ПЕПТИДЫ ТОРК И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ ВАКЦИНЫ
TOPK PEPTIDES AND THEIR VACCINES

Область техники, к которой относится изобретение
[0001] Настоящее изобретение относится к области биологической науки, более конкретно, к области терапии злокачественных опухолей. В частности, настоящее изобретение относится к новым пептидам, которые являются эффективными в качестве противораковых вакцин, и к лекарственным средствам для лечения или профилактики опухолей или для того и другого.
[0002] Приоритет
По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США №61/552817, зарегистрированной 28 октября 2011 года, полное содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.
Предшествующий уровень техники
[0003] Было продемонстрировано, что CD8-положительные цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) распознают пептиды-эпитопы, получаемые из опухолеассоциированных антигенов (ТАА) на молекуле главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I, а затем вызывают цитолиз этих опухолевых клеток. Со времени открытия семейства антигенов меланомы (MAGE) в качестве первого примера ТАА, были обнаружены многие другие ТАА посредством иммунологических подходов (NPL 1, 2), и в настоящее время некоторые из ТАА находятся в клинической разработке в качестве иммунотерапевтических мишеней.
[0004] Для пролиферации и выживания злокачественных клеток необходимыми являются подходящие ТАА. Использование таких ТАА в качестве мишеней для иммунотерапии может минимизировать хорошо описанный риск ускользания от иммунологического надзора злокачественных клеток, свойственный для делеции, мутации и/или подавления ТАА, такой как последствие терапевтически запускаемой иммунной селекции. Таким образом, необходимо дальнейшее развитие идентификации новых ТАА, способных индуцировать сильные и специфические противоопухолевые иммунные реакции. Таким образом, продолжается клиническое применение стратегий пептидной вакцинации для различных типов злокачественных опухолей (NPL 3-10). К настоящему времени существует несколько публикаций о клинических исследованиях с использованием этих получаемых из ТАА пептидов. К сожалению, к настоящему времени в этих испытания противораковых вакцин получали только низкую частоту объективных ответов (NPL 11-13). Таким образом, на данном уровне техники остается необходимость в новых ТАА, подходящих для применения в качестве иммунотерапевтических мишеней.
[0005] TOPK (протеинкиназа T-LAK-клеток) представляет собой сериновую/треониновую киназу, которая является представителем семейства MAPKK 3/6-родственных MAPK-киназ (MAPKK). Эта киназа фосфорилирует р38 МАРК и участвует в регуляции контроля клеточного цикла (NPL 14, 15). Анализ экспрессии генов TOPK с использованием клинических образцов показал, что TOPK является сверхэкспрессированной в некоторых злокачественных опухолях, таких как рак молочной железы, холангиоцеллюлярный рак, печеночноклеточная карцинома, лейкоз, колоректальный рак и меланома (NPL 16-19). Недавние исследования, свидетельствующие о том, что активность киназы играет важную роль в канцерогенезе молочной железы, вновь возродили исследовательский интерес к связанным с раком киназам, таким как TOPK. С этой целью анализом Нозерн-блоттинг выявили, что транскрипт TOPK является высоко экспрессируемым в раковых клетках молочной железы, но является трудно детектируемым в нормальных тканях человека за исключением семенников. Кроме того, было продемонстрировано, что нокдаун экспрессии эндогенной TOPK посредством миРНК в линиях клеток рака молочной железы уменьшает цитокинез и приводит к апоптозу злокачественных клеток (NPL 20).
Список цитированных документов [0006]
Непатентная литература
[NPL 1] Boon Т, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80.
[NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183 (3): 725-9.
[NPL 3] Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55.
[NPL 4] Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59 (13): 3134-42.
[NPL 5] Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9.
[NPL 6] van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156 (9): 3308-14.
[NPL 7] Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8.
[NPL 8] Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72.
[NPL 9] Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66.
[NPL 10] Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94.
[NPL 11] Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80.
[NPL 12] Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42.
[NPL 13] Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15.
[NPL 14] Abe Y et.al., J Bio Chem. 2000 July 14: 21525-21531.
[NPL 15] Ayllon V and O'connor R., Oncogene. 2007 May 24; 26(24): 3451-61.
[NPL 16] He F et al., Hum Pathol. 2010 Mar; 41(3): 415-24.
[NPL 17] Li G et al., Ann Hematol. 2006 Sep; 85(9): 583-90.
[NPL 18] Minoo P et al., Int J Oncol. 2010 Sep; 37(3): 707-18.
[NPL 19] Zykova ТА et al., Clin Cancer Res. 2006 Dec 1; 12 (23): 6884-93.
[NPL 20] Park JH et al., Cancer Res. 2006 Sep 15; 66(18): 9186-95.
Сущность изобретения
[0007] Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на открытии новых пептидов, которые могут служить в качестве подходящих мишеней иммунотерапии. Поскольку ТАА, как правило, воспринимаются иммунной системой как "свое" и, таким образом, часто не имеют природной иммуногенности, крайне важным является обнаружение подходящих мишеней. На всем протяжении настоящего изобретения продемонстрировано, что TOPK (SEQ ID NO: 86, кодируемая геном номер доступа GenBank NM_018492 (SEQ ID NO: 85)) специфически сверхэкспрессируется в злокачественных клетках, в частности при остром миелолейкозе (AML), в клетках рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиоцеллюлярного рака, хронического миелоидного лейкоза (CML), колоректального рака, рака желудка диффузного типа, немелкоклеточного рака легких (NSCLC), лимфомы, остеосаркомы, рака предстательной железы, почечно-клеточного рака, мелкоклеточного рака легких (SCLC) и опухолей мягки тканей, но не ограничивается ими. Таким образом, настоящее изобретение сосредоточено на TOPK в качестве подходящей мишени-кандидата иммунотерапии злокачественных опухолей/опухолей.
[0008] С этой целью настоящее изобретение направлено на идентификацию специфических пептидов-эпитопов среди продуктов гена TOPK, которые имеют способность индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), специфические в отношении TOPK. Как более подробно описано ниже, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), получаемые у здорового донора, стимулировали с использованием связывающих HLA (лейкоцитарного антигена человека)-А*2402 или HLA-A*0201 пептидов-кандидат, получаемых из TOPK. Затем выводили линии CTL со специфической цитотоксичностью против HLA-A24- или HLA-А2-положительных клеток-мишеней, сенсибилизированных каждым из пептидов-кандидатов. Результаты в настоящем описании демонстрируют, что эти пептиды являются рестриктированными по HLA-A24- или HLA-A2 пептидами-эпитопами, которые могут индуцировать сильные и специфические иммунные реакции против экспрессирующих TOPK клеток. Эти результаты дополнительно демонстрируют, что TOPK является сильно иммуногенным и что его эпитопы являются эффективными мишенями для противоопухолевой иммунотерапии.
[0009] Таким образом, задачей настоящего изобретения является обеспечение выделенных пептидов, которые обладают способностью связываться с HLA-антигеном, и содержат последовательность TOPK (SEQ ID NO: 86) или ее иммунологически активный фрагмент. Ожидается, что такие пептиды обладают способностью к индукции CTL, и следовательно, их можно использовать для индукции CTL in vitro, ex vivo или in vivo, или непосредственно вводить индивидууму таким образом, чтобы индуцировать in vivo иммунные реакции против злокачественных опухолей, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, колоректальный рак, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почки, SCLC и опухоль мягких тканей.
[0010] Предпочтительные пептиды являются нонапептидами или декапептидами и более предпочтительно нонапептидами или декапептидами, содержащими аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2-40 и 42-84. Из них пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27, 28, 42, 45, 47, 50, 51, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 76, являются особенно предпочтительными.
[0011] В настоящем изобретении также предоставлены модифицированные пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2-40 и 42-84, в которых заменены, удалены, введены и/или добавлены одна, две или более аминокислот при условии, что получаемые модифицированные пептиды сохраняют необходимую способность к индукции CTL исходного немодифицированного пептида.
[0012] Настоящее изобретение дополнительно включает выделенные полинуклеотиды, кодирующие любой из пептидов по настоящему изобретению. Эти полинуклеотиды можно использовать для индукции или получения антигенпрезентирующих клеток (APC), обладающих способностью к индукции CTL. Также как описанные выше пептиды по настоящему изобретению, такие APC можно вводить индивидууму для индукции иммунных реакций против злокачественной опухоли.
[0013] При введении индивидууму пептиды по настоящему изобретению предпочтительно презентируются на поверхности APC таким образом, чтобы индуцировать нацеливание CTL на соответствующие пептиды. Таким образом, одной из задач настоящего изобретения является обеспечение средств или композиций для индукции CTL, где такие композиции или средства содержат один или более пептидов по настоящему изобретению или один или более полинуклеотидов, кодирующих такие пептиды. Такие средства или композиции можно использовать для лечения и/или профилактики первичной злокачественной опухоли, метастазирования или послеоперационного рецидива рака. Примеры злокачественных опухолей-мишеней, рассматриваемых в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, колоректальный рак, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почки, SCLC и опухоль мягких тканей.
[0014] Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтические композиции или средства, которые содержат один или более пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению, составленных для лечения и/или профилактики первичной злокачественной опухоли, метастазирования или послеоперационного рецидива рака, как отмечено выше. Наряду или в дополнение к существующим пептидам или полинуклеотидам настоящие фармацевтические средства и/или композиции могут содержать в качестве активных ингредиентов APC и/или экзосомы, которые предоставляют любой из пептидов по настоящему изобретению.
[0015] Пептиды или полинуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать для индукции APC, которые презентируют на поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению, например, приведением APC, получаемых у индивидуума, в контакт с пептидом по настоящему изобретению или введением полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в APC. Такие APC имеют высокую способность к индукции CTL против пептидов-мишеней и являются пригодными для иммунотерапии злокачественных опухолей. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам индукции APC со способностью к индукции CTL, а также APC, полученным такими способами.
[0016] Дополнительной задачей настоящего изобретения является обеспечение способов индукции CTL, где такие способы предусматривают стадию совместного культивирования CD8-положительных Т-клеток с APC, которые презентируют на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению, стадию совместного культивирования CD8-положительных Т-клеток с экзосомами, презентирующими на их поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению, или стадию введения полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих полипептиды субъединиц T-клеточного рецептора (TCR), где TCR, образованный полипептидами субъединиц, может связываться с пептидом по настоящему изобретению. CTL, получаемые такими способами, находят применение при лечении и/или профилактике злокачественных опухолей, более конкретно AML, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиоцеллюлярного рака, колоректального рака, рака желудка диффузного типа, NSCLC, лимфомы, остеосаркомы, рака предстательной железы, рака почки, SCLC и опухоли мягких тканей. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам индукции CTL, а также CTL, получаемые такими способами. Еще одной задачей настоящего изобретения является предоставление выделенных APC, которые презентируют на поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенным CTL, которые направлены на пептиды по настоящему изобретению. Такие APC и CTL можно использовать для иммунотерапии злокачественных опухолей.
[0017] Еще одной задачей настоящего изобретения является предоставление способов индукции иммунной реакции против злокачественной опухоли у нуждающегося в этом индивидуума, где такие способы включают стадию введения индивидууму композиции, которая содержит по меньшей мере один компонент, выбранный из пептида по настоящему изобретению, полинуклеотида, кодирующего такой пептид, экзосом или APC, презентирующих такие пептиды, и CTL, которые могут распознавать клетки, презентирующие такие пептиды на своей поверхности.
[0018] Применимость настоящего изобретения распространяется на любое из ряда заболеваний, связанных со сверхэкспрессией TOPK или возникающих в результате сверхэкспрессии TOPK, такие как злокачественные опухоли с экспрессией TOPK, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, колоректальный рак, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почки, SCLC и опухоль мягких тканей.
Задачи и признаки изобретения станут более понятными при чтении приведенного ниже подробного описания совместно с сопровождающими фигурами и примерами. Однако следует понимать, что как предыдущий раздел "Сущность настоящего изобретения", так и следующее ниже подробное описание, являются только иллюстративными вариантами осуществления и не являются ограничивающими настоящее изобретение или другие альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения.
[0019] В частности, хотя изобретение описано в настоящем описании со ссылкой на ряд конкретных вариантов осуществления, следует понимать, что описание является иллюстративным описанием изобретения, и его не следует понимать как ограничивающее изобретение. Специалисты в данной области могут находить различные модификации и применения, не выходя за рамки сущности и объема изобретения, как описано в прилагаемой формуле изобретения. Подобным образом, другие задачи, признаки, эффекты и преимущества будут очевидными из описанных ниже сущности изобретения и определенных вариантов осуществления, и специалист в данной области легко поймет их. Такие задачи, признаки, эффекты и преимущества изобретения станут понятны из указанного выше совместно с сопровождающими примерами, данными, фигурами и разумными выводами, извлеченными из них, отдельно или с рассмотрением включенных в настоящее описание ссылок.
Краткое описание чертежей
[0020] Различные аспекты и применения настоящего изобретения станут очевидными специалисту в данной области после рассмотрения краткого описания фигур и подробного описания настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления, которые следуют далее.
[0021] Фиг. 1. Фигура 1 состоит из ряда фотографий, (a)-(j), отображающих результаты анализа иммуноферментных пятен (ELISP0T) интерферона (IFN)-гамма на CTL, которые индуцировали пептидами, получаемыми из TOPK. CTL в лунке №8, индуцируемые TOPK-А2 4-9-230 (SEQ ID NO: 2) (a), в №3 индуцируемые TOPK-А24-9-130 (SEQ ID NO: 3) (b), в №3 индуцируемые TOPK-А24-9-232 (SEQ ID NO: 6) (c), в №2 индуцируемые TOPK-А24-10-288 (SEQ ID NO: 27) (d) и в №4 индуцируемые TOPK-А24-10-289 (SEQ ID NO: 28) (е) показали эффективную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем, соответственно. Квадрат на лунке этих изображений означает, что клетки из соответствующей лунки размножали для получения линий CTL. В противоположность этому, как это характерно для отрицательных данных, не наблюдали специфической продукции IFN-гамма CTL, стимулированными TOPK-А24-9-289 (SEQ ID NO: 1) (f). На фигурах "+" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующим пептидом, и "-" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, не сенсибилизированных какими-либо пептидами.
[0022] Фиг. 2-1. Фигура 2 состоит из ряда фотографий, (a)-(о), отображающих результаты анализа иммуноферментных пятен (ELISP0T) интерферона (IFN)-гамма на CTL, которые индуцировали пептидами, получаемыми из TOPK. CTL в лунке №7, индуцируемые TOPK-А02-9-240 (SEQ ID NO: 42) (a), в №4 индуцируемые TOPK-А02-9-19 (SEQ ID NO: 45) (b), в №2 индуцируемые TOPK-А02-9-183 (SEQ ID NO: 47) (c), в №8 индуцируемые TOPK-А02-9-235 (SEQ ID NO: 50) (d) и в №4 индуцируемые TOPK-А02-9-12 (SEQ ID NO: 51) (е), в №3 индуцируемые TOPK-А02-9-285 (SEQ ID NO: 53) (f), в №3 индуцируемые TOPK-А02-9-47 (SEQ ID NO: 54) (g), в №5 индуцируемые TOPK-А02-10-236 (SEQ ID NO: 62) (h), в №3 индуцируемые TOPK-А02-10-231 (SEQ ID NO: 63) (i), в №8 индуцируемые TOPK-А02-10-47 (SEQ ID NO: 64) (j), в №1 индуцируемые TOPK-А02-10-272 (SEQ ID NO: 71) (l) показали эффективную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем, соответственно. Квадрат на лунке этих изображений означает, что клетки из соответствующей лунки размножали для получения линий CTL. В противоположность этому, как это характерно для отрицательных данных, не наблюдали специфической продукции IFN гамма CTL, стимулированными TOPK-А02-9-55 (SEQ ID NO: 41) (о). На фигурах "+" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующим пептидом, и "-" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, не сенсибилизированных какими-либо пептидами.
[0023] Фиг. 2-2. Фигура 2 состоит из ряда фотографий, (a)-(о), отображающих результаты анализа иммуноферментных пятен (ELISPOT) интерферона (IFN)-гамма на CTL, которые индуцировали пептидами, получаемыми из TOPK. CTL в №4 индуцируемые TOPK-А02-10-88 (SEQ ID NO: 72) (m) и в №4 индуцируемые TOPK-А02-10-142 (SEQ ID NO: 76) (п) показали эффективную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем, соответственно. Квадрат на лунке этих изображений означает, что клетки из соответствующей лунки размножали для получения линий CTL. В противоположность этому, как это характерно для отрицательных данных, не наблюдали специфической продукции IFN-гамма CTL, стимулированными TOPK-А02-9-55 (SEQ ID NO: 41) (о). На фигурах "+" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующим пептидом, и "-" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, не сенсибилизированных какими-либо пептидами.
[0024] Фиг. 3. Фигура 3 состоит из ряда фотографий, (a)-(e), отображающих продукцию IFN-гамма линиями CTL, стимулируемыми TOPK-А24-9-230 (SEQ ID NO: 2) (a), TOPK-А24-9-130 (SEQ ID NO: 3) (b), TOPK-А24-9-232 (SEQ ID NO: 6) (c), TOPK-A24-10-288 (SEQ ID NO: 27) (d) и TOPK-A24-10-289 (SEQ ID NO: 28) (e). Количество IFN-гамма, который продуцировали CTL, измеряли твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA) для IFN-гамма. Результаты демонстрируют, что линии CTL, получаемые стимуляцией каждым пептидом, демонстрируют эффективную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигурах "+" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующим пептидом, и "-" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, не сенсибилизированных какими-либо пептидами. Отношение R/S означает отношение числа иммунокомпетентных клеток (линии CTL) к клеткам-стимуляторам.
[0025] Фиг. 4. Фигура 4 состоит из ряда линейных графиков, (a)-(c), отображающих продукцию IFN-гамма клонами CTL, получаемыми лимитирующим разведением из линий CTL, стимулированных TOPK-А24-9-130 (SEQ ID NO: 3) (a), TOPK-А24-10-288 (SEQ ID NO: 27) (b) и TOPK-А24-10-2 8 9 (SEQ ID NO: 28) (c). Результаты демонстрируют, что клоны CTL, получаемые стимуляцией каждым пептидом, демонстрируют эффективную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигурах "+" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующим пептидом, и "-" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, не сенсибилизированных какими-либо пептидами. Отношение R/S означает отношение числа иммунокомпетентных клеток (клона CTL) к клеткам-стимуляторам.
[002 6] Фиг. 5-1. Фигура 5-1 состоит из ряда линейных графиков, (a)-(f), отображающих продукцию IFN-гамма линиями CTL, стимулированными TOPK-А02-9-240 (SEQ ID NO: 42) (a), TOPK-А02-9-19 (SEQ ID NO: 45) (b), TOPK-А02-9-235 (SEQ ID NO: 50) (c), TOPK-А02-9-12 (SEQ ID NO: 51) (d), TOPK-A02-9-285 (SEQ ID NO: 53) (e) и TOPK-А02-9-47 (SEQ ID NO: 54) (f). Количество IFN-гамма, который продуцировали CTL, измеряли твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA) для IFN-гамма. Результаты демонстрируют, что линии CTL, получаемые стимуляцией каждым пептидом, демонстрируют эффективную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигурах "+" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующим пептидом, и "-" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, не сенсибилизированных какими-либо пептидами. Отношение R/S означает отношение числа иммунокомпетентных клеток (линии CTL) к клеткам-стимуляторам.
[0027] Фиг. 5-2. Фигура 5-2 состоит из ряда линейных графиков, (g)-(k), отображающих продукцию IFN-гамма линиями CTL, стимулированными TOPK-А02-10-236 (SEQ ID NO: 62) (g), TOPK-А02-10-231 (SEQ ID NO: 63) (h), TOPK-A02-10-47 (SEQ ID NO: 64) (i), TOPK-A02-10-239 (SEQ ID NO: 66) (j) и TOPK-A02-10-88 (SEQ ID NO: 72) (k). Количество IFN-гамма, который продуцировали CTL, измеряли твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA) для IFN-гамма. Результаты демонстрируют, что линии CTL, получаемые стимуляцией каждым пептидом, демонстрируют эффективную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигурах "+" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующим пептидом, и "-" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, не сенсибилизированных какими-либо пептидами. Отношение R/S означает отношение числа иммунокомпетентных клеток (линии CTL) к клеткам-стимуляторам.
[0028] Фиг. 6. Фигура 6 состоит из ряда линейных графиков, (a) и (b), отображающих продукцию IFN-гамма клонами CTL, получаемыми лимитирующим разведением из линий CTL, стимулированных TOPK-А02-9-240 (SEQ ID NO: 42) (a) и TOPK-А02-9-285 (SEQ ID NO: 53) (b). Результаты демонстрируют, что клоны CTL, получаемые стимуляцией каждым пептидом, демонстрируют эффективную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигурах "+" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующим пептидом, и "-" означает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, не сенсибилизированных какими-либо пептидами. Отношение R/S означает отношение числа иммунокомпетентных клеток (клона CTL) к клеткам-стимуляторам.
[0029] Фиг. 7. Фигура 7 представляет собой линейный график, изображающий специфическую активность CTL клонов CTL против клеток-мишеней, которые экспрессируют TOPK и HLA-A*2402. В качестве контроля получали клетки COS7, трансфицированные HLA-А*2402 или полноразмерным геном TOPK. Клон CTL, получаемый с использованием TOPK-А02-9-240 (SEQ ID NO: 42), демонстрировал специфическую активность CTL против клеток COS7, трансфицированных TOPK и HLA-A*2402 (ромб). С другой стороны, не детектировали значимой специфической активности CTL против клеток COS7, трансфицированных HLA-A*2402 (треугольник) или TOPK (кружок).
[0030] Фиг. 8. Фигура 8 представляет собой линейный график, изображающий специфическую активность CTL линий CTL против клеток-мишеней, которые экспрессируют TOPK и HLA-A*0201. В качестве контроля получали клетки COS7, трансфицированные HLA-А*0201 или полноразмерным геном TOPK. Линия CTL, получаемая с использованием TOPK-А02-9-240 (SEQ ID NO: 42), демонстрировала специфическую активность CTL против клеток COS7, трансфицированных TOPK и HLA-A*0201 (ромб). С другой стороны, не детектировали значимой специфической активности CTL против клеток-мишеней, экспрессирующих HLA-A*0201 (треугольник) или TOPK (кружок).
Описание вариантов осуществления
[0031] Дополнительно к разделу "Сущность изобретения" задачей настоящего изобретения является предоставить:
[1] Выделенный пептид, обладающий способностью к индукции CTL, где пептид состоит из аминокислотной последовательности TOPK или ее иммунологически активного фрагмента.
[2] Выделенный пептид по [1], где пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27, 28, 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 76.
[3] Выделенный пептид, выбранный из группы, состоящей из (i) и (ii), как указано ниже:
(i) выделенного пептида (a) или (b), как указано ниже:
(a) выделенного пептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27 и 28,
(b) выделенного пептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27 и 28, в которой 1, 2 или несколько аминокислот заменены, введены, удалены и/или добавлены, где пептид обладает способностью к индукции CTL,
(ii) выделенного пептида (c) или (d), как указано ниже:
(c) выделенного пептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 76,
(d) выделенного пептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 76, в которой 1, 2 или несколько аминокислот заменены, введены, удалены и/или добавлены, где пептид обладает способностью к индукции CTL.
[4] Выделенный пептид по [3], где пептид обладает одной или обеими следующими характеристиками:
(a) вторая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27 и 28, заменена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из фенилаланина, тирозина, метионина и триптофана, и
(b) C-концевая аминокислота аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27 и 28, заменена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, триптофана и метионина.
[5] Выделенный пептид по [3], где пептид обладает одной или обеими следующими характеристиками:
(a) вторая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 76, заменена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из лейцина и метионина, и
(b) C-концевая аминокислота аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 76, заменена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из валина и лейцина.
[6] Выделенный пептид по любому из [1]-[5], где указанный пептид обладает способностью связываться с HLA-антигеном.
[7] Выделенный пептид по [6], где указанный HLA-антиген представляет собой HLA-A24 или HLA-A2.
[8] Выделенный пептид по любому из [1]-[7], где указанный пептид представляет собой нонапептид или декапептид.
[9] Выделенный полинуклеотид, кодирующий выделенный пептид по любому из [1]-[8].
[10] Композиция для индукции CTL, где композиция содержит один или несколько пептидов по любому из [1]-[8] или один или несколько полинуклеотидов по [9].
[11] Фармацевтическая композиция, содержащая:
(a) один или несколько пептидов по любому из [1]-8],
(b) один или несколько полинуклеотидов по [9],
(c) одну или несколько APC, которые презентируют комплекс пептида по любому из [1]-[8] и HLA-антигена на своей поверхности;
(d) одну или несколько экзосом, которые презентируют комплекс пептида по любому из [1]-[8] и HLA-антигена на своей поверхности, или
(е) один или несколько CTL, которые могут распознавать клетку, презентирующую комплекс пептида по любому из [1]-[8] и HLA-антигена на своей поверхности, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем,
где фармацевтическая композиция составлена для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, профилактики послеоперационного рецидива рака и/или индукции иммунной реакции против злокачественной опухоли.
[12] Фармацевтическая композиция по [11], где указанная фармацевтическая композиция составлена для введение индивидууму, HLA-антиген которого представляет собой HLA-A24 или HLA-A2.
[13] Способ индукции антигенпрезентирующей клетки (APC) со способностью к индукции CTL, где указанный способ включает стадию, выбранную из группы, состоящей из:
(a) приведения APC в контакт с пептидом по любому из [1]-[8] in vitro, ex vivo или in vivo, и
(b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид по любому из [1]-[8], в APC.
[14] Способ индукции CTL, где указанный способ включает стадию, выбранную из группы, состоящей из:
(a) совместного культивирования CD8-положительной T-клетки с APC, которая презентирует на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из [1]-[8],
(b) совместного культивирования CD8-положительной T-клетки с экзосомой, которая презентирует на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из [1]-[8], и
(c) введения в CD8-положительную Т-клетку полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих полипептиды субъединиц T-клеточного рецептора (TCR), где TCR, образованный указанными полипептидами субъединиц TCR, способен связываться с комплексом HLA-антигена и пептида по любому из [1]-[8] на клеточной поверхности.
[15] Выделенная APC, которая презентирует на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из [1]-[8].
[16] Выделенная APC по [15], которую индуцируют способом по [13].
[17] Выделенный CTL, который нацелен на пептид по любому из [1]-[8].
[18] CTL по [17], который индуцируют способом по [14].
[19] Способ индукции иммунной реакции против злокачественной опухоли у нуждающегося в этом индивидуума, где указанный способ включает стадию введения индивидууму композиции, содержащей пептид по любому из [1]-[8], его иммунологически активный фрагмент или полинуклеотид, кодирующий указанный пептид или указанный фрагмент.
[20] Антитело или его иммунологически активный фрагмент против пептидов по любому из [1]-[8].
[21] Вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид по любому из [1]-[8].
[22] Клетка-хозяин, трансформированная или трансфицированная вектором по [21].
[23] Диагностический набор, содержащий пептид по любому из [1]-[8], нуклеотид по [9] или антитело по [20].
[24] Способ скрининга пептида, обладающего способностью индуцировать CTL, который обладает специфической цитотоксической активностью против клетки, которая презентирует фрагмент, получаемый из TOPK, где способ включает стадии:
(i) предоставления последовательности-кандидата, состоящей из аминокислотной последовательности, модифицированной заменой, удалением, встраиванием и/или добавлением одного, двух или нескольких аминокислотных остатков к исходной аминокислотной последовательности, где исходная аминокислотная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27, 28, 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 7 6;
(ii) отбора последовательности-кандидата, которая не обладает по существу значительной гомологией с пептидами, получаемыми из любых известных продуктов генов человека, отличных от TOPK;
(iii) приведения пептида, состоящего из последовательности-кандидата, отобранной на стадии (ii), в контакт с антигенпрезентирующей клеткой;
(iv) приведения антигенпрезентирующей клетки стадии (c) в контакт с CD8-положительной Т-клеткой, и
(v) идентификации пептида, способность к индукции CTL которого является такой же, как у пептида, состоящего из исходной аминокислотной последовательности, или более высокой.
[0032] Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящем описании, можно использовать в практике или тестировании вариантов осуществления настоящего изобретения, теперь описываются предпочтительные способы, устройства и материалы. Однако перед описанием этих материалов и способов следует понимать, что эти описания являются лишь иллюстративными и не предназначены для ограничения. Также следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается описанными в настоящем описании конкретными размерами, формами, размерностями, методологиями, протоколами и т.д., так как они могут варьироваться в соответствии с рутинным экспериментированием и оптимизацией. Также следует понимать, что терминология, используемая в описании, предназначена только для цели описания конкретных версий или вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения.
[0033] Описание каждой публикации, патента или заявки на патент, указанные в этом описании изобретения, конкретно полностью включено в настоящем описании посредством ссылки. Однако ничто в настоящем описании не следует понимать как признание того, что это изобретение не дает права на датирование задним числом такого раскрытия на основании предыдущего изобретения.
Если нет другого определения, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же самое значение, что и значение, как правило, понимаемое специалистом в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. В случае противоречия, данное описание изобретения, в том числе определения, будет служить контролем. Кроме того, эти материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.
[0034] I. Определения
Как используют в настоящем описании, если конкретно не указано иное, термины в форме единственного числа означают "по меньшей мере один".
Термины "выделенный" и "очищенный", используемые в отношении вещества (например, пептида, антитела, полинуклеотида и т.д.), указывают, что вещество является по существу свободным от по меньшей мере одного вещества, которое может еще содержаться в природном источнике. Таким образом, выделенным или очищенным пептидом называют пептид, который по существу не содержит клеточный материал, такой как углевод, липид или другие загрязняющие белки из источника клеток или ткани, из которого получен пептид, или по существу не содержит химических предшественников или других химических веществ при химическом синтезе.
[0035] Термин "по существу не содержит клеточный материал" включает препараты пептида, в которых пептид отделен от клеточных компонентов тех клеток, из которых он изолирован или рекомбинантно получен. Таким образом, пептид, который по существу не содержит клеточный материал, включает препараты полипептида, содержащие менее чем приблизительно 30%, 20%, 10% или 5% (в расчете на сухую массу) гетерологичного белка (также называемого "загрязняющим белком"). При рекомбинантно получаемом пептиде, он также предпочтительно по существу не содержит культуральной среды, которая включает препараты пептида с культуральной средой в количестве приблизительно 20%, 10% или 5% объема этого пептидного препарата. При получении пептида химическим синтезом, он предпочтительно по существу не содержит химических предшественников или других химических веществ, включающих препараты пептида с химическими предшественниками или другими химическими веществами, участвующими в синтезе этого пептида, в количестве менее чем приблизительно 30%, 20%, 10%, 5% (в расчете на сухую массу) объема этого пептидного препарата. То, что конкретный пептидный препарат содержит выделенный или очищенный пептид, может быть показано, например, появлением единственной полосы после электрофореза препарата белка в (ДСН)-полиакриламидном геле и окрашиванием Кумасси бриллиантовым синим или т.п.этого геля. В одном предпочтительном варианте осуществления пептиды и полинуклеотиды по настоящему изобретению являются выделенными или очищенными.
[0036] Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются в настоящем описании взаимозаменяемо для ссылки на полимер аминокислотных остатков. Термины применяют к аминокислотным полимерам, в которых один или более аминокислотных остатков представляют собой модифицированный остаток(-и) или не встречающийся в природе остаток, такой как искусственный химический миметик соответствующей встречающейся в природе аминокислоты(-от), а также к встречающимся в природе полимерам аминокислот.
Термин "олигопептид", используемый иногда в этом описании изобретения, используется для ссылки на пептиды, которые имеет длину 20 аминокислотных остатков или менее, как правило, 15 аминокислотных остатков или менее и, как правило, состоят из от приблизительно 8 до приблизительно 11 аминокислотных остатков, часто из 9 или 10 аминокислотных остатков. Последний называют в настоящем описании "нонапептидом" и "декапептидом", соответственно.
[0037] Термин "аминокислота" в данном контексте относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, а также аминокислотным аналогам и миметикам аминокислот, которые функционируют сходно с встречающимися в природе аминокислотами. Аминокислоты могут представлять собой L-аминокислоты или D-аминокислоты. Встречающиеся в природе аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые в генетическом коде, а также аминокислоты, модифицированные после трансляции в клетках (например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и O-фосфосерин). Фраза "аналог аминокислот" относится к соединениям, которые имеют одну и ту же базовую химическую структуру (альфа-углерод, связанный с водородом, карбоксигруппу, аминогруппу и R-группу), что и встречающаяся в природе аминокислота, но имеют модифицированную R-группу или модифицированные скелеты макромолекулы (например, гомосерин, норлейцин, метионин, сульфоксид, метионинметилсульфоний). Фраза "миметики аминокислот" относится к химическим соединениям, которые имеют отличающиеся структуры, но сходные с основными аминокислотами функции.
Аминокислоты в настоящем описании могут быть обозначены их общеизвестными трехбуквенными символами или однобуквенными символами, рекомендуемыми IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission.
[0038] Термины "ген", "полинуклеотид", "олигонуклеотид" и "нуклеиновая кислота" используются в настоящем описании взаимозаменяемо, и если конкретно не указано иное, называются с использованием их общепринятых однобуквенных кодов.
Термины "средство", "вещество" и "композиция" используются в настоящем описании взаимозаменяемо в отношении продукта, который содержит указанные ингредиенты в указанных количествах, а также любого продукта, который происходит прямо или косвенно из комбинации указанных ингредиентов в указанных количествах. Такой термин при использовании в отношении модификации "фармацевтической" (как в "фармацевтическом средстве" и "фармацевтической композиции") предназначен включать продукт, в том числе активный ингредиент(-ы) и инертный ингредиент(-ы), которые составляют этот носитель, а также любой продукт, который происходит прямо или косвенно из объединения, комплексообразования или агрегации любых двух или более ингредиентов, или из диссоциации одного или более ингредиентов, или из других типов реакций или взаимодействий одного или более ингредиентов. Таким образом, в контексте настоящего изобретения термины "фармацевтическое средство" и "фармацевтическая композиция" относятся к любому продукту, получаемому смешиванием молекулы или соединения по настоящему изобретению и фармацевтически или физиологически приемлемого носителя.
[0039] Термин "активный ингредиент" в настоящем описании относится к веществу в средстве или композиции, которое является биологически или физиологически активным. В частности, в контексте фармацевтического средства или композиции, термин "активный ингредиент" относится к веществу компонента, которое проявляет объективный фармакологический эффект. Например, в случае фармацевтических средств или композиций для использования в лечении или профилактике злокачественной опухоли, активные ингредиенты в средствах или композициях могут приводить по меньшей мере к одному биологическому или физиологическому действию на злокачественные клетки и/или ткани прямо или опосредованно. Предпочтительно, такое действие может включать уменьшение или ингибирование роста злокачественных клеток, повреждение или цитолиз злокачественных клеток и/или тканей и т.д. Как правило, непрямым действием активных ингредиентов является индукция CTL, распознающих или вызывающих цитолиз злокачественных клеток. Перед составлением "активный ингредиент" может также называться "основной массой", "лекарственным веществом" или "техническим продуктом".
[0040] Фраза "фармацевтически приемлемый носитель" или "физиологически приемлемый носитель", как используют в настоящем описании, означает фармацевтически или физиологически приемлемый материал, композицию, вещество или носитель, включая, но, не ограничиваясь ими, жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, растворитель или инкапсулирующий материал.
Некоторые фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению находят конкретное применение в качестве вакцин. В контексте настоящего изобретения фраза "вакцина" (также обозначаемая как "иммуногенная композиция") относится к средству или композиции, которые обладают действием улучшать, усиливать и/или индуцировать противоопухолевый иммунитет после инокуляции животным.
[0041] Если не указано иное, термин "злокачественная опухоль" относится к злокачественным опухолям или опухолям, в которых сверхэкспрессируется ген TOPK, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, острый миелоидный лейкоз (AML), рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, рак желудка диффузного типа, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и опухоль мягких тканей.
[0042] Если не указано иное, термины "цитотоксический Т-лимфоцит", "цитотоксическая Т-клетка" и "CTL" используются в настоящем описании взаимозаменяемо и, если не указано иное, относятся к подгруппе Т-лимфоцитов, которые способны распознавать не-свои клетки (например, опухолевые клетки, инфицированные вирусом клетки) и индуцировать гибель таких клеток.
[0043] Если не указано иное, термин "HLA-A24" относится к типу HLA-A24, содержащему подтипы, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, HLA-A*2401, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2404, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2420, HLA-A*2425 и HLA-A*2488.
Если не указано иное, термин "HLA-A2", в данном контексте, относится репрезентативно к подтипам, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0213, HLA-A*0216, HLA-A*0218, HLA-A*0219, HLA-A*0228 и HLA-A*0250.
[0044] Если не указано иное, термин "набор" используется в данном контексте по отношению к комбинации реагентов и других материалов. В настоящем описании предусматривается, что набор может содержать микроэррей (микрочип), чип, маркер и т.д. Не предполагают, что термин "набор" ограничен конкретной комбинацией реагентов и/или материалов.
[0045] Как используют в настоящем описании, по отношению к индивидууму или пациенту фраза "HLA-антигеном индивидуума (или пациента) является HLA-A24 или HLA-A2" относится к индивидууму или пациенту, гомозиготно или гетерозиготно имеющему ген антигена HLA-A2 4 или HLA-A2, в качестве молекулы МНС (главного комплекса гистосовместимости) класса I, и антиген HLA-A24 или антиген HLA-А2-антиген экспрессируется в клетках этого индивидуума или пациента в виде HLA-антигена.
[004 6] В тех случаях, когда способы и композиции по настоящему изобретению находят применение для "лечения" злокачественной опухоли, лечение считается "эффективным", если оно приводит к клинической эффективности, такой как уменьшение экспрессии гена TOPK, уменьшение размера, распространенности или метастатического потенциала злокачественной опухоли у индивидуума, замедление прогрессирования злокачественной опухоли, ослабление клинического симптома злокачественной опухоли, увеличение времени выживания, подавления послеоперационного рецидива рака и т.д. При профилактическом применении лечения "эффективное" означает, что лечение замедляет или предотвращает возникновение злокачественной опухоли или предотвращает, или облегчает клинический симптом злокачественной опухоли. Эффективность определяют любым известным способом диагностики или лечения конкретного типа опухоли.
[0047] В тех случаях, когда способы и композиции по настоящему изобретению находят применение для "предотвращения" и "профилактики" злокачественной опухоли, такие термины в настоящем описании используются взаимозаменяемо в отношении любой активности, которая уменьшает смертность и заболеваемость, связанные с заболеванием. Предотвращение и профилактика могут проходить "на первичном, вторичном и третичном уровнях предотвращения". В то время как первичные предотвращение и профилактика устраняют возможность развития заболевания, вторичный и третичный уровни предотвращения и профилактики включают активности, направленные на предотвращение и профилактику прогрессирования заболевания и появления симптомов, а также уменьшение отрицательного действия уже установившегося заболевания посредством восстановления функции и уменьшения связанных с заболеванием осложнений. Альтернативно, предотвращение и профилактика могут включать в себя широкий диапазон профилактических способов лечения, направленных на облегчение тяжести конкретного нарушения, например, уменьшение пролиферации и метастазирования опухолей.
[0048] В контексте настоящего изобретения лечение и/или профилактика злокачественной опухоли, и/или профилактики послеоперационного рецидива рака включают любую из следующих стадий, таких как хирургическое удаление злокачественных клеток, ингибирование роста злокачественных клеток, инволюция или регресс опухоли, индукция ремиссии и подавление частоты возникновения злокачественной опухоли, регрессия опухоли и снижение или ингибирование метастазирования. Эффективное лечение и/или профилактика злокачественной опухоли уменьшает смертность и улучшает прогноз у индивидуумов, страдающих злокачественной опухолью, снижает уровни опухолевых маркеров в крови и ослабляет детектируемые симптомы, сопутствующие злокачественной опухоли. Например, эффективное лечение включает уменьшение или улучшение симптомов, и/или профилактика включает 10%, 20%, 30% или большее уменьшение или достижение стабильного состояния заболевания.
[0049] В контексте настоящего изобретения термин "антитело" относится к иммуноглобулинам и их фрагментам, которые являются специфически реактивными в отношении указанного белка или его пептида. Антитело может включать антитела человека, приматизированные антитела, химерные антитела, биспецифические антитела, гуманизированные антитела, антитела, слитые с другими белками или радиоактивными метками, и фрагменты антител. Кроме того, антитело в настоящем описании используется в самом широком смысле и конкретно охватывает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные по меньшей мере из двух интактных антител и фрагментов антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность. "Антитело" означает все классы (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM).
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же самое значение, что и значение, как правило, понимаемое специалистом в области, к которой принадлежит настоящее изобретение.
[0050] II. Пептиды
Пептиды по настоящему изобретению, описанные подробно ниже, могут называться "пептидом(-ами) TOPK" или "полипептидом(-ами) TOPK".
Для демонстрации того, что пептиды, получаемые из TOPK, функционируют как антиген, распознаваемый CTL, пептиды, получаемые из TOPK (SEQ ID NO: 86), анализировали для определения, являлись ли они антигенными эпитопами, рестриктированными по HLA-A2 4 или HLA-A2, с которыми, как правило, встречаются аллели HLA (Date Y. et al., Tissue Antigens, 47: 93-101, 1996; Kondo A. et al., J. Immunol., 155: 4307-12, 1995; Kubo R.T. et al., J. Immunol., 152: 3913-24, 1994).
[0051] Кандидаты HLA-A24-связывающих пептидов, получаемых из TOPK, идентифицируемые на основании их аффинностей связывания с HLA-A24, включают:
TOPK-А24-9-230 (SEQ ID NO: 2), TOPK-А24-9-130 (SEQ ID NO: 3), TOPK-А24-9-237 (SEQ ID NO: 4), TOPK-A24-9-155 (SEQ ID NO: 5), TOPK-A24-9-232 (SEQ ID NO: 6), TOPK-A24-9-174 (SEQ ID NO: 7), TOPK-A24-9-73 (SEQ ID NO: 8), TOPK-A24-9-235 (SEQ ID NO: 9), TOPK-A24-9-19 (SEQ ID NO: 10), TOPK-A24-9-205 (SEQ ID NO: 11), TOPK-A24-9-77 (SEQ ID NO: 12), TOPK-A24-9-270 (SEQ ID NO: 13), TOPK-A24-9-58 (SEQ ID NO: 14), TOPK-A24-9-81 (SEQ ID NO: 15), TOPK-A24-9-278 (SEQ ID NO: 16), TOPK-A24-9-183 (SEQ ID NO: 17), TOPK-A24-9-227 (SEQ ID NO: 18), TOPK-A24-9-13 (SEQ ID NO: 19), TOPK-A24-9-146 (SEQ ID NO: 20), TOPK-A24-9-140 (SEQ ID NO: 21), TOPK-A24-9-103 (SEQ ID NO: 22), TOPK-A24-9-105 (SEQ ID NO: 23), TOPK-A24-9-118 (SEQ ID NO: 24), TOPK-A24-10-31 (SEQ ID NO: 25), TOPK-A24-10-155 (SEQ ID NO: 26), TOPK-A24-10-288 (SEQ ID NO: 27), TOPK-A24-10-289 (SEQ ID NO: 28), TOPK-A24-10-130 (SEQ ID NO: 29), TOPK-A24-10-47 (SEQ ID NO: 30), TOPK-A24-10-73 (SEQ ID NO: 31), TOPK-A24-10-102 (SEQ ID NO: 32), TOPK-A24-10-39 (SEQ ID NO: 33), TOPK-A24-10-4 (SEQ ID NO: 34), TOPK-A24-10-77 (SEQ ID NO: 35), TOPK-A24-10-241 (SEQ ID NO: 36), TOPK-A24-10-12 (SEQ ID NO: 37), TOPK-A24-10-148 (SEQ ID NO: 38), TOPK-A24-10-145 (SEQ ID NO: 39) и TOPK-A24-10-114 (SEQ ID NO: 40).
[0052] Из указанных выше следующие ниже пептиды приводили к успешному получению CTL после стимуляции in vitro Т-клеток дендритными клетками (DC), нагруженными такими пептидами:
TOPK-А24-9-230 (SEQ ID NO: 2), TOPK-А24-9-130 (SEQ ID NO: 3), TOPK-А24-9-232 (SEQ ID NO: 6), TOPK-A24-10-288 (SEQ ID NO: 27) и TOPK-A24-10-289 (SEQ ID NO: 28).
[0053] Кандидаты HLA-А2-свызывающих пептидов, получаемых из TOPK, идентифицированных на основании их аффинностей связывания с HLA-A2, включают:
TOPK-А2-9-240 (SEQ ID NO: 42), TOPK-А2-9-34 (SEQ ID NO: 43), TOPK-А2-9-236 (SEQ ID NO: 44), TOPK-A2-9-19 (SEQ ID NO: 45), TOPK-A2-9-134 (SEQ ID NO: 46), TOPK-A2-9-183 (SEQ ID NO: 47), TOPK-A2-9-81 (SEQ ID NO: 48), TOPK-A2-9-149 (SEQ ID NO: 49), TOPK-A2-9-235 (SEQ ID NO: 50), TOPK-A2-9-12 (SEQ ID NO: 51), TOPK-A2-9-227 (SEQ ID NO: 52), TOPK-A2-9-285 (SEQ ID NO: 53), TOPK-A2-9-47 (SEQ ID NO: 54), TOPK-А2-9-310 (SEQ ID NO: 55), TOPK-A2-9-132 (SEQ ID NO: 56), TOPK-A2-9-242 (SEQ ID NO: 57), TOPK-A2-9-156 (SEQ ID NO: 58), TOPK-A2-9-138 (SEQ ID NO: 59), TOPK-A2-9-142 (SEQ ID NO: 60), TOPK-A2-10-190 (SEQ ID NO: 61), TOPK-A2-10-236 (SEQ ID NO: 62), TOPK-A2-10-231 (SEQ ID NO: 63), TOPK-A2-10-47 (SEQ ID NO: 64), TOPK-A2-10-234 (SEQ ID NO: 65), TOPK-A2-10-239 (SEQ ID NO: 66), TOPK-A2-10-290 (SEQ ID NO: 67), TOPK-A2-10-37 (SEQ ID NO: 68), TOPK-A2-10-20 (SEQ ID NO: 69), TOPK-A2-10-241 (SEQ ID NO: 70), TOPK-A2-10-272 (SEQ ID NO: 71), TOPK-A2-10-88 (SEQ ID NO: 72), TOPK-A2-10-81 (SEQ ID NO: 73), TOPK-A2-10-313 (SEQ ID NO: 74), TOPK-A2-10-54 (SEQ ID NO: 75), TOPK-A2-10-142 (SEQ ID NO: 76), TOPK-A2-10-35 (SEQ ID NO: 77), TOPK-A2-10-110 (SEQ ID NO: 78), TOPK-A2-10-223 (SEQ ID NO: 79), TOPK-A2-10-274 (SEQ ID NO: 80), TOPK-A2-10-173 (SEQ ID NO: 81), TOPK-A2-10-141 (SEQ ID NO: 82), TOPK-A2-10-292 (SEQ ID NO: 83) и TOPK-A2-10-180 (SEQ ID NO: 84).
[0054] Из указанных выше следующие ниже пептиды приводили к успешному получению CTL после стимуляции in vitro Т-клеток дендритными клетками (DC), нагруженными такими пептидами:
TOPK-А02-9-240 (SEQ ID NO: 42), TOPK-А02-9-19 (SEQ ID NO: 45), TOPK-А02-9-183 (SEQ ID NO: 47), TOPK-A02-9-235 (SEQ ID NO: 50), TOPK-A02-9-12 (SEQ ID NO: 51), TOPK-A02-9-285 (SEQ ID NO: 53), TOPK-A02-9-47 (SEQ ID NO: 54), TOPK-A02-10-236 (SEQ ID NO: 62), TOPK-A02-10-231 (SEQ ID NO: 63), TOPK-A02-10-47 (SEQ ID NO: 64), TOPK-A02-10-239 (SEQ ID NO: 66), TOPK-A02-10-272 (SEQ ID NO: 71), TOPK-A02-10-88 (SEQ ID NO: 72) и TOPK-A02-10-142 (SEQ ID NO: 76).
[0055] Указанные выше получаемые CTL проявляли сильную специфическую CTL-активность против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующими пептидами. Эти результаты демонстрируют, что TOPK является антигеном, распознаваемым CTL, и что пептиды являются пептидами-эпитопами TOPK, рестриктированными по HLA-A24 или HLA-A2; таким образом, такие пептиды могут представлять являться эффективными в качестве антигенов-мишеней для цитотоксичности, опосредуемой CTL.
[0056] Поскольку ген TOPK сверхэкспрессируется в злокачественных клетках и тканях, включающих, например, такие как AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, колоректальный рак, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почки, SCLC и опухоль мягких тканей, и не экспрессируется в большинстве нормальных органов, он представляет собой хорошую мишень для иммунотерапии. Таким образом, настоящее изобретение относится к нонапептидам (пептидам, состоящим из девяти аминокислотных остатков) и декапептидам (пептидам, состоящим из десяти аминокислотных остатков), соответствующим CTL-распознаваемым эпитопам из TOPK. Особенно предпочтительные примеры нонапептидов и декапептидов по настоящему изобретению включают в себя пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2-40 и 42-84.
[0057] Как правило, для расчета аффинностей связывания между различными пептидами и HLA-антигенами in silico можно использовать программы пакета программного обеспечения, доступные в настоящее время, например, в Интернете, такие как описанные у Parker K.С. et al., J. Immunol., 1994 Jan 1, 152(1): 163-75 и Nielsen M. et al., Protein. Sci., 2003; 12: 1007-17. Аффинность связывания с HLA-антигенами можно измерять, как описано, например, у Parker K.С. et al., J. Immunol., 1994 Jan 1, 152(1): 163-75; и Kuzushima K. et al., Blood, 2001, 98(6): 1872-81, Larsen M.V. et al., BMC Bioinformatics, 2007 Oct 31; 8: 424, Buus S. et al., Tissue Antigens, 62:378-84, 2003, Nielsen M. et al., Protein Sci., 2003; 12: 1007-17 и Nielsen M. et al., PLoS ONE, 2007; 2: e796, которые кратко изложены, например, у Lafuente Е.М. et al., Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220. Способы для определения аффинности связывания описаны, например, в Journal of Immunological Methods (1995, 185: 181-190) и Protein Science (2000, 9: 1838-1846). Таким образом, можно легко использовать такие программы для отбора фрагментов, получаемых из TOPK, которые имеют высокую связывающую аффинность с антигенами HLA, с использованием таких программ. Таким образом, настоящее изобретение относится к пептидам, состоящие из любых фрагментов, получаемых из TOPK, которые можно определять по связыванию HLA-антигенов посредством таких известных программ. Кроме того, такие пептиды могут включать пептид, состоящий из полноразмерной последовательности TOPK.
[0058] Пептиды по настоящему изобретению, в частности, нонапептиды и декапептиды по настоящему изобретению, могут быть фланкированы дополнительными аминокислотными остатками при условии, что получаемые пептиды сохраняют свою способность к индукции CTL. Конкретные дополнительные аминокислотные остатки могут состоять из любого типа аминокислот при условии, что они не уменьшают способность к индукции CTL исходного пептида. Таким образом, настоящее изобретение также относится к пептидам, обладающим способностью к индукции CTL, в частности пептидам, получаемым из TOPK (например, пептидам, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27, 28, 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 или 76). Такие пептиды содержат, например, менее приблизительно 40 аминокислот, часто даже менее приблизительно 20 аминокислот, как правило, приблизительно менее 15 аминокислот.
[0059] Общеизвестно, что модификация одной или более аминокислот в пептиде не влияет на функцию этого пептида или, в некоторых случаях, даже увеличивает желаемую функцию исходного белка. Фактически, известно, что модифицированные пептиды (т.е. пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, в которой 1, 2 или несколько аминокислотных остатков были модифицированы (т.е. являются замененными, добавленными, удаленными и/или введенными) по сравнению с исходной эталонной последовательностью), сохраняют биологическую активность исходного пептида (Mark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81:5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res., 1982, 10:6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, 79:6409-13). Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пептиды по настоящему изобретению обладают способностью к индукции CTL и содержат аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2-40 и 42-84, в которой одна, две или даже более аминокислот являются добавленными, удаленными, введенными и/или замененными. Другими словами, пептиды по настоящему изобретению обладают способностью к индукции CTL и содержат аминокислотную последовательность, в которой одна, две или несколько аминокислот являются замененными, удаленными, введенными и/или добавленными в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2-40 и 42-84, при условии, что модифицированные пептиды сохраняют способность к индукции CTL исходного пептида.
[0060] Специалистам в данной области понятно, что индивидуальные модификации (т.е. удаления, введения, добавления или замены) аминокислотной последовательности, которые изменяют одну аминокислоту или небольшой процент от всей аминокислотной последовательности, как правило, приводит к сохранению свойств боковой цепи исходной аминокислоты. Таким образом, они часто называются "консервативными заменами" или "консервативными модификациями", в которых изменение белка приводит к модифицированному белку, имеющему функцию, аналогичную функции исходного белка. Таблицы консервативных замен, предоставляющие функционально сходные аминокислоты, известны в данной области. Примеры характеристик боковых цепей аминокислот, которые желательно сохранять, включают, например, гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, С, E, Q, G, Н, K, S, Т) и боковые цепи, имеющие следующие функциональные группы или характеристики в целом: алифатическую боковую цепь (G, А, V, L, I, P); гидроксильную группу, содержащую боковую цепь (S, Т, Y); атом серы, содержащий боковую цепь (C, M); карбоксильную кислоту и амидсодержащую боковую цепь (D, N, E, Q); содержащую основание боковую цепь (R, K, Н) и содержащую ароматическую группу боковую цепь (Н, F, Y, W). Кроме того, каждые из следующих восьми групп содержат аминокислоты, которые являются приемлемыми в области консервативных заменами друг для друга:
1) аланин (А), глицин (G);
2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E);
3) аспарагин (N), глутамин (Q);
4) аргинин (R), лизин (K);
5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V);
6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W);
7) серии (S), треонин (T); и
8) цистеин (C), метионин (M) (см., например, Creighton, Proteins 1984).
[0061] Считается также, что такие консервативно модифицированные пептиды являются пептидами по настоящему изобретению. Однако пептиды по настоящему изобретению не ограничиваются ими и могут содержать неконсервативные модификации при условии, что получаемый модифицированный пептид сохраняет способность к индукции CTL исходного немодифицированного пептида. Кроме того, модифицированные пептиды не должны исключать способные к индукции CTL пептиды, получаемые из полиморфных вариантов, межвидовых гомологов и аллелей TOPK.
[0062] Аминокислотные остатки можно вводить, заменять и/или добавлять к пептидам по настоящему изобретению или, альтернативно, аминокислотные остатки можно удалять из них для получения более высокой аффинности связывания. Для сохранения необходимой способности к индукции CTL можно модифицировать (т.е. удалять, вводить, добавлять и/или заменять) только небольшое число (например, 1, 2 или несколько) или небольшой процент аминокислот. В настоящем описании термин "несколько" означает 5 или менее аминокислот, например, 4 или 3, или менее. Процент аминокислот, которые необходимо модифицировать, составляет предпочтительно 20% или менее, более предпочтительно 15% или менее, даже более предпочтительно 10% или менее, например, 1-5%.
[0063] При использовании в отношении иммунотерапии злокачественной опухоли пептиды по настоящему изобретению должны быть презентированы на поверхности клетки или экзосомы предпочтительно в виде комплекса с HLA-антигеном. Таким образом, предпочтительно выбирать пептиды, которые не только индуцируют CTL, а также обладают высокой аффинностью связывания с HLA-антигеном. С этой целью пептиды можно модифицировать заменой, введением, удалением и/или добавлением аминокислотных остатков для получения модифицированного пептида, имеющего улучшенную аффинность связывания. Вследствие того, что регулярность последовательностей пептидов, представляемых посредством связывания с HLA-антигенами, уже известна (J. Immunol., 1994, 152: 3913; Immunogenet ics, 1995, 41: 178; J. Immunol., 1994, 155: 4307) наряду с пептидами, которые встречаются в природе, в иммуногенные пептиды по настоящему изобретению можно вводить модификации, основанные на такой регулярности.
[0064] Например, пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с HLA-A24, как правило, содержат вторую аминокислоту от N-конца, замененную фенилаланином, тирозином, метионином или триптофаном. Аналогично, пептиды, в которых C-концевая аминокислота заменена фенилаланином, лейцином, изолейцином, триптофаном или метионином, как правило, обладают высокой аффинностью связывания с HLA-A24. Таким образом, желательной может являться замена второй аминокислоты от N-конца фенилаланином, тирозином, метионином или триптофаном и/или замена аминокислоты на С-конце лейцином, изолейцином, триптофаном или метионином для повышения аффинности связывания с HLA-A24. Таким образом, пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2-40 (в частности, SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27 и 28), в которой вторая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO, заменена фенилаланином, тирозином, метионином или триптофаном, и/или в которой С-конец аминокислотной последовательности SEQ ID NO заменен фенилаланином, лейцином, изолейцином, триптофаном или метионином, находятся в объеме настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение относится к пептидам, содержащим аминокислотную последовательность, в которой один, два или несколько аминокислот являются замененными, удаленными, введенными и/или добавленными в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2-40 (в частности, SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27 и 28), где такие пептиды обладают одной или обеими следующими характеристиками: (a) вторая аминокислота от N-конца представляет собой фенилаланин, тирозин, метионин или триптофан, и (b) C-концевая аминокислота представляет собой фенилаланин, лейцин, изолейцин, триптофан или метионин. В предпочтительных вариантах осуществления пептиды по настоящему изобретению содержат аминокислотную последовательность, в которой вторую аминокислоту от N-конца заменяют фенилаланином, тирозином, метионином или триптофаном, и/или C-концевую аминокислоту заменяют фенилаланином, лейцином, изолейцином, триптофаном или метионином в аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 2-40 (в частности, SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27 и 28).
[0065] Аналогично, пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с HLA-A2, как правило, содержат вторую аминокислоту от N-конца, замененную лейцином или метионином, и/или аминокислоту на С-конце, замененную валином или лейцином. Альтернативно, для повышения аффинности связывания с HLA-A2 желательной может являться замена второй аминокислоты от N-конца лейцином или метионином, и/или на С-конце валином или лейцином. Таким образом, пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 42-84 (в частности, SEQ ID NO: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 76), в которой вторую аминокислоту от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO заменяют лейцином или метионином, и/или в которой С-конец аминокислотной последовательности SEQ ID NO заменен валином или лейцином, находятся в объеме настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение относится к пептидам, содержащим аминокислотную последовательность, в которой одна, две или несколько аминокислот являются замененными, удаленными, введенными и/или добавленными в аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 42-84 (в частности, SEQ ID NO: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 76), где такие пептиды обладают одной или обеими следующими характеристиками: (a) вторая аминокислота от N-конца представляет собой лейцин или метионин, и (b) C-концевая аминокислота представляет собой валин или лейцин. В предпочтительных вариантах осуществления пептиды по настоящему изобретению содержат аминокислотную последовательность, в которой вторую аминокислоту от N-конца заменяют лейцином или метионином, и/или C-концевую аминокислоту заменяют валином или лейцином в аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 42-84 (в частности, SEQ ID NO: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 76).
(264-272)
(369-377)
(209-217)
[0066] Замены можно вводить не только в концевые аминокислоты, а также в положении потенциального распознавания пептидов T-клеточного рецептора (TCR). Несколько исследований продемонстрировали, что пептид с аминокислотными заменами может являться равным или лучшим, чем исходный белок, например, САР1, р53, Her-2/neu или gp100 (Zaremba et al. Cancer Res., 57, 4570-4577, 1997, Т.К. Hoffmann et al., J. Immunol., (2002) Feb 1; 168 (3): 1338-4 7., S.O. Dionne et al., Cancer Immunol. Immunother., (2003) 52: 199-206 и S.O. Dionne et al., Cancer Immunology Immunotherapy, (2004) 53, 307-314).
[0067] Настоящее изобретение также предусматривает добавление одной, двух или нескольких аминокислот к N- и/или С-концу пептидов по настоящему изобретению. Такие модифицированные пептиды, обладающие способностью к индукции CTL, также находятся в объеме настоящего изобретения.
[0068] Например, настоящее изобретение относится к выделенному пептиду с длиной менее чем 15, 14, 13, 12, 11 или 10 аминокислот, который обладает способностью к индукции CTL и содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(i) аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 2-24 и 42-60,
(ii) аминокислотной последовательности, в которой 1, 2 или несколько аминокислот являются модифицированными в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-4 и 42-60, где пептид обладает способностью индуцировать цитотоксический Т-лимфоцит,
(iii) аминокислотной последовательности (ii), где в отношении HLA-A24 аминокислотная последовательность обладает одной или обеими следующими характеристиками:
(a) вторая аминокислота от N-конца указанных SEQ ID NO представляет собой или является модифицированной, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из фенилаланина, тирозина, метионина и триптофана, и
(b) C-концевая аминокислота указанных SEQ ID NO представляет собой или является модифицированной, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, триптофана и метионина, и
(iv) аминокислотной последовательности (ii), где в отношении HLA-A2 аминокислотная последовательность обладает одной или обеими следующими характеристики:
(c) вторая аминокислота от N-конца указанной SEQ ID NO представляет собой или является модифицированной, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из лейцина и метионина, и
(d) C-концевая аминокислота указанной SEQ ID NO представляет собой или является модифицированной, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из валина и лейцина.
[0069] Кроме того, настоящее изобретение также относится к выделенному пептиду с длиной менее чем 15, 14, 13, 12 или 11 аминокислот, который обладает способностью к индукции CTL и содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(i') аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 25-40 и 61-84,
(ii') аминокислотной последовательности, в которой 1, 2 или несколько аминокислот являются модифицированными в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25-40 и 61-84, где пептид обладает способностью индуцировать цитотоксический Т-лимфоцит,
(iii') аминокислотной последовательности (i'), где в отношении HLA-A24 аминокислотная последовательность обладает одной или обеими следующими характеристиками:
(a') вторая аминокислота от N-конца указанных SEQ ID NO представляет собой или является модифицированной, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из фенилаланина, тирозина, метионина и триптофана, и
(b’) C-концевая аминокислота указанных SEQ ID NO представляет собой или является модифицированной, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, триптофана и метионина.
[0070] (iii') аминокислотной последовательности (i'), где в отношении HLA-A2 аминокислотная последовательность обладает одной или обеими следующими характеристиками:
(с') вторая аминокислота от N-конца указанных SEQ ID NO представляет собой или является модифицированной, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из лейцина и метионина, и
(d') C-концевая аминокислота указанных SEQ ID NO представляет собой или является модифицированной, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из валина и лейцина.
[0071] Эти пептиды связываются с HLA-антигенами на APC, чтобы презентироваться на APC в виде комплекса с HLA-антигеном, когда такие пептиды приводят в контакт с APC. Альтернативно, такие пептиды вводят в APC и процессируют до фрагментов, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из (i)-(iv) и (i')-(iv') в APC, чтобы презентироваться на APC в виде комплексов с HLA-антигенами, когда такие пептиды приводят в контакт с APC. Таким образом, индуцируют CTL, специфические к таким пептидам.
[0072] Однако, когда пептидная последовательность является идентичной части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка, имеющего отличающуюся функцию, могут быть индуцированы отрицательные побочные эффекты, такие как аутоиммунные нарушения и/или аллергические симптомы против конкретных веществ. Таким образом, желательным может являться сначала проведение исследования гомологии с использованием доступных баз данных во избежание ситуаций, в которых последовательность пептида совпадает с аминокислотной последовательностью другого белка. Когда из исследования гомологии становится ясно, что не существует в природе пептида, идентичного или содержащего отличия в 1 или 2 аминокислоты по сравнению с целевым пептидом, целевой пептид можно модифицировать для повышения его аффинности связывания с HLA-антигенами и/или для повышения его способности к индукции CTL без какого-либо риска таких побочных эффектов.
[0073] Хотя ожидается, что пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с HLA-антигенами, как описано выше, являются высоко эффективными, пептиды-кандидаты, которые выбраны в соответствии с наличием высокой аффинности связывания в качестве индикатора, в дальнейшем анализируют на наличие способности к индукции CTL. В настоящем описании фраза "способность к индукции CTL" означает способность пептида индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) при презентации его на антигенпрезентирующих клетках (APC). Кроме того, "способность к индукции CTL" включает способность пептида индуцировать активацию CTL, пролиферацию CTL, стимулировать лизис CTL клеток-мишеней и увеличивать продукцию IFN-гамма посредством CTL.
51
[0074] Подтверждение способности к индукции CTL проводят индукцией APC (антигенпрезентирующих клеток), несущих МНС-антигены человека (например, В-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток (DC)), или более конкретно DC, получаемых из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, и после стимуляции APC тестируемыми пептидами, смешиванием APC с CD8-положительными Т-клетками для индукции CTL, а затем измерением IFN-гамма, продуцируемого и высвобождаемого CTL против клеток-мишеней. В качестве реакционной системы можно использовать трансгенных животных, которые получали для экспрессии HLA-антигена человека (например, такие, как описанные у BenMohamed L., Krishnan R., Longmate J., Auge C, Low L., Primus J., Diamond D.J., Hum. Immunol., 2000, 61 (8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response). Альтернативно, клетки-мишени можно радиоактивно метить Cr и т.п., и можно рассчитывать цитотоксическую активность CTL из радиоактивности, высвобождаемой из этих клеток-мишеней. Альтернативно, способность к индукции CTL можно оценивать измерением продуцирования и высвобождения IFN-гамма CTL в присутствии антигенпрезентирующих клеток (APC), которые несут иммобилизованные пептиды, и визуализацией зоны ингибирования на среде с использованием моноклональных антител против IFN-гамма.
[0075] В результате исследования способности к индукции CTL пептидов, как описано выше, было обнаружено, что нонапептиды или декапептиды, выбранные из пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, указанную SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27, 28, 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 76, проявляли особенно высокую способность к индукции CTL, а также высокую аффинность связывания с HLA-антигеном. Таким образом, эти пептиды проиллюстрированы как предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения.
[0076] Кроме того, исследования гомологии показали, что такие пептиды не имеют значимой гомологии с пептидами, получаемыми из каких-либо других известных продуктов генов человека. Таким образом, вероятность неизвестных или нежелательных иммунных реакций, возникающих при использовании для иммунотерапии, снижается. Таким образом, также из этого аспекта, эти пептиды являются пригодными для индукции иммунитета против TOPK у пациентов, страдающих злокачественной опухолью. Таким образом, предпочтительные примеры пептидов по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27, 28, 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 76, и их модифицированные пептиды.
[0077] Как указано выше, пептиды по настоящему изобретению обладают способностью индуцировать CTL, специфический к TOPK. Например, пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27 и 28, или их модифицированные пептиды обладают способностью индуцировать CTL, который может проявлять специфическую цитотоксическую активность против клетки, презентирующей пептид, получаемый из TOPK, посредством HLA-A24 (например, клеток, экспрессирующих TOPK и HLA-A24). Примеры таких клеток включают HLA-A24-положительные злокачественные клетки. Аналогично, пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 76, или их модифицированные пептиды обладают способностью индуцировать CTL, который может проявлять специфическую цитотоксическую активность против клеток, презентирующих пептид, получаемый из TOPK посредством HLA-A2 (например, клеток, экспрессирующих TOPK и HLA-A2). Примеры таких клеток включают HLA-А2-положительные злокачественные клетки.
[0078] Наряду с описанными выше модификациями пептиды по настоящему изобретению также можно связывать с другими пептидами при условии, что получаемый связанный пептид сохраняет необходимую способность к индукции CTL исходного пептида, и более предпочтительно также сохраняет необходимую способность связывания с HLA. Примеры подходящих "других" пептидов включают: пептиды по настоящему изобретению или способные к индукции CTL пептиды, получаемые из других ТАА. Пептид по настоящему изобретению можно связывать с "другими" пептидами через линкер прямо или опосредованно. Подходящие межпептидные линкеры хорошо известны в данной области и включают, например, AAY (P.M. Daftarian et al., J. Trans. Med., 2007, 5:26), AAA, NKRK (R.P. M. Sutmuller et al., J. Immunol., 2000, 165: 7308-7315) или K (S. Ota et al., Can. Res., 62, 1471-1476, K.S. Kawamura et al., J. Immunol., 2002, 168: 5709-5715).
[0079] Например, не-TOPK-опухолеассоциированные антигенные пептиды также можно использовать последовательно или одновременно для повышения иммунной реакции посредством HLA класса I и/или класса II. Хорошо установлено, что злокачественные клетки экспрессируют более одного опухолеассоциированного гена. Таким образом, в объеме общепринятого экспериментирования специалист в данной области может определять, экспрессируются ли конкретного индивидуума дополнительные опухолеассоциированные гены, и затем вводить связывающие HLA класса I и/или HLA класса II пептиды, получаемые из продуктов экспрессии таких генов, в фармацевтические композиции или вакцины по настоящему изобретению.
[0080] Некоторые из связывающих HLA класса I и/или HLA класса II пептидов известны специалисту в данной области (например, см. Coulie, Stem Cells, 13:393-403, 1995), и можно их использовать в настоящем изобретении подобным способом, как способами, описанным в настоящем описании. Таким образом, специалист в данной области может легко получать полипептиды, включающая один или более пептидов TOPK и один или более пептидов не-TOPK, или нуклеиновые кислоты, кодирующие такие полипептиды, стандартными способами молекулярной биологии.
[0081] Описанные выше связанные пептиды называют в настоящем описании "политопами", т.е. группами из двух или более потенциально иммуногенных или стимулирующих иммунную реакцию пептидов, которые могут быть соединены вместе в различных расположениях (например, в виде цепочки, с перекрыванием). Политоп (или нуклеиновая кислота, кодирующая этот эпитоп) можно вводить в стандартный протокол иммунизации, например, животным для тестирования эффективности политопа при стимуляции, усилении и/или вызывании иммунной реакции.
[0082] Пептиды могут быть соединены вместе непосредственно или посредством использования фланкирующих последовательностей с образованием политопов, и применение политопов в качестве вакцин хорошо известно в данной области (см., например, Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 (13):5845-5849, 1995; Gilbert et al., Nature Biotechnol., 15(12):1280-1284, 1997; Thomson et al., J Immunol., 157 (2): 822-826, 1996; Tarn et al., J. Exp. Med., 171(1):299-306, 1990). Политопы, содержащие различные количества и различные комбинации эпитопов, можно получать и тестировать в отношении распознавания цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL) и в отношении эффективности повышения иммунной реакции.
[0083] Пептиды по настоящему изобретению также можно связывать с другими веществами, при условии, что получаемый связанный пептид сохраняет необходимую способность к индукции CTL исходного пептида. Примеры подходящих веществ включают, например: пептиды, липиды, сахар и цепи Сахаров, ацетильные группы, природные и синтетические полимеры и т.д. Пептиды могут содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление или фосфорилирование боковой цепи и т.д., при условии, что модификации не нарушают биологическую активность исходного пептида. Эти типы модификаций можно проводить для придания дополнительных функций (например, функции нацеливания и функции доставки) или для стабилизации пептида.
[0084] Например, в данной области известно, что для увеличения стабильности полипептида in vivo вводят D-аминокислоты, миметики аминокислот или неприродные аминокислоты; эта концепция может быть также адаптирована для пептидов по настоящему изобретению. Стабильность пептида можно анализировать рядом способов. Например, пептидазы и различные биологические среды, такие как плазма и сыворотка человека, можно использовать для тестирования стабильности (см., например, Verhoef et al., Eur. J. Drag. Metab. Pharmacoki., 1986, 11: 291-302).
[0085] Кроме того, как отмечалось выше, среди модифицированных пептидов, в которых 1, 2 или несколько аминокислотных остатков заменены, удалены, введены или добавлены, пептиды, имеющие ту же самую или более высокую активность по сравнению с исходными пептидами, можно подвергать скринингу или отбору. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу скрининга или отбора модифицированных пептидов, имеющих ту же самую или более высокую активность по сравнению с исходными пептидами. Иллюстративный способ включает стадии:
a: модификации (замены, удаления, введения или добавления) по меньшей мере одного аминокислотного остатка пептида по настоящему изобретению,
b: определения активности пептида, и
c: отбора пептида, имеющего ту же самую или более высокую активность по сравнению с исходным пептидом.
[0086] В предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу скрининга пептида, обладающего способностью индуцировать CTL, который обладает специфической цитотоксической активностью против клетки, которая презентирует фрагмент, получаемый из TOPK, где способ включает стадии:
(i) предоставления последовательности-кандидата, состоящей из аминокислотной последовательности, модифицированной заменой, удалением, введением и/или добавлением одного, двух или нескольких аминокислотных остатков к исходной аминокислотной последовательности, где исходная аминокислотная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27, 28, 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 76;
(ii) отбора последовательности-кандидата, которая не имеет по существу значительной гомологии (или идентичности последовательности) с пептидами, получаемыми из любых известных продуктов генов человека, отличных от TOPK;
(iii) приведения пептида, состоящего из последовательности-кандидата, отобранной на стадии (ii), в контакт с антигенпрезентирующей клеткой;
(iv) приведения антигенпрезентирующей клетки стадии (c) в контакт с CD8-положительной Т-клеткой, и
(v) идентификации пептида, способность к индукции CTL которого является такой же, как у пептида, состоящего из исходной аминокислотной последовательности, или более высокой.
В настоящем описании активность, которую необходимо оценивать, может включать активность связывания с МНС, APC или способность к индукции CTL и цитотоксическую активность. Предпочтительно активность пептида, которую необходимо оценивать, представляет собой способность к индукции CTL.
[0087] III. Получение пептидов TOPK
Пептиды по настоящему изобретению можно получать хорошо известными способами. Например, пептиды можно получать синтетически с использованием технологии рекомбинантных ДНК или химического синтеза. Пептиды по настоящему изобретению можно синтезировать индивидуально или в виде более длинных полипептидов, состоящих из двух или более пептидов. Затем можно выделять пептиды, то есть очищать или выделять таким образом, чтобы они по существу не содержали других природных белков клетки-хозяина и их фрагментов или любых других химических веществ.
[0088] Пептиды по настоящему изобретению могут содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление или фосфорилирование боковой цепи, при условии, что такие модификации не нарушают биологическую активность исходного пептида. Другие иллюстративные модификации включают введение одной или более D-аминокислот или других миметиков аминокислот, которые можно использовать, например, для увеличения полупериода выведения из сыворотки пептидов.
[0089] Пептид по настоящему изобретению можно получать химическим синтезом на основе выбранной аминокислотной последовательности. Примеры общепринятого пептидного синтеза, которые можно адаптировать для синтеза, включают:
(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;
(iii) Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1975;
(iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1985;
(v) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese), Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991;
(vi) W099/67288, и
(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118.
[0090] Альтернативно, пептиды по настоящему изобретению можно получать, адаптируя любые известные способы генетической инженерии для получения пептидов (например, Morrison J., J. Bacteriology, 1977, 132:349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds Wu et al.) 1983, 101:347-62). Например, сначала получают подходящий вектор, несущий полинуклеотид, кодирующий целевой мишень в экспрессируемой форме (например, после регуляторной последовательности, соответствующей последовательности промотора), и трансформируют подходящую клетку-хозяина. Затем эту клетку-хозяина культивируют для получения представляющего интерес пептида. Пептид также можно получать in vitro адаптацией системы трансляции in vitro.
[0091] IV. Полинуклеотиды
Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, которые кодируют любой из указанных выше пептидов по настоящему изобретению. Эти полинуклеотиды включают полинуклеотиды, получаемые из природного гена TOPK (например, номер доступа GenBank NM_018492 (SEQ ID NO: 85)), а также полинуклеотидам с консервативно модифицированной своей нуклеотидной последовательностью. В настоящем описании фраза "консервативно модифицированная нуклеотидная последовательность" относится к последовательностям, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности. Вследствие вырожденности генетического кода, большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот кодируют любой конкретный белок. Например, все кодоны GCA, GCC, GCG и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, где аланин указан кодоном, кодон может быть изменен на любой из соответствующих описанных кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот являются "молчащими вариациями", которые являются одним из видов консервативно модифицированных вариаций. В настоящем описании каждая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептид, также описывает каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области будет понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который, как правило, является единственным кодоном для метионина, и TGG, который, как правило, является единственным кодоном для триптофана) можно модифицировать с получением функционально идентичной молекулы. Таким образом, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептид, полностью описана в каждой предоставленной последовательности.
Полинуклеотид по настоящему изобретению может состоять из ДНК, РНК и их производных. Как хорошо известно в данной области, ДНК соответственно состоит из оснований, таких как А, Т, С и G, и Т заменен на U в РНК. Специалисту в данной области будет понятно, что основания, не встречающиеся в природе, также можно вводить в полинуклеотиды.
[0092] Полинуклеотид по настоящему изобретению может кодировать многие пептиды по настоящему изобретению с промежуточными аминокислотными последовательностями между ними или без них. Например, промежуточная аминокислотная последовательность может обеспечивать участок расщепления (например, последовательность, распознаваемую ферментом) полинуклеотида или транслируемых пептидов. Кроме того, полинуклеотид может содержать любые дополнительные последовательности в кодирующей последовательности, кодирующей пептид по настоящему изобретению. Например, полинуклеотид может представлять собой рекомбинантный полинуклеотид, который содержит регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии этого пептида, или может представлять собой экспрессирующий вектор (плазмиду) с маркерными генами и т.п. Как правило, такие рекомбинантные полинуклеотиды можно получать манипуляцией полинуклеотидов общепринятыми способами рекомбинации с использованием, например, полимераз и эндонуклеаз.
[0093] Как рекомбинантные способы, так и способы химического синтеза можно использовать для получения полинуклеотидов по настоящему изобретению. Например, полинуклеотид можно получать встраиванием в подходящий вектор, который может экспрессироваться при трансфицировании в компетентную клетку. Альтернативно, полинуклеотид можно амплифицировать способами ПЦР или экспрессией в подходящих хозяевах (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Альтернативно, полинуклеотид можно синтезировать твердофазными способами, как описано у Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 4 8:2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3:801-5.
[0094] V. Экзосомы
Настоящее изобретение дополнительно относится к внутриклеточным везикулам, называемые экзосомами, которые презентируют комплексы, образованные пептидами по настоящему изобретению и HLA-антигенами, на своей поверхности. Экзосомы можно получать, например, способами, подробно описанными в публикации патентной заявки Японии (Kohyo) №№ Hei 11-510507 и WO 99/03499, и можно получать с использованием APC, получаемых у пациентов, которые подвергаются лечению и/или профилактике. Экзосомы по настоящему изобретению можно инокулировать в виде вакцины аналогичным образом, как пептиды по настоящему изобретению.
[0095] Тип HLA-антигенов, содержащихся в этих комплексах, должен соответствовать типу HLA-антигенов индивидуума, требующего лечения и/или профилактики. Например, в японской популяции часто преобладают HLA-A2 4 или HLA-A2, в частности HLA-А*2402 и HLA-A*0201, и HLA-A*0206, и, таким образом, они будут подходящими для лечения японских пациентов. Применение типа HLA-А24, который является высоко экспрессируемым среди японцев и индивидуумов, принадлежащих к Индо-Европейской расе, является благоприятным для получения эффективных результатов, а также применение находят подтипы, такие как HLA-A*2402, HLA-A*0201 и HLA-A*0206. Как правило, в клинике тип HLA-антигена пациента, которому необходимо лечения, исследуют заранее, что позволяет сделать подходящий выбор пептидов, имеющих высокие уровни аффинности связывания с конкретным антигеном или имеющих способность к индукции CTL, посредством презентации антигена. Кроме того, для получения пептидов, обладающих высокой аффинностью связывания и способностью к индукции CTL, можно проводить замену, введение, удаление или добавление 1, 2 или нескольких аминокислот на основании аминокислотной последовательности природного неполного пептида TOPK.
[0096] Когда экзосома по настоящему изобретению в качестве антигена содержит тип HLA-A24, конкретное применение находят пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2-40 (в частности SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27 и 28).
Альтернативно, когда экзосома по настоящему изобретению в качестве антигена содержит тип HLA-A2, конкретное применение находят пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 42 до 84 (в частности SEQ ID NO: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 76).
[0097] В некоторых вариантах осуществления экзосомы по настоящему изобретению представляют собой экзосомы, которые презентирут комплекс пептида по настоящему изобретению и антигена HLA-A2 4 или HLA-A2 на своей поверхности. В иллюстративных вариантах осуществления экзосома по настоящему изобретению презентирует комплекс пептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27 или 28, (или его модифицированный пептид) и HLA-A24 на своей поверхности. В других вариантах осуществления экзосома по настоящему изобретению презентирует комплекс пептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 или 76 (или его модифицированный пептид) и HLA-A2 на своей поверхности.
[0098] VI. Антигенпрезентирующие клетки (APC)
Настоящее изобретение также относится к выделенным антигенпрезентирующим клеткам (APC), которые презентируют на своей поверхности комплексы, образованные между HLA-антигенами и пептидами по настоящему изобретению. APC можно получать у пациентов, которых подвергают лечению и/или профилактике, и их можно вводить в виде вакцин сами по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, содержащими пептиды, экзосомы или CTL по настоящему изобретению.
[0099] APC не ограничены конкретным видом клеток. Примеры включают, но не ограничиваются ими, дендритные клетки (DC), клетки Лангерганса, макрофаги, B-клетки и активированные T-клетки, для которых известно, что они презентируют белковые антигены на своей клеточной поверхности таким образом, чтобы их распознавали лимфоциты. Поскольку DC являются репрезентативными APC, имеющей самую сильную CTL-индуцирующую активность среди APC, DC предпочтительно можно использовать в качестве APC по настоящему изобретению.
[0100] Например, APC по настоящему изобретению можно получать индукцией DC из моноцитов периферической крови, а затем приведением (стимулированием) их в контакт с пептидами по настоящему изобретению in vitro, ex vitro или in vivo. При введении пептидов по настоящему изобретению индивидуумам, в организме индивидуума индуцируются APC, которые презентируют пептиды по настоящему изобретению. Фраза "индукция APC" включает контактирование (стимуляцию) антигенпрезентирующей клетки с пептидами по настоящему изобретению или нуклеотидами, кодирующими пептид по настоящему изобретению в антигенпрезентирующей клетке для того, чтобы APC презентировали комплекс, образованный между HLA-антигенами и пептидами по настоящему изобретению на ее поверхности. Например, APC по настоящему изобретению можно получать путем сбора APC у индивидуума после введения одного или более пептидов по настоящему изобретению индивидууму. Альтернативно, APC по настоящему изобретению можно получать путем приведения APC, собранных у индивидуума, в контакт с пептидом по настоящему изобретению.
[0101] APC по настоящему изобретению можно вводить индивидууму для индукции иммунной реакции против злокачественной опухоли у индивидуума сами по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, содержащими пептиды, экзосомы или CTL по настоящему изобретению. Например, введение ex vivo может включать стадии:
a: сбора APC у первого индивидуума;
b: приведения в контакт APC стадии a с пептидом и
c: введения APC стадии b второму индивидууму.
[0102] Первый индивидуум и второй индивидуум могут представлять собой одного и того же индивидуума или могут представлять собой различных индивидуумов. APC, получаемые на стадии b, можно составлять и вводить вакцину для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, такой как рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, CML, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфома, остеосаркома, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, SCLC, опухоль мягких тканей и опухоль половых клеток яичка, но не ограничиваются ими.
[0103] В контексте настоящего изобретения можно использовать один или более пептидов по настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции для индукции антигенпрезентирующей клетки. Способ или процесс получения фармацевтической композиции для индукции антигенпрезентирующей клетки предоставлен в настоящем описании и предпочтительно включает стадию смешивания или составления пептида по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем.
[0104] Настоящее изобретение также относится к использованию пептида по настоящему изобретению для индукции антигенпрезентирующей клетки.
По одному из аспектов настоящего изобретения APC по настоящему изобретению обладают способностью к индукции CTL. В отношении APC фраза "способность к индукции CTL" относится к способности APC индуцировать CTL при контактировании с CD8-положительной Т-клеткой. Кроме того, "способность к индукции CTL" включает способность APC индуцировать активацию CTL, пролиферацию CTL, способствовать опосредуемому CTL лизису клетки-мишени и повышать продукцию IFN-гамма CTL. В частности, APC по настоящему изобретению обладают способностью индуцировать CTL, специфические к TOPK.
[0105] Такие APC, имеющие высокий уровень способности к индукции CTL, можно получать способом, который включает стадию переноса полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в APC in vitro, а также способом, упомянутым выше. Вводимые полинуклеотиды могут находиться в форме ДНК или РНК. Примеры способов введения включают без конкретных ограничений различные способы, общепринято применяемые в данной области, такие как липофекция, электропорация и способ с использованием фосфата кальция. Более конкретно, это может выполнять, как описано в Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J. Immunol., 1998, 161: 5607-13; J. Exp. Med., 1996, 184: 465-72; опубликованном переводе на японский международной публикации №2000-509281. При переносе гена, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в APC, ген подвергается транскрипции, трансляции и т.д. в клетке, а затем получаемый белок процессируется МНС класса I или класса II, и проходит через путь презентации до рассматриваемых пептидов по настоящему изобретению. Альтернативно, APC по настоящему изобретению можно получать способом, который включает стадию приведения в контакт APC с пептидом по настоящему изобретению.
[0106] В некоторых вариантах осуществления APC по настоящему изобретению представляют собой APC, которые презентируют комплексы антигена HLA-A2 4 или HLA-A2 и пептида по настоящему изобретению на своей поверхности. В иллюстративных вариантах осуществления APC по настоящему изобретению презентирует комплекс пептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27 или 28, (или его модифицированного пептида) и HLA-A2 4 на своей поверхности. В других вариантах осуществления APC по настоящему изобретению презентирует комплекс пептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 или 76, (или его модифицированного пептида) и HLA-A2 на своей поверхности.
[0107] VII. Цитотоксические Т-лимфоциты (CTL)
CTL (цитотоксический Т-лимфоцит), индуцированный против любого из пептидов по настоящему изобретению, усиливает иммунную реакцию, направленную на злокачественные клетки in vivo, и, таким образом, его может использовать в качестве вакцин аналогичны образом, как пептидам per se. Таким образом, настоящее изобретение относится к выделенным CTL, которые являются специфически индуцированными или активированными любым из пептидов по настоящему изобретению.
[0108] Такие CTL (цитотоксические T-клетки) можно получать (1) введением пептида(-ов) по настоящему изобретению индивидууму, (2) приведением в контакт (стимулированием) in vitro получаемых у индивидуума APC и CD8-положительных клеток или мононуклеарных лейкоцитов периферической крови с пептидом(-ами) по настоящему изобретению, (3) приведением в контакт in vitro CD8-положительных клеток или мононуклеарных лейкоцитов периферической крови с APC или экзосомами, презентирующими комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению на своей поверхности или (4) введением полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих субъединицы T-клеточного рецептора (TCR), которые могут образовывать TCR, обладающий способностью связываться с комплексом HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению на своей поверхности. Такие APC или экзосомы для способа (3) можно получать способами, описанными выше. Подробное описание способа (4) описано ниже в разделе "VIII. T-клеточный рецептор (TCR)".
[0109] CTL по настоящему изобретению можно получать у пациентов, которые подвергаются лечению и/или профилактике, и их можно вводить сами по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, содержащими пептиды, APC или экзосомы для регулирующего действия. Получаемые CTL действуют специфически против клеток-мишеней, презентирующих пептиды по настоящему изобретению, или, например, аналогичные пептиды, используемые для индукции. Клетки-мишени могут представлять собой клетки, которые эндогенно экпрессируют TOPK, такие как злокачественные клетки, или клетки, которые являются трансфицированными в геном совместно с геном TOPK, и клетки, в качестве мишеней атаки активированного CTL также могут служить клетки, которые презентируют пептид по настоящему изобретению на клеточной поверхности вследствие стимуляции пептидом.
[0110] В некоторых вариантах осуществления CTL по настоящему изобретению могут распознавать клетки, презентирующие комплексы антигенов HLA-A2 4 или HLA-A2 и пептида по настоящему изобретению. В отношении CTL фраза "распознают клетку" относится к связыванию комплекса антигена HLA-A2 4 или HLA-A2 и пептида по настоящему изобретению на клеточной поверхности через его TCR и проявлению специфической цитотоксической активности против клетки. В настоящем описании "специфической цитотоксической активностью" относится к проявлению цитотоксической активности против клетки, презентирующей комплекс антигена HLA-A24 или HLA-А2 и пептида по настоящему изобретению, но не против других клеток. Таким образом, CTL, которые проявляют специфическую цитотоксическую активность против клетки, презентирующей пептид по настоящему изобретению, входят в объем настоящего изобретения.
[0111] В иллюстративных вариантах осуществления CTL по настоящему изобретению может распознавать клетку, презентирующую пептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27 или 28, (или его модифицированный пептид) через HLA-А24. В предпочтительных вариантах осуществления такой CTL по настоящему изобретению может распознавать клетку, экспрессирующую TOPK и HLA-A24, (например, HLA-A24-положительную злокачественную клетку).
В других вариантах осуществления CTL по настоящему изобретению может распознавать клетку, презентирующую пептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 или 76, (или его модифицированный пептид), через HLA А2. В предпочтительных вариантах осуществления такой CTL по настоящему изобретению может распознавать клетку, экспрессирующую TOPK и HLA-A2 (например, HLA-А2-положительную злокачественную клетку).
[0112] VIII. T-клеточный рецептор (TCR)
Настоящее изобретение также относится к композиции, которая содержит один или более полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, которые способны формировать субъединицу T-клеточного рецептора (TCR), и к способам ее применения. Такие субъединицы TCR обладают способностью формировать TCR, которые придают специфичность Т-клеткам против опухолевых клеток, экспрессирующих TOPK. Известными в данной области способами можно идентифицировать полинуклеотид, кодирующий каждую из альфа- и бета-цепей в виде субъединиц TCR CTL, индуцированного пептидами по настоящему изобретению, (WO 2007/032255 и Morgan R.A. et al., J. Immunol., 171, 3287 (2003)). Например, способ ПЦР является предпочтительным для анализа TCR. Праймеры ПЦР для анализа могут представлять собой, например, 5'-R праймеры (5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3') (SEQ ID NO: 87) в качестве 5'-концевого праймера и праймеры к 3-TRa-C (5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3') (SEQ ID NO: 88), специфичные к C-области альфа-цепи TCR, праймеры к 3-TRb-C1 (5'-tcagaaatcctttctcttgac-3') (SEQ ID NO: 89), специфичные к C1-области бета-цепи TCR или праймеры к 3-TRbeta-C2 (5'-ctagcctctggaatcctttctctt-3') (SEQ ID NO: 90), специфичные к C2-области бета-цепи TCR в качестве 3'-концевых праймеров, но не ограничиваются ими. Производные TCR могут связываться с высокой авидностью с клетками-мишенями, презентирующими пептид TOPK, и необязательно опосредовать эффективный цитолиз клеток-мишеней, презентирующих пептид TOPK, in vivo и in vitro.
[0113] Полинуклеотид/полинуклеотиды, кодирующие субъединицы TCR (т.е. полинуклеотид, кодирующий обе субъединицы TCR, или полинуклеотиды, кодирующие каждую из субъединиц TCR) можно вводить в подходящие векторы, например, ретровирусные векторы. Эти векторы хорошо известны в данной области. Полинуклеотиды или содержащие их векторы можно эффективно переносить в Т-клетку (например, CD8-положительную Т-клетку). Предпочтительно настоящее изобретение относится к готовой к использованию композиции, обеспечивающей возможность быстрой модификации собственных Т-клеток пациента (или Т-клеток другого млекопитающего), для быстрого и простого получения модифицированных Т-клеток, обладающих превосходными свойствами цитолиза злокачественных клеток.
[0114] Конкретные TCR против пептидов по настоящему изобретению должны специфически распознавать комплекс пептида по настоящему изобретению и HLA-антигена, обеспечивающий специфическую активность Т-клеток против клеток-мишеней, презентирующих комплекс с пептида по настоящему изобретению и HLA-антигена, когда TCR экспрессируется на поверхности T-клетки. Необходимую активность можно подтверждать известными способами, в которых CTL, получаемый введением полинуклеотида(-ов), кодирующих такие субъединицы TCR, может специфически распознавать такие клетки-мишени. Предпочтительные примеры о способа включают, например, тетрамерный анализ с использованием молекул и пептид HLA по настоящему изобретению и анализ ELISPOT. Анализом ELISPOT можно подтверждать, что CTL, получаемые способом, как описано выше, могут специфически распознавать клетки-мишени, и что сигналы, возникающие в результате такого распознавания, передаются внутриклеточно. Кроме того, известным способом можно подтверждать, что CTL, получаемые способом, описанным выше, обладают специфической цитотоксической активностью против клеток-мишеней. Примеры таких способов включают, например, анализ высвобождения хрома с использованием клеток, экспрессирующих TOPK и HLA-A2 4 или HLA-A2.
[0115] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к CTL, которые получают трансдукцией полипептидом/полипептидами, кодирующими полипептиды субъединицы TCR, (т.е. полинуклеотидом, кодирующим субъединицы TCR или полинуклеотиды, кодирующие такие субъединицы TCR), где TCR, образуемый такими субъединицами TCR, может связываться с комплексом пептида TOPK, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2-40, и антиген HLA-A24 на клеточной поверхности, или может связываться с комплексом пептида TOPK, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 42-84, и антигена HLA-A2 на клеточной поверхности.
[0116] Трансдуцированные CTL способны к хомингу к злокачественным клеткам in vivo, и их можно выращивать хорошо известными способами культивирования in vitro (например, Kawakami et al., J. Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). CTL по настоящему изобретению изобретения можно использовать для получения иммуногенной композиции, пригодной для лечения или предотвращения рака у пациента, нуждающегося в терапии или защите (см. WO 2006/031221, содержание которой включено в настоящем описании посредством ссылки).
[0117] IX. Фармацевтические композиции
Поскольку экспрессия TOPK является специфически повышенной в злокачественных опухолях, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, колоректальный рак, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почки, SCLC и опухоль мягких тканей и остеосаркому, по сравнению с нормальными тканями, пептиды или полинуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать индукции иммунной реакции против злокачественных опухолей, и, таким образом, служат для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли и/или профилактики метастазирования и послеоперационного рецидива рака. Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям или средствам, которые составлены для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, и/или для профилактики послеоперационного рецидива рака, где такие композиции или средства содержат один или несколько пептидов, или полинуклеотидов по настоящему изобретению в качестве одного или нескольких активных ингредиентов. Альтернативно, пептиды по настоящему изобретению можно экспрессировать на поверхности любой из указанных выше экзосом или клеток, таких как APC, для использования в качестве фармацевтических композиций или средств. Кроме того, в качестве активного ингредиента фармацевтических композиций или средств по настоящему изобретению также можно использовать указанные выше CTL, которые направлены на любой из пептидов по настоящему изобретению.
[0118] Таким образом, настоящее изобретение относится к средствам или композициям, содержащим по меньшей мере один активный ингредиент, выбранный из:
(a) одного или более пептидов по настоящему изобретению;
(b) одного или более полинуклеотидов, кодирующих такой пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;
(c) одну или более APC или экзосом по настоящему изобретению, и
(d) один или более CTL по настоящему изобретению.
[0119] Фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению также находят применение в качестве вакцины. В контексте настоящего изобретения фраза "вакцина" (также обозначаемая "иммуногенной композицией") относится к средству или композиции, которая обладает функцией индукции противоопухолевого иммунитета после инокуляции животного. Другими словами, настоящее изобретение относится к фармацевтическим средствам и композициям для индукции иммунной реакции у индивидуума.
[0120] Фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли и/или профилактики послеоперационного рецидива рака или рецидива метастазирования у индивидуумов или пациентов. Примеры таких индивидуумов включают людей, а также других млекопитающих, включая, но, не ограничиваясь ими, мышей, крыс, морских свинок, кроликов, кошек, собак, овец, коз, свиней, крупный рогатый скот, лошадей, обезьян, бабуинов и шимпанзе, особенно коммерчески важных животных или одомашненных животных. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению можно составлять для введения индивидууму, у которого HLA-антиген представляет собой HLA-A24 или HLA-A2.
[0121] В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к использованию активного ингредиента в производстве фармацевтической композиции или средства для лечения и/или профилактике злокачественной опухоли или опухоли и/или профилактики послеоперационного рецидива рака, где указанный активный ингредиент выбран из:
(a) пептида по настоящему изобретению;
(b) полинуклеотида, кодирующего такой пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;
(c) APC, презентирующей пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;
(d) экзосомы, презентирующей пептид по настоящему изобретению на своей поверхности, и
(e) цитотоксической T-клетки по настоящему изобретению.
[0122] Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к активному ингредиенту для применения в любом из или в обоих типах из лечения и профилактики злокачественных опухолей или опухолей и/или профилактики послеоперационного рецидива рака, где указанный активный ингредиент выбран из:
(a) пептида по настоящему изобретению;
(b) полинуклеотида, кодирующего такой пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;
(c) APC, презентирующей пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;
(d) экзосомы, презентирующей пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и
(e) цитотоксической T-клетки по настоящему изобретению.
[0123] Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к способу или процессу получения фармацевтической композиции или средства для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли или опухоли и/или профилактики послеоперационного рецидива рака, где способ или процесс включает стадию составления фармацевтически или физиологически приемлемого носителя с активным ингредиентом, выбранным из:
(a) пептида по настоящему изобретению;
(b) полинуклеотида, кодирующего такой пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;
(c) APC, презентирующей пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;
(d) экзосомы, презентирующей пептид по настоящему изобретению на своей поверхности, и
(e) цитотоксической T-клетки по настоящему изобретению.
[0124] В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к способу или процессу получения фармацевтической композиции или средства для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли или опухоли и/или профилактики послеоперационного рецидива рака, где способ или процесс включает стадии смешивания активного ингредиента с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем, где активный ингредиент выбран из:
(a) пептида по настоящему изобретению;
(b) полинуклеотида, кодирующего такой пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;
(c) APC, презентирующей пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;
(d) экзосомы, презентирующей пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и
(e) цитотоксической T-клетки по настоящему изобретению.
[0125] В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к способу лечения и/или профилактики злокачественной опухоли или опухоли и/или профилактики послеоперационного рецидива рака, где способ включает стадию введения индивидууму по меньшей мере одного активного ингредиента, выбранного из:
(a) пептида по настоящему изобретению;
(b) полинуклеотида, кодирующего такой пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме;
(c) APC, презентирующей пептид по настоящему изобретению на своей поверхности;
(d) экзосомы, презентирующей пептид по настоящему изобретению на своей поверхности; и
(e) цитотоксической T-клетки по настоящему изобретению.
[0126] По настоящему изобретению пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2-40, могут представлять собой рестриктированные по HLA-A24 пептиды-эпитопы. Среди этих пептидов пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27 и 28, могут эффективно индуцировать сильную и специфическую иммунную реакцию у индивидуума против злокачественной опухоли, экспрессирующей HLA-A24 и TOPK. Аналогично, пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 42-84, могут представлять собой рестриктированные по HLA-A2 пептиды-эпитопы. Среди этих пептидов пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 76, могут эффективно индуцировать сильную и специфическую иммунную реакцию у индивидуума против злокачественной опухоли, экспрессирующей HLA-A2 и TOPK. Таким образом, фармацевтические композиции или средства, которые содержат любой из пептидов с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 2-40 (в частности SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27 и 28), и их модифицированные пептиды являются особенно пригодными для введения индивидуумам, у которых HLA-антиген представляет собой HLA-A24. Аналогично, фармацевтические композиции или средства, которые содержат любой из пептидов с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 42-84 (в частности SEQ ID NO: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 76), их модифицированные пептиды являются особенно пригодными для введения индивидуумам, у которых HLA-антиген представляет собой HLA-A2. То же самое относится к фармацевтическим композициям или средствам, которые содержат полинуклеотиды, кодирующие любой из этих пептидов (т.е. полинуклеотиды по настоящему изобретению).
[0127] Злокачественные опухоли, подлежащие лечению фармацевтическими композициями или средствами по настоящему изобретению, включают все типы злокачественных опухолей, где участвует TOPK, включая, но, не ограничиваясь ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, колоректальный рак, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почки, SCLC и опухоль мягких тканей.
[0128] Фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению в дополнение к указанным выше активным ингредиентам могут содержать другие пептиды, которые обладают способностью индуцировать CTL против злокачественных клеток, другие полинуклеотиды, кодирующие другие пептиды, другие клетки, которые презентируют другие пептиды, и т.п. Примеры таких "других" пептидов, обладающих способностью индуцировать CTL против злокачественных клеток, включают, но не ограничиваются ими, специфические для злокачественной опухоли антигены (например, идентифицированные TAA).
[0129] При необходимости фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению могут необязательно содержать другие терапевтические вещества в качестве дополнительного активного ингредиента при условии, что вещество не ингибирует и противоопухолевый эффект активного ингредиента, например, любого из пептидов по настоящему изобретению. Например, составов могут содержать противовоспалительные вещества, болеутоляющие средства, химиотерапевтические средства и т.п. Наряду с введением других терапевтических веществ в само лекарственное средство лекарственные средства по настоящему изобретению также можно вводить последовательно или одновременно с одним или более другими фармакологическими композициями. Количества лекарственного средства и фармакологической композиция зависят, например, от того, какой тип фармакологической композиции(-ий) используют, от подлежащего лечению заболевания и от схемы и путей введения.
[0130] Специалистам в данной области понятно, что наряду с ингредиентами, в частности указанными в настоящем описании, фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению могут содержать другие вещества общепринятые в данной области в зависимости от типа рассматриваемого состава (например, наполнители, связывающие средства, разбавители, эксципиенты и т.д.).
[0131] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению могут содержаться в промышленных изделиях и наборах, содержащих вещества, пригодные для лечения подлежащего лечению состояния заболевания, например, злокачественной опухоли. Промышленное изделие может содержать контейнер с любой из фармацевтических композиций или средств по настоящему изобретению с этикеткой. Подходящие контейнеры включают бутылки, флаконы и тестов пробирки. Контейнеры могут быть выполнены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Этикетка на контейнере должна указывать композицию или средство, которое используют для лечения или профилактики одного или более состояний заболевания. Этикетка также может содержать инструкции по введению и т.д.
[0132] В дополнение к описанному выше контейнеру набор, содержащий фармацевтическую композицию или средство по настоящему изобретению, может необязательно дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый разбавитель. Он может дополнительно содержать другие вещества, желательные с коммерческой или пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыш в упаковку с инструкциями по применению.
Фармацевтические композиции или средства при желании можно упаковывать в упаковку или дозирующее устройство, которое может содержать одну или более стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка может, например, содержать металлическую фольгу или полимерную пленку, такую как блистерная упаковка. Упаковка или дозирующее устройство может содержать инструкции по введению.
[0133] (1) Фармацевтические средства или композиции, содержащие пептиды в качестве активного ингредиента
Пептиды по настоящему изобретению можно вводить непосредственно в виде фармацевтической композиция или средства или при необходимости можно составить общепринятыми способами составления. В последнем случае в дополнение к пептидам по настоящему изобретению при необходимости можно вводить носители, эксципиенты и такие носители, которые, как правило, используют для лекарственных средств, без конкретных ограничений. Примеры таких носителей включают, но не ограничиваются ими, стерилизованную воду, физиологический раствор, фосфатный буфер, культуральную жидкость и т.д. Кроме того, фармацевтические композиции или средства могут по мере необходимости содержать стабилизаторы, суспензии, консерванты, поверхностно-активные вещества и т.д. Фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению можно использовать для противораковой терапии.
[0134] Пептиды по настоящему изобретению можно получать в виде комбинации, состоящей из двух или более пептидов по настоящему изобретению, для индукции CTL in vivo. Комбинация пептидов может находиться в форме коктейля или и пептиды можно конъюгировать друг с другом стандартными способами. Например, пептиды можно химически связывать или экспрессировать в виде одной слитой полипептидной последовательности. Пептиды в комбинации могут являться одинаковыми или различными. В результате введения пептидов по настоящему изобретению пептиды презентируются в высокой плотности HLA-антигенами на APC, затем индуцируются CTL, которые специфически взаимодействуют с комплексом, образованным презентируемым пептидов и HLA-антигеном. Альтернативно, APC (например, DC) получают у индивидуумов, а затем стимулируют пептидами по настоящему изобретению для получения APC, которые презентируют любой из пептидов по настоящему изобретению на своей клеточной поверхности. Эти APC повторно вводят индивидуумам для индукции CTL у индивидуумов, и в результате можно повышать агрессивность к опухолеассоцированному эндотелию.
[0135] Фармацевтические композиции или средства для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащие любой пептид по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, также могут содержать адъювант, для которого известно, что он эффективно усиливают клеточный иммунитет. Альтернативно, фармацевтические композиции или средства можно вводить совместно с активными ингредиентами или вводить путем составления в гранулы. Адъювант относится к соединению, которое усиливает иммунную реакцию против белка при совместном введении (или последовательном) с белком с иммунологической активностью. Предусматриваемые в настоящем описании адъюванты включают такие, как описанные в литературе (Clin. Microbiol. Rev., 1994, 7: 277-89). Примеры подходящих адъювантов включают, но не ограничиваются ими, фосфат алюминия, гидроксид алюминия, квасцы, холерный токсин, токсин сальмонеллы, IFA (неполный адъювант Фрейнда), CFA (полный адъювант Фрейнда), ISCOMatrix, GM-CSF, CpG, эмульсия м/в и т.п.
Кроме того, можно подходящим способом использовать липосомые составы, гранулярные составы, в которых пептид связаны с гранулами диаметром несколько микрометров, и составы, в которых липид связан с пептидом.
[0136] В другом варианте осуществления настоящего изобретения пептиды по настоящему изобретению также можно вводить в форме фармацевтически приемлемой соли. Примеры предпочтительных солей включают соли с щелочным металлом, соли с металлом, соли с органическим основанием, соли с органической кислотой (например, уксусной кислотой, муравьиной кислотой, пропионовой кислотой, фумаровой кислотой, малеиновой кислотой, янтарной кислотой, винной кислотой, лимонной кислотой, яблочной кислотой, щавелевой кислотой, бензойной кислотой, метансульфоновой кислотой и т.д.) и соли с неорганической кислотой (например, соляной кислотой, фосфорной кислотой, бромистоводородной кислотой, серной кислотой и т.д.). Как используют в настоящем описании, фраза "фармацевтически приемлемая соль" относится к таким солям, которые сохраняют биологическое действие и свойства соединений, и которые получают реакцией с неорганическими кислотами или основаниями, такими как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, лара-толуолсульфоновая кислота, салициловая кислота и т.п.
[0137] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению могут дополнительно содержать компонент, который праймирует CTL. Липиды идентифицированы как вещества, способные праймировать CTL in vivo против вирусных антигенов. Например, остатки пальмитиновой кислоты можно связывать с эпсилон- и альфа-аминогруппами остатка лизина, а затем связывать с пептидом по настоящему изобретению. Затем липидированный пептид можно вводить непосредственно в мицелле или частице, заключенной в липосоме или эмульгированной в адъюванте. В качестве другого примера праймирования липидами ответов CTL можно использовать липопротеины Е. coli, такие как трипальмитоил-S-глицерилцистеинилсерилсерин (P3CSS), ковалентно связанные подходящим пептидом, для праймирования CTL (см., например, Deres et al., Nature, 1989, 342: 561-4).
[0138] Примеры подходящих способов введения включают, но не обязательно являются ограниченными ими, пероральную, интрадермальную, подкожную, внутримышечную, внутрикостную, перитонеальную и внутривенную инъекцию или т.д. и системное введение или местное введение вблизи целевых участков (т.е. прямая инъекция). Введение можно проводить посредством однократного введения или повторно проводить посредством многократных введений. Дозу пептидов по настоящему изобретению можно регулировать соответствующим образом в соответствии с подлежащим лечению заболеванием, возрастом пациента, массой, способом введения и т.д., и, как правило, она составляет от 0,001 мг до 1000 мг, например, от 0,01 мг до 100 мг, например, от 0,1 мг до 10 мг, например, от 0,5 мг до 5 мг, и ее можно вводить однократно в период от нескольких суток до нескольких месяцев. Специалист в данной области может легко определять подходящие и оптимальные дозы.
[0139] (2) Фармацевтические средства или композиции, содержащие полинуклеотиды в качестве активного ингредиента
Фармацевтические композиции или средства по настоящему изобретению также могут содержать нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды по настоящему изобретению, в экспрессируемой форме. В настоящем описании фраза "в экспрессируемой форме" означает, что полинуклеотид при введении в клетку экспрессируется in vivo в виде полипептида, который индуцирует противоопухолевый иммунитет. В одном из иллюстративных вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты представляющего интерес полинуклеотида содержит регуляторные элементы, необходимые для экспрессии полинуклеотида.
Полинуклеотид(-ы) можно конструировать таким образом, чтобы обеспечивать стабильное встраивание в геном клетки-мишени (для описания гомологичных рекомбинантных кассетных векторов см., например, Thomas K.R. & Capecchi M.R., Cell, 1987, 51:503-12). См., например, Wolff et al., Science, 1990, 247:1465-8; патенты США №№5580859, 5589466, 5804566, 5739118, 5736524, 5679647 и WO 98/04720. Примеры технологий доставки на основе ДНК включают "голую ДНК", облегченную (опосредованную бупивакаином, полимерами, пептидами) доставку, комплексы катионных липидов и опосредованную частицами ("генную пушку") или опосредованную давлением доставку (см., например, патент США №5922687).
[0140] Пептиды по настоящему изобретению также могут экпрессироваться вирусными или бактериальными векторами. Примеры экспрессирующих векторов включают хозяев аттенуированных вирусов, таких как вирус коровьей оспы или вирус оспы кур. Этот подход включает использование вируса коровьей оспы, например, в качестве вектора для экспрессии нуклеотидных последовательностей, которые кодируют этот пептид. После введения хозяину рекомбинантный вирус коровьей оспы экспрессирует иммуногенный пептид и, таким образом, индуцирует иммунную реакцию. Векторы на основе вируса коровьей оспы и способы, пригодные для протоколов иммунизации, описаны, например, в патенте США №4722848. Другой вектор представляет собой BCG (Bacille Calmette Guerin). Векторы на основе BCG описаны у Stover et al., Nature, 1991, 351: 456-60. Известен широкий спектр других векторов, пригодных для терапевтического введения или иммунизации, например, векторы на основе аденовируса и аденоассоциированного вируса, ретровирусные векторы, векторы на основе Salmonella typhi, векторы на основе обезвреженного токсина сибирской язвы и т.п. См., например, Shata et al., Mol. Med. Today, 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J. Leukoc. Biol., 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo, 2000, 14: 571-85.
[0141] Доставка полинуклеотида пациенту может быть прямой, в случае которой пациент непосредственно подвергается воздействию несущего полинуклеотид вектора, или опосредованной, в случае которой, клетки сначала трансформируют представляющим интерес полинуклеотидом in vitro, затем клетки трансплантируют пациенту. Эти два подхода известны соответственно как виды генотерапии in vivo и ex vivo.
[0142] Для общего обзора способов генотерапии см. Goldspiel et al., Clinical Pharmacy, 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy, 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science, 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann. Rev. Biochem., 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology, 1993, 11(5): 155-215). Способы, общеизвестные в данной области технологии рекомбинантных ДНК, которые можно применять к настоящему изобретению, описаны Ausubel et al. в Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, NY, 1993), и Krieger в Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual (Stockton Press, NY, 1990).
[0143] Аналогично введению пептидов введение полинуклеотидов можно проводить посредством пероральной, интрадермальной, подкожной, внутривенной, внутримышечной, внутрикостной и/или перитонеальной инъекции или т.д., и применение находит системное введение или местное введение вблизи целевых участков. Введение можно проводить посредством однократного введения или повторного введения посредством многократных введений. Дозу полинуклеотида в подходящем носителе или клетках, трансформированных полинуклеотидом, кодирующим пептиды по настоящему изобретению, можно регулировать соответствующим образом в зависимости от подлежащего лечению заболевания, возраста пациента, массы, способа введения и т.д., и, как правило, она составляет от 0,001 мг до 1000 мг, например, от 0,01 мг до 100 мг, например, от 0,1 мг до 10 мг, например, от 0,5 мг до 5 мг, и ее можно вводить от одного раза в несколько до одного раза в несколько месяцев. Специалист в данной области может легко определять подходящие и оптимальные дозы.
[0144] X. Способы применения пептидов, полинуклеотидов, экзосом, APC и CTL
Пептиды и полинуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать для получения или индукции APC и CTL. Экзосомы и APC по настоящему изобретению также можно использовать для получения или индукции CTL. Пептиды, полинуклеотиды, экзосомы и APC можно использовать в комбинации с любыми другими соединениями при условии, что дополнительное соединения не ингибирует способность к индукции CTL. Таким образом, любую из указанных выше фармацевтических композиций или средств по настоящему изобретению можно использовать для получения или индукции CTL. Кроме того, такие соединения, содержащие пептиды или полинуклеотиды, также можно использовать для получения или индукции APC, как описано ниже.
[0145] (1) Способ индукции антигенпрезентирующих клеток (APC)
Настоящее изобретение относится к способам индукции APC высокой способностью к индукции CTL с использованием пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению.
Способы по настоящему изобретению включают стадию приведения в контакт APC с пептидами по настоящему изобретению in vitro, ex vivo или in vivo. Например, способ индукции APC ex vivo может включать стадии:
a: получения APC у индивидуума, и
b: приведения в контакт APC стадии "a" с пептидом по настоящему изобретению.
[0146] APC не являются ограниченными конкретным типом клеток. Примеры APC включают, но не ограничиваются ими, DC, клетки Лангерганса, макрофаги, В-клетки и активированные T-клетки, для которых известно, что они презентируют белковые антигены на своей клеточной поверхности таким образом, чтобы их могли распознавать лимфоциты. Предпочтительно можно использовать DC, т.к. они обладают наибольшей способностью к индукции CTL среди APC. Любой из пептидов по настоящему изобретению можно использовать сам по себе или в комбинации с другими пептидами по настоящему изобретению или индуцирующими CTL пептидами, получаемыми из ТАА, отличных от TOPK.
[0147] С другой стороны, когда пептиды по настоящему изобретению вводят индивидууму, APC приводят в контакт с пептидами in vivo, и, таким образом, индуцируют APC со способностью к индукции CTL в организме индивидуума. Таким образом, способ по настоящему изобретению может включать стадию введения пептида по настоящему изобретению индивидууму для индукции APC со способностью к индукции CTL в организме индивидуума. Аналогично, когда полинуклеотиды по настоящему изобретению вводят индивидууму в экспрессируемой форме, пептиды по настоящему изобретению экспрессируются и контактируют с APC in vivo, и, таким образом, индуцируют APC со способностью к индукции CTL в организме индивидуума. Таким образом, способы по настоящему изобретению могут включать стадию введения полинуклеотида по настоящему изобретению индивидууму для индукции APC со способностью к индукции CTL в организме индивидуума. Фраза "экспрессируемая форма" описана выше в разделе "IX. Фармацевтические средства или композиции (2) Фармацевтические средства или композиции, содержащие полинуклеотиды в качестве активного ингредиента".
[0148] Альтернативно, способы по настоящему изобретению могут включать стадию введение полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в APC для индукции APC со способностью к индукции CTL. Например, способ может включать стадии:
a: получения APC у индивидуума, и
b: введения полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в APC стадии "a".
Стадию b можно проводить, как описано выше в разделе "VI. Антигенпрезентирующие клетки".
[0149] Альтернативно, способы по настоящему изобретению могут включать стадию получения антигенпрезентирующей клетки (APC), которая может специфически индуцировать активность CTL против TOPK, посредством одной из следующих ниже стадий:
(a) приведения в контакт APC с пептидом по настоящему изобретению in vitro, ex vivo или in vivo, и
(b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в APC.
[0150] Альтернативно, способы по настоящему изобретению могут служить для индукции APC, обладающих способностью к индукции CTL, где такие способы включают стадию, выбранную из:
(a) приведения в контакт APC с пептидом по настоящему изобретению,
(b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в APC.
[0151] В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу индукции или получения APC, обладающих способностью к индукции CTL, где такой способ включает одну из следующих ниже стадий:
(a) приведения в контакт APC, экспрессирующей HLA-A24, с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из SEQID NO: 2-40 (в частности SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27 и 28), или его модифицированным пептидом in vitro, ex vivo или in vivo, и
(b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2-40 (в частности SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27 и 28), или его модифицированный пептид, в APC, экспрессирующие HLA-A2.
Индуцируемые указанным выше способом APC презентируют такие пептиды посредством HLA-A24 на своей поверхности, и могут индуцировать CTL, обладающие специфической цитотоксической активностью против клеток, экспрессирующих HLA-A24 и TOPK.
[0152] В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу введения или получения APC, обладающих способностью к индукции CTL, где такой способ включает одну из следующих ниже стадий:
(a) приведения в контакт APC, экспрессирующей HLA-A2, с пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 42-84 (в частности SEQ ID NO: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 76), или его модифицированным пептидом in vitro, ex vivo или in vivo, и
(b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: SEQ ID NO: 42-84 (в частности SEQ ID NO: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 76), или его модифицированный пептид, в APC, экспрессирующую HLA-A2.
Индуцируемые указанным выше способом APC презентируют такие пептиды посредством HLA-A2 на своей поверхности, и могут индуцировать CTL, обладающие специфической цитотоксической активностью против клеток, экпрессирующих HLA-A2 и TOPK.
[0153] Способы по настоящему изобретению можно проводить in vitro, ex vivo или in vivo. Предпочтительно способы по настоящему изобретению можно проводить in vitro или ex vivo. APC, используемые для индукции APC, обладающих способностью к индукции CTL, предпочтительно могут представлять собой APC, экспрессирующие антиген HLA-A2 4 или HLA-A2. Такие APC можно получать способами, хорошо известными в данной области, из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), получаемых у индивидуума, у которого HLA-антиген представляет собой HLA-A24 или HLA-A2. APC, индуцируемые способом по настоящему изобретению, могут представлять собой APC, которые презентируют комплекс пептида по настоящему изобретению и HLA-антигена (антигена HLA-A24 или HLA-A2) на своей поверхности. Когда APC, индуцируемые способом по настоящему изобретению, вводят индивидууму для индукции иммунных реакций против злокачественной опухоли у индивидуума, индивидуум предпочтительно представляет собой одного и тог же индивидуума, у которого получали APC. Однако индивидуум может отличного от донора APC при условии, что индивидуум обладает аналогичным типом HLA с донором APC.
[0154] В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к средствам или композициям для применения для индукции APC, обладающей способностью к индукции CTL, и такие средства или композиции содержат один или более пептидов или полинуклеотидов по настоящему изобретению.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к использованию пептида по настоящему изобретению или полинуклеотида, кодирующего пептид, в производстве средства или композиции, составленной для индукции APC.
Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно
относится к пептиду по настоящему изобретению или полипептиду, кодирующему пептид для применения для индукции APC, обладающие способностью к индукции CTL.
[0155] (2) Способ индукции CTL
Настоящее изобретение также относится к способам индукции CTL с использованием пептидов, полинуклеотидов, экзосом или APC по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение также относится к способам индукции CTL с использованием полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих полипептиды (т.е. субъединицы TCR), которые способны образовывать T-клеточный рецептор (TCR), который способен распознавать комплекс пептида по настоящему изобретению и HLA-антиген. Предпочтительно способы индукции CTL включают по меньшей мере одну стадию, выбранную из:
a: приведения в контакт CD8-положительной T-клетки с антигенпрезентирующей клеткой, которая презентирует на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению;
b: приведения в контакт CD8-положительной T-клетки с экзосомой, которая презентирует на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению, и
с: введения полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, которые способны образовывать TCR, который способен распознавать комплекс пептида по настоящему изобретению и HLA-антигена в CD8-положительной Т-клетке.
[0156] Когда пептиды, полинуклеотиды, APC или экзосомы по настоящему изобретению вводят индивидууму, в организме индивидуума индуцируются CTL, и повышается эффективность иммунной реакции, направленной на злокачественные клетки, экспрессирующие TOPK. Таким образом, вместо указанной выше стадии способы по настоящему изобретению могут включать стадию введения индивидууму пептидов, полинуклеотидов, APC или экзосом по настоящему изобретению.
[0157] Альтернативно, CTL также можно индуцировать с использованием их ex vivo или in vivo и после индукции CTL повторно вводить индивидууму активированные CTL. Например, способ может включать стадии:
a: получения APC у индивидуума,
b: приведения в контакт APC стадии "a" с пептидом по настоящему изобретению, и
c: совместного культивирования APC стадии "b" с CD8-положительными Т-клетками.
[0158] APC, которые необходимо совместно культивировать с CD8-положительными Т-клетками на указанной выше стадии, также можно получать посредством переноса полинуклеотида по настоящему изобретению в APC, как описано выше в разделе "VI. Антигенпрезентирующие клетки", хотя настоящее изобретение не ограничено этим и, таким образом, включает любые APC, которые эффективно презентируют на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению.
[0159] Необязательно можно использовать экзосому, которая презентирует на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению, вместо указанных выше APC. Таким образом, настоящее изобретение может включать стадию совместного культивирования экзосом, презентирующих на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению. Такие экзосомы можно получать способами, описанными выше в разделе "V. Экзосомы". Подходящие APC и экзосомы для способа по настоящему изобретению презентируют комплекс пептида по настоящему изобретению и HLA-A24 или HLA-A2 на своей поверхности. Например, APC или экзосома, которая презентирует комплекс HLA-A2 4 и пептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27 и 28, (или его модифицированного пептида) на своей поверхности, предпочтительно можно использовать для индукции CTL, обладающего специфической цитотоксической активностью против клетки, экспрессирующей HLA-A24 и TOPK. Аналогично, APC или экзосома, которые презентируют комплекс HLA-A2 и пептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 и 76, (или его модифицированного пептида) на своей поверхности предпочтительно можно использовать для индукции CTL, обладающего специфической цитотоксической активностью против клетки, экспрессирующей HLA-А2 и TOPK.
[0160] Кроме того, CTL по настоящему изобретению можно индуцировать введением в CD8-положительную Т-клетку полинуклеотида/полинуклеотидов, кодирующих субъединицы TCR, где TCR, образованный такими субъединицами TCR, способен связываться с комплексом HLA-антигена и пептида по изобретению на клеточной поверхности. Такую трансдукцию можно проводить, как описано выше в разделе "VIII. T-клеточный рецептор (TCR)".
[0161] Способы по настоящему изобретению можно проводить in vitro, ex vivo или in vivo. Предпочтительно способы по настоящему изобретению можно проводить in vitro или ex vivo. CD8-положительные T-клетки, используемые для индукции CTL, можно получать хорошо известными в данной области способами из РВМС, получаемых у индивидуума. В предпочтительных вариантах осуществления донор CD8-положительных Т-клеток может представлять собой индивидуума, у которого HLA-антиген представляет собой HLA-A2 4 или HLA-A2. CTL, индуцируемые способом по настоящему изобретению, могут представлять собой CTL, которые могут распознавать клетки, презентирующие комплекс пептида по настоящему изобретению и HLA-антигена на своей поверхности. Такие CTL могут проявлять специфическую цитотоксическую активность против клеток, которые презентируют пептид по настоящему изобретению на своей поверхности, и, таким образом, могут проявлять специфическую цитотоксическую активность против клеток, экспрессирующих TOPK, (например, злокачественных клеток). Когда CTL, индуцируемые способом по настоящему изобретению, вводят индивидууму для индукции иммунных реакций против злокачественной опухоли у индивидуума, индивидуум предпочтительно представляет собой того же самого индивидуума, у которого получают CD8-положительные T-клетки. Однако индивидуум может представлять собой индивидуума, отличного от донора CD8-положительных Т-клеток при условии, что индивидуум имеет одинаковый тип HLA с донором CD8-положительных Т-клеток.
[0162] Кроме того, настоящее изобретение относится к способу или процессу получения фармацевтической композиции или средства, которое индуцирует CTL, где способ включает стадии смешивания или составления пептида по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем.
[0163] В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к средству или композиции для индукции CTL, где средство или композиция содержит один или более пептидов, один или более полинуклеотидов или один или более APC или экзосом по настоящему изобретению.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению пептида, полинуклеотида или APC или экзосом по настоящему изобретению для получения средства или композиции, составленной для индукции CTL.
Альтернативно, настоящее изобретение дополнительно относится к пептиду, полинуклеотиду или APC или экзосоме по настоящему изобретению для применения для индукции CTL.
[0164] (3) Способы индукции иммунной реакции
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам индукции иммунной реакции против заболеваний, связанных с TOPK. Рассматриваемые заболевания включают злокачественную опухоль, примеры которой включают, но не ограничиваются ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, колоректальный рак, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почки, SCLC и опухоль мягких тканей.
[0165] Способы по настоящему изобретению могут включать стадию введения средства(-в) или композиции(-ий), содержащих любые пептиды по настоящему изобретению или полинуклеотиды, кодирующие их. Альтернативно, способ по настоящему изобретению также включает стадию введения экзосом или APC, презентирующих любые пептиды по настоящему изобретению. Для более подробного описания см. раздел "IX. Фармацевтические средства или композиции", в частности часть, описывающую применение фармацевтических композиций по настоящему изобретению в качестве вакцин. Кроме того, экзосомы и APC, которые можно применять в способах по настоящему изобретению для индукции иммунной реакции, подробно описаны выше в разделах "V. Экзосомы", "VI. Антигенпрезентирующие клетки (APC)" и (1) и (2) из "X. Способы применения пептидов, экзосом, APC и CTL".
[0166] Настоящее изобретение также относится к способу или процессу получения фармацевтической композиции или средства, которое индуцирует иммунную реакцию против злокачественной опухоли, где способ может включать стадию смешивания или составления пептида или полинуклеотида по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем.
[0167] Альтернативно, способ по настоящему изобретению может включать стадию введения вакцины или фармацевтической композиции или средства по настоящему изобретению, которое содержит:
(a) пептид по настоящему изобретению,
(b) полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению в экспрессируемой форме,
(c) APC, презентирующую пептид по настоящему изобретению на своей поверхности,
(d) экзосомы, презентирующие пептид по настоящему изобретению на своей поверхности, или
(e) цитотоксическую Т-клетку по настоящему изобретению.
[0168] В контексте настоящего изобретения злокачественную опухоль, сверхэкспрессирующую TOPK, можно лечить этими активными ингредиентами. Примеры такой злокачественной опухоли включают, но не ограничиваются ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, колоректальный рак, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почки, SCLC и опухоль мягких тканей. Таким образом, перед введением вакцин или фармацевтических композиций или средств, содержащих указанные выше активные ингредиенты, предпочтительно подтверждать, является ли повышенным уровень экспрессии TOPK у подлежащего лечению индивидуума. Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли, (сверх)экспрессирующей TOPK, у нуждающегося в этом пациента, где такой способ включает стадии:
i) определения уровня экспрессии TOPK в биологическом образце(ах), получаемых у подлежащего лечению индивидуума со злокачественной опухолью;
ii) сравнения уровня экспрессии TOPK с нормальным контролем, и
iii) введения по меньшей мере одного компонента, выбранного из описанных выше (a)-(d), индивидууму со злокачественной опухолью, сверхэкспрессирующей TOPK, по сравнению с нормальным контролем.
[0169] Альтернативно, настоящее изобретение относится к вакцине или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из описанных выше (a)-(d), для введения индивидууму, страдающему злокачественной опухолью, сверхэкспрессирующей TOPK. Другими словами, настоящее изобретение дополнительно относится к способу идентификации индивидуума, подлежащего лечению полипептидом TOPK по настоящему изобретению, где такой способ включает стадию определения уровня экспрессии TOPK в получаемом у индивидуума биологическом образце(-ах), где повышение уровня по сравнению с нормальным контрольным уровнем гена свидетельствует о том, что индивидуум может страдать злокачественной опухолью, которую можно лечить полипептидом TOPK по настоящему изобретению. Способы лечения злокачественной опухоли по настоящему изобретению более подробно описаны ниже.
[0170] Любую получаемую у индивидуума клетку или ткань можно использовать для определения экспрессии TOPK при условии, что он содержит объективный продукт транскрипцию или трансляция TOPK. Примеры подходящих образцов включают, но не ограничиваются ими, ткани и жидкости организма, такие как кровь, мокрота и моча. Предпочтительно получаемый у индивидуума образец клетки или ткани содержит популяцию клеток, содержащих эпителиальную клетка, более предпочтительно злокачественную эпителиальную клетку или эпителиальную клетку, получаемую из ткани, для которой предполагают, что она является злокачественной. Кроме того, при необходимости клетку можно выделять из получаемых тканей и жидкостях организма, а затем использовать в качестве образца, получаемого у индивидуума.
Индивидуум, подлежащий лечению способом по изобретению, предпочтительно представляет собой млекопитающее. Иллюстративное млекопитающие включает, но не ограничивается им, например, человека, не являющегося человеком примата, мышь, крысу, собаку, кошку, лошадь и корову.
[0171] В соответствии с настоящим изобретением можно определять уровень экспрессии TOPK в биологическом образце, получаемом у индивидуума. Уровень экспрессии можно определять по уровню транскрипции продукта (нуклеиновой кислоты) известными в данной области способами. Например, мРНК TOPK можно количественно определять с использованием зондов гибридизации способами (например, нозерн гибридизацией). Детекцию можно проводить на чипе или микропанели. Для детекции уровня экспрессии TOPK использование микропанели является предпочтительным. Специалисты в данной области могут получать такие зонды с использованием информации о последовательности TOPK. Например, в качестве зондов можно использовать кДНК TOPK. При необходимости зонд можно метить подходящей меткой, такой как красители, флуоресцентные вещества и изотопы, и уровень экспрессии гена можно детектировать как интенсивность гибридизуемых меток.
Кроме того, продукт транскрипции TOPK можно количественно определять с использованием праймеров способами детекции на основе амплификации (например, ПЦР с обратной транскрипцией). Такие праймеры можно получать на основе доступной информации о последовательности гена.
[0172] В частности, зонд или праймер, используемый для способа по настоящему изобретению, гибридизуется с мРНК TOPK в жестких, умеренно жестких условиях или условиях с низкой жесткостью. Как используют в настоящем описании, фраза "жесткие условия (гибридизация)" относится к условиям, при которых зонд или праймер гибридизуется со своей последовательностью-мишенью, но не с другими последовательностями. Жесткости условия зависят от последовательности и являются различными при различных обстоятельствах. Специфическую гибридизацию более длинных последовательностей наблюдают при более высоких температурах по сравнению со более короткими последовательностями. Как правило, температуру жестких условий выбирают, чтобы она являлась приблизительно на 5 градусов Цельсия ниже температуры теплового плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенной ионной силе и pH. Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе, pH и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных их последовательности-мишени, гибридизуются с последовательностью-мишенью в равновесном состоянии. Вследствие того, что последовательности-мишени, как правило, содержатся в избытке, при Tm 50% зондов участвуют в равновесном состоянии. Как правило, жестки условия представляют собой такие, при которых концентрация солей составляет менее приблизительно 1,0 М иона натрия, как правило, приблизительно от 0,01 до 1,0 М иона натрия (или других солей) при pH от 7,0 до 8,3, и температура составляет по меньшей мере приблизительно 30 градусов Цельсия для коротких зондов или праймеров (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60 градусов Цельсия для более длинных зондов или праймеров. Жестки условия также можно получать при добавлении дестабилизирующих веществ, таких как формамид.
[0173] Зонд или праймер по настоящему изобретению, как правило, представляет собой в значительной степени очищенный олигонуклеотид. Олигонуклеотид, как правило, содержит область нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях по меньшей мере с приблизительно 2000, 1000, 500, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50 или 25 последовательной нуклеотидной последовательностью смысловой цепи нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность TOPK, или нуклеотидной последовательностью антисмысловой цепи нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность TOPK, или природным мутантом таких последовательностей. В частности, например, в предпочтительном варианте осуществления в качестве праймера для амплификации генов, которые необходимо детектировать, можно использовать олигонуклеотид длиной 5-50 нуклеотидов. Более предпочтительно мРНК или кДНК гена TOPK можно детектировать с использованием олигонуклеотидного зонда или праймера конкретного размера, как правило, длиной 15-30 пар оснований. Размер может находиться в диапазоне по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 12 нуклеотидов, по меньшей мере 15 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 25 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, и размер зондов и праймеров может находиться в диапазоне 5-10 нуклеотидов, 10-15 нуклеотидов, 15-20 нуклеотидов, 20-25 нуклеотидов и 25-30 нуклеотидов. В предпочтительных вариантах осуществления длину олигонуклеотидного зонда или праймера можно выбирать из 15-25. Способ анализа, устройство или реагенты для детекции гена с использованием такого олигонуклеотидного зонда или праймера хорошо известны (например, олигонуклеотидная микропанель или ПЦР). В таких анализах зонды или праймеры также могут содержать метку или линкерные последовательности. Кроме того, зонды или праймеры можно модифицировать детектируемой меткой или аффинным лигандом, который захватывают. Альтернативно, в способах детекции на основе гибридизации для зонда также можно использовать полинуклеотид длиной от нескольких сотен (например, приблизительно 100-200) оснований до нескольких тысяч (например, приблизительно 1000-2000) оснований (например, анализ "нозерн"-блоттинг или анализ на основе кДНК-микропанели).
2
[0174] Альтернативно, продукт трансляции можно детектировать для диагностики по настоящему изобретению. Например, можно определять количество белка TOPK (SEQ ID NO: 86) или его иммунологического фрагмента. Способы определения количества белка в виде продукта трансляции включают способы иммунологического анализа, в котором используют антитело, специфически распознающее белок. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Кроме того, для детекции можно использовать любой фрагмент или модификацию (например, химерное антитело, scFv, Fab, F(ab'), Fv и т.д.) антитела при условии, что фрагмент или модифицированное антитело сохраняет способность связываться с белком TOPK. Такие антитела против пептидов по настоящему изобретению и их фрагментов также входят в объем настоящего изобретения. Способы получения таких типов антител для детекции белков хорошо известны в данной области, и в настоящем изобретении можно использовать любой способ для получения таких антител и их эквивалентов.
[0175] В качестве другого способа детекции уровень экспрессии гена TOPK на основе его продукта трансляции, интенсивности окрашивания можно измерять иммуногистохимическим анализом с использованием антитела против белка TOPK. Таким образом, в этом измерении интенсивное окрашивание указывает на повышенное содержание/уровень белка и одновременно на высокий уровень экспрессии гена TOPK.
[0176] Можно определять, что уровень экспрессии целевого гена, например, гена TOPK, в злокачественных клетках является повышенным, если уровень повышается от контрольного уровня (например, уровня в нормальных клетках) целевого гена, например, на 10%, 25% или 50%, или повышается более чем в 1,1 раза, более чем в 1,5 раза, более чем в 2,0 раза, более чем в 5,0 раза, более чем в 10,0 раза или более.
[0177] Контрольный уровень можно определять одновременно с уровнем в злокачественных клетках с использованием предварительно полученных и хранящихся образца(-ов) индивидуума/индивидуумов, для которых известно состояние(-я) болезни (злокачественное или незлокачественное). Кроме того, в качестве нормального контроля можно использовать нормальные клетки, получаемые из незлокачественных областей органа, который содержит злокачественную опухоль, подлежащую лечению. Альтернативно, контрольный уровень можно определять статистическим способом на основе результатов, получаемых посредством анализа предварительно определяемого уровня(-ей) экспрессии гена TOPK в образцах у индивидуумов, для которых известны состояния болезни. Кроме того, контрольный уровень можно получать из базы данных профилей экспрессии из ранее тестированных клеток. Кроме того, по одному из аспектов настоящего изобретения уровень экспрессии гена TOPK в биологическом образце можно сравнивать со многими контрольными уровнями, которые определяют во многих эталонных образцах. Предпочтительно использовать контрольный уровень, определяемый в эталонном образце, получаемом из ткани аналогичного типа ткани биологического образца, получаемого у индивидуума. Кроме того, предпочтительно использовать стандартные уровни экспрессии гена TOPK в популяции с известным состоянием болезни. Стандартное значение можно получать любым известным в данной области способом. Например, в качестве стандартного значения можно использовать диапазон значений +/-2 стад. откл. или среднее значение +/-3 станд. откл.
[0178] В контексте настоящего изобретения контрольный уровень, определяемый в биологическом образце, для которого известно, что он относится к злокачественной опухоли, обозначают как "нормальный контрольный уровень". С другой стороны, если контрольный уровень определяют в биологических образцах злокачественной опухоли, его обозначают как "контрольный уровень злокачественной опухоли". Разницу между уровнем экспрессии образца и контрольным уровнем можно нормализовать на уровень экспрессии контрольной нуклеиновой кислоты, например, генов "домашнего хозяйства", для которых известно, что их уровни экспрессии не отличаются в зависимости от злокачественного или незлокачественного состояния клетки. Иллюстративные контрольные гены включают, но не ограничиваются ими, бета-актин, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу и рибосомальный белок P1.
Когда уровень экспрессии гена TOPK повышается по сравнению с нормальным контрольным уровнем или является аналогичным/эквивалентным контрольному уровню злокачественной опухоли, у индивидуума можно диагностировать злокачественную опухоль, подлежащую лечению.
[0179] Настоящее изобретение также относится к способу (i) диагностики возможного наличия у индивидуума злокачественной опухоли, подлежащей лечению, и/или (ii) отбора индивидуума для лечения злокачественных опухолей, где такой способ включает стадии:
a) определения уровня экспрессии TOPK в биологическом образце(-ах), получаемых у индивидуума, у которого предполагают наличие злокачественной опухоли, подлежащей лечению;
b) сравнения уровня экспрессии TOPK с нормальным контрольным уровнем;
c) диагностики у индивидуума злокачественной опухоли, подлежащей лечению, если уровень экспрессии TOPK является повышенным по сравнению с нормальным контрольным уровнем, и
d) отбора индивидуума для лечения злокачественных опухолей, если у индивидуума диагностировали наличие злокачественной опухоли, подлежащей лечению, на стадии c).
[0180] Альтернативно, такой способ может включать стадии:
a) определения уровня экспрессии TOPK в биологическом образце(-ах), получаемых у индивидуума, у которого предполагают наличие злокачественной опухоли, подлежащей лечению;
b) сравнения уровня экспрессии TOPK с контрольным уровнем злокачественной опухоли;
c) диагностики у индивидуума злокачественной опухоли, подлежащей лечению, если уровень экспрессии TOPK является аналогичным или эквивалентным контрольному уровню злокачественной опухоли, и
d) отбора индивидуума для лечения злокачественных опухолей, если у индивидуума диагностировали наличие злокачественной опухоли, подлежащей лечению, на стадии c).
[0181] Настоящее изобретение также относится к диагностическому набору для диагностики или определения индивидуума, который страдает, или для которого предполагают, что он страдает или подвергается риску развития злокачественной опухоли, которую можно лечить полипептидом TOPK по настоящему изобретению, который также может быть пригодным для оценки или мониторинга эффективности, или того и другого, или применимости иммунотерапии злокачественной опухоли. Предпочтительно злокачественная опухоль включает, но не ограничивается ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, колоректальный рак, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почки, SCLC и опухоль мягких тканей. Более конкретно, набор предпочтительно содержит по меньшей мере один реагент для детекции экспрессии гена TOPK в клетке, получаемой у индивидуума, где реагент можно выбирать из группы, состоящей из:
(a) реагента для детекции мРНК гена TOPK;
(b) реагента для детекции белка TOPK или его иммунологического фрагмента, и
(c) реагента для детекции биологической активности белка TOPK.
[0182] Примеры реагентов, подходящих для детекции мРНК гена TOPK, включают нуклеиновые кислоты, которые специфически связываются с или идентифицируют мРНК TOPK, такие как олигонуклеотиды, которые содержат комплементарную последовательность участку мРНК TOPK. Иллюстративными примерами таких типов олигонуклеотидов являются праймеры и зонды, которые являются специфичными к мРНК TOPK. Такие типы олигонуклеотидов можно получать на основе хорошо известных в данной области способов. При необходимости реагент для детекции МРНК TOPK можно иммобилизовать на твердой матрице. Кроме того, в наборе могут содержаться более одного реагента для детекции мРНК TOPK.
2
[0183] С другой стороны, примеры реагентов, подходящих для детекции белка TOPK или его иммунологического фрагмента, могут включать антитела к белку TOPK или его иммунологическому фрагменту. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Кроме того, в качестве реагента можно использовать любой фрагмент или модификацию (например, химерное антитело, scFv, Fab, F(ab'), Fv и т.д.) антитела при условии, что фрагмент антитела или модифицированное антитело сохраняет способность связываться с белком TOPK или его иммунологическим фрагментом. Способы получения таких типов антител для детекции белков хорошо известны в данной области, и в настоящем изобретении можно использовать любой способ для получения таких антител и их эквивалентов. Кроме того, антитело можно метить молекулами, генерирующими сигнал, способом прямого связывания или опосредованного связывания. Метки и способы мечения антител и детекции связывания антител с их мишенями хорошо известны в данной области, и для настоящего изобретения можно применять любые метки и способы. Кроме того, в наборе могут содержаться более одного реагента для детекции белка TOPK.
[0184] Набор может содержать более одного из указанных выше реагентов. Набор может дополнительно содержать твердую матрицу и реагент для связывания зонда против гена TOPK или антитела против пептида TOPK, среду и контейнер для культивирования клеток, реагенты положительного и отрицательного контроля и вторичное антитело для детекции антитела против пептида TOPK. Например, образцы тканей, получаемые у индивидуумов без злокачественной опухоли или страдающих злокачественной опухолью, могут служить в качестве контрольных реагентов. Набор по настоящему изобретению может дополнительно содержать другие желаемые вещества с коммерческой или потребительской точки зрения, включая буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку (например, напечатанные, ленту, CD-ROM и т.д.) с инструкциями по использованию. Эти реагенты и т.д. могут содержаться в контейнере с этикеткой. Подходящие контейнеры включают бутылки, флаконы и тестовые пробирки. Контейнеры могут быть выполнены из различных материалов, таких как стекло или пластик.
[0185] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, когда реагент представляет собой зонд против мРНК TOPK, реагент можно иммобилизовать на твердой матрице, такой как пористая полоска, для образования по меньшей мере одного участка детекции. Область измерения или детекции пористой полоски может содержать ряд участков, где каждый участок содержит нуклеиновую кислоту (зонд). Тестовая полоска также может содержать участки для отрицательных и/или положительных контролей. Альтернативно, контрольные участки можно располагать на полоске отдельно от тестовой полоски. Необязательно различные участки детекции могут содержать различные количества иммобилизованных нуклеиновых кислот, т.е. большее количество на первом участке детекции и меньшие количества на последующих участках. При добавлении тестируемого образца число участков, для которых выявляют детектируемый сигнал, представляет собой количественное измерение количества мРНК TOPK, содержащегося в образце. Участки детекции можно конфигурировать в любой подходящей детектируемой форме и, как правило, в форме столбца или точки по всю ширину тестовой полоски.
[0186] Набор по настоящему изобретению может дополнительно содержать положительный контрольный образец или стандартный образец TOPK. Положительный контрольный образец по настоящему изобретению можно получать, собирая положительные образцы, а затем анализируя их уровни TOPK. Альтернативно, очищенный белок или полинуклеотид TOPK можно добавлять к клеткам, которые не экспрессируют TOPK, для получения положительного образца или стандартного образца TOPK. В настоящем изобретении очищенный TOPK может представлять собой рекомбинантный белок. Уровень TOPK положительного контрольного образца, например, является больше порогового значения.
[0187] В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение дополнительно относится к диагностическому набору, содержащему белок или его неполноценный белок, специфически распознаваемый антителом по настоящему изобретению или его фрагментом.
Примеры неполного пептида белка по настоящему изобретению включают полипептиды, состоящие по меньшей мере из 8, предпочтительно 15 и более предпочтительно 20 смежных аминокислот в аминокислотной последовательности белка по настоящему изобретению. Злокачественную опухоль можно диагностировать путем детекции антитела в образце (например, крови, ткани) с использованием белка или пептида (полипептида) по настоящему изобретению. Способ получения белка по настоящему изобретению и пептидов является таким, как описано выше.
[0188] Способы диагностики злокачественной опухоли по настоящему изобретению можно проводить, определяя разницу между количеством антитела против TOPK и количеством антитела против TOPK в соответствующем контрольном образце, как описано выше. Полагают, что индивидуум страдает злокачественной опухолью, если клетки или ткани индивидуума содержат антитела против продуктов экспрессии (TOPK) гена, и определяют, что количество антитела против TOPK является больше чем пороговое значение в уровне по сравнению с пороговым значением в нормальном контроле.
[0189] В другом варианте осуществления диагностический набор по настоящему изобретению может содержать пептид по настоящему изобретению и молекулу HLA, связывающуюся с ним. Уже установлен способ детекции антигенспецифических CTL с использованием антигенных пептидов и молекул HLA (например, Altman J.D. et al., Science, 1996, 274(5284): 94-6). Таким образом, комплекс пептида по настоящему изобретению и молекулы HLA можно применять для способа детекции для детекции специфических к опухолевым антигенам CTL, таким образом, обеспечивая раннюю детекцию рецидива и/или метастазирования злокачественной опухоли. Кроме того, его можно применять для отбора индивидуумов, для которых можно применять фармацевтические средства, содержащие пептид по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, или оценки эффекта лечения фармацевтическими средствами.
[0190] В частности, известным способом (см., например, Altman J.D. et al., Science, 1996, 274(5284): 94-6) можно получать олигомерный комплекс, так как тетрамер, радиоактивно меченой молекулы HLA и пептида по настоящему изобретению. С использованием комплекса можно проводить диагностику, например, путем количественного определения специфических к антигену-пептиду CTL в лимфоцитах периферической крови, получаемых у индивидуума, у которого подозревают злокачественную опухоль.
[0191] Настоящее изобретение дополнительно относится к способу и диагностическим средствам для оценки иммунной реакции индивидуума с использованием пептидных эпитопов, как описано в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления изобретения рестриктированные по HLA-A24 или HLA-A2 пептиды, как описано в настоящем описании, используют в качестве реагентов для оценки или прогнозирования иммунной реакции индивидуума. Подлежащую оценке иммунную реакцию индуцируют путем приведения в контакт иммуногена с иммунокомпетентными клетками in vitro или in vivo. В предпочтительных вариантах осуществления иммунокомпетентные клетки для индукции иммунной реакции можно выбирать из клетки периферической крови, лимфоцита периферической крови (PBL) и мононуклеарной клетки периферической крови (РВМС). Способы сбора или выделения таких иммунокомпетентных клеток хорошо известны в данной области. В некоторых вариантах осуществления в качестве реагента можно использовать любое средство, которое может приводить к продукции антигенспецифических CTL, которые распознают и связываются с пептидным эпитопом(-ами). В качестве иммуногена не следует использовать пептидный реагент. Системы анализа, которые используют для такого анализа, включают относительно недавние технические открытия, такие как тетрамеры, анализы внутриклеточного окрашивания на лимфокины и анализы высвобождения интерферона или анализы ELISPOT. В предпочтительном варианте осуществления иммунокомпетентные клетки, которые необходимо приводить в контакт с пептидным реагентом, могут представлять собой антигенпрезентирующие клетки, включая дендритные клетки.
[0192] Например, пептиды по настоящему изобретению можно использовать в анализах с окрашиванием тетрамерами для оценки мононуклеарных клеток периферической крови на наличие антигенспецифических CTL после экспонирования антигеном или иммуногеном опухолевой клетки. Тетрамерный комплекс HLA можно использовать для непосредственной визуализации антигенспецифических CTL (см., например, Ogg et al., Science, 279: 2103-2106, 1998; и Altman et al., Science, 174: 94-96, 1996) и определения частоты популяции антигенспецифических CTL в образце мононуклеарных клеток периферической крови. Тетрамерный реагент, в котором используют пептид по изобретению, можно получать, как описано ниже.
[0193] Пептид, который связывается с молекулой HLA, повторно сворачивается в присутствии соответствующей тяжелой цепи HLA и бета-2-микроглобулина с образованием терхмолекулярного комплекса. В комплексе карбоксильный конец тяжелой цепи является биотинилированным на участке, который предварительно встраивали в белок. Затем к комплексу добавляют стрептавидин с образованием тетрамера, состоящего из терхмолекулярного комплекса и стрептавидина. Посредством флуоресцентно меченого стрептавидина тетрамер можно использовать для окрашивания антигенспецифических клеток. Затем можно идентифицировать клетки, например, посредством проточной цитометрии. Такой анализ можно использовать для диагностических или прогностических целей. Идентифицированные таким способом клетки также можно использовать для терапевтических целей.
[0194] Настоящее изобретение также относится к реагентам для оценки вторичных иммунных реакций (см., например, Bertoni et al., J. Clin. Invest., 100: 503-513, 1997 и Penna et al., J. Exp. Med., 174: 1565-1570, 1991), содержащим пептиды по настоящему изобретению. Например, образцы РВМС пациента, получаемые у индивидуумов со злокачественной опухолью, подлежащей лечению, анализируют на наличие антигенспецифических CTL с использованием конкретных пептидов. Образец крови, содержащий мононуклеарные клетки можно оценивать путем культивирования РВМС и стимуляции клеток пептидом по изобретению. После подходящего периода культивирования размноженную популяцию клеток можно анализировать, например, в отношении активности CTL.
[0195] Пептиды также можно использовать в качестве реагентов для оценки эффективности вакцины. РВМС, получаемые у пациента, вакцинированного иммуногеном, можно анализировать, например, любым из способов, описанных выше. У пациента определяют типа HLA, и для анализа выбирают реагенты на основе пептидных эпитопов, которые распознают аллель-специфические молекулы, содержащиеся у пациента. Об иммуногенности вакцины может свидетельствовать наличие эпитопспецифических CTL в образце РВМС.
[0196] Пептиды по изобретению также можно использовать для получения антител хорошо известными в данной области способами (см., например, CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, и Antibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), которые могут являться пригодными в качестве реагентов для диагностики или наблюдения за злокачественной опухолью. Такие антитела могут включать антитела, которые распознают пептид в отношении молекулы HLA, т.е. антитела, которые связываются с комплексом пептид-МНС.
[0197] Пептиды и композиции по настоящему изобретению имеют ряд дополнительный применений, некоторые из которых описаны в настоящем описании. Например, настоящее изобретение относится к способу диагностики или детекции нарушения, харакетризующегося экспрессией иммуногенного полипептида TOPK. Эти способы включают определение экспрессии связывающегося с HLA пептида TOPK, или комплекс связывающегося с HLA пептида TOPK и молекулы HLA класса I в биологическом образце. Экспрессию пептида или комплекса пептида и молекулы HLA класса I можно определять или детектировать анализом с использованием партнера по связыванию для пептид или комплекса. В предпочтительном варианте осуществления партнер по связыванию для пептида или комплекса представляет собой антитело, которое распознает и специфически связывается с пептидом. Экспрессию TOPK в биологическом образце, таком как биопсия опухоли, также можно тестировать стандартными протоколами ПЦР-амплификации с использованием праймеров для TOPK. Пример экспрессии опухоли приведен в настоящем описании, и дополнительное описание иллюстративных условий и праймеров для амплификации TOPK можно найти в WO 2003/27322.
[0198] Предпочтительно способы диагностики включают приведение в контакт биологического образца, выделяемого у индивидуума, со средством, специфическим для связывающегося с HLA пептида TOPK, для детекции наличия связывающегося с HLA пептида TOPK в биологическом образце. Как используют в настоящем описании, "приведение в контакт" означает помещение биологического образца в достаточной близости от средства и при подходящих условиях, например, концентрации, температуры, периода времени, ионной силы, для обеспечения специфического взаимодействия средства и связывающегося с HLA пептида TOPK, который содержится в биологическом образце. Как правило, условия для приведения в контакт средства с биологическим образцом представляют собой условия, известные специалистам в данной области, для облегчения специфического взаимодействия молекулы и ее родственного партнера (например, белка и его родственного рецептора, антитела и его родственного белкового антигена, нуклеиновой кислота и ее родственной комплементарной последовательности) в биологическом образце. Оптимальные условия для облегчения специфического взаимодействия между молекулой и ее родственным партнером описаны в патенте США №5108921, выданным на имя Low et al.
[0199] Способ диагностики по настоящему изобретению можно проводить in vivo и in vitro или в обоих условиях. Таким образом, в настоящем изобретении биологический образец может находиться в условиях in vivo или in vitro. Например, биологический образец может представлять собой ткань in vivo, и можно использовать средство, специфическое для иммуногенного полипептида TOPK, для детекции наличия таких молекул в ткани. Альтернативно, биологический образец может располагаться, или его можно выделять in vitro (например, образец крови, биопсия опухоли, экстракт ткани). В особенно предпочтительном варианте осуществления биологический образец может представлять собой содержащий клетку образец, более предпочтительно образец, содержащий опухолевые клетки, получаемые у индивидуума, у которого необходимо проводить диагностику или лечение.
[0200] Альтернативно, диагностику можно проводить способом, который обеспечивает прямое количественное определение антигенспецифических Т-клеток путем окрашивания меченных флуоресцеином мультимерных комплексов HLA (например, Altman J.D. et al., 1996, Science, 274: 94; Altman J.D. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10330). Также можно использовать окрашивание на внутриклеточные лимфокины и анализы выделения интерферона-гамма или анализы ELISPOT. Показано, что окрашивание тетрамерами, окрашивание внутриклеточных лимфокином и анализы ELISPOT являются по меньшей мере в 10 раз более чувствительными чем общепринятые анализы (Murali-Krishna К. et al., 1998, Immunity, 8: 177; Lalvani A. et al., 1997, J. Exp. Med., 186: 859; Dunbar P.R. et al., 1998, Curr. Biol., 8: 413). Также можно использовать пентамеры (например, US 2004-209295А), декстрамеры (например, WO 02/072631) и стрептамеры (например, Nature medicine, 6, 631-637 (2002)).
[0201] Например, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу диагностики или оценки иммунной реакции индивидуума, которому вводили по меньшей мере один из пептидов TOPK по настоящему изобретению, где способ включает стадии:
(a) приведения в контакт иммуногена с иммунокомпетентными клетками в условиях, подходящих для индукции CTL, специфического к иммуногену;
(b) детектирования или детекции индуцируемого уровня CTL, индуцируемого на стадии (a), и
(c) корреляции иммунной реакции индивидуума с уровнем индукции CTL.
[0202] В контексте настоящего изобретения иммуноген предпочтительно содержит по меньшей мере один из (a) пептида TOPK, выбранного из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2-40 и 42-84, пептидов, содержащих такие аминокислотные последовательности, и пептидов, в которых такие аминокислотные последовательности модифицировали 1, 2 или более заменами аминокислот. В то же время условия, подходящие для индукции иммуногенного специфического CTL, хорошо известны в данной области. Например, иммунокомпетентные клетки можно культивировать in vitro в присутствии иммуногена(ов) для индукции специфического к иммуногену CTL. Для индукции специфических к иммуногену CTL к культуре клеток можно добавлять любые стимулирующие факторы. Например, для индукции CTL IL-2 представляют собой предпочтительные стимулирующие факторы.
[0203] В некоторых вариантах осуществления стадию мониторинга или оценки иммунной реакции индивидуума, подлежащего лечению пептидной терапией злокачественной опухоли, можно проводить до, во время и/или после лечения. Как правило, в условиях протокола терапии злокачественной опухоли иммуногенные пептиды многократно вводят индивидууму, подлежащего лечению. Например, иммуногенные пептиды можно вводить каждую неделю в течение 3-10 недель. Таким образом, иммунную реакцию индивидуума можно оценивать или наблюдать в условия протокола терапии злокачественной опухоли. Альтернативно, стадию оценки или мониторинга иммунной реакции на терапию злокачественной опухоли можно проводить по окончанию протокола терапии.
[0204] По настоящему изобретению усиленная индукция специфического к иммуногену CTL по сравнению с контролем свидетельствует о том, что индивидуум, для которого проводили оценку или диагностику, иммунологически реагировал на иммуноген(-ы), которые вводили. Подходящие контроли для оценки иммунной реакции могут включать, например, уровень индукции CTL, когда иммунокомпетентные клетки не приводят в контакт с пептидом, или контрольный пептид(-ы), содержащие аминокислотные последовательности, отличные от аминокислотных последовательностей пептидов TOPK (например, случайная аминокислотная последовательность). В предпочтительном варианте осуществления иммунную реакцию индивидуума оценивают последовательность-специфическим образом, сравнивая с иммунной реакцией к каждому иммуногену, вводимому индивидууму. В частности, даже когда смесь из некоторых видов пептидов TOPK вводят индивидууму, иммунная реакция может изменяться в зависимости от пептидов. В этом случае, сравнивая иммунную реакцию каждого пептида, можно идентифицировать пептиды, к которым индивидуум проявляет более высокий ответ.
[0205] XII. Антитела
Настоящее изобретение дополнительно относится к антителам, которые связываются с пептидами по настоящему изобретению. Предпочтительные антитела специфически связываются с пептидами по настоящему изобретению и не связываются (или слабо связываются) с другими пептидами. Альтернативно, антитела могут связываться с пептидами по изобретению, а также их гомологами. Антитела против пептидов по изобретению могут находить применение в диагностике злокачественной опухоль и прогностических анализах, а также способах визуализации. Аналогично, такие антитела могут находить применение при лечении, диагностике и/или прогнозировании других злокачественных опухолей в тех случаях, когда TOPK также экспрессируется или сверхэкспрессируется у пациента со злокачественной опухолью. Кроме того, внутриклеточно экспрессируемые антитела (например, одноцепочечные антитела) можно терапевтически использовать для лечения злокачественных опухолей, в которых участвует сверхэкспрессия TOPK, пример которых включаю, но не ограничиваются ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, колоректальный рак, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почки, SCLC и опухоль мягких тканей.
[0206] Настоящее изобретение также относится к различным иммунологическим анализам для детекции и/или количественного определения белка TOPK (SEQ ID NO: 86) или его фрагментов, включая полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-40 и 42-84. Такие анализы могут включать одно или более антител к TOPK, способных распознавать и связываться с белком TOPK или его фрагментами при необходимости. В контексте настоящего изобретения антитела к TOPK, связывающиеся с полипептидом TOPK, предпочтительно распознают полипептид, содержащий аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-40 и 42-84, предпочтительно исключая другие пептиды. Специфичность связывания антитела можно подтверждать тестом ингибирования. Таким образом, когда связывание анализируемого антитела и полноразмерного полипептида TOPK ингибируется в присутствии любого фрагмента полипептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2-40 и 42-84, считается, что оно специфически связывается с фрагментом. В контексте настоящего изобретения такие иммунологические анализы проводят в различных форматах иммунологического анализа, известного в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, различные типы радиоиммунологического анализа, иммунохроматографического способа, твердофазных иммуноферментных анализов (ELISA), твердофазных иммунофлуоресцентных анализов (ELIFA) и т.п.
[0207] Связанные иммунологические анализы, но не на основе антител, по изобретению также могут включать анализы иммуногенности Т-клеток (ингибирования или стимуляции), а также анализы связывания МНС. Кроме того, настоящее изобретение предусматривает способы иммунологической визуализации, которыми можно детектировать злокачественные опухоли, экспрессирующие TOPK, пример который включает, но не ограничивается ими, способы радиосцинтиграфической визуализации с использованием меченых антител по настоящему изобретению. Такие анализы находят клиническое применение при детекции, мониторинге и прогнозировании экспрессирующих TOPK злокачественных опухолей, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярный рак, колоректальный рак, рак желудка диффузного типа, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, рак почки, SCLC и опухоль мягких тканей.
[0208] Настоящее изобретение также относится к антителам, которые связываются с пептидами по изобретению. Антитело по изобретению можно использовать в любой форме, например, в виде моноклонального или поликлонального антитела, и оно может дополнительно включать антисыворотку, получаемую иммунизацией животного, такого как кролик, пептидом по изобретению, все классы поликлональных и моноклональных антител, антитела человека и гуманизированные антитела, получаемые генетической рекомбинацией.
[0209] Пептид по изобретению, используемый в качестве антигена для получения антитела, можно получать от любого вида животного, но предпочтительно получать от млекопитающего, такого как человек, мышь или крыса, более предпочтительно от человека. Получаемый от человека пептид можно получать из нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, описываемых в настоящем описании.
По настоящему изобретению в качестве антигенов для иммунизации могут служить полные и неполные пептиды. Примеры подходящих неполных пептидов включают, например, амино-(N)-концевой или карбокси-(C)-концевой фрагмент пептида по настоящему изобретению.
[0210] В настоящем описании антитело определяют как белок, который взаимодействует с полноразмерным пептидом TOPK или его фрагментом. В предпочтительном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению может распознавать фрагменты пептидов TOPK, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-40 и 42-84. Способы синтеза олигопептида хорошо известны в данной области. После синтеза пептиды можно необязательно очищать перед использованием в качестве иммуногена. В контексте настоящего изобретения олигопептид (например, 9- или 10-мер) можно конъюгировать или связывать с носителями для повышения иммуногенности. В качестве носителя хорошо известным является гемоцианин фиссуреллы (KLH). Способ конъюгации KLH и пептида также хорошо известен в данной области.
[0211] Альтернативно, ген, кодирующий пептид по настоящему изобретению или его фрагмент, можно встраивать в известный экспрессирующий вектор, который затем используют для трансформации клетки-хозяина, как описано в настоящем описании. Желаемый пептид или его фрагмент можно выделять из внешней или внутренней частей клеток-хозяев любым стандартным способом, а затем можно использовать в качестве антигена. Альтернативно, в качестве антигена можно использовать цельные клетки, экспрессирующие пептид, или их лизаты и химически синтезированный пептид.
[0212] Любое млекопитающее животное можно иммунизировать антигеном, однако предпочтительно учитывать совместимость с клетками, используемыми для слияния клеток. Как правило, можно использовать животных семейства Rodentia, Lagomorpha или Primate. Животные семейства Rodentia включают, например, мышь, крысу и хомяка. Животные семейства Lagomorpha включают, например, кролика. Животные семейства Primate включают, например, обезьяну Catarrhini (обезьяна Старого Света), такую как Масаса fascicularis, макака-резус, гамадрил и шимпанзе.
[0213] Способы иммунизации животных антигенами являются известными в данной области. Внутрибрюшинная инъекция или подкожная инъекция антигенов представляет собой стандартный способ иммунизации млекопитающих. Более конкретно, антигены можно разбавлять и суспендированы в подходящем количестве фосфатно-солевого буфера (PBS), физиологического раствора и т.д. При необходимости суспензию антигена можно смешивать с подходящим количеством стандартного адъюванта, такого как полный адъювант Фрейнда, составлять в виде эмульсии, а затем вводить млекопитающим животным. Предпочтительно с последующими несколькими введениями антигена, смешанного с подходящим количеством неполного адъюванта Фрейнда на каждые 4-21 сутки. Для иммунизации также можно использовать подходящий носитель. После иммунизации, как описано выше, можно анализировать сыворотку стандартным способом в отношении увеличение количества желаемых антител.
[0214] Поликлональные антитела против пептидов по настоящему изобретению можно получать путем сбора крови у иммунизированного млекопитающего, у которого анализируют повышение уровня желаемых антител в сыворотке, и отделения сыворотки от крови любым общепринятым способом. Поликлональные антитела могут включать сыворотку, содержащую поликлональные антитела, а также из сыворотки можно выделять фракцию, содержащую поликлональные антитела. Иммуноглобулин G или М можно получать из фракции, которая распознает только пептид по настоящему изобретению, например, с использованием аффинной колонки, связанной с пептидом по настоящему изобретению, и дополнительно очищая такую фракцию с использованием колонки с белком А или белком G.
[0215] Для получения моноклональных антител для применения в контексте настоящего изобретения иммунные клетки собирают у млекопитающего, иммунизированного антигеном, и исследуют на повышенный уровень желаемого антитела в сыворотке, как описано выше, и подвергают слиянию клеток. Иммунные клетки, используемые для слияния клеток, можно предпочтительно получать из селезенки. Другие предпочтительные родительские клетки для слияния с указанным выше иммуноцитом, включают например, миеломные клетки млекопитающих, и более предпочтительно миеломные клетки, обладающие приобретенным свойством для отбора слитых клеток посредством лекарственных средств.
Указанные выше иммуноциты и миеломные клетки можно подвергать слиянию известными способами, например, способом Milstein et al. (Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)).
[0216] Гибридомы, получаемые слиянием клеток, можно отбирать путем их культивирования в стандартной селективной среде, такой как среда HAT (содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин среда). Культуру клеток, как правило, поддерживают в среде HAT в течение от нескольких суток до нескольких недель, где период времени является достаточным для обеспечения гибели всех других клеток (неслитых клеток) за исключением желаемой гибридомы. Затем можно проводить стандартное лимитирующее разведение для скрининга и клонирования гибридомной клетки, продуцирующей желаемое антитело.
[0217] В дополнение к указанному выше способу, где не являющееся человеком животное иммунизируют антигеном для получения гибридомы, лимфоциты человека, такие как лимфоциты, инфицированные вирусом ЕВ, можно иммунизировать пептидом, экспрессирующими пептид клетками или их лизатами in vitro. Затем иммунизированные лимфоциты можно подвергать слиянию с получаемыми у человека миеломными клетками, которые способны к неограниченному делению, такими как U266, с получением гибридомы, продуцирующей желаемое антитело человека, которое способно связываться с пептидом (нерассматриваемая опубликованная патентная заявка Японии № Sho 63-17688).
[0218] Получаемые гибридомы можно затем трансплантировать в брюшную полость мыши и отбирать асцит. Получаемые моноклональные антитела можно очищать, например, осаждением сульфатом аммония, на колонке с белком A или белком G, ионообменной хроматографией DEAE или на аффинной колонке, с которой связан пептид по настоящему изобретению. Антитело по настоящему изобретению можно использовать не только для очистки и детекции пептида по настоящему изобретению, а также в качестве кандидата для агонистов и антагонистов пептида по настоящему изобретению. Альтернативно, иммунную клетку, такую как иммунизированный лимфоцит, продуцирующий антитела, можно подвергать иммортализации посредством онкогена и использовать для получения моноклональных антител.
[0219] Моноклональные антитела, получаемые таким образом, также можно получать рекомбинантно способами генетической инженерии (см., например, Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, опубликованных в the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD (1990)). Например, кодирующую антитело ДНК можно клонировать из иммунной клетки, такой как гибридома или иммунизированный лимфоцит, продуцирующий антитело, встраивать в подходящий вектор и вводить в клетки-хозяева для получения рекомбинантного антитела. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным антителам, получаемым, как описано выше.
2
[0220] Антитело по настоящему изобретению может представлять собой фрагмент антитела или модифицированное антитело при условии, что оно связывается с одним или более пептидов по изобретению. Например, фрагмент антитела может представлять собой Fab, F(ab'), Fv или одноцепочечный Fv (scFv), в котором фрагменты Fv из Н- и L-цепей лигированы с подходящим линкером (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-83 (1988)). Более конкретно, фрагмент антитела можно получать обработкой антитело ферментом, так как папаин или пепсин. Альтернативно, ген, кодирующий фрагмент антитела, можно конструировать, встраивать в экспрессирующий вектор и экспрессировать в подходящей клетке-хозяине (см., например, Со et al., J. Immunol., 152: 2968-76 (1994); Better and Horwitz, Methods Enzymol., 178: 476-96 (1989); Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol., 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol., 121: 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol., 121: 663-9 (1986); Bird and Walker, Trends Biotechnol., 9: 132-7 (1991)).
[0221] Антитело можно модифицировать конъюгацией с рядом молекул, таких как полиэтиленгликоль (PEG). Настоящее изобретение относится к таким модифицированным антителам. Модифицированное антитело можно получать химической модификацией антитела. Такие способы модификации являются общепринятыми в данной области.
[0222] Альтернативно, антитело по настоящему изобретению можно получать в виде химерного антитела, между вариабельной областью, получаемой из не принадлежащего человеку антитела, и константной областью, получаемой из антитела человека, или в виде гуманизированного антитела, содержащего определяющую комплементарность область (CDR), получаемую из не принадлежащего человеку антитела, каркасную область (FR) и константную область, получаемые из антитела человека. Такие антитела можно получать известным способом. Гуманизацию можно проводить путем замены CDR грызуна или последовательностей CDR на соответствующие последовательности антитела человека (см., например, Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)). Таким образом, такие гуманизированные антитела представляют собой химерные антитела, в котором по существу менее одного интактного вариабельного домена человека заменяли соответствующей последовательностью от не являющихся человеком видов.
[0223] Также можно использовать полностью человеческие антитела, содержащие вариабельные области человека в дополнение к каркасной и константной областям человека. Такие антитела можно получать различными известными в данной области способами. Например, способы in vitro включают использование рекомбинантных библиотек фрагментов антител человека, представленных на бактериофаге (например, Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991). Аналогично, антитела человека можно получать введением локуса иммуноглобулина человека трансгенным животным, например, мышам, у которых полностью или частично инактивировали гены эндогенного иммуноглобулина. Такой подход описан, например, в патентах США №№6150584, 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5661016.
[0224] Получаемые, как указано выше, антитела можно очищать до однородного состояния. Например, разделение и очистку антител можно проводить способами разделения и очистки для основных белков. Например, антитело можно разделять и выделять соответствующим образом отобранным и комбинированным применением хроматографических колонок, таких как аффинная хроматография, фильтр, ультрафильтрация, высаливание, диализ, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS и изоэлектрофокусирование (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), но не ограничены ими. В качестве аффинной колонки можно использовать колонку с белком А и колонку с белком G. Иллюстративные колонки с белком А, которые можно использовать, включают, например, Hyper D, POROS и Sepharose F.F. (Pharmacia).
[0225] Примеры подходящих хроматографических способов за исключением аффинной хроматографии включают, например, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию, хроматографию с обращенной фазой, адсорбционную хроматографию и т.п. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Хроматографические способы можно проводить посредством жидкофазной хроматографии, так как ВЭЖХ и ЖХБР.
[0226] Например, для измерения активности связывания с антигеном антител по изобретению можно использовать измерение оптической плотности, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), ферментный иммунологический анализ (EIA), радиоиммунологический анализ (RIA) и/или иммунофлуоресценцию. В ELISA антитело по настоящему изобретению иммобилизуют на планшете, на планшет наносят пептид по изобретению, а затем наносят образец, содержащий желаемое антитело, такой как культуральный супернатант от продуцирующих антитела клеток или очищенные антитела. Затем наносят вторичное антитело, которое распознает первичное антитело и является меченым ферментом, таким как щелочная фосфатаза, и инкубируют планшет. Затем после промывания к планшету добавляют субстрат фермента, такой как пара-нитрофенилфосфат, и измеряют оптическую плотность для оценки активности связывания с антигеном образца. Для оценки активности связывания антитела можно в качестве антигена можно использовать фрагмент пептида, такой как C-концевой или N-концевой фрагмент. Для оценки активности антитела по настоящему изобретению можно использовать BIAcore (Pharmacia).
[0227] Указанные выше способы обеспечивают детекцию или измерение пептида по изобретению путем экспонирования антитела по изобретению образцом, предполагают, что он содержит пептид по изобретению, и детектирования или измерения иммунного комплекса, образуемого антителом и пептидом.
Вследствие того, что способом детекции или измерения пептида по изобретению можно конкретно детектировать или измерять пептид, способ может находить применение в различных экспериментах, в которых используют пептид.
[0228] XIII. Векторы и клетки-хозяева
Настоящее изобретение также относится к векторам и клеткам-хозяевам, в которые вводят нуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению. Вектор по настоящему изобретению находит применение в качестве носителя нуклеотидов, в частности ДНК, по настоящему изобретению в клетке-хозяине для экспрессии пептид по настоящему изобретению или для введения нуклеотида по настоящему изобретению для генотерапии.
[0229] Когда в качестве клетки-хозяина выбирают Е. coli и амплифицируют вектор и получают в большом количестве в Е. coli (например, JM109, DH5-альфа, НВ101 или XL1Blue), вектор должен содержать "ori", подходящую для амплификация в Е. coli, и маркерный ген, подходящий для отбора трансформированных Е. coli (например, ген устойчивости к лекарственному средству, отбираемый посредством лекарственного средства, такого как ампициллин, тетрациклин, канамицин, хлорамфеникол или т.п.). Например, можно использовать векторы серии М13, векторы серии pUC, pBR322, pBluescript, pCR-Script и т.д. Кроме того, pGEM-T, pDIRECT и рТ7 также можно использовать для субклонирования и выделения кДНК, а также описанные выше векторы. Когда вектор используют для получения белка по настоящему изобретению, можно использовать экспрессирующий вектор. Например, экспрессирующие вектор, который необходимо экспрессировать в Е. coli, должен обладать указанными выше характеристиками, чтобы амплифицироваться в Е. coli. Когда в качестве клетки-хозяина используют Е. coli, такую как JM109, DH5-альфа, НВ101 или XLlBlue, вектор должен содержать промотор, например, промотор lacZ (Ward et al., Nature, 341: 544-6 (1989); FASEB J., 6: 2422-7 (1992)), промотор araB (Better et al., Science, 240: 1041-3 (1988)), промотор T7 или т.п., который может эффективно экспрессировать желаемый ген в Е. coli. При этом можно использовать, например, pGEX-5X-l (Pharmacia), "QIAexpress system" (Qiagen), pEGFP и pET (в этом случае хозяин предпочтительно представляет собой BL21, который экспрессирует РНК-полимеразу Т7), вместо указанных выше векторов. Кроме того, вектор также может содержать сигнальную последовательность для секреции пептида. Иллюстративная сигнальная последовательность, которая направляет секрецию пептида в периплазму Е. coli, представляет собой сигнальную последовательность pelB (Lei et al., J. Bacterid., 169: 4379 (1987)). Способы введения векторов в целевые клетки-хозяева включают, например, способ с хлоридом кальция и способ электропорации.
[0230] В дополнение к Е. coli для получения полипептида по настоящему изобретению можно использовать, например, экспрессирующие векторы, получаемые у млекопитающих (например, pcDNA3 (Invitrogen) и pEGF-BOS (Nucleic Acids Res., 18(17): 5322 (1990)), pEF, pCDM8), экспрессирующие векторы, получаемые из клеток насекомых (например, "бакуловирусную экспрессирующую систему Bac-to-BAC" (GIBCO BRL), рВасРАК8), экспрессирующие векторы, получаемые из растений (например, pMH1, pMH2), экспрессирующие векторы, получаемые из вирусов животных (например, pHSV, pMV, pAdexLcw), экспрессирующие векторы, получаемые из ретровирусов (например, pZIpneo), экспрессирующий вектор, получаемый из дрожжей (например, "Pichia Expression Kit" (Invitrogen), pNV11, SP-Q01) и экспрессирующие векторы, получаемые из Bacillus subtilis (например, pPL608, рКТН50).
[0231] Для экспрессии вектора в животных клетках, таких как клетки CHO, COS или NIH3T3, вектор должен содержать промотор, необходимый для экспрессии в таких клетках, например, промотор SV40 (Mulligan et al., Nature, 277: 108 (1979)), промотор MMLV-LTR, промотор EFl-альфа (Mizushima et al., Nucleic Acids Res., 18: 5322 (1990)), промотор CMV и т.п., и предпочтительно маркерный ген для отбора трансформантов (например, ген устойчивости к лекарственному средству, отбираемый посредством лекарственного средства (например, неомицина, G418)). Примеры известных векторы с такими характеристиками включают, например, рМАМ, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV и pOP13.
[0232] Далее в настоящем описании настоящее изобретение более подробно описан со ссылкой на примеры. Однако, несмотря на то, что следующие ниже вещества, способы и примеры могут служить для облегчения специалисту осуществления и использования определенных вариантов настоящего изобретения, они предназначены только иллюстрировать аспекты настоящего изобретения и, таким образом, не ограничивают каким-либо образом объем настоящего изобретения. Как будет легко понятно специалисту в данной области, способы и вещества, аналогичные или эквивалентные способам и веществам, описываемым в настоящем описании, можно использовать в практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения.
Примеры
[0233] Вещества и способы
Линии клеток
TISI, HLA-A*2402-положительную В-лимфобластоидную линию клеток приобретали от IHWG Cell and Gene Bank (Seattle, WA). T2, HLA-А*0201-положительную В-лимфобластоидную линию клеток, и COS7, линию клеток почки африканской зеленой мартышки приобретали от АТСС.
[0234] Отбор пептидов-кандидатов, получаемых из TOPK
9-мерные и 10-мерные пептиды, получаемые из TOPK (номер доступа GeneBank NM_018492, например, SEQ ID No: 85), которые связываются с молекулой HLA-A*2402 или HLA-A*0201 или обоими, теоретически рассчитывали с использованием "NetMHC3.0" сервера для теоретического расчета связывания (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) (Buus et al., Tissue Antigens., 2003 Nov, 62(5):378-84; Nielsen et al., Protein Sci., 2003 May, 12(5):1007-17, Bioinformatics., 2004, Jun 12:20 (9):1388-97). Эти пептиды синтезировали посредством Biosynthesis (Lewisville, Texas) стандартным способом твердофазного синтеза и очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с обращенной фазой. Чистоту (>90%) и идентичность пептидов определяли аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрическим анализом соответственно. Пептиды растворяли в диметилсульфоксиде при 20 мг/мл и хранили при -80 градусов Цельсия.
[0235] Индукция CTL in vitro
4
5
+
Получаемые из моноцитов дендритные клетки (DC) использовали в качестве антигенпрезентирующих клеток для индукции ответов цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) против пептидов, презентируемых на лейкоцитарном антигене человека (HLA). DC получали in vitro, как описано в другом месте (Nakahara S. et al., Cancer Res, 2003, Jul 15, 63(14): 4112-8). В частности, выделяли мононуклеарные клетки периферической крови у здорового добровольца (HLA-А*2402-положительные или HLA-A*0201-положительные) посредством раствора Ficoll-Paque plus (Pharmacia), отделяли посредством прикрепления к пластиковой чашке для тканевой культуры (Becton Dickinson), таким образом, чтобы обогащать их в виде фракции моноцитов. Обогащенную моноцитами популяцию культивировали в присутствии 1000 Ед/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (R&D System) и 1000 Ед/мл интерлейкина (IL)-4 (R&D System) в среде AIM-V (Invitrogen), содержащей 2% инактивированной нагреванием аутологичной сыворотки (AS). Через 7 суток культивирования индуцированные цитокином DC сенсибилизировали 20 мкг/мл каждого из синтезированных пептидов в присутствии 3 мкг/мл бета-2-микроглобулина в течение 3 часов при 37 градусах Цельсия в среде AIM-V. Показано, что получаемые клетки экспрессируют DC-ассоциированные молекулы, такие как CD80, CD83, CD8 6 и HLA класс II, на своей клеточной поверхности (данные не показаны). Такие сенсибилизированные пептидом DC затем инактивировали рентгеновским облучением (20 Гр) и смешивали в отношении 1:20 с аутологическими CD8+Т-клетками, получаемыми положительным отбором с использованием набора CD8 Positive Isolation (Dynal). Эти культуры устанавливали в 48-луночных планшетах (Corning), каждая лунка содержала 1,5×10 сенсибилизированных пептидом DC, 3×10 CD8 Т-клеток и 10 нг/мл IL-7 (R&D System) в 0,5 мл среды AIM-V/2% AS. Через трое суток к этим культурам добавляли IL-2 (CHIRON) до конечной концентрации 20 МЕд/мл. На сутки 7 и 14 T-клетки дополнительно стимулировали аутологическими сенсибилизированными пептидом DC. Каждый раз DC получали одним и тем же способом, описанным выше. CTL тестировали против сенсибилизированных пептидом клеток TISI или клеток Т2 после 3-ей стадии стимуляции пептида на сутки 21 (Tanaka Н. et al., Br. J. Cancer, 2001, Jan 5, 84(1): 94-9; Uraano Y. et al., Br. J. Cancer, 2001, Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N. et al., Clin. Cancer Res., 2004, Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T. et al., Cancer Sci., 2006, May 97(5): 411-9; Watanabe T. et al., Cancer Sci., 2005, Aug, 96(8): 498-506).
[0236] Способ размножения CTL
4
CTL размножали в культуре способом, аналогичным способу, описанному Riddell et al. (Walter E.A. et al., N. Engl. J. Med., 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddell S.R. et al., Nat. Med., 1996 Feb, 2(2): 216-23). Общий объем 5×10 CTL суспендировали в 25 мл среды AIM-V/5% AS с 2 типами В-лимфобластоидных линий клеток человека, инактивированных митомицином С, в присутствии 40 нг/мл моноклонального антитела против CD3 (Pharmingen). Через сутки после инициации культур к культурам добавляли 120 МЕд/мл IL-2. Культуры подпитывали свежей средой AIM-V/5% AS, содержащей 30 МЕд/мл IL-2, на сутки 5, 8 и 11 (Tanaka Н. et al., Br. J. Cancer, 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y. et al., Br. J. Cancer, 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N. et al., Clin. Cancer Res., 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T. et al., Cancer Sc., 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T. et al., Cancer Sci., 2005 Aug, 96(8): 498-506).
[0237] Получение клонов CTL
4
Проводили разведения с получением 0,3, 1 и 3 CTL/лунку в 96-луночном микротитрационном планшете с лунками с круглым дном (Nalge Nunc International). CTL культивировали с 1×10 клеток/лунку 2 типами B-лимфобластоидных линий клеток человека, 30 нг/мл антител против CD3 и 125 Ед/мл IL-2 всего 150 мкл/лунку среды AIM-V, содержащей 5% AS. Через 10 суток к среде добавляли 50 мкл/лунку IL-2 с получением конечной концентрации 125 Ед/мл IL-2. Активность CTL тестировали на 14 сутки, и размножали клоны CTL аналогичным способом, как описано выше (Uchida N. et al., Clin. Cancer Res., 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T. et al., Cancer Sci., 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T. et al., Cancer Sci., 2005 Aug, 96(8): 498-506).
[0238] Специфическая активность CTL
4
Для анализа специфической активности CTL проводили анализ ELISPOT IFN-гамма и ELISA IFN-гамма. В качестве клеток-стимуляторов получали сенсибилизированные пептидом клетки TISI или клетки Т2 (1×10/лунку). Культивируемые клетки в 48-луночном планшете, линии CTL lines и клоны CTL использовали в качестве иммунореактивных клеток. Анализ ELISPOT IFN-гамма и ELISA IFN-гамма проводили в соответствии с инструкциями производителя.
4
[0239] Получение клеток, эффективно экспрессирующих целевой ген HLA-A2 4 или HLA-A2 или оба кДНК, кодирующую открытую рамку считывания целевых генов HLA-A*2402 или HLA-A*02 01, амплифицировали ПЦР. ПЦР-продукт амплификации клонировали в экспрессирующий вектор. Плазмиды трансфицировали в COS7, которая представляет собой линию клеток "нулевую" отношению к целевым генам, HLA-A*0201 и HLA-A*2402, с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Через 2 суток после трансфекции трансфицированные клетки собирали с использование версена (Invitrogen) и использовали в качестве клеток-стимуляторов (5×10 клеток/лунку) для анализа активности CTL.
[0240] Способность CTL распознавать линию клеток-мишеней, которые эндогенно экспрессировали TOPK и HLA-A*2402 или HLA-А*0201
4
Клон CTL анализировали на его способность распознавать клетки-мишени, которые эндогенно экспрессировали TOPK и HLA-А*2402 или HLA-A*0201. Получаемый клон CTL культивировали с линиями клеток-мишеней (5×10/лунку) в течение двух ночей. После инкубации измеряли IFN-гамма в средах для культивирования ELISA. ELISA IFN-гамма проводили в соответствии с инструкциями производителя.
[0241] Результаты
Усиленная экспрессия TOPK в злокачественных опухолях
Обширные данные профиля экспрессии гена, получаемые из различных злокачественных опухолей с использованием кДНК-микропанели, выявили, что экспрессия TOPK (номер доступа GeneBank NM_018492, например, SEQ ID NO: 85) являлась конкретно повышенной в тканях злокачественной опухоли по сравнению с соответствующей нормальной тканью. Экспрессия TOPK являлась закономерно повышенной в 1 из 15 случаев AML, 15 из 18 случаев рака мочевого пузыря, 36 из 4 0 случаев рака молочной железы, 2 из 6 случаев рака шейки матки, 6 из 6 случаев холангиоцеллюлярного рака, 2 из 6 случаев колоректального рака, 1 из 1 случая рака желудка диффузного типа, 5 из 5 случаев NSCLC, 1 из 2 случаев лимфомы, 7 из 11 случаев остеосаркомы, 12 из 19 случаев рака предстательной железы, 3 из 12 случаев рака почки, 14 из 14 случаев SCLC и 15 из 29 случаев опухоли мягких тканей (таблица 1).
[0242]
Таблица 1
Отношение случаев наблюдаемой повышенной экспрессии topK в тканях злокачественных опухолей по сравнению с нормальными соответствующими тканями
Злокачественная опухоль/опухоль
Отношение
AML
1/15
Рак мочевого пузыря
15/18
Рак молочной железы
36/40
Рак шейки матки
2/6
Холангиоцеллюлярный рак
6/6
Колоректальный рак
2/6
Рак желудка диффузного типа
1/1
NSCLC
5/5
Лимфома
1/2
Остеосаркома
7/11
Рак предстательной железы
12/19
Рак почки
3/12
SCLC
14/14
Опухоль мягких тканей
15/29
[0243] Прогнозирование связывающихся с HLA-A24 пептидов, получаемых из TOPK
В таблице 2 а и 2 b представлено связывание с HLA-A249-мерных и 10-мерных пептидов TOPK в порядке повышения аффинности связывания. Выбирали всего 4 0 пептидов, обладающих потенциальной способностью связываться с HLA-A24, и исследовали для определения пептидов-эпитопов.
[0244]
[0245]
Начальное положение указывает на число аминокислотных остатков от N-конца TOPK. Константу диссоциации [Kd (нМ)] получают из "NetMHC3.0".
[0246] Прогнозирование связывающихся с HLA-A02 пептидов, получаемых из TOPK
В таблицах 3 а и 3 b представлены связывающиеся с HLA-A029-мерные и 10-мерные пептиды TOPK, соответственно, в порядке повышения аффинности связывания. Выбирали всего 44 пептида с потенциальной способностью связываться с HLA-A02 и исследовали для определения пептидов-эпитопов.
[0247]
[0247]
Начальное положение указывает на число аминокислотных остатков от N-конца TOPK. Константу диссоциации [Kd (нМ)] получают из "NetMHC3.0".
[0249] Индукция CTL теоретически рассчитанными пептидами из TOPK, рестриктированными по HLA-A*2402
В соответствии с протоколами, как описано в "Веществах и способах", получали CTL для таких пептидов, получаемых из TOPK. Пептид-специфическую активность CTL детектировали анализом ELISPOT на IFN-гамма (фигура 1). Для лунки №8 с TOPK-А24-9-230 (SEQ ID NO: 2) (a), №3 с TOPK-А24-9-130 (SEQ ID NO: 3) (b), №3 с TOPK-А24-9-232 (SEQ ID NO: 6) (c), №2 с TOPK-A24-10-288 (SEQ ID NO: 27) (d) и №4 с TOPK-A24-10-28 9 (SEQ ID NO: 28) (e) демонстрировали эффективную продукцию IFN-гамма по сравнению с контрольными лунками. С другой стороны, не детектировали специфической активности CTL при стимуляции другими пептидами, представленными в таблицах 2 a и 2 b, несмотря на то, что эти пептиды обладали вероятной активностью связывания с HLA-A*2402. Как характерно для отрицательных данных не наблюдали специфической продукции IFN-гамма в CTL, стимулированном TOPK-А24-9-289 (SEQ ID NO: 1) (f). В своей совокупности эти результаты позволяют предположить, что 5 отобранных пептидов, получаемых из TOPK, могут индуцировать эффективные CTL.
[0250] Индукция CTL теоретически рассчитанными пептидами из TOPK, рестриктированного по HLA-A*0201
Пептид-специфическую активность CTL детектировали анализом ELISPOT на IFN-гамма (фигура 2). В лунке №7 с TOPK-А02-9-240 (SEQ ID NO: 42) (a), №4 с TOPK-А02-9-19 (SEQ ID NO: 45) (b), №2 с TOPK-А02-9-183 (SEQ ID NO: 47) (c), №8 с TOPK-А02-9-235 (SEQ ID NO: 50) (d), №4 с TOPK-A02-9-12 (SEQ ID NO: 51) (e), №3 с TOPK-A02-9-285 (SEQ ID NO: 53) (f), №3 с TOPK-A02-9-47 (SEQ ID NO: 54) (g), №5 с TOPK-A02-10-236 (SEQ ID NO: 62) (h), №3 с TOPK-A02-10-231 (SEQ ID NO: 63) (i), №8 с TOPK-A02-10-47 (SEQ ID NO: 64) (j), №1 с TOPK-A02-10-239 (SEQ ID NO: 66) (к), №1 с TOPK-A02-10-272 (SEQ ID NO: 71) (1), №4 с TOPK-A02-10-88 (SEQ ID NO: 72) (m) и №4 с TOPK-A02-10-142 (SEQ ID NO: 76) (n) демонстрировали эффективную продукцию IFN-гамма по сравнению с контрольными лунками. С другой стороны, не детектировали специфической активности CTL при стимуляции другими пептидами, представленными в таблицах 3 a и 3 b, несмотря на то, что эти пептиды обладали возможной активностью связывания с HLA-A*0201. Как характерно для отрицательных данных, не наблюдали специфической продукции IFN-гамма от CTL, стимулированных TOPK-А02-9-55 (SEQ ID NO: 41) (o). В своей совокупности эти результаты позволяют предположить, что 14 выбранных пептидов, получаемых из TOPK, могут индуцировать эффективные CTL.
[0251] Выведение линии и клона CTL против получаемого из TOPK пептида Клетки в лунке №8 с TOPK-А24-9-230 (SEQ ID NO: 2) (a), №3 с TOPK-А24-9-130 (SEQ ID NO: 3) (b), №3 с TOPK-А24-9-232 (SEQ ID NO: 6) (c), №2 с TOPK-A24-10-288 (SEQ ID NO: 27) (d) и №4 с TOPK-A24-10-289 (SEQ ID NO: 28) (e), для которых демонстрировали пептид-специфическую активность CTL анализом ELISPOT на IFN-гамма, размножали и получали линии CTL. Активности CTL этих линий CTL измеряли ELISA на IFN-гамма (фигура 3). Линии CTL демонстрировали эффективную продукцию IFN-гамма против клеток-мишени, сенсибилизированных соответствующим пептидом, по сравнению с клетками-мишенями без сенсибилизации пептидом. Кроме того, выводили клоны CTL путем лимитирующего разведения из линий CTL, как описано в "Веществах и способах", и измеряли продукцию IFN-гамма клонами CTL против клеток TISI, сенсибилизированных соответствующим пептидом, ELISA на IFN-гамма. Наблюдали эффективную продукцию IFN-гамма клонами CTL, стимулированными TOPK-А24-9-130 (SEQ ID NO: 3) (a), TOPK-А24-10-288 (SEQ ID NO: 27) (b) и TOPK-А24-10-289 (SEQ ID NO: 28) (c) (фигура 4).
[0252] Клетки в лунке №7 с TOPK-А02-9-240 (SEQ ID NO: 42) (a), №4 с TOPK-А02-9-19 (SEQ ID NO: 45) (b), №8 с TOPK-А02-9-235 (SEQ ID NO: 50) (c), №4 с TOPK-А02-9-12 (SEQ ID NO: 51) (d), №3 с TOPK-A02-9-285 (SEQ ID NO: 53) (e), №3 с TOPK-A02-9-47 (SEQ ID NO: 54) (f), №5 с TOPK-A02-10-236 (SEQ ID NO: 62) (g), №3 с TOPK-A02-10-231 (SEQ ID NO: 63) (h), №8 с TOPK-A02-10-47 (SEQ ID NO: 64) (i), №1 с TOPK-A02-10-239 (SEQ ID NO: 66) (j) и №4 с TOPK-A02-10-88 (SEQ ID NO: 72) (k), для которых демонстрировали пептид-специфическую активность CTL анализом ELISPOT на IFN-гамма, размножали и выводили линии CTL. Активности CTL этих линий CTL измеряли ELISA на IFN-гамма (фигура 5). Линии CTL демонстрировали эффективную продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, сенсибилизированных соответствующим пептидом, по сравнению с клетками-мишенями без сенсибилизации пептидом. Кроме того, выводили клоны CTL путем лимитирующего разведения из линий CTL, как описано в "Веществах и способах", и измеряли продукцию IFN-гамма клонами CTL против клеток T2, сенсибилизированных соответствующим пептидом, ELISA на IFN-гамма. Наблюдали эффективную продукцию IFN-гамма клонами CTL, стимулированными TOPK-А02-9-240 (SEQ ID NO: 42) (a) и TOPK-А02-9-285 (SEQ ID NO: 53) (b) (фигура 6).
[02 53] Специфическая активность CTL против клеток-мишеней, экспрессирующих TOPK и HLA-A*2402 или HLA-A*0201
Выведенные клоны CTL, индуцированные против пептида TOPK-А24-10-289 (SEQ ID NO: 28), анализировали на способность распознавать клетки-мишени, которые экспрессируют TOPK и молекулу HLA-A*2402. В качестве клеток-стимуляторов получали клетки COS7, трансфицированные полноразмерным TOPK и геном HLA-А*2402 (конкретная модель для клеток-мишеней, которые экспрессируют TOPK и ген HLA-A*2402), и в качестве контролей использовали клетки COS7, трансфицированные полноразмерным TOPK или HLA-A*2402. На фигуре 7 клон CTL, стимулированный TOPK-А24-10-289 (SEQ ID NO: 28), демонстрировал сильную активность CTL против клеток COS7, экспрессирующих TOPK и HLA-A* 2402. С другой стороны, не детектировали значительной специфической активности CTL против контролей. Таким образом, эти данные ясно демонстрируют, что пептид TOPK-А24-10-289 (SEQ ID NO: 28) эндогенно процессируется и экспрессируется на клетках-мишенях с молекулой HLA-A*24 02, и его распознают CTL. Получаемую линию CTL, индуцированную против пептида TOPK-А02-9-240 (SEQ ID NO: 42), анализировали на способность распознавать клетки-мишени, которые экспрессируют TOPK и молекулу HLA-A*0201. В качестве клеток-стимуляторов получали клетки COS7, трансфицированные полноразмерным TOPK и геном HLA-A*0201 (конкретная модель для клеток-мишеней, которые экспрессируют TOPK и ген HLA-A*0201), и в качестве контролей использовали клетки COS7, трансфицированные полноразмерным TOPK или HLA-A*0201. На фигуре 8 линия CTL, стимулированная TOPK-А02-9-240 (SEQ ID NO: 42), демонстрировала сильную активность CTL против клеток COS7, экспрессирующих TOPK и HLA-A*0201. С другой стороны, не детектировали значительной специфической активности CTL против контролей. Таким образом, эти данные ясно демонстрируют, что пептид TOPK-А02-9-240 (SEQ ID NO: 42) эндогенно процессируется и экспрессируется на клетках-мишенях с молекулой HLA-A*0201, и его распознают CTL. Эти результаты свидетельствуют о том, что эти пептиды, получаемые из TOPK, могут быть доступными для применения противораковых вакцин для пациентов с опухолями, экспрессирующими TOPK.
[0254] Анализ гомологии антигенных пептидов
CTL, стимулированные TOPK-А24-9-230 (SEQ ID NO: 2), TOPK-А24-9-130 (SEQ ID NO: 3), TOPK-А2 4-9-2 32 (SEQ ID NO: 6), TOPK-A24-10-288 (SEQ ID NO: 27), TOPK-A24-10-28 9 (SEQ ID NO: 28), TOPK-A02-9-240 (SEQ ID NO: 42), TOPK-A02-9-19 (SEQ ID NO: 45), TOPK-A02-9-183 (SEQ ID NO: 47), TOPK-A02-9-235 (SEQ ID NO: 50), TOPK-A02-9-12 (SEQ ID NO: 51), TOPK-A02-9-285 (SEQ ID NO: 53), TOPK-A02-9-47 (SEQ ID NO: 54), TOPK-A02-10-236 (SEQ ID NO: 62), TOPK-A02-10-231 (SEQ ID NO: 63), TOPK-A02-10-47 (SEQ ID NO: 64), TOPK-A02-10-239 (SEQ ID NO: 66), TOPK-A02-10-272 (SEQ ID NO: 71), TOPK-A02-10-88 (SEQ ID NO: 72) или TOPK-A02-10-142 (SEQ ID NO: 76), демонстрировали значительную и специфическую активность CTL. Этот результат может быть обусловлен тем фактом, что эти последовательности являются гомологичными пептиду, получаемому из других молекул, для которых известно, что они сенсибилизируют иммунную систему человека. Для исключения этой возможности проводили анализ гомологии для этих пептидных последовательностей с использованием запроса алгоритма BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi), который не выявил последовательностей со значительной гомологией. Результаты анализов гомологии свидетельствуют о том, что последовательности TOPK-А24-9-230 (SEQ ID NO: 2), TOPK-А24-9-130 (SEQ ID NO: 3), TOPK-А24-9-232 (SEQ ID NO: 6), TOPK-A24-10-288 (SEQ ID NO: 27), TOPK-A24-10-289 (SEQ ID NO: 28), TOPK-A02-9-240 (SEQ ID NO: 42), TOPK-A02-9-19 (SEQ ID NO: 45), TOPK-A02-9-183 (SEQ ID NO: 47), TOPK-A02-9-235 (SEQ ID NO: 50), TOPK-A02-9-12 (SEQ ID NO: 51), TOPK-A02-9-285 (SEQ ID NO: 53), TOPK-A02-9-47 (SEQ ID NO: 54), TOPK-A02-10-236 (SEQ ID NO: 62), TOPK-A02-10-231 (SEQ ID NO: 63), TOPK-A02-10-47 (SEQ ID NO: 64), TOPK-A02-10-239 (SEQ ID NO: 66), TOPK-A02-10-272 (SEQ ID NO: 71), TOPK-A02-10-88 (SEQ ID NO: 72) и TOPK-A02-10-142 (SEQ ID NO: 76) являются уникальными, и, таким образом, по сведениям автором существует маленькая вероятность, что эти молекулы вызывают непреднамеренную иммунную реакцию на некоторую неродственную молекулу. В заключении, новые пептиды-эпитопы HLA-A2 4 или HLA-A02, получаемые из TOPK, идентифицированные в настоящем описании, могут находить применение в области иммунотерапии злокачественной опухоли. Применимость в промышленности
[0255] Настоящее изобретение относится к новым ТАА, в частности таким, как получаемые из TOPK, которые могут индуцировать сильные и специфические противоопухолевые иммунные реакции, и, таким образом, находят применимость для широкого спектра типов злокачественных опухолей. Такие ТАА могут находить применение в качестве пептидных вакцин против заболеваний, ассоциированных с TOPK, например, злокачественной опухоли, более конкретно, острого миелолейкоза (AML), рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиоцеллюлярного рака, колоректального рака, рака желудка диффузного типа, немелкоклеточного рака легких (NSCLC), лимфомы, остеосаркомы, рака предстательной железы, рака почки, мелкоклеточного рака легких (SCLC) и опухоли мягких тканей.
[0256] Несмотря на то, что настоящее изобретение подробно и со ссылкой на его конкретные варианты осуществления описано в настоящем описании, следует понимать, что указанное выше описание является иллюстративным и пояснительным по природе и предназначено для иллюстрации настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления. Посредством общепринятого экспериментирования специалист в данной области легко поймет, что в настоящем изобретении можно проводить различные изменения и модификации, не выходя за рамки сущности и объема настоящего изобретения, пределы и границы которого определены прилагаемой формулой изобретения.