Способ выведения солеустойчивого сорта риса
METHOD FOR BREEDING A SALT-RESISTANT RICE VARIETY

Заявляемое изобретение относится к новым способам выращивания растений, а именно к способу выведения солеустойчивого сорта риса.
Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение урожайности риса при его возделывании на засоленных почвах и при орошении водой с массовой долей солей до 1,5%.
За счет скрещивания сортов риса разного экологического происхождения, относящихся к разным подвидам, происходит объединение генов, контролирующих признаки высокой солеустойчивости и урожайности.
Солеустойчивый рис может расти на засоленных почвах, таким образом, решается проблема возделывания риса на малопригодных землях. Урожайность повышается за счет устойчивости риса к неблагоприятным условиям, в том числе к наличию высокой концентрации соли в воде для полива.
На данный момент известны следующие способы, наиболее схожие с заявляемым:
1
1. Метод быстрого размножения солеустойчивых сортов риса по патенту CN103262788. Данное изобретение относится к способу быстрого размножения солеустойчивого сорта риса и относится к технической области селекции растений. Способ быстрого размножения включает следующие стадии: гибридизацию сортов и проведение ускоренного размножения гибридов; проведение идентификации на стадии проращивания семян в поколении F и выявление солеустойчивых зародышей в условиях лаборатории и прибрежной засоленной почвы с концентрацией солевого раствора 0,4-0,5% для скрининга отдельных растений риса. Растения с урожайностью и качеством выше, чем у Yancheng 156, пересаживаются отдельно в естественных условиях. Далее происходит выборочное традиционное размножение нового толерантного к засолению сорта риса индика с солеустойчивостью 0,4-0,5%, высокой урожайностью и хорошим качеством риса, названного солеустойчивым рисом 3931. Отличается от заявленного способа тем, что использует только генетический метод - для уже выведенных сортов, в то время как заявленный способ нацелен на первоначальное выведение солеустойчивых сортов риса.
2. Применение гена OsPIL13 в повышении солеустойчивости риса по патенту CN105002212. Изобретение раскрывает применение гена OsPIL13 для улучшения устойчивости риса к солевому стрессу. Специфический фрагмент гена OsPIL13 сорта риса Nipponbare принимается в качестве последовательности нуклеотидов, которая переносится в рис, уровень экспрессии гена OsPIL13 понижается, а солеустойчивость повышается. В условиях солевого стресса (200 мМ NaCl) выживаемость контрольных проростков риса составляет около 11,0%, а трансгенных - 71-90%. Новые генные ресурсы представляются как возможность выращивания солеустойчивых сортов сельскохозяйственных культур с высокой устойчивостью к данному стрессору, а также предоставляется поддержка для изучения солеустойчивости у других видов зерновых культур. Данный способ отличается от заявляемого тем, что использует метод редактирования генов, требующий использования дорогостоящего оборудования, которое не доступно большинству научных центров и сельских хозяйств при массовом выведения сортов риса.
3. Метод селекции для направленной и эффективной селекции солеустойчивых сортов риса по патенту CN109207509. Настоящее изобретение относится к способу направленной и эффективной селекции сортов риса с высокой солеустойчивостью и гетерозисом. Способ основан на методике редактирования гена CRISPR/Cas9 в сочетании с методами повышения гетерозиса. Метод включает выбор конкретной последовательности-мишени в соответствии с последовательностью экзонов риса OsRR22, одновременное редактирование родителей гибридного риса, создание мутантных линий со значительно улучшенной солеустойчивостью в качестве превосходных солеустойчивых родителей, а затем проведение теста на скрещивание и селекцию новых гибридных сортов риса с высокой солеустойчивостью и сильным гетерозисом. Отличается от заявляемого способа тем, что использует более низкую концентрацию соли 0,5%, что не позволяет отобрать наиболее устойчивые к солевому стрессу образцы и повысить урожайность, а также использует дорогостоящий метод редактирования генов.
Осуществление заявляемого способа выведения солеустойчивого сорта риса иллюстрируется следующими фигурами:
фиг. 1 Закладка семян риса на солеустойчивость рулонным способом;
фиг. 2 Сравнение проростков риса в соленой и дистиллированной воде для анализа солеустойчивости;
фиг. 3 Образцы микрочеков с размеченными рядками риса;
фиг. 4 Изучение солеустойчивости риса в условиях микрочеков (контрольный/опытный образец);
фиг. 5 Отбор лучших проростков риса на соленом фоне в стаканчики с целью дальнейшей пересадки в чеки в виде рассады;
фиг. 6 Изучение солеустойчивости риса в период трубкования;
Суть заявляемого способа состоит в следующем: сначала подбирают родительские формы с геном солеустойчивости и высокой урожайностью, далее их скрещивают и из каждой гибридной комбинации все линии пересевают из года в год, подвергая массовым отборам: фенотипическим, генотипическим, лабораторным под воздействием стресса. Каждая линия из первоначальной комбинации изучается 7-8 лет, пока не выделится лучшая по хозяйственно-ценным и генотипическим признакам, с урожайностью выше стандартного сорта. Такая линия имеет право называться солеустойчивым сортом риса.
1
Скрещивают родительские формы: Российский высокоурожайный скороспелый сорт и Зарубежный сорт с геном солеустойчивости Saltol. Используют минимум три сорта донора солеустойчивости. Гибридизацию проводят твел-методом в тепличных условиях. Гибриды первого поколения F выращивают в поле.
2
Гибриды второго поколения F анализируют на наличие гена Saltol методом ПЦР-анализа. При проведении маркерного анализа используют 2 пары маркеров, сцепленных с локусом солеустойчивости: RM493 и RM7075.
Амплификацию проводят в термоциклере PalmCyclerCorbettResearch. ПЦР продукты разделяют с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с бромистым этидием.
2
6
Для дальнейшей работы оставляют доминантные гомозиготы и гетерозиготы, рецессивные гомозиготы выбраковывают, поскольку они не несут искомого гена. Все гибридные формы, начиная с гибридов второго поколения F и заканчивая гибридами шестого поколения F, подвергают строгому фенотипическому отбору с учетом хозяйственно-ценных признаков.
Параллельно каждый год все гибриды изучают на солеустойчивость лабораторным способом - в рулонах из фильтровальной бумаги и полиэтилена 1, в 1,5% солевом растворе NaCl. На контроле семена проращивают в дистиллированной воде. Все растения выращивают в термостате при температуре 25°С, влажности 70%. Через 10 дней определяют всхожесть, измеряют длину и массу проростков риса, рассчитывают процент солеустойчивости 2.
Солеустойчивость определяют как соотношение длины ростков и корешков риса на солевом растворе к таковым показателям на дистиллированной воде, выраженное в процентах. Для отбора лучших форм риса опираются не только на относительные величины, но и на абсолютные. Отбирают лучшие образцы с солеустойчивостью свыше 70%.
3
4
4
Таким образом, изучают гибриды третьего поколения F и четвертого поколения F. В гибридах четвертого поколения F ключевым моментом является изучение солеустойчивости семян гибридов риса от посева до созревания в условиях микрочеков 3. Гибриды риса высевают в почву микрочеков. Микрочеки представляют собой наполненную почвой емкость размером 300×100 см, изолированную полиэтиленовой пленкой от протекания для сохранения стабильных жестких условий - 1,5% концентрации соли в почве микрочека.
Схема опыта включает в себя: контроль - вода без засоления, опыт - засоление 0,5% раствором NaCl. Полив производится водопроводной водой до фиксированного уровня 10 см. Повторность двухкратная, в микрочеке размещают по 25 рядов с 50 семенами риса в каждом ряду.
После созревания проводят биометрический анализ растений по следующим признакам: высота растения, масса снопа с делянки, кустистость, длина метелки, масса метелки, количество выполненных зерен, количество пустых колосков, общее число колосков, фертильность.
Отбирают все выжившие гибриды и пересевают для репродуцирования следующего поколения в обычных рисовых чеках. Лучшие по общему индексу солеустойчивости гибриды риса отбирают в селекционный питомник в качестве кандидатов в будущие солеустойчивые сорта.
5
5
Все семена гибридных форм пятого поколения F после фенотипического отбора проходят генотипический отбор с помощью ПЦР-анализа. Параллельно все гибриды пятого поколения Fзакладывают в рулоны фильтрованной бумаги для проращивания в 1,5% растворе NaCl, контроль - дистиллированная вода во всех случаях. На 10-й день проращивания отбирают линии риса с максимальной длиной ростков более 7 см и длины корешков более 10 см, а также имеющие искомый ген солеустойчивости. Их помещают в стаканчики 4 с почвой и удобрением нитроаммофоска, а именно 2 гранулы на 300-граммовый стакан с почвой, для восстановления, при этом поливают дистиллированной водой. Через неделю укрепившуюся рассаду высаживают вручную в чеки, разрезая пластиковый стакан по одному краю и вставляя образец с почвой в чек квадратно-гнездовым способом.
6
Гибриды шестого поколения F высевают на размножение в селекционном питомнике. Выборочно, лучшие по признаку солеустойчивости линии риса извлекают из чеков в период трубкования и помещают в ящики 5 размером 100 × 50 × 50 см с полиэтиленовой пленкой на дне для защиты от протекания, в качестве контроля для полива используют обычную водопроводную воду.
Схема опыта аналогична схеме с использованием микрочеков: контроль - без засоления, опыт - засоление 1,0% раствором NaCl. Полив производят водопроводной водой до фиксированного уровня 10 см. Повторность двухкратная, в каждом ящике размещают по 50 кустов - по 3-4 растения в каждом, согласно схеме 5×10.
После созревания проводят биометрический анализ растений по следующим признакам: высота растения, длина метелки, масса метелки, количество выполненных зерен, количество пустых колосков, общее число колосков, фертильность, масса 1000 зерен. Рассчитывают соотношение опыт/контроль (О/К) по каждому признаку и выводят средний процент солеустойчивости.
Растения, формирующие максимальное количество зерен в таких стрессовых условиях как солевой шок перед цветением, являются самыми устойчивыми к солевому стрессу во время цветения и созревания.
6
7
8
В гибридах шестого поколения F уже сформировано достаточно семян для размножения, и лучшие линии передают в контрольный питомник, где изучают их урожайность. После этого гибриды седьмого поколения F определяют в контрольный питомник второго года и далее в конкурсное сортоиспытание для определения лучших линий по урожайности. Гибриды восьмого поколения F передают в конкурсное сортоиспытание и далее на государственное сортоиспытание.