СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА КАПСУЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА Haemophilus influenzae ТИП b (Hib) C АНТИГЕНАМИ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
METHOD OF PREPARING CONJUGATE OF CAPSULAR POLYSACCHARIDE Haemophilus influenzae TYPE b (Hib) C ANTIGENS FOR PREPARING IMMUNOBIOLOGICAL PREPARATIONS

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа связывания капсульного полисахарида Haemophilus influenzae тип b (Hib) с антигенами, в качестве которых используются столбнячный и дифтерийный анатоксины.
Существует способ связывания капсульного полисахарида Hib, при котором модифицированный бромцианом капсульный полисахарид Hib и дериват дифтерийного анатоксина десятикратно отмывают от продуктов химической реакции методом ультрафильтрации, концентрируют, смешивают в равных объемах и инкубируют в течение 18 часов при 4°C до получения конъюгата (US 4496538).
Существует способ конъюгации, в котором капсульный полисахарид Hib ковалентно связывают со столбнячным анатоксином через дигидразид адипиновой кислоты и очищают методом ультрафильтрации от не связавшихся компонентов. Полученный конъюгат адсорбируют на геле фосфата алюминия и лиофилизируют. Перед применением препарат смешивают с водой для инъекций или с другой жидкой многокомпонентной вакциной (АКДС), адсорбированной на геле фосфата алюминия (US 20020182226).
Существует также способ связывания, в котором капсульные полисахариды Hib и менингококка конъюгируют со столбнячным и дифтерийным анатоксинами соответственно. Полученные препараты отмывают и концентрируют с использованием ультрафильтрации. Каждый из конъюгатов отдельно адсорбируют на геле фосфата алюминия, объединяют и лиофилизируют в присутствии сахарозы. Перед введением лиофилизат смешивают с жидкими компонентами вакцины (поверхностный антиген гепатита B, цельные клетки коклюша), адсорбированными на геле фосфата алюминия (US 20030180316).
В указанных способах конъюгация капсульного полисахарида Hib с белковыми антигенами осуществляется в водных средах. Для удаления химических реагентов и не связавшихся компонентов использовался метод мембранной ультрафильтрации. Эта технология требует высоких концентраций антигенов, больших объемов буферных растворов и ведет к значительным потерям препарата на различных стадиях производства. Для использования полученного конъюгата в качестве составляющей многокомпонентной вакцины необходима его лиофилизация в присутствии стабилизатора (сахароза, лактоза и т.п.), что существенно сказывается на свойствах и себестоимости конечного продукта. В случае смешивания конъюгата с АКДС-вакциной происходит антигенная перегрузка иммунизируемого организма дифтерийным или столбнячным анатоксинами.
Целью настоящего изобретения явилась разработка способа связывания капсульного полисахарида Hib с белковыми антигенами, который позволил бы исключить лиофилизацию конъюгатов и снизить антигенную нагрузку на иммунизируемый организм.
Поставленная цель достигается тем, что химическое связывание капсульного полисахарида Haemophilus influenzae тип b осуществляют со смесью столбнячного и дифтерийного анатоксинов, адсорбированных на геле гидроокиси алюминия или геле фосфата алюминия.
Способ осуществляют следующим образом.
Используют капсульный полисахарид Haemophilus influenzae тип b, полученный по технологии, описанной в патенте RU 2185191 (2002). Бактерии Haemophilus influenzae тип b выращивают на твердой питательной среде (шоколадный питательный агар), культуру смывают физиологическим раствором и инокулят засевают на жидкую синтетическую питательную среду. Выращенную биомассу обрабатывают 0,1% водным раствором формалина в течение 1-2 ч, а клетки отделяют ультрафильтрацией на молекулярных волоконных фильтрах. Капсульный полисахарид Hib, находящийся в ультрафильтрате, концентрируют на молекулярных волоконных фильтрах и лиофилизируют.
100 мл смеси столбнячного и дифтерийного анатоксинов, адсорбированных на геле гидроокиси алюминия или фосфата алюминия, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Осадок химически связывают карбодиимидным способом через дигидразид адипиновой кислоты с 3 мг капсульного полисахарида Hib, растворенного в 1 мл дистиллированной воды. Полученный конъюгат отмывают 0,9% раствором натрия хлорида при центрифугировании 3000 об/мин в течение 5 мин и доводят 0,9% раствором натрия хлорида до объема 100 мл.
Изучение иммуногенности препарата проводили на четырех группах беспородных белых мышей. Животных вакцинировали однократно внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл (одна человекодоза).
Первую группу прививали экспериментальным адсорбированным жидким дифтерийно-столбнячно-гемофильным конъюгатом, вторую - коммерческой АДС-вакциной, смешанной с одной человекодозой сухой коньюгированной со столбнячным анатоксином гемофильной вакциной (AKT-Hib), третью иммунизировали коммерческой АДС-вакциной, четвертую группу животных не иммунизировали, использовали в качестве контрольной. Через месяц в сыворотках крови мышей определяли методом иммуноферментного анализа содержание антител к капсульному полисахариду Hib, а также к дифтерийному и столбнячному анатоксинам, сравнивая оптическую плотность реакционной смеси. Результаты испытаний представлены в таблице №1.
Таблица 1
Результаты ИФА сывороток крови белых мышей после иммунизации вакцинными препаратами
№№ п/п
Наименование группы
Кол-во животных
Средняя оптическая плотность λ 450 нм/630 нм
Hib
столбнячный анатоксин
дифтерийный анатоксин
1.
конъюгат АДС-Hib (экспериментальная)
10
1,72
1,41
0,62
2.
смесь АДС и AKT-Hib (прототип, коммерческая)
10
0,84
1,62
0,66
3.
контрольная группа, иммунизированная АДС
10
-
1,38
0,84
4.
контрольная (неиммунизированная)
10
0,03
0,03
0,05
Как видно из таблицы, препарат, полученный предлагаемым способом, обладает более высокой иммуногенной активностью Hib-компонента по сравнению с коммерческой АДС-вакциной, смешанной с лиофилизированным гемофильно-столбнячным конъюгатом и не вызывает антигенной перегрузки столбнячным анатоксином. Полученные данные свидетельствуют, что предлагаемый способ связывания капсульного полисахарида Hib не требует высокой концентрации антигенов, большого объема буферных растворов и не приводит к потерям гемофильного компонента. В качестве антигенов могут быть использованы и другие иммуногенные полимеры. Разработанная технология не нуждается в лиофилизации и не приводит к антигенной перегрузке T-зависимым компонентом, использованным в качестве носителя.