СПОСОБ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ФРАГМЕНТА НЕЙРОЭНДОКРИННОЙ ОПУХОЛИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА В ПОДЖЕЛУДОЧНУЮ ЖЕЛЕЗУ ИММУНОДЕФИЦИТНЫХ МЫШЕЙ
METHOD OF HUMAN PANCREATIC NEUROENDOCRINE TUMOR FRAGMENT TRANSPLANTATION INTO IMMUNODEFICIENCY MICE PANCREATIC GLAND

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и касается способа трансплантации фрагмента нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы человека в поджелудочную железу иммунодефицитных мышей для получения ортотопической пациентоподобной модели, имеющей структурные и физиологические особенности, наиболее адекватно отражающие картину развития нейроэндокринных опухолей у человека.
Нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы являются редкими заболеваниями. Они вместе с нейроэндокринными опухолями желудочно-кишечного тракта составляют менее 2% всех новообразований данных локализаций (см. Майстренко Н.А., Ромащенко П.Н., Лысанюк М.В. Диагностика и хирургическое лечение нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы и желудочно-кишечного тракта // Анналы хирургической гепатологии. - 2016. Т. 21. - №1. - С. 13-20).
Вместе с этим в терапии данного заболевания существует ряд затруднений. Трудность постановки диагноза на догоспитальном этапе увеличивают срок выявления нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы (см. Пинский С.Б., Белобородое В.А., Батороев Ю.К., Дворниченко В.В. Нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы // Сибирский медицинский журнал. - 2013. - №5. - С. 12-17). Особенностью данной опухоли является высокий потенциал метастазирования.
Так гастриномы, випомы и глюкагономы в 80% случаев метастазируют в печень. Главной проблемой является высокий процент случаев (65-70%) обращения пациентов, имеющих на момент первичного обращения метастазы в печень и другие органы (см. Янкин А.В. Нейроэндокринные опухоли желудочно-кишечного тракта // Практическая онкология. - 2005. - Т. 6. - №4. - С. 227-233).
В настоящее время в клинической практике отсутствует единый подход к лечению данного заболевания (см. Черноусов А.Ф., Егоров А.В., Мусаев Г.Х. и др. Нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы: 30-летний опыт клиники факультетской хирургии им. Н.Н. Бурденко // Хирургия. - 2013. - №7. - С. 13-19). Ключевым методом лечения является хирургический. На сегодняшний день остается актуальным вопрос о разработке более эффективных ферментных и цитостатических препаратов, а также изучение этиологии данного заболевания.
Одним из ключевых инструментов в изучении особенностей нейроэндокринного рака поджелудочной железы и разработке новых терапевтических препаратов является создание моделей данного заболевания, наиболее полно отражающих реальную картину патологического процесса. Такому требованию может отвечать ортотопическая пациентоподобная модель нейроэндокринного рака поджелудочной железы, поскольку ее клеточный состав является гетерогенным аналогично реальным опухолям, а ортотопическое микроокружение оказывает влияние на онкогенез, подобное тому, в котором развиваются опухоли у человека.
Кроме того, при ортотопической имплантации опухолевого материала становится высока вероятность развития метастазов (см. Холоденко И.В., Доронин И.И., Холоденко Р.В. Опухолевые модели в изучении онкологических заболеваний // Иммунология. - 2013. - №5. - С. 282-286.; Yu Wang, Jiujie Cui, Liwei Wang. Patient-derived xenografts: a valuable platform for clinical and preclinical research in pancreatic cancer // Chin Clin Oncol. - 2019. - №8(2): 17. P. 1-11.; Wanglong Qiu, Gloria H. Su. Challenges and advances in mouse modeling for human pancreatic tumorigenesis and metastasis // Cancer Metastasis Rev. - 2013. - №32. - P. 83-107).
3
Известен способ создания пациентоподобной модели рака поджелудочной железы, когда фрагмент опухоли от пациента размером 1-2 мм имлантировали подкожно (см. Linshi Zhang, Jiarong Zhou, Yingcai Yan et al. Excipient-free nanodispersion of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin exerts potent therapeutic effects against pancreatic cancer cell lines and patient-derived xenografts // Cancer Letters. - 2019. - №465. - P. 36-44.; Guoyun Zhu, Davide Foletti, Xiaohui Liu et al. Targeting CLDN18.2 by CD3 Bispecific and ADC Modalities for the Treatments of Gastric and pancreatic Cancer // Scientific RepoRts. - 2019. - №9: 8420. - P. 1-11). Недостатком данного способа является неестественный сайт имплантации опухолевого материала, предполагающий влияние на опухоль чужеродного микроокружения.
Известен способ ортотопической иплантации рака поджелудочной железы, включающий рассечение кожи и брюшной стенки мыши, инъекцию опухолевой суспензии, полученной из фрагмента человеческой опухоли поджелудочной железы под соединительнотканную капсулу поджелудочной железы (см. Wanglong Qiu, Gloria Н. Su. Challenges and advances in mouse modeling for human pancreatic tumorigenesis and metastasis // Cancer Metastasis Rev. - 2013. - №32. - P. 83-107). Преимуществом данного способа является ортотопический сайт имплантации.
Однако опухолевый материал в виде суспензии развивается медленнее, менее способен к метастазированию по сравнению с таковым, трансплантированным в форме фрагмента (см. Трещалина Е.М. Иммунодефицитные мыши Balb/c Nude и моделирование различных вариантов опухолевого роста для доклинических исследований // Российский биотерапевтический журнал. - 2017. - Т. 16. - №16. - С. 6-13). Для улучшения приживаемости имплантата другие авторы предлагают вводить опухолевую суспензию в смеси с Матригелем, препятствующим элиминацию раковых клеток (см. Matthew С. Hernandez, John R. Bergquist, Jennifer L. Leiting et al. Patient-Derived Xenografts Can Be Reliably Generated from Patient Clinical Biopsy Specimens // Journal of Gastrointestinal Surgery. - 2019. - №23. - P. 818-824). Недостатком данного способа является трудоемкость подготовительного этапа, а соответственно его длительность, что может оказывать негативное влияние на успех приживления опухолевого материала.
Известен способ трансплантации культуры клеток карциномы поджелудочной железы COLO 357 и L3.3 сначала методом подкожной инъекции, а затем извлечение выросшей опухоли из тела иммунодефицитной мыши и его трансплантация в виде фрагмента в наружную часть поджелудочной железы (см. Трещалина Е.М. Иммунодефицитные мыши Balb/c Nude и моделирование различных вариантов опухолевого роста для доклинических исследований // Российский биотерапевтический журнал. -2017. - Т. 16. - №16. - С. 6-13). Недостатком этого способа является имплантация культуры клеток, а не гетерогенного материала, взятого непосредственно от пациента. Как известно, гетерогенный состав клеточной популяции опухолей наиболее адекватно отражает реальную картину онкогенеза.
Известен способ трансплантации фрагмента опухоли поджелудочной железы человека размером 1-2 мм3 ортотопически в поджелудочную железу иммунодефицитной мыши (см. Eunsung Jun, Seung-Mo Hong, Hyun Ju Yoo et al. Genetic and metabolic comparison of orthotopic and heterotopic patient-derived pancreatic-cancer xenografts to the original patient tumors // Oncotarget, Advance Publications. - 2017. - P. 1-15). Недостатком данного способа является небольшой размер имлантанта, что может оказать существенное влияние на его приживление.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа трансплантации фрагмента нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы человека в поджелудочную железу иммунодефицитных мышей, позволяющего получить ортотопическую пациентоподобную модель нейроэндокринного рака поджелудочной железы, наиболее точно отражающую особенности данного заболевания у человека.
Технический результат изобретения достигается тем, что разрез кожи и тканей брюшной стенки осуществляется перпендикулярно средней линии туловища в области левого подреберья на протяжении 22 мм, начало разреза расположено в 5 мм от левой реберной дуги, а его конец заходит на 3 мм за среднюю линию в правую половину туловища животного, производят рассечение желудочно-селезеночной доли поджелудочной железы в краниально-каудальном направлении на расстоянии 3 мм от каудального края и 5 мм от левого края поджелудочной железы глубиной 2 мм, длиной 2 мм, фрагмент нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы человека объемом 15 мм3 при помощи лигатуры фиксируют к стенке поджелудочной железы над рассечением, ушивают брюшную полость. Способ осуществляют следующим образом.
Фрагмент нейроэндокринного рака поджелудочной железы после иссечения незамедлительно помещается в среду Хенкса. Непосредственно перед трансплантацией вырезают кусочки объемом 15 мм3. Время от момента резекции опухолевого материала у человека до имплантации в поджелудочную железу иммунодефицитной мыши не должно превышать 20 минут. Реципиентом опухолевого материала служат иммунодефицитные мыши Balb/c Nude. В качестве премедикации используют ксилазин концентрацией 20 мг/мл. Животных наркотизируют при помощи золетила концентрацией 22,57 мг/мл.
Для обеспечения доступа к желудочно-селезеночной доли поджелудочной железы разрезают кожу и ткани брюшной стенки перпендикулярно средней линии туловища в области левого подреберья на протяжении 22 мм. Разрез начинается в 5 мм от левой реберной дуги, а его конец заходит на 3 мм за среднюю линию в правую половину туловища. Далее рассекают желудочно-селезеночную долю поджелудочной железы в краниально-каудальном направлении на расстоянии 3 мм от каудального края и 5 мм от левого края поджелудочной железы глубиной 2 мм, длиной 2 мм. Фрагмент нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы человека объемом 15 мм3 при помощи лигатуры фиксируют к стенке поджелудочной железы над рассечением. После проведения трансплантации опухолевого материала ушивают брюшную полость.
Изобретение иллюстрируется фигурами (1-3).
На Фиг 1. изображена фиксация фрагмента нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы человека к стенке желудочно-селезеночной доли поджелудочной железы иммунодефицитной мыши Balb/c Nude.
На Фиг 2. изображен фрагмент нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы человека, зафиксированный на стенке поджелудочной железы иммунодефицитной мыши Balb/c Nude.
На Фиг 3. изображена иммунодефицитная мышь Balb/c Nude после ортотопической трансплантации фрагмента нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы человека.
Данным способом произведена трансплантация фрагмента нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы человека в поджелудочную железу 20 иммунодефицитным мышам Balb/c Nude.
Пример.
Данным способом была прооперирована самка иммунодефицитной мыши Balb/c Nude возрастом 6 недель массой 21,5 г. Трансплантантом служил фрагмент нейроэндокринного рака поджелудочной железы объемом 15 мм3, который после выделения из организма человека был помещен в среду Хенкса. Время от момента резекции опухолевого материала у человека до имплантации в поджелудочную железу иммунодефицитной мыши составило 13 минут.Премедикацию проводили с использованием ксилазина концентрацией 20 мг/мл. Наркоз животных осуществляли при помощи золетила концентрацией 22,57 мг/мл.
Для обеспечения доступа к желудочно-селезеночной доли поджелудочной железы иммунодефицитной мыши разрезали кожу и ткани брюшной стенки перпендикулярно средней линии туловища в области левого подреберья на протяжении 22 мм. Разрез начинался в 5 мм от левой реберной дуги, а его конец заходил на 3 мм за среднюю линию в правую половину туловища. После этого рассекали желудочно-селезеночную долю поджелудочной железы в краниально-каудальном направлении на расстоянии 3 мм от каудального края и 5 мм от левого края поджелудочной железы глубиной 2 мм, длиной 2 мм. Фрагмент нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы человека объемом 15 мм3 при помощи лигатуры зафиксировали к стенке поджелудочной железы над рассечением. Ушили брюшную полость. Мышь благополучно перенесла операцию, без осложнений.
Технико-экономическая эффективность данного способа заключается в том, что он позволяет получить ортотопическую пациентоподобную модель нейроэндокринного рака поджелудочной железы, наиболее адекватно отражающую особенности онкогенеза, происходящего в организме человека, и являющуюся ценной тест-системой для доклинических исследований различных способов лечения нейроэндокринного рака поджелудочной железы.