КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ЧЕЛОВЕКА 190 BICan KAG
HUMAN BLADDER CANCER CELL LINE 190 BICAN KAG

Изобретение относится к области биотехнологии. Полученная новая клеточная линия рака мочевого пузыря человека 190 BlCan KAG обладает стабильными морфологическими и культуральными характеристиками. Данная клеточная линия может использоваться в активной специфической иммунотерапии солидных опухолей для создания биомедицинских клеточных продуктов, пригодна для лабораторных исследований с целью разработки диагностических наборов и тест-систем для определения активности фармацевтических препаратов. Клеточная линия депонирована в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 793Д.
В Российской Федерации рак мочевого пузыря (РМП) занимает лидирующие позиции в структуре заболеваемости онкологическими заболеваниями в 2019 г.: среди мужского населения встречаемость РМП составила 4,6% [Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, А.О. Шахзадовой. Злокачественные новообразования в России в 2019 году (заболеваемость и смертность) - М: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, - 2020. - ил. - 252 с. ISBN 978-5-85502-260-5]. Абсолютное число впервые в жизни установленных диагнозов РМП в России возросло с 2009 по 2019 гг. с 10432 до 13314 случаев на 100000 населения, и среднегодовой темп прироста заболеваемости РМП составил 2,63%. В этих условиях разработка новых подходов к лечению РМП становится все более актуальной.
Около четверти пациентов с диагнозом РМП имеют мышечно-инвазивную форму, которая распространяется в мышечную часть стенки мочевого пузыря (Т2-Т4). Этот тип рака имеет более высокую вероятность метастазирования и нуждается в более радикальной форме лечения [Patel V.G., Oh W.K., Galsky M.D.Treatment of muscle-invasive and advanced bladder cancer in 2020. CA Cancer J Clin. 2020 Sep; 70 (5): 404-423. doi: 10.3322/caac.21631]. Тем не менее, несмотря на значительные достижения в области лечения других видов злокачественных новообразований, системная терапия РМП оставалась практически неизменной на протяжении более 30 лет. До 2016 г. единственной возможностью была цитотоксическая химиотерапия со значительной токсичностью. При метастатической болезни комбинированная химиотерапия первой линии на основе цисплатина остается стандартом лечения [Jiang D.M., Sridhar S.S. Prime time for immunotherapy in advanced urothelial cancer. Asia Рас J Clin Oncol. 2018 Nov; 14 Suppl 5: 24-32. doi: 10.1111/ajco.13059]. Для пациентов, не отвечающих критериям назначения цисплатина, часто применяют менее эффективные схемы на основе карбоплатина. Для лечения резистентных к платине больных наиболее часто используют таксаны и винфлунин. В последнее время возможности лечения значительно расширились с появлением ингибиторов иммунных контрольных точек [Tripathi A., Plimack E.R. Immunotherapy for Urothelial Carcinoma: Current Evidence and Future Directions. Curr Urol Rep. 2018 Nov 7; 19 (12):109. doi: 10.1007/s11934-018-0851-7]. Постепенно апробируются и вводятся в клиническую практику новые методы лечения: фотодинамическая терапия, генная терапия и таргетная лекарственная терапия [Thompson D.B., Siref L.E., Feloney М.Р., Hauke R.J., Agrawal D.K. Immunological basis in the pathogenesis and treatment of bladder cancer. Expert Rev Clin Immunol. 2015 Feb; 11 (2): 265-79. doi: 10.1586/1744666Х.2015.983082]. Разрабатываются генномодифицированные вакцины на основе опухолевых клеток, модифицированных генами цитокинов, таких как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор GM-CSF, интерлейкины IL-2, IL-1α и 1β, интерферон IFN-γ. Проводят исследования вакцин на основе опухолеинфильтрирующих лимфоцитов TIL, активированных дендритных клеток [Zichi С., Tucci М., Leone G., Buttigliero С., Vignani F., Pignataro D., Scagliotti G.V., Di Maio M. Immunotherapy for Patients with Advanced Urothelial Cancer: Current Evidence and Future Perspectives. Biomed Res Int. 2017; 2017: 5618174. doi: 10.1155/2017/5618174]. Все эти технологии базируются на поиске эффективных клеточных мишеней, которыми могут быть опухолеассоциированные антигены, такие как рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (HER2), β-цепь хорионического гонадотропина, раково-тестикулярные антигены (MAGEA, NY-ESO-1). В этом контексте получение клеточных линий РМП и их характеристика является важным этапом создания клеточных моделей для создания и предклинических испытаний новых методов лечения. Для дальнейшего развития и надлежащего применения терапевтических стратегий необходимо изучение новых молекулярных подтипов и получение соответствующих новых клеточных линий РМП, которые являются полезными инструментами для изучения биологии этой опухоли [Soria F., Krabbe L.M.,  Т., Dobruch J., Mitra A.P., Inman B.A., Gust K.M., Lotan Y., Shariat S.F. Molecular markers in bladder cancer // World J Urol. - 2019. - Vol. 37 (1): 31-40. doi: 10.1007/s00345-018-2503-4].
Техническим результатом изобретения является расширение арсенала клеточных линий опухолей человека, которые возможно использовать для создания клеточных модельных систем, позволяющих проводить доклинические исследования на идентичном биологическом материале, и новых противоопухолевых биомедицинских клеточных продуктов, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований. Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств.
Указанный технический результат достигается тем, что получена новая клеточная линия рака мочевого пузыря человека 190 BlCan KAG, используемая для приготовления биомедицинских клеточных продуктов, создания экспериментальных моделей и тестирования противоопухолевых препаратов, экспрессирующая раково-тестикулярные антигены NY-ESO1, MAGEA1, PASD1, FRAME, депонированная в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 793Д.
Полученная клеточная линия 190 BlCan KAG обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками.
Родословная клеточной линии 190 BlCan KAG представлена следующим образом. Культура клеток рака мочевого пузыря 190 BlCan KAG выделена из рецидива опухоли - мышечно-инвазивного низкодифференцированного рака мочевого пузыря high grade больного К., 54 г., полученного в результате радикальной цистэктомии, осуществленной в специализированном онкологическом медицинском учреждении.
2
Получение клеточной линии 190 BlCan KAG было осуществлено следующим образом. Опухолевая ткань получена хирургическим путем. Измельченные стерильным скальпелем образцы опухоли (1-3 мм) подвергали механической дезагрегации в автоматическом режиме, помещая их на стерильные ножи, в течение 30 с - 1 мин. Полученную суспензию клеток пропускали последовательно через стерильные нейлоновые фильтры 100 мкм, 70 мкм, 50 мкм, суспендировали в полной среде и переносили в культуральную посуду, в которой осуществляли культивирование в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 25 пассаже.
Морфологические признаки клеточной линии 190 BlCan KAG характеризуются следующим образом. Культура представлена клетками преимущественно полигональной или фибробластоподобной формы с округлыми светлыми ядрами, содержащими до трех ядрышек. Встречаются одноядерные и многоядерные гигантские клетки. Культура образует ровный монослой с множеством митозов.
Маркерные признаки клеточной линии 190 BlCan KAG следующие. Методом ПЦР выявлена гиперэксперссия раково-тестикулярных генов NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, PRAME.
Культуральные свойства клеточной линии 190 BlCan KAG представлены следующим образом.
2
2
6
Клеточную линию культивируют в питательной среде DMEM/F12 (80%) с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотиков (пенициллин со стрептомицином в концентрации: 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно); 37°С, 5% СО, 100% влажность. Культура имеет адгезионный монослойный тип роста. Для лучшего прикрепления клеток к субстрату рекомендуется использовать 2% раствор желатина, которым предварительно покрыть культуральную посуду. Во флаконы объемом 25 см в 5 мл среды засевают 1,5×10 клеток. Пересев 1 раз в неделю в соотношении 1:1 с использованием равных объемов 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена.
6
2
Условия криоконсервации следующие. Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Криосреда: DMEM/F12 50%, эмбриональная телячья сыворотка 40%, DMSO 10%; 3×10 клеток/мл на ампулу. Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до -25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре -196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трепанового синего. Жизнеспособность клеток после криоконсервации 90%.
Контаминация исследована следующим образом.
При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Методом ПЦР были проведены исследования на наличие Mycoplasma pneumonia, genitalium, hominis - тест на микоплазму отрицателен.
Кариологическая характеристика клеточной линии 190 BlCan KAG следующая. Модальный кариотип:
52, X, -Y, t(1; 1)(q; q), del(1)(q21), +del(1)(q23), +del(1)(q12), del(1)(p22)+2, +t(2; 5), +del(3)(p), (4)(p+), der(4), +5, del(6)(q21), t(7; 15), +i(7p), t(10; 12), t(10; 12), -11, 11(p-), t(12; 13), -13, -13, 15p+, +16, +mar(16), -18, (21)(q+), -22, +mar.
Использование клеточной линии 190 BlCan KAG представлено следующими примерами.
Пример 1. Использование клеточной линии 190 BlICan KAG для приготовления противоопухолевых вакцин на основе активированных дендритных клеток
1. Клеточную линию 190 BlCan KAG культивировали как описано выше. При достижении конфлюэнтного монослоя производили пересев клеток и дальнейшее пассирование культуры с рассевом 1:1.
3. Из флакона удаляли культуральную среду, омывали поверхность флакона небольшим количеством ферментативного раствора (0,25% трипсина и 0,02% раствора версена в равных пропорциях) и затем к клеткам добавляли 1-3 мл этого раствора. Помещали флаконы в CO2-инкубатор и проводили визуальный контроль состояния клеток.
4. Клетки собирали серологической пипеткой, отмывали двукратным центрифугированием в 10 мл 0,9% раствора хлорида натрия при 1000 об/мин в течение 10 мин.
5. Производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.
6. Для приготовления опухолевого лизата клеток линии 190 BlCan KAG проводили 6 последовательных циклов моментального замораживания до -196°С и оттаивания до комнатной температуры в фосфатно-солевом буфере без криопротектора, качество лизиса контролировали с помощью 0,1% трепанового синего и светового микроскопа.
7. Осуществляли осаждение клеточного детрита центрифугированием (10 мин, 3000 об/мин), фильтрацию надосадочной фракции через фильтр 0,2 мкм и расфасовку опухолевого лизата в криопробирки для хранения при -20°С до использования.
-
+
-
2
2
8. Вносили лизат с клеточной линией 190 BlCan KAG в культуры незрелых дендритных клеток пациентов (CD14CD1aCD83) на 5-й день культивирования в соотношении 3 лизированные опухолевые клетки: 1 ДК, добавляли ростовые факторы: гранулоцитарно-макрофагальный фактор роста (72 нг/мл), интерлейкин 4 (20 нг/мл) и фактор некроза опухолей альфа (20 нг/мл). Инкубировали в условиях 37°С, 5% СО, 100% влажности в СО-инкубаторе «Heracel» (TermoElectron LTD GmbH, Германия) в течение 48 часов.
9. В результате получали активированные ДК с иммунофенотипом
-
-
+
+
+
+
+
+
CD14/CD1a/CD83/CD80/CD86/HLADR/CD209/CCR7.
Пример 2. Использование клеточной линии 190 BlCan KAG для создания трехмерных клеточных моделей солидной опухоли с целью оценки эффективности химиотерапевтических агентов при индивидуализации терапии
1. Клеточную линию 190 BlCan KAG культивировали как описано выше. При достижении конфлюэнтного монослоя клетки снимали с субстрата с помощью равновесной смеси 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена.
2. Клетки отмывали дважды в полной культуральной среде, производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.
2
2
3. Для получения гомосфероидов, содержащих клетки линии 190 BlCan KAG, использовали технологию низкоадгезивных поверхностей с применением 96-луночных планшет Ultra-Low Attachment Surface (Corning, США). Малигнизированные клетки в концентрации 20 тыс. кл./лунка высевали в лунки планшета, содержащих 200 мкл полной питательной среды DMEM/F12 с 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота. Сфероиды культивировали 7 суток в СО-инкубаторе «Heracel» (Thermo Electron LTD GmbH, Германия) при 37°С, во влажной атмосфере с 5% уровнем СО. По окончании культивирования изъятые из капель сфероиды отмывали в растворе фосфатно-солевого буфера с рН 7.4 и использовали для последующих манипуляций.
4. Сфероиды помещали в матригель (Corning, США) в объеме 50 мкл, находящегося в лунках 48-луночного планшета, куда затем добавляли по 700 мкл полной питательной среды DMEM/F12, содержащей цисплатин в концентрации, соответствующей 10% от пика концентрации препарата в плазме крови больного.
5. Планшет помещали в автоматизированную аналитическую систему Cell-IQ (CM Technologies, Финляндия) на 96 ч и осуществляли контроль за распространением сфероида в матригеле.
2
3
6. Проводили сравнительный анализ изменения занимаемой сфероидом площади на основе изображений фазового контраста в контрольных и опытных образцах. В качестве оценочного параметра использовали инвазивный потенциал (ИП), соответствующий скорости изменения площади сфероида, мкм/ч*10.
2
3
2
3
7. Получили результат о незначительной чувствительности клеток линии РМП 190 BlCan KAG: ИП контрольного образца составил 7,54 мкм/ч*10 по сравнению с ИП под влиянием цисплатина 6,06 мкм/ч*10.
Клеточная линия РМП человека 190 BlCan KAG расширяет арсенал клеточных линий опухолей человека, которые возможно использовать для создания клеточных модельных систем, позволяющих проводить доклинические исследования на идентичном биологическом материале, и новых противоопухолевых биомедицинских клеточных продуктов, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований. Полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств.