НАБОР ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫХ ЗОНДОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ РНК МЕТАПНЕВМОВИРУСА ЧЕЛОВЕКА
SET OF OLIGODEOXYRIBONUCLEOTIDE PRIMERS AND FLUORESCENT-MARKED PROBES FOR HUMAN METAPNEUMOVIRUS RNA IDENTIFICATION

Изобретение относится к наборам праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для выявления генетического материала (РНК) метапневмовируса человека в клинических образцах, секционных пробах, образцах окружающей среды, культуральных вируссодержащих жидкостях и прочих биопрепаратах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач по мониторингу и изучению свойств метапневмовируса, созданию диагностических, профилактических и лечебных препаратов и может быть использовано в медицине, биотехнологии и эпидемиологии.
При помощи разработанных диагностических праймеров и флуоресцентно-меченых зондов возможно выявление генетического материала (РНК) метапневмовируса человека.
Метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) является наиболее распространенным методом, используемым в лабораторной практике для дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний. В основе метода лежат две реакции - обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция. В реакции обратной транскрипции на матрице вирусной РНК строится комплиментарная ДНК (кДНК). В следующей за реакцией обратной транскрипции ПЦР происходит многократное избирательное удвоение целевого участка кДНК (амплификация). Амплифицируемый участок кДНК является маркерным, так как строго ограничен последовательностями ДНК-затравок (праймеров), без которых невозможно протекание ПЦР. Для детекции накопления продуктов амплификации в режиме реального времени помимо пары праймеров необходим также флуорисцентно-меченый ДНК-зонд. Сложность выбора праймеров и зонда обусловлена требованием их строгой видоспецифичности. В случае если выбранные олигонуклеотиды не обладают видовой специфичностью к целевому объекту, либо не обладают достаточной гомологией к целевой нуклеотидной последовательности, возможны ложноотрицательные результаты исследования. В случае если выбранные праймеры и зонды демонстрируют сродство к нецелевым последовательностям ДНК, то возможны ложноположительные результаты исследования. Правильный выбор сочетания пары праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет осуществить строго специфическую амплификацию целевого фрагмента кДНК и провести детекцию накопления продуктов ПЦР в режиме реального времени.
Известны зарубежные аналоги, представляющие собой набор праймеров, обеспечивающих специфичный синтез фрагментов кДНК на матрице геномной РНК метапневмовируса человека. В заявке США №20060014140, опубл. 2006 г. представлен набору праймеров для детекции метапневмовируса человека. В патентах Китая №CN102031314, опубл. 2011 г., №CN101550454, опубл. 2009 г., №CN101538618, опубл. 2009 г.  представлены  наборы праймеров и ДНК-зондов для детекции генетического материала метапневмовируса человека методом ПЦР в реальном времени.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является набор праймеров для детекции кДНК метапневмовируса человека методом ПЦР "АмплиСенсОРВИ-скрин-FL" (http://www.pacxodka39.ru/product_3056.html ЦНИИ Эпидемиологии, г. Москва).  Набор реагентов предназначен для выявления возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ): РНК респираторно-синцитиального вируса, РНК метапневмовируса, вирусов парагриппа 1-4 типов, коронавирусов, риновирусов, ДНК аденовирусов групп B, C и E и бокавируса в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.
Однако в известных аналогах и прототипе праймеры имеют недостаточный уровень гомологии ко всем циркулирующим в настоящее время метапневмовирусам человека в природе, а также имеющимся  в базе данных геномам метапневмовируса человека, что снижает надежность и достоверность диагностики указанного вируса с использованием заявляемых  праймеров.
Техническим результатом заявляемого изобретения является расширение спектра импортозамещающих олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, позволяющих надежно и достоверно идентифицировать РНК метапневмовируса человека методом ПЦР в реальном времени. Указанный результат достигается разработкой набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для детекции РНК метапневмовируса человека, содержащего четыре олигонуклеотидных полимера, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также два флуоресцентно-меченых ДНК-зонда. Указанные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:
В рамках заявляемого технического решения разработанные праймеры и ДНК-зонды обладают высокой степенью гомологии ко всем известным нуклеотидным последовательностям геномов изолятов метапневмовируса человека, доступным в международной базе данных биотехнологической информации GenBank.
По сравнению с известными наборами олигонуклеотидов-аналогов, предлагаемые к патентованию олигонуклеотиды для детекции метапневмовируса человека методом ПЦР в реальном времени имеют ряд значительных преимуществ. Во-первых, в заявляемом наборе присутствуют четыре прямых праймера, два обратных праймера и три меченых ДНК-зонда. Такая комбинация, в дополнении к примененной вырожденности олигонуклеотидов, обеспечивает максимальную гомологию патентуемых праймеров и зондов ко всем имеющимся в международной базе данных GenBank последовательностям геномов метапневмовируса человека. Во-вторых, патентуемый набор олигонуклеотидов был оптимизирован для применения с отечественными реагентами и ферментами (производства ООО «Лаборатория МЕДИГЕН»), а также самых распространенных в лабораторной практике приборов для ПЦР в реальном времени - “Rotor Gene 6000” (Corbet Research, Австралия) и iQ5 (BioRad, США).
Апробация олигонуклеотидов была осуществлена с использованием назофарингеальных смывов от пациентов с симптомами ОРВИ (порядок проведения исследования одобрен этическим комитетом ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (IRB 00001360)). Экспериментально было показано, что выбранные праймеры и ДНК-зонд обеспечивают надежный синтез целевых ДНК-фрагментов. Специфичность амплификации дополнительно подтверждали секвенированием.
Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК. Предлагаемые к патентованию праймеры, фланкируют участок гена кодирующего вирусный белок нуклеопротеина (NP-ген). В ПЦР амплифицируется фрагмент генома с 3620 по 3742 нуклеотид (122 п.н.) и с 3204 по 3379 нуклеотид (175 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.
Важно отметить, что оптимизация условий проведения ПЦР осуществлялась с использованием наборов коммерчески доступных реагентов, приборов и ферментов, предназначенных для массового использования в лабораторной практике, что позволяет быстрое и надежное применение данного изобретения в медицинских и научно-исследовательских лабораториях.
Перечень графических материалов
На фиг. 1 представлены результаты анализа образцов методом ПЦР в реальном времени. В эксперименте методом ПЦР в реальном времени были проанализированы тридцать клинических образцов на наличие маркеров респираторных вирусов, в одном образце (кривая № 12) была обнаружена РНК метапневмовируса человека.
Методика конструирования набора диагностических праймеров и флуоресцентно-меченых зондов
На основе теоретического изучения структуры генома метапневмовируса человека, на консервативную область гена вирусного нуклеопротеина (NP-ген) были рассчитаны и синтезированы праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды для проведения полимеразной цепной реакции (таблица 1). В ходе работы было проанализировано 1342 имеющихся в базе данных нуклеотидных последовательностей генома метапневмовируса человека.
Таблица 1.
Праймеры и зонды для детекции метапневмовируса человека
Вирус
Последовательность в GenBank
Локализация
Нуклеотидная последовательность5' →3'
Tm, °C
ПЦР-продукт, п.н.
MpV
DQ843659.1
3620-3639
AARATGGCYGTYAGYTTCAGAAGAATGGTCGCTAGCTTCAG
49.250.8
122
3742-3723
GGCYARYTCAGCATCNGTCAT
51.0
3678-3702
ROX-TTTCAGACAAYGCAGGGATAACACC-BHQ2ROX-TTTCAGACAAYGCTGGAATAACACC-BHQ2
58.157.2
AY525843.1
3204-32263207-3226
TYTTYACATTAGARGTTGGTGATGTTTTACACTGGAGGTAGGTGATGT
51.349.8
175
3379-3356
ACAAAYCTWGATTGYCTGGG
50.2
3250-3269
ROX-TGGRCCYAGCYTAAWCAAAACAGA-BHQ2
57.4
Методика получения положительных контрольных образцов
Положительные контрольные образцы были получены методом ТОРО-Т/А клонирования. После чего компетентные клетки E. Coli линии TOP 10 (Invitrogen, США) были трансформированы полученными плазмидами pCR2.1 (Invitrogen, США), несущими вирусспецифическую вставку синтезированных фрагментов ДНК. В ходе проделанной работы была сконструирована рекомбинантная плазмида: pMpV. Наличие специфической к вирусному геному ДНК-вставки подтверждали секвенированием.
Анализ эффективности проведенной трансформации осуществляли проведением ПЦР в режиме реального времени в соответствии с протоколом, описанным ниже, где в реакционную смесь в качестве положительного образца добавляли 1×ТЕ-буфер, содержащий рекомбинантную плазмиду pMpV, со встройкой вирусспецифического синтезированного ДНК-дуплекса. В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли 1×ТЕ-буфер.
Экстракция вирусной РНК
Вирусную РНК выделяли из 100 мкл назофарингеального смыва с использованием набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ, г. Москва) согласно инструкции производителя.
Реакция обратной транскрипции
Синтез комплементарной ДНК (кДНК) проводили на матрице суммарной РНК с использованием набора реагентов «Реверта-L» (ФБУН ЦНИИЭ, г. Москва) согласно инструкции производителя.
Проведение полимеразной цепной реакции
Условия проведения амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния, концентрации праймеров и зондов в реакционной смеси, температуре отжига праймеров.
Таблица 2.
ПЦР-смесь (из расчета на одну пробирку)
Компонент
Объем, мкл
ПЦР-буфер×10
3
дНТФ (5 мМ)
1
MgCl<sub>2</sub> (50 мМ)
1.5
Hot Start Taq ДНК-полимераза
0.3
Смесь прямых праймеров - F (каждого 10 нМ)
2
Смесь обратных праймеров - R (каждого10 нМ)
2
Смесь ДНК-зондов - Z (каждого 15 нМ)
0.5
Образец
3
diH<sub>2</sub>O
16.7
2
Реакцию амплификации проводили в 30 мкл смеси для ПЦР (таблица  2), содержащей 1×Taq буфер для амплификации, 2.5 мМ MgCl, 0.17 мМ каждого из нуклеозидтрифосфатов, 1.5 активных единиц Smart Taq ДНК-полимеразы (все компоненты ООО «Лаборатория МЕДИГЕН»), 20 пМ прямого и обратного праймеров, 8 пМ флуоресцентного ДНК-зонда.
ПЦР в режиме реального времени проводили согласно программе амплификации, приведенной в таблице 3. Детекцию интенсивности флуоресценции проводили по каналу - Orange 585/610 нм (краситель ROX). Измерение флуоресценции проводили на приборах “Rotor Gene 6000” (Corbet Research, Австралия) и iQ5 (BioRad, США). Результаты оценивали по наличию флуоресценции до 30 цикла. Результаты анализа образцов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов по каналу ROX (585/610 нм) представлены на фиг. 1, на графиках которой приведены:
1 - положительный контрольный образец (плазмидная конструкция pMpV);
12 - клинический образец, в котором обнаружена РНК метапневмовируса;
К - отрицательный контрольный образец (однократный ТЕ-буфер).
Таблица 3.
Программа амплификатора для ПЦР-РВ
№
Операция
T, °C
T, мин:с
1
Hold/Активация Smart Taq-ДНК-полимеразы
95
05:00
2
Cycling 1/Циклирование 1 (10 циклов)
95
00:15
51
00:20
72
00:15
3
Cycling 2/Циклирование 2 (30 циклов)
95
00:15
51
00:20 детекция
72
00:15
Апробация патентуемых олигонуклеотидов
Предлагаемые к патентованию олигонуклеотиды были нами апробированы в эпидемиологическом исследовании по изучению видового разнообразия агентов, вызывавших ОРВИ у жителей г. Новосибирска и Новосибирской области в октябре-апреле 2011-2012 г.г.
Нами было исследовано 164 образца назофарингеальных смывов от пациентов с симптомами острой респираторной вирусной инфекции. Этиологический агент заболевания был нами установлен в 43% случаев (69 образцов). Метапневмовирус в исследуемых образцах был выявлен в 1% случаев (2 образца). Специфичность ПЦР-исследования дополнительно подтверждали секвенированием.
Таким образом, заявляемый набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов обеспечивает наравне с известными аналогами надежную и достоверную детекцию метапневмовируса человека в клинических образцах и других биологических материалах.
Приложение
<110>  Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный
научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"» (ФБУН
ГНЦ ВБ "Вектор")
<120>  Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов для идентификации РНК метапневмовируса человека.
<210>  3
<223> Последовательности олигонуклеотидов, видоспецифических к метапневмовирусу человека.
<400>  1   прямые праймеры (forward primers) 5`→3`
F: 5`-AARATGGCYGTYAGYTTCAG-3`                      (20 н.)
F: 5`-AAGAATGGTCGCTAGCTTCAG-3`                     (21 н.)
F: 5`-TYTTYACATTAGARGTTGGTGATGT-3`                 (25 н.)
F: 5`-TTTACACTGGAGGTAGGTGATGT-3`                   (23 н.)
<400>  2   обратные праймеры (reverse primers) 5`→3`
R: 5`-GGCYARYTCAGCATCNGTCAT-3`                     (21 н.)
R: 5`-ACAAAYCTWGATTGYCTGGG-3`                      (20 н.)
<400>  3   флуоресцентно-меченые ДНК-зонды (probes) 5`→3`
Z: 5`-ROX-TTTCAGACAAYGCAGGGATAACACC-BHQ2-3`      (25 н.)
Z: 5`-ROX-TTTCAGACAAYGCTGGAATAACACC-BHQ2-3`      (25 н.)