СПОСОБ СНИЖЕНИЯ ТЯЖЕСТИ ОТДАЛЕННЫХ ПОСЛЕДСТВИЙ ОТРАВЛЕНИЙ ОКСИДОМ УГЛЕРОДА
METHOD FOR REDUCING THE SEVERITY OF THE LONG-TERM EFFECTS OF CARBON MONOXIDE POISONING

Изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии, и может быть использовано для снижения тяжести отдаленных последствий отравлений оксидом углерода.
Основным механизмом токсического действия оксида углерода является гипоксия. Ее развитие приводит к церебральной недостаточности, прогрессирование которой формирует необратимые изменения [Шилов, В.В. Фармакологическая коррекция гипоксии у больных с острой церебральной недостаточностью вследствие острых отравлений угарным газом и продуктами горения / В.В. Шилов [и др.] // Медицина труда и промышленная экология. - 2012. - №6. - С. 22-27.]. Связано но с тем, что потребность нейронов в энергетическом обеспечении выше, чем других клеток организма. У больных, перенесших острое отравление оксидом углерода в отдаленном периоде, могут развивайся различные стойкие изменения функции нервной системы, астеническое состояние и нарушения сна. В результате чего качество жизни после острого отравления оксидом углерода резко снижается.
Нейротоксичность оксида углерода связывают, помимо гемической гипоксии, с активацией растворимой гуанилатциклазы. В результате происходит расширение церебральных сосудов и, как следствие, отек головного мозга [Wang, R. Resurgence of carbon monoxide: an endogenous gaseous vasorelaxing factor / R. Wang // Can. J. Phyol. Pharmacol. - 1998. - Vol. 76, №1. - P. 1-15]. После первичной гиперперфузии отмечается гипоперфузия, которая играет важную роль в развитии отдаленных неврологических нарушений [Mariluz, H.V. In vivo exposure to carbon monoxide causes delayed imprairment of activation of soluble guanylatecyclase by nitric oxide in rat brain cortex and cerebellum / H.P. Mariluz A.F. Castoldi, T. Cocconi // J. Neurochem. - 2004. - Vol. 9, №5. - P. 1157-1165]. Особенно сильно эти изменения выражены в подкорковых ядрах, что проявляется в основном их некрозом.
В качестве антидота, кроме того обладающего профилактическим действием, при отравлении оксидом углерода, используют препарат «Ацизол» (бис-(1-винилимидазол)цинкдиацетат). С профилактической целью препарат вводится в дозе 1 мл внутримышечно за 20-30 минут до вхождения в зону задымления (загазованности), при высоком риске ингаляции оксидом углерода, в период проведения работ по ликвидации тушений самих пожаров и спасении пострадавших. Защитное действие сохраняется в течение 1,5-2 часов. Повторное применение препарата допускается через 1 час после первого введения. С лечебной целью «Ацизол» рекомендуется применять в как можно ранние сроки после отравления вне зависимости от тяжести поражения. Препарат вводится в дозе 1 мл внутримышечно сразу после извлечения пострадавшего из зоны пожара (загазованного помещения). Повторное введение допускается через 1 час после первого введения:
Механизм действия этого препарата связан с повышением сродства гемоглобина к кислороду, что позволяет гемоглобину полностью насыщайся кислородом. При этом, наблюдается некоторое затруднение отдачи кислорода, что может сказаться на кровоснабжении органов-мишеней. Кроме того, являясь химические соединением, препарат может вызывать аллергию. Практически не изучено как влияет применение этого препарата на снижение тяжести отдаленных последствий отравлений оксидом углерода. Применение этого препарата не заменяет кислородотерапию, так как настоящим высокоэффктивным профилактическим и лечебным средством является кислород. Продолжается поиск возможности применения растворов кислорода. В этой связи перспективным является применение растворов другой формы кислорода - озона.
Озонотерапия является лечебным методом, находящим в последние годы все более широкое применение в клинической практике. Озон обладает большим разнообразием лечебных эффектов. Например, известно, что он оказывает антибактериальное, антивирусное, противовоспалительное и иммуномодулирующее действие, усиливает микрогемодинамику, содействует коррекции нарушений перекисного окисления липидов и повышает активность системы антиоксидантной защиты. Все это дало возможность использовать этот метод при лечении целого ряда заболеваний [Чекман, И.С. Озон и озонирование / И.С. Чекман [и др.] - X.: «Цифрова друкарня №1», 2013. - 144 с.]
В том числе известен способ детоксикации организма путем внутривенного капельного введения озонированного физиологического раствора (ОФР) с концентрацией озона 1,8-3 мг на 500 мл вводимой жидкости (заявка на изобретение РФ №94017960, A61K 33/00, опубл. 10.05.1996).
Однако, данный метод авторы рекомендуют использовать при эндотоксикозе, и не указаны точные дозы на кг веса.
Широкого распространения для профилактики и лечения острых отравлений озонтерапия не имеет. В доступной литературе есть упоминание об эффективности внутривенного введения ОФР (200 мл с концентрацией растворенного озона 400 мкг/мл) при тяжелых отравлениях барбитуратами. При этом отмечалось достоверное ускорение снижение концентрации токсикантов в организме пациентов, улучшение состояния [Грибова, Н.Г. Дезинтоксикационная эффективность инфузионной озонотерапии при острых отравлениях барбитуратами / Н.Г. Грибова, А.А. Лаврентьева, Г.Н. Суходолова // Медицина критических состояний. - 2010. - №3. - С. 24-28].
Описан способ применения озоно-кислородной смеси для купирования алкогольного абстинентного синдрома (заявка 2006143697/14 от 08.12.2006 г.). При этом способе автору предлагают сочетать введение озоно-кислородной смеси с предварительным проведением гидроколонотерапии. Однако, ректальное применение озоновых смесей не удобно в качестве профилактического, так как требует специального оборудования и стационарных условий. Также, предварительное применение гидроколонотерапии вызывает нарушение микрофлоры толстого кишечника, имеет ряд противопоказаний (патология сердечно-сосудистой системы, заболевания толстого кишечника и др.). Кроме того, метод оправдан при алкогольных отравлениях, так как продукты распада алкоголя длительное время выделяются через слизистую желудочно-кишечного тракта, но не подходит для профилактики и лечения острых отравлений оксидом углерода, в том числе для снижения тяжести отдаленных последствий, так как в основе острого отравления оксидом углерода лежит гемическая гипоксия.
Описан способ лечения эндотоксикоза путем проведения дискретного плазмафереза с отделением эритроцитов от плазмы и возвращением их с возмещением донорской плазмой (заявка 2001114865/14 от 30.05.2001 г.). Перед возвращением в организм пациента эритроциты обрабатываются ОФР в объеме 200 мл и концентрацией озона 2 мг/л. Метод имеет недостатки. Так в ходе проведения плазмафереза удаляются из крови не только токсины, но и часть белков плазмы. Метод эффективен при отравлении некоторыми веществами: неорганической ртутью, карбамазепином, теофиллином и др. Однако, при отравлениях оксидом углерода плазмаферез не может применяться, так как в патогенезе интоксикации - образование карбоксигемоглобина, а не циркуляция токсинов в плазме крови. Кроме того, применимость метода плазмафереза ограничена из-за возможных осложнений. К возможным осложнениям относятся нарушения свертывания крови, инфекционные осложнения, аллергические реакции.
Таким образом, возможность применения ОФР при острых отравлениях оксидом углерода практически не изучена в доступной литературе. Кроме того, не исследована возможность неинвазианого (перорального) введения ОФР. Выделенные близкие аналоги не позволяют выделить конкретные дозы, способы введения, которые эффективны для снижения тяжести отдаленных последствий отравлений оксидом углерода.
В основу изобретения положена задача создания способа снижения тяжести отдаленных последствий отравлений оксидом углерода путем применения ОФР с профилактической и лечебной целями.
Технический результат заключается в снижении степени тяжести отдаленных последствий острых отравлений оксидом углерода за счет повышения устойчивости организма к воздействию оксида углерода при профилактическом применении за счет повышения парциального давления кислорода в крови, насыщения гемоглобина кислородом, доставки и утилизации кислорода тканями; и снижения тяжести гипоксического поражения головного мозга после острого отравления оксидом углерода при лечебном применении.
Изобретение поясняется чертежами: фиг. 1 - кривая «доза-летальность» в незащищенной группе, фиг. 2 - кривая «доза-летальность» в защищенной группе.
Заявляемый способ заключается в том, что за 10, 15 или 20 минут до начала ингаляционного отравления оксидом углерода профилактически перорально вводятся ОФР в дозе 150, 400, 600 мкг/100 г, концентрация растворенного озона 200 мкг/мл. С лечебной целью ОФР вводятся внутрибрюшинно в дозе 12,5 мкг/100 г при концентрации раствора 30 мгк/мл 1 раз в день (7 инъекций на курс), начиная с 1 суток после отравления (7 инъекций на курс).
Пример практической реализации.
Работа выполнена на белых беспородных крысах - самках массой 130-140 г. Крысы содержались в стандартных условиях вивария на сбалансированном питании. Легитимность исследования подтверждена решением локального независимого Этическою комитета при Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (протокол №143 от 24.12.2013 г.).
2
Статическую ингаляционную затравку СО проводили в герметичной затравочной камере. Для интоксикации использовали оксид углерода, полученный способом разложения муравьиной кислоты под действием горячей концентрированной серной кислоты. Схема реакции: НСООН→НО+СО.
50
Концентрацию СО в затравочной камере контролировали при помощи газоанализатора ДАХ-М-03-СО-1500 «Россия». Экспозицию проводили в течении 30 минут. В качестве токсикометрического параметра определяли среднесмертельную концентрацию LC, поскольку она представляет собой наиболее точную количественную характеристику токсичности вещества с минимальным значением 95% доверительного интервала и несомненным эффектом (гибель животного) [Куценко, С.А. Основы токсикологии / С.А. Куценко. - СПб: ООО «Издательство Фолиант», 2004. - 720 с.].
50
LC определяли методом пробит-анализа и методом Финни. Наглядность проводимых расчетов подтверждалась построением кривых доза-летальность.
ОФР получали при помощи озонатора «Гроза» производства ООО «Дон» (г. Томск) с использованием усовершенствованной методики (свидетельство о рационализаторском предложении №14105/3, выданное Военно-медицинской академией им. С.М. Кирова г. Санкт-Петербург).
Концентрацию растворенного озона в растворе контролировали методом йодометрического титрования (ГОСТ №2332 от 26.12.72 г.).
Эффективность профилактического применения оценивали по выживаемости в течение суток, развитию симптомов отравления, времени восстановления неврологического статуса после окончания затравки. Количественно эффективность профилактического введения ОФР оценивали при помощи коэффициента защиты [Куценко, С.А. Основы токсикологии / СА. Куценко. - СПб: ООО «Издательство Фолиант», 2004. - 720 с.], определяемого как:
50
50
LC*/LC,
50
50
где LC* - среднесмертельная концентрация у защищенных животных, LC - среднесмертельная концентрация у незащищенных животных.
Также эффективность профилактического введения ОФР оценивалась по антидотной мощности (Куценко, С.А. Основы токсикологии / СА. Куценко. - СПб: ООО «Издательство Фолиант», 2004. - 720 с.]:
16
84
LC*/LC,
84
где LC 16* - величина, определяемая у защищенных животных, LC - величина, определяемая у незащищенных животных. Если это соотношение приближается к 1, эффективность антидота признается удовлетворительной.
В работе оценивали память и обучаемость у крыс в отдаленном периоде после острого отравления СО. Память оценивали в тесте «черно-белая камера» [Буреш, Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / Я. Буреш, О. Бурешова, Д.П. Хьюстон; пер. с англ. Е.Н. Живописцевой; под. ред. А.С. Батуева. - М.: Высшая школа, 1991. - 400 с.).
Обучаемость животных оценивали методом условного рефлекса активного избегания плавания (УРАИ) [Буреш, Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / Я. Буреш, О. Бурешова, Д.П. Хьюстон; пер. с англ. Е.Н. Живописцевой; под. ред. А.С. Батуева. - М.: Высшая школа, 1991. - 400 с.].
Для статистической обработки данных использовалась программа «Exel for Windows», «Statistica 6,0» с расчетом среднего значения, ошибки средней и среднего квадратического отклонения. Оценку различий средних значений данных проводили непараметрическим методом с использованием U-критерия Манна-Уитни. Вероятность р≤0,05 и выше считали достаточной для вывода о статистической значимости различий полученных данных. В исследовании применялся непараметрический корреляционный анализ (корреляция Спирмена).
На первом этапе исследования определяли влияние ОФР на газовый состав крови крыс.
Крысы были разделены на 5 групп. Первые 4 группы составили крысы, которым вводился перорально ОФР в дозах 100 мкг/100 г, 150 мкг/100 г, 400 мкг/100 г, 600 мкг/100 г соответственно. Концентрацией растворенного озона в растворах составляла 200 мкг/мл. Данная концентрация выбиралась с чем расчетом, чтобы можно было ввести крысе одномоментно большую дозу озона и не вводить большого объема жидкости. Пятую группу составили крысы, которым вводился перорально физиологический раствор в объеме, как при максимальной из изучаемых доз (3 мл/100 г). Данная группа была условно названа контрольной. Каждая группа дополнительно была разделена на 3 подгруппы: в первой подгруппе кровь забирали через 10 мин. от момента введения раствора, во второй подгруппе - через 15 мин., в третьей - через 20 минут.
При введении ОФР в дозах 150 мкг/100 г, 400 мкг/100 г, 600 мкг/100 крови через 10, 15 и 20 минут парциальное давление кислорода в крови, насыщение гемоглобина кислородом, доставка и утилизация кислорода тканями достоверно повышались по сравнению с контрольной группой. Все эти эффекты могут «противостоять» воздействию на организм оксида углерода. Максимальный эффект при пероральном введении наблюдается через 15 мин и носит дозозависимый характер.
Для дальнейшего исследования применяли введение ОФР при дозе озона 600 мкг/100 г внутрижелудочно за 15 мин до начала интоксикации.
50
50
Проведено определение LC в двух группах животных незащищенной и защищенной. Расчеты LC проводили методом пробит-анализа и методом Финни. Индекс защиты определяли по формуле:
50
50
LC*/LC,
50
50
где LC* - среднесмертельная концентрация у защищенных животных, LC - среднесмертельная концентрация у незащищенных животных
Результаты исследования приведены в таблице 1.
16
84
Кроме того, методом пробит-анализа определяли показатели LC и LC (таблица 2).
Определяли эффективность антидота по формуле:
16
84
LC*/LC,
84
где LC 16* - величина, определяемая у защищенных животных, LC - величина, определяемая у незащищенных животных.
Антидотная мощность профилактического введения ОФР составляет 0,8, что по данным литературы является достаточно высоким.
На фиг. 1 представлена кривая «доза-летальность» в незащищенной группе.
На фиг. 2 представлена кривая «доза-летальность» в защищенной группе.
Таким образом, профилактическое применение ОФР в дозе 600 мкг/100 г за 15 мин до интоксикации оксидом углерода повышало выживаемость животных (индекс защиты составлял 1,3; антидот пая мощность составляла 0,8).
Учитывая, что основную роль в развитии отдаленных последствий острых отравлений оксидом углерода играет гипоксия и гипоперфузия, с лечебной целью нами была выбрана схема, рекомендованная в клинике при ишемических поражениях головного мозга [Методики применения озона в медицине. Методические рекомендации (утв. Минздравом Украины, 2004 г.). - URL: http://www.pdffaclory.com.]. С учетом поправки на скорость метаболизма у крыс доза ОФР составила 12,5 мкг/100 г внутрибрюшинно 1 раз в день, курс лечения 7 процедур. Данную схему применяли с 1 сут. после острого отравления оксидом углерода.
Для эксперимента по изучению тяжести отдаленных последствий отравлений оксидом углерода все крысы были разделены на 4 группы. I группа - интактные крысы, II группа - контроль, III группа - лечебное применение ОФР, IV - профилактическое применение ОФР. В качестве профилактического средства мы применили ОФР с концентраций озона 600 мкг/ 100 г перорально, затравку проводили через 15 минут после введения. Эффективность данного метода была обоснована выше.
Все крысы были взяты в эксперимент с двумя камерами. Целью данного эксперимента было проверить память у животных после перенесенного острого отравления оксидом углерода. Провели I этап эксперимента - ознакомление и II этан - обучение. Через 24 часа провели воспроизведение полученных навыков. Время ожидания перехода из камеры в камеру максимально составлял 180 сек. По истечению этого времени, если животное само не переходило из камеры в камеру, оно вынималось и возвращалось в жилую клетку. При этом латентный период перехода из камеры камеру достоверно не отличался во всех группах. Данные по проводимому эксперименту приведены ниже (табл. 3).
День проверки выработанных навыков считался нулевым днем. Вслед за тестом с двумя камерами проводили затравку животных оксидом углерода с дозировкой 3200 ppm. Данная дозировка меньше, чем LC50. Экспериментальным путем было установлено, что именно данная концентрация вызывает у животных контрольной группы тяжелое отравление с признаками поражения центральной нервной системы и не вызывает гибели животных. Было проведено наблюдение за животными каждой группы и определена клиника поражения. При этом фиксировали время развития у животных последовательно мышечной слабости, бокового положения, генерализованных мышечных судорог, наступления летального исхода. Суммарно данные приведены в таблице 3.
Как видно из приведенной таблицы 3, у животных II и III группы развились все стадии тяжелого острого отравления оксидом углерода. При этом время наступления каждой стадии в одной из групп не отличалось от соответствующего показателя в другой группе. Кроме того, через 10 часов в каждой из групп умерло по 1 животному. Данные факты говорят о том, что в контрольной и в лечебной группе развилось отравление одной и той же тяжести и дальнейшее сравнение животных обеих групп корректно.
Что касается IV группы, в которой крысам был введен профилактически ОФР, то у 5 животных признаки отравления вообще не развились, все эти животные были активны в пределах затравочной камеры. У 5 животных развилась мышечная слабость. Время ее развития составило в среднем 10,1±0,9 мин, что па 6 минут позже, чем в группах без ОФР (р<0,05).
При сравнении частоты дыхательных движений животных (ЧДД) к концу затравки, то во II и III группе в среднем она составляла 96,1±14,4 в мин, а в IV группе 72,5±7,9 в мин, что достоверно меньше, чем в других группах в 1,3 раза (р<0,05).
То есть, введение ОФР вызывает при одной и той же концентрации оксида углерода отравление меньшей степени тяжести, либо не вызывает вовсе.
По прошествии 30 минут затравки животные вынимались из камеры и оценивались временные показатели восстановления различных функций (двигательных и чувствительных). Суммарно данные приведены в таблице 4.
Как видно из приведенной таблицы, у животных II и III группы время восстановления двигательных и чувствительных функций достоверно не отличалось: в среднем через 5,3 мин животные находились в положении на животе, в среднем через 6,6 мин животные поднимались на лапы. Частичное восстановление болевой чувствительности наблюдалось в среднем через 2 мин, в среднем через 7,5 мин отмечалось полное восстановление болевой чувствительности. Данный факт еще раз подчеркивает, что у животных II и III групп развилось отравление оксидом углерода одинаковой степени тяжести. В то же время, у животных IV группы восстановление функций шло быстрее. Так, достоверно в 2,5 раза быстрее (р<0,05) животное находилось на животе. Достоверно в 2,3 раза быстрее животные вставали на лапы. Время частичного восстановления болевой чувствительности достоверно не отличалось. В то же время полное восстановление болевой чувствительности происходило в 1,8 раз быстрее (р<0,05). Следует отметить, что у 5 животных из IV группы вообще не развились двигательные и чувствительные нарушения.
ЧДД через 10 мин нахождения вне затравочной камеры во II и III группах достоверно не отличалась и составляла в среднем 86,7. В IV группе ЧДД через 10 мин достоверно меньше в 1,4 раза, чем во II и III (р<0,05).
Таким образом, у животных II и III групп развивалось тяжелое отравление оксидом углерода с генерализованными судорогами. Тяжесть отравления и скорость восстановления функций организма была одинаковой в данных группах. В IV группе благодаря профилактическому введению ОФР тяжесть отравления при прочих равных условиях была меньше и быстрее шло восстановление функций нервной системы.
В таблице 5 представлены данные тестирования животных в черно-белой камере.
Как видно из приведенной таблицы 5, в 0 сутки, перед затравкой латентный период во всех группах достоверно не отличался. В последующем, в I группе, у интактных крыс латентный период не менялся, что свидетельствует об отсутствии нарушений памяти, сохранении выработанного навыка. В контрольной (II группе), начиная с 1-х суток, латентный период Перехода из светлой камеры в темную достоверно снизился в 1,5 раза (р<0,05). Это говорит о развитии нарушений памяти уже с 1-х суток после затравки. В дальнейшем нарушения памяти нарастали на 7, 14 и 21 сутки, латентный уменьшался в 2; 3,2; 5,1 раза соответственно но сравнению с первоначальным (р<0,05). В III группе, на 1 сутки не развивались нарушения памяти, начиная с 7 сучок латентный период уменьшился в 1,2 раза (р<0,05), на 14 день уменьшился в 1,4 раза по сравнению с первоначальным (р<0,05), на 21 день достоверно не изменился по сравнению с 14 днем. В IV группе па 1 и 7 сутки латентный период достоверно не изменялся по сравнению с 0 сутками. На 14 сутки латентный период уменьшился в 1,2 раза по сравнению с первоначальным (р<0,05), на 21 сутки латентный период сохранился на уровне 7 суток.
Таким образом, в контрольной группе животных после перенесенного тяжелого острого отравления оксидом углерода, начиная с 1 суток развивались нарушения памяти, которые нарастали к 21 дню. В III группе животных, у которых сначала было смоделировано острое отравление оксидом углерода такой же степени тяжести, что и в контрольной, а затем вводился ОФР по лечебной схеме, нарушения памяти начинали развиваться, начиная с 7 суток, нарастали к 14 суткам, а на 21 сутки не изменялись по сравнению с 14. При этом выраженность нарушений была меньше, чем в контрольной группе. В IV группе степень отравления была меньше и нарушения памяти в отдаленном периоде развивались менее выражено.
Обучаемость животных исследовали методом спасения из воды. Эксперимент проводили с 7 по 11 сутки после отравления. Временные показатели латентного периода приведены в таблице 6.
В группе интактных животных (I) латентный период, начиная с 8 сут. достоверно уменьшался, а именно в 2,1 раза па 8 сут. по сравнению, в 5 раз па 9 сут., в 9 раз на 10 и 11 сут. (р<0,05) (все сравнения с данными на 7 сутки) То есть животные постепенно обучались находить выход из воды (табл. 6). В то же время в контрольной группе наблюдались нарушения обучаемости, что выражается в большем латентном периоде, по сравнению с аналогичными показателями на аналогичные сутки. Так, латентный период на 7 сут в 1,6 раза больше во II группе (р<0,05), на 8 сут. в 1,5 раза больше во II группе (р<0,05), на 9 сут в 2,8 раза больше во II группе (р<0,05), на 10 сут. в 2,7 раза больше во II группе (р<0,05), на 11 сут. в 1,5 раза больше во II группе (р<0,05). Таким образом, при тяжелых острых отравлениях оксидом углерода возникают нарушения обучаемости, наиболее выраженные на 9 и 10 сутки. В IV группе, в которой у животных развилось менее тяжелое отравление, латентный период на 7 и 8 сут. достоверно не отличается от I группы. На 9 и 10 сут. латентный период больше чем в I группе в 1,2 и 1,4 раза соответственно (р<0,05). На 11 сут. латентный период достоверно не отличается от I группы. При сравнении латентного периода на различные сутки обучения выявилось достоверное превышение аналогичных показателей во II группе по сравнению с IV. В III группе временные показатели спасения животных из воды достоверно превышают аналогичные показатели за соответствующие сутки у животных I, IV групп. В то же время, при сравнении с контрольной группой, животные III группы обучаются быстрее, только на II сут. латентный период в III и во II группах достоверно не отличается.
Таким образом, при тяжелых острых отравлениях оксидом углерода на 7-11 сут. развиваются нарушения обучаемости. Применение ОФР как с профилактической, так и с лечебной целью достоверно нивелируют эти нарушения.