СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИСХОДОВ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
BREAST CANCER OUTCOME PREDICTION METHOD

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, касается способов прогнозирования исхода рака молочной железы и может быть использовано для определения прогрессирования заболевания в виде появления рецидивов опухоли и отдаленных метастазов у больных операбельными формами рака молочной железы (РМЖ) после проведения радикального оперативного лечения
Используемые в настоящее время традиционные способы прогнозирования возможного течения заболевания, в первую очередь, предполагают анализ параметров, характеризующих непосредственно первичную опухоль: размеры новообразования, характер и степень распространенности процесса [1]. Наряду с этими факторами наиболее часто рассматриваются морфологические критерии, такие как степень гистологической злокачественности, характер роста опухоли, пролиферативная активность, степень выраженности неоангиогенеза, наличие опухолевых эмболов, а также содержание рецепторов эстрогенов, прогестерона и Her-2new. Однако прогностическая ценность перечисленных факторов далеко не всегда является однозначной и достаточной, особенно при минимальных размерах новообразований.
Наиболее близким к заявляемому является способ прогнозирования рецидива рака молочной железы для женщин в менопаузальном периоде на основании определения соотношения концентрации эстриола к сумме концентраций эстрона и эстрадиола в моче (патент РФ №2003124101 БИ 27.01.2005.). При данном способе прогнозирования рецидива рака молочной железы для менопаузальных больных после комплексного лечения определяется соотношение концентрации эстриола к концентрации эстрона и эстрадиола в моче. Показано, что в ходе динамического наблюдения за менопаузальными больными раком молочной железы после комплексного лечения констатируют развитие рецидива заболевания при снижении соотношения концентрации эстриола к сумме концентраций эстрона и эстрадиола в моче с 1,68±0,23 у больных без рецидива до 0,74±0,12 у пациенток, проживших без рецидива менее 1 года, до 0,65±0,13 у больных, проживших без рецидива от 2-х до 6 лет, и до 0,50±0,10 у больных с безрецидивным периодом от 6 до 10 лет.
Недостатками данного способа являются низкая точность и информативность, ограниченная область применения метода, а именно:
- значения соотношения концентраций эстриола к сумме концентраций эстрона и эстрадиола в моче больных без рецидива имеют наибольшее значение, а при увеличении безрецидивного периода соотношение снижается, что может вызвать затруднение при интерпритации результатов возможность использования этого критерия оценки только для больных менопаузального периода
- предложенным методом не оценивается возможность развития отдаленных метастазов в послеоперационном периоде
- определение содержания гормонов проводится в моче, что является показателем системного уровня и может изменяться в зависимости от причин, не обусловленных опухолевым процессом
- при определении соотношения концентраций эстриола к концентрации эстрона и эстрадиола в моче не учитывается выраженность локального эстрогенообразования в ткани молочной железы, играющего важную роль в развитии и опухолевой прогрессии у пациенток в менопаузе.
Новая техническая задача: расширение области применения, повышение точности и информативности прогноза прогрессирования заболевания (появление рецидива и/или метастазов) в первые 2 года у больных раком молочной железы (РМЖ) после радикального оперативного вмешательства.
Для решения поставленной задачи в способе прогнозирования исхода рака молочной железы, путем биохимического исследования биологического материала пациентов, исследуют ткани опухоли и определяют активность ароматазы, 2,4-эстрогенгидроксилазы, глютатион-S-трансферазы, и при активности ароматазы менее 20 фмоль/мг белка в час, активности 2,4-эстрогенгидроксилаз более 230 пмоль/мг белка в час и вне зависимости от активности глютатион-S-трансферазы прогнозируют высокую вероятность развития рецидива; при активности глютатион-S-трансферазы менее 40 мкмоль/мг белка в минуту и отсутствии изменений в остальных показателях прогнозируют высокую вероятность развития отдаленных метастазов; при активности ароматазы более 20 фмоль/мг белка в час, активности 2,4-эстрогенгидроксилаз менее 230 пмоль/мг белка в час, активности глутатион-S-трансферазы более 40 мкмоль/мг белка в минуту прогнозируют благоприятный исход заболевания в отношении развития рецидивов и/или отдаленных метастазов опухоли.
Новым в способе является то, что исследуют ткани опухоли и определяют активность ароматазы, 2,4-эстрогенгидроксилазы, глютатион-S-трансферазы, и при активности ароматазы менее 20 фмоль/мг белка в час, активности 2,4-эстрогенгидроксилаз более 230 пмоль/мг белка в час, вне зависимости от активности глютатион-S-трансферазы, прогнозируют высокую вероятность развития рецидива; при активности глютатион-S-трансферазы менее 40 мкмоль/мг белка в минуту и отсутствии изменений в остальных показателях прогнозируют высокую вероятность развития отдаленных метастазов, при активности ароматазы более 20 фмоль/мг белка в час, активности 2,4-эстрогенгидроксилаз менее 230 пмоль/мг белка в час, активности глутатион-S-трансферазы более 40 мкмоль/мг белка в минуту прогнозируют благоприятный исход заболевания в отношении развития рецидивов и/или отдаленных метастазов опухоли.
3
Способ осуществляют следующим образом: для прогнозирования развития рецидивов и отдаленных метастазов рака молочной железы проводят радиометрическое определение активности ароматазы и 2,4-эстрогенгидроксилаз, а также спектрофотометрическое определение активности глутатион-S-трансферазы в опухолевой ткани. Для этого из операционного материала берут образцы опухолевой ткани в течение 2-3 часов после операции, очищают от участков некроза, кровоизлияний и помещают в жидкий азот. Образцы тканей до определения активности ферментов хранят не более 12 месяцев при температуре -70°С и размораживают не более 1 раза для исследования активности маркеров. Перед определением активности исследуемых ферментов замороженную опухолевую ткань гомогенизируют до порошкообразного состояния в жидком азоте. Активность ароматазы оценивают по образованию тяжелой воды из меченного тритием в 1-β-положении андростендиона [2]. Определение суммарной 2,4-эстрогенгидроксилазной активности проводят радиометрическим методом [3] с использованием S-Аденозил-L-[метилH]метионина молярной радиоактивностью 15 Ci/mmol ("Amersham Biosciences", Великобритания) в качестве субстрата. Счет радиоактивности производят на тритиевом канале жидкостного сцинтилляционного счетчика MICROBETA (Perkin Elmer, США). Активность ароматазы выражают в фмоль андростендиона/мг белка в 1 час. Активность 2,4-эстрогенгидроксилаз выражают в пмоль метоксиэстрогенов/мг белка в час. Активность глютатионтрансферазы оценивают спектрофотометрическим методом. Принцип метода основан на образовании хромогенного комплекса восстановленного глютатиона с хлординитробензолом (ХДНБ), который регистрируют спектрофотометрически при длине волны 340 нм. [4]. Образование комплекса катализируется глутатионтрансферазой (ГST). Измерение оптической плотности проводят на спектрофотометре «SPECORD M40» (Carl Zeiss JENA-Германия). Активность ГST выражают в мкмоль хлординитробензола/мг белка в мин. При низкой активности ароматазы в опухоли - менее 20,0 фмоль/мг белка в час и высокой активности 2,4-эстрогенгидроксилаз более 230,0 пмоль/мг белка в час прогнозируют высокую вероятность возникновения рецидивов. При низкой активности глютатион-S-трансферазы - менее 40,0 мкмоль/мг белка в мин и отсутствии изменений в остальных показателях, прогнозируют высокую вероятность развития отдаленных метастазов. При активности ароматазы в опухоли более 20 фмоль/мг белка в час, активности 2,4-эстрогенгидроксилаз менее 230 пмоль/мг белка в час, активности глутатион-S-трансферазы более 40 мкмоль/мг белка в мин прогнозируют благоприятный исход в отношении развития рецидивов и/или отдаленных метастазов.
Такой подход к прогнозу возникновения рецидивов и гематогенных метастазов при раке молочной железы обусловлен рядом предпосылок:
- одним из патогенетических механизмов, лежащих в основе развития и прогрессирования рака молочной железы, является изменение метаболизма эстрогенов в тканях, в которых синтез контролируется ароматазой [5, 6, 7];
- в ходе метаболизма эстрогены под действием фермента 2,4-эстрогенгидроксилазы преобразуются в катехолэстрогены, которые обладают выраженной эстрогенной активностью, очень реакционоспособны, являются мутагененами и канцерогененами, кроме того, в большом количестве представлены в опухолевых тканях молочной железы [6, 8, 9];
- фермент глутатион-S-трансфераза предотвращает генотоксические и канцерогенные эффекты хинонов катехолэстрогенов путем конъюгирования хинонов катехолэстрогенов с глутатионом и является интегральной частью биохимической защитной системы организма, детоксицирующей липофильные, мутагенные, токсические, канцерогенные соединения, а также многие лекарственные препараты [10, 11].
1-4
0-3
0
Предлагаемые критерии подобраны на основании исследования связи активности ферментов метаболизма эстрогенов с возникновением рецидивов и/или отдаленных метастазов рака молочной железы, которое проводилось у 85 больных РМЖ TNM в возрасте 30-69 лет (средний возраст 53,62±1,08 лет), проходивших лечение в отделении общей онкологии ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМП с 2002 по 2005 год. У всех больных диагноз был морфологически верифицирован. Лечение включало в себя проведение 2-4 курсов неоадъювантной химиотерапии по схемам CMF, CAF, FAC с последующим выполнением хирургического вмешательства в объеме радикальной мастэктомии или радикальной резекции. В послеоперационном периоде проводилось 4-6 курсов адъювантной химиотерапии по одной из вышеуказанных схем, лучевая и антиэстрогенная терапия по показаниям. Опухолевая ткань забиралась из операционного материала в течение 2-3 часов после операции, замораживалась в жидком азоте. Затем в опухолевой ткани определялась активность ароматазы, 2,4-эстрогенгидроксилаз и глутатион-S-трансферазы.
Средний срок наблюдения за больными, включенными в исследование, составил 26 месяцев. Прогрессирование процесса было отмечено у 10 больных(12%) за счет развития рецидивов опухоли и у 19 пациентов (22%) были выявлены отдаленные метастазы.
Для оценки прогностической значимости активности ферментов метаболизма эстрогенов в опухолевой ткани при раке молочной железы использовали однофакторный анализ прогностической значимости признаков, который был выполнен с использованием критерия Гехана-Вилкоксона (Survival Analysis, Statistica 6.0). Показатели 2-летней безрецидивной и безметастатической выживаемости анализировали с помощью построения кривых выживаемости по методу Каплана-Майера. Сравнение показателей выживаемости в группах проводили по критерию Гехана-Вилкоксона [12].
При оценке прогностической значимости активности ферментов метаболизма эстрогенов в тканях при раке молочной железы было выявлено, что статистически значимыми факторами в отношении 2-летней безрецидивной выживаемости являются активность ароматазы и 2,4-эстрогенгидроксилазы в опухоли (фиг.1, где представлены показатели 2-летней безрецидивной выживаемости в зависимости от активности ароматазы в опухоли, и фиг.2, где представлены показатели 2-летней безрецидивной выживаемости в зависимости от суммарной активности 2,4-эстрогенгидроксилаз в опухоли). Так, при активности ароматазы в опухоли более 20 фмоль андростендиона/мг белка в 1 час ни у одной больной не было выявлено признаков местного прогрессирования заболевания. Все рецидивы РМЖ были выявлены только у тех пациенток, активность ароматазы в опухоли которых была ниже 20 фмоль/мг белка в 1 час (р<0,05). Активность 2,4-эстрогенгидроксилаз в опухоли менее 230 пмоль метоксиэстрогенов/мг белка в час явилась благоприятным фактором прогноза в отношении безрецидивной выживаемости. Ни у одной больной с активностью 2,4-эстрогенгидроксилаз менее 230 пмоль метоксиэстрогенов/мг белка в час не было выявлено признаков рецидива РМЖ и безрецидивная выживаемость составила 100%, тогда как при активности фермента более 230 пмоль/мг белка в час показатели выживаемости составили 80% (р<0,05). Достоверно значимым фактором прогноза 2-летней безметастатической выживаемости для больных РМЖ является активность глутатион-S-трансфераза (фиг.3, где представлены показатели 2-летней безметастатической выживаемости в зависимости от активности ГSТ в опухоли). Так, при активности ГSТ выше 40,0 мкмоль ХДНБ/мг белка в мин показатели 2-летней безметастатической выживаемости составили 85%, а при активности данного фермента менее 40 мкмоль/мг белка в мин этот показатель был значимо ниже и составил 68% (р<0,05).
Чувствительность использования активности ароматазы для определения прогноза генерализации процесса в виде развития рецидивов опухоли составила 100%, специфичность - 44%, эффективность - 72%; при определении активности эстрогенгидроксилаз чувствительность составила 100%, специфичность - 68,18%, эффективность - 84%. Чувствительность использования активности глутатион-S-трансферазы в опухоли для прогноза генерализации процесса в виде развития отдаленных метастазов составила 81,25%, специфичность - 42,1%, эффективность - 62%.
Клинические примеры.
2
1
0
Пример 1. Больная Г., 66 лет. В 2002 году обратилась в ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, где по результатам обследования был поставлен диагноз: рак правой молочной железы IIВ стадия TNM. В предоперационном периоде было проведено 4 курса неоадъювантной химиотерапии по схеме CAF. 19.12.2002 г. была выполнена радикальная мастэктомия. При гистологическом исследовании операционного материала диагносцирован инфильтрирующий рак с инфильтративным компонентом солидного строения, с метастазами в 3 регионарных лимфоузла. В течение 2-3 часов после проведения радикального хирургического вмешательства из операционного материала были набраны образцы опухолевой ткани и исследована активность ферментов. Активность ароматазы составила 13,45 фмоль андростендиона/мг белка в 1 час, активность 2,4-эстрогенгидроксилаз - 813,9 пмоль метоксиэстрогенов/мг белка в час, активность ГSТ - 22,3 мкмоль ХДНБ/мг белка в мин, что соответствовало неблагоприятному прогнозу в отношении развития рецидивов и метастазов. При динамическом наблюдении за больной через 16 месяцев после проведения радикального хирургического лечения был выявлен рецидив опухоли в области послеоперационного рубца, по поводу чего проводилось иссечение с последующей лучевой терапией. А через 24 месяца после проведения радикальной мастэктомии при контрольном осмотре было выявлено дальнейшее прогрессирование заболевания: множественные внутрикожные рецидивы и отдаленные метастазы в легкие и плевру. Общий срок наблюдения за больной составил 3 года.
2
1
0
Пример 2. Больная Б., 48 лет. В марте 2003 года обратилась в ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, где после комплексного обследования ей был поставлен диагноз: рак правой молочной железы IIB стадия TNM. В предоперационном периоде было проведено 2 курса неоадъювантной химиотерапии по схеме CMF. 20.05.2003 г. была выполнена радикальная мастэктомия справа. По результатам гистологического исследования операционного материала верифицирован инфильтрирующий протоковый рак с инфильтративным компонентом альвеолярно-трабекулярного строения, с метастазами в 2 регионарных лимфоузла. В течение 2-3 часов после проведения радикального хирургического вмешательства из операционного материала были набраны образцы опухолевой ткани и исследовано содержание онкомаркеров. Активность ароматазы составила 50,51 фмоль андростендиона/мг белка в 1 час, активность 2,4-эстрогенгидроксилаз - 126,98 пмоль метоксиэстрогенов/мг белка в час, активность ГST - 45,78 мкмоль ХДНБ/мг белка в мин, что соответствовало благоприятному прогнозу в отношении развития рецидивов и отдаленных метастазов. После проведения операции и адъювантной химиотерапии больная выписана домой и находилась под динамическим наблюдением в ГУ НИИ Онкологии ТНЦ СО РАМН. При очередном контрольном обследовании данных за рецидивирование и метастазирование не выявлено. Срок наблюдения составил 2 года.
Таким образом, применение предлагаемого способа совместно с основными клинико-морфологическими параметрами позволяет с большей степенью вероятности предполагать возможный исход заболевания у больных РМЖ и использовать его в качестве дополнительного прогностического критерия, что увеличивает информативность, точность прогноза и подходит для больных, находящихся в репродуктивном и менопаузальном периодах.
Список литературы
1. Thomssen, С. Do we need better prognostic factors in node-negative breast cancer? / C.Thomssen, F.Jänicke // Eur. J.Cancer. 2000. Vol.36 (15). - P.293-298.
2. Связь активности ароматазы в опухолевой ткани с характеристикой заболевания и показателями репродуктивного статуса у больных раком молочной железы / А.А.Ларионов, А.В.Упоров, В.Ф.Семиглазов, Л.М.Берштейн // Вопр. онкол. - 1998. - Т.44. - №1. - С.37-42.
3. Theron, C.N. Substrate dependency of specific and non-specific estrogen-2/4-hydroxylase activities measured by the radio-enzymatic method in rat brain microsomes / C.N.Theron, V.A.Russel, J.J.Taljard //J.Steroid Biochem. - 1986. - Vol.25. - P.585-591.
4. Keen, J.H. Mechanisms for several activities of the glutathione-S-transferase / Keen J.H., Habing W.H., Jakoby W.B. // J. Biol. Chem. - 1976. - Vol.251. - P.6183-6188.
5. Progression of human breast cancers to the metastatic state is linked to genotypes of catechol-0-methyltransferase / A.Matsui, T.Ikeda, K.Enomoto, et al. // Cancer Lett. - 2000. - Vol.150 №1. - P.23-31.
6. Relative imbalances in the expression of estrogen-metabolizing enzymes in the breast tissue of women with breast carcinoma. / S.Singh, D.Chakravarti, J.A.Edney et al. // Oncol Rep. - 2005. - Vol.14(4). - p.1091-1096.
7. Seeger. H. Dose-dependent changes of the ratio ofapoptosis to proliferation by norethisterone and medroxyprogesterone acetate in human breast epithelial cells. / H.Seeger, V.Rakov, A.O.Mueck // Horm Metab Res. - 2005. - Vol.37(8). - p.468-73.
8. Liehr, J.G.Dual role ofestrogens as hormones and pro-carcinogens: tumor initiation by metabolic activation of oestrogens / J.G.Liehr // Eur. J. of cancer prev. - 1997. - Vol.№6. - P.3-10.
9. Molecular origin of cancer: catechol estrogen-3,4-quinones as endogenus tumor initiators / E.L.Cavalieri, D.E.Stack, P.D.Devanesan, et all. // Proc. Nat. Acad. Sci. (USA). - 1997. - Vol.94. - P.10937-10942.
10. Берштейн, Л.М. Гормональный канцерогенез / Л.М.Берштейн. - СПб: Наука, 2000. - 199 с.
11. Берштейн, Л.М. Гормональный канцерогенез / Л.М.Берштейн // Природа. - 2000. - №3. - С.1-9.
12. Боровиков, В. П. STATISTICA - статистический анализ и обработка данных в среде Windows / В.П.Боровиков, П.П.Боровиков. - М.: Филин, 1998. - 608 с.