Универсальное средство для гипотермической консервации трансплантата роговицы
UNIVERSAL REMEDY FOR HYPOTHERMIC PRESERVATION OF CORNEA GRAFT

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для гипотермической консервации трансплантата роговицы для сквозной и послойной кератопластики с целью повышения жизнеспособности клеток роговицы и пролонгирования сроков ее хранения.
Ближайшим аналогом является средство для консервации донорских роговиц глаза (Патент РФ №2676311), содержащее: среду 199, среду Хэма F-10, хондроитин-сульфат А, декстран-40, гентамицин-сульфат, амфотерицин В и среду Дюльбекко-Игла, дополнительно содержащее препарат Фосфоглив (Рег.№Р N002528/01) при следующем соотношение компонентов, мас. %: Среда 199 25,0, Среда Хэма F-10 25,0, Хондроитин-сульфат А 0,5, Декстран-40 6,0-7,0, Гентамицин-сульфат 0,00014, Амфотерицин В 0,00015, Фосфоглив 0,025-0,05, Среда Дюльбекко-Игла - остальное.
Недостатком этой среды является то, что в условиях холодового хранения (при температуре ниже 8-12°С) происходит β-окисление полиненасыщенных жирных кислот, в том числе фосфолипидов, входящих в состав использованного препарата Фосфоглив, поэтому фосфолипиды не способны в полной мере осуществлять фармакологическую защиту клеточных и внутриклеточных мембран от повреждения и содействовать восстановлению поврежденных структур.
Задачей изобретения является создание универсального многокомпонентного средства для восстановления жизнеспособности клеток сквозного и послойного трансплантатов донорской роговицы, пролонгирования сроков консервации.
Техническим результатом является осуществление фармакологической защиты клеточных мембран кератоцитов и эндотелия роговицы в процессе холодового хранения, содействие восстановлению поврежденных структур, защита трансплантата роговицы от гипоксического и гипотермического стрессов, и как следствие, предупреждение развития энергодефицитного состояния в результате снижения внутриклеточной концентрации аденозинтрифосфата, а также пролонгирование сроков консервации без существенного снижения плотности эндотелиальных клеток.
Технический результат достигается тем, что средство для гипотермической консервации трансплантата роговицы, включающее хондроитин-сульфат А и декстран-40, согласно изобретению, дополнительно содержит среду 199 с солями Хэнкса, среду F-12 с Hepes, среду DMEM с Hepes, L-глутамин, антибиотик-антимикотик, триметазидина дигидрохлорид при следующем соотношении компонентов, масс%:
Среда 199 с солями Хэнкса
41,15
Среда F-12 с Hepes
25,00
Среда DMEM с Hepes
25,00
L-глутамин
0,145
Хондроидина сульфат А
1,00
Декстран-40
5,70
Антибиотик-антимикотик
(Пенициллин-
Стрептомицин-
Амфотерицин В)
2,00
Триметазидина дигидрохлорид
0,005
2
4
2
4
2
4
2
4
2
3
2
2
2
2
При этом среда 199 с солями Хэнкса имеет следующий состав, мг/л: аскорбиновая кислота 0,05, D-кальций пантотенат 0,01, холина хлорид 0,5, i-инозитол 0,05, никотиновая кислота 0,025, ниацинамид 0,025, пара-аминобензоевая кислота 0,05, пиридоксаль HCl 0,025, пиридоксин HCl 0,025, рибофлавин 0,01, тиамин HCl 0,01, менадион натрия бисульфит 0,016, кальциферол 0,1, ретинол ацетат 0,14, витамин Е (альфа-токоферол фосф.) 0,01, D-биотин 0,01, фолиевая кислота 0,01, натрия хлорид (NaCl) 76000,0, калия фосфат одноосновный (KHPO) 60,0, натрия фосфат двухосновный (NaHPO) 47,69, кальция хлорид (CaCl) 140,0, железный купорос (FeSO×7HO) 0,495, калия хлорид (KCl) 400,0, гептагидрат сульфата магния (MgSO×7HO) 122,4, натрия бикарбонат (NaHCO) 1000,0, аденин сульфат 10,0, ксантин 0,31, гипоксантин 0,31, тимин 0,3, гуанин HCl 0,3, урацил 0,3, D-глюкоза 1000,0, аденозин 5'-трифосфат 1,0, аденозин-5'-фосфат 0,2, 2-дезокси-d-рибоза 0,5, глутатион 0,05, рибоза 0,5, феноловый красный 20,0, натрия ацетат х 3НO 50,0, холестерол 0,2, твин 80 20,0, L-аланин, 25,0, L-аргинин HCl 70,0, L-аспаргиновая кислота 30,0, L-цистеин xHCl xHO 0,1, L-глутаминовая кислота 75,0, глицин 50,0, L-гистидин xHCl xHO 22,0, L-гидроксипролин 10,0, L-изолейцин 40,0, L-лейцин 60,0, L-лизин HCl 70,0, L-метионин 15,0, L-фенилаланин 25,0, L-пролин 40,0, L-серин 25,0, L-треонин 30,0, L-триптофан 10,0, L-валин 25,0, L-цистин 2HCl 26,0, L-тирозин 2NA 2HO 58,0, L-глютамин 100,0.
2
4
2
4
2
2
3
4
2
4
2
2
2
2
2
Среда F-12 с HEPES имеет следующий состав, мг/л: D-кальций пантотенат 0,5, холина хлорид 14,0, i-инозитол 18,0, ниацинамид 0,04, пиридоксин HCl 0,06, рибофлавин 0,04, тиамин HCl 0,3, D-биотин 0,007, фолиевая кислота 1,3, витамин В12 1,4, натрия хлорид (NaCl) 7068,0, натрия фосфат двухосновный (NaHPO) 142,0, кальция хлорид (CaCl) 33,2, железный купорос (FeSO×7HO) 0,83, калия хлорид (KCl) 223,8, магния хлорид (MgCl) 57,22, натрия бикарбонат (NaHCO) 1176,0, медный купорос (CuSO×5HO) 0,0025, цинковый купорос (ZnSO×7HO) 0,86, гипоксантин 4,1, D-глюкоза 1802,0, феноловый красный 1,2, липоевая кислота 0,21, линолевая кислота 0,08, тимидин 0,7, пируват натрия 110,0, путресцин 2HCl 0,161, HEPES 5958,0, L-аланин 8,9, L-аргинин HCl 211,0, L-аспаргиновая кислота 13,0, L-цистеин xHCl×HO 35,0, L-глутаминовая кислота 14,7, глицин 7,5, L-гистидин xHCl×HO 21,0, L-изолейцин 4,0, L-лейцин 13,0, L-лизин HCl 36,5, L-метионин 4,5, L-фенилаланин 5,0, L-пролин 34,5, L-серин 10,0, L-треонин 12,0, L-триптофан 2,0, L-валин 11,7, L-тирозин 2NA 2HO 7,8, L-аспарагин HO 15,0.
2
4
2
4
2
3
2
4
2
2
2
Среда DMEM с HEPES имеет следующий состав, мг/л: D-кальций пантотенат 4,0, холина хлорид 4,0, i-инозитол 7,2, ниацинамид 4,0, пиридоксин HCl 4,0, рибофлавин 0,4, тиамин HCl 4,0, фолиевая кислота 4,0, натрия хлорид (NaCl) 4750,0, кальция хлорид (CaCl) 200,0, железный купорос (FeSO×7HO) 0,07, калия хлорид (KCl) 400,0, гептагидрат сульфата магния (MgSO×7HO) 122,4, натрия бикарбонат (NaHCO) 3700,0, дигидрофосфат натрия (NaHPO) 108,7, D-глюкоза 1000,0, феноловый красный 15,0, пируват натрия 110,0, HEPES 5958,0, L-аргинин HCl 84,0, глицин 30,0, L-гистидин xHCl×HO 42,0, L-изолейцин 105,0, L-лейцин 105,0, L-лизин HCl 146,0, L-метионин 30,0, L-фенилаланин 66,0, L-серин 42,0, L-треонин 95,0, L-триптофан 16,0, L-валин 94,0, L-цистин 2HCl 63,0, L-тирозин 2NAHO 104,0.
L-глутамин представляет собой условно незаменимую аминокислоту, которая является обязательным компонентом энергетического обмена клетки, и принимает участие в транспортировке калия через клеточную стенку.
Хондроитин-сульфат А относится к цитопротекторам - вискоэластикам, обладая соответствующим знаком и электронным зарядом, он образует поверхностную защитную пленку на клетках эндотелиального пласта роговицы. Тем самым предотвращается повреждение и десквамацию клеток эндотелия роговицы в процессе гипотермической консервации.
Декстран с молекулярной массой 40000 относится к высокомолекулярным онкотическим компонентам среды и, подобранный в заявленной концентрации, создает в среде онкотическое давление примерно равное 320 мосм/л, при котором предотвращается процесс набухания клеток и коллоидного вещества стромы донорской роговицы в процессе длительной гипотермической консервации.
Для предотвращения роста патогенной микрофлоры, согласно международным требованиям при работах с изолированными тканями и клетками, добавлены: пенициллин и стрептомицин, оказывающие бактерицидное действие в отношении широкого спектра грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, и амфотерицин В, обладающий фунгицидным и фунгистатическим действиями.
Триметазидина дигидрохлорид - антигипоксический, регулирующий энергетический метаболизм фармакологический препарат. В основе фармакологического механизма действия триметазидина лежит переключение энергетического метаболизма с окисления жирных кислот на окисление глюкозы. Препарат ингибирует окисление жирных кислот за счет селективной блокады фермента 3-кетоацил-КоА-тиолазы - митохондриальной длинноцепочечной изоформы жирных кислот.
Выбор заявленных сред объясняется повышенной чувствительностью эндотелиальных клеток роговицы, имеющих нейроэктодермальное происхождение, к гипоксическому и метаболическому (энергетическому) стрессу. Наиболее оптимальным составом по необходимым ингредиентам является комбинация трех сред, а именно: среды 199 с солями Хэнкса, среды F-12 с Hepes и среды DMEM с Hepes в заявленных соотношениях, имитирующих аминокислотный и метаболический состав водянистой влаги передней камеры интактного глаза.
Заявленное Универсальное средство для гипотермической консервации трансплантата роговицы, благодаря входящим в его состав компонентам в обозначенных концентрациях, обладает мембранопротективным и мембраностабилизирующим действием, предотвращает разрушение клеточных мембран и снижение внутриклеточной концентрации аденозинтрифосфата, обеспечивает нормальное функционирование мембранных ионных каналов, трансмембранный перенос ионов калия и натрия, сохранение клеточного гомеостаза.
В результате этого создаются условия для повышения жизнеспособности клеток трансплантата роговицы и пролонгирования сроков холодового хранения.
Это подтверждается результатами проведенного морфометрического и ультраструктурного исследования 32 роговиц от 16 трупов-доноров, которые были получены из Глазного тканевого банка ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. В рамках проведенного исследования были сформированы две группы: опытная и контрольная. Все правые роговицы (n=16) от 16 доноров, составляющие опытную группу, помещались в предложенное Универсальное средство для гипотермической консервации трансплантата роговицы. Все левые роговицы (n=16) от 16 доноров, составляющие контрольную группу, помещались в Средство для консервации заднего послойного трансплантата роговицы согласно патенту РФ №2676311. Затем все роговицы обеих групп подвергались гипотермической консервации при 4-8°С в течение одних (n=4), двух (n=4), шести (n=4) и десяти (n=4) суток. Для оценки состояния мембран клетки и ее органелл использовалась трансмиссионная электронная микроскопия на электронном микроскопе (JEM 1200 EX II, Япония). Плотность эндотелиальных клеток подсчитывали при помощи кератоанализатора для Глазных банков (модель ЕКА-98, «Konan», Япония). Оценка на некроз проводилась с помощью окраски йодидом пропидия, с использованием конфокального лазерного сканирующего биологического микроскопа (FLUOVIEW FV10i, OLYMPUS Corporation, Япония).
С помощью проведенной трансмиссионной микроскопии эндотелия роговицы после первых суток консервации были выявлены следующие отличия в группах сравнения: клетки эндотелия роговицы из опытной группы характеризовались уплотнением наружных и внутриклеточных, в том числе митохондриальных мембран. На вторые и шестые сутки обнаруженный эффект нарастал и сохранялся на десятые сутки гипотермической консервации.
По результатам проведенной на десятые сутки трансмиссионной микроскопии клеток эндотелия роговиц опытной группы, определялось отсутствие участков повреждения клеточных и внутриклеточных, в частности, митохондриальных мембран.
Изобретение поясняется фигурами 1-2.
На Фигуре 1 представлена трансмиссионная электронная микроскопия ультраструктуры эндотелиальных клеток роговиц на десятые сутки гипотермической консервации опытной группы при увеличении 20000х.
Позицией 1 обозначена мембрана митохондрии.
На фигуре 2 представлена динамика потери плотности эндотелиальных клеток донорских роговиц в связи с развитием некроза в опытной и контрольной группах на 1, 2, 6 и 10 сутки консервации.
При этом в контрольной группе наблюдалось постепенное истончение и повреждение клеточных мембран, начиная с шестых суток, выявлены грубые ультраструктурные изменения с паренхиматозной дегенерацией, а именно, осаждением клеточных белков в матриксе цитоплазмы эндотелиальных клеток роговицы, что является проявлением необратимых клеточных процессов.
При оценке морфометрических характеристик выявлено, что за 10 суток консервации потеря плотности эндотелиальных клеток донорских роговиц в опытной группе составила - 2,4% (при нормативных значениях менее или равно 5,0%), в контрольной группе - 10,6% (патологически высокая потеря).
При анализе потери плотности эндотелиальных клеток в связи с развитием некроза обнаружено, что количество поврежденных клеток увеличивалось постепенно. К десяти суткам консервации в опытной группе количество некротизированных клеток было незначительным и достигало - 2,9%, в контрольной группе - 10,4%.
Универсальное средство для консервации трансплантата роговицы получают следующим образом: в условиях ламинарного шкафа в химически чистой и стерильной мерной колбе на 100 мл смешивают сначала две среды: 25,00 г среды F-12 с Hepes и 25,0 г среды DMEM с Hepes. Далее вносят 2,00 г антибиотика-антимикотика (Пенициллин-Стрептомицин-Амфотерицин В). Получившуюся смесь разливают на две равные части и растворяют в первой части 5,70 г декстрана-40, а во второй части 1,00 г хондроитин-сульфата А путем медленного нанесения сухого вещества на поверхность жидкой смеси. После внесения указанных компонентов смеси оставляют в работающем ламинарном шкафе до полного набухания, после чего механически растворяют и сливают их вместе. Затем в 10,0 г среды 199 с солями Хэнкса растворяют 0,005 г триметазидина дигидрохлорида. L-глутамин в количестве 0,145 г растворяют также в 10,0 г среды 199 с солями Хэнкса. Все полученные смеси объединяют в мерной колбе, после чего добавляют среду 199 с солями Хенкса в количестве 21,15 г. Затем полученное средство подвергают префильтрации через фильтр «Миллипор» с диаметром пор 0,45 мкм, после чего разливают в стеклянные флаконы по 20,0 мл с одновременной «глубинной стерилизацией» через систему миллипоровых фильтров с диаметром пор 0,22 мкм. Флаконы укупоривают стерильными пластиковыми крышками и помещают в холодильник для хранения при температуре 4-8°С.
Использование предлагаемого универсального средства для гипотермической консервации трансплантата роговицы в Глазном тканевом банке ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России позволило повысить жизнеспособность сквозных и послойных трансплантатов роговицы путем восстановления клеточных и внутриклеточных мембран и пролонгировать сроки консервации без снижения плотности эндотелиальных клеток.