Способ оценки злокачественности клеток в культурах глиомы
METHOD FOR ASSESSING CELL MALIGNANCY IN GLIOMA CULTURES

Изобретение относится к клеточной, молекулярной биологии и может быть использовано при оценке степени злокачественности клеток в культурах глиомы.
Глиальные опухоли головного мозга человека, по данным Всемирной организации здравоохранения, являются наиболее частыми первичными злокачественными опухолями головного мозга. Эти опухоли, согласно классификации Всемирной организации здравоохранения, подразделяют на 4 степени злокачественности (Grade I, Grade II, Grade III и Grade IV), при этом внутри грейда встречаются гистологические разделения типов опухолей. Данная классификация глиальных опухолей важна, поскольку она учитывает скорость прогрессирования опухоли, наличие признаков злокачественности, наиболее частый возраст первичной диагностики опухоли.
Культуры клеток глиомы применяют для того, чтобы проводить фундаментальные исследования опухолевых процессов, в персонализированной медицине для подбора схем лечения, учитывающих индивидуальные особенности пациента, а также в фармакологии для оценки эффективности действия лекарственных средств на опухоль. При этом часто отмечается подавление культуры глиомы в целом, но степень злокачественности культуры не снижается. При отмене препаратов может происходить вытеснение пула предшествующих клеток более злокачественными клонами, поэтому важное значение имеет определение степени злокачественности клеток в культуре.
Известен способ определения степени злокачественности глиомы, основанный на морфологическом исследовании образца (1). При этом оценивались плоидность и содержание клеточной ДНК опухоли, процент фракции S-фазы с использованием образцов, фиксированных формалином, а затем залитых в парафин. Недостатками данного метода являются изначальная неоднородность материала и отсутствие корреляции со степенью злокачественности опухоли.
Известен способ, основанный на проведении интраоперационной высокочастотной допплерографии до и после гипервентиляции (2), при котором измеряют среднюю линейную скорость мозгового кровотока в артериях, васкуляризирующих следующие области: опухоль, переходную зону и окружающее неизмененное мозговое вещество. Однако данный метод обладает недостаточной точностью и не может быть использован при определении степени злокачественности клеток в культурах.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ, основанный на измерении экспрессии маркерных генов (3). Именно его мы и выбрали в качестве прототипа. В указанном способе дифференциация глиом основана на анализе экспрессии генов и микро-РНК с выделением общей РНК из тканевых проб глиом и перифокальной зоны и последующими обратной транскрипцией, затем амплификацией в режиме реального времени RT-PCR. Особенностью данного способа является использование высокоспецифичных праймеров для генетических локусов EGFR, MSI1, PSMC4, ТВР, RPLO, микро-РНК hsa-miR-92-1-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-7-5p и высокоспецифичных референсных генов PSMC4, ТВР, RPLO и референсных высокоспецифичных микро-РНК hsa-miR-126-5p, hsa-miR-7-5p с дальнейшим анализом значения коэффициента относительной экспрессии Е. При этом различные диапазоны значений коэффициента относительной экспрессии Е позволяют дифференцировать опухоли разных степеней злокачественности: различать глиомы Grade II от глиом высокой степени злокачественности Grade III и IV. Однако способ недостаточно точен, поскольку не позволяет дифференцировать глиомы высоких грейдов Grade III и IV. К сложности способа можно отнести необходимость анализировать не только ткань опухоли, но и перифокальную зону. Последнее требование делает трудновыполнимым использование прототипа для оценки степени злокачественности клеток культуры глиомы.
Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является повышение точности способа и его упрощение. Это осуществляется подбором панели маркерных генов и использованием прогностической модели на основе линейной регрессии.
Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:
- анализируются только опухолевые клетки, без использования дополнительных зон, что делает способ проще;
- заявляемый способ дает возможность надежно различать культуры II, III и IV грейдов злокачественности, что делает его более точным.
Предлагаемый способ решения данной задачи заключается в следующем. Из культуры клеток глиомы выделяют тотальную РНК, проводят реакцию обратной транскрипции для синтеза первой цепи к-ДНК. Определяют уровень экспрессии следующих генов: NOTCH2, TUBB3, GDNF, SOX2, CDK4, PDGFA1, NANOG, MDM2. Проводят расчет степени злокачественности клеток в культуре по формуле:
1
2
3
4
5
6
7
8
y=1,842+0,118×Х-0,2×Х+0,091×Х+0,012×Х+0,072×Х-0,12×Х+0,051×Х+0,047×Х,
где
1
X - экспрессия гена NOTCH2;
2
Х - экспрессия гена TUBB3;
3
Х - экспрессия гена GDNF;
4
Х - экспрессия гена SOX2;
5
Х - экспрессия гена CDK4;
6
Х - экспрессия гена PDGFA1;
7
Х - экспрессия гена NANOG;
8
Х - экспрессия гена MDM2;
при значениях y меньше 2,5 степень злокачественности культуры соответствует Grade II, при значениях y больше 2,5, но меньше 3,5 степень злокачественности культуры соответствует Grade III, при значении y больше 3,5 степень злокачественности культуры соответствует Grade IV.
Для проверки адекватности выбора маркерных генов и для выведения формулы расчета злокачественности клеток мы провели исследование на 27 культурах глиом.
Культуры глиом получали из тканей глиальных опухолей головного мозга человека. Материал биоптатов тканей глиомы был получен при операциях по резекции опухолей. Культуры разбили на три группы по степени злокачественности. Критерием отнесения к той или иной группе служило заключение морфологического исследования опухоли. К группе злокачественности Grade II относили культуры от пациентов с диагнозом диффузная астроцитома, группу Grade III составляли культуры от пациентов с диагнозами анапластическая астроцитома и олигодендроглиома Grade III. Группа Grade IV - это культуры, полученные из глиобластомы.
Из клеток выделяли общую РНК, проводили обратную транскрипцию и определяли нормализованную экспрессию 26-ти генов.
Затем мы проанализировали полученные данные с помощью программного обеспечения IBM SPSS Statistics 26.0. Для отбора опорных генов для нашей модели мы нашли гены, у которых при подсчете коэффициента Джонкхира-Терпстры с поправкой на точный критерий Монте-Карло (при доверительном интервале 95% (CI 95) и количестве выборок 10000) с учетом поправки Бонферрони для 3 выборок была получена односторонняя значимость р<0,017. Такими генами оказались TUBB3, MELK, NESTIN, PDGFB, SOX2. Затем мы провели поиск мультиколлинеаров к этим генам, рассчитав парную корреляцию по методу Спирмена. Данные мультиколлинеары были исключены из нашего набора анализируемых генов для повышения точности модели и уменьшения итогового количества генов, необходимых для дифференциации образца культуры клеток. Затем оставшиеся гены мы исследовали на лучшее соответствие типа используемой регрессионной модели с помощью метода подгонки кривых, в результате большинство отобранных генов лучше соответствовало модели на основе линейной регрессии. Модель линейной регрессии мы составляли на основе метода прямого шагового подбора модели с использованием информационного критерия включения\исключения AICC. На данном этапе наивысшую точность модели равную 40,1% (информационный критерий равен - 22,861) дали гены TUBB3, SOX2, CDK4. Для повышения точности нашей модели мы проанализировали распределение результатов экспрессии всех отобранных генов, а затем на основе полученных данных для генов NOTCH2, GDNF, CDK4, NANOG провели ранжирование. После этого у набора генов NOTCH2, TUBB3, GDNF, SOX2, CDK4, PDGFA1, NANOG, MDM2 прогностическая точность возросла до 86% (информационный критерий равен - 49,951), при этом точность разделения степеней злокачественности также увеличилась и проиллюстрирована фигурой 1.
На фиг. 1 представлены предсказанные значения степеней злокачественности культур глиом из выборок грейдов II, III и IV.
Итоговая формула:
1
2
3
4
5
6
7
8
y=1,842+0,118×Х-0,2×Х+0,091×Х+0,012×Х+0,072×Х-0,12×Х+0,051×Х+0,047×Х,
где
1
X - экспрессия гена NOTCH2;
2
Х - экспрессия гена TUBB3;
3
Х - экспрессия гена GDNF;
4
Х - экспрессия гена SOX2;
5
Х - экспрессия гена CDK4;
6
Х - экспрессия гена PDGFA1;
7
Х - экспрессия гена NANOG;
8
Х - экспрессия гена MDM2.
На основе предсказанных значений степени злокачественности для образцов из наших выборок мы рассчитали, что при значениях y меньше 2,5 степень злокачественности культуры соответствует Grade II, при значениях y больше 2,5, но меньше 3,5 степень злокачественности культуры соответствует Grade III, при значении y больше 3,5 степень злокачественности культуры соответствует Grade IV.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.
Пример 1
Больная К., была прооперирована по поводу опухоли лобной области головного мозга. Из биоптата ткани получена перевиваемая культура клеток. Для этого образец опухоли помещали в чашку Петри с холодным раствором Хенкса, очищали ткань от кровеносных сосудов, оболочек и т.п. Измельчали образец при помощи скальпеля и стеклянной пипеткой переносили в 15 мл пробирку. После осаждения всех фрагментов убирали раствор Хенкса и добавляли 0,25% раствор трипсина. После повторного осаждения ткани отбирали трипсин и добавляли свежий, после чего помещали на подогреваемый до 37°С шейкер до размягчения ткани. Для остановки реакции трипсина в пробирку добавляли культуральную среду в соотношении 1:1, после чего вновь ждали осаждения образца и отбирали жидкость, не захватывая осадок. Диссоциацию ткани проводили в растворе Хенкса, добавляя его в пробирку и ресуспендируя ткань стеклянной пипеткой. После осаждения оставшихся крупных фрагментов взвесь образовавшихся клеток переносили в чистую пробирку. К оставшейся ткани вновь добавляли раствор Хенкса. Взвесь клеток процеживали в 50 мл пробирку для лучшего очищения от оставшихся крупных фрагментов, а затем пипеткой переносили в чистую 15 мл пробирку и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут. Отбирали жидкость, добавляли культуральную среду и рассевали на флаконы для дальнейшей культивации. Клетки культивировали в ростовой среде DMEM/F12 с пируватом натрия с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% раствора HEPES для поддержания рН, 1% GlutaMAX и 1% раствора пенициллина/стрептомицина/амфотерицина в CO2-инкубаторе при температуре 37оС и 5% содержании CO2. Из культуры выделяли общую РНК реактивом «Tri Reagent», MRC, США, по прилагаемому протоколу. Синтез первой цепи кДНК осуществляли набором реактивов «MMLV RT kit», Евроген, Россия, по прилагаемому протоколу. Объем пробы составлял 20 мкл, в реакционную смесь добавляли 2-5 мкг РНК и 2 мкл олиго(dT) 16 праймера. Длительность инкубации 40 минут при 41°. Полученный образец кДНК использовали в качестве матрицы для количественной ПЦР в реальном времени. Проводили реакцию ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 Touch (BioRad, CIIIA). Для проведения реакции использовали «Набор реагентов для проведения ПЦР в реальном времени в присутствии SYBR Green I R-402» (Синтол, Россия). Температурно-временные характеристики реакции: предварительный прогрев при 95°С - 5 мин; 40 циклов (денатурация при 95°С - 10 сек, отжиг и элонгация при 60°С - 30 сек). Определяли экспрессию генов: NOTCH2, TUBB3, GDNF, SOX2, CDK4, PDGFA1, NANOG, MDM2. Нормализованную экспрессию рассчитывали по трем референсным генам: GUSB, HPRT, GAPDH, используя программное обеспечение прибора. Нуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров приведены в Таблице 1.
По формуле рассчитали степень злокачественности:
1
2
3
4
5
6
7
8
y=1,842+0,118×Х-0,2×Х+0,091×Х+0,012×Х+0,072×Х-0,12×Х+0,051×Х+0,047×Х,
где
1
X - экспрессия гена NOTCH2;
2
Х - экспрессия гена TUBB3;
3
Х - экспрессия гена GDNF;
4
Х - экспрессия гена SOX2;
5
Х - экспрессия гена CDK4;
6
Х - экспрессия гена PDGFA1;
7
Х - экспрессия гена NANOG;
8
Х - экспрессия гена MDM2;
y=1,9. Это значение соответствует степени злокачественности Grade II. Заключение по морфологическому исследованию: диффузная астроцитома WHO grade II.
Пример 2
Больной Д. поступил в стационар с диагнозом «Внутримозговая опухоль височно-островковой доли справа». Был прооперирован. Из биоптата опухолевой ткани получена культура клеток. Определяли уровни экспрессии генов и рассчитали по формуле значение злокачественности y. Оно оказалось равным 2,9. Это значение соответствует степени злокачественности Grade III. Заключение по морфологическому исследованию: анапластическая астроцитома. WHO grade III.
Пример 3
Больной Н. проведена операция «Микрохирургическое удаление опухоли левой затылочной доли». Из биоптата удаленной ткани выделена культура клеток. В культуре заявленным способом проведена оценка злокачественности клеток. Расчет дал значение y=4,04. Это значение соответствует степени злокачественности Grade IV. Заключение по морфологическому исследованию: Глиобластома, WHO Grade IV
Таким образом из приведенных примеров видно, что предлагаемый способ решает задачу оценки степени злокачественности культур клеток глиомы. Способ позволяет достоверно различать степени злокачественности Grade II, Grade III и Grade IV.
Список использованной литературы
1. El-Rayes В.F. et al. Cellular DNA content parameters as prognostic indicators in human astrocytomas //Journal of neuro-oncology. - 2005. - T. 71. - №. 2. - C. 85-89.
2. Способ диагностики степени злокачественности глиом. Патент РФ 2423920.
3. Способ дифференциальной диагностики глиом на основании анализа экспрессии генов и микро-РНК. Патент РФ 2709651.