Сравнительные исследования возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота и других микобактерий

RYR 1. Исследования показали, что ПЦР-ПДРФ-анализ с праймерами (BLAD-F +BLAD-R) и (Ryr1-p-f+Ryr1-p-r) является удовлетворительным в плане воспроизводимости и идентификации генотипов рецессивных мутаций у крупного рогатого скота и свиней.

OPTIMIZATION OF WAYS OF REVEALING AT ANIMAL RECESSIVE MUTATIONS

Nurgaliev FM., Tjulkin S.V., Ahmetov T.M.

Summary

In the given work results are presented of the optimized reports on indication and identification of genotypes on genes of CD 18 and RYR 1. Researches have shown that the PCR-RFLP-analysis with primers (BLAD-F+BLAD-R) and (Ryr1-p-f+Ryr1-p-r) are satisfactory in respect of reproducibility and identification of genotypes of recessive mutations at a cattle and pigs.

УДК 619:616.982

СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ДРУГИХ

МИКОБАКТЕРИЙ

Нуруллин А.А.*, Ахметов Т.М.

Филиал ГОУ ВПО «Камская государственная инженерно-экономическая

академия» в г. Чистополе*

ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Ключевые слова: микобактерии, туберкулез, возбудитель,

вертикальный гель-электрофорез, дифференциальная диагностика.

Key words: micobacteria, tuberculosis, originator, vertical gel-

electrophoresis, differential diagnostics.

Наукой и практикой достигнуты определенные успехи в борьбе с туберкулезом сельскохозяйственных животных, однако эта инфекция остается одной из ведущих, наиболее сложных и экономически значимых в инфекционной патологии (Н.А. Донченко, 2008).

В настоящее время туберкулез продолжает оставаться одной из наиболее актуальных медико-биологических и социально-экономических проблем, стоящих перед мировым сообществом (А. А. Шурыгин, 2009).

Всемирная организация здравоохранения и Международный союз борьбы с туберкулезом объявили туберкулез «проблемой всемирной опасности» и «экономическим бедствием 21 века» (В.И. Добрелин, 2009).

Ю.Ю. Данко (2009) считает, что несмотря на проводимые мероприятия, эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в большинстве субъектов РФ по-прежнему остается напряженной. Это связано с увеличением заболеваемости туберкулезом взрослого населения, имеющего контакты с животными; повышением лекарственной устойчивости микобактерий; их способностью передаваться через животных других видов, в том числе диких экзотических животных являющихся носителями возбудителя туберкулеза; с изменчивостью патогенных свойств возбудителя, приводящей к вспышкам туберкулеза среди животных считающихся устойчивыми к туберкулезу (барсуков, опоссумов, оленей).

В условиях Республики Алтай было исследовано 7651 животное (59,4%) из них реагировало на введение туберкулина - 15,9%. Из 390 убитых реагирующих животных у 127 были обнаружены туберкулезные изменения. В ходе исследований в ряде предприятий инфекция была исключена, это усугубило ситуацию, и количество неблагополучных пунктов увеличилось с 30% до 56% (М.Ю. Тишков, 2007).

За последние годы (2003-2008 гг.) ветеринарными лабораториями республики Саха (Якутия) проведено 620 бактериологических экспертиз биоматериала от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств и изолировано 155 (25,0%) культур микобактерий, которые в 100% случаев идентифицированы, как атипичные микобактерии. Для определения вида микобактерий были отобраны 64 культуры. Результаты идентификации показывают, что видовой состав микобактерий, выделенных от реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота, разнообразен. Так, на долю M. vaccae приходится 39,0%. К группе фотохромогенных микобактерий, впервые выделенных от крупного рогатого скота в условиях Якутии, относится M. Kansasi (Н.А. Обоева, 2010).

Успех борьбы с туберкулёзом крупного рогатого скота определяется уровнем изученности болезни, наличием эффективных методов и средств диагностики, экономическими возможностями сельхозформирований, материальным обеспечением, а также организацией профилактических и оздоровительных мероприятий (В. А. Сапа, 2010).

В связи с этим, исследования, касающиеся диагностики туберкулеза являются весьма актуальными.

Материал и методы. В экспериментальной работе использовались культуры микобактерий: М. bovis-14, М. bovis BCG, M. tuberculosis H37RV, M. avium, M. Intracellulare и M. phlei, полученные и выращенные на питательной среде Левенштейна-Йенсена в термостате при 380С, а также

автоклавированные культуры микобактерий, полученные на Курской биофабрике.

Из микобактериальных клеток были приготовлены клеточные лизаты и ДМСО-антигены. Для получения антигенов бактериальной клетки многократно обрабатывали ацетоном для удаления несвязанных липидов, после чего подвергали воздействию диметилсульфоксида (ДМСО).

Электрофорез проводили в пластинчатом геле на приборе для вертикального гель-электрофореза по методу Laemmli (1970). В работе использовали однородную гелевую систему с концентрацией 7,5% полиакриламидного геля (ПААГ) и градиентную с концентрацией ПААГ 10-20%. Ступенчатый градиент ПААГ создавали при помощи смесителя. Раствор, содержащий акриламид и бис-акриламид в соотношении 30:0,8, служил исходным для приготовления концентрирующего и разделяющего гелей. В конечной концентрации разделяющий гель содержал 0,375 М трис-НО буфера (рН 8,8), 0,1% додецилсульфат натрия (ДСН);

концентрирующий 3% гель - 0,125 М трис-НО буфер (рН 6,8; 0,1% ДСН). Градиент ступенчатого разделяющего геля состоял из слоев: 10%, 12,5%, 15% и 20% гелей длиной по 2,5 см. Катализаторами полимеризации служили аммоний надсернокислый 1. ^^^^тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД). Пробы растворяли в буфере для концентрирующего геля, к которому добавляли 12,5% глицерина, 1,25% ДСН и 1,25% 2-

меркаптоэтанола. Перед электрофорезом их прогревали в течение 5 минут в водяной бане при 1000С. В качестве лидирующего красителя использовали бромфеноловый синий, конечная концентрация которого в пробах составляла 0,001%. Электрофорез проводили при комнатной температуре. До внедрения белков в концентрирующий гель поддерживали силу тока, равную 25 мА, основной режим разделения проводили при 50 мА. Продолжительность электрофореза составляла 3-4 часа.

Фракционированный в гелях материал фиксировали в водном растворе, содержащем 20% метанола, 7% уксусной кислоты. Белки окрашивали 0,25% раствором Кумасси ярко-голубого с-250 в водном растворе метанола и 7% уксусной кислоты. Избыток красителя отмывали раствором, использовавшимся для фиксации (Lamb et al., 1976).

Для увеличения разрешающей способности метода использовали более чувствительный способ окраски по Tsai (1986) азотнокислым серебром. Материал, полученный после разделения, фиксировали 24 часа водным раствором, содержащим 40% этанола и 5% уксусной кислоты. Затем в течение 10 мин. гель выдерживали в окисляющем растворе (0,7% иодной кислоты в 40% этаноле, 7% уксусной кислоте).

После трехкратного промывания в дистиллированной воде, выдерживали 10 мин. в растворе, содержащем 0,8% азотнокислого серебра. Избыток серебра отмывали в дистиллированной воде 3 раза по 10 мин.

Затем гели проявляли водным раствором, содержащим 0,02% формальдегида и 0,05% лимонной кислоты.

Результаты исследований. Результаты электрофореза 7,5% в ПААГ показали, что однородная система не обеспечивает равных условий разделения микобактериальных компонентов из-за большого диапазона их размеров, поэтому мы проводили электрофорез в градиентном геле с концентрацией ПААГ 10-20%.

Известно, что использование различных методов окрашивания является дополнительной информации при изучении электрофоретических профилей микобактерий. Мы в своей работе использовали два различных метода окрашивания: белковым красителем кумасси с-250 и азотнокислым серебром.

Параллельно исследовали клеточные лизаты из М. bovis, M. tuberculosis, атипичных видов микобактерий и их ДМСО-антигены.

Количество окрашенных кумасси компонентов в клеточном лизате М. bovis-14 составило 55, а в ДМСО-антигене 43 фракции. Окрашивание азотнокислым серебром дополнительно выявило в клеточном лизате 16, а в ДМСО-антигене 20 электрофоретических фракций. Обобщенные данные относительно количества электрофоретических фракций различных видов микобактерий, выявленных при использовании различных методов окрашивания, представлены в таблице 1.

1. Количество электрофоретических фракций микобактерий, выявленных при использовании различных методов окрашивания

Методы окрашива ния Виды микобактерий

М. bovis-14 М. bovis BCG M. tubercu- losis H37RV M. avium M. intracel-lulare M. phlei

КЛ АГ КЛ АГ КЛ АГ КЛ АГ КЛ АГ КЛ АГ

Кумасси с-250 55 43 49 44 47 41 51 42 49 43 59 51

Азотнокис лое серебро 71 63 76 66 63 65 65 63 68 62 73 68

Дополни тельные фракции 16 20 27 21 16 24 14 21 19 19 24 17

КЛ - клеточный лизат, АГ - ДМСО-антиген

При анализе электрофореграмм стало ясно, что в клеточном лизате М. bovis-14, окрашенном кумаси с-250 в 10% слое ПААГ имеется 10 белковых фракций, в 12,5% - 15, в 15% - 16 и в 20% - 14 фракций, тогда в ДМСО-антигене соответственно в 10% - 6, в 12,5% - 8, в 15% - 13 и в 20% - 13 полипептидных фракций. При окраске этих же образцов по серебру

выявлено следующая картина: в клеточном лизате в 10% слое имеется 7 дополнительных фракций, в 12,5% - 3, в 15% - 3 и в 20% -электрофоретических фракций. В ДМСО-антигене соответственно в 10% -14, в 12,5% - 11, в 15% - 3 и в 20% - 2 фракции. Обобщенные данные распределения электрофоретических фракций микобактерий в слоях различной концентраций ПААГ, окрашенных различными методами, представлены в таблице 2.

2. Распределение электрофоретических фракций микобактерий, окрашенных различными методами в слоях различной концентрации

ПААГ

Методы окрашивания Виды микобактерий

М. bovis-14 М. bovis BCG M. tubercu- losis H37RV M. avium M. intracel-lulare M. phlei

КЛ АГ КЛ АГ КЛ АГ КЛ АГ КЛ АГ КЛ АГ

Кумасси с-250

10% 10 6 9 4 10 6 8 7 5 5 8 6

12,5% 15 8 16 13 13 13 15 13 14 12 16 15

15% 16 13 20 17 17 14 15 14 15 15 15 13

20% 14 13 11 11 7 8 13 8 15 11 15 13

Азотнокислое серебро

10% 17 14 3 12 7 9 3 12 11 7 10 8

12,5% 3 11 3 33 3 2 3 3 4 5 9 3

15% 3 3 3 3 1 4 1 1 2 3 4 3

20% 3 2 8 3 5 9 5 5 2 2 1 3

КЛ - клеточный лизат, АГ - ДМСО-антиген

Из таблицы 2 видно, что максимальное количество окрашенных на белки фракций, как в клеточных лизатах, так и в ДМСО-антигенах выявляется в 15% слое геля, в среднем от 13 до 20 фракций. Чуть меньше фракций имеется в 12,5% и 20%, тогда как в 10% геле их значительно меньше.

Выводы. 1. Количество белковых фракций клеточных лизатов и ДМСО-антигенов различных видов микобактерий, окрашенных кумассси с-250, достигает от 41 до 59, при этом заметно преобладание белковых фракций в клеточных лизатах, по сравнению с ДСМО-антигенами. Меньшее число белковых фракций в ДМСО-антигене свидетельствует, по-видимому, о частичном лизировании их диметилсульфоксидом при сохранении целостности клетки; 2. Метод окраски азотнокислым

серебром, являясь более чувствительным по сравнению с окраской по кумасси с-250, выявляет дополнительные фракционированные компоненты

от 14 до 27 у различных видов микобактерий; 3. Максимальное количество окрашенных на белки фракций, как в клеточных лизатах, так и в ДМСО-антигенных выявляется в 15% геле, меньше фракций имеется в 12,5% и 20% геле, а в 10% геле их количество минимально. Большинство компонентов клеточного лизата и ДМСО-антигена имеют низкие молекулярные массы, так как они разгоняются в мелкопористом геле.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Данко, Ю.Ю. Туберкулез пятнистых уссурийских оленей в условиях Северо-Запада России : автореф. дисс. канд. ветер. наук : 16.00.03 / Данко Юрий Юрьевич. - Санкт-Петербург. - 2009. - 20 с.

2. Добрелин, В.И. Эпизоотологический мониторинг туберкулеза крупного рогатого скота в Ростовской области и совершенствование мероприятий по профилактике : дисс. канд. ветер. наук : 16.00.03 / Добрелин Вадим Иванович. - Новочеркасск, 2009. - 139 с. 3. Донченко, Н.А.

Усовершествование средств и методов диагностики и профилактики туберкулеза крупного рогатого скота : автореф. дисс. докт. ветер. наук : 16.00.03; 16.00.04 / Донченко Николай Александрович. - Новосибирск. -2008. - 36 с. 4. Обоева, Н.А. Оптимизация методов контроля благополучия стад крупного рогатого скота по туберкулезу : автореф. дисс. канд. ветер. наук : 06.02.02 / Обоева Наталья Александровна. - Новосибирск, 2010. - 19 с. 5. Сапа, В. А. Совершенствование системы ветеринарно-

профилактических мероприятий и её влияние на проявление неспецифической реактивности на туберкулин у крупного рогатого скота : автореф. дисс. канд. ветер. наук : 16.00.03 / Сапа Владислав Андреевич. -Республика Казахстан. - Астана, 2010. - 29 с. 6. Тишков, М.Ю. Эпизоотологический мониторинг заразных болезней маралов, методика расчета экономической эффективности схем противоэпизоотических мероприятий : автореф. дисс. канд. ветер. наук : 16.00.03 / Тишков Максим Юрьевич. - Барнаул, 2007. - 24 с. 7. Шурыгин, А.А. Оптимизация диагностики, лечения и профилактики туберкулеза у детей и подростков : автореф. дисс. докт. мед. наук : 14.00.26 / Шурыгин Александр

Анатольевич. - М., 2009. - 48 с.

СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ДРУГИХ МИКОБАКТЕРИЙ

Нуруллин А.А., Ахметов Т.М.

Резюме

В результате проведенных исследований показана возможность использования метода вертикального гель-электрофореза для индикации и идентификации возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота и других микобактерий.

COMPARATIVE RESEARCHES OF THE ORIGINATOR TUBERCULOSIS OF A CATTLE AND OTHER MICOBACTERIA

Nurullin A.A., Ahmetov T.M.

Summary

As a result of the spent researches is shown possibility of use of a vertical gel-electrophoresis method for indication and identification of the originator of a cattle tuberculosis and other micobacteria.

УДК 619:615.8.591.69.637

ВЛИЯНИЕ ГЕЛЬМИНТОВ, ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА КАЧЕСТВО

ПРОДУКТОВ УБОЯ ЖВАЧНЫХ

Нтунзвенимана М., Волков Р. А., Габдуллин Ф.Х., Галиев А.И.,

Кабиров И.Ф.

ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Ключевые слова: инвазия, гельминты, фасциолы, стронгиляты, вермитан 20% гранулят, препарат «НИСТ», качество продуктов убоя.

Key words: infestation, helminths, flukes, strongilyaty, vermitan 20% granules, drug «NIST», quality of the products of slaughter.

Инвазионные болезни животных распространены повсеместно и причиняют большой ущерб экономике сельского хозяйства, мясной, молочной и сырьевой промышленности. Гельминты, как и другие паразиты, все еще являются причиной большого числа тяжелых заболеваний домашних и диких животных и человека, подрывающих здоровье людей и повышающих экономические потери в животноводстве.

Анализ собственных исследований показывает, что при гельминтозах имеют место морфологические изменения в тканях, бактериальная обсемененность мяса и внутренних органов, замедленное созревание мяса, ухудшение его органолептических и химических показателей.

Материал и методы. Научно-производственные опыты по выяснению эффективности дегельминтизации крупного рогатого скота вермитаном в комплексе с полиферментным препаратом «НИСТ» и влияние их на качество продуктов убоя проводили в СХПК «Кунгер» Атнинского района Республики Татарстан на 15 головах молодняка крупного рогатого скота в возрасте 6 месяцев, разделенных по принципу