Метод и реактивы для детекции активности люциферазы
METHOD AND REAGENTS FOR DETECTING LUCIFERASE ACTIVITY

Область техники
Odontosyllis undecimdonta
Настоящее изобретение относится к биологии, химии и биотехнологии, а именно к биолюминесцентной системе червя .
Уровень техники
Биолюминесценция - процесс излучения света живыми организмами в ходе биохимической реакции, в которой химическая энергия превращается в световую. Способность к биолюминесценции определяется наличием специфического белка люциферазы или фотопротеина. Люциферазы - это ферменты, которые катализируют окисление низкомолекулярных соединений - люциферинов, превращая их в оксилюциферины. Окисление сопровождается выделением света и высвобождением оксилюциферина. Описано несколько типов биолюминесцентных систем.
2+
Например, у ряда морских кишечнополостных описаны системы, включающие белки семейства экворина (Prasher, et al., Biochem. 1987, 26:1326-1332; Tsuji et al., Photochem Photobiol, 1995 62(4):657-661). Семейство экворина (aequorin) включает также обелин (obelin), халистаурин или митрокомин (halistaurin = mitrocomin), фиалидин или клитин (phiallidin = clytin) и т.д. Это фотопротеины, содержащие ковалентно связанный с ними люциферин, который в присутствии ионов Са подвергается химическим превращениям с образованием продукта в возбужденном электронном состоянии.
Odontosyllis undecimdonta
Odontosyllis
Морские полихеты , широко известные как «огненные черви», излучают яркое сине-зеленое свечение. Биолюминесценция  является системой люциферин-люциферазы, белок люцифераза известен из Darrin T. Schultz et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, V. 502 (3), 2018, P. 318-323, но структура люциферина не была известна.
2+
Компоненты биолюминесцентных систем (люциферазы, фотопротеины, люциферины и т.д.) - широко используемые реагенты для множества анализов, включая диагностические системы, системы контроля качества и т.д. Например, белки семейства экворина широко используются для исследований высвобождения и связывания Са в биологических системах, например, во время мышечного сокращения. Использование биолюминесцентных систем в подробностях описано, например, в Cormier, М.L. et al., Photochem. & Photobiol. 49/4, 509-512 (1989), Smith, D.F. et al. in ′′Bioluminescence and Chemiluminescence: Current Status (P. Stanley & L. Krick, eds.), John Wiley and Sons, Chichester, U.K. 1991, 529-532.
Несмотря на большое количество биолюминесцентных систем, используемых на сегодняшний день, сохраняется потребность в расширении линейки люциферин-люциферазных пар, обладающих новыми свойствами. Расшифровка новых компонентов биолюминесцентных систем позволяет расширить спектр доступных анализов и приложений для использования.
Раскрытие изобретения
Odontosyllis undecimdonta,
Odontosyllis undecimdonta
Odontosyllis undecimdonta
Задачей настоящего изобретения является установление компонентов биолюминесцентной системы червя в частности идентификация молекулы люциферина и предлюциферина, а также разработка способа выявления люциферазы в биологическом образце с помощью люциферина или предлюциферина червя  и способа детекции биолюминесценции посредством люциферина или предлюциферина червя .
Odontosyllis undecimdonta
Odontosyllis undecimdonta.
Odontosyllis undecimdonta
Технический результат состоит в расширении арсенала технических средств в области применения биолюминесцентных систем и достигается за счет идентификации молекулы люциферина червя , окисление которого сопровождается испусканием света. Также технический результат достигается за счет идентификации молекулы предлюциферина червя Указанные компоненты бюолюминесцентной системы червя  являются перспективными для применения в качестве реагентов для множества анализов, включая диагностические системы, системы контроля качества, системы тестирования лекарственных препаратов и т.д.
Настоящее изобретение обеспечивает молекулу люциферина червя, а именно 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту, характеризующуюся следующей структурной формулой:
.
и/или её таутомер 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту, характеризующуюся следующей структурной формулой:
.
Настоящее изобретение также обеспечивает применение соединения 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты и/или его таутомера 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты в качестве субстрата для фермента люциферазы, окисление данной молекулы приводит к появлению света.
Настоящее изобретение также обеспечивает молекулу предлюциферина, а именно соединение 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота, характеризующееся следующей структурной формулой:
,
и/или его таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота, характеризующийся следующей структурной формулой:
.
Настоящее изобретение также включает применение соединения 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты и/или его таутомера 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты в качестве предшественника люциферина (предлюциферина).
Настоящее изобретение также включает набор для детекции люциферазы в биологическом образце, включающий люциферин и/или предлюциферин по изобретению.
В частных вариантах воплощения изобретения набор дополнительно включает буфер, детергент, восстановительный агент и/или глицерин.
В частных вариантах воплощения изобретения указанные компоненты набора содержатся в допустимых количествах.
Odontosyllis undecimdonta
Настоящее изобретение также включает биолюминесцентную композицию, включающую люциферазу и, по меньшей мере, одно соединение по настоящему изобретению. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза является рекомбинантной. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой люциферазу червя .
Odontosyllis undecimdonta
Кроме того, настоящее изобретение также обеспечивает способ выявления (детекции) люциферазы в биологическом образце, включающем люциферазу и, по меньшей мере, одно соединение по изобретению. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой люциферазу червя . В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой рекомбинантную люциферазу. В частных вариантах воплощения изобретения биологический образец представляет собой ткань и/или клетку. В частных вариантах воплощения изобретения биологический образец характеризуется значением рН в диапазоне от 7 до 8.
В частных вариантах воплощения изобретения способ выявления люциферазы включает следующие этапы:
а) добавление соединения по изобретению к биологическому образцу для получения реакционной смеси;
б) инкубирование реакционной смеси в условиях, подходящих для возникновения биолюминесценции;
в) детектирование биолюминесценции в реакционной смеси.
В частных вариантах воплощения изобретения концентрация соединения (люциферина и/или предлюциферина) составляет 0.03 - 300 мкМ.
Odontosyllis undecimdonta
Кроме того, обеспечивается способ детекции биолюминесценции в биологическом образце, включающем люциферазу и, по меньшей мере, одно соединение по изобретению. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой рекомбинантную люциферазу. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой люциферазу червя . В частных вариантах воплощения изобретения биологический образец представляет собой ткань и/или клетку. В частных вариантах воплощения изобретения биологически образец характеризуется значением рН в диапазоне от 7 до 8.
В частных вариантах воплощения изобретения способ детекции биолюминесценции включает следующие этапы:
а) экспрессию гена люциферазы в биологическом образце;
б) добавление соединения по изобретению к биологическому образцу;
в) детектирование биолюминесценции.
В частных вариантах воплощения изобретения концентрация соединения по изобретению (люциферина и/или предлюциферина) составляет 0.03 - 300 мкМ.
Также настоящее изобретение обеспечивает реактивы и наборы реактивов для реализации методов настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также включает получение соединений по изобретению.
Для более полного раскрытия вышеперечисленных характеристик настоящего изобретения ниже предлагается детальное описание изобретения, кратко сформулированного выше, в виде ссылок на воплощения, некоторые из которых проиллюстрированы дополнительными фигурами. При этом следует отметить, что прилагаемые фигуры иллюстрируют лишь типичные воплощения настоящего изобретения и, следовательно, не должны быть восприняты в качестве ограничения объема изобретения, которое может допускать другие, в равной степени эффективные, воплощения.
Подробное раскрытие изобретения
Краткое описание чертежей
Фигура 1.
Odontosyllis undecimdonta
Результат измерения биолюминесценции люциферина  во времени.
Фигура 2.
Odontosyllis undecimdonta
UV-vis спектр предлюциферина .
Фигура 3
Odontosyllis undecimdonta
. UV-vis спектр люциферина .
Фигура 4.
Odontosyllis undecimdon
Odontosyllis
Хроматографический профиль водного экстракта лиофилизированных червей ta на основании результатов анионообменной хроматографии на колонке DEAE Sepharose HiTrap Fast Flow. Сплошная линия - сигнал поглощения при длине волны 280 нм. Профили активности люциферазы и люциферина  в отн. ед. люминесценции.
Фигура 5.
Odontosyllis undecimdonta
Компоненты биолюминесцентной системы многощетинковых червей :
А) ампула для ЯМР-спектроскопии с очищенным оксилюциферином, видимый свет;
В) Флуоресценция оксилюциферина под УФ излучением.
Фигура 6.
Odontosyllis,
Обращенно-фазовый хроматографический профиль люциферинсодержащей фракции, полученный при проведении ионообменной хроматографии на капиллярной колонке TSK ODS 120T 5 мкм (контроль при двух разных длинах волн: 300 нм и 410 нм). Пики люциферина и оксилюциферина соответственно.
Фигура 7.
Нумерация тяжелых атомов:
А) люциферин;
Б) оксилюциферин;
В) предлюциферин.
Фигура 8
Odontosyllis
. Масс-спектр высокого разрешения люциферина, демонстрирующий сходство со схемами фрагментации люциферина  (пик шума отмечен звездочкой).
Фигура 9.
Odontosyllis undecimdonta
Обращенно-фазовый хроматографический профиль люциферинсодержащей фракции на основании данных ионообменной хроматографии водного экстракта лиофилизированных червей  на колонке YMC-Triart C18 (3 мкм, 12 нм, 75 × 4,6 мм) (контроль при λabs = 254 нм). Пики люциферина Odontosyllis и предлюциферина отмечены соответственно.
Фигура 10.
Odontosyllis
Масс-спектр высокого разрешения предлюциферина, демонстрирующий сходство со схемами фрагментации люциферина  (пик шума отмечен звездочкой).
Фигура 11.
Типичный результат выявления люциферазы в биологических образцах.
Фигура 12.
Типичный результат детекции биолюминесценции в биологических образцах.
Фигура 13.
Odontosyllis undecimdonta
Типичный результат измерения биолюминесценции предлюциферина  во времени.
Определения и термины
Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.
включает
включающий
В описании данного изобретения термины «» и «» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
биолюминесценция
люминесценция
Термин «» или «» в настоящем документе означает процесс излучения света, получаемый в результате реакции между ферментом и субстратом, который генерирует свет.
предшественник люциферина (предлюциферин)
Термин «» в настоящем документе означает соединение, способное превращаться в люциферин самопроизвольно или под действием ферментов.
люциферин
Термин «» в настоящем документе означает соединение, являющееся субстратом для ферментов люцифераз.
люцифераза
Как здесь используется, термин «» означает белок, который обладает способностью к окислению люциферина, где реакция окисления сопровождается выделением света (люминесценцией) и происходит освобождение окисленного люциферина.
Реакционная смесь люциферазы
Odontosyllis undecimdonta
Odontosyllis undecimdonta
Odontosyllis undecimdonta
«» содержит фермент люциферазу и материалы, которые позволят ферменту люциферазе генерировать световой сигнал. Необходимые материалы и конкретные концентрации и/или количества материалов, необходимых для генерации люминесцентного сигнала, варьируются в зависимости от используемого фермента люциферазы, а также от типа выполняемого анализа на основе люциферазы. Как правило, для люциферазы червя , эти материалы могут включать: буфер для поддержания реакции при правильном pH, фермент люцифераза червя  и люциферин. Часто к раствору будут добавляться другие материалы, в том числе: бычий сывороточный альбумин (BSA), чтобы поддерживать активность люциферазы, восстановители, детергенты, соли, глицерин, аминокислоты, например D-цистеин и др. Типичная реакционная смесь люциферазы может содержать люциферазу червя , 50 мМ натрий-фосфатный буфер рН 7.4, 5% глицерин.
Смесь для обнаружения люциферазы
Odontosyllis undecimdonta
Odontosyllis undecimdonta,
«» содержит материалы, которые позволят обнаружить фермент люциферазу. Необходимые материалы и конкретные концентрации и/или количества материалов, необходимых для генерации люминесцентного сигнала, будут варьируются в зависимости от используемого фермента люциферазы, а также от типа выполняемого анализа на основе люциферазы. В общем, для люциферазы червя  эти материалы могут включать в себя: восстановители, детергенты, соли, глицерин, аминокислоты, субстрат люциферазы - люциферин. Часто к раствору могут добавляться другие материалы, в том числе: буфер для поддержания реакции при правильном pH, бычий сывороточный альбумин (BSA), чтобы поддерживать активность люциферазы, восстановители, детергенты, соли, глицерин, аминокислоты, например D-цистеин и т. д. Типичная смесь для обнаружения люциферазы может содержать субстрат люциферазы - люциферин червя 50 мМ натрий-фосфатный буфер рН 7.4.
выделенный
Как здесь используется, термин "" означает молекулу или клетку, которые находятся в среде, отличной от среды, в которой молекула или клетка находятся в естественных условиях. Например, указанные компоненты могут находиться по существу в очищенной форме. По существу, очищенная форма означает, что белки являются, по меньшей мере, приблизительно на 20% чистыми, часто, по меньшей мере, на 30% чистыми, обычно на 50% чистыми, или, по меньшей мере, на 90% чистыми.
Для выделения белков могут быть использованы любые обычные методики очистки белка, описанные, например, в Guide to Protein Purification, (Deuthser ed.) (Academic Press, 1990). Например, из исходного источника может быть приготовлен лизат или холодный экстракт и очищен с использованием ВЭЖХ, эксклюзионной хроматографии, гель-электрофореза, аффинной хроматографии и т.п. Белковые препараты могут быть протестированы на наличие активной люциферазы или комплекса люциферазы и люциферина с помощью методов настоящего изобретения.
мутант
производное
мутант
мутант
Как здесь используется, термин "" или "" относятся к белку (в частности, к люциферазе), раскрытому в настоящем изобретении, в котором одна или более аминокислот добавлены и/или замещены и/или удалены (делетированы) и/или вставлены (инсертированы) в N-конец и/или С-конец, и/или в пределах нативных аминокислотных последовательностей белков настоящего изобретения. Как здесь используется, термин "" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин "" здесь относится к любому варианту, который короче или длиннее белка или нуклеиновой кислоты.
in vivo
Модификации, а также добавки или делеции могут быть встроены любым методом, известным в данной области (см., например, Gustin et al., Biotechniques (1992) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 11-123; и Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199:537-539), Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp. 15.3-15.108), включая ошибочно-направленную ПЦР, перестановку, сайт-направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов, мутагенез с использованием ПЦР на основе спаренных молекул, мутагенез , кассетный мутагенез, рекурсивный согласованный мутагенез, экспоненциальный согласованный мутагенез, сайт-направленный мутагенез, случайный мутагенез, генную повторную сборку, генный сайт-насыщенный мутагенез (GSSM), повторную сборку при проведении синтеза лигированием (SLR), или их сочетание. Указанные модификации, добавления или делеции могут быть также встроены способом, включающим рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательности, мутагенез ДНК путем фосфотиоатной модификации, мутагенез на основе включения матрицы, содержащей урацил, мутагенез на основе дуплекса, содержащего бреши, репарационный мутагенез с точечными ошибочными спариваниями, мутагенез с использованием штамма-хозяина, дефицитного по репарации, химический мутагенез, радиогенный мутагенез, делеционный мутагенез, мутагенез с использованием ограничения по селекции, мутагенез с использованием ограничения по очистке, искусственный синтез гена, согласованный мутагенез, создание химерного мультимера нуклеиновой кислоты или их сочетание.
функциональный
функциональный
Как здесь используется, термин "" означает, что нуклеотидная или аминокислотная последовательность может функционировать для указанного испытания или задачи. Термин "", используемый для описания люцифераз, означает, что белок обладает способностью производить сопровождающуюся люминесценцией реакцию окисления люциферина.
Биологические образцы
Odontosyllis undecimdonta
Реализация методов настоящего изобретения обеспечивает возникновение люминесценции реакционной смеси, содержащей биологический образец, если указанный образец содержит люциферазу, использующую в качестве субстрата (то есть люциферина) 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту и/или ее таутомер 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту. Такую люциферазу содержат, например, способные к биолюминесценции морские полихеты .
Odontosyllis undecimdonta
Биологические образцы могут быть получены с помощью различных технологий, известных в биологии, и включают образцы тканей, клеток, экстракты, гомогенаты, белковые смеси различной степени очистки и т.д. Например, биологические образцы могут быть получены из морских полихет .
Odontosyllis undecimdonta
Биологические образцы могут также содержать выделенные компоненты (люциферазу или люциферазу и люциферин или предлюциферин) биолюмнесцентных систем полихет .
Odontosyllis undecimdonta
Odontosyllis undecimdonta
Е. coli, В. subtilis, S. cerevisiae
Биологические образцы могут также экспрессировать рекомбинантную люциферазу или её функциональные мутанты. Последовательности нуклеиновых кислот для экспрессии указанных белков могут быть получены из природных источников (например, из полихет ) или синтезированы. В настоящее время известно множество методов для клонирования генов, кодирующих белки, обладающие известной активностью. Частично такие методы описаны в Maniatis, T., et al. (Molecular Cloning--A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1982) и Newman и Campagnoni (Neuromethods, v. 16, 1990, pp 13-48). Например, может быть приготовлена экспрессионная библиотека в подходящих клетках-хозяевах и протестирована на активность люциферазы. Или может быть осуществлено выделение белка из холодного экстракта, определена его частичная аминокислотная последовательность и осуществлено клонирование соответствующей кДНК из образца кДНК из полихет . Последовательности нуклеиновых кислот должны быть встроены в кассету экспрессии. Кассета экспрессии может существовать как внехромосомный элемент или может быть включена в геном клетки в результате введения указанной кассеты экспрессии в клетку. В кассете экспрессии нуклеиновая кислота, кодирующая белок, является функционально связанной с регуляторной последовательностью, которая может включить промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы. После введения кассеты экспрессии в клетку в ней может образовываться функциональный белок. Системы экспрессии включают, например, бактериальные системы, дрожжевые клетки, насекомых, рыб, земноводных или клетки млекопитающих. Методы изготовления кассет экспрессии или систем для экспрессии желаемого продукта известны специалистам, квалифицированным в данной области. Клеточные линии, которые устойчиво экспрессируют люциферазу могут быть выбраны способами, известными в данной области (например, ко-трансфекция с селектируемым маркером, таким как dhfr, gpt, неомицин, гигромицин, что делает возможным выявление и выделение трансфицированных клеток, которые содержат ген, включенный в геном). Вышеописанные системы экспрессии могут использоваться в прокариотических или эукариотических хозяевах. Для получения белка могут использоваться клетки-хозяева, такие как , клетки насекомого в комбинации с бакуловирусными векторами, или клетки высшего организма, такого как позвоночные, например, COS 7 клетки, НЕК 293, СНО, ооциты Xenopus и т.д.
функциональный
Могут быть также экспрессированы функциональные мутанты природных белков. Как используется в настоящем описании, термин «» по отношению к люциферазе означает, что указанный белок способен использовать 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту и/или ее таутомер 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту в качестве люциферина.
кодирующую
Ссылка на нуклеотидную последовательность, "" полипептид означает, что с нуклеотидной последовательности в ходе трансляции и транскрипции мРНК продуцируется этот полипептид. При этом может быть указана как кодирующая цепь, идентичная мРНК и обычно используемая в списке последовательностей, так и комплементарная цепь, которая используется как матрица при транскрипции. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, термин также включает любые вырожденные нуклеотидные последовательности, кодирующие одинаковую аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид, включают последовательности, содержащие интроны.
Реактивы для выявления активности люциферазы
Методы настоящего изобретения основаны на использовании 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты и/или ее таутомера 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту для детекции активности люциферазы в биологических образцах.
Как используется в настоящем описании, 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота представляет собой соединение, имеющее следующую структурную формулу:
.
Как используется в настоящем описании, таутомер вышеуказанного соединения представляет собой соединение 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту, имеющее следующую структурную формулу:
.
Odontosyllis
Odontosyllis
Этот новый выделенный авторами настоящего изобретения люциферин имеет уникальное строение, отличающее его от всех ранее описанных природных люциферинов. Так, основу молекулы люциферина червя  составляет конденсированный гетероцикл - тиено[3,2-f]тиохромен, состоящий из двух шестичленных и одного пятичленного циклов. Такие сложные конденсированные трициклические структуры ранее не встречались в качестве субстратов биолюминесцентных реакций. Надо также отметить, что тиопиран впервые фигурирует в составе природных биолюминесцентных субстратов. Люциферин червя  является сильно полярной молекулой и представляет собой сильную кислоту, поскольку эта молекула содержит три карбоксильных заместителя, а также несет сульфокислотный остаток. Лиофильно высушенный субстрат хранится при -20°С без снижения активности не менее 30 дней, чаще не менее 60 дней, обычно не менее года.
Odontosyllis
.
b
b
Odontosyllis
1
2
3
3
4
5
6 -
6
7
9
2
4
4
Авторами настоящего изобретения разработан путь синтеза люциферина червя  (схема 1)Рекомендованная схема синтеза указанного соединения включает 9 стадий и использует 2,3-диметоксифенилтиол в качестве исходного вещества. Обработка стартового диметоксифенилтиола метил пропиолатом в присутствии азоизобутиронитрила приводит к формированию бициклической конденсированной системы метил 6,7-диметоксибензо[]тиофен-3-карбоксилата (). Последующее бромирование бицикла и кросс-сочетание галогенида  с этил акрилатом по реакции Сузуки приводит к продукту  с высоким выходом. Окисление соединения под действием KOsO и NaIO дает метил 4-формил-6,7-диметоксибензо[]тиофен-3-карбоксилат (). Снятие защитных метильных групп и дальнейшее окисление продукта  церий аммоний нитратом приводит к продукту метил 4-формил-6,7-диоксо-6,7-дигидробензо[b]тиофен-3-карбоксилату. Реакция Виттига между соединением  и диметил 2-(диметоксифосфорил)-3-меркаптосукцинатом в щелочных условиях приводит к формированию трициклической конденсированной структуры ,последующая эстерификация которого пиридин сульфокислотой и снятие защитных метильных групп приводит к целевому продукту  - люциферину червя .
Odontosyllis
Схема 1. Синтез люциферина червя  - 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота
Как используется в настоящем описании, 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота представляет собой соединение, характеризующееся следующей структурной формулой:
,
и/или его таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота, характеризующийся следующей структурной формулой:
.
Этот новый выделенный авторами настоящего изобретения предлюциферин имеет уникальное строение, отличающее его от всех ранее описанных природных предлюциферинов.
Состав условий для развития биолюминесцентного сигнала
Формирование биолюминесценции зависит от количества и сохранности люциферазы в биологических образцах. Так же следует отметить воздействие светового излучения, особенно УФ части спектра, на люциферин, приводящее к его деградации и утрате функциональности, что было подтверждено экспериментально.
На формирование сигнала влияет рН реакционной смеси. Формирование биолюминесцентного сигнала происходит в диапазоне рН от 6.0 до 9.8, обычно в диапазоне рН от 6.5 до 9.0, преимущественно, в диапазоне от 7.0 до 8.0. Для обеспечения рН могут быть использованы любые стандартные буферные растворы для данного диапазона рН, включая фосфатный буфер, HEPES, Трис-HCl. В преимущественных воплощениях молярность буферного раствора не превышает 2, например, не превышает 1, чаще находится в диапазоне от 0.05 до 0.4, обычно от 0.1 до 0.2.
Реакционные смеси для нужд настоящего изобретения могут также содержать компоненты, стабилизирующие и защищающие ферменты биолюминесцентной системы от ингибирующего воздействия следовых количеств ионов тяжелых металлов и от деградации протеазами.
Например, реакционная смесь может содержать ДТТ в концентрации не более 20 мМ, чаще в концентрации от 0.1 до 8 мМ, преимущественно в концентрации 0.1- 4 мМ.
Реакционная смесь может также содержать бета-меркаптоэтанол и/или ЭДТА в конечной концентрации от 0 до 5 мМ.
Например, реакционная смесь может содержать 0.1 - 2 мМ ДТТ и 0.1 - 1 мМ ЭДТА.
Также реакционная смесь может содержать ингибиторы протеаз, например, фенилуксусную кислоту или щавелевую кислоту в стандартно используемых концентрациях.
Для нужд настоящего изобретения 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту и/или ее таутомер 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту добавляют к биологическому образцу до конечной концентрации 0.03 - 300 мкМ, чаще 1 - 5 мкМ.
Для нужд настоящего изобретения 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота и/или ее таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота добавляют к биологическому образцу до конечной концентрации 0.03 - 300 мкМ, , чаще 1 - 5 мкМ.
В некоторых вариантах воплощения изобретения к образцу добавляют смесь реагентов, включающих буферный раствор, компоненты, стабилизирующие и защищающие ферменты биолюминесцентной системы от ингибирующего воздействия следовых количеств ионов тяжелых металлов и от деградации протеазами. В других воплощениях к биологическому образцу сперва добавляют буферный раствор, компоненты, стабилизирующие и защищающие ферменты биолюминесцентной системы от ингибирующего воздействия следовых количеств ионов тяжелых металлов и от деградации протеазами, а затем раствор 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты и/или ее таутомера 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота или раствор 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты и/или её таутомера 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты.
В зависимости от растворителя, использованного для приготовления раствора люциферина или раствора предлюциферина, реакционная смесь может содержать небольшие количества использованных растворителей.
Также реакционная смесь может содержать детергенты, такие как Triton X100 или нонилфеноксиполиэтоксиэтанол. В некоторых вариантах воплощения изобретения концентрация детергентов в реакционной смеси не превышает 0,2%, чаще не превышает 0,1%, оптимально не превышает 0,06%.
Также реакционная смесь может содержать бычий сывороточный альбумин (БСА) или другие белки в концентрации, не превышающей 2%, чаще не превышающей 1%, оптимально не превышающей 0,5%. БСА используется, когда концентрация биологического образца крайне мала, тогда БСА играет роль стабилизатора белков.
Развитие биолюминесцентного сигнала происходит в широком диапазоне температур - от 4 до 40°С, оптимально при 20-25°С.
Формирование люминесцентного сигнала начинается сразу после инициации реакции при добавлении ключевых реактивов для выявления активности люциферазы, указанных выше.
Максимальная интенсивность люминесценции наблюдается в момент инициации реакции. Далее идет спад, скорость которого определяется активностью ферментов и начальными концентрациями субстратов. При определенных условиях (субстратов много, активность ферментов мала, температура реакции снижена) реакция может наблюдаться в течение 4 часов и более часов (фигура 1).
Детекция биолюминесценции
Методы настоящего изобретения включают детекцию биолюминесценции, возникающей в биологическом образце, содержащем люциферазу, при появлении в нем люциферина.
Биолюминесценция может быть обнаружена с помощью методов, известных специалистам в данной области, в частности, с помощью визуального скрининга или с использованием люминометра, фотометра, флуориметра, цифровой фотокамеры, с помощью светочувствительной фотопленки. В качестве количественной характеристики может быть использована максимальная интенсивность люминесценции, которая достигается через 5-30 мин после инициации биолюминесцентной реакции или скорость нарастания люминесценции в интервале до 30 мин после инициации биолюминесцентной реакции, например, в течение 5, 10, 20, 30, 60 сек после инициации реакции или дольше.
В преимущественных воплощениях измеряемая люминесценция представляет собой длительное свечение, скорее, чем световые вспышки. В преимущественных воплощениях интенсивность люминесценции зависит от активности ферментов биолюминесцентной системы, присутствующих в образце, начальных концентраций субстратов и температуры реакционной смеси и обычно колеблется в пределах от 10 кв/сек до 10 млн кв/сек, чаще 100 - 100000 кв/сек.
Реакция длится не менее 30 мин после инициации, чаще 30-60 мин, иногда (в зависимости от условий) часы и даже сутки.
Испускаемый при окислении 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты и/или ее таутомера 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты свет находится в диапазоне от 450 до 600 нм, чаще в диапазоне от 475 до 550 нм, с максимумом эмиссии при 505-510 нм.
Способы применения
in vivo
in vitro
Методы и реактивы настоящего изобретения могут быть использованы в широком спектре биолюминесцентных анализов  и .
Odontosyllis undecimdonta
В частности, методы и реактивы настоящего изобретения могут быть использованы для выявления активных компонентов биолюминесцентных системы полихет  в процессе их очистки.
Odontosyllis undecimdonta
Также методы и реактивы настоящего изобретения могут быть использованы для выявления функциональных аналогов ферментов биолюминесцентной системы полихет  в биологических образцах.
Также методы и реактивы настоящего изобретения могут быть использованы для выявления активности рекомбинантной люциферазы в клетках-хозяевах.
В некоторых вариантах воплощения изобретения для осуществления применения должна быть получена нуклеиновая кислота, кодирующая люциферазу. Полученная нуклеиновая кислота должна быть встроена в кассету экспрессии, обеспечивающую временную или постоянную экспрессию этой нуклеиновой кислоты в клетках-хозяевах, например под интересующими исследователя промоторами. Кассета экспрессии может содержать элементы, обеспечивающие адресную доставку конструкции в интересующие клетки или клеточные компартменты, или находится в составе частиц, обеспечивающих адресную доставку. После трансфекции клеток кассетой экспрессии (например, в составе экспрессионного вектора) и по истечении времени, необходимого для наработки в клетках продукта экспрессии, может быть осуществлено выявление активности люциферазы внутри клеток или в клеточном лизате.
Наборы
Также обеспечиваются в соответствии с настоящим изобретением наборы для использования при осуществлении вышеописанных применений.
В некоторых воплощениях наборы обычно включают 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту и/или ее таутомер 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту, предпочтительно с буферным раствором для растворения указанного субстрата и/или его добавления к биологическим образцам. 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота и/или ее таутомер могут присутствовать в растворенном виде в соответствующей среде для хранения, такой как водный или буферный раствор с детергентом, обычно в соответствующей емкости. Альтернативно, 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота и/или ее таутомер могут присутствовать в наборе в лиофилизованном виде.
В некоторых воплощениях наборы обычно включают 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновую кислоту и/или её таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновую кислоту, предпочтительно с буферным раствором для растворения указанного соединения  и/или его добавления к биологическим образцам. 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота и/или её таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота может присутствовать в растворенном виде в соответствующей среде для хранения, такой как водный или буферный раствор с детергентом, обычно в соответствующей емкости. Альтернативно, 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота и/или её таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота может присутствовать в наборе в лиофилизованном виде.
В дополнение к описанным выше компонентам, заявленные наборы могут дополнительно включать инструкции для осуществления заявленных способов. Эти инструкции могут присутствовать в заявленных наборах в различных формах (например, в печатном варианте или на электронном носителе в виде текстового и/или графического файла) в количестве одна или более.
Биолюминесцентные композиции
Также обеспечиваются в соответствии с настоящим изобретением биолюминесцентные композиции для использования при осуществлении вышеописанных применений.
В некоторых воплощениях композиции обычно включают 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту и/или ее таутомер 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту, предпочтительно с буферным раствором для растворения указанного субстрата и/или его добавления к биологическим образцам. 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота и/или ее таутомер могут присутствовать в растворенном виде в соответствующей среде для хранения, такой как водный или буферный раствор с детергентом. Альтернативно, 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота и/или ее таутомер могут присутствовать в композиции в лиофилизованном виде.
В некоторых воплощениях композиции обычно включают 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновую кислоту и/или её таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновую кислоту, предпочтительно с буферным раствором для растворения указанного соединения и/или его добавления к биологическим образцам. 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота и/или её таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота может присутствовать в растворенном виде в соответствующей среде для хранения, такой как водный или буферный раствор с детергентом. Альтернативно, 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота и/или её таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота может присутствовать в композиции в лиофилизованном виде.
В дополнение к описанным выше компонентам, заявленные композиции могут дополнительно включать вспомогательные вещества, в частности, адъюванты, растворители и/или наполнители, такие, которые совместимы с соединениями, составляющими суть данного изобретения, и которые не разрушают биологической активности этих соединений.
Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстративных, но не ограничивающих.
Примеры
Порядок экстракции предлюциферина
Odontosyllis undecimdonta
2
2
2
Промыть лиофилизированных червей  метанолом, а затем провести экстракцию предлюциферина 70% ацетоном. Для ТСХ нанести экстракт на силикагель с MeOH:CHCl (2:1) или EtOAc: ацетон: MeOH: HO (5:2:2:1). Собрать образцы розового или фиолетового цвета, лиофилизировать и хранить при температуре -20°С.
Анализ результатов обращенно-фазовой ВЭЖХ лиофилизированного субстрата фракций биомассы
O. undecimdonta
Каждую пробирку с законсервированным образцом дважды промыли 1 мл воды, чтобы растворить порошок, затем растворы лиофилизировали. Для анализа ВЭЖХ образцы растворили в 300 мкл 0,1%-ного водного раствора трифторуксусной кислоты. Колонку (5 мкм, 9,2 х 150 мм) ZORBAX SB-C18 (производитель Agilent Technologies, США) в системе Nexera X2 (Shimadzu, Япония) элюировали растворителем A (0,1%-ный водным раствором трифторуксусной кислоты) и растворителем B (ацетонитрилом) в линейном градиенте от 10 до 35% (15 мин) растворителя B при расходе 3 мл/мин. Контроль поглощения осуществлялся при длине волны 220, 250, 330 и 410 нм (Спектр поглощения предлюциферина, фигура 2). Фракции с биолюминесцентной активностью собрали отдельно и лиофилизировали.
Экстракция, разделение и очистка люциферина и оксилюциферина
Водная экстракция нативной люциферазы, люциферина и оксилюциферина из лиофилизированных червей
Odontosyllis undecimdonta
5 мл фосфатного буфера (5 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,4) добавить к 200 мг лиофилизированных червей. Смесь пипеткой добавить в жидкий азот для создания небольших капель замороженного материала, которые затем измельчить в ступке. Замороженный порошок добавить к 15 мл фосфатного буфера (5 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,4) и выдерживать в течение 40 минут на ледяной бане и регулярном перемешивании. Центрифугировать смесь при ускорении 40000 g (4°С) в течение 40 мин. Собрать супернатант, содержащий люциферазу, люциферин и оксилюциферин, заморозить бесклеточный экстракт и хранить при -70°С.
Ионообменная хроматография водного экстракта
Odontosyllis undecimdonta
Нанести водный экстракт  на колонку HiTrap Fast Flow (1,6 х 2,5 см) с диэтилэтаноламин-сефарозой (DEAE-сефароза производства GE Healthcare, Упсала, Швеция) в хроматографической системе Akta Prime (GE, США), уравновесить и промыть 5 мМ натрий-фосфатным буфером (рН 7,4) при расходе 5 мл/мин. Элюировать колонку в линейном градиенте с концентрацией NaCl от 0 до 0,4 М (80 мл) и собирать фракции размером 5 мл. С целью предотвращения биолюминесцентной реакции растворитель, фракции и колонку выдерживают при температуре 4°С. Провести анализ на хроматографической системе Akta Prime (GE, США). На данном этапе была выделена и выявлена специфическая активность люциферазы и люциферина путем попарного смешивания всех фракций. Для контроля биолюминесценции использовался люминометр «Оберон-К», изготовленный на заказ (г. Красноярск, Россия). На этой стадии не были разделены люциферин и оксилюциферин (обладающий видимым зеленым свечением). Все фракции заморозили.
Концентрация на патроне Strata C18 для твердофазной экстракции.
Фракции, которые содержали как люциферин, так и оксилюциферин, были подкислены путем добавления трифторуксусной кислоты (0,05%). Затем их наносили на 3 мл патрон Strata C18 для твердофазной экстракции (Phenomenex, Torrance, США), который был предварительно уравновешен с помощью 0,05%-ного водного раствора трифторуксусной кислоты. После промывки 0,05%-ной трифторуксусной кислотой патрон элюировали ацетонитрилом, содержащим 0,05% трифторуксусной кислоты. При этом осуществлялся контроль биолюминесцентной активности (см. ниже протокол анализа биолюминесцентной активности), а фракции были лиофилизированы.
Обращенно-фазовая хроматография
Дальнейшее разделение люциферина и оксилюциферина проведено с использованием колонки TSK ODS 120T 5 мкм (4,6 мм х 250 мм, производитель «LKB-Producter AB», Бромма, Швеция) в хроматографической системе «Шимадзу» (корпорация Shimadzu, Киото, Япония). Растворитель A представляет собой 0,1%-ный водный раствор трифторуксусной кислоты, а растворитель B - 0,08%-ный раствор трифторуксусной кислоты в ацетонитриле, обработанный в градиенте B 10-50% в течение 20 минут при расходе 1 мл/мин. Контроль поглощения осуществлялся при длине волны 220, 250, 330 и 410 нм (Спектр поглощения люциферина фигура 3). Фракции, содержащие люциферин и оксилюциферин, были собраны отдельно и лиофилизированы.
Люминесцентный анализ
Для контроля реакций использовался люминометр «Оберон-К», изготовленный на заказ (г. Красноярск, Россия). Для каждого измерения использовали 100 мкл реакционной смеси (10 мМ натрий-фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, 2 мкл фракции люциферазы, рН 7,4). До добавления люциферина корректировка измерений осуществлялась в соответствии с фоновой люминесценцией люциферазы на основе контроля реакций в течение 20 с.
O. undecimdonta
Применение ионообменной хроматографии охлажденного водного экстракта червей  позволило на первом этапе разделить субстратные и ферментосодержащие фракции (фигура 4). Ни одна из фракций сама по себе не обладала биолюминесцентной активностью. В результате попарного комбинирования всех фракций были определены фракции, содержащие люциферин и люциферазу. Фракции, содержащие люциферин, имели видимую желто-зеленую окраску (фигура 5А) и флуоресцировали в ультрафиолетовом свете (фигура 5В). По мнению авторов настоящего изобретения наблюдаемый желто-зеленый цвет субстрат-содержащей фракции, по всей видимости, обусловлен присутствием оксилюциферина. Это, в свою очередь, указывало на необходимость дальнейшей очистки (фигура 6). Фракции, содержащие люциферин или оксилюциферин (фигура 6), были определены с помощью биолюминесцентного анализа или спектра поглощения при длине волны 410 нм. Затем они были разделены, лиофилизированы и использованы для дальнейшего анализа.
Превращение люциферина в оксилюциферин, эксперимент с реакцией люминесценции
in vitro
in vitro
Для реакции биолюминесценции  использовали трис-солевой буферный раствор (150 мМ Трис-HCl, 1 М NaCl, pH 7,5). Каждая пробирка содержала 60 мкл фракции чистого люциферина, 40 мкл трис-солевого буферного раствора и 20 мкл высокоочищенной люциферазы (см. раздел ниже) или трис-солевого буферного раствора в случае негативного контроля. В ходе реакции наблюдалось излучение, при этом свечение в контрольной пробирке отсутствовало. Контроль реакции осуществлялся путем использования 5 мкл аликвот реакционной и контрольной смесей с последующей остановкой реакции через 0, 5, 15, 30, 60, 120, 180 и 300 мин за счет добавления 20 мкл метанола и центрифугирования, после чего для анализа супернатантов применяли метод обращенно-фазовой ВЭЖХ. Использовалась колонка Shim-Pack XR-ODS (3,0 × 75 мм, 2,2 мкм) в сочетании с системой Nexera X2 (Shimadzu, Япония). Растворитель А представляет собой 0,1%-ный раствор муравьиной кислоты, рН 4,9, растворитель В - ацетонитрил. Элюирование осуществлялось в линейном градиенте с концентрацией растворителя B от 1 до 20% (15 мин) при расходе 0,7 мл/мин.
Получение образцов нативной люциферазы и рекомбинантной люциферазы
Очистка проб образцов нативной люциферазы и рекомбинантной люциферазы
in vitro
Образцы люциферазы для измерения люминесцентной активности и экспериментов по конверсии  были получены согласно следующей процедуре.
Очищенные образцы люциферазы были получены в результате последовательной очистки водного экстракта лиофилизированных червей: ионообменной хроматографии на колонке HiTrap Fast Flow с DЭАЭ-сефарозой (производитель GE Healthcare, Упсала, Швеция), ультрафильтрации в центробежном фильтре Amicon Ultra (производитель Merck Millipore, Германия) и гель-фильтрационной хроматографии на колонке Superdex 200 (производитель Phenomenex, США).
Рекомбинантная люцифераза была получена из комплементарной ДНК люциферазы, синтезированной в виде линейного фрагмента двухцепочечной ДНК (производитель Twist Biosciences, США). Клонирование осуществлялось при помощи метода Golden Gate. Плазмиды экспрессии эукариотических клеток были собраны в плазмиду набора MoClo pICH47742 в качестве основной цепи, а следующие части были клонированы в векторах уровня 0: промоторе цитомегаловируса, ген-кандидате люциферазы, кодоне терминации, содержащем часть ДНК и терминаторе SV40 полиаденилирования Клетки HEK293NT трансфицировали полученной плазмидой с реагентом FuGene 6 (производитель Promega, г. Фитчбург, шт. Висконсин, США) в соответствии с протоколом производителя. Трансфицированные клетки выращивали в стандартных условиях.
ЯМР-спектроскопия и масс-спектрометрия
ЯМР-спектроскопия
Структуры люциферина, оксилюциферина и предлюциферина подтверждены совокупностью данных ЯМР-спектроскопии (см. табл. 1).
1
13
H ЯМР спектры люциферина и предлюциферина демонстрировали схожие паттерны протонов, однако в С ЯМР спектре предлюциферина наблюдался сигнал четвертичного углерода 177.28 м.д., соответствующий карбонильной группе (см. табл. 1).
Таблица 1.
Данные ЯМР-спектроскопии люциферина, оксилюциферина и предлюциферина
Атом<sup>a</sup>
Люциферин 10°C d<sub>4</sub>- MeOD
Оксилюциферин 15°C H<sub>2</sub>O+D<sub>2</sub>O pH 3.3
Предлюциферин 7Н15°C D<sub>2</sub>O pH 5.2
Предлюциферин 9Н15°C D<sub>2</sub>O pH 5.2
δ<sup>1</sup>H
δ <sup>13</sup>C
δ <sup>1</sup>H
δ<sup> 13</sup>C
δ<sup> 1</sup>H
δ<sup> 13</sup>C
δ<sup> 1</sup>H
δ<sup> 13</sup>C
1
-<sup>b</sup>
128.57
-
132.48
-
127.92
-
130.25
1-COOH
-
166.10
-
n.o.
-
n.o.
-
175.26
2
8.389 (1H)
136.77
8.202 (1H)
134.76
7.671 (1H)
127.80
7.631 (1H)
126.90
3a
-
129.65
-
133.92
-
136.08
-
136.76
4
-
n.o.<sup>с</sup>
-
n.o.
-
n.o.
-
n.o.
5
-
n.o.
-
n.o.
-
n.o.
-
n.o.
5a
-
130.42
-
138.73
-
125.82
-
120.68
7
4.713 (1H)
37.24
-
187.17
4.497 (1H)
40.83
-
155.36
7-COOH
-
n.o.
-
-
-
n.o.
-
n.o.
7-CO
-
-
-
-
-
177.28
-
n.o.
8
-
n.o.
-
n.o.
-
127.75
-
116.52
8-COOH
-
168.01
-
168.14
-
172.76
-
171.16
9
8.638 (1H)
136.87
9.622 (1H)
147.92
8.014 (1H)
131.15
4.072 (2H)
23.00
9a
-
n.o.
-
n.o.
-
n.o.
-
119.93
9b
-
134.10
-
135.56
-
133.77
-
133.94
Примечание:a) Нумерация тяжелых атомов указана на фигуре 7;b) «-» - неприменимо;c) «n.o.» - не наблюдается.
Масс-спектрометрия
14
9
11
3
15
9
12
3
+
+
Odontosyllis undecimdonta
HRMS спектр люциферина выявил наличие молекулярного иона с отношением масса/заряд (m/z) 448.9267, соответствующий брутто-формуле CHOS (вычисленное значение m/z 448.9301). Это позволило однозначно идентифицировать выделенный люциферин как 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту, структура которого показана на фигуре 8. HRMS профиль основного пика люциферинсодержащей фракции (фигура 9), выявил наличие молекулярного иона с отношением масса/заряд (m/z) 476.9216, паттерн фрагментации которого был подобен таковому для люциферина (фигура 10). Авторы настоящего изобретения определили, что наблюдаемый ион соответствует молекулярной формуле CHOS (вычисленное значение m/z 476.9251), что позволило однозначно установить наличие карбонильной группы в составе предлюциферина и идентифицировать выделенный предлюциферин как 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновую кислоту и/или ее таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновую кислоту. На основе совокупности данных ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии была установлена природа получения люциферина из предлюциферина как окислительное декарбоксилирование, а природа катализирующего реакцию фермента биолюминесцентной системы червя  как декарбоксилаза.
Использование 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты для выявления люциферазы в биологических образцах
Odontosyllis undecimdonta
Люциферин (4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота) был получен, как описано выше в разделе «Экстракция, разделение и очистка люциферина и оксилюциферина». В качестве биологических образцов использовали лизаты клеток млекопитающих, содержащие рекомбинантную люциферазу . Лизаты клеток были получены как описано выше в разделе «Получение образцов нативной люциферазы и рекомбинантной люциферазы».
1 мкг 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты  растворяют в 100 мкл трис-солевого буферного раствора (150 мМ Трис-HCl, 1 М NaCl, pH 7,5).
В ходе эксперимента в каждом случае сначала измеряли фоновую люминесценцию холодного экстракта, а затем добавляли аликвоты раствора 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты.
Во всех случаях была выявлена люминесценция биологических образцов (Фигура 11).
Использование 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты для детекции биолюминесценции в биологических образцах
Odontosyllis undecimdonta
Люциферин (4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота) был получен, как описано выше в разделе «Экстракция, разделение и очистка люциферина и оксилюциферина». В качестве биологических образцов использовали экстракты червей . Холодные экстракты были получены как описано выше в разделе «Водная экстракция нативной люциферазы, люциферина и оксилюциферина из лиофилизированных червей Odontosyllis undecimdonta».
1 мкг 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты растворяют в 100 мкл трис-солевого буферного раствора (150 мМ Трис-HCl, 1 М NaCl, pH 7,5).
В ходе эксперимента в каждом случае сначала измеряли фоновую люминесценцию холодного экстракта, а затем добавляли аликвоты раствора 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты.
Во всех случаях была выявлена люминесценция биологических образцов (Фигура 12).
Использование предлюциферина 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты и/или таутомера 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты для детекции биолюминесценции в биологических образцах
Odontosyllis undecimdonta
Odontosyllis undecimdonta
Предлюциферин 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота и/или таутомера 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота был получен, как описано выше в разделе «Порядок экстракции предлюциферина». В качестве биологических образцов использовали экстракты червей . Холодные экстракты были получены как описано выше в разделе «Водная экстракция нативной люциферазы, люциферина и оксилюциферина из лиофилизированных червей ».
1 мкг 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты и/или таутомера 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты растворяют в 100 мкл трис-солевого буферного раствора (150 мМ Трис-HCl, 1 М NaCl, pH 7,5).
В ходе эксперимента в каждом случае сначала измеряли фоновую люминесценцию холодного экстракта, а затем добавляли аликвоты раствора 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты и/или таутомера 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты.
Во всех случаях была выявлена люминесценция биологических образцов, типичный результат детекции люминесценции представлен на фигуре 13.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.