ЭКСТРАКТЫ КОФЕ В КАЧЕСТВЕ ИНГРЕДИЕНТОВ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, ЛЕКАРСТВ, КОСМЕТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ, ПИЩЕВЫХ ДОБАВОК И БИОПРЕПАРАТОВ
COFFEE EXTRACTS AS INGREDIENTS OF FOOD PRODUCTS, MEDICATIONS, COSMETIC PRODUCTS, FOOD ADDITIVES AND BIOPHARMACEUTICALS

Родственные заявки
Приоритет настоящей заявки основан на предварительной заявке US 61/392828, поданной 13 октября 2010 г., которая в порядке ссылки во всей полноте включена в настоящую заявку.
Область техники
Изобретение относится к веществам или экстрактам кофе в качестве ингредиентов пищевых продуктов, лекарств, косметических средств, пищевых добавок и биологических препаратов, а также к соответствующим способам.
Уровень техники
Неочищенный кофеин является одним из основных побочных продуктов удаления кофеина из сырых зерен кофе. Поскольку на кофе без кофеина приходится около 10% общего потребления кофе, ежегодно производятся тысячи тонн неочищенного кофеина. Помимо кофеина в сырых зернах кофе содержатся разнообразные биологически активные фитохимические вещества, включая хлорогеновые кислоты (Michael, N. С., Journal of the Science of Food and Agriculture 1999, 79, 362-372) и кофейные масла (Araujo, J.М.А. и Sandi, D., Food Chemistry 2007, 101, 1087-1094). "Фито-" в слове фитохимический происходит от греческого слова phyto, которое означает растение; соответственно, фитохимические вещества являются химическими веществами растительного происхождения. В процессе удаления кофеина неизбежно удаляются некоторые из не содержащих кофеин фитохимических веществ, что придает неочищенному кофеину желто-зеленый цвет.
Неочищенный кофеин является исходным сырьем для производства чистого кофеина, который используется в напитках, пищевых продуктах и лекарственных препаратах; не содержащие кофеин остатки обычно выбрасываются как отходы. В свете множества исследований, продемонстрировавших пользу содержащихся в кофе фитохимических веществ (Svilaas, А. et al., Journal of Nutrition 2004, 134, S62-S67; Daglia, M. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2000, 48, 1449-1454), авторы изобретения предположили, что неочищенный кофеин также может оказывать благоприятное действие за счет присутствии этих не содержащих кофеин компонентов.
гидро
липо
Авторами был осуществлен анализ неочищенного кофеина на содержание фенольных соединений, гидрофильную и липофильную способность поглощать радикалы кислорода (ORAC и ORAC) способность защищать клетки первичных нейронов мышей от вызванного перекисью водорода некроза, антигипергликемическое действие на культивированные клетки скелетных мышц человека и адипоциты и ингибирующее действие против циклооксигеназы-2 (COX-2), являющейся мощным посредником воспаления. С целью определения химических структур биологически активных соединений в неочищенном кофеине было осуществлено ориентированное на активность фракционирование противоокислительных соединений с последующим анализом данных мониторинга множественных реакций (MMM) методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖК-МС).
Сущность изобретения
В первом варианте осуществления предложена композиция, представляющая собой готовый пищевой продукт, состоящий из извлеченной из неочищенного кофеина фитохимической фракции, в которой соотношение полифенолов и кофеина составляет около 20, 10-30 или 40 или более 10.
В родственном варианте осуществления предложена композиция согласно первому варианту осуществления, в которой фитохимической фракцией является ультраконцентрат процесса фильтрации водной суспензии неочищенного кофеина, а неочищенным кофеином является продукт удаления кофеина из сырых зерен кофе.
В другом родственном варианте осуществления предложен способ изготовления готового пищевого продукта, включающий добавление в пищевой продукт или в компонент пищевого продукта извлеченной из неочищенного кофеина фитохимической фракции, которой является фитохимическая фракция согласно первому варианту осуществления или родственному ему варианту осуществления, в результате чего получают готовый пищевой продукт.
Во втором варианте осуществления предложена композиция, представляющая собой готовую лекарственную форму, состоящую из извлеченной из неочищенного кофеина фитохимической фракции, в которой соотношение полифенолов и кофеина составляет около 20, 10-30 или 40 или более 10.
В родственном варианте осуществления предложена композиция согласно второму варианту осуществления, в которой фитохимической фракцией является ультраконцентрат процесса фильтрации водной суспензии неочищенного кофеина, а неочищенным кофеином является продукт удаления кофеина из сырых зерен кофе. В другом родственном варианте осуществления предложен способ изготовления готовой лекарственной формы, включающий добавление в лекарственное средство или компонент лекарственного средства извлеченной из неочищенного кофеина фитохимической фракции, которой является фитохимическая фракция согласно второму варианту осуществления или родственному ему варианту осуществления, в результате чего получают готовую лекарственную форму.
В третьем варианте осуществления предложена композиция, представляющая собой готовое косметическое средство, состоящее из извлеченной из неочищенного кофеина фитохимической фракции, в которой соотношение полифенолов и кофеина составляет около 20, 10-30 или 40 или более 10.
В родственном варианте осуществления предложена композиция согласно третьему варианту осуществления, в которой фитохимической фракцией является ультраконцентрат процесса фильтрации водной суспензии неочищенного кофеина, а неочищенным кофеином является продукт удаления кофеина из сырых зерен кофе. В другом родственном варианте осуществления предложен способ изготовления готового косметического средства, включающий добавление в косметическое средство или в компонент косметического средства извлеченной из неочищенного кофеина фитохимической фракции, которой является фитохимическая фракция согласно третьему варианту осуществления или родственному ему варианту осуществления, в результате чего получают готовое косметическое средство. В четвертом варианте осуществления предложена композиция, представляющая собой готовую пищевую добавку, состоящую из извлеченной из неочищенного кофеина фитохимической фракции, в которой соотношение полифенолов и кофеина составляет около 20, 10-30 или 40 или более 10.
В родственном варианте осуществления предложена композиция согласно четвертому варианту осуществления, в которой фитохимической фракцией является ультраконцентрат процесса фильтрации водной суспензии неочищенного кофеина, а неочищенным кофеином является продукт удаления кофеина из сырых зерен кофе.
В другом родственном варианте осуществления предложен способ изготовления готовой пищевой добавки, включающий добавление в пищевую добавку или в компонент пищевой добавки извлеченной из неочищенного кофеина фитохимической фракции, которой является фитохимическая фракция согласно четвертому варианту осуществления или родственному ему варианту осуществления, в результате чего получают готовую пищевую добавку.
В пятом варианте осуществления предложена композиция, представляющая собой готовый биопрепарат, состоящий из извлеченной из неочищенного кофеина фитохимической фракции, в которой соотношение полифенолов и кофеина составляет около 20, 10-30 или 40 или более 10.
В родственном варианте осуществления предложена композиция согласно пятому варианту осуществления, в которой фитохимической фракцией является ультраконцентрат процесса фильтрации водной суспензии неочищенного кофеина, а неочищенным кофеином является продукт удаления кофеина из сырых зерен кофе.
В другом родственном варианте осуществления предложен способ изготовления готового биопрепарата, включающий добавление в биопрепарат или в компонент биопрепарата извлеченной из неочищенного кофеина фитохимической фракции, которой является фитохимическая фракция согласно пятому варианту осуществления или родственному ему варианту осуществления, в результате чего получают готовый биопрепарат.
В шестом варианте осуществления предложен способ облегчения нейропротекции, включающий выявление пациента, нуждающегося в нейропротекции; и введение ему композиции согласно первому, второму, третьему, четвертому или пятому вариантам осуществления или любому из родственных им вариантов осуществления в количестве, эффективном для облегчения нейропротекции.
В одном из вариантов осуществления, родственном шестому варианту осуществления, предложен способ облегчения нейропротекции, включающий: введение пациенту композиции согласно первому, второму, третьему, четвертому или пятому вариантам осуществления или любому из родственных им вариантов осуществления в количестве, эффективном для облегчения нейропротекции; и оценку нейропротекции у пациента.
В седьмом варианте осуществления предложен способ ингибирования СОХ-2, включающий выявление пациента, нуждающегося в ингибировании СОХ-2; и введение ему композиции согласно первому, второму, третьему, четвертому или пятому вариантам осуществления или любому из родственных им вариантов осуществления в количестве, эффективном для ингибирования СОХ-2.
В одном из вариантов осуществления, родственном седьмому варианту осуществления, предложен способ ингибирования СОХ-2, включающий введение пациенту композиции согласно первому, второму, третьему, четвертому или пятому вариантам осуществления или любому из родственных им вариантов осуществления в количестве, эффективном для ингибирования СОХ-2; и оценку ингибирования СОХ-2 у пациента.
В восьмом варианте осуществления предложен способ стимулирования поглощения глюкозы, включающий выявление пациента, нуждающегося в стимулировании поглощения глюкозы; и введение композиции согласно первому, второму, третьему, четвертому или пятому вариантам осуществления или любому из родственных им вариантов осуществления в количестве, эффективном для стимулирования поглощения глюкозы.
В одном из вариантов осуществления, родственном восьмому варианту осуществления, предложен способ стимулирования поглощения глюкозы, включающий введение композиции согласно первому, второму, третьему, четвертому или пятому вариантам осуществления или любому из родственных им вариантов осуществления пациенту в количестве, эффективном для стимулирования поглощения глюкозы; и оценку стимулирования поглощения глюкозы у пациента.
В девятом варианте осуществления предложен способ лечения деменции или возрастных когнитивных расстройств, включающий выявление пациента, нуждающегося в лечении деменции или возрастных когнитивных расстройств; и введение ему композиции согласно первому, второму, третьему, четвертому или пятому вариантам осуществления или любому из родственных им вариантов осуществления в количестве, эффективном для лечения деменции или возрастных когнитивных расстройств.
В одном из вариантов осуществления, родственном девятому варианту осуществления, предложен способ лечения деменции или возрастных когнитивных расстройств, включающий введение пациенту композиции согласно первому, второму, третьему, четвертому или пятому вариантам осуществления или любому из родственных им вариантов осуществления в количестве, эффективном для лечения деменции или возрастных когнитивных расстройств; и оценку лечения деменции или возрастных когнитивных расстройств у пациента.
В десятом варианте осуществления предложен способ ингибирования воспаление, включающий выявление пациента, нуждающегося в ингибировании воспаления; и введение ему композиции согласно первому, второму, третьему, четвертому или пятому вариантам осуществления или любому из родственных им вариантов осуществления в количестве, эффективном для ингибирования воспаления.
В одном из вариантов осуществления, родственном десятому варианту осуществления, предложен способ ингибирования воспаление, включающий: введение пациенту композиции согласно первому, второму, третьему, четвертому или пятому вариантам осуществления или любому из родственных им вариантов осуществления в количестве, эффективном для ингибирования воспаления; и оценку ингибирования воспаления у пациента.
В одиннадцатом варианте осуществления предложен способ лечения сахарного диабета, включающий выявление пациента, нуждающегося в лечении сахарного диабета; и введение ему композиции согласно первому, второму, третьему, четвертому или пятому вариантам осуществления или любому из родственных им вариантов осуществления, в количестве, эффективном для лечения сахарного диабета.
В одном из вариантов осуществления, родственном одиннадцатому варианту осуществления, предложен способ лечения сахарного диабета, включающий введение пациенту композиции согласно первому, второму, третьему, четвертому или пятому вариантам осуществления или любому из родственных им вариантов осуществления в количестве, эффективном для лечения сахарного диабета; и оценку лечения сахарного диабета у пациента.
В двенадцатом варианте осуществления предложен способ согласно шестому или девятому вариантам осуществления или любому из родственных им вариантов осуществления, в котором выявление или оценка осуществляется путем нейропсихологического обследования.
В тринадцатом варианте осуществления предложен способ согласно седьмому или десятому вариантам осуществления или любому из родственных им вариантов осуществления, в котором в котором выявление или оценка осуществляется на основании ревматологических критериев.
В четырнадцатом варианте осуществления предложен способ согласно восьмому или одиннадцатому вариантам осуществления или любому из родственных им вариантов осуществления, в котором выявление или оценка осуществляется путем определения содержания глюкозы в крови.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показана блок-схема дополнительной переработки неочищенного кофеина с целью снижения содержания кофеина и обогащения полифенолами с получением готового пищевого продукта в качестве конечного продукта,
на фиг.2 показана блок-схема неочищенного кофеина дополнительной переработки неочищенного кофеина с целью снижения содержания кофеина и обогащения полифенолами с получением готовой лекарственной формы в качестве конечного продукта,
на фиг.3 показана блок-схема неочищенного кофеина дополнительной переработки неочищенного кофеина с целью снижения содержания кофеина и обогащения полифенолами с получением готового косметического средства в качестве конечного продукта,
на фиг.4 показана блок-схема неочищенного кофеина дополнительной переработки неочищенного кофеина с целью снижения содержания кофеина и обогащения полифенолами с получением готовой пищевой добавки в качестве конечного продукта,
на фиг.5 показана блок-схема неочищенного кофеина дополнительной переработки неочищенного кофеина с целью снижения содержания кофеина и обогащения полифенолами с получением готового биопрепарата в качестве конечного продукта,
на фиг.6 показаны биологически активные соединения неочищенного кофеина, получаемого во время производства кофе,
2
на фиг.7 показано извлечение кофеина из кофе с использованием CO в сверхкритическом состоянии,
на фиг.8 показано действие чистого кофеина (A) или неочищенного кофеина (B) на обработанные перекисью водорода клетки первичных нейронов мышей,
на фиг.9 показано стимулирование инсулином, неочищенным кофеином и чистым кофеином поглощения глюкозы клетками скелетных мышц человека и адипоцитами,
на фиг.10 показано ингибирование аспирином, обычным кофе, чистым кофеином и неочищенным кофеином СОХ-2,
на фиг.11 показано отделение нерастворимых в воде частиц от неочищенного кофеина,
на фиг.12 показана защита клеток первичных нейронов мышей от вызванного перекисью водорода некроза нерастворимыми в воде частицами,
на фиг.13 показано обнаружение химических веществ в нерастворимых в воде частицах путем мониторинга множественных реакций методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии; на фиг.13А - кофейной кислоты; на фиг.13Б - кумаровой кислоты; на фиг.13В - ванилиновой кислоты; на фиг.13Г - кверцетина; на фиг.13Д - катехина; на фиг.13Е - сложного глюкозного эфира абсцизовой кислоты; на фиг.13Ж - треонина.
Подробное описание изобретения
2
гидро
липо
гидро
липо
50
50
Ежегодно в процессе удаления кофеина из кофе производятся тысячи тонн неочищенного кофеина, при этом вместе с кофеином также удаляются фитохимические вещества. Авторами были определены следующие характеристики неочищенного кофеина, получаемого в результате удаления кофеина с использованием двуокиси углерода в сверхкритическом состоянии (scCO): содержание фенольных соединений, гидрофильная и липофильная способность поглощать радикалы кислорода (ORAC и ORAC); защита клеток нейронов от вызванного перекисью водорода некроза и способность стимулировать поглощение глюкозы и ингибировать циклооксигеназу-2 (СОХ-2). В неочищенном кофеине содержалось 10 мг эквивалента хлорогеновой кислоты (далее - СЕ)/грамм фенольных соединений, он имел значение ORAC 145 мкмоль тролокс-эквивалента (далее - ТЕ)/грамм и значение ORAC 66 мкмоль ТЕ/грамм, но не повышал выживание обработанных перекисью водорода клеток первичных нейронов. Неочищенный кофеин в 1,45 раза увеличивал поглощение глюкозы культивированными клетками скелетных мышц человека и в 2,20 раза культивированными адипоцитами человека. Кроме того, неочищенный кофеин обладал более сильным ингибирующим действием на СОХ-2 (IC, 20 мкг/мл), чем аспирин (IC, 190 мкг/мл). Чистый кофеин не стимулировал поглощение глюкозы и не ингибировал СОХ-2. Авторами был разработан метод обогащения с целью отделения ингибиторов окисления от неочищенного кофеина в виде нерастворимых в воде частиц (WIP), которые в зависимости от дозы защищают клетки первичных нейронов от вызванного перекисью водорода некроза. Методом ориентированного на ORAC фракционирования WIP в сочетании с анализом путем ЖК-MC/MS было выявлено семь биоактивных компонентов: кофейная кислота, кумаровая кислота, ванилиновая кислота, кверцетин, катехин, сложный глюкозный эфир абсцизовой кислоты и треонин. Было обнаружено, что при сочетании WIP с α-токоферолом обеспечивается синергетический эффект.
Определения
Если не указано иное, используемые в описании термины имеют такое же значение, в котором их обычно используют специалисты в области техники, к которой относится настоящее изобретение.
Согласно закону "О пищевых продуктах, лекарственных веществах и косметических средствах" (FD&C) термин "пищевой продукт" означает (1) изделие, употребляемое в пищу или в качестве напитка человеком или животным, (2) жевательную резинку и (3) изделие, используемое в качестве компонента любого такого изделия. Согласно закону "О пищевых продуктах, лекарственных веществах и косметических средствах" термин "лекарственное средство" означает изделие, признанное в официальной Фармакопее США, официальной Гомеопатической Фармакопее США или официальном Фармакологическом Справочнике или любом приложении к любому из перечисленного изделием, предназначенным для применения в диагностике, лечении, облегчении, терапии или предотвращении болезни у человека или животного, изделием (помимо пищевого продукта), предназначенным для оказания влияния на строение или любую функцию организма человека или животного, и изделием, предназначенным для применения в качестве компонента любого указанного выше изделия. Согласно закону "О пищевых продуктах, лекарственных веществах и косметических средствах" термин "косметическое средство" означает изделие, предназначенное для втирания, нанесения, разбрызгивания или распыления, введения или применения иным способом в организме человека или любой его части с целью очистки, ухода, усиления привлекательности или изменения внешнего вида, и изделие, предназначенное для применения в качестве компонента любого такого изделия. Согласно закону "О пищевых продуктах, лекарственных веществах и косметических средствах" термин "пищевая добавка" означает продукт, предназначенный для дополнения рациона и включающий или содержащий один или несколько из следующих диетических ингредиентов: витамин, минерал, травянистое или другое растение, аминокислоту, диетическое вещество для употребления человеком с целью дополнения рациона путем употребления с пищей или концентрат, метаболит, компонент, экстракт или сочетание любого из перечисленных ингредиентов.
Согласно правилам Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), термин биопрепарат означает подкласс лекарственных средств, отличием которых является биологическая технология их изготовления.
Данные определения служат для дифференциации лекарственного вещества и готовой лекарственной формы. Готовой лекарственной формы является готовая форма, например, в виде твердого перорального лекарственного средства, содержащего лекарственное вещество. Для подтверждения применимости лекарственных средств в целях диагностики, лечения, облегчения, терапии или предотвращения болезни проводятся исследования эффективности. Диагностика, лечение, облегчение, терапия или предотвращение не означают 100% эффективность. Точнее, диагностика, лечение, облегчение, терапия или предотвращения означают определенный уровень эффективности в пределах от 1% до 100%.
Согласно правилам Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), пищевые продукты подразделятся на следующие общие категории: выпечку и смеси для выпечки, включая все готовые к употреблению и готовые к выпеканию продукты, муку и смеси, требующие приготовления перед употреблением; алкогольные напитки, включая солодовые напитки, вина, дистиллированные напитки и смеси для коктейлей; безалкогольные напитки и основы для напитков, включая только особые или ароматизированные чаи, заменители кофе и ароматизированные фруктовые и овощные желатиновые напитки; зерновые завтраки, включая готовые к употреблению и быстрорастворимые и обычные горячие зерновые завтраки; сыры, включая творог и сывороточные сыры, сливочные, натуральные, тертые, плавленые, пастообразные сыры, сыры для соуса и различные сыры; жевательную резинку во всех формах; кофе и чай, включая обычный, без кофеина и быстрорастворимый; специи и приправы, включая обычные соусы и пасты для заправки, оливки, маринады и приправы, но не пряности или травы; сласти и сахарную глазурь, включая леденцы и ароматизированную сахарную глазурь, зефир, шоколад для выпечки и коричневый, кусковой сахар, сахар в головах, кленовый сахар, сахарный песок и нерафинированный сахар; аналоги молочных продуктов, включая искусственное молоко, замороженные или жидкие порошковые сливки, забеливатели для кофе, украшения десертов и другие искусственные молочные продукты; яйца, включая жидкие, замороженные или порошковые яйца и приготовленные из них блюда, т.е. яичные рулеты, фу юнг, яичный салат и замороженные комплексные блюда из яиц, но не свежие яйца; жиры и масла, включая маргарин, заправки для салатов, сливочное масло, салатные масла, кулинарный жиры и масла для жарки; рыбные продукты, включая все готовые основные блюда, салаты, закуски, замороженные комплексные блюда и пасты, содержащие рыбу, мясо ракообразных и другие водяных животных, но не свежую рыбу; свежие яйца, включая вареные яйца и блюда из яиц, приготовленные только из свежих натуральных яиц; свежую рыбу, включая только свежую и замороженную рыбы, мясо ракообразных и других водяных животных; свежие плоды и плодовые соки, включая только сырые плоды, цитрусовые, бахчевые и ягоды и домашние мармелады и пунши из них; свежее мясо, включая только свежую или замороженную в домашних условиях говядину или телятину, свинину, ягнятину или баранину и содержащие свежее мясо блюда домашнего приготовления, салаты, закуски или бутербродные пасты из него; свежую птицу, включая только свежую или замороженную в домашних условиях домашнюю птицу и дичь и содержащие свежую домашнюю птицу блюда домашнего приготовления, салаты, закуски или бутербродные пасты из нее; свежие овощи, томаты и картофель, включая только свежие овощи и овощи домашнего приготовления; замороженные молочные десерты и смеси, включая сливочное мороженое, молочное мороженое, шербеты и другие замороженные молочные десерты и блюда; фруктовый лед и мороженое, включая все виды фруктового льда и мороженого; желатины, пудинги, и наполнители, включая ароматизированы желатиновые десерты, пудинги, сладкие заварные кремы, парфе, начинки для пирогов и салаты на основе желатина; зерновые продукты и макаронные изделия, включая изделия и макарон и лапши, блюда из риса и замороженные комплексные блюда без мяса или овощей; подливки и соусы, включая все мясные соусы и подливки и томатные, молочные, масляные и деликатесные соусы; твердые леденцы и капли от кашля, включая все леденцы твердого типа; травы, семена, специи, приправы, смеси, экстракты и отдушки, включая все натуральные и искусственные специи, смеси и отдушки; джемы и желе домашнего приготовления, включая только джемы, желе, повидло, консервы и сладкие пасты домашнего приготовления; джемы и желе промышленного приготовления, включая только производимые в промышленных масштабах джемы, желе, повидло, консервы и сладкие пасты домашнего приготовления; мясные продукты, включая все мясные и содержащие мясо блюда, салаты, закуски, замороженные комплексные мясные блюда и ингредиенты для сэндвичей, приготовленные путем промышленной переработки или с использованием промышленно переработанного мяса для приготовления в домашних условиях; цельное и снятое молоко, включая только цельное, обезжиренное и снятое жидкое молоко; молочные продукты, включая ароматизированное молоко и молочные напитки, сухое молоко, украшения, крем-соусы, пасты, молочные продукты для контроля веса и другие продукты молочного происхождения; орехи и продукты из орехов, включая цельные или очищенные лесные орехи, арахис, кокос и ореховые и арахисовые пасты; продукты из растительного белка, включая продукты, относящиеся к категории "восстановленного растительного белка" согласно классификации Национальной академии наук/Национального научно-исследовательского совета, и изготовленные из растительных белков заменители, аналоги и наполнители мяса, домашней птицы и рыбы; продукты из домашней птицы, включая все блюда из домашней птицы и содержащие домашнюю птицу блюда, салаты, закуски, замороженные комплексные блюда из домашней птицы и ингредиенты для сэндвичей, приготовленные путем промышленной переработки или с использованием промышленно переработанной домашней птицы для приготовления в домашних условиях; переработанные плоды и плодовые соки, включая все промышленно переработанные плоды, цитрусовые, ягоды и смеси; салаты, соки и пунши из соков, концентрированные соки, разбавленные соки, мармелады и приготовленные из них напитки-заменители; переработанные овощи и овощные соки, включая все промышленно переработанные овощи, блюда из овощей, замороженные комплексные блюда из овощей и овощные соки и смеси; закусочные продукты, включая чипсы, претцели и другие новые закусочные; мягкие сласти, включая шоколадные батончики, шоколад, помадку, мятные сласти и другие жевательные сласти и нугу; супы домашнего приготовления, включая супы домашнего приготовления из мяса, домашней птицы, овощей и комбинированные; супы и суповые смеси, включая супы и суповые смеси промышленного приготовления из мяса, домашней птицы, овощей и комбинированные; сахар, белый, гранулированный, включая белый гранулированный сахар; заменители сахара, включая гранулированные, жидкие заменители сахара и заменители сахара в таблетках; и сладкие соусы, украшения десертов и сиропы, включая шоколадный, ягодный, плодовый, кукурузный сироп и кленовые сладкие соусы и украшения.
Удаления кофеина из сырых зерен кофе
Кофеин является физиологически активным компонентом кофе, который подробно изучен. Его открыл Рунге в 1820 году. Химическим названием этого пурина является 1,3,7-триметилксантин. Он представляет собой кристаллы игольчатой формы с температурой плавления 236°C. В зернах кофе содержится от 0,8 до 2,8% кофеина в зависимости от сорта и происхождения.
2
Разработан ряд технологий удаления кофеина с целью снижения содержания кофеина с сохранением желательных атрибутов кофейного напитка. Чтобы свести к минимуму потери вкуса и аромата, промышленное удаление кофеина в настоящее время осуществляют из сырых зерен кофе до их обжарки. Различные методы удаления кофеина можно разделить на три основные группы: удаление кофеина с использованием растворителя, удаление кофеина с использованием воды и удаление кофеина с использованием CO в сверхкритическом состоянии.
В странах ЕС "кофе без кофеина" означает максимальную концентрацию кофеина 0,1% в пересчете на массу сухого вещества, а в США - менее 3% количества, изначально содержащегося в зернах кофе.
В принципе, все технологии удаления кофеина предусматривают пять стадий: разбухание сырых зерен под действием воды, чтобы придать растворимость комплексу кофеин-хлорогенат калия и сделать кофеин доступным для извлечения; извлечение кофеина из зерен с помощью растворителя; десорбцию паром с целью удаления из зерен всех остатков растворителя (если применимо); восстановление адсорбентов (если применимо); и сушку зерен кофе без кофеина до начального содержания влаги.
2
Удаление кофеина с использованием CO в сверхкритическом состоянии
2
2
2
Концепция экстрагирования с использованием текучей среды в сверхкритическом состоянии была впервые признана в 1879 году. В статье Hannay, J.B. и Hogarth, J. (1879) Proc. Roy. Soc. London, 29, 324, сообщалось о том, что твердые соединения могут растворяться в текучей среде сверхкритическом состоянии. Почти во всех технологиях обработки пищевых продуктов с использованием текучей среды в сверхкритическом состоянии в качестве растворителя применяется CO. Плотная CO является не только мощным растворителем широкого спектра соединений, представляющих интерес для пищевой промышленности, но также относительно инертной, недорогой, нетоксичной, пригодной для повторного использования, невоспламеняемой, легкодоступной с высокой степенью чистоты и не оставляющей остатков. Имеющая критическую температуру 31,1°C и давление 7,58 МПа (75,8 бар), CO в близком к критическому и сверхкритическом состоянии может использоваться при температурах и давлениях, которые являются относительно безопасными, удобными и особо применимыми для экстрагирования термолабильных соединений (Palmer, M.V. и Ting, S.S. (1995) Food Chem., 52, 345-52). Растворимость соединения в сверхкритической текучей среде зависит от плотности растворителя, а также от физико-химического сродства растворяемого вещества к растворителю. Растворенные соединения могут восстанавливаться путем простого снижения давления или повышения температуры, чтобы снизить их плотность или путем адсорбции соединения на соответствующем адсорбенте. Тем не менее, одним из недостатков этой технологии следует признать высокие начальные капиталовложения и затраты на техническое обслуживание, связанные с работой под высоким давлением. Фактор затрат является наиболее важным для промышленного внедрения.
2
2
2
2
2
2
2
Применение сжатой CO для удаления кофеина было впервые описано в середине 60-х годов (Zosel, K. (1965) Chem. Abstr., 63, 110456). Процесс предлагалось осуществлять при температуре 70-90°C и давлении 160-220 бар. Предлагались три возможных способа. (1) Увлажненные сырые зерна кофе смешивают с потоком CO в сосуде высокого давления. Кофеин диффундирует из зерен в CO, которую подают в промывную башню, в которой кофеин поглощается водой. Через 10 часов повторения цикла почти весь кофеин растворяется в промывной воде, от которой он может быть отделен путем дистилляции. (2) Кофеин удаляют из текучей CO с использованием условий экстрагирования, описанных в первом способе, путем подачи CO через слой активированного угля, который поглощает кофеин. (3) Помещают смесь сырых зерен кофе и гранул активированного угля в сосуд высокого давления, в котором доводят температуру CO до 90°C, а давление до 220 бар. Через 5 часов кофеин диффундирует из зерен через CO непосредственно в активированный уголь. После экстрагирования зерна кофе отделяют от гранул активированного угля на вибрационном сите.
На основе этих трех способов было создано значительное количество разработок, предусматривающих усовершенствования процесса с точки зрения экономичности или качества.
2
2
Известно, что с 1979 года в Германии компанией HAG осуществляется удаление кофеина из сырых увлажненных зерен кофе с использованием CO методом на основе второго описанного Zosel способа, в котором для экстрагирования кофеина используется влажная CO в сверхкритическом состоянии (патент US 3879S69).
2
Сообщалось о применении одной из модификаций первого описанного Zosel способа на предприятии Schoeller-Bleckmann (Lack, E., Seidlitz, Н. и Того, Р. (1989) In: Proceedings of the 13th ASIC Colloquium (Paipa), стр.236-245, ASIC, Париж, Франция). Оптимальное увлажнение водой от 40% до 45% осуществляется путем введения в контакт с паром, водой или их сочетанием. На предприятии применяются экстракционные колонны высокого давления. Содержащий CO растворенный кофеин поступает в адсорбционную колонну, в которой его удаляют противотоком пресной воды. Если требуемая степень удаления кофеина превышает 97% (как в США), после промывной колонны поток газа должен пройти через адсорбционную колонну с активированным углем. За счет применения каскада последовательных экстракторов гарантируется приемлемая постоянная концентрация кофеина в промывной воде.
2
2
2
В патенте GB 2235121 также описан способ, в котором увлажняют сырые сухие зерна кофе в реакторе высокого давления с использованием перенасыщенной (1-2% по весу HO) CO в сверхкритическом состоянии. Удаление кофеина осуществляется послойно по всему реактору при влажности зерен около 35%, что считается оптимальным для процесса удаления кофеина. Вода, образующаяся в скруббере с кофеином, используется для перенасыщения и содержит кофейное масло и вкусоароматические компоненты кофе. Она также необязательно используется на второй стадии экстрагирования в противоток CO.
2
2
В ЕР 0482675 описана "система пульсирующего давления", в которой увлажненные зерна выдерживают в среде CO в одном из трех или более экстракторов в течение от нескольких минут до нескольких часов под давлением 250 и при температуре 60°C. Затем быстро сбрасывают давление, что приводит к выбросу водного раствора кофеина на поверхность зерен. После восстановления в реакторе давления 250 и температуры 60°C через слой кофе по замкнутой системе прокачивают CO и завершают удаление кофеина. Кофеин поглощают водой в промывной башне и отделяют путем испарения воды. Наконец, влажные зерна обрабатывают в центрифуге путем разбавления остаточного раствора кофеина и предварительной сушки зерен.
2
2
2
2
2
Эта система была усовершенствована в ЕР 0439710. Вместо CO в сверхкритическом состоянии для удаления кофеина используют насыщенный CO не содержащий кофеина экстракт сырых зерен кофе под давлением до 300 бар и при температуре до 110°C в течение от одного до нескольких часов. После быстрого сброса давления зерна в течение до 2 часов промывают жидкостью. Затем из насыщенного CO содержащего кофеин экстракта сырых зерен кофе удаляют кофеин в промывной башне с использованием CO в сверхкритическом состоянии. Отделяют кофеин от CO в водопоглощающей башне.
2
2
2
Также сообщалось об экспериментах с использованием закиси азота в сверхкритическом состоянии вместо CO в качестве растворителя для удаления кофеина (Brunner, G. (1987) In: Proceedings of the 12th ASIC Colloquium (Montreux), стр.294-305, ASIC, Париж, Франция). Она обладает более сильной растворяющей способностью, чем CO за счет более высокой плотности при заданных условиях температуры и давления, чем CO и относительно низкой критической температурой (336,5°C).
В случае неправильного обращения с закисью азота она способна неконтролируемо разлагаться, но в интервале температур, приемлемом для удаления кофеина, и обращение с закисью азота является безопасным, если избегать источников воспламенения.
Известны количественные данные поглощающей способности активированного древесного угля, которая зависит от удельной площади поверхности (Gabel, P.W., Sarge, S. и Camenga, H.K. (1987) In: Proceedings of the 12th ASIC Colloquium (Montreux) стр.306-312, ASIC, Париж, Франция). Путем вычисления "удельной площади поверхности кофеина" и экспериментального анализа теплоты адсорбции (которая снижается с увеличением массы кофеина, то есть с увеличением степени покрытия поверхности) можно прогнозировать поглощающую способность.
th
2
Предлагалась специализированная современная технология удаления кофеина из свежих сырых зерен кофе для применения в странах-производителях кофе (Quijano-Rico, М. (1987) In: Proceedings of the 12 ASIC Colloquium (Montreux), стр.187-193, ASIC, Париж, Франция). После сбора урожая, мокрого обогащения и очистки зеленых зерен от оболочки из них может быть удален кофеин. За счет исключения традиционных стадий увлажнения и сушки снижаются эксплуатационные затраты и повышается органолептическое качество. По существу, удаление кофеина может осуществляться с использованием CO в сверхкритическом состоянии методом экстрагирования с программированием температуры (с непрерывным повышением температуры от 60°C до 85°C и тем самым уменьшением "температурного напряжения") (DE 3445502).
2
2
2
Первая полунепрерывная технология была предложена в патенте US 4911941. С одного конца вертикального цилиндрического экстрактора, содержащего сырые зерна кофе, подают преимущественно непрерывно не содержащую кофеин CO в сверхкритическом состоянии, а с противоположного конца непрерывно отводят содержащую большое количество кофеина CO. Увлажненные зерна кофе загружают в экстрактор под давлением (300 бар) через большой шаровой клапан и шлюзовой бункер (патент US 4820537). Зерна, из которых удален кофеин, выгружают со дна экстрактора в нижний шлюзовой бункер, открывая один за другим шаровые клапаны. Затем клапаны закрывают и продолжают экстрагирование. Кофеин вымывают из потока CO в колонне с противоточной промывной водой, выгодно используя при этом благоприятный коэффициент распределения кофеина для разделения на водную фазу. Воду с высоким содержанием кофеина из поглотителя концентрируют путем обратного осмоса и получают кофеин со степенью чистоты 97% или выше и растворенное вещество, содержащее кислые твердые частицы без кофеина, которые добавляются в процесс для повышения выхода и увеличения скорости экстрагирования.
2
2
2
2
th
На основе данных эксплуатации пилотной установки для удаления кофеина из кофе в промышленных масштабах с использованием CO разработан усовершенствованный процесс удаления кофеина согласно особой технологии экстрагирования с помощью CO в сверхкритическом состоянии (Lining, D.A., Leyers, W.E. и Novak, R.A. (1991) In: Proceedings of the 14 ASIC Colloquium (San Francisco), стр.357-64, ASIC, Париж, Франция). Используется экстрактор высокого давления, через несколько колонн которого непрерывно в течение 6-12 часов подают встречный поток CO под давлением 14-35 МПа и при температуре 70-130°C. Затем текучую среду с высоким содержанием CO и кофеина промывают водой при сниженной температуре (15-50°С) и давлении (5-10 МПа). Водный поток, содержащий неочищенный кофеин реализуют для дальнейшей переработки (извлечения кофеина и очистки).
2
В патенте US 5153015 описана особая установка для экстрагирования некоторых веществ из природных продуктов (таких как кофеин из чая или кофе) с помощью CO в сверхкритическом состоянии. Установка имеет высокий цилиндрический сосуд высокого давления с кольцевыми цилиндрическими перфорированными барабанами, в которых содержится натуральный продукт и адсорбент, при этом текучая среда вытекает из наружной области во внутреннюю цилиндрическую область. Уменьшается перепад давлений и риск засорения, за счет увеличения радиальной скорости улучшается перенос массы в адсорбере, а оборудование является чрезвычайно компактным.
В WO 92/03061/EP-547119 описан способ изготовления сырых зерен кофе без кофеина после предварительной обработки водным раствором кислоты. За счет подкисления предпочтительно 1,5-2% лимонной кислотой компенсируется незначительная потеря кислотности, которая происходит во время удаления кофеина в сверхкритическом состоянии, и тем самым улучшается вкус и аромат кофейного напитка. Подкисляющая обработка может осуществляться в сочетании со стадией увлажнения до удаления кофеина.
2
2
2
2
th
Удаление кофеина из зерен кофе описано в качестве примера применения экстрагирования с использованием текучей CO в сверхкритическом состоянии (МсСоу, B.J. (1993) In: Proceedings of the 6 International Congress on Engineering and Food, Чиба, Япония, том 2, Blackie, Glasgow). Удаление кофеина измерялось как функция скорости потока, температуры и давления CO. Скорость удаления кофеина увеличивалась с повышением как температуры, так и давления. Внешнее сопротивление диффузии и сопротивление диффузии внутри частиц, а также распределение кофеина между водой и CO описывается математической моделью. Коэффициент распределения кофеина между водой и CO в сверхкритическом состоянии зависит от температуры и давления; скорость удаления кофеина повышается при вымачивании сырых зерен в воде до удаления кофеина.
2
2
2
В WO 94/26125 описана новая система удаления кофеина на основе CO в сверхкритическом состоянии в традиционных условиях, но с добавлением жидкого водного потока в сосуд высокого давления поверх слоя увлажненных сырых зерен кофе. Количество используемой воды составляет 1-4 кг на кг сырых зерен кофе (в пересчете на сухое вещество); при использовании в виде непрерывного потока в насыщенной водой среде CO улучшается перенос массы кофеина с поверхности зерен в текучую среду и примерно на 50% сокращается время удаления кофеина. При использовании в виде импульсов длиной около 9 минут с частотой от одного до четырех импульсов в час обеспечивается высокий процент удаления хлорогеновой кислоты (считающейся нежелательной), которая может поглощаться водой в промывной колонне с CO.
2
В патенте US 4411923 предложено заменить активированный уголь ионообменниками вещества для поглощения кофеина из потока CO в сверхкритическом состоянии. Было обнаружено, что сильнокислотные катионные обменники обладают значительно более высокой избирательностью, чем активированный уголь, могут регенерироваться с помощью водных растворов солей или минеральных кислот, и являются стойкими к давлению. Для восстановления кофеина концентрируют водные восстанавливающие растворы, пока не выкристаллизуется кофеин, или осуществляют экстрагирование жидкости жидкостью, например, метиленхлоридом.
У Tokunaga, Y., Fujii, Т. & Nakamura, K. (1997) Biosci. Biotech. Biochem., 61, 1024-1026 описаны лабораторные испытания, в ходе которых активированный уголь заменили цеолитной мембраной с целью отделения кофеина от текучей среды в сверхкритическом состоянии. Цеолит путем гидротермального синтеза тонким слоем наносили на поверхность трубчатой мембраны из окиси алюминия. Система продемонстрировала высокую термостойкость и стойкость к давлению, а также высокую эффективность отделения кофеина. Данные о восстановлении кофеина не приводятся.
2
2
2
2
В EP 0151202 описано удаление кофеина с использованием CO в сверхкритическом состоянии применительно к обжаренному кофе (или чайным листьям). На первой стадии с помощью CO в сверхкритическом состоянии экстрагируют ароматические компоненты, а на второй стадии в обычных условиях с помощью CO удаляют кофеин из увлажненных обжаренных зерен кофе. После этого экстрагируют растворимые в воде компоненты из обжаренного кофе без кофеина. Смешивают кофейный экстракт с содержащей ароматические компоненты сухой CO в сверхкритическом состоянии, из которой после снижения давления конденсируют ароматические компоненты в жидкость; затем экстракт может быть подвергнут сублимационной сушке.
Обогащенный фитохимическими веществами или полифенолами экстракт (или фракция) Как показано на фиг.1-5, в одном из вариантов осуществления из сырых зерен кофе удаляют кофеин с помощью двуокиси углерода в сверхкритическом состоянии с целью изготовления неочищенного кофеина. Неочищенный кофеин или подвергнутый вакуумной сушке продукт его ресуспендирования в воде дополнительно обрабатывают с целью снижения содержания кофеина и обогащения полифенолами путем восстановления ультраконцентрата процесса фильтрации водной суспензии неочищенного кофеина в виде обогащенного фитохимическими веществами или полифенолами экстракта (или фракции). В пищевой продукт (фиг.1), лекарственное средство (фиг.2), косметическое средство (фиг.3), пищевую добавку (фиг.4) или биопрепарат (фиг.5) или в компонент пищевого продукта (фиг.1), лекарственного средства (фиг.2), косметического средства (фиг.3), пищевой добавки (фиг.4) или биопрепарата (фиг.5) добавляют обогащенный фитохимическими веществами или полифенолами экстракт (или фракцию) и получают готовый пищевой продукт (фиг.1), готовую лекарственную форму (фиг.2), готовое косметическое средство (фиг.3), готовую пищевую добавку (фиг.4) или готовый биопрепарат (фиг.5). Как показано на фиг.1-5, обогащенный фитохимическими веществами или полифенолами экстракт (или фракция) играет роль действующего ингредиента или в качестве альтернативы добавки или наполнителя или инертного (нетерапевтического) ингредиента. В качестве примера последнего случая, обогащенный фитохимическими веществами или полифенолами экстракт (или фракция) играет роль ингибитора окисления, повышающего стабильность или срок хранения готового пищевого продукта (фиг.1), готовой лекарственной формы (фиг.2), готового косметического средства (фиг.3), готовой пищевой добавки (фиг.4) или готового биопрепарата (фиг.5). В качестве примера первого случая, обогащенный фитохимическими веществами или полифенолами экстракт (или фракции) играет роль действующего ингредиента, стимулирующего поглощение глюкозы, ингибирующего СОХ-2, или действует как нейропротектор или дополнительно защищает от радикалов кислорода, которые повреждают ткани или кожу.
2
Авторами разработан способ обогащения с целью отделения ингибиторов окисления от неочищенного кофеина. В одном из вариантов осуществления неочищенный кофеин является побочным продуктом процесса удаления кофеина с помощью двуокиси углерода в сверхкритическом состоянии (scCO). В одном из примеров сырые зерна кофе вымачивают в воде до достижения 50% содержания влаги. Кофеин удаляют в экстракторе с помощью жидкой двуокиси водорода при высокой температуре (90-100°C) и высоком давлении (300 атмосфер). Жидкую двуокись водорода перемещают по замкнутой траектории между экстрактором и скруббером, и удаляют кофеин из жидкой двуокиси водорода с помощью воды. Затем полученный водный раствор с высоким содержанием кофеина концентрируют путем обратного осмоса и подвергают вакуумной сушке.
В одном из вариантов осуществления получают примерную композицию неочищенного кофеина. В одном из примеров основными компонентами являются кофеин (95,95%), влага (1,10%) и жир (1,04%); содержание золы, волокна, белка и сахара является пренебрежимо малым.
На фенольные соединения приходится около 10% массы сырых зерен кофе (Chu, Y. F. и др. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2009, 57, 9801-9808). В одном из вариантов осуществления содержание фенольных соединений в неочищенном кофеине определяют в одном из случаев методом Фолина-Чокальтеу. В одном из примеров содержание всех фенольных соединений и составляет 10 мг СЕ/грамм или приблизительно 1% по весу неочищенного кофеина.
гидро
липо
гидро
липо
В одном из вариантов осуществления определили противоокислительную активность гидрофильной и липофильной фракций неочищенного кофеина. В одном из примеров значение ORAC составляет 145 мкмоль ТЕ/грамм, значение ORAC составляет 66 мкмоль ТЕ/грамм, а чистый кофеин имеет крайне низкий значение ORAC (6 мкмоль ТЕ/грамм) и ORAC (0 мкмоль ТЕ/грамм).
2
2
2
2
2
2
2
2
В одном из вариантов осуществления оценили биологический коррелят противоокислительной активности in vitro неочищенного кофеина. В одном из примеров предварительно обработали клетки первичных корковых нейронов неочищенным кофеином до действия вызванного HO окислительного стресса. В одном из примеров HO в зависимости от дозы снижала выживание клеток. В этом примере чистый кофеин не оказывал токсического действия на клетки первичных нейронов, но и не защищал их от вызванного HO некроза. Аналогичным образом, в этом примере неочищенный кофеин не оказывал токсического действия на клетки первичных нейронов, но и не защищал их от вызванного HO некроза даже с учетом значительно более высоких значений ORAC у неочищенного кофеина, чем у чистого кофеина.
В одном из вариантов осуществления определяют антигипергликемическое действие неочищенного кофеина на поглощение глюкозы клетками скелетных мышц человека и адипоцитами с использованием инсулин в качестве позитивного контроля. В одном из примеров инсулин в количестве 100 нмоль вызывает увеличение поглощения глюкозы клетками скелетных мышц человека в 2,06 раза, а, хотя и менее эффективный, чем инсулин неочищенный кофеин в количестве 0,01 мг/мл увеличивает поглощение глюкозы в 1,45 раза. В отличие от этого, в этом примере чистый кофеин в количестве 0,01 мг/мл не имеет значимого эффекта. В одном из примеров неочищенный кофеин более эффективно стимулирует поглощение глюкозы адипоцитами человека, чем инсулин: неочищенный кофеин в количестве 0,01 мг/мл вызывает увеличение поглощения глюкозы в 2,20 раза, тогда как инсулин в количестве 100 нмоль вызывает увеличение в 1,6 раза. В этом примере чистый кофеин (0,01 мг/мл) не оказывает значимого действия на поглощение глюкозы.
50
50
50
В одном из вариантов осуществления определили противовоспалительную активность неочищенного кофеина путем определения его действия на воспалительный фермент СОХ-2 с использованием аспирина в качестве позитивного контроля. В одном из примеров неочищенный кофеин ингибирует активность СОХ-2; значение IC составляло 20 мкг/мл, что в 9,5 раза меньше, чем у аспирина (IC, 190 мкг/мл), что говорит о том, что неочищенный кофеин является более мощным ингибитором СОХ-2, чем аспирин. В отличие от этого, в этом примере активность обычного кофе (IC, 2010 мкг/мл) являлась примерно в 10 меньшей, чем у аспирина. В этом примере чистый  кофеин не ингибирует активность СОХ-2.
гидро
липо
2
2
2
2
В одном из вариантов осуществления неочищенный кофеин дополнительно обработали с целью снижения содержания кофеина и обогащения полифенолами. Неочищенный кофеин, полученный методом удаления кофеина с помощью двуокиси углерода в сверхкритическом состоянии, или подвергнутый вакуумной сушке продукт его ресуспендирования в воде суспендировали с получением суспензии, и путем фильтрации собрали нерастворимые в воде частицы (WIP) этой суспензии. В одном из примеров этим способом снизили содержание кофеина до менее 5%. В одном из примеров во фракции WIP содержалось всего 1,6% кофеина или примерно в 60 раз меньше, чем в неочищенном кофеине. В одном из примеров определили содержание фенольных соединений во фракции WIP в одном из случаев методом Фолина-Чокальтеу. В одном из примеров содержание всех фенольных соединений составляло 313 мг СЕ/грамм или приблизительно 30% по весу фракции WIP. В одном из примеров значения ORAC и ORAC фракции WIP составляли 1321 мкмоль ТЕ/грамм и 332 мкмоль ТЕ/грамм, соответственно, то есть примерно в 9 и 5 раз больше, соответственно, чем у неочищенного кофеина. В одном из примеров определили противоокислительную активность WIP на клетках первичных нейронов мышей. В одном из примеров фракция WIP являлась нетоксичной и в зависимости от дозы значительно уменьшала некроз клеток в случае вызванного HO окислительного стресса. В одном из примеров фракция WIP (1000 мкг/мл) примерно в 3,5 раза увеличивала выживание клеток первичных нейронов мышей, обработанных HO (250-1000 мкм). В одном из вариантов осуществления соотношение всех фенольных соединений и кофеина составляло около 20, 10-30 или 40 или более 10.
гидро
В одном из вариантов осуществления WIP подвергают ориентированному на противоокислительную активность фракционированию и анализу методом ЖК-МС. В одном из примеров делят WIP на множество фракций в испарительной хроматографической колонне С-18, и определяют ORAC каждой фракции. В одном из примеров фракцию(-и) с наибольшей противоокислительной способностью подергают анализу методом ЖК-МС.
В одном из вариантов осуществления обнаруживают во фракциях с наибольшей противоокислительной способностью семь химических веществ: кофейную кислоту, кумаровую кислоту, ванилиновую кислоту, кверцетин, катехин, сложный глюкозный эфир абсцизовой кислоты и треонин. Из их числа кофейная кислота, кумаровая кислота, ванилиновая кислота, кверцетин и катехин являются хорошо известными фенольными ингибиторами окисления. Абсцизовая кислота является растительным гормоном, но не обладает активностью, когда она присутствует в качестве конъюгата глюкозного эфира; и треонин является аминокислотой.
В одном из вариантов осуществления определяют синергетический эффект неочищенного кофеина и WIP в сочетании с другими биологическими ингибиторами окисления. В одном из примеров исследование ORAC адаптировано к микроэмульсионной системе на основе линолеатов (Sim, W.L.S. и др., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2009, 57, 3409-3414) с целью определения противоокислительной активности α-токоферола (одной из форм витамина Е) в сочетании с неочищенным кофеином, WIP, аскорбиновой кислотой, катехином, хлорогеновой кислотой, WIP+катехин или WIP+хлорогеновая кислота. В этом примере получают данные в виде относительных значений ORAC: 100% значение ORAC означает, что противоокислительная активность смеси равна сумме противоокислительных активностей каждого компонента (аддитивный эффект), а значение ORAC более 100%, означает, что противоокислительная активность смеси превышает сумму противоокислительных активностей каждого компонента (синергетический эффект). В одном из примеров неочищенный кофеин и аскорбиновая кислота в сочетании с α-токоферолом обладают аддитивным противоокислительным действием. В отличие от этого, WIP, катехин и хлорогеновая кислота в сочетании с α-токоферолом обладают синергетическим эффектом.
Экстрагирование
Экстрагирование как термин, используемый в фармацевтике, означает отделение обладающих лекарственным действием частей растительных или животных тканей от неактивных или инертных компонентов путем использования избирательных растворителей в ходе различных процедур экстрагирования. Продукты, которые получают из растений, представляют собой относительно загрязненные концентраты, предназначенные в основном для перорального или наружного применения. Получаемые из них препараты обычно называют галеновыми препаратами. Изготовление лекарственных средств и биопрепаратов Лекарственные вещества чаще всего вводятся перорально посредством твердых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы, хотя также могут использоваться порошки в качестве простейшей лекарственной формы. Для крупномасштабного производства таблеток и капсул обычно необходимы другие вещества помимо действующих ингредиентов. В их состав также могут включаться добавки, облегчающие обращение, улучшающие физические свойства, повышающие стабильность и облегчающие доставку лекарственного средства в кровоток после введения.
Таблетки могут быть определены как твердые лекарственные формы, содержащие лекарственные вещества с использованием или без использования соответствующих разбавителей и традиционного изготавливаемые методами прессования или формования. Недавно для изготовления таблеток стали применяться методы перфорирования слоистых листов, электронного осаждения и стереоскопической печати.
Прессованные таблетки формируют путем прессования, и в простейшей форме они не содержат покрытия. Их изготавливают из порошковых, кристаллических или гранулированных веществ по отдельности или в сочетании со связующими, вызывающими дезинтеграцию агентами, полимерами с контролируемым высвобождением, смазками, разбавителями и во многих случаях красителями. Подавляющее большинство производимых в настоящее время таблеток являются прессованными таблетками без покрытия или с покрытием.
Базовый механический блок во всех таблетировочных машинах имеет нижний пуансон, который снизу вставлен в матрицу, и верхний пуансон с головкой такой же формы и размера, который сверху входит в полость матрицы после того, как таблетируемый материал заполняет полость штампа. Таблетку формируют путем приложения давления к пуансонам, и затем выталкивают из матрицы. Существуют три общих способа, обычно применяемых для промышленного изготовления таблеток: мокрая грануляция, сухая грануляция и прямое прессование.
Помимо действующего или терапевтического ингредиента в таблетках содержится ряд инертных веществ. Они известны как добавки или наполнители. Они могут быть классифицированы согласно роли, которую они играют в готовой таблетке. В первую группу входят вещества, способствующие приданию составу удовлетворительных технологических свойств и прессуемости. Они включают разбавители (например, дикальцийфосфат, сульфат кальция, лактозу, целлюлозу, каолин, маннитол, хлорид натрия, сухой крахмал и сахарную пудру), связующие (например, крахмал, желатин, сахара, камеди, целлюлозные полимеры и поливинилпирролидон), улучшители скольжения (например, коллоидный диоксид кремния) и смазки (например, тальк, стеарат магния, стеарат кальция, стеариновую кислоту, бегенат глицерина, гидрогенизированные растительные масла и полиэтиленгликоль). Вторая группа добавляемых веществ способствует приданию готовой таблетке дополнительных желаемых физических свойств. В эту группу входят вызывающие дезинтеграцию агенты (например, крахмалы, глины, целлюлозы, альгины, камеди и сшитые полимеры), поверхностно-активные вещества, красители, в случае жевательных таблеток - отдушки и подслащивающие вещества, а в случае таблеток с контролируемым высвобождением - полимеры и гидрофобные вещества, такие как воски и другие замедляющие растворимость вещества. В некоторых случаях с целью повышения стабильности и увеличения срока хранения могут добавляться ингибиторы окисления или другие вещества.
Наиболее широко распространенным и самым общим способом изготовления таблеток является мокрая грануляция. Стадиями этого способа являются взвешивание, смешивание, грануляция, мокрое грохочение, сушка, сухое грохочение, смазывание и прессование. Одним из примеров таблеток, изготавливаемых путем мокрой грануляции, является аскорбиновая кислота USP, 50 мг.
Ингредиенты
В каждой таблетке
Аскорбиновая кислота USP
55 мг
Лактоза
21 мг
Крахмал
13 мг
Этилцеллюлоза N-100
16 мг
Крахмал
7 мг
Тальк
6,5 мг
Стеарат кальция
1 мг
Первые три ингредиента гранулируют с этилцеллюлозой (5%), растворенной в безводном этиловом спирте с добавлением дополнительного безводного спирта с целью изготовления влажных гранул. Осуществляют мокрое грохочение через сетчатый нержавеющий фильтр и сушку при комнатной температуре. Осуществляют сухое грохочение сетчатый нержавеющий фильтр и вводят остальные три ингредиента. Осуществляют тщательное перемешивание и прессование. Используют плоский скошенный 1/4-дюймовый перфоратор.
Сухая грануляция включает взвешивание, смешивание, агрегирование, сухое грохочение, смазывание и прессование. Одним из примеров таблеток, изготавливаемых путем сухой грануляции, является комплексный витамин В:
Ингредиенты
В каждой таблетке
Мононитрат тиамина
0,733 мг
Рибофлавин
0,733 мг
Гидрохлорид пиридоксина
0,333 мг
Пантотенат кальция
0,4 мг
Никотинамид
5 мг
Лактоза
75,2 мг
Крахмал
21,9 мг
Тальк
20 мг
Стеариновая кислота
0,701 мг
Смешивают друг с другом все ингредиенты. Прессуют из них заготовки. Измельчают и просеивают гранулы. Повторно прессуют из них таблетки с использованием 1/4-дюймового вогнутого перфоратора.
Прямое прессование предусматривает прессование таблеток непосредственно из порошкового вещества. Это дешевле, но не всегда сочетается с исходными материалами. Одним из примеров таблеток, изготавливаемых путем прямого прессования, является аскорбиновая кислота USP, 250 мг.
Ингредиенты
В каждой таблетке
Аскорбиновая кислота USP
255 мг
Микрокристаллическая целлюлоза
159 мг
Стеариновая кислота
9 мг
Коллоидный кремнезем
2 мг
Перемешивают все ингредиенты в соответствующем смесителе. Прессуют с использованием 1/4-дюймового стандартного вогнутого перфоратора.
Капсулы представляют собой твердые лекарственные формы, в которых лекарственное вещество заключено в твердую или мягкую растворимую оболочку из желатина в применимой форме. По сравнению с таблетками порошки для наполнения твердых желатиновых капсул требуют минимальных усилий по приготовлению. Порошки обычно содержат разбавители, такие как лактоза, маннитол, карбонат кальция или карбонат магния. Часто также применяются смазки, такие как стеараты. Желатин для капсул с мягкими оболочками обычно пластифицируют путем добавления глицерина, сорбита или аналогичного полиола.
Содержащая лекарственное вещество жевательная резинка может быть изготовлена разнообразными способами смешивания нескольких компонентов с целью формирования листа, который раскатывают и высекают или вырезают из него изделия. Стандартная содержащая лекарственное вещество жевательная резинка имеет следующий состав.
Компонент
Концентрация (% по весу)
Лекарственное средство
0-40
Смолистая основа
20-45
Подсластители
30-60
Смягчители
0-10
Вкусоароматические добавки
1-5
Красители
0-1
Содержащие лекарственное вещество жевательные резинки могут изготавливаться путем прессования и другими способами, но преобладающим в настоящее время способом является смешивание, раскатка и высекание готовых изделий.
Разработка новых лекарственных средств может вестись в разнообразных направлениях для различных соединений, но существует парадигма, которая в течение долгого времени успешно служит общей моделью разработки. В общих чертах, эта парадигма определяет открытие и разработку нового лекарственного средства как последовательность (возможно перекрывающих друг друга) стадий.
Процедура открытия приводит к синтезу соединений, которые исследуют в ходе доклинических испытаний, называемых анализом и испытанием на животных. Клинические испытания (на людях) обычно осуществляются на трех последовательных стадиях. На стадии I проводят испытания с участием небольшого числа обычно здоровых добровольцев, чтобы определить безопасные дозы и собрать данные поглощения, распределения, влияния на метаболизм, экскреции и токсичности соединения. Для проведения клинического испытания в США изготовитель сначала должен подать в FDA заявку на проведение клинических испытаний нового лекарственного препарата (IND). На стадии II проводят испытания с участием пациентов, страдающих соответствующим заболеванием или состоянием, с целью изготовления доказательств безопасности и предварительных данных эффективности. На этой стадии используется большее число участников испытания, чем на стадии I, и оно может исчисляться сотнями. На предшествующей одобрению завершающей стадии III клинического испытания обычно проводится несколько широкомасштабных (часто (многоцентровых) исследований с целью надежного определения эффективности и обнаружения редко возникающих побочных эффектов. Общее число участников на стадии III испытаний соединения может исчисляться тысячами. После того, как разработчики лекарственного средства сочтут, что у них имеется достаточно доказательств безопасности и эффективности, они представляют результаты испытаний в виде заявки, подаваемой в регламентирующий орган, с целью получения разрешения на продажу. В США изготовители подают на рассмотрение и одобрение FDA заявку на новое лекарственное средство (NDA) или заявку на получение разрешения на биопрепарат (BLA).
Сахарный диабет
Сахарный диабет (DM) представлен группой синдромов, характеризующихся гипергликемией; изменением липидного, углеводного и белкового обмена; и повышенным риском осложнений в результате заболевания сосудов. У большинства пациента может быть клинически диагностирован диабет 1-го или 2-го типа. DM или углеводная непереносимость также сопутствует другим состояниям или синдромам. Рядом медицинских организаций предложены критерии диагностирования DM. Критерии Американской Ассоциации по диабету (ADA) включают выборочно определенное содержание глюкозы в плазме более 200 мг/дл, определенное натощак содержание глюкозы более 126 мг/дл или содержание глюкозы в плазме более 200 мг/дл через 2 часа после тест толерантности к перорально вводимой глюкозе (Diabetes Care 2003,26,5-20).
Причиной практически всех форм DM является снижение содержания инсулина (дефицит инсулина) и ослабление реакции периферийных тканей на инсулин (резистентность к инсулину). Эти нарушения вызывают изменения углеводного, липидного, кетонного и аминокислотного обмена; основным признаком синдрома является гипергликемия. Инсулин снижает содержание концентрацию глюкозы в крови путем ингибирования выработки глюкозы в печени и путем стимулирования усвоения глюкозы и глюкозного обмена в мышечной и жировой ткани.
С помощью инсулина и пероральных гипогликемических средств у пациентов может достигаться состояние, близкое к нормогликемии. Задачей является достижение содержания глюкозы в крови натощак от 90 до 120 мг/дл и значения через 2 часа после приема пищи менее 150 мг/дл. Менее дисциплинированным пациентам или пациентам с нарушенной гормональной регуляцией в ответ на действие инсулина, возможно, необходимо согласиться с более высокими значениями содержания глюкозы натощак (например, 140 мг/дл) и через 2 часа после приема пищи (например, 200-250 мг/дл).
Неочищенный кофеин стимулирует поглощение глюкозы жировыми и мышечными клетками человека. Применимое противодиабетическое средство должно обладать действием, сходным с действием инсулина, или преодолевать недостатки действия инсулина, связанные с резистентностью к инсулину. Авторами была оценена имитирующая инсулин активность неочищенного кофеина на двух первичных культурах клеток чувствительных к инсулину тканей человека: мышечных трубочек и адипоцитов. Согласно правилам FDA может требоваться проведение испытаний на животных с целью оценки степени эффективности неочищенного кофеина или его фракций при уменьшении гипергликемия, например, испытания на страдающих дефицитом инсулина мышах в качестве модели диабета, таких как мыши линии C57BL/6 и мутантные мыши оb и db. Могут потребоваться дополнительные исследования, чтобы оценить имитирующую инсулин активность неочищенного кофеина или его фракция, например, на органных культурах или первичных клеточных культурах или линиях клеточных культур чувствительных к инсулину, таких как мышечные трубочки линии L6E9 и адипоциты линии 3T3-L1. Данные говорят в пользу клинического испытания (на людях) с целью определения эффективности и оптимальной дозы этих экстрактов для стимулирования поглощения глюкозы и лечения сахарного диабета у пациентов, которые страдают сахарным диабетом или которым угрожает развитие сахарного диабета.
Воспаление
Воспалительный процесс является реакцией на вредоносный раздражитель. В патогенез воспаления участвуют простагландины. Аспирин и NSAIDS (нестероидные противовоспалительные лекарственные средства) ингибируют биосинтез простагландинов. Первым ферментом на пути синтеза простагландинов является циклооксигеназа или СОХ. Этот фермент преобразует арахидоновую кислоту в нестабильные промежуточные соединения и вызывает образование тромбоксана А2 и разнообразных простагландинов. Аспирин и NSAIDS в терапевтических дозах ингибируют образование СОХ и простагландинов.
Существуют две формы циклооксигеназы, а именно циклооксигеназа-1 (СОХ-1) и циклооксигеназа-2 (СОХ-2). СОХ-1 встречается в большинстве нормальных клеток и тканей, а образование СОХ-2 вызывают цитокины и посредники воспаления, которые сопровождают воспалению СОХ-1, но не СОХ-2 экспрессирует в эпителиальных клетках желудка. Считается, что ингибирование СОХ-1 в этом месте преимущественно является причиной неблагоприятных желудочных явлений, которые могут осложнять терапию с помощью NSAIDS, что служит обоснованием для разработки NSAIDS, специфически ингибирующих СОХ-2.
Большинство NSAIDS ингибируют как СОХ-1, так и СОХ-2 с незначительной избирательностью. Гипотеза, согласно которой противовоспалительное действие NSAIDS сопровождается меньшим ульцерогенным потенциалом, дала толчок усилиям по разработке лекарственных средств с более высокой избирательностью в отношении СОХ-2, чем СОХ-1. Эти усилия привели к созданию, например, целекоксиба, являющегося избирательным ингибитором СОХ-2.
Аспирин ковалентно модифицирует СОХ-1 и СОХ-2, необратимо ингибируя активность циклооксигеназы. В отличие от этого, подавляющее большинство NSAIDS являются обратимо действующими конкурентными ингибиторами активности циклооксигеназы. Доказано, что избирательные ингибиторы СОХ-2 реже вызывают язву желудка, чем NSAIDS в таких же по эффективности дозах, и это послужило основанием для одобрения FDA, например, целекоксиба.
NSAIDS в основном клинически применяются в качестве противовоспалительных средств при лечении нарушений опорно-двигательного аппарата, таких как артрит. Термин артрит в действительности означает воспаление суставов и распространяется на фибромиалгию, подагру и волчанку. Из двух общих форм артрита остеоартрит является более распространенным, чем ревматоидный артрит.
Остеоартрит является болезнью, которая характеризуется дегенерацией хрящей и нижележащих костей внутри сустава, и сопровождается воспалением. Американский колледж ревматологов (ACR) опубликовал рекомендации по клинической классификации остеоартрита плечевого сустава (Altman, R. и др., Arthritis Rheum 1990, 33, 1601-10), тазобедренного сустава (Airman, R. и др., Arthritis Rheum 1991, 34, 505-14) и коленного сустава (Altman, R. и др., Arthritis Rheum 1986, 29, 1039-49). Предложен алгоритм борьбы с остеоартритом коленного сустава (Hochberg MC и др., Arthritis Rheum 1995, 38, 1541-6) и с остеоартритом тазобедренного сустава (Hochberg MC и др., Arthritis Rheum 1995, 38, 1535-40).
Ревматоидный артрит является системным воспалительным заболеванием, которое проявляется во множестве суставов и приводит к воспалению синовиальной оболочки (выстилающей сустав) и эрозии хрящей и костей. При клинической диагностике ревматоидного артрит а и определении ревматоидного артрита в эпидемиологических исследованиях используются критерии 1987 года Американского колледжа ревматологов. Пациенты должны отвечать четырем из семи критериев ACR; в основу этих критериев положены клинические наблюдения (например, число пораженных суставов), лабораторные испытания (например, позитивный ревматоидный фактор) и рентгенографическое исследование (например, рентгенограммы, подтверждающие эрозию суставов) (Arnett FC и др., Arthritis Rheum 1988, 31, 315-324).
Исторически при фармакологическом лечении ревматоидного артрита традиционно применяется пирамидальный принцип. Иными словами, лечение начинают с применения кортикостероидных/нестероидных противовоспалительных лекарственных средств, затем переходят к изменяющим течение болезни противоревматическим лекарственным средствам и, наконец, к модификаторам биологической реакции, если пациенты не реагируют на предыдущие лекарственные средства (Arthritis Rheum 2002, 46, 328-346).
Неочищенный кофеин ингибирует воспалительный фермент СОХ-2. Авторами была определена активность неочищенного кофеина в отношении СОХ-2 путем измерения поглощения кислорода в ходе реакций, инициированных путем добавления арахидоновой кислоты в смесь, содержащую в том числе гем, а также рекомбинантную СОХ-2 человека и испытуемый материал. Согласно правилам FDA может требоваться проведение испытаний на животных с целью оценки степени эффективности неочищенного кофеина или его фракций при ингибировании СОХ-2, например, на животных в качестве моделей артрита, при этом наиболее широко используемыми моделями являются адъювантный артрит, вызванный коллагеном артрит, аутоиммунный артрит и вызванный стрептококковыми клеточными оболочками артрит, а в последнее время трансгенные модели. Кроме того, может требоваться проведение анализа in vitro с целью определения активности неочищенного кофеина или его фракций в отношении СОХ-2, например, путем анализа цельной крови человека, разработанного Patrignani, P. и др., J Pharmacol Exp Ther 1994, 271, 1705-12 и утвержденного на Международной встрече по согласованию способа ингибирования СОХ-2 в декабре 1997 года в качестве анализа in vitro, который должен быть принят как стандартный способ оценки ингибирования СОХ-2 и СОХ-1. Данные говорят в пользу клинического испытания (на людях) с целью определения эффективности и оптимальной дозы этих экстрактов для ингибирования СОХ-2 и лечения воспаление у пациентов, которые страдают воспалением или которым угрожает развитие воспаления.
Деменция
Основной причиной деменции в старческом возрасте является болезнь Альцгеймера. Деменция является общим термином для обозначения угасания когнитивной функции до такой степени, что это сказывается на повседневной жизни и деятельности. Наиболее широко принятыми критериями диагностики вероятной болезни Альцгеймера являются критерии, предложенные Национальным институтом неврологических и коммуникативных нарушений и инсульта и Ассоциацией болезни Альцгеймера и родственных заболеваний (NINCDS-ADRDA; McKhann G. и др., Neurology 1984, 34, 939-44). Эти критерии включают наличие деменции, установленной путем клинического исследования и подтвержденной путем нейропсихологического обследования. Деменция описывается как сопровождающееся множественными прогрессирующими когнитивными расстройствами у пожилых людей при отсутствии нарушений сознания, психоактивных веществ или каких-либо других медицинских, неврологических или психиатрических состояний, которые могли бы являться причиной таких прогрессирующих расстройств. В 4-м издании Руководства по диагностике и статистическому учету психических расстройств Американской психиатрической ассоциации (DSM-IV, 1994) также указаны критерии диагностирования деменции типа болезни Альцгеймера, которые в целом согласуются с критериями NINCDS-ADRDA. В DSM-IV также приведены критерии диагностирования сосудистой деменции, а также деменция вследствие общих медицинских обстоятельств, включающих ВИЧ, травму головы, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, болезнь Пика, болезнь Крейтцфельда-Якоба и другие общие медицинские обстоятельства и этиологии. Продолжается выявление новых причин и разновидностей деменции, и продолжается уточнение критериев диагностирования связанных с деменцией нарушений.
Американский институт по изучению старения (NIA) и Ассоциация по борьбе с болезнью Альцгеймера ведут работу по модернизации критериев диагностирования болезни Альцгеймера. В число наиболее важных достижений в области борьбы с болезнью Альцгеймера со времени публикации в 1984 году критериев диагностики входят: (1) обусловленные болезнью Альцгеймера изменения в мозге, а также сопутствующие когнитивные расстройства медленно развиваются в течение многих лет, при этом деменция является конечной стадией накапливающихся с годами патологических изменений; (2) гены, прогнозирующие ранее появление болезни Альцгеймера, указывают, что начальные события, в конечном итоге приводящие как к клиническим симптомам, так и к патологическим изменениям в мозге, начинаются с нарушения бета-амилоидного обмена; (3) аллель е4 гена АРОЕ общепризнан как основной генетический фактор риска позднего появления болезни Альцгеймера, которым считается ее появление в возрасте 65 лет или старше; и (4) разработаны и проверяются биомаркеры болезни Альцгеймера. Они подразделяются на несколько категорий: (а) биомаркеры бета-амилоидной патологии, включающие визуализацию амилоидов методом позитрон-эмиссионной томографии (PET) и уровни бета-амилоида в спинномозговой жидкости (CSF); (б) биомаркеры повреждения нейронов, включающие уровни тау-белка в CSF и фосфорилированного тау-белка; (в) биомаркеры дисфункции нейронов, включающие снижение поглощения фтордеоксиглюкозы (FDG) по данным PET; и (г) биомаркеры дегенерацию нейронов, включающие атрофию мозга по данным структурной магнитно-резонансной визуализации (MRI).
Созданы три рабочие группы NIA/Ассоциации по борьбе с болезнью Альцгеймера по числу известных в настоящее время стадий болезни Альцгеймера, которыми являются доклиническая стадия болезни Альцгеймера, стадия умеренных когнитивных нарушений (MCI) вследствие болезни Альцгеймера и стадия деменции вследствие болезни Альцгеймера. Группа, изучающая доклиническую стадию, разрабатывает программу исследований с целью определения способов оценки, способных помочь в прогнозировании риска развития болезни. Изучаются биомаркеры и другие средства клинической оценки для выявления раннего угасания когнитивной функции, определения наличия изменений в мозге вследствие болезни Альцгеймера у людей без выраженных симптомов и выявления тех, у кого может впоследствии развиться болезнь. Группа MCI уточняет критерии MCI, которые помогут диагностировать изменение когнитивной функции до наступления деменции и лучше дифференцировать MCI и болезнь Альцгеймера. Ведутся исследования, чтобы лучше понять происходящие изменения когнитивной функции, как они могут быть связаны с биомаркерами, и какие из этих методов лучше отображают вероятность угрозы развития деменции. Группа "деменции" пересматривает существующие критерии диагностирования болезни Альцгеймера с целью включения возможных биомаркеров и других средств оценки, которые могут помочь в диагностике. После подготовки предварительных отчетов всех трех рабочих групп они будут опубликованы с целью экспертной оценки, а затем подвергнуты системной проверке путем включения критериев в клинические испытания. Ухудшение памяти и когнитивных способностей в действительности является нормальным следствием старения у людей. С целью описания пожилых людей с объективно ухудшившейся памятью по сравнению с памятью в более молодом возрасте, но с нормальной когнитивной функцией для их возрастной категории рабочей группой Национального института психиатрии (NIMH) предложена новая категория "возрастного нарушения памяти" (Crook, Т.Н. и др. Developmental Neuropsychology, 1986, 2, 261-276). В рекомендациях группы даются конкретные практические определения и психометрические критерии для облегчения выявления людей, относящихся к такой категории. Другие термины для описания этого состояния включают "соответствующее возрасту ухудшение памяти" и "возрастные когнитивные расстройства". DSM-IV (1994) создана классификация для диагностирования возрастных когнитивных расстройств.
Содержащая WIP фракция неочищенного кофеина, имеющая сниженное содержание кофеина и обогащенная полифенолами, помимо концентрирования ингибиторов окисления усиливает нейропротекторную активность.
Авторами определили нейропротекторную активность содержащей WIP фракции неочищенного кофеина в отношении клеток первичных нейронов мышей. Согласно правилам FDA может требоваться проведение испытаний на животных с целью оценки степени эффективности неочищенного кофеина или его фракций при защите нейронов, например, у мышей, служащих моделью болезни Альцгеймера, таких как тау-модели, модели с нокаутированным АРР, модели с ингибированной секретазой, модели с нокаутированным ApoE и модели с нарушениями аксонального транспорта; или, например, у животных, служащих моделью болезни Паркинсона; или, например, у животных, служащих моделью болезни Хантингтона. Может потребоваться дополнительный анализ с целью определения нейропротекторной активности неочищенного кофеина или его фракций в отношении органотипических культур срезов мозга или препаратов нейронных тканевых культур. Данные говорят в пользу клинического испытания (на людях) с целью определения эффективности и оптимальной дозы этих экстрактов для нейропротекции и лечения деменции и возрастных когнитивных расстройств у пациентов, которые страдают деменцией и возрастными когнитивными расстройствами или которым угрожает развитие деменции и возрастных когнитивных расстройств.
Дозировки
50
50
50
50
Доза лекарственного средства, необходимая для достижения заданного эффекта у 50% в экспериментальной группе, называется 50%-ной эффективной дозой, сокращенно ED. В ходе доклинических исследований лекарственных средств определяют дозу половинной смертности экспериментальных животных, сокращенно обозначаемую как LD. Соотношение LD и ED означает терапевтический индекс, который указывает, насколько избирательным является желательное действие лекарственного средства по сравнению с его нежелательным действием. Предпочтительными являются лекарственные средства с высокими терапевтическими индексами.
50
50
Дозировка экстрактов осуществляется с учетом ED, LD, терапевтического индекса и следующих значений. Общее потребление пищевых фенольных соединений составляет 1 г/сутки. Максимальное содержание в плазме составляет от 0,1 до 10 мкмоль/л после потребления от 10 до 100 мг одного фенольного соединения.
Готовый пищевой продукт, готовая лекарственная форма, готовое косметическое средство, готовая пищевая добавка или готовый биопрепарат содержат около 0,05% по весу экстракта, около 0,1% по весу экстракта, около 1% по весу экстракта, около 5% по весу экстракта, около 10% по весу экстракта, около 15% по весу экстракта, около 20% по весу экстракта, около 25% по весу экстракта, около 30% по весу экстракта, около 35% по весу экстракта, около 40% по весу экстракта, около 45% по весу экстракта, около 50% по весу экстракта, около 55% по весу экстракта, около 60% по весу экстракта, около 65% по весу экстракта, около 70% по весу экстракта, около 75% по весу экстракта, около 80% по весу экстракта, около 85% по весу экстракта, около 90% по весу экстракта, около 95% по весу экстракта или около 99% по весу экстракта.
Производство пищевых продуктов
В разделе 201(s) закона FD&C пищевая добавка определяется как любое вещество, в результате применения которого по назначению оно прямо или косвенно становится, или имеются разумные основания полагать, что оно прямо или косвенно становится компонентом какого-либо пищевого продукта, или иначе влияет на характеристики пищевого продукта (включая любое вещество, предназначенное для применения при производстве, изготовлении, расфасовке, обработке, приготовлении, обработке, упаковывании, транспортировке или хранении пищевого продукта; и включая любой источник излучения для любого такого применения); если такое вещество не признано безвредным (GRAS) или одобрено до 1958 года, или по иным причинам исключено из категории пищевых добавок.
GRAS является сокращенным обозначением "признано безвредным". В соответствии с разделами 201(s) и 409 закона FD&C любое вещество, намеренно добавляемое в пищу, является пищевой добавкой, которая подлежит предпродажному анализу и одобрению со стороны FDA, если только квалифицированными специалистами не признано, что вещество надлежащим образом зарекомендовало себя безвредным в условиях его применения по назначению, или вещество по иным причинам исключено из категории пищевых добавок.
Производство косметических средств
В соответствии с законом FD&C ингредиенты косметического средства обозначаются наименованиями, установленными комиссаром в целях маркировки ингредиентов косметического средства, или при отсутствии наименования, установленного комиссаром, наименованиями, принятыми в публикациях и приложениях к следующим руководствам: (а) справочник ингредиентов косметических средств CTFA (Ассоциации по парфюмерно-косметическим товарам и душистым веществам); (б) Фармакопея США; (в) Фармакологический Справочник; (г) Свод правил о химическом составе пищевых продуктов; и (д) Справочник наименований лекарств, официально присвоенных соответствующей организацией, и наименований лекарственных средств Фармакопеи США. Если наименование ингредиента не указано ни в одном из них, используется наименование, общепризнанное потребителями, или химическое или техническое наименование или описание. Производство пищевых добавок
Ингредиенты пищевых добавок обычно включают ингредиенты других пищевых продуктов ингредиенты (например, воду или сахар) и технические добавки или вещества для улучшения технологических свойств (например, желатин, крахмал, красители, стабилизаторы, консерванты и вкусоароматические добавки).
Пример 1
Химикаты
Если не указано иное, все реагенты были приобретены у компании Sigma-Aldrich (Сент-Луис, штат Миссури, США). Вода для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) была приобретена у компании EMD (Гибб-Таун, штат Нью-Джерси, США), а 2,2'-азо-бис (2-амидинопропан) дихлоргидрат (АВАР) был приобретен у компании Wako Chemicals USA (Ричмонд, штат Виргиния, США). Произвольно метилированный β-циклодекстрин (RMCD; марки Trappsol, фармацевтическая категория) был получен от компании Cyclodextrin Technologies Development (Хай-Спрингс, штат Флорида, США). Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), среда Е Вильямса (WME) и сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS) были приобретены в компании Gibco Life Technologies (Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк, США). Остальная телячья сыворотка (FBS) была получена от компании Atlanta Biologicals (Лоренсвиль, штат Джорджия, США). Арахидоновая кислота и СОХ-2 были приобретены в компании Cayman Chemical (Анн-Арбор, штат Мичиган, США). TNF-α был приобретен у компании Biomyx Technology (Сан-Диего, штат Калифорния, США). Минимальная питательная среда (11090081) и основная нейронная питательная среда (21103049) были приобретены в компании Invitrogen (Карлсбад, штат Калифорния, США). Неочищенный кофеин был получен от компании Maximus Coffee Group (Хьюстон, штат Техас, США). Система биодатчиков кислорода (OBS) в виде 96-луночного микропланшета, покрытого особым красителем на основе рутения, был приобретен у компании BD Biosciences Discovery Labware (Бедфорд, штат Массачусетс, США).
Неочищенный кофеин
2
Неочищенный кофеин был получен в качестве побочного продукта процесса удаления кофеина с помощью двуокиси углерода в сверхкритическом состоянии (scCO). Вымачивали сырые зерна кофе в воде до достижения 50%-го содержания влаги. Удалили кофеин в экстрактор с помощью жидкой двуокиси водорода при высокой температуре (90-100°C) и высоком давлении (300 атмосфер). Жидкую двуокись водорода перемещали по замкнутой траектории между экстрактором и скруббером, и с помощью воды удаляли из нее кофеин. Затем путем обратного осмоса концентрировали полученный водный раствор с высоким содержанием кофеина и подвергли его вакуумной сушке. Анализ примерной композиции неочищенного кофеина был проведен компанией Silliker, Inc. (Саут-Холланд штат Иллинойс, США).
Общее содержание фенольных соединений Определили общее содержание полифенолов в неочищенном кофеине методом Синглтона и Росси (Singleton, V.L. и Rossi, J.A., Jr., Am. J. Enol. Vitic. 1965, 16, 144-158). Смешали 1 мл стандартной хлорогеновой кислоты или раствора неочищенного кофеина с 15 мл воды и 1,0 мл реактива Фолина-Чокальтеу, а затем в течение 10 минут выдержали при комнатной температуре. Добавили 20% карбоната натрия (3,0 мл), в течение 20 минут выдержали при температуре 40°C, и с помощью спектрофотометра Agilent 8453 (Вальдбро, Германия) в УФ- и видимой области измерили спектральную поглощательную способность на волне длиной 755 нм. Определили общее содержание полифенолов в миллиграммах СЕ/грамм неочищенного кофеина (СЕ/грамм).
Способность поглощать радикалы кислорода
гидро
гидро
липо
Для определения значений противоокислительной способности гидрофильной фракции (ORAC) в течение 1 часа при комнатной температуре экстрагировали 5 г неочищенного кофеина с помощью 20 мл ацетона/воды (50:50 по объему) в орбитальном шейкере. Смеси центрифугировали в центрифуге Rotanta 460R (GMI, Рамси, штат Миннесота, США) с ускорением 1972xg. Определили значения ORAC супернатантов способом, заимствованным у Ou, В. и др., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2001, 49, 4619-4626, с использованием сканирующего флуоресцентного спектрофотометра FL600 для чтения планшетов (Bio-Tek Instruments, Inc., Винооски, штат Вермонт, США) под управлением программы Kc43.0. Установили длину волну возбуждения 485 (±20) нм и волны излучения 530 (±25) нм. Для определения противоокислительных значений липофильной фракции (ORAC) дважды экстрагировали 5 г неочищенного кофеина с помощью 10 мл гексан/дихлорметана (50:50 по объему). Определили значения ORAC комбинированной органической фазы описанным выше способом (Wu, X. и др.. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2004, 52, 4026-4037; Huang, D. и др., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2002, 50, 1815-1821).
Культура первичных кортикальных нейронов
2
Получили культуры первичных кортикальных нейронов новорожденных мышей линии C57BL/6. Извлекли корковое вещество, поместили в сбалансированный солевой раствор Хэнкса и в течение 30 минут диссоциировали при температуре 37°C путем инкубирования в папаине. Высеяли диссоциированные клетки на покрытые поли-L-лизином пластмассовые планшеты (Корнинг, штат Нью-Йорк, США) в минимальной питательной среде и в течение 4 часов инкубировали при температуре 37°C в 5% CO. Затем заменили среду основной нейронной питательной средой, в которую добавили B-27 и L-глутамин. Чтобы уменьшить пролиферацию глиальных клеток, в среду также добавили 1 мкмоль 5-фтор-2'-дезоксиуридина (FdU). Через 4 дня заменили среду основной нейронной питательной средой без добавления FdU, и выращивали клетки еще в течение 4 дней. Все эксперименты проводились с клетками, инкубированными in vitro в течение 8 дней.
Согласно иммуноцитохимическим данным более 90% культивированных клеток представляли собой нейроны.
Выживание клеток
5
2
2
2
570 обработанных
570 необработанных
Определили количество выживших клеток путем анализа с использованием 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ) для измерения преобразования митохондриальной сукцинатдегидрогеназы МТТ в пурпурный формазан (Mosmann, Т., Journal of Immunological Methods 1983, 65, 55-63; Cheng, I.H. и др., Nature Medicine 2004, 10, 1190-1192). Высеяли клетки на 96-луночные планшеты (10 клеток на лунку) и выращивали в течение 24 часов до экспериментов. В течение 2 часов предварительно обработали клетки 0, 250, 500 или 1000 мкг/мл неочищенного или чистого кофеина. Затем удалили среду, и промыли клетки свежей средой. После этого в течение 30 мин обработали клетки перекисью водорода (HO, 0-1000 мкмоль) при температуре 37°C с использованием 5%-ной CO. Затем в течение 4 часов инкубировали клетки при температуре 37°C в среде, с содержащей МТТ (0,5 мг/мл; Genemark, Тайвань). После удаления среды добавили в каждую лунку 100 мкл лизирующего буфера, содержащего 10%-ный SDS и 20 ммоль HCl, чтобы растворить кристаллы формазана, и определили спектральную поглощательную способность (на волне 570 нм) каждой лунки с использованием сканирующего флуоресцентного спектрофотометра FL600 для чтения планшетов (Bio-Tek Instruments, Inc., Винооски, штат Вермонт, США) под управлением программы KC43.0. Вычислили процент выживших клеток согласно формуле: (OD/OD)×100%.
Поглощение глюкозы
2
Определили действие in vitro неочищенного кофеина на поглощение глюкозы адипоцитами и клетками скелетных мышц человека (Zen-Bio, Research Triangle Park, NC). Дифференцировали первичные подкожные адипоциты человека и первичные миобласты человека на 96-луночных микропланшетах. Полученные адипоциты (через 2 недели после дифференциации) или клетки скелетных мышц человека (через 10 дней после дифференциации) обработали неочищенным кофеином (0,001-0,5 мг/мл, конечная концентрация) в присутствии Н-2-дезоксиглюкозы; клетки, обработанные инсулином (100 нмоль) использовали в качестве позитивного контроля, а необработанные клетки - в качестве негативного контроля. Испытали все образцы, включая позитивный и негативный контроль, в трех экземплярах. После 2-часового культивирования при температуре 37°C с использованием 5%-й CO промыли клетки PBS и подвергли лизису. Смешали клеточный лизат со сцинтилляционной жидкостью, и определили радиоактивность каждой лунки в пересчете на число отсчетов в минуту (СРМ).
Ингибирование СОХ-2
50
Определили поглощение кислорода реакционной камере Oxytherm (Hansatech Instrumental, Норфолк, Англия) при температуре 37°C. В течение 1 минуты культивировали реакционная смесь, состоящую из 0,5 мл трис-буфера (0,1 моль, pH 8,0), 5 мкл гема [100 мкмоль в диметилсульфоксиде (DMSO)] и 10 мкл СОХ-2. Добавили 5 мкл каждого образца (в DMSO или этаноле), и дополнительно культивировали смесь в течение 1 минуты. Осуществили анализ путем добавления 5 мкл арахидоновой кислоты, и контролировали содержание кислорода. На основании кинетической кривой определили начальную скорость поглощения кислорода. Определи ингибирование СОХ-2 в пересчете на концентрацию ингибитора, при которой начальная скорость поглощения кислорода снизилась на 50% (IC).
Синергетический эффект биологически активных соединений в сочетании с α-токоферолом
В 15-мл пробирке встряхивали метиллинолеат (1,2 г), Tween-20 (2,9 г), п-бутанол (1,5 г) и буфер на основе фосфата калия (4,4 г) до получения прозрачного раствора. Подготовили микропланшет на основе OBS с лунками со стандартным раствором Trolox в двух экземплярах (20 мкл; 500, 250, 125, 62,5 или 31,25 мкмоль) и лунками с образцами в трех экземплярах, разбавленными в фосфатном буфере (20 мкл). Расположенные по периметру лунки не использовались для кинетических исследований во избежание потенциальных краевых эффектов. Затем добавили микроэмульсию метиллинолеата (200 мкл) в качестве окислительного субстрата. Инкубировали планшет в течение 10 минут при температуре 37°C, а затем добавили в каждую лунку 20 мкл 2,2'-азо-бис(2-амидинопропан) дихлоргидрата (ААРН, 0,20 г/мл в фосфатном буфере); окончательный объем содержимого каждой лунки составлял 240 мкл. Для нормализации показаний флуоресценции использовали контрольную лунку с 200 мкл микроэмульсии и 40 мкл фосфатного буфера. В течение 2 часов контролировали кинетику реакции при температуре 37°C, снимая показания каждые 2 минуты с помощью флуоресцентного спектрофотометра Synergy HT для чтения планшетов (Biotek Instruments Inc.). Спектрофотометр был оснащен фильтром с частотой возбуждения 485 нм, фильтром с частотой излучения 590 нм и системой биологических датчиков кислорода, при этом планшет с небольшой интенсивностью встряхивали в течение 20 секунд перед каждым снятием показаний, чтобы обеспечить достаточное перемешивание. После нормализации преобразовали данные флуоресценции в содержание кислорода в каждой точке реакции. Определили значения ORAC, как описано ранее (Sim, W.L.S. и др., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2009, 57, 3409-3414). Представили синергетический эффект образцов в виде относительных значений ORA, вычисленных согласно следующей формуле: 100% × [1+(ORAC смеси - сумма ORAC каждого компонента/ORAC смеси] на основе предыдущего метода (Sim, W.L.S. и др., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2009, 57, 3409-3414).
Ориентированное на активность фракционирование и идентификация структуры соединений неочищенного кофеина путем жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ЖК-МС/МС)
Неочищенный кофеин, полученный путем удаления с помощью двуокиси углерода в сверхкритическом состоянии, подвергли дальнейшей обработке с целью снижения содержания кофеина и обогащения полифенолами. Поскольку неочищенный кофеин был подвергнут вакуумной сушке, его ресуспендировали в воде. В течение 15 минут перемешивали 1 г неочищенного кофеина с 70 мл воды при комнатной температуре с целью изготовления суспензии. Собрали нерастворимые в воде частицы (WIF) этой суспензии путем фильтрации через 0,45-мкм полиамидный фильтр ZapCap-CR (Whatman Inc., Пискатауэй, штат Нью-Джерси, США) и подвергли вакуумной сушке при комнатной температуре. Общий выход по массе составил 1,1%. Проанализировали примерную композицию, ORAC и общее содержание фенолов в высушенной фракции WIP, как описано ранее.
Затем осуществили фракционирование 30 мг WIP в испарительной хроматографической системе Yamazen AI-580 (Сан-Бруно, штат Калифорния, США), состоящей из градиентного насоса, ультрафиолетового детектора, установленного на волну 254 нм, коллектора фракций (FR340) и колонны 16 мм × 60 мм Luknova С 18 (Мансфилд, штат Массачусетс, США). Образец элюировали из колонны помощью воды и метанола; соотношение воды и метанола в смеси изменилось с 9:1 на 15:85 в течение 17 минут при скорости потока 10 мл/мин. Собрали 17 фракций (по 10 мл), подвергли вакуумной сушке, и определили значения ORAC.
Фракции с высокими значениями ORAC дополнительно проанализировали путем ЖК-МС в системе ВЭЖХ Shimadzu (насос: LC-20AT; автоматический пробоотборник: SIL-НТС; ультрафиолетовый детектор: SPD-20A; Коламбия, штат Мэриленд, США), оснащенной колонной MAC-MOD HydroBond™ PS-C18 (50×2,1 мм, 3 мкм; MAC-MOD Analytical, Чаддс-Форд, штат Пенсильвания, США). Подвижная фаза А состояла из воды и 0,4%-ой муравьиной кислоты, а подвижная фаза В представляла собой ацетонитрил. Отделили образцы (10 мкл) путем ВЭЖХ при комнатной температуре со скоростью потока 0,6 мл/мин. Процентное содержание подвижной фазы В выросло с 0% до 70% в течение первых 3 минут, достигло 95% в течение следующих 0,5 минут, 98% в течение следующих 0,5 минут, а затем поддерживалось на уровне 98% в течение 1,5 минут. Затем процентное содержание подвижной фазы В снизилось до 0% в течение 0,1 минуты и поддерживалось на уровне 0% в течение 5 минут с целью повторного приведения колонны в равновесие.
Детектирование осуществлялось с помощью детектора Q-trap AB/MDS SCEEX 4000 (Фостер-Сити, штат Калифорния, США) с использованием источника ионизации ESI с отрицательным дихроизмом при напряжении ионораспыления 4500 в и температуре 550°C. Для химического обнаружения использовался мониторинг множественных реакций (МММ). Масс-спектрометрия позволяет дифференцировать химические вещества с одинаковой молекулярной массой путем расщепления каждой молекулярной структуры на уникальную комбинацию фрагментов (химический фингерпринт). Методом МММ могут быть идентифицированы интересующие химические структуры путем одновременного обнаружения молекулярных ионов и фрагментарных ионов.
Статистический анализ
2
Данные были проанализированы методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным сравнительным тестом Таки с использованием системы анализа данных PASW Statistics 18 (Чикаго, штат Иллинойс, США). Результаты представлены в виде средних значений±стандартное отклонение (SD). Р<0,05 считалось статистически значимым. Результаты тестирования примерной композиции неочищенного кофеина В процессе производства кофе биологически активные соединения оказываются в неочищенном кофеине (фиг.6). Из кофе удалили кофеин путем экстрагирования с помощью двуокиси углерода в сверхкритическом состоянии (scCO) (фиг.7).
2
Неочищенный кофеин, полученный путем удаления с помощью scCO, был подвергнут оценке.
В Таблице 1 представлена примерная композиция неочищенного кофеина. Основными компонентами являются кофеин (95,95%), влага (1,10%) и жир (1,04%); содержание золы, волокна, белка и сахара является пренебрежимо малым.
Было определено содержание фенольных соединений в неочищенном кофеине методом Фолина-Чокальтеу и установлено, что общее содержание фенольных соединений составляет 10 мг СЕ/грамм (Таблица 2) или приблизительно 1% по весу неочищенного кофеина.
Результаты оценки противоокислительной активности неочищенного кофеина
гидро
липо
гидро
липо
Была оценена противоокислительная активность гидрофильной и липофильной фракций неочищенного кофеина. Было обнаружено, что значение ORAC составляет 145 мкмоль ТЕ/грамм, значение ORAC составляет 66 мкмоль ТЕ/грамм, тогда как чистый кофеин имеет крайне низкие значения ORAC (6 мкмоль ТЕ/грамм) и ORAC (0 мкмоль ТЕ/грамм) (Таблица 2).
2
2
2
2
2
2
2
2
Был оценен биологический коррелят противоокислительной активности in vitro неочищенного кофеина. Клетки первичных корковых нейронов предварительно обработали неочищенным кофеином до вызванного HO окислительного стресса. На фиг.8А показано, что HO в зависимости от дозы снижает выживание клеток. Чистый кофеин не оказывает токсического действия на клетки первичных нейронов, но и не защищает их от вызванного HO некроза. Аналогичным образом, на фиг.8Б показано, что неочищенный кофеин не оказывает токсического действия на клетки первичных нейронов, но и не защищает их от вызванного HO некроза даже, несмотря на значительно более высокие значения ORAC у неочищенного кофеина, чем у чистого кофеина (Таблица 2).
Результаты оценки поглощения глюкозы
Было определено антигипергликемическое действие неочищенного кофеина на поглощение глюкозы клетками скелетных мышц человека и адипоцитами с использованием инсулина в качестве позитивного контроля. Инсулин в количестве 100 нмоль вызывает увеличение поглощения глюкозы клетками скелетных мышц человека в 2,06 раза, а, хотя и менее эффективный, чем инсулин неочищенный кофеин в количестве 0,01 мг/мл увеличивает поглощение глюкозы в 1,45 раза (фиг.9). В отличие от этого, чистый кофеин в количестве 0,01 мг/мл не имеет значимого эффекта. Как ни удивительно, неочищенный кофеин более эффективно стимулирует поглощение глюкозы адипоцитами человека, чем инсулин: неочищенный кофеин в количестве 0,01 мг/мл вызывает увеличение поглощения глюкозы в 2,20 раза, тогда как инсулин в количестве 100 нмоль вызывает увеличение в 1,6 раза. Чистый кофеин (0,01 мг/мл) не оказывает значимого действия на поглощение глюкозы. Данные были проанализированы методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Таки с целью множественных сравнений. Результаты представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение (SD). *Р<0,05 - по сравнению с необработанными клетками скелетных мышц человека; **Р<0,05 - по сравнению с необработанными адипоцитами человека. Эти данные доказывают, что неочищенный кофеин стимулирует поглощение глюкозы жировыми и мышечными клетками человека.
Результаты оценки ингибирования СОХ-2
50
50
50
Была оценена противовоспалительная активность неочищенного кофеина путем определения его действия на воспалительный фермент СОХ-2 с использованием аспирина в качестве позитивного контроля. Неочищенный кофеин ингибирует активность СОХ-2; значение IC составляет 20 мкг/мл, то есть в 9,5 раза меньше, чем у аспирина (IC, 190 мкг/мл) (фиг.10), что говорит о том, что неочищенный кофеин является более мощным ингибитором СОХ-2, чем аспирин. В отличие от этого, активность обычного кофе (IC, 2010 мкг/мл) является примерно в 10 меньшей, чем у аспирина. Чистый кофеин не ингибирует активность СОХ-2. Данные были проанализированы методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Таки с целью множественных сравнений. Результаты представлены в виде средних значений±стандартное отклонение (SD). *Р<0,05 - по сравнению с аспирином. Эти данные доказывают, что неочищенный кофеин ингибирует воспалительный фермент СОХ-2.
Результаты оценки не содержащих кофеин биоактивных веществ в неочищенном кофеине
При смешивании неочищенного кофеина (1 г) и воды (70 мл) образуется водная суспензия мелких красно-коричневых нерастворимых в воде частиц (WIP), которые могут быть отделены путем фильтрации (фиг.11). Во фракции WIP содержится всего 1,6% кофеина или примерно в 60 меньше, чем в неочищенном кофеине (Таблица 2).
гидро
липо
2
2
2
2
Методом Фолина-Чокальтеу было определено содержание фенольных соединений во фракции WIP и обнаружено, что общее содержание фенольных соединений составляет 313 мг СЕ/грамм (Таблица 2) или приблизительно 30% по весу фракции WIP. Было определено, что значения ORAC составляет 1321 мкмоль ТЕ/грамм, а значение и ORAC составляет 332 мкмоль ТЕ/грамм, то есть примерно в 9 и 5 раз больше, соответственно, чем у неочищенного кофеина (Таблица 2). Кроме того, во фракции WIP содержится приблизительно 21% жира, что является основной причиной того, что она находится в воде в виде суспензии, а не растворяется в ней. Важно, что была определена противоокислительная активность WIP в отношении клеток первичных нейронов мышей. Было обнаружено, что фракция WIP является нетоксичной и в зависимости от дозы значительно уменьшает некроз клеток в случае вызванного HO окислительного стресса (Фиг.12). Фракция WIP (1000 мкг/мл) примерно в 3,5 раза увеличивает выживание клеток первичных нейронов мышей, обработанных HO (250-1000 мкм). Эти данные доказывают, что при отделении фракции WIP снижается содержание кофеина и увеличивается содержание полифенолов, а также повышается концентрация ингибиторов окисления и усиливается нейропротекторная активность.
Результаты оценки ориентированного на активность фракционирования и идентификации биологически активных соединений
гидро
гидро
Было осуществлено ориентированное на противоокислительную активность фракционирование и анализ фракции WIP методом ЖК-МС.WIP разделили на 17 фракций путем испарительной хроматографии в колонне С-18, и определили значение ORAC каждой фракции (Таблица 3). Фракции 4 и 5, имевшие наиболее высокую противоокислительную способность 26,4% и 41,0%, соответственно, общего значения ORAC (Таблица 3) были подвергнуты анализу методом ЖК-МС.
В обеих фракциях идентифицировали семь химических веществ (Таблица 4): кофейную кислоту, кумаровую кислоту, ванилиновую кислоту, кверцетин, катехин, сложный глюкозный эфир абсцизовой кислоты и треонин (фиг.13).
Результаты оценки синергетического эффекта
Был определен синергетический эффект неочищенного кофеина и WIP в сочетании с другими биологическими ингибиторами окисления. С использованием анализа ORAC, адаптированного к микроэмульсионной системе на основе линолеатов (Sim, W.L.S.; и др., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2009, 57, 3409-3414), была определена противоокислительная активность α-токоферола (одной из форм витамина Е) в сочетании с неочищенным кофеином, WIP, аскорбиновой кислотой, катехином, хлорогеновой кислотой, WTP + катехин, или WIP + хлорогеновая кислота (Таблица 5). Данные были представлены в виде относительных значений ORAC: 100% значение ORAC означает, что противоокислительная активность смеси равна сумме противоокислительных активностей каждого компонента (аддитивный эффект), а значение ORAC более 100%, означает, что противоокислительная активность смеси превышает сумму противоокислительных активностей каждого компонента (синергетический эффект). Было обнаружено, что неочищенный кофеин и аскорбиновая кислота в сочетании с α-токоферолом обладают аддитивным противоокислительным действием (Таблица 5). В отличие от этого, WIP, катехин и хлорогеновая кислота в сочетании с α-токоферолом обладают синергетическим эффектом. Эти данные доказывают, что WIP демонстрирует синергетический эффект при использовании в сочетании с α-токоферолом.
Приведенные примеры и рассмотренные варианты осуществления являются наглядными и не считаться ограничивающими объем изобретения, охарактеризованный настоящим описанием и прилагаемой формулой изобретения. Все документы, упоминаемые в описании, в порядке ссылки включены в настоящую заявку.
Таблица 1
Примерная композиция неочищенного кофеина
Компонент
%
Кофеин
95,95
Влага
1,10
Жир
1,04
Зола
0,1
Пищевая клетчатка, всего
0,47
Растворимая пищевая клетчатка
<0,47
Нерастворимая пищевая клетчатка
<0,47
Белок
0,01
Фруктоза
0,10
Глюкоза
0,10
Сахароза
0,10
Лактоза
0,10
Мальтоза
0,10
Таблица 2
Сравнение кофеина, неочищенного кофеина нерастворимых в воде частиц (WIP) неочищенного кофеина.
Кофеин
Неочищенный кофеин
WIP
Кофеин (%)
100,0
95,6
1,6
Жир (%)
0,00
1,04
1,60
ORAC<sub>гидро</sub> (мкмоль ТЕ/грамм)
6
145
1321
ORAC<sub>липо</sub> (мкмоль ТЕ/грамм)
0
66
332
Фенольные соединения, всего (мг СЕ/грамм)
0
10
313
Фенольные соединения, всего (%)
0
1
31,3
Соотношение фенольных соединений (%) и кофеина (%)
0
<1
20
ТЕ - тролокс-эквивалент; СЕ - эквивалент хлорогеновой кислоты
Таблица 3
Противоокислительная активность фракций неочищенного кофеина, отделенных методом испарительной хроматографии
Фракция, №
ORAC<sub>гидро</sub> (мкмоль ТЕ/грамм)
Вес (мг)
ТЕ (мкмоль)
ТЕ(%)
1
НО
НО
НО
НО
2
НО
НО
НО
НО
3
1975
0,3
0,59
2,1
4
847
8,6
7,29
26,4
5
2097
5,4
11,32
41
6
НО
НО
НО
НО
7
НО
НО
НО
НО
8
НО
НО
НО
НО
9
782
0,4
0,31
1,1
10
1350
2,1
2,84
10,3
11
827
2,6
2,15
7,8
12
1237
0,8
0,99
3,6
13
1290
0,5
0,65
2,4
14
554
1,0
0,55
2,0
15
651
0,6
0,39
1,4
16
1818
0,2
0,36
1,3
17
989
0,2
0,20
0,7
ТЕ - тролокс-эквивалент; ORAC - способность поглощать радикалы кислорода; НО - не обнаружено
Таблица 4
Идентификация методом масс-спектроскопии ингибиторов окисления во фракциях 4 и 5
Название
Структура
Молекулярная масса
Молекулярные ионы ([М-Н]<sup>-</sup>)
Фрагментация
Кофейная кислота
<img file="00000001.tif" he="15" wi="38" img-content="undefined" img-format="tif" />
180,16
179
[M-H-CO<sub>2</sub>]<sup>-</sup>=135
Кумаровая кислота
<img file="00000002.tif" he="19" wi="38" img-content="undefined" img-format="tif" />
164,16
163
[M-H-CO<sub>2</sub>]<sup>-</sup>=119
Ванилиновая кислота
<img file="00000003.tif" he="26" wi="29" img-content="undefined" img-format="tif" />
168,15
167
[M-H-CH<sub>3</sub>]<sup>-</sup>=152
Кверцетин
<img file="00000004.tif" he="24" wi="37" img-content="undefined" img-format="tif" />
302
301
[Продукт циклизации (179)-CO]<sup>-</sup>=151
Катехин
<img file="00000005.tif" he="19" wi="36" img-content="undefined" img-format="tif" />
290
289
[M-H-C<sub>9</sub>H<sub>8</sub>O<sub>4</sub>]<sup>-</sup>=109
Сложный глюкозный эфир абсцизовой кислоты
<img file="00000006.tif" he="18" wi="39" img-content="undefined" img-format="tif" />
428
427
[M-H-C<sub>6</sub>H<sub>12</sub>O<sub>6</sub>]<sup>-</sup>=247
Треонин
<img file="00000007.tif" he="19" wi="19" img-content="undefined" img-format="tif" />
121
121
[M-H-H<sub>2</sub>O]<sup>-</sup>=102
Таблица 5
Противоокислительная активность комбинированных ингибиторов окисления в пересчете на относительную способность поглощать радикалы кислорода
Описание
Относительная ORAC (%)
Эффект
Неочищенный кофеин + α-токоферол
100
Аддитивный
WIP + α-токоферол
126
Синергетический
Аскорбиновая кислота + α-токоферол
100
Аддитивный
Катехин + α-токоферол
166
Синергетический
Хлорогеновая кислота + α-токоферол
168
Синергетический
WIP + катехин + α-токоферол
100
Аддитивный
WIP + хлорогеновая кислота + α-токоферол
100
Аддитивный
WIP + катехин
100
Аддитивный
WIP + хлорогеновая кислота
100
Аддитивный
ORAC - способность поглощать радикалы кислорода; WIP - нерастворимые в воде частицы.