Способ прогнозирования наступления беременности у женщин с маточной формой бесплодия, обусловленной гиперплазией эндометрия
METHOD FOR PREDICTION OF PREGNANCY IN FEMALES WITH UTERINE INFERTILITY CAUSED BY ENDOMETRIAL HYPERPLASIA

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии и репродуктологии и может быть использовано для оценки имплантационных возможностей эндометрия при лечении бесплодия, обусловленного гиперплазией эндометрия и прегравидарной подготовки пациенток к участию в программах высокотехнологических репродуктивных технологий (ВРТ) (экстрокорпоральном оплодотворении – ЭКО).
Изобретение обеспечивает возможность коррекции тактики ведения женщин с маточной формой бесплодия, обусловленной гиперплазией эндометрия на этапе прегравидарной подготовки и подготовки к ЭКО.
Повторные неудачи имплантации,  являются проблемой, которая еще не полностью изучена и вызывают большой интерес в научном сообществе.  Нарушение имплантации диагностируется после трех неудачных  попыток экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) с переносом морфологически хороших эмбрионов и как правило связано с нарушением рецептивности эндометрия (Hashimoto T, Koizumi M, Doshida M, et al. Efficacy of the endometrial receptivity array for repeated implantation failure in Japan: A retrospective, two-centers study. Reprod Med Biol. 2017;16(3):290–296. Published 2017 Jun 27. doi:10.1002/rmb2.12041). Существует несколько причин утраты рецептивности, например, гиперплазия, подслизистые миомы, полипы эндометрия, эндометрит, внутриматочные синехии (Ruiz‐Alonso M, Blesa D, Díaz‐Gimeno P, et al. The endometrial receptivity array for diagnosis and personalized embryo transfer as a treatment for patients with repeated implantation failure. Fertil Steril. 2013;100:818‐824.).
«Окно имплантации – это короткий период менструального цикла, в котором эндометрий становится максимально рецептивным. Обычно он начинается на 19–20 дни цикла и продолжается  4-5 дней, когда прогестерон достигает пиковых концентраций в сыворотке крови (Lessey BA. Assessment of endometrial receptivity. Fertil Steril. 2011;96:522‐529.).
Аналогами данного изобретения являются описанные в научно-медицинской и патентной литературе способы, основанные на иммуногистохимической (ИГХ) оценке рецептивности эндометрия.
В результате многочисленных клинических исследований установлено, что важным маркером рецептивности эндометрия является соотношение прогестерона (PR) и эстрогена альфа (ERα) в среднюю секреторную фазу менструального цикла, при этом определяющим прогностическим фактором является соотношение PR / ERα в клетках стромы эндометрия. Наиболее благоприятный прогноз соответствует соотношению PR / ERα в интервале от 2 до 3 (Шуршалина А.В., Демура Т.А. Морфофункциональные перестройки эндометрия в «окно имплантации» // Акушерство и гинекология. – 2011. – № 7–2. – С. 9–13.).
Ю.С. Крыловой и соавт. (2014) предложен способ оценки рецептивности эндометрия путем исследования уровня экспрессии рецепторов прогестерона в строме, а также экспрессии трофобластического фактора роста бета (TGF-β)  в железах (Крылова Ю.С., Шарфи Ю.Н., Гзгзян А.М., Соснина А.К., Кветной И.М. Иммуногистохимические критерии имплантационной восприимчивости эндометрия // Молекулярная медицина. – 2014. – № 5. – С. 24–28).
Недостатками вышеприведенных способов, несмотря на простоту их выполнения является использование одного или двух показателей, без учета математического моделирования, что снижает прогностическую эффективность в решении вопроса о целесообразности переноса эмбриона в текущем или последующем циклах.
В отличие от предложенных способов, P. Díaz‐Gimeno et. аl. (2011) разработали способ оценки рецептивности эндометрия с использованием определенной транскриптомной сигнатуры. Он включает в себя анализ 238 генов, которые экспрессируются на разных стадиях цикла эндометрия, и связаны с вычисляемым предиктором, который может идентифицировать рецептивность образца эндометрия и оценить персонализированный риск неудач имплантации у пациента. По данным авторов, данный способ является более точным, чем гистология эндометрия, и, что важно, эти результаты были воспроизводимы у тех же пациентов через 29-40 месяцев после первого теста. (Díaz‐Gimeno P, Horcajadas JA, Martínez‐Conejero JA, et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertil Steril. 2011;95:50‐60).
Несмотря на очевидные достоинства, вышеуказанный способ имеют некоторые недостатки: дорогостоящее оборудование, сложность выполнения методики.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является разработанный нами ранее «Способ прогнозирования готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия с использованием компьютерной морфометрии» (патент на изобретение RU 2706683 C1, опубликован: 20.II.20l9 г., Бюл. № 32), позволяющий оценить рецептивность эндометрия по значениям площади и высоты пиноподий, площади сосудистого русла, определяемых с помощью компьютерной морфометрии, с вычислением прогностического индекса.
Недостатком этого способа является необходимость специального программного обеспечения, неспецифичность результата без учета патологии, что снижает эффективность применения данного способа.
Задачей изобретения является разработка способа оценки рецептивности эндометрия в период «имплантационного окна» у женщин с первичным бесплодием и гиперплазией эндометрия на основании данных иммуногистохимического исследования в эндометрии уровня экспрессии основных молекул, отвечающих за осуществление имплантации эмбриона, с последующим вычислением прогностического индекса (PI).
Технический результат: способ обеспечивает оценку рецептивности эндометрия при первичном бесплодии, обусловленном гиперплазией эндометрия.
Указанный технический результат достигается тем, что заявляется
способ оценки рецептивности эндометрия в фазу секреции у женщин с первичным бесплодием, обусловленным гиперплазией эндометрия на основании иммуногистохимических данных с использованием метода математического моделирования, отличающийся тем, что при исследовании образцов эндометрия, полученных методом Пайпель биопсии на 20-22 дни менструального цикла определяют экспрессию прогестерона и PTEN в железах и строме и количество CD20+ клеток в строме, затем вычисляют прогностический индекс (PI) по формуле:
PI = Х1×-0,48+ Х2×-1,5+ Х3×-23,07+0,87× Х4+ Х5×-1,21+592,
где:
Х1 – балл H-score экспрессии прогестерона в железах,
Х2 – балл H-score экспрессии прогестерона в строме,
Х3 – количество CD20+ клеток в строме на поле зрения,
Х4 – балл H-score экспрессии PTEN в железах,
Х5 – балл H-score экспрессии PTEN в строме,
592 – константа,
при PI менее 0 прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач, а при PI более 0 делают заключение о высокой вероятности наступления беременности.
Способ осуществляют следующим образом: иммуногистохимическое исследование биоптатов эндометрия, взятых, методом пайпель-биопсии на 20-22 день 28-дневного менструального цикла (в период предполагаемого «окна имплантации»), проводится с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода с демаскировкой антигена и применением стандартных наборов моноклональных и поликлональных антител фирмы «Bond RTU Primary» и «DAКO», США. На парафиновых срезах по стандартной методике с предварительной демаскировкой антигенов с использованием соответствующих стандартных антител выявляются следующие маркеры: PR, PTEN и CD20.
Проявление реакции осуществляется системой визуализации «Dako Cytomation». Для визуализации первичных антител используют безбиотиновую систему детекции Super Sensitive Polymer-HPR Detection System (Biogenex).
Для иммуногистохимического исследования используют серийные парафиновые срезы. Результаты реакции рецепторов к прогестеронам и PTEN  идентифицируют по ядерному или мембранному окрашиванию клеток для соответствующих маркеров с оценкой процента окрашенных клеток и интенсивностью окраски клеток. Экспрессию рецепторов к прогестеронам оценивают по 3-х балльной шкале (слабая, средняя и выраженная степени). Анализ результатов ИГХ реакций проводят методом гистологического счета H-score по формуле: HS=1а+2b+3с, где а - % слабо окрашенных клеток, b - % умеренно окрашенных клеток, с - % сильно окрашенных клеток, 1, 2, 3 - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах.
Экспрессию рецептора CD20 оценивают путем подсчета позитивных клеток в поле зрения при увеличении ×400 при подсчете не менее 10 полей зрения.
В результате проведенных исследований выявлены наиболее информативные морфометрические показатели эндометрия репродуктивных неудач у женщин с маточной формой бесплодия. С использованием метода дискриминантного анализа разработана математическая модель прогнозирования данной патологии, заключающаяся в определении прогностического индекса (PI) по формуле:
PI = Х1×-0,48+ Х2×-1,5+ Х3×-23,07+0,87× Х4+ Х5×-1,21+592, где:
Х1 – балл H-score экспрессии прогестерона в железах;
Х2 – балл H-score экспрессии прогестерона в строме;
Х3 – количество CD20+ клеток в строме;
Х4 – балл H-score экспрессии PTEN в железах;
Х5 – балл H-score экспрессии PTEN в строме на поле зрения ;
592– – константа.
При PI более 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины в программу ВРТ.
При PI менее 0 прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ.
Чувствительность метода составляет 91,66%, специфичность – 100%, эффективность – 95,83%.
Клинические примеры.
Пример 1. Ц. 31 год. Обратилась в связи с первичным бесплодием и жалобами на обильные болезненные менструации. Отмечает бесплодие в течение 5 лет, в анамнезе 1 неудачная попытка ЭКО.  По М-эхо высота эндометрия 16,5 мм. Соматически не отягощена. Материал получен методом Пайпель биопсии на 21-ый день менструального цикла. При рутинном гистологическом исследовании: эндометрий средней стадии фазы секреции с очагами простой гиперплазии без атипии. При расширенном гистологическом и ИГХ исследовании: балл  HSCORE прогестерон в железах- 90; балл HSCORE прогестерон в строме – 270;  CD 20+ количество клеток в строме на поле зрения -2; балл HSCORE PTEN в железах- 200;  балл HSCORE PTEN в строме
По формуле определили значение прогностического индекса:
PI = 90×-0,48+270×-1,5+2×-23,07+0,87×200+175×-1,21+592=59,9
PI> 0 что свидетельствует о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с гиперплазией эндометрия
В течение последующего наблюдения в результате ЭКО наступила беременность, на данный момент срок 35 недель.
Пример 2. Ф. 33 года. Обратилась в связи с отсутствием беременности в течение 8 лет, в анамнезе 3 неудачные попытки ЭКО. По М-ЭХО высота эндометрия 15,6 мм. Соматически не отягощена. Материал получен методом Пайпель биопсии на 21 день менструального цикла. При рутинном гистологическом исследовании: эндометрий средней стадии фазы секреции, очаговая простая гиперплазия без атипии. При расширенном гистологическом и ИГХ исследовании: балл  HSCORE прогестерон в железах- 270; балл HSCORE прогестерон в строме – 210;  CD20+ количество клеток в строме на поле зрения -5; балл HSCORE PTEN в железах- 150;балл HSCORE PTEN в строме – 180.
По формуле определили значение прогностического индекса:
PI = 270×-0,48+210×-1,5+5×-23,07+0,87×150+180×-1,21+592=-55,25
PI <0, что свидетельствует о высоком риске репродуктивных неудач, в программах ВРТ.
В течение периода наблюдения две неудачные попытки переноса эмбриона. Беременности зафиксированы не были, отмечен рецидив гиперплазии после гистероскопии и выскабливания полости матки.
Предложенный нами способ, дает возможность объективно оценить данные иммуногистохимических реакций при использовании программы компьютерной морфометрии, имеющиеся в свободном доступе, что позволяет проводить объективную оценку рецептивности эндометрия у женщин с гиперплазией эндометрия и первичным бесплодием, а также уменьшить количество неэффективных протоколов лечения и циклов ЭКО.
Источники информации
1.  Крылова Ю.С., Шарфи Ю.Н., и др. Иммуногистохимические критерии имплантационной восприимчивости эндометрия // Молекулярная медицина. –2014. – № 5. – С. 24–28
2.  Патент РФ № RU 2706683, 20.11.2019, Способ прогнозирования готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия с использованием компьютерной морфометрии Чистякова Г.Н., Гришкина А.А., Ремизова И.И., Данькова И.В.
3.  Пономаренко К. Ю. Рецептивность эндометрия у женщин с нарушениями в репродуктивной системе // Ж. акуш. и жен. болезн. - 2017. – Том. №4. - С. 90-97
4.  Шуршалина А.В., Демура Т.А. Морфофункциональные перестройки эндометрия в «окно имплантации» // Акушерство и гинекология. – 2011. – № 7–2. – С. 9–13.
5.  Díaz-Gimeno P, Horcajadas JA, Martínez-Conejero JA, et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature// Fertil Steril.- 2011.-Vol.95.- P. 50-60
6.  Hashimoto T, Koizumi M, Doshida M, et al. Efficacy of the endometrial receptivity array for repeated implantation failure in Japan: A retrospective, two-centers study// Reprod Med Biol. -2017.-Vol.16(3).- P. 290–296. Published 2017 Jun 27. doi:10.1002/rmb2.12041
7.  Lessey BA. Assessment of endometrial receptivity// Fertil Steril. -2011.-Vol.96.- P. 522-529
8.  Ruiz-Alonso M, Blesa D, Díaz-Gimeno P, et al. The endometrial receptivity array for diagnosis and personalized embryo transfer as a treatment for patients with repeated implantation failure// Fertil Steril.- 2013.-Vol 100.- P. 818-824.