Метод электрочувствительных зон для определения невидимых механических включений в лекарственных препаратах для парентерального применения

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ

№1, 2012 Ведомости НЦЭСМП

МЕТОД ЭЛЕКТРОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ЗОН ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕВИДИМЫХ МЕХАНИЧЕСКИХ ВКЛЮЧЕНИЙ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ ДЛЯ ПАРЕНТЕРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ

Е.С. Новик, О.В. Гунар

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России, Москва

Резюме: Сравнительный анализ методик показал, что метод Култера наряду с микроскопическим методом может быть использован для определения невидимых частиц в инъекционных растворах. На основании результатов валидации приведено обоснование включения метода электрочувствительных зон (метода Култера) в проект ОФС «Невидимые механические включения в лекарственных средствах для парентерального применения», разработанного для 2 части ГФ XII издания.

Ключевые слова: лекарственные средства, механические включения, метод электрочувствительных зон, валидация.

ELECTRICAL SENSING ZONE METHOD FOR DETERMINATION OF INVISIBLE PARTICULATE MATTERS IN PARENTERAL MEDICINES E.S. Novik, O.V Gounar

Abstract: Comparative analysis of methods showed that Coulter method along with microscopical method can be used for determination of invisible particles in solutions for injections. Validation results allowed to substantiate inclusion of electrical sensing zone method (Coulter method) to State Pharmacopoeia monograph draft “Invisible particulate matters in parenteral medicines”, developed for volume 2 of the State Pharmacopoeia XII edition.

Key words: medicines, particulate matters, electrical sensing zone method, validation.

К основным показателям, характеризующим безопасность парентеральных лекарственных препаратов, относятся стерильность, апирогенность и содержание минимально допустимого количества механических включений.

Механические включения (МВ) — посторонние подвижные нерастворимые частицы, за исключением пузырьков газа, случайно присутствующие в инъекционных и инфузионных растворах [6].

Из литературы известно, что МВ могут оказывать неблагоприятное действие на организм пациента. Осложнения выражаются в виде флебитов, головной боли, аллергических реакций, закупорки вен вплоть до некроза тканей, гранулематозного воспаления легких, иногда со смертельным исходом [4]. Попадая в организм больного парентеральным путем, механические частицы могут вызвать патологические изменения в структуре тканей внутренних органов. Результаты подобных изменений зависят от природы МВ, их размеров и локализации, а также от индивидуальных реакций и общего состояния больного. Опасность развития побочных реакций возрастает с увеличением числа и размера частиц. По литературным данным, именно частицы, невидимые невооруженным глазом, если их большое количество, могут забивать капилляры кровеносных сосудов (размер просвета 5-8 мкм), а также стать причиной гранулем и тромбозов [4].

В настоящее время при подтверждении качества парентеральных препаратов по показателю «Механические включения (невидимые частицы)» в зарубежных фармакопеях, включая Украину, Белоруссию и Казахстан, утверждены 2 метода: счетно-фотометрический (метод лазерной дифракции) и микроскопический. Однако в лаборатории микробиологии Испытательного центра экспертизы качества лекарственных средств ФГБУ НЦЭСМП определение невидимых частиц успешно проводят с помощью метода Култера (метод электрочувствительных зон) на приборе Coulter Counter MultisizerTM, производства фирмы «Beckman Coulter International S.A.», США.

Принцип метода Култера основан на регистрации электрических импульсов, возникающих при прохождении через апертуру находящихся в растворе частиц. Апертура и создает так называемую «электро-чувствительную зону». С помощью этого метода можно измерять частицы размером от 0,4 до 1200 мкм, имея соответствующий набор апертур.

Метод Култера — единственный метод, позволяющий измерить объем (размер) каждой частицы. Единственное ограничение — измерение необходимо выполнять в растворе электролита.

Для расширения методов определения невидимых механических включений в парентеральных препаратах нами была выполнена валидация указанного метода для включения его в проект ОФС «Невидимые

к

w

в

о

Ведомости НЦЭСМП

№1, 2012

механические включения в лекарственных средствах для парентерального применения».

Цель валидации — обосновать применение метода Култера для определения механических включений, невидимых невооруженным глазом, и гарантировать, что выбранный метод будет давать воспроизводимые и достоверные результаты.

При валидации было проведено сравнение методов Култера и метода микроскопии, приводимого в РД 42-501-98, ведущих международных фармакопе-ях [6, 7] и проекте ОФС «Невидимые механические включения в лекарственных средствах для парентерального применения».

Предварительно были определены подлежащие оценке параметры, а именно:

1. Предел количественного определения — это наименьшее количество механических частиц в образце, которое может быть количественно оценено с использованием валидируемой методики с требуемой правильностью и внутрилабораторной (промежуточной) прецизионностью.

2. Аналитическая область методики — это интервал между верхним и нижним значением аналитических характеристик определяемого компонента (его количества). В этом интервале получаемые с использованием валидируемой методики результаты должны иметь приемлемый уровень правильности и вну-трилабораторной (промежуточной) прецизионности.

3. Правильность методики характеризуется отклонением среднего результата определений, выполненных с ее использованием, от ожидаемого значения результата анализа, принимаемого за истинное.

При этом, валидируемая методика признается правильной, если принимаемые за истинные ожидаемые значения результатов анализов лежат внутри доверительных интервалов соответствующих средних значений результатов анализов, полученных экспериментально по данной методике.

4. Прецизионность методики характеризуется рассеянием результатов, получаемых с ее использованием, относительно величины среднего результата. Мерой такого рассеяния является величина стандартного отклонения результата отдельного определения, полученная для выборки достаточно большого объема.

5. Повторяемость (сходимость) — оценивается по результатам, полученным в одинаковых условиях в одной лаборатории (один и тот же исполнитель, одно и то же оборудование, один и тот же набор реактивов) в пределах короткого промежутка времени.

6. Устойчивость (робастность) — способность сохранять найденные для методики в оптимальных условиях вышеприведенные характеристики, при вероятных небольших отклонениях от этих условий проведения анализа.

Первоначально был составлен план валидации:

1. Краткая характеристика сравниваемых методов.

2. Условия и параметры валидации.

3. Методика испытания.

4. Сравнение полученных данных по основным параметрам.

5. Написание отчета о валидации.

1. краткая характеристика сравниваемых методов

Метод Култера используется в приборах нового поколения Coulter Counter MultisizerTM, в которых представлена уникальная система обработки электрических импульсов, используется наиболее современная процессорная технология, насос нового поколения для всасывания образца. Счетчик частиц представляет собой одну установку, содержащую апертурную трубку, систему анализа жидкостей (включающую насос и измерительный прибор) и электронику для управления апертурным током. Каждая апертурная трубка покрывает диапазон размера частиц от 2 до 60% диаметра апертуры. Стандартное время анализа около 30 секунд. Ход анализа по мере его выполнения отображается на дисплее.

Микроскопический метод используют для подсчета количества частиц в случае невозможности применения счетно-фотометрического метода или метода электрочувствительных зон, например, если лекарственный препарат непрозрачный или обладает повышенной вязкостью (эмульсии, суспензии и др.). В настоящей работе для подсчета частиц использовали бинокулярный микроскоп Olympus BX41 производства Olympus Corporation, Япония, оснащенный окулярным микрометром, с помощью которого определяют размер частиц. Для дополнительного освещения режиме отраженного света применяли осветитель KL 1500 LCD производства Schott AG, Германия.

2. Условия и параметры валидации

Непосредственно процедура валидации проводилась в следующих условиях:

— Отборы проб проводились в аттестованной ламинарной установке производства фирмы «Jouan», Франция.

— При подготовке проб для микроскопического метода использовали мембранную фильтрацию с помощью стеклянной фильтровальной установки и нитратцеллюлозных фильтров фирмы Millipore с размером пор 0,45 мкм. Стеклянную посуду и фильтровальное оборудование, за исключением мембранных фильтров, тщательно промывали снаружи и внутри водой, свободной от частиц.

— В процессе валидации использовали суспензии латексных стандартов N.I.S.T. (National Institute of Standarts and Technology) Coulter R CC Size Standarts с заданными размерами 2,061 мкм, 5,052 мкм, 10,36 мкм, 20,61 мкм и 41,15 мкм производства фирмы Beckman CoulterТМ, США. Процедуру проводили с апертурой 100 мкм, т.к. она используется в стандартных условиях определения количества и размера ме-

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ

№1, 2012

ханических включений 10 мкм и 25 мкм, принятых в ведущих международных фармакопеях [6, 7].

Каждый образец латексных стандартов анализировали в 6 повторностях для метода Култера и микроскопического метода. Подсчет количества частиц размером 2,061 мкм с помощью микроскопа не проводили из-за невозможности подсчета частиц такого размера в стандартных условиях испытания.

— Статистическую обработку результатов испытаний выполняли по ГФ XI издания [1] и Руководству по статистике в медицине [5].

з. методика испытания

Суспензии латексных частиц в количестве 0,05 мл после тщательного перемешивания добавляли в стакан с 40 мл раствора Изотона (CoulterR IsotonR II Diluent) и через 1-2 минуты измеряли количество частиц с помощью прибора.

Для сравнения такое же количество суспензии наносили на фильтр с размером пор 0,45 мкм, предварительно перемешивая суспензию в 20 мл воды, свободной от механических частиц, затем промывали такой же водой и подсчитывали число латексных частиц на фильтре, используя микроскоп Олимпус BX41 с увеличением 100.

Для оценки внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности опыты проводились в разные дни и двумя различными сотрудниками.

Для оценки устойчивости метода испытания проводили в видоизмененных условиях. Для этого в коммерческий стандартный раствор Изотона, содержащий 0,05 мл образца, добавляли 1 мл 10% соляной кислоты.

4. сравнение полученных данных по основным параметрам

Экспериментальные данные определения количества частиц с помощью метода Култера в сравнении с методом микроскопии приведены в табл. 1. Полу-

Ведомости НЦЭСМП

ченные результаты проверяли на однородность выборки с помощью Q — критерия и было установлено, что они не отягощены грубой погрешностью. Статистическая обработка результатов показала, что средние значения, полученные с помощью валидируемо-го метода, статистически не отличаются от таковых, полученных с помощью метода микроскопии.

Внутрилабораторная прецизионность подтверждается близостью данных, полученных разными сотрудниками в разные дни.

Повторяемость метода подтверждается тем, что при анализе одного и того же образца латексных стандартов одним и тем же сотрудником в одних и тех же условиях получаются данные, не различающиеся статистически достоверно между собой (табл. 1).

Робастность метода подтверждается тем, что при изменении рН образца латексных стандартов число частиц статистически не отличалось от данных, полученных в стандартных условиях испытания. Результаты по воспроизводимости и робастности аналогичны данным, представленным в табл. 1.

Дисперсии и стандартные отклонения, рассчитанные для данных, полученных с помощью метода Култера, в большинстве случаев имели более низкие значения, чем для метода микроскопии, что положительно характеризует валидируемый метод в отношении показателей прецизионности и правильности (табл. 2).

Специфичность метода Култера подтверждается использованием эталонных стандартов латексных частиц N.I.S.T. (National Institute of Standarts and Technology).

Аналитическая область в случае использования апертуры размером 100 мкм находится в пределах от 2 до 60 мкм.

Результаты сравнения методик с помощью критерия Фишера и коэффициента Стьюдента, приведенные в табл. 3, показывают, что величина критерия Стьюдента для всех размеров латексных частиц

Таблица 1

количество частиц в 0,05 мл латексных стандартов различных размеров

Размер латексных частиц (мкм) Результаты единичных экспериментов

Метод Култера

2,061 457 467 526 553 526 457

5,052 4224 4224 4268 4212 4301 4041

10,36 1508 1662 1210 1354 1620 1370

20,61 3491 2843 3413 3846 3434 3136

41,15 5770 6240 6317 6009 6154 6180

Микроскопический метод

5,052 4400 4000 3840 4480 3840 4400

10,36 1440 1629 1369 1520 1340 1520

20,61 3200 3280 3280 3120 3360 3440

41,15 6240 6400 6080 6160 6180 6560

т

Ведомости НЦЭСМП

была ниже табличного значения. На основании этого можно сделать вывод, что с вероятностью 95% не существует статистически значимых различий между результатами, полученными с использованием обеих методик.

Вычисленное значение критерия Фишера (11,76) для латексных частиц размером 5 мкм превышало табличное, что позволяет сделать заключение о более высокой воспроизводимости валидируемого метода.

№1, 2012

Для диапазона частиц от 10 до 41 мкм таких закономерностей не выявлено.

Отчет о валидации представлен в установленном порядке.

Таким образом, проведенная валидация метода Култера обосновывает возможность его включения в проект ОФС «Невидимые механические включения в лекарственных средствах для парентерального применения».

Таблица 2

СРАВНИТЕЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДВУХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ЧАСТИЦ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЛАТЕКСНЫХ СТАНДАРТОВ РАЗЛИЧНОГО РАЗМЕРА

Размер латексных частиц (мкм) Метрологические характеристики

x s2 s Дх

Метод Култера

2,061 498 1783 42 37,3

5,052 4213 8119 65 56

10,36 1454 34148 84 151

20,61 3349 12833 113 83,7

41,15 6126 12708 122 85,7

Микроскопический метод

5,052 4160 95466 308 260

10,36 1467 11466 107 86,6

20,61 3280 12800 113 80

41,15 6270 33380 182 145

Условные обозначения: х — среднее значение, s2 — дисперсия, s — стандартное отклонение, Ах — доверительный интервал.

Таблица 3

СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ С ПОМОЩЬЮ КРИТЕРИЯ ФИШЕРА И КОЭФФИЦИЕНТА СТЬЮДЕНТА

Размер латексных частиц (мкм) t (Р, f) t выч ^абл F выч

2,061 - -

5,052 0,49 11,76

10,36 2,57 0,18 6,03 2,98

20,61 1,29 1,0

41,15 2,01 2,63

Условные обозначения: t — критерий Стьюдента, Р — доверительная вероятность, f — число степеней свободы, F — критерий Фишера.

ЛИТЕРАТУРА

1. Государственная фармакопея СССР XI издания . // Москва, Медицина, 1998,

2 . Инструкция по контролю на механические включения инъекционных лекарственных средств (РД-42-501-98) // М . , 1998.

3 . Береговых В . В . , Пятигорская Н . В . , Беляев В . В . , Аладышева Ж . И . , Мешковский А . П ,

Валидация в производстве лекарственных средств . // М . , Издательский дом «Русский врач», 2010, 286 с .

4 . Моисеева Е . В . , Валевко С . А . , Шилова С . В , «Проблема загрязнения механическими включениями лекарственных средств для парентерального применения»//Фармация, 2002, № 4, С .44-47 .

5 Петри А , Сэбин К Наглядная статистика в медицине // М . : ГЭОТАР-МЕД . , 2003, 141 с .

6 European Pharmacopoeia 7th ed // Stras-burg .2011, 2 . 9 .19, С .285-287 .

7 The United State Pharmacopeia XXXIV rev // Rockville, MD, 2012, <788> .

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ