ВЕЗИКУЛЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ LACTOBACILLUS PARACASEI, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
VESICLES OBTAINED FROM LACTOBACILLUS PARACASEI AND THEIR USE

Область техники
Настоящее изобретение относится к внеклеточным везикулам, полученным из Lactobacillus paracasei, и их применению, и конкретнее, к композиции для профилактики или лечения воспалительного заболевания и рака, которая включает внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, в качестве активного ингредиента, и подобному.
Настоящая заявка притязает на приоритет и преимущество Заявок на патент Кореи №№10-2018-0174027 и 10-2019-0048671, зарегистрированных в Корейском ведомстве по интеллектуальной собственности 31 декабря 2018 и 25 апреля 2019, соответственно, и все содержание, раскрытое в описания на фигурах указанных заявок включено в данную заявку.
Уровень техники
С началом 21-го века значение острого инфекционного заболевания, которое признавалось инфекционным заболеванием в прошлом, снизилось, хотя из-за хронических заболеваний изменилась структура заболеваний и основное заболевание, которое снижает качество жизни и определяет вероятную продолжительность жизни человека. Хроническое заболевание характеризуется хроническим воспалением, сопровождающимся аномалиями иммунной функции, и заболевания, такие как различные хронические воспалительные заболевания и онкозаболевания, которые вызываются этими заболеваниями, становятся основной проблемой национального здравоохранения.
Воспаление является локальным или системным защитным механизмом против повреждения или заражения клеток и тканей, и обычно вызывается последовательными биологическими реакциями, возникающими, когда гуморальные медиаторы, которые составляют иммунную систему, непосредственно отвечают на повреждение или инфекцию или стимулируют местную или системную эффекторную систему. Примеры основного воспалительного заболевания включают заболевания органов пищеварения, такие как гастрит и энтерит, заболевания полости рта, такие как периодонтит, респираторные заболевания, такие как астма, хроническая обструктивная болезнь легких (COPD) и ринит, артрит, такой как дегенеративный артрит и ревматоидный артрит, онкозаболевания и подобное.
Распространенные композиции, используемые для лечения или предупреждения хронических воспалительных заболеваний, в основном делят на стероидные и нестероидные композиции, большинство из которых во многих случаях часто сопровождается различными побочными действиями. Поэтому в последнее время существует тенденция к увеличению интереса к ингибитору TNF-α, который является провоспалительным цитокином, известным как основная причина хронических воспалительных заболеваний.
Однако разработка лекарственных средств, которые имеют слабое побочное действие и могут по существу использоваться для предупреждения и лечения хронических воспалительных заболеваний путем эффективного подавления экспрессии TNF-α, на сегодняшний день еще недостаточная, и то же самое относится к противораковым терапевтическим средствам.
Раскрытие
Техническая проблема
Настоящее изобретение разработано для решения вышеуказанных проблем в соответствующей области техники, и его целью является создание композиции для облегчения, предупреждения или лечения воспалительного заболевания и рака, которая включает внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, в качестве активного ингредиента, и т.п.
Однако техническая проблема, которая должна быть успешно решена настоящим изобретением, не ограничивается вышеуказанными проблемами, и другие проблемы, которые не упомянуты, могут быть ясно поняты специалистами в данной области техники из последующего описания.
Техническое решение
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики или лечения воспалительного заболевания или рака, которая включает внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, в качестве активного ингредиента.
Кроме того, настоящее изобретение относится к пищевой композиции для предупреждения или облегчения воспалительного заболевания или рака, которая включает внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, в качестве активного ингредиента.
Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции лекарства для ингаляции для предупреждения или облегчения воспалительного заболевания или рака, которая включает внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, в качестве активного ингредиента.
Кроме того, настоящее изобретение относится к косметической композиции для предупреждения или облегчения воспалительного заболевания или рака, которая включает внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, в качестве активного ингредиента.
Воспалительное заболевание в настоящем изобретении является заболеванием, опосредуемым TNF-α или IL-1β, и включает энтерит (острый энтерит, хронический энтерит и т.п.), гастрит, астму, хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), ринит, атопический дерматит, алопецию, псориаз, дегенеративный артрит и ревматоидный артрит, но не ограничивается этим до тех пор, пока воспалительное заболевание является заболеванием, вызванным воспалительной реакцией.
Рак в настоящем изобретении включает колоректальный рак, рак желудка, рак легких, рак печени, рак желчных протоков, панкреатический рак, рак молочной железы, рак яичников, рак почек, рак мочевого пузыря и рак предстательной железы, но не ограничивается этим.
В одном воплощении настоящего изобретения внеклеточные везикулы имеют средний диаметр предпочтительно 10-300 нм, но не ограничиваются этим до тех пор, пока внеклеточные везикулы являются внеклеточными везикулами, которые естественно или искусственно секретированы или выделены из Lactobacillus paracasei.
В другом воплощении настоящего изобретения внеклеточные везикулы могут быть выделены из раствора культуры Lactobacillus paracasei или пищевого продукта, ферментированного путем добавления Lactobacillus paracasei, но без ограничения этим.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения воспалительного заболевания или рака, включающему стадию введения субъекту композиции, включающей внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, в качестве активного ингредиента.
Также настоящее изобретение относится к применению композиции для профилактики и/или лечения воспалительного заболевания или рака, которая включает внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, в качестве активного ингредиента.
Кроме того, настоящее изобретение относится к применению внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, для производства лекарственного средства, используемого против воспалительного заболевания и/или рака.
Выгодные эффекты
Так как внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, согласно настоящему изобретению могут эффективно подавлять экспрессию TNF-α, IL-1β и т.п., которые являются противовоспалительными цитокинами, известными в качестве факторов различных хронических воспалительных заболеваний, ожидается, что внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, согласно настоящему изобретению могут быть широко использованы в качестве агента для облегчения, предупреждения или лечения различных хронических воспалительных заболеваний и рака с небольшими побочными действиями.
Описание чертежей
Фиг.1А и 1В являются изображениями, иллюстрирующими результаты анализа внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, согласно примеру осуществления настоящего изобретения.
Фиг.2А и 2В являются изображениями, иллюстрирующими результаты подтверждения цитотоксичности и действия на индукцию воспаления внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, согласно примеру осуществления настоящего изобретения.
Фиг.3 является изображением, иллюстрирующим результаты подтверждения противовоспалительного действия внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, согласно примеру осуществления настоящего изобретения.
Фиг.4А и 4В являются изображениями, иллюстрирующими результаты подтверждения методом количественной ПЦР с детекцией в реальном времени (qRT-PCR) действия внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei согласно примеру осуществления настоящего изобретения, на супрессию ЛПС-индуцированных воспалительных реакций.
Фиг.5А и 5В являются изображениями, иллюстрирующими результаты подтверждения методом вестерн-блоттинга действия внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, согласно примеру осуществления настоящего изобретения, на супрессию ЛПС-индуцированных воспалительных реакций.
Фиг.6А-6Е являются изображениями, иллюстрирующими результаты подтверждения методом гистологического анализа действия внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, на супрессию воспалительных реакций при ДСН-индуцированном колите, согласно примеру воплощению настоящего изобретения.
Фиг.7А-7D являются изображениями, иллюстрирующими результаты подтверждения методом qRT-PCR действия внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, на супрессию воспалительных реакций при ДСН-индуцированном колите согласно примеру воплощения настоящего изобретения.
Фиг.8А и 8В являются изображениями, иллюстрирующими результаты подтверждения методом вестерн блоттинга действия внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, на супрессию воспалительных реакций при ДСН-индуцированном колите согласно примеру воплощения настоящего изобретения.
Фиг.9 является изображением, иллюстрирующим результаты измерения размеров опухоли со временем после перорального введения внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, на модели рака, полученной трансплантацией раковых клеток, согласно примеру осуществления настоящего изобретения.
Варианты осуществления изобретения
В настоящем изобретении было подтверждено, что внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, оказывают заметное терапевтическое действие при воспалительных заболеваниях путем эффективного подавления экспрессии различных факторов, связанных с воспалительными реакциями. Соответственно, ожидается, что внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei по настоящему изобретению, можно различным образом использовать для облегчения, предупреждения и лечения различных хронических воспалительных заболеваний и рака.
При использовании в настоящем описании термин «внеклеточная везикула» относится к структуре, образованной наноразмерной мембраной и секретированной различными бактериями, и в настоящем изобретении «внеклеточная везикула» относится ко всем структурам, образованным из мембраны, и естественным образом секретируемым или искусственно полученным из Lactobacillus paracasei. Внеклеточные везикулы можно выделить из культурального раствора, содержащего Lactobacillus paracasei, используя один или несколько методов, выбранных из группы, включающей центрифугирование, ультраскоростное центрифугирование, обработку высоким давлением, экструзию, обработку ультразвуком, лизис клеток, гомогенизацию, замораживание-оттаивание, электропорацию, механическое разложение, химическую обработку, фильтрацию через фильтр, гель-фильтрационную хроматографию, электрофорез в свободном потоке и капиллярный электрофорез. Также можно дополнительно включить такой способ, как промывка для удаления примесей и концентрирование полученных везикул.
При использовании в настоящем описании «воспалительным заболеванием» называется заболевание, вызванное воспалительными реакциями in vivo, и их характерные примеры включают респираторные воспалительные заболевания, такие как астма, хроническая обструктивная болезнь легких и ринит; кожные воспалительные заболевания, такие как атопический дерматит, псориаз, контактный дерматит и алопеция; воспалительные заболевания пищеварительного тракта, такие как гастрит, язва желудка и энтерит (острый энтерит, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника, колит Бехчета, неспецифический язвенный колит, бактериальный энтерит и т.п.); вагинит; артрит, такой как остеоартрит и ревматоидный артрит; их осложнения и т.п. Также термин «воспалительное заболевание» используют со значением, охватывающим помимо общих воспалительных заболеваний болезни обмена веществ, связанные с воспалительными реакциями, примеры которых включают диабет, ожирение, гепатит, склероз печени и т.п.
При использовании в настоящем описании термин «предупреждение» относится ко всем действиям, которые подавляют воспалительное заболевание и рак или отодвигают их начало через введение пищевой, косметической, вводимой ингаляцией или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.
При использовании в настоящем описании термин «лечение» относится ко всем действиям, которые облегчают или благоприятно изменяют симптомы воспалительного заболевания и рака через введение пищевой, косметической, вводимой ингаляцией или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.
При использовании в настоящем описании термин «облегчение» относится ко всем действиям, которые по меньшей мере уменьшают параметр, связанный с состоянием, от которого лечат, например, степень выраженности симптомов.
При использовании в настоящем описании термин «индивидуум» относится к субъекту, нуждающемуся в лечении от заболевания, и конкретнее, относится к млекопитающему, такому как человек или примат, не являющийся человеком, мышь, крыса, собака, кошка, лошадь и корова.
При использовании в настоящем описании «фармацевтическая композиция» может быть представлена в форме капсулы, таблетки, гранулы, инъекции, мази, порошка или напитка, и фармацевтическая композиция может быть предназначена для людей. Каждая фармацевтическая композиция может быть составлена в форме пероральной лекарственной формы, такой как порошок, гранула, капсула, таблетка или водная суспензия, наружного препарата, суппозитория или стерильного раствора для инъекции, но ее состав этим не ограничивается. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может включать фармацевтически приемлемый носитель. В качестве фармацевтически приемлемого носителя может быть использовано связующее, лубрикант, дезинтегратор, эксципиент, солюбилизатор, диспергатор, стабилизатор, суспендирующий агент, краситель, корригент и т.п. для перорального введения, смесь буферирующего агента, консерванта, аналгетика, солюбилизатора, изотонического агента, стабилизатора и т.п. может быть использована для инъекции, и основа, эксципиент, лубрикант, консервант и т.п. могут использоваться для местного введения. Препарат фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно получить различным образом, смешивая фармацевтическую композицию по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем, описанным выше. Например, препарат можно получить в форме таблетки, пастилки, капсулы, эликсира, суспензии, сиропа, облатки и т.п. для перорального введения и в виде стандартных ампул с лекарством или многих лекарственных форм для инъекции. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению также можно включать в растворы, суспензии, таблетки, капсулы, препараты с отсроченным высвобождением и т.п.
Между тем, в качестве примеров подходящих носителей, эксципиентов и разбавителей для препарата можно использовать лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтитол, крахмал, смолу акации, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло или подобное. Также фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать наполнитель, антикоагулянт, лубрикант, смачиватель, корригент, эмульгатор, консервант и т.п.
Путь введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению включает, но без ограничения, пероральный, внутривенный, внутримышечный, интраартериальный, интрамедуллярный, интрадуральный, внутрисердечный, трансдермальный, подкожный, интраперитонеальный, интраназальный, интестинальный, местный, сублингвальный и ректальный пути. Предпочтительно пероральное или парентеральное введение. При использовании в настоящем описании термин «парентеральный» имеет значение, которое включает подкожную, интрадермальную, внутривенную, внутримышечную, интраартериальную, интрасиновиальную, интрастернальную, интрадуральную, внутрибрюшинную и внутричерепную инъекцию или методы инъекции. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению также можно вводить в форме суппозитория для ректального введения.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может изменяться в зависимости от различных факторов, включая активность конкретных используемых соединений, возраст, массу тела, состояние здоровья, пол, питание, время введения, путь введения, скорость экскреции, комбинацию лекарств и тяжесть определенного заболевания, которое предупреждают или от которого лечат, и дозировка фармацевтической композиции изменяется в зависимости от состояния и массы тела пациента, тяжести заболевания, формы лекарственного средства, пути и длительности введения, но может быть соответствующим образом выбрана специалистом в данной области техники, и может составлять 0,0001-50 мг/кг или 0,001-50 мг/кг в день. Введение можно выполнять один раз в сутки, и его можно разделить на несколько раз. Дозировка не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть приготовлена в виде пилюль, покрытых сахаром таблеток, капсул, гелей, сиропов, взвесей и суспензий.
В настоящем изобретении пищевую композицию можно использовать для различных пищевых продуктов, например, напитков, жевательных резинок, чаев, витаминных комплексов, добавок к продуктам для здорового питания, и можно использовать в форме пилюли, порошка, гранулы, инфузии, таблетки, капсулы или напитка. Пищевая композиция включает пищевую композицию для функционального здорового питания. В этом случае в настоящем изобретении, как правило, количество внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, используемых в пищевом продукте или напитке, может составлять 0,01-15 мас.% относительно общей массы продукта в случае пищевой композиции, и может находиться в соотношении 0,02-10 г, и предпочтительно 0,3-1 г на 100 мл в случае композиции оздоравливающего напитка. При использовании в настоящем описании продукт для функционального здорового питания представляет собой пищевой продукт, который получен и/или переработан с использованием сырья или ингредиента, имеющего функцию, полезную для человеческого организма, и относится к продукту, который имеет уникальную особенность в своем составе по сравнению с обычными продуктами, и лучше поддерживает здоровье, реализует назначение или обеспечивает ожидаемые эффекты.
Пищевая композиция по настоящему изобретению может включать типичную пищевую добавку, например, вкусоароматический агент, вкусовой агент, краситель, наполнитель, стабилизатор и т.п. Пищевая композиция по настоящему изобретению особо не ограничивается в ингредиенте, добавляемом как основной ингредиент в дополнении к внеклеточным везикулам, полученным из Lactobacillus paracasei, и может содержать различные ароматизаторы или природные углеводы и т.п. в качестве дополнительного ингредиента. Примеры вышеуказанных природных углеводов включают обычные сахара, такие как моносахариды, например, глюкоза, фруктоза и т.п.; дисахариды, например, мальтоза, сахароза и т.п.; и полисахариды, например, декстрин, циклодекстрин и т.п., и сахарные спирты, такие как ксилит, сорбит и эритрит. В качестве вкусоароматического агента иного, чем описанные выше, можно выгодно использовать натуральный ароматизатор (тауматин, экстракт стевии (например, ребаудиозид A, глицирризин и т.п.) и синтетический корригент (сахарин, аспартам и т.п.). Доля природного углевода обычно составляет примерно 1-20 г, и предпочтительно примерно 5-12 г на 100 мл композиции по настоящему изобретению.
Пищевая композиция по настоящему изобретению может содержать, кроме добавок, различные питательные вещества, витамины, минералы (электролиты), вкусоароматические вещества, такие как синтетические вкусоароматические вещества и натуральные вкусоароматические вещества, красители и наполнители (сыр, шоколад и т.п.), пектиновую кислоту и ее соли, альгиновую кислоту и ее соли, органические кислоты, защитные коллоидные загустители, регуляторы рН, стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирты, газирующие агенты, используемые в газированных напитках, или подобные. Эти ингредиенты можно использовать или по одному или в комбинации. Доля таких добавок несущественная, но обычно выбирается в интервале 0-20 массовых частей на 100 массовых частей композиции по настоящему изобретению.
В настоящем изобретении косметическая композиция может содержать внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, в количестве 0,0005-50 мас.% относительно общей массы композиции. Кроме того, косметическая композиция по настоящему изобретению также может содержать один или несколько активных ингредиентов, кроме внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, проявляющих такие же или подобные функции
Косметическое средство, полученное с использованием косметической композиции по настоящему изобретению, можно получить в форме обычного препарата-эмульсии и обычного солюбилизированного препарата. Примеры косметического средства препарата-эмульсии включают питательный лосьон, крем, эссенцию и т.п., и примеры косметического средства солюбилизированного препарата включают смягчитель кожи. Кроме того, за счет содержания дерматологически приемлемой среды или основы косметическое средство можно получить в форме вспомогательного средства, которое можно применять местно или системно, и которое обычно используется в области дерматологии.
Подходящий косметический препарат может быть предоставлен в форме, например, раствора, геля, твердой или безводной пасты, эмульсии, суспензии, микроэмульсии, микрокапсул, микрогранул или ионной (липосомной) или неионной дисперсии везикул, которую получают путем диспергирования масляной фазы в водной фазе, крема, тоника для кожи, лосьона, порошка, мази, спрея или консилера. Кроме того, косметическую композицию можно получить в форме пенки или аэрозольной композиции, которая дополнительно содержит сжатый пропеллент.
Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать вспомогательные агенты, обычно используемые в области косметологии или дерматологии, такие как жировое вещество, органический растворитель, солюбилизатор, загуститель и желирующее вещество, умягчитель, антиоксидант, суспендирующий агент, стабилизатор, пенообразующий агент, отдушка, поверхностно-активное вещество, вода, ионный или неионный эмульгатор, наполнитель, агент, секвестирующий ионы металлов, хелатирующий агент, консервант, витамин, блокирующий агент, смачиватель, душистое масло, краситель, пигмент, гидрофильный или липофильный активный агент, липидные везикулы или любые другие ингредиенты, обычно используемые в косметике. Кроме того, ингредиенты можно вводить в количестве, обычно используемом в области дерматологии.
Примеры продуктов, к которым можно добавлять косметическую композицию по настоящему изобретению, включают такие косметические средства, как вяжущие средства, смягчители кожи, питательные тонеры, различные кремы, эссенции, маски, основы и т.п., очищающие средства, очищающие средства для лица, мыла, средства по уходу, косметические жидкости и т.п.
Отдельные препараты косметической композиции по настоящему изобретению включают лосьон для кожи, смягчитель кожи, тонер для кожи, вяжущее средство, лосьон, молочко, увлажняющий лосьон, питательный лосьон, массажный крем, питательный крем, крем для рук, эссенцию, питательную эссенцию, маску, мыло, шампунь, очищающую пену для лица, очищающий лосьон, лосьон для ухода за телом, средство для мытья тела, эмульсию, компактную пудру, рассыпную пудру, тени для глаз и т.п.
В композиции для ингаляции по настоящему изобретению активный ингредиент может быть добавлен прямо в ингалятор или может использоваться в комбинации с другими ингредиентами, и, соответственно, может использоваться согласно общему методу. Подмешиваемое количество активного ингредиента можно, соответственно, определить согласно цели его использования (для профилактики или лечения).
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения воспалительного заболевания или рака, включающему стадию введения композиции, включающей внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, в качестве активного ингредиента.
Кроме того, настоящее изобретение относится к применению фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения воспалительного заболевания или рака, которая включает внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, в качестве активного ингредиента.
Кроме того, настоящее изобретение относится к применению внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, для получения лекарственного средства, используемого против воспалительного заболевания или рака.
В настоящем изобретении «введение» означает введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению пациенту любым подходящим способом, и в отношении пути введения композиции по настоящему изобретению, композицию по настоящему изобретению можно вводить различными пероральными или парентеральными путями до тех пор, пока композиция по настоящему изобретению может достигать целевую ткань.
Далее в настоящем описании будут представлены предпочтительные примеры, чтобы поспособствовать пониманию настоящего изобретения. Однако следующие далее примеры приводятся только для более ясного понимания настоящего изобретения, и объем настоящего изобретения не ограничивается следующими далее примерами.
Примеры
Пример 1. Выделение внеклеточных везикул из Lactobacillus paracasei
600 нм
Для того чтобы выделить внеклеточные везикулы (EV), получаемые из Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paracasei инокулируют в среду Мана, Рогоза и Шарпа (MRS), культивируют при 37°C и 200 об/мин до поглощения (OD) 1,0-1,5, и затем Lactobacillus paracasei снова инокулируют в среду Луриа-Бертани (LB) и культивируют. Затем получают супернатант, из которого удаляют бактериальные клетки, путем извлечения культурального раствора, включающего бактериальные клетки, и выполняют центрифугирование при 4°C и 10000 g в течение 20 минут. Полученный супернатант снова фильтруют с использованием фильтра 0,22 мкм, и фильтрованный супернатант концентрируют до объема 50 мл или меньше с использованием кассетного мембранного фильтра 100 кДа, Pellicon 2 (Merck Millipore), и насосной системы MasterFlex (Cole-Parmer). Внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, выделяют фильтрацией концентрированного супернатанта снова с использованием фильтра 0,22 мкм. Количество белка, заключенного в супернатанте, измеряют с использованием набора для анализа белка Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific). Затем выделенные внеклеточные везикулы наблюдают с использованием трансмиссионного электронного микроскопа JEM-1011 (TEM, JEOL) и Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments). В качестве контроля тем же способом выделяют внеклеточные везикулы, полученные из Escherichia coli. Результаты приведены на фиг.1A и 1B.
Как показано на фиг.1А и 1В, было подтверждено, что внеклеточные везикулы, выделенные из культуры Lactobacillus paracasei, имеют средний диаметр 34,22 нм и выделяются нормально.
Пример 2. Получение бактериальных клеток Lactobacillus paracasei
Для того чтобы сравнить внеклеточные везикулы, выделенные из культуры Lactobacillus paracasei, с бактериальными клетками, получают бактериальные клетки Lactobacillus paracasei. Конкретнее, после того как бактериальные клетки Lactobacillus paracasei, культивированные таким же способом, как в примере 1, греют при 70°С в течение 1 часа, получают бактериальные клетки, инактивированные нагреванием, из которых удаляют супернатант центрифугированием при 4°C и 10000g в течение 20 минут. Затем, после повторного разведения бактериальных клеток с использованием забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), измеряют количество белка с использованием набора для анализа белка Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific).
Пример 3. Подтверждение действия внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, на индукцию воспаления
Для того чтобы подтвердить действие внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, на воспалительную реакцию в воспалительных клетках, внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, используют для обработки линии мышиных макрофагов Raw 264.7 в концентрации 0,1, 1 и 10 мкг/мл, и оставляют для прохождения реакции, а затем измеряют степень апоптоза клеток и количество секретированного TNF-α. Конкретнее, клетки Raw 264.7, которые распределены в 48-луночном культуральном планшете при плотности 5×10 клетки/лунка, обрабатывают везикулами, полученными из Lactobacillus paracasei, в бессывороточной модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) и культивируют в течение 12 часов. Затем измеряют степень апоптоза клеток с использованием EZ-CYTOX (Dogen), раствор клеточной культуры помещают в 1,5-мл пробирку, получают только их супернатант центрифугированием при 3000 g в течение 5 минут и затем хранят при -80°C, и выполняют ELISA. Для ELISA иммобилизованные антитела разбавляют забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS), и их 50-мкл аликвоты распределяют в 96-луночном планшете, и затем оставляют для протекания реакции при 4°C в течение 16 часов. Затем образец промывают три раза 100 мкл раствора PBST (PBS, содержащий 0,05% твина-20), и затем добавляют раствор RD (PBS, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA)) аликвотами по 100 мкл на лунку, с последующей блокировкой при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем испытываемый образец и эталон приводят к одинаковой концентрации, добавляют (в лунки) по 50 мкл обоих образцов, и полученный раствор оставляют реагировать при комнатной температуре в течение 2 часов, и промывают три раза, используя PBST. Затем антитела для детекции разбавляют RD, добавляют по 50 мкл полученного раствора на лунку, позволяют реагировать при комнатной температуре в течение 2 часов, и промывают три раза, используя PBST, для полного удаления несвязанных антител, и затем добавляют по 50 мкл стрептавидин-HRP (система R&D), разбавленного 1/40 в RD, на лунку, и полученной смеси позволяют реагировать при комнатной температуре в течение 20 минут. Наконец, образец и эталон промывают три раза по 100 мкл PBST, затем добавляют тетраметилбензидиновый (TMB) субстрат (SurModics, USA) в 50-мкл аликвотах на лунку, и затем, когда через 5 минут - 20 минут проявится окраска, добавляют 1М серную кислоту в 50-мкл аликвотах на лунку, посредством чего останавливают реакцию, и измеряют поглощение при 450 нм с использованием аппарата для прочтения микропланшетов SpectraMax M3 (Molecular Devices). Результаты приводятся на фиг.2A и 2B.
Как показано на фиг.2А, было подтверждено, что внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, не влияют на жизнеспособность клеток, и
Как показано на фиг.2В, было подтверждено, что при обработке высокой концентрацией - 10 мкг/мл или выше, внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, промотируют секрецию медиатора воспаления в линии мышиных макрофагов.
Пример 4. Подтверждение противовоспалительного действия внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei
Для того чтобы подтвердить противовоспалительное действие внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, используют для предварительной обработки клеточной линии мышиных макрофагов Raw 264.7 в концентрации 0,1, 1 и 10 мкг/мл, клетки культивируют, и затем измеряют количество секретированного TNF-α. Конкретнее, после внесения аликвот клеток Raw 264.7 в 48-луночный планшет в концентрации 5×10клетки/лунка, внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, которые разбавлены бессывороточной средой DMEM, или внеклеточные везикулы, полученные так же, как в примере 2, используют для обработки аликвот клеток Raw 264.7, и клетки культивируют в течение 12 часов. Затем образцы снова обрабатывают внеклеточными везикулами, полученными из Escherichia coli, в концентрации 1 мкг/мл, и затем культивируют еще в течение 12 часов. Затем измеряют количество секретированного TNF-α таким же способом, как в примере 3. Результаты приводятся на фиг.3.
Как показано на фиг.3, было подтверждено, что образец, предварительно обработанный бактериальными клетками Lactobacillus paracasei, не показывает существенного снижения секреции TNF-α внеклеточными везикулами, полученными из Escherichia coli, в то время как в образце, обработанном внеклеточными везикулами, полученными из Lactobacillus paracasei, секреция TNF-α внеклеточными везикулами, полученными из Escherichia coli, значимо снижается в зависимости от концентрации. На основании результата можно утверждать, что воспалительная реакция, вызванная патогенными бактериями или внеклеточными везикулами, полученными из патогенных бактерий, может быть эффективно подавлена с использованием внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei.
Пример 5. Подтверждение действия внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, на подавление воспалительной реакции, вызванной ЛПС
5.1. Эксперимент с qRT-PCR
Для того чтобы подтвердить действие внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, на подавление воспалительной реакции, вызванной липополисахаридами (ЛПС), клеточную линию НТ29 как линию клеток колоректального рака обрабатывают ЛПС и/или внеклеточными везикулами, полученными из Lactobacillus paracasei. Конкретнее, после культивирования клеточной линии НТ29 в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (PBS), 100 Е/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина клетки промывают с использованием забуференного фосфатом физиологического раствора. Затем, после культивирования в бессывороточной DMEM в течение 3 час, используют для предварительной обработки внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, в концентрации 500 нг/мл, и клетки культивируют в течение 12 часов. Культивированные клетки обрабатывают 1 мкг/мл ЛПС и затем снова культивируют в течение 12 часов. Затем выполняют количественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (qRT-PCR). Для того чтобы выполнить qRT-PCR, после экстрагирования сначала полной РНК из культивированных клеток с использованием реагента TRIZOL (Invitrogen) согласно протоколу, предложенному изготовителем, измеряют количество РНК с использованием спектрофотометра NanoDrop 2000, затем синтезируют кДНК с использованием обратной транскриптазы M-MLV, и выполняют qRT-PCR с использованием синтезированной кДНК в качестве матрицы. qRT-PCR выполняют с использованием систем Quant3 Studio Real-time PCR Systems (Applied Biosystems), и для количественного определения qRT-PCR выполняют с использованием набора CyberGreen qPCR Mastermix согласно протоколу, предложенному изготовителем. Последовательности используемых праймеров приводятся в таблице 1, и результаты приведены на фиг.4A и 4B.
Таблица 1
Ген
Праймеры (5' - 3')
SEQ ID No.
IL1α
TCAAGGAGAGCATGGTGGTA
1
IL1α
GTGCTGACCTAGGCTTGATG
2
IL1β
AGCTCGCCAGTGAAATGATG
3
IL1β
CGGAGATTCGTAGCTGGATG
4
IL2
AACCTCTGGAGGAAGTGCTA
5
IL2
AATGGTTGCTGTCTCATCAGC
6
IL3
CACGCGACATCCAATCCATA
7
IL3
TCAAAGTCGTCTGTTGAGCC
8
IL4
CCGAGTTGACCGTAACAGAC
9
IL4
GTTCTCTCTGGGCTTTGTAGG
10
TNFα
ATCATCTTCTCGAACCCCGA
11
TNFα
GTTATCTCTCAGCTCCACGC
12
IL10
CCTGCCTAACATGCTTCGAG
13
IL10
GTCTTGGTTCTCAGCTTGGG
14
TGFβ
GACTCGCCAGAGTGGTTATC
15
TGFβ
GGTAGTGAACCCGTTGATGT
16
β-актин
AACTACCTTCAACTCCATC
17
β-actin
CTTGCTGATCCACATCTG
18
Как показано на фиг.4А и 4В, было подтверждено, что как только воспалительная реакция промотирована ЛПС, уровни экспрессии провоспалительных цитокинов IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3 и TNF-α повышаются, но в клетках (LpEV), предварительно обработанных внеклеточными везикулами, полученными из Lactobacillus paracasei, экспрессия провоспалительных цитокинов, которая повысилась, подавляется. Кроме того, было подтверждено, что экспрессия IL-10 и TGF-β повысилась.
5.2. Эксперимент с вестерн-блоттингом
Для того, чтобы подтвердить действие внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, на подавление воспалительной реакции, вызванной липополисахаридами (ЛПС), выполняют вестерн-блоттинг. После того, как клетки, полученные так, как описано в примере 5.1, дважды промоют с использованием холодного забуференного фосфатом физиологического раствора и лизируют с использованием буфера для лизиса RIPA (50 мМ трис-HCl (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 1,0% NP-40, 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% додецилсульфата натрия (SDS), 50 мМ NaF, 0,1 мМ фенилметансульфонилфторида и 0,5% коктейля ингибиторов протеаз), клеточный дебрис тщательно удаляют центрифугированием при 4°C и 12000 (g в течение 5 минут, и затем измеряют количество белка с использованием набора для анализа белка Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific). Затем выполняют отделение белка, подвергая 40 мкг белка ДНС-ПААГ (Bio-Rad Laboratories) с использованием 8-12% ДСН-полиакриламидного геля, и белок, который отделен, переносят на нитроцеллюлозную мембрану Hybond™-ECL (Amersham Bioscience). Затем мембрану, на которую перенесен белок, блокируют при комнатной температуре в течение 1 часа с использованием TBST с добавлением 5% сепарированного молока и затем обрабатывают первичными антителами, разведенными 1:2000, и позволяют реакции протекать при 4°C в течение 16 часов. Затем мембрану промывают три раза с использованием TBST и затем обрабатывают вторичными антителами, с которыми связана пероксидаза из хрена (HRP), разведенная 1:2000, оставляют взаимодействовать при комнатной температуре в течение 1 часа и наблюдают, используя систему детекции ECL (Amersham). Антитела против COX-2 и активированного MMP9, закупали у SantaCruz, антитела против NFκ и iNOS закупали у BioLegend, а антитела против β-актина, фосфо-Iκκ и Iκ закупали у Cell Signaling Technology и использовали. Результаты приведены на фиг.5A и 5B.
Как показано на фиг.5А и 5В, было подтверждено, что в контроле, обработанном одним ЛПС, уровни экспрессии Cox2, активированного MMP9 и iNOS, повышаются в соответствии со временем обработки ЛПС (2, 6, 12 и 24 часа), и промотируется фосфорилирование Iκ, и было подтверждено, что промотируется переход NFκ в ядро. Однако было подтверждено, что в случае клеток, предварительно обработанных внеклеточными везикулами, полученными из Lactobacillus paracasei, экспрессия воспалительных белков, вызванная обработкой ЛПС, снижается, фосфорилирование Iκ подавляется, и подавляется переход NFκ в ядро. На основании результатов можно утверждать, что Lactobacillus paracasei может эффективно подавлять воспалительную реакцию, вызванную ЛПС.
Пример 6. Подтверждение действия внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, на подавление воспалительной реакции при ДСН-индуцированном колите
6.1. Гистологический анализ
Для того чтобы подтвердить влияние внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, на лечение ДСН-индуцированного колита, вызывают колит путем обработки мышей декстран-сульфатом натрия (ДСН). Конкретнее, после выдержки 7-недельных самцов мышей C57BL/6 в обычных условиях в течение недели периода акклиматизации, с питьевой водой смешивают 2 мас./об.% ДСН (MP Biomedicals, LLC) и дают в течение 5 дней. Контрольной группе в течение 5 дней предоставляют обычную питьевую воду. В день 1 после введения ДСН мышам с использованием перорального зонда инъецируют 10 мг на мышь внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei. Затем через 13 дней после начала эксперимента мышам дают наркоз, извлекают толстую кишку и затем измеряют длину от илеоцикального соединения до прямой кишки, и извлеченные кишки хранят при -80°C для следующего эксперимента. Ежедневно регистрируют индекс активности болезни (DAI), массу тела, консистенцию стула и уровень крови в стуле. Конкретнее, индекс активности болезни обозначают как 1, 2, 3 и 4, что соответствует массам тела, которые составляет 100% или больше, 90 - 100%, 80 - 90% и 80% или меньше по отношению к массе тела в день 0, соответственно, и консистенцию стула обозначают как 1, 2, 3 и 4, что соответствует стулу нормальному, несколько жидкому стулу, жидкому стулу и водянистому стулу, соответственно. Кроме того, уровень крови в стуле обозначают как 1, 2, 3 и 4, что соответствует стулу нормальному, стулу с кровью, крови в анусе и крови как в стуле, так и в анусе, соответственно. Результаты приведены на фиг.6A - 6E.
Было подтверждено, что длина толстой кишки сокращается у мышей, которым вводили ДСН, но начальная длина толстой кишки сохраняется в экспериментальной группе, которой вместе с ДСН вводили внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei (фиг.6А и 6Е). Кроме того, было подтверждено, что в экспериментальной группе, которой вместе с ДСН вводили внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, масса тела сохраняется на уровне, схожем с уровнем контроля, и индекс тяжести болезни также снижается по сравнению с индексом у мышей, которым вводили ДСН (фиг.6В и 6D). Кроме того, было подтверждено, что экспериментальная группа, которой (вместе с ДСН) вводили внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, показывает такую же жизнеспособность, как группа контроля (фиг.6С). На основании этих результатов можно утверждать, что внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, могут эффективно подавлять колит, вызванный ЛПС.
6.2. Эксперимент с qRT-PCR
Для того чтобы подтвердить влияние внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, на лечение вызванного ДСН колита, выполняют qRT-PCR таким же способом, как в примере 5.1, экстрагируя мРНК из толстой кишки, хранящейся при -80°С. Результаты приведены на фиг.7А-7D.
Как показано на фиг.7А-7D, было подтверждено, что у мышей (LpEV), предварительно обработанных внеклеточными везикулами, полученными из Lactobacillus paracasei, экспрессия провоспалительных цитокинов TNF-α и IL-1β, которая возрастала, заметно снижается, и экспрессия IL-10 и TGF-β возрастала. На основании этих результатов можно утверждать, что воспалительная реакция, вызываемая ДСН, эффективно подавляется внеклеточными везикулами, полученными из Lactobacillus paracasei.
6.3. Эксперимент с вестерн-блоттингом
Для того чтобы подтвердить влияние внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, на лечение колита, вызванного ДСН, выполняют вестерн-блоттинг таким же способом, как в примере 5.2, экстрагируя белок из толстой кишки, хранящейся при -80°С. Результаты приведены на фиг.8А и 8В.
Как показано на фиг.8А и 8В, было подтверждено, что у мышей, обработанных внеклеточными везикулами, полученными из Lactobacillus paracasei, уровень экспрессии воспалительного белка, вызванной обработкой ДСН, снижается, деградация Iκ подавляется из-за супрессии фосфорилирования Iκ, и переход NFκ в ядро подавляется. На основании этих результатов можно утверждать, что воспалительная реакция, вызванная ДСН, эффективно подавляется внеклеточными везикулами, полученными из Lactobacillus paracasei.
Пример 7. Подтверждение противоракового действия внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei
6
Для того чтобы подтвердить противораковое действие внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, вызывают рак у мышей инъекцией клеток CT26, клеток мышиного колоректального рака. Конкретнее, после выдержки 6-недельных самцов мышей C57BL/6 в обычных условиях в течение 3 дней периода акклиматизации, им вводят перорально 20 мкг внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, в течение 5 дней. Вводят перорально PBS контрольной группе (PBS) в течение 5 дней. В день 8 после начала эксперимента мышам инъецируют подкожно 1 (10 клеток CT26 в качестве клеток мышиного колоректального рака. Затем один раз в день в течение 5 дней в неделю в течение 3 недель вводят перорально 20 мкг внеклеточных везикул, полученных из Lactobacillus paracasei, или PBS, причем в то же время измеряют объем раковой опухоли.
Как показано на фиг.9, было подтверждено, что в контрольной группе, которой вводили только один PBS, размер опухоли экспоненциально возрастает, но в экспериментальной группе, которой вводили перорально внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, размер опухоли меньше, чем у контроля, примерно на 50%. На основании этих результатов можно утверждать, что внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, эффективно подавляют рост раковой опухоли.
На основании этих результатов было подтверждено, что внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, по настоящему изобретению проявляют противовоспалительное действие, эффективно подавляя экспрессию TNF-α и т.п., известных в качестве факторов различных хронических воспалительных заболеваний, и проявляют профилактическое и/или лечебное действие в отношении различных воспалительных заболеваний и рака путем эффективного подавления роста опухолей на животной модели рака, так что ожидается, что внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, по настоящему изобретению можно использовать для облегчения, профилактики или лечения различных воспалительных заболеваний и рака.
Приведенное выше описание приводится в целях пояснения, и специалисты в данной области техники, которым адресовано настоящее изобретение, поймут, что настоящее изобретение можно легко модифицировать в другие конкретные формы без изменения технической сущности или существенных особенностей настоящего изобретения. Поэтому следует иметь в виду, что приведенные выше примеры являются только пояснительными во всех аспектах и не являются ограничительными.
Промышленная применимость
Так как внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, согласно настоящему изобретению могут эффективно подавлять экспрессию TNF-α, IL-1β и т.п., которые известны как факторы различных хронических воспалительных заболеваний, ожидается, что внеклеточные везикулы, полученные из Lactobacillus paracasei, согласно настоящему изобретению можно широко использовать в качестве средства для облегчения, профилактики или лечения различных хронических воспалительных заболеваний и рака, имеющего слабое побочное действие, так что промышленная применимость имеет место.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> МД ХЕЛТКЕАР ИНК.
<120> ВЕЗИКУЛЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ LACTOBACILLUS PARACASEI,
И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
<130> MPO19-102RU
<150> KR 10-2018-0174027
<151> 2018-12-31
<150> KR 10-2019-0048671
<151> 2019-04-25
<160> 18
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для IL1 альфа
<400> 1
tcaaggagag catggtggta      20
<210> 2
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для IL1 альфа
<400> 2
gtgctgacct aggcttgatg      20
<210> 3
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для IL1 бета
<400> 3
agctcgccag tgaaatgatg      20
<210> 4
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер IL1 бета
<400> 4
cggagattcg tagctggatg      20
<210> 5
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для IL2
<400> 5
aacctctgga ggaagtgcta      20
<210> 6
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для IL2
<400> 6
aatggttgct gtctcatcag c     21
<210> 7
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для IL3
<400> 7
cacgcgacat ccaatccata      20
<210> 8
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для IL3
<400> 8
tcaaagtcgt ctgttgagcc      20
<210> 9
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для IL4
<400> 9
ccgagttgac cgtaacagac      20
<210> 10
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для IL4
<400> 10
gttctctctg ggctttgtag g     21
<210> 11
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для TNF альфа
<400> 11
atcatcttct cgaaccccga      20
<210> 12
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для TNF альфа
<400> 12
gttatctctc agctccacgc      20
<210> 13
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для IL10
<400> 13
cctgcctaac atgcttcgag      20
<210> 14
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для IL10
<400> 14
gtcttggttc tcagcttggg      20
<210> 15
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер TGF бета
<400> 15
gactcgccag agtggttatc      20
<210> 16
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для TGF бета
<400> 16
ggtagtgaac ccgttgatgt      20
<210> 17
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер для бета актина
<400> 17
aactaccttc aactccatc      19
<210> 18
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер для бета актина
<400> 18
cttgctgatc cacatctg      18
<---