Экспрессия молекулярно-биологических маркеров в опухолях молочной железы

ЭКСПЕРИ МЕНТАЛЬН Ы Е ИССЛЕДОВАНИЯ

ЭКСПРЕССИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ В ОПУХОЛЯХ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

М.Б. Ориновский1, Л.Е. Гуревич2, Г.Н. Швецова1, Ш.Ж. Талаева1,

Д.Д. Колоколов1, И.А. Казанцева2, В.П. Широкий1, А.С. Ожерельев1

Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН1, г. Москва Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского2

Представлены данные ретроспективного иммуногистохимического исследования экспрессии Ki-67, PCNA, Bcl-2, BAX, BclX, VEGF в опухолях двух групп больных раком молочной железы с благоприятным и неблагоприятным течением заболевания. Достоверно высокий уровень экспрессии VEGF выявлен в опухолях больных с ранним рецидивом РМЖ. Параллельно с VEGF в опухолях этих больных отмечен повышенный уровень экспрессии Ki-67 и PCNA. Полагают, что показатели экспрессии VEGF, Ki-67 и PCNA в первичной опухоли могут быть использованы в оценке прогноза РМЖ или выделения группы риска с высокой степенью вероятности развития раннего рецидива болезни.

EXPRESSION OF MOLECULAR-BIOLOGICAL MARKERS IN BREAST TUMORS

M.B. Orinovsky1, L.E. Gurevich2, G.N. Shvetsova1, Sh.Zh. Talaeva1, D.D. Kolokolov1, I.A. Kazantseva2, V.P. Shiroky1,

A.S. Ozhereljev1

N.N. Blokhin Cancer Research Center1, Moscow M.F. Vladimirsky Research Clinical Institute2, Moscow

Findings of retrospective immunohistochemical study of Ki-67, PCNA, Bcl-2, BAX, BclX, VEGF expressions in tumors of breast cancer patients with favorable and unfavorable prognosis have been presented. A significantly high level of VEGF expression was detected in tumors of patients with early breast cancer recurrence. Parallel with VEGf, the elevated levels of Ki-67 and PCNA expressions were also observed in tumors of these patients. The values of VEGF, Ki-67 and PCNA expressions in primary tumors are expected can be used for determining the breast cancer prognosis and screening the groups at high risk for early disease recurrence.

Рак молочной железы (РМЖ) в структуре онкологической заболеваемости в России прочно удерживает первое место. Статистические данные последнего десятилетия свидетельствуют о максимальном, по сравнению с другими злокачественными новообразованиями, темпе роста заболеваемости [3]. Известно, что обнаружение РМЖ на ранних стадиях способствует улучшениию отдаленных результатов лечения. Однако индивидуальная оценка прогноза болезни даже на ранней стадии опухолевого процесса

считается крайне актуальной. Выявить больных РМЖ с высокой вероятностью раннего рецидива позволяет исследование показателей экспрессии молекулярнобиологических маркеров в злокачественных опухолях молочной железы [1, 2, 6, 14].

Одной из наиболее важных биологических характеристик опухоли в прогнозе болезни считается оценка потенциала ее пролиферативной активности, инвазивной способности, ангиогенеза и апоптоза [4, 7, 8]. Так, известно, что уровень экспрессии антигена

Кл-67, тесно связан с биологически агрессивным поведением опухоли [15], вышвлена связь между показателем экспрессии РСЫЛ в опухоли и временем прогрессирования заболевания [12]. Отмечена определенная зависимость между уровнем экспрессии молекулярного маркера Вс1-2 в опухоли и ее чувствительности к адъювантной терапии. Уже не вызывает сомнения тот факт, что опухоль не может развиваться и расти без образования в ней разветвленной сети сосудов. В результате изучения молекулярных механизмов ангиогенеза было продемонстрировано наличие целого ряда регуляторных ангиогенных и антиангио-генных факторов, динамический баланс которых обеспечивает неоангиогенез в опухоли [9, 10]. В регуляции ангиогенеза тем или иным образом участвуют многие известные факторы роста и цитокины, однако важнейшим положительным регулятором ангиогенеза, бесспорно, является фактор роста эндотелия сосудов (УБвЁ) [5, 9, 13]. Уникальность этого фактора заключается в том, что, в отличие от всех других факторов роста, УБвР является активным митогеном для микро- и макроваскулярных клеток кровеносных и лимфатических сосудов, но он не действует на другие типы клеток.

В настоящей работе представлены данные сравнительного ретроспективный анализа уровней экспрессии молекулярно-биологических маркеров Ю-67, РСМЛ, Вс1-2, БАХ, Вс1Х, УБвБ в опухолях 21 больной РМЖ и их роли в прогнозе болезни, которые получали лечение и находились под наблюдением в течение 5 лет (с 1997 г.). Диагноз у всех подтвержден данными гистологического исследования удаленной опухоли. Имму-ногистохимическое исследование уровней экспрессии молекулярно-биологических маркеров проведено с использованием следующих моно- и поликлональных антител (табл. 1).

Использовали количественный метод в оценке иммуногистохимического окрашивания ядер клеток РМЖ антителами к PCNA и Ki-67. Расчет проводили общепринятым методом: выгчисляли индекс мечения или количество окрашенных ядер опухолевых клеток этим маркером на 100 опухолевых клеток при репрезентативных полях зрения. Этот показатель рассчитывали при анализе не менее 500-1000 клеток. Полу-количественный метод использовали при анализе иммуногистохимического окрашивания антителами VEGF, Вс1-2, BclX, BAX цитоплазмы раковык клеток и оценивали по балльной системе: 0 баллов - отсутствие окрашивания; + (1 балл) - более 20 % клеток со слабой интенсивностью окрашивания цитоплазмы; ++ (2 балла) - умеренное окрашивание цитоплазмы раковык клеток; +++ (3 балла) - интенсивное окрашивание; ++++ (4 балла) - интенсивное окрашивание цитоплазмы более чем 80 % клеток. Далее выводили среднее число баллов. В тех случаях, когда интенсивность окрашивания варьировала, например от + (1 балла) до ++ (2 баллов), среднее получали - 1,5 балла. Когда вышвляли равномерное окрашивание цитоплазмы клеток РМЖ, тогда цифра, характеризующая интенсивность окрашивания, быша круглой: + (1), ++ (2), +++ (3) или ++++(4 балла).

Статистический анализ распределения изучаемык признаков проводился с помощью критерия согласия Колмогорова - Смирнова. Для вышвления различий средних значений применялся однофакторный и многофакторный дисперсионный анализы. Для малых выборок и для типа распределения, отличного от нормального, достоверность различия средних оценивали с помощью непараметрических критериев - медианного, Колмогорова - Смирнова, Mann - Whitney U-test. Достоверность различий частот в изучаемых признаках оценивали с помощью критерия р2, для малых выборок рассчитывали точный критерий Фишера. Меру линейной связи оценивали с помощью коэффициента корреляции Пирсона, коэффициента корреляции рангов Spearman. Различия считались достоверными при р<0,05. При множественных сравнениях расчет уровня значимости проводили с учетом поправки Бонфер-рони. Расчет доверительных интервалов для малых долей проводился с учетом биномиального распределения. Для выявления степени влияния признаков на изучаемый показатель применяли многофакторный регрес-

Таблица 1 Моноклональные и поликлональные антитела, используемые в иммуногистохимическом исследовании опухолей

Название Рабочее Клон Фирма

антитела разведение

VEGF 1 : 100 VEGF

BAX 1 : 50 Поликлональные DAKO

Вс1-Х 1 : 50 Поликлональные DAKO

Вс1-2 1 : 80 Bc1-2/100/D5 NOVOCASTRA

Ki-67 1 : 50 Ki-S5 DAKO

PCNA Антитела в рабочем разведении PC10 DAKO

сионный анализ. Для определения прогноза риска развития рецидива заболевания строилась дискриминантная функция. Анализ кривык вы1живаемости проводили методом Kaplan - Mayer, сравнения кривых вы1живаемости проводили методами Log-Rank, с учетом поправки Бонферрони для множественных сравнений. Многофакторный анализ влияния признаков на безрецидивную выживаемость проводили с использованием модели Cox hazard proportional regression. При выборе статистических процедур учи-тытались методологические требования Международного конгресса по гармонизации GGP “Статистические принципы для клинических исследований” [11]. Все выгчисления проводили на персональном компьютере с помощью пакетов статистических программ SPSS 9,0 и STATISTICA 6,0.

Обследованные больные быши разделены на две группы: I группа - 9 больных, которые имели рецидив заболевания в течение 5-летнего периода наблюдения, и II группа - 12 больнык с отсутствием рецидива болезни в течение этого же периода времени.

В I группу вошли 9 больнык РМЖ в возрасте 3769 лет (1 - в репродуктивном периоде и 8 - в постменопаузе), которые имели следующую распространенность опухолевого процесса: T2N0M0 - 3 пациентки;

t2N1M0 - 1; t2N2M0 - 1; T3N1M0 - 2; ТЛЧ - 1; TNM

- 1. Дольковыш инфильтративный РМЖ вышвлен у 3, протоковый инфильтративный рак - у 6. Больныш выполнены следующие операции: радикальная мас-тэктомия с сохранением обеих грудных мышц - 8, радикальная резекция - 1 (пациентки оперированы в 1997 г.). РЭ вышвлены1 в 3 опухолях (33,3 % - 12, 31 и 40 фмоль/мг общего белка). В послеоперационном периоде 4 больным проводили курс лучевой терапии -СОД 46 Гр (РОД - 4 Гр). Также в послеоперационном периоде 7 больныш проводили различные курсы адъювантной химиотерапии: по схеме CIMF - 3 больным, по схемам FAP, CAF, таксотер + адриабластин, таксотер + доксорубицин - по одной больной. Всем больным был назначен тамокси-фен в дозе 20-40 мг ежедневно. В период наблюдения у больных РМЖ I группы возникли рецидивы или отдаленные метастазы через 5-30 мес от начала лечения.

Так, метастазы в кости вышвлены1 у 4 больных; метастазы в печени

- у 2; метастазы в легких - у 2; у одной пациентки обнаружен рецидив опухоли в послеоперационном рубце через 7 мес от начала лечения и метастазы в пече-

ни и регионарных лимфатических узлах надключичной области.

Во II группу вошли 12 больнык РМЖ в возрасте 35-68 лет (6 в репродуктивном периоде и 6 - в постменопаузе), которые имели следующие стадии заболевания: T2N0M0 - 3; T2NjM0 - 4; T3NtM0 - 3; T4NjM0 - 2. Дольковыш инфильтративный РМЖ вышвлен в 4 случаях, протоковый инфильтративный рак - в 7, низко-дифференцированныш плоскоклеточный рак - в 1. В предоперационном периоде 11 больнык специфическое лечение не получали. Только одной больной РМЖ (стадия - T4NjM0) было проведено неоадъювантное лечение - лучевая терапия (СОД - 32 Гр; РОД - 2 Гр) и химиотерапия по схеме Купера (CIMF + винкристин). Больныш вытолнены1 следующие операции: радикальная мастэктомия с сохранением обеих грудных мышц

- 10; радикальная резекция - 2. РЭ вышвлены в 6 опухолях (50,5 %), их уровни колебались в пределах от 12 до 21 фмолей/мг общего белка. Больным проводили следующее адъюватное лечение: лучевая терапия - 5, полихимиотерапия -7 (по схеме CIMF - 5, по схеме САР

- 1, по схеме CAF - 1), лучевая терапия + полихимиотерапия - 4. Одна пациентка от проведения адъювантной полихимиотерапии отказалась. Двум больныш назначен тамоксифен в дозе 20-40 мг ежедневно. Все больные РМЖ II группы прослежены в течение 5 лет и ни у одной из них не вышвлено рецидива заболевания.

Средняя продолжительность времени появления рецидива у больнык РМЖ в I группе 454,8 дня (0-691 день), [95 % CI=0-915,2 дня], медиана этого показателя равнялась 246 дням. Средняя продолжительность без-рецидивного периода во II группе (с благоприятныш течением болезни) составила 1660 дней (4,55 года) [95 % CI=1549-1773 дней] от начала лечения, медиана безре-цидивного периода равнялась 1690 дням.

Анализируя диапазон значений показателя экспрессии VEGF в опухолях больных РМЖ, следует отметить, что его среднее значение в группе с ранним рецидивом было достоверно выше (3,08 балла) по

Таблица 2

Уровни значимости различий в показателях VEGF, BAX, BclX, Bcl-2, Ki-67, PCNA в группе с ранним рецидивом и без рецидива у больных РМЖ

Уровень значимости, р VEGF BAX BclX Bcl-2 Ki-67 PCNA

Медианный тест 0,0000 003 0,16 >005 0001 00000

Тест Колмогорова -Смирнова 0 01 >005 >005 005 001 0001

Дисперсионный анализ 0000009 0,15 0,2 2,3 00001 0000004

Таблица 3 Оценка уровней экспресснн VEGF, BAX, BclX, Bcl-2, Ki-67, PCNA

Исследуемые коэффициенты I группа II группа Достоверность различий, р

BAX/BclX O,76+O,O7 1,46+O,35 O,O99

VEGF/BAX* 1,73+O,21 O,76+O,18 O,OO2

VEGF/BclX* 1,26+O,15 O,8O+O,14 O,O39

Ki-67/VEGF 9,39±1,33 13,29±2,16 O,17

PCNA/VEGF 14,8±1,74 21,32±4,O2 O,199

Ki-67/BAX* 15,25+1,97 7,42+1,21 O,O2

PCNA/BAX* 24,37±3,15 11,16±1,62 O,OO7

Ki-67/BclX 11,1O+1,36 9,19+1,88 O,45

PCNA/BclX 17,31±1,43 14,O3±2,73 O,47

Примечание : *** - p<0,001; значения VEGF, BAX, BclX, Bcl-2 выражены в баллах.

Таблица 4 Коэффициенты! cooтнoшeния мoлeкyляpнo-биoлoгичecкиx MapKepoB в РМЖ

Показатель Неблагоприятный уровень Благоприятный уровень

VEGF *** >З97778 >1975OO

BAX >1,88889 >2,ЗЗЗЗЗ

BclX *** >2,55556 >1,958ЗЗ

Bcl-2 >19125O >1,9O9O9

Ki-67*** >26,98889 >14,86667

PCNA *** >42,9ЗЗЗЗ >2З,8ЗЗЗ

Примечание : * - различия статистически значимы.

сравнению с группой больных, которые не имели рецидива заболевания в сроки наблюдения 5 лет (1,38 балла). Показатели экспрессии VEGF в опухолях больных с ранним рецидивом РМЖ превышают его значения в группе с благоприятным прогнозом в 2,23 раза; Ki-67 - в 1,81; PCNA - в 1,86. В то же время для про-апоптотического показателя BAX экспрессия в РМЖ имела обратную закономерность, его значения в группе пациенток с благоприятным прогнозом превышали показатели BAX относительно группы больных РМЖ с неблагоприятным прогнозом в 1,23 раза. Значения Bcl-2 не различались у больных двух групп.

При анализе результатов исследования выявлены высокозначимые различия в показателях экспрессии VEGF, BclX, Ki-67, PCNA у больных с ранним рецидивом (I группа) и пациенток без рецидива (II группа) в сроки наблюдения 5 лет (табл. 2). В табл. 3 приведены средние уровни исследуемых молекулярно-биологических маркеров в первичной опухоли больных РМЖ при благоприятном и неблагоприятном течении болезни.

Нами были также определены коэффициенты соотношений исследуемых молекулярно-биологических маркеров в двух группах больных (табл. 4). Из этих данных следует, что наиболее значимые различия в соотношении исследуемых молекулярно-биологических маркеров у больных РМЖ с благоприятным и неблагоприятным течением наблюдали между коэффициентами: VEGF/BAX, PCNA/BAX и Ki-67/BAX.

Проведено изучение корреляционных связей между исследуемыми показателями в группе больных РМЖ с ранним рецидивом заболевания и без рецидива в сроки наблюдения З лет. Выявлена сильная положительная корреляционная зависимость (r=0,89) [9З % 0=0,74-0,9З] ф<0,0З) между показателем Кі-67 и PCNA, которую наблюдали в обеих группах больных РМЖ. Также выявлена линейная положительная достоверная зависимость между экспрессией VEGF и PCNA независимо от времени появления рецидива. Между показателями VEGF и Кі-67 наблюдали менее выраженную корреляционную линейную зависимость с положительной тенденцией, ранговый коэффициент корреляции равнялся г=0,З6 (р=0,008). Показатели PCNA и BclX также коррелировали, ранговый коэффициент корреляции Spearman был равен r=0,43 (p=0,047).

Применение факторного анализа показало сильную взаимозависимость маркеров VEGF, Ki-67 и PCNA. Эти показатели могут быть объединены в обший прогностический фактор при РМЖ. Кроме того, еше одним независимым прогностическим фактором РМЖ из изученных нами молекулярно-биологических маркеров оказался показатель экспрессии BAX в первичной опухоли. Выявлено, что с увеличением уровня экспрессии VEGF в опухоли уменьшается длительность безрецидивного периода у больных РМЖ. Эта же зависимость была характерна для маркера Ki-67, но выражена слабее (г=-0,З7; p^^), и для маркера PCNA (r=-0,63; p^^). Экспрессия BclX и Bcl-2 не была связана линейной зависимостью со временем безрецидивного периода.

Для выявления возможности предсказания возникновения рецидива в З -летний срок у больных РМЖ по значениям изучаемых молекулярно-биологических маркеров применялся метод бинарной логистической регрессии с вычислением чувствительности и представительности тестируемых уровней показателей и их оценки с помошью кривых ROC (табл. З).

Использование мультирегрессионного анализа позволило построить линейную регрессионную модель предсказания времени возникновения рецидива РМЖ при известных значениях маркеров VEGF, Ki-67

Таблица 5

Результаты бинарной логистической регрессии с вычислением чувствительности и представительности тестируемых уровней показателей и их оценки с помощью кривых КОС

Показатель Граничное значение Чувствительность Представительность

VEGF 2 0,89 [95 % CI=0,68-1,0] 1,0

PCNA 30 0,89 [95 % CI=0,68-1,0] 1,0

Ki-67 24 0,78 [95 %CI=0,51-1,0] 1,0

BAX 2 0,89 [95 % CI=0,58-1,0] 0,58 [95 % С1=0,26-0,88]

Bcl-2 1,5 0,44 [95 %CI=0,18-0,82] 0,58 [95 %С1=0,26-0,88]

BclX 2 0,78 [95 % CI=0,43-0,98] 0,75 [95%С1=0,38-0,96]

\лгорнтн распознавания больнык с ранним рецидивом при РМЖ

методой CART

I

] [f O.llU ОПрИСТПЕЬП:

firm

Ht( ......FIMHI 11 Hl"

atmrn

Ели IILIjlHJL JJU.liL JLf"JL НИ I

Методом генерального дискриминантного анализа были рассчитаны пороговые значения этих показателей (р=0,0001) для класса раннего рецидива и класса без рецидива в течение 5-летнего периода. Для показателя VEGF это значение равнялось 2,06 балла, BAX - 2,26 балла, BclX - 2,21 балла, Bcl-2 - 1,66 балла, Ki-67 - 19,84 балла и PCNA - 31 балл.

Также были оценены прогностические возможности изучаемых маркеров для проведения классификации на 2 класса: 1) класс с ранним рецидивом и 2) класс без рецидива в течение 5-летнего периода

и PCNA и гистологическом варианте строения опухоли. Уровень значимости модели р=0,0001 подтверждает, что исследуемые факторы оказывают большое влияние на вероятность появления рецидива у больных РМЖ в указанные сроки. Приводим рассчитанные коэффициенты регрессии, указывающие на степень этого влияния: PVEGF=-0,46±0,11 (p=0,001), bK 67=-

0,43+0,17 (p=0,027), IE =0,21+0,09 (p=0,029) и

7 7 VA 7 ' 7 • ГИСТОЛОГИЯ 7 7 \1 7 У

Ppcna=-0,44+0,19 (p=0,0475), коэффициенты регрессии других маркеров отличались от нуля незначительно (р>0,05).

Рис. 1. Правило принятия решения с учетом использования уровней PCNA и VEGF для выявления больных РМЖ с ранним рецидивом

наблюдения методом C&RT (Breimen et al., 1984). Для маркера VEGF эта характеристика равнялась 1,0, для PCNA - 0,861, для Ki-67 - 0,723. Ценность маркеров, регулирующих апоптоз, была ниже и равнялась 0,417, 0,27 и 0,208 для BclX, BAX, Bcl-2 соответственно. Наилучшее решение, найденное с применением этого алгоритма, получено при использовании маркеров VEGF и PCNA (рис. 1).

В связи с небольшой выборкой даннык для оценки полученных результатов нами применялся метод скользящего контроля. В классе с ранним рецидивом получено 88,9 % [95 % CI=68,3-100 %] правильнык распознаваний, а в классе без рецидива в течение 5-летнего срока наблюдения 91,7 % [95 % CI=72,9-100 %] правильных классификаций. К несомненным достоинствам данного алгоритма следует отнести его наглядность и отсутствие каких-либо выгчислений для принятия решения. Распознавание же с использованием только показателей T, N и М (система TNM) бышо значительно менее эффективным при вышеперечисленный методах. При многофакторном анализе выживаемости (Proportional hazard (Cox) model) с использованием уровней всех маркеров, а также показателей TNM независимым фактором прогноза оказался только показатель VEGF (р=0,0023).

Таким образом, представленные нами данные ретроспективного сравнительного иммуногистохи-мического исследования некоторых молекулярнобиологических маркеров РМЖ на предмет анализа уровней их экспрессии в первичной опухоли убедительно вышвили следующие закономерности. Усиленная экспрессия VEGF, положительно стимулирующего неоангиогенез в первичной опухоли, указывает на то, что она характерна для опухолей больных РМЖ с неблагоприятным течением, а следовательно, и прогнозом заболевания. Все эти пациентки имели рецидив болезни в ранние сроки от начала лечения. Параллельно с VEGF в опухолях этой группы больных РМЖ отмечен повышенный индекс пролиферативной активности антигена Ki-67 и PCNA. Показатели этих маркеров дополнительно могут быть также использованы в оценке прогноза заболевания.

ЛИТЕРАТУРА

1. Герштейн Е. С., Кушлинский Н.Е. Тканевые маркеры как факторы прогноза при раке молочной железы // Практ. онкология. 2002. Т. 3, № 1. С. 38-44.

2. Кушлинский Н.Е., Герштейн Е.С. Фактор роста эндотелия сосудов при раке молочной железы // БЭБМ. 2002. Т. 133, № 6. С. 604-612.

3. ТрапезниковН.Н., АксельЕ.М. Заболеваемость злокачественными новообразованиями и смертность от них населения стран СНГ. М., 2001.

4. Adams J., Carder P.J., Downey S. et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) in breast cancer: comparison of plasma, serum, and tissue VEGF and microvessel density and effects of tamoxifen // Cancer Res. 2000. Vol. 60, № 11. P. 2898-2905.

5. Anan K., Morisaki T., Katano M. et al. Assessment of c-erbB2 and vascular endothelial growth factor mRNA expression in fine-needle aspirates from early breast carcinomas: pre-operative determination of malignant potential // Eur. J. Surg. Oncol. 1998. Vol. 24, № 1. P. 28-33.

6. Beenken S. W., BlandK.I. Biomarkers for breast cancer // Minerva Chir. 2002. Vol. 57, № 4. P. 437-448.

7. Biroccio A., Candiloro A., Mottolese M. et al. Bcl-2 overexpression and hypoxia synergistically act to modulate vascular endothelial growth factor expression and in vivo angiogenesis in a breast carcinoma line // FASEB J. 2000. Vol. 14, № 5. P 652-660.

8. Ferrara N. The role of vascular endothelial growth factor in pathological angiogenesis // Breast Cancer Res. Treat. 1995. Vol. 36, № 2. P. 127-137.

9. Folkman J. What is the evidence that tumours are angiogenesis dependent? // J. Natl. Cancer Inst. 1990. Vol. 82. P. 4-6.

10. Gasparini G. Clinical significance of determination of surrogate markers of angiogenesis in breast cancer // Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2001. Vol. 37, № 2. P 97-114.

11.ICH Guidelines // Good Clin. Pract. J. 1998. Vol. 5, № 4. P. 27-37.

12. Kato T., Kameoka S., Kimura T. et al. C-erbB-2 and PCNA as prognostic indicators of long-term survival in breast cancer // Anticancer Res. 2002. Vol. 22, № 2B. P. 1097-1103.

13. Kranz A., Mattfeldt T., Waltenberger J. Molecular mediators of tumor angiogenesis: enhanced expression and activation of vascular endothelial growth factor receptor KDR in primary breast cancer // Int. J. Cancer. 1999. Vol. 84, № 3. P. 293-298.

14.Toi M., Hoshina S., Takayanagi T., Tominaga T. Association of vascular endothelial growth factor expression with tumor angiogenesis and with early relapse in primary breast cancer // Jpn. J. Cancer Res. 1994. Vol. 85. P. 1045-1049.

15. Trihia H., Murray S., Price K. et al. Ki-67 expression in breast carcinoma // Cancer. 2003. Vol. 97, № 5. P. 13211331.

Поступила 2.02.04