РАСТВОР ДЛЯ ФИКСАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ КЛЕТОК
SOLUTION FOR FIXING BIOLOGICAL CELLS

Настоящее изобретение относится к раствору для фиксации биологических клеток (фиксирующий раствор), предназначенному для сохранения in vitro цитологического образца, типа содержащего спирт раствора для фиксации клеток. Более конкретно изобретение относится к области цитологии.
Фиксирующие растворы или фиксаторы предусмотрены для сохранения и консервации цитологических проб или образцов, включая клетки, для их последующего анализа цитологом. Образцы клеток могут быть, например, получены пункцией иглой, промыванием, соскабливанием или сбором мочи у пациента. Клетки могут быть клетками любого органа, например матки, печени, желудка, молочной железы, и тому подобными. Образец клеток может быть, например, образцом жидкости, более конкретно мочи, асцита, плевральной или перикардиальной жидкости; мазком, более конкретно мазком из шейки матки, мазком из влагалища; пункцией органа, более конкретно наружного органа, такого как молочная железа, щитовидная железа или внутреннего органа, такого как поджелудочная железа или печень и тому подобных.
Под «цитологическим фиксатором» или «цитологическим фиксирующим раствором» подразумевают раствор, обычно применяемый при цитологических анализах для фиксации клеток.
Фиксация является операцией, предназначенной для максимально возможного сохранения морфологии клеток в том состоянии, в котором они находились до их отбора. Самыми лучшими фиксаторами являются те, которые, оказывая быстрое действие, вызывают минимально возможное число вторичных или искусственных изменений, способных помешать анализу внутренней морфологии клеток.
Известен и давно применяется, в частности в сельскохозяйственной и ветеринарной области, уксусный формальдегидный спирт или AFA. AFA содержит метиловый или этиловый спирт, формалин и ледяную уксусную кислоту. Формалин представляет собой смесь, состоящую из муравьиной кислоты, формальдегида, параформальдегида и метанола. Примером является AFA компании Locquin, имеющий следующий состав:
Этиловый спирт крепостью 80°
100 см<sup>3</sup>
Лабораторный формалин концентрацией 38%
10 см<sup>3</sup>
Ледяная уксусная кислота
5 см<sup>3</sup>
Сахароза
10 г
Дистиллированная вода
20 см<sup>3</sup>
Так, ледяная уксусная кислота разрушает эритроциты и растворяет их содержимое, вследствие чего образуются отложения гемоглобина, очень мешающие при анализе после стандартного окрашивания, более конкретно по Папаниколау, или окрашивания по Май-Грюнвальду-Гимзе (MGG), или очень мешающие при имуноцитохимических или других исследованиях. Более того, с позиции нормативных актов при такой концентрации этиловый спирт считается воспламеняющимся веществом, а формалин - токсичным и канцерогенным веществом.
Цель изобретения заключается в предоставлении раствора для фиксации биологических клеток, обеспечивающего хорошую сохранность целостности ядерных клеток и эритроцитов для их анализа, но менее опасного для пользователя.
В этой связи объектом изобретения является раствор для фиксации биологических клеток вышеназванного типа, содержащий физраствор для предотвращения осмотического шока на уровне клеточной стенки, формалин и полиэтиленгликоль для сохранения размера и целостности ядерных клеток и эритроцитов, фиксированных упомянутым раствором.
Согласно другим аспектам изобретения раствор для фиксации биологических клеток обладает одним или несколькими следующими свойствами:
- фиксирующий раствор не содержит ни ацетона или соединений класса кетонов, ни уксусной кислоты для сохранения целостности эритроцитов.
- спирт является этанолом или изопропанолом;
- спирт является смесью этанола и изопропанола;
- количество спирта значительно ниже 45% по объему фиксирующего раствора;
- количество формалина по существу составляет от около 0,2 до 1% по объему фиксирующего раствора.
- фиксирующий раствор содержит буфер, гарантирующий, что рН фиксирующего раствора по существу составляет от 6,4 до 7,4; и
- фиксирующий раствор содержит от 80% до 95% по объему:
- 590 мл физраствора,
- 10 мл полиэтилен гликоля (Carbowax),
- 203 мл изопропилового спирта,
- 193 мл чистого этанола,
- 0,01% по объему азида натрия,
и от 20% до 5% по объему формалина, забуференного из расчета 4%.
Так, этот раствор обеспечивает лучшую сохранность клеточных соотношений, более конкретно размеров ядра относительно размеров клетки, и, более конкретно прекрасную сохранность эритроцитов.
Кроме того, этот фиксирующий раствор слабовоспламеним, нетоксичен и не канцерогенен.
Изобретение будет лучше понятно при ознакомлении с описанием ниже, приведенным только для примера и составленного со ссылками на рисунки, на которых:
- фигура 1 представляет собой фотографию образца клеток, полученного из молочной железы, который был сохранен в фиксирующем растворе по изобретению,
- фигура 2 представляет собой фотографию образца клеток, отобранного из щитовидной железы, который был сохранен в фиксирующем растворе по изобретению.
Настоящее изобретение относится к фиксирующему раствору, предназначенному для сохранения in vitro цитологического образца, содержащего биологические клетки, предназначенные для анализа цитологом.
Фиксирующий раствор содержит изотонический раствор хлорида натрия или физраствор вместо дистиллированной или деионизированной воды, обычно применяемой в качестве основы традиционно использующихся фиксирующих растворов.
Физраствор известен давно, он содержит хлорид натрия, растворенный в дистиллированной воде из расчета 9 граммов хлорида натрия на 1 литр воды. Физраствор является изоосмолярным, что поддерживает клетки в состоянии правильной осмолярности, предотвращающем любой осмотический шок на уровне клеточной стенки и, следовательно, разрушение клеток разрывом цитоплазматических и ядерных мембран. Осмолярность физраствора составляет 308 мОсмоль на литр.
Осмолярность представляет собой концентрацию среды. Это возвращает нас к понятию осмоса, который является диффузией растворителя через полупроницаемую мембрану, разделяющую два раствора с различной концентрацией, например, фиксирующий раствор и цитоплазматическую жидкость клеток.
Кроме того, фиксирующий раствор содержит спирт для сохранения клеток в их состоянии, фиксируя их в спиртовой среде.
Предпочтительно количество спирта значительно ниже 45% по объему фиксирующего раствора с тем, чтобы он был слабовоспламенимым. Таким образом, это небольшое содержание спирта позволяет легче транспортировать и хранить фиксирующий раствор, поскольку он менее опасен. Более конкретно под слабой воспламеняемостью подразумевают то, что раствор по изобретению не требует нанесения на упаковку раствора значка безопасности, предупреждающего о воспламеняемости продукта.
Более конкретно спирт является этанолом или изопропанолом.
По одному из вариантов осуществления изобретения спирт является смесью этанола и изопропанола.
Однако спирт является обезвоживающим уменьшающим веществом, изменяющим таким образом размер клеток за счет сокращения ядра и цитоплазмы.
Для компенсации этого недостатка фиксирующий раствор также содержит формалин для сохранения размера клеток. Факт, что фиксирующий раствор может также содержать Carbowax или полиэтиленгликоль, известен и опубликован Саккоманно (Saccomanno) и коллегами. Известен и опубликован тот факт, что формалин может сочетаться с веществами, удаляющими соли кальция или антиагрегантами, такими как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) и ее соли. Также известен и опубликован тот факт, что к образцам, содержащим слизь, можно добавлять муколитическое вещество, в частности дитиотреитол (DTT) или ацетилцистеин.
Формалин позволяет сохранить эритроциты и ядерные клетки, не лизируя их и гарантируя соотношение по размеру, что позволяет цитологу ставить более точный диагноз.
Более конкретно, как можно видеть на фигурах 1 и 2, образцы клеток, которые хранили в фиксирующем растворе по изобретению эритроциты, отмеченные цифрой 1 на фигурах, прекрасно сохранились и не нарушены, что позволяет провести точный анализ этих образцов.
Предпочтительно количество формалина по существу составляет от около 0,2 до 1% по объему фиксирующего раствора. При такой концентрации формалин или формальдегид считается простым раздражающим средством по токсикологическому реестру, выпущенному Национальным институтом научных исследований и безопасности (INRS), в отличие от обычно применяемых концентраций от 1 до 25%, при которых формалин является коррозионным и канцерогенным. Таким образом упаковка раствора по изобретению также не требует нанесения значка безопасности, предупреждающего о том, что продукт является коррозионно-опасным.
Следовательно, при концентрации ниже 1% с раствором можно безопасно совершать манипуляции, поскольку уровень мер предосторожности для совершения манипуляций с ним ниже.
Известно, что фиксирующий раствор может содержать противомикробную добавку.
Фиксирующий раствор содержит буфер, гарантирующий уровень рН фиксирующего раствора по существу от 6,4 до 7,4. Этот диапазон рН соответствует оптимальным условиям хранения клеток и крови тела человека.
Приведенные ниже примеры иллюстрирую изобретение, не ограничивая его объем.
Пример 1
Раствор, образованный на 80% по объему из:
- 590 мл физраствора,
- 10 мл полиэтилен гликоля (Carbowax),
- 203 мл изопропилового спирта,
- 193 мл чистого этанола,
- 0,01% по объему азида натрия,
и на 20% по объему забуференного 4% формалина.
В одном из вариантов раствор может быть образован из 90% по объему указанной выше смеси и из 10% по объему забуференного 4% формалина или из 95% по объему указанной выше смеси и из 5% по объему забуференного 4% формалина.
Следует также отметить, что фиксирующий раствор по изобретению не содержит ни ацетона или соединений класса кетонов, ни уксусной кислоты. Эти продукты лизируют эритроциты, при разрушении которых высвобождается гемоглобин, который оседает на клетках. Некоторые типы окрашивания, например окрашивание по Папаниколау, с учетом сложности красителей, объединяющих несколько ядерных красителей и гемоглобина, делают в этом случае цитологический анализ, и более конкретно исследование ядра очень трудным, если ни невозможным. Иммуноцитохимические исследования также зачастую оказываются затрудненными отложениями гемоглобина.
Использование фиксирующего раствора по изобретению улучшает последующие анализы образца с окрашиванием по Папаниколау или Иммуноцитохимические исследования образца, фиксированного в фиксирующем растворе, описанном в настоящем документе и не содержащем ни ацетона или соединений класса кетонов, ни уксусной кислоты.
Таким образом, описанный выше фиксирующий раствор обеспечивает прекрасную сохранность целостности ядерных клеток и эритроцитов для их анализа.