Особенности сетевого отклика на электрическую стимуляцию нейронной сети зрелой культуры клеток гиппокампа мышей

Биология

Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2014, № 3 (1), с. 57-64

УДК 576.5, 576.535, 591.1

ОСОБЕННОСТИ СЕТЕВОГО ОТКЛИКА НА ЭЛЕКТРИЧЕСКУЮ СТИМУЛЯЦИЮ НЕЙРОННОЙ СЕТИ ЗРЕЛОЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК

ГИППОКАМПА МЫШЕЙ

© 2014 г. А.А. Гладков/'2 А.С. Пимашкин,1 А.П. Лепина,1

В.Б. Казанцев,1т3 И.В. Мухина1

Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского

2 НИИ прикладной и фундаментальной медицины Нижегородской государственной медицинской академии 3Институт прикладной физики РАН, Н. Новгород

gladkov@neuro. nnov. ru

Поступила в редакцию 21.02.2014

Установлено, что в первичной культуре клеток гиппокампа вызванные электрическим стимулом сетевые отклики имеют синаптическое и несинаптическое происхождение. Показано, что на эффективность индукции сетевого ответа влияет пространственное расположение участка стимуляции нейронной сети. Обнаружено, что в ответ на электрическую стимуляцию с различных входов эффективность генерации сетевой пачки импульсов одинаково стабильна в течение часа и нескольких суток, что свидетельствует о наличие стабильной функциональной организации нейронной сети.

Ключевые слова: нейронная пластичность, диссоциированная культура, гиппокамп, электрическая стимуляция.

Введение

В настоящее время изучение пластичности нейронных сетей является одним из ключевых направлений исследований функционирования мозга. Ведется поиск сетевых механизмов высших функций центральной нервной системы, таких как обучение и память. Перспективной экспериментальной моделью для исследования пластичности нейронных сетей является культивирование на мультиэлектродных матрицах, позволяющее регистрировать и стимулировать биоэлектрическую активность нейронов одновременно с различных участков нейронной сети, а также проводить хронические эксперименты длительностью до нескольких месяцев. Однако в длительных экспериментах in vitro по изучению механизмов памяти и обучения необходимо учитывать способность нейронных сетей к спонтанным функциональным перестройкам, связанным с гомеостатическими изменениями синаптической передачи сигнала.

Активность диссоциированной нейронной сети характеризуется наличием пачек биоэлектрических импульсов, регистрируемых одновременно на различных участках сети. Вероятность генерации спонтанной сетевой пачки импульсов зависит от состояния синаптических связей. Известно, что при подавлении глута-матэргической передачи сигнала уменьшается частота пачек [1]. При подавлении тормозной синаптической передачи увеличиваются интер-

валы между пачками при увеличении длительности самих пачек [2]. Электрическая стимуляция способствует генерации сетевых пачек. При стимуляции различных участков вероятность вызова сетевой пачки оказывается различной, что отражает пространственную неравномерность в функциональной связанности культивируемой нейронной сети. Следовательно спонтанные функциональные перестройки в нейронной сети должны привести к изменениям вероятности вызова сетевой пачки при стимуляции различных участков. Цель данной работы -оценка эффективности вызова сетевого ответа нейронной сети в культуре клеток гиппокампа мышей при стимуляции ее через различные входы (электроды мультиэлектродной системы) в течение четырех дней. Для этого оценены изменения вероятности генерации сетевого ответа на стимуляцию с различных входов в течение часа и 1-4 суток, исследованы временные интервалы синаптического сетевого ответа после стимула, а также изучено влияние спонтанной активности на вероятность вызова сетевого ответа.

Методы исследования

Культивирование нервных клеток

Клеточные культуры гиппокампа были получены от 18-дневных эмбрионов (Е18) белых беспородных мышей. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, приве-

денным в Приказе Минздрава России № 267 от 19.06.03 «Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации». Диссоциирование клеток достигалось путем обработки ткани гиппокампа 0.25%-ым трипсином (Invi-trogen 25200-056). Клетки культивировали на 64-электродных матрицах (Alpha MED Sciences, Japan). Предварительно дно матриц обрабатывалось адгезивным материалом полиэтилени-мином (Sigma P 3143). Исходная плотность клеточной культуры составила 8000 клеток/мм2. Поддержание жизнеспособности клеток осуществлялось в культуральной нейробазальной среде Neurobasal™ (Invitrogen 21103-049) в комплексе с биоактивной добавкой В27 (Invitrogen 17504-044), глутамином (Invitrogen 25030-024) и эмбриональной телячьей сывороткой (ПанЭко К055) в инкубаторе (MCO-18AIC, SANYO) при постоянных условиях: температуре 35.5° C, 100% влажности, 5% CO2. Антибиотики и противогрибковые препараты не использовались. Развитие глии не подавлялось, поскольку гли-альные клетки необходимы для длительного сохранения жизнеспособности культуры в условиях in vitro. Смена половины объема среды проводилась один раз в два дня.

Регистрация биоэлектрической активности

Внеклеточные потенциалы регистрировались одновременно через 59 плоских электродов мультиэлектродной системы MEA (Multichannel systems, Германия). Запись происходила с частотой дискретизации 20 кГц/канал. Анализ сигнала в реальном времени и автоматическая стимуляция через электроды выполнялись с помощью авторской программы, написанной в среде Labview.

Пороговое детектирование внеклеточных сигналов было основано на вычислении медианы сигнала

T = NS ст, ст = median——— ) ,

где x - сигнал с фильтрованной полосой частот (0.3-8 кГц), о - оценка медианы, нормированная на стандартное отклонение сигнала с нулевым числом импульсов [3], и NS - коэффициент детектирования импульсов, определяющий порог детектирования [4]. Стандартное отклонение сигнала равно медиане абсолютных значений этого сигнала, деленных на 0.6745. Таким образом, 0.6745 - это значение нормирования медианы на стандартное отклонение сигнала.

Протокол стимуляции

Для генерации стимулов использовали четы-рехканальный стимулятор напряжением и током (модель STG4004, Multichannel systems, Германия). Мы применяли последовательности

бифазных прямоугольных импульсов напряжения (±600 мВ и 260 мкс на фазу, первая из которых положительная) с пятисекундным интервалом. Считается, что низкочастотные стимулы не вызывают функциональных изменений в нейронной сети [5]. Стимулы подавались с одного электрода, который вызывал сетевой ответ, регистрируемый на других электродах. Для оценки эффективности вызова сетевого ответа при стимуляции с различных участков использовали протокол с автоматическим переключением стимулируемого электрода. Для оценки изменений эффективности вызова сетевого ответа определяли разницу между вероятностью вызова сетевого ответа в исходной и последующих сериях стимуляции. Применяли следующий протокол:

1. регистрация спонтанной активности - 10 мин;

2. стимуляция последовательно по 30 стимулов через 12 электродов (с 1 по 60 с шагом 5, исключая электрод сравнения 15) - 50 мин;

3. повторная стимуляция последовательно по 30 стимулов через 12 электродов - 50 мин;

4. регистрация спонтанной активности - 10 мин.

Протокол эксперимента повторяли на второй, третий, четвертый и пятый дни после первой стимуляции. В эксперименте использовали пять культур после 4 недель развития in vitro, что определялось задачей исследования зрелых в функциональном и структурном отношениях нейронных сетей [6, 7].

Для выявления природы вызванных потенциалов после стимула применяли антагонисты глутаматных рецепторов CNQX (6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione) 10 мкМ (Sigma) и CPP (3-(2-сarboxypiperazin-4-yl) propyl-1-phosphonic acid) 10 мкМ (Sigma), подавляющих возбуждающую синаптическую передачу, и блокатор ионных каналов тетродотоксин (TTX) в концентрации 1 мкМ (Sigma).

Результаты и их обсуждение

Формирование синаптического сетевого ответа на электрическую стимуляцию

Известно, что стимуляция культуры нейронов, растущей на мультиэлектродной матрице, одиночными короткими импульсами (порядка нескольких сотен милливольт длительностью 200-400 мкс) способна вызвать реверберирую-щий сетевой ответ в виде пачки биоэлектрических импульсов после каждого стимула. Последовательность импульсов после электрического стимула неоднородна по своей структуре. В экспериментах с использованием антагонистов глутаматных рецепторов (CNQX и CPP), подав-

о Л н и о

о CJ

и Л ц 20

В £

о И 1 10

60 80 100 Время после стимула, мс

100

Время после стимула, мс

Рис. 1. Гистограммы количества импульсов после стимула в стандартных условиях и при добавлении различных блокаторов синаптической и несинаптической передачи импульсов. а - нормальный сетевой ответ; б - сетевой ответ в случае блокады глутаматных рецепторов АМРА и NMDA

ляющих возбуждающую синаптическую передачу, и блокатора ионных каналов (ТТХ) были вывялены три стадии отклика на стимул (рис. 1). Первые 3 мс регистрировался артефакт после стимула. От 3 до 10 мс регистрировались импульсы, распространяющиеся вдоль отростков и через электрические синапсы. Импульсы в интервале от 10 до 200-500 мс составляли так называемый сетевой синаптический ответ, именно на основе их анализа можно судить о состоянии синаптических связей в нейронной сети.

Особенности структуры вызванных ответов

Подобно спонтанным пачкам импульсов [8], сетевые синаптические ответы на стимулы можно было разделить на две группы (большие и малые пачки) на основе распределения числа импульсов в пачке индивидуально для каждой культуры клеток гиппокампа. Генерация больших пачек импульсов как спонтанных, так и вызванных стимулом зависела, вероятно, от динамики внутреннего функционального состояния нейронной сети, обусловленной накоплением медиаторов и другими процессами.

О различной природе двух типов вызванных электрическим стимулом сетевых ответов свидетельствовала взаимозависимость динамики спонтанной и вызванной активности нейронной сети при непрерывной низкочастотной стимуляции. Генерация большого сетевого ответа уменьшала вероятность появления большой спонтанной сетевой пачки импульсов на несколько секунд, и наоборот (рис. 2). При непрерывной стимуляции возникает эффект вынужденной синхронизации -захвата частоты импульсных пачек, при котором вызванные большие сетевые ответы полностью

или частично «замещают» большие спонтанные пачки импульсов.

Зависимость динамики вызванных синаптиче-ских ответов от внутренней архитектуры нейронной сети можно проследить по изменению сетевых ответов при стимуляции на ранних этапах развития культуры. В процессе развития диссоциированной нейронной культуры изменялась структура спонтанной импульсной активности, отражая происходящие изменения функциональных свойств этой сети. Данное наблюдение соответствовало результатам других исследовательских лабораторий [9, 10]. В течение первой недели формировалась нерегулярная импульсная активность, затем ее сменяла активность в виде пачек электрических импульсов. В плотных нейронных сетях после третьей недели развития in vitro наблюдалась нейронная активность в форме сложных пачек, следующих с коротким межпачечным интервалом и чередующихся с длительными периодами молчания. Такие последовательности пачек импульсов в литературе называют суперпач-ками [9]. При созревании нейронной сети in vitro сетевая активность снова приобретала вид относительно регулярных пачек импульсов. Суперпачки для одной сети могли быть более или менее вариабельны по количеству пачек внутри суперпачки. Было обнаружено, что некоторые достаточно плотные нейронные сети в процессе развития могут формировать еще более сложный, чем суперпачка, паттерн импульсной активности. На рис. 3 приведен пример активности нейронной сети, представленной в виде больших суперпачек, состоящих из последовательности супперпачек меньшего порядка, с повторяющимися частотными характеристика-

Рис. 2. Динамика спонтанной и вызванной активности нейронной сети при непрерывной низкочастотной стимуляции. Синим цветом отмечено число спонтанных импульсов между стимулами, красным - число вызванных импульсов в синаптическом сетевом ответе на стимул

Номер стимула

ми. Здесь выделяется основная длительная наиболее большая суперпачка, состоящая из последовательности небольших пачек с короткими интервалами следования (рис. 3в). Ей предшествует последовательность суперпачек с интервалами 5-10 секунд, состоящих из меньшего числа пачек, чем в основной суперпачке (рис. 3б). Сразу после основной суперпачки наблюдается последовательность небольших суперпачек с относительно высокой частотой следования, порядка 1 Гц (рис. 3г).

Для получения вызванного ответа нейронной сети со спонтанной суперпачечной активностью мы применили стимуляцию бифазными импульсами напряжения (±600 мВ, 260 мкс на фазу) с интервалом 5 секунд. Структура паттерна спонтанной суперпачки сохранялась во время низкочастотной стимуляции. Импульсы, приложенные во время интервалов между сложными суперпачками, не вызывали сетевого ответа. В то же время электрические стимулы провоцировали начало основной суперпачки, предшествующих и следующих после основной суперпачек соответственно стадии спонтанной активности (рис. 4б, в, г). Ответ сети на стимулы, которые подавались во время следования пачек в основной спонтанной суперпачке, зависел от времени относительно фазы спонтанной активности (рис. 4д, е). Стимул мог вызвать ответ, либо нет.

Таким образом, зрелая нейронная сеть гип-покампальной культуры в условиях in vitro обладает сложной внутренней динамикой процессов возбуждения и торможения. Электрические стимулы не изменяют структуру этой динамики, но вызывают сетевой ответ в виде пачки импульсов, соответствующей типичному паттерну спонтанной активности на данном этапе развития культуры in vitro.

Особенности генерации вызванных ответов сети при стимуляции различных участков культуры

Использование средних частотных характеристик вызванных ответов для оценки функ-

ционального состояния нейронной сети было затруднено из-за большого разброса значений (от нуля до 4-5 тысяч импульсов) и существования двух типов ответов. Поэтому для оценки функционального состояния нейронной сети мы использовали вероятность вызова сетевого ответа. Мы полагали, что стимул вызвал сетевой ответ, если в интервале от 10 до 50 мс после стимула детектировалось больше трех импульсов. Проследить функциональные связи в нейронной сети можно на основе анализа распространения сигнала, вызванного стимулом с определенного участка сети. Вероятность генерации сетевого отклика зависела от участка сети, на который подавался входной сигнал. С целью выявления эффективности участков нейронной сети применялся протокол стимуляции с автоматическим перебором стимулирующих электродов матрицы.

Изменение вероятности вызова сетевого ответа косвенно отражает изменения в сетевых синаптических связях. Оно определялось как разница значений в исходной и последующих сериях стимуляции для каждого стимулируемого участка. Было найдено, что низкочастотная стимуляция нейронной сети с различных входов вызывает появление сетевого ответа в виде сетевой пачки импульсов с одинаковой вероятностью (изменение равно 0±1%) только в половине случаев в течение часа (рис. 5). В основном (для более 90% стимулируемых участков) спонтанные изменения вероятности вызова ответа на стимул были небольшими (до 5%), максимальные изменения не превышали 8%. В течение более длительного времени, от 1 до 4 суток, количество входов, вызывающих сетевой ответ с той же исходной вероятностью, не было меньшим, чем в течение часа. В то же время для небольшого числа участков изменения достигали 20%. Динамика вызванной активности нейронных сетей при стимуляции различных входов указывает на наличие периодических обратимых

Рис. 3. Структура большой спонтанной суперпачки активности нейронной сети диссоциированных клеток гип-покампа мышей на 25-й день развития in vitro. Верхняя диаграмма показывает число импульсов за каждый временной интервал 5 мс, нижняя - растровая диаграмма импульсов для каждого регистрируемого электрода матрицы. а - пример последовательности сложных суперпачек спонтанной нейросетевой активности, размер ячейки соответствует 100 с; б - суперпачка, предшествующая основной суперпачке; в - основная суперпачка с последующими малыми суперпачками; г - малые суперпачки

спонтанных флуктуаций в функциональной организации нейронной сети, как в течение часа, так и при более длительном периоде наблюдения.

Заключение

Вызванные потенциалы в интервале от 10 до 200-500 мс после стимула составляют сетевой синаптический ответ, именно на основе их анализа можно судить о состоянии синаптических связей в нейронных сетях диссоциированной культуры клеток гиппокампа. Вызванные потенциалы, появляющиеся после стимула от 3 до 10 мс имеют несинаптическое происхождение.

Так же как спонтанные пачки импульсов, вызванные сетевые синаптические ответы на стимулы можно разделить на две группы (большие и малые пачки) на основе распределения числа импульсов в пачке индивидуально для каждой культуры. Генерация больших сетевых пачек как спонтанных, так и вызванных стимулом зависела от предшествующей активности. Найдено, что развитая нейронная сеть может обладать динамикой активности в виде сложных суперпачек, сохраняющихся во время низкочастотной стимуляции.

Стимуляция диссоциированной нейронной сети с разных участков с разной вероятностью

ж ' 4P-

JV IVIJ

К:

/I

&

4 [k 1 PP kl

' ш  к Ши. 1 ¡1 pi 1 1 f puvv . . V I UtfvÄ i 11 fbi) i Ц m\ r \ HN>| ч г, r > UM-".

д

Рис. 4. Ответы на стимуляцию двухфазными импульсами напряжения (±600 мВ, 260 млс на фазу) с интервалом 5 секунд нейронной сети со спонтанной сложной суперпачечной активностью. Верхняя диаграмма показывает число импульсов за каждый временной интервал 5 мс, нижняя - растровую диаграмму импульсов для каждого регистрируемого электрода матрицы. а-е - ответы на стимулы (отмечены стрелками), приложенные в различные стадии спонтанной сложной суперпачки, соответствующие рис. 3

вызывала сетевой ответ. Низкочастотная стимуляция нейронной сети с различных входов вызывала появление сетевого ответа в виде сетевой пачки импульсов с одинаковой (изменение равно 0±1%) вероятностью в 57.5% случаев в течение часа, 55.5% случаев через 4 суток. Такое небольшое различие свидетельствовало о наличии спонтанных флуктуаций в стабильной

функциональной организации нейронной сети. Максимальные изменения вероятности вызова ответа на стимул в течение часа не превышали 8%, а в течение 1-4 суток достигали 20%.

Работа поддержана грантом Президента Российской Федерации (МК-4602.2013.4), грантами РФФИ (1302-01223/13), ОФИ-М (13-04-12041/13) и мегагрантом для приглашенных ученых (11. G34.31.0012).

X : 60

Д О41

p H ta 50

& о

p. >H О 40

3 s

h о о 30

О ¡3 о и

я 20

It о

E В. о s о - 10

« г

LJL

о

-10 -5 о 5 10 15 20 Изменение вероятности вызова сетевого ответа. 0 о

час - 2 час-час - 2 день час - 3 день час - 4 день час - 5 день

£ г

л =>' S и Р и

Й" S

я4 О

й «

а

Р

о с

¡3

о »

s

в

о И

о

60 50 40 30 20 10 о

-0 5 0 0 5 Изменение вероятности вызова сетевого ответа. %

5 10 15 20 Изменение вероятности вызова сетевого ответа, %

Рис. 5. Распределение количества стимулируемых участков нейронной сети в зависимости от изменения вероятности вызова сетевого ответа при стимуляции этих участков в течение часа и нескольких дней. Приведены данные для пяти культур. Нижние рисунки иллюстрируют увеличенные фрагменты верхней диаграммы

Список литературы

1. Corner M. et al. Physiological effects of sustained blockade of excitatory synaptic transmission on spontaneously active developing neuronal networks an inquiry into the reciprocal linkage between intrinsic biorhythms and neuroplasticity in early ontogeny // Neuroscience and bio-behavioral reviews. 2002. V. 26. № 2. P. 127-185.

2. Chiappalone M. et al. Network dynamics and synchronous activity in cultured cortical neurons // International j. neural systems. 2007. V. 17. № 2. P. 87-103.

3. Quiroga R.Q., Nadasdy Z., Ben-Shaul Y. Unsu-pervised spike detection and sorting with wavelets and superparamagnetic clustering // Neural computation. 2004. V. 16. № 8. P. 1661-1687.

4. Pimashkin A. et al. Spiking signatures of spontaneous activity bursts in hippocampal cultures // Frontiers in computational neuroscience. 2011. V. 5. № 11. P. 46.

5. Chiappalone M., Massobrio P., Martinoia S. Network plasticity in cortical assemblies // European j. neuroscience. 2008. V. 28. № 4. P. 221-237.

6. Гладков А.А., Ведунова М.В., Коротченко С.А., и др. Развитие пространственно-временной структуры нейронной сети гиппокампа in vitro // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2011. Вып. 2 (2). С. 243-248.

7. Eytan D., Brenner N., Marom S. Selective adaptation in networks of cortical neurons // J. neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 2003. V. 23. № 28. P. 9349-9356.

8. Madhavan R., Chao Z.C., Potter S.M. Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks // Physical biology. 2007. V. 4. № 3. P. 181-193.

9. Wagenaar D.A., Pine J., Potter S.M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures // BMC neuroscience. 2006. V. 7. P. 11.

10. Maeda E. et al. Modification of parallel activity elicited by propagating bursts in developing networks of rat cortical neurones // European j. neuroscience. 1998. V. 10. № 2. P. 488-496.

FEATURES OF NEURAL NETWORK RESPONSE CAUSED BY ELECTRICAL STIMULATION IN MATURE HIPPOCAMPAL CELL CULTURE OF MICE

A.A. Gladkov, AS. Pimashkin, A.P. Lepina, V.B. KazantsevI. V. Mukhina

It was established in primary hippocampal cultures that network responses caused by electrical stimulation have synaptic and non-synaptic origins. The efficiency of network response induction has been shown to depend on the spatial location of the neural network stimulation area. It has been found that the efficiency of the network pulse burst generation in response to the electrical simulation from different inputs is equally stable within an hour and within several days, which testifies to the stable functional organization of the neural network.

Keywords: neural plasticity, dissociated culture, hippocampus, electrical stimulation.

References

1. Corner M. et al. Physiological effects of sustained blockade of excitatory synaptic transmission on spontaneously active developing neuronal networks an inquiry into the reciprocal linkage between intrinsic biorhythms and neuroplasticity in early ontogeny // Neuroscience and bio-behavioral reviews. 2002. V. 26. № 2. P. 127-185.

2. Chiappalone M. et al. Network dynamics and synchronous activity in cultured cortical neurons // International j. neural systems. 2007. V. 17. № 2. P. 87-103.

3. Quiroga R.Q., Nadasdy Z., Ben-Shaul Y. Unsu-pervised spike detection and sorting with wavelets and superparamagnetic clustering // Neural computation. 2004. V. 16. № 8. P. 1661-1687.

4. Pimashkin A. et al. Spiking signatures of spontaneous activity bursts in hippocampal cultures // Frontiers in computational neuroscience. 2011. V. 5. № 11. P. 46.

5. Chiappalone M., Massobrio P., Martinoia S. Network plasticity in cortical assemblies // European j. neuroscience. 2008. V. 28. № 4. P. 221-237.

6. Gladkov A.A., Vedunova M.V., Korotchenko S.A. i dr. Razvitie prostranstvenno-vremennoj struktury ne-jronnoj seti gippokampa in vitro // Vestnik Nizhegorods-kogo universiteta im. N.I. Lobachevskogo. 2011. Vyp. 2 (2). P. 243-248.

7. Eytan D., Brenner N., Marom S. Selective adaptation in networks of cortical neurons // J. neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 2003. V. 23. № 28. P. 9349-9356.

8. Madhavan R., Chao Z.C., Potter S.M. Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks // Physical biology. 2007. V. 4. № 3. P. 181-193.

9. Wagenaar D.A. Pine J., Potter S.M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures // BMC neuroscience. 2006. V. 7. P. 11.

10. Maeda E. et al. Modification of parallel activity elicited by propagating bursts in developing networks of rat cortical neurones // European j. neuroscience. 1998. V. 10. № 2. P. 488-496.