Особенности функционального статуса нейтрофилов у больных волчаночным нефритом

http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2017-19-12-277-280

УДК 616.1/9

ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СТАТУСА НЕЙТРОФИЛОВ У БОЛЬНЫХ ВОЛЧАНОЧНЫМ НЕФРИТОМ

Смирнова Е.В., Проскурнина Е.В., Краснова Т.Н.

ФГБОУ ВО Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, г. Москва, Российская Федерация

Аннотация. По современным представлениям о патогенезе системной красной волчанки (СКВ) ведущую роль в развитии заболевания в целом, и волчаночного нефрита в частности, играют нейтрофилы. Одним из подходов к изучению функциональной активности нейтрофилов является определение их способности к продукции свободных радикалов с помощью хеми-люминесцентного метода.

Радикал-продуцирующая активность нейтрофилов была оценена у 46 пациентов с СКВ, в группе сравнения было 87 практически здоровых доноров, сопоставимых с больными по полу и возрасту.

У больных СКВ был отмечен более высокий уровень удельной спонтанной продукции активных форм кислорода, удельной пиковой и интегральной активности нейтрофила, по сравнению с группой контроля. При анализе результатов больных СКВ с поражением почек было обнаружено, что для больных активным ВН с нефротическим синдромом, по сравнению с больными активными формами ВН без НС, неактивными формами ВН и больными СКВ без поражения почек, характерно значимое снижение удельной спонтанной радикал-продуцирующей активности нейтрофила. В объединённой выборке больных была выявлена корреляция коэффициента затухания респираторного взрыва нейтрофила с уровнем СОЭ. Результаты исследования соответствуют данным, полученным другими авторами, показавшим повышенную функциональную активность нейтрофилов на животных моделях волчаночного нефрита и у больных СКВ с поражением почек. Ключевые слова: Системная красная волчанка, нейтрофилы, нейтрофильные внеклеточные ловушки, хемилюминесценция

Введение. Одним из важнейших факторов, определяющих тяжесть клинической картины, течения и прогноз системной красной волчанки (СКВ) является поражение почек. По современным представлениям о патогенезе заболевания ведущую роль в развитии СКВ в целом, и волчаночного нефрита в частности, играют нейтрофилы. Результатом нарушения функции нейтрофилов является снижение фагоцитоза, усиление синтеза провоспалительных цитокинов, усиление интенсивности нетоза (характерного для нейтрофилов механизма клеточной смерти). В ходе нетоза происходит образование нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ), «сетеподобных структур», состоящих из хроматина и гранулярных антимикробных пептидов, и участвующих в захвате и инактивации патогенных микроорганизмов.

Нарушение удаления продуктов нетоза является одной из причин образования аутоантигенов и, соответственно, аутоантител, коррелирует с наличием более высокого титра антител к ДНК и поражения почек. Длительное воздействие НВЛ на эндотелий приводит к повреждению почечных клубочков через нарушение межклеточных взаимодействий, что приводит к повы-

шенной проницаемости альбумина. Наблюдают прямую корреляцию содержания НВЛ в почечных клубочках больных волчаночным нефритом с уровнем проте-инурии и уровнем экспрессии белка SNAIL1, участвующего в реализации эпителиально-мезенхимального перехода и развитии фиброза [1]. Также патологическая продукция НВЛ связана с риском развития тромбозов.

Кроме того, на природных моделях заболевания у мышей и у больных СКВ была обнаружена патологическая субпопуляция нейтрофилов - гранулоцитов низкой плотности, соответствующих незрелому фенотипу и связанных с избыточной продукцией провоспа-лительных цитокинов: ИФН-1, ИФН-2 и ФНО-а [2].

Таким образом, изучение патогенетических процессов, связанных с дисфункцией нейтрофилов, приводящих к развитию волчаночного нефрита, представляет теоретический интерес и способствует поиску новых мишеней лекарственного воздействия.

Применение хемилюминесцентных методик позволяет на новом экспериментальном уровне оценить функцию нейтрофилов через определение их радикал-продуцирующей способности.

—--—

Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК

Материал и методы. В проспективное исследование были включены 46 больных СКВ в возрасте от 17 до 64 лет, из них 4 мужчин и 42 женщины, которые наблюдались в Клинике нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний имени Е.М. Тареева Первого МГМУ имени И.М. Сеченова с 2014 по 2017 гг. Средний возраст группы составлял 32,2 (11,0) лет. Диагноз был установлен на основании критериев Американской коллегии ревматологов. Абсолютными критериями исключения являлись: острый инфекционный процесс, обострение хронических воспалительных заболеваний, онкологические заболевания, алкогольная болезнь, беременность.

Группой контроля служили здоровые доноры из Гематологического научного центра МЗ РФ (п = 87), сопоставимых с больными по полу и возрасту.

Согласно классификации И.Е. Тареевой, больные с поражением почек были разделены на группы с активным волчаночным нефритом (ВН) с нефротическим синдромом (п = 10), активным ВН без нефротического синдрома (п = 13) и группу с неактивным ВН (п = 12), больных с быстропрогрессирующим течением заболевания не было.

Обследование больных проводили по стандартам для больных СКВ, включавшее сбор жалоб, данных анамнеза, объективный осмотр и стандартные лабораторные и инструментальные методы анализа.

Методика оценки функциональной активности фагоцитирующих клеток цельной крови, применённая в данном исследовании, основана на регистрации развития во времени свечения клеток, стимулированных последовательно двумя веществами: на первом этапе форбол-12-миристат-13-ацетатом (ФМА), а затем фор-мил-метионил-лейцил-фенилаланином (фМЛФ) [3].

Анализировали следующие параметры, полученные при регистрации кривой развития ХЛ в ответ на стимуляцию нейтрофилов: 1) удельную пиковую активность нейтрофила А\* (амплитуда фМЛФ-индуци-рованной хемилюминесценции А1, делённая на число нейтрофилов), 2) удельную интегральную активность нейтрофила (площадь под кривой фМЛФ-индуци-рованной ХЛ за 30 минут после добавления фМЛФ, делённая на число нейтрофилов), 3) коэффициент затухания респираторного взрыва К& = (Л^Л!) (где А1 — амплитуда фМЛФ-индуцированной ХЛ, А2 — интенсивность фМЛФ-индуцированной ХЛ на 23-й минуте после добавления фМЛФ), 4) удельную спонтанную хе-милюминесценцию нейтрофила Асп* (базальная ради-кал-продуцирующая активность нейтрофила).

Статистическую обработку данных проводили с помощью программного пакета STATISTICA 13.1 (StatSoft, США). Для проверки гипотезы о нормальности распределения данных применяли критерий Ша-пиро-Уилка. Для изучения связи между данными использовали коэффициент ранговой корреляции Спир-мена или параметрический корреляционный метод Пирсона в зависимости от вида распределения данных. Достоверность различия между двумя группами оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни или параметрического критерия Стью-дента. Для анализа различия между несколькими группами применяли параметрический дисперсионный анализ или непараметрический метод сравнения Крас-кела-Уоллиса.

Во всех случаях различия признавали статистически достоверными при уровне значимости p < 0,05.

Результаты. В группе больных СКВ удельная спонтанная хемилюминесценция нейтрофила значимо выше, чем в группе контроля (р <0,0001) (Табл.1).

У больных СКВ было выявлено статистически значимое повышение удельной пиковой активности нейтрофила в сравнении с группой контроля (p <0,0001). Для больных СКВ также характерно повышение удельной интегральной активности нейтрофила S*, по сравнению с группой контроля (p <0,0001).

Между группой больных и группой контроля не было обнаружено статистически значимого отличия коэффициента затухания респираторного взрыва нейтрофилов.

При анализе результатов больных СКВ с поражением почек было обнаружено, что для больных активным ВН с нефротическим синдромом, по сравнению с больными активными формами ВН без НС, неактивными формами ВН и без поражения почек, характерно значимое снижение удельной спонтанной радикал-продуцирующей активности нейтрофила (p = 0,045).

В объединённой выборке больных была выявлена корреляция коэффициента затухания респираторного взрыва нейтрофила с уровнем СОЭ (коэффициент корреляции Спирмена r = 0,36, p = 0,02, n анализируемых пар = 53).

Корреляции показателей функциональной активности нейтрофилов с другими параметрами, отражающими лабораторную активность заболевания (СРБ, фибриноген, антитела к ДНК, компоненты системы комплемента) не были обнаружены.

Полученные данные для групп больных СКВ и группы контроля указаны в Таблице 1.

Таблица 1.

Радикал-продуцирующая активность нейтрофилов больных СКВ и группы контроля

Показатель Группа контроля Группа больных СКВ Вывод

Удельная пиковая активность нейтрофила, *10-2 имп/(с*кл) Медиана 2,43 ИКР* 1,67 - 4,12 Медиана 6,71 ИКР 4,63 - 10,15 А1* значимо выше в группе СКВ, р < 0,0001

Удельная интегральная активность нейтрофила, ипм/кл Медиана 2373 ИКР 1728 - 3790 Медиана 6350 ИКР 3940 - 9585 * значимо выше в группе СКВ, р < 0,0001

Коэффициент затухания респираторного взрыва Медиана 0,39 ИКР 0,26 - 0,53 Медиана 0,39 ИКР 0,32 - 0,46 Отсутствие статистически значимого различия ^ в группе СКВ и группе доноров, р = 0,6

Удельная спонтанная активность нейтрофила, имп/(с*кл) Медиана 0,095*10-2 ИКР 0,05*10-2 -0,21*10-2 Медиана 0,27*10-5 ИКР 0,04*10-5 - 1,15*105 Л сп* значимо выше в группе СКВ, р < 0,0001

*ИКР - интерквартильный размах

Обсуждение. Системная красная волчанка представляет собой системное аутоиммунное заболевание неустановленной этиологии, характеризующееся продукцией антител к широкому спектру компонентов клеточного ядра и развитием иммунокомплексного воспаления в тканях. Поражение почек при СКВ, несмотря на возможности современной иммуносупрес-сивной терапии, остается одним из наиболее тяжелых и прогностически важных для течения заболевания висцеритов.

Значительную роль в патогенезе СКВ играет нарушение функции нейтрофилов. Являясь частью системы врожденного иммунитета, они представляют собой ключевое звено в защите против патогенных микроорганизмов, а также участвуют в деградации и утилизации клеточного материала собственного организма. Нейтрофилы осуществляют их удаление благодаря ряду процессов: фагоцитозу, образованию активных форм кислорода в ходе респираторного взрыва, высвобождению бактерицидных веществ из цитоплаз-матических гранул, а также нетозу.

Проведенное нами исследование показало, что у больных СКВ, в сравнении с группой здоровых доноров значимо нарушается функция нейтрофилов.

Так уровень спонтанной свободно-радикальной активности нейтрофилов статистически значимо выше у больных, по сравнению с группой контроля. Кроме того, было обнаружено, что радикал-продуцирующая активность нейтрофилов, как пиковая, так и интегральная, выше в группе больных, это может говорить о более активном ответе на стимул. Однако, коэффициент затухания не отличался статистически значимо в группе больных и группе контроля.

Таким образом, представленное исследование продемонстрировало, что у больных СКВ отмечается нарушение функции нейтрофилов, по сравнению со

здоровыми донорами, что в целом соответствует результатам исследований других авторов, в которых была показана повышенная их функциональная активность. Она проявлялась в более высокой продукции провоспалительных цитокинов, повышенном образовании НВЛ, что было показано как на животных моделях, так и у больных волчаночным нефритом [4].

Результаты исследования подтверждают гипотезу о том, что нейтрофилы у больных СКВ находятся в прай-мированном цитокинами состоянии, т.е. имеют высокий потенциал к продукции свободных радикалов. Клиническим подтверждением этого факта могут служить полученные нами данные о максимальной выраженности удельной спонтанной радикал-продуцирую-щей активности нейтрофила у наиболее тяжелой категории из обследованных больных с наличием активного ВН с нефротическим синдромом. Полученные данные позволяют предположить, что нарушение функции нейтрофилов приводит к нарушению межклеточных взаимодействий и повышению проницаемости альбумина, что и проявляется развитием нефротиче-ского синдрома.

Таким образом, полученные нами данные подтверждают весомый вклад в патогенез СКВ нарушения функции нейтрофилов, в том числе и через нарушение оксидативного статуса.

Необходимо дальнейшее изучение механизмов, приводящих к изменению функциональной активности нейтрофилов, что может помочь понять механизм действия препаратов, уже применяемых в клинической практике. Например, уже было показано, что хлорохин и циклоспорин А способны подавлять индукцию нетоза in vitro.

Представляется перспективным поиск терапевтических средств, действующих на определенные этапы образования НВЛ или способствующих их удалению

из внеклеточной среды. Подобным действием могут обладать ингибиторы НАДФН-оксидазы, участвующей в индукции нетоза; ингибиторы PAD4 (ядерной пептидиларгинин деиминазы 4), обеспечивающей цит-руллинирование гистонов и деконденсацию хроматина при формировании НВЛ [5].

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

[1] Pieterse E. et al. Neutrophil extracellular traps drive endothelial-to-mesenchymal transition // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2017; 37(7): 1371-1379. doi: 10.1161/ATVBAHA.117.309002.

[2] Carmona-Rivera C., Kaplan M. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity //

Semin Immunopathol. 2013; 35(4): 455-463. doi: 10.1007/s00281-013-0375-7.

[3] Образцов И.В., Годков М.А., Полимова А.М., Дёмин Е.М., Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А. Оценка функциональной активности нейтрофилов цельной крови методом двухстадийной стимуляции: новый подход к хемилюминесцентному анализу // Российский иммунологический журнал. 2015; 9(18);418-425.

[4] Yao Y, Wang JB, Xin MM, Li H, Liu B, Wang LL et al. Balance between inflammatory and regulatory cytokines in systemic lupus erythematosus // Genet Mol Res. 2016; 15(2). doi: 10.4238/gmr.15027626.

[5] Lewis H.D. et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation // Nat Chem Biol. 2015; 11(3): 189-191. doi: 10.1038/nchembio.1735.

NEUTROPHIL FUNCTIONAL STATUS IN PATIENTS WITH SYSTEMIC

LUPUS ERYTHEMATOSUS

Smirnova E.V., Proskurnina E.V., Krasnova T.N.

M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russian Federation

Annotation. According to modern ideas about the pathogenesis of systemic lupus erythematosus (SLE), neutrophils play a leading role in the development of the disease in general, as well as in the kidney damage. The chemiluminescent method is an approach to study the functional activity of neutrophils, providing the estimation of free radical-producing capacity.

Radical-producing activity of neutrophils was evaluated in 46 patients with SLE, the comparison group were 87 healthy sex- and age-matched donors.

In patients with SLE, a higher level of specific spontaneous production of reactive oxygen species, specific peak and integral neutrophil activity, was noted, compared with the control group. Analyzing the results of patients with SLE with renal damage, in patients with active lupus nephritis (LN) with nephrotic syndrome, comparing to patients with active forms of LN without nephrotic syndrome, inactive forms of LN and SLE patients without renal damage, a significant decrease of neutrophil specific spontaneous radical-producing activity was found. In the total patient group, the correlation coefficient of the neutrophil respiratory burst decay correlated with the level of ESR.

The study results correspond to data obtained by other authors that showed increased functional activity of neutrophils in animal models of lupus nephritis and in patients with SLE with renal involvement.

Key words: Systemic lupus erythematosus, neutrophils, neutrophil extracellular traps, chemiluminescence

E.M., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu. A. An evaluation of neutrophil function in whole blood samples with two-step stimulation: a new approach to the chemiluminescent analysis. Russ J Immunol. 2015; 9(18);418-425. Yao Y, Wang JB, Xin MM, Li H, Liu B, Wang LL et al. Balance between inflammatory and regulatory cytokines in systemic lupus erythematosus // Genet Mol Res. 2016; 15(2). doi: 10.4238/gmr.15027626. Lewis H.D. et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation // Nat Chem Biol. 2015; 11(3): 189-191. doi: 10.1038/nchembio.1735.

REFERENCES

[1] Pieterse E. et al. Neutrophil extracellular traps drive endothelial-to-mesenchymal transition // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2017; 37(7): 1371-1379. doi: 10.1161/ATVBAHA.117.309002.

[2] Carmona-Rivera C., Kaplan M. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity // Semin Immunopathol. 2013; 35(4): 455-463. doi: 10.1007/s00281-013-0375-7.

[3] Obraztsov I.V., Godkov M.A., Polimova A.M., Dyomin

[4]

[5]