ПРОТИВОРАКОВЫЕ ВАКЦИНЫ, НАЦЕЛЕННЫЕ НА BORIS, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
ANTICANCER VACCINES TARGETING BORIS AND METHODS OF THEIR APPLICATION

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет относительно предварительной заявки на патент США № 62/598 274, поданной 13 декабря 2017 года, раскрытие которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Заявка содержит перечень последовательностей, который представлен в электронном формате ASCII и полностью включен в данный документ посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 11 декабря 2018 года, названа 104409_000447_sequence_listing.txt и составляет 9 179 байтов по размеру.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0003] Настоящее изобретение относится к антигенам BORIS и молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим их. Настоящее изобретение также относится к вакцинам, содержащим такие антигены BORIS и/или молекулы нуклеиновых кислот. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам использования вакцин для индукции иммунных ответов и предотвращения и/или лечения субъектов, имеющих раковые клетки и/или опухоли, которые экспрессируют BORIS.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] Рак является одной из основных причин смерти во всем мире. В Соединенных Штатах рак является второй наиболее распространенной причиной смерти, на которую приходится приблизительно 1 из каждых 4 смертей. Рак возникает из одной клетки, которая трансформировалась из нормальной клетки в раковую клетку. Такая трансформация часто является многостадийным процессом, переходящим от предракового поражения к злокачественному новообразованию. Множество факторов способствуют прогрессированию этого, включая старение, генетический вклад и воздействие внешних факторов, таких как физические канцерогены (например, ультрафиолетовое и ионизирующее излучение), химические канцерогены (например, асбест, компоненты табачного дыма и т.д.) и биологические канцерогены (например, некоторые вирусы, бактерии и паразиты).
[0005] Профилактика, диагностика и лечение рака могут принимать различные формы. Профилактика может включать скрининг на предрасполагающие факторы (например, конкретные генетические варианты), изменение поведения (например, курение, диета и уровень физической активности) и вакцинацию против вирусов (например, от вируса гепатита В, вируса папилломы человека). Лечение может включать химиотерапию, лучевую терапию и хирургическое удаление опухоли или раковой ткани. Несмотря на наличие многочисленных способов профилактики и лечения, такие способы часто имеют ограниченный успех в эффективной профилактике и/или лечении рака.
[0006] CCCTC-связывающий фактор (CTCF) представляет собой фактор из 11-цинковых пальцев, участвующий в регуляции генов. 11 цинковых пальцев CTCF связывают различные сайты-мишени ДНК и действуют как репрессоры транскрипции. Брат регулятора импринтированного сайта («BORIS») или CTCF-подобный («CTCFL») является паралогом CTCF, а также регулятором транскрипции. (Loukinov, D. I. et al. BORIS, a novel male germ-line-specific protein associated with epigenetic reprogramming events, shares the same 11-zinc-finger domain with CTCF, the insulator protein involved in reading imprinting marks in the soma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 6806-6811, doi:10.1073/pnas.092123699 (2002)). CTCF и BORIS имеют взаимоисключающие паттерны экспрессии в нормальной ткани, но коэкспрессируются в раковых тканях. Хотя экспрессия мРНК BORIS очень низкая или не обнаруживается в нормальной ткани яичника, она высоко экспрессируется во многих клетках эпителиальной карциномы яичника («ЭКЯ»). Аберрантная экспрессия BORIS была обнаружена в 67% первичных опухолей ЭКЯ. (Link, P.A., et al. BORIS/CTCFL mRNA isoform expression and epigenetic regulation in epithelial ovarian cancer. Cancer Immunity 13, 6 (2013)).
[0007] Существуют 23 различные изоформы мРНК BORIS, образованные путем альтернативного сплайсинга, каждая из которых имеет канонические соединения экзон-интрон и поли-А-сигналы, которые сохраняются у приматов. Шесть различных семейств изоформ BORIS (от sf1 до sf6) кодируют 17 различных белков BORIS. Домены цинкового пальца BORIS демонстрируют гомологию с доменами CTCF; однако, разные фланкирующие области между двумя белками указывают на различные функциональные последствия связывания ДНК. (См.Ohlsson, R., Renkawitz, R. & Lobanenkov, V. CTCF is a uniquely versatile transcription regulator linked to epigenetics and disease. Trends in genetics: TIG 17, 520-527 (2001).) Изоформа BORIS sf1 наиболее дифференцированно экспрессируется среди образцов нормальной ткани яичника и опухоли ЭКЯ.
in vivo
[0008] Представляют интерес вакцины для лечения и профилактики рака, в частности ЭКЯ. Однако существующие вакцины, нацеленные на антигены опухолевых клеток, ограничены плохой экспрессией антигена . Соответственно, в данной области техники сохраняется потребность в безопасных и эффективных вакцинах и способах их применения для профилактики и/или лечения рака и снижения смертности у субъектов, страдающих от рака.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0009] В данном документе предложены:
[0010] Молекулы нуклеиновых кислот, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, выбранных из группы, состоящей из: (а) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислоты 19-680 SEQ ID NO:2; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% всей длины аминокислот 19-680 SEQ ID NO:2; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-680 SEQ ID NO:2; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-680 SEQ ID NO:2.
[0011] Молекулы нуклеиновых кислот, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, выбранных из группы, состоящей из: (a) нуклеотидов 55-2040 SEQ ID NO:1; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% всей длины нуклеотидов 55-2040 SEQ ID NO:1; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидам 55-2040 SEQ ID NO:1; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% всей длины последовательности нуклеиновой кислоты, который по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидам 55-2040 SEQ ID NO:1.
[0012] Молекулы нуклеиновых кислот, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует всю длину SEQ ID NO:2; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% всей длины SEQ ID NO:2; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO:2; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% всей длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO:2.
[0013] Молекулы нуклеиновых кислот, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, выбранных из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO:1; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% всей длины SEQ ID NO:1; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO:1; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% всей длины последовательности нуклеиновой кислоты, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO:1.
[0014] Молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, приведенную в SEQ ID NO:1.
[0015] Молекулы нуклеиновой кислоты, предложенные в данном документе, для применения в качестве лекарственного средства.
[0016] Молекулы нуклеиновой кислоты, предложенные в данном документе, для применения в качестве лекарственного средства при лечении рака.
[0017] Молекулы нуклеиновой кислоты, предложенные документе, для использования при получении лекарственного средства.
[0018] Молекулы нуклеиновой кислоты, предложенные в данном документе, для применения в получении лекарственного средства для лечения рака.
[0019] Векторы, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, предложенную данном документе, в которой указанный вектор может представлять собой плазмиду или вирусный вектор.
[0020] Композиции, содержащие одну или более молекул нуклеиновой кислоты, предложенных в данном документе.
[0021] Композиции, предложенные в данном документе, содержащие фармацевтически приемлемый носитель, причем эти композиции могут содержать один или более векторов, предложенных в данном документе.
[0022] Белки, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислот 19-680 SEQ ID NO:2; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% всей длины аминокислот 19-680 SEQ ID NO:2; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-680 SEQ ID NO:2; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% всей длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-680 SEQ ID NO:2.
[0023] Белки, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO:2; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% всей длины SEQ ID NO:2; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:2; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% всей длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:2.
[0024] Белки, содержащие аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2.
[0025] Вакцины, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, предложенную в данном документе.
[0026] Вакцины, содержащие вектор, предложенный в данном документе.
[0027] Вакцины, как описано в настоящем документе, дополнительно содержащие фармацевтически приемлемый наполнитель, причем эта вакцина может дополнительно содержать адъювант, причем адъювант может быть IL-12, IL-15, IL-28 или RANTES.
[0028] Способы лечения субъекта с BORIS-экспрессирующей раковой клеткой, включающие введение терапевтически эффективного количества вакцины, предложенной в данном документе, при этом, введение может включать стадию электропорации и, при этом. введение может происходить в одном или более мест у субъекта.
[0029] Способы вакцинации субъекта против BORIS-экспрессирующей раковой клетки, включающие введение количества вакцины, предложенного в настоящем документе, эффективного для индукции гуморального или клеточного иммунного ответа.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0030] Краткое описание, а также нижеследующее подробное описание более понятны при прочтении вместе с прилагаемыми графическими материалами. В целях иллюстрации изобретения на графических материалах показаны примеры вариантов воплощения изобретения; однако изобретение не ограничено конкретными раскрытыми способами, композициями и устройствами. В графических материалах:
[0031] На фиг. 1 показана принципиальная схема аминокислотной последовательности синтетического консенсусного антигена BORIS. Звездочки обозначают мутации в 11 доменах цинковых пальцев и сигнал ядерной локализации.
[0032] На фиг. 2 показана общая структура белка BORIS. Сферы указывают на изменения относительно нативного BORIS.
[0033] На фиг.3 показано сравнение нативного цинкового пальца со структурой цинкового пальца синтетического консенсусного антигена BORIS. Структура цинкового пальца синтетического консенсусного антигена BORIS нарушает связывание ДНК.
[0034] На фиг.4 показана конструкция pGX1440, содержащая вставку синтетической консенсусной последовательности антигена BORIS.
[0035] На фиг.5 показана стратегия гейтирования проточной цитометрии.
[0036] На фиг.6 показана экспрессия in vitro синтетического консенсусного антигена BORIS в клетках рабдомиосаркомы человека (RD), трансфицированных pGX1440, как определено иммуноблоттингом человеческим антителом против BORIS.
[0037] На фиг. 7А и 7В показана иммуногенность синтетического консенсусного антигена BORIS. Самок мышей CB6F1 иммунизировали 3 раза с интервалом в 3 недели указанными дозами синтетического консенсусного антигена BORIS (pGX1440, n=8/группа) или pGX0001 (пустой вектор, n=4). Антиген-специфические IFNγ ответы на консенсусный синтетический антиген BORIS оценивали с помощью ELISpot при указанных дозах pGX1440. На фиг.7А показаны ответы отдельных животных, а на фиг.7В показаны групповые ответы.
+
+
+
+
[0038] На фиг. 8A, 8B, 8C и 8D показана относительная частота CD4+и CD8+Т-клеток. Клеточные иммунные ответы, индуцированные pGX1440, были преимущественно в компартменте CD8+T-клеток относительно компартмента CD4+T-клеток. Синтетический консенсусный антиген BORIS индуцировал частоты антиген-специфических ответов CD4 T-клеток, которые были значительно более устойчивыми, чем наивные, во всех группах доз (фиг. 8A). Частота антиген-специфических CD8 T-клеток, индуцированных синтетическим консенсусным антигеном BORIS, значительно увеличилась по сравнению с контролем во всех группах доз (фиг. 8B). Цитокиновый профиль антиген-специфических ответов CD4 T-клеток (фиг. 8C) и CD8 T-клеток на синтетический консенсусный антиген BORIS показан на (фиг. 8D).
+
+
+
+
[0039] На фиг. 9A, 9B, 9C и 9D показан цитолитический потенциал антиген-специфических Т-клеток на синтетический консенсусный антиген BORIS. Цитолитические иммунные ответы, индуцированные pGX1440, были преимущественно в компартменте CD8+T-клеток относительно компартмента CD4+T-клеток. Частота антигенспецифических CD4CD107a T-клеток была увеличена во всех дозовых группах (фиг. 9A). Аналогично, частота антиген-специфических CD8CD107a T-клеток была увеличена во всех дозовых группах (фиг. 9B). Цитокиновый профиль CD4+CD107a+T-клеток (фиг. 9C) и CD8+CD107a+T-клеток показан на (фиг. 9D).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0040] Настоящее изобретение относится к вакцине, содержащей синтетический консенсусный антиген BORIS. BORIS экспрессируется во многих опухолях. Соответственно, вакцина обеспечивает лечение рака или раковых опухолей, экспрессирующих BORIS.
[0041] Синтетический консенсусный антиген BORIS может представлять собой консенсусный антиген BORIS, полученный из последовательностей BORIS из разных видов или из разных изоформ в пределах вида, и, таким образом, синтетический консенсусный антиген BORIS не является нативным. Синтетический консенсусный антиген BORIS может быть дополнительно модифицирован путем введения одной или более мутаций в консенсусную последовательность для создания последовательности синтетического консенсусного антигена BORIS. Мутации могут разрушать или модифицировать конкретные функциональные домены нативной последовательности BORIS, тем самым нарушая или усиливая структуру или функцию функциональных доменов. В одном варианте воплощения мутации вводят в консенсусную последовательность BORIS для разрушения каждого из доменов цинковых пальцев нативного BORIS. В других вариантах воплощения синтетической консенсусной последовательности антигена BORIS мутация вводится в сигнальную последовательность ядерной локализации нативного BORIS. В других вариантах воплощения мутации вводят в консенсусную последовательность BORIS для разрушения каждого домена цинкового пальца и последовательности ядерной локализации.
[0042] Синтетический консенсусный антиген BORIS может индуцировать ответы антиген-специфических Т-клеток и/или высокий титр антител, тем самым индуцируя или вызывая иммунный ответ, который направлен или реагирует на рак или опухоль, экспрессирующую антиген. В некоторых вариантах воплощения индуцированный или вызванный иммунный ответ может представлять собой клеточный, гуморальный или как клеточный, так и гуморальный иммунные ответы. В некоторых вариантах воплощения индуцированный или вызванный клеточный иммунный ответ может включать индукцию или секрецию интерферона-гамма (IFN-γ) и/или фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) и/или интерлейкина 2 (IL-2). В других вариантах воплощения индуцированный или вызванный иммунный ответ может снижать или ингибировать один или более факторов иммуносупрессии, которые способствуют росту опухоли или рака, экспрессирующего антиген, например, но не ограничиваясь ими, факторы, которые подавляют презентацию МНС, факторы, которые стимулируют антиген-специфические регуляторные Т-клетки (Treg), PD-L1, FasL, цитокины, такие как IL-10 и TFG-β, опухоль-ассоциированные макрофаги, ассоциированные с опухолью фибробласты, растворимые факторы, продуцируемые иммуносупрессорными клетками, CTLA-4, PD-1, MDSC, MCP-1 и молекулу иммунной контрольной точки.
[0043] Вакцина, согласно изобретению, может обеспечить любую комбинацию конкретных раковых антигенов для конкретной профилактики или лечения рака у субъекта, который нуждается в лечении.
[0044] Одним из способов конструирования нуклеиновой кислоты и ее кодируемой аминокислотной последовательности рекомбинантного ракового антигена является введение мутаций, которые изменяют конкретные аминокислоты в общей аминокислотной последовательности нативного ракового антигена. Введение мутаций не настолько изменяет раковый антиген, что его нельзя универсально применять у субъекта-млекопитающего и предпочтительно субъекта-человека или собаки, но изменяет его настолько, что полученная аминокислотная последовательность нарушает толерантность или считается чужеродным антигеном в организме для того, чтобы генерировать иммунный ответ. Другим способом может быть создание консенсусного рекомбинантного ракового антигена, который имеет идентичность аминокислотной последовательности по меньшей мере от 85% до 99% по сравнению с его соответствующим нативным раковым антигеном; предпочтительно по меньшей мере 90% и до 98% идентичности последовательности; более предпочтительно по меньшей мере 93% и до 98% идентичности последовательности; или даже более предпочтительно по меньшей мере 95% и до 98% идентичности последовательности. В некоторых случаях рекомбинантный раковый антиген имеет идентичность аминокислотной последовательности на 95, 96, 97, 98% или 99% по сравнению с его соответствующим нативным раковым антигеном. Нативный раковый антиген является антигеном, обычно ассоциированным с конкретным раком или раковой опухолью. В зависимости от ракового антигена консенсусная последовательность ракового антигена может встречаться у разных видов млекопитающих или внутри подтипов вида, или среди вирусных штаммов или серотипов. Некоторые раковые антигены не сильно отличаются от аминокислотной последовательности дикого типа ракового антигена. Некоторые раковые антигены имеют последовательности нуклеиновых кислот/аминокислот, которые настолько различаются между видами, что консенсусная последовательность не может быть получена. В этих случаях рекомбинантный раковый антиген, который будет нарушать толерантность и генерировать иммунный ответ, создается таким образом, что имеет идентичность аминокислотной последовательности по меньшей мере от 85% до 99% по сравнению с его соответствующим нативным раковым антигеном; предпочтительно по меньшей мере 90% и до 98% идентичности последовательности; более предпочтительно по меньшей мере 93% и до 98% идентичности последовательности; или даже более предпочтительно по меньшей мере 95% и до 98% идентичности последовательности. В некоторых случаях рекомбинантный раковый антиген имеет идентичность аминокислотной последовательности на 95, 96, 97, 98% или 99% по сравнению с его соответствующим нативным раковым антигеном. Вышеупомянутые подходы могут быть объединены так, что конечный рекомбинантный раковый антиген имеет процентное сходство с аминокислотной последовательностью нативного ракового антигена, как обсуждалось выше.
[0045] Вакцина может быть дополнительно комбинирована с антителами к ингибиторам контрольных точек, таким как PD-1 и PDL-1, для усиления стимуляции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. Использование антител против PD-1 или против PDL-1 не позволяет PD-1 или PDL-1 подавлять ответы Т-клеток и/или В-клеток. В целом, разработка раковых антигенов, распознаваемых иммунной системой, помогает преодолеть другие формы иммуносупрессии опухолевыми клетками, и эти вакцины можно использовать в сочетании с терапией подавления или ингибирования (например, терапия анти-PD-1 и анти-PDL-1 антителами) для дальнейшего усиления Т-клеточных и/или В-клеточных ответов.
[0046] Вакцина может увеличить выживаемость без опухолей на 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44% и 45%. Вакцина может уменьшить массу опухоли на 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59% и 60% после иммунизации. Вакцина может предотвращать и блокировать повышение белка 1 хемоаттрактанта моноцитов (МСР-1), цитокина, секретируемого клетками-супрессорами миелоидного происхождения. Вакцина может увеличить выживаемость без опухолей на 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59% и 60%.
[0047] Вакцина может усиливать клеточный иммунный ответ у субъекта, которому вводят вакцину, кратную приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 5500 раз, приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 5000 раз, приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 4500 раз, приблизительно от в 100 раз до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от в 150 раз до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от 200 раз до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от в 250 раз до приблизительно в 6000 раз или приблизительно от в 300 раз до приблизительно в 6000 раз по сравнению с клеточным иммунным ответом у субъекта, которому не вводили вакцину. В некоторых вариантах воплощения вакцина может усиливать клеточный иммунный ответ у субъекта, которому вводят вакцину, кратную приблизительно в 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900 раз или 6000 раз по сравнению с клеточным иммунным ответом у субъекта, которому не вводили вакцину.
[0048] Вакцина может повышать уровни интерферона гамма (IFN-γ) у субъекта, которому вводят вакцину, кратную приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 5500 раз, приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 5000 раз, приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 4500 раз, приблизительно от в 100 раз до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от в 150 раз до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от 200 раз до приблизительно 6000 раз, приблизительно от в 250 раз до приблизительно в 6000 раз или от приблизительно в 300 раз до приблизительно в 6000 раз по сравнению с уровнями IFN-γ у субъекта, которому не вводили вакцину. В некоторых вариантах воплощения вакцина может повышать уровни IFN-γ у субъекта, которому вводят вакцину, кратную приблизительно в 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900 раз или 6000 раз по сравнению с уровнями IFN-γ у субъекта, которому не вводили вакцину.
[0049] Как более подробно описано ниже, вакцина может дополнительно содержать один или более ингибиторов одной или более молекул иммунной контрольной точки (то есть ингибитора иммунной контрольной точки). Молекулы иммунной контрольной точки описаны ниже более подробно. Ингибитором иммунной контрольной точки является любая нуклеиновая кислота или белок, которые предотвращают подавление любого компонента в иммунной системе, такого как презентация класса MHC, презентация и/или дифференцировка Т-клеток, презентация и/или дифференцировка В-клеток, любой цитокин, хемокин или передача сигналов пролиферации и/или дифференцировки иммунных клеток. Как также более подробно описано ниже, вакцина может быть дополнительно комбинирована с антителами к ингибиторам контрольных точек, таким как PD-1 и PDL-1, для усиления стимуляции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. Использование антител против PD-1 или против PDL-1 не позволяет PD-1 или PDL-1 подавлять ответы Т-клеток и/или В-клеток.
Определения
[0050] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, как общедоступное обычному специалисту в данной области техники. В случае конфликта настоящий документ, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Предпочтительные способы и материалы описаны ниже, хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе, могут быть использованы на практике или при тестировании настоящего изобретения. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упомянутые в данном документе, включены в качестве ссылки во всей их полноте. Материалы, способы и примеры, раскрытые в данном документе, являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения. Используемая в данном документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов воплощения и не предназначена для ограничения.
[0051] Термины «включают(включает)», «имеющий», «имеет», «может», «содержат(содержит)» и их варианты, используемые в данном документе, предполагаются неограничивающими переводимыми фразами, терминами или словами, которые не исключают возможности дополнительных действий или структур. Формы существительного единственного числа и «и» включают формы множественного числа, если контекст четко не определяет иное. В настоящем описании также рассматриваются другие варианты воплощения, «содержащие», «состоящие из» и «состоящие по существу из» представленных в данном документе вариантов воплощения или элементов, независимо от того, изложены они явно или нет.
[0052] Для перечисления числовых диапазонов в настоящем документе каждое промежуточное значение, имеющее ту же степень точности, что и минимум и максимум приведенного диапазона, четко предусмотрено. Например, для диапазона 6-9 числа 7 и 8 предусмотрены в дополнение к 6 и 9, а для диапазона 6,0-7,0 - числа 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 и 7,0 предусмотрены явно.
[0053] Термин «адъювант», используемый в настоящем документе, означает любую молекулу, добавленную к вакцинам, описанным в настоящем документе, для усиления иммуногенности антигена.
2
[0054] «Антитело» в контексте настоящего описания означает антитело класса IgG, IgM, IgA, IgD или IgE или его фрагмент или производное, включая Fab, F(ab'), Fd и одноцепочечные антитела, диатела, биспецифичные антитела, бифункциональные антитела и их производные. Антитело может представлять собой антитело, выделенное из образца сыворотки млекопитающего, поликлонального антитела, аффинно-очищенного антитела или любой их смеси, которое проявляет достаточную специфичность связывания с желаемым эпитопом или последовательностью, полученной из него.
[0055] «Антиген» относится к белкам, имеющим аминокислотные последовательности антигена BORIS, включая: (a) аминокислоты 19-680 SEQ ID NO:2; (б) фрагменты, содержащие по меньшей мере 90% аминокислот 19-680 SEQ ID NO:2; (в) аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 96% идентичны аминокислотам 19-680 SEQ ID NO:2; и (г) фрагменты, содержащие по меньшей мере 90% аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 96% идентична аминокислотам 19-680 SEQ ID NO:2; и белкам, имеющим аминокислотные последовательности антигена BORIS, включая: (a) SEQ ID NO:2; (б) фрагменты, содержащие по меньшей мере 90% всей длины SEQ ID NO:2; (в) аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 96% идентичны SEQ ID NO:2; и (г) фрагменты, содержащие по меньшей мере 90% всей длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:2; а также анитигенам BORIS, содержащим аминокислотную последовательность указанную в SEQ ID NO:2. Антигены могут необязательно включать сигнальные пептиды, такие как пептиды из других белков.
[0056] Термины «кодирующая последовательность» или «кодирующая нуклеиновая кислота», используемые в данном документе, означают нуклеиновые кислоты (молекулы РНК или ДНК), которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую белок. Кодирующая последовательность может дополнительно включать сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, включая промотор и сигнал полиаденилирования, способные управлять экспрессией в клетках субъекта или млекопитающего, которым вводят нуклеиновую кислоту.
[0057] Термины «комплемент» или «комплементарность», используемые в данном документе в отношении нуклеиновой кислоты, могут означать спаривание оснований Уотсона-Крика (например, A-T/U и C-G) или Хугстина между нуклеотидами или аналогами нуклеотидов молекул нуклеиновой кислоты.
[0058] Термины «консенсус», «консенсусная последовательность» или «консенсусная последовательность BORIS» в контексте настоящего описания означают полипептидную последовательность, основанную на анализе выравнивания множества последовательностей для одного и того же гена из разных организмов или из разных изоформ в организме. Могут быть получены последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют консенсусную полипептидную последовательность.
[0059] Используемый здесь термин «постоянный ток» описывает ток, который воспринимается или испытывается тканью или клетками, определяющими указанную ткань, в течение воздействия электрического импульса, доставляемого в ту же ткань. Электрический импульс подается от устройств электропорации, описанных в данном документе. Плотность тока остается постоянной в указанной ткани в течение всего времени воздействия электрического импульса, поскольку устройство электропорации, предложенное в настоящем документе, имеет элемент обратной связи, предпочтительно обладающий мгновенной обратной связью. Элемент обратной связи позволяет измерять сопротивление ткани (или клеток) на протяжении всего времени воздействия импульса и заставлять устройство электропорации изменять выходную электрическую мощность (например, увеличивать напряжение) таким образом, чтобы плотность тока в одной и той же ткани оставалась постоянной в течение всего времени воздействия электрического импульса (порядка микросекунд) и от импульса к импульсу. В некоторых вариантах воплощения элемент обратной связи содержит контроллер.
[0060] Термины «обратная связь по току» или «обратная связь», используемые в данном документе, могут применяться взаимозаменяемо и могут означать активную реакцию предоставленных устройств электропорации, которая включает измерение тока в ткани между электродами и соответствующее изменение выходной мощности, передаваемой устройством EP, для поддержания плотности тока на постоянном уровне. Этот постоянный уровень задается пользователем перед инициацией импульсной последовательности или электрического воздействия. Обратная связь может быть обеспечена компонентом электропорации, например, контроллером устройства электропорации, поскольку электрическая цепь в нем способна непрерывно контролировать ток в ткани между электродами и сравнивать этот контролируемый ток (или ток в ткани) с заданным током и непрерывно производить регулировку выходной мощности для поддержания контролируемого тока на заданных уровнях. Цикл обратной связи может быть мгновенным, поскольку он является аналоговой замкнутой обратной связью.
[0061] Термин «децентрализованный ток», используемый в данном документе, может означать структуру электрических токов, подаваемых из различных наборов игольчатых электродов устройств электропорации, описанных в данном документе, при этом схемы минимизируют или предпочтительно устраняют возникновение теплового напряжения, связанного с электропорацией, в любой области ткани, являющейся электропорированной.
[0062] «Электропорация», «электропермеабилизация» или «электрокинетическое усиление» («EP»), используемые в данном документе взаимозаменяемо, означают воздействие импульса трансмембранного электрического поля для индукции микроскопических путей (пор) в биомембране; их присутствие позволяет биомолекулам, таким как плазмиды и векторы, олигонуклеотиды, миРНК, лекарственные препараты, ионы и вода, проходить с одной стороны клеточной мембраны на другую.
[0063] Используемый в данном документе термин «фрагмент» в отношении последовательностей нуклеиновой кислоты означает последовательность нуклеиновой кислоты или ее часть, которая кодирует полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, который перекрестно реагирует с антигеном, раскрытым в данном документе. Фрагменты могут быть фрагментами ДНК, выбранными по меньшей мере из одной из различных нуклеотидных последовательностей, которые кодируют фрагменты белка, изложенные ниже. Фрагменты могут содержать по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% одной или более последовательностей нуклеиновых кислот, указанных ниже, за исключением добавления гетерологичного сигнального пептида. Фрагмент может содержать по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или, по меньшей мере 99% одной или более последовательностей нуклеиновых кислот, указанных ниже, и дополнительно необязательно включать последовательность, кодирующую гетерологичный сигнальный пептид, который не нужно включать при расчете процента идентичности. Фрагменты могут дополнительно содержать кодирующие последовательности для сигнального пептида, такого как сигнальный пептид иммуноглобулина, например, сигнальный пептид IgE или IgG. Кодирующая последовательность, кодирующая N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, может быть связана с фрагментом кодирующей последовательности.
[0064] В некоторых вариантах воплощения фрагменты могут содержать по меньшей мере 20 нуклеотидов или более, по меньшей мере 30 нуклеотидов или более, по меньшей мере 40 нуклеотидов или более, по меньшей мере 50 нуклеотидов или более, по меньшей мере 60 нуклеотидов или более, по меньшей мере 70 нуклеотидов или более, по меньшей мере 80 нуклеотидов или более, по меньшей мере 90 нуклеотидов или более, по меньшей мере 100 нуклеотидов или более, по меньшей мере 150 нуклеотидов или более, по меньшей мере 200 нуклеотидов или более, по меньшей мере 250 нуклеотидов или более, по меньшей мере 300 нуклеотидов или более, по меньшей мере 350 нуклеотидов или более, по меньшей мере 400 нуклеотидов или более, по меньшей мере 450 нуклеотидов или более, по меньшей мере 500 нуклеотидов или более, по меньшей мере 550 нуклеотидов или более, по меньшей мере 600 нуклеотидов или более, по меньшей мере 650 нуклеотидов или более, по меньшей мере 700 нуклеотидов или более, по меньшей мере 750 нуклеотидов или более, по меньшей мере 800 нуклеотидов или более, по меньшей мере 850 нуклеотидов или более, по меньшей мере 900 нуклеотидов или более, по меньшей мере 950 нуклеотидов или более, по меньшей мере 1000 нуклеотидов или более, по меньшей мере 1100 нуклеотидов или более, по меньшей мере 1200 нуклеотидов или более, по меньшей мере 1300 нуклеотидов или более, по меньшей мере 1400 нуклеотидов или более, по меньшей мере 1500 нуклеотидов или более, по меньшей мере 1600 нуклеотидов или более, по меньшей мере 1700 нуклеотидов или более, по меньшей мере 1800 нуклеотидов или более, по меньшей мере 1900 нуклеотидов или более, или по меньшей мере 2000 нуклеотидов или более по меньшей мере одной из последовательностей нуклеиновых кислот, указанных ниже.
[0065] «Фрагмент» или «иммуногенный фрагмент» в отношении полипептидных последовательностей означает полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, который перекрестно реагирует с антигеном, раскрытым в данном документе. Фрагменты могут быть полипептидными фрагментами, выбранными из по меньшей мере одной из различных аминокислотных последовательностей, приведенных ниже. Фрагменты консенсусных белков могут составлять по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% консенсусного белка, исключая добавление любого гетерологичного сигнального пептида. Фрагмент может содержать по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% одной или более аминокислотных последовательностей, указанных ниже, и дополнительно необязательно включать гетерологичный сигнальный пептид, который не нужно включать при расчете процента идентичности. Фрагменты могут дополнительно содержать сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например, сигнальный пептид IgE или IgG.
[0066] В некоторых вариантах воплощения фрагменты консенсусных белков могут содержать по меньшей мере 20 аминокислот или более, по меньшей мере 30 аминокислот или более, по меньшей мере 40 аминокислот или более, по меньшей мере 50 аминокислот или более, по меньшей мере 60 аминокислот или более, по меньшей мере 70 аминокислот или более, по меньшей мере 80 аминокислот или более, по меньшей мере 90 аминокислот или более, по меньшей мере 100 аминокислот или более, по меньшей мере 110 аминокислот или более, по меньшей мере 120 аминокислот или более, по меньшей мере 130 аминокислот или более, по меньшей мере 140 аминокислот или более, по меньшей мере 150 аминокислот или более, по меньшей мере 160 аминокислот или более, по меньшей мере 170 аминокислот или более, по меньшей мере 180 аминокислот или более, по меньшей мере 200 аминокислот или более, по меньшей мере 220 аминокислот или более, по меньшей мере 240 аминокислот или более, по меньшей мере 260 аминокислот или более, по меньшей мере 280 аминокислот или более, по меньшей мере 300 аминокислот или более, по меньшей мере 320 аминокислот или более, по меньшей мере 360 аминокислот или более, по меньшей мере 380 аминокислот или более, по меньшей мере 400 аминокислот или более, по меньшей мере 420 аминокислот или более, по меньшей мере 440 аминокислот или более, по меньшей мере 460 аминокислот или более, по меньшей мере 480 аминокислот или более, по меньшей мере 500 аминокислот или более, по меньшей мере 520 аминокислот или более, по меньшей мере 540 аминокислот или более, по меньшей мере 560 аминокислот или более, по меньшей мере 580 аминокислот или более, по меньшей мере 600 аминокислот или более, по меньшей мере 620 аминокислот или более, по меньшей мере 640 аминокислот или более или по меньшей мере 660 аминокислот или более последовательности белка, раскрытого в данном документе.
[0067] Используемый в данном документе, термин «генетическая конструкция» относится к молекулам ДНК или РНК, которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую белок. Кодирующая последовательность включает сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, включая промотор и сигнал полиаденилирования, способные управлять экспрессией в клетках субъекта, которому вводят нуклеиновую кислоту. Используемый в данном документе термин «экспрессируемая форма» относится к генной конструкции, которая содержит необходимые регуляторные элементы, функционально связанные с кодирующей последовательностью, которая кодирует белок, таким образом, что при наличии в клетке субъекта будет экспрессироваться кодирующая последовательность.
гомологичная
гомологичный
гомологичный
[0068] Используемый в данном документе термин, «гомология» относится к степени комплементарности. Может быть частичная гомология или полная гомология (то есть идентичность). Частично комплементарная последовательность, которая по меньшей мере частично ингибирует гибридизацию полностью комплементарной последовательности с нуклеиновой кислотой-мишенью, называется функциональным термином «по существу ». При использовании в отношении двухцепочечной последовательности нуклеиновой кислоты, такой как кДНК или геномный клон, термин «по существу », используемый в настоящем документе, относится к зонду, который может гибридизоваться с цепью двухцепочечной последовательности нуклеиновой кислоты в условиях низкой жесткости. При использовании в отношении последовательности одноцепочечной нуклеиновой кислоты термин «по существу », используемый в данном документе, относится к зонду, который может гибридизоваться (т.е. является комплементом) с одноцепочечной матрицей последовательности нуклеиновой кислоты в условиях низкой жесткости.
[0069] Термин «идентичный» или «идентичность», используемый в данном документе в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов, означает, что последовательности имеют определенный процент остатков, которые являются одинаковыми в указанной области. Процент может быть рассчитан путем оптимального выравнивания двух последовательностей, сравнения двух последовательностей в указанной области, определения количества позиций, в которых одинаковый остаток встречается в обеих последовательностях, для получения количества совпадающих позиций, деления количества совпавших позиций на общее количество позиций в указанной области и умножение результата на 100, чтобы получить процент идентичности последовательности. В тех случаях, когда две последовательности имеют разную длину или выравнивание приводит к одному или более ступенчатых концов и указанная область сравнения включает только одну последовательность, остатки одной последовательности включаются в знаменатель, но не в числитель вычисления. При сравнении ДНК и РНК тимин (T) и урацил (U) можно считать эквивалентными. Идентификация может быть выполнена вручную или с помощью компьютерного алгоритма последовательностей, такого как BLAST или BLAST 2.0.
[0070] «Импеданс», используемый в данном документе, может использоваться при рассмотрении в деталях механизма обратной связи и может быть преобразован в текущее значение в соответствии с законом Ома, что позволяет проводить сравнение с заданным током.
[0071] Термин «иммунный ответ», используемый в данном документе, означает активацию иммунной системы хозяина, например, млекопитающего, в ответ на введение антигена. Иммунный ответ может быть в форме клеточного или гуморального ответа, или обоих.
[0072] Термины «нуклеиновая кислота», или «олигонуклеотид», или «полинуклеотид», используемые в данном документе, означают по меньшей мере два нуклеотида, ковалентно связанных друг с другом. Описание одной цепи также определяет последовательность дополнительной цепи. Таким образом, нуклеиновая кислота также охватывает комплементарную цепь описанной одной цепи. Многие варианты нуклеиновой кислоты могут быть использованы для той же цели, что и данная нуклеиновая кислота. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает по существу идентичные нуклеиновые кислоты и их комплементы. Одна цепь обеспечивает зонд, который может гибридизоваться с последовательностью-мишенью в жестких условиях гибридизации. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает зонд, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации.
[0073] Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными или могут содержать части как двухцепочечной, так и одноцепочечной последовательности. Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК, как геномную, так и кДНК, РНК или гибридную, где нуклеиновая кислота может содержать комбинации дезоксирибо- и рибонуклеотидов и комбинации оснований, включая урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксантин, гипоксантин, изоцитозин и изогуанин. Нуклеиновые кислоты могут быть получены способами химического синтеза или рекомбинантными способами.
[0074] «Функционально связанный», в контексте настоящего документа, означает, что экспрессия гена находится под контролем промотора, с которым он пространственно связан. Промотор может быть расположен на 5’ (слева) или 3' (справа) от гена под его контролем. Расстояние между промотором и геном может быть приблизительно таким же, как расстояние между этим промотором и геном, который он контролирует, в гене, из которого происходит промотор. Как известно в данной области техники, изменение этого расстояния может быть осуществлено без потери функции промотора.
[0075] Используемые в данном документе термины «пептид», «белок» или «полипептид» могут означать связанную последовательность аминокислот и могут быть природными, синтетическими или быть модификацией или комбинацией природного и синтетического.
[0076] Термин «промотор», используемый в данном документе, означает синтетическую молекулу или молекулу природного происхождения, которая способна предоставлять, активировать или усиливать экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке. Промотор может содержать одну или более специфических последовательностей, регулирующих транскрипцию, для дополнительного усиления экспрессии и/или изменения пространственной экспрессии и/или временной экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке. Промотор также может содержать дистальные энхансерные или репрессорные элементы, которые могут находиться на расстоянии до нескольких тысяч пар оснований от стартового сайта транскрипции. Промотор может быть получен из источников, включая вирусные, бактериальные, грибковые, растительные, насекомых и животных. Промотор может регулировать экспрессию генного компонента конститутивно или дифференциально по отношению к клетке, ткани или органу, в котором происходит экспрессия, или относительно стадии развития, на которой происходит экспрессия, или в ответ на внешние раздражители, такие как физиологические стрессы, патогены, ионы металлов или возбуждающие агенты. Типичные примеры промоторов включают промотор бактериофага Т7, промотор бактериофага Т3, промотор SP6, промотор lac оператора, промотор tac, поздний промотор SV40, ранний промотор SV40, промотор RSV-LTR, промотор CMV IE, ранний промотор SV40 или поздний промотор SV40 и промотор CMV IE.
[0077] Термины «сигнальный пептид» и «лидерная последовательность» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к аминокислотной последовательности, которая может быть связана на аминоконце белка, указанного в данном документе. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности обычно направляют локализацию белка. Используемые в данном документе сигнальные пептиды/лидерные последовательности предпочтительно облегчают секрецию белка из клетки, в которой он продуцируется. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности часто отщепляются от остатка белка, часто называемого зрелым белком, при секреции из клетки. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности связаны на амино-конце (то есть на N-конце) белка.
[0078] «Жесткие условия гибридизации», в контексте данного документа, означают условия, при которых первая последовательность нуклеиновой кислоты (например, зонд) будет гибридизоваться со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (например, мишенью), таких как в сложной смеси нуклеиновых кислот. Жесткие условия зависят от последовательности и будут разными в разных обстоятельствах. Жесткие условия могут быть выбраны так, чтобы они были приблизительно на 5-10°C ниже, чем температура плавления (Tm) для конкретной последовательности при pH определенной ионной силы. Tm может быть температурой (при определенной ионной силе, pH и нуклеиновой концентрации), при которой 50% зондов, комплементарных мишени, гибридизуются с последовательностью-мишенью в равновесии (так как последовательности-мишени присутствуют в избытке, при Tm, 50% зондов заняты в равновесии). Жесткие условия могут быть такими, в которых концентрация соли составляет менее чем приблизительно 1,0 М иона натрия, например, концентрация иона натрия (или других солей) приблизительно 0,01-1,0 М при рН 7,0-8,3, а температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°С для коротких зондов (например, приблизительно 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°С для длинных зондов (например, больше, чем приблизительно 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты с добавлением дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для селективной или специфической гибридизации положительный сигнал может по меньшей мере в 2-10 раз превышать фоновую гибридизацию. Примерные строгие условия гибридизации включают следующее: 50% формамид, 5x SSC и 1% SDS, инкубирование при 42°C или 5x SSC, 1% SDS, инкубирование при 65°C, с промывкой в 0,2x SSC и 0,1% SDS при 65°C.
[0079] Термин «субъект», используемый в данном документе, может означать млекопитающее, которому необходима или требуется иммунизация описанными в данном документе вакцинами. Млекопитающим может быть человек, шимпанзе, собака, кошка, лошадь, корова, мышь или крыса.
[0080] Термин «практически комплементарный», используемый в данном документе, означает, что первая последовательность по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% идентичны комплементу второй последовательности в области 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 или более нуклеотидов или аминокислот, или что две последовательности гибридизуются в жестких условиях гибридизации.
[0081] Термин «практически идентичный», используемый в данном документе, означает, что первая и вторая последовательность по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% идентичны в области 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 или более нуклеотидов или аминокислот, или, в отношении аминокислот, если первая последовательность по существу комплементарна комплементу второй последовательности.
[0082] Термины «лечить», «лечение» или «лечащий», используемые в данном документе, могут означать защиту животного от заболевания посредством средств предотвращения, супрессии, подавления или полного устранения заболевания. Профилактика заболевания включает введение вакцины по настоящему изобретению животному до начала заболевания. Супрессия заболевания включает введение вакцины по настоящему изобретению животному после индукции заболевания, но до его клинического проявления. Подавление заболевания включает введение вакцины по настоящему изобретению животному после клинического проявления заболевания.
[0083] Термин «вариант», используемый в данном документе в отношении нуклеиновой кислоты, означает (i) часть или фрагмент эталонной нуклеотидной последовательности; (ii) комплемент эталонной нуклеотидной последовательности или ее часть; (iii) нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична эталонной нуклеиновой кислоте или ее комплементу; или (iv) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с эталонной нуклеиновой кислотой, ее комплементом или последовательностью, по существу идентичной ей.
[0084] Термин «вариант», используемый в данном документе в отношении пептида или полипептида, означает пептид или полипептид, который отличается по аминокислотной последовательности вставкой, делецией или консервативной заменой аминокислот, но сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность. Вариант также может означать белок с аминокислотной последовательностью, которая по существу идентична эталонному белку с аминокислотной последовательностью, которая сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность. Консервативная замена аминокислоты, то есть замена аминокислоты другой аминокислотой со схожими свойствами (например, гидрофильностью, степенью и распределением заряженных областей), как известно в данной области техники, обычно включает незначительные изменения. Эти незначительные изменения могут быть идентифицированы, частично, с учетом индекса гидрофобности аминокислот, как понимается в данной области техники. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). Индекс гидрофобности аминокислоты основан на оценке ее гидрофобности и заряда. В данной области техники известно, что аминокислоты с подобными индексами гидрофобности могут быть замещены и при этом сохранять функцию белка. В одном аспекте аминокислоты с индексами гидрофобности ± 2, являются замещенными. Гидрофильность аминокислот также может быть использована для выявления замен, которые приводят к тому, что белки сохраняют биологическую функцию. Оценка гидрофильности аминокислот в контексте пептида позволяет рассчитать наибольшую локальную среднюю гидрофильность этого пептида, что является полезным измерением, которое, как сообщалось, хорошо коррелирует с антигенностью и иммуногенностью. Патент США № 4554101 полностью включен в данный документ посредством ссылки. Замена аминокислот, имеющих сходные значения гидрофильности, может привести к тому, что пептиды сохраняют биологическую активность, например иммуногенность, как понимается в данной области техники. Замены могут быть выполнены с аминокислотами, имеющими значения гидрофильности у друг друга в пределах ± 2. Как на индекс гидрофобности, так и на значение гидрофильности аминокислот влияет конкретная боковая цепь этой аминокислоты. В соответствии с этим наблюдением считается, что аминокислотные замены, которые совместимы с биологической функцией, зависят от относительного сходства аминокислот и, в частности, от боковых цепей этих аминокислот, что проявляется в гидрофобности, гидрофильности, заряде, размере и других свойствах.
[0085] Вариант может представлять собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентична по всей длине полной последовательности гена или ее фрагмента. Последовательность нуклеиновой кислоты может быть на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентична по всей длине генной последовательности или ее фрагмента. Вариант может представлять собой аминокислотную последовательность, которая по существу идентична по всей длине аминокислотной последовательности или ее фрагмента. Аминокислотная последовательность может быть на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентична по всей длине аминокислотной последовательности или ее фрагмента.
[0086] Термин «вектор», используемый в данном документе, означает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую источник репликации. Вектор может представлять собой вирусный вектор, бактериофаг, бактериальную искусственную хромосому или дрожжевую искусственную хромосому. Вектор может быть вектором ДНК или РНК. Вектор может быть самореплицирующимся внехромосомным вектором и предпочтительно представляет собой ДНК-плазмиду. Вектор может содержать или включать одну или более гетерологичных последовательностей нуклеиновых кислот.
Вакцины
[0087] В данном документе представлены вакцины, содержащие синтетический консенсусный антиген BORIS, как описано в данном документе, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую синтетический консенсусный антиген BORIS, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент синтетического консенсусного антигена BORIS, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант синтетического консенсусного антигена BORIS или их комбинации. Вакцины могут быть способны вызывать у субъекта иммунный ответ против антигена. Иммунный ответ может представлять собой терапевтический или профилактический иммунный ответ. Вакцины могут содержать вектор или множество векторов, как более подробно описано ниже.
[0088] В некоторых вариантах воплощения вакцина содержит молекулу нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты кодирует синтетический консенсусный антиген BORIS. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует SEQ ID NO: 2; последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% длины SEQ ID NO 2; последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 2; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% всей длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 1; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% всей длины SEQ ID NO: 1; фрагмент, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 1; или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% всей длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах воплощения вакцина содержит синтетический консенсусный антиген BORIS, где антиген содержит SEQ ID NO: 2; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% длины SEQ ID NO 2; аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 2; или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% всей длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 2.
[0089] Вакцины могут быть использованы для защиты от рака, например, рака или опухоли, экспрессирующей BORIS. Вакцины могут быть использованы для профилактики и/или лечения опухоли, экспрессирующей BORIS, у субъекта, нуждающегося в этом. Вакцины могут индуцировать клеточные ответы и/или ответы антител против BORIS и против опухолей, экспрессирующих BORIS.
[0090] В одном варианте воплощения вакцины могут быть использованы для защиты, предотвращения и/или лечения, или для индукции клеточного ответа и/или ответа антител против клеток рака яичника, экспрессирующих BORIS, в частности клеток эпителия яичника, экспрессирующих BORIS, более конкретно клеток серозного рака яичника, экспрессирующих BORIS.
[0091] Разработка противораковой вакцины, как описано в данном документе, включает идентификацию ракового антигена, например, BORIS, который не распознается иммунной системой и является антигеном, ассоциированным с опухолью («рак/яичко», «C/T»). Идентифицированный раковый антиген изменяется от аутоантигена к чужеродному антигену для распознавания иммунной системой. Перестройка нуклеиновой кислоты и аминокислотной последовательности рекомбинантного ракового антигена от ауто- к чужеродному антигену нарушает толерантность антигена иммунной системой. Чтобы нарушить толерантность, к антигену рака могут быть применены несколько мер редизайна, как описано ниже.
[0092] Рекомбинантный раковый антиген вакцины не распознается как аутоантиген, тем самым нарушая толерантность. Нарушение толерантности может индуцировать ответы антиген-специфических Т-клеток и/или высокий титр антител, тем самым индуцируя или вызывая иммунный ответ, который направлен или реагирует на рак или опухоль, экспрессирующую антиген. В некоторых вариантах воплощения индуцированный или вызванный иммунный ответ может представлять собой клеточный, гуморальный или как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ. В некоторых вариантах воплощения индуцированный или вызванный клеточный иммунный ответ может включать индукцию или секрецию интерферона-гамма (IFN-γ) и/или фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) и/или интерлейкина 2 (IL-2). В других вариантах воплощения индуцированный или вызванный иммунный ответ может снижать или ингибировать один или более факторов иммуносупрессии, которые способствуют росту опухоли или рака, экспрессирующего антиген, например, но не ограничиваясь ими, факторы, которые подавляют презентацию МНС, факторы, которые стимулируют антиген-специфические регуляторные Т-клетки (Treg), PD-L1, FasL, цитокины, такие как IL-10 и TFG-β, опухоль-ассоциированные макрофаги, ассоциированные с опухолью фибробласты, растворимые факторы, продуцируемые иммуносупрессорными клетками, CTLA-4, PD-1, MDSC, MCP-1 и молекулу иммунной контрольной точки.
+
+
[0093] В конкретном варианте воплощения вакцина может обеспечивать клиренс или предотвращать рост опухолевых клеток путем (1) увеличения цитотоксических Т-лимфоцитов, таких как CD8 и/или CD107a (CTL), для атаки и уничтожения опухолевых клеток; (2) увеличения ответов Т-хелперов; и/или (3) усиления воспалительных реакций посредством IFN-γ, IL-2 и TFN-α или предпочтительно всего вышеупомянутого.
[0094] Вакцина может быть ДНК-вакциной. ДНК-вакцины описаны в патентах США № 5593972, 5739118, 5817637, 5830876, 5962428, 5981505, 5580859, 5703055 и 5676594, которые полностью включены в данный документ посредством ссылки. ДНК-вакцина может дополнительно содержать элементы или реагенты, которые препятствуют ее интеграции в хромосому.
[0095] Вакцина может содержать РНК, кодирующую раковый антиген. РНК-вакцина может быть введена в клетку.
[0096] Вакцина может представлять собой аттенуированную живую вакцину, вакцину с использованием рекомбинантных векторов для доставки антигена, субъединичные вакцины и гликопротеиновые вакцины, например, но не ограничиваясь этим, вакцины, описанные в патентах США №№: 4510245; 4797368; 4722848; 4790987; 4920209; 5017487; 5077044; 5110587; 5112749; 5174993; 5223424; 5225336; 5240703; 5242829; 5294441; 5294548; 5310668; 5387744; 5389368; 5424065; 5451499; 5,453364; 5462734; 5470734; 5474935; 5482713; 5591439; 5643579; 5650309; 5698202; 5955088; 6034298; 6042836; 6156319 и 6589529, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки.
[0097] В некоторых вариантах воплощения вакцина из нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать кодирующую последовательность для молекулярного адъюванта, в некоторых случаях молекулярным адъювантом может быть IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 и/или RANTES, а в некоторых случаях молекулярный адъювант представляет собой ингибитор контрольной точки, включая против цитотоксического антигена Т-лимфоцитов 4 (CTLA-4), против рецептора запрограммированной смерти-1 (PD-1) и против гена активации лимфоцитов (LAG-3). Кодирующая последовательность для IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 и/или RANTES может быть включена в одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые содержат кодирующую последовательность для одного или более антигенов. Кодирующая последовательность для IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 и/или RANTES может быть включена в отдельные молекулы нуклеиновой кислоты, такие как отдельная плазмида или вектор.
[0098] Вакцины по настоящему изобретению могут иметь свойства, требуемые для эффективных вакцин, такие как безопасность, таким образом, что сама вакцина не вызывает заболевания или смерти; защита от болезней; индукция нейтрализующего антитела; индукция защитных Т-клеточных ответов; и обеспечение простоты введения, небольшое количество побочных эффектов, биологическую стабильность и низкую стоимость на дозу. Вакцина может достигать некоторых или всех из этих свойств путем содержания молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты, кодирующей раковый антиген, как обсуждено ниже.
Вакцина в комбинации с ингибитором иммунной контрольной точки
[0099] Вакцина может дополнительно содержать один или более ингибиторов одной или более молекул иммунной контрольной точки (то есть ингибитора иммунной контрольной точки). Молекулы иммунной контрольной точки описаны ниже более подробно. Ингибитором иммунной контрольной точки является любая нуклеиновая кислота или белок, которые предотвращают подавление любого компонента в иммунной системе, такого как презентация класса MHC, презентация и/или дифференцировка Т-клеток, презентация и/или дифференцировка В-клеток, любой цитокин, хемокин или передача сигналов пролиферации и/или дифференцировки иммунных клеток.
[00100] Такой ингибитор может быть последовательностью нуклеиновой кислоты, аминокислотной последовательностью, небольшой молекулой или их комбинацией. Последовательность нуклеиновой кислоты может представлять собой ДНК, РНК, кДНК, их вариант, их фрагмент или их комбинацию. Нуклеиновая кислота также может включать дополнительные последовательности, которые кодируют последовательности линкера или метки, которые связаны с ингибитором иммунной контрольной точки пептидной связью. Малая молекула может представлять собой низкомолекулярное, например, менее 800 Дальтон, органическое или неорганическое соединение, которое может служить в качестве субстрата фермента, лиганда (или его аналога), связанного с белком или нуклеиновой кислотой, или регулятора биологического процесса. Аминокислотная последовательность может быть белком, пептидом, его вариантом, его фрагментом или их комбинацией.
[00101] В некоторых вариантах воплощения ингибитор иммунной контрольной точки может представлять собой одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих антитело, его вариант, его фрагмент или их комбинацию. В других вариантах воплощения ингибитор иммунной контрольной точки может представлять собой антитело, его вариант, его фрагмент или их комбинацию.
Молекула иммунной контрольной точки
[00102] Молекула иммунной контрольной точки может быть последовательностью нуклеиновой кислоты, аминокислотной последовательностью, небольшой молекулой или их комбинацией. Последовательность нуклеиновой кислоты может представлять собой ДНК, РНК, кДНК, их вариант, их фрагмент или их комбинацию. Нуклеиновая кислота также может включать дополнительные последовательности, которые кодируют последовательности линкера или метки, которые связаны с ингибитором иммунной контрольной точки пептидной связью. Малая молекула может представлять собой низкомолекулярное, например, менее 800 Дальтон, органическое или неорганическое соединение, которое может служить в качестве субстрата фермента, лиганда (или его аналога), связанного с белком или нуклеиновой кислотой, или регулятора биологического процесса. Аминокислотная последовательность может быть белком, пептидом, его вариантом, его фрагментом или их комбинацией.
PD-1 и PD-L1
PDCD1
+
[00103] Молекулой иммунной контрольной точки может быть белок запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-1), лиганд запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-L1), его фрагмент, его вариант или их комбинация. PD-1 представляет собой белок клеточной поверхности, кодируемый геном . PD-1 является членом суперсемейства иммуноглобулинов и экспрессируется на Т-клетках и про-В-клетках и, таким образом, способствует участию и/или дифференцировке этих клеток. В частности, PD-1 является мембранным белком типа 1 семейства регуляторов Т-клеток CD28/CTLA-4 и отрицательно регулирует сигналы рецептора Т-клеток (TCR), тем самым отрицательно регулируя иммунные ответы. PD-1 может отрицательно регулировать ответы CD8 T-клеток и, таким образом, ингибировать цитотоксичность, опосредованную CD8, и усиливать рост опухоли.
[00104] PD-1 имеет два лиганда, PD-L1 и PD-L2, которые являются членами семейства B7. PD-L1 активируется на макрофагах и дендритных клетках (DC) в ответ на обработку LPS и GM-CSF и на T-клетках и B-клетках при передаче сигналов TCR и B-клеточных рецепторов. PD-L1 экспрессируется многими линиями опухолевых клеток, включая миеломы, мастоцитомы и меланомы.
Антитело против молекулы иммунной контрольной точки
[00105] Как описано выше, ингибитор иммунной контрольной точки может представлять собой антитело. Антитело может связываться или реагировать с антигеном (т.е. молекулой иммунной контрольной точки, описанной выше). Соответственно, антитело может считаться антителом против иммунной контрольной точки или антителом иммунной контрольной точки. Антитело может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащейся в
[00106] Антитело может включать полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи. Полипептид тяжелой цепи может включать вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или по меньшей мере одну константную область тяжелой цепи (CH). По меньшей мере одна константная область тяжелой цепи может включать константную область тяжелой цепи 1 (СН1), константную область тяжелой цепи 2 (СН2) и константную область тяжелой цепи 3 (СН3) и/или шарнирную область.
[00107] В некоторых вариантах воплощения полипептид тяжелой цепи может включать область VH и область CH1. В других вариантах воплощения полипептид тяжелой цепи может включать область VH, область CH1, шарнирную область, область CH2 и область CH3.
[00108] Полипептид тяжелой цепи может включать набор областей, определяющих комплементарность («CDR»). Набор CDR может содержать три гипервариабельные области области VH. Начиная с N-конца полипептида тяжелой цепи, эти CDR обозначены как «CDR1», «CDR2» и «CDR3» соответственно. CDR1, CDR2 и CDR3 полипептида тяжелой цепи могут способствовать связыванию или распознаванию антигена.
[00109] Полипептид легкой цепи может включать область вариабельной легкой цепи (VL) и/или область константной легкой цепи (CL). Полипептид легкой цепи может включать набор областей, определяющих комплементарность («CDR»). Набор CDR может содержать три гипервариабельные области области VL. Начиная с N-конца полипептида легкой цепи, эти CDR обозначены как «CDR1», «CDR2» и «CDR3» соответственно. CDR1, CDR2 и CDR3 полипептида легкой цепи могут способствовать связыванию или распознаванию антигена.
[00110] Антитело может содержать набор областей, определяющих комплементарность («CDR») тяжелой цепи и легкой цепи, и, соответственно, помещаться между набором каркасной тяжелой цепи и легкой цепи («FR»), которые обеспечивают поддержку CDR и определяют пространственную взаимосвязь CDR относительно друг друга. Набор CDR может содержать три гипервариабельных участка V-области тяжелой или легкой цепи. Начиная с N-конца тяжелой или легкой цепи, эти области обозначены как «CDR1», «CDR2» и «CDR3» соответственно. Следовательно, антигенсвязывающий сайт может включать шесть CDR, содержащих набор CDR из каждой V-области: тяжелой и легкой цепи.
[00111] Антитело может представлять собой иммуноглобулин (Ig). Ig может быть, например, IgA, IgM, IgD, IgE и IgG. Иммуноглобулин может включать полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи. Полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина может включать область VH, область CH1, шарнирную область, область CH2 и область CH3. Полипептид легкой цепи иммуноглобулина может включать область VL и область CL.
2
2
[00112] Кроме того, протеолитический фермент папаин предпочтительно расщепляет молекулы IgG с образованием нескольких фрагментов, два из которых (фрагменты F(ab)), каждый, содержат ковалентный гетеродимер, который включает интактный антигенсвязывающий сайт. Фермент пепсин способен расщеплять молекулы IgG с образованием нескольких фрагментов, включая фрагмент F(ab'), который содержит оба антигенсвязывающих сайта. Соответственно, антитело может представлять собой Fab или F(ab'). Fab может включать полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи. Полипептид тяжелой цепи Fab может включать область VH и область CH1. Легкая цепь Fab может включать область VL и область CL.
[00113] Антитело может представлять собой поликлональное или моноклональное антитело. Антитело может представлять собой химерное антитело, одноцепочечное антитело, аффинно-зрелое антитело, человеческое антитело, гуманизированное антитело или полностью человеческое антитело. Гуманизированное антитело может представлять собой антитело от видов, не являющихся человеком, которое связывает желаемый антиген, имея одну или более областей, определяющих комплементарность (CDR), от видов, не являющихся человеком, и каркасные области от молекулы иммуноглобулина человека.
Антитело к PD-1
[00114] Антитело против иммунной контрольной точки может представлять собой антитело против PD-1 (также обозначаемое в данном документе как «антитело к PD-1»), его вариант, его фрагмент или их комбинацию. Антитело к PD-1 может представлять собой ниволумаб. Антитело против PD-1 может ингибировать активность PD-1, таким образом индуцируя, вызывая или усиливая иммунный ответ против опухоли или рака и уменьшая рост опухоли.
Антитело к PD-L1
[00115] Антитело против иммунной контрольной точки может представлять собой антитело против PD-L1 (также обозначаемое в данном документе как «антитело к PD-L1»), его вариант, его фрагмент или их комбинацию. Антитело против PD-L1 может ингибировать активность PD-L1, таким образом индуцируя, вызывая или усиливая иммунный ответ против опухоли или рака и уменьшая рост опухоли.
Антигены
[00116] Как описано выше, вакцина может содержать антиген или нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген. Антигеном может быть BORIS, его фрагмент, его вариант или комбинация его фрагмента и варианта.
[00117] Соответственно, вакцина может быть использована для лечения субъектов, страдающих от рака или опухолей, которые экспрессируют BORIS. В некоторых вариантах воплощения рак представляет собой рак яичника. В некоторых вариантах воплощения рак яичников представляет собой эпителиальный рак яичников. Рак яичников может быть серозным эпителиальным раком яичников. Вакцина может также использоваться для лечения субъектов с раком или опухолями, которые экспрессируют BORIS, для предотвращения развития таких опухолей у субъектов. Синтетический консенсусный антиген BORIS может отличаться от нативного гена BORIS и, таким образом, обеспечивать терапию или профилактику против опухоли, экспрессирующей антиген BORIS. Соответственно, в данном документе предоставлены синтетические консенсусные последовательности антигена BORIS, которые отличаются от нативного гена BORIS (то есть мутированные или синтетические гены или последовательности BORIS).
[00118] Транскрипты нативного гена BORIS перерабатываются во множество мРНК. Конкретные изоформы мРНК BORIS могут быть выбраны на основании, например, их экспрессии в раковых клетках. В конкретных вариантах воплощения изоформа BORIS выбрана на основании ее экспрессии в раковых клетках яичников. Описанные в данном документе синтетические консенсусные последовательности антигена BORIS избегают альтернативного процессинга, продуцируя один полноразмерный транскрипт, что приводит к более сильной индукции эффекторных T- и B-клеточных ответов.
[00119] Предложены выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие описанные выше гетерологичные последовательности. Предложены выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, состоящие из описанных выше гетерологичных последовательностей. Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие вышеописанные гетерологичные последовательности, могут быть включены в векторы, такие как плазмиды, вирусные векторы и другие формы молекул нуклеиновой кислоты, как описано ниже. В данном документе предложены последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют синтетические консенсусные антигены BORIS. Кодирующие последовательности, кодирующие синтетические консенсусные антигены BORIS, имеют последовательности, как описанные выше.
[00120] Предусмотрены молекулы белка, содержащие описанные выше гетерологичные синтетические консенсусные аминокислотные последовательности антигена BORIS. Предложены молекулы белка, состоящие из описанных выше гетерологичных синтетических консенсусных аминокислотных последовательностей антигена BORIS. В данном документе предложены белки и полипептиды, имеющие описанные выше синтетические консенсусные последовательности антигена BORIS. Белки и полипептид могут называться синтетическими консенсусными антигенами BORIS и иммуногенами BORIS. Консенсусные синтетические антигены BORIS способны вызывать иммунный ответ против опухолей, экспрессирующих BORIS.
[00121] В одном аспекте желательно, чтобы синтетический консенсусный антиген BORIS обеспечивал улучшенную транскрипцию и трансляцию, включая наличие одного или более из следующего: лидерной последовательности с низким содержанием GC для увеличения транскрипции; стабильность мРНК и оптимизацию кодонов; и, насколько это возможно, устранение мотивов цис-действующей последовательности (то есть внутренних TATA-боксов).
[00122] Синтетический консенсусный антиген BORIS может быть последовательностью консенсусного антигена (или иммуногена), полученной из двух или более видов. В одном варианте воплощения консенсусная последовательность создана из изоформ BORIS разных видов. Консенсусная последовательность получена из последовательностей BORIS, собранных из GenBank или другой подобной базы данных последовательностей ДНК или белков. Синтетический консенсусный антиген BORIS может содержать консенсусную последовательность и/или модификацию(модификации) для улучшения экспрессии. Модификация может включать оптимизацию кодонов, оптимизацию РНК, добавление последовательности Kozak (например, GCC ACC) для усиления инициации трансляции и/или добавление лидерной последовательности иммуноглобулина для повышения иммуногенности синтетического консенсусного антигена BORIS. Синтетический консенсусный антиген BORIS может содержать сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например, но не ограничиваясь этим, сигнальный пептид иммуноглобулина E (IgE) или иммуноглобулина G (IgG). В некоторых вариантах воплощения консенсусный антиген BORIS может содержать метку гемагглютинина (HA). Консенсусный антиген BORIS может быть сконструирован так, чтобы вызывать более сильные и более широкие клеточные и/или гуморальные иммунные ответы, чем соответствующий оптимизированный по кодонам синтетический консенсусный антиген BORIS.
[00123] Консенсусная последовательность BORIS может быть мутирована для разрушения и/или усиления определенных структур и/или функций нативного BORIS для получения синтетической консенсусной последовательности антигена BORIS. В одном варианте воплощения мутации вводятся в каждый из 11 доменов цинкового пальца, чтобы нарушить структуру и функциональность цинкового пальца. Одна или более мутаций могут представлять собой замену одной или более аминокислот, которые координируют ион цинка в одном или более цинковых пальцев. Одна или более аминокислот, которые координируют ион цинка, могут быть мотивом CCHH. Соответственно, в некоторых вариантах воплощения одна или более мутаций могут заменять 1, 2, 3 или все 4 аминокислоты одного или более мотивов CCHH. В предпочтительном варианте воплощения цистеины в одиннадцати цинковых пальцах в BORIS мутированы в глицины, чтобы нарушить структуру и связывание цинковых пальцев. (См. Stoll, R. et al. Structure of the Wilms tumor suppressor protein zinc finger domain bound to DNA. Journal of molecular biology 372, 1227-1245, doi:10.1016/j.jmb.2007.07.017 (2007)).
[00124] Синтетический консенсусный антиген BORIS может содержать мутации или делеции для разрушения, например, нативной последовательности сигнала локализации, включая, например, сигнал ядерной локализации для разрушения ядерной транслокации при экспрессии. Например, RRRK можно заменить RKRK для предотвращения ядерной локализации. В конкретном варианте воплощения разрушения осуществляются в каждом из 11 доменов цинкового пальца и в последовательности сигнала ядерной локализации. Специалистам в данной области техники будет понятно, что рекомбинантный синтетический консенсусный антиген BORIS, имеющий одну или более, или любую комбинацию описанных в данном документе мутаций, также будет иметь функциональность в качестве неаутоантигена для целей данного изобретения, и что каждый из этих вариантов предложен настоящим изобретением.
[00125] В предпочтительном варианте воплощения последовательность синтетического консенсусного антигена BORIS имеет 95,0% идентичности с SEQ ID NO:1. В этом варианте воплощения последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1 кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. В других вариантах воплощения последовательность синтетического консенсусного антигена BORIS имеет 95,0% или более идентичности, 95,2% или более идентичности, 95,4% или более идентичности, 95,6% или более идентичности, 95,8% или более идентичности, 96,0% или более идентичности, 96,2% или более идентичности, 96,4% или более идентичности, 96,6% или более идентичности, 96,8% или более идентичности, 97,0% или более идентичности, 97,2% или более идентичности, 97,4% или более идентичности, 97,6% или более идентичности, 97,8% или более идентичности , 98,0% или более идентичности, 98,2% или более идентичности, 98,4% или более идентичности, или 98,6% или более идентичности, 98,8% или более идентичности, 99,0% или более идентичности, 99,2% или более идентичности, 99,4% или более идентичности, 99,6% или более идентичности, 99,8% или более идентичности или 100% идентичности с SEQ ID NO:1.
Векторы
[00126] Вакцина может содержать один или более векторов, которые включают гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую синтетический консенсусный антиген BORIS. Например, один или более векторов могут включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую всю длину аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, включающий по меньшей мере 90% всей длины SEQ ID NO: 2; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 2; или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, включающий по меньшей мере 90% всей длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO:2. Один или более векторов могут включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислоты 19-680 SEQ ID NO: 2; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, включающий по меньшей мере 90% всей длины аминокислот 19-680 SEQ ID NO:2; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-680 SEQ ID NO:2; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% всей длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-680 SEQ ID NO:2. Один или более векторов могут быть способны экспрессировать синтетический консенсусный антиген BORIS в количестве, эффективном для того, чтобы вызвать иммунный ответ у млекопитающего. Вектор может содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую синтетический консенсусный антиген BORIS. Вектор может иметь последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую источник репликации. Вектор может представлять собой плазмиду, бактериофаг, бактериальную искусственную хромосому или дрожжевую искусственную хромосому. Вектор может быть либо самовоспроизводящимся внехромосомным вектором, либо вектором, который интегрируется в геном хозяина.
[00127] Один или более векторов могут быть экспрессионной конструкцией, которая обычно представляет собой плазмиду, которая используется для введения специфического гена в целевую клетку. Как только экспрессирующий вектор оказывается внутри клетки, белок, который кодируется геном, продуцируется рибосомальными комплексами клеточно-транскрипционной и трансляционной машинерии. Плазмиду часто конструируют так, чтобы она содержала регуляторные последовательности, которые действуют как энхансерные и промоторные области и приводят к эффективной транскрипции гена, переносимого на векторе экспрессии. Векторы по настоящему изобретению экспрессируют большие количества стабильной матричной РНК и, следовательно, белков.
[00128] Векторы могут иметь сигналы экспрессии, такие как сильный промотор, сильный кодон терминации, регулирование расстояния между промотором и клонированным геном и вставка последовательности терминации транскрипции и PTIS (переносимая последовательность инициации трансляции).
[00129] Вектор может представлять собой кольцевую плазмиду или линейную нуклеиновую кислоту. Кольцевая плазмида и линейная нуклеиновая кислота способны направлять экспрессию конкретной нуклеотидной последовательности в соответствующей клетке субъекта. Вектор может иметь промотор, функционально связанный с антиген-кодирующей нуклеотидной последовательностью, который может быть функционально связан с сигналами терминации. Вектор также может содержать последовательности, необходимые для правильной трансляции нуклеотидной последовательности, а также последовательности для клонирования и субклонирования вектора и его фрагментов. Вектор, содержащий интересующую нуклеотидную последовательность, может быть химерным, что означает, что по меньшей мере один из его компонентов является гетерологичным по отношению по меньшей мере к одному из его других компонентов. Экспрессия нуклеотидной последовательности в экспрессионной кассете может находиться под контролем конститутивного промотора или индуцибельного промотора, который инициирует транскрипцию только тогда, когда на клетку-хозяина воздействует какой-то конкретный внешний стимул. В случае многоклеточного организма промотор также может быть специфичным для конкретной ткани или органа или стадии развития. В предпочтительном варианте воплощения плазмидный вектор представляет собой pGX1440, описанный в данном документе, дополнительно содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1.
[00130] Вектор может представлять собой плазмиду. Плазмида может использоваться для трансфекции клеток нуклеиновой кислотой, кодирующей антиген. Трансформированные клетки-хозяева могут культивироваться и поддерживаться в условиях, когда имеет место экспрессия антигена.
[00131] Плазмида может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует один или более различных антигенов, раскрытых выше, включая кодирующие последовательности, которые кодируют синтетический консенсусный антиген, способный вызывать иммунный ответ против антигена, фрагменты таких белков, варианты таких белков, фрагменты вариантов или слитые белки, которые состоят из комбинаций консенсусных белков и/или фрагментов консенсусного белка и/или вариантов консенсусного белка и/или фрагментов вариантов консенсусных белков.
[00132] Одна плазмида может содержать кодирующую последовательность для одного антигена, кодирующую последовательность для двух антигенов, кодирующую последовательность для трех антигенов или кодирующую последовательность для четырех антигенов.
[00133] В некоторых вариантах воплощения плазмида может дополнительно содержать кодирующую последовательность, которая кодирует CCR20 отдельно или как часть одной из этих плазмид. Аналогично, плазмиды могут дополнительно содержать кодирующие последовательности для IL-12, IL-15 и/или IL-28.
[00134] Плазмида может дополнительно содержать кодон инициации, который может быть слева от кодирующей последовательности, и стоп-кодон, который может быть справа от кодирующей последовательности. Кодон инициации и терминации может находиться внутри рамки с кодирующей последовательностью.
[00135] Плазмида также может содержать промотор, который функционально связан с кодирующей последовательностью. Промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью, может быть промотором из вируса обезьяны 40 (SV40), промотором вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), промотором вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), таким как промотор длинного концевого повтора (LTR) бычьего вируса иммунодефицита (BIV), промотором вируса Молони, промотором вируса птичьего лейкоза (ALV), промотором цитомегаловируса (CMV), таким как немедленно-ранний промотор CMV, промотором вируса Эпштейна-Барра (EBV) или промотором вируса саркомы Рауса (RSV). Промотор также может быть промотором человеческого гена, такого как человеческий актин, человеческий миозин, человеческий гемоглобин, человеческий мышечный креатин или человеческий металлотионеин. Промотором также может быть тканеспецифичный промотор, такой как мышечный или кожный специфический промотор, природный или синтетический. Примеры таких промоторов описаны в публикации заявки на патент США №. 20040175727, содержание которого полностью включено в настоящий документ.
[00136] Плазмида также может содержать сигнал полиаденилирования, который может быть справа от кодирующей последовательности. Сигналом полиаденилирования может быть сигнал полиаденилирования SV40, сигнал полиаденилирования LTR, сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH), сигнал полиаденилирования гормона роста человека (hGH) или сигнал полиаденилирования β-глобина человека. Сигнал полиаденилирования SV40 может быть сигналом полиаденилирования от плазмиды pCEP4 (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния).
[00137] Плазмида также может содержать энхансер слева от кодирующей последовательности. Энхансером может быть энхансер человеческого актина, человеческого миозина, человеческого гемоглобина, человеческого мышечного креатина или вирусный энхансер, такой как энхансер CMV, FMDV, RSV или EBV. Усиления полинуклеотидной функции описаны в патентах США № 5593972, 5962248 и W 094/016737, содержание каждого из которых полностью включено в качестве ссылки.
[00138] Плазмида также может содержать точку начала репликации млекопитающего для поддержания внехромосомной плазмиды и получения множества копий плазмиды в клетке. Плазмидой может быть pVAXI, pCEP4 или pREP4 от Invitrogen (Сан-Диего, Калифорния), которая может включать точку начала репликации вируса Эпштейна-Барра и кодирующую область ядерного антигена EBNA-1, что может приводить к высококопийной эписомной репликации без интеграции. Основой плазмиды может быть pA V0242. Плазмида может быть плазмидой дефектного по репликации аденовируса типа 5 (Ad5).
[00139] Плазмида также может содержать регуляторную последовательность, которая может хорошо подходить для экспрессии генов в клетке, в которую вводится плазмида. Кодирующая последовательность может содержать кодон, который может обеспечить более эффективную транскрипцию кодирующей последовательности в клетке-хозяине.
[00140] Кодирующая последовательность также может содержать лидерную последовательность Ig. Лидерная последовательность может быть 5’ кодирующей последовательностью. Консенсусные антигены, кодируемые этой последовательностью, могут содержать N-концевой лидер Ig, за которым следует консенсусный белок антигена. Лидером N-концевого Ig может быть IgE или IgG.
Escherichia coli
[00141] Плазмидой может быть pSE420 (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния), которая может быть использована для продуцирования белка в  (E.coli). Плазмида также может быть p YES2 (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния), которая может быть использована для продуцирования белка в штаммах дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Плазмида также может быть полной системой экспрессии бакуловируса MAXBAC™ (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния), которая может быть использована для продуцирования белка в клетках насекомых. Плазмида также может быть pcDNA I или pcDNA3 (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния), которые могут быть использованы для продуцирования белка в клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (CHO).
[00142] Вектор может быть кольцевой плазмидой, которая может трансформировать клетку-мишень путем интеграции в клеточный геном или существовать внехромосомно (например, автономная реплицирующаяся плазмида с точкой начала репликации).
[00143] Вектором может быть pVAX, pcDNA3.0 или provax или любой другой вектор экспрессии, способный экспрессировать ДНК, кодирующую антиген, и позволяющий клетке выполнять трансляцию последовательности в антиген, который распознается иммунной системой.
[00144] Также в данном документе предоставлена линейная вакцина на основе нуклеиновых кислот или кассета с линейной экспрессией («LEC»), которая способна эффективно доставляться субъекту посредством электропорации и экспрессии одного или более желаемых антигенов. LEC может представлять собой любую линейную ДНК, лишенную какого-либо фосфатного остова. ДНК может кодировать один или более антигенов. LEC может содержать промотор, интрон, стоп-кодон и/или сигнал полиаденилирования. Экспрессия антигена может контролироваться промотором. LEC может не содержать генов устойчивости к антибиотикам и/или фосфатного остова. LEC может не содержать других последовательностей нуклеиновых кислот, не связанных с желаемой экспрессией гена антигена.
[00145] LEC может быть получен из любой плазмиды, способной к линеаризации. Плазмида может быть способной экспрессировать антиген. Плазмида может быть pNP (Пуэрто-Рико/34) или pM2 (Новая Каледония/99). Плазмидой может быть WLV009, pVAX, pcDNA3.0 или provax или любой другой вектор экспрессии, способный экспрессировать ДНК, кодирующую антиген и позволяющий клетке выполнять трансляцию последовательности в антиген, который распознается иммунной системой.
[00146] LEC может быть pcrM2. LEC может быть pcrNP. pcrNP и pcrMR могут быть получены из pNP (Пуэрто-Рико/34) и pM2 (Новая Каледония/99) соответственно.
[00147] Вектор может иметь промотор. Промотор может быть любым промотором, который способен управлять экспрессией гена и регулировать экспрессию выделенной нуклеиновой кислоты. Такой промотор представляет собой цис-действующий элемент последовательности, необходимый для транскрипции через ДНК-зависимую РНК-полимеразу, которая транскрибирует последовательность антигена, описанную в настоящем документе. Выбор промотора, используемого для прямой экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты, зависит от конкретного применения. Промотор может быть расположен приблизительно на том же расстоянии от начала транскрипции в векторе, что и от начального сайта транскрипции в его естественных условиях. Тем не менее, изменение этого расстояния может быть обеспечено без потери функции промотора.
[00148] Промотор может быть функционально связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген и сигналы, необходимые для эффективного полиаденилирования транскрипта, сайтов связывания рибосом и терминации трансляции.
[00149] Промотором может быть промотор CMV, ранний промотор SV40, поздний промотор SV40, металлотионеиновый промотор, промотор вируса опухоли молочной железы мыши, промотор вируса саркомы Рауса, промотор полиэдрина или другой промотор, показанный эффективным для экспрессии в эукариотических клетках.
[00150] Вектор может включать энхансер и интрон с функциональными донорными и акцепторными сайтами сплайсинга. Вектор может содержать область терминации транскрипции справа от структурного гена для обеспечения эффективной терминации. Область терминации может быть получена из того же гена, что и последовательность промотора, или может быть получена из разных генов.
Способы получения вектора
[00151] В настоящем документе представлены способы получения векторов, которые включают ДНК-вакцины, обсуждаемые в данном документе. Векторы после заключительного этапа субклонирования могут быть использованы для инокуляции культуры клеток в крупномасштабном ферментационном резервуаре с использованием способов, известных в данной области техники.
[00152] Вектор для использования с устройствами EP, которые более подробно описаны ниже, может быть приготовлен или изготовлен с использованием комбинации известных устройств и технологий, но предпочтительно они изготавливаются с использованием оптимизированной технологии изготовления, которая описана в находящейся на рассмотрении предварительной заявке США с серийным № 60/939792, которая была подана 23 мая 2007 года (см. Пат. США публикация № 20090004716). В некоторых примерах векторы ДНК, используемые в этих исследованиях, могут быть приготовлены в концентрациях, превышающих или равных 10 мг/мл. Технологии изготовления также включают или объединяют различные устройства и протоколы, которые обычно известны специалистам в данной области техники, в дополнение к тем, которые описаны в заявке США с серийном номером 60/939792, включая те, которые описаны в патенте США № 7238522, который выдан 3 июля 2007 года. Вышеупомянутая заявка и патент, серийный номер США 60/939792, и патент США № 7238522, соответственно, включены в данный документ полностью.
Наполнители и другие компоненты вакцины
[00153] Вакцина может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель. Фармацевтически приемлемый наполнитель может представлять собой функциональную молекулу, такую как наполнитель, переносчик или разбавитель. Фармацевтически приемлемый наполнитель может представлять собой агент, облегчающий трансфекцию, который может включать поверхностно-активные вещества, такие как иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS), неполный адъювант Фрейнда, аналог LPS, включая монофосфориллипид A, мурамилпептиды, аналоги хинона, везикулы, такие как сквален и сквален, гиалуроновая кислота, липиды, липосомы, ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы или другие известные средства, облегчающие трансфекцию.
[00154] Средство, облегчающее трансфекцию, представляет собой полианион, поликатион, включая поли-L-глутамат (LGS) или липид. Средство, облегчающее трансфекцию, представляет собой поли-L-глутамат, а поли-L-глутамат может присутствовать в вакцине в концентрации менее 6 мг/мл. Средство, облегчающее трансфекцию, может также включать поверхностно-активные вещества, такие как иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS), неполный адъювант Фрейнда, аналог LPS, включая монофосфориллипид А, мурамилпептиды, аналоги хинона и везикулы, такие как сквален и сквален, и гиалуроновую кислоту также могут быть использованы в сочетании с генетической конструкцией. ДНК-векторные вакцины могут также включать средство, облегчающее трансфекцию, такое как липиды, липосомы, включая лецитиновые липосомы или другие липосомы, известные в данной области техники, в виде смеси ДНК-липосом (см., например, W09324640), ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы, или другие известные средства, облегчающие трансфекцию. Средство, облегчающее трансфекцию, представляет собой полианион, поликатион, включая поли-L-глутамат (LGS) или липид. Концентрация трансфекционного средства в вакцине составляет менее 4 мг/мл, менее 2 мг/мл, менее 1 мг/мл, менее 0,750 мг/мл, менее 0,500 мг/мл, менее 0,250 мг/мл, менее 0,100 мг/мл, менее 0,050 мг/мл или менее 0,010 мг/мл.
[00155] Фармацевтически приемлемый наполнитель может представлять собой один или более адъювантов. Адъювант может представлять собой другие гены, которые экспрессируются в альтернативной плазмиде или векторе или доставляются в виде белков в комбинации с указанной выше плазмидой или вектором в вакцине. Один или более адъювантов могут быть выбраны из группы, состоящей из: CCL20, α-интерферона (IFN-α), β-интерферона (IFN-β), γ-интерферона, фактора роста тромбоцитов (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), хемокина, привлекающего Т-клетки кожи (CTACK), эпителиального тимус-экспрессированного хемокина (TECK), эпителиального хемокина, связанного со слизистой оболочкой (MEC), IL-12, IL-15, IL-28, MHC, CD80, CD86, IL-l, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, IL-33, MCP-1, MIP-la, MIP-1~, IL-8, L-селектина, P-селектина, E-селектина, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, мутантных форм IL-18, CD40, CD40L, фактора роста сосудов, фактора роста фибробластов, IL-7, фактора роста нервов, фактор роста сосудистого эндотелия, Fas, рецептора TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DRS, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, каспазы ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, неактивного NIK, SAP K, SAP-I, JNK, генов ответа интерферона, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI, TAP2, IL-15, имеющих сигнальную последовательность или кодирующую последовательность, которая кодирует удаленную сигнальную последовательность, и необязательно включает другой сигнальный пептид, такой как из IgE, или кодирующую последовательность, которая кодирует другой сигнальный пептид, такой как из IgE, и его функциональные фрагменты или их комбинацию. Адъювантом может быть IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), IL-1, IL-2 , IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 или их комбинация.
[00156] В некоторых вариантах воплощения адъювант может представлять собой одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют белки, выбранные из группы, состоящей из: CCL-20, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, MEC или RANTES. Примеры конструкций и последовательностей IL-12 раскрыты в заявке PCT № PCT/US1997/019502 и соответствующей серийной заявке США № 08/956865 и предварительной заявке США № 61/569600, поданной 12 декабря 2011 г., каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Примеры конструкций и последовательностей IL-15 раскрыты в заявке PCT № PCT/US04/18962 и соответствующей заявке США, серийный номер 10/560650, и в заявке PCT № PCT/US07/00886 и соответствующей заявке США, серийный № 12/160766, и в заявке PCT № PCT/USI0/048827, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Примеры конструкций и последовательностей IL-28 раскрыты в заявке PCT № PCT/US09/039648 и соответствующей заявке США, серийный номер 12/936192, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Примеры RANTES и других конструкций и последовательностей раскрыты в заявке PCT № PCT/US1999/004332 и соответствующей заявке США, серийный номер 09/622452, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Другие примеры конструкций и последовательностей RANTES раскрыты в заявке PCT № PCT/US11/024098, которая включена в данный документ посредством ссылки. Примеры RANTES и других конструкций и последовательностей раскрыты в заявке PCT № PCT/US1999/004332 и соответствующей заявке США, серийный номер 09/622452, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Другие примеры конструкций и последовательностей RANTES раскрыты в заявке PCT № PCT/US11/024098, которая включена в данный документ посредством ссылки. Примеры хемокинов CTACK, TECK и MEC конструкций и последовательностей раскрыты в заявке PCT № PCT/US2005/042231 и соответствующей заявке США, серийный номер 11/719646, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Примеры ОХ40 и других иммуномодуляторов раскрыты в заявке США № 10/560653, которая включена в данный документ посредством ссылки. Примеры DR5 и других иммуномодуляторов раскрыты в заявке США № 09/622452, которая включена в данный документ посредством ссылки.
[00157] Другие гены, которые могут быть использованы в качестве адъювантов, включают те, которые кодируют: MCP-1, MIP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-селектин, P-селектин, E-селектин, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, мутантные формы IL-18, CD40, CD40L, фактор роста сосудов, фактор роста фибробластов, IL-7, IL-22, фактора роста нервов, фактор роста сосудистого эндотелия, Fas, рецептор TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, каспазу ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, неактивный NIK, SAP K, SAP-1, JNK, гены ответа интерферона, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 и их функциональные фрагменты.
[00158] Вакцина может дополнительно содержать средство, способствующее генетической вакцине, как описано в заявке с серийным номером США 021579, поданной 1 апреля 1994 года, которая полностью включена в качестве ссылки.
[00159] Вакцина может содержать антиген-кодирующий вектор в количестве от приблизительно 1 нанограмма до 100 миллиграмм; от приблизительно 1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграмм; или предпочтительно от приблизительно 0,1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграмм; или более предпочтительно от приблизительно 1 миллиграмма до приблизительно 2 миллиграмм. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения вакцина по настоящему изобретению содержит от приблизительно 5 нанограмм до приблизительно 1000 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения вакцина может содержать от приблизительно 10 нанограмм до приблизительно 800 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения вакцина может содержать от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения вакцина может содержать от приблизительно 1 до приблизительно 350 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения вакцина может содержать от приблизительно 25 до приблизительно 250 микрограмм, от приблизительно 100 до приблизительно 200 микрограмм, от приблизительно 1 нанограмма до 100 миллиграмм; от приблизительно 1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграмм; от приблизительно 0,1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграмм; от приблизительно 1 миллиграмма до приблизительно 2 миллиграмм, от приблизительно 5 нанограмм до приблизительно 1000 микрограмм, от приблизительно 10 нанограмм до приблизительно 800 микрограмм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 микрограмм, от приблизительно 1 до приблизительно 350 микрограмм, от приблизительно 25 до приблизительно 250 микрограмм от приблизительно 100 до приблизительно 200 микрограмм антигена или плазмиды, кодирующей его.
[00160] Вакцина может быть составлена в соответствии с применяемым способом введения. Фармацевтическая композиция для инъекционных вакцин может быть стерильной, апирогенной и не содержать твердых частиц. Можно использовать изотонический состав или раствор. Добавки для изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Вакцина может содержать вазоконстриктор. Изотонические растворы могут включать забуференный фосфатом физиологический раствор. Вакцина может дополнительно содержать стабилизаторы, включая желатин и альбумин. Стабилизаторы могут обеспечивать стабильность состава при комнатной температуре или температуре окружающей среды в течение продолжительных периодов времени, включая LGS или поликатионы или полианионы.
Фармацевтические композиции вакцины
[00161] Вакцина может быть в форме фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция может содержать вакцину. Фармацевтические композиции могут содержать от приблизительно 5 нанограмм (нг) до приблизительно 10 миллиграмм (мг) молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению содержат от приблизительно 25 нг до приблизительно 5 мг молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 50 нг до приблизительно 1 мг молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 1 до приблизительно 350 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 5 до приблизительно 250 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 10 до приблизительно 200 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 15 до приблизительно 150 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 20 до приблизительно 100 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 25 до приблизительно 75 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 30 до приблизительно 50 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 35 до приблизительно 40 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 100 до приблизительно 200 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 10 микрограмм до приблизительно 100 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 20 микрограмм до приблизительно 80 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 25 микрограмм до приблизительно 60 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 30 нг до приблизительно 50 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 35 нг до приблизительно 45 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 1 до приблизительно 350 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 25 до приблизительно 250 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 100 до приблизительно 200 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины.
[00162] В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 нг молекулы нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции могут содержать по меньшей мере 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 или 1000 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции могут содержать по меньшей мере 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5 или 10 мг или более молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины.
[00163] В других вариантах воплощения фармацевтические композиции могут содержать до и включая 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 нг молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции могут содержать до и включая 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 или 1000 микрограмм молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции могут содержать до и включая 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5 или 10 мг молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты вакцины.
[00164] Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать другие средства для целей составления в соответствии с используемым способом введения. В тех случаях, когда фармацевтические композиции представляют собой фармацевтические композиции для инъекций, они являются стерильными, апирогенными и не содержат твердых частиц. Предпочтительно использовать изотонический состав. Как правило, добавки для изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. В некоторых случаях предпочтительными являются изотонические растворы, такие как забуференный фосфатом физиологический раствор. Стабилизаторы включают желатин и альбумин. В некоторых вариантах воплощения вазоконстрикторный агент добавляют к препарату.
[00165] Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель, как указано выше в Разделе 2. Например, фармацевтически приемлемый наполнитель может включать функциональные молекулы, носители, адъюванты, носители, разбавители или средства, облегчающие трансфекцию, как предложено в Разделе 2.
Показания к применению
[00166] Вакцины и фармацевтические композиции, содержащие вакцины, представленные в настоящем документе, можно использовать для лечения или профилактики раковых клеток и раковых опухолей, экспрессирующих BORIS. В частности, вакцины и фармацевтические композиции, содержащие вакцины, представленные в настоящем документе, можно использовать для лечения или профилактики рака яичников, более конкретно эпителиального рака яичников, наиболее конкретно серозного рака яичников.
Способы вакцинации
[00167] В данном документе представлены способы лечения и/или профилактики рака с использованием фармацевтических составов, описанных выше. Также в данном документе описаны способы применения фармацевтических составов, описанных выше, для лечения и/или профилактики рака у субъекта. В данном документе также описаны способы вакцинации субъекта. Также в данном документе описаны способы введения фармацевтических составов, описанных в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом. Способы, описанные в данном документе, в совокупности называемые способами лечения с использованием фармацевтических составов, описанных в данном документе, могут включать введение одной или более вакцин, как описано в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом, для индукции терапевтического и/или профилактического иммунного ответа. Вакцина может быть введена субъекту для модуляции активности иммунной системы субъекта и усиления иммунного ответа. Введение вакцины может быть трансфекцией раковых антигенов, как описано в данном документе, в виде молекулы нуклеиновой кислоты, которая экспрессируется в клетке и доставляется на поверхность клетки, после чего иммунная система распознает и индуцирует клеточный, гуморальный или клеточный и гуморальный ответ. Введение вакцины может быть использовано для того, чтобы индуцировать или вызвать иммунный ответ у субъектов против одного или более раковых антигенов, как описано в настоящем документе, путем введения субъекту вакцины, как описано в настоящем документе.
[00168] Вакцина может быть введена субъекту для модуляции активности иммунной системы субъекта и, таким образом, усиления иммунного ответа. В некоторых вариантах субъектом является млекопитающее. При введении вакцины млекопитающему и тем самым введении вектора в клетки млекопитающего трансфицированные клетки будут экспрессировать и секретировать один или более раковых антигенов, как описано в данном документе. Эти секретируемые белки или синтетические антигены будут распознаваться иммунной системой как чужеродные, что приведет к возникновению иммунного ответа, который может включать: антитела, созданные против одного или более раковых антигенов, и ответ Т-клеток, конкретно против одного или более раковых антигенов. В некоторых примерах млекопитающее, вакцинированное вакцинами, обсуждаемыми в данном документе, будет иметь примированную иммунную систему, и при заражении одним или более антигенов рака, как описано в настоящем документе, примированная иммунная система позволит быстро избавиться от последующих антигенов рака, как описано в настоящем документе, независимо от того, через гуморальный, клеточный или как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ.
[00169] Способы введения ДНК вакцины описаны в патентах США №№ 4945050 и 5036006, оба из которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
[00170] Вакцина может быть введена млекопитающему, чтобы вызвать иммунный ответ у млекопитающего. Млекопитающее может быть человеком, приматом, не являющимся человеком, коровой, свиньей, овцой, козой, антилопой, бизоном, водяным буйволом, быком, оленем, ежом, слоном, ламой, альпакой, мышью, крысой и предпочтительно человеком, коровой или свиньей Вакцина также может быть введена субъекту, не являющемуся млекопитающим, например курице, чтобы вызвать иммунный ответ.
[00171] Доза вакцины может составлять от 1 микрограмм до 10 мг активного компонента на килограмм (кг) массы тела во времени (компонент/кг массы тела/время) и может составлять от 20 микрограмм до 10 мг компонента/кг массы тела/время. Вакцину можно вводить каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31 день. Количество доз вакцины для эффективного лечения может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более доз.
Способы генерации иммунного ответа с помощью вакцины
[00172] Вакцина может быть использована для генерирования иммунного ответа у млекопитающего или немлекопитающего субъекта, включая терапевтический или профилактический иммунный ответ. Иммунный ответ может генерировать антитела и/или Т-клетки-киллеры, направленные на один или более раковых антигенов, как описано в данном документе. Такие антитела и Т-клетки могут быть выделены.
[00173] Некоторые варианты воплощения предоставляют способы генерирования иммунных ответов против одного или более раковых антигенов, как описано в данном документе, причем эти варианты воплощения включают введение вакцины субъекту. Некоторые варианты воплощения обеспечивают способы профилактической вакцинации субъекта против рака или опухоли, экспрессирующих один или более раковых антигенов, как описано выше, причем эти варианты воплощения включают введение вакцины. Некоторые варианты воплощения предоставляют способы терапевтической вакцинации субъекта, который страдает от рака или опухоли, экспрессирующих один или более раковых антигенов, причем эти варианты воплощения включают введение вакцины. Диагностика рака или опухоли, экспрессирующих один или более раковых антигенов, как описано в данном документе, до введения вакцины может проводиться в обычном режиме.
Способы лечения рака с помощью вакцины
[00174] Вакцина может быть использована для генерирования или индукции иммунного ответа у млекопитающего, который реактивен или направлен на BORIS-экспрессирующий рак или опухоль (например, рак яичника) млекопитающего или субъекта, нуждающегося в этом. Вызванный иммунный ответ может предотвратить рак или рост опухоли.
[00175] Вызванный иммунный ответ может предотвращать и/или уменьшать метастазирование раковых или опухолевых клеток. Соответственно, вакцина может быть использована при способе, который лечит и/или предотвращает рак или опухоли у млекопитающего или субъекта, которому вводят вакцину.
Пути введения
[00176] Вакцина или фармацевтическая композиция может вводиться различными путями, включая пероральный, парентеральный, сублингвальный, трансдермальный, ректальный, трансмукозальный, местный, посредством ингаляции, посредством буккального введения, внутриплеврально, внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшинно, подкожно, внутримышечно, интраназально, интратекально и/или внутрисуставно, или их комбинациями. Для ветеринарного применения композицию можно вводить в виде подходящей приемлемой композиции в соответствии с обычной ветеринарной практикой. Ветеринар может легко определить режим дозирования и путь введения, который наиболее подходит для конкретного животного. Вакцину можно вводить с помощью традиционных шприцов, безыгольных инъекционных устройств, «генных пушек с бомбардировкой микрочастицами» или других физических способов, таких как электропорация («EP»), «гидродинамический способ» или ультразвук.
[00177] Вектор вакцины может быть введен млекопитающему с помощью нескольких хорошо известных технологий, включая инъекцию ДНК (также называемую ДНК-вакцинацией) с in vivo электропорацией и без нее, трансфекцию, опосредованную липосомами, трансфекцию, обеспеченную наночастицами, и использование рекомбинантных векторов, таких как рекомбинантный аденовирус, рекомбинантный аденовирус-ассоциированный вирус и рекомбинантная вакцинация. Один или более раковых антигенов вакцины можно вводить путем инъекции ДНК вместе с in vivo электропорацией.
[00178] Вакцина или фармацевтическая композиция, содержащая вакцину, может быть введена путем электропорации. Введение вакцины посредством электропорации может быть выполнено с использованием устройств электропорации, которые могут быть сконфигурированы для доставки в желаемую ткань млекопитающего импульса энергии, эффективного для образования обратимых пор в клеточных мембранах, и предпочтительно импульс энергии представляет собой постоянный ток, соответствующий входящему току, заданному пользователем. Устройство электропорации может содержать компонент электропорации и электродную установку или ручную установку. Компонент электропорации может включать и объединять один или более различных элементов устройств электропорации, в том числе: контроллер, генератор сигналов тока, измеритель импеданса, регистратор сигналов, элемент ввода, элемент сообщения о состоянии, порт связи, компонент памяти, источник питания и выключатель. Электропорацию можно проводить с использованием устройства электропорации in vivo, например, системы CELLECTRA EP (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Блу Белл, Пенсильвания) или электропоратора Elgen (Inovio Pharmaceuticals, Inc.), чтобы облегчить трансфекцию клеток плазмидой.
[00179] Примеры устройств электропорации и способов электропорации, которые могут облегчать введение ДНК-вакцин по настоящему изобретению, включают те, которые описаны в патенте США № 7245963, Draghia-Akli и др., патентной публикации США 2005/0052630, представленной Smith et al., содержание которых полностью включено в данный документ посредством ссылки. Другие устройства электропорации и способы электропорации, которые можно использовать для обеспечения введения ДНК-вакцин, включают устройства, представленные в одновременно находящейся на рассмотрении и находящейся в совместном владении заявке на патент США, серийный № 11/874072, поданной 17 октября 2007 г., которая претендует на преимущество в соответствии с 35 USC 119 (e) к предварительным заявкам США Сер. № 60/852149, поданной 17 октября 2006 года, и 60/978982, поданной 10 октября 2007 года, и все они включены в настоящий документ в полном объеме.
[00180] Патент США № 7245963, Draghia-Akli, et al. описывает модульные электродные системы и их использование для обеспечения введения биомолекулы в клетки выбранной ткани организма или растения. Модульные электродные системы могут содержать множество игольчатых электродов; иглу для подкожных инъекций; электрический разъем, который обеспечивает проводящую связь от программируемого импульсного контроллера постоянного тока к множеству игольчатых электродов; и источник питания. Оператор может обхватить множество игольчатых электродов, которые установлены на опорной конструкции и плотно вставить их в выбранную ткань в теле или растении. Затем биомолекулы вводят через подкожную иглу в выбранную ткань. Программируемый контроллер импульсов постоянного тока активируется, и электрический импульс постоянного тока подается на множество игольчатых электродов. Применяемый электрический импульс постоянного тока облегчает введение биомолекулы в клетку между совокупностью электродов. Все содержание патента США № 7245963 полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.
[00181] Публикация патента США 2005/0052630, представленная Smith et al., описывает устройство электропорации, которое можно использовать для эффективного обеспечения введения биомолекулы в клетки выбранной ткани организма или растения. Устройство электропорации содержит электрокинетическое устройство («устройство EKD»), работа которого задается внешним программным обеспечением или встроенным программным обеспечением. Устройство EKD генерирует серию программируемых паттернов импульсов постоянного тока между электродами в массиве на основе пользовательского управления и ввода параметров импульсов, а также позволяет хранить и получать данные о форме сигнала тока. Устройство электропорации также содержит сменный электродный диск, имеющий ряд игольчатых электродов, центральный канал для инъекционной иглы и съемный направляющий диск. Все содержание публикации патента США 2005/0052630 полностью включено в данный документ посредством ссылки.
[00182] Электродные массивы и способы, описанные в патенте США № 7245963 и публикации патента США 2005/0052630, можно адаптировать для глубокого проникновения не только в такие ткани, как мышцы, но и в другие ткани или органы. Из-за конфигурации массива электродов инъекционная игла также полностью вставляется в орган-мишень, и инъекция вводится перпендикулярно целевому проблемному участку в места, которые изначально заданы электродами. Электроды, описанные в патенте США № 7245963 и публикации патента США 2005/005263, предпочтительно имеют длину 20 мм и ширину 21 мм.
[00183] Кроме того, в некоторых вариантах воплощения, которые включают устройства электропорации и их применение, существуют устройства электропорации, которые описаны в следующих патентах: патент США 5 273 525, выданный 28 декабря 1993 г., патенты США 6 110 161, выданные 29 августа 2000 г., 6 261 281, выданный 17 июля 2001 г., и 6 958 060, выданный 25 октября 2005 г., и патент США 6 939 862, выданный 6 сентября 2005 г. Кроме того, в настоящем документе рассматриваются патенты, охватывающие объект изобретения, предусмотренный в патенте США 6 697 669, выданном 24 февраля 2004 г., который касается введения ДНК с использованием любого из множества устройств, и патент США 7 328 064, выданный 5 февраля 2008 г., который относится к способу введения ДНК. Вышеуказанные патенты включены посредством ссылки во всей их полноте.
Способы получения вакцины
[00184] В данном документе предусмотрены способы получения векторов, которые содержат молекулу(ы) нуклеиновой кислоты, кодирующую синтетический консенсусный антиген BORIS, обсуждаемый в данном документе. Векторы ДНК после заключительной стадии субклонирования в плазмиду экспрессии млекопитающих могут быть использованы для инокуляции культуры клеток в крупномасштабном ферментационном резервуаре с использованием известных в данной области техники способов.
[00185] Векторы ДНК для использования с EP-устройствами по настоящему изобретению могут быть составлены или изготовлены с использованием комбинации известных устройств и технологий, но предпочтительно они изготавливаются с использованием оптимизированной технологии получения плазмиды, которая описана в опубликованной заявке США № 20090004716, поданной 23 мая 2007 года. В некоторых примерах векторы ДНК, используемые в этих исследованиях, могут быть приготовлены в концентрациях, превышающих или равных 10 мг/мл. Технологии изготовления также включают или объединяют различные устройства и протоколы, которые широко известны специалистам в данной области техники, в дополнение к тем, которые описаны в заявке США с серийном номером 60/939792, включая те, которые описаны в патенте США № 7238522, который выдан 3 июля 2007 года. Вышеупомянутая заявка и патент, серийный номер США 60/939792, и патент США № 7238522, соответственно, включены в данный документ полностью.
[00186] Настоящее изобретение имеет множество аспектов, иллюстрируемых следующими неограничивающими примерами.
Примеры
[00187] Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано в следующих примерах. Следует понимать, что эти примеры, хотя и указывают предпочтительные варианты воплощения изобретения, приведены только в качестве иллюстрации. Из приведенного выше обсуждения и этих примеров специалист в данной области техники может определить основные характеристики этого изобретения и, не отступая от его сущности и объема, может внести различные изменения и модификации изобретения, чтобы адаптировать его к различным применениям и условиям. Таким образом, различные модификации изобретения в дополнение к тем, которые показаны и описаны в данном документе, будут очевидны для специалистов в данной области техники из предшествующего описания. Такие модификации также должны попадать в объем прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1 - Получение синтетического консенсусного антигена BORIS
[00188] Для получения человеческого консенсуса BORIS из GenBank было собрано 7 последовательностей BORIS (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Номера доступа GenBank для выбранных последовательностей подсемейства 1 BORIS: NP_542185.2, XP_009435727.1, XP_004062465.1, XP_002830505.1, XP_003806212.1, XP_011833550.1 и XP_003253023.1.
[00189] Консенсусная последовательность была получена с помощью программного пакета DNASTAR Lasergene (версия 13.0.0.357). Семь последовательностей, перечисленных выше, были импортированы в MegAlign и выровнены с использованием программы выравнивания множественных последовательностей ClustalW. Полученная консенсусная последовательность BORIS имеет 98,6% идентичности с нативным BORIS человека.
[00190] Чтобы исключить потенциальную биологическую функцию консенсусной последовательности BORIS, было введено 22 мутации (по 2 мутации в каждом из 11 цинковых пальцев), чтобы нарушить структуру цинкового пальца и потенциал связывания ДНК. Кроме того, поскольку BORIS является фактором транскрипции, была введена одна мутация для предотвращения ядерной локализации. Обоснование введения этих мутаций описано ниже.
Мутации цинкового пальца
[00191] CTCF и CTCFL (BORIS) являются паралогичными генами, которые имеют одинаковые экзоны, кодирующие домен 11-цинкового пальца (и тот же потенциал связывания ДНК). Цистеины в одиннадцати цинковых пальцах в консенсусном BORIS были мутированы в глицины, чтобы нарушить структуру и связывание цинковых пальцев.
Мутации сигнала ядерной локализации (NLS)
[00192] Поскольку BORIS является транскрипционным фактором, предсказанный сигнал ядерной локализации был идентифицирован с использованием программы NucPred Стокгольмского центра биоинформатики (www.sbc.su.se/~maccallr/nucpred/cgi-bin/single.cgi). Предсказанный сигнал ядерной локализации в BORIS имеет тип NLS класса 1 с четырьмя последовательными основными аминокислотами. Чтобы предотвратить ядерную локализацию, сигнал ядерной локализации был мутирован от РКРК до РРРК.
[00193] После получения консенсусной последовательности BORIS и последующих мутаций в последовательностях цинкового пальца и NLS ДНК полученная синтетическая консенсусная белковая последовательность антигена BORIS имеет 95,2% идентичности с человеческой нативной изоформой белка BORIS «sf1» (т.е. NP_542185.2).
Homo sapiens
et al.
Journal of virology
[00194] Как только была получена синтетическая консенсусная последовательность ДНК антигена BORIS, для того чтобы иметь более высокий уровень экспрессии, к N-концу добавляли левую последовательность Kozak и лидерную последовательность IgE. Кроме того, использование кодонов этого гена было адаптировано к смещению кодонов генов . (Andre, S. et al. Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage. Journal of virology 72, 1497-1503 (1998); Deml, L. Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein.  75, 10991-11001, doi:10.1128/JVI.75.22.10991-11001.2001 (2001)). Кроме того, была также проведена оптимизация РНК: избегали областей с очень высоким (> 80%) или очень низким (<30%) содержанием GC и мотивами цис-действующей последовательности, такими как внутренние боксы TATA, chi-сайты и сайты рибосомного входа. (Muthumani, K. et al. Novel engineered HIV-1 East African Clade-A gp160 plasmid construct induces strong humoral and cell-mediated immune responses in vivo. Virology 314, 134-146 (2003); Schneider, R., Campbell, M., Nasioulas, G., Felber, B. K. & Pavlakis, G. N. Inactivation of the human immunodeficiency virus type 1 inhibitory elements allows Rev-independent expression of Gag и Gag/protease and particle formation. Journal of virology 71, 4892-4903 (1997)). Последовательность ДНК синтетического консенсусного антигена BORIS была расщеплена BamHI и XhoI и клонирована в запатентованный вектор экспрессии pGX0001 с кассетой экспрессии, помещенной под контроль транскрипции непосредственно-раннего промотора цитомегаловируса. Полученная плазмида была обозначена как pGX1440, и было выполнено секвенирование во всю длину, а затем проанализировано и подтверждено, что она является правильной. Схематическое представление ДНК-конструкции синтетического консенсусного антигена BORIS показано на фиг.1. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности синтетического консенсусного антигена BORIS по изобретению представлены в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 соответственно. Характеристики ДНК последовательностей и белковых последовательностей синтетического консенсусного антигена BORIS приведены в таблице 2 ниже.
Таблица 1.
Особенности SEQ ID NO:2
<b>Особенность</b>
<b>Позиция аминокислоты</b>
Лидерная последовательность IgE
1-18
BORIS-кодирующая последовательность
19-680
Мутации, нарушающие связывание цинковых пальцев
C276G, C279G, C304G, C307GC332G, C335G, C361G, C364GC389G, C392G, C417G, C420GC447G, C450G, C477G, C480GC505G, C508G, C533G, C536GC565G, C568G
Мутация, нарушающая GPI-присоединение
K603R
Табдица 2. Характеристики синтетического консенсусного антигена BORIS
<b>Характеристики</b>
Синтетический консенсусный антиген BORIS (SEQ ID NO:2)
<b>Идентичность к нативному BORIS человека </b>
<b>95,2%</b>
<b>Идентичность к нативному BORIS макаки-резус</b>
<b>81,5-91,8%</b>
<b>Идентичность к нативному BORIS мыши</b>
<b>56,5-57,4%</b>
<b>Количество аминокислотных мутаций (по сравнению с нативным человеческим)</b>
<b>32</b>
<b>Количество встроенных мутаций (происхождение не от консенсуса)</b>
<b>23</b>
<b>Молекулярная масса</b>
<b>680 aa (75 КДа)</b>
<b>Длина кодирующей последовательности (bp)</b>
<b>2046</b>
Пример 2. - Конструирование BORIS-экспрессирующих векторов pGX1440.
[00195] pGX0001 (модифицированный вектор экспрессии pVAX1) под контролем немедленно-раннего промотора цитомегаловируса человека (промотор hCMV) использовали в качестве каркасного вектора. Оригинальный pVAX1 был получен от Thermo Fisher Scientific.
[00196] Модификации были введены в pVAX1 для создания pGX0001 и идентифицированы на основе описанной последовательности pVAX1, доступной от Thermo Fisher Scientific. Эти модификации перечислены ниже, и не было обнаружено никаких проблем, касающихся амплификации плазмиды и транскрипции и трансляции антигена. Никаких дополнительных изменений в последовательности pGX0001 до настоящего времени не наблюдалось ни в одном из плазмидных продуктов на платформе, использующей pGX0001 в качестве основной цепи.
Модификация Пара оснований Описание
C>G 241 в CMV промоторе
C>T 1158 основная цепь, справа от бычьего гормона роста
сигнал полиаденилирования (bGH polyA)
A> - 2092 основная цепь, справа от гена устойчивости к канамицину
C>T 2493 в точке начала репликации pUC (pUC ori)
G>C 2969 в самом конце Ori pUC слева от сайта RNASeH
Пары оснований 2, 3 и 4 изменяются с ACT на CTG в основной цепи слева от промотора CMV.
[00197] pGX1440 представляет собой ДНК-плазмиду, кодирующую белок синтетического консенсусного антигена BORIS. Связанное продуцирование мРНК управляется человеческим промотором CMV (промотором hCMV) и прекращается сигналом полиаденилирования 3'-конца бычьего гормона роста (bGH polyA). Основная цепь pGX0001 включает ген устойчивости к канамицину (KanR) и плазмидную точку начала репликации (pUC ori) для производственных целей. Эти элементы не функционируют в эукариотических клетках. pGX1440 получали путем клонирования последовательности ДНК синтетического консенсусного антигена BORIS в pGX0001 в сайтах BamHI и XhoI, как показано на фиг. 4.
Пример 3 - Иммуногенность конструктов синтетического консенсусного антигена BORIS
in vitro
[00198] Иммуногенность конструкции вакцины, предназначенной для нацеливания на BORIS человека, синтетический консенсусный антиген BORIS (pGX1440), оценивали на мышах. Экспрессию антигенного белка по конструкции также оценивали  методом вестерн-блоттинга.
Материалы и способы
Плазмиды
in vitro
in vivo
[00199] Для  и  исследований, заказывали плазмиду (10 мг) от GenScript для pGX1440 (lot # U0638BC040S-3/G61425). Последовательность антигена из 10 мг плазмидного исходного материала была подтверждена секвенированием Сангера и подтверждена на точность.
Экспрессия антигена in vitro
2
[00200] Экспрессия белка антигена pGX1440 была подтверждена вестерн-блоттингом. Клетки человеческой рабдомиосаркомы (RD) (ATCC, CCL-136), поддерживаемые в среде DMEM с 10% FBS (ThermoFisher), трансфицировали pGX1440 или pGX0001 (6 мкг/10 см планшет) с использованием Turbofectin 8 (Origene). Через сорок восемь часов после трансфекции клетки лизировали с использованием буфера для лизиса клеток RIPA (ThermoFisher) и собирали лизат клеток. После анализа BCA (ThermoFisher) для определения концентрации общего белка 15 мкг клеточного лизата подвергали электрофорезу в 4-12% геле SDS-PAGE (ThermoFisher) и проводили детекцию с помощью моноклонального антитела против BORIS (CTCFL) (AbCam, клон 126778), затем визуализировали с помощью конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) антимышиного IgG (Santa Cruz Biotech, sc-2005) с использованием системы вестерн-блот анализа ECL (GE Amersham). В качестве контроля нагрузки блоты повторно исследовали на экспрессию актина с использованием моноклонального антитела против β-актина (Santa Cruz Biotech, клон, C4).
Животные и иммунизации
[00201] Самки 8-недельных мышей CB6F1 были приобретены в лаборатории Джексона. Все животные содержались в помещении с регулируемой температурой и легкой цикличностью в BTS Research (Сан-Диего, Калифорния). Уход за животными осуществлялся в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения и предложением по уходу и использованию животных (ACUP) (BTS ACUP # 15-091). Мыши были разделены на пять групп, как показано в таблице 3.
Таблица 3. Группы исследований
<b>Группа</b>
<b>n</b>
<b>Конструкция</b>
<b>Доза конструкции (мкг)</b>
<b>Объем инъекции (мкл)</b>
1
4
pGX0001
30
30
2
8
pGX1440
10
30
3
8
pGX1440
20
30
4
8
pGX1440
30
30
5
8
pGX1440
50
30
[00202] Мышей в иммунизированных группах вакцинировали указанными дозами pGX0001 или pGX1440. Вкратце, плазмиды готовили в стерильной воде для инъекций (VetOne) так, чтобы указанная доза доставлялась путем внутримышечной инъекции в переднюю мышцу большеберцовой кости в объеме инъекции 30 мкл. За каждой внутримышечной инъекцией немедленно следовала электропорация (ЕР) с использованием адаптивного устройства электропорации постоянного тока CELLECTRA 2000 с решеткой 3P (Inovio Pharmaceuticals). Устройство было настроено на подачу двух импульсов 0,1 А с шириной импульса 52 мс, разнесенных на 1 секунду. Мыши получили 3 иммунизации с интервалом 3 недели. Мышей умерщвляли через неделю после последней иммунизации, а селезенки собирали для клеточных иммунных отсчетов. Никакой другой ткани не было собрано.
Выделение лимфоцитов селезенки
[00203] Спленоциты были асептически выделены и помещены в 5 мл среды R10 (среда 1640 Rosewell Park Memorial Institute, дополненная 10% эмбриональной бычьей сывороткой и 1% антибиотиком-антимикотиком). Спленоциты выделяли путем механического разрушения селезенки с использованием аппарата Stomacher (Seward Laboratory Systems Inc.), и полученный продукт фильтровали с использованием сита для клеток 40 мкм (BD Falcon). Полученный продукт центрифугировали и осадок обрабатывали в течение 5 минут буфером для лизиса ACK (Lonza) для лизиса эритроцитов. Спленоциты затем центрифугировали, промывали в PBS, а затем ресуспендировали в среде R10 и немедленно использовали для дальнейшего анализа.
IFNγ
ELISpot
5
6
2
[00204] Анализ ELISpot IFNγ мыши (MabTech) проводили для оценки антигенспецифических клеточных ответов. Вкратце, 96-луночные планшеты, предварительно покрытые антителом против мышиного IFNγ, промывали в PBS и блокировали в течение 2 часов при комнатной температуре полной культуральной средой (RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и антибиотиков). Лимфоциты селезенки ресуспендировали в среде R10 (а затем добавляли в трех экземплярах при количестве введенных клеток 2 × 10 клеток на лунку. Был синтезирован набор пептидов (GenScript), каждый из которых содержал 15 аминокислотных остатков, перекрывающихся 11 аминокислотами, представляющими полную белковую последовательность синтетического консенсусного антигена BORIS. Эти наборы пептидов ресуспендировали в ДМСО (Sigma) и объединяли в концентрации пептида ~ 2 мкг/мл в три пептидных пула (P1, P2 и P3 на фиг. 7B). Пептидный пул содержал пептиды, соответствующие синтетическому консенсусному антигену BORIS. Конкавалин А (Sigma) в концентрации 5 мкг/мл использовали в качестве положительного контроля, а полную культуральную среду использовали в качестве отрицательного контроля. Планшеты инкубировали в течение 18 часов при 37°С в инкубаторе с 5% CO. Затем добавляли биотинилированное анти-мышиное антитело для определения IFNγ (MabTech) и планшеты инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Планшеты промывали и добавляли антитело к стрептавидину-ALP (MabTech) и планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Обнаружение пятна было выполнено в соответствии с инструкциями производителя комплекта (MabTech). Пятна на планшетах подсчитывали с использованием автоматического считывателя ELISPOT (Cellular Technology). Среднее количество единиц формирования пятен (SFU) было скорректировано до 1 × 10 спленоцитов для отображения данных.
6
[00205] Антигенспецифические ответы IFNγ ELISpot представлены как число единиц, формирующих пятно IFNγ (SFU) на 1 × 10 спленоцитов, больше, чем SFU в контроле только в среде.
Проточная цитометрия
6
[00206] Клеточные иммунные ответы, индуцированные синтетическим консенсусным антигеном BORIS, были дополнительно охарактеризованы проточной цитометрией. Вкратце, 2 × 10 спленоцитов от вакцинированных и наивных мышей сразу же стимулировали после выделения пептидами синтетического консенсусного антигена BORIS в течение 6 часов в присутствии Брефельдина A (BD Biosciences), Монензина (BD Biosciences) и FITC против мышиного антитела против CD107a (BD Biosciences). После стимуляции пептидами спленоциты центрифугировали и ресуспендировали в 20 мкл на лунку раствора BD Fc Block (BD Biosciences) мыши. Блок Fc используют при начальном разведении 1:40 в PBS и инкубируют при 4°С в течение 5 минут. После инкубации оставшиеся внеклеточные антитела (в PBS) добавляют при 30 мкл на лунку и дают возможность инкубироваться при 4°С в течение 30 минут. После добавления внеклеточного красителя конечный объем в каждой лунке составляет 50 мкл, состоящий из Fc-блока в конечном разведении 1:100 и внеклеточных антител в их соответствующих рабочих разведениях. Затем клетки окрашивали красителем жизнеспособности (Vivid, Thermo-Fisher) и следующими внеклеточными антителами: APC-Cy7 анти-мышиный CD3e, PerCP-Cy5.5 анти-мышиный CD4 и APC-анти-мышиный CD8a (BD Biosciences). Внутриклеточные цитокины затем окрашивали следующими антителами: BV605 анти-мышиный IFNγ, APC-R700 анти-мышиного IL-2 и PE анти-мышиного TNF-α (BD Biosciences). Данные ICS были собраны на 10-цветном FACS CANTO (BD Biosciences) и анализ завершен с использованием FlowJo. Стратегия гейтинга проточной цитометрии показана на фиг. 5.
[00207] Для того, чтобы клетку можно было назвать антигенспецифичной с помощью проточной цитометрии, частота описанного параметра должна превышать частоту контроля только для среды. Для того чтобы клетка была идентифицирована как продуцирующая антигенспецифичный CD107a, клетка также должна быть идентифицирована как позитивная по антигенспецифической продукции IFNγ и/или IL-2 и/или TNFα, как идентифицировано с помощью Булевого гейтинга.
Статистический анализ
[00208] Статистический анализ был выполнен с использованием IBM SPSS Statistics 22 (IBM Corporation). Анализ между группами был выполнен с использованием ANOVA с честной достоверной разницей (HSD) Тьюки для специальной оценки, чтобы скорректировать множественные сравнения. Однородность дисперсии была подтверждена с использованием F-статистики перед множественными сравнениями. Для всего статистического анализа значение р 0,050 считалось значимым.
Результаты
Экспрессия синтетического консенсусного антигена BORIS
[00209] Экспрессия синтетического консенсусного антигена BORIS pGX1440 была подтверждена вестерн-блоттингом. Вкратце, клетки рабдомиосаркомы человека (RD) трансфицировали плазмидами pGX1440 или pGX0001 (пустой вектор, отрицательный контроль). Клеточные лизаты исследовали на экспрессию синтетического консенсусного антигена BORIS с антителом против BORIS человека (CTCFL). Была обнаружена полоса белка ожидаемой молекулярной массы для синтетического консенсусного антигена BORIS (76,75 кДа) (фиг. 6). Слабая полоса была обнаружена в отрицательном контроле (pGX0001), что, скорее всего, связано с низким уровнем экспрессии эндогенного белка BORIS в клеточной линии RD. Полосы анти-β-актина были обнаружены с одинаковой интенсивностью, что указывало на то, что в каждой полосе были загружены равные количества белка. Таким образом, было обнаружено, что pGX1440 экспрессирует свой соответствующий антигенный белок.
Иммуногенность конструкций вакцины синтетического консенсусного антигена BORIS
IFNγ
ELISpot
[00210] Иммуногенность конструкции синтетического консенсусного антигена BORIS оценивали в четырех дозах (10 мкг, 20 мкг, 30 мкг и 50 мкг) с помощью IFNγ ELISpot и проточной цитометрии (n=8/группа). Мышей иммунизировали пустой плазмидной основой (pGX0001) в качестве отрицательного контроля (n=4/группа). Вакцинация синтетическим консенсусным антигеном BORIS (pGX1440) вызывала исключительно устойчивые клеточные иммунные ответы по сравнению с мышами, вакцинированными отрицательным контролем. Величина продуцирования IFNγ, специфического для синтетического консенсусного антигена BORIS, как определено ELISpot, была независимой от дозы (фиг. 7A и фиг. 7B) с аналогичным максимальным ответом, достигнутым при дозе как 20, так и 50 мкг. В частности, значение IFNγ SFU, специфичное для синтетического консенсусного антигена BORIS, составляло 10315 ± 4093, 13725 ± 6151, 8645 ± 2304 и 13600 ± 9894 при 10 мкг, 20 мкг, 30 мкг и 50 мкг соответственно. Ответы IFNγ на синтетический консенсусный антиген BORIS были значительно больше, чем наивный, при дозах 10 мкг (р=0,026), 20 мкг (р=0,002) и 50 мкг (р=0,003) pGX1440, но не при дозе 30 мкг (р=0,071). Ответы IFNγ подытожены в таблице 4.
Таблица 4. Ответы IFNγ, индуцированные синтетическим консенсусным антигеном BORIS
<b>Синтетический консенсусный антиген BORIS (pGX1440)</b>
<b>Конструкция</b>
<b>Доза</b>
<b>Среднее SFU ± Ст. Откл.</b>
<b>p-значение</b>
pGX0001
30 мкг
50 ± 24
n/a
pGX1440
10 мкг
10 315 ± 4 093
0,026
20 мкг
13 725 ± 6 151
0,002
30 мкг
8 645 ± 2 304
0,071
50 мкг
13 600 ± 9 894
0,003
Статистическая значимость принята при р≤0,05. Описанные p-значения близки к наивным (иммунизированные pGX0001 мыши).
Проточная цитометрия
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
-
+
+
[00211] Синтетический консенсусный антиген BORIS вызывал более устойчивые ответы в компартменте CD8 T-клеток по сравнению с ответами в компартменте CD4 T-клеток (фиг. 8A, 8B, 8C и 8D). Синтетический консенсусный антиген BORIS индуцировал частоты антиген-специфических ответов CD4 Т-клеток, которые были значительно более устойчивыми, чем наивные (0,11% ± 0,06%), в 10 мкг (1,41% ± 0,44%) (р <0,001), 20 мкг (1,36% ± 0,42%) (р <0,001), 30 мкг (1,50% ± 0,22%) (р <0,001) и 50 мкг (1,62% ± 0,66%) (р <0,001) в группах дозирования (фиг. 8А). Ответы CD4 Т-клеток, специфических к синтетическому консенсусному антигену BORIS, также не зависели от дозы и состояли в основном из IFNγ IL-2TNFα, IFNγIL-2TNFα или IFNγIL-2TNFα -продуцирующих CD4 T-клеток (фиг. 8C) Частота антигенспецифических CD4 Т-клеток более подробно описана в таблице 5.
Таблица 5. Ответы CD4<sup>+</sup> Т-клеток, индуцированные синтетическим консенсусным антигеном BORIS
<b>CD4</b><sup><b>+</b></sup><b> T-клетки синтетического консенсусного антигена BORIS</b>
<b>Конструкция</b>
<b>Доза</b>
<b>%CD4</b><sup><b>+</b></sup><b> ± </b><b>Ст. откл.</b>
<b>p-значение</b>
pGX0001
30 мкг
0,11 ± 0,06
n/a
pGX1440
10 мкг
1,41 ± 0,44
<0,001
20 мкг
1,36 ± 0,42
<0,001
30 мкг
1,50 ± 0,22
<0,001
50 мкг
1,62 ± 0,66
<0,001
Статистическая значимость принята при р≤0,05. Описанные p-значения близки к наивным (иммунизированные pGX0001 мыши).
+
+
+
-
-
+
-
+
+
+
[00212] Частота антиген-специфических CD8 T-клеток, индуцированных синтетическим консенсусным антигеном BORIS, значительно увеличилась по сравнению с контролем во всех группах доз (фиг. 8B). В частности, частота антиген-специфических CD8 Т-ответов в группах, иммунизированных 10 мкг (12,45% ± 3,86%) (р=0,002), 20 мкг (15,64% ± 5,63%) (р <0,001), 30 мкг (14,49% ± 3,58%) (р <0,001) и 50 мкг (17,34 ± 8,17%) pGX1440 была значительно более устойчивой по сравнению с наивной (0,10% ± 0,05%). Ответы CD8+ Т-клеток, специфических к синтетическому консенсусному антигену BORIS также не зависели от дозы и состояли в основном из IFNγIL-2TNFα и IFNγIL-2TNFα-продуцирующих CD8 T клеток (Фиг. 8D). Частота антигенспецифических CD8 Т-клеток более подробно описана в таблице 6.
Таблица 6. Ответы CD8<sup>+</sup> Т-клеток, индуцированные синтетическим консенсусным антигеном BORIS
<b>CD8</b><sup><b>+</b></sup><b> T-клетки синтетического консенсусного антигена BORIS</b>
<b>Конструкция</b>
<b>Доза</b>
<b>%CD8</b><sup><b>+</b></sup><b></b><b>± Ст. откл.</b>
<b>p-значение</b>
pGX0001
30 мкг
0,10 ± 0,05
n/a
pGX1440
10 мкг
12,45 ± 3,86
0,002
20 мкг
15,64 ± 5,63
<0,001
30 мкг
14,49 ± 3,58
<0,001
50 мкг
17,34 ± 8,17
<0,001
Статистическая значимость принята при р≤0,05. Описанные p-значения близки к наивным (иммунизированные pGX0001 мыши).
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
-
+
[00213] Все дозы синтетического консенсусного антигена BORIS индуцировали частоту CD4 CD107a T-клеток, которая была выше, чем наивная (0,08% ± 0,07%), но только более высокие дозы 30 мкг и 50 мкг были значительно более устойчивыми. В частности, частота антиген-специфических CD4 CD107a Т-клеток составляла 0,37% ± 0,23%, 0,30% ± 0,15%, 0,49% ± 0,20% и 0,50% ± 0,30% в 10 мкг (р=0,097), 20 мкг ( р=0,256), 30 мкг (р=0,012) и 50 мкг (р=0,010) дозовых групп соответственно (фиг. 9А). Профиль цитокинов CD4 CD107a Т-клеток, специфичных синтетическому консенсусному антигену BORIS, был одинаковым в разных дозовых группах и состоял в основном из IFNγIL-2TNFα, IFNγIL-2TNFα, IFNγIL-2TNFα клеток (фиг. 9C). Частота антигенспецифических CD4 Т-клеток с цитолитическим потенциалом более подробно описана в таблице 7.
Таблица 7. Цитолитический потенциал антигенспецифических CD4<sup>+</sup> Т-клеток, индуцированных синтетическим консенсусным антигеном BORIS
<b>CD4</b><sup><b>+</b></sup><b>CD107a</b><sup><b>+</b></sup><b> T клетки синтетического консенсусного антигена BORIS</b>
<b>Конструкция</b>
<b>Доза</b>
<b>%CD4</b><sup><b>+</b></sup><b>CD107a</b><sup><b>+</b></sup><b> ± Ст. откл.</b>
<b>p-значение</b>
pGX0001
30 мкг
0,08 ± 0,07
n/a
pGX1440
10 мкг
0,37 ± 0,23
0,097
20 мкг
0,30 ± 0,15
0,256
30 мкг
0,49 ± 0,20
0,012
50 мкг
0,50 ± 0,30
0,010
Статистическая значимость принята при р≤0,05. Описанные p-значения близки к наивным (иммунизированные pGX0001 мыши).
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
-
+
+
[00214] Подобно величине антиген-специфических CD8T-клеток, синтетический консенсусный антиген BORIS индуцировал значительное изменение частоты CD8CD107a T-клеток во всех группах по сравнению с наивными (0,02% ± 0,01%) (фиг. 9C). В частности, частота антиген-специфических CD8 CD107a Т-клеток составляла 11,52% ± 3,50%, 14,49% ± 5,22%, 13,57% ± 3,45% и 16,24% ± 7,74% в 10 мкг (р=0,002), 20 мкг ( р < 0,001), 30 мкг (р < 0,001) и 50 мкг (р < 0,001) дозовых групп соответственно (фиг. 9B). Профиль цитокинов CD8CD107a T-клеток, специфичных синтетическому консенсусному антигену BORIS, был одинаковым в разных дозовых группах и состоял в основном из IFNγIL-2TNFα с некоторыми IFNγIL-2TNFα клеток (фиг. 9D). Частота антигенспецифических CD8 Т-клеток с цитолитическим потенциалом более подробно описана в таблице 8.
Таблица 8. Цитолитический потенциал антигенспецифических CD8<sup>+</sup> Т-клеток, индуцированных синтетическим консенсусным антигеном BORIS
<b>CD8</b><sup><b>+</b></sup><b>CD107a</b><sup><b>+</b></sup><b> T клетки синтетического консенсусного антигена BORIS</b>
<b>Конструкция</b>
<b>Доза</b>
<b>%CD8</b><sup><b>+</b></sup><b>CD107a</b><sup><b>+</b></sup><b> ± Ст. откл.</b>
<b>p-значение</b>
pGX0001
30 мкг
0,02 ± 0,01
n/a
pGX1440
10 мкг
11,52 ± 3,50
0,002
20 мкг
14,49 ± 5,22
<0,001
30 мкг
13,57 ± 3,45
<0,001
50 мкг
16,24 ± 7,74
<0,001
Статистическая значимость принята при р≤0,05. Описанные p-значения близки к наивным (иммунизированные pGX0001 мыши).
+
+
+
+
+
+
+
В целом не было никаких существенных различий в ответах между иммунизированными группами для каких-либо представленных данных (т.е. 10 мкг не было значительно ниже, чем 50 мкг и т.д.). Синтетический консенсусный антиген BORIS значительно увеличил частоту антигенспецифических CD4, CD4CD107a и CD8, CD8CD107a T-клеток по сравнению с наивными, хотя величина ответа была гораздо более устойчивой в компартменте CD8 T-клеток.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  INOVIO PHARMACEUTICALS, INC
YAN, Jian
SLAGER, Anna
GARMAN, Bradley
COOCH, Neil
<120>  ПРОТИВОРАКОВЫЕ ВАКЦИНЫ, НАЦЕЛЕННЫЕ НА BORIS, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130>  104409.000447 / INO-1001 WO
<150>  US 62/598,274
<151>  2017-12-13
<160>  2
<170>  Патентная  версия 3.5
<210>  1
<211>  2046
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая консенсусная BORIS (CTCFL)
кодирующая последовательность ДНК pGX1440
<400>  1
atggattgga cttggattct gttcctggtc gcagcagcaa ctagagtgca ttccgcagcc       60
accgagattt ccgtcctgag tgagcagttc accaagatca aggagctgga gctgatgccc      120
gagaagggcc tgaaggagga ggagaaggac ggcgtgtgca gagagaagga tcacaggtcc      180
ccttctgagc tggaggccga gagaacaagc ggagcattcc aggactccgt gctggaggag      240
gaggtggagc tggtgctggc accatctgag gagagcgaga agcacatcct gacactgcag      300
accgtgcact ttacctctga ggccgtggag ctgcaggata tgtccctgct gtctatccag      360
cagcaggagg gagtgcaggt ggtggtgcag cagccaggcc ctggcctgct gtggctggag      420
gagggaccta ggcagtccct gcagcagtat gtggccatct ctatccagca ggagctgtac      480
agcctgcagg agatggaggt gctgcagttt cacgccctgg aggagaatgt gatggtggcc      540
agcgaggact ccaagctggc cgtgagcctg gcagagacag caggcctgat caagctggag      600
gagggccagg agaagaacca gctgctggcc gagcgcacaa aggagcagct gttctttgtg      660
gagacaatgt ctggcgacga gcggagcgat gagatcgtgc tgacagtgag caactccaat      720
gtggaggagc aggaggacca gccaaccgca ggacaggccg atgccgagaa ggccaagtcc      780
acaaagaatc agagaaagac caagggcgcc aagaggacat tccacggcga cgtgggcatg      840
tttacaagct cccgcatgtc tagcttcaac cggcacatga agacccacac aaatgagaag      900
ccacacctgg gccacctggg cctgaagacc tttagaaccg tgacactgct gaggaaccac      960
gtgaataccc acacaggcac cagaccctat aagggcaacg atggcaatat ggccttcgtg     1020
acaagcggcg agctggtgag gcaccggaga tataagcaca cccacgagaa gccttttaag     1080
ggctccatgg gcaagtacgc cagcgtggag gcctccaagc tgaagaggca cgtgcggagc     1140
cacaccggag agcggccctt ccagggctgt cagggctctt acgccagcag ggacacatat     1200
aagctgaaga gacacatgag gacccactct ggcgagaagc cctatgaggg ccacatcggc     1260
cacacacgct ttacccagag cggcacaatg aagatccaca tcctgcagaa gcacggcgag     1320
aatgtgccaa agtaccaggg accacacgga gcaaccatca tcgcacggaa gtccgatctg     1380
cgcgtgcaca tgaggaacct gcacgcatac agcgccgcag agctgaaggg cagatatggc     1440
tccgccgtgt tccacgagag gtacgccctg atccagcacc agaagacaca caagaacgag     1500
aagcggttca agggcaagca cggcagctac gcctgcaagc aggagcgcca catgacagcc     1560
cacatccgga cacacaccgg cgagaagcct ttcaccggcc tgtccggcaa caagtgtttt     1620
cgccagaagc agctgctgaa tgcccacttc cggaagtatc acgacgccaa ctttatccca     1680
accgtgtaca agggctccaa gggcggcaag ggcttctctc gctggatcaa tctgcaccgg     1740
cactccgaga agtgcggctc tggagaggca aagtccgccg catctggcaa gggcaggcgc     1800
acccggagaa ggaagcagac aatcctgaag gaggcaacca agggacagaa ggaggcagca     1860
aagggatgga aggaggcagc aaacggcgat gaggcagcag ccgaggaggc cagcaccaca     1920
aagggcgagc agttccctgg cgagatgttt ccagtggcct gtggcgagac aacagccaga     1980
gtgaaggaag aagtggatga aggggtgacc tgtgagatgc tgctgaacat gatggacaaa     2040
tgataa                                                                2046
<210>  2
<211>  680
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая консенсусная BORIS (CTCFL)
белковая последовательность pGX1440
<400>  2
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1. 5                   10                  15
His Ser Ala Ala Thr Glu Ile Ser Val Leu Ser Glu Gln Phe Thr Lys
20                  25                  30
Ile Lys Glu Leu Glu Leu Met Pro Glu Lys Gly Leu Lys Glu Glu Glu
35                  40                  45
Lys Asp Gly Val Cys Arg Glu Lys Asp His Arg Ser Pro Ser Glu Leu
50                  55                  60
Glu Ala Glu Arg Thr Ser Gly Ala Phe Gln Asp Ser Val Leu Glu Glu
65                  70                  75                  80
Glu Val Glu Leu Val Leu Ala Pro Ser Glu Glu Ser Glu Lys His Ile
85                  90                  95
Leu Thr Leu Gln Thr Val His Phe Thr Ser Glu Ala Val Glu Leu Gln
100                 105                 110
Asp Met Ser Leu Leu Ser Ile Gln Gln Gln Glu Gly Val Gln Val Val
115                 120                 125
Val Gln Gln Pro Gly Pro Gly Leu Leu Trp Leu Glu Glu Gly Pro Arg
130                 135                 140
Gln Ser Leu Gln Gln Tyr Val Ala Ile Ser Ile Gln Gln Glu Leu Tyr
145                 150                 155                 160
Ser Leu Gln Glu Met Glu Val Leu Gln Phe His Ala Leu Glu Glu Asn
165                 170                 175
Val Met Val Ala Ser Glu Asp Ser Lys Leu Ala Val Ser Leu Ala Glu
180                 185                 190
Thr Ala Gly Leu Ile Lys Leu Glu Glu Gly Gln Glu Lys Asn Gln Leu
195                 200                 205
Leu Ala Glu Arg Thr Lys Glu Gln Leu Phe Phe Val Glu Thr Met Ser
210                 215                 220
Gly Asp Glu Arg Ser Asp Glu Ile Val Leu Thr Val Ser Asn Ser Asn
225                 230                 235                 240
Val Glu Glu Gln Glu Asp Gln Pro Thr Ala Gly Gln Ala Asp Ala Glu
245                 250                 255
Lys Ala Lys Ser Thr Lys Asn Gln Arg Lys Thr Lys Gly Ala Lys Arg
260                 265                 270
Thr Phe His Gly Asp Val Gly Met Phe Thr Ser Ser Arg Met Ser Ser
275                 280                 285
Phe Asn Arg His Met Lys Thr His Thr Asn Glu Lys Pro His Leu Gly
290                 295                 300
His Leu Gly Leu Lys Thr Phe Arg Thr Val Thr Leu Leu Arg Asn His
305                 310                 315                 320
Val Asn Thr His Thr Gly Thr Arg Pro Tyr Lys Gly Asn Asp Gly Asn
325                 330                 335
Met Ala Phe Val Thr Ser Gly Glu Leu Val Arg His Arg Arg Tyr Lys
340                 345                 350
His Thr His Glu Lys Pro Phe Lys Gly Ser Met Gly Lys Tyr Ala Ser
355                 360                 365
Val Glu Ala Ser Lys Leu Lys Arg His Val Arg Ser His Thr Gly Glu
370                 375                 380
Arg Pro Phe Gln Gly Cys Gln Gly Ser Tyr Ala Ser Arg Asp Thr Tyr
385                 390                 395                 400
Lys Leu Lys Arg His Met Arg Thr His Ser Gly Glu Lys Pro Tyr Glu
405                 410                 415
Gly His Ile Gly His Thr Arg Phe Thr Gln Ser Gly Thr Met Lys Ile
420                 425                 430
His Ile Leu Gln Lys His Gly Glu Asn Val Pro Lys Tyr Gln Gly Pro
435                 440                 445
His Gly Ala Thr Ile Ile Ala Arg Lys Ser Asp Leu Arg Val His Met
450                 455                 460
Arg Asn Leu His Ala Tyr Ser Ala Ala Glu Leu Lys Gly Arg Tyr Gly
465                 470                 475                 480
Ser Ala Val Phe His Glu Arg Tyr Ala Leu Ile Gln His Gln Lys Thr
485                 490                 495
His Lys Asn Glu Lys Arg Phe Lys Gly Lys His Gly Ser Tyr Ala Cys
500                 505                 510
Lys Gln Glu Arg His Met Thr Ala His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu
515                 520                 525
Lys Pro Phe Thr Gly Leu Ser Gly Asn Lys Cys Phe Arg Gln Lys Gln
530                 535                 540
Leu Leu Asn Ala His Phe Arg Lys Tyr His Asp Ala Asn Phe Ile Pro
545                 550                 555                 560
Thr Val Tyr Lys Gly Ser Lys Gly Gly Lys Gly Phe Ser Arg Trp Ile
565                 570                 575
Asn Leu His Arg His Ser Glu Lys Cys Gly Ser Gly Glu Ala Lys Ser
580                 585                 590
Ala Ala Ser Gly Lys Gly Arg Arg Thr Arg Arg Arg Lys Gln Thr Ile
595                 600                 605
Leu Lys Glu Ala Thr Lys Gly Gln Lys Glu Ala Ala Lys Gly Trp Lys
610                 615                 620
Glu Ala Ala Asn Gly Asp Glu Ala Ala Ala Glu Glu Ala Ser Thr Thr
625                 630                 635                 640
Lys Gly Glu Gln Phe Pro Gly Glu Met Phe Pro Val Ala Cys Gly Glu
645                 650                 655
Thr Thr Ala Arg Val Lys Glu Glu Val Asp Glu Gly Val Thr Cys Glu
660                 665                 670
Met Leu Leu Asn Met Met Asp Lys
675                 680
<---