АНТИКОАГУЛЯНТ ПРЯМОГО ДЕЙСТВИЯ НА ОСНОВЕ МОДУЛЬНОГО БИВАЛЕНТНОГО ДНК АПТАМЕРА, СЕЛЕКТИВНОГО К ТРОМБИНУ
ANTICOAGULANT WITH DIRECT ACTION BASED ON MODULAR BIVALENT DNA OF APTAMER SELECTIVE TO THROMBIN

Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а конкретно, к способу химической модификации антитромбинового аптамера и к получению нового антитромбинового аптамера, обладающего антикоагулянтными свойствами и пролонгированной антитромботической активностью, который может использоваться в качестве антикоагулянтного и антитромботического лекарственного средства.
Уровень техники
Сердечно-сосудистые патологии - основная причина смертности и инвалидизации населения в промышленно развитых странах, и в том числе в Российской Федерации. Наиболее серьезные заболевания в этой группе обусловлены развитием тромбозов, к ним относятся инфаркт миокарда, острый коронарный синдром, ишемический инсульт и др. Антикоагулянты - класс лекарственных средств-ингибиторов каскада свертывания -успешно применяются для профилактики образования тромбозов. Среди них прямые ингибиторы тромбина (аргатробан, дабигатран, бивалирудин, гирудин и его производные) показали себя более безопасными препаратами, поскольку обладают более предсказуемым эффектом, меньшей частотой побочных действий и не требуют длительного подбора терапевтических доз в сравнении с гепарином и его производными.
Аптамеры (от латинского Aptus - «соответствовать» и Mer - «единица повтора») - короткие синтетические фрагменты нуклеиновых кислот (олиго(рибо)нуклеотиды) со сложной пространственной структурой, которая определяет их уникальные свойства избирательно связываться (как ключ с замком) с любой мишенью: будь то химическое вещество (изотоп, лекарство, токсин и проч.), полимеры (ферменты, рецепторы, факторы роста, регуляторные и структурные белки, иммуноглобулины и проч.), супрамолекулярные комплексы (например, вирусы), целые клетки (болезнетворные бактерии, злокачественные и другие дефектные клетки).
Разрабатываемые нами антитромботические аптамеры, в частности объект патентирования - ДНК аптамеры семейства RA-36, блокируют участок тромбина, отвечающий за связывание фибриногена (экзосайт I). Аптамеры обладают антикоагулянтной активностью нового типа, отличной от используемых в настоящее время прямых антикоагулянтов. Их ближайший аналог - гируген, С-концевой пептид гирудина, связывающийся с экзосайтом I, - обладает значительно меньшей аффинностью к тромбину, чем разрабатываемые нами антитромботические аптамеры (700 нМ для гиругена в сравнении с 7 нМ для аптамеров семейства RA-36). Таким образом, аптамеры занимают уникальную нишу среди антикоагулянтов, являясь перспективными лекарственными средствами, потенциально применяемыми как при хирургических вмешательствах, так и при профилактике тромбозов после сложных переломов, инсультов, инфарктов и др. заболеваний с высоким риском тромботических осложнений.
Прямые ингибиторы тромбина, создаваемые на основе аптамеров, могут ингибировать протромботическую активность тромбина, воздействуя только на экзосайт I, и не влияя на активный центр. Показано, что аптамеры не влияют на инактивацию тромбина антитромбином III, протеином С, а также его амидолитическую активность (Bompiani et al, "A high affinity, antidote-controllable prothrombin and thrombin-binding RNA aptamer inhibits thrombin generation and thrombin activity" J Thromb Haemost, 2012 May; 10(5): 870-80).
Важные преимущества аптамеров no сравнению с препаратами белковой и пептидной природы - низкая иммуногенность и возможность при развитии осложнений (например, кровотечений) блокировать их активность специфическими антидотами на основе олигонуклеотидов, комплементарных лекарственному аптамеру. Кроме того, возможность химического синтеза аптамеров позволяет добиваться высокой степени чистоты препарата, воспроизводимости партий и масштабируемости производства.
Существенным недостатком, препятствующим широкому применению ДНК аптамеров как лекарственных препаратов, является их очень короткое временем жизни в кровотоке (Griffin LC et al. "In vivo anticoagulant properties of a novel nucleotide-based thrombin inhibitor and demonstration of regional anticoagulation in extracorporeal circuits" Blood, 1993, v. 12, p. 3271-3276). Данные фармакокинетики аптамерных ДНК длиной до 30 нуклеотидов указывают на период полувыведения от нескольких минут до получаса, что приводит к необходимости разработки аптамеров с химической модификацией для увеличения периода полувыведения аптамера. Это и является целью данного изобретения.
В 2007 году были опубликованы данные о разработке аптамера против белка VEGF. Для того, чтобы эффективно достичь увеличения времени нахождения в кровотоке, исследователи предложили несколько видов модификаций. Для увеличения устойчивости к действию нуклеаз были добавлены тиофосфатные группы вместо фосфатных или замещение 2'ОН групп на 2'-фтор или 2'-амино-производные (Pestourie С et al, "Aptamers against extracellular targets for in vivo applications" Biochimie, 2005; 87: 921-30; Ulrich et al, "RNA aptamers: from basic science towards therapy" Handb Exp Pharmacol, 2006; (173): 305-26). Для улучшения фармакокинетики и биодоступности к 5'- или 3'-концам могут быть добавлены объекты с высокой молекулярной массой или липофильные фрагменты. Например, соединение аптамера с полиэтиленгликолем (ПЭГ) увеличивает период полураспада в плазме до 9 часов вместо нескольких минут для немодифицированного аптамера (Willis МС et al, "Liposome-anchored vascular endothelial growth factor aptamers" Bioconjug Chem, 1998; 9: 573-82). На основе этого аптамера против VEGF был создан первый коммерческий препарат аптамерной природы - Pegaptanib. Анализ опубликованных пегилированных вариантов аптамеров показывает, что в абсолютном большинстве из них молекула ПЭГ была присоединена к концевому нуклеотиду. Причиной этого является опасение, что присоединение молекулы ПЭГ к центральной части аптамера будет ингибировать его функциональную активность, то есть ухудшать связывание с мишенью (Vater A, Klussmann S. "Turning mirror-image oligonucleotides into drugs: the evolution of Spiegelmer therapeutics" Drug Discov Today, 2015 Jan; 20(1): 147-55).
Относительно недавно исследователи (Da Pieve et al, "PEGylation and Biodistribution of an anti-MUC1 Aptamer in MCF-7 Tumor-Bearing Mice" Bioconjugate Chem, 2012, 23 (7), pp 1377-1381) изучили, как добавление ПЭГ влияет на биораспределение аптмера против MUC-1 (белок, связанный с раком молочной железы). В исследовании было показано, что конъюгация с ПЭГ препятствовала поглощению аптамеров опухолью. Данные по биораспределению показали, что присоединение ПЭГ оказывало влияние на сродство аптамеров к своей мишени. Поглощение пегилированного аптамера опухолью было зафиксировано на более низком уровне (0,07±0,01%), чем поглощение непегилированного аптамера (0,12±0,05%). В целом, после 22 ч. активность аптамера в опухоли не наблюдалась. В этом исследовании показано, что пегилированный аптамер не в состоянии достигнуть и связываться с целью внутри клетки и усваиваться раковыми клетками в значительных количествах.
Последнее утверждение делает очень привлекательным использование пегилирования к антитромботическому аптамеру, так как цель этого аптамера находится в кровотоке. Пегилирование затрудняет попадание аптамера в клетки, что может приводить к ненужным побочным эффектам. Таким образом, можно заключить, что использование пегилирования позволит значительно увеличить время полувыведения аптамера (до нескольких часов) и предотвратить попадание конъюгата аптамера с полиэтиленгликолем внутрь клеток.
Несмотря на многочисленные исследования, использование аптамеров в клинической практике остается редким явлением в связи с наличием ряда нерешенных технических проблем. Данное изобретение обладает рядом необычных свойств, существенных для решения поставленной задачи, и поэтому расширяет круг имеющихся кандидатов на роль антикоагулянтных лекарственных средств на основе ДНК аптамеров.
Сущность изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание высокоэффективного и безопасного конкурентного ингибитора активности тромбина на основе ДНК аптамера к тромбину, обладающего пролонгированным действием (увеличенным временем нахождения в кровотоке).
Решение указанной задачи заключается в том, что в разработанный ранее аптамерный ДНК олигонуклеотид, характеризующийся нуклеотидной последовательностью общей формулы GGTTGGTGTGGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGG (RA-36), вносится путем замены стандартного нуклеотида, по крайней мере, один модифицированный нуклеотид таким образом, чтобы в результате модификации образовывалась химическая группа, способная эффективно образовывать ковалентную связь с молекулой ПЭГ, и при этом не нарушалась функциональная активность данного аптамера.
ДНК аптамер с последовательностью 5'-GGTTGGTGTGGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGG-3' (названный RA-36) был разработан авторами данного изобретения на основе рационального дизайна и оптимизации структуры молекулы-прототипа с привлечением методов молекулярного моделирования (Zavyalova Е et al, "Novel modular DNA aptamer for human thrombin with high anticoagulant activity" Curr Med Chem, 2011; 18(22): 3343-50). Прототипом являлся 15-звенный аптамерный ДНК олигонуклеотид с последовательностью 5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3', специфичный к тромбину, впервые описанный в Bock LC et al, "Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin" Nature, 1992 Feb 6; 355(6360): 564-6. Молекула-прототип способна образовывать антипараллельный G-квадруплекс, состоящий из двух планарных G-квартетов, соединенных тремя латеральными петлями; его трехмерная структура была определена методами ядерного магнитного резонанса и рентгеноструктурного анализа (Russo K et al, "High-resolution structures of two complexes between thrombin and thrombin-binding aptamer shed light on the role of cations in the aptamer inhibitory activity" Nucleic Acids Res, 2012 Sep; 40(16): 8119-28). Предложенный авторами изобретения аптамер RA-36 имеет модульную структуру и содержит два антипараллельных G-квадруплекса, для стабилизации которых ключевую роль играют катионы металлов, в частности, катионы калия. Катион калия координируется гуанинами G-квадруплекса, добавляя энтальпийную составляющую в энергию структуры (Zavyalova Е et al, "Module-activity relationship of G-quadruplex based DNA aptamers for human thrombin" Current medicinal chemistry, 2013; Vol. 20, no. 38). RA-36 имеет ингибирующую активность в отношении тромбина в 2 раза большую, чем молекула-прототип: кажущиеся константы ингибирования равняются 7,3 нМ и 14,7 нМ, соответственно. Обе G-квадруплексных части важны для ингибирующей активности и термической стабильности RA-36. Недавно авторами изобретения была продемонстрирована высокая функциональная активность антитромбинового аптамера RA-36 на моделях животных, сопоставимая с клинически одобренным прямым ингибитором тромбина - бивалирудином (Zavyalova Е et al. "Evaluation of antithrombotic activity of thrombin DNA aptamers by a murine thrombosis model" PLoS One, 2014 Sep 5; 9(9): e107113).
Особенностью данного изобретения является то, что для увеличения времени нахождения аптамера RA-36 в кровотоке авторами предложено присоединить молекулу ПЭГ к RA-36, модифицированному по крайней мере по одному нуклеотиду. Отличительной чертой также является возможность присоединения ПЭГ к данному аптамеру не по концевым нуклеотидам. Авторами изобретения было обнаружено, что введение модифицированных нуклеотидов в RA-36 по позициям 7, 9, 16, 23, 25 и последующая коньюгации с ПЭГ не нарушает функциональную активность данного аптамера.
Некоторые варианты изобретения включают в себя аптамерный олигонуклеотид RA-36, в котором, по крайней мере, один из тиминов модифицирован по позициям 7, 9, 16, 23 и/или 25 для возможности связывания с молекулой полиэтиленгликоля и увеличения времени нахождения данного олигонуклеотида в кровотоке.
В некоторых вариантах изобретения модификация произошла путем замены тимина на 5-[N-(6-аминогексил)-3-(Е)-акриламидо]-2'-деоксиуридин. В этих вариантах изобретения, в которых один из тиминов модифицирован по позициям 7, 9 или 16, формулу ДНК аптамера, селективного к тромбину и обладающего пролонгированным временем жизни в кровотоке, можно описать как: GGTTGGU(PEG)GTGGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGG, GGTTGGTGU(PEG)GGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGG, или GGTTGGTGTGGTTGGU(PEG)GGTTGGTGTGGTTGG (названный RA-361), где U(PEG) обозначает 5-[N-(6-аминогексил)-3-(Е)-акриламидо]-2'-деоксиуридин, конъюгированный с полиэтиленгликолем. Участок структуры -GU(PEG)G- аптамера RA-361, показывающий способ присоединения ПЭГ, показан на Рис. 1.
В других вариантах изобретения возможно применение альтернативных модификаций нуклеотидных остатков для осуществления эффективной коньюгации с молекулой ПЭГ. Примеры таких модификаций многочисленны и хорошо известны для специалистов. Например, некоторые коммерчески доступные варианты модификаций описаны в «Custom Oligonucleotide Modifications Guide», Sigma-Aldrich. Присоединение ПЭГ к модифицированному нуклеотиду может осуществляться различными способами, с использованием разных функциональных групп и разных видов ПЭГ.
В других вариантах изобретения в дополнение к модификации тимина аптамерный ДНК олигонуклеотид RA-36 может включать в себя также одну или несколько дополнительных стабилизирующих модификаций, таких как модификации азотистых оснований, модификации сахарных групп или модификации фосфатных групп.
В некоторых вариантах изобретения полиэтиленгликоль, используемый для связывания с модифицированным аптамерным олигонуклеотидом, имеет средний молекулярный вес около 20000 дальтон. В других вариантах изобретения возможно применение ПЭГа другого молекулярного веса в диапазоне от 5000 дальтон до 150000 дальтон.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей ДНК аптамер, описанный в изобретении. В частности, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей антитромбиновые ДНК аптамеры, описанные в изобретении, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, растворителем, наполнителем и/или другими неактивными ингредиентами.
В других вариантах осуществления изобретение относится к способам использования антитромбиновых аптамеров, в частности к способам ингибирования тромбина с помощью антитромбиновых аптамеров, описанных в настоящем изобретении. В частности, задача, указанная к данном изобретении, решается путем применения аптамерного олигонуклеотида RA-36, в котором по крайней мере один из тиминов модифицирован по позициям 7, 9, 16, 23 и/или 25 для возможности связывания с молекулой полиэтилен гликоля и увеличения времени нахождения данного олигонуклеотида в кровотоке, для ингибирования активности тромбина.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к профилактике или лечению состояний, связанных с нежелательной активностью тромбина, таких как тромбозы различной природы. В частности, настоящее изобретение относится к применению описанного в изобретении аптамерного ДНК олигонуклеотида в качестве антитромботического и/или антикоагулянтного лекарственного средства для лечения различных заболеваний человека и животных, в том числе при хирургических вмешательствах, при профилактике тромбозов после сложных переломов, инсультов, инфарктов и др. заболеваний с высоким риском тромботических осложнений.
В некоторых частных вариантах изобретение относится к профилактике и/или лечению состояний млекопитающего, характеризующихся нежелательным тромбозом, которые представляют собой острый коронарный синдром, инфаркт миокарда, нестабильную стенокардию, рефрактерную стенокардию, тромбоз, вызванный посттромболитической терапией или коронарной ангиопластикой, острый ишемический цереброваскулярный синдром, эмболический инсульт, тромботический инсульт, преходящие ишемические приступы, венозный тромбоз, глубокий венозный тромбоз, легочную эмболию, коагулопатию, диссеминированное внутрисосудистое свертывание, тромбоцитопенический акроангиотромбоз, облитерирующий тромбангиит, тромбозные заболевания, связанные с гепариноиндуцированной тромбоцитопенией, тромбические осложнения, связанные с искусственным кровообращением, тромбические осложнения, связанные с протезными устройствами.
При осуществлении изобретения достигаются следующие технические результаты:
- разработана форма антитромбинового ДНК аптамера RA-36, обеспечивающая его стабильность в кровотоке при введении человеку или животным. Данная форма обладает как высокой специфичностью к тромбину, приводящей к его эффективному функциональному ингибированию, так и низкой токсичностью при введении животным. Это позволяет прогнозировать успешное использование данной формы в качестве лекарственного средства.
- разработан новый эффективный способ ингибирования активности тромбина, имеющий потенциальную применимость в клинической практике.
Определения и термины
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Термин «нуклеотид» обозначает химические соединения, являющиеся составляющими частями нуклеиновых кислот (ДНК или РНК). Нуклеотиды состоят из азотистых оснований, которые соединяются ковалентной связью с 1' атомом рибозы или дезоксирибозы (образуя нуклеозиды), а также дополнительно соединены с одной или несколькими фосфатными группами, прикрепленными к 5'-гидроксильной группе сахара. Основные азотистые основания, входящие в состав ДНК или РНК, это цитозин (С), гуанин (G), аденин (А), тимин (Т) и урацил (U). Соединения, состоящие из небольшого числа нуклеотидов, называются олигонуклеотидами.
Под «стабилизирующими модификациями» следует понимать модификации аптамерного олигонуклеотида, приводящие к увеличению его стабильности при введении человеку или животному; например, приводящие к стабилизации структуры или увеличению времени нахождения в кровотоке. Подобные модификации нуклеотидов, описанные в литературе, включают модификации азотистых оснований, модификации сахарных групп или модификации фосфатных групп. Например, модификации азотистых оснований могут включать в себя присоединение электрофильных групп к цитозину (5-бромоцитозин и др.) и урацилу (5-бромоурацил и др.); модификации сахарных групп могут включать в себя различные аналоги Сахаров; модификации фосфатных групп могут включать в себя, например, образование тиофосфатов. Нуклеотиды внутри аптамера могут быть соединены как обычными фосфодиэфирными связями, так и другими, неприродными связями, например, для обеспечения стабильности ДНК аптамера в присутствии нуклеаз. Эти и другие модификации, а также способы их синтеза, подробно описаны в литературе, например, в патенте ЕР 2640426, а также в ссылках из этого патента.
Термин «аптамер» обозначает одноцепочечные олигонуклеотидные последовательности (длиной до 100 нуклеотидов), которые могут специфически распознавать и связываться с определенными молекулами-мишенями (обычно белками).
Термин «полиэтиленгликоль» или «ПЭГ» обозначает линейный или разветвленный полимер этиленгликоля молекулярной массы от 5000 дальтон до 150000 дальтон.
Термин «фармацевтически приемлемый носитель, растворитель и/или наполнитель» относится к таким носителям, растворителям и/или наполнителям, которые, являясь неактивными ингредиентами, в рамках проведенного медицинского заключения, пригодны для использования в контакте с тканями человека и животных без излишней токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.д. и отвечают разумному соотношению пользы и риска. «Неактивные ингредиенты» входят в состав лекарственного средства для улучшения его растворимости и/или стабильности, а также для улучшения фармакокинетики. Неактивные ингредиенты включают в себя множество веществ, известных специалистам в области фармацевтики, таких как вещества для контроля рН или осмотического давления, антибактериальные агенты, антиоксиданты, поверхностно активные вещества (например, полисорбат 20 или 80), криостабилизаторы, консерванты, растворители, загустители, наполнители, носители (микро- или нано-частицы) и другие вещества.
Под названием «RA-36» следует понимать ДНК аптамер с последовательностью 5'-GGTTGGTGTGGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGG-3', в то время как «RA-361» определяет специфически модифицированный вариант ДНК аптамера RA-36, фрагмент структуры которого показан на Рис. 1. RA-361 представляет собой один из возможных вариантов осуществления изобретения, в котором модификация аптамера RA-36 произошла путем замены тимина в позиции 16 на 5-[N-(6-аминогексил)-3-(Е)-акриламидо]-2'-деоксиуридин, за которой последовало присоединение в позиции 16 N-сукцинимидной производной молекулы ПЭГ с молекулярной массой 20 кДа.
Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
Краткое описание рисунков
Рис. 1. Участок химической структуры -GU(PEG)G- модифицированного аптамера RA-361, показывающий способ присоединения ПЭГ.
Рис. 2. (А) Зависимость протромбинового времени от концентрации ДНК аптамера RA-361 в плазме человека и животных. (Б) Зависимость протромбинового времени от концентрации препарата сравнения Бивалирудина в плазме человека и животных.
Рис. 3. (А) Зависимость параметра протромбиновое время in vitro на плазме человека от концентрации аптамера. Сплошным отмечен аптамер RA-36. Пунктиром отмечен аптамер RA-361. (Б) Зависимость параметра тромбиновое время in vitro на плазме человека от концентрации аптамера. Сплошным отмечен аптамер RA-36. Пунктиром отмечен аптамер RA-361.
Рис. 4. (А) Динамика массы тела крыс после внутривенного однократного введения лекарственной формы препарата «пегилированный олигонуклеотид RA-361» в дозе 84 мг/кг. Пунктиром отмечена контрольная группа. (Б) Динамика массы тела мышей после внутрибрюшинного однократного введения препарата «пегилированный олигонуклеотид RA-361» в дозе 500 мг/кг. Пунктиром отмечена контрольная группа.
Рис. 5. Результат ВЭЖХ-анализа образца реакционной смеси реакции конъюгации синтезированного исходного аминопроизводного RA-36 с N-сукцинимидным эфиром ПЭГ молекулярной массой 20 кДа при образовании модифицированного аптамера RA-361.
Подробное раскрытие изобретения
Несмотря на то, что примеры ДНК аптамеров к тромбину известны уже около 20 лет, их практическое продвижение в медицинскую практику сдерживается рядом факторов, и в настоящее время клинически одобренных препаратов на основе ДНК аптамеров к тромбину не существует. Например, аптамеры первого поколения ARC183 и ACR2172 успешно прошли стадии доклинических испытаний в США, но были остановлены на стадии клинических испытаний. Исходя из экспериментальных данных, накопленных авторами изобретения, основной причиной приостановки продвижения этих аптамеров могла быть проблема правильной сборки G-квадруплексного фармакофора с дополнительными дуплексными модулями. Авторами изобретения была разработана новая конструкция модульного бивалентного ДНК аптамера (использованная в аптамере RA-36 и модифицированном RA-361), которая имеет вместо дуплекса второй G-квадруплексный фармакофор. Значимым преимуществом данной конструкции является быстрая, самопроизвольная сборка, которая определяется его уникальной структурой. Авторы изобретения имеют патенты на дополнительные факторы стабилизации фармакофора (дуплексные элементы), например, RU 2429293.
Для создания эффективных лекарственных препаратов на основе ДНК аптамеров необходимо, чтобы соответствующая фармацевтическая композиция обладала стабильностью, достаточной для его клинического приготовления, краткосрочного хранения и применения. Химические модификации в специфических местах антитромбинового ДНК аптамера RA-36 и последующее присоединение молекулы ПЭГ позволяют получить набор антитромбиновых аптамеров с улучшенными характеристиками. Места модификации, описанные ниже, были отобраны путем тщательного экспериментального тестирования. Характерной особенностью данного изобретения является присоединение молекулы ПЭГ к модифицированным нуклеотидам аптамера, находящимся в центральной области молекулы аптамера, в то время как у большинства ранее описанных аналогов присоединение происходило по концевым нуклеотидам. Возможность присоединения молекулы ПЭГ к центральной области молекулы аптамера обеспечивается, в частности, модульной структурой аптамера RA-36.
Ключевыми характеристиками лекарственного препарата на основе антитромбинового ДНК аптамера являются: (1) высокая специфическая активность (ингибирование) по отношению тромбину человека; (2) улучшенные фармакокинетические свойства - достаточно большое время нахождения в кровотоке; (3) низкая токсичность препарата при введении человеку и животным; (4) возможность производства препарата в значительных количествах, достаточных для проведения клинических исследований.
Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Исследование эффективности ингибирования тромбина
Для анализа эффективности ингибирования тромбина аптамером RA-36 и его модифицированным вариантом RA-361 была исследована их антикоагулянтная активность в стандартных лабораторных тестах «Протромбиновое время» и «Тромбиновое время». Протромбиновое время (ПВ) отображает ингибирование тромбина, который генерируется плазмой, и позволяет оценить активность факторов свертывания I, II, V, VII и X (оценка внешнего пути свертывания крови и системы гемостаза в целом). Тромбиновый тест показывает время, необходимое для образования сгустка фибрина в плазме при добавлении к ней тромбина. Этот тест характеризует кинетику конечного этапа свертывания крови - скорость превращения фибриногена в фибрин. Тромбиновое время (ТВ) зависит только от концентрации фибриногена и активности ингибиторов тромбина.
Для проведения теста «Протромбиновое время» был использован набор реагентов «Thromborel S» компании "Dade Behring"; для проведения теста «Тромбиновое время» был использован набор реагентов «Test Thrombin Reagenb компании "Sigma", оба в соответствии с инструкцией производителя. Данные показатели определяли в цитратной плазме крови лабораторных животных, которым были введены исследуемый препарат, либо препарат сравнения, либо физиологический раствор (контрольная группа). В качестве препарата сравнения был использован клинически применяемый пептидный ингибитор тромбина Ангиокс (Бивалирудин). Проведение теста протромбинового и тромбинового времени осуществляли следующим образом. Отбирали 50 мкл исследуемого образца цитратной плазмы в пластиковую кювету коагулометра, выдерживали 60 секунд при 37°С, прибавляли 100 мкл рабочего раствора реактива для проведения теста протромбинового или тромбинового времени, прогретого при 37°С. Измеряли время свертывания исследуемого образца плазмы на коагулометре, оснащенном программным обеспечением для определения обсуждаемых показателей.
На Рис. 2 показана зависимость протромбинового времени от концентрации ДНК аптамера RA-361 в плазме человека и животных. RA-361 способен значительно удлинять время образования фибрина после генерации эндогенного тромбина в нормальной человеческой плазме и плазме животных. На том же рисунке приведены аналогичные данные для препарата сравнения. Из этих данных следует значительно более высокая специфическая активность RA-361 по отношению тромбину человека по сравнению с тромбинами животных. На Рис. 3 показано сравнение немодифицированного (RA-36) и модифицированного (RA-361) ДНК аптамеров в функциональных тестах по измерению ПВ и ТВ. Из этих данных следует, что модификация RA-36, включающая в себя замену нуклеотида и присоединение молекулы ПЭГ, не влияет на функциональную активность ДНК аптамера.
Исследование фармакокинетических свойств модифицированного аптамера RA-361 в сравнении с аптамером RA-36
ДНК аптамеры против тромбина первого поколения характеризуются очень коротким (не более нескольких минут) временем жизни в кровотоке (Griffin LC et al., Blood 1993, v. 12, p. 3271-3276). Размер аптамера имеет критическое значение для его удержания в кровотоке: при молекулярной массе 30000 Да и выше замедляется его пассивное выведение через почки.
Для исследования увеличения времени нахождения в кровотоке пегилированного аптамера RA-361 в сравнении с исходным аптамером RA-36 использовали однократное внутривенное введение данных препаратов крысам. Животным, с предварительно вживленными катетерами и адаптированным к содержанию в метаболических камерах, однократно натощак вводили аптамер RA-361 или RA-36, меченые фосфором, внутривенно через боковые вены хвоста. Через 1, 3, 7, 15, 30, 60, 90 мин, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 24, 48 ч после введения вещества проводили отбор пробы крови крыс через катетеры. Образцы мочи и кала собирали за интервалы 0-2, 2-4, 4-6, 6-8, 8-12, 12-16, 16-24, 24-36, 36-48 ч. Концентрацию RA-361 в собранных образцах определяли радиометрическим методом жидкостного сцинтилляционного счета. Измерения проводили для 7 крыс. В других экспериментах оценивали также линейность фармакокинетики RA-361 и RA-36 в крови крыс после его однократного внутривенного введения, а также распределение RA-361 и RA-36 по органам и тканям.
Экспериментальные данные показывают существенное изменение фармакокинетических показателей RA-361 в сравнении с RA-36. Период полураспределения RA-361 составил 7.3±0.8 мин. с доверительным интервалом 95% - 3.9-9.1 мин., в то время как период полураспределения для RA-36 составил 0.99 мин с доверительным интервалом 95% - 0.77-1.4 мин. Период полувыведения RA-361 составил 7.6±1.5 часов с доверительным интервалом 95% - 4.6-10.5 ч, в то время как период полувыведения для RA-36 составил 23 мин, доверительный интервал 95% - 18.45-31.93. Особенностью фармакокинетики RA-36 являлось также то, что уже через 3 мин. после внутривенного ведения в мочевом пузыре животных обнаруживалась высокая концентрация радиоактивного фосфора, что свидетельствовало о интенсивном энзиматическом расщеплении RA-36 и выведении меченных фрагментов почками. Таким образом, экспериментальные данные подтверждают значительное повышение стабильности пегилированного аптамера RA-361.
Исследование токсичности RA-361 на лабораторных животных
(А) Изучение острой токсичности RA-361 на мышах и крысах
Для установления доз, характеризующих токсичность аптамера RA-361, препарат вводили однократно внутривенно в максимально высокой концентрации и максимальном объеме, разрешенном для подкожного введения мышам SHK (1 мл) и крысам Wistar (10 мл). Доза препарата при этом для мышей составила 125 мг/кг и была определена как доза, равная 20 терапевтическим дозам для человека, для крыс - 85 мг/кг и была определена как доза, равная 12 терапевтическим дозам для человека. Внутрибрюшинно препарат вводили в максимально допустимых объемах - мышам по 1,0 мл, крысам по 5,0 мл. При этом доза для мышей составила 500 мг/кг и была определена как 80-кратная терапевтическая доза для человека, для крыс доза составила 450 мг/кг и была определена как 72-кратная терапевтическая доза для человека. После введения препарата за состоянием и поведением животных следили на протяжении 30 дней. После введения препарата состояние и поведение животных не изменялось. Животные хорошо перенесли введение препарата. Гибели подопытных животных не наблюдалось. Прирост массы тела подопытных мышей и крыс не отличался от животных контрольной группы (Рис. 4). Дозы, характеризующие токсичность препарата рассчитать не представляется возможным, так как не удалось достигнуть смертельных доз препарата. После эвтаназии на 30 сутки эксперимента при макроскопическом исследовании внутренних органов экспериментальных животных, получивших однократно внутривенно и внутрибрюшинно пегилированный олигонуклеотид RA-361 в максимально возможных объемах, различий в состоянии внутренних органов (тимус, сердце, селезенка, почка и печень) по сравнению с контрольной группой не было обнаружено.
(Б) Изучение хронической токсичности RA-361 на крысах.
Дополнительное исследование токсикологической безопасности RA-361 в хроническом опыте проводилось на половозрелых крысах Wistar, самцах и самках. Исследования проведены с использованием визуального, инструментального и лабораторного контроля за состоянием животных, современных гематологических, биохимических и морфологических методов оценки действия препаратов в соответствии с «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств» под редакцией Миронова А.Н. При изучении хронической токсичности крысам самцам и самкам в течение 7 дней производили ежедневное внутривенное введение испытуемого препарата в разовых дозах 4,5 мг/кг (1 терапевтическая доза для человека) и 22,5 мг/кг (пятикратная терапевтическая доза для человека). За время введения препарата, а также в течение 15 суток после прекращения введения препарата, гибели крыс не наблюдалось ни в одной из групп экспериментальных и контрольных животных. Животные подопытных групп хорошо переносили введения препарата. Ежедневное введение препарата в течение 7 дней в испытанных дозах не оказывало статистически значимого влияния на потребление крысами корма и воды, а также изменение массы тела. Биохимические показатели сыворотки крови во всех подопытных группах не отличались от контроля. Эти и другие проведенные исследования позволяют заключить, что препарат RA-361 в использованных концентрациях является малотоксичным.
Масштабирование процесса синтеза RA-361
Для оптимизации и масштабирования технологии получения препарата RA-361 налажен процесс синтеза аминопроизводного олигонуклеотида с помощью высокопроизводительного синтезатора AKTA oligopilot plus 100 и проточного колоночного картриджа с фиксированным объемом 6,3 мл (Column Reactor 6.3 ml, prod code 18-1101-13) с последующей депротекцией, очисткой полученного аминопроизводного препаративной хроматографией, получением и очисткой конъюгата. Использованный подход применялся для наработки препарата для проведения доклинических испытаний аптамера RA-361. Основным этапом масштабирования является процесс твердофазного синтеза. Синтезируемая нуклеотидная последовательность аминопроизводного на 58% является G-богатой, оставшуюся часть последовательности составляют dT-нуклеотиды. Данная последовательность может в ряде случаев усложнять процесс синтеза из-за низкой эффективности конденсации dG-нуклеотида, а также чувствительность dT-богатых последовательностей к модификации во время процедуры депротекции, вызванной реакцией акрилонитрила с N3-позицией dT-остатков. Снижение эффективности конденсации dG-мономера, в частности, связано с тем, что связанные с носителем и защищенные dG-богатые олигомеры предрасположены к агрегации, а также к снижению растворимости олигонуклеотида в ацетонитриле после достижения определенной длины и/или соотношения типа оснований в последовательности, вызывающих сложность к доступу 5'-ОН-гидроксильной группы. Эти особенности в общем случае вызывают снижение выхода целевого продукта и увеличение содержания примесей олигонуклеотидной природы, в том числе и продуктов модификации основной последовательности. Выбор подходящих составов рабочих реагентов и оптимизация параметров процесса синтеза позволяет значительно снизить влияние негативных факторов на качество получаемого продукта. Для синтеза аминомодифицированного олигонуклеотида использовался коммерческий полимерный носитель Primer Support 200 dG-iBu Synth (200±10 μmol/g, cat no. 17-5290-02, далее в тексте PS 200 dG) компании GE Healthcare, аналогично может быть использованы полимерный носитель NittoPhaseHL (200±10 μmol/g, Standard Deoxy dG-Base Loaded) компании Kinovate Life Sciences, Inc., a также полимерные носители повышенной нагрузки производства других компаний и HybCPG™ носитель с dG-dmf-лигандом (code DGF Y-150,150±10 μmol/g) от PrimeSynthesis. Использование PS 200 dG при синтезе олигонуклеотидов, чья длина превышает 30 нуклеотидов, требует увеличения количества растворителей и реагентов на этапах промывки проточного реактора и детритилирования, в особенности на последних этапах синтеза для инициирования полного протекания реакции детритилирования. После этапа конъюгации аминомодифицированного dT-цианоэтил-фосфорамидита следует свести до минимума (или полностью исключить) этап кэппирования для снижения риска ацилирования первичной аминогруппы аминолинкера. Так как данная нуклеотидная вставка с аминолинкером расположена в 16-ой позиции последовательности, во второй половине синтеза этап кэппирования пропускается (15 циклов конденсации мономеров), что приводит к снижению выхода целевой нуклеотидной последовательности и увеличения в пределах допустимого количества примесей «недосинтеза» при тщательной оптимизации этапов депротекции и конденсации. Для предотвращения миграции ацильной группы с экзоциклической аминогруппы (dG-iBu на полимерном носителе) на аминогруппу линкерного нуклеотида, также после синтеза необходимо обрабатывать синтезированную последовательность перед депротекцией и отщепления от PS-носителя 20% раствором N,N-диалкиламином (например, диэтиламином в ацетонитриле), что увеличивает стабильность при хранении синтезированного олигонуклеотида на PS-носителе. Подобная обработка также удаляет цианоэтильную защитную группу, которая может приводить к пришивке молекул акрилонитрила к N3-атому тимидина при депротекции данного основания. Находящаяся на аминолинкере TFA-защитная группа (TFA-трифторацетильная, лабильная в основных условиях, т.о. удаляющая в процессе депротекции результирующей последовательности) сокращает стабильность материала во время хранения на носителе после синтеза, а также является относительно восприимчивой к побочным реакциям по механизму трансацилирования во время синтеза. Процесс синтеза рабочей нуклеотидной последовательности аминомодифицированного производного [5' - GGT TGG TGT GGT TGG 16-pos/iAmMC6T/ GG TTG GTG TGG TTG G - 3'] подобен синтезу на автоматизированном синтезаторе MerMade 48 компании BioAutomation (далее ММ48) с использованием стандартных реагентов и параметров процесса синтеза.
Последовательность присоединения нуклеотидного звена состоит из следующих реакций:
Детритилирование: удаление 5'-диметокситритильной защитной группы от связанного с носителем нуклеозида. Реакция должна проводиться в максимально безводной среде (<3 ppm) в атмосфере аргона. Отщепление защитной группы генерирует раствор ярко-оранжевой окраски, относительные количества которого могут мониторироваться по УФ-поглощению (контроль UV-Vis). На основании этих данных можно производить оценку эффективности реакций конденсации во время всего процесса синтеза. Измеренное количество диметокситритильного иона интегрируется в режиме реального времени контролирующим синтезатор ПО. Композиция рабочего раствора для проведения реакции детритилирования на синтезаторе AKTA Oligopilot 100 отличается от аналогичного раствора для синтеза на синтезаторе ММ48. Вместо сильной трихлоруксусной кислоты (ТХУ, pKa 0,7) используется более слабая дихлоруксусная кислота (ДХУ, pKa 1,5, рабочая концентрация в растворе 5% (w/v)), что приводит к снижению вероятности отщепления нуклеотидных оснований (депуринизация) во время детритилирования. Мониторинг реакции детритилирования осуществляется при длинах волн 350 и 280 нм;
Промывка носителя после детритилирования: после детритилирования реактор промывается безводным ацетонитрилом для удаления оставшейся ДХУ и тритильного катиона, которые могут в процессе присоединения следующего нуклеотида генерировать N+1 примеси и снижать конечное содержание целевого олигонуклеотида;
Конденсация: вторая реакция включает в себя конденсацию соответствующего фосфорамидитного мономера (dG-dmf-CE, dTCE или TFA-AmC6dT-CE фосфорамидита в концентрации 0,2 М, 2,2 эквивалента), смешанного с активатором (0,25 М 5-этил-1Н-тиотетразол, ЕТТ, в безводном ацетонитриле, 60% (v/v)). Во время этой реакции формируется с высоким выходом (более 98%) фосфотриэфирная межнуклеотидная связь. Для синтеза ДНК конденсация проводится путем рециркуляции раствора активатора и фосфорамидита через реактор в течение 3 минут, для конденсации амидита с аминолинкером используется более длительное время - 5 минут. После этапа конденсации выполняется промывка носителя безводным ацетонитрилом для удаления избытка реагентов и снижения возможного образования N+1 примесей;
Окисление: образованная при конденсации фосфотриэфирная межнуклеотидная связь в процессе окисления раствором йода с органическим основанием (обычно, пиридин или лутидин) переводится в фосфодиэфирную. После окисления носитель промывается безводным ацетонитрилом. Для проведения реакции используется проточная обработка носителя в реакторе раствором 0,05 М йода в смеси гетероциклического основания (обычно, пиридин, лутидин, коллидин) с водой в соотношении 90:10. Вода действует как донор кислорода, а йод образует аддукт с фосфорной связью, который разлагается водой, оставляя стабильную фосфодиэфирную связь;
Кэппирование: последней реакцией в цикле присоединения мономерного звена является кэппирование непрореагировавшей 5'- гидроксильной группы с последующей промывкой носителя безводным ацетонитрилом. В стандартных условиях синтеза используется раствор уксусного ангидрида в ацетонитриле. При масштабировании синтеза G-богатых последовательностей изобутирильная защита аминогруппы у С2-позиции dG-обоснования фосфорамидитов может замещаться ацетильной группой в результате протекания реакции по механизму транс-амидирования на этапе кэппирования; подобную примесь нельзя устранить в стандартных условиях депротекции. Использование N-диметил-формамидной защиты и изобутирильного ангидрида устраняет данную проблему, блокируя свободную 5'-ОН-группу без возможности побочной реакции транс-амидирования. В конце синтеза включен единичный цикл обработки 20% раствором диэтиламина в ацетонитриле. При расщеплении линкерной связи между новосинтезированным олигонуклеотидом и носителем для защиты фосфатной группы используется β-цианоэтильная группа. При депротекции данная группа отщепляется и в форме акрилонитрила взаимодействует с N3-позицией тимина с образованием цианоэтильного аддукта по механизму присоединения по Михаэлю, который невозможно удалить при хроматографической очистке смеси после синтеза. Этот эффект минимизируется обработкой носителя после синтеза алкиламинами (диэтиламин, трет-бутиламин) по механизму β-элиминирования, результирующий продукт удаляется при обработке раствором депротекции. Этапы синтеза повторяются 30 раз для синтеза заданной последовательности. Синтезированный олигонуклеотид подвергается процедуре отщепления и депротекции согласно инструкциям к твердофазному носителю PS 200 dG. После синтеза носитель на реакторе сушится в течение часа под вакуумом для количественной оценки изменения массы носителя после синтеза (взвешивания). Далее носитель еще раз разводится минимум в 1 объеме колонки (6,3 мл), переносится в емкость для работы с растворами под давлением с плотной крышкой, который затем заполняется охлажденным водным раствором концентрированного аммиака (35%) в соотношении 10 мл на 1 грамм носителя. Смесь инкубируется при мягком перемешивании при 55°С в течение 16 часов. После охлаждается в течение 30 минут при -34°С и фильтруется на стеклянном фильтре с пористостью 3 (16-40 мкм). Фильтр промывается пятикратно водным раствором этанола (1:1) в объеме, равным объему использованного аммиачного раствора. Методом спектрофотомерии по прямому поглощению раствора при длине волны 260 нм определяется концентрация олигонуклеотида (выход с синтеза составляет 130-135 CD260/мкмоль). Методом анионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии (АО-ВЭЖХ) определяется состав смеси и процентного содержание основного компонента. После аналитических процедур компоненты растворителя (аммиачный раствор и этанол) удаляется с помощью вакуумного концентрирования, а сконцентрированный водный раствор олигонуклеотида разбавляется в перхлоратном буфере для хроматографической очистки. Примеси синтеза и остаточные низкомолекулярные компоненты реагентов удаляется методом препаративной анионообменной хроматографии на 150 мл колонне с АО-носителем Source 15Q (GE Healthcare). После 3 циклов хроматографической очистки проводили один цикл концентрирования методом тангенциальной фильтрации (использовалась многоразовая регенерируемая кассета Sartorius Slice PES для фильтров Sartocon с номинальным отсечением по молекулярному весу 1 кДа). Контроль качества осуществлялся с помощью ВЭЖХ-системы Agilent Series 1200 с анионообменной колонной DNA РАС 100 («Dionex», США) длиной 25 см, внутренним диаметром 2 мм. Потери на тангенциальную фильтрацию аминопроизводного составляют порядка 8%, в результате чего получают препарат олигонуклеотида с содержанием основного компонента не менее 85%.
Коньюгация аминомодифицированного производного олигонуклеотида RA-36 и N-сукцинимидного производного ПЭГ
Наработанные продукты исходного аминопроизводного олигонуклеотида RA-36 были использованы для проведения реакций конъюгации с N-сукцинимидным производным полиэтиленгликоля молекулярной массой 20 кДа. Пегилирование модифицированного олигонуклеотида проводили в буферном растворе со значением рН=8,5 (буфер Theorell-Stenhagen с содержанием органической фазы диметилсульфоксида (ДМСО) в соотношении 1 объем водного буфера: 0,5 объема органической фазы) при постепенном прибавлении шести 0,5 молярных эквивалента ПЭГ к молярному эквиваленту олигонуклеотида с последующей инкубацией раствора в течение 30 минут при 37°С; всего за реакцию прибавляют 3 эквивалента полиэтиленгликоля. Контроль протекания процесса осуществлялся с помощью метода АО-ВЭЖХ. Реакцию прекращали путем разбавления смеси водой мили-Q качества. Выход целевого продукта на стадии проведения конъюгации составлял около 77%, анализ продукта с помощью ВЭЖХ показан на Рис. 5.
Для удаления непрореагировавшего с ПЭГ олигонуклеотида и не удаленных на препаративной хроматографии олигонуклеотидных примесей удобно использовать процедуру переосаждения конъюгата по следующей методике. На 30 мл реакционной смеси внести 3 мл 5 М водного раствора перхлората натрия, после чего добавить 100 мл ацетона (ХЧ), расфасовать в 50 мл пробирки типа фалькон и открутить раствор на центрифуге (15 мин, 3000 rpm). После центрифугирования отдекантировать полученный раствор от осадка. В осадке содержатся непрореагировавший олигонуклеотид и примеси сходной природы. Пегилированный аптамер содержится в растворе, из которого после декантирования при слабом нагревании под вакуумом удаляется ацетон. Избыток непрореагировавшего ПЭГ удаляется препаративной анионообменной хроматографией; в качестве подвижной фазы используется 10 mM Tris, 50 mM NaCl, в качестве элюента -10 mM Tris, 700 mM NaCl. Непрореагировавший ПЭГ элюируется практически сразу после инжекции, для его детекции первые фракции после очистки анализируются по поглощению при длине волны 280 нм. Единичный пик поглощения (пегилированный олигонуклеотид) с хроматографической очистки обессаливается и концентрируется методом тангенциальной фильтрации. Полученный раствор сушится в течение 1,5 суток лиофилизацией, после чего передается на преформирование. Полученные экспериментальные данные позволяют заключить, что разработанная технология оптимизирована по сравнению с ранее описанными в литературе за счет выбора подходящих составов рабочих реагентов и оптимизации параметров процесса синтеза, таких как пропуск этапа кэппирования во второй половине синтеза, обработка синтезированной последовательности перед депротекцией и отщепления от PS-носителя 20% раствором N,N-диалкиламина, использование дихлоруксусной кислоты на этапе детритилирования и др.
Таким образом, вышеперечисленные примеры позволяют высоко оценить потенциал модифицированного и пегилированного аптамера RA-361 как возможного лекарственного средства для лечения тромбозов. Высокая функциональная активность, достигнутая ранее для аптамера первого поколения RA-36 (Zavyalova Е et al, "Evaluation of antithrombotic activity of thrombin DNA aptamers by a murine thrombosis model" PLoS One, 2014 Sep 5; 9(9): e107113), сохранилась и в пегилированном варианте RA-361 (см. Рис. 2 и Рис. 3). Необычная модульная структура аптамера RA-36 сделала возможным присоединение молекулы ПЭГ к центральной части аптамера без существенного снижения его активности. Это отличает его от предыдущих аналогов, описанных в литературе, где присоединение ПЭГ происходило по концевым нуклеотидам. Кроме того, в результате пегилирования существенно возросло время нахождения в кровотоке, что позволит использовать этот препарат для обеспечения длительного антитромбинового эффекта. Далее, препарат RA-361 показал низкую токсичность в доклинических исследованиях на животных, что делает его вероятным кандидатом для клинических испытаний. Наконец, было тщательно отработано масштабирование процесса синтеза RA-361 для обеспечения количеств аптамера, достаточных для клинических испытаний.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования значимости настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.