ПОЛУЧЕНИЕ ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ ВИРУСА ГРИППА В РАСТЕНИЯХ
OBTAINING VIRUS-LIKE PARTICLES OF INFLUENZA VIRUS IN PLANTS

Область техники, которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к получению вирусоподобных частиц в растениях.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Грипп вызывается РНК-содержащим вирусом семейства ортомиксовирусов (Orthomyxoviridae). Существуют три типа этих вирусов, и они могут вызывать три различных типа гриппа: тип А, В и С. Вирусы гриппа типа А инфицируют млекопитающих (людей, свиней, хорьков, лошадей) и птиц. Для человечества они представляют особое значение, поскольку являются типом вируса, вызывающим всемирные пандемии. Вирус гриппа тип В (также известный просто как грипп В) инфицирует только людей. Периодически он вызывает локальные вспышки гриппа. Вирусы гриппа С также инфицируют только людей. Они инфицируют в основном людей в молодом возрасте и редко вызывают серьезное заболевание.
Вакцинация обеспечивает защиту от заболевания, вызываемого подобным агентом, индуцируя у субъекта повышение защитных функций до инфицирования. Общепринято она осуществляется посредством применения живых ослабленных или цельных инактивированных форм инфекционных агентов в качестве иммуногенов. Во избежание опасности использования цельного вируса (такого как убитые или ослабленные вирусы) в качестве вакцины, рекомбинантные вирусные белки, например, субъединицы, были исследованы в качестве вакцин. Как пептидные, так и субъединичные вакцины подвержены действию ряда потенциальных ограничений. Субъединичные вакцины могут проявлять слабую иммуногенность вследствие неправильной укладки или слабой презентации антигена. Основной проблемой является сложность обеспечения того, чтобы конформация сконструированных белков имитировала конформацию антигенов в их природном окружении. Для обеспечения повышения иммунного ответа необходимо использовать подходящие адъюванты и в случае пептидов белки-носители. Кроме того, указанные вакцины вызывают первичные гуморальные ответы и, таким образом, могут оказаться неспособными вызывать эффективный иммунитет. Субъединичные вакцины зачастую неэффективны для заболеваний, при которых цельный инактивированный вирус может продемонстрировать обеспечение защиты.
Вирусоподобные частицы (ВПЧ) представляют собой потенциальных кандидатов для введения в иммуногенные композиции. ВПЧ очень напоминают зрелые вирионы, но они не содержат вирусный геномный материал. Следовательно, ВПЧ являются нерепликативными по природе, что делает их безопасными для введения в качестве вакцины. Кроме того, ВПЧ можно сконструировать для экспрессии вирусных гликопротеинов на поверхности ВПЧ, что представляет собой их наиболее нативное физиологическое расположение. Более того, поскольку ВПЧ напоминают интактные вирионы и представляют собой поливалентные крупнодисперсные структуры, ВПЧ могут являться более эффективными в индукции нейтрализирующих антител к гликопротеину, чем растворимые капсулярные белковые антигены.
ВПЧ получили в растениях (международные патентные публикации WO 2009/009876; WO 2009/076778; WO 2010/003225; WO 2010/003235; WO 2011/03522; WO 2010/148511; которые включены в настоящий документ посредством ссылки), и в системах насекомых и млекопитающих (Noad, R. and Roy, P., 2003, Trends Microbiol 11: 438-44; Neumann et al., 2000, J. Virol., 74, 547-551). Latham and Galarza (2001, J. Virol., 75, 6154-6165) сообщили об образовании ВПЧ гриппа в клетках насекомых, инфицированных бакуловирусом, коэкспрессирующим гены гемагглютинина (НА), нейраминидазы (NA), M1 и М2. Это исследование продемонстрировало, что белки вириона гриппа обладают самосборкой при коэкспрессии в эукариотических клетках и что для производства ВПЧ был необходим белок матрикса M1. Gomez-Puertas с соавт. (1999, J. Gen. Virol, 80, 1635-1645) показали, что избыточная экспрессия М2 полностью блокировали передачу РНК CAT в культурах MDCK.
Гликопротеин шиловидных отростков - гемагглютинин (НА) вирусов гриппа очень важен для поглощения вирусных частиц клеткой - хозяином. Он отвечает за их прикрепление к содержащим сиаловые кислоты клеточным рецепторам и вовлечен в проникновение вируса посредством слияния оболочки вируса с клеточными мембранами. Активность слияния и, следовательно, инфекционность вируса зависят от расщепления молекулы - предшественника НА, НА0, на соединенные дисульфидными мостиками полипептидные цепи, НА1 и НА2. Расщепление и последующее рН-зависимое конформационное изменение приводят к выходу на поверхность и перемещение высоко консервативного гидрофобного пептида на амино-конце транс мембранного полипептида НА2, что опосредует слияние мембран.
НА синтезируется в виде белка-предшественника НА0, который подвергается протеолитическому процессингу на две субъединицы (НА1 и НА2), соединенные вместе дисульфидным мостиком. Полагают, что два структурных признака вовлечены в расщепляемость НА: в НА с ограниченной расщепляемостью линкер, как правило, состоит из одного остатка аргинина, тогда как НА, расщепляемые в широком диапазоне различных типов клкток, содержит вставку серии множественных основных остатков в этом положении с основным мотивом распознавания ферментами Arg-X-Lys/Arg-Arg, где Х представляет собой неосновную аминокислоту. НА с состоящим из множественных основных остатков сайтом расщепления расщепляются на экзоцитозном транспортном пути до того, как они достигают сайт бадинга на клеточной поверхность; в отличие от НА с одноосновным линкером, которые активируются на вирусных частицах либо во внеклеточном пространстве, либо, как показано для штамма WSN, на стадии входа вируса в клетку. Вторая детерминанта расщепления НА, вероятно, представляет собой углеводную боковую цепь, которая находится вблизи сайта расщепления и влияет на доступность для протеазы. Потеря этого углевода приводила к усиленной расщепляемости НА и вирусной патогенности.
Штаммы вируса гриппа млекопитающих и апатогенные птичьи штаммы вируса гриппа вызывают анатомически локализованные инфекции в результате ограниченного диапазона клеток, секретирующих протеазу, которая расщепляет предшественник НА0 внеклеточно (Chen J, et. al. 1998, Cell. Vol 95 :409-417). Протеазы, отвечающие за расщепление НА0 при инфекциях гриппа у людей, секретируются клетками дыхательных путей или коинфицирующими бактериями или микоплазмами, или они могут быть произведены в воспалительных ответах на инфекции. Основной кандидат - протеаза представляет собой триптазу Клара, которая производится клетками Клара эпителия бронхиол и характеризуется ограниченным распределением в тканях (верхние дыхательные пути). Протеаза является специфической в отношении одноосновной последовательности Q/E-X-R, обнаруженной на сайте расщепления H1, Н2, Н3 и Н6. НА из штаммов Н9 и В демонстрирует немного отличающийся одноосновный сайт расщепления с последовательностью SSR и KER, соответственно. Ни одна протеаза не была идентифицирована для большинства вирусов гриппа, которые вызывают кишечную и респираторную инфекцию, наблюдаемую у водоплавающих птиц. Большинство клеточных линий не поддерживают многоцикловую репликацию, если только не была добавлена экзогенная протеаза (как правило, трипсин).
Тем не менее у высокопатогенных птичьих штаммов НА0 расщепляются с помощью семейства более широко распространенных внутриклеточных протеаз, приводя к системным инфекциям гриппа. Это отличие в патогенности коррелирует со структурными различиями на сайте расщепления НА0. Патогенные штаммы содержат вставки многоосновных аминокислот в пределах или рядом с одноосновным сайтом. Расщепление в этом случае происходит внутриклеточно, и вовлеченные в него протеазы были идентифицированы как фурин и другие субтилизин-подобные ферменты, встречающиеся в аппарате Гольджи и вовлеченные в посттрансляционный процессинг предшественников гормонов и факторов роста. Последовательность распознавания фурином R-X-R/K-R представляет собой часто встречающуюся аминокислотную вставку на сайтах расщепления НА0 Н5 и Н7. Широкое распространение фермента в тканях и эффективность внутриклеточного расщепление вносят вклад в широко распространенную и вирулентную системную инфекцию, вызванную указанными вирусами.
Сайт расщепления НА представляет собой мишень для ослабления вируса, поскольку активирующее расщепление предшественника НА0 на фрагменты НА1 и НА2 протеазами хозяина представляет собой стадию цикла репликации всех штаммов вируса гриппа А и В. Только расщепленный НА может подвергаться конформационному изменению в кислой среде эндосомы после опосредованного рецептором эндоцитоза для обнажения гидрофобного N-конца фрагмента НА2 для опосредования слияния между мембранами эндосомы и вириона.
Horimoto Т с соавт. (2006, Vaccine, Vol 24: 3669-3676) описали устранение многоосновного сайта расщепления Н5 (RERRRKKR↓G) в Н5. Выбранных мутантов подвергали исследованию иммуногенности на мышах, включая в себя мутанта с делецией первых четырех заряженных аминокислот (RERR) и модификацией для инактивации многоосновного сайта расщепления (RKKR на TETR). Устранение сайта расщепления не оказало воздействия на иммуногенные свойства мутантного Н5. Также сообщалось об устранение многоосновного сайта (GERRRKKR↓G, замещенного RETR) с получением мутантной формы NIBSC 05/240 NIBSC эталонного вируса гриппа NIBG-23. Hoffman с соавт. (2002, 2002, Vaccine, Vol 20:3165-3170) провели замещение многоосновного сайта расщепления НА Н5 одноосновным сайтом Н6 для усиления экспрессии в яйцах. Первые 4 остатка подвергали делеции и четыре последних аминокислоты многоосновного сайта замещали IETR (замещение RERRRKKR↓G с помощью IETR↓G). Указанный мутантный Н5 показал высокий уровень экспрессии, потенциальный протеолиз и конформационное изменение при низком значении рН, необходимые для вирусной репликации и производства в клетке-хозяине, нет данных в отношении имумногенности. Указанные исследования показывают, что модификацию сайта расщепления можно использовать для уменьшения вирулентности вирусной частицы (в случаях, когда реплицируются настоящие вирусы), позволяя вирусу реплицироваться, не убивая яйцо-хозяина. Без таких мутаций вирусы убивают яйцо до достижения высоких титров.
В международной патентной публикации WO 2013043067 Sirko с соавт. описывают ДНК - содержащую вакцину для цыплят, которая содержит кДНК, кодирующую модифицированный белок гемагглютинин Н5 (НА), в котором протеолитический сайт расщепления между субъединицами НА подвергнут делеции. Sirko в соавт. утверждают, что это обеспечивает большую безопасность вакцин и экспрессию "супер-антигена" в форме длинного, непроцессированного полипептида. Sirko с соавт. также утверждают, что кодирующая область НА модифицирована таким образом, что производство белка в клетках птицы достигает максимального выхода. Основная модификация представляет собой оптимизацию кодона для цыплят и делецию чувствительной к протеолизу области НА.
В международной патентной публикации WO 2013/044390 описан способ получения вирусоподобной частицы (ВПЧ) в растении с модифицированным гемагглютинином (НА), в которой модифицированный белок НА содержит модифицированную протеолитическую петлю. Модифицированный НА экспрессируется в присутствии регуляторной области НТ вируса мозаики коровьего гороха (CPMV) и геминивирусного амплификационного элемента из вируса желтой карликовости бобов (BeYDV).
В заявке на выдачу патента США №2008/0069821 Yang с соавт. раскрывают варианты полипептидов и полинуклеотидов НА гриппа для применения в производстве вирусов гриппа в качестве вакцин. Реассортантные вирусы гриппа получают путем введения подгруппы векторов, соответствующих геномным сегментам исходного вируса гриппа, в комбинации с комплементарными сегментами, происходящими из вариантов НА гриппа. Как правило, исходные штаммы выбирают на основании требуемых свойств, имеющих отношение к введению вакцины. Например, для производства вакцины, например, для производства живой ослабленной вакцины исходный донорный штамм вируса может быть выбран для ослабленного фенотипа, холодовой адаптации и/или температурной чувствительности.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к получению вирусоподобных частиц и модифицированных белков НА в растениях.
Целью настоящего изобретения является обеспечение улучшенного производства вирусоподобных частиц и белков НА в растениях.
В настоящем документе описана нуклеиновая кислота, содержащая энхансер экспрессии, активный в растении и функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный гемагглютинин гриппа (НА), содержащий модифицированную протеолитическую петлю.
Более того, в настоящем документе описан способ (А) получения вирусоподобной частицы (ВПЧ) в растении, предусматривающий следующее:
a) введение нуклеиновой кислоты, содержащей энхансер экспрессии, активный в растении и функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный гемагглютинин гриппа (НА), содержащий модифицированную протеолитическую петлю, в растение или часть растения;
b) инкубация растения или части растения при условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновой кислоты с получением при этом ВПЧ.
Кроме того, в настоящем документе описан способ (В) получения вирусоподобных частиц гриппа (ВПЧ) в растении, предусматривающий следующее:
a) предоставление растения или части растения, содержащих нуклеиновую кислоту, содержащую энхансер экспрессии, активный в растении и функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный гемагглютинин гриппа (НА), содержащий модифицированную протеолитическую петлю, и
b) инкубация растения или части растения при условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновой кислоты с получением при этом ВПЧ.
Более того в настоящем документе описан способ (С) получения модифицированного белка НА, содержащего модифицированную протеолитическую петлю, содержащую один или несколько сайтов расщепления протеазой, проявляющих сниженное или устраненное расщепление в растении, предусматривающий следующее:
a) введение нуклеиновой кислоты, содержащей энхансер экспрессии, активный в растении и функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный гемагглютинин гриппа (НА), содержащий модифицированную протеолитическую петлю, в растение или часть растения;
b) инкубация растения или части растения при условиях, которые обеспечивают экспрессию белка НА с получением при этом модифицированного белка НА,
c) сбор растения и очищение модифицированного белка НА.
Описанные выше способы (А), (В) или (С) могут дополнительно предусматривать стадии
c) сбора растения, и
d) очищения ВПЧ, причем размер ВПЧ находится в диапазоне 80-300 нм.
Более того, в настоящем документе описан способ (D) увеличения выхода продукта белка НА в растении, предусматривающий следующее:
а) введение нуклеиновой кислоты, содержащей энхансер экспрессии, активный в растении и функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный гемагглютинин гриппа (НА), содержащий модифицированную протеолитическую петлю, в растение или часть растения;
b) инкубация растения или части растения при условиях, которые обеспечивают экспрессию белка НА с получением при этом модифицированного белка НА,
c) сбор растения и очищение белка НА.
Энхансер экспрессии может представлять собой CPMVX, CPMVX+ или CPMV-HT+. Более того, нуклеиновая кислота может не содержать элемент амплификации геминивируса. Следовательно, нуклеиновая кислота может не содержать длинную межгенную область вируса желтой карликовости бобов (BeYDV LIR) и короткую межгенную область BeYDV (BeYDV SIR). Модифицированная протеолитическая петля может содержать один или несколько сайтов расщепления протеазой, проявляющих пониженное или устраненное расщепление протеазой. Протеаза может быть Клара-подобной или фуриноподобной. Более того, модифицированная протеолитическая петля может содержать линкерную последовательность, и линкерная последовательность может характеризоваться аминокислотной последовательностью GG, TETQ или TETR. Модифицированный НА может содержать нативный или ненативный сигнальный пептид. Более того, нуклеотидная последовательность, кодирующая модифицированный НА, может содержать химерную нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательно следующее: модифицированный эктодомен НА, содержащий модифицированную протеолитическую петлю, трансмембранный домен гриппа и цитоплазматический хвост, причем модифицированный эктодомен НА происходит из первого штамма гриппа, а транс мембранный домен и цитоплазматический хвост из второго штамма гриппа.
Модифицированная протеолитическая петля может содержать один или несколько сайтов расщепления протеазой, проявляющих пониженное или устраненное расщепление протеазой. Более того, нуклеотидная последовательность, кодирующая НА, выбрана из группы, состоящей из НА типа В, НА типа С, H1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, H11, Н12, Н13, Н14, Н15 и Н16. Также в настоящем документе описана вирусоподобная частица (ВПЧ), полученная способом (А). Вирусоподобная частица (ВПЧ) может содержать специфические для растения N-гликаны или модифицированные N-гликаны.
Согласно настоящему раскрытию также предусмотрена композиция, содержащая эффективную дозу ВПЧ для индукции иммунного ответа и фармацевтически приемлемый носитель.
Также в настоящем документе описана нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую гемагглютинин гриппа (НА), при этом нуклеотидная последовательность функционально связана с регуляторной областью, которая активна в растении; причем НА содержит последовательность модифицированной протеолитической петли. Нуклеиновая кислота может кодировать НА, содержащий модифицированную протеолитическую петлю, причем белок характеризуется активностью гемагглютинина (НА). Также предусмотрено растение, содержащее нуклеиновую кислоту. Также предусмотрена вирусоподобная частица (ВПЧ), полученная в растении, причем ВПЧ содержит гемагглютинин вируса гриппа (НА), кодируемый нуклеиновой кислотой, и один или несколько липидов растительного происхождения.
В приведенном кратком раскрытии настоящего изобретения не обязательно описаны все признаки настоящего изобретения.
Краткое описание графически материалов
Эти и другие признаки настоящего изобретения станут более понятными из последующего описания, в котором приведены ссылки на прилагаемые графические материалы, где:
На фигуре 1 показаны компоненты, используемые для получения A-2X35S/CPMV-НТ/Н5 Indonesia/NOS (конструкт номер 489). На фигуре 1А показан праймер IF-H5A-I-05.s1+3c (SEQ ID NO: 2). На фигуре 1В показан праймер IF-H5dTm.r (SEQ ID NO: 3). На фигуре 1C показано схематическое изображение конструкта 1191. На фигуре 1D показан конструкт 1191 (SEQ ID NO 4). На фигуре 1Е показана экспрессионная кассета номер 489 (SEQ ID NO 5). На фигуре 1F показана аминокислотная последовательность Н5 из вируса гриппа A/Indonesia/5/2005 (H5N1) (SEQ ID NO: 6). На фигуре 1G показана нуклеотидная последовательность, кодирующая Н5 из вируса гриппа A/Indonesia/5/2005 (H5N1) (SEQ ID NO: 42).
На фигуре 2 показаны компоненты, используемые для получения B-2X35S/CPMV НТ/М2 New Caledonia/NOS (конструкт номер 1261). На фигуре 2А показан праймер IF-S1-M1+M2ANC.c (SEQ ID NO: 7). На фигуре 2В показан праймер IF-S1-4-M2ANC.r (SEQ ID NO: 8). На фигуре 2С показана нуклеотидная последовательность для синтезированного гена М2 (соответствующего нуклеотидам 1-26, соединенным с 715-982 из учетного номера Genbank DQ508860) (SEQ ID NO: 9). На фигуре 2D показана экспрессионная кассета номер 1261 от промотора 2X35S до терминатора NOS. М2 из вируса гриппа A/New Caledonia/20/1999 (H1N1) подчеркнут. (SEQ ID NO: 10). На фигуре 2Е показана аминокислотная последовательность М2 из вируса гриппа A/New Caledonia/20/1999 (H1N1) (SEQ ID NO: 11).
На фигуре 3 показаны компоненты, используемые для получения C-2X35S/CPMV-НТ/М2 Puerto Rico/NOS (конструкт номер 859). На фигуре 3А показана нуклеотидная последовательность синтезированного гена М2 (соответствующего нуклеотидам 26-51, соединенным с нуклеотидами 740-1007 из учетного номера Genebank EF467824) (SEQ ID NO: 12). На фигуре 3В показана экспрессионная кассета номер 859 от промотора 2X35S до терминатора NOS. М2 из вируса гриппа A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) подчеркнут. (SEQ ID NO: 13). На фигуре 3С показана аминокислотная последовательность М2 из вируса гриппа A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) (SEQ ID NO: 14).
На фигуре 4 показаны компоненты, используемые для получения G-2X35S/CPMV-HT/PDISP/HA В Brisbane/NOS в амплификационной системе BeYDV+репликаза (конструкт номер 1008). На фигуре 4А показано схематическое изображение конструкта 1194. На изображении указаны сайты распознавания рестрикционными ферментами SacII и StuI, используемые для линеаризации плазмиды. На фигуре 4В показан конструкт 1194 от левой до правой границ т-ДНК (подчеркнуто). 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS в амплификационной системе BeYDV+репликаза с экспрессионной кассетой ингибитора сайленсинга пластоцианин-Р19-пластоцианин (SEQ ID NO: 31). На фигуре 4С показана экспрессионная кассета номер 1008 от левой LIR BeYDV до правой LIR BeYDV. PDISP/HA из вируса гриппа B/Brisbane/60/2008 подчеркнут. (SEQ ID NO: 32).
На фигуре 5 показаны компоненты, используемые для получения I-2X35S/CPMV-HT/PDISP/HA В Brisbane с подвергнутыми делеции протеолитической петлей/NOS в амплификационной системе BeYDV+репликаза (конструкт номер 1059). На фигуре 5А показан праймер 1039+1059.r (SEQ ID NO: 38). На фигуре 5В показан праймер 1039+1059.с (SEQ ID NO: 39). На фигуре 5С показана экспрессионная кассета номер 1059 от левой LIR BeYDV до правой LIR BeYDV. PDISP/HA из штамма гриппа B/Brisbane/60/2008 с подвергнутой делеции протеолитической петлей подчеркнут (SEQ ID NO: 40). На фигуре 5D показана аминокислотная последовательность PDISP/HA из штамма гриппа B/Brisbane/60/2008 с подвергнутой делеции протеолитической петлей (SEQ ID NO: 41). На фигуре 5Е показаны нуклеотидная последовательность PDISP/HA из штамма гриппа B/Brisbane/60/2008 с подвергнутой делеции протеолитической петлей (SEQ ID NO: 43).
На фигуре 6 показаны компоненты, используемые для получения B-2X35S/CPMV-НТ/НА В Wisconsin/NOS в амплификационной системе BeYDV(m)+репликаза (конструкт номер 1462). На фигуре 6А показан праймер IF-HAB110.S1+3c (SEQ ID NO: 49). На фигуре 6В показан праймер IF-HAB110.s1-4r (SEQ ID NO: 50). На фигуре 6С показана нуклеотидная последовательность синтезированного НА В Wisconsin (учетный номер Genbank JN993010) (SEQ ID NO: 51). На фигуре 6D показано схематическое изображение конструкта 193. На фигуре 6Е показан конструкт 193 от левой до правой границ т-ДНК (подчеркнуто). 2X35S/CPMV-HT/NOS в амплификационной системе BeYDV(m)+репликаза с экспрессионной кассетой ингибитора сайленсингапластоцианин-Р19-пластоцианин (SEQ ID NO: 52). На фигуре 6F показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 1462 от промотора 2X35S до терминатора NOS. НА из штамма гриппа B/Wisconsin/1/2010 подчеркнут (SEQ ID NO: 53). На фигуре 6G показана аминокислотная последовательность НА из штамма гриппа B/Wisconsin/1/2010 (SEQ ID NO: 54). На фигуре 6Н показано схематическое изображение конструкта 1462.
На фигуре 7 показаны компоненты, используемые для получения C-2X35S/CPMV-НТ/НА В Wisconsin с подвергнутыми делеции протеолитической петлей/NOS в амплификационной системе BeYDV(m)+репликаза (конструкт номер 1467). На фигуре 7А показан праймер HAB110(PrL-).r (SEQ ID NO: 55). На фигуре 7В показан праймер НАВ110(PrL-).c (SEQ ID NO: 56). На фигуре 7С показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 1467 от промотора 2X35S до терминатора NOS. НА из штамма гриппа B/Wisconsin/1/2010 с подвергнутой делеции протеолитической петлей подчеркнут (SEQ ID NO: 57). На фигуре 7D показана аминокислотная последовательность вируса грипп B/Wisconsin/1/2010 с подвергнутой делеции протеолитической петлей (SEQ ID NO: 58). На фигуре 7Е показано схематическое изображение конструкта 1467.
На фигуре 8 показаны компоненты, используемые для получения A-2X35S/CPMV-HT/PDISP/HA В Brisbane с подвергнутыми делеции протеолитической петлей/NOS (конструкт номер 1039). На фигуре 8А показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 1039 от промотора 2X35S до терминатора NOS. НА из штамма гриппа B/Brisbane/60/2008 с подвергнутой делеции протеолитической петлей подчеркнут (SEQ ID NO: 15). На фигуре 8В показано схематическое изображение конструкта 1039.
На фигуре 9 показана плазмидная карта конструкта номер 1008. Конструкт номер 1008 управляет экспрессией НА дикого типа из штамма гриппа B/Brisbane/60/2008. Указанный конструкт содержит управляемые BeYDV элементы для амплификации ДНК.
На фигуре 10 показана плазмидная карта конструкта номер 1059. Конструкт номер 1059 управляет экспрессией мутантного НА из штамма гриппа B/Brisbane/60/2008 с подвергнутой делеции протеолитической петлей. Указанный конструкт содержит управляемые BeYDV элементы для амплификации ДНК.
На фигуре 11 показана плазмидная карта конструкта номер 1261. Конструкт номер 1261 управляет экспрессией М2 дикого типа из штамма гриппа A/New Caledonia/20/99 (H1N1).
На фигуре 12 показана плазмидная карта конструкта номер 859. Конструкт номер 859 управляет экспрессией М2 дикого типа из штамма гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1).
На фигуре 13А показан анализ вестерн-блоттинг экспрессии белка НА в агроинфильтрованных листьях Nicotiana benthamiana. "1008'": экспрессия НА дикого типа из B/Brisbane/60/2008 в присутствии амплификационных элементов (BeYDV); "1008+1261": коэкспрессия НА дикого типа из B/Brisbane/60/2008 в присутствии амплификационных элементов (BeYDV) с М2 из A/New Caledonia/20/99; "1059": экспрессия мутантного НА из B/Brisbane/60/2008 в присутствии амплификационных элементов (BeYDV); "1059+1261": коэкспрессия мутантного НА из B/Brisbane/60/2008 в присутствии амплификационных элементов (BeYDV) с М2 из A/New Caledonia/20/99. Анализировали растения из трех отдельных инфильтраций (А, В и С). Соотношения указывают на пропорцию культур Agrobacterium, используемых в экспериментах по коэкспрессии. На фигуре 13В показано сравнение гемагглютинационной способности сырых белковых экстрактов из производящих НА растений.
На фигуре 14 показан анализ вестерн-блоттинг экспрессии белка НА в агроинфильтрованных листьях Nicotiana benthamiana. "1059": экспрессия мутантного НА из B/Brisbane/60/2008 в присутствии амплификационных элементов (BeYDV); "1059+1261": коэкспрессия мутантного НА из B/Brisbane/60/2008 в присутствии амплификационных элементов (BeYDV) с М2 из A/New Caledonia/20/99. "1059+859": коэкспрессия мутантного НА из B/Brisbane/60/2008 в присутствии амплификационных элементов (BeYDV) с М2 из A/Puerto Rico/8/34. Анализировали растения из трех отдельных инфильтраций (А, В и С). Соотношения указывают на пропорцию культур Agrobacterium, используемых в экспериментах по коэкспрессии.
На фигуре 15 показано выравнивание аминокислотной последовательности области, окружающей линкер НА из нескольких штаммов гриппа: H1 New Cal (SEQ ID NO: 22); H1 Brisbane (SEQ ID NO: 23); H1 Sol Islands (SEQ ID NO: 24); H2A Singapore (SEQ ID NO: 25); H3A Brisbane (SEQ ID NO: 26); H3A WCN (SEQ ID NO: 27); H5 Anhui (SEQ ID NO: 28); H5 Indo (SEQ ID NO: 29); H5 Vietnam (SEQ ID NO: 30); H6 Teal HK (SEQ ID NO: 33); H7 Eq Prague (SEQ ID NO: 34); H9A HK (SEQ ID NO: 35); В Florida (SEQ ID NO: 36); В Malaysia (SEQ ID NO: 37). Сайт расщепления предшественника НА0 указан стрелкой.
На фигуре 16А показан анализ вестерн-блоттинг экспрессии белка НА в агроинфильтрованных листьях Nicottana benthamiana. НА из B/Wisconsin/1/2010 коэкспрессирован с М2 из A/New Caledonia/20/99. 10 мкг белкового экстракта загружали на каждую полосу. "С+": положительный контроль, полуочищенный вирус B/Wisconsin/1/2010 из Национального института биологических стандартов и контроля, Великобритания; "1462": экспрессия НА дикого типа из B/Wisconsin/1/2010 в присутствии амплификационных элементов (BeYDV); "1467": экспрессия мутантного НА из B/Wisconsin/1/2010 в присутствии амплификационных элементов (BeYDV); "1462+1261": коэкспрессия НА дикого типа из B/Wisconsin/1/2010 в присутствии амплификационных элементов (BeYDV) с М2; "1467+1261": коэкспрессия мутантного НА из B/Wisconsin/1/2010 в присутствии амплификационных элементов (BeYDV) с М2. Соотношения указывают оптическую плотность для каждой культуры Agrobacterium, используемой в экспериментах по экспрессии и коэкспрессии. На фигуре 16 В показано сравнение гемагглютинационной способности сырых белковых экстрактов из растений, трансформированных с помощью AGL1/1462, AGL1/1467, AGL1/1462+AGL1/1261 и AGL1/1467+AGL1/1261.
На фигурах 17А и 17В показан анализ вестерн-блоттинг экспрессии белка НА в агроинфильтрованных листьях Nicotiana benthamiana. "1008": экспрессия НА дикого типа из B/Brisbane/60/2008 в присутствии амплификационных элементов (BeYDV); "1008+1261": коэкспрессия НА дикого типа из B/Brisbane/60/2008 в присутствии амплификационных элементов (BeYDV) с М2 из A/New Caledonia/20/99;"1039":экспрессия мутантного НА из B/Brisbane/60/2008 при отсутствии амплификационных элементов (BeYDV). "1039+1261": коэкспрессия мутантного НА из B/Brisbane/60/2008 при отсутствии амплификационных элементов (BeYDV) с М2 из A/New Caledonia/20/99. НА из A/Brisbane/59/2007 (H1N1). "1059'": экспрессия мутантного НА из B/Brisbane/60/2008 в присутствии амплификационных элементов (BeYDV); "1059+1261": коэкспрессия мутантного НА из B/Brisbane/60/2008 в присутствии амплификационных элементов (BeYDV) с М2 из A/New Caledonia/20/99.
На фигуре 18А показано схематическое изображение расщепления НА0 с помощью Клара-подобной и/или фуриноподобной протеазой в НА1 и НА2. На фигуре 18В показано выравнивание последовательности НА из нескольких штаммов гриппа: H1 New Cal (SEQ ID NO: 22); H1 Brisbane (SEQ ID NO: 23); H1 Sol Islands (SEQ ID NO: 24); H2A Singapore (SEQ ID NO: 25); H3A Brisbane (SEQ ID NO: 26); H3A WCN (SEQ ID NO: 27); H5 Anhui (SEQ ID NO: 28); H5 Indo (SEQ ID NO: 29); H5 Vietnam (SEQ ID NO: 30); H6 Teal HK (SEQ ID NO: 33); H7 Eq Prague (SEQ ID NO: 34); H9A HK (SEQ ID NO: 35); В Florida (SEQ ID NO: 36); В Malaysia (SEQ ID NO: 37). На фигуре 18С показана делеция части сайта расщепления в штаммах H5: A/Anhui/1/2005 (H5N1) SEQ ID NO: 69, A/Indonesia/5/2005 (H5N1) SEQ ID NO: 70, A/Vietnam/I 194/2004 (H5N1) SEQ ID NO: 71, и штаммах типа В: B/Florida/4/2006 SEQ ID NO: 72 и B/Malaysia/2506/2004 SEQ ID NO: 73.
На фигуре 19 показана мутация сайта расщепления в H5/Indo. Нативная последовательность (SEQ ID NO: 44); модифицированный сайт расщепления H5/Indo, содержащий TETR (SEQ ID NO: 45); модифицированный сайт расщепления H5/Indo, содержащий TETQ (SEQ ID NO: 46).
На фигуре 20 показаны титры, обнаруженные в исходных биомассах после ферментативной экстракции различных модифицированных НА H5/Indo, содержащих мутации внутри протеолитической петли. Контроль H5/Indo (конструкт 489); протеолитическая петля H5/Indo, замещенная линкером GG (конструкт 928); протеолитическая петля H5/Indo, замещенная линкером TETR (конструкт 676); протеолитическая петля H5/Indo, замещенная линкером TETQ (конструкт 766).
На фигуре 21 показаны различные подходы для модификации протеолитической петли НА типа В. На фигуре 21А показана аминокислотная последовательность нативного B/Brisbane/60/2008 (SEQ ID NO: 16). Подчеркнутая часть представляет собой протеолитическую петлю и домен НА2. На фигуре 21В показана аминокислотная последовательность B/Brisbane/60/2008 с модифицированной протеолитической петлей (SEQ ID NO: 17), причем, содержащая 19 аминокислотных остатков последовательность AKLLKERGFFGAIAGFLEG была замещены линкером GG (курсив). На фигуре 21С показана аминокислотная последовательность B/Brisbane/60/2008 (SEQ ID NO: 18), причем содержащая 9 аминокислотных остатков последовательность PPAKLLKER была замещена линкером GSSSGSSSG- (курсив). На фигуре 21 D показана аминокислотная последовательность нативного Н3 A/Perth/I 6/2009 (SEQ ID NO: 19). На фигуре 21Е показана аминокислотная последовательность Н3 A/Perth/16/2009 (SEQ ID NO: 20) с содержащей 12 аминокислотных остатков последовательностью RNVPEKQTRGIF, замещенной линкером GS (курсив). На фигуре 21F показана аминокислотная последовательность Н3 A/Perth/16/2009 (SEQ ID NO: 21), причем содержащая 9 аминокислотных остатков последовательность RNVPEKQTR была замещена линкером GSSGSSGSS (курсив).
На фигуре 22 показан анализ вестерн-блоттинг экспрессии белка НА в агроинфильтрованных листьях Nicotiana benthamiana. НА из H5/Indo. На верхней панели перечислены компоненты, загружаемые на каждую полосу; нижняя панель: вестерн-блоттинг. С: рекомбинантный Н5 Indonesia/5/05 S-STD-0002; первичное антитело: анти-НА A/Indonesia/05/2005 CBER # S-BIO-0003 1/50 000; блот. Полосы 1 и 2: контроль H5/Indo (конструкт 489); полосы 3 и 4 протеолитическая петля H5/Indo, замещенная линкером GG (конструкт 928); полосы 5 и 6 протеолитическая петля H5/Indo, замещенная линкером TETR (конструкт 676); полосы 7 и 8 протеолитическая петля H5/Indo, замещенная линкером TETQ (конструкт 766); полоса 9 маркер ММ; полоса 10 контроль Н5.
На фигуре 23 показаны компоненты, используемые для получения B-2X35S/CPMV-НТ/Н5 из A/Indonesia/5/2005 с мутацией сайта расщепления TETR (конструкт номер 676). На фигуре 23А показана последовательность праймера MutCleavage-H5(Indo).r (SEQ ID NO: 74). На фигуре 23В показана последовательность праймера MutCleavage-H5(Indo).c (SEQ ID NO: 75). На фигуре 23С показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 76) для экспрессионной кассеты 676 от промотора 2X35S до терминатора NOS. Мутант сайта расщепления TETR H5 из вируса гриппа A/hidonesia/5/2005 (H5N1) подчеркнут. На фигуре 23D показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 77) мутанта сайта расщепления TETR H5 из вируса гриппа A/Indonesia/5/2005 (H5N1). На фигуре 23Е показано схематическое изображение конструкта номер 676.
На фигуре 24 показаны компоненты, используемые для получения B-2X35S/CPMV-НТ/Н5 из A/Indonesia/5/2005 с мутацией сайта расщепления TETQ (конструкт номер 766). На фигуре 24А показана последовательность праймера H5I505 TETQ.r (SEQ ID NO: 78). На фигуре 24В показана последовательность праймера H5I505 TETQ. с (SEQ ID NO: 79). На фигуре 24С показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 80) для экспрессионной кассеты 766 от промотора 2X35S до терминатора NOS. Мутант сайта расщепления TETQ H5 из вируса гриппа A/Indonesia/5/2005 (H5N1) подчеркнут. На фигуре 24D показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 81) мутанта сайта расщепления TETQ H5 из вируса гриппа A/Indonesia/5/2005 (H5N1). На фигуре 24Е показано схематическое изображение конструкта номер 766.
На фигуре 25 показаны компоненты, используемые для получения B-2X35S/CPMV-НТ/Н5 из A/Indonesia/5/2005 с подвергнутой делеции протеолитической петлей (конструкт номер 928). На фигуре 25А показана последовательность праймера H5I505(PrL-).r (SEQ ID NO: 82). На фигуре 25В показана последовательность праймера H5I505(PrL-).c (SEQ ID NO: 83). На фигуре 25С показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 84) для экспрессионной кассеты 928 от промотора 2X35S до терминатора NOS. Подвергнутая делеции протеолитическая петля H5 из вируса гриппа A/Indonesia/5/2005 (H5N1) подчеркнута. На фигуре 25D показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 85) мутанта H5 из вируса гриппа A/Indonesia/5/2005 (H5N1), содержащего подвергнутую делеции протеолитическую петлю. На фигуре 25Е показано схематическое изображение конструкта номер 928.
На фигуре 26А показана общая схема примера нескольких энхансерных последовательностей, CPMVX и CPMVX+ (содержащая CPMVX и спейсерный фрагмент, который в настоящем неограничивающем примере содержит сайт множественного клонирования и последовательность Козак растения), описанных в настоящем документе. Каждая из СРМСХ и CPMVX+ показана как функционально связанная с регуляторной областью растения на своих 5' концах, а на своих 3' концах, последовательно, с представляющей интерес нуклеотидной последовательность (включая в себя сайт инициации ATG и стоп-сайт), 3'UTR и последовательностью - терминатором. Пример конструкта CPMVX, описанного в настоящем документе, представляет собой CPMV160. Пример конструкта CPMVX+, описанного в настоящем документе, представляет собой CPMV160+. На фигуре 26В показаны относительные титры гемагглютинации (HMG) в сырых белковых экстрактах модифицированных белков НА, произведенных в растениях, содержащих CPMV-НТ экспрессионные конструкты, и основанные на CPMV160+ экспрессионные конструкты. Показаны данные в отношении экспрессии НА В Brisbane/60/08 с подвергнутой делеции протеолитической петлей и с сигнальным пептидом PDI (конструкт номер 1039, 5'UTR: CMPV НТ; и конструкт номер 1937, 5'UTR: CMPV160+; смотрите пример 5.7), В Brisbane/60/08+H1Tm, с подвергнутой делеции протеолитической петлей, с трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом, замещенными трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом H1, В Massachusetts/2/2012 2012 с подвергнутой делеции протеолитической петлей и с сигнальным пептидом PDI (конструкт номер 2072, 5'UTR: CMPV НТ; и конструкт номер 2050, 5'UTR: CMPV160+; смотрите пример 5.14), В Massachusetts/2/2012+H1Tm с подвергнутой делеции протеолитической петлей, с трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом, замещенными трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом H1 A/California/07/2009 и с сигнальным пептидом PDI (конструкт номер 2074, 5'UTR: CMPV НТ; и конструкт номер 2060, 5'UTR: CMPV160+; смотрите пример 5.15), B Wisconsin/1/2010 с подвергнутой делеции протеолитической петлей и с нативным сигнальным пептидом (конструкт номер 1445, 5'UTR: CMPV НТ; и конструкт номер 1975, 5'UTR: CMPV160+; смотрите пример 5.16), и В Wisconsin/1/2010+H1Tm с подвергнутой делеции протеолитической петлей, с трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом, замещенными транс мембранным доменом и цитоплазматическим хвостом H1 A/California/07/2009 и с нативным сигнальным пептидом (конструкт номер 1454, 5TJTR: CMPV HT; и конструкт номер 1893, 5'UTR: CMPV160+; смотрите пример 5.18).
На фигуре 27А показана общая схема энхансерной последовательности CPMV HT и CPMV HT+, слитой с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. Не все элементы, показанные на этой фигуре, могут быть необходимы в энхансерной последовательности. Дополнительные элементы могут быть включены на 3' конце представляющей интерес нуклеотидной последовательности (не показано), включая в себя последовательность, кодирующую 3' нетранслируемую область комовируса (UTR), 3' UTR пластоцианина или комбинацию 3' UTR комовируса и 3' UTR пластоцианина. На фигуре 27В показан относительный титр гемагглютинации (HMG) в сырых белковых экстрактах белков, произведенных в растениях, содержащих экспрессионные конструкты CPMV-HT, и основанные на CPMV HT+ экспрессионные конструкты, функционально связанные с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. Показаны данные для экспрессии НА В Brisbane/60/08 с подвергнутой делеции протеолитической петлей и с сигнальным пептидом PDI (конструкт номер 1039: CPMV HT; смотрите пример 5.7 и конструкт номер 1829: CPMV HT+; смотрите пример 5.12), В Brisbane/60/08+Н1ТМ с подвергнутой делеции протеолитической петлей, с трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом, замещенными транс мембранным доменом и цитоплазматическим хвостом H1 A/California/07/2009 и с сигнальным пептидом PDI (конструкт номер 1067: CPMV HT; смотрите пример 5.14 и конструкт номер 1875: CPMV HT+; смотрите пример 5.19), В Massachusetts/2/2012 с подвергнутой делеции протеолитической петлей и с сигнальным пептидом PDI (конструкт номер 2072: CMPV HT; смотрите пример 5.15 и конструкт номер 2052: CMPV HT+; смотрите пример 5.20), В Massachusetts/2/2012+H1Tm с подвергнутой делеции протеолитической петлей, с трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом, замещенными трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом H1 A/California/07/2009 и с сигнальным пептидом PDI (конструкт номер 2074: CMPV HT; смотрите пример 5.16 и конструкт номер 2062: CMPV HT+; смотрите пример 5.21), В Wisconsin/1/2010 с подвергнутой делеции протеолитической петлей и с нативным сигнальным пептидом (конструкт номер 1445: CMPV HT; смотрите пример 5.17 и конструкт номер 1839: CMPV HT+; смотрите пример 5.22), и В Wisconsin/1/2010+H1Tm с подвергнутой делеции протеолитической петлей, с трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом, замещенными трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом H1 A/California/07/2009 и с нативным сигнальным пептидом (конструкт номер 1454: CMPV НТ; смотрите пример 5.18 и конструкт номер 1860: CMPV HT+; смотрите пример 5.23).
На фигуре 28А показан анализ вестерн-блоттинг экспрессии белка Н3 Perth в агроинфильтрованных листьях Nicotiana benthamiana. Полоса 1: (2019+1261) коэкспрессия нативного НА (дикого типа) из Н3 Perth-16-09 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV-НТ+) с М2 из A/New Caledonia/20/99; полоса 2: (2139+1261) коэкспрессия нативного НА (дикого типа) из Н3 Perth-16-09 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV 160+) с М2 из A/New Caledonia/20/99; полоса 3 (2039+1261) коэкспрессия мутантного (модифицированного) НА из Н3 Perth-16-09 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV HT+) с М2 из A/New Caledonia/20/99; полоса 4: (2159+1261) коэкспрессия мутантного (модифицированного) НА из Н3 Perth-16-09 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV 160+) с М2 из A/New Caledonia/20/99.
На фигуре 28В показан анализ вестерн-блоттинг экспрессии белка В Malaysia в агроинфильтрованных листьях Nicotiana benthamiana. Полоса 2: (2013+1261) коэкспрессия нативного НА (дикого типа) из В Malaysia 2506-04 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV-160+) c M2 из A/New Caledonia/20/99; полоса 2: (2014+1261) коэкспрессия мутантного (модифицированного) НА из В Malaysia 2506-04 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV 160+) с М2 из A/New Caledonia/20/99.
На фигуре 28С показан анализ вестерн-блоттинг экспрессии белка Н9 Hong Kong в агроинфильтрованных листьях Nicotiana benthamiana. Полоса 1: (1610+1261) коэкспрессия нативного НА (дикого типа) из Н9 Hong Kong-1037-99 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV-HT) с М2 из A/New Caledonia/20/99; полоса 2: (1630+1261) коэкспрессия нативного НА (дикого типа) из Н9 Hong Kong -1037-99 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV-НТ+) и амплификационного элемента BEYDV с М2 из A/New Caledonia/20/99; полоса 3: (2244+1261) коэкспрессия нативного НА (дикого типа) из Н9 Hong Kong -1037-99 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV-HT+) с М2 из A/New Caledonia/20/99; полоса 4: (2226+1261): коэкспрессия нативного НА (дикого типа) из Н9 Hong Kong -1037-99 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV 160+) с М2 из A/New Caledonia/20/99. Полоса 6: (2246+1261) коэкспрессия нативного НА (дикого типа) из Н9 Hong Kong -1037-99 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV-160+) и амплификационного элемента BeYDV с М2 из A/New Caledonia/20/99; полоса 7: (2225+1261) коэкспрессия мутантного (модифицированного) НА из Н9 Hong Kong -1037-99 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV-HT+) с М2 из A/New Caledonia/20/99; полоса 8: (2245+1261) коэкспрессия мутантного (модифицированного) НА из Н9 Hong Kong -1037-99 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV HT+) и амплификационного элемента BeYDV с М2 из A/New Caledonia/20/99. Полоса 9: (2227+1261) коэкспрессия мутантного (модифицированного) НА из Н9 Hong Kong -1037-99 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV 160+) с М2 из A/New Caledonia/20/99. Полоса 10: (2247+1261) коэкспрессия мутантного (модифицированного) НА из Н9 Hong Kong -1037-99 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV 160+) и амплификационного элемента BeYDV с М2 из A/New Caledonia/20/99.
На фигуре 28D показан анализ вестерн-блоттинг экспрессии белка В Massachusetts в агроинфильтрованных листьях Nicotiana benthamiana. Полоса 1: (2070+1261) коэкспрессия нативного НА (дикого типа) из В Massachusetts -2-12 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV-HT) с М2 из A/New Caledonia/20/99; полоса 2: (2080+1261) коэкспрессия нативного НА (дикого типа) из В Massachusetts -2-12 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV-HT+) с М2 из A/New Caledonia/20/99; полоса 3: (2090+1261) коэкспрессия нативного НА (дикого типа) из В Massachusetts -2-12 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV-160+) с М2 из A/New Caledonia/20/99; полоса 4: (2072+1261) коэкспрессия мутантного (модифицированного) НА из В Massachusetts -2-12 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV НТ) с М2 из A/New Caledonia/20/99; полоса 5: (2052+1261) коэкспрессия мутантного (модифицированного) НА из В Massachusetts -2-12 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV HT+) с М2 из A/New Caledonia/20/99; полоса 6: (2050+1261) коэкспрессия мутантного (модифицированного) НА из В Massachusetts -2-12 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV 160+) с М2 из A/New Caledonia/20/99.
На фигуре 28Е показан анализ вестерн-блоттинг экспрессии белка Н2 Sin в агроинфильтрованных листьях Nicotiana benthamiana. Полоса 1: (2220+1261) коэкспрессия нативного НА (дикого типа) из Н2 Singapore -1-57 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV-HT+) с М2 из A/New Caledonia/20/99; полоса 2: (2222+1261) коэкспрессия нативного НА (дикого типа) из Н2 Singapore -1-57 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV 160+) с М2 из A/New Caledonia/20/99. Полоса 3: (2221+1261) коэкспрессия мутантного (модифицированного) НА из Н2 Singapore -1-57 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV-HT+) с М2 из A/New Caledonia/20/99; полоса 4: (2223+1261) коэкспрессия мутантного (модифицированного) НА из Н2 Singapore-1-57 в присутствии энхансера экспрессии (CPMV 160+) с М2 из A/New Caledonia/20/99.
На фигуре 28F показан анализ вестерн-блоттинг экспрессии белка B/Forida в агроинфильтрованных листьях Nicotiana benthamiana. Полоса 1: (1004+1261) коэкспрессия нативного НА (дикого типа) из B/Florida в присутствии энхансера экспрессии (CPMV-HT) с М2 из A/New Caledonia/20/99; полоса 2: (1003+1261) коэкспрессия нативного НА (дикого типа) из B/Florida в присутствии энхансера экспрессии (CPMV НТ) и амплификационный элемент BeYDV с М2 из A/New Caledonia/20/99. Полоса 3: (2102+1261) коэкспрессия мутантного (модифицированного) НА из B/Florida в присутствии энхансера экспрессии (CPMV-HT+) с М2 из A/New Caledonia/20/99; полоса 4: (2104+1261) коэкспрессия мутантного (модифицированного) НА из B/Florida в присутствии энхансера экспрессии (CPMV HT+) и амплификационный элемент BeYDV с М2 из A/New Caledonia/20/99. Полоса 5: (2106+1261) коэкспрессия мутантного (модифицированного) НА из B/Florida+H1 California TMCT в присутствии энхансера экспрессии (CPMV HT+) с М2 из A/New Caledonia/20/99. Lane 6: (2108+1261) коэкспрессия мутантного (модифицированного) НА из B/Florida+H1 California TMCT в присутствии энхансера экспрессии (CPMV HT+) и амплификационный элемент BeYDV с М2 из A/New Caledonia/20/99.
На фигуре 29А показан относительный титр НА модифицированного НА из различных штаммов гриппа, которые экспрессировали в присутствии энхансерного элемента CPMV НТ, CPMV HT+ или CPMV 160+. Активность сравнивают с нативным белком НА, экспрессированным с помощью того же энхансерного элемента. Н3 A Perth/16/09 (Н3 Pei-1609), Н3 Victoria/361/11 (Н3 Vic26111), В Brisbane 60/2008 (НВ Bris60008), В Malaysia 2506/04 (НВ Mal 250604) и В Massachusetts 2/12 (Ма212) коэкспрессировали с белком гриппа М2.
На фигуре 30А показан праймер IF-S2+S4-B Bris.c (SEQ ID NO: 86). На фигуре 30В показан праймер IF-Sla4-B Bris.r (SEQ ID NO: 87). На фигуре 30С показана нуклеотидная последовательность синтезированного гена НА В Brisbane (соответствующего нуклеотидам 34-1791 из учетного номера Genbank FJ766840) (SEQ ID NO: 88). На фигуре 30D показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 1029 от промотора 2X35S до терминатора NOS. PDISP/HA из штамма гриппа B/Brisbane/60/2008 подчеркнут.(SEQ ID NO: 89). На фигуре 30Е показана аминокислотная последовательность PDISP/HA из штамма гриппа B/Brisbane/60/2008 (SEQ ID NO: 90). На фигуре 30F показано схематическое изображение конструкта 1029. На изображении указаны сайты распознавания рестрикционными ферментами SacII и StuI, использованные для линеаризации плазмиды.
На фигуре 31 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 1039 и 1829 (2X35S/CPMV НТ PDISP/HA В Brisbane (PrL-) NOS и 2X35S/CPMV HT+PDISP/HA В Brisbane (PrL-) NOS, соответственно; смотрите пример 5.12). Конструкт номер 1039 содержит известную из предшествующего уровня техники последовательность CPMV-HT (5'UTR CMPV с мутированным старт-кодоном в положении 161, слитую с последовательностью, кодирующей неполный белок М) и не содержит гетерологичную последовательность Козак между 5'UTR и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью (PDISP/HA В Brisbane (PrL-)). Конструкт номер 1829 включает в себя 5'UTR CPMV, содержащую 160 нуклеотидов, спейсерный фрагмент, содержащий неполный белок М, сайт множественного клонирования и последовательность Козак растения, и представляет собой пример основанного на CPMV HT+ конструкт. PDISP: сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы; NOS: терминатор нопалинсинтазы; PrL-: подвергнутая делеции протеолитическая петля. На фигуре 31А показана нуклеотидная последовательность PDISP/HA В Brisbane (PrL-) (SEQ ID NO: 91). На фигуре 31В показана аминокислотная последовательность PDISP/HA В Brisbane (PrL-); SEQ ID NO: 92). На фигуре 31С показано схематическое изображение конструкта номер 1829 (2X35S/CPMV HT+).
На фигуре 32 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 1039 и 1937 (2X35S/CPMV НТ PDISP/HA В Brisbane (PrL-) NOS и 2X35S/CPMV160+ PDISP/HA В Brisbane (PrL-) NOS, соответственно; смотрите пример 5.7). Конструкт номер 1039 содержит известную из предшествующего уровня техники последовательность CPMV-HT (5'UTR CMPV с мутированным старт-кодоном в положении 161, слитую с последовательностью, кодирующей неполный белок М) и не содержит гетерологичную последовательность Козак между 5'UTR и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью (PDISP/HA В Brisbane (PrL-)). Конструкт номер 1937 включает в себя 5'UTR CPMV, содержащую 160 нуклеотидов, спейсерный фрагмент (сайт множественного клонирования) и последовательность Козак растения (указанный конструкт не содержит последовательность, кодирующую неполный белок М) и представляет собой пример основанного на CPMV160+ (CPMVX+, где Х=160) конструкта. PDISP: сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы; NOS: терминатор нопалинсинтазы; PrL-: подвергнутая делеции протеолитическая петля. На фигуре 32А показано схематическое изображение конструкта номер 1937 (2X35S/CPMV160+; основанный на CPMVX+ конструкт, где Х=160).
На фигуре 33 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 1067 и 1977 (2X35S/CPMV НТ PDISP/HA В Brisbane (Prl-)+H1 California ТМСТ NOS и 2X35S/CPMV160+ PDISP/HA В Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT NOS, соответственно; смотрите пример 5.14). Конструкт номер 1067 содержит известную из предшествующего уровня техники CPMV-HT последовательность (5'UTR CMPV с мутированным старт-кодоном в положении 161, слитую с последовательностью, кодирующей неполный белок М) и не содержит гетерологичную последовательность Козак между 5'UTR и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью (PDISP/HA В Brisbane (PrL-)+Н1 California TMCT). Конструкт номер 1977 включает в себя 5'UTR CPMV, содержащую 160 нуклеотидов, спейсерный фрагмент (сайт множественного клонирования) и последовательность Козак растения (указанный конструкт не содержит последовательность, кодирующую неполный белок М) и представляет собой пример основанного на CPMV160+ (CPMVX+, где Х=160) конструкта. PDISP: сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы; NOS: терминатор нопалинсинтазы; PrL-: подвергнутая делеции протеолитическая петля; ТМСТ: транс мембранный домен цитоплазматический хвост. На фигуре 33А показана нуклеотидная последовательность PDISP/HA В Brisbane (PrL-)+H1 California ТМСТ (SEQ ID NO: 95). На фигуре 33В показана аминокислотная последовательность PDISP/HA В Brisbane (PrL-)+H1 California ТМСТ (SEQ ID NO: 96). На фигуре 33С показано схематическое изображение конструкта номер 1067 (2X35S/CPMV НТ; эталонный конструкт). На фигуре 33D показано схематическое изображение конструкта номер 1977 (2X35S/CPMV160+; основанный на CPMVX+ конструкт, где X=160).
На фигуре 34 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 2072 и 2050 (2X35S/CPMV НТ PDISP/HA В Massachusetts (PrL-) NOS и 2X35S/CPMV160+ PDISP/HA В Massachusetts (PrL-) NOS, соответственно; смотрите пример 5.15). Конструкт номер 2072 содержит известную из предшествующего уровня техники CPMV-HT последовательность (5'UTR CMPV с мутированным старт-кодоном в положении 161, слитую с последовательностью, кодирующей неполный белок М) и не содержит гетерологичную последовательность Козак между 5'UTR и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью (PDISP/HA В Massachusetts (PrL-)). Конструкт номер 2050 включает в себя 5'UTR CPMV, содержащую 160 нуклеотидов, спейсерный фрагмент (сайт множественного клонирования) и последовательность Козак растения (указанный конструкт не содержит последовательность, кодирующую неполный белок М) и представляет собой пример основанного на CPMV160+ (CPMVX+, где Х=160) конструкта. PDISP: сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы; NOS: терминатор нопалинсинтазы; PrL-: подвергнутая делеции протеолитическая петля. На фигуре 34А показана нуклеотидная последовательность PDISP/HA В Massachusetts (PrL-) (SEQ ID NO: 97). На фигуре 34В показана аминокислотная последовательность PDISP/HA В Massachusetts (PrL-) (SEQ ID NO: 98). На фигуре 34С показано схематическое изображение конструкта номер 2072 (2X35S/CPMV НТ; эталонный конструкт). На фигуре 34D показано схематическое изображение конструкта номер 2050 (2X35S/CPMV160+; основанный на CPMVX+ конструкт, где Х=160).
На фигуре 35 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 2074 и 2060 (2X35S/CPMV НТ PDISP/HA В Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT NOS и 2X35S/CPMV160+ PDISP/HA В Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT NOS, соответственно; смотрите пример 5.16). Конструкт номер 2074 содержит известную из предшествующего уровня техники CPMV-HT последовательность (5'UTR CMPV с мутированным старт-кодоном в положении 161, слитую с последовательностью, кодирующей неполный белок М) и не содержит гетерологичную последовательность Козак между 5'UTR и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью (PDISP/HA В Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT). Конструкт номер 2060 включает в себя 5'UTR CPMV, содержащую 160 нуклеотидов, спейсерный фрагмент (сайт множественного клонирования) и последовательность Козак растения (указанный конструкт не содержит последовательность, кодирующую неполный белок М) и представляет собой пример основанного на CPMV160+ (CPMVX+, где Х=160) конструкта. PDISP: сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы; NOS: терминатор нопалинсинтазы; PrL-: подвергнутая делеции протеолитическая петля; TMCT: трансмембранный домен цитоплазматический хвост. На фигуре 35А показана нуклеотидная последовательность PDISP/HA В Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT (SEQ ID NO: 99). На фигуре 35В показана аминокислотная последовательность PDISP/HA В Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT (SEQ ID NO: 100). На фигуре 35С показано схематическое изображение конструкта номер 2074 (2X35S/CPMV НТ; эталонный конструкт). На фигуре 35D показано схематическое изображение конструкта номер 2060 (2X35S/CPMV160+; основанный на CPMVX+ конструкт, где Х=160).
На фигуре 36 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 1445, 1820 и 1975 (2X35S/CPMV НТ НА В Wisconsin (PrL-) NOS, 2X35S/CPMV160+ НА В Wisconsin (PrL-) NOS и 2X35S/CPMV160 НА В Wisconsin (PrL-) NOS, соответственно; смотрите пример 15.17). Конструкт номер 1445 содержит известную из предшествующего уровня техники CPMV-HT последовательность (5'UTR CMPV с мутированным старт-кодоном в положении 161, слитую с последовательностью, кодирующей неполный белок М) и не содержит гетерологичную последовательность Козак между 5 'UTR и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью (НА В Wisconsin (PrL-)). Конструкт номер 1820 включает в себя 5'UTR CPMV, содержащую 160 нуклеотидов, спейсерный фрагмент (сайт множественного клонирования) и последовательность Козак растения (указанный конструкт не содержит последовательность, кодирующую неполный белок М) и представляет собой пример основанного на CPMV160+ (CPMVX+, где Х=160) конструкта. Конструкт номер 1975 включает в себя 5'UTR CPMV, содержащую 160 нуклеотидов, и не включает в себя спейсерный фрагмент (сайт множественного клонирования) или последовательность Козак растения (указанный конструкт также не содержит последовательность, кодирующую неполный белок М) и представляет собой пример основанного на "CPMV160" (CPMVX) конструкта. prL-: подвергнутая делеции протеолитическая петля; NOS: терминатор нопалинсинтазы. На фигуре 36А показана нуклеотидная последовательность НА В Wisconsin (PrL-) (SEQ ID NO: 101). На фигуре 36В показана аминокислотная последовательность НА В Wisconsin (PrL-) (SEQ ID NO: 102). На фигуре 36С показано схематическое изображение конструкта номер 1445 (2X35S/CPMV НТ; эталонный конструкт). На фигуре 36D показано схематическое изображение конструкта номер 1820 (2X35S/CPMV160+; основанный на CPMVX+ конструкт). На фигуре 36Е показано схематическое изображение конструкта номер 1975 (2X35S/CPMV160; основанный на CPMVX конструкт, где Х=160).
На фигуре 37 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 1454 и 1893 (2X35S/CPMV НТ НА В Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT NOS и 2X35S/CPMV160+ НА В Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCTNOS, соответственно; смотрите пример 5.18). Конструкт номер 1454 содержит известную из предшествующего уровня техники CPMV-HT последовательность (5'UTR CMPV с мутированным старт-кодоном в положении 161, слитую с последовательностью, кодирующей неполный белок М) и не содержит гетерологичную последовательность Козак между 5'UTR и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью (НА В Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT). Конструкт номер 1893 включает в себя 5'UTR CPMV, содержащую 160 нуклеотидов, спейсерный фрагмент (сайт множественного клонирования) и последовательность Козак растения (указанный конструкт не содержит последовательность, кодирующую неполный белок М) и представляет собой пример основанного на CPMV160+ (CPMVX+, где Х=160) конструкта. NOS: терминатор нопалинсинтазы; PrL-: подвергнутая делеции протеолитическая петля; TMCT: трансмембранный домен цитоплазматический хвост. На фигуре 37А показана нуклеотидная последовательность НА В Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT (SEQ ID NO: 103). На фигуре 37В показана аминокислотная последовательность PDISP/HA В Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT (SEQ ID NO: 104). На фигуре 37С показано схематическое изображение конструкта номер 1454 (2X35S/CPMV НТ; эталонный конструкт). На фигуре 37D показано схематическое изображение конструкта номер 1893 (2X35S/CPMV160+; основанный на CPMVX+ конструкт, где Х=160).
На фигуре 38 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 1067 и 1875 (2X35S/CPMV НТ PDISP/HA В Brisbane (Prl-)+H1 California TMCT NOS и 2X35S/CPMV НТ+ PDISP/HA В Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT NOS, соответственно; смотрите пример 5.19). Конструкт номер 1067 содержит известную из предшествующего уровня техники CPMV-HT последовательность (5'UTR CMPV с мутированным старт-кодоном в положении 161, слитую с последовательностью, кодирующей неполный белок М) и не содержит гетерологичную последовательность Козак между 5 'UTR и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью (PDISP/HA В Brisbane (PrL-)+Н1 California TMCT). Конструкт номер 1875 включает в себя 5'UTR CPMV, содержащую 160 нуклеотидов, спейсерный фрагмент, содержащий неполный белок М, сайт множественного клонирования и последовательность Козак растения, и представляет собой пример основанного на CPMV HT+ конструкта. PDISP: сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы; NOS: терминатор нопалинсинтазы; PrL-: подвергнутая делеции протеолитическая петля; TMCT: трансмембранный домен цитоплазматический хвост. На фигуре 38А показана нуклеотидная последовательность PDISP/HA В Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT (SEQ ID NO: 105). На фигуре 38В показана аминокислотная последовательность PDISP/HA В Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT (SEQ ID NO: 106). На фигуре 38С показано схематическое изображение конструкта номер 1875 (2X35S/CPMV160+).
На фигуре 39 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 2072 и 2052 (2X35S/CPMV НТ PDISP/HA В Massachusetts (PrL-) NOS и 2X35S/CPMV HT+ PDISP/HA В Massachusetts (PrL-) NOS, соответственно; смотрите пример 5.20). Конструкт номер 2072 содержит известную из предшествующего уровня техники CPMV-HT последовательность (5'UTR CMPV с мутированным старт-кодоном в положении 161, слитую с последовательностью, кодирующей неполный белок М) и не содержит гетерологичную последовательность Козак между 5'UTR и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью (PDISP/HA В Massachusetts (PrL-)). Конструкт номер 2052 включает в себя 5'UTR CPMV, содержащую 160 нуклеотидов, спейсерный фрагмент, содержащий неполный белок М, сайт множественного клонирования и последовательность Козак растения, и представляет собой пример основанного на CPMV HT+ конструкта. PDISP: сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы; NOS: терминатор нопалинсинтазы; PrL-: подвергнутая делеции протеолитическая петля. На фигуре 39А показана нуклеотидная последовательность PDISP/HA В Massachusetts (PrL-) (SEQ ID NO: 107). На фигуре 39В показана аминокислотная последовательность PDISP/HA В Massachusetts (PrL-) (SEQ ID NO: 108). На фигуре 39С показано схематическое изображение конструкта номер 2052 (2X35S/CPMV HT+).
На фигуре 40 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 2074 и 2062 (2X35S/CPMV НТ PDISP/HA В Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT NOS и 2X35S/CPMV HT+PDISP/HA В Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT NOS, соответственно; смотрите пример 5.21). Конструкт номер 2074 содержит известную из предшествующего уровня техники CPMV-HT последовательность (5'UTR CMPV с мутированным старт-кодоном в положении 161, слитую с последовательностью, кодирующей неполный белок М) и не содержит гетерологичную последовательность Козак между 5'UTR и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью (PDISP/HA В Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT). Конструкт номер 2062 включает в себя 5'UTR CPMV, содержащую 160 нуклеотидов, спейсерный фрагмент, содержащий неполный белок М, сайт множественного клонирования и последовательность Козак растения, и представляет собой пример основанного на CPMV HT+ конструкта. PDISP: сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы; NOS: терминатор нопалинсинтазы; PrL-: подвергнутая делеции протеолитическая петля; TMCT: трансмембранный домен цитоплазматический хвост. На фигуре 40А показана нуклеотидная последовательность PDISP/HA В Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT (SEQ ID NO: 109). На фигуре 40В показана аминокислотная последовательность PDISP/HA В Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT (SEQ ID NO: 110). На фигуре 40С показано схематическое изображение конструкта номер 2062 (2X35S/CPMV HT+).
На фигуре 41 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 1445 и 1839 (2X35S/CPMV НТ НА В Wisconsin (PrL-) NOS, и 2X35S/CPMV HT+НА В Wisconsin (PrL-) NOS, соответственно; смотрите пример 5.22). Конструкт номер 1445 содержит известную из предшествующего уровня техники CPMV-HT последовательность (5'UTR CMPV с мутированным старт-кодоном в положении 161, слитую с последовательностью, кодирующей неполный белок М) и не содержит гетерологичную последовательность Козак между 5'UTR и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью (НА В Wisconsin (PrL-)). Конструкт номер 183 9 включает в себя 5'UTR CPMV, содержащую 160 нуклеотидов, спейсерный фрагмент, содержащий неполный белок М, сайт множественного клонирования и последовательность Козак растения, и представляет собой пример основанного на CPMV HT+ конструкта. PrL-: подвергнутая делеции протеолитическая петля; NOS: терминатор нопалинсинтазы. На фигуре 41А показана нуклеотидная последовательность НА В Wisconsin (PrL-) (SEQ ID NO: 111). На фигуре 41В показана аминокислотная последовательность НА В Wisconsin (PrL-) (SEQ ID NO: 112). На фигуре 41С показано схематическое изображение конструкта номер 1839 (2X35S/CPMV HT+).
На фигуре 42 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 1454 и 1860 (2X35S/CPMV HT HA B Wisconsin(PrL-)+H1 California TMCT NOS и 2X35S/CPMV НТ+ НА В Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCTNOS, соответственно; смотрите пример 5.23). Конструкт номер 1454 содержит известную из предшествующего уровня техники CPMV-HT последовательность (5'UTR CMPV с мутированным старт-кодоном в положении 161, слитую с последовательностью, кодирующей неполный белок М) и не содержит гетерологичную последовательность Козак между 5'UTR и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью (НА В Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT). Конструкт номер 1860 включает в себя 5'UTR CPMV, содержащую 160 нуклеотидов, спейсерный фрагмент, содержащий неполный белок М, сайт множественного клонирования и последовательность Козак растения, и представляет собой пример основанного на CPMV НТ+ конструкта. NOS: терминатор нопалинсинтазы; prL-: подвергнутая делеции протеолитическая петля; TMCT: трансмембранный домен цитоплазматический хвост. На фигуре 42А показана нуклеотидная последовательность НА В Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT (SEQ ID NO: 113). На фигуре 42В показана аминокислотная последовательность PDISP/HA В Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT (SEQ ID NO: 114). На фигуре 42С показано схематическое изображение конструкта номер 1893 (2X35S/CPMV НТ+).
На фигуре 43 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 489 (2X35S/CPMV НТ Н5 Indonesia NOS смотрите пример 5.24). Конструкт номер 489 содержит последовательность CPMV-HT (5'UTR CMPV с мутированным старт-кодоном в положении 161, слитую с последовательностью, кодирующей неполный белок М) и не содержит гетерологичную последовательность Козак между 5 'UTR и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью (PDISP/H1 California). На фигуре 43А показана нуклеотидная последовательность нативного Н5 Indonesia (SEQ ID NO: 115). На фигуре 43В показана аминокислотная последовательность нативного Н5 Indonesia (SEQ ID NO: 116). На фигуре 43С показано схематическое изображение конструкта номер 489 (2X35S/CPMV НТ; эталонный конструкт).
На фигуре 44 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструкта номер 1800 (A-2X35S CPMV160+ PDISP H3Victoria NOS; смотрите пример 5.25). Конструкт номер 1800 включает в себя 5'UTR CPMV, содержащую 160 нуклеотидов, спейсерный фрагмент (сайт множественного клонирования) и последовательность Козак растения (указанный конструкт не содержит последовательность, кодирующую неполный белок М) и представляет собой пример основанного на CPMV160+ (CPMVX+, где Х=160) конструкта. PDISP: сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы. NOS: терминатор нопалинсинтазы. На фигуре 44А показана последовательность праймера IF**(SacII)-PDI.s1+4c (SEQ ID NO:117). На фигуре 44В показана последовательность праймера IF-H3V36111.s1-4r (SEQ ID NO: 118). На фигуре 44С показана последовательность PDISP/H3 Victoria (SEQ ID NO:119). На фигуре 44D показано схематическое изображение конструкта 2171 (указаны сайты распознавания рестрикционными ферментами SacII и StuI, используемые для линеаризации плазмиды). На фигуре 44Е показан конструкт 2171 от левой до правой границ т-ДНК (подчеркнуто), 2X35S/CPMV160+/NOS с экспрессионной кассетой ингибитора сайленсинга пластоцианин-Р19-пластоцианин, трансмембранный цитоплазматический хвост HI California и 3'UTR CPMV (SEQ ID NO: 120). На фигуре 44F показана экспрессионная кассета номер 1800 от промотора 2X35S до терминатора NOS. нуклеотидная последовательность PDISP/H3 Victoria подчеркнута; 5'UTR показана жирным шрифтом; последовательность Козак растения дважды подчеркнута; спейсерный фрагмент (сайт множественного клонирования) из 16 пар оснований расположен между 5'UTR и последовательность Козак растения (SEQ ID NO:121). На фигуре 44G показана аминокислотная последовательность PDISP/H3 Victoria (SEQ ID NO:122). На фигуре 44Н показано схематическое изображение конструкта номер 1800 (основанный на CPMVX+ конструкт, где Х=160).
На фигуре 45 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструкта номер 1819 (2X35S CPMV-HT+ PDISP Н3 Victoria NOS). Конструкт номер 1819 содержит последовательность CPMV-HT+ (5'UTR CMPV с мутированным старт-кодоном в положении 161, слитую со спейсерным фрагментом, кодирующим неполный белок М, сайт множественного клонирования, и содержит последовательность Козак растения между сайтом множественного клонирования и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью (PDISP/H3 Victoria)). PDISP: сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы. NOS: терминатор нопалинсинтазы. На фигуре 45А показана последовательность праймера IF(SacII)-Kozac_PDI.c (SEQ ID NO: 123). На фигуре 45В показана последовательность праймера IF-H3V36111.s1-4r (SEQ ID NO: 124). На фигуре 45С показано схематическое изображение конструкта 2181. На фигуре 45D показана последовательность для конструкта 2181 (от левой к правой границе т-ДНК, подчеркнуто; 2X35S/CPMV-HT+/NOS с экспрессионной кассетой ингибитора сайленсинга пластоцианин-Р19-пластоцианин; SEQ ID NO:126). На фигуре 45Е показана экспрессионная кассета номер 1819 от промотора 2X35S до терминатора NOS. Нуклеотидная последовательность PDISP/H3 Victoria подчеркнута (SEQ ID NO:127). На фигуре 45F показано схематическое изображение конструкта 1819.
На фигуре 46А показана относительная активность гемагглютинации нативного Н7 Hangzhou НА и модифицированного Н7 Hangzhou НА, с протеолитической петлей, подвергнутой делеции при коэкспрессии с М2. Нативный и модифицированный Н7 Hangzhou НА (конструкты №2142 и 2152, смотрите примеры 5.33 и 5.34) экспрессировали в присутствии М2 (конструкт №1261, смотрите пример 5.1) и очищали из растений. На фигуре 46В показан выход белка нативного Н7 Hangzhou НА (конструкт №2142) и модифицированного Н7 Hangzhou НА, с протеолитической петлей, подвергнутой делеции (конструкт №2152). На фигуре 46С показан анализ SDS-PAGE, в котором полоса 2 показывает очищенный модифицированный Н7 Hangzhou НА с удаленной протеолитической петлей (конструкт №2152) и полоса 3 показывает очищенный нативный Н7 Hangzhou НА (конструкт №2142). Для каждой полосе 2 мкг общего белка загружали на гель. Чистота профилей белков является сходной для обоих конструктов.
4
На фигуре 47А показано сравнение устойчивости к трипсину между нативным белком НА и модифицированным НА с протеолитической петлей, замещенной линкером GG (pr1-), модифицированным НА с протеолитической петлей, замещенной линкером TETQ (TETQ), и модифицированным НА с протеолитической петлей, замещенной линкером TETR (TETR). Очищали конструкты ВПЧ НА: нативный (№489), PRL- (№928), TETQ (№766) и TETR (№676) H5 Indonesia. Для каждой партии два образца ВПЧ НА ресуспендировали в буфере (100 мМ Na/KPO, 150 мМ NaCl, 0,01% TWEEN 80) при рН 7,4 в целевой концентрации, составляющей 150 мкг/мл. Трипсин добавляли в соотношении 1:100 по белку к одному ресуспендированному образцу. Образцы инкубировали в течение 30, 60 и 120 минут при комнатной температуре. 30 мкл необработанного трипсином экстракта (контроль) и 30 мкл обработанных ферментом экстрактов загружали на гель SDS-PAGE, который окрашивали кумасси голубым. На фигуре 47В показана иммуногенность (титр HI) нативной ВПЧ Н5 и ее мутантных аналогов (prl-, TETQ и TETR) у мышей после двух доз. Столбики представляют собой относительное (%) сравнение титров HI каждого из мутантов ВПЧ H5 с нативной ВПЧ H5.
На фигуре 48 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 2220 (2X35S/CPMV НТ+ / PDISP/H2 Singapore/ NOS, смотрите пример 5.27). На фигуре 48А показана нуклеотидная последовательность праймера IF**-H2S157.s1-6r (SEQ ID NO: 127). На фигуре 48В показана нуклеотидная последовательность PDISP/H2 Singapore (SEQ ID NO: 128) На фигуре 48С показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 2220 от промотора 2X35S до терминатора NOS. Нуклеотидная последовательность PDISP/H2 Singapore подчеркнута. На фигуре 48D показана аминокислотная последовательность PDISP/H2 Singapore. На фигуре 48Е показано схематическое изображение конструкта номер 2220.
На фигуре 49 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 2221 (2X35S/CPMV НТ+ / PDISP/H2 Singapore с подвергнутой делеции протеолитической петлей/NOS, смотрите пример 5.28). На фигуре 49А по казана нуклеотидная последовательность праймера H2S157(Prl-).r (SEQ ID NO: 131). На фигуре 49В показана нуклеотидная последовательность праймера H2S 157(Prl-).c (SEQ ID NO: 132) На фигуре 49С показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 2221 от промотора 2X35S до терминатора NOS. Нуклеотидная последовательность PDISP/H2 Singapore подчеркнута (SEQ ID NO: 133). На фигуре 49D показана аминокислотная последовательность PDISP/H2 Singapore с подвергнутой делеции протеолитической петлей (SEQ ID NO:134). На фигуре 49Е показано схематическое изображение конструкта номер 2221.
На фигуре 50 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 2222 (2X35S/CPMV 160+/ PDISP/H2 Singapore) и 2223 (2X35S/CPMV 160+/ PDISP/H2 Singapore с подвергнутой делеции протеолитической петлей/NOS), смотрите пример 5.29). На фигуре 50А показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 2222 от промотора 2X35S до терминатора NOS. Нуклеотидная последовательность PDISP/H2 Singapore подчеркнута (SEQ ID NO:135). На фигуре 50В показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 2223 от промотора 2X35S до терминатора NOS. Нуклеотидная последовательность PDISP/H2 Singapore с подвергнутой делеции протеолитической петлей подчеркнута (SEQ ID NO: 136). На фигуре 50С а схематическое изображение конструкта номер 2222. На фигуре 50D показано схематическое изображение конструкта номер 2223.
На фигуре 51 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 2219 (2X35S/CPMV НТ+ PDISP/H3 Perth) и 2139 (2X35S/CPMV 160+/ PDISP/H3 Perth), смотрите пример 5.30). На фигуре 51А показана нуклеотидная последовательность PDISP/H3 Perth (SEQ ID NO: 137). На фигуре 51В показана нуклеотидная последовательность праймера IF**-H3P1609.S1-6r (SEQ ID NO: 138). На фигуре 51 С показана аминокислотная последовательность PDISP/H3 Perth (SEQ ID NO: 139). На фигуре 51D показано схематическое изображение конструкта номер 2219. На фигуре 51Е показано схематическое изображение конструкта номер 2139.
На фигуре 52 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 2039 (2X35S/CPMV НТ+ PDISP/H3 Perth с подвергнутой делеции протеолитической петлей) и 2159 (2X35S/CPMV 160+ PDISP/H3 Perth с подвергнутой делеции протеолитической петлей), смотрите пример 5.31). На фигуре 52А показана нуклеотидная последовательность PDISP/H3 Perth с подвергнутой делеции протеолитической петлей (SEQ ID NO: 140). На фигуре 52В показана нуклеотидная последовательность праймера H3P1609(Prl-)#2.r (SEQ ID NO: 141). На фигуре 52С показана нуклеотидная последовательность праймера H3P1609(Prl-)#2.c (SEQ ID NO: 142). На фигуре 52D показана аминокислотная последовательность PDISP/H3 Perth с подвергнутой делеции протеолитической петлей (SEQ ID NO: 143). На фигуре 52Е показано схематическое изображение конструкта номер 2039. На фигуре 52F показано схематическое изображение конструкта номер 2159.
На фигуре 53 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 2230 (2X35S/CPMV НТ+ PDISP/H3 Victoria с подвергнутой делеции протеолитической петлей) и 2250 (2X35S/CPMV 160+ PDISP/H3 Victoria с подвергнутой делеции протеолитической петлей), смотрите пример 5.32). На фигуре 53А показана нуклеотидная последовательность PDISP/H3 Victoria с подвергнутой делеции протеолитической петлей (SEQ ID NO: 144). На фигуре 53В показана нуклеотидная последовательность праймера H3V36111(Prl-).r (SEQ ID NO: 145). На фигуре 53С показана нуклеотидная последовательность праймера H3V36111(Prl-).c (SEQ ID NO: 146). На фигуре 53D показана аминокислотная последовательность PDISP/H3 Victoria с подвергнутой делеции протеолитической петлей (SEQ ID NO: 147). На фигуре 53Е показано схематическое изображение конструкта номер 2230. На фигуре 53F показано схематическое изображение конструкта номер 2250.
На фигуре 54 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструкта номер 2142 (2X35S/CPMV HT+/PDISP/H7 Hangzhou/NOS), смотрите пример 5.33). На фигуре 54А показана нуклеотидная последовательность PDISP/H7 Hangzhou (SEQ ID NO: 148). На фигуре 54В показана нуклеотидная последовательность праймера IF*-H7H113.s1-6r (SEQ ID NO: 149). На фигуре 54С показана аминокислотная последовательность PDISP/H7 Hangzhou (SEQ ID NO: 150). На фигуре 53D показано схематическое изображение конструкта номер 2142.
На фигуре 55 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструкта номер 2152 (2X35S/CPMV HT+/PDISP/H7 Hangzhou с подвергнутыми делеции протеолитической петлей/NOS), смотрите пример 5.34). На фигуре 55А показана нуклеотидная последовательность PDISP/H7 Hangzhou с подвергнутой делеции протеолитической петлей (SEQ ID NO: 151). На фигуре 55В показана нуклеотидная последовательность праймера H7H113(PrL-).r (SEQ ID NO: 152). На фигуре 55С показана нуклеотидная последовательность праймера Н7Н 113(PrL-).c (SEQ ID NO: 153). На фигуре 55D показана аминокислотная последовательность PDISP/H7 Hangzhou с подвергнутой делеции протеолитической петлей (SEQ ID NO: 154). На фигуре 53Е показано схематическое изображение конструкта номер 2152.
На фигуре 56 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 2224 (2X35S/CPMV НТ+ PDISP/H9 Hong Kong) и 2226 (2X35S/CPMV 160+ PDISP/H9 Hong Kong), смотрите пример 5.35). На фигуре 56А показана нуклеотидная последовательность PDISP/H9 Hong Kong (SEQ ID NO: 155). На фигуре 56В показана нуклеотидная последовательность праймера IF**-H9HK107399.S1-6r (SEQ ID NO: 156). На фигуре 56С показана аминокислотная последовательность PDISP/H9 Hong Kong (SEQ ID NO: 157). На фигуре 56D показано схематическое изображение конструкта номер 2224. На фигуре 56Е показано схематическое изображение конструкта номер 2226.
На фигуре 57 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 2225 (2X35S/CPMV НТ+ PDISP/H9 Hong Kong с подвергнутой делеции протеолитической петлей) и 2227 (2X35S/CPMV 160+ PDISP/H9 Hong Kong с подвергнутой делеции протеолитической петлей), смотрите пример 5.36. На фигуре 57А показана нуклеотидная последовательность PDISP/H9 Hong Kong с подвергнутой делеции протеолитической петлей (SEQ ID NO: 158). На фигуре 57В показана нуклеотидная последовательность праймера H9HK107399(Prl-).r(SEQ ID NO: 159). На фигуре 57С показана нуклеотидная последовательность праймера H9HK107399(Prl-).c (SEQ ID NO: 160). На фигуре 57D показана аминокислотная последовательность PDISP/H9 Hong Kong с подвергнутой делеции протеолитической петлей (SEQ ID NO: 161). На фигуре 57Е показано схематическое изображение конструкта номер 2225. На фигуре 57F показано схематическое изображение конструкта номер 2227.
На фигуре 58 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструкта номер 2013 (2X35S/CPMV 160+/PDISP/HA В Malaysia/NOS), смотрите пример 5.37. На фигуре 58А показана нуклеотидная последовательность PDISP/HA В Malaysia (SEQ ID NO: 162). На фигуре 58В показана нуклеотидная последовательность праймера IF**-HBM250604.S1-6r (SEQ ID NO: 163). На фигуре 58С показана аминокислотная последовательность PDISP/HA В Malaysia (SEQ ID NO: 164). На фигуре 58D показано схематическое изображение конструкта номер 2013.
На фигуре 59 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструкта номер 2014 (2X35S/CPMV 160+/PDISP/HA В Malaysia с подвергнутыми делеции протеолитической петлей/NOS), смотрите пример 5.38. На фигуре 59А по казана нуклеотидная последовательность PDISP/HA В Malaysia с подвергнутой делеции протеолитической петлей (SEQ ID NO: 165). На фигуре 59В показана нуклеотидная последовательность праймера HBM250604(PrL-).r (SEQ ID NO: 166). На фигуре 59С показана нуклеотидная последовательность праймера HBM250604(PrL-).c (SEQ ID NO: 167). На фигуре 59D показана аминокислотная последовательность PDISP/HA В Malaysia с подвергнутой делеции протеолитической петлей (SEQ ID NO: 168). На фигуре 59Е показано схематическое изображение конструкта номер 2014.
На фигуре 60 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 2070 (2X35S/CPMV НТ PDISP/HA В Massachusetts). 2080 (2X35S/CPMV НТ+ PDISP/HA В Massachusetts) и 2090 (2X35S/CPMV 160+ PDISP/HA В Massachusetts). смотрите пример 5.39. На фигуре 60А показана нуклеотидная последовательность PDISP/HA В Massachusetts (SEQ ID NO: 169). На фигуре 60В показана аминокислотная последовательность PDISP/HA В Massachusetts (SEQ ID NO: 170). На фигуре 60С показано схематическое изображение конструкта номер 2070. На фигуре 60D показано схематическое изображение конструкта номер 2080. На фигуре 60Е показано схематическое изображение конструкта номер 2090.
На фигуре 61 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 2102 (2X35S/CPMV НТ PDISP/HA В Florida с подвергнутой делеции протеолитической петлей) и 2104 (2X35S/CPMV НТ+ /BeYDV/PDISP/HA В Florida с подвергнутой делеции протеолитической петлей), смотрите пример 5.40. На фигуре 61А показана нуклеотидная последовательность праймера HBF406(PrL-).r (SEQ ID NO: 190). На фигуре 61В показана нуклеотидная последовательность праймера HBF406(PrL-).c (SEQ ID NO: 191). На фигуре 61С показана нуклеотидная последовательность праймера IF*-HBF406.s1-6r (SEQ ID NO: 192). На фигуре 61D показана нуклеотидная последовательность PDISP/HA В Florida с подвергнутой делеции протеолитической петлей. На фигуре 61Е показана аминокислотная последовательность PDISP/HA В Florida с подвергнутой делеции протеолитической петлей. На фигуре 61F показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 2102. На фигуре 61G показано схематическое изображение конструкта номер 2102. На фигуре 61Н показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 2104. На фигуре 61I показано схематическое изображение конструкта номер 2104.
На фигуре 62 показаны компоненты последовательности, используемые для получения конструктов номер 2106 (2X35S/CPMV НТ+ / PDISP/B Florida +H1 California TMCT с подвергнутой делеции протеолитической петлей / NOS) и 2108 (2X35S/CPMV НТ+ / BeYDV/PDISP/B Florida +H1 California TMCT с подвергнутой делеции протеолитической петлей/ NOS), смотрите пример 5.41. На фигуре 62А показана нуклеотидная последовательность праймера IF-H1cTMCT.S1-4r (SEQ ID NO: 197). На фигуре 62В показана нуклеотидная последовательность PDISP/HAB Florida+H1Cal TMCT с подвергнутой делеции протеолитической петлей (SEQ ID NO: 198). На фигуре 62С показана аминокислотная последовательность PDISP/HA В Florida+H1Cal TMCT с подвергнутой делеции протеолитической петлей. На фигуре 62D показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 2106. На фигуре 62Е показано схематическое изображение конструкта номер 2106. На фигуре 62F показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 2108. На фигуре 62G показано схематическое изображение конструкта номер 2108.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Ниже приведено описание предпочтительного варианта осуществления.
Настоящее изобретение относится к вирусоподобным частицам (ВПЧ) и способам получения и повышения выхода, накопления и производства ВПЧ в растениях.
Настоящее изобретение относится частично к способу получения вирусоподобной частицы (ВПЧ) в растении или части растения. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты в растение или часть растения. Нуклеиновая кислота содержит регуляторную область, активную в растении и функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей гемагглютинин гриппа (НА). НА содержит модифицированную протеолитическую петлю или сайт расщепления. Растение или часть растения инкубируют при условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновой кислоты с получением при этом ВПЧ. При необходимости растение или часть растения могут быть собраны и ВПЧ очищена.
Настоящее изобретение также относится к ВПЧ, полученной таким способом. ВПЧ может содержать один или несколько липидов растительного происхождения.
ВПЧ можно использовать для получения композиции, содержащей эффективную дозу ВПЧ для индукции иммунного ответа и фармацевтически приемлемый носитель.
Также в настоящем документе предусмотрен модифицированный гемагглютинин, в котором протеолитическая петля или сайт расщепления были модифицированы.
Настоящее изобретение также относится к растительному материалу, содержащему ВПЧ, полученную путем экспрессии нуклеиновых кислот, описанных выше. Растительный материал можно использовать в индукции иммунитета к инфекции вируса гриппа у субъекта. Растительный материал также можно добавлять в смесь в качестве биологически активной пищевой добавки.
ВПЧ согласно настоящему изобретению также можно получить путем предоставления растения или части растения, содержащих нуклеиновую кислоту, определенную выше, и инкубация растения или части растения при условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновой кислоты с получением при этом ВПЧ. ВПЧ может содержать один или несколько липидов растительного происхождения. ВПЧ можно использовать для получения композиции, содержащей эффективную дозу ВПЧ для индукции иммунного ответа и фармацевтически приемлемый носитель. Настоящее изобретение также относится к растительному материалу, содержащему ВПЧ, полученную путем экспрессии первой и второй нуклеиновых кислот. Растительный материал можно использовать в индукции иммунитета к инфекции вируса гриппа у субъекта. Растительный материал также можно добавлять в смесь в качестве биологически активной пищевой добавки.
ВПЧ согласно настоящему изобретению содержит один или несколько модифицированных гемагглютининов гриппа (НА). Модифицированный НА может происходить из любого НА, например, H1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, H14, H15, H16, или НА типа В, описанных в международных патентных публикациях WO 2009/009876; WO 2009/076778; WO 2010/003225; WO 2010/003235; WO 2011/03522; которые включены в настоящий документ посредством ссылки).
Согласно настоящему изобретению предусмотрены ВПЧ, содержащие последовательности НА штаммов гриппа, причем последовательности НА содержат модифицированные многоосновные сайты расщепления, включая в себя, например, модификации, описанные в настоящем документе.
Белок НА
Используемый в настоящем документе термин "гемагглютинин" или "НА" относится к гликопротеину, встречающемуся снаружи вирусных частиц гриппа. НА представляет собой гомотримерный мембранный гликопротеин I типа, как правило, содержащий сигнальный пептид, домен НА1 и домен НА2, содержащий трансмембранный якорный сайт на С-конце и небольшой цито плазматический хвост. Нуклеотидные последовательности, кодирующие НА, хорошо известны и доступны - смотрите, например, базу данный BioDefence Public Health (вирус гриппа; смотрите URL: biohealthbase.org) или Национальный центр биотехнологической информации (смотрите URL: ncbi.nlm.nih.gov), причем оба этих источника включены в настоящий документ посредством ссылки. НА может включать в себя любой НА, например, H1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, H11, Н12, Н13, Н14, Н15, Н16 или НА типа В; описанные в международных патентных публикациях WO 2009/009876; WO 2009/076778; WO 2010/003225; WO 2010/003235; WO 2011/03522; которые включены в настоящий документ посредством ссылки). Более того, НА может быть основан на последовательности гемагглютинина, который выделен из одного или нескольких новых или только что идентифицированных вирусов гриппа. Согласно настоящему изобретению также предусмотрены ВПЧ, которые содержат модифицированные НА, полученные из одного или больше чем одного подтипа гриппа.
Мономер НА можно подразделить на три функциональных домена - стволовой домен, или кластер стволового домена (SDC), домен глобулярной головки, или кластер головного домена (HDC) и кластер трансмембранного домена (TDC). SDC и HDC могут обобщенно называться 'эктодомен'. В публикации На et al. 2002 (EMBOJ. 21:865-875; которая включена в настоящий документ посредством ссылки) проиллюстрирована относительная ориентация различных субдоменов SDC и HDC в различных подтипах гриппа на основании рентгеновских кристаллографических структур.
Белок НА синтезируется в виде белка - предшественника (НА0) молекулярной массой приблизительно 75 кДа, который собирается на поверхности в удлиненный тримерный белок. Белок - предшественник белок расщепляется на консервативном активационном сайте расщепления на 2 полипептидных цепи, НА1 и НА2 (содержащую трансмембранную область), связанные дисульфидной связью. На фигуре 15 представлены неограничивающие примеры аминокислотных последовательностей линкерной области некоторых НА.
Термин "гомотример" или "гомотримерный" указывает на то, что олигомер образован тремя молекулами белка НА. Не связываясь с теорией, можно сказать, что белок НА синтезируется в виде мономерного белка - предшественника (НА0) молекулярной массой приблизительно 75 кДа, который собирается на поверхности в удлиненный тримерный белок. Перед тем, как происходит тримеризация, белок - предшественник расщепляется на консервативном активационном сайте расщепления (который также называется пептид слияния) на 2 полипептидных цепи, НА1 и НА2 (содержащую трансмембранную область), соединенные дисульфидной связью. Длина сегмента НА1 может составлять 328 аминокислот, и длина сегмента НА2 может составлять 221 аминокислоту. Хотя указанное расщепление может быть важным для инфекционности вируса, она может не быть необходимой для тримеризации белка или для иммуногенности. Встраивание НА внутрь мембраны эндоплазматического ретикулума (ER) клетки-хозяина, расщепление сигнального пептида и гликозилирование белка являются котрансляционными событиями. Для правильного рефолдинга НА необходимо гликозилирование белка и образование 5-6 внутрицепочечных дисульфидных связей. Тример НА собирается внутри цис- и транс-комплекса Гольджи, причем трансмембранный домен играет роль в процессе тримеризации. Кристаллические структуры обработанных бромелаином белков НА, которые не содержат трансмембранный домен, показали высоко консервативную структуру среди штаммов гриппа. Также было установлено, что НА подвергается основным конформационным изменениям во время процесса инфицирования, который требует, чтобы предшественник НА0 расщепился на 2 полипептидных цепи, НА1 и НА2. Белок НА может быть процессированным (т.е. может содержать домены НА1 и НА2) или может быть непроцессированным (т.е. может содержать домен НА0). Непроцессированный белок - предшественник НА синтезируется в виде белка -предшественник (НА0) молекулярной массой приблизительно 75 кДа, который собирается на поверхности в удлиненный тримерный белок. Белок - предшественник расщепляется на консервативном сайте расщепления (также известном как протеолитическая петля) на 2 полипептидные цепи, НА1 и НА2 (содержащую трансмембранную область), связанные дисульфидной связью.
Белок НА, описанный в настоящем документе, может дополнительно представлять собой модифицированный белок НА (также называемый "мутантный НА"), например, модифицированный белок - предшественник (НА0), в котором протеолитическая петля или сайт расщепления модифицированы.
Модифицированный НА/сайт расщепления
После расщепления НА0, НА становится чувствительным к рН, подвергаясь необратимому конформационному изменению при рН эндосомы (<рН 6,0). Конформация предшественника НА0 является стабильной при низком рН, расщепленной НА1-НА2 формы, является метастабильной (Bullough PA et. al., 1994, Nature. Vol 371:37-43). Пороговое значение рН, которые вызывает конформационное изменение в различных НА, составляет приблизительно рН 5,8-5,9 для штаммов В, тогда как оно является более кислым, рН 5,1-5,8, для НА типа A (Beyer WEP et al, 1986, Archives Virol, vol 90: 173). После расщепления амино-конец НА2 представляет собой неполярную последовательность из 23 аминокислот, которая затем становится транс мембранным доменом, пересекающем мембрану клетки-хозяина (который называется пептид слияния; фигура 15). Сайт расщепления НА расположен на выступающей петле на поверхности НА, и этот сайт доступен действию протеаз.
Для оптимизации производства вакцины в яйцах и сохранения вируса активным, но ослабленным, исследовали модификацию многоосновного сайта расщепления Н5 (RERRRKKR↓G) (Horimoto Т., et al, 2006, Вакцина, Vol 24: 3669-3676). Представляющие интерес мутанты содержали делецию 4 первых заряженных аминокислот (RERR) и замещение аминокислот RKKR на TETR, которые инактивируют многоосновные сайт расщепления, но сохраняли возможность процессирования НА0 до НА1-НА2 через остаток аргинина мотива TETR (смотрите фигуру 19). Аналогичная стратегия для получения ослабленного вируса используется NIBS С для устранения многоосновного сайта, обеспечивая получение высоких выходов штамма A/Turkey/Turkey/1/200 5 H5N1, оставляя яйца живыми. Последовательность многоосновного сайта (GERRRKKR↓G) замещена RETR в их мутанте (NIBSC 05/240 NIBSC эталонный вирус гриппа NIBG-23). Многоосновный сайт расщепления Н5 НА также был замещен моноосновным сайтом Н6 для экспрессии в яйцах. В этом примере первые 4 остатка и четыре последние аминокислоты многоосновного сайта замещены IETR (замещение RERRRKKR↓G на IETR↓G; Hoffman Е., et al., 2002, Вакцина, Vol 20:3165-3170). В каждом из приведенных выше примеров модификацию проводили для ослабления вируса при сохранении производства НА внутри яиц. Таким образом, расщепление предшественника НА0 было не полностью инактивировано для обеспечения процессинга НА0 до НА1-НА2 и индуцированного рН конформационного изменения, тем самым обеспечивая репликацию вируса в клетке-хозяине.
Используемый в настоящем документе термин "модифицированный гемагглютинин" или "модифицированный НА", "мутированный гемагглютинин" или "мутированный НА" относится к НА, в котором НА содержит модификацию или мутацию, например, замену, вставку, делецию или их комбинацию, которая дает в результате измененную аминокислотную последовательность в протеолитической петле или сайте расщепления белка НА.
Была определена кристаллическая структура НА0 из A/Hong Kong/68 (Chen, J., 1998. Cell 95:409-417; включенная в настоящий документ посредством ссылки). Остатки, которые подвергаются действию растворителя, как правило, считаются частью сайта расщепления, который образует вытянутую, сильно выходящую на поверхность петлю. Консенсусную последовательность можно определить в указанной выбранной области, например, без ограничения:
Консенсусная последовательность А/Н3/НА0: NVPEKQTR/GIFGAIAGFIE (SEQ ID NO: 66)
Консенсусная последовательность А/Н1/НА0: NIPSIQSR/GLFGAIAGFIE (SEQ ID NO: 67)
Консенсусная последовательность птичьего Н5: QRESRRKKR/GLFGAIAGFIEG (SEQ ID NO: 1)
Консенсусная последовательность В/НА0: PAKLLKER/GFFGAIAGFLE (SEQ ID NO: 68), где расщепление между НА1 и НА2 обозначено с помощью "/" (смотрите Bianchi et al., 2005, Journal of Virology, 79:7380-7388; включенную в настоящий документ посредством ссылки), а также фигуры 15 и 18А.
Белок НА может представлять собой белок гемагглютинина гриппа типа В или белок гемагглютинина гриппа типа А с модификацией в области протеолитической петли, например, делецией, вставкой, заменой или их комбинацией в протеолитической петле (сайте расщепления). Не связываясь с теорией, полагают, что модификация протеолитической петли может обеспечивать то, что молекула НА сохраняется в качестве предшественника НА0. При этом получают гомогенные и однородные ВПЧ, содержащие белки НА0.
Под терминами "протеолитическая петля" или "сайт расщепления" понимают консенсусную последовательность протеолитического сайта, который вовлечен в расщепление предшественника НА0. Используемый в настоящем документе термин "консенсусная" или "консенсусная последовательность" означает последовательность (либо аминокислотную, либо нуклеотидную последовательность), которая характеризуется изменчивостью последовательности в отношении родственных последовательностей на основании анализа выравнивания множественных последовательностей, например, подтипов конкретной последовательности НА0 гриппа. Консенсусная последовательность сайта расщепления НА0 гриппа может включать в себя консенсусные аминокислотные последовательности гемагглютинина гриппа А, включая в себя, например, консенсусную последовательность H1, консенсусную последовательность Н3, консенсусную последовательность Н5, или аминокислотные последовательности гемагглютинина гриппа В, например, без ограничения В Florida и В Malaysia. Неограничивающие примеры последовательностей области протеолитической петли показаны на фигуре 15 и 18В (а также смотрите Bianchi et al., 2005, Journal of Virology, 79:7380-7388; включенную в настоящий документ посредством ссылки).
Остатки в протеолитической петле или сайте расщепления могут быть либо мутированными, например, без ограничения с помощью точечной мутации, замены, вставки или делеции. Используемый в настоящем документе термин "аминокислотная мутация" или "аминокислотная модификация" означает введение аминокислотных замен, делеции, вставок и модификаций. Любая комбинация замены, делеции, вставки и модификации может быть осуществлена для получения конечного конструкта при условии, что конечный конструкт обладает требуемыми характеристиками, например, пониженным или устраненным расщеплением протеолитической петли или сайта расщепления протеазой.
Под термином "модифицированная протеолитическая петля" понимают, что протеолитическая петля может включать в себя одну или несколько точечных мутаций, может быть частично подвергнута делеции, полностью подвергнута делеции, частично замещена линкерной последовательностью, полностью замещена линкерной последовательностью, может содержать частичное или полное замещение аминокислот в пределах сайта расщепления одной или несколькими небелковыми аминокислотами, или включать в себя комбинацию перечисленного. Аналогично, под термином "модифицированный сайт расщепления" понимают, что сайт расщепления в пределах протеолитической петли может включать в себя одну или несколько точечных мутаций, может быть частично подвергнута делеции, полностью подвергнута делеции, частично замещена линкерной последовательностью, полностью замещена линкерной последовательностью, может содержать частичное или полное замещение аминокислот в пределах сайта расщепления одной или несколькими небелковыми аминокислотами, или включать в себя комбинацию перечисленного. Модификации в протеолитической петле, сайте расщепления или в них обоих также могут включать в себя делецию, замещение или замену одной или нескольких аминокислот, которые расположены вне или смежно с последовательностью протеолитической петли или сайта расщепления. Под термином "линкер" понимают аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько аминокислот, которые могут быть введены в протеолитическую петлю или сайт расщепления, или которые могут заместить несколько или все аминокислоты в протеолитической петле или сайте расщепления. Линкер можно обработать ферментами, чтобы убедиться, что любые аминокислотные делеции в пределах протеолитической петли или сайта расщепления не нарушили экспрессию или последующую активность модифицированного НА.
Путем стабилизации белка НА с помощью модификации или делеции протеолитической петли можно достичь увеличенных выходов продукта или белка, при экспрессии модифицированного НА в растении, по сравнению с нативным НА, экспрессированным в растении при тех же условиях. Более того, путем модификации или делеции протеолитической петли изменчивость в экспрессии экспрессированного модифицированного НА снижается и однородность производимого модифицированного НА повышается по сравнению с нативным НА, экспрессированным в растении при тех же условиях.
Следовательно, согласно настоящему изобретению также предусмотрен способ увеличения выхода продукта белка НА в растении. Не связываясь с теорией, предполагают, что модификация или делеция протеолитической петли в белке НА обеспечивает улучшенную стабильность в отношении протеолитического разрушения в растении, стабилизацию во время прохождения НА в процессе секреции в аппарате Гольджи и во время процесса очищения.
Более того, согласно настоящему изобретению также предусмотрен способ увеличения качества продукта белка НА, экспрессированного в растении. Под качеством продукта понимают, например, увеличенный выход продукта НА, экспрессированного в растении, стабильность продукта, например, увеличенная стабильность НА, экспрессированного в растении, однородность продукта, например, производство гомогенного продукта, например, НА0, или их комбинацию.
Под увеличением выхода продукта или белка понимают увеличение относительного выхода белка на приблизительно 20% - приблизительно 100%, или любую величину в пределах указанного диапазона, определенную с использованием стандартных техник в настоящей области техники, например, приблизительно 40% - приблизительно 70% или любое значение в пределах указанного диапазона, например, приблизительно на 20, 22, 24, 25, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 48, 50, 52, 54, 55, 56, 58, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100% или любую величину в пределах указанного диапазона, по сравнению с выходом продукта или белка того же белка НА, в котором его протеолитическая петля не удалена.
Как показано на фигурах 13А и 14, НА из B/Brisbane/60/2008 слабо экспрессируется в агроинфильтрованных листьях Nicotiana benthamiana (смотрите полосу 1008). Тем не менее, экспрессия НА типа В, который был модифицирован с делецией протеолитической петли (смотрите полосу 1059, фигура 13А, фигура 14) приводила к увеличенной экспрессии. Более того, коэкспрессия НА типа В с М2 из A/New Caledonia/20/99 дает в результате увеличение экспрессии НА (смотрите полосы "1008+1261"; и 1059+1261"). Коэкспрессия НА типа В, содержащего делецию в протеолитической петле, с М2 из A/Puerto Rico/8/34 также приводила к увеличенной экспрессии (1059+859; фигура 14).
Как дополнительно показано на фигуре 46 В, выход белка НА из Н7 A/Hangzhou/1/13, экспрессированного в агроинфильтрованных листьях Nicotiana benthamiana, увеличивался для НА, который был модифицирован с делецией или модификацией протеолитической петли. Коэкспрессия нативного НА (дикого типа) Н7 A/Hangzhou/1/13 с М2 из A/New Caledonia/20/99 приводила к 100% относительному выходу белка, тогда как коэкспрессия НА Н7 A/Hangzhou/1/13, содержащего делецию в протеолитической петле, с М2 из A/New Caledonia/20/99, приводила к 182% относительному выходу белка (фигура 46 В). Увеличение относительного выхода белка НА, содержащего делецию в протеолитической петле, тем не менее, не зависит от М2. Например, как показано на фигуре 29А, Н7 A/Hangzhou/1/13, содержащий делецию в протеолитической петле, продемонстрировал увеличенную экспрессию (измеренную по относительному титру НА) по сравнению с нативным Н7 A/Hangzhou/1/13.
Несколько стратегий оценили для инактивации расщепления НА0 как для А, так и В штаммов. Консенсусная последовательность, которая распознается протеазами, заключена в вытянутой петле, подверженной действию растворителя и расположенную вблизи дистальной части мембраны относительно белка. В штамме В эта петля содержит 2 мотива последовательностей, распознаваемых протеазами и первые N-концевые аминокислоты домена НА2. Подход точечной мутации (для примеров смотрите таблицу 2, ниже) для инактивации расщепления предшественника НА0 приводил к производству НА0 без увеличенного накопления ВПЧ штамма В. Делеция мотивов последовательностей, содержащих 2 мотива расщепления протеазой (7 аминокислот), устраняло накопление НА В. Удаление целой петли из 18 аминокислот из белка НА штамма В и вставка линкера, чтобы сохранить структурные признаки (бета-цепи) белковой структуры была эффективной (смотрите ниже; фигуры 13А, 14, 16А, 17В). Удаление или замещение протеолитической петли в белке НА штаммов А также было эффективным (смотрите фигуры 20, 22).
Делеции и вставки аминокислотных последовательностей включают в себя аминокислотные делеции и вставки аминокислот. Неограничивающий пример делеции в штамме гриппа В представляет собой делецию 17 аминокислот (AKLLKERGFFGAIAGFLE) из положения 340-357 зрелого белка НА, например, как показано на фигуре 18С для штаммов гриппа В Florida и В Malaysia. Указанная делеция может быть замещена подходящим линкером для соединения полипептидных цепей для правильной экспрессии, например, без ограничения с использованием последовательности "GG", как показано на фигуре 21 В (SEQ ID NO: 17; модифицированный B/Brisbane/60/2008; замена AKLLKERGFFGAIAGFLEG на GG; например, конструкт 1059, фигуры 5D, 10; конструкт 1039, фигура 8 В или конструкт 1467; фигура 7D, 7Е). Альтернативное замещение может содержать замещение "PPAKLLKER" Ha"GSSSGSSSG", как показано на фигуре 21С (SEQ ID NO: 18). Более того, последовательность "RESRRKKR" может быть замещена "TETR" или "TETQ", как показано на фигуре 19 для штамма гриппа H5/Indonesia.
Альтернативные аминокислотные мутации для НА из штамма А включают в себя аминокислотные замены, вставки и делении, например, без ограничения делецию в области протеолитической петли Н5 Anhui аминокислотной последовательности "RERRRKRGLFGAIAGFIE", делецию аминокислотной последовательности области протеолитической петли Н5 Indo, содержащую "RESRRKKRGLFGAIAGFIE", или делецию аминокислотной последовательности области протеолитической петли Н5 Vietnam "RERRRKKRGLFGAIAGFIE". Для Н3 последовательность "RNVPEKQTRGIF" может быть подвергнута делеции и замещена соответствующей линкерной последовательностью, например, без ограничения "GS", как показано на фигуре 21Е (SEQ ID N0:20). Альтернативно, последовательность "RNVPEKQTR" в Н3 может быть замещена "GSSGSSGSS", как показано на фигуре 21F (SEQ ID NO: 21; модифицированный Н3 A/Perth/16/2009).
Более того, модификация или изменение протеолитической петли или сайта расщепления НА для снижения или устранения расщепления протеолитической петли или сайта расщепления протеазой также может содержать неконсервативные аминокислотные замены, т.е. замещение одной аминокислотой другой аминокислотой, характеризующейся отличающимися структурными и/или химическими свойствами. Небелковые аминокислоты также можно использовать для замены. Например, аминокислотные замены могут включать в себя замещение гидрофобной аминокислоты на гидрофильную. Аминокислотные замены могут включать в себя замещение не встречающимися в природе аминокислотами или встречающимися в природе аминокислотными производными белковых аминокислот.
Аминокислотные мутации для НА из штамма В и/или штаммов А могут включать в себя аминокислотные делеции. Например, для снижения или устранения расщепления протеолитической петли или сайта расщепления протеазой одну или несколько аминокислот подвергают делеции или удаляют в пределах последовательности протеолитической петли или сайта расщепления. Неограничивающие примеры делеции включают в себя удаление аминокислот 323-341 нативного белка НА Н5, например, Н5 Anhui (RERRRKRGLFGAIAGFIE), Н5 Indo (RESRRKKRGLFGAIAGFIE) или Н5 Vietnam (RERRRKKRGLFGAIAGFIE), как показано на фигуре 18С. Для Н3 последовательность "RNVPEKQTRGIF" может быть замещена "GS" (фигура 21Е; SEQ ID NO: 20) или последовательность Н3 "RNVPEKQTR" может быть замещена "GSSGSSGSS" (фигура 21F; SEQ ID NO: 21). Для штаммов В последовательность "AKLLKERGFFGAIAGFLE" может быть подвергнута делеции и/или замещена последовательностью "GG", как показано на фигуре 21 В (SEQ ID NO: 17), последовательность "AKLLKERGFFGAIAGFLEG" может быть замещена "GG"), или последовательность "PPAKLLKER" замещена "GSSSGSSSG" (фигура 21С; SEQ ID NO: 18).
Аминокислотные мутации можно создать с использованием генетических или химических способов, хорошо известных в настоящей области техники. Генетические способы могут включать в себя сайт-направленный мутагенез, ПЦР, генный синтез и подобное. Следует понимать, что также могут быть применимы способы изменения группы боковой цепи аминокислоты способами, отличными от генной инженерии, такими как химическая модификация.
Следовательно, последовательности гемагглютинина (НА) согласно настоящему изобретению могут содержать модифицированные последовательности протеолитической петли или сайты расщепления, тем самым характеризуясь пониженным или устраненным расщеплением протеолитической петли или сайта расщепления протеазой. Полипептидные последовательности гемагглютинина могут содержать модифицированную протеолитическую петлю или модифицированные последовательности сайта расщепления, например, как представлено на фигурах 5D, 7D, 8А, 18С, 19, 21В, 21С, 21Е, 21F, 24D, 25D и 26D. Сайты расщепления любой полипептидной последовательности гемагглютинина любого штамма гриппа можно определить или предсказать с использованием любого количества способов, известных в настоящей области техники, включая в себя выравнивание последовательностей (смотрите, например, фигуру 15).
Анализ последовательности из НА H1, Н3 и В выявил, что H1 обладает одним одноосновным протеолитическим сайтом (одноосновный сайт типа Клара: Q/EXR), который непосредственно предшествует пептиду слияния, тогда как НА Н3 и В содержат 2 протеолитических сайта, один из которых распознается Клара-подобными протеазами (как обнаружено в H1), а другой сайт распознается трипсин- и химотрипсин-подобными протеазами (Р-Е/А-К). Консенсусная последовательность для расщепления указанных НА представлена в таблице 1.
Во избежание потенциального протеолитического расщепления предшественника НА, НА0, только один протеолитический сайт может быть необходимо модифицировать от последовательности H1, тогда как в случае Н3 и В два одноосновных сайта необходимо модифицировать.
Например, первой сайт расщепления НАо B/Florida и B/Brisbane, например, можно устранить путем замещения Lys 341 (нумерация зрелого белка) на Не (смотрите таблицу 2). Второй одноосновный сайт можно устранить путем замещения трех аминокислот перед пептидом слияния, KER (344-346), на NIQ. Последовательности некоторых модифицированных протеолитических петель НА представлены в таблице 2.
В дополнительных примерах последовательности, содержащие протеолитическую петлю в НА0, могут быть замещены или подвергнуты делеции. Например, вариант Н3, содержащий делецию последовательности RNVPEKQT на С-конце НА1 в дополнение к делеции N-концевых аминокислот GIFGIA НА2, представлен на фигуре 21 Е. Укороченный НА1-НА2 может быть соединен вместе с помощью линкера GS.
Согласно другому примеру петля, содержащая протеолитический сайт расщепления, например, в Н3, может быть замещена гибким линкером, и часть НА2 может остаться интактной. Можно разработать линкер (GSS)3, чтобы присоединить укороченный НА1 к НА2. (смотрите фигуру 21F).
Согласно другому примеру НА из штамма гриппа В может содержать делецию последовательности ALKLLKER на С-конце НА1 в дополнение к делеции N-концевых аминокислот GFFGAIAGFLEG НА2. Укороченный НА1-НА2 может быть соединен вместе с помощью линкера GG (смотрите, например, фигуру 21 В; конструкт 1008). Экспрессия указанного конструкта показана на фигурах 13А и В.
Согласно другому примеру петля НА из штамма гриппа В, содержащая протеолитический сайт, может быть замещена гибким линкером, и часть НА2 может остаться интактной. Можно разработать удлиненный линкер GSSS, чтобы присоединить укороченный НА1 к НА2. (смотрите, например, фигуру 21 С).
Как показано на фигурах 13А и 14, НА из B/Brisbane/60/2008 слабо экспрессируется в агроинфильтрованных листьях Nicotiana benthamiana (смотрите полосу 1008). Тем не менее, экспрессия НА типа В, который был модифицирован с делецией протеолитической петли (смотрите полосу 1059, фигура 13А, фигура 14), приводила к увеличенной экспрессии. Более того, коэкспрессия НА типа В с М2 из A/New Caledonia/20/99 дает в результате увеличение экспрессии НА (смотрите полосы "1008+1261" и 1059+1261"). Коэкспрессия НА типа В, содержащего делецию в протеолитической петле, с М2 из A/Puerto Rico/8/34, также приводила к увеличенной экспрессии (1059+859; фигура 14).
Аналогично, делеция протеолитической петли в H5/Indo и замещение либо последовательностью "GG" (конструкт 928; смотрите фигуру 46D), "TETR" (конструкт 676; также смотрите фигуры 19, 24D), либо "TETQ" (конструкт 766; также смотрите фигуры 19, 25D), приводило к уровням экспрессии, которые совпадали или увеличивались по сравнению с уровнем экспрессии, наблюдаемым у нативного H5/Indo (конструкт 489; смотрите фигуры 20 и 23).
Как показано на фигуре 1 В, путем делеции протеолитической петли НА0 (последовательность, показанная на фигуре 21В), полученный белок НА0 проявляет увеличенную активность, продемонстрированную большей гемагглютинационной способностью по сравнению с белком НА, у которого его протеолитическая петля не удалена.
Под увеличением активности понимают увеличение гемагглютинационной способности на приблизительно 2% - приблизительно 100% или любую величину в пределах указанного диапазона, определенную с использованием стандартных техник в настоящей области техники, например, на приблизительно 10% - приблизительно 50% или любую величину в пределах указанного диапазона, например, приблизительно на 2, 5, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 48, 50, 52, 54, 55, 56, 58, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100% или любую величину в пределах указанного диапазона по сравнению с активностью того же белка НА, у которого его протеолитическая петля не удалена.
Согласно настоящему изобретению также предусмотрены нуклеотидные последовательности, кодирующие модифицированный НА, например, из модифицированного H1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15, Н16 или НА типа В, или любые нуклеотидные последовательности, которые гибридизируются с H1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15, Н16 или НА типа В при жестких условиях, или нуклеотидная последовательность, которая гибридизируется при жестких условиях гибридизации с комплементарной последовательностью H1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, H12, Н13, Н14, Н15, Н16 или НА типа В, причем нуклеотидная последовательность кодирует белок гемагглютинин, который будучи экспрессированным, образует ВПЧ, и указанная ВПЧ индуцирует производство антитела. Например, экспрессия нуклеотидная последовательность в клетке растения образует ВПЧ, и ВПЧ можно использовать для производства антитела, которое способно связываться с НА, включая в себя зрелый НА из В или Н3. ВПЧ при введении субъекту вызывает иммунный ответ. Предпочтительно, чтобы ВПЧ индуцировала производство антитела и ВПЧ при введении субъекту вызывала иммунный ответ.
Например, экспрессия нуклеотидной последовательности в клетке растения образует ВПЧ, и ВПЧ можно использовать для производства антитела, которое способно связываться с вирусным белком, например, НА, включая в себя без ограничения HA0, белок HA0, у которого его протеолитическая петля подвергнута делеции или модифицирована, НА1 или НА2 одного или нескольких типов или подтипов гриппа, например, без ограничения подтипов H1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15, Н16, НА типа В. ВПЧ при введении субъекту вызывает иммунный ответ.
е
4
Гибридизация при жестких условиях гибридизации известна в настоящей области техники (смотрите, например, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995 и дополнения; Maniatis et al, в Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Sambrook and Russell, в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 издание 2001; каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки). Пример одних таких жестких условий гибридизации может представлять собой приблизительно 16-20 часов гибридизации в 4 X SSC при 65°C с последующей отмывкой в 0,1 X SSC при 65°С в течение часа или 2 отмывками в 0,1 X SSC при 65°С, по 20 или 30 минут каждая. Альтернативно, иллюстративное жесткое условие гибридизации может представлять собой гибридизацию в течение ночи (16-20 часов) в 50% формамиде, 4Х SSC при 42°C с последующей отмывкой в 0,1 X SSC при 65°С в течение часа или 2 отмывками в 0,1 X SSC при 65°С по 20 или 30 минут каждая, или гибридизацию в течение ночи (16-20 часов) или гибридизацию в водном фосфатном буфере Черча (буфере 7% SDS; 0,5М NaPO рН 7,2; 10 мМ EDTA) при 65°С, с 2 отмывками или при 50°С в 0,1 X SSC, 0,1% SDS в течение 20 или 30 минут каждая, или с 2 отмывками при 65°С в 2 X SSC, 0,1% SDS в течение 20 или 30 минут каждая.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предусмотрены нуклеотидные последовательности, которые характеризуются приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% идентичностью последовательность или любым значением идентичности последовательность в пределах указанных или сходством последовательности с нуклеотидной последовательностью, кодирующей Н1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15, Н16 или НА типа В, причем нуклеотидная последовательность кодирует белок гемагглютинин (модифицированный НА) с модифицированными последовательностями протеолитической петли или сайтами расщепления, которая характеризуется пониженным или устраненным расщеплением протеолитической петли или сайта расщепления протеазой. Когда нуклеотидная последовательность, кодирующая модифицированный НА, экспрессируется, она образует ВПЧ, иВПЧ вызывает производство антитела. Например, экспрессия нуклеотидной последовательность в клетке растения образует ВПЧ, и ВПЧ можно использовать для производства антитела, которое способно связываться с НА, включая в себя непроцессированный НА (HA0) или непроцессированный, в котором протеолитическая петля была подвергнута делеции. ВПЧ при введении субъекту вызывает иммунный ответ.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предусмотрены нуклеотидные последовательности, которые характеризуются приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% идентичностью последовательность или любым значением идентичности последовательность в пределах указанных или сходством последовательности с нуклеотидной последовательностью согласно SEQ ID NO: 43, 91, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 137, 140, 144, 151, 158, 165, причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок НА, который будучи экспрессирован, образует ВПЧ, и указанная ВПЧ вызывает производство антитела, которое способно связываться с НА, включая в себя непроцессированный НА (HA0) или непроцессированный, в котором протеолитическая петля была подвергнута делеции или модифицирована. ВПЧ при введении субъекту вызывает иммунный ответ.
Более того, согласно настоящему изобретению предусмотрены аминокислотные последовательности, которые характеризуются приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% идентичностью последовательность или любым значением идентичности последовательность в пределах указанных или сходством последовательности с аминокислотными последовательностями согласно SEQ ID NO: 17, 18, 20, 21, 41, 58, 77, 81, 85, 92, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 134, 143, 147, 154, 161,168, 194 и 199, причем аминокислотная последовательность кодирует модифицированный белок НА, который будучи экспрессированным, образует ВПЧ, и указанная ВПЧ вызывает производство антитела, которое способно связываться с НА, включая в себя непроцессированный НА (НА0) или непроцессированный, в котором протеолитическая петля была подвергнута делеции или модифицирована. ВПЧ при введении субъекту вызывает иммунный ответ.
Идентичность последовательность или сходство последовательности можно определить с использованием программы сравнения нуклеотидных последовательностей, таких как представлены в DNASIS (например, с использованием без ограничения следующих параметров: штраф на введение делеции 5, число непрерывно совпадающих к-плетов на участке парного выравнивания 5, штраф на фиксированную делецию 10, k-tuple (размер идентичного участка) 2, блуждающая делеция 10 и длина сегмента, включающего «наилучший выровненный сегмент 5). Тем не менее, другие способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в настоящей области техники, например, алгоритмы Smith & Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2:482), Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444), и с помощью компьютеризированных воплощений указанных алгоритмов (например GAP, BESTFIT, FASTA и BLAST) или с помощью неавтоматизированного выравнивания и визуального осмотра. Пример выравнивания последовательностей НА из различных штаммов гриппа можно найти на фигуре 24.
Например, без ограничения нуклеотидные последовательности, кодирующие:
- НА типа В с модифицированной протеолитической петлей, определенные в SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114 и SEQ ID NO: 168, или нуклеотидные последовательности, кодирующие НА типа В, содержащие модифицированные области протеолитической петли, определенные в SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113 и SE ID NO: 165.
- H1 с модифицированной протеолитической петлей, включают в себя последовательности, содержащие модифицированный сайт расщепления, определенный в SEQ ID NO: 63.
- Н2 с модифицированной протеолитической петлей, включают в себя последовательности, содержащие модифицированный сайт расщепления, определенный в SEQ ID NO: 134.
- Н3 с модифицированной протеолитической петлей, включают в себя последовательности, определенные в SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO 143, SEQ ID NO: 147, или содержащие модифицированный сайт расщепления, определенный в SEQ ID NO: 64.
- Н5 с подвергнутой делеции протеолитической петлей, включают в себя последовательности, содержащие модифицированный сайт расщепления, определенный в SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71.
- H7 с модифицированной протеолитической петлей, включают в себя последовательности, содержащие модифицированный сайт расщепления, определенный в SEQ ID NO: 154, или нуклеотидные последовательности, кодирующие НА типа Н7, содержащие модифицированные области протеолитической петли, определенные в SEQ ID NO: 151.
- Н9 с модифицированной протеолитической петлей, включают в себя последовательности, содержащие модифицированный сайт расщепления, определенный в SEQ ID NO: 161, или нуклеотидные последовательности, кодирующие НА типа Н9, содержащие модифицированные области протеолитической петли, определенные в SEQ ID NO: 158.
Согласно настоящему изобретению предусмотрено применение белка НА, содержащего трансмембранный домен и включающего в себя домены НА1 и НА2, например, белок НА может представлять собой НА0 или процессированный НА, содержащий НА1 и НА2. Белок НА можно использовать в получении или образовании ВПЧ с использованием экспрессионной системы растения или растительной клетки.
Амплификационные элементы и энхансерные элементы/регуляторные элементы
Согласно другому примеру модифицированный белок НА можно экспрессировать в экспрессионной системе, которая содержит амплификационные элементы и/или регуляторные элементы или области (которые в настоящем документе также называются энхансерные элементы). Например, амплификационный элемент из геминивируса, такой как, например, амплификационный элемент из вируса желтой карликовости бобов (BeYDV) можно использовать для экспрессии модифицированного НА. BeYDV принадлежит к роду Mastreviruses, адаптированному к двудольным растениям. BeYDV является одинарным, характеризуясь геномом в виде одноцепочечной кольцевой ДНК, и может реплицироваться до очень высокого числа копий по механизму катящегося кольца. Происходящие из BeYDV репликона ДНК векторные системы использовались для быстрого производства белка в растениях с высоким выходом.
Используемая в настоящем документе фраза "амплификационные элементы" относится к сегменту нуклеиновой кислоты, содержащему по меньшей мере часть одной или нескольких длинных межгенных областей (LIR) генома геминивируса. Используемый в настоящем документе термин "длинная межгенная область" относится к области длинной межгенной области, которая содержит сайт связывания Rep, способный опосредовать вырезание и репликацию с помощью белка Rep геминивируса. Согласно некоторым аспектам сегмент нуклеиновой кислоты, содержащий одну или несколько LIR, может дополнительно содержать короткую межгенную область (SIR) генома геминивируса. Используемый в настоящем документе термин "короткая межгенная область" относится к комплементарной цепи (короткой IR (SIR) Mastreviruses). Любой подходящий происходящий из геминивируса амплификационный элемент можно использовать в настоящем документе. Смотрите, например, международные патентные публикации WO 2000/20557; WO 2010/025285; Zhang X. et al. (2005, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 93, 271-279), Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, 706-714), Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 106, 9-17); которые включены в настоящий документ посредством ссылки). Если в конструкте используется больше одной LIR, например, две LIR, то промотор, области CMPV-HT и представляющей интерес последовательность нуклеиновой кислоты и терминатор ограничены каждой из двух LIR.
Как описано в настоящем документе, совместная доставка происходящего из вируса желтой карликовости бобов (BeYDV) вектора и доставляющего Rep/RepA вектора с помощью агроинфильтрации листьев Nicotiana benthamiana приводит к результативной амплификации репликона и устойчивому производству белка. Анализ вестерн-блоттинг белковых экстрактов из растений, трансформированных генными конструктами, управляющими экспрессией модифицированного НА гриппа В (из B/Brisbane/60/2008) с удаленной или не удаленной протеолитической петлей (смотрите фигуру 17А в отношении конструктов) и в присутствии или при отсутствии амплификационного элемента BeYDV (конструкт №1059 и 1039), показал, что при отсутствии BeYDV не смогли обнаружить никакого накопления НА гриппа В (фигура 17 В), в случае, когда регуляторный элемент представлял собой CPMV-HT.
Как показано на фигурах 17В, экспрессия НА из B/Brisbane/60/2008 с удаленной протеолитической петлей при отсутствии BeYDV не приводит к обнаруживаемой экспрессии с помощью анализа вестерн-блоттинг (смотрите полосу 1039 на фигуре 17 В). Тем не менее экспрессия НА типа В с удаленной протеолитической петлей в присутствии амплификационного элемента BeYDV приводит к повышенной экспрессии (смотрите полосу 1059). Аналогично, при отсутствии BeYDV коэкспрессия мутантного НА типа В, содержащего делецию в протеолитической петле, с М2 из A/New Caledonia/20/99, не приводит к обнаруживаемой экспрессии НА (смотрите полосы "1039+1261" на фигуре 17В). Коэкспрессия мутантного НА типа В, содержащего делецию в протеолитической петле, в присутствии BeYDV, с М2 из A/New Caledonia/20/99 с другой стороны приводила к повышенной экспрессии (смотрите полосу "1059+1261"; фигура 17В).
Тем не менее, присутствие BeyDV не является необходимым, когда энхансерный элемент присутствует в экспрессионной системе и когда энхансерный элемент не является CPMV-HT. Например, как показано на фигурах 29А, экспрессия НА различных штаммов В под контролем энхансерного элемента, такого как, например, CPMV 160, CPMV160+ или СРМ V НТ+, приводит к производству белков НА, которые демонстрируют повышенный титр гемагглютинации (HMG) при отсутствии BeYDV.
Следовательно, мутантный (модифицированный) белок НА можно экспрессировать при отсутствии амплификационного элемента, такого как амплификационный элемент на основе геминивируса, например, BeYDV, но в присутствии энхансерного элемента, такого как, например, CPMV 160, CPMV160+ или CPMV НТ+.
Мутантный (модифицированный) НА можно экспрессировать в присутствии энхансерного элемента, такого как, например, CPMV 160, CPMV160+ или CPMV НТ+, но при отсутствии или в присутствии амплификационного элемента, такого как, например, BeYDV. Как показано на фигурах 28В, 28С и 28F, мутантный (модифицированный) НА можно экспрессировать в присутствии энхансерного элемента, в присутствии или при отсутствии амплификационного элемента. Следовательно, настоящее изобретение также относится к экспрессии мутантного (модифицированного) НА в присутствии энхансерного элемента и необязательно амплификационного элемента.
Конструкты НА, содержащие энхансерный элемент (или CMPV НТ+, или CMPV 160+) и протеолитическую петлю, замещенную линкером GG (подвергнутую делеции протеолитическую петлю), проявляют повышенную экспрессию по сравнению с НА дикого типа или конструктами НА, содержащими CPMV НТ (фигура 28А, Н3 Per; фигура 28В, В Malaysia; фигура 28С, Н9 НК; фигура 29D, В Mass; фигура 28Е, Н2 Sin).
На фигуре 29А представлены обобщенные данные для титра гемагглютинации модифицированных белков НА, произведенных в растениях, содержащих основанные на CPMV НТ, CPMV НТ+, CPMV 160 или CPMV160+ энхансерные элементы, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью, кодирующей или модифицированный НА с подвергнутой делеции протеолитической петлей (линкер GG), или нативный НА. В большинстве случаев экспрессия (определенная как титр гемагглютинации) была выше для основанных на CPMV НТ+, CPMV 160 или CPMV160+ конструктов, которые продемонстрировали существенные уровни экспрессии.
Энхансерные элементы можно использовать для достижения высокого уровня транзиентной экспрессии мутантных (модифицированных) белков НА с модифицированными протеолитическими петлями. Энхансерные элементы могут быть основаны на растительных РНК-содержащих вирусах, включая в себя комовирусы, такие как вирус мозаики коровьего гороха (CPMV; смотрите, например, международные патентные публикации WO 2007/135480; WO 2009/087391; заявку на патент США № US 2010/0287670, Sainsbury F. et al., 2008, Plant Physiology; 148: 121-1218; Sainsbury F. et al., 2008, Plant Biotechnology Journal; 6: 82-92; Sainsbury F. et al., 2009, Plant Biotechnology Journal; 7: 682-693; Sainsbury F. et al. 2009, Methods in Molecular Biology, Recombinant Proteins From Plants, vol. 483: 25-39).
CPMV160 (CPMVX) и CPMV 160+ (CPMVX+)
Согласно одному варианту осуществления энхансерные элементы представляют собой "CPMVX" (также называемый "CPMV 160") и/или "CPMVX+" (также называемый "CPMV 160+"), описанные в предварительной заявке на выдачу патента США №61/925852, включенной в настоящий документ посредством ссылки.
Энхансер экспрессия "CPMVX" содержит 5' нетранслируемую область (UTR) комовируса, вируса мозаики коровьего гороха (CPMV). 5'UTR из нуклеотидов 1-160 РНК-2 последовательности CPMV (SEQ ID NO: 93) начинается на сайте начала транскрипции до первого в рамке считывания старт-кодона инициации (в положении 161), который служит в качестве сайта инициации для производства более длинного из двух имеющих общие карбокси-концы белков, кодируемых сегментом генома комовируса дикого типа. Более того, 'третий' сайт инициации в положении (или соответствующий положению) 115 в геномной последовательности РНК-2 CPMV, также может являться мутированным, подвергнутым делеции или иным образом измененным. Было показано, что удаление AUG 115 в дополнение к удалению AUG 161, усиливает экспрессию при комбинации с неполным белком М (Sainsbury and LomonossofF, 200S, Plant Physiology; 148: 1212-1218; WO 2009/087391; которые включены в настоящий документ посредством ссылки).
CPMVX содержит нуклеотиды X из SEQ ID NO:93, где X=160, 155, 150 или 114 из SEQ ID NO: 93, или последовательность, которая характеризуется 80% - 100% сходством последовательности с CPMVX, где Х=160, 155, 150 или 114 из SEQ ID NO: 93. Указанный энхансер экспрессии, как правило, называется CPMVX (смотрите фигуру 26А).
Энхансер экспрессии CPMVX, где Х=160, состоит из нуклеотидов 1-160 из SEQ ID NO: 93:
Энхансерная последовательность CPMVX дополнительно может быть слита со спейсерной последовательностью, причем CMPVX содержит нуклеотиды X из SEQ ID NO: 1, где Х=160, 155, 150 или 114 из SEQ ID NO: 1, или последовательность, которая характеризуется 80%-100% сходством последовательности с CPMVX, где Х=160, 155, 150 или 114 из SEQ ID NO: 93, и спейсерная последовательность содержит 1-100 нуклеотидов, слитых с 3'-концом последовательности CMPVX. Например, спейсерная последовательность может содержать приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 нуклеотидов или любое значение нуклеотидов в пределах указанных значений.
Если последовательность CMPVX содержит спейсерный фрагмент, то указанный энхансер экспрессии может называться CPMVX+ (смотрите фигуру 26А), где Х=160, 155, 150, 114 из SEQ ID NO: 1, также он может упоминаться как CMPVX, содержащий спейсерную последовательность, или он может упоминаться как CPMV160+; CPMV155+; CPMV150+; CPMV114+, где Х=160, 155,150 или 114, соответственно. Конструкты, содержащие CPMVX, которые не содержат спейсерную последовательность, могут носить название СРМ VX+, где Х=160, 155, 150, 114 из SEQ ID NO: 93, и где спейсерная последовательность составляет 0 нуклеотидов в длину.
Спейсерная последовательность может быть модифицирована путем процессирования, делеции или замещения нативной последовательности 5'UTR CMPV, которая расположена 3' относительно нуклеотида 160. Модифицированная спейсерная последовательность может быть удалена, замещена, процессирована или укорочена по сравнению с исходной или немодифицированной (т.е. нативной) спейсерной последовательностью, связанной с 5'UTR (как описано в Sainsbury F., and Lomonossoff G.P., 2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218). Спейсерная последовательность может содержать один или несколько сайтов рестрикции (полилинкер, сайт множественного клонирования, один или несколько сайтов клонирования), одну или несколько последовательностей Козак растения, одну или несколько линкерных последовательностей, один или несколько сайтов рекомбинации, или их комбинацию. В качестве примера, который не должен рассматриваться как ограничивающий, спейсерная последовательность может содержать последовательно: сайт множественного клонирования требуемой длины, слитый с последовательность Козак растения. Спейсерная последовательность не содержит нуклеотидную последовательность из нативной последовательности 5'UTR, которая расположена 3' относительно нуклеотида 160 нативной 5'UTR CPMV, например, нуклеотиды 161-512, как показано на фигуре 1 в Sainsbury F., and Lomonossoff G.P. (2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218; которая включена в настоящий документ посредством ссылки), или нуклеотиды 161-509 SEQ ID NO: 4. Иными словами, неполный белок М, присутствующий в известной из предшествующего уровня техники последовательности НТ CPMV (фигура 1 в Sainsbury F., and Lomonossoff G.P., 2008) удален из 5'UTR согласно настоящему изобретению.
Консенсусные последовательности Козак растения известны в настоящей области техники (смотрите, например, Rangan et al. Mol. Biotechnol., 2008, July 39(3), pp. 207-213). Как встречающиеся в природе, так и синтетические последовательности Козак можно использовать в энхансере экспрессии или они могут быть слиты с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, описанной в настоящем документе.
Последовательность Козак растения может представлять собой любые известные последовательности Козак растения (смотрите, например, L. Rangan et al. Mol. Biotechnol. 2008), включая в себя без ограничения следующие консенсусные последовательности растение:
Последовательность Козак растения также можно выбрать из следующей группы:
(SEQ ID NO: 186; консенсусная последовательность)
Энхансер экспрессии CPMVX, или CPMVX+, может быть функционально связан на 5'-конце энхансерной последовательности с регуляторной областью, которая является активной в растении и функционально связана с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью на 3'-конце энхансера экспрессии (фигура 26А) для управления экспрессией представляющей интерес нуклеотидной последовательности в хозяине-растении.
Согласно другому варианту осуществления энхансерные элементы представляют собой "CPMV НТ+", описанный в предварительной заявке на выдачу патента США №61/971274, включенной в настоящий документ посредством ссылки. Энхансер экспрессии "CPMV НТ+" (смотрите фигуру 27А) содержит 5' нетранслируемую область комовируса (UTR) и модифицированную, удлиненную или усеченную спейсерную последовательность.
Также предусмотрена экспрессионная система растения, содержащая первую последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторную область, функционально связанную с одним или несколькими энхансерами экспрессии, описанными в настоящем документе (например, CPMV НТ+, CPMV HT+[WT115], CPMV HT+[511]), и нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный НА. Более того, описана нуклеиновая кислота, содержащая промоторную (регуляторную область) последовательность, энхансер экспрессии (например, CPMV НТ+ или CPMV HT+[WT115]), содержащая 5'UTR комовируса и спейсерную последовательность с последовательностью Козак растения, слитой с одной или несколькими последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими модифицированный НА. Нуклеиновая кислота может дополнительно содержать последовательность, содержащую 3' нетранслируемую область (UTR) комовируса, например, 3'UTR пластоцианина, или другую 3'UTR, активную в растении, и последовательность - терминатор, например, терминатор NOS, функционально связанную с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей модифицированный НА (называемой представляющий интерес нуклеотид на фигуре 27А), так чтобы нуклеотидная последовательность, кодирующая модифицированный НА, была вставлена выше относительно хода транскрипции 3' нетранслируемой области (UTR) комовируса, 3'UTR пластоцианина или другой последовательности 3'UTR.
SEQ ID NO: 173 содержит энхансер экспрессии"СРМУ НТ", известный из предшествующего уровня техники (например, на фигуре 1 Sainsbury and Lomonossoff 2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218; которая включена в настоящий документ посредством ссылки). CPMV НТ включает в себя последовательность 5'UTR из нуклеотидов 1-160 из SEQ ID NO: 173 с модифицированными нуклеотидами в положении 115 (cgt), и неполный белок М с модифицированным нуклеотидом в положении 162 (acg), и не содержит последовательность Козак растения (5'UTR: нуклеотиды 1-160; неполный белок М подчеркнут, нуклеотиды 161-509). SEQ ID NO: 173 также включает в себя сайт множественного клонирования (курсив, нуклеотиды 510-528), который отсутствует в известной из предшествующего уровня техники последовательности CPMV НТ:
CPMV HT+ с консенсусной последовательностью Козак растения представлена в SEQ ID NO: 187 (нуклеотиды 1-160, 5'UTR, включая в себя модифицированный ATG в положениях 115 (GTG) показан строчными жирным шрифтом и курсивом; спейсерный фрагмент, содержащий: подчеркнутый неполный белок М, нуклеотиды 161 509, с модифицированным нуклеотидом в положении 162 (ACG); сайт множественного клонирования, курсивом, нуклеотиды 510-528; и консенсусную последовательность Козак растения, заглавными буквами и жирным шрифтом, нуклеотиды 529-534).
SEQ ID NO: 188 ("CPMV HT+511") содержит сегмент нативной последовательности генома РНК 2 CPMV из нуклеотидов 1-154. Последовательность 5'UTR из нуклеотидов 1-511 из SEQ ID NO: 188 содержит модифицированные последовательности "atg" в положениях 115 ("g" вместо "а"; курсивом, жирным шрифтом) и 162 ("с" вместо "t"; курсивом, жирным шрифтом), и неполный белок М (подчеркнут) из нуклеотидов 161-511. CPMV НТ+ 511 содержит консенсусная последовательность Козак нативного белка М (нуклеотиды 508-511; жирным шрифтом):
Другой неограничивающий пример энхансерной последовательности CPMV НТ+ представлен последовательностью SEQ ID NO: 189 (CPMV HT+[WT115]). Экспрессионные кассеты или векторы, содержащие CPMV НТ+ и включающие в себя регуляторную область растения в функциональной связи с последовательностью - энхансером экспрессии согласно SEQ ID NO: 189, и сайт начала транскрипции (ATG) на 3' - конце, слитый с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный НА, также представляют собой часть настоящего изобретения.
SEQ ID NO: 189 (CPMV НТ+[WT115]) нуклеотиды 1-160, 5'UTR, с ATG в положении 115-117, строчным жирным шрифтом; спейсерный фрагмент, содержащий: неполный белок М, подчеркнут, нуклеотиды 161 - 509; с модифицированным ATG в положении 161-153, строчным жирным шрифтом и подчеркнут, сайт множественного клонирования, курсивом, нуклеотиды 510-528; и последовательность Козак растения, заглавными буквами и жирным шрифтом, нуклеотиды 529-534).
Последовательность Козак растения согласно SEQ ID NO: 189 может представлять собой любую последовательность Козак растения, включая в себя без ограничения одну из последовательностей согласно SEQ ID NO: 174-186.
"Химерный белок"
Модифицированный НА может дополнительно представлять собой химерный белок. Под "химерным вирусным белком" или "химерным вирусным полипептидом", также называемым "химерный белок" или "химерный полипептид" или "химерный НА" понимают белок или полипептид, который содержит аминокислотные последовательности их двух или больше чем двух источников, например, без ограничения двух или более типов или подтипов гриппа или штаммы гриппа различного происхождения, которые слиты в один полипептид. Химерный белок или полипептид может включать в себя сигнальный пептид, который является таким же или гетерологичным в отношении остального полипептида или белка. Химерный белок или химерный полипептид можно получить в виде транскрипта из химерной нуклеотидной последовательности и после синтеза и при необходимости его можно соединить с образованием мультимерного белка. Следовательно, химерный белок или химерный полипептид также включает в себя белок или полипептид, содержащий субъединицы, которые соединены посредством дисульфидных мостиков (т.е. мультимерный белок). Например, химерный полипептид, содержащий аминокислотные последовательности из двух или более источников, можно процессировать до субъединиц и субъединицы соединить посредством дисульфидных мостиков с образованием химерного белка или химерного полипептида. Химерный белок НА также может содержать антигенный белок или его фрагмент первого вируса гриппа и комплекс трансмембранного домена (TDC) из НА второго вируса гриппа, включая в себя транс мембранный домен и домены цитозольного хвоста (ТМ/СТ). Полипептид может представлять собой модифицированный НА, и каждая из двух или более аминокислотных последовательностей, которые образуют полипептид, может быть получена из различных НА для получения химерного НА, химерного НА гриппа, химерного модифицированного НА или химерного модифицированного НА гриппа. Химерный НА также может включать в себя аминокислотную последовательность, содержащую гетерологичный сигнальный пептид (химерный пребелок НА), который отщепляется после или во время синтеза белка. Предпочтительно, чтобы химерный полипептид или химерный НА гриппа не являлся встречающимся в природе. Нуклеиновая кислота, кодирующая химерный полипептид, может быть описана как "химерная нуклеиновая кислота" или "химерная нуклеотидная последовательность". Например, химерная нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный НА, содержит химерную нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательно следующее: модифицированный эктодомен НА, содержащий модифицированную протеолитическую петлю, транс мембранный домен гриппа и цитоплазматический хвост, причем модифицированный эктодомен НА происходит из первого штамма гриппа, а трансмембранный домен и цитоплазматический хвост - из второго штамма гриппа. Примеры химерных нуклеиновых кислот, в которых модифицированный эктодомен НА происходит из первого штамма гриппа, а трансмембранный домен и цитоплазматический хвост из второго штамма гриппа, представлены в примерах 5.14, 5.16, 5.18, 5.19, 5.21 и 5.23. Вирусоподобная частица, в составе которой присутствует химерный НА, может быть описана как "химерная ВПЧ".
Как описано выше, химерный белок, химерный полипептид или химерный НА могут включать в себя сигнальный пептид, который является таким же, как и остальной полипептид или белок или гетер о логичным ему. Термин "сигнальный пептид" хорошо известен в настоящей области техники и, как правило, относится к короткой (приблизительно 5-30 аминокислот) последовательности аминокислот, встречающейся, как правило, на N-конце полипептида, который может направлять транслокацию вновь транслированного полипептида к конкретной органелле или способствовать в размещении конкретных доменов полипептидной цепи относительно других. В качестве неограничивающего примера сигнальный пептид может направлять транслокацию белка в эндоплазматический ретикулум и/или способствовать расположению N-концевого проксимального домена относительно мембранного якорного домена образующегося полипептида для содействия в расщеплении и укладке зрелого белка, например, модифицированного НА или химерного модифицированного НА.
НА также может представлять собой химерный НА или химерный модифицированный НА, причем нативный транс мембранный домен НА или модифицированного НА замещен гетерологичным трансмембранным доменом. Трансмембранный домен белков НА является высоко консервативным (смотрите, например, фигуру 1С международной патентной публикации WO 2010/148511; которая включена в настоящий документ посредством ссылки). Гетерологичный трансмембранный домен может быть получен из трансмембранного домена любого НА, например, без ограничения трансмембранного домена из H1 California, B/Florida/4/2006 (учетный номер GenBank АСА33493.1), B/Malaysia/2506/2004 (учетный номер GenBank ABU99194.1), H1/Bri (учетный номер GenBank ADE28750.1), H1 A/Solomon Islands/3/2006 (учетный номер GenBank ABU99109.1), H1/NC (учетный номер GenBank AAP34324.1), H2 A/Singapore/1/1957 (учетный номер GenBank ААА64366.1), Н3 A/Brisbane/10/2007 (учетный номер GenBank ACI26318.1), Н3 A/Wisconsin/67/2005 (учетный номер GenBank АВ037599.1), Н5 A/Anhui/1/2005 (учетный номер GenBank ABD28180,1), Н5 A/Vietnam/1194/2004 (учетный номер GenBank ACR48874.1), H5-Indo (учетный номер GenBank ABW06108.1). Трансмембранный домен также может быть определен следующей консенсусной аминокислотной последовательностью:
Примеры конструктов, содержащих химерный НА с гетерологичным транс мембранным доменом, включают в себя: конструкт номер 1875 (CPMV-HT+ В Brisbane/60/08 с подвергнутой делеции протеолитической петлей + Н1ТМ, с транс мембранным доменом и цито плазматическим хвостом, замещенными таковыми в H1 A/California/07/2009; смотрите пример 5.19), конструкт номер 1977 (CPMV-160+ В Brisbane/60/08 с подвергнутой делеции протеолитической петлей + Н1ТМ, с транс мембранным доменом и цито плазматическим хвостом, замещенными таковыми в H1 A/California/07/2009; смотрите пример 5.14), конструкт номер 1067 (CPMV-HT В Brisbane/60/08 с подвергнутой делеции протеолитической петлей + Н1ТМ, с транс мембранным доменом и цитоплазматическим хвостом, замещенными таковыми в H1 A/California/07/2009; смотрите пример 5.14), конструкт номер 2074 (CPMV НТ В Massachusetts/2/2012+H1Tm, с трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом, замещенными таковыми в H1 A/California/07/2009; смотрите пример 5.16), конструкт номер 2060 (CPMV НТ160+ Massachusetts/2/2012+H1Tm, с трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом, замещенными таковыми в H1 A/California/07/2009; смотрите пример 5.16), конструкт номер 2062 (CPMV 160+ В Massachusetts/2/2012+H1Tm, с транс мембранным доменом и цитоплазматическим хвостом, замещенными таковыми в H1 A/California/07/2009; смотрите пример 5.21), конструкт номер 1860 (CPMV НТ+ В Wisconsin/1/2010+H1Tm с трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом, замещенными таковыми в H1 A/California/07/2009; смотрите пример 5.23), конструкт номер 1454 (CPMV НТ В Wisconsin/1/2010+H1Tm с трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом, замещенными таковыми в H1 A/California/07/2009, смотрите пример 5.18) и конструкт номер 1893 (CPMV 160+ В Wisconsin/1/2010+H1Tm с транс мембранным доменом и цитоплазматическим хвостом, замещенными таковыми в H1 A/California/07/2009), смотрите пример 5.18. Активность указанных химерных модифицированных НА показана на фигурах 26В и 27В.
Сигнальный пептид
Сигнальный пептид (SP) может являться нативным относительно модифицированного НА или химерного модифицированного НА, или сигнальный пептид может быть гетерологичным в отношении первичной последовательности экспрессируемого модифицированного НА. Модифицированный НА может содержать сигнальный пептид из первого типа подтипа или штамма гриппа, с равновесием НА из одного или нескольких различных типов, подтипов или штаммов гриппа. Например, нативный сигнальный пептид подтипов НА H1, Н2, Н3, Н5, Н6, Н7, Н9 или НА гриппа типа В можно использовать для экспрессии модифицированного НА в растительной системе. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения SP может относиться к типу гриппа В, H1, Н3 или Н5; или подтипу H1/Bri, H1/NC, H5/Indo, Н3/Bri или B/Flo.
Более того, модифицированный НА или химерный модифицированный НА может содержать нативный или ненативный сигнальный пептид; ненативный сигнальный пептид может быть растительного происхождения или может быть получен из относящегося к животному или бактериального полипептида. Нативный сигнальный пептид может соответствовать таковому из НА или модифицированного НА, подлежащего экспрессии, кроме того, сигнальный пептид может происходить из структурного белка или гемагглютинина вируса, отличного от гриппа. Неограничивающие примеры сигнального пептида, который можно использовать, представляет собой сигнальный пептид из протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP; нуклеотиды 32-103 учетного номера Z11499, также смотрите международные патентные публикации WO 2009/076778; WO 2010/148511 или WO 2010/003235) или сигнальный пептид пататина (PatA SP; расположенный на нуклеотидах 1738 - 1806 учетного номера Genbank А08215). Нуклеотидная последовательность PatA SP для указанного учетного номера представляет собой:
аминокислотная последовательность сигнального пептида пататина А представляет собой:
Настоящее изобретение, следовательно, относится к модифицированному НА или химерному модифицированному НА, содержащему нативный или ненативный сигнальный пептид, и нуклеиновым кислотам, кодирующим такие химерные модифицированные белки НА.
Коэкспрессия с канальным белком
Мутантный (модифицированный) НА может быть произведен в растении путем коэкспрессии первой нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный НА, со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей канальный белок, например, без ограничения белок протонного канала. Первая и вторая нуклеиновые кислоты могут быть введены в растение за один этап или они могут быть введены в растение последовательно. Первая и вторая нуклеиновые кислоты могут быть введены в растение транзиентно (временно) или стабильно. Более того, растение, которое экспрессирует первую нуклеиновую кислоту, кодирующую модифицированный НА, может быть трансформировано канальным белком, например, без ограничения белком протонного канала (второй нуклеиновой кислотой) так, чтобы как первая, так и вторая нуклеиновые кислоты коэкспрессировались в растении. Альтернативно, растение, которое экспрессирует канальный белок, например, без ограничения белок протонного канала (вторую нуклеиновую кислоту), может быть трансформировано первой нуклеиновой кислотой, кодирующей модифицированный НА так, чтобы как первая, так и вторая нуклеиновые кислоты коэкспрессировались в растении. Кроме того, первое растение, экспрессирующее первую нуклеиновую кислоту, кодирующую модифицированный НА, можно скрестить со вторым растением, экспрессирующим вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую канальный белок, например без ограничения белок протонного канала, для получения растения - потомства, которое коэкспрессирует первую и вторую нуклеиновые кислоты, кодирующие модифицированный НА и канальный белок, например, без ограничения белок протонного канала, соответственно.
Не связываясь с теорией, рН клеточного компартмента, содержащего модифицированный НА, включая в себя аппарат Гольджи, может быть важным для укладки, стабильности и/или протеолиза НА. Белки протонного канала, такие как, например, белок гриппа М2 и ВМ2, могут регулировать рН в клеточных компартментах. Например, М2 регулирует потенциацию слияния мембраны путем забуферивания внутриклеточных компартментов как на поздней, так и на ранней стадиях репликации вируса гриппа.
Путем коэкспрессии канального белка, например, без ограничения белка протонного канала, вместе с модифицированным НА, рН внутри аппарата Гольджи может повышаться и приводить к повышению стабильности, снижению разложения или их комбинации и увеличению уровней экспрессии и выхода модифицированного НА и/или ВПЧ.
Путем коэкспрессии модифицированного НА вместе с канальным белком, например, без ограничения белком протонного канала, в растении, наблюдается повышенный выход НА и/или ВПЧ по сравнению с растением, которое экспрессировало модифицированный НА без коэкспрессии канального белка, например, без ограничения белка протонного канала (смотрите фигуры 13А и 14). Как показано, например, на фигуре 13А коэкспрессия М2 с модифицированным НА гриппа В увеличивала уровень накопления НА (фигура 13А, 1059 по сравнению с 1059+1261).
Более того, эффективность М2 из вируса гриппа A/Puerto Rico/8/1934 в отношении повышения накопления модифицированного НА гриппа В и Н3 сравнивали с М2 из вируса гриппа A/New Caledonia/20/1999. Для модифицированного НА гриппа В сравнение выполняли с помощью анализа вестерн-блоттинг белковых экстрактов из растений, трансформированных конструктами 1059, 1059+1261 и 1059+859. Полученные результаты продемонстрировали, что коэкспрессия М2 из вируса гриппа A/Puerto Rico/8/1934 (кодируемого конструктом №859) была такой же эффективной, как и коэкспрессия М2 из вируса гриппа A/New Caledonia/20/1999 (кодируемого конструктом №1261) в отношении повышенного накопления модифицированного НА гриппа В (фигура 14).
Используемые в настоящем документе термины "М2," "белок М2," "последовательность М2" и "домен М2" относятся ко всему или части последовательности белка М2, выделенной, основанной или присутствующей в любом встречающемся в природе или искусственно произведенному штамму или изоляту вируса гриппа. Таким образом, термин М2 и подобное включают в себя встречающиеся в природе варианты последовательности М2, произведенные с помощью мутации в течение жизненного цикла вируса или произведенные в ответ на селективное давление (например, лекарственная терапия, расширение тропизма клетки-хозяина или инфекционности и т.д.), а также рекомбинантно или синтетически полученные последовательности М2. Неограничивающий пример последовательностей, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, включают в себя М2 из A/Puerto Rico/8/1934 и М2 из A/New Caledonia/20/1999.
Иммунный ответ
"Иммунный ответ", как правило, относится к ответу системы приобретенного иммунитета. Система приобретенного иммунитета, как правило, включает в себя гуморальный ответ и клеточно-опосредованный ответ. Гуморальный ответ представляет собой аспект иммунитета, который опосредуется секретированными антителами, произведенными в клетках линии дифференцировки В-лимфоцитов (В-клетке). Секретированные антитела связываются с антигенами на поверхностях внедряющихся микроорганизмов (таких как вирусы или бактерии), которые метят их для разрушения. Гуморальный иммунитет используется, как правило, для обозначения производства антител и процессов, которые это сопровождают, а также эффекторных функций антител, включая в себя активацию клеток Th2 и производство цитокинов, создание клеток памяти, опсониновую стимуляцию фагоцитоза, устранение патогенов и подобное. Термины "модулируют" или "модулирование" или подобное относятся к увеличению или уменьшению конкретного ответа или параметра, определяемых любым из нескольких анализов, как правило, известных или используемых, некоторые из которых проиллюстрированы в настоящем документе.
Клеточно-опосредованный ответ представляет собой иммунный ответ, который не предусматривает участие антител, а скорее предусматривает активацию макрофагов, клеток - натуральных киллеров (NK), антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов и высвобождение различных цитокинов в ответ на антиген. Клеточно-опосредованный иммунитет используется, как правило, для обозначения активации некоторых Т-клеток, активации Тс-клеток и опосредованных Т-клетками ответов. Клеточно-опосредованный иммунитет особенно важен в реакции на вирусные инфекции.
Например, индукцию антиген-специфических CDS-положительных Т-лимфоцитов можно измерить с использованием анализа ELISPOT; стимуляцию CD4-положительных Т-лимфоцитов можно измерить с использованием анализа пролиферации. Титры антител к вирусу гриппа можно количественно оценить с использованием анализа ELISA; изотипы антиген-специфических или перекрестно-реактивных антител также можно измерить с использованием антиизотипных антител (например, анти-IgG, IgA, IgE или IgM). Способы и техники для проведения таких анализов хорошо известны в настоящей области техники.
Титры HAI перекрестной реактивности также можно использовать для демонстрации эффективности иммунного ответа на другие штаммы вируса, родственные подтипу вакцины. Например, сыворотку от субъекту, иммунизированного композицией вакцины первого штамма (например, ВПЧ A/Indonesia 5/05), можно использовать в анализе HAI со вторым штаммом целого вируса или вирусных частиц (например, A/Vietnam/1194/2004), и определении титра HAI.
Присутствие или содержания цитокинов также можно оценить количественно. Например, ответ клеток Т-хелперов (Th1/Th2) будет характеризоваться измерением секретирующих IFN-γ и IL-4 клеток с использованием ELISA (например, наборов BD Biosciences OptEIA). Мононуклеары периферической крови (РВМС) или спленоциты от субъекта можно культивировать и проанализировать супернатант. Т-лимфоциты также можно оценить количественно с помощью сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS), с использованием маркерный специфических флуоресцентных меток и способов, известных в настоящей области техники.
Анализ микронейтрализации также можно провести, чтобы охарактеризовать иммунный ответ у субъекта, смотрите, например, способы в Rowe et al., 1973. Титры вирусной нейтрализации можно получить несколькими путями, включая в себя: 1) подсчет бляшек лизиса (анализ бляшкообразования) после фиксации/окрашивании клеток кристаллическим фиолетовым; 2) наблюдение под микроскопом лизиса клеток в культуре; 3) ELISA и спектрофотометрическое обнаружение вирусного белка NP (что коррелирует с инфицированием вирусом клеток-хозяина).
Термин "вирусоподобная частица" (ВПЧ) или "вирусоподобные частицы" или "ВПЧ" относится к структурам, которые собираются самостоятельно и содержат вирусные белки, например, белок НА гриппа или модифицированный белок НА гриппа, такой как, например, белок НА0, в котором протеолитическая петля была модифицирована. ВПЧ, как правило, являются морфологически и антигенно сходными с вирионами, произведенными при инфекции, но не содержат генетической информации, необходимой для репликации и, таким образом, не являются инфекционными. В некоторых примерах ВПЧ могут содержать один вид белка или несколько видов белков. Для ВПЧ, содержащих несколько видов белков, виды белков могут происходить из одного и того же вида вируса или могут содержать белок из различных видов, родов, подсемейства или семейства вируса (что обозначено с помощью номенклатуры ICTV). В других примерах один или несколько видов белка, содержащихся в ВПЧ, могут быть модифицированы от встречающейся в природе последовательности, такой как, например, модифицированный НА, описанный в настоящем документе. ВПЧ могут быть произведены в подходящей клетке-хозяине, включая в себя клетки-хозяева растения и насекомого. После экстракции из клетки-хозяина и при выделении и дополнительной очистке при подходящих условиях ВПЧ можно очистить в виде интактных структур.
Более того, могут быть произведены ВПЧ, которые содержат комбинацию подтипов НА. Например, ВПЧ может содержать один или несколько НА или один или несколько модифицированных НА из подтипа H1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, H14, H15, H16, НА подтипа В или их комбинацию. Выбор комбинации НА или модифицированных НА можно осуществить по предусмотренному применению вакцины, полученной из ВПЧ. Например, вакцина для применения в прививании птиц может содержать любую комбинацию подтипов НА или подтипов модифицированного НА, тогда как ВПЧ, применимые для прививания людей, могут содержать один или несколько подтипов или модифицированный подтип H1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, H15, H16, НА подтипа В. Тем не менее комбинации других подтипов НА или подтипов модифицированного НА можно получить в зависимости от применения ВПЧ. Для получения ВПЧ, содержащих комбинации подтипов НА или подтипов модифицированных НА, требуемый подтип НА или подтип модифицированного НА может быть коэкспрессирован в одной и той же клетке, например, растительной клетке.
ВПЧ, произведенные из происходящих из вируса гриппа белков, согласно настоящему изобретению не содержат белок M1. Известно, что белок M1 связывается с РНК (Wakefield and Brownlee, 1989), которая является примесью в получении ВПЧ. Присутствие РНК является нежелательным при получении разрешения регуляторного органа для продукта ВПЧ, следовательно, препарат ВПЧ, не содержащий РНК, может быть предпочтительным.
ВПЧ, полученные, как описано в настоящем документе, как правило, не содержат нейраминидазы (NA). Тем не менее NA может быть коэкспрессирована с НА при необходимости получения ВПЧ, содержащих НА и NA.
Настоящее изобретение также предусматривает без ограничения происходящие из вируса ВПЧ, которые получают липидную оболочку из плазматической мембраны клетки, в которой белки ВПЧ экспрессируются. Например, если ВПЧ экспрессируются в растительной системе, ВПЧ может получить липидную оболочку из плазматической мембраны клетки.
Как правило, термин "липид" относится к жирорастворимым (липофильным), встречающимся в природе молекулам. Термин также используется более конкретно для обозначения жирных кислот и их производных (включая в себя три-, ди- и моноглицериды и фосфолипиды), а также другие жирорастворимые стеринсодержащие метаболиты или стерины. Фосфолипиды представляют собой основной компонент всех биологических мембран, наряду с гликолипидами, стеринами и белками. Примеры фосфолипидов включают в себя фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин и подобное. Примеры стеринов включают в себя зоостерины (например, холестерин) и фитостерины. Свыше 200 фитостеринов были идентифицированы в различных видах растений, среди которых наиболее распространенными являются кампестерин, стигмастерин, эргостерин, брассикастерин, дельта-7-стигмастерин, дельта-7-авенастерин, дауностерин, ситостерин, 24-метилхолестерин, холестерин или бета-ситостерин. Специалисту в настоящей области техники понятно, что липидный состав плазматической мембраны клетки может варьировать в зависимости от культуры условий роста клетки или организма, из которого получают клетку.
Клеточные мембраны, как правило, содержат липидные бислои, а также белки для различных функций. Локальные концентрации конкретных липидов, которые можно обнаружить в липидном бислое, называются ‘липидные рафты’. Не связываясь с теорией, липидные рафты могут играть значительную роль в эндо- и экзоцитозе, проникновении или выходе вирусов или других инфекционных средств, межклеточной передаче сигналов, взаимодействии с другими структурными компонентами клетки или организма, такими как внутри- и внеклеточные матриксы.
В растениях ВПЧ гриппа развиваются из плазматической мембраны, следовательно, липидный состав ВПЧ отражает их происхождение. Полученные согласно настоящему изобретению ВПЧ содержат НА одного или нескольких типов или подтипов гриппа, в комплексе с происходящими из растения липидами. Растительные липиды могут стимулировать специфические иммунные клетки и усиливать индуцированный иммунный ответ. Растительные мембраны состоят из липидов, фосфатидилхолина (PC) и фосфатидилэтаноламина (РЕ), а также содержат гликосфинголипиды, сапонины и фитостерины. Кроме того, липидные рафты также встречаются в растительных плазматических мембранах - указанные микродомены обогащены сфинголипидами и стеринами. Известно, что в растениях встречаются разнообразные фитостерины, включая в себя стигмастерин, ситостерин, 24-метилхолестерин и холестерин (Mongrand et al., 2004).
PC и РЕ, а также гликосфинголипиды могут связываться с молекулами CD1, экспрессированными иммунными клетками млекопитающих, такими как антиген-презентирующие клетки (АРС), например, дендритные клетки и макрофаги и другие клетки, включая в себя В- и Т-лимфоциты в тимусе и печени (Tsuji М,. 2006). Молекулы CD1 являются структурно сходными с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) I класса и их роль состоит в презентации гликолипидных антигенов клеткам NKT (Т-клеткам - натуральным киллерам). При активации клетки NKT активируют клетки врожденного иммунитета, такие как клетки NK и дендритные клетки, а также активируют клетки приобретенного иммунитета, такие как антитело-продуцирующие В-клетки и Т-клетки.
Разнообразные фитостерины можно обнаружить в плазматической мембране - конкретный состав может варьировать в зависимости от вида, условий роста, запасов питательных веществ или патогенного статуса, в качестве примеров некоторых факторов. Как правило, бета-ситостерин представляет собой самый распространенный фитостерин.
Фитостерины, присутствующие в ВПЧ гриппа, находящиеся в комплексе с липидным бислоем, например, в виде происходящей из плазматической мембраны оболочки, могут обеспечивать предпочтительную композицию вакцины. Не связываясь с теорией, произведенные в растении ВПЧ, находящиеся в комплексе с липидным бислоем, например, в виде происходящей из плазматической мембраны оболочки, могут индуцировать боле сильную иммунную реакцию, чем ВПЧ, полученные в других экспрессионных системах, и могут быть сходными с иммунной реакцией, индуцированной живыми или ослабленными цельновирусными вакцинами.
Описанная в настоящем документе ВПЧ может находиться в комплексе с происходящим из растения липидным бислоем. Согласно некоторым вариантам осуществления происходящий из растения липидный бислой может содержать оболочку ВПЧ. Происходящие из растения липиды могут содержать липидные компоненты плазматической мембраны растения, в котором производится ВПЧ, включая в себя без ограничения фосфатидилхолин (PC), фосфатидилэтаноламин (РЕ), гликосфинголипиды, фитостерины или их комбинацию. Происходящий из растения липид может альтернативно называться ‘растительный липид’. Примеры фитостеринов известны в настоящей области техники и включают в себя, например, стигмастерин, ситостерин, 24-метилхолестерин и холестерин, смотрите, например, Mongrand et al., 2004.
ВПЧ можно оценить в отношении структуры и размера, например, с помощью анализа гемагглютинации, электронной микроскопии или эксклюзионной хроматографии.
Для эксклюзионной хроматографии, общие растворимые белки можно экстрагировать из ткани растения путем гомогенизации (Polytron) образца измельченного в замороженном состоянии растительного материала в буфере для экстракции, и удалением нерастворимого материала путем центрифугирования. Можно использовать осаждение с помощью ПЭГ. Растворимый белок оценивают количественно и экстракт пропускают через эксклюзионную матрицу, например, без ограничения Sephacryl™. После хроматографии фракции можно дополнительно проанализировать с помощью иммуноблоттинга для определения белкового состава фракции.
Не связываясь с теорией, способность НА связываться с эритроцитами от различных животных управляется аффинностью НА к сиаловым кислотам α2,3 или α2,3 и присутствием указанных сиаловых кислот на поверхности эритроцитов. НА лошадей и птиц из штаммов вирус гриппа агглютинируют эритроциты из всех приведенных видов, включая в себя индеек, куриц, уток, морских свинок, людей, овец, лошадей и коров; тогда как НА человека будет связываться с эритроцитами индеек, куриц, уток, морских свинок, людей и овец (смотрите также Ito Т. et al, 1997, Virology, vol 227, p 493-499; и Medeiros R et al, 2001, Virology, vol 289 p. 74-85).
Правильная укладка экспрессированного вирусного белка может быть важной для стабильности белка, образования мультимеров, образования ВПЧ, функции вирусного белка и распознавания вирусного белка антителом, в числе других характеристик. Укладка и накопление белка могут находиться под влиянием одного или нескольких факторов, включая в себя без ограничения последовательность белка, относительная распространенность белка, степень внутриклеточного краудинга, рН в клеточном компартменте, доступность кофакторов, которые могут связываться или могут быть временно связаны со свернутым, частично свернутым или несвернутым белком, присутствие одного или нескольких белков шаперонов или тому подобное.
Белки теплового шока (Hsp) или стресс-белки представляют собой примеры белков шаперонов, которые могут принимать участие в различных клеточных процессах, включая в себя синтез белка, внутриклеточную направленную миграцию, предотвращение неправильной укладки, предотвращение агрегации белка, сборку и разборку белковых комплексов, укладку белка и дезагрегацию белка. Примеры таких белков шаперонов включают в себя без ограничения Hsp60, Hsp65, Hsp 70, Hsp90, Hsp100, Hsp20-30, Hsp10, Hsp100-200, Hsp100, Hsp90, Lon, TF55, FKBP, циклофилины, ClpP, GrpE, убиквитин, калнексин и протеиндисульфидизомеразы (смотрите, например, Macario, A.J.L., Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25:59-70. 1995; Parsell, D.A. & Lindquist, S. Ann. Rev. Genet. 27:437-496 (1993); патент США №5232833). Как описано в настоящем документе, белки шапероны, например, без ограничения Hsp40 и Hsp70, можно использовать для подтверждения укладки вирусного белка.
Примеры Hsp70 включают в себя Hsp72 и Hsc73 из клеток млекопитающих, DnaK из бактерий, в частности, таких микобактерий, как Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis (такие как Bacille-Calmette Guerin: в настоящем документе имеющий название Hsp71). DnaK из Escherichia coli, дрожжей и других прокариот, и BiP и Grp78 из эукариот, таких как A thaliana (Lin et al. 2001 (Cell Stress and Chaperones 6:201-208). Конкретный пример Hsp70 представляет собой Hsp70 A. thaliana (закодированный под учетным номером Genbank: AY 120747.1). Hsp70 способен специфически связываться с АТФ, а также несвернутыми полипептидами и пептидами, тем самым участвуя в укладке и разворачивании белка, а также в сборке и разборке белковых комплексов.
Примеры Hsp40 включают в себя DnaJ из прокариот, таких как E. coli и микобактерий, и HSJ1, HDJ1 и Hsp40 их эукариот, таких как люцерна (Frugis et al., 1999. Plant Molecular Biology 40:397-408). Конкретный пример Hsp40 представляет собой MsJIM sativa (учетный номер Genbank: AJ000995.1). Hsp40 играет роль в качестве молекулярного шаперона в укладке белка, термотолерантности и репликации ДНК, наряду с другими клеточными активностями.
Среди Hsps, Hsp70 и его кошаперон, Hsp40, вовлечены в стабилизацию проходящих трансляцию и вновь синтезированных полипептидов до завершения синтеза. Не связываясь с теорией, Hsp40 связывается с гидрофобными участками несвернутых (возникающих или вновь перенесенных) полипептидов, таким образом, облегчая взаимодействие комплекса Hsp70-АТФ с полипептидом. Гидролиз АТФ приводит к образованию стабильного комплекса между полипептидом, Hsp70 и АДФ и высвобождению Hsp40. Ассоциация комплекса Hsp70-АДФ с гидрофобными участками полипептида предотвращает их взаимодействие с другими гидрофобными участками, предотвращая неправильную укладку и образование агрегатов с другими белками (обзор в Hartl, FU. 1996. Nature 381:571-579).
Нативные белки шапероны могут быть способными облегчать правильную укладку низких содержаний рекомбинантного белка, но если уровни экспрессии повышаются, распространенность нативных шаперонов может становиться ограничивающим фактором. Высокие уровни экспрессии вирусного белка в агроинфильтрованных листьях могут приводить к накоплению вирусного белка в цитозоле, и коэкспрессия одного или нескольких белков шаперонов, таких как Hsp70, Hsp40 или как Hsp70, так и Hsp40 может снижать содержание неправильно свернутых или агрегированных белков, и увеличению количества белков, проявляющих характеристики третичной и четвертичной структуры, которые обеспечивают образование вирусоподобных частиц.
Следовательно, согласно настоящему изобретению также предусмотрен способ получения ВПЧ вирусного белка в растении, при котором первую нуклеиновую кислоту, кодирующую вирусный белок, коэкспрессируют со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей канальный белок, например, без ограничения белок протонного канала, и третьей нуклеиновой кислотой, кодирующей шаперон. Первую, вторую и третью нуклеиновые кислоты можно вводить в растение во время одной и той же стадии, или они могут быть введены последовательно.
ВПЧ, полученная в растении, может индуцировать вирусный белок, содержащий специфические для растения N-гликаны. Следовательно, настоящее изобретение также относится к ВПЧ, содержащей вирусный белок, содержащий специфические для растения N-гликаны.
Более того, известна модификация N-гликана в растениях (смотрите, например, патентные документы WO 2008/151440; WO 2010/006452 или US 60/944344; которые включены в настоящий документ посредством ссылки) и можно получить вирусный белок с модифицированными N-гликанами. Можно получить вирусный белок, содержащий модифицированный паттерн гликозилирования, например, со сниженным содержанием фукозилированных, ксилозилированных или как фукозилированных, так и ксилозилированных N-гликанов, или вирусный белок с модифицированным паттерном гликозилирования, причем белок не характеризуется фукозилированием, ксилозилированием или как фукозилированием, таки и ксилозилированием, и характеризуется повышенным галактозилированием. Более того, модулирование посттрансляционных модификаций, например, добавление концевой галактозы, может приводить к снижению фукозилирования и ксилозилирования экспрессированного вирусного белка по сравнению с растением дикого типа, экспрессирующим вирусный белок.
В качестве примера, который не должен рассматриваться как ограничивающий, синтез вирусного белка с модифицированным паттерном гликозилирования может быть достигнут путем коэкспрессии представляющего интерес белка вместе с нуклеотидной последовательностью, кодирующей бета-1.4-галактозилтрансферазу (GalT), например, без ограничения GalT млекопитающего или GalT человека, хотя также можно использовать GalT из других источников. Каталитический домен GalT также может быть слит с доменом CTS (т.е. цитоплазматический хвост, трансмембранный домен, стволовая область) N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (GNT1) для получения гибридного фермента GNT 1-GalT и гибридный фермент может быть коэкспрессирован с вирусным белком. Вирусный белок также можно коэкспрессировать вместе с нуклеотидной последовательностью, кодирующей N-ацетилглюкозаминилтрансферазу III (GnT-III), например, без ограничения GnT-III млекопитающего или GnT-III человека, хотя также можно использовать GnT-III из других источников. Кроме того, также можно использовать гибридный фермент GNT1-GnT-III, содержащий CTS из GNT1, слитый с GnT-III.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к ВПЧ, содержащим один или несколько вирусных белков с модифицированными N-гликанами.
Неограничивающий пример последовательностей, которые можно использовать согласно настоящему изобретению для получения модифицированных НА, также включает в себя последовательности, описанные в международных патентных заявках WO 2009/009876; WO 2009/076778; WO 2010/003225; WO 2010/148511; WO 2010/003235; WO 2010/006452 (которые включены в настоящий документ посредством ссылки), например, без ограничения:
белок H1, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, например, из штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1), A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/Solomon Islands 3/2006 (H1N1), /PuertoRico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1);
белок H2, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, может происходить из штамма A/Singapore/1/57 (H2N2);
белок Н3, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, может происходить из штамма A/Brisbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), A/Victoria/361/2011 (H3N2) или A/Perth/16/2009 (H3N2);
белок Н5, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, может происходить из штамма A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Indonesia/5/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1);
белок Н6, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты может происходить из штамма A/Teal/HongKong/W312/97 (H6N1);
белок Н7, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, также может происходить из штамма А/ Hangzhou/1/13 (H7N9), A/Equine/Prague/56 (H7N7);
белок Н9, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, может происходить из штамма A/HongKong/1073/99 (H9N2);
белок НА из подтипа В, кодируемый нуклеиновой кислотой, может происходить из штамма B/Florida/4/2006, B/Massachusetts/2/12, B/Malaysia/2506/2004, B/Wisconsin/1/2010, или B/Brisbane/60/2008.
Примеры
Пример 1
Трансфекция Agrobacterium
600
2
Штамм Agrobacterium AGL1 трансфектировали путем электропорации с помощью конструктов ДНК с использованием способов, описанных D'Aoust et al., 2008 (Plant Biotechnology Journal 6:930-940). Трансфектированные Agrobacterium выращивали в среде YEB, дополненной 10 мМ 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES), 20 мкМ ацетосирингона, 50 мкг/мл канамицина и 25 мкг/мл карбенициллина, рН 5,6 до OD, составляющей 0,6-1,6. Суспензии Agrobacterium центрифугировали перед применением и ресуспендировали в среде для инфильтрации (10 мМ MgCl и 10 мМ MES рН 5,6).
Получение растительной биомассы, инокулята и агроинфильтрация
Используемые в настоящем документе термины "биомасса" и "растительный материал" используют для обозначения любого материал, происходящий из растения. Биомасса или растительный материал может содержать целое растение, ткань, клетки или любую их фракцию. Кроме того, биомасса или растительный материал может содержать внкутриклеточные растительные компоненты, внеклеточные растительные компоненты, жидкие или твердые экстракты растений или их комбинацию. Кроме того, биомасса или растительный материал может содержать растения, растительные клетки, ткань, жидкий экстракт или их комбинацию из листьев, стеблей, плодов, корней растений или их комбинацию. Часть растения может содержать растительный материал или биомассу.
Растения Nicotiana benthamiana выращивали из семян в поддонах, заполненных коммерческим субстратом торфяным мхом. Обеспечивали рост растений в теплице с фотопериодом 16/8 и температурным режимом 25°С днем/20°С ночью. Через три недели после посева отдельные саженцы выдергивали, пересаживали в горшки и оставляли расти в теплице в течение трех дополнительных недель при таких же окружающих условиях.
600
2
Agrobacteria, трансфектированные каждым конструктом, выращивали в среде YEB, дополненной 10 мМ 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES), 20 мкМ ацетосирингона, 50 мкг/мл канамицина и 25 мкг/мл карбенициллина, рН 5,6, пока они не достигали OD 0,6-1,6. Суспензии Agrobacterium центрифугировали перед применением и ресуспендировали в среде для инфильтрации (10 мМ MgCl и 10 мМ MES рН 5,6) и хранили в течение ночи при 4°С. В день инфильтрации партии культур разводили в 2,5 объемах культуры и оставляли нагреваться перед использованием. Целые растения N. benthamiana помещали в перевернутом положении в бактериальную суспензию в непроницаемом для воздуха резервуаре из нержавеющей стали в условиях вакуума 20-40 мм рт.ст. в течение 2 мин. Растения возвращали в теплицу в течение 2-6 - дневного инкубационного периода до сбора.
Сбор листьев и экстракция общего белка
После инкубации надземную часть растений собирали, замораживали при -80°С и измельчали на кусочки. Общие растворимые белки экстрагировали путем гомогенизации (Polytron) каждого образца измельченного в замороженном состоянии растительного материала в 3 объемах холодного раствора, содержащего 50 мМ трис, рН 8,0, 0,5 М NaCl, 0,1% Triton Х-100 и 1 мМ фенилметансульфонилфторид. После гомогенизации суспензии центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин при 4°С и эти осветленные сырые экстракты (супернатант) сохраняли для анализов.
Анализ белка и иммуноблоттинг
Содержание общего белка осветленных сырых экстрактов определяли с помощью анализа Брэдфорда (Bio-Rad, Hercules, СА) с использованием альбумины бычьей сыворотки в качестве аналитического стандарта. Белки разделяли с помощью SDS-PAGE и подвергали электрофорезу на поливинилендифторидных (PVDF) мембранах (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) для иммунодетекции. Перед иммуноблоттингом мембраны блокировали с помощью 5% обезжиренного молока и 0,1% Tween-20 в трис-буферном солевом растворе (TBS-T) в течение 16-18 ч при 4°С.
Иммуноблоттинг проводили с помощью первой инкубации с первичным антителом (в таблице 4 представлены антитела и условия, используемые для обнаружения каждого НА), в 2 мкг/мл в 2% обезжиренном молоке в TBS-Tween 20 0,1%. Вторичные антитела, используемые для хемилюминесцентного обнаружения, были такими, как представлено в таблице 4, разбавленными, как указано, в 2% обезжиренном молоке в TBS-Tween 20 0,1%. Иммунореактивные комплексы обнаруживали с помощью хемилюминесценции с использованием луминола в качестве субстрата (Roche Diagnostics Corporation). Конъюгацию с ферментом пероксидазой хрена антитела IgG человека проводили с использованием набора для конъюгации с активированной пероксидазой EZ-Link Plus Activated Peroxidase (Pierce, Rockford, IL).
Анализ гемагглютинации
Анализ гемагглютинация основан на способе, описанном Nayak and Reichl (2004). Кратко, двойные серийные разведения исследуемых образцов (100 мкл) выполняли в 96-луночных микротитровальных планшетах с V-образным дном, содержащих 100 мкл PBS, оставляя по 100 мкл разведенного образца на лунку. 100 мкл 0,25% суспензии эритроцитов индейки (Bio Link Inc., Syracuse, NY) добавляли к каждой лунке и планшеты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Величину, обратную максимальному разведению, показывающему полную гемагглютинацию, регистрировали как активность НА. В параллели стандарт - рекомбинантный НА (A/Vietnam/1203/2004 H5N1) (Protein Science Corporation, Meriden, CT) разводили в PBS и исследовали как контроль на каждой лунке.
Экстракция ВПЧ путем обработки ферментами клеточной стенки
2
2
Ткань листьев собирали из растений Nicotiana benthamiana и разрезали на кусочки ~1 см. Кусочки листьев замачивали в 500 мМ манните в течение 30 минут при комнатной температуре (RT). Раствор маннита затем удаляли и заменяли ферментной смесью (смесь целлюлаз из Trichoderma viride (Onozuka R-10; 3% объем/объем) и смесь пектиназ wiRhizopus sp. (MACEROZYME™; 0,75% объем/объем; обе от Yakult Pharmaceuticals) в растворе для протопластов (500 мМ маннит, 10 мМ CaCl и 5 мМ MES/KOH (рН 5,6)). Используемое соотношение составляло 20 г кусочков листьев на 100 мл раствора. Этот препарат равномерно распределяли в плоском сосуде (~11×18 см) и инкубировали в течение 16 часов на ротационном шейкере при 40 об/мин и 26°С.
2
Альтернативно, экстракцию ВПЧ можно провести следующим образом: растения подвергали агроинфильтрации с помощью AGL1#489, 928,676 и 766. Ткань листьев обирали из растений N. benthamiana на 7 день после инфильтрации и разрезали на кусочки по ~1 см. Пектиназу 162L (Biocatalysts), Multifect CX CG и Multifect CX В (Genencor) добавляли к буферу обработки, содержащему 200 мМ маннит, 75 мМ цитрат, 0,04% бисульфит натрия, рН 6,0. Биомассы обрабатывали в двух параллелях при комнатной температуре в орбитальном шейкере.
После экстракции с помощью ферментов детрит листьев удаляли с помощью фильтрации (нейлоновый фильтр с размером ячейки 250 или 400 мкм). Грубо отфильтрованный экстракт центрифугировали при 5000xg в течение 5 минут. Супернатант подвергали обнаружению экспрессии НА (активность гемагглютинации (смотрите фигуру 20) и вестерн-блоттингу (смотрите фигуру 22).
Пример 2:
Эффект модифицированной протеолитической петли на накопление НА
Как показано на фигуре 13А, экспрессия нативного B/Brisbane (конструкт №1008) была ниже, чем экспрессия B/Brisbane, содержащего модифицированную протеолитическую петлю (конструкт №1059). Повышенная активность гемагглютинации также наблюдалась для B/Brisbane, содержащего модифицированную протеолитическую петлю (конструкт №1059) по сравнению с нативным НА B/Brisbane (конструкт №1008; фигура 13В).
Сходные результаты наблюдали в уровне накопления В/Wisconsin, содержащего модифицированную протеолитическую петлю (конструкт №1467), который был больше, чем уровень, наблюдаемый для нативного НА B/Wisconsin (конструкт №1462; фигура 16А). Повышенная активность гемагглютинации также наблюдалась для B/Wisconsin, содержащего модифицированную протеолитическую петлю (конструкт №1467) по сравнению с нативным НА B/Wisconsin (конструкт №1462; фигура 16В), указывая на большее накопление мутантного белка.
Экспрессия H5/Indo, содержащего модифицированную протеолитическую петлю, также наблюдалась с модификациями, включая в себя протеолитическую петлю, содержащую линкер GG (конструкт №928; SEQ ID NO: 85), линкер TETR (конструкт №676; SEQ ID NO: 77) или линкер TETQ (конструкт №766; SEQ ID NO: 8; фигура 22).
Эффект коэкспрессия М2 гриппа на уровень накопления НА
Коэкспрессию М2 оценивали в отношении ее влияния на уровень накопления модифицированного НА гриппа В. Конструкт №1059 кодирует НА гриппа В, в котором протеолитическая петля замещена 2 аминокислотным линкером (GG вместо аа 341-359). Результаты анализа вестерн-блоттинг, представленные на фигуре 13А, показывают, что удаление протеолитической петли приводило к увеличенному уровню накопления НА гриппа В (сравните 1008 с 1059) и что коэкспрессия М2 с модифицированным НА гриппа В также увеличивала уровни накопления НА (фигура 13А, 1059 по сравнению с 1059+1261). Анализ активности гемагглютинации на сырых белковых экстрактах из растений, трансформированных НА гриппа В с модификацией или без нее и с коэкспрессией М2 или без нее подтвердил положительный эффект коэкспрессии М2 на уровень накопления нативного НА гриппа В (фигура 13В, 1008 по сравнению с 1008+1261) и модифицированного НА гриппа В (фигура 13В, 1059 по сравнению с 1059+1261).
3
Коэкспрессия М2 с НА типа А, содержащем модифицированную протеолитическую петлю, также приводила к экспрессии НА. Например, коэкспрессия модифицированного Н3 с протеолитической петлей замещенной линкером GS или линкером (GSS) (смотрите фигуру 21Е, 21F) вместе с М2 также может приводить к накоплению НА в растении.
Эффективность М2 из вируса гриппа A/Puerto Rico/8/1934 в увеличении накопления модифицированного НА гриппа В и Н3 сравнивали с таковой у М2 из вируса гриппа A/New Caledonia/20/1999. Для модифицированного НА гриппа В сравнение проводили с помощью анализа вестерн-блоттинг белковых экстрактов из растений, трансформированных конструктами 1059, 1059+1261 и 1059+859. Полученные результаты продемонстрировали, что коэкспрессия М2 из вируса гриппа A/Puerto Rico/8/1934 (кодируемого конструктом №859) была такой же эффективной, как и коэкспрессия М2 из вируса гриппа A/New Caledonia/20/1999 (кодируемого конструктом №1261) в отношении повышения накопления модифицированного НА гриппа В (фигура 14).
Эффект коэкспрессии М2 гриппа на уровни накопления различных штаммов НА В
Анализ вестерн-блоттинг белковых экстрактов из растений, трансформированных генными конструктами, управляющими экспрессией НА гриппа В (из B/Wisconsin/1/2010) (конструкты №1462) в присутствии или при отсутствии конструкта экспрессии М2 (конструкт №1261) показал, что коэкспрессия М2 приводит к повышенному накоплению НА гриппа В (фигура 16А).
Коэкспрессию М2 также оценивали в отношении ее влияния на уровень накопления модифицированного НА гриппа В. Конструкт №1467 кодирует НА гриппа В, в котором протеолитическая петля замещена 2-аминокислотным линкером (GG вместо аа 341-359). Результаты анализа вестерн-блоттинг, представленные на фигурах 16А, показывают, что удаление протеолитической петли приводило к повышенному уровню накопления НА гриппа В (сравните 1462 с 1467) и что коэкспрессия М2 с модифицированным НА гриппа В также увеличивала уровень накопления НА (фигура 16А, 1467 по сравнению с 1467+1261). Анализ активности гемагглютинации на сырых белковых экстрактах из растений, трансформированных НА гриппа В с модификацией или без нее и с коэкспрессией М2 или без нее подтвердил положительный эффект коэкспрессии М2 на уровень накопления нативного НА гриппа В (фигура 16В, 1462 по сравнению с 1462+1261) и модифицированного НА гриппа В (фигура 16В, 1467 по сравнению с 1467+1261).
Эффект амплификационного элемента BeYDV и модифицированной протеолитической петли на накопление НА
Анализ вестерн-блоттинг белковых экстрактов из растений, трансформированных генными конструктами, управляющими экспрессией модифицированного НА гриппа В (из B/Brisbane/60/2008) с удаленной или не удаленной протеолитической петлей (смотрите фигуру 17А в отношении конструктов) и в присутствии или при отсутствии амплификационного элемента BeYDV (конструкт №1059 и 1039) показал, что при отсутствии BeYDV не могли обнаружить никакого накопления НА гриппа В (фигура 17В), если регуляторный элемент представлял собой CPMV-HT.
Эффект модифицированной протеолитической петли на относительный титр НА и гемагглютинацию
На фигуре 29А показано сравнение активности модифицированных белков НА, произведенных в растениях, содержащих основанные на CPMV НТ, CPMV НТ+, CPMV 160 или CPMV160+ энхансерные элементы, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью, кодирующей или модифицированный НА с протеолитической петлей, подвергнутой делеции (замещенной линкером GG), или нативный НА. В большинстве случаев экспрессия (определяемая как титр или активность гемагглютинации) была выше для основанного на CPMV НТ+, CPMV 160 или CPMV160+ конструкта, который продемонстрировал значительные уровни экспрессии.
Пример 3
Увеличенные выходы ВПЧ НА Н7 Hangzhou при удаленной протеолитической петле (PrL-) по сравнению с нативным конструктом.
2
Растения N. benthamiana подвергали инфильтрации с помощью AGL1/№2142+1261 и №2152+1261 и листья собирали после семидневного периода инкубации. Ткань листьев собирали и разрезали на кусочки по ~1 см. Пектиназу 162L и пектиназу 444L (Biocatalysts), Multifect CX CG и Multifect CX В (Genencor) добавляли в буфер, содержащий 200 мМ маннит, 125 мМ Цитрат, 0,04% бисульфит натрия, рН 6,0. Биомассу обрабатывали ферментами в течение ночи при комнатной температуре в орбитальном шейкере.
После ферментативной обработки апопластическую фракцию фильтровали через 400 мкм нейлоновый фильтр для удаления крупной необработанной ферментами вегетативной ткани (<5% исходной биомассы). Отфильтрованный экстракт затем центрифугировали при комнатной температуре в течение 15 мин при 5000xg для удаления протопластов и внутриклеточных примесей (белков, ДНК, мембран, везикул, пигментов и т.д.). Далее супернатант фильтровали (для осветления) с использованием 1,2 мкм стекловолоконного фильтра (Sartopore GF plus/Sartorius Stedim), и 0,45/0,2 мкм фильтра (Sartopore 2/Sartorius Stedim), перед тем, как подвергнуть образец хроматографии.
Осветленную апопластическую фракцию загружали на катионообменную колонку (Poros HS Applied Biosystems), уравновешенную равновесным/элюирующим буфером (50 мМ NaPO4, 100 мМ NaCl, 0,005% Tween 80, рН 6,0). Как только УФ возвращался к нулю, экстракт поэтапно элюировали с помощью равновесного/элюирующего буфера, содержащего повышающиеся концентрации NaCl (500 мМ). Очищенные ВПЧ концентрировали с помощью TFF, подвергали диафильтрации против буфера для получения состава(100 мМ PO4, 150 мМ NaCl, 0,01% Tween 80 при рН 7,4) и пропускали через 0,22 мкм фильтр.
Анализ гемагглютинации в отношении Н7 проводили на основании способа, описанного Nayak and Reichl (2004). Кратко, последовательные двойные разведения исследуемых образцов (100 мкл) проводили в 96-луночных микротитровальных планшетах с V-образным дном, содержащих 100 мкл PBS, оставляя по 100 мкл разведенного образца на каждую лунку. 100 мкл 0,25% суспензии клеток эритроцитов индейки (Bio Link Inc., Syracuse, NY) добавляли к каждой лунке и планшеты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Величину, обратную максимальному разведению, показывающему полную гемагглютинацию, регистрировали как активность гемагглютинации.
Содержание общего белка осветленных сырых экстрактов определяли с использованием альбумина бычьей сыворотки в качестве аналитического стандарта. Относительные выходы получали путем сравнения PrL-конструкта с нативным конструктом, используемым в качестве контроля. Разделение с помощью SDS-PAGE с использованием денатурирующего буфера для загрузки образца (0,1М трис рН 6,8, 0,05% бромфеноловый синий, 12,5% глицерин, 4% SDS и 5% бета-меркаптоэтанол), проводили при восстанавливающих условиях и кумасси бриллиантовый синий R-250 использовали для окрашивания белка.
На фигуре 46 А показано, что активность гемагглютинации в растительных экстрактах была больше для конструкта Н7 Hangzhou, в котором удалена протеолитическая петля (№2152+№1261, смотрите пример 5.34) по сравнению с нативным конструктом (№2142+№1261, смотрите пример 5.33).
На фигуре 46 В показано, что относительный общий выход белка в очищенной ВПЧ был выше для конструкта Н7 Hangzhou, в котором удалена протеолитическая петля (№2152+№1261) по сравнению с нативным конструктом (№2142+№1261). Этот пример демонстрирует хорошую корреляцию между улучшением накопления ВПЧ в растениях по сравнению с конечными выходами при проведении полного способа.
На фигура 46С показан анализ SDS-PAGE, причем полоса 2 показывает очищенный конструкт Н7 Hangzhou с удаленной протеолитической петлей, и полоса 3 показывает очищенный нативный конструкт Н7 Hangzhou. Для каждой полосы 2 мкг общего белка загружали на гель. Чистота профилей белков сходна для обоих конструктов и больше чем 90%.
Пример 4.1.
Устойчивость к трипсину мутантов Н5 Indonesia ВПЧ, в которых протеолитическая петля модифицирована или удалена, больше чем у нативного Н5 Indonesia.
2
Растения N. benthamiana подвергали агроинфильтрации с помощью AGL1/№489, №928, №766 и №676, как описано в примере 1 (выше). Листья собирали от растений через 7 дней после инфильтрации, разрезали на кусочки по ~1 см. Пектиназу 162L (Biocatalysts), Multifect СХ CG и Multifect СХ В (Genencor) добавляли в буфер, содержащий 200 мМ маннит, 75 мМ цитрат, 0,04% бисульфит натрия, рН 6,0. Биомассу обрабатывали ферментами в течение ночи при комнатной температуре в орбитальном шейкере. Обработанные ферментами экстракты грубо фильтровали, центрифугировали, осветляли и очищали, как описано в примере 3 (Н7 Hangzhou).
4
Для каждого из экстрактов ВПЧ НА нативного (№489), PRL-(№928), TETQ (№766) и TETR (№676), Н5 Indonesia, два образца ВПЧ НА ресуспендировали в буфере (100 мМ Na/KPO, 150 мМ NaCl, 0,01% TWEEN 80) при рН 7,4. Трипсин добавляли в соотношении к белку 1:100. Образцы отбирали через 30, 60 и 120 минут инкубации при комнатной температуре, затем кипятили в буфере загрузки образца для остановки реакции. Необработанные ферментом экстракты (контроль) и обработанные трипсином экстракты анализировали с помощью геля SDS-PAGE, как описано в примере 3.
На фигуре 47А показан анализ SDS-PAGE обработанных трипсином образцов, причем полосы 2-5 показывают ВПЧ нативного Н5 Indonesia (№489), полосы 69 показывают ВПЧ PrL-Н5 Indonesia (№928), полосы 10-13 показывают ВПЧ TETQ Н5 Indonesia (№766) и полосы 14-17 показывают ВПЧ TETR Н5 Indonesia (№676) в различные временные точки ферментативной обработки (0, 30, 60 и 120 минут). VPL нативного Н5 Indonesia с полосой, соответствующей мономеру HA0, обнаруживаемому при приблизительно 75 кДа в необработанной ферментом экстракте в полосе 2, быстро процессировался в полосы НА1 и НА2 путем добавления трипсина, обнаруживаемые при приблизительно 50 и 25 кДа, соответственно, во время обработки трипсином в полосах 3-5. ВПЧ как PrL-, так и TETQ Н5 Indonesia, стабилизированные путем удаления или модификации протеолитического сайта, показали устойчивость к трипсину, поскольку полоса HA0 не расщеплялась на полосы НА1 и НА2. ВПЧ TETR Н5 Indonesia были частично стабилизированы путем модификации протеолитического сайта, и мономеры HA0 расщеплялись на НА1 и НА2 медленнее, чем в ВПЧ нативного Н5 Indonesia.
Полученные данные продемонстрировали успешную защиту белка HA0 на его протеолитическом сайте в пределах НА1-НА2 либо с помощью подхода, при котором осуществляли делецию протеолитической петли (prl-), либо с помощью замещения протеолитической петли линкерной последовательностью (TETQ).
Пример 4.2. Иммуногенность нативной ВПЧ Н5 Indonesia является аналогичной иммуногенности ее мутантных аналогов (PrL-, TETQ и TETR) у мышей.
Экстракты ВПЧ нативного, PrL-, TETR и TETQ Н5 Indonesia очищали, как описано в примере 4.1 (выше).
На фигуре 47 В показана иммуногенность (титр HI) ВПЧ нативного Н5 и ее мутантных аналогов (prl-, TETQ и TETR) у мышей после введения двух доз. Мышам BALB/c (n=8/группа) вводили инъекцию дважды в день внутримышечно, с интервалом в 21 дня в дозе, составляющей 10 мкг вакцин растительных ВПЧ Н5 (нативная, prl-, TETQ или TETR) на основании содержания НА в них. Анализ титров HI проводили в сыворотке каждого животного, через 42 дня после вакцинации (21 день после второй дозы) и ВПЧ Н5 A/Indonesia/5/2005 (H5N1) использовали в качестве антигена. Столбики представляют сравнение относительных титров (%) H1 каждого из ВПЧ мутантных Н5 с ВПЧ нативного Н5 (рассчитанные с log2 титра HI GMT и 95% CI). Статистические различия между группами для каждой дозы сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа последующим апостериорным анализом Тьюки на Log2-трансформированных данных (при условии их нормального распределения). *р<0,05 считали значимым. Не наблюдали различий между группами для каждой дозы.
Пример 5.1: B-2X35S/CPMV-HT/M2 New Caledonia/NOS (конструкт номер 1261)
Последовательность, кодирующую М2 из вируса гриппа A/New Caledonia/20/1999 (H1N1), клонировали в экспрессионную систему 2X35S/CPMV-HT/NOS в плазмиде, содержащей экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий полную кодирующую М2 последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF-S1-M1+M2ANC.C (фигура 2A, SEQ ID NO: 7) и IF-Sl-4-M2ANC.r (фигура 2В, SEQ ID NO: 8) с использованием синтезированного гена М2 (соответствующего нуклеотидам 1-26, соединенным с нуклеотидами 715-982 из учетного номера Genbank DQ508860; фигура 2С, SEQ ID NO: 9) в качестве матрицы. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионную систему 2X35S/CPMV-HT/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт 1191 (фигура 1С) обрабатывали с помощью рестрикционного фермента SacII и StuI и линеаризированную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 1191 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для "In Fusion" клонирования представляющих интерес генов в основанной на CPMV НТ экспрессионной кассете. Он также включает в себя генный конструкт для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV Р19 под контролем промотора и терминатора гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, и последовательность от левой до правой границ т-ДНК представлена на фигуре 1D (SEQ ID NO: 4). Полученному конструкту присваивали номер 1261 (фигура 2D, SEQ ID NO: 10). Аминокислотная последовательность М2 из вируса гриппа A/New Caledonia/20/1999 (H1N1) представлена на фигуре 2Е (SEQ ID NO: 11). Изображение плазмиды 1261 представлено на фигуре 11.
Пример 5.2: C-2X35S/CPMV-HT/M2 Puerto Rico/NOS (конструкт номер 859)
Последовательность, кодирующую М2 из вируса гриппа A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1), клонировали в экспрессионную систему 2X35S/CPMV-HT/NOS в плазмиде, содержащей экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий полную кодирующую М2 последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF-S1-M1+M2ANC.c (фигура 2А, SEQ ID NO: 7) и IF-S1-4-M2ANC.r (фигура 2В, SEQ ID NO: 8), с использованием синтезированного гена М2 (соответствующего нуклеотидам 26-51, соединенным с нуклеотидами 740-1007 из учетного номера Genbank EF467824) (фигура 3А, SEQ ID NO: 12) в качестве матрицы. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионной системе 2X35S/CPMV-HT/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт 1191 (фигура 1С) обрабатывали с помощью рестрикционного фермента SacII и StuI и линеаризированную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 1191 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для "In Fusion" клонирования представляющих интерес генов в основанной на CPMV НТ экспрессионной кассете. Он также включает в себя генный конструкт для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV Р19 под контролем промотора и терминатора гена пластоцианина люцерны. Вектор представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, и последовательность от левой до правой границ т-ДНК представлена на фигуре 1D (SEQ ID NO: 4). Полученному конструкту присваивали номер 859 (фигура 3В, SEQ ID NO: 13). Аминокислотная последовательность М2 из вируса гриппа A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) представлена на фигуре 3С (SEQ ID NO: 14). Изображение плазмиды 859 представлено на фигуре 17.
Пример 5.3: G-2X35S/CPMV-HT/PDISP/HA В Brisbane/NOS в амплификационной системе BeYDV + репликаза (конструкт номер 1008)
Получение конструкта 1008 описано в предварительной заявке на выдачу патента США №61/541780. Кратко, последовательность, кодирующую НА из штамма гриппа B/Brisbane/60/2008, клонировали в 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS, содержащую амплификационную систему BeYDV + репликаза в плазмиде, содержащей экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием основанного на ПЦР способа с использованием синтезированного гена НА В Brisbane (соответствующего нуклеотидам 34-1791 из учетного номера Genbank FJ766840). Продукт ПЦР клонировали в одной рамке считывания с сигнальным пептидом PDI люцерны в экспрессионной кассете 2X35S/CPMV-HT/NOS в амплификационную систему BeYDV. Конструкт 1194 (смотрите фигуры 4А, 4В) обрабатывали с помощью рестрикционного фермента SacII и StuI и линеаризированную плазмиду использовали для реакции сборки для получения конструкта номер 1008 (фигура 4С, фигура 9; SEQ ID NO: 32).
Конструкт номер 1194 (фигура 4А) представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для "In Fusion" клонирования представляющих интерес генов в одной рамке считывания с сигнальным пептидом PDI люцерны в основанной на CPMV-HT экспрессионной кассете в амплификационную систему BeYDV. Он также включает в себя генный конструкт для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV Р19 под контролем промотора и терминатора гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA.
Пример 5.4: I-2X35S/CPMV-HT/PDISP-HA В Brisbane с подвергнутой делеции протеолитической петлей в амплификационной системе BeYDV + репликаза (конструкт номер 1059)
Получение конструкта 1059 описано в предварительной заявке на выдачу патента США №61/541780. Кратко, последовательность, кодирующую НА из штамма гриппа B/Brisbane/60/2008 с подвергнутой делеции протеолитической петлей, клонировали в 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS, содержащую амплификационную систему BeYDV + репликазав плазмиде, содержащей экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием основанного на ПЦР способа лигирования (Darveau et al., 1995, Methods in Neuroscience 26: 77-85). В первом раунде ПЦР фрагмент, содержащий кодирующую НА В Brisbane последовательность от нуклеотида 46 до нуклеотида 1065, амплифицировали с использованием синтезированного гена НА В Brisbane (соответствующего нуклеотидам 34-1791 из учетного номера Genebank FJ766840) в качестве матрицы. Второй фрагмент, содержащий кодирующую НА В Brisbane последовательность от нуклеотида 1123 до нуклеотида 1758, амплифицировали с использованием синтезированного гена НА В Brisbane (соответствующего нуклеотидам 34-1791 из учетного номера Genbank FJ766840) в качестве матрицы. Продукты ПЦР из обеих амплификации затем смешивали и использовали в качестве матрицы для второго раунда амплификации. Полученный фрагмент (кодирующий НА B/Brisbane/60/2008 Δа.а. 356-374 с линкером GG между фрагментами; смотрите фигуру 21В) клонировали в одной рамке считывания с сигнальным пептидом PDI люцерны в экспрессионной кассете 2X35S/CPMV-HT/NOS, содержащей амплификационную систему BeYDV для получения конструкта 1194 (фигуры 4А, 4В), который обрабатывали с помощью рестрикционного фермента SacII и StuI и линеаризированную плазмиду использовали для реакции сборки. Полученному конструкту присваивали номер 1059 (фигура 5С; SEQ ID NO: 40).
Аминокислотная последовательность PDISP-HA B/Brisbane/60/2008 с подвергнутой делеции протеолитической петлей представлена на фигуре 5D (SEQ ID NO: 41).
Пример 5.5: B-2X35S/CPMV-HT/HA В Wisconsin/NOS в амплификационной системе BeYDV(m)+репликаза (конструкт номер 1462)
Получение конструкта 1462 описано в предварительной заявке на выдачу патента США №61/541780. Кратко, последовательность, кодирующую НА из штамма гриппа B/Wisconsin/1/2010, клонировали в 2X35S/CPMV-HT/NOS, содержащую амплификационную систему BeYDV(m)+репликаза в плазмиде, содержащей экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto ter, с использованием основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий полную кодирующую НА В Wisconsin последовательность, амплифицировали с использованием синтезированного гена НА В Wisconsin (учетный номер Genbank JN993010) в качестве матрицы. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионной кассете 2X35S/CPMV-HT/NOS в амплификационную систему BeYDV(m). Конструкт 193 (фигура 6D) обрабатывали с помощью рестрикционного фермента SacII и StuI и линеаризированную плазмиду использовали для реакции сборки.
Конструкт номер 193 (фигура 6D, 6Е) представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для "In Fusion" клонирования представляющих интерес генов в основанной на CPMV НТ экспрессионной кассете в амплификационную систему BeYDV(m). Он также включает в себя генный конструкт для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV Р19 под контролем промотора и терминатора гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, и последовательность от левой до правой границ т-ДНК представлена на фигуре 6Е (SEQ ID NO: 52). Полученному конструкту присваивали номер 1462 (фигура 6F, SEQ ID NO: 53). Аминокислотная последовательность PDISP/HA из штамма гриппа B/Wisconsin/1/2010 представлена на фигуре 6G (SEQ ID NO: 54). Изображение плазмиды 1462 представлено на фигуре 6Н.
Пример 5.6: C-2X35S/CPMV-HT/HA В Wisconsin с подвергнутой делеции протеолитической петлей в амплификационной системе BeYDV(m)+репликаза (конструкт номер 1467)
Получение конструкта 1467 описано в предварительной заявке на выдачу патента США №61/541780. Кратко, последовательность, кодирующую НА из штамма гриппа B/Wisconsin/1/2010 с подвергнутой делеции протеолитической петлей, клонировали в 2X35S/CPMV-HT/NOS, содержащую амплификационную систему BeYDV(m)+репликаза в плазмиде, содержащей экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием основанного на ПЦР способа лигирования (Darveau et al. 1995, Methods in Neuroscience 26: 77-85). В первом раунде ПЦР фрагмент, содержащий кодирующую НА В Wisconsin последовательность отнуклеотида 1 до нуклеотида 1062, амплифицировали с использованием праймеров IF-HAB100.S1+3 с (фигура 6A, SEQ ID NO: 49) и НАВ110(PrL-).r (фигура 7А, SEQ ID NO: 55), с использованием синтезированного гена НА В Wisconsin (учетный номер Genbank JN993010) (фигура 6С, SEQ ID NO: 51) в качестве матрицы. Второй фрагмент, содержащий кодирующую НА В Wisconsin последовательность от нуклеотида 1120 до нуклеотида 1755, амплифицировали с использованием праймеров НАВ110(PrL-).c (фигура 7В, SEQ ID NO: 56) и and IF-HAB110.s1-4r (фигура 6В, SEQ ID NO: 50), с использованием синтезированного гена НА В Wisconsin (учетный номер Genbank JN993010) (фигура 6С, SEQ ID NO: 51) в качестве матрицы. Продукты ПЦР из обеих амплификации затем смешивали и использовали в качестве матрицы для второго раунда амплификации с использованием IF-НАВ110.S1+3 с (фигура 6А, SEQ ID NO: 49) и IF-HAB110.s1.4r (фигура 6В, SEQ ID NO: 50) в качестве праймеров. Полученный фрагмент (кодирующий HAB/Wisconsin/1/2010 Δа.а. 340-358 с линкером GG между фрагментами) клонировали в экспрессионной кассете 2X35S/CPMV-HT/NOS, содержащей амплификационную систему BeYDV(m), с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт 193 (фигура 6D) обрабатывали с помощью рестрикционного фермента SacII и StuI и линеаризированную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion.
Конструкт номер 193 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для "In Fusion" клонирования представляющих интерес генов в основанной на CPMV НТ экспрессионной кассете в амплификационную систему BeYDV(m). Он также включает в себя генный конструкт для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV P19 под контролем промотора и терминатора гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, и последовательность от левой до правой границ т-ДНК представлена на фигуре 6Е (SEQ ID NO: 52). Полученному конструкту присваивали номер 1467 (фигура 7С, SEQ ID NO: 57). Аминокислотная последовательность НА из штамма гриппа B/Wisconsin/1/2010 с подвергнутой делеции протеолитической петлей представлена на фигуре 7D (SEQ ID NO: 58). Изображение плазмиды 1467 представлено на фигуре 7Е.
Пример 5.7: A-2X35S/CPMV-HT/PDISP-HA В Brisbane с подвергнутой делеции протеолитической петлей (конструкт номер 1039)
Получение конструкта 1192 описано в предварительной заявке на выдачу патента США №61/541780. Кратко, последовательность, кодирующую НА из штамма гриппа B/Brisbane/60/2008 с подвергнутой делеции протеолитической петлей, клонировали в 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS в плазмиде, содержащей экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter с использованием следующего основанного на ПЦР способа лигирования (Darveau et al., 1995, Methods in Neuroscience 26: 77-85). В первом раунде ПЦР фрагмент, содержащий кодирующую НА В Brisbane последовательность от нуклеотида 46 до нуклеотида 1065, амплифицировали с использованием синтезированного гена НА В Brisbane (соответствующего нуклеотидам 34-1791 из учетного номера Genebank FJ766840) в качестве матрицы. Второй фрагмент, содержащий кодирующую НА В Brisbane последовательность от нуклеотида 1123 до нуклеотида 1758, амплифицировали с использованием синтезированного гена НА В Brisbane (соответствующего нуклеотидам 34-1791 из учетного номера Genbank FJ766840) в качестве матрицы. Продукты ПЦР из обеих амплификации затем смешивали и использовали в качестве матрицы для второго раунда амплификации. Полученный фрагмент (кодирующий НА B/Brisbane/60/2008 Δа.а. 356-374 с линкером GG между фрагментами) клонировали в одной рамке считывания с сигнальным пептидом PDI люцерны в экспрессионной кассете 2X35S/CPMV-HT/NOS. Конструкт 1192 обрабатывали с помощью рестрикционного фермента SacII и StuI и линеаризированную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion.
Конструкт номер 1192 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для "In Fusion" клонирования представляющих интерес генов в одной рамке считывания с сигнальным пептидом PDI люцерны в основанной на CPMV-HT экспрессионной кассете. Он также включает в себя генный конструкт для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV Р19 под контролем промотора и терминатора гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA Полученному конструкту присваивали номер 1039 (фигура 8В). Аминокислотная последовательность PDISP-HA B/Brisbane/60/2008 с подвергнутой делеции протеолитической петлей представлена на фигуре 5D (SEQ ID NO: 41). Изображение плазмиды 1039 представлено на фигуре 8А (SEQ ID NO: 15).
Пример 5.8: A-2X35S/CPMV-HT/H5 из A/Indonesia/5/2005 с мутацией сайта расщепления TETR (конструкт номер 676)
Последовательность, кодирующую Н5 из A/Indonesia/5/2005 с мутацией сайта расщепления TETR, клонировали в 2X35S/CPMV-HT/ NOS в плазмиде, содержащей экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа лигирования (Darveau et al., 1995, Methods in Neuroscience 26: 77-85). В первом раунде ПЦР фрагмент, содержащий кодирующую Н5 из A/Indonesia/5/2005 последовательность от нуклеотида 1 до нуклеотида 1015, амплифицировали с использованием праймеров IF-H5A-I-05.s1+3c (фигура 1А, SEQ ID NO: 2) и MutCleavage-H5(Indo).r (фигура 23А, SEQ ID NO: 74), с использованием синтезированного Н5 из A/Indonesia/5/2005 (фигура 1G, SEQ ID NO: 42) в качестве матрицы. Второй фрагмент, содержащий кодирующую Н5 из A/Indonesia/5/2005 последовательность от нуклеотида 1038 до нуклеотида 1707; амплифицировали с использованием праймеров MutCleavage-H5(Indo).c (фигура 23В, SEQ ID NO: 75) и IF-H5dTm.r (фигура 1В, SEQ ID NO: 3), с использованием синтезированного Н5 из A/Indonesia/5/2005 (фигура 1G, SEQ ID NO: 42) в качестве матрицы. Продукты ПЦР из обеих амплификации затем смешивали и использовали в качестве матрицы для второго раунда амплификации с использованием IF-H5A-I-05.s1+3c (фигура 1А, SEQ ID NO: 2) и IF-H5dTm.r (фигура 1В, SEQ ID NO: 3) в качестве праймеров. Полученный фрагмент (кодирующий Н5 из A/Indonesia/5/2005 Δа.а. 339-346 с линкером TETR между фрагментами) клонировали в экспрессионной кассете 2X35S/CPMV-HT/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт 1191 (фигура 1D) обрабатывали с помощью рестрикционного фермента SacII и StuI и линеаризированную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 1191 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для "In Fusion" клонирования представляющих интерес генов в рамке считывания в основанной на CPMV-HT экспрессионной кассете. Он также включает в себя генный конструкт для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV P19 под контролем промотора и терминатора гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, и последовательность от левой до правой границ т-ДНК представлена на фигуре 1D (SEQ ID NO: 4). Полученному конструкту присваивали номер 676 (фигура 23С, SEQ ID NO: 76). Аминокислотная последовательность Н5 из мутанта A/Indonesia/5/2005 с сайтом расщепления TETR представлена на фигуре 23D (SEQ ID NO: 77). Схематическое изображение плазмиды 676 представлено на фигуре 23Е.
Пример 5.9: B-2X35S/CPMV-HT/H5 из A/Indonesia/5/2005 с мутацией сайта расщепления TETQ (конструкт номер 766)
Последовательность, кодирующую Н5 из A/Indonesia/5/2005 с мутацией сайта расщепления TETQ мутация, клонировали в 2X35S/CPMV-HT/NOS в плазмиде, содержащей экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа лигирования (Darveau et al., 1995, Methods in Neuroscience 26: 77-85). В первом раунде ПЦР фрагмент, содержащий кодирующую Н5 из A/Indonesia/5/2005 последовательность от нуклеотида 1 до нуклеотида 1015, амплифицировали с использованием праймеров IF-H5A-I-05.s1+3c (фигура 1А, SEQ ID NO: 2) и H5I505_TETQ.r (фигура 24А, SEQ ID NO: 78), с использованием синтезированного Н5 из A/Indonesia/5/2005 (фигура 1G, SEQ ID NO: 42) в качестве матрицы. Второй фрагмент, содержащий кодирующую Н5 из A/Indonesia/5/2005 последовательность от нуклеотида 1038 до нуклеотида 1707, амплифицировали с использованием праймеров H5I505_TETQ.c (фигура 24В, SEQ ID NO: 79) и IF-H5dTm.r (фигура 1В, SEQ ID NO: 3), с использованием синтезированного Н5 из A/Indonesia/5/2005 (фигура 1G, SEQ ID NO: 42) в качестве матрицы. Продукты ПЦР из обеих амплификации затем смешивали и использовали в качестве матрицы для второго раунда амплификации с использованием IF-H5A-I-05.s1+3c (фигура 1А, SEQ ID NO: 2) и IF-H5dTm.r (фигура 1В, SEQ ID NO: 3) в качестве праймеров. Полученный фрагмент (кодирующий Н5 из A/Indonesia/5/2005 Δа.а. 339-346 с линкером TETQ между фрагментами) клонировали в экспрессионной кассете 2X35S/CPMV-HT/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт 1191 (фигура 1D) обрабатывали с помощью рестрикционного фермента SacII и StuI и линеаризированную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 1191 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для "In Fusion" клонирования представляющих интерес генов в рамке считывания в основанной на CPMV-HT экспрессионной кассете. Он также включает в себя генный конструкт для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV P19 под контролем промотора и терминатора гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, и последовательность от левой до правой границ т-ДНК представлена на фигуре 1D (SEQ ID NO: 4). Полученному конструкту присваивали номер 766 (фигура 24С, SEQ ID NO: 80). Аминокислотная последовательность Н5 из мутанта A/Indonesia/5/2005 с сайтом расщепления TETQ представлена на фигуре 24D (SEQ ID NO: 81). Схематическое изображение плазмиды 766 представлено на фигуре 24Е.
Пример 5.10: C-2X35S/CPMV-HT/H5 из A/Indonesia/5/2005 с подвергнутой делении протеолитической петлей (конструкт номер 928)
Последовательность, кодирующую Н5 из A/Indonesia/5/2005 с подвергнутой делеции протеолитической петлей, клонировали в 2X35S/CPMV-HT/ NOS в плазмиде, содержащей экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа лигирования, представленного в Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77-85 (1995)). В первом раунде ПЦР фрагмент, содержащий кодирующую Н5 из A/Indonesia/5/2005 последовательность от нуклеотида 1 до нуклеотида 1011 амплифицировали с использованием праймеров IF-H5A-I-05.s1+3c (фигура 1А, SEQ ID NO: 2) и H5I505(PrL-).r (фигура 25А, SEQ ID NO: 82), с использованием синтезированного Н5 из A/Indonesia/5/2005 (фигура 1G, SEQ ID NO: 42) в качестве матрицы. Второй фрагмент, содержащий кодирующую Н5 из A/Indonesia/5/2005 последовательность от нуклеотида 1075 до нуклеотида 1707, амплифицировали с использованием праймеров H5I505(PrL-).c (фигура 25 В, SEQ ID NO: 83) и IF-H5dTm.r (фигура 1В, SEQ ID NO: 3), с использованием синтезированного Н5 из A/Indonesia/5/2005 (фигура 1G, SEQ ID NO: 42) в качестве матрицы. Продукты ПЦР из обеих амплификаций затем смешивали и использовали в качестве матрицы для второго раунда амплификации с использованием IF-H5A-I-05.s1+3c (фигура 1А, SEQ ID NO: 2) и IF-H5dTm.r (фигура 1 В, SEQ ID NO: 3) в качестве праймеров. Полученный фрагмент (кодирующий Н5 из A/Indonesia/5/2005 Δа.а. 338-358 с линкером GG между фрагментами) клонировали в экспрессионную кассету 2X35S/CPMV-HT/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт 1191 (фигура 1D) обрабатывали с помощью рестрикционного фермента SacII и StuI и линеаризированную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 1191 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для "In Fusion" клонирования представляющих интерес генов в рамке считывания в основанной на CPMV-HT экспрессионной кассете. Он также включает в себя генный конструкт для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV P19 под контролем промотора и терминатора гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, и последовательность от левой до правой границ т-ДНК представлена на фигуре 1D (SEQ ID NO: 4). Полученному конструкту присваивали номер 928 (фигура 25С, SEQ ID NO: 84). Аминокислотная последовательность Н5 из A/Indonesia/5/2005 с подвергнутой делеции протеолитической петлей представлена на фигуре 25D (SEQ ID NO: 85). Изображение плазмиды 928 представлено на фигуре 25Е.
Пример 5.11 - F-2X35S/CPMV-HT/PDISP/HA В Brisbane/NOS (конструкт номер 1029)
Последовательность, кодирующую НА из штамма гриппа B/Brisbane/60/2008, клонировали в экспрессионную систему 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS в плазмиде, содержащей экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plastoter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую НА В Brisbane последовательность без ее сигнального пептида дикого типа, амплифицировали с использованием праймеров IF-S2+S4-B Bris.c (фигура 30А, SEQ ID NO: 86) и IF-Sla4-B Bris.r (фигура 30В, SEQ ID NO: 87), с использованием синтезированного гена НА В Brisbane (соответствующего нуклеотидам 34-1791 из учетного номера Genbank FJ766840) (фигура 30С, SEQ ID NO: 88) в качестве матрицы. Продукт ПЦР клонировали в одной рамке считывания с сигнальным пептидом PDI люцерны в 2X35S/CPMV-HT/NOS экспрессионную систему с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт 1192 обрабатывали с помощью рестрикционного фермента SacII и StuI и линеаризированную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 1192 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для "In Fusion" клонирования представляющих интерес генов в одной рамке считывания с сигнальным пептидом PDI люцерны в основанной на CPMV-HT экспрессионной кассете. Он также включает в себя генный конструкт для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV P19 под контролем промотора и терминатора гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA и последовательность от левой до правой границ т-ДНК. Полученному конструкту присваивали номер 1029 (фигура 30D, SEQ ID NO: 89). Аминокислотная последовательность PDISP/HA из штамма гриппа B/Brisbane/60/2008 представлена на фигуре 30Е (SEQ ID NO: 90). Изображение плазмиды 1029 представлено на фигуре 30F.
Пример 5.12 - 2X35S/CPMV НТ (конструкт №1039) и НТ+ (конструкт №1829) для PDISP/HA В Brisbane (PrL-)
Кодирующую последовательность, соответствующую НА из штамма гриппа B/Brisbane/60/2008 с подвергнутой делеции протеолитической петлей (PrL-), в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/HA В Brisbane (PrL-; фигура 31А, SEQ ID NO: 91), клонировали в исходный НТ и модифицированный НТ+ с использованием такого же основанного на ПЦР способа, как описан в примерах 5.7 и 5.11, но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для PDISP/HA В Brisbane (PrL-). Аминокислотная последовательность зрелого НА В Brisbane (PrL-), слитая с PDISP, представлена на фигуре 31 В (SEQ ID NO: 92). Изображения плазмиды 1039 и 1829 представлены на фигуре 8 В и 31D.
Пример 5.13 - 2X35S/CPMV НТ (конструкт №1039) и 2X35S/CPMV160+(конструкт №1937) для PDISP/HA В Brisbane (PrL-)
Кодирующую последовательность, соответствующую НА из штамма гриппа B/Brisbane/60/2008 с подвергнутой делеции протеолитической петлей (PrL-) (смотрите предварительную заявку на выдачу патента США №61/806227, выданную 28 марта 2013, которая включена в настоящий документ посредством ссылки, для дополнительной информации с отношении подвергнутых делеции областей протеолитической петли в последовательностях НА), в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/HA В Brisbane (PrL-)) (фигура 32А, SEQ ID NO: 93), клонировали в исходный CPMV-HT и CPMV160+ с использованием такого же основанного на ПЦР способа, как описан в примерах 5.7 и 5.11, но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для PDISP/HA В Brisbane (PrL-). Аминокислотная последовательность зрелого НА В Brisbane (PrL-), слитая с PDISP, представлена на фигуре 31В (SEQ ID NO: 92). Изображения плазмиды 1039 и 1937 представлены на фигуре 8В и фигуре 32С.
Пример 15.14 - 2X35S/CPMV НТ (конструкт №1067) и 2X35S/CPMV160+ (конструкт №1977) для PDISP/HA В Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT
Химерную кодирующую гемагглютинин последовательность, соответствующую эктодомену НА из штамма гриппа B/Brisbane/60/08 с подвергнутой делеции протеолитической петлей (PrL-) (смотрите предварительную заявку на выдачу патента США №61/806227, выданную 28 марта 2013, которая включена в настоящий документ посредством ссылки, для дополнительной информации с отношении подвергнутых делеции областей протеолитической петли в последовательностях НА), слитую с трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом (TMCT) H1 из вируса гриппа A/California/7/2009 и с сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/HA В Brisbane (PrL-)+Н1 California TMCT) (фигура 33А, SEQ ID NO: 95), клонировали в исходный CPMV-HT и CPMV160+ с использованием такого же основанного на ПЦР способа, как описан в примерах 5.7 и 5.11, но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для PDISP/HA В Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT. Аминокислотная последовательность зрелого НА В Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT, слитая с PDISP, представлена на фигуре 33В (SEQ ID NO: 96). Изображения плазмиды 1067 и 1977 представлены на фигуре 33С и фигуре 33D.
Пример 5.15 - 2X35S/CPMV НТ (конструкт №2072) и 2X35S/CPMV160+(конструкт №2050) для PDISP/HA В Massachussetts (PrL-)
Кодирующую последовательность, соответствующую НА из штамма гриппа B/Massachussetts/2/2012 с подвергнутой делеции протеолитической петлей (PrL-) (смотрите предварительную заявку на выдачу патента США №61/806227, выданную 28 марта 2013 для дополнительной информации с отношении подвергнутых делеции областей протеолитической петли в последовательностях НА, которая включена в настоящий документ посредством ссылки), в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/HA В Massachussetts (PrL-)) (фигура 34А, SEQ ID NO: 97), клонировали в исходный CPMV-HT и CPMV160+с использованием такого же основанного на ПЦР способа, как описан в примерах 5.7 и 5.11, но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для PDISP/HA В Massachussetts (PrL-). Аминокислотная последовательность зрелого НА В Massachussetts (PrL-), слитая с PDISP, представлена на фигуре 34В (SEQ ID NO: 98). Изображения плазмиды 2072 и 2050 представлены на фигуре 34С и фигуре 34D.
Пример 5.16 - 2X35S/CPMV НТ (конструкт №2074) и 2X35S/CPMV160+ (конструкт №2060) для PDISP/HA В Massachussetts (PrL-)+H1 California TMCT
Химерную кодирующую гемагглютинин последовательность, соответствующую эктодомену НА из штамма гриппа B/Massachussetts/2/2012 с подвергнутой делеции протеолитической петлей (PrL-) (смотрите предварительную заявку на выдачу патента США №61/806227; выданную 28 марта 2013 для дополнительной информации с отношении подвергнутых делеции областей протеолитической петли в последовательностях НА, которая включена в настоящий документ посредством ссылки), слитую с трансмембранным доменом и цито плазматическим хвостом (TMCT) HI из вируса гриппа A/California/7/2009 и с сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/HA В Massachussetts (PrL-)+H1 California TMCT) (фигура 35А, SEQ ID NO: 99), клонировали в исходный CPMV-НТ и CPMV160+ с использованием такого же основанного на ПЦР способа, как описан в примерах 5.7 и 5.11, но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для PDISP/HA В Massachussetts (PrL-)+H1 California TMCT. Аминокислотная последовательность зрелого НА В Massachussetts (PrL-)+H1 California TMCT, слитая с PDISP, представлена на фигуре 35В (SEQ ID NO: 100). Изображения плазмиды 2074 и 2060 представлены на фигуре 35С и 35D.
Пример 5.17 - 2X35S/CPMV НТ (конструкт №1445), 2X35S/CPMVHT+ (конструкт №1820) и CPMV160+ (конструкт №1975) для НА В Wisconsin (PrL-)
Кодирующую последовательность, соответствующую НА из штамма гриппа B/Wisconsin/1/2010 с подвергнутой делеции протеолитической петлей (PrL-) (смотрите предварительную заявку на выдачу патента США №61/806227, выданную 28 марта 2013 для дополнительной информации с отношении подвергнутых делеции областей протеолитической петли в последовательностях НА, которая включена в настоящий документ посредством ссылки) с его нативным сигнальным пептидом (НА В Wisconsin (PrL-)) (фигура 36АА, SEQ ID NO: 101) клонировали в исходный CPMV-HT, CPMVHT+ и CPMV160 с использованием такого же основанного на ПЦР способа, как описан в примерах 5.7 и 5.11, но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для НА В Wisconsin (PrL-). Аминокислотная последовательность НА В Wisconsin (PrL-) с его нативным сигнальным пептидом представлена на фигуре 36В (SEQ ID NO: 102). Изображения плазмиды 1445, 1820 и 1975 представлены на фигурах 36С, 36D и 36Е, соответственно.
Пример 5.18 - 2X35S/CPMV НТ (конструкт №1454) и 2X35S/CPMV160+ (конструкт №1893) для НА В Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT
Химерную кодирующую гемагглютинин последовательность, соответствующую эктодомену НА из штамма гриппа В/ Wisconsin /2/2012 с подвергнутой делеции протеолитической петлей (PrL-) (смотрите предварительную заявку на выдачу патента США №61/806227, выданную 28 марта 2013 для дополнительной информации с отношении подвергнутых делеции областей протеолитической петли в последовательностях НА, которая включена в настоящий документ посредством ссылки), слитую с трансмембранным доменом и цито плазматическим хвостом (ТМСТ) H1 из вируса гриппа A/California/7/2009 с нативным сигнальным пептидом НА В Wisconsin (НА В Wisconsin (PrL-)+H1 California ТМСТ) (фигура 37А, SEQ ID NO: 103) клонировали в исходный CPMV-HT и CPMV160+ с использованием такого же основанного на ПЦР способа, как описан в примерах 5.7 и 5.11, но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для НА В Wisconsin (PrL-)+H1 California ТМСТ. Аминокислотная последовательность НА В Wisconsin (PrL-)+H1 California ТМСТ представлена на фигуре 37 (SEQ ID NO: 104). Изображения плазмиды 1454 и 1893 представлены на фигуре 37С и 37D.
Пример 5.19: 2X35S/CPMV НТ (конструкт №1067) и НТ+ (конструкт №1875) доя PDISP/HA В Brisbane (PrL-)+H1 California ТМСТ
Химерную кодирующую гемагглютинин последовательность, соответствующую эктодомену НА из штамма гриппа B/Brisbane/60/08 с подвергнутой делеции протеолитической петлей (PrL-), слитую с трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом (ТМСТ) H1 из вируса гриппа A/California/7/2009 и с сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/HA В Brisbane (PrL-)+H1 California ТМСТ) (фигура 38А, SEQ ID NO: 105), клонировали в исходный НТ и модифицированный НТ+ с использованием такого же основанного на ПЦР способа, как описан в примере 5.26, но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для PDISP/HA В Brisbane (PrL-)+H1 California ТМСТ. Аминокислотная последовательность зрелого НА В Brisbane (PrL-)+H1 California ТМСТ, слитая с PDISP, представлена на фигуре 38 В (SEQ ID NO: 106). Изображения плазмиды 1067 и 1875 представлены на фигуре 33С и 39С.
Пример 5.20: 2X35S/CPMV НТ (конструкт №2072) и НТ+ (конструкт №2052) для PDISP/HA В Massachussetts (PrL-)
Кодирующую последовательность, соответствующую НА из штамма гриппа B/Massachussetts/2/2012 с подвергнутой делеции протеолитической петлей (PrL-), в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/HA В Massachussetts (PrL-)) (фигура 39А, SEQ ID NO: 107), клонировали в исходный НТ и модифицированный НТ+ с использованием такого же основанного на ПЦР способа, как описан в примере 5.26, но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для PDISP/HA В Massachussetts (PrL-). Аминокислотная последовательность зрелого НА В Massachussetts (PrL-), слитая с PDISP, представлена на фигуре 39В (SEQ ID NO: 108). Изображения плазмиды 2072 и 2052 представлены на фигуре 34С и фигуре 39С.
Пример 5.21: 2X35S/CPMV НТ (конструкт №2074) и НТ+ (конструкт №2062) для PDISP/HA В Massachussetts (PrL-)+H1 California TMCT
Химерную кодирующую гемагглютинин последовательность, соответствующую эктодомену НА из штамма гриппа B/Massachussetts/2/2012 с подвергнутой делеции протеолитической петлей (PrL-), слитую с трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом (TMCT) HI из вируса гриппа A/California/7/2009 и с сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/HA В Massachussetts (PrL-)+H1 California TMCT) (фигура 40А, SEQ ID NO: 109), клонировали в исходный НТ и модифицированный НТ+ с использованием такого же основанного на ПЦР способа, как описан в примере 5.26, но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для PDISP/HA В Massachussetts (PrL-)+H1 California TMCT. Аминокислотная последовательность зрелого НА В Massachussetts (PrL-)+H1 California TMCT, слитая с PDISP, представлена на фигуре 40В (SEQ ID NO: 110). Изображения плазмиды 2074 и 2062 представлены на фигуре 35С и фигуре 40С.
Пример 5.22: 2X35S/CPMV НТ (конструкт №1445) и НТ+ (конструкт №1839) для НА В Wisconsin (PrL-)
Кодирующую последовательность, соответствующую НА из штамма гриппа B/Wisconsin/1/2010 с подвергнутой делеции протеолитической петлей (PrL-) с его нативным сигнальным пептидом (НА В Wisconsin (PrL-)) (фигура 41А, SEQ ID NO: 111) клонировали в исходный НТ и модифицированный НТ+ с использованием такого же основанного на ПЦР способа, как описан в примере 5.26, но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для НА В Wisconsin (PrL-). Аминокислотная последовательность НА В Wisconsin (PrL-) с его нативным сигнальным пептидом представлена на фигуре 41В (SEQ ID NO: 112). Изображения плазмиды 1445 и 1839 представлены на фигуре 36С и 41С.
Пример 5.23: 2X35S/CPMV НТ (конструкт №1454) и НТ+ (конструкт №1860) для НА В Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT
Химерную кодирующую гемагглютинин последовательность, соответствующую эктодомену НА из штамма гриппа В/ Wisconsin /2/2012 с подвергнутой делеции протеолитической петлей (PrL-), слитую с трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом (ТМСТ) H1 из вируса гриппа A/California/7/2009 с нативным сигнальным пептидом НА В Wisconsin (НА В Wisconsin (PrL-)+H1 California ТМСТ) (фигура 42А, SEQ ID NO: 113), клонировали в исходный НТ и модифицированный НТ+ с использованием такого же основанного на ПЦР способа, как описан в примере 5.26, но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для НА В Wisconsin (PrL-)+H1 California ТМСТ. Аминокислотная последовательность НА В Wisconsin (PrL-)+H1 California ТМСТ представлена на фигуре 42В (SEQ ID NO: 114). Изображения плазмиды 1454 и 1860 представлены на фигуре 37С и 42С.
Пример 5.24 - 2X35S/CPMV НТ (конструкт №489), 2X35S/CPMV160+ (конструкт №1880) и 2X35S/CPMV160 (конструкт №1885) дом Н5 Indonesia
Кодирующую последовательность, соответствующую нативному Н5 из вируса гриппа A/Indonesia/5/2005 (фигура 43А, SEQ ID NO: 115), клонировали в исходный CPMV-HT, CPMV160+ и CPMV160 с использованием такого же основанного на ПЦР способа, как описан в примере 5.25. но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для Н5 Indonesia. Аминокислотная последовательность нативного Н5 из вируса гриппа A/Indonesia/5/2005 представлена на фигуре 43В (SEQ ID NO: 116). Изображение плазмиды 489 представлено на фигуре 43С.
Пример 5.25 - 2X35S/CPMV160+/PDISP/H3 Victoria/ NOS (конструкт номер 1800)
Последовательность, кодирующую Н3 из вируса гриппа A/Victoria/361/2011, в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/H3 Victoria), клонировали экспрессионную систему 2X35S/CPMV160+/NOS (CPMV160+) с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую PDISP/H3 Victoria последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF**(SacII)-PDI.s1+4c (фигура 44А, SEQ ID NO: 117) и IF-H3V36111.s1-4r (фигура 44В, SEQ ID NO: 118), с использованием последовательности PDISP/H3 Victoria (фигура 44С, SEQ ID NO: 119) в качестве матрицы. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионную систему 2X35S/CPMV160+/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт номер 2171 (фигура 44D) обрабатывали с помощью рестрикционного фермента SacII и StuI и линеаризированную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 2171 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для "In Fusion" клонирования представляющих интерес генов в основанной на CPMV160+ экспрессионной кассете. Он также включает в себя генный конструкт для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV P19 под контролем промотора и терминатора гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду рСАМВ1А, и последовательность от левой до правой границ т-ДНК представлена на фигуре 44Е (SEQ ID NO: 120). Полученному конструкту присваивали номер 1800 (фигура 44F, SEQ ID NO: 121). Аминокислотная последовательность зрелого Н3 из вируса гриппа A/Victoria/361/2011, слитая с PDISP, представлена на фигуре 44G (SEQ ID NO: 122). Изображение плазмиды 1800 представлено на фигуре 44Н.
Пример 5.26: 2X35S/CPMV-HT+/PDISP/H3 Victoria/ NOS (конструкт номер 1819)
Последовательность, кодирующую Н3 из вируса гриппа A/Victoria/361/2011, в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/H3 Victoria), клонировали экспрессионную систему 2Х35 S-CPMV-HT+/NOS с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую PDISP/H3 Victoria последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF(SacII)-Kozac_PDI.c (фигура 45А, SEQ ID NO: 123) и IF-H3V36111.s1.4r (фигура 45 В, SEQ ID NO: 124), с использованием последовательности PDISP/H3 Victoria (фигура 44С, SEQ ID NO: 119) в качестве матрицы. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионную систему 2X35S/CPMV-HT+/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт номер 2181 (фигура 45D) обрабатывали с помощью рестрикционного фермента SacII и StuI и линеаризированную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 2181 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для "In Fusion" клонирования представляющих интерес генов в основанной на CPMV-HT+ экспрессионной кассете. Он также включает в себя генный конструкт для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV P19 под контролем промотора и терминатора гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, и последовательность от левой до правой границ т-ДНК представлена на фигуре 45Е (SEQ ID NO: 125). Полученному конструкту присваивали номер 1819 (фигура 45Е, SEQ ID NO: 126). Аминокислотная последовательность зрелого Н3 из вируса гриппа A/Victoria/361/2011, слитая с PDISP, представлена на фигуре 44G (SEQ ID NO: 122). Изображение плазмиды 1819 представлено на фигуре 45F.
Пример 5.27 2X35S/CPMV НТ+/ PDISP/H2 Singapore/ NOS (конструкт номер 2220)
Последовательность, кодирующую Н2 из вируса гриппа A/Singapore/1/1957, в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/H2 Singapore), клонировали экспрессионную систему 2X35S/CPMV HT+/NOS с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую PDISP/H2 Singapore последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF(SacII)-Kozac_PDI.c (описанного для конструкта 1819 в примере 5.26) и IF**-H2S157.s1-6r (фигура 48А, SEQ ID NO: 127), с использованием последовательности PDISP/H2 Singapore (фигура 48В, SEQ ID NO: 128) в качестве матрицы. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионную систему 2X35S/CPMV HT+/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт номер 2181 (описанный для конструкта 1819 в примере 5.26) обрабатывали с помощью рестрикционного фермента SacII и StuI и линеаризированную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 2181 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для "In Fusion" клонирования представляющих интерес генов в основанной на CPMV HT+ экспрессионной кассете. Он также включает в себя генный конструкт для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV P19 под контролем промотора и терминатора гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, и последовательность от левой до правой границ т-ДНК представлена на фигуре 45D. Полученному конструкту присваивали номер 2220 (фигура 48С, SEQ ID NO: 129). Аминокислотная последовательность зрелого Н2 из вируса гриппа A/Singapore/1/1957 слитая с PDISP, представлена на фигуре 48D (SEQ ID NO: 130). Изображение плазмиды 2220 представлено на фигуре 48Е.
Пример 5.28 2X35S/CPMV HT+/ PDISP/H2 Singapore с подвергнутой делеции протеолитической петлей/NOS (конструкт номер 2221)
Последовательность, кодирующую Н2 из вируса гриппа A/Singapore/1/1957 с подвергнутой делеции протеолитической петлей, в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/H2 Singapore с подвергнутой делеции протеолитической петлей), клонировали экспрессионную систему 2X35S/CPMV HT+/NOS с использованием следующего основанного на ПЦР способа лигирования, представленного в Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77-85 (1995)). В первом раунде ПЦР фрагмент, содержащий кодирующую Н2 из вируса гриппа A/Singapore/1/1957 последовательность от нуклеотида 1 до нуклеотида 1032, амплифицировали с праймерами IF(SacII)-Kozac_PDI.c (описанным для конструкта 1819 в примере 5.26) и H2S157(Prl-).r (фигура 49А, SEQ ID NO: 131), с использованием последовательности PDISP/H2 Singapore (фигура 48В, SEQ ID NO: 128) в качестве матрицы. Второй фрагмент, содержащий кодирующую Н2 из вируса гриппа A/Singapore/1/1957 последовательность от нуклеотида 1084 до нуклеотида 1716, амплифицировали с праймерами H2S157(Prl-).c (фигура 49В, SEQ ID NO: 132) и IF**-H2S157.sl.6r (фигура 48А, SEQ ID NO: 127) с использованием последовательности PDISP/H2 Singapore (фигура 48В, SEQ ID NO:128) в качестве матрицы. Продукты ПЦР из обеих амплификации затем смешивали и использовали в качестве матрицы для второго раунда амплификации с использованием IF(SacII)-Kozac_PDI.c (описанного для конструкта 1819 в примере 5.26) и IF**-H2S157.s1-6r (фигура 48А, SEQ ID NO: 127) в качестве праймеров. Продукт ПЦР (содержащий кодирующую PDISP/H2 Singapore последовательность с аа 321 - 337, замещенными линкером GG) клонировали в экспрессионной системе 2X35S/CPMV HT+/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт номер 2181 (описанный для конструкта 1819 в примере 5.26) обрабатывали с помощью рестрикционного фермента SacII и StuI и линеаризированную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 2181 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для "In Fusion" клонирования представляющих интерес генов в основанной на CPMV HT+ экспрессионной кассете. Он также включает в себя генный конструкт для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV P19 под контролем промотора и терминатора гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, и последовательность от левой до правой границ т-ДНК представлена на фигуре 45D (описана для конструкта 1819 в примере 5.26). Полученному конструкту присваивали номер 2221 (фигура 49С, SEQ ID NO: 133). Аминокислотная последовательность зрелого Н2 из вируса гриппа A/Singapore/1/1957 с подвергнутой делеции протеолитической петлей, слитая с PDISP, представлена на фигуре 49D (SEQ ID NO: 134). Изображение плазмиды 2221 представлено на фигуре 49Е.
Пример 5.29 PDISP/H2 Singapore (конструкт номер 2222) и PDISP/H2 Singapore с подвергнутой делеции протеолитической петлей (конструкт номер 2223) в экспрессионной системе 2X35S/CPMV 160+/NOS
Последовательности, кодирующие Н2 из вируса гриппа A/Singapore/1/1957 с протеолитической петлей или без нее, в которых нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/H2 Singapore и PDISP/H2 Singapore с подвергнутой делеции протеолитической петлей), клонировали в экспрессионную систему 2X35S/CPMV 160+/NOS с использованием такого же основанного на ПЦР способа, что и для конструкта 2220 и 2221, соответственно, но с использованием модифицированного прямого праймера IF**(SacII)-PDI.s1+4c (описанного для конструкта 1800 в примере 5.25) для амплификации и другой акцепторной плазмиды. Полученные продукты ПЦР клонировали в экспрессионной системе 2X35S/CPMV 160+/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт номер 2171 (описанный для конструкта 1800 в примере 5.25) обрабатывали с помощью рестрикционного фермента SacII и StuI и линеаризированную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 2171 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для "In Fusion" клонирования представляющих интерес генов в основанной на CPMV 160+ экспрессионной кассете. Он также включает в себя генный конструкт для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV P19 под контролем промотора и терминатора гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, и последовательность от левой до правой границ т-ДНК представлена (описана для конструкта 1800 в примере 5.25). Полученным конструктам присваивали номер 2222 для PDISP/H2 Singapore (фигура 50А, SEQ ID NO: 135) и 2223 для PDISP/H2 Singapore с подвергнутой делеции протеолитической петлей (фигура 50В, SEQ ID NO: 136). Изображения плазмиды 2222 и 2223 представлены на фигуре 50С и 50D соответственно.
Пример 5.30 2X35S/CPMV НТ+(конструкт №2019) и 160+ (конструкт №2139) для PDISP/H3 Perth
Кодирующую последовательность, соответствующую Н3 из вируса гриппа A/Perth/16/2009, в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/H3 Perth) (фигура 51А, SEQ ID NO: 137), клонировали в модифицированный CPMV HT+ и 160+ с использованием такого же основанного на In Fusion подхода, что и для конструкта 2220 и 2222, соответственно, но с модифицированным праймером ПЦР, специально сконструированными для PDISP/H3 Perth (фигура 51 В, SEQ ID NO: 138). Аминокислотная последовательность зрелого Н3 из вируса гриппа A/Perth/16/2009, слитая с PDISP, представлена на фигуре 51C (SEQ ID NO: 139). Изображения плазмиды 2019 и 2139 представлено на фигуре 51D и фигуре 51Е.
Пример 5.312X35S/CPMV HT+ (конструкт №2039) и 160+ (конструкт №2159) для PDISP/H3 Perth с подвергнутой делении протеолитической петлей
Кодирующую последовательность, соответствующую Н3 из вируса гриппа A/Perth/16/2009 с подвергнутой делеции протеолитической петлей, в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/H3 Perth с подвергнутой делеции протеолитической петлей) (фигура 52, SEQ ID NO: 140), клонировали в модифицированный CPMV HT+ и 160+ с использованием такого же основанного на In Fusion подхода, что и для конструкта 2221 и 2223, соответственно, но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для PDISP/H3 Perth с подвергнутой делеции протеолитической петлей (фигура 51В (SEQ ID NO: 138), 52В (SEQ ID NO: 141) и 53С (SEQ ID NO: 142). Аминокислотная последовательность зрелого Н3 из вируса гриппа A/Perth/16/2009 с подвергнутой делеции протеолитической петлей, слитая с PDISP, представлена на фигуре 52D (SEQ ID NO: 143). Изображения плазмиды 2039 и 2159 представлены на фигуре 52Е и фигуре 52F.
Пример 5.32 2X35S/CPMV НТ+(конструкт №2230) и 160+(конструкт №2250) для PDISP/H3 Victoria с подвергнутой делеции протеолитической петлей
Кодирующую последовательность, соответствующую Н3 из вируса гриппа A/Victoria/361/2011 с подвергнутой делеции протеолитической петлей, в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/H3 Victoria с подвергнутой делеции протеолитической петлей) (фигура 53, SEQ ID NO: 144), клонировали в модифицированный CPMV НТ+ и 160+ с использованием такого же основанного на In Fusion подхода, что и для конструкта 2221 и 2223 (смотрите примеры 5.28 и 5.29), соответственно, но с модифицированным праймером ПЦР, специально сконструированными для PDISP/H3 Victoria с подвергнутой делеции протеолитической петлей (фигуры 53В (SEQ ID NO: 145) и 53С (SEQ ID NO: 146). Аминокислотная последовательность зрелого Н3 из вируса гриппа A/Victoria/361/2011 с подвергнутой делеции протеолитической петлей, слитая с PDISP, представлена на фигуре 53D (SEQ ID NO: 147). Изображения плазмиды 2230 и 2250 представлены на фигуре 53Е и фигуре 53F.
Пример 5.33 2X35S/CPMV HT+/PDISP/H7 Hangzhou/NOS (конструкт №2142)
Кодирующую последовательность, соответствующую Н7 из вируса гриппа A/Hangzhou/1/2013, в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/H7 Hangzhou) (фигура 54А, SEQ ID NO: 148), клонировали в модифицированный CPMV НТ+ с использованием такого же основанного на In Fusion подхода, что и для конструкта 2220, но с модифицированным праймером ПЦР, специально сконструированными для PDISP/H7 Hangzhou (фигура 54В, SEQ ID NO: 149). Аминокислотная последовательность зрелого Н7 из вируса гриппа A/Hangzhou/1/2013, слитая с PDISP, представлена на фигуре 54С (SEQ ID NO: 150). Изображение плазмиды 2142 представлено на фигуре 54Е.
Пример 5.34 2X35S/CPMV HT+/PDISP/H7 Hangzhou с подвергнутыми делеции протеолитической петлей/NOS (конструкт №2152)
Кодирующую последовательность, соответствующую Н7 из вируса гриппа A/Hangzhou/1/2013 с подвергнутой делеции протеолитической петлей, в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/ H7 Hangzhou с подвергнутой делеции протеолитической петлей) (фигура 55А, SEQ ID NO: 151), клонировали в модифицированный CPMV НТ+ с использованием такого же основанного на In Fusion подхода, что и для конструкта 2221, но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для PDISP/ H7 Hangzhou с подвергнутой делеции протеолитической петлей (фигура 54В (SEQ ID NO: 149), фигура 55В (SEQ ID NO: 152) и фигуре 55С (SEQ ID NO: 153)). Аминокислотная последовательность зрелого H7 из вируса гриппа A/Hangzhou/1/2013 с подвергнутой делеции протеолитической петлей, слитая с PDISP, представлена на фигуре 55D (SEQ ID NO: 154). Изображение плазмиды 2152 представлено на фигуре 55Е.
Пример 5.35 2X35S/CPMV НТ+(конструкт №2224) и 160+(конструкт №2226) для PDISP/H9 Hong Kong
Кодирующую последовательность, соответствующую Н9 из вируса гриппа A/Hong Kong/1073/1999, в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/H9 Hong Kong) (фигура 56А, SEQ ID NO: 155), клонировали в модифицированный CPMV НТ+ и 160+ с использованием такого же основанного на In Fusion подхода, что и для конструкта 2220 и 2222, соответственно, но с модифицированным праймером ПЦР, специально сконструированными для PDISP/H9 Hong Kong (фигура 56В, SEQ ID NO: 156). Аминокислотная последовательность зрелого Н9 из вируса гриппа A/Hong Kong/1073/1999, слитая с PDISP, представлена на фигуре 56С (SEQ ID NO: 157). Изображения плазмиды 2224 и 2226 представлены на фигурах 56D и фигуре 56Е.
Пример 5.36 2X35S/CPMV НТ+ (конструкт №2225) и 160+ (конструкт №2227) для PDISP/H9 Hong Kong с подвергнутой делеции протеолитической петлей
Кодирующую последовательность, соответствующую Н9 из вируса гриппа A/Hong Kong/1073/1999 с подвергнутой делеции протеолитической петлей, в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/H9 Hong Kong с подвергнутой делеции протеолитической петлей) (фигура 57А, SEQ ID NO: 158), клонировали в модифицированный CPMV НТ+ и 160+ с использованием такого же основанного на In Fusion подхода, что и для конструкта 2221 и 2223, соответственно, но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для PDISP/H9 Hong Kong с подвергнутой делеции протеолитической петлей (фигура 56В (SEQ ID NO: 156), фигура 57В (SEQ ID NO: 159) и фигуре 57С (SEQ ID NO: 160)). Аминокислотная последовательность зрелого Н9 из вируса гриппа A/Hong Kong/1073/1999 с подвергнутой делеции протеолитической петлей, слитая с PDISP, представлена на фигуре 57D (SEQ ID NO: 161). Изображения плазмиды 2225 и 2227 представлены на фигуре 57Е и фигуре 57F.
Пример 5.37 2X35S/CPMV 160+/PDISP/HA В Malaysia/NOS (конструкт №2013)
Кодирующую последовательность, соответствующую НА из штамма гриппа B/Malaysia/2506/2004, в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/HA В Malaysia) (фигура 58А, SEQ ID NO: 162), клонировали в модифицированный CPMV 160+ с использованием такого же основанного на In Fusion подхода, что и для конструкта 2222 но с модифицированным праймером ПЦР, специально сконструированными для PDISP/HA В Malaysia (фигура 58В, SEQ ID NO: 163). Аминокислотная последовательность зрелого НА из штамма гриппа B/Malaysia/2506/2004, слитая с PDISP, представлена на фигуре 58С (SEQ ID NO: 164). Изображение плазмиды 2013 представлено на фигуре 58D.
Пример 5.38 2X35S/CPMV 160+/PDISP/HA В Malaysia с подвергнутыми делеции протеолитической петлей/NOS (конструкт №2014)
Кодирующую последовательность, соответствующую НА из штамма гриппа B/Malaysia/2506/2004 с подвергнутой делеции протеолитической петлей, в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/HA В Malaysia с подвергнутой делеции протеолитической петлей) (фигура 59А, SEQ ID NO: 165) клонировали в модифицированный CPMV 160+ с использованием такого же основанного на In Fusion подхода, что и для конструкта 2223, но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для PDISP/HA В Malaysia с подвергнутой делеции протеолитической петлей (фигура 58 В (SEQ ID NO: 163), фигура 59В (SEQ ID NO: 166), фигура 59С (SEQ ID NO: 167). Аминокислотная последовательность зрелого НА из штамма гриппа B/Malaysia/2506/2004 с подвергнутой делеции протеолитической петлей, слитая с PDISP, представлена на фигуре 59D (SEQ ID NO: 168). Изображение плазмиды 2014 представлено на фигуре 59Е.
Пример 5.39 2X35S/CPMV НТ (конструкт №2070), НТ+ (конструкт №2080) и 160+(-Mprot) (конструкт №2090) для PDISP/HA В Massachusetts
Кодирующую последовательность, соответствующую НА из штамма гриппа B/Massachusetts/2/2012, в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/ НА В Massachusetts) (фигура 60А, SEQ ID NO: 169), клонировали в исходный НТ, модифицированный НТ+ и 160+ с использованием такого же основанного на In Fusion подхода, что и для конструкта 2072, 2220 и 2222, соответственно, но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для PDISP/ НА В Massachusetts. Аминокислотная последовательность зрелого НА из штамма гриппа B/Massachusetts/2/2012, слитая с PDISP, представлена на фигуре 60В (SEQ ID NO: 170). Изображения плазмиды 2070, 2080 и 2090 представлены на фигуре 60С, фигура 60D и фигуре 60Е.
Пример 5.40 2X35S/CPMV НТ+(конструкт №2102), НТ+ с BeYDV (конструкт №2104) для PDISP/HA В Florida с подвергнутой делении протеолитической петлей
Кодирующую последовательность, соответствующую НА из штамма гриппа B/Florida с подвергнутой делеции протеолитической петлей и в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/ НА В Florida) (фигура 61D, SEQ ID NO: 193), клонировали в модифицированный НТ+ с использованием такого же основанного на In Fusion подхода, как описан выше, но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для PDISP/ НА B/Florida (смотрите фигуры 61А (SEQ ID No: 190), фиг. 61В (SEQ ID NO: 191) и фиг. 61С (SEQ ID NO: 192). Нуклеотидная последовательность полученной экспрессионной кассеты 2102 представлена на фиг. 61F (SEQ ID NO: 195). Аналогично, кодирующую последовательность, соответствующую НА из штамма гриппа B/Florida с подвергнутой делеции протеолитической петля и в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны, клонировали в модифицированный НТ+ вместе с амплификационным элементом BeYDV. Нуклеотидная последовательность полученной экспрессионной кассеты 2104 представлена на фиг. 61F (SEQ ID NO: 196). Аминокислотная последовательность зрелого НА из штамма гриппа B/Florida с подвергнутой делеции протеолитической петлей, слитая с PDISP, представлена на фигуре 61Е (SEQ ID NO: 194). Изображения плазмиды 2102 и 2104 представлены на фигуре 61G и 61I.
Пример 5.41 2X35S/CPMV НТ+(конструкт №2106), НТ+ с BeYDV (конструкт №2108) для PDISP/HA В Florida+H1 California TMCT с подвергнутой делеции протеолитической петлей
Кодирующую последовательность, соответствующую НА из штамма гриппа B/Florida+H1 California TMCT с подвергнутой делеции протеолитической петлей и в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP/ НА В Florida+H1 California TMCT) (фигура 62В, SEQ ID NO: 198), клонировали в модифицированный НТ+ с использованием такого же основанного на In Fusion подхода, как описан выше, но с модифицированными праймерами ПЦР, специально сконструированными для PDISP/ НА B/Florida+H1 California TMCT (смотрите фиг. 61А (SEQ ID No: 197). Нуклеотидная последовательность полученной экспрессионной кассеты 2106 представлена на фиг. 62D (SEQ ID NO: 200). Аналогично, кодирующую последовательность, соответствующую НА из штамма гриппа B/Florida +H1 California TMCT с подвергнутой делеции протеолитической петлей и в котором нативный сигнальный пептид был замещен сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы люцерны, клонировали в модифицированный НТ+ вместе с амплификационным элементом BeYDV. Нуклеотидная последовательность полученной экспрессионной кассеты 2108 представлена на фиг. 62F (SEQ ID NO: 201). Аминокислотная последовательность зрелого НА из штамма гриппа B/Florida+H1 California TMCT с подвергнутой делеции протеолитической петлей, слитая с PDISP, представлена на фигуре 62С (SEQ ID NO: 199). Изображения плазмиды 2106 и 2108 представлены на фигуре 62Е и 62G.
Все цитаты включены в настоящий документ посредством ссылки.
Настоящее изобретение было описано в отношении одного или нескольких вариантов осуществления. Тем не менее, специалистам в настоящей области техники будет очевидно, что ряд изменений и модификаций можно осуществить, не отклоняясь от объема настоящего изобретения, определенного в формуле изобретения.
В частных воплощениях настоящее изобретение может относиться к следующим вариантам:
Вариант 1. Нуклеиновая кислота, содержащая регуляторную область, активную в растении, и энхансер экспрессии, активный в растении, причем регуляторная область и энхансер экспрессии функционально связаны с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный гемагглютинин гриппа (НА), содержащий модифицированную протеолитическую петлю.
Вариант 2. Нуклеиновая кислота по варианту 1, в которой энхансер экспрессии выбран из группы, состоящей из CPMVX, CPMVX+, CPMV-HT+CPMV HT+[WT115] и CPMV НТ+[511].
Вариант 3. Нуклеиновая кислота по варианту 1, в которой энхансер экспрессии не является CPMV НТ.
Вариант 4. Нуклеиновая кислота по варианту 1, причем нуклеиновая кислота не содержит длинную межгенную область вируса желтой карликовости бобов (BeYDV LIR) и короткую межгенную область BeYDV (BeYDV SIR).
Вариант 5. Нуклеиновая кислота по варианту 1, в которой модифицированная протеолитическая петля содержит один или несколько сайтов расщепления протеазой, проявляющих пониженное или устраненное расщепление протеазой по сравнению с расщеплением одного или нескольких сайтов расщепления нативного НА.
Вариант 6. Нуклеиновая кислота по варианту 5, где протеаза является Клара-подобной, фуриноподобной или представляет собой трипсин.
Вариант 7. Нуклеиновая кислота по варианту 1, в которой модифицированная протеолитическая петля содержит линкерную последовательность.
Вариант 8. Нуклеиновая кислота по варианту 7, в которой линкерная последовательность характеризуется аминокислотной последовательностью GG, TETQ или TETR.
Вариант 9. Нуклеиновая кислота по варианту 1, причем НА, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбран из группы, состоящей из НА из типов гриппа В, С, А и подтипов H1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15 и Н16.
Вариант 10. Нуклеиновая кислота по варианту 1, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая белок гемагглютинин (НА) гриппа характеризуется по меньшей мере 70% идентичностью последовательности по отношению к последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17, 18, 20, 21, 41, 58, 77, 81, 85, 92, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 134, 143, 147, 154, 161, 168, 194 и 199.
Вариант 11. Нуклеиновая кислота по варианту 1, причем НА представляет собой НАО.
Вариант 12. Нуклеиновая кислота по варианту 1, причем модифицированный НА содержит нативный или ненативный сигнальный пептид.
Вариант 13. Нуклеиновая кислота по варианту 1, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая модифицированный НА, содержит химерную нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательно модифицированный эктодомен НА, содержащий модифицированную протеолитическую петлю, трансмембранный домен гриппа и цитоплазматический хвост, причем модифицированный эктодомен НА происходит из первого штамма гриппа, а транс мембранный домен и цитоплазматический хвост происходят из второго штамма гриппа.
Вариант 14. Способ получения вирусоподобной частицы (ВПЧ) вируса гриппа в растении, предусматривающий следующее:
a) введение нуклеиновой кислоты по варианту 1 в растение или часть растения;
b) инкубация растения или части растения при условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновых кислот с получением при этом ВПЧ.
Вариант 15. Способ по варианту 14, при котором на стадии а) вторую нуклеиновую кислоту вводят в растение или часть растения, причем вторая нуклеиновая кислота содержит вторую регуляторную область, активную в растении и функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок протонного канала.
Вариант 16. Способ по варианту 15, при котором белок протонного канала выбирают из М2 или ВМ2 гриппа.
Вариант 17. Способ получения вирусоподобных частиц (ВПЧ) вируса гриппа в растении, предусматривающий следующее:
a) предоставление растения или части растения, содержащих нуклеиновую кислоту по п. 1, и
b) инкубация растения или части растения при условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновой кислоты с получением при этом ВПЧ.
Вариант 18. Способ по варианту 14, дополнительно предусматривающий стадию
c)сбора растения, и
d) очищения ВПЧ, причем размер ВПЧ находится в диапазоне 80-300 нм.
Вариант 19. ВПЧ, полученная с помощью способа по варианту 14.
Вариант 20. ВПЧ по варианту 19, дополнительно содержащая один или несколько липидов растительного происхождения.
Вариант 21. ВПЧ по варианту 20, в которой модифицированный белок НА содержит специфические для растения N-гликаны или модифицированные N-гликаны.
Вариант 22. Способ получения модифицированного белка НА, содержащего
модифицированную протеолитическую петлю, содержащую один или несколько сайтов расщепления протеазой, проявляющих пониженное или устраненное расщепление в растении, предусматривающий следующее:
a) введение нуклеиновой кислоты по п. 1 в растение;
b) инкубация растения или части растения при условиях, которые обеспечивают экспрессию белка НА с получением при этом модифицированного белка НА,
c) сбор растения и очищение модифицированного белка НА. Вариант 23. Белок НА, полученный с помощью способа по варианту 22, причем белок характеризуется активностью гемагглютинина (НА).
Вариант 24. НА, кодируемый нуклеиновой кислотой по варианту 1. Вариант 25. Способ по варианту 14, при котором на стадии введения (стадии а) нуклеиновую кислоту вводят в растение транзиентным образом или нуклеиновую кислоту вводят растение так, чтобы она являлась стабильной.
Вариант 26. Растение, содержащее нуклеиновую кислоту по варианту 1. Вариант 28. Композиция, содержащая эффективную дозу ВПЧ по варианту 19 для индукции иммунного ответа и фармацевтически приемлемый носитель.
Вариант 29. Вакцина, содержащая эффективную дозу ВПЧ по варианту 19 для индукции иммунного ответа.
Вариант 30. Способ индукции иммунитета к инфицированию вирусом гриппа у субъекта, предусматривающий введение ВПЧ по варианту 19.
Вариант 31. Способ по варианту 30, при котором ВПЧ вводят субъекту перорально, интрадермально, интраназально, внутримышечно, интраперитонеально, внутривенно или подкожно.
Вариант 32. Способ повышения качества продукта белка НА, экспрессированного в растении, предусматривающий следующее:
a) введение нуклеиновой кислоты по варианту 1 в растение;
b) инкубация растения или части растения при условиях, которые обеспечивают экспрессию белка НА с получением при этом модифицированного белка НА,
c) сбор растения и очищение модифицированного белка НА, причем модифицированный белок НА характеризуется повышенным качеством продукта по сравнению с нативным НА.
Вариант 33. Способ по варианту 32, при котором качество включает в себя повышенный выход продукта, стабильность продукта, однородность продукта или их комбинацию.