СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО ТКАНЕВОГО АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ
METHOD FOR CLEANING RECOMBINANT TISSUE PLASMINOGEN ACTIVATOR FOR MEDICAL USE

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ хроматографической очистки препарата рекомбинантного человеческого тканевого активатора плазминогена (ТАП) для медицинского применения.
Из уровня техники известны следующие решения для очистки ТАП:
Решение 1 (Rijken DC, Biochim Biophys Acta 1979 [1]), представляющее собой шестистадийную методику выделения ТАП из ткани матки, и включающее экстракцию ТАП из делипидированной ткани, осаждение сульфатом аммония, металлхелатную, гидрофобную, псевдоаффинную хроматографию и гель-фильтрацию. В качестве сорбента для металлхелатной хроматографии использовалась цинк-хелатная агароза; белок элюировали в градиенте имидазола от 0 до 0,05 М. Для гидрофобной хроматографии использовалась колонка с н-бутил-агарозой; псевдоаффинная стадия представляла собой хроматографию на ConA-агарозе. Гель-фильтрацию проводили на Сефадексе G-150 в присутствии 1,6 М роданида калия (KSCN).
Решение 2 (Rijken DC, J Biol Chem 1981 [2]), сходное с решением 1, но предназначенное для очистки ТАП из культуры клеток Bowes и позволяющее получить порядка нескольких десятков граммов ТАП;
Решение 3 (Wallen Р, 1983 [3]), представляющее собой способ очистки ТАП из культуры клеток меланомы Bowes, включающий хроматографию на иммуноаффинном сорбенте и псевдоаффинную хроматографию на аргинин-сефарозе с последующей гель-фильтрацией.
Решение 4 (Dowdle EBD [4]), представляющее собой аффинный сорбент с иммобилизованным ингибитором протеаз из бобов Erythrina latissima.
Решение 5 (Kruithof EK, Biochem J 1985 [5]), представляющее собой крупномасштабное получение ТАП из культуры клеток меланомы о его очищении при помощи SP-сефарозы и гель-фильтрации на Сефадексе G-100.
Решение 6 (Rice С [6]), представляющее собой метод очистки ТАП с использованием цинк-хелатной хроматографии и лизин-сефарозы; при хроматографии на цинк-хелатной сефарозе использовались промежуточные промывки с 1 М NaCl и элюция 0,05 М имидазолом; при хроматографии на лизин-сефарозе также применялась высокосолевая промывка (0,5 М NaCl), целевой белок элюировали 0,5 М аргинином.
Решение 7 (Edmunds Т [7]), представляющее собой метод очистки ТАП с использованием колонки с иммобилизованными полианионами.
Решение 8 (Morii М [8]), представляющее собой очистку ТАП при помощи высокоселективной хроматографии на катионообменном сорбенте карбоксиметил-сефарозе с промежуточной промывкой буфером с рН ниже, чем рК сорбента.
Решение 9 (Patel А [9]), в котором ТАП очищают с применением иммобилизованных на сорбенте аффинных трипептидов состава X-Y-Arg, где X и Y - аминокислоты Pro, Phe, Trp и Tyr и пептидов состава Phe-Y-Arg, где Y аминокислота Phe, Pro, Trp, Tyr, Val, Ile или Glu.
Решение 10 (Maclennan JM [10]), пептидный аффинный сорбент для ТАП, в котором длина аффинных пептидов составляет 7-8 аминокислотных остатков.
Решение 11 ([11]), принадлежащее МБЦ «Генериум», в котором технология очистки ТАП включает стадии хроматографической очистки на IMAC-сефарозе, SP-сефарозе с предколонкой (Q-сефароза) и псевдоаффинную хроматографию на Лизин-сефарозе; приготовление субстанции в буфере ГЛФ осуществляется методом диафильтрации.
Указанные в литературе схемы получения ТАП обладают рядом недостатков. Так в патенте [1] в качестве источника ТАП используется делипидированная ткань матки, что влечет за собой риски, связанные с вирусной контаминацией получаемого продукта, обеспечение сырьем и т.д. Включение в схему очистки гель-фильтрационной стадии снижает технологичность процесса (с учетом высокой потребности в ТАП).
Процесс, описанный в работе Rijken DC [2], не позволяет рассматривать его в качестве промышленной схемы, так как он обладает низкой эффективностью.
В работах [3, 11] приведена схема очистки с использованием псевдоаффинных сорбентов Arg Sepharose, Lys Sepharose, обладающих высокой стоимостью и низкой емкостью (около 0,8 мг белка на 1 мл сорбента), что приводит к удорожанию процесса.
Процесс, описанный в работе [4] предполагает использование аффинного сорбента на основе ингибитора ТАП из бобовых вида Erythrina latissima. Такой подход к очистке ТАП не технологичен по причине вариабельности сырья для синтеза аффинного сорбента от серии к серии.
В работе [5] авторами предложена двухстадийная схема очистки ТАП с использованием катионообменной и гель-фильтрационной хроматографий. Данный подход не технологичен.
Использование Lys Sepharose в качестве стадии очистки описано так же в работе [6]. Как отмечалось выше, указанный сорбент приводит к значительному удорожанию технологии.
В документе [7] описывается метод очистки с использованием хроматографического сорбента с иммобилизованными полианионами. Недостатки данного метода очистки заключаются в низких выходах и отсутствии коммерчески доступных сорбентов.
Решение [8] раскрывает процесс очистки с использованием сывороточных антител. Такой подход повышает риски вирусной контаминации конечного продукта.
Документы [9, 10] описывают использование пептидных аффинных сорбентов для очистки ТАП. Каждый из описанных подходов имеет свои недостатки, которые будут описаны ниже.
Приведенный анализ данных уровня техники указывает на отсутствие приемлемой промышленной схемы получения ТАП. Основными недостатками известных методов очистки ТАП являются:
- устаревшие подходы к очистке, не обеспечивающие безопасность получаемого препарата для пациентов (в том числе вирусную);
- нетехнологичность приведенных методов очистки, их немасштабируемость и сложность;
- высокая стоимость используемых реактивов и сорбентов, что отражается на себестоимости финального продукта.
Технический результат изобретения заключается в получении препарата рекомбинантного ТАП с низким содержанием белков штамма-продуцента, а также в расширении арсенала методов очистки ТАП с получением препарата, пригодного для медицинского использования.
В качестве сырья может быть использована культуральная жидкость, полученная из культуры клеток СНО, трансфицированных человеческим геном ТАП, как раскрыто в документе, и культивируемых в суспензии перфузионным или иным способом.
Предлагаемая схема очистки включает следующие стадии (последовательно):
- цинк-хелатная хроматография на металлхелатном сорбенте с метакрилатной матрицей (например, EMD Chelat (Millipore)) с промывками буферным растворами, содержащими 1) хлорид натрия в концентрации 1,5-4 М; 2) изопропанол в концентрации 10-25%; 3) каприлат натрия в концентрации 0,03-0,15 М; 4) мочевину в концентрации 0,5-2 М с градиентной элюцией целевого белка буферным раствором, содержащим мочевину в концентрации 0,5-2 М и имеющим значение рН 3,5-5,0 ед.
- аффинная хроматография на пептидном аффинном сорбенте (например, Capture Select tPA (Thermo)) с промывками буферными растворами, содержащими 1) хлорид натрия в концентрации 1,5-3,0 М; 2) каприлат натрия в концентрации 0,1-0,3 М + мочевину в концентрации 0,5-1,5 М; 3) аргинин в концентрации 0,1-0,15 М с элюцией буферным раствором, содержащим мочевину в концентрации 0,5-2 М и имеющим значение рН 4,0-4,5 ед.
- перевод ТАП в финальный буферный раствор путем хроматографии на сильном катионообменном сорбенте (например, Eshmuno S (Millipore)) с последующим доведением содержания аргинин-фосфата путем разбавления водой и значения рН до 7,3±0,05 ед путем титрования раствором гидроксида натрия или фосфорной кислоты.
Очистка методом металлхелатной хроматографии
Нами было показано, что использование металлхелатного сорбента с полимерной матрицей, например EMD Chelat Fractogel (Millipore), значительно снижает содержание белков-контаминантов в элюате целевого белка. Псевдоаффинный механизм связывания ТАП на ионе цинка позволяет отделить молекулу от других белков, присутствующих в культуральной жидкости, но не имеющих сродства к цинку. Так же нами были исследованы оптимальные условия проведения процесса с целью получения максимального выхода целевого белка с минимально возможным содержанием примесных белков.
В рамках исследований, направленных на установление влияния материала матрицы сорбента на содержание примесных белков штамма-продуцента в элюате целевого белка, было проведено сравнительное выделение целевого белка на сорбентах IMAC Sepharose (GE) и EMD Chelat Fractogel (Millipore). На одинаковые колонны с указанными сорбентами, заряженные ионами цинка, наносили культуральную жидкость, содержащую целевой продукт. Процесс очистки ТАП проводили в одинаковых условиях. Сравнение двух процессов представлено в таблице 1.
Предлагаемый для проведения первой стадии очистки способ с использованием металлхелатного сорбента на основе метакрилатной матрицы является предпочтительным по сравнению с описанными в литературе. Использование указанного сорбента позволяет провести большее количество циклов по сравнению с сорбентом IMAC (GE) за счет меньшей сорбционной способности по отношению к примесям (в том числе по отношению к пигментам). Качество получаемого целевого белка при этом значительно выше, как в случае с содержанием мономерной формы, так и в случае с содержанием белков штамма-продуцента. Еще одним преимуществом предлагаемого способа является возможность оценки содержания целевого белка в получаемом полупродукте простым спектрофотометрическим методом (в противопоставляемом методе такая возможность отсутствует по причине окрашивания элюата).
Предлагаемый способ очистки предлагает новый процесс промывки целевого белка, адсорбированного на металлхелатной колонне. Описанный ниже метод позволяет дополнительно снизить уровень (по сравнению с имеющимся уровнем техники) содержания белков штамма-продуцента в элюате целевого белка.
Для проведения экспериментальных работ был использован сорбент EMD Chelat Fractogel (Millipore).
На уравновешенную стартовым буфером колонку наносили культуральную жидкость, содержащую целевой белок, затем через колонку пропускали стартовый буфер (0,02 М Трис-НСl, 0,1 М хлорид натрия, 0,05% полисорбат 80, рН 8.0), после чего проводили промывку сорбента буферами следующего состава (объем промывок был одинаковый и составлял 10 колоночных объемов):
буфер промывки 1, содержащий 1 М хлорид натрия (согласно [6, 11];
буфер промывки 2, содержащий 0,1 М имидазол (согласно [11]);
буфер промывки 3, содержащий 5% изопропанола (согласно [11]);
разработанный буфер промывки 4, содержащий хлорид натрия в концентрации 1,5-4 М;
разработанный буфер промывки 5, содержащий изопропанол в концентрации 10-25%;
разработанный буфер промывки 6, содержащий каприлат натрия в концентрации 0,03-0,15 М;
разработанный буфер промывки 7, содержащий мочевину в концентрации 0,5-2 М.
Полученные промывки коллекционировали и определяли в них содержание белков штамма-продуцента (СНО) методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов производства компании Cignus). Полученные результаты представлены в таблице 2.
Приведенные в таблице 2 данные указывают на превосходство разработанных промывок по сравнению с существующим уровнем техники. Увеличение содержания хлорида натрия позволяет увеличить эффективность удаления СНО белков в среднем в 2,2 раза. Увеличение содержания изопропилового спирта позволяет увеличить эффективность удаления белков штамма-продуцента в среднем в 1,6 раза. Разработанные промывки, не имеющие аналогов, так же позволяют эффективно удалять белки штамма-продуцента. Указанные промывки обладают разным принципом действия и позволяют удалять большинство примесных белков без значительных потерь целевого белка.
В предлагаемом способе очистки большое значение имеет и метод элюции целевого белка. Разработана схема элюции, позволяющая проводить процесс съема белка с колонны более эффективно, чем в случае использования буферных растворов, описанных в литературе.
В качестве сравнительного эксперимента был проведен процесс очистки ТАП с использованием следующих растворов для элюции:
элюирующий буфер 8, содержащий 0,05 М ЭДТА с низким значением рН (согласно [11]);
элюирующий буфер 9, содержащий 0,05 М имидазола (согласно [6]);
разработанный элюирующий буфер 10, содержащий мочевину в концентрации 0,5-2 М и значение рН 3,5-5,0 ед.
В качестве стартового материала использовали культуральную жидкость, содержащую ТАП. После нанесения культуральной жидкости сорбент с адсорбированным белков промывали стартовым буферным раствором и элюировали целевой белок указанными буферными растворами.
Полученные с использованием растворов различного состава элюаты анализировали на содержание белков штамма-продуцента (СНО) методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов производства компании Cignus) и на содержание целевой мономерный формы методом гель-фильтрационной ВЭЖХ. Полученные результаты представлены в таблице 3.
Приведенные в таблице 3 данные указывают на преимущество разработанного процесса элюции над существующими с т.з. содержания белков штамма-продуцента в элюате целевого белка. При этом содержание целевой мономерной формы остается неизменным и составляет более 99%.
Предложенная комбинация разработанных процессов промывки и элюции целевого белка на металлхелатном сорбенте с метакрилатной матрицей позволяет получать целевой белок с содержанием СНО белков на уровне 100-150 нг/мг, содержанием мономерной формы на уровне 99,5±0,3% и выходом на уровне 90,0±5,0%, что превосходит показатели, получаемые при реализации ближайшего аналогичного изобретения [11].
Очистка методом аффинной хроматографии
Применение пептидного аффинного сорбента описано в литературе ([9], [10]). Использование пептидных аффинных сорбентов предпочтительнее использования аффинных сорбентов с иммобилизованными полноразмерными антителами или их фрагментами, так как позволяет избежать использования компонентов животного происхождения и связанных с этим рисков контаминации вирусами и прионами финального продукта. Кроме того, пептидные аффинные сорбенты химически более устойчивы. Однако использование схем очистки, приведенных в литературе, не позволяет получать кондиционный белок.
Так, схема промывок на пептидном аффинном сорбенте, указанные в патентах [9, 10] не позволяет получить высокоочищенный белок с низким содержанием белков штамма-продуцента.
Альтернативой пептидным аффинным сорбентам являются псевдоаффинные сорбенты Lys Sepharose и Arg Sepharose, применение которых показано в нескольких патентах. Однако емкость указанных сорбентов значительно уступает пептидным сорбентам (0,8 мг белка на 1 мл сорбента против 5-7 мг/мл), что делает их применение невыгодным с финансовой точки зрения.
Для разработки альтернативной схемы очистки с использованием пептидного аффинного сорбента был проведен сравнительный эксперимент с применением следующих буферных растворов для промывки (коммерческий аффинный пептидный сорбент Capture Select (Thermo)):
буфер промывки 11: 0,1 М фосфат натрия, рН 7,0 (согласно [9]);
буфер промывки 12: 0,1 М фосфат натрия, 1 М хлорид натрия, рН 7,0 (согласно [9];
буфер промывки 13: 0,025 М фосфат калия, 0,05 М аргинин, 0,125 М хлорид натрия, рН 7,0 (согласно [10]);
разработанный буфер промывки 14, содержащий хлорид натрия в концентрации 1,5-3 М;
разработанный буфер промывки 15, содержащий каприлат натрия в концентрации 0,1-0,3 М и мочевину в концентрации 0,5-1,5 М;
разработанный буфер промывки 16, содержащий аргинин в концентрации 0,1-0,15 М.
На колонку Capture Select (Thermo) наносили элюат со стадии очистки методом металлхелатной хроматографии, содержащий целевой белок, затем проводили промывку сорбента буферами указанного состава (объем промывок был одинаковый и составлял 10 колоночных объемов).
Полученные промывки коллекционировали и определяли в них содержание белков штамма-продуцента (СНО) методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов производства компании Cignus). Полученные результаты представлены в таблице 4.
Приведенные в таблице 4 данные указывают на превосходство разработанных промывок по сравнению с существующим уровнем техниики. Увеличение содержания хлорида натрия и аргинина в промывочных буферных растворах, а так же введение промывки, содержащей каприлат натрия, позволяет повысить эффективность удаления белков СНО по сравнению с описанными в литературе методами.
В предложенном нами изобретении раскрыта схема элюции целевого белка, позволяющая проводить процесс съема белка с колонны более эффективно, чем в случае использования буферных растворов, описанных в литературе.
В качестве сравнительного эксперимента был проведен процесс очистки ТАП с использованием следующих растворов для элюции:
элюирующий буфер 17: 0,1 М уксусная кислота (согласно [9]);
элюирующий буфер 18: 0,05 М фосфат калия, 0,15 М хлорид натрия, рН 3,0 (согласно [10]);
разработанный элюирующий буфер 19, содержащий мочевину в концентрации 0,5-2 М и значение рН 4,0-4,5 ед.
В качестве стартового материала использовали элюат со стадии очистки методом металлхелатной хроматографии. После нанесения раствора белка сорбент с адсорбированным белком промывали стартовым буферным раствором и элюировали целевой белок указанными буферными растворами.
Полученные с использованием растворов различного состава элюаты анализировали на содержание белков штамма-продуцента (СНО) методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов производства компании Cignus), а также на содержание целевой мономерный и одноцепочечной форм методом гель-фильтрационной ВЭЖХ. Полученные результаты представлены в таблице 5.
Приведенные в таблице 5 данные указывают на преимущество разработанного процесса элюции над существующими с т.з. содержания белков штамма-продуцента в элюате целевого белка. При этом возможность использования элюирующего буферного раствора с более высоким значением рН за счет добавления мочевины не приводит к снижению содержания целевой одноцепочечной формы. Содержание мономерной формы остается неизменным и составляет более 99%.
Предложенная комбинация разработанных процессов промывки и элюции целевого белка на пептидном аффинном сорбенте позволяет получать целевой белок с содержанием СНО белков на уровне 5-15 нг/мг, содержанием мономерной формы на уровне 99,7±0,2%, одноцепочечной формы на уровне 79,5±1,0%, что превосходит показатели, получаемые при реализации ближайших аналогичных изобретений [9, 10].
Получение фармацевтической субстанции
Методика перевода ТАП в финальный буферный раствор (400 мМ аргинин-фосфата, 0,02% полисорбат 80, рН 7,3) методом диафильтрации описана в патенте [11]. Однако данный способ приводит к необходимости использования аргинин-фосфата, что сказывается на финальной себестоимости продукта.
Предлагаемая инновационная схема перевода ТАП в финальный буфер путем использования сильного катионобменного сорбента позволяет сократить количество используемого аргинин-фосфата в 10 раз и не имеет аналогов в литературе.
Предлагаемая схема перевода ТАП в финальный буфер представлена на Фиг.
В полученном растворе белка далее доводят значение содержания аргинин-фосфата до 0,4 М путем добавления деионинизованной воды и доведением рН до значения 7,3±0,05 ед.
Предлагаемая схема позволяет получать кондиционный белок с высоким выходом относительно содержания в исходном материале (более 95%).
Пример 1. Очистка ТАП на металлхелатном сорбенте
Была использована колонна:HiSсаlе 50/20 со 110 мл сорбента EMD Fractogel chelat. В качестве образца для нанесения использовали КЖ, полученную при перфузионном культивировании продуцента ТАП, объемом 4449 мл. Скорость подачи буферных растворов составляла 50 мл/мин, объем всех промывок составлял 10 колоночных объемов. Сорбент с адсорбированным белком последовательно промывали буферным раствором 4 (содержащим 2 М NaCl); буферным раствором 5 (содержащим 10% изопропанола); буферным раствором 6 (содержащим 0,1 М каприлат натрия); буферным раствором 7 (содержащим 1 М мочевину) и элюировали градиентом от 0% до 100% буфера элюции 10 (содержащем 1 М мочевину, рН 4,0) в промывочном буфере 7 за 10 колоночных объемов. Целевой белок элюировался симметричным пиком при 28-80% буфера элюции 10, объем элюата составил 4 колоночных объема, количество белка 547 мг. Содержание белков штамма-продуцента составило 110 нг/мг, мономерной формы 99,5%.
Пример 2. Очистка ТАП на пептидном аффинном сорбенте
Была использована колонна HiScale 16/20, содержащая 23 мл сорбента Capture Select. В качестве образца для нанесения на колонку использовалась аликвота элюата с колонки EMD Chelat Fractogel, разбавленная в 20 раз стартовым буфером (100 мМ ацетат натрия, 0,05% полисорбат 80, рН 5,0). Содержание ТАП в образце составляло 138,9 мг.
Скорость подачи буферных растворов составляла 5 мл/мин, объем всех промывок составлял 10 колоночных объемов. Сорбент с адсорбированным белком последовательно промывали буферным раствором 14 (содержащим 2 М NaCl); буферным раствором 15 (содержащим 0,2 М каприлат натрия +1 М мочевину); буферным раствором 16 (содержащим 0,1 М аргинин) и элюировали буфером элюции 19 (содержащем 1,5 М мочевину, рН 4,0). Объем элюата составил 1,5 колоночных объема, количество белка 118 мг. Содержание белков штамма-продуцента составило 12 нг/мг, мономерной формы 99,7%, одноцепочечной формы 80%.
Пример 3. Получение ТАП в финальном буферном растворе
Использовалась колонка HiScale 16/20, содержащая 5 мл сорбента Eshmuno S (Millipore). В качестве образца для нанесения на колонку использовался элюат с колонки Capture Select, разбавленный в 3 раза деионизированной водой. Содержание ТАП в образце составляло 118 мг.
Скорость подачи буферных растворов составляла 5 мл/мин, объем всех промывок составлял 10 колоночных объемов. Сорбент с адсорбированным белком промывали буферным раствором, содержащим 0,05 М аргинин и элюировали буфером элюции, содержащим 450 мМ аргинин-фосфат рН 7,3.
Объем элюата составил 3 колоночных объема, количество белка 112 мг. Содержание белков штамма-продуцента составило 10 нг/мг, мономерной формы 99,6%, одноцепочечной формы 79%.
Список использованной литературы:
1. Rijken DC, Wijngaards G, Zaal-de Jong M, Welbergen J. Purification and partial characterization of plasminogen activator from human uterine tissue. Biochim Biophys Acta 1979, 580:140-153.
2. Rijken DC, Collen D. Purification and characterization of the plasminogen activator secreted by human melanoma cells in culture. J Biol Chem 1981, 256:7035-7041.
3.  P, Pohl G, Bergsdorf N,  M, Ny T,  H. Purification and Characterization of a Melanoma Cell Plasminogen Activator. 1983.
4. Dowdle EBD. Plasminogen activator. In: Google Patents; 1990.
5. Kruithof EK, Schleuning WD, Bachmann F. Human tissue-type plasminogen activator. Production in continuous serum-free cell culture and rapid purification. Biochem J 1985, 226:631-636.
6. Rice C, Morser MJ, Glaser C, Donner PA. Methods for recovery of tissue plasminogen activator. In: Google Patents; 1990.
7. Edmunds T, Foley SF. Recovery of tissue plasminogen activator. In: Google Patents; 1990.
8. Morii M, Kawashima N, Mori K, Ohoka M. Method for purifying a crude tissue plasminogen activator preparation. In: Google Patents; 1992.
9. Patel A, Nishikawa AH. Method of purifying tpa or plasminogen activator using a tripeptide of the formula: -X-Y-argininal wherein X and Y are selected from the group consisting of pro, phe, trp and tyr. In: Google Patents; 1992.
10. Maclennan JM, Ladner RC, Ransohoff TC. Purification of tissue plasminogen activator (tpa). In: Google Patents; 2010.
11. Григорьева О.В. Рекомбинантная плазмидная днк рвк415, кодирующая полипептид рекомбинантного тканевого активатора плазминогена человека, линия клеток cricetulus griseus cho 1f8 - продуцент рекомбинантного тканевого активатора плазминогена человека и способ получения и выделения полипетида, обладающего активностью активатора плазминогена. Патент № RU 2500817.
12. Kumar MS, Arvind G, Saxena B. Process for purification of human tissue type plasminogen activator. In: Google Patents; 2010