Способ прогнозирования риска развития миомы матки
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF UTERINE FIBROID

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития миомы матки.
Миома матки представляет собой наиболее распространенную доброкачественную опухоль женской половой сферы [Tаylоr D.K.,  Hоlthоusеr K., Sеgаrs J.H., et. al. Recent scientific advances in leiomyoma (uterine fibroids) research facilitates better understanding and management // J List. 2015. V. 4. P. 183]. Согласно литературным данным, миому матки диагностируют у 30-35% женщин репродуктивного возраста, а в перименопаузальном периоде частота ее возникновения составляет около 60%.
Среди женщин, подверженных данному заболеванию, отмечается совокупность симптомов, таких как тяжелые или длительные маточные кровотечения, анемия, симптомы сдавления органов малого таза, частое мочеиспускание, хронические тазовые боли, боли при половом акте и репродуктивные осложнения. Выраженность симптомов зависит от размера, а также расположения миомы матки. Кроме того, клинические проявления при миоме матки связаны с возрастными функциональными изменениями репродуктивной системы женщины. Почти у 50% больных с миомой матки к 45-летнему возрасту нарушается ритм менструаций и с течением времени прогрессивно возрастает частота нарушений менструальной функции. Во многих странах мира миома матки является главной причиной гистерэктомии. В России, по различным данным, с миомой матки связано до 50-70% случаев гистерэктомии при заболеваниях матки. Данная патология у большей части женщин является причиной значительного ухудшения качества жизни.
Миомы матки имеют моноклональное происхождение, развиваясь из неопластических клеток миометрия, хотя сам механизм и ранние стадии развития не вполне понятны [Singh S.S., Belland L. Contemporary management of uterine fibroids: focus on emerging medical treatments // Curr. Med. Res. Opin. 2015 Jan. Vol. 31, №1. P. 1-12]. Тем не менее среди факторов, вовлеченных в формирование и последующее развитие опухоли, можно выделить мутации определенных групп генов, а также влияние половых гормонов и биохимические изменения во внеклеточной матрице миом матки.
С практической точки зрения представляется крайне необходимым выделение критериев индивидуального прогнозирования у женщин риска развития миомы матки на основании исследования генов-кандидатов с целью выявления индивидуумов, предрасположенных к миоме матки.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития миомы матки на основе данных о сочетании генетических полиморфизмов             rs7538038, rs1782507 и rs7589318.
Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2016 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования риска развития миомы матки на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров генов rs7538038, rs1782507 и rs7589318.
В патенте РФ № 2350259 (дата публикации 27.03.2009), где предложен «Способ прогнозирования быстрого роста миомы матки», заключающийся в определении таких показателей как: количество медицинских абортов в анамнезе, наличие артериальной гипертензии во время предшествующих беременностей, угрозы невынашивания беременности, продолжительность родов, наличие аномалий родовой деятельности в предшествующих родах, воспалительных послеродовых заболеваний, а также хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта и рассчитывают показатель прогноза скорости роста миомы матки.
Выявлен патент РФ №2484473 (дата публикации 10.06.2013), где предложен «Способ прогнозирования развития злокачественной или доброкачественной патологии матки», согласно которому для оценки риска развития миомы матки производят диагностическое выскабливание, определяют содержание в эндометрии прогестерона и тестостерона и при уровнях прогестерона 24,0-29,6 нг/г ткани и тестостерона от 16,8 до 22,4 нг/г ткани прогнозируют развитие миомы матки.
Общий недостаток указанных способов заключается в том, что не рассматриваются генетические полиморфизмы и их сочетания с риском развития миомы матки.
В патенте РФ №2475740 (дата публикации 20.02.2013) «Способ выявления наследственной предрасположенности к быстрому росту миомы матки», сущность которого заключается в выделении из лимфоцитов ДНК, из которой амплифицируют фрагменты генов глутатион-S-трансферазы GSTM1 и метионин-синтазы-редуктазы MTRR, и при выявлении генотипа GSTM1 del/del в сочетании с генотипом MTRR 66G/G или MTRR 66A/G делают вывод о наличии у женщины генетической предрасположенности к быстрому росту миоматозных узлов в течение 5 лет с момента их появления.
Недостаток метода заключается в том, что он позволяет прогнозировать быстрый рост миомы матки при наличии миоматозных узлов, но не дает возможности прогноза развития миомы матки.
За прототип выбран патент РФ № 2550933 (дата публикации 20.05.2015) «Способ прогнозирования риска формирования миомы матки», который заключается в выделении ДНК из периферической венозной крови, проведении типирования генетических полиморфизмов генов интерлейкинов и анализе сочетаний полиморфизмов гена интерлейкина -1 (-889 ТТ IL-1) и интерлейкина - 5 (-703 С IL-5).
Недостаток метода заключается в его ограниченном применении,  т.к. используется анализ сочетаний только генов интерлейкинов -889 ТТ IL-1 и -703 С IL-5.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования развития миомы матки на основе данных о сочетании однонуклеотидных полиморфизмов – rs7538038, rs1782507 и rs7589318.
Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития миомы матки у женщин русской национальности, уроженок Центрального Черноземья на основе данных о сочетаниях генетических вариантов локусов rs7538038, rs1782507 и rs7589318.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования риска развития миомы матки, включающий:
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- анализ полиморфизмов генов rs7538038, rs1782507 и rs7589318;
- прогнозирование повышенного риска развития миомы матки у женщин русской национальности, уроженок Центрального Черноземья в случае выявления сочетания аллеля G rs7538038 с аллелем С rs1782507 с аллелем G rs7589318.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития миомы матки  по данным о сочетании генетических вариантов локусов rs7538038, rs1782507 и rs7589318.
Способ осуществляют следующим образом.
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови  индивидуумов в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl2, 10мМ трис-HCl (pH 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и 75 мМNaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -200С. Выделенную ДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Анализ всех локусов (rs7538038, rs1782507 и rs7589318) осуществляют методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. ПЦР проводилась на аппарате IQ5 (Bio-Rad) в режиме real time с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс-М» и стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол» с последующим анализом полиморфизмов методом дискриминации аллелей. Для дискриминации аллелей используют программу Bio-Rad «IQ5-Standart Edition».
Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития миомы матки подтверждает анализ результатов наблюдений 569 женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья РФ больных миомой матки и 981 человек контрольной группы. Обследование  пациенток проводили врачи гинекологического отделения и отделения вспомогательных репродуктивных технологий перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. В контрольную группу включали женщин, не имеющих пролиферативных заболеваний органов малого таза и доброкачественных заболеваний молочных желез. Формирование контрольной выборки осуществляли при профилактических осмотрах (диспансеризации).
Критерии включения в исследуемые выборки:
1. Женщины русской национальности, родившиеся в Центральном Черноземье России и не имеющие между собой родства.
2. Добровольное согласие пациенток на проведение исследования.
3. В группу больных включались индивидуумы только после установления диагноза миомы матки, подтвержденного с помощью клинических, клинико-инструментальных и клинико-лабораторных методов исследования.
Критерии исключения из исследуемых выборок:
1. Пациентки со злокачественными заболеваниями  органов малого таза и молочных желез.
2. Женщины с нерусской национальностью, родившиеся вне Центрального Черноземья.
3. Индивидуумы, отказавшиеся от участия в исследовании.
Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществляли в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета.
Изучение роли комбинаций генетических вариантов rs7538038, rs1782507 и rs7589318 в формировании миомы матки проводили с помощью программного обеспечения АРSampler [http://sources.redhat.com/cygwin/], использующего метод Монте-Карло марковскими цепями и байесовскую непараметрическую статистику [A Gibbs sampler for identiﬁcation of symmetrically structured, spaced DNA motifs with improved estimation of the signal length [Text] / A. V.Favorov, M. S. Gelfand, A. V. Gerasimova [et al.] // Bioinformatics. – 2005. – Vol. 21, № 10. – P. 2240-2245].
Зарегистрированы различия в распространенности сочетания аллелей G rs7538038 с С rs1782507 с G rs7589318 между больными с миомой матки (26,80%) и контролем (18,83%). Эта комбинация аллельных вариантов является фактором риска формирования миомы матки (p=0,0008, OR=1,58, 95% CI 1,23-2,02).
Таким образом, результаты, полученные с помощью биоинформатического анализа, свидетельствуют о вовлеченности комбинации полиморфных вариантов генов rs7538038, rs1782507 и rs7589318 в формирование миомы матки. Фактором риска развития миомы матки у женщин является сочетание аллеля G rs7538038 с аллелем С rs1782507 с аллелем G rs7589318.
В качестве примеров конкретного выполнения разработанного способа приведено генетическое обследование по локусам rs7538038, rs1782507 и rs7589318 трех женщин (добровольцев) русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья, не имеющих среди родственников 1-й степени родства больных миомой матки.
Пример 1. У женщины А. было выявлено сочетание аллеля G rs7538038 с аллелем С rs1782507 с аллелем G rs7589318. На основании этого женщина включена в группу риска по развитию миомы матки. Повторное обследование через 1 год подтвердило обоснованность прогноза. Назначен комплекс лечебных мероприятий, регулярный профилактический осмотр (посещение гинеколога раз в 6 месяцев).
Пример 2. У женщины В. было выявлено сочетание аллеля  G rs7538038  с алелем С rs1782507 с аллелем G rs7589318. На основании этого у нее прогнозируют повышенный риск развития миомы матки. Данная женщина включена в группу риска по развитию миомы матки, и ей назначен комплекс профилактических мероприятий по предупреждению развития миомы матки (лечение хронических гинекологических заболеваний, рациональное питание, физическая активность, нормализация психо-эмоционального состояния, регулярный профилактический осмотр (посещение гинеколога раз в 6 месяцев и УЗИ органов малого таза) и др. Повторные осмотры подтвердили эффективность проведенного комплекса профилактических мероприятий.
Пример 3. У женщины С. было выявлено сочетание аллеля  A rs7538038  с алелем A rs1782507 с аллелем A rs7589318. На основании этих результатов у данной пациентки  прогнозируют низкий риск развития миомы матки, что подтверждено дальнейшим наблюдением.
Применение данного способа позволит формировать среди женщин на доклиническом этапе группы риска по развитию миомы матки и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития миомы матки.