Рекомбинантный вакцинный препарат пролонгированного действия для профилактики чумы у млекопитающих и человека и способ его получения
RECOMBINANT VACCINE PREPARATION OF PROLONGED ACTION FOR PREVENTION OF PLAGUE IN MAMMALS AND HUMANS AND METHOD OF PREPARATION THEREOF

Изобретение относится к вакцинам молекулярного, субъединичного или «химического» типа, применяемым для профилактики гибели от заражения микроорганизмом Yersinia pestis, их составу и способу получения. Защита от бубонной и легочной чумы обеспечивается путем иммунизации индивидуума, подвергающегося угрозе заражения возбудителем чумы, введением известной дозы вакцинного препарата, описываемого в настоящей заявке.
Для профилактики инфекционных заболеваний незаменимым средством до сих пор остаются вакцины Широко используемые в Российской Федерации и за рубежом до настоящего времени вакцины применяют в качестве агента, индуцирующего протективный иммунитет, ослабленные или убитые клетки вакцинных штаммов Y. pestis например, EV76 или Cutter Такие вакцины обладают целым рядом недостатков. Одни из них, обеспечивая надежный уровень иммунной защиты, вызывают тяжелые побочные эффекты и действуют ограниченный срок, другие, кроме индукции побочных эффектов, действуют в различной степени на разных индивидов и не способны индуцировать иммунитет дольше, чем на несколько месяцев.
Авторы работ (E.D. Williamson et al., FEMS Immun. Med. Microbiol., 1995, v. 12, p. 223-230; J.E. Eyles et al., 1998, Vaccine, v. 16, No. 7, pp. 698-707) показали, что введение подопытным животным (мышам и морским свинкам) одновременно двух различных очищенных антигенов чумного микроба, а именно LcrV (далее V антиген) и F1, способно защитить их от последующей гибели при заражении летальными дозами вирулентных штаммов Y. pestis не вызывая при этом серьезных побочных эффектов.
Известны составы микрокапсулированных медицинских препаратов и технологии их получения (например, патенты США №№5417986, 4897268, 5384133 и другие). Так, авторы патента США №5417986 предложили микрогранулированную вакцину против большой группы кишечных инфекций с использованием биодеградируемого полимера поли-(D,L-лактида-когликолида) как носителя, в объеме которого распределен полипептидный антиген. Технология получения такого препарата, согласно описанию авторов патента, предполагает растворение белковых молекул в органическом растворителе вместе с полимером, что не может не сказаться на активности белка, и последующую экстракцию растворителя другим, легколетучим растворителем (гептаном), что технологически малопригодно, поскольку необходимые для этого большие объемы гептана и опасны для здоровья персонала, и пожароопасны. В патенте США №4897268 авторы предлагают пролонгированную систему доставки лекарственных веществ, состоящую из специально подобранной смеси микрокапсул, например на основе сополимеров полилактид-когликолид с разным соотношением мономеров, однако их технология получения микрокапсул имеет те же недостатки.
Авторы патента США №5384133 предлагают микрокапсулированный фармпрепарат с замедленным высвобождением инкапсулированного действующего начала за счет жирорастворимого ПАВ (имеющего гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ) в диапазоне от 1,8 до 10), включенного в стенку микрокапсул на стадии получения эмульсии из биодеградируемого полимера, который растворен в несмешивающейся с водой органической среде. Последнее обстоятельство, как и в случае двух предыдущих патентов, ограничивает сферу его применимости использованием для инкапсулирования сравнительно простых не растворимых в воде химических соединений и, в частности, малопригодно для микрокапсулирования белковых антигенов при конструировании молекулярных вакцин.
В патенте РФ №2197988, который является прототипом настоящего изобретения, авторы, расширяя область применения вакцинного препарата, заявили об использовании микрокапсулирования для защиты антигенов в организме реципиента и возможном пролонгировании действия вакцины. Однако доказательств увеличения срока действия микрокапсулированного вакцинного препарата по сравнению с субъединичным неинкапсулированным они не приводят.
При получении микрокапсулированного препарата по способу, описанному в упомянутом патенте, включение антигенов в микрокапсулы составляет, по оценкам авторов, от 40% до 75% от массы исходного антигена, что, практически, означает большие потери ценного рекомбинантного белка. Кроме того, авторы не приводят способа оценки содержания активного антигена в конечном продукте, что совершенно необходимо делать для расчета доз препарата при вакцинировании, но представляет определенную проблему из-за ограниченной доступности для анализа инкапсулированного антигена. Гидрофобность поверхности микрокапсул препаратов, получаемых из полилактида и его производных, далеко не всегда играет положительную роль при вакцинации, и, например, может приводить к неконтролируемой агрегации в водных растворах и вследствие этого невозможности их применения в виде инъекционных препаратов. Наконец, авторы данного патента совершенно не рассматривают крайне важное в практике применения свойство микрокапсулированных вакцинных препаратов, а именно способность храниться достаточно долгий срок без использования специальных средств для сохранения иммуногенности, что необходимо для создания запасов вакцины в случае массовой вакцинации.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является достижение определенной структуры и состава конечного препарата, что позволяет применять препарат строго дозированно и после длительного хранения (до 3 лет и более) в виде инъекционного препарата.
Сущность предлагаемого нами способа получения вакцины заключается в микрокапсул ировании по крайней мере двух антигенов чумного микроба, V и F1, в биосовместимую и биодеградируемую полимерную оболочку из полилактида, либо полилактида-когликоглида, обеспечивающую защиту белковых молекул от разрушающего влияния внешней среды, с одновременным сорбированием антигенов, не включившихся в микрокапсулы, на биосовместимом тонкодисперсном сорбенте (оксид либо гидроксид алюминия, или соли алюминия), с последующим сублимационным высушиванием. Это позволяет сохранить как структуру препарата, так и антигенную активность инкапсулированных белков. Для получения микрокапсулированных препаратов используют водорастворимые полимеры, образующие губчатую матрицу-ядро микрокапсулы с распределенным в ней белковым антигеном, и нерастворимые в воде полимеры, такие как поли-(D,L-лактид) или поли(D,L-лактид-когликолид), образующие защитную оболочку микрокапсулы. Для сорбирования белковых антигенов применяют тонкодисперсные биосовместимые сорбенты, такие, как оксид или гидроксид алюминия, или соли алюминия, которые входят в состав вакцинного препарата. Схема получения препарата включает в себя приготовление первичного водного раствора белковых антигенов и полимера(-ов), его эмульгирование в легколетучем органическом растворителе, содержащем полимер-пленкообразователь (например, полилактид) и стабилизатор первичной эмульсии (например, Tween 20, Tween 80 или стеарат сахарозы), получение вторичной (двойной) эмульсии путем диспергирования первичной эмульсии в водном растворе со стабилизирующими добавками (например, ПВС, Tween 20, ПВП, декстран, крахмал, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза), выпаривание органического растворителя и лиофильное высушивание образовавшейся суспензии.
Основными отличиями от прототипа в предлагаемом изобретении являются использование оригинальных антигенов повышенной иммуногенности и тонкодисперсного сорбента в составе препарата. В отличие от прототипа, в предлагаемом способе достигается определенная структура и состав конечного препарата, что позволяет применять препарат строго дозированно и после длительного хранения (до 3 лет и более). Потери антигена составляют не более 5%, поверхность микрокапсул хорошо смачивается водой и водными растворами, а стенки микрокапсул плотные, непроницаемые для жидких веществ и малопроницаемые для газов, что обеспечивает соответственно лучшую технологичность процесса микрокапсулировании, хорошую или удовлетворительную суспендируемость и устойчивость в водных растворах, а также длительную сохраняемость вакцинного препарата. Предлагаемый вакцинный препарат содержит антигены с повышенной иммуногенностью, а также дополнительные биосовместимые и биоразлагаемые полимеры, такие как ПВС, ПВП, полилактид и тонкодисперсный неорганический сорбент, например, оксида алюминия, для защиты белковых антигенов от инактивации ферментными системами живого организма (при вакцинации) и факторами внешней среды (кислород, водные пары, ультрафиолетовое облучение и другие) при хранении. Предлагаемый способ получения микрокапсулированного препарата позволяет достигать технологически эффективного включения антигена в состав микрокапсул на уровне не менее 40%, и в состав конечного препарата на уровне не менее 95% от его исходной массы, обеспечивает достаточно точную оценку содержания инкапсулированного действующего белкового компонента в конечном препарате, а также диспергированное в виде мелких твердых частиц состояние, при котором возможно использование препарата в виде стабильной водной суспензии для инъекций. В предлагаемом способе получения вакцинного препарата, на стадии приготовления водного раствора антигена используют максимально концентрированные растворы, полученные путем ультрафильтрации через мембранные ультрафильтры и затем стерилизованные микрофильтрацией. В результате последующего добавления полимера-гелеобразователя в виде раствора или сухого вещества, менее растворимый белковый антиген частично выпадает в осадок, образуя мелкие агрегаты, взвешенные в водной фазе. Это способствует сохранению антигена внутри капель первичной эмульсии и повышению, таким образом, его включения в состав конечного препарата. Другим фактором, способствующим сохранению белкового антигена внутри капель первичной эмульсии, является применение смеси органических растворителей: несмешивающегося с водными растворами ди- либо трихлорметана и этанола, неограниченно смешивающегося с водой. Содержание этанола в этой смеси не должно превышать 20% по объему во избежание выпадения в осадок растворенного в дихлорметане полимера. Смесь органических растворителей образует «масляную» фазу, в которой диспергируется первичная водная фаза в виде первичной эмульсии типа «вода в масле». Нерастворимый в дихлорметане (хлороформе) белковый антиген все же способен диффундировать в его объем, хотя и в небольшом количестве, однако с учетом большой поверхности раздела между фазами, такие потери могут оказаться существенными (большая поверхность раздела возникает при дроблении первичной водной фазы на мелкие капли эмульсии, что необходимо для генерации достаточно мелких микрокапсул). Для диспергирования хорошо подходят механические дезинтеграторы в виде концентрических цилиндров с перфорированной боковой стенкой (например, фирмы «Кинематика», Швейцария) или ультразвуковые дезинтеграторы достаточной мощности (например, фирмы «Виртис», США). Средний размер капель эмульсии не должен превышать 10 мкм, в противном случае не будет обеспечено эффективное действие препарата. При образовании таких мелких капель в их приповерхностной зоне значительный объем оказывается в близком контакте с дисперсионной средой. В случае, если в составе дисперсионной среды находится денатурирующий компонент, например, этанол, способный переходить из масляной фазы в водную, белок в приповерхностном слое частично денатурирует, образуя препятствие для диффузии других молекул из капель и способствуя, в конечном счете, увеличению доли инкапсулированного антигена. Следующий этап микрокапсулирования - формирование твердой стенки микрокапсул из растворенного в органическом растворителе полимера, в качестве которого часто используют полилактид либо полилактид-когликолид, который не только нерастворим в водных растворах, но и способен деградировать в окружающей среде и в том числе в биологических жидкостях. Стенка микрокапсул образуется за счет удаления органического растворителя, например, выпариванием, при концентрировании полимера вокруг водных капель эмульсии. Для ускорения выпаривания и облегчения образования стенок микрокапсул масляная фаза диспергируется во вторичной водной фазе, с образованием большой поверхности масляной фазы за счет мелких капель, что значительно ускоряет процесс. Для еще большего ускорения можно использовать роторный испаритель, где испарение усиливается «растягиванием» вторичной водной фазы в пленку и соответствующим увеличением площади испарения. Еще одним фактором, снижающим потери антигена, теперь уже во вторичную водную фазу, является использование солевых растворов с добавлением поверхностно-активных веществ (ПАВ). В то время как ПАВ стабилизируют вторичную эмульсию, раствор соли достаточной концентрации препятствует выходу белкового антигена из микрокапель эмульсии вследствие эффекта «высаливания» и также способствует стабилизации вторичной эмульсии. После полного испарения органического растворителя полимер-пленкообразователь (полилактид или его аналоги) окружает водные капли, образуя твердые частицы с жидким ядром. С целью длительного сохранения антигеном его свойств микрокапсулы затем высушивают сублимационным (лиофильным) способом в щадящем режиме. При этом влага из ядра микрокапсул удаляется, оставляя сухую рыхлую структуру, образованную водорастворимым полимером с распределенным в нем небольшим по объему количеством белкового антигена. Известно, что совместное введение биологически инертных полимеров в диспергированном состоянии и антигенов усиливает иммуногенное действие последних. Таким образом, полимерная составляющая микрокапсул оказывает дополнительное стимулирующее воздействие при иммунизации. Несмотря на все описанные приемы, часть белковых антигенов (до 60%) переходит в водный раствор. Чтобы избежать потерь антигенов, в препарат вводят сорбент с высокой удельной поверхностью адсорбции, представляющий собой суспензию твердых частиц размером от десятых долей микрометра до нескольких микрометров. Свободные белковые антигены из раствора практически полностью сорбируются в порах сорбента, например, гидроокиси алюминия. В дальнейшем суспензия микрокапсул и тонкодисперсного сорбента сублимационно высушивается, а перед применением регидратируется и ресуспендируется в чистой стерильной воде. При регидратации небольшая часть антигенов десорбируется, обеспечивая первичную «ударную» дозу антигенов в месте введения, однако большая часть выходит в окружающую среду постепенно, обеспечивая постоянный контакт иммунной системы вакцинированного с вакцинирующими агентами.
Для лучшего понимания и более подробного описания настоящего изобретения ниже приводятся примеры, раскрывающие все этапы получения вакцинного препарата.
Пример 1. Получение очищенного рекомбинантного антигена V возбудителя чумы. Для выделения V антигена клетки Е. coli BL21(DE3)/pETV-I-3455 культивируют на плотной питательной среде Хоттингера, при этом 1 л бульона BHI, содержащего 1,5% агара, разливают в 5 матрасов объемом по 200 мл. Среду стерилизуют при 1 ати в течение 30 мин, после чего охлаждают до температуры 50°С и добавляют канамицин до конечной концентрации 40 мкг/мл. После остывания среды и ее проверки на стерильность инокулируют взвесь клеток указанного выше штамма. Для ее приготовления используют суточный газон штамма, выращенного на чашке Петри с агаром Хотингера, содержащим 40 мкг/мл канамицина. Газон с чашки смывают 5 мл стерильного фосфатно-солевого буферного раствора, рН 7,0 (ФСБР), смытую взвесь суспендируют в 95 мл этого раствора. 20 мл суспензии перемешивают и инокулируют в матрас с плотной питательной средой Хоттингера. Культивирование штамма в матрасах проводят в горизонтальном положении при 28°С в течение 48 ч при периодическом покачивании для равномерного смачивания агара.
По окончании культивирования штамма проводят смыв культуры с поверхности среды культивирования в каждом матрасе 40 мл стерильного ФСБР. Смывы со всех матрасов объединяют и отделяют клетки центрифугированием при 8000 об/мин в течение 40 мин в стаканах ротора JA-10 (Beckman). После центрифугирования отбирают только ту часть над осадочной фракции, которая не содержит взвесь клеток. Суспензию неосажденных клеток отделяют от плотного осадка и центрифугируют повторно при 16000 об/мин в течение 40 мин в стаканах ротора JA-20 (Beckman). Отбирают также часть надосадочной фракции, не содержащую неосажденные клетки. Надосадочные фракции объединяют и измеряют их объем, осадки клеточной массы инактивируют.
К объединенной надосадочной фракции культуры постепенно добавляют аммоний сернокислый при непрерывном перемешивании. Количество аммония сернокислого рассчитывают с учетом объема надосадочной фракции таким образом, чтобы после полного растворения соли ее концентрация составляла 30% (176 г на 1000 мл раствора) от насыщяющей концентрации при 20°С. Образующуюся взвесь перемешивают в течение 60 мин и оставляют на ночь при 6°С. Осадок отделяют центрифугированием при 6000 g в течение 20 мин (ротор JA-14, центрифуга Beckman J-21), над осадочную часть удаляют и растворяют осадок в стерильном ФСБР при длительном перемешивании, количество ФСБР устанавливают таким образом, чтобы соотношение объема ФСБР и культуры Е. coli BL21(DE3)/pETV-I-3455 составляло 1:20. Из полученного раствора проводят повторное осаждение белка V аммонием сернокислым с его последующим растворением при тех же условиях. Полученный раствор переосажденного антигена центрифугируют при 16000 g в течение 45 мин в стаканах ротора JA-20. Надосадочную часть отделяют и диализуют против десятикратного избытка ФСБР с трехкратной сменой буферного раствора, после чего пропускают через стерильный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм Раствор антигена V концентрируют ультрафильтрацией на мембране YM-30 (Millipore) таким образом, чтобы общая концентрация белка составляла 5-10 мг/мл, фасуют на аликвоты объемом 1 мл и хранят в замороженном состоянии при - 70°С.
Пример 2. Получение микрокапсулированного вакцинного препарата.
Очищенный V антиген и антиген возбудителя чумы F1 испольэуютв виде концентрированных водных растворов. Для их получения непосредственно перед приготовлением разбавленные растворы антигенов продавливали через ультрафильтры с порогом разделения 10 кДа и 30 кДа для F1 и V антигена соответственно до получения растворов с концентрацией 5 мг/мл и 10 мг/мл соответственно. Аликвоту одного из антигенов, содержащую 4,5 мг антигена в 0,5 мл буферного раствора, приливали к 1 мл 5% стерильного водного раствора поливинилового спирта (ЛВС) с молекулярной массой 72 кДа и тщательно перемешивали пипетированием, избегая образования пузырьков воздуха. Затем полученный водный раствор диспергировали в 7,5 мл 5% раствора поли (D,L-лактида) молекулярной массой 30 кДа в хлороформе с добавлением этанола до конечной концентрации 13%. Для диспергирования применяли погружной механический дезинтегратор модели «Polytron FT1200» производства швейцарской фирмы «Кинематика АГ». Время (2 мин) и интенсивность обработки (10000-25000-40000-20000 об/мин) подбирали так, чтобы образовалась водная эмульсия в «масляной» (гидрофобной) фазе со средним размером частиц не более 5-7 мкм. Полученную эмульсию немедленно переносили в стерильный водный раствор полимера-стабилизатора эмульсии (объем 150 мл), в качестве которого в данном случае применяли 1% раствор ПВП с молекулярной массой 360 кДа в 0,9% растворе хлористого натрия, в который был добавлен Tween 20 до конечной концентрации 0,05 вес. %. Эмульсию вносили капельно на магнитной мешалке, чтобы образовалась вторичная (двойная) эмульсия «вода/масло/вода». Полученную двойную эмульсию оставляли в ламинарном шкафу на магнитной мешалке в режиме перемешивания со средней скоростью (200 об/мин) до полного испарения легколетучего органического растворителя (хлороформа). Образовывалась, таким образом, суспензия твердых частиц в полимерной оболочке из сконденсированного полилактида вокруг поливинилового матрикса с распределенным в нем белковым антигеном. За 20 мин до окончания процесса в суспензию вводили аликвоту тонкодисперсного сорбента, геля гидроксида алюминия (концентрация 13 мг/мл) в количестве 1,1 мл, предварительно стерилизованного автоклавированием Твердую фазу отделяли центрифугированием, используя препаративную центрифугу Beckman J2-21. Для этого использовали ротор JA-15 и стаканы емкостью 250 мл. Разделение проводили при т-ре +4°C и скорости вращения ротора 8-10 тыс.об/мин в течение 55-75 мин. Супернатант сливали и в дальнейшем использовали для измерения содержания антигена, не включившегося в микрокапсулы (см. Пример 3). Осадок, состоящий из микрокапсул, отмывали от излишков стабилизатора вторичной эмульсии деионизо ванной водой, ресуспендируя его в 100 мл воды и перемешивая в течение 10 мин в закрытом центрифужном стакане на качалке при 200-250 об/мин. Микрокапсулы отделяли от воды центрифугированием как описано выше. Отмытый осадок вновь ресуспендировали в 20 мл или 30 мл воды (в зависимости от нужной концентрации в конечном препарате), используя качалку, в течение 20-30 мин. Операции по приготовлению эмульсий повторяли для второго антигена, беря его в таком же количестве для получения равного содержания антигенов. Сливали отмытые суспензии микрокапсулированных антигенов вместе. Полученную смешанную суспензию разливали в стерильные пенициллиновые флаконы по 3,0 мл во флакон, укупоривали бумажными пробками и переносили в лиофильную сушилку. Сублимационное высушивание проводили в стандартном режиме на лиофильной сушилке Virtis (США) до конечной влажности препарата 3-6 вес. %; обычная продолжительность сушки составляла 22-28 ч. Стеклянные флаконы с высушенным препаратом укупоривали резиновыми пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками. Хранили при температуре (4±2°C) в бытовом холодильнике.
Пример 3. Определение дозы антигена в вакцинном препарате на основе микрокапсул.
Определение содержания антигенов является ключевым моментом в характеризации полученного вакцинного препарата, поскольку позволяет рассчитать ту дозу, которую необходимо ввести реципиенту. Содержание каждого из антигенов рассчитывается отдельно на основании определения его концентрации в исходном водном растворе и в надосадочном растворе после осаждения микрокапсул центрифугированием (см. Пример 2). Принимается, что содержание антигена во фракции микрокапсул соответствует разности между его содержанием в исходном водном растворе и в супернатанте после отделения от него микрокапсул. Ниже рассмотрен пример конкретного расчета в одном из экспериментов.
2
2
2
Анализировали препараты, полученные на стадии двойной эмульсии на содержание антигена двумя различными способами: ДСН-ПААГ электрофорезом и иммуноблотгингом с моноклональными антителами к указанным антигенам (получены в ФГУН ГНЦ ПМБ). При белковом электрофоретическом исследовании по Лэммли определяли положение окрашенной красителем Кумасси полосы в пластинке геля относительно белковых стандартов известной молекулярной массы и чистого антигена в известной концентрации Интенсивность окрашивания полосы антигена в препарате позволяла определять его содержание (концентрацию в пробе), положение полосы свидетельствовало о сохранении молекулярной массы антигена в препарате такой же, как у исходного (чистого) антигена. Наличие характерной полосы антигена в пробе из супернатанта свидетельствует о неполном включении его в микрокапсулы. Зная объем суспензии микрокапсул, разлитый по флаконам перед сублимационным высушиванием, можно рассчитать дозу антигена в одном флаконе. Более точные результаты можно получить, применяя твердофазный иммуноферментный анализ в варианте иммуноблоттинга (дот-блот анализ). В нашем случае препараты в 5-кратных разведениях по 2 мкл наносили на нитроцеллюлозную мембрану (Hybond-C extra, Amersham Life Sciences) Участки неспецифического связывания блокировали инертным белком (БСА - бычьим сывороточным альбумином), после чего мембрану последовательно инкубировали с раствором моноклональных антител (МкАт) и кроличьими антимышиными иммуноглобулинами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Sigma, США). Реакцию визуализировали добавлением субстратной смеси (0,05% раствор диаминобензидина в фосфатно-солевом буфере рН 7,4, плюс 1 мкл 33% НО, плюс 0,1 мг/мл NiCl).
Вакцинный препарат на основе антигена F1 на стадии подсушенной (от хлороформа) вторичной эмульсии Э2 при анализе показал следующее содержание белка F1.
В опыт было взято 4,5 мг антигена с концентрацией 4 мг/мл буферного раствора, из 150 мл водного раствора получилось практически столько же вторичной эмульсии (хлороформ испарился), после отделения фракции микрокапсул центрифугированием получилось 146 мл супернантанта с концентрацией, по результатам дот-блоттинга, 20 мкг/мл. Т.о. всего во фракции супернатанта оказалось 146×20=2920 мкг антигена из 4500 мкг, тогда во фракции микрокапсул содержится 4500-2920=1580 мкг (35%).
Микрокапсулы ресуспендированы в 20 мл воды, в каждый флакон для лиофильного высушивания перенесено 3 мл суспензии, поэтому содержание антигена F1 в каждом флаконе составляет (3:20)×1580 мкг = 237 мкг.
Пример 4 Определение дозы антигена в вакцинном препарате на основе микрокапсул с тонкодисперсным сорбентом
В одном эксперименте использовали меченый флуоресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ) антиген F1. Были получены два препарата: с микрокапсулированным в полил актидную оболочку антигеном (МК) и с антигеном микрокапсулиро ванным и сорбированным на гидроокиси алюминия (ГОА) Оба препарата были получены по одной и той же схеме через двойную эмульсию и имели одинаковый состав за исключением введения 4 мг ГОА на 0,5 мг антигена во втором препарате (МК+ГОА) В процессе приготовления обоих препаратов после отделения твердого осадка от надосадочной жидкости в последней определяли содержание свободного антигена F1-ФИТЦ с целью расчета количества включенного в препарат антигена F1. Определение проводили двумя способами, при помощи ТИФА как описано в Примере 3 и спектрофотометрически по характерному пику поглощения хромофорной флуоресцеиновой химической группы при 496 нм В последнем случае расчет производили в соответствии с предварительно проведенной калибровкой с использованием водных растворов F1-ФИТЦ разной концентрации. Результаты определения приведены в Таблице 2.
Как можно видеть из Табл. 2, введение в состав препарата высокодисперсного сорбента приводит к практически полному включению антигена в вакцинный препарат. Аналогичные результаты были получены с антигеном V.
Пример 5. Вакцинирование лабораторных животных полученным препаратом. Защитную эффективность вакцинного препарата рассчитывают как напряженность противочумного иммунитета или индекс иммунитета (ИИ), под которым понимают способность вакцинного препарата предохранять животное от гибели при заражении массивными дозами вирулентной культуры. ИИ определяют по формуле:
50
50
инт
ИИ=LD/LD,
50
50
50
инт
где ИИ - индекс иммунитета; соответственно - LD для животных, иммунизированных вакцинным препаратом за 28 сут до заражения, колониеобразующих единиц (КОЕ); LD - LD для интактных животных, КОЕ.
2
3
4
5
2
3
50
Ниже описано испытание вакцинного микрокапсулиро ванного препарата в одном из экспериментов на белых беспородных мышах и крысах. Вакцинацию проводили препаратом, содержащим смесь V и F1 антигенов в объеме 0,2 мл подкожно в верхнюю треть правого бедра. В качестве контроля использовали микрокапсулы, в которых антиген заменен бычьим сывороточным альбумином (БСА). Заражение проводили вирулентным штаммом Y. pestis 231 на 28-й день после начала иммунизации (независимо от количества вакцинаций) дозами 10, 10, 10, 10 КОЕ на животное. Каждая группа состояла из 4-х животных. Для определения LD использовали группу непривитых животных, зараженных дозами 1, 10, 10, 10 КОЕ.
50
50
50
3
2
2
3
Для определения LD Y. pestis 231 использовали четыре неиммунных группы мышей и крыс, которых заражали подкожно серией 10-кратных разведений (от 10 КОЕ до 1 КОЕ, 4 мыши на одну дозу) двухсуточной культуры, выращенной при 28°С на агаре Хотгингера, содержащем 2% гемолизированной крови крупного рогатого скота. Животных содержали в клетках группами по 4 особи (пища и вода - ad libitum). В случае гибели животных вскрывали и проводили бактериологический анализ. Эксперимент проводили в течение 21 сут. Выживших животных усыпляли с помощью двуокиси углерода. LD с 95% доверительным интервалом вычисляли по методу Кербера. В трех сериях экспериментов LD для мышей составляла 1-2 КОЕ, крыс - 7-32 КОЕ. По результатам трех экспериментов при однократной иммунизации мышей вакцинным препаратом в группе, зараженной дозой 10 КОЕ вирулентного штамма Y. pestis 231 не отмечено ни одного случая падежа животных при полном отсутствии каких-либо признаков побочного действия вакцины. При двукратной иммунизации защитные свойства вакцинного препарата повышались еще в 10 раз. При использовании в качестве биомодели крыс применяли двукратную иммунизацию. В этом случае при заражении дозой 10 КОЕ вирулентного штамма Y. pestis 231 не отмечено случаев падежа животных, а при дозе 10 КОЕ падеж составил менее 10%, также при полном отсутствии признаков побочных эффектов вакцинации.
50
Протективную способность вакцинного препарата рассчитывали по его способности предохранять животное от гибели после заражения массивной дозой вирулентной культуры Y. pestis. Протективную способность оценивали по LD для мышей и крыс, иммунизированных однократно и двукратно исследуемым препаратом, а также индексом иммунитета.
50
Величины LD и индекса иммунитета, рассчитанные для испытуемого вакцинного препарата, содержащего микрокапсулиро ванные V и F1 антигены, повышались в 2800 и 28000 раз для мышей при однократном и двукратном введении соответственно, по сравнению с интактными мышами, что свидетельствует о формировании напряженного продолжительного иммунитета (таблица 3). Данные по крысам представлены в таблице 4.
Пример 6. Исследование сохраняемости микрокапсулиро ванного вакцинного препарата. О сохранении вакцинным препаратом его свойств свидетельствуют его способность легко диспергироваться в воде и водных растворах и поддержание содержания антигенов на уровне, не отличающемся от первоначального более чем на 10% (ошибка измерения). Ниже приведены результаты изучения сохраняемости одной из приготовленных нами серий микрокапсулированных сухих препаратов при их хранении в течение более двух месяцев при различных температурах (табл. 5)
4
Как можно видеть из приведенных данных, несмотря на очень большие скачки в определяемых электрофоретически или иммуноблоттингом величинах титров обоих антигенов, через два месяца наблюдений их значения в среднем остаются на прежнем уровне независимо от температуры хранения. Даже для хранившихся при +47°C препаратов, т.е. при превышении обычной температуры хранении на 45°C, через более чем 2 мес хранения средние титры обоих антигенов остаются прежними (с учетом разброса при измерениях). Если принять, что средняя скорость химических реакций, приводящих к инактивации белковых антигенов, в этом случае возрастает в 2=16 раз, такое хранение аналогично хранению при температуре бытового холодильника в течение не менее 32 мес, т.е. более 2,5 лет.
Пример 7 Продление срока действия вакцинного препарата при использовании иммобилизованных антигенов
Для изучения длительности сохранения напряженного иммунитета провели эксперименты, в которых вакцинированных лабораторных животных (мышей и морских свинок) заражали п/к летальными дозами вирулентного штамма возбудителя чумы в различные сроки после введения вакцинного препарата
50
50
Животных дважды вакцинировали: мышей дозой 15+15 мкг, морских свинок 30+30 мкг. Контрольная группа каждого вида животных состояла из 10 не вакцинированных особей. На 56, 120 и 180 дни после первой вакцинации животных заражали вирулентным штаммом Y. pestis 231 в дозе 200 КОЕ (40 LD) на животное в эксперименте с мышами и 2000 КОЕ (40 LD) в эксперименте с морскими свинками. Результаты определения выживаемости приведены в табл. 6 и 7.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что требуемая для поддержания протективных свойств напряженность иммунитета сохраняется не менее чем в течение 6 мес после иммунизации.
Пример 8. Получение микрокапсулированного вакцинного препарата из альтернативных компонентов
Использовали очищенный V антиген и антиген возбудителя чумы F1 как описано в Примерах 1 и 2. Аликвоту одного из антигенов, содержащую 5 мг антигена в 1 мл буферного раствора, приливали к 2 мл 5% стерильного водного раствора декстрана с молекулярной массой 64-76 кДа и обрабатывали как описано в Примере 2. Затем полученный водный раствор диспергировали в 8 мл 2,5% раствора поли(D,L-лактида)-когликолида молекулярной массой 40-75 кДа в хлороформе с добавлением этанола до конечной концентрации 10 об. % и Твина 20 до конечной концентрации 0,1%. Далее технологический процесс вели как описано в Примере 2 за исключением того, что выпаривание органического растворителя проводили при помощи лабораторного ротационного испарителя. Полученные микрокапсулы с добавкой сорбента (гель гидроокиси алюминия) отмывали 1% раствором поливинилпирролидона (ПВП) с молекулярной массой 25 кДа в фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,2 как описано в Примере 2. Отмытый осадок микрокапсул вновь ресуспендировали в 25 мл того же раствора как описано в Примере 2. Операции по приготовлению эмульсий повторяли для второго антигена, беря его в таком же количестве для получения равного содержания антигенов. Сливали отмытые суспензии микрокапсулированных антигенов вместе. Полученную смешанную суспензию разливали в стерильные пенициллиновые флаконы по 2,0 мл во флакон, закрывали бумажными пробками и переносили в лиофильную сушилку. Сублимационное высушивание, укупоривание и хранение полученного препарата проводили как описано в Примере 2.
Пример 9. Получение микрокапсулированного вакцинного препарата из альтернативных компонентов
Использовали очищенный V антиген и антиген возбудителя чумы F1 как описано в Примерах 1 и 2. Аликвоту одного из антигенов, содержащую 5 мг антигена в 1,5 мл буферного раствора, приливали к 2 мл 1% стерильного водного раствора хитозана и обрабатывали как описано в Примере 2. Затем полученный водный раствор диспергировали в 9 мл 3% раствора поли(D,L-лакгида)-когликолида молекулярной массой 40-75 кДа (соотношение мономеров лактид : гликолид = 50:50) в дихлорметане с добавлением стеарата сахарозы до конечной концентрации 0,8 вес. % Далее технологический процесс вели как описано в Примере 2, за исключением того, что в качестве тонкодисперсного сорбента использовали гель фосфата алюминия в той же конечной концентрации, что и в Примере 2. Полученные микрокапсулы отмывали 1% раствором декстрана с молекулярной массой 35-45 кДа в фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,2 как описано в Примерах 2 и 8. Отмытый осадок микрокапсул вновь ресуспендировали в 30 мл того же раствора. Операции по приготовлению эмульсий повторяли для второго антигена. Далее все операции соответствовали описанным в Примерах 2 и 8.
Согласно представленному описанию технологии приготовления и исследованиям свойств полученного по этой технологии вакцинного препарата на основе микрокапсулиро ванных V и F1 антигенов, заявленный способ получения и характеристики препарата вполне соответствуют поставленным задачам по снижению расхода антигенов, улучшению диспергируемости, протективных иммуногенных свойств, точности определяемых доз антигенов и высокой сохраняемости. Действительно, из Примеров 2 и 3 можно видеть, что включение антигена в микрокапсулы составляет не менее 40% от взятой в опыт массы, что позволяет получать в небольшом по объему (количеству) препарате дозу антигенов, достаточную для эффективной вакцинации нескольких лабораторных животных, а в присутствии в составе препарата тонкодисперсного сорбента включение антигенов в препарат достигает более 95%. Средний размер микрокапсул около 5-7 мкм обеспечивает хорошую диспергируемость препарата и эффективное применение, в том числе, в виде инъекций (Пример 5). При этом нет проблем с расчетом дозы препарата для вакцинации, поскольку содержание обоих антигенов достаточно точно определяется на этапе получения микрокапсул (Примеры 3 и 4). Это убедительно подтверждают опыты по вакцинации лабораторных животных (Пример 5), в которых показано, что применение микрокапсулированной молекулярной вакцины для профилактики чумы позволяет защитить от гибели до 100% лабораторных животных, зараженных летальной дозой вирулентного штамма Y. pestis, при практически полном отсутствии каких-либо побочных эффектов. Наконец, как явствует из Примеров 6 и 7, микрокапсулированный вакцинный препарат может даже при комнатной температуре, т.е. в самых непритязательных условиях хранения, сохранять свои свойства достаточно долго, не менее года, следовательно, потенциально способен широко применяться при массовых вакцинациях.