ПОЛИПЕПТИДЫ ЛИЗИНА, АКТИВНЫЕ ПРОТИВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ
LYSINE POLYPEPTIDES ACTIVE AGAINST GRAM-NEGATIVE BACTERIA

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
В настоящей заявке на патент заявляется приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/220,212, поданной 17 сентября 2015 года, и предварительной заявки на патент США 62/247,619, поданной 28 октября 2015 года; содержание данных предварительных заявок полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область техники
[0001] Настоящее изобретение в общем смысле относится к профилактике и лечению инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями. Более конкретно, настоящее изобретение относится к средствам и композициям, способным предотвращать и/или ингибировать рост грамотрицательных бактерий.
Описание предшествующего уровня техники
[0002] Грамотрицательные патогены представляют значительную угрозу и характеризуются развитием резистентности практически ко всем лекарственным средствам, которые ранее рассматривали для лечения. Особое беспокойство вызывают инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи, которые вызваны грамотрицательным патогеном Pseudomonas aeruginosa, у которого может развиваться резистентность к многочисленным антимикробным средствам, таким как антибиотики, включая, без ограничения, ципрофлоксацин, левофлоксацин, гентамицин, цефепим, имипенем, меропенем (Lister et al. Clin Microbiol Rev. 4: 582-610 (2009)). Помимо резистентности к отдельным лекарственным средствам, развитие и увеличение распространенности резистентных к различным лекарственным средствам штаммов в сочетании с недостатком новых антибиотиков является основанием для беспокойства. Для устранения угрозы, вызванной резистентностью к различным лекарственным средствам, однозначно необходимы новые и эффективные варианты лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями. Один весьма перспективный подход основан на применении гидролаз бактериальных пептидогликанов, или ПГГ (пептидогликангидролаз), включающих лизины, аутолизины и некоторые бактериоцины, для расщепления основного структурного компонента клеточной стенки бактерий (т.е. пептидогликана). ПГГ включают глюкозаминидазы и мурамидазы (т.е. лизоцимы), которые расщепляют сахарный остов пептидогликана, эндопептидазы, которые расщепляют стволовой пептид или перекрестные мостики, или L-аланинамидазы, которые расщепляют амидную связь, соединяющую сахар и пептидные фрагменты (Bush K., Rec Sci Tech. (1): 43-56 (2012); Reith J. et al. Appl Microbiol Biotechnol. (1):1-11 (2011)).
[0003] Исследования, проведенные в течение последних 14 лет, позволили установить, что ПГГ можно экспрессировать рекомбинантным способом, очистить и экзогенно добавить к чувствительным бактериям для быстрого бактериолиза. Данный феномен «лизиса извне» является основой эффективной антибактериальной стратегии, разрабатываемой на сегодняшний день в отношении нескольких грамположительных бактериальных патогенов. Однако по сравнению с грамположительными бактериями применение лизинов для лечения инфекций грамотрицательных бактерий было ограничено в связи с существованием дополнительного слоя мембраны в клеточной стенке бактерий. Данный дополнительный слой, известный как внешняя мембрана (ВМ), препятствует доступу лизинов к их субстратам - пептидогликанам в клеточной стенке. Несмотря на это в последнее время сообщалось, что несколько ПГГ из грамотрицательных бактерий и связанных бактериофагов обладают некоторой природной способностью уничтожать грамотрицательные бактерии (Lood et al., Antimicrob Agents Chemother, 4: 1983-91, (2015)). В случае бактерицидных грамотрицательных лизинов активность может зависеть от положительно заряженных (и амфипатических) N- и С-концевых альфа-спиральных доменов в природных последовательностях, которые делают возможным связывание с анионной ВМ и осуществление транслокации в расположенный под ней пептидогликан (Lai et al. Microbiol Biotechnol, 90: 529-539 (2011)). В последнее время исследователи использовали данное свойство для создания «артилизинов», сконструированных лизинов с добавленными катионными пептидами для обеспечения антибактериальной активности против грамотрицательных Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii (Briers et al., Antimicrob Agents Chemother. 58(7): 3774-84 (2014)). Данные артилизины состоят из положительно заряженных ПГГ (активных против грамположительных бактерий), гибридизованных с экзогенно полученными катионными пептидами, которые не родственны лизинам или не получены из лизинов (Briers et al., Antimicrob Agents Chemother. 58(7): 3774-84 (2014); Briers et al. MBio. 4:e01379-14 (2014); патент США 8,846,865).
[0004] Приведение ссылок в данном документе не следует истолковывать как признание того, что такие ссылки являются релевантными или что они определяют предшествующий уровень техники настоящего изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, которая содержит эффективное количество выделенного полипептида лизина, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95% идентична полипептидной последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 10, или фрагмент указанной последовательности, обладающий активностью лизина, причем указанный полипептид лизина ингибирует рост, или уменьшает количество, или приводит к уничтожению Р. aeruginosa и, необязательно, по меньшей мере одного другого вида грамотрицательных бактерий; и фармацевтически приемлемый носитель.
[0006] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид лизина или фрагмент присутствует в количестве, эффективном для ингибирования роста, уменьшения количества (популяции) или уничтожения P. aeruginosa и, необязательно, по меньшей мере одного другого вида грамотрицательных бактерий.
[0007] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция представляет собой раствор, суспензию, эмульсию, ингалируемый порошок, аэрозоль или спрей.
[0008] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция также содержит по меньшей мере один антибиотик, подходящий для обработки грамотрицательных бактерий.
[0009] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен вектор, который содержит выделенный полинуклеотид, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид лизина, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95% идентична последовательностьи, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 10, или фрагмент указанной последовательности, обладающий активностью лизина, причем кодируемый полипептид лизина ингибирует рост, или уменьшает количество, или приводит к уничтожению Р. aeruginosa и, необязательно, по меньшей мере одного другого вида грамотрицательных бактерий, или последовательность, комплементарную последовательности указанного полинуклеотида.
[0010] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид лизина, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95% последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 10, или фрагмент указанной последовательности, обладающий активностью лизина, причем кодируемый полипептид лизина обладает свойством ингибировать рост, или уменьшать количество, или приводить к уничтожению Р. aeruginosa и, необязательно, по меньшей мере одного другого вида грамотрицательных бактерий, причем нуклеиновая кислота функционально связана с гетерологичным промотором.
[0011] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность кДНК.
[0012] Согласно еще одному аспекту в настоящем изобретении предложен выделенный полинуклеотид, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид лизина, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95% идентична последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 10, или фрагмент указанной последовательности, обладающий активностью лизина, причем кодируемый полипептид лизина ингибирует рост, или уменьшает количество, или приводит к уничтожению P. aeruginosa и, необязательно, по меньшей мере одного другого вида грамотрицательных бактерий.
[0013] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид представляет собой кДНК.
[0014] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ ингибирования роста, или уменьшения количества, или уничтожения по меньшей мере одного вида грамотрицательных бактерий, причем указанный способ включает осуществление контакта бактерий с композицией, содержащей эффективное количество полипептида лизина, содержащего аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% полипептидной последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 10, или активным фрагментам указанной последовательности, причем полипептид лизина обладает свойством ингибировать рост, или уменьшать количество, или приводить к уничтожению P. aeruginosa и, необязательно, по меньшей мере одного другого вида грамотрицательных бактерий.
[0015] Согласно близкому аспекту в настоящем изобретении предложен способ лечения бактериальной инфекции, вызванной грамотрицательной бактерией, которая выбрана из группы, состоящей из P. aeruginosa и, необязательно, одного или нескольких дополнительных видов грамотрицательных бактерий, причем указанный способ включает введение субъекту, которому был поставлен диагноз бактериальной инфекции, который подвержен риску или у которого наблюдаются симптомы бактериальной инфекции, композиции, которая содержит эффективное количество полипептида лизина, содержащего аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% полипептидной последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 10, или активного фрагмента указанной последовательности, причем полипептид лизина обладает свойством ингибировать рост, или уменьшать количество, или приводить к уничтожению P. aeruginosa и, необязательно, по меньшей мере одного другого вида грамотрицательных бактерий.
[0016] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ лечения местной или системной патогенной бактериальной инфекции, вызванной грамотрицательной бактерией, которая выбрана из группы, состоящей из P. aeruginosa и, необязательно, одного или нескольких дополнительных видов грамотрицательных бактерий, у субъекта, причем указанный способ включает введение субъекту композиции, которая содержит эффективное количество полипептида лизина, содержащего аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% полипептидной последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 15, причем полипептид или пептид обладает свойством ингибировать рост, или уменьшать количество, или приводить к уничтожению P. aeruginosa и, необязательно, по меньшей мере одной другой грамотрицательной бактерии.
[0017] Согласно еще одному аспекту в настоящем изобретении предложен способ предотвращения или лечения бактериальной инфекции, причем указанный способ включает совместное введение субъекту, которому был поставлен диагноз бактериальной инфекции, который подвержен риску или у которого наблюдаются симптомы бактериальной инфекции, комбинации первого эффективного количества композиции, которая содержит эффективное количество полипептида лизина, содержащего аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95% полипептидной последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 10, или фрагментам указанной последовательности, и второго эффективного количества антибиотика, подходящего для лечения грамотрицательной бактериальной инфекции.
[0018] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения грамотрицательная бактерия выбрана из группы, состоящей из Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis и Franciscella tulerensis.
[0019] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная последовательность полипептида лизина идентична по меньшей мере на 85% или по меньшей мере на 90% последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 10, или представляет собой фрагмент указанной последовательности, обладающий активностью лизина.
[0020] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная последовательность полипептида лизина идентична по меньшей мере на 95% последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 10, или представляет собой фрагмент указанной последовательности, обладающий активностью лизина.
[0021] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения грамотрицательная бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную Pseudomonas aeruginosa.
[0022] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антибиотик выбран из одного или нескольких членов группы, состоящей из цефтазидима, цефепима, цефоперазона, цефтобипрола, ципрофлоксацина, левофлоксацина, аминогликозидов, имипенема, меропенема, дорипенема, гентамицина, тобрамицина, амикацина, пиперациллина, тикарциллина, пенициллина, рифампицина, полимиксина В и колистина.
[0023] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ увеличения эффективности антибиотика, подходящего для лечения грамотрицательной бактериальной инфекции, причем указанный способ включает совместное введение антибиотика в комбинации с одним или несколькими полипептидами лизина, содержащими аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% полипептидной последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1  - SEQ ID NO: 10, или активным фрагментом указанной последовательности, причем введение комбинации является более эффективным для ингибирования роста или уменьшения количества или уничтожения грамотрицательных бактерий, чем введение антибиотика или полипептида лизина или его активного фрагмента в отдельности.
[0024] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная последовательность полипептида лизина идентична по меньшей мере на 90% последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 10, или представляет собой фрагмент указанной последовательности, обладающий активностью лизина.
[0025] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная последовательность полипептида лизина идентична по меньшей мере на 95% последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 10, или представляет собой фрагмент указанной последовательности, обладающий активностью лизина.
[0026] Согласно другому аспекту выделенный полипептид лизина содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95% с полипептидной последовательностью, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 10, или фрагмент указанной последовательности, обладающий активностью лизина, причем полипептид лизина ингибирует рост, или уменьшает количество, или приводит к уничтожению P. aeruginosa и, необязательно, по меньшей мере одного другого вида грамотрицательных бактерий.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0027] На Фигуре 1 представлены нуклеотидная и аминокислотная последовательности полипептида лизина GN37, представленного в настоящем изобретении. Фигура 1А (слева) представляет собой аминокислотную последовательность GN37. Фигура 1А (справа) представляет собой нуклеотидную последовательность GN37. Фигура 1 В представляет собой схематичное изображение GN37, которое свидетельствует, что GN37 является членом семейства пептидаз ПГГ М15_4 с DD- и DL-карбоксипептидазными активностями (включая членов суперсемейства VanY). На Фигуре 1С представлено множественное выравнивание последовательности для сравнения GN37 с грамположительным частичным гомологом (Streptomyces, последовательность GenBank AGJ50592.1) и с предполагаемыми или подтвержденными эндолизинами из других грамотрицательных патогенов, включая Е.coli (GenBank WP_001117823.1 и NP_543082.1 - оба предполагаемые эндолизины), Yersinia spp.(GenBank CAJ28446.1 - подтвержденный эндолизин) и Acinetobacter baumannii (GenBank WP_034684053.1, предполагаемый лизин).
[0028] На Фигуре 2 представлены аминокислотная (жирный шрифт) и нуклеотидная (обычный шрифт) последовательности полипептидов лизина GN2, GN4, GN14 и GN43, представленных в настоящем изобретении.
[0029] Фигура 3 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую степень индукции флуоресцентного сигнала относительно контроля в штамме PAO1 P. aeruginosa в присутствии различных GN (грамотрицательных) полипептидов лизина, где флуоресценция свидетельствует о пермеабилизации внешней мембраны.
[0030] Фигура 4 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую антибактериальную активность GN полипептидов лизина против штамма PAO1 Р. aeruginosa. Снижение количества колониеобразующих единиц (КОЕ) представлено на логарифмической шкале.
[0031] На Фигуре 5 представлены аминокислотные последовательности пяти пептидов лизина, полученных из GN4: PGN4, FGN4-1, FGN4-2, FGN4-3 и FGN4-4.
[0032] Фигура 6 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую антибактериальную активность каждого полученного из GN4 пептида лизина (PGN4, FGN4-1, FGN4-2, FGN4-3 и FGN4-4) против штамма PAO1 P. aeruginosa. Снижение количества КОЕ представлено на логарифмической шкале.
[0033] Фигура 7 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую антибактериальную активность объединенных GN полипептидов лизина и полученных из GN4 пептидов лизина согласно настоящему изобретению против штамма PAO1 Р. aeruginosa в сыворотке человека. Снижение количества КОЕ представлено на логарифмической шкале.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБЕРТЕНИЯ
Определения
[0034] В данном документе следующие термины и фразы включают значения, представленные ниже, если контекст однозначно не диктует обратное.
[0035] «Грамотрицательные бактерии», как правило, относятся к бактериям, образующим окрашивание кристаллическим фиолетовым, которое обесцвечивается в результате окрашивания по Граму, т.е. в протоколе окрашивания по Граму данные бактерии не сохраняют краситель кристаллический фиолетовый. В данном документе термин «грамотрицательные бактерии» может описывать, без ограничений, один или несколько (т.е. один или комбинацию) из следующих видов бактерий: Acinetobacter baumannii, Acinetobacter haemolyticus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aeromonas hydrophila, Bacteroides fragilis, Bacteroides theataioatamicron, Bacteroides distasonis, Bacteroides ovatus, Bacteroides vulgatus, Bordetella pertussis, Brucella melitensis, Burkholderia cepacia, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei, Prevotella corporis, Prevotella intermedia, Prevotella endodontalis, Porphyromonas asaccharolytica, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Edwarsiella tarda, Eikenella corrodens, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Enterobacter agglomerans, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, Kingella kingae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella rhinoscleromatis, Klebsiella ozaenae, Legionella penumophila, Moraxella catarrhalis, Morganella morganii, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pasteurella multocida, Plesiomonas shigelloides, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Proteus myxofaciens, Providencia stuartii, Providencia rettgeri, Providencia alcalifaciens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Serratia marcescens, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Stenotrophomonas maltophilia, Streptobacillus moniliformis, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus, Yersinia enterocolitica, Yersiniapestis, Yersinia pseudotuberculosis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila trachomatis, Ricketsia prowazekii, Coxiella burnetii, Ehrlichia chaffeensis или Bartonella hensenae. Соединения согласно настоящему изобретению будут подходящими для предотвращения или ингибирования патогенного бактериального роста и для лечения одной или нескольких бактериальных инфекций, в особенности, но необязательно включающих исключительно грамотрицательные бактерии и, в особенности, P. aeruginosa.
[0036] Термин «бактерицидный» в контексте средства или соединения общепринято означает способность вызывать гибель бактерий или способность уничтожать бактерии в степени по меньшей мере 3-log (99,9%) или лучшее снижение среди исходной популяции бактерий.
[0037] Термин «бактериостатический» общепринято означает способность ингибировать рост бактерий, в том числе ингибировать рост клеток бактерий, таким образом, вызывая снижение 2-log (99%) или больше, и вплоть до немного менее 3-log среди исходной популяции бактерий.
[0038] Термин «антибактериальный» в контексте средства используют в общем случае для включения как бактериостатических, так и бактерицидных средств.
[0039] Термин «резистентный к лекарственным средствам» в контексте патогена и, более конкретно, бактерии, как правило, означает бактерию, которая является резистентной к антимикробной активности лекарственного средства. При использовании в более конкретном способе резистентность к лекарственным средствам конкретно означает резистентность к антибиотикам. В некоторых случаях у бактерии, которая, как правило, чувствительна к конкретному антибиотику, может развиться резистентность к антибиотику, в результате чего она становится микроорганизмом или штаммом, резистентным к лекарственным средствам. «Резистентный к различным лекарственным средствам» патоген представляет собой такового, у которого развивается резистентность к по меньшей мере двум классам антимикробных лекарственных средств при использовании каждого в монотерапии. Например, было обнаружено, что определенные штаммы Pseudomonas aeruginosa являются резистентными практически ко всем или всем антибиотикам, включая аминогликозиды, цефалоспорины, фторхинолоны и карбапенемы (Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013, U.S. Department of Health and Services, Centers for Disease Control and Prevention). Специалист в данной области техники может с легкостью определить, является ли бактерия резистентной к лекарственным средствам, с применением общепринятых лабораторных методик, которые определяют чувствительность или резистентность бактерий к лекарственному средству или антибиотику.
[0040] Термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, добавки, вспомогательные вещества, диспергирующие среды, солюбилизирующие средства, покрытия, консерванты, изотонические средства и средства, замедляющие всасывание, поверхностно-активные вещества, пропелленты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Носитель или носители должны быть «приемлемыми» в смысле их безвредности в отношении субъекта, лечение которого проводят, в количествах, которые, как правило, применяют в медицинских препаратах. Фармацевтически приемлемые носители являются совместимыми с другими компонентами композиции и не делают композицию неподходящей для предполагаемой цели ее применения. Более того, фармацевтически приемлемые носители являются подходящими для применения у субъектов, как представлено в данном документе, без чрезмерных серьезных побочных эффектов (таких как токсичность, раздражение и аллергический ответ). Побочные эффекты являются «чрезмерными», когда их риск преобладает над пользой, обеспечиваемой композицией. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ включают любой из стандартных фармацевтических носителей, таких как фосфатно-буферные солевые растворы, вода и эмульсии, такие как эмульсии масло/вода и микроэмульсии.
[0041] В случае твердых композиций, содержащих лиофилизированный полипептид лизина, для улучшения стабильности можно добавить вспомогательные вещества, такие как мочевина или месна. Другие вспомогательные вещества включают объемообразующие средства, буферные средства, модификаторы тоничности, поверхностно-активные вещества, консерванты и сорастворители.
[0042] В случае твердых композиций для перорального применения, содержащих полипептид лизина, подходящие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества включают, без ограничения, крахмалы, сахара, разбавители, гранулирующие средства, смазывающие средства, связывающие средства, разрыхлители и т.п.
[0043] В случае жидких композиций для перорального применения подходящие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества включают, без ограничения, воду, гликоли, масла, спирты, ароматизирующие средства, консерванты и т.п.
[0044] В случае твердых композиций для местного введения, таких как кремы, гели, пены, мази или спреи, подходящие вспомогательные вещества включают, без ограничения, кремовую, целлюлозную или масляную основу, эмульгирующие средства, наполнители, повышающие жесткость, средства, модифицирующие реологические свойства, или загустители, поверхностно-активные вещества, смягчающие средства, консерванты, увлажняющие средства, подщелачивающие или буферные средства и растворители.
[0045] Подходящие вспомогательные вещества для получения пенной основы включают, без ограничения, пропиленгликоль, эмульгирующий воск, цетиловый спирт и глицерилстеарат.Потенциальные консерванты включают метилпарабен и пропилпарабен.
[0046] Термин «эффективное количество» означает количество, которое при применении или введении с соответствующей частотой или режимом введения доз является достаточным для предотвращения или ингибирования роста бактерий или предотвращения, снижения или облегчения манифестации, тяжести, длительности или прогрессирования нарушения, лечение которого проводят (здесь - роста бактериального патогена или инфекции), предотвращения распространения нарушения, лечение которого проводят, вызова регрессии нарушения, лечение которого проводят, или усиления либо улучшения профилактического или терапевтического эффекта или эффектов другой терапии, такой как терапия антибиотиками или бактериостатическая терапия.
[0047] Термин «совместное введение» включает отдельное введение полипептида лизина и антибиотика или любого другого антибактериального средства последовательным способом, а также введение данных средств по существу одновременным способом, например, в единой смеси/композиции или в дозах, которые вводят отдельно, но, несмотря на это, вводят по существу одновременно субъекту, например, в различное время в один и тот же день или 24-часовой период. Такое совместное введение полипептидов лизина с одним или несколькими дополнительными антибактериальными средствами может быть обеспечено в виде непрерывного лечения, которое длится в течение дней, недель или месяцев. Дополнительно, в зависимости от применения, совместное введение необязательно должно быть непрерывным или одинаковым по длительности. Например, если применение в качестве местного антибактериального средства использовали для лечения, например, бактериальной язвы или инфицированной диабетической язвы, лизин можно вводить исключительно вначале в течение 24 часов после применения первого антибиотика, а затем можно продолжать применение антибиотика без дополнительного введения лизина.
[0048] Термин «субъект» означает субъекта, лечение которого проводят, и включает, среди прочего, млекопитающее, растение, низшее растение, одноклеточный организм или культуру клеток. Например, термин «субъект» включает организмы, например, прокариоты и эукариоты, которые восприимчивы к грамотрицательным бактериальным инфекциям или страдают от них. Примеры субъектов включают млекопитающих, например, людей, собак, коров, лошадей, свиней, овец, коз, кошек, мышей, кроликов, крыс и трансгенных животных, отличных от человека. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения субъект представляет собой человека, например, человека, страдающего от грамотрицательной бактериальной инфекции, подверженного риску заражения или восприимчивого к грамотрицательной бактериальной инфекции, вне зависимости от того, является ли такая инфекция системной или ограничена конкретным органом или тканью.
[0049] Термин «полипептид» используется взаимозаменяемо с термином «белок» и «пептид» и означает полимер, состоящий из остатков аминокислот и содержащий по меньшей мере приблизительно 30 остатков аминокислот.Термин включает не только полипептиды в выделенной форме, но также их активные фрагменты и производные (как определено ниже). Термин «полипептид» также включает слитые белки или слитые полипептиды, содержащие полипептид лизина, описанный ниже, и сохраняющие функцию лизина. Полипептид может представлять собой встречающийся в природе полипептид либо сконструированный или полученный синтетическим способом полипептид. Конкретный полипептид лизина может, например, быть получен или выделен из нативного белка посредством ферментативного или химического расщепления либо может быть получен с применением общепринятых методик пептидного синтеза (например, твердофазного синтеза) или методик молекулярной биологии (таких как таковые, раскрытые в руководстве Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), или может быть, следуя определенной стратегии, усечен или сегментирован с получением активных фрагментов, как проиллюстрировано, например, в данном документе фрагментом GN4, содержащим амфипатический домен GN4, и другими усеченными версиями указанного фрагмента, сохраняющими активность лизина против той же или по меньшей мере одной общей бактерии-мишени. Также включены варианты нативных полипептидов лизина, которые характеризуются идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 98% с нативным полипептидом лизина (который, как указано выше, включает активные фрагменты нативного белка лизина).
[0050] Термин «слитый полипептид» означает продукт экспрессии, полученный в результате слияния двух или нескольких сегментов нуклеиновой кислоты, который приводит к получению слитого продукта экспрессии, как правило, содержащего два домена или сегмента с различными свойствами или функциональными возможностями. В более конкретном смысле термин «слитый полипептид» также означает полипептид или пептид, содержащий два или более гетерологичных полипептидов или пептидов, ковалентно связанных напрямую или посредством аминокислотного или пептидного линкера. Полипептиды, образующие слитый полипептид, как правило, связаны С-концом к N-концу, хотя они могут также быть связаны С-концом к С-концу, N-концом к N-концу или N-концом к С-концу. Термин «слитый полипептид» можно использовать взаимозаменяемо с термином «слитый белок». Таким образом, неограничивающее выражение «полипептид, содержащий» определенную структуру, включает молекулы, превышающие указанную структуру, такие как слитые полипептиды.
[0051] Термин «гетерологичный» означает нуклеотидные, пептидные или полипептидные последовательности, которые в природе не являются непрерывными. Например, в контексте настоящего изобретения термин «гетерологичный» можно использовать для описания комбинации или слияния двух или более пептидов и/или полипептидов, с которыми в норме слитый пептид или полипептид не обнаруживают в природе, такой как, например, полипептид лизина или его активного фрагмента и катионный и/или поликатионный пептид, амфипатический пептид, пептид суши (Ding et al. Cell Mol Life Sci., 65(7-8): 1202-19 (2008)), пептид дефензин (Ganz, Т. Nature Reviews Immunology 3, 710-720 (2003)), гидрофобный пептид и/или антимикробный пептид, который может обладать усиленной активностью лизина. В данное определение включены два или более полипептидов лизина или его активных фрагментов, которые можно использовать для получения слитого полипептида с активностью лизина.
[0052] Термин «активный фрагмент» означает часть полноразмерного полипептида, раскрытого в данном документе, которая сохраняет одну или несколько функций или биологических активностей выделенного исходного полипептида. См., например, GN4 на Фигуре 2 и его фрагменты на Фигуре 5 (FGN4-1 и FGN4-2). Биологическая активность, представляющая в данном документе особенный интерес, соответствует лизину, способному проникать через внешнюю мембрану и гидролизовать покрытие грамотрицательных бактерий, будь то посредством расщепления сахарного остова или пептидной связи.
[0053] Термин «амфипатический пептид» означает пептид, содержащий как гидрофильные, так и гидрофобные функциональные группы. Предпочтительно, вторичная структура располагает гидрофобные и гидрофильные остатки аминокислот на различных концах пептида. Данные пептиды часто принимают спиральную вторичную структуру.
[0054] Термин «катионный пептид» означает пептид, содержащий положительно заряженные остатки аминокислот.Предпочтительно, катионный пептид характеризуется значением pKa, составляющим 9,0 или более. Термин «катионный пептид» в контексте настоящего изобретения также включает поликатионные пептиды.
[0055] Термин «поликатионный пептид» в данном документе означает полученный синтетическим способом пептид, состоящий преимущественно из положительно заряженных остатков аминокислот, в частности, остатков лизина и/или аргинина. Остатки аминокислот, которые не являются положительно заряженными, могут представлять собой нейтрально заряженные остатки аминокислот и/или отрицательно заряженные остатки аминокислот, и/или гидрофобные остатки аминокислот.
[0056] Термин «гидрофобная группа» означает химическую группу, такую как боковая цепь аминокислоты, которая характеризуется низкой аффинностью или отсутствием аффинности в отношении молекул воды, но большей аффинностью в отношении молекул масла. Гидрофобные вещества имеют тенденцию характеризоваться низкой растворимостью или отсутствием растворимости в воде или водных фазах и, как правило, являются неполярными, но имеют тенденцию характеризоваться более высокой растворимостью в масляных фазах. Примеры гидрофобных аминокислот включают глицин (Gly), аланин (Ala), валин (Val), лейцин (Leu), изолейцин (Не), пролин (Pro), фенилаланин (Phe), метионин (Met) и триптофан (Trp).
[0057] Термин «увеличение» в контексте настоящего изобретения означает, что степень антимикробной активности превышает таковую, которая наблюдалась бы в противном случае. «Увеличение» включает аддитивные, а также синергетические (сверхаддитивные) эффекты.
[0058] Термин «синергетический» или «сверхаддитивный» в отношении эффекта означает благоприятный эффект, обусловленный двумя активными веществами, который превосходит эффект, вызываемый каждым веществом, введенным или применяемым в отдельности. Один или оба активных компонента можно применять на субпороговом уровне, т.е. уровне, на котором активное вещество при применении в отдельности не оказывает эффекта или оказывает весьма ограниченный эффект.
[0059] Термин «лечение» означает любой процесс, действие, применение, терапию или т.п., при которых субъект, включая человека, получает медицинскую помощь с целью обеспечения лечения или излечения расстройства, или уничтожения или истребления патогена, или улучшения состояния субъекта, напрямую либо опосредованно. Лечение также означает снижение заболеваемости или облегчение симптомов, устранение повторного возникновения, предотвращение повторного возникновения, предотвращение заболеваемости, улучшение симптомов, улучшение прогноза или комбинации указанных событий. «Лечение» также включает уменьшение количества, скорости роста или вирулентности бактерий у субъекта и посредством этого контроль над бактериальной инфекцией или снижение бактериальной инфекции у субъекта или бактериальной контаминации органа либо ткани или окружающей среды. Таким образом, «лечение», которое снижает заболеваемость, является эффективным для ингибирования роста по меньшей мере одной грамотрицательной бактерии в конкретной среде, независимо от того, является ли таковая субъектом или окружающей средой. С другой стороны «лечение» уже установившейся инфекции или контаминации означает уменьшение популяции или уничтожение, включая даже истребление, грамотрицательных бактерий, ответственных за инфекцию или контаминацию.
[0060] Термин «предотвращение» включает предотвращение заболеваемости, повторного возникновения, распространения, манифестации или установления нарушения, такого как бактериальная инфекция. Не предполагается, что настоящее изобретение ограничено полным предотвращением или предотвращением установления инфекции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отсрочивают манифестацию или снижают тяжесть обусловленного впоследствии заболевания, что является примерами предотвращения. Обусловленные заболевания в контексте настоящего изобретения включают таковые, манифестация которых сопровождается клиническими или предклиническими симптомами, такими как обнаружение бактериального патогена, а также обнаружение роста бактериального патогена, когда симптомы, связанные с данной патологией, еще не проявляются.
[0061] Термин «производное» в контексте пептида или полипептида (который, как указано в данном документе, включает активный фрагмент) включает, например, полипептид, модифицированный для добавления одного или нескольких химических фрагментов, отличных от аминокислот, которые по существу не оказывают отрицательного влияния или не подавляют активность лизина. Химический фрагмент может быть ковалентно связан с пептидом, например, посредством амино-концевого остатка аминокислоты, карбокси-концевого остатка аминокислоты или внутреннего остатка аминокислоты. Такие модификации включают добавление защитной или кэпирующей группы на реактивный фрагмент, добавление обнаруживаемой метки, такой как антитело и/или флуоресцентная метка, добавление или модификацию гликозилирования или добавление объемной группы, такой как ПЭГ (ПЭГилирование), или другие изменения, которые по существу не оказывают отрицательного влияния или не подавляют активность полипептида лизина.
[0062] Широко используемые защитные группы, которые можно добавить к полипептидам лизина, включают, без ограничения, t-Boc и Fmoc.
[0063] Широко используемые белки-флуоресцентные метки, такие как, без ограничения, зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein, GFP), красный флуоресцентный белок (red fluorescent protein, RFP), голубой флуоресцентный белок (cyan fluorescent protein, CFP), желтый флуоресцентный белок (yellow fluorescent protein, YFP) и mCherry, представляют собой компактные белки, которые могут быть связаны ковалентно или нековалентно с полипептидом лизина или слиты с полипептидом лизина без препятствования нормальным функциям белков клеток. Как правило, полинуклеотид, кодирующий флуоресцентный белок, встраивают выше или ниже последовательности полинуклеотида лизина. В результате этого будет получен слитый белок (например, полипептид лизина::GFP), который не препятствует функции клетки или функции полипептида лизина, к которому он присоединен.
[0064] Конъюгацию полиэтиленгликоля (ПЭГ) с белками применяли в качестве способа увеличения периода полужизни множества фармацевтических белков в кровотоке. Таким образом, в контексте производных полипептида лизина термин «производное» включает полипептиды лизина, модифицированные химическим способом посредством ковалентного присоединения одной или нескольких молекул ПЭГ. Предполагается, что ПЭГилированные полипептиды лизина будут демонстрировать пролонгированный период полужизни в кровотоке по сравнению с неПЭГилированными полипептидами лизина, при этом сохраняя биологическую и терапевтическую активность.
[0065] Термин «процент идентичности аминокислотной последовательности» в отношении последовательностей полипептида лизина определен в данном документе как процент остатков аминокислот в последовательности-кандидате, которые идентичны остаткам аминокислот в конкретной последовательности полипептида лизина после выравнивания последовательностей и введения пропусков, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей и без учета каких бы то ни было консервативных замен как части идентичности последовательности. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотной последовательности можно осуществить различными путями, которые известны специалистам в данной области техники, например, с помощью общедоступного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST или Megalign (DNASTAR). Две или более полипептидные последовательности могут быть идентичны на 0-100%, или на любое целое число между указанными значениями. В контексте настоящего изобретения два полипептида являются «по существу идентичными», когда по меньшей мере 80% остатков аминокислот (предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90% и, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 95%) являются идентичными. Термин «процент (%) идентичности аминокислотной последовательности», как описано в данном документе, также применим к пептидам лизина. Таким образом, термин «по существу идентичные» включает мутантные, усеченные, слитые или иные варианты с модифицированной последовательностью выделенных полипептидов лизина и пептидов, описанных в данном документе, и активные фрагменты указанных вариантов, а также полипептиды с существенной идентичностью последовательности (например, идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%, которая измерена, например, одним или несколькими способами, упомянутыми выше), по сравнению с эталонным полипептидом.
[0066] Две аминокислотные последовательности являются «по существу гомологичными», если по меньшей мере приблизительно 80% остатков аминокислот (предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90% и, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 95%) являются идентичными или представляют собой консервативные замены. Последовательности полипептидов лизина согласно настоящему изобретению являются по существу гомологичными, если одна или более, или несколько, или вплоть до 10%, или вплоть до 15%, или вплоть до 20% аминокислот полипептида лизина замещены аналогичными или консервативными заменами аминокислот, и причем полученный в результате лизин характеризуется профилем активностей, антибактериальными эффектами и/или бактериальными специфичностями полипептидов лизина, раскрытых в данном документе. Значение «по существу гомологичные», описанное в данном документе, также применимо к пептидам лизина.
[0067] Термин «ингалируемая композиция» означает фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, которые приготовлены в состав для прямой доставки в дыхательные пути в течение или в сочетании с обычным или вспомогательным дыханием (например, посредством интратрахеобронхиального, легочного и/или назального введения), включая, без ограничения, мелкодисперсные, распыляемые составы, сухой порошок и/или составы в виде аэрозоля.
[0068] Термин «биопленка» означает бактерии, которые присоединены к поверхностям и агрегируют в гидратированный полимерный матрикс, произведенный в процессе собственного синтеза. Биопленка представляет собой совокупность микроорганизмов, в которой клетки прилипают друг к другу на поверхности. Данные прилипающие клетки часто являются включенными в самопродуцируемый матрикс внеклеточного полимерного вещества (ВПВ). Биопленка ВПВ, которую также называют слизью (несмотря на то, что не все, описанное как слизь, представляет собой биопленку) или налетом, представляет собой полимерный конгломерат, как правило, состоящий из внеклеточной ДНК, белков и полисахаридов.
[0069] Термин «подходящий» в контексте антибиотика, подходящего для применения против определенных бактерий, означает антибиотик, который, как было обнаружено, является эффективным против данных бактерий, даже если впоследствии развивается резистентность.
[0070] Термин «антимикробный пептид» (АМП) означает члена широкого диапазона коротких (как правило, от 6 до 50 остатков аминокислот в длину) катионных кодируемых генами пептидных антибиотиков, которые можно обнаружить практически в каждом организме. Различные АМП демонстрируют различные свойства, и множество пептидов данного класса интенсивно исследуют не только в качестве антибиотиков, но также в качестве матриц для пептидов, проникающих через клетки. Несмотря на несколько общих характеристик (например, катионность, амфипатичность и короткий размер), последовательности АМП в значительной степени варьируют, и для классификации разнообразия наблюдаемых конформаций АМП были предложены по меньшей мере четыре структурные группы (альфа-спираль, бета-слой, протяженная и петлевая). Аналогично, было предложено несколько способов действия в качестве антибиотиков, и было показано, например, что первичной мишенью многих из данных пептидов является мембрана клетки, тогда как для других пептидов первичной мишенью является цитоплазматическая инвазия и нарушение метаболических функций ядра. АМП могут стать в достаточной степени концентрированными, чтобы демонстрировать кооперативную активность, несмотря на отсутствие специфичного связывания с мишенью; например, посредством образования поры в мембране, как в случае большинства АМП. Однако данный феномен наблюдался исключительно на модельных фосфолипидных бислоях, и в некоторых случаях для осуществления данных событий требовались концентрации АМП в мембране, которые составляли вплоть до одной молекулы пептида на шесть молекул фосфолипида. Данные концентрации близки, если не соответствуют, полному насыщению мембраны. Поскольку минимальная ингибирующая концентрация (МИК) для АМП, как правило, находится в низком микромолярном диапазоне, по понятным причинам возник скептицизм относительно значимости данных порогов и их важности in vivo (Melo et al., Nature Reviews Microbiology, 7, 245-250 (2009)).
[0071] Дефензины представляют собой обширное семейство небольших катионных обогащенных цистеином и аргинином антимикробных пептидов, обнаруженных как у позвоночных, так и у беспозвоночных (Wilmes, М. and Sahl, Н., Int J Med Microbiol.; 304(1): 93-9 (2014)). Дефензины подразделяют на пять групп в зависимости от пространственного расположения цистеинов: дефензины растений, беспозвоночных, альфа-, бета- и тета-дефензины. Последние три преимущественно обнаруживают у млекопитающих. Альфа-дефензины представляют собой белки, обнаруживаемые в нейтрофилах и эпителии кишечника. Бета-дефензины наиболее широко распространены и секретируются лейкоцитами и эпителиальными клетками многих типов, тета-дефензины на сегодняшний день встречаются редко, например, в лейкоцитах макаков-резус. Дефензины являются активными против бактерий, грибов и многих оболочечных и безоболочечных вирусов. Однако концентрации, необходимые для эффективного уничтожения бактерий, являются преимущественно высокими, т.е. находятся в микромолярном диапазоне. Активность многих пептидов может быть ограничена в присутствии физиологических солевых условий, двухвалентных катионов и сыворотки. Помимо этого, дефензины часто обладают гемолитической активностью, которая нежелательна для продуктов и способов согласно настоящему изобретению.
[0072] Пептиды суши характеризуются наличием доменов суши, также известных как модули контрольного белка комплемента (complement control protein, ССР) или короткие консенсусные повторы (short consensus repeats, SCR)). Домены суши обнаружены во многих белках комплемента и адгезивных белках, которые содержат тандемно организованные домены суши, разделенные короткими линкерными последовательностями. Домены суши содержат консенсусную последовательность, охватывающую приблизительно 60 остатков, которая в свою очередь содержит четыре инвариантных остатка цистеина, участвующих во внутримолекулярных дисульфидных связях, в высокой степени консервативный триптофан и консервативный глицин, пролин и гидрофобные остатки (Kirkitadze, М. and Barlow, P., Immunol Rev., 180:146-61 (2001)). Известно, что домены суши участвуют во взаимодействиях белок-белок и белок-лиганд. Было показано, что пептиды, содержащие домен суши, обладают антимикробными активностями (Ding, JL. and Но, В. Drug Development Research, 62: 317-335 (2004)).
[0073] Кателицидины представляют собой мультифункциональные антимикробные пептиды, также известные как катионные пептиды иммунной защиты (cationic host-defence peptides, CHDP) - класс пептидов, предложенных в качестве антимикробных терапевтических средств, - и являются важным компонентом природной защиты хозяина от инфекции. Помимо микробицидного потенциала, данные пептиды обладают свойствами с возможностью модулировать воспаление и иммунитет.В последнее время было обнаружено, что доставка экзогенного кателицидина человека LL-37 усиливает защитный провоспалительный ответ на инфекцию на модели острой инфекции легких P. aeruginosa на мышах, демонстрируя опосредованное кателицидином повышение клиренса бактерий in vivo (Beaumont et al. PLoS One. 2; 9(6):e99029 (2014)). Таким образом, кателицидин эффективно способствовал клиренсу бактерий из легких при отсутствии прямой микробицидной активности, с усиленным ранним ответом нейтрофилов, для которого требовалось воздействие как инфекции, так и пептида, и не зависел от образования нативного кателицидина. Более того, несмотря на то, что дефицитные по кателицидину мыши демонстрировали интактный ранний клеточный воспалительный ответ, у данных животных отсутствовал ответ нейтрофилов поздней фазы на инфекцию с в значительной степени нарушенным клиренсом P. aeruginosa. Данные результаты продемонстрировали важность модулирующих свойств кателицидинов при легочной инфекции in vivo и подчеркнули ключевую роль кателицидинов в индукции защитных легочных ответов нейтрофилов, специфичных к инфекционной среде. Beaumont, Р.Е. et al, PLoS One. 2014; 9(6): e99029. Опубликовано онлайн 2 июня 2014. doi: 10.1371/iournal.pone.0099029.
ВАРИАНТЫ РЕАЛИЗАЦИИ
[0074] Настоящее изобретение относится к новым антибактериальным средствам против грамотрицательных бактерий. В частности, настоящее изобретение относится к полипептидам лизина (включая их активные фрагменты), активным против грамотрицательных бактерий, таких как Pseudomonas aeruginosa. Примеры таких полипептидов лизина являются таковыми, которые содержат аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 10. Нативные последовательности были идентифицированы посредством биоинформационных способов из ранее секвенированного, но частично установленного фагового генома. Несмотря на то что некоторые из последовательностей, идентифицированных таким образом, были аннотированы как предполагаемые эндолизины, ранее полипептидам, содержащим данные последовательности, с определенностью не предписывали какую-либо функцию. Более того, несколько последовательностей, аннотированных как предполагаемые эндолизины, при синтезе или экспрессии оказались полностью лишенными активности лизина или неактивными против патогена-мишени. При выделении, экспрессии и исследовании лишь единицы из идентифицированных биоинформационными способами последовательностей фактически обладали функцией грамотрицательного лизина. Дополнительно были идентифицированы активные фрагменты лизинов и были получены активные пептиды и полипептиды с модифицированной последовательностью, обладающие активностью грамотрицательного лизина. Более того, согласно настоящему изобретению такие пептиды с модифицированной последовательностью включают фрагменты подтвержденных нативных грамотрицательных полипептидов лизина, сохраняющие активность лизина, а также варианты указанных полипептидов, которые характеризуются идентичностью последовательности 80% или более (например, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85% или по меньшей мере 98%) с нативными полипептидами лизина или активными фрагментами указанных полипептидов, и в действительности неидентичные части могут содержать замены на природные и неприродные (синтетические) остатки аминокислот.Авторы настоящего изобретения определили, что альфа-спиральный домен С-терминального конца данных полипептидов является важным для активности грамотрицательного лизина, и провели исследования для точного определения активности, но любой пептид с последовательностью, которая на 80% или более (например, на 85%, 90%, 95% или 98% или 99%) идентична нативным лизинам, раскрытым в данном документе, или фрагментам указанных лизинов, можно быстро исследовать в отношении активности против грамотрицательных бактерий, включающих P. aeruginosa и другие, такие как Klebsiella spp., Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis и Franciscella tulerensis. В таком исследовании можно следовать, например, руководствам, представленным в Примерах 2, 3, 4 или в Примере возможного применения 1. Разумеется, процедуры и протоколы исследования сами по себе не ограничены таковыми из данных примеров, но могут представлять собой любые способы, известные специалистам в данной области техники для оценки эффективности антибактериальных, а также антимикробных средств.
[0075] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложены способы лечения бактериальной инфекции у субъекта, вызванной грамотрицательными бактериями, причем указанные способы включают введение субъекту эффективного количества полипептида лизина, который характеризуется идентичностью аминокислотной последовательности по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95% с SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 10. Бактерии могут быть выбраны из группы, состоящей из Acinetobacter baumannii, Acinetobacter haemolyticus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aeromonas hydrophila, Bacteroides fragilis, Bacteroides theataioatamicron, Bacteroides distasonis, Bacteroides ovatus, Bacteroides vulgatus, Bordetella pertussis, Brucella melitensis, Burkholderia cepacia, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei Fusobacterium, Prevotella corporis, Prevotella intermedia, Prevotella endodontalis, Porphyromonas asaccharolytica, Campylobacter jejuni, Campylobacter fetus, Campylobacter coli, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Edwarsiella tarda, Eikenella corrodens, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Enterobacter agglomerans, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, Kingella kingae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella rhinoscleromatis, Klebsiella ozaenae, Legionella penumophila, Moraxella catarrhalis, Morganella morganii, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pasteurella multocida, Plesiomonas shigelloides, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Proteus myxofaciens, Providencia stuartii, Providencia rettgeri, Providencia alcalifaciens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Serratia marcescens, Shigella Jlexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Stenotrophomonas maltophilia, Streptobacillus moniliformis, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Ricketsia prowazekii, Coxiella burnetii, Ehrlichia chafeensis и Bartonella hensenae. Например, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения грамотрицательная бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную бактериями, которые выбраны из группы, состоящей из Acinetobacter baumannii, Bordetella pertussis, Burkholderia cepacia, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Legionella penumophila, Moraxella catarrhalis, Morganella morganii, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pasteurella multocida, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Serratia marcescens, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Stenotrophomonas maltophilia, Vibrio cholera и Chlamydia pneumoniae. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения грамотрицательная бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную одной или несколькими бактериями, которые выбраны из группы, состоящей из Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella spp., Escherichia coli, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella пневмония, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitides, Serratia spp.Proteus mirabilis, Morganella morganii, Providencia spp., Edwardsiella spp., Yersinia spp., Haemophilus influenza, Bartonella quintana, Brucella spp., Bordetella pertussis, Burkholderia spp., Moraxella spp., Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Bacteroides spp., Enterobacter spp.и Chlamydia spp.
[0076] На основании того (i) факта, что пептиды и полипептиды лизина согласно настоящему изобретению способны проникать через ВМ грамотрицательных бактерий и достигать своего субстрата, уничтожать такие бактерии и по существу снижать скорость роста колоний бактерий, и (ii) аналогичных наблюдений над другими полипептидами лизина, которые сконструированы для проникновения через ВМ в буфере и среде, такими как артилизины, предполагается, что полипептиды лизина согласно настоящему изобретению будут подходящими для лечения одной или нескольких грамотрицательных бактериальных инфекций. Более того, тот факт, что полипептиды лизина согласно настоящему изобретению обладают активностью против грамотрицательных мишеней даже до слияния (в случае его наличия) с катионными и другими антимикробными пептидами, может характеризоваться преимуществом над артилизинами, поскольку последние, как представляется, ингибируются сывороткой человека. Deslouches, В. et al, Activity of the De Novo Engineered Antimicrobial Peptide WLBU2 against Pseudomonas aeruginosa in Human Serum and Whole Blood: Implications for Systemic Applications, Antimicrobial Agents & Chemotherapy, Aug. 2005, p. 3208-3216 Vol. 49, No 8; Brogden N. et al, Int J Antimicrob Agents. 2011 September; 38(3): 217-225. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2011.05.004; Svenson, J. et al, J. Med. Chem., 2007, 50 (14), pp 3334-3339.
[0077] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения термины «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать, среди прочего, инфекцию дыхательных путей (ИДП), в особенности, но не исключительно, инфекции нижних дыхательных путей. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения термины «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать заболевание, передающееся половым путем. Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения термины «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать инфекцию мочевыводящих путей. Согласно следующему варианту реализации настоящего изобретения термины «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать острые приступы хронического бронхита (acute exacerbation of chronic bronchitis, АСЕВ). Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать инфекции дыхательных путей пациентов, страдающих от кистозного фиброза (КФ). Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать острый отит среднего уха или неонатальную септицемию. Согласно следующему варианту реализации настоящего изобретения термины «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать острый синусит.Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения термины «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать инфекцию, вызванную резистентными к лекарственным средствам бактериями, даже резистентными к различным лекарственным средствам бактериями. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения термины «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать сепсис вследствие осложнений катетеризации. Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения термины «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать хламидию. Согласно следующему варианту реализации настоящего изобретения термины «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать внебольничную пневмонию (ВП) или нозокомиальные инфекции дыхательных путей. Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения термины «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать осложненную инфекцию кожи и кожных структур. Согласно следующему варианту реализации настоящего изобретения термины «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать неосложненные инфекции кожи и кожных структур. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретенитермины «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать эндокардит. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения термины «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать фебрильную нейтропению. Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения термины «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать гонококковый цервицит. Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения термины «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать гонококковый уретрит. Согласно следующему варианту реализации настоящего изобретения термины «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать внутрибольничную пневмонию (ВБП). Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения термины «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать остеомиелит.Согласно следующему варианту реализации настоящего изобретения термины «инфекция» и «бактериальная инфекция» могут означать сепсис.Распространенные грамотрицательные патогены и вызываемые ими инфекции перечислены в Таблице 1 настоящего изобретения. Данные варианты реализации, а также патогены и заболевания, перечисленные в Таблице 1, предназначены в качестве примеров вариантов применения способов согласно настоящему изобретению и не являются ограничивающими.
[0078] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложены способы лечения грамотрицательной бактериальной инфекции у субъекта, вызванной Pseudomonas aeruginosa и, необязательно, по меньшей мере одним дополнительным видом грамотрицательных бактерий, таким как таковые, выбранные из группы, состоящей из Klebsiella spp., Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis и Franciscella tulerensis, которые представляют собой грамотрицательные бактерии, наиболее значимые при заболеваниях человека.
[0079] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложены способы лечения грамотрицательной бактериальной инфекции у субъекта, вызванной Pseudomonas aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) представляет собой оксидаза-положительный грамотрицательный палочковидный организм, который обнаружен повсеместно в окружающей среде. P. aeruginosa может расти во множестве сред обитания, включая, без ограничения, почву, воду, а также на тканях растений и животных. P. aeruginosa представляет собой оппортунистический организм и один из наиболее проблематичных нозокомиальных патогенов, способных вызывать локализованное или системное заболевание у восприимчивых индивидуумов, таких как люди, страдающие от кистозного фиброза, рака, ожогов, диабетических язв или дефектов иммунной системы. В частности, в больничных условиях P. aeruginosa стал резистентным ко многим широко используемым антибиотикам.
[0080] Согласно данным Центров США по контролю и профилактике заболеваний и Национальной системы мониторинга нозокомиальных инфекций P. aeruginosa является второй наиболее частой причиной нозокомиальной пневмонии, третьей наиболее частой причиной инфекции мочевыводящих путей, четвертой наиболее частой причиной инфекции в области хирургического вмешательства, седьмым наиболее часто выделяемым патогеном из сосудистого русла и пятым наиболее распространенным изолятом из всех участков в целом (Solh and Alhajhusain, J Antimicrob Chemother. 64(2): 229-38 (2009)). Более того, P. aeruginosa является наиболее распространенным резистентным к различным лекарственным средствам (РЛС) грамотрицательным патогеном, вызывающим пневмонию у госпитализированных пациентов (Goossens et al., Clin Microbiol Infect. 980-3 (2003)).
[0081] Неограничивающие примеры инфекций, вызванных P. aeruginosa, включают: A) Нозокомиальные инфекции: 1. Инфекции дыхательных путей, в особенности, у пациентов, страдающих от кистозного фиброза, и пациентов с искусственной вентиляцией легких; 2. Бактериемию и сепсис; 3, Раневые инфекции, в частности, таковые у пострадавших от ожогов; 4. Инфекции мочевыводящих путей; 5. Послеоперационные инфекции на инвазивных устройствах; 6. Эндокардит в результате внутривенного введения контаминированных растворов лекарственных средств; 7, Инфекции у пациентов с синдромом приобретенного иммунодефицита, химиотерапией рака, стероидной терапией, гематологическими злокачественными опухолями, трансплантацией органов, заместительной почечной терапией и другими состояниями с тяжелой нейтропенией. В) Внебольничные инфекции: 1. Внебольничные инфекции дыхательных путей; 2. Менингит; 3. Фолликулит и инфекции ушного канала, вызванные контаминированной водой; 4. Злокачественный отит наружного уха у пожилых людей и лиц, страдающих от диабета; 5. Остеомиелит пяточной кости у детей; 6. Глазные инфекции, обычно вызванные контаминированными контактными линзами; 7. Инфекции кожи, такие как инфекции ногтя у людей, руки которых часто подвергаются воздействию воды; 8. Инфекции желудочно-кишечного тракта; и 9. Инфекции скелетно-мышечной системы.
[0082] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептиды лизина согласно настоящему изобретению применяют для лечения субъекта, который подвержен риску приобретения инфекции, вызванной P. aeruginosa и/или другой грамотрицательной бактерией. Субъекты, подверженные риску заражения P. aeruginosa или другой грамотрицательной бактериальной инфекцией, включают, например, без ограничения, пациентов с кистозным фиброзом, пациентов с нейтропенией, пациентов с некротизирующим энтероколитом, пострадавших от ожогов, пациентов с раневыми инфекциями и, в более широком смысле, пациентов в больничных условиях, в частности, пациентов, нуждающихся в хирургической помощи, и пациентов, получавших лечение с применением имплантируемого медицинского устройства, такого как катетер, например, центральный венозный катетер, устройство Хикмана или электрофизиологические кардиологические устройства, например, кардиостимуляторы и имплантируемые дефибрилляторы. Другие группы пациентов, которые подвержены риску инфекции грамотрицательными бактериями, в том числе P. aeruginosa, включают, без ограничений, пациентов с имплантируемыми протезами, такими как полная замена сустава (например, полная замена колена или тазобедренного сустава).
[0083] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъект страдает от грамотрицательной бактериальной респираторной инфекции. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект страдает от кистозного фиброза, и каждый активный компонент вводят независимо в ингалируемой композиции, пероральной композиции или буккальной композиции. Согласно более конкретному варианту реализации настоящего изобретения субъект страдает от грамотрицательной бактериальной респираторной инфекции, связанной с кистозным фиброзом, и каждый из активных компонентов вводят совместно в ингалируемой композиции. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъект страдает от раны, которая была инфицирована P. aeruginosa или другой грамотрицательной бактерией. Пример раны, которую можно лечить способами согласно настоящему изобретению, представляет собой инфицированный ожог или ожог, подверженный риску инфицирования. Такие ожоги включают термические (тепловые) ожоги, ожоги низкими температурами, химические ожоги, электрические ожоги или радиационные ожоги.
[0084] Дополнительно, P. aeruginosa и другие грамотрицательные бактерии часто колонизируют больничную пищу, раковины, краны, швабры и респираторное оборудование. Инфекция распространяется от пациента к пациенту в результате контакта с фомитами или в результате проглатывания контаминированной пищи и воды (Barbara Iglewski, Medical Microbiology, 4th edition, Chapter 27, Pseudomonas, 1996).
[0085] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептиды лизина согласно настоящему изобретению применяют для лечения грамотрицательной бактериальной инфекции (или инфекции, которая не была охарактеризована) у субъекта в комбинации с другими вариантами терапии. Такая необязательная комбинированная терапия может включать совместное введение пациенту, который нуждается в таком введении, дополнительного терапевтического средства, такого как антибиотик или другое бактерицидное или бактериостатическое средство, и/или другой лизин, нацеленный на отличный компонент поверхности патогена (например, нацеленный на отличный компонент внешней мембраны). Помимо антибиотиков, бактерицидные и бактериостатические средства включают, без ограничения, лизины, дезинфицирующие вещества, антисептические вещества и консерванты. Любые из данных веществ можно необязательно использовать в комбинации с полипептидами лизина согласно настоящему изобретению.
[0086] Антимикробные дезинфицирующие вещества включают, без ограничения, гипохлориты, хлорамины, дихлоризоцианурат и трихлоризоцианурат, мокрый хлор, диоксид хлора, надуксусную кислоту, персульфат калия, перборат натрия, перкарбонат натрия и пергидрат мочевины, иодповидон, настой иода, иодированные неионные поверхностно-активные вещества, этанол, н-пропанол и изопропанол и смеси указанных веществ; 2-феноксиэтанол и 1- и 2-феноксипропанол, крезолы, гексахлорофен, триклозан, трихлорфенол, трибромфенол, пентахлорфенол, Дибромол и соли указанных веществ, бензалкония хлорид, цетил триметиламмония бромид или хлорид, дидецилдиметиламмония хлорид, цетилпиридиния хлорид, бензетония хлорид, хлоргексидин, глюкопротамин, октендина дигидрохлорид, озон и растворы перманганата, коллоидное серебро, нитрат серебра, хлорид ртути, фенилртутные соли, медь, сульфат меди, оксид-хлорид меди, фосфорную кислоту, азотную кислоту, серную кислоту, сульфаминовую кислоту, толуолсульфоновую кислоту, гидроксид натрия, гидроксид калия и гидроксид кальция.
[0087] Комбинация полипептидов лизина согласно настоящему изобретению с антисептическими реактивами может обеспечить большую эффективность против грамотрицательных бактерий, чем комбинации антибиотиков. Антисептические реактивы включают, без ограничения, раствор Дакена, раствор натрия или калия гипохлорита, раствор натрия бензолсульфонамида, определенные препараты иода, такие как иодповидон, пероксиды, такие как растворы пергидрата мочевины и рН-забуференные растворы надуксусной кислоты, спирты с антисептическими добавками или без них, слабые органические кислоты, такие как сорбиновая кислота, бензойная кислота, молочная кислота и салициловая кислота, некоторые фенольные соединения, такие как гексахлорофен, триклозан и Дибромол, и катион-активные соединения, такие как бензалконий, хлоргексидин, метилизотиазолон, α-терпинеол, тимол, растворы хлороксиленола и октенидина.
[0088] Лизины согласно настоящему изобретению можно вводить совместно с антибиотиками стандарта лечения или с антибиотиками последней надежды, в отдельности или в различных комбинациях в пределах компетентности в данной области техники. Традиционные антибиотики, используемые против активности P. aeruginosa, включают аминогликозиды, тикарциллин, уреидопенициллины, цефтазидим, цефепим, азтреонам, карбапенемы, ципрофлоксацин, левофлоксацин и т.д. (Таблица 2). Полипептиды лизина согласно настоящему изобретению можно вводить совместно с антибиотиками, применяемыми для лечения P. aeruginosa и другими, перечисленными в Таблице 2. Перечень антибиотиков для других грамотрицательных бактерий, таких как Klebsiella spp., Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis и Franciscella tulerensis, будет аналогичен таковому, представленному для P. aeruginosa, и будет представлять собой антибиотики стандарта лечения для конкретной рассматриваемой бактерии или даже антибиотики последней надежды (если конкретный штамм является резистентным к антибиотикам стандарта лечения).

[0089] Дополнительные необязательные терапевтические средства, которые будут вводить совместно, включают, без ограничения, антибиотики, упомянутые выше, и таковые, перечисленные в Таблице 2, такие как комбинация тикарциллин - клавуланат, комбинация пиперациллин - тазобактам, цефтазидим, цефепим, цефоперазон, ципрофлоксацин, левофлоксацин, имипенем, меропенем, дорипенем, гентамицин, тобрамицин, амикацин, полимиксин В и колистин (полимиксин Е). Терапевтические средства для лечения ран, которые будут введены совместно, включают, без ограничения, пропиленгликоль гидрогель (например, SOLUGEL (Johnson & Johnson)); антисептическое вещество; антибиотик; и кортикостероид.
[0090] В качестве антибактериальных средств для лечения бактериальных инфекций Р. aeruginosa применяли антибиотические пептиды, такие как полимиксин В и родственный колистин (полимиксин Е). Таким образом, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептиды лизина согласно настоящему изобретению будут вводить совместно с полимиксином В и/или колистином.
[0091] Сочетание полипептидов лизина согласно настоящему изобретению с антибиотиками обеспечивает новый эффективный антимикробный режим. Согласно одному варианту реализации совместное введение полипептидов лизина согласно настоящему изобретению с одним или несколькими антибиотиками можно осуществлять при сниженных дозах и количествах лизина или антибиотика или их обоих, и/или при сниженной частоте и/или длительности лечения с увеличением бактерицидной и бактериостатической активности, со снижением риска резистентности к антибиотику и снижением риска пагубных нейрологических или почечных побочных эффектов (таких как таковые, связанные с применением колистина или полимиксина В). Предшествующие исследования продемонстрировали, что общая кумулятивная доза колистина связана с поражением почек; это свидетельствует, что снижение дозы или уменьшение длительности лечения с применением комбинированной терапии полипептидами лизина может снизить частоту нефротоксичности (Spapen et al. Ann Intensive Care. 1: 14 (2011)). В данном документе термин «сниженная доза» означает дозу одного активного компонента в комбинации по сравнению с монотерапией тем же активным компонентом. Это справедливо и для «длительности лечения». Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения доза лизина или антибиотика в комбинации может являться субоптимальной или даже субпороговой по сравнению с соответствующей монотерапией.
[0092] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептиды лизина согласно настоящему изобретению применяют для лечения бактериальной инфекции, такой как инфекция, вызванная резистентными к лекарственным средствам грамотрицательными бактериями. Согласно следующим вариантам реализации настоящего изобретения полипептиды лизина согласно настоящему изобретению в отдельности или вместе с одним или несколькими антибиотиками применяют для лечения бактериальной инфекции, такой как инфекция, вызванная резистентными к различным лекарственным средствам грамотрицательными бактериями. Резистентные к лекарственным средствам или резистентные к различным лекарственным средствам грамотрицательные бактерии в контексте настоящего изобретения включают, без ограничения, P. aeruginosa.
[0093] На практике инфекции часто являются полимикробными со смесью грамположительных и грамотрицательных видов (Citron et al. J Clin Microbiol. 45(9): 2819- 2828 (2007)). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептиды лизина согласно настоящему изобретению, активные против грамотрицательных бактерий, можно использовать не только вместе с антибиотиком, эффективным против грамотрицательных бактерий, но также в комбинации с одним или несколькими антибиотиками и/или с одним или несколькими другими лизинами, подходящими для лечения грамположительных бактерий, в зависимости от инфекции у данного субъекта.
[0094] Согласно одному варианту реализации полипептиды лизина согласно настоящему изобретению способны к разрушению или расщеплению клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения полипептиды лизина согласно настоящему изобретению способны к разрушению или расщеплению клеточной стенки P. aeruginosa.
[0095] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ ингибирования роста одной или нескольких грамотрицательных бактерий, причем указанный способ включает введение субъекту или доставку в конкретную окружающую среду одного или нескольких полипептидов лизина, раскрытых в данном документе, или фармацевтически приемлемой композиции указанных полипептидов в количестве и при условиях, при которых ингибируется рост грамотрицательных бактерий.
[0096] Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ ингибирования роста P. aeruginosa и/или одной или нескольких других грамотрицательных бактерий, причем указанный способ включает введение субъекту одного или нескольких полипептидов лизина, раскрытых в данном документе, в комбинации с другими соответствующими с клинической точки зрения средствами.
[0097] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ увеличения проницаемости внешней мембраны P. aeruginosa и/или одной или нескольких других грамотрицательных бактерий посредством осуществления контакта внешней мембраны с одним или несколькими полипептидами лизина (посредством воздействия на бактерии одного или нескольких полипептидов лизина) согласно настоящему изобретению.
[0098] Согласно следующему варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ увеличения проницаемости внешней мембраны P. aeruginosa и/или одной или нескольких других грамотрицательных бактерий посредством осуществления контакта внешней мембраны с полипептидами лизина, раскрытыми в данном документе, в комбинации с другими соответствующими с клинической точки зрения средствами, такими как антибиотики, бактерицидные средства, антисептические средства и т.д.
[0099] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ увеличения антибиотической активности одного или нескольких антибиотиков против грамотрицательных бактерий по сравнению с активностью указанных антибиотиков, используемых в монотерапии, посредством введения субъекту одного или нескольких полипептидов лизина, раскрытых в данном документе, вместе с антибиотиком, представляющим интерес.Комбинация является эффективной против бактерий и обеспечивает преодоление резистентности против антибиотика и/или применение антибиотика в меньших дозах, что снижает нежелательные побочные эффекты, такие как нефротоксичные и нейротоксичные эффекты полимиксина В.
[00100] Соединения согласно настоящему изобретению можно использовать в монотерапии или в комбинации с дополнительными средствами, пермеабилизирующими внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий, включая, без ограничения, хелаторы металлов, например EDTA, TRIS, молочную кислоту, лактоферрин, полимиксины, лимонную кислоту (Vaara М. Microbiol Rev. 56(3): 395-441 (1992)).
[00101] Согласно одному варианту реализации полипептиды лизина согласно настоящему изобретению являются модифицированными химическим способом. Химическая модификация включает, без ограничения, добавление химических фрагментов, создание новых связей и удаление химических фрагментов. Химические модификации могут возникать где угодно в полипептиде лизина, включая боковые цепи аминокислот, а также амино- или карбоксильный конец. Такие модификации могут присутствовать в полипептиде лизина в более чем одном участке. Более того, одна или несколько боковых групп или концевых групп полипептида лизина могут быть защищены защитными группами, известными среднему специалисту в данной области техники.
2
2
n
[00102] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептиды лизина содержат присоединение фрагмента, увеличивающего время действия. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения фрагмент, увеличивающий время действия, представляет собой полиэтиленгликоль. Полиэтиленгликоль («ПЭГ») применяли для получения терапевтических полипептидов с увеличенным временем действия (Zalipsky, S., Bioconjugate Chemistry, 6: 150-165 (1995); Mehvar, R., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3: 125-136 (2000)). Остов ПЭГ [(CHCH-О-), n: количество повторяющихся мономеров] является гибким и амфифильным. При присоединении к другим химическим молекулам, таким как полипептид лизина, полимерные цепи ПЭГ могут защитить такой полипептид лизина от иммунного ответа и других механизмов клиренса. В результате ПЭГилирование может привести к улучшению эффективности полипептида лизина и безопасности посредством оптимизации фармакокинетики, увеличения биодоступности и снижения иммуногенности и количества и/или частоты введения доз. «ПЭГилирование» означает конъюгацию молекулы ПЭГ с другим соединением, например, полипептидом лизина.
[00103] Согласно одному варианту реализации настоящее изобретение относится к предотвращению, снижению, лечению или устранению грамотрицательной бактериальной контаминации медицинских изделий, поверхностей, таких как полы, лестницы, стены и столешницы в больницах и других зданиях, связанных со здравоохранением, или в зданиях общественного пользования, и поверхностей оборудования в операционных, комнатах оказания неотложной помощи, больничных палатах, клиниках и ванных комнатах и т.п. Примеры медицинских изделий, которые можно защитить с применением композиций, описанных в данном документе, включают, без ограничения, системы для интубаций и другие поверхности медицинских изделий, таких как мочевые катетеры, катетеры для извлечения слизи, катетеры для отсасывания, пупочная канюля, контактные линзы, внутриматочные противозачаточные средства, внутривагинальные и внутрикишечные устройства, эндотрахеальные трубки, бронхоскопы, зубные протезы и ортодонтические аппараты, хирургические инструменты, стоматологические инструменты, системы для интубаций, стоматологические водопроводы, марля, бумага, индикаторные полоски (например, бумажные индикаторные полоски или пластиковые индикаторные полоски), связывающие вещества (например, связывающие вещества на основе гидрогеля, термоплавкие связывающие вещества или связывающие вещества на неводной основе), перевязочный материал, тканевые повязки или заживляющие устройства и закрытые повязки, а также любые другие изделия, контактирующие с поверхностью тела человека, используемые в области медицины. Изделия могут включать электроды, эктопротезы, фиксирующие ленты, давящие повязки и мониторы различных типов. Медицинские изделия могут также включать любое изделие, которое можно разместить в участке введения или имплантации, таком как кожа возле участка введения или имплантации, и которое может содержать по меньшей мере одну поверхность, чувствительную к колонизации грамотрицательными бактериями.
[00104] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептиды лизина согласно настоящему изобретению применяют для предохранения пищи от грамотрицательной бактериальной контаминации, которое включает добавление к пищи композиций согласно настоящему изобретению, содержащих полипептиды лизина. Примерами таких пищевых продуктов являются мясные продукты (вяленые и/или невяленые, свежие и/или после кулинарной обработки), салаты и другие овощные продукты, напитки и молочные продукты, полуфабрикаты, «удобная пища», такая как, например, готовые к употреблению продукты и обезвоженные пищевые продукты, и т.д.
[00105] Одна из проблем, которые бактерии создают для людей, заключается в образовании биопленок. Образование биопленок происходит, когда микробные клетки прилипают друг к другу и включаются в матрикс внеклеточного полимерного вещества (ВПВ) на поверхности. Рост микроорганизмов в такой защищенной среде, обогащенной биомакромолекулами (например, полисахаридами, нуклеиновыми кислотами и белками) и питательными веществами, обеспечивает усиленное микробное взаимодействие и повышенную вирулентность. Поскольку биопленка может развиваться в любой поддерживающей среде, необходимы способ или композиция, которые могут предотвратить или устранить образование биопленки. Было показано, что Pseudomonas aeruginosa образуют биопленки на множестве живых и неживых поверхностях, таких как слизистые массы в легком с КФ, контаминированные катетеры, контактные линзы и т.д. (Sharma et al. Biologicals, 42(1): 1-7 (2014)). Таким образом, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептиды лизина согласно настоящему изобретению можно использовать для предотвращения, контроля, разрушения и лечения бактериальной биопленки, в особенности таковой, образованной P. aeruginosa или с участием P. aeruginosa.
[00106] Полипептиды лизина согласно настоящему изобретению можно использовать in vivo, например, для лечения бактериальных инфекций у субъекта, а также in vitro, например, для обработки клеток (например, бактерий) в культуре для устранения или снижения уровня бактериальной контаминации культуры клеток.
Способы получения полипептидов лизина
[00107] Согласно одному варианту реализации настоящее изобретение включает способы получения полипептидов лизина согласно настоящему изобретению, которые уничтожают или ингибируют рост одной или нескольких грамотрицательных бактерий, предпочтительно, P. aeruginosa, причем указанные способы включают культивирование клетки-хозяина, содержащей полинуклеотид лизина, кодирующий один или несколько полипептидов лизина, в подходящих условиях для экспрессии указанного полипептида.
[00108] Для получения высокого уровня экспрессии полипептида лизина полинуклеотидные последовательности лизина, как правило, экспрессируют посредством функционального связывания их с контрольной последовательностью экспрессии в соответствующем векторе экспрессии и применения данного вектора экспрессии для трансформации соответствующего клеточного хозяина. Такое функциональное связывание полинуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептиды лизина согласно настоящему изобретению, с контрольной последовательностью экспрессии, включает обеспечение кодона инициации, ATG, в правильной рамке считывания выше от полинуклеотидной последовательности (ДНК). Как правило, для экспрессии полипептидов лизина можно применять любую систему или вектор, подходящие для поддержания, размножения или экспрессии полинуклеотидов и/или для экспрессии полипептида в хозяине. Соответствующую последовательность ДНК/полинуклеотидную последовательность можно встроить в систему экспрессии любым из множества хорошо известных и общепринятых способов, таких как, например, способы, представленные в руководстве Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Дополнительно к полипептидам лизина также можно добавить метки для обеспечения удобных способов выделения, например, с-myc, биотин, поли-His и т.д. Наборы для таких систем экспрессии являются коммерчески доступными.
[00109] При экспрессии полинуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептиды лизина согласно настоящему изобретению, можно применять широкое разнообразие комбинаций хозяин/вектор экспрессии. Специалистам в данной области техники известно множество подходящих векторов, которые являются коммерчески доступными. Примеры подходящих векторов приведены в руководстве Sambrook et al, eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001). Такие векторы включают, среди прочих, хромосомные, эписомальные и полученные из вирусов векторы, например, векторы, полученные из бактериальных плазмид, из бактериофага, транспозонов, из дрожжевых эписом, из элементов включения, из хромосомных элементов дрожжей, из вирусов, таких как бакуловирусы, паповавирусы, такие как SV40, вирус осповакцины, аденовирусы, вирусы оспы птиц, вирусы псевдобешенства и ретровирусы и векторы, полученные из комбинаций указанных векторов, таких как таковые, полученные из плазмидных и бактериофаговых генетических элементов, таких как космиды и фагемиды. Более того, указанные векторы могут обеспечивать конститутивную или индуцибельную экспрессию полипептидов лизина согласно настоящему изобретению. Более конкретно, подходящие векторы включают, без ограничения, производные SV40 и известных бактериальных плазмид, например, плазмид Е. coli colE1, pCR1, pBR322, pMB9 и их производных, плазмид, таких как RP4, pBAD24 и pBAD-TOPO; фаговые ДНК, например, многочисленные производные фага λ, например, NM989, и другую фаговую ДНК, например, М13 и нитевидную одноцепочечную фаговую ДНК; плазмиды дрожжей, такие как 2 D плазмида или ее производные; векторы, подходящие в эукариотических клетках, такие как векторы, подходящие в клетках насекомых или млекопитающих; векторы, полученные из комбинаций плазмид и фаговой ДНК, такие как плазмиды, которые были модифицированы для применения фаговой ДНК или других контрольных последовательностей экспрессии; и т.п. Многие из векторов, упомянутых выше, являются коммерчески доступными от поставщиков, таких как New England Biolabs, Addgene, Clontech, Life Technologies etc., многие из которых также обеспечивают подходящие клетки-хозяева).
[00110] Дополнительно, векторы могут содержать различные регуляторные элементы (включая промотор, сайт связывания рибосомы, терминатор, энхансер, различные цис-элементы для контроля уровня экспрессии), причем вектор сконструирован в зависимости от клетки-хозяина. В данных векторах можно применять любую из широкого разнообразия контрольных последовательностей экспрессии (последовательностей, которые контролируют экспрессию полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с ними) для экспрессии полинуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептиды лизина. Подходящие контрольные последовательности включают, без ограничения: ранние или поздние промоторы SV40, CMV, оспавакцины, полиомы или аденовируса, lac-систему, trp-систему, ТАС-систему, TRC-систему, LTR-систему, главную область оператора и промотора фага λ, контрольные области белка оболочки fd, промотор 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислой фосфатазы (например, Pho5), промоторы факторов спаривания дрожжей, промотор Е. coli для экспрессии в бактериях и другие последовательности промоторов, которые, как известно, контролируют экспрессию генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов, и различные комбинации указанных контрольных последовательностей.
[00111] Широкое множество клеток-хозяев является подходящим при экспрессии полипептидов лизина согласно настоящему изобретению. Неограничивающие примеры клеток-хозяев, подходящих для экспрессии полипептидов лизина согласно настоящему изобретению, включают хорошо известных эукариотических и прокариотических хозяев, таких как штаммы Е. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, грибы, такие как дрожжи, и клетки животных, такие как клетки CHO, Rl.1, B-W и L-M, клетки почек африканской зеленой мартышки (например, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 и ВМТ10), клетки насекомых (например, Sf9) и клетки человека, а также клетки растений в культуре клеток. Несмотря на то, что хозяином экспрессии может являться любая известная клетка-хозяин экспрессии, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения хозяин экспрессии представляет собой один из штаммов Е. coli. Данные штаммы включают, без ограничения, коммерчески доступные штаммы Е. coli, такие как Тор10 (Thermo Fisher Scientific), DH5α (Thermo Fisher Scientific), XL1-Blue (Agilent Technologies), SCS110 (Stratagene), JM109 (Promega), LMG194 (АТСС) и BL21 (Thermo Fisher Scientific). Существует несколько преимуществ применения Е. coli в качестве системы-хозяина, включая: быструю кинетику роста, при которой при оптимальных условиях окружающей среды время удвоения бактерии составляет приблизительно 20 мин. (Sezonov et al., J. Bacteriol. 189 8746-8749 (2007)), легкое достижение культур высокой плотности, простую и быструю трансформацию экзогенной ДНК и т.д. Подробности относительно экспрессии белка в Е. coli, включая выбор плазмид, а также выбор штамма, детально обсуждаются в публикации Rosano, G. and Ceccarelli, Е., Front Microbiol, 5: 172 (2014).
[00112] Эффективная экспрессия полипептидов лизина и их векторов зависит от множества факторов, таких как оптимальные сигналы экспрессии (как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции), правильный фолдинг белка и характеристики роста клеток. В качестве способов конструирования вектора и способов трансдукции сконструированного рекомбинантного вектора в клетки-хозяева можно применять общепринятые способы, известные в данной области техники. Хотя понятно, что не все векторы, контрольные последовательности экспрессии и хозяева будут одинаково хорошо функционировать для экспрессии полинуклеотидных последовательностей, кодирующих пептиды лизина согласно настоящему изобретению, специалист в данной области техники способен выбрать надлежащие векторы, контрольные последовательности экспрессии и хозяев без чрезмерного экспериментирования, чтобы осуществить желаемую экспрессию в пределах объема настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения авторы настоящего изобретения обнаружили корреляцию между уровнем экспрессии и активностью экспрессированного полипептида; в системах экспрессии E.coli, в частности, умеренные уровни экспрессии (например, от приблизительно 1 до 10 мг/литр) позволяли получать полипептиды лизина с более высокими уровнями активности, чем таковые, которые экспрессировались в Е. coli при более высоких уровнях (например, от приблизительно 20 до приблизительно 100 мг/литр), причем в последнем случае иногда нарабатывались полностью неактивные полипептиды.
[00113] Полипептиды лизина согласно настоящему изобретению можно восстановить и очистить из культур рекомбинантных клеток хорошо известными способами, включая преципитацию сульфатом аммония или этанолом, экстрагирование кислотой, анионо- или катионобменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию гидрофобных взаимодействий, аффинную хроматографию, хроматографию с гидроксиапатитом и хроматографию с лектином. Для очистки полипептида лизина также можно применять высокоэффективную жидкостную хроматографию.
[00114] В качестве альтернативы, система векторов, применяемая для получения полипептидов лизина согласно настоящему изобретению, может представлять собой бесклеточную систему экспрессии. Различные бесклеточные системы экспрессии являются коммерчески доступными, включая, без ограничения, таковые, доступные от компаний Promega, LifeTechnologies, Clonetech и т.д.
[00115] Как упоминалось выше, существует множество вариантов выбора применительно к получению и очистке белка. Ниже авторы настоящего изобретения приводят в качестве неограничивающего примера общий протокол, который можно использовать для получения полипептидов лизина согласно настоящему изобретению в Е. coli. Примеры подходящих способов и стратегий, которые принимают во внимание при получении и очистке белка, дополнительно представлены в публикации Structural Genomics Consortium, Nat Methods.. 5(2): 135-146 (2008).
Иллюстративный протокол:
1. ДНК, кодирующую полипептид лизина, получают посредством синтеза целого гена.
2. Затем фрагменты ДНК лигируют, предпочтительно, в индуцибельный вектор, такой как pBAD24 (индуцибельный арабинозой), и трансформируют вектором клетки Е. coli (например, ТОР10 от компании Invitrogen, Карлсбад, Калифорния).
3. Трансформированные бактерии переносят на планшеты с агаром с добавлением бульона, такого как лизогенный бульон (Lysogeny broth, LB), агента для индукции вектора (например, 0,2% арабинозы) и селектируемого маркера (например, 50 мкг/мл карбенициллин) и инкубируют, предпочтительно, в течение ночи при температуре 37°С.
4. Отдельные близкие культуры клеток Тор10 Е. coli, содержащие плазмиду лизина, выращивают в бульоне с добавлением селектируемого маркера (например, LB с добавлением 50 мкг/мл карбенициллина), предпочтительно, в течение ночи при температуре 37°С. Затем культуру можно разбавить, например, в соотношении 1:200 в свежей среде с добавлением селектируемого маркера (например, LB с добавлением карбенициллина) и инкубировать, например, в течение еще 3 ч. Экспрессию лизина индуцируют добавлением индуцирующего агента (например, 0,2% L-арабинозы), и клетки инкубируют, предпочтительно, в течение ночи при температуре 30°С.
5. Осадок клеток ресуспендируют в буфере (например, 20 мМ Tris, рН 6,8) и гомогенизируют.
6. Солюбилизацию и очистку белка (с применением одной или нескольких хроматографических методик) осуществляют в хорошо забуференном растворе, содержащем подходящую ионную силу моновалентной соли, например, ионную силу, эквивалентную 300-500 мМ NaCl.
7. На первом этапе очистки, предпочтительно, применяют аффинную хроматографию с использованием иммобилизованных металлов (immobilized metal affinity chromatography, IMAC). Если необходима дополнительная очистка, на следующем этапе можно применять эксклюзионную хроматографию (гель-фильтрацию). При необходимости, в качестве финального этапа можно применять ионообменную хроматографию.
Идентификация полипептидов лизина
[00116] Настоящее изобретение основано на идентификации пяти лизинов с мощной антибактериальной активностью против штамма PAO1 Pseudomonas aeruginosa в фазе экспоненциального роста (примеры 1 и 2). Для идентификации полипептидов лизина согласно настоящему изобретению авторы настоящего изобретения применяли подход на основе биоинформатики в сочетании с антибактериальным скринингом. Из последовательностей, идентифицированных таким образом, некоторые были ранее аннотированы как предполагаемые эндолизины. Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что подавляющее большинство данных последовательностей (был проведен скрининг более 80 полипептидов) не обладает какой-либо активностью лизина или не обладает активностью против организма-мишени, P. aeruginosa. Пять лизинов, идентифицированных как активные, были обозначены как GN37 (SEQ ID NO: 1), GN2 (SEQ ID NO: 2), GN4 (SEQ ID NO: 3), GN14 (SEQ ID NO: 4) и GN43 (SEQ ID NO: 5). Сначала авторы настоящего изобретения оценивали способность очищенных лизинов (которые были синтезированы, клонированы в вектор экспрессии pBAD26, а затем очищены) пермеабилизовать внешнюю мембрану (ВМ) P. aeruginosa (пример 1).
[00117] Большинство грамотрицательных бактерий не включают гидрофобные соединения и не поглощают гидрофобные средства, такие как 1-N-фенилнафтиламин (NPN), кристаллический фиолетовый или 8-анилино-1-нафталенсульфоновая кислота (ANS). Мощная резистентность к гидрофобным соединениям обусловлена наличием внешней мембраны (ВМ), содержащей связанные белки, которые заякоревают ВМ в пептидогликан и поддерживают мембрану стабильной. В связи со своей гидрофобной природой NPN интенсивно флуоресцирует в гидрофобных условиях и слабо - в водных условиях (J Sokatch, The biology of pseudomonas, December 2012, Elsevier). Соответственно, флуоресценцию NPN можно использовать в качестве показателя проницаемости внешней мембраны.
[00118] В настоящем изобретении исследовали способность многочисленных лизинов (GN1, GN2, GN4, GN8, GN14, GN20, GN22, GN26, GN27, GN28, GN30, GN37 и GN43) пермеабилизовать ВМ штамма РАО1 P. aeruginosa посредством инкубации NPN с клетками PAOl в присутствии или при отсутствии вышеуказанных лизинов. Как показано на Фигуре 3, инкубация NPN в присутствии GN37 (SEQ ID NO: 1), GN2 (SEQ ID NO: 2), GN4 (SEQ ID NO: 3), GN14 (SEQ ID NO: 4) и GN43 (SEQ ID NO: 5) привела к большей индукции флуоресценции по сравнению с флуоресценцией, испущенной при отсутствии лизина (отрицательный контроль). Более того, каждый из пяти лизинов (GN2, GN4, GN14, GN37 и GN43) вызывал в значительной степени более сильную проницаемость ВМ по сравнению с таковой, вызываемой общепринятым пермеабилизирующим средством EDTA (этилендиаминтетраацетатом). Более того, каждый из пяти лизинов пермеабилизовал ВМ в аналогичной степени или лучше, чем известный антибиотик последней надежды, применяемый для лечения P. aeruginosa, - полимиксин В (РМВ). Активные лизины согласно настоящему изобретению, как правило, содержат С-концевой (за исключением GN14, который содержит N-концевой) альфа-спиральный амфипатический домен, размер которого варьирует от 15 остатков аминокислот в случае GN14 до 33 остатков аминокислот в случае GN43. Общие характеристики GN2, GN4, GN14, GN37 и GN43, включая последовательность альфа-спирального амфипатического домена, представлены в Таблице 3. Вторичную структуру полипептида можно определить с применением различного программного обеспечения, такого как Jpred4 на сайте http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/. Амфипатические альфа-спирали, в частности, исследовали с применением Helical Wheel (http://kael.net/helical.htm). Также представлены последовательности нуклеиновой кислоты GN37 (SEQ ID NO 11), GN2 (SEQ ID NO 12), GN4 (SEQ ID NO 13), GN14 (SEQ ID NO 14) и GN43 (SEQ ID NO 15) (Фигура 1A и Фигура 2).
Таблица 3. Общие характеристики каждого полипептида лизина и последовательности соответствующих С-концевых альфа-спиральных амфипатических доменов (набранная жирным шрифтом и подчеркнутая область представляет альфа-спиральный амфипатический домен).
[00119] Поскольку GN2, GN4, GN14, GN37 и GN43 демонстрируют мощную активность по пермеабилизации мембраны, оценивали антибактериальную активность каждого из пяти лизинов в отношении штамма PAO1 P. aeruginosa (пример 2). Помимо применения EDTA и РМВ в качестве положительных контролей, в исследование также включали лизоцим и новобиоцин человека. Лизоцим человека (HuLYS) представляет собой встречающийся в природе антимикробный пептид, обнаруженный во множестве тканей, клеток и секретов, вовлеченных в патофизиологию инфекций легких (Callewaert et al. J. Biosci. 35:127-160 (2010)). Было показано, что лизоцим является эффективным против как грамположительных, так и грамотрицательных организмов, включая P. aeruginosa, благодаря расщеплению пептидогликанов в бактериальной клеточной стенке. Новобиоцин (альбамицин, катамицин, сферомицин) представляет собой аминокумариновый антибиотик, выделенный из Streptomyces niveus. Новобиоцин преимущественно является активным против грамположительных бактерий, но к нему также чувствительны определенные грамотрицательные штаммы (Lindsey Grayson, Kucers' The Use of Antibiotics: A Clinical Review of Antibacterial, Antifungal and Antiviral Drugs, CRC Press 6th Edition, 2010).
[00120] Как показано на Фигуре 4, все пять лизинов (GN2, GN4, GN14, GN37 и GN43) продемонстрировали большую антибактериальную активность против штамма PAOl Р. aeruginosa, чем HuLYS или новобиоцин в монотерапии, в то время как GN4, GN14 и GN37 демонстрировали антибактериальную активность, эквивалентную активности EDTA и РМВ.
[00121] GN37 был получен из Micavibrio aeruginosavorus, хищника P. aeruginosa, который ранее не применяли в качестве источника ПГГ активностей против Pseudomonas. Было предложено применение живых Micavibrio aeruginosavorus в качестве биологического агента для контроля РЛС P. aeruginosa (Dashiff et al. J Appl., 110(2): 431-44 (2011)). Однако, насколько известно авторам настоящего изобретения, сообщения о применении данного организма в качестве источника отдельных антимикробных белков, ПГГ, бактериоцинов, антибиотиков и т.д. отсутствуют. Авторы настоящего изобретения заключили, что эпибиотная хищная бактерия, которая присоединена к поверхности Pseudomonas aeruginosa и выделяет питательные вещества изнутри, должна кодировать антипсевдомоназную ПГГ активность, чтобы проколоть внешнюю мембрану и клеточную стенку. На основании этого геномную последовательность штамма ARL-13 Micavibrio aeruginosavorus сканировали в отношении генов, аннотированных как ПГГ-подобные ферменты. Пять гидролаз идентифицировали, клонировали и подвергали скринингу в отношении антипсевдомоназной активности. Локус, обозначенный на сегодняшний день как GN37, являлся единственной ОРС (открытой рамкой считывания), которая позволила получить свободную зону (ореол) на верхнем слое агара на планшете. Таким образом, в связи с уникальным источником GN37 и мощной активностью, описанной в Примере 3, GN37 исследовали более подробно. Как проиллюстрировано в Примере 3, множественное выравнивание последовательности, в котором сравнивали GN37 с различными известными или предполагаемыми лизинами, позволило выявить, что GN37 является всего на 67% идентичным митрецину A (Farris and Steinberg, Lett Appl Microbiol., 58(5): 493-502 (2014); и публикация патента US 20140094401 A1). В отличие от GN37 митрецин А был идентифицирован в геноме грамположительного организма (т.е. Streptomyces). Более того, активность, описанная для митрецина А, является весьма слабой по сравнению с таковой GN37 (при примерно эквивалентных концентрациях). Митрецин А достигал снижения жизнеспособности бактерий, составляющего всего лишь <1-log, в течение 16 часов инкубации (против Yersinia pseudotuberculosis) по сравнению со снижением >3-log всего лишь после 1 часа обработки GN37.
[00122] Помимо полноразмерных лизинов, раскрытых в данном документе, в настоящем изобретении предложены пептидные производные на основе С-концевого альфа-спирального амфипатического домена лизинов согласно настоящему изобретению. Последовательное усечение (делеция аминокислот) С-концевых (и/или N-концевых) полипептидов, содержащих данный домен, позволяет получить активные фрагменты пептида лизина вплоть до активного пептида лизина минимальной длины. Такие пептиды можно дополнительно модифицировать посредством добавления одной или нескольких аминокислот (отличных от таковых встречающегося в природе лизина) к усеченному С-(или N-) концу способом, не нарушающим альфа-спираль. С- и N-концевые альфа-спиральные амфипатические домены можно идентифицировать с применением биоинформационного подхода. Примеры аминокислот, не нарушающих альфа-спираль, представляют собой гидрофобные или заряженные остатки, которые удлиняют альфа-спиральную область или которые способствуют введению в мембрану. Добавление аминокислот дополнительно проиллюстрировано с применением полипептида лизина GN4 (пример 4, Фигура 5). Хотя пептиды FGN4-1 (SEQ ID NO: 7) и FGN4-2 (SEQ ID NO: 8) представляют собой пептидные фрагменты GN4 (SEQ ID NO: 3), PGN4 (SEQ ID NO: 6), FGN4-3 (SEQ ID NO: 9) и FGN4-4 (SEQ ID NO: 10), каждый содержащий модификацию (Фигура 5), анализ жизнеспособности позволил установить, что PGN4 и FGN4-3 демонстрируют большую антибактериальную активность, чем другие исследованные пептиды GN4 (Фигура 6). PGN4-4 представляет собой полипептид размером 39 аминокислот, который содержит полипептид FGN4-2 размером 31 аминокислоту и антибактериальный пептид размером 8 оснований, идентифицированный из капсида гепатита В (SQSRESQC). Таким образом, как видно на Фигуре 6, добавление пептида SQSRESQC увеличивает активность FGN4-2. Сравнение нативного фрагмента FGN4-1 и FGN4-4, который содержит добавленный С-концевой цистеин (FGN4-4), свидетельствует, что добавление цистеина к С-концу усиливает активность FGN4-1. Цистеин добавляли, чтобы установить, будет ли данный остаток способствовать димеризации и увеличению активности. Результаты свидетельствуют, что концевой цистеин увеличивает активность. Дополнительные модификации включают FGN4-2, в котором удалены 11 С-концевых остатков. Данные остатки не являются необходимыми для альфа-спиральной структуры (на основе рассмотрения вторичной структуры белка), и авторы настоящего изобретения проводили исследование, чтобы определить, будет ли поддерживаться активность. Удаление всех 11 остатков снизило активность, но активность можно было восстановить и фактически улучшить с помощью других модификаций, таких как таковые, описанные в данном абзаце выше. В свете вышеизложенного средние специалисты могут с легкостью получить усеченные лизины с интактными С-концевыми альфа-спиральными амфипатическими доменами посредством получения полипептидов лизина, в которых в возрастающем количестве отсутствуют один или несколько остатков аминокислот с С-конца данного домена или с N-конца или с обоих концов, и исследования таких полипептидов по отдельности или в комбинации с одним или несколькими антибиотиками, активными против грамотрицательных бактерий, в отношении активности против (т.е. способности ингибировать, уменьшать количество или уничтожать) P. aeruginosa и/или другой грамотрицательной бактерии. Такое исследование можно проводить, например, согласно руководствам, представленным в Примерах 2, 3, 4 или в примере возможного применения 1. Разумеется, процедуры исследования и протоколы сами по себе не ограничены таковыми из данных примеров, но могут представлять собой любые способы, известные специалистам в данной области техники, для оценки эффективности антибактериального и, более того, антимикробного средства.
[00123] Для анализа антибактериальной активности в сыворотке человека GN полипептиды лизина и GN пептиды каждый объединяли в присутствии и при отсутствии суб-МИК концентрации полимиксина В (пример 5, Фигура 7). РМВ представляет собой мощный антибиотик, активный против P. aeruginosa. В концентрации 1 мкг/мл РМВ приводил к снижению жизнеспособности <2-log10 после обработки в течение 1 часа в сыворотке человека. Пул пептида GN4 (содержащий каждый пептид в концентрации 25 мкг/мл, отмечен «пул пептида» на Фигуре 7) в отдельности не приводил к снижению жизнеспособности, и пул полипептида лизина (содержащий каждый GN лизин в концентрации 25 мкг/мл) в отдельности приводил к снижению жизнеспособности всего лишь <2-log10 (Фигура 7). Однако в сочетании с РМВ как пул пептидов, так и пул лизина привели к снижению жизнеспособности >4-log10 (Фиг. 7). Данные результаты свидетельствуют о мощном аддитивном или даже синергетическом эффекте комбинации РМВ и GN полипептидов лизина согласно настоящему изобретению. Предполагается, что отдельные полипептиды лизина также приведут к существенному снижению жизнеспособности грамотрицательных бактерий, таких как P. aeruginosa, при применении индивидуально вместо применения в пуле. Наблюдение относительно Фиг. 7 заключается в том, что пул пептида сам по себе не является активным, как было спрогнозировано на основе Фиг. 6. Это, наиболее вероятно, обусловлено тем фактом, что биологическая активность многих антибактериальных средств снижается в присутствии сыворотки человека (Zhanel et al., Antimicrob Agents Chemother. 42(9): 2427-2430 (1998)). Однако после того как пул лизина вводят совместно с РМВ, антибактериальная активность пула лизина восстанавливается, несмотря на присутствие сыворотки (Фигура 7). Таким образом, снижение антимикробной активности в пуле лизина в присутствии сыворотки человека может быть обусловлено антагонистической активностью между пептидами в пуле пептидов, которая больше не является ингибирующей в присутствии РМВ. В качестве альтернативы, один или несколько белков, присутствующих в сыворотке человека, могут оказывать антагонистической эффект в отношении пула лизина, причем данный эффект подавляется после добавления РМВ. Два возможных сценария можно разграничить посредством повторения анализа с применением отдельных полипептидов лизина, проведения анализа в сыворотке в присутствии или при отсутствии РМВ и сравнения результатов с таковыми, полученными с применением пулов лизина. Более того, ингибирование активности пула лизина в сыворотке может быть обусловлено высокой концентрацией соли, нарушающей электростатическое взаимодействие между лизином и внешней мембраной.
[00124] GN полипептиды лизина согласно настоящему изобретению обладают бактериальной активностью, отличной от традиционных вариантов лечения антибиотиком, вакциной и антитоксинного лечения, и являются подходящими для борьбы с инфекциями, вызванными грамотрицательными бактериями. Как описано в примерах, лизины, в отличие от других вариантов лечения, обеспечивают быстрый бактерицидный и, при применении в суб-МИК количествах, бактериостатический эффект и являются активными против диапазона бактерий, резистентных к антибиотикам, зеркально отражая результаты, полученные ранее с применением специфичных лизинов против грамположительных бактерий, включая S. aureus, S. pyogenes, S. pneumoniae, В. anthracis и В. cereus, а также не были связаны с развитием резистентности (Fischetti, V. Curr Opin Microbiol., 11(5): 393-400 (2008)). Как следует из настоящего изобретения, в клинических условиях лизины являются мощной альтернативой для лечения инфекций, возникающих вследствие резистентных к лекарственным средствам и резистентных к различным лекарственным средствам бактерий. Существующие механизмы резистентности грамотрицательных бактерий не должны оказывать влияния на чувствительность к ПГГ активности лизинов.
[00125] Полипептиды лизина согласно настоящему изобретению отличаются от существующих ПГГ, находящихся в разработке, для лечения грамотрицательных инфекций. Ранее описанные артилизины состоят из положительно заряженных ПГГ, слитых с экзогенно полученными катионными пептидами (Briers et al., Antimicrob Agents Chemother. 58(7): 3774-84 (2014); патент США 8,846,865). Более того, вместе с артилизинами применяют поликатионные пептиды, не полученные из эндолизинов. Напротив, поликатионные области полипептидов лизина согласно настоящему изобретению получены из лизинов, которые в природе взаимодействуют с ВМ P. aeruginosa и дестабилизируют ее; данное свойство, как прогнозируют, приведет к улучшенной эффективности нацеливания против данного патогена.
[00126] Полипептиды лизина согласно настоящему изобретению не должны быть модифицированы посредством добавления антимикробных катионных пептидов, хотя, разумеется, предусмотрены и слитые полипептиды, содержащие такие пептиды, присоединенные к полипептидам лизина, выделенным и полученным рекомбинантным способом, как описано в данном документе. Однако даже при отсутствии добавленных катионных или других антимикробных (антибактериальных) пептидов полипептиды лизина согласно настоящему изобретению обладают существенной анти-грамотрицательной антибактериальной активностью, включая как бактериостатическую, так и бактерицидную активность. Несмотря на вышеизложенное, в настоящем изобретении также предусмотрены слитые полипептиды лизина, содержащие полипептид лизина, который обладает нативной грамотрицательной антибактериальной функцией, слитый с фрагментом антимикробного пептида (АМП, дефензина, пептида суши, катионного пептида, поликатионного пептида, амфипатического пептида, гидрофобного пептида), таким как таковые, описанные в заявке на патент США №US 2015/0118731 и в международных заявках на патент WO 2014/0120074, WO 2015/070912; WO 2015/071436; WO 2015/070911; WO.2015/071437; WO/2012/085259; WO 2014/001572 и WO 2013/0344055. Также предусмотрены слитые полипептиды, содержащие дополнительные бактерицидные сегменты, т.е. сегменты, обладающие собственной бактерицидной активностью до слияния или вносящие положительный вклад в бактерицидную активность родительского полипептида лизина.
Фармацевтические композиции и составы
[00127] Композиции согласно настоящему изобретению могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, драже, пеллет, капсул, капсул, содержащих липиды, порошков, составов с замедленным высвобождением, суппозиториев, эмульсий для нанесения на тампоны, аэрозолей, спреев, суспензий, таблеток для рассасывания, пастилок, конфет, инъекционных растворов, жевательных резинок, мазей, мазков, пластырей с замедленным высвобождением, салфеток, пропитанных жидкостью, и комбинации указанных форм.
[00128] Введение композиций согласно настоящему изобретению или их фармацевтически приемлемых форм может являться местным, т.е. фармацевтическую композицию наносят непосредственно там, где ее действие является желательным (например, непосредственно на рану), или системным. В свою очередь, системное введение может являться энтеральным или пероральным, т.е. вещество вводят через пищеварительный тракт, парентеральным, т.е. вещество вводят путями, отличными от пищеварительного тракта, например, посредством инъекции или ингаляции. Таким образом, полипептиды лизина согласно настоящему изобретению можно вводить субъекту пероральным, парентеральным путем, посредством ингаляции, местным, ректальным, назальным, буккальным путем или посредством имплантируемого резервуара или посредством любого другого известного способа. Полипептиды лизина согласно настоящему изобретению можно также вводить посредством лекарственных форм с замедленным высвобождением.
[00129] В случае перорального введения полипептиды лизина согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены в состав в твердых или жидких препаратах, например, таблетках, капсулах, порошках, растворах, суспензиях и дисперсиях. Соединение может быть приготовлено в состав со вспомогательными веществами, такими как, например, лактоза, сахароза, кукурузный крахмал, желатин, картофельный крахмал, альгиновая кислота и/или стеарат магния.
[00130] Для получения твердых композиций, таких как таблетки и драже, полипептид лизина согласно настоящему изобретению или его фрагмент перемешивают с фармацевтическим вспомогательным веществом для получения твердой композиции до придания ей лекарственной формы. При необходимости таблетки можно покрыть сахарной оболочкой или кишечнорастворимой оболочкой с помощью стандартных методик. Таблетки или драже могут являться покрытыми или иным способом составленными для получения лекарственной формы, которая обеспечивает преимущество пролонгированного действия. Например, таблетка или драже может содержать внутренний и внешний компонент дозы, причем последний находится в форме оболочки над первым. Два компонента могут быть разделены кишечнорастворимым слоем, который выступает для препятствования разрушению в желудке и позволяет внутреннему компоненту поступать в неизменном виде в двенадцатиперстную кишку или быть отсроченным в высвобождении. Для таких кишечнорастворимых слоев или покрытий можно использовать множество материалов; такие вещества включают множество полимерных кислот и смесей полимерных кислот с такими веществами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.

[00131] Композиции для местного применения согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать фармацевтически или физиологически приемлемый носитель, такой как дерматологически приемлемый носитель или носитель, приемлемый для ушного применения. Такие носители в случае дерматологически приемлемых носителей, предпочтительно, являются совместимыми с кожей, ногтями, слизистыми мембранами, тканями и/или волосами, и могут включать любой общепринято применяемый дерматологический носитель, соответствующий данным требованиям. В случае носителей, приемлемых для ушного применения, носитель, предпочтительно, является совместимым со всеми частями уха. Такие носители может с легкостью выбрать средний специалист в данной области техники. Носители для местного введения соединения согласно настоящему изобретению включают, без ограничения, минеральное масло, жидкую нефть, белый вазелин, пропиленгликоль, соединения полиоксиэтилена и/или полиоксипропилена, эмульгирующий воск, сорбитанмоностеарат, полисорбат 60, воск цетиловых эфиров, цетеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и воду. При приготовлении кожных мазей активные компоненты согласно настоящему изобретению можно приготовить в состав в маслянистой углеводородной основе, безводной абсорбирующей основе, абсорбирующей основе вода-в-масле, удаляемой водой основе масло-в-воде и/или водорастворимой основе. При приготовлении композиций для ушного введения активные компоненты согласно настоящему изобретению можно приготовить в состав в водной полимерной суспензии, содержащей такие носители как декстраны, полиэтиленгликоли, поливинилпирролидон, полисахаридные гели, Gelrite, полимеры целлюлозы, такие как гидроксипропилметилцеллюлоза, и карбоксил-содержащие полимеры, такие как полимеры или сополимеры акриловой кислоты, а также другие полимерные мягчительные средства. Композиции для местного введения согласно настоящему изобретению могут находиться в любой форме, подходящей для местного применения, включая водные, водно-спиртовые или масляные растворы, лосьоны или сыворотки на основе дисперсии, водные, безводные или масляные гели, эмульсии, полученные посредством дисперсии жирной фазы в водной фазе (OAV, oil adjuvant vaccine, вакцина с масляным адъювантом, или масло в воде) или, наоборот, (В/М или вода в масле), микроэмульсии или, в качестве альтернативы, микрокапсулы, микрочастицы или дисперсии липидных везикул ионного и/или неионного типа, кремы, лосьоны, гели, пены (для которых, как правило, требуется находящийся под давлением контейнер, подходящий аппликатор и эмульгирующее средство, а также инертный пропеллент), эссенции, молочко, суспензии или пластыри. Композиции для местного введения согласно настоящему изобретению могут также содержать адъюванты, такие как гидрофильные или липофильные гелеобразующие средства, гидрофильные или липофильные активные агенты, консервирующие средства, антиоксиданты, растворители, ароматические вещества, наполнители, солнцезащитные фильтры, поглотители запахов и красящие вещества. Согласно следующему аспекту настоящего изобретения антибактериальные композиции для местного введения можно вводить в сочетании с устройствами, такими как трансдермальные пластыри, перевязочные материалы, мягкие подкладки, материалы для обертывания, матрицы и повязки, способные прилипать или иным способом связываться с кожей или другой тканью субъекта, способные доставлять терапевтически эффективное количество одного или нескольких антибактериальных полипептидов лизина согласно настоящему изобретению.
[00132] Согласно одному варианту реализации композиции для местного введения согласно настоящему изобретению дополнительно содержат один или несколько компонентов, применяемых для лечения местных ожогов. Такие компоненты, как правило, включают, без ограничения, пропиленгликоль гидрогель; комбинации гликоля, производное целлюлозы и водорастворимую соль алюминия; антисептическое средство; антибиотик; и кортикостероид. Также можно добавить увлажняющие вещества (такие как твердые или жидкие сложные эфиры воска), стимуляторы всасывания (такие как гидрофильные глины или крахмалы), загущающие средства и средства, защищающие кожу. Составы для местного введения могут находиться в форме ополаскивателей, таких как ополаскиватели для полости рта. См., например, публикацию WO 2004/004650.
[00133] Соединения согласно настоящему изобретению можно также вводить посредством инъекции терапевтического средства, содержащего соответствующее количество полипептида лизина и носитель. Например, полипептиды лизина можно вводить внутримышечным, интратекальным, субдермальным, подкожным или внутривенным путем для лечения инфекций грамотрицательных бактерий, более конкретно, таковых, вызванных P. aeruginosa. Носитель может содержать дистиллированную воду, солевой раствор, альбумин, сыворотку или любые комбинации указанных веществ. Дополнительно, фармацевтические композиции для парентеральных инъекций могут содержать фармацевтически приемлемые водные или неводные растворы полипептидов лизина, помимо одного или нескольких из следующих веществ: рН-забуференные растворы, вспомогательные средства (например, консерванты, смачивающие средства, эмульгирующие средства и диспергирующие средства), липосомальные составы, наночастицы, дисперсии, суспензии или эмульсии, а также стерильные порошки для восстановления в стерильные инъецируемые растворы или в дисперсии перед самым применением.
[00134] В случаях, когда выбранным способом введения является парентеральная инъекция, предпочтительно, применяют изотонический состав. Как правило, добавки для изотоничности могут включать натрия хлорид, декстрозу, маннитол, сорбитол и лактозу. В некоторых случаях предпочтительными являются изотонические растворы, такие как фосфатный буферный солевой раствор. Стабилизаторы могут включать желатин и альбумин. В состав можно добавить сосудосуживающее средство. Фармацевтические препараты согласно данному типу применения обеспечивают стерильными и апирогенными.
[00135] Растворитель может также содержать один или несколько других вспомогательных веществ, таких как, например, этанол, пропиленгликоль, масло или фармацевтически приемлемое эмульгирующее или поверхностно-активное вещество.
[00136] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения композиции согласно настоящему изобретению представляют собой ингалируемые композиции. Ингалируемые композиции согласно настоящему изобретению могут также содержать фармацевтически приемлемый носитель. Согласно одному варианту реализации полипептид или полипептиды лизина согласно настоящему изобретению, предпочтительно, приготовлены в состав в виде сухого ингалируемого порошка. Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения раствор полипептидов лизина для ингаляций может быть дополнительно приготовлен в состав с пропеллентом для доставки посредством аэрозоля. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения растворы могут быть распылены.
[00137] К ингалируемой фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению может быть добавлено поверхностно-активное вещество с целью снижения поверхностного и межфазного натяжения между лекарственными средствами и пропеллентом. Если лекарственные средства, пропеллент и вспомогательное вещество должны образовать суспензию, поверхностно-активное вещество может требоваться или может не требоваться. Если лекарственные средства, пропеллент и вспомогательное вещество должны образовать раствор, поверхностно-активное вещество может быть необходимым или может не быть необходимым, отчасти в зависимости от растворимости конкретного лекарственного средства и вспомогательного вещества. Поверхностно-активное вещество может представлять собой любое подходящее нетоксичное соединение, которое не вступает в реакцию с лекарственным средством и которое по существу снижает поверхностное натяжение между лекарственным средством, вспомогательным веществом и пропеллентом и/или выступает в качестве смазки.
[00138] Примеры подходящих поверхностно-активных веществ включают, без ограничения: олеиновую кислоту; сорбитан триолеат; цетилпиридиния хлорид; соевый лецитин; полиоксиэтилен (20) сорбитан монолаурат; полиоксиэтилен (10) стеариловый эфир; полиоксиэтилен (2) олеилэфир; блоксополимеры полиоксипропилена - полиоксиэтилен этилендиамина; полиоксиэтилен (20) сорбитанмоностеарат; полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат; блоксополимеры полиоксипропилена -полиоксиэтилена; этоксилат касторового масла; и комбинации указанных соединений.
[00139] Примеры подходящих пропеллентов включают, без ограничения: дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлор-тетрафторэтан и диоксид углерода.
[00140] Примеры подходящих вспомогательных веществ для применения в ингалируемых композициях включают, без ограничения: лактозу, крахмал, двузамещенные эфиры пропиленгликоля и среднецепочечных жирных кислот; сложные эфиры триглицерида и среднецепочечных жирных кислот, короткоцепочечных или длинноцепочечных, или любые комбинации указанных соединений; перфтордиметилциклобутан; перфторциклобутан; полиэтиленгликоль; ментол; лаурогликоль; моноэтиловый эфир диэтиленгликоля; полигликолизированные глицериды среднецепочечных жирных кислот; спирты; эвкалиптовое масло; короткоцепочечные жирные кислоты; и комбинации указанных соединений.
[00141] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции согласно настоящему изобретению предусматривают назальные применения. Назальные применения включают, например, назальные спреи, назальные капли, назальные мази, назальные лосьоны, назальные инъекции, назальные тампоны, бронхиальные спреи и ингаляционные препараты или опосредованное введение посредством применения таблеток для рассасывания для горла, жидкостей для полоскания рта или горла, или посредством применения мазей, наносимых на ноздри носа либо лицо, или любую комбинацию данных и подобных способов применения.
[00142] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению содержат дополняющее средство, включающее одно или несколько антимикробных средств и/или один или несколько общепринятых антибиотиков. Для ускорения лечения инфекции или увеличения антибактериального эффекта терапевтическое средство, содержащее один или несколько полипептидов лизина согласно настоящему изобретению, может дополнительно содержать по меньшей мере одно дополняющее средство, которое также может усиливать бактерицидную активность полипептида лизина. Дополняющее средство может представлять собой один или несколько антибиотиков, применяемых для лечения грамотрицательных бактерий. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения дополняющие средства представляют собой антибиотик или антимикробные средства, применяемые для лечения инфекций, вызванных P. aeruginosa.
Доза и частота введения субъектам
[00143] Композиции согласно настоящему изобретению могут быть представлены в единичной лекарственной форме и могут быть получены любыми способами, хорошо известными в данной области техники. Количество активных компонентов, которое можно объединить с материалом-носителем для получения единичной лекарственной формы, будет варьировать в зависимости от хозяина, лечение которого проводят, длительности воздействия инфекционных бактерий на реципиента, размера и массы тела субъекта, а также конкретного способа введения. Количество активных компонентов, которое можно объединить с материалом-носителем для получения единичной лекарственной формы, как правило, будет представлять собой такое количество каждого соединения, которое вызывает терапевтический эффект. Как правило, из ста процентов общее количество будет варьировать от приблизительно 1 процента до приблизительно девяноста девяти процентов активных компонентов, предпочтительно, от приблизительно 5 процентов до приблизительно 70 процентов, наиболее предпочтительно, от приблизительно 10 процентов до приблизительно 30 процентов.
[00144] Вводимые дозы зависят от множества факторов, включая активность инфекции, лечение которой проводят, возраст, состояние здоровья и общее физическое состояние субъекта, лечение которого проводят, активность конкретного полипептида лизина, природу и активность антибиотика, в случае его наличия, с которым объединяют полипептид лизина согласно настоящему изобретению, и суммарный эффект такого сочетания. Как правило, эффективные количества полипептидов лизина согласно настоящему изобретению, которые будут вводить, как ожидается, будут находиться в диапазоне 1-50 мг/кг, которые будут вводить 1-4 раза в день в течение вплоть до 14 дней. Антибиотик, если его также применяют, будут вводить в стандартных режимах введения доз или в меньших количествах. Однако все такие дозы и режимы (будь то полипептида лизина или любого антибиотика, который вводят в сочетании с ним) подлежат оптимизации. Оптимальные дозы можно определить посредством осуществления предварительных экспериментов по определению эффективности in vitro и in vivo в пределах компетенции в данной области техники, но с учетом настоящего изобретения.
[00145] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время воздействия единиц активного полипептида или полипептидов лизина может повлиять на желаемую концентрацию единиц активного полипептида лизина на мл. Носители, которые классифицированы как носители с «длительным» или «замедленным» высвобождением (такие как, например, определенные назальные спреи или таблетки для рассасывания), могут обладать меньшей концентрацией или обеспечивать меньшую концентрацию единиц полипептида лизина на мл, но в течение более длительного периода времени, тогда как носитель с «коротким» или «быстрым» высвобождением (такой как, например, жидкость для полоскания горла) может обладать высокой концентрацией или обеспечивать высокую концентрацию единиц полипептида лизина на мл, но в течение более короткого периода времени. Существуют обстоятельства, при которых может быть необходимо обеспечить намного большую дозу в единицах/мл или меньшую дозу в единицах/мл.
[00146] Для любого полипептида лизина согласно настоящему изобретению терапевтически эффективную дозу можно вычислить сначала в анализах на культуре клеток или на моделях на животных, обычно на мышах, кроликах, собаках или свиньях. Модель на животных также можно применять для достижения желаемого диапазона концентрации и пути введения. Затем полученную информацию можно использовать для определения эффективных доз, а также путей введения у людей. Дозу и введение можно дополнительно откорректировать для обеспечения достаточных уровней активного компонента или для поддержания желаемого эффекта. Дополнительные факторы, которые могут быть учтены, включают тяжесть состояния заболевания, возраст, массу тела и пол пациента; рацион, желательную длительность лечения, способ введения, время и частоту введения, комбинацию или комбинации лекарственных средств, аллергические реакции и переносимость/ответ на терапию, а также оценку лечащего врача.
[00147] Режим лечения может предполагать ежедневное введение (например, один раз, два раза, три раза и т.д. в день), введение через день (например, один раз, два раза, три раза и т.д. через день), два раза в неделю, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в месяц и т.д. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения лечение может быть введено в виде непрерывной инфузии. Единичные дозы можно вводить многократно. Интервалы также могут быть неравномерными, на что указывает мониторинг клинических симптомов. В качестве альтернативы, единичную дозу можно вводить в виде состава с замедленным высвобождением, и в данном случае необходимо менее частое введение. Доза и частота могут варьировать в зависимости от пациента. Специалист в данной области техники понимает, что такие руководства будут откорректированы для локализованного введения, например, интраназального, ингаляции, ректального и т.д., или для системного введения, например, перорального, ректального (например, через клизму), в.м. (внутримышечного), и.п.(интраперитонеального), в.в. (внутривенного), п. к. (подкожного), трансуретального и т.п.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Идентификация грамотрицательных лизинов
[00148] Предполагаемые кандидаты ПГГ, которые можно применять для уничтожения грамотрицательных бактерий, были идентифицированы с применением протокола биоинформационного поиска. Сначала авторы настоящего изобретения сгенерировали итоговый список ПГГ P. aeruginosa, полученных из аннотированных геномных последовательностей, скрининг которых проводили, с критериями поиска для лизинов бактериофага, включая «амидаза», «лизоцим», «глюкозаминидаза», «эндопептидаза», «пептидогликангидролаза», «литическая трансгликозилаза», «эндолизин», «лизин» и «гидролаза клеточной стенки». Затем ПГГ, идентифицированные данным способом, использовали для поиска посредством анализа BLASTP всех геномных последовательностей генома P. aeruginosa в GenBank (группа P. aeruginosa; Taxid: 136841) и геномной последовательности штамма ARL-13 Micavibrio aeruginosavorus для получения большей группы предполагаемых ПГГ. Затем подгруппу данной группы, содержащую 46 ПГГ, выбрали для последующего исследования - критериями включения в данном случае являлись разнообразие в отношении консервативности последовательности и включение как высоко-, так и слабоконсервативных ферментов с диапазоном предполагаемых каталитических активностей и активностей по связыванию клеточной стенки. 46 ПГГ синтезировали, клонировали в бактериальный вектор экспрессии pBAD24 (Guzman et al., J Bacteriol. (14): 4121-30 (1995)) и трансформировали полученными векторами штамм Top10 Е. coli (Life Technologies). Для оценки активности проводили скрининг всех клонов Е. coli (включая контроли вектора) с применением анализа литической активности против штамма PAO1 P. aeruginosa на планшетах. Затем положительные клоны дополнительно анализировали в отношении индукции растворимого белка в жидких культурах LB описанным способом (Schuch et al., Nature, 418 (6900):884-9, (2002)). В случае растворимых и активных лизинов неочищенные экстракты индуцированных культур Е. coli затем исследовали для определения способности индуцировать пермеабилизацию штамма PAO1 P. aeruguinosa с применением гидрофобного флуоресцентного зонда 1-N-фенилнафтиламина (NPN). Анализ NPN представляет собой стандартный способ (Helander and Mattila-Sandholm, J Appl Microbiol., 88(2): 213-9. (2000)) скрининга соединений, которые разрушают внешнюю мембрану бактерий. Данный подход скрининга в конечном итоге позволил получить 5 кандидатов ПГГ (с N- и С-концевыми альфа-спиральными доменами) в геномах штаммов Pseudomonas aeruginosa и других грамотрицательных организмов (включая Micavibrio aeruginosavorus), а также таковых, идентифицированных с применением морской метагеномики. Затем исследовали антибактериальную активность полученных в результате белков против штамма PAO1 P. aeruginosa, который является резистентным к антибиотикам пенициллинового ряда (Okamoto et al. Antimicrob Agents Chemother. 45(7): 1964-71 (2001)).
[00149] С целью оценки активности очищенных лизинов исследовали поглощение штаммом PAO1 P. aeruginosa гидрофобного флуоресцентного зонда 1-N-фенилнафтиламина (NPN). Поскольку внешняя мембрана грамотрицательных бактерий выступает в качестве барьера проницаемости для гидрофобных соединений, включая лизины и NPN, пермеабилизирующую активность GN можно оценить и оценивали посредством способности гидрофобного соединения достигать внутренней мишени. Таким образом, хотя NPN в норме исключается внешней мембраной, он демонстрирует значительную интенсивность флуоресценции, когда проникает в липидный бислой внешней мембраны.
5
[00150] PAO1 P. aeruginosa получали в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, АТСС). Бактерии культивировали при начальной концентрации 10КОЕ/мл в среде LB (Sigma-Aldrich) в шейкере-инкубаторе при температуре 37°С и 250 об./мин. Культуру P. aeruginosa выращивали до начала фазы экспоненциального роста (А550 ~ 0,3) и добавляли каждый из кандидатов лизинов (GN) в концентрации 10 мкг/мл. Для измерения поглощения NPN к клеткам в фазе экспоненциального роста, содержащим GN1, GN2, GN4, GN8, GN14, GN20, GN22, GN26, GN27, GN28, GN30, GN37 и GN43 в ФБР, добавляли 10 мкМ NPN, и через 1 час флуоресценцию контролировали при 420 нм с помощью флуоресцентного спектрофотометра (Фигура 3). В качестве положительных контролей использовали антибиотик полимиксин В (5 мкг/мл) и EDTA (1 мМ), в то время как в качестве отрицательного контроля выступали клетки, обработанные NPN, но без добавления лизина.
[00151] Как показано на Фигуре 3, когда клетки P. aeruginosa обрабатывали GN2 (SEQ ID NO: 2), GN4 (SEQ ID NO: 3), GN14 (SEQ ID NO: 4), GN37 (SEQ ID NO: 1) или GN43 (SEQ ID NO: 5) в присутствии NPN (серые столбцы), наблюдался мощный сигнал флуоресценции. Общие характеристики каждого лизина показаны в Таблице 4.
[00152] Взятые вместе, данные результаты позволили идентифицировать группу GN лизинов, которые демонстрируют способность проникать через ВМ грамотрицательных бактерий, что представляет собой первый этап идентификации лизинов, активных против грамотрицательных бактерий, без необходимости прибегать к добавлению сегментов гетерологичных пептидов.
Пример 2
GN лизины демонстрируют мощную антибактериальную активность против
грамотрицательных бактерий
6
[00153] С целью оценки антибактериальной активности очищенных лизинов оценивали жизнеспособность штамма PAO1 живых P. aeruginosa после инкубации с отдельными GN лизинами. Вкратце, 10 клеток РАО1 обрабатывали указанным GN лизином в концентрации 25 мкг/мл в течение 1 часа (при температуре 37°С без встряхивания) в присутствии 20 мМ буфера Tris-HCl (рН 7,2). В качестве контролей использовали полимиксин В (РМВ, в концентрации 25 мкг/мл), новобиоцин (Nov, в концентрации 5 мкг/мл), EDTA (1 мМ) и лизоцим человека (HuLYZ, в концентрации 25 мкг/мл). Предел обнаружения составил 2,0 Log10KOE/мл.
[00154] Как показано на Фигуре 4, каждый GN лизин демонстрировал большую антибактериальную активность, чем каждый из HuLYZ или новобиоцина, и при этом каждый из GN4 (SEQ ID NO: 3), GN14 (SEQ ID NO: 4) и GN37 (SEQ ID NO: 1) продемонстрировал более мощную или аналогичную антибактериальную активность по сравнению с EDTA и РМВ, соответственно.
[00155] Данный эксперимент свидетельствует, что GN могут демонстрировать аналогичную или большую антибактериальную активность, чем любой из общепринятых антибиотиков, лизоцим человека или хелатирующее средство EDTA, против грамотрицательных бактерий.
Пример 3
GN37 является высокоэффективным грамотрицательным антибактериальным средством
[00156] Лизин GN37 представляет собой полипептид длиной 126 аминокислот (Фигура 1А), кодируемый локусом MICA_542 размером 381 п.о. Micavibrio aeruginosavorus. М. aeruginosavorus представляет собой хищник P. aeruginosa, который ранее не применяли в качестве источника антипсевдомоназных ПГГ активностей. Лизин GN37 представляет собой в высокой степени положительно заряженный белок с предсказанным pI, составляющим 9,69. Дополнительно, GN37 является членом семейства ПГГ Пептидазы_М15_4 с DD- и DL-карбоксипептидазными активностями (включая членов суперсемейства VanY) (Фигура 1 В). По результатам анализа BLASTP GN37 (SEQ ID NO: 1) является идентичным на ≤67% с белками из >50 различных грамотрицательных видов и 1 вида грамположительных бактерий. Множественное выравнивание последовательностей представлено на Фигуре 1С для сравнения GN37 с грамположительным гомологом (из Streptomyces, последовательность GenBank AGJ50592.1) и белков из грамотрицательных патогенов, включая Е. coli (WP_001117823.1 и NP_543082.1), Yersinia spp.(CAJ28446.1) и Acinetobacter baumannii (WP_034684053.1). Важно отметить, что в общедоступной базе данных отсутствуют последовательности с идентичностью >67% с GN37.
Пример 4
Пептидные производные GN4 демонстрируют мощную антибактериальную активность
Помимо полноразмерных лизинов, также получали и изучали пять пептидных производных GN4 (соответствующих альфа-спиральным С-концевым фрагментам) (Фигура 5). Первый пептид (FGN4-1, (SEQ ID NO: 7)) соответствует 42 аминокислотам С-концевого альфа-спирального домена. Данный пептид был получен с учетом прогнозирования вторичной структуры белка, согласно которому данная область являлась достаточной для получения С-концевого альфа-спирального амфипатического домена GN4 (в качестве альтернативы, данный пептид мог быть получен посредством последовательного усечения самого конца С-конца и всякий раз исследования влияния на активность). Обоснование дополнительных модификаций описано в другом месте в данном документе.
5
[00157] К FGN4-1 (SEQ ID NO: 7) добавляли один С-концевой цистеин для получения FGN4-4 (SEQ ID NO: 10). Для получения 3 дополнительных пептидов 11 С-концевых остатков FGN4-1 (FGN4-2, (SEQ ID NO: 8)) удаляли или удаляли и заменяли одним остатком лизина (К) (FGN4-3, (SEQ ID NO: 9)) или антибактериальным пептидом размером 8 остатков, который был идентифицирован в капсиде гепатита В (PGN4 (SEQ ID NO: 6)). Пептид гепатита В представляет собой SQSRESQC и характеризуется идентификационным номером эпитопа 96916 в Базе данных иммунных эпитопов. Антибактериальную активность каждого полученного из GN4 пептида исследовали в анализе уничтожения (Фигура 6), в котором 10 клеток PAO1 обрабатывали указанным пептидным производным в концентрации 10 мкг/мл в течение 1 часа (при температуре 37°С без встряхивания) в присутствии 20 мМ буфера Tris-HCl (рН 7,2). Предел обнаружения составил 2,0 log10 КОЕ/мл. Как проиллюстрировано на Фигуре 6, каждый из исследованных пептидов продемонстрировал некоторую антибактериальную активность (по сравнению с буфером, который выступал в качестве отрицательного контроля), при этом FGN4-1 и FGN4-4 продемонстрировали превосходящую активность со снижением жизнеспособности клеток ≥4 log.
Пример 5
GN лизины и GN пептиды демонстрируют устойчивые антибактериальные свойства [00158] Затем оценивали антибактериальные свойства GN лизинов и GN пептидов в сыворотке человека. Клетки P. aeruginosa инкубировали в сыворотке человека в течение 1 ч при температуре 37°С без встряхивания, и исследовали активность против PAO1 в фазе экспоненциального роста. GN лизины и GN пептиды (в концентрации 25 мкг/мл) каждый объединяли в присутствии и при отсутствии суб-МИК концентрации полимиксина В (РМВ) (1 мкг/мл). Предел обнаружения составил 2,0 log10 КОЕ/мл. Как показано на Фигуре 7, пул GN лизина в отдельности продемонстрировал антибактериальные свойства, аналогичные таковым, продемонстрированным полимиксином В. Более того, при сочетании с РМВ как пул пептида, так и пул лизина привел к снижению жизнеспособности ≥4-log10.
[00159] Взятые вместе, данные результаты свидетельствуют о мощной аддитивной или синергетической активности между РМВ и полипептидами лизина (GN) или пептидами лизина в сыворотке человека. Поскольку в предшествующих исследованиях была продемонстрирована мощная антимикробная активность отдельных компонентов объединенной смеси лизинов, предполагается, что, помимо пулов лизина, отдельные компоненты лизинов также продемонстрируют мощную аддитивную или синергетическую активность с антибиотиками (Loeffler et al. Antimicrob Agents Chemother. Jan; 47(1): 375-377 (2003)).
Пример возможного применения 1
Исследование выделенных GN лизинов
[00160] В данном примере была поставлена цель подтвердить, что GN полипептиды лизина и пептидные производные GN4, описанные в данном документе, индивидуально способны к ингибированию роста или уничтожению грамотрицательных бактериальных штаммов, помимо P. aeruginosa. Для этого будет проведено исследование антимикробной активности выделенных полипептидов согласно настоящему изобретению (которые можно экспрессировать, как описано в данном документе, и очистить с помощью общепринятых методик) против различных грамотрицательных штаммов, таких как NCTC 9633 Klebsiella pneumoniae (АТСС 13883), NCTC 10006 Enterobacter aerogenes (АТСС 13048), NCT 9750 Citrobacter freundii (ATCC 8090), CDC 6516-60 Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Yersinia pestis (ATCC BAA-1511D-5), Francisella tulerensis (ATCC 6223) и DSM 1103 Escherichia coli (ATCC 25822), все из которых являются коммерчески доступными. В дополнительных группах данного эксперимента можно выбрать штамм, резистентный к одному или нескольким антибиотикам стандарта лечения, например, штамм Br667 P. aeruginosa, резистентный к различным лекарственным средствам.
[00161] Вкратце, GN полипептиды лизина и GN4 пептиды будут исследовать в концентрации 5-15 мкг/мл в течение 1 часа (при температуре 37°С без встряхивания) в присутствии 20 мМ буфера Tris-HCl (рН 7,2). Предел обнаружения составит 2,0 Log10 КОЕ/мл. Активность каждого полипептида лизина или его фрагмента будут исследовать в отдельности или в комбинации с антибиотиком, активным против грамотрицательных бактерий, таким как полимиксин В, или с другим антибиотиком, активным против грамотрицательных бактерий, таким как гентамицин. В группах данного эксперимента, в которых исследуют способность полипептида лизина преодолевать резистентность к антибиотику, выбранный антибиотик будет представлять собой таковой, к которому резистентна конкретная бактерия. Аликвоту инокулюма объемом 100 мкл будут отбирать от культуральной среды в различные временные точки (0, 1, 4 и 8 ч) для определения КОЕ/мл с помощью методики определения количества микроорганизмов посредством посева.
[00162] На основе консервативности структуры внешней мембраны грамотрицательных бактерий и эффективности GN4 и его вышеуказанных производных и других лизинов согласно настоящему изобретению и примерам против P. aeruginosa предполагается, что полипептиды лизина согласно настоящему изобретению будут демонстрировать антибактериальную активность против дополнительных (отличных от P. aeruginosa) штаммов грамотрицательных бактерий.
Пример возможного применения 2
Исследование синергетических и аддитивных эффектов между GN лизинами/пептидами лизина и дополнительными антибиотиками
Аналогично дизайну эксперимента, описанному в Примере 5, будут исследовать синергетические или аддитивные эффекты полипептидов лизина, раскрытых в данном документе, при применении в комбинации с дополнительными (отличными от РМВ) антибиотиками. Синергетические или аддитивные антибактериальные свойства GN лизинов и GN пептидов будут оценивать в сыворотке человека. P. aeruginosa будут инкубировать в сыворотке человека в течение 1 ч при температуре 37°С без встряхивания, и будут оценивать активность против PAO1 в фазе экспоненциального роста. GN лизины и GN пептиды (в концентрации 10-25 мкг/мл) каждый будут инкубировать в присутствии и при отсутствии суб-МИК концентрации антибиотика, такого как новобиоцин, аминогликозид, карбапенем, цефтазидим (3-е поколение), цефепим (4-е поколение), цефтобипрол (5-е поколение), фторхинолон, пиперациллин, тикарциллин, колистин, рифамицин (такой как рифампицин, рифабутин, рифапентин и т.д.) и пенициллин. Жизнеспособность бактерий будут определять в КОЕ/мл с помощью методики определения количества микроорганизмов посредством посева.
Пример возможного применения 3
Исследование полипептидов лизина для лечения резистентных к различным лекарственным средствам P. aeruginosa с применением модели пневмонии in vivo
6
[00163] Взрослых черных мышей С57 будут содержать в контролируемых условиях в клетках в специальных стерильных условиях. Вкратце, животным будут проводить анестезию в результате вдыхания севорана (Abbot Laboratories) в насыщенной кислородом камере и будут помещать в положение лежа на спине, приподняв головы. Бактериальный инокулюм штамма Ka02 P. aeruginosa РЛС (10 КОЕ в 50 мкл раствора Рингера с лактатом) будут медленно вводить в левое легкое каждого животного с применением иглы для искусственного питания.
[00164] Животных случайным образом будут распределять на 3 экспериментальные группы лечения. 3 группы будут являться следующими: 1) Группа, получающая лечение солевым раствором (n=5), которой через 1 ч после инфекции будет в.в. введен солевой раствор с последующим еще одним и.п.введением через 5 ч после инфекции; 2) Группа полипептида лизина GN4 (n=5), которой через 1 ч после инфекции будет в.в. введен GN4 в дозе 20 мг/кг с последующим еще одним и.п.введением в дозе 15 мг/кг через 5 ч после инфекции; и 3) положительный контроль, группа, получающая лечение имипенемом (n=5), которой через 1 ч после инфекции будет и.п. введен «Тиенам» (Merck, Sharpe and Dohme) (активный компонент имипенем, карбапенемовый антибиотик) в дозе 25 мг/кг с последующими и.п.введениями в дозе 25 мг/кг во временные точки через 5 ч, 24 ч, 29 ч, 48 ч и 53 ч после инфекции.
[00165] Для всех трех групп будут контролировать выживаемость каждые 12 ч вплоть до дня 9 после инфекции. Такой же экспериментальный дизайн будут использовать для исследования антимикробной активности дополнительных полипептидов лизина, раскрытых в данном документе, in vivo.
Пример возможного применения 4
Исследование защитного потенциала полипептидов лизина против сепсиса, вызванного Pseudomonas aeruginosa, на модели нейтропении на мышах
R
3
[00166] Эффективность защиты полипептидов лизина против инвазивной инфекции Pseudomonas aeruginosa будут определять на модели нейтропении на мышах, описанной ранее (Pier et al. Infect. Immun. 57: 174-179 (1989); Schreiber et al. J. Immunol. 146: 188-193 (1991)). Взрослых мышей BALB/c ByJ (Jackson Laboratories, Бар-Харбор, Мэн) будут содержать в стерильных условиях, не содержащих Pseudomonas. Нейтропению будут вызывать посредством интраперитонеального введения каждой мыши 3 мг циклофосфамида (Цитоксан', Bristol-Myers Squibb, Принстон, Нью-Джерси) в дни 1, 3 и 5. В день 5 циклофосфамид будут вводить в моменты времени 0 часов и через 2 часа, лизин (в дозе 20 мг/кг) или контроль ФБР будут вводить и.п.с последующим введением 10КОЕ живых Pseudomonas aeruginosa 06ad РА через два часа. За мышами будут наблюдать ежедневно, в качестве исхода будут определять смертность. Более того, с целью определения оптимальной концентрации лизина для лечения животных будут исследовать дополнительные концентрации полипептидов лизина.
[00167] Такой же экспериментальный дизайн будут использовать для исследования защитной антимикробной активности дополнительных полипептидов лизина, раскрытых в данном документе, in vivo.
Пример возможного применения 5
Лечение системной инфекции у субъекта-человека
[00168] Пациент, которому был поставлен диагноз системной респираторной инфекции, вызванной резистентным к различным лекарственным средствам P. aeruginosa, будет получать лечение внутривенным полимиксином В или полимиксином В в виде аэрозоля в комбинации с одним или несколькими полипептидами лизина, раскрытыми в данном документе.
[00169] Рекомендуемая доза внутривенного полимиксина В составляет от 1,5 до 2,5 мг/кг/день (1 мг=10000 ME, международных единиц) (Sobieszczyk ME et al., J Antimicrob Chemother., 54(2): 566-9 (2004)). В.в. инфузии полимиксина В будут вводить в течение 60-90 минут в течение 15 дней. Фармацевтическую композицию, содержащую один или несколько полипептидов лизина согласно настоящему изобретению, будут вводить внутривенно ежедневно в предварительно определенной концентрации. В качестве альтернативы, терапию полимиксином В в виде аэрозоля будут вводить ежедневно (в течение 14 дней) в дозе 2,5 мг/кг/день в комбинации с фармацевтической композицией, содержащей один или несколько полипептидов лизина согласно настоящему изобретению. В зависимости от клинического статуса индивидуального пациента длительность и/или концентрацию режима лечения можно варьировать. Дополнительно внутривенный полимиксин В или полимиксин В в виде аэрозоля можно вводить многократно в течение дня. Подробная информация относительно применения внутривенных полимиксинов и полимиксинов в виде аэрозоля представлена, например, в публикации Falagas et al. Clin Med Res. 4(2): 138-146 (2006)).
[00170] По окончании лечения будут поводить оценку микробиологического клиренса у пациентов, а также безопасности. Предполагается, что лечение пациентов, страдающих от системной респираторной инфекции, приведет к снижению симптомов, связанных с инфекцией, и/или к снижению или искоренению популяции бактерии-возбудителя у пациентов.
Пример возможного применения 6
Местное лечение диабетической язвы у субъекта-человека
[00171] Инфекция язвы, обусловленной синдромом диабетической стопы, представляет собой одно из тяжелых осложнений сахарного диабета и одну из основных причин госпитализации среди пациентов, страдающих от диабета. Важно отметить, что Р. aeruginosa часто вызывает тяжелое поражение тканей в язвах, обусловленных синдромом диабетической стопы (Sivanmaliappan and Sevanan, Int J Microbiol. Идентификационный номер статьи: 605195 (2011)). С целью демонстрации эффективности полипептидов лизина согласно настоящему изобретению при лечении инфекции язвы, обусловленной синдромом диабетической стопы, будет проведено клиническое исследование.
[00172] Сначала образец посева раневого отделяемого от индивидуального пациента будут исследовать для определения присутствия P. aeruginosa. Затем будут подтверждать чувствительность P. aeruginosa к одному или нескольким полипептидам лизина согласно настоящему изобретению (например, в пуле) с применением, например, способа диффузии дисков согласно критериям Института клинических и лабораторных стандартов (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) (van der Heijden et al. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 6:8 (2007)). В качестве альтернативы, будут проводить предварительный отбор пациентов, удовлетворяющих критерию микробиологической чувствительности к лизину. Параллельно будут определять чувствительность индивидуального штамма к подходящему применяемому антибиотику, например, полимиксину В, in vitro (или будут проводить предварительный отбор пациентов, удовлетворяющих критерию микробиологической чувствительности к конкретному антибиотику). Чувствительный штамм, например, АТСС 27853 P. aeruginosa (чувствительный к полимиксину), можно применять для контроля качества (КК). Помимо этого, будут определять чувствительность P. aeruginosa, присутствующего в образце посева раневого отделяемого, к комбинированной терапии, включающей как полипептид или полипептиды лизина, так и предпочтительный антибиотик, такой как полимиксин В (чтобы исключить возможность ингибирования лизина раневой средой - см. Пример 5 и Фиг. 7 и их обсуждение выше).
[00173] После исследований чувствительности in vitro авторы настоящего изобретения будут исследовать эффективность полипептидов лизина согласно настоящему изобретению in vivo при лечении инфекций диабетической язвы. Лизин можно вводить посредством инъекции, например, внутривенной или подкожной инъекции, или можно непосредственно наносить на рану в виде состава для местного применения. Более того, полипептиды лизина будут исследовать в комбинации с антибиотиком, применяемым для лечения диабетической язвы, где антибиотик можно вводить системно (перорально или парентерально) или местно, как указано согласно стандартному режиму введения доз конкретного антибиотика. Например, если полимиксин В используют в комбинации с полипептидами лизина, рекомендуемый режим введения доз внутривенного полимиксина В составляет от 1,5 до 2,5 мг/кг/день.
[00174] Поскольку инфекции язвы, обусловленной синдромом диабетической стопы, часто являются полимикробными со смесью грамположительных и грамотрицательных видов (Citron et al. J Clin Microbiol. 45(9): 2819-2828 (2007)), полипептиды лизина согласно настоящему изобретению можно применять в комбинации с более чем одним антибиотиком и/или с одним или несколькими другими лизинами, подходящими для лечения грамположительных бактерий, присутствующих в инфекции язвы стопы данного пациента. Предполагается, что лечение лизином будет сопровождаться высокой частотой ответа, например, в показателях log снижения или уничтожения популяции бактерий или любого другого клинического или лабораторного показателя улучшения. Ответ на комбинацию лизина согласно настоящему изобретению и антибиотик, как предполагается, будет даже более высоким, поскольку лизины и антибиотики действуют синергически. В действительности, возможно снизить вводимое количество одного или обоих из лизина или антибиотика без ущерба эффективности.
Пример возможного применения 7
Местное лечение ожога у субъекта-человека
[00175] Инфекции ожоговых ран вызывают серьезную озабоченность, поскольку они отсрочивают заживление, способствуют образованию рубцов и могут привести к бактериемии, сепсису или недостаточности органов. P. aeruginosa является наиболее частой причиной ожоговых инфекций (Church et al. Clinical Microbiology Reviews, 19 (2), 403-434 (2006)). Поскольку было показано, что полипептиды лизина согласно настоящему изобретению являются активными против P. aeruginosa, предполагается, что их можно использовать для лечения таких инфекций в виде монотерапии или, более предпочтительно, в комбинации с одним или несколькими антибиотиками.
[00176] Композиции для местного введения в форме крема, геля и/или пены, содержащие полипептиды лизина согласно настоящему изобретению, будут наносить на пораженную область кожи пациентов, страдающих от ожогов различной степени, включая ожоги I, II и III степени. Композицию для местного введения, содержащую полипептиды лизина с антибиотиками или дополнительными активными средствами (лизинами, активными против отличных организмов-мишеней, и, необязательно, антибиотиками, направленными против данных организмов-мишеней) или без них, будут наносить непосредственно на инфицированную область ожога в течение различных периодов времени.
[00177] Местное применение полипептидов лизина, как предполагается, приведет к снижению или устранению симптомов у пациентов, а также к снижению или уничтожению количества бактерии-возбудителя.
[00178] Представленные выше примеры иллюстрируют способы и свойства, описанные в данном документе, и не являются ограничивающими. Более того, они содержат утверждения общей применимости настоящего изобретения, и такие утверждения не ограничены конкретным примером, в котором они указаны, но представляют собой выводы, описания и выражения более широкой сущности экспериментальных результатов, описанных в данном документе.
[00179] Содержание всех источников, ссылки на которые приводятся в данном документе, полностью включено посредством ссылки так, как если бы каждый источник был полностью приведен в данном документе, для всех целей.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> КОНТРАФЕКТ КОРПОРЕЙШН, US
<120> ПОЛИПЕПТИДЫ ЛИЗИНА, АКТИВНЫЕ ПРОТИВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ
<130> 11003/005100-WO0
<140> PCT/US2016/052338
<141> 2016-09-16
<150> 62/247,619
<151> 2015-10-28
<150> 62/220,212
<151> 2015-09-17
<161> Число SEQ ID NO: 21
<210> SEQ ID NO 1
<211> Длина: 126
<212> Тип: Белок
<213> Организм: Micavibrio aeruginosavorus
<400> Последовательность: 1
Met Thr Tyr Thr Leu Ser Lys Arg Ser Leu Asp Asn Leu Lys Gly Val
His Pro Asp Leu Val Ala Val Val His Arg Ala Ile Gln Leu Thr Pro
Val Asp Phe Ala Val Ile Glu Gly Leu Arg Ser Val Ser Arg Gln Lys
Glu Leu Val Ala Ala Gly Ala Ser Lys Thr Met Asn Ser Arg His Leu
Thr Gly His Ala Val Asp Leu Ala Ala Tyr Val Asn Gly Ile Arg Trp
Asp Trp Pro Leu Tyr Asp Ala Ile Ala Val Ala Val Lys Ala Ala Ala
Lys Glu Leu Gly Val Ala Ile Val Trp Gly Gly Asp Trp Thr Thr Phe
Lys Asp Gly Pro His Phe Glu Leu Asp Arg Ser Lys Tyr Arg
<210> SEQ ID NO 2
<211> Длина: 147
<212> Тип: Белок
<213> Организм: Неизвестно
<220> Характеристика:
<221> Название/Ключ: источник
<223> ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /комментарий=“Описание неизвестного источника: морской метагеном”
<400> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 2
Met Lys Ile Ser Leu Glu Gly Leu Ser Leu Ile Lys Lys Phe Glu Gly
Cys Lys Leu Glu Ala Tyr Lys Cys Ser Ala Gly Val Trp Thr Ile Gly
Tyr Gly His Thr Ala Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Cys Thr Gln Glu
Glu Ala Glu Lys Leu Leu Arg Gly Asp Ile Phe Lys Phe Glu Glu Tyr
Val Gln Asp Ser Val Lys Val Asp Leu Asp Gln Ser Gln Phe Asp Ala
Leu Val Ala Trp Thr Phe Asn Leu Gly Pro Gly Asn Leu Arg Ser Ser
Thr Met Leu Lys Lys Leu Asn Asn Gly Glu Tyr Glu Ser Val Pro Phe
Glu Met Arg Arg Trp Asn Lys Ala Gly Gly Lys Thr Leu Asp Gly Leu
Ile Arg Arg Arg Gln Ala Glu Ser Leu Leu Phe Glu Ser Lys Glu Trp
His Gln Val
<210> SEQ ID NO 3
<211> Длина: 144
<212> Тип: Белок
<213> Организм: фаг Pseudomonas PAJU2
<400> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 3
Met Arg Thr Ser Gln Arg Gly Ile Asp Leu Ile Lys Ser Phe Glu Gly
Leu Arg Leu Ser Ala Tyr Gln Asp Ser Val Gly Val Trp Thr Ile Gly
Tyr Gly Thr Thr Arg Gly Val Thr Arg Tyr Met Thr Ile Thr Val Glu
Gln Ala Glu Arg Met Leu Ser Asn Asp Ile Gln Arg Phe Glu Pro Glu
Leu Asp Arg Leu Ala Lys Val Pro Leu Asn Gln Asn Gln Trp Asp Ala
Leu Met Ser Phe Val Tyr Asn Leu Gly Ala Ala Asn Leu Ala Ser Ser
Thr Leu Leu Lys Leu Leu Asn Lys Gly Asp Tyr Gln Gly Ala Ala Asp
Gln Phe Pro Arg Trp Val Asn Ala Gly Gly Lys Arg Leu Asp Gly Leu
Val Lys Arg Arg Ala Ala Glu Arg Ala Leu Phe Leu Glu Pro Leu Ser
<210> SEQ ID NO 4
<211> Длина: 181
<212> Тип: Белок
<213> Организм: фаг Pseudomonas Lu11
<400> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 4
Met Asn Asn Glu Leu Pro Trp Val Ala Glu Ala Arg Lys Tyr Ile Gly
Leu Arg Glu Asp Thr Ser Lys Thr Ser His Asn Pro Lys Leu Leu Ala
Met Leu Asp Arg Met Gly Glu Phe Ser Asn Glu Ser Arg Ala Trp Trp
His Asp Asp Glu Thr Pro Trp Cys Gly Leu Phe Val Gly Tyr Cys Leu
Gly Val Ala Gly Arg Tyr Val Val Arg Glu Trp Tyr Arg Ala Arg Ala
Trp Glu Ala Pro Gln Leu Thr Lys Leu Asp Arg Pro Ala Tyr Gly Ala
Leu Val Thr Phe Thr Arg Ser Gly Gly Gly His Val Gly Phe Ile Val
Gly Lys Asp Ala Arg Gly Asn Leu Met Val Leu Gly Gly Asn Gln Ser
Asn Ala Val Ser Ile Ala Pro Phe Ala Val Ser Arg Val Thr Gly Tyr
Phe Trp Pro Ser Phe Trp Arg Asn Lys Thr Ala Val Lys Ser Val Pro
Phe Glu Glu Arg Tyr Ser Leu Pro Leu Leu Lys Ser Asn Gly Glu Leu
Ser Thr Asn Glu Ala
<210> SEQ ID NO 5
<211> Длина: 439
<212> Тип: Белок
<213> Организм: Pseudomonas sp.
<400> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 5
Met Lys Arg Thr Thr Leu Asn Leu Glu Leu Glu Ser Asn Thr Asp Arg
Leu Leu Gln Glu Lys Asp Asp Leu Leu Pro Gln Ser Val Thr Asn Ser
Ser Asp Glu Gly Thr Pro Phe Ala Gln Val Glu Gly Ala Ser Asp Asp
Asn Thr Ala Glu Gln Asp Ser Asp Lys Pro Gly Ala Ser Val Ala Asp
Ala Asp Thr Lys Pro Val Asp Pro Glu Trp Lys Thr Ile Thr Val Ala
Ser Gly Asp Thr Leu Ser Thr Val Phe Thr Lys Ala Gly Leu Ser Thr
Ser Ala Met His Asp Met Leu Thr Ser Ser Lys Asp Ala Lys Arg Phe
Thr His Leu Lys Val Gly Gln Glu Val Lys Leu Lys Leu Asp Pro Lys
Gly Glu Leu Gln Ala Leu Arg Val Lys Gln Ser Glu Leu Glu Thr Ile
Gly Leu Asp Lys Thr Asp Lys Gly Tyr Ser Phe Lys Arg Glu Lys Ala
Gln Ile Asp Leu His Thr Ala Tyr Ala His Gly Arg Ile Thr Ser Ser
Leu Phe Val Ala Gly Arg Asn Ala Gly Leu Pro Tyr Asn Leu Val Thr
Ser Leu Ser Asn Ile Phe Gly Tyr Asp Ile Asp Phe Ala Leu Asp Leu
Arg Glu Gly Asp Glu Phe Asp Val Ile Tyr Glu Gln His Lys Val Asn
Gly Lys Gln Val Ala Thr Gly Asn Ile Leu Ala Ala Arg Phe Val Asn
Arg Gly Lys Thr Tyr Thr Ala Val Arg Tyr Thr Asn Lys Gln Gly Asn
Thr Ser Tyr Tyr Arg Ala Asp Gly Ser Ser Met Arg Lys Ala Phe Ile
Arg Thr Pro Val Asp Phe Ala Arg Ile Ser Ser Arg Phe Ser Leu Gly
Arg Arg His Pro Ile Leu Asn Lys Ile Arg Ala His Lys Gly Val Asp
Tyr Ala Ala Pro Ile Gly Thr Pro Ile Lys Ala Thr Gly Asp Gly Lys
Ile Leu Glu Ala Gly Arg Lys Gly Gly Tyr Gly Asn Ala Val Val Ile
Gln His Gly Gln Arg Tyr Arg Thr Ile Tyr Gly His Met Ser Arg Phe
Ala Lys Gly Ile Arg Ala Gly Thr Ser Val Lys Gln Gly Gln Ile Ile
Gly Tyr Val Gly Met Thr Gly Leu Ala Thr Gly Pro His Leu His Tyr
Glu Phe Gln Ile Asn Gly Arg His Val Asp Pro Leu Ser Ala Lys Leu
Pro Met Ala Asp Pro Leu Gly Gly Ala Asp Arg Lys Arg Phe Met Ala
Gln Thr Gln Pro Met Ile Ala Arg Met Asp Gln Glu Lys Lys Thr Leu
Leu Ala Leu Asn Lys Gln Arg
<210> SEQ ID NO 6
<211> Длина: 39
<212> Тип: Белок
<213> Организм: Искусственная Последовательность
<220> Характеристика:
<221> Название/Ключ: источник
<223> ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /комментарий=“Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид”
<400> Последовательность: 6
Asn Lys Gly Asp Tyr Gln Gly Ala Ala Asp Gln Phe Pro Arg Trp Val
Asn Ala Gly Gly Lys Arg Leu Asp Gly Leu Val Lys Arg Arg Ala Ser
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
<210> SEQ ID NO 7
<211> Длина: 42
<212> Тип: Белок
<213> Организм: фаг Pseudomonas PAJU2
<400> Последовательность: 7
Asn Lys Gly Asp Tyr Gln Gly Ala Ala Asp Gln Phe Pro Arg Trp Val
Asn Ala Gly Gly Lys Arg Leu Asp Gly Leu Val Lys Arg Arg Ala Ala
Glu Arg Ala Leu Phe Leu Glu Pro Leu Ser
<210> SEQ ID NO 8
<211> Длина: 31
<212> Тип: Белок
<213> Организм: фаг Pseudomonas PAJU2
<400> Последовательность: 8
Asn Lys Gly Asp Tyr Gln Gly Ala Ala Asp Gln Phe Pro Arg Trp Val
Asn Ala Gly Gly Lys Arg Leu Asp Gly Leu Val Lys Arg Arg Ala
<210> SEQ ID NO 9
<211> Длина: 31
<212> Тип: Белок
<213> Организм: Искусственная последовательность
<220> Характеристика:
<221> Название/Ключ: источник
<223> ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /комментарий=“Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид”
<400> Последовательность: 9
Asn Lys Gly Asp Tyr Gln Gly Ala Ala Asp Gln Phe Pro Arg Trp Val
Asn Ala Gly Gly Lys Arg Leu Asp Gly Leu Val Lys Arg Arg Lys
<210> SEQ ID NO 10
<211> Длина: 43
<212> Тип: Белок
<213> Организм: Искусственная последовательность
<220> Характеристика:
<221> Название/Ключ: источник
<223> ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /комментарий=“Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид”
<400> Последовательность: 10
Asn Lys Gly Asp Tyr Gln Gly Ala Ala Asp Gln Phe Pro Arg Trp Val
Asn Ala Gly Gly Lys Arg Leu Asp Gly Leu Val Lys Arg Arg Ala Ala
Glu Arg Ala Leu Phe Leu Glu Pro Leu Ser Cys
<210> SEQ ID NO 11
<211> Длина: 381
<212> Тип: ДНК
<213> Организм: Micavibrio aeruginosavorus
<400> Последовательность: 11
atgacataca ccctgagcaa aagaagcctg gataacctaa aaggcgttca tcccgatctg 60
gttgccgttg tccatcgcgc catccagctt acaccggttg atttcgcggt gatcgaaggc 120
ctgcgctccg tatcccgcca aaaggaactg gtggccgccg gcgccagcaa gaccatgaac 180
agccgacacc tgacaggcca tgcggttgat ctagccgctt acgtcaatgg catccgctgg 240
gactggcccc tgtatgacgc catcgccgtg gctgtgaaag ccgcagcaaa ggaattgggt 300
gtggccatcg tgtggggcgg tgactggacc acgtttaagg atggcccgca ctttgaactg 360
gatcggagca aatacagatg a 381
<210> SEQ ID NO 12
<211> Длина: 444
<212> Тип: ДНК
<213> Организм: Неизвестно
<220> Характеристика:
<221> Название/Ключ: источник
<223> ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /комментарий=“Описание неизвестного источника: морской метагеном»
<400> Последовательность: 12
atgaaaatta gtttagaggg attatctctc atcaaaaaat ttgagggttg taaactagaa 60
gcatacaaat gttctgcagg agtgtggact ataggttatg gtcatactgc aggtgtaaaa 120
gaaggtgatg tttgcacaca agaggaagct gaaaaattat taagaggaga tatctttaaa 180
tttgaagagt atgtgcaaga tagtgtaaag gttgatttag accaaagtca atttgacgca 240
ttagttgcat ggacatttaa tttaggccca ggtaatttaa gaagttcaac catgttgaaa 300
aaattaaata atggagagta tgaatctgtt cctttcgaaa tgagaaggtg gaataaagca 360
ggtggtaaaa ccttagatgg tttaatcaga agacgccaag cagaatcatt attatttgaa 420
agtaaagagt ggcatcaagt ataa 444
<210> SEQ ID NO 13
<211> Длина: 435
<212> Тип: ДНК
<213> Организм: фаг Pseudomonas PAJU2
<400> Последовательность: 13
atgcgtacat cccaacgagg catcgacctc atcaaatcct tcgagggcct gcgcctgtcc 60
gcttaccagg actcggtggg tgtctggacc ataggttacg gcaccactcg gggcgtcacc 120
cgctacatga cgatcaccgt cgagcaggcc gagcggatgc tgtcgaacga cattcagcgc 180
ttcgagccag agctagacag gctggcgaag gtgccactga accagaacca gtgggatgcc 240
ctgatgagct tcgtgtacaa cctgggcgcg gccaatctgg cgtcgtccac gctgctcaag 300
ctgctgaaca agggtgacta ccagggagca gcggaccagt tcccgcgctg ggtgaatgcg 360
ggcggtaagc gcttggatgg tctggttaag cgtcgagcag ccgagcgtgc gctgttcctg 420
gagccactat cgtga 435
<210> SEQ ID NO 14
<211> Длина: 546
<212> Тип: ДНК
<213> Организм: фаг Pseudomonas Lu11
<400> Последовательность: 14
atgaataacg aacttccttg ggtagccgaa gcccgaaagt atatcggcct tcgcgaagac 60
acttcgaaga cttcgcataa cccgaaactt cttgccatgc ttgaccgcat gggcgaattt 120
tccaacgaat cccgcgcttg gtggcacgac gacgaaacgc cttggtgcgg actgttcgtc 180
ggctattgct tgggcgttgc cgggcgctac gtcgtccgcg aatggtacag ggcgcgggca 240
tgggaagccc cgcagcttac gaagcttgac cggcccgcat acggcgcgct tgtgaccttc 300
acgcgaagcg gcggcggcca cgtcggtttt attgtgggca aggatgcgcg cggaaatctt 360
atggttcttg gcggtaatca gtcgaacgcc gtaagtatcg caccgttcgc agtatcccgc 420
gtaaccggct atttctggcc gtcgttctgg cgaaacaaga ccgcagttaa aagcgttccg 480
tttgaagaac gttattcgct gccgctgttg aagtcgaacg gcgaactttc gacgaatgaa 540
gcgtaa 546
<210> SEQ ID NO 15
<211> Длина: 546
<212> Тип: ДНК
<213> Организм: Pseudomonas sp.
<400> Последовательность: 15
atgaataacg aacttccttg ggtagccgaa gcccgaaagt atatcggcct tcgcgaagac 60
acttcgaaga cttcgcataa cccgaaactt cttgccatgc ttgaccgcat gggcgaattt 120
tccaacgaat cccgcgcttg gtggcacgac gacgaaacgc cttggtgcgg actgttcgtc 180
ggctattgct tgggcgttgc cgggcgctac gtcgtccgcg aatggtacag ggcgcgggca 240
tgggaagccc cgcagcttac gaagcttgac cggcccgcat acggcgcgct tgtgaccttc 300
acgcgaagcg gcggcggcca cgtcggtttt attgtgggca aggatgcgcg cggaaatctt 360
atggttcttg gcggtaatca gtcgaacgcc gtaagtatcg caccgttcgc agtatcccgc 420
gtaaccggct atttctggcc gtcgttctgg cgaaacaaga ccgcagttaa aagcgttccg 480
tttgaagaac gttattcgct gccgctgttg aagtcgaacg gcgaactttc gacgaatgaa 540
gcgtaa 546
<210> SEQ ID NO 16
<211> Длина: 8
<212> Тип: Белок
<213> Организм: вирус Гепатита B
<400> Последовательность: 16
Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
<210> SEQ ID NO 17
<211> Длина: 1320
<212> Тип: ДНК
<213> Организм: Pseudomonas sp.
<400> Последовательность: 17
atgaagagga ccacgctcaa tctggagctt gaaagcaaca ccgatcgcct ccttcaggag 60
aaagacgacc tcctgccgca atcggtcacc aattccagcg acgaaggcac gcctttcgct 120
caggtagaag gcgcctccga cgacaacacc gccgagcaag actcggacaa gccgggcgca 180
tctgtagccg atgccgacac caagcccgtc gatcccgagt ggaagaccat caccgtcgcc 240
agtggcgata cgctgtcgac cgtattcacc aaggcaggcc tttccacctc ggccatgcac 300
gacatgctga ccagcagcaa ggatgccaag cgcttcaccc atctgaaggt cggccaggag 360
gtcaagctca agctcgaccc caaaggagag ctgcaggcac tgcgagtcaa gcagagcgaa 420
ctcgagacca tcggcctgga caagaccgac aagggctact ccttcaaacg cgagaaggcc 480
cagatcgacc tgcataccgc ctatgcccat ggccgcatca ccagctcgct gttcgttgcc 540
ggtcgtaacg ccggcctgcc ctataacctg gtcacgtcgc tgtcgaacat cttcggctac 600
gacatcgact tcgccctcga tctgcgtgaa ggcgacgagt tcgacgtgat ctacgaacaa 660
cacaaggtca acggcaagca agtggcgacc ggcaatatcc tcgccgcccg cttcgtcaac 720
cgtggcaaga cctacaccgc cgtgcgctat accaacaagc agggcaatac cagctactac 780
cgcgccgacg gctccagcat gcgcaaggca ttcatccgta cgccggtgga tttcgcccgt 840
atcagctcgc gcttctccct gggccgccgc cacccgatcc tgaacaagat ccgcgcacac 900
aagggcgtcg actacgcagc ccccatcggc acaccgatca aggccaccgg agacggcaag 960
atcctcgaag ccggacgcaa ggggggctac ggcaacgccg tggtgatcca gcacggccag 1020
cgctatcgga ccatctacgg acacatgagc cgcttcgcca agggtatccg cgccggtacc 1080
agcgtgaagc agggccagat catcggttac gtaggcatga cgggcctggc caccggcccg 1140
cacctgcact acgagttcca gatcaatggc cgtcacgtcg atccgctgag cgccaagctg 1200
cccatggcgg acccgctcgg tggcgcagat cgcaagcgct tcatggcgca gacccagccg 1260
atgatcgcgc gcatggatca ggagaagaaa accctcctgg ccctgaacaa gcagcgctga 1320
<210> SEQ ID NO 18
<211> Длина: 127
<212> Тип: Белок
<213> Организм: Streptomyces sp. 212
<400> Последовательность: 18
Met Ser Phe Gly Leu Ser Gln Arg Ser Arg Glu Arg Leu Lys Gly Val
His Pro Asp Leu Val Ala Val Val Glu Ala Ala Ile Arg Leu Thr Pro
Val Asp Phe Met Ile Thr Glu Gly Leu Arg Thr Pro Ala Arg Gln Ala
Glu Leu Val Arg Ala Gly Ala Ser Arg Thr Leu Asn Ser Arg His Leu
Thr Gly His Ala Val Asp Val Ala Ala Trp Ile Asp Gly Glu Val Arg
Trp Asp Trp Pro Leu Tyr Pro Arg Ile Ala Glu Ala Phe Lys Ala Ala
Ala Lys Asp Arg Asp Val Ala Leu Ile Trp Gly Gly Asp Trp Pro Arg
Leu Arg Asp Gly Pro His Phe Glu Leu Asp Arg Arg Gly Tyr Pro
<210> SEQ ID NO 19
<211> Длина: 125
<212> Тип: Белок
<213> Организм: Escherichia coli
<400> Последовательность: 19
Met Pro Gly Lys Phe Arg Phe Ser Arg Arg Ser Glu Lys Asn Leu Glu
Gly Val Lys Pro Gln Leu Val Ala Val Val Arg Arg Ala Leu Glu Leu
Thr Glu Val Asp Phe Gly Ile Thr Glu Gly Leu Arg Ser Lys Tyr Arg
Gln Lys Gln Leu Val Ala Ala Gly Lys Ser Gln Thr Met Asn Ser Arg
His Leu Thr Gly Asp Ala Val Asp Val Val Ala Tyr Ile Gly Ser Gln
Val Ser Trp Asp Trp Pro Leu Tyr Glu Lys Ile Ala Gln Ala Phe Lys
Gln Ala Ala Ala Glu Leu Gly Thr Ala Ile Glu Trp Gly Gly Asp Trp
Lys Thr Leu Lys Asp Gly Pro His Phe Gln Leu Lys Arg
<210> SEQ ID NO 20
<211> Длина: 125
<212> Тип: Белок
<213> Организм: фаг Enterobacteria phiP27
<400> Последовательность: 20
Met Ser Gly Lys Phe Arg Phe Ser Arg Arg Ser Glu Lys Asn Leu Glu
Gly Val Lys Pro Gln Leu Val Ala Val Val Arg Arg Ala Leu Glu Leu
Thr Glu Val Asp Phe Gly Ile Thr Glu Gly Leu Arg Thr Lys Glu Arg
Gln Lys Gln Leu Val Ala Glu Gly Lys Ser Gln Thr Met Asn Ser Arg
His Leu Thr Gly Asp Ala Val Asp Val Val Ala Tyr Ile Gly Ser Gln
Val Ser Trp Asp Trp Pro Leu Tyr Glu Lys Ile Ala Gln Ala Phe Lys
Gln Ala Ala Ala Glu Leu Gly Thr Ala Ile Glu Trp Gly Gly Asp Trp
Lys Thr Leu Lys Asp Gly Pro His Phe Gln Leu Lys Trp
<210> SEQ ID NO 21
<211> Длина: 138
<212> Тип: Белок
<213> Организм: фаг Yersinia PY100
<400> Последовательность: 21
Met Glu Val Gln Pro Thr Ile Glu Glu Val Ser Met Gly Phe Lys Leu
Gly Ser Arg Ser Leu Gln Arg Leu Gln Gly Val His Pro Asp Leu Val
Lys Val Val Lys Arg Ala Ile Glu Ile Ser Pro Val Asp Phe Thr Val
Thr Glu Gly Leu Arg Thr Leu Glu Arg Gln Lys Glu Leu Phe Ala Lys
Gly Ala Ser Lys Thr Met Arg Ser Arg His Leu Thr Gly His Ala Val
Asp Ile Ser Pro Leu Val Asp Gly Lys Val Ser Trp Asp Trp Lys Tyr
Tyr Tyr Pro Met Ala Asp Ala Met Lys Gln Ala Ala Lys Glu Leu Asn
Ile Pro Val Glu Trp Gly Gly Asp Trp Lys Thr Phe Lys Asp Gly Pro
His Phe Gln Leu Pro Tyr Gly Val Tyr Lys
<---