Конструирование иммунодиагностикума для выявления и идентификации типичных и атипичных (бескапсульных) форм возбудителя чумы

Литература

1. Апарин Г.П., Голубинский Е.П. Микробиология чумы. - Иркутск, 1989. - 92 с.

2. Балахонов С.В. Геномные маркеры возбудителей чумы, псевдотуберкулеза, холеры, бруцеллеза (эпидемиологическое и диагностическое значение): Автореф. дис. ... д.м.н. - Иркутск, 2000. - 44 с.

3. Балахонов С.В., Вержуцкий Д.Б., Корзун В.М. и др. Современное состояние природных очагов чумы Сибири // Журн. инфекц. патологии. 2009. Т. 16. № 3. С. 16 - 20.

4. Вахрушева З.П., Агапов В.А., Носков А.К. Современное состояние Забайкальского природного очага чумы // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. 2004. Т. 2. № 1. С. 48 - 51.

5. Вержуцкий Д.Б. Эпизоотологическая роль популяционной организации населения блох длиннохвостого суслика в Тувинском природном очаге чумы // Паразитология. 1999. Т. 33. № 3. С. 242 - 249.

6. Вержуцкий Д.Б., Галацевич Н.Ф., Ковалева Н.И. Особенности изменения численности блох длиннохвостого суслика в Тувинском очаге чумы // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. 200l. № З. С. 85 - 87.

7. Голубинский Е.П., Жовтый И.Ф., Лемешева Л.Б. О чуме в Сибири. - Иркутск, l987. - 244 с.

8. Денисов А.В., Чипанин Е.В. Динамика проявлений эпизоотий чумы в Горно-Алтайском природном очаге // Журн. инфекц. патологии. 2009. Т. l6. № З. С. l00, l0l.

9. Логачев А.И., Балахонов С.В., Белькова С.А. и др. Биологические свойства триптофанзависимых штаммов чумного микроба, изолированных в Горном Алтае // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. 2004. Т. 2. № 1.

С. l07 - lll.

10. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири / Под ред. Г.Г. Онищенко и В.В. Кутырева. - М., 2004. - 192 с.

Конструирование иммунодиагностикума для выявления и идентификации типичных и атипичных (бескапсульных) форм возбудителя чумы

О.В. Тихвинская, Г.Д. Елагин, В.А. Пятков, И.В. Живов, Д.А. Кутаев

ФГУ «48-й Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации», г. Киров

Резюме

Совершенствование средств и методов экспресс-диагностики возбудителя чумы продолжает оставаться актуальной проблемой. Атипичные штаммы чумного микроба представляют собой трудный объект для лабораторной диагностики и с помощью традиционных методов иммуноанализа не определяются. В связи с этим проведены исследования и представлены результаты по разработке экспериментального образца иммунодиагностикума, позволяющего выявлять как капсулообразующие, так и бескапсульные штаммы Yersinia pestis при их содержании в пробах в концентрации от 125 до 500 тыс. м.к./мл в реакции непрямой агглютинации.

Ключевые слова: эритроцитарный диагностикум, чума, Yersinia pestis, идентификация, иммуноанализ

Construction of Immunodiagnostic Kit for Detection and Identification of Typical and Atypical (Non-Capsulated) Forms of Plague Causative Agent

O.V. Tikhvinskaya, G.D. Elagin, V.A. Pyatkov, I.V. Zhivov, D.A. Kutaev Federal State Establishment «Russian Federation Ministry of Defense the 48th Research Institute», Kirov Abstra€t

Upgrading of apparatus and methods for express diagnostics of plague causative agents keeps on staying an important problem nowadays. Atypical strains of plague microorganisms are difficult to be laboratory diagnosed and they are not recognized by traditional methods of immunoassay. In this connection the studies were carried out and the results of developing an experimental model of immunodiagnostic kit for detection of capsulogenous as well as for non-capsulated Yersinia pestis strains with microorganisms concentrated from 125 to 500 000 microbial cells/ml to a sample by indirect agglutination are shown.

Key words: erythrocytic diagnostic kit, plague, Yersinia pestis, identification, immunoassay

Введение

В настоящее время угроза распространения карантинных и других особо опасных инфекций стала чрезвычайно актуальной, в частности в связи с протяженной границей Российской Федерации на западном, кавказском и центрально-азиатском направлениях и открытостью ее со стороны стран СНГ, развитием международных связей, усилением миграционных процессов, возросшей угрозой терроризма [5]. Поэтому совершенствование средств и методов экспресс-диагностики возбудителя чумы

в настоящее время продолжает оставаться актуальной проблемой.

Как известно, классическая серологическая диагностика чумы основана на выявлении видоспецифического капсульного антигена Ф1 Yersinia pestis или антител к нему. Основным недостатком подобных средств является то, что продукция указанного антигена зависит от условий культивирования и генетического статуса штаммов Y. pestis [1]. До настоящего времени не решен вопрос об антигенных структурах Y. pestis, наиболее перспективных для создания имму-

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (51)/2010

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (51)/2010

нодиагностикумов, позволяющих одновременно выявлять как типичные, так и атипичные формы чумного микроба [3, 4]. В то же время его атипичные штаммы представляют собой трудный объект для лабораторной диагностики и с помощью традиционных методов иммуноанализа не определяются. Между тем, например, в Среднеазиатском пустынном очаге чумы выделяется около 10% штаммов чумного микроба, частично или полностью лишенных специфического капсульного антигена Ф1. L-формы чумного микроба, как доказано, персистируют в диких грызунах и эктопаразитах и также часто не содержат Ф1-антигена [2].

Таким образом, экспрессное выявление типичных и атипичных (бескапсульных) форм чумного микроба - актуальная задача, для решения которой с успехом могут быть использованы соответствующие средства иммуноанализа, и в первую очередь эритроцитарные диагностикумы, как весьма чувствительные и специфичные.

Цель настоящего исследования - конструирование иммунодиагностикума для выявления и идентификации типичных и атипичных (бескапсульных) форм возбудителя чумы.

Материалы и методы

Для иммунизации животных использовали живую бактериальную культуру Y. pestis вакцинного штамма EV, а также инактивированную культуру штамма EV чумного микроба, выращенную при температуре +28 °С. Для экспериментальной оценки специфической активности и специфичности диагностикума использовали инактивированные микробные культуры Y. pestis штаммов EV (pFra+Tox+), 231 (pFra+Tox+) и 167 (pFra-Tox-), Yersinia pseudotuberculosis штаммов 147 (I серовариант), 326 (III серовариант) и 680 (I серовариант), а также Yersinia enterocolitica серогрупп Е5 и Е9 из федеральной коллекции микробных культур, депонированных в ФГУ «48-й ЦНИИ Минобороны России». Все использованные в работе штаммы обладали типичными культурально-морфологическими, биохимическими и серологическими свойствами.

Иммунизацию кроликов и адсорбцию полученных гипериммунных сывороток проводили по оригинальной методике. Контроль серологической активности и специфичности сывороток исследовали в реакции диффузионной преципитации (РДП) [6].

При конструировании диагностикума использовались эритроциты барана, формалинизиро-ванные по методике R. Weinbach в модификации П.И. Меньшова и М.Ф. Шмуттера.

Изучение специфической активности, специфичности, сохраняемости и воспроизводимости свойств разработанного диагностического препарата проводили с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Результаты и обсуждение

Для получения гипериммунных сывороток нами была разработана схема иммунизации животных,

включающая пять циклов, интервалы между которыми составляли 21 день.

Первый цикл предусматривал подкожное введение живой бактериальной культуры Y. pestis вакцинного штамма EV, второй - четырехкратное сочетанное внутривенное введение инактивированной микробной взвеси Y. pestis штамма EV в двукратно возрастающих дозах и подкожные аппликации Ф1-антигена с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ). Третий и последующие циклы были аналогичны второму, за исключением концентрации инактивированной микробной культуры Y. pestis штамма EV, которая была увеличена в два раза относительно предыдущей иммунизации.

Серологическую активность и специфичность гипериммунных кроличьих сывороток оценивали в РДП (табл. 1).

Согласно полученным экспериментальным данным, все сыворотки реагировали с культурами как капсульных, так и бескапсульных вариантов чумного микроба в титрах от 1:64 до 1:128. Однако при этом они оказались недостаточно специфичными и вступали в перекрестное взаимодействие с антигенами гетерологичных иерсиний.

Для удаления перекрестно реагирующих антител сыворотки были подвергнуты адсорбции смесью инактивированных формалином агаровых культур возбудителей Y. pseudotuberculosis и Y. anterocolitica тех штаммов, которые по результатам РДП давали наиболее выраженные неспецифические реакции (табл. 2).

Как следует из анализа данных, приведенных в таблице 2, после адсорбции сывороток практически во всех случаях было отмечено заметное снижение серологической активности, однако при этом только три из исследованных сывороток реагировали в РДП с культурами гетерологичных иерсиний в титрах от 1:2 до 1:4.

Из адсорбированных сывороток путем осаждения сульфатом аммония с последующей очисткой методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефацеле получили препараты иммуноглобулинов. В процессе конструирования эритро-цитарного иммуноглобулинового диагностикума в качестве носителя очищенных чумных антител были взяты эритроциты барана, формалинизиро-ванные по методике R. Weinbach в модификации П.И. Меньшова и М.Ф. Шмуттера. Их танизацию и сенсибилизацию иммуноглобулинами, а также определение удельной серологической активности и сенсибилизирующей дозы последних проводили по ранее разработанным методикам. В результате был сконструирован эритроцитарный иммуноглобулиновый диагностикум, предназначенный для обнаружения и идентификации типичных и атипичных (бескапсульных) форм возбудителя чумы, и осуществлена наработка трех его экспериментальных серий.

Лабораторно-экспериментальное изучение сконструированного препарата показало, что все ис-

Таблица 1.

Серологическая активность и специфичность чумных гипериммунных кроличьих сывороток при их исследовании в РДП с типичными и атипичными (бескапсульными) вариантами Y. pestis и культурами гетерологичных иерсиний

№ сыворотки Серологическая активность и специфичность сывороток (титр) при их исследовании в РДП с культурой:

Y. pestis штамма EV ^га+Тох+), выращенной при температуре: Y. pestis штамма 647 (pFra- Tox-) Y. pestis штамма 231 (pFra+ Tox+) Y. pseudotuberculosis штамма: Y. enterocolitica серогруппы:

+28 °С +37 °С 147 326 680 Е9 Е5

1 1:64 1:64 1:64 1:64 1:2 1:2 1:2 0 1:2

2 1:64 1:128 1:64 1:128 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2

3 1:64 1:128 1:64 1:64 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2

4 1:64 1:128 1:64 1:128 1:8 1:8 1:8 1:4 1:4

5 1:64 1:64 1:64 1:64 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2

6 1:64 1:128 1:64 1:128 1:4 1:4 1:4 1:2 1:2

7 1:64 1:128 1:64 1:64 1:8 1:8 1:8 1:4 1:4

8 1:64 1:64 1:64 1:64 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2

9 1:64 1:128 1:64 1:128 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4

10 1:64 1:128 1:64 1:128 1:4 1:8 1:8 1:4 1:4

11 1:64 1:64 1:64 1:64 1:4 1:4 1:4 1:2 1:2

12 1:64 1:128 1:64 1:128 1:4 1:8 1:8 1:4 1:4

Таблица 2.

Серологическая активность и специфичность адсорбированных чумных гипериммунных кроличьих сывороток при их исследовании в РДП с типичными и атипичными (бескапсульными) вариантами Y. pestis и культурами гетерологичных иерсиний

№ сыворотки Серологическая активность и специфичность сывороток (титр) при их исследовании в РДП с культурой:

Y. pestis штамма EV №а+Тох+), выращенной при температуре: Y. pestis штамма 647 (pFra- Tox-) Y. pestis штамма 231 (pFra+ Tox+) Y. pseudotuberculosis штамма: Y. enterocolitica серогруппы:

+28 °С +37 °С 147 326 680 Е9 Е5

5 1:32 1:32 1:32 1:32 0 0 0 0 0

6 1:32 1:64 1:32 1:64 0 0 0 0 0

7 1:32 1:64 1:32 1:32 1:2 0 0 0 0

8 1:32 1:32 1:32 1:32 0 0 0 0 0

9 1:16 1:64 1:32 1:64 0 0 1:2 0 0

10 1:32 1:64 1:32 1:64 0 0 0 0 0

11 1:32 1:32 1:32 1:32 0 0 0 0 0

12 1:32 1:64 1:32 1:64 0 0 0 0 0

пытанные образцы обеспечивали выявление как капсульных, так и бескапсульных вариантов чумного микроба при их содержании в исследованных пробах в концентрации от 125 до 500 тыс. м.к./мл.

При этом ни один из образцов не давал ложных положительных результатов при анализе культур гетерологичных иерсиний, взятых в концентрации 100 млн м.к./мл (табл. 3).

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (51)/2010

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (51)/2010

Таблица 3.

Специфическая активность образцов разных лабораторных серий разработанного диагностикума при исследовании типичных и атипичных (бескапсульных) форм возбудителя чумы

Номер серии диагностикума Количество испытанных образцов, шт. Минимальная выявляемая концентрация (тыс. м.к./мл) в РНГА (микрометод) инактивированных культур Y. pestis штамма (п = 5):

EV

1 3 250 500 500

2 3 125 250 125

3 3 125 250 250

Примечание: n - количество определений

Исследование сохраняемости свойств трех лио-филизированных экспериментальных серий диагностикума при различных температурных режимах показало, что при температуре от +18 до +22 °С специфическая активность препарата заметно снижалась после трех месяцев хранения, а в условиях его содержания при температуре от +2 до +6 °С она оставалась стабильной в течение года (срок наблюдения).

Для оценки воспроизводимости определяли количество положительных результатов при исследовании заведомо положительных проб (положительный контрольный образец в концентрации

Литература

1. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2002. № 3.

С. 3 - 23.

2. Зыкин Л.Ф., Яковлев А.Т. Очерки по лабораторной диагностике опасных инфекций. - Саратов: Изд-во Саратовского университета, 1993. - 109 с.

500 тыс. м.к./мл), которое выражали в процентах. Всего было выполнено 96 определений. При постановке РНГА с разработанным диагностикумом воспроизводимость составила 98%.

Выводы

В ходе исследований был разработан экспериментальный образец иммунодиагностикума, позволяющий выявлять как капсулообразующие, так и бескапсульные штаммы Y. pestis при их содержании в исследованных пробах в концентрации от 125 до 500 тыс. м.к./мл в реакции непрямой агглютинации. ^

3. Козлов М.П. Чума. - М.: Медицина, 1979. - 191 с.

4. Рудник М.П. и др. Применение энзимсвязанного иммуносорбентного определения (ELISA) для диагностики чумы // Иммунология. 1983. № 6. С. 74 - 76.

5. Федоров Ю.М. и др. История становления и современные принципы организации санитарной охраны территории от завоза и распространения карантинных болезней // Проблемы особо опасных инфекций. 2001. Вып. 81. С. 3 - 12.

6. Ouchterlony O. Double diffusion in plates // Scand. J. Lab. Invest. 1948. V. 21. P. 246 - 258.

Официальная информация

О мерах по предупреждению заболеваний российских граждан, выезжающих в зарубежные страны

Письмо Роспотребнадзора № 01/4256-0-32 от 25.03.2010 г

По информации Федерального агентства по туризму, за 2009 год число российских граждан, выехавших за рубеж с туристической целью, составило более 9,5 млн человек и 1,3 млн - со служебной, что меньше, чем за тот же период 2008 года. В 2009 году в страну въехали более 3,8 млн иностранцев с туристическими и деловыми целями, в том числе и из стран с неустойчивой эпидемиологической обстановкой по ряду особо опасных инфекционных болезней (страны Юго-Восточной Азии, Африки и др.).

В 2009 году в 56 странах отмечены вспышки холеры. Сохраняется постоянная угроза завоза холеры с последующим распространением на свободные от этой болезни территории. С 2005 по 2009 год в Российской Федерации было зарегистрировано пять случаев завоза холеры из Индии и Таджикистана.

С 2004 по 2009 год ВОЗ была проинформирована о 12 503 случаях заболевания чумой, в том числе - 843 летальных из 16 стран Африки, Азии и Америки.

В конце прошлого века активизировались природные очаги контагиозных вирусных геморрагических лихорадок, вызванных вирусами Марбург, Эбола, Ласса.

Ежегодно в Российской Федерации регистрируются импортированные случаи заболеваний тропической малярией, амебиазом, тропическими гельминтозами.

По оценкам ВОЗ, ежегодно желтой лихорадкой заболевает до 200 тыс. и умирает до 30 тыс. человек.

Профилактическая вакцинация против желтой лихорадки лиц, направляющихся в эндемичные по данной инфекции страны, является единственным и самым надежным средством предупреждения заболевания. В соответствии с требованиями Международных медикосанитарных правил (2005 г.) лица, подвергшиеся вакцинации, получают Международное свидетельство о вакцинации или профилактике, которое действительно в течение десяти лет.

В субъектах Российской Федерации вакцинация против желтой лихорадки осуществляется в имеющих разрешение на проведение вакцинации кабинетах иммунопрофилактики (прививочных кабинетах).

Руководитель - Г.Г. Онищенко