БЕСКЛЕТОЧНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ САХАРОВ

1. Способ получения соединения аллюлозы, предусматривающий стадии:
превращения полимерного глюкозного углевода в глюкозо-1-фосфат (G1P), катализируемого α-глюкан- или целлодекстринфосфорилазой; превращения указанного глюкозо-1-фосфата (G1P) с получением глюкозо-6-фосфата (G6P), катализируемого фосфоглюкомутазой; превращения указанного глюкозо-6-фосфата (G6P) в фруктозо-6-фосфат (F6P), катализируемого фосфоглюкоизомеразой; превращения указанного фруктозо-6-фосфата (F6P) с получением аллюлозо-6-фосфата (A6P), катализируемого аллюлозо-6-фосфатэпимеразой (A6PE); и превращения указанной аллюлозо-6-фосфатэпимеразы (A6P) в аллюлозу, катализируемого аллюлозо-6-фосфатфосфатазой (A6PP).
2. Способ по п. 1, при котором полимерный глюкозный углевод представляет собой крахмал, целлодекстрин или гликоген.
3. Способ по п. 1 или 2, при котором α-глюканфосфорилаза выбрана из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз Aquifex aeolicus, Thermocrinis minervae, Thermosulfidibacter takaii, Thermosulfurimonas dismutans, Thermococcus litoralis, Palaeococcus pacificus, Thermotoga neapolitana, Ruminiclostridium thermocellum, Pyrococcus abyssi, Thermococcus thioreducens, Deinococcus radiodurans, Sulfolobus acidocaldarius, Thermus caldophilus, Meiothermus silvanus, Oceanithermus profundus, Ardenticatena maritima, Thermococcus barophilus, Pseudothermotoga thermarum, Hydrogenobacter thermophilus, Thermus oshimai, Meiothermus ruber и Marinitoga piezophila.
4. Способ по любому из пп. 1-3, при котором целлодекстринфосфорилаза выбрана из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз Clostridium thermocellum, Clostridium straminisolvens, Thermotoga RQ2; Ignisphaera aggregans, Thermotoga maritima, Spirochaeta thermophila, Caldicellulosiruptor bescii, Dictyoglomus thermophilum, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Thermosipho africanus, Caldisalinibacter kiritimatiensis, Defluviitalea phaphyphila, Caldicellulosiruptor kronotskyensis, Thermococcus sibiricus и Thermosphaera aggregans.
5. Способ по любому из пп. 1-4, при котором фосфоглюкомутаза выбрана из группы, состоящей из фосфоглюкомутаз Thermococcus kodakaraensis, Pyrococcus kukulkanii, Ammonifex degensii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermus fervidus, Sulfolobus acidocaldarius, Archaeoglobus fulgidus, Ferroglobus placidus, Geoglobus ahangari, Archaeoglobus veneficus, Archaeoglobus sulfaticallidus, Aciduliprofundum boonie, Clostridium thermocellum, Defluviitalea phaphyphila, Caminicella sporogenes, Caloranaerobacter ferrireducens, Thermosipho malanesiensis, Fervidobacterium pennivorans, Symbiobacterium thermophilum, Spirochaeta thermophila и Thermoanaerobacter wiegelii.
6. Способ по любому из пп. 1-5, при котором фосфоглюкоизомераза выбрана из группы, состоящей из фосфоглюкоизомераз Thermus thermophilus, Meiothermus timidus, Thermus filiformis, Marinithermus hydrothermalis, Thermosipho africanus, Sulfurihydrogenibium azorense, Persephonella marina, Marinitoga piezophila, Kosmotoga olearia, Thermotoga maritima, Geobacillus stearothermophilus, Anoxybacillus flavithermus, Thermosulfidibacter takaii, Fervidobacterium nodosum, Clostridium thermocellum, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Methanococcus jannaschii, Methanotorris igneus, Methanocaldococcus villosus, Methanothermococcus okinawensis, Pseudothermotoga thermarum, Deferribacter desulfuricans и Thermovibrio ammonificans.
7. Способ по любому из пп. 1-6, при котором аллюлозо-6-фосфатэпимераза выбрана из группы, состоящей из аллюлозо-6-фосфатэпимераз Thermobacterium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacter brockii, Caldanaerobacter subterraneus, Deferribacter desulfuricans, Thermocrinis ruber, Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1, Brevibacillus thermoruber, Thermosipho atlanticus и Thermosulfidibacter takaii.
8. Способ по любому из пп. 1-7, при котором аллюлозо-6-фосфатфосфатаза выбрана из группы, состоящей из аллюлозо-6-фосфатфосфатаз Thermoanaerobacter wiegelii, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermus islandicus, Deinococcus geothermalis DSM 11300, Thermosphaera aggregans, Crenarchaeota archaeon, Pyrococcus horikoshii Ot3, Aquifex aeolicus, Ruminiclostridium thermocellum, Desulfotomaculum kuznetsovii, Caldanaerobacter subterraneus, Acidothermus cellulolyticus, Methanothermobacter thermautotrophicus, Thermobifida fusca, Thermotoga neapolitana, Petrotoga mobilis и Thermodesulfatator indicus, Thermus thermophilus, Bacteroides vulgatus и Bacteroides fragilus.
9. Способ по любому из пп. 1-8, при котором аллюлозо-6-фосфатфосфатаза специфична к аллюлозо-6-фосфату.
10. Способ по любому из пп. 1-9, при котором по меньшей мере один из указанных ферментов является термостабильным, или по меньшей мере два из указанных ферментов являются термостабильными.
11. Способ по любому из пп. 2-10, при котором крахмал или гликоген предварительно обрабатывают α-амилазой и деветвящим ферментом с получением неразветвленного мальтодекстрина.
12. Способ по п. 11, при котором деветвящий фермент выбран из изоамилаз и пуллуланаз.
13. Способ по п. 12, при котором изоамилазы выбраны из изоамилаз Sulfolobus tokodaii, Metallosphaera hakonensis, Sphaerobacter thermophiles и Bacillus lentus.
14. Способ по п. 12 или 13, при котором пуллуланазы выбраны из пуллуланаз Fervidobacterium pennavorans. Thermotoga sp. RQ5, Bacillus flavocaldarius, Thermosipho africanus и Kosmotoga olearia.
15. Бесклеточный способ получения аллюлозы, причем способ предусматривает:
(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии термостабильной α-глюканфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной фосфоглюкоизомеразы, термостабильной аллюлозо-6-фосфатэпимеразы и термостабильной аллюлозо-6-фосфатфосфатазы, с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют термостабильные ферменты;
(b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата;
(с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и
(d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии крахмала, гликогена или его частично гидролизированного производного и неорганического фосфата с получением аллюлозы.
16. Бесклеточный способ по п. 15, при котором крахмал или гликоген предварительно обрабатывают α-амилазой и деветвящим ферментом с получением неразветвленного мальтодекстрина.
17. Бесклеточный способ по п. 15, при котором крахмал или гликоген предварительно обрабатывают α-амилазой с получением разветвленного мальтодекстрина и на стадии (d) добавляют деветвящий фермент.
18. Бесклеточный способ по п. 15, при котором на стадии (d) добавляют деветвящий фермент.
19. Бесклеточный способ по любому из пп. 16-18, при котором деветвящий фермент выбран из изоамилаз и пуллуланаз.
20. Бесклеточный способ по п. 19, при котором изоамилазы выбраны из изоамилаз Sulfolobus tokodaii, Metallosphaera hakonensis, Sphaerobacter thermophiles и Bacillus lentus.
21. Бесклеточный способ по п. 19 или 20, при котором пуллуланазы выбраны из пуллуланаз Fervidobacterium pennavorans. Thermotoga sp. RQ5, Bacillus flavocaldarius, Thermosipho africanus и Kosmotoga olearia.
22. Бесклеточный способ получения аллюлозы, причем способ предусматривает:
(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильных аллюлозо-6-фосфатэпимераз и термостабильных аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;
(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;
(c) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит термостабильную α-глюканфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, термостабильную фосфоглюкоизомеразу, термостабильную аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и термостабильную аллюлозо-6-фосфатфосфатазу;
(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (с), с получением инактивированного нагреванием лизата; и
(e) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала, гликогена или его частично гидролизированного производного и неорганического фосфата с получением аллюлозы.
23. Бесклеточный способ получения аллюлозы, причем способ предусматривает:
(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, аллюлозо-6-фосфатэпимераз и аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты, причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным;
(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;
(с) необязательно нагревание одного или более из клеточных лизатов со стадии (b) до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;
(d) объединение клеточных лизатов со стадий (b) и (c) с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и аллюлозо-6-фосфатфосфатазу, причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным; и
(e) инкубирование смеси клеточных лизатов в присутствии крахмала, гликогена или его частично гидролизированного производного и неорганического фосфата с получением аллюлозы.
24. Бесклеточный способ получения аллюлозы, причем способ предусматривает:
(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных α-глюканфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильных аллюлозо-6-фосфатэпимераз и термостабильных аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;
(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;
(с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов;
(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;
(e) добавление к инактивированному нагреванием лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, аллюлозо-6-фосфатэпимераз и аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и аллюлозо-6-фосфатфосфатазу; и
(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала, гликогена или его частично гидролизированного производного и неорганического фосфата с получением аллюлозы.
25. Бесклеточный способ получения аллюлозы, причем способ предусматривает:
(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, аллюлозо-6-фосфатэпимераз и аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты, причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным;
(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;
(с) необязательно нагревание одного или более из клеточных лизатов со стадии (b) до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;
(d) объединение клеточных лизатов со стадий (b) и (с) с получением смеси клеточных лизатов;
(e) добавление к смеси клеточных лизатов по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, аллюлозо-6-фосфатэпимераз и аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и аллюлозо-6-фосфатфосфатазу; и
(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии крахмала, гликогена или его частично гидролизированного производного и неорганического фосфата с получением аллюлозы.
26. Бесклеточный способ по любому из пп. 15-25, при котором α-глюканфосфорилаза(ы) выбрана(ы) из группы, состоящей из α-глюканфосфорилаз Aquifex aeolicus, Thermocrinis minervae, Thermosulfidibacter takaii, Thermosulfurimonas dismutans, Thermococcus litoralis, Palaeococcus pacificus, Thermotoga neapolitana, Ruminiclostridium thermocellum, Pyrococcus abyssi, Thermococcus thioreducens, Deinococcus radiodurans, Sulfolobus acidocaldarius, Thermus caldophilus, Meiothermus silvanus, Oceanithermus profundus, Ardenticatena maritima, Thermococcus barophilus, Pseudothermotoga thermarum, Hydrogenobacter thermophilus, Thermus oshimai, Meiothermus ruber и Marinitoga piezophila.
27. Бесклеточный способ по любому из пп. 15-26, при котором фосфоглюкомутаза(ы) выбрана(ы) из группы, состоящей из фосфоглюкомутаз Thermococcus kodakaraensis, Pyrococcus kukulkanii, Ammonifex degensii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermus fervidus, Sulfolobus acidocaldarius, Archaeoglobus fulgidus, Ferroglobus placidus, Geoglobus ahangari, Archaeoglobus veneficus, Archaeoglobus sulfaticallidus, Aciduliprofundum boonie, Clostridium thermocellum, Defluviitalea phaphyphila, Caminicella sporogenes, Caloranaerobacter ferrireducens, Thermosipho malanesiensis, Fervidobacterium pennivorans, Symbiobacterium thermophilum, Spirochaeta thermophila и Thermoanaerobacter wiegelii.
28. Бесклеточный способ по любому из пп. 15-27, при котором фосфоглюкоизомераза(ы) выбрана(ы) из группы, состоящей из фосфоглюкоизомераз Thermus thermophilus, Meiothermus timidus, Thermus filiformis, Marinithermus hydrothermalis, Thermosipho africanus, Sulfurihydrogenibium azorense, Persephonella marina, Marinitoga piezophila, Kosmotoga olearia, Thermotoga maritima, Geobacillus stearothermophilus, Anoxybacillus flavithermus, Thermosulfidibacter takaii, Fervidobacterium nodosum, Clostridium thermocellum, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Methanococcus jannaschii, Methanotorris igneus, Methanocaldococcus villosus, Methanothermococcus okinawensis, Pseudothermotoga thermarum, Deferribacter desulfuricans и Thermovibrio ammonificans.
29. Бесклеточный способ по любому из пп. 15-28, при котором аллюлозо-6-фосфатэпимераза(ы) выбрана(ы) из группы, состоящей из аллюлозо-6-фосфатэпимераз Thermobacterium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacter brockii, Caldanaerobacter subterraneus, Deferribacter desulfuricans, Thermocrinis ruber, Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1, Brevibacillus thermoruber, Thermosipho atlanticus и Thermosulfidibacter takaii.
30. Бесклеточный способ по любому из пп. 15-29, при котором аллюлозо-6-фосфатфосфатаза(ы) выбрана(ы) из группы, состоящей из аллюлозо-6-фосфатфосфатаз Thermoanaerobacter wiegelii, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermus islandicus, Deinococcus geothermalis DSM 11300, Thermosphaera aggregans, Crenarchaeota archaeon, Pyrococcus horikoshii Ot3, Aquifex aeolicus, Ruminiclostridium thermocellum, Desulfotomaculum kuznetsovii, Caldanaerobacter subterraneus, Acidothermus cellulolyticus, Methanothermobacter thermautotrophicus, Thermobifida fusca, Thermotoga neapolitana, Petrotoga mobilis и Thermodesulfatator indicus, Thermus thermophilus, Bacteroides vulgatus, а также Bacteroides fragilus.
31. Бесклеточный способ по пп. 16-30, при котором крахмал или гликоген предварительно обрабатывают α-амилазой и деветвящим ферментом с получением неразветвленного мальтодекстрина.
32. Бесклеточный способ по пп. 16-30, при котором крахмал или гликоген предварительно обрабатывают α-амилазой с получением разветвленного мальтодекстрина и реакционную смесь инкубируют в присутствии деветвящего фермента.
33. Бесклеточный способ по пп. 16-30, при котором реакционную смесь инкубируют в присутствии деветвящего фермента.
34. Бесклеточный способ по любому из пп. 31-33, при котором деветвящий фермент выбран из изоамилаз и пуллуланаз.
35. Бесклеточный способ по п. 34, при котором изоамилазы выбраны из изоамилаз Sulfolobus tokodaii, Metallosphaera hakonensis, Sphaerobacter thermophiles и Bacillus lentus.
36. Бесклеточный способ по п. 34 или 35, при котором пуллуланазы выбраны из пуллуланаз Fervidobacterium pennavorans. Thermotoga sp. RQ5, Bacillus flavocaldarius, Thermosipho africanus и Kosmotoga olearia.
37. Способ по любому из пп. 15-36, при котором клетки включают бактериальные клетки.
38. Способ по любому из пп. 15-37, при котором клетки включают дрожжевые клетки.
39. Способ по любому из пп. 15-38, при котором по меньшей мере один из ферментов является гетерологичным по отношению к клеткам.
40. Способ по любому из пп. 15-39, при котором стадия (b) лизирования включает механическое, химическое, ферментативное, осмотическое или термическое лизирование культивированных клеток.
41. Способ по любому из пп. 15-40, при котором стадия нагревания (c) или (d) включает нагревание клеточного лизата до температуры по меньшей мере 50°C.
42. Способ по любому из пп. 15-41, при котором крахмал содержит амилозу, амилопектин или как амилозу, так и амилопектин.
43. Способ по любому из пп. 15-42, при котором два или более ферментов из α-глюканфосфорилазы, фосфоглюкомутазы, фосфоглюкоизомеразы, аллюлозо-6-фосфатэпимеразы, аллюлозо-6-фосфатфосфатазы и/или деветвящего фермента экспрессируются в форме единого гибридного белка, бифункционального или мультифункционального белка.
44. Клеточный лизат, полученный способом по любому из пп. 15-43.
45. Сконструированная клетка, содержащая α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу, аллюлозо-6-фосфатфосфатазу и, необязательно, деветвящий фермент, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.
46. Сконструированная клетка по п. 45, причем такая клетка представляет собой бактериальную клетку или дрожжевую клетку.
47. Единый клеточный лизат, смесь клеточных лизатов, полученных по меньшей мере из двух клеточных популяций, или реакционная смесь, которые содержат α-глюканфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу, аллюлозо-6-фосфатфосфатазу и, необязательно, деветвящий фермент, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.
48. Бесклеточный способ получения аллюлозы, причем способ предусматривает:
(a) культивирование клеток, сконструированных для экспрессии термостабильной целлодекстринфосфорилазы, термостабильной фосфоглюкомутазы, термостабильной фосфоглюкоизомеразы, термостабильной аллюлозо-6-фосфатэпимеразы и термостабильной аллюлозо-6-фосфатфосфатазы, с получением культивируемых клеток, которые экспрессируют ферменты;
(b) лизирование культивируемых клеток с получением клеточного лизата;
(с) нагревание клеточного лизата до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата; и
(d) инкубирование инактивированного нагреванием лизата в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением аллюлозы.
49. Бесклеточный способ получения аллюлозы, причем способ предусматривает:
(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильных аллюлозо-6-фосфатэпимераз и термостабильных аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;
(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;
(c) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит термостабильную целлодекстринфосфорилазу, термостабильную фосфоглюкомутазу, термостабильную фосфоглюкоизомеразу, термостабильную аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и термостабильную аллюлозо-6-фосфатфосфатазу;
(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (с), с получением инактивированного нагреванием лизата; и
(e) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением аллюлозы.
50. Бесклеточный способ получения аллюлозы, причем способ предусматривает:
(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, аллюлозо-6-фосфатэпимераз и аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты, причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным;
(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;
(с) необязательно нагревание одного или более из клеточных лизатов со стадии (b) до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;
(d) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов со стадий (b) и (c) с получением смеси клеточных лизатов, которая содержит целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и аллюлозо-6-фосфатфосфатазу, причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным; и
(e) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением аллюлозы.
51. Бесклеточный способ получения аллюлозы, причем способ предусматривает:
(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из термостабильных целлодекстринфосфорилаз, термостабильных фосфоглюкомутаз, термостабильных фосфоглюкоизомераз, термостабильных аллюлозо-6-фосфатэпимераз и термостабильных аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты;
(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;
(с) объединение по меньшей мере двух клеточных лизатов с получением смеси клеточных лизатов;
(d) нагревание смеси клеточных лизатов до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;
(e) добавление к инактивированному нагреванием лизату по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, аллюлозо-6-фосфатэпимераз и аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и аллюлозо-6-фосфатфосфатазу; и
(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением аллюлозы.
52. Бесклеточный способ получения аллюлозы, причем способ предусматривает:
(а) культивирование по меньшей мере двух клеточных популяций, причем клетки каждой популяции сконструированы для экспрессии по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз, фосфоглюкоизомераз, аллюлозо-6-фосфатэпимераз и аллюлозо-6-фосфатфосфатаз, с получением по меньшей мере двух культивируемых популяций клеток, экспрессирующих разные ферменты, причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным; и
(b) лизирование клеток по меньшей мере двух культивируемых популяций с получением по меньшей мере двух клеточных лизатов;
(с) необязательно нагревание одного или более из клеточных лизатов со стадии (b) до температуры, которая инактивирует природные молекулы с ферментативной активностью, но не инактивирует термостабильные ферменты со стадии (а), с получением инактивированного нагреванием лизата;
(d) объединение клеточного лизата со стадий (b) и (с) с получением смеси клеточных лизатов;
(e) добавление к смеси клеточных лизатов по меньшей мере одного очищенного фермента, выбранного из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз, фосфоглюкомутаз и глюкозо-6-фосфатфосфатаз, с получением реакционной смеси, содержащей целлодекстринфосфорилазы, фосфоглюкомутазы, фосфоглюкоизомеразы, аллюлозо-6-фосфатэпимеразы и аллюлозо-6-фосфатфосфатазы, с получением реакционной смеси, содержащей целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и аллюлозо-6-фосфатфосфатазы;
(f) инкубирование реакционной смеси в присутствии целлодекстрина и неорганического фосфата с получением аллюлозы.
53. Бесклеточный способ по любому из пп. 48-52, при котором целлодекстринфосфорилаза(ы) выбрана(ы) из группы, состоящей из целлодекстринфосфорилаз Clostridium thermocellum, Clostridium straminisolvens, Thermotoga RQ2; Ignisphaera aggregans, Thermotoga maritima, Spirochaeta thermophila, Caldicellulosiruptor bescii, Dictyoglomus thermophilum, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Thermosipho africanus, Caldisalinibacter kiritimatiensis, Defluviitalea phaphyphila, Caldicellulosiruptor kronotskyensis, Thermococcus sibiricus и Thermosphaera aggregans.
54. Бесклеточный способ по любому из пп. 48-53, при котором фосфоглюкомутаза(ы) выбраны(ы) из группы, состоящей из фосфоглюкомутаз Thermococcus kodakaraensis, Pyrococcus kukulkanii, Ammonifex degensii, Methanothermobacter wolfeii, Methanothermus fervidus, Sulfolobus acidocaldarius, Archaeoglobus fulgidus, Ferroglobus placidus, Geoglobus ahangari, Archaeoglobus veneficus, Archaeoglobus sulfaticallidus, Aciduliprofundum boonie, Clostridium thermocellum, Defluviitalea phaphyphila, Caminicella sporogenes, Caloranaerobacter ferrireducens, Thermosipho malanesiensis, Fervidobacterium pennivorans, Symbiobacterium thermophilum, Spirochaeta thermophila и Thermoanaerobacter wiegelii.
55. Бесклеточный способ по любому из пп. 48-54, при котором фосфоглюкоизомераза(ы) выбрана(ы) из группы, состоящей из фосфоглюкоизомераз Thermus thermophilus, Meiothermus timidus, Thermus filiformis, Marinithermus hydrothermalis, Thermosipho africanus, Sulfurihydrogenibium azorense, Persephonella marina, Marinitoga piezophila, Kosmotoga olearia, Thermotoga maritima, Geobacillus stearothermophilus, Anoxybacillus flavithermus, Thermosulfidibacter takaii, Fervidobacterium nodosum, Clostridium thermocellum, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Methanococcus jannaschii, Methanotorris igneus, Methanocaldococcus villosus, Methanothermococcus okinawensis, Pseudothermotoga thermarum, Deferribacter desulfuricans и Thermovibrio ammonificans.
56. Бесклеточный способ по любому из пп. 48-55, при котором аллюлозо-6-фосфатэпимераза(ы) выбрана(ы) из группы, состоящей из аллюлозо-6-фосфатэпимераз Thermobacterium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacter brockii, Caldanaerobacter subterraneus, Deferribacter desulfuricans, Thermocrinis ruber, Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1, Brevibacillus thermoruber, Thermosipho atlanticus и Thermosulfidibacter takaii.
57. Бесклеточный способ по любому из пп. 48-56, при котором аллюлозо-6-фосфатфосфатаза(ы) выбрана(ы) из группы, состоящей из аллюлозо-6-фосфатфосфатаз Thermoanaerobacter wiegelii, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermus islandicus, Deinococcus geothermalis DSM 11300, Thermosphaera aggregans, Crenarchaeota archaeon, Pyrococcus horikoshii Ot3, Aquifex aeolicus, Ruminiclostridium thermocellum, Desulfotomaculum kuznetsovii, Caldanaerobacter subterraneus, Acidothermus cellulolyticus, Methanothermobacter thermautotrophicus, Thermobifida fusca, Thermotoga neapolitana, Petrotoga mobilis и Thermodesulfatator indicus, Thermus thermophilus, Bacteroides vulgatus и Bacteroides fragilus.
58. Способ по любому из пп. 48-57, при котором клетки включают бактериальные клетки.
59. Способ по любому из пп. 48-58, при котором клетки включают дрожжевые клетки.
60. Способ по любому из пп. 48-59, при котором по меньшей мере один из ферментов является гетерологичным по отношению к клеткам.
61. Способ по любому из пп. 48-60, при котором стадия (b) лизирования включает механическое, химическое или ферментативное лизирование культивированных клеток.
62. Способ по любому из пп. 48-61, при котором стадия нагревания (c) или (d) включает нагревание клеточного лизата до температуры по меньшей мере 50°C.
63. Способ по любому из пп. 48-62, при котором целлодекстринфосфорилаза содержит амилозу, амилопектин или как амилозу, так и амилопектин.
64. Способ по любому из пп. 48-63, при котором два или более ферментов из целлодекстринфосфорилазы, фосфоглюкомутазы, фосфоглюкоизомеразы, аллюлозо-6-фосфатэпимеразы, аллюлозо-6-фосфатфосфатазы и/или деветвящего фермента экспрессируются в форме единого гибридного белка, бифункционального или мультифункционального белка.
65. Клеточный лизат, полученный способом по любому из пп. 48-64.
66. Сконструированная клетка, содержащая целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и аллюлозо-6-фосфатфосфатазу.
67. Сконструированная клетка, содержащая целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и аллюлозо-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.
68. Единый клеточный лизат, смесь клеточных лизатов, полученных по меньшей мере из двух клеточных популяций, или реакционная смесь, которые содержат целлодекстринфосфорилазу, фосфоглюкомутазу, фосфоглюкоизомеразу, аллюлозо-6-фосфатэпимеразу и аллюлозо-6-фосфатфосфатазу, необязательно причем по меньшей мере один из вышеперечисленных ферментов является термостабильным ферментом.