Новый метод выделения чистой фракции интактных клеточных ядер для иммунофлуоресцентного анализа на проточном цитофлуориметре

новый метод выделения чистои фракции

интактных клеточных ядер для иммунофлуоресцентного анализа на проточном цитофлуориметре

С.И. Никулицкий, Е.Г. Тырсина, А.Н. Иншаков, Н.Б. Боровкова

ФГБУ«Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478, Москва, Каширское ш., 24

Контакты: Екатерина Григорьевна Тырсина tyrsina@yandex.ru

Введение. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ), результаты которой детектируются с помощью проточной цитофлуори-метрии, позволяет идентифицировать клеточные белки, находящиеся либо на поверхности клетки, либо внутри нее в случае использования пермеабилизации. Однако этот метод не дает ответа на вопрос о распределении искомого антигена по клеточным компартментам, в частности о его ассоциации с клеточным ядром. Между тем ядерная локализация изучаемого белка во многом позволяет судить о механизмах его действия. Поэтому разработка протокола выделения интактных клеточных ядер, пригодных для анализа на проточном цитофлуориметре, способна дополнить сведения о расположении и функциональном значении многих ядерноассоциированных протеинов.

Цель исследования — разработка метода выделения чистой фракции интактных, стабилизированных клеточных ядер, пригодных для иммунофлуоресцентного анализа на проточном цитофлуориметре.

Материалы и методы. В работе изучали ядерную локализацию рецептора фактора роста эндотелия сосудов 1-го типа (УБОБ-Ш). В качестве объекта исследования использовали линию опухолевых клеток человека А431. Интактность экстрагированных ядер оценивали путем микроскопического исследования окрашенных мазков из ядерной суспензии. Экспрессию рецептора регистрировали с помощью непрямой РИФ на проточном цитофлуориметре.

Результаты. Применение разработанного протокола позволило получить суспензию из одиночных неповрежденных клеточных ядер, что является необходимым условием постановки РИФ. На экстрагированных ядрах нам удалось выявить рецептор как на наружной мембране (интактные ядра), так и внутри ядра (пермеабилизованные ядра). Причем внутриядерное содер-жаниерецептора УБОБ-Я1 превышало таковое на ядерной поверхности в 3,8раза (17,9 ± 1,04 и 4,8 ± 0,26 % соответственно). Заключение. Разработанный нами метод оказался пригодным для идентификации и установления локализации искомых ядерных белков на проточном цитофлуориметре. В сочетании с такими широко применяемыми методиками, как иммуноци-тохимическое исследование, вестерн-блоттинг и др., РИФ на ядрах поможет исследователю сформировать более полное представление о свойствах ядерноассоциированных белков.

Ключевые слова: экстракция интактных ядер, проточная цитофлуориметрия, рецептор фактора роста эндотелия сосудов 1-го типа, клеточная линия А431

Background. Identification of cellular proteins can be performed by indirect immunofluorescence assay using flow cytometry. However, this method allows to detect cellular proteins that are either on the cell surface or inside the cell and cannot demonstrate a protein distribution within cellular compartments, particularly in nucleus. Meanwhile, the nuclear localization of the protein of interest in many respects gives an indication of the mechanisms of its action. Therefore, the development of the protocol of extraction of nuclei suitable for analysis on a flow cytometer is able to complement the information about the localization and functional significance of many nucleus-associated proteins.

Objective. The aim of this study was to develope a method for extraction, purification and stabilization of intact nuclei suitable for flow cytofluorimetry analysis.

Materials and methods. In this work we studied the nuclear localization of the receptor type 1 for vascular endothelial growth factor (VEGF-R1). The A431 human cancer cell line was used as an object of the study. The quality of extracted nuclei was assessed by microscopic examination of stained smears of nuclear suspension. Expression of the receptor was determined by indirect immunofluorescence assay using flow cytometry.

DOI: 10.17650/1726-9784-2016-15-2-76-81

NEW METHOD OF EXTRACTION OF INTACT NUCLEI FROM CELLS FOR FLOW CYTOMETRY FLUORESCENCE IMMUNOASSAY

S.I. Nikulitskiy, E.G. Tyrsina, A.N. Inshakov, N.B. Borovkova

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia; 24 Kashyrskoe shosse, Moscow, 115478, Russia

Results. New method was successfully applied to obtain the suspension of intact cellular nuclei that is crucial to perform further flow cytometry. Applied method revealed the presence of the receptor type 1 for vascular endothelial growth factor at the external nuclear membrane and inside of the nucleus. Interesting to note that the presence of the receptor type 1 for vascular endothelial growth factor inside ofthe nucleus was 3,8 times as much as its surface location (17,9 ± 1,04 % and 4,8 ± 0,26 % respectively). Conclusions. The new method of extraction, purification and stabilization ofthe nuclei is applicable for proteins identification by flow cytometry. In combination with other methods (ICC, Western blotting, etc.) flow cytometry of intact nuclei is able to complement the information about the properties of nucleus-associated proteins.

Key words: extraction of nuclei, flow cytometry, receptor type 1 for vascular endothelial growth factor, A431 cell line

Введение

Целью многих исследований в различных областях биологии является регистрация определенных клеточных белков. Многие годы эту задачу с успехом позволяет реализовать реакция иммунофлуоресцен-ции (РИФ) с использованием проточного цитофлу-ориметра. Несомненные достоинства этого метода заключаются в объективности, точности и высокой воспроизводимости результатов. Вместе с тем РИФ позволяет детектировать антигены либо на наружной поверхности клетки, либо внутри нее после предварительной пермеабилизации. Однако даже регистрация соответствующего белка внутри клетки не позволяет судить о его распределении по клеточным компартментам. Между тем данный вопрос неизбежно встает в ходе многих исследований, например при разработке чувствительных методов диагностики и мишеньнаправленного лечения онкологических заболеваний. Для решения вопроса о точной внутриклеточной локализации белка применяют, как правило, вестерн-блоттинг и иммуноцитохимическое (ИЦХ) исследование. Однако данные методики являются полуколичественными и лишь относительно сопоставимы с результатами РИФ. В связи с этим мы решили расширить возможности РИФ, а именно: разделить ядерные и цитоплазматические сигналы.

В доступной литературе мы не нашли работ об использовании меченных антителами ядер в проточной цитометрии. Необходимым условием постановки РИФ на ядрах является их наиболее щадящая экстракция из клеток для получения неповрежденных, одиночных и функционально активных ядер.

Получить более или менее целостные ядра удалось Г. П. Георгиеву с сотрудниками еще в 60-х гг. прошлого столетия [1]. Авторами был использован фенольный метод извлечения ядер из различных тканей млекопитающих. При этом основная задача работы заключалась в выделении ядерной РНК, а не в получении функционально активных ядер как таковых. Однако для поставки РИФ данный способ не подходит ввиду высокой токсичности фенольных соединений [2]. В частности, эти агенты приводят к денатурации белков, что изменяет антигенные детерминанты и, соответственно, искажает получаемые результаты.

В 1990 г. был описан другой метод выделения транскрипционно-активного ядерного экстракта из печени крыс [3]. Данная методика более приемлемая для сохранения целостности ядер, однако в связи с использованием лабораторных животных довольно трудоемкая и дорогостоящая. К тому же она не позволяет исследовать ядра человеческих клеток.

Для вестерн-блот-анализа также необходимо получение ядерной фракции. Объектами в данном случае служат культивируемые клетки, что дает возможность изучать в том числе различные клеточные линии опухолей человека. Вместе с тем метод нацелен исключительно на получение чистых белковых экстрактов цитоплазмы и ядра и не предполагает сохранения стабильных, функционально активных ядер в силу жестких условий выделения. Таким образом, на сегодняшний день не существует приемлемого метода «мягкой» экстракции цельных клеточных ядер, т. е. исследование белков в нативном ядре не представляется возможным. Чтобы решить эту проблему, нами был разработан метод выделения чистой фракции интактных клеточных ядер для иммунофлуорес-центного анализа на проточном цитофлуориметре.

Ранее с помощью непрямой РИФ (нРИФ) на клетках линии эпидермоидной карциномы человека А431 мы обнаружили преимущественную внутриклеточную локализацию УБОР-Я1. Это подтвердилось и данными ИЦХ-окрашивания. Однако установить указанными методами, где именно внутри клетки расположен УБОР-Ю, было невозможно. Например, не было понятно, связан ли рецептор с ядром.

В связи с этим целью настоящего исследования явилось выяснение вопроса об ассоциации УБОР-Ю с ядром опухолевой клетки. Для этого прежде всего необходимо было разработать методику щадящего выделения интактных ядер. Отправной точкой работы стало рассмотрение существующих модификаций разделения цитоплазматической и ядерной фракций при вестерн-блот-анализе, которое выявило значительные различия. Они касались числа циклов центрифугирования (от 1 до 3), скорости (от 1000 до 16 000 об/мин), количества клеток на пробу, а также состава буферов для выделения фракций [4—6]. Для вестерн-блоттинга сохранность ядер не имеет принципиального значения, поскольку этот метод пред-

78 Оригинальные статьи

полагает лишь получение «чистых растворов» ядер- тона-Х100. Непосредственно перед применением до-ных и цитоплазматических белков. Но поскольку бавляли дитиотреитол (DTT) из расчета 1 мкл на 1 мл целью нашей работы было установление точной ло- буфера. кализации VEGF-R1 в интактном ядре, вышеописан- Среди всех изученных протоколов ядерной экс-ные условия разделения фракций нам не подходили. тракции как наиболее щадящий нами был выбран В связи с этим мы предприняли попытку разработки метод, описанный в работах [6, 8]. Согласно данной методики щадящего выделения интактных клеточ- методике клетки в количестве 1 х 107 отмывали от ных ядер для их дальнейшего иммунофлуоресцент- среды при 1000 об/мин в течение 5 мин. К осадку ного анализа с применением проточной цитометрии. добавляли 1,0 мл холодного натрий-фосфатного бу-Важно, что полученные результаты на ядрах можно фера (PBS), ресуспендированные клетки переносили объективно сопоставлять с результатами РИФ, ранее в чистую пробирку и повторно отмывали в течение полученными на клетках. 2 мин при 2000 об/мин. Супернатант полностью от-При разработке метода выделения интактных бирали. Полученный осадок мягко ресуспендирова-клеточных ядер нам необходимо было установить: ли в 100 мкл приготовленного буфера с помощью минимально необходимое количество клеток для по- дозатора с 1,0 мл наконечником с отрезанным кон-следующего выделения ядер; фазу клеточного роста, цом и оставляли для инкубации на 30 мин при +4 °С. оптимальную для постановки эксперимента; наилуч- Все дальнейшие манипуляции проводили на льду. шие условия отделения цельных ядер от цитоплазмы Чтобы разрушить набухшие клетки, полученную (состав буфера и время инкубации в нем, режим очист- суспензию 10 раз пропускали через 1 мл шприц с толки полученной суспензии, условия стабилизации щиной иглы 26G, после чего отделяли цитозольную ядер); оптимальное количество ядер на пробу для фракцию путем 2-минутного центрифугирования РИФ; наилучший пермеабилизующий реагент; кон- при 7000 об/мин при +4 °С. Супернатант (цитоплаз-центрацию антител для мечения ядер; а также необ- матическая фракция) отбирали и помещали на хо-ходимо было разработать протокол для анализа проб лод (—70 °С) до использования. Полученный осадок на проточном цитофлуориметре. (ядерная фракция) 2—3 раза отмывали от остатков цитоплазмы в 800 мкл буфера в течение 2 мин при Материалы и методы 7000 об/мин на холоде. Супернатант тщательно от-Объекты исследования бирали. Для стабилизации ядер осадок ресуспенди-Изучаемым белком являлся VEGF-R1, который, ровали в 1,0 мл PBS с 5 ммоль MgCl2 и оставляли по данным литературы, представлен в клеточной ли- в полученном растворе минимум на 18 ч при +4 °С. нии эпидермоидной карциномы человека A431 [7]. Клетки A431 выращивали в среде ДМЕМ («Gibco», Мечение ядер Великобритания), содержащей глутамин, 10 % теля- Экспериментальным путем было подобрано оп-чью эмбриональную сыворотку и антибиотик гента- тимальное количество ядер на пробу для постановки мицин (40 мкг/мл), в пластиковой культуральной РИФ. Суспензию стабилизированных ядер перено-посуде («Costar», США) при температуре 37 °С и по- сили в каждую из пробирок для измерений в объеме даче влажного воздуха с 5 % СО2. Клетки рассевали 400—500 мкл, что по расчетам соответствовало коли-в концентрации из расчета 1,5 х 105/мл каждые 3 сут. честву ядер (4—5) х 106. Для снятия клеток с подложки использовали 0,25 % Успешность процедуры выделения ядер контро-раствор трипсина-ЭДТА. лировали путем окрашивания ядерной суспензии три-В результате серии экспериментов мы устано- пановым синим с последующим подсчетом количества вили, что наибольшую активность демонстрируют жизнеспособных ядер. Кроме этого, под микроско-ядра, выделенные из клеток в логарифмической фа- пом анализировали мазки из полученной суспензии, зе роста. Определено оптимальное количество кле- окрашенные азур-эозином по Романовскому и гема-ток, равное 1 х 107 на 1,5 мл. токсилином Майера. Для получения мазков ядерную суспензию дополнительно разбавляли в 5 раз. Экстракция ядер Одну часть стабилизированной ядерной суспензии Основой буфера для отделения ядер от цитозоль- сразу окрашивали соответствующими антителами, ной фракции был выбран гипоосмолярный раствор, а другую — подвергали пермеабилизации с последу-содержащий HEPES (10 ммоль, pH 7,9), MgCl2 (5 ммоль), ющим мечением. Для пермеабилизации ядер экспе-EDTA (0,1 ммоль). Для ингибирования протеазной риментальным путем был выбран 90 % холодный активности использовали таблетированный антипро- метанол как наиболее щадящий и в то же время эф-теазный «коктейль» («Complete Mini», Roche, Швей- фективный реагент. Его добавляли в каждую из опыт-цария) по инструкции производителя. Далее к 50 мл ных проб по 1,0 мл с последующей инкубацией полученного раствора прибавляли 2,0 мл 10 % Три- в течение 10 мин при комнатной температуре.

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BIOTHERAPY 2 2016 том 15 | vol.15

Мечение ядер проводили с использованием в качестве первичных anti-mouse VEGF-R1 #MAB321 (R&D Systems, США) в концентрации 50 мкг/мл по 50 мкл на пробу. Время инкубации составляло 30 мин при комнатной температуре. Вторичными антителами служили поликлональные goat anti-mouse IgG: FITC #STAR70 (AbD Serotec, Великобритания) в концентрации 10 мкг/мл по 30 мкл на пробу, инкубация длилась 30 мин при +4 °С. Чтобы проконтролировать отсутствие остатков цитоплазмы в ядерном экстракте, использовали первичные кроличьи антитела к бета-актину как специфичному цитоплазматиче-скому белку, #4970L (Cell Signaling Technology, США) в разведении 1: 200 по 50 мкл на пробу. Вторичными антителами служили goat anti-rabbit IgG: Alexa Fluor 488 #A-11008 (Invitrogen, США) 1: 1000 по 30 мкл.

Анализ ядер на проточном цитофлуориметре

Анализ ядер клеток А431 проводили на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения BD FACSDiva.

Область гейтирования интактных ядер определяли на логарифмическом графике «DotPlot» FSC/SSC. Для выбора гейта интактные стабилизированные ядра окрашивали раствором пропидия йодида (Becton Dickinson, США). Ядра в количестве (4—5) х 106 инкубировали 30 мин в 500 мкл раствора пропидия йодида в концентрации 50 мкг/мл при +4 °С.

На графике «DotPlot» FSC/SSC целые ядра располагаются отдельным «облаком» в правой верхней области (рис. 1, а), что подтверждается гистограммой клеточного цикла окрашенных пропидия йодидом ядер (рис. 1, б).

Статистическая обработка результатов

Все результаты исследований подвергали статистической обработке по t-тесту Стьюдента. Достоверными различиями считали значения приp < 0,05.

Результаты

Данные 4 независимых экспериментов подтвердили, что выбранный нами алгоритм экстракции, очистки и стабилизации ядер подходит для их имму-нофлуоресцентного исследования на проточном ци-тофлуориметре.

В капле неокрашеной ядерной суспензии практически не наблюдалось поврежденных и слипшихся ядер. Дальнейший анализ мазков, окрашенных три-пановым синим, показал, что ~98 % ядер жизнеспособны. Эти данные были подтверждены также результатами микроскопического исследования препаратов, окрашенных азур-эозином и гематоксилином Майера (рис. 2). На представленных снимках хорошо видно, что ядерная мембрана не нарушена, в кариоплазме различимы ядрышки. Остатки цитоплазмы не выявляются, о чем свидетельствует отсутствие розовой окраски эозином.

Чистоту ядерной фракции также контролировали методом нРИФ путем определения цитоплазматиче-ского белка бета-актина в ядерной суспензии. Было показано, что во всех экспериментах уровень данного белка не превышал 1 %.

Для оценки локализации VEGF-R1 в пределах ядра использовали интактные ядра, а также ядра после пермеабилизации метанолом. В первом случае сигнал указывал на наличие белка исключительно на наружной ядерной мембране, а во 2-м — еще и внутри ядра (либо на внутренней ядерной мембране, либо непо-

Рис. 1. Выбор гейта для интактных ядер клеток A431: а — график «DotPlot» FSC/SSC. Цельные ядра расположены в верхней правой области рисунка отдельным пятном; б — гистограмма клеточного цикла (окраска пропидия йодидом) подтверждает правильность выбора гейта

б

а

80

Оригинальные статьи

а

в

Рис. 2. Микрофотография выделенных интактных ядер клеток А431. Ув. х 400: а — окраска гематоксилином Майера; б, в — окраска азур эозином по Романовскому

средственно в кариоплазме) (рис. 3). Обнаружено, что уровень сигнала в пермеабилизованных ядрах (рис. 3, г) был выше, чем в интактных (рис. 3, б), в 3,8 раза

(17,9 ± 1,04 и 4,8 ± 0,26 % соответственно, р = 0,003). Это означает, что УЕОР-Я1 локализуется преимущественно внутри ядра. В обоих случаях доля ядер, не-

Рис. 3. Непрямая реакция иммунофлуоресценции с интактными ядрами. Уровень флуоресценции коррелирует с содержанием VEGF-R1: а — негативный контроль 1, окраска интактных ядер вторичными антимышиными антителами; б — опыт 1, интактные ядра, экспрессия VEGF-R1 на поверхности ядра; в — негативный контроль 2, окраска пермеабилизованных метанолом ядер вторичными антимышиными антителами; г — опыт 2, ядра после пермеабилизации метанолом. Видно значительное усиление экспрессии рецептора 1-го типа

б

а

г

в

специфически связавшихся со вторичными антителами, не превышала 0,5 % (рис. 3, а, в). При точном соблюдении вышеописанных условий результаты независимых экспериментов хорошо воспроизводились.

Заключение

Полученные в работе результаты наглядно свидетельствуют о том, что разработанный нами метод экстракции, очистки и стабилизации ядер пригоден для идентификации изучаемых ядерных белков на проточном цитофлуориметре. С его помощью нами была доказана ассоциация УБОР-Я1 с ядром опухолевой клетки. Причем внутри ядра содержание рецептора почти в 4 раза превышало таковое на наружной ядерной оболочке.

В доступной литературе связь рецептора 1-го типа с ядром была показана только в работе [5]. В этом исследовании ИЦХ-методом с применением конфокальной микроскопии авторы установили преимущественную ассоциацию рецептора 1-го типа с ла-минами А/С. Ламины, как известно, ответственны за формирование ядерной оболочки и организацию хроматина, а их деградация приводит к апоптозу. Вероятно, УБОР-Я1 каким-то образом поддерживает целостность ламинов А/С, чем способствует выживанию опухолевых клеток [9].

Наши результаты не только хорошо согласуются с данными вышеприведенного исследования, но и в ка-

кой-то мере даже дополняют информацию об ассоциации VEGF-R1 с ядром опухолевой клетки. Дело в том, что ИЦХ-анализ не позволяет четко разделить окрашивание наружной и внутренней ядерных мембран, в то время как нРИФ дает такую возможность. Так, в случае интактных ядер разработанным методом определяется белок, расположенный исключительно на наружной ядерной мембране, а после ее пермеабилизации — еще и внутриядерный. Вероятно, что обнаруженный в нашем исследовании резко возросший во 2-м случае уровень сигнала указывал, в том числе, и на VEGF-R1, связанный с ядерной ламиной. В то же время нельзя исключить возможность локализации рецептора и непосредственно в кариоплазме, например во взаимосвязи с хроматином.

Разумеется, наиболее точная информация о локализации и предполагаемых функциях любого белка будет получена лишь при сочетании различных методов исследования. Поэтому нРИФ на выделенных ядрах вместе с широко применяемыми ИЦХ-методом и вестерн-блоттингом позволит дополнить сведения о свойствах ядерноассоциирован-ных протеинов.

Авторы выражают искреннюю благодарность за консультативную и практическую поддержку настоящего исследования сотрудникам компании ООО «ТераМАБ» Д.Ю. Тырсину и С. А. Чувпило.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Георгиев Г.П., Мантьева В.Л. Выделение клеточных ядер фенольным методом и их характеристика. Биохимия 1960;25(1):143-50.

2. Mittag F., Leichtle C., Keickbusch I. et al. Cytotoxic effect and tissue penetration

of phenol for adjuvant treatment of giant cell tumours. Oncol Lett 2013;5(5):1595-98. doi: 10.3892/ol. 2013.1244. Epub 2013 Mar 11. PMID: 23760940.

3. Hattori M., Tugores A., Veloz L. et al. A simplified method for the preparation of transcriptionally active liver nuclear extracts. DNA Cell Biol 1990; 9(10):777-81. doi: 10.1089/dna. 1990.9.777. PMID: 2264931.

4. Fan F., Wey J.S., McCarty M. F. et al. Expression of vascular endothelial growth factor receptor-1 on human colorectal cancer cells. Oncogen 2005; 24(16):2647-53. doi: 10.1038/sj. onc. 1208246. PMID: 15735759.

5. Lee T.-H., Seng S., Sekine M. et al. Vascular Endothelial Growth Factor Mediates Intracrine Survival in Human Breast Carcinoma Cells through Internally Expressed VEGFR1/FLT1. PLoS Med 2007;4(6):1001-16. doi:10.1371/journal pmed. 0040186.

6. Tyrsin D. Autoregulation of NFATc1 gene. [Doctorate degree in Natural Sciences].

Wurzburg: Bayerische Julius-Maximilians-Universitat Wurzburg; 2007.

7. Abcam. Product Datasheet for Anti-VEGF Receptor 1 antibody ab2350.

8. Chuvpilo S., Avots A., Berberich-Siebelt F. et al. Multiple NF-ATc isoforms with individual transcriptional properties

are synthesized in T lymphocytes. J Immunol 1999;162(12):7294-301. PMID: 10358178.

9. Broers J.L. V., Ramaekers F.C. S. The role of the nuclear lamina in cancer and apoptosis. Adv Exp Med Biol 2014;773: 27-48. doi: 10.1007/978-1-4899-8032-8_2. PMID: 24563342.