ПРИМЕНЕНИЕ НОВЫХ ОЛИГОПЕПТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ БЕЛКА S100b В КАЧЕСТВЕ СТИМУЛЯТОРОВ И МОДУЛЯТОРОВ РЕГЕНЕРАТОРНЫХ ПРОЦЕССОВ В РОГОВИЦЕ ГЛАЗА
APPLICATION OF NOVEL OLIGOPEPTIDE FRAGMENTS OF PROTEIN S100b AS STIMULATORS AND MODULATORS OF REGENERATIVE PROCESSES IN EYE CORNEA

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им.П.К.Анохина РАМН
Изобретение относится к медицине, в частности, к офтальмологии, и может быть использовано для лечения различных травматических и дистрофических повреждений роговицы глаза.
Требования к качественной и быстрой реабилитации больных после различных травматических повреждений и дистрофических заболеваний роговицы стимулировали развитие как современной микрохирургии глаза (см., в частности, Беляев B.C., «Операции на роговой оболочке и склере» (М., Медицина. 1984), «Операции на роговой оболочке и склере» (в кн.:
Руководство по глазной хирургии, М., 1988); Каспаров А.А. и др. «Новый способ хирургического лечения буллезной кератопатии»), так и патогенетически обоснованной фармакотерапии репаративных процессов роговицы глаза (Исаева Р.Т. и др. «Новые возможности воздействия на репаративные процессы при проникающих ранах роговой оболочки» Офтальмологический журнал., 1981, №4, стр.75-81); Майчук Ю.Ф. и др. «Новые подходы к терапии первичной дистрофии роговицы», Тези доповiдей дев'ятого з'зду отальмологiв Украiни, 1996).
В структуре глазного травматизма ранения роговицы и их последствия составляют 31-34%, из них самую тяжелую группу патологии, ведущую к значительному снижению зрения, представляют поражения роговицы химическими, термическими и термохимическими агентами, которые составляют от 30 до 62,8% от общего числа глазного травматизма. Согласно различным данным, процент инвалидности вследствие травмы роговицы в Российской Федерации колеблется от 22,8 до 26%.
Несмотря на постоянно расширяющийся арсенал лекарственных веществ и внедрение микрохирургической техники, частота роговичных осложнений остается достаточно высокой. В связи с этим, наряду с совершенствованием методов хирургического лечения, актуальным остается поиск новых, более эффективных лекарственных веществ.
Разработке и внедрению лекарственных средств, способных оказывать положительное влияние на репаративные процессы роговицы, посвящено большое количество работ. Проводились исследования по изучению влияния на регенераторные процессы различных лекарственных средств - см. Азнабаев М.Т. и др., «Эффективность керакола в лечении ожогов глаз и кожи». Поражение глаз при экспериментальных ситуациях. М. 1995; Безуглый Б.С.и др., «Эффективность применения тиотриазолона в комплексном лечении травматических кератитов», Тези доповiдей дев'ятого з'зду отальмологiв Украiни, 1996; Зубарев С.Ф. и др., «Влияние глазных капель арониол на процессы регенерации поврежденной роговицы» (там же); Козлова Т.В. и др., «Влияние агрегатов протеогликанов на послеоперационную регенерацию роговицы», VI съезд офтальмологов, М., 1994 и некоторые другие. На основании комплексных морфологических исследований было установлено стимулирующее влияние на регенеративные процессы фибронектина и коллагена (см., в частности, Полунин Г.С.и др. «Ингибиторы плазминоподобных ферментов и аутофибринонектина в лечении эпителиальных дефектов роговицы», Вестник офтальмол. 1993., №4, стр.14-16). Особый интерес представляют биологически активные препараты, полученные из природного сырья, к которым, в частности, относятся обладающий иммуностимулирующим действием апилак, раствор хлорфиллипта, а также мази, содержащие вытяжки из цветов календулы и шиповника. (Можеренков В.П. и др., «Фитотерапия в офтальмологии». Мед. помощь, 1998, №2, стр.27-29; Неделька А.Ф. и др., «Экспериментальное изучение глазных мазей на основе фитопрепаратов при проникающих травмах роговицы». Новое в лечении ожогов глаз, Тезисы докладов, М., 1989, стр.48-49). Однако, несмотря на широкий арсенал лекарственных средств, используемых для лечения травматических и дистрофических повреждений роговицы, эффективность таких средств, в большинстве случаев, не соответствует современным требованиям.
В связи с этим, особый интерес для лечения различных травматических и дистрофических повреждений роговицы вызывают так называемые регуляторные пептиды, которым принадлежат пусковая, регуляторная и модуляторная функции в обменных процессах, а также участие в воспалительных процессах (см, например, Ашмарин И.П. и др., «Каскадные однонаправленные регуляторные процессы, осуществляемые короткоживущими пептидами (тиролиберин)». Физиолог, журнал СССР им. И.М.Сеченова, 1989, Т.75, №5, с.627-632). Так, в литературе имеются сообщения о влиянии регуляторных пептидов на регенераторные процессы в различных органах и тканях. В патологически измененных тканях такие пептиды проявляют свойства эндогенных протекторов, способствуя сохранению межклеточных кооперативных взаимодействий, увеличивая жизнеспособность клеток и стимулируя восстановительные и репаративные процессы (Борисенко А.В., Биология стволовых клеток, фундаментальные аспекты. Тезисы докладов, 2005, с.17-18). Вместе с тем, в связи с полифункциональным действием биологически активных олигопептидных соединений, которое реализуется по каскадному принципу, в настоящее время активно развивается направление получения синтетических аналогов коротких пептидов, сохраняющих биологическую активность и избирательность действия их белковых предшественников.
2+
В ходе ранее проведенных исследований авторами были полученны новые данные, свидетельствующие о положительном стимулирующем влиянии Са- связывающего белка SlOOb, с выраженной нейротрофичекой активностью на заживление роговичной раны у кролика, что выражалось в восстановлении базальной мембраны, слоя эпителиальных клеток, роговичных пластин и поврежденных нервных окончаний. [Краснов М.М, Шерстнев В.В., Зиангирова Г.Г., Бочаров В.Е., Малаева Л.В., Олиневич В.Б. // Вестник офтальмологии. 1994. - Т.110. - N4. - С.29-32; Sherstnev VV, Krasnov MM, Ziangirova GG, Malaeva LV, Bocharov VE, Olinevich VB, Gruden' MA. The stimulating effect of S100beta protein on regeneration of the rabbit cornea]. Biull Eksp Biol Med. 1994 Jul; 118 (7): 98-101. Зиангирова Г.Г., Олиневич В.Б. // Известия АН. СССР Серия Биологическая. 2000. - №1. - С.27-32).
Задачей, положенной в основу создания заявленного решения, является возможность применения в офтальмологии новых синтетических аналогов эндогенных фрагментов белка Sl00b в качестве стимуляторов регенераторно-репаративных процессов в роговице глаза, в частности, после частичной кератэктомии. Техническим результатом, достигаемым при решении поставленной задачи, является быстрое и качественное восстановление поврежденной зоны роговицы после лечения острой и/или хронической травмы роговицы, в частности, после частичной кератэктомии при одновременном сохранении простоты и удобства введения лекарственного средства.
-6
Поставленный результат в заявленном способе лечения острой и/или хронической травмы роговицы, включающем стимуляцию регенераторно-репараторных процессов в роговице глаза, достигается тем, что стимуляцию ведут путем введения синтезированных пептидных фрагментов белка S100b наименованных - SP2 и SP3 в концентрации 10 М два раза в сутки в течение 10 дней конъюнктивальную полость или эндонозально.
Предпочтительный, но не обязательный вариант реализации заявленного способа предусматривает его применение после частичной кератэктомии.
Возможность достижения поставленного результата в заявленном способе лечения острой и/или хронической травмы роговицы и сетчатки обусловлена тем, что упомянутые синтезированные пептидные фрагменты обладают выраженными селективными свойствами в сравнении с матричной молекулой белка S100b, которая участвует в широком спектре биологической активности, таких, как рост, развитие и дифференцировка клеточных элементов, обмен ионов Са,2+, Zn2+, обладает выраженной нейротрофической и ростовой активностью, принимает активное участие в различных патологических процессах в нервной системе. Введение в носовую полость или в конъюнктивальную полость обеспечивает простоту применения при сохранении биологической активности синтезированных пептидных фрагментов белка S100b.
-6
-6
-6
-6
Для подтверждения достижения поставленного результата при использовании заявленного способа были проведены исследования, объектом которых являлись роговицы глаз, полученные от половозрелых самцов крыс линии «Wistar» (n=90), весом 180-200 грамм. В работе использовали экспериментальную модель частичной кератэктомии, которой были подвергнуты все животные после чего крысы были разделены на 6 групп, две группы крыс были контрольными, четыре группы животных использовались для исследования эффектов при двух способах введения препаратов пептидных фрагментов белка S100b -SP2 и SP3 полученных путем пептидного синтеза. Группу №1 (n=15) составили крысы контрольной группы, которым вводили по 25 мкл 0,9% водного раствора хлорида натрия (физиологический раствор) два раза в день в конъюнктивальный мешок поврежденного правого глаза в течение 10 дней; Группу №2 составили крысы, которым вводили физиологический раствор в носовую полость два раза в день по 25 мкл в течение 10 дней. В группу №3 вошли крысы, которым вводили два раза в день по 25 мкл пептида SP2, растворенного в физиологическом растворе в концентрации 10М в конъюнктивальный мешок поврежденного правого глаза в течение 10 дней. В группу №4 вошли крысы, которым вводили два раза в день по 25 мкл пептида SP2, растворенного в физиологическом растворе в концентрации 10 М в носовую полость два раза в день по 25 мкл в течение 10 дней.. В группу №5 вошли крысы, которым вводили два раза в день по 25 мкл пептида SP3, растворенного в физиологическом растворе в концентрации 10 М в конъюнктивальный мешок поврежденного правого глаза в течение 10 дней. В группу №6 вошли крысы, которым вводили два раза в день по 25 мкл пептида SP3, растворенного в физиологическом растворе в концентрации 10M в носовую полость два раза в день по 25 мкл в течение 10 дней.
Синтез фрагментов белка S100b осуществлялся твердофазным методом с использованием Boc/Bzl - стратегии в проточном реакторе с непрерывной регистрацией изменения объема пептидилполимера (свеллографический мониторинг). Были получены пептидные препараты адекватной величиной молекулярных масс и степенью чистоты очистки 92%.
В работе использовали экспериментальную модель частичной кератэктомии глаза крыс. Влияние исследуемых веществ на регенераторно-репаративные процессы в роговице глаза оценивали по характеру эпителизации, восстановлению базальной мембраны и роговичных пластин, пролиферативной активности фибробластов и эпителиальных клеток. С помощью сетки окулярмикрометра при увеличении 125 и 1250 осуществляли подсчет плотности и рядности клеток эпителиального пласта по всей раневой поверхности. Оценивали состав и активность клеток воспаления по периферии, в средней и центральной зоне эктомии. Морфологические признаки апоптоза включали в себя: ослабление межклеточных контактов с потерей десмосом и отделение от соседних клеток; фрагментацию и конденсацию ядерного хроматина по периферии клетки; формирование крупных и мелких, сферических и овальных по формы структур содержащих эозинофильные цитоплазматические фрагменты с пикнотическими, базофильными фрагментами ядер. Клиническое течение воспалительного процесса оценивалось биомикроскопически..
Пример 1. У крыс в контрольной группе после проведения частичной кератэктомии правого глаза независимо от способа введения физиологического раствора на 10 сутки наблюдалось, формирование эпителиальной пробки неравномерной толщины, покрывающей всю раневую поверхность и насчитывающей 5-8 рядов, что можно объяснить выраженным полиморфизмом эпителиальных клеток. Ближе к центру толщина эпителиального пласта уменьшалась. Клетки приобретали вытянутую форму в горизонтальной плоскости. Ядра клеток дифференцировались только в базальном слое эпителия. Выявлялось ослабление эпителиально-стромальных и межклеточных контактов на всем протяжении. Плотность эпителиальных клеток в среднем составляла 10±2 в поле зрения (п/з). На отдельных участках она была выше и насчитывала 12-14 клеток в п/з. Клетки в этих зонах отличались разнообразием по форме и размеру. В базальном эпителии встречались вакуолизированные с разреженной цитоплазмой и фрагментированными ядрами клетки. Во многих клетках было отмечено отсутствие ядер, при сохранении цитоскелета. В эпителиальном пласте митотическая и апоптотическая активность проявлялась неравномерно. Митоз встречался в среднем от 2-6 на периферии и 1-2 в центре. Клетки с признаками апоптоза выявлялись на периферии раневой поверхности 1-4 клетки, в центральной зоне 0-2 в п/з.
Базальная мембрана на большем протяжении дифференцировалась слабо и имела неравномерную толщину с участками порозного строения.
Пролиферация фибробластов отмечалась на периферии раневой поверхности в средних слоях. По всей площади кератэктомии лизис роговичных пластин сопровождался хаотичным расположением коллагеновых волокон.
Новообразованные сосуды выявлялись преимущественно на периферии раневой поверхности. Инфильтрат в средних и глубоких слоях стромы состоял из полиморфно-ядерных лейкоцитов, моноцитов и макрофагов и насчитывал от 8 до 10 клеток в поле зрения.
При биоофтальмоскопии пик неоваску ляризация приходился на 3-5 сутки и захватывал периферию и среднюю часть раневой поверхности. В центральной зоне на фоне выраженного отека стромы сосуды не выявлялись.
В 30% случаях отмечалось изъязвления стромы с формированием десцеметоцеле и перфорацией роговицы.
-6
-6
Пример 2. У крыс в экспериментальной группе после проведения частичной кератэктомии правого глаза при последуюшим эндоназальном введении (введение в носовую полость) пептида SP2 в концентрации 10 М на 10 сутки эпителий покрывает всю раневую поверхность. На отдельных участках отмечалось ослабление межклеточных контактов. Клетки имели различную форму и шиповатый вид. Подобные изменения отмечались на участках, где выявлялись участи порозного строения базальной мембраны. Рядность эпителиального пласта на периферии раневой поверхности составляла 8-9, ближе к центру 5-7 рядов клеток. Ослабления межклеточных контактов в базальном эпителии в отдельных клетках сопровождалось фрагментацией ядер, вакуолизация цитоплазмы с сохранением контуров цитоскелета. Большинство фибробластов в субэпителиальном слое находилось в апоптотическом лизисе. В глубоких слоях восстановление поврежденной зоны роговицы происходило за счет формирования ориентированных роговичных пластин. В поверхностных слоях роговичные пластины были дезориентированы в следствии очагами лизиса. Процесс восстановления зоны эктомии сопровождался запустением и тромбозом новообразованных сосудов на всем протяжении зоны эктомии. Полиморфно-ядерные клетки выявлялись в поверхностных и средних слоях 4-8 клеток в поле зрения. Клинически, при введении пептида SP2 в концентрации 10 М отмечалось формирование в поверхностных слоях помутнения средней интенсивности. При сравнении с действием пептида SP3 в той же концентрации и способах введения препарата пептида плотность эпителия роговицы поврежденного глаза была ниже (8±1 рядов клеток).
-6
Пример 3. У крыс в экспериментальной группе после проведения частичной кератэктомии правого глаза м последующем закапывании в нос раствора пептида SP3 в концентрации 10 М эпителиальный пласт покрывал всю раневую поверхность клетками преимущественно овальной формы. Отмечалось восстановление межклеточных связей, базальной мембраны на всем протяжении. На периферии раневой поверхности эпителиальный пласт насчитывал 8-10 рядов. Ближе к центру рядность уменьшалась и достигала 6-8 рядов. Потеря верхнего слоя эпителия происходила путем обычного слущивания клеток. Плотность клеток была, приблизительно одинаковая на всем протяжении эпителиального пласта и насчитывала 12±1. Из них апоптотических клеток в среднем насчитывалось 1-3 в поле зрения, в состоянии митоза 2-5. На фоне восстановления межклеточных контактов, в центральной зоне отмечался полиморфизм базального эпителия, изменение ядерно-цитоплазматического соотношения в сторону увеличения доли цитоплазмы, уменьшение цитохромозии клеток. Ядерный аппарат клеток прокрашивался неравномерно, менее интенсивно в центре, чем на периферии и в парацентральной зоне. В цитоплазме эпителиальных клеток, расположенных ближе к центральной зоне, отмечалась фрагментация ядер на разнообразные по форме и размеру глыбки.
Восстановление рядности и ориентации роговичных пластин в зоны кератэктомии в глубоких и средних слоях сопровождалось облитерацией новообразованных сосудов. В поверхностных слоях выявлялись очаги лизиса и дезориентации роговичных пластин. Отмечено формирование фибробластической мембраны состоящей из ориентированных веретенообразных по форме кератоцитов, расположенной преимущественно в средних слоях. Субэпителиально в клоне фибробластов отмечалось преобладание пролиферативных процессов над апоптотическими 3 к 1. Формированные роговичных пластин отмечалось на всем протяжении эктомированной зоны. Структура роговичных пластин в глубоких и частично поверхностных слоях в зоне эктомии была близка к норме. В поверхностных слоях на отдельных участках выявлялись очаги дезориентированных коллагеновых волокон.
В инфильтрате преобладали полиморфно-ядерные лейкоциты расположенные неравномерно преимущественно в поверхностных слоях от 2 до 4 в п/з.
-6
Фибробластическая мембрана при введении SP3 в концентрации 10М выявлялась практически по всей поверхности зоны эктомии и состояла из веретенообразных кератоцитов. Межклеточное пространство было заполнено тонкими, интенсивно прокрашенными роговичными пластинами. Полиморфно-ядерные лейкоциты выявлялись в субэпителии от 2 до 4 в п/з.
-6
Биоофтальмоскопии при введении SP3 в концентрации 10 М в роговице отмечалось формирование выраженного помутнения. Активность формирования новообразованных сосуды пришлось на 3-4 сутки и оставалось стабильным в течение 2 дней. К 10 суткам сосуды выявлялись на отдельных участках по периферии зоны эктомии и находились в состоянии запустения.
Отличительной особенностью SP3 являлось его выраженное влияние на пролиферативную активность фибробластов.
Необходимо подчеркнуть, что существенных различий влияния SP2 и SP3 на течение регенераторно-репаративного процесса от способа введения отмечено не было.
Таким образом, на экспериментальных моделях частичной кератэктомии показано выраженное стимулирующее влияние на протекающие регенераторно-репаративные процессы в частично поврежденной роговице глаза взрослых крыс синтезированных новых олигопептидных фрагментов белка S100b SP2 и SP3. Доказана выраженная пролиферативная активность фибробластов при применении SP3, что обеспечивало восстановление объема стромы роговицы в зоне эктомии. Эффекты SP2 характеризовались стабилизирующим действием на клеточный состав и частичное восстановление стромы роговицы. Внедрение олигопептидных фрагментов в офтальмологическую практику позволит существенное снизить эффект повреждающего агента и обеспечить повышение качества реабилитации пациентов при повреждении роговицы.