Генетическая конструкция, кодирующая предшественник белка YB-1 человека, штамм Escherichia coli - продуцент предшественника белка YB-1 человека, способ микробиологического синтеза этого предшественника
GENETIC CONSTRUCT CODING HUMAN YB-1 PROTEIN PRECURSOR, ESCHERICHIA COLI STRAIN - PRODUCER OF HUMAN YB-1 PROTEIN PRECURSOR, METHOD FOR MICROBIOLOGICAL SYNTHESIS OF SAID PRECURSOR

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения предшественника белка YB-1 человека во фракции нерастворимых белков в клетках E. coli.
Болезнь Альцгеймера (БА) является одним из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний, которое поражает каждого четвертого человека старше 75 лет [Татарникова и др. 2015]. Актуальной проблемой остается поиск эффективных средств для лечения этого заболевания.
В качестве такого средства может выступать Y-бокс связывающий белок YB-1. Белок YB-1 представляет собой полифункциональное соединение, способное связываться со специальными сайтами на молекулах нуклеиновых кислот и белков [Скабкин и др.. 2004]. Интраназальное введение белка YB-1 предотвращает ухудшение пространственной памяти, вызванное удалением обонятельных луковиц у мышей (такие бульбоэктамированные мыши являются одной из моделей БА) [Bobkova, et al, 2015, RU 2561050]. В этой связи белок YB-1 представляет собой перспективную основу для разработок лекарственных средств для лечения БА.
Известен способ получения белка YB-1 человека в виде зрелого растворимого белка в клетках E. coli [RU 2561050]. К его недостаткам относят потенциальную гетерогенность синтезируемого белка, вызванную особенностями процесса его созревания, недостаточно высокий уровень его экспрессии, затрудненную очистку и склонность растворимого белка YB-1 к деградации под действием протеиназ клеточного лизата на первой стадии очистки.
В то же время известен способ получения целевого белка с использованием интеин-содержащего предшественника. Использование температуро-чувствительного варианта IntMUT интеина PRP8 Penicillium chrysogenum обеспечивает накопление предшественника целевого белка во фракции нерастворимых клеточных белков и его автокаталитический процессинг с образованием целевого белка [RU 2619217].
Задачей настоящего изобретения является разработка способа микробиологического синтеза предшественника белка YB-1 человека.
Задача решена путем:
- разработки генетической конструкции, имеющей последовательность SEQ ID N1 и кодирующей предшественник белка YB-1 человека, содержащий в своем составе последовательность декстран-связывающего домена GBD-7 глюкансукразы штамма NRRL B512-F, последовательность температуро-чувствительного мутантного варианта IntMUT интеина PRP8 Penicillium chrysogenum и последовательность зрелого белка YB-1 человека;
- получения штамма Escherichia coli ECR-proYB-1 - продуцента предшественника белка YB-1 человека путем введения генетической конструкции, имеющей последовательность SEQ ID N1, в клетки реципиентного штамма Escherichia coli ВКПМ В-10189;
- разработки способа микробиологического синтеза предшественника белка YB-1 человека путем культивирования штамма Escherichia coli ECR-proYB-1 в подходящих условиях в присутствии индуктора изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) или лактозы.
Для осуществления заявляемого изобретения:
- в состав предшественника белка YB-1 человека вводят последовательность самоотрезаемого температуро-чувствительного мутантного варианта IntMUT интеина PRP8 P. chrysogenum [RU 2619217], далее именуемого интеином Int4bPRO, обеспечивающего «нерастворимую экспрессию предшественников целевых белков» и их последующий автокаталитический процессинг;
- в состав предшественника белка YB-1 человека дополнительно вводят последовательность декстран-связывающего домена GBD-7 глюкансукразы штамма NRRL B512-F [Suwannarangsee et al. 2007; Пручковский с соавт. 2018], далее именуемого белком DBD, снижающего растворимость белков-предшественников, в том числе предшественника белка YB-1 человека.
Способ получения предшественника белка YB-1 человека в общем виде
С использованием методов генетической инженерии получают заявляемую генетическую конструкцию, имеющую последовательность SEQ ID N1, кодирующую предшественник белка YB-1 человека.
Конструируют заявляемый штамм Е. coli ECR-proYB-1, в клетки которого путем трансформации вводят генетическую конструкцию, кодирующую предшественник белка YB-1 человека.
Разрабатывают способ культивирования заявляемого штамма, обеспечивающий эффективный биосинтез и накопление предшественника белка YB-1 человека во фракции нерастворимых клеточных белков.
Для этого посевной материал клеток заявляемого штамма засевают и культивируют при температуре 37°С в питательной среде, включающей источники углерода, азота и минеральные соли, обычно используемые для выращивания клеток E. coli [Маниатис и др., 1984]. Культивирование осуществляют в колбах или в биореакторах (ферментерах). Индукцию синтеза целевого гибридного белка осуществляют путем внесения в среду культивирования индуктора. В качестве индуктора используют изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) в концентрации от 0,1 до 2 мМ или лактозу в концентрации от 0,5% до 3%. Индуктор вносят на стадии роста культуры, предшествующей стационарной фазе роста. Индукцию осуществляют на протяжении не менее 1 ч. В результате клетки штамма-продуцента накапливают предшественник белка YB-1 человека в количестве до 40% от суммарного белка клеток.
Примеры
Пример 1. Получение вспомогательной плазмиды pUC18m-His10-GFP
С целью получения вспомогательной плазмиды проводят ПЦР-амплификацию гена GFP. Матрицей для амплификации служит плазмида pEGFP (Clontech). Для амплификации используют праймеры:
pGFP-dir (5'-tataccatggaaaagagatctcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatggatccggtaccgtgagcaagggcgaggag) и
pGFP-rev (5'-ggtgctcgagcggccgctttacttgtacagctcgtccatg)
Амплифицированный фрагмент ДНК очищают из геля, используя с этой целью набор Qiagen (Qiagen, cat. №28706) и после открывания концов с использованием рестриктаз NcoI и XhoI клонируют в лабораторном векторе pUC19mx, производном стандартного вектора pUC19, содержащем модифицированную последовательность полилинкера в окружении сайтов узнавания рестриктаз NcoI и XhoI.
В результате клонирования получают вспомогательную плазмиду pUC19mx-His10-GFP. В составе этой плазмиды клонированный фрагмент ДНК заключает структурный ген GFP прецизионно слитый с 5'-концевой последовательностью ДНК, кодирующей 10 остатков гистидина и находящейся в окружении сайтов узнавания рестриктаз BglII и BamHI (см. структуру праймера pGFP-dir).
Вспомогательную плазмиду pUC19mx-His10-GFP используют для клонирования других фрагментов ДНК.
Пример 2. Клонирование фрагмента ДНК, кодирующего белок DBD
Фрагмент ДНК, кодирующий белок DBD, амплифицируют с использованием ПЦР. Матрицей для ПЦР служит ДНК плазмиды pDBD-1 (получают от В.Г. Лунина, Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи, г. Москва). Одновременно в ходе амплификации осуществляют сайт-направленный мутагенез амплифицируемой последовательности ДНК с целью инактивации внутреннего уникального сайта узнавания рестриктазы BamHI.
С этой целью реакции амплификации осуществляют в 2 этапа.
На первом этапе получают 2 фрагмента ДНК, имеющих перекрывающиеся концы:
Фрагмент 1 получают, используя праймеры N1236 (5'-tttagatctacaaatcagtattatcaat) и N1235 (5'-gttagtatctgggtccacaatgatagcatct);
Фрагмент 2 получают, используя праймеры N1234 (5'-gacccagatactaacttgagtt) и N1237 (5'-tttctcgagttaggatcctctggcgccaga).
Амплифицированные фрагменты ДНК очищают из геля, используя набор Qiagen (Qiagen, cat. №28706).
На следующем этапе проводят ПЦР-опосредованное лигирование очищенных фрагментов ДНК. Матрицей для ПЦР служит смесь фрагментов 1 и 2. Для амплификации матрицы используют праймеры N1236 и N1237. Амплифицированный фрагмент ДНК элюируют из агарозного геля и после открывания концов с использованием рестриктаз BglII и XhoI клонируют в плазмиде pUC19mx-His10-GFP (Пример 1), расщепленной по сайтам BamHI и XhoI. В результате клонирования получают плазмиду pUC19mx-His10-DBD, заключающую в своем составе фрагмент ДНК, кодирующий белок DBD, содержащий на N-конце 10 остатков гистидина.
Плазмиду pUC19mx-His10-DBD используют для клонирования фрагмента ДНК, кодирующего интеин Int4bPRO.
Пример 3. Получение плазмиды pUC19mx-His10-DBD-Int4bPRO
Фрагмент ДНК, кодирующий мутантный вариант интеина Int4bPRO амплифицируют с использованием ПЦР. Матрицей для амплификации служит плазмида pET28b_(His)x10_IntMUT [RU 2619217]. Для амплификации используют праймеры:
pINT-dir (5'-tcatagatctgctctcgccaaggggacccgt) и
ctcgag
ggatcc
pINT-revl (5'-tttttaactgttgtgcaggacaaggta)
Амплифицированный фрагмент ДНК очищают из геля и после открывания концов с использованием рестриктаз BglII и XhoI клонируют в плазмиде pUC19mx-His10-DBD (Пример 2), расщепленной по сайтам BamHI и XhoI. В результате клонирования получают плазмиду pUC19mx-His10-DBD-Int4bPRO, заключающую в своем составе фрагмент ДНК, кодирующий гибридный белок DBD-Int4bPRO, содержащий на N-конце 10 остатков гистидина.
Плазмиду pUC19mx-His10-DBD-Int4bPRO используют для клонирования фрагмента ДНК, кодирующего целевой белок YB-1 человека.
Пример 4. Конструирование плазмиды для экспрессии предшественника белка YB-1 человека
Конструирование плазмиды для экспрессии предшественника белка YB-1 человека проводят с использованием ПЦР. Реакции амплификации осуществляют в 2 этапа. На первом этапе получают 2 фрагмента ДНК, имеющих перекрывающиеся концы:
Фрагмент 1, кодирующий гибридный белок His10-DBD-Int4bPRO, амплифицируют с использованием в качестве матрицы ДНК плазмиды pUC19mx-His10-DBD-Int4bPRO. Для амплификации используют стандартный праймер "direct" для плазмид серии pUC и pINT-rev2 (5'-gttgtgcaggacaaggta), отжигающийся на 3'-конец гена Int4bPRO.
Фрагмент 2, кодирующий безметиониновый вариант белка YB-1 человека, амплифицируют, используя в качестве матрицы ДНК плазмиды pET-3-1-YB-1 (получают от Л.П. Овчинникова, Институт белка РАН, г. Пущино). Для амплификации используют праймеры pYB1-dir (5'-taccttgtcctgcacaactctagtgaagccgaaaccc), отжигающийся на 5'-конец структурного гена YB-1, и pYB1-rev (5'-ctcgagtcattactctgcaccgccttgtt), отжигающийся на 3'-конец структурного гена YB-1. Амплифицируемый фрагмент ДНК кодирует безметиониновый вариант белка YB-1 человека;
Амплифицированные фрагменты ДНК очищают из геля, используя набор Qiagen (Qiagen, cat. №28706).
На следующем этапе проводят ПЦР-опосредованное лигирование очищенных фрагментов ДНК. Матрицей для ПЦР служит смесь фрагментов 1 и 2. Для амплификации матрицы используют праймеры "direct" и pYB1-rev.
Амплифицированный фрагмент ДНК кодирующий белок His10-DBD-Int4bPRO-YB1, называемый proYB-1, элюируют из агарозного геля и после открывания концов с использованием рестриктаз NcoI и XhoI клонируют в плазмиде pET28b+ [Novagen], расщепленной по сайтам NcoI и XhoI.
В результате клонирования получают плазмиду pET28-proYB-1, в составе которой структурный ген, кодирующий предшественник белка YB-1 человека, находится под контролем мощного промотора, узнаваемого РНК-полимеразой фага Т7.
Полученную плазмиду используют для экспрессии предшественника белка YB-1 человека в клетках E. coli.
Пример 5. Получение заявляемого штамма
2
Заявляемый штамм получают путем трансформации реципиентного штамма E. coli BL21(DE3) (Novagen) - ВКПМ В-10189. Трансформацию осуществляют путем введения в клетки реципиентного штамма плазмиды pET28-proYB-1 с применением реактива CaCl [Маниатис с соавт., 1984]. Колонии трансформированного штамма отбирают на селективной среде, содержащей антибиотик канамицин. В результате трансформации получают заявляемый штамм ECR-proYB-1.
Клетки заявляемого штамма E. coli ECR-proYB-1 содержат экспрессионную плазмиду pET28-proYB-1 и в ответ на внесение в среду культивирования индуктора ИПТГ или лактозы осуществляют биосинтез предшественника белка YB-1 человека.
Пример 6. Биосинтез предшественника белка YB-1 человека
Биосинтез предшественника белка YB-1 человека осуществляют следующим образом. Сначала получают посевную культуру. Для этого одну колонию заявляемого штамма засевают в пробирку, содержащую 3 мл среды YTS следующего состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 1, триптон бакто - 2, NaCl - 1, канамицин - 0,003, вода - остальное. Посевную культуру заявляемого штамма выращивают на роторной качалке со скоростью 250 об/мин в течение 18 часов при температуре 37°С.
На втором этапе посевную культуру переносят в среду для индукции. С этой целью 0,5 мл посевной культуры переносят в колбу, содержащую 50 мл среды TRB следующего состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 2,4; триптон бакто - 1,2; одномолярный фосфатный буфер (рН7) - 10; одномолярный раствор сульфата магния - 0,2; лактоза - 0,5; глицерин - 0,5; канамицин - 0,009; вода - остальное. Культивирование в среде для индукции продолжают в течение 20 часов в тех же условиях.
В результате проведенного выращивания получают биомассу клеток заявляемого штамма. Согласно результатам анализа, выполненного методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, содержание предшественника белка YB-1 человека в полученной биомассе составляет до 40% относительно суммарного белка клеток.
В тех же условиях контрольный процесс, осуществляемый по способу, приведенному в RU 2561050, обеспечивает получение зрелого белка YB-1 человека в количестве около 15% относительно суммарного белка клеток.
Таким образом, с учетом доли целевого белка YB-1 человека составляющей 50% от молекулярного веса предшественника, заявляемое изобретение обеспечивает получение до 20% целевого белка относительно суммарного белка клеток, что сравнимо с показателем контрольного процесса по способу RU 2561050.
Вследствие того, что последовательность природного белка YB-1 человека содержит два остатка серина, следующими непосредственно за N-концевым метионином [RU 2561050], в клетках E. coli он может подвергаться удалению N-концевого метионина и ацетилированию открывающегося остатка серина [Flinta, et al, 1986], что способно приводить к образованию гетерогенной смеси белков, имеющих разное время жизни [Nguyen et al. 2018] и специфическую активность [Van Doren et al. 2008]. Поскольку клетки E.coli характеризуются нестабильным уровнем ацетилирования [Flinta et al. 1986, Schmidt et al. 2016, Willy et al. 2008], процесс биосинтеза белка YB-1 по способу RU 2561050 может приводить к получению препаратов, отличающихся уровнем ацетилирования, а следовательно, - непостоянством биологических характеристик.
В тоже время заявляемое изобретение обеспечивает получение предшественника белка YB-1 человека для его последующего прецизионного процессинга с образованием зрелого белка YB-1 in vitro, и в этой связи не подвергающегося ацетилированию и, как следствие, обладающего структурной гомогенностью и постоянными биологическими характеристиками, соответствующими требованиям, предъявляемым к белкам медицинского назначения.
Список литературы
Bobkova, N.V., Lyabin, D.N., Medvinskaya, N.I., Samokhin, A.N., Nekrasov, P.V., Nesterova, I.V., Aleksandrova, I.Y., Tatarnikova, O.G., Bobylev, A.G., Vikhlyantsev. I.M., Kukharsky, M.S., Ustyugov, A.A., Polyakov, D.N., Eliseeva, I.A., Kretov, D.A., Guryanov, S.G., and Ovchinnikov, L.P. (2015) "The Y-Box Binding Protein 1 Suppresses Alzheimer's Disease Progression in Two Animal Modes". PLoS One. 10(9):e0138867
Flinta, C., Persson, B.„Jornval, H., and von Htijnee, G. (1986) "Sequence determinants of cytosolic N-terminal protein processing" Eur. J. Biochem. 154, 193-196
Nguyen, K.T., Mun, S-H., Lee, C-S., and Hwang, C-S. (2018) "Control of protein degradation by N-terminal acetylation and the N-end rule pathway" Experimental & Molecular Medicine 50:91
Suwannarangsee, S., Moulis, C,, Potocki-Veronese, G., Monsan, P., Remaud-Simeonb, M., and Chulalaksananukul, W.(2007) "Search for a dextransucrase minimal motif involved in dextran binding" FEBS Lett.; 581(24):4675-80.
Schmidt, A., Kochanowski'K.,., Vedelaa, S.,  E., Volkmer, В., Callipo, L., Knoops, K., Bauer, M., Aebersold, R., and Heinemann, M. (2016) "The quantitative and condition dependent Escherichia coli proteome" Nat Biotechnol. 34(1): 104-110.
Van Doren, S.R., Wei, S., Gao, G., DaGue, B.B., Palmier, M.O., Bahudhanapati, H., and Brew, K. (2008) "Inactivation of N-TIMP-1 by N-terminal Acetylation when Expressed in Bacteria" Biopolymers. 89(11): 960-968.
Willy, V.. (2015) "Proteome-wide analysis of the amino terminal status of Escherichia coli proteins at the steady-state and upon deformylation inhibition" Proteomics 2015, 15, 2503-2518
Скабкин. M.А., Скабкина, О.В., Овчинников Л.П. (2004) «Мультифункциональные белки с доменом холодового шока в регуляции экспрессии генов» Успехи биологической химии. 44: 3-52.
Татарникова, О.Г., Орлов М.А., Бобкова, Н.В. (2015)« Бета-амилоид и тау-белок: структура, взаимодействие и прионоподобные свойства». Усп. Биол. хим. 55: 351-390.
RU 2561050. Медвинская Н.И., Овчинников Л.П., Самохин А.Н., Бобкова Н.В., Александрова И.Ю., Некрасов П.В., Гурьянов С.Г., Елисеева И.А., Нестерова И.В. "Применение белка YB-1 и его фрагментов для изготовления лекарственных средств при лечении болезни альцгеймера
--->
Перечень последовательностей
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» (НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика)
<120> Генетическая конструкция, кодирующая предшественник белка YB-1 человека, штамм Escherichia coli - продуцент предшественника белка YB-1 человека,способ микробиологического синтеза этого предшественника
<160> 1
<210> 1
<211> 1956
<212> DNA
<213> Artificial sequence encoding precursor of human protein YB-1
<220>
<221> CDS
<222> (4)…(1947)
<223> Sequence encodes recombinant phospholipase A2 of Streptomyces violaceoruber strain 2917
<221> misc_feature
<222> (2)…(7)
<223> Sequence encodes site for endonuclease NcoI
<221> misc_feature
<222> (4)…(54)
<223> Sequence encodes His-tag
<221> misc_feature
<222> (55)…(459)
<223> Sequence encodes protein DBD
<221> misc_feature
<222> (460)…(504)
<223> Sequence encodes linker peptide
<221> misc_feature
<222> (505)…(975)
<223> Sequence encodes mutant intein int4bPRO
<221> misc_feature
<222> (976)…(1947)
<223> Sequence encodes mature human protein YB-1
<221> misc_feature
<222> (1948)…(1953)
<223> Sequence encodes site for endonuclease XhoI
<400> 1
ACC ATG GAA AAG AGA TCT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT            48
Met Glu Lys Arg Ser His His His His His His His His His His
1               5                  10                  15
GGA TCT ACA AAT CAG TAT TAT CAA TTA GCA GAT GGT AAA TAT ATG TTG            96
Gly Ser Thr Asn Gln Tyr Tyr Gln Leu Ala Asp Gly Lys Tyr Met Leu
20                  25                  30
TTA GAT GAT AGT GGT CGT GCG AAA ACA GGG TTT GTA TTG CAA GAT GGT           144
Leu Asp Asp Ser Gly Arg Ala Lys Thr Gly Phe Val Leu Gln Asp Gly
35                  40                  45
GTA CTA AGA TAC TTC GAT CAA AAC GGT GAG CAA GTG AAA GAT GCT ATC           192
Val Leu Arg Tyr Phe Asp Gln Asn Gly Glu Gln Val Lys Asp Ala Ile
50                  55                  60
ATT GTG GAC CCA GAT ACT AAC TTG AGT TAT TAT TTC AAT GCA ACA CAA           240
Ile Val Asp Pro Asp Thr Asn Leu Ser Tyr Tyr Phe Asn Ala Thr Gln
65                  70                  75
GGT GTC GCT GTA AAA AAT GAT TAT TTC GAG TAT CAA GGT AAT TGG TAT           288
Gly Val Ala Val Lys Asn Asp Tyr Phe Glu Tyr Gln Gly Asn Trp Tyr
80                  85                  90                  95
TTA ACA GAT GCT AAT TAT CAA CTT ATC AAA GGT TTT AAA GCA GTT GAC           336
Leu Thr Asp Ala Asn Tyr Gln Leu Ile Lys Gly Phe Lys Ala Val Asp
100                 105                 110
GAC AGC TTA CAA CAT TTT GAT GAA GTC ACT GGT GTA CAA ACA AAA GAT           384
Asp Ser Leu Gln His Phe Asp Glu Val Thr Gly Val Gln Thr Lys Asp
115                 120                 125
AGT GCT TTA ATA AGT GCT CAG GGT AAG GTT TAC CAA TTT GAT AAT AAT           432
Ser Ala Leu Ile Ser Ala Gln Gly Lys Val Tyr Gln Phe Asp Asn Asn
130                 135                 140
GGA AAT GCT GTG TCA GCA AGA TCC CCG GGT TCT GGC TCC GGC TCT GGT           480
Gly Asn Ala Val Ser Ala Arg Ser Pro Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
145                 150                 155
TCC GGT TCT GGC GCC AGA GGA TCT GCT CTC GCC AAG GGG ACC CGT CTC           528
Ser Gly Ser Gly Ala Arg Gly Ser Ala Leu Ala Lys Gly Thr Arg Leu
160                 165                 170                 175
TTG CGA TAC GAT GGA ACC GAG ATC AAT GTG GAA GAC GTG CGC GAA GGT           576
Leu Arg Tyr Asp Gly Thr Glu Ile Asn Val Glu Asp Val Arg Glu Gly
180                 185                 190
GAC CTA CTT CTG GGT CCC GAT GGA GAG CCT CGC CGT GCA TTC AAC ATA           624
Asp Leu Leu Leu Gly Pro Asp Gly Glu Pro Arg Arg Ala Phe Asn Ile
195                 200                 205
GTG AAT GGC ATC GAC CGC CTG TAC CGC ATC AAG ATC GGC GGT GAG AAA           672
Val Asn Gly Ile Asp Arg Leu Tyr Arg Ile Lys Ile Gly Gly Glu Lys
210                 215                 220
GAG GAC CTT GTG GTG ACG CCG AAC CAT ATT CTG GTG CTT TAT AGA GAG           720
Glu Asp Leu Val Val Thr Pro Asn His Ile Leu Val Leu Tyr Arg Glu
225                 230                 235
GAT GGT TCC AAG AAT GTG GAG AAG CAA ACG GTG GAG ATC ACT GCT GCC           768
Asp Gly Ser Lys Asn Val Glu Lys Gln Thr Val Glu Ile Thr Ala Ala
240                 245                 250                 255
GAG TTT GCC GCG CCT TCT ACC GAG GAA AGA AGC CTC TAT AGT GCC TTT           816
Glu Phe Ala Ala Pro Ser Thr Glu Glu Arg Ser Leu Tyr Ser Ala Phe
260                 265                 270
ACA TCT CCT AGG GCT GAG AAG GGC GCC GAT GAT TCG GCT CAA ACG CAC           864
Thr Ser Pro Arg Ala Glu Lys Gly Ala Asp Asp Ser Ala Gln Thr His
275                 280                 285
AGT TTC AAG ATT GAG CAA GTT AGC CTC GAA TCC GAG AAG ACA GAG TGG           912
Ser Phe Lys Ile Glu Gln Val Ser Leu Glu Ser Glu Lys Thr Glu Trp
290                 295                 300
GCT GGT TTC CGA GTC GAC AAA GAT CAG CTT TAC CTG CGT CAT GAC TAC           960
Ala Gly Phe Arg Val Asp Lys Asp Gln Leu Tyr Leu Arg His Asp Tyr
305                 310                 315
CTT GTC CTG CAC AAC TCT AGT GAA GCC GAA ACC CAA CAG CCA CCG GCT          1008
Leu Val Leu His Asn Ser Ser Glu Ala Glu Thr Gln Gln Pro Pro Ala
320                 325                 330                 335
GCA CCG CCA GCA GCA CCA GCA CTG TCT GCT GCG GAT ACC AAA CCG GGT          1056
Ala Pro Pro Ala Ala Pro Ala Leu Ser Ala Ala Asp Thr Lys Pro Gly
340                 345                 350
ACG ACT GGC TCT GGT GCA GGC AGT GGT GGT CCG GGT GGC CTG ACC AGC          1104
Thr Thr Gly Ser Gly Ala Gly Ser Gly Gly Pro Gly Gly Leu Thr Ser
355                 360                 365
GCT GCG CCT GCC GGC GGT GAC AAG AAA GTG ATT GCG ACC AAA GTT CTG          1152
Ala Ala Pro Ala Gly Gly Asp Lys Lys Val Ile Ala Thr Lys Val Leu
370                 375                 380
GGC ACC GTG AAG TGG TTC AAT GTG CGC AAC GGC TAT GGT TTC ATC AAC          1200
Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Val Arg Asn Gly Tyr Gly Phe Ile Asn
385                 390                 395
CGT AAT GAT ACC AAG GAA GAT GTG TTT GTT CAT CAG ACT GCG ATC AAA          1248
Arg Asn Asp Thr Lys Glu Asp Val Phe Val His Gln Thr Ala Ile Lys
400                 405                 410                 415
AAG AAC AAT CCG CGC AAA TAC TTA CGT AGC GTA GGT GAT GGT GAA ACC          1296
Lys Asn Asn Pro Arg Lys Tyr Leu Arg Ser Val Gly Asp Gly Glu Thr
420                 425                 430
GTG GAG TTT GAC GTG GTT GAA GGC GAG AAA GGT GCG GAA GCA GCG AAT          1344
Val Glu Phe Asp Val Val Glu Gly Glu Lys Gly Ala Glu Ala Ala Asn
435                 440                 445
GTG ACT GGT CCT GGT GGC GTT CCG GTG CAA GGC AGC AAG TAT GCT GCC          1392
Val Thr Gly Pro Gly Gly Val Pro Val Gln Gly Ser Lys Tyr Ala Ala
450                 455                 460
GAT CGT AAC CAC TAC CGT CGC TAT CCA CGT CGT CGC GGT CCT CCG CGC          1440
Asp Arg Asn His Tyr Arg Arg Tyr Pro Arg Arg Arg Gly Pro Pro Arg
465                 470                 475
AAC TAC CAA CAG AAC TAT CAG AAT AGT GAA TCT GGT GAG AAG AAC GAA          1488
Asn Tyr Gln Gln Asn Tyr Gln Asn Ser Glu Ser Gly Glu Lys Asn Glu
480                 485                 490                 495
GGC AGT GAG AGT GCT CCG GAA GGC CAG GCG CAG CAA CGC CGT CCG TAT          1536
Gly Ser Glu Ser Ala Pro Glu Gly Gln Ala Gln Gln Arg Arg Pro Tyr
500                 505                 510
CGC CGT CGC CGC TTC CCA CCG TAC TAT ATG CGT CGT CCG TAT GGT CGT          1584
Arg Arg Arg Arg Phe Pro Pro Tyr Tyr Met Arg Arg Pro Tyr Gly Arg
515                 520                 525
CGT CCG CAG TAT AGC AAC CCA CCG GTT CAG GGT GAA GTG ATG GAA GGT          1632
Arg Pro Gln Tyr Ser Asn Pro Pro Val Gln Gly Glu Val Met Glu Gly
530                 535                 540
GCG GAT AAC CAA GGT GCA GGT GAA CAA GGT CGT CCA GTT CGT CAG AAT          1680
Ala Asp Asn Gln Gly Ala Gly Glu Gln Gly Arg Pro Val Arg Gln Asn
545                 550                 555
ATG TAT CGT GGA TAC CGT CCG CGC TTT CGC CGT GGC CCT CCA CGC CAG          1728
Met Tyr Arg Gly Tyr Arg Pro Arg Phe Arg Arg Gly Pro Pro Arg Gln
560                 565                 570                 575
CGT CAA CCG CGT GAA GAT GGC AAT GAG GAA GAC AAA GAG AAC CAG GGC          1776
Arg Gln Pro Arg Glu Asp Gly Asn Glu Glu Asp Lys Glu Asn Gln Gly
580                 585                 590
GAT GAA ACC CAA GGT CAG CAA CCA CCG CAA CGT CGC TAT CGC CGC AAC          1824
Asp Glu Thr Gln Gly Gln Gln Pro Pro Gln Arg Arg Tyr Arg Arg Asn
595                 600                 605
TTC AAC TAT CGT CGC CGT CGT CCA GAG AAT CCG AAA CCT CAG GAT GGC          1872
Phe Asn Tyr Arg Arg Arg Arg Pro Glu Asn Pro Lys Pro Gln Asp Gly
610                 615                 620
AAA GAG ACC AAA GCA GCT GAC CCA CCA GCG GAG AAT AGC TCT GCT CCG          1920
Lys Glu Thr Lys Ala Ala Asp Pro Pro Ala Glu Asn Ser Ser Ala Pro
625                 630                 635
GAA GCG GAA CAA GGC GGT GCA GAG TAA TGA CTC GAG                          1956
Glu Ala Glu Gln Gly Gly Ala Glu ***
640                 645
<---