СПОСОБ ОТБОРА И ПРОБОПОДГОТОВКИ ПРОБ ШЕРСТИ ГРЫЗУНОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОЭЛЕМЕНТНОГО СОСТАВА
METHOD FOR SELECTION AND SAMPLING PREPARATION OF WOOL SAMPLES OF RODENTS FOR DETERMINATION OF MICROELEMENTAL COMPOSITION

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано при отборе проб шерсти млекопитающих отряда грызунов для оценки особенностей метаболизма химических элементов в организме животных.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Волосяной (шерстный) покров служит одним из объективных показателей приспособленности животного к условиям среды. Шерсть является второй по порядку метаболически активной тканью организма, их микроэлементный статус соответствует определенному периоду накопления элемента, а не моменту взятия пробы (Степанова, М.В. Содержание некоторых микроэлементов и токсичных тяжелых металлов в окружающей среде и биосубстратах детей-дошкольников на сельских и промышленных территориях (на примере Ярославской области): дис…кандидата биологических наук [Текст] / М.В. Степанова // Оренбург, гос.мед. акад. Ярославль, 2012 - 267 с.). В этой связи неинвазивные методики взятия и оценки химического состава шерсти позволяют разрабатывать индивидуальные программы профилактики и коррекции элементозов.
Волос (шерсть), как биосубстрат, не требует специального оборудования для хранения и транспортировки, может храниться практически неограниченное время, не теряя своей информационной ценности. При этом следует учесть, что концентрация химических элементов в волосах значительно выше, чем в физиологических жидкостях традиционно используемых в клинической практике при проведении биохимических анализов, что позволяет существенно расширить набор химических элементов, доступных для аналитического определения (Харламов, А.В. Информативность биосубстратов при оценке элементного статуса сельскохозяйственных животных (обзор) / А.В. Харламов, А.Н. Фролов, О.А. Завьялов, A.M. Мирошников // Вестник мясного скотоводства. 2014. №4 (87). С. 53-58).
Грызуны (лат. Rodentia) - самый многочисленный отряд млекопитающих, которые распространены по всему миру. Эти животные легко адаптируются, и у них выработались различные приспособления, необходимые для выживания в существующих условиях. Волосяной покров у представителей этого отряда очень разнообразный - от густого и мягкого до изреженного, щетинковидного или даже образующего иглы. На туловище отсутствуют потовые железы, характерно только наличие сальных желез. Они характеризуются быстрым обменом веществ и хорошими кумулятивными свойствами шерсти. В настоящий момент времени виды этого отряда имеют широкое значение для человека и природы, поскольку являются основным компонентом цепей питания, участвуя в передаче, в том числе, и токсических элементов, имеют декоративную ценность, проживая в качестве домашних питомцев у людей, содержатся в зоологических коллекция и используются в качестве лабораторных объектов.
В ветеринарии до настоящего времени не существует унифицированной комплексной методики отбора волос (шерсти) грызунов и подготовки проб для исследований на элементный состав. Не определен порядок, место на теле животного для отбора образцов шерсти грызунов.
2
Известен способ отбора проб шерсти у племенных каракульских овец серой окраски, характеризующийся тем, что у ягнят при рождении и 30 дневном возрасте берут образцы шерсти с 1 см кожи на крестце и холке с последующим определением степени пигментированности волосков методом электронно-парамагнитной резонансной спектрометрии (Пат. №23604 Республика Казахстан, МПК А01К 67/00 (2010.01). Способ отбора каракульских овец серой масти [Текст] / Байбеков Е., Омбаев A.M., Ескара М.А., Алибаев Н., Саденов А., Абуов Г., Байбеков М.Е.; заявитель и патентообладатель ТОО «Юго-Западный НИИ жив-ва и растениеводства». -№2008/0876.1; заявл. 28.07.2008; опубл. 15.10.2010, Бюл. №12. - 4 с.). Однако данный способ не предназначен для отбора образцов с целью их исследования на элементный состав методом атомно-абсорбционной спектрометрии. Опыт проведен на ягнятах 30-дневного возраста, которые сильно отличаются от грызунов по морфологии, особенностям строения и формированию волосяного покрова на различных участках тела, в том числе на гриве и хвосте. Животные имеют разные анатомические и физиологические характеристики.
Известны несколько способов отбора шерсти крупных сельскохозяйственных животных:
Способ диагностики хронических микроэлементозов сельскохозяйственных копытных животных, характеризующийся отбором образцов шерсти путем настрига ее с кисти хвоста (Пат. №2477483 Российская Федерация, МПК G01N 33/50 (2006.01).
Способ диагностики хронических микроэлементозов сельскохозяйственных копытных животных [Текст] / Тютиков С.Ф., Ермаков В.В.; заявитель и патентообладатель ФГНУ Орд. Ленина и Орд. Октябр. Революции ин-т геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского. - №2012107116/15; заявл. 28.02.2012; опубл. 10.03.2013, Бюл. №7. - 5 с.).
- Способ отбора и подготовки проб шерсти крупного рогатого скота (КРС) для исследований на элементный состав, включающий настриг требуемого образца по массе не менее 0,4±0,01 г с длиной остатка шерсти на корне 0,5 мм, который производится с верхней части холки животного с участка кожи размером 5×5 см в зимний и 10×10 см в летний периоды (Пат. №2607751 Российская Федерация, МПК G01N 33/48 (2006.01). G01N 33/50 (2006.01).
- Способ отбора и подготовки проб шерсти крупного рогатого скота для исследования на элементный состав [Текст] / Мирошников С.А., Харламов А.В., Фролов А.Н.. Завьялов О.А., Мирошников A.M., Дускаев Т.К.; заявитель и патентообладатель ГНУ Всерос. науч.-исслед. ин-т мясн. скотоводства. №2014550406, заявл. 11.11.2014; опубл. 10.01.2017, Бюл. №1. -5 с.
- Способ отбора образцов шерсти для исследования элементного статуса крупного рогатого скота в различные временные периоды [Текст] / Мирошников С.А., Харламов А.В., Завьялов О.А., Фролов А.Н., Рогачев Б.Г., Дускаев Т.К., Курилкина М.Я., патентообладатель ГНУ Всерос.науч.-исслед. ин-т мясн. скотоводства. №2015150158, заявл. 23.11.2015; опубл. 28.02.2017, Бюл. №7. - 6 с.)
- Способ отбора проб волос лошадей для исследования на элементный состав [Текст] / Калашников В.В., Зайцев A.M., Атрощенко М.М., Калинова Л.В., Мирошников С.А., Завьялов О.А., Фролов А.Н., Рогачев Б.Г; патентообладатель Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт коневодства». №2017141548, заявл. 28.11.2017; опубл. 19.12.2018, Бюл. №35. - 8 с.)
Эти способы неприемлемы для грызунов, поскольку не представляется возможным собрать достаточный объем волос с хвоста, брюха и большинства других участков тела исследуемых животных, изученные химические элементы не дают полной оценки состояния животных. Основным отличием данного способа от заявляемых является то, что шерсть для исследований отбираются с участка спины животного (ниже проекции лопаток), а не с разных участков животного. Кроме того, выборка химических элементов, изученных в прототипе, не дает полного представления об уровне обменных процессов по сравнению с предлагаемым способом (n=402), что значительно снижает эффективность способа. Способ проведен на 13 видах животных, принадлежащим к четырем семействам отряда.
Существенным недостатком прототипа является то, что он не учитывает скорость отрастания волос грызунов и не предоставляет возможности оценить элементный состав волос в различные возрастные периоды, по участку волоса, сформировавшемуся за соответствующий период времени, что важно в практической работе.
РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Основным отличием заявляемого способа от прототипа является то, что отбор образцов волос производится с участка спины животного (ниже проекции лопаток).
Целью нашего изобретения является разработка способа отбора и подготовки проб волос грызунов для исследования на элементный состав.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ осуществляется следующим образом:
1. Отбор образцов волос, осуществляется с участка спины животного (ниже проекции лопаток) площадью участка 1 см;
2. Для исследований выбирается участок, отмеряемый от корня волоса, соответствующий дистальному отрастанию за изучаемый возрастной период, который рассчитывается по формуле:
L=S×I,
где L - дистальное расстояние, отмеряемое от корня волос, мм;
S - скорость роста волос, мм/сут.;
I - изучаемый возрастной период, сут.
Для реализации предлагаемого способа был проведен эксперимент на грызунах, содержащихся в зоологических коллекциях в г. Москве, Ярославле и Иваново. Исследования выполнены на базе Ярославской государственной сельскохозяйственной академии на микро популяциях физиологически здоровых животных следующих видов: желтая пеструшка - Eolagurus luteus (n=18), монгольская (когтистая) песчанка - Meriones unguiculatus (n=42), пушистохвостая песчанка - Sekeetamys calurus (n=18), кактусовый хомячок -Peromyscus eremicus (n=18), золотистый (сирийский) хомячок - Mesocricetus auratus (n=36), акациевая крыса - Thallomys loringi (n=18), иглистая мышь - Acomys cahirinus (n=30), карликовая мышь - Mus minutoides (n=24), серая крыса - Rattus norvegicus (n=54), мышь домашняя - Mus musculus (n=48), мышь многососковая - Mastomys natalensis (n=18), шиншилла (домашняя форма) Chinchilla laniger var. dom. (n=42), дегу Octodon degus (n=36). Bee животные находились в половозрелом возрасте.
Исследования проводились в 2018-2020 годах с помощью комплекса современных экологических, биологических и статистических методов на представителях отряда грызуны, содержащихся в зоологических учреждениях Центрального Федерального округа (г. Москва, г. Ярославль, г. Иваново и г. Углич). В пробах проводилась оценка уровня содержания микроэлементов и токсичных тяжелых металлов - цинка, меди, железа, кадмия, свинца и мышьяка. Анализ металлов выполнен с помощью атомно-абсорбционной масс-спектрометрии на атомно-абсорбционном спектрометре «КВАНТ-2АТ». Исследования были выполнены в условиях повторяемости и промежуточной прецизионности. При расчете концентраций определяемых элементов в пробах осуществлялась метрологическая обработка результатов в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
Полученные результаты обрабатывали статистически. Определяли средние арифметические величины (М), средние ошибки (m) и среднеквадратичное отклонение (δ). Для выявления статистически значимых различий в сравниваемых группах и сопряженности между признаками, характера распределения данных совместимости, были использованы непараметрический критерий W критерий Шапиро-Уилка, t - тест Стьюдента и коэффициент корреляции Спирмена. Были сформированы базы данных в программах «Microsoft Office Excel» 2010, «Statistica» версия 10.0 в среде Windows XP.
2
Пробы отбирались настригом с участка кожи животного массой около 0,1-3 г (в зависимости от вида животного) ножницами медицинскими в течение всего года. В начале исследований определялся период накопления микроэлементов в отобранных участках шерсти по длине волоса. Для этого с участка спины животного (ниже проекции лопаток) площадью участка 1 смотбиралась проба шерсти массой 0,1-3 г., помещались в специальные конверты, которые затем запечатывали и маркировали с указание вида, пола, года рождения животного и датой взятия пробы. Далее в лаборатории проводилась очистка волос следующим образом:
1. Пробы помещаются в стеклянные емкости с притертой крышкой,
2. Заливали ацетоном в объемном соотношении 3:1 при постоянном перемешивании в течение 10 минут на протяжении 1 часа
3. Затем шерсть выдерживали в ацетоне на протяжении 24
часов
4. После механической очистки волос, пробу несколько раз промывали дистиллированной водой и вновь высушивали в течение 12 часов для определения сухого веса образца перед анализом.
После подготовки определялась длина волоса, сформировавшегося в определенный возрастной период, отражающий уровень обменных процессов химических элементов в аналогичный возрастной интервал с учетом даты отбора пробы. Волосы, отобранные с животного, с учетом установленной скорости отрастания (0,22±0,003 мм/сут) (Голиченкова, П.Д. Волосяные фолликулы и волосяной покров в постнатальном онтогенезе мыши в норме и эксперименте: автореферат дис.…кандидата биологических наук [Текст] / П.Д. Голиченкова // МГУ им. М.В. Ломоносова. М., 2008 - 24 с.), разделялись, на участки, соответствующие дистальному отрастанию за зимний и летний период времени.
Дистальное отрастание для каждого участка рассчитывалось по формуле:
L=S × I,
где L - дистальное расстояние, отмеряемое от корня волос, мм; S - скорость роста волос, мм/сут.; I - изучаемый возрастной период, сут.
Согласно схеме эксперимента продолжительность изучаемых сезонов составила 90 суток. Применив приведенную выше формулу, было рассчитано дистальное отрастание волос за один месяц.
L=0,22 мм/сут × 30 суток=6,6 мм ≈ 0,7 см
Данные по уровню содержания исследуемых микроэлементов в шерсти грызунов представлены в табл. 1
В зависимости от даты взятия пробы, длины образца шерсти полученных результаты измерения уровня накопления тяжелых металлов были разделены на два периода накопления: летний и зимний сезон. Данные о колебаниях элементного состава волос грызунов за соответствующий период их формирования (таблица 2).
Как видно из таблицы, участки волос, сформировавшиеся в различные сезоны, отличались по концентрации в них химических элементов. Статистически значимые различия отмечались в сем. Мышиные - Muridae по меди, свинцу и кадмию (р меньше 0,001), мышьяку (р меньше 0,01), в сем. Хомяковые - Cricetidae по железу, свинцу и мышьяку (р меньше 0,001). В целом в отряде Грызуны Rodentia свинцу, кадмию и мышьяку (р меньше 0,001). Все элементы кумулируются в биосубстратах в более высоких концентрациях за летний период времени, что согласуется с уровнем потребления этих элементов из окружающей среды, с пищей, особенностями физиологических процессов.
Таким образом, применение данного способа позволит повысить эффективность и точность оценки элементного статуса грызунов и своевременно скорректировать дисбаланс обменной концентрации химических элементов в организме животного.