Направляемое РНК уничтожение вируса JC человека и других полиомавирусов
RNA-guided destruction of human JC virus and other poliomaviruses

Данное изобретение было сделано при поддержке правительства США в соответствии с грантами NIH (Национальные институты здравоохранения США) номер R01 NS087971, выданными Kamel Khalili и Wenhui Hu Национальными институтами здравоохранения США. Правительство США может иметь определенные права в данном изобретении.
Перечень последовательностей, ассоциированный с данной заявкой, подан в электронном формате через EFS-Web и является тем самым включенным в данное описание изобретения посредством ссылки во всей его полноте. Название текстового файла, содержащего перечень последовательностей - 0392-7 Temple JCV РСТ SeqLst 10 30 2015_ST25. Размер текстового файла составляет 8 Кбайт, и данный текстовый файл был создан 30 октября 2015 г.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к композициям, которые специфично расщепляют целевые последовательности в полиомавирусах, например в нейротропном полиомавирусе человека, таком как вирус Джона Каннингема. Такие композиции, которые могут включать эндонуклеазу, ассоциированную с кластерными короткими палиндромными повторами, разделенными регулярными промежутками (CRISPR), и одну или более чем одну специфическую последовательность РНК-проводника, можно вводить субъекту, имеющему инфекцию нейротропным полиомавирусом.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Нейротропный полиомавирус человека - вирус Джона Каннингема (JCV) является этиологическим агентом смертельного демиелинизирующего заболевания - прогрессирующей мультифокальной лейкоэнцефалопатии (PML). Литическая инфекция JCV в глиальных клетках центральной нервной системы (CNS) приводит к гибели олигодендроцитов - клеток, которые отвечают за продукцию миелиновых оболочек в мозге. Это приводит к широкому спектру неврологических нарушений, от умеренных до тяжелых, и, в конечном счете, к смерти (Berger, 2011). Существует ряд факторов, предрасполагающих к PML, но все они включают некоторый уровень ослабления иммунной системы.
В то время как данное заболевание было сначала признано редким расстройством, преимущественно наблюдаемым у пациентов с лимфопролиферативными и миелопролиферативными расстройствами (Astrom, et al., 1958), начало пандемии AIDS (синдром приобретенного иммунодефицита человека) значительно увеличило число случаев PML. Инфекция HIV-1 (вирус иммунодефицита человека-1) и AIDS остаются самыми частыми условиями иммунонедостаточности для реактивации JCV, ответственными за приблизительно 80% случаев PML (Tavazzi, et al. 2012). Иммуносупрессорные терапии стали другим спусковым крючком активной инфекции JCV. Лечение аутоиммунных расстройств, таких как рассеянный склероз и ревматоидный артрит, новыми терапевтическими иммуномодулирующими моноклональными антителами, включающими натализумаб (Chakley and Berger, 2013), эфализумаб (Schwab, et al., 2102) и ритуксимаб (Clifford, et al., 2011), считается предрасполагающим фактором для PML (Nagayama, et al., 2013).
JCV является членом полиомавирусного семейства вирусов, геном которых состоит из двуцепочечной кольцевой ДНК размером 5,1 т.н., который продуцирует два класса белков на ранней фазе вирусной инфекции, то есть до репликации ДНК, и на поздней фазе инфекционного цикла (DeCaprio, et al., 2013). Двунаправленная кодирующая последовательность, расположенная между ранними и поздними генами, является ответственной за экспрессию вирусных генов и содержит точку начала репликации вирусной ДНК. Ранний вирусный белок - большой Т-антиген (Т-Ag) и семейство Т-Ag белков меньшего размера - продуцируются посредством альтернативного сплайсинга и имеют регуляторную роль в управлении вирусом во время его цикла репликации. Большой Т-антиген, в частности, отвечает за инициацию репликации вирусной ДНК и стимуляцию транскрипции поздних вирусных генов и, таким образом, является критически важным для всех аспектов жизненного цикла вируса. Кроме того, Т-Ag JCV демонстрирует трансформирующую способность в культуре клеток, и его экспрессия в животных моделях в отсутствие других вирусных белков индуцирует опухоли неврального происхождения (относительно обзора см. White and Khalili, 2004). T-Ag связывается с несколькими клеточными белками, такими как р53 и pRb, и разрегулирует пролиферацию клеток, таким образом, потенциально приводя к трансформации клеток и к образованию опухолей в нескольких животных моделях. Поздние белки представляют собой белки вирусного капсида VP1, VP2 и VP3, и маленький регуляторный белок, известный как агнопротеин (Khalili, et al., 2005). Сероэпидемиологические исследования показали, что инфекция JCV является очень распространенной у населения во всем мире, и исходное инфицирование обычно происходит в детстве (White and Khalili, 2004). Высокое доминирование серотипа инфекции JCV и редкость PML свидетельствуют о том, что иммунная система способна поддерживать вирус в стойком асимптоматическом состоянии, так как измененная иммунная функция, по-видимому, лежит в основе всех состояний, которые предрасполагают к PML.
В отношении PML применяли ряд возможностей лечения, главным образом, безуспешно (Tavazzi, et al. 2012). Разные подходы были нацелены на разные точки в жизненном цикле вируса, такие как проникновение и репликация. Поскольку было описано, что для проникновения вируса требуется взаимодействие между JCV и рецептором 2А серотонина (5-HT2AR) (Elphick, et al., 2004), исследовали рисперидон, который связывается с 5-HT2AR, но обнаружили, что он не имеет эффекта (Chapagain, et al., 2008). Низкомолекулярные ингибиторы вирусной репликации, такие как цидофовир, тестировали in vitro и in vivo, но они дали противоречивые результаты (Andrei, et al., 1997, Hou and Major, 1998). Ясно, что для лечения этого смертельного демиелинизирующего заболевания срочно требуются альтернативные варианты стратегии.
Новые стратегии, которые нацелены на вирусный геном JCV для уничтожения, являются особенно привлекательными. Данная стратегия может оказывать эффективное направленное воздействие как на активно реплицирующийся вирус, так и на персистирующий вирус, при этом вирус либо сохраняется в покоящемся состоянии, либо вирусные белки не экспрессируются или продуцируются на очень низких уровнях. Недавние успехи в технологии конструированной нуклеазы подняли перспективу того, что данная терапевтическая стратегия скоро может стать возможной в клинике. Примерами являются нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALEN), и совсем недавно - нуклеаза 9, ассоциированная с кластерными короткими палиндромными повторами, разделенными регулярными промежутками (CRISPR) (Cas9) (Gai, et al., 2013).
В частности, инструменты и методики, основанные на системах редактирования ДНК CRISPR/Cas9, предлагают беспрецедентное управление редактированием генома (Mali, et al., 2013, Hsu, et al., 2014). Система CRISPR/Cas9 была разработана из адаптивной иммунной системы бактерий и архей, и в ней используется короткая РНК-проводник (пРНК) для направления расщепления специфических нуклеиновых кислот посредством эндонуклеазы Cas9 (Bhaya, et al., 2011). Расщепление, обычно двуцепочечное разрезание с тупыми концами, обычно вызывает делеции, вставки и вырезания отрезков ДНК, вызванные дефектной репарацией ДНК.
Системы редактирования ДНК CRISPR/Cas9 использовали для инактивации онкогенных генов папилломы человека Е6 и Е7 в клетках карциномы шейки матки (Kennedy, et al., 2014) и для облегчения клиренса внутрипеченочных матриц генома вируса гепатита В in vivo (Lin, et al., 2014). Совсем недавно сообщали о том, что CRISPR/Cas9 можно использовать для устранения провируса HIV-1 из латентно инфицированных клеток и предупреждения новой инфекции HIV-1 (Hu, et al., 2014). К сожалению, еще не было разработано систем для нацеливания на JCV эндонуклеазной атаки, направляемой пРНК. Существует огромная потребность в композициях CRISPR/эндонуклеазы и способах расщепления специфических мишеней в генах JCV, разрушающих целостность генома JCV и, таким образом, устраняющих JCV из клеток-хозяев.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно настоящему изобретению предложена композиция для применения в устранении JCV из клетки-хозяина, инфицированной JCV. Данная композиция включает по меньшей мере одну выделенную нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую эндонуклеазу, ассоциированную с кластерными короткими палиндромными повторами, разделенными регулярными промежутками (CRISPR), и по меньшей мере одну РНК-проводник (пРНК), имеющую спейсерную последовательность, комплементарную последовательности-мишени в ДНК JCV. Предпочтительные последовательности-мишени для пРНК находятся в гене большого Т-антигена (Т-Ag) ДНК JCV, особенно области ТМ1, ТМ2 и ТМ3 Т-Ag.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ устранения JCV из клетки-хозяина, инфицированной JCV. Данный способ включает стадии обработки клетки-хозяина композицией, содержащей эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, и по меньшей мере одну пРНК, имеющую спейсерную последовательность, комплементарную последовательности-мишени в ДНК JCV; и устранение JCV из клетки-хозяина.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложена композиция вектора для применения в устранении JCV из клетки-хозяина, инфицированной JCV. Данная композиция вектора включает по меньшей мере одну выделенную нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, и по меньшей мере одну пРНК, имеющую спейсерную последовательность, комплементарную последовательности-мишени в ДНК JCV. Выделенные нуклеиновокислотные последовательности включаются в по меньшей мере один экспрессионный вектор для индуцирования экспрессии в клетке-хозяине эндонуклеазы, ассоциированной с CRISPR, и по меньшей мере одной пРНК.
Согласно настоящему изобретению, кроме того, дополнительно предложен способ предупреждения инфекции JCV клеток пациента, подверженного риску инфекции JCV. Данный способ включает стадии определения того, что пациент подвержен риску инфекции JCV; воздействие на клетки пациента эффективным количеством композиции экспрессионного вектора, включающей выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, и по меньшей мере одну выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере одну пРНК, которая включает спейсерную последовательность, комплементарную последовательности-мишени в ДНК JCV; стабильное экспрессирование эндонуклеазы, ассоциированной с CRISPR, и пРНК в клетках пациента; и предупреждение инфекции JCV клеток пациента.
Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция для устранения JCV из клеток субъекта-млекопитающего. Данная фармацевтическая композиция включает по меньшей мере одну выделенную нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, и по меньшей мере одну выделенную нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую по меньшей мере одну пРНК, имеющую спейсерную последовательность, комплементарную последовательности-мишени в ДНК JCV. В предпочтительном воплощении выделенные нуклеиновокислотные последовательности включены в по меньшей мере один экспрессионный вектор.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен способ лечения субъекта, имеющего расстройство, связанное с JCV, такое как прогрессирующая мультифокальная лейкоэнцефалопатия, включающий стадию введения субъекту эффективного количества указанной ранее фармацевтической композиции.
Кроме того, согласно настоящему изобретению дополнительно предложен набор для лечения или профилактики инфекции JCV, включающий отмеренное количество одной или более чем одной указанной ранее композиции, включающей эндонуклеазы, ассоциированные с CRISPR, и пРНК, комплементарную последовательностям-мишеням в ДНК JCV. Данный набор также включает один или более чем один элемент, такой как инструкции для применения, стерильные контейнеры и шприцы.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ устранения полиомавирусов, отличных от JCV, из клеток-хозяев вирусов. Данный способ включает стадии обработки клеток-хозяев композицией, включающей эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, и по меньшей мере одну пРНК, имеющую спейсерную последовательность, комплементарную последовательности-мишени в ДНК полиомавируса; и устранение полиомавируса из клеток-хозяев. Предпочтительно последовательность-мишень располагается в области, кодирующей большой Т-антиген конкретного полиомавируса.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Файл данного патента или заявки содержит по меньшей мере один графический материал, выполненный в цвете. Копии данного патента или публикации патентной заявки с цветным(и) графическим(и) материалом(ами) будут предоставлены Ведомством при запросе и выплате необходимого сбора.
Другие преимущества настоящего изобретения легко оценить, так как оно становится понятнее посредством ссылки на следующее подробное описание при рассмотрении в связи с сопровождающими графическими материалами, в которых:
На Фиг. 1А и 1Б показана конструкция РНК-проводников для нацеливания CRISPR/Cas9 на JCV. На Фиг. 1А показано три пРНК (ТМ1, ТМ2 и ТМ3), которые были сконструированы в разных положениях в пределах кодирующей области Т-Ag JCV (Т), как показано. Кодирующая область Т-Ag начинается на нуклеотиде (нт) 5013 кольцевого генома JCV Mad-1 из 5130 нт (эталонная последовательность NCBI (Национальный центр биотехнологической информации): NC_001699.1; Frisque et al, 1984) и идет против часовой стрелки до нт 2603. На Фиг. 1Б показана последовательность генома JCV в каждом из трех целевых сайтов (выделение жирным и красным). Следует отметить то, что последовательность верхней нити направлена по часовой стрелке и является антисмысловой по отношению к кодирующей области Т-Ag, поскольку Т-Ag транскрибируется против часовой стрелки и показан внизу (смысловая нить). Положение последовательности мотива, смежного с протоспейсером (РАМ), показано синим курсивом;
L
На Фиг. 2А-2В показано, что экспрессия пРНК m1 и m2 вызывала уменьшение экспрессии Т-Ag и T-Ag-стимулированной экспрессии поздних генов JCV в клетках ТС620, трансфицированных Т-Ag и Cas9. Фиг. 2А: клетки ТС620 трансфицировали репортерной плазмидой JCV-LUC и экспрессионной плазмидой для Cas9 с экспрессионными плазмидами для Т-Ag и каждой из пРНК, показанными на Фиг. 1, одних или в комбинации, или без них, как показано. Клетки отбирали и активность люциферазы анализировали, как описано в Примере 1. Активности нормировали к клеткам, трансфицированным одной репортерной плазмидой (полоса 1). Фиг. 2Б: экстракты клеток, на которые дается ссылка на Фиг. 2А, анализировали посредством вестерн-блоттинга на предмет экспрессии Т-Ag, Cas9 и α-тубулина (контроль загрузки). Фиг. 2В: вестерн-блоты, показанные на Фиг. 2Б, подвергали количественному анализу с использованием программы Quantity One от Bio-Rad, и данные показаны в виде гистограммы, нормированной к одному Т-Ag (полоса 2);
На Фиг. 3А-3Г показано, что клональное производное SVGA, экспрессирующее Cas9 и пРНК m1, имеет пониженную способность поддерживать инфекцию JCV. Фиг. 3А: клетки SVGA трансфицировали Cas9 или Cas9 плюс пРНК m1, и отбирали стабильные клональные линии клеток. Отбирали три клона и анализировали на предмет инфекции JCV (moi (множественность заражения) равна 1, 7 суток): один клон с одним Cas9 и два с Cas9 плюс пРНК m1 (клоны 8 и 10) относительно родительских клеток SVGA. Вирусную инфекцию оценивали посредством вестерн-блоттинга на предмет VP1 и агнопротеина с α-тубулином в качестве контроля загрузки. Фиг. 3Б: вирус в супернатантах культуры из эксперимента на Фиг. 3А количественно анализировали с использованием кПЦР (количественная полимеразная цепная реакция). Фиг. 3В: SVGACas9 и SVGACas9m1c8 анализировали на предмет экспрессии Cas9 посредством вестерн-блоттинга с β-тубулином, используемым в качестве контроля загрузки. Фиг. 3Г: клетки ТС620 трансфицировали экспрессионной плазмидой для Cas9, меченной FLAG, и проводили иммуноцитохимию с антителом против FLAG, как описано в Материалах и методах. Ядра метили 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI);
На Фиг. 4А-4В показана прямая демонстрация расщепления гена Т-Ag после временной трансфекции Cas9 и JCV-специфичной пРНК. Мышиные клетки BsB8 и клетки хомяка HJC-2, где и те, и другие содержат интегрированный ген Т-Ag, трансфицировали экспрессионной плазмидой для Cas9 и пРНК в разных комбинациях, как указано. Геномную ДНК амплифицировали с использованием JCV-специфичных праймеров. На Фиг. 4А показана диаграмма гена Т-Ag, указывающая положения ПЦР-праймеров, ожидаемые точки расщепления и ожидаемые длины образующихся областей гена Т-Ag. Фиг. 4Б: ген Т-Ag из трансфицированных клеток BsB8 амплифицировали посредством ПЦР, разделяли посредством электрофореза на агарозном геле и метили бромистым этидием. Изображение инвертировали для ясности представления. Фиг. 4В: ген Т-Ag из трансфицированных клеток HJC-2 амплифицировали посредством ПЦР, разделяли посредством электрофореза на агарозном геле и метили бромистым этидием. Изображение инвертировали для ясности представления;
На Фиг. 5 показаны праймеры для нацеливания на три разных мотива Т-антигена;
На Фиг. 6А и 6Б показано, что стабильные производные клеток HJC-2, экспрессирующие индуцируемую доксициклином Cas9, демонстрируют InDel (инсерционно-делеционные) мутации гена Т-Ag при трансдукции лентивирусами, экспрессирующими JCV-специфичные пРНК, и при индуцировании доксициклином. Фиг. 6А: клетки HJC-2, экспрессирующие индуцируемую доксициклином Cas9, трансдуцировали лентивирусами, экспрессирующими JCV-специфичные пРНК, и обрабатывали с доксициклином или без него, как описано в Примере 1. Общую геномную ДНК экстрагировали, и области Т-Ag амплифицировали посредством ПЦР, клонировали в вектор pCR4-TOPOTA и секвенировали. Фиг. 6Б: анализ Surveyor использовали для выявления присутствия мутаций в ПЦР-продуктах, полученных из клеток HJC-2, экспрессирующих Cas9 и трансдуцированных лентивирусными векторами для каждой из пРНК (m1, m2 и m3). ПЦР-продукты денатурировали и гибридизировали посредством постепенного охлаждения, как описано в Примере 1. Гибридизированную ДНК расщепляли нуклеазой SURVEYOR для разрезания гетеродуплексной ДНК, и образцы разделяли на 2%-ном агарозном геле вместе с равными количествами контрольных образцов; контрольные образцы обрабатывали параллельно, но они имели происхождение из клеток HJC-2, экспрессирующих Cas9, но не трансдуцированных лентивирусными векторами, кодирующими пРНК (m1 Con, m2 Con и m3 Con);
На Фиг. 7А и 7Б показано, что стабильные производные клеток HJC-2, экспрессирующих Cas9, индуцируемую доксициклином, демонстрируют абляцию экспрессии Т-Ag при трансдукции лентивирусами, экспрессирующими JCV-специфичные пРНК, и индуцировании доксициклином. Фиг. 7А: вестерн-блот, показывающий экспрессию Cas9 и Т-Ag. Стабильные в отношении JC-2 клоны клеток, экспрессирующих Cas9, индуцируемую доксициклином, трансдуцировали лентивирусными векторами для каждой из трех пРНК, как описано в Примере 1. Через 24 часа трансдуцированные клетки обрабатывали с 2 мкг/мл доксициклина или без него и еще через 48 часов собирали и анализировали экспрессию Т-Ag и Cas9 посредством вестерн-блоттинга с α-тубулином в качестве контроля загрузки. На Фиг. 7Б показана количественная оценка вестерн-блота;
На Фиг. 8А-8Д показано, что стабильные производные клеток HJC-2, экспрессирующие Cas9, индуцируемую доксициклином, демонстрируют уменьшенное образование колоний при трансдукции лентивирусами, экспрессирующими JCV-специфичные пРНК, и индуцировании доксициклином. Клетки HJC-2, экспрессирующие Cas9, индуцируемую доксициклином, трансдуцировали лентивирусами, экспрессирующими пРНК m1, m2 и m3 в разных комбинациях, как указано, высаживали на чашки, обрабатывали с доксициклином или без него и оценивали на предмет образования колоний. Результаты продемонстрированы в виде гистограмм общего числа полученных колоний с планками погрешностей, представляющими одно стандартное отклонение, рассчитанное из повторностей числа колоний. На Фиг. 8А показаны результаты для комбинации m1 плюс m2, на Фиг. 8Б показаны результаты для комбинации m1 плюс m3, на Фиг. 8В показаны результаты для комбинации m2 плюс m3, и на Фиг. 8Г показаны результаты для комбинации m1 плюс m2 плюс m3. На Фиг. 8Д показана фотография репрезентативного эксперимента с демонстрацией двух чашек, окрашенных метиленовым синим, из эксперимента, обобщенного на Фиг. 8А.
На Фиг. 9А-9В показано, что стабильные производные клеток SVG-A, экспрессирующих Cas9 и пРНК, не демонстрируют InDel мутаций в нецелевых генах. Для выявления присутствия мутаций в ПЦР-продуктах, полученных из клеток SVG-A, экспрессирующих Cas9 и пРНК m1 (комплементарна SEQ ID NO: 1, Фиг. 9А), m2 (комплементарна SEQ ID NO: 5, Фиг. 9Б) и m3 (комплементарна SEQ ID NO: 9, Фиг. 9В), использовали анализ SURVEYOR. Гены человеческих клеток с наивысшей степенью гомологии с каждым мотивом идентифицировали посредством поиска BLAST на веб-сайте NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Для каждого мотива ПЦР-продукт амплифицировали из трех генов с наивысшей степенью гомологии и исследовали на предмет InDel мутации с использованием анализа SURVEYOR, как описано в Примере 1. На каждой Фиг. амплификация Т-Ag была положительным контролем. Фиг. 9А: для мотива m1 осуществляли амплификацию М12 (NM_017821, человеческий RHBDL2 ромбовидный, жилкоподобный 2 (Drosophila), Gene ID: 54933, этал. послед. NCBI: NC 000001.11, >gi|568815597:c38941830-38885806), М17 (М_001243540, человеческий KIAA1731NL, ID гена: 100653515, этал. послед. NCBI: NC_000017.11, >gi|568815581:78887721-78903217), и М19 (NM_016252, человеческий BIRC6, содержащий бакуловирусный повтор IAP 6, ID гена: 57448, этал. послед. NCBI: NC_000002.12); Фиг. 9Б: для мотива m2 осуществляли амплификацию М21 (NM_012090, человеческий MACF1 микротрубочково-актиновый поперечно связывающий фактор 1, ID гена: 23499, этал. послед. NCBI: NC_000001.11, >gi|568815597:39084167-39487138), М23 (NM_005898, человеческий белок 1, ассоциированный с клеточным циклом - CAPRIN1, ID гена: 4076, этал. послед. NCBI: NC_000011.10, >gi|568815587:34051683-34102610), М24 (NM_024562, человеческий гомолог транспорта и организации Гольджи 6 - TANGO6 (Drosophila), ID гена: 79613, этал. послед. NCBI: NC_000016.10, >gi|568815582:68843553-69085482); Фиг. 9В: для мотива m3 осуществляли амплификацию М31 (NM_001048194, человеческий регулятор конденсации хромосом 1 - RCC1, ID гена: 1104, этал. послед. NCBI: NC_000001.11, >gi|568815597:28505943-28539196), М32 (NM_004673, человеческий ангиопоэтиноподобный 1 - ANGPTL1, ID гена: 9068, этал. послед. NCBI: NC_000001.11, >gi|568815597:c178871353-178849535), М33 (NM_174944, человеческая специфичная для яичка сериновая киназа 4 - TSSK4, ID гена: 283629, этал. послед. NCBI: NC_000014.9, >gi|568815584:24205530-24208248).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение представляет собой первое применение технологии CRISPR к проблеме активной, латентной и потенциальной инфекции JCV. Технология CRISPR, в отличие от альтернативных технологий ZFN и TALEN предшествующего уровня техники, легко адаптируется для специфических мишеней и является мультиплексной. Композиции CRISPR и способы по настоящему изобретению являются эффективными в устранении инфекции JCV из клеток-хозяев и защите клеток-хозяев от будущей инфекции.
Композиции и способы для устранения полиомавируса и предупреждения инфекции
Направляемая РНК биотехнология CRISPR адаптирует геномные защитные механизмы бактерий, где локусы CRISPR/Cas кодируют направляемые РНК адаптивные иммунные системы против мобильных генетических элементов (вирусов, мобильных элементов генома и конъюгативных плазмид).
Кластеры CRISPR кодируют спейсеры, последовательности, комплементарные последовательностям-мишеням («протоспейсеры») в вирусной нуклеиновой кислоте или другой нуклеиновой кислоте, подлежащей нацеливанию. Кластеры CRISPR транскрибируются и подвергаются процессингу до зрелой РНК CRISPR (кластерные короткие палиндромные повторы, разделенные регулярными промежутками) (крРНК). Кластеры CRISPR также кодируют ассоциированные с CRISPR белки (Cas), которые включают ДНК-эндонуклеазы. крРНК связывается с последовательностью ДНК-мишени, при этом эндонуклеаза Cas расщепляет ДНК-мишень в последовательности-мишени или рядом с ней.
Одна полезная система CRISPR включает ассоциированную с CRISPR эндонуклеазу Cas9. Cas9 направляется зрелой крРНК, которая содержит примерно 20-30 пар оснований (п.о.) спейсера и транс-активируемую малую РНК (тракрРНК), которая служит в качестве проводника для поддерживаемого рибонуклеазой III процессинга пред-крРНК. Дуплекс крРНК:тракрРНК направляет Cas9 к ДНК-мишени посредством комплементарного спаривания оснований между спейсером на крРНК и последовательностью-мишенью на ДНК-мишени. Cas9 распознает трехнуклеотидный (NGG) фотоспейсерный смежный мотив (РАМ) для принятия решения о сайте разрезания (3-ий нуклеотид от РАМ). крРНК и тракрРНК могут экспрессироваться раздельно или быть генетически модифицированными до искусственной химерной малой РНК-проводника (мпРНК) через синтетическую «петлю на стебле» (AGAAAU) для имитации природного дуплекса крРНК/тракрРНК. Такие мпРНК могут быть синтезированы или транскрибированы in vitro для прямой трансфекции РНК, или они могут экспрессироваться in situ, например из РНК-экспрессионных векторов с U6 или Н1 промотором. Термин «РНК-проводник» (пРНК) будет использоваться для обозначения либо дуплекса крРНК:тракрРНК, либо мпРНК. Будет понятно то, что термин «пРНК, комплементарная» последовательности-мишени, обозначает пРНК, спейсерная последовательность которой комплементарна последовательности-мишени.
Композиции по изобретению включают нуклеиновые кислоты, кодирующие эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, например Cas9, и по меньшей мере одну пРНК, комплементарную последовательности-мишени в полиомавирусе, например JCV.
В предпочтительных воплощениях настоящего изобретения эндонуклеаза, ассоциированная с CRISPR, представляет собой нуклеазу Cas9. Нуклеаза Cas9 может иметь нуклеотидную последовательность, идентичную последовательности Streptococcus pyrogenes дикого типа. В некоторых воплощениях эндонуклеаза, ассоциированная с CRISPR, может быть последовательностью из другого вида, например другого вида Streptococcus, такого как thermophilus; Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli или другого секвенированного генома бактерий или архей, или других прокариотических микроорганизмов. В качестве альтернативы, последовательность Cas9 Streptococcus pyrogenes дикого типа может быть модифицирована. Предпочтительно данная нуклеиновокислотная последовательность имеет оптимизированные кодоны для эффективной экспрессии в клетках млекопитающих, т.е. является «гуманизированной». Гуманизированная последовательность нуклеазы Cas9 может представлять собой, например, последовательность нуклеазы Cas9, кодируемую любым из экспрессионных векторов, перечисленных в номерах доступа Genbank КМ099231.1 Gl:669193757; КМ099232.1 Gl:669193761 или КМ099233.1 Gl:669193765. В качестве альтернативы, последовательность нуклеазы Cas9 может представлять собой, например, последовательность, содержащуюся в имеющемся в продаже векторе, таком как РХЗЗО или РХ260 от Addgene (Cambridge, MA). В некоторых воплощениях эндонуклеаза Cas9 может иметь аминокислотную последовательность, которая представляет собой вариант или фрагмент любой из последовательностей эндонуклеазы Cas9 с номерами доступа Genbank КМ099231.1 Gl:669193757; КМ099232.1 Gl:669193761 или КМ099233.1 Gl:669193765, или аминокислотной последовательности Cas9 РХ330 или РХ260 (Addgene, Cambridge, MA).
Нуклеотидную последовательность Cas9 можно модифицировать для того, чтобы она кодировала биологически активные варианты Cas9, и эти варианты могут иметь или могут включать, например, аминокислотную последовательность, которая отличается от Cas9 дикого типа за счет содержания одной или более чем одной мутации (например, мутации в виде присоединения, делеции или замены, или комбинации таких мутаций). Одна или более чем одна мутация в виде замены может представлять собой замену (например, консервативную аминокислотную замену). Например, биологически активный вариант полипептида Cas9 может иметь аминокислотную последовательность с по меньшей мере или примерно 50%-ной идентичностью последовательности (например, с по меньшей мере или примерно 50%-ной, 55%-ной, 60%-ной, 65%-ной, 70%-ной, 75%-ной, 80%-ной, 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью последовательности) с полипептидом Cas9 дикого типа. Консервативные аминокислотные замены типично включают замены в пределах следующих групп: глицин и аланин; валин, изолейцин и лейцин; аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин, серии и треонин; лизин, гистидин и аргинин; фенилаланин и тирозин.
Аминокислотные остатки в аминокислотной последовательности Cas9 могут быть аминокислотными остатками, не встречающимися в природе. Аминокислотные остатки, встречающиеся в природе, включают аминокислотные остатки, кодируемые в природе генетическим кодом, а также нестандартные аминокислоты (например, аминокислоты, имеющие D-конфигурацию вместо L-конфигурации). Настоящие пептиды также могут включать аминокислотные остатки, которые представляют собой модифицированные версии стандартных остатков (например, вместо лизина может быть использован пирролизин, и вместо цистеина может быть использован селеноцистеин). Аминокислотные остатки, не встречающиеся в природе, представляют собой аминокислотные остатки, которые не были обнаружены в природе, но которые соответствуют основной формуле аминокислоты и могут быть включены в пептид. Они включают D-аллоизолейцин(2R,3S)-2-амино-3-метилпентановую кислоту и L-циклопентилглицин-(S)-2-амино-2-циклопентилуксусную кислоту. Относительно других примеров можно проконсультироваться с учебниками или всемирной сетью (сайт в настоящее время поддерживается Калифорнийским институтом технологии, и на нем продемонстрированы структуры аминокислот, не встречающихся в природе, которые были успешно включены в функциональные белки).
Последовательность нуклеазы Cas9 может быть мутировавшей последовательностью. Например, нуклеаза Cas9 может быть мутирована в консервативных доменах HNH и RuvC, которые участвуют в специфичном для нити расщеплении. Например, мутация от аспартата до аланина (D10A) в каталитическом домене RuvC позволяет никазному мутанту Cas9 (Cas9n) осуществлять одноцепочечный разрыв, а не расщепление ДНК, давая одноцепочечные разрывы, и последующая предпочтительная репарация посредством HDR22 может потенциально уменьшать частоту нежелательных InDel мутаций из-за двуцепочечных разрывов вне мишени.
В некоторых воплощениях композиции по изобретению могут включать полипептид эндонуклеазы, ассоциированной с CRISPR, кодируемый любой из нуклеиновокислотных последовательностей, описанных выше. Полипептиды могут быть получены рядом способов, включая, например, методики генной инженерии или химический синтез. Сразу после получения полипептиды можно выделять и очищать до любой желательной степени способами, хорошо известными в данной области. Например, можно использовать лиофилизацию после, например, HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) с обращенной фазой (предпочтительно) или нормальной фазой, гель-фильтрацию или распределительную хроматографию на средах на основе полисахаридного геля, таких как Sephadex G-25. Состав конечного полипептида может быть подтвержден посредством аминокислотного анализа после деградации пептида стандартными способами, посредством секвенирования аминокислот или посредством методик FAB-MS (масс-спектрометрия с бомбардировкой быстрыми атомами).
В типичных воплощениях настоящее изобретение включает конструированную систему CRISPR, включающую Cas9 и одну или более чем одну пРНК, комплементарную последовательности Т-антигена JCV. Типичная геномная последовательность JCV принадлежит штамму Mad-1, эталонная последовательность NCBI, номер GenBank: NC_001699.1, общедоступный идетнификатор Gl (Frisque et al, 1984). В штамме Mad1 кодирующая область Т-Ag начинается на нуклеотиде (нт) 5013 кольцевого генома JCV Mad-1 из 5130 нт. Типичные спейсерные последовательности пРНК комплементарны последовательности областей ТМ1, ТМ2 или ТМ3 Т-антигена JCV. Структурная организация JCV Mad-1 показана на Фиг. 1А. Нуклеотидные последовательности, соответствующие ТМ1, ТМ2 и ТМ3, показаны на Фиг. 1Б, и последовательности-мишени для пРНК показаны жирными большими буквами. Последовательности-мишени могут иметь от приблизительно 20 до 40 или более нт в длину. Будет понятно, что в разных штаммах JCV или в мутационных вариантах последовательности, гомологичные ТМ1, ТМ2 и ТМ3, могут быть легко идентифицированы посредством хорошо известных методик секвенирования и геномики.
Типичная последовательность-мишень в ТМ1 включает SEQ ID NO: 1 или комплементарную ей последовательность на антипараллельной нити - SEQ ID NO: 2. Последовательность РАМ в каждой нити (показанная маленькими жирными буквами) может быть включена в последовательность-мишень таким образом, что последовательности-мишени могут включать SEQ ID NO: 3 или комплементарную ей последовательность на антипараллельной нити - SEQ ID NO: 4. пРНК, комплементарная ТМ1, обозначенная как пРНК m1, следовательно, может включать спейсерную последовательность, комплементарную SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4.
Нуклеотидные последовательности являются следующими:
Типичная последовательность-мишень в TM2 включает SEQ ID NO: 5 или комплементарную ей последовательность на антипараллельной нити - SEQ ID NO: 6. В последовательность-мишень в каждой нити также может быть включена последовательность РАМ таким образом, что последовательности-мишени могут включать SEQ ID NO: 7 или комплементарную ей последовательность на антипараллельной нити - SEQ ID NO: 8. пРНК, комплементарная ТМ2, обозначенная как пРНК m2, следовательно, может включать спейсерную последовательность, комплементарную SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8.
Нуклеотидные последовательности являются следующими:
Типичная последовательность-мишень в ТМ3 включает SEQ ID NO: 9 или комплементарную ей последовательность на антипараллельной нити - SEQ ID NO: 10. Последовательность РАМ в каждой нити также может быть включена в последовательность-мишень таким образом, что последовательности-мишени могут включать SEQ ID NO: 11 или комплементарную ей последовательность - SEQ ID NO: 12. пРНК, комплементарная ТМ3, обозначенная как m3, может, следовательно, включать спейсерную последовательность, комплементарную SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.
Нуклеотидные последовательности являются следующими:
Отрезки ДНК, содержащие сайты-мишени для ТМ1, ТМ2 и ТМ3, показаны в виде диаграммы на Фиг. 1А, и их нуклеотидные последовательности показаны на Фиг. 1Б в виде SEQ ID NO: 13-18. Будет понятно, что пРНК по настоящему изобретению также могут включать дополнительные 5'- и/или 3'-последовательности, которые могут быть или могут не быть комплементарными последовательности-мишени. Спейсеры каждой пРНК могут иметь менее чем 100%-ную комплементарность с ее последовательностью-мишенью, например 95%-ную комплементарность.
В Примерах 2, 4 и 5 обнаружили, что системы CRISPR, включающие Cas9 и пРНК m1, m2 и/или m3, ингибируют репликацию JCV и экспрессию Т-Ag в клетках-хозяевах и повреждают целостность генома JCV. Данные эффекты вызывают устранение и свободного эписомного вируса, и вируса, интегрированного в геномы хозяев. Вредные эффекты вне мишени на здоровые гены не производились. Следовательно, настоящее изобретение охватывает композицию для применения в устранении JCV из клетки-хозяина, инфицированной JCV. Данная композиция включает по меньшей мере одну выделенную нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, и по меньшей мере одну пРНК, имеющую спейсерную последовательность, комплементарную последовательности-мишени в ДНК JCV. Настоящее изобретение также охватывает способ устранения JCV из клетки-хозяина, инфицированной JCV. Данный способ включает стадии обработки клетки-хозяина композицией, содержащей эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, и по меньшей мере одну пРНК, имеющую спейсерную последовательность, которая комплементарна последовательности-мишени в ДНК JCV; и устранение JCV из клетки-хозяина.
В экспериментах из Примера 3 определили, что стабильная экспрессия систем CRISPR по настоящему изобретению может делать клетки-хозяева невосприимчивыми к новой инфекции JCV. Следовательно, настоящее изобретение также охватывает способ предупреждения инфекции JCV клеток пациента, подверженных риску инфекции JCV. Данный способ включает стадии определения того, что пациент подвержен риску инфекции JCV; воздействия на клетки пациента, подверженного риску инфекции JCV, эффективным количеством композиции экспрессионного вектора, которая включает выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, и по меньшей мере одну выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере одну пРНК-проводник, включающую спейсерную последовательность, комплементарную последовательности-мишени в ДНК JCV; стабильной экспрессии эндонуклеазы, ассоциированной с CRISPR, и по меньшей мере одной пРНК в клетках пациента; и предупреждение инфекции JCV клеток пациента.
пРНК по настоящему изобретению могут быть сконфигурированы в виде одной последовательности или в виде комбинации одной или более разных последовательностей, например в виде мультиплексной конфигурации. Мультиплексные конфигурации могут включать комбинации двух, трех или более разных пРНК. При введении в экспрессионный вектор данных композиций РНК-проводники могут кодироваться одним вектором. В качестве альтернативы, многие векторы могут быть сконструированы так, чтобы каждый включал две или более чем две разные РНК-проводника. Особенно полезными являются комбинации пРНК, которые вызывают вырезание вирусных последовательностей между сайтами расщепления, приводя к абляции генома JCV или экспрессии белка JCV. Вырезанная область может варьировать по размеру от одного нуклеотида до нескольких сотен нуклеотидов.
4
4
4
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Молекулы РНК (например, крРНК, тракрРНК, пРНК) могут быть модифицированы так, чтобы они содержали одно или более чем одно модифицированное нуклеотидное основание. Например, известные модификации молекул РНК можно найти, например, в Genes VI, Глава 9 («Interpreting the Genetic Code»), Lewin, ed. (1997, Oxford University Press, New York) и Modification and Editing of RNA, Grosjean and Benne, eds. (1998, ASM Press, Washington DC). Модифицированные компоненты РНК включают следующие: 2'-O-метилцитидин; N-метилцитидин; N-2'-O-диметилцитидин; N-ацетилцитидин; 5-метилцитидин; 5,2'-O-диметилцитидин; 5-гидроксиметилцитидин; 5-формилцитидин; 2'-O-метил-5-формаилцитидин; 3-метилцитидин; 2-тиоцитидин; лизидин; 2'-O-метилуридин; 2-тиоуридин; 2-тио-2'-О-метилуридин; 3,2'-O-диметилуридин; 3-(3-амино-карбоксипропил)уридин; 4-тиоуридин; рибозилтимин; 5,2'-O-диметилуридин; 5-метил-2-тиоуридин; 5-гидроксиуридин; 5-метоксиуридин; уридин-5-оксиуксусная кислота; сложный метиловый эфир уридин-5-оксиуксусной кислоты; 5-карбоксиметилуридин; 5-метоксикарбонилметилуридин; 5-метоксикарбонилметил-2'-O-метилуридин; 5-метоксикарбонилметил-2'-тиоуридин; 5-карбамоилметилуридин; 5-карбамоилметил-2'-O-метилуридин; 5-(карбоксигидроксиметил)уридин; сложный метиловый эфир 5-(карбоксигидроксиметил)уридина; 5-аминометил-2-тиоуридин; 5-метиламинометилуридин; 5-метиламинометил-2-тиоуридин; 5-метиламинометил-2-селеноуридин; 5-карбоксиметиламинометилуридин; 5-карбоксиметиламинометил-2'-O-метил-уридин; 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин; дигидроуридин; дигидрорибозилтимин; 2'-метиладенозин; 2-метиладенозин; N-метиладенозин; N,N-диметиладенозин; N,2'-O-триметиладенозин; 2-метилтио-N-N-изопентениладенозин; N-(цис-гидроксиизопентенил)-аденозин; 2-метилтио-N-(цис-гидроксиизопентенил)-аденозин; N-(глицинилкарбамоил)аденозин; N-треонилкарбамоиладенозин; N-метил-N-треонилкарбамоиладенозин; 2-метилтио-N-метил-N-треонилкарбамоиладенозин; N-гидроксинорвалилкарбамоиладенозин; 2-метилтио-N-гидроксинорвалилкарбамоиладенозин; 2-О-рибозиладенозин (фосфат); инозин; 2'-O-метилинозин; 1-метилинозин; 1,2'-O-диметилинозин; 2'-О-метилгуанозин; 1-метилгуанозин; N-метилгуанозин; N,N-диметилгуанозин; N,2'-O-диметилгуанозин; N,N,2'-O-триметилгуанозин; 2'-O-рибозилгуанозин (фосфат); 7-метилгуанозин; N,7-диметилгуанозин; N,N,7-триметилгуанозин; виозин; метилвиозин; недомодифицированный гидроксивибутозин; вибутозин; 30-гидроксивибутозин; пероксивибутозин; квеуозин; эпоксиквеуозин; галактозил-квеуозин; маннозил-квеуозин; 7-циано-7-деазагуанозин; арахеозин [также называемый 7-формамидо-7-деазагуанозин] и 7-аминометил-7-деазагуанозин. Для идентификации дополнительных модифицированных молекул РНК можно использовать способы по настоящему изобретению или другие способы, известные в данной области.
пРНК по настоящему изобретению не ограничиваются пРНК, комплементарными последовательностям, обнаруженным в области ТМ1, ТМ2 или ТМ3 Т-антигена JCV. Другие области JCV и другие полиомавирусы могут быть мишенью систем CRISPR при использовании подходящим образом сконструированных пРНК. Для систем CRISPR с использованием Cas9 S. pyogenes последовательность РАМ может представлять собой AGG, TGG, CGG или GGG. Последовательности-мишени, являющиеся кандидатами, могут быть идентифицированы посредством близости к 5' РАМ, таким как AGG, TGG, CGG или GGG. Другие ортологи Cas9 могут иметь другие специфичности в отношении РАМ. Например, для Cas9 из S. thermophiius требуется 5'-NNAGAA для CRISPR 1 и 5'-NGGNG для CRISPR3, и для Neiseria meningitis требуется 5'-NNNNGATT. Специфическая последовательность пРНК может варьировать, но полезными последовательностями пРНК будут последовательности, которые минимизируют эффекты вне мишени при достижении высокой эффективности и полного устранения JCV. Эффективность пРНК-кандидатов и эффекты вне мишени можно определять анализами, раскрытыми в Примерах 1-5.
Настоящее изобретение не ограничивается эндонуклеазами Cas9. Оно также охватывает композиции и способы, влекущие за собой применение любой эндонуклеазы, ассоциированной с CRISPR, которая способна расщеплять вирусный геном после направления к сайту РАМ посредством пРНК. Примеры включают эндонуклеазы семейства Cpf1 (CRISPR из Prevotella и Francisella 1) (Zetsche, et al., 2015). Уже было показано, что две эндонуклеазы Cpf1 являются эффективными в редактировании генов в системе культивируемых клеток печени человека: Cpf1 Acidaminococcus sp. BV3L6 и Cpf1 Lachnospiraceae bacterium ND2006.
Эндонуклеазы Cpf1 расширяют интервал возможных мишиней в JCV и в других полиомавирусах, так как они распознают РАМ, отличный от обогащенного цитозином РАМ, распознаваемого Cas9. Cpfl распознает обогащенный тимином РАМ с консенсусной последовательностью TTN, и данный РАМ расположен на 5'-конце последовательности-мишени. Cpf1 направляется меньшей, более простой пРНК, чем пРНК систем Cas9. Вместо двухкомпонентной пРНК, включающей крРНК и тракрРНК, или сконструированного химерного гибрида крРНК и тракрРНК, Cpf1 направляется одной РНК-проводником, именуемой пРНК. Молекула Cpf1 также меньше, чем молекула Cas9. Эта большая простота и меньший размер облегчает и конструирование, и применение систем CRISPR/Cpfl, и доставку эндонуклеазного компонента в ядро клетки-хозяина.
Последовательности пРНК будут зависеть от последовательности специфических сайтов-мишеней, выбранных для редактирования. Предпочтительные сайты-мишени располагаются в области Т-Ag JCV или другого полиомавируса. В общем, прогнозируется, что пРНК комплементарны последовательностям ДНК-мишеней, которые располагаются непосредственно в направлении к 3'-концу по отношению к РАМ, обогащенному тимином, последовательности 5'-TTN. Последовательность пРНК может быть комплементарной смысловой или антисмысловой последовательности. Последовательность пРНК может включать или может не включать комплементарную последовательность последовательности РАМ. Последовательность пРНК может включать дополнительные 5' и/или 3'-последовательности, которые могут не быть комплементарными последовательности-мишени. Последовательность пРНК может иметь меньше чем 100%-ную комплементарность последовательности-мишени, например 95%-ную комплементарность. пРНК имеет последовательность, комплементарную кодирующей или некодирующей последовательности-мишени. Последовательности пРНК могут использоваться в мультиплексной конфигурации, включающей комбинации двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти или более чем десяти разных пРНК.
Композиции и способы по настоящему изобретению оказались эффективными в устранении JCV посредством атаки на ген Т-Ag, направляемой пРНК. Следовательно, вероятно, что настоящее изобретение является легко адаптируемым для того, чтобы служить в качестве эффективного лечения в отношении других полиомавирусов, таких как SV40. Адаптация, главным образом, является вопросом идентификации последовательностей РАМ для Cas9 или другой подходящей эндонуклеазы в гене Т-Ag или других критических генах конкретного полиомавируса. Затем генерируются пРНК, комплементарные последовательностям, смежным с последовательностями РАМ, и тестируются посредством методологии, раскрытой в Примерах 1-5.
Следовательно, настоящее изобретение охватывает способ устранения полиомавируса из клетки-хозяина, инфицированной полиомавирусом. Данный способ включает стадии обработки клетки-хозяина эндонуклеазой, ассоциированной с CRISPR, и по меньшей мере одной направляющей пРНК, имеющей спейсерную последовательность, которая комплементарна последовательности-мишени в ДНК полиомавируса; и устранение полиомавируса из клетки-хозяина. В предпочтительных воплощениях спейсерные последовательности пРНК комплементарны последовательностям-мишеням в кодирующей области большого Т-антигена (Т-Ag) ДНК полиомавируса.
Векторы. Настоящее изобретение включает вектор, содержащий одну или более чем одну кассету экспрессии компонентов CRISPR, таких как одна или более чем одна пРНК и эндонуклеаза Cas, такая как Cas9. Вектор может быть любым вектором, который известен в данной области и подходит для экспрессии желательной кассеты экспрессии. Известен целый ряд векторов, способных опосредовать перенос генных продуктов в клетки млекопитающих, как известно в данной области и описано в данном документе. Термин «вектор» (иногда именуемый как «носитель» доставки генов или переноса генов) относится к макромолекуле или комплексу молекул, содержащему полинуклеотид, подлежащий доставке в клетку-хозяина, либо in vitro, либо in vivo. Полинуклеотид, подлежащий доставке, может содержать кодирующую последовательность, представляющую интерес в генотерапии.
Предпочтительным вектором является лентивирусный вектор. Лентивирусные векторы имеют преимущество обеспечения эффективной трансдукции как пролиферирующих, так и покоящихся клеток, стабильной экспрессии доставленных генов посредством интеграции в хроматин хозяина и отсутствия мешающего воздействия предсуществующего противовирусного иммунитета. В экспериментах, раскрытых в Примере 5, было показано, что индуцируемые лекарственным средством лентивирусные экспрессионные векторы для компонентов Cas9/nPHK являются эффективными в устранении экспрессии Т-Ag JCV в инфицированных клетках. В типичной конфигурации клетки-хозяева были стабильно трансдуцированы Cas9 или другой подходящей эндонуклеазой CRISPR в лентивирусном векторе, индуцируемом доксициклином. Когда устранение JCV было желательным, клетки-хозяева трансдуцировали одной или более чем одной пРНК и обрабатывали доксициклином для активации экспрессии Cas9 для вызывания направленного расщепления генома JCV и инактивации вируса. В качестве альтернативы, одна или более чем одна пРНК может быть стабильно трансдуцирована индуцируемым лекарственным средством способом, или и эндонуклеаза, ассоциированная с CRISPR, и пРНК могут быть трансдуцированы таким образом. В клинической ситуации данная обработка могла бы использоваться для пациентов, подверженных риску инфекции JCV, причем компоненты CRISPR активируются при инфекции.
Следовательно, настоящее изобретение охватывает композицию вектора для применения в устранении JCV из клетки-хозяина. Композиция вектора включает по меньшей мере одну последовательность выделенную нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, и по меньшей мере одну пРНК, имеющую спейсерную последовательность, комплементарную последовательности-мишени в ДНК JCV. Выделенные нуклеиновокислотные последовательности включены по меньшей мере в один экспрессионный вектор, который индуцирует экспрессию в клетке-хозяине эндонуклеазы, ассоциированной с CRISPR, и по меньшей мере одной пРНК.
Настоящее изобретение ни в коей мере не ограничено плазмидными и лентивирусными векторами, описанными в Примерах 1-5. Другие предпочтительные векторы включают аденовирусные векторы и векторы на основе аденоассоциированного вируса. Они имеют преимущество отсутствия интеграции в ДНК клетки-хозяина. Многие другие рекомбинантные вирусные векторы также являются подходящими, включая, без ограничения, векторы на основе вируса везикулярного стоматита (VSV), векторы на основе вируса оспы и ретровирусные векторы.
Термин «рекомбинантный вирусный вектор» относится к вирусному вектору, содержащему один или более чем один гетерологичный продукт гена или последовательность. Поскольку многие вирусные векторы демонстрируют ограничения по размеру, ассоциированные с упаковкой, гетерологичные продукты генов или последовательности типично вводят посредством замены одной или более чем одной части вирусного генома. Такие вирусы могут стать дефектными в отношении репликации, требующими предоставления устраненной(ых) функции(й) от внешнего источника во время вирусной репликации и инкапсидирования (например, посредством применения хелперного вируса или пакующей линии клеток, несущей продукты генов, необходимые для репликации и/или инкапсидирования). Также были описаны модифицированные вирусные векторы, в которых полинуклеотид, подлежащий доставке, переносится снаружи вирусной частицы.
Ретровирусные векторы включают векторы на основе вирусов мышиного лейкоза Молони и вирусов на основе HIV. Один предпочтительный вирусный вектор на основе HIV содержит по меньшей мере два вектора, где гены gag (специфических антигенов) и pol (полимеразы) происходят из генома HIV, и ген env (оболочки) происходит из другого вируса. Вирусные векторы на основе ДНК являются предпочтительными. Данные векторы включают векторы на основе вируса оспы, такие как векторы на основе ортопоксвируса или авипоксвируса, векторы на основе вируса герпеса, такие как вектор на основе вируса простого герпеса I (HSV).
Векторы на основе вируса оспы вводят ген в цитоплазму клеток. Векторы на основе авипоксвируса приводят только к кратковременной экспрессии нуклеиновой кислоты. Аденовирусные векторы, векторы на основе аденоассоциированного вируса и векторы на основе вируса простого герпеса (HSV) могут быть показанием для некоторых воплощений изобретения. Аденовирусный вектор приводит к более кратковременной экспрессии (например, меньше, чем примерно месяц), чем вектор на основе аденоассоциированного вируса, который в некоторых воплощениях может демонстрировать значительно более длительную экспрессию. Конкретный выбранный вектор будет зависеть от клетки-мишени и состояния, которое лечат. Легко можно осуществить выбор подходящих промоторов. В некоторых воплощениях можно использовать промотор, обеспечивающий высокую экспрессию. Примером подходящего промотора является промотор цитомегаловируса (CMV) из 763 пар оснований. Также можно использовать промоторы вируса саркомы Рауса (RSV) и ММТ. Определенные белки могут экспрессироваться с использованием их природного промотора. Также могут быть включены другие элементы, которые могут усиливать экспрессию, такие как энхансер или система, которая приводит к высоким уровням экспрессии, такая как ген tat (трансактиватор транскрипции) и элемент tar (реагирующий на трансактивацию элемент). Такая кассета может быть затем вставлена в вектор, например плазмидный вектор, такой как pUC19, pUC118, pBR322 или другие известные плазмидные векторы, которые включают, например, репликатор Е. coli. Плазмидный вектор также может включать селектируемый маркер, такой как ген р-лактамазы для устойчивости к ампициллину, при условии, что маркерный полипептид не оказывает вредного влияния на метаболизм организма, подвергаемого лечению. Кассета также может быть связана со группировкой, связывающей нуклеиновую кислоту, в синтетической системе доставки, такой как система, раскрытая в WO 95/22618.
Другой способ доставки предназначен для применения одноцепочечной ДНК с получением векторов, которые могут внутриклеточно продуцировать экспрессированные продукты. См., например, Chen et al, BioTechniques, 34: 167-171 (2003), которая включена сюда посредством ссылки во всей ее полноте.
Экспрессия может контролироваться любым промоторным/энхансерным элементом, для которого в данной области известно, что он является функциональным у хозяина, выбранного для экспрессии. Помимо промоторов, описанных в разделе примеров, другие промоторы, которые можно использовать для экспрессии генов, включают промотор цитомегаловируса (CMV), область раннего промотора SV40, промотор, содержащийся в 3' длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса, промотор тимидинкиназы вируса герпеса, регуляторные последовательности гена металлотионеина; прокариотические экспрессионные векторы, такие как с промотором бета-лактамазы или промотором tac; промоторные элементы из дрожжей или других грибов, такие как промотор Gal 4, промотор ADC (алкогольдегидрогеназа), промотор PGK (фосфоглицеринкиназа), промотор щелочной фосфатазы; и области контроля транскрипции животных, которые демонстрируют тканеспецифичность и использовались у трансгенных животных: контрольная область гена эластазы I, которая является активной в ацинарных клетках поджелудочной железы; контрольная область гена инсулина, которая является активной в бета-клетках поджелудочной железы, контрольная область гена иммуноглобулина, которая является активной в лимфоидных клетках, контрольная область вируса опухоли молочной железы мыши, которая является активной в клетках яичка, молочной железы, лимфоидных и тучных клетках, контрольная область гена альбумина, которая является активной в печени, контрольная область гена альфа-фетопротеина, которая является активной в печени, контрольная область гена альфа-1-антитрипсина, которая является активной в печени, контрольная область гена бета-глобина, которая является активной в миелоидных клетках, контрольная область гена основного белка миелина, которая является активной в клетках олигодендроцитах в мозге, контрольная область гена легкой цепи-2 миозина, которая является активной в скелетных мышцах, и контрольная область гена гонадотропин-высвобождающего гормона, которая является активной в гипоталамусе, но не ограничиваются ими.
При экспрессировании нуклеиновокислотных последовательностей по данному изобретению можно использовать широкий спектр комбинаций хозяин/экспрессионный вектор. Полезные экспрессионные векторы, например, могут состоять из отрезков хромосомных, нехромосомных и синтетических последовательностей ДНК. Подходящие векторы включают производные SV40 и известные бактериальные плазмиды, например плазмиды Е. coli col Е1, pCR1, pBR322, pMal-C2, рЕТ, pGEX, рМВ9 и их производные, такие плазмиды как RP4; фаговые ДНК, например многочисленные производные фага 1, например NM989, и другие фаговые ДНК, например ДНК М13 и одноцепочечная ДНК нитчатого фага; дрожжевые плазмиды, такие как плазмида 2μ или ее производные, векторы, полезные в эукариотических клетках, такие как векторы, полезные в клетках насекомых или млекопитающих; векторы, полученные из комбинаций плазмид и фаговых ДНК, таких как плазмиды, которые были модифицированы для применения фаговой ДНК и других последовательностей контроля экспрессии; и тому подобное.
Также можно использовать дрожжевые системы экспрессии. Например, согласно изобретению можно использовать неслитый вектор pYES2 (сайты клонирования Xbal, Sphl, Shol, Notl, GstXI, EcoRI, BstXI, BamH1, Sad, Kpn1 и Hind III; Invitrogen) или слитый pYESHisA, В, С (сайты клонирования Xbal, Sphl, Shol, Notl, BstXI, EcoRI, BamH1, Sacl, Kpnl и HindIII, N-концевой пептид, очищенный с использованием смолы ProBond и расщепленный энтерокиназой; Invitrogen), для упоминания лишь двух из них. Согласно изобретению можно получать дрожжевые двугибридные экспрессионные системы.
Дополнительные подходящие векторы включают слитые белки v и химические конъюгаты. Если это желательно, полинуклеотиды по изобретению также можно использовать с носителем для микродоставки, таким как катионные липосомы и другие липидсодержащие комплексы, и другими макромолекулярными комплексами, способными опосредовать доставку полинуклеотида в клетку-хозяина.
Векторы также могут содержать другие компоненты или функциональные группы, которые дополнительно модулируют доставку гена и/или экспрессию гена, или которые иным образом предоставляют полезные свойства клеткам-мишеням. Такие другие компоненты включают, например, компоненты, которые влияют на связывание с клетками или нацеливаине на клетки (включая компоненты, которые опосредуют специфичное для типа клеток или тканеспецифичное связывание); компоненты, которые влияют на поглощение нуклеиновой кислоты вектора клеткой; компоненты, которые влияют на локализацию полинуклеотида в клетке после поглощения (такие как агенты, опосредующие ядерную локализацию); и компоненты, которые влияют на экспрессию полинуклеотида. Такие компоненты также могут включать маркеры, такие как выявляемые и/или селектируемые маркеры, которые можно использовать для выявления или отбора клеток, которые поглотили и экспрессируют нуклеиновую кислоту, доставленную вектором. Такие компоненты могут быть предоставлены в качестве природной характеристики вектора (как, например, применение определенных вирусных векторов, которые имеют компоненты или функциональные группы, опосредующие связывание и поглощение), или векторы могут быть модифицированы для предоставления таких функциональных групп. Другие векторы включают векторы, описанные Chen et al.; BioTechniques, 534: 167-171 (2003). В данной области известен широкий выбор таких векторов, и они являются общедоступными.
Фармацевтические композиции
Композиции и способы, которые оказались эффективными для устранения JCV из культивируемых клеток (Примеры 1-5), весьма вероятно являются эффективными in vivo при доставке посредством одного или более чем одного подходящего экспрессионного вектора. Следовательно, настоящее изобретение охватывает фармацевтическую композицию для устранения JCV из клеток субъекта-млекопитающего, включающую выделенную нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, и по меньшей мере одну выделенную нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую по меньшей мере одну пРНК, которая комплементарна последовательности-мишени в геноме JCV. Предпочтительные пРНК включают спейсерные последовательности, которые комплементарны ТМ1, ТМ2, ТМ3 или другим областям Т-Ag JCV. Например, могут быть включены пРНК m1, m2 и m3, индивидуально или в любой комбинации. Также является предпочтительным, чтобы фармацевтическая композиция также включала по меньшей мере один экспрессионный вектор, в котором кодируются выделенные нуклеиновокислотные последовательности.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть получены рядом способов, известных обычному специалисту в данной области. Например, нуклеиновые кислоты и векторы, описанные выше, могут быть приготовлены в композициях для применения в отношении клеток в культуре ткани или для введения пациенту или субъекту. Данные композиции можно получать способом, хорошо известным в области фармацевтики, и их можно вводить рядом путей, в зависимости от того, является ли желательным местное или системное лечение, и от области, подлежащей лечению. Введение может быть местным (включая глазное и на слизистые оболочки, включая интраназальную, вагинальную и ректальную доставку), легочным (например, посредством ингаляции или вдувания порошков или аэрозолей, включая применение небулайзера; внутритрахеальным, интраназальным, эпидермальным и чрескожным), глазным, пероральным или парентеральным. Способы глазной доставки могут включать местное введение (глазные капли), субконъюнктивальную, окологлазную инъекцию или инъекцию в стекловидное тело, или введение посредством баллонного катетера или глазных вставок, хирургически помещенных в конъюнктивальный мешок. Парентеральное введение включает внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; или внутричерепное, например подоболочечное или внутрижелудочковое введение. Парентеральное введение можно осуществлять в форме одной болюсной дозы или, например, можно осуществлять посредством непрерывного перфузионного насоса. Фармацевтические композиции и препараты для местного введения могут включать чрескожные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости, порошки и тому подобное. Необходимыми или желательными могут быть традиционные фармацевтические носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители или тому подобное.
Данное изобретение также включает фармацевтические композиции, которые содержат в качестве активного ингредиента описанные здесь нуклеиновые кислоты и векторы в комбинации с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым носителем. Авторы изобретения используют термины «фармацевтически приемлемый» (или «фармакологически приемлемый») в отношении химических соединений и композиций, которые не дают вредной, аллергической или другой неблагоприятной реакции при введении животному или человеку, в зависимости от того, что является подходящим. Термин «фармацевтически приемлемый носитель» в том виде, как он здесь использован, включает все и любые растворители, диспергирующие среды, покрытия, антибактериальные, изотоничные и задерживающие поглощение агенты, буферы, эксципиенты, связывающие агенты, смазывающие агенты, гели, поверхностно-активные вещества и тому подобное, которые можно использовать в качестве сред для фармацевтически приемлемого вещества. При получении композиций по изобретению активный ингредиент типично смешивают с эксципиентом, разводят эксципиентом или включают в такой носитель в форме, например, капсулы, таблетки, саше, бумажной упаковки или другого контейнера. Когда эксципиент служит в качестве разбавителя, он может быть твердым, полутвердым или жидким веществом (например, нормальным физиологическим раствором), который действует в качестве наполнителя, носителя или среды для активного ингредиента. Таким образом, композиции могут находиться в форме таблеток, пилюль, порошков, пастилок, саше, крахмальных облаток, эликсиров, суспензий, эмульсий, растворов, сиропов, аэрозолей (в виде твердого вещества или в жидкой среде), лосьонов, кремов, мазей, гелей, мягких и твердых желатиновых капсул, суппозиториев, стерильных инъецируемых растворов и стерильных упакованных порошков. Как известно в данной области, тип разбавителя может варьировать в зависимости от намеченного пути введения. Полученные в результате композиции могут включать дополнительные агенты, такие как консерванты. В некоторых воплощениях носитель может представлять собой или может включать коллоид на основе липидов или на основе полимеров. В некоторых воплощениях вещество носителя может представлять собой коллоид, приготовленный в виде липосомы, гидрогеля, микрочастицы, наночастицы или мицеллы блоксополимера. Как отмечено, вещество носителя может образовать капсулу, и данным веществом может быть коллоид на основе полимеров. Дополнительное описание типичных фармацевтически приемлемых носителей и разбавителей, а также фармацевтических композиций можно найти в Remington’s Pharmaceutical Sciences, стандартном справочнике в данной области, и в USP(Фармакопея Соединенных Штатов)/NF(Национальный формуляр). Для стабилизации и/или консервирования композиций в данные композиции можно добавлять другие вещества.
Нуклеиновокислотные последовательности по изобретению можно доставлять в подходящую клетку субъекта. Этого можно достигнуть, например, посредством применения полимерных, биодеградируемых микрочастиц или носителя для доставки на основе микрокапсул, сортированных по размеру для оптимизации фагоцитоза фагоцитарными клетками, такими как макрофаги. Например, можно использовать микрочастицы PLGA (полилактосогликолид), имеющие диаметр приблизительно 1-10 мкм. Полинуклеотид инкапсулируется в данные микрочастицы, которые поглощаются макрофагами и постепенно биодеградируют в клетке, посредством этого высвобождая полинуклеотид. Сразу после высвобождения ДНК экспрессируется в клетке. Второй тип микрочастиц предназначен не для того, чтобы непосредственно поглощаться клетками, но скорее, чтобы, главным образом, служить в качестве резервуара, обеспечивающего медленное высвобождение нуклеиновой кислоты, которая поглощается клетками, только при высвобождении из микрочастиц посредством биодеградации. Данные полимерные частицы, следовательно, должны быть достаточно большими для предотвращения фагоцитоза (т.е. больше чем 5 мкм и, предпочтительно, больше чем 20 мкм). Другим способом достижения поглощения нуклеиновой кислоты является применение липосом, полученных стандартными способами. Нуклеиновые кислоты могут быть включены в данные носители для доставки одни или включены совместно с тканеспецифичными антителами, например антителами, которые нацелены на типы клеток, которые являются обычными латентно инфицированными резервуарами инфекции HIV, например на макрофаги мозга, микроглию, астроциты и лимфоидные клетки, ассоциированные с кишечником. В качестве альтернативы, можно получать молекулярный комплекс, состоящий из плазмиды или другого вектора, присоединенного к поли-L-лизину посредством электростатических или ковалентных сил. Поли-L-лизин связывается с лигандом, который может связываться с рецептором на клетках-мишенях. Доставка «голой ДНК» (то еесть без носителя для доставки) во внутримычечный, внутрикожный или подкожный сайт является другим средством достижения экспрессии in vivo. В релевантных полинуклеотидах (например, экспрессионных векторах) нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая выделенную нуклеиновокислотную последовательность, содержащую последовательность, кодирующую эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, и РНК-проводник, связаны функциональным образом с промотором или комбинацией энхансер-промотор. Промоторы и энхансеры описаны выше.
В некоторых воплощениях композиции по изобретению могут быть приготовлены в виде наночастиц, например наночастиц, содержащих ядро линейного полиэтиленимина с высокой молекулярной массой (LPEI), комплексированного с ДНК и окруженного оболочкой LPEI с низкой молекулярной массой, модифицированного полиэтиленгликолем (ПЭГилированного).
Нуклеиновые кислоты и векторы также могут быть нанесены на поверхность устройства (например, катетера) или содержаться в насосе, пластыре или другом устройстве доставки лекарственного средства. Нуклеиновые кислоты и векторы по изобретению можно вводить в отдельности или в смеси, в присутствии фармацевтически приемлемого эксципиента или носителя (например, физиологического раствора). Эксципиент или носитель выбирают на основе способа и пути введения. Подходящие фармацевтические носители, а также фармацевтически необходимые компоненты для применения в фармацевтических композициях описаны в Remington’s Pharmaceutical Sciences (Е.W. Martin), хорошо известном справочнике в данной области, и в USP/NF (Фармакопея Соединенных Штатов и Национальный формуляр).
В некоторых воплощениях композиции могут быть приготовлены в виде наночастицы, инкапсулирующей нуклеиновую кислоту, кодирующую Cas9 или вариант Cas9 и по меньшей мере одну последовательность пРНК, комплементарную HIV-мишени; или она может включать вектор, кодирующий данные компоненты. В качестве альтернативы, композиции могут быть приготовлены в виде наночастицы, инкапсулирующей эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, полипептиды, кодируемые одной или более чем одной нуклеиновокислотной композицией по настоящему изобретению.
Способы лечения
Результаты, раскрытые в Примерах 1-4, показывают, что системы CRISPR по настоящему изобретению являются эффективными в устранении JCV из клеток-хозяев и в придании клеткам-хозяевам невосприимчивости к новой инфекции. Эти данные показывают, что компоненты систем CRISPR можно доставлять пациентам, инфицированным JCV, и пациентам, подверженным риску JCV, в качестве куративных и профилактических лечений. Предпочтительные способы доставки включают ранее описанные фармацевтические композиции.
Настоящее изобретение, следовательно, охватывает способ лечения субъекта, имеющего расстройство, связанное с LCV, такое как прогрессирующая мультифокальная лейкоэнцефалоптия, включающий стадию введения субъекту эффективного количества ранее описанной фармацевтической композиции. Настоящее изобретение также охватывает способ предупреждения инфекции JCV клеток пациента, подверженного риску инфекции JCV, включающий следующие стадии: определение того, что пациент подвержен риску инфекции JCV; воздействие на клетки пациента эффективным количеством композиции экспрессионного вектора, включающей выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, и по меньшей мере одну выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере пРНК, включающую спейсерную последовательность, комплементарную последовательности-мишени в ДНК JCV; стабильное экспрессирование эндонуклеазы, ассоциированной с CRISPR, и по меньшей мере одной пРНК в клетках пациента; и предупреждение инфекции JCV клеток пациента.
Композиции и способы по данному изобретению являются, в общем и в разных отношениях, полезными для лечения субъекта, имеющего инфекцию, опосредованную полиомавирусом, например инфекцию JCV. Субъекта эффективно лечат всякий раз, когда обеспечивается клинически полезный результат. Это может означать, например, полное устранение симптомов заболевания, уменьшение тяжести симптомов заболевания или замедление прогрессирования заболевания. Таким образом, способы по изобретению могут быть полезными для лечения заболеваний и расстройств, ассоциированных с инфекциями JCV, таких как нейробластома надпочечника, нейроэктодермальные опухоли, опухоли мозжечкового происхождения, гипофизарная неоплазия, опухоли оболочек периферических нервов и рак, включая злокачественные новообразования мозга, такие как олигоастроцитома, ксантоастроцитома, медуллобластомы, олигодендроглиома, мультиформная глиобластома, опухоли мозга глиального происхождения, лимфома ЦНС (центральной нервной системы); а также злокачественные новообразования ободочной кишки и пищевода; или вторичные инфекции. Данные способы могут дополнительно включать стадии (а) идентификации субъекта (например, пациента и, более конкретно, пациента-человека), который имеет инфекцию JCV, и (б) предоставления данному субъекту композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, и РНК-проводник, комплементарную последовательности-мишени JCV, например последовательности Т-антигена. Терапевтически эффективным количеством считается количество такой композиции, предоставленное субъекту, которое приводит к полному исчезновению симптомов инфекции, уменьшению тяжести симптомов инфекции или замедлению прогрессирования инфекции. Настоящие способы также могут включать стадию мониторинга для помощи в оптимизации дозирования и расписания введения, а также в прогнозировании результата.
В некоторых способах настоящего изобретения сначала можно определить, имеет ли пациент инфекцию JCV, и затем сделать определение того, лечить или нет пациента одной или более чем одной из описанных здесь композиций. Мониторинг также можно использовать для выявления начала устойчивости к лекарственному средству и для быстрого отличения отвечающих пациентов от неотвечающих пациентов. В некоторых воплощениях способы могут дополнительно включать стадию определения нуклеиновокислотной последовательности конкретного JCV, которого имеет пациент, и затем конструирования РНК-проводника так, чтобы она была комплементарна этим конкретным последовательностям. Например, можно определить нуклеиновокислотную последовательность области ТМ1, ТМ2 и/или ТМ3 субъекта и затем сконструировать одну или более чем одну пРНК так, чтобы она была точно комплементарна последовательностям пациента.
В некоторых воплощениях композиции можно вводить ex vivo для лечения клеток или органов, удаленных от одного индивида для трансплантации другому индивиду. Клетки или органы, предназначенные для трансплантации, можно трансдуцировать вектором, содержащим композиции Cas9 по изобретению. Удаление или ослабление последовательностей JCV-мишеней может быть подтверждено, и подвергнутые лечению клетки могут быть инфундированы пациенту.
Композиции или агенты, идентифицированные воплощенными здесь способами, можно вводить субъектам, включающим животных и людей, в любой подходящей композиции. Например, композиции могут быть приготовлены в фармацевтически приемлемых носителях или разбавителях, таких как физиологический раствор или забуференный солевой раствор. Подходящие носители и разбавители могут быть выбраны на основе способа и пути введения, и стандартной фармацевтической практики.
Композиции по изобретению можно вводить субъекту посредством любой традиционной методики. Данные композиции можно вводить непосредственно в сайт-мишень, например посредством хирургической доставки во внутренний или внешний сайт-мишень, или посредством катетера в сайт, доступный для кровеносного сосуда. В данной области известны другие способы доставки, например липосомная доставка или диффузия из устройства, импрегнированного композицией. Композиции можно вводить в одном болюсе, множественных инъекциях или посредством непрерывной инфузии (например, внутривенно). Для парентерального введения полезные композиции готовят в стерилизованной апирогенной форме.

Композиции можно вводить с дополнительным терапевтическим агентом, например агентом, используемым для лечения демиелинизирующего заболевания, например натализумабом (Тисабри), финголимодом (гиления); дисфункции В-клеток (ритуксимаб (Ритуксан, мабТера и Зитукс); иммуноопосредованных расстройств и трансплантации (адалимумаб/хумира; брентуксимаб ведотин/адцетрис; эфализумаб/раптива; этанерцепт/энбрел, инфликсимаб (ремикад); микофенолята мофетил (ММР)/селлсепт; или ретровирусной инфекции, например HAART (высокоэффективная противоретровирусная терапия). Сопутствующее введение двух или более чем двух терапевтических агентов не требует того, чтобы данные агенты были введены в одно и то же время или одним и тем же путем, при условии, что имеется перекрывание в периоде времени, на протяжении которого агенты оказывают их терапевтический эффект. Рассматривается одновременное или последовательное введение, как и введение в разные сутки или недели. Терапевтические агенты можно вводить согласно метрономной схеме, например непрерывными малыми дозами терапевтического агента.
50
50
50
Дозировку, токсичность и терапевтическую эффективность таких композиций можно определять в культурах клеток или экспериментальных животных посредством стандартных фармацевтических методик, например для определения LD (летальная доза для 50% популяции) и ED50 (терапевтически эффективная доза у 50% популяции). Дозовое отношение между токсическими и терапевтическими эффектами представляет собой терапевтический индекс, и он может быть выражен как отношение LD/ED. Композиции Cas9/пРНК, которые демонстрируют высокие терапевтические индексы, являются предпочтительными. В то время как можно использовать композиции Cas9/пРНК, которые демонстрируют токсичные побочные эффекты, нужно быть осторожными при разработке системы доставки, которая нацеливает такие композиции в место пораженной ткани для того, чтобы минимизировать потенциальное поражение неинфицированных клеток и, посредством этого, уменьшить побочные эффекты.
50
50
Данные, полученные из анализов на культуре клеток и исследований на животных, можно использовать для приготовления ряда дозировок для применения у человека. Дозировка таких композиций обычно находится в пределах интервала циркулирующих концентраций, которые включают ED, с малой токсичностью или ее отсутствием. Дозировка может варьировать в пределах данного интервала в зависимости от используемой лекарственной формы и применяемого пути введения. Для любой композиции, используемой в способе по изобретению, терапевтически эффективную дозу можно оценить исходно на основании анализов культуры клеток. Доза может быть приготовлена в животных моделях для достижения интервала концентрации, циркулирующей в плазме, который включает IC (то есть концентрация тестируемого соединения, при которой достигается полумаксимальное ингибирование симптомов) при определении в культуре клеток. Такую информацию можно использовать для более точного определения полезных доз у человека. Уровни в плазме можно измерять, например, посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Терапевтически эффективное количество композиции (то есть эффективная дозировка), как здесь определено, означает количество, достаточное для получения терапевтически (например, клинически) желательного результата. Композиции можно вводить от одного или более чем одного раза в сутки до одного или более чем одного раза в неделю; включая один раз через сутки. Квалифицированному специалисту будет понятно, что определенные факторы могут влиять на дозировку и выбор времени введения, требующиеся для эффективного лечения субъекта, включая тяжесть заболевания или расстройства, предыдущие лечения, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта и другие присутствующие заболевания, но не ограничиваясь ими. Кроме того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством композиций по изобретению может включать одну обработку или серию обработок.
Описанные здесь композиции подходят для применения в ряде систем доставки лекарственного средства, описанных выше. Дополнительно, для того, чтобы увеличить период полувыведения введенного соединения в сыворотке in vivo, композиции могут быть инкапсулированы, введены в полость липосом, получены в виде коллоида, или могут быть использованы другие традиционные методики, которые обеспечивают увеличенный период полувыведения композиций в сыворотке. Доступен ряд способов для получения липосом, как описано, например, в Szoka, et al., патенты США №4235871, 4501728 и 4837028, каждый из которых включен сюда посредством ссылки. Кроме того, можно вводить лекарственное средство в системе направленной доставки лекарственного средства, например в липосоме, покрытой тканеспецифичным антителом. Данные липосомы будут нацелены в орган и избирательно поглощаться органом.
Препараты для введения композиций включают препараты, подходящие для ректального, назального, перорального, местного (включая трансбуккальное и подъязычное), вагинального или парентерального (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное и внутрикожное) введения. Композиции могут с удобством быть представлены в стандартной лекарственной форме, например в таблетках и в капсулах, обеспечивающих замедленное высвобождение, и они могут быть приготовлены любыми способами, хорошо известными в области фармации.
Композиции могут включать клетку, которая была трансформирована или трансфицирована одним или более чем одним вектором с Cas/пРНК. Данная клетка может представлять собой клетки субъекта, или они могут быть соответствующими по гаплотипу или линией клеток. Данные клетки могут быть облучены для предупреждения репликации. В некоторых воплощениях клетки являются соответствующими по лейкоцитарному антигену человека (HLA), аутологичными, линией клеток или их комбинациями. В других воплощениях клетки могут быть стволовыми клетками, например эмбриональными стволовыми клетками или искусственными плюрипотентными стволовыми клетками (индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (клетка iPS)). Эмбриональные стволовые клетки (клетки ES) и искусственные плюрипотентные стволовые клетки (индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, клетки iPS) были получены из многих видов животных, включая человека. Данные типы плюрипотентных стволовых клеток были бы самым полезным источником клеток для регенеративной медицины, так как данные клетки способны к дифференциации в почти все органы посредством подходящего индуцирования их дифференциации, с сохранением их способности активно делиться при поддержании их плюрипотентности. Клетки iPS, в частности, могут быть получены из аутогенных соматических клеток и, следовательно, вероятно не будут вызывать этические и социальные проблемы по сравнению с клетками ES, которые получают посредством разрушения эмбрионов. Кроме того, клетки iPS, которые представляют собой аутогенные клетки, делают возможным избежание реакций отторжения, которые являются наибольшим препятствием для регенеративной медицины или трансплантационной терапии.
Экспрессионную кассету пРНК можно доставлять субъекту способами, известными в данной области. В некоторых аспектах Cas может представлять собой фрагмент, в который включены активные домены молекулы Cas, посредством этого сокращая размер молекулы. Таким образом, молекулы Cas9/пРНК можно использовать клинически, аналогично подходам, взятым современной генотерапией. В частности, для применения у субъектов будут разработаны стволовые клетки со стабильной экспрессией Cas9/мультиплексной пРНК или клетки iPS для трансплантационной клеточной терапии, а также для вакцинации против полиомавируса.
6
10
50
Трансдуцированные клетки готовят для реинфузии согласно установившимся способам. После периода примерно 2-4 недели в культуре число клеток может составлять от 1×10 до 1×10. В данном отношении характеристики роста клеток варьируют от пациента к пациенту и от типа клетки к типу клетки. Примерно за 72 часа до реинфузии трансдуцированных клеток отбирается аликвота для анализа фенотипа и процентной доли клеток, экспрессирующих терапевтический агент. Для введения клетки по настоящему изобретению можно вводить со скоростью, определяемой LD данного типа клеток и побочными эффектами для данного типа клеток при разных концентрациях, применительно к массе тела и общему состоянию здоровья пациента. Введение можно осуществлять посредством одной или раздельных доз. Взрослые стволовые клетки также могут быть мобилизованы с использованием экзогенно введенных факторов, которые стимулируют их продукцию и выходят из тканей или пространств, которые могут включать костный мозг или жировые ткани, но не ограничиваются ими.
Изделия
Описанные здесь композиции могут быть упакованы в подходящие контейнеры, помеченные, например, для применения в качестве терапии для лечения субъекта, имеющего ретровирусную инфекцию, например инфекцию JCV, или субъекта, подверженного риску инфекции JCV. Данные контейнеры могут включать композицию, содержащую нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, например эндонуклеазу Cas9, и РНК-проводник, комплементарную последовательности-мишени в JCV, или вектор, кодирующий данную нуклеиновую кислоту, и один или более чем один подходящий стабилизатор, молекулу-носитель, корригент и/или тому подобное, в зависимости от того, что является подходящим для намеченного применения. Соответственно, упакованные продукты (например, стерильные контейнеры, содержащие одну или более чем одну описанную здесь композицию и упакованные для хранения, отправки или продажи в концентрированном состоянии или в концентрациях, готовых к применению) и наборы, включающие по меньшей мере одну композицию по изобретению, например нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, например эндонуклеазу Cas9, и РНК-проводник, комплементарную последовательности-мишени в JCV, или вектор, кодирующий данную нуклеиновую кислоту, и инструкции для применения, также находятся в пределах объема данного изобретения. Продукт может включать контейнер (например, флакон, банку, бутыль, мешок или тому подобное), содержащий одну или более чем одну композицию по изобретению. Кроме того, изделие может дополнительно включать, например, упаковочные материалы, инструкции для применения, шприцы, устройства для доставки, буферы или другие контрольные реактивы для лечения или контроля состояния, для которого требуется профилактика или лечение.
В некоторых воплощениях наборы могут включать один или более чем один дополнительный терапевтический агент, как описано выше. Дополнительные агенты могут быть упакованы совместно в том же самом контейнере, что и нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, например эндонуклеазу Cas9, и РНК-проводник, комплементарную последовательности-мишени в вирусе JC, или вектор, кодирующий данную нуклеиновую кислоту, или они могут быть упакованы раздельно. Нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, например эндонуклеазу Cas9, и РНК-проводник, комплементарную последовательности-мишени в вирусе JC, или вектор, кодирующий данную нуклеиновую кислоту, и дополнительный агент, могут быть объединены непосредственно перед применением или введены раздельно.
Данный продукт также может включать пояснение (например, напечатанную этикетку или вкладыш, или другой носитель, описывающий применение продукта (например, аудио- или видеопленка). Пояснение может быть ассоциировано с контейнером (например, прикреплено к контейнеру) и может описывать способ, которым должны быть введены находящиеся в нем композиции (например, частоту и путь введения), показания для нее и другие применения. Данные композиции могут быть готовыми для введения (например, присутствовать в упаковках, подходящих для дозы) и могут включать один или более чем один дополнительный фармацевтически приемлемый адъювант, носитель или другой разбавитель и/или дополнительный терапевтический агент. В качестве альтернативы, композиции могут быть предоставлены в концентрированной форме с разбавителем и инструкциями для разбавления.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: материалы и методы
Эффекты Cas9 и пРНК в нацеливании на Т-антиген и на его функцию проверяли с использованием технологии CRISPR/Cas9. Конструкция РНК-проводников для нацеливания на JCV посредством CRISPR/Cas9 показана на Фиг. 1А и 1Б.
Культура клеток. Линию клеток ТС620 олигодендроглиомы человека (Wollebo, et al., 2011) и SVG-A - линию клеток, имеющую происхождение из первичных фетальных глиальных клеток человека, трансформированных SV40 с дефектным репликатором, который экспрессирует Т-Ag SV40 (Major, et al., 1985), поддерживали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной телячей сыворотки (FBS), как описано ранее (Wollebo, et al., 2011). HJC-2 представляет собой линию клеток глиобластомы хомяка, индуцированную JCV, которая экспрессирует Т-Ag JCV (Raj, et al., 1995). BsB8 представляет собой мышиную линию клеток, имеющую происхождение из опухоли мозжечкового нейроэктодермального происхождения, образующейся в трансгенных мышах, экспрессирующих Т-Ag раннего белка JCV (Krynska, et al., 2000). Производные клеток SVG-A, экспрессирующие Cas9 и пРНК Т-антигена JCV, получали посредством трансфекции клеток SVG-A плазмидами, полученными из рХ260 (описаны ниже), селекции в средах, содержащих пуромицин, и выделения одиночных клонов посредством клонирования разведением.
Получение плазмид. Векторы, содержащие экспрессионную кассету человеческой Cas9 и пРНК, рХ260 и рХ330 (Addgene), использовали для создания различных конструкций. Оба вектора содержат гуманизированную кодирующую последовательность Cas9, управляемую промотором CAG, и экспрессионную кассету пРНК, управляемую человеческим промотором U6 (Cong, et al., 2013). Векторы расщепляли Bbsl и обрабатывали фосфатазой Antarctic. Пару олигонуклеотидов для каждого целевого сайта отжигали, фосфорилировали и лигировали в линеаризованный вектор. Данные олигонуклеотиды показаны на Фиг. 5 (SEQ ID NO: 19-30). Экспрессионную кассету пРНК секвенировали с использованием праймера для секвенирования U6 в GENEWIZ. Для векторов рХ330 конструировали пару универсальных ПЦР-праймеров с выступающими сайтами расщепления, которые могут извлекать экспрессионную кассету пРНК (U6-пРНК-крРНК-стебель-тракрРНК) для прямой трансфекции или субклонирования в другие векторы.
L
Репортерная конструкция - JCV-LUC (Wollebo, et al, 2011) и экспрессионная плазмида с пкДНК 3.1-большим Т-Ag были описаны ранее (Chang, et al., 1996). Для лентивирусного продуцирования от Addgene были получены следующие плазмиды: pCW-Cas9 (#50661), psPAX2 (#12260), pCMV-VSV-G (#8454), pKLV-U6gRNA(Bbsl)-PGKpuro2ABFP (#50946), pMDLg/pRRE (#12251), pRSV-Rev (#12253). Для конструирования лентивирусных экспрессионных пРНК плазмид для каждой из трех мишеней экспрессионную кассету U6 из каждой из трех пРНК плазмид рХ330, описанных выше, амплифицировали посредством ПЦР с фланкирующими праймерами 5'-tatgggcccacgcgtgagggcctatttcccatgattcc-3' (SEQ ID NO: 42) и 5'-tgtggatcctcgaggcgggccatttaccgtaagttatg-3') (SEQ ID NO: 43), и ПЦР-продукты обрабатывали Mlul и BamHI и клонировали в pKLV-U6gRNA(Bbsl)-PGKpuro2ABFP, которая была разрезана Mlul и BamHI. Вектор pCR 4-ТОРО ТА был от Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA.
L
Временная трансфекция и репортерные анализы. Котрансфекцию репортерной плазмидой JCV-LUC и экспрессионной плазмидой Т-Ag проводили, как описано ранее (Wollebo, et al, 2011, Wollebo, et al, 2012). Вкратце, клетки ТС620 трансфицировали либо одними репортерными конструкциями (200 нг), либо в комбинации с разными экспрессионными плазмидами в течение 48 ч до сбора. Общее количество трансфицированной ДНК нормировали с использованием ДНК пустого вектора. Люциферазный анализ проводили, как описано ранее (Wollebo, et al, 2011, Wollebo, et al, 2012).
Получение клональных производных SVG-A, экспрессирующих Cas9 и пРНК. Клетки SVG-A трансфицировали рХ260 или плазмидами, полученными из рХ260, экспрессирующими каждую из трех описанных ранее пРНКаз. Отбор осуществляли с использованием 3 мкг/мл пуромицина, и клоны выделяли посредством клонирования разведением.
Анализ инфекции JCV. Эксперименты по инфицированию проводили с использованием клеток SVG-A или клональных производных SVG-A, экспрессирующих Cas9 и пРНК, описанные выше. Клетки инфицировали JCV Mad-1 при MOI (множественность заражения) 1, как описано ранее (Radhakrishnan, et al., 2003; Radhakrishnan, et al., 2004); и собирали и анализировали через 7 суток вместе с неинфицированными контрольными культурами. Экспрессию вирусных белков VP1 и агнопротеина измеряли в экстрактах общего белка клетки посредством вестерн-блоттинга. Параллельно также отбирали ростовые среды клеток для измерения вирусной нагрузки посредством кПЦР (количественная полимеразная цепная реакция).
Иммуноцитохимия. Клетки ТС620 трансфицировали экспрессионной плазмидой для Cas9, меченной FLAG, и проводили иммуноцитохимию с мышиным первичным антителом против Flag М2 (1:500, Sigma), как описано ранее (Hu, et al., 2014).
Анализ расщепления гена Т-Ag посредством ПЦР. Клетки BsB8 или HJC-2 трансфицировали плазмидой рХ260 или плазмидами, полученными из рХ260, экспрессирующими пРНК, описанные выше. Общую геномную ДНК экстрагировали через 48 часов. Ген Т-Ag амплифицировали посредством ПЦР с использованием праймеров, которые фланкируют кодирующую область Т-Ag JCV (5'-gcttatgccatgccctgaaggt-3' (SEQ ID NO: 44) и 5'-atggacaaagtgctgaataggga-3' (SEQ ID NO: 45), и ПЦР-продукты подвергали электрофорезу на агарозном геле.
Получение лентивирусных векторов для Cas9 и создание клеток HJC-2, экспрессирующих индуцибельную Cas9. Для получения лентивирусного вектора для трансдукции экспрессии Cas9, индуцируемой доксициклином, клетки 293Т трансфицировали плазмидами pCW-Cas9, psPAX2 и pCMV-VSV-Gusing посредством способа осаждения с фосфатом кальция (Graham, van der Eb, 1973). Лентивирус собирали из супернатанта через 48 ч, осветляли посредством центрифугирования и пропускали через 0,45 мкм фильтр, как описано ранее (Wollebo, et al., 2013). Для получения стабильно трансдуцированных клональных производных клеток HJC-2, индуцибельно экспрессирующих Cas9, лентивирус добавляли к клеткам HJC-2 в присутствии 6 мкг/мл полибрена, с последующим отбором с 3 мкг/мл пуромицина и выделением клонов посредством клонирования разведением. Для индуцирования экспрессии Cas9 в полученных в результате клонах в культуральные среды добавляли 2 мкг/мл доксициклин.
Получение лентивирусных векторов для пРНК и трансдукция клеток HJC-2, экспрессирующих индуцибельную Cas9. Для получения лентивирусного вектора для трансдукции трех пРНК каждое из трех производных лентивирусных экспрессионных плазмид с пРНК, сконструированное, как описано выше, из pKLV-U6gRNA (Bbsl)-PGKpuro2ABFP, трансфицировали в клетки 293Т посредством осаждения с хлоридом кальция вместе с упаковочными плазмидами pCMV-VSV-G, pMDLg/pRRE и pBSV-Rev. Лентивирус собирали из супернатанта через 48 ч, осветляли посредством центрифугирования, пропускали через 0,45 мкм фильтр и добавляли к клеткам HJC-2 в присутствии 6 мкг/мл полибрена с последующей селекцией. Через 24 часа трансдуцированные клетки обрабатывали 2 мкг/мл доксициклина для индуцирования экспрессии Cas9 и еще через 48 часов отбирали и анализировали на предмет мутаций Т-Ag посредством ПЦР/секвенирования, на предмет экспрессии Т-Ag - посредством вестерн-блоттинга и на предмет клоногенности - посредством анализа колониеобразования.
Анализ мутаций InDel. Поскольку расщепление ДНК Cas9 оставляет характерные мутации в виде коротких вставок/делеций (InDel), последовательность гена Т-Ag из клеток HJC-2, трансдуцированных пРНК, анализировали на предмет InDel. Общую геномную ДНК выделяли из клеток с использованием набора для очистки геномной ДНК согласно инструкциям изготовителя (5prime Inc., Gaithersburg MD), и области гена T-Ag, который служил в качестве мишени, амплифицировали посредством ПЦР с использованием фланкирущих праймеров. Для ТМ1 и ТМ2 следующими использованными праймерами были 5'-ctctggtcatgtggatgctgt-3' (SEQ ID NO: 46) и 5'-atggacaaagtgctgaataggga-3' (SEQ ID NO: 47). Праймеры 5'-gcttatgccatgccctgaaggt-3' (SEQ ID NO: 48) и 5'-acagcatccacatgaccagag-3' (SEQ ID NO: 49) использовали для ТМ3. ПЦР-продукты клонировали в клонирующий вектор для ТА pCR4-TOPO, и секвенировали колонии.
2
Анализ SURVEYOR. Присутствие мутаций в ПЦР-продуктах, полученых из клеток HJC-2, экспрессирующих Cas9, и трансдуцированных лентивирусными векторами для пРНК, исследовали с использованием набора для выявления мутаций SURVEYOR (Transgenomic) согласно протоколу изготовителя. Использовали те же самые праймеры, как описано для анализа мутаций InDel. Гетерогенный ПЦР-продукт денатурировали в течение 10 мин при 95°C и затем гибридизировали посредством постепенного охлаждения с использованием термоциклера. Триста нанограммов гибридизованной ДНК (9 мкл) расщепляли 0,25 мкл нуклеазы SURVEYOR, которая представляет собой ДНК-эндонуклеазу, специфичную в отношении областей с ошибочным спариванием оснований, используемую для сканирования на предмет мутаций в гетеродуплексной ДНК; плюс 0,25 мкл энхансера S SURVEYOR и 15 мМ MgCl в течение 4 ч при 42°C. Добавляли останавливающий раствор, и образцы разделяли на 2%-ном агарозном геле, наряду с равными количествами контрольных образцов. Контрольные образцы обрабатывали параллельно, но они были получены из клеток HJC-2, экспрессирующих Cas9, но не трансдуцированных лентивирусным вектором для пРНК. Анализ SURVEYOR также использовали для выявления присутствия мутаций клеточных генов вне мишени с использованием стабильных производных линий клеток SVG-A, экспрессирующих Cas9 и пРНК.
Анализ колониеобразования. Клетки HJC-2, экспрессиующие индуцибельную Cas9, трансдуцировали лентивирусными экспрессионными векторами для пРНК для каждой из трех мишеней либо в отдельности, либо в комбинации. Клетки высаживали на чашки для анализов колониеобразования в присутствии или в отсутствие доксициклина. Клетки выращивали в течение 10-14 суток, промывали PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), фиксировали и окрашивали 40%-ным метанолом и 0,4%-ным метиленовым синим. Подсчитывали колонии с более чем 50 клетками.
Пример 2: экспрессия пРНК, нацеленных на Т-Ag, уменьшает и экспрессию Т-Ag, и стимулированную Т-Ag экспрессию поздних генов JCV в клетках ТС620, трансфицированных Т-Ag и Cas9
В первом наборе экспериментов определили может ли Cas9, в комбинации с разными пРНК, нацеленными на ТМ1, ТМ2 и ТМ3, подавлять экспрессию Т-антигена в клеточной линии олигодендроцитов человека - ТС620. В данных экспериментах пРНК m1 комплементарна последовательности-мишени ТМ1 SEQ ID NO: 1; пРНК m2 комплементарна последовательности-мишени ТМ2 SEQ ID NO: 5; и пРНК m3 комплементарна последовательности-мишени ТМ3 SEQ ID NO: 9.
Результаты анализа посредством вестерн-блоттинга клеток ТС620, трансфицированных плазмидой, экспрессирующей Т-антиген, либо одной, либо в комбинации с Cas9 и/или в комбинации с экспрессионными плазмидами пРНК, нацеленными на Т-Ag, показаны на Фиг. 2А. Как видно на этой Фиг., присутствие Cas9 вместе с пРНК либо m1, либо m2, заметно снижало уровень продукции Т-Ag в трансфицированных клетках. Однако экспрессия пРНК m3 не демонстрировала значимого эффекта на уровень экспрессии Т-Ag. На Фиг. 2Б показаны результаты количественного измерения продукции Т-антигена на основе интенсивности полосы, соответствующей Т-антигену, которая была нормирована к гену домашнего хозяйства - β-тубулину.
Затем были проведены функциональные исследования для оценки способности Т-Ag стимулировать активность позднего промотора JCV (Lashgari, et al., 1989). Клетки ТС620 являются особенно подходящими в данном исследовании, так как их олигодендроцитарное происхождение обеспечивает специфичную в отношении типа клеток транскрипцию от промотора JCV на базовом уровне, которая может быть индуцирована при экспрессии Т-Ag. Результаты транскрипционных исследований с использованием позднего промотора JCV - JCVL - управляющего репортерным геном люциферазы, показали то, что уровень активации промотора JCVL посредством Т-Ag значимо уменьшается в клетках, экспрессирующих Cas9/nPHK m1 или Cas9/nPHK m2, но не Cas9/nPHK m3 (Фиг. 2В). В целом, данные наблюдения показывают, что пРНК m1 и m2, в отдельности или в комбинации, при экспрессии совместно с Cas9, уменьшают экспрессию Т-Ag и ингибируют последующие стимулированные Т-Ag события, связанные с вирусной литической инфекцией. Результатом данных эффектов является устранение JCV из клеток-хозяев.
Пример 3: клональное производное SVGA, экспрессирующее Cas9 и пРНК, нацеленную на Т-Ag, имеет пониженную способность поддерживать инфекцию JCV
Для исследования эффектов Cas9, направляемой пРНК, при инфекции JCV, проводили эксперименты с использованием линии клеток SVG-A. Данная линия поддерживает экспрессию вирусных генов и также обеспечивает полную продуктивную вирусную литическую инфекцию. Во-первых, из клеток SVG-A были заложены стабильные клональные линии клеток, которые экспрессируют либо Cas9, либо Cas9 плюс пРНК m1. В данных экспериментах пРНК m1 была комплементарна последовательности-мишени ТМ1 SEQ ID NO: 1. Отбирали три отдельных клона и использовали для инфекции JCV при MOI, составляющем 1,0, в течение семи суток. Вирусную инфекцию оценивали посредством анализа вестерн-блоттингом на предмет присутствия белка вирусного капсида - VP1 и вспомогательного белка - агнопротеина с использованием α-тубулина в качестве контроля загрузки. Параллельно проводили количественную ПЦР (кПЦР) для определения уровня вирусной ДНК в культуральных средах в качестве маркера репликации ДНК и, следовательно, продукции вируса. Как показано на Фиг. 3А, клональная линия клеток, экспрессирующая только Cas9 (полоса 3), поддерживала инфекцию JCV, что подтверждается присутствием в данных клетках белка вирусного капсида - VP1 и вспомогательного агнопротеина (полоса 2). В отличие от этого, клон SVG-A, экспрессирующий и Cas9, и пРНК m1, не мог поддерживать вирусную репликацию. Эти данные были поддержаны экспериментами кПЦР для измерения вируса в супернатантах культуры (Фиг. 3Б). Некоторые из клональных клеток, которые были исходно трансфицированы и Cas9, и пРНК m1, могли поддерживать репликацию JCV, свидетельствуя о том, что данные клетки или теряли экспрессию Cas9 и/или продукцию пРНК m1 (данные не показаны). Для определения того, воздействует ли инфекция JCV на экспрессию Cas9, экспрессию Cas9 подтверждали посредством вестерн-блоттинга в клетках SVG-А Cas9 и SVG-A Cas9m1c8 (Фиг. 3В), и посредством иммуноцитохимии было показано то, что Cas9, меченная FLAG, локализована в ядре (Фиг. 3Г).
Данные результаты показывают, что стабильная экспрессия Cas9 и по меньшей мере одной пРНК, нацеленной на ген Т-Ag JCV, делает клетки невосприимчивыми к инфекции JCV.
Пример 4. Непосредственная демонстрация расщепления гена Т-Ag после временной трансфекции Cas9 и пРНК, нацеленной на Т-Ag JCV
Далее определяли способность Cas9 и пРНК редактировать последовательность ДНК JCV, соответствующую гену Т-Ag. Для данных экспериментов использовали клетки BsB8. BsB8 представляет собой мышиную линию клеток, которая содержит раннюю область JCV в качестве включенного трансгена, и которая эспрессирует Т-Ag (Krynska, et al. 2000). Также использовали другую линию клеток - HJC-2 - линию клеток хомяка, выделенную посредством ограничивающего разведения из глиобластомы, индуцированной внутримозговой инъекцией JCV (Raj, et al., 1995). Данные клетки также несут ранние гены JCV, интегрированные в геном хозяина, и экспрессируют Т-Ag. Данные линии клеток были выбраны для экспериментов, так как интегрированные в них копии генома JCV обеспечивают точное измерение способностей к редактированию Cas9/nPHK, нацеленных на последовательности JCV. Данные клетки трансфицировали экспрессионными плазмидами для Cas9 и пРНК в разных комбинациях, и геномную ДНК амплифицировали с использованием праймеров, специфичных в отношении JCV. На Фиг. 4А проиллюстрированы положения точек расщепления и ожидаемые длины полученных в результате фрагментов ДНК, соответствующих гену Т-Ag после редактирования.
Как показано на Фиг. 4Б, трансфекция клеток BsB8 экспрессионными плазмидами для Cas9 и пРНК m1 и m3 (полоса 1); m1, m2 и m3 (полоса 2); и m2 и m3 (полоса 3) приводила к появлению меньших фрагментов, помимо ожидаемой интактной последовательности из 1465 пар оснований (полоса 4). Как показано на Фиг. 4В, трансфекция клеток HJC-2 экспрессионными плазмидами для Cas9 и пРНК m1 и m2 или m1, m2 и m3 также приводила к появлению продуктов расщепления. На Фиг. 4Б и 4Б показано появление меньшего фрагмента из 327 п.о. вместо ожидаемой интактной последовательности из 1465 п.о., когда комбинацию пРНК m1 и m3 использовали для направления расщепления ДНК. Дополнительный анализ свидетельствовал о том, что фрагмент из 327 п.о. соответствует повторному связыванию остающихся последовательностей ДНК (107 плюс 220), как только отщепляется отрезок ДНК между последовательностями-мишенями m1 и m3 сайтов-мишеней. Аналогичное событие наблюдали при использовании мультиплекса m2 и m3 в комбинации, приводя к образованию ДНК из 824 п.о. (604 плюс 220). Данные результаты указывают на расщепление двух областей, нацеливание на которые опосредовано пРНК, в пределах вирусного генома, причем остающиеся последовательности гена повторно связываются посредством негомологичного концевого связывания (NHEJ).
Данные результаты показывают, что пРНК согласно настоящему изобретению, одни или в комбинации, индуцируют расщепление и большие делеции в ДНК JCV при их экспрессии в комбинации с Cas9. Данное повреждение ДНК может нарушать целостность гена Т-Ag JCV и приводить к устранению вируса из клеток-хозяев.
ПРИМЕР 5: Стабильная, индуцируемая лекарственным средством экспрессия компонентов системы Cas9/пРНК обеспечивает индуцируемое лекарственным средством устранение экспрессии Т-Ag в клетках-хозяевах
Для определения того, может ли JCV инактивироваться в клетке-хозяине посредством индуцирования лекарственным средством, клетки HJC-2 трансдуцировали индуцируемым доксициклином лентивирусным вектором, кодирующим Cas9. Получали стабильные производные. Полученные клетки затем трансдуцировали лентивирусными векторами, кодирующими пРНК, специфичные в отношении сайтов-мишеней в кодирующей области Т-Ag JCV. Данные пРНК включали m1, m2 и m3 со спейсерами, комплементарными SEQ ID NO: 1, 5 и 9 соответственно. После индуцирования доксициклином экстрагировали общую геномную ДНК. Области Т-Ag амплифицировали посредством ПЦР, клонировали в вектор ТА и секвенировали.
Для выявления мутаций InDel в ПЦР-продуктах использовали анализ Surveyor (Фиг. 6Б). Все пРНК m1, m2 и m3 давали мутации InDel, как продемонстрировано присутствием продуктов расщепления нуклеазы Surveyor (Фиг. 6Б).
Мутации InDel выявляли в соответствующей области гена Т-Ag геномной ДНК, экстрагированной из данных культур через 48 ч, посредством секвенирования клонов, полученных из продуктов, амплифицированных посредством ПЦР. Репрезентативные последовательности, включающие делеции или вставки, показаны на Фиг. 6А (SEQ ID NO: 31-34, 35-36 и 39-41). Данные результаты показывают, что большинство InDel были близкими к областям РАМ и состояли из вставки или делеции одного или двух нуклеотидов. Прогнозируется, что это вызывало бы мутации сдвига рамки считывания, влияющие на трансляцию Т-Ag. Как и ожидалось, посредством вестерн-блоттинга было определено, что экспрессия Т-Ag была устранена с каждой из трех пРНК при индуцировании экспрессии Cas9 доксициклином (Фиг. 7А). Фиг. 7Б иллюстрирует денситометрический количественный анализ результатов вестерн-блоттинга.
Также был исследован эффект экспрессии Cas9 и пРНК m1, m2 и m3 в разных комбинациях на клоногенность клеток HJC-2. Клоногенность в данных клетках представляет собой фенотип, который зависит от экспрессии Т-Ag. пРНК m1, m2 и m3 (комплементарные SEQ ID NO: 1, 5 и 9 соответственно) экспрессировались в разных комбинациях. Как видно на Фиг. 8, индуцирование экспрессии Cas9 доксициклином, наряду с пРНК, сильно уменьшало число колоний, которые образовались данными клетками (Фиг. 8А-8Г), указывая на подавление Т-Ag посредством Cas9 и пРНК в данных клетках. Все комбинации пРНК m1 плюс m2, m1 плюс m3, m2 плюс m3 и m1 плюс m2 плюс m3 уменьшали число колоний. На Фиг. 8Д проиллюстрирован типичный результат анализа колониеобразования.
Для оценки любых возможных событий вне мишени, происходящих в клеточном геноме, клетки SVG-A, стабильно экспрессирующие Cas9 и пРНК, анализировали посредством анализа SURVEYOR на предмет InDel мутаций в генах вне мишени. Человеческие клеточные гены с наивысшей степенью гомологии к каждому из трех мотивов идентифицировали посредством поиска BLAST на сайте NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Для каждого мотива амплифицировали ПЦР-продукты из трех генов с наивысшей степенью гомологии и проверяли на предмет InDel мутаций с использованием анализа SURVEYOR, как описано в Примере 1. Результаты анализа мотива 1 пРНК показаны на Фиг. 9А. Результаты анализа мотива 2 показаны на Фиг. 9Б. Результаты анализа мотива 3 показаны на Фиг. 9В. В каждом эксперименте амплификацию Т-Ag использовали в качестве позитивного контроля. Дополнительные полосы, возникающие в результате расщепления нуклеазой SURVEYOR, показаны звездочками. Во всех случаях не было выявлено расщепления генов вне мишени, что указывает на специфичность CRISPR/Cas9.
Раскрытые в данном примере результаты показывают, что индуцибельная система CRISPR согласно настоящему изобретению может вызывать индуцируемое лекарственным средством устранение Т-Ag JCV и облегчать эффекты инфекции JCV без вызывания вредных эффектов вне мишени на аналогичные нормальные гены. В целом, результаты всех предшествующих примеров указывают на то, что система CRISPR согласно настоящему изобретению является полезной в устранении активно реплицирующегося JCV у пациентов с PML, удаляя латентный JCV у асимптоматических хозяев JCV и предупреждая приобретение вируса неинфицированными индивидами, подверженными риску JCV.
Данное изобретение было описано иллюстративным способом, и следует понимать, что терминология, которая была использована, предназначена для того, чтобы относиться к формулировкам описания, а не ограничения. Очевидно, что в свете приведенных выше идей возможны многие модификации и вариации настоящего изобретения. Следовательно, необходимо понимать, что в пределах объема приложенной формулы изобретения данное изобретение может быть воплощено на практике иначе, чем конкретно описано.
--->
SEQUENCE LISTING
<110>  Temple University
Khalili, Kamel
<120>  RNA GUIDED ERADICATION OF HUMAN JC VIRUS AND OTHER POLYOMAVIRUSES
<130>  0392-07
<160>  49
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  31
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  1
aaatgcaaag aactccaccc tgatgaaggt g                                      31
<210>  2
<211>  34
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  2
aaatgcaaag aactccaccc tgatgaaggt gggg                                   34
<210>  3
<211>  31
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  3
cacctttatc agggtggagt tctttgcatt t                                      31
<210>  4
<211>  34
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  4
ccccaccttt atcagggtgg agttctttgc attt                                   34
<210>  5
<211>  40
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  5
gatgaatggg aatcctggtg gaatacattt aatgagaagt                             40
<210>  6
<211>  43
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  6
gatgaatggg aatcctggtg gaatacattt aatgagaagt ggg                         43
<210>  7
<211>  40
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  7
acttctcatt aaatgtattc caccaggatt cccattcatc                             40
<210>  8
<211>  43
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  8
cccacttctc attaaatgta ttccaccagg attcccattc atc                         43
<210>  9
<211>  33
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  9
aaggtactgg ctattcaagg ggccaataga cag                                    33
<210>  10
<211>  36
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  10
aaggtactgg ctattcaagg ggccaataga cagtgg                                 36
<210>  11
<211>  33
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  11
ctgtctattg gccccttgaa tagccagtac ctt                                    33
<210>  12
<211>  36
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  12
ccactgtcta ttggcccctt gaatagccag tacctt                                 36
<210>  13
<211>  50
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  13
cttgtcttcg tccccacctt tatcagggtg gagttctttg cattttttca                  50
<210>  14
<211>  50
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  14
tgaaaaaatg caaagaactc caccctgatg aaggtgggga cgaagacaag                  50
<210>  15
<211>  50
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  15
ttcatcccac ttctcattaa atgtattcca ccaggattcc cattcatctg                  50
<210>  16
<211>  50
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  16
cagatgaatg ggaatcctgg tggaatacat ttaatgagaa gtgggatgaa                  50
<210>  17
<211>  50
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  17
tttgccactg tctattggcc ccttgaatag ccagtacctt ttttttggaa                  50
<210>  18
<211>  50
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  18
ttccaaaaaa aaggtactgg ctattcaagg ggccaataga cagtggcaaa                  50
<210>  19
<211>  37
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  TM1 fwd primer px260
<400>  19
aaacaaatgc aaagaactcc accctgataa aggtggt                                37
<210>  20
<211>  37
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  TM1 rev primer px260
<400>  20
taaaaccacc tttatcaggg tggagttctt tgcattt                                37
<210>  21
<211>  46
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  TM2 fwd primer px260
<400>  21
aaacgatgaa tgggaatcct ggtggaatac atttaatgag aagtgt                      46
<210>  22
<211>  46
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  TM2 rev primer px260
<400>  22
taaaactctt ctcattaaat gtattccacc aggattccca ttcatc                      46
<210>  23
<211>  40
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  TM2 fwd primer px260
<400>  23
aaacaaaggt actggctatt caaggggcca atagacaggt                             40
<210>  24
<211>  40
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  TM3 rev primer px260
<400>  24
taaaacctgt catttggccc cttgaatagc cagtaccttt                             40
<210>  25
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  TM1 fwd primer px330
<400>  25
caccgcacca ccctgataaa ggtg                                              24
<210>  26
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  TM1 rev primer px330
<400>  26
aaaccacctt tatcagggtg gtgc                                              24
<210>  27
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  TM2 fwd primer px330
<400>  27
caccgaatac atttaatgag aagt                                              24
<210>  28
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  TM2 rev primer px330
<400>  28
aaacacttct cattaaatgt attc                                              24
<210>  29
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  TM3 fwd primer px330
<400>  29
caccgtcaag gggccaatag acag                                              24
<210>  30
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  TM3 rev primer px330
<400>  30
aaacctgtct attggcccct tgac                                              24
<210>  31
<211>  51
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  31
cttgtcttcg tccccaccct ttatcagggt ggagttcttt gcattttttc a                51
<210>  32
<211>  51
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  32
cttgtcttcg tccccaccct ttatcagggt ggagttcttt gcattttttc a                51
<210>  33
<211>  51
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  33
cttgtgttcg tccccaccct ttatcagggt ggagttcttt gcattttttc a                51
<210>  34
<211>  48
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  34
cttgtcttcg tccccattta tcagggtgga gttctttgca ttttttca                    48
<210>  35
<211>  49
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  35
ttcatcccac tctcattaaa tgtattccac caggattccc attcatctg                   49
<210>  36
<211>  48
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  36
ttcatcccat ctcattaaat gtattccacc aggattccca ttcatctg                    48
<210>  37
<211>  49
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  37
ttcatcccac tctcattaaa tgtattccac caggattccc attcatctg                   49
<210>  38
<211>  49
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  38
ttcatcccac tctcattaaa tgtattccac caggattccc attcatctg                   49
<210>  39
<211>  48
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  39
tttgccactg tattggcccc ttgaatagcc agtacctttt ttttggaa                    48
<210>  40
<211>  49
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  40
tttgccactg ttattggccc cttgaatagc cagtaccttt tttttggaa                   49
<210>  41
<211>  51
<212>  DNA
<213>  JC Virus
<400>  41
tttgccactg gtctattggc cccttgaata gccagtacct tttttttgga a                51
<210>  42
<211>  38
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  primer
<400>  42
tatgggccca cgcgtgaggg cctatttccc atgattcc                               38
<210>  43
<211>  38
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  primer
<400>  43
tgtggatcct cgaggcgggc catttaccgt aagttatg                               38
<210>  44
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  primer
<400>  44
gcttatgcca tgccctgaag gt                                                22
<210>  45
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  primer
<400>  45
atggacaaag tgctgaatag gga                                               23
<210>  46
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  primer
<400>  46
ctctggtcat gtggatgctg t                                                 21
<210>  47
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  primer
<400>  47
atggacaaag tgctgaatag gga                                               23
<210>  48
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  primer
<400>  48
gcttatgcca tgccctgaag gt                                                22
<210>  49
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  primer
<400>  49
acagcatcca catgaccaga g                                                 21
<---