N-ГЛИКОЗИДЫ ИНДОЛО[2,3-a]ПИРРОЛО[3,4-c]КАРБАЗОЛОВ, ОБЛАДАЮЩИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ
N-GLYCOSIDES OF INDOLO[2,3-a]PYRROLO[3,4-c]CARBAZOLES HAVING ANTITUMOUR ACTIVITY

Изобретение относится к области фармацевтической химии и касается новых производных индолопирролокарбазолов, обладающих противоопухолевой активностью.
Известны производные N-гликозидов индоло[2,3-а]карбазолов, обладающие высокой противоопухолевой активностью. К их числу относятся природный антибиотик ребеккамицин [патенты США 4487925, 4552842], его модифицированный аналог [патент США 4785085], а также соединение NB-506 [Tomoko Yoshinari, Mami Matsumoto, at al., Cancer Res., 1995, 55, p. 1310-1315; Hiroharu Arakawa, Tomoko Iguchi, at al., Cancer Res., 1995, 55, p. 1316-1320] и эдотекарин [WO 096/04293 и WO 097/09339]. Структура этих соединений представляет собой малеимид индоло[2,3-а]карбазола, в котором один из индольных атомов азота связан с остатком моносахарида гликозидной связью.
Недостатками вышеперечисленных аналогов являются высокая токсичность, низкая растворимость соединений.
Наиболее близкими к заявляемым соединениям являются соединения N-гликозиды индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-дионов [патент РФ №2427585] (прототип).
Недостатками соединений являются высокая токсичность при применении относительно невысоких доз соединений, отсутствие пролонгированного эффекта.
Задачей изобретения является получение новых соединений этого ряда, обладающих противоопухолевой активностью, пролонгированным действием и меньшей токсичностью при применении более высоких доз соединений.
Заявляемые соединения содержат различные заместители по имидному атому азота в сочетании с различными углеводными фрагментами общей формулы I:
где Gly - остатки пентоз (L-арабинозы, D-рибозы, D-ксилозы) и гексозы (D-галактозы), R - аминогруппа, бензамидогруппа, (пиридин-2-ил) аминогруппа, ацетамидогруппа или карбамидогруппа.
Для получения заявляемых соединений в качестве исходных соединений были использованы N-гликозиды индоло[2,3-а]фурано[3,4-с]карбазол-5,7-дионов [патент РФ №2427585] и 6-амино-индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-дионов, полученные при обработке ацетилированных гликозидов индолофуранокарбазолов гидразин-гидратом при температуре 50С в течение 2 часов.
Технический результат заявляемого изобретения состоит в получении новых соединений, обладающих противоопухолевой активностью с пролонгированным эффектом, меньшей токсичностью при применении более высоких доз соединений на более широкой панели опухолей.
1
1
Заявляемые соединения охарактеризованы данными спектров Н-ЯМР и масс-спектров высокого разрешения. Спектры H-ЯМР записаны на приборе Bruker DRX-500 с программным обеспечением, внутренний стандарт - тетраметилсилан, химические сдвиги δ приведены в миллионных долях (м.д.). При описании формы сигналов приведены следующие сокращения: с - синглет, д - дублет, т - триплет, м - мультиплет, дд - дублет дублетов, уш. с. - уширенный синглет; значения констант спин-спинового взаимодействия J приведены в герцах. Масс-спектры зарегистрированы на масс-спектрометре Finnigan МАТ 8430 с системой обработки данных SS-300 при ускоряющем напряжении 3 кВ, энергии ионизирующих электронов 70 эВ, температуре источника ионов 250С, температуре испарения образца 170-250С, с применением системы прямого ввода вещества в область ионизации. Приведены значения m/z (отношение массы частиц к заряду). Аналитическую тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на силуфоле.
Получение заявляемых соединений иллюстрируется примерами 1-6.
Пример 1.
Получение 6-амино-12-(α-L-арабинопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона (1).
+
К 0,55 г (0.9 ммоль) 13-формил-12-(2,3,4-три-O-ацетил-α-L-арабинопиранозил)индоло[2,3-а]фурано[3,4-с]карбазол-5,7-диона добавляли 3.2 мл (65.25 ммоль) гидразин-гидрата, смесь выдерживали при температуре 50С в течение двух часов, охлаждали до температуры 22С, выливали в воду. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали 10% спиртом. Выход 6-амино-12-(α-L-арабино-пиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона составил 0.37 г (89%). Масс-спектр: М 457 m/z.
1
6
1′2′
2
H-ЯМР (DMSO-d, δ м.д.): 12.15 (с, 1H, NH-индол), 9.23 (д, 1Н, Ar), 9.14 (д, 1H, Ar), 7.94 (д, 1H, Ar), 7.70 (д, 1H, Ar), 7.62 (т, 1H, Ar), 7.59 (т, 1H, Ar), 7.41 (т, 1H, Ar), 7,37(т, 1Н, Ar), 6.11 (д, 1H, H1′, J 9.1), 6.86, 5.38, 5.24 (3 уш с, 3H, 2′, 3′, 4′-OH), 4.99 (2H, c, NH), 4.20-4.05 (м, 3H, H2′, Н3′, H5″), 4.25 (м, 1H, H5′), 3.85 (м, 1H, H4′).
Пример 2.
Получение 6-амино-12-(β-D-галактопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона (2).
+
Пирролокарбазол (2) получали из 13-формил-12-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-галактопиранозил)индоло[2,3-а]фурано[3,4-с]карбазол-5,7-диона аналогично способу получения соединения (1). Выход 6-амино-12-(β-D-галактопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона 80%. Масс-спектр: М 502 m/z.
1
6
1′2′
2
Н-ЯМР (DMSO-d, δ м.д.): 12.17 (с, 1H, NH-индол), 9.23 (д, 1Н, Ar), 9.13 (д, 1H, Ar), 7.96 (д, 1Н, Ar), 7.70 (д, 1Н, Ar), 7.62 (т, 1H, Ar), 7.59 (т, 1H, Ar), 7.40 (м, 1H, Ar), 7,36 (т, 1H, Ar), 6.19 (д, 1H, Н1′, J. 9.2), 6.84, 5.36, 5.22, 4.85 (4 уш с, 4Н, 2′, 3′, 4′, 6′-OH), 4.99 (2Н, с, NH), 4.25 (м, 1Н, Н2′), 4.17-4.12 (м, 2Н, Н4′, Н5′), 3.86 (м, 1H, Н3′), 3.73 (м, 1H, Н6″а), 3.66 (м, 1H, Н6″b).
Пример 3.
Получение 6-ацетамидо-12-(α-L-арабинопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона (3).
f
+
К смеси, состоящей из 2.5 мл метанола и 5.0 мл тетрагидрофурана, добавляли 56 мг (0.12 ммоль) 6-амино-12-(α-L-арабинопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона, затем 0.2 мл (0.002 ммоль) уксусного ангидрида. Реакционную массу перемешивали в течение 4 часов при температуре 22°C, затем добавляли 4.0 мл 50% водного метанола. Смесь выдерживали в течение 30 минут, упаривали досуха, добавляли 5.0 мл воды. Образовавшийся осадок отфильтровывали и с помощью препаративной хроматографии на силикагеле в системе бензол-ацетон в соотношении 5:6 из зоны с R 0.5 выделяли 31 мг соединения. Выход 6-ацетамидо-12-(α-L-арабинопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона составил 55%. Масс-спектр: М 514 m/z
1
6,
1′2′
Н-ЯМР (DMSO-d δ м.д.): 12.24 (д, 1Н, NH-индол), 10.72 (д, 1H, NHAc), 9.12 (д, 1H, Ar), 9.06 (д, 1H, Ar), 8.02 (д, 1H, Ar), 7.74 (д, 1Н, Ar), 7.68 (м, 2Н, Ar), 7.40 (м, 2Н, Ar),7.15, 5.67, 5.55 (уш с, м 3Н, 3-ОН), 6.45 (1Н, д, Н1′ J 9.0), 4.2-4.05 (м, 4Н, Н2′, Н3′, Н5′, Н5″), 3.39 (м, 1Н, Н4′).
Пример 4.
Получение 6-(пиридин-2-иламино)-12-(β-D-рибопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с] карбазол-5,7-диона (4).
К 1,51 г (2.7 ммоль) 12-(2,3,4-три-О-ацетил-β-D-рибопиранозил)индоло[2,3-а]фурано[3,4-с]карбазол-5,7-диона в 30 мл метанола добавляли 0.58 г (5.3 ммоль) гидразинопиридина. Далее реакционную смесь кипятили 20 минут. Растворитель упаривали, к остатку добавляли 30 мл воды. Выпавший осадок отфильтровывали, высушивали и получали 1,5 г ацетилированного рибозида 6-(пиридин-2-иламино)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона.
+
Затем к 1,50 г (2.2 ммоль) полученного ацетилированного рибозида в 50 мл абсолютного метанола добавляли 17,2 мл 0,1 н. раствора метилата натрия в метаноле. Реакционную смесь перемешивали при температуре 22°C в течение 15 минут. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали горячим ацетоном и высушивали. Выход 6-(пиридин-2-иламино)-12-(β-D-рибопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона составил 1,11 г.(91%). Масс-спектр: М 549 m/z.
1
6
Н-ЯМР (DMSO-d, δ м.д.): 11.72 (c, 1H, NH-индол), 9.36 (с, 1H, NH-Py), 9.14 (д, 1Н, Ar), 9.06 (д, 1H, Ar), 8.08-7.35 (м, 8HAr, Ру), 6,90-6,66 (м, 2Н, Ру), 6,27 (д, 1H, Н′), 5.25-3.85 (м, 5Н, Н2′, Н3′, Н4′, Н5′, Н5″).
Пример 5.
Получение 6-(бензамидо)-12-(β-D-галактопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона (5).
f
+
К 45 мг (0.09 ммоль) 6-амино-12-(β-D-галактопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона добавляли 0,05 мл (0.43 ммоль) бензоилхлорида. Смесь перемешивали при температуре 22°C в течение двух часов. Раствор упаривали, остаток хроматографировали на силикагеле в системе хлороформ : метанол : тетрагидрофуран в соотношении 4:1:1. Из зоны с R 0,53 выделяли 26 мг 6-(бензамидо)-12-(β-D-галактопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона. Выход составил 47,7%. Масс-спектр M 606 m/z.
1
6
1′2′
Н-ЯМР (DMSO-d, δ м.д.): 12.2 (уш. с, 1H, NH-индол), 9.18 (д, 1H, Ar), 9.07 (д, 1H, Ar), 8.06 (д, 1H, Ar), 8.00 (д, 1H, Ar), 7.75 (д, 1H, Ar), 7.70-7.57 (м, 7Н, Ar, NH-Bz), 6.22 (д, 1H, Н′, J, 7.0), 5.42, 5.28, 4.35, 4.18 (4 уш с, 4Н, 2′, 3′, 4′, 6′-ОН), 4.14 (т, 1Н, Н4′), 3.85 (дд, 1Н, Н2′), 3.76 (м, 1Н, Н5′), 3.67 (дд, 1Н, Н3′), 3.33 (м, 2Н, Н6′, Н6″).
Пример 6.
Получение 6-(карбамидо)-12-(β-D-ксилопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона (6).
К 100 мг (0.17 ммоль) 12-(2,3,4-три-O-ацетил-β-D-ксилопиранозил)индоло[2,3-а]фурано[3,4-с]карбазол-5,7-диона в 5 мл метанола добавляли 46,5 мг (0.42 ммоль) семикарбазида гидрохлорида и 58,4 мл (0.42 ммоль) триэтиламина. Смесь кипятили 3 часа, растворитель упаривали. К остатку добавляли воду. Образовавшийся осадок отфильтровывали, высушивали. Выход ацетилированного ксилопиранозида 6-(карбамидо)-индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона составил 80 мг.
+
Далее к 80 мг ацетилированного ксилопиранозида (0.125 ммоль) в 2,5 мл абсолютного метанола добавляли 0,6 мл 0,1 н. раствора метилата натрия в метаноле. Реакционную смесь перемешивали при температуре 22°C в течение 5 минут. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой, высушивали и получали 45 мг 6-(карбамидо)-12-(β-D-ксилопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона. Выход продукта составил 70%. Масс-спектр M 515 m/z.
1
6
Н-ЯМР (DMSO-d, δ м.д.): 11.87 (с, 1H, NH-индол), 9.20 (д, 1H, Ar), 9.12 (д, 1H, Ar), 8.65 (уш с, 1H, NH), 8.04 (д, 1H, Ar), 7.97(с, 1Н, NH), 7.81(д, 1Н, Ar), 7.62-7.57 (т, 1Н, Ar), 6,42 (2Н, с NH2), 6.40(2Н, д, Н1′), 5.40-3.30 (м, 5Н, Н2′, Н3′, Н4′, Н5′, Н5″).
Исследование цитотоксической активности соединений (1-6) in vitro
Исследование цитотоксической активности соединений (1-6) проводили на клетках рака толстой кишки человека линии НСТ-116:
6-амино-12-(α-L-арабинопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона, (1);
6-амино-12-(β-D-галактопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона, (2);
6-(ацетамидо)-12-(α-L-арабинопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7-диона, (3);
6-(пиридин-2-иламино)-12-(β-D-рибопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло-[3,4-с]карбазол-5,7-диона, (4);
6-(бензамидо)-12-(β-D-галактопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло-[3,4-с] карбазол-5,7-диона, (5);
6-(карбимидо)-12-(β-ксилопиранозил)индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с] карбазол-5,7-диона, (6);
2
Опухолевые клетки выращивали на среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка, при 5% содержании CO и температуре 37°C. Цитотоксическую активность соединений (1-6) оценивали по выживаемости клеток, которую определяли с помощью стандартного МТТ-теста с использованием МТТ-реагента (3,4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолиум бромид), основанного на способности дегидрогеназ живых метаболически активных клеток восстанавливать МТТ-реагент до голубых нерастворимых кристаллов формазана [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005, М., с 649-651].
Исследования выполняли на 96-луночных микропланшетах. Опухолевые клетки рассевали в 180 мкл культуральной среды и выращивали в течение 24 час. Затем добавляли соединения (1-6) в концентрациях от 0,01 до 100 мкМ в объеме 20 мкл. Время инкубации соединений (1-6) с клетками опухолевых линий составляло 48 час. Контролем служили образцы клеток, к которым соединения (1-6) не добавляли. Через 48 час к клеткам добавляли МТТ-реагент в конечной концентрации 0,5 мкг/мл и инкубировали в течение 2 час. Выпавшие кристаллы формазана растворяли в 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) в течение 20 мин при температуре 37°C. Далее оптическое поглощение окрашенных растворов измеряли на счетчике оптического поглощения при длине волны 540 нм. При этом оптическое поглощение растворенного в ДМСО формазана коррелировало с количеством оставшихся живых клеток в пробе. Выживаемость клеток для каждой концентрации соединений (1-6) определяли по формуле в (%):
о
к
(П/П)×100,
о
к
где П - оптическое поглощение растворенного в ДМСО формазана в опытных образцах, П - оптическое поглощение растворенного в ДМСО формазана в контрольных образцах.
50
50
На основании полученной кривой «доза-эффект» вычисляли значение ингибирующей концентрации (IC, мкМ) соединения, при которой поглощение формазана в опытных образцах составляло 50% от контрольных образцов. Соединение считали активным, если IC была равна или менее 50 мкМ. Ошибка измерений в экспериментах не превышала 5%.
50
Наиболее высокой цитотоксической активностью обладало соединение (1), при этом IC составило 0,5 мкМ, что послужило основанием изучить цитотоксическую активность соединения (1) на других клеточных линиях рака человека.
3
Соединение (1) было изучено на клетках меланомы MeWo, рака яичников SKOV, рака предстательной железы DU 145, рака толстой кишки LS174T, рака молочной железы MCF-7.
Изобретение иллюстрируется таблицами 1-4.
50
В табл.1 представлена цитотоксическая активность соединений (1-6) на линии клеток рака толстой кишки человека НСТ-116. Показано, что наибольшей цитотоксической активностью обладало соединение (1), при этом IC составило 0,5 мкМ.
3
3
50
50
В табл.2 представлена цитотоксическая активность соединения (1) на меланоме MeWo, раке яичников SKOV, раке предстательной железы DU 145, раке толстой кишки LS174T, раке молочной железы MCF-7. Выявлена высокая цитотоксическая активность соединения (1) на клеточных линиях рака толстой кишки LSI74 Т и рака яичников SKOV; при этом IC составила 0,8 мкМ. Цитотоксическая активность на клеточных линиях рака предстательной железы DU 145, меланомы MeWo и рака молочной железы MCF-7 была ниже и показатели IC составляли 1,8 мкМ, 2,6 мкМ и 10 мкМ, соответственно.
Соединение (1), обладающее максимально выраженной цитотоксической активностью, было изучено in vivo на перевиваемых опухолях мышей.
Исследование противоопухолевой активности соединения (1) in vivo
1
57
Противоопухолевую активность изучали на перевиваемых опухолях мышей линий СВА, BALB/c и мышах гибридах первого поколения BDF(CB1/6×DBA/2) массой 18-25 г, которых получали из отдела экспериментальных животных ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН и содержали в виварии на обычном рационе питания.
Противоопухолевую активность изучали на четырех моделях солидных опухолей мышей: эпидермоидной карциноме легкого Льюис (LLC), меланоме (В-16), раке шейки матки РШМ-5 (РШМ-5), аденокарциноме толстой кишки АКАТОЛ (АКАТОЛ) и на трех асцитных опухолях: лимфоцитарной лейкемии Р-388 (Р-388), лимфоидной лейкемии L1210 (L1210), опухоли Эрлиха.
1
Опухолевые клетки LLC и меланомы В-16 перевивали мышам- гибридам BDF, РШМ-5 мышам-самкам линии СВА, клетки аденокарциномы толстой кишки АКАТОЛ-мышам линии BALB/c, подкожно в правую подмышечную область по 0,5 мл взвеси опухолевых клеток при разведении 1:10 в среде 199.
Противоопухолевую активность оценивали по торможению роста опухоли (ТРО) и увеличению продолжительности жизни (УПЖ) опытных по сравнению с контрольными мышами.
1
6
Опухолевые клетки Р-388, L1210 и опухоли Эрлиха перевивали мышам-гибридам BDF внутрибрюшинно по 10 опухолевых клеток в 0,3 мл асцитной жидкости при разведении ее средой 199. Критерием оценки противоопухолевой активности являлось только УПЖ.
Введение соединения (1) начинали через 24 час после перевивки асцитных опухолей и через 48 час после перевивки солидных опухолей, при этом непосредственно перед введением соединение растворяли в ДМСО и разводили физиологическим раствором до 10% концентрации. Соединение (1) вводили ежедневно внутрибрюшинно в течение 5 дней в дозах 10 мг/кг, 25 мг/кг, 50 мг/кг, 75 мг/кг и 100 мг/кг.
Опытные группы при перевивке солидных опухолей состояли из 8 мышей, а при перевивке асцитных опухолей - из 6 мышей. Контрольная группа включала 10-12 мышей.
Для оценки ТРО измеряли три максимальных взаимно перпендикулярных размера опухоли (длина, ширина, высота) у каждой мыши и вычисляли ее объем, а затем определяли средний объем опухолей в группе. Измерение объема опухоли проводили каждые 3 дня, начиная с 1 дня после окончания введения соединения, когда размеры опухолей у мышей контрольной группы были измеримыми.
3
V (мм)=L×S×Н
ТРО вычисляли по формуле:
к
о
к
ТРО(%)=(V-V)/V×100, где
к
3
V - средний объем опухолей в контрольной группе (мм)
о
3
V - средний объем опухолей в опытной группе (мм)
Сравнительную оценку противоопухолевой активности по УПЖ проводили после гибели мышей от опухолевого процесса. Сначала определяли среднюю продолжительность жизни (СПЖ) в днях в опытной и контрольной группах, а затем вычисляли УПЖ по формуле:
о
к
к
УПЖ(%)=(СПЖ-СПЖ)/СПЖ×100, где
к
СПЖ - средняя продолжительность жизни мышей в контрольной группе (дни)
о
СПЖ - средняя продолжительность жизни мышей в опытной группе (дни)
Минимальными критериями противоопухолевой активности служили: ТРО≥50% и УПЖ≥25%.
Статистическую значимость результатов оценивали по критерию Стьюдента-Фишера. Статистически значимой противоопухолевую активность считали при р≤0,05.
Токсичность соединения оценивали по срокам ранней гибели мышей в опытной по сравнению контрольной группой, состоянию внутренних органов животных (селезенки, легких, наличию метастазов в легких) и изменению массы тела по сравнению с исходной.
В табл.3 показана зависимость противоопухолевой активности от дозы соединения (1) в диапазоне от 10 мг/кг до 100 мг/кг на LLC. При применении соединения (1) в дозах 75 мг/кг и 100 мг/кг отмечена высокая противоопухолевая активность на следующий день после окончания курса введения: ТРО составило 91% и 90% соответственно. При этом противоопухолевая активность оставалась статистически значимой в течение 15 дней после введения соединения: при значениях ТРО 53% и 58% соответственно. Максимально переносимой дозой соединения (1) была доза 100 мг/кг, которая вызвала гибель одной из 8 мышей.
Таким образом, доза 75 мг/кг соединения (1) являлась терапевтической при ежедневном внутрибрюшинном введении в течение 5 дней.
В табл.4 представлена противоопухолевая активность соединения (1) на других опухолях мышей: меланоме В-16, РШМ-5, АКАТОЛе, Р-388, L-1210, опухоли Эрлиха. Противоопухолевую активность соединения (1) в дозе 75 мг/кг наблюдали непосредственно после окончания его введения на меланоме В-16 и РШМ-5, при этом ТРО составило 91% и 97% соответственно. Противоопухолевая активность соединения (1) через неделю после окончания его введения снижалась при значении ТРО 58% и 52% соответственно.
Противоопухолевую активность соединения (1) в дозе 20 мг/кг наблюдали непосредственно после окончания введения на АКАТОЛе. ТРО составило 81% и до 29 дня сохранялось на уровне 56%. При этом УПЖ составило 16%.
Противоопухолевую активность соединения (1) на Р-338, на L-1210 и на опухоли Эрлиха оценивали по УПЖ, которое составило соответственно 91%, 47% и 193%.