Конструирование антигенного полимерного хеликобактерного диагностикума

низацию генов чумного диагностического бактериофага JI-413C. Показано, что он относится к таксономической группе Р2, в отличие от всех остальных известных чумных фагов (Покровской, д'Эрел-ля, фА1122 и др.), которые входят в семейство Ро-doviridae, морфотип С1, группу Т7 [1, 12, 14]. Нами установлен рекомбинантный характер ряда генов, связанных с интеграцией, эксцизией генома и строением хвостового отростка Л-413С. Горизонтальная передача центральной области гена Я, определяющего структуру дистальной части хвостового отростка, от Тб-подобного фага является наиболее вероятной причиной уникальной специфичности Л-41 ЗС по отношению к возбудителю чумы.

Полная последовательность ДНК фага Л-413С депонирована в международных базах данных National Center of Biological Information (NCBI, США) и GenBank под номерами NC_004745 и gi:30065704 соответственно.

Работа выполнена при поддержке Департамента энергетики США (контракт W7405-Eng-48).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бобров А.Г., Кириллина O.A., Филиппов A.A. и др. // Пробл. особо опасных инф. - 1999. - Вып. 79. - С. 138-144. -2. Имамалиев О.Г., Серебрякова В.Г., Анисимова Т.И. и др. // Стандарты, штаммы и методы контроля бактерийных и вирусных препаратов. - М., 1986. - С. 102-106. - 3. Ларина B.C., Анисимов П.И., Адамов А.К. // Пробл. особо опасных инф. -1970. - Вып. 11. - С. 132-136. - 4. Ларина B.C., Коннов Н.П. // Генет. и биохим. особо опасных инф. - Саратов, 1980. - С. 21-24. - 5. Ларина B.C., Розанова Г.Н., Тимофеева Л.А. и др. // Пробл. особо опасных инф. - 1973. - Вып. 30. - С. 97-99.-6. Лешкович Н.Л., Арутюнов Ю.И., Токарев Ю.И., Кирдеев

В.К. // Журн. микробиол. - 1975. - № 10. - С. 31-34. - 7. Ново-

сельцев H.H., Арутюнов Ю.И., Токарев С.А. и др. // Там же. -197). - № 3. - С. 16-19. - 8. Новосельцев H.H., Марченков

B.И. // Там же. - 1990. - №' 11. - С. 9-12. - 9. Новосельцев H.H., Марченков В.И., Арутюнов Ю.И. // Там же. - 1994. - № б. -

C. 9-10. - 10. Пак Г.Ю., Сатыбалдиев H.A., Баканурская Т.Л. и др. // Там же. - 1985. - № 8. - С. 33-36. - 11. Плотников О.П., Коннов Н.П., Гольдфарб Л.М. // Вопр. генет., мол. биол. и микробиол. чумы и холеры. - Саратов, 1985. - С. 53-58. -12. Ackermann H.W. // Arch. Virol. - 2001. - Vol. 146. - P. 843-857. - 13. Altschul S.F., Gish W., Miller W. et al. // J. Mol. Biol. -1990. - Vol. 215. - P. 403-410. - 14. Garcia E., Elüott J.M., Ra-manculov E. et al. II J. Bacteriol. - 2003. - Vol. 185. - P. 5248-5262. - IS. Gordon D., Abajian C., Green P. // Genome Res. -1998. - Vol. 8. - P. 195-202. - 16. Haggärd-Ljungquist E., Halling

C., Calendar R.//J. Bacteriol.-1992.-Vol. 174.-P. 1462-1477.

A.A.Filippov, J.M.Elliott, A.G.Bobrov, O.A.Kirillina, V.L.Motin, P.S.Chain, E.Garsia, V.V.Kutyrev

Description of the Genomic Nucleotide Sequence of the Plague Diagnostic Bacteriophage, L-413C

Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe", Saratov, Russia; University of California, Livermore, USA

We have succeeded in sequencing the complete genome and in determining the genetic organization of L-413C bacteriophage genome, which is most specific for Yersinia pestis cells. The phage genome presented itself as a linear DNA molecule, 30725 n.p. in size, containing 52.1% G+C pairs and encoding 39 open reading frames (ORS). L-413C was shown to be a homolog of Escherichia coli P2 phage sharing 32 genes (of 39 ones determined) as well as terminal direct DNA repeats, 19- n.p. long. The functions of thirty-one L-413C genes were studied on the basis of the similarity of DNA and the presumed polypeptide products with known coliphages. The high specificity of this phage to the plague agent was likely to be associated with the caudal extention of H protein recombinant in its character: it manifests relatedness to analogous polypeptides of P2 and T6 coliphages.

riocTyniuia 15.07.05.

ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОДИАГНОСТИКА

УДК 616-07

Е.А.Березняк, Г.Л.Карбышев, А.Н.Терентьев, В.Н.Некляев, А.Н.Наркевич

КОНСТРУИРОВАНИЕ АНТИГЕННОГО ПОЛИМЕРНОГО ХЕЛИКОБАКТЕРНОГО ДИАГНОСТИКУМА

Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт

В работе обобщены результаты по подбору условий получения диагностикума хеликобактерного антигенного полимерного для реакции агломерации. Проведена оценка его специфичности и чувствительности. Результаты проведенного исследования позволяют заключить, что сконструированный диагностикум является эффективным средством верифицирования хеликобактерной инфекции, которое можно использовать для проведения популяционно-эпидемиологических исследований.

Спиралевидной формы бактерия, получившая название Helicobacter pylori, впервые выделена из биоптата слизистой оболочки желудка больного с антральным гастритом в 1983 г. Б.Маршаллом и Д.Уорреном.

Доказана роль Н. pylori в патогенезе гастрита, дуоденита, язвенной болезни желудка и двенадцати-

перстной кишки, лимфомы и рака желудка [1,4].

Примерно 60 % населения земного шара инфицировано Н. pylori [3]. В развивающихся странах инфекция встречается в более раннем возрасте и более часто, чем в развитых, уже к 20-летнему возрасту инфицированность населения Н. pylori может достигать 90 %. В развитых странах этот показатель

не превышает 30-50 % и достигается к гораздо более позднему возрасту [4]. Инфицированность взрослого, населения России, по результатам выборочных исследований, колеблется от 50 до 80 %, а в некоторых регионах она приближается к 100 % [2].

Поскольку Н. pylori играет существенную роль в патогенезе заболеваний гастродуоденальной области, 1 диагностике хеликобактер-ассоциированных поражений уделяется существенное внимание. Подобного рода диагностика осуществляется с помощью различных методов исследования, позволяющих прямым или косвенным образом подтвердить присутствие возбудителя в слизистой оболочке желудка и (или) двенадцатиперстной кишки.

В настоящее время для определения Н. pylori используются многочисленные инвазивные и неинвазивные методы исследования [3, 6]. Вопрос об оптимальном сочетании различных методов для достоверного выявления Н. pylori продолжает обсуждаться [5].

Поскольку хеликобактерная инфекция является хронической и вызывает системный:, иммунный ответ, в сыворотке крови больных выявляются антитела классов IgM, IgG и IgA, направленные против различных бактериальных антигенов [8, 13]. Серологический метод является самым простым, наименее дорогим и наиболее доступным. Во многих странах серологическое исследование используют в качестве метода, предваряющего эндоскопию, стоимость проведения которой достаточно высока. Показано,; что у пациентов моложе 45 лет в серологических тестах в 93-100 % случаев отрицательный результат подтверждается эндоскопическим анализом [12]. Этот метод является незаменимым и наиболее информативным для выяснения инфицированное™ микроорганизмом при проведении крупных эпидемиологических исследований [4].

В настоящее время основным методом серологической диагностики является иммуноферментный анализ. Однако этот метод относительно дорогой, требует специального оборудования и обученного персонала. Целью настоящего исследования явилась разработка хеликобактерного антигенного полимерного дйагностикума для реакции объемной агломерации (РАО).

, Материалы и методы

I-

В [работе использован референтный штамм

Н. pylori NCTC 11637, обладающий типичными морфологическими и биохимическими свойствами.

Исходную культуру высевали на элективную питательную среду СЭХ (среда элективная хеликобактерная), разработанную в Ростовском НИПЧИ, pH 7,6, | и помещали в микроаэрофильные условия (5 % кислорода, 10 % углекислого газа, 85 % азота) при 37 |°С на 3-5 сут. Через 72 ч типичные по морфологии колонии диаметром от 0,5 до 2,5 мм идентифицировали по культуральным и биохимическим признакам.

Выращенную бактериальную массу использовали для приготовления клеточного лизата в качестве сенситина. К суспензии бактериальной массы добавляли 1 % раствор натрия дезоксихолата из расчета 0,5 мл раствора на 2,0 мл суспензии с кон-

центрацйей (5-7)-Ю10 м.к./мл, суспензию перемешивали на магнитной мешалке в термостате при 40 °С в течение 2 ч; затем проводили ультразвуковую дезинтеграцию (5 циклов по 30 с). После перемешивания нелизированные обломки клеток осаждали центрифугированием при 8000 об./мин в течение 40 мин. Супернатант использовали в качестве растворимого хеликобактерного антигена.

Растворимый антиген характеризовали по концентрации белка, которую определяли по методу Лоури. Качественную характеристику белков осуществляли в системе диск-электрофореза по методу Laemmly. [11]. Для оценки иммунногенных свойств сенситина применяли метод Western Blot [14]. Полученный сенситин иммобилизировали на полимерный носитель.

В качестве носителя сенситина использовали сферические полимерные частицы диаметром

1,5 мкм,||Содержащие 1,ЗмМ/г альдегидных групп. Носитель получен анионной полимеризацией акролеина в ¡водно-щелочной среде. Окрашивание частиц производили добавлением красителя в полиме-ризационную смесь в процессе синтеза.

Лиофилизацию диагностикума хеликобактерного антигенного полимерного для РАО осуществляли в 3!|% желатозно-сахарозной среде высушивания с предварительным замораживанием в парах жидкого; азота. Лиофилизацию диагностикума проводили в течение 23 ч в азотном лиофилизаторе.

При|; получении хеликобактерной кроличьей сыворотки использовали убитую кипячением в течение 30 мин бактериальную массу штамма Н. pylori NCTCj 11637. Для иммунизации кроликов применяли модифицированную схему с предварительным введением иммуномодулятора Т-активина. Полученные серии сывороток использовали для контроля чувствительности диагностикума.

Результаты и обсуждение

Экспериментально показано, что комбинированное разрушение бактериальных клеток ультразвуком и1дезоксихолатом натрия приводило к существенному увеличению выхода белка. В полученных препаратах сенситинов концентрация белка варьировала от 1,5 до 2,0 мг/мл. Наиболее эффективно сенсибилизация латексных микросфер лизатом осуществлялась при использовании 0,1 М карбонатного буферного раствора, pH 9,2.

Исследование белкового спектра растворимого хеликобактерного антигена методом диск-электро-фореза в полиакриамидном геле в присутствии 0,1 % додецил сульфата натрия (SDS) показало, что комбинированный метод разрушения клетки приводит к получению пула белков.

На рисунке показаны белковые спектры, характеризующие штамм Helicobacter pylori (В), лизат (С) и супернатант (D), полученный после иммобилизации 'растворимого хеликобактерного антигена на полимерный носитель (А - маркеры молекулярных масс). Из рисунка видно, что белки, присутствующие в бакмассе, представлены, в той или иной степени, в растворимом хеликобактерном антигене. Колонка ;D, характеризующая супернатант, демон-стрирует!|наличие отдельных полос в областях раз-

94

68

43

17.5

12.5

Электрофоретические профили белков Helicobacter pylori в нативной бактериальной массе, лизате и в супернатанте после посадки растворимого хеликобактерного антигена на полимерный носитель:

А - маркеры молекулярных масс; В - бактериальная масса;

С - лизат; D - супернатант после растворимого хеликобактерного антигена посадки на носитель

личных молекулярных масс.

Молекулярные массы белков, присутствующих в растворимом антигене, в целом соответствуют молекулярным массам белков, наиболее часто рассматриваемых в качестве основных антигенов Helicobacter pylori - CagA (125-130 kDa), VacA (87 kDa), флагеллины (FlaA - 56 kDa, FlaB -57 kDa), HspB (54 kDa), HspA (13 kDa), уреаза (30 kDa) [7, 9].

Полученные результаты показывают, что белки, молекулярная масса которых составляла, предположительно, 130, 115 и 100 kDa частично перешли в растворимый антиген, тогда как в супернатанте они отсутствуют. В иммуноблоте показана их иммуногенность. Поскольку иммунная кроличья сыворотка (ИКС) с ними реагировала, а нормальная кроличья сыворотка (НКС) не реагировала, можно говорить о их специфической иммунной активности. То же самое относится к линии в области 85 kDa, которая прослеживается в растворимом антигене и практически отсутствует в супернатанте.

Мажорная линия в области 66 kDa прослеживается в бакмассе и в растворимом антигене, в супернатанте она выражена весьма слабо. В области 54 kDa наблюдается двойная полоса. Верхняя линия из этой полосы хорошо представлена в супернатанте. Иммуноблот показал, что она является неспецифической, так как реагирует и с ИКС, и с НКС. Нижняя полоса, отсутствующая в супернатанте, -специфическая. Специфическими являются антигены с молекулярной массой 35, 33 и 30 kDa. Белки с молекулярной массой 13, 20 kDa являются неспе-

ш ш

1—И

wm

їШШ

А в С Е

цифическими, они присутствуют в супернатанте, и можно полагать, что на поверхности микросфер они представлены в незначительных количествах.

Таким образом, полученный диагностикум содержит на поверхности полимерных микросфер следующие иммуногенные антигенные детерминанты: 130, 115, 100, 85, 54, 35, 33, 30 и 18 kDa.

Полученная нами антигенная характеристика сенситина, в целом, согласуется с имеющимися в литературе данными об основных антигенах Helicobacter pylori [7, 9]. Это позволило полагать, что сконструированный диагностикум является адекватным и эффективным инструментом для определения иммунного ответа организма на наличие хе-ликобактерной инфекции. Для проверки этого предположения нами был проведен сравнительный анализ специфичности и чувствительности полученного диагностикума.

Поскольку у пациентов, страдающих хроническими заболеваниями, вызванными такими возбудителями, как Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter jejuni, Haemophilus influenzae, продуцируются антитела против широкого диапазона антигенов, включая антигены, общие для многих бактерий [10], нами в качестве контрольных гетерологичных сывороток были отобраны гипериммунные сыворотки против возбудителей, ассоциированных с группой кишечных инфекций: лептоспирозная групповая, поливалентная эшерихиозная, сальмонеллезная, ши-геллезная, псевдотуберкулезная, кампилобактери-озная, холерная эльтор, кишечно-иерсиниозная поливалентная, листериозная.

Было установлено, что только с кампилобак-терной сывороткой имела место перекрестная реакция в разведен™ 1:40. Все остальные сыворотки перекрестов не давали.

Используемые для контроля чувствительности диагностикума кроличьи иммунные сыворотки в объемной реакции агглютинации (РА) давали титры 1:640-1:1280.

Экспериментальное изучение чувствительности диагностикума хеликобактерного антигенного полимерного проводили на четырех сериях гипериммун-ных сывороток, полученных в Ростовском НИПЧИ, и трех сериях диагностикума. Показано, что контрольная хеликобактерная кроличья сыворотка в РАО давала положительную реакцию в разведении не менее чем 1:640. После лиофильного высушивания активность диагностикума не менялась.  .

Таким образом, в результате проведенного исследования получен диагностикум хеликобактерный антигенный полимерный сухой для выявления специфических антител в сыворотках крови больных.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аруин Л.И. // Совр. пробл. физиол. и патол. пищеварения. - М., 1999. - С. 33-37. - 2. Григорьев П.Я., Яковенко Э.П. // Рос. гастроэнтерол. журн. - 1999. -№ 4. - С. 92-98. - 3. Кишкун А. А. // Клин. лаб. диагн. - 2002. - № 8. -

С. 41-46. - 4. Кожанова М.Г. // Клин. лаб. диагн. - 1999. -№11. - С. 52-55. - 5. Логинов А.С., Ильченко А. А., Мукамолова Г.Ф. и др. // Рос. гастроэнтерол. журн. - 1998. -№ 3. - С. 3-11. - 6. Минаев В.И., Несвижский Ю.В., Воробьев А. А. и др. // Матер. 6-й сес. Рос. группы по изучению Helicobacter pylori. - Омск, 1997. - С. 10—18. - 7. Allan

E., Dorrell N., Foynes S. et al. II J. Bacteriol. - 2000. -Vol. 182, N 18. - P. 5274-5277. - 8. Andersen L.P., Espersen

F., Souckova A. et.al. II Clin. Diagn. Lab. Immunol.. - 1995. -Vol. 2, N 2. - P. 156-159. - 9. Aucher P., Petit M.L., Man-nant P.R|. et al. II J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol. 36, N 4. -P. 931-936. - 10. Johansen H.K., Norgaard A., Andersen L.P. et al) II Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 1995. - Vol. 2, N 2. -P. 149-155. - 11. Laemmli U. // Nature. - 1970. - Vol. 222. -P. 293-298. - 12. Laheij R.J.F., Staatman H., Jansen J.B. et al. И J. Clin. Microbiol. - 1998. — Vol. 36, N 10. - P. 2803. -13.,Mattsson A., Tinnert A., Hamlet A. et al. ll Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 1998. - Vol. 5, N 3. - P. 288-293. -14.Towbin H., Stacytlin Т., Gordon J.//Proc. Natl. Accad.

Sci. USA. - 1979. - Vol. 76, N 9. - P. 4350-4354.

УДК 616.24-002-022:616.9

Iі ...

Г.Л.Карбышев, А.Н.Терентьев, Л.М.Веркина, А.Н.Наркевич, Е.В.Безуглова,

И.Р.Симонова, А.П.Кочет|кова

КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРЕПАРАТА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА Сообщение 1. Конструирование и экспериментальные испытания легионеллезного серогруппы 1 антигенного полимерного диагностикума

Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт

В работе представлены результаты исследований по конструированию диагностикума легионеллезного серогруппы 1 полимерного для реакции объемной агломерации.|| Описаны условия получения диагностикума. Представлены результаты экспериментального определения ч>^твительности и специфичности, разработанного диагностикума. Полученные результаты позволяют рекомендовать диагностикум к. практическому использо-

ях заболевания - до 10-го дня [10, 11, 12, 13].

Целью настоящего исследования явилось конструирование полимерного антигенного легионеллезного диагностикума на основе антигенов Legionella prieumophila серогруппы 1 для реакции объемной агломерации (РАО).

Материалы и методы

Для конструирования антигенного диагностического препарата использовали штамм Legionella pneumophila Philadelphia серогруппы 1 штамм 15976, типичный по' культуральным, морфологическим, серологическим, биохимическим свойствам.

Для культивирования микроорганизмов применяли элективную питательную среду (СЭЛ) для выделения й| культивирования возбудителя легионеллеза, разработанную сотрудниками института и рекомендованную в практику при посеве L. pneumophila Philadelphia на питательные среды. Наблюдали рост легионелл в виде синевато-сероватых плоско-выпуклых'; колоний диаметром 1,5-2 мм. В проходящем свете колонии имели зеленоватый оттенок с влажно-волокнистой микроструктурой.

Полимерные микросферы диаметром (2+0,5) мкмоль/г получали методом анионной полимеризации акрилового альдегида в водно-щелочной среде. Окрашенные частицы получали добавлением красителя в полимеризационную смесь в процессе синтеза. Выход полимерного носителя составил 75 %, содержание альдегидных групп - 1,3 ммоль/г.

Растворимый легионеллезный антиген полу-

ванию в учреждениях здравоохранения страны.

i ' ‘

I

Болезни легионеров - острое лихорадочное заболевание, вызываемое группой микроорганизмов, относящихся к семейству Legionellaceae ведущее значение среди которых играет Legionella pneumophila серогруппы 1, с воздушно-KanejibHbiM механизмом передачи и поражением верхних дыхательных путей в случае непневмонической формы -респираторной лихорадки Понтиак и нижних дыхательных путей - в случае пневмонической формы заболевания [2].

Впервые на территории нашей страны легионеллез зарегистрирован в 1979 г. [4, 5], а в последующем! отмечены спорадические и отдельные групповые вспышки заболеваний [1, 3, 6, 7]. Однако в целом 'это заболевание продолжает оставаться малоизвестным в нашей стране. Сложности бактериологической диагностики, отсутствие коммерческих тест-систем для серологической диагностики и трудности клинической диагностики заболевания делают проблему легионеллеза в настоящее время малодоступной для практического здравоохранения. В то же[ время наиболее доступным для практиче-скЬго здравоохранения являются серологические методы диагностики.

В настоящее время для серологической диагностики легионеллеза в мире используют три метода: реакцию^ непрямой иммунофлюоресценции, имму-ноферментный анализ и реакцию агломерации латекса [9]. Ранее в литературе было описано, что реакция латексной агломерации является более чувствительной, чем реакция непрямой иммунофлюоресценции, и выявляет диагностические титры на ранних стади-

E.A.Bereznyak, G.L.Karbyshev, A.N.Terentiev, V.N.Neklyaev, A.N.Narkevich

I Construction

of a Helicobacterial Antigenic Polymer Diagnosticum Preparation-

Rostov-on-Don Anti-Plague Research Institute

Summarized in the.paper are the results of the efforts to optimize the combination of conditions for the production of helicobacterial antigenic polymer diagnosticum for agglomeration reactions. The evidence thus obtained makes impossible to conclude that the diagnosticum is an efficient tool to verify the helicobacterial infection which can be used in populational epidemiologic investigations.

1 Поступила 05.07.05.