Штамм дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий ксиланазу из Paenibacillus brasilensis
PICHIA PASTORIS YEAST STRAIN PRODUCING XYLANASE FROM PAENIBACILLUS BRASILENSIS

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения трансформантов дрожжей Pichia pastoris, способных продуцировать ксиланазу.
Ксилан является основным структурным полисахаридом растительных клеткок и вторым после целлюлозы наиболее распространенным полисахаридом в природе [Biotech. Genet. Eng. Rev. 1995, 13, 100-131]. Это комплексный полисахарид, основная цепь которого состоит из β-(1-4) связанного ксилозного скелета с небольшим количеством β-(1-3) ответвлений [Macromol Rapid Commun., 2000, 21(9), 542-556. doi: 10.1002/1521-3927(20000601)21:9<542::AID-MARC542>3.0.СО;2-7].
Полная деградация ксилана требует комплекса ксиланолитических ферментов, включающих эндо-ксиланазу, ксилозидазу, глюкуронидазу, ацетилэстеразу и арабинофуранозидазу [Crit Rev Biotechnol., 2002, 22, 33-64, doi: 10.1080/07388550290789450].
Основную роль в разрушении ксилана играет эндо-ксиланаза (эндо-1,4-β-ксиланаза, ЕС 3.2.1.8), которая катализирует случайный гидролиз ксилана до ксилололигосахаридов.
Эндо-1,4-β-ксиланазу широко используют в различных отраслях промышленности. При кормопроизводстве введение ксиланаз уменьшает содержание некрахмальных полисахаридов, тем самым снижая вязкость корма в кишечнике животных и улучшая усвояемость и питательную ценность плохо разлагаемых кормов. [J. Anim. Sci., 2002, 80, 2773-2779; Br. Poult. Sci., 2003, 44, 60-66; Br. Poult. Sci., 2003, 44, 291-298]
Природными источниками ксиланаз являются различные микроорганизмы: бактерии, грибы, дрожжи и актиномицеты [FEMS Microbiology Reviews, 2005, 29 (1), 3-23].
Традиционно ферментные препараты, в состав которых входят ксиланазы, получают на основе нерекомбинантных или рекомбинантных штаммов грибов рода Trichoderma, Aspergillus или Penicillium. Однако грибные штаммы, помимо ксиланазы, продуцируют ряд других ферментов, относящихся к карбогидразам, а именно: целлюлазу, глюканазу, пектиназу и маннаназу, что не позволяет использовать их при производстве моноферментных препаратов.
Наиболее перспективным является создание продуцентов ферментов на основе рекомбинантных штаммов метилотрофных дрожжей Pichia pastoris. При использовании несбраживаемых источников углерода (глицерина, метанола и т.п.) дрожжи Pichia pastoris способны к росту с образованием биомассы высокой плотности, что позволяет получать значительные количества гетерологичного белка [Appl. Microbiol. Biotechnol, 2000, 54(6), 741-750]. При этом процесс культивирования метилотрофных дрожжей достаточно прост, поскольку их рост не блокируется продуктами метаболизма [FEMS Microbiol. Rev., 2000, 24: 45-66, doi: 10.1111/j.1574-6976.2000.tb00532.x].
Известны примеры создания продуцентов ксиланазы на основе дрожжей Pichia pastoris.
Показано [Protein Expression and Purification 57 (2008), 101-107], что ген reBlxA из Bacillus licheniformis, кодирующий ксиланазу А, эффективно экспрессируется в клетках дрожжей Pichia pastoris, при этом активность рекомбинантной ксиланазы в культуральной жидкости составляет 122.9 U/mg.
Известны также рекомбинантные штаммы Pichia pastoris, продуцирующие ксиланазу из Streptomyces sp. FA1 [CN 107142225 А] и ксиланазу из Neocallimastix frontalis [CN 104130951 A].
Показано [Биотехнология, 2018, 34 (6), 22-32], что эндо-1,4-β-ксиланаза из Paenibacillus brasilensis обладает промышленно ценными свойствами. На основе Р pastoris получены штаммы, секретирующие ксиланазу из Paenibacillus brasilensis, продуктивность которых при культивировании в пробирках составляет 1114 и 1728 ед/мл культуральной жидкости [RU 2701308, RU 2701642].
Однако, остается потребность в расширении арсенала штаммов P. pastoris с повышенной продукцией эндо-1,4-β-ксиланазы из Paenibacillus brasilensis.
Одним из подходов, позволяющих повысить продукцию целевых белков в Р. pastoris, является коэкспрессия генов-помощников, входящих в систему ответа клетки на несвернутый белок (UPR - unfolded protein response) [Экологическая генетика, 2017, 15(2), 21-30]. В качестве таких генов используют, в частности, ген, кодирующий протеиндисульфидизомеразу (Pdi), которая выступает в качестве шаперона, ингибируя агрегацию неправильно свернутых белков; ген НАС1, кодирующий активатор транскрипции генов UPR и другие. Так, в работе [Journal of proteomics, 91 (2013) 58-72] в состав хромосомы рекомбинантного штамма Р. pastoris, продуцирующего ксиланазу из Bacillus halodurans, был интегрирован ген НАС1 из P. pastoris, что привело к увеличению продуктивности на 38% по сравнению с исходным штаммом.
Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих эндо-1,4-β-ксиланазу.
Задача решена путем конструирования штамма дрожжей Pichia pastoris, продуцирующего эндо-1,4-β-ксиланазу, содержащего в составе хромосомы ген xyl, кодирующий эндо-1,4-β-ксиланазу из Paenibacillus brasilensis, и дополнительные копии гена НАС1 из Pichia pastoris.
Рекомбинантный штамм получен:
- интеграцией в состав хромосомы штамма Pichia pastoris ВКПМ Y-4392 экспрессионной кассеты 1, содержащей ген xyl из Paenibacillus brasilensis;
- выщеплением маркерного гена с использованием Cre-lox системы;
- интеграцией экспрессионной кассеты 2, содержащей ген НАС1 из Pichia pastoris.
Штамм является продуцентом эндо-1,4-β-ксиланазы и депонирован в Биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика как Pichia pastoris Х2 ВКПМ Y-4607.
Культурально-морфологические характеристики заявляемого штамма:
При культивировании при температуре 28°С в течение 48 часов на агаризованной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %) клетки имеют овальную форму, 3-4 мкм в диаметре. Клетки почкуются, при этом почкование истинное, многостороннее. Истинного мицелия не образуют.
Споруляция происходит при инкубации культуры на агаризованной среде следующего состава (мас. %): хлорид калия - 1.0, ацетат натрия - 0.5, глюкоза - 1.0, агар - 2.0, вода - остальное. Аски имеют тетраэдрическую форму, включают 4 аскоспора.
На агаризованной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) колонии светло-бежевого цвета с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и пастообразной консистенцией.
При росте в жидкой среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода -остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %), при 28°С в течение 24 ч культивирования - жидкость мутная, осадок белый, коагуляции не наблюдается, пристеночных пленок не образует.
Физиолого-биохимические признаки:
Штамм способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях.
В качестве единственного источника углерода способен использовать метанол, этанол, глюкозу, глицерин, лактат, сукцинат, не способен ассимилировать мальтозу, сахарозу, ацетат, крахмал, лактозу.
При культивировании в присутствии метанола штамм способен синтезировать ксиланазу.
Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами.
Фиг. 1 Экспрессионная кассета 1
Фиг. 2 Экспрессионная кассета 2.
Фиг. 3 Фингерпринт штамма Pichia pastoris ВКПМ Х2 Y-4607
Пример 1. Конструирование заявляемого штамма.
При конструировании интегративной кассеты для экспрессии гена xyl используют метод "фьюжн-пцр" [Gene., 1989, 15, 77(1), 61-68.]. В качестве источника гена xyl используют тотальную геномную ДНК Paenibacillus brasilensis X1 ВКПМ В-13092 [Биотехнология, 2018, 34 (6), 22-32]. Синтезируют ДНК гена xyl методом ПЦР с использованием праймеров XylP-f и XylP-r
XylP-f5'-gcgacagactactggcaaaat-3',
XylP-r5'-ttaccacaccgttacgttaga-3'.
Полученную последовательность ДНК встраивают в состав экспрессионной кассеты 1 (фиг. 1), в состав которой входят следующие генетические элементы:
1. Ген xyl Paenibacillus brasilensis, встроенный в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида α-фактора, под контролем АОХ1 промотора;
2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1;
3. Дрожжевой селективный маркер kan (kanMX), фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, под контролем дрожжевого TEF промотора и обуславливающий у дрожжей Pichia pastoris устойчивость к антибиотику генетицину (G418);
4. Область интеграции - нуклеотидная последовательность гена АОХ2.
Указанную интегративную экспрессионную кассету трансформируют в штамм Pichia pastoris ВКПМ Y-4392, полученный на основе штамма Pichia pastoris DSMZ 70877 интеграцией в хромосому кассеты Pcup-cre, состоящей из гена cre, кодирующего рекомбиназу бактериофага Р1 под контролем Pcup промотора из Saccharomyces cerevisiae.
8
9
Штамм Pichia pastoris ВКПМ Y-4392 предварительно выращивают в жидкой питательной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) до концентрации 1×10 клеток на 1 мл. Клетки центрифугируют, промывают в ледяной стерильной воде, а затем в ледяном растворе 1 М сорбитола. Затем клетки инкубируют в 25 мМ растворе дитиотрейтола в течение 15 минут и промывают в ледяном растворе 1 М сорбитола. Обработанные таким образом клетки ресуспендируют в ледяном растворе 1 М сорбитола в концентрации 1-5×10 клеток на 1 мл. Аликвоту, объемом 40 мкл клеточной суспензии, переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 400 нг ДНК экспрессионной интеграционной кассеты, и инкубируют во льду 5 минут. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при следующих условиях: 1,5 кВ, 400 Ом, 25 uF. После порации добавляют 1 мл ледяного раствора 1 М сорбитола.
Селекцию ведут на агаризованной среде среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) в течение 5 суток при температуре 30°С. В качестве селективного агента добавляют антибиотик G418 в количестве 500 мкг/мл.
Для отбора наиболее продуктивных трансформантов проводят их культивирование в жидкой ферментационной питательной среде YP с добавлением метанола (3 мас. %) в 96-луночных планшетах при 30°С в течение 72 ч на качалке (250 об/мин). В качестве контроля используют штамм Pichia pastoris ВКПМ Y-4392.
Определение активности ксиланазы в культуральной жидкости проводят с использованием ДНС метода [Anal. Chem., 1959, 31 (3), 426-428] в 96-луночном планшете следующим образом: в каждой лунке смешивают 25 мкл 1% раствора субстрата ксилана березы в 0,5 М ацетатном буфере (рН 6) и 25 мкл культуральной жидкости. Инкубацию проводят при 50°С 10 минут, после чего добавляют в лунку 50 мкл раствора ДНС. Планшет прогревают при 99°С 10 минут и измеряют оптическую плотность окрашенного раствора при длине волны 546 нм. В качестве стандарта используют раствор глюкозы.
По результатам ферментации отбирают наиболее продуктивный трансформант X1, который при культивировании в планшете синтезирует ксиланазу в количестве 445 ед/мл культуральной жидкости.
8
Для выщепления маркерного гена kanMX из экспрессионной кассеты, интегрированной в хромосому трансформанта X1, проводят индукцию гена cre, кодирующего рекомбиназу бактериофага Р1, встроенного в хромосому штамма Pichia pastoris ВКПМ Y-4392 (Mut+, INS Pcup-cre) и находящегося под контролем промотора Pcup. Индукция происходит в присутствии ионов меди. Для этого клетки трансформанта X1 выращивают в жидкой питательной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) до концентрации 1×10 клеток на 1 мл, после чего добавляют раствор сульфата меди до концентрации 0,3 М, инкубируют в течение 3 часов, после чего клетки высевают на агаризованную питательную среду YP с добавлением глюкозы (2 мас. %). Отбирают колонии, не способные к росту в присутствии антибиотика G418.
Таким образом отобран трансформант X1 с выщепленным маркерным геном kanMX, способный к синтезу фермента эндо-1,4-β-ксиланазы Paenibacillus brasilensis.
При конструировании интегративной кассеты для экспрессии гена НАС1 используют метод "фьюжн-пцр" [Gene., 1989, 15, 77(1), 61-68.]. В качестве источника гена НАС1 используют тотальную геномную ДНК Pichia pastoris ВКПМ Y-4392. Синтезируют ДНК гена НАС1 методом ПЦР с использованием праймеров HAC1-f и HAC1-r.
НАС1-f5'-atgcccgtagattcttctca-3',
HAC1-r5'-ctattcctggaagaatacaaagt-3'
Полученную последовательность ДНК встраивают в состав экспрессионной кассеты 1 (фиг. 2), в состав которой входят следующие генетические элементы:
1. Ген HAC1_Pichia pastoris под контролем GAP промотора;
2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1;
3. Дрожжевой селективный маркер kan (kanMX), фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, под контролем дрожжевого TEF промотора и обуславливающий у дрожжей Pichia pastoris устойчивость к антибиотику генетицину (G418);
Указанную экспрессионную кассету интегрируют в состав хромосомы трансформанта X1. Трансформацию экспрессионной кассеты, отбор наиболее активного трансформанта и выщепление маркерного гена проводят как описано выше.
Результаты ПЦР-фингерпринта [Applied and Environmental Microbiology, Oct, 1999, 4351-4356] штамма Pichia pastoris X2 ВКПМ Y-4607 представлены на фиг 3.
Фингерпринт проведен путем полимеразной цепной реакции (PCR) с использованием неспецифических праймеров М13 (линия 2 фиг. 3) и 1254 (линия 3 фиг. 3).
Праймер М13 gagggtggcggttct
режим реакции:
1 цикл
95°С - 3 мин.
39 циклов
95°С - 30 сек.
45°С - 30 сек.
72°С - 2 мин.
1 цикл
72°С - 5 мин
Праймер 1254 ccgcagccaa
режим реакции:
1 цикл
95°С - 3 мин.
39 циклов
95°С - 30 сек.
48°С - 30 сек.
72°С- 1 мин.
1 цикл
72°С - 5 мин
Для контроля величины фрагментов ДНК при электрофорезе использован молекулярный маркер 1kb DNA GeneRuler (Fermentas) (линия 1, фиг. 3 размер фрагментов снизу вверх 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 п.н.).
Таким образом отобран трансформант, в состав хромосомы которого интегрированы кассеты для совместной экспрессии гена xyl и дополнительных копий гена НАС1 из P. pastoris, способный к синтезу фермента эндо-1,4-β-ксиланазы Paenibacillus brasilensis в количестве 618 ед/мл КЖ при культивировании в планшете.
Полученный трансформант является продуцентом эндо-1,4-β-ксиланазы и депонирован в Биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика как Pichia pastoris Х2 ВКПМ Y-4607.
Пример 2. Получение ксиланазы с использованием штамма Pichia pastoris Х2 ВКПМ Y-4607.
Посевную культуру выращивают в пробирках (50 мл) с 10 мл жидкой питательной среды YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 30°С в течение 24 ч на качалке с 250 об/мин. Посев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/10.
Ферментацию проводят при 30°С на качалке (250 об/мин) в питательной среде состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, вода - остальное с добавлением глюкозы (1 мас. %) в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 5 мл. Через 18 часов добавляют метанол (1 мас. %) Ферментацию продолжают в течение 72 часов, добавляя метанол (1 мас. %) через каждые 24 часа. После окончания ферментации определяют количество фермента ксиланазы в культуральной жидкости с использованием ДНС метода [Anal. Chem., 1959, 31 (3), 426-428].
Через 72 часа ферментации количество фермента составило 2219 ед/мл культуральной жидкости.