoassay using antigen-enzyme conjugates". FEBS Letters 15 (3): 232-236. doi:10.1016/0014-5793(71)80319-8. PMID 11945853.
7. Folmer O. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome с oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates / O. Folmer, M. Black, W. Hoeh, R. Lutz, R. Vrijenhoek // Mol. Mar. Biol. Biotechnol. - 1994. - V. 3. - P. 294-299.
8. Watts D. Automated fluorescent DNA sequencing on the ABI PRISM 310 Genetic Analyzer / D. Watts, J.R. MacBeath // Methods Mol Biol. 2001. - P. 167, 153-170.
9. Экология города Казани. - Казань: Изд-во АН РТ, 2005. - 527 с.
10. Методические рекомендации по сбору и обработке материалов при гидробиологических исследованиях на пресноводных водоемах. Зообентос и его продукция. / Ред. Г.Г. Винберг, Г.М. Лаврентьева. - Л.: ГосНИОРХ, ЗИН АН СССР. - 51 с.
11. Жукинский В.Н., Оксиюк О.П., Олейник Г.Н., Кошелева С.И. Принципы и опыт построения экологической классификации качества поверхностных вод суши // Гидробиол. журн. - 1981. - 17, №2. - С. 38-49.
12. Методические рекомендации по сбору и обработке материалов при гидробиологических исследованиях на пресноводных водоемах. Фитопланктон и его продукция. - Л.: ГосНИОРХ, ЗИН АН СССР, 1984. - 32 с. (Ред. Г.Г. Винберг, Г.М. Лаврентьева).
13. Абакумов В.А. (ред.) Руководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и донных отложений. Л.: Гидрометеоиздат, 1983. - 240 с.
14. Международная база данных аминокислотных последовательностей GenPept - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein
15. Бондарева Н.В. Использование медоносных пчел как биоиндикаторов загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами // Фундаментальные исследования №10, 2005. - С. 76.
16. Сарапий М.И. Муравьи - биологические индикаторы состояния окружающей среды в городских экосистемах // Вестник Российской военно-медицинской академии. 2008. №3 (23). Приложение 2. - С. 55.