СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ НАЛИЧИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБРАЗЦЕ

1. Способ определения наличия определенных микроорганизмов в биологическом образце, причем микроорганизмы представляют собой бактерии, грибки, вирусы и простейшие, включающий:
(а) иммобилизацию биологического образца на и/или в твердом субстрате в одном первом местоположении;
(б) перенос иммобилизованного биологического образца, по меньшей мере, в другое местоположение и осуществление стадии экстракции на твердом субстрате таким образом, чтобы экстрагировалась ДНК любого микроорганизма, иммобилизованная на и/или в твердом субстрате;
(в) амплификацию нуклеиновой кислоты на ДНК микроорганизмов, экстрагированных на стадии (б), причем стадия амплификации относится к амплификации, по меньшей мере, одной высококонсервативной последовательности одного или более определенных микроорганизмов, а амплифицированные последовательности именуются целевыми последовательностями;
(г) смешение целевых последовательностей с последовательностями совокупности праймеров, содержащихся на диагностической мультиплексной панели, причем последовательность каждого праймера способствует генотипированию целевой последовательности;
(д) проведение реакции удлинения праймеров с применением комбинации, смеси, целевых последовательностей и DMP, представленной на стадии (г), с получением продукта реакции с DMP; и
(е) анализ продукта реакции с тем, чтобы определить генотип любых присутствующих целевых последовательностей, и корреляция генотипа целевых последовательностей, имеющихся в продукте реакции, с идентификацией определенных микроорганизмов в биологическом образце.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что биологический образец представляет собой, по меньшей мере, один образец из группы, состоящей из мочи, слюны, крови, мокроты, спермы, фекалий, назального мазка, слез, вагинального мазка, ректального мазка, цервикальных выделений, биоптатов тканей и уретрального мазка.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что твердый субстрат представляет собой поглощающий волокнистый материал, пропитанный одним или двумя реагентами, которые способствуют иммобилизации и инактивации любых микроорганизмов в биологическом образце, причем поглощающий волокнистый материал выбирают из целлюлозной бумаги, мембран из микроволокна, стекловолокон, материала из полимерного волокна, тканого материала и нетканого материала, и твердый субстрат содержит реагент Whatman FTA или Whatman FTA Elute и бумагу Whatman FTA Elute.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что один или более инфекционных патогенных микроорганизмов включает человеческие патогены, являющиеся причиной одного или более заболеваний, выбранных из группы, состоящей из инфекции, передающейся половым путем; пищевого отравления; туберкулеза; вирусного рака; энцефалита; малярии; гепатита; менингита; лейшманиоза; сонной болезни; пневмонии; чумы; атипичной пневмонии SARS; устойчивого к метициллину золотистого стафилококка (MRSA); бешенства; сибирской язвы; лихорадки долины Рифт; туляремии; шигеллеза; ботулизма; желтой лихорадки; Q лихорадки; лихорадки Эбола; лихорадки денге; лихорадки Западного Нила (ЛЗН); дизентерии; гриппа; кори и тифа.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что бактерии выбирают из группы, состоящей из Микоплазмы (Mycoplasma spp.); Хламидии (Chlamydia spp.); Уреаплазмы (Ureaplasma spp); Нейссерии (Neisseria spp.); Гарднереллы (Gardnerella spp.); Трихомонаса (Trichomonas spp.) и Трепонемы (Treponema spp), дрожжи представляют собой кандиду альбиканс (Candida albicans), вирусы выбирают из группы, состоящей из цитомегаловируса (ЦМВ, CMV); вируса гепатита A (HAV); вируса гепатита В (HBV); вируса гепатита С (HCV), вируса гепатита Е (HEV), вируса гепатита G и GB (GBV-C); вирусов иммунодефицита человека (ВИЧ, HIV); вирусов папилломы человека (ВПЧ, HPV); вирусов простого герпеса (ВПГ, HSV); вируса контагиозного моллюска (Molluscum contagiosum, MCV); вируса гриппа; вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ, EBV) и вируса варицелла-зостер (ВВЗ, VZV).
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что DMP предназначена для идентификации аллелей из комбинации микроорганизмов, предположительно присутствующих в биологическом образце, причем эта комбинация включает бактерии, вирусы и грибки, причем все микроорганизмы предпочтительно являются патогенами.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что DMP предназначена для идентификации микроорганизмов, ассоциированных с конкретным типом заболевания, выбранным из группы, состоящей из инфекции, передающейся половым путем; пищевого отравления; туберкулеза; вирусного рака; энцефалита; малярии; гепатита; менингита; пневмонии; чумы и гриппа, предпочтительно представляет собой инфекцию, передающуюся половым путем, а DMP содержит праймерные последовательности, которые гибридизуются с одной или более целевых последовательностей, полученных из микроорганизмов, выбранных из группы, состоящей из Микоплазмы гениталиум (Mycoplasma genitalium); Микоплазмы хоминис (Mycoplasma hominis); Хламидии трахоматис (Chlamydia trachomatis); Уреаплазмы уреалитикум (Ureaplasma urealyticum); Нейссерии гонореи (Neisseria gonorrhoea); Гарднереллы вагиналис (Gardnerella vaginalis); Трихомонас вагиналис (Trichomonas vaginalis); Бледной трепонемы (Treponema pallidum); CMV; HAV; HBV; HCV; HEV, GBV-C, ВИЧ-1; ВИЧ-2; ВПЧ; ВПГ-1; ВПГ-2; MCV; ВВЗ; ВЭБ и Кандиды альбиканс (Candida albicans).
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что высококонсервативный полиморфный аллель содержит целый ген или часть гена микроорганизма, причем ген выбирают из бактериального гена 16S рРНК; бактериального гена 32S рРНК; гена 16S рРНК дрожжей; гена 18S рРНК дрожжей и вирусной полимеразы, и высококонсервативная последовательность представляет собой полиморфный аллель, выбранный из группы, состоящей из однонуклеотидного полиморфизма (SNP); инсерции; делеции; инверсии и замены.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что при наличии в биологическом образце двух или более определенных микроорганизмов в результате реакции удлинения праймеров образуется DMP реакционный продукт, содержащий, по меньшей мере, две удлиненные праймерные последовательности известной заданной молекулярной массы, отличающейся одна от другой, и DMP реакционные продукты анализируют методом, позволяющим разделять удлиненные праймерные последовательности по их молекулярной массе, предпочтительно MALDI-TOF масс- спектрометрией и/или капиллярным электрофорезом.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что в реакции удлинения праймеров участвует реагент для мечения праймера, так что если один или более определенных микроорганизмов присутствуют в биологическом образце, то в ходе реакции удлинения праймеров реагент для мечения включается в праймерный удлиненный продукт, при этом образуется DMP реакционный продукт, содержащий реагент для мечения, и DMP реакционные продукты анализируют методом, позволяющим определять присутствие включенного реагента для мечения в продукте, содержащем удлиненный праймер, предпочтительно реагент для мечения праймера содержит метку, выбранную из радиоактивной метки; флуоресцентной метки и антигена, а метод анализа выбирают из SNPstream и/или SNPlex.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что совокупность праймерных последовательностей, содержащихся в DMP, иммобилизована на твердой подложке, предпочтительно выбранной из стекла и кремния.
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия амплификации нуклеотидной последовательности включает совокупность праймеров амплификации, которые предназначены для амплификации совокупности высококонсервативных последовательностей одного или более определенных микроорганизмов, предпочтительно совокупность праймеров представляет собой одну или более пар праймеров, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1/2; 3/4; 5/6; 7/8; 9/10; 11/12; 13/14; 15/16; 17/18; 19/20; 21/22; 23/24; 25/26; 27/28 и 29/30, и/или одну или более пар праймеров, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 46/47; 48/49; 50/51; 52/53; 54/55; 56/57; 58/59; 60/61; 62/63; 64/65; 66/67; 68/69; 70/71; 72/73 и 74/75.
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что DMP содержит одну или более праймерных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 31-45, и/или одну или более праймерных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 76-90.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что одну или более контрольных конкурентных последовательностей объединяют с целевыми последовательностями перед стадией амплификации нуклеиновой кислоты, причем каждая конкурентная последовательность идентична соответствующей целевой последовательности за исключением того, что по сравнению с соответствующей целевой последовательностью конкурентная последовательность представляет собой вариант последовательности по определенному положению, предпочтительно вариант последовательности содержит искусственно введенный SNP, и/или одну или более контрольных последовательностей объединяют с целевыми последовательностями перед стадией амплификации нуклеиновой кислоты, и одна или более контрольных последовательностей содержат последовательность ДНК, выбранную из ДНК последовательности, не являющейся родственной последовательности в биологическом образце; ДНК последовательности, не относящейся к тестируемому (тестируемым) микроорганизму (микроорганизмам); и синтетической ДНК последовательности, а стадия амплификации нуклеиновой кислоты и DMP содержат соответствующие праймерные последовательности, которые специфически гибридизуются с одной или более контрольными последовательностями.
15. Способ по п.1, отличающийся тем, что биологический образец берут у человека, у отличного от человека животного, из растения, из продукта питания, предпочтительно у человека.
16. Диагностическая мультиплексная панель (DMP), пригодная для применения при генотипировании патогенных микроорганизмов, вызывающих, по меньшей мере, одно инфекционное заболевание, которые могут находиться в биологическом образце, содержащая совокупность праймерных последовательностей, предназначенных для идентификации, по меньшей мере, двух или более высококонсервативных последовательностей, по меньшей мере, одного микроорганизма, вызывающего инфекционное заболевание, с помощью реакции удлинения праймеров, причем инфекционное заболевание выбирают из одного или более заболеваний в группе, состоящей из инфекции, передающейся половым путем; пищевого отравления; туберкулеза; вирусного рака; энцефалита; малярии; гепатита; менингита; пневмонии; чумы и гриппа, и DMP содержит праймерные последовательности, пригодные для генотипирования микроорганизмов, выбранных из группы, состоящей из Микоплазмы гениталиум (Mycoplasma genitalium); Микоплазмы хоминис (Mycoplasma hominis); Хламидии трахоматис (Chlamydia trachomatis); Уреаплазмы уреалитикум (Ureaplasma urealyticum); Нейссерии гонореи (Neisseria gonorrhoea); Гарднереллы вагиналис (Gardnerella vaginalis); Трихомонас вагиналис (Trichomonas vaginalis); Бледной трепонемы (Treponema pallidum); CMV; HAV; HBV; HCV; HEV, GBV-C, ВИЧ-1; ВИЧ-2; ВПЧ; ВПГ-1; ВПГ-2; MCV; ВВЗ; ВЭБ и Кандиды альбиканс (Candida albicans).
17. Диагностическая мультиплексная панель (DMP) по п.16, отличающаяся тем, что высококонсервативная последовательность содержит целый ген или часть гена микроорганизма, причем ген выбирают из бактериального гена 16S рРНК; бактериального гена 32S рРНК; гена 16S рРНК дрожжей; гена 18S рРНК дрожжей и вирусной полимеразы, предпочтительно высококонсервативная последовательность представляет собой полиморфный аллель, выбранный из группы, состоящей из однонуклеотидного полиморфизма (SNP); инсерции; делеции; инверсии и замены.
18. Диагностическая мультиплексная панель (DMP) по п.16 или 17, отличающаяся тем, что она содержит одну или более праймерных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 31-45, или одну или более праймерных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 76-90.
19. Диагностическая мультиплексная панель (DMP) по п.18, отличающаяся тем, что совокупность праймерных последовательностей, содержащихся в DMP, иммобилизована на твердой подложке, предпочтительно выбраной из стекла и кремния.
20. Набор для тестирования микроорганизмов, пригодный для персонального использования пользователем, расположенным в первом местоположении, содержащий поверхность тестирования, находящуюся в герметизируемой камере, и содержащую твердый субстрат, способный иммобилизовать биологический образец либо в, либо на своей поверхности, и когда биологический образец осаждается на поверхности тестирования, герметизируется пространство вокруг поверхности тестирования таким образом, что набор для тестирования можно отправить во второе местоположение для анализа, позволяющего определить, действительно ли в биологическом образце присутствует один или более микроорганизмов, выбранных из бактерий, грибков, вирусов и простейших, являющихся патогенными и вызывающих заболевание, выбранное из группы, состоящей из инфекции, передающейся половым путем; пищевого отравления; туберкулеза; вирусного рака; энцефалита; малярии; гепатита; менингита; пневмонии; чумы и гриппа.

21. Набор для тестирования по п.20, отличающийся тем, что твердый субстрат представляет собой поглощающий; волокнистый материал, пропитанный одним или более реагентами, которые способствуют иммобилизации и инактивации любых микроорганизмов в биологическом образце, таких как Whatman FTA или Whatman FTA Elute, предпочтительно твердый субстрат представляет собой материал, выбранный из целлюлозной бумаги, мембран из микроволокна, стекловолокон, материала из полимерного волокна, тканого материала, и нетканого материала, такого как бумага Whatman FTA Elute.
22. Набор для тестирования по п.20 или 21, отличающийся тем, что биологический образец представляет собой, по меньшей мере, один образец из группы, состоящей из мочи, слюны, крови, мокроты, спермы, фекалий, назального мазка, слез, вагинального мазка, ректального мазка, цервикальных выделений, биоптатов тканей и уретрального мазка.
23. Набор для тестирования по п.20, отличающийся тем, что биологический образец берут у человека.
24. Набор для тестирования по п.20, отличающийся тем, что микроорганизм вызывает инфекцию, передающуюся половым путем.
25. Способ лечения животного, предпочтительно человека, предположительно, являющегося носителем одного или более инфекционных микроорганизмов, заключающийся в получении биологического образца от животного, тестировании биологического образца в соответствии со способом по любому из пп.1-15, диагностировании в результате этого, действительно ли животное инфицировано одним или более инфекционных микроорганизмов, и проведении лечения животного, с учетом сведений относительно типа инфекционных микроорганизмов, найденных в биологическом образце, таких как статус резистентности одного или более инфекционных микроорганизмов, обнаруженных в биологическом образце, к антибиотикам.