Способ получения гетеротетрамерного рекомбинантного стрептавидина из периплазмы E.coli
METHOD FOR OBTAINING HETEROTETRAMERIC RECOMBINANT STREPTAVIDIN FROM PERIPLASM OF ESCHERICHIA COLI

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии, и представляет собой способ получения гетеротетрамерного стрептавидина из периплазматического пространства клетки. Предлагаемый способ включает создание двух плазмид, полученных на базе векторов pET22b+ и рЕТ28а+ и кодирующих мономеры мутантного стрептавидина (не способного связывать биотин) и стрептавидина дикого типа соответственно, и создание штамм-продуцента Е. Coli, обеспечивающего экспрессию генов в клетке. Получение периплазматической фракции клеток бактериального штамма и очистку белка на никель-агарозе. Гетеротетрамерный стрептавидин находит применение в различных методах диагностики заболеваний, к примеру, в таких методах как иммуноферментный анализ и иммуногистохимия.
В настоящее время основным источником стрептавидина является продуцент S. avidinii АТСС 27419, обладающий высокой природной устойчивостью к антибиотикам и требующий длительного времени культивирования. Кроме того, при выделении стрептавидина из S. Avidinii, целевой белок часто загрязнен биотином [Proc. Natl. Acad. Sci. 1980. V. 77. P. 4666-4668; Biochem. Biophys. Methods. 1986. V. 13. P. 103-112; J. Immunol. Methods. 1988. V. 113. P. 83-91].
В международной заявке PCT/US 2006/016480, опубликованной 13 августа 2009 г., предлагается способ экспрессии стрептавидина в питательную среду, что усложняет процесс выделения белка из-за больших объемов питательной среды, прогоняемых через никелевую колонку.
Известен способ получения конструкции экспрессионной плазмиды для наработки стрептавидина в периплазматическом пространстве (pSAV27) [RU 2153535, опуб. 27.07.2000]. Получение плазмиды включает: выделение из S. avidinii M170791 нуклеотидной последовательности, кодирующей лидерный пептид стрептавидина и зрелый белок (прострептавидин) с введением сайтов рестрикции; конструирование высококопийной pSAV27 плазмиды с ампицилиновым маркером; трансформация штамма E.coli JM110 полученной конструкцией; выращивание штамма-продуцента на LB-среде; лизирование полученной биомассы для выделения периплазматической фракции; определение биологической активности стрептавидина путем разделения в ПААГ продуктов связывания стрептавидина с синтетическим биотинилированным олигонуклеотидом. По сравнению с вышеприведенным методом выделения белка из телец включения, данный метод обладает значительным преимуществом. Плазмида pSAV27, несущая последовательность лидерного пептида вместе с нуклеотидной последовательностью гомотетрамерного стрептавидина, селективно экспрессирует белок в периплазматическое пространство, где он локализируется в биологически активном состоянии. Недостаток метода получения стрептавидина, приведенного в патенте RU 2153535, заключается в том, что получаемый в данной работе гомотетрамерный стрептавидин способен связывать четыре молекулы биотина, что впоследствии приводит к конгломерации и потере физиологических свойств транспортируемой молекулы.
Наиболее близким по совокупности существенных признаков к предлагаемому способу является способ получения гетеротетрамерного стрептавидина, описанный в патенте США US 8586708 В2. Авторы предлагают получать моновалетный стрептавидин в несколько этапов: на первом этапе происходит создание двух плазмид, кодирующих мономеры мутантного стрептавидина и стрептавидина дикого типа, затем данными конструкциями трансформируются разные клетки E.coli и трансформаты раздельно культивируются в питательной среде при 37°С. Индукция синтеза белка происходит за счет добавления изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида. На втором этапе происходит раздельное выделение мутантного (не способного связывать биотин) и стрептавидина дикого типа (способного связывать биотин) из телец включения клеток Е. Coli. На третьем этапе производят денатурацию стрептавидинов в 6М Gu-HCl для получения мономеров стрептавидина обоих типов, смесь мутантного и стрептавидина дикого типа предлагают смешивать в соотношении 3:1 соответственно, и на заключительном этапе производят ренатурацию полученного белка в ФБР (фосфатный буферный раствор). Получившийся белок концентрируют осаждением с использованием сульфата аммония и затем подвергают двукратному диализу против ФБР для очистки стрептавидина дикого типа от биотина. Затем гетеротетрамерный стрептавидин выделяют на никель-агарозной колонке. Метод получения гетеротетрамерного белка, приведенный в патенте США US 8586708 В2, обладает рядом недостатков: данный процесс является трудоемким и ресурсозатратным, происходит снижение выхода целевого белка и необратимая потеря биологических свойств белка. Это приводит к повышению себестоимости стрептавидина. Причина данных недостатков заключается в наличии дополнительных стадий выделения, денатурации и ренатурации гомотетрамеров белка для получения гетеротетрамерного стрептавидина.
Технической проблемой, решаемой изобретением, является создание такого способа получения гетеротетрамерного рекомбинантного стрептавидина из периплазмы E.coli, который бы позволил снизить себестоимость целевого белка без потери биологических свойств молекул.
Техническим результатом является повышение эффективности процесса получения гетеротетрамерного стрептавидина, состоящего одновременно из мономеров мутантного стрептавидина и стрептавидина дикого типа, за счет исключения дополнительных стадий выделения и денатурации-ренатурации белка.
Предлагается создавать две генетические конструкции, одна из которых кодирует мономер мутантного стрептавидина, а другая мономер стрептавидина дикого типа. Данными конструкциями трансформируют одни и те же клетки E. coli, что позволяет получить целевой гетеротетрамер непосредственно в клетке, минуя дополнительные стадии выделения и денатурации-ренатурации белка in vitro.
Таким образом, технический результат достигается за счет того, что в способе получения гетеротетрамерного рекомбинантного стрептавидина из периплазмы E. coli, включающем создание двух плазмид, обеспечивающих экспрессию стрептавидинов, трансформацию полученными плазмидами клеток E. coli, культивирование клеток в культуральной среде, индукцию синтеза стрептавидинов изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом, выделение стрептавидина из периплазматического пространства и очистку гетеротетрамерного стрептавидина на аффинном сорбенте,
предлагается
- в качестве первой плазмиды на базе исходного вектора создавать плазмиду, обеспечивающую экспрессию стрептавидина дикого типа, сцепленного с аффинной меткой и имеющую ген устойчивости к антибиотику группы аминогликозидов,
- в качестве второй плазмиды на базе исходного вектора создавать плазмиду, обеспечивающую экспрессию мутантного стрептавидина, сцепленного с pelB-лидерным
пептидом и не способного к связыванию биотина, имеющую ген устойчивости к антибиотику пенициллинового ряда,
- проводить трансформацию одних и тех же клеток E. coli двумя указанными плазмидами, с последующим культивированием этих трансформированных клеток в культуральной среде, содержащей одновременно антибиотик пенициллинового ряда и антибиотик группы аминогликозидов,
или предлагается
- в качестве первой плазмиды на базе исходного вектора создавать плазмиду, обеспечивающую экспрессию мутантного стрептавидина, сцепленного с аффинной меткой и не способного к связыванию биотина, имеющую ген устойчивости к антибиотику группы аминогликозидов,
- в качестве второй плазмиды на базе исходного вектора создавать плазмиду, обеспечивающую экспрессию стрептавидина дикого типа, сцепленного с pelB-лидерным пептидом, имеющую ген устойчивости к антибиотику пенициллинового ряда,
- проводить трансформацию одних и тех же клеток E. coli двумя указанными плазмидами, с последующим культивированием этих трансформированных клеток в культуральной среде, содержащей одновременно антибиотик пенициллинового ряда и антибиотик группы аминогликозидов.
Дополнительными отличиями предлагаемого способа являются:
- в качестве аффинного сорбента предпочтительно использовать никель-агарозу;
- в качестве антибиотика группы аминогликозидов предпочтительно использовать ампициллин;
- в качестве антибиотика пенициллинового ряда предпочтительно использовать канамицин;
- в качестве вектора для первой плазмиды может быть использован вектор рЕТ28а+;
- в качестве вектора для второй плазмиды может быть использован вектор pET22b+;
- в качестве штамма для трансформации клеток E. coli может быть использован штамм E. coli BL21(DE3);
- мутантный стрептавидин, не способный к связыванию биотина, или стрептавидин дикого типа сцеплен с пептидом слияния;
- в качестве пептида слияния используют ТАТ-пептид;
- в качестве аффинной метки предпочтительно использовать олигогистидиновую последовательность.
Сущность изобретения поясняется следующими фигурами.
a
На фиг. 1 приведено схематичное изображение процесса синтеза моновалентного стрептавидина с ТАТ-пептидом в штамме Е. coli. На фиг. 2 приведено схематичное изображение процесса синтеза бивалентного стрептавидина с ТАТ-пептидом в штамме Е. coli. На фиг. 3 приведено схематичное изображение процесса синтеза тетравалентного стрептавидина с ТАТ-пептидом в штамме Е. coli. На фиг. 4 приведено схематичное изображение процесса синтеза гомотетрамера стрептавидина дикого типа с ТАТ-пептидом в штамме Е. coli. На фиг. 5 приведено схематичное изображение процесса синтеза гомотетрамеров мутантного стрептавидина в штамме Е. coli. На фиг. 6 схематично показано как эндонуклеазы рестрикции NcoI и XhoI режут вектор pET22b(+) с образованием двух «липких концов». На фиг. 7 схематично показан процесс получения продуктов SAD с использованием олигонуклеотидов f-SA-NCO и r-SA-stop-XHO. Черным цветом на схеме обозначена нуклеотидная последовательность SAD. Справа на схеме обозначен конечный продукт амплификации - SAD. На фиг. 8 схематично показан процесс лигирования конструкции pEP22b(+)/NcoI/XhoI и амплификатов SAD. Черным цветом обозначена нуклеотидная последовательность SAD. На фиг. 9 схематично показан процесс разрезания вектора pET28(+)эндонуклеазами рестрикции.
На фиг. 10 схематично представлен процесс получения ПЦР-продукта SAA с использованием олигонуклеотидов f-SA-XBA и f-SA-ХНО. Черным цветом на схеме обозначена нуклеотидная последовательность SAA. Справа на схеме обозначен конечный продукт амплификации - SAA.
На фиг. 11 схематично представлен процесс лигирования конструкции pEP22a(+)/XbaI/XhoI и амплификатов SAA. Черным цветом обозначена нуклеотидная последовательность SAA.
На фиг. 12 схематично представлен процесс лигирования конструкции pEP28a(+)-SAA/XbaI и амплификатов нуклеотидной последовательности, кодирующих ТАТ-белок. Черным цветом обозначена нуклеотидная последовательность SAA. Серым цветом обозначена нуклеотидная последовательность ТАТ-пептида.
Краткое описание рисунков.
Фиг. 1 Схематичное изображение процесса синтеза моновалентного стрептавидина с ТАТ-пептидом в штамме Е. coli. В начале происходит экспрессия генов сконструированных ДНК плазмид, обеспечивающих синтез мономеров мутантного стрептавидина (Позиции 1,2,3), сцепленных с PelB-лидерым пептидом (белок-транспортер в периплазму) и мономеров стрептавидина дикого типа (позиция 4), сцепленных с ТАТ-пептидом (белок вируса иммунодифециты человека) и олигогистидиновой последовтаельностью. Затем происходит тетрамеризация мономеров белка в цитоплазме клетке (позиция 5) и транспортировка данного тетерамера в периплазму клетки, где PelB-лидерный пептид отщепляется протеиназами клетки (позиция 6).
Фиг. 2 Схематичное изображение процесса синтеза бивалентного стрептавидина с ТАТ-пептидом в штамме Е. coli. Вначале происходит экспрессия генов сконструированных ДНК плазмид, обеспечивающих синтез мономеров мутантного стрептавидина (Позиции 1, 2), сцепленных с PelB-лидерным пептидом (белок-транспортер в периплазму) и мономеров стрептавидина дикого типа (позиция 3, 4), сцепленных с ТАТ-пептидом(белок вируса иммунодифецита человека) и олигогистидиновой последовательностью. Затем происходит тетрамеризация мономеров белка в цитоплазме клетке (позиция 5) и транспортировка данного тетрамера в периплазму клетки, где PelB-лидерный пептид отщепляется протеиназами клетки (позиция 6).
Фиг. 3 Схематичное изображение процесса синтеза тетравалентного стрептавидина с ТАТ-пептидом в штамме Е. coli. Вначале происходит экспрессия генов сконструированных ДНК плазмид, обеспечивающих синтез мономеров мутантного стрептавидина (Позиции 2), сцепленных с PelB-лидерным пептидом (белок-транспортер в периплазму) и мономеров стрептавидина дикого типа (позиция 1, 3, 4), сцепленных с ТАТ-пептидом(белок вируса иммунодифецита человека) и олигогистидиновой последовательностью. Затем происходит тетрамеризация мономеров белка в цитоплазме клетке (позиция 5) и транспортировка данного тетерамера в периплазму клетки, где PelB-лидерный пептид отщепляется протеиназами клетки (позиция 6).
Фиг. 4 Схематичное изображение процесса синтеза гомотетрамера стрептавидина дикого типа с ТАТ-пептидом в штамме Е. coli. Вначале происходит экспрессия генов сконструированных ДНК плазмид, обеспечивающих синтез мономеров мутантного стрептавидина(на фиг. не показаны), сцепленных с PelB-лидерным пептидом (белок-транспортер в периплазму) и мономеров стрептавидина дикого типа(позиция 1, 2, 3, 4), сцепленных с ТАТ-пептидом(белок вируса иммунодифецита человека) и олигогистидиновой последовательностью. Затем происходит тетрамеризация мономеров стрептавидина дикого типа в цитоплазме клетке (позиция 5). Данный тетерамер не имеет в своем составе мутантный стрептавидин, несущий на себе PelB-лидерный пептид, в связи с чем транспорт тетрамеров данной конструкции в периплазму осуществляться не будет. Таким образом удается in vivo очистить гетеротетрамеры белка от нецелевого гомотетрамера стрептавидина.
Фиг. 5 Схематичное изображение процесса синтеза гомотетрамеров мутантного стрептавидина в штамме Е. coli. Вначале происходит экспрессия генов сконструированных ДНК плазмид, обеспечивающих синтез мономеров мутантного стрептавидина (Позиция 1, 2, 3, 4), сцепленных с PelB-лидерным пептидом (белок-транспортер в периплазму) и мономеров стрептавидина дикого типа(на фиг. не показаны), сцепленных с ТАТ-пептидом(белок вируса иммунодефицита человека) и олигогистидиновой последовательностью. Затем происходит тетрамеризация мономеров мутантного стрептавидина в цитоплазме клетке (позиция 5) и транспортировка данного тетрамера в периплазму клетки, где PelB-лидерный пептид отщепляется протеиназами клетки (позиция 6). Данный тетрамер не имеет в своем составе стрептавидина дикого типа, несущего на себе олигогистидиновую последовательность, в связи с чем тетрамеры данной конструкции не возможно будет выделить из периплазматической фракции на никель-агарозном сорбенте. Таким образом, удается очистить гетеротетрамеры белка от нецелевого гомомтетрамера стрептавидина.
Предлагаемый способ получения гетеротетрамерного стрептавидина включает в себя несколько стадий:
- создание плазмиды pET22b+-SAD, обеспечивающей экспрессию мутантного стрептавидина, сцепленного с pelB лидером, осуществляющим транспорт гетеротетрамерного белка в периплазму;
- создание плазмиды pET22a+-SAA-TAT, обеспечивающей экспрессию стрептавидина дикого типа, сцепленного с олигогистидиновой последовательностью и ТАТ-белком вируса иммунодефицита человека;
- трансформация штамма E.coli BL21(DE3) конструкциями pET22b+-SAD и pET22b+-SAA-TAT, с последующим культивированием данного штамма в LB-среде;
- выделение гетеротетрамерного стрептавидина из периплазматического пространства на никель-агарозном сорбенте;
- подтверждение наличия белка в пробах с помощью электрофоретического разделения белка в денатурирующих условиях; проверка способности стрептавидина связывать биотин с помощью метода иммуноблоттинга.
Пример 1. Создание плазмиды pET22b+-SAD
3
3
Для создания плазмиды, кодирующий нуклеотидную последовательность мутантного стрептавидина, был использован исходный вектор pET22b(+) [Novagen, рЕТ System Manual, 11th Edition], содержащий ген устойчивости к ампициллину и нуклеотидную последовательность pe1B-лидерного пептида [Novagen, рЕТ System Manual, 11th Edition], необходимого для направленного транспорта белка в периплазму. Для наработки исходного вектора pET22b(+) был использован штамм E.coli DH5(α). К 100 мкл компетентных клеток E.coli DH5(α) добавили от 100 до 300 нг плазмидной ДНК pET22b(+). Затем инкубировали во льду 15 минут. Для осуществления теплового шока суспензию клеток инкубировали в течение 5 минут при 42°С на водяной бане, с последующей инкубацией во льду 2 минуты. К суспензии добавили 900 мкл среды LB и инкубировали 1 час при 37°С. Клетки высевали на чашки, содержащие агаризованную LB-среду с ампициллином (100 мкг/мл). Чашки инкубировали в течение ночи при 37°. Клетки E.coli DH5(α), трансформированные pET22b(+), выращивались при 37°С в условиях аэрации, осаждались центрифугированием и использовали для выделения плазмидной ДНК фенол-хлороформным методом. Супернатант сливали, остаток клеток ресуспендировали в 4 мл среды и осаждали центрифугированием, затем супернатант снова сливали. Добавляли по 200 мкл раствора I в каждую пробирку. Раствор I имеет следующий состав: 50 мМ глюкозы, 25 мМ TrisHCl рН 8.0, 10 мМ EDTA рН 8.0. Смесь ресуспендировали на вортексе и добавляли по 400 мкл раствора II, следующего состава: 0.2Н NaOH, 1% SDS. Получившуюся суспензию перемешивали быстрым переворачиванием в течение 5 минут и добавляли по 300 мкл раствора III (5М CHCOOK, 11.5% СНСООН), несколько раз переворачивали и инкубировали во льду в течение 5 минут. Клетки осаждали центрифугированием и отбирали по 600 мкл суспензии и переносили в чистые эппендорфы и затем добавляли по 600 мкл изопропилового спирта (-20°С). Затем суспензию инкубировали при - 20°С в течение 10 минут и осаждали центрифугированием. Спирт сливали и осадок высушивали. Растворяли осадок в 200 мкл воды. Добавляли 250 мкл смеси фенол:хлороформ (1:1) и перемешивали. Суспензию осаждали центрифугированием, супернатант отбирали и добавляли 250 мкл смеси хлороформ: изоамиловый спирт (24:1) и перемешивали. Суспензию осаждали центрифугированием. Получившийся супернатант отбирали, добавляли 2.5 объема 96% этилового спирта и инкубировали при -20°С в течение 30 минут. Затем осаждали центрифугированием, спирт сливали и добавляли 1 мл 70% этилового спирта. Затем смесь осаждали центрифугированием, спирт сливали. Высушивали осадок до исчезновения запаха спирта. Осадок растворяли в 200 мкл воды. Полученную плазмидную ДНК разделяли в 0.8% агарозном геле. Состав геля: 0.8% агароза, 0.5х ТВЕ буфер, 1 мкг/мл этидиум бромид. Состав буфер для образцов: 30%-ный глицерин (v/v), 0.025%-ный ксиленцианол (w/v), 0.025%-ный бромфеноловый синий (w/v). Электродный буфер: 0.5х буфер ТВЕ Состав 10х буфера ТВЕ: 890 мМ Tris, 890 мМ борная кислота (рН 8.0), 20М EDTA. Для приготовления геля смесь компонентов прогревали до полного растворения агарозы, после чего охлаждали до 50°С, добавляли бромид этидия до концентрации 0.5 мг/мл и заливали на горизонтальную платформу размером 80×110 мм. Толщина геля составляла 5 мм. Напряженность электрического поля составляла 5 В/см В качестве маркеров использовали коммерческие маркеры 250-10000 п.н. («Медиген»). Очистка плазмиды из агарозного геля проводилась с использованием специального набора фирмы Promega (WizardSV Gel and PCR Clean-Up System, США). - удалить все
Для вставки нуклеотидной последовательности мутантного стрептавидина (SAD) в исходную плазмиду использовались «липкие концы», получаемые за счет обработки вектора эндонуклеазми рестрикции NcoI и XhoI (фиг. 6). Под мутантным стрептавидином подразумевается стрептавидин, не способный связывать биотин.
Реакционная смесь рестрикции имела следующий состав (V=60 мкл, , 1 час):
pET22b(+): 22 мкл
NcoI 2,5 мкл, XhoI 2,5 мкл,
Х
10буфер 6 мкл,
2
НО 27 мкл
После процедуры гидролиза, получившийся линейный вектор подвергался электрофоретическом разделению в 0.8% агарозном геле с использование протокола, указанного выше в тексте. Очистка плазмиды из агарозного геля проводилась с использованием специального набора фирмы Promega (WizardSV Gel and PCR Clean-Up System, США).
Для наработки необходимого количества нуклеотидной последовательности SAD проводилась ПЦР с использованием специально подобранных олигонуклеотидов.
В качестве матрицы для наработки нуклеотидной последовательности использовалась плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность мутантного стрептавидина [Biochem Biophys Res Commun. 2015 Aug 7; 463(4): 1059-1063]. Для получения нуклеотидной последовательности нами были подобраны специальные олигонуклеотиды:
ccatgg
f-SA-NCO: 5'-ctgctgaagctggtatcacc - олигонуклеотид с сайтом рестрикции для NcoI и последовательностью, комплементарной последовательности гена стрептавидина
ctcgag
r-SA-stop-XHO: 5'-ctgtcattoggaagcagcggacggtt - с сайтом рестрикции XhoI, стоп кодоном перед олигогистидиновой последовательностью и последовательностью комплементарной последовательности гена стрептавидина.
2
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводилась в реакционной смеси конечным объемом 30 мкл. Состав реакционной смеси: Олигонуклеотиды (прямой и обратный) по 10 пМоль, Буфер для Taq-полимеразы x1, (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) 6 нМоль, MgCl 50 нМоль, Taq-полимераза 1 единица. ПЦР проводилась в микроцентрифужных пробирках объемом 0.5 мл на аппарате «Терцик» (Россия) с набором программ, определяющих температурный режим ПЦР. Была проведена амплификация нуклеотидных последовательностей методом ПЦР. Температурный профиль ПЦР: 5 минут 95°С, 1 минута 95°С (денатурация), 1 минута  30 циклов, 1 минута 72°С (достройка), 5 минут 72°С.
Схема получения продукта SAD представлена на фиг. 7.
Встраивание нуклеотидной последовательности SAD в плазмиду pET22b(+) производилось следующим способом. Полученные продукты амплификации нуклеотидной последовательности SAD обрабатывались эндонуклеазами рестрикции XhoI и NcoI. Состав реакционной смеси для NcoI и XhoI (V=60 мкл, , 1 час):
нуклеотидная последовательность SAD: 35 мкл
NcoI 2,5 мкл, XhoI 2,5 мкл,
Х
10буфер 6 мкл,
2
НО 16 мкл
Таким образом, нами была подготовлена плазмида pET22b(+)/NcoI/XhoI и продукты амплификации нуклеотидной последовательности SAD, имеющие идентичные липкие концы. Продукты рестрикции нуклеотидной последовательности SAD смешивались с подготовленным вектором и затем литеровались. Молярное соотношение плазмиды и ПЦР-продукта брали 1/20. Для лигирования использовали лигазу фирмы «Fermentas» (Литва). Состав реакционной смеси (объем пробы составлял 10 мкл.): нуклеотидная последовательность SAD 65 нг (4 мкл), Лигаза 1 мкл, Лигазный буфер 1 мкл, Плазмида 40 нг (4 мкл). Литерование проводили в течение 16 часов при температуре +4°С. В результате была получена генетическая конструкция названная нами pEP22b(+)-SAD, кодирующая белок SAD с PelB-лидерным пептидом. Схема создания данных конструкций представлена на фиг. 8.
Отбор колоний, содержащих плазмиды со вставкой нуклеотидной последовательности SAD, производился следующим образом. Полученной лигазной смесью были трансформированы компетентные клетки штамма DH5(α) E.coli. К 100 мкл компетентных клеток E.coli DH5(α) добавили от 100 до 300 нг плазмидной ДНК pET22b(+)-SAD и далее проводили трансформацию с помощью аналогичного метода, изложенного выше. Трансформанты были высеяны на чашку Петри с агаризованной LB средой, в состав которой входил антибиотик ампициллин. Таким образом, на селективной среде выросли клетки, резистентные к ампициллину, содержащие плазмиды - продукты лигирования.
Клетки E.coli DH5(α), трансформированные pET22b(+)-SAD, выращивались при 37°С в условиях аэрации, осаждались центрифугированием при 4000 об/мин на центрифуге К23 при 4°С в течение 30 минут и использовали для выделения плазмидной ДНК методом подробно изложенным выше в тексте.
Для проверки вставки с помощью ПЦР было выбрано несколько колоний. Нуклеотидная последовательность целевой генетической конструкции дополнительно проверялась с помощью секвенирования по Сэнгеру [J.Mol.Biol. 1975. V. 94. Р. 441-446].
Пример 2. Создание плазмиды pET28a+-SAA-TAT
Для создания плазмиды, кодирующий нуклеотидную последовательность стрептавидина дикого типа, был использован исходный вектор рЕТ28а(+) [Novagen, рЕТ System Manual, 11th Edition], содержащий ген устойчивости к канамицину и олигогистидиновой последовательностью, необходимую для последующей очистки целевого белка на никель-агарозном сорбенте. Для наработки исходного вектора рЕТ28а(+) был использован штамм E.coli DH5(α). К 100 мкл компетентных клеток E.coli DH5(α) добавили от 100 до 300 нг плазмидной ДНК рЕТ28а(+) и далее проводили трансформацию с помощью аналогичного метода, изложенного выше. Клетки E.coli DH5(α), трансформированные рЕТ28а(+), выращивались при 37°С в условиях аэрации, осаждались центрифугированием и использовали для выделения плазмидной ДНК методом подробно изложенным выше в тексте. Полученную плазмидную ДНК разделяли в 0.8% агарозном геле с использование протокола, указанного выше в тексте. Очистка плазмиды из агарозного геля проводилась с использованием набора фирмы Promega (WizardSV Gel and PCR Clean-Up System, США).
Для вставки фрагментов нуклеотидной последовательности стрептавидина дикого типа (SAA) в исходную плазмиду, использовались «липкие концы», получаемые за счет обработки вектора эндонуклеазмами рестрикции XbaI и XhoI (Фиг. 9).
Реакционная смесь рестрикции имела следующий состав: состав реакционной смеси для XbaI и XhoI (V=60 мкл, t0=370С, 1 час):
рЕТ28а(+): 22 мкл
XbaI 2,5 мкл,
XhoI 2,5 мкл,
Х
10буфер 6 мкл,
2
НО 27 мкл
После процедуры гидролиза, получившийся линейный вектор подвергался электрофоретическом разделению в 0.8% агарозном геле с использованием протокола, указанного выше в тексте. Очистка плазмиды из агарозного геля проводилась с использованием набора фирмы Promega (WizardSV Gel and PCR Clean-Up System, США).
Для наработки необходимого количества нуклеотидной последовательности SAA проводилась ПЦР с использованием специально подобранных олигонуклеотидов.
В качестве матрицы для наработки нуклеотидной последовательности использовалась плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность стрептавидина дикого типа [J Chromatogr А. 1994 Aug 5; 676(2): 337-45]. Для получения нуклеотидной последовательности SAA нами были подобраны специальные олигонуклеотиды:
f-SA-XBA: 5'-ctgtctagactgaagctggtatcacc - олигонуклеотид с сайтом рестрикции для XbaI и последовательностью, комплементарной последовательности гена стрептавидина
ctcgag
r-SA-XHO: 5'-ctgggaagcagcggacggtt - олигонуклеотид с сайтом рестрикции для XhoI, последовательностью, комплементарной последовательности гена стрептавидина
Схема получения продукта SAA представлена на фиг. 10.
Встраивание нуклеотидной последовательности SAA в плазмиду рЕТ28а(+) проводилось следующим способом. Полученные продукты амплификации SAA предварительно обрабатывались эндонуклеазмами рестрикции XhoI и XbaI. Состав реакционной смеси для XbaI и XhoI (V=60 мкл, , 1 час):
нуклеотидная последовательность SAA: 35 мкл
XbaI 2,5 мкл, XhoI 2,5 мкл,
Х
10буфер 6 мкл,
2
НО 16 мкл
Таким образом, нами были подготовлены плазмида pET28a(+)/XbaI/XhoI и продукты амплификации нуклеотидной последовательности SAA, имеющие идентичные липкие концы. Продукты рестрикции нуклеотидной последовательности SAA смешивались с подготовленным вектором и затем лигировались. Молярное соотношение плазмиды и ПЦР-продукта брали 1/20. Для лигирования использовали лигазу фирмы «Fermentas» (Литва). Состав реакционной смеси (объем пробы составлял 10 мкл.): нуклеотидная последовательность SAA 65 нг (4 мкл), Лигаза 1 мкл, Лигазный буфер 1 мкл, Плазмида 40 нг (4 мкл). Лигирование проводили в течение 16 часов при температуре +4°С. В результате была получена генетическая конструкция условно названная нами pEP28a(+)-SAA, экспрессирующая ген SAA, сцепленный с олигогистидиновой последовательностью. Схема создания данных конструкций представлена на фиг. 11.
Отбор колоний, содержащих плазмиды со вставкой нуклеотидной последовательности SAA, производился следующим способом. Полученной лигазной смесью были трансформированы компетентные клетки штамма DH5(α) E.coli. К 100 мкл компетентных клеток E.coli DH5(α) добавили от 100 до 300 нг плазмидной ДНК pET22b(+)-SAA и далее проводили трансформацию с помощью аналогичного метода, изложенного выше. Трансформанты были высеяны на чашку Петри с агаризованной LB средой, в состав которой входил антибиотик канамицин. Таким образом, на селективной среде выросли клетки, резистентные к канамицину, содержащие плазмиды - продукты лигирования.
Клетки E.coli DH5(α), трансформированные pET28a(+)-SAA, выращивались при 37°С в условиях аэрации, осаждались центрифугированием при 4000 об/мин на центрифуге К23 при 4°С в течение 30 минут и использовали для выделения плазмидной ДНК методом подробно изложенным выше в тексте.
Для проверки вставки с помощью ПЦР было выбрано несколько колоний. Нуклеотидная последовательность целевой генетической конструкции дополнительно проверялась с помощью секвенирования по Сэнгеру [J.Mol.Biol. 1975. V. 94. Р. 441-446].
Встраивание нуклеотидной последовательности, кодирующей ТАТ-пептид в плазмиду pEP28a(+)-SAA производилось следующим способом. Полученный ранее вектор подготавливали к вставке нуклеотидной последовательности ТАТ-пептида. Для этого вектор подвергался рестрикции по сайту XbaI. Состав реакционной смеси для XbaI (V=60 мкл,
t0=370C, 1 час):
pET28a(+)-SAA: 22 мкл
XbaI 4 мкл,
Х
10буфер 6 мкл,
2
HO 28 мкл
После процедуры гидролиза, получившийся линейный вектор подвергался электрофоретическом разделению в 0.8% агарозном геле с использование протокола, указанного выше в тексте. Очистка плазмиды из агарозного геля проводилась с использованием набора фирмы Promega (WizardSV Gel and PCR Clean-Up System, США)..
Необходимое для вставки в плазмиду количество нуклеотидной последовательности ТАТ-пептида, было получено с помощью метода, подробно изложенного в статье [J Drug Target. 2012 Sep; 20(8): 678-690]. Продукты амплификации нуклеотидной последовательности ТАТ-пептида предварительно обрабатывались эндонуклеазой рестрикции Xbal.
Реакционная смесь для XbaI_(V=60 мкл, t0=370C, 1 час): нуклеотидная последовательность ТАТ: 35 мкл
XbaI 4 мкл,
Х
10буфер 6 мкл,
2
НО 15 мкл
Продукты рестрикции нуклеотидной последовательности ТАТ-пептида смешивались с подготовленным вектором и затем лигировались. Молярное соотношение плазмиды и ПЦР-продукта брали 1/100. Для лигирования использовали лигазу фирмы «Fermentas» (Литва). Состав реакционной смеси (объем пробы составлял 10 мкл.): нуклеотидная последовательность ТАТ-пептида 65 нг (4 мкл), Лигаза 1 мкл, Лигазный буфер 1 мкл, Плазмида 40 нг (4 мкл). Лигирование проводили в течение 16 часов при температуре +4°С. В результате была получена генетическая конструкция условно названная нами pEP28a(+)-SAA-TAT, экспрессирующая нуклеотидную последовательность SAA, сцепленную с нуклеотидной последовательностью ТАТ-пептида. Схема создания данных конструкций представлена на фиг. 12.
Полученной лигазной смесью были трансформированы компетентные клетки штамма DH5(α) E.coli. К 100 мкл компетентных клеток E.coli DH5(α) добавили от 100 до 300 нг плазмидной ДНК pET22b(+)-SAA-TAT и далее проводили трансформацию с помощью аналогичного метода, изложенного выше. Трансформанты были высеяны на чашку Петри с агаризованной LB средой, в состав которой входил антибиотик канамицин. Таким образом, на селективной среде выросли клетки, резистентные к канамицину, содержащие плазмиды - продукты лигирования.
Клетки E.coli DH5(α), трансформированные pET28a(+)-SAA-TAT, выращивались при 37°С в условиях аэрации, осаждались центрифугированием и использовались для выделения плазмидной ДНК, изложенным выше в тексте.
Для проверки вставки с помощью ПЦР было выбрано несколько колоний. Нуклеотидная последовательность целевой генетической конструкции проверялась с помощью секвенирования по Сэнгеру [J.Mol.Biol. 1975. V. 94. Р. 441-446].
Пример 3. Трансформация штамма E.coli BL21(DE3) конструкциями pET22b+-SAD и pET22b+-SAA-TAT
Полученные конструкции pET22b(+) -SAA-TAT и pET22b+-SAD были использованы для трансформации клеткок E.coli BL21(DE3). К 100 мкл компетентных клеток E.coli BL21(DE3) добавили от 100 нг плазмидной ДНК pET22b(+) -SAA-TAT и pET22b(+)-SAD. Затем инкубировали во льду 15 минут. Для осуществления теплового шока суспензию клеток инкубировали в течение 5 минут при 42°С на водяной бане, с последующей инкубацией во льду 2 минуты. Добавляли 900 мкл среды LB и инкубировали 1 час при 37°С. Клетки высевали на чашки, содержащие агаризованную LB-среду с ампицилином (100 мкг/мл) и канамицином (50 мкг/мл). Чашки инкубировали в течение ночи при 37°.
Пример 4. Культивирование штамма E.coli BL21(DE3)/pET28a(+) -SAA-ТАТ/ pET22b+-SAD.
Полученные трансформаты E.coli BL27(DE3)/рЕТ28а(+) -SAA-ТАТ/ pET22b+-SAD засевали в 10 мл LB-среды с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) и канамицина (50 мкг/мл) растили в течение ночи при 37°С при постоянном покачивании. Утром инокулят переливали в 500 мл LB-среды. Для селекции трансформированных обеими плазмидами клеток производилось добавление антибиотика ампицилина и канамицина (в расчете 100 мкг и 50 мкг соответственно на 1 мл среды). Клетки выращивали при 37°С в условиях аэрации до плотности А600=0.6-1. Синтез белка индуцировали добавлением IPTG (0,5 ммоль/л), культивирование продолжали в течение ночи при 26°С.
Пример 5. Выделение белка из периплазматической фракции E.coli BL21(DE3).
После отделения бактериальных клеток путем центрифугирования в течение 15 минут при 10000 g, периплазматическую фракцию получали методом «осмотического шока» [Current Protocols in Molecular Biology. 1989. John Wiley & Sons, New York]. Гетеротетрамеры стрептавидина были аффинно очищены на металл-хелатном никель-агарозном сорбенте (Sigma). Для этого к полученному содержимому периплазмы бактерий добавляли фенилметилсульфонилфторид и имидазол (конечная концентрация 1 mM и 10 тМ соответственно). Раствор фильтровали через металл-хелатный сорбент. Балластные белки отмывали 0,5 м раствором NaCl на 0,1 М К-фосфатном буфере, рН=8,0, содержащем 20 мМ имидазола. Далее белок элюировали 0,15 М NaCl, рН=7,4, содержащем 200 мМ имидазола.
Пример 6. Электрофоретическое разделение белка в SDS-электрофорезе.
Содержащие белок фракции анализировали при помощи электрофоретического разделения. Электрофоретическое разделение белков осуществляли в 12% полиакриламидном геле 9*9 см при градиенте напряжения 20 В/см в разделяющем геле следующего состава: 12% акриламид/метиленбисакриламид 29:1, 37 мМ Tris-HCl, рН=9,2, 0,01% персульфат аммония, 0,001% тетраметилэтилендиамин с использованием электродного буфера, содержащего 0,125 М Tris-HCl, рН=6,8.
Образцы смешивались в соотношении 4:1 с буфером, состоящим из 0.3 М TrisHCl, рН 6.8, 30% глицерина и 0.025%) бромфенолового синего. Для проведения электрофоретического анализа белков в ПААГ в денатурирующих условиях в состав гелей, электродного буфера и буфера для образцов добавлялся ДСД до конечной концентрации 0.1%. В буфер для образцов добавляли 5% меркаптоэтанол и прогревали смесь с белками в течение 10 минут при 100°С.
Для проведения электрофоретического разделения белков использовалась Электрофоретическая установка с блоком питания фирмы Эльф-4.
Наличие белка в пробах подтверждалось с помощью следующего эксперимента. В соседние лунки на геле наносили пробы с предварительным кипячением при 100°С и с добавлением меркаптоэтанола и пробы без предварительного кипячения. Тетрамер белка стрептавинида имеет молярную массу примерно 60 кДа и дает бенд на геле в соответствующем для этой молекулярной массе месте. При кипячении тетрамерная структура данного белка разрушается, и он распадается на мономеры, дающие бенды на геле в области молекулярных масс равных 15 кДа. Наличие бендов в указанных областях молекулярных масс одновременно, а именно в области 60 кДа в случае нанесения проб без кипячения и в области 15 кДа в случае нанесения проб с кипячением, говорит о присутствии белка стрептавидина в пробе. Таким образом, с помощью данного эксперимента удалось подтвердить наличие белка стрептавидина в пробах, выделенных из периплазматической фракции.
Пример 9. Проверка активности белка методом иммуноблоттинга.
Для проверки полученного гетеротетрамерного стрептавидина на способность связывать биотин был использован метод иммуноблоттинга. На нитроцеллюлозный фильтр 1×1 см или 2×2,5 см наносили по 1 мкл гетеротетромеров стрептавидина. «Окраску» нитроцеллюлозного фильтра осуществляли с использованием следующих растворов:
Раствор I: 3% обезжиренное молоко («Sigma», США) на
ФБР (профильтрованное).
Раствор II: Разведенный в 3 раза раствор I.
Раствор III: 6 мг 4-хлор-1-нафтола, 2 мл 96% этанола, до 12 мл ФБР, 6 мкл 3033% перекиси водорода.
Инкубировали нитроцеллюлозный фильтр в растворе I в течение 30 минут при постоянном покачивании при комнатной температуре. Затем инкубировали с биотинилированной пероксидазой в растворе I в течение 1 часа при покачивании при комнатной температуре и отмывали 3 раза по 5 минут раствором II.
Далее инкубировали в течение 1 часа при покачивании при комнатной температуре со вторыми антителами, стрептавидином конъюгированным с пероксидазой хрена («ICN», США). Необходимое количество вторых антител рассчитывали исходя из протокола фирмы-производителя. Нитроцеллюлозный фильтр отмывали трижды по 5 минут ФБР и окрашивали раствором III.
С помощью данного эксперимента удалось подтвердить наличие активного стрептавидина в пробах.