АНТИТЕЛА К ТИКАГРЕЛОРУ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ
ANTIBODIES TO TICAGRELOR AND APPLICATION METHODS

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПОДАННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ
[0001]
Данная заявка включает посредством ссылки перечень последовательностей, поданный с настоящей заявкой в машино-читаемой форме (CRF) в виде текстового файла под названием "Ticagrelor_SeqList_ST25.TXT", созданного 1 октября 2014 года и имеющего размер 33900 байт.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002]
12
Тикагрелор (BRILINTA™, BRILIQUE™) представляет собой активный при пероральном введении циклопентилтриазолопиримидин, селективный и обратимо связывающий антагонист рецепторов аденозиндифосфата (ADP). Было подтверждено, что у пациентов с острыми коронарными синдромами (ACS) прием 90 мг тикагрелора два раза в день в комбинации с низкой дозой аспирина приводит к уменьшению основных сердечно-сосудистых (CV) патологий. Тикагрелор оказывает действие по двойному пути, который опосредует как антитромбоцитарное действие (P2Y), так и усиленный ответ на аденозин (ENT-1)(Cattaneo M et al. 2014. J Am Coll Cardiol. 63(23):2503-9). Хотя и не существует утвержденных критериев, в продолжающихся в настоящее время и запланированных исследованиях оценивают тикагрелор в отношении уменьшения частоты возникновения основных CV патологий у пациентов с первичным инфарктом миокарда, установленной болезнью периферических артерий и острым инсультом, а также у пациентов с сахарным диабетом и подтвержденным коронарным атеросклерозом.
[0003]
12
12
Тикагрелор имеет два основных метаболита, активный метаболит тикагрелора (TAM) и неактивный метаболит тикагрелора (TIM)(Teng et al. 2010 Drug Metab. and Dispos. 38:1514-1521). TAM, также известный как AR-C124910XX, представляет собой основной циркулирующий метаболит тикагрелора и в равной степени эффективен в плане антагонистической активности по отношению к P2Y. Как правило, TAM присутствует в количестве приблизительно 30-40% от концентрации исходного тикагрелора у пациентов, принимающих BRILINTA/BRILIQUE. Тикагрелор и TAM имеют периоды полувыведения из крови в 8 и 12 часов соответственно. TIM, также известный как AR-C133913XX, представляет собой неактивный агонист P2Y, который составляет <10% от исходного тикагрелора, при этом его невозможно выявить через 8 часов, и он представляет собой основной метаболит, экскретируемый из организма с мочой.
[0004]
Исследование "ингибирование тромбоцитов и результаты лечения пациентов" (PLATO) продемонстрировало более высокую эффективность тикагрелора без повышения случаев общего серьезного кровотечения в сравнении с клопидогрелем у обширной группы пациентов с ACS (UA, NSTEMI, STEMI) вне зависимости от стратегии ведения лечения (медикаментозного или с применением инвазивных процедур)(Wallentin et al. 2009 NEJM 361 (11): 1045-1057). Однако, как и в отношении всех антитромбоцитарных средств, у пациентов, использующих тикагрелор, существует вероятность кровотечения. Если у пациентов, получающих лечение с использованием двойной антитромбоцитарной терапии (DAPT), возникает тяжелое кровотечение, то существующие варианты лечения ограничены. Если эпизод кровотечения возникает у пациента с DAPT, то в попытке усиления гемостаза можно применять переливание тромбоцитов или введение факторов коагуляции. Однако на текущий момент не существует клинических данных, которые дают оценку, с точки зрения гемостатического преимущества, переливанию тромбоцитов или применению рекомбинантного фактор VIIa после или во время случаев серьезного кровотечения у субъектов, принимающих тикагрелор(Dalén M et al. 2013 J Cardiothorac Vasc Anesth. 27(5):e55-7).
[0005]
Соответственно, доступность антидота, такого как специфичное к тикагрелору нейтрализующее антитело, предоставило бы лучшее клиническое ведение лечения с балансом между необходимым антитромботическим эффектом и контролем кровотечения. Поскольку тикагрелор представляет собой единственный реализуемый на рынке обратимо связывающий ингибитор тромбоцитов, антитело может обеспечить обратимость ингибирования тромбоцитов без потребности в переливании свежих тромбоцитов, предупреждая таким образом опасные явления, связанные с переливаниями тромбоцитов. Доступность средства, которое устраняет ингибирование ADP-индуцированной агрегации тромбоцитов, обусловленной тикагрелором и TAM, будет удовлетворять важную нерешенную клиническую потребность, например, у пациентов с серьезным кровотечением или которые требуют неотложного хирургического вмешательства.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО РАСКРЫТИЯ
[0006]
Ia
В одном аспекте данное раскрытие относится к антителу, которое специфически связывает циклопентилтриазолопиримидиновое соединение формулы ():
Ia
(),
где
1
1
6
1
6
R выбран из группы, состоящей из C-Cалкокси и C-Cалкилтио;
2
1
6
1
6
3
6
3
6
R выбран из группы, состоящей из H, C-Cалкила, замещенного C-Cалкила, C-Cциклоалкила и замещенного C-Cциклоалкила; и
3
1
6
1
6
1
6
R выбран из группы, состоящей из H, C-Cалкила, C-Cалкокси и C-Cалканола.
[0007]
IIa
В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с эпитопом в пределах части соединений, обозначенной квадратными скобками как формула (),
1
2
3
где R, R, и R определены выше.
[0008]
IIIa
В дополнительных вариантах осуществления антитело связывается с эпитопом в пределах части соединений, обозначенной квадратными скобками как формула (),
2
3
1
1
4
где R и R определены выше, и R' выбран из групп, состоящей из C-Cалкила.
[0009]
В дополнительных вариантах осуществления антитело связывается с соединением, выбранным из группы, состоящей из:
тикагрелора;
активного метаболита тикагрелора (TAM) и
неактивного метаболита тикагрелора (TIM).
[0010]
В дополнительных вариантах осуществления указанных выше аспектов и вариантов осуществления антитело или его фрагмент содержит последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (VH), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:62, и SEQ ID NO:72; и последовательность вариабельного участка легкой цепи (VL), выбранную из группы, состоящей изSEQ ID NO:7, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:67, и SEQ ID NO:77. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит комбинацию последовательностей VH и VL, выбранную из группы, состоящей изSEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:22 и SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:32 и SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:42 и SEQ ID NO:47; SEQ ID NO:52 и SEQ ID NO:57; SEQ ID NO:62 и SEQ ID NO:67; и SEQ ID NO:72 и SEQ ID NO:77. В дополнительных вариантах осуществления антитело содержит комбинацию VH и VL, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:52 и SEQ ID NO:57; SEQ ID NO:62 и SEQ ID NO:67; и SEQ ID NO:72 и SEQ ID NO:77.
[0011]
В дополнительных вариантах осуществления указанных выше аспектов и вариантов осуществления антитело или его фрагмент содержит каркасные участки (FR) и определяющие комплементарность участки (CDR) 1, 2, и 3 вариабельного участка тяжелой цепи и вариабельного участка легкой цепи, где последовательности CDR1, CDR2, и CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи предусматривают SEQ ID NO:3 (CDR1), SEQ ID NO:4 (CDR2), и SEQ ID NO:5 (CDR3); SEQ ID NO:13 (CDR1), SEQ ID NO:14 (CDR2), и SEQ ID NO:15 (CDR3); SEQ ID NO:23 (CDR1), SEQ ID NO:24 (CDR2), и SEQ ID NO:25 (CDR3); SEQ ID NO:33 (CDR1), SEQ ID NO:34 (CDR2), и SEQ ID NO:35 (CDR3); SEQ ID NO:43 (CDR1), SEQ ID NO:44 (CDR2), и SEQ ID NO:45 (CDR3); SEQ ID NO:53 (CDR1), SEQ ID NO:54 (CDR2), и SEQ ID NO:55 (CDR3); SEQ ID NO:63 (CDR1), SEQ ID NO:64 (CDR2), и SEQ ID NO:65 (CDR3); или SEQ ID NO:73 (CDR1), SEQ ID NO:74 (CDR2), и SEQ ID NO:75 (CDR3); и где последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного участка легкой цепи предусматривают SEQ ID NO:8 (CDR1), SEQ ID NO:9 (CDR2), и SEQ ID NO:10 (CDR3); SEQ ID NO:18 (CDR1), SEQ ID NO:19 (CDR2), и SEQ ID NO:20 (CDR3); SEQ ID NO:28 (CDR1), SEQ ID NO:29 (CDR2), и SEQ ID NO:30 (CDR3); SEQ ID NO:38 (CDR1), SEQ ID NO:39 (CDR2), и SEQ ID NO:40 (CDR3); SEQ ID NO:48 (CDR1), SEQ ID NO:49 (CDR2), и SEQ ID NO:50 (CDR3); SEQ ID NO:58 (CDR1), SEQ ID NO:59 (CDR2), и SEQ ID NO:60 (CDR3); SEQ ID NO:68 (CDR1), SEQ ID NO:69 (CDR2), и SEQ ID NO:70 (CDR3); или SEQ ID NO:78 (CDR1), SEQ ID NO:79 (CDR2), и SEQ ID NO:80 (CDR3). В дополнительных вариантах осуществления антитело содержит комбинацию участков CDR, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO:53 (VH CDR1), SEQ ID NO:54 (VH CDR2), SEQ ID NO:55 (VH CDR3), SEQ ID NO:58 (VL CDR1), SEQ ID NO:59 (VL CDR2), и SEQ ID NO:60 (VL CDR3); SEQ ID NO:63 (VH CDR1), SEQ ID NO:64 (VH CDR2), SEQ ID NO:65 (VH CDR3), SEQ ID NO:68 (VL CDR1), SEQ ID NO:69 (VL CDR2), и SEQ ID NO:70 (VL CDR3); и SEQ ID NO:73 (VH CDR1), SEQ ID NO:74 (VH CDR2), SEQ ID NO:75 (VH CDR3), SEQ ID NO:78 (VL CDR1), SEQ ID NO:79 (VL CDR2), и SEQ ID NO:80 (VL CDR3).
[0012]
2
В указанных выше аспекте и вариантах осуществления антитело выбрано из поликлонального антитела, моноклонального антитела, гуманизированного антитела, антитела человека, одноцепочечного Fv (scFv), однодоменного антитела, Fab, F(ab'), одноцепочечного диатела, миметика антитела и вариабельного домена антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело предусматривает scFv. В некоторых вариантах осуществления антитело предусматривает Fab.
[0013]
В некоторых вариантах осуществления антитело, описанное выше, связывается с тикагрелором или активным метаболитом тикагрелора (TAM).
[0014]
50
50
50
В дополнительных вариантах осуществления антитело связывает тикагрелор или его метаболит или производное при IC, составляющей приблизительно 200 нМ или ниже. В других дополнительных вариантах осуществления антитело связывает тикагрелор или его метаболит или производное при IC, составляющей от приблизительно 100 нМ до приблизительно 1 нМ, или при IC, составляющей от приблизительно 10 нМ до приблизительно 1 нМ.
[0015]
В дополнительных вариантах осуществления антитело связывает тикагрелор или его метаболит или производное с Kd, составляющей приблизительно 50 нМ или ниже. В других дополнительных вариантах осуществления антитело связывает тикагрелор или его метаболит или производное с Kd в диапазоне от приблизительно 250 пМ до приблизительно 1 пМ или в диапазоне от приблизительно 100 пМ до приблизительно 1 пМ.
[0016]
50
В дополнительных вариантах осуществления антитело связывает тикагрелор или его метаболит или производное и не связывается с соединением, выбранным из группы, состоящей из фенофибрата, нилвадипина, цилостазола, букладезина, регаденозона, циклотиазида, цифлутрина, ловастатина, линезолида, симвастатина, кангрелора, пантопразола, аденозина, аденозиндифосфата, аденозинтрифосфата, 2-MeS-аденозиндифосфата и 2-MeS-аденозинтрифосфата. В вариантах осуществления антитело не ингибирует активность соединения, выбранного из группы, состоящей из фенофибрата, нилвадипина, цилостазола, букладезина, регаденозона, циклотиазида, цифлутрина, ловастатина, линезолида, симвастатина, кангрелора, пантопразола, аденозина, аденозиндифосфата, аденозинтрифосфата, 2-MeS-аденозиндифосфата и 2-MeS-аденозинтрифосфата. В дополнительных вариантах осуществления антитело характеризуется IC, составляющей по меньшей мере приблизительно 1000 мкM по отношению к соединению, выбранному из группы, состоящей из фенофибрата, нилвадипина, цилостазола, букладезина, регаденозона, циклотиазида, цифлутрина, ловастатина, линезолида, симвастатина, кангрелора, пантопразола, аденозина, аденозиндифосфата, аденозинтрифосфата, 2-MeS-аденозиндифосфата и 2-MeS-аденозинтрифосфата.
[0017]
in vivo
В некоторых вариантах осуществления антитело имеет время полужизни , составляющее приблизительно 4-12 часов. В определенных вариантах осуществления антитело имеет время полужизни in vivo, составляющее приблизительно 12 часов.
[0018]
В некоторых вариантах осуществления антитело нейтрализует антитромбоцитарное действие тикагрелора или активного метаболита тикагрелора. В дополнительных вариантах осуществления антитело нейтрализует антитромбоцитарное действие тикагрелора или активного метаболита тикагрелора в течение приблизительно 60 минут после введения.
[0019]
В некоторых вариантах осуществления антитело имеет скорость диссоциации по отношению к тикагрелору или активному метаболиту тикагрелора, что допускает возобновление терапии, включающей тикагрелор.
[0020]
В других аспектах настоящее раскрытие предлагает способ лечения острого кровотечения у пациента, нуждающегося в лечении, включающий введение пациенту эффективного количества антитела, раскрытого в данном документе. В некоторых вариантах осуществления способа пациент подвергался или подвергается хирургическое вмешательство и ему был введен тикагрелор. В некоторых вариантах осуществления способа пациент нуждается в неотложной помощи и/или неотложной травматологической помощи.
[0021]
Другие аспекты настоящего раскрытия предлагают композицию, содержащую антитело по любому из предыдущих аспектов и вариантов осуществления в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
[0022]
Некоторые дополнительные аспекты предлагают молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело по любому из предыдущих пунктов. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:71, и SEQ ID NO:76.
[0023]
Дополнительные аспекты настоящего раскрытия предлагают композиции, векторы и клетки-хозяева, которые могут содержать по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, раскрытую в данном документе. В некоторых вариантах осуществления композиции, векторы и клетки-хозяева содержат первую молекулу нуклеиновой кислоты и вторую молекулу нуклеиновой кислоты, которые кодируют один или несколько белков, раскрытых в данном документе.
[0024]
Другие аспекты описания и иллюстративных графических материалов, следующих после описания, будут очевидными для специалиста в данной области техники.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0025]
С целью иллюстрации настоящего раскрытия в графических материалах изображены отдельные аспекты настоящего раскрытия. Тем не менее, настоящее раскрытие не ограничено точными схемами и средствами из аспектов, изображенных на графических материалах.
[0026] На фигуре 1
изображено PK/PD моделирование тикагрелор-нейтрализующего Fab на основе III фазы данных PLATO. После введения тикагрелора в ударной дозе, составляющей 180 мг, и в дозе 90 мг два раза в день, в день ноль добавляли нейтрализующий Fab. Введение тикагрелора пациентам возобновляли в день 1. Прогнозируется, что Fab быстро нейтрализует тикагрелор и TAM, восстанавливая таким образом агрегацию тромбоцитов у 99% пациентов. ʹВозвышение' между днями 0 и 1 представляет перераспределение тикагрелора из других тканей у 1% пациентов, у которых тикагрелор выводится медленнее.
[0027] Фигура 2 -
гаптены и специфичность Fab. На (A) представлены химические структуры тикагрелора, активного метаболита тикагрелора (TAM), неактивного метаболита тикагрелора (TIM) и аденозина. Уникальные R-группы, дифторфенилциклопропильные и тиопропильные заместители, выделены пунктирной линией. (B) Профиль специфичности для TICA0072. (C) Профиль специфичности для TICA0212 (MEDI 2452). Профили специфичности включают тикагрелор, TAM, TIM, аденозин, ADP, ATP и три из двенадцати родственных соединений на фиг. 4 (для наглядности; для какого-либо из двенадцати соединений в концентрациях до 0,1 мМ связывание не выявили). Данные представляют собой средние значения и SEM для трех параллелей.
[0028] На фигуре 3
проиллюстрирована корреляция связывания scFv с тикагрелором с биотинилированным линкером (ось x) и связывания с тикагрелором с биотинилированным линкером при 50-кратном избытке немодифицированного тикагрелора (ось y). Ингибирование связывания scFv в присутствии избытка немодифицированного тикагрелора показано линиями для 0%, 50%, 80% и 90% ингибирования.
[0029] На фигуре 4
показаны соединения, для которых идентифицированы определенные степени 2D-, 3D- или электростатического подобия с тикагрелором.
[0030] На фигуре 5
представлены исследования селективности для Fab TICA0049 и TICA0072. a-c - конкурирование за связывание Fab TICA0049 с биотинилированным тикагрелором для перечисленных соединений. d-f - конкурирование за связывание Fab TICA0072 с биотинилированным тикагрелором для перечисленных соединений. Данные нормализованы по DMSO.
[0031] На фигуре 6
представлены кривые конкурентного связывания для исходного TICA0072 и оптимизированных вариантов Fab TICA0152, Fab TICA0162 и Fab TICA0212 в анализе конкурентного связывания эпитопов второго поколения.
[0032] На фигуре 7
показаны результаты исследований селективности для TICA0162 и Fab TICA0212. а-c - конкурирование за связывание Fab TICA0162 с биотинилированным тикагрелором для перечисленных соединений. d-f - конкурирование за связывание Fab TICA0212 с биотинилированным тикагрелором для перечисленных соединений. Данные нормализованы по DMSO.
[0033] На фигуре 8
A)
(B)
(C)
12
показаны результаты обратимости действия тикагрелора в зависимости от концентрации TICA0212/MEDI2452 или TICA0072. (Влияние TICA0212/MEDI2452 на ингибирование, опосредованное 1 мкM тикагрелора () или 1 мкM TAM (•), агрегации, индуцированной 20 мкM ADP. TICA0212/MEDI2452 демонстрирует снижение концентрации свободного тикагрелора в плазме крови в присутствии 1 мкM тикагрелора. Среднее значение (n=5) ± стандартная погрешность среднего значения. TICA0072 вызывает обратимость ингибирования сигналов P2Y, индуцированного тикагрелором и TAM.
[0034] На фигуре 9
ex vivo
показаны результаты для TICA0212-опосредованной, 250 мг/кг, обратимости ADP-индуцированной агрегации цельной крови после введения дозы мышам, обработанным тикагрелором.
[0035] На фигуре 10
H
L
показаны частичные изображения кристаллических структур TICA0072 (A) и TICA0212/MEDI2452 (B) в комплексе с тикагрелором. Fab показаны в ленточном представлении с остатками аминокислот в пределах 7 Å от тикагрелора, показанного палочками. Некоторые атомы главной цепи опустили для упрощения. Легкие цепи показаны бежевым цветом, а тяжелая цепь показана голубым. CDR3 обеих цепей окрашены зеленым. Невозможно было смоделировать CDR3 V в структуре TICA0072, и ориентировочное местоположение обозначено пунктирной линией. Оранжевой стрелкой указан сдвиг в CDR3 V, отмеченный для TICA0212/MEDI2452, в сравнении с TICA0072. Остатки пронумерованы согласно Kabat и имеют приставку L или H для обозначения легкой или тяжелой цепи.
[0036] На фигуре 11
показано изменение ADP-индуцированной агрегации цельной крови ex vivo. (A) Отдельные данные для каждой группы лечения после прекращения инфузии тикагрелора. Контроль со средой (), только тикагрелор (•), тикагрелор+TICA0212/MEDI2452 (○) и тикагрелор+изотипический контроль (Δ). В виде полосы представлены средние значения (n=4). AU=единицы агрегирования. Данные через 15 минут собирали только для группы тикагрелор+TICA0212/MEDI2452. (B) Процент обратимости, индуцированной TICA0212/MEDI2452, среднее значение (n=4) ± SEM.
[0037] На фигуре 12
показано изменение кровотечения, индуцированного тикагрелором. (A) Отдельные данные для общей потери крови и (B) для общего времени кровотечения. Контроль со средой (), только тикагрелор (•) и тикагрелор+TICA0212/MEDI2452 (○). В виде полосы представлены средние значения (n=12).
[0038]
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0039]
Прежде чем продолжить описание настоящего раскрытия более подробно, следует понимать, что настоящее раскрытие не ограничивается конкретными композициями или стадиями способа, поскольку они могут варьироваться. Следует отметить, что, как используется в данном описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают определяемые объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное.
[0040]
Если не определено иное, все технические и научные термины и выражения, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимает специалист в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Например, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press и Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, обеспечивают специалиста общим словарем многих терминов и выражений, используемых в настоящем изобретении.
[0041]
Аминокислоты могут называться в данном документе по их общеизвестным трехбуквенным символам либо по однобуквенным символам, рекомендованным комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Аналогично, нуклеотиды могут называться по их общепринятым однобуквенным кодам.
[0042]
При нумерации аминокислот в вариабельном домене, определяющих комплементарность участках (CDR) и каркасных участках (FR) антитела следуют, если не указано иное, определению согласно Kabat, как изложено в публикации Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Бетезда, Мэриленд. (1991). При использовании этой системы нумерации настоящая неразветвленная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению FR или CDR вариабельного домена или вставке в них. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать в себя вставку одной аминокислоты (остаток 52a согласно Kabat) после остатка 52 в H2 и вставленные остатки (например, остатки 82a, 82b и 82c и т. д., согласно Kabat) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерацию остатков по Kabat можно определить для данного антитела путем выравнивания последовательности антитела в участках гомологии со "стандартной" последовательностью с нумерацией по Kabat. Максимальное выравнивание остатков каркасных участков зачастую требует введения "спейсерных" остатков в систему нумерации, чтобы использовать ее для Fv-участка. Кроме того, идентичность определенных отдельных остатков в любом указанном сайте с нумерацией по Kabat может варьироваться от цепи антитела к цепи антитела из-за межвидовой или аллельной дивергенции.
[0043]
Используемые в данном документе термины "антитело" и "антитела", также известные как иммуноглобулины, охватывают моноклональные антитела (в том числе полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, полиспецифические антитела, образованные по меньшей мере из двух различных эпитоп-связывающих фрагментов (например полиспецифические антитела, например, публикация PCT WO2009018386, заявка PCT № PCT/US2012/045229, включенные в данный документ посредством ссылки во всей их полноте), biMab, антитела человека, гуманизированные антитела, камелизированные антитела, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, однодоменные антитела, доменные антитела, Fab-фрагменты, фрагменты F(аb')2, фрагменты антител, которые проявляют необходимую биологическую активность (например антиген-связывающий участок), дисульфидно-связанные Fv (dsFv) и антиидиотипические (anti-Id) антитела (в том числе, например, anti-Id-антитела к антителам по настоящему изобретению), внутриклеточные антитела и эпитоп-связывающие фрагменты любого из вышеупомянутого. В конкретных вариантах осуществления, представленных в данном документе, антитела относятся к активным связывающим фрагментам антитела, т. е., к молекулам, содержащим по меньшей мере один антиген-связывающий сайт, такой как, например scFv и Fab. Антитела также включают слияния пептидов с антителами или их частями, как, например, белок, слитый с Fc-доменом. Молекулы иммуноглобулина могут быть любого изотипа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), субизотипа (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или аллотипа (например, Gm, например, G1m(f, z или x), G2m(n), G3m(g, b или c), Am, Em, и Km(1, 2 или 3)). Антитела могут быть получены от любого млекопитающего, включая без ограничения людей, обезьян, свиней, лошадей, кроликов, собак, котов, мышей и т. д., или других животных, как, например, птиц (например, кур).
[0044]
1
6
Используемый в данном документе C-Cалкил относится к алкилам с прямой и разветвленной цепью, имеющим от одного до шести атомов углерода, и включает метил, этил, пропил, н-бутил, изобутил, пентил, изопентил, неопентил и гексил.
[0045]
1
6
Используемый в данном документе C-Cалкокси относится к алкилу, как указано выше, содержащему кислород в группе. В некоторых вариантах осуществления атом кислорода расположен в положении, в котором он связывает группу заместителя с каркасной структурой (т. е., кольцевой структурой).
[0046]
1
6
Используемый в данном документе C-Cалкилтио относится к алкилу, как указано выше, содержащему серу в группе. В некоторых вариантах осуществления атом серы расположен в положении, в котором он связывает группу заместителя с коровой структурой (т. е., кольцевой структурой).
[0047]
1
6
Используемый в данном документе C-Cалканол относится к алкилу, как указано выше, содержащему гидроксильную группу на конце структуры заместителя.
[0048]
3
6
Как используется в данном документе, C-Cциклоалкил относится к циклопропилу, циклобутилу, циклопентилу и циклогексилу.
[0049]
3
6
1
6
Используемые в данном документе "замещенный" C-Cциклоалкил и C-Cалкил относятся к алкильным и циклоалкильным группам, рассмотренным выше, которые замещены по меньшей мере в одном атоме углерода арильной группой, которая также замещена 1-3 атомами галогена.
[0050]
12
Используемый в данном документе "тикагрелор" относится к обратимому ингибитору P2Y ((1S,2S,3R,5S)-3-[7-{[(1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил]амино}-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-3-ил]-5-(2-гидроксиэтокси)циклопентан-1,2-диолу) и имеющему следующую химическую структуру:
.
[0051]
12
Используемый в данном документе "активный метаболит тикагрелора" или "TAM" относится к основному активному метаболиту тикагрелора, также называемому AR-C124910XX, обратимому ингибитору P2Y, и имеющему следующую химическую структуру:
.
[0052]
Используемый в данном документе "неактивный метаболит тикагрелора" или "TIM" относится к неактивному метаболиту тикагрелора, также называемому AR-C133913XX, и имеющему следующую химическую структуру:
.
Антитела
[0053]
Ia
В общем смысле настоящее раскрытие предлагает новые антитела, которые связывают циклопентилтриазолопиримидиновое соединение формулы ():
Ia
(),
где
1
1
6
1
6
R выбран из группы, состоящей из C-Cалкокси и C-Cалкилтио;
2
1
6
1
6
3
6
3
6
R выбран из группы, состоящей из H, C-Cалкила, замещенного C-Cалкила, C-Cциклоалкила и замещенного C-Cциклоалкила; и
3
1
6
1
6
1
6
R выбран из группы, состоящей из H, C-Cалкила, C-Cалкокси и C-Cалканола.
[0054]
В конкретных вариантах осуществления антитела специфично связывают соединение, выбранное из группы, состоящей из:
тикагрелора;
активного метаболита тикагрелора (TAM) и
неактивного метаболита тикагрелора (TIM).
[0055]
В конкретных аспектах настоящее раскрытие предлагает антитело, которое связывается с тикагрелором и TAM, при наличии какой-либо одной или нескольких из следующих характеристик, включающих высокую специфичность связывания, высокую аффинность связывания, быстрое время наступления действия и быстрое время окончания действия (например, обеспечивающее возможность необязательного продолжения терапии или терапии с совместным введением, включающей тикагрелор).
[0056]
В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с тикагрелором и нейтрализует антиагрегантную активность тикагрелора и TAM, восстанавливая таким образом ADP-индуцированную агрегацию тромбоцитов в присутствии тикагрелора и TAM.
[0057]
В некоторых вариантах осуществления время полужизни антитела у субъекта является приблизительно таким же, как и период полувыведения тикагрелора и TAM. В некоторых вариантах осуществления время полужизни антитела составляет от приблизительно 4 до 24 часов (например, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 часов). В некоторых вариантах осуществления время полужизни антитела составляет от приблизительно 4 до 12 часов (например, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 часов).
[0058]
В некоторых вариантах осуществления антитело обуславливает быстрое наступление действия. Например, в вариантах осуществления время наступления действия антитела или время, необходимое для нейтрализации ингибирования, опосредованного тикагрелором и TAM, составляет от приблизительно 15 минут до 120 минут или от приблизительно 15 минут до 60 минут. В некоторых вариантах осуществления время наступления действия составляет менее 60 минут.
[0059]
В некоторых вариантах осуществления антитело характеризуется PK/PD-профилем, который обеспечивает быстрое проявление активности, вследствие чего, например, субъект, которому вводили данное антитело, может возобновить назначенную терапию тикагрелором. В некоторых вариантах осуществления субъект, который получал антитело, раскрытое в данном документе (например, путем i.v. инфузии), может получать тикагрелор или возобновить терапию тикагрелором в пределах двадцати четырех часов после введения антитела.
[0060]
Как рассмотрено и проиллюстрировано в определенных вариантах осуществления в данном документе, антитело связывает тикагрелор или его метаболит и не связывается с другими соединениями, имеющими родственную структуру, или с соединениями, которые можно вводить в качестве средств для coвместной терапии с тикагрелором. Например, соответственно, антитело не ингибирует активность соединения выбранного из группы, состоящей из фенофибрата, нилвадипина, цилостазола, букладезина, регаденозона, циклотиазида, цифлутрина, ловастатина, линезолида, симвастатина, кангрелора, пантопразола, аденозина, аденозиндифосфата, аденозинтрифосфата, 2-MeS-аденозиндифосфата и 2-MeS-аденозинтрифосфата.
[0061]
2
Антитела, описанные в данном документе, могут содержать антиген-связывающие фрагменты, содержащие только выбранные части молекулы антитела, такие как Fab, F(ab'), Fab', scFv, di-scFv, фрагменты sdAb, и они могут использоваться в качестве диагностических или терапевтических средств. Кроме того, специфические остатки в вариабельных доменах можно изменять с целью улучшения специфичности связывания и/или стабильности антитела и фрагментов антитела. Другие остатки, не вовлеченные непосредственно в связывание с антигеном, были удалены для "гуманизации" участков антител, не являющихся человеческими, и снижения иммуногенности антитела.
[0062]
В определенных аспектах антитело представляет собой Fab-фрагмент, например, Fab-фрагмент антитела или антиген-связывающий фрагмент, полученный рекомбинантным путем, содержащий часть вариабельного участка легкой цепи (VL), константного участка легкой цепи (CL), вариабельного участка легкой цепи (VH) и константного участка тяжелой цепи (CH1). Необязательно легкая и тяжелая цепи Fab могут быть связаны между собой посредством одной или нескольких дисульфидных связей, как, например, посредством подходящего шарнирного участка антитела. Как описано в данном документе, Fab связывается с эпитопом соединения из активных при пероральном введении средств класса циклопентилтриазолопиримидинов. В некоторых вариантах осуществления Fab связывается с тикагрелором или его метаболитом.
[0063]
В определенных аспектах Fab может быть получен из или может быть на основе последовательности антитела, такого как традиционно используемое антитело мыши, гуманизированное антитело или антитело человека. В определенных аспектах Fab может быть получен из или может быть на основе одного или нескольких scFv, таких как scFv, подвергнутых скринингу и полученных из библиотеки. В таких вариантах осуществления Fab получен из последовательности традиционного используемого антитела или может быть на ее основе, или scFv сохраняет одну или несколько функциональных активностей традиционного используемого антитела (например, сохраняет по меньшей мере 80% или более (80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100%) функциональной активности). Например, в определенных аспектах Fab сохраняет аффинность к одному или нескольким антигенам (например, тикагрелору), ингибиторную активность и/или селективность антитела или scFv.
[0064]
Хотя Fab-фрагмент может содержать последовательность, которая связывается с эпитопом циклопентилтриазолопиримидина, в конкретных вариантах осуществления Fab связывается с тикагрелором. В некоторых аспектах Fab связывается с активным метаболитом тикагрелора. В определенных аспектах Fab может связываться как с тикагрелором, так и с активным метаболитом тикагрелора.
[0065]
В некоторых вариантах осуществления Fab может содержать комбинацию участков CDR из разных антител, которые связываются с тикагрелором или его активным метаболитом.
[0066]
В определенных аспектах Fab содержит часть легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:67 и SEQ ID NO:77. В дополнительных вариантах осуществления Fab содержит часть легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:67 и SEQ ID NO:77. В определенных аспектах Fab содержит часть тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислоту, изложенную в любой из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:62 и SEQ ID NO:72. В дополнительных вариантах осуществления Fab содержит часть тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:62 и SEQ ID NO:72. В определенных аспектах Fab кодируется нуклеотидной последовательностью, кодирующей часть легкой цепи (VL), и нуклеотидной последовательностью, кодирующей часть тяжелой цепи (VH), например, нуклеотидной последовательностью, представляющей собой последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:61 или SEQ ID NO:71; и нуклеотидной последовательностью, представляющей собой последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную в SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:76.
[0067]
В определенных аспектах антитело может представлять собой scFv. Подразумевают, что scFv охватывает полипептидную цепь, содержащую вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) посредством подвижного полипептидного линкера. В некоторых аспектах полипептидный линкер между VH и VL содержит сайт для расщепления протеазами. Домены VH и VL scFv могут быть получены из одного и того же или из разных антител. В некоторых аспектах VH или VL scFv могут содержать один или нескольких CDR, которые связываются с представляющей интерес мишенью, тогда как остальная часть домена VH или VL получена из разных антител или синтезирована. В некоторых аспектах scFv содержит по меньшей мере один CDR антитела, например, антитела с активностью связывания с тикагрелором или его метаболитом. В некоторых аспектах scFv содержит по меньшей мере два CDR указанного антитела. В некоторых аспектах scFv содержит по меньшей мере три CDR указанного антитела. В некоторых аспектах scFv содержит по меньшей мере четыре CDR указанного антитела. В некоторых аспектах scFv содержит по меньшей мере пять CDR указанного антитела. В некоторых аспектах scFv содержит по меньшей мере шесть CDR указанного антитела.
[0068]
Множество методик можно использовать по отдельности или в комбинации для улучшения стабильности молекулы scFv. Одна методика, которую можно использовать отдельно или в комбинации с одной или несколькими другими методиками, представляет собой конструирование длины и/или композиции линкера, связывающего домены scFv для стабилизации части scFv.
[0069]
Другая возможная методика, которую можно использовать отдельно или в комбинации с одной или несколькими другими методиками, описанными в данном документе, представляет собой введение по меньшей мере двух аминокислотных замен (также называемых модификациями или мутациями) в домены VH и/или VL scFv с целью активации образования дисульфидных связей (см., например, Brinkmann et al., 1993, PNAS, 90:7538-42; Zhu et al., 1997, Prot. Sci. 6:781-8; Reiter et al., 1994, Biochem. 33:5451-9; Reiter et al., 1996, Nature 14: 1239-45; Luo et al., 1995, J. Biochem. 118:825-31; Young et al., 1995, FEBS Let. 377:135-9; Glockshuber et al., 1990, Biochem. 29:1362-7).
[0070]
В определенных аспектах одну мутацию вводят в каждый из доменов VH и VL scFv с целью активации образования дисульфидных связей между доменами VH и VL при экспрессии scFv. В другом аспекте две мутации вводят в один и тот же домен цепи. В определенном аспекте две мутации вводят в разные цепи. В определенных аспектах множественные пары двух мутаций вводят с целью активации образования множественных дисульфидных связей. В определенных аспектах цистеин вводят с целью активации образования дисульфидных связей. Иллюстративные аминокислоты, которые можно подвергнуть мутации с заменой на цистеин, включают аминокислоты 43, 44, 45, 46, 47, 103, 104, 105 и 106 VH2 и аминокислоты 42, 43, 44, 45, 46, 98, 99, 100 и 101 VL2. Изложенная выше нумерация основана на нумерации по Kabat, определяющей положение только по отношению к VH2 и VL2 scFv (а не по отношению к положению аминокислоты в полноразмерной последовательности антитела). Иллюстративные комбинации положений аминокислот, которые можно подвергнуть мутации с заменой на остатки цистеина, включают: VH44-VL100, VH105-VL43, VH105-VL42, VH44-VL101, VH106-VL43, VH104-VL43, VH44-VL99, VH45-VL98, VH46-VL98, VH103-VL43, VH103-VL44, и VH103-VL45. В некоторых аспектах аминокислота 44 VH и аминокислота 100 VL подвергнуты мутации с заменой на цистеины.
[0071]
Дополнительная возможная методика, которую можно использовать отдельно или в комбинации с одной или несколькими другими методиками, описанными в данном документе, представляет собой выбор порядка доменов scFv. В определенных аспектах ориентация домена VH по отношению к домену VL оптимизирована в целях стабильности. В определенных аспектах scFv находится в ориентации типа VH-линкер-VL. В определенных аспектах scFv находится в ориентации типа VL-линкер-VH.
[0072]
Дополнительная методика, которую можно использовать отдельно или в комбинации с одной или несколькими методиками, описанными в данном документе, представляет собой введение одной или нескольких стабилизирующих мутаций путем осуществления мутирования одного или нескольких поверхностных остатков scFv. В некоторых аспектах один, два, три, четыре, пять, шесть или больше шести остатков подвергнуты мутации в одном или обеих доменах VH и/или VL scFv. В определенных аспектах изменения проведены только в домене VH scFv. В определенных аспектах изменения проведены только в домене VL scFv. В определенных аспектах изменения проведены в обеих доменах VH и VL scFv. Можно осуществить одинаковое количество изменений в каждом домене или можно осуществить разное количество изменений в каждом домене. В определенных аспектах одно или несколько изменений представляют собой консервативную аминокислотную замену в остатке, присутствующем в немодифицированном исходном scFv. В других аспектах одно или несколько изменений представляет собой неконсервативную аминокислотную замену в остатке, присутствующем в немодифицированном исходном scFv. При проведении множественных замен в одном из доменов VH или VL scFv или в обеих доменах VH или VL scFv, каждая замена независимо представляет собой консервативную или неконсервативную замену. В определенных аспектах все замены представляют собой консервативные замены. В определенных аспектах все замены представляют являются неконсервативными. В определенных аспектах по меньшей мере одна из замен является консервативной. В определенных аспектах по меньшей мере одна из замен является неконсервативной.
[0073]
Еще одна методика, которую можно использовать отдельно или в комбинации с одной или несколькими необязательными методиками, описанными в данном документе, представляет собой введение одной или нескольких замен путем мутирования по одному или нескольким остаткам, присутствующим в доменах VH и/или VL scFv, с целью сопоставления наиболее часто встречающегося остатка в указанном конкретном положении с консенсусной последовательностью домена VH и/или VL из известных подвергнутых скринингу и/или идентифицированных антител. В определенных аспектах замены вводят в одно, два, три, четыре, пять, шесть или более шести положений в одном или обеих доменах VH и/или VL scFv. Можно осуществить одинаковое количество изменений в каждом домене или можно осуществить разное количество в каждом домене. В определенных аспектах одно или несколько изменений в последовательности, соответствующих таким изменениям в указанной консенсусной последовательности, представляют собой консервативную аминокислотную замену в остатке, присутствующем в немодифицированных последовательностях VH и/или VL. В других аспектах одно или несколько изменений представляют собой неконсервативную аминокислотную замену в остатке, присутствующем в немодифицированных последовательностях VH и/или VL. При проведении множественных замен либо в одном из доменов VH или VL scFv, либо или в обеих этих доменах каждая замена независимо представляет собой консервативную или неконсервативную замену. В определенных аспектах все замены представляют собой консервативные замены. В определенных аспектах все замены представляют собой неконсервативные замены. В определенных аспектах по меньшей мере одна из замен является консервативной. В определенных аспектах по меньшей мере одна из замен является неконсервативной.
[0074]
Следует отметить, что любые из модификаций, описанных в качестве применимых для модифицирования или стабилизации части scFv, можно использовать для модификации части Fab. Например, вариабельные домены Fab можно модифицировать с целью улучшения стабильности, связывания с антигеном и им подобного. Более того, либо часть Fab, либо часть scFv можно модифицировать для снижения иммуногенности.
[075]
В определенных аспектах антитело может представлять собой scFv, который содержит вариабельную часть легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:67 и SEQ ID NO:77. В дополнительных вариантах осуществления scFv содержит часть легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:67 и SEQ ID NO:77. В определенных аспектах scFv содержит часть тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислоту, изложенную в любой из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:62 и SEQ ID NO:72. В дополнительных вариантах осуществления scFv содержит часть тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:62 и SEQ ID NO:72.
[076]
Антитела, раскрытые в данном документе, могут дополнительно содержать один или несколько линкерных полипептидов. Линкер может связывать между собой домен тяжелой цепи с доменом легкой цепи (scFv) или связывать антитело или его антиген-связывающий фрагмент с другим средством, таким как метка, Fc-домен или им подобные. Линкеры могут варьироваться по длине и последовательности, и в целом они известны из уровня техники.
[077]
Время полужизни антитела, содержащего Fc-участок, в сыворотке крови может быть увеличено с помощью увеличения аффинности связывания Fc-участка с FcRn. Термин "время полужизни антитела", используемый в данном документе, означает фармакокинетическое свойство антитела, которое представляет собой показатель среднего времени существования молекул антител после их введения. Время полужизни антитела можно выразить как время, необходимое для выведения 50 процентов известного количества иммуноглобулина из организма пациента (или другого млекопитающего) или его конкретного компартмента, например, измеренного в сыворотке крови, т.е., время полужизни в крови или в других тканях. Время полужизни может варьировать среди разных иммуноглобулинов или классов иммуноглобулинов. Как правило, увеличение времени полужизни антитела приводит в результате к увеличению среднего времени удержания (MRT) в кровотоке введенного антитела.
[078]
Увеличение времени полужизни может позволить уменьшить количество средства, принимаемого пациентом, а также снизить частоту введения. Для увеличения периода полужизни антитела в сыворотке крови в состав антитела (в частности, фрагмента антитела) может быть введен эпитоп, связывающийся с рецептором реутилизации, как описано, например, в патенте США. № 5739277. Используемый в данном документе термин "эпитоп, связывающийся с рецептором реутилизации" относится к эпитопу Fc-участка молекулы IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), который отвечает за увеличение in vivo периода полужизни в сыворотке крови молекулы IgG. В качестве альтернативы, антитела по настоящему раскрытию с увеличенным временем полужизни можно получить с помощью модификации аминокислотных остатков, идентифицированных как вовлеченные во взаимодействие между Fc- и FcRn-рецептором (смотри, например, патенты США №№ 6,821,505 и 7,083,784; и WO 09/058492). Кроме того, время полужизни антител по настоящему раскрытию можно увеличить путем конъюгирования с PEG или альбумином при помощи методик, широко используемых в данной области.
[079]
off
50
Антитела, находящиеся в пределах объема настоящего раскрытия, можно идентифицировать с помощью любых структурных и/или функциональных характеристик, рассмотренных в данном документе. Например, антитела можно подвергнуть скринингу в отношении конкретных свойств связывания (например, K, Kd, IC, специфичность к/селективность к тикагрелору и метаболитам тикагрелора) с использованием любых методик, проиллюстрированных в данном документе, или которые иным образом известны из уровня техники.
Метки, конъюгаты и фрагменты
[0080]
Антитела по настоящему раскрытию могут быть конъюгированы с метками в диагностических целях и для других анализов, в которых антитела и/или их мишень(мишени) можно выявить. Метки включают без ограничения хромофор, флуорофор, флуоресцентный белок, фосфоресцентный краситель, тандемный краситель, частицу, гаптен, фермент и радиоактивный изотоп.
[0081]
В определенных аспектах антитела конъюгированы с флуорофором. Выбор флуорофора, присоединяемого к антителу, будет определять свойства поглощения и испускания флуоресценции конъюгированным антителом. Физические свойства флуорофорной метки, которую можно использовать для антитела и связанных с антителом лигандов, включают без ограничения спектральные характеристики (поглощение, испускание и стоксов сдвиг), интенсивность, длительность, поляризацию флуоресценции и скорость обесцвечивания или их комбинацию. Все эти физические свойства можно использовать для того, чтобы отличить один флуорофор от другого, и, таким образом, обеспечить возможность мультиплексного анализа. Другие необходимые свойства флуоресцентной метки могут включать клеточную проницаемость и низкую токсичность, например, если мечение антитела необходимо проводить в клетке или модельном организме (например, живом животном).
[0082]
В определенных аспектах фермент представляет собой метку и конъюгирован с антителом. Ферменты являются желательными метками, поскольку можно получить усиление поддающегося выявлению сигнала, приводящее к повышению чувствительности анализов. Сам фермент не вызывает поддающийся выявлению ответ, а действует путем разрушения субстрата, когда он вступает в контакт с соответствующим субстратом, так что превращаемый субстрат испускает флуоресцентный, колориметрический или люминесцентный сигнал. Ферменты усиливают поддающийся выявлению сигнал, поскольку один фермент в реактиве для мечения может приводить к превращению нескольких субстратов в поддающийся выявлению сигнал. Субстрат для фермента выбирают так, чтобы получить предпочтительный поддающийся измерению продукт, например, колориметрический, флуоресцентный или хемилюминесцентный. Такие субстраты широко используются в данной области, и хорошо известны специалисту в данной области, и включают, например, оксидоредуктазы, такие как пероксидаза хрена, и субстрат, такой как 3,3'-диаминобензидин (DAB); ферменты фосфатазы, такие как кислая фосфатаза, щелочная, и субстрат, такой как 5-бром-6-хлор-3-индолилфосфат (BCIP); гликозидазы, такие как бета-галактозидаза, бета-глюкуронидаза или бета-гликозидаза, и субстрат такой как 5-бром-4-хлор-3-индолил бета-D-галактопиранозид (X-gal); дополнительные ферменты включают гидролазы, такие как холинэстеразы и пептидазы, оксидазы, такие как глюкозооксидаза и цитохромоксидазы, и редуктазы, для которых известны подходящие субстраты.
[0083]
Ферменты и их соответствующие субстраты, которые инициируют хемилюминесценцию, являются подходящими для некоторых анализов. Они включают без ограничения природные и рекомбинантные формы люцифераз и экворинов. Также применимы инициирующие хемилюминесценцию субстраты для фосфатаз, гликозидаз и оксидаз, как, например, содержащие стабильные диоксетаны, люминол, изолюминол и сложные эфиры акридиния.
[0084]
В другом аспекте гаптены, такие как биотин, также используются в качестве меток. Биотин является подходящим, поскольку он может функционировать в ферментной системе с дополнительным усилением детектируемого сигнала, и он может выполнять функцию в качестве маркера для использования в аффинной хроматографии для целей выделения. В целях выявления используют конъюгат фермента, который характеризуется аффинностью к биотину, такой как авидин-HRP. Затем добавляют субстрат для пероксидазы для получения поддающегося выявлению сигнала.
[0085]
Гаптены также включают гормоны, встречающиеся в природе и синтетические лекарственные средства, загрязнители, аллергены, эффекторные молекулы, факторы роста, хемокины, цитокины, лимфокины, аминокислоты, пептиды, промежуточные химические соединения, нуклеотиды и им подобные.
[0086]
В определенных аспектах флуоресцентные белки могут быть конъюгированы с антителом в качестве метки. Примеры флуоресцентных белков включают зеленый флуоресцентный белок (GFP) и фикобилипротеины и их производные. Флуоресцентные белки, в частности, фикобилипротеин, особенно применимы в получении реагентов для мечения на основе тандемных красителей. Эти тандемные красители содержат флуоресцентный белок и флуорофор для целей получения большего стоксового сдвига, при котором спектр испускания смещен дальше от длины волны спектра поглощения флуоресцентного белка.
[0087]
121
123
125
131
14
35
3
111
112
113
115
99
99
201
68
67
103
99
135
18
153
177
159
149
140
175
166
90
47
186
188
142
105
97
В определенных аспектах метка представляет собой радиоактивный изотоп. Примеры подходящих радиоактивных материалов включают без ограничения йод (I, I, I, I), углерод (C), серу (S), тритий (H), индий (In, In, mIn, mIn,), технеций (Tc, mTc), таллий (Ti), галлий (Ga, Ga), палладий (Pd), молибден (Mo), ксенон (Xe), фтор (F), SM, Lu, Gd, Pm, La, Yb, Ho, Y, Sc,Re, Re, Pr, Rh иRu.
[0088]
В некоторых аспектах лекарственные средства могут быть конъюгированы с антителом. Например, антитело, содержащее scFv, может быть конъюгировано с лекарственным средством для лечения сердечно-сосудистого заболевания и/или острых коронарных синдромов.
[0089]
В определенных конструкциях лекарственные средства и другие молекулы можно на антитело через сайт-специфичные конъюгации. Например, антитело может содержать сконструированные цистеиновые домены (включая сконструированный(сконструированные) цистеин(цистеины) в связывающей единице и/или Fc-домене), что дает в результате свободные тиольные группы для реакций конъюгации. В определенных аспектах антитело сконструировано для встраивания специфичных сайтов конъюгации.
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела
[090]
Настоящее раскрытие предлагает молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют антитела или их антиген-связывающие фрагменты. Один аспект настоящего раскрытия предлагает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любые из антител, конкретно описанных в данном документе. Молекула нуклеиновой кислоты может кодировать вариабельный участок тяжелой цепи и/или легкой цепи антитела.
[091]
В некоторых аспектах антитело представляет собой Fab или scFv, где часть нуклеиновой кислоты, кодирующая Fab или scFv, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую домен VL, и нуклеотидную последовательность, кодирующую VH, и где нуклеотидная последовательность, кодирующая домен VL, необязательно связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей домен VH, через нуклеотидную последовательность, кодирующую подвижный полипептидный линкер.
[092]
Дополнительный аспект предлагает клетку-хозяина, трансформированную с помощью любой из молекул нуклеиновых кислот, что описано в данном документе. В другом аспекте настоящего раскрытия предлагают клетку-хозяин, содержащую вектор, содержащий молекулы нуклеиновых кислот, что описано в данном документе. В одном аспекте клетка-хозяин может содержать больше одного вектора.
[093]
Настоящее раскрытие представляет молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любое антитело по настоящему раскрытию, а также либо легкую цепь, либо тяжелую цепь антитела. Например, данное раскрытие представляет молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую одно или несколько из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:67, и SEQ ID NO:77. Настоящее раскрытие дополнительно представляет молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любое антитело по настоящему раскрытию, дополнительно содержащее дополнительные участки (например, Fc или модифицированный Fc). В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновых кислот могут быть выбраны из одного или нескольких из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:41,, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:51,, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:71, или SEQ ID NO:76. В дополнительных вариантах осуществления настоящее раскрытие предлагает вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из одного или нескольких из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:41,, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:51,, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:71, или SEQ ID NO:76.
Способы получения антител, Fab и scFv
[094]
2
2
Настоящее раскрытие обеспечивает способы получения антител и их фрагментов, которые описаны в данном документе. В некоторых аспектах антиген-связывающие фрагменты антител, которые распознают тикагрелор и специфические эпитопы тикагрелора и/или TAM, раскрытые в данном документе, можно создать с помощью любой методики, известной специалисту в данной области. Например, фрагменты Fab и F(ab') можно получить из антител путем протеолитического расщепления молекул иммуноглобулина с использованием таких ферментов, как папаин (для получения фрагментов Fab) или пепсин (для получения фрагментов F(ab')). Кроме того, антитела, включая scFv и Fab, как описано в данном документе, можно создавать с использованием различных способов фагового дисплея, известных из уровня техники.
[095]
E. coli
E. coli
например
Как правило, в способах фагового дисплея функциональные домены антител представлены на поверхности фаговых частиц, которые несут последовательности полинуклеотидов, кодирующие их. В частности, последовательности ДНК, кодирующие домены VH и VL, амплифицируют из библиотек кДНК животных (например, из библиотек кДНК лимфоидной ткани человека или мыши). Осуществляют рекомбинацию ДНК, кодирующей домены VH и VL, вместе с линкером scFv при помощи ПЦР и ее клонируют в фагмидный вектор. Вектор вводят в путем электропорации, и инфицируют фагом-помощником. Фаг, используемый в этих способах, может быть нитевидным фагом, в том числе fd и M13, и домены VH или VL могут быть слиты рекомбинантным путем либо с геном III, либо с геном VIII фага. Фаг, экспрессирующий антиген-связывающий домен, который связывается с тикагрелором и/или TAM, можно выбрать или идентифицировать с помощью антигена, , с использованием меченого антигена или антигена, связанного с твердой поверхностью или гранулой или зафиксированного на них. Подобным образом, домены связывания, которые связываются с антигенами/гаптенами в дополнение к тикагрелору или отличному от тикагрелора и/или TAM, можно идентифицировать для отрицательного отбора. Примеры способов на основе фагового дисплея, которые можно использовать для создания антител по настоящему изобретению, включают раскрытые в Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280; заявке по PCT № PCT/GB91/O1 134; в заявках по PCT №№ WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401 и WO97/13844; и в патенте США №№ 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727, 5733743 и 5969108; все из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[0096]
Как описано в указанных выше источниках, после отбора фага кодирующие антитело участки можно выделять из фага и использовать их для получения полных антител, в том числе антител человека, или любого другого предпочтительного антиген-связывающего фрагмента (scFv и Fab), и экспрессировать у любого желаемого хозяина, в том числе в клетках млекопитающих, клетках насекомых, растительных клетках, у дрожжей и бактерий, например, как описано ниже. Также можно использовать методики рекомбинантного получения Fab-, Fab'- и F(ab')2-фрагментов, используя способы, известные из уровня техники, такие как раскрытые в публикации PCT № WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; и Better et al., 1988, Science 240:1041-1043 (указанные источники включены во всей своей полноте посредством ссылки).
[0097]
В определенных аспектах нуклеиновые кислоты, раскрытые в данном документе, могут быть функционально связаны с одной или несколькими регуляторными нуклеотидными последовательностями в экспрессирующей конструкции. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие легкие и тяжелые цепи антител, можно клонировать в одном и том же векторе экспрессии при любой ориентации (например, легкая цепь перед тяжелой цепью или наоборот) или можно клонировать в двух разных векторах. Если экспрессию осуществляют с использованием одного вектора, то два кодирующих гена могут иметь свои собственные генетические элементы (например, промотор, RBS, лидерная последовательность, стоп-кодон, хвост полиА и т. д.) или они могут быть клонированы в одном отдельном наборе генетических элементов, но связаны с одним цистронным элементом. Регуляторные нуклеотидные последовательности будут, как правило, являться подходящими для клетки-хозяина, которую используют для экспрессии. Множество типов подходящих векторов экспрессии и подходящих регуляторных последовательностей являются известными из уровня техники для множества клеток-хозяев. Как правило, указанные одна или несколько регуляторных нуклеотидных последовательностей могут включать без ограничения промоторные последовательности, лидерные или сигнальные последовательности, сайты связывания рибосомы, последовательности инициации и терминации транскрипции, последовательности инициации и терминации трансляции и последовательности энхансеров и активаторов. Конститутивные или индуцируемые промотеры, известные из уровня техники, предтавлены в настоящем раскрытии. Промоторы могут быть либо промоторами, встречающимися в природе, либо гибридными промоторами, которые объединяют элементы более чем одного промотора. Экспрессирующая конструкция может присутствовать в клетке в эписоме, такой как плазмида, или экспрессирующая конструкция можно вставить в хромосому.
[0098]
Gene Expression Technology
Methods in Enzymology
В определенных аспектах вектор экспрессии содержит ген селектируемого маркера, обеспечивающего возможность отбора трансформированных клеток-хозяев. Гены селектируемых маркеров являются хорошо известными из уровня техники и будут варьироваться в зависимости от используемой клетки-хозяина. В определенных аспектах данное раскрытие относится к вектору экспрессии, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, и функционально связанную по меньшей мере с одной регуляторной последовательностью. Регуляторные последовательности являются принятыми в данной области и выбраны для управления экспрессией кодируемого полипептида. Соответственно, термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспресиии. Иллюстративные неограничивающие регуляторные последовательности описаны в Goeddel; : , Academic Press, San Diego, CA (1990). Следует понимать, что конструирование вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, подлежащей трансформации, и/или тип белка, экспрессия которого требуется. Более того, также следует принять во внимание количество копий вектора, способность контролировать данное число копий и экспрессию любого другого белка, кодируемого вектором, такого как маркеры устойчивости к антибиотикам.
[0099]
Способы получения антитела по настоящему раскрытию могут включать, например, клетку-хозяин, трансфицированную одним или несколькими векторами экспрессии, кодирующего антитело (например, отдельным вектором, кодирующим тяжелые и легкие цепи или их вариабельные участки, или двумя векторами: одним, кодирующим тяжелую цепь, и одним, кодирующим легкую цепь или их вариабельные участки), которую можно культивировать в подходящих условиях, чтобы обеспечивать возможность экспрессии антитела. Секретируемое антитело можно выделять из смеси клеток и среды, содержащей антитело. В качестве альтернативы, антитело может задерживаться в цитоплазме или в мембранной фракции, и клетки можно собирать, лизировать с последующим выделением белка. Культура клеток включает клетки-хозяева, среды и другие побочные продукты. Подходящие среды для культивирования клеток являются хорошо известными из уровня техники. Антитело можно выделить из среды для культивирования клеток, из клеток-хозяев или и того, и другого, с использованием методик очистки белков, антител и антиген-связывающих фрагментов антитела, известных из уровня техники, включая ионообменную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию, ультрафильтрацию, электрофорез и иммуноаффинную очистку. В определенных аспектах антитело сконструировано в виде антиген-связывающего фрагмента антитела, который содержит вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, что может повысить растворимость и облегчить очистку.
[00100]
E. coli
Molecular Cloning Laboratory Manual
Рекомбинантную нуклеиновую кислоту можно получать путем лигирования клонированного гена или его части в вектор, подходящий для экспрессии либо в прокариотических клетках, либо эукариотических клетках (клетках дрожжей, птиц, насекомых или млекопитающих), или и в тех, и в других. Средства для экспрессии для получения рекомбинантного полипептида включают плазмиды и другие векторы. К примеру, подходящие векторы включают плазмиды следующих типов: pBR322-производные плазмиды, pEMBL-производные плазмиды, pEX-производные плазмиды, pBTac-производные плазмиды и pUC-производные плазмиды для экспрессии в прокариотических клетках, таких как . В определенных аспектах векторы экспрессии для млекопитающих содержат как прокариотические последовательности для облегчения размножения вектора в бактериях, так и одну или несколько эукариотических единиц транскрипции, которые экспрессируются в эукариотических клетках. Векторы-производные pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, пМSG, pSVT7, pko-neo и pHyg представляют собой примеры векторов экспрессии для млекопитающих, подходящих для трансфекции эукариотических клеток. Некоторые из данных векторов модифицируют последовательностями из бактериальных плазмид, как, например, pBR322, для облегчения репликации и отбора по устойчивости к лекарственному средству как у прокариотических, так и у эукариотических клеток. В качестве альтернативы, производные вирусов, таких как вирус папилломы крупного рогатого скота (BPV-1) или вирус Эпштейна-Барр (pHEBo, производный pREP и p205), можно использовать для временной экспрессии белков в эукариотических клетках. Различные способы, используемые в получении плазмиды и трансформации организмов-хозяев, являются хорошо известными из уровня техники. В отношении других подходящих систем экспрессии как у прокариотических, так и у эукариотических клеток, а также общих процедур рекомбинации, см. , 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), Chapters 16 and 17. В некоторых случаях может быть необходимым экспрессировать рекомбинантный полипептид с использованием бакуловирусной системы экспрессии. Примеры подобных бакуловирусных систем экспрессии включают векторы-производные pVL (такие как pVL1392, pVL1393 и pVL941), векторы-производные pAcUW (такие как pAcUW1), и векторы-производные pBlueBac (такие как pBlueBac III, содержащие ген β-галактозидазы).
[00101]
Current Protocols in Molecular Biology
Методики создания генов слияния являются хорошо известными. В сущности, соединение различных фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих разные последовательности полипептида/антитела, осуществляют в соответствии с традиционными методиками, используя лигирование тупых концов или острых концов, расщепление с помощью ферментов рестрикции с получением подходящих концов, соединение липких концов при необходимости, обработку щелочной фосфатазы с целью предупреждения нежелательного соединения концов, а также ферментативное лигирование. В другом аспекте ген слияния можно синтезировать при помощи традиционных методик, включая автоматические синтезаторы ДНК. В качестве альтернативы, ПЦР-амплификацию фрагментов генов можно выполнять с использованием якорных праймеров, которые обуславливают образование комплементарных выступающих концов между двумя последовательными фрагментами нуклеиновой кислоты, которые можно впоследствии подвергнуть отжигу с образованием последовательности химерного гена (см., например, , eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).
[00102]
E. coli
В некоторых аспектах вектор экспрессии, экспрессирующий любые нуклеиновые кислоты, описанные в данном документе, можно использовать для экспрессии антитела в клетке-хозяине. Например, антитело может быть экспрессировано в бактериальных клетках, таких как , клетках насекомых (например, с использованием бакуловирусной системы экспрессии), клетках дрожжей или клетках млекопитающих. Другие подходящие клетки-хозяева известны специалистам в данной области техники.
[00103]
Непосредственно после переноса вектора экспрессии в клетку-хозяина с помощью традиционных методик трансфицированные клетки затем культивируют с помощью традиционных методик с получением антитела. Таким образом, настоящее раскрытие включает клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид, кодирующий антитело или его фрагменты, функционально связанные с гетерологичными промотором. В определенных аспектах как тяжелая, так и легкая цепь и/или вариабельные участки тяжелой и легкой цепей могут быть совместно экспрессированы (из одного и того же или из разных векторов) в клетке-хозяине для экспрессии целого антитела. В определенных аспектах как тяжелые, так и легкие цепи антитела экспрессируются с одного промотора. В определенных аспектах тяжелые и легкие цепи антитела экспрессируются со множества промоторов. В определенных аспектах тяжелые и легкие цепи антитела кодируются одним вектором. В определенных аспектах тяжелые и легкие цепи антитела кодируются множеством векторы.
[00104]
Линии клеток млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессии рекомбинантных антител, хорошо известны из уровня техники и включают многие иммортализированные линии клеток, доступные в Американской коллекции типовых культур (ATCC), в том числе без ограничения клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки HeLa, клетки почки новорожденного хомячка (BHK), клетки почки обезьяны (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), клетки почечного эпителия человека 293 и ряд других линий клеток. Разные клетки-хозяева имеют характерные и специфические механизмы посттрансляционного процессинга и модификации белков, а также продуктов генов. Подходящие линии клеток или системы-хозяева можно выбрать для того, чтобы обеспечить правильную модификацию и процессинг экспрессируемого антитела или его части. В связи с этим можно использовать эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточным аппаратом для надлежащего процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования продукта гена. Такие клетки-хозяева млекопитающих включают без ограничения клетки CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O и T47D, NS0 (линия клеток мышиной миеломы, которая не продуцирует эндогенно каких-либо функциональных цепей иммуноглобулинов), SP20, CRL7O3O и HsS78Bst. В одном аспекте линии клеток человека, разработанные путем иммортализации лимфоцитов человека, можно использовать для рекомбинантного продуцирования моноклональных антител. В одном аспекте линию клеток человека PER.C6. (Crucell, Нидерланды) можно использовать для рекомбинантного получения моноклональных антител.
[00105]
Trichoplusia ni
S. cerevisiae, Pichia
Дополнительные линии клеток, которые можно использовать в качестве хозяев для экспрессии рекомбинантных антител, включают без ограничения клетки насекомых (например, Sf21/Sf9, Bti-Tn5b1-4 ) или клетки дрожжей (например, , US7326681 и т. д.), растительные клетки (US20080066200) и куриные клетки (WO2008142124).
[00106]
например
В определенных аспектах антитело по настоящему раскрытию стабильно экспрессируется в линии клеток. Стабильную экспрессию можно использовать для длительного высокопродуктивного получения рекомбинантных белков, антител и их антиген-связывающих фрагментов. Например, можно создать линии клеток, стабильно экспрессирующих молекулу антитела. Клетки-хозяева можно трансформировать подходящим образом сконструированным вектором, содержащим элементы контроля экспрессии (, промотор, энхансер, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования и т. д.) и ген селектируемого маркера. После введения чужеродной ДНК клеткам можно позволить расти в течение 1-2 суток на обогащенной среде, а затем их переносят на селективную среду. Селектируемый маркер в рекомбинантной плазмиде придает устойчивость к отбору и позволяет клеткам со стабильно интегрированной плазмидой в их хромосомах расти и образовывать очаги, которые, в свою очередь, можно клонировать и наращивать с получением линий клеток. Способы получения стабильных линий клеток с высокой продуктивностью хорошо известны из уровня техники, и реактивы, как правило, являются коммерчески доступными.
[00107]
В определенных аспектах антитело по настоящему раскрытию временно экспрессируется в линии клеток. Транзиентная трансфекция представляет собой процесс, при котором нуклеиновая кислота, вводимая в клетку, не интегрируется в геномную или хромосомную ДНК такой клетки. Она фактически сохраняется в виде внехромосомного элемента, например, в виде эписомы, в клетке. Процессы транскрипции нуклеиновой кислоты эписомы не затрагиваются, и продуцируется белок, кодируемый нуклеиновой кислотой эписомы.
[00108]
Линию клеток, подвергнутую стабильной или транзиентной трансфекции, поддерживают в среде для культивирования и условиях, хорошо известных из уровня техники, что приводит к экспрессии и продуцированию моноклональных антител. В определенных аспектах в основе среды для культивирования клеток млекопитающих лежат коммерчески доступные составы сред, в том числе, например, DMEM или среды Хема F12. В других аспектах среду для культивирования клеток модифицируют для поддержания как роста клеток, так и биологической экспрессии белка. Используемые в данном документе выражения "среда для культивирования", "культуральная среда" и "состав среды" относятся к питательному раствору для поддержания, роста, размножения или наращивания клеток в искусственном окружении in vitro за пределами многоклеточного организма или ткани. Среду для культивирования можно оптимизировать для использования в конкретной культуре клеток, в том числе, например, ростовую среду для культивирования клеток, которая составлена для стимуляции клеточного роста, или продуктивную среду для культивирования клеток, которая составлена для стимуляции выработки рекомбинантного белка. Термины "питательное вещество", "ингредиент" и "компонент", используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к составляющим компонентам, которые образуют среду для культивирования клеток.
[00109]
например
Непосредственно после получения молекулы ее можно очистить любым способом, известным из уровня техники, для очистки молекулы иммуноглобулина или ее фрагментов, например, с помощью хроматографии (, ионообменной, аффинной, в частности, по аффинности к специфическим антигенам - белку A или белку G, и эксклюзионной колоночной хроматографией), центрифугирования, дифференциальной растворимости или любой другой стандартной методики очистки белков, антител и/или фрагментов антител. Кроме того, молекулы по настоящему раскрытию или их фрагменты могут быть слиты с гетерологичными полипептидными последовательностями (называемыми в данном документе как "маркеры", как, например, гистидиновый маркер) описанными в данном документе или иным образом известными из уровня техники, для облегчения очистки.
[00110]
et al., Bio/Technology
E. coli
При использовании рекомбинантных технологий молекула может быть получена внутриклеточно, в периплазматическом пространстве или непосредственно секретировано в среду. Если молекула получена внутриклеточно, то в качестве первой стадии удаляют твердые остатки, или клетки-хозяева, или лизированные фрагменты, например путем центрифугирования или ультрафильтрации. В публикации Carter , 10:163-167 (1992) описана процедура выделения антител, которые секретируются в периплазматическое пространство . Если молекула секретируется в среду, то надосадочные жидкости из таких систем экспрессии, как правило, вначале концентрируют с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрирования белка, например, ультрафильтрационного блока Amicon или Millipore Pellicon. Ингибитор протеаз, такой как PMSF, может быть включен в любую из последующих стадий для ингибирования протеолиза, и антибиотики могут быть включены для предупреждения роста случайных загрязнителей.
[00111]
Композицию, полученную из клеток, можно очищать с использованием, например, хроматографии с гидроксиапатитом, хроматографии с гидрофобным взаимодействием, ионообменной хроматографии, гель-электрофореза, диализа и/или аффинной хроматографии либо отдельно, либо в комбинации с другими стадиями очистки. Пригодность белка A в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа любого Fc-домена иммуноглобулина, если он присутствует в молекуле, и будет понятна специалисту в данной области. Матрицей, к которой прикрепляется аффинный лиганд, чаще всего представляет собой агарозу, но доступны и другие матрицы. Механически стабильные матрицы, такие как стекло с контролируемым размером пор или поли(стиролдивинил)бензол, обеспечивают более высокие скорости потока и меньшее время обработки, чем те, которые достигаются при использовании агарозы. Также доступны другие методики очистки белка, такие как фракционирование на ионообменной колонке, осаждение этанолом, обращенно-фазовая HPLC, хроматография на силикагеле, хроматография на гепарине, хроматография с использованием сефарозы на анионо- или катионообменной смоле (как, например, на колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, SDS-PAGE и осаждение сульфатом аммония, в зависимости от молекулы, которая подлежит извлечению.
[00112]
например
После любой(любых) стадии(стадий) предварительной очистки смесь, содержащую молекулу, представляющую интерес, и загрязнители можно подвергнуть хроматографии гидрофобных взаимодействий при низком показателе pH с использованием элюирующего буфера при показателе pH в приблизительно 2,5-4,5, и проводимой при низких концентрациях солей (, от приблизительно 0 до 0,25 M соли).
[00113]
Антитело можно получить и очистить с использованием, например, какой-либо одной методики или комбинации методик, изложенных выше и/или в разделе примеры. Независимо от того, как именно очищается антитело, для подтверждения функционального связывания антитела по настоящему раскрытию можно проводить анализы связывания (до и/или после очистки). Например, можно использовать анализы на основе двойного ELISA. В некоторых аспектах первым антигеном (например, тикагрелор или его конкурент) покрывают лунку и связывание с этим антигеном иммобилизирует антитело, подготавливая его для выявления.
Фармацевтические составы
[00114]
В определенных аспектах настоящее раскрытие предлагает фармацевтические композиции. Такие фармацевтические композиции могут представлять собой композиции, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело. Такие фармацевтические композиции также могут представлять собой композиции, содержащие антитело или комбинацию антитела и фармацевтически приемлемый наполнитель. В отдельных аспектах фармацевтические композиции по настоящему раскрытию используют в качестве лекарственного препарата.
[00115]
st
th
В отдельных аспектах антитело или комбинацию антитела (или молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих антитело или комбинацию антитела) можно составлять с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или стабилизатором в виде фармацевтических композиций. В отдельных аспектах такие фармацевтические композиции являются подходящими для введения человеку или животному, не являющемуся человеком, посредством любого одного или нескольких путей введения с использованием способов, известных из уровня техники. Как будет понятно специалисту в данной области техники, путь и/или способ введения будет варьироваться в зависимости от необходимых результатов. Выражение "фармацевтически приемлемый носитель" означает один или несколько нетоксичных материалов, которые не препятствуют эффективности биологической активности активных ингредиентов. Такие препараты, как правило, могут содержать соли, буферные средства, консерванты, совместимые носители и необязательно другие терапевтические средства. Такие фармацевтически приемлемые препараты также могут содержать совместимые твердые или жидкие наполнители, разбавители или инкапсулирующие вещества, которые являются подходящими для введения в организм человека. Другие представленные носители, наполнители и/или добавки, которые можно использовать в составах, описанных в данном документе, включают, например, ароматизирующие вещества, противомикробные средства, подсластители, антиоксиданты, антистатики, липиды, белковые наполнители, такие как сывороточный альбумин, желатин, казеин, солеобразующие противоионы, такие как натрий, и им подобные. Эти и дополнительные известные фармацевтические носители, наполнители и/или добавки, подходящие для использования в композициях, описанных в данном документе, известны в данной области, например, такие, которые перечислены в ʺRemington: The Science & Practice Pharmacyʺ, 21ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005), и в "Physician's Desk Reference", 60ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (2005). Фармацевтически приемлемые носители нужно выбирать так, чтобы они были подходящими в плане желаемых или требуемых способа введения, растворимости и/или стабильности.
[00116]
Составы, описанные в данном документе, содержат активные средства (например, антитела или фрагменты антител, такие как Fab или scFv) в концентрации, приведенной в масса/объем, подходящей для желаемой дозы. В определенных аспектах активное средство присутствует в составе в концентрации от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 200 мг/мл, от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл, от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 50 мг/мл или от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 25 мг/мл. В определенных аспектах активное средство присутствует в концентрации, составляющей приблизительно 25 мг/мл. В определенных аспектах концентрация активного средства в составе может варьироваться от приблизительно 0,1% до приблизительно 100% по весу. В определенных аспектах концентрация активного средства в отношении находится в диапазоне от 0,003 до 1,0 моль.
[00117]
В одном аспекте составы по настоящему раскрытию являются апирогенными составами, которые практически свободны от эндотоксинов и/или аналогичных пирогенных веществ. Эндотоксины включают токсины, которые заключены внутри микроорганизма и выпускаются только тогда, когда микроорганизмы разрушаются или умирают. Пирогенные вещества также включают индуцирующий повышение температуры термостабильные вещества (гликопротеины) из внешней мембраны бактерий и других микроорганизмов. Оба эти вещества могут вызывать повышение температуры, гипотонию и шок при введении людям. Из-за возможных вредных эффектов даже низкие количества эндотоксинов должны быть удалены из фармацевтических лекарственных растворов для внутривенного введения. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США («FDA») установило верхний предел в 5 единиц эндотоксина (EU) на дозу на килограмм веса тела в период, продолжительностью один час, для внутривенных введений лекарственных средств (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). В отдельных конкретных аспектах уровни эндотоксинов и пирогенов в композиции составляют менее 10 EU/мг, или менее 5 EU/мг, или менее 1 EU/мг, или менее 0,1 EU/мг, или менее 0,01 EU/мг, или менее 0,001 EU/мг.
[00118]
in vivo
st
При использовании для введения составы по настоящему раскрытию должны быть стерильными. Составы по настоящему раскрытию можно стерилизовать различными способами стерилизации, в том числе стерилизацией фильтрованием, ионизирующим излучением и т. д. В одном аспекте состав является простерилизован фильтрацией с использованием предварительно простерилизованным 0,22-микронного фильтра. Стерильные композиции для инъекций могут быть составлены в соответствии со стандартной фармацевтической практикой, как описано в ʺRemington: The Science & Practice Pharmacyʺ, 21ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005).
[00119]
Терапевтические композиции по настоящему раскрытию могут быть составлены для конкретных путей введения, таких как пероральное, назальное, легочное, местное (включая трансбуккальное и сублингвальное), ректальное, вагинальное и/или парентеральное введение. Формулировки "парентеральное введение" и "вводимый парентерально", используемые в данном документе, относятся к способам введения, отличным от энтерального и местного введения, обычно путем инъекции, и включают без ограничения внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрикапсульную, интраорбитальную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, подкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию. Составы по настоящему раскрытию, которые пригодны для местного или трансдермального введения включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и средства для ингаляции. Антитела можно смешивать в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и с любыми консервантами, буферами или пропеллентами, которые могут потребоваться (патент США № 7,378,110; 7,258,873; 7,135,180; заявка на патент США № 2004-0042972; и 2004-0042971).
[00120]
Составы в целях удобства могут быть представлены в стандартной лекарственной форме, и могут быть получены любым способом, известным в области фармации. Фактические уровни дозировки активных ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему раскрытию можно изменять таким образом, чтобы получить количество активного ингредиента, которое эффективно для достижения необходимого терапевтического ответа у конкретного пациента, состава и способа введения, который не является токсичным для пациента (например, "терапевтически эффективное количество"). Выбранный уровень дозировки будет зависеть от разнообразных фармакокинетических факторов, включающих активность конкретных используемых композиций, путь введения, время введения, скорость экскреции конкретного используемого соединения, длительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, используемые в комбинации с конкретными используемыми композициями, возраст, пол, вес, состояние, общее состояние здоровья и анамнез пациента, подлежащего лечению, и подобные факторы, хорошо известные в области медицины. Подходящие дозировки могут варьироваться от приблизительно 0,0001 до приблизительно 100 мг/кг массы тела или больше, например, приблизительно 0,1, 1, 10 или 50 мг/кг массы тела, при этом подходящими являются от приблизительно 1 до приблизительно 10 мг/кг массы тела.
[00121]
Следует отметить, что раскрытие аналогично предусматривает, что можно создать составы, подходящие для применения в диагностике и исследованиях. Концентрацию активного средства в таких составах, а также присутствие или отсутствие наполнителей и/или пирогенов, можно выбирать, исходя из конкретной задачи запланированного применения.
Применения
[00122]
Антитела, раскрытые в данном документе, являются применимыми в терапевтических способах, включая комбинированную терапию, для нейтрализации активности ингибиторов активации, агрегации и грануляции тромбоцитов, активаторов дезагрегации тромбоцитов и антитромботических средств. Таким образом, антитела, описанные в данном документе, находят применение во множестве задач, которые относятся к введению тикагрелора (включая сопутствующие способы) и соответственно применимы для нейтрализации действия тикагрелора и/или одного или нескольких метаболитов тикагрелора. В таких способах антитело может снижать, нейтрализовать, выводить или иным образом ингибировать активность тикагрелора, необязательно обратимо, и лечить или предупреждать любое число действий, нарушений и/или симптомов, связанных с введением тикагрелора и/или возникающих вследствие терапии, включающей тикагрелор.
[00123]
Антитела можно вводить пациентам, которые получают лечение или которые нуждаются в лечении или профилактике показаний, которые поддаются лечению тикагрелором (BRILINTA) и/или при которых назначают этот препарат, включая, например, нестабильную стенокардию, первичные артериальные тромботические осложнения при атеросклерозе, такие как тромботический или эмболический инсульт, транзиторные ишемические приступы, заболевания периферических сосудов, инфаркт миокарда с тромболизом или без него, артериальные осложнения вследствие процедур при коронарной болезни, таких как коронарная ангиопластика (PTCA), эндартерэктомия, установка стента, хирургическое вмешательство по установке коронарного и другого сосудистого трансплантата, тромботические осложнения при хирургическом или механическом повреждении, такие как сохранение ткани после травмы при случайной или хирургической травме, реконструктивную хирургию, включающую кожные и мышечные лоскуты, состояния с вовлечением диффузного тромбозного/тромбоцитарного компонента, такие как диссеминированное внутрисосудистое свертывание, тромботическая тромбоцитопеническая пурпура, гемолитико-уремический синдром, тромботические осложнения при септицемии, респираторный дистресс-синдром у взрослых, антифосфолипидный синдром, гепарин-индуцированная тромбоцитопения и предэклампсия/эклампсия, или венозный тромбоз, такой как тромбоз глубоких вен, вено-окклюзионная болезнь, гематологические состояния, такие как миелопролиферативное заболевание, включая тромбоцитемию, серповидно-клеточную анемию; или в предотвращении активации тромбоцитов, индуцированной механическим путем in vivo, такой как сердечно-легочное шунтирование и экстракорпоральная мембранная оксигенация (предупреждение микротромбоэмболии), активации тромбоцитов, индуцированной механическим путем in vitro, такой как применение для хранения препаратов крови, например тромбоцитарной массы, или окклюзия шунта, как, например, при гемодиализе и плазмаферезе, тромбоз вследствие сосудистого повреждения/воспаления, такого как васкулит, артрит, гломерулонефрит, воспалительное заболевание кишечника и отторжение трансплантируемого органа, такие состояния, как мигрень.
[00124]
В некоторых вариантах осуществления антитела, раскрытые в данном документе, можно вводить пациенту, который получает или который получал лечение, включающее тикагрелор, и который нуждается в лечении или будет нуждаться в лечении кровотечения или потенциального кровотечения, связанного с аортокоронарным шунтированием (CABG), кардиоторакальным хирургическим вмешательством, медиастинальным повторным зондированием, послеоперационным инсультом, механической вентиляцией, продолжительным пребыванием в отделении интенсивной терапии, неотложным хирургическим вмешательством, не связанным с сердцем (например, нейрологическим или офтальмологическим хирургическим вмешательством, хирургическим вмешательством на позвоночнике, интракраниальным хирургическим вмешательством, орбитальным хирургическим вмешательством, ортопедическим хирургическим вмешательством, нефрэктомией, гемиколэктомии и им подобными). В связи с этим, способы, представленные в данном документе, могут охватывать введение антитела в качестве совместного терапевтического средства с тикагрелором (одновременно) или в пределах периода времени после введения тикагрелора (например, минут, часов или дней). Например, в некоторых вариантах осуществления способ может включать введение антитела пациенту, которому вводили тикагрелор, в пределах 10-120 минут после введения тикагрелора. В некоторых вариантах осуществления способ может включать введение антитела пациенту, которому вводили тикагрелор, в пределах 1-48 часов после введения тикагрелора. В некоторых вариантах осуществления антитело водят субъекту, которому вводили тикагрелор в пределах периода времени, которое не будет достаточным для метаболизма и выведения тикагрелора и/или его метаболитов из субъекта.
[00125]
12
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие предлагает способ ингибирования действия тикагрелор или его активного метаболита в отношении рецептора (P2Y) у пациента.
[00126]
12
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие предлагает способ ингибирования связывания тикагрелора или его активного метаболита с рецептором P2Y у пациента.
[00127]
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие предлагает способ обеспечения активации ADP-индуцированной агрегации тромбоцитов у пациента, которому вводили тикагрелор.
[00128]
Антитела по настоящему раскрытию, такие как проиллюстрированы в примерах, можно использовать в диагностических целях. Например, одно или несколько целевых средств (тикагрелор или его метаболиты) можно выявлять в тканях или клетках субъекта с целью определения или скрининга циркулирующего в крови количества тикагрелора у субъекта. Диагностический набор может содержать одно или несколько антител и систему выявления, показывающую реакцию антитела с тикагрелором или его метаболитами, если она вообще присутствует.
[00129]
Таким образом, настоящее раскрытие предусматривает ряд применений антител, включая применения в целях терапии, диагностики и исследований. Применения в целях диагностики и исследований могут быть in vivo или ex vivo.
Наборы
[00130]
Другой аспект настоящего раскрытия представляет собой набор. В одном аспекте набор содержит любую из композиций или фармацевтических композиций на основе нуклеиновой кислоты, антитела, вектора экспрессии или клетки-хозяина, описанных выше, и инструкции или маркировку, указывающие на соответствующее применение или введение. Необязательно набор может также включать в себя один или нескольких контейнеров и/или шприцов или других устройств для облегчения доставки или применения. Настоящее раскрытие предполагает, что все компоненты или любое подмножество компонентов для проведения анализов с целью исследований, анализов с целью диагностики и/или введения терапевтически эффективных количеств можно поместить в набор. Аналогичным образом, данный набор может содержать инструкции для получения антитела путем, например, культивирования клетки-хозяина, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту, которая кодирует антитело по настоящему раскрытию в подходящих условиях. В качестве дополнительного примера набор для введения с целью терапии антитела по настоящему раскрытию может содержать раствор, содержащий фармацевтический состав на основе антитела, или лиофилизированный препарат на основе антитела, и инструкции для введению композиции пациенту, нуждающемуся в этом, и/или для восстановления лиофилизированного продукта. В определенных вариантах осуществления данный набор будет дополнительно содержать тикагрелор в составе, подходящем для введения субъекту (например, BRILINTA™, BRILIQUE™). В таких вариантах осуществления набор может дополнительно содержать инструкции для введения состава как с антителом, так и с тикагрелором пациенту, нуждающемуся в лечении антителом, тикагрелором или и антителом, и тикагрелором.
[00131]
например
Настоящее раскрытие также охватывает готовый упакованный и маркированный фармацевтический продукт. Это готовое изделие включает соответствующую стандартную лекарственную форму в соответствующей емкости или контейнере, как, например, в стеклянном флаконе или другом контейнере, который герметично запечатан. В случае с лекарственными формами, подходящими для парентерального введения, активный ингредиент, , вышеописанные антитела и/или состав на основе тикагрелора, является стерильным и подходящим для введения в виде не содержащего частиц раствора. В определенных аспектах данный состав является подходящим для инъекционного пути введения. В некоторых вариантах осуществления представляет собой подкожное введение. В некоторых вариантах осуществления введение представляет собой внутривенное введение. Таким образом, предусматриваются пути введения, включающие инъекцию или инфузию человеку или животному.
[00132]
В конкретном аспекте составы по настоящему раскрытию составлены в отдельных однодозовых емкостях в виде стерильной жидкости. Иллюстративные контейнеры включают без ограничения флаконы, бутыли, предварительно наполненные шприцы, IV пакеты, блистерные упаковки (содержащие одну или несколько пилюль). Необязательно, совместно с таким(такими) контейнером(контейнерами) может прилагаться уведомление в форме, предписанной государственным органом, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических или биологических продуктов, и такое уведомление отражает разрешение органа в отношении производства, применения или продажи для диагностики и/или введения человеку.
[00133]
Как и в случае любого фармацевтического продукта, упаковочный материал и контейнер разработаны для защиты стабильности продукта во время хранения и транспортировки. Кроме того, продукты настоящего раскрытия включают инструкции для применения или другой информационный материал, который советует врачу, специалисту или пациенту, как правильно предупредить или лечить рассматриваемое заболевание или нарушение. Другими словами, готовое изделие включает инструктирующие средства, которые указывают или предлагают режим дозирования, включая без ограничения действующие дозы, процедуры мониторинга и т. д., и другую информацию о мониторинге.
[00134]
Набор для диагностических анализов может предусматривать раствор, содержащий антитело или лиофилизированный препарат на основе антитела по настоящему раскрытию, где антитело специфично связывается с тикагрелором и/или его метаболитом, а также реагенты для выявления данного антитела. Антитело можно метить согласно способам, известным из уровня техники и описанным в данном документе, включая без ограничения метки, такие как низкомолекулярные флуоресцентные маркеры, белки, как, например, биотин, GFP или другие флуоресцентные белки, или эпитопные последовательности, такие как his или myc. Аналогично, основные антитела, используемые для выявления антитела, могут быть включены в набор. Первичные антитела могут быть направлены на последовательности антитела или метки, маркеры или эпитопы, которыми мечено антитело. В свою очередь, основные антитела могут быть маркированы для выявления или, если необходимо, дополнительного усиления сигнала, при этом первичные антитела могут быть выявлены по вторичным антителам, которые также могут быть включены в набор.
[00135]
Также предусматриваются наборы для применения в исследованиях. Например, такие наборы могут иметь сходство с наборами, предназначенными для примений с целью диагностики или терапии, но дополнительно включают маркировку, уточняющую, что данный набор и его применение ограничиваются только исследовательскими целями.
Примеры
[00136] Список сокращений
Аббревиатура
Пояснение
ACN ацетонитрил
br широкий
BSA бычий сывороточный альбумин
CV объем колонки
d дублет
dd двойной дублет
DCM дихлорметан
DMF N,N-диметилформамид
DMSO диметилсульфоксид
DPBS физиологический раствор, забуференный фосфатом Дульбекко
EDC 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид)
EtOAc этилацетат
FA муравьиная кислота
HOAc уксусная кислота
HPLC высокоэффективная жидкостная хроматография
HRMS масс-спектрометрия высокого разрешения
HTS высокопроизводительный скрининг

HTRF гомогенная флуоресценция с временным разрешением
HYFLO вспомогательный фильтрующий материал, подвергнутый термощелочной обработке, обработанный карбонатом натрия
Hz герц
J константа взаимодействия
LC жидкостная хроматография
m мультиплет
MS масс-спектры
NMR ядерный магнитный резонанс
OAc ацетат
Pd/C палладий на угле
pM пикомолярный
PK/PD фармакокинетика/фармакодинамика
KF фторид калия
q квартет
r.t. комнатная температура
s синглет
sat. насыщенный
scFv одноцепочечный вариабельный фрагмент
t триплет
TFA трифторуксусная кислота
TEA триэтиламин
трет
TBME -бутилметиловый эфир
THF тетрагидрофуран
TIM неактивный метаболит тикагрелора
TLC тонкослойная хроматография
TR-FRET Времяразрешенный флуоресцентный индуктивно-резонансный перенос энергии
Пример 1. Получение и характеристика гаптенов
[00137]
В данном пример описаны способы синтеза, оптимизации, выделения и характеристики ряда гаптенов, которые использовали для создания иллюстративных антител, описанных в данном документе. Гаптены включают тикагрелор, метаболиты тикагрелора (TAM и TIM), биотинилированный тикагрелор и биотинилированный аденозин (см., например, фиг. 2 в отношении химических структур гаптенов в небиотинилированных формах). Тикагрелор синтезировали как описано в международной публикации патента WO 2000/034283 (Guile, et al., 2000), а TAM синтезировали как описано в международной публикации патента WO 1999/005143 (Guile, et al., 1999), каждая из которых включена посредством ссылки во всей своей полноте.
[00138]
H
H
Прямофазную хроматографию проводили с использованием силикагеля 40S, 40M или 12i от Biotage или силикагеля 60 от Merck (0,063-0,200 мм). Флеш-хроматографию проводили с использованием либо стандартных стеклянных, либо пластиковых колонок, или на системе Biotage Horizon. Химические сдвиги приведены в ppm с использованием растворителя в качестве внутреннего стандарта. Протоны на гетероатомах, такие протоны как N и O, описывают только тогда, когда их выявляют с помощью ЯМР и, таким образом, они могут быть пропущены.
Пример 1.1. Биотинилированный тикагрелор
[00139]
1.1
N-(2-(((1S,2S,3S,4R)-4-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)амино)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-3-ил)-2,3-дигидроксициклопентил)окси)этил)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамидо)гексанамидо)гексанамид ()
1.1
()
[00140]
1.a
(i) Получение 2-(((3aR,4S,6R,6aS)-6-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)амино)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-3-ил)-2,2-диметилтетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-4-ил)окси)этилметансульфоната ()
1.a
()
[00141]
2007
et. al.
Метансульфонил хлорид (0,086 мл, 1,10 ммоль) добавляли по каплям к раствору 2-(((3aR,4S,6R,6aS)-6-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)амино)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-3-ил)-2,2-диметилтетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-4-ил)окси)этанола (см., Springthorpe, B. Bioorg.Med. Chem. Lett., , 17, 6013-6018) (0,563 г, 1,0 ммоль) и TEA (0,209 мл, 1,50 ммоль) в DCM (5 мл) при 0°C. Смесь перемешивали при от 0°C до приблизительно 5°C на протяжении 3 ч. Реакционную смесь разбавляли DCM (30 мл) и промывали водой (5 мл). Смесь высушивали путем пропускания через разделитель фаз. Выпаривание растворителя и совместное выпаривание из толуола давали указанное в заголовке соединение (1.a) (714 мг, 111%) в виде густого масла желтого цвета, которое использовали необработанным без дополнительной очистки.
[00142]
1
3
H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 1,02 (dd, 3H), 1,3-1,47 (m, 5H), 1,55 (s, 3H), 1,72 (d, 2H), 2,20 (d, 1H), 2,6-2,71 (m, 2H), 2,97 (s, 3H), 3-3,19 (m, 3H), 3,57-3,68 (m, 1H), 3,69-3,79 (m, 1H), 4,02 (td, 1H), 4,13-4,24 (m, 2H), 4,78 (dd, 1H), 5,13 (td, 1H), 5,57 (s, 1H), 6,50 (s, 1H), 7,03 (s, 1H), 7,07-7,16 (m, 2H).
[00143]
19
3
F ЯМР (376 МГц, CDCl) δ -141,37 (J=21,3), -138,10 (J=21,3).
[00144]
1.b
(ii) Получение 3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-азидоэтокси)-2,2-диметилтетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-4-ил)-N-((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-7-амина ()
1.b
()
[00145]
1.b
2
4.
Смесь 2-(((3aR,4S,6R,6aS)-6-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)амино)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-3-ил)-2,2-диметилтетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-4-ил)окси)этилметансульфоната (1.a) (0,641 г, 1 ммоль) и азида натрия (0,070 мл, 2,00 ммоль) в DMF (7 мл) нагревали до 60°C в течение 15,5 ч. в атмосфере азота. Образовывался белый осадок. Добавляли воду (20 мл) и продукт экстрагировали дважды с TBME (100 мл+40 мл). Органическую фазу сушили над NaSOОрганическую фазу фильтровали и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали при помощи флеш-хроматографии на кварцевой колонке 2×8 cм с использованием смеси гептан/EtOAc 1/1 в качестве элюента (TLC с использованием смеси гептан/EtOAc 1/1 (Rf продукта=0,5)). Сбор соответствующих фракций и выпаривание растворителей давали указанное в заголовке соединение () (514 мг, 87%) в виде чистого густого масла.
[00146]
1
3
H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 1,00 (s, 3H), 1,33-1,42 (m, 5H), 1,59 (s, 3H), 1,73 (d, 2H), 2,17 (s, 1H), 2,68 (t, 2H), 2,96-3,17 (m, 3H), 3,19-3,33 (m, 2H), 3,52-3,63 (m, 1H), 3,72 (ddd, 1H), 4,03 (td, 1H), 4,79 (dd, 1H), 5,13 (td, 1H), 5,54 (dd, 1H), 6,43 (s, 1H), 6,96-7,23 (m, 3H).
[00147]
1.c
(iii) Получение промежуточного продукта 3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-аминоэтокси)-2,2-диметилтетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-4-ил)-N-((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-7-амина ()
1.c
()
[00148]
1.b
1.c
3
3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-азидоэтокси)-2,2-диметилтетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-4-ил)-N-((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-7-амин () (62,0 мг, 0,11 ммоль) в EtOH (99,5%) (2 мл) добавляли в Pd/C (5% Pd, 50 вес. % Pd/C, 22,46 мг, 5,28 мкмоль) и cмесь гидрогенизировали при атмосферном давлении в течение 2 ч. Реакционную смесь фильтровали через HYFLO и затем фильтр промывали EtOH (99,5%). Растворитель удаляли при пониженном давлении, остаток повторно растворяли в DCM (2×2 мл), и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали при помощи флеш-хроматографии на кварцевой колонке 2×8 cм с использованием смеси DCM/NH(нас.) в MeOH 95/5 в качестве элюента. Сбор соответствующих фракций давал указанное в заголовке соединение () (41 мг, 69%).
[00149]
1
3
H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 0,98 (m, 3H), 1,28-1,46 (m, 7H), 1,54 (s, 3H), 1,62-1,81 (m, 2H), 2,15 (s, 1H), 2,48-2,81 (m, 4H), 3,07 (tt, 3H), 3,34-3,47 (m, 1H), 3,53 (ddd, 1H), 3,99 (td, 1H), 4,79 (dd, 1H), 5,12 (td, 1H), 5,52 (dd, 1H), 7,02 (s, 1H), 7,09 (dt, 2H), 7,23 (s, 1H).
[00150]
19
3
J
J
F ЯМР (376 МГц, CDCl) δ -141,43 (=21,3), -138,13 (=21,3).
[00151]
1.d
(iv) Получение промежуточного продукта (1S,2S,3S,5R)-3-(2-аминоэтокси)-5-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)амино)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-3-ил)циклопентан-1,2-диола ()
1.d
()
[00152]
1.c
1.d
3
2
4
2
3
+
Предварительно охлажденную, с температурой ледяной/водяной бани, cмесь TFA (8 мл, 103,84 ммоль) и воды (0,88 мл, 48,85 ммоль) добавляли в предварительно охлажденную колбу с 3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-аминоэтокси)-2,2-диметилтетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-4-ил)-N-((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-7-амином () (340 мг, 0,61 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 0-5°C в течение 1 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении, а остаток растворяли в DCM (100 мл) и промывали NaHCO(нас. 10 мл). Солевой раствор (5 мл) добавляли в водную фазу и экстрагировали с EtOAc (30 мл). Объединенные органические фазы сушили над NaSO. Фильтрация после выпаривания растворителей давала неочищенный продукт в виде твердого вещества грязно-белого цвета. Соединение очищали посредством препаративной HPLC на колонке XBridge C18 (10 мкм 250×50 ID мм) с использованием градиента 35-75% ACN в буфере HO/ACN/NH 95/5/0,2 на протяжении 20 минут при скорости потока 100 мл/мин. Соединения выявляли с помощью УФ-детектирования при 298 нм. Пиковые фракции выпаривали досуха при пониженном давлении. Остаток растворяли в DCM и фильтровали через разделитель фаз. Удаление растворителя при пониженном давлении давало указанное в заголовке соединение () (213 мг, 67,5%). LC-MS масса/заряд 522,3 (M+H).
[00153]
1.1
(v) Получение соединения N-(2-(((1S,2S,3S,4R)-4-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)амино)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-3-ил)-2,3-дигидроксициклопентил)окси)этил)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамидо)гексанамидо)гексанамида. ()
[00154]
1.1
2
2,5-диоксопирролидин-1-ил 6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамидо)гексанамидо)гексаноат (21,77 мг, 0,04 ммоль) добавляли к раствору (1S,2S,3S,5R)-3-(2-аминоэтокси)-5-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)амино)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-3-ил)циклопентан-1,2-диола (20 мг, 0,04 ммоль) в сухом DMF (1,0 мл) и смесь помещали в атмосферу азота и перемешивали при r.t. в течение 6 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении при 40°C. Соединение очищали посредством препаративной HPLC на колонке Kromasil C18 (10 мкм 250×20 ID мм) с использованием градиента 20-60% ACN в буфере HO/ACN/FA 95/5/0,2 на протяжении 20 минут со скоростью потока 19 мл/мин. Соединения выявляли с помощью УФ-детектирования при 298 нм. Пиковые фракции собирали, концентрировали и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения () (21,4 мг, 57,3%).
[00155]
1
CH
3
H ЯМР (600 МГц, DMSO): Присутствуют два ротамера (соотношение 5:1), сигналы от основного ротамера при δ 0,81 (t, 3H), 1,15-1,64 (m, 20H), 2,03 (ddd, 7H), 2,12 (ddd, 1H), 2,57 (d, 1H), 2,59-2,67 (m, 1H), 2,77-2,89 (m, 2H), 2,93 (dd, 1H), 2,96-3,01 (m, 4H), 3,05-3,12 (m, 1H), 3,15 (td, 1H), 3,18-3,25 (m, 2H), 3,39-3,46 (m, 1H), 3,48 (tt, 1H), 3,7-3,76 (m, 1H), 3,92 (s, 1H), 4,08-4,14 (m, 1H), 4,30 (dd, 1H), 4,54 (dd, 1H), 4,95 (q, 1H), 5,06 (s, 1H), 5,13 (d, 1H), 6,35 (s, 1H), 6,42 (s, 1H), 7,07 (d, 1H), 7,31 (ddt, 2H), 7,71 (dt, 2H), 7,82 (t, 1H), 9,36 (d, 1H). Выбранные сигналы от минорного ротамера при δ 0,98 (), 8,95 (ArNH).
[00156]
HRMS Calcd [C45H65F2N11O7S2]+: 974,4556; измеренное значение: 974.4585 (M+H)+
Пример 1.2. Биотинилированный аденозин
[00157]
1.2
N-(((2R,3S,4R,5R)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-3,4-дигидрокситетрагидрофуран-2-ил)метил)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамидо)гексанамидо)гексанамид ()
1.2
()
[00158]
1.e
(i) Получение N-(((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-2,2-диметилтетрагидрофуро[3,4-d][1,3]диоксол-4-ил)метил)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамидо)гексанамидо)гексанамида ()
1.e
()
[00159]
2001
1.e
+
-
DMF (2 мл) добавляли к 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамидо)гексанамидо)гексаноату (55,6 мг, 0,10 ммоль) и 9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(аминометил)-2,2-диметилтетрагидрофуро[3,4-d][1,3]диоксол-4-ил)-9H-пурин-6-амину (30 мг, 0,10 ммоль) (см. Austin, D.J. and Liu, F., Tetrahedr. Lett., , 3153-3154) при r.t. и реакционную смесь помещали в атмосферу азота и перемешивали в течение 1 ч. и 45 мин. с получением (). Растворитель затем удаляли при пониженном давлении. Использовали в виде необработанного продукта без дополнительной очистки. LC-MS масса/заряд 759 (M+H), 757 (M-H).
[00160]
1.2
(ii) Получение конечного соединения N-(((2R,3S,4R,5R)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-3,4-дигидрокситетрагидрофуран-2-ил)метил)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамидо)гексанамидо)гексанамида ()
[00161]
1.e
1.2
2
3
Смесь TFA (1,8 мл, 23,36 ммоль) и воды (0,2 мл, 11,10 ммоль) добавляли к неочищенному N-(((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-2,2-диметилтетрагидрофуро[3,4-d][1,3]диоксол-4-ил)метил)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамидо)гексанамидо)гексанамиду () (76 мг, 0,1 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 1 ч. 25 минут. Растворители удаляли при пониженном давлении и остаток растворяли в DMSO. Соединение очищали посредством препаративной HPLC на колонке XBridge C18 (10 мкм 250×19 ID мм) с использованием градиента 5-45% ACN в буфере HO/ACN/NH 95/5/0,2 на протяжении 20 минут при скорости потока 19 мл/мин. Соединения выявляли с помощью УФ при 259 нм. Пиковые фракции концентрировали и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения () (50 мг, 69,6%) в виде рыхлого твердого вещества белого цвета.
[00162]
1
H ЯМР (600 МГц, DMSO, 40°C) δ 1,17-1,26 (m, 4H), 1,27-1,4 (m, 6H), 1,43-1,54 (m, 7H), 1,62 (ddt, 1H), 1,99-2,06 (m, 4H), 2,12 (t, 2H), 2,58 (d, 1H), 2,82 (dt, 1H), 2,96-3,05 (m, 4H), 3,05-3,14 (m, 1H), 3,36 (dt, 1H), 3,44 (dt, 1H), 3,96 (dd, 1H), 4,04 (dd, 1H), 4,11-4,15 (m, 1H), 4,29-4,33 (m, 1H), 4,67 (dd, 1H), 5,16 (d, 1H), 5,38 (d, 1H), 5,84 (d, 1H), 6,29 (s, 1H), 6,33 (d, 1H), 7,25 (s, 2H), 7,64 (dt, 2H), 8,11 (t, 1H), 8,16 (s, 1H), 8,31 (s, 1H). HRMS рассч. для [C32H50N10O7S]+: 719,3657; найденное значение: 719,3667 (M+H)+
Пример 2. Выделение и идентификация антител к тикагрелору/TAM
[00163]
фиг. 2
Данный пример иллюстрирует стратегии и методики, которые можно использовать в получении антител к тикагрелору и его метаболитам, соединениям, которые характеризуются структурным подобием с ATP, и содержат аденозин-подобный кор (Springthorpe et al 2007 Bioorg Med Chem Lett. 17:6013-6018). Химические структуры тикагрелора, активного метаболита тикагрелора (TAM) и неактивного метаболита тикагрелора (TIM) показаны на . Как рассматривается выше, антитела, раскрытые и созданные в данном документе, могут связывать и нейтрализовывать тикагрелор и TAM и могут связываться с TIM, но не связывают или в значительной степени не ингибируют другие соединения, имеющие родственную структуру, такие как аденозин. В то время, как активность связывания с TIM представляет собой необязательное свойство антитела, раскрытого в данном документе, антитела, которые характеризуется активностью связывания с TIM, как ожидается, не влияют на требуемую дозу антитела/антидота, поскольку TIM обычно представляет малую или незначительную фракцию метаболитов тикагрелора.
[00164]
фиг. 2
Общие эпитопы, т.е., уникальные R-группы для тикагрелора и TAM (дифторфенилциклопропильные и тиопропильные заместители), использовали с целью подтверждения специфичности связывания антитела и селективности в отношении данных соединений. Эпитоп, представляющий интерес, обведен пунктирной линией на . Гаптены, описанные в примере 1, использовали с целью определения эпитопа антитела дл групп дифторфенилциклопропильных и тиопропильных заместителей. Как описано в примере 1, линкеры для биотинилированных гаптенов (биотинилированного тикагрелора и биотинилированного аденозина) располагались на гликольной группе. Данная стратегия обеспечивала возможность получения антител, характеризующихся специфичностью связывания с немодифицированными дифторфенилциклопропильной и тиопропильной группами, биотинилированным тикагрелором/TAM, а также предоставляла возможность проведения скрининга и отрицательного отбора библиотек антител, которые связывают аденозин.
[00165]
et al
Используя известные методики, применяли библиотеку фагового дисплея scFv человека для создания scFv антител, и конкретные scFv выделяли из библиотеки в серии повторяющихся циклов отбора по отношению к биотинилированному тикагрелору с отрицательным отбором по биотинилированному аденозину, как описано в сущности в Lloyd 2009 PEDS 22:159-168, включенной в данный документ посредством ссылки. Отбирали определенное количество отдельных клонов из числа проведенных 2 раунда и 3 раунда отбора, scFv экспрессировали в бактериальной периплазме и подвергались скринингу в отношении специфичности в трех параллельных биохимических анализах. Данные анализы использовали для скрининга в отношении i) связывания с биотинилированным тикагрелором (анализ 1), ii) связывания с биотинилированным аденозином (анализ 2) и iii) связывания с биотинилированным тикагрелором в присутствии 50-кратного избытка немодифицированного тикагрелора (анализ 3) с целью подтверждения специфичности к тикагрелору, но не к биотинилированному линкеру.

665
665
Анализы 1, 2 и 3 осуществляли с использованием одинаковых общих методик и стратегии. Вкратце, HTS неочищенных образцов периплазматического scFv в отношении связывания с биотинилированным тикагрелором или с биотинилированным аденозином осуществляли с использованием технологии анализа HTRF. HTRF (гомогенная флуоресценция с временным разрешением) основана на принципе TR-FRET (времяразрешенного флуоресцентного индуктивно-резонансного переноса энергии). Вкратце, в TR-FRET используется перенос энергии от донорного флуорофора (в данном случае криптата европия) к акцепторному флуорофору (в данном случае XL). С учетом того, что донорный и акцепторный флуорофоры находятся в непосредственной близости (примерно <10 нм), возбуждение донорного криптата европия (337 нм) вызывает перенос энергии на акцепторный XL, который, в свою очередь, испускает сигнал флуоресценции при 665 нм. Данную технологию можно использовать для чувствительного измерения биомолекулярных взаимодействий путем присоединения донорного и акцепторного флуорофоров (либо непосредственно, либо опосредованно) к каждому партнеру по связыванию в конкретном взаимодействии. Формат HTS для связывания scFv с биотинилированным тикагрелором (анализ 1) представлен ниже и основан на присутствии химических меток как на биотинилированном тикагрелоре, так и на периплазматическом scFv, меченого гистидином:
665
стрептавидин, конъюгированный с криптатом европия:биотинилированный тикагрелор:scFv-His:XL, конъюгированный с антителом к His
[00166]
665
Анализ осуществляли в буфере, содержащем DPBS, pH 7,4 (Gibco 14190-086), KF (VWR 103444T) (0,4M), и Tween 20 (Sigma P9416) (0,05%) в объеме анализа, составляющем 10 мкл, с использованием 384-луночных планшетов для анализа с черными лунками уменьшенного объема (Corning/Costar 3676). Данный анализ проводили путем добавления 5 мкл биотинилированного тикагрелора (60 нМ с получением конечной концентрации в 30 нМ), 2 мкл образца периплазматического scFv (20% конечной концентрации) и 3 мкл раствора, содержащего как стрептавидин, меченный криптатом европия (CisBio 610SAKLB) (4,2 нМ с получением конечной концентрации в 1,26 нМ), так и антитело к His, меченное XL (CisBio 61HISXLB) (40 нМ с получением конечной концентрации в 12 нМ). Предусматривали лунки для отрицательного контроля связывания, которые содержали все перечисленные выше компоненты анализа за исключением того, что вместо периплазматического scFv добавляли 2 мкл буфера для анализа. Планшеты для анализа инкубировали в течение 4 ч. при RT перед тем как их считывали на планшет-ридере Envision с использованием стандартного протокола считывания HTRF, при котором возбуждение образцов происходит при 337 нм и времяразрешенное испускание флуоресценции измеряют как при 620 нм, так и при 665 нМ.
[00167]
Необработанные импульсы при 665 нм и при 620 нм сперва конвертировали в значения соотношения 665 нм/620 нм, а затем результаты выражали в виде значений дельта F (%). Дельта F рассчитывали согласно следующему уравнению:
Дельта F (%)={((соотношение образцов 665/620)- (соотношение 665/620 для отрицательного контроля))/(соотношение 665/620 для отрицательного контроля)}x100
[00168]
(Соотношения для отрицательного контроля получали от лунок отрицательного контроля связывания). scFv, представляющие значения дельта F выше 100%, определяли как хиты в данном анализе.
[00169]
Тот же самый описанный выше протокол использовали для проведения анализа неочищенных образцов периплазматического scFv в отношении связывания с биотинилированным аденозином (конечная концентрация для анализа 30 нМ). Формат анализа 2 можно изобразить как показано ниже:
665
стрептавидин, конъюгированный с криптатом европия:биотинилированный аденозин:scFv-His:XL, конъюгированный с антителом к His
[00170]
В анализе 3 использовали тот же самый описанный выше протокол для проведения анализа HTS, при помощи которого идентифицировали неочищенные образцы периплазматического scFv, которые демонстрировали сниженное связывание с биотинилированным тикагрелором в присутствии избытка свободного немодифицированного тикагрелора. Данный протокол модифицировали из анализа 1 с отличием в том, что анализ 3 осуществляли в присутствии 50-кратного молярного избытка свободного немодифицированного тикагрелора (1500 нМ).
[00171]
фиг. 3
Хит определяли как связывание с биотинилированным тикагрелором (дельта F > 100% в анализе 1), отсутствие связывания с биотинилированным аденозином (дельта F < 25% в Анализе 2) и сниженное на >50% связывание с биотинилированным тикагрелором в присутствии избытка свободного немодифицированного тикагрелора. Пример корелляции данных анализов 1 и 3 показан на . Некоторое количество scFv продемонстрировало ограниченное ингибирование в присутствии избытка свободного немодифицированного тикагрелора, свидетельствуя о том, что они имели связывающее взаимодействие c определенным компонентом тикагрелора и линкером. Определили подмножество scFv, у которых связывание с биотинилированным тикагрелором ингибировалось (>50%) в присутствии избытка свободного немодифицированного тикагрелора. scFv ранжировали на основе % ингибирования связывания, наблюдаемого в анализе 3 против анализа 1 (50-80%, 80-90%, >90%), причем scFv, дающему >90% ингибирования (включая TICA0072), назначали приоритет для проведения дальнейшей характеристики. Хиты scFv с уникальными последовательностями превращали в Fab и экспрессировали в клетках CHO с использованием стандартных методик.
Экспрессия и очистка Fab
[00172]
et al.
OriP
et al
Отдельные плазмиды для экспрессии HC и LC использовали для транзиентной трансфекции на основе векторов экспрессии, описанных в Persic 1997. Векторы модифицировали так, чтобы они содержали точку начала репликации EBV (). Вектор Fab (HC) содержал только константный участок 1 (CH1) и шарнирные участки, а CH2 и CH3 удаляли. ДНК HC и LC добавляли к 150 мМ NaCl и 25 кДа линейного PEI (Polysciences Europe, Германия 23966), согласно рекомендациям производителя. Комплекс ДНК-PEI затем добавляли к клеткам яичника китайского хомячка дикого типа (CHO wt), которые происходят от клеточной линии CHOK1 (ECACC № 85051005), адаптированной для суспензионной культуры (Daramola O, 2014). Через 7 дней клетки собирали путем центрифугирования и надосадочные жидкости фильтровали. Надосадочную жидкость культуры клеток, содержащую белок Fab, загружали непосредственно в колонку для хроматографии, заполненную 5 мл IgG-CH1 CaptureSelect (Life Technologies, Карлсбад, США), при скорости потока 5 мл/мин. с использованием Äkta Purifier (GE Healthcare). Колонки уравновешивали и промывали физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS), pH 7,2, и элюировали с использованием 20 мМ цитрата натрия, 150 мМ хлорида натрия, pH 3,5 (IgG-CH1 CaptureSelect), согласно инструкциям производителя смолы. Элюированные Fab доводили до pH 5,5 и фильтровали (0,22 мкм Steriflip, Millipore EMD, Бетесда, США) перед анализом. Концентрацию белка определяли посредством абсорбции при 280 нм с использованием спектрофотометра DU520 UV/vis (Beckman Coulter, Брея, США). Чистоту образцов определяли с использованием колонки TSKgel G3000SWxl (Tosoh Bioscience, Токио, Япония) и системы 1100 HPLC (Agilent Technologies, Санта Клара, США) работающих при 1,0 мл/мин.
Пример 3. Fab к тикагрелору/TAM
[00173]
фиг. 4
in silico
Структурную базу данных ("DrugsDB", Oprea T.I et al 2011 Mol. Inform. 30(2-3), 100-111, включена в данный документ посредством ссылки), содержащую имеющиеся на рынке лекарственные средства, проверяли с целью определения молекул, которые характеризуются определенным структурным подобием с тикагрелором. При определении данные структурно подобные молекулы использовали для изучения специфичности связывания Fab помимо аденозина и его фосфорилированных форм (например, ADP и ATP). Базу данных проверяли в отношении молекул, характеризующихся 2D-подобием по фингерпринтам, подобием 3D-формы и электростатическим подобием с тикагрелором на основе cтруктур, определенных при помощи ЯМР- и рентгеновского анализа. Из этого анализа выбирали панель из 12 соединений, которая включала шесть потенциальных сопутствующий препаратов. Структуры этих соединений показаны на .
[00174]

Специфичность изучали в анализе в формате конкурентного связывания, в котором исследовали способность или иное свойство каждого исследуемого соединения конкурентно ингибировать взаимодействие биотинилированного тикагрелора с соответствующим Fab. Конкурентный анализ в формате HTRFиспользовали как показано ниже, в котором целью являлось измерение конкурентного связывания биотинилированного тикагрелора с каждым His-Fab из панели исследуемых соединений:
665
антитело к His, конъюгированное с криптатом европия: исследуемый His-Fab: биотинилированный тикагрелор: стрептавидин, меченный XL.
[00175]
Данный анализ в базовом формате использовали для оценки профиля селективности лидерных Fab в конце как фазы выделения лидера, так и фазы оптимизации лидера, и для целей данных исследований Fab получали с использованием вектора экспрессии His-Fab.
[00176]
665
Анализ осуществляли в буфере, содержащем DPBS, pH 7,4 (Gibco 14190-086), KF (VWR 103444T) (0,4 M) и BSA (PAA K05-013) (0,1%), в объеме анализа 20 мкл в 384-луночных планшетах для анализа с черными лунками уменьшенного объема (Corning/Costar 3676). Протокол анализа включал добавление 5 мкл биотинилированного тикагрелора, 5 мкл титра каждого исследуемого в отношении селективности соединения, 5 мкл соответствующего His-Fab и 5 мкл объединенного раствора, содержащего как антитело к His, меченное криптатом европия (CisBio 61HISKLB) (5,33 нМ с получением конечной концентрации в 1,33 нМ), так и стрептавидин, меченный XL (CisBio 611SAXLB) (40 нМ с получением конечной концентрации в 10 нМ). Предусматривали лунки общего контроля связывания, которые содержали все перечисленные выше компоненты для анализа за исключением того, что вместо исследуемого в отношении селективности соединения добавляли 5 мкл буфера для анализа. Подготавливали лунки отрицательного контроля связывания, которые содержали все компоненты для анализа, включенные в лунки с контролем общего связывания, за исключением того, что вместо His-Fab добавляли 5 мкл буфера для анализа. Серийные титры исследуемого соединения составляли либо 1/2, либо 1/3, в зависимости от конкретного эксперимента, и наибольшие конечные концентрации соединения в анализе оптимизировали в зависимости от конкретного соединения. Концентрацию биотинилированного тикагрелора и His-Fab оптимизировали в зависимости от конкретного Fab в отдельных экспериментах. Для четырех исследованных Fab в конце фазы выделения лидера (TICA0010, TICA0049, TICA0053 и TICA0072) использованные конечные концентрации реагентов для анализа изложены в таблице 1 ниже:
Таблица 1
ID антитела
[Антитело] (нМ)
[Биотинилированный тикагрелор] (нМ)
TICA0039
16,0
139,9
TICA0049
16,0
37,9
TICA0053
16,0
70,7
TICA0072
8,0
17,6
[00177]
В отношении двух Fab, исследованных в конце фазы оптимизации лидера (TICA0162 и TICA0212), использованные конечные концентрации реагентов для анализа составляли: 5 нМ биотинилированного тикагрелора и 1 нМ His-Fab в обоих случаях. Множество исследуемых в отношении селективности соединений, используемых в данных экспериментах, растворяли в 100% DMSO, а возникновение снижения анализируемого сигнала, обусловленного средой-носителем, может начаться при концентрациях выше примерно 1% DMSO. С целью обеспечения последующей нормализации данных для устранения любых подобных эффектов, обусловленных средой-носителем, в большинство экспериментов, в которых конечные концентрации DMSO в анализе отражали концентрации серийных разведений исследуемых соединений, включали параллельные титры отдельно DMSO. В конце проведения процедуры данную пробу инкубировали в течение 3 ч. при RT перед считыванием на планшет-ридере Envision с использванием стандартного протокола для считывания.
[00178]
Для последующего анализа данных необработанные импульсы при 665 нм и при 620 нм сперва конвертировали в значения соотношения 665 нм/620 нм, которые затем использовали для подсчета значений дельта F в % согласно уравнению, изложенному в анализе 1. Значение соотношения для отрицательного контроля, использованное в подсчете дельта F в %, получали для лунок отрицательного контроля связывания. Значения дельта F в % использовали для подсчета значений в % специфичного связывания согласно уравнению ниже:
Специфичное связывание (%)={(дельта F образца-дельта F для отрицательного
контроля связывания)/
(Дельта F общего связывания-дельта F для отрицательного контроля связывания)}x100
[00179]
Для стандартных подсчетов % специфичного связывания значение дельта F общего связывания брали из лунок с контролем общего связывания, которые содержали все из вышеперечисленных компонентов анализа, но без включения какого-либо конкурирующего исследуемого соединения.
[00180]
В тех экспериментах, где использовали нормализацию по DMSO, % специфичного связывания подсчитывали в сущности согласно уравнению выше за исключением того, что в данном случае значение дельта F для общего связывания брали из лунок, содержащих все из компонентов в лунках с контролем общего связывания, а также DMSO в концентрации, эквивалентной концентрации в соответствующей лунке с образцом.
[00181]
Результаты первичных экспериментов данного типа обобщены в таблице 2. В трех из четырех первичных Fab, которые были изучены (TICA0010, TICA0049 и TICA0053), соединение кангрелор продемонстрировало конкурентное ингибирование связывания Fab с биотинилированным тикагрелором. В данном случае с TICA0049 как пантопразол, так и линезолид демонстрировали частичное конкурентное ингибирование. Как показано в таблице 2, Fab TICA0072 не демонстрировал ингибирования в случае с одиннадцатью из двенадцати соединений, а в случае с пантопразолом показал слабое частичное ингибирование.
[00182]
50
50
Ингибирование с немодифицированным тикагрелором и TAM наблюдали для всех четырех Fab, исследованных в данной серии экспериментов, при значениях IC, находящихся в диапазоне от 0,1 мкM до 0,5 мкM. Конкурентное ингибирование также выявляли с TIM для двух их четырех Fab (TICA0049 и TICA0072), однако при значениях IC >50 мкM, указывая на наличие значительно сниженной аффинности TIM относительно немодифицированного тикагрелора и TAM. На основе результатов в таблице 2 TICA0072 идентифицировали как средство, которре характеризуется наиболее благоприятным профилем селективности. TICA0049 идентифицировали как потенциальное резервное средство на основе тех критериев, что данный Fab продемонстрировал наименьшее связывание с кангрелором среди оставшихся трех Fab.
Таблица 2.
50
Относительные значения IC для каждого из 12 исследуемых соединений (фиг. 4) и немодифицированного тикагрелора, TAM и TIM в отношении ингибирования связывания с биотинилированным тикагрелором для каждого исследуемого Fab
<b>IC50 (мкM) для разных соединений в отношении лидерного his-Fab</b>
<b>Соединение</b>
<b>TICA0010</b>
<b>TICA0049</b>
<b>TICA0053</b>
<b>TICA0072</b>
Фенофибрат
NI
NI
NI
NI
Нилвадипин
NI
NI
NI
NI
Цилостазол
NI
NI
NI
NI
Букладезин
NI
NI
NI
NI
Регаденозон
NI
NI
NI
NI
Циклотиазид
NI
NI
NI
NI
Цифлутрин
NI
NI
NI
NI
Ловастатин
NI
NI
NI
NI
Линезолид
NI
467,1
NI
NI
Симвастатин
NI
NI
NI
NI
Кангрелор
102,4
207,9
17,5
NI
Пантопразол
NI
263,7
NI
498,0
Тикагрелор
0,122
0,257
0,109
0,113
TAM
0,124
0,412
0,134
0,299
TIM
NI
53,4
NI
54,4
NI означает отсутствие ингибирования.
[00183]
фиг. 4
фиг. 5
50
Во второй серии экспериментов получали дополнительные данные о селективности Fab TICA0049 и TICA0072, в которой подмножество четырех из двенадцати соединений, перечисленных в , повторно исследовали вместе с тикагрелором, TAM и TIM и рядом соединений, родственных аденозину. В данном случае, в качестве уточнения результатов ранее проведенных исследований в таблице 2, эксперименты разрабатывали с целью обеспечить возможность нормализации процентных значений специфичного связывания для устранения любых неспецифических эффектов, обусловленных средой-носителем с DMSO. Нанесенные на график данные из примера второй этой серии экспериментов показаны на вместе со сведенными в таблицу 3 значениями IC.
Таблица 3.
фиг. 4
50
Результаты из примера в отношении IC для подмножества четырех из двенадцати соединений, перечисленных на , тикагрелора, TAM, TIM и ряда родственных аденозину соединений в исследованиях селективности конкурентного связывания (нормализованы по DMSO)
<b>Соединение</b>
<b>TICA0049</b>
<b>TICA0072</b>
Аденозин
NI
NI
ADP
NI
NI
2MeS ADP
NI
NI
ATP
NI
NI
2 MeS ATP
NI
NI
Букладезин
864,9
NI
Линезолид
902,0
NI
Кангрелор
188,4
NI
Пантопразол
243,5
1546,0
Тикагрелор
0,368
0,356
TAM
0,366
0,483
TIM
74,8
119,5
[00184]
50
50
Как и в более ранних экспериментах TICA0072 показал наиболее благоприятный профиль селективности, и только в случае с пантопразолом показывал слабое частичное ингибирование (IC > 1500 мкM) среди четырех исследованных соединений. В случае с TICA0049 наблюдали значительное ингибирование в отношении кангрелора и пантопразола при наблюдаемом слабом ингибировании в отношении линезолида и букладезина. Следует отметить, что незначительные отличия в абсолютных значениях IC между первой и второй серией экспериментов для конкретного исследуемого соединения, по сути, не изменяют общих заключений. Такие различия могут исходить из того факта, что нормализацию по DMSO включали во вторую серию экспериментов в комбинации с тем фактом, что в ряде случаев авторы настоящего изобретения пытались измерить очень слабое ингибирование.
[00185]
50
50
Измеренные как для TICA0049, так и для TICA0072 значения IC в отношении тикагрелора и TAM находились в диапазоне от 0,3 мкM до 0,5 мкM, при этом значения IC для TIM при значениях выше 2 log были выше при 74,8 мкM и 119,5 мкM, соответственно. Остаточное ингибирование наблюдали в случае с аденозином, ADP, ATP и метилтио-производными последних двух соединений как для Fab TICA0049, так и для Fab TICA0072, однако его выявляли только при наиболее высоких концентрациях исследуемых соединений и его считали значимым.
[00186]
Мы пришли к выводу, что TICA0072 являлся единственным Fab, который рассматривается в качестве специфичного для тикагрелора и TAM.
Пример 4. Измерение аффинности Fab к тикагрелору/TAM
[00187]
Аффинность Fab к тикагрелору, полученных выше, определяли с использованием интерферометрии биослоя на Octet Red384. Для измерения аффинности Fab-антитела к тикагрелору разбавляли до концентрации 2x конечной концентрации для анализа в буфере для анализа (PBS, Tween20 0,05%, BSA 0,02%), например, 200 нМ. 2-кратное серийное разведение тикагрелора по 10 точкам готовили в 96-луночном полпропиленовом планшете Greiner. Равные объемы (например 70 мкл плюс 70 мкл) разведеного антитела и свободного тикагрелора затем переносили во второй полипропиленовый планшет Greiner. Образцы перемешивали путем пипетирования, накрывали пленкой для планшетов и позволяли им уравновеситься в течение 3-5 дней при комнатной температуре. После уравновешения 60 мкл титров антитела/тикагрелора переносили в двух параллелях в 384-луночный черный полипропиленовый планшет. Биотинилированный тикагрелор разводили до 250 нМ в буфере для анализа и добавляли в чередующиеся лунки из первых 2 колонок 384-луночного планшета для анализа, при этом оставшиеся лунки содержали только буфер для анализа. Стрептавидиновые биосенсоры предварительно выдерживали в буфере для анализа в течение по меньшей мере 10 минут. Планшеты с образцами и биосенсоры затем загружали в платформу OctetRed384.
[00188]
Все анализы проводили при комнатной температуре. После уравновешения на исходном уровне в течение 60 с. в буфере для анализа биотинилированный тикагрелор загружали на стрептавидиновые биосенсоры в течение 300 с., с последующим добавлением буфера для анализа в течение 600 с. для установления нового исходного уровня. Смесям антитело/тикагрелор затем позволяли связаться с поверхностью сенсора с биотинилированным тикагрелором в течение 30-600 с., в зависимости от используемой концентрации антитела. Полученные в результате данные фазы ассоциации анализировали с использованием программного обеспечения для анализа OctetRed Data. Сигналы выравнивали по исходному уровню и сигнал от эталонного сенсора (контроль без антитела) вычитали для каждого образца, затем данные экспортировали для анализа с использованием программного обеспечения для анализа KinExA n-Curve. Используя анализ Constant Partner, определяли равновесную KD для Fab-антител к тикагрелору. Данные продемонстрировали, что Fab TICA0072 и TICA0049 характеризовались аффинностью к тикагрелору при 7,4 нМ и 11,6 нМ, соответственно (таблица 4).
Таблица 4
. Анализ равновесной аффинности для Fab к тикагрелору
<b>ID антитела</b>
<b>Гаптен</b>
<b>Равновесная KD</b>
<b>Доверительный интервал 95%</b>
TICA0072
Тикагрелор
7,43 нМ
1,75-21,46 нМ
TICA0049
Тикагрелор
11,6 нМ
1,7-66,5 нМ
Пример 5. Оптимизация антитела к тикагрелору/TAM TICA0072
[00189]

Антитело TICA0072 оптимизировали с использованием отборов с помощью фаговых дисплеем на основе аффинности. Большие фаговые библиотеки scFv, полученные из лидерных последовательностей scFv, создавали с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза определяющих комплементарность участков (CDR) 1, 2 или 3 вариабельного участка тяжелой (VH) цепи или CDR 1, 2 или 3 вариабельного участка легкой (VL) цепи с использованием стандартных методик молекулярной биологии, как описано в (Clackson and Lowman 2004 Practical Approach Series 266). Библиотеки подвергали отборам с использованием фагового диспля на основе аффинности, чтобы выбрать варианты с более высокой аффинностью к тикагрелору и TAM. Вкратце, частицы scFv-фаг инкубировали в растворе со уменьшающимися концентрациями биотинилированного тикагрелора (типичным примером будет от 20 нМ до 20 пМ за четыре раунда отбора), как описано, по сути, ранее (Thompson et al 1996 J Mol Biol. 256 (1):77-88). Неочищенные периплазматические экстракты, содержащие scFv, получали для репрезентативного числа отдельных scFv из направленных на CDR продуктов отбора и подвергали скринингу в формате конкурентного анализа связывания с эпитопом HTRF, разработанного для скрининга на наличие улучшений в отношении аффинности относительно TICA072.
[00190]

50
50
Вкратце, с целью скрининга вариантов scFv и Fab с улучшенной аффинностью конкурентный анализ связывания с эпитопом HTRFиспользовали на основе конкуренции в отношении исследуемых вариантов scFv, по взаимодействию между исходным IgG TICA0072 и биотинилированным тикагрелором. Данный анализ использовали в качестве первичного одноточечного HTS для скрининга образцов неочищенных периплазматических экстрактов scFv, а также в качестве многоточечного вторичного анализа профиля с целью измерения улучшений по значениям IC для очищенных как scFv-, так и Fab-вариантов к исходному TICA0072. Хотя анализы конкурентного связывания эпитопов, как, например, описанный в данном документе, обычно не используют для определения значений абсолютной аффинности, такие анализы можно использовать в качестве базы для HTS на основе аффинности. Кроме того, кратности повышения IC для очищенных вариантов scFv/Fab (относительно исходных scFv/Fab) могут предоставить хороший индикатор общей кратности усиления аффинности и могут представлять собой эффективный путь оценки аффинности для вариантов scFv/Fab в циклах по оптимизации лидерных молекул. Формат описанного в данном документе конкурентного анализа связывания эпитопа для исходного IgG TICA0072 изложен ниже:
665
стрептавидин, меченный европием:биотинилированный тикагрелор: IgG TICA0072: антитело к Fc-фрагменту человека, меченное XL
[00191]
50
Анализ осуществляли в буфере, содержащем DPBS, pH 7,4 (Gibco 14190-086), KF (VWR 103444T) (0,4M) и Tween 20 (Sigma P9416) (0,05%) с использованием 384-луночных планшетов для анализа с черными лунками уменьшенного объема (Corning/Costar 3676). Для одноточечного исследования неочищенных периплазматических вариантов scFv использовали объем пробы в 10 мкл, однако объем пробы в 20 мкл использовали при исследовании очищенных scFv и Fab в многоточечных вторичных анализах профиля IC.
[00192]
665
Для одноточечного HTS анализ осуществляли путем добавления 3 мкл IgG TICA0072 (53,3 нМ с получением конечной концентрации в 16 нМ), 2 мкл образца неочищенного периплазматического экстракта scFv, 2,5 мкл биотинилированного тикагрелора (8 нМ с получением конечной концентрации в 2 нМ) и 2,5 мкл объединенного раствора, содержащего стрептавидин, меченный европием (CisBio 610SAKLB) (3 нМ для конечной концентрации для анализа 0,75 нМ), и антитело к Fc-фрагменту человека, меченное XL (CisBio 61HFCXLB) (30 нМ с получением конечной концентрации для анализа в 7,5 нМ). Исходный неочищенный периплазматический scFv TICA0072 использовали для сравнения и HTS настраивали для идентификации вариантов, дающих улучшенное ингибирование относительно исходного. Лунки контроля общего связывания содержали все компоненты для анализа за исключением того, что вместо образца scFv добавляли 2 мкл буфера для анализа. Лунки отрицательного контроля связывания содержали все компоненты из контрольных лунок общего связывания за исключением того, что вместо IgG TICA0072 добавляли 3 мкл буфера для анализа.
[00193]
50
50
665
Для многоточечного исследования IC в отношении очищенных вариантов scFv/Fab анализ осуществляли путем добавления 5 мкл IgG TICA0072 (53,3 нМ с получением конечной концентрации в 16 нМ), 5 мкл титра в 1/3 очищенного исследуемого варианта scFv или Fab, 5 мкл биотинилированного тикагрелора (8 нМ с получением конечной концентрации в 2 нМ (профилирование scFv), 4 нМ с получением конечной концентрации для анализа в 1 нМ (профилирование Fab)) и 5 мкл объединенного раствора, содержащего стрептавидин, меченный европием (CisBio 610SAKLB) (3 нМ для конечной концентрации для анализа 0,75 нМ) и антитело к Fc-фрагменту человека, меченное XL (CisBio 61HFCXLB) (30 нМ с получением конечной концентрации для анализа в 7,5 нМ). Очищенный исходный TICA0072 (scFv или Fab) использовали для сравнения во всех экспериментах, в результате чего улучшения в IC, измеренные с оптимизированными вариантами (scFv или Fab), можно было выразить в виде кратных улучшений по сравнению с исходным TICA0072. Лунки контроля общего связывания содержали все компоненты для анализа за исключением того, что вместо образца очищенного scFv или Fab добавляли 5 мкл буфера для анализа. Лунки отрицательного контроля связывания содержали все компоненты из контрольных лунок общего связывания за исключением того, что вместо IgG TICA0072 добавляли 5 мкл буфера для анализа.
[00194]
50
Как в одноточечной HTS, так и в многоточечной профилирующих версиях анализа IC планшеты для анализа инкубировали в течение 3 ч. при RT перед тем, как их считывали на планшет-ридере Envision с использованием стандартного протокола для считывания HTRF, в ходе выполнения которого возбуждение образцов происходит при 337 нм и испускание флуоресценции с временным разрешением измеряют как при 620 нм, так и при 665 нМ.
[00195]
50
Необработанные импульсы при 665 нм и 620 нм использовали для подсчета значений дельта F (%) и % специфического связывания согласно уравнениям, описанным ранее в анализах 1 и 4, соответственно. Для многоточечных вторичных профилирующих экспериментов значения IC определяли с помощью программного обеспечения Graphpad Prism, используя аппроксимацию кривой (4-параметрическое логистическое уравнение) зависимости доза-ответ (с изменяемым наклоном).
[00196]
т. е.
50
50
Хиты, идентифицированные в ходе скрининга, варианты scFv, которые показали значительно улучшенный ингибиторный эффект по сравнению с исходным scFv TICA0072, подвергали секвенированию ДНК, а затем получали отдельные варианты продуктов из библиотеки CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи и CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельного участка легкой цепи в виде очищенного scFv и повторно исследовали в том же анализе для определения кривых зависимости концентрация-ответ для IC. Затем варианты scFv, демонстрирующие наиболее улучшенные значения IC, получали в виде Fab и исследовали в анализе конкурентного связывания эпитопов второго поколения, описанном ниже.
Анализ конкуретного связывания эпитопов второго поколения для скрининга/ранжирования Fab с наивысшей аффинностью
[00197]

50
50
С целью эффективного разделения очищенных Fab с очень высокой аффинностью в конце цикла оптимизации лидерных молекул осуществляли дополнительный HTRF анализ конкурентного связывания эпитопа, однако в данном случае анализ основывался на конкурентном ингибировании связывания промежуточно оптимизированного по аффинности IgG линии TICA0072 (TICA0159) с биотинилированным тикагрелором в противоположность исходному IgG TICA0072. Данный анализ использовали только в формате многоточечного профилирующего анализа IC (в противоположность формату HTS) и осуществляли, по сути, аналогично способу, приведенному в анализе 5 (выше) для многоточечного IC профилирующего анализа очищенных Fab-вариантов в конкурентом анализе связывания с эпитопом исходного IgG TICA0072. Единственное отличие заключалось в том, что вместо IgG TICA0072 использовали IgG TICA0159 в соответствующий момент анализа, но при той же конечной концентрации для анализа в 16 нМ. Во всех других отношениях данный анализ осуществляли точно также, как описано выше для версии многоточечного вторичного профилирующего анализа для очищенного Fab.
[00198]
В анализе второго поколения TICA0072 заменяли на частично оптимизированное антитело TICA0159 для обеспечения более эффективного установления различия и ранжирования Fab по наивысшей аффинности, чем это было возможно в анализе конкурентного связывания эпитопа с TICA0072.
[00199]
фиг. 6
50
50
Наилучшие VH идентифицировали как вариант CDR3 TICA0162. Наилучшие VL идентифицировали как вариант CDR3 TICA0152. Для достижения дополнительного улучшения аффинности разные CDR от улучшенных антител объединяли в новые Fab с использованием стандартных методик молекулярной биологии В результате данной работы по рекомбинации комбинация TICA0162 и TICA0152 образовывала новый Fab TICA0212 с дополнительно улучшенным профилем конкуренции за связывание с эпитопом. Нанесенные на график кривые конкурирования для Fab TICA0072, TICA0152, TICA0162 и TICA0212 в конкурентном анализе связывания эпитопов второго поколения показаны на с измеренными значениями IC в таблице 5. TICA0212 демонстрирует улучшение примерно на 2 log в IC относительно исходного Fab TICA0072.
Таблица 5.
50
Данные IC для перечисленных оптимизированных Fab к тикагрелору в анализе конкурентного связывания эпитопов второго поколения
<b>Fab </b>
<b>IC</b><sub><b>50</b></sub><b> (нМ)</b>
<b>Кратность улучшения</b>
TICA0072
1714,0
0
TICA0152
73,5
23,3
TICA0162
16,3
105,2
TICA0212
12,0
142,8
Пример 6. Измерение аффинности оптимизированных Fab к тикагрелору/TAM
[00200]
3
3
Аффинность Fab к тикагрелору/TAM, полученных в примере 5, определяли с использованием KinExA3200. Для измерения аффинности с помощью KinExA гранулы (600 мг гранулы азлактона) сперва подготавливали путем воздействия на них в течение ночи 1 мг стрептавидина в 50 мМ NaHCO. После блокирования посредством 2 замен буфера Tris (1 M Tris pH 8,7, 10 мг/мл BSA) гранулы, покрытые стрептавидином, ресуспендировали с общим объемом 8 мл. Гранулы (1,33 мл, эквивалентно 100 мг исходных сухих гранул азлактона) целиком промывали PBS, позволяя им затем связываться с примерно 2,5 мкг биотина-тикагрелора в 1 мл PBS в течение 10 минут с периодическим помешиванием. Полученные в результате гранулы, покрытые биотином-тикагрелором, промывали PBS, затем ресуспендировали в 50 мл PBS, содержащем 0,1% BSA и 0,02% NaN, и хранили при комнатной температуре до переноса во флакон для гранул KinExA.
[00201]
3
Подготовку образцов антитело/тикагрелор в целом проводили как описано в предыдущем способе. Fab-антитела к тикагрелору рахзводили в 2 раза до конечной концентрации для анализа в буфере для анализа (PBS, Tween20 0,05%, BSA 0,02%, 0,02% NaN), например, 200 нМ. 2-кратное серийное разведение тикагрелора по 10 точкам получали в 50 мл полипропиленовых пробирках Falcon. Равные объемы, например, 5 мл с 5 мл, разбавленного антитела и свободного тикагрелора затем переносили во вторую полипропиленовую пробирку Falcon. Образцы перемешивали путем пипетирования и позволяли им уравновеситься в течение 3-5 дней при комнатной температуре. После уравновешения пробирки с образцами переносили на KinExA 3200 для анализа.
[00202]
Все анализы проводили при комнатной температуре. Из смесей антитело/тикагрелор отбирали образцы и обеспечивали возможность их смешивания с гранулами био-тикагрелора, тогда как несвязанный свободный тикагрелор отмывали. Связанное антитело затем выявляли с использованием антитела мыши, меченного DyLight649, к тяжелой и легкой цепям Ig человека. Объем образцов (300 мкл - 1300 мкл) и время введения образца (90 с. -120 с.) варьировались по концентрациям, и 2-3 считывания варьировались на образец. Данные анализировали с использованием программного обеспечения для анализа KinExA n-Curve. Используя анализ Constant Partner, определяли равновесную KD для Fab-антител к тикагрелору.
[00203]
Как и в предыдущем примере, Fab позволяли уравновеситься при комнатной температуре в присутствии либо немодифицированного тикагрелора, либо TAM в концентрациях от 20-кратного избытка. Биотинилированным тикагрелором нагружали поверхность гранул, покрытых стрептавидином. После уравновешения оставшемуся свободному антителу позволяли связаться с биотинилированным тикагрелором. Связанное антитело затем выявляли с использованием антитела мыши для выявления, меченного DyLight649, к тяжелой и легкой цепям Ig человека. Титры свободного тикагрелора или TAM готовили по меньшей мере с тремя различными фиксированными концентрациями антитела с получением отдельных профилей титров по меньшей мере с 10-кратным сдвигом в измеряемой KD. Данные анализировали с использованием программного обеспечения для анализа KinExA Pro n-Curve для определения равновесной KD для свободного тикагрелора или TAM. Fab TICA0212 характеризовался аффинностью к немодифицированному тикагрелору и TAM, составляющей около 20 пМ (таблица 6). Исходя из равновесных данных, TICA0212 демонстрирует эквивалентно высокую аффинность (~20 пМ) при связывании с тикагрелором и TAM.
Таблица 6.
Анализ равновесной аффинности для Fab к тикагрелором/TAM
<b>ID антитела</b>
<b>Посл. CDR3 (SEQ ID NO)</b>
<b>Гаптен</b>
<b>Равновесная KD</b>
<b>95% доверительный интервал (C. I.)</b>
TICA0072
VH GSHLY<sup>99</sup>DFW<sup>100b</sup>SASHPPNDALAI (35)VL GTW<sup>91</sup>D<sup>92</sup>I<sup>93</sup>S<sup>94</sup>LSAGL (40)
Тикагрелор
7,4 нМ
1,8-21,5 нМ
TICA0152
VH GSHLYDFWSASHPPNDALAI (65)VL GTW<b>LYDRAV</b>GL (70)
Тикагрелор
43,17 пМ
2,8-119,2 пМ
TICA0162
VH GS<b>FD</b>Y<b>Y</b>FWSASHPPNDALAI (55)VL GTWDISLSAGL (60)
Тикагрелор
162,48 пМ
125,4-206,3 пМ
TICA0212(MEDI2452)
VH GS<b>FD</b>Y<b>Y</b>FWSASHPPNDALAI (75)VL GTW<b>LYDRAV</b>GL (80)
Тикагрелор
19,6 пМ
13,0-28,7 пМ
TAM
19,7 пМ
4,9-44,7 пМ
TIM
~ 20 нМ
жирным
Изменения в остатках последовательностей из исходного TICA0072 выделены , а номера по Kabat идентифицированы для определенных остатков в TICA0072.
Пример 7. Специфичность Fab TICA0162 и TICA0212 к тикагрелору/TAM
[00204]
фиг. 4
фиг. 7
Специфичность Fab, TICA0162 и TICA0212 исследовали как в примере 3 и нормализовали по DMSO. Итоговая таблица всех доступных данных селективности для TICA0162 и TICA0212 включена в таблицу 7. Кроме того, иллюстративные данные, нанесенные на график, из эксперимента, в котором пять из двенадцати соединений, перечисленных на , исследовали помимо тикагрелора, TAM, TIM и нескольких родственных аденозину соединений, показаны на .
Таблица 7.
50
Относительные значения ICдля двенадцати структурно родственных соединений в дополнение к тикагрелору, TAM, TIM и соединений семейства аденозина в отношении ингибирования связывания биотинилированного тикагрелора с Fab TICA0162 и TICA0212.
<b>IC50 (мкM) для разных соединений в отношении лидерного his-Fab</b>
<b>Соединение</b>
<b>TICA0162</b>
<b>TICA0212</b>
Фенофибрат
NI
NI
Нилвадипин
NI
NI
Цилостазол
NI (n=2)
NI (n=2)
Букладезин
NI
NI
Регаденозон
NI (n=2)
NI (n=2)
Циклотиазид
> 1000 (n=2)
NI (n=2)
Цифлутрин
NI
NI
Ловастатин
NI
NI
Линезолид
NI
NI
Симвастатин
NI (n=2)
NI (n=2)
Кангрелор
NI
NI
Пантопразол
> 1000 (n=2)
NI (n=2)
Аденозин
NI
NI
ADP
NI
NI
2MeS-APD
NI
NI
ATP
NI
NI
2MeS-ATP
NI
NI
Тикагрелор
0,023 (n=2)
0,035 (n=2)
TAM
0,032 (n=2)
0,031 (n=2)
TIM
19,8 (n=2)
28,8 (n=2)
NI означает отсутствие ингибирования.
[00205]
Как проиллюстрировано посредством данных, TICA0212 (MEDI2452) характеризуется, по сути, эквивалентной специфичностью связывания с тикагрелором и TAM и более слабым связыванием с TIM. Кроме того, MEDI2452/TICA0212 не показал значительного связывания с любыми другими структурно родственными лекарственными средствами или родственными аденозину соединениями.
Пример 8. Кристаллография белков
[00206]

TICA0072 с C-концевой his-меткой концентрировали в PBS до 9 мг/мл. Образования комплекса достигали путем добавления 1 мМ тикагрелора, растворенного в DMSO. Комплекс инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов перед проведением испытаний по кристаллизации с использованием способа диффузии паров в "сидячей" капле. Обширный скрининг осуществляли с использованием 3 коммерческих наборов для скрининга и получали ряд хитов. Кристаллы с наилучшим показателем рассеивания получали в результате оптимизации решеток хита с помощью Morpheus (Molecular Dimensions, Соединенное Королевство). Кристаллы, использованные для определения структуры, выращивали при 20°C путем перемешивания равных объемов комплекса TICA0072-тикагрелор и резервуарного раствора из 12,8% PEG 3350, 12,8% PEG 1000, 12,8% MPD, 1,7% 1,6-гександиола, 1,7% 1-бутанола, 1,7% 1,2-пропандиола, 1,7% 2-пропанола, 1,7% 1,4 бутандиола, 1,7% 1,3-пропандиола, 25 мМ имидазола, 25 мМ карбоната натрия, 25 мМ MES и 25 мМ Bis-Tris, pH 6,5. Кристаллы быстро замораживали в жидком азоте без добавления какого-либо криопротектора.
[00207]
TICA0212/MEDI2452 в PBS в концентрации около 15 мг/мл смешивали с тикагрелором до концентрации 1 мМ и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре перед осуществлением обширного скрининга. Спонтанных хитов не получали. Кристаллы-затравки TICA0072-тикагрелор получали путем дробления множества кристаллов в 30 мкл раствора в лунке и использовали их в ММS (скрининге по методу микропереноса кристаллов) в обширном коммерческом скрининге. Получали множество хитов, но кристаллы, используемые для определения структуры, выращивали при 20°C в среде из 20% глицерина, 20% PEG 4000, 10% 2-пропанола, 0,1 M NaCl и 0,5 M ацетата Na, pH 4,6. Формирование капель затем проводили с 0,2 мкл белка, 0,18 мкл раствора в лунке и 0,02 мкл затравочных кристаллов. Кристаллы быстро замораживали в жидком азоте без добавления какого-либо криопротектора.
[00208]
Данные собирали в канале ID23-1 Европейской установки синхротронного излучения, Гренобль, Франция. Данные обрабатывали, сопоставляли и дополнительно сводили с использованием схемы AutoProc [Vonrhein, C., et al., Acta Cryst. 2011; D67: 293-302], статистические данные см. в таблице 8. Для TICA0072 первичное фазирование проводили посредством молекулярной замены с использованием структуры Fab высокого разрешения (PDB id code 1aqk, [Faber C., et al., Immunotechnology. 1998; 3:253-70]) в качестве стартовой модели. Для TICA0212/MEDI2452 структуру TICA0072 использовали в качестве стартовой модели. Реконструирование модели осуществляли с использованием Coot [Bricogne G., et al., (2011). BUSTER версии 2.11.4., Кембридж, Соединенное Королевство: Global Phasing Ltd] и уточнение структуры осуществляли с использованием autobuster [Emsley, P., et al., Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr. 2004, D60, 2126-2132]. В отношении статистических данных для финальных моделей см. таблицу 8.
<b>Таблица 8.</b> Совокупность данных и статистические данные по уточнению структур сокристалла Fab и тикагрелора. Значения в скобках относятся к единицам измерения значений наивысшего разрешения. Описание
TICA0072
TICA0212(MEDI2452)
Код доступа в PDB
Статистика для совокупности данных
Источник ионизирующего излучения
ESRF/ID23-1
ESRF/ID23-1
Детектор ионизирующего излучения
Pilatus
Pilatus
Пространственная группа симметрии
P21
P21212
Постоянные решетки
a=41,2, b=72,6, c=67,8 β=98,9
a=69, b=173, c=42
Разрешение (Å)
49-1,7 (1,87-1,7)
41-2,16 (2,27-2,16)
Наблюдаемые отражения
143002
232480
Уникальные отражения
41888
36570
Завершенность (%)
97,0 (95,3)
99,4 (94,7)
Среднее значение I/σ<sub>I</sub>
13,6 (1,7)
10,7 (1,2)
R<sub>симм.</sub>%<sup>b</sup>
4,8 (74,4)
9,7 (27,7)
Статистические данные по уточнению структур
Разрешение (Å)
49-1,7
41-2,16
Количество атомов белка+лигандов
3308
3371
Количество атомов растворителя
142
87
R (%), Rсвободный (%)
19,8, 23,7
21,7, 25,7
Фактор Wilson B (Å<sup>2</sup>), уточнено <B> (Å<sup>2</sup>)
45,6, 48,5
42,1, 44,6
Идеальная длина связи Rmsd (Å)
0,008
0,010
Валентные углы (°)
1,10
1,25
[00209]
Структуру TICA0072 в комплексе с тикагрелором определяли до разрешения 1,7 Å (фиг. 10). CDR образуют сильно вогнутую поверхность и тикагрелор встраивается глубоко в участке спроикосновения доменов VH и VL. Данный тип связывания чаще всего наблюдают для небольших гаптенов. Все CDR за исключением CDR2 VL непосредственно участвуют в связывании с тикагрелором и большая часть CDR3 VH является неупорядоченной. Дифторфенильная группа тикагрелора располагается в полости, выстроенной из гидрофобных остатков, включая остатки зоны Вернье Trp47 VH, Phe98 VL и остаток Leu100L CDR3 VH. Главным остатком при взаимодействии с тикагрелором является VL Trp91, который вовлечен как в формирование пи-стэкинга к аденозин-подобному кору, так и водородной связи с одной из гидроксильных групп рибозы при циклопентильном фрагменте. Дополнительные взаимодействия с аденозин-подобным кором обеспечиваются His35 CDR1 VH и Tyr99 CDR3 VH. Тиопропильный заместитель расположен перпендикулярно главной цепи петли CDR2 VH. Гидроксиэтильный заместитель на циклопентильном фрагменте выступает в растворитель и не участвует в каких-либо взаимодействиях с Fab.
[00210]
В структуре Fab с улучшенной аффинностью, TICA0212/MEDI2452, связывания с тикагрелором аналогично такому связыванию для TICA0072 с сохранением всех упомянутых выше взаимодействий, но с некоторыми важными отличиями (фиг. 10B). Комбинация мутаций Asp92Leu и Ser94Asp в CDR3 VL разрушает водородную связь в пределах петли CDR3 VL с образованием более "слабой" структуры. Новая конформация коррелирует с углом в 15° пиримидинового кольца рядом с местом присоединения циклопропилдифторфенильного заместителя. Новое положение пиримидинового кольца подводит его примерно на 0,2 Å ближе к Tyr99 CDR3 VH в TICA0212/MEDI2452 по сравнению с Fab 72. Более того, Ile93Tyr VL предоставляет донора водородной связи, который взаимодействует с петлей CDR3 VH, определяя таким образом дополнительный сайт связывания.
[00211]
H
L
L
Кристаллическая структура TICA0212/MEDI2452 показывает, что тикагрелор связывается в глубоком зазоре между поверхностями V и V. Стратегия, касающаяся разработки мечения тикагрелора и биотина посредством триамидного линкера с гидроксиэтильной группой, является обоснованной, поскольку кристаллическая структура демонстрирует, что гидроксиэтильная группа не участвует в каких-либо взаимодействиях с TICA0212/MEDI2452. Это дополнительно подтверждается тем фактом, что Fab также связывает TAM c идентичной аффинностью, у которого отсутствует гидроксиэтильная группа. TICA0212/MEDI2452 демонстрирует слабое связывание с TIM, у которого отсутствует циклопропилдифторфенильная группа. В комплексе TICA0212/MEDI2452-тикагрелор циклопропилдифторфенильная группа погружена на дно гидрофобного кармана и должна играть ключевую структурную роль в выравнивании аденозин-подобного кора тикагрелора с остатком Trp L91 CDR3 V. Поскольку химической начальной точкой для тикагрелора являлся ATP и он сохраняет аденозин-подобный кор, то ключевым атрибутом для специфичности антидота является демонстрация отсутствия связывания аденозина. Ведущая стратегия выделения включала как высокопроизводительный, так и детализированный анализ специфичности, и обнаруживали отсутствие связывания аденозина либо посредством анализа конкурентного связывания, либо анализа прямого связывания. По результатам структурного анализа можно ожидать, что пуриновое кольцо и группа аденозина рибозы имитируют взаимодействие аденозин-подобного кора тикагрелора. Однако отсутствие связывания можно объяснить отсутствием двух гидрофобных групп R (циклопропилдифторфенильной и тиопропильной), которые значительно снижают как относительную комплементарность формы, так и гидрофобность связывающего взаимодействия.
[00212]
L
H
L
H
L
Анализ структуры исходных TICA0072 и TICA0212/MEDI2452 демонстрирует значимость ряда изменений, введенных в ходе созревания аффинности. Очевидно, мутации в CDR3 V обладают особенно высоким влиянием, что приводит в результате к различной конформации петель и к образованию дополнительной водородной связи в TICA0212/MEDI2452, что определяет полость связывания. Напротив, вклады мутаций в CDR3 V структурно менее очевидны. Данные наблюдения структуры частично подтверждаются данными для модифицированных антител, содержащими модификации только в CDR3 V (TICA0152) или CDR3 V (TICA0162), что приводило в результате к 200-кратному и 50-кратному улучшению по сравнению с TICA0072, соответственно. Однако, хотя изменения в CDR3 V, по-видимому, характеризуются большим эффектом, обе серии мутаций привносят значительное улучшение. Следует отметить, что кристаллическая структура представляет собой статическое изображение комплекса и не способна фиксировать какие-либо динамические свойства белка и лиганда, вовлеченных в связывание.
Пример 9. Восстановление агрегации тромбоцитов
in vitro
в зависимости от концентрации TICA0212/MEDI2452 в присутствии тикагрелора или TAM
[00213]
Степень и активность TICA0212/MEDI2452 в отношении обратимости опосредованного тикагрелором или TAM ингибирования ADP-индуцированной агрегации тромбоцитов определяли в плазме крови человека, богатой тромбоцитами (PRP), с использованием световой трансмиссионной агрегометрии.
[00214]
Для анализа in vitro с PRP человека кровь отбирали у здоровых добровольцев натощак посредством венепункции латеральной подкожной вены руки. Первые 2 мл крови удаляли перед отбором аликвот в пробирки, содержащие 0,109 M цитрата натрия, 1+9 (цитрат+кровь), с конечной концентрацией 10,9 мМ. Несвернувшуюся кровь человека центрифугировали при 240 x g в течение 15 мин. PRP осторожно отбирали и переносили в чистый флакон. Обедненную тромбоцитами плазму (PPP) получали посредством центрифугирования PRP при 2000 x g в течение 15 мин. PRP оценивали при помощи световой трансмиссионной агрегометрии (LTA) с использованием Platelet Aggregation Profiler (PAP-8E, Bio/Data Corporation, Пенсильвания, США). Агрегацию с нулевым % определяли как световую трансмиссию для PRP, а 100% агрегацию определяли как световую трансмиссию для PPP.
[00215]
PRP предварительно инкубировали с 1 мкM тикагрелора или TAM за 1 час до совместного инкубирования с различными концентрациями TICA0212 или изотипического контрольного Fab в течение 30 минут. Агрегацию тромбоцитов инициировали посредством добавления 20 мкM ADP и ее непрерывно регистрировали в течение 6 мин. Данные степени конечной агрегации (FA) анализировали на 6 мин.
[00216]
фиг. 8
50
50
Подсчитывали концентрации TICA0212/MEDI2452, которые вызывали полумаксимальную обратимость (IC). TICA0212/MEDI2452 вызывали зависимую от концентрации обратимость опосредованного 1 мкM тикагрелора и 1 мкM TAM ингибирования агрегации тромбоцитов, индуцированной 20 мкM ADP, с рассчитанными средними значениями (n=5) IC в 0,64 мкM и 0,78 мкM, соответственно (). При оценке в условиях 1:1 (1 мкM TICA0212/MEDI2452: 1 мкM тикагрелора или TAM) среднее значение степени обратимости составляло 78% и 62%, соответственно. Изотипический контрольный Fab не вызывал значительной обратимости ADP-индуцированной агрегации тромбоцитов в присутствии тикагрелора и TAM. Например, после 30 мин. инкубирования изотипический контрольный Fab приводил в результате к -3% и 2% обратимости для тикагрелора и TAM, соответственно.
[00217]
in vitro
Исходя из этого, данные демонстрируют, что TICA0212/MEDI2452 может вызывать обратимость как опосредованного тикагрелором, так и опосредованного TAM ингибирования ADP-индуцированной агрегации тромбоцитов зависимым от концентрации способом. Максимального эффекта и эффекта с практически полной обратимость достигали при оценке с параметрами эксперимента 1:1, что, как предсказано, наблюдается, когда TICA0212/MEDI2452 связывается с тикагрелором или TAM при стехиометрии 1:1.
Пример 10. TICA0212/MEDI2452 эффективно и быстро восстанавливает агрегацию тромбоцитов
in vitro
в присутствии тикагрелора или TAM
[00218]
При использовании TICA0212/MEDI2452 время до начала обращения эффекта, вызванного тикагрелором или TAM, определяли в плазме крови человека, богатой тромбоцитами (PRP), с использованием световой трансмиссионной агрегометрии, как и в примере 8. PRP предварительно инкубировали с 1 мкM тикагрелора или TAM в течение 1 часа перед добавлением 1 мкM TICA0212/MEDI2452 и совместного инкубирования в течение 5, 10, 15, 30 и 60 мин., или добавлением изотипического контрольного Fab в течение 30 мин. Агрегацию тромбоцитов инициировали посредством добавления 20 мкM ADP и ее непрерывно регистрировали в течение 6 мин. Данные степени конечной агрегации (FA) анализировали на 6 мин.
[00219]
TICA0212/MEDI2452 вызывали аналогичную степень обратимости опосредованного тикагрелором ингибирования независимо от времени совместной инкубации, причем среднее значение (n=3) степени обращения составляло 85%, 69%, 74%, 80% и 81% после 5, 10, 15, 30 и 60 минут, соответственно. Аналогичным образом, среднее значение (n=3) степени обратимости эффекта TAM, индуцированной TICA0212/MEDI2452, составляло 53%, 56%, 58%, 69%, 74% через 5, 10, 15, 30 и 60 минут, соответственно. TICA0212/MEDI2452 вызывали быструю и эффективную обратимость опосредованного тикагрелором ингибирования ADP-индуцированной агрегации тромбоцитов. Обратимость эффекта, среднее значение (n=3) -2%, отсутствовала после 30 мин. совместного инкубирования с изотипическиим контрольным Fab.
На основе этих данных было показано, что TICA0212/MEDI2452 вызывают быструю и эффективую обратимость ингибирования, опосредованного как тикагрелором, так и TAM, ADP-индуцированной агрегации при оценке с параметрами эксперимента 1:1.
Пример 11. TICA0212/MEDI2452 эффективно и быстро восстанавливает агрегацию тромбоцитов
in vivo
после введения мышам, обработанным тикагрелором
[00220]
ex vivo
Скорость наступления и степень TICA0212/MEDI2452-опосредованной обратимости ингибирования, опосредованного тикагрелором, ADP-индуцированной агрегации тромбоцитов в цельной крови (импедансная агрегометрия) определяли после внутривенного (i.v.) введения тикагрелора мышам. Мышам вводили тикагрелор i.v. в виде болюса 1200 мкг/кг, на протяжении 5 минут, после чего его вводили посредством непрерывной инфузии в течение 15 мин. в дозе 30 мкг/кг/мин. После завершения инфузии тикагрелора, когда измеренное содержание тикагрелора в плазме крови составляло в среднем 1,4 мкM, мышам вводили i.v. болюс TICA0212/MEDI2452 в дозе 250 мг/кг. Через 5, 30 и 60 мин. после введения TICA0212/MEDI2452 мышей умерщвляли и отбирали образцы крови. В данном исследовании реакцию в виде ADP-индуцированной агрегации измеряли в течение 6 мин. и данные выражали в виде среднего значения площади под фармакокинетической кривой для единиц агрегации (AU), регистрируемого в динамике (AU*мин).
[00221]
2
При проведении анализа импедансной агрегометрии мышей умерщвляли и отбирали образцы крови в 7 мкM гирудина. Кровь (175 мкл) добавляли к предварительно нагретому NaCl (37°C, 175 мкл) в Multiplate Mini Test Cells и перемешивали в течение 3 мин. перед добавлением 12 мкл ADP до конечной концентрации 6,5 мкM. Одноразовые Multiplate Mini Test Cells содержат магнитный якорь и имеют пару отдельных электродов, которые погружают в образец крови.
[00222]
При добавлении агониста (ADP) и при индуцировании сдвига посредством перемешивания тромбоциты начинали прилипать и агрегировать на электродах. Это приводило к увеличению импенданса над электродами, что регистрировали непрерывно в динамике с помощью импендансного агрегометра Multiplate (DynaByte, Мюнхен, Германия).
[00223]
фиг. 9
фиг. 9
in vivo
Обработка тикагрелором вызывала практически полное ингибирование ADP-индуцируемой агрегации, поскольку среднее значение (n=4) ответа на агрегацию снижалось от 432 до 2 AU*мин, от 474 до 6 AU*мин и от 494 до 14 AU*мин через 5, 30 и 60 мин. после инфузии тикагрелора и болюса с PBS, соответственно (). TICA0212/MEDI2452 опосредовали обратимость ингибирования агрегации, опосредованного тикагрелором, поскольку среднее значение (n=4) ответа на агрегацию повышалось от 2 до 147 AU*мин., от 6 до 448 AU*мин. и от 14 до 413 AU*мин. через 5, 30 и 60 минут после инфузии тикагрелора и болюса c TICA0212, соответственно (). Эффект обратимости отсутствовал через 30 минут после введения изотипического контроля, поскольку среднее значение (n=4) ответа на агрегацию оставалось неизменным от 6 до 4 AU*мин.
[00224]
Эти данные демонстрируют, что TICA0212/MEDI2452 могут быстро и эффективно восстанавливать ADP-индуцированную агрегацию тромбоцитов, когда их вводят в виде i.v. болюса мышам, которым вводили тикагрелор, с концентрацией тикагрелора в плазме крови, составляющей 1,4 мкM, при этом такая концентрация обеспечила полное ингибирование ADP-индуцированой агрегации.
Пример 12. Кровотечение у мышей, обработанных тикагрелором
[00225]
Поскольку одно из заявляемых показаний для использования TICA0212/MEDI2452 представляет собой использованием в качестве антидота у получающих тикагрелор пациентов, требующих неотложного хирургического вмешательства, то TICA0212/MEDI2452 оценивали в эксперименте c кровотечением у мышей, разработанным для имитации клинических условий, в которых перед началом хирургического вмешательства необходимо достичь полной обратимости эффекта.
[00226]
Мышей предварительно обрабатывали посредством непрерывной инфузии тикагрелора, 300 мкг/кг/мин., или среды-носителя в течение 20 минут. После остановки инфузии, t=0, вводили болюсную дозу TICA0212/MEDI2452 (600 мг/кг) или среду-носитель (буфер, содержащий сахарозу и гистидин) на протяжении 45 секунд, и в t=30 минут индуцировали кровотечение путем отрезания 5 мм кончика хвоста. Кончик хвоста промывали водой (2 мл/мин.) и смесь крови и воды собирали в маленькую камеру, в которой мешалка перемешивала жидкость для усиления гемолиза и получения однородного раствора. Световую трансмиссию, при 525 нм, регистрировали в течение 30 минут, когда итоговые образцы крови отбирали из брюшной аорты для агрегации тромбоцитов. Светопропускание трансформировали в поглощение и использовали для подсчета потери крови в виде площади под кривой поглощения (AUC, поглощение*с.) и общего времени кровотечения (BT, с.) путем нанесения на график показателя поглощения в зависимости от времени. Все пропускание ниже 95% определяли как кровотечение. Образцы для агрегации тромбоцитов и определения концентрации общего и свободного соединения в плазме крови также отбирали в конце инфузии тикагрелора (t=0) и в момент отрезания хвоста (t=30 минут).
[00227]
Исследования были одобрены комиссией по этике исследований на животных при университете Гетеборга, Швеция. Мышей анестезировали газом изофлураном (Forene, Abbot Scandinavia AB, Швеция). Вводили катетер в левую яремную вену для введения среды-носителя или лекарственного средства. Температуру тела поддерживали при 38°C с помощью внешнего источника тепла.
[00228]
ex vivo
in vivo
Для перевода эффекта TICA0212/MEDI2452 в отношении агрегации тромбоцитов в потенциальный эффект в отношении кровотечения осуществляли исследование профилактики кровотечения из хвоста мыши. Тикагрелор вливали до среднего значения концентрации общего тикагрелора и TAM в плазме крови, составляющей 7,6 мкM и 0,3 мкM, соответственно, для обеспечения диапазона значимого кровотечения, зависимого от лекарственного средства. Сразу после прекращения инфузии тикагрелора вводили дозу TICA0212/MEDI2452 в виде однократного болюса при 600 мг/кг за 30 секунд. Через 30 минут ADP-индуцированная агрегация полностью нормализовывалась и среднее значение свободного тикагрелора в плазме крови снизилось от 4,7 нМ до ниже 0,03 нМ (ниже предела количественного определения). Кровотечение инициировали посредством отрезания хвоста и наблюдение проводили в течение 30 минут. У мышей, обработанных средой-носителем, среднее значение концентрации общего тикагрелора и TAM в плазме крови в момент времени отрезания хвоста составляло 2,4 мкM и 0,6 мкM. Общая потеря крови и общее время кровотечения на протяжении 30 минут были значительно (p<0,05) увеличены за счет тикагрелора в приблизительно 3,8 раза и 1,6 раза, соответственно. С помощью TICA0212/MEDI2452 в значительной степени (p<0,05) устранялась потеря крови и сокращалось время кровотечения относительно только тикагрелора, при этом данные показатели восстанавливались до уровня, которые незначительно отличались от уровня у мышей, которых не обрабатывали тикагрелором (фиг. 12). При такой профилактике введение TICA0212/MEDI2452 нормализовывало кровотечение, обусловленное тикагрелором. Время наступления эффекта 30 минут переводили из модели в данную модель с демонстрацией того, что TICA0212/MEDI2452 могут нормализовывать как потерю крови, так и время кровотечения в сравнении с такими показателями у мышей, не обработанных тикагрелором.
Пример 13. Общая концентрация в плазме крови тикагрелора и TAM
[00229]
Образцы крови отбирали в пробирки с антикоагулянтом EDTA и центрифугировали в течение 5 мин. при 10000 x g при комнатной температуре для получения плазмы крови. Концентрацию в плазме крови тикагрелора и TAM определяли путем преципитации белков и жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS), как описано в опубликованном способе [Sillén H., et al., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2010;878:2299-306], со следующими отличиями. Преципитацию белков плазмы крови осуществляли в образце объемом 50 мкл со 180 мкл внутреннего стандарта (D7-ZD6140) в ацетонитриле. Система для жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии представляла собой устройство Acquity Ultra Performance LC, соединенное с масс-спектрометром Xevo TQ-S от Waters. Хроматографического разделения достигали на колонке Aquity UPLC BEH C18 (2,1×50 мм, размер частиц 1,7 мкм). Использовали отрицательную ионизацию электрораспылением. Элюент А представлял собой воду с 10 ммоль/л ацетата аммония, pH 5, а элюент B представлял собой ацетонитрил с 10 ммоль/л ацетата аммония. Объем загружаемой пробы составлял от 1 мкл до 5 мкл, и аналитический градиент начинался от 4% для B с повышением до 95% за 1,5 мин., оставаясь неизменным до 2,3 мин. перед тем, как возвратиться до исходных условий в течении 2,4 мин., после чего следовало повторное уравновешивание в течение 0,3 мин. Образцов для контроля качества в данном анализе не использовали. Нижний предел количественного определения (LLOQ) составлял 0,005 мкмоль/л, а диапазон калибровки составлял от 0,005 мкM до 15,0 мкM.
[00230]
Значения общей концентрации в плазме крови тикагрелора и TAM в присутствии TICA0212/MEDI2452 определяли путем добавления 1% муравьиной кислоты (FA: образец, 1:5) с последующей преципитацией белков и LC-MS/MS, как описано выше. Муравьиную кислоту добавляли к образцу для облегчения диссоциации тикагрелора и TICA0212/MEDI2452.
Пример 14. Концентрация свободного тикагрелора в плазме крови
[00231]
2
Способ оптимизировали на основе ранее опубликованного способа [Sillén H., et al., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2011 Aug 1;879(23):2315-22]. Диализные мембраны (Spectrum Laboratories, Inc), которые позволяют молекулам с массой ниже от 6 кДа до 8 кДа проходить сквозь них, пропитывали в воде с ELGA в течение от 10 до 15 мин. и размещали их между половинами планшета для диализа (сделаны в самой лаборатории). Плазму крови, 130 мкл, вносили на одну сторону планшета для диализа, а 130 мкл фосфатного буфера, pH 7,0, вносили на противоположную сторону. Лунки на обеих сторонах герметично закрывали крышками и на каждой стороне планшета размещали алюминиевые пластины для предупреждения утечки. Планшет затем помещали в вертикальном положении в орбитальный шейкер при 100 об./мин. при 37°C на 24 ч. Диализ завершали посредством переноса 50 мкл ретентата со стороны с плазмой крови и 75 мкл диализата со стороны с буфером на чистый 96-луночный планшет с глубокими лунками для ПЦР Protein LoBind, содержащий 150 мкл и, соответственно, 75 мкл внутреннего стандарта (D7-ZD6140) в ацетонитриле. Образцы в планшете перемешивали в течение 1 мин., а затем центрифугировали в течение 20 мин., 1500 x g, при 4°C. После центрифугирования 50 мкл надосадочной жидкости из осажденного ретантата переносили и разбавляли с использованием 50 мкл HO ELGA перед LC-MS/MS анализом (устройство Acquity Ultra Performance LC, соединенное с масс-спектрометром Xevo TQ-S, Waters). Образцов для контроля качества в данном анализе не использовали. Диапазон калибровки для ретантата составлял от 0,4 до 1000 нмоль/л, а для диализата от 0,003 до 50 нмоль/л. LLOQ для тикагрелора в диализате составлял 0,03 нмоль/л.
[00232]
В таблице 9 ниже представлен обзор иллюстративных антител, описанных в указанных выше примерах и используемых для иллюстрации определенных вариантов осуществления данной технологии, раскрытой в данном документе.
Таблица 9. Краткое описание последовательностей антитело/scFv/Fab
<b>Последовательность реферетного антитела</b>
<b>Последовательность</b>
<b>TICA0010 Vh ДНК</b><b>(SEQ ID NO:1)</b>
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aacagagtac gacctgcaac ggcctttcgg gtttgacttc tggggcaagg ggacaatggt caccgtctcg agt
<b>TICA0010 Vh</b><b>(SEQ ID NO:2)</b>
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS<u>SYAMS</u>WVRQAPGKGLEWVS<u>AISGSGGSTYYADSVKG</u>RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAT<u>EYDLQRPFGFDF</u>WGKGTMVTVSS
<b>TICA0010 Vh CDR1</b><b>(SEQ ID NO:3)</b>
SYAMS
<b>TICA0010 Vh CDR2</b><b>(SEQ ID NO:4)</b>
AISGSGGSTYYADSVKG
<b>TICA0010 Vh CDR3</b><b>(SEQ ID NO:5)</b>
EYDLQRPFGFDF
<b>TICA0010 Vl ДНК</b><b>(SEQ ID NO:6)</b>
tcctatgtgc tgactcagcc accctcagcg tctggggccc ccgggcagag ggctaccatc tcctgctctg gaagcagctc caacatcgga agtaatcttg tgaactggta ccaacaattc ccaggagagg cccccaagct cctcatcttt agtgacaatc aacgaccctc aggggtccct gaccgattct ctggctccag gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca acgtgggatg acagactgga tggttatgtg gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta
<b>TICA0010 Vl</b><b>(SEQ ID NO:7)</b>
SYVLTQPPSASGAPGQRATISC<u>SGSSSNIGSNLVN</u>WYQQFPGEAPKLLIF<u>SDNQRPS</u>GVPDRFSGSRSGTSASLAISGLQSEDEADYYC<u>ATWDDRLDGYVV</u>FGGGTKLTVL
<b>TICA0010 Vl CDR1</b><b>(SEQ ID NO:8)</b>
SGSSSNIGSNLVN
<b>TICA0010 Vl CDR2</b><b>(SEQ ID NO:9)</b>
SDNQRPS
<b>TICA0010 Vl CDR3</b><b>(SEQ ID NO:10)</b>
ATWDDRLDGYVV
<b>TICA0049 Vh ДНК</b><b>(SEQ ID NO:11)</b>
caggtacagc tgcagcagtc aggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt tcctgcaagg cttctggata caccttcatt acctatggta ttcactgggt gcgccaggcc cccggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcgaccccg ggcatggtta cacaaaatat tcacagaagt tccagggcag agtcaccatt accagggaca catccgcgag cacagcctac atggagatga gcagcctcag atctgaagac acggctgtgt attactgtgc gagagcggac ctgggtgact actggggccg gggaaccctg gtcaccgtct cgagt
<b>TICA0049 Vh</b><b>(SEQ ID NO:12)</b>
QVQLQQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFI<u>TYGIH</u>WVRQAPGQGLEWMG<u>WIDPGHGYTKYSQKFQG</u>RVTITRDTSASTAYMEMSSLRSEDTAVYYCAR<u>ADLGDY</u>WGRGTLVTVSS
<b>TICA0049 Vh CDR1</b><b>(SEQ ID NO:13)</b>
TYGIH
<b>TICA0049 Vh CDR2</b><b>(SEQ ID NO:14)</b>
WIDPGHGYTKYSQKFQG
<b>TICA0049 Vh CDR3</b><b>(SEQ ID NO:15)</b>
ADLGDY
<b>TICA0049 Vl ДНК</b><b>(SEQ ID NO:16)</b>
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aagaattatg tttcctggtt ccagcagctc ccaggtacag cccccaaact cctcatttat gacaatcata agcgaccctc agggattcct gaccgattct ctgcctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggtcatctc cggtctccag actggggacg aggcccatta ttactgcgga acatgggata ccagactgag tgctggggtg ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta
<b>TICA0049 Vl</b><b>(SEQ ID NO:17)</b>
QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISC<u>SGSSSNIGKNYVS</u>WFQQLPGTAPKLLIY<u>DNHKRPS</u>GIPDRFSASKSGTSATLVISGLQTGDEAHYYC<u>GTWDTRLSAGV</u>FGGGTKVTVL
<b>TICA0049 Vl CDR1</b><b>(SEQ ID NO:18)</b>
SGSSSNIGKNYVS
<b>TICA0049 Vl CDR2</b><b>(SEQ ID NO:19)</b>
DNHKRPS
<b>TICA0049 Vl CDR3</b><b>(SEQ ID NO:20)</b>
GTWDTRLSAGV
<b>TICA0053 Vh ДНК</b><b>(SEQ ID NO:21)</b>
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgg ccatgatagt agtggttact cctactcctt tgacttctgg gggcggggga ccacggtcac cgtctcgagt
<b>TICA0053 Vh</b><b>(SEQ ID NO:22)</b>
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS<u>SYAMS</u>WVRQAPGKGLEWVS<u>AISGSGGSTYYADSVKG</u>RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGH<u>DSSGYSYSFDF</u>WGRGTTVTVSS
<b>TICA0053 Vh CDR1</b><b>(SEQ ID NO:23)</b>
SYAMS
<b>TICA0053 Vh CDR2</b><b>(SEQ ID NO:24)</b>
AISGSGGSTYYADSVKG
<b>TICA0053 Vh CDR3</b><b>(SEQ ID NO:25)</b>
DSSGYSYSFDF
<b>TICA0053 Vl ДНК</b><b>(SEQ ID NO:26)</b>
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc tcttgttctg gcaacatctc caacatcgga agtaacactg tcaactggta tcaacacgtc ccaggagcgg cccccagact cctcatctat gttaatgatc agcggccgtc aggggtccct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag tctgaagatg aggctgatta ttactgtgca acgtgggatg acaccctgaa tggaggggtc ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta
<b>TICA0053 Vl</b><b>(SEQ ID NO:27)</b>
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC<u>SGNISNIGSNTVN</u>WYQHVPGAAPRLLIY<u>VNDQRPS</u>GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYC<u>ATWDDTLNGGV</u>FGGGTKLTVL
<b>TICA0053 Vl CDR1</b><b>(SEQ ID NO:28)</b>
SGNISNIGSNTVN
<b>TICA0053 Vl CDR2</b><b>(SEQ ID NO:29)</b>
VNDQRPS
<b>TICA0053 Vl CDR3</b><b>(SEQ ID NO:30)</b>
ATWDDTLNGGV
<b>TICA0072 Vh ДНК</b><b>(SEQ ID NO:31)</b>
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagggtcc catctttacg atttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt
<b>TICA0072 Vh</b><b>(SEQ ID NO:32)</b>
QVQLQESGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFD<u>SYSIH</u>WVRQAPGQGLEWMG<u>GIIPAFGTLSSAQDFQA</u>RVTISADKSTSTAYMELSGLRSEDTAVYYCAR<u>GSHLYDFWSASHPPNDALAI</u>WGQGTLVTVSS
<b>TICA0072 Vh CDR1</b><b>(SEQ ID NO:33)</b>
SYSIH
<b>TICA0072 Vh CDR2</b><b>(SEQ ID NO:34)</b>
GIIPAFGTLSSAQDFQA
<b>TICA0072 Vh CDR3</b><b>(SEQ ID NO:35)</b>
GSHLYDFWSASHPPNDALAI
<b>TICA0072 Vl ДНК</b><b>(SEQ ID NO:36)</b>
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatgggata tcagcctgag cgctggcttg ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta
<b>TICA0072 Vl</b><b>(SEQ ID NO:37)</b>
QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISC<u>SGSNSDIGNNYVS</u>WYQQLPGTAPKLLIY<u>DNNKRPS</u>GIPDRFSGSKSGTSATLAITGLQAGDEADYYC<u>GTWDISLSAGL</u>FGGGTKVTVL
<b>TICA0072 Vl CDR1</b><b>(SEQ ID NO:38)</b>
SGSNSDIGNNYVS
<b>TICA0072 Vl CDR2</b><b>(SEQ ID NO:39)</b>
DNNKRPS
<b>TICA0072 Vl CDR3</b><b>(SEQ ID NO:40)</b>
GTWDISLSAGL
<b>TICA0159 Vh ДНК</b><b>(SEQ ID NO:41)</b>
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagggagc ttcgactaca ggttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt
<b>TICA0159 Vh</b><b>(SEQ ID NO:42)</b>
QVQLQESGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFD<u>SYSIH</u>WVRQAPGQGLEWMG<u>GIIPAFGTLSSAQDFQA</u>RVTISADKSTSTAYMELSGLRSEDTAVYYCAR<u>GSFDYRFWSASHPPNDALAI</u>WGQGTLVTVSS
<b>TICA0159 Vh CDR1</b><b>(SEQ ID NO:43)</b>
SYSIH
<b>TICA0159 Vh CDR2</b><b>(SEQ ID NO:44)</b>
GIIPAFGTLSSAQDFQA
<b>TICA0159 Vh CDR3</b><b>(SEQ ID NO:45)</b>
GSFDYRFWSASHPPNDALAI
<b>TICA0159 Vl ДНК</b><b>(SEQ ID NO:46)</b>
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatgggata tcagcctgag cgctggcttg ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta
<b>TICA0159 Vl</b><b>(SEQ ID NO:47)</b>
QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISC<u>SGSNSDIGNNYVS</u>WYQQLPGTAPKLLIY<u>DNNKRPS</u>GIPDRFSGSKSGTSATLAITGLQAGDEADYYC<u>GTWDISLSAGL</u>FGGGTKVTVL
<b>TICA0159 Vl CDR1</b><b>(SEQ ID NO:48)</b>
SGSNSDIGNNYVS
<b>TICA0159 Vl CDR2</b><b>(SEQ ID NO:49)</b>
DNNKRPS
<b>TICA0159 Vl CDR3</b><b>(SEQ ID NO:50)</b>
GTWDISLSAGL
<b>TICA0162 Vh ДНК</b><b>(SEQ ID NO:51)</b>
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagaggctcc ttcgactact acttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt
<b>TICA0162 Vh</b><b>(SEQ ID NO:52)</b>
QVQLQESGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFD<u>SYSIH</u>WVRQAPGQGLEWMG<u>GIIPAFGTLSSAQDFQA</u>RVTISADKSTSTAYMELSGLRSEDTAVYYCAR<u>GSFDYYFWSASHPPNDALAI</u>WGQGTLVTVSS
<b>TICA0162 Vh CDR1</b><b>(SEQ ID NO:53)</b>
SYSIH
<b>TICA0162 Vh CDR2</b><b>(SEQ ID NO:54)</b>
GIIPAFGTLSSAQDFQA
<b>TICA0162 Vh CDR3</b><b>(SEQ ID NO:55)</b>
GSFDYYFWSASHPPNDALAI
<b>TICA0162 Vl ДНК</b><b>(SEQ ID NO:56)</b>
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatgggata tcagcctgag cgctggcttg ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta
<b>TICA0162 Vl</b><b>(SEQ ID NO:57)</b>
QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISC<u>SGSNSDIGNNYVS</u>WYQQLPGTAPKLLIY<u>DNNKRPS</u>GIPDRFSGSKSGTSATLAITGLQAGDEADYYC<u>GTWDISLSAGL</u>FGGGTKVTVL
<b>TICA0162 Vl CDR1</b><b>(SEQ ID NO:58)</b>
SGSNSDIGNNYVS
<b>TICA0162 Vl CDR2</b><b>(SEQ ID NO:59)</b>
DNNKRPS
<b>TICA0162 Vl CDR3</b><b>(SEQ ID NO:60)</b>
GTWDISLSAGL
<b>TICA0152 Vh ДНК</b><b>(SEQ ID NO:61)</b>
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagggtcc catctttacg atttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt
<b>TICA0152 Vh</b><b>(SEQ ID NO:62)</b>
QVQLQESGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFD<u>SYSIH</u>WVRQAPGQGLEWMG<u>GIIPAFGTLSSAQDFQA</u>RVTISADKSTSTAYMELSGLRSEDTAVYYCAR<u>GSHLYDFWSASHPPNDALAI</u>WGQGTLVTVSS
<b>TICA0152 Vh CDR1</b><b>(SEQ ID NO:63)</b>
SYSIH
<b>TICA0152 Vh CDR2</b><b>(SEQ ID NO:64)</b>
GIIPAFGTLSSAQDFQA
<b>TICA0152 Vh CDR3</b><b>(SEQ ID NO:65)</b>
GSHLYDFWSASHPPNDALAI
<b>TICA0152 Vl ДНК</b><b>(SEQ ID NO:66)</b>
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatggctgt acgaccgggc cgtcggcttg ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta
<b>TICA0152 Vl</b><b>(SEQ ID NO:67)</b>
QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISC<u>SGSNSDIGNNYVS</u>WYQQLPGTAPKLLIY<u>DNNKRPS</u>GIPDRFSGSKSGTSATLAITGLQAGDEADYYC<u>GTWLYDRAVGL</u>FGGGTKVTVL
<b>TICA0152 Vl CDR1</b><b>(SEQ ID NO:68)</b>
SGSNSDIGNNYVS
<b>TICA0152 Vl CDR2</b><b>(SEQ ID NO:69)</b>
DNNKRPS
<b>TICA0152 Vl CDR3</b><b>(SEQ ID NO:70)</b>
GTWLYDRAVGL
<b>TICA0212/MEDI2452 Vh ДНК</b><b>(SEQ ID NO:71)</b>
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagaggctcc ttcgactact acttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt
<b>TICA0212/MEDI2452 Vh</b><b>(SEQ ID NO:72)</b>
QVQLQESGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFD<u>SYSIH</u>WVRQAPGQGLEWMG<u>GIIPAFGTLSSAQDFQA</u>RVTISADKSTSTAYMELSGLRSEDTAVYYCAR<u>GSFDYYFWSASHPPNDALAI</u>WGQGTLVTVSS
<b>TICA0212/MEDI2452 Vh CDR1</b><b>(SEQ ID NO:73)</b>
SYSIH
<b>TICA0212/MEDI2452 Vh CDR2</b><b>(SEQ ID NO:74)</b>
GIIPAFGTLSSAQDFQA
<b>TICA0212/MEDI2452 Vh CDR3</b><b>(SEQ ID NO:75)</b>
GSFDYYFWSASHPPNDALAI
<b>TICA0212/MEDI2452 Vl ДНК</b><b>(SEQ ID NO:76)</b>
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatggctgt acgaccgggc cgtcggcttg ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta
<b>TICA0212/MEDI2452 Vl</b><b>(SEQ ID NO:77)</b>
QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISC<u>SGSNSDIGNNYVS</u>WYQQLPGTAPKLLIY<u>DNNKRPS</u>GIPDRFSGSKSGTSATLAITGLQAGDEADYYC<u>GTWLYDRAVGL</u>FGGGTKVTVL
<b>TICA0212/MEDI2452 Vl CDR1</b><b>(SEQ ID NO:78)</b>
SGSNSDIGNNYVS
<b>TICA0212/MEDI2452 Vl CDR2</b><b>(SEQ ID NO:79)</b>
DNNKRPS
<b>TICA0212/MEDI2452 Vl CDR3</b><b>(SEQ ID NO:80)</b>
GTWLYDRAVGL
Ссылочный материал
J Thromb Haemost.
1. Van Giezen JJ, Nilsson L, Berntsson P, et al. Ticagrelor binds to human P2Y(12) independently from ADP but antagonizes ADP-induced receptor signalling and platelet aggregation. 2009;7(9):1556-1565
N Engl J Med.
2. Wallentin L, Becker RC, Budaj A, et al. Ticagrelor versus clopidogrel in patients with acute coronary syndromes. 2009;361:1045-1057.
Circulation.
3. Amsterdam EA, Wenger NK, Brindis RG, et al. 2014 ACC/AHA guideline for the management of patients with non-ST-elevation acute coronary syndromes: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines. 2014;000:000-000
J Am Coll Cardiol.
4. Storey RF, Angiolillo DJ, Patil SB, et al. Inhibitory effects of ticagrelor compared with clopidogrel on platelet function in patients with acute coronary syndromes: the PLATO (PLATelet inhibition and patient Outcomes) PLATELET substudy. 2010;56(18):1456-1462.
J Trauma Acute Care Surg.
5. Taylor G, Osinski D, Thevenin A, et al. Is platelet transfusion efficient to restore platelet reactivity in patients who are responders to aspirin and/or clopidogrel before emergency surgery? 2013;74:1367-1369.
J Thromb Haemost.
6. Prüller F, Drexler C, Archan S, Macher S, Raggam RB, Mahla E. Low platelet reactivity is recovered by transfusion of stored platelets: a healthy volunteer in vivo study. 2011;9(8):1670-1673.
Br J Anaesth
7. Hansson EC, Shams Hakimi C, Åström-Olsson K, et al. Effects of ex vivo platelet supplementation on platelet aggregability in blood samples from patients treated with acetylsalicylic acid, clopidogrel, or ticagrelor. . 2014;112(3):570-575.
J Thromb Haemost.
8. Thiele T, Sümnig A, Hron G. Platelet transfusion for reversal of dual antiplatelet therapy in patients requiring urgent surgery: a pilot study. 2012;10:968-971.

J Am Coll Cardiol.
9. Pehrsson S, Hansson K, Nylander S. Ticagrelor-induced bleeding in mice can be reversed by FVIIa (NovoSeven) and FII. 2013;61(10S):E212.
Nat Med.
10. Dolgin E. Antidotes edge closer to reversing effects of new blood thinners. 2013;19(3):251.
Ann Intern Med.
11. Crowther MA, Ageno W, Garcia D, et al. Oral vitamin K versus placebo to correct excessive anticoagulation in patients receiving warfarin: a randomized trial. 2009;150:293-300.
Blood.
12. Schiele F, van Ryn J, Canada K, et al.A specific antidote for dabigatran: functional and structural characterization. 2013;121:3554-3562.
Nat Med.
13. Lu G, DeGuzman FR, Hollenbach SJ, et al. A specific antidote for reversal of anticoagulation by direct and indirect inhibitors of coagulation factor Xa. 2013;19:446-451.
J Am Coll Cardiol.
14. Storey RF, Husted S, Harrington RA, et al. Inhibition of platelet aggregation by AZD6140, a reversible oral P2Y12 receptor antagonist, compared with clopidogrel in patients with acute coronary syndromes. 2007;50:1852-1856.
Clin Pharmacokinet.
15. Husted SE, Storey RF, Bliden K, et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of ticagrelor in patients with stable coronary artery disease: results from the ONSET-OFFSET and RESPOND studies. 2012;51(6):397-409.
Drug Metab Dispos.
16. Teng R, Oliver S, Hayes MA, Butler K. Absorption, distribution, metabolism, and excretion of ticagrelor in healthy subjects. 2010;38(9):1514-1521.
Biotechnol Prog.
17. Daramola O, Stevenson J, Dean G, et al. A high-yielding CHO transient system: coexpression of genes encoding EBNA-1 and GS enhances transient protein expression. 2014;30(1):132-141.
Mol Inform.
18. Oprea TI, Nielsen SK, Ursu O, et al. Associating Drugs, Targets and Clinical Outcomes into an Integrated Network Affords a New Platform for Computer-Aided Drug Repurposing. 2011;30:100-111.
Bioorg Med Chem Lett.
19. Springthorpe B, Bailey A, Barton P, et al. From ATP to AZD6140: the discovery of an orally active reversible P2Y12 receptor antagonist for the prevention of thrombosis. 2007;17:6013-6018.
Protein Sci.
20. Fanning SW1, Horn JR. An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop. 2011;20:1196-1207.
Nature.
21. Zhang K, Zhang J, Gao ZG, et al. Structure of the human P2Y12 receptor in complex with an antithrombotic drug. 2014;509:115-118.
J Am Coll Cardiol.
22. Cattaneo M, Schulz R, Nylander S. Adenosine-mediated effects of ticagrelor: evidence and potential clinical relevance. 2014;63:2503-2509.
J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.
23. Sillén H, Cook M, Davis P. Determination of unbound ticagrelor and its active metabolite (AR-C124910XX) in human plasma by equilibrium dialysis and LC-MS/MS. 2011;879(23):2315-2322.
[00233]
Все публикации и патенты, упомянутые в данном документе, настоящим включены в данное описание посредством ссылки в их полном объеме, как если бы каждая отдельная публикация или патент были конкретно и индивидуально указаны как включенные посредством ссылки.
[00234]
Хотя обсуждались конкретные аспекты объекта настоящего раскрытия, вышеуказанное описание носит иллюстративный, а не ограничительный характер. Многие варианты настоящего раскрытия будут очевидны специалистам в данной области техники после рассмотрения настоящего описания и приведенной ниже формулы изобретения. Полный объем настоящего раскрытия должен определяться со ссылкой на пункты формулы изобретения вместе с полным объемом их эквивалентов, и описанием вместе с такими вариантами.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>
<120>  Антитела к тикагрелору и способы их применения
<130>  TICA-100WO1
<160>  80
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  363
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  1
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc       60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct      120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac      180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat      240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aacagagtac      300
gacctgcaac ggcctttcgg gtttgacttc tggggcaagg ggacaatggt caccgtctcg      360
agt                                                                    363
<210>  2
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Glu Tyr Asp Leu Gln Arg Pro Phe Gly Phe Asp Phe Trp Gly
100                 105                 110
Lys Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  3
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Ser Tyr Ala Met Ser
1               5
<210>  4
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  4
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  5
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  5
Glu Tyr Asp Leu Gln Arg Pro Phe Gly Phe Asp Phe
1               5                   10
<210>  6
<211>  333
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  6
tcctatgtgc tgactcagcc accctcagcg tctggggccc ccgggcagag ggctaccatc       60
tcctgctctg gaagcagctc caacatcgga agtaatcttg tgaactggta ccaacaattc      120
ccaggagagg cccccaagct cctcatcttt agtgacaatc aacgaccctc aggggtccct      180
gaccgattct ctggctccag gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag      240
tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca acgtgggatg acagactgga tggttatgtg      300
gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta                                   333
<210>  7
<211>  111
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  7
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20                  25                  30
Leu Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Phe Ser Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Arg Leu
85                  90                  95
Asp Gly Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  8
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  8
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Leu Val Asn
1               5                   10
<210>  9
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  9
Ser Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1               5
<210>  10
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  10
Ala Thr Trp Asp Asp Arg Leu Asp Gly Tyr Val Val
1               5                   10
<210>  11
<211>  345
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  11
caggtacagc tgcagcagtc aggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt       60
tcctgcaagg cttctggata caccttcatt acctatggta ttcactgggt gcgccaggcc      120
cccggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcgaccccg ggcatggtta cacaaaatat      180
tcacagaagt tccagggcag agtcaccatt accagggaca catccgcgag cacagcctac      240
atggagatga gcagcctcag atctgaagac acggctgtgt attactgtgc gagagcggac      300
ctgggtgact actggggccg gggaaccctg gtcaccgtct cgagt                      345
<210>  12
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  12
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Thr Tyr
20                  25                  30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asp Pro Gly His Gly Tyr Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ala Asp Leu Gly Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  13
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  13
Thr Tyr Gly Ile His
1               5
<210>  14
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  14
Trp Ile Asp Pro Gly His Gly Tyr Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  15
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  15
Ala Asp Leu Gly Asp Tyr
1               5
<210>  16
<211>  330
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  16
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc       60
tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aagaattatg tttcctggtt ccagcagctc      120
ccaggtacag cccccaaact cctcatttat gacaatcata agcgaccctc agggattcct      180
gaccgattct ctgcctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggtcatctc cggtctccag      240
actggggacg aggcccatta ttactgcgga acatgggata ccagactgag tgctggggtg      300
ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta                                       330
<210>  17
<211>  110
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  17
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Lys Asn
20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Phe Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn His Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Val Ile Ser Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Thr Gly Asp Glu Ala His Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Thr Arg Leu
85                  90                  95
Ser Ala Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  18
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  18
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Lys Asn Tyr Val Ser
1               5                   10
<210>  19
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  19
Asp Asn His Lys Arg Pro Ser
1               5
<210>  20
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  20
Gly Thr Trp Asp Thr Arg Leu Ser Ala Gly Val
1               5                   10
<210>  21
<211>  360
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  21
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc       60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct      120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac      180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat      240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgg ccatgatagt      300
agtggttact cctactcctt tgacttctgg gggcggggga ccacggtcac cgtctcgagt      360
<210>  22
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Gly His Asp Ser Ser Gly Tyr Ser Tyr Ser Phe Asp Phe Trp Gly Arg
100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  23
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  23
Ser Tyr Ala Met Ser
1               5
<210>  24
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  24
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  25
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  25
Asp Ser Ser Gly Tyr Ser Tyr Ser Phe Asp Phe
1               5                   10
<210>  26
<211>  330
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  26
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc       60
tcttgttctg gcaacatctc caacatcgga agtaacactg tcaactggta tcaacacgtc      120
ccaggagcgg cccccagact cctcatctat gttaatgatc agcggccgtc aggggtccct      180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag      240
tctgaagatg aggctgatta ttactgtgca acgtgggatg acaccctgaa tggaggggtc      300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta                                       330
<210>  27
<211>  110
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  27
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Asn Ile Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20                  25                  30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln His Val Pro Gly Ala Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Val Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Thr Leu
85                  90                  95
Asn Gly Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  28
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  28
Ser Gly Asn Ile Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn
1               5                   10
<210>  29
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  29
Val Asn Asp Gln Arg Pro Ser
1               5
<210>  30
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  30
Ala Thr Trp Asp Asp Thr Leu Asn Gly Gly Val
1               5                   10
<210>  31
<211>  387
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  31
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc       60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc      120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc      180
gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat      240
atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagggtcc      300
catctttacg atttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc      360
caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt                                          387
<210>  32
<211>  129
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  32
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asp Ser Tyr
20                  25                  30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe
50                  55                  60
Gln Ala Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Ser His Leu Tyr Asp Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro
100                 105                 110
Asn Asp Ala Leu Ala Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  33
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  33
Ser Tyr Ser Ile His
1               5
<210>  34
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  34
Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe Gln
1               5                   10                  15
Ala
<210>  35
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  35
Gly Ser His Leu Tyr Asp Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro Asn Asp
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala Ile
20
<210>  36
<211>  330
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  36
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc       60
tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc      120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct      180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag      240
gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatgggata tcagcctgag cgctggcttg      300
ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta                                       330
<210>  37
<211>  110
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  37
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn
20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ile Ser Leu
85                  90                  95
Ser Ala Gly Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  38
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  38
Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser
1               5                   10
<210>  39
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  39
Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1               5
<210>  40
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  40
Gly Thr Trp Asp Ile Ser Leu Ser Ala Gly Leu
1               5                   10
<210>  41
<211>  387
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  41
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc       60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc      120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc      180
gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat      240
atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagggagc      300
ttcgactaca ggttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc      360
caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt                                          387
<210>  42
<211>  129
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  42
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asp Ser Tyr
20                  25                  30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe
50                  55                  60
Gln Ala Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Ser Phe Asp Tyr Arg Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro
100                 105                 110
Asn Asp Ala Leu Ala Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  43
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  43
Ser Tyr Ser Ile His
1               5
<210>  44
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  44
Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe Gln
1               5                   10                  15
Ala
<210>  45
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  45
Gly Ser Phe Asp Tyr Arg Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro Asn Asp
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala Ile
20
<210>  46
<211>  330
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  46
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc       60
tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc      120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct      180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag      240
gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatgggata tcagcctgag cgctggcttg      300
ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta                                       330
<210>  47
<211>  110
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  47
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn
20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ile Ser Leu
85                  90                  95
Ser Ala Gly Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  48
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  48
Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser
1               5                   10
<210>  49
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  49
Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1               5
<210>  50
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  50
Gly Thr Trp Asp Ile Ser Leu Ser Ala Gly Leu
1               5                   10
<210>  51
<211>  387
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  51
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc       60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc      120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc      180
gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat      240
atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagaggctcc      300
ttcgactact acttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc      360
caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt                                          387
<210>  52
<211>  129
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  52
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asp Ser Tyr
20                  25                  30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe
50                  55                  60
Gln Ala Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Ser Phe Asp Tyr Tyr Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro
100                 105                 110
Asn Asp Ala Leu Ala Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  53
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  53
Ser Tyr Ser Ile His
1               5
<210>  54
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  54
Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe Gln
1               5                   10                  15
Ala
<210>  55
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  55
Gly Ser Phe Asp Tyr Tyr Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro Asn Asp
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala Ile
20
<210>  56
<211>  330
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  56
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc       60
tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc      120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct      180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag      240
gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatgggata tcagcctgag cgctggcttg      300
ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta                                       330
<210>  57
<211>  110
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  57
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn
20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ile Ser Leu
85                  90                  95
Ser Ala Gly Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  58
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  58
Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser
1               5                   10
<210>  59
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  59
Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1               5
<210>  60
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  60
Gly Thr Trp Asp Ile Ser Leu Ser Ala Gly Leu
1               5                   10
<210>  61
<211>  387
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  61
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc       60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc      120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc      180
gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat      240
atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagggtcc      300
catctttacg atttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc      360
caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt                                          387
<210>  62
<211>  129
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  62
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asp Ser Tyr
20                  25                  30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe
50                  55                  60
Gln Ala Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Ser His Leu Tyr Asp Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro
100                 105                 110
Asn Asp Ala Leu Ala Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  63
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  63
Ser Tyr Ser Ile His
1               5
<210>  64
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  64
Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe Gln
1               5                   10                  15
Ala
<210>  65
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  65
Gly Ser His Leu Tyr Asp Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro Asn Asp
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala Ile
20
<210>  66
<211>  330
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  66
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc       60
tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc      120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct      180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag      240
gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatggctgt acgaccgggc cgtcggcttg      300
ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta                                       330
<210>  67
<211>  110
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  67
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn
20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Leu Tyr Asp Arg
85                  90                  95
Ala Val Gly Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  68
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  68
Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser
1               5                   10
<210>  69
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  69
Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1               5
<210>  70
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  70
Gly Thr Trp Leu Tyr Asp Arg Ala Val Gly Leu
1               5                   10
<210>  71
<211>  387
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  71
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc       60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc      120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc      180
gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat      240
atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagaggctcc      300
ttcgactact acttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc      360
caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt                                          387
<210>  72
<211>  129
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  72
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asp Ser Tyr
20                  25                  30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe
50                  55                  60
Gln Ala Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Ser Phe Asp Tyr Tyr Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro
100                 105                 110
Asn Asp Ala Leu Ala Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  73
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  73
Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Ile Leu Glu His Ile Ser
1               5                   10                  15
<210>  74
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  74
Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe Gln
1               5                   10                  15
Ala
<210>  75
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  75
Gly Ser Phe Asp Tyr Tyr Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro Asn Asp
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala Ile
20
<210>  76
<211>  330
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  76
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc       60
tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc      120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct      180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag      240
gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatggctgt acgaccgggc cgtcggcttg      300
ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta                                       330
<210>  77
<211>  110
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  77
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn
20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Leu Tyr Asp Arg
85                  90                  95
Ala Val Gly Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  78
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  78
Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser
1               5                   10
<210>  79
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  79
Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1               5
<210>  80
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  80
Gly Thr Trp Leu Tyr Asp Arg Ala Val Gly Leu
1               5                   10
<---