ЛЕЧЕНИЕ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С ПОМОЩЬЮ СОЕДИНЕНИЯ 4-ИОД-3-НИТРОБЕНЗАМИД В КОМБИНАЦИИ С ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМИ СРЕДСТВАМИ
METHOD OF TREATING BREAST CANCER WITH COMPOUND OF 4-IODINE-3-NITROBENZAMINE IN COMBINATION WITH ANTICANCER AGENTS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА
Настоящая заявка истребует приоритет предварительных заявок: №60/987333, озаглавленной «Лечение трижды негативного метастатического рака молочной железы комбинационной терапией с применением антиметаболита, комплекса платины и ингибитора PARP», поданной 12 ноября 2007 года (Запись поверенного №28825-742.101); №61/012364, озаглавленной «Лечение рака ингибиторами топоизомеразы в сочетании с ингибиторами PARP», поданной 7 декабря 2007 года (Запись поверенного №28825-747.101), и №61/058528, озаглавленной «Лечение рака молочной железы, яичников и матки ингибитором PARP», поданной 3 июня 2008 года (Запись поверенного №28825-757.101), каждая из таковых заявок в силу ссылки на них полностью включается в настоящий документ.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Рак представляет собой группу заболеваний, которые характеризуются аномальным регулированием роста клеток. Частота рака в одних только США превышает 1,3 млн случаев в год. Несмотря на использование хирургии, лучевой терапии, химиотерапии и терапии гормонами для лечения рака, он остается второй главной причиной смертей в США. По оценкам, более 560000 американцев умирают от рака ежегодно.
Раковые клетки одновременно активируют несколько каналов, которые положительно или отрицательно регулируют рост клеток и их гибель. Эта особенность свидетельствует о том, что модуляция сигналов гибели и выживания клеток может позволить создать новые стратегии совершенствования эффективности существующих методов химиотерапевтического лечения.
Рак молочной железы обычно лечат путем хирургического удаления злокачественных очагов в сочетании с адъювантной терапией - лучевой терапии, химиотерапии или их сочетания - для уничтожения любых раковых клеток, которые могут оставаться после хирургии. В целом, рак молочной железы может классифицироваться по наличию или отсутствию рецепторов гормонов (HR). Гормон-рецептор положительный (HR+) рак характеризуется экспрессией одного или нескольких рецепторов женских гормонов - рецепторов эстрогенов (ER) или рецепторов прогестерона (PR). Адъювантная терапия ER+ рака молочной железы часто включает химиотерапию с применением селективного модулятора рецепторов эстрогенов (SERM), например тамоксифена или ралоксифена. К сожалению, в то время как примерно 70% случаев рака молочной железы являются ER-положительными, остальные 30% случаев рака молочной железы, которые являются HR-отрицательными, не поддаются лечению с помощью SERM. Соответственно, другие адъювантные методы химиотерапии, например лечение антрациклином (монотерапия или комбинационная терапия с таксаном), проверялись как метод лечения ER-отрицательного рака молочной железы.
Возможности лечения антрациклином ограничены из-за лимитов доз на время жизни по соображениям кардиотоксичности. Лечение гемцитабином и карбоплатином является устоявшимся методом комбинационной химиотерапии пациентов, страдающих метастатическим раком молочной железы - как не получавших, так и получавших премедикацию таксаном. Препараты платины продемонстрировали обнадеживающую противоопухолевую активность в отношении базального местнораспространенного рака молочной железы. Агенты, повреждающие ДНК, обладают обнадеживающей противоопухолевой эффективностью в отношении базального рака молочной железы из-за того, что дефекты путей репарации ДНК характерны для рака молочной железы данного типа.
Несмотря на наличие антиметаболитов, например гемцитабина, и комплексов платины, например карбоплатина, не существует общепринятого стандарта лечения ER-отрицательного рака молочной железы. В частности, трижды негативный метастатический рак молочной железы (то есть рак молочной железы, который ER-отрицателен, и (или) PR-отрицателен, и (или) отрицателен по эпидермальному фактору роста человека 2 (HER2)) устойчив по отношению к стандартным методам лечения и совершенно не поддается лечению химиотерапией SERM. Поэтому существует потребность в эффективном лечении рака в целом, в особенности трижды негативного метастатического рака молочной железы.
Несмотря на существование ограниченного выбора методов терапии для лечения рака, варианты рака, в том числе трижды негативный рак молочной железы, представляют особую сложность, поскольку они могут быть устойчивыми по отношению к стандартному химиотерапевтическому или гормональному лечению. Поэтому существует потребность в эффективном лечении рака в целом и вариантов рака, в частности.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В некоторых осуществлениях настоящего изобретения предлагается способ лечения рака молочной железы, который является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из ER, PR или HER2, у пациента, предусматривающий введение пациенту по меньшей мере одного ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях настоящего изобретения предлагается способ лечения рака молочной железы, который является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из ER, PR или HER2, у пациента, нуждающегося в таком лечении, предусматривающий: (а) получение образца от пациента; (b) анализ образца для установления каждого из приведенных ниже фактов: является ли рак ER-положительным или ER-отрицательным; является ли рак PR-положительным или PR-отрицательным; является ли рак HER2-положительным или HER2-отрицательным; (с) если анализ показывает, что рак является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из ER, PR или HER2, провести лечение пациента по меньшей мере одним из ингибиторов PARP. В некоторых осуществлениях способ дополнительно предусматривает лечение пациента по меньшей мере одним ингибитором PARP, если выполнены два или более перечисленных ниже условий: (а) рак является ER-отрицательным, (b) рак является PR-отрицательным, (с) рак является HER2-отрицательным. В некоторых осуществлениях настоящего изобретения предлагается способ лечения рака молочной железы, который является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из ER, PR или HER2, у пациента, предусматривающий: (а) анализ образца пациента на предмет экспрессии PARP; и (b) если экспрессия PARP превышает заранее установленный уровень, введение пациенту по меньшей мере одного ингибитора PARP. В случае практического применения описываемых способов, которые раскрываются в настоящем документе, регистрируется по меньшей мере один терапевтический эффект, причем упомянутый терапевтический эффект представляет собой уменьшение размеров опухоли молочной железы, сокращение метастазов, полную ремиссию, частичную ремиссию, стабильное течение болезни или полный патологический ответ. В некоторых осуществлениях сопоставимый уровень клинического ответа (CBR=CR+PR+SD≥6 месяцев) удалось достигнуть за счет лечения ингибитором PARP по сравнению с лечением противоопухолевым агентом. В некоторых осуществлениях улучшение уровня клинического ответа составляет по меньшей мере примерно 30% по сравнению с монотерапией противоопухолевым агентом. В некоторых осуществлениях в качестве ингибитора PARP используется ингибитор PARP-1. В некоторых осуществлениях в качестве ингибитора PARP 1 используется 4-иод-3-нитробензамид. В некоторых осуществлениях ингибитором PARP является соединение с формулой (IIa):
Соединение с формулой (IIa)
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
6
1
6
3
7
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
где: (1) по меньшей мере один из заместителей R, R, R, R и R всегда является серосодержащим заместителем, а остальные заместители R, R, R, R и R независимо выбираются из группы, включающей водород, гидрокси, амино, нитро, иод, бром, фтор, хлор, (C-C)алкил, (C-С)алкокси, (С-С)циклоалкил и фенил, при этом по меньшей мере двумя из пяти заместителей R, R, R, R и R всегда является водород; или (2) по меньшей мере один из заместителей R, R, R, R и R не является серосодержащим заместителем и по меньшей мере одним из пяти заместителей R, R, R, R и R всегда является иод, и при этом упомянутый иод-заместитель всегда соседствует с R, R, R, R и R группой, в качестве которой выступает нитро-, нитрозо-, гидроксиамино-, гидрокси- или аминогруппа, а также фармацевтически приемлемые соли, сольваты, изомеры, таутомеры, метаболиты, аналоги или их пролекарства. В некоторых осуществлениях соединения (2) имеют такую структуру, что иод-группа всегда соседствует с группой R, R, R, R или R, в качестве которой выступает нитрозо-, гидроксиамино-, гидрокси- или аминогруппа. В некоторых осуществлениях соединения (2) имеют такую структуру, что иод-группа всегда соседствует с группой R, R, R, R или R, в качестве которой выступает нитрозо-, гидроксиамино- или аминогруппа.
В некоторых осуществлениях раком молочной железы является метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях рак молочной железы диагностирован на I стадии, II стадии или III стадии. В некоторых осуществлениях рак молочной железы является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из: ER, PR или HER2. В некоторых осуществлениях рак молочной железы является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из: ER, PR или HER2; и при этом рак молочной железы положителен по отношению по меньшей мере к одному из ER, PR или HER2. В некоторых осуществлениях рак молочной железы характеризуется дефицитом репарации гомологичной рекомбинантной ДНК. В некоторых осуществлениях рак молочной железы характеризуется нарушенными функциями BRCA1 или BRCA2. В некоторых осуществлениях лечение предусматривает цикл лечения продолжительностью по меньшей мере 11 дней, при этом в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно от 1 до 100 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях 4-иод-3-нитробензамид применяется перорально, в качестве парентеральной инъекции или вливания, или ингаляции. В некоторых осуществлениях цикл лечения составляет примерно от 11 до 30 дней. В некоторых осуществлениях способ дополнительно включает введение пациенту ингибитора PARP в сочетании с по меньшей мере одним противоопухолевым агентом. В качестве противоопухолевого агента выступают противоопухолевый антиметаболит, противоопухолевый комплекс платины. В некоторых осуществлениях в качестве противоопухолевого агента выступает гемцитабин. В некоторых осуществлениях способ дополнительно включает введение пациенту ингибитора PARP в сочетании с несколькими противоопухолевыми агентами. В некоторых осуществлениях противоопухолевый агент вводится до, вместе или после введения ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях способ дополнительно включает хирургию, лучевую терапию, химиотерапию, генную терапию, терапию ДНК, вирусную терапию, терапию РНК, терапию ДНК, адъювантную терапию, неоадъювантную терапию, иммунотерапию, нанотерапию или их сочетание. В некоторых осуществлениях способ дополнительно включает введение пациенту ингибитора PARP в сочетании с гамма-облучением. В некоторых осуществлениях в качестве образца используется ткань или проба жидкостей организма. В некоторых осуществлениях в качестве образца используется образец опухоли, проба крови, проба плазмы крови, проба жидкости брюшной полости, экссудат или эффузия. В некоторых осуществлениях способ дополнительно предусматривает анализ образца пациента на предмет экспрессии рецепторов эстрогенов, рецепторов прогестерона или рецепторов эпидермального фактора роста человека 2.
В некоторых осуществлениях настоящего изобретения предлагается способ лечения рака молочной железы у пациента, предусматривающий введение пациенту по меньшей мере одного ингибитора PARP в сочетании с по меньшей мере одним противоопухолевым агентом. В некоторых осуществлениях настоящего изобретения предлагается способ лечения рака молочной железы у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий: (а) получение образца от пациента; (b) анализ образца для установления каждого из приведенных ниже фактов: является ли рак ER-положительным или ER-отрицательным; является ли рак PR-положительным или PR-отрицательным; является ли рак HER2-положительным или HER2-отрицательным; (с) если анализ показывает, что рак является отрицательным по меньшей мере для одного из ER, PR или HER2, провести лечение пациента сочетанием терапевтических агентов, причем такие терапевтические агенты включают по меньшей мере один ингибитор PARP и по меньшей мере один противоопухолевый агент. В некоторых осуществлениях способ также предусматривает лечение пациента сочетанием терапевтических агентов, причем такие терапевтические агенты включают по меньшей мере один ингибитор PARP и по меньшей мере один противоопухолевый агент, если выполнены два или более перечисленных ниже условий: (а) рак является ER-отрицательным, (b) рак является PR-отрицательным, (с) рак является HER2-отрицательным. В некоторых осуществлениях настоящего изобретения предлагается способ лечения рака молочной железы у пациента, включающий: (а) анализ образца пациента на предмет экспрессии PARP; и (b) если экспрессия PARP превышает заранее установленный уровень, введение пациенту по меньшей мере одного ингибитора PARP и по меньшей мере одного противоопухолевого агента.
В случае практического применения описываемых способов, которые раскрываются в настоящем документе, в некоторых осуществлениях регистрируется по меньшей мере один терапевтический эффект, причем упомянутый терапевтический эффект представляет собой уменьшение размеров опухоли молочной железы, сокращение метастазов, полную ремиссию, частичную ремиссию, стабильное течение болезни или полный патологический ответ. В некоторых осуществлениях удалось достигнуть улучшения сопоставимого уровня клинического ответа (CBR=CR+PR+SD≥6 месяцев) по сравнению с лечением противоопухолевым агентом, но без ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях улучшение уровня клинического ответа составляет по меньшей мере примерно 60%. В некоторых осуществлениях в качестве ингибитора PARP используется 4-иод-3-нитробензамид. В некоторых осуществлениях ингибитором PARP является соединение с формулой (IIa):
Соединение с формулой (IIa)
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
6
1
6
3
7
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
где: (1) по меньшей мере один из заместителей R, R, R, R и R всегда является серосодержащим заместителем, а остальные заместители R, R, R, R и R независимо выбираются из группы, включающей водород, гидрокси, амино, нитро, иод, бром, фтор, хлор, (C-C)алкил, (C-C)алкокси, (С-С)циклоалкил и фенил, при этом по меньшей мере двумя из пяти заместителей R, R, R, R и R всегда является водород; или (2) по меньшей мере один из заместителей R, R, R, R и R не является серосодержащим заместителем и по меньшей мере одним из пяти заместителей R, R, R, R и R всегда является иод, и при этом упомянутый иод-заместитель всегда соседствует с R, R, R, R и R группой, в качестве которой выступает нитро-, нитрозо-, гидроксиамино-, гидрокси- или аминогруппа, а также фармацевтически приемлемые соли, сольваты, изомеры, таутомеры, метаболиты, аналоги или их пролекарства. В некоторых осуществлениях соединения (2) имеют такую структуру, что иод-группа всегда соседствует с группой R, R, R, R или R, в качестве которой выступает нитрозо-, гидроксиамино-, гидрокси- или аминогруппа. В некоторых осуществлениях соединения (2) имеют такую структуру, что иод-группа всегда соседствует с группой R, R, R, R или R, в качестве которой выступает нитрозо-, гидроксиамино- или аминогруппа. В некоторых осуществлениях в качестве противоопухолевого агента выступают противоопухолевый антиметаболит, противоопухолевый комплекс платины. В некоторых осуществлениях в качестве противоопухолевого агента выступает гемцитабин. В некоторых осуществлениях способ также включает хирургию, лучевую терапию, химиотерапию, генную терапию, терапию ДНК, вирусную терапию, терапию ДНК, адъювантную терапию, неоадъювантную терапию, терапию РНК, иммунотерапию, нанотерапию или их сочетание. В некоторых осуществлениях способ дополнительно включает введение пациенту ингибитора PARP в сочетании с гамма-облучением.
2
2
2
2
2
2
2
В некоторых осуществлениях раком молочной железы является метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях рак молочной железы диагностирован на I стадии, II стадии или III стадии. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HR-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях рак молочной железы является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из: ER, PR или HER2. В некоторых осуществлениях рак молочной железы является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из: ER, PR или HER2; и при этом рак молочной железы положителен по отношению по меньшей мере к одному из ER, PR или HER2. В некоторых осуществлениях рак молочной железы характеризуется дефицитом репарации гомологичной рекомбинантной ДНК. В некоторых осуществлениях рак молочной железы характеризуется нарушенными функциями BRCA1 или BRCA2. В некоторых осуществлениях лечение предусматривает цикл лечения продолжительностью по меньшей мере 11 дней, при этом: (а) в 1 и 8 дни цикла пациент получает примерно 100-5000 мг/м гемцитабина; (b) в 1 и 8 дни цикла пациент получает примерно от 10 до 400 мг/м карбоплатина; и (с) в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно от 1 до 100 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях цикл лечения составляет примерно от 11 до 30 дней. В некоторых осуществлениях в 1 и 8 дни цикла пациент получает примерно 100-2500 мг/м гемцитабина и примерно от 10 до 400 мг/м карбоплатина; и в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно от 1 до 50 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях в 1 и 8 дни цикла пациент получает примерно 500-2000 мг/м гемцитабина и примерно от 50 до 400 мг/мкарбоплатина; и в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно от 1 до 50 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях в 1 и 8 дни цикла пациент получает примерно 1000 мг/м гемцитабина и примерно AUC 2 (площадь под кривой фармакокинетики) карбоплатина; и в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно 1, 2, 3, 4, 6, 8 или 10, 12, 14, 16, 18 или 20 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях противоопухолевый агент вводится в форме парентеральной инъекции или вливания. В некоторых осуществлениях ингибитором PARP является 4-иод-3-нитробензамид, который применяется перорально, или в качестве парентеральной инъекции или вливания, или ингаляции. В некоторых осуществлениях в качестве образца используется ткань или проба жидкостей организма. В некоторых осуществлениях в качестве образца используется образец опухоли, проба крови, проба плазмы крови, проба жидкости брюшной полости, экссудат или эффузия. В некоторых осуществлениях способ дополнительно предусматривает анализ образца пациента на предмет экспрессии рецепторов эстрогенов, рецепторов прогестерона или рецепторов эпидермального фактора роста человека 2.
ВКЛЮЧЕНИЕ В СИЛУ ССЫЛКИ
Все публикации и патентные заявки, упомянутые в настоящем описании в силу ссылки на них, включаются в настоящий документ точно так же, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка специальным образом и на индивидуальной основе включались бы в настоящий документ в силу ссылки на них.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Новизна изобретения более подробно представлена в прилагаемой формуле изобретения. Более четкое представление об особенностях и преимуществах настоящего изобретения можно будет получить из приведенного ниже подробного описания, где изложены наглядные осуществления, в которых использованы принципы настоящего изобретения, а также сопровождающих текст фигур, где:
ФИГ.1 демонстрирует активацию экспрессии гена PARP1 при первичном раке человека. Горизонтальная линия, медианная экспрессия PARP1; окно, межквартильный размах; полосы, стандартное отклонение.
На ФИГ.2 отображен эффект воздействия 4-иод-3-нитробензамида в присутствии карбоплатина или гемцитабина на ход клеточного цикла для клеток трижды негативного рака молочной железы in vitro. Жизнеспособность клеток MDA-MB-463 трижды негативного рака молочной железы количественно оценивалась посредством анализа FACS.
ФИГ.3 демонстрирует ингибирование PARP в мононуклеарных клетках периферической крови (МНК ПК) пациентов, получавших 4-иодо-3-нитробензамид.
На ФИГ.4 изображено профилирование экспрессии PARP1, ER, PR и HER2 в пробах рака молочной железы человека на 2 этапе испытаний для трижды негативного метастатического рака молочной железы. Данные нормированы по экспрессии гена бета-глюкуронидазы. Данные получены по результатам анализа 50 клинических образцов рака молочной железы и 19 образцов молочной железы в норме. Вертикальная линия соответствует медиане экспрессии генов, а окно ограничивает межквартильный размах.
На ФИГ.5 приведена кривая Каплан-Мейера для PFS у пациентов, страдающих трижды негативным метастатическим раком молочной железы, которые получали 4-иод-3-нитробензамид с гемцитабином/карбоплатином по сравнению с получавшими только гемцитабин/карбоплатин. Распределение PFS по двум группам лечения проведено по методу Каплан-Мейера. Две группы сопоставляли с помощью двустороннего логарифмического рангового критерия с 5% уровнем значимости. G/C, гемцитабин/карбоплатин; G/C+BA, гемцитабин/карбоплатин+4-иод-3-нитробензамид (ВА).
ФИГ.6 показывает, что 4-иод-3-нитробензамид (ВА) стимулирует остановку клеточного цикла в фазах S- и G2/M и усиливает антипролиферативный эффект гамма-облучения на клетки MDA-MB-468 трижды негативного рака молочной железы человека.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В некоторых осуществлениях настоящего изобретения предлагается способ лечения рака молочной железы, который является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из ER, PR или HER2, у пациента, предусматривающий введение пациенту по меньшей мере одного ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях регистрируется по меньшей мере один терапевтический эффект, причем упомянутый терапевтический эффект представляет собой уменьшение размеров опухоли молочной железы, сокращение метастазов, полную ремиссию, частичную ремиссию, полный патологический ответ или стабильное течение болезни. В некоторых осуществлениях сопоставимый уровень клинического ответа (CBR=CR+PR+SD≥6 месяцев) удалось достигнуть за счет лечения ингибитором PARP по сравнению с лечением противоопухолевым агентом. В некоторых осуществлениях улучшение уровня клинического ответа составляет по меньшей мере примерно 30%. В некоторых осуществлениях в качестве ингибитора PARP используется ингибитор PARP-1. В некоторых осуществлениях ингибитором PARP является соединение с формулой (IIa):
Соединение с формулой (IIa)
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
6
1
6
3
7
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
где: (1) по меньшей мере один из заместителей R, R, R, R и R всегда является серосодержащим заместителем, а остальные заместители R, R, R, R и R независимо выбираются из группы, включающей водород, гидрокси, амино, нитро, иод, бром, фтор, хлору (C-C)алкил, (C-C)алкокси, (С-С)циклоалкил и фенил, при этом по меньшей мере двумя из пяти заместителей R, R, R, R и R всегда является водород; или (2) по меньшей мере один из заместителей R, R, R, R и R не является серосодержащим заместителем и по меньшей мере одним из пяти заместителей R, R, R, R и R всегда является иод, и при этом упомянутый иод-заместитель всегда соседствует с R, R, R, R и R группой, в качестве которой выступает нитро-, нитрозо-, гидроксиамино-, гидрокси- или аминогруппа, а также фармацевтически приемлемые соли, сольваты, изомеры, таутомеры, метаболиты, аналоги или их пролекарства. В некоторых осуществлениях соединения (2) имеют такую структуру, что иод-группа всегда соседствует с группами R, R, R, R или R, в качестве которой выступает нитрозо-, гидроксиамино-, гидрокси- или аминогруппа. В некоторых осуществлениях соединения (2) имеют такую структуру, что иод-группа всегда соседствует с группами R, R, R, R или R, в качестве которой выступает нитрозо-, гидроксиамино- или аминогруппа. В некоторых осуществлениях в качестве ингибитора PARP1 используется 4-иод-3-нитробензамид.
В некоторых осуществлениях раком молочной железы является метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях рак молочной железы диагностирован на I стадии, II стадии или III стадии. В некоторых осуществлениях рак молочной железы является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из: ER, PR или HER2. В некоторых осуществлениях рак молочной железы является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из: ER, PR или HER2; и при этом рак молочной железы положителен по отношению по меньшей мере к одному из ER, PR или HER2. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и HER2-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и PR-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и одновременно HER2-положительный и PR-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный и ER-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный и HER2-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный и одновременно ER-положительный и HER2-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является НЕР2-отрицательный и ER-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HER2-отрицательный и PR-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является НЕР2-отрицательный и одновременно ER-положительный и PR-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и PR-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный, PR-отрицательный и HER2-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и НЕР2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный, HER2-отрицательный и PR-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный, HER2-отрицательный и ER-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный, PR-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях рак молочной железы характеризуется дефицитом репарации гомологичной рекомбинантной ДНК.
В некоторых осуществлениях лечение предусматривает цикл лечения продолжительностью по меньшей мере 11 дней, при этом в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно от 1 до 100 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях 4-иод-3-нитробензамид применяется перорально в качестве парентеральной инъекции или вливания, или ингаляции. В некоторых осуществлениях цикл лечения составляет примерно от 11 до 30 дней.
В некоторых осуществлениях способ дополнительно включает введение пациенту ингибитора PARP в сочетании с по меньшей мере одним противоопухолевым агентом. В качестве противоопухолевого агента выступают противоопухолевый антиметаболит, противоопухолевое органическое соединение платины. В некоторых осуществлениях в качестве противоопухолевого агента выступает гемцитабин. В некоторых осуществлениях противоопухолевым агентом является комплекс платины. В некоторых осуществлениях метод дополнительно включает введение пациенту ингибитора PARP в сочетании с несколькими противоопухолевыми агентами. Противоопухолевый агент вводится до, вместе или после введения ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях способ дополнительно включает введение пациенту ингибитора PARP в сочетании с гамма-облучением. В некоторых осуществлениях способ также включает хирургию, лучевую терапию, химиотерапию, генную терапию, терапию ДНК, адъювантную терапию, неоадъювантную терапию, терапию РНК, терапию ДНК, вирусную терапию, иммунотерапию, нанотерапию или их сочетание.
В некоторых осуществлениях, описанных в настоящем документе, предлагается способ лечения рака молочной железы, предусматривающий введение пациенту по меньшей мере одного ингибитора PARP в сочетании с по меньшей мере одним противоопухолевым агентом. В некоторых осуществлениях регистрируется по меньшей мере один терапевтический эффект, причем упомянутый терапевтический эффект представляет собой уменьшение размеров опухоли молочной железы, сокращение метастазов, полную ремиссию, частичную ремиссию, полный патологический ответ или стабильное течение болезни. В некоторых осуществлениях удалось достигнуть улучшения сопоставимого уровня клинического ответа (CBR=CR+PR+SD≥6 месяцев) по сравнению с лечением антиметаболитом и комплексом платины, но без ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях улучшение уровня клинического ответа составляет по меньшей мере примерно 60%. В некоторых осуществлениях ингибитором PARP является бензамид. В некоторых осуществлениях в качестве бензамида используется 4-иод-3-нитробензамид. В некоторых осуществлениях комплекс платины выбирается из карбоплатина. В некоторых осуществлениях комплексом платины является карбоплатин. В некоторых осуществлениях антиметаболитом является цитабин. В некоторых осуществлениях антиметаболитом является гемцитабин. В некоторых осуществлениях под раком молочной железы является метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях рак молочной железы диагностирован на I стадии, II стадии или III стадии. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HR-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях рак молочной железы является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из: ER, PR или HER2. В некоторых осуществлениях рак молочной железы является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из: ER, PR или HER2; и при этом рак молочной железы положителен по отношению по меньшей мере к одному из ER, PR или HER2. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HR-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и HER2-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и PR-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и одновременно HER2-положительный и PR-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный и ER-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный и HER2-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный и одновременно ER-положительный и HER2-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HER2-отрицательный и ER-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HER2-отрицательный и PR-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HER2-отрицательный и одновременно ER-положительный и PR-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и PR-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный, PR-отрицательный и HER2-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный, HER2-отрицательный и PR-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный, HER2-отрицательный и ER-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный, PR-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях рак молочной железы характеризуется дефицитом репарации гомологичной рекомбинантной ДНК.
В некоторых осуществлениях способ дополнительно включает введение пациенту ингибитора PARP в сочетании с противоопухолевым агентом. В некоторых осуществлениях в качестве противоопухолевого агента выступают противоопухолевый антиметаболит, противоопухолевый комплекс платины или их фармацевтически приемлемая соль. В некоторых осуществлениях комплексом платины является карбоплатин. В некоторых осуществлениях в качестве антиметаболита выступает гемцитабин. В некоторых осуществлениях способы дополнительно включают введение пациенту ингибитора PARP в сочетании с несколькими противоопухолевыми агентами. В некоторых осуществлениях противоопухолевый агент вводится до, вместе или после введения ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях в качестве противоопухолевого агента используется антиангиогенный агент, например авастин. В некоторых осуществлениях способ также включает хирургию, лучевую терапию, химиотерапию, генную терапию, терапию ДНК, адъювантную терапию, неоадъювантную терапию, вирусную терапию, терапию РНК, иммунотерапию, нанотерапию или их сочетание.
В некоторых осуществлениях лечение предусматривает цикл лечения продолжительностью по меньшей мере 11 дней, при этом в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно от 10 до 100 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях лечение предусматривает цикл лечения продолжительностью по меньшей мере 11 дней, при этом в 4, 8 и 11 день цикла пациент получает примерно от 1 до 50 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях лечение предусматривает цикл лечения продолжительностью по меньшей мере 11 дней, при этом в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 или 10, 12, 14, 16, 18 или 20 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида.
2
2
2
2
2
2
2
В некоторых осуществлениях лечение предусматривает цикл лечения продолжительностью по меньшей мере 11 дней, при этом: (а) в 1 и 8 дни цикла пациент получает примерно 100-2000 мг/мгемцитабина; (b) в 1 и 8 дни цикла пациент получает примерно от 10 до 400 мг/м карбоплатина; и (с) в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно от 10 до 100 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях в 1 и 8 дни цикла пациент получает примерно 100-2500 мг/м гемцитабина и примерно AUC 1-5 карбоплатина (примерно от 10 до 400 мг/м карбоплатина); и в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно от 1 до 50 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях в 1 и 8 дни цикла пациент получает примерно 500-2000 мг/м гемцитабина и примерно от 50 до примерно 400 мг/м карбоплатина; и в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно от 1 до 50 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях в 1 и 8 дни цикла пациент получает примерно 1000 мг/м гемцитабина и примерно AUC 2 карбоплатина; и в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно 1, 2, 3, 4, 6, 8 или 10, 12, 14, 16, 18 или 20 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида.
В некоторых осуществлениях, описанных в настоящем документе, приводится способ лечения рака молочной железы у пациента, страдающего трижды негативным раком молочной железы, который предусматривает цикл лечения продолжительностью по меньшей мере 21 день, при этом в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно от 10 до 100 мг/кг 4-иодо-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях 4-иод-3-нитробензамид применяется перорально или в качестве внутривенного вливания.
2
2
В некоторых осуществлениях приводится способ лечения рака молочной железы у пациента, страдающего трижды негативным раком молочной железы, который предусматривает цикл лечения продолжительностью 21 день: (а) в 1 и 8 дни цикла пациент получает примерно 100-2000 мг/м гемцитабина; (b) в 1 и 8 дни цикла пациент получает AUC 0,1-10 карбоплатина (примерно от 10 до 400 мг/м карбоплатина); и (с) в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно от 10 до 100 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях гемцитабин вводится в форме внутривенного вливания. В некоторых осуществлениях карбоплатин вводится в форме внутривенного вливания. В некоторых осуществлениях 4-иод-3-нитробензамид применяется перорально или в качестве внутривенного вливания. В некоторых осуществлениях гемцитабин вводится в форме внутривенного вливания. В некоторых осуществлениях карбоплатин вводится в форме внутривенного вливания. В некоторых осуществлениях 4-иод-3-нитробензамид применяется перорально или в качестве внутривенного вливания.
В некоторых осуществлениях, описанных в настоящем документе, приводится способ лечения рака молочной железы у пациента, страдающего трижды негативным раком молочной железы, который предусматривает: (а) формирование цикла лечения продолжительностью примерно от 10 до 30 дней; (b) в 1 по 10 отдельные дни цикла пациенту вводится примерно от 1 до 50 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях 4-иод-3-нитробензамид применяется перорально или в качестве внутривенного вливания.
2
2
В некоторых осуществлениях, описанных в настоящем документе, приводится способ лечения рака молочной железы у пациента, страдающего трижды негативным раком молочной железы, который предусматривает: (а) формирование цикла лечения продолжительностью примерно от 10 до 30 дней; (b) в 1 по 5 отдельные дни цикла пациент получает примерно от 100 до 5000 мг/м гемцитабина в виде внутривенного вливания; (с) начиная с 1 по 5 отдельные дни цикла пациент получает от AUC 1 до AUC 10 карбоплатина в форме внутривенного вливания (например, примерно от 10 до 400 мг/м карбоплатина); и (d) начиная с 1 по 10 отдельные дни цикла пациент получает примерно от 1 до 50 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях гемцитабин вводится в форме внутривенного вливания. В некоторых осуществлениях карбоплатин вводится в форме внутривенного вливания. В некоторых осуществлениях 4-иод-3-нитробензамид применяется перорально или в качестве внутривенного вливания.
Некоторые осуществления включают способ лечения рака молочной железы у пациента, нуждающегося в таком лечении, который предусматривает: (а) получение образца от пациента; (b) анализ образца для установления по меньшей мере одного из приведенных ниже фактов: (i) является ли рак ER-положительным или ER-отрицательным; (ii) является ли рак PR-положительным или PR-отрицательным; (iii) является ли рак HER2-положительным или HER2-отрицательным; (с) если анализ показывает, что рак является ER-отрицательным, PR-отрицательным или HER2-отрицательным, провести лечение пациента сочетанием терапевтических агентов, при этом такие терапевтические агенты включают по меньшей мере один антиметаболит, по меньшей мере один комплекс платины и по меньшей мере один ингибитор PARP; и (d) если анализ не показывает, что рак является ER-отрицательным, PR-отрицательным или HER2-отрицательным, выбрать другой вариант лечения.
Некоторые осуществления включают способ лечения рака молочной железы у пациента, нуждающегося в таком лечении, который предусматривает: (а) получение образца от пациента; (b) анализ образца для установления по меньшей мере одного из приведенных ниже фактов: (i) является ли рак ER-положительным или ER-отрицательным; (ii) является ли рак PR-положительным или PR-отрицательным; (iii) является ли рак HER2-положительным или HER2-отрицательным; (с) если анализ показывает, что рак является ER-отрицательным, PR-отрицательным или HER2-отрицательным, провести лечение пациента по меньшей мере одним ингибитором PARP; и (d) если анализ не показывает, что рак является ER-отрицательным, PR-отрицательным или HER2-отрицательным, выбрать другой вариант лечения.
В некоторых осуществлениях регистрируется по меньшей мере один терапевтический эффект, причем упомянутый терапевтический эффект представляет собой уменьшение размеров опухоли молочной железы, сокращение метастазов, полную ремиссию, частичную ремиссию, полный патологический ответ или стабильное течение болезни. В некоторых осуществлениях удалось достигнуть улучшения сопоставимого уровня клинического ответа (CBR=CR+PR+SD≥6 месяцев) по сравнению с лечением без ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях уровень клинического ответа составляет по меньшей мере примерно 30%. В некоторых осуществлениях удалось достигнуть улучшения сопоставимого уровня клинического ответа (CBR=CR+PR+SD≥6 месяцев) по сравнению с лечением антиметаболитом и комплексом платины, но без ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях уровень клинического ответа составляет по меньшей мере примерно 60%. В некоторых осуществлениях в качестве ингибитора PARP используется ингибитор PARP-1. В других осуществлениях ингибитором PARP является бензамид. В некоторых осуществлениях в качестве бензамида используется 4-иод-3-нитробензамид. В некоторых осуществлениях комплексом платины является карбоплатин. В некоторых осуществлениях антиметаболитом является цитабин. В некоторых осуществлениях антиметаболитом является гемцитабин. В некоторых осуществлениях в качестве образца используется ткань или проба жидкостей организма. В некоторых осуществлениях в качестве образца используется образец опухоли, проба крови, проба плазмы крови, проба жидкости брюшной полости, экссудат или эффузия. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях рак молочной железы диагностирован на I стадии, II стадии или III стадии. В некоторых осуществлениях рак молочной железы является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из: ER, PR или HER2. В некоторых осуществлениях рак молочной железы является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из: ER, PR или HER2; и при этом рак молочной железы положителен по отношению по меньшей мере к одному из ER, PR или HER2. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и PR-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и HER2-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и одновременно PR-положительный и HER2-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный и ER-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный и HER2-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный и одновременно ER-положительный и HER2-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HER2-отрицательный метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HER2-отрицательный и ER-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HER2-отрицательный и PR-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HER2-отрицательный и одновременно ER-положительный и PR-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и PR-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный, PR-отрицательный и HER2-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный, HER2-отрицательный и PR-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный, HER2-отрицательный и PR-положительный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный, PR-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы.
2
2
Некоторые осуществления настоящего изобретения содержат способ лечения рака молочной железы у пациента, нуждающегося в таком лечении, который предусматривает: (а) получение образца от пациента; (b) анализ образца для установления каждого из приведенных ниже фактов: (i) является ли рак ER-положительным или ER-отрицательным; (ii) является ли рак PR-положительным или PR-отрицательным; (iii) является ли рак HER2-положительным или HER2-отрицательным; (с) если соблюдены два или более приведенных ниже условий, провести лечение пациента по меньшей мере одним из ингибиторов PARP: (i) рак ER-отрицательный, (ii) рак PR-отрицательный, или (iii) рак HER2-отрицательный; и (а) если по меньшей мере два из приведенных выше условий не соблюдены, выбрать другой вариант лечения. Некоторые осуществления изобретения содержат способ лечения рака молочной железы у пациента, нуждающегося в таком лечении, который предусматривает: (а) получение образца от пациента; (b) анализ образца для установления каждого из приведенных ниже фактов: (i) является ли рак ER-положительным или ER-отрицательным; (ii) является ли рак PR-положительным или PR-отрицательным; (iii) является ли рак HER2-положительным или HER2-отрицательным; (с) если соблюдены два или более приведенных ниже условий, провести лечение пациента сочетанием терапевтических агентов, причем терапевтические агенты включают по меньшей мере один антиметаболит, по меньшей мере один комплекс платины и по меньшей мере один ингибитор PARP: (i) рак ER-отрицательный, (ii) рак PR-отрицательный, или (iii) рак НЕР2-отрицательный; и (d) если по меньшей мере два из приведенных выше условий не соблюдены, выбрать другой вариант лечения. В некоторых осуществлениях регистрируется по меньшей мере один терапевтический эффект, причем упомянутый терапевтический эффект представляет собой уменьшение размеров опухоли молочной железы, сокращение метастазов, полную ремиссию, частичную ремиссию, полный патологический ответ или стабильное течение болезни. В некоторых осуществлениях удалось достигнуть улучшения сопоставимого уровня клинического ответа (CBR=CR+PR+SD≥6 месяцев) по сравнению с лечением без ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях уровень клинического ответа составляет по меньшей мере примерно 30%. В некоторых осуществлениях удалось достигнуть улучшения сопоставимого уровня клинического ответа (CBR=CR+PR+SD≥6 месяцев) по сравнению с лечением антиметаболитом и комплексом платины, но без ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях уровень клинического ответа составляет по меньшей мере примерно 60%. В некоторых осуществлениях в качестве образца используется ткань или проба жидкостей организма. В некоторых осуществлениях в качестве образца используется образец опухоли, проба крови, проба плазмы крови, проба жидкости брюшной полости, экссудат или эффузия. В некоторых осуществлениях в качестве ингибитора PARP используется ингибитор PARP-1. В других осуществлениях ингибитором PARP является бензамид. В некоторых осуществлениях в качестве бензамида используется 4-иод-3-нитробензамид. В некоторых осуществлениях комплексом платины является карбоплатин. В некоторых осуществлениях антиметаболитом является цитабин. В некоторых осуществлениях антиметаболитом является гемцитабин. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях рак молочной железы диагностирован на I стадии, II стадии или III стадии. В некоторых осуществлениях рак молочной железы является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из: ER, PR или HER2. В некоторых осуществлениях рак молочной железы является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из: ER, PR или HER2; и при этом рак молочной железы положителен по отношению по меньшей мере к одному из ER, PR или HER2. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HER2-отрицательный метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и PR-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный, PR-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях лечение предусматривает цикл лечения продолжительностью по меньшей мере 11 дней, при этом: (а) в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно от 10 до 100 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях 4-иод-3-нитробензамид применяется перорально или в качестве внутривенного вливания. В некоторых осуществлениях лечение предусматривает цикл лечения продолжительностью по меньшей мере 11 дней, при этом: (а) в 1 и 8 дни цикла пациент получает примерно 100-2000 мг/м гемцитабина; (b) в 1 и 8 дни цикла пациент получает примерно от 10 до 400 мг/м карбоплатина; и (с) в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно от 10 до 100 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях гемцитабин вводится в форме внутривенного вливания. В некоторых осуществлениях карбоплатин вводится в форме внутривенного вливания. В некоторых осуществлениях 4-иод-3-нитробензамид применяется перорально или в качестве внутривенного вливания.
Некоторые осуществления, раскрываемые в настоящем документе, включают способ лечения рака молочной железы у пациента, нуждающегося в таком лечении, который предусматривает: (а) получение образца от пациента; (b) анализ образца для установления каждого из приведенных ниже фактов: (i) является ли рак ER-положительным или ER-отрицательным; (ii) является ли рак PR-положительным или PR-отрицательным; и (iii) является ли рак HER2-положительным или HER2-отрицательным; (с) если соблюдены два или более приведенных ниже условий, провести лечение пациента по меньшей мере одним из ингибиторов PARP: (i) рак ER-отрицательный, (ii) рак PR-отрицательный, или (iii) рак HER2-отрицательный; и (d) если по меньшей мере два или более из условий (i)-(iii) не соблюдены, выбрать другой вариант лечения.
Некоторые осуществления, описанные в настоящем документе, содержат способ лечения ER-отрицательного, PR-отрицательного, HER-2 отрицательного метастатического рака молочной железы у пациента, нуждающегося в таком лечении, предусматривающий введение упомянутому пациенту по меньшей мере одного ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях удалось достигнуть улучшения сопоставимого уровня клинического ответа (CBR=CR+PR+SD≥6 месяцев) по сравнению с лечением без ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях уровень клинического ответа составляет по меньшей мере примерно 30%. В некоторых осуществлениях пациенту вводятся два или более терапевтических соединений в единой лекарственной форме. В некоторых осуществлениях в качестве ингибитора PARP используется ингибитор PARP-1. В других осуществлениях ингибитором PARP является бензамид. В некоторых осуществлениях в качестве бензамида используется 4-иод-3-нитробензамид. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HER2-отрицательный метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и PR-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях под раком молочной железы является ER-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный, PR-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях лечение предусматривает выбор цикла лечения продолжительностью по меньшей мере 11 дней, при этом в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно от 10 до 100 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях 4-иод-3-нитробензамид применяется перорально или в качестве внутривенного вливания.
Некоторые осуществления содержат способ лечения рака молочной железы у пациента, включающий: (а) анализ образца пациента на предмет экспрессии PARP; и (b) если экспрессия PARP превышает заранее установленный уровень, введение пациенту по меньшей мере одного ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях регистрируется по меньшей мере один терапевтический эффект, причем упомянутый терапевтический эффект представляет собой уменьшение размеров опухоли молочной железы, сокращение метастазов, полную ремиссию, частичную ремиссию, полный патологический ответ или стабильное течение болезни. В некоторых осуществлениях удалось достигнуть улучшения сопоставимого уровня клинического ответа (CBR=CR+PR+SD≥6 месяцев) по сравнению с лечением без ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях улучшение уровня клинического ответа составляет по меньшей мере примерно 30%. В некоторых осуществлениях в качестве ингибитора PARP используется ингибитор PARP-1. В других осуществлениях ингибитором PARP является бензамид. В некоторых осуществлениях в качестве бензамида используется 4-иод-3-нитробензамид. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является метастатический рак молочной железы.
В некоторых осуществлениях способ дополнительно предусматривает анализ образца пациента на предмет экспрессии рецепторов эстрогенов, рецепторов прогестерона или рецепторов эпидермального фактора роста человека 2. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HR-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и PR-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный, PR-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях лечение предусматривает выбор цикла лечения продолжительностью по меньшей мере 11 дней, при этом в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно от 10 до 100 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях 4-иод-3-нитробензамид применяется перорально или в качестве внутривенного вливания.
Некоторые осуществления, раскрываемые в настоящем документе, включают способ лечения рака молочной железы у пациента, нуждающегося в таком лечении, который предусматривает: (а) получение образца от пациента; (b) анализ образца для установления каждого из приведенных ниже фактов: (i) является ли рак ER-положительным или ER-отрицательным; (ii) является ли рак PR-положительным или PR-отрицательным; и (iii) является ли рак HER2-положительным или HER2-отрицательным; (с) если соблюдены два или более приведенных ниже условий, провести лечение пациента сочетанием терапевтических агентов, причем терапевтические агенты включают по меньшей мере один антиметаболит, по меньшей мере один комплекс платины и по меньшей мере один ингибитор PARP: (i) рак ER-отрицательный, (ii) рак PR-отрицательный, или (iii) рак HER2-отрицательный; и (d) если по меньшей мере два или более из условий (i)-(iii) не соблюдены, выбрать другой вариант лечения. В некоторых осуществлениях гемцитабин вводится в форме внутривенного вливания. В некоторых осуществлениях карбоплатин вводится в форме внутривенного вливания. В некоторых осуществлениях 4-иод-3-нитробензамид применяется перорально или в качестве внутривенного вливания.
2
2
Некоторые осуществления, описанные в настоящем документе, содержат способ лечения ER-отрицательного, PR-отрицательного, HER-2 отрицательного метастатического рака молочной железы у пациента, нуждающегося в таком лечении, предусматривающий введение упомянутому пациенту по меньшей мере одного антиметаболита, по меньшей мере одного комплекса платины и по меньшей мере одного ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях удалось достигнуть улучшения сопоставимого уровня клинического ответа (CBR=CR+PR+SD≥6 месяцев) по сравнению с лечением антиметаболитом и комплексом платины, но без ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях уровень клинического ответа составляет по меньшей мере примерно 60%. В некоторых осуществлениях пациенту вводятся два или более терапевтических соединений в единой лекарственной форме. В некоторых осуществлениях ингибитором PARP является бензамид. В некоторых осуществлениях в качестве бензамида используется 4-иод-3-нитробензамид. В некоторых осуществлениях комплексом платины является карбоплатин. В некоторых осуществлениях антиметаболитом является цитабин. В некоторых осуществлениях антиметаболитом является гемцитабин. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях рак молочной железы диагностирован на I стадии, II стадии или III стадии. В некоторых осуществлениях рак молочной железы является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из: ER, PR или HER2. В некоторых осуществлениях рак молочной железы является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из: ER, PR или HER2; и при этом рак молочной железы положителен по отношению по меньшей мере к одному из ER, PR или HER2. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HER2-отрицательный метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и PR-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях под раком молочной железы является ER-отрицательный, PR-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях лечение предусматривает выбор цикла лечения продолжительностью по меньшей мере 11 дней, при этом: (а) в 1 и 8 дни цикла пациент получает примерно 100-2000 мг/м гемцитабина; (b) в 1 и 8 дни цикла пациент получает примерно от 10 до 400 мг/м карбоплатина; и (с) в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно от 10 до 100 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях гемцитабин вводится в форме внутривенного вливания. В некоторых осуществлениях карбоплатин вводится в форме внутривенного вливания. В некоторых осуществлениях 4-иод-3-нитробензамид применяется перорально или в качестве внутривенного вливания.
2
2
Некоторые осуществления содержат способ лечения рака молочной железы у пациента, включающий: (а) анализ образца пациента на предмет экспрессии PARP; и (b) если экспрессия PARP превышает заранее установленный уровень, введение пациенту по меньшей мере одного антиметаболита, по меньшей мере одного комплекса платины и по меньшей мере одного ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях регистрируется по меньшей мере один терапевтический эффект, причем упомянутый терапевтический эффект представляет собой уменьшение размеров опухоли молочной железы, сокращение метастазов, полную ремиссию, частичную ремиссию, полный патологический ответ или стабильное течение болезни. В некоторых осуществлениях удалось достигнуть улучшения сопоставимого уровня клинического ответа (CBR=CR+PR+SD≥6 месяцев) по сравнению с лечением антиметаболитом и комплексом платины, но без ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях улучшение уровня клинического ответа составляет по меньшей мере примерно 60%. В некоторых осуществлениях ингибитором PARP является бензамид. В некоторых осуществлениях в качестве бензамида используется 4-иод-3-нитробензамид. В некоторых осуществлениях комплексом платины является карбоплатин. В некоторых осуществлениях антиметаболитом является цитабин. В некоторых осуществлениях антиметаболитом является гемцитабин. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является метастатический рак молочной железы. В некоторых осуществлениях способ дополнительно предусматривает анализ образца пациента на предмет экспрессии рецепторов эстрогенов, рецепторов прогестерона или рецепторов эпидермального фактора роста человека 2. В некоторых осуществлениях рак молочной железы является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из: ER, PR или HER2. В некоторых осуществлениях рак молочной железы является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из: ER, PR или HER2; и при этом рак молочной железы положителен по отношению по меньшей мере к одному из ER, PR или HER2. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HR-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и PR-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является PR-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является ER-отрицательный, PR-отрицательный и HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях лечение предусматривает выбор цикла лечения продолжительностью по меньшей мере 11 дней, при этом: (а) в 1 и 8 дни цикла пациент получает примерно 100-2000 мг/м гемцитабина; (b) в 1 и 8 дни цикла пациент получает примерно от 10 до 400 мг/м карбоплатина; и (с) в 1, 4, 8 и 11 дни цикла пациент получает примерно от 10 до 100 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида. В некоторых осуществлениях гемцитабин вводится в форме внутривенного вливания. В некоторых осуществлениях карбоплатин вводится в форме внутривенного вливания. В некоторых осуществлениях 4-иод-3-нитробензамид применяется перорально или в качестве внутривенного вливания.
Таким образом, приведенные в настоящем документе осуществления предусматривают лечение пациента по меньшей мере тремя химически различными веществами, одно из которых является антиметаболитом, другое представляет собой платиносодержащий комплекс, а в качестве третьего применяется ингибитор PARP. В некоторых осуществлениях одно или несколько таких веществ могут применяться в самых различных физических формах - например, свободное основание, соли (особенно фармацевтически приемлемые соли), гидраты, полиморфы, сольваты, метаболиты и пр. За исключением случаев, специально оговоренных в настоящем документе, использование химического названия подразумевает охват всех физических форм упомянутого химического вещества. Например, упоминание 4-иод-3-нитробензамида без дополнительных характеристик подразумевает в общем случае свободное основание, а также все фармацевтически приемлемые соли, полиморфы, гидраты, метаболиты и пр. В тех случаях, когда есть необходимость ограничить раскрытие или формулу изобретения какой-либо конкретной физической формой соединения, это будет очевидно из контекста формулировки или пункта формулы, в котором приводится ссылка на такое соединение.
2
2
В некоторых осуществлениях настоящего изобретения предлагается способ лечения рака молочной железы, предусматривающий введение пациенту по меньшей мере одного таксана, по меньшей мере одного комплекса платины, по меньшей мере одного ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях регистрируется по меньшей мере один терапевтический эффект, причем упомянутый терапевтический эффект представляет собой уменьшение размеров опухоли молочной железы, сокращение метастазов, полную ремиссию, частичную ремиссию, полный патологический ответ или стабильное течение болезни. В некоторых осуществлениях ингибитором PARP является бензамид. В некоторых осуществлениях в качестве бензамида используется 4-иод-3-нитробензамид. В некоторых осуществлениях комплексом платины является карбоплатин. В некоторых осуществлениях способ предусматривает цикл лечения продолжительностью по меньшей мере 11 дней: (а) в 1 день цикла пациент получает примерно 10-200 мг/м паклитаксела; (b) в 1 день цикла пациент получает примерно 10-400 мг/м карбоплатина; и (с) в 1 день и дважды в неделю в течение цикла пациент получает примерно 1-100 мг/кг 4-иод-3-нитробензамида.
В некоторых осуществлениях раскрываемая в настоящем документе информация содержит способ лечения рака молочной железы у пациента, включающий: (а) взятие образца у пациента; (b) анализ образца пациента на предмет уровня экспрессии PARP в образце; (с) определение возможного превышения экспрессии PARP заранее установленного уровня, и если это регистрируется, введение пациенту по меньшей мере одного комплекса платины и по меньшей мере одного ингибитора PARP. В некоторых осуществлениях способ также включает возможный выбор другого варианта лечения, если уровень экспрессии PARP в образце не превышает заранее установленного уровня. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является рак, отрицательный по одному или нескольким рецепторам гормонов. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является HER2-отрицательный рак молочной железы. В некоторых осуществлениях раком молочной железы является отрицательный по рецепторам эстрогена (ER), рецепторам прогестерона (PR) или HER2. В некоторых осуществлениях рак молочной железы является положительным по меньшей мере по одному рецептору гормонов или HER2. В некоторых осуществлениях комплексом платины является карбоплатин. В некоторых осуществлениях комплексом платины является карбоплатин. В некоторых осуществлениях ингибитором PARP является бензамид. В некоторых осуществлениях в качестве ингибитора PARP используется 4-иод-3-нитробензамид. В некоторых осуществлениях в качестве образца используется срез опухоли или проба жидкостей организма.
Термины «эффективное количество» или «фармацевтически эффективное количество» относятся к количеству агента, достаточному для достижения желаемого биологического, терапевтического и (или) профилактического результата. Таким результатом может быть снижение и (или) смягчение признаков, симптомов или причин заболевания, или любое другое желательное изменение в биологической системе. Например, «эффективным количеством» для терапевтического применения является количество нитробензамидного соединения в чистом виде, информация о котором раскрывается в настоящем документе, или состава, включающего нитробензамидное соединение настоящего изобретения, которое необходимо для достижения клинически значимого смягчения заболевания. Подходящее эффективное количество в каждом индивидуальном случае может определяться квалифицированным специалистом в области в рамках стандартных экспериментов.
Под «фармацевтически приемлемым» или «фармакологически приемлемым» понимают материал, который не является недопустимым с биологической или иной точки зрения, то есть такой материал может вводиться в организм человека без значительных нежелательных биологических эффектов или разрушительного по своей сути взаимодействия с любым из компонентов состава, вместе с которыми он вводится.
Используемый в настоящем документе термин «лечение» и его грамматические эквиваленты предполагают достижение терапевтических и (или) профилактических благоприятных эффектов. Под терапевтическим благоприятным эффектом понимается устранение или облегчение основного заболевания, лечение которого производится. Например, в случае онкологического пациента терапевтический благоприятный эффект включает устранение или смягчение проявлений рака. Кроме того, терапевтический благоприятный эффект достигается при устранении или смягчении одного или нескольких физиологических симптомов, связанных с основным заболеванием, так что у пациента отмечаются улучшения, несмотря на то что пациент может по-прежнему страдать от основного заболевания. Для профилактического благоприятного эффекта в отношении пациента, у которого выявлен риск развития рака, или пациент, у которого выявлены один или несколько физиологических симптомов такого состояния, даже при отсутствии постановки диагноза такого состояния может применяться способ настоящего изобретения или вводиться препарат настоящего изобретения.
Противоопухолевые агенты
В качестве противоопухолевых агентов, которые могут использоваться в настоящем изобретении, среди прочих, выступают противоопухолевые антиметаболиты, противоопухолевый комплекс платины или их фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых осуществлениях противоопухолевым агентом является антиметаболит. Используемый в настоящем документе термин «антиметаболит» вообще охватывает вещества, которые нарушают нормальный метаболизм, и вещества, которые ингибируют систему переноса электрона, чтобы воспрепятствовать образованию высокоэнергетических интермедиатов за счет их структурных или функциональных сходств с метаболитами, имеющими важное значение для живых организмов (например, витамины, коферменты, аминокислоты и сахариды). Примерами антиметаболитов, которые обладают противоопухолевой активностью, среди прочих, могут служить метотрексат, 6-меркаптопуринрибозид, меркаптопурин, 5-фторурацил, тегафур, доксифлуридин, кармофур, цитарабин, цитарабин окфосфат, эноцитабин, S-1, гемцитабин, флударабин или перметрексед динатрий, и предпочтительными являются 5-фторурацил, S-1, гемцитабин и пр.
В некоторых осуществлениях противоопухолевым агентом является органическое соединение платины или координационное соединение платины, которое проявляет противоопухолевую активность. В настоящем документе органическим соединением платины называют соединение, содержащее платину в форме иона. Предпочтительными органическими соединениями платины, среди прочих, являются цисплатин, ион цис-диаминодиакваплатины (II); хлор(диэтилентриамин)платина (II) хлорид; дихлор(этилендиамин)платина (II); диамин(1,1-циклобутандикарбоксилато)платина (II) (карбоплатин); спироплатин; ипроплатин; диамин(2-этилмалонато)платина (II); этилендиаминмалонатплатина (II); аква(1,2-диаминодициклогексан)сульфатоплатина (II); аква(1,2-диаминодициклогексан)малонатоплатина (II); (1,2-диаминоциклогексан)малонатоплатина (II); (4-карбоксифталато)(1,2-диаминоциклогексан)платина (II); (1,2-диаминоциклогексан)-(изоцитрато)платина (II); (1,2-диаминоциклогексан)оксалоплатина (II); ормаплатин; тетраплатин; карбоплатин, недаплатин и оксалиплатин, и предпочтительными являются карбоплатин или оксалиплатин. Кроме того, известны и другие противоопухолевые органические соединения платины, перечисленные в описании, и они серийно выпускаются и (или) могут производиться специалистом в области с использованием стандартных методик.
Описанные выше термины «противоопухолевый антиметаболит», «противоопухолевое координационное соединение платины» хорошо известны и либо серийно выпускаются, либо могут производиться специалистом в области с использованием специальных методов или хорошо известных или стандартных методик. Процесс получения гемцитабина описан, например, в патентах U.S. Pat. №№5434254 и 5223608; и процесс получения камптотецина описан в патентах U.S. Pat. №№. 5162532, 5247089, 5191082, 5200524, 5243050 и 5321140.
Упомянутые выше противоопухолевые антиметаболиты производятся серийно, что отражено в приведенном ниже перечне: метотрексат производит Takeda Pharmaceutical Co., Ltd. под названием метотрексат (торговое название); 6-меркаптопуринрибозид производит Aventis Corp. под названием тиоинозин (торговое название); меркаптопурин производит Takeda Pharmaceutical Co., Ltd. под названием лейкерин (торговое название); 5-фторурацил производит Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. под названием 5-FU (торговое название); тегафур производит Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. под названием футрафул (торговое название); доксифлуридин производит Nippon Roche Co., Ltd. под названием фурутулон (торговое название); кармофур производит Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. под названием ямафур (торговое название); цитарабин производит Nippon Shinyaku Co., Ltd. под названием цилоцид (торговое название); цитарабин окфосфат производит Nippon Kayaku Co., Ltd. под названием стразид (торговое название); эноцитабин производит Asahi Kasei Corp. под названием санрабин (торговое название); S-1 производит Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. под названием TS-1 (торговое название); гемцитабин производит Eli Lilly & Со. под названием гемзар (торговое название); флударабин производит Nippon Schering Co., Ltd. под названием флудара (торговое название); и пеметрексед динатрий производит Eli Lilly & Со. под названием алимта (торговое название). Упомянутые выше противоопухолевые антибиотики производятся серийно, что отражено в приведенном ниже перечне: актиномицин D производит Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. под названием космеген (торговое название); доксорубицин производит Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. под названием адриацин (торговое название); даунорубицин производит Meiji Seika Kaisha Ltd. под названием дауномицин; неокарциностатин производит Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. под названием неокарциностатин (торговое название); блеомицин производит Nippon Kayaku Co., Ltd. под названием блео (торговое название); пепромицин производит Nippon Kayaku Co, Ltd. под названием пепро (торговое название); митомицин С производит Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. под названием митомицин (торговое название); акларубицин производит Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. под названием аклацинон (торговое название); пирарубицин производит Nippon Kayaku Co., Ltd. под названием пинорубицин (торговое название); эпирубицин производит Pharmacia Corp. под названием фарморубицин (торговое название); зиностатин стималамер производит Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. под названием сманкс (торговое название); идарубицин производит Pharmacia Corp. под названием идамицин (торговое название); сиролимус производит Wyeth Corp. под названием рапамун (торговое название); и валрубицин производит Anthra Pharmaceuticals Inc. под названием валстар (торговое название).
Упомянутые выше противоопухолевые координационные соединения платины производятся серийно, что отражено в приведенном ниже перечне: цисплатин производит Nippon Kayaku Co., Ltd. под названием ранда (торговое название); карбоплатин производит Bristol-Myers Squibb Co. под названием параплатин (торговое название); недалплатин производит Shionogi & Co., Ltd. под названием аквапла (торговое название); и оксалиплатин производит Sanofi-Synthelabo Co. под названием элоксатин (торговое название).
Использованный в описании термин «противоопухолевый агент» включает описанный выше противоопухолевый антиметаболит, противоопухолевое координационное соединение платины.
Антиметаболиты:

2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Антиметаболитами называют лекарственные препараты, которые вмешиваются в нормальные процессы клеточного метаболизма. Поскольку раковые клетки воспроизводят себя исключительно быстро, вмешательство в процессы клеточного метаболизма затрагивает раковые клетки в гораздо большей степени по сравнению с клетками организма-носителя. Гемцитабин (4-амино-1-[3,3-дифтор-4-гидрокси-5-(гидроксиметил)тетрагидрофуран-2]-1Н-пиримидин-2-он, выпускаемый под названием ГЕМЗАР компанией Eli Lilly and Company), представляет собой аналог нуклеозида, который вмешивается в процесс деления клеток посредством блокирования синтеза ДНК, тем самым приводя к гибели клеток очевидно за счет механизма апоптоза. Дозировка гемцитабина может корректироваться для конкретного пациента. Для взрослых дозировка гемцитабина при его использовании вместе с препаратом платины и ингибитором PARP будет находиться в интервале примерно от 100 мг/м до 5000 мг/м, в интервале примерно от 100 мг/м до 2000 мг/м, в интервале примерно от 750 мг/м до 1500 мг/м, примерно от 900 мг/м до 1400 мг/м или примерно 1250 мг/м. Размерность мг/м означает количество гемцитабина в миллиграммах (мг) на единицу площади поверхности тела пациента в квадратных метрах (м). Гемцитабин может вводиться посредством внутривенного вливания (в/в), например, в течение периода примерно от 10 до 300 минут, примерно от 15 минут до 180 минут, примерно от 20 минут до 60 минут или примерно 10 минут. Термин «примерно» в данном контексте указывает на стандартное применение приблизительного количества; и в некоторых осуществлениях определяет допустимый интервал ±10% или ±5%.
Комплексы платины:
2
2
Комплексы платины представляют собой лекарственные препараты, применяемые для лечения рака, они содержат по меньшей мере один платиновый центр, связанный в комплекс с по меньшей мере одной органической группой. Карбоплатин ((SP-4-2)-диамин[1,1-циклобутандикарбоксилат(2-)-О,О′платина), например цисплатин и оксалиплатин, является агентом, алкилирующим ДНК. Дозировка карбоплатина определяется по расчету площади под кривой концентрации в плазме (AUC) с помощью методов, известных специалистам в области химиотерапии рака, с учетом клиренса креатинина пациента. В некоторых осуществлениях дозировка карбоплатина для комбинационной терапии вместе с антиметаболитом (например, гемцитабином) и ингибитором PARP (например, 4-иод-3-нитробензамидом) рассчитывается таким образом, чтобы обеспечить AUC, равную примерно 0,1-6 мг/мл мин, примерно 1-3 мг/мл мин, примерно от 1,5 до 2,5 мг/мл мин, примерно от 1,75 до 2,25 мг/мл мин или примерно 2 мг/мл мин (AUC 2, например, является сокращением для 2 мг/мл мин). В некоторых осуществлениях дозировка карбоплатина для комбинационной терапии вместе с таксаном (например, паклитакселом или доцетакселом) и ингибитором PARP (например, 4-иод-3-нитробензамидом) рассчитывается таким образом, чтобы обеспечить AUC, равную примерно 0,1-6 мг/мл мин, примерно 1-3 мг/мл мин, примерно от 1,5 до 2,5 мг/мл мин, примерно от 1,75 до 2,25 мг/мл мин или примерно 2 мг/мл мин (AUC 2, например, является сокращением для 2 мг/мл мин). В некоторых осуществлениях подходящая доза карбоплатина вводится в диапазоне примерно от 10 до 400 мг/м, например примерно 360 мг/м. Комплексы платины, например карбоплатин, обычно вводятся посредством внутривенного вливания (в/в), например, в течение периода примерно от 10 до 300 минут, примерно от 30 минут до 180 минут, примерно от 45 минут до 120 минут или примерно 60 минут. Термин «примерно» в данном контексте указывает на стандартное применение приблизительного количества. В некоторых осуществлениях примерно означает ±10% или ±5%.
Ингибиторы PARP:
В некоторых осуществлениях настоящего изобретения предлагается способ лечения рака молочной железы, который является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из ER, PR или HER2, предусматривающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, по меньшей мере одного ингибитора PARP. В других осуществлениях настоящего изобретения предлагается способ лечения рака молочной железы, предусматривающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, по меньшей мере одного ингибитора PARP в сочетании с по меньшей мере одним противоопухолевым агентом, описанным в настоящем изобретении.
Соединения, описанные в настоящем документе, без каких-либо ограничений в отношении любого конкретного механизма действия, считаются обладающими противораковыми свойствами благодаря модуляции активности поли(АДФ-рибозы) полимеразы (PARP). Такой механизм действия связан со способностью ингибиторов PARP связывать PARP и снижать ее активность. PARP катализирует трансформацию β-никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) в никотинамид и поли-АДФ-рибозу (PAR). И поли(АДФ-рибоза), и PARP связывались с регулированием транскрипции, пролиферации клеток, стабильности генома и карциногенеза (Bouchard V.J. et. al. Experimental Hematology, Volume 31, Number 6, June 2003, pp.446-454 (9); Herceg Z.; Wang Z.-Q. Mutation Research/ Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Volume 477, Number 1, 2 June 2001, pp.97-110 (14)). Поли(АДФ-рибоза) полимераза 1 (PARP1) является ключевой молекулой в репарации одноцепочечных разрывов (SSB) ДНК (de Murcia J, et al. 1997, Proc Nati Acad Sci USA 94: 7303-7307; Schreiber V, Dantzer F, Ame JC, de Murcia G (2006) Nat Rev Mol Cell Biol 7:517-528; Wang ZQ, et al. (1997) Genes Dev 11:2347-2358). Нокаут репарации SSB посредством ингибирования функции PARP1 индуцирует двухцепочечные разрывы (DSB) ДНК, которые могут вызвать синтетическую летальность раковых клеток с дефектом гомологически ориентированной репарации DSB (Bryant HE, et al. (2005) Nature 434:913-917; Fanner H, et al. (2005) Nature 434:917-921).
BRCA1 и BRCA2 являются неотъемлемым элементом механизма гомологической рекомбинации (HR) (Narod SA, Foulkes WD (2004) Nat Rev Cancer 4:665-676; Gudmundsdottir К, Ashworth A (2006) Oncogene 25:5864-5874).
Клетки с дефектами BRCA1 или BRCA2 характеризуются дефектом репарации двухцепочечных разрывов (DSB) по механизму гомологической рекомбинации (HR) посредством конверсии гена (Fanner H, et al. (2005) Nature 434:917-921; Narod SA, Poulkes WD (2004) Nat Rev Cancer 4:665-676; Gudmundsdottir K, Ashworth A (2006) Oncogene 25:5864-5874; Helleday T, et al. (2008) Nat Rev Cancer 8:193-204). Дефицит под одному из определяющих чувствительность к раку молочной железы белков BRCA1 или BRCA2 индуцирует заметную клеточную чувствительность к ингибированию активности поли(АДФ-рибозы) полимеразы (PARP), приводя к остановке клеточного цикла и апоптозу. Отмечалось, что важнейшая роль BRCA1 и BRCA2 в репарации двухцепочечных разрывов посредством гомологической рекомбинации (HR) является основной причиной такой чувствительности, и недостаток RAD51, RAD54, DSS1, RPA1, NBS1, ATR, АТМ, CHK1, CHK2, FANCD2, FANCA или FANCC индуцирует такую чувствительность (McCabe N. et.al. Deficiency in the repair of DNA damage by homologous recombination and sensitivity to poly(ADP-ribose) polymerase inhibition. Cancer research 2006, vol.66, 8109-8115). Предполагалось, что ингибирование PARP1 может использоваться в качестве специфической терапии для рака с дефектами BRCA1/2 или других компонентов пути гомологической рекомбинации (Helleday Т, et al. (2008) Nat Rev Cancer 8:193-204). На долю трижды негативных опухолей приходится 15% всех случаев рака молочной железы, и они часто характеризуются дефектами в репарации двухцепочечных разрывов ДНК посредством гомологической рекомбинации (HR), например нарушением функции BRCA1 (Rottenberg S, et.al. Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Nov 4:105 (44):17079-84).
Ингибирование активности молекулы PARP подразумевает снижение активности этих молекул. Термин «ингибирует» и его грамматические формы, например «ингибирующий», не подразумевают обязательного полного снижения активности PARP. В некоторых осуществлениях такое снижение составляет по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 90% или по меньшей мере примерно 95% активности молекулы в отсутствие ингибирующего эффекта, например в отсутствие ингибитора, например нитробензамидного соединения настоящего изобретения. В некоторых осуществлениях под ингибированием понимают наблюдаемое или измеримое снижение активности. В некоторых сценариях лечения ингибирование оказывается достаточным для получения терапевтических и (или) профилактических благоприятных эффектов для заболевания, в отношении которого проводится лечение. Выражение «не ингибирует» и его грамматические формы необязательно предполагают полное отсутствие эффекта воздействия на активность. Например, оно относится к ситуациям, при которых наблюдается менее примерно 20%, менее примерно 10% и предпочтительно менее примерно 5% снижения активности PARP в присутствии ингибитора, например, нитробензамидного соединения настоящего изобретения.
Поли(АДФ-рибоза) полимераза (PARP) является важным ферментом для репарации ДНК, тем самым играя потенциально значимую роль в резистентности по отношению к химиотерапии. Считается, что целенаправленное воздействие на PARP потенциально в состоянии нарушить репарацию ДНК, тем самым усиливая воздействие таксана, антиметаболита, ингибитора топоизомеразы и ингибитора рецептора фактора роста, например, ингибитора IGF1R, и (или) комплекса платины на репликацию ДНК и (или) репарацию ДНК в раковых клетках. Ингибиторы PARP могут также проявлять высокую активность против рака молочной железы с нарушенными функциями BRCA1 и BRCA2 или у тех пациентов, у которых наблюдаются другие дефекты путей репарации ДНК. ER, PR, HER2-отрицательные формы первичного рака молочной железы характеризуются повышенной активностью PARP. Для такого подтипа рака молочной железы существует 9-кратный риск мутации BRCA-1, и могут проявляться дополнительные дефекты, характерные для путей репарации ДНК при анемии Фанкони.
4-Иод-3-нитробензамид (ВА) представляет собой малую молекулу, которая воздействует на клетки опухоли, не вызывая токсических эффектов в здоровых клетках. Считается, что антинеопластический эффект ВА обеспечивается за счет ингибирования PARP. ВА весьма липофилен и быстро и широко распределяется внутри тканей, в том числе в головном мозге и спинно-мозговой жидкости (СМЖ). Он проявляет активность против широкого спектра раковых клеток, в том числе против фармакорезистентных клеточных линий. Специалистам в области будет очевидно, что ВА может вводиться в любой фармацевтически приемлемой форме, например в виде фармацевтически приемлемой соли, сольвата или комплекса. Кроме того, поскольку ВА склонен к таутомеризации в растворах, таутомерная форма ВА также считается входящей в определение ВА (или ее эквивалент 4-иод-3-нитробензамид) наряду с солями, сольватами или комплексами. В некоторых осуществлениях ВА может вводиться в сочетании с циклодекстрином, например гидроксипропил-бета-циклодекстрином. При этом специалистам в области будет очевидно, что и другие активные и неактивные агенты могут применяться в сочетании с ВА; и упоминание ВА, если не указано иное, будет охватывать все его фармацевтически приемлемые формы.
Базальные формы рака молочной железы проявляют высокую склонность к метастазированию в головной мозг; и известно, что ВА проникает через гематоэнцефалический барьер. Не имея намерения ограничиваться рамками какой-либо конкретной теории, отметим, что антинеопластический эффект ВА предположительно обеспечивается за счет ингибирования функции PARP. В некоторых осуществлениях ВА может использоваться для лечения трижды негативных метастатических опухолей молочной железы. В некоторых осуществлениях ВА может использоваться для лечения опухолей молочной железы, отрицательных по отношению по меньшей мере к одному из ER, PR и Her2. В некоторых осуществлениях ВА может использоваться для лечения опухолей молочной железы, отрицательных по отношению по меньшей мере к двум из ER, PR и Her2, например ER-отрицательная, PR-отрицательная и Her2-положительная; или ER-положительная, PR-отрицательная и Her2-отрицательная; или ER-отрицательная, PR-положительная и Her2-отрицательная.
В некоторых осуществлениях ВА может использоваться для лечения опухолей молочной железы в сочетании с противоопухолевым агентом. В некоторых осуществлениях в качестве противоопухолевого агента выступают противоопухолевый антиметаболит, противоопухолевый комплекс платины или их фармацевтически приемлемая соль. В других осуществлениях ВА может использоваться для лечения опухолей молочной железы в сочетании с антиметаболитом, например гемцитабином, и комплексом платины, например карбоплатином. В других осуществлениях ВА может использоваться для лечения опухолей молочной железы в сочетании с антиметаболитом, например гемцитабином, и комплексом платины, например карбоплатином. В некоторых осуществлениях рак молочной железы отрицателен по меньшей мере по двум из ER, PR или Her-2. В некоторых осуществлениях рак молочной железы отрицателен по отношению по меньшей мере к одному из ER, PR или Her-2 и положителен по отношению по меньшей мере к одному из ER, PR или Her-2. В некоторых осуществлениях рак молочной железы отрицателен по меньшей мере по двум из ER, PR или Her2, например ER-отрицательный, PR-отрицательный и Her2-положительный; или ER-положительный, PR-отрицательный и Her2-отрицательный; или ER-отрицательный, PR-положительный и Her2-отрицательный.
Дозировку ингибитора PARP можно менять в зависимости от возраста, роста, веса, общего состояния здоровья пациента и пр. В некоторых осуществлениях дозировка ВА находится в пределах примерно от 1 мг/кг до 100 мг/кг, примерно от 2 мг/кг до 50 мг/кг, примерно 2 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 6 мг/кг, примерно 8 мг/кг, примерно 10 мг/кг, примерно 12 мг/кг, примерно 15 мг/кг, примерно 20 мг/кг, примерно 25 мг/кг, примерно 30 мг/кг, примерно 35 мг/кг, примерно 40 мг/кг, примерно 50 мг/кг, примерно 60 мг/кг, примерно 75 мг/кг, примерно 90 мг/кг, примерно от 1 до 25 мг/кг, примерно от 2 до 70 мг/кг, примерно от 4 до 100 мг, примерно от 4 до 25 мг/кг, примерно от 4 до 20 мг/кг, примерно от 50 до 100 мг/кг или примерно от 25 до 75 мг/кг. ВА может вводиться внутривенно, например посредством в/в вливания в течение примерно от 10 до 300 минут, примерно от 30 до 180 минут, примерно от 45 до 120 минут или примерно 60 минут (то есть примерно 1 час). В некоторых применениях ВА может в качестве альтернативы вводиться перорально. Термин «примерно» в данном контексте указывает на стандартное применение приблизительного количества. В некоторых осуществлениях «примерно» означает ±10% или ±5%.
Синтез ВА (4-иод-3-нитробензамида) описан в патенте США №5464871, который в силу ссылки на него полностью включается в настоящий документ. ВА может готовиться в концентрациях 10 мг/мл и расфасовываться в удобную для применения форму, например во флаконы емкостью 10 мл.
Метаболиты ВА:
Используемые в настоящем документе сокращения: «ВА» означает 4-иод-3-нитробензамид; «BNO» означает 4-иод-3-нитрозобензамид; «BNHOH» означает 4-иод-3-гидроксиаминобензамид.
Соединения-предшественники настоящего изобретения имеют формулу (Ia)
1
2
3
4
5
1
6
1
6
3
7
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
где R, R, R, R и R независимо выбираются из группы, включающей водород, гидрокси, амино, нитро, иод, (C-C) алкил, (C-C) алкокси, (С-С) циклоалкил и фенил, при этом по меньшей мере двумя из пяти заместителей R, R, R, R и R всегда является водород, по меньшей мере одним из пяти заместителей всегда является нитро и по меньшей мере одним заместителем, находящимся рядом с нитро, всегда является иод, а также фармацевтически приемлемые соли, сольваты, изомеры, таутомеры, метаболиты, аналоги или их пролекарства. R, R, R, R и R может также быть галогеном, например, хлор, фтор или бром.
Предпочтительное соединение-предшественник с формулой Ia:
4-иод-3-нитробензамид(ВА)
Некоторые метаболиты, используемые в настоящем изобретении, имеют формулу (IIa):
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
6
1
6
3
7
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
где: (1) по меньшей мере один из заместителей R, R, R, R и R всегда является серосодержащим заместителем, а остальные заместители R, R, R, R и R независимо выбираются из группы, включающей водород, гидрокси, амино, нитро, иод, бром, фтор, хлор, (C-С) алкил, (C-C) алкокси, (С-С) циклоалкил и фенил, при этом по меньшей мере двумя из пяти заместителей R, R, R, R и R всегда является водород; или (2) по меньшей мере один из заместителей R, R, R, R и R не является серосодержащим заместителем и по меньшей мере одним из пяти заместителей R, R, R, R и R всегда является иод, и при этом упомянутый иод-заместитель всегда соседствует с R, R, R, R и R группой, в качестве которой выступает нитро-, нитрозо-, гидроксиамино-, гидрокси- или аминогруппа, а также фармацевтически приемлемые соли, сольваты, изомеры, таутомеры, метаболиты, аналоги или их пролекарства. В некоторых осуществлениях соединения (2) имеют такую структуру, что иод-группа всегда соседствует с группами R, R, R, R или R, в качестве которой выступает нитрозо-, гидроксиамино-, гидрокси- или аминогруппа. В некоторых осуществлениях соединения (2) имеют такую структуру, что иод-группа всегда соседствует с группами R, R, R, R или R, в качестве которой выступает нитрозо-, гидроксиамино- или аминогруппа.
Приведенные ниже составы являются предпочтительными метаболитами, каждый из них представлен соответствующей химической формулой:
6
1
8
1
8
R выбирается из группы, включающей водород, (C-C)алкил, (C-C)алкокси, изохинолины, индолы, тиазол, оксазол, оксадиазол, тиофен или фенил.
Хотя настоящий документ не предусматривает каких-либо ограничений в отношении того или иного конкретного механизма, ниже приводится пример метаболизма MS292 в рамках механизма с участием нитроредуктазы или конъюгации глутатиона:
Механизм с участием нитроредуктазы
Конъюгация ВА с глутатионом и метаболизм:
В настоящем изобретении предлагается использовать упомянутые выше соединения-метаболиты нитробензамида для лечения рака молочной железы, в том числе рака молочной железы, отрицательного по одному или нескольким ER, PR и (или) HER2.
Сообщалось, что соединения-метаболиты нитробензамида обладают селективной цитотоксичностью в отношении злокачественных раковых клеток, но не затрагивают доброкачественные раковые клетки. См. работу Rice et at., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7703-7707 (1992), которая полностью включается в настоящий документ. В одном из осуществлений соединения-метаболиты нитробензамида, использованные в способах настоящего изобретения, возможно, проявляют более селективную токсичность в отношении опухолевых клеток по сравнению со здоровыми.
В некоторых осуществлениях настоящего изобретения предлагается способ лечения рака молочной железы, который является отрицательным по отношению по меньшей мере к одному из ER, PR или HER2, предусматривающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, по меньшей мере одного ингибитора PARP. В других осуществлениях настоящего изобретения предлагается способ лечения рака молочной железы, предусматривающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, по меньшей мере одного ингибитора PARP в сочетании с по меньшей мере одним противоопухолевым агентом. В некоторых осуществлениях настоящего изобретения метаболиты вводятся пациенту, нуждающемуся в таком лечении, в сочетании с химиотерапией с по меньшей мере одним антиметаболитом (например, одним из цитабинов, например гемцитабином) и по меньшей мере одним комплексом платины (например, карбоплатин, цисплатин и пр.). Диапазон дозы для таких метаболитов может находиться в интервале примерно от 0,0004 до 0,5 ммоль/кг (миллимолей метаболита на килограмм массы тела пациента), причем такая дозировка в пересчете на моли соответствует интервалу примерно от 0,1 до 100 мг/кг ВА. Другие эффективные диапазоны дозы для метаболитов включают 0,0024-0,5 ммоль/кг и 0,0048-0,25 ммоль/кг. Такие дозы могут вводиться ежедневно, через день, дважды в неделю, еженедельно, раз в две недели, ежемесячно или в соответствии с другим подходящим графиком. Для введения метаболитов могут использоваться по сути те же способы, что и для ВА - например перорально, в/в, в/б и пр.
Комбинационная терапия
В некоторых осуществлениях настоящего изобретения способы изобретения также включают лечение рака молочной железы посредством введения пациенту ингибитора PARP с по меньшей мере одним противоопухолевым агентом или без него в сочетании с другими формами противораковой терапии, включая, среди прочего, хирургией, лучевой терапией (например, рентгеновским облучением), генной терапией, иммунотерапией, терапией ДНК, адъювантной терапией, неоадъювантной терапией, вирусной терапией, терапией РНК или нанотерапией.
В тех случаях, когда комбинационная терапия также включает безмедикаментозное лечение, такое безмедикаментозное лечение может проводиться в любое подходящее время, до тех пор пока не будет достигнут благоприятный эффект от совместного действия сочетания терапевтических агентов и безмедикаментозного лечения. Например, в соответствующих случаях благоприятный эффект все же достигается, если безмедикаментозное лечение на время прекращают при введении лекарственных препаратов на значительный период времени. Конъюгат или другой фармакологически активный агент может вводиться пациенту одновременно, последовательно или в комбинации. Следует понимать, что при использовании сочетания настоящего изобретения соединение настоящего изобретения и другой фармакологически активный агент могут находиться в одном и том же фармацевтически приемлемом носителе, а потому вводиться одновременно. Они могут быть в разных фармацевтических носителях, например в обычных лекарственных формах перорального введения, которые принимаются одновременно. Термин «комбинация» также относится к случаю, когда соединения готовятся в различных лекарственных формах и вводятся последовательно.
Лучевая терапия
Лучевая терапия (или радиотерапия) представляет собой применение ионизирующего излучения в медицинских целях при лечении рака для контроля злокачественных клеток. Радиотерапия может использоваться для радикального или адъювантного лечения рака. Она применяется в качестве паллиативного лечения (если излечение невозможно, и целью является локальный контроль заболевания или облегчение симптомов) или же терапевтического лечения (если терапия обеспечивает выживание и может быть радикальной). Радиотерапия используется для лечения злокачественных опухолей и может применяться в качестве первичной терапии. Также распространено сочетание радиотерапии с хирургическим вмешательством, химиотерапией, гормональной терапией или определенным сочетанием трех перечисленных выше методик. Для лечения большинства распространенных форм рака могут применяться те или иные методы радиотерапии. Точная адресация лечения (радикальное, адъювантное, неоадъювантное, терапевтическое или паллиативное) будет зависеть от вида опухоли, локализации и стадии, а также от общего состояния здоровья пациента.
Лучевая терапия обычно применяется к раковым опухолям. Области облучения могут также включать дренирующие лимфатические узлы, если они клинически или радиологически связаны с опухолью, или предположительно существует риск субклинического злокачественного метастазирования. Необходимо захватывать край нормальной ткани вокруг опухоли, чтобы учесть неопределенности, связанные с ежедневной установкой и внутренними движениями опухоли.
Действие лучевой терапии основано на повреждении ДНК клеток. Такое повреждение вызывается пучком фотонов, электронов, протонов, нейтронов или ионов, который прямо или косвенно ионизирует атомы, образующие цепочку ДНК. Непрямая ионизация является результатом ионизации воды, образующей свободные радикалы, в частности гидроксильные радикалы, которые, в свою очередь, повреждают ДНК. В наиболее распространенных формах лучевой терапии большинство радиационных эффектов обеспечивается свободными радикалами. Поскольку клетки обладают механизмами репарации повреждений ДНК, разрыв ДНК по обеим цепочкам оказывается наиболее важной методикой модификации характеристик клетки. Поскольку раковые клетки обычно не дифференцируются и подобны стволовым, они репродуцируются в больших количествах и обладают пониженной способностью к репарации сублетальных повреждений по сравнению с большинством нормальных дифференцированных клеток. Повреждение ДНК передается через процесс деления клеток, накапливая повреждения в раковых клетках и приводя к их гибели или более медленному репродуцированию. Протонная радиотерапия действует посредством сообщения протонам различной кинетической энергии, которой достаточно, чтобы затормозить их точно в опухоли.
Гамма-лучи также используются для лечения некоторых форм рака, в том числе рака молочной железы. В ходе процедуры, называемой хирургией с помощью гамма-ножа, несколько концентрированных пучков гамма-лучей направляют на новообразование, с тем чтобы уничтожить раковые клетки. Пучки направляют под различными углами, с тем чтобы сфокусировать облучение на новообразовании при минимальном повреждении окружающих тканей.
В некоторых осуществлениях гамма-облучение используется для лечения трижды негативного рака молочной железы, и иллюстрация такого использования приводится в примере 9.
Агенты для генной терапии
Агенты для генной терапии производят вставку копий генов в конкретный набор клеток пациента и могут быть нацелены на раковые и нормальные клетки. Цель генной терапии может состоять в том, чтобы заменить измененные гены функционирующими, стимулировать иммунный отклик пациента на рак, сделать раковые клетки более чувствительными к химиотерапии, поместить «суицидальные» гены в раковые клетки или ингибировать ангиогенез. Гены могут доставляться в клетки-мишени с помощью вирусов, липосом или других носителей или векторов. Данная процедура может осуществляться посредством введения состава носителя гена непосредственно пациенту или же ex vivo с возвратом инфицированных клеток в организм пациента. Такие составы пригодны для использования в настоящем изобретении.
Адъювантная терапия
Адъювантной терапией называют лечение, проводимое после основного с целью повысить вероятность излечения. Адъювантная терапия может включать химиотерапию, лучевую терапию, гормональную терапию или биологическую терапию.
Поскольку основной целью адъювантной терапии является уничтожение всех раковых клеток, которые могли метастазировать по организму, лечение обычно носит системный характер (используются соединения, которые циркулируют по системе кровообращения, достигая раковые клетки во всех частях организма и воздействуя на них). Адъювантная терапия в случае рака молочной железы включает химиотерапию или гормональную терапию, как в форме монотерапии, так и в комбинации.
Адъювантная химиотерапия подразумевает использование лекарственных препаратов для уничтожения раковых клеток. Исследования показали, что использование химиотерапии в качестве адъювантной терапии на ранних стадиях рака молочной железы помогает предупреждать рецидивы первичного рака. Адъювантная химиотерапия обычно использует комбинацию противораковых препаратов, которая известна своей более высокой эффективностью по сравнению с тем или иным отдельно взятым противораковым препаратом.
Адъювантная гормональная терапия лишает раковые клетки женского гормона эстрогена, который нужен некоторым раковым клеткам для роста. Чаще всего при адъювантной гормональной терапии используется лечение препаратом тамоксифеном. Исследования показали, что в случае применения тамоксифена для адъювантной терапии на ранних стадиях рака молочной железы он помогает предупредить рецидивы первичного рака, а также способствует профилактике развития новых раковых форм в другой молочной железе.
До менопаузы основным источником эстрогенов являются яичники. Для женщин в предменопаузе, страдающих раком молочной железы, адъювантная гормональная терапия может включать тамоксифен, с тем чтобы лишить раковые клетки эстрогенов. В настоящее время ведутся исследования по созданию лекарственных препаратов, подавляющих продукцию эстрогенов яичниками. В качестве альтернативы может проводиться хирургическое вмешательство по удалению яичников.
В качестве локального адъювантного лечения иногда используется лучевая терапия. Лучевая терапия рассматривается в качестве адъювантного лечения, если она проводится до или после мастэктомии. Такое лечение призвано уничтожить раковые клетки молочной железы, которые метастазировали в прилегающие участки организма, например грудную стенку или лимфатические узлы. Лучевая терапия является частью первичной терапии, а не адъювантной терапии, если она следует после хирургического вмешательства с сохранением молочной железы.
Неоадъювантная терапия
Неоадъювантной терапией называют лечение, проводимое до первичного лечения. К примерам неоадъювантной терапии относятся химиотерапия, лучевая терапия и гормональная терапия. При лечении рака молочной железы неоадъювантная терапия позволяет пациентам с распространившимся раком молочной железы прибегать к хирургическому вмешательству с сохранением молочной железы.
Онколитическая вирусная терапия
Для вирусной терапии рака используются виды вирусов, называемые онколитическими вирусами. Онколитическим является вирус, который в состоянии инфицировать и разрушать раковые клетки, оставляя при этом неповрежденными здоровые клетки, что делает такие вирусы потенциально полезными при терапии рака. Репликация онколитических вирусов способствует распаду клеток опухоли, а также обеспечивает увеличение дозы в месте локализации опухоли. Они также могут действовать в качестве векторов для противораковых генов, открывая возможности для их специфической доставки в место локализации опухоли.
Существует два основных подхода для формирования селективности к опухоли: трансдукционная и нетрансдукционная направленность. Трансдукционная направленность предусматривает модификацию специфичности оболочечного белка вируса, тем самым увеличивая попадание в клетки-мишени, одновременно снижая проникновение в нецелевые клетки. Нетрансдукционная направленность предполагает изменение генома вируса, так что его репликация становится возможной только в раковых клетках. Такая процедура может осуществляться посредством либо транскрипционной направленности, при которой гены, имеющие важное значение для репликации вируса, начинают регулироваться посредством специфичного для опухоли промотора, либо аттенюации, которая предусматривает введение делений в вирусный геном, что устраняет функции, являющиеся заменимыми в раковых клетках, но не в здоровых клетках. Существуют и другие, несколько более сложные методы.
В работе Chen et al (2001) использовался CV706, специфичный к простате аденовирус, в сочетании с радиотерапией для лечения рака простаты у мышей. Комбинированное лечение приводит к синергическому росту гибели клеток, а также существенному увеличению масштабов продукции вируса (число вирусных частиц, выделяемых после каждого лизиса клеток).
ONYX-015 проходил испытания в сочетании с химиотерапией. Комбинированное лечение обеспечивает более заметный отклик, чем любая из терапий в отдельности, но результаты не были в полной мере убедительными. ONYX-015 продемонстрировал обнадеживающие результаты в сочетании с радиотерапией.
Вирусные агенты, вводимые внутривенно, могут быть особенно эффективны против метастатического рака, который чрезвычайно сложно лечить обычными методами. При этом переносимые кровью вирусы могут инактивироваться антителами и быстро выводиться из кровотока, например купферовскими клетками (исключительно активными фагоцитарными клетками в печени, которые несут ответственность за удаление аденовирусов). Обход иммунной системы до уничтожения опухоли может быть наибольшим препятствием на пути к успеху онколитической вирусной терапии. До настоящего времени ни одна из методик обхода иммунной системы не была в полной мере удовлетворительной. Только в сочетании с традиционной терапией рака онколитические вирусы являются наиболее многообещающими, поскольку комбинационная терапия действует синергически без очевидных негативных эффектов.
Специфичность и гибкость онколитических вирусов означает, что они обладают потенциальными возможностями лечения широкого круга форм рака, в том числе рака молочной железы, с минимальными побочными эффектами. Онколитические вирусы обладают потенциалом решения проблемы селективного уничтожения раковых клеток.
Нанотерапия
Наноразмерные частицы обладают новыми оптическими, электронными и структурными свойствами, которые недостижимы в случае использования отдельных молекул или крупных твердых частиц. Связанные с элементами противодействия опухоли, например специфичными к опухоли лигандами или моноклональными антителами, эти наночастицы могут использоваться против специфичных к раку рецепторов, антигенов опухоли (биомаркеров) и сосудистой сети опухоли с высокой аффинностью и точностью. Составы и процесс получения для нанотерапии рака раскрываются в патенте US 7179484 и в статье М.N.Khalid, P.Simard, D.Hoarau, A.Dragomir, J.Leroux, Long Circulating Poly(Ethylene Glycol)Decorated Lipid Nanocapsules Deliver Docetaxel to Solid Tumors, Pharmaceutical Research, 23 (4), 2006, при этом оба документа полностью включаются в настоящий документ в силу ссылки на них.
Терапия РНК
РНК, включая, среди прочего, миРНК, короткие РНК-шпильки, микро-РНК, могут использоваться для модулирования экспрессии генов и лечения рака. Двухцепочечные олигонуклеотиды образуются посредством сборки двух различных олигонуклеотидных последовательностей, в которых олигонуклеотидная последовательность одной цепочки комплементарна олигонуклеотидной последовательности второй цепочки; такие двухцепочечные олигонуклеотиды обычно собираются из двух отдельных олигонуклеотидов (например, миРНК) или из одной молекулы, которая складывается с образованием двухцепочечной структуры (например, короткая РНК-шпилька). Все такие известные двухцепочечные олигонуклеотиды обладают общим свойством - в каждой такой цепочке дуплекса присутствует четкая последовательность нуклеотидов, в которой только одна область нуклеотидной последовательности (адапторная последовательность или антисенсовая последовательность) обладает комплементарностью по отношению к целевой последовательности нуклеиновой кислоты, а другая цепочка (сенсовая последовательность) включает нуклеотидную последовательность, гомологичную целевой последовательности нуклеиновой кислоты.
МикроРНК представляют собой одноцепочечные молекулы РНК с примерно 21-23 нуклеотидами по длине, которые регулируют экспрессию генов. МикроРНК кодируются генами, которые транскрибируются из ДНК, но не транслируются в белок (некодирующая РНК); напротив, они обрабатываются из первичных транскриптов, называемых при-микроРНК, до коротких структур «стебель-петля», называемых пре-микроРНК, и, наконец, до функциональной микроРНК. Сформировавшиеся молекулы микроРНК частично комплементарны одной или нескольким молекулам матричной РНК (мРНК), и их главная функция заключается в подавлении экспрессии генов.
Некоторые агенты, ингибирующие РНК, могут использоваться для ингибирования экспрессии или трансляции матричной РНК («мРНК»), которая связана с раковым фенотипом. Примерами таких агентов, пригодных для использования в настоящем изобретении, среди прочих, являются малая интерферирующая РНК («миРНК»), рибозимы и антисенсовые олигонуклеотиды. Конкретными примерами агентов, ингибирующих РНК, пригодных для использования в настоящем документе, среди прочих, являются Cand5, Sirna-027, фомивирсен и ангиозим.
Ингибиторы ферментов из малых молекул
Некоторые терапевтические агенты из малых молекул в состоянии направленно воздействовать на ферментативную активность тирозинкиназы или промежуточные сигнальные пути некоторых клеточных рецепторов, например рецепторов эпидермального фактора роста («EGFR») или рецептора эндотелиального фактора роста сосудов («VEGFR»). Такое нацеливание препаратов из малых молекул может приводить к противораковым эффектам. Примерами подобных агентов, пригодных для использования в настоящем изобретении, среди прочих, являются иматиниб, гефитиниб, эрлотиниб, лапатиниб, канертиниб, ZD6474, сорафениб (BAY 43-9006), ERB-569 и их аналоги и производные.
Антиметастатические агенты
Процесс, при котором раковые клетки распространяются от локализации первоначальной опухоли в другие зоны организма, называют метастазированием рака. Некоторые агенты обладают антиметастатическими свойствами, призваны подавлять распространение раковых клеток. Примерами подобных агентов, пригодных для использования в настоящем изобретении, среди прочих, являются маримастат, бевацизумаб, трастузумаб, ритуксимаб, эрлотиниб, MMI-166, GRN163L, белки-киллеры, тканевые ингибиторы металлопротеиназ (TIMP) и их аналоги и производные.
Хемопревентивные агенты
Некоторые фармацевтические агенты могут использоваться для предупреждения изначального развития рака или профилактики рецидивов или метастазов. Введение таких хемопревентивных агентов в сочетании с конъюгатами эфлорнитина-НСПВП настоящего изобретения может способствовать как лечению рака, так и предупреждению его рецидивов. К примерам хемопревентивных агентов, пригодных для использования в настоящем изобретении, среди прочих, относятся тамоксифен, ралоксифен, тиболон, бифосфонат, ибандронат, модуляторы рецепторов эстрогена, ингибиторы ароматазы (летрозол, анастрозол), агонисты рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона, госерелин, витамин А, ретиналь, ретиноевая кислота, фенретинид, 9-цис-ретиноевая кислота, 13-цис-ретиноевая кислота, полностью транс-ретиноевая кислота, изотретиноин, третиноид, витамин В6, витамин В12, витамин С, витамин D, витамин Е, ингибиторы циклооксигеназы, нестероидные противовоспалительные препараты (НСПВП), аспирин, ибупрофен, целекоксиб, полифенолы, полифенол Е, экстракт зеленого чая, фолиевая кислота, глукаровая кислота, интерферон-альфа, анетол дитиолетион, цинк, пиридоксин, финастерид, доксазоцин, селен, индол-3-карбинал, альфа-дифторметилорнитин, каротиноиды, бета-каротин, ликопен, антиоксиданты, коэнзим Q10, флавоноиды, кверцетин, куркумин, катехины, эпигаллокатехин галлат, N-ацетилцистеин, индол-3-карбинол, инозитол гексафосфат, изофлавоны, глюкановая кислота, розмарин, соя, пальма сереноа и кальций. Еще одним примером хемопревентивных агентов, пригодных для применения в настоящем изобретении, являются вакцины против рака. В рамах этого метода производится иммунизация пациента полным или частичным типом раковой клетки, против которой направлен процесс вакцинации.
Клиническая эффективность:
Определение стадий рака молочной железы:
Стадия 0 используется для описания неинвазивных форм рака молочной железы, например протоковая карцинома in situ и лобулярная карцинома in situ. На стадии 0 отсутствуют свидетельства наличия раковых клеток или незлокачественных аномальных клеток, распространяющихся из части молочной железы, где они возникли, или их прохождения или инвазии соседней здоровой ткани.
Стадия I описывает инвазивный рак молочной железы (раковые клетки проходят через или прорастают через соседнюю нормальную ткань), при котором опухоль достигает до 2 см, и не затронуты никакие лимфатические узлы.
Стадия II подразделяется на подкатегории, известные как IIA и IIB. Стадия IIA описывает инвазивный рак молочной железы, при котором в молочной железе не обнаруживается присутствия опухоли, но раковые клетки регистрируются в подмышечных лимфатических узлах (лимфатические узлы подмышками), или же опухоль достигает не более 2 сантиметров и распространяется на подмышечные лимфатические узлы, или же опухоль достигает более 2 сантиметров, но не более 5 сантиметров, и не распространяется на подмышечные лимфатические узлы. Стадия IIB описывает инвазивный рак молочной железы, при котором: опухоль превышает 2 сантиметра, но не превышает 5 сантиметров, и распространяется на подмышечные лимфатические узлы, или же опухоль превышает 5 сантиметров, но не распространяется на подмышечные лимфатические узлы.
Стадия III подразделяется на подкатегории, известные как IIIA, IIIB и IIIC. Стадия IIIA описывает инвазивный рак молочной железы, при котором в молочной железе не обнаруживается присутствия опухоли. Рак обнаруживается в подмышечных лимфатических узлах, которые спаяны друг с другом или с другими структурами, или же рак, возможно, распространился на лимфатические узлы поблизости от грудной кости, или же опухоль не превышает 5 сантиметров и распространяется на подмышечные лимфатические узлы, которые спаяны друг с другом или с другими структурами, или же опухоль превышает 5 сантиметров и распространяется на подмышечные лимфатические узлы, которые спаяны друг с другом или с другими структурами. Стадия IIIB описывает инвазивный рак молочной железы, при котором опухоль может быть любого размера и распространяется на грудную стенку и (или) кожу молочной железы и, возможно, распространилась на подмышечные лимфатические узлы, которые спаяны друг с другом или с другими структурами, или же рак может распространяться на лимфатические узлы вблизи грудной кости. Стадия IIIC описывает инвазивный рак молочной железы, при котором могут отсутствовать признаки рака в молочной железе, или же при наличии опухоли она может быть любого размера и может распространяться на грудную стенку и (или) кожу молочной железы, и рак распространяется на лимфатические узлы выше или ниже ключицы, и рак, возможно, распространился на подмышечные лимфатические узлы или на лимфатические узлы вблизи грудной кости.
GCB
GC
GCB
GCB
GC
GCB
Клиническая эффективность может оцениваться по любому известному методу. В некоторых осуществлениях клиническая эффективность лечения, описанного в настоящем документе, может определяться по измерениям уровня клинического ответа (CBR). Уровень клинического ответа оценивается по сумме процента пациентов, которые находятся на стадии полной ремиссии (CR), числа пациентов, которые находятся на стадии частичной ремиссии (PR), и числа пациентов со стабильным течением болезни (SD) в момент времени по меньшей мере через 6 месяцев после завершения терапии. Упрощенная запись этой формулы: CBR=CR+PR+SD≥6 месяцев. CBR для комбинационной терапии с гемцитабином и карбоплатином составляет 45%. Таким образом, CBR для тройной комбинационной терапии с антиметаболитом, комплексом платины и ингибитором PARP (например, гемцитабином, карбоплатином и ВА; СВR) может сравниваться с двойной комбинационной терапией с гемцитабином и карбоплатином (CBR). В некоторых осуществлениях СВR составляет по меньшей мере примерно 60%. В некоторых осуществлениях CBR составляет по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40% или по меньшей мере примерно 50%. CBR для комбинационной терапии с паклитакселом и карбоплатином составляет 45%. Таким образом, CBR для тройной комбинационной терапии с таксаном, комплексом платины и ингибитором PARP (например, паклитакселом, карбоплатином и ВА; CBP) может сравниваться с двойной комбинационной терапией с паклитакселом и карбоплатином (CBR). В некоторых осуществлениях CBR составляет по меньшей мере примерно 60%.
В некоторых осуществлениях CBR составляет по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40% или по меньшей мере примерно 50%. В некоторых осуществлениях терапевтический эффект представляет собой уменьшение размеров опухоли молочной железы, сокращение метастазов, полную ремиссию, частичную ремиссию, стабильное течение болезни или полный патологический ответ.
Неоадъювантная химиотерапия в настоящее время широко используется для лечения локально распространенных или потенциально операбельных больших опухолей молочной железы. Рандомизированные испытания продемонстрировали, что неоадъювантная химиотерапия уменьшает потребность в мастэктомии (Powles et al, 1995; Fisher et al, 1998) с примерно такой же общей выживаемостью, что и при адъювантной химиотерапии (Fisher et al, 1998). Женщины без остаточных гистологических свидетельств опухоли после химиотерапии на момент хирургического вмешательства (то есть полный патологический ответ (pCR)) демонстрировали существенно более высокую выживаемость (Bonadonna et al, 1998; Fisher et al, 1998; Kuerer et al, 1999), и pCR часто используется в качестве раннего суррогатного маркера эффективности лечения. Вместе с тем не существует стандартного метода классификации патологического ответа опухолей молочной железы на неоадъювантную химиотерапию, и предлагалось несколько различных систем классификации (Chevallier et al, 1993; Sataloff et al, 1995; Fisher et al, 1997; Honkoop et al, 1998; Kuerer et al, 1998; Ogston et al, 2003). Большинство, но не все, этих классификационных систем в определение pCR включали отсутствие остаточных признаков заболевания какого-либо рода и остаточную протоковую карциному in situ (DCIS) без инвазивного заболевания. В некоторых осуществлениях, раскрываемых в настоящем изобретении, способы включают предварительное определение возможности лечения рака модуляторами PARP. Некоторые из таких способов предусматривают определение уровня PARP в образце опухоли молочной железы пациента, выяснение, насколько уровень экспрессии PARP в образце превышает ранее определенное значение, и, если экспрессия PARP превышает упомянутое ранее определенное значение, лечение пациента комбинацией таксана (например, паклитаксела), комплекса платины (например, карбоплатина) и ингибитора PARP, например ВА. В других осуществлениях способы предусматривают определение уровня PARP в образце опухоли молочной железы пациента, выяснение, насколько уровень экспрессии PARP в образце превышает ранее определенное значение, и, если экспрессия PARP превышает упомянутое ранее определенное значение, лечение пациента ингибитором PARP, например ВА. В других осуществлениях способы включают предварительное определение возможности лечения рака модуляторами PARP. Некоторые из таких способов предусматривают определение уровня PARP в образце опухоли молочной железы пациента, выяснение, насколько уровень экспрессии PARP в образце превышает ранее определенное значение, и, если экспрессия PARP превышает упомянутое ранее определенное значение, лечение пациента комбинацией антиметаболита (например, гемцитабина), комплекса платины (например, карбоплатина) и ингибитора PARP, например, ВА.
Опухоли молочной железы у женщин с наследственными нарушениями в генах BRCA1 или BRCA2 возникают из-за того, что клетки опухоли утрачивают специфический механизм репарации поврежденной ДНК. BRCA1 и BRCA2 имеют важное значение для репарации разрывов двухцепочечной ДНК посредством гомологической рекомбинации, и мутации таких генов определяют предрасположенность к раку молочной железы и другим формам рака. PARP участвует в эксцизионной репарации оснований - одном из путей репарации одноцепочечных разрывов ДНК. Нарушение функций BRCA1 или BRCA2 сенсибилизирует клетки по отношению к ингибированию ферментативной активности PARP, что приводит к хромосомной нестабильности, остановке клеточного цикла и последующему апоптозу (Jones С, Plummer ER. PARP inhibitors and cancer therapy - early results and potential applications. Br J Radiol. 2008 Oct; 81 Spec No 1:S2-5; Drew Y, Calvert H. The potential of PARP inhibitors in genetic breast and ovarian cancers. Ann N Y Acad Sci. 2008 Sep; 1138: 136-45; Farmer H, et. al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 2005 Apr 14: 434 (7035): 917-21).
У пациентов с нарушениями в генах BRCA могут наблюдаться повышенные уровни PARP. Повышенная активность PARP может указывать на дефекты путей репарации ДНК и неустановленные генетические дефекты, подобные BRCA. Оценка экспрессии гена PARP и репарации поврежденной ДНК, особенно репарации дефектов ДНК по механизму гомологической рекомбинации, может использоваться в качестве индикатора чувствительности опухоли к ингибитору PARP. Поэтому в некоторых осуществлениях лечение рака молочной железы может совершенствоваться не только за счет определения состояния рака по HR и (или) HER2, но также посредством идентификации раннего развития рака у пациентов с нарушениями BRCA и гомологической рекомбинации при репарации ДНК при измерении уровня PARP. При повышенной активности PARP можно выявить пациентов с нарушениями BRCA и гомологической рекомбинации при репарации ДНК, которых можно лечить с помощью ингибиторов PARP. Кроме того, такие пациенты с нарушениями гомологической рекомбинации при репарации ДНК могут проходить лечение ингибиторами PARP.
В некоторых осуществлениях образец берется у пациента с поражениями молочной железы или новообразованиями, в отношении которых имеются подозрения по злокачественности. Таким образцом может быть любая доступная биологическая ткань, но в большинстве случаев образец будет представлять собой часть подозреваемой пораженной области молочной железы, полученный либо минимально инвазивной биопсией, либо в ходе лечебной хирургии (например, лампэктомии, мастэктомии, частичной или модифицированной мастэктомии или радикальной мастэктомии, гистереэктомии или овариоэктомии). Такой образец может также включать полностью или частично один или несколько лимфатических узлов, удаленных во время лечебного хирургического вмешательства. Затем можно проанализировать экспрессию PARP. В некоторых осуществлениях, если экспрессия PARP превышает ранее установленный уровень (например, активность повышена по сравнению с нормальной тканью), пациент может получать лечение ингибитором PARP в сочетании с антиметаболитом и препаратом платины. В других осуществлениях, если экспрессия PARP превышает ранее установленный уровень (например, активность повышена по сравнению с нормальной тканью), пациент может получать лечение ингибитором PARP, в том числе таким ингибитором PARP, как ВА. Поэтому следует понимать, что хотя описанные в настоящем документе осуществления и направлены на лечение трижды негативного метастатического рака молочной железы, в некоторых осуществлениях рак молочной железы необязательно должен обладать указанными характеристиками, если удовлетворено предельное условие повышенной активности PARP.
В некоторых осуществлениях опухоли с нарушениями гомологической рекомбинации идентифицируют по оценкам уровней экспрессии PARP. Если регистрируется повышенная активность PARP, такие опухоли можно лечить ингибиторами PARP. Другим применением является способ лечения рака с нарушением гомологической рекомбинации, предусматривающий оценку уровня экспрессии PARP, и, если наблюдается повышенный уровень экспрессии, рак лечат с помощью ингибитора PARP.
Отбор, подготовка и выделение образцов
Биологические образцы можно отбирать у пациента из самых различных источников, в том числе это могут быть жидкости организма или образец ткани. Среди отобранных образцов могут быть образцы здоровой и опухолевой ткани, отборы жидкости из сосков. Образцы могут отбираться у пациентов повторно в течение продолжительного периода времени (например, примерно раз в день, раз в неделю, раз в месяц, дважды в год или ежегодно). Отбор нескольких образцов у пациента в течение определенного периода времени может использоваться для подтверждения результатов предыдущих анализов и (или) выявления изменений в биологической структуре в результате, например прогрессии заболевания, медикаментозного лечения и пр.
Подготовка и выделение образца может включать любые методы в зависимости от характеристик отобранного образца и (или) анализа PARP. К таким методам относятся, например, концентрирование, разбавление, корректировка рН, удаление чрезмерных количеств полипептидов (например, альбумина, гамма-глобулина и трансферина и пр.), добавление консервантов и калибрантов, добавление ингибиторов протеазы, добавление денатурантов, удаление солей из образцов, концентрирование белков образца, экстракция и очищение липидов.
При подготовке образца может также проводиться выделение молекул, которые связаны в нековалентные комплексы с другими белками (например, белками-носителями). В ходе этого процесса можно выделять молекулы, связанные со специфическим белком-носителем (например, альбумином), или же использовать более общий процесс, например, высвобождение связанных молекул из всех белков-носителей посредством денатурации белка, например с помощью кислоты, с последующим отделением белков-носителей.
Удаление нежелательных белков (например, с высоким содержанием, неинформативных или нерегистрируемых белков) из образца можно проводить с использованием высокоаффинных реагентов, высокомолекулярных фильтров, ультрацентрифугирования и/ил электродиализа. К высокоаффинным реагентам относятся антитела или другие реагенты (например, аптамеры), которые селективно связываются с белками, присутствующими в высоких концентрациях. Подготовка образца также может включать ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию с ионами металла, гель-фильтрацию, гидрофобную хроматографию, хроматофокусирование, адсорбционную хроматографию, изоэлектрическое фокусирование и подобные им методидики. К фильтрам по молекулярным весам относятся мембраны, которые разделяют молекулы по размерам и молекулярному весу. Для таких фильтров может также использоваться обратный осмос, нанофильтрация, ультрафильтрация и микрофильтрация.
Ультрацентрифугирование представляет собой один из методов удаления нежелательных полипептидов из образца. При ультрацентрифугировании производится центрифугирование образца со скоростью примерно 15000-60000 об/мин с одновременным контролем осаждения (или его отсутствия) частиц с помощью оптической системы. Электродиализом называют метод, в котором используется электромембрана или полупроницаемая мембрана для процесса, в ходе которого ионы перемещаются через полунепроницаемые мембраны из одного раствора в другой под воздействием градиента потенциала. Поскольку применяемые при электродиализе мембраны могут обладать способностью селективного транспорта ионов с положительным или отрицательным зарядом, отделять ионы с противоположным зарядом или создавать возможность для транспорта частиц через полунепроницаемую мембрану в зависимости от их размера и заряда, эти особенности делают электродиализ удобным методом для концентрирования, удаления или разделения электролитов.
Для разделения и очистки в настоящем изобретении может использоваться любой известный метод, например капиллярный электрофорез (в частности, капиллярный или на чипе), или хроматография (например, капиллярная, колоночная или на чипе).
Электрофорез представляет собой метод, который может использоваться для разделения ионных молекул под воздействием электрического поля. Электрофорез может проводиться в геле, в капилляре или в микроканале на чипе. К примерам гелей, применяемых для электрофореза, относятся крахмал, акриламид, полиэтиленоксиды, агароза или их сочетания. Гель может модифицироваться кросс-сшивками, добавлением детергентов, денатурантов, иммобилизацией ферментов или антител (аффинный электрофорез) или субстратов (зимография) и с использованием рН градиента. К примерам капилляров, которые используются для электрофореза, относятся капилляры, которые связаны с электрораспылением.
Капиллярный электрофорез (СЕ) является предпочтительным методом разделения сложных гидрофильных молекул и растворенных веществ с высоким уровнем заряда. Технология СЕ может также применяться на микрожидкостных чипах. В зависимости от типа использованных капилляров и буферов СЕ может дополнительно разбиваться на такие методики разделения, как капиллярный зонный электрофорез (CZE), капиллярное изоэлектрическое фокусирование (CIEF), капиллярный изотахофорез (cITP) и капиллярная электрохроматография (СЕС). В осуществлении, сочетающем методики СЕ с ионизацией электрораспылением, предусматривается использование летучих растворов, например водных смесей, содержащих летучую кислоту и (или) основание и органическое соединение, например спирт или ацетонитрил.
Капиллярный изотахофорез (cITP) представляет собой методику, в которой анализируемые соединения проходят через капилляр с постоянной скоростью, но при этом разделяются по их соответствующим подвижностям. Капиллярный зонный электрофорез (CZE), также известный как капиллярный электрофорез в свободном растворе (FSCE), основан на различиях в электрофоретической подвижности частиц, которая определяется зарядом молекулы и фрикционным сопротивлением, которое испытывает молекула в процессе миграции, часто прямопропорциональным размерам молекулы. Капиллярное изоэлектрическое фокусирование (CIEF) позволяет разделять слабоионизированные амфотерные молекулы с помощью электрофореза в рН градиенте. СЕС представляет собой гибридную методику, занимающую промежуточное положение между традиционной высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC) и СЕ.
Методики разделения и очистки, использованные в настоящем изобретении, включают все известные хроматографические методы. Хроматография может быть основана на дифференциальной адсорбции и элюировании определенных анализируемых веществ или на разделении анализируемых веществ между подвижной и неподвижной фазами. К различным примерам методов хроматографии, среди прочих, относятся жидкостная хроматография (LC), газовая хроматография (GC), высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) и пр.
Определение уровня PARP
Поли(АДФ-рибоза) полимераза (PARP) также известна как поли(АДФ-рибоза) синтаза и поли-АДФ-рибозилтрансфераза. PARP катализирует образование моно- и поли(АДФ-рибоза) полимеров, которые могут связываться с клеточными белками (а также друг с другом), и тем самым изменять активность таких белков. Ферменты играют определенную роль в регулировании транскрипции, пролиферации клеток и реконструкции хроматина (обзор см. в работе: D.D'amours et al. "Poly (ADP-ribosylation reactions in the regulation of nuclear functions," Biochem. J. 342: 249-268 (1999)).
PARP содержит N-терминальный ДНК-связывающий домен, домен аутомодификации и С-терминальный каталитический домен, и различные клеточные белки могут взаимодействовать с PARP. N-терминальный ДНК-связывающий домен содержит два мотива «цинковые пальцы». В этом домене с PARP взаимодействуют энхансерный фактор транскрипции-1 (TEF-1), ретиноидный Х рецептор α, ДНК-полимераза α, кросс-комплементарный фактор репарации повреждений в результате рентгеновского излучения-1 (XRCC1) и сама PARP. Домен аутомодификации содержит мотив BRCT - один из модулей взаимодействия белок-белок. Данный мотив первоначально был обнаружен в С-терминальном конце BRCA1 (белок, определяющий чувствительность к раку молочной железы, 1) и присутствует в различных белках, связанных с репарацией и рекомбинацией ДНК, а также в качестве контрольной точки клеточного цикла. POU-гомеодоменсодержащий октамерный фактор транскрипции-1 (Oct-1), инь-ян (YY)1 и убиквитин конъюгирующий фермент 9 (ubc9) могут взаимодействовать с таким мотивом BRCT в PARP.
В геноме млекопитающих присутствует более 15 членов семейства генов PARP. Белки семейства PARP и поли(АДФ-рибоза) гликогидролаза (PARG), которая разлагает поли(АДФ-рибозу) до АДФ-рибозы, могут участвовать в самых различных клеточных регуляторных функциях, в том числе отклике на повреждение ДНК и транскрипционном регулировании, и во многих отношениях могут быть связаны с карциногенезом и природой рака.
Были идентифицированы несколько белков семейства PARP. Было установлено, что танкираза является взаимодействующим белком с фактором регуляции теломеров 1 (TRF-1) и участвует в регулировании теломеров. Рибонуклеопротеиновая PARP (VPARP) является компонентом рибонуклеопротеинового комплекса, который действует в качестве переносчика ядро-цитоплазма. Были также идентифицированы PARP-2, PARP-3 и индуцируемая 2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксином PARP (TiPARP). Поэтому метаболизм поли(АДФ-рибозы) может быть связан с самыми различными клеточными регуляторными функциями.
Членом данного семейства генов является PARP-1. Генный продукт PARP-1 экспрессируется с высокими уровнями в ядре клеток, и его активация зависит от повреждений ДНК. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, считается, что PARP-1 связывается с одноцепочечными или двухцепочечными разрывами ДНК через аминотерминальное окончание ДНК-связывающего домена. Связывание активирует карбокситерминальный каталитический домен и приводит к образованию полимеров АДФ-рибозы на молекулах-мишенях. PARP-1 сама по себе является мишенью для поли-АДФ-рибозилирования за счет расположенного по центру домена аутомодификации. Рибозилирование PARP-1 вызывает отщепление молекул PARP-1 от ДНК. Весь процесс связывания, рибозилирования и диссоциации происходит очень быстро. Предполагалось, что такое промежуточное связывание PARP-1 с сайгами повреждения ДНК приводит к запуску механизма репарации ДНК или может действовать на подавление рекомбинации в течение достаточно продолжительного времени для запуска механизма репарации.
Источником АДФ-рибозы для реакции PARP является никотинамидаденозиндинуклеотид (NAD). NAD синтезируется в клетках из клеточного резерва АТФ, а потому высокие уровни активации активности PARP могут быстро приводить к истощению клеточных запасов энергии. Было показано, что индуцирование активности PARP может приводить к гибели клеток, которая коррелирует с истощением клеточных пулов NAD и АТФ. Активность PARP индуцируется во многих случаях окислительным стрессом или в воспалительном процессе. Например, во время реперфузии ишемических тканей генерируется реакционноспособная окись азота, и эта окись азота приводит к генерации дополнительных реакционноспособных соединений кислорода, в том числе перекиси водорода, пероксинитрата и гидроксильного радикала. Последние могут непосредственно повреждать ДНК, и сформировавшиеся повреждения индуцируют активацию активности PARP. Часто оказывается, что достаточная активация активности PARP происходит таким образом, что клеточные запасы энергии истощаются и клетка погибает. Считается, что аналогичный механизм действует и в воспалительном процессе, когда эндотелиальные клетки и провоспалительные клетки синтезируют окись азота, которая приводит к окислительному повреждению ДНК в окружающих клетках, с последующей активацией активности PARP. Предполагается, что гибель клеток в результате активации PARP является основным определяющим фактором масштабов повреждений ткани, которые возникают из-за ишемической реперфузии или из-за воспаления.
В некоторых осуществлениях уровень PARP во взятом у пациента образце сравнивается с заранее измеренным стандартным образцом. Взятый у пациента образец обычно отбирается в пораженной ткани, например из раковых клеток или тканей. Стандартный образец можно брать у того же пациента или у другого человека. Стандартным образцом, как правило, является нормальный, не пораженный заболеванием образец. Вместе с тем в некоторых осуществлениях, например для определения стадии заболевания или для оценки эффективности лечения, стандартный образец отбирают из пораженной ткани. Стандартным образцом может быть комбинация образцов, взятых у нескольких разных людей. В некоторых осуществлениях уровень PARP во взятом у пациента образце сравнивается с заранее определенным уровнем. Такой заранее определенный уровень обычно устанавливается по здоровым образцам. Как указано в настоящем документе, «заранее определенным уровнем PARP» может быть уровень PARP, который использовался только для примера, для оценки состояния пациента, который может выбираться для проведения лечения, оценки отклика на лечение ингибитором PARP, оценки отклика на лечение комбинацией ингибитора PARP и второго терапевтического агента, и (или) постановки диагноза пациенту, страдающему раком, воспалением, от болей и (или) иных связанных с этим состояний. Заранее определенный уровень PARP может устанавливаться для групп пациентов, страдающих раком, и здоровых людей. В качестве заранее определенного уровня PARP может использоваться единичный показатель, в равной мере применимый к каждому пациенту, или же заранее определенный уровень PARP можно менять в соответствии с конкретными подгруппами пациентов. Например, у мужчин может быть отличный от женщин заранее определенный уровень PARP; у некурящих может быть отличный от курящих заранее определенный уровень PARP. Возраст, вес и рост пациента могут влиять на заранее определенный уровень PARP конкретного человека. Кроме того, в качестве заранее определенного уровня PARP может использоваться уровень, который был определен для каждого пациента в индивидуальном порядке. Заранее определенным уровнем PARP может быть любой удобный стандарт. Например, заранее определенный уровень PARP можно установить по данным для одного и того же человека или для другого человека, для которого производится оценка выбора пациентов. В одном из осуществлений заранее определенный уровень PARP может быть установлен на основе предыдущей оценки для того же пациента. Таким образом, изменения в процессе выбора пациента можно отслеживать во времени. Кроме того, стандарт может устанавливаться на основе оценки другого человека или нескольких людей, например выбранной группы людей. Таким образом, размер группы людей, для которых производится оценка выбора, может сопоставляться с подходящей группой других людей, например других людей, находящихся в таком же положении, что и рассматриваемая группа людей, например страдающих подобным или таким же заболеванием (заболеваниями).
В некоторых осуществлениях настоящего изобретения изменение PARP по сравнению с заранее определенным уровнем составляет примерно 0,5 раза, примерно 1,0 раза, примерно 1,5 раза, примерно 2,0 раза, примерно 2,5 раза, примерно 3,0 раза, примерно 3,5 раза, примерно 4,0 раза, примерно 4,5 раза или примерно 5,0 раз. В некоторых осуществлениях кратность изменения меньше примерно 1, меньше примерно 5, меньше примерно 10, меньше примерно 20, меньше примерно 30, меньше примерно 40 или меньше примерно 50. В других осуществлениях изменение уровня PARP по сравнению с заранее определенным уровнем больше примерно 1, больше примерно 5, больше примерно 10, больше примерно 20, больше примерно 30, больше примерно 40 или больше примерно 50. Предпочтительная кратность изменения по сравнению с заранее определенным уровнем составляет примерно 0,5, примерно 1,0, примерно 1,5, примерно 2,0, примерно 2,5 и примерно 3,0.
Анализ уровней PARP у пациентов особенно важен и информативен, поскольку дает возможность врачу более эффективно выбирать наилучшую схему лечения, а также использовать более агрессивные формы лечения и схемы терапии, руководствуясь повышенным или пониженным уровнем PARP. Более агрессивное лечение или комбинированная терапия и схемы могут помочь опровергнуть неблагоприятный прогноз для пациента и общее время выживания в целом. Вооружившись такой информацией, медицинский работник может выбрать проведение определенного рода лечения, например лечения ингибиторами PARP и (или) более агрессивную терапию.
При отслеживании уровней PARP у пациента в течение определенного периода времени, который может составлять дни, недели, месяцы, а в некоторых случаях и годы, или в течение различных периодов времени можно отбирать у пациента образцы жидкостей организма, например сыворотки или плазмы, через промежутки времени, устанавливаемые специалистом, например лечащим врачом или клиницистом, с тем чтобы определять уровни PARP и в течение заболевания или его лечения сравнивать их с уровнями для здоровых людей. Например, образцы пациента можно отбирать и отслеживать ежемесячно, каждые два месяца или же комбинируя одно-, двух- или трехмесячные интервалы в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, уровни PARP для пациента, полученные в разные периоды времени, можно в течение периода мониторинга удобным образом сопоставлять друг с другом, а также со значениями PARP для контроля в норме, тем самым используя собственные значения PARP для пациента в качестве внутреннего или личного контроля для долгосрочного мониторинга PARP.
Методики анализа PARP
Анализ PARP может включать анализ экспрессии гена PARP, в том числе анализ ДНК, РНК, анализ уровня PARP и (или) анализ активности PARP, включая уровень моно- и поли-АДФ-рибозилирования. Без ограничения охвата настоящего изобретения любое число известных специалистам методик может применяться для анализа PARP, и все они входят в сферу охвата настоящего изобретения. Некоторые из примеров таких методик детектирования приводятся ниже, но такие примеры никоим образом не устанавливают ограничений для различных методик детектирования, которые могут использоваться в настоящем изобретении.
Профилирование экспрессии генов: Методы профилирования экспрессии генов включают методы, основанные на гибридизационном анализе полинуклеотидов, полирибонуклеотидные методы, основанные на секвенировании полинуклеотидов, полирибонуклеотидов, а также методы на основе протеомики. Наиболее широко используемые методы, известные специалистам в области для количественного определения экспрессии мРНК в образце, включают нозерн-блоттинг и гибридизацию in situ (Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106: 247-283 (1999)); пробы на защиту РНКазы (Hod, Biotechniques 13: 852-854 (1992)); и методы на основе ПЦР, например полимеразная цепная реакция с использованием обратной транскриптазы (ОТ-ПЦР) (Weis et al., Trends in Genetics 8: 263-264 (1992)). В качестве альтернативы могут использоваться антитела, которые распознают специфические дуплексы, включая ДНК-дуплексы, РНК-дуплексы и ДНК-РНК гибридные дуплексы или дуплексы ДНК-белок. К репрезентативным методам анализа экспрессии генов на основе секвенирования относятся серийный анализ экспрессии генов (SAGE) и анализ экспрессии генов методом массивно-параллельного опознавательного секвенирования (MPSS), сравнительная геномная гибридизация (CGH), иммунопреципитация хроматина (ChIP), однонуклеотидный полиморфизм (SNP) и чипы SNP, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), наборы связывающих белков и микрочипы ДНК (также широко известные как генные или геномные чипы, ДНК-чипы или генные чипы), РНК-микрочипы.
ПЦР с использованием обратной транскриптазы (ОТ-ПЦР): Одним из наиболее чувствительных и наиболее гибких количественных методов профилирования экспрессии генов на основе ПЦР является ОТ-ПЦР, которая может использоваться для сопоставления уровней мРНК в различных выборках образцов, в здоровых тканях и опухолевых тканях, в условиях медикаментозного лечения и без него, с тем чтобы охарактеризовать характер экспрессии генов, различить близко связанные мРНК и проанализировать структуру РНК. Первым шагом является выделение мРНК из целевого образца. Например, исходный материал может, как правило, представлять собой суммарную РНК, выделенную из опухолей человека или клеточных линий опухоли и соответствующих здоровых тканей или клеточных линий. Таким образом, РНК может выделяться из самых различных здоровых и пораженных клеток и тканей, например опухоли, в том числе молочной железы, легких, колоректальных опухолей, простаты, головного мозга, печени, почек, поджелудочной железы, селезенки, вилочковой железы, яичек, яичников, матки и пр., или клеточных линий опухоли. Если источником мРНК является первичная опухоль, мРНК может извлекаться, например, из замороженных или хранящихся фиксированных срезов тканей, например заключенных в парафин и фиксированных (например, фиксированных формалином) образцов тканей. Общие методы извлечения мРНК хорошо известны специалистам в области и описаны в стандартных учебниках по молекулярной биологии, в том числе Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997).
В частности, получение РНК может проводиться с помощью набора для очистки, набора буферов и протеазы от коммерческих производителей в соответствии с инструкциями изготовителей. Полученная из опухоли РНК может выделяться, например, посредством центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия. Поскольку РНК не может служить матрицей для ПЦР, первым шагом в профилировании экспрессии генов методом ОТ-ПЦР является обратная транскрипция матрицы РНК в кДНК с последующей ее экспоненциальной амплификацией в реакции ПЦР. Среди двух наиболее широко используемых обратных транскриптаз - обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц (AMV-RT) и обратная транскриптаза вируса мышиного лейкоза Молони (MMLV-RT). Стадию обратной транскрипции обычно проводят с использованием специфических праймеров, случайных гексамеров или праймеров олиго-dT в зависимости от ситуации и цели профилирования экспрессии гена. Полученная кДНК может затем использоваться в качестве матрицы для последующей ПЦР.
Чтобы свести к минимуму ошибки и эффект расхождений между образцами, ОТ-ПЦР обычно проводят с использованием внутреннего стандарта. Идеальный внутренний стандарт экспрессируется с постоянным уровнем в среде различных тканей, и на него не влияет экспериментальное воздействие. РНК, которые чаще всего используются для нормализации характера экспрессии генов, являются мРНК для облигатных генов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) и β-актина.
Одним из последних вариантов методики ОТ-ПЦР является количественная ПЦР в реальном времени, при которой измеряется накопление продукта ПЦР по флуоресцентному зонду с двойной меткой. ПЦР в реальном времени сопоставима с количественной конкурентной ПЦР, при которой для нормализации используется внутренний конкурент для каждой целевой последовательности, и с количественной сравнительной ПЦР, использующей ген нормализации, содержащийся в образце, или облигатный ген для ОТ-ПЦР.
Флуоресцентная микроскопия: Некоторые осуществления настоящего изобретения предполагают использование флуоресцентной микроскопии для анализа PARP. Флуоресцентная микроскопия позволяет идентифицировать молекулярный состав наблюдаемых структур за счет использования флуоресцентно-меченых зондов с высокой химической специфичностью, например антител. Это можно осуществить путем прямой конъюгации флуорофора с белком с его последующим возвратом в клетку. Флуоресцентный аналог может вести себя так же, как и нативный белок, а потому может использоваться для регистрации распределения и поведения этого белка в клетке. Наряду с ЯМР инфракрасной спектроскопией, круговым дихроизмом и другими методиками, к другим методикам регистрации белков относятся спад внутренней флуоресценции белка и связанное с ним наблюдение анизотропии флуоресценции, коллизионного гашения и резонансного переноса энергии. В качестве флуоресцентных зондов могут использоваться белки с природной флуоресценцией. Медуза Aeguorea victoria продуцирует белок с природной флуоресценцией, известный как зеленый флуоресцентный белок (GFP). Связывание таких флуоресцентных зондов с целевым белком обеспечивает визуализацию с помощью флуоресцентной микроскопии и количественное определение с помощью проточной цитометрии. В качестве примера приведем лишь некоторые зонды, которые являются метками, например флуоресцеин и его производные, карбоксифлуоресцеин, родамины и их производные, атто-метки, флуоресцентный красный и флуоресцентный оранжевый: аналоги cy3/cy5, комплексы лантанидов с высокими временами жизни, длинноволновые метки - до 800 нм, цианиновые метки DY и белки фикобилина. В качестве примера приведем лишь некоторые из зондов, которые являются конъюгатами, например конъюгаты изотиоцианата, конъюгаты стрептавидина и конъюгаты биотина. В качестве примера приведем лишь некоторые из зондов, которые являются субстратами ферментов, например флуорогенные и хромогенные субстраты. В качестве примера приведем лишь некоторые из зондов, которые являются флуорохромами, например FITC (зеленая флуоресценция, возбуждение/испускание=506/529 нм), родамин В (оранжевая флуоресценция, возбуждение/испускание=560/584 нм) и нильский голубой А (красная флуоресценция, возбуждение/испускание=636/686 нм). Флуоресцентные наночастицы могут использоваться для различных видов иммуноанализа. Основой для флуоресцентных наночастиц являются различные материалы, например полиакрилонитрил и полистирол и пр. Флуоресцентные молекулярные роторы являются сенсорами для ограничений в микроокружении, которые становятся флуоресцентными, если их вращение ограничивают. К примерам ограничений на молекулярном уровне относятся интенсификация окраски (агрегация), связывание с антителами или захват при полимеризации актина. IEF (изоэлектрическое фокусирование) является аналитическим инструментом для разделения амфолитов, главным образом белков. Преимуществом IEF-гель-электрофореза с флуоресцентным IEF-маркером является возможность прямого наблюдения образования градиента. Флуоресцентный IEF-маркер может также обнаруживаться по УФ-поглощению на 280 нм (20°С).
Пептидная библиотека может синтезироваться на твердых подложках, и за счет использования окрашивающих рецепторов поочередно можно отбирать окрашенные твердые подложки. Если рецепторы не могут быть цветовыми индикаторами, можно окрашивать их связывающие антитела. Метод можно использовать не только на рецепторах белков, но также при скрининге связывающих лигандов синтезированных искусственных рецепторов и скрининге новых связывающих металл лигандов. Могут также применяться автоматизированные методы для HTS и FACS (клеточный сортер с возбуждением флуоресценции). В приборе для FACS клетки вначале прогоняются через капиллярную трубку и разделяются по детектированию интенсивностей их флуоресценции.
Иммуноанализ: Некоторые осуществления настоящего изобретения предполагают использование иммуноанализа для анализа PARP. В иммуноблоттинге, например в вестерн-блоттинге белков, разделенных электрофорезом, отдельный белок можно идентифицировать по его антителу. Иммуноанализ может представлять собой иммуноанализ конкурентного связывания, при котором анализируемое соединение конкурирует с меченым антигеном за ограниченный набор молекул антитела (например, радиоиммуноанализ, EMIT). Иммуноанализ может быть неконкурентным, при котором антитело присутствует в избытке и помечено. По мере нарастания количества антигенного комплекса с анализируемым веществом может также увеличиваться количество меченого комплекса антитело-антиген (например, ELISA). Антитела могут быть поликлональными, если они продуцируются инъекцией антигена экспериментальному животному, или же моноклональными, если они получаются посредством слияния клеток и методиками культивирования клеток. При иммуноанализе антитела могут служить в качестве специфического реагента для анализируемого антигена.
Не ограничивая сферу охвата и содержание настоящего изобретения, приведем лишь несколько примеров некоторых методов иммуноанализа, например RIA (радиационный иммуноанализ), иммуноферментные методы анализа, например ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), EMIT (метод иммуноанализа с ферментативным усилением), микрочастичный иммуноферментный анализ (MEIA), LIA (люминесцентный иммуноанализ) и FIA (флуоресцентный иммуноанализ). Такие методики могут использоваться для регистрации биологических веществ в назальных пробах. Антитела, как используемые в качестве первичных, так и в качестве вторичных, могут быть помечены радиоизотопами (например, 125I), флуоресцентными красителями (например, FITC) или ферментами (например, HRP и АР), которые в состоянии катализировать флуорогенные или люминогенные реакции.
Биотин или витамин Н является коферментом, который унаследует специфическую аффинность по отношению к авидину и стрептавидину. Такое взаимодействие превращает биотинилированные пептиды в полезный инструмент для количественных и качественных тестов в рамках различных биотехнологических анализов. Чтобы улучшить распознавание биотин/стрептавидин за счет минимизации стерических затруднений, может потребоваться увеличить расстояние между биотином и самим пептидом. Это может достигаться за счет введения молекулы спейсера (например, 6-нитрогексановой кислоты) между биотином и пептидом.
Количественный анализ биотина для биотинилированных белков является чувствительным методом флуориметрического анализа для точного определения числа меток биотина в белке. Биотинилированные пептиды широко используются в самых различных системах биомедицинского скрининга, требующих иммобилизации по меньшей мере одного из взаимодействующих партнеров на покрытых стрептавидином гранулах, мембранах, стеклянных пластинах или планшетах для микротитрования. Анализ основан на вытеснении лиганда, меченого окрашенным тушителем, из сайтов связывания биотина реагента. Для высвобождения любых групп биотина в белке со множеством меток, которые находятся в стерически затрудненном окружении и недоступны для реагента, белок можно обрабатывать протеазой для расщепления белка.
EMIT представляет собой иммуноанализ конкурентного связывания, при котором удается обойтись без обычной стадии разделения. Это такого рода иммуноанализ, при котором белок метится ферментом, и комплекс фермент-белок-антитело является ферментативно неактивным, позволяя количественно оценить белок без метки. Некоторые осуществления настоящего изобретения предполагают использование ELISA для анализа PARP. ELISA основан на использовании селективных антител, связанных с твердой подложкой, в сочетании с ферментативными реакциями для получения систем, которые в состоянии регистрировать низкие уровни белков. Метод также называют иммуноферментным анализом или EIA. Белок детектируется антителами, которые были для него приготовлены, то есть для которых он является антигеном. Часто используются моноклональные антитела. Для тестирования может быть необходимо, чтобы антитела фиксировались на твердой поверхности, например внутренней поверхности пробирки, и готовились такие же антитела, связанные с ферментом. Фермент (например, β-галактозидаза) может продуцировать окрашенный продукт из бесцветного субстрата. Тест, например, может проводиться при наполнении пробирки раствором антигена (например, белка), который подвергается анализу. Любая присутствующая молекула антигена может связываться с иммобилизированными молекулами антитела. К реакционной смеси может добавляться конъюгат антитело-фермент. Содержащая антитело часть конъюгата связывается с любыми молекулами антигена, которые были связаны ранее, образуя «сэндвич» антитело-антиген-антитело. После отмывки от остатков какого-либо несвязанного конъюгата можно добавлять раствор субстрата. После заданного промежутка времени реакцию останавливают (например, приливая 1 н. NaOH), и измеряют концентрацию образованного окрашенного продукта на спектрофотометре. Интенсивность цвета пропорциональна концентрации связанного антигена.
ELISA может также адаптироваться для измерения концентрации антител, в этом случае лунки покрывают соответствующим антигеном. Может добавляться раствор (например, сыворотка), содержащий антитело. После выдерживания в течение достаточного времени для связывания с иммобилизированным антигеном может добавляться конъюгат антииммуноглобулина с ферментом, который содержит антитело против тестируемых антител. После отмывки от остатков непрореагировавшего реагента можно добавлять раствор субстрата. Интенсивность получаемой окраски пропорциональна количеству меченых ферментом связанных антител (а значит, концентрации антител, анализ которых проводится).
1
12
31
32
127
3
14
32
35
125
Некоторые осуществления настоящего изобретения предполагают использование радиоиммунологического анализа для анализа PARP. Радиоактивные изотопы могут использоваться для изучения метаболизма, распределения и связывания небольших количеств соединений in vivo. В организм вводятся радиоактивные изотопы Н, С, Р, S и I, например, H, С, Р, S и I. В методе фиксирования на рецепторах в 96-луночных планшетах рецепторы могут фиксироваться в каждой лунке за счет использования антител или химических методов, и лиганды с радиоактивной меткой могут добавляться в каждую лунку для индуцирования связывания. Несвязанные лиганды могут отмываться, а затем стандарт может определяться количественным анализом радиоактивности связанных лигандов или смытых лигандов. Затем при добавлении целевых соединений скрининга может индуцироваться реакция конкурентного связывания с рецепторами. Если соединения демонстрируют более высокую аффинность по отношению к рецепторам по сравнению со стандартными радиоактивными лигандами, то большинство радиоактивных лигандов не будет связываться с рецепторами и может оставаться в растворе. Поэтому, анализируя количество связанных радиоактивных лигандов (или смытых лигандов), можно определить аффинность испытываемых соединений по отношению к рецепторам.
Метод фильтровальных мембран может потребоваться в том случае, если рецепторы не могут быть зафиксированы на 96-луночных планшетах или если связывание лиганда необходимо проводить в растворе. Иными словами, после реакции связывания лиганда с рецептором в растворе, если реакционный раствор профильтровать через нитроцеллюлозную фильтровальную бумагу, малые молекулы, в том числе лиганды, могут проходить через нее, и только рецепторы белков могут оставаться на бумаге. Только лиганды, прочно связанные с рецепторами, могут задерживаться на фильтровальной бумаге, и относительная аффинность добавляемых соединений может определяться количественным анализом стандартных радиоактивных лигандов.
Некоторые осуществления настоящего изобретения предполагают использование флуоресцентного иммуноанализа для анализа PARP. Флуоресцентные иммунологические методы основаны на конкурентном связывании меченых лигандов в сравнении с немечеными на высоко специфичных сайгах рецепторов. Флуоресцентная методика может быть использована для иммуноанализа на основе изменений времени жизни флуоресценции при изменении концентрации анализируемого вещества. Такая методика может применяться для красителей с короткими временами жизни, например, изотиоцианат флуоресцеина (FITC) (донор), флуоресценция которого может тушиться за счет переноса энергии на эозин (акцептор). Могут использоваться различные фотолюминесцирующие соединения, например цианины, оксазины, тиазины, порфирины, фталоцианины, полициклические ароматические углеводороды с флуоресценцией в инфракрасном диапазоне, фикобилипротеины, скварены и металлоорганические комплексы, углеводороды и азокрасители.
Иммунологические методы на основе флуоресценции могут быть, например, гетерогенными или гомогенными. Гетерогенный иммуноанализ включает физическое разделение связанного меченого анализируемого соединения от свободного. Анализируемое соединение или антитело могут быть связаны с твердой поверхностью. Методика может быть конкурентной (для более высокой селективности) или неконкурентной (для более высокой чувствительности). Детектирование может быть прямым (используются антитела одного типа) или косвенным (используются антитела второго типа). Гомогенный иммуноанализ не предполагает физического разделения. Меченый флуоресцентной меткой антиген двойного антитела участвует в реакции равновесия с антителами против антигена и флуорофора. Антиген с меткой и без метки может конкурировать за ограниченное количество антиантиген антител.
К примерам некоторых методов флуоресцентного иммуноанализа относятся простой метод флуоресцентной метки, флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET), времяразрешенная флуоресценция (TRF) и сканирующая зондовая микроскопия (SPM). Простой метод флуоресцентной метки может использоваться для связывания лиганд-рецептор, ферментативной активности по соответствующей флуоресценции, а также флуоресцентного индикатора различных физиологических изменений in vivo, например рН, концентрации ионов и электрического давления. TRF является методом, который позволяет селективно измерять флуоресценции лантанидов после окончания испускания других флуоресцентных молекул. TRF может использоваться с FRET, и серии лантанидов могут стать донорами или акцепторами. В сканирующей зондовой микроскопии на этапе захвата, например, по меньшей мере одно моноклональное антитело закрепляется на твердой фазе, и сканирующий зондовый микроскоп используется для детектирования комплексов антиген/антитело, которые могут находиться на поверхности твердой фазы. Использование сканирующей туннельной микроскопии исключает потребность в метках, которые обычно используются во многих системах иммуноанализа для детектирования комплексов антиген/антитело.
Методы идентификации белков: Лишь в качестве примера приведем методы идентификации белков, которые включают низкопроизводительное секвенирование деградацией по Эдману, методики масс-спектрометрии, фингерпринтинг пептидов по массе, секвенирование de novo и анализы на основе антител. Количественные анализы белков включают гельокрашивание флуоресцентными красителями, методы введения метки или химической модификации (т.е. аффинные маркеры с изотопной кодировкой (ICATS), комбинированная фракционированная диагональная хроматография (COFRADIC)). Очищенный белок может также использоваться для определения трехмерной кристаллической структуры, которая может использоваться для моделирования межмолекулярных взаимодействий. Распространенными методами для определения трехмерной кристаллической структуры являются рентгеновская кристаллография и ЯМР-спектроскопия. Характеристики, указывающие на трехмерную структуру белков, могут анализироваться с помощью масс-спектрометрии. За счет использования химических сшивок для соединения частей белков, близко расположенных в пространстве, но удаленных по последовательности, можно получать информацию обо всей структуре в целом. Отслеживая обмен амидных протонов на дейтерий из раствора, можно анализировать доступ растворителя к различным частям белка.
В одном из осуществлений клеточный сортер с возбуждением флуоресценции (FACS) используется для идентификации клеток, экспрессирующих PARP. FACS представляет собой специализированную разновидность проточной цитометрии. В его основе лежит метод сортировки гетерогенной смеси биологических клеток в два или более контейнера, по одной клетке поочередно, по специфическому светорассеянию и флуоресцентным характеристиками каждой клетки. Он позволяет количественно регистрировать сигналы флуоресценции от отдельных клеток, а также физически отделять представляющие особый интерес клетки. В еще одном осуществлении для оценки экспрессии PARP применяются устройства на основе микрожидкостных чипов.
Масс-спектрометрия может также использоваться для определения характеристик PARP в образцах пациентов. Два метода ионизации общих белков включают ионизацию электрораспылением (ESI) и матричную лазерную десорбцию/ионизацию (MALDI). В первом интактные белки ионизуются посредством любой из описанных выше методик, а затем вводятся в анализатор масс. Во втором белки ферментативно разлагаются в более мелкие пептиды с использованием такого агента, как трипсин или пепсин. Также используются и другие протеолитические агенты расщепления. Набор пептидных продуктов затем вводится в анализатор масс. Такой подход часто называют «восходящим» подходом к анализу белка.
Массовый анализ общего белка проводится либо с использованием времяпролетного (TOF) масс-спектрометра или ионциклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (Фурье-ИЦР). Инструментом, который используется для пептидного масс-анализа, является квадрупольная ионная ловушка. Многоступенчатый квадрупольный времяпролетный и MALDI времяпролетный приборы также используются для данного осуществления.
Два метода используются для фракционирования белков или их пептидных продуктов ферментативного расщепления. В первом методе фракционируются общие белки, и он называется двумерным гель-электрофорезом. Во втором методе для фракционирования пептидов после ферментативного расщепления используется высокоэффективная жидкостная хроматография. В некоторых случая может потребоваться сочетание этих двух методик.
Существует два метода применения масс-спектроскопии для идентификации белков. В масс-спектрометрии массы протеолитических пептидов используются в качестве исходной информации для проверки базы данных предсказанных масс, которые будут возникать при расщеплении перечня известных белков. Если последовательность белка в справочном перечне дает значительное число прогнозируемых масс, которые соответствуют экспериментальным значениям, значит, существуют определенные свидетельства в пользу того, что настоящий белок присутствует в исходном образце.
Тандемная масс-спектроскопия также относится к методам идентификации белков. Столкновительная диссоциация используется в основных приложениях, чтобы генерировать набор фрагментов от конкретного пептидного иона. Процесс фрагментации в основном приводит к образованию продуктов расщепления, которые образуются при разрыве пептидных связей.
Описано несколько различных алгоритмических подходов для идентификации пептидов и белков по тандемной масс-спектрометрии (МС/МС), de novo секвенирования пептида и поиска последовательности по маркеру. Одной из опций, которая объединяет широкий диапазон анализа данных, является PEAKS. Другие примеры существующего программного обеспечения масс-спектрометрического анализа включают: фингерпринтинг пептидных фрагментов SEQUEST, Mascot, OMSSA и X!Tandem).
Белки также можно количественно определять масс-спектрометрией. Как правило, стабильные (например, нерадиоактивные) более тяжелые изотопы углерода (С13) или азота (N15) включают в один образец, а другой метят соответствующими легкими изотопами (например, С12 и N14). Два образца смешивают перед проведением анализа. Пептиды, полученные из разных образцов, могут различаться по разнице их масс. Отношение их пиковых интенсивностей соответствует коэффициенту относительного содержания пептидов (и белков). К методам введения изотопной метки относятся SILAC (введение стабильной изотопной метки с аминокислотами в клеточной культуре), трипсин-катализируемое введение O18, ICAT (маркировка аффинности с изотопной кодировкой), ITRAQ (изотопные маркеры для относительного и абсолютного количественного определения). Без введения метки в образцы можно проводить «полуколичественную» масс-спектрометрию. Как правило, это производится с помощью анализа MALDI (в линейном режиме). Интенсивность пика или его площадь для отдельных молекул (как правило, белков) в данном случае коррелирует с количеством белка в образце. Вместе с тем индивидуальный сигнал зависит от первичной структуры белка, от сложности образца и установок параметров прибора.
N-терминальное секвенирование способствует идентификации неизвестных белков, подтверждает идентичность и соответствие рекомбинантного белка (рамка считывания, исходная точка трансляции и пр.), помогает интерпретировать данные ЯМР и кристаллографии, демонстрирует степень идентичности между белками или содержит данные для дизайна синтетических пептидов для генерации антител и пр. N-терминальное секвенирование использует деструктивные химические подходы по Эдману, последовательное удаление аминокислотных остатков от N-терминального окончания белка и идентификацию их по обращеннофазовой HPLC. Чувствительность может находиться на уровне сотен фемтомолей, и для считывания длинных последовательностей (20-40 остатков) может часто быть достаточно нескольких десятков пикомолей исходного материала. Для чистых белков (>90%) можно получать данные, не вызывающие сложностей при интерпретации, но смеси белков с недостаточным уровнем очистки могут также быть источником полезных данных при условии строгой интерпретации результатов. N-терминально модифицированные (в особенности ацетилированные) белки не поддаются прямому секвенированию, поскольку отсутствие свободной первичной аминогруппы препятствует проведению химических процедур по Эдману. Вместе с тем ограниченный протеолиз блокированного белка (например, с использованием бромциана) может дать возможность получать смеси аминокислот в каждом цикле работы прибора, и такую смесь можно проанализировать по базе данных, с тем чтобы интерпретировать существенную информацию о последовательности. С-терминальное секвенирование представляет собой посттрансляционную модификацию, которая влияет на структуру и активность белка. Различные заболевания могут быть связаны с нарушениями процессинга белков, и С-терминальное секвенирование является дополнительным инструментом исследования структуры белка и механизмов процессинга.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Экспрессия PARP1 при инфильтрирующем протоковом раке (ИПР) молочной железы
Предыдущие исследования показали увеличение, в сравнении с нормальными контрольными тканями, активности PARP при раке яичников, гепатокарциномах и опухолях прямой кишки, а также в лимфоцитах периферической крови человека у больных лейкозом (Yalcintepe L, et. al. Braz J Med Biol Res 2005; 38: 361-5. Singh N. et.al. Cancer Lett 1991; 58: 131-5; Nomura F, et. al. J Gastroenterol Hepatol 2000; 15: 529-35). Настоящее изобретение использует базы данных генной экспрессии для анализа регуляции гена PARP1 в более чем 2000 образцов первичных злокачественно измененных и нормальных тканей организма человека. В то время как экспрессия и активность PARP1 очень низки и однородны в большинстве нормальных тканей и органов организма человека, они повышены в клетках ряда опухолей и в первичных злокачественных опухолях человека и наиболее выражены при раке молочной железы, яичников, легких и матки (фиг.1).
Образцы тканей
Образцы тканей получают в ходе стандартного оперативного вмешательства и быстро замораживают в течение 30 минут с момента резекции. Патологическую оценку и подтверждение диагноза осуществляют в процессе анализа образцов. Для подтверждения и классификации диагностической категории и оценки клеточного состава опухоли используют окрашенные гематоксилином и эозином (Г-Э) предметные стекла с полученными из соседней ткани образцами. Экспрессию ER, PR и HER2 определяют с использованием иммуногистохимии и флуоресцентной гибридизации in situ. Эти результаты в совокупности с сопуствующими патологоанатомическими и клиническими данными заносят в перечень образцов и вносят в базы данных учета (базы данных Ascenta, BioExpress; GeneLogic, Inc., Gaifchersburg, MD).
Выделение РНК и профилирование экспрессии
Выделение и гибридизацию РНК осуществляют по методу, описанному Hansel et al. Качество упорядоченных данных генной экспрессии оценивают при помощи приложений для высокоэффективного анализа экспрессии (Ascenta, Bioexpress Gene Logic, Gaithersburg MD и Affymetrix, Santa Clara, CA), позволяющих выполнить оценку данных по множественным объективным критериям, включая соотношение 5'/3' глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), соотношение сигнал/помеха, оценку фоновой экспрессии, а также другие параметры. Анализ GeneChip выполняют с использованием программных пакетов Affymetrix Microarray Analysis Suite, версия 5.0, Data Mining Tool 2.0, a также программного обеспечения для анализа базы данных генной экспрессии по методу микрочипов (Affymetrix, Santa Clara, CA). Все гены, оцениваемые при помощи GeneChip, глобально нормализуют и соизмеряют с интенсивностью сигнала, равной 100.
Анализ данных на микрочипах
Образцы патологически неизмененных тканей используют для определения фоновой экспрессии мРНК PARP1. Высчитывают средние арифметические значения и верхние пределы доверительного интервала в 90%, 95%, 99%, и 99,9% (ВПДИ) для индивидуального прогнозируемого значения. Поскольку авторы оценивают вероятность, с которой индивидуальные анализируемые образцы вне нормального множества оказываются в пределах фонового распределения, для анализа ожидаемого диапазона будущих индивидуальных измерений используют прогнозируемый, а не доверительный интервал для среднего арифметического значения.
Прогнозируемый интервал определяется формулой , где  - это среднее арифметическое значение нормального образца ткани молочной железы, S - это среднеквадратическое отклонение, n - размер образца и А - это 100(1-(р/2))-й критерий t - распределения Стьюдента со степенью свободы n-1.
Образцы патологически неизмененных тканей используют для определения фоновой экспрессии PARP1. Образцы сгруппированы в различные подкатегории в соответствии с характеристиками, включающими стадию развития опухоли, курит ли больной, статус СА125 или возраст. Каждый образец опухоли анализируют в соответствии с 90%, 95%, 99% или 99,9% ВПДИ. Анализ выполняют с использованием программного обеспечения SAS v8.2 для Windows (www.sas.com).
Корреляции Пирсона высчитывают для наборов из 11 зондов в сравнении с PARP1. Корреляции основаны на полном наборе из 194 образцов. Корреляцию продукт-момент Пирсона определяют формулой ,
Где Ошибка! Объекты нельзя создать из кодов поля редактирования - среднее значение набора зондов PARP1 и Ошибка! Объекты нельзя создать из кодов поля редактирования - среднее значение набора зондов, для которого определяется коррелятивное значение PARP1. Статистическую значимость определяют по формуле , где r - коэффициент корреляции и n - число образцов. Предполагается, что результирующее значение характеризуется t-распределением со степенями свободы n-2.
Мультиплексная полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием обратной транскриптазы (ОТ-ПЦР):
Мультиплексную ОТ-ПЦР осуществляют с использованием 25 нг тотальной РНК, выделенной из каждого образца, по методу, описанному ранее (Khan et al., 2007). Мультиплексный анализ, использованный в этом исследовании, предназначается для детекции РНК в образцах тканей, фиксированных формалином и заключенных в парафин (ФФЗП) либо замороженных. Концентрацию РНК определяют при помощи набора RiboGreen RNA Quantitation Kit (Invitrogen) с использованием Wallac Victo r2 1420 Multilabel Counter. Образец РНК из каждого образца ткани анализируют при помощи биоанализатора Agilent Bioanalyzer в соответствии с инструкциями к прибору Agilent 2100 Bioanalyzer. Реакции обратного транскрибирования (ОТ) выполняют, как описано ранее, при помощи амплификатора Applied Biosystems 9700. Реакции ПЦР с каждым образцом кДНК выполняют с использованием термоциклера Applied Biosystems 9700. В реакционные смеси для ОТ добавляют РНК канамицина с целью мониторирования эффективности реакций ОТ и ПЦР. Используемые контроли включали положительный РНК-контроль, контроль без добавления матричной РНК и контроль без добавления обратной транскриптазы. Реакции ПЦР анализируют при помощи капиллярного электрофореза. Флюоресцентно меченые продукты ПЦР разбавляют, смешивают со стандартом для оценки размера молекул ДНК (Genome Lab size Standard-400, поставляется компанией Beckman-Coulter), денатурируют и анализируют при помощи CEQ 8800 Genetic Analysis System. Экспрессию каждого из анализируемых генов для каждого из образцов оценивают относительно экспрессии гена β-глюкоронидазы (GUSB) в той же самой реакционной смеси и выражают в виде среднего и среднеквадратического отклонения 3 независимых измерений.
Пациенты с инфильтрирующим протоковым раком (ИПР) молочной железы демонстрируют, в сравнении с нормальными тканями молочной железы, увеличение среднего уровня экспрессии PARP1 в 1,8 раза (P<00001). Важно отметить, что увеличенная экспрессия PARP1 чаще отмечается при раке молочной железы, который является отрицательным по отношению к ER, PR или HER2 (таблица 1).
ТАБЛИЦА 1
Увеличение экспрессии PARP1 в случаях инфильтрирующего протокового рака (ИПР) молочной железы
Подтип ИПР
Число случаев
% образцов с усилением экспрессии PARP1
Норма
68
2,9%
ИПР
169
30,2%
ER+
35
22,9%
ER-
18
55,6%
PR+
26
23,1%
PR-
20
45,0%
HER2+
24
29,2%
HER2-
10
70,0%
ER+/PR+
26
23,1%
ER-/PR-
8
62,5%
ER+/PR-
8
25,0%
Усиление экспрессии PARP1 расценивалось как таковое, если выявлялось превышение 95% верхнего предела доверительного интервала, показанного для распределения образцов нормальных тканей молочных желез.
Пример 2. Комбинация 4-иод-3-нитробензамида (ВА) с химиотерапией
Клеточная культура
5
4
Клетки рака молочной железы получают из коллекции клеточных культур АТСС и культивируют в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки плода коровы. Клетки помещают в количестве 10 клеток в культуральную чашку Р100 или в количестве 10 клеток в культуральную чашку Р60 в присутствии различных концентраций соединений или ДМСО в качестве контроля. После обработки количество прилипших клеток оценивают с использованием счетчика клеток Coulter и при помощи окрашивания 1% раствором метиленового синего. Метиленовый синий растворяют в 50%-50% смеси метанола и воды. Клетки помещают в 24- или 96-луночные планшеты для культивирования и подвергают желаемой обработке, после чего культуральную среду удаляют, клетки промывают физиологическим раствором с фосфатным буфером, фиксируют метанолом в течение 5-10 минут, метанол удаляют и дают планшетам полностью высохнуть. К клеткам добавляют метиленовый синий и планшеты инкубируют в течение 5 минут. Раствор красителя удаляют, планшеты промывают дистиллированной водой до тех пор, пока она не перестает окрашиваться в синий цвет. Для того чтобы экстрагировать метиленовый синий из клеток, после полного высыхания планшетов в каждую из лунок добавляют небольшое количество 1 н. HCl. Оптическую плотность растворов определяют при 600 нм, после чего количество клеток рассчитывают с помощью калибровочной кривой.
Соединения
Для каждого отдельного эксперимента соединения растворяют непосредственно в виде сухого порошка в ДМСО для получения маточного раствора концентрацией 10 мМ. Контрольные эксперименты выполняют с применением равных объемов/концентраций растворителя (ДМСО); в этих контролях клетки не проявляют изменений роста или цикла деления.
Анализ исключения PI, анализ клеточного цикла и исследование по методу TUNEL
После воздействия на клетки добавлением различных препаратов и инкубации клетки обрабатывают раствором трипсина, отбирают аликвоты для подсчитывания, а также проводят анализ исключения PI (пропидия иодид). При этом часть клеток центрифугируют и ресуспендируют в 0,5 мл ледяного физиологического раствора с фосфатным буфером, содержащего 5 мкг/мл PI. Оставшиеся клетки фиксируют ледяным 70% этанолом и сохраняют в течение ночи в морозильнике. Для анализа клеточного цикла клетки окрашивают PI в соответствии со стандартной процедурой. Содержание клеточной ДНК определяется проточной цитометрией с использованием BD LSRII FACS, при этом пропорции клеток в фазах G1, S или G2/M определяют с использованием программы ModFit.
Для оценки уровня апоптоза клетки окрашивают с помощью набора "In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein" (Roche Diagnostics Corporation, Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Коротко говоря, зафиксированные клетки центрифугируют, промывают один раз физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS), содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), и затем ресуспендируют в 2 мл пермеабилизирующего буфера (0,1% Тритона Х-100 и 0,1% раствора цитрата натрия в PBS), инкубируют 25 минут при комнатной температуре и дважды промывают в 0,2 мл PBS/1% BSA. Клетки ресуспендируют в 50 мкл реакционной смеси для TUNEL (фермент TdT и раствор для окрашивания) и инкубируют в течение 60 минут при температуре 37°С в темноте в увлажненной атмосфере инкубатора. Окрашенные клетки однократно промывают PBS/1%/BSA, а затем ресуспендируют в 0,5 мл ледяного PBS, содержащего 1 мкг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), и инкубируют еще по меньшей мере в течение 30 минут. Все образцы анализируют с помощью BD LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA).
Анализ окрашивания клеток бромдезоксиуридином (BrdU)
Для получения конечной концентрации BrdU, равной 10 мкМ, добавляют 50 мкл 1 мМ маточного раствора BrdU (Sigma Chemical Co., St. Louis, МО). Клетки инкубируют при температуре 37°С в течение 30 минут, после чего фиксируют ледяным 70% этанолом и оставляют на ночь в холодном помещении при температуре 4°С. Фиксированные клетки центрифугируют и однократно промывают в 2 мл PBS, после чего ресуспендируют в 0,7 мл денатурирующего раствора (0,2 мг/мл пепсина в 2 н. HCl) в течение 15 минут при температуре 37°С в темноте, суспендируют с 1,04 мл 1М буфера Трис (Trizma base, Sigma Chemical Co.) и промывают в 2 мл PBS. Затем клетки ресуспендируют в 100 мкл раствора антитела к анти-BrdU (DakoCytomation, Carpinteria, CA), разбавленного в соотношении 1:100 в пермеабилизирующем буфере TBFP (0,5% Твин-20, 1% бычьего сывороточного альбумина и 1% сыворотки плода коровы в PBS), инкубируют 25 минут в темноте при комнатной температуре и промывают в 2 мл PBS. Клетки, окрашенные первичным антителом, ресуспендируют в 100 мкл раствора Alexa Fluor-меченого F(ab')2 фрагмента козлиного антимышиного IgG (H+L) (исходная концентрация 2 мг/мл) (Molecular Probes, Eugene, OR), разбавленного в соотношении 1:200 в пермеабилизирующем буфере TBFP, инкубируют 25 минут в темноте при комнатной температуре и промывают в 2 мл PBS, а затем ресуспендируют в 0,5 мл ледяного PBS, содержащего 1 мкг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), по меньшей мере в течение 30 минут. Все образцы клеток анализируют при помощи BD LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA).
Комбинации 4-иод-3-нитробензамида (ВА) с разнообразными химиотерапевтическими агентами тестировали на моделях раковых опухолей in vitro и in vivo. Оценка эффекта сочетания ВА с гемцитабином или карбоплатином на клетки аденокарциномы молочной железы клеточной линии MDA-MB-468, полученной от пациента с метастатической трижды негативной аденокарциномой, показывает, что ВА стимулирует остановку клеточного цикла в фазах S- и G2/M и усиливает цитотоксические эффекты, вызванные как карбоплатином, так и гемцитабином (фиг.2).
Активность ВА в сочетании с гемцитабином и карбоплатином оценивают на модели ксенотрансплантата трижды негативной метастатической аденокарциномы молочной железы MDA-MB-231 в мышах nude nu/nu. ВА усиливает активность комбинации с гемцитабином и карбоплатином, результатом чего становятся 4 частичных ответа (PR), 2 полных ответа (CR) а также 1 случай выживаемости без признаков наличия опухоли (TFS) при сроке 35 дней с момента назначения (таблица 2). Комбинация ВА с гемцитабином и карбоплатином хорошо переносится.
ТАБЛИЦА 2
Действие комбинации ВА с гемцитабином и карбоплатином на модели ксенотрансплантации трижды негативной аденокарциномы молочной железы MDA-MB-231 in vivo
Лечение
Частичный ответ
Полный ответ
Безопухолевая выживаемость
Контроль
0
0
0
Гемцитабин (15 мг/кг; внутрибрюшинно; 4 раза с интервалом в 3 дня) + Карбоплатин (10 мг/кг; внутрибрюшинно; один раз в неделю в течение 3 недель)
4
0
0
BSI-201 (50 мг/кг; внутрибрюшинно; два раза в неделю) + Гемцитабин (15 мг/кг; внутрибрюшинно; 4 раза с интервалом в 3 дня) + Карбоплатин (10 мг/кг; внутрибрюшинно; один раз в неделю в течение 3 недель)
4
2
1
Таким образом, 4-иод-3-нитробензамид (ВА) способен стимулировать действие различных цитотоксических химиотерапевтических агентов, включая карбоплатин и гемцитабин.
Пример 3. Комбинация 4-иод-3-нитробензамида (ВА) с иринотеканом
5
4
Клетки рака молочной железы получают из коллекции клеточных культур АТСС и культивируют в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки плода коровы. Клетки помещают в количестве 10 клеток в культуральную чашку Р100 или в количестве 10 клеток в культуральную чашку Р60 в присутствии различных концентраций соединений или ДМСО в качестве контроля. После обработки количество прилипших клеток оценивают с использованием счетчика клеток Coulter и при помощи окрашивания 1% раствором метиленового синего. Метиленовый синий растворяют в 50%-50% смеси метанола и воды. Клетки помещают в 24- или 96-луночные планшеты для культивирования и подвергают желаемой обработке, после чего культуральную среду удаляют, клетки промывают физиологическим раствором с фосфатным буфером, фиксируют метанолом в течение 5-10 минут, метанол удаляют и дают планшетам полностью высохнуть. К клеткам добавляют метиленовый синий, и планшеты инкубируют в течение 5 минут. Раствор красителя удаляют, планшеты промывают дистиллированной водой до тех пор, пока она не перестает окрашиваться в синий цвет. Для того чтобы экстрагировать метиленовый синий из клеток, после полного высыхания планшетов в каждую из лунок добавляют небольшое количество 1 н. HCl. Оптическую плотность растворов определяют при 600 нм, после чего количество клеток рассчитывают с помощью калибровочной кривой.
Для каждого отдельного эксперимента соединения непосредственно в виде сухого порошка растворяют в ДМСО для получения маточных растворов концентрацией 10 мМ. Контрольные эксперименты выполняют с применением равных объемов/концентраций растворителя (ДМСО); в этих контролях клетки не показывают изменений роста или цикла деления.
Анализ исключения PI, анализ клеточного цикла, исследование по методу TUNEL и анализ окрашивания клеток BrdU выполняют, как указано выше в примере 2.
Комбинации различных концентраций 4-иод-3-нитробензамида (ВА) с иринотеканом тестировали на моделях раковых опухолей in vitro. Оценка эффекта сочетания ВА с иринотеканом клетки трижды негативной аденокарциномы молочной железы клеточной линии MDA-МВ-468, полученной от пациента с метастатической трижды негативной аденокарциномой, показывает, что ВА стимулирует остановку клеточного цикла в фазах S- и G2/M и усиливает цитотоксические эффекты, вызванные иринотеканом (таблица 3).
ТАБЛИЦА 3
Регуляция клеточного цикла клеток трижды негативной аденокарциномы молочной железы MDA-MB-468 воздействием комбинации 4-иод-3-нитробензамида (ВА) с иринотеканом
G1
S
G2/M
Жизнеспособные клетки, % контроль
Иринотекан
Иринотекан 0 мкМ + ВА мкМ
0
64,40
24,18
11,42
100,0
50
65,50
23,48
11,02
91,5
100
57,72
26,93
15,34
67,5
Иринотекан 5 мкМ + ВА мкМ
0
38,17
33,77
28,05
48,6
50
24,94
41,85
33,21
31,6
100
9,28
51,43
39,29
23,4
Таким образом, 4-иод-3-нитробензамид (ВА) способен стимулировать действие различных цитотоксических химиотерапевтических агентов, включая карбоплатин, гемцитабин и иринотекан.
Пример 4. Комбинация 4-иод-3-нитробензамида (ВА) с ингибитором IGF1R пикроподофиллином (РРР)
5
4
Клетки рака молочной железы получают из коллекции клеточных культур АТСС и культивируют в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки плода коровы. Клетки помещают в количестве 10 клеток в культуральную чашку Р100 или в количестве 10 клеток в культуральную чашку Р60 в присутствии различных концентраций соединений или ДМСО в качестве контроля. После обработки количество прилипших клеток оценивают с использованием счетчика клеток Coulter и при помощи окрашивания 1% раствором метиленового синего. Метиленовый синий растворяют в 50%-50% смеси метанола и воды. Клетки помещают в 24- или 96-луночные планшеты для культивирования и подвергают желаемой обработке, после чего культуральную среду удаляют, клетки промывают физиологическим раствором с фосфатным буфером, фиксируют метанолом в течение 5-10 минут, метанол удаляют и дают планшетам полностью высохнуть. К клеткам добавляют метиленовый синий, и планшеты инкубируют в течение 5 минут. Раствор красителя удаляют, планшеты промывают дистиллированной водой до тех пор, пока она не перестает окрашиваться в синий цвет. Для того чтобы экстрагировать метиленовый синий из клеток, после полного высыхания планшетов в каждую из лунок добавляется небольшое количество 1н. HCl. Оптическую плотность растворов определяют при 600 нм, после чего количество клеток рассчитывают с помощью калибровочной кривой.
Для каждого отдельного эксперимента соединения растворяют в ДМСО непосредственно в виде сухого порошка для получения маточных растворов концентрацией 10 мМ. Контрольные эксперименты выполняют с применением равных объемов/концентраций растворителя (ДМСО); в этих контролях клетки не показывают изменений роста или цикла деления.
Анализ исключения PI, анализ клеточного цикла, исследование по методу TUNEL и анализ окрашивания клеток BrdU выполняют, как указано выше в примере 2.
Комбинации различных концентраций 4-иод-3-нитробензамида (ВА) с ингибитором рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1R) пикроподофиллином (РРР) тестировали на моделях раковых опухолей in vitro. Оценка эффекта сочетания ВА с РРР на клетки аденокарциномы молочной железы, трижды негативной клеточной линии аденокарциномы молочной железы MDA-MB-468, полученной от пациента с метастатической трижды негативной аденокарциномой, показывает, что ВА стимулирует остановку клеточного цикла в фазах S- и G2/M и усиливает цитотоксические эффекты, вызванные РРР (таблица 4).
ТАБЛИЦА 4
Регуляция клеточного цикла клеток трижды негативной аденокарциномы молочной железы MDA-MB-468 воздействием комбинации 4-иод-3-нитробензамида (ВА) с ингибитором IGF1R пикроподофиллином (РРР)
G1
S
G2/M
Жизнеспособные клетки,% контроль
РРР 0 нМ + 201 мкМ
0
50,96
30,37
16,04
100
50
50,20
31,34
15,21
82
100
40,63
34,52
20,16
61
РРР 200 нМ + 201 мкМ
0
51,42
30,22
15,01
89
50
49,75
31,41
15,10
77
100
37,51
35,58
21,30
59
РРР 400 нМ + 201 мкМ
0
37,29
25,32
20,17
60
50
32,88
28,47
22,37
42
100
23,62
31,78
29,98
32
Таким образом, 4-иод-3-нитробензамид (ВА) способен стимулировать действие ингибиторов рецепторов фактора роста, включая пикроподофиллин (РРР).
Пример 5. Лечение трижды негативного рака молочной железы с помощью ВА
Осуществляется многоцентровое открытое рандомизированное исследование с целью демонстрации терапевтической эффективности лечения трижды негативного метастатического рака молочной железы 4-иод-3-нитробензамидом.
Цели исследования: настоящее исследование преследует следующие первичные цели:
Уровень клинического ответа (CBR=CR+PR+SD≥6 месяцев):
Выяснить, способен ли ВА улучшить CBR на 30% или более в сравнении с 45% улучшением CBR, выявляемым при лечении гемцитабином и карбоплатином.
- Дальнейшее исследование безопасности и переносимости ВА.
- Вторичные цели данного исследования следующие:
- определение суммарной эффективности терапии (ORR);
- оценка выживаемости без признаков прогрессии заболевания (PFS);
- оценка токсичности в каждой из групп.
- Поисковые задачи настоящего исследования следующие:
- охарактеризовать ингибирование активности PARP со стороны ВА;
- ретроспективно охарактеризовать уровень активности PARP на основе коллекций препаратов опухолевых тканей;
- исследовать состояние BRCA при трижды негативном раке молочной железы;
- изучить ответную реакцию организма у пациентов с раком и известными формами мутаций BRCA в сравнении с пациентами, не имеющими подобных мутаций;
- гистологически классифицировать рак молочной железы либо как базальный, либо как протоковый.
План исследования: открытое двухгрупповое рандомизированное исследование безопасности и эффективности, включающее до 90 пациентов (по 45 в каждой из двух групп), которые будут рандомизированы по группам:
2
- Группа исследования 1: гемцитабин (1000 мг/м; внутривенное вливание в течение 30 минут) и карбоплатин (расчет дозы по методу AUC 2; внутривенное вливание в течение 60 минут) в 1 и 8 дни 21-дневного цикла; либо
- Группа исследования 2: 4-иод-3-нитробензамид (4 мг/кг, внутривенное вливание в течение 1 часа) в 1, 4, 8 и 11 дни каждого 21-дневного цикла.
- У пациентов, рандомизированных в группу 2, исследование будет прервано в случае прогрессии заболевания.
- Перекрест: пациентам, рандомизированным в группу 1, в случае прогрессии заболевания может назначаться перекрестное лечение гемцитабином/карбоплатином в сочетании с 4-иод-3-нитробензамидом.
- Размеры исследования: в исследовании планируется включить до 90 пациентов, до 45 в каждую из групп исследования.
- Популяционные критерии:
- Критерии включения:
- Возраст не моложе 18 лет.
Метастатический рак молочной железы (Стадия IV) с измеримыми параметрами заболевания, оцениваемыми согласно критериям RECIST.
- 0-2 предшествующих курса химиотерапии в связи с наличием метастазирования. Разрешается наличие в анамнезе адъювантной/неоадъювантной терапии.
- Гистологически подтвержденное наличие (либо первичного, либо метастатического очага) рака молочной железы, который является ER-отрицательным, PR-отрицательным и не характеризуется повышенной экспрессией HER-2, оцениваемой при помощи иммуногистохимии, (0, 1), либо амплификацией гена HER-2, оцениваемой методом FISH, в области первичных опухолевых или метастатических очагов.
- Завершение предшествующей химиотерапии не менее чем за три недели до начала исследования.
- Пациенты могли получать лечение адъювантами в связи с метастазированием, однако если они получали бифосфонаты, оценка поражения костей не должна использоваться в качестве показателя ответа пациентов или прогрессии заболевания в целях настоящего исследования.
- Радиотерапия должна быть завершена не менее чем за две недели до начала исследования, очаги, подвергшиеся радиотерапии, не должны использоваться в качестве измеримого параметра заболевания.
- Пациенты могут иметь метастазы в ЦНС, если их состояние стабильно (нет признаков прогрессии) в течение по меньшей мере 3 месяцев после завершения местной терапии;
- общее состояние здоровья согласно критериям ECOG (Восточной кооперативной онкологической группы) - 0-1.
3
3
- Адекватное состояние органов определяется как: абсолютное количество нейтрофилов больше или равно 15000/мм, тромбоцитов - больше или равно 100000/мм, клиренс креатинина - больше 50 мл/мин, АЛТ и ACT - ниже 2,5× верхний предел нормы (ВПН) (или меньше 5× ВПН в случае метастазов печени); общий билирубин - ниже 1,5 мг/дл.
- Наличие образца ткани для исследования PARP рекомендовано, но не будет препятствием для участия пациента в исследовании.
- Беременные или кормящие женщины не будут включаться в исследование. Женщины репродуктивного возраста должны получить документальное подтверждение отсутствия беременности за две недели до начала исследования и должны дать согласие на использование контрацептивов в течение всего периода лечения в рамках исследования.
- Подписанное письменное информированное согласие на участие в исследовании, составленное в соответствии с рекомендациями наблюдательной комиссии учреждения.
Критерии исключения из исследования:
- Очаги, идентифицируемые только при помощи ПЭТ.
- Больше двух предшествовавших курсов химиотерапии (включая адъюванты). Последовательные курсы, такие как АС-паклитаксель, расцениваются как один курс.
- Пациент уже принимал гемцитабин, карбоплатин, цисплатин или 4-иод-3-нитробензамид.
- Серьезные нарушения состояния здоровья, которые могут повлиять на возможность участия в исследовании (неконтролируемые нарушения легочной, почечной или печеночной функций, неконтролируемая инфекция).
- Серьезные нарушения сердечно-сосудистой системы в анамнезе, например неконтролируемая гипертензия, нестабильная стенокардия, недавний инфаркт миокарда (в предшествующие 6 месяцев), неконтролируемая сердечная недостаточность и кардиомиопатия, симптомная либо бессимптомная, но характеризующаяся уменьшением сердечного выброса до менее чем 45%.
- Другие существенные сопутствующие заболевания, которые, по мнению исследователя, могут существенно повлиять на возможность эффективного и безопасного участия в исследовании.
- Пациент уже принимает участие в другом исследовании, будь то оборудование или лекарственный препарат, либо принимает иные агенты, проходящие клиническое испытание.
- Одновременная или предшествовавшая (в пределах 7 дней до начала исследования) антикоагулянтная терапия (разрешается прием поддерживающих низких доз).
- Ряд специально указанных лекарственных препаратов.
- Одновременная радиотерапия не разрешается в течение всей продолжительности исследования.
- Неспособность подчиняться требованиям настоящего исследования.
- Скрининговое тестирование и оценка будут выполняться только после подписания каждым пациентом письменного информированного согласия на участие в исследовании, составленного в соответствии с рекомендациями наблюдательной комиссии учреждения. Процедуры начнутся в течение 14 дней с момента определения требуемых доз препаратов (день 1), если не указано иначе.
Клиническая оценка: полная история болезни, физикальное обследование, оценка общего состояния здоровья в соответствии с критериями ECOG, определение роста, веса, основных показателей жизнедеятельности и данных по приему сопутствующих лекарственных препаратов.
2
Лабораторные исследования: гематологические (количество лейкоцитов, ретикулоцитов и тромбоцитов); протромбиновое время (РТ) и частичное тромбопластиновое время (РТТ); комплексный биохимический анализ крови (натрий, хлор, калий, CO, креатинин, кальций, фосфор, магний, мочевина, мочевая кислота, альбумин, ACT, АЛТ, щелочная фосфатаза, общий билирубин, холестерин, липиды высокой и низкой плотности), анализ мочи с микроскопическим исследованием, ингибирование PARP в мононуклеарных клетках периферической крови, для женщин детородного возраста - также тест на беременность с использованием мочи или сыворотки крови. Профилирование BRCA производят лишь при наличии дополнительного заверенного подписью информированного согласия пациента. Эта информация также может быть получена из истории болезни пациента. Определение клинической стадии заболевания: компьютерной томографией (КТ) или магнитно-резонансной томографией (МРТ) для оценки заболевания.
Лечение: подходящие для исследования пациенты будут включаться и случайным образом распределяться между группами исследования 1 и 2:
2
- Группа исследования 1: гемцитабин (1000 мг/м; внутривенное вливание в течение 30 минут) и карбоплатин (расчет дозы по методу AUC 2; внутривенное вливание в течение 60 минут) в 1 и 8 дни 21-дневного цикла; либо
- Группа исследования 2; 4-иод-3-нитробензамид (4 мг/кг, внутривенное вливание в течение 1 часа) в 1, 4, 8 и 11 дни каждого 21-дневного цикла.
- Перекрест: пациентам, рандомизированным в группу 1, в случае прогрессии заболевания может назначаться перекрестное лечение гемцитабином/карбоплатином в сочетании с 4-иод-3-нитробензамидом.
- До и после приема доз будут выполняться тесты, отмеченные в протоколе исследования.
- Прием доз в обеих группах будет осуществляться 21-дневными циклами.
Пациенты могут принимать участие в исследовании до тех пор, пока не развивается непереносимость препаратов, прогрессия заболевания либо они прекращают лечение по собственному желанию. Пациенты, достигшие клинического ответа, должны будут получить еще 4 дополнительных цикла лечения. Пациенты, прекращающие лечение до достижения стадии прогрессии заболевания, должны будут проходить регулярную оценку стадии заболевания вплоть до момента начала прогрессии. С прекращением лечения оценка выживаемости без признаков прогрессии заболевания и суммарной эффективности терапии будет продолжаться с трехмесячными интервалами до начала прогрессирования заболевания либо до момента смерти пациента.
Первая плановая оценка ответа опухоли при наличии измеримых параметров заболевания будет осуществляться по завершении цикла 2, а затем после каждого очередного цикла терапии (примерно каждые 6-8 недель) в дополнение к исходной оценке стадии заболевания, проводимой перед началом исследования. Ответ опухоли в соответствии с модифицированными Критериями оценки ответа солидных опухолей (RECIST) будет использован для подтверждения опухолевой прогрессии по результатам КТ или МРТ (необходимо использовать тот же метод, который использовали во время скрининга).
Завершение лечения: лечение всех пациентов должно быть завершено в соответствии с процедурами, описанными в протоколе исследования, не позднее чем в течение 30 дней с момента введения последней дозы 4-иод-3-нитробензамида. Дополнительно у всех пациентов должна быть проведена оценка суммарного показателя ответа опухоли посредством клинического визуализирования, если это не было сделано на протяжении 30 дней до введения последней дозы 4-иод-3-нитробензамида.
Оценка безопасности: безопасность необходимо оценивать посредством стандартных клинических и лабораторных тестов (гематологического анализа крови, биохимического анализа крови и анализа мочи). Степень токсичности определяется в соответствие критериями Национального института исследования рака CTCAE v3.0.
Фармакокинетика/Фармакодинамика
Образцы крови для фармакокинетического и фармакодинамического анализа будут забирать лишь у пациентов, включенных в группу исследования 2, в том числе и у тех, кто участвует в перекрестном исследовании.
Образцы крови для фармакокинетического анализа будут забирать в течение 1 цикла лечения, до назначения дозы препарата и сразу после завершения вливания в 1 и на 11 день.
Образцы крови для фармакодинамического анализа и для оценки активности PARP будут забирать в течение 1 цикла, до назначения дозы препарата в 1, 4, 8 и 11 дни, образец после завершения вливания необходимо взять только в первый день.
Учреждения, которые не могут забирать образцы для фармакокинетического и фармакодинамического анализа, как указано выше, также смогут принимать участие в настоящем исследовании, при этом для них будут соответствующим образом скорректированы протоколы исследования.
Эффективность: опухоли будут оцениваться с использованием стандартных методов (например, КТ) перед началом исследования и затем приблизительно каждые 6-8 недель, при условии отсутствия клинически видимых признаков прогрессии заболевания.
Статистические методы
Основной задачей настоящего исследования является оценка уровня клинического ответа (CBR) в группе приема ВА. В каждой из двух групп исследования будет установлена конечная точка (CBR) и вычислен точный биноминальный 90% доверительный интервал. Показатели CBR в обеих группах будут сравниваться с использованием одностороннего точного теста Фишера с уровнем статистической значимости 5%. Вторичные и эксплоративные конечные точки выживаемости без признаков прогрессии заболевания и общей выживаемости будут оцениваться, и 95% доверительный интервал будет рассчитываться с использованием метода Каплана-Мейера. Распределения данных выживаемости без признаков прогрессии заболевания и общей выживаемости между двумя группами будут сравнивать с использованием логарифмического рангового критерия. Анализ данных ингибирования PARP будет эксплоративным и по своей природе описательным. Для оценки первичной конечной точки безопасности проводимого лечения случаи возникновения нежелательных явлений и серьезных нежелательных явлений будут сгруппированы в соответствии с группами исследования, поражаемыми органами, классом системы органов и предпочтительными терминами. Данные лабораторных анализов по завершении 1 цикла будут суммированы относительно сдвигов в сравнении с соответствующими показателями перед началом исследования.
Последующее наблюдение: сбор данных будут производить на 90 день и затем каждые 90 дней (±20 дней) после введения завершающей дозы исследуемого препарата.
Лабораторные исследования - образцы крови и мочи для выполнения гематологического анализа крови, биохимического анализа сыворотки крови и анализа мочи приготавливают стандартным способом. Оцениваться будут следующие лабораторные показатели:
Гематологический анализ крови: лейкоциты и определение дифференциальной формулы крови, эритроциты, тромбоциты, гемоглобин и гематокрит.
2
Биохимический анализ крови: альбумин, щелочная фосфатаза, АЛТ, ACT, мочевина, кальций, CO, хлорид, креатинин, γ-глютамилтрансфераза, глюкоза, лактатдегидрогеназа, фосфор, калий, натрий, общий билирубин и общий белок.
Анализ мочи: внешний вид, цвет, рН, удельный вес, содержание кетонов, белка, глюкозы, билирубина, нитритов, уробилиногена, скрытой крови (микроскопическое исследование осадка проводят в случае положительного результата экспресс-теста).
Образцы крови для фармакокинетического анализа будут забирать лишь у пациентов, включенных в группу исследования 2, в том числе и у тех, кто участвует в перекрестном исследовании. Образцы крови будут забирать в течение 1 цикла лечения, до назначения дозы препарата и сразу после завершения вливания в 1 и на 11 день.
Биомаркеры представляют собой объективно измеримые и оцениваемые показатели нормальных биологических процессов, патологических процессов, либо фармакологических ответов на терапевтические воздействия. В онкологии существует особый интерес к молекулярным изменениям, лежащим в основе онкогенных процессов, которые могли бы помочь в идентификации подтипов рака, стадии болезни, оценить степень роста опухоли или спрогнозировать опухолевую прогрессию, возникновение метастазов и развитие ответа на воздействие ВА.
Функциональную активность PARP до и после начала лечения ВА будут оценивать посредством анализа активности PARP в мононуклеарных клетках периферической крови (МНК ПК). МНК ПК будут выделять из образцов периферической крови объемом 5 мл в соответствии с процедурами, подробно описанными в руководстве к исследованию, и будут оценивать активность PARP либо ее ингибирование.
Обращайтесь к руководству, которое будет предоставлено в распоряжении каждого центра, участвующего в данном исследовании, для подробной информации по процедурам забора, обращения и транспортировки всех образцов для анализа PARP.
Тест для оценки гена, ассоциированного с раком молочной железы (BRCA), включает анализ образцов крови с целью обнаружения специфических изменений (мутаций) генов (BRCA1 и BRCA2), участвующих в контроле нормального клеточного роста. Как было показано, у женщин, имеющих мутации гена BRCA, вероятность возникновения рака молочной железы составляет от 36% до 85%, а рака яичников - от 16% до 60%. Назначение женщинам, имеющим мутации гена BRCA, ингибитора PARP может оказаться полезным профилактическим средством. Данное исследование представляет собой начальный шаг к определению возможных ассоциаций между состоянием генов BRCA и ответом на лечение ВА.
С этой целью будут определять состояние генов BRCA (если оно еще не известно) для всех пациентов, принимающих участие в исследовании. Пациенты должны будут подписать отдельное информированное согласие. Поскольку такое согласие не является критерием для отбора пациентов для настоящего исследования, потенциальных участников исследования, не давших согласия на проведение этого тестирования, не будут лишать права участия в исследовании лишь на этом основании.
В каждой из двух групп исследования будут устанавливать первичную конечную точку (CBR) и вычислять точный биноминальный 90% доверительный интервал. Показатели CBR в обеих группах будут сравнивать с использованием одностороннего точного теста Фишера с уровнем статистической значимости 5%. Вторичные и эксплоративные конечные точки выживаемости без признаков прогрессии заболевания и общей выживаемости будут сравнивать между двумя группами с использованием логарифмического рангового критерия.
Отчет, содержащий данные по ответу опухолей, будет носить описательный характер и представлять собой список всех пациентов в составе популяции безопасности, сгруппированной в целях выявления поддающихся измерению клинических эффектов лечения ВА (например, времени до начала прогрессии), и должен быть продолжен по завершении первых 8 недель. Данные по ответам будут сгруппированы по категориям в соответствии с модифицированными критериями RECIST.
Анализ ингибирования PARP будет носить поисковый характер и являться описательным. Будет проводиться сравнение статистических групп для выявления различий во взаимосвязи ингибирования PARP с любыми возможными фармакогеномными результатами (например, экспрессией BRCA), полученными на основании исследования образцов взятых до, в процессе и по завершении лечения ВА.
Анализ безопасности лечения будет проведен для всех пациентов, кто получит хотя бы 1 дозу ВА.
ВА, используемый в исследовании, будут приготавливать в виде раствора с концентрацией 10 мг/мл, содержащего 25% гидроксипропилбетациклодекстрина в 10 мМ фосфатном буферном растворе (рН 7,4).
Критерии оценки ответа, солидных опухолей (RECIST):
Отбор пациентов
В протоколы исследования, где первичной конечной точкой является объективная оценка ответа опухоли на проводимое лечение, должны отбираться лишь больные, имеющие измеримые параметры заболевания к моменту начала исследования.
Измеримые параметры заболевания - наличие хотя бы одного измеримого очага. Если измеримый параметр заболевания ограничивается лишь одиночным очагом поражения, его опухолевая природа должна быть подтверждена данными цитологического/гистологического анализа.
Измеримые очаги поражения - такие очаги поражения, которые могут быть аккуратно измерены по меньшей мере в одном направлении с наибольшим диаметром ≥20 мм при использовании обычных технологий или ≥10 мм - при сканировании спиральной КТ.
Неизмеримые очаги поражения - все прочие поражения, включая очаги малых размеров (наибольший диаметр <20 мм, выявляемый при использовании обычных технологий, или <10 мм при сканировании спиральной КТ), т.е. поражения костей, карцинома мягких мозговых оболочек, асцит, плевральный/перикардиальный выпот, воспалительные заболевания молочной железы, лимфангит кожи/легких, поражения мочевого пузыря, а также наличие новообразований в брюшной полости, не подтвержденных и не отслеженных методами визуализации.
Все измерения необходимо выполнять и записывать в метрических единицах с использованием измерительной линейки или штангенциркуля. Все стартовые оценки должны выполняться как можно ближе по времени к моменту начала лечения и никогда не должны отстоять от него более чем на 4 недели.
В начале исследования и во время последующего наблюдения для описания всех идентифицированных и подтвержденных очагов поражения необходимо применять одни и те же методы анализа и ту же самую технологию.
Клинически выявляемые очаги поражения считаются измеримыми только в том случае, если они располагаются поверхностно (например, кожные узелки и пальпирующиеся лимфатические узлы). В случае поражений кожи рекомендуется документирование при помощи цветной фотографии с измерительной линейкой для оценки размеров очага поражения.
Методы измерения
КТ и МРТ являются наилучшими из доступных и воспроизводимых в настоящий момент методов измерения очагов поражения с целью оценки ответа на проводимое лечение. Традиционные КТ и МРТ необходимо проводить с получением смежных сечений размером не более 10 мм. Спиральную КТ необходимо проводить с использованием алгоритма реконструкции смежных сечений толщиной не более 5 мм. Такие подходы применимы к анализу опухолей области грудной клетки, брюшной полости и полости малого таза. Опухоли головы и шеи, а также опухоли конечностей обычно требуют использования специальных протоколов.
Очаги поражения, выявляемые при рентгенографии грудной клетки, могут считаться измеримыми, если они ясно очерчены и окружены легочной тканью, наполненной воздухом. Тем не менее, предпочтение отдается КТ.
Когда первичной конечной точкой исследования является объективная оценка ответа на проводимую терапию, для измерения очагов поражения не следует использовать ультразвуковые методы. Их применение, однако, возможно в качестве альтернативы клинической оценке поверхностных пальпирующихся лимфатических узлов, подкожных очагов и узелков щитовидной железы. Этот подход может также оказаться полезным для подтверждения полного исчезновения поверхностных очагов поражения, которое обычно оценивается клиническим осмотром.
Использование эндоскопии и лапароскопии для объективной оценки опухолей все еще не нашло полного и широкого утверждения. Их использование в данном специфическом контексте требует наличия сложного оборудования и значительного опыта, которые имеются лишь в некоторых центрах. Таким образом, применение этих технологий для объективной оценки ответа опухоли должно быть ограничено использованием в целях дополнительной диагностической оценки в специализированных центрах. Тем не менее, эти технологии могут быть полезными в случаях, когда требуется выполнение биопсии для подтверждения полного патологического ответа.
Опухолевые маркеры сами по себе нельзя использовать для оценки ответа на проводимое лечение. Если маркеры изначально превышают границы нормального уровня, то клинический ответ будет считаться полным только в том случае, когда наряду с исчезновением всех очагов происходит нормализация уровня опухолевых маркеров.
Данные цитологического и гистологического анализа можно использовать для дифференцирования полного и частичного ответа в ряде редких случаев (например, после проведенного лечения, чтобы провести различие между остаточным доброкачественным и злокачественным очагами поражения в случае таких типов опухолей, как опухоли половых клеток).
Исходная документация очагов поражения, являющихся и не являющихся мишенями
Все измеримые очаги, максимально до пяти очагов в каждом отдельно взятом органе и максимально до 10 очагов в целом, представляющие все вовлеченные органы, необходимо расценивать как очаги-«мишени» и регистрировать и измерять перед началом исследования.
Очаги-«мишени» необходимо отбирать на основании своих размеров (очаги с наибольшим диаметром) и возможности их аккуратного повторного измерения (либо при использовании технологий визуализирования, либо клинически).
Сумму наибольших диаметров всех очагов-«мишеней» будут рассчитывать и расценивать в качестве стартовой суммы диаметров. Этот параметр будут использовать в качестве контрольного для дальнейшей объективной оценки опухоли.
Все прочие очаги поражения необходимо идентифицировать в качестве очагов, не являющихся «мишенями», и они также должны быть зарегистрированы перед началом исследования в качестве стартового параметра. Хотя в дальнейшем не требуется проводить измерения этих очагов, необходимо будет отмечать их появление и исчезновение в ходе последующего динамического наблюдения пациентов.
Критерии ответа на проводимое лечение
Оценка очагов-«мишеней»:
- Полный ответ (CR): исчезновение всех очагов-«мишеней».
- Частичный ответ (PR): по меньшей мере 30% уменьшение суммы диаметров очагов-«мишеней» в сравнении со стартовой суммой диаметров.
- Прогрессирующее течение болезни (PD): по меньшей мере 20% увеличение суммы диаметров очагов-«мишеней» в сравнении с наименьшей суммой диаметров, зарегистрированной с момента начала лечения, либо появление одного или нескольких новых очагов.
- Стабильное течение болезни (SD): нет ни достаточного для «частичного ответа» уменьшения суммы диаметров очагов-«мишеней», ни достаточного для «прогрессирующего заболевания» увеличения этого показателя; оценивается в сравнении с наименьшей суммой диаметров, зарегистрированной с момента начала лечения.
Оценка очагов, не являющихся «мишенями»:
- Полный ответ (CR): исчезновение всех очагов, не являющихся «мишенями», нормализация уровня опухолевого маркера.
- Неполный ответ/стабильное течение болезни (SD): сохранение одного-двух очагов, не являющихся «мишенями», и (или) поддержание уровня опухолевого маркера выше верхней границы нормы.
- Прогрессирующее течение болезни (PD): появление одного или более новых очагов и (или) несомненная прогрессия уже имеющихся очагов, не являющихся «мишенями» (1).
- Хотя отчетливая прогрессия очагов, не являющихся «мишенями», скорее является исключением, в подобных обстоятельствах мнение лечащего врача имеет определяющее значение и подтверждение прогрессии заболевания должно происходить позднее либо специально отобранной коллегией, либо лицом, ответственным за проведение данного исследования.
Оценка наилучшего суммарного ответа
Наилучшим суммарным ответом является наилучший ответ, зарегистрированный с момента начала лечения до момента начала прогрессии/возвращения заболевания (используя для сравнения наименьшие результаты измерений, учитываемых с момента начала лечения). В целом определение наилучшего ответа будет зависеть от достижения как критериев измерений, так и подтверждающих критериев.
Очаги - «мишени»
Очаги, не являющиеся «мишенями»
Новые очаги
Суммарный ответ
CR
CR
Нет
CR
CR
Неполный ответ/SD
Нет
PR
PR
Не прогрессирующее течение болезни
Нет
PR
SD
Не прогрессирующее течение болезни
Нет
SD
PD
Любой
Да или нет
PD
Любой
PD
Да или нет
PD
Любой
Любой
Да
PD
Пациентов с общим ухудшением состояния здоровья, требующих прекращения проводимого лечения без наличия объективных признаков прогрессии заболевания, необходимо классифицировать как имеющих «симптоматическое ухудшение». В таком случае даже после прекращения лечения необходимо приложить всяческие усилия для того, чтобы задокументировать наличие объективной прогрессии.
В ряде обстоятельств может оказаться затруднительным дифференцировать нормальные ткани и ткани с признаками остаточной болезни. Если от этого будет зависеть оценка степени полноты ответа, рекомендуется исследование остаточного очага (аспирация/биопсия тонкой иглой) для подтверждения полноты ответа.
Подтверждение
Главной целью подтверждения объективного ответа является избежание переоценки наблюдаемого показателя ответа. В случаях, когда подтверждение ответа не представляется возможным, это обстоятельство необходимо четко отметить в отчете по результатам исследования.
Для придания статуса PR или CR изменения в измерениях опухоли должны быть подтверждены повторным анализом, который необходимо выполнять не ранее 4 недель со дня, когда впервые было выявлено соответствие классифицирующим критериям ответа. Более длительные интервалы времени, как определяется в протоколе настоящего исследования, тоже могут быть приемлемы.
В случае SD замеры, сделанные в ходе последующего динамического наблюдения, должны соответствовать критериям SD по меньшей мере однократно по истечении минимального интервала, определяемого протоколом данного исследования (в целом не менее 6-8 недель).
Продолжительность суммарного ответа
Продолжительность суммарного ответа замеряют начиная с первого момента, когда выявляется соответствие критериям измерения CR или PR (какой бы ни был зарегистрирован первым), до того момента, когда возвращение заболевания или PD оказываются объективно задокументированными, основываясь на сравнении с наименьшими замерами, отмеченными с момента начала лечения.
Продолжительность периода стабильного течения болезни
SD замеряют с момента начала лечения до тех пор, пока не удовлетворяются критерии прогрессии заболевания, основываясь на сравнении с наименьшими замерами, отмеченными с момента начала лечения.
Клиническое значение продолжительности периода SD различается для разных видов опухолей и клинических стадий. Таким образом, настоятельно рекомендуется, чтобы протокол исследования содержал информацию о минимальных временных интервалах между двумя последовательными измерениями, проводимыми с целью определения SD. Такой временной интервал должен учитывать ожидаемый клинический результат, какой таковой статус может предоставить исследуемой популяции.
Оценка ответа на проводимое лечение
Для исследований, где показатель ответа является первичной конечной точкой, настойчиво рекомендуется привлечение независимого экспертного мнения для оценки по завершении исследования всех получаемых ответов. При этом наилучшим подходом является одновременный анализ историй болезней пациентов и данных рентгенологических исследований.
Представление результатов
Все пациенты, участвующие в настоящем исследовании, должны быть проанализированы на предмет оценки ответа на проводимое лечение, даже если имеются значительные отклонения в лечебных протоколах, либо если пациенты оказываются несоответствующими критериям отбора. Каждый пациент будет отнесен к одной из следующих категорий: 1) полный ответ, 2) частичный ответ, 3) стабильное течение болезни, 4) прогрессирующее течение болезни, 5) ранняя смерть от злокачественной опухоли, 6) ранняя смерть от токсического эффекта проводимой терапии, 7) ранняя смерть по другой причине, или 9) ответ неизвестен (не поддающийся оценке, недостаточно данных).
Все пациенты, соответствующие критериям отбора, должны быть включены в основную группу анализа показателя ответа на проводимое лечение. Пациенты, отнесенные к категориям 4-9, должны расцениваться как не сумевшие ответить на лечение (прогрессия болезни). Таким образом, неправильно выбранный курс лечения или ошибочное назначение лекарственного препарата не должны становиться поводом для исключения из анализа показателя ответа на проводимое лечение. Более точные определения категорий 4-9 будут зависеть от применяемого специфического протокола.
Все выводи должны строиться на данных, полученных от пациентов, соответствовавших критериям отбора.
Дальнейший анализ может быть выполнен на основе подгрупп пациентов, после исключения тех из них, для кого были выявлены существенные отклонения от протокола исследования (например, ранняя смерть по другим причинам, раннее прекращение лечения, существенные нарушения протокола и т.д.). Однако такой анализ может не являться основанием для выводов в отношении эффективности лечения, и причины исключения пациентов из проводимого анализа должны быть ясно разъяснены.
Необходим расчет 95% доверительных интервалов.
Пример 6. Лечение рака молочной железы ВА
Открытое исследование с увеличением дозы препарата в фазе 1b оценивает безопасность приема ВА (2,0, 2,8, 4,0, 5,6, 8,0 и 11,2 мг/кг) в сочетании с химиотерапевтическими курсами лечения (топотекан, гемцитабин, темозоломид и карбоплатин+паклитаксел) у пациентов с поздними стадиями рака молочной железы. Анализ МНК ПК пациентов демонстрирует значительное продолжительное ингибирование PARP после повторного введения ВА в дозах 2,8 мг/кг или выше (фиг.3).
Показана хорошая переносимость сочетаний ВА с каждым из цитотоксических курсов. Все наблюдавшиеся токсические явления соответствовали хорошо известным и ожидаемым побочным эффектам каждого из химиотерапевтических курсов лечения. Нет никаких указаний на то, что добавление ВА к какому-либо из тестированных цитотоксических курсов лечения либо потенцирует известное токсическое действие, либо увеличивает частоту возникновения таких ожидаемых токсических действий. Установлена биологически оправданная доза (2,8 мг/кг), которая вызывает значительное и продолжительное ингибирование PARP при наличии эффективных преклинических концентраций в крови. Около 80% пациентов демонстрировали стабильное течение болезни в течение 2 или более циклов проводимой терапии, что свидетельствует о наличии потенциального клинического ответа.
Пример 7. Исследование 2 фазы по определению эффективности лечения трижды негативного метастатического рака молочной железы с применением монотерапии ВА или в сочетании с гемцитабином/карбоплатином
Открытое двухгрупповое рандомизированное исследование безопасности и эффективности 2 фазы оценивает то, насколько ингибирование активности PARP комбинацией ВА с гемцитабином/карбоплатином улучшает уровень клинического ответа (CBR=CR+PR+SD≥6 месяцев) у больных с трижды негативным метастатическим раком молочной железы в сравнении со стандартной химиотерапией. Проверяется гипотеза, что добавление ВА к гемцитабину/карбоплатину обеспечит достижение CBR, равного 60%, в сравнении с уровнем в 45%, достигаемым у больных с трижды негативным метастатическим раком молочной железы при лечении с применением монотерапии гемцитабином/карбоплатином.
Конечные точки
Первичные конечные точки
- Уровень клинического ответа (CBR=CR+PR+SD≥6 месяцев).
- Оценка безопасности и переносимости ВА.
Вторичные конечные точки
- Определение суммарного показателя отвечаемости (ORR).
- Оценка выживаемости без признаков прогрессии заболевания (PFS).
Эксплоративные конечные точки
- Характеристика экспрессии гена PARP и фармакогеномики на основе архивированных образцов опухолевых тканей.
- Оценка состояния генов BRCA.
- Анализ ответной реакции организма у пациентов с раком и известными формами мутаций BRCA в сравнении с пациентами, не имеющими подобных мутаций.
- Классификация ткани молочной железы как базальной, либо люминальной.
Доза/Схема
Пациенты рандомизированы в соотношении 1:1 и отнесены либо к:
2
Группе исследования 1: гемцитабин (1000 мг/м; внутривенное вливание в течение 30 минут) и карбоплатин (расчет дозы по методу AUC 2; внутривенное вливание в течение 60 минут) в 1 и 8 дни 21-дневного цикла.
2
Группе исследования 2: гемцитабин (1000 мг/м; внутривенное вливание в течение 30 минут) +карбоплатин (расчет дозы по методу AUC 2; внутривенное вливание в течение 60 минут) в 1 и 8 дни +ВА (5,6 мг/кг, внутривенное вливание в течение 1 часа) в 1, 4, 8 и 11 дни 21-дневного цикла.
Циклы введения доз повторяются с периодичностью в 21 день.
У пациентов, рандомизированных в группу 2, исследование будет прервано в случае прогрессии заболевания. Пациентам, рандомизированным в группу 1, в случае прогрессии заболевания может назначаться перекрестное лечение ВА в сочетании с гемцитабином/карбоплатином.
Основные критерии отбора
- Метастатический рак молочной железы (Стадия IV) с измеримыми параметрами заболевания, оцениваемыми согласно критериям RECIST.
- 0-2 предшествующих курса химиотерапии в связи с наличием метастазирования. Разрешается наличие в анамнезе адъювантной/неоадъювантной терапии.
- Гистологически подтвержденное наличие (либо первичного, либо метастатического очага) рака молочной железы, который является ER-отрицательным, PR-отрицательным и не характеризуется повышенной экспрессией HER-2, оцениваемой при помощи иммуногистохимии, (0, 1), либо амплификацией гена HER-2, оцениваемой методом FISH.
- Общее состояние здоровья согласно критериям ECOG - 0-1.
Популяция исследования
К настоящему моменту в исследование включено 85 пациентов в 23 исследовательских центрах (таблица 5).
ТАБЛИЦА 5
Демографические данные пациентов исследования 2 фазы
Группа А: гемцитабин/карбоплатин
Группа В: BSI-201 + гемцитабин/карбоплатин
Число случаев
43
42
Возраст (лет), средний (ранг)
51 (32-80)
54 (35-68)
Пол
Мужчины
0 (0%)
0 (0%)
Женщины
43 (100%)
42 (100%)
Раса
Европеоидная
29 (07%)
32 (70%)
Негроидная
8 (19%)
6 (14%)
Неизвестна
6 (14%)
4 (10%)
# предшествующих терапевтических курсов лечения
Неоадъюванты
5
4
0
5
3
1
18
13
2
7
13
3
1
0
* на основании имеющихся данных
Профилирование экспрессии ER, PR и HER2
Включение в настоящее исследование основано на традиционном гистогическом тестировании, проводимом в исследовательском центре. Срезы исходного материала биопсии, полученные от пациентов, участвующих в исследовании, и заключенные в парафин, характеризуют в отношении состояния генов, являющихся маркерами трижды негативного рака молочной железы, включая ER, PR, HER2, а также PARP1, Тор2А и Ki-67. Метод исследования основан на оптимизированной мультиплексной количественной ОТ-ПЦР, используемой для количественной оценки экспрессии генов в образцах тканей, фиксированных формалином и заключенных в парафин (ФФЗП). Образцы, получаемые в ходе данного клинического исследования, сравнивают с независимо полученными контрольными образцами, представляющими собой ФФЗП образцы нормальных и опухолевых тканей. В дополнение ряд образцов получен от пациентов с подтвержденным повышением уровня экспрессии HER2.
Образцы тканей
Образцы тканей получают в ходе стандартного оперативного вмешательства и быстро замораживают в течение 30 минут с момента резекции. Патологическую оценку и подтверждение диагноза осуществляют в процессе анализа образцов. Для подтверждения и классификации диагностической категории и оценки клеточного состава опухоли используют окрашенные гематоксилином и эозином (Г-Э) предметные стекла с полученными из соседней ткани образцами. Экспрессию ER, PR и HER2 определяют с использованием иммуногистохимии и флуоресцентной гибридизации in situ. Эти результаты, в совокупности с сопутствующими патологоанатомическими и клиническими данными, заносят в перечень образцов и вносят в базы данных учета (базы данных Ascenta, BioExpress; GeneLogic, Inc., Gaithersburg, MD).
Выделение РНК и оценка экспрессии
Выделение и гибридизацию РНК осуществляют по методу, описанному Hansel et al. Качество результатов анализа генной экспрессии оценивают при помощи приложений для высокоэффективного анализа экспрессии (Ascenta, Bioexpress Gene Logic, Gaithersburg MD и Affymetrix, Santa Clara, CA), позволяющих выполнить оценку данных по множественным объективным критериям, включая соотношение уровней экспрессии гена 5'/3' глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), соотношение сигнал/помеха, оценку фоновой экспрессии, а также другие параметры. Анализ GeneChip выполняют с использованием программных пакетов Affymetrix Microarray Analysis Suite версия 5.0, Data Mining Tool 2.0, а также программного обеспечения для анализа базы данных генной экспрессии по методу микрочипов (Affymetrix, Santa Clara, CA). Все гены, оцениваемые при помощи GeneChip, глобально нормализуют и соизмеряют с интенсивностью сигнала, равной 100.
Анализ данных на микрочипах
Образцы патологически неизмененных тканей используют для определения фоновой экспрессии мРНК PARP1. Высчитывают средние арифметические значения и верхние пределы доверительного интервала в 90%, 95%, 99%, и 99,9% (ВПДИ) для индивидуального прогнозируемого значения. Поскольку авторы оценивают вероятность, с которой индивидуальные анализируемые образцы вне нормального множества оказываются в пределах фонового распределения, для анализа ожидаемого диапазона будущих индивидуальных измерений используют прогнозируемый, а не доверительный интервал для среднего арифметического значения. Прогнозируемый интервал определяется формулой , где  - это среднее арифметическое значение нормального образца ткани молочной железы, S - это среднеквадратическое отклонение, n - размер образца и А - это 100(1-(р/2))-й критерий t-распределения Стьюдента со степенью свободы n-1.
Образцы патологически неизмененных тканей используют для определения фоновой экспрессии PARP1. Образцы сгруппированы в различные подкатегории в соответствии с характеристиками, включающими стадию развития опухоли, курит ли больной, статус СА125 или возраст. Каждый образец опухоли анализируют в соответствии с 90%, 95%, 99% или 99,9% ВПДИ. Анализ выполняют с использованием программного обеспечения SAS v8.2 для Windows (www.sas.com).
Корреляции Пирсона высчитывают для наборов из 11 проб в сравнении с PARP1. Корреляции основаны на полном наборе из 194 образцов. Корреляция продукт-момент Пирсона определяется формулой
где Ошибка! Объекты нельзя создать из кодов поля редактирования - среднее значение набора зондов PARP1 и Ошибка! Объекты нельзя создать из кодов поля редактирования - среднее значение набора зондов, для которого определяется коррелятивное значение PARP1. Статистическая значимость определяется по формуле , где r - коэффициент корреляции и n - число образцов. Предполагается, что результирующее значение характеризуется t-распределением со степенями свободы n-2.
Мультиплексная полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием обратной транскриптазы (ОТ-ПЦР):
Мультиплексную ОТ-ПЦР осуществляют с использованием 25 нг тотальной РНК, выделенной из каждого образца, по методу, описанному ранее (Khan et al., 2007). Мультиплексный анализ, использованный в этом исследовании, предназначается для детекции РНК в образцах тканей, фиксированных формалином и заключенных в парафин (ФФЗП) либо замороженных. Концентрацию РНК определяют при помощи набора RiboGreen RNA Quantitation Kit (Invitrogen) с использованием Wallac Victo r2 1420 Multilabel Counter. Образец РНК из каждого образца ткани анализируют при помощи биоанализатора Agilent Bioanalyzer в соответствии с инструкциями к прибору Agilent 2100 Bioanalyzer. Реакции обратного транскрибирования (ОТ) выполняют, как описано ранее, при помощи амплификатора Applied Biosystems 9700. Реакции ПЦР с каждым образцом кДНК выполняют с использованием термоциклера Applied Biosyskems 9700. В реакционные смеси для ОТ добавляют РНК канамицина с целью мониторирования эффективности реакций ОТ и ПЦР. Используемые контроли включали положительный РНК-контроль, контроль без добавления матричной РНК и контроль без добавления обратной транскриптазы. Реакции ПЦР анализируют при помощи капиллярного электрофореза. Флюоресцентно меченые продукты ПЦР разбавляют, смешивают со стандартом для оценки размера молекул ДНК (Genome Lab size standard-400, поставляется компанией Beckman-Coulter), денатурируют и анализируют при помощи CEQ 8800 Genetic Analysis System. Экспрессию каждого из анализируемых генов для каждого из образцов оценивают относительно экспрессии гена β-глюкоронидазы (GUSB) в той же самой реакционной смеси и выражают в виде среднего среднеквадратического отклонения 3 независимых измерений.
Фиг.4 иллюстрирует результаты, полученные для первых 50 пациентов, принявших участие в исследовании. В то время как классификация пациентов в качестве «трижды негативных» основывается на результатах анализа ER, PR и HER2 с использованием обычной клинической методологии, эти результаты показывают, что экспрессия генов ER и PR снижена в сравнении с нормальными тканями. Экспрессия HER2 сравнима с нормальными тканями и в отличие от пациентов, которые имеют повышенную экспрессию гена PARP1, значительно увеличена, что подтверждает полученные нами ранее данные.
Предварительные результаты
Безопасность
Данные снижения доз, представленные либо в виде доли пациентов (%), у которых отмечалось снижение дозы, либо в виде общего числа случаев снижения доз, оказываются сходными в обеих группах исследования (таблица 6).
ТАБЛИЦА 6
Снижения доз
Группа А: гемцитабин/карбоплатин
Группа В: BSI-201 + гемцитабин/карбоплатин
Пациенты со снижением дозы, n из N (%)
15/39 (38,5%)
11/39 (28,2%)
Общее количество снижений доз
20
19
Снижение доз гемцитабина/карбоплатина определяется алгоритмом в составе протокола исследования
В группе, где назначалась только химиотерапия, 15 из 39 пациентов (38,9%) имели снижения доз, а в группе, где назначалась комбинация ВА+химиотерапия, снижения доз происходили у 11 из 39 пациентов (28,2%). В целом, отмечалось 20 случаев снижения дозы в группе, где назначался только гемцитабин/карбоплатин, и 19 случаев группе, где назначалась комбинация ВА+гемцитабин/карбоплатин. С учетом того, что в группе В было назначено примерно в три раза большее количество доз в сравнении с группой А, безопасность добавления ВА к гемцитабину/карбоплатину получает дополнительное подтверждение.
Анализ нежелательных явлений показывает, что обе группы исследования сравнимы (показатель риска=1,0, без поправки на общую продолжительность участия в исследовании; таблица 7).
ТАБЛИЦА 7
Нежелательные явления
Система Орган Класс
Группа А: гемцитабин/карбоплатин n=33
Группа В (гем/карб + BSI-201) n=23
G 1
G 2
G 3
G 4
Всего
G 1
G 2
G 3
G 4
Всего
Нарушения кровеносной и лимфатической систем
1
3
12
9
25
3
2
11
4
20
Нарушения сердечно-сосудистой системы
2
2
1
1
Нарушения ЛОР-органов (ухо и лабиринт внутреннего уха)
1
1
1
1
2
Нарушения эндокринной системы
0
1
1
2
Заболевания глаз
2
2
5
5
Нарушения желудочно-кишечного тракта
16
10
1
27
14
8
22
Осложнения общего характера и местные реакции
11
8
4
23
11
7
18
Нарушения печени
1
1
2
1
1
Нарушения иммунной системы
1
1
2
1
3
Инфекции и инвазии
8
6
14
8
5
13
Травмы, отравления и осложнения после процедуры
1
3
4
1
1
Исследования
3
3
1
7
4
1
2
7
Нарушения питания и метаболизма
10
2
2
14
4
1
5
Поражения мышц и соединительной ткани
9
8
2
19
6
1
1
8
Доброкачественные, злокачественные новообразования и опухоли неясной этиологии (включая кисты и полипы)
1
1
1
1
Расстройства нервной системы
5
6
3
14
8
5
13
Психиатрические расстройства
5
2
7
4
2
6
Нарушения почек и мочевыделительной системы
4
2
6
4
4
Расстройства репродуктивной системы и поражения молочных желез
2
2
1
1
Нарушения дыхательной системы, области грудной клетки и средостения
13
5
2
20
4
2
6
Поражения кожи и подкожных тканей
9
6
15
7
1
8
Хирургические и медицинские процедуры
1
1
2
2
Сосудистые нарушения
6
2
8
2
2
ОБЩЕЕ КОЛИЧЕСТВО
107
70
29
9
215
93
39
15
4
151
Показатель риска
1,0
Оценка эффективности
Представляется, что пациенты в группе А (гемцитабин/карбоплатин) демонстрируют более раннее начало прогрессии заболевания в сравнении с пациентами, рандомизированно включенными в группу В (гемцитабин/карбоплатин+ВА). Приблизительно у 50% пациентов в группе А прогрессия отмечается к концу 2 цикла в сравнении с менее чем 15% пациентов из группы В, у которых прогрессия заболевания отмечается в те же сроки.
Формальный статистический анализ выполнен с использованием имеющихся в наличии предварительных данных. Этот анализ показывает, что пациенты, получавшие ВА в комбинации с гемцитабином/карбоплатином, имеют значительно более продолжительную среднюю выживаемость без признаков прогрессии заболевания (PFS) в сравнении с пациентами, получавшими только гемцитабин/карбоплатин (211 дней против 67 дней; Р<,0001; фиг.5).
Предварительная оценка уровня клинического ответа (CBR) выполнена для пациентов, участвующих в исследовании, на 120 и 180 дни (CBR-120 и CBR-180 соответственно) и представлена в таблице 8.
ТАБЛИЦА 8
Предварительная оценка клинического эффекта
Показатель
Группа А: гемцитабин/карбоплатин
Группа В: BSI-201 + гемцитабин/карбоплатин
Р
Средняя PFS
67 дней
211 дней
<,0001
CBR-IBO<sup>a</sup>
5/20 (25%)
10/20 (50%)
0,1908
CBR-120<sup>b</sup>
6/20 (30%)
14/20 (70%)
0,0256
<sup>a</sup>SD (180 дней) + PR + CR, для первых 40 пациентов, включенных в исследование; <sup>b</sup>SD (120 дней)+PR+CR, для первых 40 пациентов, включенных в исследование. SD - стабилизация заболевания; PR - частичный ответ, включает подтвержденные и неподтвержденные ответы; CR - полный ответ.
Результаты демонстрируют тенденцию к увеличению CBR в группе, получающей комбинацию гемцитабин/карбоплатин+ВА.
Предварительные выводы исследования
Основываясь на представленных выше результатах 2 фазы исследования, включающего пациентов с трижды негативной формой рака молочной железы, можно сделать следующие выводы:
- Был проведен правильный отбор пациентов. Результаты профилирования генома первых 50 пациентов, проведенного с использованием как традиционной иммуногистохимии, так и профилирования экспрессии генов, подтверждают, что эти пациенты в действительности ER- и PR-отрицательны и у них нет повышенной экспрессии гена HER2.
- Популяционный состав в двух группах является сопоставимым.
- Демографическая информация показывает, что пациенты в обеих группах имеют сравнимый возраст и общее состояние здоровья.
- Количество предшествовавших курсов химиотерапии, назначаемой в связи с метастазированием, сравнимо в обеих группах. Данные, полученные от первых 69 пациентов, показывают отсутствие значимых различий между группами в отношении получаемого ранее лечения. Большее число пациентов в группе, получавшей ВА, имели в анамнезе 2 курса химиотерапии, что позволяло предполагать, что эти пациенты потенциально более рефракторными к химиотерапии, чем пациенты, которым назначались только гемцитабин/карбоплатин.
- Данные о снижении доз, представленные либо в виде доли пациентов (%), у которых отмечалось снижение дозы, либо в виде общего числа случаев снижения доз, оказываются сходными в обеих группах исследования. В группе, где назначалась лишь химиотерапия, 15 из 39 пациентов (38,9%) имели снижения доз, а в группе, где назначалась комбинация ВА + химиотерапия, снижения доз происходили у 11 из 39 пациентов (28,2%). В целом, отмечалось 20 случаев снижения дозы в группе, где назначался только гемцитабин/карбоплатин, и 19 случаев группе, где назначалась комбинация ВА + гемцитабин/карбоплатин.
Частота неблагоприятных явлений является сходной в обеих группах, что подтверждает вывод о том, что добавление ВА к гемцитабину/карбоплатину не потенцирует известные токсические эффекты химиотерапии и не оказывает дополнительного токсического действия на организм пациентов.
- Пациенты, получавшие ВА в комбинации с гемцитабином/карбоплатином, показывают значительный клинический ответ в сравнении с пациентами, получавшими только гемцитабин/карбоплатин, основываясь на данных предварительного анализа средней выживаемости без признаков прогрессии заболевания (211 дней против 67 дней; Р<,0001). Эти результаты представляют собой значительное улучшение показателя PFS в сравнении с результатами других испытаний с участием пациентов, страдающих трижды негативным раком молочной железы.
- Анализ уровня клинического ответа, основываясь на данных, полученных при участии первых 40 пациентов, демонстрирует тенденцию к его улучшению вследствие добавления ВА к гемцитабину/карбоплатину. Этот эффект, как ожидается, будет еще более выражен по мере дальнейшего расширения настоящего исследования.
Пример 8. Лечение рака молочной железы комбинацией паклитаксела, карбоплатина и ВА
Пациенты, страдающие трижды негативным метастатическим раком молочной железы, с документально подтвержденной прогрессией заболевания. Требуется гистологическое подтверждение исходной первичной опухоли.
Все пациенты будут иметь заболевание с измеримыми параметрами. Заболеванием с измеримыми параметрами считается заболевание при наличии хотя бы одного очага, который может быть аккуратно измерен по меньшей мере в одном направлении (регистрируется наибольший размер). Каждый очаг должен быть размером ≥20 мм, если измеряется при помощи обычных методов, включая пальпацию, обычную рентгенографию, КТ и МРТ, или ≥10 мм при исследовании с помощью спиральной КТ.
Пациенты будут иметь хотя бы один очаг-«мишень», который будет использоваться для анализа ответа на данную схему лечения в соответствии с критериями RECIST (Раздел 8.1). Опухоли в пределах области, подвергавшейся ранее облучению, будут рассматриваться в качестве очагов, не являющихся «мишенями», если только они не являются результатом документально подтвержденной прогрессии или не будут представлены результаты биопсии, подтверждающей существование очага по меньшей мере в течение 90 дней с момента завершения радиотерапии. В дополнение пациенты должны восстановиться после недавно проведенного хирургического вмешательства, радиотерапии или иного лечения и не должны иметь активной инфекции, требующей назначения антибиотиков.
Любая гормональная противоопухолевая терапия должна быть остановлена по меньшей мере за одну неделю до регистрации. Разрешается продолжать гормональную заместительную терапию.
Пациент должен иметь удовлетворительную:
- функцию костного мозга: количество тромбоцитов больше или равно 100000/мкл и абсолютное количество нейтрофилов больше или равно 1500/мкл, что эквивалентно 1 степени по классификации СТСАЕ v3.0;
- функцию почек: уровень креатинина меньше или равен 1,5× верхний предел нормы (ВПН) учреждения, что эквивалентно 1 степени по классификации СТСАЕ v3.0;
- функцию печени: уровень билирубина меньше или равен 1,5× ВПН (1 степень СТСАЕ v3.0). Уровень сывороточной глутаматпируваттрансаминазы и щелочной фосфатазы меньше или равен 2,5× ВПН (1 степень СТСАЕ v3.0);
- неврологические функции: нейропатия (сенсорная и моторная) менее или соответствует 1 степени СТСАЕ v3.0.
- Пациенты детородного возраста должны иметь отрицательные результаты теста на беременность, выполненного с использованием сыворотки крови, до начала исследования, а также применять эффективные формы контрацепции в ходе его.
Пациенты, не подходящие для участия в исследовании:
Пациенты, которые предварительно получали цитотоксическую химиотерапию для лечения рака молочной железы.
Пациенты, имевшие другие инвазивные формы злокачественных новообразований, за исключением немеланомного рака кожи и ряда других специфических злокачественных опухолей, перечисленных в разделах 3.23 и 3.24, исключаются из исследования, если существует доказательство наличия такого злокачественного образования в последние пять лет. Пациенты также исключаются из исследования, если их предшествовавшее лечение является противопоказанием для применения настоящего терапевтического протокола.
Пациенты, которые ранее получали радиотерапию в какой-либо части брюшной полости или малого таза по причине, НЕ СВЯЗАННОЙ с лечением рака молочной железы, в течение последних пяти лет, исключаются из состава участников исследования. Разрешается наличие предшествующей исследованию радиотерапии по поводу локализованного рака молочной железы, головы и шеи, либо кожи, при условии, что такое лечение было завершено более чем за три года до регистрации, и пациент по-прежнему не испытывает рецидивов или метастазов.
Пациенты МОГУТ иметь в анамнезе адъювантную химиотерапию по поводу локализованного рака молочной железы при условии, что такое лечение было завершено более чем за три года до регистрации и пациент по-прежнему не испытывает рецидивов или метастазов.
Метастазы в головной мозг, проявляющиеся симптоматически или нелеченные, требующие одновременного лечения, включая, среди прочего, хирургическое вмешательство, радиотерапию и кортикостероиды.
Инфаркт миокарда (ИМ) в течение 6 месяцев, предшествующих началу настоящего исследования, нестабильная стенокардия, застойная сердечная недостаточность (ЗСН) с функциональным классом больше чем класс II в соответствии с классификацией Нью-Йоркской Ассоциации кардиологов (NYHA), либо наличие неконтролируемой гипертензии.
Наличие эпилептических припадков в анамнезе или прием противоэпилептических препаратов в настоящее время.
Тестируемые методы лечения

Карбоплатин (Параплатин, NSC # 241240)
Лекарственная форма: карбоплатин выпускается в виде стерильного лиофилизированного порошка, упакованного во флаконы с одноразовой дозой по 50 мг, 150 мг и 450 мг карбоплатина для внутривенного вливания. Каждый флакон содержит карбоплатин и маннитол в равных весовых соотношениях.
Приготовление раствора: немедленно перед использованием необходимо растворить содержимое каждого флакона либо в стерильной воде для инъекций, USP (Фармакопея США), 5% растворе глюкозы в воде либо 0,9% растворе хлорида натрия для инъекций, USP, в соответствии со следующей схемой:
Доза во флаконе
Растворитель, объем
50 мг
5 мл
150 мг
15 мл
450 мг
45 мл
В результате разведения получается раствор карбоплатина с концентрацией 10 мг/мл.
Примечание. Алюминий реагирует с карбоплатином, вызывая образование осадка и потерю активности. Поэтому запрещается использование для приготовления раствора карбоплатина или его введения игл или наборов для внутривенного вливания, содержащих алюминиевые части, которые могут приходить в контакт с препаратом.
Хранение: запечатанные флаконы карбоплатина стабильны на протяжении всего срока годности, указанного на упаковке, если они хранятся в условиях контролируемой комнатной температуры и защищены от света.
Стабильность препарата: растворы карбоплатина, приготовленные в соответствии с инструкцией, стабильны в течение 8 часов при комнатной температуре. Поскольку препарат не содержит никаких консервантов, обладающих антибактериальным действием, рекомендуется выбрасывать растворы карбоплатина через 8 часов после разведения.
Поставщик: серийно выпускается компанией Bristol-Myers Squibb.

Паклитаксел (Таксол, NSC #673089)
Лекарственная форма: паклитаксел представляет собой плохо растворимый растительный продукт, выделенный из Taxus baccata. Для улучшения его растворимости необходимо использовать смешанную систему растворителей с последующим разведением либо в 0,9% растворе хлорида натрия, либо в 5% растворе декстрозы в воде.
Паклитаксел выпускается в виде стерильного концентрата для приготовления раствора во флаконах по 5 мл в концентрации 6 мг/мл (30 мг во флаконе) в смеси полиоксиэтилированного касторового масла (Cremophor EL) и обезвоженного этилового спирта, USP, в равных соотношениях. Содержимое флакона необходимо развести сразу же перед началом клинического использования. Препарат также выпускается во флаконах по 100 и 300 мг.
Приготовление раствора: паклитаксел в соответствующей дозе разводится в 500-1000 мл 0,9% раствора хлорида натрия, USP, или 5% растворе декстрозы в воде, USP (D5W) (достаточно 500 мл, если паклитаксел является единственным агентом). Для приготовления раствора паклитаксела необходимо использовать стеклянные или сделанные из полиолефина контейнеры в связи с тем, что при использовании мешков и трубок для внутривенного вливания, произведенных из поливинилхлорида (ПВХ), происходит выделение пластификатора диэтилгексилфталата (ДЭГФ) под действием растворителя Cremophor, в котором растворен паклитаксел.
Примечание. После приготовления раствора паклитаксела в нем наблюдается образование некоторого количества волокон (в допустимых пределах, устанавливаемых Тестом для определения частиц в больших объемах растворов для парентерального введения, согласно Фармакопее США). В связи с этим необходимо осуществлять фильтрацию раствора паклитаксела в процессе его введения. Такую фильтрацию необходимо обеспечивать за счет использования специальных инфузионных систем, снабженных встроенными гидрофильными микропористыми фильтрами с размером пор не больше чем 0,22 мкм (например, IVEX-II, IVEX-HP или подобные системы), располагающимися на пути раствора в системе для внутривенного введения дистально к инфузионному насосу. Хотя образование частиц не означает снижение активности препарата, растворы, в которых происходит избыточное образование частиц, не использовать.
Хранение: запечатанный флакон может храниться в первоначальной упаковке при температуре 20-25°С (36-77°F). Замораживание или охлаждение не оказывает никакого неблагоприятного воздействия на стабильность препарата.
Стабильность препарата: все приготовленные растворы паклитаксела являются мутноватыми, причем мутность раствора прямо пропорциональна концентрации лекарственного препарата и времени, прошедшему с момента приготовления раствора, хотя если растворы паклитаксела приготовлены в соответствии с вышеупомянутыми инструкциями (0,3-1,2 мг/мл), они сохраняют физическую и химическую стабильность в течение 27 часов при комнатной температуре (приблизительно 25°С) и освещении помещения.
Поставщик: серийно выпускается компанией Bristol-Myers Squibb.
Способ введения: Паклитаксел в соответствующей дозе и разведении назначается в форме непрерывного внутривенного вливания продолжительностью 3 часа. Введение паклитаксела осуществляется при помощи инфузионного насоса с использованием компонентов (трубок и соединителей), не содержащих ПВХ, таких как наборы для внутривенного вливания (изготовленные из полиэтилена или полиолефина), используемые для парентеральных вливаний нитроглицерина. Запрещается введение любых других препаратов с использованием системы, через которую в данный момент осуществляется введение паклитаксела. Смотрите раздел 5.2.
ВА (4-иод-3-нитробензамид)
ВА будет производиться и упаковываться от имени компании BiPar Sciences и распространяться в соответствии с согласованными с BiPar процедурами распространения лекарств для клинических исследований. ВА будет предоставляться в форме жидкого стерильного продукта, упакованного во флаконы однократного применения объемом 10 мл. Лекарственная форма ВА представляет собой раствор с концентрацией активного ингредиента 10 мг/мл, растворенного в 25% гидроксипропилбетациклодекстрина/10 мМ фосфатного буфера с рН 7,4. Каждый флакон содержит не менее 9,0 мл экстрагируемого объема. Информация, представленная на этикетках исследуемого препарата, будет отвечать требованиям нормативов Международной конференции по гармонизации, а также соответствовать требованиям Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США. Большие партии флаконов ВА будут транспортироваться в коробках по 10 флаконов, помеченных наклейкой, содержащей следующую информацию: предупреждение, по принятой в США форме для экспериментальных лекарственных препаратов, номер клинического исследования, наименование продукта, концентрация, условия хранения, дата повторного тестирования и имя спонсора данного исследования.
Приготовление раствора: ВА будет приготовлен так, как описано ниже, и введен внутривенно в течение одного часа:
рассчитайте количество (4 мг/кг) ВА, требуемое в качестве назначаемой дозы, пользуясь данными исходного веса пациента, умноженными на уровень дозы. Например:
исходный вес пациента = 70 кг,
доза = 4 мг/кг,
требуемая доза = (4 мг/кг × 70 кг) = 280 мг ВА.
Разделите требуемую дозу ВА на концентрацию ВА во флаконе (10 мг/мл), для того чтобы определить выраженное в мл количество ВА, требуемое для введения. Например:
280 мг/10 мг/мл = 28 мл.
Рассчитайте количество флаконов ВА объемом 10 мл, необходимых для получения требуемого объема. (В данном примере потребуется 3 флакона.) В случае необходимости воспользуйтесь дополнительным флаконом для получения желаемого объема ВА.
При помощи шприца извлеките соответствующий объем лекарственного продукта ВА из флакона и отложите в сторону на время, пока идет приготовление инфузионного контейнера.
Рекомендуется, чтобы общий объем раствора 250 мл помещался в один контейнер и вводился в течение одного часа. Используйте для внутривенного вливания 0,9% раствор хлорида натрия или 5% раствор декстрозы в воде. Если контейнер для внутривенного вливания содержит больший чем 250 мл объем раствора, удалите избыток раствора, а также дополнительный объем, равный объему добавляемого лекарственного препарата. Введите при помощи шприца рассчитанный объем препарата ВА внутрь контейнера и обеспечьте равномерное перемешивание. Присоедините трубки для внутривенного вливания и заполните их полученным раствором. Примечание. Разрешается использовать пустой контейнер для внутривенного введения, в который можно вначале ввести рассчитанный объем препарата ВА, а затем добавить 0,9% раствор хлорида натрия или 5% раствор декстрозы в воде до общего объема 250 мл. Такой подход, вероятно, будет более удобен для введения объемов препарата ВА, больших чем 50 мл.
Хранение: флаконы с препаратом ВА должны храниться при температуре 2-8°С и быть защищены от воздействия света. Храните флаконы в оригинальной упаковке в условиях хранилища с контролируемым поддержанием температуры в пределах 2-8°С. В случае необходимости ВА может храниться при 25°С в течение не более 24 часов. Если обнаруживается, что ВА не хранился в указанных условиях, немедленно свяжитесь с компанией BiPar. Без разрешения компании BiPar ни в коем случае не используйте флаконы, если они не хранились в рекомендованных условиях хранения.
Стабильность препарата: введение препарата ВА необходимо осуществлять не позднее чем через 8 часов после приготовления раствора. После приготовления раствор должен оставаться при комнатной температуре до момента введения препарата пациенту.
Поставщик: BiPar Sciences Inc.
ПЛАН ЛЕЧЕНИЯ
2
Паклитаксел по 175 мг/м в форме трехчасового внутривенного вливания, затем карбоплатин в дозе AUC=6,0 в течение 30 минут в 1 день, с повторением через 21 день, и ВА в дозе 4 мг/кг в форме одночасового внутривенного вливания дважды в неделю начиная с 1 дня (введение очередных доз ВА должно быть разделено по меньшей мере двухдневными интервалами), до тех пор пока прогрессия заболевания или возникновение нежелательных эффектов не ограничит дальнейшее продолжение терапии. Такой трехнедельный период рассматривается как один цикл лечения. Число циклов лечение после достижения полного клинического ответа определяется лечащим врачом. У пациентов, которые не соответствуют критериям прогрессии заболевания (в случае частичного ответа или стабильного течения болезни), лечение в рамках данного исследования должно быть продолжено до тех пор, пока возникновение побочных токсических эффектов не ограничит его дальнейшее продолжение.
Дозирование карбоплатина: Расчет дозы будет проводиться, чтобы достигнуть целевую AUC (площади под кривой фармакокинетики) «концентрация-время» в соответствии с формулой Кальверта с использованием расчетных данных уровня клубочковой фильтрации (УКФ), полученных по формуле Джеллиффа. Начальная доза составляет AUC=6, вводится инфузионно в течение 30 минут.
Начальная доза карбоплатина должна рассчитываться с использованием УКФ. При отсутствии вновь возникшей почечной обструкции или нефротоксичности со степенью тяжести ≥2 степени согласно критериям CTCAE v3.0 (креатинин сыворотки >1,5× ВПН) доза карбоплатина для последующих циклов лечения не будет пересчитываться, но, как уже отмечено, ее можно будет менять при возникновении такой необходимости.
У пациентов с ненормально сниженным уровнем креатинина сыворотки (меньшим или равным 0,6 мг/дл), связанным с пониженным употреблением белковой пищи и (или) низкой мышечной массой тела, клиренс креатинина необходимо оценивать с использованием минимального значения, равного 0,6 мг/дл. При получении более подходящих фоновых значений этого показателя в течение 4 недель с момента начала лечения их также можно использовать для исходной оценки УКФ.
Формула Кальверта: доза карбоплатина (мг) = желаемая AUC × (УКФ + 25).
В применении к настоящему протоколу УКФ считается равным клиренсу креатинина. Клиренс креатинина (Ккр) оценивается по методу Джеллиффа с использованием следующей формулы: {98-[0,8(возраст - 20)]}Ккр=0,9×Скр, где Ккр - оцениваемый клиренс креатинина в мл/мин; возраст - возраст пациента в годах (от 20-80); Скр - креатинин сыворотки в мг/дл. При отсутствии вновь возникшей почечной обструкции или повышения креатинина сыворотки свыше 1,5× ВПН (2 степень согласно критериям CTCAE v3.0) доза карбоплатина для последующих циклов лечения не будет пересчитываться, но, как уже отмечено, ее можно будет менять при изменении гематологического критерия или по другим причинам.
Предлагаемый метод проведения химиотерапии: Настоящий курс химиотерапии можно назначать в амбулаторных условиях. Паклитаксел будет назначаться в форме трехчасового вливания, за которым последует 30-минутное введение карбоплатина и последующее введение ВА в течение часа. ВА будет назначаться внутривенно (в форме вливания в течение одного часа) дважды в неделю на протяжении всего периода исследования. Введение очередных доз ВА должно быть разделено по меньшей мере двухдневными интервалами (например, дозы могут вводиться в понедельник/четверг, понедельник/пятницу или вторник/пятницу). Рекомендуется прием антиэметиков в 1 день лечения паклитакселом и карбоплатином. Назначаемый курс приема антиэметиков должен основываться на коллегиально одобренных руководствах. Проведение профилактики антиэметиками не требуется, если назначается монотерапия ВА.
Подготовительный курс при приеме паклитаксела: В рамках настоящего исследования паклитаксел будет назначаться в форме трехчасовых вливаний. Для всех терапевтических циклов, включающих паклитаксел, в целях снижения риска возникновения аллергических реакций рекомендуется проведение подготовительного курса. Такой курс должен включать введение дексаметазона (либо внутривенно, либо перорально), антигистаминных препаратов, блокирующих H1 - (например, дифенгидрамина) и Н2-рецепторы (например, циметидина, ранитидина или фамотидина).
2
Максимальная площадь поверхности тела, используемая для расчетов доз, принимается равной 2,0 м.
При отсутствии тяжелых побочных эффектов пациент может продолжать прием испытуемых агентов неопределенно долгое время в зависимости от решения, принимаемого исследователем. Пациенты, достигающие полного клинического ответа, могут продолжать лечение дополнительными циклами в зависимости от решения, принимаемого их лечащим врачом.
КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ
Параметры ответа - критерии RECIST
Заболеванием с измеримыми параметрами считается заболевание при наличии хотя бы одного очага, который может быть аккуратно измерен по меньшей мере в одном направлении (регистрируется наибольший размер). Каждый очаг должен быть размером ≥20 мм, если измеряется при помощи обычных методов, включая пальпацию, обычную рентгенографию, КТ и МРТ, или ≥10 мм при исследовании с помощью спиральной КТ.
Исходная документация очагов поражения, являющихся или не являющихся мишенями
Все измеримые очаги, максимально до пяти очагов в каждом отдельно взятом органе и максимально до 10 очагов в целом, представляющие все вовлеченные органы, должны расцениваться как очаги-«мишени» и должны регистрироваться и измеряться в качестве стартовой точки исследования. Очаги-«мишени» должны отбираться на основании своих размеров (очаги с наибольшим размером) и возможности их аккуратного повторного измерения с использованием того же метода оценки (либо при использовании технологий визуализирования, либо клинически). Сумма наибольших размеров всех очагов-«мишеней» будет рассчитываться и расцениваться в качестве стартовой суммы размеров. Этот параметр будет использоваться в качестве контрольного для дальнейшей объективной оценки ответа опухоли по измеримым параметрам заболевания.
Все прочие очаги поражения должны идентифицироваться в качестве очагов, не являющихся «мишенями», и также должны быть зарегистрированы перед началом исследования в качестве стартового параметра. Хотя в дальнейшем не требуется проводить измерения этих очагов, необходимо будет отмечать их наличие или отсутствие в ходе последующего динамического наблюдения пациентов.
Все стартовые измерения, характеризующие стадию болезни, должны проводиться как можно ближе по времени к началу лечения и ни в коем случае не должны отстоять от него более чем на 4 недели.
Наилучший ответ
Для последующего динамического наблюдения требуется измерение наибольшего размера каждого очага. Изменение суммы этих размеров позволяет дать определенную оценку изменениям размеров опухоли, а значит, эффективности проводимой терапии. Оценка должна проводиться с применением тех же самых методов, которые использовались вначале при проведении стартовых измерений. Для каждого отдельного пациента необходимо указывать наилучший результат, достигнутый у него с момента включения его в исследование.
Полный ответ (CR) характеризуется исчезновением всех очагов, являющихся и не являющихся «мишенями», и отсутствием признаков появления новых очагов, что должно быть документально подтверждено результатами двух осмотров с интервалом по меньшей мере в 4 недели.
Частичный ответ (PR) характеризуется по меньшей мере 30% уменьшением суммы наибольших размеров очагов-«мишеней» в сравнении со стартовой суммой наибольших размеров. Не должно отмечаться никакой отчетливой прогрессии очагов, не являющихся «мишенями», и появления новых очагов. Требуется документальное подтверждение результатами двух осмотров с интервалом по меньшей мере в 4 недели. В случае, когда ЕДИНСТВЕННЫМ очагом-«мишенью» является одиночная масса, располагающаяся в полости малого таза, измеряемая методами физикального обследования и не поддающаяся измерению рентгенографически, требуется 50% уменьшение ее наибольшего размера.
Прогрессирующее течение болезни (PD) характеризуется по меньшей мере 20% увеличением суммы наибольших размеров очагов -«мишеней» в сравнении с наименьшей суммой наибольших размеров либо появлением новых очагов в течение 8 недель с момента начала исследования. Очевидная прогрессия существующих очагов, не являющихся «мишенями», исключая плевральные выпоты, не имеющие цитологического подтверждения опухолевого происхождения, может, если они увеличиваются в течение 8 недель с момента начала исследования и если это отражает мнение лечащего врача, считаться признаком прогрессии заболевания (в этом случае должно даваться соответствующее обоснование). В случае, когда ЕДИНСТВЕННЫМ очагом-«мишенью» является одиночная масса, располагающаяся в полости малого таза, измеряемая методами физикального обследования и не поддающаяся измерению рентгенографически, требуется 50% увеличение ее наибольшего размера.
Симптоматическое ухудшение определяется как ухудшение общего состояния здоровья пациента, связанное с основным заболеванием и требующее изменений в характере проводимой терапии, без наличия объективных признаков прогрессии болезни.
Стабильное течение болезни определяется в случае любого состояния, не соответствующего вышеуказанным критериям.
Не поддающийся оценке ответ определяется как состояние, не имевшее повторной оценки после начала клинического исследования по причинам, не имеющим отношения симптомам или признакам заболевания.
Прогрессия (в случае исследования заболевания с измеримыми параметрами) определяется ЛЮБЫМ из следующих условий:
по меньшей мере 20% увеличение суммы наибольших размеров очагов-«мишеней» в сравнении с наименьшей суммой наибольших размеров, зарегистрированной с момента начала исследования; либо
в случае, когда ЕДИНСТВЕННЫМ очагом-«мишенью» является одиночная масса, располагающаяся в полости малого таза, измеряемая методами физикального обследования и не поддающаяся измерению рентгенографически, требуется 50% увеличение ее наибольшего размера в сравнении с наименьшей суммой наибольших размеров, зарегистрированной с момента начала исследования;
появление одного или нескольких новых очагов;
смерть вследствие болезни при отсутствии полученных ранее объективных признаков ее прогрессии;
общее ухудшение, определяемое как связанное с основным заболеванием и требующее изменений в характере проводимой терапии, без наличия объективных признаков прогрессии болезни;
очевидная прогрессия существующих очагов, не являющихся «мишенями», исключая плевральные выпоты, не имеющие цитологического подтверждения опухолевого происхождения, согласно мнению лечащего врача (в этом случае должно даваться соответствующее обоснование).
Рецидив (в случае исследования заболевания с неизмеримыми параметрами) определяется как возрастающие клинические, радиологические или гистологические признаки заболевания, отмечаемые с момента начала исследования.
Выживаемость представляет собой продолжительность жизни от момента начала исследования до момента смерти пациента либо даты последнего с ним контакта.
Выживаемость без признаков прогрессии заболевания (в случае исследования заболевания с измеримыми параметрами) - это период от момента начала исследования до начала прогрессии заболевания, момента смерти пациента либо даты последнего с ним контакта.
Безрецидивная выживаемость (в случае исследования заболевания с неизмеримыми параметрами) - это период от момента начала исследования до начала рецидива заболевания, момента смерти пациента либо даты последнего с ним контакта.
Субъективные параметры, включая общее состояние здоровья, специфические симптомы и побочные эффекты, оцениваются в соответствии с критериями CTCAE v3.0.
ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Пациенты будут получать лечение до тех пор, пока его дальнейшему продолжению не помешают прогрессия заболевания или крайне выраженные побочные токсические эффекты. Пациент имеет право в любое время отказаться от продолжения экспериментального лечения. У пациентов с полным клиническим ответом на проводимую терапию лечение будет продолжено с назначением дополнительного числа циклов, в зависимости от решения лечащего врача. У пациентов с частичным ответом или стабильным течением болезни лечение должно продолжаться, если только дальнейшей терапии не мешают крайне выраженные побочные токсические эффекты.
Все пациенты будут получать лечение (с заполнением всех требуемых регистрационных форм) до начала прогрессии заболевания или выхода из исследования. За пациентами затем будет установлено динамическое наблюдение (с физикальным обследованием и заполнением историй болезни) каждые три месяца в течение первых двух лет и затем каждые шесть месяцев в течение следующих трех лет. Будет осуществляться мониторинг пациентов на предмет отсроченных токсических нежелательных эффектов и выживаемости в течение этого пятилетнего периода с подачей Q форм в Центр статистики и обработки данных Группы гинекологической онкологии (GOG Statistical and Data Center), если только пациенты не отзывают свое согласие.
Пример 9. Комбинация 4-иод-3-нитробензамида (ВА) с гамма-облучением
5
4
Клетки трижды негативного рака молочной железы MDA-MB-468 получают из коллекции клеточных культур АТСС и культивируют в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки плода коровы. Клетки помещают в количестве 10 клеток в культуральную чашку Р100 или в количестве 10 клеток в культуральную чашку Р60 в присутствии различных концентраций соединений или ДМСО в качестве контроля. После обработки количество прилипших клеток оценивают с использованием счетчика клеток Coulter и при помощи окрашивания 1% раствором метиленового синего. Метиленовый синий растворяют в 50%-50% смеси метанола и воды. Клетки помещают в 24- или 96-луночные планшеты для культивирования и подвергают желаемой обработке, после чего культуральную среду удаляют, клетки промывают физиологическим раствором с фосфатным буфером, фиксируют метанолом в течение 5-10 минут, метанол удаляют и дают планшетам полностью высохнуть. К клеткам добавляют метиленовый синий, и планшеты инкубируют в течение 5 минут. Раствор красителя удаляют, планшеты промывают дистиллированной водой до тех пор, пока она не перестает окрашиваться в синий цвет. Для того чтобы экстрагировать метиленовый синий из клеток, после полного высыхания планшетов в каждую из лунок добавляется небольшое количество 1 н. HCl. Оптическую плотность растворов определяют при 600 нм, после чего количество клеток рассчитывают с помощью калибровочной кривой.
Для каждого отдельного эксперимента соединения ВА растворяют в ДМСО непосредственно в виде сухого порошка для получения маточных растворов концентрацией 10 мМ. Контрольные эксперименты выполняют с применением равных объемов/концентраций растворителя (ДМСО); в этих контролях клетки не показывают изменений роста или цикла деления.
Анализ исключения PI, анализ клеточного цикла, исследование по методу TUNEL и анализ окрашивания клеток BrdU выполняют, как указано выше в примере 2.
Клетки рака MDA-MB-468 подвергают воздействию гамма-облучения в дозе 3 Гр в присутствии 100 мкМ ВА или без него. Как показано на фиг.6, ВА стимулирует остановку клеточного цикла в фазах S- и G2/M и усиливает антипролиферативный эффект гамма-облучения на клетки трижды негативного рака молочной железы MDA-MB-468.
Несмотря на то что здесь были показаны и описаны предпочтительные осуществления настоящего изобретения, для специалистов будет являться очевидным, что эти варианты приведены лишь с иллюстративными целями. Квалифицированные специалисты найдут многочисленные вариации, изменения и замены без какого-либо отклонения от сути изобретения. Необходимо понимать, что различные альтернативные варианты осуществлении описанного здесь изобретения могут применяться в ходе его практического использования. Подразумевается, что нижеследующая формула определяет суть и содержание изобретения и что способы и структуры в рамках этой формулы, а также их эквиваленты будут таким образом защищены.