ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ИНДУКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ВИРУСА ЭБОЛА
IMMUNOBIOLOGICAL AGENT AND METHOD FOR USE THEREOF TO INDUCE SPECIFIC IMMUNITY AGAINST EBOLA VIRUS

Область техники
Изобретение относится к иммунологии и вирусологии и может быть использовано в качестве специфического профилактического средства против заболеваний, вызванных вирусом Эбола.
Предшествующий уровень техники
Геморрагическая лихорадка Эбола в настоящий момент является одним из самых опасных заболеваний, смертность от которого достигает 90%. Возбудителем данного заболевания является вирус Эбола (Ebolavirus), который относится к семейству филовирусов. С момента обнаружения данного вируса в 1976 году он стал причиной нескольких серьезных эпидемий в Западной Африке, последняя из которых в 2014 году унесла жизни более 4000 людей. Поэтому разработка вакцин против геморрагической лихорадки Эбола является актуальной задачей современного здравоохранения.
Известно решение согласно патенту WO 2012050193, в котором предполагается использование липосом, включающих в себя белковые антигены вируса Эбола.
Изобретение согласно патенту СА 2768801 предусматривает использование вирусоподобных частиц, которые представляют собой белки вируса Эбола, экспрессированные в клетках млекопитающих и самопроизвольно собирающиеся в вирусоподобные структуры.
Известно решение согласно патенту US 2013323243, где предусматривается использование гибридного белка, часть из которого представлена антигеном - гликопротеином вируса Эбола, а вторая часть сегментом иммуноглобулина. Данный гибридный белок может вводиться самостоятельно, либо ген данного белка может быть вставлен в вирусный вектор.
Известно решение согласно патенту US 20100047282 А1, где в качестве вакцины против геморрагической лихорадки Эбола используют рекомбинантный аденовирус, содержащий ген гликопротеина вируса Эбола (GP). Данное решение основывается на том, что при попадании в организм аденовирусный вектор проникает в клетки, где начинается экспрессия вирусного антигена. Это приводит к индукции иммунного ответа, направленного против вирусного антигена и экспрессирующих его клеток.
Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по составу действующего вещества и способу его использования выбрано авторами заявляемого изобретения за прототип. В связи с тем, что на дату национального приоритета заявки US 20100047282 А1 2 августа 2004 года ничего не было известно о штамме вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056, так как впервые данный возбудитель выделен и охарактеризован в июле 2014 года, нуклеотидная последовательность его генов не могла быть использована для конструирования рекомбинантных аденовирусных частиц. Соответственно, заявители не имели возможности создать аденовирусную конструкцию с охарактеризованными культурально-морфологическими свойствами, уровнем экспрессии, иммуногенными свойствами. Это является существенным недостатком этой конструкции, так как не позволяет использовать ее для получения специфического иммунитета к вирусу Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056.
Раскрытие настоящего изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание иммунобиологического средства для эффективной индукции иммунного ответа против вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID КМ233056.
Поставленная задача решается за счет того, что разработано иммунобиологическое средство, включающее рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, содержащий экспрессирующую кассету со вставкой гена GP вируса Эбола, при этом в качестве гена GP вируса Эбола используют ген GP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056 с модифицированной нуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, и дополнительно включающее рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, содержащий экспрессирующую кассету со вставкой гена NP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056 SEQ ID NO: 5 с обеспечением усиления иммуногенных свойств разработанного средства. Иммунобиологическое средство дополнительно включает гиалуронидазу. Разработан также способ использования иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола путем введения этого иммунобиологического средства в эффективном количестве.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлена нуклеотидная последовательность GP №1, которая представляет собой последовательность гена GP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056, модифицированную путем замены редких кодонов на более часто встречающиеся у человека.
На фиг. 2 представлена нуклеотидная последовательность GP№2, которая представляет собой последовательность гена GP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056, модифицированную путем добавления аденина в 887 положение.
На фиг. 3 представлена нуклеотидная последовательность GP №3, которая представляет собой последовательность гена GP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056, модифицированную путем добавления аденина в 887 положение и замены кодона GAG на кодон GAC.
На фиг. 4 представлена нуклеотидная последовательность GP №4, которая представляет собой последовательность гена GP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056, модифицированную путем добавления аденина в 887 положение и замены 2 кодонов AAA на кодоны AAG.
На фиг. 5 представлена немодифицированная нуклеотидная последовательность гена NP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056.
На фиг. 6 представлена немодифицированная нуклеотидная последовательность GP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056.
На фиг. 7 представлены результаты определения экспрессии белков GP и NP в клетках HEK293 после добавления к ним рекомбинантных аденовирусов (Ad-GP №1, Ad-GP №2, Ad-GP №3, Ad-GP №4 и Ad-NP соответственно).
С 1 по 7 трек представлены данные по экспрессии белка GP, где
1 - лизат клеток, к которым добавляли фосфатно-солевой буфер,
2 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-null,
3 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-wt,
4 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-GP №1,
5 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-GP №2,
6 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-GP №3,
7 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-GP №4.
С 8 по 10 трек представлены данные по экспрессии белка NP, где
8 - лизат клеток, к которым добавляли фосфатно-солевой буфер,
9 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-null,
10 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-NP.
На фиг. 8 представлены результаты лимфопролиферативного анализа.
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс - различные группы животных, которым вводили:
1. фосфатный буфер (100 мкл)
8
2. Ad-null 2·10 БОЕ/мышь
8
8
3. Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №1 10 БОЕ/мышь
8
8
4. Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №2 10 БОЕ/мышь
8
8
5. Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №3, 10 БОЕ/мышь
8
8
6. Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №4 10 БОЕ/мышь
На фиг. 9 представлены результаты анализа способности гиалуронидазы увеличивать способность аденовирусов проникать в клетки млекопитающих.
Ось ординат - люминесценция, кванты/секунду.
Ось абсцисс - различные группы животных, которым вводили:
7
1. Ad-luc (рекомбинантный аденовирус, содержащий ген люциферазы) 10 БОЕ/мышь
7
2. Ad-luc (рекомбинантный аденовирус, содержащий ген люциферазы) 10 БОЕ/мышь и гиалуронидазу 10 МЕ/мышь
7
3. Ad-luc (рекомбинантный аденовирус, содержащий ген люциферазы) 10 БОЕ/мышь и гиалуронидазу 25 МЕ/мышь
7
4. Ad-luc (рекомбинантный аденовирус, содержащий ген люциферазы) 10 БОЕ/мышь и гиалуронидазу 50 МЕ/мышь
5. Гиалуронидаза 10 МЕ/мышь
6. Гиалуронидаза 25 МЕ/мышь
7. Гиалуронидаза 50 МЕ/мышь
8. Интактные животные
Реализация изобретения
Из литературных данных известно, что наиболее перспективными вакцинными антигенами вируса Эбола являются гликопротеин GP, который является поверхностным белком вириона, и ядерный белок NP. Использование обоих антигенов одновременно позволит добиться более комплексного иммунного ответа и обеспечить протективный эффект против большего количества штаммов вируса Эбола.
Настоящее изобретение представляет собой композицию, состоящую из рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа, содержащего ген гликопротеина (GP) вируса Эбола, и рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа, содержащего ген ядерного белка (NP) вируса Эбола, взятых в эффективном соотношении. При этом в качестве гена GP была использована модифицированная последовательность, выбранная как один из 4 вариантов: GP №1 (фиг. 1), GP №2 (фиг. 2), GP №3 (фиг. 3), GP №4 (фиг. 4).
В качестве гена NP была использована немодифицированная последовательность гена NP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056 (фиг. 5).
1 доза разработанного иммуностимулирующего средства включает:
7
9
Рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, который содержит ген белка NP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056 - 10 до 10 бляшкообразующих единиц (БОЕ);
7
9
Рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, который содержит модифицированную последовательность гена GP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056, выбранную из GP №1, GP №2, GP №3, GP №4 - 10 до 10 бляшкообразующих единиц (БОЕ);
Буфер, обеспечивающий жизнеспособность рекомбинантных аденовирусов и безопасный для введения млекопитающим.
Для улучшения проникновения рекомбинантных аденовирусов в клетки млекопитающих, в состав композиции включен фермент гиалуронидаза, который расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав межклеточного вещества.
Пример 1
Получение рекомбинантных аденовирусов, содержащих гены антигенов вируса Эбола - ядерного белка NP и гликопротеина GP
Разработанное иммунобиологическое средство представляет собой композицию, состоящую из рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа, содержащего ген гликопротеина (GP) вируса Эбола, и рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа, содержащего ген (NP) вируса Эбола, взятых в эффективном соотношении. При этом в качестве гена GP была использована модифицированная последовательность, выбранная как один из 4 вариантов: GP №1 (фиг. 1), GP №2 (фиг. 2), GP №3 (фиг. 3), GP №4 (фиг. 4).
Последовательность GP №1 была получена из последовательности гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056 путем частичных замен кодонов, которые редко встречаются в генах человека, на кодоны, которые встречаются наиболее часто. Данные по частоте использования кодонов у различных организмов общедоступны (например, ресурс www.kazusa.or.jp). Использование оптимизированной таким образом нуклеотидной последовательности в конечном итоге приведет к усилению экспрессии целевого гена в клетках человека.
Последовательность GP №2 была получена из последовательности гена GP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056 путем добавления аденина в 887 положение. Известно (J. Lee, Ε. Saphire. Ebolavirus glycoprotein structure and mechanism of entry. Future Virol., 2009; 4(6), с. 621-635), что в гене GP в этом месте образуется шпилька и L-полимераза вируса Эбола останавливается, при этом образуется «короткая» секретируемая форма GP. Однако с вероятностью 20% L-полимераза делает в этом месте ошибку, вставляя дополнительный нуклеотид, в результате чего сдвигается рамка считывания и образуется трансмембранный вариант GP, который считается наиболее иммуногенным антигеном вируса Эбола. Таким образом, если для конструирования рекомбинантного аденовируса использовать исходную последовательность гена GP, то в результате будет экспрессироваться «короткая», низкоиммуногенная форма белка; а если использовать модифицированную последовательность GP №2, то будет экспрессироваться трансмембранный высокоиммуногенный белок.
Последовательность GP №3 была получена из последовательности гена GP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056 путем добавления аденина в 887 положение, которое необходимо для экспрессии трансмембранного выскоиммуногенного белка. Кроме того, произведена замена кодона GAG, кодирующего глутаминовую кислоту, на кодон GAC, кодирующий аспарагиновую кислоту.
Данная замена приводит к уменьшению цитотоксичности данного белка in vitro при сохранении его иммуногенности.
Последовательность GP №4 была получена из последовательности гена GP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056 путем добавления аденина в 887 положение, которое необходимо для экспрессии трансмембранного выскоиммуногенного белка. Кроме того, произведена замена 2 кодонов AAA на кодоны AAG. Оба эти триплета кодируют одну аминокислоту - лизин. Однако благодаря данной замене в этом месте нуклеотидной последовательности не образуется шпилька, что в конечном итоге приводит к увеличению экспрессии данного белка в клетках млекопитающих.
В качестве гена NP была использована немодифицированная последовательность гена NP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056 (фиг. 5).
Было получено 6 плазмидных конструкций, несущих различные варианты гена GP и ген NP вируса Эбола: pShuttle-NP, pShuttle-GP №1, pShuttle-GP №2, pShuttle-GP №3, pShuttle-GP №4, pShuttle-GPwt (контроль, содержит немодифицированный ген GP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056 (фиг. 6)). Все последовательности антигенов вируса Эбола были химически синтезированы.
Полученные плазмидные векторы далее были использованы для получения плазмидных конструкций, несущих полноразмерные рекомбинантные геномы аденовирусов. Для этого плазмидные векторы с соответствующими экспрессионными кассетами, содержащими гены вируса Эбола (pShuttle-NP, pShuttle-GP №1, pShuttle-GP №2, pShuttle-GP №3, pShuttle-GP №4, pShuttle-GPwt), были обработаны эндонуклеазами Pacl и Bstll07I для извлечения экспрессионной кассеты с целью последующего лигирования с космидным вектором, содержащим полный геном рекомбинантного аденовируса. В качестве космидного вектора, несущего полный геном рекомбинантного аденовируса, была использована конструкция cAd5-EGFP, полученная нами ранее. Космида cAd5-EGFP также была обработана эндонуклеазами Pacl и Bstll07I. Продукты гидролиза лигировали. Полученную ДНК, содержащуюся в лигазной смеси, упаковывали в фаговые головки и ими трансдуцировали компетентные клетки DH5α. Трансформированные клетки отбирали на агаризованной среде LB с антибиотиком ампициллином. Плазмидную ДНК выделяли методом кипячения.
Таким образом, в результате были получены космидные конструкции, содержащие геном рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа с экспрессионными кассетами, в состав которых входит ген NP (космида cAd5-NP), ген GP №1 (космида cAd5-GP №1), GP №2 (космида cAd5 - GP №2), GP №3 (космида cAd5-GP №3), GP №4 (космида cAd5-GP №4).
На следующем этапе для получения мини-препаратов рекомбинантных аденовирусов плазмидные конструкции, несущие экспрессионные кассеты с генами вируса Эбола в составе полноразмерных рекомбинантных геномов аденовирусов, были гидролизованы эндонуклеазами рестрикции Pacl и Swal для удаления плазмидной части и трансфицированы в эукариотические клетки линии HEK293. Через 5 дней после трансфекции проводили слепые пассажи материала для размножения рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих гены вируса Эбола. В результате был получен «затравочный» материал, который затем был использован для накопления препаративных количеств рекомбинантных аденовирусов.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены рекомбинантные аденовирусы, экспрессирующие Ad-NP, Ad-GP №1, Ad-GP №2, Ad-GP №3, Ad-GP №4. По результатам проведенного исследования можно заключить, что выбранные варианты антигенов вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056, могут быть встроены в геном рекомбинантного аденовируса. При этом ни один из вариантов генов не проявил выраженной токсичности, что позволило получить полный комплект рекомбинантных аденовирусных векторов.
Пример 2
Проверка экспрессии белков NP и GP в клетках, трансфицированных Ad-NP, Ad-GP №1, Ad-GP №2, Ad-GP №3, Ad-GP №4.
Целью данного эксперимента являлась проверка возможности экспрессии антигенов вируса Эбола NP и GP с помощью сконструированных рекомбинантных аденовирусов. Эксперимент был проведен по следующей схеме.
2
2
Клетки HEK293 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в инкубаторе при температуре 37°С и 5% CO. Клетки помещали на 30 мм культуральные чашки Петри и инкубировали в течение суток до достижения 70% конфлюэнтности. Далее к клеткам добавляли исследуемые препараты аденовирусов (Ad-NP, Ad-GP №1, Ad-GP №2, Ad-GP №3, Ad-GP №4) и контрольные препараты аденовируса (Ad-null - рекомбинантый аденовирус, не содержащий вставок, Ad-GPwt - рекомбинантный аденовирус, содержащий неоптимизированную последовательность GP) из расчета 100 БОЕ/клетку или фосфатный буфер в качестве отрицательного контроля. Через сутки проверяли экспрессию антигенов вируса Эбола методом иммуноблотинга. Для этого был произведен отбор среды с клеток, клетки были промыты стерильным фосфатно-солевым буфером, а затем лизированы с помощью RIPA буфера (Pierce) по протоколу фирмы-производителя.
После лизиса клеток производили измерение концентрации тотального белка в пробах с помощью реактива Bradford (Sigma) согласно инструкции производителя. Аликвоту выровненных по содержания белка образцов смешивали с Laemmli Sample Buffer (Sigma) и инкубировали в течение 5 минут при 95°С.
Далее проводили электрофорез в денатурирующих условиях в 10% SDS-полиакриламидном геле SPRINT NEXT GEL 10% (Amresco) в NEXT GEL Running Buffer, 20X (Amresco) с помощью системы Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad) в течение 20 минут при 250V. После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану Trans-Blot Turbo™ Mini Nitrocellulose Transfer Packs (Bio-Rad) в буфере Tris-CAPS (Bio-Rad) с помощью системы для переноса Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad) в течение 15 минут при 25V. Затем проводили блокирование неспецифического сигнала. Для этого мембрану инкубировали в растворе 3% обезжиренного молока в фосфатно-солевом буфере с 0,05% Твин20 (ТФСБ) в течение часа при комнатной температуре. После этого мембрану инкубировали 16 часов при 4°C с антителами к белку GP или с антителами к белку NP в растворе 3% обезжиренного молока в ТФСБ. Далее проводили отмывку мембраны раствором ТФСБ и обрабатывали мембрану раствором вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, в растворе 3% обезжиренного молока в ТФСБ при 37°С на шейкере в течение 1 часа. Затем мембрану тщательно отмывали раствором ТФСБ. Дальнейшую детекцию проводили с помощью набора Clarity™ Western ECL Substrate (Bio-Rad) и проявляли на пленку Hyperfilm ECL™ (Amersham). По такому же протоколу проводили детекцию белка сравнения GAPDH с помощью антител Anti-GAPDH.
Результаты иммуноблотинга представлены на фиг. 7.
С 1 по 7 трек представлены данные по экспрессии белка GP, где
1 - лизат клеток, к которым добавляли фосфатно-солевой буфер,
2 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-null,
3 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-wt,
4 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-GP №1,
5 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-GP №2,
6 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-GP №3,
7 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-GP №4.
С 8 по 10 трек представлены данные по экспрессии белка NP, где
8 - лизат клеток, к которым добавляли фосфатно-солевой буфер,
9 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-null,
10 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-NP.
Как видно из полученных данных, в клетках, к которым добавляли Ad-NP, через 24 часа была детектирована экспрессия целевого белка NP. В клетках, трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами, содержащими как модифицированные и немодифицированный ген GP, наблюдалась экспрессия целевого белка GP. При этом в клетках, к которым добавляли рекомбинантные аденовирусы, которые содержат модифицированные гены GP, наблюдались более высокие уровни экспрессии, чем в клетках, трансдуцированных аденовирусом, экспрессирующим немодифицированный ген GP.
Пример 3
Определение титра антител к NP и GP после иммунизации животных рекомбинантными аденовирусами Ad-NP, Ad-GP №1, Ad-GP №2, Ad-GP №3, Ad-GP №4
Из литературных данных известно, что антитела играют важную роль в защите организма против вируса Эбола. На модели грызунов показано, что титр антител против антигенов вируса Эбола коррелирует с выживаемостью животных. Поэтому в данном эксперименте мы оценили титр антител против антигенов NP и GP вируса Эбола через 5 дней после двукратной иммунизации животных иммунобиологическим средством, включающим рекомбинантный аденовирус, содержащий модифицированный ген GP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056, выбранный один из 4 вариантов: GP №1, GP №2, GP №3, GP №4, и рекомбинантный аденовирус, содержащий ген NP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056.
В эксперименте использовались мыши линии Balb/c, самки 18 г. Все животные были разделены на 52 группы по 3 животных, которым внутримышечно вводили:
7
7
1) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №1 10 БОЕ/мышь
7
8
2) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №1 10 БОЕ/мышь
7
9
3) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №1 10 БОЕ/мышь
7
7
4) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №2 10 БОЕ/мышь
7
8
5) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №2 10 БОЕ/мышь
7
9
6) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №2 10 БОЕ/мышь
7
7
7) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №3 10 БОЕ/мышь
7
8
8) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №3 10 БОЕ/мышь
7
9
9) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №3 10 БОЕ/мышь
7
7
10) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №4 10 БОЕ/мышь
7
8
11) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №4 10 БОЕ/мышь
7
9
12) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №4 10 БОЕ/мышь
8
7
13) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №1 10 БОЕ/мышь
8
8
14) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №1 10 БОЕ/мышь
8
9
15) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №1 10 БОЕ/мышь
8
7
16) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №2 10 БОЕ/мышь
8
8
17) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №2 10 БОЕ/мышь
8
9
18) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №2 10 БОЕ/мышь
8
7
19) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №3 10 БОЕ/мышь
8
8
20) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №3 10 БОЕ/мышь
8
9
21) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №3 10 БОЕ/мышь
8
7
22) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №4 10 БОЕ/мышь
8
8
23) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №4 10 БОЕ/мышь
8
9
24) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №4 10 БОЕ/мышь
9
7
25) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №1 10 БОЕ/мышь
9
8
26) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №1 10 БОЕ/мышь
9
9
27) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №1 10 БОЕ/мышь
9
7
28) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №2 10 БОЕ/мышь
9
8
29) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №2 10 БОЕ/мышь
9
9
30) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №2 10 БОЕ/мышь
9
7
31) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №3 10 БОЕ/мышь
9
8
32) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №3 10 БОЕ/мышь
9
9
33) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №3 10БОЕ/мышь
9
7
34) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №4 10 БОЕ/мышь
9
8
35) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №4 10 БОЕ/мышь
9
9
36) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №4 10 БОЕ/мышь
7
37) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, фосфатно-солевой буфер
8
38) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, фосфатно-солевой буфер
9
39) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, фосфатно-солевой буфер
7
40) фосфатно-солевой буфер, Ad-GP №1 10 БОЕ/мышь
8
41) фосфатно-солевой буфер, Ad-GP №1 10 БОЕ/мышь
9
42) фосфатно-солевой буфер, Ad-GP №1 10 БОЕ/мышь
7
43) фосфатно-солевой буфер, Ad-GP №2 10 БОЕ/мышь
8
44) фосфатно-солевой буфер, Ad-GP №2 10 БОЕ/мышь
9
45) фосфатно-солевой буфер, Ad-GP №2 10 БОЕ/мышь
7
46) фосфатно-солевой буфер, Ad-GP №3 10 БОЕ/мышь
8
47) фосфатно-солевой буфер, Ad-GP №3 10 БОЕ/мышь
9
48) фосфатно-солевой буфер, Ad-GP №3 10 БОЕ/мышь
7
49) фосфатно-солевой буфер, Ad-GP №4 10 БОЕ/мышь
8
50) фосфатно-солевой буфер, Ad-GP №4 10 БОЕ/мышь
9
51) фосфатно-солевой буфер, Ad-GP №4 10 БОЕ/мышь
52) фосфатно-солевой буфер
Дозы рекомбинантных аденовирусов были выбраны исходя из имеющихся в литературе данных об использовании данных векторов для индукции иммунного ответа к различным патогенам (Шмаров М.М. и соавт. Исследование возможности индукции рекомбинантными аденовирусными векторами гетеросубтипического иммунного ответа против вируса гриппа А. Биопрепараты, 2011, 1 (41); Щербинин Д.Н. и соавт. Индукция иммунного ответа к bacillus anthracis при интраназальном введении рекомбинантного аденовируса, экспрессирующего протективный антиген, слитый с Fc-фрагментом антитела IGG2a. Acta Naturae, 2014, 1 (20), т. 6, с. 82-90, Kim E.H. et аl. Intranasal adenovirus-vectored vaccine for induction of long-lasting humoral immunity-mediated broad protection against influenza in mice. J Virol. 2014, 88(17), с. 9693-9703).
7
9
Таким образом, дозы рекомбинантных аденовирусов 10-10 БОЕ/дозу были выбраны как наиболее оптимальные для иммунизации животных, однако, как понятно специалисту среднего уровня, повышение дозы рекомбинантных аденовирусов будет приводить к увеличению иммунного ответа на целевые белки, вплоть до возникновения токсических эффектов.
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены, из которой затем получали сыворотку. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа.
Вначале определяли титр антител к белку GP. Образцы сыворотки разводили методом 2-кратных разведений, начиная с разведения 1:200. Всего было приготовлено 8 разведений каждого образца, которые по 50 мкл были добавлены в лунки планшета, с предварительно адсорбированным белком GP. Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
После инкубации проводилась промывка лунок, и далее были добавлены вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с биотином. После инкубации и промывки в лунки планшета был добавлен конъюгат стрептовидина и пероксидазы хрена. На заключительном этапе, после промывки лунок, был добавлен раствор ТМВ, который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм. Титр антител определяли как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Аналогичным образом определяли титр антител к белку NP в сыворотке крови мышей, иммунизированных иммунобиологическим средством. Полученные результаты представлены в таблице 2.
7
9
Как видно из результатов эксперимента, разработанное иммунобиологическое средство, включающее рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, содержащий ген GP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056 с модифицированной нуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 (фиг. 1, фиг. 2, фиг. 3, фиг. 4), и рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, содержащий экспрессирующую кассету со вставкой гена NP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056, SEQ ID NO: 5 (фиг. 5), где количество каждого из аденовирусов изменяется от 10 БОЕ/дозу до 10 БОЕ/дозу, эффективно стимулируют гуморальный иммунный ответ против антигенов вируса Эбола во всем диапазоне выбранных доз.
Пример 4
Определение доли пролиферирующих лимфоцитов у мышей после введения разработанного иммунобиологического средства
Лимфопролиферативный тест позволяет оценивать одно из ключевых свойств адаптивного иммунного ответа - способность клонов антиген-специфических лимфоцитов быстро пролиферировать и дифференцироваться в эффекторные клетки. Наиболее распространенной методикой для оценки лимфопролиферации является окраска клеток красителем CFSE. Конъюгат CFSE с белками, который образуется в меченых клетках, сохраняется этими клетками в течение всего развития, а также во время деления. Метка передается дочерним клеткам и никогда не переходит к соседним клеткам в популяции. CFSE позволяет отслеживать деление клеток, так как при делении концентрация метки в дочерних клетках снижается ровно в 2 раза и интенсивность флуоресценции соответственно тоже.
В эксперименте использовались мыши линии Balb/c. Все животные были разделены на шесть групп, которым внутримышечно вводили:
1) фосфатный буфер (100 мкл)
8
2) Ad-null 2·10 БОЕ/мышь
8
8
3) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №1 10 БОЕ/мышь
8
8
4) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №2 10БОЕ/мышь
8
8
5) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №3, 10 БОЕ/мышь
8
8
6) Ad-NP 10 БОЕ/мышь, Ad-GP №4 10 БОЕ/мышь
Дозы рекомбинантных аденовирусов, входящих в состав иммунобиологического средства, были выбраны на основании данных предыдущего эксперимента.
Через две недели после иммунизации у животных отбирали селезенку, из которой затем выделяли лимфоциты методом центрифугирования в градиенте фиколла-урографина. Затем выделенные клетки окрашивали CFSE по методике (Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester / Quah BJ, Warren HS, Parish CR Nat Protoc. 2007; 2(9), с.2049-2056) и анализировали методом проточной цитофлуориметрии. Полученные результаты представлены в виде гистограммы (фиг. 8).
Как видно из результатов эксперимента, разработанное иммунобиологическое средство, включающее рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, содержащий ген GP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056 с модифицированной нуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4. (фиг. 1, фиг. 2, фиг. 3, фиг. 4), и рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, содержащий экспрессирующую кассету со вставкой гена NP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1 GenBank ID KM233056, SEQ ID NO: 5 (фиг. 5), эффективно стимулируют пролиферацию лимфоцитов.
Пример 5
Определение эффективности использования ферментов для улучшения проникновения рекомбинантных аденовирусов в клетки млекопитающих in vivo
Целью данного эксперимента являлось определение возможности использования гиалуронидазы в составе разрабатываемого иммунобиологического средства для увеличения эффективности трансдукции клеток рекомбинантными аденовирусами. Данный фермент деполимеризует гиалуроновую кислоту, входящую в состав межклеточного вещества. В результате молекула гиалуроновой кислоты распадается на мелкие фрагменты, что вызывает утончение слоя геля межклеточного вещества и соответственно облегчает проникновение рекомбинантных аденовирусов непосредственно к клеткам-мишеням.
Для того чтобы проверить данную гипотезу, нами был использован рекомбинантный аденовирус Ad-luc, содержащий ген люциферазы. При введении рекомбинантного аденовируса Ad-luc в организм в тех клетках, куда он проникает, начинается экспрессия люциферазы. Продукцию фермента люциферазы в клетках легко детектировать по реакции со специфическим субстратом люциферином, которая сопровождается испусканием квантов света.
В эксперименте использовали лабораторных мышей линии BALB/c самок весом 18 г. Животные были разделены на 5 групп, которым внутримышечно вводили:
7
1) Ad-luc (рекомбинантный аденовирус, содержащий ген люциферазы) 10 БОЕ/мышь
7
2) Ad-luc (рекомбинантный аденовирус, содержащий ген люциферазы) 10 БОЕ/мышь и гиалуронидазу 10 МЕ/мышь
7
3) Ad-luc (рекомбинантный аденовирус, содержащий ген люциферазы) 10 БОЕ/мышь и гиалуронидазу 25 МЕ/мышь
7
4) Ad-luc (рекомбинантный аденовирус, содержащий ген люциферазы) 10 БОЕ/мышь и гиалуронидазу 50 МЕ/мышь
5) Гиалуронидаза 10 МЕ/мышь
6) Гиалуронидаза 25 МЕ/мышь
7) Гиалуронидаза 50 МЕ/мышь
8) Интактные животные
Дозы ферментов были выбраны исходя из их растворимости и максимального объема, который можно вводить внутримышечно мыши. Доза рекомбинантного аденовируса была выбрана как наименьшая из тех, которые предполагается использовать в разрабатываемом иммунобиологическом средстве. Через 24 часа, животных усыпляли и выделяли мышцу, в которую вводили препараты. Мышечную ткань гомогенизировали в лизирующем буфере, специально предназначенном для измерения активности люциферазы (Promega). Далее образцы центрифугировали 12000×g и отбирали в планшет по 100 мкл супернатанта. Люциферин (Е1602, Promega) разводили согласно инструкции производителя и добавляли по 100 мкл к каждому образцу. После этого оценивали люминесценцию с помощью планшетного спектрофотометра. Результаты представлены на фиг. 9.
Как видно из полученных данных, во всех группах, где использовали аденовирус совместно с гиалуронидазой, наблюдалась более высокая люминесценция, чем в группе, которой вводили только аденовирус. При этом экспрессия люциферазы наблюдалась в тканях животных, которым вводили Ad-luc совместно с гиалуронидазой в дозе 50 МЕ/мышь (в пересчете на дозу для человека это составляет 672 МЕ). В контрольных группах (№5, 6, 7) по сравнению с интактными животными отличий не было.
Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что гиалуронидаза в дозах по крайней мере до 672 МЕ/человека обеспечивает лучшее проникновение аденовируса в ткани и, следовательно, может быть использована для этих целей в составе разрабатываемого иммунобиологического препарата.
Пример 6
Предполагаемые лекарственные формы иммунобиологического средства
Из литературных данных известно, что иммунизация рекомбинантными аденовирусами, экспрессирующими различные целевые гены, эффективно работает при различных способах введения векторов: подкожном, внутримышечном, ингаляционном.
Фермент гиалуронидаза разрешен для применения человеку для коррекции различных патологических состояний, связанных с болезнями суставов, для улучшения всасывания радиоконтрастных веществ, местных анестетиков и др. для внутримышечного, подкожного и ингаляционного путей введения. Таким образом, разрабатываемое иммунобиологическое средство может использоваться для внутримышечного, подкожного и ингаляционного введения и может быть представлено в виде различных лекарственных форм: раствора для подкожного/внутримышечного введения, порошка или раствора для ингаляций, в виде лиофилизата.
Для получения раствора для подкожного/внутримышечного/ингаляционного введения смешивают аденовирус человека 5 серотипа, содержащий ген GP, аденовирус человека 5 серотипа, содержащий ген NP в эффективном соотношении и содержащий гиалуронидазу в 1-5 мл буферного раствора. В качестве буферного раствора может выступать любой раствор, не токсичный для человека и содержащий все необходимые компоненты, обеспечивающие жизнеспособность аденовирусного вектора и активность ферментов. Например, фосфатно-солевой буфер.
Лиофилизированную форму получают путем лиофильной сушки суспензии, содержащей аденовирус человека 5 серотипа, содержащий ген GP, аденовирус человека 5 серотипа, содержащий ген NP в эффективном соотношении и содержащий гиалуронидазу в 1-5 мл буферного раствора. В качестве буферного раствора может быть использован любой раствор, сохраняющий жизнеспособность аденовирусных частиц и активность ферментов после лиофильной сушки. Лиофилизированный препарат перед применением разводят стерильной дистиллированной водой до объема 1-5 мл (необходимо восстановить объем, который был перед лиофильной сушкой).
Иммунобиологическое средство может быть также представлено в виде двух растворов, находящихся в двух отдельных флаконах и смешивающихся непосредственно перед использованием. При этом в одном флаконе содержится аденовирус человека 5 серотипа, содержащий ген GP и аденовирус человека 5 серотипа, содержащий ген NP в эффективном соотношении в буферном растворе, а в другом флаконе содержится гиалуронидаза, а также компоненты буфера. Содержимое одного или обоих флаконов может быть также лиофильно высушено.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают выполнение поставленной задачи, а также промышленную применимость созданного изобретения.