РЕГУЛЯЦИЯ АЛЬТЕРНАТИВНОГО СПЛАЙСИНГА ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ

1. Способ обеспечения и/или контроля экспрессии белка в клетке млекопитающего, включающий введение в клетку:
ой
ым
(a) 1 экспрессионной кассеты, содержащей химерный ген, функционально связанный с 1 элементом, осуществляющим контроль экспрессии, где химерный ген содержит первую часть, содержащую мини-ген, подвергнутый альтернативному сплайсингу, и вторую часть, которая кодирует RNA, кодирующую белок, где экспрессия белка контролируется альтернативным сплайсингом первой части.
2. Способ предоставления белка субъекту, включающий введение субъекту:
ой
ым
(a) 1 экспрессионной кассеты, содержащей химерный ген, функционально связанный с 1 элементом, осуществляющим контроль экспрессии, где химерный ген содержит первую часть, содержащую мини-ген, подвергнутый альтернативному сплайсингу, и вторую часть, которая кодирует RNA, кодирующую белок, где экспрессия белка контролируется альтернативным сплайсингом первой части.
3. Способ лечения заболевания у млекопитающего, включающий введение млекопитающему:
ой
ым
(a) 1 экспрессионной кассеты, содержащей химерный ген, функционально связанный с 1 элементом, осуществляющим контроль экспрессии, где химерный ген содержит первую часть, содержащую мини-ген, подвергнутый альтернативному сплайсингу, и вторую часть, которая кодирует РНК, кодирующую белок, где экспрессия белка контролируется альтернативным сплайсингом первой части.
4. Способ по п.3, где вторая часть, которая кодирует RNA, кодирующую белок, белок включает стоп-кодон трансляции, не имеет инициирующего или стартового кодона, не является открытой рамкой считывания для продуцирования белка или кодирует только часть белка.
5. Способ по п.4, где альтернативный сплайсинг первой части модифицирует транскрипт, тем самым удаляя или обнуляя стоп-кодон, вводя инициирующий или стартовый кодон, восстанавливая открытую рамку считывания или обеспечивая недостающую часть белка.
6. Способ по любому из пп.1-5, где первая часть составляет 5ʼ второй части.
7. Способ по любому из пп.1-6, где первая часть включает внутрирамочный стоп-кодон трансляции.
8. Способ по п.7, где альтернативный сплайсинг первой части удаляет кодон остановки процесса трансляции.
9. Способ по любому из пп.1-8, где белок представляет собой трансактиваторный белок.
10. Способ по любому из пп.1 и 4-9, где белок представляет собой трансактиваторный белок, где способ представляет собой способ контроля экспрессии РНК в клетке млекопитающего, и где способ дополнительно включает введение в клетку:
ой
ым
(b) 2 экспрессионной кассеты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую РНК, функционально связанную со 2 элементом, осуществляющим контроль экспрессии, который связывается трансактиваторным белком, тем самым увеличивая экспрессию РНК в клетке млекопитающего.
11. Способ по любому из пп.2 и 4-9, где белок представляет собой трансактиваторный белок, где способ представляет собой способ контроля экспрессии РНК у субъекта, и где способ дополнительно включает введение субъекту:
ой
ым
(b) 2 экспрессионной кассеты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую РНК, функционально связанную со 2 элементом, осуществляющим контроль экспрессии, который связывается трансактиваторным белком, тем самым увеличивая экспрессию РНК у субъекта.
12. Способ по любому из пп.3, и 4-9, где белок представляет собой трансактиваторный белок, где способ представляет собой лечение заболевания у млекопитающего, и где способ дополнительно включает введение млекопитающему:
ой
ым
(b) 2 экспрессионной кассеты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую РНК, функционально связанную со 2 элементом, осуществляющим контроль экспрессии, который связывается трансактиваторным белком, тем самым увеличивая экспрессию РНК у млекопитающего и излечивая заболевание.
13. Способ по любому из пп.10-12, где РНК представляет собой ингибирующую РНК.
14. Способ по п.13, где ингибирующая РНК представляет собой siRNA, shRNA или miRNA.
15. Способ по п.13 или 14, где ингибирующая РНК ингибирует или снижает экспрессию аберрантного или аномального белка, связанного с заболеванием, тем самым излечивая заболевание.
16. Способ по любому из пп.1-15, где RNA кодирует терапевтический белок.
17. Способ по п.16, где терапевтический белок корректирует дефицит белка, связанный с заболеванием, тем самым излечивая заболевание.
18. Способ по любому из пп.1-15, где RNA кодирует белок Cas9.
ей
им
19. Способ по п.18, дополнительно включающий введение субъекту 3 экспрессионной кассеты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую направляющую РНК, функционально связанную с 3 элементом, осуществляющим контроль экспрессии,.
им
20. Способ по п.19, где 3 элементом, осуществляющим контроль экспрессии, является конститутивный промотор.
21. Способ по п.19 или 20, где экспрессия белка Cas9 и направляющей РНК корректирует генетическое заболевание.
22. Способ по любому из пп.18-20, где белок Cas9 лишен нуклеазной функции, при этом экспрессия белка Cas9 и направляющей РНК ингибирует экспрессию гена.
ый
23. Способ по любому из пп.1-22, где 1 элемент, осуществляющий контроль экспрессии, представляет собой конститутивный промотор, клеточно-типоспецифический промотор или индуцируемый промотор.
ой
ой
24. Способ по любому из пп.1-23, где первая часть 1 экспрессионной кассеты и вторая часть 1 экспрессионной кассеты разделены расщепляемым пептидом.
25. Способ по п.24, где расщепляемый пептид представляет собой саморасщепляемый пептид, чувствительную к лекарству протеазу или субстрат для эндогенной эндопротеазы.
26. Способ по любому из пп.1-25, где сплайсинг альтернативно сплайсированного мини-гена регулируется с помощью низкомолекулярного модификатора сплайсинга.
27. Способ по любому из пп.1-25, где сплайсинг альтернативно сплайсированного мини-гена регулируется болезненным состоянием в клетке.
28. Способ по любому из пп.1-25, где сплайсинг альтернативно сплайсированного мини-гена регулируется типом клетки или типом ткани.
29. Способ по любому из пп.1-28, где повышенная экспрессия трансактиватора или белка обеспечивается включением альтернативно сплайсированного экзона в первую часть химерного гена.
30. Способ по п.29, где включенный экзон содержит регуляторные последовательности инициации трансляции.
31. Способ по любому из пп.1-30, где повышенная экспрессия трансактиватора или белка обеспечивается включением экзона 7 SMN2.
32. Способ по п.31, где включение экзона 7 SMN2 инициируется присутствием низкомолекулярного модификатора сплайсинга.
33. Способ по п.32, дополнительно включающий введение низкомолекулярного модификатора сплайсинга в клетку или субъекту, тем самым увеличивая экспрессию РНК или белка.
34. Способ по п.32 или 33, где низкомолекулярный модификатор сплайсинга представляет собой
, или  , или  .
35. Способ по любому из пп.1-28, где повышенная экспрессия трансактиватора или белка обеспечивается путем скиппинга альтернативно сплайсированного экзона в первой части химерного гена.
36. Способ по п.35, где пропущенный экзон содержит стоп-кодон.
37. Способ по любому из пп.1-36, где повышенная экспрессия трансактиватора или белка обеспечивается скиппингом экзона 4-11 MDM2.
38. Способ по п.37, где пропуск экзона 4-11 MDM2 запускается присутствием низкомолекулярного модификатора сплайсинга.
39. Способ по п.38, где низкомолекулярный модификатор сплайсинга представляет собой судемицин.
ая
ая
40. Способ по любому из пп.1-39, где 1 или 2 экспрессионная кассета содержится в вирусном векторе.
41. Способ по п.40, где вирусный вектор выбран из аденоассоциированного вирусного (AAV) вектора, лентивирусного вектора или ретровирусного вектора.
42. Способ по любому из пп.3-6 и 10-41, где заболевание вызвано дефицитом белка.
43. Способ по любому из пп.3-6 и 10-41, где заболевание вызвано генетическим дефектом.
44. Способ по любому из пп.3-6 и 10-41, где заболевание представляет собой нейродегенеративное заболевание.
45. Способ по п.44, где нейродегенеративное заболевание включает заболевание с полиглютаминовыми повторами.
46. Способ по п.45, где заболевание с полиглутаминовыми повторами включает болезнь Хантингтона (HD).
47. Способ по п.44, где нейродегенеративное заболевание включает спинно-церебеллярную атаксию (SCA), необязательно любую из SCA1-SCA29.
48. Способ по любому из пп.1-47, где млекопитающим является человек.
49. Способ по любому из пп.2-6 и 8-48, где введение осуществляют в центральную нервную систему.
50. Способ по любому из пп.2-6 и 8-49, где введение осуществляют в мозг.
51. Способ по п.50, где введение осуществляют в желудочек мозга.
ая
ая
52. Способ по любому из пп.41-51, где AAV включает частицу AAV, содержащую капсидные белки AAV и 1 или 2 экспрессионная кассета вставлена между парой инвертированных концевых повторов AAV (ITR).
53. Способ по п.52, где AAV капсидные белки получены или выбраны из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-rh74, AAV-rh10 и AAV-2i8 капсидных белков VP1, VP2 и/или VP3, или капсидного белка, имеющего 70% или более идентичности с AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-rh74, AAV-Rh10 или AAV-2i8 капсидных белков VP1, VP2 и/или VP3.
54. Способ по п.52, где одна или несколько пар ITR получены из, содержат или состоят из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-rh74, AAV-rh10 или AAV-2i8 ITR, или ITR, имеющей 70% или более идентичности с AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-rh74, AAV-Rh10, или AAV-2i8 последовательности ITR.
ая
ая
55. Способ по любому из пп.1-54, где 1 или 2 экспрессионная кассета включает промотор.
ая
ая
56. Способ по любому из пп.1-55, где 1 или 2 экспрессионная кассета включает энхансерный элемент.
ая
ая
57. Способ по любому из пп.1-55, где 1 или 2 экспрессионная кассета включает энхансер CMV или промотор бета-актина курицы.
ая
ая
58. Способ по любому из пп.1-57, где 1 или 2 экспрессионная кассета дополнительно содержит один или несколько из интрона, полинуклеотидной последовательности наполнителя и/или сигнала поли А или их комбинации.
59. Способ по любому из пп.41-58, где вводят множество вирусных векторов.
6
18
60. Способ по п.59, где вирусные векторы вводят в дозе от примерно 1×10 до примерно 1×10 векторных геномов на килограмм (вг/кг).
7
17
8
16
9
15
10
14
10
13
10
13
10
11
11
12
12
13
13
14
61. Способ по п.59, где вирусные векторы вводят в дозе примерно 1×10-1×10, примерно 1×10-1×10, примерно 1×10-1×10, примерно 1×10-1×10, примерно 1×10-1×10, примерно 1×10-1×10, примерно 1×10-1×10, примерно 1×10-1×10, примерно 1×10-1×10 или примерно 1×10-1×10 вг/кг млекопитающего.
6
16
62. Способ по п.59, где вирусные векторы вводят в дозе от примерно 0,5-4 мл 1×10-1×10 вг/мл.
63. Способ по любому из пп.41-62, дополнительно включающий введение множество пустых вирусных капсидов.
64. Способ по п.63, где пустые вирусные капсиды составляют с вирусными частицами, вводимыми млекопитающему.
65. Способ по любому из пп.63 или 64, где пустые вирусные капсиды вводят или формулируют с 1,0-100-кратным избытком частиц вирусного вектора или пустых вирусных капсидов.
66. Способ по любому из пп.63 или 64, где пустые вирусные капсиды вводят или готовят с примерно 1,0-100-кратным избытком пустых вирусных капсидов по отношению к частицам вирусного вектора.
67. Способ по любому из пп.1-66, где доставка или введение включает внутрижелудочковую инъекцию и/или интрапаренхимальную инъекцию.
68. Способ по любому из пп.1-66, включающий введение или доставку в желудочек мозга, субарахноидальное пространство и/или интратекальное пространство.
69. Способ по любому из пп.1-68, где клетки включают эпендимальные, пиальные, эндотелиальные, желудочковые, менингеальные, глиальные клетки и/или нейроны.
70. Способ по п.69, где эпендимальная, пиальная, эндотелиальная, желудочковая, менингеальная, глиальная клетка и/или нейрон экспрессируют РНК или белок.
71. Способ по любому из пп.3-6 и 10-70, где введение осуществляют в единственный участок головного мозга.
72. Способ по любому из пп.3-6 и 10-70, где введение осуществляют в 1-5 участков головного мозга.
73. Способ по любому из пп.3-6 и 10-70, где введение осуществляют в: ростральный боковой желудочек; и/или хвостовой боковой желудочек; и/или правый боковой желудочек; и/или левый боковой желудочек; и/или правый ростральный боковой желудочек; и/или левый ростральный боковой желудочек; и/или правый хвостовой боковой желудочек; и/или левый каудальный боковой желудочек.
74. Способ по любому из пп.3-6 и 10-70, где введение представляет собой одноразовую или многоразовую дозу в любое из следующих: мостомозжечковая цистерна млекопитающего, внутрижелудочковое пространство, желудочек мозга, субарахноидальное пространство, интратекальное пространство и/или эпендима.
75. Способ по любому из пп.3-6 и 10-70, где способ уменьшает неблагоприятный симптом болезни Хантингтона (HD) или спинно-церебеллярной атаксии (SCA).
76. Способ по п.75, где неблагоприятный симптом включает симптом ранней или поздней стадии; поведенческий, личностный или языковой симптом; симптом двигательной функции; и/или когнитивный симптом.
77. Способ по любому из пп.2-6 и 8-76, где способ увеличивает, улучшает, сохраняет, восстанавливает или устраняет дефицит памяти, дефекты памяти или когнитивные функции млекопитающего.
78. Способ по любому из пп.2-6 и 8-77, где способ улучшает или подавляет, или уменьшает, или предотвращает ухудшение координации, медленное движение или скованность тела.
79. Способ по любому из пп.2-6 и 8-78, где способ улучшает или подавляет, или уменьшает, или предотвращает обострение спазмов или суетливых движений.
80. Способ по любому из пп.2-6 и 8-79, где способ улучшает или подавляет, или уменьшает, или предотвращает обострение депрессии или раздражительности.
81. Способ по любому из пп.2-6 и 8-80, где способ улучшает или подавляет, или уменьшает, или предотвращает обострение состояния падения предметов из рук, падения, потери равновесия, затруднения речи или затруднения глотания.
82. Способ по любому из пп.2-6 и 8-81, где способ улучшает или подавляет, или уменьшает, или предотвращает ухудшение способности к организации.
83. Способ по любому из пп.2-6 и 8-82, где способ улучшает или подавляет, или уменьшает, или предотвращает ухудшение атаксии или снижение рефлексов.
84. Способ по любому из пп.2-6 и 8-83, где способ улучшает или подавляет, или уменьшает, или предотвращает обострение приступов или тремора, припадков или тремора.
85. Способ по любому из пп.1-84, где млекопитающее не является грызуном.
86. Способ по п.85, где млекопитающим, не являющимся грызуном, является примат.
87. Способ по п.86, где приматом является человек.
88. Способ по п.87, где возраст человека составляет 50 лет или старше.
89. Способ по п.88, где человек является ребенком.
90. Способ по п.89, где возраст ребенка составляет примерно от 1 до 8 лет.
91. Способ по любому из пп.3-6 и 10-90, дополнительно включающий введение одного или нескольких иммунодепрессивных агентов.
92. Способ по п.91, где иммунодепрессивный агент вводят до или одновременно с введением или доставкой вектора.
93. Способ по п.91, где иммунодепрессивным агентом является противовоспалительный агент.