СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ
METHOD OF PRODUCTION OF RABIES DIAGNOSTIC SERUM

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения гипериммунной антирабической сыворотки крови овец, и может быть использовано для получения компонентов тест-систем для диагностики бешенства животных.
Согласно рекомендациям ВОЗ и МЭБ, метод прямой иммунофлюоресценции (МФА) является «золотым стандартом», который предназначенный для обнаружения вируса бешенства на свежих образцах ткани мозга животных, с подозрением на бешенство, с помощью антител, маркированных флюоресцеинизоционатом (ФИТЦ). Это единственный стандартизованный экспресс-метод, который позволяет в 95-99% случаев идентифицировать Lyssavirus-специфические антигены, независимо от географического происхождения и статуса хозяина [1]. В качестве поддерживающих тестов вирус бешенства, по данным МЭБ, может быть обнаружен с использованием методов РДП, РСК, ИФА и иммунохроматографического анализа [2, 3]. Чувствительность диагностических методов индикации вируса бешенства напрямую зависит от активности и специфичности антител, направленных к штаммо- и специфическим антигенным детерминантам нуклеопротеина (N-белок), выделенных из антирабических сывороток различных видов животных (лошадей, КРС, овец, кроликов, морских свинок, собак, ослов). Производство высокоактивной антирабической сыворотки связано с состоянием иммунной системы продуцентов и титром специфических к нуклеопротеину вируса бешенства антител. Известно, что инактивированный антигенный материал индуцирует преимущественно гуморальный иммунный ответ, поэтому эффективность иммунизации можно достичь применением иммунокорригирующих средств. [4].
Известен способ получения высокоспецифичной гетерологичной антирабической сыворотки, который включает иммунизацию очищенным и концентрированным вирусом бешенства, полученным на культуре перевиваемых клеток Vero или на первичной культуре клеток почек сирийского хомяка; в качестве адъюванта используют гель фосфата алюминия и/или нуклеинат натрия; длительность схемы иммунизации лошадей составляет 2-6 месяцев, включая грундиммунизацию, основной, поддерживающий и укороченный циклы иммунизации [5].
Известен способ получения антирабической сыворотки путем введения подкожно с интервалом 7 дней инактивированного вируса бешенства на протяжении 105 дней, первую инъекцию делают с полным адъювантом Фрейнда [6].
Известен способ иммунизации лошадей фиксированным вирусом бешенства, выращенным в культуре перевиваемых клеток почки хомяков или новорожденных морских свинок для производства антирабического гаммаглобулина [7].
Таким образом, все известные способы получения диагностических поливалентных антирабических сывороток имеют общие недостатки, заключающиеся в недостаточной активности получаемых сывороток, длительности их получения.
Наиболее близким по существу заявленных признаков является способ получения гипериммунной антирабической сыворотки, сущностью которого является 5-кратная иммунизация овец 5%-ной суспензией мозга овец, инфицированной вирусом бешенства референс-штамма «CVS», инактивированной β-пропиолактоном (1:4000, в течение 2 ч при 37°С). Иммунизацию проводят в 3-42 точки животного с интервалом 14 дней, используя внутрикожное и внутримышечное введение антигена вируса бешенства с адъювантами (адъюванты Фрейнда и гидроокись алюминия соответственно). Способ позволяет получать сыворотки крови овец с титрами антител в тесте ингибиции фокусов флюоресценции 1:10240-20480, а в реакции диффузной преципитации - 1:16-32 [8].
Недостатком указанного способа является использование для иммунизации суспензии ткани мозга, инфицированной вирусом бешенства, что приводит к накоплению в сыворотке крови овец балластных антител и получению сыворотки с низкими тирами специфических преципитирующих антител. Другим недостатком прототипа является множественность точек введения и большой расход вирусного антигена, а также использование высокореактогенного адъюванта Фрейнда и 0,3%-ной гидроокиси алюминия.
Техническим результатом изобретения является упрощение и ускорение способа, а также повышение качества целевого продукта за счет увеличения специфической активности сыворотки.
Технический результат достигается в способе получения антирабической диагностической сыворотки, включающем иммунизацию животных-продуцентов антигенным материалом и адъювантом, крововзятие и приготовление сыворотки, тем, что в качестве адъюванта используют смесь ланолина и полиэтилсилоксановой жидкости, взятых в весовых соотношениях 1:2-9 соответственно, дополнительно используют иммуномодулятор иммунофан из расчета 0,8-1,2 мл на одно животное, иммунизацию осуществляют 5-кратно, причем вначале трехкратно с интервалом 20-24 часа вводят антиген совместно с адъювантом, взятых в весовых соотношениях 1:0,8-1,0 из расчета 10-14 мл смеси антигена с адъювантом на одно животное и одновременно - иммунофан, затем через 12-16 суток антиген вводят из расчета 5-7 мл антигена на одно животное и одновременно - иммунофан, затем через 7-8 суток вводят антиген из расчета 5-7 мл антигена на одно животное.
Технический результат также достигается в способе получения антирабической диагностической сыворотки тем, что смесь антигена с адъювантом и отдельно антиген вводят подкожно в паховую область, а иммунофан - внутримышечно в противоположное от введения смеси антигена с адъювантом или отдельно антигена бедро.
Технический результат также достигается в способе получения антирабической диагностической сыворотки тем, что в качестве полиэтилсилоксановой жидкости используют полиэтилсилоксановую жидкость марки ПЭС-2 или ПЭС-3.
Технический результат также достигается в способе получения антирабической диагностической сыворотки тем, что в качестве антигенного материала используют штамм вируса бешенства «овечий ВГНКИ» и референс-штамм «CVS».
Ланолин (от лат. lana - шерсть и лат. oleum - масло) - шерстяной воск, животный воск, получаемый при вываривании шерсти овец. Ланолин, Е913, другие названия: животный воск, безводный ланолин, ацетилированный ланолин, гидратный ланолин, оксиэтилированный ланолин, Е913, Англ: Е913, lanolin. Широко применяется в составе различных косметических средств - кремов и т.п., в медицине используется как основа для различных мазей (в частности глазных), пластырей и клейких повязок [1], а также для смягчения кожи / Блинова К.Ф. и др. Ботанико-фармакогностический словарь: Справ, пособие / Под ред. К.Ф. Блиновой, Г.П. Яковлева. - М.: Высш. шк., 1990. - С. 80/.
Жидкость полиэтилсилоксановая (Большая энциклопедия нефти и газа, стр. 3; ГОСТ 13004-77), представляющие собой смеси полимеров преимущественно линейной структуры. Жидкости ПЭС-2 и ПЭС-3 представляют собой полидиэтилсилоксановый полимер линейной структуры (ГОСТ 13004-77). Полиэтилсилоксановая жидкость ПЭС-3 применяется в качестве охлаждающей и рабочей жидкости в гидравлических системах, а также в качестве добавки в полировальные составы. Полиэтилсилоксановая жидкость ПЭС-2 применяется как теплоноситель и как демпфирующая жидкость в низкотемпературных приборах.
Штаммы вирусов бешенства: «овечий ВГНКИ» (патент Республики Казахстан №26221, МПК A61K 39/205, опубл.: 15.10.2012 Бюл. №10) и референс-штамм «CVS» (патент РФ №2196607, МПК A61K 39/205, опубл.: 20.01.2003) известны.
В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы получения антирабической диагностической сыворотки, аналогичные заявляемым, т.е. предложение соответствует критерию «новизны».
Все режимы способа осуществимы в промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».
Впервые предложен способ получения антирабической диагностической сыворотки, где в качестве адъюванта используют смесь ланолина и полиэтилсилоксановой жидкости, дополнительно используют иммуномодулятор иммунофан, а иммунизацию осуществляют 5-кратно. Кроме того, исключение ряда этапов в способе получения антирабической диагностической сыворотки при увеличении качества целевого продукта позволило существенно упростить и ускорить процесс его получения, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.
50
Пример 1. В качестве антигена для иммунизации баранов используют вирус бешенства, который получают из 10-ной суспензии ткани мозга баранов, зараженных штаммом «овечий ВГНКИ», центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 мин и последующим ультрацентрифугированием супернатанта при 36 тыс. об/мин в течение 60 мин. Осадок после центрифугирования растворяли в 1/10 первоначального объема в 10 мМ трис-HCl рН 7,6 и инактивировали β-пропиолактоном (1:4000, в течение 2 ч при 37°С). Содержание белка в препарате антигена составляет 0,03 мг/мл, очистка от белков ткани мозга - 97,3%, индекс иммуногенности - 5,6 lg/0,03. Для получения антирабической диагностической сыворотки проводят иммунизацию животных-продуцентов (овцам) антигенным материалом и адъювантом, а в качестве адъюванта используют смесь ланолина и полиэтилсилоксановой жидкости марки ПЭС-3, взятых в весовых соотношениях 1:9 соответственно, дополнительно используют иммуномодулятор иммунофан из расчета 1,2 мл на одно животное, иммунизацию осуществляют 5-кратно, причем вначале трехкратно с интервалом 24 часа вводят антиген совместно с адъювантом, взятых в весовых соотношениях 1:1 из расчета 14 мл смеси антигена с адъювантом на одно животное и одновременно - иммунофан, затем через 16 суток антиген вводят из расчета 7 мл антигена на одно животное и одновременно - иммунофан, затем через 8 суток вводят антиген из расчета 7 мл антигена на одно животное. Крововзятие и приготовление сыворотки проводят в соответствии с известным способом.
50
Пример 2. В качестве антигена для иммунизации баранов используют вирус бешенства, который получают из 10-ной суспензии ткани мозга баранов, зараженных штаммом «овечий ВГНКИ», центрифугированием при 6 тыс. об/мин в течение 25 мин и последующим ультрацентрифугированием супернатанта при 40 тыс. об/мин в течение 70 мин. Осадок после центрифугирования растворяли в 1/8 первоначального объема в 10 мМ трис-HCl рН 7,4 и инактивировали β-пропиолактоном (1:4000, в течение 2,5 ч при 38°С). Содержание белка в препарате антигена составляет 0,04 мг/см, очистка от белков ткани мозга - 97,3%, индекс иммуногенности - 5,7 lg/0,03. Для получения антирабической диагностической сыворотки проводят иммунизацию животных-продуцентов (овец) антигенным материалом и адъювантом, а в качестве адъюванта используют смесь ланолина и полиэтилсилоксановой жидкости марки ПЭС-3, взятых в весовых соотношениях 1:2, соответственно, дополнительно используют иммуномодулятор иммунофан из расчета 0,8 мл на одно животное, иммунизацию осуществляют 5-кратно, причем вначале трехкратно с интервалом 20 часов вводят антиген совместно с адъювантом, взятых в весовых соотношениях 1:0,8 из расчета 10 мл смеси антигена с адъювантом на одно животное и одновременно - иммунофан, затем через 12 суток антиген вводят из расчета 5-7 мл антигена на одно животное и одновременно - иммунофан, затем через 7 суток вводят антиген из расчета 5 мл антигена на одно животное. Крововзятие и приготовление сыворотки проводят в соответствии с известным способом. Активность сыворотки составила 320 МЕ/мл, титры комплементсвязывающих антител в РСК достигают 1:320, преципитирующих антител в РДП - 1:128, в НМФА 1:2560.
50
Пример 3. В качестве антигена для иммунизации баранов используют вирус бешенства, который получают из 10-ной суспензии ткани мозга баранов, зараженных референс-штаммом «CVS», центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 мин и последующим ультрацентрифугированием супернатанта при 36 тыс. об/мин в течение 60 мин. Осадок после центрифугирования растворяли в 1/10 первоначального объема в 10 мМ трис-HCl рН 7,6 и инактивировали β-пропиолактоном (1:4000, в течение 2 ч при 37°С). Содержание белка в препарате антигена составляет 0,03 мг/мл, очистка от белков ткани мозга - 97,3%, индекс иммуногенности - 5,6 lg/0,03. Для получения антирабической диагностической сыворотки проводят иммунизацию животных-продуцентов (овец) антигенным материалом и адъювантом, а в качестве адъюванта используют смесь ланолина и полиэтилсилоксановой жидкости марки ПЭС-2, взятых в весовых соотношениях 1:9 соответственно, дополнительно используют иммуномодулятор иммунофан из расчета 1,2 мл на одно животное, иммунизацию осуществляют 5 - кратно, причем вначале трехкратно с интервалом 24 часа вводят антиген совместно с адъювантом, взятых в весовых соотношениях 1:1 из расчета 14 мл смеси антигена с адъювантом на одно животное и одновременно - иммунофан, затем через 16 суток антиген вводят из расчета 7 мл антигена на одно животное и одновременно - иммунофан, затем через 8 суток вводят антиген из расчета 7 мл антигена на одно животное. Крововзятие и приготовление сыворотки проводят в соответствии с известным способом.
50
Пример 4. В качестве антигена для иммунизации баранов используют вирус бешенства, который получают из 10-ной суспензии ткани мозга баранов, зараженных референс-штаммом «CVS», центрифугированием при 6 тыс. об/мин в течение 25 мин и последующим ультрацентрифугированием супернатанта при 40 тыс. об/мин в течение 70 мин. Осадок после центрифугирования растворяли в 1/8 первоначального объема в 10 мМ трис-HCl рН 7,4 и инактивировали β-пропиолактоном (1:4000, в течение 2,5 ч при 38°С). Содержание белка в препарате антигена составляет 0,04 мг/мл, очистка от белков ткани мозга - 97,3%, индекс иммуногенности - 5,7 lg/0,03. Для получения антирабической диагностической сыворотки проводят иммунизацию животных-продуцентов (овец) антигенным материалом и адъювантом, а в качестве адъюванта используют смесь ланолина и полиэтилсилоксановой жидкости марки ПЭС-2, взятых в весовых соотношениях 1:2, соответственно, дополнительно используют иммуномодулятор иммунофан из расчета 0,8 мл на одно животное, иммунизацию осуществляют 5-кратно, причем вначале трехкратно с интервалом 20 часов вводят антиген совместно с адъювантом, взятых в весовых соотношениях 1:0,8 из расчета 10 мл смеси антигена с адъювантом на одно животное и одновременно - иммунофан, затем через 12 суток антиген вводят из расчета 5-7 мл антигена на одно животное и одновременно - иммунофан, затем через 7 суток вводят антиген из расчета 5 мл антигена на одно животное. Крововзятие и приготовление сыворотки проводят в соответствии с известным способом. Активность сыворотки составила 320 МЕ/мл, титры комплементсвязывающих антител в РСК достигают 1:320, преципитирующих антител в РДП - 1:128, в НМФА 1:2560.
Пример 5. Эффективность антирабической диагностической сыворотки (полученной согласно примерам 1-4 и прототипа) для диагностики бешенства животных определяют на белых мышах. 50 животных заражают вирусом бешенства интрацеребрально в дозе 0,03 мл штаммом «овечий ВГНКИ» и 50 животных заражают вирусом бешенства интрацеребрально в дозе 0,03 мл референс-штаммом «CVS». Диагностику бешенства определяют в реакции диффузионной преципитации и реакции связывания комплемента (РСК) антирабической диагностической сывороткой путем выявления антигена вируса бешенства в суспензии мозга мышей, павших на 6-12 день после их заражения. В результате исследования при диагностике антирабической диагностической сывороткой, полученным согласно примерам 1-4, у всех 100 животных было определено наличие бешенства (т.е. подтверждено 100%-ное выявление антигена вируса бешенства в РДП и РСК), в то время при использовании для диагностики антирабической диагностической сыворотки, полученной согласно прототипу, наличие бешенства подтвердилось лишь у 42 животных из 50 животных, зараженных вирусом бешенства штаммом «овечий ВГНКИ», т.е. только в 84% случаев было подтверждено наличие бешенства и наличие бешенства подтвердилось лишь у 40 животных из 50 животных, зараженных вирусом бешенства референс-штаммом «CVS», т.е. только в 80% случаев было подтверждено наличие бешенства.
Заявленный способ позволяет получить антирабическую диагностическую сыворотку, не содержащую по данным РСК и РДП антител к белкам ткани мозга, позволяет диагностировать бешенство на 16-20% точнее, чем известное техническое решение. Кроме того, сыворотки отличаются высокой специфичностью, активность в тесте протективной защиты in vivo на белых беспородных мышах составляет не менее 1:320 МЕ/мл. Способ позволяет получать сыворотки крови овец с титрами антител в РСК 1:320, РДП - 1:128-256 и в НМФА 1:2560.
Время получения сыворотки сокращается с 70-75 до 21,5-27 дней, т.е. в 2,6-3,48 раза, а также уменьшается расход антигенного материала за счет сокращения количества точек введения вируса.
Использование изобретения в биотехнологии позволит организовать выпуск высокоактивных специфичных сывороток для производства диагностических препаратов.