ФТОРСОДЕРЖАЩИЕ ПИРАЗОЛИЛТИОСЕМИКАРБАЗОНЫ С ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ
FLUORINATED PYRAZOLYL THIOSEMICARBAZONES WITH ANTITUMOR ACTIVITY

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Предлагаемое техническое решение относится к органической химии, конкретно, к новым индивидуальным соединениям класса пиразолилтиосемикарбазонов, проявляющим противоопухолевую активность в отношении культуры клеток карциномы легкого и эпидермоидной карциномы гортани человека.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Molecules
Одной из важнейших проблем современной химиотерапии злокачественных образований является множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток [SzumilakM.,Wiktorowska-Owczarek A., Stanczak A. Hybriddrugs – a strategy for over coming anticancer drug resistance? // . 2021, 26, 2601]. Исходя из этого, поиск веществ, обладающих высоким цитотоксическим действием по сравнению с известными и широко применяемыми препаратами в этой области, является актуальной задачей.
1
Synth. Commun
На протяжении нескольких десятилетий тиосемикарбазоны общей формулы являются объектами пристального внимания благодаря доступным методам синтеза и разнообразным видам их биологической активности [Prajapati N.P.,Patel H.D. Novel thiosemicarbazone derivatives and their metal complexes: Recent development // . 2019, 49(21),2767–2804]. Данный класс соединений проявляет широкий спектр действия против ряда заболеваний, в том числе демонстрируя противогрибковую, противодиабетическую, противоопухолевую, гербицидную, антиоксидантную и противовоспалительную активности.
J. Med. Chem
Ряд замещенных ди-2-пиридилкетонтиосемикарбазонов и 2-бензоилпиридитиосемикарбазонов представляет перспективность с точки зрения дальнейшего применения в медицинской практике благодаря выраженной и селективной активности против рака легких человека [Richardson, D.R.; Lovejoy, D.B. Preparation of dipyridylthiosemicarbazone compound suseful in the treatment of cancer // Патент (2012), WO 2012079128 A1 20120621; Warner, J.C.; Gladding, J.A.; Cheruku, S.R. Preparation of dipyridylthiosemicarbazones as anticancer agents // Патент (2017), WO 2017058748 A1 20170406; Richardson, D. R.; Lovejoy, D. B. Thiosemicarbazone compounds and use in the treatment of cancer // Патент (2015), US 8927580 B2 20150106].Отмечается увеличение терапевтического эффекта от комбинированного использования тиосемикарбазонов с их производными меди (II) [Lovejoy, D. B.; Sharp, D. M.; Seebacher, N.; Obeidy, P.; Prichard, T.; Stefani, C.; Basha, M.T.; Sharpe, P.C.; Jansson, P.J.; Kalinowski, D.S.; et al. Novel second-generation di-2-pyridylketone thiosemicarbazones show synergism with standard chemotherapeutics and demonstrate potent activity against lung cancer xenografts after oral and intravenous administration in vivo // .2012, 55(16), 7230–7244]
Chem. Rev
Science
J. Med. Chem
Не менее популярным подходом при поиске биологически активных веществ является синтез веществ, содержащих пиразольное кольцо [MykhailiukP. K. Fluorinated pyrazoles: from synthesis to applications // . 2021, 121(3), 1670–1715]. Помимо пиразольного и тиосемикарбазонного фрагмента, важным инструментом при улучшении фармакофорных свойств молекул является введение атомов фтора, что повышает мембранную проницаемость, метаболическую стабильность и т.д. [Müller, K., Faeh, C., Diederich, F. Fluorine in Pharmaceuticals: Looking beyond intuition //  2007, 317, 1881– 1886; Hagmann, W. K. Themanyroles for fluorine in medicinal chemistry // . 2008, 51, 4359–4369].
ActaPharmacol.Sin
J. Cell. Mol. Med
Chem. Heterocyclic Comp.
При этом исследования веществ в ряду тиосемикарбазонов на основе кетонов и альдегидов, содержащих пиразольный и фторсодержащий заместители, немногочисленны [Wang, J.; Gong, G. Q.; Zhou, Y.; Lee, W.-J.; Buchanan, C. M.; Denny, W. A.; Rewcastle, G. W.; Kendall, J. D.; Dickson, J. M. J.; Flanagan, J. U.;et. al. High-throughput screening campaigns against a PI3Ka isoform bearing the H1047R mutation identified potential inhibitors with novel scaffolds // . 2018, 39(11), 1816–1822; Pahontu, E.; Julea, F.; Rosu, T.; Purcarea, V.; Chumakov, Y.; Petrenco, P.; Gulea, A. Antibacterial, antifungal and in vitro antileukaemia activity of metal complexes with thiosemicarbazones // . 2015, 19(4), 865–878; Bazhin, D. N.; Kudyakova, Y. S.; Onoprienko, A.Ya.; Slepukhin, P. A.; Burgart, Y. V.; Saloutin, V. I. Synthesis and tuberculostatic activity of functionalized pyrazoles derived from (trifluoromethyl)pyrazole containing a hydrazone group // 2017, 53(12), 1324–1329].
Chem. HeterocyclicComp
4a-в
Наиболее близкими к нашему изобретению являются трифторметилсодержащие пиразолилтиосемикарбазоны, полученные из 4,4-диметокси-1-(трифторметил)пентан-1,3-дионаталития в несколько стадий синтеза согласно общей Cхеме 1 [Bazhin, D. N.; Kudyakova, Y. S.; Onoprienko, A. Ya.; Slepukhin, P. A.; Burgart, Y. V.; Saloutin, V. I. Synthesis and tuberculostatic activity of functionalized pyrazoles derived from (trifluoromethyl)pyrazole containing a hydrazone group // . 2017, 53(12), 1324–1329].Суммарный выход тиосемикарбазонов в результате трех стадийного процесса составил 41-43 %.
Н
Н
5
Ранее предложен одностадийный способ получения 1-[(5-(трифторметил)-1-пиразол-3-ил]этанонов , что открывает возможности для синтеза разнообразных производных с использованием реакций конденсации по карбонильной группе (Схема 2) [Кудякова Ю. С., Эдилова Ю. О., Оноприенко А. Я., Бургарт Я. В., Салоутин В. И., Бажин Д. Н. Способ получения 1-[5-(перфторалкил)-1-пиразол-3-ил]этанонов// Патент №RU 2741549 C1].
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей настоящего изобретения является получение ряда фторсодержащих пиразолилтиосемикарбазонов, в том числе ранее неописанных, с высоким суммарным выходом, проявляющих противоопухолевую активность.
4г-ж
7
4г-ж
4г-ж
Н
Задача решается путем синтеза пиразолилтиосемикарбазонов , который осуществляют следующим образом: смесь в эквимолярных количествах 1-[(5-(трифторметил)-1-пиразол-3-ил]этанонаи соответствующего тиосемикарбазида в этаноле кипятят при 76-78°С в течение 3-5 ч (Схема 3). После чего реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, добавляют воды, осадок отфильтровывают. Суммарный выход тиосемикарбазонов в результате двухстадийного процесса составил 82-87 %.Структуры соединений подтверждены спектральными методами исследования (ЯМР и ИК спектроскопии), чистота продуктов согласуется с данными элементного анализа. Соединения получены и охарактеризованы впервые.
1
19
6
6
Анализ целевых соединений проводят с использованием ЯМР-спектроскопии (Спектры ЯМР H, F регистрировались на спектрометрах BrukerDRX-400 (400 МГц),BrukerAVANCEIII-500 (500 МГц), внутренние стандарты ТМС и CF), газовой хроматографии/масс-спектрометрии (газовый хроматограф-масс-спектрометр Agilent GC 7890А MS 5975С Inert XL EI/CI с квадрупольным масс-спектрометрическим детектором) и элементного анализа на автоматическом анализаторе Perkin-Elmer РЕ-2400.
Пример 1
Синтез
N
-(2,4-дифторфенил)-2-{1-[3-(трифторметил)-1
Н
-пиразол-5-ил]этилиден}гид-разинкарботиоамида (4г)
Н
N
5
4г
К раствору 0.89 г (5 ммоль) 1-[(5-(трифторметил)-1-пиразол-3-ил]этанона в 15 мл 95%-ного этанола добавляли 1.016 г (5 ммоль) -(2,4-дифторфенил)-гидразинкарботиоамида, 0.1 мл соляной кислоты, кипятили при 76-78°С в течение 5 ч, добавляли 50 мл воды, осадок отфильтровывали, сушили. Выход соединения составил 1.597 г (88 %).
Белый порошок, т.пл. 209-210°C.
1
d
6
3
pyr
Спектр ЯМРH (500 МГц, ДМСО-), δ, м.д.:2.35 (с, 3H, CH), 7.15 (м, 1Н), 7.23 (с, 1H), 7.39 (м, 1H), 7.49 (м, 1H), 10.11 (с, 1H, NH), 11.19 (с, 1Н, NH), 14.05 (с, 1Н, NH).
19
d
J
J
6
6
6
Ar
Ar
3
Спектр ЯМРF (470МГц, ДМСО-/CF), δ, м.д.:47.19 (д.д.,  = 17 Гц,  = 9 Гц, 1F, C-F), 51.38 (м, 1F, C-F), 102.13 (с, 3F, CF).
13
d
J
J
J
J
J
J
J
J
J
J
J
J
J
6
Спектр ЯМРC (125МГц, ДМСО-), δ, м.д.:14.2, 104.4 (д.д.,  = 27Гц,  = 25Гц), 104.5, 111.2 (д.д.,  = 22Гц,  = 3Гц), 121.5 (кв, =268 Гц), 123.4 (д.д.,  = 12 Гц,  =  4 Гц), 131.8 (д.,  = 10 Гц), 138.2, 141.6 (кв, =37Гц), 142.7, 157.6 (д.д.,  = 250 Гц,  = 13 Гц), 160.7 (д.д.,  = 246 Гц,  = 12Гц), 178.9.
13
10
5
5
Элементный анализ для CHFNS (363.31).
Найдено(%): С,42.84; H, 2.65; N, 19.13.
Вычислено(%): С,42.98; H, 2.77; N,19.28.
Пример 2
Синтез2-{1-[3-(трифторметил)-1
H
-пиразол-5-ил]этилиден}
-N
-(
м
-фторфенил)гидра-зинкарботиоамида (4д).
Н
N
м
5
4д
К раствору 0.89 г (5 ммоль) 1-[(5-(трифторметил)-1-пиразол-3-ил]этанона в 15 мл 95%-ного этанола добавляли 0.926 г (5 ммоль) -(-фторфенил)гидразинкарботиоамида, 0.1 мл соляной кислоты, кипятили при 76-78°С в течение 4 ч, добавляли 50 мл воды, осадок отфильтровывали, сушили. Выход соединения составил 1.484 г (86 %).
Белый порошок, т.пл. 208-209°C.
1
d
6
3
pyr
Спектр ЯМРH (500 МГц, ДМСО-), δ, м.д.:2.36 (с, 3H, CH), 7.10 (м, 1Н), 7.24 (м, 1H), 7.38 (м, 1H), 7.45 (м, 1H), 7.54 (м, 1H), 10.34 (с, 1H, NH), 11.05 (с, 1Н, NH), 14.22 (с, 1Н, NH).
19
d
J
J
J
6
6
6
Ar
3
Спектр ЯМРF (470 МГц, ДМСО-/CF), δ, м.д.: 49.51 (д.д.д.,  = 11Гц,  = 9 Гц,  = 7Гц, 1F, C-F), 102.15 (с, 3F, CF).
13
d
J
J
J
J
J
J
J
6
Спектр ЯМРC (125МГц, ДМСО-), δ, м.д.:14.4, 104.7, 112.4 (д.,  = 21Гц), 113.0 (д.,  = 24Гц),121.5 (кв, =268 Гц), 121.9, 129.7 (д.,  = 9Гц), 138.4, 140.5 (д., =11Гц), 141.6 (д., =37Гц), 142.6, 161.6 (кв.,  = 242Гц), 176.9.
13
11
4
5
Элементный анализ для CHFNS (345.32).
Найдено(%): С,45.04; H,3.11; N,20.04.
Вычислено(%): С,45.22; H,3.21; N,20.28.
Пример 3
Синтез
N
-(
м
-трифторметилфенил)-2-{1-[3-(трифторметил)-1
H
-пиразол-5-ил]эти-лиден}гидразинкарботиоамида (4е).
Н
N
м
5
4е
К раствору 0.89 г (5 ммоль) 1-[(5-(трифторметил)-1-пиразол-3-ил]этанона  в 15 мл 95%-ного этанола добавляли 1.266 г (5 ммоль) -(-трифторметилфенил)гидразинкарботиоамида, 0.1 мл соляной кислоты, кипятили при 76-78°С в течение 5 ч, добавляли 50 мл воды, осадок отфильтровывали, сушили. Выход соединения составил 1.818 г (92 %).
Белый порошок, т.пл. 192-193°C.
1
d
6
3
pyr
Спектр ЯМРH (500 МГц, ДМСО-), δ, м.д.:2.38 (с, 3H, CH),7.25 (с, 1H, Ar),7.60-7.68 (м, 2H, Ar),7.90-7.91 (м, 1Н, Ar), 7.98 (c, 1Н, Ar), 10.46 (с,1H, NH),11.16 (с, 1Н, NH), 14.22 (с, 1Н, NH).
19
d
6
6
6
3
3
Спектр ЯМРF (470МГц, ДМСО-/CF), δ, м.д.: 101.4 (с, 3F, CF), 102.15 (с, 3F, CF).
13
d
J
J
J
J
J
J
6
Спектр ЯМРC (125МГц, ДМСО-), δ, м.д.:14.9, 104.7, 121.5 (кв, =268 Гц), 122.1 (д.д.,  = 7, 4 Гц), 122.3 (д.д.,  = 8, 4 Гц), 124.0 (кв, =272Гц), 129.0 (кв, =31Гц), 129.4, 130.0, 139.6, 139.5, 141.6 (кв, =37Гц), 142.6, 176.9.
14
11
6
5
Элементный анализ для CHFNS (341.36).
Найдено (%): С,42.41; H,2.69; N,17.57.
Вычислено (%): С,42.54; H,2.80; N,17.72.
Пример 4
Синтез2-{1-[3-(трифторметил)-1
H
-пиразол-5-ил]этилиден}
-N
-(
п
-фторфенил)гидра-зинкарботиоамида (4ж).
Н
N
п
5
4ж
К раствору 0.89 г (5 ммоль) 1-[(5-(трифторметил)-1-пиразол-3-ил]этанона в 15 мл 95%-ного этанола добавляли 0.926 г (5 ммоль) -(-фторфенил)гидразинкарботиоамида, 0.1 мл соляной кислоты, кипятили 4 часа, добавляли 50 мл воды, осадок отфильтровывали, сушили. Выход соединения составил 1.571 г (91 %).
Белый порошок, т.пл. 211-212°C.
1
d
6
3
pyr
Спектр ЯМРH (500 МГц, ДМСО-), δ, м.д.:2.35 (с, 3H, CH),7.23 (с, 1H, Ar),7.24-7.27 (м, 2H, Ar),7.50-7.53 (м, 2Н, Ar), 10.31 (с,1H, NH),10.98 (с, 1Н, NH), 14.18 (с, 1Н, NH).
19
d
6
6
6
Ar
3
Спектр ЯМРF (470МГц, ДМСО-/CF), δ, м.д.: 46.09 (м, 1F, C-F), 102.17 (с, 3F, CF).
13
d
J
J
J
J
J
J
6
Спектр ЯМРC (125МГц, ДМСО-), δ, м.д.:14.3, 104.5, 115.0 (д.,  = 22 Гц), 121.5 (кв, =268 Гц), 128.5 (д.,  = 8 Гц),135.1 (д.,  = 8Гц), 138.0, 141.6 (кв., =37Гц), 142.7 (д., =243Гц), 177.5.
13
11
4
5
Элементный анализ для CHFNS (345.32).
Найдено (%): С,45.06; H,3.09; N,20.07.
Вычислено (%): С,45.22; H,3.21; N,20.28.
Пример 5
Исследование цитотоксичности заявляемых тиосемикарбазонов.
Культура клеток А549, карцинома легкого человека. Получена из коллекции клеточных культур лаборатории клеточных культур ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева».
Культура клеток Hep-2, эпидермоидная карцинома гортани человека. Получена из коллекции клеточных культур лаборатории клеточных культур ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева».
Состав ростовой среды: среда D-МЕМ (Биолот), ципрофлоксацин (2 мкг/мл), глутамин, (300 мкг/мл).
2
2
50
Цитотоксичность соединений на культурах клеток А549 и Hep-2 была определена с помощью МТТ-теста (микротетразолиевый тест).Растворы исследуемых соединений в концентрациях от 1000 до 16 мкг/мл (с использованием двукратного шага при разведении) вносили в объеме 100 мкл в 96ЛП на культуру клеток  и инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°С и 5% СО. Далее клетки промывали раствором PBS и вносили раствор метилтетразолиум бромида на поддерживающей среде в концентрации 0,5 мкг/мл, после чего инкубировали в течение 1,5 часов при температуре 37°С и 5% СО. По окончании срока инкубации раствор МТТ удаляли, растворяли осадок в 96%-м этиловом спирте и определяли оптическую плотность раствора при длине волны 535 нм на планшетном ридере WallacPerkinElmer [Aletvan Tonder, Annie MJoubert, A Duncan Cromarty//Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide (MTT) assay when compared to three commonly used cellenumeration assays.BMCResearch Notes-2015. DOI 10.1186/s13104-015-1000-8]. На основании полученных данных с помощью программного обеспечения GraphPadPrizm 5.0 была определена ЦТД (концентрация препарата, вызывающая гибель 50% клеток)[GraphPadCurveFittingGuide [Электронный ресурс] - URL: https://www.graphpad.com/guides/prism/7/curve-fitting/index.htm?reg_dr_inhibit_variable.htm (дата обращения 23.12.2020)]. В качестве контроля использовали клетки, к которым вносили культуральную среду.
in vitro
Оценку цитотоксичности проводили на культурах клеток А549 и Hep-2 через 24 часа инкубации клеток монослоя с тестируемыми образцами с помощью МТТ-теста с использованием планшетного анализатора Victor2 Wallac (PerkinElmer). Итоговые результаты определения цитотоксичности соединений  представлены в таблице 1. В качестве референтных соединений использованы лекарственные средства: доксорубицин и камптотецин.
4а-в
4а
4д
4ж
4е
В ряду соединений , в котором тиосемикарбазонный фрагмент не содержит атомов фтора, только продукт  проявляет активность, сопоставимую с камптотецином (табл. 1). Из данных таблицы 1 следует, что цитотоксическое действие соединений ,сравнимо с доксорубицином и превосходит камптотецин. Тогда как соединение  проявляет высокую цитотоксическую активность как в отношении культуры клеток А549 (карцинома легкого человека), так и в отношении культуры клеток Hep-2 (эпидермоидная карцинома гортани человека).
4
4е
мета
Таким образом, введение атомов фтора в арилтиосемикарбазонный фрагмент ряда веществ  является определяющим фактором для повышения их цитотоксического действия, в частности, наиболее активное соединение  содержит трифторметильную группу в -положении ароматического кольца.
Цитотоксичность исследуемых соединений свидетельствует об их перспективности для проведения дальнейших разработок противоопухолевых лекарственных средств.