ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/common gull/Altai/804/2011/H16N3-СУБТИПА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНСОДЕРЖАЩЕГО ПРЕПАРАТА, ПОЛИКЛОНАЛЬНОЙ СЫВОРОТКИ И ПРИМЕНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ КОНТРОЛЬНОГО РЕФЕРЕНС-ОБРАЗЦА ПРИ ОЦЕНКЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
STRAIN OF FLU VIRUS A/common gull/Altai/804/2011/H16NO-SUBTYPE FOR PRODUCTION OF ANTIGENE-CONTAINING PREPARATION, POLYCLONAL SERUM AND APPLICATION AS CONTROL REFERENCE-SAMPLE WHEN ASSESSING SPECIFICITY OF TEST-SYSTEMS BASED ON POLYMERASE CHAIN REACTION

Изобретение относится к штаммам вируса гриппа H16N3-субтипа и может быть использовано в медицине, ветеринарии и микробиологии. Указанный штамм предназначен для приготовления антигенсодержащего препарата и сыворотки для серодиагностики гриппа H16-субтипа в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), как компонента панели поликлональных сывороток к различным субтипам вируса гриппа A (H1-H17) для типирования вновь выделяемых из природы вариантов вируса гриппа в РТГА, а также выявления антител к вирусу гриппа H16-субтипа в сыворотках крови диких животных для оценки популяционного иммунитета к вирусу гриппа данного субтипа в РТГА. Штамм также может быть применен в качестве контрольного референс-штамма H16 при проведении апробации тест-систем на основе ПНР.
Вирусы гриппа A (Orthomyxoviridae, Influenzavirus А) имеют широкий круг хозяев среди млекопитающих и птиц, но их основным резервуаром в природе являются дикие птицы околоводного комплекса (Д.К.Львов с соавт., 2004; Д.К.Львов, 2005; R.G.Webster et al., 1992; T.Horimoto, Y.Kawaoka, 2005). Вирусы гриппа А подразделяются на субтипы на основании антигенных свойств их поверхностных гликопротеинов - гемагглютинина и нейраминидазы. На сегодняшний день известно 17 субтипов гемагглютинина (Н) и 10 субтипов нейраминидазы (N) (Tong S, Li Y, Rivailler P, Conrardy С, Castillo DA, Chen LM, Recuenco S, Ellison JA, Davis CT, York IA, Turmelle AS, Moran D, Rogers S, Shi M, Tao Y, Weil MR, Tang K, Rowe LA, Sammons S, Xu X, Frace M, Lindblade KA, Cox NJ, Anderson LJ, Rupprecht CE, Donis RO. A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Mar 13; 109(11):4269-74).
К настоящему моменту циркуляция вирусов гриппа А со всеми известными подтипами гемагглютинина и нейраминидазы, кроме H17N10, зарегистрирована только среди птиц (R.G.Webster et al., 1992; I.Capua, D.J.Alexander, 2008). В процессе эволюции нередко возникают высокопатогенные для человека и животных варианты вируса гриппа. Яркий пример - возникновение нового азиатского варианта вируса H5N1-субтипа, впервые зарегистрированного у домашних птиц в 1996 (R.G.Webster et al., 2006; D.J.Alexander, I.H.Brown, 2009).
Вирус гриппа H16 субтипа впервые был описан в Швеции в 1999 году (Fouchier RA, Munster V, Wallensten A, Bestebroer TM, Herfst S, Smith D, Rimmelzwaan GF, Olsen B, Osterhaus AD. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls. J Virol. 2005 Mar; 79(5):2814-22.).
От озерных чаек был выделен гемагглютинирующий агент, который не удалось субтипировать существующими методами. В соответствии с установленными критериями для определения антигенных субтипов гемагглютинина, реакции торможения гемагглютинации и реакции иммунодиффузии, не удалось обнаружить специфическую реактивность между новым H16 и описанными ранее субтипами H1-H15.
Генетически H16 оказался отдаленно связан с Н13 субтипом, который также был обнаружен исключительно у чаек. Аминокислотный состав предполагаемого рецептор-связывающего сайта Н13 и H16 оказался отличным от такового у штаммов, выделенных у уток и гусей.
Эти H16 вирусы содержали гены нейраминидазы, родственные генам вирусов других чаек евразийского континента, но отличались от N3 генов других птиц и географических регионов. Этот новый вирус был отличен от других на основании анализа РВ2, NP и NS генов.
В некоторых европейских популяциях чаек вирус H16N3 представлен очень широко - до 40% особей являются носителями {Munster VJ, Baas С, Lexmond Р, Waldenström J, Wallensten A, Fransson Т, Rimmelzwaan GF, Beyer WE, Schutten M, Olsen B, Osterhaus AD, Fouchier RA. Spatial, temporal, and species variation in prevalence of influenza A viruses in wild migratory birds. PLoS Pathog. 2007 May 11; 3(5):e61.)
Анализ данных, полученных ранее в результате ежегодного мониторинга (1980-2005 гг.) циркуляции вирусов гриппа А в бассейне Северного Каспия и дельты реки Волга, а также первичной структуры гемагглютинина изолятов различных лет позволил установить циркуляцию вирусов А/Н13 и A/H16 среди чайковых с 1976 г. Филогенетический анализ выявил три существенно различающиеся эволюционные линии А/Н13: американскую, европейскую и линию, объединяющую изоляты из Америки и Евразии. Вирусы H13N6 и H16N3, изолированные в России, реплицировались в респираторном и кишечном трактах уток и индуцировали выработку антител, причем вирусы H16N3 индуцировали антитела, нейтрализующие только вирусы подтипа H16. Использование полимерных гликоконъюгатов показало, что рецепторный фенотип изученных вирусов H16 отличался от такового Н13 способностью связывать 3'SL с более высоким сродством, чем aNANA. Данные сравнительного филогенетического анализа позволяют предположить существование единого предшественника вирусов Н13 и Н16 и их дальнейшую эволюцию в зависимости от экологических условий, в том числе и адаптацию к новому хозяину (С.С.Ямникова, А.С.Гамбарян, В.А.Аристова, Д.К.Львов, Н.Ф.Ломакина, V.Munster, P.Lexmond, R.A.Foucher. Вирусы гриппа А/Н13 и А/Н16 - различные линии одного предшественника// Вопросы вирусологии, 2009. - № 4. - С.10-18).
В результате межведомственных усилий по эпиднадзору за гриппом у диких птиц в США, четыре изолята вируса гриппа были первоначально определены как Н7 по реакции торможения гемагглютинации (РТГА), но впоследствии при анализе нуклеотидной последовательности генома были идентифицированы как H16. Разработка и оптимизация праймеров на гены внутренних и поверхностных белков и применение их при скрининге полевых образцов выявило более обширную циркуляцию вируса гриппа H16-субтипа, чем предполагалось ранее. Было показано, что при диагностике возможна кросс-реактивность вируса Н7 и H16 субтипов в РТГА, что может приводить к недостоверным результатам. Очевидно, это может иметь критические последствия для птицеводства, так как Н7 вирус гриппа является высокопатогенным, может приводить к 100% летальности кур и его обнаружение приводит к жестким ветеринарным мерам (тотальный забой). (VanDalen KK, Anderson TD, Killian ML, Pedersen JC, Franklin AB, Piaggio AJ. Increased detection of influenza A H16 in the United States. Arch Virol. 2008; 153(10):1981-3). Поэтому очевидна необходимость специфической дифференциальной диагностики вируса гриппа H16-субтипа различными методами.
Результаты серомониторинга диких птиц Северной Европы показали, что взрослые особи вида Обыкновенная моевка (Rissa tridactyla) из семейства чайковых (Laridae) имеют гемагглютинирующие антитела, специфичные к вирусу гриппа Н13 и H16 субтипов, причем антитела к H16 достоверно были более распространены.
Эти результаты подтверждают, что Обыкновенная моевка (Rissa tridactyla) является резервуаром вируса гриппа А. Серологические исследования показали, что вирус гриппа H16 субтипа может являться основным в популяции этого вида. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять экологию вируса этого субтипа и возможности его диагностики с использованием современных штаммов вируса гриппа Н16-субтипа. (Toennessen R, Germundsson A, Jonassen CM, Haugen I, Berg K, Barrett RT, Rimstad E. Virological and serological surveillance for type A influenza in the black-legged kittiwake (Rissa tridactyla). Virol J. 2011 Jan 17; 8:21).
При совершенствовании методик диагностики и усилении надзора за вирусом гриппа А в природе вероятно, что новые субтипы НА и NA будут обнаруживаться. Это подтверждается выделением нового субтипа H17N10 от летучих мышей Южной Америки (Tong S, Li Y, Rivailler P, Conrardy C, Castillo DA, Chen LM, Recuenco S, Ellison JA, Davis CT, York IA, Turmelle AS, Moran D, Rogers S, Shi M, Tao Y, Weil MR, Tang K, Rowe LA, Sammons S, Xu X, Frace M, Lindblade KA, Cox NJ, Anderson LJ, Rupprecht CE, Donis RO. A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Mar 13; 109(11):4269-74).
В связи с этим получение информации по всему спектру субтипов вируса гриппа, циркулирующих в окружающей среде, и развитие новых методов и подходов диагностики, в том числе с использованием предлагаемого штамма A/common gull/Altai/804/2011 (H16N3), остаются важными задачами мероприятий по эпиднадзору за гриппом и контролю эпизоотической ситуации животных.
В настоящее время в основном используются тест-системы для определения субтипов вируса гриппа на основе полимеразной цепной реакции, на основе микрочипов (B.А.Рябинин, Е.В.Костина, Г.А.Максакова, А.Н.Синяков. Типирование гемагглютинина вируса гриппа а с использованием гибридизационного микрочипа//Биоорганическая Химия, 2010, том 36, №6, с.849-852; Михайлович, В.М. Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах: дис. … доктор, биол. наук / В.М.Михайлович. - Москва, 2009. - 197 с.; Qin ZF, Sun J, Lu TK, Zeng SL, Hua QY, Ling QY, Chen SK, Lv JQ, Zhang CH, Cheng B, Ruan ZX, Bi YZ, Giambrone JJ, Wu HZ. Subtyping animal influenza virus with general multiplex RT-PCR and Liquichip high throughput (GMPLex). Virol Sin. 2012 Apr; 27(2):120-31.; Inoue Е, Wang X, Osawa Y, Okazaki K. Full genomic amplification and subtyping of influenza A virus using a single set of universal primers. Microbiol Immunol. 2010 Mar; 54(3): 129-34.; Jindal N, Chander Y, de Abin М, Sreevatsan S, Stallknecht D, Halvorson DA, Goyal SM. Amplification of four genes of influenza A viruses using a degenerate primer set in a one step RT-PCR method. J Virol Methods. 2009 Sep; 160(1-2): 163-6). Однако при апробации этих тест-систем, необходимо применять контрольный референс-штамм H16 субтипа, наиболее близкий к циркулирующим в настоящее время в природе. В вышеупомянутых исследованиях проверки систем в отношении штамма вируса гриппа H16 проведено не было. Это связано, в том числе, с отсутствием на отечественном рынке коммерческого референс-штамма H16.
Анализ известных аналогов.
За рубежом для исследований и в качестве компонента панели референс-штаммов для РТГА и ПЦР применяют целый ряд вирусов.
Для исследования мембранного слияния используют штамм A/gull/Sweden/2/1999 (H16N3) и его рекомбинанты (Dr. David Steinhauer; dsteinh@emory.edu):
A/gull/Sweden/2/99-H16N3 H16 WT
A/gull/Sweden/2/99-H16N3 H16 HA1 Y17H
A/gull/Sweden/2/99-H16N3 H16 HA2 K58I
A/gull/Sweden/2/99-H16N3 H16 HA2 H111A
A/gull/Sweden/2/99-H16N3 H16 HA2 D112G
Этот же штамм применялся как контрольный при апробации ПНР-системы детекции вирусов гриппа А и В в реальном времени (Dawm LT, Canas LC, Arulanandam BP, Niemeyer D, Valdes JJ, Chambers JP. Real-time RT-PCR assays for type and subtype detection of influenza A and В viruses. Influenza Other Respi Viruses. 2007 Jul; 1(4):167-75).
Оригинальный штамм хранится в коллекции Department of Virology, Erasmus Medical Center, The Netherlands (Drs. R.A.Fouchier; A.D.Osterhaus).
При проведении исследований методом нейтрализации с моноклональными антителами к H5N1 (ELISA), в качестве контрольного был использован штамм, выделенный в Дании A/Gull/Denmark/68110/2002 (Oh S, Selleck P, Temperton NJ, Chan PK, Capecchi B, Manavis J, Higgins G, Burrell CJ, Kok T. Neutralizing monoclonal antibodies to different clades of Influenza A H5N1 viruses. J Virol Methods. 2009 May; 157(2):161-7).
Этот же штамм A/Gull/Denmark/68110/02 был использован в качестве контрольного для разработки и исследования иммуномагнитной ПЦР ловушки вируса гриппа (Dhumpa R, Handberg KJ, Jergensen PH, Yi S, Wolff A, Bang DD. Rapid detection of avian influenza virus in chicken fecal samples by immunomagnetic capture reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. Diagn Microbiol Infect Dis. 2011 Mar; 69(3):258-65).
Для апробации тест-системы экспресс-диагностики высокопатогенного вируса гриппа Н7 была применена панель контрольных штаммов вируса гриппа различных субтипов, которая включала штамм A/black-headed gull/Sweden/5/1999. Нуклеотидная последовательность этого же штамма была использована для филогенетического анализа штаммов вируса гриппа, выделенных на территории Японии (Rashid Manzoor. Studies on the Diagnosis and Molecular Epidemiology of Avian Influenza. 2008, Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers: HUSCAP. P.4-21)
Для апробации экспресс тест-системы Н5 Dot ELISA на основе двух комплементарных моноклональных антител к вирусу гриппа Н5 субтипа в качестве контроля был использован американский штамм A/herring gull/Delaware/712/1988 H16N3 (Не F, Soejoedono RD, Murtini S, Goutama M, Kwang J. Complementary monoclonal antibody-based dot ELISA for universal detection of Н5 avion influenza virus. BMC Microbiol. 2010 Dec 30; 10:330).
Для апробации метода иммуноанализа на основе флуоресцентных ДНК также был применен этот штамм (Сао С, Dhumpa R, Bang DD, Ghavifekr Z, Høgberg J, Wolff A. Detection of avion influenza virus by fluorescent DNA barcode-based immunoassay with sensitivity comparable to PCR. Analyst. 2010 Feb; 135(2):337-42).
На мировом рынке компания Sino Biological Inc. предлагает продукцию, компонентом которой является рекомбинантный штамм H16N3 A/black-headed gull/Sweden/5/99 11711-V08H.
В панели по диагностике вируса гриппа методом РТГА применяют штамм A/black-headed gull/Sweden/5/1999.
Исследования методом РТГА нескольких штаммов, выделенных в Северной Америке, показали, что они достоверно антигенно отличны от вирусов, циркулирующих в Евразии:
A/Shorebird/DE/168/06 H16N3
A/Shorebird /DE/172/06 H16N3
A/Shorebird /DE/195/06 H16N3
A/Herring gull/DE/712/88 H16N3
A/ Shorebird/DE/840/86 H16N3
A/Black-legged Kittiwake/AK/295/75 H16N3
(Krauss S, Obert CA, Franks J, Walker D, Jones K, Seiler P, Niles L, Pryor SP, Obenauer JC, Naeve CW, Widjaja L, Webby RJ, Webster RG. Influenza in migratory birds and evidence of limited intercontinental virus exchange. PLoS Pathog. 2007 Nov; 3(11):el67).
Таким образом, для производства коммерческих систем и наборов, а также для научных исследований в настоящее время используется несколько штаммов вируса гриппа H16 субтипа. Однако все они имеют ряд недостатков.
Во-первых, все они были выделены до 2006 г. Вместе с тем описанные штаммы по причине быстрой изменчивости вируса гриппа А могут значительно отличаться антигенно от современных вариантов вируса гриппа H16-субтипа. При этом для корректной и достоверной диагностики необходимо использовать современные варианты вируса гриппа H16-субтипа, как компоненты диагностических тест-систем. Этому условию удовлетворяет предлагаемый штамм A/common gull/Altai/804/2011 (H16N3), выделенный в 2011 г.
Во-вторых, американские штаммы антигенно отличны от евроазиатских штаммов и образуют различные филогенетические линии. Они не проявляют кросс-реактивности со штаммами, циркулирующими в Евразии. Следовательно, они не могут использоваться как референс-штаммы для панели РТГА в этом регионе и необходимо использовать с этой целью современные штаммы, циркулирующие в Евразии. Однако ввиду большой территории Евразии очевиден поиск вариантов, локально представленных в Азии. Этому условию удовлетворяет предлагаемый нами штамм A/common gull/Altai/804/2011 (H16N3), выделенный в азиатской части России.
Кроме того, анализ доступной в настоящее время информации показывает, что на рынке отсутствует отечественный аналог референс-штамма вируса гриппа H16-субтипа для серодиагностики вируса гриппа.
При оценке эффективности разработанных методов ПЦР типирования необходим анализ референс-штаммов, в том числе H16 субтипа. При этом важно, чтобы не было отмечено перекрестного взаимодействия с референс-штаммами других субтипов и результаты полностью совпадали с данными определения вирусного субтипа иммунологическими методами (РТГА).
Предлагаемый штамм может быть использован для этих задач и в полной мере может удовлетворять этим двум условиям апробации тест-систем ПЦР.
Таблица 1
Информация о доступных в базах Genbank нуклеотидных последовательностях НА сегмента вируса гриппа H16-субтипа.
Номер Genbank
Длина послед. (н.о)
Субтип
Место выделения
Год выд-я
Штамм вируса гриппа А
1.
CC15025
208
16N3
Норвегия
2010
A/European Herring Gull/Norway/10_ 680/2010(H 16N3)
2.
CC15027
203
16
Норвегия
2010
A/European Herring Gull/Norway /10_687/2010(H16)
3.
CE78936
565
16N3
Россия
1986
A/Fulica atra/Volga/635/1986(H16N3)
4.
BL51546
202
16
Норвегия
2007
A/Herring Gull/Norway/10_2298/2007(H16)
5.
CV86820
565
16N3
Монголия
2006
A/black headed gull/Mongolia/1756/2006(H16N3)
6.
AV91214
564
16N3
Швеция
1999
A/black-headed gull/Sweden/2/99(H16N3)
7.
AV91215
564
16N3
Швеция
1999
A/black-headed gull/Sweden/3/99(H16N3)
8.
AV91216
564
16N3
Швеция
1999
A/black-headed gull/Sweden/4/99(H16N3)
9.
AP58180
28
16N3
Швеция
1999
A/black-headed gull/Sweden/5/99(H16N3)
0.
AV91217
566
16N3
Швеция
1999
A/black-headed gull/Sweden/5/99(H16N3)
1.
CA48475
567
16N3
Туркменистан
1976
A/black-headed gull/Turkmenistan/13/76(H16N3)
2.
BI85221
565
16N3
США
1975
A/black-legged kittywake/Alaska/295/1975(H16N3)
3.
AQ77188
565
16N3
Норвегия
2006
A/common gull/Norway/10_ 1617/2006(H16N3)
4.
DF29825
565
16N3
США
2006
A/glaucous gull/Alaska/44198-027/2006(H16N3)
5.
DM0711
565
16N3
США
2009
A/glaucous-winged gull/Southcentral Alaska /9JR0783RO/2009(H16N3)
6.
CS93995
558
16N3
Дания
2002
A/gull/Denmark/68110/2002(H16N3)
7.
DE21667
520
16N3
Казахстан
2007
A/herring gull/Atyrau/2216/2007(H16N3)
8.
BB87356
565
16N3
США
1988
A/herring gull/Delaware/712/1988(H16N3)
9.
AQ77189
565
16N3
Норвегия
2006
A/herring gull/Norway/10_ 1623/2006(H16N3)
0.
BX79922
564
16N3
Россия
1983
A/little tern/Gurjev/779/83(H16N3)
1.
BX79921
564
16N3
Россия
1983
A/mallard/Gurjev/785/83 (H16N3)
2.
BS52593
565
16N3
США
2006
A/shorebird/Delaware/168/06(H16N3)
3.
CV41614
565
16N3
США
2006
A/shorebird/Delaware/195/2006(H16N3)
4.
BI84447
565
16N3
США
1986
A/shorebird/New Jersey/840/1986(H16N3)
5.
CA48476
565
16N3
Россия
1976
A/slender-billed gull/Astrakhan/28/76(H16N3)
6.
BX79923
565
16N3
Россия
1986
A/teal/Volga/671/86(H16N3)
Следует отметить, что во многих панелях референс-антисывороток вообще отсутствуют штаммы H16-субтипа, ввиду того, что он был впервые описан и детально изучен сравнительно недавно, в 2005 г.(Lee CW, Senne DA, Suarez DL. Development and application of reference antisera against 15 hemagglutinin subtypes of influenza-virus by DNA vaccination of chickens, Clin Vaccine Immunol. 2006 Mar; 13(3). - 395-402).
В референс-панели ВОЗ H16 сыворотка не используется (The National Training Course on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. - Harbin, 2001. - 79 p.).
В международной базе данных Genbank по состоянию на 25 апреля 2012 существует следующая информация о вирусе гриппа H16N3-субтипа (Таблица 1).
Ранее вирусы с субтипом H16 были выделены на европейской территории России в 1976-2005 гг. от птиц семейства чайковых. При этом данные о выделении вируса H16-субтипа и характеризации на территории России крайне немногочисленны (С.С.Ямникова, А.С.Гамбарян, В.А.Аристова, Д.К.Львов, Н.Ф.Ломакина, V.Munster, P.Lexmond, R.A.Foucher. Вирусы гриппа А/H13 и А/H16 - различные линии одного предшественника // Вопросы вирусологии, 2009. - № 4. - C.10-18).
Однако это не исключает возможности его появления, поэтому существует необходимость готовности его диагностики.
Все упомянутые источники содержат информацию о некоторых свойствах штаммов вируса гриппа H16-субтипа, выделенных в России. Однако в этих работах не была сделана попытка использовать свойства при разработке диагностических препаратов, в том числе с использованием метода РТГА.
Все вышеперечисленные факты делают актуальным эффективную диагностику вируса гриппа H16-субтипа в области медицины, ветеринарии, экологии.
Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемого штамма является A/slender-billed gull/Astrakhan/28/76(H16N3) - см. таблицу 1. Он применялся в составе лабораторной панели, разработанной Институтом Ивановского РАМН (С.С.Ямникова, А.С.Гамбарян, В.А.Аристова, Д.К.Львов, Н.Ф.Ломакина, V.Munster, Р.Lexmond, R.A.Foucher. Вирусы гриппа А/Н13 и А/Н 16 - различные линии одного предшественника // Вопросы вирусологии, 2009. - № 4. - С.10-18).
Однако он был выделен более двадцати лет назад и антигенно может быть отличным от ныне существующих вариантов (данные о сравнительных исследованиях отсутствуют). Отсутствует и подробная антигенная характеристика, поэтому применение его в дальнейшем как компонента диагностических систем является нецелесообразным.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение такого штамма-продуцента вируса гриппа птиц H16N3-субтипа, который обладал бы более высоким антигенным сродством к современным вариантам вируса гриппа H16 и был пригоден для получения поликлональной сыворотки для определения принадлежности вируса гриппа к H16-субтипу, а также мог быть использован как контрольный референс-образец при оценке специфичности тест-систем на основе ПЦР.
Указанный технический результат достигается получением штамма вируса гриппа птиц A/common gull/Altai/804/2011/H16N3-субтипа, используемого для приготовления антигенсодержащего препарата и поликлональной сыворотки для диагностических целей, а также для применения его в качестве контрольного референс-образца при оценке специфичности тест-систем на основе полимеразной цепной реакции, депонированный в государственной Коллекции вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирской области) под регистрационным номером V-583.
Предлагаемый штамм является единственным известным штаммом вируса гриппа H16-субтипа, выделенным на азиатской территории России за последние 5 лет. Очевидна необходимость использования его при разработке современной диагностической системы вируса гриппа различных субтипов в РТГА.
По причине быстрой изменчивости вируса гриппа А, его антигенных свойств крайне необходимо постоянно отслеживать антигенные изменения (в частности поверхностного гликопротеина гемагглютинина НА) для своевременной замены штамма-продуцента для серодиагностики вируса гриппа А. На сегодняшний день коммерческого антигена и сыворотки для диагностики вируса гриппа H16-субтипа в России в РТГА не существует.
Характеристика штамма.
Штамм A/common gull/Altai/804/2011/H16N3-субтипа принят на патентное депонирование под номером V-583 в государственной Коллекцию возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирской области).
Штамм был выделен от сизой чайки (Larus canus) на территории Новосибирской области. Принадлежность к H16N3-субтипу определена методом PCR. Подтвержден в реакции PCR с типирующими праймерами на гемагглютинин (H1-H16) и нейраминидазу (N1-N9) (Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. World Health Organization (WHO). - 2002. - 105 P.; Bao-Feng Qiu et al. A reverse transcription-PCR for subtyping of the neuraminidase of avian influenza viruses // Journal of Virological Methods. - 2009. - 155. - P.193-198). Принадлежность гемагглютинина штамма к Н16-субтипу подтверждена определением и сравнительным анализом нуклеотидной последовательности фрагмента гена гемагглютинина (574 н.о.).
Для длительного хранения штамм A/common gull/Altai/804/2011 (H16N3) необходимо лиофилизировать с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в соотношении 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение не менее 5 лет при хранении на -70ºС. Ранее показано, что одним из способов, обеспечивающих длительное хранение жизнеспособности вирусов, является получение лиофилизированных культур (А.Ю.Селезнева, 1978). Для хранения пулы штаммов необходимо разливать в стеклянные ампулы объемом 3-5 мл и лиофильно высушивать (Селезнева, А.Ю. Выживаемость вируса гриппа при длительном хранении / А.Ю.Селезнева // Вопросы вирусологии. - 1978. - №6. - С.738-739).
Антиген штамма A/common gull/Altai/804/2011/H16N3-субтипа также можно длительно хранить в лиофилизированном состоянии (см. выше). Для использования его необходимо разводить фосфатно-солевым (рН 7,2) буфером соответствующего объема.
При использовании разведенного готового антигена штамма в течение одной недели допускается его хранение в холодильнике при температуре +4ºС.
Определены первичные последовательности полного генома исследуемого штамма.
Был проведен филогенетический анализ гена гемагглютинина методом ближайших соседей с бутстреп анализом (500 повторов). Как видно из дендрограммы, исследуемый изолят образует отдельную линию и не входит в субкладу с ранее выделенными вирусами H16-субтипа. Данный результат свидетельствует о некотором генетическом отличии A/common gull/Altai/804/2011 H16N3-субтипа от остальных вирусов H16-субтипа.
Анализ показывает актуальность и целесообразность использования штамма A/common gull/Altai/804/2011/H16N3-субтипа для создания антигенсодержащего препарата вируса гриппа H16-субтипа. Он может быть использован при проведении реакции торможения гемагглютинации для детектирования антител к гемагглютинину вируса гриппа H16-субтипа и диагностики вновь выделяемых изолятов. Кроме того, штамм может быть использован как контрольный при апробации тест-систем на основе ПЦР, т.к. она обладает 99%-идентичностью последовательности нуклеотидных остатков гена НА (H16).
При культивировании в системе развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) данного штамма инфекционный титр достигал 5,6 lg EID50/мл. Максимальная продукция гемагглютинина в аллантоисной жидкости РКЭ составляла 1280 ГАЕ/мл. Данные свойства позволяют эффективно использовать предлагаемый штамм для получения антигена штамма A/common gull/Altai/804/2011 (H16N3).
В эксперименте штамм имеет одинаковые титры в реакции гемагглютинации с эритроцитами следующих видов животных: курица, гусь, лошадь.
Пример 1. Получение поликлональной сыворотки на основе штамма вируса гриппа A/common gull/Altai/804/2011/H16N3-субтипа.
Шести 8-недельным курицам породы Род-Айленд (кросс Изобраун) была внутривенно (в подкрыльцовую вену) введена вируссодержащая жидкость, содержащая 640 ГАЕ/мл. Жидкость представляла собой раствор вируссодержащей аллантоисной жидкости в физиологическом растворе (1:1). Объем вируссодержащего раствора составил 2,5 мл на каждое животное. До заражения у каждого животного была отобрана кровь (1 мл) для контрольной постановки РТГА сыворотки с антигеном штамма A/common gull/Altai/804/2011 (H16N3). РТГА дала отрицательный результат. По истечении 21 суток после инфицирования была тотально отобрана кровь и получена сыворотка крови в объеме 5-10 мл от каждого животного.
Таблица 2
Титры сывороток крови от куриц в РТГА с антигеном штамма A/common gull/Altai/804/2011 (H16N3).
Животное
Титр сыворотки до инфицирования
Титр сыворотки на 21 сутки после инфицирования
1
<1/10
1/320
2
<1/10
1/320
3
<1/10
1/640
4
<1/10
1/640
5
1/640
6
1/640
После 10 суток после инфицирования была отобрана кровь для постановки промежуточной реакции торможения гемагглютинации.
Титр сыворотки в РТГА с антигеном предлагаемого штамма составил 1/320-1/640 (таблица 2). Диагностическим является значение титра сыворотки в РТГА≥1/40 (WHO, 2009).
Таким образом, получена поликлональная сыворотка к предлагаемому штамму A/common gull/Altai/804/2011 (H16N3), которая обладает значимым титром в РТГА. Она позволит выявлять вирус гриппа H16-субтипа гемагглютинина наиболее близких в антигенном отношении вариантов.
Пример 2. Приготовление антигенсодержащего диагностического препарата на основе штамма вируса гриппа A/common gull/Altai/804/2011 (H16N3).
Для приготовления антигенсодержащего препарата вируссодержащую аллантоисную жидкость инактивируют 0,05% β-пропиолактоном при температуре 37°С в течение 2 ч. Далее необходимо подтвердить инактивацию вируса заражением чувствительной системы - 3 пассажа (РКЭ). Полученный антигенсодержащий субстрат хранится при температуре +4-+7°С, без снижения гемагглютинирующего титра в течение 12 месяцев.
Таким образом, полученный антигенсодержащий препарат вируса гриппа H16-субтипа далее может быть использован при проведении реакции торможения гемагглютинации для детектирования антител к гемагглютинину вируса гриппа H16-субтипа в сыворотке крови. Применение предлагаемого штамма в качестве антигена для проведения РТГА описано в примере 1 (таблица 2).
Пример 3. Определение специфичности разработанного праймера, предназначенного для диагностики H16-субтипа гемагглютинина методом ПЦР.
Для типирования изолятов методом ПЦР амплификацию проводили набором Fast PCR Mix (Fermentas, США) с парами подтипспецифичных праймеров - для определения подтипов изолятов.
Состав реакционной смеси:
1)MasterMix - 10 мкл
2) кДНК - 2 мкл
3) Прямой праймер (2 о.u) - 1 мкл
4) Обратный праймер (2 o.u) - 1 мкл
5) Вода Nuclease-free - 4 мкл
Таблица 3
Результат контрольной реакции ПЦР с использованием разработанного праймера H16. В качестве контрольных используются штаммы референс-панели (St. Jude Research Hospital, США) и предлагаемый штамм A/common gull/Altai/804/2011 (H16N3)
НА Субтип
Штамм
Результат контрольной реакции ПЦР с использованием разработанного праймера Н16*
H1
A/FM/1/47 (H1N1)
-
Н2
A/Japan/305/57 (H2N2)
-
Н3
A/duck/Ukraine/63 (H3N8)
-
Н4
A/duck/Czech/56 (H4N6)
-
Н5
A/tern/So.Af./61 (H5N3)
-
Н6
A/turkey/MA/65 (H6N2)
-
Н7
A/equine/Prague/56 (H7N7)
-
Н8
A/turkey/Ont./6118/68 (H8N4)
-
Н9
A/turkey/WI/66 (H9N2)
-
Н10
A/chicken/N/Germany/49 (H10N8)
-
Н11
A/duck/Memphis/546/74 (H11N9)
-
Н12
A/duck/Alberta/60/76 (H12N5)
-
Н13
A/gull/MD/707/77 (H13N6)
-
Н14
A/mallard/Ast./263/82 (H14N5)
-
Н15
A/shearwater/W.Aus./79 (H15N8)
-
Н16
A/common gull/Altai/804/2011 (H16N3)
+
Для наработки ПЦР продукта для определения первичной последовательности проводили амплификацию с праймерами, специфичными к генам НА и NA.
Программа для амплификатора:
1)Т=95ºС, 10 секунд,
2) Т=52ºC∗, 30 секунд
3) Т=72ºС, 20 секунд
4) Т=4ºС, хранение.
В таблице 3 приведены результаты контрольной реакции ПЦР с использованием разработанного праймера H16. В качестве контрольных используются штаммы референс-панели (St. Jude Research Hospital, США) и предлагаемый штамм A/common gull/Altai/804/2011 (H16N3).
Таким образом, штамм A/common gull/Altai/804/2011/H16N3-субтипа был использован как контрольный при постановке реакции ПЦР с использованием разработанного праймера для субтипирования H16 гемагглютинина. Положительный результат получен исключительно со штаммом A/common gull/Altai/804/2011 (H16N3). Праймер не проявил специфичности к контрольным референс-штаммам всех остальных субтипов (H1-H15).