Пробиотический бактериальный штамм (варианты) и симбиотическая композиция, содержащая штамм, для детского питания
PROBIOTIC BACTERIAL STRAIN (VERSIONS) AND SYMBIOTIC COMPOSITION CONTAINING STRAINS FOR CHILD NUTRITION

Настоящее изобретение относится к селекции пробиотических штаммов, принадлежащих к роду Bifidobacterium, и к симбиотической композиции, содержащей эти штаммы и предназначенной для детского питания.
Грудные дети, находящиеся на искусственном вскармливании, демонстрируют значительные различия в составе кишечной микробиоты по сравнению с детьми на грудном вскармливании: в частности, можно наблюдать уменьшение концентрации бифидобактерий за счет роста других, потенциально патогенных микроорганизмов, таких как Escherichia coli и Clostridium spp. Колонизация микроорганизмами, принадлежащими к роду Bifidobacterium, происходит у детей на грудном вскармливании в первые 4 суток после рождения, и бифидобактерий очень скоро становятся преобладающей группой микроорганизмов. С другой стороны, при искусственном вскармливании развивается более гетерогенная флора, состоящая из колиформных бактерий, бактероидов, клостридий и стрептококков. Именно по этим причинам грудные дети на искусственном вскармливании имеют повышенный риск заражения кишечными инфекциями.
Кроме того, чрезмерное образование газа в кишечнике, по-видимому, является причиной так называемой «колики», которая беспокоит многих грудных детей в первые месяцы жизни. Поэтому существует назревшая потребность иметь возможность добиться у грудных детей физиологически бифидогенного эффекта, достигаемого при кормлении грудным молоком. В частности, желательно иметь возможность обеспечить грудных детей, находящихся на искусственном вскармливании, кишечной флорой так, чтобы избежать колик.
Заявитель предложил решение проблемы вышеупомянутых потребностей после интенсивного научного исследования, в конце которого был проведен отбор бактериальных штаммов, принадлежащих к роду Bifidobacterium.
Объект настоящего изобретения относится к бактериальному штамму, принадлежащему к роду Bifidobacterium и обладающему свойствами, которые раскрыты в прилагаемой независимой формуле изобретения.
Объект настоящего изобретения также относится к пищевой композиции, или пищевой добавке, или фармацевтической композиции, содержащей указанные бактериальные штаммы, как раскрыто в прилагаемой независимой формуле изобретения. Указанные композиции имеют обоснованное применение для использования в лечении колики, диареи и кишечных расстройств, предпочтительно у субъектов в детском возрасте.
Предпочтительные воплощения настоящего изобретения будут проиллюстрированы в подробном описании, которое следует далее.
Бактериальные штаммы, отобранные заявителем, обладают пробиотическими свойствами и могут быть введены грудным детям, поскольку они соответствуют специальным рекомендациям (ФАО (Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН)/ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения), 2002), в соответствии с которыми требуется: оценка антимикробной активности в отношении антагонистических бактерий, нетоксичность и непатогенность штамма, его точная таксономическая идентификация, адгезия к кишечному эпителию, устойчивость в желудочно-кишечном тракте (к желудочному соку и желчи), генетическая стабильность, особенно в отношении передачи антибиотикорезистентности, и желательные органолептические и технологические свойства при использовании в промышленном способе производства. Также имеет особое значение изучение цитотоксичности пробиотиков в отношении клеток человека и проверка их способности прилипать к слизистой оболочке кишечника и способности блокировать адгезию патогенов к самим клеткам кишечника.
Заявитель отбирал штаммы по настоящему изобретению, только экспериментально проверив вышеупомянутые характеристики.
Бактериальные штаммы, отобранные заявителем, принадлежат к роду Bifidobacterium и обладают антимикробной активностью в отношении Е. coli.
Более того, указанные штаммы дополнительно обладают антимикробной активностью в отношении Salmonella enteriditis, Clostridium difficile и Campylobacter jejunii.
Отобранные штаммы принадлежат к видам Bifidobacterium breve и Bifidobacterium longum или Bifidobacterium longum subsp. longum.
Штаммы, отобранные заявителем, представляют собой:
1) Bifidobacterium breve В632, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) в институте депонирования DSMZ (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур) 07.04.2011 и имеющий депозитный номер DSM 24706.
2) Bifidobacterium breve В2274, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) в институте депонирования DSMZ 07.04.2011 и имеющий депозитный номер DSM 24707.
3) Bifidobacterium breve В7840, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) в институте депонирования DSMZ 07.04.2011 и имеющий депозитный номер DSM 24708.
4) Bifidobacterium longum subsp. longum B1975, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) в институте депонирования DSMZ 07.04.2011 и имеющий депозитный номер DSM 24709.
Все вышеуказанные штаммы имеются в наличии и являются общедоступными согласно условиям, установленным Будапештским договором.
Пищевая композиция, или пищевая добавка, или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит бактериальную смесь, которая в свою очередь содержит по меньшей мере один вышеупомянутый бактериальный штамм, для применения в лечении колики, диареи и кишечных расстройств, предпочтительно у субъектов в детском возрасте.
В одном воплощении бактериальная смесь содержит или, альтернативно, состоит из штамма (1), или (2), или (3), или (4).
В одном воплощении бактериальная смесь содержит или, альтернативно, состоит из штаммов (1) и (2).
В одном воплощении бактериальная смесь содержит или, альтернативно, состоит из штаммов (1) и (3).
В одном воплощении бактериальная смесь содержит или, альтернативно, состоит из штаммов (1) и (4).
В одном воплощении бактериальная смесь содержит или, альтернативно, состоит из штаммов (2) и (3).
В одном воплощении бактериальная смесь содержит или, альтернативно, состоит из штаммов (2) и (4).
В одном воплощении бактериальная смесь содержит или, альтернативно, состоит из штаммов (3) и (4).
В одном воплощении бактериальная смесь содержит или, альтернативно, состоит из штаммов (1), и (2), и (3).
В одном воплощении бактериальная смесь содержит или, альтернативно, состоит из штаммов (1), и (2), и (4).
В одном воплощении бактериальная смесь содержит или, альтернативно, состоит из штаммов (2), и (3), и (4).
В одном воплощении бактериальная смесь содержит или, альтернативно, состоит из штаммов (1), и (3), и (4).
В одном воплощении бактериальная смесь содержит или, альтернативно, состоит из штаммов (1), и (2), и (3), и (4).
Более того, объект настоящего изобретения относится к симбиотической композиции, содержащей по меньшей мере один из вышеупомянутых пробиотических бактериальных штаммов в сочетании с по меньшей мере одним пребиотическим волокном. Указанное сочетание преимущественно дает возможность достичь селективного размножения существующих полезных бактерий, тем самым оказывая полезное местное и системное воздействие на организм хозяина. Симбиотическая композиция предназначена для грудных детей.
В частности, некоторые «неусваиваемые олигосахариды», выбранные из группы, содержащей галактоолигосахариды (GOS), фруктоолигосахариды (FOS) и инулин, имеют обоснованное применение в качестве волокон в контексте настоящего изобретения.
Предпочтительное воплощение относится к композиции, содержащей молочную смесь для кормления грудных детей, по меньшей мере один бактериальный штамм по настоящему изобретению и по меньшей мере одно пребиотическое волокно, выбранное из тех, которые упомянуты выше. Преимущественно, указанная композиция способна оказывать на грудного ребенка заметное «бифидогенное» действие, сходное с действием грудного молока.
Объект настоящего изобретения относится к бактериальному штамму, принадлежащему к виду Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum или Bifidobacterium longum subsp. longum и обладающему антимикробной активностью против патогенов Е. coli, Salmonella enteriditis, Clostridium difficile и Campylobacter jejunii. Патоген E.coli включает биотип E.coli O157:H7. Штамм, который принадлежит к виду Bifidobacterium breve выбран из группы, содержащей или, альтернативно, состоящей из Bifidobacterium breve В632, депонированного компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) в институте депонирования DSMZ 07.04.2011 и имеющего депозитный номер DSM 24706; Bifidobacterium breve В2274, депонированного компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) в институте депонирования DSMZ 07.04.2011 и имеющего депозитный номер DSM 24707; Bifidobacterium breve В7840, депонированного компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) в институте депонирования DSMZ 07.04.2011 и имеющего депозитный номер DSM 24708, и Bifidobacterium breve BR03, депонированного компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) в институте депонирования DSMZ и имеющего депозитный номер DSM 16604; предпочтительно штамм представляет собой Bifidobacterium breve BR03, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) в институте депонирования DSMZ и имеющий депозитный номер DSM 16604. Штамм, который принадлежит к виду Bifidobacterium longum, представляет собой Bifidobacterium longum subsp. longum B1975, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) в институте депонирования DSMZ 07.04.2011 и имеющий депозитный номер DSM 24709.
Объект настоящего изобретения относится к штамму Bifidobacterium breve В632, депонированному компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) в институте депонирования DSMZ 07.04.2011 и имеющему депозитный номер DSM 24706; в сочетании с Bifidobacterium breve BR03, депонированным компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) в институте депонирования DSMZ и имеющим депозитный номер DSM 16604.
Объект настоящего изобретения относится к штамму Bifidobacterium breve BR03, депонированному компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) в институте депонирования DSMZ и имеющему депозитный номер DSM 16604, в сочетании с Lactobacillus plantarum LP01, депонированным компанией Mofin Sri, Новара (Италия) в институте депонирования BCCM-LMG (Бельгийская координированная коллекция микроорганизмов) 16.10.2001 и имеющим депозитный номер LMG Р-21021. Преимущественно, штамм Lactobacillus plantarum LP01 демонстрирует значительную ингибиторную активность в отношении патогенных штаммов, как показано в экспериментальной части, которая следует далее (Фиг.1-5).
Настоящее изобретение относится к пищевой композиции, или пищевой добавке, или медицинскому устройству, или фармацевтической композиции, содержащим бактериальную смесь, где указанная бактериальная смесь содержит или, альтернативно, состоит из по меньшей мере одного бактериального штамма, принадлежащего к виду Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum или Bifidobacterium longum subsp. longum, как описано выше, для применения в лечении колики, диареи и кишечных расстройств; предпочтительно у субъектов в детском возрасте. Указанная бактериальная смесь содержит или, альтернативно, состоит из штаммов Bifidobacterium breve В632 в сочетании с Bifidobacterium breve BR03 или, альтернативно, Bifidobacterium breve BR03 в сочетании с Lactobacillus plantarum LP01. Указанная пищевая композиция, или пищевая добавка, или медицинское устройство, или фармацевтическая композиция содержат бактериальную смесь, как описано выше, где указанную бактериальную смесь добавляют, или суспендируют, или диспергируют в растительном масле, выбранном из оливкового масла, кукурузного масла, подсолнечного масла, масла из семян растений и пальмового масла. Предпочтительно оно представляет собой кукурузное масло.
Пищевая композиция, или пищевая добавка, или медицинское устройство, или фармацевтическая композиция могут находиться в форме масляной суспензии или гранул, порошка, капсул, таблеток и саше.
Объект настоящего изобретения относится к пищевой композиции, или пищевой добавке, или медицинскому устройству, или фармацевтической композиции в виде симбиотической композиции. Указанная симбиотическая композиция содержит по меньшей мере одно растительное вещество, выбранное из группы, содержащей или, альтернативно, состоящей из стеринов или фитостеринов, станолов или фитостанолов, глюкоманнана, конжаковой камеди и/или по меньшей мере одного пребиотического волокна, выбранного из группы, содержащей фруктоолигосахариды - FOS, галактоолигосахариды - GOS, ксилоолигосахариды - XOS, инулин, волокна лиственницы или арабиногалактан, и/или ферментированный красный рис, и/или бета-глюканы из овса, овсяных отрубей, ячменя, ячменных отрубей, и/или гель алоэ древовидного в лиофилизированной форме. В одном воплощении указанная симбиотическая композиция содержит симетикон. В другом воплощении указанная симбиотическая композиция содержит по меньшей мере одно растительное вещество, выбранное из группы, содержащей галактоолигосахариды (GOS), фруктоолигосахариды (FOS) и инулин.
Экспериментальная часть
1. СЕЛЕКЦИЯ БИФИДОБАКТЕРИЙ
Было изучено сорок шесть штаммов Bifidobacterium spp.; они были выделены преимущественно из кала грудных детей и принадлежат к 5 различным видам (Б. bifidum, В. breve, В. longum subsp. infantis, В. longum subsp.longum, В. adolescentis и В. pseudocatenulatum). Рассматриваемые микрооорганизмы являются частью коллекции BUSCoB (Scardovi коллекция бифидобактерий Болонского университета, университет Болоньи, Италия), представленной в DiSTA.
2. СЕЛЕКЦИЯ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ-МИШЕНЕЙ
К рассмотрению были приняты различные штаммы Escherichia coli: 1 штамм Е. coli из коллекции (АТСС (Американская коллекция типовых культур) 11105), 1 штамм Е. coli, выделенный из кала при инфекции мочевых путей (штамм М85), который, как было продемонстрировано в предыдущих исследованиях, является подходящим микроорганизмом-мишенью, и два штамма Е. coli, выделенные от грудных детей, страдающих коликой (штамм GC6a и GC23a). Е. coli является главным этиологическим фактором острой диареи у детей. Кроме того, было проведено исследование штамма Salmonella enteriditis, основного микроорганизма, ответственного за случаи диареи бактериального происхождения у детей в Италии (Infante Pina et al., 2008); штамма Clostridium difficile, главного этиологического фактора острой диареи у детей (Infante Pina et al., 2008); и штамма Campylobacter jejuni, который также является причиной острой диареи у детей (Infante Pina et al., 2008).
3. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ ОТОБРАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Все 46 микроорганизмов были проанализированы на способность ингибировать рост Е. coli АТСС 11105ТМ, М85, GC 6а, GC 23а и S. enteriditis М94. Предварительный отбор по антимикробной активности проводили при использовании «капельного теста на агаре», согласно протоколу, кратко изложенному здесь.
600
КАПЕЛЬНЫЙ ТЕСТ НА АГАРЕ: используют ночную (o.n.) культуру каждого штамма Bifidobacterium, имеющую оптическую плотность при 600 нм (A) примерно 0,7-1, точно соответствующую фазе экспоненциального роста. Используют чашку с TPY(триптиказа, пептон, дрожжевой экстракт)-агаром; чашку делят на 4 части, и каждый квадрант инокулируют 10 нл ночной культуры каждого штамма. Чашку инкубируют в течение 24 часов при 37°C в анаэробных условиях. Когда появляется рост, поверхность покрывают 7-8 мл слоем мягкой агаризованной среды для Е. coli (NB (питательный бульон) плюс 0,7% агара), инокулированной 100 нл ночной культуры маркерного штамма. Чашку инкубируют в условиях, обеспечивающих рост маркерного штамма. Через 24-48 часов инкубирования, в зависимости от использованного маркерного штамма, можно наблюдать наличие зоны задержки роста вокруг инокулированной культуры каждого штамма рода Bifidobacterium. Эту зону измеряют линейкой. Тест повторяют по меньшей мере дважды. Полученные результаты - среднее двух экспериментов - показаны в таблице 1. В таблице 1 показаны зоны задержки роста 5 маркерных штаммов только для 16 из 46 исследованных штаммов.
Как можно заметить при рассмотрении таблицы 1, это исследование выявило наличие штаммов с высокой антагонистической активностью, прежде всего в отношении двух штаммов Е. coli, выделенных от грудных детей с коликой, и Salmonella entehditis. Были отобраны только те штаммы, которые глобально вызывали образование зон задержки роста большего размера.
Затем оценивали антагонистическую активность 16 отобранных штаммов в отношении Clostridium difficile М216 и Campylobacter jejuni LMG8841. Полученные результаты - среднее двух экспериментов - представлены в таблице 2.
Полученные результаты выявили высокую ингибиторную активность в отношении С. jejuni LMG8846 и более слабую - но тем не менее явно имеющуюся у большинства штаммов - активность против С. difficile М216.
Затем проводили оценку антимикробной способности надосадочной жидкости, полученной из ночных культур 16 отобранных микроорганизмов, в отношении двух штаммов, выделенных от грудных детей, страдающих коликой, и в отношении S. enteriditis. Надосадочную жидкость, имеющую pH, находящийся в интервале 5,5-6,2, доводили до значения pH 6,5 перед проведением исследования. Анализ проводили при использовании двух способов, кратко описанных здесь: «луночный метод диффузии в агар» и «метод бумажных дисков».
600
6
ЛУНОЧНЫЙ МЕТОД ДИФФУЗИИ В АГАР: используют ночную (o.n.) культуру каждого штамма Bifidobacterium, имеющую A примерно 0,7-1, точно соответствующую фазе экспоненциального роста. Культуру центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 минут; надосадочную жидкость повторно центрифугируют при 14000 об/мин в течение 15 минут и сразу же повторно центрифугируют. Затем доводят значение pH до 6,5 с помощью 1 н. NaOH. На чашку заливают слой мягкого агара, инокулированного 500 нл суспензии Е. coli в концентрации 10 КОЕ (колониеобразующих единиц)/мл (или любого другого используемого маркерного штамма). После затвердения агара делают лунки с помощью стерильной пастеровской пипетки и вносят в лунки 50-80 нл нейтрализованной надосадочной жидкости Bifidobacterium spp. Чашку инкубируют в течение ночи при 37°C в условиях, обеспечивающих рост маркерного штамма (37°C в аэробных условиях для Е. coli).
МЕТОД БУМАЖНЫХ ДИСКОВ: центрифугирование культуры Bifidobacterium и нейтрализацию надосадочной жидкости проводили, как указано выше. Используют чашку с питательным агаром (NA) в случае Е. coli или другие среды, если используют другие штаммы. Маркерный штамм инокулируют на поверхность, исходя из того, что суспензия имеет концентрацию клеток 106 КОЕ/мл. Диск (предварительно стерилизованный), имеющий диаметр один см, пропитывают 0,1 мл надосадочной жидкости (как нейтрализованной, так и не нейтрализованной) и помещают на чашку. Чашку инкубируют в условиях, подходящих для роста маркерного штамма.
По-видимому, ингибиторное действие микроорганизмов на маркерные микроорганизмы, как показано с помощью капельного теста на агаре, объясняется главным образом, но не только, выработкой кислотных метаболитов, которые посредством снижения pH окружающей среды вызывают ингибирование патогенов. Однако и выработка бактериоцинов представляется возможной.
620
Тем не менее, чтобы лучше оценить антимикробную активность надосадочной жидкости используемых в этом исследовании микроорганизмов, проводили оценку кинетики роста некоторых маркерных штаммов (Е. coli АТСС11105™, S. enteriditis М94, Е. coli GC 6а и Е. coli GC 23а) в присутствии известных количеств надосадочной жидкости каждого штамма Bifidobacterium. Маркерный штамм инокулировали в среду NB (питательный бульон) без добавления (что представляет собой контроль) и с добавлением известных количеств надосадочной жидкости, полученной из ночной культуры Bifidobacterium spp. Надосадочную жидкость использовали и как таковую, и после нейтрализации в трех различных концентрациях: 12,5% (об./об.), 25% (об./об.) и 50% (об./об.). Через определенные интервалы времени проводили измерение А маркерного штамма, свидетельствующего о росте микроорганизма. Наибольшую концентрацию надосадочной жидкости исключили после первых опытов, поскольку она полностью подавляла рост маркерного микроорганизма.
Полученные данные подтверждают выводы, сделанные выше.
4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ИЛИ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОТОБРАННЫХ БИФИДОБАКТЕРИЙ К РАЗЛИЧНЫМ АНТИБИОТИКАМ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИНИМАЛЬНОЙ ИНГИБИРУЮЩЕЙ КОНЦЕНТРАЦИИ (МИК)
620
Определение чувствительности или резистентности к антибиотикам является одним из основных исследований для оценки возможности использования микроорганизма в анализах in vivo. Важно, чтобы микроорганизм был как можно более чувствительным к основным антибиотикам, используемым в терапии, чтобы избежать риска передачи антибиотикорезистентности другим кишечным микроорганизмам; с другой стороны, пробиотики часто применяют совместно с антибиотикотерапией и, следовательно, антибиотикорезистентность становится основной потребностью для совместного введения (Ouba et al, 2008). В этом исследовании рассматривали 10 антибиотиков, традиционно используемых для оценки антибиотикорезистентности у пробиотических штаммов (ампициллин, хлорамфеникол, эритромицин, тетрациклин, ванкомицин, канамицин, стрептомицин, триметоприм, цефуроксим и гентамицин); их анализировали в интервале концентраций 2-1024 мкг/мл. Кроме того, определяли МИК трех других антибиотиков, обычно используемых в неонатальной терапии (амоксициллин, цефтриаксон и кларитромицин), анализируемых в таких же концентрациях. МИК оценивали посредством анализа роста отобранных бифидобактерий в присутствии возрастающих концентраций антибиотиков; рост оценивали при помощи измерения A. Резистентность или чувствительность к антибиотикам оценивали при использовании рекомендаций, опубликованных Европейской комиссией (Еврокомиссия, 2002) и Европейским управлением по безопасности пищевых продуктов (EFSA, 2005).
Полученные результаты показывают, что отобранные штаммы демонстрируют резистентность к ампициллину, канамицину и амоксициллину, хотя, в основном, многие из исследованных штаммов, как показано, являются чувствительными к другим антибиотикам, принятым к рассмотрению.
Полученные результаты позволили отобрать 4 штамма Bifidobacterium spp., к которым относится настоящее изобретение, поскольку они проявляют антимикробную активность в отношении различных штаммов Е. coli (газообразующие бактерии, присутствующие у грудных детей, страдающих от колики, в более высоких концентрациях, чем у грудных детей, которые ею не страдают). Более того, указанные штаммы демонстрируют вызывающую интерес антимикробную активность в отношении бактерий, которые наиболее часто являются причиной диареи бактериального происхождения у грудных детей (Salmonella enteriditis, Clostridium difficile и Campylobacter jejunii), а также резистентность только к ограниченному числу антибиотиков. Было продемонстрировано, что ни один из 4 отобранных штаммов не способен к передаче генов антибиотикорезистентности бифидобактериям или молочнокислым бактериям, даже в случаях, когда гены идентифицировали посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция) в хромосомной ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) бифидобактерий.
5. СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ИНГИБИРОВАНИЯ НА ЧАШКАХ
Бактерии с ингибирующим действием
а. Бактерию, чью ингибиторную активность против фекальных бактерий намереваются проверить, подвергают по меньшей мере двум последовательным пересевам в бульонной питательной среде MRS (deMann-Rogosa-Sharpe, среда де Манн-Рогоза-Шарпа) (пробирки, содержащие 15 мл).
1. Если бактерия принадлежит к роду Bifidobacterium, MRS бульон будет обогащен 1% хлоргидрата цистеина (5% раствор).
6. Свежую бульонную культуру (культивированную в течение 22±2 часов) центрифугируют и клетки промывают однократно в стерильной воде.
в. Клетки затем центрифугируют и ресуспендируют в 5 мл свежей бульонной питательной среды MRS.
2. Чувствительная фекальная бактерия
а. Бактерию, которая подвергается ингибированию, подвергают по меньшей мере двум последовательным пересевам в бульоне МакКонки (пробирки, содержащие 10 мл).
б. Свежую бульонную культуру разбавляют водой, так чтобы получить оптическую плотность 0,600-0,700 при длине волны 600 нм.
в. 100 мл этой бактериальной суспензии переносят на чашку с агаром МакКонки и равномерно распределяют по всей поверхности при использовании подходящего стерильного шпателя до тех пор, пока жидкость полностью не абсорбируется.
3. На поверхность чашки помещают бумажный диск диаметром 11 мм (диск для антибиограммы), который пропитывают 100 мл бактериальной суспензии штамма, который нужно исследовать (смотри стадию 1-в).
4. Чашку инкубируют в термостате при 37°C в течение 24 часов. Результаты: если бактерия является ингибирующей, зона, указывающая на отсутствие роста, будет видна вокруг диска. Размеры зоны будут пропорциональны способности штамма продуцировать вещества с бактериостатическим/бактерицидным действием, которые проникают в агар.
6. ИССЛЕДОВАНИЯ ИНГИБИРОВАНИЯ НА ЧАШКАХ
Для каждого потенциального пробиотика, обладающего ингибиторной активностью, готовят культуру и инкубируют в течение 24 часов в MRS бульоне. Клетки затем промывают и ресуспендируют в свежей бульонной среде MRS. Свежую бульонную культуру патогенной бактерии равномерно распределяют по поверхности чашек, содержащих агаризованную среду, специфическую для патогенных видов, которые предполагается ингибировать, в количестве 100 л первого десятикратного разведения на чашку. Обработанные таким образом клетки абсорбируют на бумажный диск в количестве 100 л на диск. После инкубации при 37°C в течение 24 часов проводят измерение зоны задержки роста, представляющей собой участок, который простирается между краем диска и границей роста исследуемого патогена.
Исследования ингибиторной активности шести пробиотиков в отношении пяти патогенов перечислены и приведены ниже. Результаты представлены в виде зон задержки роста, выраженных в миллиметрах.
6.1. Для Listeria monocytogenes АТСС 19112 результаты представлены на фиг.1.
На фиг.1 показаны:
Пробиотические штаммы, мм:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684 - 0 мм
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878 - 0 мм
3. L. reuteri DSM 17938 (положительный контроль) - 0 мм
4. L plantarum LP01 LMG P-21021 - 5 мм
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01 - 2 мм
6. L. pentosus PCB 101 - 4 мм
6.2. Для Enterococcus sp.(из кала грудных детей) результаты представлены на фиг.2.
На фиг.2 показаны (в направлении по часовой стрелке, начиная от стрелки - обратная сторона чашки):
Пробиотические штаммы, мм:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878
3. L. reuteri DSM 17938 (положительный контроль)
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01
6. L. pentosus PCB 101
На фиг.2 показаны (в направлении по часовой стрелке, начиная от стрелки - внутри чашки):
Пробиотические штаммы, мм:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878
3. L. reuteri DSM 17938 (положительный контроль)
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01
6. L. pentosus PCB 101
Результаты: зоны задержки роста, выраженные в миллиметрах.
Пробиотические штаммы, мм:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684 - 3 мм
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878 - 3 мм
3. L. reuteri DSM 17938 (положительный контроль) - 3 мм
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021 - 5 мм
5. L. delbr. susp.bulgaricus LDD01 - 4 мм
6. L. pentosus PCB 101 - 2 мм
6.3. Для Escherichia coli ATCC 8739 результаты представлены на фиг.3.
На фиг.3 показаны (в направлении по часовой стрелке, начиная от стрелки - обратная сторона чашки):
Пробиотические штаммы, мм:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878
3. L. reuteri DSM 17938 (положительный контроль)
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01
6. L. pentosus PCB 101
На фиг.3 показаны (в направлении по часовой стрелке, начиная от стрелки - внутри чашки):
Пробиотические штаммы, мм:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878
3. L. reuteri DSM 17938 (положительный контроль)
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01
6. L. pentosus PCB 101
Результаты: зоны задержки роста, выраженные в миллиметрах.
Пробиотические штаммы, мм:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684 - 0 мм
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878 - 1 мм
3. L. reuteri DSM 17938 (положительный контроль) - 2 мм
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021 - 4 мм
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01 - 2 мм
6. L. pentosus PCB 101 -1 мм
6.4. Для Escherichia coli ATCC 35218 результаты представлены на фиг.4.
На фиг.4 показаны (в направлении по часовой стрелке, начиная от стрелки - обратная сторона чашки):
Пробиотические штаммы, мм:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878
3. L. reuteri DSM 17938 (положительный контроль)
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01
6. L. pentosus PCB 101.
На фиг.4 показаны (в направлении по часовой стрелке, начиная от стрелки - внутри чашки):
Пробиотические штаммы, мм:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878
3. L. reuteri DSM 17938 (положительный контроль)
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01
6. L. pentosus PCB 101.
Результаты: зоны задержки роста, выраженные в миллиметрах.
Пробиотические штаммы, мм:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684 - 4 мм
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878 - 2 мм
3. L. reuteri DSM 17938 (положительный контроль) - 5 мм
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021 - 5 мм
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01 - 2 мм
6. L. pentosus PCB 101-1 мм.
6.5 Для Klebsiella sp (из кала грудных детей) результаты представлены на фиг.5.
На фиг.5 показаны (в направлении по часовой стрелке, начиная от стрелки - обратная сторона чашки):
Пробиотические штаммы, мм:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878
3. L. reuteri DSM 17938 (положительный контроль)
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01
6. L. pentosus PCB 101.
На фиг.5 показаны (в направлении по часовой стрелке, начиная от стрелки - внутри чашки):
Пробиотические штаммы, мм:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878
3. L. reuteri DSM 17938 (положительный контроль)
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01
6. L. pentosus PCB 101
Результаты: зоны задержки роста, выраженные в миллиметрах.
Пробиотические штаммы, мм:
1. L. reuteri DLLRE08, DSM 25684 - 0 мм
2. L. reuteri ID 1774 LRE 02, DSM 23878 - 2 мм
3. L. reuteri DSM 17938 (положительный контроль) - 2 мм
4. L. plantarum LP01 LMG P-21021 - 3 мм
5. L. delbr. susp. bulgaricus LDD01 - 1 мм
6. L. pentosus PCB 101 0 мм.