Современные методы получения β-галактозидаз

ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ

«НАУКА. ИННОВАЦИИ. ТЕХНОЛОГИИ», № 3, 2014

УДК: 577.152.32 Скрипнюк А. А. [Skripnyuk A. A.], Рябцева С. А. [Riabtseva S. A.]

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ В-ГАЛАКТОЗИДАЗ

Modern methods for producing p-galactosidase

В статье рассмотрены различные методы получения и выделены несколько основных направлений совершенствования технологии р-галактозидаз.

Ключевые слова: р-галактозидаза, лактоза, продуцент, иммобилизация.

This article discusses various methods for obtaining and identify several key areas for improving p-galactosidase technology.

Key words: p-galactosidase, lactose, producing, immobilization.

Р-Галактозидаза (лактаза, КФ 3.2.1.23) - фермент класса гидролаз, катализирующий реакции гидролиза и трансгалакто-зилирования лактозы [1]. Это дает возможность для широкого применения фермента в медицине и пищевой промышленности для получения:

— лекарственных средств;

— глюкозо-галактозных сиропов;

— продуктов функционального назначения для людей с лактазной недостаточностью;

— сухих смесей для детского питания;

— галактоолигосахаридов (ГОС);

— спирта из молочной сыворотки;

— питательных сред для культивирования микроорганизмов.

В качестве промышленных продуцентов Р-галакто-зидазы используют грибы (дрожжи, плесени) и бактерии. При этом оптимальные условия применения ферментов, полученных из разных видов микроорганизмов, различны, особенно в рН диапазоне.

Р-Галактозидазы условно подразделяются на внутриклеточные и внеклеточные. Продуцентами внутриклеточной Р-галактозидазы являются дрожжи и бактерии, внеклеточной - плесени. Р-Галактозидазы дрожжей, как правило, являются олигомерами, имеющими молекулярную массу от 200 до 600 кДа и представленными различным количеством субъединиц. Ферментные белки проявляют максимум активности в диапазоне рН 6,8-7,2, активаторы фермента - ионы магния и марганца. Р-Галактозидазы бактериального происхождения представляют собой белки внутриклеточной локализации, которые различаются молекулярной массой, количеством субъединиц, рН-оптимумом действия, термостабильностью. Бактериальные Р-галактозидазы, как и дрожжевые, проявляют максимум активности в диапазоне рН 6,5-7,5. Внеклеточная Р-галактозидаза плесеней - гликопротеин молекулярной массы 115-176 кДа, субъединичной структуры не имеет, не активируется металлами, оптимальный рН действия 3,6-5,3. Внеклеточная Р-галактозидаза более стабильна, но менее активна, чем внутриклеточная Р-галактозидаза дрожжей и бактерий [1]. Недостатком получения фермента из плесеней является необходимость очистки фермента от токсичных метаболитов продуцента, а недостатком уже полученного фермента является низкая активность. Недостаток применения дрожжей и бактерий как продуцентов - это сложность извлечения фермента из клеток продуцентов, кроме того, фермент в свободном состоянии не стабилен, а для его активации требуется вносить ионы металлов.

Для преодоления данных недостатков в настоящее время ведется поиск продуцентов фермента с расширенным рН и температурным диапазоном действия. В литературе описаны продуценты Р-галактозидаз, которые хорошо работают при высоких температурах. Так, например, Р-галактозидаза Teratosphaeria а^о^вгта АШ BGA-1 стабильна в диапазоне рН от 1,5 до 7.0, имея оптимум рН 2.54.0 при температуре 70 °С [2]. В работе [3] в качестве продуцента Р-галактозидазы используется штамм из рода Пегтт, оптимальными условиями действия фермента, полученного из этого штамма, являются температура 75-85 °С и рН 4,5-6,5.

В Китае клонировали и выделили ген термоустойчивой бета-галактозидазы bgaB из В. stearothermophilus и В. subtilis WB600 [4]. Оптимальная температура для этой бета-галактозидазы - 70 °С. Этот

рекомбинантный термоустойчивый фермент показал высокий уровень трансгалактозилирующей активности при гидролизе лактозы. Результаты показывают, что фермент может быть использован для гидролиза лактозы и производства галактоолигосахаридов (ГОС) [4].

Российские ученые определили последовательность нуклео-тидов геномного фрагмента ДНК 4936-bp термофильной бактерии Thermoanaerobacter ethanolicus [5]. Фрагмент содержал три открытых рамки считывания (ORFs). Один из ORF соответствовал гену Lac термоустойчивой ß-галактозидазы. Нативный рекомбинантный LacA показал самую высокую активность при 75-80 °C [5].

Кроме поиска продуцентов фермента, который будет стабилен при высоких температурах, также ведутся исследования продуцента с низким диапазоном температур. Это связано с тем, что производство холодоустойчивых ß-D-галактозидаз из микроорганизмов представляет интерес для биотехнологических производств, для гидролиза лактозы в молоке и молочных продуктах при низких температурах, переработки подсырной сыворотки и производства биоэтанола. Генетический код ß-D-галактозидазы был изолирован из генома антарктической бактерии Arthrobacter sp. 32 c. [6]. Хотя самая высокая активность этого очищенного фермента была получена при 50 °C, 60 % активности этого фермента были определены при 25 °C, и 15 % активности были обнаружены при 0 °C [6]. ß-Галактозидаза Arthrobacter psychrolactophilus имеет высокую 70 % активность при 0 °С [7]. ß-Галактозидаза, продуцируемая базидиомицетными дрожжами Guehomyces pullulans, имеет высокую каталитическую активность при 0 °С и рН 4,0 [8]. H0y0ux и др. [9] очистили бета-галактозидазу антарктической грамотрица-тельной бактерии Pseudoalteromonas haloplanktis ТЭ 79, причем очищенный фермент характеризуется оптимальной активностью при низкой температуре. ß-Галактозидаза, полученная с использованием Pseudoalteromonas sp. 22b, сохраняла активность при температуре от 0 до 40 °С с увеличением удельной активности соответственно от 20 до 190 U мг-1 при рН 6-8 [10].

Для решения проблемы сохранения активности лактазы в настоящее время ведутся разработки по усовершенствованию технологии иммобилизации фермента. В работе [11] ß-галактозидаза Bacillus circulans, применяемая для синтеза галактоолигосахаридов

(ГОС), была иммобилизована на глиоксил агарозу. В следующей работе [12] проводилась ковалентная иммобилизация ß-галактозидазы Kluyveromyces lactis на активированные многослойные углеродные нано-трубки (MWCNTs). Прикрепление большего количества фермента на поверхность MWCNTs было достигнуто с помощью глу-тарового альдегида. Оптимальное значение pH иммобилизованной ß-галактозидазы равно 7,0, а оптимальный диапазон рабочих температур от 40 °C до 50 °C.

В работах [13, 14] ß-D-галактозидаза плесени Aspergillus oryzae была иммобилизована на различных носителях. В работе [13] в качестве сорбента выступают магнитные наночастицы Fe3O4 - хитозан (Fe3O4-CS). Авторы другой статьи [14] проводили исследования по усовершенствованию наночастиц серебра (AgNPs) с помощью глута-рового альдегида для высокоэффективной иммобилизации фермента. Иммобилизованный фермент показал повышенную устойчивость к изменению рН и температуры.

Для иммобилизации ß - галактозидазы в следующей работе [15] использовали гибридный носитель альгинат-желатин-фосфат кальция, причем альгинатная капсула была покрыта желатиновой пленкой или кальцинированной оболочкой. Следует отметить, что желатин был впервые использован для иммобилизации ферментов при комнатной температуре и нейтральном рН. Проведенные исследования показали, что собранная фосфат кальциевая оболочка значительно увеличивает механическую стабильность и снижает степень набухания капсулы, повышает эффективность иммобилизации и ингибирует потерю ß-галактозидазы. Иммобилизованная ß-галактозидаза в капсулах из альгината, желатина и фосфата кальция показала повышенную стабильность к изменению рН и температуры [15].

Для получения более активного продуцента ß-галактозидазы выполнены работы по выделению и клонированию генов, ответственных за синтез ß-галактозидазы. К примеру, в одной из работ [16] предложен комбинированный белок бета-галактозидазы и целлюлозосвя-зывающей эндоглюканазы CelD из Anaerocellum thermophilium.

В следующих исследованиях [17] в ген MIG1 дрожжей Kluyveromyces marxianus КМ интегрировали ген HPT (кодирование гигромицина фосфотрансферазы) при помощи ORF (открытая рамка

считывания) гена MIG1. Полученный мутант (migl мутант) КМ-15 может вырасти в средах, содержащих гигромицин или 2-дезокси-О-глюкозу. Свойства Р-галактозидазы Migl КМ-15 были значительно выше по сравнению с Р-галактозидазой K. marxianus КМ. Это подтверждает, что Mig1, транскрипционный репрессор, действительно регулирует экспрессию гена и биосинтеза фермента.

Новый ген Р-галактозидазы (Tnap1577) от гипертермофильной бактерии Thermotoga naphthophila RUK-10 был клонирован и включен в Escherichia coli BL21 (DE3) [19]. Рекомбинантную Р-галактозидазу очищали в три этапа: термообработка, Ni-NTA аффинная хроматография и Q-сахарозная хроматография. Оптимальными температурами для гидролиза o-нитрофенил-бета-о-галактозида (o-NPG) и лактозы рекомбинантной Р-галактозидазой оказались 90 °C и 70 °C. Соответствующие оптимальные значения рН составили 5,8-6,8. Молекулярная масса фермента ровна 70 кДа. Рекомбинантная Р-галактозидаза от Thermotoga naphthophila RUK-10 также показала трансгликозилиру-ющую активность в синтезе алкил-галактопиранозида. Эта означает, что фермент имеет потенциал для более широкого биотехнологического применения [18].

Таким образом, анализ литературы позволяет выделить несколько основных направлений совершенствования технологии Р-галактозидаз:

— проведение генно-инженерных работ с целью повышения активности продуцентов;

— поиск природных продуцентов ферментов, способных работать как при повышенных (70-85 °C), так и при пониженных (0 °С) температурах, а также в расширенном температурном диапазоне (например, от 0 до 40 °С) и диапазоне рН (в частности, от 1,5 до 7,0);

— разработка новых методов иммобилизации клеток и ферментов.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Seyis I, Aksoz N. Production of lactase by Trichoderma sp. // Food Technol Biotechnol 2004; V. 42. P. 121-124.

2. Kimiyasu I. Characterization of new p-galactosidase from acidophilic fungus,Teratosphaeria acidotherma AIU BGA-1 / I. Kimiyasu, M. Yamashita, S. Chiba, N. Takahashi, T. Koyama // Bioscience and Bioengineering. 2013. Vol 116, № 3. Р 293-297.

3. Three forms of thermostable lactose-hydrolase from Thermus sp. IB-21: cloning, expression, and enzyme characterization / S. K. Kang [et al.] // J. Biotechnol. 2005. Vol. 116, № 4. P. 337-346.

4. Chen W. Production, purification, and characterization of a potential thermostable galactosidase for milk lactose hydrolysis from Bacillus stearothermophilus / W. Chen, H. Chen, Y. Xia, J. Zhao, F. Tian, H. Zhang // J. Dairy Sci. 2008; 91:1751-1758.

5. Volkov I. Y. Thermoanaerobacter ethanolicus gene cluster containing the a- and & Galactosidase genes mel A and lac A and properties of recombinant LacA / L. Y. Volkov, N. A. Lunina, O. V. Berezina, G.A. Velikodvorskaya, V. V. Zverlov // Molecular Biology. 2005; 39(6):799-805.

6. Hildebrandt P. A new cold-adapted p-D-galactosidase from the Antarctic Arthrobacter sp. 32 c. - gene cloning, overexpression, purification and properties / P. Hildebrandt, M. Wanarska, J. Kur // BMC Microbiology-2009. 9 (151): 1-11.

7. Nakagawа Т. Overexpression and functional analysis of cold-active p-galactosidase from Arthrobacter psychrolactophilus strain F2 / T. Nakagawa, R. Ikehata, T. Myoda, T. Miyaji, N. Tomizuka // Protein Expression and Purification. 2007. Vol 54. № 3. Р. 295-299.

8. p-Galactosidase production by the psychrotolerant yeast Gueho-myces pullulans 17-1 isolated from sea sediment in Antarctica and lactose hydrolysis / C. Song [et al.] // Bioproc. Biosyst. Eng. 2010. Vol. 33, № 9. P. 1025-1031.

9. Hoyoux A. Cold-adapted ^-galactosidase from the Antarctic psy-chrophile Pseudoalteromonas haloplanktis / A. Hoyoux, I. Jennes, P. Dubois, S. Genicot, F. Dubail, J. M. Francois, E. Baise, G. Feller, C. Gerday // Applied and Environmental Microbiology. 2001.

10. Turkiewicz М. Antarctic marine bacterium Pseudoalteromonas sp. 22b as a source of cold-adapted p-galactosidase / M. Turkiewicz, J. Kur, А. Biatkowska, H. Cieslinskib, H. Kalinowskaa, S. Bielecki // Biomolecular Engineering, 2003. Vol. 20. Р 317-324.

11. Urrutia P. Immobilization of Bacillus circulans p-galactosidase and its application in the synthesis of galacto-oligosaccharides under repeated-batch operation / P. Urrutia, C. Mateo, J.M. Guisan, L.

Wilson, A. Illanes // Biochemical Engineering Journal. 2013. Vol. 77. P. 41-48.

12. Ansari S. A. Enhanced stability of Kluyveromyces lactis p galac-tosidase immobilized on glutaraldehyde modified multiwalled carbon nanotubes / S. A. Ansaria R. Satarb, S. Chibberc, M. J. Khan // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2013. Vol. 97. P. 258-263.

13. Pan C. Novel and efficient method for immobilization and stabilization of p-d-galactosidase by covalent attachment onto magnetic Fe3O4-chitosan nanoparticles / C. Pan, B. Hu, W. Li, Y. Sun, H. Ye, X. Zeng // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2009. Vol. 61. P. 208-215.

14. Ansari S. A. Cost effective surface functionalization of silver nanoparticles for high yield immobilization of Aspergillus ory-zae p-galactosidase and its application in lactose hydrolysis / S. A. Ansari, R. Satar, F. Alam, M. H. Alqahtani, А. G. Chaudhary, M. I. Naseer, S. Karim, I. A. Sheikh // Process Biochemistry. 2012. Vol. 47. №12. - P. 2427-2433.

15. Shen Q. Gelatin-templated biomimetic calcification for p-ga-lactosidase immobilization / Q. Shen, R. Yang, X. Hua, F. Ye, W. Zhang, W. Zhao // Process Biochemistry. 2011. Vol. 46. P. 15651571.

16. Патент № 2278160, C2. Рекомбинантный белок LACspCBD, обладающий бета-галактозидазной активностью и способностью связываться с целлюлозосодержащими сорбентами, реком-бинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез рекомбинан-тного белка LACspCBD, штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pLACspCBD] - продуцент рекомбинантного белка LACspCBD. Способ получения иммобилизованного рекомбинантного белка LACspCBD на целлюлозе / И.М. Великодворская и др. 13.04.2004.

17. Zhou H-X. p-Galactosidase over-production by a mig1 mutant of Kluyveromyces marxianus KM for efficient hydrolysis of lactose / H. Zhou, Jin-Li Xu, Z. Chi, Guang-Lei Liu, Zhen-Ming Chi // Biochemical Engineering Journal. 2013. Vol. 76. P. 17-24.

18. Kong F. Cloning, purification and characterization of a thermostable p-galactosidase from Thermotoga naphthophila RUK-10 / F. Kong, Y. Wang, S. Cao, R. Gao, Guiqiu Xie // Process Biochemistry, 2014. Vol 49. P. 775-782.

ОБ АВТОРАХ

Рябцева Светлана Андреевна, доктор технических наук ро-фессор кафедры прикладной биотехнологии Северо-Кавказского федерального университета. Тел. 8 (8652) 23-39-43. E-mail: ryabtseva07@mail.ru

Скрипнюк Андрей Александрович, аспирант кафедры прикладной биотехнологии Института живых систем Северо-Кавказского федерального университета. Тел. 89880887416. E-mail: skripnyuk1989@mail.ru.

Ryabtseva Svetlana Andreevna, doctor of technical sciences Professor of the Department of Applied Biotechnology North Caucasus Federal University. Phone: 8 (8652) 23-39-43. E-mail: ryabtseva07@mail.ru

Skripnyuk Andrew Aleksandrovich, graduate of the Department of Applied Biotechnology North-Caucasian Federal University. Phone: 89880887416. E-mail: skripnyuk1989@mail.ru.