СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОК С ПОМОЩЬЮ БИОЧИПА
METHOD OF CELL ANALYSIS BY MEANS OF BIOCHIP

Изобретение относится к области медицины, но также может быть использовано в ветеринарии и биологии.
Известен способ исследования клеток с помощью иммунологических биочипов (см. Liu A.Y. Differential Expression of Cell Surface Molecules in Prostate Cancer Cells // Cancer Research. 2000, Vol.60, p.3429-3434), заключающийся в том, что биочип, содержащий иммобилизованные антитела, инкубируют с суспензией клеток. Клетки, имеющие на своей поверхности соответствующие антигены, связываются с антителами, иммобилизованными в строго определенных участках подложки. Затем биочип отмывают от клеток, не связавшихся с иммобилизованными антителами. Проводят считывание результата путем микроскопического исследования биочипа, в результате которого определяют, в каких именно его участках произошло связывание клеток. Таким образом, устанавливают наличие определяемых поверхностных антигенов у исследуемых клеток.
Недостатком известного способа является то, что не предусмотрена возможность окрашивания и морфологического исследования клеток. В результате, при исследовании суспензий, содержащих несколько типов клеток, нельзя точно установить на каких именно клетках присутствует тот или иной из определяемых антигенов.
Известен способ исследования клеток с помощью иммунологических биочипов (см. А.В. Шишкин, И.И. Шмырев, С.А. Кузнецова, Н.Г. Овчинина, А.А. Бутылин, Ф.И. Атауллаханов, А.И. Воробьев «Иммунологические биочипы для параллельного определения поверхностных антигенов и морфологического исследования клеток», Биологические мембраны, 2008, том 25, №4, с 277-284), взятый за прототип, заключающийся в том, что биочип, содержащий иммобилизованные антитела, инкубируют с суспензией клеток. Клетки, имеющие на своей поверхности соответствующие антигены, связываются с антителами, иммобилизованными в строго определенных участках подложки (пятнах биочипа). Затем биочип отмывают от клеток, не специфически связавшихся с поверхностью биочипа, но не связавшихся с иммобилизованными антителами. В результате, на поверхности биочипа остаются только клетки, связавшиеся с антителами. После этого биочип высушивают на воздухе, фиксируют метанолом, окрашивают по Романовскому-Гимзе и проводят морфологическое исследование связавшихся клеток. Выполняют считывание результата, при котором получают изображение пятен биочипа (участков поверхности биочипа с иммобилизованными антителами), в которых связались клетки. Определяют плотность связывания клеток в каждом пятне биочипа (отношение количества связанных клеток к площади поверхности участка). Осуществляют анализ результата. При этом, исходя из значений плотности связывания клеток, полученных для каждого пятна, рассчитывают содержание в суспензии клеток, имеющих соответствующие поверхностные антигены. Кроме того, проводят анализ изображения клеток (морфологическое исследование) путем непосредственного микроскопического исследования клеток, связавшихся в области пятен биочипа или путем изучения изображений, полученных при микрофотографировании пятен. Проведение морфологического исследования позволяет определить, какие именно типы клеток имеют на своей поверхности тот или иной антиген.
Недостатком известного способа является то, что в процессе высушивания биочипа происходит существенное изменение морфологических характеристик клеток. При морфологическом исследовании клеток отмечается их деформация, многие клетки имеют признаки апоптоза. Часть клеток разрушается. Это затрудняет их распознавание. В пятнах с высокой плотностью связывания клеток в ряде случаев клетки выглядят «слившимися» друг с другом. Это затрудняет определение плотности их связывания. Причина заключается в том, что при высушивании биочипа происходит испарение воды из оставшихся на его поверхности капель буферного раствора. Это приводит к постепенному увеличению концентрации солей. Изменение осмотического давления приводит к деформированию клеток и, по всей вероятности, вызывает процессы, приводящие к запуску механизмов апоптоза.
Задачей заявленного изобретения является сохранение морфологических характеристик связавшихся с биочипом клеток, повышение точности и надежности получаемых результатов вследствие исключения возможных ошибок при проведении морфологического исследования и определения плотности связывания клеток.
Поставленная задача решается за счет того, что согласно способу исследования клеток с помощью биочипа, содержащего иммобилизованные молекулы веществ, способных связываться с молекулами, находящимися на поверхности клеток, включающего инкубацию биочипа с суспензией клеток, отмывку биочипа от не специфически связавшихся клеток, фиксацию и окрашивание клеток, считывание результата, оценку количества клеток, связавшихся в одном или нескольких участках биочипа заданной площади, анализ изображения связавшихся клеток, перед проведением фиксации с поверхности биочипа удаляют избыток жидкости, не допуская при этом ее высушивания.
Из биочипа приготовляют долговременный препарат для микроскопических исследований.
Во время удаления избытка отмывочной жидкости биочип помещают в атмосферу с повышенной влажностью воздуха.
Результатом использования изобретения является повышение точности и надежности получаемых результатов вследствие сохранения морфологических характеристик связавшихся с биочипом клеток и исключения возможных ошибок при проведении их морфологического исследования и определении плотности связывания клеток.
Использование заявленного способа позволяет предотвратить изменение формы клеток, формы ядра и других морфологических характеристик клеток, обусловленное изменением осмотического давления при испарении воды из оставшихся на поверхности биочипа капель буферного раствора и апоптотическими процессами в клетках. При добавлении фиксирующей жидкости непосредственно после устранения избытка отмывочного раствора происходит гибель клеток без запуска механизма апоптоза. При этом также не происходит изменений, обусловленных повышением концентрации солей.
Из биочипа после выполнения окрашивания может быть приготовлен долговременный препарат для микроскопического исследования. Это позволяет защитить его поверхность со связавшимися клетками от повреждения и многократно проводить микроскопическое исследование с использованием иммерсионных объективов. Кроме того, это позволяет неограниченно долго сохранять биочип после выполнения исследования.
Выполнение манипуляций, связанных с удалением избытка отмывочного раствора, в условиях повышенной влажности воздуха позволяет замедлить или предотвратить высыхание поверхности биочипа и позволяет увеличить допустимый промежуток времени между удалением избытка отмывочного раствора и помещением биочипа в фиксирующую жидкость.
Заявленный способ поясняется чертежами (фиг.1-4).
На фиг.1 представлены результаты исследования с помощью биочипа клеток больного С., 51 год, с диагнозом хронический В-клеточный лимфоцитарный лейкоз (В-ХЛЛ). На представленной диаграмме приводятся выраженные в процентах значения плотности связывания клеток в тестовых участках биочипа с иммобилизованными антителами. Данные значения численно соответствуют процентному содержанию в исследуемом образце клеток, имеющих каждый из определяемых антигенов.
На фиг.2 представлены микрофотографии участков пятен (с иммобилизованными антителами, специфичными к антигену CD23) двух биочипов, на которых проводилось исследование лимфоцитов, выделенных из периферической крови больного с диагнозом хронический В-клеточный лимфоцитарный лейкоз. Окраска по Романовскому-Гимзе. Увеличение в 1000 раз. а) Исследование проводилось по заявленному способу. Структура клеток хорошо сохранена. б) Исследование проводилось способом, взятым в качестве прототипа. Клетки деформированы, у части клеток отмечается фрагментация ядра. Часть клеток разрушена.
На фиг.3 представлены результаты определения с помощью биочипа процентного содержания клеток, имеющих различные антигены. Клетки больного В. 77 лет. Диагноз: волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ). На представленной диаграмме приводятся выраженные в процентах значения плотности связывания клеток в тестовых участках биочипа с иммобилизованными антителами. Данные значения численно соответствуют процентному содержанию в исследуемом образце клеток, имеющих каждый из определяемых антигенов.
На фиг.4 представлена микрофотография участка пятна (с иммобилизованными антителами анти-СD19) биочипа, на котором проводилось исследование лимфоцитов, выделенных из периферической крови больного с диагнозом волосатоклеточный лейкоз. Исследование проводилось по заявленному способу. Структура клеток хорошо сохранена. Хорошо видны выросты цитоплазмы, напоминающие ворсинки, что характерно для клеток данной опухоли. Увеличение в 1000 раз. Окраска по Паппенгейму.
Заявленный способ осуществляется следующим образом. Биочип, представляющий собой прозрачную твердую подложку с иммобилизованными в заданных участках (пятнах) антителами или иными молекулами, способными связываться с поверхностными молекулами клеток, закрепляют в кювете, чашке Петри или иной емкости. В емкость наливают исследуемую клеточную суспензию и осуществляют инкубацию. Клетки оседают на поверхность биочипа и приходят в контакт с иммобилизованными антителами. Если клетки имеют соответствующие поверхностные антигены, происходит их связывание в данных участках (пятнах) поверхности биочипа. Затем осуществляют отмывку биочипа изотоническим раствором для устранения клеток, не связавшихся с антителами. После завершения отмывки в области пятен биочипа остаются связанными только те клетки, которые имеют соответствующие поверхностные антигены. Сразу же после выполнения отмывки оставшийся отмывочный раствор сливают, а его капли устраняют со стенок емкости пипеткой, не касаясь биочипа. После этого в емкость с биочипом наливают фиксирующую жидкость, например метанол, спиртово-формалиновый раствор или иную жидкость, и осуществляют инкубацию в течение необходимого времени. Промежуток времени между удалением избытка отмывочного раствора и добавлением фиксирующей жидкости не должен превышать 15-30 секунд. Но он может быть увеличен, если данный этап проведения анализа выполняется при повышенной влажности воздуха, препятствующей испарению воды с поверхности биочипа.
После завершения обработки биочипа фиксирующей жидкостью (12-15 минут для метанола, 30 секунд для спиртово-формалинового раствора) ее сливают. На данном этапе высушивание биочипа допускается. В кювету наливают окрашивающий раствор, например раствор азура II и эозина при окраске по Романовскому-Гимзе. Возможно проведение окрашивания препарата любым другим известным способом. В частности, возможно выполнение различных вариантов цитохимического окрашивания, позволяющего выявлять в клетках наличие различных веществ (См., например, «Атлас клеток крови и костного мозга» под редакцией Г.И.Козинца, М.: «Триада-Х», 1998 г., с.65-73).
После завершения окрашивания биочип ополаскивают водой или иной жидкостью и высушивают. Затем осуществляют приготовление долговременного препарата любым известным способом, применяющимся при работе с цитологическими препаратами. Возможно, в частности, заключение биочипа в канадский бальзам или иную композицию с подобными свойствами, например, в жидкость для приготовления и цитологических гистологических препаратов «Shandon-Mount» (производитель-«Thermo-electron corporation», США, Pitsburg).
Осуществляют считывание результата, для этого получают изображение пятен и фоновых участков биочипа (например, путем фотографирования с помощью фотокамеры, смонтированной на микроскопе или иного устройства) и определяют плотность связывания клеток (количество клеток, связавшихся на участке поверхности биочипа заданной площади) в области пятен биочипа и фоновых участков. Процесс может быть автоматизирован.
В случае, если инкубация биочипа с клеточной суспензией осуществлялась без какого-либо перемешивания или возникновения потоков жидкости, при анализе результата возможно определение содержания в суспензии клеток, экспрессирующих определяемые поверхностные антигены. Плотность связывания клеток в области пятна биочипа пропорциональна содержанию в суспензии клеток, экспрессирующих соответствующий поверхностный антиген. При выполнении анализа результата определяют отношение значений плотности связывания клеток в области каждого пятна биочипа к максимально возможному при данных условиях значению плотности связывания клеток (в области пятна положительного контроля). В качестве такового может, например, выступать пятно с антителами, специфичными к антигену CD45 на биочипе, предназначенном для исследования лейкоцитов. Полученные результаты могут быть выражены в процентах (фиг.1, 3). Эти значения численно хорошо соответствуют фактическому процентному содержанию в образце клеток, имеющих соответствующие антигены, устанавливаемому с помощью референтных методов. Помимо количественного определения плотности связывания клеток в некоторых случаях может быть использовано ее качественное или полуколичественное определение. В этих случаях оценка содержания в образце клеток, имеющих определяемые антигены, также будет качественной или полуколичественной.
В зависимости от целей и задач исследования может определяться плотность связывания клеток во всех пятнах биочипа или только в некоторых пятнах.
Выполняют морфологическое исследование клеток, связавшихся в области каждого пятна биочипа (фиг.1, 2). Его осуществляют путем непосредственного микроскопического исследования клеток, связавшихся в области пятен биочипа или путем изучения изображений, полученных при микрофотографировании пятен. Микроскопическое исследование может выполняться как с применением объективов, не приходящих в контакт с поверхностью препарата, так и с применением иммерсионных (масляных) объективов. При этом возможно многократное микроскопическое исследование препарата с использованием иммерсионных объективов без каких-либо повреждений препарата и загрязнения объективов. Изображение пятен биочипа и связавшихся в них клеток также может быть получено, например, с помощью проекционной аппаратуры, что в некоторых случаях является более предпочтительным.
При проведении морфологического исследования клеток, связавшихся с биочипом, определяют признаки, необходимые для их идентификации (форму и размеры клеток и их ядер, ядерно-цитоплазматическое соотношение, структуру хроматина, наличие или отсутствие ядрышек, наличие перинуклеарного просветления, цвет ядра и цитоплазмы, наличие вакуолей, гранул и других цитоплазматических структур, а также наличие, локализацию и характер окрашивания любых других структур и объектов, выявляемых при используемом способе окрашивания). На основании этого определяют, какие именно клетки связались в области того или иного пятна биочипа. При анализе результата на участке с заданной площадью того или иного пятна может быть определено количество связавшихся клеток определенных типов или клеток, имеющих какой-либо морфологический или иной признак (совокупность признаков). Может быть определено отношение плотности связывания клеток того или иного вида к общей плотности связывания клеток в области данного пятна или к максимально возможной плотности связывания. Такой подход позволяет определять содержание в образце клеток, относящихся к различным субпопуляциям.
При необходимости может осуществляться морфометрическое исследование связавшихся клеток. Морфологическое или морфометрическое исследование связавшихся клеток может осуществляться как без автоматизации (например, путем просмотра каждого пятна биочипа под микроскопом или путем изучения микрофотографий участков соответсвующих пятен), так и с помощью компьютерных программ, распознающих изображение и проводящих его анализ.
Заявленное изобретение направлено на повышение точности, надежности и диагностической ценности результатов анализа.
Примеры использования способа.
Пример 1.
С помощью двух биочипов (№1 и №2) исследовались лимфоциты, выделенные из периферической крови больного С., 51 год, с диагнозом хронический В-клеточный лимфатический лейкоз (В-ХЛЛ). Клетки были ресуспензированы в изоосмотическом буферном растворе, к которому были добавлены ЭДТА (до концентрации 0,5 мг/мл) и инактивированная нагреванием человеческая сыворотка (20% по объему).
Использовались биочипы с антителами (IgG), специфичными к антигенам: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11a, CD11b,CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD27, CD29, CD31, CD36, CD38, CD41, CD44, CD45, CD45RA, CD56, CD71, CD72, CD95, CD98, HLA-DR, IgM. Биочип представляет собой подложку из прозрачного материала, в заданных участках которой были иммобилизованы данные антитела.
С помощью биочипа №1 исследование выполнялось заявленным способом, а с помощью биочипа №2 исследование выполнялось способом, взятым за прототип.
Перед проведением исследования биочипы были закреплены в прозрачных кюветах и обработаны белковым раствором, блокирующим сайты неспецифического связывания и уменьшающим прочность неспецифического связывания клеток с подложкой. После выполнения данной обработки биочипы были отмыты раствором детергента и буферным раствором.
6
В каждую кювету было внесено 1000 мкл клеточной суспензии, с концентрацией клеток 10 кл/мл. Инкубация биочипов с клеточной суспензией осуществлялась в течение 60 минут без какого-либо перемешивания. Затем биочипы несколько раз ополаскивали изотоническим буферным раствором для отмывки от клеток, не связавшихся с иммобилизованными антителами. Качество отмывки контролировалось с помощью микроскопии (использовался инвертированный микроскоп). Отмывка считалась выполненной, когда не оставалось связанных клеток в тех участках поверхности биочипа, где отсутствовали иммобилизованные антитела. Из кюветы с биочипом №1 сливали отмывочный раствор и устраняли его оставшиеся капли со стенок кюветы автоматической пипеткой, не касаясь поверхности биочипа (на ней также оставались капли раствора). Данная манипуляция выполнялась в помещении, где поддерживалась 100% влажность воздуха. Время выполнения данной манипуляции составило 2 минуты. После этого в кювету с биочипом №1 вносили 1 мл метанола и проводили инкубацию в течение 15 минут. После этого метанол сливали.
Из кюветы с биочипом №2 выливали отмывочную жидкость. После этого биочип в течение 30 минут высушивали на воздухе, а затем фиксировали метанолом в течение 15 минут и вновь высушивали.
Оба биочипа окрашивали по Романовскому-Гимзе. Для этого в кюветы наливали разбавленный раствор азура II и эозина и инкубировали в течение 35 минут. Затем раствор красителей сливали, а кюветы с биочипами ополаскивали водой и высушивали. Извлекали биочипы из кювет и осуществляли приготовление из них долговременных препаратов. Для этого каждый из биочипов помещали на предметное стекло, куда предварительно наносили каплю жидкости для приготовления долговременных гистологических препаратов («Shandon-Mount»; производитель - «Thermo-electron corporation», Питсбург, США). Слегка прижимали биочип, сверху наносили на него еще одну каплю данной жидкости, накрывали покровным стеклом и помещали под пресс до ее затвердевания.
Затем каждое пятно биочипа фотографировали с помощью фотокамеры, установленной на микроскопе. На полученных микрофотографиях выбирали по 3-4 области с заданной площадью (в данном случае 100х100 мкм) и осуществляли подсчет клеток в каждой из них. Полученные значения усредняли. Средние значения плотности связывания клеток, полученные для каждого из пятен биочипа, выражали в процентах. За 100% принимали среднюю плотность связывания клеток в области пятна биочипа с антителами, специфичными к антигену CD45 (данный антиген присутствует на поверхности всех типов лейкоцитов). Полученные результаты (биочип №1) приводятся на фиг.1.
Затем проводили морфологическое исследование связавшихся клеток. Для этого каждое пятно биочипа просматривали на большом увеличении (использовали объектив с увеличением х100). Приготовление из биочипа долговременного препарата позволяло использовать иммерсионный объектив без повреждения связанных клеток и их механического отделения от поверхности биочипа. С помощью фотокамеры, смонтированной на микроскопе, получали микрофотографии клеток, связавшихся в каждом пятне биочипа. Примеры приводятся на фиг.2. Клетки, окрашенные на биочипе №1 (фиг.2-а) хорошо сохраняли форму и размеры, форму ядра, структуру хроматина и другие морфологические признаки, типичные для зрелых лимфоцитов. Клетки, находящиеся на биочипе №2 (фиг.2-б) были деформированными. Значительная часть клеток имела измененную форму ядер. Часть клеток была разрушена. Некоторые клетки выглядели слившимися между собой.
Таким образом, использование заявленного способа позволяет получать значительно более адекватные результаты по сравнению со способом, взятым за прототип.
Пример 2.
С помощью биочипа были исследованы лимфоциты, выделенные из периферической крови больного В., 77 лет, страдающего волосатоклеточным лейкозом (ВКЛ). Использовался точно такой же биочип, как в примере 1. Подготовка биочипа к проведению анализа, инкубация с клеточной суспензией и отмывка от не связавшихся с антителами клеток выполнялись так же, как описано в примере 1.
После завершения отмывки из кюветы сливали буферный раствор. Со стенок кюветы пипеткой убирали капли жидкости, не прикасаясь к биочипу. Данная процедура выполнялась при обычной влажности воздуха (около 70%), время ее осуществления составило 20 секунд. После этого проводилось окрашивание связавшихся с биочипом клеток по Паппенгейму. Для этого сразу же после устранения избытка отмывочной жидкости в кювету заливали раствор Мая-Грюнвальда (раствор эозина и метиленового синего в метаноле) и осуществляли инкубацию в течение 5 минут. При такой обработке фиксация совмещалась с первым этапом окрашивания. После этого биочип ополаскивали дистиллированной водой, в кювету наливали разбавленный раствор азура II и эозина и инкубировали в течение 30 минут. Затем раствор красителей сливали, а биочип вновь ополаскивали водой.
Приготовление из биочипа долговременного препарата осуществлялось так же, как описано в примере 1.
Так же, как в примере 1, осуществлялось получение изображения пятен биочипа, определение плотности связывания клеток и оценка процентного содержания клеток (всех типов), имеющих каждый из определяемых антигенов. Полученные результаты приводятся на фиг.3.
Проводилось морфологическое исследование связавшихся клеток. Структура клеток хорошо сохранялась (фиг.4). Признаков деформации, фрагментации ядер и разрушения клеток не отмечалось. При окраске по Паппенгейму хорошо определялись все морфологические признаки клеток. Значительная часть связавшихся с биочипом клеток была представлена лимфоцитами округлой формы, с округлым или бобовидным ядром с разреженным хроматином, бледной цитоплазмой, имеющей тонкие выросты, напоминающие ворсинки, что характерно для клеток волосатоклеточного лейкоза.
Перевод фрагмента статьи - описания аналога.
Реактивность CD антигенов, определенная с помощью проточной цитофлюориметрии, была проверена связыванием клеток с теми же самыми антителами, иммобилизованными на пластиковом биочипе. Этот биочип был создан путем нанесения пятен индивидуальных антител на поверхность полистироловой чашки Петри Falcon - 1034 (65 х 15 мм) с шагом 10 мм. На 1 чашке могло быть нанесено 16 пятен антител. Каждое пятно увлажнялось 1 мкл PBS перед нанесением 0,1 мкг антител в 0,1% BSA- PBS [растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA) в фосфатном буфере (PBS)]. Антитела связывались с пластиковой поверхностью в течение 1 часа. Затем биочип ополаскивали 0,1% BSA - PBS. Далее инкубировали 1 час в 1% BSA-PBS. Клетки были ресуспензированы в малых аликвотах (менее 5 мкл) в 0,1% BSA - PBS. Связывание клеток [на такой поверхности] было удобным для световой микроскопии и фотографирования. Этот метод также использовался для определения фусина, интегрина β7, антигенов CD47, CD62L, CD62E, CD72, CD93, CD99R, CD114, CD121a, CDwl25 и CDwl31.