Оценка влияния ультрадисперсных частиц железа и его оксидов с использованием одноклеточных тест-систем

Инновационное направление науки 9

УДК 577.17.049

Оценка влияния ультрадисперсных частиц железа и его оксидов с использованием одноклеточных тест-систем

Д.Б. Косян1, Е.А. Русакова1'2, О.Ю. Сипайлова1'2, Е.А. Сизова1'2 ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт мясного скотоводства»

2 ФГБОУВО «Оренбургский государственный университет»

Аннотация. Область использования наноматериалов быстро расширяется, несмотря на недостаточное освещение их положительных и отрицательных свойств. Также особое внимание вызывают поведение наноматериалов в окружающей среде и их влияние на гидробионтов, поскольку их поступление в окружающую среду увеличивается, в т. ч. вопросы биоаккумуляции техногенных наночастиц в водных беспозвоночных. Объектом для исследования явилась культура пресноводной инфузории Stylonychia mytilus. В качестве определяемых параметров выступали выживаемость и численность. В исследованиях использовали наночастицы Fe3O4 (I), Fe3O4 (II), Fe (I). Анализ концентрационных воздействий показал, что наночастицы Fe (I) вызывают максимальный токсических эффект, который наблюдался при концентрации до 4*10-5 М на клетки простейших. Во всех остальных разведениях до б^Ш-6 М число выживших клеток постепенно увеличивалось (40-95 %). Токсичное действие оксидов железа также сохранялось до 9*10-5 М. С каждым последующим разведением число живых клеток увеличивалось. Проведённые эксперименты свидетельствуют о том, что быстрая реакция простейших к негативному воздействию наночастиц тяжёлых металлов (на примере наночастиц железа и его оксидов) позволяет использовать инфузории в биологических тестах с целью оценки токсичности сред на наличие и концентрации тяжёлых металлов.

Ключевые слова: Stylonychia mytilus, наночастицы, простейшие, токсикологическая оценка, оксидативный стресс.

Введение.

Наночастицы металлов, их окиси активно применяются для реализации биологических и медицинских целей, в частности, для разделения и очистки биологических молекул, клеток, доставки лекарственных препаратов в клетки и ткани [1], диагностики заболеваний [2]. Несмотря на широкий спектр использования, в том числе железа, данный вид соединений является основанием для дестабилизации коллоидной системы при их проникновении в биологическую среду, а также высокая степень неспецифического связывания с компонентами клеток является причиной их токсичности [3].

В мировой практике для оценки действия веществ используют различные тест-объекты. Среди них можно выделить микроорганизмы, клеточные и субклеточные компоненты, ряд гидробионтов, насекомых, животных и растительные организмы [4]. Комплекс ответных реакций организма имеет защитный характер и обеспечивает приспособление к изменяющимся условиям при воздействии ряда негативных факторов [5, 6]. Простейшие как тест-организмы имеют ряд преимуществ, в частности, благодаря относительно большой поверхности соприкосновения с внешней средой, обеспечивается быстрый контакт клетки с анализируемым веществом. При этом можно сразу оценить влияние вещества за счёт целого комплекса изменений (хемотаксис, реверсия ресничной активности, скорость размножения и т. д.). Ряд гидробионтов обладают фильтрационным типом питания, это увеличивает вероятность накопления ими веществ, содержащихся в среде, что позволяет оценить степень их влияния на организм [7].

Экологические риски и методологические подходы для тестирования влияния наноматериалов с использованием гидробионтов рассмотрены в недавних публикациях [8]. В частности, показана эффективность использования наночастиц железа с нулевой валентностью (Zero-valent iron nanoparticles) (INP) для рекультивации сложных U-загрязнённых стоков (for the

10 Инновационное направление науки

remediation of complex U-contaminated effluents) [9]. Описан опыт применения инфузорий родов Euglena, Vorticella и Stylonychia в качестве тест-объектов при токсикологических исследованиях сточных вод [10].

Однако поведение наноматериалов в окружающей среде и их влияние на гидробионтов изучено далеко неполно и требует пристального внимания, особенно вопросы биоаккумуляции техногенных наночастиц в водных беспозвоночных [11].

Цель исследования.

Оценка токсического действия наночастиц железа и его оксидов на выживаемость организма на примере Stylonychia mytilus.

Материалы и методы исследования.

Объект исследования. Культура пресноводной инфузории Stylonychia mytilus (дикий штамм), находящаяся в фазе активного роста.

Экспериментальные исследования были выполнены в соответствии с инструкциями и рекомендациями Russian Regulations, 1987 (Order No.755 on 12.08.1977 the USSR Ministry of Health) and «The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press Washington, D.C. 1996)». При выполнении исследований были предприняты усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных и уменьшения количества используемых образцов.

Схема эксперимента. В качестве исследуемых веществ были использованы наночастицы Fe, Fe3O4 (I) и Fe3O4 (II) («Передовые порошковые технологии», Россия) (табл. 1).

Таблица 1. Характеристики используемых наночастиц металлов

Наименование Размер, нм Компонентный состав наночастиц Метод получения Удельная поверхность

Fe (I) 90 Металлическое железо (не менее 99,8 % масс.) и сорбированные газы: СН4, СО2, Аг, N2. Электрический взрыв проводника в атмосфере аргона 7,7

Fe3O4 (I) 65 FeзO4 не менее 99 % масс., около 1 % масс. - адсорбированные газы: СН4, СО2, О2, N2 Электрический взрыва проводника в атмосфере воздуха 10

Fe3O4 (II) 65 FeзO4 99 % масс. Химический 20

Подготовка культуры к анализу проводилась путём культивирования клеток Stylonychia mytilus в среде Лозина-Лозинского, с добавлением дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) в качестве питательного компонента.

Подготовка препарата наночастиц была проведена путём диспергирования в течение 30 минут изотонического раствора наночастиц на ультразвуковом диспергаторе

Чувствительность культуры клеток Stylonychia mytilus к действию наночастиц была определена по временному показателю, оценке количества умерших клеток, фиксируемой по отсутствию движения, которое сопровождалось нарушением целостности и лизосом клетки. Количество клеток в 5 мл среды, содержащей культуру инфузорий без добавления наночастиц, выступало в качестве контроля. Подсчёт общего количества клеток в среде, содержащей инфузории, осуществлялось с использованием световой микроскопии. Промежуточный подсчёт осуществлялся через 1 ч, 12 ч. и 24 ч.

Инновационное направление науки 11

Оборудование и технические средства. Наночастицы Fe, Fe3O4 (I) и Fe3O4 (II) («Передовые порошковые технологии», Россия), электронный микроскоп JSM-740 IF (Япония), ультразвуковой диспергатор «Сапфир» (Россия), световой микроскоп MT 5300L («Meiji Techno Co., Ltd», Япония, x400).

Статистическая обработка. Проводилась с использованием стандартных параметров ANOVA, дополнительно использовался критерий Тьюки (SPSS вер. 17,0). Статистически достоверными считались различия при P<0,05.

Результаты исследования.

На первом этапе исследований был определён вид наночастиц, оказывающих максимальное токсическое действие. В ходе проведённых экспериментов было выявлено, что наночастицы железа (Fe (I)) и оксиды (Fe3O4 (I), Fe3O4 (II)) имеют сходный эффект воздействия на клетку испытуемого организма. Во-первых, отмечалась 100 % гибель культуры клеток Stylonychia mytilus (рис. 1).

120 -L

Время

-С -e-Fo -a- Fe2O3 —♦— Fe3O4

Рис. 1 - Выживаемость Stylonychia mytilus, %

Во-вторых, микроскопические исследования показали многочисленные грубые морфологические изменения, в частности нарушения наружной стенки мембраны (рис. 2).

400 дт

4

Рис. 2 - Микрофото (40x10): Stylonychia щй1т через 1 час после внесения наночастиц (а);

Stylonychia шуШш через 24 часа после внесения наночастиц (Ь). Стрелками указаны многочисленные разрывы в мембране

12 Инновационное направление науки

В таблице 2 указаны морфологические изменения клеток (хлопьеобразование, разрыв, атрофия) в зависимости от длительности инкубации культуры клеток Stylonychia шуШш с токсикантом (табл. 2).

Таблица 2. Морфологические изменения клеток Stylonychia шуШш на фоне токсического действия наночастиц

Время инкубации, мин Морфология изменения

Fe

60 (1 ч) 720 (12 ч) 1440(24 ч) Без изменений Образование хлопьев, разрушение клеточной мембраны Образование хлопьев, разрушение клеточной мембраны Без изменений Образование хлопьев, разрушение клеточной мембраны Образование хлопьев, разрушение клеточной мембраны Без изменений Образование хлопьев, разрушение клеточной мембраны Образование хлопьев, разрушение клеточной мембраны

Касаемо временного параметра, полученные результаты показывают отсутствие влияния наночастиц Fe и его оксидов ^ез04 (I) и FeзO4 (II)) в первый час инкубации, и полное разрушение мембраны к 12 часам воздействия.

Также можно отметить, что локализация наночастиц Fe и его оксидов ^ез04 (I) и FeзO4 (II)) в клетках находилась в зависимости от времени инкубации с культурой клеток Stylonychia шуШш. Так, после 1 часа исследования было зафиксировано периферическое распределение наночастиц в клетках (рис. 3).

ш.

400 цт

Рис. 3 - Микрофото (40x10): Stylonychia шуШш через 1 час после внесения наночастиц.

Стрелками указано периферическое расположение наночастиц в клетке

После 12 часов инкубации было отмечено равномерное распределение наночастиц в клетке. По истечению 24 часов зафиксирован «окислительный взрыв». Смертность 100 % клеток в результате деструктивной мембранной патологии говорят об интенсивном свободно-радикальном окислении ^з04 (I), FeзO4 (II)).

Также можно констатировать положительный хемотаксис (движение к аттрактанту), поскольку основная часть мёртвых клеток располагалась по всему периметру поля от основной концентрации наночастиц. Изменений клеток инфузорий в более ранних промежутках выявлено не было.

Анализ концентрационных воздействий показал, что наночастицы Fe (I) вызывают максимальный токсических эффект, который наблюдался при концентрации до 4*10-5 М на клетки простейших. Во всех остальных разведениях до 6*10-6 М число выживших клеток постепенно увеличивалось (от 40-95 %).

Инновационное направление науки 13

Токсичное действие оксидов железа (Fe3O4 (I) и Fe3O4 (II)) также сохранялось до 9*10-5 М. С каждым последующим разведением число живых клеток увеличивалось.

Меньшей токсичностью обладала наносистема Fe304 (I), полная гибель клеток наблюдалась через 24 часа до концентрации 0,05 М, в остальных концентрациях токсического эффекта выявлено не было.

Обсуждение полученных результатов.

Токсическое действие исходных наночастиц, а также окиси железа является специфическим и зависит от концентрации и времени экспозиции с клетками [12].

Механизм проникновения наночастиц в клетку можно объяснить как с химической точки зрения, так и с физической. Химический процесс связан с клеточным поглощением, что в итоге приводит к образованию свободных радикалов и возникновению окислительного стресса - процесса повреждения клеток в результате окислительных реакций. «Окислительный взрыв» представляет собой самую раннюю реакцию на инфицирование [13, 14]. Ранее активные формы кислорода (АФК) рассматривались как короткоживущие молекулы, подавляющие развитие патогена, однако, несмотря на это, они были высокотоксичны. В настоящее время выявлена ещё одна функция этих соединений - трансдукция сигнала для генетической экспрессии и индукция защитных реакций. Повышение уровня активных форм кислорода запускает цепную реакцию окислительного разрушения биомолекул, например, инициируется перекисное окисление липидов клеточной мембраны, которое нарушает структуру и повышает проницаемость [15].

Физический процесс транслокации наночастиц железа через мембрану объясняется, в первую очередь, соответствующими размерами и свойствами наноматериалов. Данные аспект включает в себя мембранную активность [16, 17], транспортную цепь [18], белковую конформацию [19, 20] и белковую агрегацию [21].

Оба процесса приводят к возникновению так называемого «биологического ответа». Эти клеточные реакции могут произойти до или после проникновения частиц, а также как ответ на поглощение или «фагоцитоз», когда клетка не может полностью поглотить частицу из-за размера или формы [22]. Это связано с проницаемостью мембраны, что обеспечивает жизнедеятельность клетки, в частности обеспечивает селективный транспорт ионов, молекул и наночастиц. Эта способность мембран обуславливается контролем и сохранением внутриклеточного гомеостаза за счёт селективной проницаемости и транспортных механизмов, что делает их уязвимой мишенью для возможного повреждающего воздействия наночастиц [23].

Исследования показали, что наночастицы, как правило, локализуются в лизосомах, где клетка пытается либо переваривать, либо выделять их в окружающую среду.

Изучению такого явления, как окислительный стресс, посвящены многие работы. Это связано с тем, что данный механизм определяет наиболее ранние и стабильные показатели поражения клеток и тканей. Экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что окисление белков за счёт гидроксид-анионов (ОН") происходит при действии металлов с переменной валентностью [24, 25]. Этот процесс называется металл-катализируемое окисление и определяется как посттранскрипционное окислительное изменение белковых молекул, играющее немаловажную роль в тканях при ряде патологических состояний. Процесс связан с окислением аминогрупп металлами с переменной валентностью и затрагивающим определённую часть белка, которая отвечает за связывание с металлом. Так, на примере наночастиц меди показано увеличение процессов окислительного разрушения белков тимуса крыс под влиянием меди в ультрадисперсном состоянии. Это приводит к изменению интенсивности обмена в организме, что отражается на обновлении белков тканей [26].

Похожий эффект отмечен в отношении в нанотрубок, хотя механизм токсичности пока неизвестен. Некоторые учёные предполагают, что нанотрубки индуцируют апоптоз за счёт накопления активных форм кислорода. Исследования проведены на Т-лимфоцитах [27], эмбриональных почечных клетках НЕК293 [28]. В культуре макрофагов RAW 264.7 наблюдается выраженный ок-сидативный стресс [29].

14 Инновационное направление науки

Выводы.

Проведённые эксперименты свидетельствуют о том, что основное действие наночастиц железа и его оксидов связано с процессами окисления, которые приводят к деструктивной мембранной патологии в следствие эндоцитоза. Деструкция мембраны связана с действием наночастиц на пищеварительную вакуоль, в результате повреждения которой активизируются внутриклеточные ферменты, и клетка начинает «переваривать» сама себя.

Также можно отметить эффективность использования в качестве тест-культуры инфузорий в биологическом тестировании с целью оценки токсичности сред на наличие и концентрации тяжёлых металлов.

Литература

1. Пиотровский Л.Б., Киселёв О.И. Фуллерены в биологии. СПб.: Росток, 2006. 336 с.

2. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC / P. Borm, D. Robbins, S. Haubold et al. // Particle and Fibre Toxicology. 2006. Vol. 3. № 1. P. 1743-1777.

3. Toxic potential of materials at the nanolevel / A. Nel, T. Xia, L. Madler, N. Li // Science. 2006. 311(5761). P. 622-626.

4. Global life cycle releases of engineered nanomaterials / A.A. Keller, S. McFerran, A. Lazareva, S. Suh // Journal of Nanoparticle Research. 2013. Vol. 15. No. 6. doi: 10.1007/s11051-013-1692-4.

5. Petersen E.J., Henry T.B. Methodological considerations for testing the ecotoxicity of carbon nanotubes and fullerenes: review // Environmental Toxicology and Chemistry. 2011. Vol. 31. P. 1-13.

6. Understanding the toxicity of carbon nanotubes in the environment is crucial to the control of nanomaterials in producing and processing and the assessment of health risk for human: a review / J. Du, S. Wang, H. You, X. Zhao // Environmental Toxicology and Pharmacology. 2013. Vol. 36. No. 2. P. 451462.

7. The interaction and toxicity of multi-walled carbon nanotubes with Stylonychia mytilus / Y. Zhu, Q. Zhao, Y. Li et al. // Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 2006. № 6. P. 1357-1364.

8. Dickinson M., Scott T.B. The application of zero-valent iron nanoparticles for the remediation of a uranium-contaminated waste effluent // Journal of Hazardous Materials. 2010. 178(1-3). P. 171-179.

9. Haq R.U., Rehman A., Shakoori A.R. Effect of dichromate on population and growth of various protozoa isolated from industrial effluents // Folia Microbiologica (Praha). 2000. 45(3). P. 275-278.

10. Наночастицы в окружающей среде и их влияние на гидробионтов / Е.Ю. Крысанов, Д.С. Павлов, Т.Б. Демидова, Ю.Ю. Дгебуадзе // Известия Российской академии наук. Серия биологическая. 2010. № 4. С. 478-485.

11. Ecotoxicity of engineered nanoparticles to aquatic invertebrates: a brief review and recommendations for future toxicity testing / A. Baun, N.B. Hartmann, K. Grieger, K.O. Kusk // Ecotoxicology. 2008. Vol. 17. P. 387-395.

12. The interaction and toxicity of multi-walled carbon nanotubes with Stylonychia mytilus / Y. Zhu, Q. Zhao, Y. Li et al. // Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 2006. Vol. 6. № 5. P. 1357-1364.

13. Enhanced bioaccumulation of cadmium in carp in the presence of titanium dioxide nanoparticles / X. Zhang, H. Sun, Z. Zhang et al. // Chemosphere. 2007. Vol. 67. № 1. P. 160-166.

14. Wide varieties of cationic nanoparticles induce defects in supported lipid bilayers / P.R. Leroueil, S.A. Berry, K. Duthie, G. Han, V.M. Rotello, D.Q. McNerny, J.R. Baker, B.G. Orr, M.M. Banaszak Holl // Nano Letters. 2008. 8(2). P. 420-424.

15. In vitro toxicity of nanoparticles in BRL 3A rat liver cells / S.M. Hussain, K.L. Hess, J.M. Gearhart, K.T. Geiss, J.J. Schlager // Toxicology in Vitro. 2005. 19(7). P. 975-983.

16. Understanding the nanoparticle-protein corona using methods to quantify exchange rates and affinities of proteins for nanoparticles / T. Cedervall, I. Lynch, S. Lindman, T. Berggard, E. Thulin, H. Nilsson, K.A. Dawson, S. Linse // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2007. № 104. P. 2050-2055.

Инновационное направление науки 15

17. Lynch I., Salvati A., Dawson K.A. Protein-nanoparticle interactions: what does the cell see? // Nature Nanotechnology. 2009. № 4. P. 546-547.

18. The ecotoxicology and chemistry of manufactured nanoparticles / R.D. Handy, F. von der Kammer, J.R. Lead, M. Hassellov, R. Owen, M. Crane // Ecotoxicology. 2008. № 17. P. 287-314.

19. Effect of natural organic matter on cerium dioxide nanoparticles settling in model fresh water / J.T. Quik, I. Lynch, K. Van Hoecke, C.J. Miermans, K.A. De Schamphelaere, C.R. Janssen, K.A. Dawson, M.A. Stuart, D. Van De Meent // Chemosphere 2010. № 81. P. 711-715.

20. Biosorption of nanoparticles to heterotrophic wastewater biomass / M.A. Kiser, H. Ryu, H. Jang, K. Hristovski, P. Westerhoff // Water Research. 2010. Vol. 44. № 14. P. 4105-4114.

21. Nowack B. The behavior and effects of nanoparticles in the environment // Environmental Pollution. 2009. 157. P. 1063-1064.

22. Nanomaterials as possible contaminants: the fullerene example // M.R. Wiesner, E.M. Hotze, J.A. Brant, B. Espinasse / Water Science and Technology. 2008. 57. P. 305-310.

23. Aust S.D., Morehouse L.A., Thomas C.E. Role of metals in oxygen radical reactions // Free Radical Biology and Medicine. 1985. Vol. 1. № 1. P. 3-25.

24. Stadtman E.R. Metal ion-catalyzed oxidation of proteins: biochemical mechanism and biological consequences // Free Radical Biology and Medicine. 1990. Vol. 9. № 4. P. 315-325.

25. Окислительная модификация белков тимуса крыс под влиянием меди в ультрадисперсной форме / Ю.В. Абаленихина, М.А. Фомина, Г.И. Чурилов, Ю.Н. Иванычева // Фундаментальные исследования. 2012. № 11-6. С. 1315-1319.

26. Multi-walled carbon nanotubes induce T lymphocyte apoptosis / M. Bottini, S. Bruckner, K. Nika et al. // Toxicology Letters. 2006. Vol. 160(2). P. 121-126.

27. Effect of single wall carbon nanotubes on human HEK293 cells / D. Cui, F. Tian, C.S. Ozkan et al. // Toxicology Letters. 2005. Vol. 155(1). P. 73-85.

28. Direct and indirect effects of single walled carbon nanotubes on RAW 264.7 macrophages: role of iron / V.E. Kagan, Y.Y. Tyurina, V.A. Tyurin et al. // Toxicology Letters. 2006. Vol. 165(1). P. 88100.

29. Molecular characterization of the cytotoxic mechanism of multiwall carbon nanotubes and na-noonions on human skin fibroblast / L.H. Ding, J. Stilwell, H.J. Zhang et al. // Nano Letters. 2005. Vol. 5(12). P. 2448-2464.

Косян Дианна Багдасаровна, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией микробиологии Испытательного центра ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт мясного скотоводства», 460000, г. Оренбург, ул. 9 Января 29, тел.: +7-9228-44-89-15, e-mail: kosyan.diana@mail.ru

Русакова Елена Анатольевна, кандидат биологических наук, ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт мясного скотоводства», 460000, г. Оренбург, ул. 9 Января, 29; научный сотрудник Института биоэлементологии ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный университет», 460000, г. Оренбург, проспект Победы, 13, тел.: +7-919-860-24-78, e-mail: elenka_rs@mail.ru

Сипайлова Ольга Юрьевна, кандидат биологических наук, ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт мясного скотоводства», 460000, г. Оренбург, ул. 9 Января, 29; научный сотрудник Института биоэлементологии ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный университет», 460000, г. Оренбург, проспект Победы, 13, тел.: +7-912-353-34-13, e-mail: inst_bioelement@mail.ru

Сизова Елена Анатольевна, кандидат биологических наук, доцент, руководитель лаборатории «Агроэкология техногенных наноматериалов» ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт мясного скотоводства», 460000, г. Оренбург, ул. 9 Января, 29; доцент кафедры биологии и почвоведения ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный университет», 460018, г. Оренбург, пр. Победы, 13, тел.: +7-912-344-99-07, e-mail: Sizova.L78@yandex.ru

16 Инновационное направление науки

Поступила в редакцию 14 июня 2016 года

UDC 577.17.049

Kosyan Dianna Bagdasarovna1, Rusakova Elena Anatolyevna1,2, Sipaylova Olga Yuryevna1,2, Sizova Elena Anatolievna12

1FSBSI «All-Russian Research Institute of Beef Cattle Breeding», e-mail: kosyan.diana@mail.ru

2 FSBEIHE «Orenburg State University», e-mail: inst_bioelement@mail.ru

Evaluation of the effect of ultradisperse iron particles and its oxides using unicellular test systems Summary. The field of using nanomaterials is rapidly expanding, despite the insufficient knowledge about the positive and negative properties of nanomaterials. Also, special attention is paid to the behavior of nanomaterials in the environment and their impact on hydrobionts, as their release into the environment increases, including questions of bioaccumulation of technogenic nanoparticles in aquatic invertebrates. The object of study was the culture of the freshwater infusorian Stylonychia mytilus. The parameters were survival and number. In the studies, nanoparticles Fe3O4 (I), Fe3O4 (II), Fe (I) were used. Analysis of concentration effects showed that Fe (I) nanoparticles cause the maximum toxic effect, which was observed at a concentration of up to 4*10-5 M per protozoan cells. In all other dilutions up to 6*10-6 M, the number of surviving cells gradually increased (from 40-95 %). The toxic effect of iron oxides was also preserved up to 9*10-5 M. With each subsequent dilution, the number of living cells increased. The carried out experiments show that the fast reaction of protozoa to the negative effects of heavy metal nanoparticles (for example, iron nanoparticles and oxides) allows the use of infusoria in biological tests to assess the toxicity of media for the presence and concentration of heavy metals. Key words: Stylonychia mytilus, nanoparticles, protozoa, toxicological assessment, oxidative stress.