КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛО К SEZ6-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ
SEZ6 ANTIBODY-DRUG CONJUGATE AND METHODS FOR APPLICATION

1. ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Данная заявка заявляет приоритет согласно 35 U.S.C. § 119(e) по предварительной заявке США № 62/678061, поданной 30 мая 2018 года, содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки.
2. ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Данная заявка содержит Перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и полностью включен в данный документ посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 30 мая 2019 года, имеет название 381493-703WO(167862)_SL.txt и имеет размер 28992 байта.
3. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Данная заявка относится к новому конъюгату антитело к SEZ6-лекарственное средство, его компонентам и композициям, содержащим его, для лечения, диагностики или профилактики рака и любым его рецидивам или метастазам.
4. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0004] Дифференцировка и пролиферация стволовых клеток и клеток-предшественников представляет собой нормальные постоянно протекающие процессы, которые происходят совместно для поддержания роста ткани в ходе органогенеза, восстановления клеток и замены клеток. Система жестко регулируется, чтобы гарантировать, что генерируются только соответствующие сигналы, основанные на потребностях организма. Пролиферация и дифференцировка клеток обычно происходит только по мере необходимости для замены поврежденных или гибнущих клеток, или в течение роста. Однако, нарушение этих процессов может являться результатом множества факторов, включая недостаток или переизбыток различных сигнальных химических веществ, наличия измененных микроокружений, генетических мутаций или их комбинации. Нарушение нормальной клеточной пролиферации и/или дифференцировки может привести к различным расстройствам, включая пролиферативные заболевания, такие как злокачественные новообразования.
[0005] Обычные терапевтические способы лечения злокачественного новообразования включают химиотерапию, лучевую терапию и иммунотерапию. Часто эти способы лечения неэффективны, а хирургическое вмешательство может не быть эффективной клинической альтернативой. Ограничения, присущие текущим стандартам лечения, особенно очевидны в тех случаях, когда пациенты проходят лечение первой линии и впоследствии имеют рецидивы. В таких случаях часто возникают трудно поддающиеся лечению опухоли, которые часто являются агрессивными и неизлечимыми. Общая частота выживания в случае большинства опухолей в течение многих лет оставалась в значительной степени неизменной вследствие, по меньшей мере частично, неспособности существующих способ лечения предотвратить рецидив, повторное возникновение опухоли и метастазов. Таким образом, остается большая потребность в разработке более направленных и эффективных способов лечения пролиферативных расстройств. Данное изобретение удовлетворяет эту потребность.
5. СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0006] В широком аспекте в данном изобретении предлагается конъюгат антитело-лекарственное средство или его композиции, которые специфически связываются с детерминантами SEZ6 человека. В некоторых вариантах реализации, детерминанта SEZ6 представляет собой белок SEZ6, экспрессируемый на опухолевых клетках, тогда как в других вариантах реализации детерминанта SEZ6 экспрессируется на клетках, инициирующих опухоль. В предпочтительном варианте реализации, конъюгат антитело к SEZ6-лекарственное средство будет иметь формулу:
,
Формула I
КАЛП1
где Ab содержит антитело к SEZ6, имеющее тяжелую цепь SEQ ID NO: 3 и легкую цепь SEQ ID NO: 4, и где n равно 2. Для целей данного раскрытия этот конъюгат антитело-лекарство будет называться «hSEZ6-1.ss1 КАЛП1», если не указано иное.
[0007] В выбранных вариантах реализации, данное изобретение содержит антитело, содержащее тяжелую цепь SEQ ID NO: 3 и легкую цепь SEQ ID NO: 4. В некоторых аспектах, данное изобретение включает нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь (SEQ ID NO: 3) или легкую цепь (SEQ ID NO: 4) антитела к SEZ6 в соответствии с данным изобретением или его фрагмент. В других вариантах реализации, данное изобретение включает вектор, содержащий одну или более описанных выше нуклеиновых кислот, или клетку-хозяин, содержащую указанные нуклеиновые кислоты или векторы.
[0008] В еще одном варианте реализации, данное изобретение включает линкер-лекарственное средство калихемицин или его фармацевтически приемлемую соль, или сольват, имеющий структуру, представленную Формулой II.
Формула II
[0009] Как изложено выше, в данном изобретении предлагается конъюгат антитело к SEZ6-лекарственное средство, в котором антитело конъюгировано с одной или более нерасщепляющейся нагрузкой калихемицином Формулы II. Также, предлагаются фармацевтические композиции, содержащие анти-SEZ6 КАЛП, как раскрыто в данном документе. В некоторых вариантах реализации, композиции будут содержать выбранное соотношение лекарственного средства к антителу (СЛСА), где преобладающие виды КАЛП (например, содержащие 2 активных блока калихемицина) составляют более чем около 50%, более чем около 60%, более чем около 70%, более чем около 80%, более чем около 90% или более чем около 95% представленных видов. Предпочтительно нагрузка лекарственным средством преобладающих видов будет равна 2.
[0010] Другой аспект данного изобретения представляет собой способ лечения рака, включающий введение конъюгата антитело-лекарственное средство или фармацевтической композиции, такой как описана в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах реализации, субъект страдает от рака легких и, в выбранных вариантах реализации, от мелкоклеточного рака легкого (МКРЛ).
[0011] В других вариантах реализации, раскрытый КАЛП будет содержать предел безопасности (полученный, как описано в данном документе) более чем 6. В других вариантах реализации, предел безопасности будет больше чем 7, а еще в других вариантах реализации, предел безопасности будет больше чем 8 или больше чем 9. В других вариантах реализации, предел безопасности будет около 10.
in vitro
in vivo
[0012] В еще одном варианте реализации, данное изобретение включает способ уменьшения количества опухоль-инициирующих клеток в популяции опухолевых клеток, причем способ включает приведение в контакт (например,  или ) популяции опухоль-инициирующих клеток с конъюгатом антитело-лекарственное средство, как описано в данном документе, посредством чего снижается частота опухоль-инициирующих клеток.
[0013] В одном аспекте данное изобретение включает способ доставки цитотоксина в клетку, включающий приведение в контакт клетки с раскрытым конъюгатом антитело-лекарственное средство.
[0014] В другом аспекте данное изобретение также предлагает наборы или устройства, и связанные с ними способы, которые можно применять при лечении рака легких. С этой целью в данном изобретении предпочтительно предлагается готовое изделие, пригодное для лечения рака легких, содержащее емкость, содержащую SEZ6 КАЛП, и инструкции по использованию КАЛП для лечения рака легких (например, мелкоклеточного рака легких) или по схеме применения для того же. В других вариантах реализации раскрытые наборы будут содержать инструкции, этикетки, вкладыши, считывающие устройства и т.п., указывающие, что набор или устройство используются для лечения рака легких или предлагать схему применения для того же.
[0015] Вышеизложенное является кратким изложением сущности изобретения и поэтому содержит, по необходимости, упрощения, обобщения и упущения деталей; следовательно, специалисты в данной области техники поймут, что краткое изложение является только иллюстративным и никоим образом не предназначено для ограничения. Другие аспекты, особенности и преимущества данных способов, композиций и/или устройств, и/или других объектов данного изобретения, описанных в данном документе, станут очевидными из изложенных в данном документе идей. Краткое изложение сущности изобретения предоставлено для ознакомления с выбором концепций в упрощенной форме, которые дополнительно описаны ниже в подробном описании сущности изобретения.
6. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0016] На Фиг. 1 представлено схематическое изображение hSEZ6-1.ss1 КАЛП1;
[0017] На Фиг. 2 представлены кривые связывания, демонстрирующие, что антитело SEZ6, содержащее мутацию S60N, имеет профиль аффинности по существу такой же, как у антитела SEZ6 без мутации S60N;
[0018] На Фиг. 3 продемонстрировано, что описанные SEZ6 КАЛП эффективно убивают клетки, экспрессирующие hSEZ6, дозозависимым образом, в то же время, не истощая наивные контрольные клетки, которые не экспрессируют hSEZ6;
[0019] На Фиг. 4A и 4B изображена способность описанных SEZ6 КАЛП задерживать рост опухоли мелкоклеточного рака легкого у иммунодефицитных мышей с имплантированными LU 95 МКРЛ (Фиг. 4A) и LU 149 МКРЛ (Фиг. 4B); и
[0020] На Фиг. 5A - 5D продемонстрировано, что опухоли МКРЛ особенно чувствительны к лечению с помощью КАЛП, содержащим нерасщепляющийся линкер-лекарственное средство калихемицин, причем на Фиг. 5A и 5B продемонстрированы, соответственно, уровни относительной экспрессии SEZ6 и положительного антиген-контроля в различных линиях опухолевых клеток, на Фиг. 5C продемонстрировано, что токсин PBD равномерно убивает различные типы раковых клеток, а на Фиг. 5D продемонстрировано, что калихемицин особенно активен в уничтожении клеток МКРЛ.
7. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0021] В данном документе раскрыты неограничивающие, иллюстративные варианты реализации данного изобретения, которые иллюстрируют его принципы. Любые заголовки разделов, используемые в данном документе, предназначены только для организационных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие описанные объекты данного изобретения. Для целей данного изобретения все идентифицирующие номера доступа к последовательностям могут быть найдены в базе данных NCBI Reference Sequence (RefSeq) и/или в базе данных архивных последовательностей в NCBI GenBank, если не указано иное.
[0022] В данном изобретении предлагаются новые анти-SEZ6 КАЛП и их компоненты (включая антитело hSEZ6-1.ss1 и линкер-лекарственное средство калихемицин Формулы II), содержащие агент нацеливания сайт-специфическое антитело к SEZ6 и цитотоксическую нагрузку калихемицином. Как более подробно обсуждается ниже и изложено в прилагаемых Примерах, описанный анти-SEZ6 КАЛП особенно эффективен в подавлении роста опухоли по сравнению с другими анти-SEZ6 КАЛП.
[0023] Способность эффективно уменьшать или убивать опухолевые и/или раковые стволовые клетки посредством использования SEZ6 КАЛП, раскрытого в данном документе, обусловлена относительным отсутствием токсичности за пределами участка, что позволяет увеличить дозировку. Это, в свою очередь, обеспечивает более высокие уровни калихемицина в очаге опухоли, чем в случае других КАЛП, содержащих калихемицин, и приводит к увеличению гибели клеток. Как показано в прилагаемых Примерах, повышенная концентрация токсина в месте опухоли обеспечивает длительное подавление опухоли у иммунодефицитных мышей. Таким образом, описанный в данном документе SEZ6 КАЛП, вероятно будет демонстрировать благоприятный терапевтический индекс и может быть использован для лечения и/или предотвращения отдельных пролиферативных нарушений, таких как мелкоклеточный рак легкого или при его прогрессировании или рецидиве.
Раковые стволовые клетки SEZ6
[0024] Было высказано предположение, что МКРЛ имеет бронхогенное происхождение, частично возникая из легочных нейроэндокринных клеток (Galluzzo and Bocchetta, 2011; PMID: 21504320). Каким бы ни был источник клеток этих опухолей, ясно, что они демонстрируют плохо дифференцированный эндокринный фенотип, часто обладают высокой пролиферацией и агрессивностью, и часто сверхэкспрессируют нейрональные белки. Результирующее повышение маркеров нейрональной экспрессии в этих опухолях, которые в противном случае могут быть в основном ограничены нервной системой или проявлять ограниченную экспрессию во время развития, примером которых может служить SEZ6, может, следовательно, стать уникальной терапевтической мишенью для опухолей с нейроэндокринным фенотипом.
[0025] Экспрессия SEZ6 связана с различными субпопуляциями опухолегенных клеток способом, который делает их восприимчивыми к лечению, как изложено в данном документе. В этом отношении в данном изобретении предлагается hSEZ6-1.ss1 КАЛП1, который может быть особенно полезен для нацеливания на онкогенные клетки, тем самым облегчая лечение, ведение и/или предотвращение рака. Будь то ингибирование или устранение онкогенных клеток, изменение их потенциала (например, путем индуцированной дифференцировки или разрушения ниши) или иным образом препятствуя способности онкогенных клеток влиять на опухолевую среду или другие клетки, данное изобретение позволяет более эффективно лечить рак путем ингибирования туморогенеза, поддержания опухоли и/или метастазирования, и повторение. Кроме того, следует понимать, что те же характеристики описанных антител делают их особенно эффективными при лечении рецидивирующих опухолей, которые оказались устойчивыми или невосприимчивыми к стандартным схемам лечения.
in vitro
in vivo
et al.
et al.
[0026] Способы, которые можно использовать для оценки снижения частоты появления онкогенных клеток, включают, но не ограничиваются ими, цитометрический или иммуногистохимический анализ, предпочтительно с помощью анализа серийных разведении  или  (Dylla  2008, PMID: PMC2413402 и Hoey  2009, PMID: 19664991).
[0027] Таким образом, способность антител в соответствии с данным изобретением снижать частоту появления онкогенных клеток может быть определена с использованием способов и маркеров, известных в данной области техники. В некоторых случаях анти-SEZ6 КАЛП могут снижать частоту онкогенных клеток на 10%, 15%, 20%, 25%, 30% или даже на 35%. В других вариантах реализации, снижение частоты появления онкогенных клеток может составлять порядка 40%, 45%, 50%, 55%, 60% или 65%. В некоторых вариантах реализации, раскрытые соединения могут снижать частоту появления онкогенных клеток на 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или даже на 95%. Следует понимать, что любое снижение частоты появления онкогенных клеток, вероятно, приведет к соответствующему снижению онкогенности, устойчивости, повторного возникновения и агрессивности новообразования.
Структура антител
et al.
Cellular and Molecular Immunology
et al.
Janeway’s Immunobiology
th
th
[0028] Антитела и их варианты, и производные, включая принятую систему номенклатуры и нумерации, подробно описаны, например, в Abbas  (2010),  (6 Ed.), W.B. Saunders Company; или Murphey  (2011),  (8 Ed.), Garland Science.
[0029] «Антитело» или «интактное антитело» обычно относится к Y-образному тетрамерному белку, содержащему две тяжелые (H) и две легкие (L) полипептидные цепи, удерживаемые вместе ковалентными дисульфидными связями и нековалентными взаимодействиями. Каждая легкая цепь состоит из одного вариабельного домена (VL) и одного константного домена (CL). Каждая тяжелая цепь включает один вариабельный домен (VH) и константную область, которая в случае антител IgG, IgA и IgD включает три домена, называемых CH1, CH2 и CH3 (IgM и IgE имеют четвертый домен, CH4). В классах IgG, IgA и IgD домены CH1 и CH2 разделены гибкой шарнирной областью, которая представляет собой богатый пролином и цистеином сегмент переменной длины (от около 10 до около 60 аминокислот в различных подклассах IgG). Вариабельные домены как в легкой, так и в тяжелой цепях соединены с константными доменами областью «J» из около 12 или более аминокислот, а тяжелая цепь также имеет область «D» из около 10 дополнительных аминокислот. Каждый класс антител дополнительно включает межцепочечные и внутрицепочечные дисульфидные связи, образованные парными остатками цистеина.
[0030] Термин «антитело», в контексте данного документа, конкретно включает гуманизированные моноклональные антитела IgG1, содержащие легкие цепи каппа (κ).
[0031] Вариабельные домены антител демонстрируют значительные различия в аминокислотном составе от одного антитела к другому и в первую очередь отвечают за распознавание и связывание антигена. Вариабельные области каждой пары легкой/тяжелой цепи образуют сайт связывания антитела, так что интактное антитело IgG имеет два сайта связывания (т.е., оно является двухвалентным). Домены VH и VL включают три области крайней изменчивости, которые называются гипервариабельными областями, или более чаще, областями, определяющими комплементарность (CDR), обрамленные и разделенные четырьмя менее вариабельными областями, известными как каркасные области (FR). Нековалентная ассоциация между VH и VL областью образует Fv-фрагмент (для «вариабельного фрагмента»), который содержит один из двух антигенсвязывающих сайтов антитела.
et al.
Sequences of Proteins of Immunological Interest
et al.
et al.
et al.
Handbook of Therapeutic Antibodies,
th
rd
[0032] В контексте данного документа, назначение аминокислот каждому домену, каркасной области и CDR будет осуществляться в соответствии с одной из схем, представленных Kabat  (1991)  (5Ed.), US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242;Chothia , 1987, PMID: 3681981; Chothia , 1989, PMID: 2687698; MacCallum ,1996, PMID: 8876650; или Dubel, Ed. (2007)  3 Ed., Wily-VCH Verlag GmbH and Co or AbM (Oxford Molecular/MSI Pharmacopia), если не указано иное. Как хорошо известно в данной области техники, нумерация остатков вариабельной области обычно такая, как указано Чотия или Кабат. Аминокислотные остатки, которые содержат CDR, как определено по Кабат, Чотия, МакКалум (также известный как Контакт) и AbM, полученные из базы данных веб-сайта Abysis (ниже), представлены ниже в Таблице 1. Обратите внимание, что МакКалум использует систему нумерации Чотия.
Таблица 1
Кабат
Чотия
МакКалум
AbM
VH CDR1
31-35
26-32
30-35
26-35
VH CDR2
50-65
52-56
47-58
50-58
VH CDR3
95-102
95-102
93-101
95-102
VL CDR1
24-34
24-34
30-36
24-34
VL CDR2
50-56
50-56
46-55
50-56
VL CDR3
89-97
89-97
89-96
89-97
et al.
et al.
[0033] Вариабельные области и CDR в последовательности антитела могут быть идентифицированы в соответствии с общими правилами, разработанными в данной области техники (например, как изложено выше), или путем выравнивания последовательностей с базой данных известных вариабельных областей. Способы идентификации этих областей описаны в Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001 и Dinarello , Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000. Типовые базы данных последовательностей антител описаны и доступны на веб-сайте «Abysis» по адресу www.bioinf.org.uk/abs (поддерживается A.C. Martin на кафедре биохимии и молекулярной биологии Университетского колледжа Лондона, Лондон, Англия) и веб-сайте VBASE2 по адресу www.vbase2.org, как описано в Retter , Nucl. Acids Res., 33 (Database issue): D671 -D674 (2005).
Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains
Antibody Engineering Lab Manual
et al
[0034] Предпочтительно последовательности анализируют с использованием базы данных Abysis, которая объединяет данные последовательностей из Kabat, IMGT и Базы данных структуры белков (PDB) со структурными данными из PDB. См. Dr. Andrew C. R. Martin's book chapter . In: (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547, также доступно на веб-сайте bioinforg.uk/abs). Веб-сайт базы данных Abysis также включает общие правила, которые были разработаны для идентификации CDR, которые можно использовать в соответствии с изложенными в данном документе принципами. Если не указано иное, все указанные в данном документе CDR получены в соответствии с веб-сайтом базы данных Abysis согласно Kabat .
et al.
et al.
выше
et al
выше
[0035] Для константной области тяжелой цепи нумерация аминокислотных положений, описанных в данном изобретении, соответствует Eu-индексу, впервые описанному Edelman , 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1): 78-85, которая описывает аминокислотную последовательность миеломного белка Eu, который, как сообщается, был первым секвенированным IgG1 человека. Индекс Eu Эдельмана также указан в Kabat , 1991 (). Таким образом, термины «Eu-индекс, изложенный в Kabat», или «Eu-индекс по Kabat», или «Eu-индекс», или «Eu-нумерация» в контексте тяжелой цепи обозначают систему нумерации остатков на основе IgG1-антитела Eu человека по Edelman et al., изложенную в Kabat et al., 1991 (выше). Система нумерации, используемая для аминокислотной последовательности константной области легкой цепи, аналогичным образом изложена в Kabat ., ().
[0036] Специалисты в данной области техники поймут, что последовательности константных областей тяжелой и легкой цепей антитела hSEZ6-1.ss1 были сконструированы, как описано в данном документе, для получения неспаренных цистеинов. Затем эти константные области функционально связываются с раскрытыми вариабельными областями тяжелой и легкой цепей с использованием стандартных методов молекулярной биологии для получения полноразмерных цепей антител, которые включены в раскрытый hSEZ6-1.ss1.
Образование и получение антител
[0037] Гуманизированное антитело hSEZ6-1.ss1 получают, как указано в Примерах 1 и 2, прилагаемых к данному документу, и полученные аминокислотные последовательности полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи представлены непосредственно ниже как SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4. Как обсуждается ниже, тяжелая цепь гуманизированного антитела содержит мутацию S60N, предназначенную для инактивации сайта гликозилирования, и мутацию C220S (пронумерованную в соответствии с EU-индексом по Кабат), которая обеспечивает свободный цистеин в легкой цепи. Обратите внимание, что в тяжелой цепи мутации S60N и C220S подчеркнуты, а образующийся свободный цистеин в положении 214 подчеркнут в легкой цепи. Жирным шрифтом выделена вариабельная область обеих цепей.
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSSWINWVRQMPGKGLEWMGRIYPGEGDTNYNGNFEGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCTRGLVMDYWGQGTLVTVSS
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
(SEQ ID NO:3)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDYNGISYMHWYQQKPGQAPRLLIYAASNVQSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSIEDPPTFGGGTKVEIK
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO:4)
[0038] Кроме того, совместимые последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие вышеупомянутые полноразмерные тяжелые и легкие цепи, указаны непосредственно ниже как SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 соответственно.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ (с интронами)
gaagtccaactcgtccaatccggtgccgaagtgaaaaagcctggggaatccctgaagatcagctgcaagggatccggttactcgttcacctcctcctggattaactgggtccggcagatgcccggaaagggactggagtggatgggcagaatctatccgggcgaaggggacactaattacaacggaaacttcgagggccaggtcaccatttcggccgataagagcatctcaaccgcgtacttgcagtggtcaagcctgaaggcttccgacaccgccatgtactactgtactcgcggccttgtgatggactactggggacagggaactctcgtgaccgtgtcgtccgcctctaccaagggcccttccgtgttccctctggccccctcgagcaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgagccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttggtgagaggccagcacagggagggagggtgtctgctggaagccaggctcagcgctcctgcctggacgcatcccggctatgcagccccagtccagggcagcaaggcaggccccgtctgcctcttcacccggaggcctctgcccgccccactcatgctcagggagagggtcttctggctttttccccaggctctgggcaggcacaggctaggtgcccctaacccaggccctgcacacaaaggggcaggtgctgggctcagacctgccaagagccatatccgggaggaccctgcccctgacctaagcccaccccaaaggccaaactctccactccctcagctcggacaccttctctcctcccagattccagtaactcccaatcttctctctgcagagcccaaatctagtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccaggtaagccagcccaggcctcgccctccagctcaaggcgggacaggtgccctagagtagcctgcatccagggacaggccccagccgggtgctgacacgtccacctccatctcttcctcagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaaggtgggacccgtggggtgcgagggccacatggacagaggccggctcggcccaccctctgccctgagagtgaccgctgtaccaacctctgtccctacagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt
(SEQ ID NO:5)
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ЛЕГКОЙ ЦЕПИ
gaaatcgtgttgacccagtcccccgctaccctgtcactgagccccggagaacgcgcgactctgtcctgccgggcatcccagtccgtggactacaacggaatctcctacatgcactggtatcagcaaaagccaggccaagccccgagactgctcatctacgccgcctcgaacgtgcagagcggtattccggcgcggttctccggctcgggcagcggaaccgattttaccctcactatctcgtcacttgaacctgaggacttcgccgtgtactactgccagcagtccattgaggacccgcctactttcggggggggaaccaaagtcgagatcaagcggactgtggctgcaccaagtgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
(SEQ ID NO:6)
[0039] Компонент антитела SEZ6 в соответствии с данным изобретением был разработан для облегчения эффективной конъюгации токсина калихемицина. В этом отношении препараты конъюгата антитело-лекарственное средство (КАЛП) в соответствии с данным изобретением включают относительно гомогенную популяцию молекул КАЛП как с точки зрения положения цитотоксина на антителе, так и с точки зрения соотношения лекарственного средства к антителу (СЛСА). На основании данного описания специалист в данной области техники может легко изготовить раскрытую сайт-специфичную сконструированную конструкцию, содержащую SEQ ID NO: 3 и 4. Термин «сайт-специфическое антитело» или «сайт-специфическая конструкция», в контексте данного изобретения, означает антитело, в котором по меньшей мере одна аминокислота в тяжелой или легкой цепи удалена, изменена или заменена (предпочтительно другой аминокислотой) для обеспечения по меньшей мере одного свободного цистеина. Аналогично, «сайт-специфический конъюгат» должен означать КАЛП, содержащий сайт-специфическое антитело и по меньшей мере один цитотоксин, конъюгированный с неспаренным или свободным цистеином(ами). В данном изобретении цистеин в положении 220 тяжелой цепи (Eu-нумерация по Кабат) мутировал в серин, тем самым разрушая дисульфидный мостик, который естественным образом образуется с концевым цистеином в положении 214 константной области легкой цепи каппа. Это превращает цистеин в положении 214 в свободный или неспаренный цистеин в соответствии с положениями данного документа, который затем конъюгируется с описанным линкер-лекарственное средство калихемицин.
[0040] Термины «свободный цистеин» или «неспаренный цистеин», в контексте данного документа, могут использоваться взаимозаменяемо, если иное не диктуется контекстом, и должны означать цистеиновый (или тиол-содержащий) компонент (например, остаток цистеина) антитела, присутствующего в природе или специально включенный в положение выбранного остатка с использованием методов молекулярной инженерии, который не является частью встречающейся в природе (или «нативной») дисульфидной связи в физиологических условиях. В выбранных вариантах реализации, свободный цистеин может включать встречающийся в природе цистеин, чей нативный межцепочечный или внутрицепочечный партнер дисульфидного мостика был заменен, удален или иным образом изменен для разрушения встречающегося в природе дисульфидного мостика в физиологических условиях, тем самым делая неспаренный цистеин подходящим для сайт-специфической конъюгации. Следует понимать, что до конъюгации свободные или неспаренные цистеины могут присутствовать в виде тиола (восстановленный цистеин), в виде кепованого цистеина (окисленного) или как часть ненативной внутри- или межмолекулярной дисульфидной связи (окисленного) с другой цистеиновой или тиоловой группой на той же или другой молекуле в зависимости от степени окисления системы. Как более подробно обсуждается ниже, умеренное восстановление сконструированной соответствующим образом конструкции антитела обеспечит тиолы, доступные для сайт-специфической конъюгации. Соответственно, в особенно предпочтительных вариантах реализации свободные или неспаренные цистеины будут подвергаться селективному восстановлению и последующей конъюгации для получения гомогенных композиций DAR. Такие положения остатков больше не «свободные» или «неспаренные» могут называться «сконструированными сайтами конъюгации», если они ковалентно связаны с линкер-лекарственное средство.
Handbook of Therapeutic Antibodies
Molecular Cloning: A Laboratory Manual
et al.
Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology
nd
rd
[0041] Антитела и их фрагменты могут быть получены или модифицированы с использованием генетического материала, полученного из клеток, продуцирующих антитела, и рекомбинантной технологии (см., например; Dubel and Reichert (Eds.) (2014) , 2 Edition, Wiley-Blackwell GmbH; Sambrook and Russell (Eds.) (2000)  (3 Ed.), NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel  (2002) , Wiley, John & Sons, Inc.; и патент США 7709611).
[0042] Другой аспект данного изобретения относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют антитело в соответствии с данным изобретением. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или практически чистой форме. Нуклеиновую кислоту «выделяют» или делают по существу чистой при отделении от других клеточных компонентов или других загрязняющих веществ, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, включая щелочную/ SDS обработку, CsCl-связывание, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие, хорошо известные в данной области техники. Нуклеиновая кислота в соответствии с данным изобретением может представлять собой, например, ДНК (например, геномную ДНК, кДНК), РНК и ее искусственные варианты (например, пептидные нуклеиновые кислоты), одноцепочечные или двухцепочечные, или РНК, РНК и могут или могут не содержат интронов. В выбранных вариантах реализации, нуклеиновая кислота представляет собой молекулу кДНК.
[0043] Нуклеиновые кислоты в соответствии с данным изобретением могут быть получены с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Для антител, экспрессируемых гибридомами (например, гибридомами, полученными, как описано в примерах ниже), кДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела, могут быть получены стандартными методами амплификации ПЦР или клонирования кДНК. Для антител, полученных из библиотеки генов иммуноглобулинов (например, с использованием методов фагового дисплея), молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитело, могут быть извлечены из библиотеки.
[0044] Фрагменты ДНК, кодирующие сегменты VH и VL, могут быть дополнительно модифицированы стандартными методами рекомбинантной ДНК, например, для преобразования генов вариабельной области в гены полноразмерной цепи антитела, в гены фрагментов Fab или в ген scFv. В этих манипуляциях фрагмент ДНК, кодирующий VL или VH, функционально связан с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, таким как константная область антитела или гибкий линкер. Термин «функционально связанный», используемый в данном контексте, означает, что два фрагмента ДНК соединены таким образом, что аминокислотные последовательности, кодируемые двумя фрагментами ДНК, остаются в рамке считывания.
[0045] Выделенная ДНК, кодирующая область VH, может быть преобразована в ген полноразмерной тяжелой цепи путем функционального связывания ДНК, кодирующей VH, с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (CH1, CH2 и CH3 в случае IgG1). Последовательности генов константной области тяжелой цепи человека известны в данной области техники (см., например, Kabat, et al. (1991) (выше)), и фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены с помощью стандартной ПЦР-амплификации.
[0046] Выделенная ДНК, кодирующая область VL, может быть преобразована в ген полноразмерной легкой цепи путем функционального связывания ДНК, кодирующей VL, с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи, CL. Последовательности генов константной области легкой цепи человека известны в данной области техники (см., например, Kabat, et al. (1991) (выше)), и фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены с помощью стандартной ПЦР-амплификации. Константная область легкой цепи может быть константной областью каппа или лямбда, но наиболее предпочтительно является константной областью каппа.
[0047] В каждом случае домены VH или VL могут быть функционально связаны с их соответствующими константными областями (CH или CL), где константные области представляют собой сайт-специфические константные области и обеспечивают сайт-специфическое антитело. В выбранных вариантах реализации, полученное сайт-специфическое антитело будет содержать два неспаренных цистеина в домене CL.
[0048] Для длительного получения рекомбинантных белков с высоким выходом предпочтительна стабильная экспрессия. Соответственно, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют выбранное антитело, могут быть сконструированы с использованием стандартных методов, признанных в данной области техники, и составляют часть данного изобретения. Вместо использования векторов экспрессии, которые содержат вирусные источники репликации, клетки-хозяева могут быть трансформированы ДНК, контролируемой соответствующими элементами контроля экспрессии (например, последовательностями промотора или энхансера, терминаторами транскрипции, сайтами полиаденилирования и т.д.) и селективным маркером. Может использоваться любая из систем селекции, хорошо известных в данной области техники, включая систему экспрессии гена глутаминсинтетазы (система ГС), которая обеспечивает эффективный подход для усиления экспрессии в выбранных условиях. Система ГС полностью или частично обсуждается в рамках EP 0216846, EP 0256055, EP 0323997 и EP 0338841, и US 5591639, и 5879936. Другой совместимой системой экспрессии для создания стабильных клеточных линий является набор Freedom™ CHO-S (Life Technologies).
in situ
[0049] После того, как антитело в соответствии с данным изобретением было получено рекомбинантной экспрессией или любым другим из описанных способов, оно может быть очищено или выделено с помощью способов, известных в данной области техники, в том, что оно идентифицируется и отделяется, и/или выделяется из его естественной среды и отделяется от загрязнителей, которые могут помешать диагностическому или терапевтическому использованию антитела или связанного КАЛП. Выделенные антитела включают антитела  в рекомбинантных клетках.
[0050] Эти изолированные препараты могут быть очищены с использованием различных методов, признанных в данной области техники, таких как, например, ионообменная и эксклюзионная хроматография, диализ, диафильтрация и аффинная хроматография, в частности аффинная хроматография с белком A или белком G.
Конъюгаты антител
[0051] Как обсуждалось выше, антитело в соответствии с данным изобретением конъюгировано с двумя молекулами калихемицина с образованием «конъюгата антитело-лекарственное средство» (КАЛП) или «конъюгата антитело». Термин «конъюгат» используется в широком смысле и означает ковалентное объединение калихемицина с антителом в соответствии с данным изобретением. В данном документе объединение осуществляется через остатки цистеина в положении 214 константных областей легкой цепи.
[0052] Следует понимать, что КАЛП в соответствии с данным изобретением может быть использован для селективной доставки предопределенных активных блоков калихемицина к онкогенным клеткам и/или клеткам, экспрессирующим SEZ6. Как изложено в данном документе, термины «лекарственное средство» или «активный блок» могут использоваться взаимозаменяемо и означать молекулу калихемицина. «Полезная нагрузка» включает калихемицин в комбинации с нерасщепляющимся линкером, которое обеспечивает стабильный фармацевтический комплекс, пока КАЛП не достигнет цели. Формула II (изложенная выше) представляет собой пример полезной нагрузки с активным блоком калихемицина.
[0053] В предпочтительных вариантах реализации, раскрытый КАЛП будет направлять связанную полезную нагрузку (например, Формулы II) к целевому сайту в относительно инертном, нетоксическом состоянии до высвобождения и активации токсина калихемицина. Такое целевое высвобождение активного блока предпочтительно достигается за счет стабильной конъюгации полезных нагрузок и относительно однородного состава препаратов КАЛП, в которых минимизированы чрезмерно конъюгированные токсичные виды КАЛП. В сочетании с особенно стабильным нерасщепляющимся линкер-лекарственное средство, который предназначен для высвобождения активного блока при доставке к месту опухоли, конъюгаты в соответствии с данным изобретением могут существенно снизить нежелательную неспецифическую токсичность. Это преимущественно обеспечивает относительно высокие уровни активного цитотоксина на участке опухоли при минимальном воздействии на нецелевые клетки и ткань, тем самым обеспечивая повышенную эффективность.
[0054] Конъюгат в соответствии с данным изобретением может быть в целом представлен Формулой III:
Ab-[L-D]n
где:
a) Ab включает антитело к SEZ6, имеющее тяжелую цепь SEQ ID NO: 3 и легкую цепь SEQ ID NO: 4;
b) [L-D] включает линкер-лекарственное средство Формулы II, ковалентно присоединенное к Ab; и
c) n равно 2.
[0055] В некоторых предпочтительных вариантах реализации, данное изобретение включает селективную конъюгацию полезной нагрузки калихемицином со свободными цистеинами с использованием стабилизирующих агентов в комбинации со слабыми восстановителями, как описано в данном документе. Такие условия реакции имеют тенденцию обеспечивать более гомогенные препараты с меньшим количеством неспецифических конъюгаций и примесей и, соответственно, меньшей токсичностью.
Активный блок калихемицина
1
1
1
2
3
1
1
I
Br
Br
I
I
i
i
[0056] Как обсуждается в данном документе, антитела в соответствии с данным изобретением конъюгированы с токсином калихемицин. То есть раскрытый SEZ6 КАЛП в соответствии с данным изобретением может иметь формулу Ab-[L-D]n (Формула III) или его фармацевтически приемлемую соль, где D представляет собой калихемицин или его аналог в любой из молекулярных структур, представленных в данном документе. Как известно в данной области техники, калихемицины представляют собой класс ендииновых противоопухолевых антибиотиков, полученных из бактерий Micromonospora echinospora, включая выделенные и охарактеризованные калихемицин γ, калихемицин β, калихемицин γ, калихемицин α, калихемицин α, калихемицин β и калихемицин δ. Структуры каждого из вышеуказанных аналогов калихемицина хорошо известны в данной области техники (например, см. Lee et al., Journal of Antibiotics, July 1989, которая полностью включена в данный документ посредством ссылки) и совместимы с конструкциями линкер-лекарственное средство калихемицин и раскрытыми в данном документе конъюгатами антитело-лекарственное средство.
1
[0057] Как правило, калихемицин γсодержит две отдельные структурные области, каждая из которых играет определенную роль в биологической активности соединения. Более крупный из двух состоит из удлиненного остатка сахара, включающего четыре моносахаридных звена и одно гексазамещенное бензольное кольцо; они соединены вместе посредством весьма необычного ряда гликозидных, тиоэфирных и гидроксиламинных связей. Вторая структурная область, агликон (известный как калихемицинон), содержит компактное, высокофункциональное бициклическое ядро, вмещающее напряженное звено ендиина в мостиковом 10-членном кольце. Эта субъединица агликона дополнительно содержит аллильный трисульфид, который, как описано ниже, функционирует как активатор для образования цитотоксической формы молекулы.
1
I
[0058] В качестве примера структура трисульфида калихемицина γ показана непосредственно ниже в Формуле IV:
Формула IV
1
1
1
2
3
1
1
I
Br
Br
I
I
i
I
[0059] Термин «калихемицин», в контексте данного документа, должен означать любой из калихемицина γ, калихемицина β, калихемицина γ, калихемицина α, калихемицина α, калихемицина β и калихемицина δ вместе с N-ацетильными производными, их сульфидными аналогами и аналогами. Соответственно, термин «калихемицин», в контексте данного документа, будет пониматься как охватывающий любой калихемицин, встречающийся в природе, а также молекулы калихемицина с дисульфидным фрагментом, имеющим точку присоединения к другой молекуле (например, конъюгату антитело-лекарственное средство), и их аналоги. В качестве примера, в контексте данного документа, следует понимать, что калихемицин γ включает следующие молекулы:
Формула V
и
Формула VI
1
где R является таким, как определено ниже.
1
I
[0060] Следует понимать, что любое из вышеупомянутых соединений совместимо с идеями, изложенными в данном документе, и может быть использовано для изготовления описанных конструкций линкер-лекарственное средство калихемицин и конъюгатов антитело-лекарственное средство. В некоторых вариантах реализации, таких как показанных в Формуле II, калихемициновый компонент описанных конъюгатов антитело-лекарственное средство будет включать N-ацетилкалихемицин γ (N-Ас калихемицин).
[0061] Калихемицины нацелены на нуклеиновые кислоты и вызывают разрыв цепи, тем самым убивая клетку-мишень. В частности, было обнаружено, что калихемицины связывают малую борозду ДНК, где они затем подвергаются реакции, аналогичной реакции циклизация Бергмана для создания бирадикальных частиц. В этом отношении субъединица арилтетрасахарида служит для доставки лекарственного средства к его мишени, прочно связываясь с малой бороздой двойной спирали ДНК, как показано Crothers et al. (1999). Когда нуклеофил (например, глутатион) атакует центральный атом серы трисульфидной группы, это вызывает значительное изменение структурной геометрии и создает большую нагрузку на 10-членное ендииновое кольцо. Этот штамм полностью избавляется от эндиина, который подвергается реакции циклоароматизации, образуя высокореактивный 1,4-бензоидный бирадикал и приводя, в конечном итоге, к расщеплению ДНК посредством привлечения атомов водорода из основной цепи дезоксирибозы ДНК, что приводит к разрыву цепи. Следует отметить, что в конструкциях аналога дисульфида калихемицина в соответствии с данным изобретением нуклеофил расщепляет защищенную дисульфидную связь с образованием желаемого бирадикала.
3
[0062] Более конкретно, понятно, что D явно включает любого члена класса калихемицина, известного в данной области техники, где концевой фрагмент --S-S-S-CH может быть заменен на -S-S-  , где символ  представляет собой точку привязки к линкеру.
[0063] Таким образом, в некоторых вариантах реализации, D имеет Формулу V,
,
Формула V
1
1E
1A
1B
1C
1A
1B
1C
1D
1B
1B
1C
1
1
3
3
3
3
n1
v1
3
где R представляет собой водород, галоген, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный циклоалкил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил, замещенный или незамещенный арил, или замещенный, или незамещенный гетероарил, -CF, -CCl, -CBr, - CI, -CN, -C(O)R, -OR, -NRR, -C(O)OR, -C(O)NRR, -SR, -SOR или -SONRR. В некоторых выбранных вариантах реализации, R будет содержать H. В других выбранных вариантах реализации, R будет содержать -C(O)CH.
1A
1B
1C
1D
1E
3
3
3
3
2
2
2
3
4
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
R, R, R, R и Rнезависимо представляют собой водород, галоген, -CF, -CCl,-CBr, -CI, -OH, -NH, -COOH, -CONH, -N(O), -SH, -S(O)H, -S(O)H, -S(O)NH, -NHNH, -ONH, -NHC(O)NHNH, -NHC(O)NH, -NHS(O)H, -NHC(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF, -OCCl, -OCBr, -OCI, -OCHF, -OCHCl, -OCHBr, -OCHI, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный циклоалкил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил, замещенный или незамещенный арил, или замещенный, или незамещенный гетероарил.
1B
1C
[0064] В некоторых вариантах реализации, заместители R и R,связанные с одним и тем же атомом азота, необязательно могут быть соединены с образованием замещенного или незамещенного гетероциклоалкила, или замещенного, или незамещенного гетероарила. Символ n1 независимо является целым числом от 0 до 4, символ v1 независимо равен 1 или 2, а символ  представляет собой точку присоединения к линкеру.
[0065] Что касается формулы V, следует понимать, что проиллюстрированное соединение включает аналог дисульфида калихемицина (например, аналог N-ацетилкалихемицина, такой как показано в Формуле II), предпочтительно связанный с дисульфидной защитной группой (в точке присоединения, представленной ), который ковалентно связан с остальной частью линкера. Дисульфидная защитная группа улучшает стабильность дисульфидной связи в кровотоке и позволяет эффективно синтезировать описанные конструкции калихемицин-линкер. В некоторых вариантах реализации, дисульфидная группа калихемицина предпочтительно защищена короткоцепочечной замещенной или незамещенной бифункциональной алифатической или арильной группой («дисульфидная защитная группа»), которая обеспечивает стабильность (например, стабильность плазмы) до тех пор, пока КАЛП не достигнет клетки-мишени. Более конкретно конфигурация дисульфидной защитной группы обеспечивает степень стерических препятствий для дисульфидной связи, тем самым снижая ее склонность к расщеплению посредством реакций тиол-дисульфидного обмена. В этом положении дисульфидная защитная группа ковалентно связывает дисульфидную группу калихемицина с остатком нерасщепляющегося линкера.
[0066] При достижении мишени (например, раковой клетки) линкер предпочтительно будет разорван или разрушен с высвобождением калихемицина, присоединенного к части линкера через дисульфидную защитную группу. В некоторых вариантах реализации, как только линкер был первоначально расщеплен за пределы дисульфидной защитной группы (т.е., дистальнее калихемицина), оставшаяся часть линкера, присоединенного к калихемицину, будет разлагаться в физиологических условиях до точки, где дисульфидная связь разорвана (предпочтительно внутриклеточно) с последующей перестройкой и образованием активных бирадикальных форм калихемицина. Именно эта форма активного блока на основе калихемицина связывается с малой бороздой клеточной ДНК и вызывает желаемые цитотоксические эффекты (см. Walker et al., Biochemistry 89: 4608-4612, 5/92, который полностью включен в данные документ посредством ссылки).
Линкерные соединения
[0067] Как указано выше, полезные нагрузки, совместимые с данным изобретением, содержат один или более активных блоков, и нерасщепляющийся линкер, связывающий активные блоки с нацеливающим агентом на основе антител. Совместимые нерасщепляющиеся линкеры ковалентно связываются с реакционноспособным остатком на антителе (предпочтительно цистеином или лизином) и калихемицином через дисульфидный фрагмент.
[0068] В особенно предпочтительных вариантах реализации, линкер будет содержать выбранные нерасщепляющиеся линкеры. В некоторых вариантах реализации, КАЛП будут содержать совместимые нерасщепляющиеся линкеры, содержащие амидно-связанный полиэтиленгликоль или алкильные спейсеры, которые высвобождают полезную нагрузку калихемицина во время лизосомной деградации КАЛП в клетке-мишени. Особенно совместимый нерасщепляющийся линкер, используемый в Формуле II, показан непосредственно ниже в Формуле VII, где волнистая линия указывает точку присоединения к дисульфидной группе калихемицина.
Формула VII
Синтез Формулы II, включая линкерный компонент, показан в Примере 3 ниже с соответствующими условиями.
Конъюгация
[0069] В данной области техники известны различные методы конъюгирования терапевтического соединения с остатком цистеина, которые будут очевидны специалисту в данной области техники. В основных условиях остатки цистеина будут депротонированы с образованием тиолат нуклеофила, который может приводится в контакт со слабыми электрофилами, такими как малеимиды и йодацетамиды. Обычно реагенты для таких конъюгаций могут напрямую приводится в контакт с цистеин-тиолом с образованием конъюгированного белка или с линкером-лекарственным средством с образованием промежуточного линкер-лекарственного средства. В случае линкера специалистам в данной области техники известно несколько способов с использованием реакций, условий и реагентов органической химии, включая: (1) приведение в контакт цистеиновой группы белка в соответствии с данным изобретением с линкерным реагентом для образования промежуточного соединения белок-линкер через ковалентную связь с последующем приведением в контакт с активированным соединением; и (2) приведение в контакт нуклеофильной группы соединения с линкерным реагентом с образованием промежуточного линкер-лекарственного средства через ковалентную связь с последующем приведением в контакт с цистеиновой группой белка в соответствии с данным изобретением.
трис
[0070] Перед конъюгацией антитела могут быть полученными реактивноспособными для конъюгации с линкерными реагентами путем обработки восстанавливающим агентом, таким как дитиотреитол (DTT) или ((2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP). В других вариантах реализации, дополнительные нуклеофильные группы могут быть введены в антитела посредством реакции лизинов с реагентами, включая, помимо прочего, 2-иминотиолан (реагент Траута), SATA, SATP или SAT(PEG)4, что приводит к превращению амина в тиол.
[0071] Реагенты конъюгации обычно включают малеимид, галогенацетил, йодацетамидсукцинимидиловый эфир, изотиоцианат, сульфонилхлорид, 2,6-дихлортриазинил, пентафторфениловый эфир и фосфорамидит, хотя могут быть использованы и другие функциональные группы. В некоторых вариантах реализации, способы включают, например, использование малеимидов, йодацетимидов или галогенацетила/алкилгалогенидов, азиридина, производных акрилоила для приведения в контакт с тиолом цистеина с получением тиоэфира, который приводят в контакт с соединением. Дисульфидный обмен свободного тиола с активированным пиридилдисульфидом также полезен для получения конъюгата (например, использование 5-тио-2-нитробензойной (TNB) кислоты). Предпочтительно использовать малеимид.
[0072] Как обсуждалось выше сайт-специфические антитела или сконструированные антитела, позволяют получать препараты конъюгатов, которые демонстрируют повышенную стабильность и существенную гомогенность, по меньшей мере частично, благодаря обеспечению сконструированного сайта(ов) свободного цистеина и/или новых процедур конъюгирования, изложенных в данном документе. В отличие от традиционной методологии конъюгации, которая полностью или частично уменьшает каждую из внутрицепочечных или межцепочечных дисульфидных связей антитела для обеспечения сайтов конъюгации (и полностью совместимо с данным изобретением), в данном изобретении дополнительно предлагается селективное восстановление определенных подготовленных свободных цистеиновых сайтов и присоединение линкер-лекарственного средства к тому же.
[0073] В этом отношении следует понимать, что специфичность конъюгирования, которой способствуют сконструированные сайты и селективное восстановление, обеспечивает высокий процент сайт-направленного конъюгирования в требуемых положениях. Существенно, что некоторые из этих сайтов конъюгации, такие как те, которые присутствуют в концевой области константной области легкой цепи, обычно трудно эффективно конъюгировать, поскольку они имеют тенденцию перекрестно вступать в контакт с другими свободными цистеинами. Однако с помощью молекулярной инженерии и избирательного восстановления образующихся свободных цистеинов можно получить эффективные скорости конъюгации, что значительно снижает нежелательные примеси с высоким содержанием DAR и неспецифическую токсичность. В более общем плане сконструированные конструкции и раскрытые новые способы конъюгации, включающие селективное восстановление, обеспечивают препараты КАЛП, имеющие улучшенную фармакокинетику и/или фармакодинамику и, возможно, улучшенный терапевтический индекс.
трис
[0074] В некоторых вариантах реализации, сайт-специфические конструкции представляют собой свободный цистеин(ы), который при восстановлении содержат тиоловые группы, которые являются нуклеофильными и способны приступать в контакт с образованием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных фрагментах, таких как раскрытые выше. Как обсуждалось выше, антитела в соответствии с данным изобретением предпочтительно содержат восстанавливаемые неспаренные межцепочечные цистеины, то есть цистеины, обеспечивающие такие нуклеофильные группы. Таким образом, в некоторых вариантах реализации реакция свободных сульфгидрильных групп восстановленных свободных цистеинов и концевых малеимидо- или галогенацетамидных групп совместимых линкер-лекарственных средств будет обеспечивать желаемую конъюгацию. В таких случаях свободные цистеины антител могут быть получены реактивными для конъюгации с линкерными реагентами путем обработки восстанавливающим агентом, таким как дитиотреитол (DTT) или (-(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP). Таким образом, каждый свободный цистеин теоретически представляет реактивный тиолсодержащий нуклеофил. Хотя такие реагенты особенно совместимы с данным изобретением, следует понимать, что конъюгация сайт-специфических антител может быть достигнута с использованием различных реакций, условий и реагентов, обычно известных специалистам в данной области техники.
[0075] Кроме того, было обнаружено, что количество свободных цистеинов сконструированных антител могут быть избирательно восстановлены для обеспечения усиленной сайт-направленной конъюгации и уменьшения количества нежелательных, потенциально токсичных примесей. В частности, было обнаружено, что «стабилизирующие агенты», такие как аргинин, модулируют внутри- и межмолекулярные взаимодействия в белках, и они могут быть использованы в сочетании с выбранными восстановителями (предпочтительно относительно слабыми) для селективного восстановления свободных цистеинов и облегчения сайт-специфической конъюгации, как указано в данном документе. Термины «селективное восстановление» или «селективно восстанавливающий», в контексте данного документа, могут использоваться взаимозаменяемо и должны означать восстановление свободного цистеина(ов) без существенного разрушения нативных дисульфидных связей, присутствующих в сконструированном антителе. В выбранных вариантах реализации, это селективное восстановление может быть достигнуто за счет использования определенных восстанавливающих агентов или определенных концентраций восстанавливающих агентов. В других вариантах реализации, селективное восстановление сконструированной конструкции будет включать использование стабилизирующих агентов в комбинации с восстановителями (включая слабые восстанавливающие агенты). Следует понимать, что термин «селективная конъюгация» будет означать конъюгацию сконструированного антитела, которое было селективно восстановлено в присутствии цитотоксина, как описано в данном документе. В этом отношении использование таких стабилизирующих агентов (например, аргинин) в комбинации с выбранными восстановителями может заметно повысить эффективность сайт-специфической конъюгации, что определяется степенью конъюгации на тяжелой и легкой цепях антител и распределением DAR препарата. Совместимые конструкции антител, способы и реагенты селективной конъюгации широко раскрыты в WO2015/031698, который включен в данное описание конкретно в отношении такой методологии и конструкций.
[0076] Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, такие стабилизирующие агенты могут действовать, модулируя электростатическое микроокружение и/или модулируя конформационные изменения в желаемом сайте конъюгации, тем самым позволяя относительно слабым восстанавливающим агентам (которые существенно не восстанавливают интактные нативные дисульфидные связи) облегчать конъюгацию в желаемом сайте(ах) свободного цистеина. Такие агенты (например, определенные аминокислоты), как известно, образуют солевые мостики (посредством водородных связей и электростатических взаимодействий) и могут модулировать белок-белковые взаимодействия таким образом, чтобы придавать стабилизирующий эффект, который может вызывать благоприятные конформационные изменения и/или уменьшать неблагоприятные белок-белковые взаимодействия. Более того, такие агенты могут действовать, ингибируя образование нежелательных внутримолекулярных (и межмолекулярных) связей цистеин-цистеин после восстановления, тем самым облегчая желаемую реакцию конъюгации, при которой сконструированный сайт-специфический цистеин связывается с лекарственным средством (предпочтительно через линкер). Поскольку условия селективного восстановления не обеспечивают значительного восстановления интактных нативных дисульфидных связей, последующая реакция конъюгации естественным образом приводит к относительно небольшому количеству реакционноспособных тиолов на свободных цистеинах (например, предпочтительно 2 свободных тиола на антитело). Как упоминалось ранее, такие способы могут быть использованы для значительного снижения уровней неспецифической конъюгации и соответствующих нежелательных видов DAR в препаратах конъюгатов, изготовленных в соответствии с данным раскрытием.
[0077] В выбранных вариантах реализации, стабилизирующие агенты, совместимые с данным изобретением, обычно будут включать соединения по меньшей мере с одним фрагментом, имеющим основную pKa. В некоторых вариантах реализации, фрагмент будет содержать первичный амин, тогда как в других вариантах реализации, фрагмент амина будет содержать вторичный амин. В еще других вариантах реализации, аминовая группа будет включать третичный амин или гуанидиниевую группу. В других выбранных вариантах реализации, аминовый фрагмент будет содержать аминокислоту, тогда как в других совместимых вариантах реализации аминовый фрагмент будет содержать боковую цепь аминокислоты. В еще других вариантах реализации, аминовый фрагмент будет содержать протеиногенную аминокислоту. В других вариантах реализации, аминовый фрагмент содержит непротеиногенную аминокислоту. В некоторых вариантах реализации, совместимые стабилизирующие агенты могут включать аргинин, лизин, пролин и цистеин. В некоторых предпочтительных вариантах реализации, стабилизирующий агент будет содержать аргинин. Кроме того, совместимые стабилизирующие агенты могут включать гуанидин и азотсодержащие гетероциклы с основным pKa.
[0078] В некоторых вариантах реализации, совместимые стабилизирующие агенты включают соединения по меньшей мере с одной аминогруппой, имеющей pKa более чем около 7,5, в других вариантах реализации, рассматриваемая аминогруппа будет иметь pKa более чем около 8,0, еще в других вариантах реализации аминогруппа будет иметь pKa более чем около 8,5, и еще в других вариантах реализации, стабилизирующий агент будет содержать аминогруппу, имеющую pKa более чем около 9,0. Другие варианты реализации будут включать стабилизирующие агенты, в которых аминогруппа будет иметь pKa более чем около 9,5, в то время как некоторые другие варианты реализации будут включать стабилизирующие агенты, проявляющие по меньшей мере одну аминогруппу, имеющую pKa более чем около 10,0. В еще других вариантах реализации, стабилизирующий агент будет включать соединение, имеющее аминогруппу с pKa более чем около 10,5, в других вариантах реализации, стабилизирующий агент будет включать соединение, имеющее аминогруппу с pKa более чем около 11,0, а в других вариантах реализации, стабилизирующий агент будет содержать аминогруппу с pKa более чем около 11,5. В еще других вариантах реализации, стабилизирующий агент будет включать соединение, имеющее аминогруппу с pKa более чем около 12,0, в то время как еще в других вариантах реализации стабилизирующий агент будет включать аминогруппу с pKa более чем около 12,5. Специалисты в данной области техники поймут, что релевантные pKa можно легко рассчитать или определить с использованием стандартных методик и использовать для определения применимости использования выбранного соединения в качестве стабилизирующего агента.
[0079] Показано, что раскрытые стабилизирующие агенты особенно эффективны в отношении конъюгирования со свободными сайт-специфическими цистеинами в сочетании с некоторыми восстановителями. Для целей данного изобретения совместимые восстанавители могут включать любое соединение, которое продуцирует восстановленный свободный сайт-специфический цистеин для конъюгации без значительного разрушения нативных дисульфидных связей сконструированного антитела. В таких условиях, предпочтительно обеспечиваемых комбинацией выбранных стабилизирующих и восстанавливающих агентов, активированный линкер-лекарственное средство в значительной степени ограничен связыванием с желаемым свободным сайт-специфическим сайтом(ами) цистеина. Особенно предпочтительны относительно слабые восстановители или восстановители, используемые в относительно низких концентрациях для обеспечения мягких условий. Термины «слабый восстановитель» или «мягкие восстанавливающие условия», в контексте данного документа, должны означать любой агент или состояние, вызванное восстановителем (необязательно в присутствии стабилизирующих агентов), который обеспечивает тиолы в свободном цистеиновом сайте (сайтах) без существенного разрушения нативных дисульфидных связей, присутствующих в сконструированном антителе. То есть слабые восстановители или условия (предпочтительно в комбинации со стабилизирующим агентом) способны эффективно восстанавливать свободный(е) цистеин(ы) (обеспечивать тиол) без значительного разрушения нативных дисульфидных связей белка. Желаемые восстановительные условия могут быть обеспечены рядом соединений на основе сульфгидрила, которые создают подходящую среду для селективного конъюгирования. В вариантах реализации, слабые восстановители могут включать соединения, содержащие один или более свободных тиолов, тогда как в некоторых вариантах реализации, слабые восстановители будут включать соединения, имеющие один свободный тиол. Неограничивающие примеры восстановителей, совместимых с методами селективного восстановления в соответствии с данным изобретением, включают глутатион, н-ацетилцистеин, цистеин, 2-аминоэтан-1-тиол и 2-гидроксиэтан-1-тиол.
[0080] Кроме того, следует понимать, что сконструированные антитела, способные к конъюгации, могут содержать остатки свободного цистеина, которые содержат сульфгидрильные группы, которые блокируются или закрываются по мере продуцирования или хранения антитела. Такие кэпы включают небольшие молекулы, белки, пептиды, ионы и другие вещества, которые взаимодействуют с сульфгидрильной группой и предотвращают или ингибируют образование конъюгата. В некоторых случаях неконъюгированное сконструированное антитело может содержать свободные цистеины, которые связывают другие свободные цистеины с тем же или другими антителами. Как обсуждается в данном документе, такая перекрестная реактивность может приводить к различным загрязнениям во время процедуры изготовления. В некоторых вариантах реализации, сконструированные антитела могут потребовать снятия кэпа перед реакцией конъюгации. В конкретных вариантах реализации, антитела в данном документе не кэпированы и содержат свободную сульфгидрильную группу, способную к конъюгации. В конкретных вариантах реализации, антитела в данном изобретении подвергаются реакции снятия кэпа, которая не нарушает и не перестраивает встречающиеся в природе дисульфидные связи. Следует понимать, что в большинстве случаев реакции снятия кэпа будут происходить во время обычных реакций восстановления (восстановления или селективного восстановления).
Распределение СЛСА и очистка
[0081] В выбранных вариантах реализации, методология конъюгации и очистки, совместимая с данным изобретением, преимущественно обеспечивает возможность получения относительно гомогенных препаратов КАПС, содержащих узкое распределение СЛСА. В этом отношении раскрытые конструкции (например, сайт-специфические конструкции) и/или селективная конъюгация обеспечивают гомогенность видов КАЛП в образце с точки зрения стехиометрического соотношения между лекарственным средством и сконструированным антителом и в отношении местоположения токсина. Как кратко обсуждалось выше, термин «соотношение лекарственного средства к антителу» или «СЛСА» относится к молярному соотношению лекарственного средства к антителу в препарате КАЛП. В некоторых вариантах реализации, препарат конъюгата может быть по существу гомогенным в отношении его распределения СЛСА, что означает, что в препарате КАЛП преобладают виды сайт-специфичных КАЛП с определенной нагрузкой лекарственного средства (например, нагрузка лекарственного средства 2), которая также является однородной относительно места нагрузки (то есть свободных цистеинов). В других определенных вариантах реализации данного изобретения можно достичь желаемой гомогенности за счет использования сайт-специфических антител и/или селективного восстановления и конъюгации. В других вариантах реализации желаемая гомогенность может быть достигнута за счет использования сайт-специфических конструкций в сочетании с избирательным восстановлением. В еще других вариантах реализации, совместимые препараты могут быть очищены с использованием методов аналитической или препаративной хроматографии для обеспечения желаемой гомогенности. В каждом из этих вариантов реализации гомогенность образца КАЛП может быть проанализирована с использованием различных методик, известных в данной области техники, включая, помимо прочего, масс-спектрометрию, ВЭЖХ (например, гель-фильтрующая ВЕРХ, ВЭЖХ с обращенной фазой, ВЕРХ с гидрофобным взаимодействием и т.д.) или капиллярный электрофорез.
[0082] Что касается очистки препаратов КАЛП, следует понимать, что для получения желаемой чистоты можно использовать стандартные фармацевтические препаративные способы. Как обсуждается в данном документе, способы жидкостной хроматографии, такие как обращено-фазовая (ОФ) и хроматография гидрофобного взаимодействия (ГВ), могут разделять соединения в смеси по величине нагрузки лекарственного средства. В некоторых случаях ионообменная хроматография (ИОХ) или хроматография со смешанным режимом (ХСР) также может использоваться для выделения видов с определенной лекарственной нагрузкой.
[0083] В любом случае описанные КАЛП и их препараты могут включать лекарственные средства и фрагменты антител в различных стехиометрических молярных соотношений в зависимости от конфигурации антитела и, по меньшей мере частично, от способа, используемого для осуществления конъюгации. В некоторых предпочтительных вариантах реализации нагрузка лекарственного средства на КАЛП может включать 2 активных блока калихемицина.
[0084] Несмотря на относительно высокий уровень гомогенности, обеспечиваемый данным изобретением, раскрытые композиции фактически содержат смесь конъюгатов с рядом лекарственных средств/препаратов. Таким образом, раскрытые композиции КАЛП включают смеси конъюгатов, где большинство составляющих антител ковалентно связаны с одним или более фрагментами лекарственного средства и (несмотря на относительную специфичность конъюгата, обеспечиваемую сконструированными конструкциями и селективным восстановлением), где фрагменты лекарственного средства могут быть присоединены к антителу различными тиоловыми группами. То есть после конъюгации композиции в соответствии с данным изобретением будут включать смесь КАЛП с различными нагрузками лекарственного средства в различных концентрациях (наряду с определенными примесями реакции, в первую очередь вызванными перекрестной реактивностью свободного цистеина). Однако с использованием селективного восстановления и очистки после изготовления композиции конъюгатов могут быть доведены до такой степени чистоты, что они в значительной степени содержат один преобладающий желаемый вид КАЛП (например, с нагрузкой лекарственного средства равной 2) с относительно низкими уровнями других видов КАЛП (например, с нагрузкой лекарственного средства равной 1, 4, 6 и т. д.). Среднее значение СЛСА (отношение лекарственного средства к антителу) представляет собой средневзвешенное значение нагрузки лекарственного средства для композиции в целом (то есть для всех видов КАЛП, взятых вместе). Специалисты в данной области техники поймут, что приемлемые значения или спецификации СЛСА часто представлены как среднее значение, диапазон или распределение (то есть среднее значение СЛСА 2 +/- 0,5). Предпочтительно композиции, содержащие измеренное среднее значение СЛСА в диапазоне (например, от 1,5 до 2,5), будут использоваться в фармацевтических условиях.
[0085] Таким образом, в некоторых вариантах реализации, данное изобретение будет включать композиции, имеющие среднее СЛСА равное 2 +/- 0,5. В других вариантах реализации, данное изобретение будет содержать среднее СЛСА равное 2 +/- 0,4, или СЛСА 2 +/- 0,3, или СЛСА 2 +/- 0,2. В других вариантах реализации, композиции конъюгата IgG1 предпочтительно будут содержать композицию с относительно низкими уровнями (т.е. менее 30%) не преобладающих видов КАЛП (например, КАЛП с нагрузкой лекарственного средства 0, 1, 3, 4, 5 и т. д.). В некоторых вариантах реализации, композиция КАЛП будет иметь среднее значение СЛСА 2 +/- 0,4 с относительно низкими уровнями (<30%) не преобладающих видов КАЛП. В некоторых вариантах реализации, композиция КАЛП будет иметь среднее значение СЛСА 2 +/- 0,3 с относительно низкими уровнями (<30%) не преобладающих видов КАЛП. Еще в других вариантах реализации, преобладающие виды КАЛП (например, с нагрузкой лекарственного средства 2) будут присутствовать в концентрации более 50%, при концентрации более 55%, при концентрации более 60%, при концентрация более 65%, при концентрации более 70%, при концентрации более 75%, при концентрации более 80%, при концентрации более 85%, при концентрации более 90% при концентрации более 93%, при концентрации более 95% или даже при концентрации более 97% при измерении относительно всех других видов СЛСА, присутствующих в композиции.
[0086] Как подробно описано в приведенных ниже примерах, распределение количества лекарственных средств на антитело в составах КАЛП из реакций конъюгации может быть охарактеризовано обычными средствами, такими как спектрофотометрия в УФ-видимом диапазоне, обратно-фазовая ВЭЖХ, ХГВ, масс-спектроскопия, ИФА и электрофорез. Также может быть определено количественное распределение КАЛП относительно количества лекарственного средства на антитело.
Фармацевтические составы и терапевтическое применение
[0087] Антитела или КАЛП в соответствии с данным изобретением могут быть составлены различными способами с использованием признанных в данной области способов. В некоторых вариантах реализации, терапевтические композиции в соответствии с данным изобретением можно вводить в чистом виде или с минимальным количеством дополнительных компонентов, в то время как другие могут быть необязательно составлены таким образом, чтобы содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители. Как используется в данном документе, термин «фармацевтически приемлемые носители» включает вспомогательные вещества, носители, адъюванты и разбавители, которые хорошо известны в данной области техники.
Дозировки и схемы введения
[0088] Конкретная схема введения, т.е. доза, время и повторение, будет зависеть от конкретного человека, а также от эмпирических соображений, таких как фармакокинетика (например, период полувыведения, скорость клиренса и т. д.). Определение частоты введения может быть выполнено специалистами в данной области техники, такими как лечащий врач, на основании рассмотрения состояния и тяжести состояния, которое лечат, возраста и общего состояния здоровья субъекта, подвергаемого лечению, и т.п. Частота введения может быть скорректирована в ходе терапии на основе оценки эффективности выбранной композиции и схемы введения. Такая оценка может быть сделана на основе маркеров конкретного заболевания, расстройства или состояния. В вариантах реализации, в которых у индивидуума есть рак, это включает прямые измерения размера опухоли путем пальпации или визуального наблюдения; косвенное измерение размера опухоли с помощью рентгеновских лучей или других способов визуализации; улучшение, оцененное с помощью прямой биопсии опухоли и микроскопического исследования образца опухоли; измерение уровня непрямого опухолевого маркера или антигена, идентифицированного согласно признанным в данной области техники методикам; уменьшение количества пролиферативных или онкогенных клеток, поддержание уменьшения количества таких опухолевых клеток; уменьшение разрастания неопластических клеток; или задержка развития метастазов.
Показания
[0089] В данном изобретении предлагается использование КАЛП в соответствии с данным изобретением для лечения различных неопластических расстройств. В некоторых вариантах реализации, заболевания, подлежащие лечению, представляют собой неопластические состояния, включающие солидные опухоли. В выбранных вариантах реализации, КАЛП в соответствии с данным изобретением будет использоваться для лечения опухолей или онкогенных клеток, экспрессирующих детерминанту SEZ6. В некоторых других вариантах реализации, раскрытый КАЛП будет использоваться для лечения субъекта, страдающего мелкоклеточным раком легкого (МКРЛ). Предпочтительно, «субъект» или «пациент», подлежащий лечению, будет человеком, хотя в контексте данного описания термины явно включают любой вид млекопитающих.
[0090] В выбранных вариантах реализации, КАЛП можно вводить пациентам с мелкоклеточным раком легкого, демонстрирующим ограниченную стадию заболевания или обширную стадию заболевания. В других вариантах реализации, описанный КАЛП будет вводиться рефрактерным пациентам (т.е. тем, у кого заболевание рецидивирует во время или вскоре после завершения курса начальной терапии); чувствительным пациентам (т. е. тем, у кого рецидив продолжается более 2-3 месяцев после первичной терапии); или пациентам, проявляющим устойчивость к агенту на основе платины (например, карбоплатину, цисплатину, оксалиплатину) и/или таксану (например, доцетакселу, паклитакселу, ларотакселу или кабазитакселу). В некоторых предпочтительных вариантах реализации, SEZ6 КАЛП в соответствии с данным изобретением можно вводить пациентам первой линии. В других вариантах реализации, SEZ6 КАЛП в соответствии с данным изобретением можно вводить пациентам второй линии. В других вариантах реализации, SEZ6 КАЛП в соответствии с данным изобретением можно вводить пациентам третьей линии или пациентам четвертой линии.
Готовые изделия
[0091] Данное изобретение включает фармацевтические упаковки и наборы, содержащие один или более контейнеров или емкостей, причем контейнер может содержать одну или более доз КАЛП в соответствии с данным изобретением. В некоторых вариантах реализации, упаковка или набор содержат стандартную дозу, означающую заранее определенное количество композиции, содержащей, например, КАЛП в соответствии с данным изобретением, с одним или более дополнительными агентами или без них и, необязательно, с одним или более противораковыми агентами.
[0092] Когда компоненты набора представлены в одном или более жидких растворах, водных или неводных, обычно предпочтительным является водный раствор, особенно предпочтительным является стерильный водный раствор. Композиция в наборе также может быть представлена в виде высушенного порошка(ов) или в лиофилизированной форме, которая может быть восстановлена после добавления соответствующей жидкости. Жидкость, используемая для восстановления, может храниться в отдельном контейнере. Такие жидкости могут содержать стерильный, фармацевтически приемлемый буфер(ы) или другой(ие) разбавитель(и), такой как бактериостатическая вода для инъекций. Если набор содержит КАЛП в соответствии с данным изобретением в комбинации с дополнительными терапевтическими средствами или агентами, раствор может быть предварительно смешан либо в молярной эквивалентной комбинации, либо с одним компонентом в избытке по отношению к другому. Альтернативно, КАЛП в соответствии с данным изобретением и любой необязательный противораковый агент или другой агент могут храниться отдельно в разных контейнерах перед введением пациенту.
[0093] В некоторых предпочтительных вариантах реализации, вышеупомянутые наборы, включающие композиции в соответствии с данным изобретением, будут содержать этикетку, маркер, вкладыш в упаковку, штрих-код и/или считывающее устройство, указывающее, что содержимое набора может быть использовано для лечения рака. В других предпочтительных вариантах реализации, набор может содержать этикетку, маркер, вкладыш в упаковку, штрих-код и/или считывающее устройство, указывающее, что содержимое набора можно вводить в соответствии с определенной дозировкой или схемой применения для лечения субъекта, страдающего раком. В других особенно предпочтительных аспектах этикетка, маркер, вкладыш в упаковку, штрих-код и/или считывающее устройство, указывающее, что содержимое набора может быть использовано для лечения мелкоклеточного рака легкого или схемы применения для его лечения.
[0094] Подходящие контейнеры или емкости включают, например, бутыли, флаконы, шприцы, инфузионные пакеты (пакеты для в/в введения) и т.д. Контейнеры могут быть сформированы из различных материалов, таких как стекло или фармацевтически совместимые пластмассы. В некоторых вариантах реализации, емкость(и) может содержать стерильный порт доступа. Например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, которую можно проткнуть иглой для подкожных инъекций.
[0095] В некоторых вариантах реализации, набор может содержать средство для введения КАЛП и любых необязательных компонентов пациенту, например, одну или более игл, или шприцев (предварительно заполненных или пустых) или другое подобное устройство, из которого композицию можно инъецировать или вводить субъекту, либо наносить на больной участок тела. Наборы в соответствии с данным изобретением также обычно включают средства для содержания флаконов и т.п., а также другие компоненты в тесном ограничении для коммерческой продажи, такие как, например, выдувные пластиковые контейнеры, в которые помещаются и в которых хранятся желаемые флаконы и другое устройство.
Прочее
[0096] Если в данном документе не определено иное, научные и технические термины, используемые в связи с изобретением, имеют значения, которые обычно понимаются специалистами в данной области техники. Кроме того, если иное не требуется по контексту, термины в единственном числе должны включать множественное число, а термины во множественном числе должны включать единственное число. Кроме того, диапазоны, указанные в спецификации и прилагаемой формуле изобретения, включают как конечные точки, так и все точки между конечными точками. Следовательно, диапазон от 2,0 до 3,0 включает 2,0, 3,0 и все точки от 2,0 до 3,0.
[0097] Как правило, описанные в данном документе способы культивирования клеток и тканей, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики и химии хорошо известны и широко используются в данной области техники. Номенклатура, используемая в данном документе, в сочетании с такими способами, также широко используется в данной области техники. Способы и технологии изобретения обычно выполняются в соответствии с обычными способами, хорошо известными в данной области техники и описанными в различных ссылках, которые цитируются по всему данному описанию, если не указано иное.
Ссылки
[0098] Полное раскрытие всех патентов, патентных заявок и публикаций, а также материалов, доступных в электронном виде (включая, например, регистрационные номера нуклеотидных последовательностей, например, в GenBank и RefSeq, и регистрационные номера аминокислотных последовательностей, например, в SwissProt, PIR, PRF, PDB, и переводы из аннотированных кодирующих областей в GenBank и RefSeq), цитируемых в данном документе, включены в качестве ссылки, независимо от того, используется ли фраза «включен посредством ссылки» по отношению к конкретной ссылке. Вышеприведенное подробное описание и следующие ниже примеры даны только для ясности понимания. Таким образом их не следует понимать, как ограничивающие. Данное изобретение не ограничивается точными показанными и описанными деталями. Варианты, очевидные для специалистов в данной области техники, включены в данное изобретение, определенное формулой изобретения. Любые заголовки разделов, используемые в данном документе, предназначены только для организационных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие описанные объекты данного изобретения.
8. Примеры
[0099] Данное изобретение, в целом описанное выше, будет легче понять, если обратиться к следующим примерам, которые предоставлены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения данного изобретения. Примеры не предназначены для демонстрации того, что приведенные ниже эксперименты являются всеми или единственными выполненными экспериментами. Если не указано иное, части являются массовыми частями, молекулярная масса представляет собой средневзвешенную молекулярную массу, температура дана в градусах Цельсия, а давление равно или близко к атмосферному.
Краткое описание списка последовательностей
[0100] В ТАБЛИЦЕ 2 представлено краткое описание аминокислотных и нуклеиновых последовательностей, включенных в данный документ.
Таблица 2
SEQ ID NO
Описание
1
Белок связанный с припадком гомолог 6 изоформа 1 предшественник (NP_849191)
2
Белок связанный с припадком гомолог 6 изоформа 2 предшественник (NP_001092105)
3
последовательность тяжелой цепи белка hSEZ6-1.ss1
4
последовательность легкой цепи белка hSEZ6-1.ss1
5
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая последовательность тяжелой цепи белка hSEZ6-1.ss1 включая интроны
6
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая последовательность легкой цепи белка hSEZ6-1.ss1
Пример 1: Получение антител к SEZ6
[0101] Антитела к SEZ6 мыши получали в соответствии с изложенными в данном документе идеями путем инокуляции SEZ6-Fc человека. В связи с этим были использованы три линии мышей для генерирования высокоаффинных моноклональных антител модуляторов мыши, которые можно использовать для связывания и/или ингибирования действия SEZ6 человека (например, NP_849191: Белок связанный с припадком гомолог 6 изоформа 1 предшественник; NP_001092105: Белок связанный с припадком гомолог 6 изоформа 2 предшественник) для профилактики и/или лечения различных пролиферативных расстройств. В частности, линии мышей Balb/c, CD-1 и FVB были иммунизированы рекомбинантным SEZ6-Fc человека и использованы для получения гибридом.

[0102] Антиген SEZ6-Fc очищали из супернатанта клеток CHO-S сверхэкспрессирующих конструкцию SEZ6-Fc. 10 мкг иммуногена SEZ6-Fc использовали для первой иммунизации, затем 5 мкг и 2,5 мкг иммуногена SEZ6-Fc для последующих трех иммунизаций и пяти иммунизаций, соответственно. Все иммунизации были проведены с иммуногеном, эмульгированным с равным объемом TITERMAX Gold (CytRx Corporation) или алюминиевого адъюванта. Мышиные антитела получали путем иммунизации шести самок мышей (по две из каждой из: Balb/c, CD-1, FVB) в подушечку стопы для всех инъекций.
2
4,
[0103] Твердофазный анализы ИФА использовали для скрининга сыворотки мышей на антитела IgG мыши, специфичные к SEZ6 человека. Положительный сигнал выше фона указывает на наличие антител, специфичных к SEZ6. Вкратце, 96-луночные планшеты (VWR International, номер в кат. 610744) покрывали рекомбинантным SEZ6-His в концентрации 0,5 мкг/мл в буфере для покрытия ИФА в течение ночи. После промывания ФСБ, содержащим 0,02% (об./об.) Твин 20, лунки блокировали 3% (маcс./об.) БСА в ФСБ, 200 мкл/лунку в течение 1 часа при комнатной температуре (к.т.). Сыворотку мышей титровали (1: 100, 1: 200, 1: 400 и 1: 800) и добавляли в планшеты, покрытые SEZ6, в количестве 50 мкл/лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшеты промывали, а затем инкубирували с 50 мкл/лунку меченного HRP козьего антимышиного IgG, разведенного 1: 10000 в 3% БСА-ФБС или 2% ФТС в ФСБ в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты снова промывали и добавляли 40 мкл/лунку раствора субстрата TMБ (Thermo Scientific 34028) на 15 минут при комнатной температуре. После проявления добавляли равный объем 2 н. HSO чтобы остановить проявление субстрата, и планшеты анализировали на спектрофотометре при ОП 450.
6
2
[0104] Сероположительных иммунизированных мышей умерщвляли и дренирующие лимфатические узлы (подколенные, паховые и медиальные подвздошные, если они увеличены) иссекали и использовали в качестве источника клеток, продуцирующих антитела. Одноклеточную суспензию В-клеток (228,9 × 10 клеток) сливали с несекретирующими клетками миеломы P3×63Ag8.653 (ATCC # CRL-1580) в соотношении 1: 1 посредством электрослияния. Электрослияние выполняли с использованием системы BTX Hybrimmune™ (BTX Harvard Apparatus) в соответствии с инструкциями производителя. После процедуры слияния клетки ресуспендировали в гибридомной селективной среде с добавлением азасерина (Sigma номер в кат. A9666), среде DMEM с высоким содержанием глюкозы и пирувата натрия (Cellgro номер в кат. 15-017-CM), содержащей 15% сыворотки Фетального Клона I (Hyclone), 10% BM Condimed (Roche Applied Sciences), 4 мМ L-глутамина, 100 МЕ пенициллин-стрептомицина и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, а затем высевали в три колбы Т225 в 90 мл селективной среды на колбу. Затем колбы помещали в увлажненный инкубатор при 37°C, содержащий 5% CO и 95% воздуха, на 6-7 дней.
[0105] После шести-семи дней роста библиотеку, состоящую из клеток, выращенных в массе в T225, высевали по 1 клетке на лунку в 96-луночные планшеты с U-образным дном Falcon с использованием сортировщика клеток Aria I. Отобранные гибридомы затем выращивали в 200 мкл культуральной среды, содержащей 15% сыворотки Фетал Клон I (Hyclone), 10% BM-Condimed (Roche Applied Sciences), 1 мМ пирувата натрия, 4 мМ L-глутамина, 100 МЕ пенициллин-стрептомицина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола и 100 мкМ гипоксантина. Все оставшиеся неиспользованные клетки библиотеки гибридомы замораживали для будущего тестирования библиотеки. После десяти-одиннадцати дней роста супернатанты из каждой лунки посеянных клеток анализировали на антитела, реактивные в отношении SEZ6, с помощью анализов ИФА и FACS.
[0106] Для скрининга с помощью ИФА 96-луночные планшеты покрывали SEZ6-Fc в концентрации 0,3 мкг/мл в ФСБ в течение ночи при 4°C. Планшеты промывали и блокировали 3% БСА в ФСБ/Твин в течение одного часа при 37°C и использовали сразу или держали при 4°C. Неразбавленные супернатанты гибридомы инкубировали на планшетах в течение одного часа при комнатной температуре. Планшеты промывали и зондировали меченным HRP козьим антимышиным IgG, разведенным 1: 10000 в 3% БСА-ФСБ, в течение одного часа при комнатной температуре. Затем планшеты инкубировали с раствором субстрата, как описано выше, и считывали при ОП 450. Лунки, содержащие иммуноглобулин, который предпочтительно связывал SEZ6 человека, как определено по сигналу выше фона, переносили и увеличивали.
[0107] Отобранные лунки гибридомы с положительным ростом, секретирующие иммуноглобулин мыши, также подвергали скринингу на специфичность к SEZ6 человека и перекрестную реактивность с SEZ6 яванского макака, крысы и мышы с использованием анализа на основе проточной цитометрии с использованием клеток 293, сконструированных для сверхэкспрессии выбранного видоспецифического антигена.
4
+
+
[0108] Для анализов проточной цитометрии 50 × 10 клеток h293, трансдуцированных, соответственно, SEZ6 человека, яванского макака, крысы или мыши, инкубировали в течение 30 минут с 25-100 мкл супернатанта гибридомы. Клетки дважды промывали ФСБ, 2% ФТС, а затем инкубировали с 50 мкл Fc-фрагмента козьего антимышиного IgG, вторично конъюгированного с DyLight 649, разведенным 1: 200 в ФСБ/2% ФТС. После 15 минут инкубации клетки дважды промывали ФСБ, 2% ФТС, ресуспендировали в том же буфере с DAPI и анализировали проточной цитометрией с использованием FACSCanto II в соответствии с инструкциями производителя. Лунки, содержащие иммуноглобулин, который предпочтительно связывал клетки SEZ6 GFP, переносили и увеличивали. Полученные клональные гибридомы, специфичные к hSEZ6, криоконсервировали в замораживающей среде CS-10 (Biolife Solutions) и хранили в жидком азоте. Антитела, которые связывались с клетками SEZ6 человека, яванского макака, крысы или мыши, были отмечены как перекрестно-реактивные.
[0109] ИФА и анализ проточной цитометрии подтвердили, что очищенные антитела из большинства или всех этих гибридом связывают SEZ6 зависимым от концентрации образом. Лунки, содержащие иммуноглобулин, который связывал клетки SEZ6 GFP, переносили и увеличивали. Полученные клональные гибридомы криоконсервировали в замораживающей среде CS-10 (Biolife Solutions) и хранили в жидком азоте.
[0110] Одно слияние было выполнено и засеяно в 48 планшетов (4608 лунок при около 40% эффективности клонирования). Первоначальный скрининг выявил шестьдесят три антитела мыши, связанных с SEZ6 человека. Впоследствии был проведен второй скрининг, в результате которого было выявлено 134 антитела, ассоциированных с SEZ6 человека.
Пример 2: Получение гуманизированного сайт-специфичного антитела SEZ6
[0111] Антитело из Примера 1 было выбрано для дальнейшей обработки и гуманизации. РНК из гибридомы, экспрессирующей выбранное антитело, выделяли, амплифицировали и секвенировали, используя стандартные признанные в данной области техники. Из информации о нуклеотидных последовательностях были получены данные относительно сегментов генов V, D и J тяжелой и легкой цепей исследуемых антител мыши. Последовательности V-(D)-J выровняли с последовательностями зародышевой линии Ig мыши, и акцепторные вариабельные каркасные области человека были выбраны на основе их наивысшей гомологии последовательности с исследуемой каркасной последовательностью мыши и ее канонической структурой для трансплантации CDR. Полученная генетическая структура гуманизированных вариабельных областей антитела показана в Таблице 3А непосредственно ниже.
Таблица 3A
mAb
VH человека
JH человека
Изменения FW
VK человека
JK человека
Изменения FW
SEZ6-1
IGHV5-51
JH4
нет
IGKV-L6
JK4
нет
[0112] Сконструированные вариабельные области затем использовали для создания сайт-специфического антитела IgG1/каппа к SEZ6 человека, содержащего константную область нативной легкой цепи каппа (LC) и константную область тяжелой цепи (HC), мутированные с получением неспаренного цистеина. В связи с этим цистеин 220 (C220) в верхней шарнирной области HC был заменен серином (C220S), чтобы получить антитело hSEZ6-1.ss1. При сборке HC и LC образуют антитело, содержащее два свободных цистеина на c-концах константных областей легкой цепи (например, C214), которые подходят для конъюгации с терапевтическим агентом. Если не указано иное, вся нумерация остатков константной области соответствует схеме нумерации ЕС, изложенной в Kabat et al.
[0113] Для создания сайт-специфичных конструкций нуклеиновую кислоту VH клонировали в вектор экспрессии, содержащий константную область HC с мутацией C220S. Полученные векторы, кодирующие мутантный C220S HC, котрансфицировали в клетки CHO-S с вектором, кодирующим выбранную вариабельную область легкой цепи, функционально связанную с LC IgG1 kappa дикого типа, и экспрессировали с использованием системы временной экспрессии млекопитающих.
[0114] В дополнение к мутации C220S, обеспечивающей свободные цистеины в константной области, были сделаны две дополнительные модификации тяжелой цепи. Во-первых, был удален С-концевой лизин, чтобы уменьшить гетерогенность экспрессии. Во-вторых, консервативная мутация была сделана в вариабельной области тяжелой цепи для улучшения молекулярной стабильности и облегчения продукции антител. Более конкретно, консервативная мутация была включена в CDR2 тяжелой цепи (как определено по Кабат) для устранения канонического сайта гликозилирования. Гликозилирование в этом сайте потенциально может придать гетерогенность экспрессируемому белку, что может привести к снижению аффинности связывания. Соответственно, замена серина на аспарагин в положении 60 по Кабат (S60N) была включена в тяжелую цепь для устранения сайта гликозилирования. Полученное гуманизированное антитело с этими мутациями было названо hSEZ6-1.ss1. Как более подробно обсуждается ниже, была подтверждена существенная эквивалентность hSEZ6-1.ss1 родительскому гуманизированному антителу и исходному антителу мыши в отношении аффинности.
[0115] Полученная генетическая организация гуманизированных вариабельных областей мутировавшего антитела показана в Таблице 3B непосредственно ниже.
Таблица 3B
mAb
VH человека
JH человека
Изменения FW
Изменения CDR (VH)
VK человека
JK человека
Изменения FW
Изменения CDR (VK)
SEZ6-1.ss1
IGHV5-51
JH4
нет
S60N
IGKV-L6
JK4
нет
нет
[0116] Аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи сайт-специфического антитела hSEZ6-1.ss1 представляет собой SEQ ID NO: 3, имеющую сайт мутации вариабельной области S60N и сайт мутации константной области C220S. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи показана ниже как SEQ ID NO: 7 с подчеркнутой мутацией S60N.
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSSWINWVRQMPGKGLEWMGRIYPGEGDTNYNGNFEGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCTRGLVMDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:7)
Аминокислотная последовательность полноразмерной сайт-специфической легкой цепи hSEZ6-1.ss1 представляет собой SEQ ID NO: 4, имеющую остаток для конъюгации токсина на C214. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи показана ниже как SEQ ID NO: 8.
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDYNGISYMHWYQQKPGQAPRLLIYAASNVQSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSIEDPPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:8)
Пример 3: Получение линкера-лекарственного средства для hSEZ6-1.ss1
[0117] Линкер-лекарственное средство Формулы II
Формула II
синтезировали, как изложено непосредственно ниже.
Стадия 1.
трет-
бутил[34-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-
1H-
пиррол-1-ил)-4,32-диоксо-7,10,13,16,19,22,25,28-октаокса-3,31-диазатетратриаконтан-1-ил]карбамат
1H-
N
N, N-
трет-
m/z
3
2
2
3
2
2,
+
3-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-пиррол-1-ил)--{27-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-27-оксо-3,6,9,12,15,18,21,24-октаоксагептакозан-1-ил}пропанамид (434 мг) растворяли в диметилформамиде (5 мл) и обрабатывали бутил(2-аминоэтил)карбаматом (108,1 мг). Через 6 часов реакционную смесь концентрировали и остаток очищали хроматографией на силикагеле, элюируя смесью от 0% CHOH/CHCl до 10% CHOH/CHCl с получением указанного в заголовке соединения (154,2 мг). ЖХ/МС (Аналитический способ A): Rt=1,65 мин,  735,46 [M+H].
Стадия 2. N-(2-аминоэтил)-31-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азаентриаконтан-1-амид
N, N-
m/z
+
Амин, защищенный трет-бутоксикарбонилом (Стадия 1, 154,2 мг), растворяли в  диметилформамиде (5 мл), добавляли трифторуксусную кислоту (500 мкл) в течение 30 секунд, и полученную смесь перемешивали в течение 30 минут. После завершения реакции реакционную смесь концентрировали и использовали без дополнительной очистки. ЖХ/МС (Аналитический способ A): Rt=1,29 мин,  635,39 [M+H].
Стадия 3. 4-{[(2
E
)-2-{(1
R
,4
Z
,8
S
)-8-({(2
R
,3
R
,4
S
,5
S
,6
R
)-3-({(2
S
,4
S
,5
S
)-5-[ацетил (этил)амино]-4-метоксиоксан-2-ил}окси)-5-[({(2
S
,4
S
,5
S
,6
R
)-5-[(4-{[(2
S
,3
R
,4
R
,5
S
,6
S
)-3,5-дигидрокси-4-метокси-6-метилоксан-2-ил]окси}-3-йод-5,6-диметокси-2-метилбензоил)сульфанил]-4-гидрокси-6-метилоксан-2-ил}окси)амино]-4-гидрокси-6-метилоксан-2-ил}окси)-1-гидрокси-10-[(метоксикарбонил)амино]-11-оксобицикло[7.3.1]тридека-4,9-диен-2,6-диин-13-илиден}этил]дисульфанил}-4-метилпентановая кислота
N-
N-
m/z
+
Ацетилкалихемицин γ 1 (0,2 г, 0,142 ммоль, 1 экв.) растворяли в ацетонитриле (30 мл), и полученный раствор охлаждали до -15°C. 4-Меркапто-4-метилпентановую кислоту (0,420 мл, 2,837 ммоль, 20 экв.) растворяли в ацетонитриле (10 мл) и медленно добавляли к охлажденному раствору  ацетилкалихемицина γ 1. К реакционной смеси добавляли триэтиламин (0,377 мл, 2,837 ммоль, 20 экв.), а затем реакционной смеси давали возможность нагреться до комнатной температуры в течение 3-18 часов. После завершения реакции смесь концентрировали и остаток наносили в сухом виде на силикагель для очистки флэш-хроматографией, элюируя смесью 2-20% метанол/дихлорметан, с получением указанного в заголовке соединения. Указанное в заголовке соединение осаждали из холодного диэтилового эфира. ЖХ/МС (аналитический способ A): Rt=1,92 мин,  1478,64 [M+H].
Стадия 4.
S
-[(2
R
,3
S
,4
S
,6
S
)-6-({[(2
R
,3
S
,4
S
,5
R
,6
R
)-5-({(2
S
,4
S
,5
S
)-5-[ацетил(этил)амино]-4-метоксиоксан-2-ил}окси)-6-{[(2
S
,5
Z
,9
R
,13
E
)-13-[43-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-
1H-
пиррол-1-ил)-5,5-диметил-8,13,41-триоксо-16,19,22,25,28,31,34,37-октаокса-3,4-дитиа-9,12,40-триазатритетраконтан-1-илиден]-9-гидрокси-12-[(метоксикарбонил)амино]-11-оксобицикло[7.3.1]тридека-1(12),5-диен-3,7-диин-2-ил]окси}-4-гидрокси-2-метилоксан-3-ил]амино}окси)-4-гидрокси-2-метилоксан-3-ил] 4-{[(2
S
,3
R
,4
R
,5
S
,6
S
)-3,5-дигидрокси-4-метокси-6-метилоксан-2-ил]окси}-3-иод-5,6-диметокси-2-метилбензол-1-карботиоат
N-
N, N-
N, N-
N
H-
N, N-
d
J
J
J
J
J
J
J
J
J
J
J
J
J
J
J
+
+
1
6
Ацетилкалихемициновую кислоту (Стадия 3, 100 мг, 0,068 ммоль, 1 экв.) растворяли в диметилформамиде (3,4 мл) и охлаждали до 0°C. Затем последовательно добавляли диизопропилэтиламин (176 мкл, 1,01 ммоль, 15 экв.) и (1-циано-2-этокси-2-оксоэтилиденаминоокси)диметиламиноморфолино-карбения гексафторфосфат (COMU, 43 мг, 0,1 ммоль, 1,5 экв.). Через 2 минуты добавляли -(2-аминоэтил)-31-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азаентриаконтан-1-амид (Стадия 2, 51,4 мг, 0,08 ммоль, 1,2 экв.) в диметилформамиде (200 мкл). Через 1 час реакционную смесь концентрировали и остаток очищали препаративной ВЭЖХ (способ pA) с получением указанного в заголовке соединения (16,8 мг, выход 12%). ЖХ/МС (аналитический способ B или C): Rt=8,18 мин. Рассчитано МСВР [M+H] = 2094,7049, найдено [M+H] = 2094,6902.H ЯМР (400 МГц, ДМСО-) δ 9,03 (с, 1H), 8,01 (т, =5,5 Гц, 1H), 7,86 (с, 2H), 7,01 (с, 3H), 6,80 (д, =8,0 Гц, 1H), 6,30-6,18 (м, 1H), 6,13 (дд, =9,5, 7,1 Гц, 1H), 6,09-5,99 (м, 2H), 5,56 (д, =4,0 Гц, 1H), 5,45 (с, 1H), 5,43-5,37 (м, 2H), 5,12 (дд, =13,4, 5,1 Гц, 2H), 4,94 (д, =9,9 Гц, 1H), 4,63-4,47 (м, 2H), 4,27-4,13 (м, 2H), 4,11 (с, 1H), 4,08-3,97 (м, 1H), 3,91 (дд, =10,8, 6,1 Гц, 1H), 3,81 (с, 3H), 3,78-3,81 (м, 1H), 3,77 (с, 3H), 3,73-3,63 (м, 1H), 3,63-3,55 (м, 7H), 3,55-3,46 (м, 30H), 3,41 (с, 3H), 3,25 (д, =2,3 Гц, 3H), 3,15 (кв, =5,8 Гц, 2H), 3,07 (с, 5H), 2,93 (д, =17,7 Гц, 1H), 2,47-2,38 (м, 1H), 2,36-2,26 (м, 7H), 2,15-2,06 (м, 2H), 2,01 (д, =2,7 Гц, 3H), 1,87 (д, =12,3 Гц, 1H), 1,80-1,62 (м, 3H), 1,26 (дд, =6,1, 3,3 Гц, 4H), 1,24-1,19 (м, 2H), 1,19-1,12 (м, 7H), 1,09 (т, =7,1 Гц, 2H), 0,95 (т, =6,9 Гц, 1H).
Общая информация об аналитических и препаративных способах ВЭЖХ.
[0118] Аналитический способ А:

МС: Waters Acuity Ultra SQ Детектор ЭСИ, диапазон сканирования 120-2040 Да.

Колонка: Waters Acuity UPLC BEH C18, 1,7 мкм, 2,1×50 мм
Температура колонки: 50°C
Скорость потока: 0,6 мл/мин
Подвижная фаза A: 0,1% муравьиной кислоты в воде.
Подвижная фаза B: 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле.
Градиент:
Время, минуты
% A
% B
0
95
5
0,25
95
5
2
0
100
2,5
0
100
3
95
5
4
95
5
Аналитический способ B:

МС: Waters Acuity Ultra SQ Детектор ЭСИ, диапазон сканирования 120-2040 Да,

Колонка: Waters Acuity UPLC BEH C18, 1,7 мкм, 2,1×50 мм
Температура колонки: 60°C
Скорость потока: 0,4 мл/мин
Подвижная фаза A: 0,1% муравьиной кислоты в воде.
Подвижная фаза B: 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле.
Градиент:
Время, минуты
% A
% B
0
95
5
2
95
5
3
80
20
13
20
80
14
20
80
14,10
5
95
15
5
95
15,10
95
5
20
95
5
Аналитический способ C:

МСВР: AB Sciex 5600 Plus Тройной Времяпролетный (TOF), диапазон сканирования 250-2500 Да

Колонка: Waters Acuity UPLC BEH C18, 1,7 мкм, 2,1×50 мм
Температура колонки: 60°C
Скорость потока: 0,4 мл/мин
Подвижная фаза A: 0,1% муравьиной кислоты в воде.
Подвижная фаза B: 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле.
Градиент:
Время, минуты
% A
% B
0
95
5
2
95
5
3
80
20
13
20
80
14
20
80
14,10
5
95
15
5
95
15,10
95
5
20
95
5
Аналитический способ D

Колонка: EMD Millipore Chromolith Flash RP-18 эндкэпированная 25-2 мм.
Температура колонки: 40°C
Длина волны: 220 нм
Скорость потока: 1,5 мл/мин
2
Подвижная фаза A: HO (4 л с 1,5 мл трифторуксусной кислоты)
Подвижная фаза B: ацетонитрил (4 л с 0,75 мл трифторуксусной кислоты)
Градиент:
Время, минуты
% A
% B
0
95
5
0,01
95
5
0,70
5
95
1,15
5
95
1,16
95
5
1,60
95
5
Аналитический способ E
Колонка: Halo C18 2,1×30 мм, 2,7 мкм
Детектирование: диодная матрица и положительная/отрицательная электроспрей ионизация
Скорость потока: 1,0 мл/мин
Подвижная фаза A: 0,0375% трифторуксусной кислоты в воде
Подвижная фаза B: 0,018% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле
Градиент:
Время, минуты
% A
% B
0
90
10
2,00
20
80
2,48
20
80
2,50
90
10
3,00
90
10
Аналитический способ F
Колонка: Venusil XBP-C18, 2,1×50 мм, 5 мкм
Детектирование: диодная матрица и положительная/отрицательная электроспрей ионизация
Скорость потока: 0,8 мл/мин
Подвижная фаза A: 0,0375% трифторуксусной кислоты в воде
Подвижная фаза B: 0,018% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле
Градиент:
Время, минуты
% A
% B
0
99
1
3,40
10
90
3,85
0
100
3,86
99
1
4,51
99
1
Препаративная ВЭЖХ способ рА:
Колонка: Waters XBridge™ Prep C18 5 мкм OBD, 19×100 мм
Температура колонки: температура окружающей среды
Скорость потока: 15 мл/мин
Подвижная фаза A: 0,1% муравьиной кислоты в воде.
Подвижная фаза B: 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле.
Градиент:
Время, мин
% A
% B
0
95
5
5
95
5
8
80
20
50
20
80
52,59
20
80
52,92
5
95
55,87
5
95
56,20
95
5
60
95
5
Препаративная ВЭЖХ способ рВ:

Колонка: Phenomenex Luna C18 (2), 250 × 50 мм ВД, 10 мкм
Длины волн: 220 и 254 нм
Скорость потока: 80 мл/мин
4
3
2
Подвижная фаза A: 0,01 M NHHCO в HO.
Подвижная фаза B: ацетонитрил
Градиент: 30-50% подвижной фазы B за 20 минут
Препаративная ВЭЖХ способ рС

Колонка: Phenomenex Luna C18 (2), 250 × 50 мм ВД, 10 мкм
Длины волн: 220 и 254 нм
Скорость потока: 80 мл/мин
Подвижная фаза A: 0,075% об./об. трифторуксусной кислоты в воде
Подвижная фаза B: ацетонитрил
Градиент: 10-40% подвижной фазы B за 20 минут
Препаративная ВЭЖХ способ рD

Колонка: Phenomenex Luna C18 (2), 250 × 50 мм ВД, 10 мкм
Длины волн: 220 и 254 нм
Скорость потока: 80 мл/мин
Подвижная фаза A: 0,09% об./об. трифторуксусной кислоты в воде
Подвижная фаза B: ацетонитрил
Градиент: 15-43% подвижной фазы B за 20 минут
Пример 4: Получение конъюгатов антитела hSEZ6-1.ss1 с лекарственным средством
in
vitro
in vivo
[0119] Анти-hSEZ6-1.ss1 КАЛП были приготовлены в соответствии с изложенными в данном документе принципами для дальнейшего тестирования  и .
[0120] В связи с этим h SEZ6-1.ss1 из Примера 2 конъюгировали с нерасщепляемым линкером-лекарственным средством калихемицином (Формула II, полученная, как в Примере 3) через концевую малеимидную группу со свободной сульфгидрильной группой с получением описанного SEZ6 КАЛП, который в настоящем документе называется hSEZ6-1.ss1 КАЛП1. Кроме того, три контрольных SEZ6 КАЛП были приготовлены путем конъюгирования hSEZ6-1.ss1 с теми же полезными нагрузками калихемицина, но содержащими расщепляемые линкеры (КАЛП2, КАЛП3 и КАЛП4). Наконец, были приготовлены контрольные КАЛП, содержащие hSEZ6-1.ss1 без мутации S60N.
[0121] Сайт-специфический гуманизированный SEZ6 КАЛП (hSEZ6-1.ss1) конъюгировали с использованием модифицированного способа частичного восстановления. Желаемый продукт представляет собой КАЛП, который максимально конъюгирован с неспаренным цистеином (C214) в каждой константной области LC и который сводит к минимуму количество КАЛП, имеющих нагрузку лекарственным средством, превышающую 2, при максимальном увеличении количества КАЛП, имеющих нагрузку лекарственным средством 2. Для дальнейшего повышения специфичности конъюгации антитела были избирательно восстановлены с использованием способа, включающего стабилизирующий агент (например, L-аргинин) и мягкий восстанавливающий агент (например, глутатион) перед конъюгацией с линкером-лекарственным средством с последующей диафильтрацией и стадией составления.
[0122] Более конкретно, состав каждого антитела частично восстанавливали в буфере, содержащем 1 М L-аргинин/5 мМ ЭДТА с предварительно определенной концентрацией восстановленного глутатиона (GSH), pH 8,0, в течение минимум 20 часов при комнатной температуре. Затем во всех составах заменяли буфер на 20 мМ Трис/3,2 мМ ЭДТА, pH 7,0 буфер с использованием 30 кДа мембраны (Millipore Amicon Ultra) для удаления восстанавливающего буфера. Затем полученные частично восстановленные составы конъюгировали с соответствующим линкером-лекарственным средством калихемицином через группу малеимида в течение по меньшей мере 60 минут при комнатной температуре. Затем pH доводили до 6,0 добавлением 0,5 М уксусной кислоты. В составах КАЛП заменяли буфер на буфер для диафильтрации путем диафильтрации с использованием мембраны 30 кДа. Затем диалфильтрованный SEZ6 КАЛП составляли с сахарозой и полисорбатом-20 до целевой конечной концентрации.
in vitro
[0123] Полученный состав затем анализировали на концентрацию белка (путем измерения УФ), агрегацию (ЭХ), отношение лекарственного средства к антителу (СЛСА) с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ) и активности (цитотоксичность ). Затем его замораживали и хранили до использования.
[0124] Схематическое изображение hSEZ6-1.ss1 КАЛП1 представлено на Фиг. 1 и прилагается к настоящему документу.
in vitro
Пример 5: Характеристики антитела к hSEZ6-1.ss1
[0125] Были проведены эксперименты, чтобы проверить, влияет ли мутация S60N на взаимодействие между hSEZ6-1.ss1 mAb и антигеном SEZ6. В этом отношении связывание растворимого антигена SEZ6-his с поверхностно-иммобилизованными антителами SEZ6 и SEZ6 КАЛП, с мутацией S60N и без нее, измеряли на Biacore T200 (чип к захвату антител человека).
[0126] Более конкретно, 5 мкг/мл IgG пропускали в течение 12 секунд при 5 мкл/мин, получая иммобилизационный ответ 115-124 ОЕ. 22, 66 и 200 нМ hSEZ6-his вводили в течение 90 секунд при 30 мкл/мин с последующей диссоциацией в течение 300 секунд. Поверхности регенерировали путем пропускания 2М хлорида магния (30 мкл/мин, 30 секунд) в конце каждого цикла. В сенсограммах использовали два контроля (ячейка для ввода буфера и контрольная проточная ячейка), они представлены на Фиг. 2, где антитело с мутацией обозначено как hSEZ6-1.ss1, а исходное антитело без мутации обозначено как исходное hSEZ6-1.ss1.
[0127] Кроме того, измерения аффинности были выполнены с использованием Biacore T200 для определения характеристик связывания hSEZ6-1.ss1, содержащего S60N. В связи с этим были получены и очищены Fab-конструкции антитела hSEZ6-1.ss1 с мутацией S60N и без нее. Связывание Fab-конструкций с растворимым иммобилизованным на поверхности лигандом SEZ6-His человека затем сравнивали на Biacore T200 (чип для захвата анти-His). Более конкретно, 2 мкг/мл SEZ6-His человека пропускали через чип в течение 12 секунд при 5 мкл/мин, получая иммобилизационный отклик 45-66 ОЕ. Инъекции Fab 22, 66 и 200 нМ происходили в течение 90 секунд при 30 мкл/мин с последующей диссоциацией в течение 400-450 секунд. Поверхности регенерировали путем пропускания 10 мМ глицина, pH 1,5, в течение 60 секунд при 30 мкл/мин. В сенсограммах использовали два контроля (ячейка для ввода буфера и контрольная проточная ячейка). Результаты показаны в Таблице 4 непосредственно ниже.
Таблица 4
Аналит
ka(1/мсек)
kd(1/сек)
hSEZ6-HisKd (нM)
Rmax (ОЕ)
Дикий тип Fab
1,1E+06
0,006
5,8
35,2
MutA (S60N) Fab
1,3E+06
0,006
4,8
4,0
[0128] Анализ Фиг. 2 показывает, что мутация S60N и удаление сайта гликозилирования в вариабельной области тяжелой цепи существенно не изменяют связывающие свойства антител hSEZ6-1.ss1 по сравнению с исходным антителом, лишенным мутации. Аналогичным образом, измерения аффинности, представленные в Таблице 4, демонстрируют, что введенная мутация не оказывает отрицательного воздействия на связывание антитела, используемого в описанном КАЛП. Таким образом, потенциально дестабилизирующее положение может быть изменено без ущерба для фармацевтической эффективности молекулы.
in vitro
Пример 6: hSEZ6 КАЛП эффективно убивают клетки, экспрессирующие hSEZ6
in vitro
[0129] Чтобы определить, могут ли КАЛП к SEZ6 в соответствии с данным изобретением эффективно опосредовать доставку конъюгированных цитотоксических агентов к живым клеткам, был проведен анализ на уничтожение клеток  с использованием КАЛП к SEZ6, полученных в Примере 4 выше.

[0130] Суспензии одиночных клеток HEK293T, сверхэкспрессирующих hSEZ6, или наивные клетки HEK293T высевали по 500 клеток на лунку в планшеты BD Tissue Culture (BD Biosciences). Через день к культурам добавляли различные концентрации очищенного КАЛП, конъюгированного с калихемицином. Клетки инкубировали 96 часов. После инкубации жизнеспособные клетки подсчитывали с помощью CellTiter-Glo (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Необработанные подсчеты люминесценции с использованием культур, содержащих необработанные клетки, принимали за 100% эталонные значения, а все другие подсчеты рассчитывали, как процент от эталонного значения.
[0131] На Фиг. 3 показано, что все обработанные экспрессирующие hSEZ6 клетки были намного более чувствительны к КАЛП к SEZ6 по сравнению с наивными клетками HET293T, демонстрируя специфичность КАЛП к антигену SEZ6.
[0132] Приведенные выше результаты демонстрируют способность КАЛП к SEZ6 специфически опосредовать интернализацию и доставку непосредственно конъюгированных цитотоксических нагрузок в клетки, экспрессирующие SEZ6.
Пример 7: Фармакокинетика КАЛП у мышей с ослабленным иммунитетом
[0133] Фармакокинетику (ФK) hSEZ6-1.ss1 КАЛП1, hSEZ6-1.ss1 КАЛП2 и hSEZ6-1.ss1 КАЛП3 оценивали на мышах NOD SCID. Мышей (n=4 самки в группе) рандомизировали в группы лечения, по равной средней массе тела, а затем вводили такое же количество КАЛП с помощью одной внутривенной инъекции (объем 100 мкл). Каждый КАЛП вводили совместно с 10 мг/кг неконъюгированного антитела HuIgG1, чтобы насытить FcγR -опосредованный клиренс и обеспечить подходящую экспозицию КАЛП. Образцы сыворотки собирали через 5 минут, 4, 24, 72, 120, 168, 216 и 336 часов после каждой дозы, и общие концентрации антител (TAb) и КАЛП оценивали с помощью иммуноанализа MSD. Параметры фармакокинетики, включая максимальные концентрации (Cmax), экспозицию (площадь под кривой или AUC), оцененные в период от 0 до 14 дней после введения дозы) и период полувыведения, оценивали с использованием способов некомпартментального анализа.
[0134] Фармакокинетика КАЛП и TAb в сыворотке крови снижалась двухэкспоненциально для всех КАЛП, и пиковые концентрации (Cmax) наблюдались через 5 минут после введения дозы. Не было существенной разницы в воздействии КАЛП (AUC 0-14 дней) между тестируемыми SEZ6 КАЛП. Конечный период полувыведения КАЛП в сыворотке был одинаковым для КАЛП. Стабильность КАЛП измерялась отношением экспозиций TAb к КАЛП и была аналогичной для тестируемых соединений в диапазоне от 1,4 до 1,6. Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что фармакокинетика hSEZ6-1.ss1 КАЛП1, hSEZ6-1.ss1 КАЛП2 и hSEZ6-1.ss1 КАЛП3 сопоставима у мышей NOD SCID.
Пример 8: Конъюгаты антитела hSEZ6-1.ss1 и лекарственного средства подавляют рост опухоли in vivo
in vivo
in vivo
[0135] Были проведены эксперименты  для подтверждения способность уничтожать клетки hSEZ6-1.ss1 КАЛП1, hSEZ6-1.ss1 КАЛП2 и hSEZ6-1.ss1 КАЛП3 продемонстрированных в Примере 6. С этой целью сайт-специфичные КАЛП, нацеленные на SEZ6, полученные, как изложено в предыдущих примерах, были протестированы на терапевтические эффекты  у мышей NOD SCID с ослабленным иммунитетом, несущих подкожные опухоли мелкоклеточного рака легкого (МКРЛ), полученные в виде ксенотрансплантанта, полученного от пациента (PDX), имеющие эндогенную экспрессию SEZ6 на поверхности клетки. Конъюгаты анти-SEZ6 hSEZ6-1.ss1 КАЛП1, hSEZ6-1.ss1 КАЛП2 и hSEZ6-1.ss1 КАЛП3 были протестированы в двух разных моделях МКРЛ.
a ×
b
а
b
2
3
3
[0136] МКРЛ-PDX линии, LU95 и LU149 обе вводили в виде диссоциированной инокуляции клеток под кожу вблизи грудной области жировой ткани и измеряли еженедельно штангельциркулем (эллипсоидный объем=/2, где  представляет собой длинный диаметр эллипса, и  представляет собой короткий диаметр эллипса). После того, как опухоли выросли до среднего размера 130-200 мм (диапазон 100-300 мм), мышей рандомизировали в группы лечения (n=5 мышей на группу) с равными средними значениями объема опухоли. Мышам (5 в группе) вводили идентичные разовые дозы либо носителя (5% глюкозы в стерильной воде), либо препаратов HuIgG1- или SEZ6-КАЛП посредством внутрибрюшинной инъекции (объем 100 мкл). SEZ6-КАЛП вводили совместно с 10 мг/кг голого антитела HuIgG1 для линеаризации фармакокинетики.
3
3
3
[0137] Терапевтические эффекты оценивали по еженедельному объему опухоли (измерение штангельциркулем, как указано выше) и измерениям массы тела. Критерии конечной точки для отдельных мышей или групп лечения включали оценку здоровья (любые признаки болезни), потерю массы тела (потеря массы тела более чем 20% с начала исследования) и опухолевую нагрузку (объем опухоли> 1000 мм). Эффективность контролировали путем еженедельных измерений объема опухоли (мм) до тех пор, пока группы не достигли среднего значения около 800-1000 мм. Объемы опухолей рассчитывали, как среднее значение со стандартной ошибкой среднего для всех мышей в экспериментальной группе и наносили на график в зависимости от времени (суток) с момента первоначального лечения. Результаты лечения представлены на Фиг. 4A и 4B, где показаны средние объемы опухолей со стандартной ошибкой среднего (СОС) у 5 мышей на группу лечения.
[0138] SEZ6-связывающие КАЛП, конъюгированные с калихемицином (hSEZ6-1.ss1 КАЛП1, hSEZ6-1.ss1 КАЛП2 и hSEZ6-1.ss1 КАЛП3) были оценены на мышах, несущих PDX МКРЛ-LU95 (Фиг. 4A) или PDX МКРЛ-LU149 (Фиг. 4B). Нерасщепляемый линкер КАЛП1 имел аналогичную или большую эффективность по сравнению с расщепляемым линкером КАЛП2, тогда как расщепляемый линкер КАЛП3 имел большую эффективность по сравнению с КАЛП1 при 2 мг/кг. В любом случае, hSEZ6-1.ss1 КАЛП1 и hSEZ6-1.ss1 КАЛП3 могут обеспечить устойчивый ответ в течение 50 дней или дольше в PDX МКРЛ. Ответ был специфичным для SEZ6-КАЛП, так как не наблюдалось ответа после лечения несвязывающими КАЛП (HuIgG1), конъюгированными с теми же линкерами-лекарственными средствами калихемицина (данные не показаны).
[0139] Такие результаты демонстрируют, что hSEZ6-1.ss1 КАЛП1, изготовленный, как изложено в настоящем документе, потенциально может быть фармацевтически эффективным в замедлении роста клеток мелкоклеточного рака легкого.
Пример 9: hSEZ6-1.ss1 КАЛП1 демонстрирует широкий диапазон безопасности
[0140] Был проведен анализ для определения диапазона безопасности, обеспечиваемого hSEZ6-1.ss1 КАЛП1.
[0141] В этом отношении hSEZ6-1.ss1 КАЛП1, hSEZ6-1.ss1 КАЛП2 и hSEZ6-1.ss1 КАЛП3 содержат идентичные целевые mAb (hSEZ6-1.ss1) и активный блок (N-ацетил гамма-калихемицин) с различиями в месте присоединения линкера-лекарственного средства. hSEZ6-1.ss1 КАЛП1 уникален тем, что содержит нерасщепляемый линкер по сравнению с другими линкерами-лекарственными средствами на основе дипептида, чувствительного к катепсину B. SEZ6 КАЛП оценивали на четырех дискретных моделях PDX мышей с высоким уровнем экспрессии SEZ6 МКРЛ (LU64, LU86, LU95 и LU149), а также в исследовании на токсичность при повторном введении дозы на яванских макаках.
[0142] Полумеханистическая модель ФК/ФД, основанная на данных роста необработанной опухоли и данных ответа опухоли, обработанной SEZ6 КАЛП, у мышей была использована для прогнозирования опухолестатических концентраций (TSC), которые соответствуют концентрации КАЛП, приводящей к остановке роста опухоли у пациентов. Впоследствии ФК у человека моделировали на основе данных ФК у яванского макака. Затем прогнозы ФК у человека использовали для оценки дозы, необходимой для достижения минимальной концентрации в плазме в интервале доз у пациентов, эквивалентном TSC. Диапазон безопасности оценивали путем сравнения воздействия КАЛП при максимальной переносимой дозе (MTD) на яванского макака с воздействием прогнозируемой эффективной дозы для человека. Этот анализ повторяли для каждой оцениваемой модели PDX легких (LU64, LU86, LU95 и LU149).
[0143] В Таблице 5 представлен прогнозируемый диапазон безопасности для каждого из SEZ6 КАЛП. Основываясь на этом анализе, ожидается, что hSEZ6-1.ss1 КАЛП1 будет более переносимым, чем другие SEZ6 КАЛП (hSEZ6-1.ss1 КАЛП2, hSEZ6-1.ss1 КАЛП3), конъюгированные с той же нагрузкой, но содержащие расщепляемые линкеры. Этот анализ предсказал диапазон безопасности около 10 для hSEZ6-1.ss1 КАЛП1, что значительно выше, чем у двух конструкций с расщепляемыми линкерами.
Таблица 5
<b>Соединение</b>
<b>Расчетный диапазон безопасности</b>
hSEZ6-1.ss1 КАЛП1
10
hSEZ6-1.ss1 КАЛП2
0,3
hSEZ6-1.ss1 КАЛП3
5,5
[0144] Прогнозируемый более широкий диапазон безопасности для людей, основанный на данных, полученных на яванских макаках, и соответствующая гибкость дозирования указывают на то, что hSEZ6-1.ss1 КАЛП1 является сильным терапевтическим кандидатом.
Пример 10: hSEZ6-1.ss1 КАЛП1 особенно активен в МКРЛ
[0145] Чтобы дополнительно продемонстрировать потенциальную эффективность описанного КАЛП, были проведены токсин-специфические анализы с использованием различных линий опухолевых ксенотрансплантатов. Изначально клеточные линии МКРЛ, BR, CR, GA, НМКРЛ и PA PDX оценивали с помощью анализа на микрочипах для определения соответствующего уровня экспрессии антигена SEZ6 (Фиг. 5A) и CD46, известного антигена положительного контроля (Фиг. 5B). Анализ на микрочипах проводили с использованием анализа Affymetrix ClariomD на очищенных образцах РНК, полученных из PDX человека. Анализ Фиг. 5A и 5B показывает, что, хотя экспрессия SEZ6 повышается в опухолях МКРЛ по сравнению с другими типами опухолей, положительный антигенный контроль CD46 демонстрирует стабильно высокий уровень экспрессии мРНК в группе ксенотрансплантатов, полученных от пациентов (PDX). Соответственно, антиген CD46 использовали в качестве суррогатной мишени КАЛП для оценки воздействия описанного нового линкера-лекарственного средства калихемицина (Формула II) на различные типы опухолей.
[0146] В этом отношении N149, гуманизированное антитело CD46 (USPN 10017565 B2) было конъюгировано с линкером-лекарственным средством калихемицином, описанным в данном документе, или с линкером контрольного лекарственного средства пирролобензодиазепина (PBD). КАЛП были получены по существу, как указано в Примере 4 выше. После получения КАЛП CD46 замораживали и хранили до использования.
3
3
[0147] Клетки PDX инокулировали в бок мышей NOD-SCID. Когда размер опухоли достигал 100-300 мм, составы PBD КАЛП вводили в виде разовой дозы 1,6 мг/кг (Фиг. 5C), в то время как составы КАЛП калихемицина вводили в виде разовой дозы 8 мг/кг для всех типов опухолей, кроме PDX МКРЛ (Фиг. 5D). Для PDX МКРЛ состав КАЛП калихемицина вводили в дозе 2 мг/кг или 4 мг/кг (Фиг. 5D). Затем в опухолях наблюдали за изменениями по сравнению с составом КАЛП без нацеливания, но с тем же активным блоком. Дельта-время до прогрессирования опухоли (dTTP) рассчитывали путем вычитания времени прогрессирования для ненацеливающего КАЛП из времени прогрессирования для нацеливающего агента. Прогрессирование опухоли определяли, как период времени, когда наблюдаемое измерение вырастает, по меньшей мере, на 100 мм больше, чем объем надира после лечения. Каждая точка данных на Фиг. 5C и 5D представляют отдельную линию клеток PDX соответствующего типа опухоли.
[0148] Как представлено на Фиг. 5C, составы PBD КАЛП обеспечивали относительно однородный опухолевый ответ независимо от типа опухоли PDX. В частности, чувствительность PDX МКРЛ к уничтожению токсином PBD была в значительной степени эквивалентна чувствительности других линий опухолевых клеток. В отличие от этого, линии клеток PDX МКРЛ оказались гораздо более восприимчивыми к уничтожению под действием КАЛП калихемицина, чем другие линии клеток PDX (Фиг. 5D). Более конкретно, после однократной дозы 8 мг/кг КАЛП калихемицина большинство полученных от пациентов ксенотрансплантатов опухолей BR, CR, GA и НМКРЛ проявляли минимальную реакцию или ее отсутствие. В опухолях поджелудочной железы наблюдалась смесь ответов, но даже опухоли поджелудочной железы показали минимальные ответы (<25 дней dTTP) в большинстве тестируемых клеточных линий. Напротив, более низкие дозы 2 мг/кг (черные кружки) или 4 мг/кг (белые кружки) КАЛП калихемицина последовательно снижали рост опухоли НМРЛ в значительно большей степени, чем более высокие дозы КАЛП калихемицина, достигаемые на других опухолях PDX. Более того, большинство опухолей НМРЛ демонстрировало задержку роста более чем на 40 дней по сравнению с ненацеливающим антителом, несущим тот же активный блок (данные не показаны).
[0149] Эти данные свидетельствуют о том, что опухоли МКРЛ более чувствительны к активному блоку с калихемицином, чем к другим активным блокам, повреждающим ДНК. Этот результат был неожиданным, поскольку ожидалось, что активный блок с калихемицином даст результаты, аналогичные тем, которые наблюдались с активным блоком с PBD.
ВАРИАНТЫ РЕАЛИЗАЦИИ ДАННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Выделенное антитело, специфически связывающееся с SEZ6 человека, причем антитело содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 3 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 4.
2. Антитело по варианту реализации 1, в котором антитело конъюгировано с полезной нагрузкой калихемицином.
3. Антитело по варианту реализации 2, в котором полезная нагрузка калихемицином включает N-Ac калихемицин.
4. Антитело по варианту реализации 3, в котором полезная нагрузка калихемицином содержит Формулу II.
5. Способ лечения мелкоклеточного рака легкого, включающий введение антитела по любому из вариантов реализации 1-4 субъекту, нуждающемуся в этом.
6. Набор, содержащий один или более контейнеров, содержащих антитело по любому из вариантов реализации 1-4.
7. Набор по варианту реализации 6, дополнительно содержащий этикетку или вкладыш в упаковку, связанные с одним или более контейнерами, указывающие, что антитело предназначено для лечения субъекта, страдающего мелкоклеточным раком легкого.
8. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из вариантов реализации 1-4.
9. Набор, содержащий один или более контейнеров, содержащих фармацевтическую композицию по варианту реализации 8.
10. Набор по варианту реализации 9, дополнительно содержащий этикетку или вкладыш в упаковку, связанные с одним или более контейнерами, указывающие, что фармацевтическая композиция предназначена для лечения субъекта, страдающего мелкоклеточным раком легкого.
11. Нуклеиновая кислота, кодирующая все или часть антитела по любому из вариантов реализации 1-4.
12. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по варианту реализации 11.
13. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 11 или вектор по варианту реализации 12.
14. SEZ6 КАЛП имеющий структуру:
,
КАЛП1
где Ab содержит антитело к SEZ6, имеющее последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 3 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 4, и где n равно 2.
15. Способ лечения мелкоклеточного рака легкого, включающий введение SEZ6 КАЛП по варианту реализации 14 субъекту, нуждающемуся в этом.
16. Набор, содержащий один или более контейнеров, содержащих SEZ6 КАЛП по варианту реализации 14.
17. Набор по варианту реализации 16, дополнительно содержащий этикетку или вкладыш в упаковку, связанные с одним или более контейнерами, указывающие, что SEZ6 КАЛП предназначен для лечения субъекта, страдающего мелкоклеточным раком легкого.
18. Фармацевтическая композиция, содержащая SEZ6 КАЛП по варианту реализации 14.
19. Фармацевтическая композиция по варианту реализации 18, в которой SEZ6 КАЛП по п. 14 является преобладающим видом КАЛП.
20. Фармацевтическая композиция по варианту реализации 19, в которой преобладающие виды КАЛП включают более чем около 70% видов КАЛП, присутствующих в композиции.
21. Фармацевтическая композиция по варианту реализации 19, в которой преобладающие виды КАЛП включают более чем около 80% видов КАЛП, присутствующих в композиции.
22. Фармацевтическая композиция по варианту реализации 19, в которой преобладающие виды КАЛП включают более чем около 90% видов КАЛП, присутствующих в композиции.
23. Набор, содержащий один или более контейнеров, содержащих любую одну из фармацевтических композиций по вариантам реализации 18-22.
24. Набор по варианту реализации 23, дополнительно содержащий этикетку или вкладыш в упаковку, связанные с одним или более контейнерами, указывающие, что фармацевтическая композиция предназначена для лечения субъекта, страдающего мелкоклеточным раком легкого.
25. Способ лечения мелкоклеточного рака легкого, включающий введение любой из фармацевтических композиций по вариантам реализации 18-22.
26. Способ уменьшения количества инициирующих опухоль клеток в популяции опухолевых клеток, причем способ включает приведение в контакт популяции опухолевых клеток, включающей клетки, инициирующие опухоль, и опухолевые клетки, отличные от клеток, инициирующих опухоль, с SEZ6 КАЛП по варианту реализации 14, посредством чего количество клеток, инициирующих опухоль, уменьшается.
in vivo
27. Способ по варианту реализации 26, в котором приведение в контакт осуществляют .
in vitro
28. Способ по варианту реализации 26, в котором приведение в контакт осуществляют .
29. Способ доставки цитотоксина в клетку, включающий приведение клетки в контакт с SEZ6 КАЛП по варианту реализации 14.
30. Способ получения КАЛП по варианту реализации 14, включающий стадию конъюгирования антитела hSEZ6-1.ss1, имеющего последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 3 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 4, с линкером- лекарственным средством, содержащим Формулу II.
31. Способ по варианту реализации 30, дополнительно включающий стадию лиофилизации КАЛП.
32. Способ лечения мелкоклеточного рака легкого у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение SEZ6 КАЛП, имеющего диапазон безопасности более 6, при этом SEZ6 КАЛП содержит структуру:
,
КАЛП1
где Ab содержит антитело к SEZ6, имеющее последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 3 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 4, и где n равно 2.
33. Способ по варианту реализации 32, в котором диапазон безопасности составляет около 10.
34. Линкер-лекарственное средство калихемицин или его фармацевтически приемлемая соль, или сольват, содержащий структуру:
Формула II.
[0150] Специалисты в данной области техники также поймут, что данное изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без отступления от его сущности или основных атрибутов. Поскольку вышеприведенное описание данного изобретения раскрывает только примерные варианты его реализации, следует понимать, что другие варианты рассматриваются как находящиеся в пределах объема данного изобретения. Соответственно, данное изобретение не ограничивается конкретными вариантами реализации, которые были подробно описаны в данном документе. Скорее, следует ссылаться на прилагаемую формулу изобретения, указывающую на объем и содержание данного изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ЭББВИ СТЕМСЕНТРКС ЭлЭлСи
<120>  КОНЬЮГАТЫ АНТИТЕЛО К SEZ6-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБЫ
ПРИМЕНЕНИЯ
<130>  381493-703WO(167862)
<150>  62/678,061
<151>  2018-05-30
<160>  8
<170>  Патент в версии 3.5
<210>  1
<211>  994
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Met Arg Pro Val Ala Leu Leu Leu Leu Pro Ser Leu Leu Ala Leu Leu
1               5                   10                  15
Ala His Gly Leu Ser Leu Glu Ala Pro Thr Val Gly Lys Gly Gln Ala
20                  25                  30
Pro Gly Ile Glu Glu Thr Asp Gly Glu Leu Thr Ala Ala Pro Thr Pro
35                  40                  45
Glu Gln Pro Glu Arg Gly Val His Phe Val Thr Thr Ala Pro Thr Leu
50                  55                  60
Lys Leu Leu Asn His His Pro Leu Leu Glu Glu Phe Leu Gln Glu Gly
65                  70                  75                  80
Leu Glu Lys Gly Asp Glu Glu Leu Arg Pro Ala Leu Pro Phe Gln Pro
85                  90                  95
Asp Pro Pro Ala Pro Phe Thr Pro Ser Pro Leu Pro Arg Leu Ala Asn
100                 105                 110
Gln Asp Ser Arg Pro Val Phe Thr Ser Pro Thr Pro Ala Met Ala Ala
115                 120                 125
Val Pro Thr Gln Pro Gln Ser Lys Glu Gly Pro Trp Ser Pro Glu Ser
130                 135                 140
Glu Ser Pro Met Leu Arg Ile Thr Ala Pro Leu Pro Pro Gly Pro Ser
145                 150                 155                 160
Met Ala Val Pro Thr Leu Gly Pro Gly Glu Ile Ala Ser Thr Thr Pro
165                 170                 175
Pro Ser Arg Ala Trp Thr Pro Thr Gln Glu Gly Pro Gly Asp Met Gly
180                 185                 190
Arg Pro Trp Val Ala Glu Val Val Ser Gln Gly Ala Gly Ile Gly Ile
195                 200                 205
Gln Gly Thr Ile Thr Ser Ser Thr Ala Ser Gly Asp Asp Glu Glu Thr
210                 215                 220
Thr Thr Thr Thr Thr Ile Ile Thr Thr Thr Ile Thr Thr Val Gln Thr
225                 230                 235                 240
Pro Gly Pro Cys Ser Trp Asn Phe Ser Gly Pro Glu Gly Ser Leu Asp
245                 250                 255
Ser Pro Thr Asp Leu Ser Ser Pro Thr Asp Val Gly Leu Asp Cys Phe
260                 265                 270
Phe Tyr Ile Ser Val Tyr Pro Gly Tyr Gly Val Glu Ile Lys Val Gln
275                 280                 285
Asn Ile Ser Leu Arg Glu Gly Glu Thr Val Thr Val Glu Gly Leu Gly
290                 295                 300
Gly Pro Asp Pro Leu Pro Leu Ala Asn Gln Ser Phe Leu Leu Arg Gly
305                 310                 315                 320
Gln Val Ile Arg Ser Pro Thr His Gln Ala Ala Leu Arg Phe Gln Ser
325                 330                 335
Leu Pro Pro Pro Ala Gly Pro Gly Thr Phe His Phe His Tyr Gln Ala
340                 345                 350
Tyr Leu Leu Ser Cys His Phe Pro Arg Arg Pro Ala Tyr Gly Asp Val
355                 360                 365
Thr Val Thr Ser Leu His Pro Gly Gly Ser Ala Arg Phe His Cys Ala
370                 375                 380
Thr Gly Tyr Gln Leu Lys Gly Ala Arg His Leu Thr Cys Leu Asn Ala
385                 390                 395                 400
Thr Gln Pro Phe Trp Asp Ser Lys Glu Pro Val Cys Ile Ala Ala Cys
405                 410                 415
Gly Gly Val Ile Arg Asn Ala Thr Thr Gly Arg Ile Val Ser Pro Gly
420                 425                 430
Phe Pro Gly Asn Tyr Ser Asn Asn Leu Thr Cys His Trp Leu Leu Glu
435                 440                 445
Ala Pro Glu Gly Gln Arg Leu His Leu His Phe Glu Lys Val Ser Leu
450                 455                 460
Ala Glu Asp Asp Asp Arg Leu Ile Ile Arg Asn Gly Asp Asn Val Glu
465                 470                 475                 480
Ala Pro Pro Val Tyr Asp Ser Tyr Glu Val Glu Tyr Leu Pro Ile Glu
485                 490                 495
Gly Leu Leu Ser Ser Gly Lys His Phe Phe Val Glu Leu Ser Thr Asp
500                 505                 510
Ser Ser Gly Ala Ala Ala Gly Met Ala Leu Arg Tyr Glu Ala Phe Gln
515                 520                 525
Gln Gly His Cys Tyr Glu Pro Phe Val Lys Tyr Gly Asn Phe Ser Ser
530                 535                 540
Ser Thr Pro Thr Tyr Pro Val Gly Thr Thr Val Glu Phe Ser Cys Asp
545                 550                 555                 560
Pro Gly Tyr Thr Leu Glu Gln Gly Ser Ile Ile Ile Glu Cys Val Asp
565                 570                 575
Pro His Asp Pro Gln Trp Asn Glu Thr Glu Pro Ala Cys Arg Ala Val
580                 585                 590
Cys Ser Gly Glu Ile Thr Asp Ser Ala Gly Val Val Leu Ser Pro Asn
595                 600                 605
Trp Pro Glu Pro Tyr Gly Arg Gly Gln Asp Cys Ile Trp Gly Val His
610                 615                 620
Val Glu Glu Asp Lys Arg Ile Met Leu Asp Ile Arg Val Leu Arg Ile
625                 630                 635                 640
Gly Pro Gly Asp Val Leu Thr Phe Tyr Asp Gly Asp Asp Leu Thr Ala
645                 650                 655
Arg Val Leu Gly Gln Tyr Ser Gly Pro Arg Ser His Phe Lys Leu Phe
660                 665                 670
Thr Ser Met Ala Asp Val Thr Ile Gln Phe Gln Ser Asp Pro Gly Thr
675                 680                 685
Ser Val Leu Gly Tyr Gln Gln Gly Phe Val Ile His Phe Phe Glu Val
690                 695                 700
Pro Arg Asn Asp Thr Cys Pro Glu Leu Pro Glu Ile Pro Asn Gly Trp
705                 710                 715                 720
Lys Ser Pro Ser Gln Pro Glu Leu Val His Gly Thr Val Val Thr Tyr
725                 730                 735
Gln Cys Tyr Pro Gly Tyr Gln Val Val Gly Ser Ser Val Leu Met Cys
740                 745                 750
Gln Trp Asp Leu Thr Trp Ser Glu Asp Leu Pro Ser Cys Gln Arg Val
755                 760                 765
Thr Ser Cys His Asp Pro Gly Asp Val Glu His Ser Arg Arg Leu Ile
770                 775                 780
Ser Ser Pro Lys Phe Pro Val Gly Ala Thr Val Gln Tyr Ile Cys Asp
785                 790                 795                 800
Gln Gly Phe Val Leu Met Gly Ser Ser Ile Leu Thr Cys His Asp Arg
805                 810                 815
Gln Ala Gly Ser Pro Lys Trp Ser Asp Arg Ala Pro Lys Cys Leu Leu
820                 825                 830
Glu Gln Leu Lys Pro Cys His Gly Leu Ser Ala Pro Glu Asn Gly Ala
835                 840                 845
Arg Ser Pro Glu Lys Gln Leu His Pro Ala Gly Ala Thr Ile His Phe
850                 855                 860
Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Val Leu Lys Gly Gln Ala Ser Ile Lys Cys
865                 870                 875                 880
Val Pro Gly His Pro Ser His Trp Ser Asp Pro Pro Pro Ile Cys Arg
885                 890                 895
Ala Ala Ser Leu Asp Gly Phe Tyr Asn Ser Arg Ser Leu Asp Val Ala
900                 905                 910
Lys Ala Pro Ala Ala Ser Ser Thr Leu Asp Ala Ala His Ile Ala Ala
915                 920                 925
Ala Ile Phe Leu Pro Leu Val Ala Met Val Leu Leu Val Gly Gly Val
930                 935                 940
Tyr Phe Tyr Phe Ser Arg Leu Gln Gly Lys Ser Ser Leu Gln Leu Pro
945                 950                 955                 960
Arg Pro Arg Pro Arg Pro Tyr Asn Arg Ile Thr Ile Glu Ser Ala Phe
965                 970                 975
Asp Asn Pro Thr Tyr Glu Thr Gly Ser Leu Ser Phe Ala Gly Asp Glu
980                 985                 990
Arg Ile
<210>  2
<211>  993
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Met Arg Pro Val Ala Leu Leu Leu Leu Pro Ser Leu Leu Ala Leu Leu
1               5                   10                  15
Ala His Gly Leu Ser Leu Glu Ala Pro Thr Val Gly Lys Gly Gln Ala
20                  25                  30
Pro Gly Ile Glu Glu Thr Asp Gly Glu Leu Thr Ala Ala Pro Thr Pro
35                  40                  45
Glu Gln Pro Glu Arg Gly Val His Phe Val Thr Thr Ala Pro Thr Leu
50                  55                  60
Lys Leu Leu Asn His His Pro Leu Leu Glu Glu Phe Leu Gln Glu Gly
65                  70                  75                  80
Leu Glu Lys Gly Asp Glu Glu Leu Arg Pro Ala Leu Pro Phe Gln Pro
85                  90                  95
Asp Pro Pro Ala Pro Phe Thr Pro Ser Pro Leu Pro Arg Leu Ala Asn
100                 105                 110
Gln Asp Ser Arg Pro Val Phe Thr Ser Pro Thr Pro Ala Met Ala Ala
115                 120                 125
Val Pro Thr Gln Pro Gln Ser Lys Glu Gly Pro Trp Ser Pro Glu Ser
130                 135                 140
Glu Ser Pro Met Leu Arg Ile Thr Ala Pro Leu Pro Pro Gly Pro Ser
145                 150                 155                 160
Met Ala Val Pro Thr Leu Gly Pro Gly Glu Ile Ala Ser Thr Thr Pro
165                 170                 175
Pro Ser Arg Ala Trp Thr Pro Thr Gln Glu Gly Pro Gly Asp Met Gly
180                 185                 190
Arg Pro Trp Val Ala Glu Val Val Ser Gln Gly Ala Gly Ile Gly Ile
195                 200                 205
Gln Gly Thr Ile Thr Ser Ser Thr Ala Ser Gly Asp Asp Glu Glu Thr
210                 215                 220
Thr Thr Thr Thr Thr Ile Ile Thr Thr Thr Ile Thr Thr Val Gln Thr
225                 230                 235                 240
Pro Gly Pro Cys Ser Trp Asn Phe Ser Gly Pro Glu Gly Ser Leu Asp
245                 250                 255
Ser Pro Thr Asp Leu Ser Ser Pro Thr Asp Val Gly Leu Asp Cys Phe
260                 265                 270
Phe Tyr Ile Ser Val Tyr Pro Gly Tyr Gly Val Glu Ile Lys Val Gln
275                 280                 285
Asn Ile Ser Leu Arg Glu Gly Glu Thr Val Thr Val Glu Gly Leu Gly
290                 295                 300
Gly Pro Asp Pro Leu Pro Leu Ala Asn Gln Ser Phe Leu Leu Arg Gly
305                 310                 315                 320
Gln Val Ile Arg Ser Pro Thr His Gln Ala Ala Leu Arg Phe Gln Ser
325                 330                 335
Leu Pro Pro Pro Ala Gly Pro Gly Thr Phe His Phe His Tyr Gln Ala
340                 345                 350
Tyr Leu Leu Ser Cys His Phe Pro Arg Arg Pro Ala Tyr Gly Asp Val
355                 360                 365
Thr Val Thr Ser Leu His Pro Gly Gly Ser Ala Arg Phe His Cys Ala
370                 375                 380
Thr Gly Tyr Gln Leu Lys Gly Ala Arg His Leu Thr Cys Leu Asn Ala
385                 390                 395                 400
Thr Gln Pro Phe Trp Asp Ser Lys Glu Pro Val Cys Ile Ala Ala Cys
405                 410                 415
Gly Gly Val Ile Arg Asn Ala Thr Thr Gly Arg Ile Val Ser Pro Gly
420                 425                 430
Phe Pro Gly Asn Tyr Ser Asn Asn Leu Thr Cys His Trp Leu Leu Glu
435                 440                 445
Ala Pro Glu Gly Gln Arg Leu His Leu His Phe Glu Lys Val Ser Leu
450                 455                 460
Ala Glu Asp Asp Asp Arg Leu Ile Ile Arg Asn Gly Asp Asn Val Glu
465                 470                 475                 480
Ala Pro Pro Val Tyr Asp Ser Tyr Glu Val Glu Tyr Leu Pro Ile Glu
485                 490                 495
Gly Leu Leu Ser Ser Gly Lys His Phe Phe Val Glu Leu Ser Thr Asp
500                 505                 510
Ser Ser Gly Ala Ala Ala Gly Met Ala Leu Arg Tyr Glu Ala Phe Gln
515                 520                 525
Gln Gly His Cys Tyr Glu Pro Phe Val Lys Tyr Gly Asn Phe Ser Ser
530                 535                 540
Ser Thr Pro Thr Tyr Pro Val Gly Thr Thr Val Glu Phe Ser Cys Asp
545                 550                 555                 560
Pro Gly Tyr Thr Leu Glu Gln Gly Ser Ile Ile Ile Glu Cys Val Asp
565                 570                 575
Pro His Asp Pro Gln Trp Asn Glu Thr Glu Pro Ala Cys Arg Ala Val
580                 585                 590
Cys Ser Gly Glu Ile Thr Asp Ser Ala Gly Val Val Leu Ser Pro Asn
595                 600                 605
Trp Pro Glu Pro Tyr Gly Arg Gly Gln Asp Cys Ile Trp Gly Val His
610                 615                 620
Val Glu Glu Asp Lys Arg Ile Met Leu Asp Ile Arg Val Leu Arg Ile
625                 630                 635                 640
Gly Pro Gly Asp Val Leu Thr Phe Tyr Asp Gly Asp Asp Leu Thr Ala
645                 650                 655
Arg Val Leu Gly Gln Tyr Ser Gly Pro Arg Ser His Phe Lys Leu Phe
660                 665                 670
Thr Ser Met Ala Asp Val Thr Ile Gln Phe Gln Ser Asp Pro Gly Thr
675                 680                 685
Ser Val Leu Gly Tyr Gln Gln Gly Phe Val Ile His Phe Phe Glu Val
690                 695                 700
Pro Arg Asn Asp Thr Cys Pro Glu Leu Pro Glu Ile Pro Asn Gly Trp
705                 710                 715                 720
Lys Ser Pro Ser Gln Pro Glu Leu Val His Gly Thr Val Val Thr Tyr
725                 730                 735
Gln Cys Tyr Pro Gly Tyr Gln Val Val Gly Ser Ser Val Leu Met Cys
740                 745                 750
Gln Trp Asp Leu Thr Trp Ser Glu Asp Leu Pro Ser Cys Gln Arg Val
755                 760                 765
Thr Ser Cys His Asp Pro Gly Asp Val Glu His Ser Arg Arg Leu Ile
770                 775                 780
Ser Ser Pro Lys Phe Pro Val Gly Ala Thr Val Gln Tyr Ile Cys Asp
785                 790                 795                 800
Gln Gly Phe Val Leu Met Gly Ser Ser Ile Leu Thr Cys His Asp Arg
805                 810                 815
Gln Ala Gly Ser Pro Lys Trp Ser Asp Arg Ala Pro Lys Cys Leu Leu
820                 825                 830
Glu Gln Leu Lys Pro Cys His Gly Leu Ser Ala Pro Glu Asn Gly Ala
835                 840                 845
Arg Ser Pro Glu Lys Gln Leu His Pro Ala Gly Ala Thr Ile His Phe
850                 855                 860
Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Val Leu Lys Gly Gln Ala Ser Ile Lys Cys
865                 870                 875                 880
Val Pro Gly His Pro Ser His Trp Ser Asp Pro Pro Pro Ile Cys Arg
885                 890                 895
Ala Ala Ser Leu Asp Gly Phe Tyr Asn Ser Arg Ser Leu Asp Val Ala
900                 905                 910
Lys Ala Pro Ala Ala Ser Ser Thr Leu Asp Ala Ala His Ile Ala Ala
915                 920                 925
Ala Ile Phe Leu Pro Leu Val Ala Met Val Leu Leu Val Gly Gly Val
930                 935                 940
Tyr Phe Tyr Phe Ser Arg Leu Gln Gly Lys Ser Ser Leu Gln Leu Pro
945                 950                 955                 960
Arg Pro Arg Pro Arg Pro Tyr Asn Arg Ile Thr Ile Glu Ser Ala Phe
965                 970                 975
Asp Asn Pro Thr Tyr Glu Thr Gly Glu Thr Arg Glu Tyr Glu Val Ser
980                 985                 990
Ile
<210>  3
<211>  444
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Cинтетический полипептид
<400>  3
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Ser
20                  25                  30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Glu Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Asn Phe
50                  55                  60
Glu Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Gly Leu Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115                 120                 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130                 135                 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145                 150                 155                 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165                 170                 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180                 185                 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195                 200                 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290                 295                 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340                 345                 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405                 410                 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440
<210>  4
<211>  218
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Cинтетический полипептид
<400>  4
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asn
20                  25                  30
Gly Ile Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35                  40                  45
Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Gln Ser Gly Ile Pro Ala
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile
85                  90                  95
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165                 170                 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180                 185                 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195                 200                 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  5
<211>  1938
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полинуклеотид
<400>  5
gaagtccaac tcgtccaatc cggtgccgaa gtgaaaaagc ctggggaatc cctgaagatc    60
agctgcaagg gatccggtta ctcgttcacc tcctcctgga ttaactgggt ccggcagatg    120
cccggaaagg gactggagtg gatgggcaga atctatccgg gcgaagggga cactaattac    180
aacggaaact tcgagggcca ggtcaccatt tcggccgata agagcatctc aaccgcgtac    240
ttgcagtggt caagcctgaa ggcttccgac accgccatgt actactgtac tcgcggcctt    300
gtgatggact actggggaca gggaactctc gtgaccgtgt cgtccgcctc taccaagggc    360
ccttccgtgt tccctctggc cccctcgagc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg    420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgag ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc    480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc    540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg    600
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg gtgagaggcc agcacaggga    660
gggagggtgt ctgctggaag ccaggctcag cgctcctgcc tggacgcatc ccggctatgc    720
agccccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc ttcacccgga ggcctctgcc    780
cgccccactc atgctcaggg agagggtctt ctggcttttt ccccaggctc tgggcaggca    840
caggctaggt gcccctaacc caggccctgc acacaaaggg gcaggtgctg ggctcagacc    900
tgccaagagc catatccggg aggaccctgc ccctgaccta agcccacccc aaaggccaaa    960
ctctccactc cctcagctcg gacaccttct ctcctcccag attccagtaa ctcccaatct    1020
tctctctgca gagcccaaat ctagtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa    1080
gccagcccag gcctcgccct ccagctcaag gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat    1140
ccagggacag gccccagccg ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcacctg    1200
aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga    1260
tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg    1320
tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg    1380
aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact    1440
ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg    1500
agaaaaccat ctccaaagcc aaaggtggga cccgtggggt gcgagggcca catggacaga    1560
ggccggctcg gcccaccctc tgccctgaga gtgaccgctg taccaacctc tgtccctaca    1620
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag    1680
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag    1740
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc    1800
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg    1860
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc    1920
ctctccctgt ctccgggt                                                  1938
<210>  6
<211>  654
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полинуклеотид
<400>  6
gaaatcgtgt tgacccagtc ccccgctacc ctgtcactga gccccggaga acgcgcgact    60
ctgtcctgcc gggcatccca gtccgtggac tacaacggaa tctcctacat gcactggtat    120
cagcaaaagc caggccaagc cccgagactg ctcatctacg ccgcctcgaa cgtgcagagc    180
ggtattccgg cgcggttctc cggctcgggc agcggaaccg attttaccct cactatctcg    240
tcacttgaac ctgaggactt cgccgtgtac tactgccagc agtccattga ggacccgcct    300
actttcgggg ggggaaccaa agtcgagatc aagcggactg tggctgcacc aagtgtcttc    360
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg    420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg    480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc    540
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc    600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt          654
<210>  7
<211>  115
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Cинтетический полипептид
<400>  7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Ser
20                  25                  30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Glu Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Asn Phe
50                  55                  60
Glu Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Gly Leu Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  8
<211>  111
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Cинтетический полипептид
<400>  8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asn
20                  25                  30
Gly Ile Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35                  40                  45
Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Gln Ser Gly Ile Pro Ala
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile
85                  90                  95
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<---