Способ измерения концентрации кислорода в подкожной опухоли экспериментальных животных
METHOD OF MEASURING CONCENTRATION OF OXYGEN IN A SUBCUTANEOUS TUMOR OF EXPERIMENTAL ANIMALS

Область техники
Заявляемое изобретение относится к области биомедицины и касается способов реализации прижизненных наблюдений за уровнем кислорода в органах и тканях и может быть использовано при скрининге для оценки свойств опухолевого микроокружения, а также влияния противоопухолевых препаратов на опухолевые клетки.
2
2
2
Оксиметрия - одно из основных применений современной ЭПР (электронный парамагнитный резонанс) - томографии. Молекулярный кислород - один из важнейших компонентов клеточного баланса. Для нормального функционирования тканей необходимо их адекватное снабжение кислородом, а по уровню содержания О можно диагностировать различные патологические состояния. В онкологии также необходимо знать пространственное распределение кислорода в злокачественных опухолях, поскольку уровень О в значительной степени определяет чувствительность новообразования к воздействию радио- или химиотерапии. Разработка более точных методов измерения уровня О в тканях имеет широкие перспективы практического применения в биологии и медицине.
Уровень техники
В настоящее время отсутствуют надежные и неинвазивные способы получения данных об уровне кислорода в опухолях. Между тем, такие данные могли бы быть использованы при принятии решения о методах лечения, поскольку известно, что опухоли в среде с низким содержанием кислорода, как правило, более устойчивы к терапии и обладают  потенциалом к метастазированию [Liu V.H. et al. Solid MRI contrast agents for long-term, quantitative in vivo oxygen sensing //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2014. - T. 111. - №. 18. - C. 6588-6593]. Поэтому так важно иметь возможность количественной оценки уровня кислорода в опухоли.
Из уровня техники известен способ определения распределения кислорода в опухолевой ткани, основанный на электронном парамагнитном резонансе [Epel В. et al. Oxygen-guided radiation therapy /International Journal of Radiation Oncology* Biology* Physics. - 2019. - T. 103. - №. 4. - C. 977-984]. Известный способ имеет такие существенные признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, как измерение уровня кислорода внутри опухолевой ткани.
Недостатком известного способа определения уровня кислорода внутри опухолевой ткани является отсутствие возможности проведения измерений в режиме реального времени.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ, реализуемый с помощью устройства для определения кислорода в тканях полярографическим методом, раскрытый в патенте РФ №2218865. Известный способ основан на применении устройства, состоящего из анода и катода, изготовленных из разных металлов, а также полярографа и позволяет неинвазивно в режиме реального времени определять содержание кислорода в живых тканях организма.
Недостатками известного устройства является невозможность определения абсолютных значений концентрации кислорода в ткани, невозможность определения концентрации кислорода локально в заданной области ткани с высоким пространственным разрешением, а также с помощью данного устройства невозможно определение распределения кислорода в ткани по глубине.
Раскрытие сущности изобретения
Техническая проблема, решаемая посредством заявляемого изобретения, заключается в необходимости преодоления недостатков, присущих аналогам, за счет создания способа определения концентрации кислорода в подкожной опухоли экспериментальных животных, обеспечивающего возможность измерения в выбранной области опухоли.
Технический результат, достигаемый при использовании заявляемого изобретения, заключается в обеспечении возможности определения концентрации кислорода внутри опухоли живого экспериментального животного в заданной точке с высоким пространственным и временным разрешением с помощью наноэлектрода при значениях потенциала от -500 мВ до -600 мВ относительно хлорсеребряного электрода сравнения, что позволит получить полную картину распределения кислорода в объеме опухоли.
Поставленная задача решается тем, что способ измерения концентрации кислорода в подкожной опухоли экспериментальных животных включает последовательное выполнение следующих этапов:
1) предварительная подготовка экспериментальных животных с подкожно привитой опухолью, для чего животных наркотизируют посредством внутрибрюшинного введения раствора золетила (50-75 мг/кг) с ксилазином (5-7,5 мг/кг),
2) обеспечение доступа к подкожной опухоли животного, для чего проводят разрез кожи по линии позвоночника и отделяют кожную складку с опухолью от прилегающих тканей, проводят прижигание кровеносных сосудов в местах разреза и очищают опухоль от капсулы посредством удаления ее верхних слоев,
3) формирование ванночки для проведения исследования из кожной складки и подкожной мускулатуры спины животного, для чего края кожной складки приподнимают и закрепляют с помощью шовного материала,
4) заполнение ванночки фосфатно-солевым буфером с рН 7.4,
5) подготовка измерительного наноэлектрода, представляющего собой нанопипетку, заполненную пиролитическим углеродом с осажденной на нем платиной, с предварительной калибровкой наноэлектрода по кислороду,
6) размещение экспериментального животного на предметном столике микроскопа, установка измерительного наноэлектрода в держателе интравитально-электрохимического модуля (ИВЭХ-модуля), взаимное позиционирование опухоли и измерительного наноэлектрода, помещение хлорсеребряного электрода сравнения в ванночку с раствором фосфатно-солевого буфера, подключение его к измерительной системе,
7) подача линейной развертки потенциала от -800 мВ до +800 мВ,
8) пошаговое введение наноэлектрода в опухоль на глубину 1-2 мм под заданным углом и измерение силы тока при потенциалах от -500 мВ до -600 мВ для определения уровня кислорода на каждом шаге погружения наноэлектрода,
9) определение значения концентрации кислорода в опухоли по соответствующей калибровочной кривой.
Для реализации способа используют мышей линии BALB/c с подкожно привитыми опухолями карциномы молочной железы мыши 4Т1. Экспериментальное животное подвергают дополнительному наркозу через установленный в хвостовую вену животного катетер. Глубина погружения наноэлектрода в опухоль, как правило, составляет 1-3 мм.
Краткое описание чертежей
Заявляемое изобретение поясняется следующими чертежами и изображениями.
На фиг. 1 приведена схема расположения опухоли, подкожно привитой мыши линии BALB/c.
На фиг. 2 схематично представлены подготовленное к измерению экспериментальное животное и измерительная система для реализации заявляемого способа.
На фиг. 3 приведено изображение наноэлектрода.
На фиг. 4 приведена микрофотография кончика наноэлектрода.
На фиг. 5 представлен пример калибровочной кривой, построенной для расчета концентрации кислорода по току.
На фиг. 6 представлены результаты измерений снижения концентрации кислорода при проникновении в опухоль и в здоровую ткань относительно концентрации кислорода в растворе.
Позициями на чертежах обозначены:
1. Место имплантации опухоли экспериментальному животному (латеральнее срединной линии)
2. Место имплантации опухоли экспериментальному животному (краниально от основания хвоста)
3. Опухоль
4. Венозный катетер
5. Кожная складка с опухолью
6. Шовный материал
7. Хлорсеребряный электрод сравнения
8. Наноэлектрод
9. Лейкопластырь
10. Усилитель тока
11. Микроманипулятор
12. Платформа для создания ванночки
Осуществление изобретения
Ниже представлено подробное описание изобретения. Специалисту понятно, что нижеприведенное описание осуществления настоящего изобретения носит исключительно пояснительный характер и не ограничивает объем притязаний, заявленных в формуле изобретения.
Заявляемый способ реализуют в несколько этапов.
1) предварительная подготовка экспериментальных животных с подкожно привитой опухолью
2
2
2
2
6
6
Для проведения измерений кислорода в опухоли брали лабораторных мышей. При проведении экспериментальных работ по реализации заявляемого способа были проанализированы опухоли различного размера - от 15 до 80 мм - для выявления наиболее оптимального. Было установлено, что опухоли, площадь которых превышала 40 мм, не подходят для данного вида исследований, поскольку такие опухоли имеют очень развитую разветвленную систему кровеносных сосудов, что затрудняет их подготовку. Что касается опухолей, площадь которых не превышала 25 мм, то их использование для работы также представлялось неоптимальным, поскольку в силу своих размеров они обладали ограниченным количеством мест для введения наноэлектрода (1-2 измерений на опухоль). В связи с этим для проведения исследований по измерению кислорода в опухоли после введения наноформулированного цисплатина использовали опухоли площадью 25-40 мм. Для этого мышам подкожно вводили 0,5 × 10 - 1,5 × 10 опухолевых клеток и через 7-8 дней проводили эксперименты. Для того, чтобы обеспечить доступ наноэлектрода к максимальной площади поверхности опухоли, ее следует имплантировать на расстоянии 0,7-1 см латеральнее срединной линии (линии позвоночника) и 2,5-3,5 см краниально от основания хвоста животного (Фиг. 1).
Для обеспечения общей анестезии экспериментальных животных при реализации заявляемого способа используют дозу 50-75 мг/кг золетила в смеси с ксилазином 5-7,5 мг/кг. Указанная доза обеспечивает адекватное наркотизирование животного на протяжении 40-90 минут. Поддерживающая доза составляла 10% от исходной; ее введение каждые 30-60 минут позволяло проводить исследования на протяжении 3-6 ч.
2) обеспечение доступа к подкожной опухоли животного
Животное укладывают на живот на операционный столик. Предпочтительно, чтобы столик был оборудован камерой для поддержания температуры тела животного, а также подвижными светодиодными лампами и увеличительным стеклом. В хвостовую вену животного вводят катетер, через который осуществляются инъекции дополнительной смеси золетила с ксилазином в течение эксперимента. Конечности животного фиксируют на поверхности столика при помощи кожного пластыря Blenderm. Хирургическое вмешательство начинают, убедившись в том, что животное находится в глубоком наркозе (замедленное дыхание, торможение сухожильных и вибрисс-рефлексов). Несмотря на то, что перед имплантацией опухоли зону инъекции выбривают, на момент проведения измерений шерсть отрастает, кроме того, электробритва не может полностью удалить волосяной покров. В то же время попадание даже мелких волос на поверхность препарата ограничивает рабочую зону для исследования. В связи с этим перед разрезом поверхность кожи обрабатывают минеральным маслом, которое уменьшает вероятность попадания шерсти на инструменты и позволяет добиться чистоты препарата. Разрез проводят при помощи ножниц и пинцета вдоль линии позвоночника от основания хвоста вверх на 3-5 см. Отклонение от срединной линии может привести к кровотечению. Остановку кровотечения в этом и других случаях осуществляют коагулятором.
3) формирование ванночки для проведения исследования из кожной складки и подкожной мускулатуры спины животного
Вокруг опухоли создают специальную ванночку, имеющую достаточно протяженные (3-5 см в длину и 2-3 см в ширину) размеры, высотой 0,5-0,7 см. Это связано с тем, что небольшая или узкая ванночка, а также высокие стенки ванночки могут препятствовать движению наноэлектрода, закрепленного в держатель под углом 45°, приводя при этом к большим погрешностям измерений. С одной стороны краем ванночки служит мускулатура спина мыши, с другой - кожная складка.
Для формирования ванночки при помощи двух пинцетов с загнутым краем отделяют кожный лоскут с опухолью, отрезая ножницами соединительно-тканные пленки. При этом следует избегать прямого контакта инструментов с поверхностью опухоли, а также повреждения сосудов. Убедившись, что выделенный кожный лоскут позволяет экспонировать опухоль, края этого лоскута фиксируют шовным материалом с атравматической иглой с двух сторон. Для этого иглу захватывают иглодержателем, прокалывают кожу на краю лоскута, избегая повреждения крупных сосудов. Далее проводят иглу с ниткой через отверстие и, отрезав 7-10 см нитки, фиксируют один ее конец к коже при помощи двойного узла. Свободный конец прикрепляют к поверхности хирургического стола при помощи кожного пластыря Blenderm так, чтобы обеспечить расправление и равномерное натяжение кожного лоскута с опухолью на столе (Фиг. 2). После того как кожный лоскут с опухолью закреплен и растянут, прижигают его края (где проходил разрез) для предотвращения кровотечения, даже если отсутствуют его видимые признаки. Далее при помощи специальных ножниц и пинцета под тщательным визуальным контролем с использованием увеличительного стекла аккуратно удаляют соединительную ткань капсулы с поверхности опухоли, не допуская повреждения сосудов и по возможности минимизируя количество контактов инструментов с предполагаемой областью исследования. После этого опухоль промывают раствором фосфатно-солевого буфера (PBS) для удаления тканевого дебриса и мелкого мусора, избытки раствора удаляют салфеткой с края препарата. Процедуру повторяют дважды. Ванночку заполняют PBS так, чтобы вся опухоль была полностью погружена в раствор. Подготовленное таким образом животное помещают рядом с измерительной установкой.
4) подготовка измерительного наноэлектрода
Измерение проводят с помощью наноэлектрода, основой которого выступает изготовленная из кварцевого стекла пипетка, острый конец которой заполнен углеродом. В полости осажденного углерода содержится платина (Фиг. 3, 4). Методика изготовления наноэлектродов подробно описана в патенте РФ №2647464.
Известно, что внутри опухоли концентрация кислорода может варьироваться. Поэтому при реализации предлагаемого способа необходимо предварительно осуществить калибровку вводимого в опухоль измерительного наноэлектрода по кислороду.
2
3
2
3
2
3
2
3
2
3
Для построения калибровочного графика по кислороду готовят водные растворы NaSO. В зависимости от количества добавляемого NaSO концентрация кислорода в полученных растворах может варьировать от 0 до 250 мкмоль/л, поскольку NaSO способен окисляться кислородом, растворенным в воде. Наноэлектрод и электрод сравнения подключают к традиционно используемым приборам для снятия вольтамперных характеристик и последовательно опускают в свежеприготовленные водные растворы NaSO с известной концентрацией кислорода в диапазоне от 0 до 250 мкмоль/л, подают развертку потенциала, от -800 мВ до +800 мВ, на наноэлектрод и измеряют значения силы тока при потенциалах +800 мВ в каждом водном растворе NaSO. Это позволяет построить калибровочную кривую, где на одной оси приведена концентрация кислорода, а на другой - величина силы тока, что позволят осуществлять количественную оценку уровня кислорода (Фиг. 5).
5) размещение экспериментального животного на предметном столе микроскопа, установка измерительного наноэлектрода в держателе интравитально-электрохимического модуля (ИВЭХ-модуля), взаимное позиционирование опухоли и измерительного наноэлектрода, помещение хлорсеребряного электрода сравнения в ванночку с раствором фосфатно-солевого буфера, подключение его к измерительной системе
Помещают наноэлектрод в держатель так, чтобы серебряная проволока имела контакт со слоем пиролитического графита. Держатель, размещенный в микроманипуляторе, подключают к измерительной системе (усилителю), позволяющей регистрировать силу тока и/или потенциал, а также подавать разность потенциалов на наноэлектрод. Измерительную систему подключают к аналого-цифровому преобразователю с целью дальнейшей передачи сигнала на компьютер. Опускают наноэлектрод с помощью манипулятора в буферный раствор над опухолью. Туда же помещают солевой мостик, соединенный с емкостью, в которой находится хлорсеребряный электрод.
6) подача линейной развертки потенциала для исследования концентрации кислорода
Подают линейную развертку потенциала от -800 мВ до +800 мВ на наноэлектрод относительно хлорсеребряного электрода со скоростью развертки, например, 400 мВ/с, и получают вольтамперную характеристику. Сначала в фосфатно-солевом буферном растворе над опухолью, затем внутри опухоли. Для определения значений концентрации кислорода регистрируют значение силы тока при -500 - -600 мВ.
7) пошаговое введение наноэлектрода внутрь опухоли под заданным углом и измерение силы тока на каждом шаге погружения наноэлектрода
С помощью микроманипулятора пошагово вводят наноэлектрод вглубь опухоли. Величина шага может быть различной и составляет, например, 100 мкм. На каждом шаге записывают 10 циклов вольтамперной характеристики. Глубина вхождения внутрь опухоли может быть различной и составляет, например, от 1000 до 3000 мкм.
Выбор угла подведения наноэлектрода зависит от размещения экспериментального животного на предметном столе микроскопа и выбора места вхождения в опухоль. Таким образом, угол вхождения наноэлектрода выбирается так, чтобы наноэлектрод проникал по нормали к выбранной области. На каждом шаге записывают 10 циклов вольтамперной характеристики. Глубина вхождения внутрь опухоли может быть различной и составляет, например, от 1000 до 3000 мкм.
8) определение значения концентрации кислорода в опухоли по соответствующей калибровочной кривой
С помощью программного обеспечения Origin определяют значения силы тока при -500 - -600 мВ для полученной вольтамперной характеристики на различных глубинах. Полученные значения с помощью ранее полученной калибровочной кривой преобразовывают в концентрацию кислорода (Фиг. 6).
Примеры конкретного выполнения
Преимущества предлагаемого способа иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1
Посредством заявляемого способа были измерены концентрации кислорода в поверхностных и глубоких слоях карциномы молочной железы, подкожно привитой экспериментальным мышам линии BALB/c. Кроме того, была исследована концентрация кислорода в поверхностных и глубоких слоях здоровой ткани животных. Животные были получены из Андреевского центра животных (Андреевка, Россия) в возрасте 7-9 недель и весом 18-21 г. Все эксперименты на животных были одобрены биоэтическим комитетом Российского национального исследовательского медицинского университета имени Н.И. Пирогова (протокол №25/2017, 26/2017). Мышей содержали по 4-6 штук в клетках с системой индивидуальной вентиляции.
Установка для исследования концентрации кислорода, с помощью которой реализован заявляемый способ, позволяющая измерять сверхмалые токи порядка 1 пА, включает следующие элементы:
- АЦП-ЦАП преобразователь AxonDigidata 1550В (MolecularDevices, США);
- Patch-clamp усилитель тока Axon MultiClamp 700В (Molecular Devices, США);
- Микроманипулятор PatchStar (Scientifica, США);
- Компьютер с установленной программой WinWCP и с установленным программным обеспечением для управления и обработки данных;
- Цифровой микроскоп с увеличением 200х;
- Стол для подавления посторонних вибрация (SuperTech, Венгрия).
2
Измерения концентрации кислорода в поверхностных и глубоких слоях опухоли проводили с помощью наноэлектродов, основой которых выступали нанопипетки, заполненные пиролитическим углеродом с осажденной на них платиной. С целью убедиться в том, что наноэлектрод обладает правильной дисковой формой и эффективно заполнен углеродом, на него подавали линейную развертку потенциала от -800 мВ до +800 мВ относительно хлорсеребряного электрода сравнения со скоростью развертки 400 мВ/с и получали вольтамперную характеристику (ВАХ) полученного наноэлектрода в ферроцен метаноле. Затем электрохимическим путем в вытравленную полость наноэлектрода осаждали платину. В качестве дополнительного контроля вновь осуществляли измерение ВАХ полученного наноэлектрода в растворе ферроцен метанола. После этого полученный платиновый наноэлектрод калибровали по кислороду непосредственно перед проведением исследования. Для этого его помещали в раствор PBS вдали от опухоли и записывали 5-7 кривых изменения тока, подавая потенциал от -800 мВ до +800 мВ: одну при разомкнутой цепи (приборный нуль; соответствует нулевой концентрации кислорода), остальные - при замкнутой (соответствует концентрации кислорода 253 мкмоль/л при комнатной температуре). В результате получали калибровочную кривую, исходя из которой впоследствии рассчитывали концентрацию О в опухоли, измеренную с помощью ИВЭХ-модуля. Затем наноэлектрод устанавливали в держатель и подключали последний к предусилительной головке. С помощью манипулятора опускали наноэлектрод в раствор PBS, находящийся в ванночке с опухолью. В этот же раствор помещали солевой мостик от хлорсеребряного электрода сравнения. Подавали потенциал от -800 до +800 мВ (скорость развертки 100 мВ/с). При измерениях отмечали значения тока при -500 - -600 мВ для определения уровня кислорода. С помощью джойстика наноэлектрод подводили к выбранному участку опухоли. Устанавливали параметры для дальнейшего профилирования опухоли по кислороду с шагом 100 мкм. После введения наноэлектрода в опухоль на глубину 1-2 мм и стабилизации потенциала пошагово отводили наноэлектрод. Данную процедуру повторяли 4-5 раз, выбирая при этом различные места опухоли, находящиеся на расстоянии 3-5 мм друг от друга. В результате были получены данные, демонстрирующие постепенное уменьшение уровня кислорода по мере проникновения в глубокие слои опухоли. Было показано, что на глубине 200 мкм относительно поверхности опухоли содержание кислорода в ней снижалось в 2,5 раза. При выведении наноэлектрода из опухоли концентрация кислорода вновь возрастала. Вследствие измерения профиля по кислороду внутри здоровой ткани (мышечной ткани) было установлено, что внутри нее концентрация кислорода падала, однако это падение было не столь существенно по сравнению с таковым в опухоли. На глубине 300 мкм в опухоли концентрация кислорода уменьшалась на 80%, а в здоровой ткани только на 40%.
Заявляемый способ обеспечивает возможность определении концентрации кислорода внутри опухоли живого экспериментального животного в заданной точке с высоким пространственным и временным разрешением. Измерение концентрации кислорода внутри опухоли экспериментального животного обеспечивается за счет специальной подготовки экспериментального животного к проведению эксперимента. Сверхмалый размер наноэлектрода позволяет определять кислород внутри опухоли с высоким пространственным разрешением на различных глубинах. Используемая программа подачи потенциала позволяет регистрировать концентрацию кислорода внутри опухоли с хорошим временным разрешением в режиме реального времени.