ПРИМЕНЕНИЕ АРИЛБОРОНОВЫХ КИСЛОТ В МЕЧЕНИИ БЕЛКОВ

1. Способ ковалентного присоединения аффинной метки (маркера) к белку, содержащему гистидин, предусматривающий стадию приведения данного белка в контакт с соединением общей структуры (I):
где А означает аффинную метку, В означает бор и L означает необязательный линкер, в присутствии содержащего медь катализатора.
2. Способ по п.1, где соединение дополнительно замещено в ароматическом кольце галогеном, алкоксигруппой или алкильной группой.
3. Способ по п.1, где аффинной меткой А является биотин.
4. Способ по п.1, где соединение соответствует молекуле формулы (II):
5. Способ по п.1, где соединение дополнительно содержит метку.
6. Способ по п.5, где метка состоит из изотопов тяжелых атомов.
7. Способ по п.1, где соединение соответствует молекуле формулы (III):
8. Способ выделения гистидинсодержащих пептидов из белкового образца или смеси белковых образцов, предусматривающий стадии:
а) расщепления интактных белков в белковом образце (образцах) расщепляющим агентом на пептиды,
b) приведения белкового образца (образцов) в контакт с маркирующим арилбороновой кислотой реагентом, имеющим общую структурную формулу (I):
где А означает аффинную метку, В означает бор и L означает необязательный линкер, в присутствии содержащего медь катализатора таким образом, чтобы дать возможность реакции метящего арилбороновой кислотой реагента с гистидином, где он присутствует в данных пептидах,
с) связывания маркированных пептидов с аффинным матриксом через указанную аффинную метку и
d) удаления связанных маркированных пептидов из аффинного матрикса, с получением выделенных гистидинсодержащих пептидов.
9. Способ по п.8, где стадию b) выполняют перед стадией а) и метящий арилбороновой кислотой реагент приводят в контакт с нерасщепленными белками в образце (образцах), что приводит к маркированию гистидина, где он присутствует в данных белках.
10. Способ одновременного анализа присутствия одного или более гистидинсодержащих белков в различных образцах, предусматривающий стадии:
а) необязательного расщепления интактных белков в образце (образцах) расщепляющим агентом на пептиды,
b) приведения каждого из образцов в контакт с одним реагентом из набора метящих арилбороновой кислотой реагентов в присутствии содержащего медь катализатора, где метящие бороновой кислотой реагенты имеют общую структурную формулу (I):
где А означает аффинную метку, В означает бор и L означает необязательный линкер, и дополнительно содержат метку, которая является изотопной или изобарной меткой, так что структура каждого из данных метящих реагентов является, по существу, одной и той же,
с) объединения данных различных образцов с получением смеси образцов полипептидов или пептидов,
d) селективного выделения меченых полипептидов или пептидов из смеси образцов полипептидов или пептидов посредством аффинной метки и
е) анализа присутствия выделенных меченых полипептидов или пептидов при помощи масс-спектроскопии.
11. Способ идентификации присутствия белка в белковом образце, предусматривающий стадии:
а) модификации гистидина белков в белковом образце посредством приведения данных белков в контакт с маркирующим реагентом общей структуры (I):
где А означает аффинную метку, В означает бор и L означает необязательный линкер, в присутствии содержащего медь катализатора,
b) расщепления белков в данном белковом образце на пептиды расщепляющим агентом,
с) выделения из указанных белков гистидинсодержащих пептидов посредством аффинной метки,
d) очистки выделенных гистидинсодержащих пептидов посредством одной или более стадий очистки пептидов с получением таким образом очищенных гистидинсодержащих пептидов,
е) определения или расчета по меньшей мере одного физико-химического свойства, очищенных гистидинсодержащих пептидов, отличного от массы,
f) определения массы выделенных и очищенных гистидинсодержащих пептидов на МС, и
g) сравнения для каждого выделенного и очищенного гистидинсодержащего пептида массы и по меньшей мере одного другого физико-химического свойства с базой данных, содержащей массу и одно или более физико-химических свойств всех гистидинсодержащих пептидов, генерированных указанным расщепляющим агентом, для идентификации таким образом соответствующего родительского белка очищенного гистидинсодержащего пептида, посредством чего определяется присутствие родительского белка в данном белковом образце.
12. Способ по п.11, где стадия (g) предусматривает идентификацию для каждого из выделенных и очищенных гистидинсодержащих пептидов одного или более гистидинсодержащих пептидов в базе данных с массой, соответствующей массе данного выделенного и очищенного гистидинсодержащего пептида, и, когда идентифицирован более чем один пептид для каждого одного выделенного и очищенного гистидинсодержащего пептида, сравнение по меньшей мере одного другого физико-химического параметра выделенного и очищенного гистидинсодержащего пептида с физико-химическими параметрами более чем одного из пептидов, идентифицированных в данной базе данных.
13. Способ по п.12, где белковый образец является пробой из некоторого вида, и база данных содержит по меньшей мере массу и по меньшей мере одно другое физико-химическое свойство всех гистидинсодержащих пептидов данного вида, генерируемых указанным расщепляющим агентом.
14. Способ по п.11, где данный белок идентифицируют одновременно в двух или более образцах, где данный способ предусматривает:
в стадии (а) выполнение модификации каждого из образцов одним реагентом из набора маркирующих реагентов, содержащих компонент дифференциальной метки,
дополнительную стадию объединения двух или более образцов перед стадией (d), и
перед стадией (f) стадию идентификации природы данной метки для идентификации таким образом образца, из которого происходит данный пептид.
15. Способ по п.11, где по меньшей мере одно физико-химическое свойство определяют во время одной или более стадий очистки пептидов.
16. Способ по п.11, где по меньшей мере одно физико-химическое свойство выбирают из группы, состоящей из pI, времени удерживания во время хроматографии с обращенной фазой и отношения УФ-поглощения при 280 и 214 нм.
17. Соединение для маркирования гистидина в белке или пептиде, причем соединение имеет общую структуру (I):
где А означает аффинную метку, выбранную из группы, состоящей из биотина или молекулы производного биотина, мальтозы, лектина и гаптена, связывающегося с гаптен-специфическими антителами, В означает бор и L означает необязательный линкер.
18. Соединение по п.17, где ароматическое кольцо дополнительно замещено галогеном, алкоксигруппой или алкильной группой.
19. Соединение по п.17, где аффинной меткой А является биотин.
20. Соединение по п.17 формулы (II):
21. Соединение по п.17, дополнительно содержащее метящий компонент.
22. Соединение по п.21, где указанный метящий компонент состоит из одного или более тяжелых изотопов.
23. Соединение по п.22 формулы (III)
13
где один или более атомов углерода и/или один или более атомов водорода в линкере между группой биотина и группой арилбороновой кислоты заменены соответственно С или дейтерием.
24. Набор метящих реагентов для масс-спектрометрического анализа полипептидов, где все метящие реагенты в данном наборе имеют идентичную химическую структуру по п.17, и где каждый метящий реагент в данном наборе имеет компонент уникальной изотопной метки.
25. Набор реагентов, в котором индивидуальные метящие реагенты указанного набора имеют структуру согласно формуле (III):
13
где один или более атомов углерода и/или один или более атомов водорода в линкере между группой биотина и группой арилбороновой кислоты заменены соответственно С или дейтерием.
26. Применение соединения по п.17 или набора метящих реагентов по п.24 для мечения белков.
27. База данных гистидинсодержащих пептидов белков организма, расщепленных in silico расщепляющим агентом, где каждый пептид характеризуется:
идентификатором белка,
его аминокислотным составом,
его массой,
где данная масса является массой немодифицированного пептида или массой пептида после модификации или мечения.
28. База данных по п.27, где пептиды с различающейся последовательностью и одной и той же массой дополнительно характеризуются по меньшей мере одним физико-химическим параметром указанного пептида, отличным от массы.
29. База данных по п.27, где расщепляющим агентом является трипсин.
30. Применение базы данных по п.27 для идентификации белков.
31. Устройство (100) для мультиплексного мечения и анализа белковых образцов, содержащее по меньшей мере один источник образцов (101), узел мечения (103) и соответствующие источники метящих арилбороновой кислотой реагентов (104), узел расщепления белка (105), узел аффинного разделения (106), узел разделения (107), узел масс-спектрометра (109) и узел анализа данных (110), присоединенные к аннотированной базе данных (112) расщепленных in silico гистидинсодержащих пептидов.
32. Устройство по п.31, дополнительно содержащее узел получения образцов (102) и/или узел анализа (108) для определения одного или более физико-химических свойств пептидов, очищенных в узле разделения (107).
33. Применение соединения для маркирования гистидина в белке или пептиде, где соединение имеет общую структуру (I):
где А означает аффинную метку, выбранную из группы, состоящей из биотина или молекулы производного биотина, мальтозы, лектина, гаптена, связывающегося с гаптен-специфическими антителами, и глутатиона, В означает бор, и L означает необязательный линкер.