СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ГИПОГЛИКЕМИЧЕСКОЙ И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
AGENT HAVING HYPOGLYCEMIC AND ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY

Изобретение относится к области фармации и может быть использовано в качестве средства растительного происхождения, обладающего высокой гипогликемической и противовоспалительной активностью.
Данный вид активности полученного средства планируется использовать для лечения и профилактики сахарного диабета II типа, так как данное заболевание представляет значительную угрозу здоровью, приводя к ранней инвалидизации и высокой летальности в относительно раннем возрасте [3]. Сахарный диабет является одним из социально значимых заболеваний и все еще остается актуальным как для медицинской науки, так и для здравоохранения практически всех стран мира [4].
В последнее время все большее внимание уделяется разработке экстракционных препаратов из растительного сырья вместо отваров и настоев, поскольку известно, что в экстракционных препаратах обеспечивается максимальный выход биологически активных веществ, повышается терапевтический эффект за счет точности дозировки лекарств, обеспечивается рациональность их использования, пролонгирования сроков и оптимизации условий хранения [5].
Предложенное средство содержит компоненты из растительного сырья, масс.ч.: корни и корневища лопуха большого 14,5-15,5; корни одуванчика лекарственного 10,5-11,5; корни и корневища девясила высокого 10,5-11,5; побеги фасоли обыкновенной 20,0-21,0; побеги черники обыкновенной 20,0-21,0 побеги пятилистника кустарникового 10,0-11,0 и листья крапивы двудомной 14,0-15,0 в виде сухого экстракта, получаемого путем экстракции 35-45% спиртом этиловым, выпаривания и сушки в вакуум-выпарительном шкафу, при этом соотношение растительное сырье: экстрагент составляет 1:(10-12). Экстракцию проводят трехкратно при нагревании до температуры 60°C в течение 2 часов, фильтрования, выпаривания и сушки в вакуум-выпарительном шкафу. При использовании лекарственного средства получены положительные результаты на опытах с животными.
Известны состав и лекарственные средства, получаемые из лекарственных растений, обладающих гипогликемической и противовоспалительной активностью:
1. Комплексное антидиабетическое растительное средство, содержащее: траву галеги лекарственной, листья крапивы двудомной, корень одуванчика, плоды шиповника, корень лопуха большого, морковь сушеная, фруктоза или сорбит. Средство снижает в крови уровень холестерина, мочевой кислоты и выделяет из организма соли щавелевой и мочевой кислот (пат. №2283659, 2006).
2. Известно антидиабетическое средство «САМСАР», обладающее общеукрепляющим тонизирующим действием, а также антианемической и противовоспалительной активностью. Предлагаемый сбор помимо листьев грецкого ореха и винограда культурного включает в свой состав листья земляники лесной, траву галеги лекарственной и цветка клевера лугового при определенном отношении компонентов (пат. №2114630, 1998).
Данные средства применяются в виде отвара, что является существенным недостатком, так, как данная форма не обеспечивает полноценное извлечение действующих веществ из растительного сырья. Недостатком указанных средств также являются: 1) узкая направленность действия, включающего только регулировку обменных процессов в организме; 2) отсутствие гипогликемического действия, необходимого антидиабетическому средству.
3. Обнаружен многокомпонентный сбор, обладающий антидиабетическим действием, который влючает: траву козлятника лекарственного (галеги), листья ореха грецкого, траву горца птичьего (спорыша), соцветия коровяка скипетровидного, корни одуванчика лекарственного, цветки липы сердцевидной, листья шелковицы белой, корни девясила высокого, листья брусники, створки плодов фасоли обыкновенной, листья барвинка малого, траву репешка аптечного в различных соотношениях (пат. №2430735, 2011).
В отличие от предлагаемого средства, данный сбор имеет ряд недостатков. Учитывая предполагаемый выпуск средства в фильтр-пакетах и применение его в виде фиточая, трудно оценить степень выхода действующих веществ при каждом приготовлении данной формы. Активность данного средства направлена преимущественно на снижение уровня сахара в крови.
4. Для лечения и профилактики сахарного диабета предложено применение известного средства по новому назначению, т.е. в качестве антидиабетического экстракта курильского чая кустарникового. Средство обладает выраженным гипогликемическим действием, оказывает выраженное защитное действие на инсулярный аппарат поджелудочной железы, обладает антиоксидантными свойствами, благоприятно влияет на липидный обмен и функциональное состояние печени и почек (пат. №2150952, 2000).
Однако предлагаемое новое фитосредство (в отличие от представленного выше) имеет ряд преимуществ: среднее содержание экстрактивных веществ, составляет 25,0% в отличие от известного ранее (20%).
Многокомпонентность нового полифитоэкстракта обеспечивает взаимное усиление полезных фармакологических свойств каждого входящего ингредиента. Комплексное действие предлагаемого средства направлено не только на гипогликемическое действие, но и на противовоспалительный эффект, что является необходимым в профилактике и лечении сахарного диабета и его осложнений.
В качестве препарата сравнения для изучения гипогликемической и панкреозащитной активности использован официнальный сбор «Арфазетин» состоящий из: побегов черники 20,0; створок плодов фасоли 20,0; корней аралии маньчжурской или корневищ с корнями заманихи 15,0; травы хвоща полевого 10,0; цветков ромашки аптечной 10,0; плодов шиповника 15,0; травы зверобоя 10,0. Содержимое одного пакета (10 г) помещают в эмалированную посуду, заливают 400 мл (2 стакана) горячей кипяченой воды, нагревают в кипящей воде (водяной бане) 15 минут, охлаждают при комнатной температуре не менее 45 минут, процеживают. Оставшееся сырье отжимают. Объем полученного настоя доводят кипяченой водой до 400 мл. Принимают настой внутрь за 30 минут до еды, лучше в теплом виде по 1/3-1/2 стакана 2-3 раза в день в течение 20-30 дней (регистрационное удостоверение 86/710/6). Данный состав имеет недостатки перед предложенным нами средством:
1. Получение его не позволяет получать продукт постоянного состава;
2. Менее выраженное гипогликемическое и противовоспалительное действие данного средства;
Целью данного изобретения является повышение выхода конечного продукта и расширение ассортимента лекарственных средств за счет использования распространенного растительного сырья, имеющего надежную и обеспеченную сырьевую базу, для повышения фармакотерапевтической эффективности при данном виде заболевания, отсутствии токсического влияния при его длительном использовании.
Поставленная цель достигается тем, что в средстве, обладающем гипогликемической и противовоспалительной активностью, содержащем компоненты из растительного сырья, в качестве последних используют (в мас.ч.): корни и корневища лопуха большого 14,5-15,5; корни одуванчика лекарственного 10,5-11,5; корни и корневища девясила высокого 10,5-11,5; побеги фасоли обыкновенной 20,0-21,0; побеги черники обыкновенной 20,0-21,0 побеги пятилистника кустарникового 10,0-11,0 и листья крапивы двудомной 14,0-15,0 в виде экстракта сухого, получаемого путем экстракции 35-45% спиртом этиловым. Экстракцию проводят трехкратно при нагревании до температуры 60°C в течение 2 часов, фильтрования, выпаривания и сушки в вакуум-выпарительном шкафу, при этом соотношение растительное сырье: экстрагент составляет 1:(10-12). Технология получения данного средства достаточно проста, без трудоемких затрат и позволяет получить эффективное лекарственное средство постоянного состава.
Для выявления оптимальных технологических режимов нами изучены основные факторы, влияющие на процесс экстрагирования растительного сырья: природа экстрагента, его соотношения с сырьем, температурный режим, степень измельчения, продолжительность и количество экстракций. Выбор оптимальных параметров контролировали по выходу экстрактивных веществ. Для подбора типа экстрагента изучены процессы экстракции сырья водой и спиртом этиловым различной концентрации: от 10 до 95%. Результаты анализа приведены в таблице 1.
Из данных таблицы 1 следует, что оптимальным является 40 и 45% спирт, при этом достигается максимальный выход суммы экстрактивных веществ и фенольных соединений.
Измельчение сырья проводили согласно требованиям ГФ XI изд. для каждого сырья в отдельности. Коэффициент поглощения экстрагента составляет 3, 4.
Измельченность сырья оказывает большое влияние на процесс экстракции. На основании полученных данных установлено, что оптимальным степенью измельчения сырья является 3 мм (в масс.ч.) (таблица 2).
Таблица 2
Выход суммы экстрактивных веществ и суммы полифенольных соединений в зависимости от размера частиц
Степень измельчения, мм
Выход суммы экстрактивных веществ, %
Выход суммы полифенольных соединений в пересчете на (+)-катехин, %
1
Не фильтруется
-
2
24,7
13,6
3
24,6
13,6
5
22,5
12,1
7
19,6
9,5
Уменьшение размера частиц приводит к затруднению процесса фильтрования, получению мутных извлечений. Увеличение размера частиц приводит к снижению выхода БАВ.
Также установлено, что увеличение температуры экстракции положительно влияет на эффективность процесса экстракции, увеличивая выход экстрактивных веществ и полифенольных соединений, сокращая время проведения экстракции (таблица 3).
Таблица 3
Выход экстрактивных веществ и суммы полифенольных соединений в зависимости от температуры экстракции
Температура экстракции, °C
Выход суммы экстрактивных веществ, %
Выход суммы полифенольных соединений в пересчете на (+)-катехин, %
20
15,7
9,7
40
21,3
10,5
50
22,5
11,2
60
24,5
12,7
70
245
13,6
80
24,6
13,4
Учитывая полученные данные экстракцию сырья предложено проводить при температуре 60°C. Дальнейшее нагревание экстракционной смеси нецелесообразно.
Также определено оптимальное соотношение фаз сырье - экстрагент, соответствующее 1:(10-12) Увеличение объема экстрагента неоправданно ввиду незначительного увеличения выхода экстрактивных веществ и полифенольных соединений (таблица 4).
С целью определения продолжительности и кратности экстракции установлено время достижения равновесной концентрации в системе сырье-экстрагент. Продолжительность настаивания и кратность экстракции определены по следующей методике:
В колбу вместимостью 150 мл загружали навеску сырья в количестве 10 г, заливали 10 кратным количеством 40% спирта этилового в соотношении и настаивали в течение 1 ч, затем нагревали на водяной бане при температуре (60±5)°C с обратным холодильником. Нагревание проводили 30 мин, 1 ч, 1,5 ч, 2 ч, 2,5 ч. По истечении времени извлечения охлаждали до комнатной температуры, фильтровали, определяли содержание суммы экстрактивных веществ и полифенольных соединений. Экстракцию повторяли трижды, заливая сырье новой порцией экстрагента в количестве, равном слитому извлечению. Полученные данные приведены в таблице 5.
Таблица 5
Выход экстрактивных веществ и суммы полифенольных соединений в зависимости от времени экстрагирования
Время экстракции
Выход экстрактивных веществ, %
Выход суммы полифенольных соединений в пересчете на (+)-катехин
I
II
III
I
II
III
30 мин
12,8
5,6
2,7
5,6
3,4
1,3
1 час
13,8
6,8
2,6
5,8
4,9
1,3
1,5 часа
13,7
6,6
2,7
6,6
5,4
1,6
2 часа
14,0
6,6
2,8
6,7
5,4
1,6
2,5 часа
14,2
6,2
3,0
6,6
5,5
1,7
3 часа
14,5
6,2
3,0
6,6
5,2
1,8
Полученные результаты свидетельствуют о том, что равновесное состояние при первом, втором, третьем контакте фаз достигается через 2 часа. При этом при первом контакте в извлечение переходит 60-65% экстрактивных веществ и полифенольных соединений, при втором - 20-25% и 8-10% при третьем контакте. Таким образом, трехкратная экстракция обеспечивает истощение сырья в среднем на 85-95%.
С целью ускорения экстракционного процесса, экстракцию сырья следует вести при постоянном перемешивании, т.к. при этом происходит обновление поверхности контактирующих фаз, что приводит к увеличению движущей силы процесса.
Определение выхода суммы экстрактивных веществ во всех указанных экспериментах проводили по следующей однотипной методике по ГФ XI издания «Определение экстрактивных веществ в растительном материале».
Методика эксперимента получения суммы экстрактивных веществ:
Измельченное воздушно-сухое лекарственное сырье 10,000 г (точная навеска) заливают 45% раствором этанола в соотношении сырье-экстрагент 1:10, равном 1:(10-15) с учетом коэффициента водопоглощения, экстрагируют на водяной бане при температуре 55-65°C при постоянном перемешивании в течение 2,5 часов. Процесс повторяют трижды. Извлечения объединяют, фильтруют через бумажный фильтр в сухую колбу, 25 мл фильтрата переносят в предварительно высушенную при температуре 100°C до постоянной массы в точно взвешенную фарфоровую чашку и выпаривают на водяной бане досуха. Чашку с остатком сушат при температуре 100-105°C до постоянной массы и взвешивают. Содержание экстрактивных веществ в процентах на абсолютно-сухое сырье вычисляют по формуле:
где M - масса сухого остатка, в г;
м - масса сырья, в г;
в - потеря в массе при высушивании.
Предложенное средство в своем составе содержит следующее растительное сырье: корни и корневища девясила высокого; побеги фасоли обыкновенной; побеги черники обыкновенной; побеги пятилистника кустарникового; листья крапивы двудомной; корни и корневища лопуха большого; корни одуванчика лекарственного.
Данные литературы позволили выявить следующие химические особенности данных лекарственных растений [1]:
Корневища и корни девясила высокого - Inula helenium L., сем. Астровые (Сложноцветные) - Asteraceae (Compositae) - содержат сесквитерпеноиды (до 5%, в их числе алантолактон, изоалантолактон, дигидроалантолактон, дигидроизоалантолактон), моно- и тритерпеноиды, фитостерины, циклитолы, углеводы (в том числе фруктозан инулин), фенолкарбоновые и органические кислоты. Препараты девясила используются в качестве отхаркивающих, тонизирующих, иммуномодулирующих, противовоспалительных, антисептических и других средств. Корневища и корни девясила высокого входят в состав большого количества фитосборов, имеющих широкий спектр применения, в том числе при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, гепатобилиарной, дыхательной, мочевыделительной, сердечно-сосудистой и других систем.
Побеги фасоли обыкновенной - Phaseolus vulgaris L., сем. Бобовые - Fabaceae (Leguminosae) - содержат 24-27% белка, до 50% углеводов, 2% жира, около 20% кристаллического глобулина фазеолина, протеазу, холестерин, лецитин, β-галактоарабин, декстрин, гемагиотипин фазин, лимонную и кремниевую кислоты, много солей фосфора и калия, аскорбиновую кислоту, витамины группы В. Зеленые стручки также содержат витамины С, В и провитамин А. В створках плодов фасоли обнаружены флавоноиды (производные кверцетина и кемпферола), аминокислоты, β-каротин, витамины E, B, C. Экспериментально установлено, что водный отвар и экстракты шелухи бобов фасоли снижают уровень сахара в крови на 30-40% и увеличивают диурез. Фасоль усиливает секрецию желудочного сока и работу поджелудочной железы, стимулирует выработку инсулина поджелудочной железой.
Побеги черники обыкновенной - Vaccinium myrtillus L, сем. Вересковых - Ericaceae по ФС 42-2948-93. Содержат до 12% дубильных веществ; миртиллин, являющийся смесью монометиловых эфиров хлоридов дельфинидина и мальвидина; до 30% сахара; до 7% органических кислот, главными из которых являются лимонная, яблочная, янтарная, хинная, щавелевая и молочная; витамины C, B; каротин. В них также обнаружен гликозид вакциниин, производные антрацена, идеин, инозит. Применяют в виде настоя, экстракта, сиропа, а также в составе желудочных чаев как нежное вяжущее и диетическое средство при острых и хронических расстройствах желудочно-кишечного тракта. Содержащийся в листьях неомиртиллин значительно понижает содержание сахара в крови при экспериментальном диабете.
Побеги пятилистника кустарникового - Pentaphylloides fruticosa L. сем. Розоцветных - Rosaceae. По ТУ 9370-008-93533369-10. В качестве реакции подлинности предложены реакция на дубильные вещества, флавоноиды, тритерпеноиды, полисахариды.
f
Методом бумажной хроматографии качественно определены индивидуальные соединения в сравнении с метчиками. На бумаге проявляется пятно голубого света R - 0,84(1); 0,87(11) (кофейная кислота). После проявления хроматограмм 3% спиртовым раствором алюминия хлорида флюоресценция зон усиливалась, и зоны флавоноидного характера приобретали желтый, желтовато-зеленый цвет.
f
f
f
f
Со стандартными образцами идентифицированы: кверцетин - R ~ 0,07 (I), R ~ 0,68 (II); рутин - R ~ 0,59 (I), R ~ 0,46 (II). Определено количественное содержание флавоноидов 2,0% в пересчете на рутин-стандарт. Препараты пятилистника кустарникового при его курсовом применении оказывает антидиабетическое действие, которое характеризуется снижением уровня глюкозы в крови, уменьшением концентрации липидов в сыворотке крови, протекторным действием в отношении поджелудочной железы и функциональной деятельности печени и почек.
1
2
Крапива двудомная (листья) - Urtica dioica L., сем. Крапивные - Urticaceae. ГФ XI изд. Ч.2, ст.25. Листья содержат дубильные вещества, углеводы - крахмал 10%, органические кислоты: щавелевая, уксусная, муравьиная, лимонная, хинная, молочная, фумаровая, янтарная, масляная. Витамины: B, B, E, K, C - (содержание 0,6%), каротиноиды 13-14% (ксантофиллин и др.), фенолкарбоновые кислоты: галловая, дубильные вещества, флавоноиды 1,86%, стероиды: ситострин. Сухой экстракт листьев входит в официнальный препарат «Аллохол» (Раст. Ресурсы СССР, 1993). Препараты крапивы двудомной повышают свертываемость крови, увеличивают количество эритроцитов и гемоглобина, обладают выраженным сосудосуживающим и тонизирующим гладкую мускулатуру матки действием. Хлорофилл, выделенный из листьев крапивы, обладает стимулирующим и тонизирующим действием, усиливает обмен веществ в организме, повышает тонус сердечно-сосудистой системы, дыхательного центра, кишечника, матки, грануляцию и эпителизацию пораженных тканей.
Корневища и корни лопуха большого - Arctium laapa L., сем. Астровые (Сложноцветные) - Asteraceae (Compositae). Содержит инулин (27-45%), белковые вещества (до 12%), жир (около 0,8%), органические кислоты, дубильные вещества, горечи, небольшое количество эфирного масла. Препараты из лопуха стимулируют регенерацию тканей, оказывают желчегонное антибактериальное и противодиабетическое действие, нормализуют состав крови, функцию желудка и кишечника. Корни используют, как мочегонное действие при мочекаменной болезни, отеках, как жаропонижающее и потогонное при простудных заболеваниях, как болеутоляющее и восстанавливающее обмен веществ при подагре, суставном ревматизме, геморрое, а также наружно для лечения кожных заболеваний.
Корни одуванчика лекарственного - Taraxacum officinale Wigg., сем. Астровые (Сложноцветные) - Asteraceae (Compositae). В корнях одуванчика содержатся тритерпеновые соединения - тараксастерол, тараксерол, псевдотараксастерол, β-амирин; стерины - β-ситостерин, стигмастерин, тараксол; а также до 24% инулина; до 3% каучука и жирное масло. Действующим веществом является горький гликозид тараксацин. Применяется в качестве горечи для возбуждения аппетита и улучшения работы желудочно-кишечного тракта. Также относится к инсулиноносным растениям, он усиливает деятельность поджелудочной железы и повышает выделение инсулина. Улучшает пищеварение и обмен веществ.
Примеры конкретного выполнения изобретения
Пример 1. Получение средства при нижних граничных соотношениях.
3
3
3
3
1
15
Измельченные и просеянные через сито №30 корни и корневища лопуха большого 14,5; корни одуванчика лекарственного 10,5; корни и корневища девясила высокого 10,5; побеги фасоли обыкновенной 20,0; побеги черники обыкновенной 20,0 побеги пятилистника кустарникового 10,5 и листья крапивы двудомной 14,5 смешивают, загружают в колбу и заливают 700,0 мл раствора 35% этанола при соотношении сырье экстрагент 1: 9, с учетом коэффициента водопоглощения. Экстрагируют при температуре 60°C при постоянном перемешивании в течение 2,0 часа на водяной бане. Экстракцию повторяют еще два раза, подавая каждый раз в колбу спирт этиловый 35% в количестве, равном объему слитого извлечения. 1-й слив 570,0 мл (плотность 0,945 г/см), 2-й слив - 565,0 мл (плотность 0,935 г/см), 3-й слив - 565,0 мл (плотность 0,930 г/см). Три слива объединяют, объединенное извлечение фильтруют в сборник (плотность 0,937 г/см) и упаривают до / первоначального объема. Концентрированный экстракт очищают сепарированием, сушат в вакуумной сушилке в течение 6 часов и измельчают на мельнице. Получают 17,3 г готового продукта, что составляет 17,2% от веса исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой мелкодисперсный порошок коричневого цвета со специфическим запахом. Гигроскопичен, слегка комкуется. Содержание влаги 0,95%.
Пример 2. Получение средства при средних граничных соотношениях.
3
3
3
3
1
15
Измельченные и просеянные через сито №30 корни и корневища лопуха большого 15,0; корни одуванчика лекарственного 11,0; корни и корневища девясила высокого 11,0; побеги фасоли обыкновенной 20,5; побеги черники обыкновенной 20,5 побеги пятилистника кустарникового 11,0 и листья крапивы двудомной 15,0 смешивают, загружают в колбу и заливают 1100,0 мл раствора 40% этанола при соотношении сырье экстрагент 1:10, с учетом коэффициента водопоглощения. Экстрагируют при температуре 60°C при постоянном перемешивании в течение 2,0 часа на водяной бане. Экстракцию повторяют еще два раза, подавая каждый раз в колбу спирт этиловый 40% в количестве, равном объему слитого извлечения. 1-й слив - 930,0 мл (плотность 0,944 г/см), 2-й слив - 910,0 мл (плотность 0,941 г/см), 3-й слив - 910,0 мл (плотность 0,939 г/см). Три слива объединяют, и объединенное извлечение фильтруют в сборник (плотность 0,941 г/см) и упаривают до / первоначального объема. Концентрированный экстракт очищают сепарированием, сушат в вакуумной сушилке в течение 6 часов и измельчают на мельнице. Получают 22,95 г готового продукта, что составляет 23,5% от веса исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой мелкодисперсный порошок коричневого цвета со специфическим запахом. Гигроскопичен, слегка комкуется. Содержание влаги 0,95%.
Пример 3. Получение средства при верхних граничных соотношениях.
3
3
3
3
1
15
Измельченные и просеянные через сито №30 корни и корневища лопуха большого 15,5; корни одуванчика лекарственного 11,5; корни и корневища девясила высокого 11,5; побеги фасоли обыкновенной 21,0; побеги черники обыкновенной 21,0 побеги пятилистника кустарникового 11,5 и листья крапивы двудомной 15,5 смешивают, загружают в колбу и заливают 1300,0 мл раствора 45% этанола при соотношении сырье экстрагент 1:12, с учетом коэффициента водопоглощения. Экстрагируют при температуре 60°C при постоянном перемешивании в течение 2,0 часа на водяной бане. Экстракцию повторяют еще два раза, подавая каждый раз в колбу спирт этиловый 45% в количестве, равном объему слитого извлечения. 1-й слив - 1100,0 мл (плотность 0,943 г/см), 2-й слив - 1050,0 мл (плотность 0,940 г/см), 3-й слив - 1050,0 мл (плотность 0,938 г/см). Три слива объединяют, и объединенное извлечение фильтруют в сборник (плотность 0,940 г/см) и упаривают до / первоначального объема. Концентрированный экстракт очищают сепарированием, сушат в вакуумной сушилке в течение 6 часов и измельчают на мельнице. Получают 21,80 г готового продукта, что составляет 20% от веса исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой мелкодисперсный порошок коричневого цвета со специфическим запахом. Гигроскопичен, слегка комкуется. Содержание влаги 0.95%.
Нами проведен химический анализ данной композиции сырья на содержание основных биологически активных веществ.
1. Обнаружение органических кислот.
f
f
f
Спиртовое извлечение, полученное вышеописанным способом, объемом 0,1 мл наносят микропипеткой на линию старта пластинки «силуфол». Параллельно наносят спиртовые растворы «свидетелей» - яблочную, лимонную, янтарную, галловую кислоты капилляром в одно касание на стартовую линию хроматографической пластинки. Высушенную пластинку помещают в хроматографическую камеру со свежеприготовленной, насыщенной системой 96% этанол-аммиак (34%) - (16:5). Время хроматографирования 30 минут. Хроматограмму высушивают на воздухе и проявляют спиртовым раствором бромкрезоловогозеленого. Отмечают пятна желтого цвета на бледно-розовом фоне. В исследуемом сборе обнаружены: яблочная кислота с R - 0,86, лимонная кислота с R - 0,63, галловая кислота с R - 0,43.
2. Обнаружение полифенольных соединений.
2.1. 0,5 г сухого экстракта растворяют в 10 мл воды при нагревании и периодическом перемешивании на кипящей водяной бане. Извлечение охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через бумажный фильтр. К 1 мл фильтрата прибавляют 9 мл воды и 3 капли раствора железа окисного хлорида [1]; появляется черно-зеленого окрашивания (полифенольные соединения).
f
2.2. Хроматографией в тонком слое сорбента на пластинке «Sorbfil ПТСХ-ПА» в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (26:14:3) после проявления 1% спиртовым раствором железа окисного хлорида [1] обнаружен (+)-катехин - R=0,56.
2.3. 0.2 г сухого экстракта растворяют в 25 мл спирта метилового 70%. 20 мкл полученного раствора вводили в высокоэффективный жидкостный хроматограф Gilston (Франция) (колонка Zirbax ODS 4.6×250 мм, подвижная фаза: ацетонитрил-0,1% фосфорная кислота (15:85)). При детектировании с помощью УФ-детектора при длине волны 280 нм идентифицированы галловая кислота, катехин, эпикатехин.
3. Обнаружение углеводов.
3.1. Полученный экстракт в количестве 0,5 г растворяют в 10 мл воды при нагревании и периодическом перемешивании на кипящей водяной бане. К 5 мл полученного фильтрата прибавляют 15 мл спирта этилового 96%, нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин; появляется небольшой хлопьевидный аморфный осадок (полисахариды).
3.2. Полученный экстракт в количестве 0.1 г растворяют в 10 мл 40% этилового спирта при нагревании и периодическом перемешивании на кипящей водяной бане. Извлечение охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через бумажный фильтр. К 1 мл фильтрата прибавляют 1 мл реактива Фелинга; появляется кирпично-красный осадок (восстанавливающие сахара).
3.3. Полученный экстракт в количестве 0.1 г растворяют в 10 мл 40% этилового спирта при нагревании и периодическом перемешивании на кипящей водяной бане. Полученное спиртовое извлечение объемом 0,2 мл наносят на бумажную хроматограмму на линию старта полоской в 5 см. Рядом на линию старта наносят в виде точек 0,1 мл раствора «свидетелей»: глюкозу, сахарозу, примверозу. Хроматографируют нисходящим способом в системе н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3) с перетеканием. Время хроматографирования 24 часа. Хроматограмму высушивают на воздухе и проявляют анилин-фталатным реактивом и сушат в сушильном шкафу при температуре 110°C в течение 2 минут. Пятна сахаров окрашиваются в коричневый цвет.
4. Обнаружение аминокислот
4.1. Свободные аминокислоты
1,0 г сухого экстракта растворяли в 50 мл воды очищенной и нагревали на водяной бане 10 мин. Извлечение охлаждали и фильтровали. Далее проводили пробоподготовку по унифицированной методике [2]. 200 мкл полученного раствора наносили на колонку аминокислотного анализатора Biotronik (Германия). Установлено наличие аспарагиновой и глута-миновой кислот, треонина, серина, глутамина, пролина, глицина, аланина, цистеина, валина, изолейцина, лейцина, тирозина, фенилаланина, лизина, гистидина, аргинина.
4.2. Свободные и связанные аминокислоты
1,0 г сухого экстракта растворяли в 50 мл воды очищенной и нагревали на водяной бане 10 мин. Извлечение охлаждали и фильтровали. Далее проводили пробоподготовку по унифицированной методике [2], в ходе которой осуществляли кислотный гидролиз пробы 6Н раствором кислоты хлористоводородной. 200 мкл полученного раствора наносили на колонку аминокислотного анализатора. Установлено наличие аспарагиновой и глутаминовой кислот, треонина, серина, пролина, глицина, аланина, цистеина, валина, метионона, изолейцина, лейцина, тирозина, фенилаланина, лизина, гистидина, аргинина.
5. Количественное определение
Около 0,1 г (точная навеска) сухого экстракта помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл спирта этилового 50% и нагревают на кипящей водяной бане при перемешивании. Раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора тем же спиртом до метки, перемешивают (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 0,5 мл раствора А, прибавляют 10 мл спирта этилового 50% подкисленного, перемешивают и объем раствора доводят тем же спиртом до метки, перемешивают (раствор Б).
Оптическую плотность раствора Б измеряют с помощью спектрофотометра в максимуме поглощения при длине волны 279 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют спирт этиловый 50% подкисленный.
Содержание суммы полифенольных соединений в пересчете на (+)-катехин и абсолютно сухое вещество в процентах (X) вычисляют по формуле:
где D - оптическая плотность испытуемого раствора;
m - масса навески сухого экстракта в граммах;
144 - удельный показатель поглощения (+)-катехина при длине волны 279 нм в спирте этиловом спирте 50% подкисленном;
W - потеря в массе при высушивании сухого экстракта в процентах.
Примечание. Приготовление спирта этилового 50% подкисленного. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 20 мл спирта этилового 50%, прибавляют 1 мл 1% раствора кислоты хлористоводородной, перемешивают, объем раствора доводят спиртом этиловым 50% до метки, перемешивают.
Для изучения основных свойств гипогликемического и противовоспалительного у полученного средства были использованы следующие методики:
1. Основным симптомом сахарного диабета является гипергликемия, в связи с этим проводилось изучение гипогликемического действия полученного продукта на базовый уровень глюкозы в крови и после сахарной нагрузки (4 мг/кг) у лабораторных животных.
Результаты свидетельствуют о том, что данное средство повышает скорость утилизации глюкозы, причем его выраженное гипогликемическое действие проявляется уже к 15 минуте эксперимента и продолжается в течение 2 часов после его введения. Таким образом, можно сделать вывод, что данное средство обладает гипогликемической активностью.
В результате было установлено, что данное средство снижает базальный уровень глюкозы в крови при его однократном введении на 19,5%. При сахарной нагрузке превентивное введение данного средства в дозе 300 мг/кг сопровождается снижением содержания глюкозы в крови белых крыс на 53% по сравнению с показателями у животных контрольной группы.
2. Для определения гипогликемического действия полученного продукта использовали модель аллоксанового диабета. Эксперимент проводился на белых крысах обоего пола линии Wistar, с исходной массой 180-200 г. Аллоксановый диабет вызывали путем однократного внутрибрюшинного введения аллоксана в дозе 55 мг/кг, голодавшим перед введением 24 часа животным. Экстракт сухой вводили внутрижелудочно в форме водного раствора превентивно в течение 5 дней в дозе 300 мг/кг 1 раз в сутки и далее до конца эксперимента.
В качестве препарата сравнения использовали официнальный фитосбор «Арфазетин». Контрольная группа животных получала дистиллированную воду. Исследования проводили на 3-е, 7-е сутки от начала эксперимента (Баранов В.Г., 1983).
Из полученных данных, представленных в таблице 6, следует, что испытуемое средство обладает наиболее выраженным эффектом при его введении животным в дозе 300 мг/кг, снижая на 49% количество глюкозы на 3-е сутки после введения аллоксана по сравнению с контрольной группой. При этом аналогичный показатель для препарата сравнения составил 28%.
Таблица 6
Влияние экстракта сухого на течение аллоксанового диабета у белых крыс
Показатели
Интактный контроль
Позитивный контроль (аллоксан + H<sub>2</sub>O)
Аллоксан + «Арфазетин»
Аллоксан + экстракт сухой 300 мг/кг
Глюкоза, ммоль/л 3-е сутки
4,5±0,34*
15,1±1,04
10,8±0,90*
7,6±0,53*
Глюкоза, ммоль/л 7-е сутки
4,7±0,32
8,6±0,73
6,0±0,43
5,2±0,41
Примечание: здесь и далее: * - различия значимы по сравнению с данными у животных группы позитивного контроля при P≤0,05.
3. Противовоспалительную активность полученного продукта исследовали на модели формалинового воспаления. Опыты проводились на белых крысах обоего пола линии Wistar массой 180-190 г. Воспроизведение острого асептического воспаления конечности осуществляли по методу Ю.В. Стрельникова: субплантарно в заднюю правую конечность крысы вводили 0,1 мл 3% раствора формалина. За 3 часа до субплантарного введения формалина и через 5 и 18 часов после инициации воспаления животным интрагастрально вводили раствор экстракта в дозе 300 мг/кг. Животные контрольной группы в равном объеме и одинаковом режиме получали воду дистиллированную. Через 24 часа после введения формалина проводили оценку антиэкссудативного эффекта, вычисляя процент угнетения отека лапки по отношению к контролю. Данные представлены в таблице 7.
Таблица 7
Влияние экстракта сухого на степень экссудации при «формалиновом» отеке у белых крыс.
Группы животных
Количество животных
V, мл
% угнетения отека
Контрольная
6
0,3±0,05
-
Экстракт сухой
6
0,1±0,01*
67%
Результаты исследований показали, что введение белым крысам полученного продукта в дозе 300 мг/кг оказывает выраженное антиэкссудативное действие, угнетая развитие формалинового отека на 67% по сравнению с аналогичным показателем у животных контрольной группы (таблице 8).
4. Противовоспалительную активность оценивали по влиянию полученного продукта на процессы альтерации у лабораторных животных.
Опыты проведены на белых крысах линии Wistar обоего пола с исходной массой 180-200 г. Альтеративную фазу воспалительной реакции у белых крыс воспроизводили путем подкожного введения 0,5 мл 9% раствора уксусной кислоты в область спинки (Ойвин И.А. 1988). Одновременно внутрибрюшинно вводили раствор декстрана в дозе 300 мг/кг. Фитопрепарат вводили за 1 час до введения раствора уксусной кислоты, а затем ежедневно 1 раз в сутки в течение 21 дня. Антиальтеративное действие фитопрепарата оценивали по степени развития некроза и регенерации тканей планиметрическим методом на 7-е, 14-е и 21-е сутки эксперимента. Как следует из полученных данных, фитопрепарат оказывает противовоспалительное действие на альтеративной стадии воспалительного процесса, о чем свидетельствует уменьшение степени альтерации тканей и усиление регенераторных процессов в очаге воспаления. Так, у животных, получавших фитопрепарат в дозе 300 мг/кг, площадь деструкции на 7-е, 14-е и 21-е сутки наблюдения была ниже такового показателя у крыс контрольной группы на 28, 47 и 45%.
5. Противовоспалительную активность оценивали по влиянию полученного продукта на асептический перитонит у лабораторных животных.
Асептический перитонит вызывали внутрибрюшинным введением крысам 1 мл 0,2% раствора натрия серебра (Александров П.Н., Сперанская Т.В., 1986). Экстракт сухой вводили животным опытных групп 1 раз в сутки в течение 5 дней, последний раз за 30 минут до введения нитрата серебра. Через 3 часа после введения нитрата серебра животных декапитировали под легким эфирным наркозом. Брыжейку белых крыс фиксировали смесью Карнуа, окрашивали 0,05% раствором толуидинового синего. Критерием развития и выраженности перитонита являлись количество жидкости в брюшной полости лабораторных животных и процент дегранулированных тучных клеток в брыжейке. Различия считали существенными при P≤0,05. На фоне введения нитрата серебра у животных контрольной группы отмечались увеличение количества внутрибрюшинной жидкости и тотальная дегрануляция тучных клеток по сравнению с данными у животных интактной группы (таблица 8), что свидетельствует о выраженном воспалительном процессе. На фоне введения полученного продукта у животных опытных групп объем внутрибрюшинной жидкости снижался на 46%, количество деграну-лирующих тучных клеток - в 2 раза по сравнению с показателями у контрольных животных.
Таблица 8
Влияние экстракта сухого на асептический перитонит у белых крыс.
Группы животных
Количество животных
Объем внутрибрюшинной жидкости, мл
Количество дегранулирующих тучных клеток, %
Интактный контроль
6
0,2±0,01
5,4±0,20
Контроль
6
2,4±0,4
71±5,6
Экстракт сухой
6
1,3±0,07*
34±3,9*
6. Панкреозащитную активность оценивали, по результатам патоморфологического исследования поджелудочной железы лабораторных животных.
Исследования проведены на белых крысах линии Wistar обоего пола с исходной массой тела 160-180 г. Экспериментальный сахарный диабет вызывали внутрибрюшинным введением 1 мл раствора аллоксана 55 мг/кг после 24-часовой пищевой депривации. Животные были разделены на 3 группы. Животным опытной группы на фоне сахарного диабета вводили внутрижелудочно исследуемое комплексное средство в дозе 300 мг/кг, животным контрольной группы - дистиллированную воду, в эквивалентном объеме. Для проведения пато-морфологических исследований поджелудочную железу фиксировали в 10% нейтральном формалине. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином (Микроскопическая техника, 1996). На препаратах с помощью компьютерной программы «Motic Images 2000» определяли площадь островков Лангерганса, общее количество клеток в островках. Высчитывали плотность клеток в островках Лангерганса.
Результаты патоморфологических исследований показали, что инъекция аллоксана вызывает атрофию инкреторной и экскреторной паренхимы поджелудочной железы. У животных контрольной группы на 3 сутки опыта в поджелудочной железе отмечаются нарушения микроциркуляции, локальные деструктивно-некротические процессы экскреторной ткани, при которых мало различимы апикальная и базальная части клеток, наблюдаются явления кариоцитолиза и кариолизиса. В то же время сохраняется ацинарная структура органа, но отдельные ацинусы теряют характерную для них округлую форму. При этом отмечается выраженные структурные изменения в островках Лангерганса, характеризующиеся незначительным увеличением площади островков и выраженной пролиферацией клеток. Клетки в островках подвержены дистрофическим изменениям, в них отмечается вакуолизация цитоплазмы, кариопикноз отельных клеток. Отмечается лимфогистиоцитратная инфильтрация отдельных островков.
Результаты морфометрических исследований показали, что на фоне инъекции аллоксана отмечается незначительное увеличение площади островков (на 13%) и выраженное повышение клеток в островках в 2,0 раза по сравнению с данными у животных интактной группы (таблица 9).
Таблица 9
Влияние экстракта сухого на морфометрические показатели островков Лангерганса при аллоксановом сахарном диабете
Показатели
Группы животных
Интактный контроль
Позитивный контроль (аллоксан+H<sub>2</sub>O)
Опытная (аллоксан + растительное средство)
S островка Лангерганса, мкр<sup>2</sup>
45867±3886
52056±6266
48995±3642
Общее количество клеток в островке
28,2±3,23
57,2±1,29
42,0±2,64*
Плотность клеток в островках на 10000 мкр<sup>2</sup>
6,1±0,02
11,0±0,91
8,5±0,46*
На фоне фармакотерапии полифитоэкстрактом в поджелудочной железе животных опытной группы отмечаются нарушения микроциркуляции, очаговые некротические изменения ацинусов и незначительная вакуолизация паренхимы. Результаты морфометрических исследований показали, что на фоне курсового введения полиэкстракта средняя площадь островков незначительно отличается от показателя у животных контрольной группы. При этом у животных опытных групп количество клеток в островках меньше - в среднем на 26,6%, и плотность их в островках - в среднем на 22,8% соответственно по сравнению таковыми показателями у животных группы позитивного контроля.
Таким образом, установлено, что на фоне сахарного аллоксанового диабета увеличивается плотность клеток в островках Лангерганса, что по данным литературы (Алеева Т.Н., 2002) обусловлено повышением глюкагонпродуцирующих α-клеток поджелудочной железы на первой недели развития сахарного диабета. Курсовое введение исследуемого средства оказывало выраженное гипогликемическое действие на фоне экспериментального диабета, что вероятно обусловлено его ингибирующим влиянием на пролиферацию α-клеток поджелудочной железы.
Предложенный способ получения достаточно прост, не требует сложной схемы очистки, позволяет получить продукт постоянного состава. Технология может быть внедрена на предприятиях, выпускающих лекарственные препараты. Посчитать экономическую эффективность предлагаемого способа в настоящее время не предлагается возможным, однако вышеуказанные преимущества в сочетании с простой схемой получения способствует рациональному использованию лекарственного растительного сырья и открывает перспективу внедрения данного способа в фармацевтическую промышленность.
Предлагаемый способ получения по сравнению с известным, позволяет получить препарат постоянного состава с более высокой активностью за счет использования рациональной технологии получения и более высокого содержания действующих веществ (таблица 10).
Таблица 10
Сравнительная характеристика заявленного способа с выбранным прототипом
Параметры сравнения
Известный способ
Заявляемый способ
Растительное сырье
побеги черники 20,0; створки плодов фасоли 20,0; корни аралии маньчжурской или корневища с корнями заманихи 15,0; трава хвоща полевого 10,0; цветки ромашки аптечной 10,0; плоды шиповника 15,0; трава зверобоя 10,0.
корни и корневища лопуха большого 15,0 - корни одуванчика лекартвенного - 10,0; корни и корневища девясила высокого 10,0; побеги фасоли обыкновенной - 20,0; побеги черники обыкновенной 20,0; побеги пятилистника кустарникового 10,0 и листья крапивы двудомной 15,0
Лекарственная форма
Настой для приема внутрь
Сухой экстракт - субстанция для производства лекформ
Содержание биологически активных веществ
Содержание суммы полифенолов в пересчете на пирогаллол (спектрофотометрия) - 7,2-18,0 мг/100 мл
Содержание суммы полифенольных соединений в пересчете на (+)-катехин (спектрофотометрия) не менее 13,6%
Источники информации
1. Государственная фармакопея СССР, XI изд., вып.1. М.: Медицина. - 1987. - 336 с.
2. Benson J.R. Some recend advances in amino acid analisis / Instrumentation in amino acid sequence analisis. - London, San-Francisco. - 1985. - P.1-140.
3. Балаболкин М.И., Клебанова E.M., Креминская B.M. // Лечение сахарного диабета и его осложнений (руководство для врачей). - М.: Медицина, 2005. - 511 с.
4. Bloomgarden Z.Т. Developments in diabetes and insulin resistance // Diabetes Care. - 2006. - Vol.29. - P.161-167.
5. Изучение процесса экстракции и количественное определение суммы биологически активных веществ в суммарном препарате желчегонного действия / Г.И. Российская и др. // Фармация. - 1985. - №21. - С.38 - 41.