Идентификация породной принадлежности кур на основе микросателлитного анализа

УДК 636.5.082.12

идентификация породной принадлежности кур на основе микросателлитного анализа

И.П. НОВГОРОДОВА1, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Е.А. ГЛАДЫРЬ1, кандидат биологических наук, руководитель лаборатории

В.И. ФИСИНИН2, академик РАН, директор Н.А. ЗИНОВЬЕВА1, академик РАН, директор Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства имени академика Л.К. Эрнста, пос. Ду-бровицы, д.60, Подольский р-н, Московская обл., 142132, Российская Федерация

2Всероссийский научно-исследовательский и техно -логический институт птицеводства, ул. Птицеградская, 10, Сергиев-Посад, Московская обл., 141311, Российская Федерация

Резюме. Проведена сравнительная оценка точности определения популяционной (породной) принадлежности 14-и пород кур мясо-яичного направления продуктивности (n=420) c использо-ванием различного числа микросателлитных локусов. Изучали эффективность применения 2 тест-систем, каждая из которых включала восемь маркеров - GAL-1 (MCW0111, MCW0067, LEI0094, MCW0123, MCW0081, MCW0069, MCW0104 и MCW0183) и GAL-2 (MCW0295, ADL0112, MCW0037, MCW0034, ADL0268, MCW0222, MCW0014 и LEI0074). Исследуемые группы птиц были представлены следующими породами: ленинградская белая и ситцевая, московская белая, панциревская белая и черная, первомайская, полтавская глинистая, юрловская голосистая, котляровская, кучинская, род-айлан, суссекс, плимутрок полосатый и нью-гемпшир. Генотипирование с использованием мультилокусньк панелей проводили на генетическом анализаторе ABI 3130х1 («AppliedBiosystems»). Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программного обеспечения GenAlEx(ver.6.4.1.). Показатели среднего числа аллелей, числа информативных аллелей и другие в расчете на один локус при сравнении изучаемых тест-систем достоверно не отличались. Среднее число аллелей на локус (Na) в целом по популяциям при использовании 8-и и 16-и локусов составляло, соответственно, 6,64±0,24и6,16±0,17. Сравнительныйанализдвухисследуемых тест-систем позволил выявить их высокую специфичность. Среднее значение вероятности идентификационной принадлежности особей на основании 16-и маркеров в зависимости от популяции составило 96,0%, в то время как при использовании 8-и маркеров - 89,0%. В некоторых породах отнесение особи к собственной популяции на основании микросателлитов при использовании панелей GAL-1 и GAL-2достигало 100%. Наиболее предпочтительно для определения породной принадлежности кур использование тест-системы, включающей 16 локусов микросателлитов.

Ключевые слова: микросателлитный анализ, мясо-яичные по -роды кур, аллели, полиморфизм, гетерозиготность. Для цитирования: Идентификация породной принадлежности кур на основе микросателлитного анализа/И.П. Новгородова, Е.А. Гладырь, В.И. Фисинин, Н.А. Зиновьева //Достижения науки и техники АПК. 2015. Т.29. №11. С. 88-90.

Изучение аллелофонда кур различных пород с использованием микросателлитных маркеров сегодня актуально для птицеводства во всем мире. Современные молекулярно-генетические методы оценки генетической структуры популяций животных на уровне ДНК дают возможность использовать их при планировании селекционной работы [1, 2].

Использование микросателлитных маркеров позволяет получать молекулярно-генетическую информацию для детальной характеристики видов и пород животных [3, 4] и птиц [5, 6]. Это, в свою очередь, дает возможность сохранять генетический потенциал исчезающих видов.

Цель наших исследований заключалась в выявлении наиболее информативного количества мультилокусных маркеров для идентификации породной принадлежности кур мясо-яичных пород.

Условия, материалы и методы. Материалом для исследований служили образцы пера (пульпы) кур (n=420), разводимых в генофондном стаде ВНИТИП. Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики животных ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста на 14-и породах кур мясо-яичного направления: ленинградская белая (ЛЕН_Б) и ситцевая (ЛЕН_С), московская белая (МОС_Б), панциревская белая (ПАН_Б) и черная (ПАН_Ч), первомайская (ПЕРВ), полтавская глинистая (ПОЛТ_ГЛ), юрловская голосистая (ЮРЛ_Г), котляровская (КОТЛ), кучинская (КУЧ), род-айланд (РОД_А), суссекс (СУС), пли -мутрок полосатый (ПЛИМ_П) и нью-гемпшир (НЬЮ_Г).

Ранее разработанная мультилокусная система анализа микросателлитов (МС) GAL-1, включающая 8 локусов (MCW0111, MCW0067, LEI0094, MCW0123, MCW0081, MCW0069, MCW0104 и MCW0183) [6], была дополнена второй панелью GAL-2, также с 8 маркерами (MCW0295, ADL0112, MCW0037, MCW0034, ADL0268, MCW0222, MCW0014 и LEI0074).

Выделение ДНК проводили с использованием набора реагентов DiatomTM DNA Prep100 (Россия) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Анализ ДНК и постановку ПЦР осуществляли согласно методическим рекомендациям [7]. Микросателлитный профиль исследуемых популяций птиц определяли путем электро-форетического разделения фрагментов ДНК методом капиллярного электрофореза на приборе ABI 3130X1 («Applied Biosystems»). Идентификацию аллелей исследуемых микросателлитных маркеров проводили с помощью программного обеспечения GeneMapper version 4.0. Статистическую обработку данных осуществляли по стандартным методикам [8] с использованием программ GenAtex (ver. 6.4.1) и PAST.

При проведении исследований использовали оборудование Центра коллективного пользования «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ВИЖ им. Л.К. Эрнста.

результаты и обсуждение. Мы идентифицировали 128 различных аллелей по 8-и локусам и 234 - по 16-и локусам микросателлитов. Число аллелей на локус при использовании как одной, так и двух тест-систем, варьировало в зависимости от породы от 3 (локус MCW0111 у ПАН_Б и КУЧ, локус MCW0067 у ПЛИМ_П) до 15 (локус MCW0183 у ЛЕН_Б).

Мультилокусная система GAL-1 позволила установить наличие трех и более аллелей в шести локусах, в то время как при использовании двух панелей (GAL-1 и GAL-2) выявлено наличие 14-и локусов с таким же количеством аллелей. Этот факт позволяет рассматривать изучаемые тест-системы как информативные для характеристики генетического разнообразия пород кур.

В зависимости от породы кур среднее число аллелей на локус (Na) при использовании тест-системы GAL-1 варьировало от 5,25±0,80 у МОС_Б и 5,25±1,12 у КУЧ до 8,75±0,92 у ПАН_Ч и 8,75±0,69 у РОД_А (рис. 1). В среднем в исследуемых породах кур величина показателя Na была равна 6,64±0,24. При использовании 16-и локусов наименьшее число Na составило 4,37±0,50 (у ПЛИМ_П),

Рис. 1. Генетические показатели информативности мультилокусных панелей у мясо-яичных пород кур при использовании 8 (а) и 16 локусов (б): Na - среднее число аллелей, Ne - среднее число эффективных аллелей: И - Na;  - Ne.

самое большое - 8,06±0,73 (у ПАН_Ч), среднее по породам - 6,16±0,17.

Наблюдаемая гетерозиготность (Но) при использовании панели GAL-1 варьировала от 17,5% у МОС_Б до 55,8% у кур породы СУС и в среднем составила 36,5% (рис. 2). Показатели ожидаемой гетерозиготности (Не) изменялись от 54,8% у птиц ЛЕН_С до 79,0% у птиц ЛЕН_Б.

При увеличении количества используемых локусов (16 маркеров) самые низкие значения Но были выявлены у птиц породы МОС_Б и НЬЮ_Г (26,9%), а наибольшие - у птиц ЮРЛ_Г (58,5%). Средняя величина наблюдаемой гетерозиготности по породам достигла 38,2%. Ожидаемая гетерозиготность в зависимости от породы колебались от 57,1% у кур ПЛИМ_П до 74,2% у кур ЛЕН_Б. Хотя показатели генетической изменчивости мало зависели от количества локусов, лучшие результаты обеспечило использование двух панелей.

Следует ометить, что в исследовании И.Г. Моисеевой [9] степень гетерозиготности у ЮРЛ_Г по 25 микросателлитным локусам в среднем составила 0,500. Уровень фактической и ожидаемой гетерозиготности внутри этой же породы в наших исследованиях достигал 0,585 и 0,655 соот-

у 9-и из 14-и пород. В отдельных породах их число колебалось от 1 (МОС_Б, ПАН_Б, КОТЛ, и РОД_А) до 8 (ЛЕН_Б) с частотой встречаемости от 1,7 до 30,0%. По двум панелям (GAL-1 и GAL-2, 16 локусов) было установлено 14 приватных аллелей в 12-и породах из 14-и. Наименьшее их число (один) выявлено у птиц ПАН_Б, ПОЛТ_Г, КОТЛ, РОД_А и ПЛИМ_П, а самое значительное (10 аллелей) - у кур ЛЕН_Б (частота встречаемости достигала 60%). Полученные результаты подтверждают гипотезу о наличии породоспецифических аллелей, свойственных замкнутым популяциям.

В нашем исследовании при использовании 8-и локусной системы было выявлено от 1 до 7 приватных аллелей, а по 16-и локусам от 1 до 14. В исследованиях Hillel J. с савт. [10] с 22 маркерными локусами было обнаружено 8 приватных аллелей. Наличие в исследуемых породах кур породоспецифичных аллелей

РОД_А

ПАН_Б СУС

ПАН_Ч РОД_А

ветственно.

При использовании панели GAL-1 (8 локусов) выявлено 7 приватных аллелей

а)

КОТЛ

б) ЮРЛ_Г

ПЕРВ ПОЛТ_ГЛ

Рис. 2. Показатели генетической изменчивости кур при использовании 8 (а) и 16 (б) локусов: Ho - наблюдаемая гетерозиготность, He - ожидаемая гетерозиготность, Fis - коэффициент инбридинга: (а) > - Ho; — - - He; - -ь - - Fis; (б) —♦--Ho; —--He; - -а- - - Fis.

из 14-и (см. табл.), в 7-и (СУС, КОТЛ, ПЛИМ_П, НЬЮ_Г, ЛЕН_Б, ПАН_Б и РОД_А) принадлежность к породе колебалась от 86,7 до 96,7%. Наименее генетически консолидированными при применении одной панели оказались куры ПАН_Ч (50,0%).

В случае использовании 16-и маркеров, наибольшая идентичность особей отмечена у восьми пород: ЛЕН_Б, ЛЕН_С, МОС_Б, КОТЛ, КУЧ, СУС, ПЛИМ_П и НЬЮ_Г. Их принадлежность к породе на основании анализа генотипа по МС была определена в 100% случаев. Высокую консолидированность отмечали и в остальных 6-и породах кур (от 80,0 до 96,7%). Это свидетельствует о высокой степени типичности каждой особи внутри группы. Среднее значение оценки породной принадлежности кур при использовании 8-и локусов достигало 89,0%, в варианте с 2-мя панелями (16 локусов) - 96,0%.

выводы. Таким образом, результаты исследований по идентификации породной принадлежности мясо-яичных пород кур с использованием заранее определенного количества микросателлитных локусов позволили сделать вывод, что применение 2-х панелей (16 маркеров) более информативно, чем одной (8 маркеров).

Литература.

1. FAO. The State of the World's Animal Genetic Resources for Food and Agriculture // Commission on Genetic Resources for Food and Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, Italy, 2007.

2. Semik, E. Krawczyk, J. The state of poultry genetic resources and genetic diversity of hen populations //Animal Science, 2011. V.11 (2). Pp 181-191.

3. Зиновьева Н.А., Гладырь Е.А. Генетическая экспертиза сельскохозяйственных животных: применение тест-систем на основе микросателлитов //Достижения науки и техники АПК. 2011. №9. С. 19-20.

4. Генетическое маркирование, сохранение биоразнообразия и проблемы разведения животных / Н.С. Марзанов, Д.А. Девришов, С.Н. Марзанова, Е.А. Комкова, М.Ю. Озеров, Ю. Кантанен//Сельскохозяйственная биология. 2011. №2. С. 3-14.

5. Анализ генетической структуры пород домашних кур с использованием микросателлитных маркеров / В.И. Фисинин, Е.А. Гладырь, В.В. Волкова, А.А. Севастьянова, Н.А. Зиновьева //Проблемы биологии продуктивных животных. 2011. №1. С. 68-72.

6. Исследование информативности мультиплексных тест-систем анализа микросателлитов кур с различным числом локусов /И.П. Новгородова, В.И. Фисинин, Н.А. Зиновьева, Е.И. Гладырь, М.В. Михайлов, Я.С. Ройтер, Г. Брем//Достижения науки и техники АПК. 2012. №6. С. 62-65.

7. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве /Н.А. Зиновьева, А.Н. Попов, Л.К. Эрнст, Н.С. Марзанов, В.В. Бочкарев, Н.И. Стрекозов, Г. Брем. Дубровицы: ВИЖ, 1998. 47с.

8. Меркурьева Е.К., Шангин-Березовский Г.Н. Генетика с основами биометрии. М.: Колос, 1983. 400 с.

9. Эволюция, генетическая изменчивость юрловской голосистой породы кур. Системный анализ форм изменчивости / И.Г. Моисеева, М.Н. Романов, А.В. Александров, А.А. Никифоров, А.А.Севастьянова//Изв. Тимирязев.с.-х.акад. 2009. №3. С. 132-147.

10. Biodiversity of 52 chicken populations assessed by microsatellite typing of DNA pools / J. Hillen, A.M. Groenen Martien, M. Tixier-Boichard, A.B. Korol, L. David, V.M. Kirzhner, T. Burke, A. Barre-Dirie, P.M.A. Rooijmans Richard, K. Elo, M.W. Feldman, P.J. Freidlin, A. Maki-Tanila, M. Oortwijn, P. Thomson, A. Vignal, K. Wimmers, S. Weigend//Genet. Sel. Evol. 2003. V.35. Pp. 533-557.

IDENTIFICATION OF CHICKEN BREEDS ON THE BASIS OF MICROSATELLITE ANALYSIS

I.P. Novgorodova1, E.A. Gladyr1, V.I. Fisinin2, N.A. Zinovieva1

'All-Russian Research Institute of Animal Husbandry named after academy member L.K.Ernst, 60, Dubrovitsy, Podolskiy r-n, Moskowskaya obl., Russian Federation

2All-Russian Research and Technological Institute of Poultry Husbandry, ul. Ptizegradskaya, 10, Sergiev-Posad, Moskowskaya obl., Russian Federation

Summary. The comparative assessment of 14 chicken breeds of meat and egg direction of productivity (n = 420) with the use of different number of microsatellite loci was carried out to determine population (breed) belonging of chickens. We studied the efficacy of two testsystems, each of them included eight markers - GAL-1 (MCW0111, MCW0067, LEI0094, MCW0123, MCW0081, MCW0069, MCW0104 и MCW0183) and GAL-2 (MCW0295, ADL0112, MCW0037, MCW0034, ADL0268, MCW0222, MCW0014 и LEI0074). The studied groups of birds were represented by the following breeds: Leningradskaya Belaya (LEN_B), Leningradskaya Sittsevaya (LEN_S), Moskovskaya Belaya (MOS_B), Pantsirevskaya Belaya (PAN_B), Pantsirevskaya Chernaya (PAN_CH), Pervomajskaya (PERV), Poltavskaya Glinistaya (POLT_GL), Yurlovskaya Golosistaya (YURL_G), Kotlyarovskaya (KOTL), Kuchinskaya (KUCH), Rhode Island Red (ROD_A), Sussex (SUS), Plymouth Rock Polosaty (PLIM_P) and New Hampshire (NYU_G). Genetic typing using multilocus panels was performed on the genetic analyzer ABI 3130x1 (Applied Biosystems, USA). Statistical data processing was performed using the software GenAlEx (ver.6.4.1.). There were no significant differences in the mean number of alleles, number of informative alleles and other indexes per locus between two studied test systems. The mean number of alleles per locus (Na) for the whole populations using 8 and 16 loci was 6.64 ± 0.24 and 6.16 ± 0.17, respectively. The comparative analysis of two test-systems revealed their high specificity. The mean value of the probability of identity depending on the population was up to 96.0% using 16 markers, while the same index reached 89% using 8 markers. The population assignment using microsatellites of the GAL-1 and GAL-2 systems was 100% in some breeds. The use of the test system based on 16 loci was the most preferred for this purpose.

Key words: microsatellite analysis, meat and egg breeds of chickens, alleles, polymorphism, heterozygosity.

Author Details: I.P. Novgorodova, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow (e-mail: novg-inna2005@yandex.ru); E.A. Gladyr, Cand. Sc. (Biol.), head of laboratory; V.I. Fisinin, member of the RAS, director; N.A. Zinovieva, member of the RAS, director. For citation: Novgorodova I.P., Gladyr E.A., Fisinin V.I., Zinovieva N.A. Identification of Chicken Breeds on the Basis of Microsatellite Analysis. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2015. V.29. No11. Pp. 88-90 (In Russ.).

Таблица. Генетическая принадлежность кур к популяции (n=30), %

Порода GAL-1

к собственной породе к другой породе к собственной породе к другой породе

ЛЕН_Б

ЛЕН_С

МОС_Б

ПАН_Б

ПАН_Ч

ПЕРВ

ПОЛТ_ГЛ

ЮРЛ_Г

КОТЛ

КУЧ

РОД_А

СУС

ПЛИМ_П

НЬЮ_Г

Среднее

86,7 100,0 100,0 86,7 50,0 83,3 76,7 100,0 93,3 100,0 86,7 96,7 93,3 93,3 89,0

13,3

13,3 50,0 16,7 23,3

6,7

13,3 3,3 6,7 6,7 11,0

100,0 100,0 100,0 93,3 80,0 90,0 90,0 96,7 100,0 100,0 96,7 100,0 100,0 100,0 96,0

6,7 20,0 10,0 10,0 3,3

3,3

4,0

характеризует аллелофонд замкнутых групп, а также указывает на его уникальность.

Анализ, проведенный по восьми локусам МС, показал высокую идентичность особей (100%) в 4-х породах