Биофармацевтическая композиция с антибактериальной и пробиотической активностью и лекарственная форма на её основе
BIOPHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH ANTIBACTERIAL AND PROBIOTIC ACTIVITY AND DOSAGE FORM BASED ON IT

Изобретение относится к медицине и биофармацевтической промышленности, а именно к комплексным лекарственным средствам, содержащим бактериофаги и пробиотики, с широким спектром антибактериальной и пробиотической активности, которые могут быть использованы для восстановления симбиотного равновесия микрофлоры кишечника и других биотопов организмов человека.
Наиболее близкой к предлагаемой биофармацевтической композиции является композиция на основе пробиотика и бактериофага (см. патент RU №2453320, опубл. 20.06.2012)
Недостатком известной композиции является:
- низкий уровень совместимости фагового и клеточного пробиотического компонентов по  значениям рН (менее 6,5 и более 7,0 соответственно)   и стабильности  при хранении;
- невозможность получения стабильной лекарственной формы биофармацевтической композиции со сроком годности более 3-6 месяцев на основе жидкого пробиотического клеточного компонента и со сроком годности более 12-18 месяцев на основе лиофилизированного пробиотического клеточного компонента;
- низкая устойчивость пробиотического компонента по сохранению жизнеспособности клеток лакто- и бифидобактерий при воздействии желудочного сока и желчи при попадании биофармацевтической композиции в желудочно-кишечный тракт;
- ограниченность линейки лекарственных форм биофармацевтической композиции, связанная с технологическими свойствами пробиотических бактериальных культур;
- необходимость использования дорогостоящего процесса лиофилизации для получения сухой пробиотической субстанции при изготовлении любой лекарственной формы биофармацевтической композиции со сроком годности не менее 12 месяцев;
- необходимость учитывать совместимость (возможный антагонизм) бактериальных штаммов при конструировании пробиотической составляющей биофармацевтической композиции;
Технической задачей предлагаемой биофармацевтической композиции является:
- повышение уровня совместимости фагового и пробиотического компонентов;
- возможность изготовления лекарственных форм биофармацевтических композиций с продолжительным (не менее 12 мес.) сроком годности без применения процесса лиофилизации пробиотического компонента;
- повышение устойчивости пробиотического компонента (из-за отсутствия живых клеток) при бактерицидном воздействии желудочного сока и желчи при попадании биофармацевтической композиции в желудочно-кишечный тракт;
- исключение необходимости подбора совместимых штаммов и отказ от использования живых бактериальных культур;
- возможность получения лекарственных форм со сроком годности не менее 12 месяцев без использования лиофилизации;
- расширение линейки лекарственных форм.
Lactobacillus
Bifidobacterium
7
10
-5
Для решения поставленной технической задачи предлагается биофармацевтическая композиция со специфической антибактериальной и пробиотической активностью на основе бактериофага и пробиотика, выполненная в виде лекарственной формы, причём она содержит в качестве пробиотического компонента экзометаболиты пробиотических культур, полученные из культуральной жидкости бактерий рода и/или бактерий рода с плотностью популяции 10– 10 КОЕ/мл, смешанные в нативном или концентрированном виде с видоспецифическими вирулентными бактериофагами и/или видоспецифическими бактериофагами с индуцированной вирулентностью с литической активностью не ниже 10по Аппельману в отношении тест-штаммов и выполнена в виде лекарственной формы для внутреннего и/или наружного и/или местного применения.
Lactobacillus
Bifidobacterium
7
10
-5
Предлагаемое решение отличается тем, что она содержит в качестве пробиотического компонента экзометаболиты пробиотических культур, полученные из культуральной жидкости бактерий рода и/или бактерий рода с плотностью популяции 10– 10 КОЕ/мл, смешанные в нативном или концентрированном виде с видоспецифическими вирулентными бактериофагами и/или видоспецифическими бактериофагами с индуцированной вирулентностью с литической активностью не ниже 10по Аппельману в отношении тест-штаммов и выполнена в виде лекарственной формы для внутреннего и/или наружного и/или местного применения.
Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих возможность осуществления при использовании биофармацевтической композиции и соответствующим соотношением фармацевтически приемлемых целевых добавок для различных лекарственных форм. При этом приведенные в примерах комбинации ингредиентов биофармацевтической композиции показывают конкретную реализацию заявленного изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемого изобретения.
Пример 1.
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus acidophilus
Bifidobacterium bifidum
Bifidobacterium bifidum
3
24
Биофармацевтическая композиция на основе пробиотика и бактериофага, выполненная в виде жидкой лекарственной формы для внутреннего, наружного и местного применения. Для препарата используют пробиотический компонент (метабиотик) на основе бесклеточной фракции культуральной жидкости пробиотических штаммов (например:  8Р-А3 и/или  KШи/или 1 и/или 791), полученный методом ультрафильтрации с последующей стабилизацией ультрафильтрата (экзометаболитов пробиотических культур) термической обработкой и
• Монобактериофаг (например: Стафилококковый, представляющий собой стерильный очищенный фаголизат соответствующих бактерий Staphylococcus spp.); или
Staphylococcus
Streptococcus
Enterococcus
Proteus
Pseudomonas aerugenosa
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
• Комплексный поливалентный бактериофаг Секстафаг (Пиобактериофаг поливалентный) представляющий собой смесь стерильных очищенных фаголизатов бактерий spp.,  spp.,  spp.,  spp., , энтеропатогенными  различных серогрупп, ;  или
Staphylococcus
Streptococcus
Enterococcus
Proteus
Pseudomonas aerugenosa
Escherichia coli
Salmonella
Shigella
Sh.flexneri
Sh
sonnei
• Комплексный поливалентный бактериофаг Интести-бактериофаг представляющий собой смесь стерильных очищенных фаголизатов бактерий  spp.,  spp.,  spp.,  spp.,, энтеропатогенными  различных серогрупп,   групп А, В, С, D,  ( 1, 2, 3, 4, 6 сероваров, . ).
-5
Для  приготовления биофармацевтической композиции метабиотик  в нативном или сконцентрированном  в 2-10 раз виде с рН (7,0±0,3) смешивают со стерильными фильтратами фаголизатов бактериофагов с титром не менее 10 по Аппельману в соотношении соответственно 1:9.
Полученную биофармацевтическую композицию разливают по 20 мл во флаконы вместимостью 20 мл, укупоривают резиновыми пробками и обкатывают металлическими колпачками. Получаемая лекарственная форма для внутреннего, наружного и местного применения содержит биологически активную субстанцию в жидком виде в количестве 100,0 мас.% со сроком годности не менее 12 месяцев.
Пример 2.
Биофармацевтическая композиция на основе пробиотика и бактериофага, выполненная в виде лиофилизата во флаконах.
Смешивание компонентов биофармацевтической композиции проводят как описано в примере 1.
К полученной биофармацевтической композиции добавляют защитную среду для лиофилизации (например: сахарозо-желатиновую) и после тщательного перемешивания разливают по 2 мл во флаконы вместимостью       5 мл. Флаконы помещают в кассеты, замораживают при температуре не выше минус 40°С и высушивают в сублимационной установке до остаточной влажности 1-4%. Флаконы с лиофилизатом укупоривают резиновыми пробками и обкатывают металлическими колпачками.
Лекарственная форма для внутреннего, наружного и местного применения в виде лиофилизата во флаконах содержит биологически активную субстанцию в количестве до 85,0 мас.% и фармацевтически приемлемые целевые добавки (защитная среда) в количестве до 15,0 мас.% от массы единицы лекарственной формы со сроком годности более 12 месяцев.
Пример 3
Биофармацевтическая композиция на основе пробиотика и бактериофага, выполненная в виде твердых капсул.
Смешивание компонентов биофармацевтической композиции проводят как описано в примере 1.
К биофармацевтической композиции добавляют фармацевтически приемлемые целевые добавки, предварительно стерилизованные в сушильно-стерилизационном шкафу (метилцеллюлозу и/или лактозу, и/или сорбит, и/или кальция карбонат, и/или натрия альгинат, и/или пектин или др.) до/после процесса лиофилизации, в количестве 15-30 мас.% от массы единицы лекарственной формы. После гомогенизации полученной массой наполняют кассеты, замораживают при температуре не выше -40°С и высушивают в сублимационной установке до остаточной влажности 1-4%. Сухую массу гранулируют, опудривают стерильной массой фармацевтически приемлемых целевых добавок (вспомогательных антифрикционных веществ), тщательно перемешивают и расфасовывают в твердые капсулы для внутреннего применения со сроком годности не менее 24 месяцев.
Пример 4
Биофармацевтическая композиция на основе пробиотика и бактериофага, выполненная в виде суппозиториев.
Смешивание компонентов биофармацевтической композиции проводят, как описано в примере 1.
Биофармацевтическую композицию смешивают с суппозиторной основой (например: витепсол, эмульгатор Т-2) составляющей 80,0-85,0 мас.% от массы единицы лекарственной формы. После гомогенизации полученную суппозиторную массу используют для формования суппозиториев со сроком годности не менее 12 мес.
Полученные варианты биофармацевтической композиции на основе пробиотика и бактериофага испытывали на антимикробную и пробиотическую активность.
Исследование специфической и неспецифической антимикробной активности биофармацевтической композиции
Staphylococcus
Streptococcus
Enterococcus
Proteus
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Salmonella
Shigella
Sh. flexneri
Sh. sonnei
Неспецифическую антимикробную активность исследовали дискодиффузионным методом (МУК 4.2.1890-04. «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам») в отношении тест-штаммов  spp.,  spp.,  spp.,  spp., , энтеропатогенными  различных серогрупп, ,  групп А, В, С, D, Е,  ( 1, 2, 3, 4, 6 сероваров, ).
Бактериальную культуру засевали газоном на питательный агар Мартена в чашке Петри. На газон культуры на равных расстояниях друг от друга размещали диски, пропитанные соответствующим предлагаемым препаратом, затем инкубировали при температуре (37±1) ºС в течение (18±2) ч.
Исследуемые препараты
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus acidophilus
L. plantarum
L. acidophilus
Bifidobacterium bifidum
3
24
3
24
: Биофармацевтическая композиция I (экзометаболит пробиотической культуры штамма  8Р-АЗ+ Интести-бактериофаг в соотношении 1:9), Биофармацевтическая композиция II (экзометаболит пробиотической культуры штамма  KШ+ Секстафаг в соотношении 1:9); Экзометаболит I (экзометаболит пробиотической культуры штамма  8Р-АЗ), Экзометаболит II (экзометаболит пробиотической культуры штамма  KШ + экзометаболит пробиотической культуры штамма 1, Интести-бактериофаг, Секстафаг (Пиобактериофаг поливалентный), коммерческий препарат Хилак-форте – все препараты были приведены к значению рН, равному 6,5 – 6,8. Диффузия препарата в агар приводила к формированию зоны подавления роста тест-культуры вокруг дисков. Результаты учитывали путем измерения зоны ингибирования роста тест-штамма.
Определение антимикробной активности дискодиффузионным методом
Таблица 1
<b>Образец</b>
<b>Зона ингибирования роста, мм</b>
Биофармацевтическая композиция I*
18,7±0,2
Биофармацевтическая композиция II*
18,2±0,1
Экзометаболит I
6,5±0,2
Экзометаболит II
2,6±0,2
Хилак-форте
Отсутствие зоны ингибирования
Интести-бактериофаг
15,1±0,2
Секстафаг
14,6±0,3
Примечание:
Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, энтеропатогенными Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae, Salmonella
Shigella
Sh. flexneri
Sh. sonnei
* Величина зоны ингибирования рассчитана как среднее значение зон ингибирования на  восьми газонах культур  различных серогрупп,  групп А, В, С, D, Е,  ( 1, 2, 3, 4, 6 сероваров, ).
Полученные данные свидетельствуют что, биофармацевтические композиции I и II в данном тесте обладают более выраженным антибактериальным действием в сравнении с комплексными бактериофагами, экзометаболитами пробиотических культур и коммерческим препаратом Хилак-форте.
Специфическая антимикробная активность комплексного препарата
Staphylococcus
Streptococcus
Enterococcus
Proteus
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Salmonella
Shigella
Sh. flexneri
Sh. Sonnei)
Специфическую антимикробную активность определяли титрованием по методу Аппельмана путем наибольшего разведения, при котором препарат проявляет антимикробный эффект в отношении тест-штаммов  spp.,  spp.,  spp.,  spp., , энтеропатогенными  различных серогрупп, ,  групп А, В, С, D, Е,  ( 1, 2, 3, 4, 6 сероваров, .
Исследуемые препараты
L. plantarum
L. acidophilus
3
24
: Биофармацевтическая композиция I (экзометаболит пробиотической культуры штамма  8Р-АЗ + Интести-бактериофаг в соотношении 1:9), Биофармацевтическая композиция II (экзометаболит пробиотической культуры штамма  KШ+ Секстафаг в соотношении 1:9); Интести-бактериофаг, Секстафаг (Пиобактериофаг поливалентный) – все препараты были приведены к значению рН 6,5 – 6,8.
Специфическая антимикробная активность
Таблица 2
Микроорганизм
Специфическая активность по Аппельману(Средний титр по препарату)
Интести-бактериофаг
Секстафаг
Биофармацевтическая композиция I
Биофармацевтическая композиция II
<i>Klebsiella pneumoniae</i>
-*
10<sup>-6,00±0,00</sup>
-*
10<sup>-6,00±0,00</sup>
<i>Streptococcus spp.</i>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
<i>Proteus vulgaris et mirabilis</i>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
<i>Escherichia coli</i>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
<i>Staphylococcus spp.</i>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
<i>Pseudomonas aeruginosa</i>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
<i>Staphylococcus spp.</i>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
<i>Salmonella групп А,В,С,D,Е, </i>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
-*
10<sup>-6,00±0,00</sup>
-*
<i>Shigella (Sh.flexneri 1,2,3,4,6 сероваров, Sh. sonnei).</i>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
-*
10<sup>-6,00±0,00</sup>
-*
Примечание:
*Отсутствует в составе препарата
Из представленных данных видно, что специфическая антибактериальная активность биофармацевтических композиций сопоставима со специфической активностью коммерческих препаратов бактериофагов.
Пробиотическая активность комплексного препарата
Bifidobacterium bifidum
B. bifidum
Lactobacillus acidophilus
L. plantarum
3
24
Пробиотическую активность определяли по накоплению биомассы тест-штамов 1,  791,  КШ и  8Р-А3. В качестве питательной среды использовали 0,5% стерильный раствор глюкозы. В 24 мл питательной среды в пробирке вносили 3 мл испытуемого препарата и такой же объем культуры лакто- или бифидобактерий. В контроле вместо препарата добавляли аналогичное количество физиологического раствора. Посевы выдерживали в термостате при температуре (37±1)ºС в течение (22±2) часа с лактобактериями и (44±4) часа с бифидобактериями. Рост бактериальных культур оценивали по величине оптической плотности (ОD) в контрольном и исследуемом образце на фотоэлектроколориметре «КФК-3» в кювете с толщиной слоя 3 мм при длине волны 540 нм. Уровень стимуляции бактериальных культур выражали с помощью коэффициента (КС роста)
опыт
контроль
КС роста= ОD/ ОD, где
опыт
ОD– средний  показатель в опытной пробе,
контроль
ОD– средний  показатель в контрольной пробе.
Исследуемые препараты
L. plantarum
L. acidophilus
L. plantarum
L. acidophilus
L. plantarum
L. acidophilus
L. acidophilus
+
B. bifidum
3
24
3
24
3
24
3
24
: Биофармацевтическая композиция I (экзометаболиты пробиотических культур штаммов  8Р-АЗ и  KШ+ Интести-бактериофаг в соотношении 1:9), Биофармацевтическая композиция II (экзометаболиты пробиотических культур штаммов  8Р-АЗ и  KШ+ Секстафаг в соотношении 1:9); Биофармацевтическая композиция III (экзометаболиты пробиотических культур штаммов  8Р-АЗ и  KШ+ монобактериофаг Стафилококковый в соотношении 1:9), экзометаболит пробиотической культуры штамма  KШэкзометаболит пробиотической культуры штамма 791, коммерческий препарат Хилак-форте – все препараты приведены к значению рН 6,5-6,8.
Влияние комплексного препарата на накопление
B. bifidum
биомассы штамма 1
Таблица 3
<b>Образец</b>
<b>Прирост оптической плотности</b><b>(ОD, λ=540нм)</b>
<b>Опыт</b>
<b>Контроль</b>
<b>КС</b><b>роста</b>
Биофармацевтическая композиция I
0,380±0,02
0,085±0,02
4,47
Биофармацевтическая композиция II
0,380±0,02
4,47
Биофармацевтическая композиция III
0,380±0,02
4,47
Экзометаболит пробиотической культуры <i>L. acidophilus</i> K<sub>3</sub>Ш<sub>24 </sub><i>+ </i>экзометаболит пробиотической культуры <i>B. bifidum </i>791
0,351±0,01
4,13
Хилак-форте
0,228±0,02
2,68
Результаты исследования пробиотической активности показали, что биофармацевтические композиции I, II и III обладают высоким стимулирующим эффектом, сопоставимым с действием экзометаболититов пробиотических культур и коммерческого препарата Хилак-форте, что свидетельствует о наличие у биофармацевтической композиции выраженного пробиотического эффекта.
Оценка стабильности препаратов в процессе хранения
Staphylococcus
Streptococcus
Enterococcus
Proteus
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Salmonella
Shigella
Sh. flexneri
Sh. sonnei
При изучении стабильности полученных препаратов активность бактериофага по методу Аппельмана выражали в титрах (наибольшее его разведение, которое подавляет рост тест-штаммов в условиях данного опыта). В качестве тест-штаммов использовали  spp.,  spp.,  spp.,  spp., , энтеропатогенными  различных серогрупп, ,  групп А, В, С, D, Е,  ( 1, 2, 3, 4, 6 сероваров, ). А пробиотическую активность выражали коэффициентом стимуляции роста тест-штамма.
Исследуемые препараты
L. plantarum
L. acidophilus
L. acidophilus
B. bifidum
3
24
3
24
: Биофармацевтическая композиция (экзометаболиты пробиотических культур штаммов  8Р-АЗ и  KШ+ Интести-бактериофаг в соотношении 1:9), Интести-бактериофаг, Секстафаг (Пиобактериофаг поливалентный), экзометаболит пробиотической культуры штамма  KШ+ экзометаболит пробиотической культуры штамма 791. Все препараты имели уровень рН 6,5 - 6,8.
Стабильность препаратов в процессе хранения
Таблица 4.
Срок хранения(мес.)
Специфическая активность по Аппельману(Средний титр по препарату)
Пробиотическая активность(Коэффициент стимуляции роста штамма <i>B. bifidum </i>1)
Интести-бактериофаг
Секстафаг
Биофармацевтическая композиция
Экзометаболит пробиотической культуры <i>L. acidophilus</i> K<sub>3</sub>Ш<sub>24 </sub><i>+</i>Экзометаболит пробиотической культуры <i>B. bifidum </i>791
Биофармацевтическая композиция
0
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
4,13
4,47
6
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
4,13
4,47
12
10<sup>-5,80±0,37</sup>
10<sup>-5,90±0,27</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
4,13
4,47
18
10<sup>-5,70±0,37</sup>
10<sup>-5,80±0,37</sup>
10<sup>-6,00±0,00</sup>
4,13
4,47
24
10<sup>-5,60±0,20</sup>
10<sup>-5,60±0,37</sup>
10<sup>-5,80±0,20</sup>
4,13
4,47
30
10<sup>-5,40±0,24</sup>
10<sup>-5,60±0,20</sup>
10<sup>-5,60±0,24</sup>
4,13
4,46
36
10<sup>-4,8±0,00</sup>
10<sup>-5,0±0,37</sup>
10<sup>-5,20±0,23</sup>
4,11
4,46
Из представленных данных видно, что специфическая антибактериальная и пробиотическая активность биофармацевтической композиции сохраняется на высоком уровне при хранении в течении 36 мес при температуре от +2°С до +8°С. Наличие метаболитного пробиотического компонента способствует высокой сохраняемости специфической антибактериальной активности композиции.