К вопросу о природе антикомплементарной активности холерных вибрионов

14

ЗНиСО июнь №С

К ВОПРОСУ О ПРИРОДЕ АНТИКОМПЛЕМЕНТАРНОЙ АКТИВНОСТИ

ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

В.В. Балахнова, Р.В. Писанов, И.Я. Черепахина, О.С. Бурлакова, В.А. Подройкина, Е.В. Сизова, Л.П. Алексеева, В.В. Евдокимова

ON THE NATURE OF ANTICOMPLEMENTARY ACTIVITY OF CHOLERA VIBRIOS

V.V. Balakhnova, R.V. Pisanov, I.A. Cherepakhina, O.S. Burlakova,V.A. Podroykina, E.V. Sizova, L.P. Alekseeva, V.V. Evdokimova

ФГУЗ «Научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону

Для выяснения природы антикомплементарной активности (АКА) было проведено изучение белковой и полисахаридной составляющих супернатантов холерных вибрионов, используемых для изучения АКА. Показано, что АКА обусловлена компонентами полисахаридной природы, т. к. после депротеинизации активность в безбелковом препарате не снижалась. Методом дот-ИФА с моно-клональными антителами было подтверждено присутствие свободного ЛПС или компонентов капсулы в бесклеточных супернатантах бульонных культур холерных вибрионов. Можно предположить, что в данном случае имеет место дистантная инактивация комплемента.

To elucidate the nature of anticomplementary activity (ACA) we were examining the protein and polysaccharide components of Vibrio cholerae supernatants, used in ACA investigations. It was shown that ACA was mediated by the component of protein nature, since after deproteinization the level of activity in protein-free preparation didn't decrease. Presence of free lipopolysaccharide (LPS) or capsule components in cell-free V. cholerae supernatants was confirmed by the results of dot-ELISA with monoclonal antibodies. Thus, in this case a supposition could be made of distant complement inactivation as ACA level was dependent upon the length of polysaccharide side chains.

Свойства бактерий, приводящие к низкоэффективной активации комплемента, рассматриваются почти исключительно с точки зрения комплементрезистентности бактерий, играющей, по мнению ряда ученых, роль фактора вирулентности грамнегативных возбудителей [1]. Ранее было показано, что антикомплементарная активность (АКА) принимает деятельное участие в персистенции холерных вибрионов. Особенно демонстративно полученные результаты выглядели при сравнении

штаммов V. cholerae О1 серогруппы, ранжированных по эпидемической значимости, что свидетельствует о роли АКА в патогенности этого возбудителя.

Патогенные микроорганизмы способны ингибировать действие комплемента посредством различных защитных механизмов. Природу факторов, вызывающих инактивацию системы комплемента, участвующего во внеклеточном киллинге микроорганизмов, связывают как с секрецией специфических про-

июнь

15

теаз, так и с наличием специализированных структур клеточной стенки, ответственных за инактивацию отдельных компонентов комплемента [2]. Обсуждается и роль полисаха-ридной капсулы в этом процессе [3]. Длинные боковые цепи О-антигена могут связывать С3Ь, но на некотором удалении от чувствительного к действию комплемента липидного бислоя мембраны, так что лизиса не происходит [4]. Это так называемая дистантная инактивация комплемента, которую отождествляют с акти-комплементарностью [5].

В данной работе была предпринята попытка изучить природу АКА у возбудителя холеры. Для выяснения роли белков в нейтрализации комплемента культуру холерных вибрионов, выращенную в течение 18 ч в бульоне Мартена рН 7,6 в режиме шуттелирования при 120 об/ мин, центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 20 мин на холоде. К надосадочной жидкости добавляли сульфат аммония до 70 % насыщения и оставляли на 24 ч в холодильной камере при 4 °С. Выпавший осадок отделялся центрифугированием при 15 000 об/мин при 4 °С. Осадок растворяли в 1 мл забуференного физиологического раствора (рН 7,2), на приборе Invitrogen определялось количество белка (оно составляло 1,2 мг/мл). Полученный раствор делили на две части по 500 мкл. Первые 500 мкл растворенного осадка наносили на гельфильтрационную колонку с Тоуореаг1 HW55F, уравновешенную буфером (200 мМ СА,10 мМ ТрисНС1 рН 8,2, 1 % изопропанол, 0,5 мМ ЭДТА). Детекция пиков проводилась при 260 нм. В полученных фракциях определяли АКА.

Вторую половину раствора (500 мл) депро-теинизировали. К раствору добавляли SDS до 1 % и раствор протеиназы К (100 мкг/мл). Полученная смесь инкубировалась при 45°С в течении 12 ч до полной депротеинизации. После инкубации к смеси добавлялся равный объем водонасыщенного фенола (рН 8,0) для удаления протеиназы К и перемешивался встряхиванием 15 мин при комнатной температуре. Фенольную смесь центрифугировали на 13 000 об/мин 5 мин при комнатной температуре. Отбиралась фракция без фенола и осаждалась 3-кратным объемом 96 % этанола. Полученный осадок отделяли центрифугированием при 13 000 об/мин 5 мин при комнатной температуре, промывали дважды ацетоном, высушивали на воздухе и растворяли в 500 мкл забуференного физиологического раствора (рН 7,2), на приборе Invitrogen оце-

нивалось количество оставшегося белка (оно составляло менее 0,01 мкг/мл). Полученный депротеинизированный раствор изучался на АКА.

Проведенное исследование по изучению белковой природы АКА у холерных вибрионов показало, что все 33 фракции, независимо от молекулярной массы, полученные при помощи гельфильтрации и изученные на антикомплементарную активность, содержали «вещество», разрушающее комплемент. Вероятно, АКА была обусловлена компонентами небелковой природы, попавшими во все фракции при гельфильтрации. Исследования с использованием метода депротеинизации подтвердили, что АКА у холерных вибрионов не обусловлена белками, поскольку ее активность в безбелковом препарате не снижалась.

Для того, чтобы доказать роль полисахаридов ¥.ско1егав О1 и /или полисахаридной капсулы ¥.ско1егае О139 серогрупп в инактивации комплемента прежде всего следовало выяснить, присутствует ли свободный ЛПС или компоненты капсулы в бесклеточных супер-натантах бульонных культур, используемых для изучения АКА. Для этого использовались моноклональные антитела, полученные к антигенным детерминантам холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп.

Для подтверждения полисахаридной природы антикомплементарной активности су-пернатанты бульонных культур холерных вибрионов исследовались в дот-ИФА с моно-клональными антителами к ЛПС холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп. Для этого на нитроцеллюлезную мембрану наносились су-пернатанты, разведенные 1 : 2 посадочным карбонатно-бикарбонатным буфером, затем инкубировались с МКА гибридом F8G12 (к 01 серогруппе), Д7 (к серовару Огава) и 3Е4 (к 0139 серогруппе), образовавшийся комплекс обрабатывался антимышинным конъюгатом, меченным пероксидазой хрена. Проявляли окрашенные точки погружением в субстратный буфер с диаминобензидином.

При постановке дот-ИФА было показано (рис.1 ), что МКА всех трех гибридом активно связывались с соответствующими эпитопами ЛПС и капсулы.

Дополнительным подтверждением участия боковых цепей ЛПС в связывании комплемента служат результаты определения АКА у холерных вибрионов разных сероваров. Так, у штаммов Огава, имеющих наиболее длинную боковую цепь в ЛПС, среднее значение АКА

16

ЗНиСО июнь №С

Рис. 1. Дот-ИФА с МКА для обнаружения ЛПС возбудителя холеры О1 и О139 серогрупп

I — МКА F8G12 (к V.cholerae О1 серогруппы); II —МКА Д7 (к серовару Огава); III -МКА 3E4 (к О139 серогруппе); 1 — V.cholerae О1 (Огава); 2 - V.cholerae О1 (Инаба); 3 - V.cholerae О1 (R-вариант); 4 — V.cholerae О139

равнялось 0,9 ± 0,18, у Инаба (более короткая цепь) — 0,63 ± 0,32 и у Я-вариантов, лишенных боковой цепи, — 0,59 ± 0,27.

Таким образом, можно предположить, что именно полисахариды ответственны у холерных вибрионов за инактивацию комплемента и/или уровень антикомплементарности зависит от длины полисахаридной цепи, связывающей компоненты комплемента, что препятствует лизису вибрионов. Исследования в этом направлении продолжаются.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Брудастов Ю.А., Дерябин Д.Г. Биологическое значение антикомплементарной активности бактерий //Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. Приложение (август-сентябрь), 1994. С. 28—31.

4.

Бухарин О.В., Брудастов Ю.А., Дерябин Д.Г. Изучение антикомплементарной активности стафилококков //Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1992. № 6. С. 68-71.

Кудрина Н.В., Беседнова Н.Н., Вавилова Л.М. Система комплемента при бактериальных инфекциях //Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. № 5. С. 74-77.

Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.,«Мир». 2000. 582 с.

Бухарин О.В., Бойко А.В., Журавлева Л.А. Факторы персистенции и (или) патоген-ности вибрионов и аэромонад различной экотопической принадлежности //Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1998. № 5. С. 30-33.