СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
METHOD OF CULTURING STEM CELLS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способу культивирования стволовых клеток для культивирования стволовых клеток с использованием аспирата костного мозга, полученного от донора.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
2
2
2
Раскрыт способ культивирования стволовых клеток со средой для культивирования стволовых клеток и способами лазерного облучения для активации стволовых клеток путем подвергания воздействию облучающего света углекислотного газового лазера с низкой выходной мощностью, имеющего энергию облучения свыше 0 и 10 Дж/смили менее, плотность мощности лазерного облучения 0,1 Вт/см или менее, которая расфокусирована до энергии облучения 0,1 или более и 2,5 Дж/см или менее для облучения всей среды, где стволовые клетки активируются путем облучения лазером с низкой выходной мощностью для их активации, и затем в стволовых клетках устанавливается заданный период покоя для размножения до установленного количества пролифераций. В соответствии с данным способом культивирования стволовых клеток, стволовые клетки, присутствующие в тканях или клетках, полученных от человека или не относящегося к человеку (животного), активируются и могут быть значительно размножены.
ДОКУМЕНТ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ
ПАТЕНТНЫЙ ДОКУМЕНТ
Патентный документ 1: JP 2015-186465A
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПРОБЛЕМЫ, РЕШАЕМЫЕ С ПОМОЩЬЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Поскольку различные стволовые клетки присутствуют в тканях или клетках, полученных от донора, даже если культивируются стволовые клетки, присутствующие в тканях или клетках, размножаются различные стволовые клетки, при этом не могут быть культивированы только определенные типы стволовых клеток. Стволовые клетки используются для лечения, регенеративной медицины или нетерапевтического применения при различных заболеваниях (заболеваниях сердечно-сосудистой и центральной нервной системы и т. д.), но культивируемые различные стволовые клетки оказывают незначительное терапевтическое воздействие на различные заболевания или регенеративный эффект в регенеративной медицине, низкая вероятность полного излечения различных заболеваний и низкая вероятность регенерации различных тканей или различных органов по сравнению со случаем, когда содержатся только определенные типы стволовых клеток. В вышеупомянутом способе культивирования стволовых клеток, раскрытом в Патентном документе 1, культивируются различные стволовые клетки, и не могут культивироваться только определенные типы стволовых клеток.
Целью настоящего изобретения является создание способа культивирования стволовых клеток, способного предотвращать пролиферацию различных стволовых клеток, и культивирование только определенных типов стволовых клеток. Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление способа культивирования стволовых клеток, с помощью которого можно культивировать стволовые клетки, имеющие большой терапевтический эффект при различных заболеваниях или регенеративный эффект в регенеративной медицине, высокую вероятность полного излечения различных заболеваний и высокую вероятность регенерации различных тканей или органов.
СПОСОБЫ ДЛЯ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ
Идея, лежащая в основе настоящего изобретения для решения вышеупомянутых проблем, представляет собой способ культивирования стволовых клеток для культивирования определенного типа стволовых клеток с использованием первого аспирата костного мозга, полученного от донора.
Отличительным признаком настоящего изобретения в вышеупомянутой идее является то, что способ культивирования стволовых клеток включает стадию разделения на слои первого аспирата костного мозга, полученного от донора, стадию выделения аспирата костного мозга для выделения второго аспирата костного мозга, расположенного в промежуточном слое между первым аспиратом костного мозга, разделенного на слои на стадии разделения аспирата костного мозга, стадия первого выделения стволовых клеток для введения второго аспирата костного мозга, выделенного на стадии выделения аспирата костного мозга, и выбранной культуральной среды в первый культуральный сосуд, имеющий заданный объем и заданную площадь нижней поверхности, статически выдерживая первый культуральный сосуд в течение заданного времени для прикрепления первых стволовых клеток к нижней поверхности первого культурального сосуда и пролиферации первых стволовых клеток, и когда общая площадь поверхности первых стволовых клеток по отношению к площади нижней поверхности первого культурального сосуда достигла первого установленного соотношения путем увеличения плоской формы первых стволовых клеток на нижней поверхности первого культурального сосуда, выделение первых стволовых клеток из первого культурального сосуда, стадию центрифугирования стволовых клеток для центрифугирования первых стволовых клеток, выделенных на стадии первого выделения стволовых клеток в слоях, стадию второго выделения стволовых клеток для выделения вторых стволовых клеток, расположенных в нижнем слое, после разделения первых стволовых клеток на слои на стадии центрифугирования стволовых клеток, и стадию третьего выделения стволовых клеток для введения вторых стволовых клеток, выделенных на стадии второго выделения стволовых клеток, и заданной культуральной среды во второй культуральный сосуд, имеющий большую емкость и большую площадь нижней поверхности, чем те, что у первого культурального сосуда, статически выдерживая второй культуральный сосуд в течение заданного времени для прикрепления вторых стволовых клеток к нижней поверхности второго культурального сосуда и пролиферации вторых стволовых клеток, и когда общая площадь поверхности вторых стволовых клеток по отношению к площади нижней поверхности второго культурального сосуда достигла второго заданного соотношения путем увеличения плоской формы вторых стволовых клеток на нижней поверхности второго культурального сосуда, выделение вторых стволовых клеток из второго культурального сосуда.
В качестве примера настоящего изобретения способ культивирования стволовых клеток включает в себя стадию первого наблюдения деформации введения второго аспирата костного мозга, выделенного на стадии выделения аспирата костного мозга, и культуральную среду в первый культуральный сосуд, затем наблюдение деформации первых стволовых клеток в первом культуральном сосуде из первоначальной плоской формы, при этом статически выдерживая их в течение заданного времени в состоянии наклона первого культурального сосуда под заданным углом с заданными временными интервалами, и стадии первого наблюдения общей площади поверхности для подачи новой культуральной среды в первый культуральный сосуд при отводе культуральной среды в первом культуральном сосуде путем оценки первых стволовых клеток, прикрепленных к нижней поверхности первого культурального сосуда, когда первые стволовые клетки деформируются из первоначальной плоской формы в заданную плоскую форму в итоге наблюдения на стадии первого наблюдения деформации, и наблюдение общей площади поверхности первых стволовых клеток, прикрепленных к нижней поверхности первого культурального сосуда по отношению к площади нижней поверхности первого культурального сосуда, при этом статически выдерживая их в течение заданного времени в состоянии наклона первого культурального сосуда под заданным углом с заданными временными интервалами, и на стадии первого выделения стволовых клеток, когда плоскую форму первых стволовых клеток увеличивают путем пролиферации первых стволовых клеток, и общая площадь поверхности первых стволовых клеток по отношению к площади нижней поверхности первого культурального сосуда достигла первого заданного соотношения в итоге наблюдения на стадии первого наблюдения общей площади поверхности, первые стволовые клетки извлекаются из первого культурального сосуда.
В качестве другого примера настоящего изобретения способ культивирования стволовых клеток включает стадию второго наблюдения деформации для введения вторых стволовых клеток, выделенных на стадии второго выделения стволовых клеток, и культуральную среду во второй культуральный сосуд, затем наблюдение деформации вторых стволовых клеток во втором культуральном сосуде из первоначальной плоской формы, при этом статически выдерживая их в течение заданного времени в состоянии наклона второго культурального сосуда под заданным углом в течение заданного времени с заданными временными интервалами, и стадию второго наблюдения общей площади поверхности для подачи новой культуральной среды во второй культуральный сосуд при отводе культуральной среды во втором культуральном сосуде путем оценки вторых стволовых клеток, прикрепленных на нижней поверхности второго культурального сосуда, когда вторые стволовые клетки деформируются из первоначальной плоской формы в заданную плоскую форму в итоге наблюдения на стадии второго наблюдения деформации, и наблюдение общей площади поверхности вторых стволовых клеток, прикрепленных к нижней поверхности второго культурального сосуда по отношению к площади нижней поверхности второго культурального сосуда, при этом статически выдерживая их в течение заданного времени в состоянии наклона второго культурального сосуда под заданным углом с заранее определенными временными интервалами, и на стадии третьего выделения стволовых клеток, в итоге наблюдения на стадии второго наблюдения общей площади поверхности, когда плоская форма вторых стволовых клеток увеличивается путем пролиферации вторых стволовых клеток, и общая площадь поверхности вторых стволовых клеток по отношению к площади нижней поверхности второго культурального сосуда достигла второго установленного отношения, вторые стволовые клетки извлекаются из второго культурального сосуда.
3
3
В качестве еще одного примера настоящего изобретения на стадии разделения аспирата костного мозга собирают 2-3 см первого аспирата костного мозга от донора, 2-3 см первого аспирата костного мозга вводят в разделительный сосуд, находящийся в вертикальном положении, и разделительный сосуд статически выдерживается при фактически той же температуре, что и температура тела, в течение заданного времени, для разделения в вертикальном положении первого аспирата костного мозга в разделительном сосуде на слои, и на стадии выделения аспирата костного мозга выделяется второй аспират костного мозга, расположенный в промежуточном слое в первом аспирате костного мозга, разделенного на слои в разделительном сосуде.
3
В качестве еще одного примера настоящего изобретения емкость первого культурального сосуда составляет приблизительно 20-30 см, первоначальная плоская форма первых стволовых клеток является фактически круглой, плоская форма первых стволовых клеток после деформации является плоской формой, в которой первые стволовые клетки удлиняются неравномерно в одном направлении с фактически круглым ядром, и на стадии первого наблюдения деформации деформация первых стволовых клеток в первом культуральном сосуде из первоначальной плоской формы наблюдается в течение 12-24 ч с интервалами приблизительно 1-2 ч, при этом статически выдерживая первый культуральный сосуд фактически при той же температуре, что и температура тела, в течение 12-24 ч, и когда первые стволовые клетки деформируются в неправильную плоскую форму, первые стволовые клетки оцениваются как прикрепленные к нижней поверхности первого культурального сосуда.
В качестве другого примера настоящего изобретения на стадии первого наблюдения общей площади поверхности общая площадь поверхности первых стволовых клеток, прикрепленных к нижней поверхности первого культурального сосуда, по отношению к площади нижней поверхности первого культурального сосуда в течение 36-48 ч с интервалами приблизительно 1-2 ч, при этом статически выдерживая первый культуральный сосуд фактически при той же температуре, что и температура тела, в течение 36-48 ч.
В качестве еще одного примера настоящего изобретения первое установленное соотношение общей площади поверхности первых стволовых клеток по отношению к площади нижней поверхности первого культурального сосуда составляет 70-80%.
В качестве еще одного примера настоящего изобретения на стадии центрифугирования стволовых клеток первые стволовые клетки вводят в разделительный сосуд, разделительный сосуд расположен в центрифуге для центрифугирования первых стволовых клеток, и на стадии второго выделения стволовых клеток первые стволовые клетки центрифугируют для получения слоев в разделительном сосуде, и затем выделяют вторые стволовые клетки, расположенные в самом нижнем слое.
3
В качестве другого примера настоящего изобретения емкость второго культурального сосуда составляет приблизительно 40-60 см, первоначальная плоская форма вторых стволовых клеток является фактически круглой, плоская форма первых стволовых клеток после деформации вторых стволовых клеток представляет собой плоскую форму, в которой вторые стволовые клетки удлиняются неравномерно в одном направлении с фактически круглым ядром, и на стадии второго наблюдения деформации деформация вторых стволовых клеток во втором культуральном сосуде из первоначальной плоской формы наблюдается в течение 36-48 ч с интервалами приблизительно 1-2 ч, при этом статически выдерживая второй культуральный сосуд фактически при той же температуре, что и температура тела, в течение 36-48 ч, и когда вторые стволовые клетки деформируются в неправильную плоскую форму, вторые стволовые клетки считаются прикрепленными к нижней поверхности второго культурального сосуда.
В качестве еще одного примера настоящего изобретения на стадии второго наблюдения общей площади поверхности наблюдается общая площадь поверхности вторых стволовых клеток, прикрепленных к нижней поверхности второго культурального сосуда по отношению к площади нижней поверхности второго культурального сосуда в течение 36-48 ч с интервалами приблизительно 1-2 ч, при этом статически выдерживая второй культуральный сосуд фактически при той же температуре, что и температура тела, в течение 36-48 ч.
В качестве другого примера настоящего изобретения второе установленное соотношение общей площади поверхности вторых стволовых клеток по отношению к площади нижней поверхности второго культурального сосуда составляет 88-92%.
В качестве другого примера настоящего изобретения первые и вторые стволовые клетки являются мезенхимальными стволовыми клетками.
ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с методом культивирования стволовых клеток в соответствии с настоящим изобретением выделяется второй аспират костного мозга, расположенный в промежуточном слое между первым аспиратом костного мозга, разделенным на слои, второй аспират костного мозга культивируют с культуральной средой для прикрепления первых стволовых клеток к нижней поверхности первого культурального сосуда, и пролифелируют первые стволовые клетки. Когда общая площадь поверхности первых стволовых клеток достигла первого установленного соотношения по отношению к площади нижней поверхности первого культурального сосуда, первые стволовые клетки извлекают из первого культурального сосуда, выделяют вторые стволовые клетки, расположенные в самом нижнем слое между первыми стволовыми клетками, центрифугированными для получения слоев, вторые стволовые клетки культивируют с культуральной средой для прикрепления вторых стволовых клеток к нижней поверхности второго культурального сосуда, и пролифелируют вторые стволовые клетки. Когда общая площадь поверхности вторых стволовых клеток достигла второго установленного соотношения по отношению к площади нижней поверхности второго культурального сосуда, вторые стволовые клетки извлекают из второго культурального сосуда. Таким образом, с помощью выделения определенного второго аспирата костного мозга из первого аспирата костного мозга, разделенного на слои, и с помощью выделения определенных вторых стволовых клеток из первых стволовых клеток, разделенных на слои, можно предотвратить пролиферацию различных стволовых клеток, и можно культивировать только определенные типы стволовых клеток (вторые стволовые клетки), которые являются подлежащим получению объектом, в результате чего могут быть получены чистые (истинные) стволовые клетки, из которых были удалены ненужные стволовые клетки. С помощью способа культивирования стволовых клеток можно культивировать только определенные типы стволовых клеток, так что можно культивировать стволовые клетки, обладающие большим терапевтическим эффектом при различных заболеваниях и регенеративным эффектом в регенеративной медицине и имеющие высокую вероятность полного излечения различных заболеваний, а также высокую вероятность регенерации различных тканей или различных органов.
Способ культивирования стволовых клеток, в котором после введения выделенного второго аспирата костного мозга и культуральной среды в первый культуральный сосуд наблюдается деформация первых стволовых клеток в первом культуральном сосуде из первоначальной плоской формы, при этом статически выдерживая их в течение заданного времени в состоянии наклона первого культурального сосуда под заданным углом с заданными временными интервалами, и когда первые стволовые клетки деформируются из первоначальной плоской формы в заданную плоскую форму в итоге наблюдения деформации первых стволовых клеток, первые стволовые клетки считаются прикрепленными к нижней поверхности первого культурального сосуда, и новую культуральную среду подают в первый культуральный сосуд при отводе культуральной среды в первом культуральном сосуде, наблюдается общая площадь поверхности первых стволовых клеток, прикрепленных к нижней поверхности первого культурального сосуда по отношению к площади нижней поверхности первого культурального сосуда, при этом статически выдерживая их в течение заданного времени в состоянии наклона первого культурального сосуда под заданным углом с заданными временными интервалами, и когда общая площадь поверхности первых стволовых клеток достигла первого установленного соотношения по отношению к площади нижней поверхности первого культурального сосуда путем пролиферации первых стволовых клеток для увеличения плоской формы первых стволовых клеток в итоге наблюдения общей площади поверхности, тогда первые стволовые клетки извлекаются из первого культурального сосуда, первые стволовые клетки могут быть прочно прикреплены к нижней поверхности первого культурального сосуда, статически выдерживая их в состоянии наклона первого культурального сосуда под заданным углом в течение заданного времени, и после прикрепления первых стволовых клеток к нижней поверхности первого культурального сосуда, новую культуральную среду подают в первый культуральный сосуд при отводе культуральной среды в первом культуральном сосуде, а также статически выдерживая в состоянии наклона первый культуральный сосуд под заданным углом в течение заданного времени, в результате чего точно может быть повышена пролиферация первых стволовых клеток. В способе культивирования стволовых клеток прикрепление первых стволовых клеток к нижней поверхности первого культурального сосуда может быть точно подтверждено путем наблюдения деформации первых стволовых клеток в первом культуральном сосуде из первоначальной плоской формы, и может быть точно подтверждена степень достижения общей площади поверхности первых стволовых клеток до первого установленного соотношения. В способе культивирования стволовых клеток первые стволовые клетки могут быть точно прикреплены и размножены в первом культуральном сосуде, а также может быть точно подтверждена степень достижения общей площади поверхности первых стволовых клеток до первого установленного соотношения, так что могут быть культивированы только первые стволовые клетки, не содержащие других стволовых клеток, и могут быть культивированы только определенные типы стволовых клеток (вторые стволовые клетки), которые являются подлежащим получению объектом, могут быть культивированы при одновременном предотвращении пролиферации различных стволовых клеток.
В способе культивирования стволовых клеток, при котором после введения выделенных вторых стволовых клеток и культуральной среды во второй культуральный сосуд наблюдается деформация вторых стволовых клеток во втором культуральном сосуде из первоначальной плоской формы, при этом статически выдерживая их в состоянии наклона второго культурального сосуда под заданным углом в течение заданного времени с заданными временными интервалами, и когда вторые стволовые клетки деформируются из первоначальной плоской формы до заданной плоской формы в итоге наблюдения деформации вторых стволовых клеток, вторые стволовые клетки считаются прикрепленными к нижней поверхности второго культурального сосуда, и новая культуральная среда вводится во второй культуральный сосуд при отводе культуральной среды во втором культуральном сосуде, наблюдается общая площадь поверхности вторых стволовых клеток, прикрепленных к нижней поверхности второго культурального сосуда по отношению к площади нижней поверхности второго культурального сосуда, при этом статически выдерживая их в состоянии наклона второго культурального сосуда под заданным углом в течение заданного времени с заданными временными интервалами, и в результате наблюдения общей площади поверхности, когда общая площадь поверхности вторых стволовых клеток достигла второго установленного соотношения по отношению к площади нижней поверхности второго культурального сосуда путем пролиферации вторых стволовых клеток для увеличения плоской формы вторых стволовых клеток, и затем стволовые клетки извлекаются из второго культурального сосуда, можно прочно прикреплять вторые стволовые клетки к нижней поверхности второго культурального сосуда, статически выдерживая их в состоянии наклона второго культурального сосуда под заданным углом в течение заданного времени, и точно можно способствовать пролиферации вторых стволовых клеток путем подачи новой культуральной среды во второй культуральный сосуд при отводе культуральной среды во втором культуральном сосуде после прикрепления вторых стволовых клеток к нижней поверхности второго культурального сосуда, так же как статически выдерживая второй культуральный сосуд в состоянии наклона под заданным углом в течение заданного времени. В способе культивирования стволовых клеток прикрепление вторых стволовых клеток к нижней поверхности второго культурального сосуда может быть точно подтверждено путем наблюдения деформации вторых стволовых клеток во втором культуральном сосуде из первоначальной плоской формы, и может быть точно подтверждена степень достижения общей площади поверхности 21-ых стволовых клеток второго установленного соотношения. В способе культивирования стволовых клеток вторые стволовые клетки могут быть точно прикреплены и размножены во втором культуральном сосуде, а также точно может быть подтверждена степень достижения общей площади поверхности вторых стволовых клеток второго установленного соотношения, так что могут быть культивированы только вторые стволовые клетки, не содержащие других стволовых клеток, и могут быть культивированы только конкретные типы стволовых клеток (вторые стволовые клетки), которые являются подлежащим получению объектом, могут быть культивированы при одновременном предотвращении пролиферации различных стволовых клеток.
3
3
3
3
В способе культивирования стволовых клеток, при котором 2-3 см вышеупомянутого первого аспирата костного мозга получают от донора, 2-3 см первого аспирата костного мозга вводят в разделительный сосуд, находящийся в вертикальном положении, и разделительный сосуд статически выдерживается фактически при той же температуре, что и температура тела, в течение заданного времени для разделения первого аспирата костного мозга в разделительном сосуде на слои в вертикальном положении, и выделяется второй аспират костного мозга, расположенный в промежуточном слое в первом аспирате костного мозга, разделенном на слои в разделительном сосуде, определенный второй аспират костного мозга может быть точно извлечен из первого аспирата костного мозга, статически выдерживая первый аспират костного мозга, содержащий различные стволовые клетки, фактически при той же температуре, что и температура тела, в течение заданного времени, для разделения его на слои в вертикальном направлении, и могут быть удалены ненужные стволовые клетки, содержащиеся в первом аспирате костного мозга, а также могут быть культивированы только определенные типы стволовых клеток (вторые стволовые клетки), которые являются подлежащим получению объектом. Несмотря на то, что для культуры стволовых клеток обычно требуется 150-200 см аспирата костного мозга, в способе культивирования стволовых клеток от донора могут быть собраны 2-3 см аспирата костного мозга, и определенные типы стволовых клеток (вторые стволовые клетки) могут быть культивированы с небольшим количеством аспирата костного мозга, так что время отбора проб аспирата костного мозга может быть резко сокращено, а аспират костного мозга может быть получен по низкой цене, и может быть сведена к минимуму нагрузка на донора во время сбора аспирата костного мозга.
3
3
В способе культивирования стволовых клеток, при котором емкость первого культурального сосуда составляет приблизительно 20-30 см, первоначальная плоская форма первых стволовых клеток является фактически круглой, плоская форма первых стволовых клеток после деформации является плоской формой, в которой первые стволовые клетки удлиняются неравномерно в одном направлении с фактически круглым ядром, деформация первых стволовых клеток в первом культуральном сосуде из первоначальной плоской формы наблюдается в течение 12-24 ч с интервалами 1-2 ч, при этом статически допуская первый культуральный сосуд, фактически при той же температуре, что и температура тела, в течение 12-24 ч, и когда первые стволовые клетки деформируются в неправильную плоскую форму, то первые стволовые клетки оцениваются как прикрепленные к нижней поверхности первого культурального сосуда, когда большой культуральный сосуд, имеющий емкость свыше 30 см, используется во время прикрепления первых стволовых клеток, затрудняется прикрепление первых стволовых клеток к нижней поверхности сосуда, и замедляется пролиферация первых стволовых клеток, но с использованием первого культурального сосуда, имеющего указанную выше емкость, первые стволовые клетки могут быть быстро и легко прикреплены к нижней поверхности первого культурального сосуда, и первые стволовые клетки могут быть быстро размножены в первом культуральном сосуде. В способе культивирования стволовых клеток, так как деформация первых стволовых клеток в первом культуральном сосуде наблюдается из первоначальной плоской формы в течение 12-24 ч с интервалами 1-2 ч, при этом статически выдерживая первый культуральный сосуд фактически при той же температуре, что и температура тела, в течение 12-24 ч, деформация первых стволовых клеток никогда не пропускается, может быть точно подтверждено прикрепление первых стволовых клеток к нижней поверхности первого культурального сосуда, и после подтверждения прикрепления первых стволовых клеток путем подачи новой культуральной среды в первый культуральный сосуд при отводе культуральной среды в первом культуральном сосуде, может быть точно повышена пролиферация первых стволовых клеток. В способе культивирования стволовых клеток первые стволовые клетки считаются прикрепленными к нижней поверхности первого культурального сосуда, когда первые стволовые клетки деформированы в плоскую форму, удлиненную неравномерно в одном направлении с фактически круглым ядром, прикрепление первых стволовых клеток к нижней поверхности первого культурального сосуда никогда не пропускается, и прикрепление первых стволовых клеток к нижней поверхности первого культурального сосуда может быть точно подтверждено изменением плоской формы первых стволовых клеток.
В способе культивирования стволовых клеток, при котором общая площадь поверхности первых стволовых клеток, прикрепленных к нижней поверхности первого культурального сосуда, по отношению к площади нижней поверхности первого культурального сосуда наблюдается в течение 36-48 ч с интервалами приблизительно 1-2 ч, при этом статически выдерживая первый культуральный сосуд фактически при той же температуре, что и температура тела, в течение 36-48 ч, общая площадь поверхности первых стволовых клеток относительно площади нижней поверхности первого культурального сосуда может быть точно подтверждена наблюдением общей площади поверхности первых стволовых клеток, прикрепленных к нижней поверхности первого культурального сосуда, с интервалами от 1-2 ч, и может быть точно подтверждено, что общая площадь поверхности первых стволовых клеток достигла первого установленного соотношения по отношению к площади нижней поверхности первого культурального сосуда. В способе культивирования стволовых клеток первые стволовые клетки могут быть извлечены из первого культурального сосуда при сохранении активности первых стволовых клеток, без учета времени извлечения первых стволовых клеток из первого культурального сосуда.
В способе культивирования стволовых клеток, при котором первое установленное соотношение общей площади поверхности первых стволовых клеток по отношению к площади нижней поверхности первого культурального сосуда составляет 70-80%, активность первых стволовых клеток постепенно утрачивается, когда первые стволовые клетки пролифелируют, превышая общую площадь поверхности первых стволовых клеток 80% по отношению к площади нижней поверхности первого культурального сосуда, первые стволовые клетки извлекают из первого культурального сосуда, когда общая площадь поверхности первых стволовых клеток достигает 70-80% по отношению к площади нижней поверхности первого культурального сосуда, так что активность первых стволовых клеток может быть сохранена, и первые стволовые клетки могут быть размножены с сохранением активности.
В способе культивирования стволовых клеток, при котором первые стволовые клетки вводят в разделительный сосуд, разделительный сосуд расположен в центрифуге для центрифугирования первых стволовых клеток, первые стволовые клетки центрифугируют для получения слоев в разделительном сосуде, и затем выделяют вторые стволовые клетки, расположенные в самом нижнем слое, первые стволовые клетки, содержащие ненужные смешанные стволовые клетки, разделяют на слои путем центрифугирования с использованием центрифуги, и выделяют вторые стволовые клетки, расположенные в самом нижнем слое в первых стволовых клетках, центрифугированных для получения слоев, таким образом, определенные стволовые клетки могут быть точно выделены из первых стволовых клеток, и ненужные стволовые клетки могут быть удалены из первых стволовых клеток, а также могут быть культивированы только определенные типы стволовых клеток (вторые стволовые клетки), которые являются подлежащим получению объектом.
3
3
В способе культивирования стволовых клеток, при котором емкость второго культурального сосуда составляет приблизительно 40-60 см, первоначальная плоская форма вторых стволовых клеток является фактически круглой, плоская форма первых стволовых клеток после деформации вторых стволовых клеток представляет собой плоскую форму, в которой вторые стволовые клетки удлиняются неравномерно в одном направлении с фактически круглым ядром, деформация вторых стволовых клеток во втором культуральном сосуде из первоначальной плоской формы наблюдается в течение 36-48 ч с интервалами приблизительно от 1-2 ч, при этом статически выдерживая второй культуральный сосуд фактически при той же температуре, что и температура тела, в течение 36-48 ч, и вторые стволовые клетки оцениваются как прикрепленные к нижней поверхности второго культурального сосуда, когда вторые стволовые клетки деформируются в неправильную плоскую форму, если на момент прикрепления вторых стволовых клеток используется большой культуральный сосуд, имеющий емкость свыше 60 см, затрудняется прикрепление вторых стволовых клеток к нижней поверхности сосуда, и замедляется пролиферация вторых стволовых клеток, но с использованием второго культурального сосуда, имеющего указанную выше емкость, вторые стволовые клетки могут быть быстро и легко прикреплены к нижней поверхности второго культурального сосуда, и вторые стволовые клетки могут быть быстро размножены во втором культуральном сосуде. В способе культивирования стволовых клеток, так как деформация вторых стволовых клеток во втором культуральном сосуде наблюдается из первоначальной плоской формы в течение 36-48 ч с интервалами 1-2 ч, при этом статически выдерживая второй культуральный сосуд фактически при той же температуре, что и температура тела, в течение 36-48 ч, деформация вторых стволовых клеток никогда не пропускается, прикрепление вторых стволовых клеток к нижней поверхности второго культурального сосуда может быть точно подтверждено, и после подтверждения прикрепления вторых стволовых клеток путем подачи новой культуральной среды во второй культуральный сосуд при отводе культуральной среды во втором культуральном сосуде точно может быть повышена пролиферация вторых стволовых клеток. В способе культивирования стволовых клеток вторые стволовые клетки считаются прикрепленными к нижней поверхности второго культурального сосуда, когда вторые стволовые клетки деформированы в плоскую форму, удлиненную неравномерно в одном направлении, с фактически круглым ядром, прикрепление вторых стволовых клеток к нижней поверхности второго культурального сосуда никогда не пропускается, и прикрепление вторых стволовых клеток к нижней поверхности второго культурального сосуда может быть точно подтверждено изменением плоской формы вторых стволовых клеток.
В способе культивирования стволовых клеток, при котором общая площадь поверхности вторых стволовых клеток, прикрепленных к нижней поверхности второго культурального сосуда по отношению к площади нижней поверхности второго культурального сосуда, наблюдается в течение 36-48 ч с интервалами приблизительно 1-2 ч, при этом статически выдерживая второй культуральный сосуд фактически при той же температуре, что и температура тела, в течение 36-48 ч, общая площадь поверхности вторых стволовых клеток по отношению к площади нижней поверхности второго культурального сосуда может быть точно подтверждена наблюдением общей площади поверхности вторых стволовых клеток, прикрепленных к нижней поверхности второго культурального сосуда с интервалами приблизительно 1-2 ч, и может быть точно подтверждено, что общая площадь поверхности вторых стволовых клеток достигла второго установленного соотношения по отношению к площади нижней поверхности второго культурального сосуда. В способе культивирования стволовых клеток, вторые стволовые клетки могут быть извлечены из второго культурального сосуда при сохранении активности вторых стволовых клеток, без учета времени извлечения вторых стволовых клеток из второго культурального сосуда.
В способе культивирования стволовых клеток, при котором второе установленное соотношение общей площади поверхности вторых стволовых клеток по отношению к площади нижней поверхности второго культурального сосуда составляет 88-92%, активность вторых стволовых клеток постепенно утрачивается, когда вторые стволовые клетки пролифелируют, превышая общую площадь поверхности вторых стволовых клеток 92% по отношению к площади нижней поверхности второго культурального сосуда, вторые стволовые клетки извлекают из второго культурального сосуда, когда общая площадь поверхности вторых стволовых клеток достигает 88-92% по отношению к площади нижней поверхности второго культурального сосуда, так что активность вторых стволовых клеток может быть сохранена, и могут быть получены вторые стволовые клетки, обладающие высокой активностью. В способе культивирования стволовых клеток могут быть культивированы только определенные типы стволовых клеток (вторые стволовые клетки), обладающие высокой активностью, так что могут быть культивированы стволовые клетки, обладающие большим терапевтическим эффектом при различных заболеваниях и регенеративным эффектом в регенеративной медицине и имеющие высокую вероятность полного излечения различных заболеваний, а также высокую вероятность регенерации различных тканей или различных органов.
В способе культивирования стволовых клеток, при котором первые и вторые стволовые клетки являются мезенхимальными стволовыми клетками, путем выделения определенного второго аспирата костного мозга из первого аспирата костного мозга, разделенного на слои, и путем выделения определенных вторых мезенхимальных стволовых клеток из первых мезенхимальных стволовых клеток, разделенных на слои, удаляются ненужные смешанные мезенхимальные стволовые клетки, и может быть предотвращена пролиферация различных мезенхимальных стволовых клеток, в результате чего могут быть культивированы только определенные типы мезенхимальных стволовых клеток (вторые мезенхимальные стволовые клетки), которые являются подлежащим получению объектом. С помощью способа культивирования стволовых клеток можно культивировать только определенные типы мезенхимальных стволовых клеток, так что могут быть культивированы мезенхимальные стволовые клетки, обладающие большим терапевтическим эффектом при различных заболеваниях и регенеративным эффектом в регенеративной медицине и имеющие высокую вероятность полного излечения различных заболеваний, а также высокую вероятность регенерации различных тканей или различных органов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1 представляет собой принципиальную схему конфигурации системы культивирования стволовых клеток, показанной в качестве примера;
Фиг. 2 представляет собой пояснительный схематический чертеж, показывающий пример стадии разделения аспирата костного мозга;
Фиг. 3 представляет собой пояснительный схематический чертеж стадии разделения аспирата костного мозга, продолжающий Фиг. 2;
Фиг. 4 представляет собой пояснительный схематический чертеж стадии разделения аспирата костного мозга, продолжающий Фиг. 3;
Фиг. 5 представляет собой пояснительный схематический чертеж, показывающий пример стадии первого наблюдения деформации;
Фиг. 6 представляет собой вид сбоку первого плоского культурального сосуда;
Фиг. 7 представляет собой частичный увеличенный вид, показывающий пример плоской формы первых мезенхимальных стволовых клеток;
Фиг. 8 представляет собой частичный увеличенный вид, показывающий другой пример плоской формы первых мезенхимальных стволовых клеток;
Фиг. 9 представляет собой частичный увеличенный вид, показывающий другой пример плоской формы первых мезенхимальных стволовых клеток;
Фиг. 10 представляет собой пояснительный схематический чертеж, показывающий пример стадии центрифугирования стволовых клеток;
Фиг. 11 представляет собой пояснительный схематический чертеж, показывающий пример стадии второго выделения стволовых клеток;
Фиг. 12 представляет собой пояснительный схематический чертеж, показывающий пример стадии второго наблюдения деформации;
Фиг. 13 представляет собой вид сбоку второго плоского культурального сосуда;
Фиг. 14 представляет собой частичный увеличенный вид, показывающий пример плоской формы вторых мезенхимальных стволовых клеток;
Фиг. 15 представляет собой частичный увеличенный вид, показывающий другой пример плоской формы вторых мезенхимальных стволовых клеток;
Фиг. 16 представляет собой частичный увеличенный вид, показывающий другой пример плоской формы вторых мезенхимальных стволовых клеток; а также
Фиг. 17 представляет собой схематический чертеж, показывающий пример консервации вторых мезенхимальных стволовых клеток.
ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Ссылаясь на прилагаемые схематические чертежи, такие как Фиг. 1, который представляет собой принципиальную схему конфигурации системы культивирования стволовых клеток 10, показанную в качестве примера, и т.д., подробности способа культивирования стволовых клеток в соответствии с настоящим изобретением поясняются следующим образом. В данном случае Фиг. 2 представляет собой пояснительный схематический чертеж, показывающий пример стадии разделения аспирата костного мозга, и Фиг. 3 представляет собой пояснительный схематический чертеж стадии разделения аспирата костного мозга, продолжающий Фиг. 2. Фиг. 4 представляет собой пояснительный схематический чертеж стадии разделения аспирата костного мозга, продолжающий Фиг. 3.
Способ культивирования стволовых клеток использует первый аспират костного мозга, полученный от различных доноров (людей), и путем проведения стадии разделения аспирата костного мозга, стадии выделения аспирата костного мозга, стадии первого наблюдения деформации), стадию первого наблюдения общей площади поверхности, стадии первого выделения стволовых клеток, стадии центрифугирования стволовых клеток, стадии второго выделения стволовых клеток, стадии второго наблюдения деформации, стадии наблюдения общей площади поверхности и стадии третьего выделения стволовых клеток, определенные типы одного вида мезенхимальных стволовых клеток культивируют (получают) в нескольких видах мезенхимальных стволовых клеток, содержащихся в первом аспирате костного мозга 19.
Система культивирования стволовых клеток 10 формируется с помощью компьютера 11, штрих-код ридера 12 и электронного микроскопа 13. Компьютер 11 имеет центральный процессор (CPU или виртуальный CPU), запоминающее устройство (память или виртуальную память) и область накопителя данных (жесткий диск или виртуальный жесткий диск и т. д.), и управляется физической OS (операционной системой) или виртуальной OS (виртуальной операционной системой). К компьютеру 11 подключены устройство ввода, такое как клавиатура 14 и мышь 15 и т. д., и устройство вывода, такое как дисплей 16 и принтер (не показан на схематическом чертеже) и т. д., через интерфейс (беспроводной или проводной).
В системе культивирования стволовых клеток 10 данные донора (информация, идентифицирующая донора) регулируются с помощью QR-кода (зарегистрированный товарный знак). В данных донора есть имя, адрес, номер телефона, дата рождения, пол, группа крови, рост, вес, адрес электронной почты и т. д. донора. В системе 10 QR-код используется в качестве двухмерного кода, и в дополнение к QR-коду - SP-код матричной системы, верикод (VeriCode), максикод (MaxiCode), CP-код, штрих-код (DataMatrix), Code1, код ацтеков (AztecCode), можно использовать intacta code и card e. В данном случае двухмерный код, используемый в системе 10, включает все те, которые будут разработаны в будущем. Кроме того, данные донора (информация, идентифицирующая донора) могут регулироваться с помощью IC-тега (IC-чипа).
3
На стадии разделения аспирата костного мозга первый аспират костного мозга 19, полученный от донора, разделяется на слои. При сборе аспирата костного мозга из грудины или подвздошной кости (таза) донора собирают 2-3 см (2-3 мл) первого аспирата костного мозга 19. Первый аспират костного мозга 19 получают с помощью «аспирации костного мозга» (отметка), что местная анестезия применяется к донору, и затем делается пункция костного мозга, и отсасывается аспират костного мозга (кровь костного мозга). Одновременно со сбором первого аспирата костного мозга 19, ответственное лицо, такое как врач, медсестра и научный сотрудник и т. д., активирует систему 10 в компьютере 11 и использует устройство ввода, такое как клавиатура 14 и мышь 15 и т. д. для введения данных донора в компьютер 11.
Компьютер 11 генерирует уникальный идентификатор донора, который определяет каждого донора каждый раз, когда вводятся данные донора (каждый раз, когда первый аспират костного мозга 19 получают от донора), и сохраняет (записывает) в область хранения данных в таком виде, что данные донора связаны с идентификатором донора (средствами хранения данных донора). Компьютер 11 преобразует входные данные донора в QR-код (двумерный код) посредством функции записи двумерного кода (средство преобразования двумерного кода (QR-кода)), выводит с первого по четвертый бланки кодирования 18a-18d, на который печатается QR-код (средства вывода двумерного кода (QR-кода)), и сохраняет (записывает) в область хранения данных в таком виде, что QR-код связан с идентификатором донора, который определяет каждого донора (средства хранения двумерного кода (QR-кода)).
В данном случае в QR-коде, напечатанном на первом бланке кодирования 18a, на котором был напечатан NO1, номер 1 сохраняется до стадии разделения аспирата костного мозга и стадии выделения аспирата костного мозга, и в QR-коде, напечатанном на втором бланке кодирования 18b, на котором был напечатан NO2, номер 2 сохраняется до стадии первого наблюдения деформации, стадии первого наблюдения общей площади поверхности и стадии первого выделения стволовых клеток. В QR-коде, напечатанном на третьем бланке кодирования 18c, на котором был напечатан NO3, номер 3 сохраняется до стадии центрифугирования стволовых клеток и стадии второго выделения стволовых клеток, и в QR-коде, напечатанном на четвертом бланке кодирования 18d, на котором был печатан NO4, номер 4 сохраняется до стадии второго наблюдения деформации, стадии второго наблюдения общей площади поверхности и стадии третьего выделения стволовых клеток. Компьютер 11 сравнивает данные донора, хранящиеся в области хранения данных, с данными донора, обозначенными QR-кодом, считываемым штрих-код ридером 12 для каждой стадии от стадии разделения аспирата костного мозга до стадии третьего выделения стволовых клеток.
3
3
7
Как показано на Фиг. 2, 2-3 см первого аспирата костного мозга 19, полученного от донора, вводят (помещают) в стеклянную пробирку 20 (разделительный сосуд), находящуюся в вертикальном положении. В данном случае в 2-3 см первого аспирата костного мозга 19 содержится 0,5-1 мл (около 5×10 (клеток/мл)) нескольких видов мезенхимальных стволовых клеток. Первый бланк кодирования 18а прикреплен к внешней периферийной поверхности стеклянной пробирки 20, в которую вводится первый аспират костного мозга 19. Как показано на Фиг. 3, стеклянная пробирка 20, в которую был введен первый аспират костного мозга 19, установлена в штативе для пробирок 21 и помещена в камеру термостата 22 со штативом для пробирок 21.
Ответственное лицо, такое как врач, медсестра и научный сотрудник и т. д., прикрепляет первый бланк кодирования 18a, на котором был напечатан QR-код на внешней периферийной поверхности стеклянной пробирки 20, и затем наводит штрих-код ридер 12 для считывания QR-кода стеклянной пробирки 20. Штрих-код ридер 12 подключен к компьютеру 11 через интерфейс (проводной или беспроводной). Штрих-код ридер 12 передает считываемый QR-код на компьютер 11.
Компьютер 11 извлекает номер 1 и данные донора, обозначенные QR-кодом, переданным от штрих-код ридера 12, из области хранения данных, и считывает их в кэш-память и отображает первое электронное табло процесса (не показано на схематическом чертеже) на дисплее 16. На первом электронном табло процесса отображаются номер 1 и данные донора, и в то же время кнопка разделения аспирата костного мозга, кнопка выделения аспирата костного мозга, кнопка первого наблюдения деформации, кнопка первого наблюдения общей площади поверхности, кнопка первого выделения стволовых клеток, кнопка центрифугирования стволовых клеток, кнопка второго выделения стволовых клеток, кнопка второго наблюдения деформации, кнопка второго наблюдения общей площади поверхности, кнопка третьего выделения стволовых клеток и кнопка выхода из системы. Когда не проводится культивирование стволовых клеток, должна быть нажата кнопка выхода из системы. Когда нажата кнопка выхода из системы, система 10 остановлена на компьютере 11.
После нажатия кнопки разделения аспирата костного мозга, отображенной на дисплее 16, ответственное лицо вводит первый аспират костного мозга 19 в стеклянную пробирку 20 из шприца, и стеклянная пробирка 20, в которую вводится первый аспират костного мозга 19, вставляется (устанавливается) в штатив для пробирок 21. Как показано на Фиг. 3, ответственное лицо помещает штатив для пробирок 21 в камеру термостата 22, и стеклянная пробирка 20, в которую был введен первый аспират костного мозга 19, статически выдерживается (оставьте ее в ровном положении, не двигая) в камере термостата 22 в течение заданного времени (около 2 ч). Температура внутри камеры термостата 22 поддерживается приблизительно от 36 до 37°С, что фактически совпадает с температурой тела. Компьютер 11 отображает номер 1, обозначенный QR-кодом, напечатанным на первом бланке кодирования 18a, и данные донора на дисплее 16, а также отображает текущее сообщение о выделении аспирата костного мозга и кнопку завершения разделения аспирата костного мозга на дисплее 16.
3
3
Как показано на Фиг. 4, статически выдерживая стеклянную пробирку 20 в камере термостата 22 в течение заданного времени (около 2 ч) в вертикальном положении, первый аспират костного мозга 19, введенный в пробирку 20, разделяется на слои с некоторым количеством слоев (3 слоя) в пробирке 20. Обычно для культивирования стволовых клеток требуется 150-200 см (150-200 мл) аспирата костного мозга, но в данном способе культивирования стволовых клеток достаточно получить только 2-3 см первого аспирата костного мозга 19 от донора, и могут быть культивированы (получены) определенные типы мезенхимальных стволовых клеток (вторых мезенхимальных стволовых клеток 31) при небольшом количестве аспирата костного мозга 19, так что время отбора проб аспирата костного мозга 19 может быть резко сокращено, и аспират костного мозга 19 может быть получен по низкой цене, и может быть сведена к минимуму нагрузка на донора во время сбора аспирата костного мозга.
После стадии разделения аспирата костного мозга, в котором первый аспират костного мозга 19 разделяют на слои, выполняется стадия выделения аспирата костного мозга. На стадии выделения аспирата костного мозга второй аспират костного мозга 23 выделяется из первого аспирата костного мозга 19, разделенного на слои. После подтверждения того, что первый аспират костного мозга 19 разделен на слои, ответственное лицо нажимает кнопку завершения разделения аспирата костного мозга, отображаемую на дисплее 16.
Когда нажата кнопка завершения разделения аспирата костного мозга, компьютер 11 отображает второе электронное табло процесса (не показано на схематическом чертеже) на дисплее 16. На втором электронном табло процесса отображаются номер 1 и данные донора, и в то же время отображаются сообщение о завершении разделения аспирата костного мозга, кнопка выделения аспирата костного мозга, кнопка первого наблюдения деформации, кнопка первого наблюдения общей площади поверхности, кнопка первого выделения стволовых клеток, кнопка центрифугирования стволовых клеток, кнопка второго выделения стволовых клеток, кнопка второго наблюдения деформации, кнопка второго наблюдения общей площади поверхности и кнопка третьего выделения стволовых клеток.
Ответственное лицо нажимает кнопку выделения аспирата костного мозга на втором электронном табло процесса и считывает штрих-код ридером 12 QR-код стеклянной пробирки 20. Когда QR-код передается из штрих-код ридера 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), отображаемые на дисплее 16, и данные донора, обозначенные QR-кодом, считанные штрих-код ридером 12, и когда эти данные донора сопоставляются, номер 1 и данные донора отображаются на дисплее 16, и в то же время на дисплее отображаются сообщение о завершении выделения аспирата костного мозга, текущее сообщение о выделении аспирата костного мозга и кнопка завершения выделения аспирата костного мозга. Когда эти данные доноров не сопоставляются, компьютер 11 отображает на дисплее 16 сообщение об ошибке и сообщение о прекращении культивирования.
Ответственное лицо вынимает штатив для пробирок 21 из камеры термостата 22, достает стеклянную пробирку 20 из штатива для пробирок 21 и извлекает второй аспират 23 костного мозга, находящийся в определенном слое первого аспирата костного мозга 19, разделенный на слои. Ответственное лицо извлекает (отсасывает) второй аспират костного мозга 23 с толщиной слоя 3-4 мм, расположенный на промежуточном слое в первом аспирате костного мозга 19, разделенного на слои, используя шприц (не показан на схематическом чертеже). В ином случае второй аспират костного мозга 23 с толщиной слоя 3-4 мм, расположенный в промежуточном слое в первом аспирате костного мозга 19, разделенном на слои, извлекается (отсасывается) с использованием пипетки (не показано на схематическом чертеже). В способе культивирования стволовых клеток после разделения в вертикальном положении первого аспирата костного мозга 19, содержащего различные мезенхимальные стволовые клетки в слоях (3 слоя), определенный (промежуточный) второй аспират костного мозга 23 может быть точно извлечен из первого аспирата костного мозга 19 с использованием шприца или пипетки, и могут быть удалены ненужные мезенхимальные стволовые клетки, содержащиеся в первом аспирате костного мозга 19.
Фиг. 5 представляет собой пояснительный схематический чертеж, показывающий пример стадии первого наблюдения деформации, и Фиг. 6 представляет собой вид сбоку первого плоского культурального сосуда 25 (первый культуральный сосуд). Фиг. 7 представляет собой частичный увеличенный вид, показывающий пример плоской формы первых мезенхимальных стволовых клеток 35, и Фиг. 8 представляет собой частичный увеличенный вид, показывающий другой пример плоской формы первых мезенхимальных стволовых клеток 35. На Фиг. 7 и 8 показаны увеличенные виды плоской формы первых мезенхимальных стволовых клеток 35, сфотографированных с помощью электронного микроскопа 13.
После стадии выделения аспирата костного мозга, в котором определенный аспират второго костного мозга 23, расположенный в промежуточном слое, выделяется из первого аспирата костного мозга 19, выполняется стадия первого наблюдения деформации. На стадии первого наблюдения деформации второй аспират костного мозга 23 и культуральную среду 24 вводят (помещают) в первый плоский культуральный сосуд 25 (первый культуральный сосуд) (сосуд для культивирования клеток), статически выдерживается (оставьте его в ровном положении, не двигая) в течение 12-24 ч при поддержании внутри культурального сосуда 25 фактически той же температуры, что и температура тела (приблизительно 36-37°С), деформация первых мезенхимальных стволовых клеток 35 (первые стволовые клетки), содержащихся во втором аспирате костного мозга 23, в культуральном сосуде 25 из первоначальной плоской формы наблюдается с помощью электронного микроскопа 13 в течение 12-24 ч с интервалами 1-2 ч, и оценивается независимо от того, прикреплены ли стволовые клетки 35 к нижней поверхности 36 культурального сосуда 25. На нижнюю поверхность 36 (внешнюю поверхность нижней стенки) первого плоского культурального сосуда 25, в который вводят второй аспират костного мозга 23 и культуральную среду 24, прикрепляют второй бланк кодирования 18b, на котором QR-код, который определяет донора.
Ответственное лицо, такое как врач, медсестра и научный сотрудник и т. д. нажимает кнопку завершения выделения аспирата костного мозга, отображаемую на дисплее 16 после выделения определенного второго аспирата костного мозга 23 из первого аспирата костного мозга 19. Когда нажата кнопка завершения выделения аспирата костного мозга, компьютер 11 третье электронное табло процесса (не показано на схематическом чертеже) на дисплее 16. На третьем электронном табло процесса отображаются номер 1 и данные донора, и в то же время время отображаются сообщение о завершении разделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении выделения аспирата костного мозга, кнопка первого наблюдения деформации, кнопка первого наблюдения общей площади поверхности, кнопка первого выделения стволовых клеток, кнопка центрифугирования стволовых клеток, кнопка второго выделения стволовых клеток, кнопка второго наблюдения деформации, кнопка второго наблюдения общей площади поверхности и кнопка третьего выделения стволовых клеток.
Ответственное лицо прикрепляет второй бланк кодирования 18b, на котором напечатан QR-код, к нижней поверхности 36 (внешней поверхности нижней стенки) первого плоского культурального сосуда 25. Затем нажимает кнопку первого наблюдения деформации на третьем электронном табло процесса, чтобы штрих-код ридер 12 считал QR-код культурального сосуда 25. Когда QR-код передается из штрих-код ридера 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), отображаемые на дисплее 16, и данные донора, обозначенные QR-кодом, считываемым штрих-код ридером 12, и когда эти данные донора сопоставляются, номер 2 и данные донора отображаются на дисплее 16, и в то же время на дисплее отображаются сообщение о завершении разделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении выделения аспирата костного мозга, текущее сообщение о первом наблюдении деформации и кнопка завершения первого наблюдении деформации. Когда эти данные доноров не сопоставляются, компьютер 11 отображает на дисплее 16 сообщение об ошибке и сообщение о прекращении культивирования.
3
3
2
Первый плоский культуральный сосуд 25, используемый на стадии первого наблюдения деформации, представляет собой плоский сосуд, выполненный из прозрачного стекла или прозрачного пластика, и имеющий нижнюю поверхность 36 с небольшой емкостью и заданной площадью, и имеющую фактически прямоугольную плоскую форму. Первый плоский культуральный сосуд 25 имеет верхнюю часть 26, нижнюю часть 28, центральную часть 27, расположенную между верхней и нижней частями 26 и 28, и отверстие для введений 29, сформированное в верхней части 26. Отверстие для введений 29 является водонепроницаемым, закрытым крышкой 30. Первый плоский культуральный сосуд 25 имеет емкость приблизительно 20-30 см (предпочтительно, 25 см), и площадь его нижней поверхности составляет приблизительно 25-36 мм. Длина одной стороны первого плоского культурального сосуда 25 составляет 5-6 мм. В данном случае в качестве первого плоского культурального сосуда 25 может использоваться плоский сосуд с круглой или эллиптической плоской формой, и имеющий нижнюю поверхность 28 с небольшой емкостью и заданной площадью.
Ответственное лицо снимает крышку 30 с отверстия для ввода 29, вводит (помещает) второй аспират костного мозга 23, собранный шприцем или пипеткой, внутрь культурального сосуда 25 через отверстие для ввода 29 культурального сосуда 25, и вводит (помещает) культуральную среду 24, собранную шприцем или пипеткой, внутрь культурального сосуда 25 через отверстие для ввода 29 культурального сосуда 25 и закрывает отверстие для ввода 29 крышкой 30.
В культуральной среде 24, растворе минеральных солей, дополненной пенициллином (приблизительно 100 ед/мл), амфотерицином (приблизительно 100 нг/мл), стрептомицином (приблизительно 100 мкг/мл), L-глутамином (приблизительно 2-4 мл), 20% эмбриональной бычьей сыворотки, и содержащей аминокислоты. Первые мезенхимальные стволовые клетки 35, содержащиеся во втором аспирате костного мозга 23, введенном в первый плоский культуральный сосуд 25, культивируемые с культуральной средой 24, прикрепляются к нижней поверхности 36 культурального сосуда 25 с течением времени и постепенно пролиферируют (дифференцируются) на нижней поверхности 36 культурального сосуда 25 с образованием колоний.
После введения второго аспирата костного мозга 23 и культуральной среды 24 в первый плоский культуральный сосуд 25 ответственное лицо размещает (устанавливает) культуральный сосуд 25 на держателе образца 31 электронного микроскопа 13. В данном случае промежуточная вставка 33 расположена между верхней поверхностью 32 держателя образца 31 электронного микроскопа 13 и нижней частью 28 первого плоского культурального сосуда 25, так что нижняя часть 28 культурального сосуда 25 удерживается в приподнятом состоянии промежуточной вставкой 33, и культуральный сосуд 25 удерживается в состоянии наклона под заданным углом, так что нижняя часть 28 культурального сосуда 25 находится сверху, а верхняя часть 26 (отверстие для ввода 29) культурального сосуда 25 находится снизу. Кроме того, промежуточная вставка 33 расположена между верхней поверхностью 32 держателя образца 31 электронного микроскопа 13 и верхней частью 26 первого плоского культурального сосуда 25, верхняя часть 26 культурального сосуда 25 удерживается в приподнятом состоянии промежуточной вставкой 33, культуральный сосуд 25 может удерживаться в состоянии наклона под заданным углом, так что верхняя часть 26 культурального сосуда 25 находится сверху, а нижняя часть 28 культурального сосуда 25 находится снизу. Угол наклона α1 первого плоского культурального сосуда 25 по отношению к верхней поверхности 32 держателя образца 31 находится в диапазоне 2-5°, предпочтительно, в диапазоне 2-3°.
В способе культивирования стволовых клеток с помощью наклона первого плоского культурального сосуда 25 к верхней поверхности 32 держателя образца 31 под вышеупомянутым углом наклона, второй аспират костного мозга 23 и культуральная среда 24 наклонены на сторону верхней части 26 (или на сторону нижней части 28) культурального сосуда 25 в первом плоском культуральном сосуде 25 и на сторону верхней части 26 (или на сторону нижней части 28) стороны культурального сосуда 25, гидростатические давления второго аспирата костного мозга 23 и культуральной среды 24 становятся большими, и первые мезенхимальные стволовые клетки 35 концентрируются на стороне нижней поверхности 36 культурального сосуда 25, в результате чего активность первых мезенхимальных стволовых клеток 35 увеличивается, и первые мезенхимальные стволовые клетки 35 могут быть легко и быстро прикреплены на нижней поверхности 36 культурального сосуда 25.
Электронный микроскоп 13 подключен к компьютеру 11 через интерфейс (проводной или беспроводной). Электронный микроскоп 13 имеет функцию фотографирования изображения с получением увеличенного изображения объекта с помощью элемента съемки изображения и имеет функцию передачи изображения c отправкой увеличенного изображения на компьютер 11. Электронный микроскоп 13 фотографирует увеличенное изображение плоской формы первых мезенхимальных стволовых клеток 35, содержащихся во втором аспирате костного мозга 23, введенном в первый плоский культуральный сосуд 25 с интервалами приблизительно 1-2 ч, и сфотографированное увеличенное изображение плоской формы стволовых клеток 35 передается на компьютер 11 с интервалами 1-2 ч. Интервал фотографирования изображения и интервал передачи изображения в электронном микроскопе 13 можно устанавливать по своему усмотрению в пределах 1-2 ч с помощью устройства ввода, такого как клавиатура 14 и мышь 15 и т. д.
Компьютер 11 хранит (записывает) увеличенное изображение плоской формы первых мезенхимальных стволовых клеток 35 и время фотографирования, переданное из электронного микроскопа 13 в область хранения в состоянии связывания с идентификатором донора (средство хранения изображений стволовых клеток). Компьютер 11 отображает на дисплее 16 увеличенное изображение плоской формы первых мезенхимальных стволовых клеток 35 и время фотографирования, переданное из электронного микроскопа 13. Ответственное лицо подтверждает (просматривает) увеличенное изображение плоской формы первых мезенхимальных стволовых клеток 35, отображаемых на дисплее 16 в течение 12-24 ч с интервалами приблизительно 1-2 ч, и наблюдает изменение плоской формы стволовых клеток 35, содержащихся во втором аспирате костного мозга 23. В данном случае ответственное лицо может непосредственно наблюдать изменение плоской формы первых мезенхимальных стволовых клеток 35 из окна наблюдения электронного микроскопа 13 в течение 12-24 ч с интервалами 1-2 ч.
Первоначальная плоская форма первых мезенхимальных стволовых клеток 35 фактически круглая, и когда плоская форма стволовых клеток 35 фактически круглая, стволовые клетки 35 не прикреплены к нижней поверхности 36 (внутренней поверхности нижней стенки) первого плоского культурального сосуда 25, и пролиферация (дифференцировка) стволовых клеток 27 не начинается. Плоская форма первой мезенхимальной стволовой клетки 27 после деформации является плоской формой, в которой стволовые клетки 27 неравномерно удлиняются (распространяются) в одном направлении (заданное направление), с фактически круглым ядром перед прикреплением, а стволовые клетки 27 прикрепляются к нижней поверхности 36 (внутренняя поверхность нижней стенки) первого плоского культурального сосуда 25, и запускается пролиферация (дифференцировка) стволовых клеток 27.
Как показано на Фиг. 6, когда увеличенное изображение плоской формы первых мезенхимальных стволовых клеток 35, отображаемых на дисплее 16, наблюдается фактически круглой в итоге стадии первого наблюдения деформации, ответственное лицо оценивает, что стволовые клетки 35 не прикреплены к нижней поверхности 36 (внутренней поверхности нижней стенки) первого плоского культурального сосуда 25, и непрерывно наблюдает изменения в плоской форме стволовых клеток 35 с интервалами приблизительно 1-2 ч. Как показано на Фиг. 7, когда плоская форма первых мезенхимальных стволовых клеток 35, отображаемых на дисплее 16, деформирована из фактически круглой в неправильную плоскую форму с фактически круглым ядром в итоге наблюдения стадии первого наблюдения деформации, ответственное лицо считает, что стволовые клетки 35 прикреплены к нижней поверхности 35 первого плоского культурального сосуда 25.
3
2
Если во время прикрепления первой мезенхимальной стволовой клетки 35 используется большой культуральный сосуд, имеющий емкость свыше 30 см и площадь нижней поверхности свыше 36 мм, стволовые клетки 35, как правило, затруднительно прикрепляются к нижней поверхности сосуда, и пролиферация стволовых клеток 35 становится медленной, но в способе культивирования стволовых клеток, используя первый плоский культуральный сосуд 25, имеющий вышеупомянутую емкость и вышеупомянутую площадь нижней поверхности, стволовые клетки 35 могут быть легко прикреплены к нижней поверхности 36 культурального сосуда 25, и стволовые клетки 27 могут быть быстро размножены в культуральном сосуде 25.
В способе культивирования стволовых клеток, поскольку деформация первых мезенхимальных стволовых клеток 35 в культуральном сосуде 25 из первоначальной плоской формы наблюдается в течение 12-24 ч с интервалами приблизительно 1-2 ч, при этом статически выдерживая первый плоский культуральный сосуд 25 фактически при той же температуре, что и температура тела, в течение 12-24 ч, деформация стволовых клеток 35 никогда не пропускается, и может быть точно подтверждено прикрепление стволовых клеток 35 к нижней поверхности 36 культурального сосуда 25.
Фиг. 9 представляет собой частичный увеличенный вид, показывающий другой пример плоской формы первых мезенхимальных стволовых клеток 35. На Фиг. 9 показано увеличенное изображение плоской формы первых мезенхимальных стволовых клеток 35, сфотографированных с помощью электронного микроскопа 13. В итоге наблюдения на стадии первого наблюдения деформации первые мезенхимальные стволовые клетки 35 (первые стволовые клетки) деформируются из фактически круглой формы (первоначальной плоской формы) в неправильную плоскую форму с фактически круглым ядром, и после стадии первого наблюдения деформации, подтверждающей прикрепление стволовых клеток 35 к нижней поверхности 36 первого плоского культурального сосуда 25 (первого сосуда для культивирования), выполняется стадия первого наблюдения общей площади поверхности.
На стадии первого наблюдения общей площади поверхности культуральную среду 24, введенную в первый плоский культуральный сосуд 25, отводят из культурального сосуда 25, и новую культуральную среду 24 вводят (помещают) в культуральный сосуд 25. Затем общую площадь поверхности первых мезенхимальных стволовых клеток 35, прикрепленных к нижней поверхности 36 культурального сосуда 25 по отношению к площади нижней поверхности культурального сосуда 25, наблюдают с помощью электронного микроскопа 13 в течение 36-48 ч с интервалами 1-2 ч, про этом статически выдерживая (оставьте его в ровном положении, не двигая) первый плоский культуральный сосуд 25 фактически при той же температуре, что и температура тела (около 37°С) в течение 36-48 ч, и оценивается, достигла или нет общая площадь поверхности стволовых клеток 35 первого установленного соотношения по отношению к площади нижней поверхности культурального сосуда 25. Первое установленное соотношение общей площади поверхности первых мезенхимальных стволовых клеток 35 по отношению к площади нижней поверхности первого плоского культурального сосуда 25 составляет 70-80% (70-80% конфлюэнтного монослоя).
Ответственное лицо, такое как врач, медсестра и научный сотрудник и т. д., нажимает кнопку завершения первого наблюдения деформации, отображаемую на дисплее 16, после подтверждения прикрепления первых мезенхимальных стволовых клеток 35, содержащихся во втором аспирате костного мозга 23, к нижней поверхности 36 первого плоского культурального сосуда 25. Когда нажата кнопка завершения первого наблюдения деформации, компьютер 11 отображает четвертое электронное табло процесса (не показано на схематическом чертеже) на дисплее 16. На четвертом электронном табло процесса отображаются номер 2 и данные донора, и в то же время отображаются сообщение о завершении разделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении выделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении первого наблюдения деформации, кнопка первого наблюдения общей площади поверхности, кнопка первого выделения стволовых клеток, кнопка центрифугирования стволовых клеток, кнопка второго выделения стволовых клеток, кнопка второго наблюдения деформации, кнопка второго наблюдения общей площади поверхности и кнопка третьего выделения стволовых клеток.
Ответственное лицо нажимает кнопку второго наблюдения стволовых клеток на четвертом электронном табло процесса, и первый плоский культуральный сосуд 25 удаляется из держателя образца 31 электронного микроскопа 16, и QR-код культурального сосуда 25 считывается штрих-код ридером 12. Когда QR-код передается из штрих-код ридера 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), отображаемые на дисплее 16, и данные донора, обозначенные QR-кодом, считанные штрих-код ридером 12, и и когда эти данные донора сопоставляются, номер 2 и данные донора отображаются на дисплее 16, и в то же время на дисплее 16 отображаются сообщение о завершении разделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении выделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении первого наблюдения деформации, сообщение о текущем первом наблюдении общей площади поверхности и кнопка завершения первого наблюдения общей площади поверхности. Когда эти данные доноров не сопоставляются, компьютер 11 отображает на дисплее 16 сообщение об ошибке и сообщение о прекращении культивирования.
Ответственное лицо отводит культуральную среду 24, введенную в первый плоский культуральный сосуд 25 на стадии первого наблюдения деформации, из культурального сосуда 25 с использованием шприца или пипетки и вводит (помещает) новую культуральную среду 24, собранную шприцем или пипеткой, в культуральный сосуд 25. Новая среда для культивирования 24 такая же, как и введенная на стадии первого наблюдения деформации. Ответственное лицо размещает (устанавливает) культуральный сосуд 25 в держателе образца 31 электронного микроскопа 13 после введения новой культуральной среды 24 в первый плоский культуральный сосуд 25.
В данном случае промежуточная вставка 33 расположена между верхней поверхностью 32 держателя образца 31 электронного микроскопа 13 и нижней частью 28 первого плоского культурального сосуда 25, нижняя часть 28 культурального сосуда 25 удерживается в приподнятом состоянии промежуточной вставкой 33, и культуральный сосуд 25 удерживается в состоянии наклона под заданным углом, так что нижняя часть 28 культурального сосуда 25 находится сверху, а верхняя часть 26 (отверстие для ввода 29) культурального сосуда 25 находится снизу (см. Фиг. 6). Кроме того, промежуточная вставка 33 расположена между верхней поверхностью 32 держателя образца 31 электронного микроскопа 13 и верхней частью 26 первого плоского культурального сосуда 25, верхняя часть 26 культурального сосуда 25 удерживается в приподнятом состоянии промежуточной вставкой 33, культуральный сосуд 25 может удерживаться в состоянии наклона под заданным углом, так что верхняя часть 26 культурального сосуда 25 находится сверху, а нижняя часть 28 культурального сосуда 25 находится снизу. Угол наклона α1 первого плоского культурального сосуда 25 по отношению к верхней поверхности 32 держателя образца 31 находится в диапазоне 2-5°, предпочтительно, в диапазоне 2-3°.
В способе культивирования стволовых клеток после подтверждения прикрепления первых мезенхимальных стволовых клеток 35 путем введения новой культуральной среды 24 в культуральный сосуд 25 при отводе культуральной среды 24 из первого плоского культурального сосуда 25, может быть точно повышена пролиферация стволовых клеток 35. В способе культивирования стволовых клеток с помощью наклона первого плоского культурального сосуда 25 к верхней поверхности 32 держателя образца 31 под вышеупомянутым углом наклона, первые мезенхимальные стволовые клетки 35 и культуральная среда 24 наклонены на сторону верхней части 26 (или на сторону нижней части 26) культурального сосуда 25 в первом плоском культуральном сосуде 25, гидростатические давления первых мезенхимальных стволовых клеток 35 и культуральной среды 24 становятся большими на стороне верхней части 26 (или на стороне нижней части 26) культурального сосуда 25, и первые мезенхимальные стволовые клетки 35 концентрируются на стороне нижней поверхности 36 культурального сосуда 25, в результате чего активность первых мезенхимальных стволовых клеток 35 увеличивается, и первые мезенхимальные стволовые клетки 35 могут быть легко и быстро размножены (дифференцированы) на нижней поверхности 36 культурального сосуда 25.
Электронный микроскоп 13 фотографирует увеличенное изображение плоской формы первых мезенхимальных стволовых клеток 35 в первом плоском культуральном сосуде 25 с интервалами приблизительно 1-2 ч, а сфотографированное увеличенное изображение плоской формы стволовых клеток 35 передается на компьютер 11 с интервалами приблизительно 1-2 ч. Компьютер 11 хранит (записывает) увеличенное изображение плоской формы первых мезенхимальных стволовых клеток 35 и время фотографирования, переданные из электронного микроскопа 13 в область хранения в состоянии связывания с идентификатором донора (средство хранения изображений стволовых клеток). Компьютер 11 отображает на дисплее 16 увеличенное изображение плоской формы первых мезенхимальных стволовых клеток 35 и время фотографирования, переданные из электронного микроскопа 13.
Ответственное лицо подтверждает (просматривает) увеличенное изображение плоской формы первых мезенхимальных стволовых клеток 35, отображаемых на дисплее 16 в течение 36-48 ч с интервалами приблизительно 1-2 ч, и оценивает, достигла или нет общая площадь поверхности стволовых клеток 25 первого установленного соотношения (70-80% конфлюэнтного монослоя) по отношению к площади нижней поверхности культурального сосуда 25, наблюдая общую площадь поверхности стволовых клеток 35, прикрепленных к нижней поверхности 36 первой плоской культурального сосуда 25 относительно площади нижней поверхности культурального сосуда 25. В данном случае ответственное лицо может непосредственно наблюдать общую площадь поверхности по отношению к площади нижней поверхности первого плоского культурального сосуда 25 первых мезенхимальных стволовых клеток 35 из окна наблюдения электронного микроскопа 13 в течение 36-48 ч с интервалами от 1-2 ч и может оценивать, достигла или нет общая площадь поверхности стволовых клеток 35 первого установленного соотношения (70-80% конфлюэнтного монослоя) по отношению к площади нижней поверхности культурального сосуда 25.
Как показано на Фиг. 8, когда общая площадь поверхности первых мезенхимальных стволовых клеток 35 по отношению к площади нижней поверхности первого плоского культурального сосуда 25, отображаемого на дисплее 16, не достигает первого установленного соотношения (70-80% конфлюэнтного монослоя) в итоге наблюдения на стадии первого наблюдения общей площади поверхности, ответственное лицо непрерывно наблюдает общую площадь поверхности стволовых клеток 35 по отношению к площади нижней поверхности культурального сосуда 25 с интервалами 1-2 ч. В данном случае, когда общая площадь поверхности первых мезенхимальных стволовых клеток 35 достигла первого установленного соотношения по отношению к общей площади поверхности увеличенного изображения, отображаемого на дисплее 16, считается, что общая площадь поверхности стволовых клеток 35 достигла первого установленного соотношения по отношению к площади нижней поверхности первого плоского культурального сосуда 25.
В итоге наблюдения на стадии первого наблюдения общей площади поверхности первые мезенхимальные стволовые клетки 35 размножаются на нижней поверхности 36 (внутренней поверхности нижней стенки) первого плоского культурального сосуда 25, стволовые клетки 35 образуют колонии, и наращивается плоская форма стволовых клеток 35, и когда общая площадь поверхности стволовых клеток 35 по отношению к площади нижней поверхности культурального сосуда 25, отображаемая на дисплее 16, достигает первого установленного соотношения (70-80% конфлюэнтного монослоя), как показано на Фиг. 9, выполняется стадия первого выделения стволовых клеток для извлечения стволовых клеток 35 из культурального сосуда 25. На стадии первого выделения стволовых клеток первые мезенхимальные стволовые клетки 35, размноженные (дифференцированные) в первом плоском культуральном сосуде 25, извлекают из культурального сосуда 25.
Ответственное лицо, такое как врач, медсестра и научный сотрудник и т. д. нажимает кнопку завершения первого наблюдения общей поверхности, отображаемую на дисплее 16 после подтверждения того, что общая площадь поверхности первых мезенхимальных стволовых клеток 35 достигла первого установленного соотношения по отношению к площади нижней поверхности первого плоского культурального сосуда 25. Когда нажата кнопка завершения первого наблюдения общей площади поверхности, компьютер 11 отображает пятое электронное табло процесса (не показано на схематическом чертеже) на дисплее 16. На пятом электронном табло процесса отображается номер 2 и данные донора, и в то же время отображаются сообщение о завершении разделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении выделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении второго наблюдения деформации, сообщение о завершении первого наблюдения общей площади поверхности, кнопка первого выделения стволовых клеток, кнопка центрифугирования стволовых клеток, кнопка второго выделения стволовых клеток, кнопка второго наблюдения деформации, кнопка второго наблюдения общей площади поверхности и кнопка третьего выделения стволовых клеток.
Ответственное лицо нажимает кнопку первого выделения стволовых клеток на пятом электронном табло процесса и наводит штрих-код ридер 12 для считывания QR-кода первого плоского культурального сосуда 25. Когда QR-код передается из штрих-код ридера 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), отображаемые на дисплее 16, и данные донора, обозначенные QR-кодом, считанные штрих-код ридером 12, и когда эти данные донора сопоставляются, номер 2, и данные донора отображаются на дисплее 16, и в то же время на дисплее 16 отображаются сообщение о завершении разделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении выделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении второго наблюдения деформации, сообщение о завершении первого наблюдении общей площади поверхности, сообщение о текущей первом выделении стволовых клеток и кнопка завершения первого выделения стволовых клеток. Когда эти данные доноров не сопоставляются, компьютер 11 отображает на дисплее 16 сообщение об ошибке и сообщение о прекращении культивирования.
Ответственное лицо отводит культуральную среду 24, введенную в первый плоский культуральный сосуд 25 на стадии первого наблюдения общей площади поверхности, из культурального сосуда 25 с использованием шприца или пипетки и после промывания культурального сосуда 25 фосфатно-солевым буфером (PBS), раствор трипсина, собранный шприцем или пипеткой, вводится в культуральный сосуд 25. Когда раствор трипсина вводится в первый плоский культуральный сосуд 25, первые мезенхимальные стволовые клетки 35, прикрепленные к нижней поверхности 36 культурального сосуда 25, открепляются от нижней поверхности 36 с помощью раствора трипсина и плавают на поверхности раствора трипсина. Ответственное лицо использует пипетку для сбора стволовых клеток 35 и помещает стволовые клетки 35 в пипетку.
В способе культивирования стволовых клеток путем наблюдения общей площади поверхности первых мезенхимальных стволовых клеток 35 с интервалами приблизительно 1-2 ч, может быть точно подтверждена общая площадь поверхности стволовых клеток 35 по отношению к площади нижней поверхности первого плоского культурального сосуда 25, и может быть точно подтверждено, что общая площадь поверхности стволовых клеток 27 достигает первого установленного соотношения по отношению к площади нижней поверхности культурального сосуда 25.
Фиг. 10 представляет собой пояснительный схематический чертеж, показывающий пример стадии центрифугирования стволовых клеток. После стадии первого выделения стволовых клеток, в которой первые мезенхимальные стволовые клетки 35 извлекаются из первого плоского культурального сосуда 25, выполняется стадия центрифугирования стволовых клеток. На стадии центрифугирования стволовых клеток первые мезенхимальные стволовые клетки 35, выделенные на стадии первого выделения стволовых клеток, центрифугируют для получения слоев с помощью центрифуги 37. Ответственное лицо, такое как врач, медсестра и научный сотрудник и т. д. собирает первые мезенхимальные стволовые клетки 35 из первого плоского культурального сосуда 25 с помощью пипетки и нажимает на кнопку завершения первого выделения стволовых клеток, отображаемую на дисплее 16.
Когда нажата кнопка завершения первого выделения стволовых клеток, компьютер 11 отображает шестое электронное табло процесса (не показано на схематическом чертеже) на дисплее 16. На шестом электронном табло процесса отображается номер 2 и данные донора, и в то же время отображаются сообщение о завершении разделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении выделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении первого наблюдения деформации, сообщение о завершении первого наблюдения общей площади поверхности, сообщение о завершении первого выделения стволовых клеток, кнопка центрифугирования стволовых клеток, кнопка второго выделения стволовых клеток, кнопка второго наблюдения деформации, кнопка второго наблюдения общей площади поверхности и кнопка третьего выделения стволовых клеток.
Ответственное лицо прикрепляет третий бланк кодирования 18c, на котором напечатан QR-код, на внешнюю округлую поверхность стеклянной пробирки 38, в которую вводятся первые мезенхимальные стволовые клетки 35. Затем нажимает кнопку центрифугирования стволовых клеток на шестом электронное табло процесса, чтобы навести штрих-код ридер 12 для считывания QR-кода стеклянной пробирки 38. Когда QR-код передается из штрих-код ридера 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), отображаемые на дисплее 16, и данные донора, обозначенные QR-кодом, считываемым штрих-код ридером 12, и когда эти данные донора сопоставляются, номер 3 и данные донора отображаются на дисплее 16, и в то же время на дисплее 16 отображаются сообщение о завершении разделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении выделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении первого наблюдения деформации, сообщение о завершении первого наблюдения общей площади поверхности, сообщение о завершении первого выделения стволовых клеток, текущее сообщение о центрифугировании стволовых клеток и кнопка завершения центрифугирования стволовых клеток. Когда эти данные доноров не сопоставляются, компьютер 11 отображает на дисплее 16 сообщение об ошибке и сообщение о прекращении культивирования.
Ответственное лицо вводит (помещает) первые мезенхимальные стволовые клетки 35 в пипетке в стеклянную пробирку 38 и размещает (устанавливает) стеклянную пробирку 38 в центрифуге 37. Ответственное лицо выполняет разделение центрифугированием первых мезенхимальных стволовых клеток 35 в течение заданного времени с помощью центрифуги 37, а затем вынимает стеклянную пробирку 38 из центрифуги 37. Первые мезенхимальные стволовые клетки 35 в стеклянной пробирке 38 разделяются в вертикальном положении для получения слоев с помощью центрифуги 37 на два слоя.
Фиг. 11 представляет собой пояснительный схематический чертеж, показывающий пример стадии второго выделения стволовых клеток. После стадии центрифугирования стволовых клеток, в которой первые мезенхимальные стволовые клетки 35 разделены на слои, выполняется стадия второго выделения стволовых клеток. На стадии второго выделения стоволовых клеток вторые мезенхимальные стволовые клетки 39, расположенные в нижнем слое (самый нижний слой), выделяются из первых мезенхимальных стволовых клеток 35, разделенных на слои. Ответственное лицо, такое как врач, медсестра и научный сотрудник и т. д. выполняет разделение первых мезенхимальных стволовых клеток 35 для получения слоев в вертикальном положении с помощью центрифуги 37, затем стеклянную пробирку 38 вынимается из центрифуги 37, и нажимается кнопка завершения центрифугирования стволовых клеток, отображаемая на дисплее 16.
Когда нажата кнопка завершения центрифугирования стволовых клеток, компьютер 11 отображает седьмое электронное табло процесса (не показано на схематическом чертеже) на дисплее 16. На седьмом электронном табло процесса отображается номер 3 и данные донора, и в то же время отображаются сообщение о завершении разделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении выделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении первого наблюдения деформации, сообщение о завершении первого наблюдения деформации, сообщение о завершении первого выделения стволовых клеток, сообщение о завершении центрифугирования стволовых клеток, кнопка второго выделения стволовых клеток, кнопка второго наблюдения деформации, кнопка второго наблюдения общей площади поверхности и кнопка третьего выделения стволовых клеток.
Ответственное лицо нажимает кнопку второго выделения стволовых клеток на седьмом электронном табло процесса и наводит штрих-код ридер 12 для считывания QR-кода стеклянной пробирки 38. Когда QR-код передается из штрих-код ридера 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), отображаемые на дисплее 16, и данные донора, обозначенные QR-кодом, считываемым штрих-код ридером 12, и когда эти данные донора сопоставляются, номер 3 и данные донора отображаются на дисплее 16, и в то же время на дисплее 16 отображаются сообщение о завершении разделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении выделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении первого наблюдения деформации, сообщение о завершении первого наблюдения общей площади поверхности, сообщение о завершении первого выделения стволовых клеток, сообщение о завершении центрифугирования стволовых клеток, текущее сообщение о втором выделении стволовых клеток и сообщение о завершении второго выделения стволовых клеткок. Когда эти данные доноров не сопоставляются, компьютер 11 отображает на дисплее 16 сообщение об ошибке и сообщение о прекращении культивирования.
Ответственное лицо выделяет вторые мезенхимальные стволовые клетки 39, присутствующие в нижнем слое (самом нижнем слое) первых мезенхимальных стволовых клеток 35, разделенных на слои в стеклянной пробирке 38. Ответственное лицо выделяет (отсасывает) вторые мезенхимальные стволовые клетки 39, расположенные в нижнем слое (самом нижнем слое) первых мезенхимальных стволовых клеток 35, разделенных на слои, с использованием шприца. Или же другие мезенхимальные стволовые клетки 39, расположенные в нижнем слое (самом нижнем слое) первых мезенхимальных стволовых клеток 35, разделенных на слои, выделяет (отсасывает) с помощью пипетки.
В способе культивирования стволовых клеток путем центрифугирования первых мезенхимальных стволовых клеток 35, содержащих ненужные стволовые клетки, в центрифуге 37, для разделения их на слои в вертикальном положении и выделения вторых мезенхимальных стволовых клеток 39, расположенных в нижнем слое (самом нижнем слое) стволовых клеток 35, центрифугированных для получения слоев, определенные вторые мезенхимальные стволовые клетки 39 могут быть точно выделены из вторых стволовых клеток 35, а ненужные мезенхимальные стволовые клетки могут быть удалены из стволовых клеток 35.
Когда стволовые клетки 35 пролифелируют, превышая 80% общей площади поверхности первых мезенхимальных стволовых клеток 35 по отношению к площади нижней поверхности первого плоского культурального сосуда 25 (первый сосуд для культивирования), активность стволовых клеток 35 постепенно утрачивается, но в способе культивирования стволовых клеток, когда общая площадь поверхности стволовых клеток 35 увеличивается до 70-80% по отношению к площади нижней поверхности культурального сосуда 25, стволовые клетки 35 извлекают из культурального сосуда 25, так что активность стволовых клеток 35 может быть сохранена, и стволовые клетки 35 могут быть размножены с сохранением их активности, в результате чего вторые мезенхимальные стволовые клетки 39, обладающие активностью, могут быть выделены из стволовых клеток 35.
Фиг. 12 представляет собой пояснительный схематический чертеж, показывающий пример стадии второго наблюдения деформации, и Фиг. 13 представляет собой вид сбоку второго плоского культурального сосуда 25 (второго сосуда для культивирования). Фиг. 14 представляет собой частичный увеличенный вид, показывающий пример плоской формы вторых мезенхимальных стволовых клеток 39, и Фиг. 15 представляет собой частичный увеличенный вид, показывающий другой пример плоской формы вторых мезенхимальных стволовых клеток 39. На Фиг. 14 и 15 показаны увеличенные изображения плоских форм вторых мезенхимальных стволовых клеток 39, сфотографированных с помощью электронного микроскопа 13.
После стадии второго выделения стволовых клеток, в которой определенные первые мезенхимальные стволовые клетки 39, расположенные в нижнем слое (самом нижнем слое), выделяются из первых мезенхимальных стволовых клеток 35, выполняется стадия второго наблюдения деформации. На стадии второго наблюдения деформации вторые мезенхимальные стволовые клетки 39 и культуральную среду 24 вводят (помещают) во второй плоский культуральный сосуд 34 (второй сосуд для культивирования) (культуральный сосуд для клеток), при этом статически выдерживая культуральный сосуд 34 фактически при той же температуре, что и температура тела (приблизительно 37°С), в течение 36-48 ч (оставьте его в ровном положении, не двигая), деформация вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 (вторых стволовых клеток) в культуральном сосуде 34 из первоначальной плоской формы наблюдается с помощью электронного микроскопа 13 в течение 36-48 ч с интервалами 1-2 ч, и оценивается, прикреплены или нет стволовые клетки 39 к нижней поверхности 45 культурального сосуда 34. На нижнюю поверхность 45 (наружную поверхность нижней стенки) второго плоского культурального сосуда 34, в который вводятся вторые мезенхимальные стволовые клетки 39 и культуральная среда 24, прикрепляется четвертый бланк кодирования 18d, на котором напечатан QR-код, определяющий донора.
Ответственное лицо, такое как врач, медсестра и научный сотрудник и т. д. нажимает сообщение о завершении второго выделения стволовой клетки, отображаемое на дисплее 16, после выделения вторых определенных мезенхимальных стволовых клеток 39 из первых мезенхимальных стволовых клеток 35. Когда нажимается сообщение о завершении выделения вторых стволовых клеток, компьютер 11 отображает восьмое электронное табло процесса (не показано на схематическом чертеже) на дисплее 16. На восьмом электронном табло процесса отображаются номер 4 и данные донора, и в то же время время отображается сообщение о завершении разделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении выделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении первого наблюдения деформации, сообщение о завершении наблюдения общей площади поверхности, сообщение о завершении первого выделения стволовых клеток, сообщение о завершении центрифугирования стволовых клеток, сообщение о завершении второго выделения стволовых клеток, кнопка второго наблюдения деформации, кнопка второго наблюдения общей площади поверхности и кнопка третьего выделения стволовых клеток.
Ответственное лицо прикрепляет четвертый бланк кодирования 18d, на котором напечатан QR-код, к нижней поверхности 45 (внешней поверхности нижней стенки) второго плоского культурального сосуда 34. Затем нажимает кнопку второго наблюдения деформации на восьмом электронном табло процесса, чтобы штрих-код ридер 12 считал QR-код культурального сосуда 34. Когда QR-код передается из штрих-код ридера 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), отображаемые на дисплее 16, и данные донора, обозначенные QR-кодом, считываемым штрих-код ридером 12, и когда эти данные донора сопоставляются, номер 4 и данные донора отображаются на дисплее 16, и в то же время на дисплее 16 отображаются сообщение о завершении разделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении выделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении первого наблюдения деформации, сообщение о завершении наблюдения первой общей площади поверхности, сообщение о завершении первого выделения стволовых клеток, сообщение о завершении центрифугирования стволовых клеток, сообщение о завершении второго выделения стволовых клеток, сообщение о втором наблюдении деформации и кнопка завершения второго наблюдении деформации. Когда эти данные доноров не сопоставляются, компьютер 11 отображает на дисплее 16 сообщение об ошибке и сообщение о прекращении культивирования.
Ответственное лицо вводит (помещает) вторые мезенхимальные стволовые клетки 39, собранные шприцем или пипеткой, во второй плоский культуральный сосуд 34, а также вводит (помещает) культуральную среду 24, собранную шприцем или пипеткой, в культуральный сосуд 34 Второй плоский культуральный сосуд 34 (второй сосуд для культивирования), используемый на стадии второй деформации, представляет собой плоский сосуд, выполненный из прозрачного стекла или прозрачного пластика, и имеющий нижнюю поверхность 45 с небольшой емкостью и заданной площадью, и имеющий фактически четырехугольную плоскую форму, и площадь нижней поверхности 45 приблизительно в 2 раза превышает площадь поверхности первого плоского культурального сосуда 25 (первый сосуд для культивирования). Второй плоский культуральный сосуд 34 имеет верхнюю часть 40 и нижнюю часть 42, центральную часть 41, расположенную между верхней и нижней частями 40 и 42, и отверстие для ввода 43, сформированное в верхней части 40. Отверстие для ввода 43 является водонепроницаемым, закрытым крышкой 44.
3
3
2
Второй плоский культуральный сосуд 34 (второй сосуд для культивирования) имеет емкость приблизительно 40-60 см(предпочтительно, 50 см), и площадь его нижней поверхности составляет 50-72 мм. Длина одной стороны второго плоского культурального сосуда 26 приблизительно 7-8,5 мм. В данном случае в качестве второго плоского культурального сосуда 34 может использоваться плоский сосуд с круглой или эллиптической плоской формой, и имеющий нижнюю поверхность 45 с небольшой емкостью и заданной площадью. Культуральная среда 24 такая же, как и введенная на стадии первого наблюдения деформации. Вторые мезенхимальные стволовые клетки 39, введенные в культуральный сосуд 34, культивируются с культуральной средой 24 и прикрепляются к нижней поверхности 45 культурального сосуда 34 с течением времени и постепенно пролиферируют (дифференцируются) на нижней поверхности 45 культурального сосуда 34 с образованием колоний.
Ответственное лицо снимает крышку 44 с отверстия для ввода 43, вводит (помещает) вторые мезенхимальные стволовые клетки 39, собранные пипеткой, внутрь культурального сосуда 34 через отверстие для ввода 43 второго плоского культурального сосуда 34, и вводит (помещает) культуральную среду 24, собранную шприцем или пипеткой, внутрь культурального сосуда 34 через отверстие для ввода 43 культурального сосуда 34 и закрывает отверстие для ввода 43 крышкой 44. После введения вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 и культуральной среды 24 во второй плоский культуральный сосуд 34, ответственное лицо размещает (устанавливает) культуральный сосуд 34 в держателе образца 31 электронного микроскопа 13.
Промежуточная вставка 33 расположена между верхней поверхностью 32 держателя образца 31 электронного микроскопа 13 и нижней частью 42 второго плоского культурального сосуда 34, нижняя часть 42 культурального сосуда 34 удерживается в приподнятом состоянии промежуточной вставкой 33, и культуральный сосуд 34 удерживается в состоянии наклона под заданным углом, так что нижняя часть 42 культурального сосуда 34 находится сверху, а верхняя часть 40 (отверстие для ввода 43) культурального сосуда 34 находится внизу. Кроме того, промежуточная вставка 33 расположена между верхней поверхностью 32 держателя образца 31 электронного микроскопа 13 и верхней частью 40 второго плоского культурального сосуда 34, верхняя часть 40 культурального сосуда 34 удерживается в приподнятом состоянии промежуточной вставкой 33, культуральный сосуд 34 может удерживаться в состоянии наклона под заданным углом, так что верхняя часть 40 культурального сосуда 34 находится сверху, а нижняя часть 42 культурального сосуда 34 находится снизу. Угол наклона α2 второго плоского культурального сосуда 34 по отношению к верхней поверхности 32 держателя образца 31 находится в диапазоне 2-5°, предпочтительно, в диапазоне 2-3°.
В способе культивирования стволовых клеток с помощью наклона второго плоского культурального сосуда 34 к верхней поверхности 32 держателя образца 31 под вышеупомянутым углом наклона, вторые мезенхимальные стволовые клетки 39 и культуральная среда 24 наклонены на сторону верхней части 40 (или на сторону нижней части 42) культурального сосуда 34 во втором плоском культуральном сосуде 34, гидростатические давления вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 и культуральной среды 24 становятся большими на стороне верхней части 40 (или на стороне нижней части 42) культурального сосуда 25, и вторые мезенхимальные стволовые клетки 39 концентрируются на стороне нижней поверхности 45 культурального сосуда 34, в результате чего активность вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 увеличивается, и вторые мезенхимальные стволовые клетки 39 могут быть легко и быстро прикреплены к нижней поверхности 45 культурального сосуда 34.
Электронный микроскоп 13 фотографирует увеличенное изображение плоской формы вторых мезенхимальных стволовых клеток 39, введенных во второй плоский культуральный сосуд 34 с интервалами приблизительно 1-2 ч, и сфотографированное увеличенное изображение плоской формы стволовых клеток 39 передается на компьютер 11 с интервалами приблизительно 1-2 ч. Компьютер 11 хранит (записывает) увеличенное изображение плоской формы вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 и время фотографирования, переданные из электронного микроскопа 13 в область хранения в состоянии связывания с идентификатором донора (средство хранения изображений стволовых клеток). Компьютер 11 отображает на дисплее 16 увеличенное изображение плоской формы вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 и время фотографирования, переданные из электронного микроскопа 13. Ответственное лицо подтверждает (просматривает) увеличенное изображение плоской формы вторых мезенхимальных стволовых клеток 39, отображаемых на дисплее 16 в течение 36-48 ч с интервалами приблизительно 1-2 ч, и оценивает изменение в плоской форме стволовых клеток 39. В данном случае ответственное лицо может непосредственно наблюдать изменение плоской формы вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 из окна наблюдения электронного микроскопа 13 в течение 36-48 ч с интервалами приблизительно 1-2 ч.
Первоначальная плоская форма вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 является фактически круглой, и когда плоская форма стволовых клеток 39 является фактически круглой, стволовые клетки 39 не прикреплены к нижней поверхности 45 (внутренней поверхности нижней стенки) второго плоского культурального сосуда 34, и пролиферация (дифференцировка) стволовых клеток 39 не начинается. Плоская форма вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 после деформации является плоской формой, в которой стволовые клетки 39 удлиняются неравномерно с фактически круглым ядром, и стволовые клетки 39 прикрепляются к нижней поверхности 45 (внутренней поверхности нижней стенки) второго плоского культурального сосуда 34 и начинается пролиферация (дифференцировка) стволовых клеток 39.
Как показано на Фиг. 14, когда плоская форма вторых мезенхимальных стволовых клеток 39, отображаемая на дисплее 16, остается фактически круглой в итоге наблюдения на стадии второго наблюдения деформации, ответственное лицо считает, что стволовые клетки 39 не прикрепляются к нижней поверхности 45 (внутренней поверхности нижней стенки) второго плоского культурального сосуда 34 и непрерывно наблюдает изменения в плоской форме стволовых клеток 39 с интервалами приблизительно 1-2 ч. Как показано на Фиг. 15, когда плоская форма вторых мезенхимальных стволовых клеток 39, отображаемых на дисплее 16, деформируется из фактически круглой в неправильную плоскую форму с фактически круглым ядром в итоге наблюдения на стадии второго наблюдения деформации, ответственное лицо считает, что стволовые клетки 39 прикрепляются к нижней поверхности 45 второго плоского культурального сосуда 34.
3
2
Если во время прикрепления вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 используется большой культуральный сосуд, имеющий емкость свыше 60 см и площадь нижней поверхности свыше 72 мм, стволовые клетки 39, как правило, затруднительно прикрепляются к нижней поверхности сосуда, и пролиферация стволовых клеток 39 становится медленной, но в способе культивирования стволовых клеток стволовые клетки 39 могут быть легко прикреплены к нижней поверхности 45 культурального сосуда 34, используя второй плоский культуральный сосуд 34, имеющий вышеупомянутую емкость и вышеупомянутую площадь нижней поверхности, и стволовые клетки могут быть быстро размножены в культуральном сосуде 34.
В способе культивирования стволовых клеток, поскольку деформация вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 в культуральном сосуде 34 из первоначальной плоской формы наблюдается в течение 36-48 ч с интервалами приблизительно 1-2 ч, при этом статически выдерживая второй плоский культуральный сосуд 34 фактически при той же температуре, что и температура тела, в течение 36-48 ч, деформация стволовых клеток 39 никогда не пропускается, и может быть точно подтверждено прикрепление стволовых клеток 39 к нижней поверхности 45 культуральной емкости 34.
Фиг. 16 представляет собой частичный увеличенный вид, показывающий другой пример плоской формы вторых мезенхимальных стволовых клеток 39, и Фиг. 17 представляет собой схематический чертеж, показывающий пример консервации вторых мезенхимальных стволовых клеток 39. На Фиг. 16 показано увеличенное изображение плоской формы вторых мезенхимальных стволовых клеток 39, сфотографированных с помощью электронного микроскопа 13. В итоге наблюдения на стадии второго наблюдения деформации вторые мезенхимальные стволовые клетки 39 (вторые стволовые клетки) деформируются из фактически круглой формы (первоначальнай плоской формы) в неправильную плоскую форму с фактически круглым ядром, и после стадии третьего наблюдения стволовых клеток, подтверждающей прикрепление стволовых клеток 39 к нижней поверхности 45 второго плоского культурального сосуда 34 (второго сосуда для культивирования) выполняется стадия второго наблюдения общей площади поверхности.
На стадии второго наблюдения общей площади поверхности культуральная среда 24, введенная во второй плоский культуральный сосуд 34, отводится из культурального сосуда 34, и новая культуральная среда 24 вводится (помещается) в культуральный сосуд 34. Затем общая площадь поверхности вторых мезенхимальных стволовых клеток 39, прикрепленных к нижней поверхности 45 культурального сосуда 34, по отношению к площади нижней поверхности культурального сосуда 34 наблюдается с помощью электронного микроскопа 13 в течение 36-48 ч с интервалами приблизительно 1-2 ч, при этом статически выдерживая (оставьте его в ровном положении, не двигая) второй плоский культуральный сосуд 34 фактически при той же температуре, что и температура тела (приблизительно 36-37°С), в течение 36-48 ч, и оценивается, достигла или нет общая площадь поверхности стволовых клеток 39 второго установленного соотношения по отношению к площади нижней поверхности культурального сосуда 34. Второе установленное сотношение общей площади поверхности вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 по отношению к площади нижней поверхности второго плоского культурального сосуда 34 составляет 88-92% (88-92% конфлюэнтного монослоя).
Ответственное лицо, такое как врач, медсестра и научный сотрудник и т. д. нажимает кнопку завершения второго наблюдения деформации, отображаемую на дисплее 16, после подтверждения прикрепления вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 к нижней поверхности 45 второго плоского культурального сосуда 34. Когда нажата кнопка завершения второго наблюдения деформации, компьютер 11 отображает девятое электронное табло процесса (не показано на схематическом чертеже) на дисплее 16. На девятом электронном табло процесса отображается номер 4 и данные донора, и в то же время отображаются сообщение о завершении разделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении выделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении первого наблюдения деформации, сообщение о завершении первого наблюдения общей площади поверхности, сообщение о завершении первого выделения стволовых клеток, сообщение о завершении центрифугирования стволовых клеток, сообщение о завершении второго извлечения стволовых клеток, сообщение о завершении второго наблюдения деформации, кнопка второго наблюдения общей площади поверхности и кнопка третьего выделения стволовых клеток.
Ответственное лицо нажимает кнопку второго наблюдения общей площади поверхности на девятом электронном табло процесса для извлечения второго плоского культурального сосуда 34 из держателя образца 31 электронного микроскопа 13 и наводит штрих-код ридер 12 для считывания QR-кода культурального сосуда 34. Когда QR-код передается из штрих-код ридера 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), отображаемые на дисплее 16, и данные донора, обозначенные QR-кодом, считываемым штрих-код ридером, и когда эти данные донора сопоставляются, номер 4 и данные донора отображаются на дисплее 16, и в то же время на дисплее 16 отображаются сообщение о завершении разделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении выделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении первого наблюдения деформации, сообщение о завершении первого наблюдения общей площади поверхности, сообщение о завершении первого выделения стволовых клеток, сообщение о завершении центрифугирования стволовых клеток, сообщение о завершении второго выделения стволовых клеток, сообщение о завершении второго наблюдения деформации, текущее сообщение о втором наблюдении общей площади поверхности и кнопка завершения второго наблюдения общей площади поверхности. Когда эти данные доноров не сопоставляются, компьютер 11 отображает на дисплее 16 сообщение об ошибке и сообщение о прекращении культивирования.
Ответственное лицо отводит культуральную среду 24, введенную во второй плоский культуральный сосуд 34 на стадии второго наблюдения общей площади поверхности, из культурального сосуда 34 с использованием шприца или пипетки и вводит (помещает) новую культуральную среду 24, собранную шприцем или пипеткой, в культуральный сосуд 34. Новая культуральная среда 24 такая же, как и введенная на стадии первого наблюдения деформации. Ответственное лицо размещает (устанавливает) культуральный сосуд 34 в держателе образца 31 электронного микроскопа 13 после введения новой культуральной среды 24 во второй плоский культуральный сосуд 34.
Промежуточная вставка 33 расположена между верхней поверхностью 32 держателя образца 31 электронного микроскопа 13 и нижней частью 42 второго плоского культурального сосуда 34, нижняя часть 42 культурального сосуда 34 удерживается в приподнятом состоянии промежуточной вставкой 33, и культуральный сосуд 34 удерживается в состоянии наклона под заданным углом, так что нижняя часть 42 культурального сосуда 34 находится сверху, а верхняя часть 40 (отверстие для ввода 43) культурального сосуда 34 находится внизу (см. Фиг. 13). Кроме того, промежуточная вставка 33 расположена между верхней поверхностью 32 держателя образца 31 электронного микроскопа 13 и верхней частью 40 второго плоского культурального сосуда 34, верхняя часть 40 культурального сосуда 34 удерживается в приподнятом состоянии промежуточной вставкой 33, и культуральный сосуд 34 может удерживаться в состоянии наклона под заданным углом, так что верхняя часть 40 культурального сосуда 34 находится сверху, а нижняя часть 42 культурального сосуда 34 находится снизу. Угол наклона α2 второго плоского культурального сосуда 34 по отношению к верхней поверхности 32 держателя образца 31 находится в диапазоне 2-5°, предпочтительно, в диапазоне 2-3°.
В способе культивирования стволовых клеток после подтверждения прикрепления вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 путем введения новой культуральной среды 24 в культуральный сосуд 34 при отводе культуральной среды 24 из второго плоского культурального сосуда 34, может быть точно повышена пролиферация стволовых клеток 39. В способе культивирования стволовых клеток с помощью наклона второго плоского культурального сосуда 34 к верхней поверхности 32 держателя образца 31 под вышеупомянутым углом наклона, вторые мезенхимальные стволовые клетки 39 и культуральная среда 24 наклонены на сторону верхней части 40 (или на сторону нижней части 42) культурального сосуда 34 во втором плоском культуральном сосуде 34 и на сторону верхней части 40 (или на сторону нижней части 42) культурального сосуда 34, гидростатические давления вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 и культуральной среды 24 становится большим, и вторые мезенхимальные стволовые клетки 39 концентрируются на стороне нижней поверхности 45 культурального сосуда 34, в результате чего активность активность вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 увеличивается, и второй вторые мезенхимальные стволовые клетки 39 могут быть легко и быстро размножены (дифференцированы) на нижней поверхности 45 культурального сосуда 34.
Электронный микроскоп 13 фотографирует увеличенное изображение плоской формы вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 во втором плоском культуральном сосуде 34 с интервалами приблизительно 1-2 ч, и сфотографированное увеличенное изображение плоской формы стволовых клеток 39 передается на компьютер 11 с интервалами приблизительно 1-2 ч. Компьютер 11 хранит (записывает) увеличенное изображение плоской формы вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 и время фотографирования, переданные из электронного микроскопа 13 в область хранения в состоянии связывания с идентификатором донора (средство хранения изображений стволовых клеток). Компьютер 11 отображает на дисплее 16 увеличенное изображение плоской формы вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 и время фотографирования, переданные из электронного микроскопа 13.
Ответственное лицо подтверждает (просматривает) увеличенное изображение плоской формы вторых мезенхимальных стволовых клеток 39, отображаемых на дисплее 16 в течение 36-48 ч с интервалами 1-2 ч, и оценивает, достигла или нет общая площадь поверхности стволовых клеток 39 второго установленного соотношения (82-92% конфлюэнтного монослоя) по отношению к площади нижней поверхности культурального сосуда 34, наблюдая общую площадь поверхности стволовых клеток 39, прикрепленных к нижней поверхности 45 второго плоского культурального сосуда 34 по отношению к площади нижней поверхности культурального сосуда 34. В данном случае ответственное лицо может непосредственно наблюдать общую площадь поверхности второго плоского культурального сосуда 34 вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 по отношению к площади нижней поверхности из окна наблюдения электронного микроскопа 13 в течение 36-48 ч с интервалами приблизительно 1-2 ч и может оценивать, достигла или нет общая площадь поверхности стволовых клеток 39 второго установленного соотношения (88-92% конфлюэнтного монослоя) по отношению к площади нижней поверхности культурального сосуда 34.
Как показано на Фиг. 15, когда общая площадь поверхности вторых мезенхимальных стволовых клеток 39, отображаемых на дисплее 16, по отношению к площади нижней поверхности второго плоского культурального сосуда 34 не достигает второго установленного соотношения (88-92% конфлюэнтного монослоя) в итоге наблюдения на этапе второго наблюдения общей площади поверхности ответственное лицо непрерывно наблюдает общую площадь поверхности стволовых клеток 39 по отношению к площади нижней поверхности культурального сосуда 34 с интервалами приблизительно 1-2 ч. В данном случае, когда общая площадь поверхности вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 достигла второго установленного соотношения по отношению к общей площади поверхности увеличенного изображения, отображаемого на дисплее 16, считается, что общая площадь поверхности стволовых клеток 39 по отношению к площади нижней поверхности второго плоского культурального сосуда 34 достигла второго установленного соотношения.
В итоге наблюдения на стадии второго наблюдения общей площади поверхности вторые мезенхимальные стволовые клетки 39 пролифелируют на нижней поверхности 45 (внутренней поверхности нижней стенки) второго плоского культурального сосуда 34 (второго сосуда для культивирования), стволовые клетки 39 образуют колонии и наращивается плоская форма стволовых клеток 39, и когда общая площадь поверхности стволовых клеток 39 по отношению к площади нижней поверхности культурального сосуда 34, отображаемых на дисплее 16, достигает второго установленного соотношения (88-92% конфлюэнтного монослоя), как показано на Фиг. 16, выполняется стадия третьего выделения стволовых клеток - извлечение стволовых клеток 39 из культурального сосуда 34. На стадии третьего выделения стволовых клеток вторые мезенхимальные стволовые клетки 39, размноженные (дифференцированные) во втором плоском культуральном сосуде 34, извлекаются из культурального сосуда 34. В способе культивирования стволовых клеток путем наблюдения общей площади поверхности с интервалами приблизительно 1-2 ч, может быть точно подтверждена общая площадь поверхности вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 по отношению к площади нижней поверхности второго плоского культурального сосуда 34, и может быть точно подтверждено, что общая площадь поверхности стволовых клеток 39 достигла второго установленного соотношения по отношению к площади нижней поверхности культурального сосуда 34.
Ответственное лицо, такое как врач, медсестра и научный сотрудник и т. д. нажимает кнопку завершения второго наблюдения общей площади поверхности, отображаемую на дисплее 16, после подтверждения того, что общая площадь поверхности вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 достигла второго установленного соотношения по отношению к площади нижней поверхности второго плоского культурального сосуда 34. Когда нажата кнопка завершения второго наблюдения общей площади поверхности, компьютер 11 отображает десятое электронное табло процесса (не показано на схематическом чертеже) на дисплее 16. На десятом электронном табло процесса отображаются номер 4 и данные донора, и в то же время отображаются сообщение о завершении разделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении выделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении первого наблюдения деформации, сообщение о завершении первого наблюдения общей площади поверхности, сообщение о завершении первого выделения стволовых клеток, сообщение о завершении центрифугирования стволовых клеток, сообщение о завершении второго выделения стволовых клеток, сообщение о завершении второго наблюдения деформации, сообщение о завершении второго наблюдения общей площади поверхности и кнопка третьего выделения стволовых клеток.
Ответственное лицо нажимает кнопку третьего выделения стволовых клеток на десятом электронном табло процесса и наводит штрих-код ридер 12 для считывания QR-кода второго плоского культурального сосуда 34. Когда QR-код передается из штрих-код ридера 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), отображаемые на дисплее 16, и данные донора, обозначенные QR-кодом, считываемым штрих-код ридером 12, и когда эти данные донора сопоставляются, номер 4 и данные донора отображаются на дисплее 16, и в то же время на дисплее 16 отображаются сообщение о завершении разделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении выделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении первого наблюдения деформации, сообщение о завершении первого наблюдения общей площади поверхности, сообщение о завершении первого выделения стволовых клеток, сообщение о завершении центрифугирования стволовых клеток, сообщение о завершении второго выделения стволовых клеток, сообщение о завершении второго наблюдения деформации, сообщение о завершении второго наблюдения общей площади поверхности и кнопка завершения третьего выделения стволовых клеток. Когда эти данные доноров не сопоставляются, компьютер 11 отображает на дисплее 16 сообщение об ошибке и сообщение о прекращении культивирования.
На стадии второго наблюдения общей площади поверхности ответственное лицо отводит культуральную среду 24, введенную во второй плоский культуральный сосуд 34, из культурального сосуда для 34 с использованием шприца или пипетки, и после промывания культурального сосуда 34 с помощью PBS, раствор трипсина, собранный шприцем или пипеткой, вводится в культуральный сосуд 34. Когда раствор трипсина вводится во второй плоский культуральный сосуд 34, вторые мезенхимальные стволовые клетки 39, прикрепленные к нижней поверхности 45 культурального сосуда 34, открепляются от нижней поверхности 45 с помощью раствора трипсина и плавают на поверхности раствора трипсина.
Когда раствор трипсина вводится в первый плоский культуральный сосуд 25, первые мезенхимальные стволовые клетки 35, прикрепленные к нижней поверхности 36 культурального сосуда 25, открепляются от нижней поверхности 36 с помощью раствора трипсина и плавают на поверхности раствора трипсина.
Ответственное лицо использует пипетку для сбора вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 и вводит (помещает) стволовые клетки 39 из пипетки в консервирующий сосуд 46. Вторые мезенхимальные стволовые клетки 39, введенные в консервирующий сосуд 46, представляют собой определенный тип (фактически единственный вид) чистых мезенхимальных стволовых клеток, обладающих активностью, с подлежащим культивированию объектом, из которого были удалены ненужные мезенхимальные стволовые клетки. После введения вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 в консервирующий сосуд 46 из пипетки ответственное лицо прикрепляет четвертый бланк кодирования 18d, на котором напечатан QR-код, на внешнюю округлую поверхность консервирующего сосуда 46.
Ответственное лицо нажимает кнопку завершения третьего выделения стволовых клеток на десятом электронном табло процесса, отображаемом на дисплее 16, наводит штрих-код ридер 12 для считывания QR-кода консервирующего сосуда 46, а затем консервирующий сосуд 46, в который введены вторые мезенхимальные стволовые клетки 39, перемешивают в холодильнике 47. Вторые мезенхимальные стволовые клетки 39 сохраняются в холодильнике 47 при температуре приблизительно 3-4°С.
Когда QR-код передается из штрих-код ридера 12 на компьютер 11, компьютер 11 сравнивает данные донора (данные донора, считанные в памяти), отображаемые на дисплее 16, и данные донора, обозначенные QR-кодом, штрих-код ридером 12, и когда эти данные доноров сопоставляются, номер 4 и данные донора отображаются на дисплее 16, и в то же время на дисплее 16 отображаются сообщение о завершении разделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении выделения аспирата костного мозга, сообщение о завершении первого наблюдения деформации, сообщение о завершении первого наблюдения общей площади поверхности, сообщение о завершении первого выделения стволовых клеток, сообщение о завершении центрифугирования стволовых клеток, сообщение о завершении второго выделения стволовых клеток, сообщение о завершении второго наблюдения деформации, сообщение о завершении второго наблюдения общей площади поверхности и сообщение о завершении третьего выделения стволовых клеток.
Если стволовые клетки 39 пролифелируют, превышая 92% общей площади поверхности вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 по отношению к площади нижней поверхности второго плоского культурального сосуда 34 (второго сосуда для культивирования), активность стволовых клеток 39 постепенно утрачивается, но в способе культивирования стволовых клеток, когда общая площадь поверхности стволовых клеток 39 увеличивается до 88-92% по отношению к площади нижней поверхности культурального сосуда 34, стволовые клетки 39 извлекаются из культурального сосуда 34, так что активность стволовых клеток 39 может быть сохранена, и стволовые клетки 39 могут быть размножены с сохранением их активности.
В способе культивирования стволовых клеток второй аспират костного мозга 23, расположенный в промежуточном слое между первым аспиратом костного мозга 19, разделенного на слои, второй аспират костного мозга 23 культивируется с культуральной средой 24 для прикрепления первых мезенхимальных стволовых клеток 35 (первых стволовых клеток) к нижней поверхности 36 первого плоского культурального сосуда 25 (первого сосуда для культивирования), а также размножаются первые мезенхимальные стволовые клетки 35. Когда общая площадь поверхности первых мезенхимальных стволовых клеток 35 первого установленного соотношения по отношению к площади нижней поверхности первого плоского культурального сосуда 25, первые мезенхимальные стволовые клетки 35 извлекаются из культурального сосуда 25, выделяются вторые мезенхимальные стволовые клетки 39 (вторые стволовые клетки), расположенные на нижнем слое (самом нижнем слое) среди первых мезенхимальных стволовых клеток 35, центрифугированных для получения слоев, вторые мезенхимальные стволовые клетки 39 культивируются с культуральной средой 24 для прикрепления вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 к нижней поверхности 45 второго плоского культурального сосуда 34, и размножаются вторые мезенхимальные стволовые клетки 39. Когда общая площадь поверхности вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 достигла второго установленного соотношения по отношению к площади нижней поверхности второго плоского культурального сосуда 34, вторые мезенхимальные стволовые клетки 39 извлекают из культурального сосуда 34. Таким образом, путем выделения определенного второго аспирата костного мозга 23 из первого аспирата костного мозга 19, разделенного на слои, и путем выделения определенных вторых мезенхимальных стволовых клеток 39 из первых мезенхимальных стволовых клеток 35, разделенных на слои, можно предотвратить пролиферацию различных стволовых клеток, и могут быть культивированы только определенные типы стволовых клеток (вторых мезенхимальных стволовых клеток), которые являются подлежащим получению объектом, и могут быть получены чистые (истинные) стволовые клетки, из которых были удалены ненужные стволовые клетки.
С помощью способа культивирования стволовых клеток можно культивировать только определенные типы стволовых клеток (вторых мезенхимальных стволовых клеток 39), так что могут быть культивированы стволовые клетки, обладающие большим терапевтическим эффектом при различных заболеваниях и регенеративным эффектом в регенеративной медицине и имеющие высокую вероятность полного излечения различных заболеваний, а также высокую вероятность регенерации различных тканей или различных органов.
Объяснение ссылочных номеров
10 Система культивирования стволовых клеток
11 Компьютер
12 Штрих-код ридер
13 Электронный микроскоп
14 Клавиатура
15 Мышь
16 Дисплей
18a Первый бланк кодирования
18b Второй бланк кодирования
18c Третий бланк кодирования
18d Четвертый бланк кодирования
19 Первый аспират костного мозга
20 Стеклянная пробирка
21 Штатив для пробирок
22 Камера термостата
23 Второй аспират костного мозга
24 Культурная среда
25 Первый плоский культуральный сосуд (первый сосуд для культивирования)
26 Верхняя часть
27 Центральная часть
28 Нижняя часть
29 Отверстие для ввода
30 Крышка
31 Держатель образца
32 Верхняя поверхность
33 Промежуточная вставка
34 Второй плоский культуральный сосуд (второй сосуд для культивирования)
35 Первые мезенхимальные стволовые клетки (первые стволовые клетки)
36 Нижняя поверхность
37 Центрифуга
38 Стеклянная пробирка
39 Вторые мезенхимальные стволовые клетки (вторые стволовые клетки)
40 Верхняя часть
41 Центральная часть
42 Нижняя часть
43 Отверстие для ввода
44 Крышка
45 Нижняя поверхность
46 Консервирующий сосуд
47 Холодильник