НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ЗОНДОВ И СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕТАЛЬНОЙ ДНК В КРОВОТОКЕ БЕРЕМЕННОЙ ЖЕНЩИНЫ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ГИПЕРМЕТИЛИРОВАННЫХ УЧАСТКОВ ДНК ПЛОДА

1. Способ получения ДНК-праймеров и зондов для определения присутствия и определения относительного количества фетальной ДНК в образце плазмы крови беременной женщины, в котором используют:
(а) образец геномной ДНК клеточной линии человека Jurkat;
(б) олигонуклеотидные праймеры и зонды, которые
(i) обладают специфичностью к противоположным концам последовательностей амплифицируемого фрагмента;
(ii) имеют длину от 15 до 25 нуклеотидов;
(iii) соответствуют такому амплифицируемому фрагменту, в котором присутствует, по меньшей мере, один сайт рестрикции рестриктазы BstFNI, а его длина составляет, самое большее, 280 пар нуклеотидных оснований,
(iv) температура их плавления лежит в диапазоне от 55 до 62°C;
характеризующийся тем, что он предусматривает следующие стадии:
(1) выбирают амплифицируемый фрагмент ДНК, соответствующий дифференциально метилированным участкам фетальной ДНК и ДНК взрослого человека;
(2) синтезируют упомянутые праймеры и зонды;
(3) проводят полимеразную цепную реакцию упомянутого образца ДНК (а);
(4) отбирают пары праймеров и зонды, обеспечивающие эффективность реакции ПЦР выше 65% и линейность при изменении концентрации образца (а) выше 0,9.
2. Набор для определения присутствия и определения относительной концентрации фетальной ДНК в образце плазмы крови женщины, путем определения гиперметилированных участков в локусах, перечисленных в таблице 1 описания, содержащий для каждого из указанных локусов, по меньшей мере, одну пару из прямого и обратного праймеров, полученных в соответствии со способом по п. 1, и, по меньшей мере, один соответствующий им зонд.
3. Набор по п. 2, характеризующийся тем, что он включает в себя эндонуклеазу рестрикции BspFNI в концентрации 10 ед./мкл и реакционный буфер.
4. Набор по п. 2, характеризующийся тем, что размер ампликона составляет целое число в диапазоне от 71 до 280 пар нуклеотидов, предпочтительно от 80 до 150.
5. Набор по п. 2, характеризующийся тем, что он включает в себя 14 комбинаций праймеров, по одной для каждого из выбранных и представленных в таблице 1 описания локусов, состоящие из трех олигонуклеотидов разного назначения - прямого, обратного праймера и зонда, представленных в таблице 3 описания и/или гомологичных им, по меньшей мере, на 95%.
6. Набор по п. 2, характеризующийся тем, что он дополнительно включает в себя синтетическую ДНК для положительных контролей.
7. Набор по п. 2, характеризующийся тем, что он дополнительно включает в себя термостабильную ДНК-полимеразу 5 ед./мкл.
8. Набор по п. 2, характеризующийся тем, что он дополнительно включает в себя водный раствор, содержащий:
приблизительно 67 мМ трис-HCl, рН 8,8 при 25°C,
приблизительно 16,6 мМ (NH4)2SO4,
приблизительно 6,7 мМ MgCl2,
приблизительно 6,7 мкм ЭДТА,
приблизительно 170 мкг БСА, и
смесь четырех основных dNTP в концентрации приблизительно 0,2 мМ каждого.
9. Набор по п. 2, характеризующийся тем, что он дополнительно включает в себя воду деионизированную.
10. Способ определения наличия и концентрации фетальной ДНК в образце плазмы крови женщины, в котором используют:
(а) образец плазмы крови женщины;
(б) набор для проведения реакции рестрикции с использованием рестриктазы BstFNI
(в) праймеры и зонды по любому из пп. 1-5;
характеризующийся тем, что он предусматривает следующие стадии:
(1) выделяют ДНК из образца (а);
(2) разделяют выделенный на стадии (1) образец ДНК на два объема (I) и (II), соответственно;
(3) с объемом (I) образца ДНК, выделенного на стадии (1) проводят реакцию рестрикции с использованием набора (б);
(4) проводят параллельно реакции полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени продуктов реакции рестрикции, полученных на стадии (3) и объема (II) выделенного на стадии (1) образца ДНК;
(5) определяют количество продуктов ПЦР посредством флуоресцентной спектрометрии в присутствии зондов (в).
11. Способ по п. 10, характеризующийся тем, что в нем в качестве показателя количественного соотношения используют соотношение сигналов образцов без и после метил-специфической реакции рестрикции от зондов.
12. Способ по п. 10, характеризующийся тем, что сравнительным образцом является ДНК из клеточной линии Jurkat.
13. Способ по п. 10, характеризующийся тем, что при проведении стадии ПЦР проводят начальное плавление в течение 1-5 мин при температуре 94-96°C, 30-60 раз проводят цикл, включающий плавление при 94-96°C в течение 10÷30 секунд, отжиг и синтез при температуре 28-62°C в течение 40÷60 мин, детекцию продуктов ПЦР проводят во время стадии отжига.
14. Способ по п. 10, характеризующийся тем, что в нем проводят реакцию рестрикции с использованием рестриктазы BstFNI, с использованием 50 единиц рестриктазы в течение 120 минут при температуре 37°C.
15. Способ по п. 10, характеризующийся тем, что в нем концентрация праймеров в реакционной смеси составляет 400 нМ, зондов - 200 нМ, а температура отжига 58÷68°C.
16. Способ по п. 10, характеризующийся тем, что в нем определение относительного количества фетальной ДНК проводят по результатам количественной ПЦР, при этом относительное количество фрагментов фетальной ДНК определяют соотношением относительного количества фрагментов ПЦР-продуктов образца ДНК до и после проведения реакции рестрикции ферментов BstFNI, при этом расчет осуществляют по методу «дельта-дельта Ct», в частности, с применением формулы
при этом полученный коэффициент X отражает снижение содержания материнской ДНК в смеси тотальной ДНК и может быть использован для расчета концентрации фетальной ДНК относительно ДНК женщины, в частности, по формуле
где F - количество копий фетальной ДНК,
М - количество копий материнской ДНК.
17. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что в нем по полученному отношению судят о присутствии и об относительном количестве фетальной ДНК в образце плазмы крови женщины; присутствие в образце и измерение относительно количества производят при уровне абсолютного количества фетальной ДНК не менее 100 копий.