СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА НЕВЫНАШИВАНИЯ ПЕРВОЙ ПОЛОВИНЫ БЕРЕМЕННОСТИ
METHOD OF PREDICTING RISK OF MISCARRIAGE IN FIRST HALF OF PREGNANCY

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано в диагностике.
Невынашивание беременности является одной из наиболее актуальных проблем здравоохранения и современного акушерства. Частота невынашивания первой половины беременности, по мнению разных авторов, составляет от 10% до 25%, причем в I триместре она достигает по некоторым данным 50% (Сидельникова В.М. Подготовка и ведение беременности у женщин с привычным невынашиванием: Методические пособия и клинические протоколы. - М.: - МЕДпресс-информ, 2010. - 219 с.). Невынашивание беременности является мультифакториальной патологией, основными причинами которой являются гормональные, инфекционные, аутоиммунные, анатомические, физиологические нарушения (Серов В.Н., Тихомиров А.Л., Лубнин Д.М. Современные принципы терапии воспалительных заболеваний женских половых органов: Методическое пособие для врачей акушеров-гинекологов. - М., 2003). Особое место среди причин невынашивания беременности занимают генетические нарушения. Аномалии кариотипа являются основной причиной репродуктивных потерь на сроке менее 8 недель, на более поздних сроках гестации большую роль играет поддержание нормального гомеостаза материнского организма, все молекулярно-биохимические процессы в котором являются генетически детерминированными.
Существует ряд способов прогнозирования риска невынашивания беременности, имеющих как свои плюсы, так и недостатки.
Известен способ прогнозирования невынашивания беременности с применением ультразвукового исследования органов малого таза и определения в сыворотке крови прогестерона, хорионического гонадотропина и уровня альфа-2-микроглобулина в сыворотке крови (RU 2004135161 A, Краснопольский и др., 2006). Недостатком данного способа является низкая специфичность, отсутствие единственной прямой взаимосвязи уровня перечисленных гормонов с невынашиванием беременности, невозможность использования данного метода во втором триместре гестации и в качестве преконцепционного обследования.
Известен способ прогноза невынашивания беременности путем определения содержания цитокинов в периферической крови и слизи цервикального канала у женщин с невынашиванием беременности инфекционного генеза по уровню ИФН-γ и ИЛ-8 в периферической крови и слизи цервикального канала, повышение которых служит маркерами неблагополучия на ранних этапах беременности (Т.Н. Сумеди, Л.В. Ганковская, Е.Н. Долгина и др. Содержание цитокинов в периферической крови и слизи цервикального канала у женщин с невынашиванием беременности инфекционного генеза // Российский журнал иммунологии, 2005 г. - т. 9, - № 2. - стр. 93-102). Недостатком вышеуказанного способа является возможность использования только в I триместре беременности.
Также описан способ прогнозирования угрозы прерывания на ранних сроках с помощью определения в периферической крови концентрации фактора, угнетающего миграцию лейкоцитов до и после однократной иммунизации донорскими лейкоцитами (RU 2014598 С1, ИИИ материнства и детства, 15.06.1994). Недостаток способа заключается в сложности и трудоемкости его выполнения, невозможности использования для прогнозирования невынашивания во II триместре и использования в комплексе предгравидарной подготовки.
Известен способ прогнозирования угрозы прерывания беременности по определению концентрации эстриола, плацентарного лактогена и интерлейкина (ИЛ)-6 в сыворотке крови (RU 2285926 С2, УНИИ охраны материнства и младенчества, 20.10.2006). Недостатками данного способа является его неспецифичность.
Описан другой способ прогнозирования невынашивания беременности с использованием ультразвуковой оценки маточно-плацентарного кровотока (Игнатко И.В., Стрижаков А.Н. / Акуш. и гин., 1997. - № 1. - С. 23-26). Недостатками способа является необходимость специального технического оснащения, большие временные затраты.
Наиболее близким к заявленному является способ прогнозирования риска невынашивания беременности у супружеских пар путем генотипирования на наличие полиморфизма гена SOD2, при котором носительство генотипа С/С или генотипа Т/С повышает риск невынашивания беременности (RU 2454669 С1, ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, 27.06.2012 - прототип). Недостатком данного способа является необходимость обследования обоих супругов, что сопряжено с техническими трудностями.
Настоящее изобретение направлено на прогнозирование невынашивания беременности с минимальными техническими затратами, не требующими многократных повторных обследований.
Патентуемый способ прогнозирования риска невынашивания первой половины беременности состоит в выделении ДНК из периферической крови пациентки с последующим генотипированием. Отличие состоит в том, что при выявлении аллеля А полиморфизма G1947A rs-4680 гена катехол-О-метилтрансфераза СОМТ риск невынашивания беременности оценивают как высокий.
Технический результат - выявление специфичности генетических маркеров повышенного риска невынашивания первой половины беременности и возможность использования в комплексе предгравидарной подготовки.
В основе патентуемого способа лежат следующие положения. Известно, что все физиологические процессы организма являются генетически детерминированными и оказывают влияние на течение беременности. Одной из таких систем является система обмена катехоламинов, активирующихся в условиях стресса. Стресс является важнейшим приспособительным механизмом, однако в условиях хронического длительного воздействия даже слабого дестабилизирующего фактора развивается истощение защитных ресурсов организма с нарушением функций всех органов и систем. Основными активными веществами, отвечающими за адаптацию во время стресса, являются биогенные амины - катехоламины. Они проявляют двойственные функции, являются гормонами, регулируя все звенья обмена веществ в организме, а также играют роль нейромедиаторов в передаче сигнала между клетками. Физиологическая активность катехоламинов обусловлена способностью связываться со специфическими восприимчивыми структурами в эффекторной клетке - адренорецепторами, потенциируя ответ в органах мишенях посредством связывания с α- и β-адренорецепторами (Агаджанян Н.А. Нормальная физиология: учеб. / Н.А. Агаджанян, В.М. Смирнов. - М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2007). Иннервация матки осуществляется путем взаимодействия симпатических и парасимпатических нервных волокон, оказывающих неодинаковое влияние на функциональное состояние миометрия, однако совместно реализующих главную задачу: сохранение либо прерывание беременности. В условиях гиперпродукции катехоламинов возникает гипертонус миометрия, нарушение маточно-плацентарного кровотока. В организме функцию распада и элиминации катехоламинов выполняет моноаминоксидаза (МАО) и цитозольный фермент катехол-О-метилтрансфераза (СОМТ) (Лычкова А.Э. Серотонинергическая нервная система: градиенты нервных влияний в норме и патологии / Лычкова А.Э. // Экспер. клин. гастроэнтерол. - 2003. - № 6. - С. 114-120).
При наличии аллелей гена СОМТ с нормальной активностью фермета происходит адекватная катализация катехоламинов, в результате чего поддерживаются физиологические концентрации нейромедиаторов в организме. При наличии вариантных аллелей в гене количество и активность фермента снижены, что сопровождается дисбалансом уровня катехоламинов, особенно в условиях их гиперпродукции. Изучаемый нами полиморфизм G1947A rs-4680, при котором происходит замена в локусе 1947 азотистого основания гуанина на аденин, с заменой валина на метионин в аминокислотной последовательности белка приводит к выработке фермента катехол-О-метилтансферазы со сниженной активностью. При этом доказано, что у носителей генотипа G/G наблюдается экспрессия полноценного фермента, гетерозиготы G/A отличают некоторое снижение активности СОМТ, у гомозигот по мутантному аллелю А (генотип А/А) наблюдается 3-4-кратное снижение активности фермента, по сравнению генотипом дикого типа. Описанный полиморфизм по данным разных авторов играет роль в развитии болезни Альцгеймера, онкологических и других заболеваний. Woo, J.-M., Yoon, K.-S., Yu, B.-H. Catechol O-methyltransferase genetic polymorphism in panic disorder. Am. J. Psychiat. 159: 1785-1787, 2002. [PubMed: 12359690]. The Val158Met polymorphism in the COMT gene is associated with increased cancer risks in Chinese population. Tian C, Liu L, Yang X, Wu H, Ouyang Q. Tumour Biol. 2013 Dec 5. [Epub ahead of print] PMID: 24307619.
Нами было проведено обследование 274 женщин, из которых у 151 пациентки отмечались 2 и более эпизода репродуктивных потерь в анамнезе на сроке более 7 недель беременности, исключая тяжелую хромосомную патологию эмбриона и потерю беременности, наступившей в результате ЭКО. В качестве группы сравнения были отобраны 123 женщины с 2 и более беременностями в анамнезе, протекавшими без угрозы прерывания и закончившимися самопроизвольными родами, исключая эпизоды потери беременности в анамнезе.
На основании проведенного генотипирования всех пациенток на предмет частот встречаемости аллелей rs-4680 гена СОМТ получены результаты, представленные на фигуре.
В группе пациенток с репродуктивными потерями гомозигота G/G выявлена всего в 13,30% случаев (n=12), что оказалось почти в два раза ниже по сравнению со здоровыми женщинами, где частота генотипа G/G достигала 33% (n=37).
Аллель А является неблагоприятным, так как по данным литературы сопряжен со снижением активности фермента при носительстве генотипа А/А и G/A.
Согласно полученным данным гомозиготный генотип А/А встречался у пациенток основной группы в 29% случаев (n=26), в контрольной группе этот показатель составил 24,4% (n=28).
Что касается гетерозиготного генотипа G/A, то в нашем исследовании он оказался наиболее часто встречающимся и среди пациенток с невынашиванием беременности выявлен в 57, 80% (n=52), против здоровых женщин, у которых этот показатель составил 42,47% (n=48).
2
С целью выяснения характера проявления наследуемого признака в гетерозиготном состоянии среди пациенток с невынашиванием беременности нами был проведен аддитивный тест Кохрана-Армитажа. По результатам было установлено, что у пациенток основной группы имеется доминантная модель наследования аллеля А, из чего следует что оба генотипа А/А и G/A являются рисковыми по развитию невынашивания беременности у данных пациенток, χ=5,47, р=0,02.
Для оценки отношения шансов мы провели сравнение по двустороннему точному критерию Фишера, в результате чего было установлено, что аллель А ассоциирован с повышенным риском потери беременности в первые 20 недель гестации (OR=1,61, р=0,02, 95% df=1,06-2,43).
Таким образом, приведенные результаты подтверждают достижение технического результата: носительство аллеля A rs4680 гена СОМТ повышает риск невынашивания первой половины беременности.
Способ осуществляют следующим образом.
Пациентке с невынашиванием первой половины беременности в перечень обследований включают генотипирование на предмет выявления аллелей rs4680 гена СОМТ, которое проводится в один этап на стандартном оборудовании для ПЦР-диагностики. Для проведения генотипирования образцы периферической крови помещали в ЭДТА, содержащие вакутейнеры. Хранение образцов осуществлялось при температуре -20°-80°C  вплоть до постановки реакции.
В ходе исследования проводилось выделение ДНК из образцов крови с использованием наборов реактивов Diatom DNA Prep 200 (Isogene Lab. Ltd, страна производитель Россия) согласно протоколу, заявленному производителем.
Для проведения ПЦР реакции используют лиофилизированные готовые наборы Master Mix (Фирма Изоген). В пробирки с лиофилизированным содержимым добавляют 10 мкл ПЦР-растворителя (входит в набор), 3 мкл праймеров (Евроген или Синтол и разводят деионизованной водой до концентрации 4 оптические единицы), 2 мкл деионизованной воды, 5 мкл исследуемой ДНК. Общий объем реакционной смеси составляет 20 мкл. После соединения компонентов реакции пробирки откручиваются на вортексе и ставятся в амплификатор.
Электрофорез амплифицированных фрагментов ДНК проводили в 2%-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Параметры источника тока (напряжение 150 В, сила тока 50 мА, расстояние между электродами 15 см).
При выявлении аллеля А полиморфизма rs-4680 гена СОМТ пациентку относят к группе высокого риска невынашивания беременности.
Достижение технического результата подтверждено нижеследующими клиническими примерами.
Пример 1. Пациентка А., 32 лет. В анамнезе 2 эпизода невынашивания беременности на сроке 9-11 недель. В план предгравидарной подготовки к планируемой беременности было включено генотипирование на выявление полиморфизма гена СОМТ. По результатам обнаружен генотип А/А полиморфизма rs-4680, на основании чего пациентка была отнесена в группу высокого риска невынашивания беременности. В дальнейшем была проведена профилактика, после чего через 6 месяцев у пациентки наступила самопроизвольная беременность, спустя 9 месяцев закончившаяся срочными самопроизвольными родами.
Пример 2. Пациентка К., 28 лет. В анамнезе привычное невынашивание беременности. Поступила в отделение гинекологии с диагнозом: Беременность 8 недель, начавшийся выкидыш. При комплексном обследовании выявлено носительство аллеля A rs-4680 в гетерозиготном состоянии (генотипа G/A) гена СОМТ, однако пациентка не была отнесена в группу высокого риска невынашивания беременности и ей проводился стандартный курс лечение для пролонгирования беременности. Спустя 10 дней у пациентки произошел неполный самопроизвольный выкидыш. В течение следующего года пациентка получала должную терапию с учетом результатов генотипирования. После чего самостоятельно наступила беременность с исходом в нормальное родоразрешение.
Пример 3. Пациентка Л., 35 лет. В анамнезе одна беременность, закончившаяся самопроизвольным выкидышем. Поступила в отделение с диагнозом: Беременность 11 недель, угроза выкидыша. В ходе обследования было произведено генотипирование на предмет распределения частот аллелей rs-4680 гена СОМТ, выявлен генотип А/А, пациентка была отнесена к группе высокого риска потери беременности. Комплекс терапии подобран с учетом результатов генотипирования. После проведенного лечения пациентка выносила беременность и родила здорового ребенка.
Пример 4. Пациентка Т., 25 лет. Невынашивания беременности в анамнезе нет. Поступила с диагнозом: Неполный выкидыш при беременности 9 недель. Пациентке было произведено инструментальное удаление остатков плодного яйца. Послеоперационный период протекал без осложнений. Амбулаторно в последующем было проведено генотипирование, выявлен генотип G/G полиморфизма rs-4680 гена СОМТ, пациентка не отнесена к группе высокого риска невынашивания беременности и не получала специально профилактической терапии. Спустя год у пациентки наступила самопроизвольная беременность, закончившаяся нормальными родами на сроке 38 недель.
Таким образом, представленные результаты подтверждают возможность использования генетических маркеров повышенного риска невынашивания первой половины беременности и их использование в комплексе предгравидарной подготовки. Это дает возможность проводить раннюю профилактику со снижением риска потери беременности в первые 20 недель гестации, что благоприятно для демографической ситуации.