СЧИТЫВАЮЩИЕ СИСТЕМЫ

1. Считывающая система, содержащая:
- pH-датчик, включающий в себя:
- два электрода; и
- проводящий канал, функционально соединенный с двумя электродами; и
- комплекс, присоединенный к проводящему каналу pH-датчика, причем комплекс включает в себя полимеразу, связанную, по меньшей мере, с одним изменяющим pH компонентом, который должен участвовать в формировании изменения pH поблизости от проводящего канала за счет потребления вторичного субстрата в текучей среде, которая выявляется pH-датчиком, причем, по меньшей мере, один изменяющий pH компонент выбран из группы, состоящей из фермента, координационного комплекса металла, кофактора и активатора.
2. Считывающая система по п. 1, в которой, по меньшей мере, один изменяющий pH компонент представляет собой фермент, при этом фермент генерирует кислоту или основание в реакции с вторичным субстратом.
3. Считывающая система по п. 2, в которой фермент выбран из группы, состоящей из гидролаз и оксидаз.
4. Считывающая система по п. 1, в которой кинетика, по меньшей мере, одного изменяющиего pH компонента , по меньшей мере, в 10 раз быстрее кинетики полимеразы.
5. Считывающая система по п. 1, в которой, по меньшей мере, один изменяющий pH компонент представляет собой фермент, и при этом комплекс дополнительно содержит конъюгат нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента, присоединенный к ферменту.
6. Считывающая система по п. 1, в которой, по меньшей мере, один изменяющий pH компонент представляет собой фермент; и комплекс дополнительно включает в себя второй фермент, присоединенный к полимеразе.
7. Считывающая система по п. 1, в которой комплекс представляет собой слитый белок или химеру белка.
8. Считывающая система по п. 1, в которой проводящий канал pH-датчика выбран из группы, состоящей из полупроводящей наноструктуры, графеновой наноструктуры, металлической наноструктуры и проводящей полимерной наноструктуры.
9. Считывающая система по п. 1, дополнительно содержащая:
- подложку, включающую в себя множество углублений, отделенных посредством промежуточных областей, при этом, по меньшей мере, проводящий канал pH-датчика находится внизу одного из множества углублений; и
- множество дополнительных pH-датчиков, при этом, по меньшей мере, проводящий канал каждого из множества дополнительных pH-датчиков находится внизу соответствующего одного из множества углублений.
10. Считывающая система по п. 9, в которой каждое из множества углублений включает в себя боковые стенки, при этом боковые стенки включают в себя pH-буферный материал.
11. Комплект, содержащий:
- pH-датчик, включающий в себя:
- два электрода; и
- проводящий канал, функционально соединенный с двумя электродами; и
- текучую среду, включающую в себя:
- жидкость-носитель; и
- комплекс в жидкости-носителе, причем комплекс включает в себя полимеразу, связанную, по меньшей мере, с одним ферментом, который должен создавать изменение pH поблизости от проводящего канала за счет потребления вторичного субстрата во второй текучей среде, которая выявляется pH-датчиком.
12. Комплект по п. 11, дополнительно содержащий вторую текучую среду, включающую в себя:
- вторую жидкость-носитель; и
- меченый нуклеотид, включающий в себя:
- нуклеотид;
- молекулу-линкер, присоединенную к терминальной фосфатной группе нуклеотида; и
- метку, присоединенную к молекуле-линкеру, причем метка выбирается из группы, состоящей из первой группы, которая улучшает кинетику фермента, и второй группы, которая замедляет кинетику фермента.
13. Комплект по п. 12, в котором:
- вторичный субстрат находится во второй текучей среде и представляет собой отдельную молекулу относительно меченого нуклеотида; и
- первая группа или вторая группа должны изменять кинетику реакции образования кислоты или основания, в которой участвуют фермент и вторичный субстрат.
14. Комплект по п. 12, в котором:
- вторичный субстрат находится во второй текучей среде и представляет собой отдельную молекулу относительно меченого нуклеотида;
- метка представляет собой вторую группу, которая замедляет кинетику фермента; и
- вторая группа выбрана из группы, состоящей из аллостерического ингибитора, группы стерической эксклюзии и буферизующей группы.
15. Комплект по п. 12, в котором:
- вторичный субстрат находится во второй текучей среде и представляет собой отдельную молекулу относительно меченого нуклеотида;
- метка представляет собой первую группу, которая улучшает кинетику фермента; и
- первая группа представляет собой кофактор фермента.
16. Комплект по п. 11, дополнительно содержащий вторую текучую среду, включающую в себя:
- вторую жидкость-носитель; и
- меченый нуклеотид, включающий в себя:
- нуклеотид; и
- вторичный субстрат, присоединенный к основанию или сахару нуклеотида, при этом кинетика вторичного субстрата, по меньшей мере, в 10 раз быстрее кинетики полимеразы.
17. Комплект, содержащий:
- pH-датчик, включающий в себя:
- два электрода; и
- проводящий канал, функционально соединенный с двумя электродами; и
- текучую среду, включающую в себя:
- жидкость-носитель; и
- комплекс в жидкости-носителе, причем комплекс включает в себя полимеразу, связанную с координационным комплексом металла, который должен создавать изменение pH поблизости от проводящего канала за счет потребления вторичного субстрата во второй текучей среде, которая выявляется pH-датчиком.
18. Комплект по п. 17, дополнительно содержащий вторую текучую среду, включающую в себя:
- вторую жидкость-носитель;
- вторичный субстрат, при этом вторичный субстрат должен генерировать кислоту или основание посредством реакции с координационным комплексом металла; и
- меченый нуклеотид, включающий в себя:
- нуклеотид;
- молекулу-линкер, присоединенную к терминальной фосфатной группе нуклеотида; и
- метку, присоединенную к молекуле-линкеру, причем метка представляет собой лиганд для металла координационного комплекса металла, при этом лиганд изменяет каталитическое свойство координационного комплекса металла.
19. Меченый нуклеотид, содержащий:
- нуклеотид;
- молекулу-линкер, присоединенную к терминальной фосфатной группе нуклеотида; и
- каталитическую метку, присоединенную к молекуле-линкеру, при этом каталитическая метка должна создавать изменение pH за счет потребления вторичного субстрата в текучей среде с меченым нуклеотидом.
20. Меченый нуклеотид по п. 19, в котором каталитическая метка выбрана из группы, состоящей из гидролаз и оксидаз.
21. Комплект, содержащий:
- меченый нуклеотид по п. 19; и
- считывающую систему, включающую в себя:
- два электрода;
- проводящий канал, функционально соединенный с двумя электродами; и
- комплекс, присоединенный к проводящему каналу, причем комплекс включает в себя полимеразу, конъюгированную с кофактором или активатором каталитической метки меченого нуклеотида.
22. Меченый нуклеотид, содержащий:
- нуклеотид, имеющий блокирующую группу 3'-OH;
- расщепляемую молекулу-линкер, присоединенную к основанию или сахару нуклеотида; и
- метку, присоединенную к расщепляемой молекуле-линкеру, при этом метка должна участвовать в реакции изменения pH, заключающей в себе вторичный субстрат.
23. Комплект, содержащий:
- меченый нуклеотид по п. 22;
- считывающую систему, включающую в себя:
- два электрода;
- проводящий канал, функционально соединенный с двумя электродами; и
- комплекс, присоединенный к проводящему каналу, причем комплекс включает в себя полимеразу, конъюгированную с кофактором или активатором каталитической метки меченого нуклеотида.
24. Способ, включающий в себя этап, на котором:
- вводят текучую среду в массив датчиков, включающий в себя множество отдельно адресуемых проводящих каналов, за счет этого присоединяя комплекс, по меньшей мере, к некоторым из множества отдельно адресуемых проводящих каналов, причем комплекс включает в себя:
- полимеразу; и
- изменяющий pH компонент, связанный с полимеразой, причем изменяющий pH компонент выбран из группы, состоящей из фермента, который должен катализировать потребление вторичного субстрата в растворе, который должен быть выявлен массивом датчиков, координационного комплекса металла, который должен катализировать потребление вторичного субстрата в растворе, который должен быть выявлен массивом датчиков, и кофактора или активатора каталитической метки, присоединенной к меченому нуклеотиду, который должен вводиться в массив датчиков.
25. Способ, включающий в себя этапы, на которых:
- вводят матричную полинуклеотидную цепь в датчик, имеющий полимеразу, привязанную к проводящему каналу;
- вводят в датчик текучую среду, включающую в себя вторичный субстрат и меченые нуклеотиды, за счет чего нуклеотид одного из меченых нуклеотидов связывается с полимеразой, и метка данного одного из меченых нуклеотидов участвует в реакции изменения pH, в которой участвует вторичный субстрат, который находится поблизости от проводящего канала; и
- детектируют ответ проводящего канала.
26. Способ по п. 25, в котором:
- полимераза датчика представляет собой часть комплекса с ферментным катализатором;
- метка представляет собой группу, которая улучшает или замедляет кинетику ферментного катализатора; и
- способ дополнительно включает этап, на котором детектируют изменение заряда по сравнению с базовым зарядом.
27. Способ по п. 25, в котором:
- полимераза датчика представляет собой часть комплекса с ферментным катализатором;
- метка представляет собой вторичный субстрат; и
- способ дополнительно включает этап, на котором детектируют изменение заряда по сравнению с базовым зарядом.
28. Способ по п. 25, в котором:
- полимераза датчика представляет собой часть комплекса с координационным комплексом металла;
- метка представляет собой лиганд для металла координационного комплекса металла; и
- способ дополнительно включает этап, на котором детектируют изменение заряда по сравнению с базовым зарядом.
29. Способ по п. 25, в котором:
- полимераза датчика представляет собой часть комплекса с ферментным катализатором;
- конъюгат нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента присоединяется к ферментному катализатору;
- метка представляет собой олигонуклеотидную последовательность, которая является комплементарной к части конъюгата нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента; и
- способ дополнительно включает этап, на котором детектируют изменение заряда по сравнению с базовым зарядом.
30. Способ по любому из пп. 26-29, дополнительно включающий этап, на котором идентифицируют нуклеотид, связанный с полимеразой, исходя из изменения заряда и/или скорости изменения заряда.
31. Способ по п. 25, в котором меченые нуклеотиды имеют разные индивидуальные скорости накопления, при этом способ дополнительно содержит этап, на котором идентифицируют связанный меченый нуклеотид посредством его индивидуальной скорости накопления.
32. Способ, включающий этапы, на которых:
- выбирают изменяющий pH компонент из группы, состоящей из фермента, который должен катализировать потребление вторичного субстрата в растворе, координационного комплекса металла, который должен катализировать потребление вторичного субстрата в растворе, и кофактора или активатора каталитической метки, присоединенной к меченому нуклеотиду;
- конъюгируют полимеразу с изменяющим pH компонентом с образованием комплекса; и
- присоединяют комплекс к проводящему каналу, функционально соединенному с двумя электродами.
33. Смесь для включения, содержащая:
- жидкость-носитель;
- комплекс, включающий в себя:
- полимеразу; и
- изменяющий pH компонент, связанный с полимеразой, причем изменяющий pH компонент выбран из группы, состоящей из фермента, который должен катализировать потребление вторичного субстрата, координационного комплекса металла, который должен катализировать потребление вторичного субстрата, и кофактора или активатора, который должен катализировать потребление вторичного субстрата; и
- меченый нуклеотид, включающий в себя:
- нуклеотид;
- молекулу-линкер, присоединенную к терминальной фосфатной группе нуклеотида; и
- метку, присоединенную к молекуле-линкеру, при этом метка должна участвовать в реакции изменения pH, в которой участвует вторичный субстрат.
34. Смесь для включения по п. 33, в которой:
- изменяющий pH компонент представляет собой фермент, и метка выбрана из группы, состоящей из первой группы, которая улучшает кинетику фермента, и второй группы, которая замедляет кинетику фермента;
- изменяющий pH компонент представляет собой координационный комплекс металла, и метка представляет собой лиганд для металла координационного комплекса металла, при этом лиганд изменяет каталитическое свойство координационного комплекса металла; или
- изменяющий pH компонент представляет собой кофактор или активатор, и метка представляет собой каталитическую метку, которая активируется посредством кофактора или активатора.
35. Смесь для включения по п. 33, в которой:
- изменяющий pH компонент представляет собой фермент;
- комплекс дополнительно включает в себя конъюгат нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента, присоединенный к ферменту; и
- метка представляет собой олигонуклеотидную последовательность, которая является комплементарной к части конъюгата нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента.
36. Комплект, содержащий:
- смесь для включения по п. 33; и
- смесь с вторичным субстратом, включающую в себя вторую жидкость-носитель и вторичный субстрат.
37. Комплект по п. 36, дополнительно содержащий:
- проточную кювету, включающую в себя:
- подложку, включающую в себя множество углублений, отделенных посредством промежуточных областей;
- проводящий канал внизу каждого из множества углублений; и
- по меньшей мере, один праймер, прикрепленный в каждом из углублений.
38. Смесь для включения, содержащая:
- жидкость-носитель, включающую в себя буфер;
- комплекс, включающий в себя:
- полимеразу; и
- изменяющий pH компонент, связанный с полимеразой, причем изменяющий pH компонент выбран из группы, состоящей из фермента, который должен катализировать потребление вторичного субстрата, координационного комплекса металла, который должен катализировать потребление вторичного субстрата, и кофактора или активатора, который должен катализировать потребление вторичного субстрата; и
- меченый нуклеотид, включающий в себя:
- нуклеотид, имеющий блокирующую группу 3'-OH;
- расщепляемую молекулу-линкер, присоединенную к основанию или сахару нуклеотида; и
- метку, присоединенную к молекуле-линкеру, при этом метка должна участвовать в реакции изменения pH, которой участвует вторичный субстрат.
39. Смесь для включения по п. 38, в которой:
- изменяющий pH компонент представляет собой фермент, и метка выбрана из группы, состоящей из первой группы, которая улучшает кинетику фермента, второй группы, которая замедляет кинетику фермента, и вторичного субстрата; или
- изменяющий pH компонент представляет собой координационный комплекс металла, и метка представляет собой лиганд для металла координационного комплекса металла, при этом лиганд изменяет каталитическое свойство координационного комплекса металла; или
- изменяющий pH компонент представляет собой кофактор или активатор, и метка представляет собой каталитическую метку, которая активируется посредством кофактора или активатора.
40. Смесь для включения по п. 38, в которой:
- изменяющий pH компонент представляет собой фермент;
- комплекс дополнительно включает в себя конъюгат нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента, присоединенный к ферменту; и
- метка представляет собой олигонуклеотидную последовательность, которая является комплементарной к части конъюгата нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента.
41. Комплект, содержащий:
- смесь для включения по п. 38; и
- смесь с вторичным субстратом, включающую в себя вторую жидкость-носитель и вторичный субстрат.
42. Комплект по п. 41, дополнительно содержащий:
- проточную кювету, включающую в себя:
- подложку, включающую в себя множество углублений, отделенных посредством промежуточных областей;
- проводящий канал внизу каждого из множества углублений; и
- праймер, прикрепляемый в каждом из углублений.
43. Комплект по п. 41, дополнительно содержащий раствор деблокирующего агента.