СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ГЕСТОЗА У БЕРЕМЕННЫХ
METHOD FOR PREDICTION OF ONSET OF GESTOSIS IN PREGNANT WOMEN

Предлагаемое изобретение относится к исследованию биологических жидкостей физическими и химическими методами исследования и может быть использовано в медицине, а именно в акушерстве, для прогнозирования возникновения гестоза у беременных женщин.
Гестоз - не самостоятельное заболевание, это синдром, обусловленный невозможностью адаптационных систем организма матери адекватно обеспечить потребности развивающегося плода.
Гестоз встречается у 6-8% беременных в развитых странах, превышает 20% в развивающихся (Айламазян Э.К. Гестоз: теория и практика. М.: МЕДпресс-информ, 2008; с.7) и до настоящего времени остается одним из самых тяжелых осложнений беременности. По данным отечественных авторов, гестоз занимает третье место в структуре материнской летальности. В последние годы частота данной патологии не только не имеет тенденции к снижению, но и неуклонно растет и составляет, по данным различных авторов, от 7 до 25% от числа родов (Robillard P.Y. Interest in preeclampsia for researches in production. J Reprod Immunol 2002; 53 (1-2): 279-287).
Увеличению частоты данной патологии в популяции женщин репродуктивного возраста способствует рост экстрагенитальных заболеваний, среди которых основными являются следующие: заболевания почек, эндокринопатии, сердечно-сосудистые заболевания, сахарный диабет, анемии, аутоиммунные заболевания, генетические формы тромбофилий (Венцковский Б.М. Гестозы: руководство для врачей. М., 2005, с.25).
В этой связи чрезвычайно актуальными остаются проблема донозологической диагностики гестоза и поиск маркеров для раннего распознавания и мониторинга данной патологии беременности. Учитывая все вышеизложенное, предлагаемое изобретение является актуальным.
Выявление маркеров развития гестоза ведется в различных направлениях. На сегодняшний день протестировано более 100 методов ранней диагностики и прогнозирования данного осложнения беременности, однако до сих пор отсутствует достаточно надежный и чувствительный метод доклинического распознавания гестоза.
Известен способ прогнозирования гестоза, включающий определение концентрации антител к нейроспецифической енолазе (NSE) и глиофибриллярно-кислому протеину (GFAP) (анти-NSE-антител и анти-CFAP-антител) в сыворотке крови беременных. Развитие гестоза прогнозируют при уровне анти-NSE-антител более 0,6 мкг/мл или анти-CFAP-антител более 0,9 мкг/мл (патент RU 2287823 C1, G01N 33/53, выдан в 2006, опубл. 20.11.2006).
Известен способ прогнозирования гестоза заключающийся в том, что в ранние сроки (с 5 недель) в плазме крови беременной определяют уровень карбонильных производных белков и при величине, равной 51,7 ед. оптической плотности/г белка и выше, прогнозируют развитие гестоза (RU 2249212 C1, G01N 33/48, выдан в 2005, опубл. 27.03.2005).
Недостатками указанных способов являются: 1) в изобретениях не указан точный срок беременности, в котором необходимо производить анализ, а те сроки, которые рассматриваются в примерах, слишком размыты; 2) в первом изобретении развитие гестоза прогнозируется при изменении одного из двух маркеров, а это достаточно дорого и трудоемко.
За прототип предлагаемого изобретения выбран известный способ прогнозирования возникновения гестоза у беременных, включающий исследование сыворотки крови иммуноферментным анализом в сроке 16-18 недель и определение содержания антител к катепсину G (Лапина В.Г., Качалина Т.С., Каткова Н.Ю. Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения 2010; 148 (III): 95-96).
Известный способ осуществляют следующим образом: в сыворотке крови беременных женщин в сроке 16-18 недель гестации определяют содержание антител к катепсину G с использованием иммуноферментного анализа (ИФА). Возникновение гестоза прогнозируют при уровне показателя - 1,3±0,7 Ед/мл.
Однако данный метод обладает недостаточной чувствительностью - 75%.
Задачей предлагаемого изобретения является повышение чувствительности и специфичности прогнозирования гестоза.
Поставленная задача решается тем, что в известном способе прогнозирования возникновения гестоза у беременных, включающем исследование сыворотки крови иммуноферментным методом в сроки 16-18 недель и определение содержания антител к катепсину G, определяют содержание неоптерина иммуноферментным анализом и возникновение гестоза прогнозируют при уровне неоптерина выше 8,1 нмоль/л, при норме 4,30-8,10 нмоль/л.
Предлагаемое изобретение отвечает критерию изобретения «новизна», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источников патентной и научно-технической литературы, которые бы порочили новизну предлагаемого способа.
Предлагаемое изобретение отвечает критерию изобретения «изобретательский уровень», так как при проведении патентно-информационных исследований не обнаружено технических решений с существенными признаками предлагаемого способа.
Основным источником НП являются клетки крови. Его концентрация в крови отражает совместное действие различных цитокинов на популяцию моноцитов/макрофагов, стимулированных IFN γ. НП является интегральным маркером индукции клеточного иммунитета, поэтому его определение особенно важно при инфекционных заболеваниях, хронических воспалительных процессах, сопровождающихся активацией иммунной системы (Шевченко О.П., Олефиренко Г.А., Орлова О.В. Неоптерин. М.: Реафарм, 2003; с.64). В акушерстве и гинекологии неоптерин используется как критерий прогнозирования развития плацентарной недостаточности у беременных группы высокого риска по внутриутробному инфицированию плода (Андосова Л.Д. Патогенетические аспекты плацентарной недостаточности при инфекции. Автореф. канд. дисс. Н.Н., 2006), а так же для диагностики угрозы прерывания беременности (Стояненко О.О. Роль неоптерина и провоспалительных цитокинов в диагностике угрозы прерывания беременности в ранние сроки. Автореф. канд. дисс. М., 2006).
Для подтверждения получаемого положительного эффекта авторы провели обследование беременных в сроке 16-18 недель гестации путем определения в сыворотке крови концентраций антител к катепсину G и неоптерина.
В исследование включено 120 беременных в сроках от 16-18 недель гестации до родов:
1) основная группа - пациентки, у которых развился гестоз легкой или средней степени тяжести, n=68;
2) контрольная группа - женщины, беременность которых не осложнилась гестозом, n=52.
На каждую женщину заполнялась «Карта обследования», в которую вносились данные анамнеза, сведения о тактике ведения больных и исходах заболеваний. Комплексное обследование беременных проводилось в I, II, III триместрах с использованием общеклинических, лабораторных, инструментальных методов. Результаты методов объективного исследования сопоставлялись с анамнестическими данными и показателями клинического обследования беременных. Состояние плода и фетоплацентарного комплекса оценивались при помощи УЗИ и допплерометрии.
Изучение концентрации антител к катепсину G и неоптерина проводилось в сыворотке крови у беременных женщин в сроки 16-18 недель (таблица 1, фиг.1, 2).
Проведенные исследования показали, что уровень неоптерина в сыворотке крови женщин контрольной группы составил 6,20±1,90 нмоль/л. У пациенток же основной группы концентрация НП была в пределах 12,61±4,48 нмоль/л, что в 2 раза выше в сравнении с контрольной (р<0,0001).
Что касается антител к катепсину G, то в основной группе этот показатель составил 1,32±0,61 Ед/мл, что достоверно ниже, чем у женщин контрольной группы - 1,71±0,37 Ед/мл (р<0,005).
Нами установлено, что при уровнях неоптерина, превышающих значение 8,1 нмоль/л, развитие гестоза прогнозируется в 77,6% случаев, а при уровнях антител к катепсину G ниже 1,4 Ед/мл - в 74,6%. Повышенные концентрации неоптерина в сочетании с низким содержанием антител к катепсину G в сыворотке крови отмечаются в 69% случаев.
Кроме того, между концентрациями неоптерина и антителами к катепсину G в основной группе женщин установлена значимая отрицательная корреляционная связь (r=-0,55, р=0,000001). Это свидетельствует о том, что из этой пары показателей с ростом одного другой снижается или, находясь под воздействием некоего третьего фактора, эти показатели изменяются разнонаправлено. Следовательно, мы имеем возможность определять лишь один из указанных маркеров для прогнозирования возникновения гестоза, а это существенно сокращает материальные затраты лечебных учреждений.
Таблица 1
Уровень провоспалительных протеинов в сыворотке крови беременных в сроке 16-18 недель гестации
Исследуемый показатель
Основная группа
Контрольная группа
Неоптерин, нмоль/л
12,61±4,48**
6,20±1,90
Антитела к катепсину G, Ед/мл
1,32±0,61*
1,71±0,37
Примечание: * - достоверность различия показателя между группами, р<0,005;
** - достоверность различия показателя между группами, р<0,0001.
Содержание неоптерина в крови у пациенток с развившимся гестозом было достоверно выше, а антител к катепсину G - ниже, чем в группе женщин с неосложненной гестозом беременностью, что определяет данные показатели как маркеры прогнозирования развития гестоза. При концентрации неоптерина в сыворотке крови у беременных в сроки 16-18 недель более 8,1 нмоль/л и антител к катепсину G менее 1,4 Ед/мл возможно прогнозирование развития гестоза.
Предлагаемый способ позволяет получить при использовании следующий технический эффект: чувствительность - 77%; специфичность - 97%.
Предлагаемый способ прогнозирования гестоза позволяет выявлять начальные изменения в организме женщины еще до клинических проявлений заболевания. Разработанный автором подход по исследованию содержания неоптерина может быть использован для определения групп риска по возникновению гестоза.
Результаты работы могут быть использованы в деятельности женских консультаций, акушерских стационаров, гинекологических и лабораторных отделений, диагностических центров. Внедрение разработанного метода прогнозирования гестоза дает возможность более объективно оценить риск развития заболевания, своевременно провести лечебно-профилактические мероприятия, что, в конечном итоге, будет благоприятно влиять на перинатальные исходы и снижение заболеваемости новорожденных.
Способ осуществляют следующим образом: в сыворотке крови беременных женщин в сроке 16-18 недель гестации определяют содержание антител к катепсину G и неоптерина с использованием ИФА тест-систем ELISA фирмы IBL (Гамбург).
Количественное определение антител к катепсину G методом иммуноферментного анализа. Исходным материалом для определения катепсина G методом иммуноферментного анализа является сыворотка крови. Анализ проводится в микропланшете, покрытом особо чистым препаратом катепсина G. Присутствующие в образцах антитела к катепсину G связываются с иммобилизованным в микроячейках антигеном. При промывке удаляют несвязавшиеся компоненты сыворотки. Конъюгат антител к IgG человека с пероксидазой хрена добавляется в ячейки и иммунологически связывается с аутоантителами из сывороток ORGENTEC Anti-Cathepsin G ELISA, ORG 525 пациентов, связанных с иммобилизованными антигенами, в результате чего образуется комплекс конъюгат/антитело/антиген. Избыток ферментного конъюгата удаляется при следующей промывке. Раствор хромогенного субстрата в присутствии связавшегося конъюгата гидролизуется с образованием голубого окрашивания. Развитие окраски останавливается добавлением кислого стоп-раствора, при этом окрашивание меняется на желтое. Интенсивность этого окрашивания определяют фотометрически при 450 нм. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации аутоантител IgG к катепсину G в образце.
Количественное определение неоптерина методом иммуноферментного анализа. В качестве исходного материала для определения НП методом иммуноферментного анализа используют сыворотку или плазму крови. Принцип метода количественного определения неоптерина заключается в следующем: антиген, конъюгированный с пероксидазой, и неконъюгированный антиген конкурируют между собой за ограниченное число мест связывания при взаимодействии с антителами кролика к неоптерину человека. Комплекс пероксидаза - конъюгированный антиген-антитело связывается с поверхностью лунок на стрипе для микротитрования, покрытых антителами козы к антителам кролика. Несвязавшийся антиген удаляется из лунок на стадии промывания. После проведения ферментативной реакции со специфическим субстратом, в лунках измеряют поглощение при 450 нм. Количество комплексов, связавшихся с поверхностью микролунок, и оптическая плотность обратно пропорциональны концентрации неоптерина в исследуемом образце. Количественное определение проводят путем сравнения ферментативной активности в исследуемом образце с кривой, полученной при анализе стандартов с известными концентрациями.
Примеры конкретного исполнения даны в виде выписок из историй болезни.
Пациентка А., 24 года. Срок беременности 16 недель.
Проведено количественное определение в сыворотке крови провоспалительных протеинов:
неоптерин - 4,7 нмоль/л (N 4,30-8,10);
антитела к катепсину G - 1,7 Ед/мл (N 1,40-2,50).
Особенности течения беременности: анемия.
Роды своевременные доношенным плодом, без осложнений.
Пациентка А., 24 года. Срок беременности 17 недель.
Проведено количественное определение в сыворотке крови провоспалительных протеинов:
неоптерин - 11,5 нмоль/л (N 4,30-8,10);
антитела к катепсину G - 1,1 Ед/мл (N 1,40-2,50).
Особенности течения беременности: гестоз легкой степени в сроке 38 недель (отеки+протеинурия). Стационарное лечение в палате беременных.
Роды своевременные доношенным плодом, без осложнений.
На клиническом примере показана целесообразность определения неоптерина в сыворотке крови беременных женщин в начале второго триместра гестации, что дает возможность прогнозировать гестоз.