АНТИСМЫСЛОВЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ К HIF-1-АЛЬФА
ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES TO HIF-1-ALPHA

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США 62/406,577, поданной 11 октября 2016 года, которая полностью включена в настоящий документ посредством отсылки.
Уровень техники
Фактор, индуцируемый гипоксией 1-альфа (HIF-1α), индуцируется в условиях гипоксии (дефицита кислорода) в клетках млекопитающих [Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol 92(12), 5510-5514 (1995)]. HIF-1α играют важную роль в регуляции кислородного гомеостаза в клетках, а также в системном кровотоке [Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. vol 15, 551-578 (1999)]. Как известно, HIF-1α вызывал транскрипцию продуктов более 60 генов, в том числе эритропоэтина (ЭПО), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2), переносчиков глюкозы (GLUT) и т.д. [Trends Mol. Med. vol 8, S62-67 (2002); Nature Rev. Cancer vol 3, 721-732 (2003); J. Biol. Chem. vol 276, 9519-9525 (2001)]. Таким образом, HIF-1α может рассматриваться в качестве основного выключателя, включаемого в ответ на гипоксию.
Как известно, HIF-1α участвует в разнообразных физиологических или патологических ситуациях. Например, HIF-1α индуцирует VEGF, который является известным фактором ангиогенеза. HIF-1α индуцирует эритропоэз посредством экспрессии ЭПО. HIF-1α индуцирует транскрипцию генов, участвующих в пролиферации и выживании клеток [Exp. Mol. Med. vol 36(1), 1-12 (2004)].
HIF-1α кодируется геном HIF-1α (или HIF1A) и является субъединицей гетеродимерного фактора транскрипции HIF-1. В условиях нормоксии (при нормальном уровне кислорода) уровень белка HIF-1α регулируется путем гидроксилирования по остатку пролина пролилгидроксилазой-2 (PHD2) [EMBO J. vol 22(16), 4082-4090 (2003)]. Гидроксилированный продукт HIF-1α распознается онкосупрессорным белком Гиппеля-Линдау (VHL). Связывание HIF-1α с VHL способствует убиквитинированию HIF-1α и, как следствие, протеасомальному разрушению. При гипоксических условиях PHD2 инактивирована, протеасомальное разрушение HIF-1α супрессировано, и, как результат, уровень HIF-1α повышается [Endocrine-Related Cancer vol 13, S61-S75 (2006)].
Экспрессия HIF-1α в опухолях
: Гипоксия является характерным признаком микроокружения опухоли. Когда опухоль растет, части опухолевой массы становятся плохо васкуляризированными, что создает гипоксическое микроокружение в опухоли. Внутриопухолевая гипоксия вызывает адаптивные изменения в раковых клетках, которые могут привести к повышенной устойчивости к химиотерапии и предрасположенности к метастазу. Одним из механизмов, лежащих в основе этих адаптивных ответов на низкие уровни кислорода, является повышение уровня белка HIF-1α в раковых клетках.
Согласно литературным сведениям в первичных и метастатических опухолях обнаруживали повышенную экспрессию HIF-1α. Уровень экспрессии HIF-1α в раковых опухолях человека коррелировал с внутриопухолевым ангиогенезом и смертностью [Cancer Res. vol 61, 2911-2916 (2001); Clin. Cancer Res. vol 7, 1661-1668 (2001); Cancer Res. vol 60, 4693-4696 (2000); Am. J. Pathol. vol 157, 411-421 (2000); Cancer Res. vol 59, 5830-5835 (1999)].
У больных раком молочной железы (T1/T2) с высоким уровнем HIF-α наблюдали менее длительную безрецидивную выживаемость (DFS) и менее длительную выживаемость без отдаленных метастазов (DMFS), что указывает на то, что внутриопухолевый уровень HIF-1α может быть хорошим прогностическим маркером у пациентов с высоким риском развития рака молочной железы [Breast Cancer Res. vol 6(3), R191-R198 (2004)]. Гипоксия или повышенная экспрессия HIF-1α в клетках карциномы толстой кишки человека HCT116 стимулировали инвазию клеток карциномы толстой кишки в матригель. Метастатическую инвазию ингибировала миРНК HIF-1α [Cancer Res. vol 63, 1138-1143 (2003)]. Ингибиторы HIF-1α могут применяться для ингибирования метастазирования опухоли.
Низкомолекулярные ингибиторы HIF-1α
: HIF-1α - фактор транскрипции. Существуют малые молекулы, которые ингибируют функциональную активность или экспрессию HIF-1α. Такие низкомолекулярные ингибиторы опосредованно воздействуют на функциональную активность или уровень HIF-1α. Имеются многочисленные примеры таких ингибиторов HIF-1α, как описано ниже [Endocrine-Related Cancer vol 13, S61-S75 (2006); Oncotarget vol 7(7), 8172-8183 (2016)].
Ингибитор микротрубочек таксол, ингибиторы топоизомеразы I топотекан и ингибитор гистондеацетилазы FK228 ингибируют экспрессию белка HIF-1α посредством неизвестного механизма. Ингибитор топоизомеразы II антрациклин ингибирует HIF-1α, снижая уровень мРНК HIF-1α. Ингибитор HSP90 гелданамицин дестабилизирует белок HIF-1α или ингибирует связывание HIF-1α с ДНК. Ингибитор P300 CH1 хетомин ингибирует трансактивирующую активность HIF-1. Ингибитор протеасомы бортезомиб ингибирует активность HIF-1α посредством неизвестного механизма. Ингибитор PI3K вортманин, ингибитор mTOR рапамицин, ингибитор ЦОГ-2 целекоксиб, ингибитор тирозинкиназы генистеин и моноклональное антитело к erbB2 трастузумаб (герцептин) блокируют трансляцию мРНК HIF-1α. Однако такие ингибиторы не взаимодействуют селективно с путем HIF-1α и поэтому сложно оценить их терапевтический вклад из-за ингибирования HIF-1α.
Рибосомный синтез белка
: Белки кодируются нуклеиновой кислотой, содержащей 2-дезоксирибозу (ДНК). ДНК транскрибируется с получением пре-мРНК (пре-матричной рибонуклеиновой кислоты) в ядре. Интроны пре-мРНК ферментативно вырезаются с получением мРНК (матричной рибонуклеиновой кислоты), которая затем перемещается в цитозольный компартмент. В цитозоле комплекс аппарата трансляции, называемый рибосомой, связывается с мРНК и производит синтез белка при считывании генетической информации, кодируемой в цепи мРНК [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659-2668 (1988)].
Антисмысловой олигонуклеотид
: Олигонуклеотид, связывающийся с РНК сиквенс-специфическим образом (т.е. комплементарно) называют антисмысловым олигонуклеотидом (АСО). АСО может прочно связываться с мРНК или пре-мРНК.
АСО, прочно связывающийся с мРНК, может ингибировать синтез белка рибосомой с цепи мРНК в цитозоле. АСО должен присутствовать в цитозоле, чтобы ингибировать рибосомный синтез белка своего белка-мишени.
Чтобы АСО, прочно связывающийся с пре-мРНК, нарушал процесс сплайсинга пре-мРНК, АСО должен присутствовать в ядре, чтобы изменить процесс сплайсинга.
Неприродные олигонуклеотиды
: ДНК или РНК олигонуклеотид подвержен деградации эндогенными нуклеазами, что ограничивает их терапевтическое применение. На сегодняшний день было разработано и подробно изучено множество типов неприродных (т.е. не существующих в природе) олигонуклеотидов [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)]. Некоторые из них демонстрируют долговременную метаболическую стабильность по сравнению с ДНК и РНК. Ниже представлены химические структуры нескольких типичных неприродных олигонуклеотидов. Такие олигонуклеотиды предсказуемо связываются со своей комплементарной нуклеиновой кислотой, как ДНК или РНК.
Фосфотиоатный олигонуклеотид
: Фосфотиоатный олигонуклеотид (ФТО) является аналогом ДНК, в котором один из атомов кислорода фосфатного скелета заменен атомом серы на каждый мономер. Такое небольшое структурное изменение делает ФТО сравнительно устойчивым к деградации нуклеазами [Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402 (1985)].
in vitro
Отражая структурное подобие скелета ФТО и ДНК, они плохо проникают через клеточную мембрану большинства типов клеток млекопитающих. Однако в некоторых типах клеток с высокой экспрессией переносчика(ов) ДНК, ДНК и ФТО показывают хорошее проникновение в клетку. При системном введении ФТО, как известно, легко распределяются в печени и почках [Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296 (1997)]. Чтобы повысить клеточную проницаемость для ФТО , широко применяли липофектин. Однако липофектин физически изменяет мембрану клеток, вызывая цитотоксичность, и поэтому не был бы безопасным при длительном терапевтическом применении.
За последние 30 лет антисмысловые ФТО и варианты ФТО проходили клиническую оценку для лечения онкологических заболеваний, иммунологических нарушений, нарушений обмена веществ и так далее [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)]. Многие из таких кандидатных антисмысловых лекарственных средств не удалось успешно внедрить, отчасти из-за плохой клеточной проницаемости для ФТО. Чтобы преодолеть плохую клеточную проницаемость, ФТО требуется вводить в более высокой дозе для терапевтической активности. Однако ФТО, как известно, связаны с дозолимитирующей токсичностью, включающей увеличение времени коагуляции, активацию комплемента, канальцевую нефропатию, активацию клеток Купфера и иммунную стимуляцию, в том числе спленомегалию, лимфоидную гиперплазию, инфильтрацию мононуклеарных клеток [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)].
Было обнаружено, что многие антисмысловые ФТО демонстрировали клиническую активность в отношении заболеваний со значительным вкладом печени или почек. Мипомерсен является аналогом ФТО, который ингибирует синтез апоB-100, белка, участвующего в транспорте холестерина ЛПНП. Мипомерсен показал достаточную клиническую активность в определенной группе пациентов с атеросклерозом, скорее всего из-за своего предпочтительно распределения в печени [Circulation vol 118(7), 743-753 (2008)]. ISIS-113715 является антисмысловым ФТО аналогом, ингибирующим синтез протеинтирозинфосфатазы 1B (PTP1B), и, как было обнаружено, демонстрировал терапевтическую активность у больных диабетом II типа [Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336 (2004)].
Запертая нуклеиновая кислота
: В запертой нуклеиновой кислоте (ЗНК) кольцо рибозы скелета РНК структурно затруднено для увеличения аффинности связывания с РНК или ДНК. Таким образом, ЗНК может рассматриваться как высокоаффинный аналог ДНК или РНК [Biochemistry vol 45, 7347-7355 (2006)].
Фосфодиамидатный морфолиновый олигонуклеотид
: В фосфодиамидатном морфолиновом олигонуклеотиде (ФМО) скелетный фосфат и 2-дезоксирибоза ДНК заменены фосфоамидатом и морфолином, соответственно [Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 71, 575-586 (2006)]. Тогда как скелет ДНК отрицательно заряжен, скелет ФМО не заряжен. Таким образом, связывание между ФМО и мРНК исключает электростатическое отталкивание между скелетами и является более сильным, чем между ДНК и мРНК. Так как ФМО структурно сильно отличается от ДНК, ФМО не распознается переносчиком(ами) в печени, распознающими ДНК или РНК. Однако ФМО также не способен с легкостью проникать через клеточную мембрану.
Пептидо-нуклеиновая кислота
: Пептидо-нуклеиновая кислота (ПНК) представляет собой полипептид с N-(2-аминоэтил)глицином в качестве звеньев скелета и была открыта доктором Нильсеном с коллегами [Science vol 254, 1497-1500 (1991)]. Химическая структура и сокращенная номенклатура ПНК показана на изображении, предоставленном ниже. Как ДНК и РНК, ПНК также селективно связывается с комплементарной нуклеиновой кислотой [Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)]. При связывании с комплементарной нуклеиновой кислотой, N-конец ПНК рассматривается как эквивалент "5'-конца" ДНК или РНК, а C-конец ПНК - как эквивалент "3'-конца" ДНК или РНК.
Как и у ФМО, скелет ПНК не заряжен. Таким образом, связывание между ПНК и РНК обычно более сильное, чем между ДНК и РНК. Так как ПНК сильно отличается от ДНК по химической структуре, ПНК не распознается переносчиком(ами) ДНК в печени и демонстрирует профиль распределения в тканях, отличающийся от ДНК или ФТО. Однако ПНК также плохо проникает через мембрану клеток млекопитающих (Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, 2003).
Модифицированные нуклеиновые основания для улучшения мембранной проницаемости ПНК
: ПНК придавали высокую способность проникать через мембрану клеток млекопитающих путем введения модифицированных нуклеиновых оснований, к которым присоединен катионный липид или его эквивалент. Химические структуры таких модифицированных нуклеиновых оснований представлены ниже. Такие модифицированные нуклеиновые основания цитозина, аденина и гуанина, как обнаружили, ожидаемо и комплементарно гибридизовались с гуанином, тимином и цитозином, соответственно [заявка PCT PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253].
Включение такого модифицированного нуклеинового основания в ПНК напоминает ситуации с липофектином. При липофекции молекулы олигонуклеотидов оборачиваются молекулами катионного липида, такого как липофектамин, и связываются с ними, при этом такие комплексы липофектамина/олигонуклеотида проникают через клеточную мембрану довольно легко по сравнению с голыми молекулами олигонуклеотидов.
п
п
В дополнение к хорошей мембранной проницаемости, такие производные ПНК, как было обнаружено, обладали сверхвысокой аффинностью к комплементарной нуклеиновой кислоте. Например, введение 4-5 модифицированных нуклеиновых оснований в 11-13-мерные производные ПНК легко давало повышение Т на 20°C или выше при образовании дуплекса с комплементарной ДНК. Такие производные ПНК очень чувствительны к ошибочному спариванию одной пары оснований. Ошибочное спаривание одной пары оснований приводит к падению Т на 11-22°C в зависимости от типа модифицированного основания, а также последовательности ПНК.
HIF-1α АСО
: В отличие от низкомолекулярных ингибиторов HIF-1α, АСО, комплементарно взаимодействующие с мРНК HIF-1α, могут селективно ингибировать рибосомный синтез белка HIF-1α сиквенс-специфическим образом.
Xenopus
Xenopus
Несколько 25-мерных морфолино (ФМО) АСО HIF-1α оценивали на их способность ингибировать трансляцию искусственно сконструированной мРНК HIF-1α человека в . По 40 нг каждого морфолино АСО водили в эмбрион  методом микроинъекций и, как было обнаружено, они ингибировали экспрессию HIF-1α [J. Biol. Chem. vol 283(17), 11841-11849 (2008)]
50
RX-0047 - мощный ФТО АСО HIF-1α. RX-0047 оценивали на его HIF-1α-ингибирующую активность в различных клеточных линиях. При липофекции в таких клетках, как MDA-MB-231, PC3 и A549, RX-0047 ингибировал экспрессию белка HIF-1α с IC 1,9 ~ 4 нМ in vitro. Также RX-0047 ингибировал экспрессию мРНК HIF-1α в клетках UMRC2   сиквенс-специфическим образом. Внутрибрюшинные инъекции RX-0047 в дозе 30 мг/кг ингибировали метастазирование клеток A549 в легких у мышей. Также RX-0047 в дозе 30 мг/кг ингибировал рост опухоли в ксенотрансплантатной модели на голых мышах [J. Cell. Biochem. vol 104, 985-994 (2008)].
in vivo
EZN-2968 - производное запертой нуклеиновой кислоты (ЗНК), комплементарно взаимодействующее с кодирующей областью мРНК HIF-1α человека. EZN-2968 вызывает расщепление мРНК HIF-1α РНКазой H и в результате ингибирует экспрессию белка HIF-1α , а также в клетках. Рост опухоли (ксенотрансплантата DU145) был значимо ингибирован у голых мышей, внутрибрюшинно получавших EZN-2968 в дозе 50 мг/кг, два раза в неделю [Mol. Cancer Ther. vol 7(11), 3598-3608 (2008)].
EZN-2968 оценивали в небольшой группе больных раком с рефрактерными распростаненными солидными опухолями. EZN-2968 вводили раз в неделю путем внутривенной инфузии в дозе 18 мг/кг. Уровень мРНК HIF-1α снижался у 4 из 6 пациентов при исследовании биопсии опухоли, хотя клиническое исследование было досрочно остановлено спонсором [Рак Chemother. Pharmacol. vol 73 (2), 343-348 (2014)]
EZN-2968 представляет собой крайне редкий пример АСО HIF-1α, который оценивали у людей, больных раком. Как и в случае других олигонуклеотидных лекарственных средств, терапевтическая доза EZN-2968 считается все еще высокой из-за его ограниченной клеточной проницаемости. Существует острая необходимость в улучшении клеточной проницаемости олигонуклеотидных лекарственных средств, направленно воздействующих на HIF-1α, для преодоления дозолимитирующего токсического действия олигонуклеотидных лекарственных средств с ДНК или РНК-скелетом.
Малая интерферирующая РНК (миРНК)
in vitro
in vivo
: Малая интерферирующая РНК (миРНК) относится к двухцепочечной РНК из 20-25 пар оснований [Microbiol. Mol. Biol. Rev. vol 67(4), 657-685 (2003)]. Антисмысловая цепь миРНК некоторым образом взаимодействует с белками с образованием РНК-индуцируемого комплекса сайленсинга (RISC). Затем RISC связывается с определенной частью мРНК, комплементарной антисмысловой цепи миРНК. мРНК, связанная в комплексе с RISC, подвергается расщеплению. Таким образом, миРНК каталитически индуцирует расщепление своей мРНК-мишени и, следовательно, ингибирует экспрессию белка с мРНК. RISC не всегда связывается с полностью комплементарной последовательностью в своей мРНК-мишени, что вызывает опасения, связанные с нецелевыми эффектами миРНК-терапии. Как и другие классы олигонуклеотидов с ДНК или РНК-скелетом, миРНК обладает плохой клеточной проницаемостью и, следовательно, может проявлять низкую терапевтическую активность  или , если она не включена в соответствующую лекарственную форму или не модифицирована химически, чтобы демонстрировать хорошую мембранную проницаемость.
миРНК HIF-1α
in vitro
: Существует множество примеров миРНК к HIF-1α, снижающих экспрессию HIF-1α в клетках. Однако  ингибирующую активность обычно наблюдали в случаях, когда молекулы миРНК были эффективно доставлены в клетку. Например, при трансфекции миРНК HIF-1α в количестве 100 нМ в клетки HCT116 методом липофекции обнаруживали заметное снижение мРНК HIF-1α, а также белка HIF-1α при гипоксии. миРНК также вызывала изменения уровня экспрессии белков-мишеней HIF-1 или мРНК, таких как VEGF, TGF-α и т.д. [Cancer Res. vol 63, 1138-1143 (2003)].
Клетки глиомы U251MG и U343MG трансфицировали 75 нМ миРНК HIF-1α с помощью липофекции. Экспрессия HIF-1α значимо снижалась в клетках, обработанных миРНК HIF-1α, независимо от гипоксии или нормоксии [BMC Cancer 10:605 (2010)].
Катионные мицеллярные наночастицы миРНК, направленно воздействующей на мРНК HIF-1α человека, заметно ингибировали рост опухоли у мышей с ксенотрансплантатом PC3. Кроме того, комбинированное лечение наночастицами миРНК HIF-1α с доксорубицином обеспечивало дополнительную противоопухолевую активность в ксенотрансплантатной модели PC3 [Mol. Pharmaceutics vol 9(10), 2863-2874 (2012)].
Наночастицы миРНК HIF-1α и RGD-направленного многофункционального липида ECO оценивали на противоопухолевую и антиангиогенную активность у мышей с ксенотрансплантатом раковой опухоли толстой кишки HT-29. Лекарственные формы миРНК HIF-1α, которые вводили внутривенно в дозе 2 мг/кг раз в 3 дня в течение 3 недель, как обнаружили, ингибировали рост опухоли на 50%. Исследование МРТ указывало на значимое снижение васкуляризации в опухоли и 70% уменьшение внутриопухолевого кровотока. Наблюдали значимое снижение экспрессии HIF-1α, и также родственных белков, таких как VEGF, GLUT-1 и CA9 (карбоангидраза 9) [Mol. Pharmaceutics vol 13(7), 2497-2506 (2016)].
Сплайсинг пре-мРНК
: ДНК транскрибируется с получением пре-мРНК (пре-матричной рибонуклеиновой кислоты) в ядре. Затем пре-мРНК процессируется в мРНК после удаления интронов в последовательности сложных реакций, совокупно называемых "сплайсингом", как схематично представлено на диаграмме, показанной на Фигуре 13 [Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291-336 (2003); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386-398 (2005); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2), 108-121 (2014)].
35
Сплайсинг инициируется при образовании "E-комплекса сплайсомы" (т.е. раннего комплекса сплайсомы) между пре-мРНК и адаптерными факторами сплайсинга. В "E-комплексе сплайсомы", U1 связывается с соединением экзона N и интрона N, а U2AF связывается с соединением интрона N и экзона (N+1). Таким образом, соединения экзона/интрона или интрона/экзона очень важны для формирования раннего комплекса сплайсомы. "E-комплексе сплайсомы" трансформируется в "A-комплекс сплайсомы" после дополнительного связывания комплекса с U2. "A-комплекс сплайсомы" подвергается последовательности сложных реакций с удалением или вырезанием интрона для соединения соседних экзонов.
Антисмысловое ингибирование сплайсинга
: В ядре АСО может прочно связываться с определенным положением в пре-мРНК и может препятствовать процессу сплайсинга пре-мРНК в мРНК, с образованием полноразмерной мРНК или варианта(ов) мРНК, не содержащих целевой экзон. Такая мРНК, называемая "сплайс-вариантом(ами)", кодирует белок(ки) меньшего размера, чем белок, кодируемый полноразмерной мРНК.
В принципе, сплайсинг может быть прерван при ингибировании образования "E-комплекса сплайсомы". Если АСО прочно связывается с соединением (5'→3') экзон-интрона, т.е. "5'-сайтом сплайсинга", АСО блокирует образование комплекса между пре-мРНК и фактором U1 и, следовательно, образование "E-комплекса сплайсомы". Аналогичным образом, "E-комплекс сплайсомы" не может образовываться, если АСО прочно связывается с соединением (5'→3') интрона-экзона, т.е. "3'-сайтом сплайсинга".
Антисмысловой пропуск экзонов пре-мРНК HIF-1α
: До настоящего времени нет никаких описанных случаев ингибирования антисмысловыми олигонуклеотидами процесса сплайсинга пре-мРНК HIF-1α, которое бы вызывало пропуск экзонов.
Сущность изобретения
Формулой I
В настоящем изобретении предложено производное пептидо-нуклеиновой кислоты, представленное , или его фармацевтически приемлемая соль:
где
n является целым числом от 10 до 26;
Формулы I
соединение  обладает по меньшей мере, 10-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 20-мерной последовательностью РНК [(5'→3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU], частью пре-мРНК HIF-1α человека, предпочтительно с 14-мерной последовательностью РНК [(5'→3') UAAGUAGGAUAAGU] в пре-мРНК HIF-1α человека;
1
2
n-1
n
1
2
n-1
n
S, S,..., S, S, T, T,..., T и T независимо представляют собой дейтеридо, гидридо, замещенный или незамещенный алкильный или замещенный или незамещенный арильный радикал;
2
X и Y независимо представляют собой гидридо [H], формильный [H-C(=O)-], аминокарбонильный [NH-C(=O)-], замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный ацильный, замещенный или незамещенный сульфонильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный, замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный арилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный алкиламинокарбонильный, замещенный или незамещенный ариламинокарбонильный, замещенный или незамещенный алкилсульфонильный, замещенный или незамещенный арилсульфонильный радикал;
Z представляет собой гидридо, гидрокси, замещенный или незамещенный алкилокси, замещенный или незамещенный арилокси, замещенный или незамещенный амино, замещенный или незамещенный алкиламино, замещенный или незамещенный ариламино, замещенный или незамещенный алкильный или замещенный или незамещенный арильный радикал;
1
2
n-1
n
B, B,..., B и B независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований; и
1
2
n-1
n
по меньшей мере три (предпочтительно по меньшей мере четыре) из B, B,..., B и B независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, где замещенный или незамещенный аминорадикал ковалентно связан с молекулой нуклеинового основания.
1
2
n-1
n
1
2
n-1
n
В некоторых вариантах осуществления S, S,..., S, S, T, T,..., T и T независимо представляют собой гидридо, замещенный или незамещенный алкильный или замещенный или незамещенный арильный радикал.
2
В некоторых вариантах осуществления X и Y независимо представляют собой гидридо [H], замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный ацильный, замещенный или незамещенный сульфонильный, замещенный или незамещенный арильный радикал. В других вариантах осуществления X и Y независимо представляют собой гидридо [H], формильный [H-C(=O)-], аминокарбонильный [NH-C(=O)-], замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный, замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный арилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный алкиламинокарбонильный, замещенный или незамещенный ариламинокарбонильный, замещенный или незамещенный алкилсульфонильный, замещенный или незамещенный арилсульфонильный радикал.
В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой гидридо, гидрокси, замещенный или незамещенный алкилокси, замещенный или незамещенный арилокси, замещенный или незамещенный амино, замещенный или незамещенный алкильный или замещенный или незамещенный арильный радикал. В других вариантах осуществления Z представляет собой гидрокси, замещенный или незамещенный алкилокси, замещенный или незамещенный арилокси, замещенный или незамещенный амино, замещенный или незамещенный алкиламино, замещенный или незамещенный ариламино, замещенный или незамещенный алкильный или замещенный или незамещенный арильный радикал.
Формулы I
Формулы I
В некоторых вариантах осуществления соединение  полностью комплементарно целевой последовательности пре-мРНК HIF-1α. В других вариантах осуществления соединение  частично комплементарно целевой последовательности пре-мРНК HIF-1α, например содержит одно или два некомплементарных основания с целевой последовательностью пре-мРНК HIF-1α.
Формулы I
Соединение  индуцирует альтернативный сплайсинг пре-мРНК HIF-1α человека, дает сплайс-вариант(ы) мРНК HIF-1α без "в экзона 2" и может применяться для лечения солидных опухолей или состояний, включающих активность HIF-1α.
Краткое описание фигур
Фигура 1A
18
. Хроматограмма C-обращенно-фазовой ВЭЖХ "ASO 1" до препаративной ВЭЖХ очистки.
Фигура 1B
18
. Хроматограмма C-обращенно-фазовой ВЭЖХ "ASO 1" после препаративной ВЭЖХ очистки.
Фигура 2
18
. ЭРИ-ВП масс-спектр "ASO 1" после очистки с помощью препаративной C-ОФ ВЭЖХ.
Фигура 3A
. Данные электрофореза продуктов вложенной ОТ-ПЦР HIF-1α в клетках HeLa, обработанных "ASO 2" в концентрации 0 (отрицательный контроль), 10, 100 или 1000 зМ.
Фигура 3B
. Предсказанный размер полос ПЦР.
Фигура 3C
. Данные секвенирования по Сэнгеру для полосы продукта ПЦР, отнесенной к пропуску экзона 2.
Фигура 4A
. Данные Вестерн-блоттинга HIF-1α в клетках HeLa, обработанных "ASO 2" в концентрации 0 зМ (отрицательный контроль), 10 зМ, 100 зМ, 1 аМ или 10 аМ в течение 24 часов.
Фигура 4B
. Уровни экспрессии HIF-1α, нормализованные по β-актину, в клетках HeLa, обработанных "ASO 2" в концентрации 0 зМ (отрицательный контроль), 10 зМ, 100 зМ, 1 аМ или 10 аМ в течение 24 часов.
Фигура 5A
. Вложенная кПЦР с SYBR Green в клетках HeLa, обработанных "ASO 2" в концентрации 0 (отрицательный контроль), 10, 100 или 1000 зМ. (планка погрешности соответствует стандартной ошибке)
Фигура 5B
. Вложенная кПЦР с зондами TaqMan в клетках HeLa, обработанных "ASO 2" в концентрации 0 (отрицательный контроль), 10, 100 или 1000 зМ (планка погрешности соответствует стандартной ошибке)
Фигура 6A
. Данные электрофореза продуктов вложенной ОТ-ПЦР HIF-1α в клетках HeLa, обработанных "ASO 6" в концентрации 0 (отрицательный контроль), 10, 100 или 1000 зМ.
Фигура 6B
. Данные Вестерн-блоттинга HIF-1α в клетках HeLa, обработанных "ASO 6" в концентрации 0 зМ (отрицательный контроль), 10 зМ, 100 зМ или 1 аМ в течение 24 часов.
Фигура 6C
. Уровни экспрессии HIF-1α, нормализованные по β-актину, в клетках HeLa, обработанных "ASO 6" в концентрации 0 зМ (отрицательный контроль), 10 зМ, 100 зМ или 1 аМ в течение 24 часов (планка погрешности соответствует стандартной ошибке).
Фигура 7A
. Данные вложенной кПЦР с SYBR Green в клетках HeLa, обработанных "ASO 6" в концентрации 0 (отрицательный контроль), 10, 100 или 1000 зМ. (планка погрешности соответствует стандартной ошибке)
Фигура 7B
. Данные вложенной кПЦР с зондами TaqMan в клетках HeLa, обработанных "ASO 6" в концентрации 0 (отрицательный контроль), 10, 100 или 1000 зМ (планка погрешности соответствует стандартной ошибке).
Фигура 8A
. Данные Вестерн-блоттинга HIF-1α в клетках HeLa, обработанных "ASO 1" в концентрации 0 зМ (отрицательный контроль), 100 зМ, 300 зМ, 1 аМ, 3 аМ, 10 аМ, 30 аМ, 100 аМ или 300 аМ в течение 72 часов.
Фигура 8B
. Уровни экспрессии HIF-1α, нормализованные по β-актину, в клетках HeLa, обработанных "ASO 1" в концентрации 0 зМ (отрицательный контроль), 100 зМ, 300 зМ, 1 аМ, 3 аМ, 10 аМ, 30 аМ, 100 аМ или 300 аМ в течение 72 часов (N=4 только для отрицательного контроля; планка погрешности соответствует стандартной ошибке).
Фигура 9A
. Рост опухоли U251 у голых мышей, получавших подкожно "ASO 1" в концентрации 0 (отрицательный контроль), 100, 1000 или 3000 пмоль/кг (планка погрешности соответствует стандартной ошибке).
Фигура 9B
. Репрезентативные изображения ИГХ внутриопухолевого HIF-1α из каждой группы дозы ASO.
Фигура 9C
. Средний уровень экспрессии HIF-1α в каждой группе дозы, нормализованный по группе отрицательного контроля (N=5 в группе; планка погрешности соответствует стандартной ошибке).
Фигура 10A
. Рост опухоли A431 у голых мышей, подкожно обработанных "ASO 6" в концентрации 0 (отрицательный контроль), 30, 100 или 300 пмоль/кг, 3× в неделю.
Фигура 10B
. Средний вес опухоли в День 25 (планка погрешности соответствует стандартной ошибке).
Фигура 10C
. Рост опухоли PC3 у голых мышей, подкожно обработанных "ASO 6" в концентрации 0 (отрицательный контроль), 1, 10 или 100 пмоль/кг, 2× в неделю.
Фигура 10D
. Средний вес опухоли в День 28 (планка погрешности соответствует стандартной ошибке).
Фигура 11A
. Рост опухоли U-251 MG у голых мышей, подкожно обработанных "ASO 6" плюс "ASO 11" в эквивалентном количестве в концентрации 0 (отрицательный контроль), 0,1, 1,0 или 10 пмоль/кг, 2× в неделю (планка погрешности соответствует стандартной ошибке).
Фигура 11B
. Средний вес опухоли U-251 MG в День 92.
Фигура 12A
. Репрезентативные изображения ИГХ внутриопухолевого HIF-1α из группы отрицательного контроля и группы дозы 1,0 пмоль/кг.
Фигура 12B
. Средний уровень экспрессии HIF-1α в группе дозы 1,0 пмоль/кг, нормализованный по группе отрицательного контроля (N=4 в группе; планка погрешности соответствует стандартной ошибке).
Фигура 12C
. Репрезентативные изображения ИГХ внутриопухолевого VEGF-A из группы отрицательного контроля и группы дозы 1,0 пмоль/кг.
Фигура 12D
. Средний уровень экспрессии VEGF-A в группе дозы 1,0 пмоль/кг, нормализованный по группе отрицательного контроля (N=4 в группе; планка погрешности соответствует стандартной ошибке).
Фигура 13
. Пре-мРНК процессируется в мРНК после удаления интронов в последовательности сложных реакций, совокупно называемой "сплайсингом".
Подробное описание
Формулой I
В настоящем изобретении предложено производное пептидо-нуклеиновой кислоты, представленное , или его фармацевтически приемлемая соль:
где
n является целым числом от 10 до 26;
Формулы I
соединение  обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 20-мерной последовательностью РНК [(5'→3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU], частью пре-мРНК HIF-1α человека, предпочтительно с 14-мерной последовательностью РНК [(5'→3') UAAGUAGGAUAAGU] в пре-мРНК HIF-1α человека;
1
2
n-1
n
1
2
n-1
n
S, S,..., S, S, T, T,..., T и T независимо представляют собой дейтеридо, гидридо, замещенный или незамещенный алкильный или замещенный или незамещенный арильный радикал;
2
X и Y независимо представляют собой гидридо [H], формильный [H-C(=O)-], аминокарбонильный [NH-C(=O)-], замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный ацильный, замещенный или незамещенный сульфонильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный, замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный арилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный алкиламинокарбонильный, замещенный или незамещенный ариламинокарбонильный, замещенный или незамещенный алкилсульфонильный, замещенный или незамещенный арилсульфонильный радикал;
Z представляет собой гидридо, гидрокси, замещенный или незамещенный алкилокси, замещенный или незамещенный арилокси, замещенный или незамещенный амино, замещенный или незамещенный алкиламино, замещенный или незамещенный ариламино, замещенный или незамещенный алкильный или замещенный или незамещенный арильный радикал;
1
2
n-1
n
B, B,..., B и B независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований; и
1
2
n-1
n
по меньшей мере три (предпочтительно по меньшей мере четыре) из B, B,..., B и B независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, где замещенный или незамещенный аминорадикал ковалентно связан с молекулой нуклеинового основания.
1
2
n-1
n
1
2
n-1
n
В некоторых вариантах осуществления S, S,..., S, S, T, T,..., T и T независимо представляют собой гидридо, замещенный или незамещенный алкильный или замещенный или незамещенный арильный радикал.
2
В некоторых вариантах осуществления X и Y независимо представляют собой гидридо [H], замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный ацильный, замещенный или незамещенный сульфонильный, замещенный или незамещенный арильный радикал. В других вариантах осуществления X и Y независимо представляют собой гидридо [H], формильный [H-C(=O)-], аминокарбонильный [NH-C(=O)-], замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный, замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный арилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный алкиламинокарбонильный, замещенный или незамещенный ариламинокарбонильный, замещенный или незамещенный алкилсульфонильный, замещенный или незамещенный арилсульфонильный радикал.
В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой гидридо, гидрокси, замещенный или незамещенный алкилокси, замещенный или незамещенный арилокси, замещенный или незамещенный амино, замещенный или незамещенный алкильный или замещенный или незамещенный арильный радикал. В других вариантах осуществления Z представляет собой гидрокси, замещенный или незамещенный алкилокси, замещенный или незамещенный арилокси, замещенный или незамещенный амино, замещенный или незамещенный алкиламино, замещенный или незамещенный ариламино, замещенный или незамещенный алкильный или замещенный или незамещенный арильный радикал.
Формулы I
Формулы I
В некоторых вариантах осуществления соединение  полностью комплементарно целевой последовательности пре-мРНК HIF-1α. В других вариантах осуществления соединение  частично комплементарно целевой последовательности пре-мРНК HIF-1α, например, содержащей одно или два некомплементарных основания с целевой последовательностью пре-мРНК HIF-1α.
Формулы I
Соединение  индуцирует альтернативный сплайсинг пре-мРНК HIF-1α человека, дает сплайс-вариант(ы) мРНК HIF-1α без "экзона 2" и может применяться для лечения солидных опухолей или состояний, включающих активность HIF-1α.
Условие, согласно которому "n является целым числом от 10 до 26", буквально означает, что n является целым числом, которое может быть выбрано из группы целых чисел 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и 25.
Формулы I
Соединение  прочно связывается с 3'-сайтом сплайсинга "экзона 2" пре-мРНК HIF-1α человека, полученной из гена HIF-1α человека (Референсная последовательность NCBI: NG_029606.1). 20-мерная последовательность пре-мРНК HIF-1α, состоящая из 10-мера из "интрона 1" и 10-мера из "экзона 2", читается [(5'→3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU], хотя нумерация экзонов и интронов может изменяться в зависимости от представленных транскриптов мРНК HIF-1α. Предоставление 20-мерной последовательности перед мРНК служит для однозначного определения целевого 3'-сайта сплайсинга в пре-мРНК HIF-1α человека.
Формулы I
20-мерная последовательность пре-мРНК может быть альтернативно представлена как , где последовательности интрона и экзона указаны "строчными" и "заглавными" буквами, соответственно, а соединение между интроном и экзоном указано знаком  Таким образом, 14-мерная последовательность пре-мРНК [(5'→3') UAAGUAGGAUAAGU], принятая для описания соединения  в настоящем изобретении, может быть альтернативно представлена как .
Формулы I
Соединение  прочно связывается с целевым 3'-сайтом сплайсинга "экзона 2" в пре-мРНК HIF-1α человека и препятствует образованию "раннего комплекса сплайсомы", включающего целевой сайт сплайсинга. Поскольку указанное соединение стерически ингибирует образование "раннего комплекса сплайсомы", включающего целевой сайт сплайсинга, "экзон 2" HIF-1α вырезается или удаляется с получением сплайс-варианта или вариантов мРНК HIF-1α без "экзона 2". Следовательно, соединение согласно настоящему изобретению, как говорят, индуцирует пропуск "экзона 2" HIF-1α. Полученный сплайс-вариант(ы) мРНК HIF-1α кодирует вариантный белок(и) HIF-1α, не обладающий функциональной активностью HIF-1α, которую демонстрирует полноразмерный белок HIF-1α.
Формулы I
Формулы I
Формулы I
п
п
п
Соединение  прочно связывается с комплементарной ДНК, как показано в предшествующем уровне техники [PCT/KR2009/001256]. Дуплекс между производным ПНК  и ее комплементарной полноразмерный ДНК или РНК демонстрирует слишком высокое значение T, чтобы его можно было достоверно определить в водном буфере. Буферный раствор часто выпаривается при измерении T. Соединение ПНК  также дает высокие значения T с более короткими комплементарными ДНК, например, 10-мерными. Вследствие высокой аффинности связывания, производное ПНК согласно настоящему изобретению мощно индуцирует пропуск "экзона 2" HIF-1α в клетках даже с комплементарным перекрывающимся участком не больше 10-мера с 3'-сайтом сплайсинга "экзона 2".
Формулы I
Формулы I
Указанное соединение обладает очень высокой аффинностью с целевой последовательностью пре-мРНК HIF-1α с полной комплементарностью. Даже в том случае, если соединение  имеет одно или два некомплементарных основания с целевой последовательностью пре-мРНК HIF-1α, соединение ПНК все еще способно прочно связываться с целевой последовательностью пре-мРНК и прерывает процесс сплайсинга, поскольку аффинность между указанным соединением и целевой последовательностью пре-мРНК HIF-1α является достаточно высокой, несмотря на присутствие некомплементарного основания(й). Даже если 14-мерное производное ПНК  обладает только 12-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 14-мерной последовательностью пре-мРНК HIF-1α, например,  14-мерное соединение все еще способно индуцировать пропуск "экзона 2" HIF-1α, несмотря на два некомплементарных основания с целевой 14-мерной последовательностью пре-мРНК. Тем не менее, желательно исключить присутствие слишком большого количества некомплементарных оснований с целевой последовательностью пре-мРНК, чтобы избежать нецелевого связывания с другими пре-мРНК.
Формулы I
Химические структуры природных или неприродных нуклеиновых оснований, которые могут применяться в производном ПНК , представлены ниже.
Формулы I
Формулы I
Природные (т.е. существующие в природе) или неприродные (т.е. не существующие в природе) нуклеиновые основания настоящего изобретения включают, без ограничения перечисленными, нуклеиновые основания, представленные выше. Предоставление таких природных или неприродных нуклеиновых оснований служит для иллюстрации разнообразия допустимых в соединении  нуклеиновых оснований и, следовательно, не должно интерпретироваться как ограничение объема настоящего изобретения. Специалист в данной области может легко выяснить, что вариации природных или неприродных нуклеиновых оснований возможны для определенных положений в соединении ПНК , при условии, что такие вариации соответствуют требованиям комплементарности с последовательностью целевой пре-мРНК согласно настоящему изобретению.
Формулы I
Примеры заместителей, используемых для описания производного ПНК , представлены в настоящем документе. Примеры замещенных или незамещенных алкильных радикалов представлены ниже.
Примеры замещенных или незамещенных алкилацильных и замещенных или незамещенных арилацильных радикалов представлены ниже.
Примеры замещенных или незамещенных алкиламино, замещенных или незамещенных ариламино, замещенных или незамещенных арильных и замещенных или незамещенных алкилсульфонильных или арилсульфонильных радикалов представлены ниже.
Примеры замещенных или незамещенных алкилоксикарбонильных, замещенных или незамещенных арилоксикарбонильных, замещенных или незамещенных алкиламинокарбонильных, замещенных или незамещенных ариламинокарбонильных радикалов представлены ниже.
Примеры замещенных или незамещенных алкиламинотиокарбонильных, замещенных или незамещенных ариламинотиокарбонильных, замещенных или незамещенных алкилокситиокарбонильных и замещенных или незамещенных арилокситиокарбонильных радикалов представлены ниже.
Формулы I
Представление таких примерных заместителей служит для иллюстрирования разнообразных допустимых заместителей для соединения  и, таким образом, не должно интерпретироваться как ограничение объема настоящего изобретения. Специалист в данной области может легко выяснить, что последовательность олигонуклеотида ПНК является более важным фактором для сиквенс-специфического связывания указанного олигонуклеотида ПНК с целевой последовательностью пре-мРНК по сравнению с заместителями на N-конце или C-конце.
Формулы I
Формулы I
Формулы I
Соединение ПНК  обладает хорошей клеточной проницаемостью и может быть с легкостью доставлено в клетку при обработке в виде "голого" олигонуклеотида, как показано в предшествующем уровне техники [PCT/KR2009/001256]. Таким образом, соединение настоящего изобретения индуцирует пропуск "экзона 2" в пре-мРНК HIF-1α с получением сплайс-варианта(ов) мРНК HIF-1α без "экзон 2" HIF-1α в клетках, обработанных указанным соединением в виде "голого" олигонуклеотида. Клетки, обработанные соединением  в виде "голого" олигонуклеотида, экспрессируют более низкий уровень полноразмерной мРНК и белка HIF-1α, чем клетки без обработки указанным соединением ПНК. Аналогичным образом, соединение  ингибирует экспрессию HIF-1α в тканях солидной опухоли при системном введении в виде "голого олигонуклеотида". Таким образом, указанное соединение может применяться для лечения солидных опухолей или нарушений, включающих избыточную экспрессию HIF-1α.
Формулы I
Формулы I
Соединение  не требует инвазивной лекарственной формы для увеличения системной доставки в целевую ткань для предполагаемой терапевтической или биологической активности. Обычно соединение  растворяют в PBS (фосфатно-солевом буферном растворе) или солевом растворе и вводят системно для проявления требуемой терапевтической (т.е. противоопухолевой) или биологической активности в целевых тканях.
Формулы I
Производное ПНК  может применяться в комбинации или в лекарственной форме с фармацевтически приемлемой кислотой или основанием, включающими, без ограничения перечисленными, гидроксид натрия, гидроксид калия, соляную кислоту, метансульфоновую кислоту, лимонную кислоту, трифторуксусную кислоту и т.д.
Формулы I
Соединение ПНК  или его фармацевтически приемлемую соль могут вводить субъекту в комбинации с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом, включающим, без ограничения перечисленными, лимонную кислоту, соляную кислоту, винную кислоту, стеариновую кислоту, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, этанол, изопропанол, бикарбонат натрия, дистиллированную воду, консервант(ы) и т.д.
Соединение настоящего изобретения могут системно вводить субъекту в терапевтически эффективной дозе в пределах от 1 фмоль/кг до более чем 1 нмоль/кг, которая может изменяться в зависимости от схемы применения, условий или ситуаций у субъекта и т.д.
Соединение настоящего изобретения могут наружно применять у субъекта в терапевтически эффективной концентрации в пределах от 1 аМ до более чем 1 нМ, которая может изменяться в зависимости от схемы применения, условий или ситуаций у субъекта и т.д.
Формулы I
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено производное ПНК  или его фармацевтически приемлемая соль:
где
n является целым числом от 10 до 26;
Формулы I
соединение  обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 14-мерной последовательностью РНК [(5'→3') UAAGUAGGAUAAGU] в пре-мРНК HIF-1α человека;
Формулы I
соединение  полностью комплементарно целевой последовательности пре-мРНК HIF-1α или частично комплементарно целевой последовательности пре-мРНК HIF-1α с одним или двумя некомплементарными основаниями;
1
2
n-1
n
1
2
n-1
n
S, S,..., S, S, T, T,..., T и T независимо представляют собой дейтеридо, гидридо, замещенный или незамещенный алкильный или замещенный или незамещенный арильный радикал;
2
X и Y независимо представляют собой гидридо [H], формильный [H-C(=O)-], аминокарбонильный [NH-C(=O)-], замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный, замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный арилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный алкиламинокарбонильный, замещенный или незамещенный ариламинокарбонильный, замещенный или незамещенный алкилсульфонильный, замещенный или незамещенный арилсульфонильный радикал;
2
Z представляет собой гидрокси, замещенный или незамещенный алкилокси, замещенный или незамещенный арилокси, амино [-NH], замещенный или незамещенный алкиламино, замещенный или незамещенный ариламино, замещенный или незамещенный алкильный или замещенный или незамещенный арильный радикал;
1
2
n-1
n
B, B,..., B и B независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований; и
1
2
n-1
n
по меньшей мере четыре из B, B,..., B и B независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, где замещенный или незамещенный аминорадикал ковалентно связан с молекулой нуклеинового основания.
Формулы I
Предпочтительным является производное ПНК  или его фармацевтически приемлемая соль:
где
n является целым числом от 10 до 26;
Формулы I
соединение  обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 14-мерной последовательностью РНК [(5'→3') UAAGUAGGAUAAGU] в пре-мРНК HIF-1α человека;
Формулы I
соединение  полностью комплементарно целевой последовательности пре-мРНК HIF-1α или частично комплементарно целевой последовательности пре-мРНК HIF-1α с одним или двумя некомплементарными основаниями;
1
2
n-1
n
1
2
n-1
n
S, S,..., S, S, T, T,..., T и T независимо представляют собой дейтеридо, гидридо, замещенный или незамещенный алкильный или замещенный или незамещенный арильный радикал;
X и Y независимо представляют собой гидридо, формильный, аминокарбонильный, замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный, замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный арилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный алкиламинокарбонильный, замещенный или незамещенный ариламинокарбонильный, замещенный или незамещенный алкилсульфонильный, замещенный или незамещенный арилсульфонильный радикал;
2
Z представляет собой гидрокси, замещенный или незамещенный алкилокси, замещенный или незамещенный арилокси, амино [-NH], замещенный или незамещенный алкиламино, замещенный или незамещенный ариламино, замещенный или незамещенный алкильный или замещенный или незамещенный арильный радикал;
1
2
n-1
n
B, B,..., B и B независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований; и
1
2
n-1
n
Формулой II
Формулой III
Формулой IV
по меньшей мере три из B, B,..., B и B независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных ,  или :
где
1
2
3
4
5
6
R, R, R, R, R и R независимо выбраны из замещенного или незамещенного алкильного, гидридо, гидрокси и замещенного или незамещенного алкилоксирадикала; и
1
2
3
Формулой V
L, L и L являются ковалентным линкером, представленным , соединяющей основную аминогруппу с группой, ответственной за свойства спаривания нуклеинового основания:
где
1
m
2
m
Q и Q являются замещенным или незамещенным метиленовым (-CH-) радикалом, и Q непосредственно связан с основной аминогруппой;
2
3
m-1
Q, Q,... и Q независимо выбраны из замещенного или незамещенного метилена, кислорода (-O-), серы (-S-) и замещенного или незамещенного аминорадикала [-N(H)- или -N(заместитель)-]; и
m является целым числом от 1 до 16.
Формулы I
Интерес представляет олигомер ПНК  или его фармацевтически приемлемая соль:
где
n является целым числом от 11 до 23;
Формулы I
соединение  обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 14-мерной последовательностью РНК [(5'→3') UAAGUAGGAUAAGU] в пре-мРНК HIF-1α человека;
Формулы I
соединение  полностью комплементарно целевой последовательности пре-мРНК HIF-1α или частично комплементарно целевой последовательности пре-мРНК HIF-1α с одним или двумя некомплементарными основаниями;
1
2
n-1
n
1
2
n-1
n
S, S,..., S, S, T, T,..., T и T независимо представляют собой гидридорадикал;
X и Y независимо представляют собой гидридо, замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный, замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный, замещенный или незамещенный алкиламинокарбонильный, замещенный или незамещенный ариламинокарбонильный, замещенный или незамещенный алкилсульфонильный, замещенный или незамещенный арилсульфонильный радикал;
Z представляет собой амино или замещенный или незамещенный алкиламинорадикал;
1
2
n-1
n
B, B,..., B и B независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований; и,
1
2
n-1
n
Формулой II
Формулой III
Формулой IV
по меньшей мере четыре из B, B,..., B и B независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных ,  или ;
1
2
3
4
5
6
R, R, R, R, R и R независимо выбраны из замещенного или незамещенного алкильного и гидридорадикала;
1
m
m
Q и Q являются замещенным или незамещенным метиленовым радикалом, и Q непосредственно связан с основной аминогруппой;
2
3
m-1
Q, Q,... и Q независимо выбраны из замещенного или незамещенного метилена, кислорода (-O-) и аминорадикала [-N(H)-]; и
m является целым числом от 1 до 11.
Формулы I
Особый интерес представляет производное ПНК  или его фармацевтически приемлемая соль:
где
n является целым числом от 11 до 21;
Формулы I
соединение  обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 14-мерной последовательностью РНК [(5'→3') UAAGUAGGAUAAGU] в пре-мРНК HIF-1α человека;
Формулы I
соединение  полностью комплементарно целевой последовательности пре-мРНК HIF-1α;
1
2
n-1
n
1
2
n-1
n
S, S,..., S, S, T, T,..., T и T независимо представляют собой гидридорадикал;
X и Y независимо представляют собой гидридо, замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный арильный, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный, замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный радикал;
Z представляет собой амино или замещенный или незамещенный алкиламинорадикал;
1
2
n-1
n
B, B,..., B и B независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин и цитозин, и неприродных нуклеиновых оснований; и
1
2
n-1
n
Формулой II
Формулой III
Формулой IV
по меньшей мере четыре из B, B,..., B и B независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных ,  или ;
1
2
3
4
5
6
R, R, R, R, R и R независимо выбраны из замещенного или незамещенного алкильного и гидридорадикала;
1
m
m
Q и Q являются метиленовым радикалом, и Q непосредственно связан с основной аминогруппой;
2
3
m-1
Q, Q,... и Q независимо выбраны из замещенного или незамещенного метиленового и кислородного радикала; и
m является целым числом от 1 и 9.
Формулы I
Высокий интерес представляет олигомер ПНК  или его фармацевтически приемлемая соль:
где
n является целым числом от 12 до 19;
Формулы I
соединение  обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 14-мерной последовательностью РНК [(5'→3') UAAGUAGGAUAAGU] в пре-мРНК HIF-1α человека;
Формулы I
соединение  полностью комплементарно целевой последовательности пре-мРНК HIF-1α;
1
2
n-1
n
1
2
n-1
n
S, S,..., S, S, T, T,..., T и T независимо представляют собой гидридорадикал;
X и Y независимо представляют собой гидридо, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный или замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный радикал;
Z представляет собой амино или замещенный или незамещенный алкиламинорадикал;
1
2
n-1
n
B, B,..., B и B независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин и цитозин, и неприродных нуклеиновых оснований; и,
1
2
n-1
n
Формулой II
Формулой III
Формулой IV
по меньшей мере четыре из B, B,..., B и B независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных ,  или ;
1
2
3
4
5
6
R, R, R, R, R и R независимо выбраны из замещенного или незамещенного алкильного и гидридорадикала;
1
m
m
Q и Q являются метиленовым радикалом, и Q непосредственно связан с основной аминогруппой;
2
3
m-1
Q, Q,... и Q независимо выбраны из метиленового и кислородного радикала; и
m является целым числом от 1 до 9.
Формулы I
Более высокий интерес представляет производное ПНК  или его фармацевтически приемлемая соль:
где
n является целым числом от 12 до 19;
Формулы I
соединение  обладает по меньшей мере 11-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 14-мерной последовательностью РНК [(5'→3') UAAGUAGGAUAAGU] в пре-мРНК HIF-1α человека;
Формулы I
соединение  полностью комплементарно целевой последовательности пре-мРНК HIF-1α;
1
2
n-1
n
1
2
n-1
n
S, S,..., S, S, T, T,..., T и T независимо представляют собой гидридорадикал;
X и Y независимо представляют собой гидридо, замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный или замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный радикал;
Z представляет собой амино или замещенный или незамещенный алкиламинорадикал;
1
2
n-1
n
B, B,..., B и B независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин и цитозин, и неприродных нуклеиновых оснований; и
1
2
n-1
n
Формулой II
Формулой III
Формулой IV
по меньшей мере четыре из B, B,..., B и B независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных ,  или ;
1
2
3
4
5
6
R, R, R, R, R и R являются гидридорадикалом;
1
m
m
Q и Q являются метиленовым радикалом, и Q непосредственно связан с основной аминогруппой;
2
3
m-1
Q, Q,... и Q независимо выбраны из метиленового и кислородного радикала; и
m является целым числом от 1 до 8.
Формулы I
Наибольший интерес представляет производное ПНК  или его фармацевтически приемлемая соль:
где
n является целым числом от 12 до 19;
Формулы I
соединение  обладает по меньшей мере 12-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 14-мерной последовательностью РНК [(5'→3') UAAGUAGGAUAAGU] в пре-мРНК HIF-1α человека;
Формулы I
соединение  полностью комплементарно целевой последовательности пре-мРНК HIF-1α;
1
2
n-1
n
1
2
n-1
n
S, S,..., S, S, T, T,..., T и T независимо представляют собой гидридорадикал;
X является гидридорадикалом;
Y представляет собой замещенный или незамещенный алкилацильный, замещенный или незамещенный арилацильный или замещенный или незамещенный алкилоксикарбонильный радикал;
Z представляет собой амино или замещенный или незамещенный алкиламинорадикал;
1
2
n-1
n
B, B,..., B и B независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин и цитозин, и неприродных нуклеиновых оснований;
1
2
n-1
n
Формулой II
Формулой III
Формулой IV
по меньшей мере четыре из B, B,..., B и B независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных ,  или ;
1
2
3
4
5
6
R, R, R, R, R и R являются гидридорадикалом;
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
4
2
2
5
2
2
6
2
2
7
L представляет собой -(CH)-O-(CH)-, -CH-O-(CH)-, -CH-O-(CH)-, -CH-O-(CH)-, -CH-O-(CH)-, -CH-O-(CH)- или -CH-O-(CH)-, правый конец которого непосредственно связан с основной аминогруппой; и
2
3
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
3
2
2
2
3
2
4
2
5
2
6
2
7
2
8
L и L независимо выбраны из -(CH)-O-(CH)-, -(CH)-O-(CH)-, -(CH)-O-(CH)-, -(CH)-, -(CH)-, -(CH)-, -(CH)-, -(CH)-, -(CH)- и -(CH)-, правый конец которых непосредственно связан с основной аминогруппой.
Формулы I
Определенный интерес представляет производное ПНК , которое выбрано из группы соединений, представленных ниже, или его фармацевтически приемлемая соль:
2
(N→C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH;
2
(N→C) Fmoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH;
2
(N→C) H-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O3)-TA(5)-NH;
2
(N→C) Ac-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH;
2
(N→C) Piv-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH;
2
(N→C) Бензоил-CA(5)G(2O3)-AA(5)C-TTA(4)-TCC(1O2)-TA(5)-NH;
2
(N→C) н-Пропил-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(2O2)-TA(5)-NH;
2
(N→C) Бензил-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH;
2
(N→C) п-Толуолсульфонил-CA(5)G-AA(5)C-TTA(2O2)-TCC(1O2)-TA(5)-NH;
2
(N→C) [N-(2-Фенилэтил)амино]карбонил-CA(5)G(3)-AA(5)C-TTA(3)-TCC(1O2)-TA(5)-NH;
2
(N→C) Fethoc-Lys-Leu-CA(5)G(2O2)-AA(5)C-TTA(8)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH;
2
(N→C) N-Ph-N-Me-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH;
2
(N→C) Piv-HEX-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH;
2
(N→C) FAM-HEX-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH;
2
(N→C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH;
2
(N→C) Fethoc-G(5)AA(5)-CTT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH;
2
(N→C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-CT-NH;
2
(N→C) Fethoc-G(5)AA(6)-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)T-NH;
2
(N→C) Fethoc-GA(2O2)A-C(1O5)TT-A(3)TC-CTA(5)-C(1O3)T-NH;
2
(N→C) Бензоил-Gly-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH;
2
(N→C) Fethoc-Arg-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-Gly-NH;
2
(N→C) Fethoc-Val-GA(5)A-CTT-A(6)TC-CTA(5)-C(2O2)T-Gly-Lys-NH;
2
(N→C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH;
2
(N→C) Fethoc-A(5)GA-AC(1O2)T-TG(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH;
2
(N→C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-CA-NH;
2
(N→C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-AT-NH;
2
(N→C) Piv-Lys-AA(6)C-TTA(6)-TCC(1O2)-TA(6)C-TTA(5)-Val-NH;
2
(N→C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-CA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH;
2
(N→C) Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH;
2
(N→C) Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH;
2
(N→C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH;
2
(N→C) Piv-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC-NH;
2
(N→C) Fethoc-TTC(1O5)-AG(5)A-A(4)CT-TA(5)T-CC(2O2)T-A(6)CT-TA(6)A-C-NH;
2
(N→C) Fethoc-G-TTC(1O5)-AG(5)A-A(4)CT-TA(5)T-CC(1O2)T-AC(1O5)T-TA(6)A-C-NH; и
2
(N→C) Fethoc-TTC(1O5)-AG(5)A-A(4)CT-TA(5)T-CCT-AC(1O5)T-TAA-CA(2O2)A-NH:
где
A, G, T и C являются мономерами ПНК с природным нуклеиновым основанием, аденином, гуанином, тимином и цитозином, соответственно;
Формулой VI
Формулой VII
Формулой VIII
Формулой IX
Формулой X
C(pOq), A(p), A(pOq), G(p) и G(pOq) являются мономерами ПНК с неприродным нуклеиновым основанием, представленным , , ,  и , соответственно;
где
p и q являются целыми числами; и
2
сокращенные обозначения N- и C-концевых заместителей являются такими, как конкретно описано далее: "Fmoc-" является сокращенным обозначением "[(9-флуоренил)метилокси]карбонила-"; "Fethoc-" - "[2-(9-флуоренил)этил-1-окси]карбонила"; "Ac-" - "ацетила-"; "Бензоил-" - "бензолкарбонила-"; "Piv-" - "пивалоила-"; "н-Пропил-" - "1-(н-пропила)-"; "H-" - "гидридо-" группы; "п-Толуолсульфонил" - "(4-метилбензол)-1-сульфонила"; "-Lys-" - остатка аминокислоты "лизина"; "-Val-" - остатка аминокислоты "валина"; "-Leu-" - остатка аминокислоты "лейцина"; "-Arg-" - остатка аминокислоты "аргинина"; "-Gly-" - остатка аминокислоты "глицина"; "[N-(2-Фенилэтил)амино]карбонил-" - "[N-1-(2-фенилэтил)амино]карбонила-"; "Бензил-" - "1-(фенил)метила-"; "Фенил-" - "фенила-"; "Me-" - "метила-"; "-HEX-" - "6-амино-1-гексаноила-", "FAM-" - "5 или 6-флуоресцеин-карбонила- (изомерной смеси)" и "-NH" - незамещенной "-амино" группы.
Формулы I
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено производное ПНК  или его фармацевтически приемлемая соль:
где
Формулы I
соединение  обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 20-мерной последовательностью РНК [(5'→3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU], частью пре-мРНК HIF-1α человека;
n является целым числом от 10 до 26;
1
2
n-1
n
1
2
n-1
n
S, S,..., S, S, T, T,..., T и T независимо представляют собой гидридо, замещенный или незамещенный алкильный или замещенный или незамещенный арильный радикал;
X и Y независимо представляют собой гидридо, замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный ацильный, замещенный или незамещенный сульфонильный или замещенный или незамещенный арильный радикал;
Z представляет собой гидридо, гидрокси, замещенный или незамещенный алкилокси, замещенный или незамещенный арилокси, замещенный или незамещенный аминорадикал;
1
2
n-1
n
B, B,..., B и B независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований; и,
1
2
n-1
n
по меньшей мере три из B, B,..., B и B независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, где замещенный или незамещенный аминорадикал ковалентно связан с группой, ответственной за свойства спаривания нуклеинового основания.
Формулы I
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено производное ПНК  или его фармацевтически приемлемая соль:
где
Формулы I
соединение  обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 20-мерной последовательностью РНК [(5'→3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU], частью пре-мРНК HIF-1α человека;
n является целым числом от 10 до 26;
1
2
n-1
n
1
2
n-1
n
S, S,..., S, S, T, T,..., T и T независимо представляют собой гидридорадикал;
X и Y независимо представляют собой гидридо, замещенный или незамещенный алкильный, замещенный или незамещенный ацильный, замещенный или незамещенный сульфонильный или замещенный или незамещенный арильный радикал;
Z представляет собой гидридо, гидрокси, замещенный или незамещенный алкилокси, замещенный или незамещенный арилокси, замещенный или незамещенный аминорадикал;
1
2
n-1
n
B, B,..., B и B независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований;
1
2
n-1
n
Формулой II
Формулой III
Формулой IV
по меньшей мере три из B, B,..., B и B независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных ,  или :
где
1
2
3
4
5
6
R, R, R, R, R и R независимо выбраны из замещенного или незамещенного алкильного, гидридо, гидрокси и замещенного или незамещенного алкилоксирадикала; и
1
2
3
Формулой V
L, L и L являются ковалентным линкером, представленным , соединяющим основную аминогруппу с группой, ответственной за свойства спаривания нуклеинового основания:
где
1
m
2
m
Q и Q являются замещенным или незамещенным метиленовым (-CH-) радикалом, и Q непосредственно связан с основной аминогруппой;
2
3
m-1
Q, Q,... и Q независимо выбраны из замещенного или незамещенного метилена, кислорода (-O-), серы (-S-) и замещенного или незамещенного амино радикала [-N(H)- или -N(заместитель)-]; и
m является целым числом от 1 до 16.
Формулы I
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено производное ПНК  или его фармацевтически приемлемая соль:
где
Формулы I
соединение  обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 20-мерной последовательностью РНК [(5'→3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU], частью пре-мРНК HIF-1α человека;
n является целым числом от 11 до 21;
1
2
n-1
n
1
2
n-1
n
S, S,..., S, S, T, T,..., T и T являются гидридорадикалом;
X и Y независимо выбраны из гидридо, замещенного или незамещенного алкильного и замещенного или незамещенного ацильного радикала;
Z представляет собой гидрокси или замещенный или незамещенный аминорадикал;
1
2
n-1
n
B, B,..., B и B независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований;
1
2
n-1
n
Формулой II
Формулой III
Формулой IV
по меньшей мере четыре из B, B,..., B и B независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных ,  или ;
1
2
3
4
5
6
R, R, R, R, R и R независимо выбраны из замещенного или незамещенного алкильного и гидридорадикала;
1
m
m
Q и Q являются замещенным или незамещенным метиленовым радикалом, и Q непосредственно связан с основной аминогруппой;
2
3
m-1
Q, Q,... и Q независимо выбраны из замещенного или незамещенного метиленового, кислородного и аминорадикала; и
m является целым числом от 1 до 11.
Формулы I
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено производное ПНК  или его фармацевтически приемлемая соль:
где
Формулы I
соединение  обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 20-мерной последовательностью РНК [(5'→3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU], частью пре-мРНК HIF-1α человека;
n является целым числом от 11 до 19;
1
2
n-1
n
1
2
n-1
n
S, S,..., S, S, T, T,..., T и T являются гидридорадикалом;
X и Y независимо выбраны из гидридо и замещенного или незамещенного ацильного радикала;
Z представляет собой замещенный или незамещенный аминорадикал; и
1
2
n-1
n
B, B,..., B и B независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований;
1
2
n-1
n
Формулой II
Формулой III
Формулой IV
по меньшей мере четыре из B, B,..., B и B независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных ,  или ;
1
2
3
4
5
6
R, R, R, R, R и R независимо выбраны из замещенного или незамещенного алкильного и гидридорадикала;
1
m
m
Q и Q являются метиленовым радикалом, и Q непосредственно связан с основной аминогруппой;
2
3
m-1
Q, Q,... и Q независимо выбраны из метиленового, кислородного и аминорадикала; и
m является целым числом от 1 до 9.
Формулы I
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено производное ПНК  или его фармацевтически приемлемая соль:
где
Формулы I
соединение  обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 20-мерной последовательностью РНК [(5'→3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU], частью пре-мРНК HIF-1α человека;
n является целым числом от 11 до 19;
1
2
n-1
n
1
2
n-1
n
S, S,..., S, S, T, T,..., T и T являются гидридорадикалом;
X и Y независимо выбраны из гидридо и замещенного или незамещенного ацильного радикала;
Z представляет собой замещенный или незамещенный аминорадикал;
1
2
n-1
n
B, B,..., B и B независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включающих аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и неприродных нуклеиновых оснований;
1
2
n-1
n
Формулой II
Формулой III
Формулой IV
по меньшей мере четыре из B, B,..., B и B независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных ,  или ;
1
3
5
2
4
6
R, R и R являются гидридорадикалом, а R, R и R независимо представляют собой гидридо или замещенный или незамещенный алкильный радикал;
1
m
m
Q и Q являются метиленовым радикалом, и Q непосредственно связан с основной аминогруппой;
2
3
m-1
Q, Q,... и Q независимо выбраны из метиленового, кислородного радикала; и
m является целым числом от 1 до 9.
Формулы I
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено производное ПНК  или его фармацевтически приемлемая соль:
где
Формулы I
соединение  обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 20-мерной последовательностью РНК [(5'→3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU], частью пре-мРНК HIF-1α человека;
n является целым числом от 11 до 19;
1
2
n-1
n
1
2
n-1
n
S, S,..., S, S, T, T,..., T и T являются гидридорадикалом;
X и Y независимо выбраны из гидридо и замещенного или незамещенного ацильного радикала;
Z представляет собой замещенный или незамещенный аминорадикал;
1
2
n-1
n
B, B,..., B и B независимо выбраны из аденина, тимина, гуанина, цитозина и неприродных нуклеиновых оснований;
1
2
n-1
n
Формулой II
Формулой III
Формулой IV
по меньшей мере четыре из B, B,..., B и B независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных ,  или ;
1
2
3
4
5
6
R, R, R, R, R и R являются гидридорадикалом;
1
m
m
Q и Q являются метиленовым радикалом, и Q непосредственно связан с основной аминогруппой;
2
3
m-1
Q, Q,... и Q независимо выбраны из метиленового и кислородного радикала; и
m является целым числом от 1 до 8.
Формулы I
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено производное ПНК  или его фармацевтически приемлемая соль:
где
Формулы I
соединение  обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 20-мерной последовательностью РНК [(5'→3') UGUUAAGUAGGAUAAGUUCU], частью пре-мРНК HIF-1α человека;
n является целым числом от 11 до 17;
1
2
n-1
n
1
2
n-1
n
S, S,..., S, S, T, T,..., T и T являются гидридорадикалом;
X является гидридорадикалом;
Y представляет собой замещенный или незамещенный ацильный радикал;
Z представляет собой замещенный или незамещенный аминорадикал;
1
2
n-1
n
B, B,..., B и B независимо выбраны из аденина, тимина, гуанина, цитозина и неприродных нуклеиновых оснований;
1
2
n-1
n
Формулой II
Формулой III
Формулой IV
по меньшей мере четыре из B, B,..., B и B независимо выбраны из неприродных нуклеиновых оснований, представленных ,  или ;
1
2
3
4
5
6
R, R, R, R, R и R являются гидридорадикалом;
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
L представляет собой -(CH)-O-(CH)-, -CH-O-(CH)- или -CH-O-(CH)-, правый конец которого непосредственно связан с основной аминогруппой; и
2
3
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
3
2
2
2
3
2
4
2
5
2
6
2
7
2
8
L и L независимо выбраны из -(CH)-O-(CH)-, -(CH)-O-(CH)-, -(CH)-O-(CH)-, -(CH)-, -(CH)-, -(CH)-, -(CH)-, -(CH)-, -(CH)- и -(CH)-, правый конец которых непосредственно связан с основной аминогруппой.
Формулы I
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено производное ПНК , которое выбрано из группы соединений, представленных ниже, или его фармацевтически приемлемая соль:
2
(N→C) Fethoc-CTT-A(6)TC(1O5)-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC-NH;
2
(N→C) Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC(1O5)-A-NH;
2
(N→C) Fethoc-CA(5)T-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC(1O5)-A-NH;
2
(N→C) Fethoc-CG(6)T-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC(1O5)-A-NH;
2
(N→C) Fethoc-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T-TA(5)A-C-NH;
2
(N→C) Fethoc-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC-NH;
2
(N→C) Piv-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T-TA(5)A-C-NH;
2
(N→C) Бензоил-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T-TA(5)A-C-NH;
2
(N→C) Fethoc-Lys-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T-TA(5)A-C-NH;
2
(N→C) Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH;
2
(N→C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH;
2
(N→C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH;
2
(N→C) Fethoc-AG(5)A-A(2O2)CT-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA-NH;
2
(N→C) Piv-AG(5)A-A(2O2)CT-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA-NH;
2
(N→C) Ac-AG(5)A-A(2O3)CT-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA-NH;
2
(N→C) Fethoc-A(5)GA(5)-AC(1O3)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(4)-NH;
2
(N→C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH;
2
(N→C) Fethoc-G(5)AA(5)-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH;
2
(N→C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-Lys-NH;
2
(N→C) Бензоил-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH;
2
(N→C) Ac-HEX-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH;
2
(N→C) Fmoc-Gly-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH;
2
(N→C) Me-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH;
2
(N→C) Бензил-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH;
2
(N→C) Fethoc-G(5)AA(5)-CTT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH;
2
(N→C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-CT-NH;
2
(N→C) Fethoc-G(5)AA(6)-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)T-NH; and
2
(N→C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH:
где
A, G, T и C являются мономерами ПНК с природным нуклеиновым основанием, аденином, гуанином, тимином и цитозином, соответственно;
Формулой VI
Формулой VII
Формулой VIII
Формулой IX
Формулой X
C(pOq), A(p), A(pOq), G(p) и G(pOq) являются мономерами ПНК с неприродным нуклеиновым основанием, представленным , , ,  и , соответственно;
где
p и q являются целыми числами; и
сокращенные обозначения N- и C-концевых заместителей являются такими, как конкретно описано далее: "Fmoc-" является сокращенным обозначением "[(9-флуоренил)метилокси]карбонила-"; "Fethoc-" - "[2-(9-флуоренил)этил-1-окси]карбонила"; "Ac-" - "ацетила-"; "Бензоил-" - "бензолкарбонила-"; "Piv-" - "пивалоила-"; "н-пропил-" - "1-(н-пропила)-"; "-Lys-" - остатка аминокислоты "лизина"; "-Val-" - остатка аминокислоты "валина"; "-Leu-" - остатка аминокислоты "лейцина"; "-Arg" - остатка аминокислоты "аргинина"; "-Gly-" - остатка аминокислоты "глицина"; "Бензил-" - "1-(фенил)метила-"; "Фенил-" - "фенила-"; "Me-" - "метила-".
Химические структуры мономеров ПНК, сокращенно обозначенных A, G, T, C, C(pOq), A(p), A(pOq), G(p) и G(pOq), коллективно представлены ниже. Как обсуждается в предшествующем уровне техники [PCT/KR2009/001256], C(pOq) рассматривается в качестве модифицированного мономера ПНК, соответствующего "цитозину" из-за его предпочтительной гибридизации с "гуанином". A(p) и A(pOq) взяты в качестве модифицированных мономеров ПНК, выступающих в качестве "аденина" из-за их высокой аффинности к "тимину". Аналогичным образом, G(p) и G(pOq) считаются модифицированными мономерами ПНК, эквивалентными "гуанину" из-за их эффективного спаривания с "цитозином".
Формулы I
Химические структуры различных сокращенных обозначений заместителей, используемых для диверсификации N-конца или C-конца производного ПНК  в настоящем изобретении, представлены ниже.
2
Для иллюстрации сокращенных обозначений производных ПНК, химическая структура 14-мерного производного ПНК, сокращенно обозначенного "(N→C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2) T-NH", представлена ниже.
2
В качестве другой иллюстрации, химическая структура 15-мерного производного ПНК, сокращенно обозначенного "(N→C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-А(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH", представлена ниже.
2
14-мерное производное ПНК, сокращенно обозначенное "(N→C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH", эквивалентно последовательности ДНК "(5'→3') CAG-AAC-TTA-TCC-TA" для комплементарного связывания с пре-мРНК. 14-мерная ПНК обладает 14-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 30-мерной последовательностью пре-мРНК  охватывающей соединение интрона 1 и экзона 2 в пре-мРНК HIF-1α человека, при этом комплементарные спаренные основания выделены "полужирным" и "подчеркнуты" в .
2
15-мерное производное ПНК, сокращенно обозначенное "(N→C) Fethoc-CTC(1O2)-А(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH", эквивалентно последовательности ДНК "(5'→3') CAA-TTC-ATC-CTA-CTC" для комплементарного связывания с пре-мРНК. 15-мерная ПНК обладает 15-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 30-мерной последовательностью пре-мРНК HIF-1α человека  при этом комплементарные спаренные основания выделены "полужирным" и "подчеркнуты" в
2
15-мерная последовательность ПНК "(N→C) Piv-Lys-AA(6)C-TTA(6)-TCC(1O2)-TA(6)C-TTA(5)-Val-NH" эквивалентна последовательности ДНК "(5'→3') AAT-CAT-CCT-AAT-CAA" для комплементарного связывания с пре-мРНК. 15-мерная ПНК обладает 15-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с 30-мерной последовательностью пре-мРНК HIF-1α человека  при этом комплементарные спаренные основания выделены "полужирным" и "подчеркнуты" в
2
Формулы I
Формулы I
17-мерное производное ПНК, сокращенно обозначенное "(N→C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-CA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH", эквивалентна последовательности ДНК "(5'→3') AGA-ACT-CAT-CCT-ACT-TA" для комплементарного связывания с пре-мРНК. 17-мерная ПНК обладает 16-мерным комплементарным перекрывающимся участком и одним некомплементарным основанием в сравнении с 30-мерной последовательностью пре-мРНК HIF-1α человека [(5'→3')  Комплементарные спаренные основания выделены "полужирным" и "подчеркнуты", а одиночное некомплементарное основание отмечено знаком кавычек (" "), как в  Несмотря на присутствие одиночного некомплементарного основания, эта 17-мерная ПНК отвечает структурным требованиям для соединения . Таким образом, 17-мерное производное ПНК относится к соединению .
Формулы I
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено производное ПНК , которое выбрано из группы определенных соединений, включенных в список ниже, или его фармацевтически приемлемая соль:
2
(N→C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH;
2
(N→C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH;
2
(N→C) Fethoc-G(5)AA(5)-CTT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH;
2
(N→C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-CT-NH;
2
(N→C) Fethoc-G(5)AA(6)-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)T-NH;
2
(N→C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH;
2
(N→C) Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH;
2
(N→C) Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH;
2
(N→C) Piv-Lys-AA(6)C-TTA(6)-TCC(1O2)-TA(6)C-TTA(5)-Val-NH;
2
(N→C) Бензоил-CA(5)G(2O3)-AA(5)C-TTA(4)-TCC(1O2)-TA(5)-NH; и
2
(N→C) п-Толуолсульфонил-CA(5)G-AA(5)C-TTA(2O2)-TCC(1O2)-TA(5)-NH.
Формулы I
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено производное ПНК , которое выбрано из группы определенных соединений, включенных в список ниже, или его фармацевтически приемлемая соль:
2
(N→C) Fethoc-CTT-A(6)TC(1O5)-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC-NH;
2
(N→C) Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC(1O5)-A-NH;
2
(N→C) Fethoc-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T-TA(5)A-C-NH;
2
(N→C) Fethoc-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC-NH;
2
(N→C) Piv-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T-TA(5)A-C-NH;
2
(N→C) Fethoc-Lys-AC(1O2)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)C(1O2)T-TA(5)A-C-NH;
2
(N→C) Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH;
2
(N→C) Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH;
2
(N→C) Piv-AG(5)A-A(2O2)CT-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA-NH;
2
(N→C) Fethoc-A(5)GA(5)-AC(1O3)T-TA(5)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(4)-NH;
2
(N→C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH;
2
(N→C) Бензоил-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH;
2
(N→C) Fethoc-G(5)AA(5)-CTT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH;
2
(N→C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-CT-NH;
2
(N→C) Fethoc-G(5)AA(6)-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)T-NH; и
2
(N→C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH:
Подробное описание изобретения
Общие методики получения олигомеров ПНК
18
Олигомеры ПНК синтезировали с помощью твердофазного синтеза пептидов (ТФСП) на основе Fmoc-химии, согласно способу, раскрытому в предшествующем уровне техники [US6,133,444; WO96/40685], с небольшими, но важными модификациями. В этом исследовании в качестве твердой подложки использовали H-Rink Amide-ChemMatrix, приобретенную в PCAS BioMatrix Inc. (Quebec, Canada). Мономеры Fmoc-ПНК с модифицированным нуклеиновым основанием синтезировали, как описано в предшествующем уровне техники [PCT/KR 2009/001256], или с небольшими модификациями. Такие Fmoc-ПНК мономеры с модифицированным нуклеиновым основанием и мономеры Fmoc-ПНК с природным нуклеиновым основанием использовали для синтеза производных ПНК настоящего изобретения. Олигомеры ПНК очищали с помощью C-обращенно-фазовой ВЭЖХ (вода/ацетонитрил или вода/метанол с 0,1% ТФУ) и исследовали с помощью масс-спектрометрии.
На Схеме 1 представлен типичный цикл элонгации мономера, применяемый в ТФСП согласно настоящему изобретению, соответствующие детали методики предоставлены ниже. Впрочем, специалисту в данной области будет очевидно, что множество небольших изменений можно сделать при эффективном проведении таких реакций ТФСП на автоматическом синтезаторе пептидов или ручном синтезаторе пептидов. Каждая стадия реакции на Схеме 1 коротко представлена следующим образом.
Схема 1
[Активация смолы H-Rink-ChemMatrix] 0,01 ммоль (приблизительно 20 мг смолы) смолы ChemMatrix в 1,5 мл 20% пиперидина/ДМФА обрабатывали на вортексе в пробирке LibraTube в течение 20 мин, и раствор DeFmoc удаляли с помощью фильтрования. Смолу каждый раз последовательно промывали по 30 сек 1,5 мл метиленхлорида (МХ), 1,5 мл диметилформамида (ДМФА), 1,5 мл МХ, 1,5 мл ДМФА и 1,5 мл МХ. Полученные свободные амины на твердой подложке подвергали связыванию либо с мономером Fmoc-ПНК, либо с Fmoc-защищенным производным аминокислоты
[DeFmoc] Смолу обрабатывали на вортексе в 1,5 мл 20% пиперидина/ДМФА в течение 7 мин, и раствор DeFmoc удаляли с помощью фильтрования. Смолу каждый раз последовательно промывали по 30 сек 1,5 мл МХ, 1,5 мл ДМФА, 1,5 мл МХ, 1,5 мл ДМФА и 1,5 мл МХ. Полученные свободные амины на твердой подложке непосредственно подвергали связыванию с мономером Fmoc-ПНК.
Формулы I
[Связывание с мономером Fmoc-ПНК] Свободные амины на твердой подложке связывали с мономером Fmoc-ПНК следующим образом. 0,04 ммоль мономера ПНК, 0,05 ммоль HBTU и 10 ммоль DIEA инкубировали в течение 2 мин в 1 мл безводного ДМФА и добавляли к смоле со свободными аминами. Раствор смолы обрабатывали на вортексе в течение 1 часа, и реакционный раствор удаляли с помощью фильтрования. Затем смолу последовательно промывали по 30 сек 1,5 мл МХ, 1,5 мл ДМФА и 1,5 мл МХ. Химические структуры мономеров Fmoc-ПНК с модифицированным нуклеиновым основанием, используемым в настоящем изобретении, представлены ниже. Мономеры Fmoc-ПНК с модифицированным нуклеиновым основанием, представленные ниже, следует рассматривать в качестве примеров, и поэтому не следует рассматривать как ограничение объема настоящего изобретения. Специалист в данной области сможет легко представить множество изменений в мономерах Fmoc-ПНК для синтеза производного ПНК .
[Блокирование] После реакции присоединения непрореагировавшие свободные амины блокировали путем перемешивания в течение 5 мин в 1,5 мл блокирующего раствора (5% уксусного ангидрида и 6% 2,6-лутидина в ДМФА). Затем блокирующий раствор удаляли с помощью фильтрования и последовательно промывали по 30 сек 1,5 мл МХ, 1,5 мл ДМФА и 1,5 мл МХ.
20
17
5
[Введение "Fethoc-" радикала на N-конец] Радикал "Fethoc-" вводили на N-конец при взаимодействии свободного амина на смоле с "Fethoc-OSu" при основных условиях связывания. Химическая структура "Fethoc-OSu" [номер CAS 179337-69-0, CHNO, мол. масса 351,36] представлена ниже.
[Снятие со смолы] Олигомеры ПНК, связанные на смоле, снимали со смолы путем перемешивания в течение 3 часов в 1,5 мл раствора для снятия (2,5% триизопропилсилана и 2,5% воды в трифторуксусной кислоте). Смолу удаляли при фильтровании и выпаривали фильтрат при пониженном давлении. Остаток растирали с диэтиловым эфиром и собирали полученный осадок при фильтровании для очистки с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ.
18
[ВЭЖХ анализ и очистка] После снятия со смолы неочищенный продукт производного ПНК очищали с помощью C-обращенно-фазовой ВЭЖХ при элюировании в воде/ацетонитриле или воде/метаноле (градиентный метод), содержащих 0,1% ТФУ. Фигуры 7A и 7B являются примерами хроматограмм ВЭЖХ для "ASO 1" до и после очистки ВЭЖХ, соответственно. Последовательность олигомера "ASO 1" представлена в Таблице 1.
Примеры синтеза производных ПНК Формулы I
Формулы I
Производные ПНК настоящего изобретения получали согласно методикам синтеза, представленным выше, или с небольшими модификациями. В Таблице 1 представлены примеры АСО HIF-1α настоящего изобретения наряду с данными структурных исследований, полученными с помощью масс-спектрометрии. Предоставление АСО HIF-1α в Таблице 1 служит в качестве примеров производных ПНК  и не должно интерпретироваться как ограничение объема настоящего изобретения.
Таблица 1
Формулы I
. Производные ПНК  и структурная идентификация с помощью масс-спектрометрии.
ПНК
Последовательность ПНК (N→C)
Точная масса, m/z
Теор.<sup>a</sup>
Набл.<sup>b</sup>
ASO 1
Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH<sub>2</sub>
4486,05
4486,04
ASO 2
Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH<sub>2</sub>
4473,99
4474,02
ASO 3
Fethoc-G(5)AA(5)-CTT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH<sub>2</sub>
4462,03
4462,07
ASO 4
Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-CT-NH<sub>2</sub>
4376,94
4376,99
ASO 5
Fethoc-G(5)AA(6)-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)T-NH<sub>2</sub>
4504,07
4504,09
ASO 6
Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH<sub>2</sub>
5393,47
5393,44
ASO 7
Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH<sub>2</sub>
4784,18
4784,14
ASO 8
Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH<sub>2</sub>
4727,13
4727,79
ASO 9
Piv-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC-NH<sub>2</sub>
3695,73
3695,74
ASO 10
Piv-Lys-AA(6)C-TTA(6)-TCC(1O2)-TA(6)C-TTA(5)-Val-NH<sub>2</sub>
4844,33
4844,33
ASO 11
Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-CA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH<sub>2</sub>
5448,54
5448,50
ASO 12
H-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-T CC(1O3)-TA(5)-NH<sub>2</sub>
4263,98
4263,99
ASO 13
Бензоил-CA(5)G(2O3)-AA(5)C-TTA(4)-TCC(1O2)-TA(5)-NH<sub>2</sub>
4441,06
4441,06
ASO 14
н-Пропил-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(2O2)-TA(5)NH<sub>2</sub>
4306,03
4306,05
ASO 15
п-Толуолсульфонил-CA(5)G-AA(5)C-TTA(2O2)-TCC(1O2)-TA(5)-NH<sub>2</sub>
4405,95
4405,90
ASO 16
[N-(2-Фенилэтил)амино]карбонил-CA(5)G(3)-AA(5)C-TTA(3)-TCC(1O2)-TA(5)-NH<sub>2</sub>
4426,06
4426,08
ASO 17
Fethoc-Lys-Leu-CA(5)G(2O2)-AA(5)C-TTA(8)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH<sub>2</sub>
4984,44
4984,46
ASO 18
N-Ph-N-Me-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH<sub>2</sub>
4468,11
4468,14
a) точная теоретическая масса, b) точная наблюдаемая масса
18
Формулы I
Фигура 1A является хроматограммой ВЭЖХ, полученной с неочищенным продуктом ASO 1. Неочищенный продукт очищали с помощью C-ОФ препаративной ВЭЖХ. Фигура 1B является хроматограммой ВЭЖХ для очищенного продукта ASO 1. Чистота ASO 1 заметно повысилась после очистки с помощью препаративной ВЭЖХ. На Фигуре 2 предоставлен масс-спектр ЭРИ-ВП, полученный с очищенным продуктом ASO 1. Предоставление аналитических данных для ASO 1 служит для иллюстрации того, как производные ПНК  были очищены и идентифицированы в настоящем изобретении, и не должно интерпретироваться как ограничение объема настоящего изобретения.
Аффинность связывания ПНК в отношении 10-мерной комплементарной ДНК
п
п
п
п
Производные ПНК в Таблице 1 оценивали на их аффинность связывания в отношении 10-мерных ДНК при комплементарном взаимодействии либо с N-концом, либо с C-концом. Аффинность связывания оценивали по значению T для дуплекса между ПНК и 10-мер комплементарной ДНК. Дуплекс между производными ПНК в Таблице 1 и полностью комплементарными ДНК показывает, что значение Т слишком высокое, чтобы его можно было достоверно определить в водном буферном растворе, так как при измерении Т может происходить выпаривание буферного раствора. Значения Т определяли на УФ/ВИД спектрометре следующим образом или с незначительными модификациями.
п
п
www.bioneer.com
Смешанный раствор 4 мкМ ПНК олигомера и 4 мкМ комплементарной 10-мерной ДНК в 4 мл водного буфера (pH 7,16, 10 мМ фосфата натрия, 100 мМ NaCl) в полипропиленовой пробирке Falcon объемом 15 мл инкубировали при 90°C в течение минуты и медленно охлаждали до температуры окружающей среды в течение нескольких минут. Затем раствор переносили в кварцевую УФ кювету на 3 мл, снабженную герметичной пробкой, и проводили измерение Т при 260 нм на спектрофотометре Agilent 8453 для УФ/видимой области спектра, как описано в предшествующем уровне техники [PCT/KR2009/001256] или с небольшими модификациями. 10-мерные комплементарные ДНК для измерения Т приобретели в Bioneer (, Dajeon, Republic of Korea) и использовали без дополнительной очистки.
п
п
2
п
2
Формулы I
CTC(1O2)-А(6)TC-CTA(6)-C(1O2)
TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C
Наблюдаемые значения Т производных ПНК  являются очень высокими для комплементарного связывания с 10-мерной ДНК из-за их низкого содержания G/C и представлены в Таблице 2. Например, "ASO 8" показал значение Т 73,0°C для дуплекса с 10-мерной комплементарной ДНК, направленно взаимодействующей с N-концевым 10-мером в ПНК, выделенным "полужирным" и "подчеркнутым" в [(N→C) Fethoc-TT-AA(6)C-NH]. В то же время, "ASO 8" показал Т 61,0°C для дуплекса с 10-мерной комплементарной ДНК, направленно взаимодействующей с C-концевым 10-мером в ПНК, выделенным "полужирным" и "подчеркнутым" в [(N→C) Fethoc-CTC(1O2)-А(6)-NH].
Таблица 2
п
. Значения Т между ПНК в Таблице и 10-мерной комплементарной ДНК, направленно взаимодействующей либо с N-концом, либо C-концом ПНК.
ПНК
Значение Т<sub>п</sub>, °C
10-мерная ДНК против N-конца
10- мерная ДНК против C-конца
ASO 1
66,0
60,0
ASO 4
66,0
53,4
ASO 5
62,0
58,0
ASO 7
69,0
61,0
ASO 8
73,0
61,0
ASO 9
60,9
59,0
ASO 10
61,0
60,0
ASO 11
73,4
61,0
Примеры биологической активности производных ПНК Формулы I
Формулы I
Формулы I
in vitro
Производные ПНК  оценивали на их антисмысловую активность  в клетках HeLa, и на противоопухолевую активность у голых мышей с ксенотрансплантатом опухоли. Эти биологические примеры были представлены в качестве примеров для иллюстрации биологических профилей производных ПНК  и, таким образом, не должны интерпретироваться как ограничение объема настоящего изобретения.
Пример 1
. Пропуск экзона, вызванный "ASO 2".
"ASO 2", указанный в Таблице 1, является 14-мерным АСО, комплементарно связывающимся с 3'-сайтом сплайсинга экзона 2 в пре-мРНК HIF-1α человека, в котором комплементарные перекрывающиеся участки выделены "полужирным" и "подчеркнуты" в 30-мерной последовательности пре-мРНК  "ASO 2" обладает 5-мер перекрывающимся участком с интроном 1 и 9-мерным перекрывающимся участком с экзоном 2.
"ASO 2" оценивали с помощью вложенной ОТ-ПЦР на его способность вызывать пропуск экзона 2 в мРНК HIF-1α человека в клетках HeLa. Используемые процедуры описаны ниже.
2
[Культивирование клеток и обработка АСО] Клетки HeLa (номер по кат. ATCC CCL-2) субкультивировали в чашке для культур клеток диаметром 60 мм, содержащей 5 мл EMEM с добавкой 10% FBS, 1% стрептомицина/пенициллина и 1% L-глутамина и 1% пирувата натрия в атмосфере с 5% CO при 37°C. Клетки обрабатывали "ASO 2" в концентрации 0 (т.е. отрицательный контроль), 10, 100 или 1000 зМ.
[Выделение РНК] Через 5 часов суммарную РНК выделяли при использовании набора "Universal RNA Extraction Kit" (номер по кат. Takara 9767) согласно инструкциям производителя.

[Синтез кДНК с помощью ОТ-ПЦР One-step] 200 нг РНК матрицы подвергали реакции обратной транскрипции в объеме 25 мкл при использовании набора для ОТ-ПЦР Super Script One-Step с Taq-полимеразой Platinum (номер по кат. Invitrogen 10928-042) против набора экзонспецифических праймеров [exon 1_forward: (5'→3') CTTGCCTTTCCTTCTCTTCT и exon 9_reverse: (5'→3') AACCCAGACATATCCACC] согласно следующим параметрам циклов: 50°C в течение 30 мин и 94°C в течение 2 мин, затем 15 циклов по 30 сек при 94°C, 30 сек при 55°C и 1 мин при 72°C.
[Вложенная ПЦР] 1 мкл комплементарной ДНК подвергали реакции вложенной ПЦР в объеме 20 мкл (номер по кат. Bioneer K2612) против набора экзонспецифических праймеров [exon 1n_forward: (5'→3') TGAAGACATCGCGGGGAC; exon 5n_reverse: (5'→3') TTTTTCACAAGGCCATTTCT] согласно следующим условиям цикла: 95°C в течение 5 мин, затем 39 циклов по 30 сек при 95°C, 40 сек при 50°C и 50 сек при 72°C.
[Идентификация пропуска экзона] Продукты ПЦР подвергали электрофоретическому разделению в 2% агарозном геле со смесью маркеров размера. Полосы нужного размера собирали и исследовали с помощью секвенирования по Сэнгеру. Наблюдаемые полосы ПЦР соответствовали полноразмерной мРНК (т.е. без пропуска экзона) и сплайс-варианту без экзона 2, как отмечено на Фигуре 3A. Клетки, обработанные АСО, давали интенсивную полосу ПЦР с размером, соответствующим пропуску экзона 2. Клетки без обработки АСО (т.е. отрицательный контроль) также давали продукт ПЦР, соответствующий пропуску экзона 2, что указывает на то, что экзон 2 до некоторой степени удалялся спонтанно. Однако интенсивность полосы с пропуском экзона была намного более высокой в клетках, обработанных АСО, чем в клетках без обработки АСО. Таким образом "ASO 2" вызывал пропуск экзона 2 в клетках HeLa. Данные секвенирования для полосы с пропуском экзона представлены на Фигуре 3C, и содержат последовательность мРНК для соединения экзона 1 и экзона 3.
Пример 2
. Ингибирование экспрессии белка HIF-1α в клетках HeLa при воздействии "ASO 2".
"ASO 2" оценивали на его способность ингибировать экспрессию белка HIF-1α в клетках HeLa, как описано ниже.
[Культивирование клеток и обработка АСО] Клетки HeLa, выращенные в 5 мл среды в 60 мм культуре, обрабатывали "ASO 2" в концентрации 0 зМ (отрицательный контроль), 10 зМ, 100 зМ, 1 аМ или 10 аМ.
2
2
[Обработка CoCl и лизис клеток] Через 24 часа после обработки АСО, чашки с культурами за исключением одной без обработки ASO обрабатывали 200 мкМ CoCl в течение 3 часов для подавления активности пролилгидроксилаз (PHD). Затем клетки 2× промывали 1 мл холодного PBS и подвергали лизису во льду с 200 мкл 1× буфера RIPA (номер по кат. Cell Signaling Tech 9806) с добавкой 1% ДСН и 1× смеси ингибиторов протеиназ (cOmplete Mini, Roche). Затем лизаты собирали в пробирки Eppendorf объемом 1,5 мл, смешивали с 100 мкл 5× буфера для образцов и кипятили в течение 5 мин при 100°C. Лизаты подвергали электрофоретическому разделению в 8% геле ДСН-ПААГ и переносили на 0,45 мкм мембрану PVDF. Мембрану метили антителом против HIF-1α (номер по кат. BD Biosciences 610958) и антителом против β-актина (номер по кат. Santa Cruz sc4778).
2
2
2
[Ингибирование экспрессии белка HIF-1α] На Фигуре 4A представлены данные Вестерн-блоттинга HIF-1α, полученные с клетками HeLa, обработанными "ASO 2". В лизате клеток без обработки CoCl полосы HIF-1α не было обнаружено. Лизаты клеток после обработки CoCl показали интенсивную полосу HIF-1α, что указывает на заметную супрессию активности PHD при воздействии CoCl.
На Фигуре 4B представлены интенсивности отдельных полос HIF-1α в сравнении с интенсивностью отдельной полосы β-актина с помощью денситометрии. Экспрессия HIF-1α постепенно снижалась при повышении концентрации "ASO 2" до 10 аМ. Наблюдаемое снижение составило приблизительно 75% при 10 аМ "ASO 2".
Пример 3
. кПЦР с SYBR Green для мРНК HIF-1α в клетках HeLa, обработанных "ASO 2".
"ASO 2" оценивали с помощью вложенной кПЦР на его способность ингибировать экспрессию полноразмерной мРНК HIF-1α в клетках HeLa, как описано ниже.
[Культивирование клеток и обработка АСО] Клетки HeLa, выращенные в 5 мл среды в 60 мм культуре, обрабатывали "ASO 2" в концентрации 0 (отрицательный контроль), 10, 100 или 1000 зМ (по 2 чашки с культурой на каждую концентрацию ASO).
[Выделение РНК] Через 3 часа после обработки АСО суммарную РНК выделяли при использовании набора "MiniBEST Universal RNA Extraction Kit" (номер по кат. Takara 9767) согласно инструкциям производителя.

[Синтез кДНК с помощью ОТ-ПЦР One-step] 200 нг матрицы РНК подвергали реакции обратной транскрипции в объеме 25 мкл при использовании набора для ОТ-ПЦР Super Script One-Step с Taq-полимеразой Platinum (номер по кат. Invitrogen 10928-042) против набора экзонспецифических праймеров [exon 1_forward: (5'→3') CTTGCCTTTCCTTCTCTTCT; exon 8_reverse: (5'→3') AACCCAGACATATCCACC] согласно следующим параметрам циклов: 50°C в течение 30 мин и 94°C в течение 2 мин, затем 15 циклов по 30 сек при 94°C, 30 сек при 55°C и 1 мин при 72°C.
[Вложенная кПЦР] 1 мкл кДНК, разведенной в 100 раз, подвергали реакции ПЦР в реальном времени в объеме 20 мкл против следующих наборов экзонспецифических праймеров: [exon 2n_forward (5'→3') CTTGCTCATCAGTTGCCACTTC; exon 2n_reverse (5'→3') AAGTTTCCTCACACGCAAATAG; exon 3n_forward (5'→3') GAAAGCACAGATGAATTGC; exon 3n_reverse (5'→3') TCATGTCACCATCATCTGT; exon 4n_forward (5'→3') CTAACTGGACACAGTGTGTTTG; exon 4n_reverse (5'→3') TCTGTGTGTAAGCATTTCTCTC; exon 5n_forward (5'→3') GCCTTGTGAAAAAGGGTAAAG; exon 5n_reverse (5'→3') CCATGTTGCAGACTTTATGT]. Реакции ПЦР детектировали SYBR Green (Takara, Japan) согласно следующим параметрам циклов: 95°C в течение 3 мин, затем 40 циклов по 5 сек при 95°C и 30 сек при 60°C.
[Изменения уровней экзона мРНК HIF-1α] Уровни отдельных экзонов в обработанных АСО образцах нормализовали по уровню каждого отдельного экзона без обработки ASO. Относительные уровни для каждого экзона представлены на Фигуре 5A. Все уровни отдельных экзонов значительно снизились на 60-80% и 50-70% в клетках, обработанных "ASO 2" в концентрации 10 зМ и 100 зМ, соответственно. Однако уровни отдельных экзонов, полученные с клетками, обработанными "ASO 2" в концентрации 1000 зМ (т.е. 1 аМ), не отличались от уровней в клетках без обработки АСО. Остается только выяснить, почему уровни экзонов вернулись к уровням отрицательного контроля при повышении концентрации АСО до 1000 зМ. Тем не менее, профиль зависимости эффекта от дозы по данным кПЦР сопоставим с профилем зависимости эффекта от дозы при пропуске экзона на Фигуре 3A "Примера 1".
Пример 4
. кПЦР с зондом TaqMan для мРНК HIF-1α в клетках HeLa, обработанных "ASO 2".
"ASO 2" оценивали с помощью вложенной кПЦР на его способность ингибировать экспрессию полноразмерной мРНК HIF-1α в клетках HeLa, как описано в "Примере 3", если не указано иное.

[Синтез кДНК с помощью ОТ-ПЦР One-step] 200 нг матрицы РНК подвергали реакции обратной транскрипции в объеме 25 мкл при использовании набора для ОТ-ПЦР Super Script One-step с Taq-полимеразой Platinum (номер по кат. Invitrogen 10928-042) против набора экзонспецифических праймеров [exon 1_forward: (5'→3') CGCGAACGACAAGAAAAA; exon 8_reverse: (5'→3') CTGTGGTGACTTGTCCTTT] согласно следующим параметрам циклов: 50°C в течение 30 мин и 94°C в течение 2 мин, затем 20 циклов по 30 сек при 94°C, 40 сек при 51°C и 50 сек при 72°C.
[Вложенная кПЦР] 1 мкл кДНК, разведенной в 100 раз, подвергали реакции ПЦР в реальном времени в объеме 20 мкл при использовании зонда TaqMan (Hs00936371_m1, Thermo Fisher) созданного для обнаружения соединения экзона 1 и экзона 2 HIF-1α человека, согласно следующим параметрам циклов: 95°C в течение 3 мин, затем 40 циклов по 10 сек при 95°C и 30 сек при 60°C.
[Изменения уровня полноразмерной мРНК HIF-1α] Уровень полноразмерной мРНК образцов обработанных АСО, нормализовали по уровню мРНК без обработки АСО. Наблюдаемые относительные уровни мРНК представлены на Фигуре 5B. Уровень полноразмерной мРНК HIF-1α значительно снизился на 65% и 55% в клетках, обработанных "ASO 2" в концентрации 100 зМ и 1000 зМ, соответственно. Однако уровень полноразмерной мРНК остался без изменения в клетках, обработанных "ASO 2" в концентрации 10 зМ.
Пример 5
. Пропуск экзона, вызванный "ASO 6".
"ASO 6", указанный в Таблице 1, является 17-мерным АСО, комплементарно связывающимся с 3'-сайтом сплайсинга экзона 2 в пре-мРНК HIF-1α человека с комплементарными спаренными основаниями, выделенным "полужирным" и "подчеркнутыми" в  "ASO 6" обладает 7-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с интроном 1, и 10-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с экзоном 2.
"ASO 6" оценивали с помощью вложенной ОТ-ПЦР на его способность вызывать пропуск экзона 2 в мРНК HIF-1α человека в клетках HeLa согласно процедурам, описанным в "Примере 1", если не указано иное.
Продукты ПЦР подвергали электрофоретическому разделению в 2% агарозе, и результаты электрофореза представлены на Фигуре 6A. Пропуск экзона 2 был надежным при всех концентрациях обработки "ASO 6". "ASO 6" вызывал пропуск экзона 2 эффективнее, чем "ASO 2". Полоса ПЦР полноразмерной мРНК HIF-1α отсутствовала почти полностью при всех протестированных концентрациях "ASO 6" [см. Фигуру 6A]. При этом присутствовал значительный уровень полноразмерной мРНК HIF-1α, остающейся в экстрактах РНК клеток, обработанных "ASO 2" при концентрации 10-1000 зМ. [см. Фигуру 3A]
Пример 6
. Ингибирование экспрессии белка HIF-1α в клетках HeLa при воздействии "ASO 6".
"ASO 6" оценивали на его способность ингибировать экспрессию белка HIF-1α в клетках HeLa согласно процедурам, описанным в "Примере 2", если не указано иное.
На Фигуре 6B представлены данные Вестерн-блоттинга, полученные с клетками HeLa, обработанными "ASO 6" в концентрации 0 (отрицательный контроль), 10, 100 или 1000 зМ. Экспрессия белка HIF-1α снижалась приблизительно на 45~55% при концентрациях обработки (Фигура 6C).
Пример 7
. кПЦР с SYBR Green для мРНК HIF-1α в клетках HeLa, обработанных "ASO 6".
"ASO 6" оценивали на его способность вызывать изменение мРНК HIF-1α в клетках HeLa с помощью вложенной кПЦР согласно процедурам в "Примере 4", если не указано иное.

[Синтез кДНК с помощью ОТ-ПЦР One Step] 200 нг матрицы РНК подвергали реакции обратной транскрипции в объеме 25 мкл при использовании набора для ОТ-ПЦР Super Script One-Step с Taq-полимеразой Platinum (номер по кат. Invitrogen 10928-042) против набора экзонспецифических праймеров [exon 1_forward: (5'→3') CGCGAACGACAAGAAAAA; exon 8_reverse: (5'→3') CTGTGGTGACTTGTCCTTT] согласно следующим параметрам циклов: 50°C в течение 30 мин и 94°C в течение 2 мин, затем 15 циклов по 30 сек при 94°C, 40 сек при 51°C и 50 сек при 72°C.
[Изменения уровней экзонов в мРНК HIF-1α] Уровни отдельных экзонов, нормализованные по уровням отдельных экзонов без обработки АСО, представлены на Фигуре 7A. Уровни экзонов значительно снизились на 35%, приблизительно 30% и приблизительно 45% в клетках, обработанных "ASO 6" в концентрации 10, 100 и 1000 зМ, соответственно.
Пример 8
. кПЦР с зондом TaqMan для мРНК HIF-1α в клетках HeLa, обработанных "ASO 6".
"ASO 6" оценивали с помощью вложенной кПЦР на его способность ингибировать экспрессию полноразмерной мРНК HIF-1α в клетках HeLa, как описано в "Примере 7", если не указано иное.
[Изменения уровня полноразмерной мРНК HIF-1α] Уровень полноразмерной мРНК обработанных АСО образцов нормализовали по уровню мРНК без обработки АСО. Наблюдаемые относительные уровни мРНК представлены на Фигуре 7B. Уровень полноразмерной мРНК HIF-1α значительно снизился приблизительно на 60% и 80% в клетках, обработанных "ASO 6" в концентрации 100 зМ и 1000 зМ (1 аМ), соответственно. Однако уровень полноразмерной мРНК остался без изменения в клетках, обработанных "ASO 6" в концентрации 10 зМ.
Пример 9
. Ингибирование экспрессии белка HIF-1α в клетках HeLa при воздействии "ASO 1".
"ASO 1", указанный в Таблице 1, является 14-мерным АСО, комплементарно связывающимся с 3'-сайтом сплайсинга экзона 2 в пре-мРНК HIF-1α человека с комплементарными спаренными основаниями, выделенными "полужирным" и "подчеркнутыми" в  "ASO 1" обладает 3-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с интроном 1, и 11-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с экзоном 2.
2
"ASO 1" оценивали на его способность снижать экспрессию HIF-1α в клетках HeLa согласно процедурам, описанным в "Примере 2", если не указано иное. В этом примере клетки HeLa обрабатывали "ASO 1" в концентрации 0 зМ (отрицательный контроль), 100 зМ, 300 зМ, 1 аМ, 3 аМ, 10 аМ, 30 аМ, 100 аМ или 300 аМ в течение 72 часов перед ингибированием активности PHD при инкубировании с 200 мкМ CoCl в течение 3 часов. Присутствовали 4 чашки с культурами отрицательного контроля, т.е. 0 зМ "ASO 1".
На Фигуре 8A предоставлены данные Вестерн-блоттинга HIF-1α, полученные с лизатами клеток HeLa. Уровень белка HIF-1α был значительно выше в лизатах отрицательного контроля, чем во всех лизатах клеток, обработанных "ASO 1".
На Фигуре 8B представлены интенсивности индивидуальных полос HIF-1α в сравнении с интенсивностью индивидуальной полосы β-актина с помощью денситометрии. Экспрессия HIF-1α в клетках HeLa снижалась на 40-80% при инкубировании в течение 72 часов с "ASO 1" в концентрации 0,1-300 аМ.
Пример 10
. Ингибирование опухолевого роста ксенотрансплантата U-251 у голых мышей при воздействии "ASO 1".
"ASO 1" оценивали на его способность ингибировать рост опухоли у голых мышей с ксенотрансплантатом U-251, как описано ниже.
2
5
[Индукция ксенотрансплантата U-251] Клетки глиобластомы U-251 человека выращивали в DMEM с добавкой 10% FBS, 1% стрептомицина-пенициллина, 1% L-глутамина и 1% пирувата натрия в атмосфере 5% CO при 37°C. В День -14 самцам голых мышей (Charles River, Japan) возрастом 6 недель подкожно инокулировали 5×10 клеток U-251 на животное в правую надлопаточную область. Животным обеспечивали свободный доступ к корму и водопроводной воде.
3
[Распределение в группы и обработка АСО] В День 0, животных рандомизированно распределяли в 4 группы отрицательного контроля (без обработки АСО), 100 пмоль/кг "ASO 1", 1000 пмоль/кг "ASO 1" и 3000 пмоль/кг "ASO 1". По 7 животных в группу со средним объемом опухоли 50 мм. Группы лечения АСО получали подкожно "ASO 1", растворенный в PBS, в дозе 5 мл/кг, 3× в неделю со Дня 0 до Дня 21.
[Ингибирование роста опухоли] Объем опухоли измеряли три раза в неделю. Рост опухоли был значимо ингибирован в группах лечения АСО приблизительно на 35-45% в День 21 [см. Фигуру 9A].
[ИГХ опухолевой массы на HIF-1α] В День 22, животных умерщвляли и изымали опухолевую массу для оценки экспрессии белкы HIF-1α в опухолевой массе с помощью ИГХ (иммуногистохимии) на HIF-1α. Образцы ткани для ИГХ изготавливали при использовании парафинового блока. Ткани на стекле последовательно метили кроличьим антителом против HIF-1α человека (номер по кат. Santa Cruz SC-10790) в разведении 1:100, антителом против IgG кролика (номер по кат. Vector BA-1100) в разведении 1:200 и, наконец, Dylight 594-стрептавидином (номер по кат. Vector SA-5594) в разведении 1:200. ИГХ изображения HIF-1α фиксировали на флуоресцентном микроскопе Olympus. Ядра окрашивали DAPI.
На Фигуре 9B представлен репрезентативный набор ИГХ изображений HIF-1α из каждой группы. Экспрессия HIF-1α в группе отрицательного контроля была заметной, тогда как экспрессия в контрольных группах было минимальной. Каждое изображение ИГХ оценивали на экспрессию HIF-1α с помощью денситометрии при использовании программы ImageJ. На Фигуре 9C представлен средний уровень экспрессии HIF-1α в каждой группе дозы, нормализованный по группе отрицательного контроля (N=5 в каждой группе). Внутриопухолевая экспрессия HIF-1α значительно (t-критерий Стьюдента) снизилась приблизительно на 40-50% во всех группах лечения АСО.
Пример 11
. Ингибирование опухолевого роста ксенотрансплантата A431 у голых мышей при воздействии "ASO 6".
"ASO 6" оценивали на его способность ингибировать опухолевый рост ксенотрансплантата A431 у голых мышей, как описано ниже.
2
5
[Индукция ксенотрансплантата A431] Клетки эпидермоидной карциномы человека A431 (номер по кат. ATCC CRL1555) выращивали в DMEM с добавкой 10% FBS, 1% стрептомицина/пенициллина, 1% L-глутамина и 1% пирувата натрия в атмосфере с 5% CO при 37°C. В День -10 самцам голых мышей (Charles River, Japan) возрастом 6 недель подкожно инокулировали 5×10 клеток A431 на животное в левую лапу. Животным обеспечивали свободный доступ к корму и водопроводной воде.
3
[Распределение в группы и обработка АСО] В День 0, животных рандомизированно распределяли в 4 группы отрицательного контроля (без обработки АСО), 30 пмоль/кг "ASO 6", 100 пмоль/кг "ASO 6" и 300 пмоль/кг "ASO 6". По 8 животных в каждой группе со средним объемом опухоли 108 мм. Группы лечения АСО подкожно получали "ASO 6", растворенный в PBS, в дозе 2 мл/кг, 3× в неделю со Дня 0 до Дня 25.
[Ингибирование роста опухоли] Объем опухоли измеряли три раза в неделю. При повторном введении "ASO 6", рост опухоли ингибировался дозозависимо, хотя и без статистической значимости [см. Фигуру 10A]. Рост опухоли был ингибирован приблизительно на 20% в группе 300 пмоль/кг. В День 25 животных умерщвляли для изъятия опухоли. Средняя масса опухоли в День 25 (при умерщвлении) демонстрировала тенденцию к уменьшению при увеличении дозы АСО [см. Фигуру 10B]. Масса опухоли уменьшилась приблизительно на 20% без значимости в группе лечения 300 пмоль/кг АСО.
Пример 12
. Ингибирование опухолевого роста ксенотрансплантата PC3 у голых мышей при воздействии "ASO 6".
"ASO 6" оценивали на его способность ингибировать опухолевый рост ксенотрансплантата PC3 у голых мышей, как описано ниже.
2
6
[Индукция ксенотрансплантата PC3] Клетки карциномы предстательной железы РС3 человека (номер по каталогу ATCC CRL1435) выращивали в среде F-12K с добавкой 10% FBS, 1% стрептомицина-пенициллина, 1% L-глутамина и 1% пирувата натрия в атмосфере с 5% CO при 37°C. В день -7, самцам голых мышей (Harlan Laboratories, Italy) возрастом 6 недель подкожно инокулировали 3×10 клеток РС3 на животное в левую ногу. Животным предоставили свободный доступ к корму и водопроводной воде.
3
[Распределение в группы и обработка АСО] В День 0, животных рандомизированно распределяли в 4 группы отрицательного контроля (без обработки ASO), 1 пмоль/кг "ASO 6", 10 пмоль/кг "ASO 6" и 100 пмоль/кг "ASO 6". По 9 животных в группе со средним объемом опухоли приблизительно 88 мм. Контрольные группы подкожно получали "ASO 6", растворенный в PBS, в дозе 2 мл/кг, 2× в неделю со Дня 0 до Дня 28.
[Ингибирование роста опухоли] Объем опухоли измеряли три раза в неделю. Рост опухоли был значительно ингибирован приблизительно на 25~30% в группе 10 пмоль/кг в Дни 19~26 [см. Фигуру 10C]. В День 28, животных умерщвляли для изъятия опухоли. Средняя масса опухоли в группе 10 пмоль/кг была меньше, чем масса в группе отрицательного контроля, на 21%, но без значимости [см. Фигуру 10D].
При увеличении дозы с 10 до 100 пмоль/кг противоопухолевая активность исчезала. С учетом того, что повышенная экспрессия HIF-1α предположительно увеличивает выживание лимфоцитов у трансгенных мышей [PLOS One vol 8(4), e57833 (April 2013)], наблюдаемое снижение противоопухолевой активности в группе 100 пмоль/кг могло быть обусловлено снижением врожденного иммунитета в результате нокдауна активности HIF-1α в группе высокой дозы.
Пример 13
. Ингибирование опухолевого роста ксенотрансплантата U-251 MG у голых мышей при воздействии "ASO 6" и "ASO 11".
Хотя "ASO 6" полностью комплементарен пре-мРНК HIF-1α человека, он обладает одиночным некомплементарным основанием с экзоном 2 пре-мРНК HIF-1α мыши. "ASO 11" представляет собой 17-мерный АСО, созданный для комплементарного направленного взаимодействия с мышиной пре-мРНК в той же области, с которой направленно взаимодействует "ASO 6" в пре-мРНК HIF-1α человека. "ASO 11" обладает 7-мерным и 10-мерным комплементарным участком, перекрывающимся с интрономом 1 и экзоном 2 в пре-мРНК HIF-1α мыши, соответственно.
"ASO 6" и "ASO 11" комбинировали в эквивалентном количестве для оценки противоопухолевой активности против ксенотрансплантата U-251 MG у голых мышей посредством ингибирования экспрессии HIF-1α в ксенотрансплантате человеческого происхождения, а также у мыши.
2
6
[Индукция ксенотрансплантата U-251 MG] Клетки глиобластомы астроцитомы U-251 MG человека (номер по кат. Sigma 09063001) выращивали в MEM с добавкой 10% FBS, 1% стрептомицина-пенициллина, 1% L-глутамина и 1% пирувата натрия в атмосфере с 5% CO при 37°C. В День -30, самцам голых мышей (Harlan Laboratories, Italy) возрастом 5 недель подкожно инокулировали 3×10 клеток U-251 MG в Матригеле в правую надлопаточную область каждого животного. Животным обеспечивали свободный доступ к корму и водопроводной воде.
3
[Распределение в группы и обработка АСО] В День 0, животных рандомизированно распределяли в 4 группы отрицательного контроля (без обработки АСО), 0,1 пмоль/кг "ASO 6" плюс 0,1 пмоль/кг "ASO 11", 1 пмоль/кг "ASO 6" плюс 1 пмоль/кг "ASO 11" и 10 пмоль/кг "ASO 6" плюс 1 пмоль/кг "ASO 11". По 9 животных в группе со средним объемом опухоли приблизительно 75 мм. Группы лечения подкожно получали "ASO 6" и "ASO 11", растворенные в PBS, в дозе 2 мл/кг 2× в неделю со Дня 0 до Дня 91.
[Умерщвление животных для исследования органов/тканей] Животных умерщвляли в День 92 для взятия образцов ткани, включая опухоль, цельную кровь, печень, легкое, селезенку, сердце и почки. Образцы ткани подвергали ИГХ и биологическому анализу.
[Ингибирование роста опухоли] Объем опухоли измеряли 2× в неделю в течение первых двух недель после введения доз, а затем 1× в неделю. Наблюдали четкую и значимую тенденцию ингибирования роста опухоли в группах лечения АСО. Однако наиболее сильное ингибирование роста опухоли показала группа лечения 1,0 пмоль/кг. В День 91, рост опухоли был значимо (дисперсионный анализ) ингибирован на 66%, 83% и 56% в группе лечения 0,1, 1,0 и 10 пмоль/кг АСО, соответственно [см. Фигуру 11A].
На Фигуре 11B представлен средний вес опухоли по группам в День 92. Хотя вес опухоли в группах лечения АСО уменьшился на 47-71%, группа дозы 1,0 пмоль/кг показала наибольшее уменьшение 71%. Различие между отрицательным контролем и группой 1 пмоль/кг было значимым согласно t-критерию Стьюдента.
С учетом того, что повышенная экспрессия HIF-1α предположительно увеличивает выживание лимфоцитов у трансгенных мышей [PLOS One vol 8 (4), e57833 (April 2013)], более слабая противоопухолевая активность в группе 10 пмоль/кг, чем в группе 1,0 пмоль/кг вероятно может отражать снижение врожденного иммунитета при слишком сильном нокдауне активности HIF-1α в группе 10 пмоль/кг.
[Средняя массы тела и органов] Хотя отсутствовали какие-либо значимые изменения массы тела, группа 10 пмоль/кг показала наименьшую среднюю массу тела на Неделе 13, т.е. 39,6 г для группы отрицательного контроля и 38,0 г для группы 10 пмоль/кг.
Группа лечения 10 пмоль/кг демонстрировала тенденцию к меньшему весу органов, за исключением селезенки, чем в группе отрицательного контроля. Вес сердца и почек был значительно меньше в группе 10 пмоль/кг, чем в группе отрицательного контроля, (0,23±0,01) г и (0,20±0,01) г для сердца и (0,60±0,02) г и (0,56±0,02) г для почки.
Вес селезенки был больше в группе 10 пмоль/кг, чем в группе отрицательного контроля. (0,27±0,03) г для группы отрицательного контроля и (0,33±0,13) г для группы 10 пмоль/кг.
На основе приведенных выше результатов веса считается, что лечение 10 пмоль/кг в большей степени повлияло на рост или развитие животных, чем лечение более низкими дозами или отрицательным контролем. С учитом того, что HIF-1α индуцирует экспрессию VEGF и ЭПО (эритропоэтина), было бы неудивительно предполагать заметное увеличение массы селезенки вследствие длительного системного ингибирования HIF-1α. Таким образом, экспрессия HIF-1α могла быть ингибирована в большей степени в группе 10 пмоль/кг, чем в группе 1,0 пмоль/кг.
in vitro
[Уровень VEGF-A в сыворотке] Уровень VEGF-A в сыворотке определяли при использовании набора для ИФА мышиного VEGF-A (номер по кат. R&D Systems USA NMV00). Интересно, что уровень VEGF-A в сыворотке демонстрировал тенденцию к более высоким значениям в группах лечения АСО, хотя без значимости. Наблюдаемые уровни VEGF-A в сыворотке составляли (47,0±2,5) пг/мл, (48,7±3,1) пг/мл, (51,0±5,6) пг/мл и (50,0±2,7) пг/мл для группы отрицательного контроля, группы лечения 0,1 пмоль/кг, 1 пмоль/кг и 10 пмоль/кг АСО, соответственно. Наблюдаемые уровни VEGF-A в сыворотке могут показаться противоречащими обычным прогнозам на основе биологии HIF-1α . В контролируемом клиническом исследовании, тем не менее, транзиторная гипоксия вызвала значимое снижение уровня VEGF-A в сыворотке, что указывает на сложность физиологии VEGF [Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. vol 290, E434-439 (2006)].
[ИГХ HIF-1α опухолевой массы] Образцы опухоли из группы отрицательного контроля и группы лечения 1,0 пмоль/кг подготавливали при использовании парафинового блока для ИГХ HIF-1α (N=4 в группе). Ткани на стекле метили сначала кроличьим антителом против HIF-1α (номер по кат. Abcam ab51608) в разведении 1:100, а затем антителом к IgG кролика (номер по кат. Invitrogen A21207) в разведении 1:250. Изображения ИГХ HIF-1α фиксировали на сканере для препаратов Zeiss. Ядра окрашивали DAPI.
На Фигуре 12А представлен репрезентативный набор изображений ИГХ HIF-1α из каждой группы. Каждое изображение ИГХ оценивали на экспрессию HIF-1α с помощью денситометрии при использовании программы ImageJ. На Фигуре 12В представлен средний уровень экспрессии HIF-1α в группе 1 пмоль/кг, нормализованный по группе отрицательного контроля (N=4 в группе). Внутриопухолевая экспрессия HIF-1α значимо (согласно t-критерию Стьюдента) снижалась на 42% в группе лечения 1,0 ммоль/кг АСО.
[ИГХ VEGF-A опухолевой массы] Образцы опухоли из группы отрицательного контроля и группы лечения 1,0 пмоль/кг подготавливали при использовании парафинового блока для ИГХ VEGF-A (N=4 в группе). Ткани на стекле метили сначала кроличьим антителом против VEGF-A (номер по кат. Abcam ab46154) в разведении 1:100, а затем антителом к IgG кролика (номер по кат. Invitrogen A21207) в разведении 1:250. Изображения ИГХ VEGF-A фиксировали на сканере для препаратов Zeiss. Ядра окрашивали DAPI.
На Фигуре 12C представлен репрезентативный набор изображений ИГХ VEGF-A из каждой группы. Каждое изображение ИГХ оценивали на экспрессию VEGF-A с помощью денситометрии при использовании программы ImageJ. На Фигуре 12D представлен средний уровень VEGF-A в группе 1 пмоль/кг, нормализованный по группе отрицательного контроля. Внутриопухолевая экспрессия VEGF-A незначимо снижалась на 13% в группе лечения 1,0 пмоль/кг АСО.