Роль нарушений обмена глутаминовои кислоты в патогенезе антенатального повреждения головного мозга плода экспериментальных животных

Вопросы общей патологии

РОЛЬ НАРУШЕНИЙ ОБМЕНА ГЛУТАМИНОВОИ КИСЛОТЫ В ПАТОГЕНЕЗЕ АНТЕНАТАЛЬНОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПЛОДА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

Маслюкова А.В., Томилова И.К., Слободин В.Б.

ГОУ ВПО ИвГМА Росздрава

Кафедра общей, биоорганической и биологической химии

РЕЗЮМЕ Исследован метаболизм глутаминовой кислоты в головном мозге плодов крыс при нарушении маточно-плацентарного

кровообращения. Установлена роль эксайто-

В настоящее время обширные специальные исследования, проведенные в ряде стран при непосредственном участии ВОЗ, показали достоверную связь между нарушением внутриутробного развития плода и возникновением в последующем риска формирования психомоторных и соматических расстройств, нередко не компенсируемых в течение всей последующей жизни. Кроме того, общеизвестным является тот факт, что патологическое течение антенатального периода часто приводит к невынашиванию беременности, задержке внутриутробного развития плода, повреждению различных органов и систем, что, в свою очередь, обусловливает высокие показатели перинатальной смертности и отрицательно влияет на здоровье будущего поколения.

Среди факторов, неблагоприятно воздействующих на антенатальный период, большое значение имеет нарушение маточно-плацентарного кровотока (МПК), причиной которого могут быть: экстрагенитальная патология у матери, наличие острых или хронических инфекций, гестоз и т.п. Нарушение МПК приводит к развитию гипоксии, являющейся центральным звеном патогенеза антенатального повреждения различных органов и систем, в частности ЦНС.

Общеизвестно, что глутамат — основной медиатор в центральной нервной системе - представлен в высокой концентрации в нервной ткани (ЮМм). Ферменты, ответственные за синтез глу-тамата, являются частью общих метаболических путей и присутствуют во всех клетках.

Нейротрансмиттерная функция глутамата убедительно продемонстрирована в кортикофу-гальных волокнах, особенно в кортикостриат-ных и кортикоталамических проекциях [10, 13], а также в волокнах, проецирующихся в другие области, включая аккумбальное ядро перегородки [7], обонятельные бугорки, миндалину, вер-

токсичности глутамата в патогенезе антенатальных энцефалопатии.

Ключевые слова: плод, головной мозг, маточ-

но-плацентарное кровообращение, глутамат.

хние холмики пластинки четверохолмия [14], вентральное поле покрышки, красные ядра [5], черную субстанцию, ядра моста и спинной мозг [15]. Эти пути формируют слой V пирамидных нейронов коры. Глутамат также является основным медиатором [11] в кортико-кортикальных путях и путях, проходящих через мозолистое тело (образованы нейронами II и III слоев коры). Изучение гиппокампа млекопитающих позволило сделать заключение о том, что все основные входящие в него и выходящие нервные пути также являются глутаматэргическими [15].

Установлено, что активация рецепторов возбуждающих аминокислот играет решающую роль в патогенезе как острых, так и хронических заболеваний мозга [6, 8]. При избыточном высвобождении возбуждающего медиатора в межсинаптическую щель возникают токсические эффекты, в связи с чем глутамат относят к эк-сайтотоксическим соединениям. Имеются убедительные свидетельства вовлечения рецепторов глутамата и эксайтотоксического процесса в нейродегенерацию в результате глобальной и фокальной [12] церебральной ишемии.

Теория эксайтотоксичности, как известно, состоит в том, что любое повреждающее воздействие на «первый» нейрон, вызывающее деполяризацию мембраны и генерацию продолжительной серии потенциалов действия, обусловливает массивное высвобождение нейротрансмиттеров его синаптическими окончаниями. Избыточная активация рецепторов постсинаптичес-кой мембраны приводит к гибели «второго» нейрона, его «смерти от перевозбуждения» (эксай-тотоксичность) (Голубев А.Г., 1994).

В клинической практике изучение недостаточности МПК и ее влияния на течение антенатального периода представляет собой трудную задачу вследствие невозможности проведения биохимических исследований на уровне органов

и тканей. Наиболее адекватными для решения этих вопросов являются экспериментальные исследования.

Исходя из этого, представлялось целесообразным проанализировать некоторые показатели обмена глутаминовои кислоты в головном мозге плода крыс в условиях гипоксии, возникающей в результате нарушения МПК, а также те биохимические процессы, которые лежат в основе эксайтотоксического действия глутамата.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Экспериментальная модель нарушения маточно-плацентарного кровотока была воспроизведена по методу М.М.Вартановой (1984) [1] на 120 плодах белых беспородных крыс путем перевязки части преплацентарных сосудов в опытном роге, которая производилась на 16-е сутки беременности, т.е. в тот период, когда плацен-тация уже завершена и плод полностью переходит на плацентарное кровообращение.

На 21-22 день беременности, т.е. в сроки, соответствующие концу периода гестации, животные забивались. Эвтаназия вызывалась передозировкой нембуталового наркоза в соответствии с методическими рекомендациями «Эвтаназия экспериментальных животных» [2]. После извлечения плодов производилось их взвешивание и измерение длины. Плоды обезглавливались, извлекался мозг.

В качестве критериев степени повреждающего действия уменьшения интенсивности маточно-плацентарного кровотока рассчитывались процент гибели и резорбции плодов после оперативного вмешательства, а также процент уменьшения массы тела выживших плодов. Гибель плодов в нашем эксперименте составила 10,7 + 0,6%. Масса выживших плодов экспериментального рога крысы составила в среднем 75% массы плодов контрольного рога. Длина их туловища в экспериментальном роге крысы была

равна 51,9 + 1,2 мм, в то время как в контрольном роге она равнялась 59,8 + 1,08 мм (р<0,001).

Отставшие в развитии плоды отличались от контрольных и внешними проявлениями: вялыми движениями после извлечения их из матки и освобождения из оболочек, а также более морщинистой и прозрачной кожей.

В головном мозге определялись содержание глутаминовои кислоты (Ещенко Н.Д., 1982), активность глутаматдегидрогеназы в митохондриальной фракции (Клюева Н.Н., 1978), активность аспартатаминотрансфера-зы и аланинаминотрансферазы (с помощью набора реактивов, в основу которых положен унифицированный метод определения активности аминотрансфераз по Рейтману и Френкелю), удельная радиоактивность С02, выделяемая срезами мозга плодов крыс при их инкубации с 1-14С- а-кетоглутаратом (Прохорова М.И., 1959), содержание внутриклеточного кальция и магния (с помощью наборов реактивов Са 130 и 208 РЫУА-ЬаеЬеша, Чешская республика).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты исследования выявили статистически достоверное увеличение содержания глутаминовои кислоты в головном мозге плодов опытного рога в 2 раза по сравнению с контролем (13,01+ 1,01 мкмоль/г ткани в опытной группе против 6,48 + 0,95 мкмоль/г ткани в контрольной, р<0,001) (табл. 1).

Полученные результаты дают основание считать, что увеличение концентрации глута-мата может привести к активации глутаматных рецепторов в условиях гипоксии наряду с пере-кисной модификацией самих рецепторов.

Для оценки состояния метаболического пула глутамата нами была определена активность глутаматдегидрогеназы, которая в головном мозге плодов опытного рога составила 9,4+1,2 мкмоль НАДФ/мин на 1мг белка (в кон-

Таблица 1

Содержание глутаминовои кислоты и активность глутаматдегидрогеназы в головном мозге плодов крыс

Статистический параметр Опытная группа Контрольная группа

Содержание глутамата (мкмоль/г ткани) М + т 13,01+1,01 6,48+0,95

Р <0,001

п 12 11

% к контролю 201

Активность ГДГ (мкмоль НАДФ/мин/мг белка) М + т 9,4+1,2 6,03+0,70

Р <0,01

п 14 16

% к контролю 156

троле - 6,03+0,70 мкмоль НАДФ/ мин на 1мг белка, р<0,01) (табл. 1).

Высокая активность глутаматдегидрогена-зы в головном мозге обеспечивает превращение глутамата в а-кетоглутарат для его дальнейшей окислительной утилизации, что подтверждается результатами исследования интенсивности включения радиоактивного углерода в состав 14С02 из 1-14С- а-кетоглутарата: удельная радиоактивность 14С02, выделяемой срезами мозга плодов опытной группы, была достоверно выше и составляет 269% по сравнению с контролем (табл. 2).

Этот процесс можно рассматривать как компенсаторно-приспособительный, так как, во-первых, поступление а-кетоглутарата в цикл Кребса пропорционально снижает включение в него пирувата, продуцируемого гликолизом. Это тем более важно, что утилизация пирувата в ЦТК ограничена низкой активностью пируватдегидрогеназного комплекса в митохондриях головного мозга плода по сравнению со взрослыми, а во-вторых, реакция превращения глутамата в а-кетоглутарат является энергодающей. Данный анаплеротичес-кий механизм обеспечивает энергией и пластическими ресурсами процессы синтеза белка, нуклеиновых кислот и фосфолипидов, являющихся основными структурными компонентами клеток головного мозга плода.

Определение активности трансаминаз, также участвующих в превращениях глутамат <-> а-кетоглутарат, выявило их существенное повышение. Так, активность АЛТ в головном мозге плодов, развивавшихся в условиях нарушенного МПК, составила 0,2+0,03 мкмоль/г ткани против 0,12 + 0,02мкмоль/г ткани в контроле, р<0,05 (табл. 3).

В условиях избытка глутамата равновесие реакции: пируват + глутамат <-> аланин + а-кетоглутарат смещается вправо, что можно рассматривать, с одной стороны, как компенсаторно-приспособительную реакцию, направленную на уменьшение концентрации глутамата в клетках головного мозга и на обеспечение цикла трикарбоновых кислот а-кетоглутаратом, однако, с другой стороны, может иметь отрицательное значение, т.к. при этом еще в большей степени истощается пул пирувата.

Активность ACT в мозге плодов, развивающихся в условиях нарушенного МПК, была также увеличенной - 0,1 + 0,02мкмоль/г против

0,06 + 0,01мкмоль/г ткани в контроле (р<0,05) (табл. 3), что также может иметь неоднозначные последствия. С одной стороны, таким образом обеспечивается цикл трикарбоновых кислот а-кето-глутаратом, что носит адаптивный характер, но, с другой - истощается пул щавелево-уксусной кислоты и синтезируется аспартат, обладающий наряду с глутаматом эксайтотоксичностью [9, 15].

Таблица 2

Удельная радиоактивность14С02, выделяемая срезами мозга плодов крыс при их инкубации

с 1-14С- б-кетоглутаратом

Статистический параметр Контрольная группа Опытная группа

М+т 614+318 1654+227

п 8 9

Р <0,01

% к контролю 269

Таблица 3

Активность АЛТ и ACT в головном мозге плодов крыс

Показатели Статистический параметр Опытная группа Контрольная группа

Активность АЛТ (мкмоль/г ткани) М+т 0,2+0,03 0,12+0,02

Р <0,05

п 8 9

% к контролю 167

Активность ACT (мкмоль/г ткани) М+т 0,1+0,02 0,06+0,01

Р <0,05

п 8 10

% к контролю 167

Все вышесказанное позволяет сделать вывод, что в условиях гипоксии в головном мозге плода метаболический пул глутамата будет истощаться.

Однако общее количество глутаминовой кислоты, как показано нашими исследованиями, у опытной группы возрастает, что позволяет предположить увеличение нейротрансмит-терного пула.

В роли второго посредника при активации рецепторов глутамата выступают ионы кальция [3]. Образование глутамат-рецепторного комплекса приводит к увеличению внутриклеточной концентрации Са2+ (за счет открытия связанных с КМБЛ (К-метил-В-аспартат) и АМРА (а-амино-3-гидро-кси-5-метил-4-изоксазол-пропионат) - рецепторами кальциевых каналов), что подтверждается результатами исследования уровня внутриклеточного кальция, представленными на рис 1.

В свою очередь увеличение внутриклеточной концентрации кальция вызывает активацию протеинкиназ, фосфолипаз, протеаз, нитроксид-синтетазы, нарушение митохондриальных функций и образование свободных радикалов. Увеличение Са2+ может задействовать один или более из этих потенциально летальных процессов [4].

Поскольку естественным антагонистом кальция является магний, наиболее важной функцией которого является защита нервной системы от всевозможных разрушительных стрессов, и он в этой ситуации выступает как проти-вострессовый, противотоксический и противоаллергический фактор, нами был исследован уровень внутриклеточного магния в головном мозге плодов крыс, развивавшихся в условиях нарушенного МПК.

Полученные результаты, приведенные на рис. 1, свидетельствуют о недостатке маг-

ния в нейронах плодов крыс, находившихся в условиях гипоксии. Это может способствовать реализации эксайтотоксического эффекта глутамата, т.к. ионы магния связываются с областью снаружи от ионных каналов и рядом с областью распознавания и областью связывания глицина NMDA-рецептора, блокируя (по вольтажзависимому типу) проведение импульсов и деполяризацию, вызванных заполнением локуса распознавания возбуждающими аминокислотами.

Таким образом, вышеизложенное (в виде схемы представлено на рис. 2) дает возможность сделать следующие выводы:

1. Метаболический пул глутамата в условиях гипоксии истощается: глутаматдегидрогена-

за, ACT и АЛТ в нейронах обеспечивает перевод глутамата в а-кетоглутарат, который, поступая в ЦТК, обеспечивает энергией и пластическими ресурсами процессы синтеза белка, нуклеиновых кислот, фосфолипидов и других компонентов клеток головного мозга плода.

2. В патогенезе повреждений головного мозга плода в условиях гипоксии при нарушении МПК большую роль играет эксайтотоксичность глутамата.

3. Эксайтотоксический эффект глутамата реализуется посредством увеличения внутриклеточной концентрации кальция и уменьшения внутриклеточной концентрации магния.

ЛИТЕРАТУРА

1. Вартанова М.М. Патогенез и профилактика синдрома отставания в развитии плода при плацентарной недостаточности и его отдаленные последствия // Дис. ... на соиск. учен. степ. докт. мед. наук. - Л., 1984. - 462с.

3,909

V  т -

2,721

5 > . ! . i

0,847

I 0,645

л' : I

• контроль в опыт!

Рис. 1. Содержание внутриклеточного кальция и магния в головном мозге плодов крыс (р<0,05).

2,

S

ГИПОКСИЯ

усиление перекисного окисления липидов

модификация -> глутаматных -рецепторов

Цикл трикарбоновых кислот

уменьшение количества магния

активация NMDA-рецепторов

->• вход Са2* внутрь клетки —

t

Нейротрансмиттерный

пул

ГЛУТАМАТ

Метаболический

ЩУК

пул

ACT

гдг

активация: фосфолипазы А2

фосфолипазы С ксантиноксидазы нитроксидсинтетазы

I

аспартат

кетоглутарат

гибель клетки

пируват АЛТ аланин

Анаплеротический механизм Рис. 2. Схема патогенеза повреждений головного мозга плода в условиях гипоксии при нарушении МПК.

2. Голубев А.Г. Смерть нейрона // Международный мед. обзор. - 1994. - Т. 2, № 2. - С. 134-140.

3. Дамбинова С.А. Нейрорецепторы глута-мата. - Л.: Наука. - 1989. - 114 с.

4. Ещенко Н.Д. Определение количества глутаминовой кислоты в тканях // Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен): Учеб. пособие /Под ред. М.И. Прохоровой. - Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1982. -С. 244-246.

5. Клюева Н.Н. Определение активности глутаматдегидрогеназы в митохондриях тканей животных // Вопросы медицинской химии. — № 1. — С. 49-51.

6. Прохорова М.И. Методы определения радиоактивного углерода. - Л., 1959. - 176 с.

7. Эвтаназия экспериментальных животных: Методические рекомендации. — М., 1985.

8. Alford S. From excitatory amino acids receptors to long-term potentiation: an insight into the role of Ca++//Excitatory amino acids and second messenger system // Eds. Teichberg V.I. and Turski L. Berlin: Springer Verlag. - 1992. -Vol. 3. - P. 43-53.

9. Beal M.F. Does impairment of energy metabolism result in excitotoxic neuronal death

in neurodegenerative illness? // Ann. Neurol. -1992. - Vol. 31. - P. 119-130.

10. Choi D.W. NMDA receptors and AMPA/ kainite receptors mediparallel injury in cerebral cortical culture subjected to oxygen-glucose deprivation // Prog. Brain Res. - 1993. - Vol. 96. -P. 137-143.

11. Coyel J.T. Oxidative stress, glutamate and neurodegenerative disorders // Science. — 1993. -Vol. 262. - P. 689-695.

12. Fonnum F. Glutamate: a neurotransmitter in mammalian brain // J. Neurochem. — 1984. -Vol. 42, N 1. - P. 1-11.

13. Ottersen O.P. Exitatory amino acids

neurotransmitters: anatomical system// Exitatory amino acid antagonist. - Oxford: Blackwell

Scientific, 1991. - P. 14-38.

14. Park C.K. Focal cerebral ischemia in the cat: treatment with the glutamate antagonist MK-801 after induction of ischemia // J. Cereb. Blood Flow Metab. - 1988. - Vol. 8, N 4. - P. 757-762.

15. Sheardown M. J. 2,3,-Dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo(F)-quinoxaline: a neuroprotectant for cerebral ischemia // Science. - 1990. - Vol. 247. -P. 571-574.

Поступила 11.02.2005 г.