СПОСОБЫ ОЧИСТКИ АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫХ ВИРУСОВ

1. Способ очистки полных капсидов аденоассоциированного вируса (AAV) от концентрированной фракции AAV, содержащей пустые капсиды AAV и полные капсиды AAV, предусматривающий:
(i) загрузку в зональный ротор а) концентрированной фракции AAV и b) по меньшей мере двух растворов сахара, каждый из которых характеризуется различной концентрацией сахара и каждый из которых содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 45 % (в массовом отношении) до приблизительно 65% (в массовом отношении) сахарозы,
(ii) работу ультрацентрифуги, содержащей зональный ротор, в периодическом режиме, после чего образуется градиент сахара,
(iii) получение фракции градиента сахара для получения фракции AAV, причем по меньшей мере или приблизительно 60% частиц AAV во фракции AAV представляют собой полные капсиды AAV,
причем (A) объем растворов сахара больше или равен приблизительно 50% объема зонального ротора, (B) общий объем растворов сахара и фракции AAV меньше или равен объему зонального ротора, (C) отношение объема растворов сахара к объему фракции AAV меньше или равно единице или (D) их комбинация.
2. Способ по п. 1, при котором каждый раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 50% (в массовом отношении) до приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы.
3. Способ по п. 1 или 2, при котором каждый раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 55% (в массовом отношении) до приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы.
4. Способ по п. 1 или 2, при котором по меньшей мере один из растворов сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, превышающей приблизительно 50% (в массовом отношении) сахарозы.
5. Способ по любому из пп. 1-4, при котором по меньшей мере один из растворов сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, превышающей приблизительно 55% (в массовом отношении) сахарозы.
6. Способ по любому из пп. 1-5, при котором по меньшей мере один из растворов сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 60% (в массовом отношении) до приблизительно 65% (в массовом отношении) сахарозы.
7. Способ по любому из пп. 1, 2 или 4-6, при котором один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, причем второй раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 57% (в массовом отношении) до приблизительно 63% (в массовом отношении) сахарозы, и, необязательно, причем третий раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 47% (в массовом отношении) до приблизительно 53% (в массовом отношении) сахарозы.
8. Способ по любому из пп. 1-7, при котором два раствора сахара загружают в зональный ротор.
9. Способ по любому из пп. 1, 2 или 4-8, при котором два раствора сахара загружают в зональный ротор и при котором один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, и второй раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 57% (в массовом отношении) до приблизительно 63% (в массовом отношении) сахарозы.
10. Способ по любому из пп. 1-7, при котором по меньшей мере три раствора сахара загружают в зональный ротор.
11. Способ по любому из пп. 1-7 или 10, при котором три раствора сахара загружают в зональный ротор.
12. Способ по любому из пп. 1, 2, 4-7, 10 или 11, при котором три раствора сахара загружают в зональный ротор и при котором один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 47% (в массовом отношении) до приблизительно 53% (в массовом отношении) сахарозы, второй раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, и третий раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, в диапазоне от приблизительно 57% (в массовом отношении) до приблизительно 63% (в массовом отношении) сахарозы.
13. Способ по любому из пп. 1, 2 или 4-12, при котором на стадии (i) концентрированную фракцию AAV загружают перед раствором сахара, содержащим сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, и причем раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы загружают перед раствором сахара, содержащим сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 57% (в массовом отношении) до приблизительно 63% (в массовом отношении) сахарозы.
14. Способ по любому из пп. 1, 2, 4-7 или 10-13, при котором на стадии (i) концентрированную фракцию AAV загружают перед раствором сахара, содержащим сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от приблизительно 47% (в массовом отношении) до приблизительно 53% (в массовом отношении) сахарозы, причем раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, находится в диапазоне от приблизительно 47% (в массовом отношении) до приблизительно 53% (в массовом отношении) сахарозы, загружают перед раствором сахара, содержащим сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, и причем раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, загружают перед раствором сахара, содержащим сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 57% (в массовом отношении) до приблизительно 63% (в массовом отношении) сахарозы.
15. Способ по любому из пп. 1-14, при котором каждый раствор сахара загружают в зональный ротор в равных объемах.
16. Способ по любому из пп. 1-14, при котором раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в зональный ротор в объеме, в два раза превышающем объем по меньшей мере одного из других растворов сахара в зональном роторе.
17. Способ по любому из пп. 1-14 или 16, при котором раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в зональный ротор в объеме, равном по меньшей мере объему всех других растворов сахара, объединенных в зональном роторе.
18. Способ по пп. 1-14, 16 или 17, при котором раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в зональный ротор в объеме, который по меньшей мере вдвое превышает объем раствора сахара с наибольшей концентрацией сахара, необязательно, причем объем раствора сахара с наибольшей концентрацией сахара равен объему раствора сахара с промежуточной концентрацией сахара.
19. Способ по любому из пп. 1-14 или 16-18, при котором по меньшей мере два раствора сахара загружают в зональный ротор, причем раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в зональный ротор в объеме, который по меньшей мере вдвое больше объема по меньшей мере одного другого раствора сахара в зональном роторе.
20. Способ по любому из пп. 1-19, при котором по меньшей мере два раствора сахара загружают в зональный ротор, причем раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в зональный ротор в объеме, равном объему по меньшей мере одному другому раствору сахара в зональном роторе.
21. Способ по любому из пп. 1-20, при котором раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в зональный ротор в объеме, который составляет половину объема концентрированной фракции AAV.
22. Способ по любому из пп. 1-21, при котором отношение объема общего градиента сахара к объему фракции AAV, загруженной в зональный ротор, составляет от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:5.
23. Способ по любому из пп. 1-22, при котором фракция AAV содержит забуференный раствор.
24. Способ по п. 23, при котором забуференный раствор содержит трис-HCl и NaCl.
25. Способ по п. 24, при котором концентрация трис-HCl составляет от приблизительно 20 до приблизительно 50 мМ, а концентрация NaCl составляет от приблизительно 150 до приблизительно 900 мМ.
26. Способ по любому из пп. 23-25, при котором буферный раствор характеризуется рН от приблизительно 7,4 до приблизительно 9,0.
27. Способ по любому из пп. 23-26, при котором забуференный раствор содержит 45-55% (в массовом отношении) этиленгликоля.
28. Способ по любому из предыдущих пунктов, при котором каждый раствор сахара содержит дисахарид или трисахарид.
29. Способ по п. 28, при котором дисахарид содержит сахарозу, мальтозу, лактозу и их комбинации.
30. Способ по любому из предыдущих пунктов, при котором каждый раствор сахара содержит сахарозу.
31. Способ по любому из предыдущих пунктов, при котором каждый из растворов сахара дополнительно содержит трис-HCl и NaCl.
32. Способ по п. 31, при котором концентрация трис-HCl составляет от приблизительно 20 до приблизительно 50 мМ, а концентрация NaCl составляет от приблизительно 150 до приблизительно 500 мМ.
33. Способ по п. 31 или 32, при котором буферный раствор характеризуется рН от приблизительно 7,4 до приблизительно 8,5.
34. Способ по любому из предыдущих пунктов, предусматривающий работу ультрацентрифуги на первой скорости вращения менее чем 10000 об/мин в течение менее чем 60 минут и на второй скорости вращения в диапазоне от приблизительно 30000 до приблизительно 40000 об/мин в течение минимум 4 часов.
35. Способ по любому из предыдущих пунктов, предусматривающий работу ультрацентрифуги на первой скорости вращения менее чем 10000 об/мин в течение менее чем 60 минут и второй скорости вращения в диапазоне от приблизительно 30000 до приблизительно 40000 об/мин в течение минимум 12 часов.
36. Способ по п. 34 или 35, при котором первая скорость вращения составляет от приблизительно 3000 до приблизительно 6000 об/мин, необязательно, приблизительно 4000 об/мин.
37. Способ по п. 34 или 36, при котором вторая скорость вращения составляет приблизительно 35000 об/мин и, необязательно, поддерживается в течение от приблизительно 4 до приблизительно 6 часов.
38. Способ по любому из пп. 34-36, при котором вторую скорость вращения поддерживают в течение по меньшей мере приблизительно 16 часов или по меньшей мере 20 часов.
39. Способ по любому из пп. 34-36 или 38, при котором вторая скорость вращения составляет приблизительно 35000 об/мин и, необязательно, поддерживается в течение от приблизительно 16 до приблизительно 20 часов.
12
40. Способ по любому из предыдущих пунктов, при котором концентрированная фракция AAV, загруженная в зональный ротор, содержит по меньшей мере 1×10 капсидов AAV на мл.
41. Способ по любому из предыдущих пунктов, предусматривающий сбор супернатанта из клеточной культуры, содержащей клетки HEK293, трансфицированные тройной плазмидной системой.
6
42. Способ по п. 41, предусматривающий сбор супернатанта через приблизительно от 3 до приблизительно 5 дней после трансфекции клеток HEK293 или когда клеточная культура характеризуется плотностью клеток более чем или приблизительно 5×10 клеток/мл и жизнеспособностью клеток более чем 50%.
43. Способ по п. 41 или 42, предусматривающий фильтрацию собранного супернатанта с помощью глубокой фильтрации.
2
44. Способ по п. 43, предусматривающий фильтрацию собранного супернатанта через фильтр, содержащий целлюлозу и перлит и характеризующийся минимальной проницаемостью приблизительно 500 л/м.
45. Способ по п. 43, предусматривающий фильтрацию собранного супернатанта через фильтр с минимальным размером пор приблизительно 0,2 мкм.
46. Способ по любому из предыдущих пунктов, предусматривающий (i) внесение фракции AAV в колонку для анионообменной хроматографии (AEX) в условиях, которые позволяют AAV проходить через хроматографическую колонку AEX, и (ii) сбор потока, содержащего AAV.
47. Способ по п. 46, при котором фракцию AAV вносят в хроматографическую колонку AEX с загрузочным буфером, содержащим от приблизительно 100 мМ до приблизительно 150 мМ NaCl, необязательно, причем рН загрузочного буфера составляет от приблизительно 8 до приблизительно 9.
48. Способ по п. 47, при котором загрузочный буфер содержит от приблизительно 115 мМ до приблизительно 130 мМ NaCl, необязательно, причем загрузочный буфер содержит от приблизительно 120 мМ до приблизительно 125 мМ NaCl.
49. Способ по любому из предыдущих пунктов, предусматривающий концентрирование фракции AAV с использованием системы ультра/диафильтрации.
50. Способ по п. 49, предусматривающий концентрирование фракции AAV с использованием системы ультра/диафильтрации до, после или до и после стадии, предусматривающей внесение фракции AAV в колонку для анионообменной хроматографии (AEX) в условиях, которые позволяют AAV протекать через хроматографическую колонку AEX.
51. Способ по любому из предыдущих пунктов, при котором удаляют белки клетки-хозяина.
52. Способ по п. 51, при котором белки клетки-хозяина представляют собой HSP70 и/или LDH.
53. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно предусматривающий инактивацию вирусов с липидной оболочкой фракции AAV растворителем и/или детергентом.
54. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно предусматривающий нанофильтрацию фракции AAV для удаления вирусов размером более чем 35 нм.
55. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно предусматривающий стадию завершающей очистки, предусматривающей проведение AEX-хроматографии с колонкой, содержащей гель типа «щупальца».
56. Способ получения продукта AAV, предусматривающий (i) трансфекцию клеток-хозяев тремя плазмидами, (ii) сбор супернатанта клеточной культуры, содержащей трансфицированные клетки-хозяева, и (iii) осуществление способа в соответствии с любым из пп. 1-55.
57. Способ по п. 56, при котором стадии способа выполняются в порядке, показанном на фиг. 1.
58. Способ по любому из предыдущих пунктов, предусматривающий исследование фракции AAV с помощью AAV-специфического ИФА.
59. Способ по п. 58, при котором способ не предусматривает стадию измерения активности с помощью количественной ПЦР.
60. Способ по п. 58 или 59, при котором AAV-специфический ИФА представляет собой специфический для AAV сэндвич-ИФА.
61. Способ по любому из предыдущих пунктов, причем способ предусматривает первый раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы приблизительно 55%, второй раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы приблизительно 60%, и, необязательно, третий раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы приблизительно 50%.
62. Способ по любому из предыдущих пунктов, при котором AAV представляет собой AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 или AAV10.
63. Способ по любому из предыдущих пунктов, при котором AAV представляет собой AAV8.
64. Продукт AAV, полученный способом по любому из пп. 1-63.
65. Фармацевтическая композиция, содержащая продукт AAV, полученный способом по любому из пп. 1-63.