ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ СЛИТОГО БЕЛКА РЕЦЕПТОРА ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА БЕТА И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION OF THE FUSION PROTEIN OF THE TRANSFORMING GROWTH FACTOR BETA RECEPTOR AND ITS APPLICATION

В настоящей заявке испрашивается приоритет патентной заявки 201811328326.1, поданной 9 ноября 2018 г, которая включается в данный документ посредством ссылки во всей ее полноте.
Область изобретения
Настоящее раскрытие принадлежит к области фармацевтического препарата и, в частности, относится к фармацевтической композиции, содержащей слитый белок антитела против PD-L1 (лиганд 1 программируемой клеточной смерти)/внеклеточной области TGF-βRII (рецептор II трансформирующего фактора роста бета), и к ее применению в качестве лекарственного средства.
Предшествующий уровень техники
Утверждения в данном документе лишь дают базовую информацию, относящуюся к настоящему раскрытию, и не обязательно составляют предшествующий уровень техники.
Люди осознали, что во время лечения опухолей высокая токсичность, обусловленная химиотерапией, и химиотерапия могут приводить к образованию резистентных к лекарственным средствам раковых клеток. Даже при применении таргетных терапий, которые нацелены на сверхэкспрессируемые или сверхактивируемые белки, связанные с выживаением и ростом опухоли, все еще будут раковые клетки, которые мутируют с уменьшением или уклонением зависимости от путей, на которые нацелены таргетные терапии, и данные раковые клетки выживали бы посредством других путей.
Иммунотерапия опухолей привлекла в последние годы значительное внимание, и она является приоритетом в области лечения опухолей. Выдающимся преимуществом такой терапии является повышенная сложность в формировании лекарственной резистентности. В иммунотерапии опухолей, главным образом, используются иммунологические принципы и способы для улучшения иммуногенности опухолевых клеток и чувствительности к умерщвлению эффекторными клетками, и для стимуляции и усиления противоопухолевого иммунного ответа в организме. Иммунотерапия опухолей включает инфузию иммунных клеток и эффекторных молекул хозяину, и данные два компонента сотрудничают с иммунной системой в умерщвлении опухолей и ингибировании роста опухолей в организме.
Рецептор 1 программируемой смерти (PD-1) является членом надсемейства CD28. PD-1 экспрессируется на активированных Т-клетках, В-клетках и миелоидных клетках. PD-1 имеет два лиганда: лиганд 1 программируемой смерти (PD-L1) и PD-L2. PD-L1 взаимодействует с рецептором PD-1 на Т-клетках и играет важную роль в негативной регуляции иммунного ответа. Экспрессию белка PD-L1 можно выявлять во многих тканях человеческих опухолей. Микроокружение в месте опухоли может индуцировать экспрессию PD-L1 на опухолевых клетках, и экспрессируемый PD-L1, в свою очередь, способствует онкогенезу и росту, и индуцирует апоптоз Т-клеток против опухоли. Ингибиторы пути PD-1/PD-L1 блокируют связывание PD-1 с PD-L1, блокируют негативные регуляторные сигналы, восстанавливают активность Т-клеток и усиливают иммунный ответ.Следовательно, иммуномодуляция PD-1/PD-L1 в качестве мишени очень важна для подавления опухолей.
Трансформирующий фактор роста-β (TGF-β) принадлежит к надсемейству TGF-β, которое регулирует рост и дифференциацию клеток. TGF-β передает сигналы через гетеротетрамерный рецепторный комплекс, который состоит из двух трансмембранных серин/треонинкиназных рецепторов типа I и двух типа II.
TGF-β представляет собой мультифункциональный цитокин, который оказывает опухолеподавляющий или опухолестимулирующий эффект способом, зависимым от клеток или зависимым от фона. Опухолеподавляющий эффект TGF-β зависит от способности индуцировать экспрессию многих генов. При введении мутаций или эпигенетических модификаций во время развития опухолей раковые клетки постепенно становятся толерантными к ингибирующему эффекту TGF-β, что, в конечном счете, приводит к развитию опухоли.
В исследованиях обнаружили, что блокирование пути сигнализации TGF-β может уменьшать метастазы опухоли. Обнаружили, что метастатическая способность опухолевых клеток ингибировалась при ингибировании пути сигнализации TGF-β линий клеток опухоли молочной железы посредством нагативного мутанта Smad2/3 с усечением. В исследовании нестабильности микросателлита рака толстой кишки обнаружили, что инактивирующая мутация TGF-βRII уменьшала метастазы и увеличивала показатель постоперационного выживания пациентов. Однако, в общем, данный эффект является слабым при введении одного ингибитора пути сигнализации TGF-β в клиническом лечении, возможно из-за того, что TGF-β, главным образом, ненормально экспрессируется в опухолевых клетках, в то время как для одного ингибитора пути сигнализации TGF-β сложно быть нацеленным на опухоль, приводя к низкой эффективности или низкой биодоступности данного ингибитора.
Следовательно, на основе нацеливания и нейтрализации TGF-β в микроокружении опухоли ингибирование пути PD-1/PD-L1 может восстанавливать активность Т-клеток, усиливать иммунный ответ и более эффективно улучшать ингибирующий эффект на онкогенез и развитие.
Согласно предыдущей заявке РСТ данного заявителя - PCT/CN2016/104320 (номер публикации WO 2017084495) предложено антитело против PD-L1. В настоящее время был опубликован слитый белок антитело/рецептор TGF-β, как, например, в WO 2006074451 A2, WO 2009152610 A1, WO 2011109789 А2, WO 2013164694 A1, WO 2014164427 A1, WO 2015077540 A2, WO 9309228 A1, WO 9409815 A1, WO 2015077540 А2, WO 2015118175 A2 и т.д. Среди них Merck раскрывает бифункциональный слитый белок PD-L1/TGF-β - бинтрафусп альфа (WO 2015118175, также известный как М7824, FP17022). В настоящее время бинтрафусп альфа находился в фазе клинического исследования опухолевых заболеваний, таких как рак желудка, рак легкого, рак пищевода, NSCLC (немелкоклеточный рак легкого), рак желчного пузыря. Однако лекарственные средства на основе антител в предыдущем уровне техники становятся нестабильными из-за больших молекулярных масс, сложных структур и являются чувствительными к деградации, полимеризации или появлению нежелательных химических модификаций. Для того чтобы сделать антитело подходящим для введения, поддержания стабильности во время хранения и последующего применения, и для оказания лучшего эффекта особенно важным является исследование стабильных препаратов лекарственных средств на основе антитела.
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно настоящему раскрытию предложена фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок PD-L1/TGF-βRII, которая является более располагающей к производству и введению, и более стабильной по эффективности; данная фармацевтическая композиция включает:
- слитый белок рецептора TGF-β и
- буфер,
где данный буфер выбран из группы, состоящей из буфера на основе соли гистидина, сукцинатного буфера, фосфатного буфера и цитратного буфера.
В некоторых воплощениях данный буфер представляет собой цитратный буфер. В некоторых воплощениях буфер на основе соли гистидина представляет собой буфер гистидин-соляная кислота; а сукцинатный буфер представляет собой буфер янтарная кислота-сукцинат натрия; цитратный буфер представляет собой буфер лимонная кислота-цитрат натрия. В некоторых воплощениях данный буфер представляет собой буфер лимонная кислота-цитрат натрия.
В альтернативном воплощении концентрация слитого белка рецептора TGF-β в описанной выше фармацевтической композиции составляет от примерно 0,5 мг/мл до примерно 100 мг/мл, предпочтительно от примерно 30 мг/мл до примерно 70 мг/мл.
В некоторых воплощениях концентрация слитого белка рецептора TGF-β в данной фармацевтической композиции составляет от 0,5 мг/мл до 100 мг/мл, предпочтительно от 30 мг/мл до 70 мг/мл. Неограничивающие примеры концентрации слитого белка рецептора TGF-β включают: примерно 30 мг/мл, примерно 35 мг/мл, примерно 40 мг/мл, примерно 45 мг/мл, примерно 50 мг/мл, примерно 55 мг/мл, примерно 60 мг/мл, примерно 65 мг/мл, примерно 70 мг/мл, предпочтительно примерно 50 мг/мл.
В некоторых воплощениях концентрация слитого белка рецептора TGF-β в данной фармацевтической композиции составляет 30 мг/мл, 35 мг/мл, 40 мг/мл, 45 мг/мл, 50 мг/мл, 55 мг/мл, 60 мг/мл, 65 мг/мл, 70 мг/мл, более предпочтительно 50 мг/мл.
В альтернативном воплощении значение рН буфера в описанной выше фармацевтической композиции составляет от примерно 5,0 до примерно 7,5, предпочтительно от примерно 6,0 до примерно 6,5, и возможно примерно 6,0, примерно 6,1, примерно 6,2, примерно 6,3, примерно 6,4, примерно 6,5, более предпочтительно примерно 6,2.
В некоторых воплощениях значение рН буфера составляет от 5,0 до 7,5 или от 6,0 до 6,5, предпочтительно 6,0; 6,1; 6,2; 6,3; 6,4 или 6,5, более предпочтительно 6,2.
В альтернативном воплощении концентрация буфера составляет от примерно 5 мМ до примерно 30 мМ, предпочтительно от примерно 5 мМ до примерно 20 мМ; ее неограничивающие примеры включают 5 мМ, 6 мМ, 7 мМ, 8 мМ, 9 мМ, 10 мМ, 12 мМ, 14 мМ, 16 мМ, 18 мМ, 20 мМ, более предпочтительно 10 мМ.
В некоторых воплощениях концентрация буфера составляет от 5 мМ до 30 мМ, предпочтительно от 5 мМ до 20 мМ; и в некоторых воплощениях концентрация буфера составляет примерно 10 мМ, примерно 12 мМ, примерно 14 мМ, примерно 16 мМ, примерно 18 мМ, примерно 20 мМ и более предпочтительно примерно 10 мМ.
2
n
В альтернативном воплощении описанная выше фармацевтическая композиция также содержит сахарид. «Сахарид» в настоящем раскрытии включает традиционные соединения /композиции (CHO) или их производные, включающие моносахариды, дисахариды, трисахариды, полисахариды, сахароспирты, восстанавливающие сахариды, невосстанавливающие сахариды и тому подобное. В некоторых воплощениях сахарид выбран из группы, состоящей из глюкозы, сахарозы, трегалозы, лактозы, фруктозы, декстрана, глицерина, эритрита, глицерина, арабита, ксилита, сорбита, маннита, мелибиозы, мелезитозы, мелитриозы, маннотриозы, стахиозы, мальтозы, лактулозы, мальтулозы, сорбита, мальтита, лактита, изомальтулозы и так далее. Предпочтительным сахаридом является невосстанавливающий дисахарид, более предпочтительно трегалоза или сахароза, и наиболее предпочтительно - сахароза.
В альтернативном воплощении концентрация сахарида в фармацевтической композиции, описанной выше, составляет от примерно 50 мг/мл до примерно 100 мг/мл, предпочтительно от примерно 60 мг/мл до примерно 90 мг/мл; неограничивающие примеры включают 60 мг/мл, 65 мг/мл, 70 мг/мл, 75 мг/мл, 80 мг/мл, 85 мг/мл, 90 мг/мл, наиболее предпочтительно 80 мг/мл.
В некоторых воплощениях концентрация сахарида составляет от 50 мг/мл до 100 мг/мл, предпочтительно от 60 мг/мл до 90 мг/мл; и в некоторых воплощениях концентрация сахарида составляет примерно 60 мг/мл, примерно 65 мг/мл, примерно 70 мг/мл, примерно 75 мг/мл, примерно 80 мг/мл, примерно 85 мг/мл или примерно 90 мг/мл.
В альтернативном воплощении фармацевтическая композиция, описанная выше, дополнительно содержит поверхностно-активное вещество, которое может быть выбрано из группы, состоящей из полисорбата 20, полисорбата 80, полигидроксиалкилена, тритона, натрия додецицилсульфоната, натрия лаурилсульфоната, натрия октилгликозида, лаурил-сульфобетаина, миристил-сульфобетаина, линолеил-сульфобетаина, стеарил-сульфобетаина, лаурил-саркозина, миристил-саркозина, линолеил-саркозина, стеарил-саркозина, линолеил-бетаина, миристил-бетаина, цетил-бетаина, лауреламидопропил-бетаина, кокаамидопропил-бетаина, линолеамидопропил-бетаина, миристамидопропил-бетаина, пальмитамидопропил-бетаина, изостеариламидопропил-бетаина, миристамидопропил-диметиламина, пальмамидопропил-диметиламина, изостеарамидопропил-диметиламина, натрия метилкокоила, натрия метилолеилтаурата, полиэтилен гликоля, полипропиленгликоля, сополимера этилен и пропиленгликоля и т.д. Предпочтительное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80 или полисорбат 20, более предпочтительно - полисорбат 80.
В другом альтернативном воплощении концентрация поверхностно-активного вещества в описанной выше фармацевтической композиции составляет от примерно 0,1 мг/мл до примерно 0,8 мг/мл, более предпочтительно от примерно 0,4 мг/мл до примерно 0,8 мг/мл. В некоторых воплощениях концентрация поверхностно-активного вещества составляет от 0,1 мг/мл до 0,8 мг/мл, предпочтительно от 0,4 мг/мл до 0,8 мг/мл, более предпочтительно примерно 0,4 мг/мл, примерно 0,45 мг/мл, примерно 0,5 мг/мл, примерно 0,55 мг/мл, примерно 0,6 мг/мл, примерно 0,7 мг/мл, примерно 0,8 мг/мл.
В некоторых воплощениях концентрация поверхностно-активного вещества составляет 0,4 мг/мл, 0,45 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,55 мг/мл, 0,6 мг/мл, 0,7 мг/мл или 0,8 мг/мл, более конкретно - 0,4 мг/мл.
В альтернативном воплощении описанная выше фармацевтическая композиция содержит:
(а) от примерно 0,5 мг/мл до примерно 100 мг/мл слитого белка рецептора TGF-β, (b) от примерно 5 мМ до примерно 30 мМ цитратного буфера, (с) от примерно 50 мг/мл до примерно 100 мг/мл сахарозы и (о!) от примерно 0,1 мг/мл до примерно 0,8 мг/мл полисорбата 80, предпочтительно рН данной фармацевтической композиции составляет от примерно 5,0 до примерно 7,5, более предпочтительно от примерно 6,0 до примерно 6,5.
В альтернативном воплощении описанная выше фармацевтическая композиция содержит:
от 0,5 мг/мл до 100 мг/мл слитого белка рецептора TGF-β
от 5 мМ до 30 мМ цитратного буфера
от 50 мг/мл до 100 мг/мл сахарозы и
от 0,1 мг/мл до 0,8 мг/мл полисорбата 80;
предпочтительно рН данной фармацевтической композиции составляет от 5,0 до 7,5, более предпочтительно от 6,0 до 6,5.
В альтернативном воплощении описанная выше фармацевтическая композиция содержит:
(а) от примерно 30 мг/мл до примерно 70 мг/мл слитого белка рецептора TGF-β, (b) от примерно 5 мМ до примерно 20 мМ буфера лимонная кислота-цитрат натрия, (с) от примерно 60 мг/мл до примерно 90 мг/мл сахарозы и (d) от примерно 0,4 мг/мл до примерно 0,8 мг/мл полисорбата 80, предпочтительно рН данной фармацевтической композиции составляет от примерно 6,0 до примерно 6,5.
В альтернативном воплощении описанная выше фармацевтическая композиция содержит:
от 30 мг/мл до 70 мг/мл слитого белка рецептора TGF-β
от 5 мМ до 20 мМ буфера лимонная кислота-цитрат натрия
от 60 мг/мл до 90 мг/мл сахарозы и
от 0,4 мг/мл до 0,8 мг/мл полисорбата 80;
рН данной фармацевтической композиции составляет от примерно 6,0 до примерно 6,5.
В альтернативном воплощении данная фармацевтическая композиция содержит:
(а) примерно 50 мг/мл слитого белка рецептора TGF-β, (b) примерно 10 мМ буфера лимонная кислота-цитрат натрия, (с) примерно 80 мг/мл сахарозы и (d) примерно 0,4 мг/мл полисорбата 80, рН данной фармацевтической композиции предпочтительно составляет примерно 6,2.
В альтернативном воплощении данная фармацевтическая композиция содержит:
50 мг/мл слитого белка рецептора TGF-β
10 мМ буфера лимонная кислота-цитрат натрия
80 мг/мл сахарозы и
0,4 мг/мл полисорбата 80;
предпочтительно рН данной фармацевтической композиции составляет примерно 6,2.
В альтернативном воплощении слитый белок рецептора TGF-β в описанной выше фармацевтической композиции показан в виде общей формулы (I):
Ab-L-TGF-βRII ECD (I)
где внеклеточный домен (ECD) TGF-βRII представляет собой усеченную форму внеклеточной области TGF-βRII; Ab представляет собой антитело против PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент;
L представляет собой линкерную последовательность.
4
x
В альтернативном воплощении линкерная последовательность в фармацевтической композиции, описанной выше, представляет собой (GS)G, где х представляет собой целое число 3-6. В альтернативном воплощении х представляет собой 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 4.
В альтернативном воплощении усеченная форма внеклеточной области TGF-βRII представляет собой последовательность внеклеточного домена TGF-βRII (показанную как SEQ ID NO: 14) с делецией самое большее 26 последовательных аминокислотных остатков на амино конце (также именуемом N конец). В некоторых воплощениях усеченная форма внеклеточной области TGF-βRII представляет собой последовательность внеклеточного домена TGF-βRII с делецией 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 последовательных аминокислотных остатков на N конце. В некоторых воплощениях последовательность ECD TGF-βRII в описанной выше фармацевтической композиции показана как SEQ ID NO: 14, 15, 16 или 17; предпочтительно данная последовательность показана как SEQ ID NO: 15.
В альтернативном воплощении антитело против PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент в описанной выше фармацевтической композиции содержит:
определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR): HCDR1, HCDR2 и HCDR3, показанные как SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 соответственно; и
определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR): LCDR1, LCDR2 и LCDR3, показанные как SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно.
В альтернативном воплощении антитело против PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент в описанной выше фармацевтической композиции содержит:
HCDR1, HCDR2 и HCDR3, показанные как SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 3 соответственно; и
LCDR1, LCDR2 и LCDR3, показанные как SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно.
В альтернативном воплощении антитело против PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент в описанной выше фармацевтической композиции содержит:
вариабельную область тяжелой цепи, показанную как SEQ ID NO: 7, и
вариабельную область легкой цепи, показанную как SEQ ID NO: 8;
или содержит:
вариабельную область тяжелой цепи, показанную как SEQ ID NO: 9, и
вариабельную область легкой цепи, показанную как SEQ ID NO: 11.
В альтернативном воплощении аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела против PD-L1 в описанной выше фармацевтической композиции показана как SEQ ID NO: 12 или имеет по меньшей мере 85%-ную, 86%-ную, 87%-ную, 88%-ную, 89%-ную, 90%-ную, 91%-ную, 92%-ную, 93%-ную, 94%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную или 100%-ную идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 12; аминокислотная последовательность легкой цепи антитела против PD-L1 и показана как SEQ ID NO: 13 или имеет по меньшей мере 85%-ную, 86%-ную, 87%-ную, 88%-ную, 89%-ную, 90%-ную, 91%-ную, 92%-ную, 93%-ную, 94%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную или 100%-ную идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 13.
В альтернативном воплощении описанной выше фармацевтической композиции в слитом белке рецептора TGF-β ECD TGF-βRII слит с карбоксильным концом тяжелой цепи антитела против PD-L1 через линкерную последовательность.
В некоторых воплощениях слитый белок рецептора TGF-β содержит:
• слитый пептид, образованный тяжелой цепью антитела против PD-L1, слитой с ECD TGF-βRII, последовательность которого показана как SEQ ID NO: 23 или имеет по меньшей мере 85%-ную, 86%-ную, 87%-ную, 88%-ную, 89%-ную, 90%-ную, 91%-ную, 92%-ную, 93%-ную, 94%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную или 100%-ную идентичность последовательности с последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 23, и
• легкую цепь антитела против PD-L1, последовательность которого показана как SEQ ID NO: 13 или имеет по меньшей мере 85%-ную, 86%-ную, 87%-ную, 88%-ную, 89%-ную, 90%-ную, 91%-ную, 92%-ную, 93%-ную, 94%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную или 100%-ную идентичность последовательности с последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 13.
В других воплощениях слитый белок рецептора TGF-β содержит:
• слитый пептид, образованный тяжелой цепью антитела против PD-L1, слитой с ECD TGF-βRII, последовательность которого показана как SEQ ID NO: 24 или имеет по меньшей мере 85%-ную, 86%-ную, 87%-ную, 88%-ную, 89%-ную, 90%-ную, 91%-ную, 92%-ную, 93%-ную, 94%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную или 100%-ную идентичность последовательности с последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 24, и
• легкую цепь антитела против PD-L1, последовательность которой показана как SEQ ID NO: 13 или имеет по меньшей мере 85%-ную, 86%-ную, 87%-ную, 88%-ную, 89%-ную, 90%-ную, 91%-ную, 92%-ную, 93%-ную, 94%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную или 100%-ную идентичность последовательности с последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 13.
Согласно настоящему раскрытию также предложен способ получения описанной выше фармацевтической композиции, который включает стадию приведения в контакт слитого белка рецептора TGF-β с буфером, например, осуществляя замену буфера в маточном растворе слитого белка рецептора TGF-β, и данный буфер предпочтительно представляет собой цитратный буфер; более предпочтительно буфер лимонная кислота-цитрат натрия, причем концентрация данного буфера предпочтительно составляет от примерно 5 мМ до примерно 20 мМ; неограничивающие примеры включают 5 мМ, 6 мМ, 7 мМ, 8 мМ, 9 мМ, 10 мМ, 12 мМ, 14 мМ, 16 мМ, 18 мМ, 20 мМ, более предпочтительно 10 мМ; рН данного буфера составляет от примерно 6,0 до примерно 6,5, неограничивающие примеры включают 6,0; 6,1; 6,2; 6,3; 6,4; 6,5; предпочтительно 6,2. В альтернативном воплощении концентрация буфера составляет от 5 мМ до 20 мМ, неограничивающие примеры включают примерно 5 мМ, примерно 6 мМ, примерно 7 мМ, примерно 8 мМ, примерно 9 мМ, примерно 10 мМ, примерно 12 мМ, примерно 14 мМ, примерно 16 мМ, примерно 18 мМ, примерно 20 мМ, более предпочтительно примерно 10 мМ; рН данного буфера составляет от 6,0 до 6,5, неограничивающие примеры включают примерно 6,0, примерно 6,1, примерно 6,2, примерно 6,3, примерно 6,4, примерно 6,5, предпочтительно примерно 6,2.
Согласно настоящему раскрытию также предложен способ получения описанной выше фармацевтической композиции, дополнительно включающий следующие стадии после приведения в контакт слитого белка рецептора TGF-β с буфером: добавление в полученный раствор сахарозы и полисорбата 80 (между ними нет порядка предшествования), затем подведение объема с использованием буфера, где концентрация буферного раствора предпочтительно составляет от примерно 5 мМ до примерно 20 мМ, более предпочтительно от 5 мМ до 20 мМ, неограничивающие примеры включают 5 мМ, 8 мМ, 10 мМ, 12 мМ, 14 мМ, 16 мМ, 18 мМ, 20 мМ; рН буфера составляет от примерно 6,0 до примерно 6,5, неограничивающие примеры включают 6,0; 6,1; 6,2; 6,3; 6,4; 6,5.
Согласно настоящему раскрытию также предложен способ получения лиофилизированного препарата, содержащего слитый белок рецептора TGF-β, который включает стадию осуществления лиофилизации описанной выше фармацевтической композиции.
В альтернативном воплощении предложен способ получения описанного выше лиофилизированного препарата, содержащего слитый белок рецептора TGF-β, где лиофилизация осуществляется согласно известному в данной области способу, как, например, стадиями, включающими предварительную заморозку, первичную сушку и вторичную сушку, но не ограничиваясь ими. Специалистам понятно, что к настоящему ракрытию применим любой способ удаления воды из фармацевтической композиции в настоящем раскрытии.
Согласно настоящему раскрытию также предложен лифилизированный препарат, содержащий слитый белок рецептора TGF-β, который получают способом получения описанного выше лифилизированного препарата.
Согласно настоящему раскрытию также предложен лифилизированный препарат, содержащий слитый белок рецептора TGF-β, который может быть восстановлен с образованием описанной выше фармацевтической композиции.
В некоторых воплощениях данный лиофилизированный препарат может быть стабильным при 2°С-8°С в течение по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев или по меньшей мере 24 месяцев. В некоторых воплощениях данный лиофилизированный препарат может быть стабильным при 40°С в течение по меньшей мере 7 суток, по меньшей мере 14 суток или по меньшей мере 28 суток.
Согласно настоящему раскрытию также предложен восстановленный раствор, содержащий слитый белок рецептора TGF-β, который получают посредством повторного восстановления лиофилизированного препарата, содержащего описанный выше слитый белок рецептора TGF-β.
Согласно настоящему раскрытию также предложен способ получения восстановленного раствора, содержащего описанный выше слитый белок рецептора TGF-β, который включает стадию повторного восстановления описанного выше лиофилизированного препарата, причем раствор, использованный для восстановления, содержит воду для инъекции, физиологический раствор или раствор глюкозы, но не ограничивается ими, предпочтительно воду для инъекции.
Согласно настоящему раскрытию дополнительно предложено изделие или набор, содержащий: фармацевтическую композицию согласно настоящему раскрытию и контейнер(ры).
В некоторых воплощениях данный контейнер представляет собой стеклянную бутыль, такую как бутыль для инъекции, сделанную из флакона из нейтрального борсиликатного стекла, но не ограничиваясь ей.
Согласно настоящему раскрытию также предложено изделие, содержащее контейнер(ры), который(рые) содержит(жат) описанную выше фармацевтическую композицию или ее лиофилизированный препарат, или восстановленный раствор лиофилизированного препарата.
Согласно настоящему раскрытию также предложено применение любого, выбранного из следующего, при получении лекарственного средства:
описанная выше фармацевтическая композиция или лиофилизированный препарат, или восстановленный раствор данного лиофилизированного препарата, или изделие; причем данное лекарственное средство используется для лечения или ингибирования заболевания(ний) или расстройства(ств), связанного(ных) с пролиферацией опухолевых клеток или метастазами.
В некоторых воплощениях заболевание(ния) или расстройство(ва) представляет(ют) собой опухоль.
В некоторых воплощениях заболевание(ния) или расстройство(ва) выбрано(ны) из группы, состоящей из колоректального рака, рака молочной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака простаты, рака почки, рака шейки матки, миеломы, лимфомы, лейкоза, рака щитовидной железы, рака эндометрия, рака матки, рака мочевого пузыря, нейроэндокринного рака, рака головы и шеи, рака печени, назофарингеальной карциномы, рака яичка, рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, меланомы, базальноклеточной кожной карциномы, плоскоклеточной кожной карциномы, возвышающейся дерматофибросаркомы, карциномы из клеток Меркеля, глиобластомы, глиомы, саркомы, мезотелиомы и миелодиспластического синдрома.
Согласно настоящему раскрытию также предложен способ лечения или ингибирования заболевания(ний) или расстройства(расстройств), относящегося(щихся) к пролиферации или метастазу раковой клетки, включающий предоставление терапевтически эффективного количества описанной выше фармацевтической композиции или лиофилизированного препарата, или восстановленного раствора, или изделия субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых воплощениях данный способ включает введение субъекту единичной дозы композиции, содержащей от 0,1 мг до 3000 мг слитого белка рецептора TGF-β, как описано выше, фармацевтической композиции или лиофилизированного препарата, или восстановленного раствора, или изделия. В некоторых воплощениях данным(ными) заболеванием(ниями) или расстройств ом (вам и) является(ются) опухоль. В некоторых воплощениях данное(ные) заболевание(ния) или расстройство(ва) выбрано(ны) из группы, состоящей из колоректального рака, рака молочной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака простаты, рака почки, рака шейки матки, миеломы, лимфомы, лейкоза, рака щитовидной железы, рака эндометрия, рака матки, рака мочевого пузыря, нейроэндокринного рака, рака головы и шеи, рака печени, назофарингеальной карциномы, рака яичка, рака легкого, рака тонкого кишечника, немелкоклеточного рака легкого, меланомы, базальноклеточной кожной карциномы, плоскоклеточной кожной карциномы, возвышающейся дерматофибросаркомы, карциномы из клеток Меркеля, глиобластомы, глиомы, саркомы, мезотелиомы и миелодиспластического синдрома.
Согласно настоящему изобретению также предложены описанные выше слитый белок рецептора TGF-β, фармацевтическая композиция или лиофилизированный препарат, или восстановленный раствор, или изделие для лечения или ингибирования заболевания(ний) или расстройства(расстройств), относящегося(сихся) к пролиферации или метастазу раковой клетки. В некоторых воплощениях данное заболевание(ния) или расстройство(ва) представляет(ют) собой опухоль. В некоторых воплощениях данное заболевание(ния) или расстройство(ва) выбрано(ны) из группы, состоящей из колоректального рака, рака молочной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака простаты, рака почки, рака шейки матки, миеломы, лимфомы, лейкоза, рака щитовидной железы, рака эндометрия, рака матки, рака мочевого пузыря, нейроэндокринного рака, рака головы и шеи, рака печени, назофарингеальной карциномы, рака яичка, рака легкого, рака тонкого кишечника, немелкоклеточного рака легкого, меланомы, базальноклеточной кожной карциномы, плоскоклеточной кожной карциномы, возвышающейся дерматофибросаркомы, карциномы из клеток Меркеля, глиобластомы, глиомы, саркомы, мезотелиомы и миелодиспластического синдрома.
Как хорошо известно специалистам в данной области, одна, некоторые или все из характеристик разных воплощений, описанных в настоящем раскрытии, может быть дополнительно объединена с образованием других воплощений настоящего раскрытия. Приведенные выше воплощения настоящего раскрытия и другие воплощения, полученные комбинацией, дополнительно иллюстрируются следующим подробным описанием.
Описание графических материалов
Фиг. 1: схематическая диаграмма, демонстрирующая структуру слитого белка.
Фиг. 2: результаты, показывающие связывание слитых белков с человеческим TGF-β1 in vitro.
Фиг. 3: результаты, показывающие связывание слитых белков с человеческим TGF-β1 in vitro.
Фиг. 4: результаты, показывающие связывание слитых белков с человеческим PD-L1 in vitro.
Фиг. 5: результат, показывающий выявление блокирования пути PD-1/PD-L1 посредством слитых белков in vitro.
Фиг. 6: слитые белки ингибируют индуцированную TGFβ активность репортера pSMAD3 дозозависимым образом.
Фиг. 7. Все образцы слитых белков усиливают секрецию цитокина IFN-γ посредством активированных Т-лимфоцитов.
Фиг. 8. Влияние слитых белков на массу опухоли несущих опухоль мышей.
Подробное описание изобретения
Терминология
Для более легкого понимания данного раскрытия определенные технические и научные термины конкретно определяются ниже. Если в данном документе конкретно не определено, все другие технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значение, обычно понятное обычным специалистом в области, к которой относится данное раскрытие.
Термин «буфер» относится к раствору, который является устойчивым к изменению рН посредством действия кислотно-основных конъюгатных компонентов. Примеры буферов, которые могут контролировать рН в пределах подходящего интервала, включают ацетатный, сукцинатный, глюконатный, гистидиновый, оксалатный, лактатный, фосфатный, цитратный, тартратный, фумаратный и глицилглициновый.
«Буфер на основе соли гистидина» представляет собой буфер, содержащий ионы гистидинового радикала. Примеры буферов на основе соли гистидина включают гистидин-гидрохлоридный, гистидин-ацетатный, гистидин-фосфатный, гистидин-сульфатный и тому подобные; предпочтительно гистидин-гидрохлоридный буфер. Гистидин-гидрохлоридный буфер получают из гистидина и соляной кислоты.
«Цитратный буфер» представляет собой буфер, который содержит ионы цитратного радикала. Примеры цитратных буферов включают лимонную кислоту-цитрат натрия, цитрат-цитрат калия, цитрат-цитрат кальция, цитрат-цитрат магния и тому подобные. Предпочтительный цитратный буфер представляет собой лимонную кислоту-цитрат натрия.
«Сукцинатный буфер» представляет собой буфер, который содержит ионы сукцинатного радикала. Примеры сукцинатных буферов включают янтарную кислоту-сукцинат натрия, янтарную кислоту-сукцинат калия, янтарную кислоту-сукцинат кальция и тому подобные. Предпочтительный сукцинатный буфер представляет собой янтарную кислоту-сукцинат натрия.
«Фосфатный буфер» представляет собой буфер, который содержит ионы фосфатного радикала. Примеры фосфатных буферов включают динатрия гидрофосфат-натрия дигидрофосфат, динатрия гидрофосфат-калия дигидрофосфат и тому подобные. Предпочтительный фосфатный буфер представляет собой динатрия гидрофосфат-натрия дигидрофосфат.
«Ацетатный буфер» представляет собой буфер, содержащий ионы ацетатного радикала. Примеры ацетатных буферов включают уксусную кислоту-ацетат натрия, гистидина ацетат, уксусную кислоту-ацетат калия, уксусную кислоту-ацетат кальция, уксусную кислоту-ацетат магния и тому подобные. Предпочтительный ацетатный буфер представляет собой уксусную кислоту-ацетат натрия.
Термин «фармацевтическая композиция» относится к смеси, содержащей одно или более чем одно соединение, описанное в данном документе, или его физиологически/фармацевтически приемлемые соли или пролекарства и другие химические компоненты, такие как физиологически/фармацевтически приемлемый(мые) носитель(ли) или эксципиент(ты). Целью фармацевтической композиции является поддержание стабильности активного ингредиента в виде антитела, стимуляция введения в организм и облегчение поглощения активного ингредиента таким образом, чтобы он оказывал биологическую активность. Используемые в данном документе термины «фармацевтическая композиция» и «препарат» не являются взаимоисключающими.
Если не определено иначе, при ссылке на форму раствора фармацевтической композиции, описанной в настоящем раскрытии, используемым в ней растворителем является вода.
Термин «лиофилизированный препарат» относится к препарату или фармацевтической композиции, полученной после стадии лиофилизации (например, стадия сублимационной сушки в вакууме) фармацевтической композиции в ее жидкой форме или форме раствора, или к лиофилизации препарата в его жидкой форме или форме раствора.
Термин «примерно» или «приблизительно» в том виде, в котором он используется в настоящем раскрытии, означает то, что данное значение находится в пределах приемлемого интервала ошибки конкретного значения, определенного обычными специалистами в данной области, и данное значение частично зависит от того, как оно измеряется или определяется (т.е. предела измерительной системы). Например, термин «примерно» или «приблизительно» относится в данной области к стандартному отклонению меньшему чем единица или большему чем единица. В качестве альтернативы, термин «примерно» или «приблизительно», или «по существу содержащий» относится к интервалу вплоть до 20%. Кроме того, в частности, для биологических систем или процессов, данный термин означает порядок значения вплоть до одного или вплоть до 5 раз больше, чем данное значение. Если не определено иначе, значение «примерно XX» или «приблизительно XX», или «по существу содержащий XX», используемое в настоящем раскрытии, относится к значению в пределах приемлемого интервала ошибки конкретного значения «XX» (включая само значение «XX», а также значения в пределах приемлемого интервала ошибки данного значения при определении обычными специалистами в данной области).
Фармацевтическая композиция, описанная в настоящем раскрытии, способна к достижению стабильного эффекта: слитый белок рецептора TGF-β или его фармацевтическая композиция по существу сохраняет физическую стабильность и/или химическую стабильность, и/или биологическую стабильность после хранения; предпочтительно данная фармацевтическая композиция по существу сохраняет физическую и химическую стабильность, и его биологическую активность после хранения. Срок хранения обычно определяется на основе предварительно определенного срока хранения фармацевтической композиции. В настоящее время имеется множество аналитических методик для измерения стабильности активных ингредиентов, которые могут измерять стабильность после хранения при заданной температуре в течение заданного периода времени.
Стабильный фармацевтический препарат антитела или белка представляет собой такой препарат, для которого не наблюдается значительных изменений при следующих условиях: хранение при температуре охлаждения (2-8°С) в течение по меньшей мере 3 месяцев, предпочтительно в течение 6 месяцев, более предпочтительно в течение 1 года и даже более предпочтительно вплоть до 2 лет. Кроме того, стабильные жидкие препараты включают жидкие препараты, которые демонстрируют желательные характеристики после хранения при температуре (включающей 25°С) в течение 1 месяца, 3 месяцев, 6 месяцев или после хранения при 40°С в течение периода 28 суток.
Типичными приемлемыми стандартами стабильности являются следующие: при измерении ГФ-ВЭЖХ (гель-фильтрация на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии) деградирует обычно не больше, чем примерно 10%, предпочтительно не больше, чем примерно 5% активных ингредиентов (таких как белки, антитела). Посредством визуальной проверки данный фармацевтический препарат является бледно-желтой почти бесцветной, прозрачной или бесцветной жидкостью, или от прозрачной до слегка молочно-белой, или бледно-желтой почти бесцветной прозрачной жидкостью. Изменение концентрации, рН и осмоляльности препарата составляет не более, чем плюс/минус 10%. Обычно наблюдается уменьшение не больше, чем примерно на 10%, предпочтительно не больше, чем примерно на 5%. Обычно образуется не больше, чем примерно 10%, предпочтительно не больше, чем примерно 5% агрегатов.
Считают, что активный ингредиент в фармацевтическом препарате «сохраняет его физическую стабильность», если антитело не демонстрирует какого-либо значимого увеличения агрегации, выпадения в осадок и/или денатурации посредством визуальной проверки цвета и/или прозрачности, или рассеяния в УФ (ультрафиолетовый свет), гель-фильтрации (ГФ) и динамического рассеяния света (ДРС). Изменения конформации белка можно оценивать посредством флуоресцентной спектроскопии (которая определяет третичную структуру белка) или посредством спектроскопии FTIR (инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье) (которая определяет вторичную структуру белка).
Считается, что активный ингредиент (такой как белок или антитело) в фармацевтическом препарате «сохраняет его химическую стабильность», если данный активный ингредиент (такой как белок или антитело) не демонстрирует какого-либо значимого химического изменения. Посредством выявления и количественного измерения химически измененных форм белков или антител можно оценивать химическую стабильность. Процессы деградации, которые часто приводят к изменению химической структуры белков, включают гидролиз или усечение (оцениваемые такими способами, как гель-фильтрация или SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия)), окисление (оцениваемое такими способами, как пептидное картирование в сочетании с масс-спектрометрией или MALDI/TOF/MS (времяпролетная масс-спектрометрия с матрично активированной лазерной десорбцией/ионизацией) и т.д.), дезамидирование (оцениваемое такими способами, как ионообменная хроматография, капиллярная изоэлектрофокусировка, пептидное картирование, измерение содержания изоаспарагиновой кислоты и т.д.) и изомеризацию (оцениваемую измерением содержания изоаспарагиновой кислоты, пептидным картированием и т.д.).
Активный ингредиент (например, белок или антитело) «сохраняет его биологическую стабильность» в фармацевтическом препарате, если данный активный ингредиент (например, белок или антитело) демонстриует в течение заданного периода времени биологическую активность в пределах заданного интервала при получении фармацевтического препарата. Биологическую активность активного ингредиента (такого как белок или антитело) можно определять, например, посредством анализа связывания антигена.
Трехбуквенный код и однобуквенный код для аминокислот в том виде, в котором они используются в данном раскрытии, являются такими, как описано в J. Biol. Chem, 243, р 3558 (1968).
Термин «антитело» в том виде, в котором он используется в настоящем раскрытии, относится к иммуноглобулину - структуре из четырех пептидных цепей, образованной двумя идентичными тяжелыми цепями и двумя идентичными легкими цепями, соединенными межцепочечной(ными) дисульфидной(ными) связью(зями).
В настоящем раскрытии легкая цепь антитела, описанная в настоящем раскрытии, дополнительно содержит константную(ные) область(ти) легкой цепи, которая(рые) содержит(жат) человеческую или мышиную κ, λ цепь или ее вариант (ты).
В настоящем раскрытии тяжелая цепь антитела, описанная в настоящем раскрытии, дополнительно содержит константную(ные) область(ти) тяжелой цепи, которую(рые) содержит(жат) человеческий или мышиный lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, или его вариант(ты).
th
На N-конце тяжелой цепи и легкой цепи антитела значительно варьирует область из примерно 110 аминокислот, которая известна как вариабельная область (область Fv); аминокислотная последовательность на С-конце, которая известна как константная область, является относительно стабильной. Вариабельная область содержит три гипервариабельные области (HVR) и четыре области FR (FR) с относительно консервативной последовательностью. Три гипервариабельные области определяют специфичность антитела, и они также известны как область, определяющая комплементарность (CDR). Каждая вариабельная область легкой цепи (LCVR или VL) и каждая вариабельная область тяжелой цепи (HCVR или VH) состоит из трех областей CDR и четырех областей FR, расположенных от аминоконца до карбоксильного конца следующим образом: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Три области CDR легкой цепи относятся к LCDR1, LCDR2 и LCDR3; три области CDR тяжелой цепи относятся к HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Число и расположение аминокислотных остатков области CDR областей LCVR и HCVR антитела или антигенсвязывающего фрагмента в данном документе соответствует известным критериям нумерации Kabat (LCDR1-3, HCDR1-3) или соответствует критериям нумерации Kabat и Chothia; критерии нумерации Kabat (см. Kabat et al (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, the 5 edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD), и критерии нумерации Chothia (см. Al-Lazikani et al (1997) JMB 273: 927-948).
Антитело по настоящему раскрытию включает мышиное антитело, химерное антитело и гуманизированное антитело, предпочтительно гуманизированное антитело.
Термин «антитело или его связывающий фрагмент» или «функциональный фрагмент» в том виде, в котором он используется в настоящем раскрытии, относится к фрагменту Fab, фрагменту Fab', фрагменту F(ab')2, имеющему антигенсвязывающую активность, а также к фрагменту Fv, фрагменту scFv, связывающемуся с антигеном. Фрагмент Fv представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит все антигенсвязывающие сайты, фрагмент Fv содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, но без константной(ных) области(тей). Обычно антитело Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, с образованием структуры, требующейся для связывания антигена. Разные линкеры также можно использовать для соединения вариабельных областей двух антител с образованием полипептидной цепи, именуемой одноцепочечным антителом или одноцепочечным Fv (sFv). Термин «связывающийся с PD-L1» в том виде, в котором он используется в настоящем раскрытии, означает способность взаимодействовать с человеческим PD-L1. Термин «антигенсвязывающий сайт» в том виде, в котором он используется в настоящем раскрытии, относится к непоследовательным или последовательным трехмерным сайтам на антителе или его антигенсвязывающем фрагменте, который распознает антиген-мишень и специфично связывается сданным антигеном.
Термин «мышиное антитело» в настоящем раскрытии относится к моноклональному антителу против человеческого PD-L1, полученному согласно знаниям и квалификации в данной области. Во время получения анализируемому субъекту инъецируется антиген PD-L1, и затем выделяют гибридому, экспрессирующую антитело, которое обладает желательной последовательностью или функциональными характеристиками.
«Химерное антитело» представляет собой антитело, которое образуется слиянием вариабельной области антитела, не являющегося человеческим (такого как мышиное), с константной областью человеческого антитела таким образом, чтобы облегчать иммунный ответ, индуцированный антителом, не являющимся человеческим (таким как мышиное). Для создания химерного антитела сначала создается гибридома, секретирующая специфичное моноклональное антитело, затем из клеток гибридомы клонируются гены вариабельной области, и затем, если это желательно, клонируются гены константной области человеческого антитела, гены вариабельной области антитела, не являющегося человеческим (такого как мышиное), лигируются с генами константной области человека с образованием химерного гена, который может быть вставлен в человеческий вектор, и молекула химерного антитела, наконец, экспрессируется в эукариотической или прокариотической промышленной системе. В предпочтительном воплощении настоящего раскрытия легкая цепь химерного антитела против PD-L1 дополнительно содержит константную(ные) область(ти), полученную(ные) из человеческой цепи к, X или ее варианта(тов). Тяжелая цепь химерного антитела против PD-L1 дополнительно содержит константную(ные) область(ти) тяжелой цепи, полученную(ные) из человеческого lgG1, lgG2, lgG3, lgG4 или его варианта(тов). Константная(ные) область(ти) человеческого антитела может быть выбрана из константной(ных) области(тей) тяжелой цепи, полученной(ных) из человеческого lgG1, lgG2, lgG3, lgG4 или его варианта(тов), предпочтительно содержит константую область тяжелой цепи, полученную из человеческого lgG2 или lgG4, или lgG4 без ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность) из-за аминокислотной мутации.
Термин «гуманизированное антитело», также известное как антитело с привитой CDR, относится к антителу, полученному посредством прививки последовательностей CDR, не являющихся человеческими (таких как мышиные), на каркас вариабельной области человеческого антитела, т.е. антитела, образованного из разных типов последовательностей каркаса антитела человеческой зародышевой линии. Гуманизированное антитело преодолевает сильный ответ против антитела, индуцированный химерным антителом, которое несет большое количество компонентов, не являющихся человеческими (таких как мышиные). Такие последовательности каркаса могут быть получены из общедоступной базы данных ДНК или опубликованных ссылок, охватывающих последовательности генов антител зародышевой линии. Например, последовательности ДНК зародышевой линии генов вариабельной области человеческой тяжелой и легкой цепи могут быть найдены в базе данных человеческих последовательностей зародышевой линии «VBase» (доступна в сети на www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), а также находятся в Kabat, ЕА et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, the 5th Ed. Для того чтобы избежать уменьшения активности, вызванного пониженной иммуногенностью, каркас вариабельной области человеческого антитела подвергают минимальной обратной мутации для поддержания активности. Гуманизированное антитело по настоящему раскрытию также относится к гуманизированному антителу, которое дополнительно получают фаговым дисплеем с целью созревания аффинности CDR.
Термин «ADCC» (от англ. antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), а именно антителозависимая клеточная цитотоксичность в том виде, в котором он используется в настоящем раскрытии, относится к клеткам, экспрессирующим рецепторы Fc, которые непосредственно умерщвляют клетки-мишени, покрытые антителом, посредством распознавания сегмента Fc антитела. Эффекторная функция ADCC антитела может быть снижена или устранена посредством модифицирования сегмента Fc IgG. Данная модификация относится к мутациям константной области тяжелой цепи антитела, таким как мутации, выбранные из группы, состоящей из N297A, L234A, L235A в lgG1; химере lgG2/4; или мутаций F234A/L235A в lgG4.
Термин «идентичность» в том виде, в котором он используется в настоящем раскрытии, указывает степень сходства между последовательностями двух полинуклеотидов или двух полипептидов. Идентичность последовательности в настоящем раскрытии составляет по меньшей мере 85%, 90% или 95%, предпочтительно по меньшей мере 95%. Неограничивающие примеры включают 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, но не ограничиваются ими. Сравнение и определение процента идентичности между двумя последовательностями может осуществляться с использованием установок по умолчанию алгоритма BLASTN/BLASTP, доступного на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации.
Термин «рецептор II TGF-β» или «TGFβRII», или «рецептор II трансформирующего фактора роста β» относится к связыванию лигандов (включающих TGFβl, TGFβ2 и TGFβ3, но не ограничивающихся ими), посредством которого данные рецепторы клеточной поверхности запускают путь трансдукции внутриклеточной сигнализации.
Термин «PD-L1» относится к лиганду 1 программируемой смерти, также известному как CD274 и В7Н1. PD-L1 представляет собой белок из 290 аминокислот, имеющий внеклеточный lgV-подобный и lgC-подобный домен (аминокислоты 19-239 полноразмерного PD-L1), трансмембранный домен и внутриклеточный домен из примерно 30 аминокислот. PD-L1 конститутивно экспрессируется на многих клетках, таких как антигенпрезентирующие клетки (такие как дендритные клетки, макрофаги и В-клетки), а также гематопоэтические и негематопоэтические клетки (такие как клетки эндотелия сосудов, островки Лангерганса и иммунологически привилегированный сайт). PD-L1 также экспресируется на множестве опухолей и клеток, инфицированных вирусом, и является элементом в иммунодепрессивной среде (Ribas 2012, NEJM 366: 2517-2519). PD-L1 связывается с одним из двух соингибиторов Т-клеток (PD-1 и В7-1).
«Антитело против PD-L1 или его антигенсвязывающий белок» по настоящему раскрытию включает любые антитела против PD-L1 или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной области. Антитело против PD-L1 может представлять собой имеющееся в продаже антитело против PD-L1, или оно было раскрыто в литературе; включая BMS-936559, MPDL3280A, MEDI4736, MSB0010718C (см. US 2014341917, US 20130034559, US 8779108) и тому подобные, но не ограничиваясь ими. Данное антитело может представлять собой моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело. Фрагмент антитела включает фрагмент Fab, фрагмент Fab', фрагмент F(ab')2, имеющий антигенсвязывающую активность, и фрагмент Fv, и фрагмент scFv, который связывается с антигеном.
В качестве типичного способа получения для антитела против PD-L1 по настоящему раскрытию он был опубликован в заявке РСТ PCT/CN 2016/104320 (№ публикации WO 2017084495), причем антитело против PD-L1 содержит последовательности CDR в вариабельных областях тяжелой цепи, как описано ниже:
1
2
В альтернативном воплощении X выбран из Н или G; и Х выбран из G или F.
В другом воплощении типичное антитело против PD-L1 по настоящему раскрытию дополнительно содержит последовательности CDR вариабельной области легкой цепи, как описано ниже:
В другом воплощении приведенные выше области CDR гуманизируются посредством стратегии пересадки CDR, a FR матриц гуманизированной легкой цепи представляют собой IGKV7-3*01 и hjk2.1, FR матриц гуманизированной тяжелой цепи представляют собой IGHV1-46*01 и hjh6.1, и последовательности гуманизированной вариабельной области являются следующими:
Вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела против PD-L1:
1
2
SEQ ID NO: 7, где X выбран из Н или G; и Х выбран из G или F.
Вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела против PD-L1:
ПРИМЕЧАНИЕ: порядком является FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, часть, приведенная курсивом, представляет собой последовательность FR, и подчеркнутая часть представляет собой последовательность CDR (аминокислотные остатки CDR определяются и обозначаются на основе критериев нумерации Kabat).
В другом воплощении осуществляется план обратной(ных) мутации(ций) на гуманизированном антителе по настоящему раскрытию, и запланированные обратные мутации показаны в Таблице 1, приведенной ниже:
Примечание: например, Y91F указывает обратную мутацию от Y до F в положении 91 согласно естественной нумерации. «Привитый» указывает на то, что CDR мышиного антитела имплантируется на последовательностях FR человеческой зародышевой линии.
Новые гуманизированные антитела могут быть получены разными комбинациями мутаций тяжелой цепи и легкой цепи, показанных в Таблице 1.
В другом аспекте данного раскрытия предложено воплощение для конструирования гуманизированного клона следующим образом:
Сконструировали праймеры, и фрагменты гена VH/VK каждого гуманизированного антитела конструировали посредством ПЦР, и затем вставляли в экспрессионный вектор рНг (имеющий сигнальный пептид и фрагмент гена константной области (CH1-Fc/CL)) для осуществления гомологичной рекомбинации для того, чтобы сконструировать экспрессионный вектор для полноразмерного антитела VH-CH1-Fc-pHr/VK-CL-pHr.
1. Конструирование праймеров:
Доступную онлайн программу DNAWorks (v3.2.2) (http://helixweb.nih.gov/dnaworks/) использовали для конструирования многочисленных праймеров для синтеза фрагментов генов, содержащих VH/VK, требующихся для рекомбинации: 5'-сигнальный пептид из 30 п.н. плюс VH/VK плюс 30 п. н. CH1/CL-3'.
2. Сплайсинг фрагментов:
Согласно руководствам для ДНК-полимеразы Primer STAR GXL от TaKaRa с использованием праймеров, сконструированных выше, посредством двухэтапной ПЦР(полимеразная цепная реакция)-амплификации получали фрагменты генов, содержащих VH/VK, требующиеся для рекомбинации.
3. Конструирование и ферментативное расщепление экспрессионного вектора pHr (имеющего сигнальный пептид и фрагмет гена константной области (CH1-FC/CL)):
Экспрессионный вектор pHr (имеющий сигнальный пептид и фрагмет гена константной области (CH1-FC/CL)) разрабатывали и конструировали посредством применения некоторой специальной рестрикционной эндонуклеазы, такой как BsmBl, которая распознает различимый элемент между последовательностью и рестрикционным сайтом. Данный вектор расщепляли с использованием BsmBI, и затем расщепленные фрагменты экстрагировали с использованием геля и хранили для применения.
4. Рекомбинантная конструкция экспрессионного вектора VH-CH1-Fc-pHr/VK-CL-pHr
Фрагменты генов, содержащие VH/VK, требующиеся для рекомбинации, и экспрессионный вектор pHr (имеющий сигнальный пептид и фрагмет гена константной области (CH1-FC/CL)), который был расщеплен BsmBl, добавляли в компетентные клетки DH5H в соотношении 3:1, инкубировали при 0°С на льду в течение 30 мин, подвергали воздействию теплового шока при 42°С в течение 90 с, добавляли 5 объемов среды LB, затем инкубировали при 37°С в течение 45 минут, затем высаживали на чашку LB-Amp, культивировали при 37°С в течение ночи. Одиночный клон отбирали для секвенирования, и получали интересующий клон.
5. Плазмиду конструировали согласно конструкции в настоящем примере, затем экспрессировался очищенный белок, и аффинность полученного белка измеряли посредством выявления, описанного в примере SPR.
6. Наконец, аффинность гуманизированного(ных) мутанта(тов) с обратной мутацией или гибридомных антител в отношении человеческого PD-L1-his измеряли посредством BIACORE, причем гуманизированные сайты с обратной мутацией и комбинации последовательностей, полученные от скрининга, являются следующими:
Вариабельная область тяжелой цепи антитела против PD-L1:
1
2
где HCDR2 является такой, как показано в RIGPNSGFTSYNEKFKN SEQ ID NO: 10, т.е., X в SEQ ID NO: 7 представляет собой G, и Х в SEQ ID NO: 7 представляет собой F;
Вариабельная область легкой цепи антитела против PD-L1:
SEQ ID NO: 11;
ПРИМЕЧАНИЕ: порядок представляет собой FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, часть, приведенная курсивом, представляет последовательность FR, и подчеркнутая часть представляет последовательность CDR (аминокислотные остатки CDR определяются и обозначаются на основе критериев нумерации Kabat).
В другом аспекте настоящего раскрытия предложено воплощение для конструирования и экспрессии человеческого антитела типа lgG4 против PD-L1, и дополнительно предложено антитело против PD-L1, используемое для конструирования слитого белка. Антитело против PD-L1 также может использоваться в качестве контрольной молекулы в Примерах анализа по настоящему раскрытию.
Поскольку PD-L1 также экспрессируется в активированных Т-клетках, следовательно, применение константных областей lgG1 дикого типа может вызывать Fc-опосредованные эффекты (такие как ADCC и CDC), что могло бы приводить к уменьшению уровня активированных Т-клеток. В настоящем раскрытии выбран мутировавший lgG4 для получения антител без ADCC и CDC. Клон, полученный посредством созревания аффинности, превращали до типа lgG4, и центральная шарнирная область lgG4 содержит мутацию S228P (соответствующую положению 227 в природной последовательности SEQ ID NO: 12). Дополнительно вводили мутацию F234A (соответствующую положению 233 в природной последовательности SEQ ID NO: 12) и L235A (соответствующую положению 234 в природной последовательности SEQ ID NO: 12) (mAb 4:3, 310-318; май/июнь 2012). В то же самое время, для того чтобы избежать разрыва, происходящего на С-конце тяжелой цепи антитела при введении линкерного пептида (который используется для связывания внеклеточного домена TGF-βRII), K в конечном положении тяжелой цепи антитела против PD-L1 дополнительно мутировали до А (соответствующего последнему положению в природной последовательности SEQ ID NO: 12) таким образом, чтобы увеличить стабильность слитого белка. Последовательность антитела против PD-L1 по настоящему раскрытию, используемая для конструирования слитого белка, является следующей:
тяжелая цепь антитела против PD-L1: lgG4 (АА) (S228P)
ПРИМЕЧАНИЕ: подчеркнутая часть представляет собой последовательность вариабельной области тяжелой цепи, и неподчеркнутая часть представляет собой последовательность константной области тяжелой цепи (часть, приведенная курсивом, представляет собой сайт мутации);
Легкая цепь антитела против PD-L1:
SEQ ID NO: 13;
ПРИМЕЧАНИЕ: подчеркнутая часть представляет собой последовательность вариабельной области легкой цепи, а неподчеркнутая часть представляет собой последовательность константной области легкой цепи.
В том виде, в котором он используется в настоящем раскрытии, слитый белок, описанный в настоящем раскрытии, представляет собой белковый продукт, полученный соэкспрессией двух генов посредством методики генной инженерии. Способы получения и очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны в данной области и могут быть найдены (например, в Antibodies, А Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, главы 5-8 и 15). Например, мыши могут быть иммунизированы человеческим PD-L1 или его фрагментами, и образующиеся антитела могут быть ренатурированы, очищены и секвенированы на аминокислотные последовательности посредством применения традиционных способов, хорошо известных в данной области. Антигенсвязывающие фрагменты также могут быть получены традиционными способами. Антитело или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему раскрытию сконструированы для пересадки CDR, полученных из антитела, не являющегося человеческим, в один или более чем один человеческий FR. Посредством выравнивания относительно базы данных IMGT зародышевой линии вариабельной области человеческого антитела с использованием программы МОЕ последовательности зародышевой линии человеческого каркаса могут быть получены на веб-сайте ImMunoGeneTics (IMGT) http://imgt.cines.fr или из The Immunoglobulin Facts Book, 2001, ISBN 012441351.
Сконструированные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему раскрытию могут быть получены и очищены с использованием известных способов. Например, последовательности кДНК, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь, могут быть клонированы и сконструированы в экспрессионном векторе GS. Сконструированный экспрессионный вектор иммуноглобулина может быть затем стабильно трансфицирован в клетки СНО. В качестве более рекомендуемого способа, известного в данной области, экспрессионная система млекопитающего будет приводить к гликозилированию антитела, типично на высококонсервативных N-концевых сайтах в области Fc. Могут быть получены стабильные клоны посредством экспрессии антитела, специфично связывающегося с человеческим PD-L1. Позитивные клоны могут быть размножены в бессывороточной культуральной среде для продукции антител в биореакторах. Культуральная среда, в которую было секретировано антитело, может быть очищена традиционными методиками. Например, данная среда может быть загружена на колонку сефарозы FF с белком А или G, которая была уравновешена совместимым буфером. Данная колонка промывается для удаления неспецифичных связывающих компонентов. Связанное антитело элюируется посредством градиента рН, фракции антитела выявляются SDS-PAGE и затем отбираются. Данное антитело может быть отфильтровано и сконцентрировано с использованием традиционных методик. Растворимый агрегат и мультимеры могут быть эффективно удалены обычными методиками, включающими гель-фильтрацию или ионообменную хроматографию. Продукт может быть немедленно заморожен, например, при -70°, или может быть лиофилизирован.
«Иммуномодулирующая молекула» по настоящему раскрытию может использоваться для ослабления иммунотолерантности раковых клеток. В настоящем раскрытии используется усеченная форма внеклеточного домена TGF-βRII в качестве иммуномодулирующей молекулы в слитом белке. «Рецептор II TGF-β (TGF-βRII)» связывается с лигандами TGF-β1 и TGF-β3 с высокой аффинностью. Комплекс TGF-βRII/TGF-β рекрутирует TGF-βRI с образованием комплекса трансдукции сигнала (Won et al, Cancer Res. 1999; 59: 1273-7). Внеклеточный домен TGF-βRII представляет собой пептид из 136 аминокислотных остатков из внеклеточного N-конца TGF-βRII, типичный пример которого показан в SEQ ID NO: 14. Другие варианты из примерно 136 аминокислот в длину и происходящие из внеклеточного домена человеческого TGF-βRII, которые способы к связыванию с TGF-β1 и TGF-рЗ, также принадлежат к внеклеточному домену TGF-βRII по данному раскрытию. В настоящем раскрытии обнаружили, что структура и функция формы с последовательным усечением на N-конце внеклеточного домена TGF-βRII является более стабильной, чем структура неусеченной молекулы. Слитый белок, содержащий неусеченную на N-конце форму внеклеточного домена TGF-βRII (полипептид, показанный как ак (аминокислоты) 1-136 SEQ ID NO: 14), является чувствительным к разрушению. В частности, внеклеточный домен TGF-βRII, который усекается меньше, чем на 26 последовательных аминокислот с N-конца, является более стабильным; предпочтительно внеклеточный домен TGF-βRII, который усекается на 14-26 и, более предпочтительно, усекается на 14-21 последовательную аминокислоту с N-конца, имеет более высокий уровень экспрессии; и, наиболее предпочтительно, усеченный на 19 или 21 последовательную аминокислоту.
4
x
«Слитый белок рецептора TGF-β» представляет собой слитый белок, содержащий рецептор TGF-β. В некоторых воплощениях слитый белок рецептора TGF-β по настоящему раскрытию представляет собой слитый белок рецептора TGF-β, описанный в международной патентной заявке PCT/CN 2018/086451 (WO 2018205985 А1). Полное содержание WO 2018205985 А1 целиком включается в настоящее раскрытие. В некоторых воплощениях слитый белок рецептора TGF-β представляет собой слитый белок антитела против PD-L1/внеклеточного домена TGF-βRII (PD-LI/ловушка TGF-β) с внеклеточным доменом TGF-βRII, служащим в качестве иммуномодулирующей части молекулы данного слитого белка, антитело против PD-L1 служит в качестве нацеливающей части данного слитого белка, внеклеточный домен TGF-βRII (например, показанный как SEQ ID NO: 14, 15, 16 или 17) соединяется с С-концом (также известным как карбоксильный конец) тяжелой цепи антитела против PD-L1 посредством линкерной последовательности (например, (GS)G, х равен 3-6) с образованием слитой последовательности, и данная слитая последовательность соединяется с легкой цепью антитела против PD-L1 через межцепочечную(ные) дисульфидную(ные) связь(зи), наконец, с образованием слитого белка PD-LI/ловушка TGF-β, данная структура показана на Фиг. 1. В некоторых воплощениях слитый белок рецептора TGF-β представляет собой слитый белок, описанный в Таблице 2 Примера 1 данного раскрытия.
4
x
4
3
4
4
4
5
4
6
Термин «линкер» или «линкерная последовательность» относится к соединительной пептидной последовательности, используемой для соединения доменов белка, обычно с определенной степенью гибкости, и применение линкеров не будет приводить к потере исходной функции домена белка. В некоторых воплощениях настоящего раскрытия линкерная последовательность представляет собой (GS)G, где х равен 3-6, например, данная линкерная последовательность представляет собой полипепид, такой как: (GS)G, (GS)G, (GS)G или (GS)G.
Термин «консервативная модификация» или «консервативная замена или замещение» относится к заменам аминокислот в белке другими аминокислотами, имеющими аналогичные характеристики (например, заряд, размер боковой цепи, гидрофобность/гидрофильность, конформация и жесткость остова и т.д.), таким образом, что данные изменения часто могут быть сделаны без изменения биологической активности белка. Специалистам в данной области известно, что, в общем, одиночная аминокислотная замена в несущественной области полипептида существенно не изменяет биологическую активность (см., например, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p 224 (4th edition)). Кроме того, замены структурно или функционально аналогичных аминокислот с меньшей вероятностью нарушат биологическую активность.
Термин «возможный» или «возможно» означает, что событие или ситуация, которая следует, может, но не обязательно случится, и данное описание включает случаи, в которых событие или обстоятельство действительно случается или не случается. Например, «возможно содержащий 1-3 вариабельные области тяжелой цепи» означает, что может присутствовать, но не обязательно присутствует вариабельная область тяжелой цепи антитела.
Термины «введение», «осуществление введения» и «обработка» в том виде, в котором они применяются к животному, человеку, экспериментальному субъекту, клетке, ткани, органу или биологической жидкости, относятся к контакту экзогенного фармацевтического, терапевтического, диагностического средства или композиции с животным, человеком, субъектом, клеткой, тканью, органом или биологической жидкостью. Термины «введение», «осуществление введения» и «обработка» могут относиться, например, к терапевтическим, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским и экспериментальным способам. Обработка клетки охватывает приведение в контакт реактива с клеткой, а также приведение в контакт реактива с жидкостью, где жидкость находится в контакте с клеткой. Термины «введение», «осуществление введения» и «обработка» также означают обработки in vitro и ex vivo, например, клетки посредством реактива, диагностического средства, связывающей композиции или другой клетки. Термины «введение» или «обработка» в том виде, в котором они применяются по отношению к человеческому, ветеринарному или исследовательскому субъекту, относятся к терапевтическому лечению, профилактическим или предупредительным мерам, к исследовательским и диагностическим применениям.
«Лечить» означает вводить терапевтическое средство, такое как композиция по настоящему раскрытию, внутренне или внешне субъекту, имеющему один или более чем один симптом заболевания, для которого данное средство имеет известную терапевтическую активность. Типично данное средство вводится в эффективном количестве для облегчения одного или более чем одного симптома заболевания у субъекта или популяции, подлежащей лечению, для индукции регрессии или предупреждения прогрессирования такого(ких) симптома(мов) в клинически измеримой степени. Количество терапевтического средства, которое является эффективным для облегчения любого конкретного симптома заболевания (также именуемое «терапевтически эффективное количество»), может варьировать согласно таким факторам, как состояние заболевания, возраст и масса субъекта, и способность данного средства вызывать желательный ответ у субъекта. Облегчается ли симптом заболевания можно оценивать любым клиническим измерением, обычно используемым лечащими врачами или другими сотрудниками системы здравоохранения для оценки тяжести или состояния прогрессирования симптома. Хотя одно воплощение настоящего раскрытия (например, способ лечения или изделие) и может не быть эффективным в облегчении целевого(вых) симптома(мов) заболевания у каждого субъекта, оно должно облегчать целевой(вые) симптом(мы) заболевания у статистически значимого числа субъектов при определении любым статистическим критерием, известным в данной области, таким как t-критерий Стьюдента, критерий хи-квадрат, U-критерий согласно Манну и Уитни, критерий Крускала-Уоллиса (Н-критерий), критерий Джонкхиера-Терпстра и критерий Уилкоксона.
«Эффективное количество» охватывает достаточное количество для облегчения или предупреждения симптома или признака медицинского состояния. Эффективное количество также означает достаточное количество для обеспечения или облегчения постановки диагноза. Эффективное количество для конкретного субъекта или ветеринарного субъекта может варьировать, в зависимости от таких факторов, как состояние, которое лечат, общее состояние здоровья субъекта, путь и дозировка введения и тяжесть побочных эффектов. Эффективное количество может представлять собой максимальную дозировку или протокол дозирования, в котором избегаются значительные побочные эффекты или токсические эффекты.
«Значение Tm» относится к температуре, при которой происходит тепловая денатурация белка, то есть, к температуре, при которой половина белка является развернутой. В данное время нарушается пространственная структура белка. Следовательно, чем выше значение Tm, тем выше тепловая стабильность данного белка.
Термин «замена» относится к замене системы растворителя, который растворяет белок антитела. Например, система растворителей с высоким содержанием соли или гипертоническая, содержащая белок антитела, заменяется с использованием физической операции относительно буферной системы для получения стабильного препарата, таким образом, что белок антитела может присутствовать в стабильном препарате. Данная физическая операция включает ультрафильтрацию, диализ или восстановление после центрифугирования, но не ограничивается ими.
Подробное описание изобретения
Ниже настоящее изобретение дополнительно описывается со ссылкой на примеры, примеры анализа или примеры получения. Однако данные примеры, примеры анализа или примеры получения служат лишь цели иллюстрации, объем настоящего раскрытия не ограничивается ими.
В примерах, примерах анализа или примерах получения по настоящему раскрытию, где конкретные условия не описываются, они обычно проводятся при традиционных условиях или при условиях, предложенных изготовителями вещества или продукта. Когда источник реактивов конкретно не указан, данные реактивы представляют собой традиционные реактивы, имеющиеся в продаже.
Примеры
Пример 1: клонирование и экспрессия слитого белка PD-L1/ловушка TGF-β
Внеклеточный домен TGF-βRII (полноразмерная или усеченная форма SEQ ID NO: 14) использовали в качестве части иммуномодулирующей молекулы в слитом белке, а антитело против PD-L1 использовали в качестве нацеливающей части слитого белка с образованием слитого белка антитело против PD-L1/внеклеточный домен TGF-βRII (PD-L1/ловушка TGF-β).
Неожиданно обнаружили, что усеченная форма внеклеточного домена TGF-βRII является относительно стабильной, особенно более стабильной после усечения на меньше, чем 26 аминокислот от ее N-конца, предпочтительно более высокий уровень экспрессии и более стабильную структуру получают после усечения на 14-26 аминокислот, более предпочтительно, усекая на 14-21 последовательную аминокислоту от N-конца, и более предпочтительно усекая на 14, 19 или 21 последовательную аминокислоту от N-конца.
Последовательности неограничивающих примеров внеклеточного домена TGF-βRII и его усеченной формы в настоящем раскрытии являются следующими:
Последовательность внеклеточного домена TGF-βRII: ECD (1-136)
SEQ ID NO: 14;
Последовательность внеклеточного домена TGF-βRII с усечением или делецией 19 аминокислот на N-конце: ECD (20-136)
SEQ ID NO: 15;
Последовательность внеклеточного домена TGF-βRII с усечением или делецией 21 аминокислоты на N-конце: ECD (22-136)
SEQ ID NO: 16;
Последовательность внеклеточного домена TGF-βRII с усечением или делецией 14 аминокислот на N-конце: ECD (15-136)
SEQ ID NO: 17.
4
x
В качестве примера, аминокислоту С-конца тяжелой цепи антитела против PD-L1 по настоящему раскрытию (антитело против PD-L1, в котором тяжелая цепь показана как SEQ ID NO: 12, и легкая цепь показана как SEQ ID NO: 13) лигировали с внеклеточным доменом TGF-βRII с варьирующей длиной линкера (GS)G (х равен 3-6) посредством методики гомологичной рекомбинации и с удобством экспрессировали в экспрессионной системе 293, наряду с легкой цепью антитела против PD-L1, и полученные слитые белки показаны в Таблице 2.
Примечание: Ab представляет антитело против PD-L1 по настоящему раскрытию (тяжелая цепь показана как SEQ ID NO: 12, и легкая цепь показана как SEQ ID NO: 13); ECD (n-136) в описании последовательности представляет собой полноразмерную или усеченную форму внеклеточного домена TGF-βRII; n представляет исходное число аминокислот после усечения внеклеточного домена TGF-βRII. Структура слитого белка по настоящему раскрытию показана на Фиг. 1; N19A указывает, что аминокислота в положении 19 полноразмерного внеклеточного домена TGF-βRII (SEQ ID NO: 14) мутирует от N до А.
4
x
Нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело против PD-L1, нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен TGF-βRII, и нуклеотидную последовательность линкерного фрагмента белка ((GS)G) получали традиционной в данной области методикой. С-конец нуклеотида антитела против PD-L1 лигировали через линкерный белок с N-концом нуклеотида внеклеточного домена TGF-βRII разной длины посредством методики гомологичной рекомбинации и затем клонировали в вектор Phr-Bsmbl. Рекомбинантный PD-L1/ловушка TGF-β экспрессировали в клетках 293 и очищали, как описано в Примере 2. Очищенный белок можно использовать в экспериментах следующих примеров.
Пример 2: очистка слитого белка PD-L1/ловушка TGF-β
2
4
2
4
Среду культуры клеток центрифугировали при высокой скорости, супернатант отбирали, и первую стадию очистки проводили посредством аффинной хроматографии. Хроматографической средой является белок А или производный наполнитель, который взаимодействует с Fc, такой как Mabselect от GE. Уравновешивающим буфером был 1×PBS (137 ммоль/л NaCl, 2,7 ммоль/л KCl, 10 ммоль/л NaHPO, 2 ммоль/л KHPO, рН 7,4). После уравновешивания 5× объемами колонки клеточный супернатант загружали для связывания, и скорость тока контролировали таким образом, что давали образцу оставаться в колонке в течение 1 мин или больше. После загрузки образца колонку помывали 1×PBS (рН 7,4), пока поглощение в УФ (ультрафиолетовая область) А280 (при 280 нм) не снижалось до исходного уровня. Затем колонку промывали 0,1 М глициновым (рН 3,0) элюционным буфером, элюированный пик отбирали согласно пику поглощения в УФ А280, и отобранный элюированный образец нейтрализовали 1 М Tris (рН 8,5).
Нейтрализованный элюированный образец концентрировали посредством ультрафильтрации и затем подвергали гель-фильтрации, буфер представлял собой 1×PBS, и колонка представляла собой XK26/60 Superdex 200 (GE). Скорость тока контролировали на уровне 4 мл/мин, объем загрузки был меньше, чем 5 мл, и целевой пик белка объединяли согласно поглощению в УФ А280. Чистота отобранного белка составяла больше, чем 95% при идентификации посредством ГФ-ВЭЖХ, и ее подтверждали ЖХ-МС. Подтвержденный образец аликвотировали для применения. Получали PD-L1/ловушка TGF-β.
Пример анализа (биологическая оценка in vivo, in vitro)
Пример анализа 1: выявление ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) связывания PD-L1/ловушка TGF-β cTGF-β1 in vitro
Процесс выявления описывается следующим образом:
a. 96-луночные планшеты покрывали 100 мкл/лунку человеческого TGF-β1 (8915LC, CST) в концентрации 1 мкг/мл при 4°С в течение ночи.
b. Промывка 3 раза 250 мкл 1×PBST, 250 мкл 5% молока в PBS добавляли для блокирования при 37°С в течение 2 часов.
c. Промывка 3 раза 250 мкл 1×PBST, добавляли градиентные разведения PD-L1/ловушка TGF-β, и ловушку TGF-β использовали в качестве позитивного контроля, и инкубировали в течение 1 часа при 37°С.
d. Промывка 3 раза 250 мкл 1×PBST.
e. 100 мкл антитела против человеческого Fc, конъюгированного с HRP (пероксидаза хрена) (1:4000) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 40 минут при 37°С.
2
4
f. 100 мкл ТМВ (тетраметилбензидин) добавляли в каждую лунку, инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, и реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1 М HSO.
g. Поглощение при 450 нм измеряли на микропланшет-ридере, и данные анализировали посредством Graphpad Prism 5.
Результаты связывания слитых белков с человеческим TGF-β1 in vitro показаны на Фиг. 2 и 3. ELISA показала, что слитый белок 1 в Таблице 2 не сохранял активность связывания с человеческим TGF-β1. Анализ масс-спектрометрией показал, что слитый белок 1 (т.е. неусеченная форма внеклеточного домена TGF-βRII (1-136)) не был стабильным, и он легко разрушался в тяжелой цепи TGF-βRII, и позитивный контроль имел тот же самый дефект. Слитые белки, содержащие усеченную на N-конце форму внеклеточного домена TGF-βRII, такие как слитые белки 7, 9, 10, 12-15, специфично связываются с человеческим TGF-β1.
Опытный пример 2: ELISA выявления связывания PD-LI/ловушка TGF-β с PD-L1 in vitro
Антиген, используемый для выявления: PD-L1-His
SEQ ID NO: 18.
Способ выявления описывается следующим образом:
a. 96-луночные планшеты покрывали 100 мкл/лунку человеческого PD-L1-His (SEQ ID NO: 18) в концентрации 5 мкг/мл при 4°С в течение ночи.
b. Промывка 3 раза 250 мкл 1×PBST, 250 мкл 5% молока в PBS добавляли для блокирования при 37°С в течение 2 часов.
c. Промывка 3 раза 250 мкл 1×PBST, добавляли градиентные разведения PD-LI/ловушка TGF-β, и антитело против PD-L1 в качестве позитивного контроля, и инкубировали в течение 1 часа при 37°С.
d. Промывка 3 раза 250 мкл 1×PBST.
e. 100 мкл антитела против человеческого Fc, конъюгированного с HRP (1:4000) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 40 минут при 37°С.
2
4
f. 100 мкл ТМВ добавляли в каждую лунку, инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, и реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1 М HSO.
д. Поглощение при 450 нм измеряли на микропланшет-ридере, и данные анализировали посредством Graphpad Prism 5.
Результаты связывания слитых белков по настоящему раскрытию с человеческим PD-L1 in vitro показаны на Фиг. 4. ELISA показал, что все слитые белки сохраняли активность связывания с человеческим PD-L1.
Пример анализа 3: блокирование выявления пути PD-1/PD-L1 in vitro
1. Цель анализа:
Для того чтобы исследовать блокирующий эффект PD-LI/ловушка TGF-β на путь сигнализации PD-1/PD-L1 осуществляли эксперимент по блокированию антитела на основе клеток на клетках, несущих молекулы рецептора человеческого PD-1 и PD-L1, которые были сконструированы Promaga соответственно.
2. Опытные образцы
1) Антитело против PD-L1 с тяжелой цепью, показанной какЭЕО. ID NO: 12, и легкой цепью, показанной какЭЕО ID NO: 13;
2) Контроль 1 (20T-Fc): ECD(20-136)-Fc, слитый белок, содержащий учеченный фрагмент внеклеточного домена TGF-βRII - ECD (20-136) и Fc, и данная последовательность является следующей:
3) Контроль 2 (22T-Fc): ECD(22-136)-Fc - слитый белок усеченного фрагмента внеклеточного домена TGF-βRII - ECD (22-136) и Fc, и данная последовательность является следующей:
4) Слитый белок рецептора TGF-β, полученный в Примере 1 настоящего раскрытия: слитый белок 9, слитый белок 15:
4
4
В слитом белке 9 последовательность слитого пептида - тяжелая цепь антитела против PD-L1-(GS)G-ECD TGF-β R11 (20-136) является следующей:
ПРИМЕЧАНИЕ: обычный шрифт представляет собой последовательность тяжелой цепи антитела против PD-L1, курсив представляет собой линкерную последовательность, и подчеркивание представляет собой последовательность усеченного фрагмента ECD (20-136) внеклеточной области TGF-βRII.
Последовательность легкой цепи антитела против PD-L1 в слитом белке 9 является следующей:
SEQ ID NO: 13;
4
5
Последовательность слитого пептида тяжелая цепь антитела против PD-L1-(GS)G-ECD TGF-β R11 (22-136) в слитом белке 15 является следующей:
ПРИМЕЧАНИЕ: обычный шрифт представляет собой последовательность тяжелой цепи антитела против PD-L1, курсив представляет собой линкерную последовательность, и подчеркивание представляет собой последовательность усеченного фрагмента ECD (22-136) внеклеточной области TGF-βRII.
Последовательность легкой цепи антитела против PD-L1 в слитом белке 15 является следующей:
5) человеческий IgG: пустой контроль, человеческий иммуноглобулин, полученный из смешанной нормальной человеческой сыворотки посредством очистки с использованием традиционного способа аффинной хроматографии, как, например, на белке А;
6) Позитивный контроль (FP17022): слитый белок антитело 2 против PD-И/внеклеточный домен TGF-βRII;
Аминокислотная последовательность легкой цепи антитела 2 против PD-L1 в слитом белке FP17022:
SEQ ID NO:21;
Аминокислотная последовательность слитого пептида - тяжелая цепь антитела 2 против PD-L1/внеклеточный домен TGF-βRII (1-136) в слитом белке FP17022:
3. Способ анализа
5
6
2
2
Клетки CHO/PD-L1 (CS187108, Promega) расщепляли и ресуспендировали в полной среде на основе питательной среды F-12 (Ham). Плотность клеток доводили до 4×10/мл с использованием полной среды согласно результатам подсчета клеток. Клеточную суспензию переносили в загрузочную емкость, добавляли в 96-луночный планшет в объеме 100 мкл/лунку с использованием многоканальной пипетки и инкубировали в инкубаторе при 37°С, 5% CO в течение 20-24 ч; клеточную суспензию Jurkat/PD-1 (CS187102, Promega) получали на следующие сутки, и клетки ресуспендировали согласно результатам подсчета клеток с использованием среды для анализа, и плотность клеток доводили до 1,25×10/мл; планшеты с культурой клеток, содержащие клетки CHO/PD-L1, вынимали из инкубатора, отбирали 95 мкл культурального раствора на лунку с использованием многоканальной пипетки, и добавляли градиентно разведенный слитый белок, антитело против PD-L1 и позитивный контроль (FP17022), соответственно, в объеме 40 мкл/лунку. Затем суспензию клеток Jurkat/PD-1 переносили в загрузочную емкость, добавляли на планшет для культуры клеток в объеме 40 мкл/лунку и инкубировали при 37°С, 5% CO в течение 5-6 ч. Во время инкубации с белком отбирали реактив Bio-Glo™, и давали ему охлаждаться до комнатной температуры. Вынимали планшеты для культуры клеток и помещали их при комнатной температуре на 5-10 мин. Затем добавляли в каждую лунку реактив Bio-Glo™, инкубировали в ламинаре в течение 5-10 мин, и считывали значение сигнала хемилюминисценции с использованием многофункционального микропланшет-ридера.
4. Результаты
Как показано на Фиг. 5, аналогично молекуле позитивного контроля, слитый белок 9 по настоящему раскрытию мог эффективно блокировать связывание клеток Jurkat, экспрессирующих PD-1, с клетками CHO/PD-L1, и имелся эффект концентрации лекарственного средства и дозозависимый эффект.Слитый белок 15 имеет такую же блокирующую способность, что и блокирующая способность слитого белка 9.
Пример анализа 4: выявление аффинности и кинетики связывания in vitro посредством Biacore
Аффинность опытной молекулы в отношении человеческого или мышиного TGF-β1 или человеческого белка PD-L1 определяли посредством Biacore Т200 (GE). Экспериментальная процедура описывается следующим образом:
Определенное количество PD-L1/ловушки TGF-β захватывали с использованием чипа с белком А, и затем создавали через поверхность чипа ток человеческого или мышиного TGF-β1 (8915LC, CST) или человеческого PD-L1 (Sino Biological). Сигнал реакции выявляли в реальном времени с использованием Biacore с получением кривых ассоциации и диссоциации. Данный биочип затем промывали и регенерировали глицином-соляной кислотой (рН 1,5, GE). Буферным раствором, используемым в данном эксперименте, был буфер HBS-EP (GE). Экспериментальные данные аппроксимировали к модели Лангмюра (1:1) с использованием программы BIAevaluation в версии 4.1 (GE), и получали значения аффинности, как показано в Таблице 3.
Активность связывания слитого белка показана в Таблице 3. Результаты показывают, что слитый белок 9 и слитый белок 15 по настоящему раскрытию имеют крайне высокую аффинность к человеческому, мышиному TGF-β1 и человеческому PD-L1.
Пример анализа 5: анализ ингибирования репортерного гена SMAD3
1. Цель анализа:
В данном эксперименте элемент связывания Smad3 (SBE) с репортерным геном люциферазы экспрессировали в клетках HepG2 для исследования ингибирующего эффекта PD-L1/ловушки TGF-β на активацию Smad3, индуцированную TGF-β1, и активность PD-L1/ловушки TGF-β in vitro оценивали согласно значению IC50 (полумаксимальная ингибирующая концентрация).
2. Образец для анализа: слитый белок 9, позитивный контроль (FP17022).
3. Способ анализа
2
2
2
Клетки HepG2 культивировали в полной среде MEM (GE, SH30243.01), содержащей 10% FBS (фетальная телячья сыворотка), и субкультивировали каждые 3 суток. На первые сутки эксперимента 25000 клеток на лунку инокулировали в 96-луночные планшеты (Corning, 3903) и культивировали при 37°С, 5% CO в течение 24 часов. На следующие сутки среду в планшетах для культуры клеток отбрасывали, и 100 нг плазмиды 3ТР-Lux трансфицировали на лунку. Данные клетки дополнительно культивировали при 37°С, 5% CO в течение 24 часов. За шесть часов до добавления образца для анализа полную среду в 96-луночном планшете отбрасывали, и добавляли в каждую лунку 80 мкл неполной среды (MEM плюс 0,5% FBS). Через 6 часов добавляли 10 мкл раствора человеческого TGF-β1 (R&D, 240-В-010), приготовленного в неполной среде (конечная концентрация 2 нг/мл), и 10 мкл раствора для анализа (конечная концентрация 500; 50; 5; 0,5; 0,05; 0,005; 0,0005 и 0 нМ), человеческий растворитель TGF-β1 использовали в качестве контроля, и клетки культивировали при 37°, 5% CO в течение еще 18 ч. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл приготовленного субстрата люциферазы системы анализа люциферазы ONE-Glo™ (Promega, Е6110) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте, и затем значение люминисцентного сигнала считывали с использованием микропланшет-ридера Victor 3 (Perkin Elmer). Значение IC50 образца для анализа получали посредством расчета с использованием программы анализа данных Graphpad Prism 5.0.
На Фиг. 6 показано, что слитый белок 9 дозозависимо ингибировал индуцированную TGF-β активность репортера pSMAD3 и имел сравнимые эффективность и IC50 (концентрация, требующаяся для ингибирования 50% максимальной активности) с эффективностью и IC50 позитивного контроля FP17022. Результаты анализа антитела против PD-L1 показали, что оно не имело ингибирующего эффекта (IC50 больше 500 нМ).
Пример анализа 6: выявление in vitro секреции IFNγ (интерферон-гамма) РВМС (одноядерные клетки периферической крови) из-за стимуляции туберкулином (ТВ)
1. Цель анализа
Для исследования активации Т-лимфоцитов посредством PD-L1/ловушки TGF-β человеческие одноядерные клетки периферической крови (РВМС) отбирали, очищали и стимулировали in vitro туберкулином (ТВ) в течение 5 суток для выявления уровня секреции цитокина IFNγ.
2. Образец для анализа
1) Человеческий IgG;
2) Антитело против PD-L1;
3) Слитый белок 9;
4) Контроль 1 (20T-Fc): ECD (20-136)-Fc;
5) Антитело против PD-L1 плюс контроль 1 (20T-Fc).
3. Способ анализа
7
6
2
2
20 мкл туберкулина добавляли в свежевыделенные и очищенные РВМС, 15 мл, примерно 3×10, и культивировали в инкубаторе в течение 5 суток при 37°С, 5% CO. В сутки 6 культивируемые клетки отбирали и центрифугировали, один раз промывали PBS и ресуспендировали в свежей среде с плотностью, доведенной до 1×10 клеток/мл, 90 мкл ресуспендированных клеток добавляли в 96-луночный планшет. В соответствующие лунки приведенного выше 96-луночного планшета для культуры клеток по отдельности добавляли 10 мкл/лунку разных концентраций антител, 10 мкл PBS добавляли в контрольную и пустую группу соответственно. Затем планшет для культуры клеток инкубировали в инкубаторе в течение 3 суток при 37°С, 5% CO. Планшет для культуры клеток вынимали, и супернатант отбирали из каждой лунки после центрифугирования (4000 об./мин, 10 мин). После 10-кратного разведения секрецию IFN-γ выявляли посредством ELISA (набор для выявления человеческого IFN-γ, NEOBIOSCIENCE, ЕНС 102д.96) согласно инструкциям к реактиву в отношении конкретных операций. Как показано в Таблице 4, все образцы слитого белка PD-LI/ловушка TGF-β могли усиливать секрецию цитокина IFN-γ посредством активированных Т-лимфоцитов, и имелся эффект дозы концентрации лекарственного средства.
4. Результат
Как показано на Фиг. 7 и в Таблице 4, слитый белок 9 мог дозозависимо усиливать секрецию активированным Т-лимфоцитом цитокина IFN-γ и имел более сильный активирующий эффект, чем эффект антитела против PD-L1 и 20T-FC.
Пример анализа 7: фармакокинетическая оценка
Трех крыс SD, самок приобретали в Jie Si Jie Laboratory Animal Co., Ltd. и содержали при цикле свет-темнота 12/12 часов (температура составляла 24 плюс/минус 3°С, относительная влажность составляла 50-60%), крысы имели свободный доступ к воде и питанию. В сутки эксперимента крысам SD инъецировали в хвостовую вену слитый белок в дозе 6 мг/кг и с инъекционным объемом 5 мл/кг.
Кровь отбирали в момент времени: 15 мин, 7 ч (в первые сутки), 24 ч (2-е сутки), 3-тьи сутки, 4-ые сутки, 6-ые сутки, 8-ые сутки, 10-ые сутки и 15-ые сутки после введения, 200 мкл крови (эквивалентно 100 мкл сыворотки) отбирали из фундальной вены (англ. fundus vein) крысы. Образец крови помещали при комнатной температуре на 30 мин для обеспечения агглютинации и затем центрифугировали при 10000 g в течение 10 минут при 4°С. Супернатант немедленно отбирали и хранили при -80°С. Концентрацию слитого белка в сыворотке измеряли посредством ELISA.
Способ измерения описывается следующим образом:
a. 96-луночные планшеты покрывали 100 мкл/лунку человеческого PD-L1-His в концентрации 2 мкг/мл в течение ночи при 4°С.
b. Промывка 4 раза 250 мкл 1×PBST, добавляли 250 мкл 5% молока в PBS для блокирования при 37°С в течение 3 часов.
c. Промывка 4 раза 250 мкл 1×PBST, добавляли градиентно разведенный образец сыворотки и инкубировали при 37°С в течение 1 часа со слитым белком 9, служащим в качестве позитивного контроля.
d. Промывка 5 раз 250 мкл 1×PBST.
e. Добавляли 100 мкл/лунку биотинилированного антитела против человеческого TGF-βRII (R&D) и инкубировали в течение 1 часа при 37°С.
f. Промывка 5 раз 250 мкл 1×PBST.
2
4
g. Добавляли 100 мкл/лунку ТМВ, инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, и останавливали реакцию добавлением 100 мкл 1 М HSO.
h. Измеряли поглощение при 450 нм на микропланшет-ридере, и данные анализировали Graphpad Prism 5.
Результаты PK анализа показали, что период полувыведения слитого белка 9 по настоящему раскрытию у крыс составлял 236 ч (9,8 суток), см. Таблицу 5.
Пример анализа 8: эффект PD-L1/ловушки TGF-β на мышиный подкожный ксенотрансплантат человеческого рака молочной железы MDA-MB-231
6
Мышиной линией, используемой в данном эксперименте, были самки мышей NOD/SCID (Cavens). Человеческие одноядерные клетки периферической крови, используемые в данном эксперименте, выделяли из свежеотобранной крови, и способ выделения является следующим: обработанную гепарином против свертывания венозную кровь смешивали с таким же объемом PBS, содержащего 2% FBS, и после смешивания 25 мл разведенной крови медленно добавляли в центрифужную пробирку, содержащую 15 мл раствора для отделения лимфоцитов, и центрифугировали при 1200 g в течение 10 минут при комнатной температуре. Лимфоцитарный слой отбирали пипеткой в другую центрифужную пробирку; клетки промывали PBS и центрифугировали при 300 g в течение 8 минут при комнатной температуре. После повторения один раз клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS, и данные клетки добавляли в 6-луночный планшет, предварительно покрытый антителом против CD3 (ОКТЗ, 40 нг/мл) количестве 2×10 клеток/лунку (2 мл) и затем помещали в инкубатор при 37°С на 4 суток. Образец для анализа:
1) Пустой контроль: PBS;
2) Слитый белок 9: 4,8 мг/кг;
3) Слитый белок 9: 24 мг/кг;
4) Антитело против PD-L1: 4 мг/кг;
5) Антитело против PD-L1: 20 мг/кг;
6) Антитело против PD-L1 4 мг/кг плюс контроль 1 (20T-Fc) 2,14 мг/кг;
7) Контроль 1 (20T-Fc) 2,14 мг/кг.
6
5
6
Клетки MDA-MB-231 ресуспендировали в бессывороточной среде RPMI-1640 и смешивали с равным объемом Matrigel, 100 мкл (2,3×10) подкожно инокулировали в правый бок мышей NOD/SCID. Через 11 суток исключали животных, имеющих опухоли избыточного или недостаточного размера, мышей рандомизировали в группы с 9 животными в каждой группе. 5×10 стимулированных РВМС (60 мкл) инъецировали в ткани опухоли, и остающиеся РВМС дополнительно культивировали без стимуляции. Через одну неделю 5×10 РВМС (100 мкл) внутрибрюшинно инъецировали мышам, имеющим опухоль, в качестве первого цикла инъекции. По всему экспериментальному периоду обеспечивали 2 с половиной цикла: всего 5 инъекций РВМС. В сутки первой внутриопухолевой инъекции осуществляли внутрибрюшинное введение, три раза в неделю, всего 14 введений. Схема введения была показана в Таблице 6. Объем опухоли и массу тела измеряли дважды в неделю. Экспериментальные результаты показаны в Таблице 7. В конце эксперимента мышей, имеющих опухоль, умерщвляли, и опухоль удаляли и взвешивали.
Результаты показаны на Фиг. 8, слитый белок 9 антитела (4,8 мг/кг, 24 мг/кг) может значительно ингибировать рост мышиного подкожного ксенотрансплантата человеческого рака молочной железы MDA-MB-231. Имелась дозозависимая связь между высокой и низкой дозами, и он превосходил контрольное лекарственное средство - антитело против PD-L1 (4 мг/кг, 20 мг/кг), контрольную молекулу TGF-βRII 20T-FC (2,14 мг/кг) и комбинированную группу (антитело против PD-L1 - 4 мг/кг плюс 20T-FC - 2,14 мг/кг) в эквивалентной молярной дозе соответственно. Каждая доза слитого белка 9 поддерживала желательный противоопухолевый эффект с 14-ых суток после введения; по сравнению с антителом против PD-L1 - 20 мг/кг слитый белок 9 в более высокой дозе имел очевидное преимущество (р меньше 0,05). На 25-е сутки после введения противоопухолевый эффект каждого антитела достигал оптимального уровня. Противоопухолевый показатель низкой и высокой дозы слитого белка 9 и антитела против PD-L1, и комбинированной группы составлял 37,24%, 52,38%, 30,24%, 28,01% и 31,38% соответственно. На 32-е сутки после введения противоопухолевый эффект слитого белка 9 был все еще очень значительным. %TGI группы с низкой и высокой дозой составлял 36,68% и 50,76%, соответственно, и объем опухоли был статистически отличным при сравнении  с контрольной группой (р меньше 0,05).
Пример анализа 9: физическая стабильность PD-LI/ловушки TGF-β
Данный пример анализа использовали для выявления стабильности слитого белка 9 и слитого белка 15.
Для выявления тепловой стабильности разных антител использовали ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия), и сравнивали стабильность в разных буферных системах. Буферные системы содержат такие вещества как 10 мМ ацетат/135 мМ NaCl (рН 5,5) и 10 мМ ацетат/9% трегалозу (рН 5,5).
2
Образец растворяли в соответствующих буферах, и контролировали концентрацию примерно 50 мг/мл. Выявление осуществляли посредством капиллярной ДСК MicroCal* VP (Malvern). Перед анализом каждый образец и пустой буфер дегазировали в течение 1-2 мин с использованием вакуумного дегазирующего прибора. В каждую лунку планшета добавляли 400 мкл образца или пустого буфера (загрузочное количество составляло 300 мкл). Наконец, в две пары луночных планшетов добавляли 14% Decon 90 и ddHO, соответственно, и они были готовы для промывки. Образец загружали на планшет, и затем данный планшет запечатывали пластиковым покрытием. Сканирование начиналось с температуры 25°С и завершалось при 100°С, и скорость сканирования составляет 60°С/ч. Результаты показаны в Таблице 8, указывая на то, что и слитый белок 9, и слитый белок 15 демонстрируют хорошую тепловую стабильность в данных двух системах анализах.
Периодическую стабильность при определенной концентрации исследовали отслеживанием чистоты посредством ГФ-ВЭЖХ, типичные условия, например, концентрация образца контролировалась на уровне примерно 50 мг/мл в 10 мМ ацетате/135 мМ NaCl (рН 5,5), и стабильность сравнивали при таких условиях как 5 циклов замораживания и оттаивания при -80°С относительно состояния после хранения при 40°С в течение одного месяца. Для выявления использовали колонку ВЭЖХ для белка Xbridge ВЕН SEC 200А (Waters). Результаты показаны в Таблице 9 следующим образом: данные два слитых белка демонстрировали хорошую стабильность.
Пример анализа 10: химическая стабильность слитого белка Дезамидирование представляет собой обычную химическую модификацию, которая будет влиять на стабильность антитела на поздней стадии, в частности, ее обычно выбирают для того, чтобы избегать или уменьшать высокодезамидированную модификацию некоторых аминокислот в областях CDR настолько, насколько это возможно посредством мутации. 1600 мкг антитела, подлежащего анализу, растворяли в 200 мкл 10 мМ ацетата/135 мМ NaCl (рН 5,5) и помещали в инкубатор при 40°С. Образцы отбирали в сутки 0, 14 и 28 для анализа ферментативного гидролиза. 100 мкг каждого образца, отобранного в разные моменты времени, растворяли в 100 мкл 0,2 М His-HCl, 8 М растворе гуанидин-HCl, рН 6,0; добавляли 3 мкл 0,1 г/мл DTT (дитиотрейтол), и затем образец инкубировали в водной бане при 50°С в течение 1 часа. Затем данный образец дважды подвергали ультрафильтрации с использованием 0,02 М His-HCl (рН 6,0) и расщепляли в течение ночи при 37°С в водной бане посредством добавления 3 мкл 0,25 мг/мл трипсина. Модификацию в виде дезамидирования проверяли с использованием ГХ-МС (газовая хроматография-масс-спектрометрия) Q-TOF (квадрупольная-времяпролетная) Agilent 6530, и результаты показаны в Таблице 10 ниже.
Примечание: N представляет собой выявляемый модифицированный аспарагин, и число представляет положение в легкой цепи или тяжелой цепи от N-конца. Процент содержания представляет собой отношение модификации в виде дезамидирования, выявленной ГХ-МС, к сигналу всех пептидов в данном сайте.
Результаты масс-спектрометрии показали, что два слитых белка не имеют явных сайтов с модификацией в виде дезамидирования, свидетельствуя о том, что данные слитые белки имеют хорошую химическую стабильность.
Пример получение
Типичные способы получения для фармацевтической композиции (препарата) слитого белка
Первая стадия: отбирали определенное количество маточного раствора очищенного слитого белка рецептора TGF-β, и осуществляли замену растворителя (предпочтительно посредством ультрафильтрации) с использованием буфера, не содержащего белок (такого как 10 мМ буфер лимонная кислота-цитрат натрия, рН 6,2), посредством пропускания через мембрану для ультрафильтрации для по меньшей мере 6-кратного объема, затем данный белок концентрировали до примерно 70 мг/мл. Добавляли определенный объем маточного раствора сахарозы и перемешивали с достижением конечной концентрации сахарозы 80 мг/мл. Добавляли определенный объем маточного раствора Tween-80 и перемешивали с достижением конечной концентрации Tween-80 0,4 мг/мл. Добавляли 10 мМ цитратный буфер, рН 6,2, для достижения точно определенного объема таким образом, чтобы получать концентрацию 50 мг/мл белка (другие препараты, подлежащие анализу, или стабильные препараты получали согласно аналогичным стадиям).
После фильтрования отбирали образцы данного продукта для анализа стерильности в связи с целью контроля среды. Маточный раствор пропускали через 0,22 мкм PVDF (поливинилиденфторид) фильтр, и фильтрат отбирали.
Вторая стадия: объем заполнения доводили до 6,3 мл, фильтат загружали в 6 мл флакон, который затем закрывали пробкой, и образцы отбирали в начале, в середине и в конце заполнения для того, чтобы выявлять различие в объеме заполнения с целью контроля среды.
Третья стадия: начинали работу укупоривателя, покрывали алюминиевыми колпачками.
Четвертая стадия: проводили визуальную проверку для подтверждения того, что продукт не имел недостатков, таких как неточная загрузка. Печатали этикетки и наносили на флаконы; печатали картонные упаковки, картонки складывали, загружали в них флаконы и метили.
Пример получения 1. Скрининг значения рН для буферной системы препарата слитого белка рецептора TGF-β
Препараты слитого белка рецептора TGF-β (слитый белок 9) получали с использованием следующих буферов с концентрацией белка 50 мг/мл:
1) 10 мМ гистидин-уксусная кислота, рН 5,0;
2) 10 мМ гистидин-уксусная кислота, рН 6,0;
3) 10 мМ гистидин-уксусная кислота, рН 6,5;
4) 10 мМ натрия дигидрофосфат-динатрия гидрофосфат, рН 7,0;
5) 10 мМ натрия дигидрофосфат-динатрия гидрофосфат, рН 7,5.
Каждый препарат фильтровали и добавляли в объеме 1,2 мл/флакон в 2 мл инъекционный флакон, сделанный из нейтрального борсиликатного стекла. Инъекционный флакон снабжали пробкой, колпачком и запечатывали. Образцы отбирали и подвергали экспериментам по воздействию высокой температуры 40°С и встряхивания. Экспериментальные результаты показаны в Таблице 11. Данные результаты показывают, что слитые белки рецептора TGF-β имеют лучшую стабильность при рН 6,0-6,5.
Пример получения 2. Скрининг буферной системы для препаратов слитого белка рецептора TGF-β
Препараты слитого белка рецептора TGF-β (слитый белок 9) получали с использованием следующих буферов с концентрацией белка 50 мг/мл:
1) 10 мМ янтарная кислота-сукцинат натрия, рН 6,0;
2) 10 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, рН 6,0;
3) 10 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, рН 6,5;
4) 10 мМ натрия дигидрофосфат-динатрия гидрофосфат, рН 6,5;
5) 10 мМ гистидин-гидрохлорид, рН 6,5.
Каждый препарат фильтровали и добавляли в объеме 1,2 мл/флакон в 2 мл инъекционный флакон из нейтрального борсиликатного стекла. Инъекционный флакон снабжали пробкой, покрывали колпачком и запечатывали. Образцы отбирали для эксперимента по встряхиванию (при 25°С, 300 об./мин). Экспериментальные результаты показаны в Таблице 12. Данные результаты показывают, что в группе натрия дигидрофосфата-динатрия гидрофосфата на 6-е сутки при встряхивании наблюдалось большое количество маленьких частиц, и агрегаты достигали 1,8% при выявлении посредством ГФ. Однако лишь крошечные частицы время от времени наблюдались в других группах. Можно видеть, что стабильность слитого белка рецептора TGF-β в буферных системах на основе лимонной кислоты, гистидина и сукцината лучше, чем стабильность в фосфатных буферных системах.
Пример получения 3. Дополнительный скрининг буферной системы для препарата слитого белка рецептора TGF-β
Буфер с рН 6,2, содержащий 10 мМ гистидин-гидрохлорид или 10 мМ лимонную кислоту-цитрат натрия, использовали для получения препарата, содержащего 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80, слитый белок рецептора TGF-β (слитый белок 9) в концентрации 50 мг/мл.
Каждый препарат фильтровали и добавляли в объеме 1,2 мл/флакон в 2 мл инъекционный флакон, сделанный из нейтрального борсиликатного стекла. Инъекционный флакон снабжали пробкой, покрывали колпачком и запечатывали. Образцы хранили при 25°С для анализа стабильности в течение 6 месяцев с выявлением ГФ или CE-SDS (капиллярный электрофорез с додецилсульфатом натрия) в невосстанавливающих условиях.
Экспериментальные результаты показаны в Таблице 13. Данные результаты демонстрируют, что система лимонная кислота-цитрат натрия лучше, чем система гистидин-гидрохлорид (агрегат Мб ГФ: 1,8% относительно 2,2%; СЕ-SDS в невосстанавливающих условиях: 94,5% относительно 92,2%); таким образом, система лимонной кислоты может быть выбрана в качестве буферной системы для слитого белка рецептора TGF-β.
Пример получения 4. Скрининг стабилизаторов для препаратов слитого белка рецептора TGF-β
Препараты слитого белка рецептора TGF-β (слитый белок 9) получали с использованием следующих буферов или разных сахаридов с концентрацией белка 50 мг/мл:
1) 10 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, 80 мг/мл сахарозы, рН 6,2;
2) 10 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, 80 мг/мл а,а-трегалозы дигидрата, рН 6,2.
Каждый препарат фильтровали и добавляли в объеме 1,2 мл/флакон в 2 мл инъекционный флакон, сделанный из нейтрального борсиликатного стекла. Инъекционный флакон снабжали пробкой, покрывали колпачком и запечатывали. Образцы отбирали для экспериментов по долговременному хранению при комнатной температуре 25°С и низкой температуре 2-8°С.
Экспериментальные результаты показаны в Таблице 14. Данные результаты показывают, что сахароза и трегалоза имеют аналогичные эффекты на стабильность слитого белка рецептора TGF-β (слитый белок 9). В качестве стабилизатора слитого белка рецептора TGF-β (слитый белок 9) выбирали сахарозу. При концентрации сахарозы 80 мг/мл осмотическое давление составляет примерно 300 мосм/кг, что близко к изотоничности, следовательно, концентрация сахарозы может составлять 80 мг/мл.
Пример получения 5. Скрининг поверхностно-активных веществ для препаратов слитого белка рецептора TGF-β
Препараты слитого белка рецептора TGF-β (слитый белок 9) получали с использованием следующих буферов и разных типов поверхностно-активных веществ при разных концентрациях с концентрацией белка 50 мг/мл.
1) 10 мМ гистидин-гидрохлорид, 0,1 мг/мл полисорбата 20, рН 6,2;
2) 10 мМ гистидин-гидрохлорид, 0,2 мг/мл полисорбата 20, рН 6,2;
3) 10 мМ гистидин-гидрохлорид, 0,4 мг/мл полисорбата 20, рН 6,2;
4) 10 мМ гистидин-гидрохлорид, 0,6 мг/мл полисорбата 20, рН 6,2;
5) 10 мМ гистидин-гидрохлорид, 0,8 мг/мл полисорбата 20, рН 6,2;
6) 10 мМ гистидин-гидрохлорид, 0,1 мг/мл полисорбата 80, рН 6,2;
7) 10 мМ гистидин-гидрохлорид, 0,2 мг/мл полисорбата 80, рН 6,2;
8) 10 мМ гистидин-гидрохлорид, 0,4 мг/мл полисорбата 80, рН 6,2;
9) 10 мМ гистидин-гидрохлорид, 0,6 мг/мл полисорбата 80, рН 6,2;
10) 10 мМ гистидин-гидрохлорид, 0,8 мг/мл полисорбата 80, рН 6,2.
Каждый препарат фильтровали, 0,5 мл препарата инъецировали в 50 мл инъекции физиологического раствора или в инъекционный раствор 5% глюкозы с достижением концентрации белка 0,5 мг/мл после разведения. Наблюдали стабильность образца после разведения. Результаты данного эксперимента показаны в Таблице 15. Результаты показывают, что при достижении концентрации полисорбата 20 более чем 0,2 мг/мл в данном препарате, уровень нерастворимых частиц значительно снижался после разведения; что касается полисорбата 80, уровень нерастворимых частиц, продуцированных из-за разведения хлоридом натрия, снижался наряду с увеличением концентрации полисорбата 80. При достижении концентрации полисорбата 80 0,4 мг/мл или больше уровень частиц больше, чем 10 мкм снижался до меньше, чем 10 частиц/мл.
Пример получения 6. Дополнительный скрининг поверхностно-активных веществ для препаратов слитого белка рецептора TGF-β
Препараты слитого белка рецептора TGF-β (слитый белок 9) получали с использованием следующих буферов с разными типами поверхностно-активных веществ с концентрацией белка 50 мг/мл:
1) 10 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, 0,4 мг/мл полисорбат 80, рН 6,2;
2) 10 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, 0,6 мг/мл полисорбат 20, рН 6,2. Каждый препарат фильтровали и добавляли в объеме 1,2 мл/флакон в 2 мл инъекционный флакон, сделанный из нейтрального борсиликатного стекла. Инъекционный флакон снабжали пробкой, покрывали колпачком и запечатывали.
Образцы отбирали для экспериментов по долговременному хранению при низкой температуре 2-8°С.
Экспериментальные результаты показаны в Таблице 16. Данные результаты показывают, что полисорбат 80 имеет лучший эффект на стабильность слитого белка рецептора TGF-β (слитый белок 9). Следовательно, полисорбат 80 выбирали в качестве поверхностно-активного вещества для слитого белка рецептора TGF-β (слитый белок 9).
Пример получения 7. Анализ совместимости на фильтровальной мембране для препаратов слитого белка рецептора TGF-β
Слитый белок рецептора TGF-β (слитый белок 9) готовили в концентрации 50 мг/мл в 10 мМ буфере лимонная кислота-цитрат натрия, 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80, рН 6,2. Данные препараты пропускали через 0,22 мкм PES (полиэфирсульфон) фильтровальную мембрану и PVDF фильтровальную мембрану, соответственно, и образцы отбирали в начале, в середине и в конце проведения анализа.
Экспериментальные результаты показаны в Таблице 17. Анализ содержания белка, внешнего вида и чистоты показывает, что слитый белок рецептора TGF-β (слитый белок 9) был стабильным во время контакта с фильтровальной мембраной, и данный препарат был совместимым с обеими фильтровальными мембранами - PES и PVDF.
Пример получения 8. Лиофилизация препарата слитого белка рецептора TGF-β
Препарат слитого белка рецептора TGF-β (слитый белок 9), содержащий концентрацию слитого белка рецептора TGF-β (слитый белок 9) 50 мг/мл, 80 мг/мл сахарозы и 0,4 мг/мл полисорбата 80, готовили с буфером с рН 6,2, содержащим 10 мМ лимонную кислоту-цитрат натрия. Добавляли антитело в объеме 6,3 мг/флакон в 20 мл флакон и помещали в низкотемпературную морозильную камеру для лиофилизации.
Процедуры лиофилизации включают предварительное замораживание, первичную сушку и вторичную сушку. Как только процесс лиофилизации завершался, флакон закупоривали под вакуумом. Образцы восстанавливали, и делали сравнение состояния до и после лиофилизации. Результаты показывают, что восстановленный раствор может сохранять благоприятную эффективность, такую же, как и эффективность препарата раствора.
Пример получения 9. Другие возможные композиции препарата
Кроме того, согласно настоящему раскрытию также предложены другие
препараты фармацевтических препаратов слитого белка рецептора TGF-β (слитый белок 9):
(1) 70 мг/мл слитого белка 9, 75 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 20 мМ буфер лимонная кислота-цитрат натрия, конечный рН 6,4;
(2) 80 мг/мл слитого белка 9, 85 мг/мл сахарозы, 0,5 мг/мл полисорбата 80 и 15 мМ буфер лимонная кислота-цитрат натрия, конечный рН 6,2;
(3) 60 мг/мл слитого белка 9, 90 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 5 мМ буфер лимонная кислота-цитрат натрия, конечный рН 6,2;
(4) 30 мг/мл слитого белка 9, 60 мг/мл сахарозы, 0,3 мг/мл полисорбата 80 и 30 мМ буфер лимонная кислота-цитрат натрия, конечный рН 6,3;
(5) 90 мг/мл слитого белка 9, 95 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфер лимонная кислота-цитрат натрия, конечный рН 6,0;
(6) 100 мг/мл слитого белка 9, 70 мг/мл сахарозы, 0,1 мг/мл полисорбата 80 и 25 мМ буфер лимонная кислота-цитрат натрия, конечный рН 6,5;
(7) 50 мг/мл слитого белка 9, 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфер лимонная кислота-цитрат натрия, конечный рН 7,0;
(8) 50 мг/мл слитого белка 9, 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфер лимонная кислота-цитрат натрия, конечный рН 7,5;
(9) 50 мг/мл слитого белка 9, 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфер лимонная кислота-цитрат натрия, конечный рН 5,0;
(10) 60 мг/мл слитого белка 9, 70 мг/мл сахарозы, 0,5 мг/мл полисорбата 80 и 15 мМ буфер лимонная кислота-цитрат натрия, конечный рН 5,5;
(11) 40 мг/мл слитого белка 9, 80 мг/мл сахарозы, 0,5 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфер лимонная кислота-цитрат натрия, конечный рН 6,2;
(12) 55 мг/мл слитого белка 9, 75 мг/мл сахарозы, 0,3 мг/мл полисорбата 80 и 5 мМ буфер лимонная кислота-цитрат натрия, конечный рН 6,0;
(13) 65 мг/мл слитого белка 9, 90 мг/мл сахарозы, 0,7 мг/мл полисорбата 80 и 30 мМ буфер лимонная кислота-цитрат натрия, конечный рН 7,5;
(14) 70 мг/мл слитого белка 9, 75 мг/мл сахарозы, 0,8 мг/мл полисорбата 80 и 30 мМ буфер лимонная кислота-цитрат натрия, конечный рН 7,0;
(15) 50 мг/мл слитого белка 9, 80 мг/мл сахарозы, 0,8 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфер лимонная кислота-цитрат натрия, конечный рН 7,0.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO., LTD.;
SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.
<120>  ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ СЛИТОГО БЕЛКА РЕЦЕПТОРА
ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА БЕТА И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
<130>  719079CPCT
<150>  201811328326.1
<151>  2019-11-09
<160>  24
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<223>  Определяющая комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1)
<400>  1
Ser Tyr Trp Met His
1               5
<210>  2
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<223>  HCDR2
<220>
<221>  Домен
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa выбран из His или Gly
<220>
<221>  Домен
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa выбран из Gly или Phe
<400>  2
Arg Ile Xaa Pro Asn Ser Gly Xaa Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Asn
<210>  3
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<223>  HCDR3
<400>  3
Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  4
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<223>  Определяющая комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1)
<400>  4
Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His Gly Thr His Leu Met His
1               5                   10                  15
<210>  5
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<223>  LCDR2
<400>  5
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1               5
<210>  6
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<223>  LCDR3
<400>  6
Gln Gln Ser Phe Glu Asp Pro Leu Thr
1               5
<210>  7
<211>  119
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<223>  Вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела против
лиганда-1 запрограммированной смерти клетки (PD-L1)
<220>
<221>  Домен
<222>  (52)..(52)
<223>  Xaa выбран из His или Gly
<220>
<221>  Домен
<222>  (57)..(57)
<223>  Xaa выбран из Gly или Phe
<400>  7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Xaa Pro Asn Ser Gly Xaa Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  8
<211>  111
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<223>  Вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела против PD-L1
<400>  8
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His
20                  25                  30
Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe
85                  90                  95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  9
<211>  119
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<223>  Вариабельная область тяжелой цепи антитела против PD-L1
<400>  9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  10
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<223>  HCDR2
<400>  10
Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Asn
<210>  11
<211>  111
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<223>  Вариабельная область легкой цепи антитела против PD-L1
<400>  11
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His
20                  25                  30
Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe
85                  90                  95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  12
<211>  446
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Цепь
<223>  Последовательность тяжелой цепи антитела против PD-L1: Ig G4(AA) (S228P)
<400>  12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245                 250                 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260                 265                 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275                 280                 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290                 295                 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325                 330                 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340                 345                 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355                 360                 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370                 375                 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405                 410                 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420                 425                 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Ala
435                 440                 445
<210>  13
<211>  218
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Цепь
<223>  Последовательность легкой цепи антитела против PD-L1
<400>  13
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His
20                  25                  30
Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe
85                  90                  95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165                 170                 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180                 185                 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195                 200                 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  14
<211>  136
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Пептид
<223>  Последовательность внеклеточного домена (ECD) TGF-бета RII: ECD (1-136)
<400>  14
Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr
1               5                   10                  15
Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
20                  25                  30
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
35                  40                  45
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
50                  55                  60
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
65                  70                  75                  80
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
85                  90                  95
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
100                 105                 110
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
115                 120                 125
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
130                 135
<210>  15
<211>  117
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Пептид
<223>  Последовательность внеклеточного домена TGF-бета RII c усечением или
отсутствием 19 аминокислот на N-конце: ECD (20-136)
<400>  15
Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe
1               5                   10                  15
Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr
20                  25                  30
Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys
35                  40                  45
Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu
50                  55                  60
Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile
65                  70                  75                  80
Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys
85                  90                  95
Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn
100                 105                 110
Thr Ser Asn Pro Asp
115
<210>  16
<211>  115
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Пептид
<223>  Последовательность внеклеточного домена TGF-бета RII c усечением или
отсутствием 21 аминокислоты на N-конце: ECD (22-136)
<400>  16
Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr
1               5                   10                  15
Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile
20                  25                  30
Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp
35                  40                  45
Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr
50                  55                  60
His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys
65                  70                  75                  80
Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser
85                  90                  95
Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser
100                 105                 110
Asn Pro Asp
115
<210>  17
<211>  122
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Пептид
<223>  Последовательность внеклеточного домена TGF-βRII c усечением или
отсутствием 14 аминокислот на N-конце: ECD (15-136)
<400>  17
Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe
1               5                   10                  15
Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser
20                  25                  30
Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val
35                  40                  45
Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys
50                  55                  60
His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala
65                  70                  75                  80
Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe
85                  90                  95
Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe
100                 105                 110
Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
115                 120
<210>  18
<211>  236
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Пептид
<223>  Антиген используемый для детекции: PD-L1-His
<400>  18
Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser
1               5                   10                  15
Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu
20                  25                  30
Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln
35                  40                  45
Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg
50                  55                  60
Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys
85                  90                  95
Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val
100                 105                 110
Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro
115                 120                 125
Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys
130                 135                 140
Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys
145                 150                 155                 160
Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr
165                 170                 175
Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr
180                 185                 190
Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile
195                 200                 205
Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Glu Gln Lys Leu
210                 215                 220
Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His
225                 230                 235
<210>  19
<211>  346
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Пептид
<223>  Контроль 1 (20Т-Fc): ECD(20-136)-Fc, слитый белок усеченного фрагмента
внеклеточного домена TGF-бета RII – ECD (20-136) и Fc
<400>  19
Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe
1               5                   10                  15
Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr
20                  25                  30
Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys
35                  40                  45
Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu
50                  55                  60
Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile
65                  70                  75                  80
Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys
85                  90                  95
Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn
100                 105                 110
Thr Ser Asn Pro Asp Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
115                 120                 125
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
130                 135                 140
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
145                 150                 155                 160
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
165                 170                 175
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
180                 185                 190
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
195                 200                 205
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
210                 215                 220
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
225                 230                 235                 240
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
245                 250                 255
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
260                 265                 270
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
275                 280                 285
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
290                 295                 300
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
305                 310                 315                 320
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
325                 330                 335
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
340                 345
<210>  20
<211>  344
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Пептид
<223>  Контроль 2 (22T-Fc): ECD(22-136)-Fc, литый белок усеченного фрагмента
внеклеточного домена TGF-бета RII – ECD (22-136) и Fc
<400>  20
Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr
1               5                   10                  15
Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile
20                  25                  30
Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp
35                  40                  45
Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr
50                  55                  60
His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys
65                  70                  75                  80
Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser
85                  90                  95
Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser
100                 105                 110
Asn Pro Asp Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
115                 120                 125
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
130                 135                 140
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
145                 150                 155                 160
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
165                 170                 175
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
180                 185                 190
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
195                 200                 205
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
210                 215                 220
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
225                 230                 235                 240
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
245                 250                 255
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
260                 265                 270
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
275                 280                 285
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
290                 295                 300
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
305                 310                 315                 320
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
325                 330                 335
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
340
<210>  21
<211>  216
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Цепь
<223>  В слитом белке FP17022 аминокислотная последовательность легкой цепи
антитела 2 против PD-L1
<400>  21
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20                  25                  30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85                  90                  95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100                 105                 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115                 120                 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145                 150                 155                 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165                 170                 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180                 185                 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195                 200                 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210                 215
<210>  22
<211>  607
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Пептид
<223>  В слитом белке FP17022 последовательность слитого петида - тяжелая цепь
антитела 2 против PD-L1/внеклеточный домен TGF-бета RII (1-136)
<400>  22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450                 455                 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val
465                 470                 475                 480
Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro
485                 490                 495
Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln
500                 505                 510
Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro
515                 520                 525
Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr
530                 535                 540
Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile
545                 550                 555                 560
Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys
565                 570                 575
Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn
580                 585                 590
Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
595                 600                 605
<210>  23
<211>  584
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Пептид
<223>  В слитом белке 9 последовательность слитого пептида - тяжелая цепь
антитела против PD-L1-(G4S)4G-внеклеточный домен TGF-бета RII (20-136)
<400>  23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245                 250                 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260                 265                 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275                 280                 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290                 295                 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325                 330                 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340                 345                 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355                 360                 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370                 375                 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405                 410                 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420                 425                 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Ala Gly Gly
435                 440                 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450                 455                 460
Gly Ser Gly Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
465                 470                 475                 480
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
485                 490                 495
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
500                 505                 510
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
515                 520                 525
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
530                 535                 540
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
545                 550                 555                 560
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
565                 570                 575
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
580
<210>  24
<211>  587
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Пептид
<223>  В слитом белке 15 последовательность слитого пептида - тяжелая цепь
антитела против PD-L1-(G4S)5G-внеклеточный домен TGF-бета RII (22-136)
<400>  24
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245                 250                 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260                 265                 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275                 280                 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290                 295                 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325                 330                 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340                 345                 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355                 360                 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370                 375                 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405                 410                 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420                 425                 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Ala Gly Gly
435                 440                 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450                 455                 460
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys
465                 470                 475                 480
Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met
485                 490                 495
Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys
500                 505                 510
Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val
515                 520                 525
Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala
530                 535                 540
Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr
545                 550                 555                 560
Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile
565                 570                 575
Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
580                 585
<---