О ВЗАИМОСВЯЗИ АУТОФАГИИ И АПОПТОЗА В ГИБЕЛИ КЛЕТОК КАРЦИНОМЫ ЛЕГКОГО А549, ИНДУЦИРОВАННОЙ CD437

о взаимосвязи аутофагии и апоптоза в гибели клеток карциномы легкого а549, индуцированной cd437

А.А. Вартанян, Д.А. Хоченков, Е.Н. Кособокова, В.С. Косоруков

ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России;

Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24

Контакты: Амалия Арташевна Вартанян zhivotov57@mail.ru

Введение. Синтетический ретиноид CD437, агонист у-рецептора ретиноевой кислоты (RARy), не только останавливает клеточный цикл, но и, в отличие от ретиноевой кислоты, индуцирует в опухолевых клетках RARy-независимый апоптоз посредством уникального механизма, не зависящего от пути, опосредованного рецепторами ретиноевой кислоты. Цель исследования — изучение взаимосвязи между апоптозом и аутофагией в CD437-индуцированной гибели клетки. Материалы и методы. В работе были использованы: 2D-культивирование клеток карциномы легкого А549, иммуноцитохи-мия, проточная цитофлуориметрия, флуоресцентная микроскопия.

Результаты. CD437в диапазоне концентраций от 0,2 до 5,0мкМ увеличивал количество PI-положительных клеток в культуре карциномы легкого А549. При концентрациях, близких к IC00, ретиноид снижал популяцию клеток в G2/M-фазе клеточного цикла и останавливал клеточный цикл в S-фазе. CD437дозозависимо увеличивал количество апоптотических клеток в присутствии нецитотоксических концентраций вортманнина, необратимого ингибитора антистрессовой киназы PI-3K, и LY294002, обратимого ингибитора. CD437 также активировал формирование аутофагосом, наблюдалось дозозависимое повышение интенсивности флуоресценции монодансилкадаверина, маркера аутофагии. Однако избирательного накопления LC-3B с возрастанием концентрации CD437 (0,1—5,0 мкМ) в клетках не наблюдалось, что позволяет сделать предположение об ингибировании слияния аутофагических вакуолей и лизосом. zVAD-fmk, необратимый ингибитор каспаз, не восстанавливал аутофагию в клетках А549, и уровень LC-3B существенно не менялся при увеличении концентрации CD437, что указывало на участие CD437 в слиянии аутофагосомы с лизосомой. При инкубировании клеток с нецитотоксическими концентрациями хлорокина, ингибитора терминальной стадии аутофагии, при концентрациях CD437, близких к IC00, живых клеток практически не оставалось. Аддитивный эффект CD437 и хлорокина в индукции гибели клеток А549 предполагает, что CD437участвует в слиянии аутофагосом и лизосом, необходимом для завершения катаболизма аутофагического материала.

Заключение. Полученные нами данные указывают на отмену CD437цитопротекторной функции аутофагии и запуск апоптоза, что позволяет поднять вопрос о комбинированной терапии CD437 с цитотоксическими препаратами в лечении карциномы легкого.

Ключевые слова: CD437, апоптоз, аутофагия, PI-ЗК-киназа, zVAD-fmk

Для цитирования: Вартанян А.А., Хоченков Д.А., Кособокова Е.Н., Косоруков В.С. О взаимосвязи аутофагии и апоптоза в гибели клеток карциномы легкого А549, индуцированной CD437. Российский биотерапевтический журнал 2020;19(4):65—73.

DOI: 10.17650/1726-9784-2020-19-4-65-73

CROSSTALK BETwEEN AUTOPHAGY AND APOPTOSIS IN CD437-INDUCED А549 LUNG CARCINOMA CELL DEATH

A.A. Vartanian, D.A. Khochenkov, E.N. Kosobokova, V.S. Kosorukov

N. N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology of the Ministry of Health of the Russian Federation;

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia

Introduction. Synthetic retinoids CD437, an agonist of the gamma retinoic acid receptor (RARy), not only induces growth arrest, but in contrast to retinoid acid, it also induces RARy-independent apoptosis in many tumor cells through a unique mechanism that is independent of the retinoic acid receptor-mediated pathway.

The aim of the study was to study the relationship between apoptosis and autophagy in CD437-induced cell death.

Materials and methods. In this study we used 2D-culturing of lung carcinoma cells A549, immunocytochemistry, flow cytometry and

fluorescence microscopy.

Results. CD437at concentrations between 0.2 and 5.0^M increased the number of Pi-positive cells in A549 lung cancer cells. The retinoid at concentrations close to IC00 reduced the cell population in the G2/M-phase and arrest cell cycle in the S-phase. CD437dose-dependent

increased the number of apoptotic cells in the presence ofnon-cytotoxic concentrations of wortmanin, an irreversible inhibitor of anti-stress kinase PI-3K, and LY200192, a reversible inhibitor. CD437also activated the biogenesis of autophagosomes, and there was a dose-dependent increase in the fluorescence intensity of monodansilkadaverine, a marker of autophagy. However, accumulation of LC-3B was not observed with an increase of CD437 concentration from 0.1 to 5.0 ^M suggesting that the fusion between autophagic vacuoles and lysosomes was inhibited. zVAD-fmk, an irreversible caspase inhibitor, did not restore autophagy in A549 cells, and LC-3B levels did not change significantly with the increasing of CD437concentration, indicating that CD437was involved in autophagosome-lysosome fusion. When cells grew with non-cytotoxic concentrations of chlorokine, a late stage autophagy inhibitor, there were virtually no living cells at CD437 concentrations close to IC0ff The additive effect of CD437 and chlorokine in inducing A549 cell death confirms that CD437 involved in fusion between autophagosomes and lysosomes required for final catabolism of autophagic material. Conclusions. The data obtained indicate that CD437 induced a failure of cytoprotective function of autophagy and apoptosis, that raise the question of combined therapy of CD437with cytotoxic drugs in the treatment of lung carcinoma

Key words: CD437, apoptosis, autophagy, PI-3K-kinase, zVAD-fmk

For citation: Vartanian A.A., Khochenkov D.A., Kosobokova E.N., Kosorukov V.S. Crosstalk between autophagy and apoptosis in CD437-induced A549 lung carcinoma cell death. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2020;19(4): 65-73. (In Russ.).

Введение

Термин «ретиноиды», обозначающий семейство природных и синтетических аналогов витамина А, был введен в практику в середине 1970-х годов [1]. Фактически это была 1-я фармакологическая группа, которая обратила на себя внимание в качестве средства профилактики рака [2]. Основанием послужили наблюдения, указывающие на то, что дефицит витамина А индуцирует развитие эпителиальных диспла-зий, и что здоровые ткани, предраковые состояния эпителия и эпителиальные опухоли по-разному реагируют на производные витамина А [3]. Начался поиск наиболее эффективной модификации витамина А, способной показать наилучший клинический ответ. В последние годы внимание исследователей все больше привлекает ретиноид CD437, который избирательно связывается с у-рецептором ретиноевой кислоты (RARy) и трансактивирует рецептор, запуская дифференцировку клеток [4]. Этот ретиноид также индуцирует апоптоз в различных типах опухолевых клеток с помощью механизма, независимого от пути, опосредованного RARy [5]. Его противоопухолевая активность была подтверждена на моделях ксенотрансплантатов животных, демонстрируя высокий потенциал для профилактики и/или лечения рака [6].

Современная цитотоксическая терапия опухоли направлена на уничтожение опухолевых клеток путем индукции в них программированной клеточной гибели 1-го типа — апоптоза. Однако атака на геном опухолевой клетки часто не дает нужной эффективности. Наиболее серьезным препятствием к повышению эффективности химиотерапии опухолей остается лекарственная устойчивость. Одной из широко обсуждаемых в последние годы причин резистентности к апоптозу является активация аутофагии — процесса, при котором эндогенные макромолекулы клетки доставляются внутрь ее лизосом и подвергаются

в них деградации [7]. Опухолевая клетка использует аутофагию для преодоления неблагоприятных условий или нехватки питательных веществ и энергии. Аутофагия в таких условиях становится альтернативным источником субстратов и энергии в опухолевой клетке. На ранних стадиях опухолевой трансформации клетки аутофагия проявляет цитопротекторный эффект, способствуя утилизации опухолеассоци-ированных сигнальных белков для поддержания внутриклеточного гомеостаза. На поздних стадиях заболевания, при гипоксии, лучевой терапии или действии цитотоксических противоопухолевых препаратов аутофагия используется опухолевой клеткой как механизм выживания и может стать причиной лекарственной устойчивости и быстрой прогрессии опухоли [8].

Существование нескольких типов гибели в одной клетке позволяет допустить, что метаболические пути различных форм клеточной гибели могут встречаться, и конечная судьба клетки будет зависеть от уровня неблагоприятного воздействия. Цель настоящего исследования — изучение функциональных связей между апоптозом и аутофагией в гибели клетки, индуцированной CD437. Полученный нами экспериментальный материал позволяет предположить, что CD437, блокируя слияние аутофагосомы с лизо-сомой, отменяет цитопротекторную функцию ауто-фагии и запускает апоптоз.

Материалы и методы

Материалы

Набор для флуоресцентной окраски клеток Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit (№ 88-8005-72) был приобретен у ThermoFisher Scientific (США). Ретиноид CD437 и монодансилкадаверин (MDC) (#D4008) приобретены у Sigma-Aldrich Corporation (США). Антитела к LC-3B (ab51 520) получены от Abcam (США). Вторичные антитела, конъюгированные с флуоресцеина

Оригинальные статьи 67

изотиоцианатом (goat anti-rabbit IgG — козьи анти- Dickinson, США), инкубировали в темноте при ком-кроличьи иммуноглобулины класса G, № STAT121F), натной температуре в течение 15 мин. Флуоресцен-получены от AbD Serotec (Великобритания). zVAD- цию пропидия йодида измеряли на проточном цито-fmk приобретен у BD Pharmingen (Bedford, метре ACEA NovoCyte, а распределение клеток по Massachusetts, США). Вортманнин (WM), LY 200192 G1/G0-, S- и G2/M-фазам клеточного цикла анали-(LY) и хлорокин (CQ) любезно предоставлены Ря- зировали путем определения относительного содер-бой О.О. (ФГБУ «Национальный медицинский ис- жания ДНК в клетках с использованием программ-следовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» ного обеспечения ModFit 3.2 software. Минздрава России). Анализ течения аутофагии Культивирование клеток Клетки карциномы легкого А549 (3 х 104 клеток/ В работе были использованы клетки аденокарци- лунка) высаживали на 24-луночные планшеты. После номы легкого А549 (ATCC CCL-185™). Клетки куль- адгезии к клеткам добавляли 20 мкМ CQ, или 5 мкМ тивировали в полной питательной среде RPMI-1640 LY, или 1 мкМ WM, или ДМСО как контроль в эк-(Gibco, Великобритания), содержащей 10 % эмбрио- вимолярном количестве и инкубировали в течение нальной сыворотки теленка (HyClone, США); 2 мM/мл 24 ч. Утром среду замещали на свежую и добавляли глутамина (ПанЭко, Россия), 10 ед/мл пеницил- 0,05 ммоль MDC в RPMI-1640 без сыворотки, инку-лин-стрептомицина (ПанЭко, Россия) при 37 °С бировали 20—30 мин при 37 °С в СО2-инкубаторе. в атмосфере 5 % СО2. Клетки поддерживали в лога- Далее клетки 3 раза промывали ледяным натрий-фос-рифмической фазе роста постоянным пересевом фатным буфером и немедленно определяли флуорес-культуры каждые 2—3 сут с использованием раствора ценцию на клеточном анализаторе In Cell Analyzer Версена (ПанЭко, Россия). 6000 с использованием программного обеспечения In Cell Investigator (GE Healthcare, США). Определение апоптоза методом проточной цитометрии Определение экспрессии LC-ЭВ Клеточные линии высаживали по 2 х 105 клеток Клетки А549 (3 х 105 клеток/лунка) высаживали в дуплетах на 6-луночные планшеты в полной пита- на 8-луночный планшет. После адгезии к клеткам тельной среде. Через 24 ч к клеткам добавляли WM добавляли 0,2 или 3 мкМ CD437 или ДМСО как кон-(1,0 мкМ), CQ (20 мкМ) или LY (5 мкM), инкуби- троль в эквимолярном количестве и инкубировали ровали в течение 1 ч при 37 °С, затем вносили CD437 клетки в течение следующих 24 ч. Далее после фик-(0,1—5,0 мкМ) и оставляли клетки на 24 ч. сации клеток в системе этанол—ацетон ингибиро-Для окрашивания клеток на ранний и поздний вали неспецифическое связывание в 5 % растворе апоптоз использовали коммерческий набор Annexin-V бычьего сывороточного альбумина и инкубировали FITC Apoptosis Kit. После инкубации клеток с пре- клетки в течение 18 ч при 4 °C с поликлональными паратами их центрифугировали, осадок ресуспенди- кроличьими антителами LC-3В (1 : 2000) (Abcam, США). ровали в 100 мкл аннексинсвязывающего буфера, Затем клетки промывали дважды в фосфатно-солевом добавляли раствор, содержащий пропидий йодид буфере по 5 мин и инкубировали со вторичными ани аннексин V. Клетки инкубировали при комнатной тикроличьими антителами, меченными флуорохро-температуре, в темноте, в течение 15 мин, далее до- мом AlexaFluor 488 нм (Life Technologies, США), бавляли 400 мкл аннексин-связывающего буфера для а затем с Хекстом 33258 (ПанЭко, Россия). Клетки остановки реакции. Анализ данных (не менее 10 тыс. заключали под покровные стекла с использованием событий) проводили на проточном цитофлуориметре полимерной среды Fluorescent mounting medium ACEA NovoCyte (США) с использованием программ- (Dako, Дания). Колокализацию пунктата белка LC-3B ного обеспечения NovoExpress. Длина волны для на мембранах лизосом и интенсивность флуорес-зеленой флуоресценции (FITC) устанавливалась в ка- ценции LC-3B анализировали на In Cell Analyzer 6000 нале FL1 (515—545 нм), для красной (РЕ) флуорес- при помощи программного обеспечения In Cell In-ценции — в канале FL2 (563—607 нм). Данные полу- vestigator. чали в логарифмическом измерении для обоих каналов FL1 и FL2 (FITC и РЕ соответственно). Статистический анализ Все эксперименты выполняли 3 раза независимо Анализ клеточного цикла друг от друга. Данные представлены как среднее зна-После инкубации с препаратами клетки промы- чение ± стандартное отклонение. Различия считали вали и снимали с чашек Петри раствором Версена. статистически значимыми прир <0,05. Все статисти-Осадок клеток ресуспендировали в 400 мкл буфера, ческие анализы проведены с использованием про-содержащего 50 мкг /мл пропидия йодида (Becton граммного обеспечения GraphPad 5.0.

4'2020 том 19 | vol. 19 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL 0F BiOTHERAPY

68 Оригинальные статьи

Результаты и обсуждение

Синтетический ретиноид 6-[3-(1-адамантил)-4-гидроксифенил]-2-нафталинкарбоновая кислота (CD437) является агонистом RARy. Многочисленные эффекты этого соединения и очевидные специфические реакции клеток на этот ретиноид затрудняют выявление общей биохимической основы механизма его действия. Одним из первых был описан эффект этого ретиноида в качестве RARy-агониста, приводящий к остановке клеточного цикла и дифферен-цировке клеток, не вызывая гибели клетки [9]. Недавно в опухолевых клетках был обнаружен другой эффект CD437 — р53-независимое повреждение ДНК [10]. CD437-опосредованное повреждение ДНК объясняет, почему большинство клеток, независимо от их чувствительности к ретиноевой кислоте, отвечают на CD437. Это также объясняет дивергентный генетический ответ на CD437. С другой стороны, р53-независимое повреждение ДНК сочетает несколько путей гибели клетки. Полученный нами экспериментальный материал указывает на то, что CD437 способствует накоплению аутофагических вакуолей, нагруженных для утилизации эндогенных компонентов клетки, однако слияния их с лизосомой не происходит: отменяется цитопротекторная функция аутофагии и активируется апоптотическая гибель клетки.

Цитотоксичность CD437 на клетках А549 была изучена в МТТ-тесте. Антипролиферативная активность препарата оценивалась по величине IC50. При инкубировании клеток А549 в диапазоне концентраций CD437 от 0,1 до 10 мкМ в течение 24 ч наблюдалось ингибирование роста клеток на 30—80 %, IC

равнялась 3 мкМ. Дозозависимое снижение количества живых клеток можно объяснить как гибелью клеток (например, апоптозом), так и арестом клеточного цикла. При инкубировании клеток с 0,1—3 мкМ CD437 в течение 24 ч наблюдалось снижение популяции клеток в G2/M-фазе клеточного цикла и накопление их в G1/S-фазе. На рис. 1 представлены результаты исследований концентрации 2 мкМ CD437. Наблюдается накопление клеток в S-фазе клеточного цикла (от 20 % в контроле до 42 %). Полученные нами результаты согласуются с данными литературы о способности CD437 останавливать пролиферацию опухолевых клеток в S-фазе [11]. Мы также отметили, что после воздействия CD437 опухолевые клетки претерпевали морфологические изменения, характерные для апоптоза, такие как сморщивание клеток в объеме из-за потери воды, выраженная конденсация хроматина и округление ядер, ошаривание и открепление от пластика (данные не приводятся). Метод проточной цитофлуориметрии позволил дать количественную характеристику этому процессу. Доля клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, являющаяся критерием интенсивности апоптоза, увеличивалась с повышением концентрации CD437 и достигала 42 ± 2 % к 24 ч инкубирования с 5 мкМ CD437 (рис. 2). Количество апоптотических клеток в контроле не превышало 6—8 %, что соответствовало уровню спонтанного апоптоза. Полученные нами данные о способности CD437 индуцировать апоптоз в опухолевых клетках согласуются с литературными [12].

Любое неблагоприятное воздействие воспринимается клеткой как стресс. Ответом является активация антистрессовой программы клетки, которая

Контроль / Control

2 мкМ CD437 / 2 цM CD437

1,5 2

PE-A

1,5 2

PE-A

Рис. 1. Влияние CD437на арест клеточного цикла клеток линии А549. Под воздействием CD437наблюдается накопление клеток в S-фазе Fig. 1. The involvement of CD437 in cell cycle arrest. Under the condition of CD437 treatment accumulation of cells in S-phase is visible

50-

cl 40-

30-

20-

10-

CD437

CD437 + LY

CD437 + WM

ЛИ .llll .III

Контроль / ДМСО / Control DMSO

0,2 0,5 1,0 3,0 5,0

Рис. 2. Влияние CD437(0,2—5мкМ) на пролиферацию клеток А549 Fig. 2. The influence of CD437(0.2—5^M) on A549 cells proliferation

находится под контролем фосфатидил-инозитол-3-киназы (PI-3K). PI-ЗК-сигнальный путь сегодня рассматривается как один из универсальных сигнальных путей, контролирующих ключевые функции клеток. Этот белок получает и интегрирует сигналы от факторов роста и многочисленных биомолекул, определяющих доступность аминокислот, уровень энергии и гипоксии в клетке [13]. Активация PI-3K сопровождается повышением экспрессии мезенхи-мальных белков, репрессии E-кадгерина и усиленной миграцией опухолевых клеток [14]. Под контролем PI-3K также находятся: передача антиапоптотиче-ского сигнала в клетке, метаболизм глюкозы, устойчивость к повреждающим воздействиям, блокада TGF-p-сигнального пути, что определяет ведущую роль этого фермента в регуляции роста и выживаемости злокачественной опухоли [15]. Разумным было бы предположить участие PI-ЗК-сигнального пути в CD437-индуцированной гибели клетки. В предварительных экспериментах при инкубировании клеток А549 с препаратами в диапазоне концентраций от 0,001 до 1 мМ были определены нецитотоксиче-ские концентрации необратимого (WM) и обратимого (LY294002) ингибиторов PI-3K. Влияние ингибиторов антистрессовой киназы на цитотоксичность CD437 исследовали предварительной инкубацией клеток в течение 1 ч с нецитотоксическими концентрациями LY294002 (5 мкМ) или WM (1 мкМ), после чего добавляли CD437 (0,1—5 мкМ), культивировали клетки в течение 24 ч и определяли количество PI-положительных клеток. Такая схема эксперимента позволяла исключить влияние токсичности ингибиторов на гибель клетки, индуцированной CD437. Оба ингибитора усиливали цитотоксический эффект

0,2 0,5 1,0 3,0 5,0 мкМ/^М

0,2 0,5 1,0 3,0 5,0

CD437 (см. рис. 2), приводя к увеличению гибели клеток А549 в среднем на 14—16 %. Необратимый ингибитор киназы усиливал цитотоксический эффект CD437 в большей степени. Полученные результаты подтвердили нашу гипотезу: антистрессовая программа клетки вносит свой вклад в гибель клеток, индуцированную CD437.

В нескольких независимых исследованиях последних лет было показано, что ингибиторы Р1-3К блокируют аутофагию на стадии инициации, препятствуя образованию аутофагосом, двумембранных липидных образований, которые изолируют подлежащий уничтожению материал и расщепляют его в аутолизосоме [16]. Целью следующей части работы было подтверждение или опровержение вовлечения аутофагии в цитотоксический эффект CD437. В качестве индикатора формирования аутофагосом мы использовали окрашивание клеток MDC, флуоресцентным агентом, который избирательно взаимодействует с липидами мембран аутофагосом [17]. Как следует из рис. 3, CD437 дозозависимо повышал биогенез аутофагосом.

Конечным пунктом утилизируемого материала при процессе аутофагии является лизосома, и инги-бирование функций лизосом (например, ацидифи-кация или ферментативная деградация) способствует блокированию аутолизосом. Маркером активной аутофагии является экспрессия LC-3В. Активация аутофагии сопровождается протеолитическим расщеплением белка LC-3 (Atg8) в изоформу LC-3A. Его конъюгация с фосфатидилэтаноламином приводит к образованию LC-3B-изоформы, которая и встраивается в мембрану аутофагосомы. В процессе формирования аутофагосомы участвует только LC-3B-изоформа

0

а б в г

Рис. 3. Влияние CD437на активацию аутофагии в клетках А549

Fig. 3. CD437activated autophagy in A549 cells

Рис. 4. Влияние CD437на активацию аутофагии в клетках А549 (экспрессия LC-3B): а — контроль; б — 0,2мкМCD437; в — 3мкМCD437. у 200 Fig. 4. CD437activated autophagy in A549 cells (LC-3B expression): а - control; б - 0.2pMCD437; в - 3pMCD437. у 200

белка [18]. Согласно литературным данным, клетки карциномы легкого А549 имеют низкий базальный уровень экспрессии данного белка, но инкубирование клеток с цитотоксическим агентом в концентрациях, приближающихся к 1С50, приводит к заметному повышению экспрессии белка LC-3B в опухолевой клетке [19]. На рис. 4а, б, в представлено иммуно-цитохимическое окрашивание клеток А549 на экспрессию LC-3B. Можно видеть, что стимуляция аутофагии 3 мкМ CD437 существенно не влияет на экспрессию LC-3B.

Полученные нами результаты указывают на то, что CD437, по всей видимости, вовлекается в слияние аутофагосомы с лизосомой. Для подтверждения участия CD437 в активации аутофагии мы ингибирова-ли апоптоз в клетках А549, ожидая активации аутофагии: каспазо-зависимое расщепление ВесИп 1 и Atg3 было показано несколько лет назад [20]. В качестве ингибитора апоптоза мы выбрали панкаспаз-ный ингибитор, zVAD-fmk, который не влияет на изменение трансмембранного потенциала митохондрий

и высвобождение цитохрома с, инициирующего формирование апоптосомы и активацию каспазы-3. zVAD-fmk необратимо связывается с активным центром каспаз, блокируя расщепление таргетных белков. В условиях ингибирования апоптоза 50 мкМ zVAD-fmk 3,0 мкМ CD437 не влияли на накопление аутофагосом (рис. 5а, б, в), это указывало на то, что аутофагическая вакуолизация происходит раньше и не зависит от апоптотического процесса. В условиях блокирования апоптоза уровень LC-3В при стимуляции аутофагии 1—3 мкМ CD437 практически не отличался от его экспрессии в контрольных клетках (рис. 5г, д, е), что подтверждало участие CD437 в блокировании формирования аутолизосом. Таким образом, блокирование апоптоза в клетках, которые росли с CD437, не активирует аутофагию.

Другим подтверждением участия CD437 в биогенезе аутолизосом явился аддитивный эффект CD437 и антималярийного препарата CQ — ингибитора терминальной стадии аутофагии [21]. Известно, что CQ накапливается в эндолизосомном компартменте,

Оригинальные статьи 71

Рис. 5. CD437блокирует слияние аутофагосомы с лизосомой: а — интенсивность флуоресценции монодансилкадаверина (MDC) в контрольных клетках; б — интенсивность флуоресценции MDC в присутствии 50мкМ zVAD-fmk; в — интенсивность флуоресценции MDC в присутствии 50 мкМ zVAD-fmk и 3 мкМ CD437; г — экспрессия LC-3B в контрольных клетках; д, е — экспрессия LC-3B в присутствии 1 и 3 мкМ CD437в условиях блокирования апоптоза 50мкМ zVAD-fmk; ж — влияние 20мкМхлорокина (CQ), ингибитора терминальной фазы аутофа-гии, на гибель клеток А549, индуцированную CD437(0,2—3,0мкМ). x200

Fig. 5. CD437 disrupted autophagosome-lysosome fusion: а — immunofluorescent staining for monodansilkadaverine (MDC) of control cells; б — Immunofluorescent staining for MDC cells grown in the presence of 50 ^MzVAD-fmk; в — immunofluorescent staining for MDC cells grown in the presence of 50 ^M z.VAD-fmk and 3 ^M CD437; г — LC-3B expression in control cells; д, е — LC-3B expression in cells grown in the presence of 1 and 3 ^M CD437 under conditions of apoptosis inhibition by 50 ^m z.VAD-fmk; ж — effect of 20 ^M chlorokine (CQ), inhibitor of terminal phase of autophagy, on CD437-induced A549 cell death. x 200

способствуя деацидификации лизосом и нарушая ферментативные лизосомальные функции. При воздействии на клетки 3 мкМ СD437 в присутствии не-цитотоксических концентраций CQ (20 мкМ) живых клеток практически не оставалось (рис. 5ж). По всей видимости, СD437 и CQ действуют на разные мишени в слиянии аутофагосомы с лизосомой или СD437 является ингибитором других лизосомо-опосредо-ванных функций. Таким образом, получено экспериментальное подтверждение блокирования CD437 цитопротекторной функции аутофагии.

Заключение

В России рак легкого является наиболее часто встречающейся злокачественной опухолью и наиболее распространенной причиной смерти от онкологии. В случае нелеченого рака легкого 87 % больных умирают в течение 2 лет с момента установления диагноза [22]. Совместное проведение хирургического, лучевого и медикаментозного лечения позволяет повысить выживаемость больных, однако на поздних

стадиях заболевания выживаемость остается по-прежнему низкой и за последние десятилетия существенно не улучшилась.

Несмотря на то что нарушение процессов апо-птоза является лишь одним из признаков инициации злокачественного новообразования, современная противоопухолевая терапия направлена, в основном, на активацию апоптоза в опухолевых клетках. Хотя существуют успехи в лечении злокачественных новообразований, проблема возникновения резистентности остается актуальной. В последние годы в качестве мишени для преодоления лекарственной резистентности активно изучается процесс аутофа-гии. В настоящее время достоверно известно, что нелетальный уровень стресса обычно активирует антистрессовую киназу (Р1-3К) с последующей активацией аутофагии по mTOR-сигнальному пути [23]. Такой путь сегодня рассматривается как цитопротек-торная функция аутофагии, когда расщепление эндогенных макромолекул в аутолизосомах обеспечивает клетку строительным материалом и энергией,

или когда поврежденные органеллы клетки должны быть удалены. Если стрессовое воздействие на клетку превышает критические значения по длительности или интенсивности, в клетках включается кас-паза-зависимое расщепление белков Atg3 и Beclin 1, отменяется аутофагия и наблюдается апоптотиче-ская гибель клетки [19]. В недавних исследованиях было показано, что ингибиторы аутофагии на основе хинолина в сочетании с традиционной химиотерапией значительно увеличивают выживаемость и улучшают качество жизни пациентов с мультицент-

ральной глиобластомой и другими солидными опухолями [24].

Ингибирование слияния аутофагосомы с лизо-сомой CD437, обнаруженное нами в ходе исследования, вместе с данными литературы о том, что CD437 практически не проявляет цитотоксического эффекта на нормальных бронхиальных эпителиальных клетках легкого [25, 26], позволяют поднять вопрос о возможности нового режима лечения рака легкого на основе комбинирования CD437 с цитотоксическими препаратами.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Wolf G. A history of vitamin A and retinoids. FASEB J 1996;10:1102-1107. DOI: 10.1096/fasebj.10.9.8801174.

2. Goodman G.E., Alberts D.S., Meys-kens F.L. Retinol, vitamins, and cancer prevention: 25 Years of learning and relearning. J Clin Oncol 2008;26:5495-6. DOI: 10.1200/JC0.2008.19.0884.

3. Smith W.E., Yazdi E., Miller L. Carcinogenesis in pulmonary epithelia in mice on different levels of vitamin A. Environ Res 1972;5:152-63.

DOI: 10.1016/0013-9351(72)90030-8.

4. Zhao X., Spanjaard R.A. The apoptotic action of the retinoid CD437/AHPN: diverse effects, common basis. J Biomed Sci 2003;10(1):44-9.

DOI: 10.1007/BF02255996.

5. Chen J.Y., Clifford J., Zusi C. Two distinct actions of retinoid-receptor ligands. Nature 1996;382(6594):819-22. DOI: 10.1038/382819a0.

6. Garattini E., Gianni M., Terao M. Retinoid related molecules an emerging class of apoptotic agents with promising therapeutic potential in oncology: pharmacological activity and mechanisms of action. Curr Pharm Des 2004;10(4):433-48.

DOI: 10.2174/1381612043453351.

7. White E. The role for autophagy in cancer. J Clin Invest 2015;125(1):42-6. DOI: 10.1172/JCI73941.

8. Levy J.M., Towers C.G., Thorburn A. Targeting autophagy in cancer. Nature Reviews Cancer 2017;17(9):528-42. DOI: 10.1038/nrc.2017.53.

9. Bollag W., Isnardi L., Jablonska S. Links between pharmacological properties of retinoids and nuclear retinoid receptors. Int J Cancer 1997;70:470-2. PMID: 9033657.

10. Zhao X., Demary K., Wong L., Vaziri C. Retinoic acid receptor-independent mechanism of apoptosis of melanoma cells by the retinoid CD437 (AHPN).

Cell Death Differ 2001;8(9):878-86. DOI: 10.1038/sj.cdd.4400894.

11. Shyu R.Y., Lin D.Y., Reichert U. Synthetic retinoid CD437 induces cell-dependent cycle arrest by differential regulation of cell cycle associated proteins. Anticancer Res 2002;22(5):2757-64. PMID: 12529993.

12. Lotan R. Receptor-independent induction of apoptosis by synthetic retinoids. J Biol Regul Homeost Agents 2003;17(1):13-28. PMID: 12757019.

13. Saxton R.A, Sabatini D.M. mTOR Signaling in Growth, Metabolism, and Disease. Cell 2017;168:960-76. PMID: 28283069.

14. Karimi Roshan M., Soltani A., Soleimani A. Role of AKT and mTOR signaling pathways in the induction of epithelial-mesenchymal transition (EMT) process. Biochimie 2019;165:229-34.

DOI: 10.1016/j.biochi.2019.08.003.

15. Guo X., Wang X.F. Signaling cross-talk between TGF-beta/BMP and other pathways. Cell Res 2009;19(1):71-88. DOI: 10.1038/cr.2008.302.

16. Xuefei Li, Xiaorong Hu, Jichun Wang. Inhibition of autophagy via activation of PI3K/Akt/mTOR pathway. Int J Mol Med 2018;42(4):1917-24.

DOI: 10.3892/ijmm.2018.3794.

17. Perry C.N., Kyoi S., Hariharan N. Novel methods for measuring cardiac autophagy. Methods Enzymol 2009;453:325-42. DOI: 10.1016/S0076-6879(08)04016-0.

18. Maheswari U., Sadras S.R. Mechanism and Regulation of Autophagy in Cancer. Crit Rev Oncog 2018;23(5v6):269-80. DOI: 10.1615/ CritRevOncog.2018028394.

19. Wang Z., Liu G., Jiang J. Profiling

of apoptosis- and autophagy-associated molecules in human lung cancer A549 cells in response to cisplatin treatment.

It J Oncol 2019;543:1071-85. DOI: 10.3892/ijo.2019.4690.

20. Wirawan E. Caspase-mediated cleavage of Beclin-1 inactivates Beclin-1-induced autophagy and enhances apoptosis by promoting the release of proapoptotic factors from mitochondria.

Cell Death & Disease 2010;1(1):e18. DOI: 10.1038/cddis.2009.16.

21. Pasquier B. Autophagy inhibitors. Cell Mol Life Sci 2016;73(5):985-1001. DOI: 10.1007/s00018-015-2104-y.

22. Мерабишвили B.M., Арсеньев А.И., Тарков С.А. Заболеваемость и смертность населения от рака легкого, достоверность учета. Сибирский онкологический журнал 2018;17(6):15—26. DOI.org/10.21294/1814-4861-2018-17-6-15-26. [Merabishvily V.M., Arseniev A.I., Tarkov S.A. Lung cancer morbidity and mortality in population, accuracy

of accounting. Sibirskiy onkologicheskiy zhurnal = Siberian journal of oncology 2018;17(6):15-26. (In Russ.)].

23. Xu Z., Han X., Ou D., Liu T. Targeting PI3K/AKT/mTOR-mediated autophagy for tumor therapy. Appl Microbiol Biotechnol 2020;104(2):575-87.

DOI: 10.1007/s00253-019-10257-8.

24. Noonan J., Zarrer J., Murphy B.M. Targeting Autophagy in Glioblastoma. Crit Rev Oncog 2016;21(3-4):241-52. DOI: 10.1615/CritRevOncog.

25. Sun S.Y., Kurie J.M., Yue P. Differential responses of normal, premalignant, and malignant human bronchial epithelial cells to receptor-selective retinoids. Cancer Res 1999;5(2):431-7.

PMID: 10037194.

26. Sun S.Y., Yue P., Chen X. The synthetic retinoid CD437 selectively induces apoptosis in human lung cancer cells while sparing normal human lung epithelial cells. Cancer Res 2002;62(8):2430-6.

PMID: 11956107.

Благодарности

Авторы благодарят Уласова И.В. за помощь в обсуждении результатов и Рябую О.О. за предоставление ингибиторов PI-3K и хлорокина. Acknowledgments

The authors thank I. Ulasov for valuable comments and critical reading the MS and O. Ryabaya for providing the PI-3K inhibitors, CQ and LY. ORCID авторов / ORCID of authors

A.А. Вартанян / A.A. Vartanian: https://orcid.org/0000-0001-9342-5523 Д.А. Хоченков / D.A. Khochenkov: https://orcid.org/0000-0002-5694-3492 Е.Н. Кособокова / E.N. Kosobokova: https://orcid.org/0000-0002-4660-8519

B.С. Косоруков / V.S. Kosorukov: https://orcid.org/0000-0002-8462-2178

Вклад авторов

А.А. Вартанян: разработка концепции и дизайна статьи, сбор и обработка данных, подготовка рукописи;

Д.А. Хоченков, Е.Н. Кособокова, В.С. Косоруков: сбор и обработка данных, предоставление материалов исследования, анализ и интерпретация данных. Author's contribution

A.A. Vartanian: developing the concept and design of the article, data collection and processing, preparation of the manuscript;

D.A. Khochenkov, E.N. Kosobokova, V.S. Kosorukov: data collection and processing, providing research materials, data analysis and interpretation.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

финансирование. Работа выполнена в рамках НИОКТР № АААА-А20-120031190017-7 «Разработка и доклиническое исследование лекарственного средства BEL400, предназначенного для терапии опухолей».

Financing. This work was carried out with the financial support of the Russian Ministry of Health within the framework of experimental scientific development program № АААА-А20-120031190017-7 "Development and preclinical study of the drug BEL400 for tumor therapy".

Статья поступила: 06.10.2020. Принята к публикации: 22.10.2020. Article submitted: 06.10.2020. Accepted for publication: 22.10.2020.