МОДУЛЯЦИЯ УРОВНЯ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ АРОМАТА КОФЕ В СЫРЫХ (НЕОБЖАРЕННЫХ) КОФЕЙНЫХ ЗЕРНАХ
MODULATION OF COFFEE AROMA PRECURSORS IN RAW (NON-FRIED) COFFEE GRAIN

Уровень техники.
Кофе содержит очень сложную смесь ароматических молекул. До насто щего времени в ходе интенсивных исследований состава напитков из быстрорастворимого и свежемолотого кофе идентифицировано свыше 850 соединений, многие из которых представл ют собой активные ароматические молекулы (Flament I. (2002) Coffee Flavor Chemistry, John Wiley and Sons, UK). Однако некоторые из ароматических молекул, обнаруженных в чашке готового кофе, присутствуют в сырье, т.е. в сырых зернах (зеленых бобах) растений видов Coffea arabica или Coffea canephora (robustd). Фактически большинство ароматических соединений кофе генерируетс  в процессе одной или более многочисленных стадий обработки, начина  со сбора зрелых красных плодов кофейного дерева и конча  готовым продуктом из обжаренных молотых зерен кофе или экстрактами из них, например, растворимым кофе.
Различные стадии производства кофе описаны Smith A.W., in Coffee; Volume 1: Chemistry, pp.1-41, dark R.J. and Macrea R. Eds. Elsevier Applied Science, London and New York, 1985; Clarke R.J., in Coffee: Botany, Biochemistry, and Production of Beans and Beverage, pp.230-250 and pp.375-393; and Clifford M.N. and Willson K.C., Eds. Croom Helm Ltd., London. Если говорить кратко, то процесс начинаетс  со сбора зрелых, выдержанных красных плодов (кост нок) кофейного дерева. Затем может удал тьс  наружный слой, или перикарпий, с применением либо сухого, либо влажного способа. Сухой способ  вл етс  наиболее простым и включает: 1) классификацию и мойку плодов, 2) сушку плодов после классификации (либо естественной воздушной сушкой, либо механическим способом) и 3) шелушение высушенных плодов с целью удалени  сухого перикарпи . Влажный способ  вл етс  несколько более сложным и обычно приводит к производству высококачественных зеленых бобов. Влажный способ чаще ассоциируетс  с плодами С. arabica. Влажный способ включает (1) классификацию плодов кофейного дерева, (2) удаление плодовой м коти (пульпы), эта стади  проводитс  сразу после сбора плодов и обычно включает механическое удаление "пульпы", или перикарпи , из зрелых плодов, (3) "ферментацию", т.е. удаление слизи, остающейс  на зернах плодов после удалени  м коти, путем инкубации их вместе с оставшейс  слизью водой в танках в периодическом режиме (процесс "ферментации" может продолжатьс  в течение до 80 часов, хот  зачастую 24 часов бывает вполне достаточно дл  достижени  приемлемой ферментации и снижени  рН примерно с 6,8-6,9 до 4,2-4,6 под действием различной ферментной активности и метаболическим действием микроорганизмов, рост которых происходит в процессе ферментации), (4) сушку (эта стади  включает либо воздушную, либо механическую сушку нагретым воздухом ферментированного кофейного зерна) и (5) "лущение", эта стади  включает механическое удаление "пергаментной оболочки" с высушенного кофейного зерна (с так называемого высушенного кофейного зерна с пергаментной оболочкой); на этой стадии часто удал етс  также и серебриста  семенна  оболочка. Полученное после влажной или сухой обработки сырое кофейное зерно зачастую подвергают сортировке, при этом большинство процессов сортировки основано на сортировке по размерам и/или форме зерна.
Следующа  стади  обработки кофе - обжарка сырого кофейного зерна после шелушени  или лущени  обработанного сухим или влажным способом кофе, соответственно. Этот процесс зависит от времени и индуцирует значительные химические изменени  в зерне. В первой фазе обжарки происходит выпаривание оставшейс  в зерне воды за счет подачи теплоты. После испарени  основной массы воды начинаетс  собственно обжарка, когда температура повышаетс  до 190-200°С. Степень обжарки, котора  обычно регулируетс  по изменению цвета кофейного зерна, играет важную роль в формировании ароматических характеристик готового кофейного напитка. Поэтому врем  и температура обжарки строго контролируютс  в цел х достижени  требуемого ароматического профил  кофе. После обжарки провод т помол кофе с тем, чтобы облегчить экстракцию в процессе производства кофейного напитка или кофейных экстрактов (последние используютс  дл  производства быстрорастворимых кофейных продуктов). Вид помола также может вли ть на конечный аромат напитка.
th
В то врем  как по проблеме идентификации ароматических молекул в кофе проводилось значительное число научных исследований, вопросам изучени  физических и химических реакций, происход щих внутри кофейных зерен на каждой из стадий их обработки, посв щено намного меньше исследовательских работ. В большей степени это относитс  к обжарке, в ходе которой большое количество компонентов зерен подвергаетс  чрезвычайно сложной серии индуцируемых нагревом реакций (Homma S. 2001, in "Coffee: Recent Developments", R.J. dark and O.G. Vitzthum, Eds. Blackwell Science, London; Yeretzian C., et al. (2002) Eur. Food Res. Technol. 214, 92-104; Flament I. (2002) Coffee Flavor Chemistry, John Wiley and Sons, UK; Reineccius G.A., "The Maillard Reaction and Coffee Flavor", Conference Proceedings of ASIC, 16 Colloque, Kyoto, Japan 1995).
Хот  подробности большинства реакций, происход щих на различных стади х обработки кофе, остаютс  относительно не изученными, предполагаетс , что наиболее важной, генерирующей аромат реакцией, ответственной за многие оттенки, св занные с ароматом кофе,  вл етс  реакци  Май ра (Maillard reaction) в ходе обжарки кофе. Интенсивна  реакци  Май ра происходит между содержащимис  в кофейном зерне продуктами распада сахаров/полисахаридов и содержащими аминогруппу молекулами (в частности, белками, пептидами и аминокислотами) в процессе обжарки.
Очевидно, что реакци  Май ра вносит важный вклад в формирование кофейного аромата и образование ароматических молекул в процессе обжарки кофе, постольку существует взаимосв зь между уровнем первичных реагентов-участников реакции Май ра в сыром кофейном зерне и качеством аромата, формирующегос  после обжарки.
Как отмечалось выше, важной группой субстратов в реакции Май ра  вл ютс  аминокислоты, пептиды и белки. С использованием двумерного (2-D) электрофореза было показано, что существуют различи  в уровн х и количествах основных запасных белков в сыром (необжаренном) кофейном зерне между сортами арабика (arabica) и робуста (robusta), однако взаимосв зи между указанными различи ми в содержании запасных белков и качеством аромата установить не удалось (Rogers et al., 1999, Plant Physiol. Biochem. Vol.37, 261-272). В последнее врем  было обнаружено, что небольшие различи  существуют и между запасными белками незрелых и зрелых кофейных зерен, обладающих различным качеством аромата (Montavon Р. et al., 2003, J. Agric. and Food Chemistry Vol.51, 2328-2334). Поскольку в процессе созревани  зерен происходит много изменений, в этой последней работе высказываетс  предположение о возможном существовании св зи между улучшением качества, вызываемым созреванием зерен, и различи ми в миграции основных запасных белков кофейных зерен в 2-D геле.
В последнее врем  было установлено, что существуют различи  и в профил х пептидов, выделенных из сырых кофейных зерен сортов арабика и робуста (Ludwig et al., 2000, Eur. Food Res. Technol., Vol.211, 111-116). Хот  результаты указанных авторов показали, что пептидные экстракты из арабики и робусты различаютс  профилем предшественников аромата, данные, представленные в их работе, не идентифицируют, какой компонент (компоненты) в экстрактах  вл етс / вл ютс  ответственными за указанные различи  в профил х предшественников аромата. Эти ученые обнаружили также, по меньшей мере, две различные протеазные активности в неочищенных экстрактах из сырого (необжаренного) кофейного зерна, которые, однако, не коррелировали ни с какой специфической активностью, св занной с качеством аромата (Ludwig et al., 2000, Eur. Food Res. Technol., Vol.211, 111-116). И, наконец, также выдвинуто предположение о том, что очень высокие температуры на поздних стади х обжарки сырого кофейного зерна вызывают значительный распад белков, присутствующих в кофейном зерне (Homma S. 2001, в "Coffee: Recent Developments". R.J. dark and O.G. Vitzthum, Eds. Blackwell Science, London; Montavon, P., et al., 2003, "Changes in green coffee protein profiles during roasting = Изменени  белковых профилей сырого кофейного зерна в процессе его обжарки", J. Agric. Food Chem. 51, 2335-2343). Однако обща  схема этого распада белков очень плохо изучена, но предположительно она зависит, помимо прочего, от определенного состо ни  основных белков кофе в сырье до начала обжарки. Насколько известно авторам насто щей за вки, других значительных публикаций о возможном участии пептидного профил  кофе в формировании аромата кофе не имеетс .
th
В процессе обжарки ферментированных сем н Theobroma cacao (какао-бобов), как предполагаетс , содержащиес  в семенах аминокислоты и пептиды вовлекаютс  в формирование аромата с помощью реакции Май ра. В сравнении с семенами других растений, семена Т. cacao обладают, как было показано, необычайно высоким уровнем специфичной к аспарагиновой кислоте протеазной активности (Biehl В., Voigt J., Voigt G., Heinrichs H., Senyuk V. and Bytof G. (1994) "pH dependent enzymatic formation of oligopeptides and amino acids, the aroma precursors in raw cocoa beans = рН-зависимое ферментативное образование олигопептидов и аминокислот - предшественников аромата в сырых какао-бобах"; в The Proceedings of the 11 International Cocoa Research Conference, 18-24 July 1993, Yamoussoukro, Ivory Coast). Дл  получени  какао-бобов с высоким уровнем предшественников аромата какао необходимо проводить стадию естественной ферментации (при обжарке неферментированных какао-бобов формируетс  очень слабый аромат). Во врем  этой стадии ферментации сахара плодовой м коти ферментируютс , генериру  высокий уровень кислот, в частности, уксусной кислоты (Carr J.G. (1982) Cocoa. В Fermented Foods. Economic Microbiology. Vol.7, pages 275-292, A.H. Rose ed., Academic Press). По мере продолжени  ферментации рН в семенах снижаетс , и клеточные структуры разрушаютс . Низкий рН инициирует мобилизацию и/или активацию специфичной к аспарагиновой кислоте протеазы, содержащейс  в большом количестве в семенах какао, что приводит к массовому распаду клеточного белка (Biehl В., Passem D. and Sagemann W. (1982) "Effect of Acetic Acid on Subcellular Structures of Cocoa Bean Cotyledons = Вли ние уксусной кислоты на субклеточные структуры сем долей какао-бобов". J. Sci. Food Agric. 33, 1101-1109; Biehl В., Brunner E., Passem D., Quesnel V.C. and Adomako D. (1985) "Acidification, proteolysis and flavour potential in fermenting cocoa beans = Подкисление, протеолиз и ароматический потенциал в ферментированных какао-бобах". J. Sci. Food Agric. 36, 583-598). Пептиды и аминокислоты, как было показано,  вл ютс  предшественниками аромата какао (Rohan Т., 1964, "The precursors of chocolate aroma: a comparative study of fermented and unfermented cocoa beans = Предшественники шоколадного аромата: сравнительное исследование ферментированных и неферментированных какао-бобов". J. Food Sci., 29, 456-459; Voigt J. and Biehl В., 1995, "Precursors of the cocoa specific aroma components are derived from the vicilin-class (7S) globulin of the cocoa seeds by proteolytic processing = Предшественники компонентов специфического аромата какао образуютс  из глобулина класса викилина (7S) какао-бобов путем протеолиза". Bot. Acta, 108, 283-289). Таким образом, специфична  к аспарагиновой кислоте протеаза сем н Т. cacao вместе с содержащейс  в семенах серин-карбоксипептидазой  вл ютс , как предполагаетс , критическими дл  образовани  предшественников аромата какао в процессе ферментации (Voigt J. and Biehl В., 1995, "Precursors of the cocoa specific aroma components are derived from the vicilin-class (7S) globulin of the cocoa seeds by proteolytic processing". Bot. Acta 108, 283-289; Voigt J., Heinrichs H., Voigt G. and Biehl В., 1994, "Cocoa-specific aroma precursors are generated by proteolytic digestion of the vicilin-like globulin of cocoa seeds = Предшественники специфического аромата какао образуютс  в результате протеолиза глобулина класса викилина (7S) какао-бобов". Food Chemistry, 50, 177-184). Идентифицирован ген, кодирующий специфичную к аспарагиновой кислоте протеазу, содержащуюс  в большом количестве в семенах какао, а совсем недавно в опубликованной за вке на Международный патент №02/04617, включенной в полном объеме в перечень ссылок к насто щей за вке, описан метод сверхэкспрессии указанного белка в семенах какао, который может генерировать повышенный уровень аминокислот и пептидов -предшественников аромата какао в ферментированных какао-бобах. Однако содержание опубликованной за вки на Международный патент №02/04617 направлено на семена какао, которые подвергаютс  специфической длительной стадии кислотной ферментации, в отличие от кофейных зерен, которые не подвергаютс  такой ферментации.
Важной цистеинпротеазой (СР, cysteine proteinase) вакуолей  вл етс  KDEL-содержаща  цистеинпротеаза. Этот тип протеазы был охарактеризован в нескольких растени х. В последнее врем  были обнаружены три гена, кодирующие цистеинпротеазы с С-концевыми KDEL последовательност ми в arabidopsis (Gietl С. and Schmid M., 2001, Naturwissenschaften, 88, 49-58). Один экспрессируетс  в стареющих сем почках, второй - в сосудах, а третий - в зрелых стручках. Однако более подробные исследовани  этого белка были проведены в других растени х. Например, СР, называема  сульфгидрильной эндопротеазой (SH-EP), была охарактеризована в сем дол х сем н Vigna mungo (Toyooka К., Okamoto Т. and Minamikawa Т., 2000, J. Cell Biol. 148, 453-463). SH-EP экспрессируетс  de novo в прорастающих сем дол х V. mungo', предполагаетс , что она вовлекаетс  в распад запасных белков, аккумулированных в запасающих белки вакуол х (Okamoto Т. and Minamikawa Т. J. Plant Physiol. 152, 675-682). Ключевым отличием SH-EP полипептида  вл етс  то, что он обладает специфической СООН-концевой последовательностью KDEL, котора  управл ет транспортом этого белка из эндоплазматического ретикулума (ER) в запасающие белки вакуоли (Toyooka et al., 2000). В последнее врем  выдвинуто также предположение о том, что SH-EP белок действительно вовлекаетс , благодар  наличию в нем KDEL последовательности, в образование специфических везикул, называемых KV (KDEL Vesicles), в ранее не описанной в литературе везикул рной транспортной системе (Okamoto Т., Shimada Т., Hara-Nishimura I., Nishimura M. and Minamikawa Т., 2003, Plant Physiology, 132, 1892-1900).
Аналогичное предположение было сделано и в отношении KDEL-содержащего СР белка, обнаруженного в прорастающих сем дол х касторового боба (Ricinus communis). В этом растении, как подразумевают авторы, указанна  KDEL-содержаща  протеаза в рамках запрограммированной гибели клеток (алоптоза) эндосперма продолжает поставл ть питательные вещества дл  прорастающего зародыша касторового боба (Gietl С. and Schmid M., 2001, Naturwissenschaften, 88, 49-58). Указанные авторы предполагают, что в касторовом бобе KDEL протеаза образуетс  в ER прорастающих сем н до наступлени  3-их суток. Когда семенна  оболочка сбрасываетс , примерно на 3 сутки, KDEL-содержащий СР оказываетс  упакованным в специфическую везикулу, называемую рициносомой. Позднее, когда эндосперм становитс  м гким (между 4 и 5 сутками), от KDEL-CP отщепл етс  прикрепивша с  последовательность (KDEL), и эта протеаза мигрирует в цитоплазму, где она участвует в основном распаде клеточного белка.
Раскрытие изобретени
Целью насто щего изобретени   вл етс  модификаци  пула белковых/пептидных/аминокислотных предшественников аромата в кофе.
Если говорить более конкретно, то целью насто щего изобретени   вл етс  модификаци  уровн  предшественников аромата в сырье (сыром кофейном зерне) таким образом, чтобы в процессе последующей послеуборочной обработки и обжарки мог достигатьс  измененный аромат. Не останавлива сь на теории, авторы за вки выдвинули предположение, что, если между сортами кофе с совершенно разным ароматом существуют различи  в уровне пептидов и распада белка, то эти различи  скорей всего обусловлены разной эндогенной протеазной активностью в указанных сортах кофейного зерна. Эти различи  могут быть обнаружены по различию в уровне экспрессии мРНК при экспрессии определенных генов протеазы кофейного зерна.
Таким образом, насто щее изобретение включает идентификацию последовательностей генов, кодирующих специфичные протеазы кофейного зерна (сем н), и доказательство того, что различи  в экспрессии этих генов в арабике и робусте существуют на самом деле.
Если говорить более конкретно, то насто щее изобретение раскрывает две основные цистеинпротеазы кофе (СсСР-1 и СсСР-4), четыре ингибитора основных цистеинпротеаз кофе (CcCPI-1, CcCPI-2, CcCPI-3 и CcCPI-4) и две специфичные к аспарагиновой кислоте протеазы кофе (СсАР-1 и СсАР-2), все из которых экспрессируютс  в кофейном зерне. Авторы за вки показывают, как сверхэкспресси  этих белков, особенно на поздней стадии развити  зерна, или пониженна  экспресси  указанных белков, особенно на поздней стадии развити  зерна, может изменить аминокислотный/пептидный/белковый профиль зрелого зерна. Использу  одну или более раскрытых последовательностей и генных конструкций дл  изменени  аминокислотного/пептидного/белкового профил  зрелых кофейных зерен, авторы за вки открыли новый способ изменени  профил  предшественников аромата в зрелом кофейном зерне.
В первом аспекте насто щее изобретение обеспечивает изолированный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий цистеинпротеазной активностью, в котором аминокислотна  последовательность полипептида и аминокислотна  последовательность, выбираема  из SEQ ID No 2 или 16, идентичны, по меньшей мере, на 70%, предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, при этом идентичность последовательностей основываетс  на методе выравнивани  ClustalW; или комплемент нуклеотидной последовательности, в которой комплемент содержит такое же число нуклеотидов, что и нуклеотидна  последовательность, и комплемент и нуклеотидна  последовательности  вл ютс  на 100% комплементарными. Предпочтительно аминокислотна  последовательность полипептида и аминокислотна  последовательность SEQ ID No 2 или 16 идентичны, по меньшей мере, на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 90% и необ зательно, по меньшей мере, на 95%, при этом идентичность последовательностей основываетс  на методе выравнивани  ClustalW. Предпочтительно нуклеотидна  последовательность содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID No 1 или 15. Предпочтительно полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No 2 или 16.
Во втором аспекте обеспечиваетс  изолированный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий активностью ингибитора цистеинпротеазы, в котором аминокислотна  последовательность полипептида и аминокислотна  последовательность, выбираема  из SEQ ID No 4, 10, 12 и 14, идентичны, по меньшей мере, на 70%, предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, при этом идентичность последовательностей основываетс  с помощью метода выравнивани  ClustalW; или комплемент нуклеотидной последовательности, в котором комплемент содержит такое же число нуклеотидов, что и нуклеотидна  последовательность, и комплемент и нуклеотидна  последовательность  вл ютс  на 100% комплементарными. Предпочтительно аминокислотна  последовательность полипептида и аминокислотна  последовательность SEQ ID No 4, 10, 12 и 14 идентичны, по меньшей мере, на 85%, предпочтительно, по меньшей мере, на 90% и необ зательно, по меньшей мере, на 95%, при этом идентичность последовательностей основываетс  на методе выравнивани  ClustalW. Предпочтительно нуклеотидна  последовательность содержит нуклеотидную последовательность, выбираемую из SEQ ID No 3, 9, 11 или 13, необ зательно из SEQ ID No 9, 11 или 13, также необ зательно из SEQ ID No 9 или 13, либо, что тоже необ зательно, из SEQ ID No 9. Предпочтительно полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбираемую из SEQ ID No 4, 10, 12 и 14, необ зательно из SEQ ID No 10, 12 и 14, также необ зательно из SEQ ID No 10 или 14, либо, что тоже необ зательно, из SEQ ID No 10.
В третьем аспекте обеспечиваетс  изолированный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий специфичной к аспарагиновой кислоте эндопротеазной активностью, в котором аминокислотна  последовательность полипептида и аминокислотна  последовательность, выбираема  из SEQ ID No 6 или 8, предпочтительно из SEQ ID No 8, идентичны, по меньшей мере, на 75%, предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, при этом идентичность последовательностей основываетс  на методе выравнивани  ClustalW; или комплемент нуклеотидной последовательности, в котором комплемент содержит такое же число нуклеотидов, что и нуклеотидна  последовательность, и комплемент и нуклеотидна  последовательность  вл ютс  на 100% комплементарными. Предпочтительно аминокислотна  последовательность полипептида и аминокислотна  последовательность, выбираема  из SEQ ID No 6 или 8, предпочтительно из SEQ ID No 8, идентичны, по меньшей мере, на 85%, предпочтительно, по меньшей мере, на 90% и, необ зательно, по меньшей мере, на 95%, при этом идентичность последовательностей основываетс  на методе выравнивани  ClustalW. Предпочтительно нуклеотидна  последовательность содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID No 5 или 7, предпочтительно SEQ ID No 7. Предпочтительно полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No 6 или 8, предпочтительно SEQ ID No 8.
В следующем аспекте обеспечиваетс  вектор, содержащий полинуклеотид согласно любому из предшествующих (с первого по третий) аспектов изобретени .
В следующем аспекте обеспечиваетс  конструкци  чужеродной рекомбинантной ДНК, содержаща  полинуклеотид согласно любому из предшествующих (с первого по третий) аспектов изобретени , оперативно св занный с регул торной последовательностью. Важно, чтобы в чужеродной конструкции либо полинуклеотид был чужеродным, либо регул торна  последовательность была чужеродной, либо оба они были чужеродными.
В следующем аспекте обеспечиваетс  метод трансформации клетки, предусматривающий трансформацию клетки полинуклеотидом согласно любому из предшествующих (с первого по третий) аспектов насто щего изобретени .
В следующем аспекте обеспечиваетс  клетка, содержаща  вышеупом нутую конструкцию чужеродной рекомбинантной ДНК, в которой клетка предпочтительно  вл етс  прокариотической клеткой, эукариотической клеткой или растительной клеткой, предпочтительно клеткой кофейного дерева.
В следующем аспекте обеспечиваетс  трансгенное растение, содержащее такую трансформированную клетку.
В контексте насто щего описани  термин "плод кофейного дерева" (coffee cherry) обозначает кост нку (плод) кофейного дерева; целый плод; экзокарпий (кожица); перикарпий (м систый основной наружный слой плода); кофейное зерно. Более подробное разъ снение указанного термина см. Clarke R.J., Coffee: Botany,Biochemistry, and Production of Beans and Beverage, pp.230, Clifford M.N. and Willson K.C. eds, Croom Helm Ltd., London (указанный источник в полном объеме включен в перечень ссылок к насто щей за вке).
Изобретение можно лучше пон ть из нижеследующего подробного описани  и сопровождающего его Перечн  последовательностей, который  вл етс  частью насто щей за вки.
В приведенной ниже таблице 1 перечислены описанные в насто щем изобретении полипептиды вместе с идентификатором соответствующих последовательностей (SEQ ID No).
Таблица 1
 
SEQ ID No 1 (CcCP1: цистеинпротеаза, нуклеинова  кислота и соответствующие ей аминокислоты)
 
SEQ ID No 2 (CcCP1: цистеинпротеаза, аминокислоты)
 
SEQ ID No 3 (CcCPI-1: ингибитор цистеинпротеазы, нуклеинова  кислота и соответствующие ей аминокислоты)
 
SEQ ID No 4 (CcCPI-1: ингибитор цистеинпротеазы, аминокислоты)
 
SEQ ID No 5 (CcAPl: специфична  к аспарагиновой кислоте эндопротеаза 1, нуклеинова  кислота и соответствующие ей аминокислоты)
 
SEQ ID No 6 (CcAP1: специфична  к аспарагиновой кислоте эндопротеаза 1, аминокислоты)
 
SEQ ID No 7 (СсАР2: специфична  к аспарагиновой кислоте протеаза 2, нуклеинова  кислота и соответствующие ей аминокислоты)
 
SEQ ID No 8 (СсАР2: специфична  к аспарагиновой кислоте протеаза 2, аминокислоты)
 
SEQ ID No 9 (CcCPI-2: ингибитор цистеинпротеазы, нуклеинова  кислота и соответствующие ей аминокислоты)
 
SEQ ID No 10 (CcCPI-2: ингибитор цистеинпротеазы, аминокислоты)
 
SEQ ID No 11 (CcCPI-3: ингибитор цистеинпротеазы, нуклеинова  кислота и соответствующие ей аминокислоты)
 
SEQ ID No 12 (CcCPI-3: ингибитор цистеинпротеазы, аминокислоты)
 
SEQ ID No 13 (CcCPI-4: ингибитор цистеинпротеазы, нуклеинова  кислота и соответствующие ей аминокислоты)
 
SEQ ID No 14 (CcCPI-4: ингибитор цистеинпротеазы, аминокислоты)
 
SEQ ID No 15 (СсСР-4: цистеинпротеаза, нуклеинова  кислота и соответствующие ей аминокислоты)
 
SEQ ID No 16 (СсСР-4: цистеинпротеаза, аминокислоты)
 
В перечне последовательностей однобуквенные коды обозначают нуклеотидные последовательности, а трехбуквенные коды обозначают аминокислоты, как они определ ютс  в стандартах IUPAC-IUBMB и как они описываютс  в Nucleic Acids Research 13: 3021-3030 (1985), котора  включена в перечень ссылок к насто щей за вке.
Краткое описание чертежей.
Фигура 1 показывает нозерн-блот анализ гена цистеинпротеазы в различных ткан х Coffea arabica, в котором дорожки в геле обозначены следующим образом: R -корневище; S - стебель; L - молодые листочки; SG, LG, Y и Red - зерно из мелких зеленых плодов, крупных зеленых плодов, желтых плодов и красных плодов, соответственно. Загрузка суммарной РНК в каждую дорожку гел  составила п ть микрограммов. MW обозначает маркерную "лесницу" размеров РНК. Панель В представл ет собой авторадиограмму через 24 часа экспозиции, показывающую по вление СсСР-1 мРНК в исследуемых ткан х, а панель А показывает гель, окрашенный бромистым этидием перед блоттингом.
Фигура 2 показывает нозерн-блот анализ экспрессии гена СсСР-1 цистеинпротеазы в различных ткан х Coffea arabica, в котором дорожки в геле обозначены следующим образом: R - корневище; S - стебель; L - молодые листочки; F - цветки; SG(g), LG(g), Y(g) и Red(g) соответствуют РНК, выделенной из зерна мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов, соответственно, а дорожки в геле, обозначенные SG(p), LG(p), Y(p) и Red(p), соответствуют РНК, выделенной из ткани перикарпи  мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов, соответственно. Загрузка суммарной РНК в каждую дорожку гел  составила п ть микрограммов. Панель А показывает окрашенные бромистым этидием большие субъединицы рибосомальной РНК перед блоттингом, которые  вл ютс  контролем загрузки, а панель В представл ет собой авторадиограмму, показывающую по вление СсСР-1 мРНК в специфических исследуемых ткан х.
Фигура 2А: Выравнивание полноразмерной последовательности белка, кодируемого СсСР-1 кДНК, по отношению к другим полноразмерным цистеинпротеазам из базы данных NCBI. Оно выполн лось с использованием программы CLUSTAL из пакета программ MegAlign (DNASTAR). Зачерненные блоки показывают идентичные аминокислоты. Номера доступа в базу данных EMBL указываютс  в круглых скобках: Arabidopsis thaliana (AY070063); Vicia sativa (Z99172); Glycine max. GMCP3 (Z32795); Glycine max GmPM33 (AF 167986); Phaseolus vulgaris Moldavain (Z99955); Solanum melongena (AF082181); Nicotiana tabacum (AJ242994); Lycopersicon esculentum (Z14028); Vicia faba (АY161277).
Фигура 3 показывает нозерн-блот анализ гена ингибитора цистеинпротеазы (CcCPI-1) в различных ткан х Coffea arabica, в котором дорожки в геле обозначены следующим образом: R - корневище; S - стебель; L - молодые листочки; SG, LG, Y и Red - зерно из мелких зеленых плодов, крупных зеленых плодов, желтых плодов и красных плодов, соответственно. Загрузка суммарной РНК в каждую дорожку гел  составила п ть микрограммов. MW обозначает маркерную "лесницу" размеров РНК. Панель В представл ет собой авторадиограмму через 24 часа экспозиции, а панель А показывает гель, окрашенный бромистым этидием перед блоттингом.
Фигура 4 показывает нозерн-блот анализ гена ингибитора цистеинпротеазы (CcCPI-1) на различных стади х развити  плодов Coffea arabica (ARA) и Coffea robusta (ROB). Дорожки вгеле обозначены следующим образом: мелкий зеленый плод  (SG), крупный зеленый плод (LG), желтый плод (Y) и красный плод (Red), соответственно. Загрузка суммарной РНК в каждую дорожку гел  составила п ть микрограммов. MW обозначает маркерную "лесницу" размеров РНК. Панель В представл ет собой авторадиограмму через 24 часа экспозиции, показывающую по вление CcCPI-1 мРНК в специфических исследуемых ткан х. Панель А показывает гель, окрашенный бромистым этидием перед блоттингом.
Фигура 5 показывает анализ методом полимеразной цепной реакции с матрицы кДНК, полученной с мРНК с помощью реакции обратной транскрипции (так называемый метод RT-PCR) экспрессии гена СсСР-1 в процессе прорастани  зерна Coffea arabica. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием 10 мкл каждой реакционной смеси дл  получени  кДНК, разбавленной в соотношении 1/100. Режимы циклов ПЦР: 2 мин при 94°С и затем 35 циклов: 94°С и 61°С в течение 1,5 мин, 72°С в течение 2,5 мин. Стади  конечной достройки цепей продолжалась 7 мин при 72°С. Используемые ПЦР праймеры:
A4-43-Верхний: 5'-ACCGAGGAGGAGTTTGAGGCTACG-3'
А4-43-нижний: 5'-АСССТТСССССАТСАСТТСТТСА-3'.
0
мРНК амплифицировали методом RT-PCR с использованием специфичных праймеров (СсСР-1 верхний/СсСР-1 нижний) на различных матрицах: кДНК из стерилизованного зерна (Т) и зерен, отобранных спуст  2 суток (2d), 3 суток (3d), 5 суток (5d), 1 мес ц (1m) и 2 мес ца (2m) прорастани , соответственно. ПЦР продукты раздел ли в 1% (масса/объем) агарозном геле и окрашивали бромистым этидием. RPL39: амплифицированный фрагмент кДНК, кодирующий белок L39 большой субъединицы рибосом 60S.
Фигура 6 показывает вестерн-блот анализ экспрессии белка СсСР-1 (А). Общий белок экстрагировали из зерен (g) и перикарпи  (р), отобранных из развивающихс  плодов кофейного дерева на стади х мелких зеленых (SG), крупных зеленых (LG), желтых (Y) и красных (Red) плодов. Панель В: Разделение 50 мкг общего белка в 12% SDS-PAGE геле и окрашивание "кумасси голубым". Панель А: Обнаружение белка проводили с использованием анти-CКР4 поликлональных антител (кролика), как описываетс  в методах. Приблизительный размер окрашенных полос в панели В указан стрелками слева. Больша  стрелка внутри каждой панели указывает на присутствие основного запасного белка, который участвует в перекрестной реакции св зывани  с одним из антител.
Фигура 6А показывает оптимальное выравнивание полноразмерного белка, кодируемого CcCPI-1 кДНК, по отношению к другим гомологичным полноразмерным цистеинпротеазам из базы данных NCBI. Зачерненные блоки показывают идентичные аминокислоты. Номера доступа в базу данных EMBL и процент идентичности привод тс  в круглых скобках. Malus x domestica (AAО18638; идентичность 42,3%), Common sunflower (JE0308; идентичность 41,5%), Arabidopsis thaliana (AAM64985; идентичность 30%) и Rumex obtusifolius (CAD21441; идентичность 29,3%).
Фигура 7 показывает RT-PCR анализ экспрессии гена CcCPI-1 в различных ткан х Coffea arabica CCCA2 (А) и Coffea robusta FRT-32 (В). ПЦР проводили с использованием 10 мкл каждой смеси с полученной кДНК, разбавленной в соотношении 1/1000. Режимы циклов: 2 мин при 94°С и затем 40 циклов: 94°С, 1 мин - 60°С, 1,5 мин - 72°С, 1 мин. Стади  конечной достройки цепей продолжалась 7 мин при 72°С. Используемые ПЦР праймеры:
CcCPI-1 (верхний): 5'-AGGAAAGTGGGAGCAAGGGAGAAGA-3'
CcCPI-1 (нижний): 5'-TAGTATGAACCCAAGGCCGAACCAC-3'.
Дорожки в геле обозначены следующим образом: М - маркеры; +Р - разбавленна  плазмида, содержаща  ген CcCPI-1; R - корневище; S - стебель; L - молодые листочки; F - цветки. SGg, LGg, Yg и Rg - зерно, выбранное из мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов, соответственно. SGp, LGp, Yp и Rp - ткань перикарпи , изолированна  из мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов, соответственно.
Фигура 8 показывает оптимальное выравнивание полноразмерного белка, кодируемого CcCPI-2 кДНК, по отношению к другим гомологичным полноразмерным цистеинпротеазам из базы данных NCBI. Зачерненные блоки показывают идентичные аминокислоты. Номера доступа в базу данных EMBL и процент идентичности привод тс  в круглых скобках. Rumex obtusifolius (CAD21441; идентичность 66,7%), Dianthus caryophyllus (AAK30004; идентичность 71,7%), Manihot esculenta (AAF72202; идентичность 65,2%).
Фигура 9 показывает RT-PCR анализ экспрессии гена CcCPI-2 в различных ткан х Coffea arabica CCCA2 (А) и Coffea robusta FRT-32 (В). ПЦР проводили с использованием 10 мкл каждой смеси дл  получени  кДНК, разбавленной в соотношении 1/1000. Режимы циклов: 2 мин при 94°С и 40 циклов: 94°С, 1 мин - 57°С, 1,5 мин. - 72°С, 1 мин. Стади  конечной достройки цепей продолжалась 7 мин при 72°С. Используемые ПЦР праймеры:
CcCPI-2 (верхний): 5'-GTGAAGCCATGGTTGAACTT-3'
CcCPI-2 (нижний): 5'-GTAATGATACTCAAGCCAGA-3'.
Дорожки в геле обозначены следующим образом: М - маркеры; +Р - разбавленна  плазмида, содержаща  ген CcCPI-2; R - корневище; S - стебель; L - молодые листочки; F - цветки. SGg, LGg, Yg и Rg - зерно, выбранное из мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов, соответственно. SGp, LGp, Yp и Rp - ткань перикарпи , изолированна  из мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов, соответственно.
Фигура 10 показывает оптимальное выравнивание полноразмерного белка, кодируемого CcCPI-3 кДНК, по отношению к другим гомологичным полноразмерным цистеинпротеазам из базы данных NCBI. Зачерненные блоки показывают идентичные аминокислоты. Номера доступа в базу данных EMBL и процент идентичности привод тс  в круглых скобках. Citrus x paradisi (AAG38521; идентичность 42,4%), Actinidia deliciosa (AAR92223; идентичность 44,4%) и Arabidopsis thaliana (AAM64661; идентичность 44%).
Фигура 11 показывает оптимальное выравнивание полноразмерного белка, кодируемого CcCPI-4 кДНК, по отношению к другим гомологичным полноразмерным цистеинпротеазам из базы данных NCBI. Зачерненные блоки показывают идентичные аминокислоты. Номера доступа в базу данных EMBL и процент идентичности даютс  в круглых скобках. Citrus x paradisi (AAG38521; идентичность 23,6%) и Arabidopsis thaliana (AAM64661; идентичность 20%).
Фигура 12 показывает RT-PCR анализ экспрессии гена CcCPI-4 в различных ткан х Coffea arabica CCCA2 (А) и Coffea robusta FRT-32 (В). ПЦР проводили с использованием 10 мкл каждой смеси дл  получени  кДНК, разбавленной в соотношении 1/100. Режимы циклов были следующие: 2 мин при 94°С и 40 циклов: 94°С, 1 мин - 60°С, 1,5 мин - 72°С, 1 мин. Стади  конечной достройки цепей продолжалась 7 мин. при 72°С. Используемые ПЦР праймеры:
CcCPI-4 (верхний): 5'-CTACGGTCGCAGCCAAATC-3'
CcCPI-4 (нижний): 5'-ACAACTGCACCTTCAATGTAC-3'.
Дорожки в геле обозначены следующим образом: М - маркеры; +Р - разбавленна  плазмида, содержаща  ген CcCPI-4; R - корневище; S - стебель; L - молодые листочки; F - цветы. SGg, LGg, Yg и Rg - зерно, выбранное из мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов, соответственно. SGp, LGp, Yp и Rp - ткань перикарпи , изолированна  из мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов, соответственно.
Фигура 13 показывает нозерн-блот анализ гена специфичной к аспарагиновой кислоте протеазы 2 (СсАР2) в различных ткан х Coffea arabica, в котором дорожки в геле обозначены следующим образом: R - корневище; S - стебель; L - молодые листочки; F -цветки; SG (G) и (Р), LG (G) и (Р), Y (G) и (Р) и Red (G) и (Р) - соответственно зерно и перикарпий мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов; SG (G), LG (G), Y (G) и R (G) - перикарпий мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов кофейного дерева. В каждую дорожку гел  загружали по п ть микрограммов суммарной РНК. Панель А показывает в качестве контрол  загрузки окрашенную бромистым этидием большую рибосомальную РНК перед блоттингом, а панель В представл ет собой авторадиограмму, показывающую по вление СсАР2 мРНК в специфических исследуемых ткан х.
Фигура 14 показывает последовательность кДНК и предсказанную по ней аминокислотную последовательность СсСР-4. Строчные буквы: 5' и 3' нетранслируемые области гена. Прописные буквы: открыта  рамка считывани . Жирный шрифт: аминокислотна  последовательность; * - терминирующий трансл цию кодон (стоп-кодон).
Фигура 15 показывает выравнивание полноразмерной последовательности белка, кодируемого СсСР-4 кДНК, по отношению к другим полноразмерным цистеинпротеазам из базы данных NCBI. Оно выполн лось с использованием программы CLUSTAL W из пакета программ MegAlign (пакет Lasergene, DNASTAR). Зачерненные блоки показывают идентичные аминокислоты. Номера доступа даютс  в круглых скобках: Dacus carrota (JC7787); Ricinus communis (AF050756); Vicia sativa (Z34895); Phaseolus vulgaris (X56753); Helianthus annuus (AB109188); Glycine max Cysl (AB092555); Glycine max Cys2 (AB092557); Canavalia ensiformis (P49046); Oryza sativa (AB004648); Vigna mungo (PI 2412); Pisum sativum (AJ004985).
Фигура 16 показывает выравнивание полноразмерной кДНК последовательности СсСР-4 (KDDL) и неполной кДНК последовательности СсСР-4 (KDEL) с использованием программы ClustalW в пакете программ MegAlign.
Фигура 17 показывает выравнивание полноразмерной открытой рамки считывани  СсСР-4 (KDDL) и неполной открытой рамки считывани  СсСР-4 (KDEL) с использованием программы ClustalW в пакете программ MegAlign.
Фигура 18 показывает хроматограммы определени  последовательностей ДНК в амплифицированной методом ПЦР геномной ДНК, кодирующей KDEL/KDDL область гена СсСР-4. "Rob" обозначает сорт робуста, "Arab" - сорт арабика.
Фигура 19 показывает нозерн-блот анализ экспрессии гена цистеинпротеазы СсСР-4 в различных ткан х Coffea arabica. Дорожки в геле обозначены следующим образом: R - корневище; S - стебель; L - молодые листочки; F - цветки; SG(g), LG(g), Y(g) и Red(g) - зерно, выбранное из мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов, соответственно. SG(p), LG(p), Y(p) и Red(p) - ткань перикарпи , изолированна  из мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов кофейного дерева, соответственно. В каждую дорожку гел  загружали по п ть микрограммов суммарной РНК. Панель А показывает в качестве контрол  загрузки окрашенную бромистьм этидием большую субъединицу рибосомальной РНК перед блоттингом, а панель В представл ет собой авторадиограмму, показывающую по вление СсСР-3 мРНК в специфических исследуемых ткан х.
Фигура 20 показывает RT-PCR анализ экспрессии СсСР-4 в цельном зерне в процессе прорастани . Образцы отбирали спуст  0 суток, т.е. сразу после обработки стерилизацией, 2D - 2 суток после обработки, 3D - 3 суток после обработки, 5D - 5 суток после обработки, 1М - один мес ц после обработки, 2М - два мес ца после обработки, "-" - контроль без ДНК; +Р - разведенна  ДНК плазмиды СсСР-4; М - маркеры молекул рной массы.
Фигура 21 показывает оптимальное выравнивание полноразмерного белка, кодируемого СсАР-1 кДНК, по отношению к другим гомологичным полноразмерным последовательност ми специфичных к аспарагиновой кислоте протеаз из базы данных NCBI. Зачерненные блоки показывают идентичные аминокислоты. Номера доступа в базу данных указываютс  в круглых скобках. Arabidopsis thaliana (AY099617) и Arabidopsis thaliana (BAB09366).
Фигура 22 показывает оптимальное выравнивание полноразмерного белка, кодируемого кДНК СсАР-2, по отношению к другим гомологичным полноразмерным последовательност ми специфичных к аспарагиновой кислоте протеаз из базы данных NCBI. Зачерненные блоки показывают идентичные аминокислоты. Номера доступа в базу данных указываютс  в круглых скобках: Glycine max (BAB64296), Ipomoea batatas (ААК48494), Lycopersicon esculentum (S71591) и Nepenthes alata (BAB20972).
Осуществление изобретени .
Прин та  терминологи .
В контексте описани  термин "полинуклеотид" обозначает нуклеотидную последовательность, например, фрагмент нуклеиновой кислоты. Полинуклеотид может быть полимером РНК или ДНК, т.е. одно- или двунитевым, который необ зательно содержит синтетические, неприродные или измененные основани  нуклеотидов. Полинуклеотид в форме полимера ДНК может содержать один или более сегментов кДНК, геномной ДНК, синтетической ДНК или их смеси.
Сходные фрагменты нуклеиновых кислот характеризуютс  в насто щем изобретении процентом идентичности кодируемых ими аминокислотных последовательностей с раскрываемыми здесь аминокислотными последовательност ми, определ емым алгоритмами, традиционно используемыми квалифицированными специалистами в данной области. Пригодные дл  данной цели фрагменты нуклеиновых кислот (или выделенные полинуклеотиды согласно аспектам с первого по третий насто щего изобретени ) кодируют полипептиды, которые идентичны, по меньшей мере, на 70%, предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, аминокислотным последовательност м, раскрываемым в насто щем описании. Предпочтительные фрагменты нуклеиновых кислот кодируют аминокислотные последовательности, которые идентичны, по меньшей мере, на 85% аминокислотным последовательност м, раскрываемым в насто щем описании. Более предпочтительные фрагменты нуклеиновых кислот кодируют аминокислотные последовательности, которые идентичны, по меньшей мере, на 90% аминокислотным последовательност м, раскрываемым в насто щем описании. Еще более предпочтительными  вл ютс  фрагменты нуклеиновых кислот, которые кодируют аминокислотные последовательности, которые, по меньшей мере, на 95% идентичны аминокислотным последовательност м, раскрываемым в насто щем описании. Множественное выравнивание последовательностей должно осуществл тьс  с применением метода выравнивани  ClustalW (Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, Vol.22, p.4673-4680; Higgins & Sharp, 1989, Cabios. 5: 151-153).
В контексте описани  термин "сходные фрагменты нуклеиновых кислот" обозначает полинуклеотидные последовательности, в которых изменени  в одном или более оснований нуклеотидов привод т к замене одной или более аминокислот, но при этом указанные изменени  либо не вли ют на функцию полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью, либо не вли ют на способность фрагмента нуклеиновой кислоты служить посредником дл  сайленсинга ("замолкани ") экспрессии гена с применением, например, антисмысловой технологии или технологии коэкспрессии. Термин "сходные фрагменты нуклеиновых кислот" относитс  также к модифицированным полинуклеотидным последовательност м, в которых одно или более оснований нуклеотидов делегируетс  (делегируютс ) или встраиваетс  (встраиваютс ) при условии, что модификации либо не вли ют на функцию полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью, либо не вли ют на способность фрагмента нуклеиновой кислоты служить посредником дл  сайленсинга экспрессии гена. Отсюда можно видеть, что масштаб насто щего изобретени  выходит за рамки полинуклеотидных и полипептидных последовательностей, раскрываемых в описании.
Сходные фрагменты нуклеиновых кислот могут отбиратьс  скринингом фрагментов нуклеиновых кислот в форме субфрагментов или модифицированных фрагментов нуклеиновых кислот по их способности вли ть на уровень полипептида, кодируемого немодифицированными фрагментами нуклеиновых кислот в растении или растительной клетке.
Термин "оперативно св занный" определ ет св зывание двух или более фрагментов нуклеиновой кислоты в один фрагмент нуклеиновой кислоты таким образом, чтобы функци  одного из них вли ла на функцию другого.
Термин "регул торные последовательности" относитс  к нуклеотидным последовательност м, локализованным перед, внутри или после кодирующей последовательности, которые вли ют на транскрипцию, процессинг или стабильность РНК, либо на трансл цию кодирующей последовательности, св занной с ними. Регул торные последовательности могут включать промоторы, лидерные последовательности трансл ции, интроны, терминаторы транскрипции и последовательности распознавани  полиаденилировани . Если регул торна  последовательность в форме промотора оперативно св зана с кодирующей последовательностью, то така  регул торна  последовательность способна вли ть на экспрессию кодирующей последовательности. Кодирующие последовательности могут быть оперативно св заны с регул торными последовательност ми в смысловой или антисмысловой ориентации.
Термин "экспресси " относитс  к транскрипции (и стабильному накоплению) смысловой РНК (мРНК) или антисмысловой РНК, выделенной из фрагментов нуклеиновых кислот насто щего изобретени . Экспресси  может также относитьс  к трансл ции мРНК в полипептид. "Сверхэкспресси " относитс  к такому продуцированию генного продукта в трансгенной клетке, которое превышает уровень продуцировани  в нормальных, или нетрансформированных, клетках. Термин "измененные уровни" относитс  к продуцированию генного продукта (продуктов) в трансгенной клетке в количествах или соотношени х, которые отличаютс  от его (их) количества или соотношени  в нормальных, или нетрансформированных, клетках.
Термин "трансформаци " относитс  к переносу фрагмента нуклеиновой кислоты в геном клетки-хоз ина, привод щему к генетически стабильной наследственности. Клетки-хоз ева, содержащие трансформированные фрагменты нуклеиновых кислот, обозначаютс  в контексте описани  как "трансгенные клетки".
Стандартна  рекомбинантна  ДНК и методы молекул рного клонировани , примен емые в насто щем изобретении, хорошо известны из уровн  техники и очень подробно описаны в книге Sambrook et al. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989, котора  включена в перечень ссылок к насто щей за вке.
Примеры
Нижеследующие примеры служат иллюстрацией изобретени  и не ограничивают масштаба изобретени . В примерах количество в част х и процентах указываетс  в мас.част х и % мас., градусы - в градусах Цельси , если нет ссылки на другую размерность.
В нижеприведенных примерах используютс  следующие аббревиатуры:
ПЦР: полимеразна  цепна  реакци  (PCR, polymerase chain reaction);
RACE: скоростна  амплификаци  концов кДНК (rapid amplification cDNA ends);
RT-PCR: ПЦР с предварительным получением кДНК с матрицы РНК за счет реакции обратной транскрипции (reverse transcriptase PCR).
Из вышеприведенного обсуждени  и нижеприведенных примеров квалифицированные специалисты в данной области могут оценить существенные отличи  насто щего изобретени  и, не выход  за пределы изобретени , могут вносить различные изменени  и модификации с целью адаптации его в случае необходимости к различным област м применени  и услови м.
Получение библиотек кДНК и скрининг кДНК
Получение специфической РНК из кофейного зерна
+
Кофейные плоды сорта Robusta Q 121 собирали спуст  30 WAF (недель после цветени ) в ICCRI, Индонези . Затем из собранных плодов удал ли перикарпий, а оставшийс  материал - перисперм/эндосперм - замораживали и измельчали в порошок в жидком азоте. РНК экстрагировали из замороженного порошкообразного материала с помощью метода, описанного ранее дл  экстракции РНК из какао-бобов (Guilloteau M. et al., 2003, "Oil bodies in Theobroma cacao seeds: cloning and characterisation of cDNA encoding the 15.8 and 16.9 kDa oleosins". Plant Science, Vol.164, 597-606). Поли А РНК готовили примерно из 250 мкг суммарной РНК с использованием готового набора реактивов "PolyA Purist™" kit AMBION (фирма-изготовитель Ambion, Inc.) в соответствии с инструкцией к указанному набору.
Получение первой серии клонов кДНК из кофейного зерна.
+
-
Примерно 50-100 нг указанной поли А РНК использовали дл  синтеза первой цепи кДНК с применением готового препарата обратной транскриптазы "Superscript™ II RNase Н (GIBCOBRL™) и готового набора реактивов дл  синтеза кДНК "SMART™ PCR cDNA synthesis" (Clontech). Готовили реакционную смесь, содержащую 2 мкл 30 WAF поли А РНК, 1 мкл CDS oligo ("SMART™ PCR cDNA kit", Clontech), 1 мкл Smart II oligo ("SMART™ PCR cDNA kit", Clontech) и 8 мкл деионизованной Н20. Полученную смесь прогревали при 72°С в течение 5 минут, а затем помещали на лед. После этого добавл ли следующее: 1 мкл 10 мМ смеси дезокситринуклеотидов (dNTP), 4 мкл SuperScriptII™ буфера дл  1-й цепи и 2 мкл дитиотреитола (DTT). Эту смесь выдерживали при 42°С в течение 2 минут, после чего добавл ли 1 мкл готового препарата обратной транскриптазы "SuperScriptII™ RNaseH" reverse transcriptase" (200 единиц/мкл, GIBCO BRL™) и инкубировали смесь в термостате с циркул цией воздуха при 42°С в течение 50 минут.
После реакции обратной транскрипции проводили ПЦР. 98 мкл Master Mix, описанной в "SMART™ PCR cDNA kit" (Clontech), содержащей полимеразу Advantage™2 (готовый набор "Advantage™ 2 PCR kit", ClonTech), помещали на лед, а затем добавл ли 3 мкл описанной выше реакционной смеси дл  синтеза 1-й цепи кДНК. Эти 100 мкл смеси дл  ПЦР помещали в аппарат "MJ Research РТС-150" (НВ), в котором поддерживались следующие услови  ПЦР: 95°С в течение 1 мин, затем 16 циклов: 95°С, 15 секунд - 65°С, 30 секунд - 68°С, 6 минут. Амплифицированную ДНК очищали с использованием готового набора "Strataprep™ PCR Purification Kit" (Stratagene) в соответствии с инструкцией поставщика. ДНК элюировали 50 мкл деионизованной воды, а затем ДНК "заглаживали" (polished, в данном случае, это процесс "затуплени " концов ДНК) с использованием Pfu-1 полимеразных реагентов, содержавшихс  в готовом наборе "PCR-Script™ Amp cloning kit" (Stratagene) в следующей смеси: 50 мкл ДНК, 5 мкл 10 мМ смеси dNTP, 6,5 мкл 10 × Pfu-1 "polished" буфера, 5 мкл клонированной Pfu-1 ДНК полимеразы (0,5 ед./мкл). Эту реакционную смесь инкубировали при 72°С в течение 30 минут в ПНР-аппарате с обогреваемой крышкой (Perkin Elmer). Пользу сь методикой, описанной в инструкции к готовому набору реактивов "pPCR-Script™ Amp kit" (Stratagene), затупленные ПЦР продукты лигировали с гидролизованным Srf-1 вектором pPCR-Script™ Amp SK(+) в присутствии Srf-1 фермента, а продукты реакции лигировани  трансформировали в "XL-10 Gold™ Kan" ультракомпетентные клетки Е.coli. Отбор клонов, трансформированных плазмидами, содержащими вставки, проводили с использованием LB-Amp чашек Петри, a IPTG и Xgal распредел ли по поверхности, как указано в инструкции к готовому набору реактивов "pPCR-Script™ Amp kit". Отбирали колонии белого цвета и обозначали их как клоны Davl-1 и т.д.
Получение второй серии клонов кДНКиз кофейного зерна с отобранной по размеру кДНК.
Зерна сильно экспрессируют небольшое количество белков, таких как запасные белки зерен (White et al., 2000, Plant Physiology, Vol. 124, 1582-1594). Если кДНК получают из такой ткани, то очень высокий уровень запасных белков и других специфических белков зерен приводит к высокому уровню "избыточности" кодирующих их кДНК, т.е. попул ци  получаемой кДНК содержит высокие относительные количества одной и той же кДНК. Дл  снижени  избыточности кДНК, полученной из мРНК кофейного зерна, и селективной характеризации прот женных и слабо экспрессируемых кДНК примен ли также стратегию клонировани  второй кДНК. Продукты описанной выше реакции с обратной транскриптазой использовали в качестве матрицы дл  последующий ПЦР с применением готового набора реактивов "Advantage™ 2 PCR" (ClonTech): 3 мкл реакционной смеси обратной транскриптазы, 5 мкл 10 х Advantage™ 2 ПЦР буфера, 1 мкл смеси dNTP (по 10 мМ каждого дезокситрифосфата), 2 мкл ПЦР праймера (готовый набор "SMART™ PCR cDNA kit", ClonTech), 39 мкл деионизованной воды и 1 мкл 50 × Advantage™ 2 полимеразной смеси. Полученную ПЦР смесь помещали в аппарат "MJ ResearchPTC-150" (НВ), где поддерживались следующие режимы ПЦР: 95°С в течение 1 минуты, а затем 16 циклов: 95°С, 15 секунд - 65°С, 30 секунд - б8°С, 6 минут. В конце ПЦР добавл ли 1 мкл 10% SDS в гель-загрузочном буфере, образец нагревали до 37°С в течение 10 минут. Затем образец делили на части дл  загрузки в 0,7% агарозный гель без бромистого этиди : 10% загружали в небольшую лунку р дом с лункой маркерной ДНК, а остальные 90% загружали в соседнюю, большую препаративную лунку. После электрофореза участок гел  с маркерами размера плюс 10% реакционного образца окрашивали бромистьм этидием. Этот окрашенный участок гел  использовали затем в качестве маркера дл  вырезани  тонких слоев гел , содержащих амплифицированную ПЦР кДНК различных размеров, из остальной неокрашенной (препаративной) части гел . Получили шесть тонких слоев гел , имеющие указанный диапазон размеров ПЦР фрагментов: А1А (0,8-1 kb), A1B (1-1,5 kb), A2 (1,5-2,25 kb), A3 (2,25-3,25 kb), A4 (3,25-4 kb) и А5 (4-6,5 kb).
ДНК из каждого сло  элюировали из агарозы с использованием готового набора "QIAEX II kit" от фирмы Qiagen согласно инструкци м поставщика (образцы 3А, 4А и 5А нагревали в течение 10 минут при 50°С, а образцы 1А, 1В и 2 А нагревали в течение 10 минут при комнатной температуре). Очищенную двунитевую кДНК амплифицировали повторно, использу  ПЦР с TAQ ферментной смесью, котора  позвол ет получить фрагменты с 3' Т выступом, следующим образом: 30 мкл выделенной из гел  двунитевой кДНК, 5 мкл 10 × TAQ буфера (поставл емого вместе с полимеразной смесью "TAQ PLUS precision polymerase mix", Stratagene), 1 мкл 40 мМ смеси dNTP (no 10 мМ каждого), 2 мкл ПЦР праймера (готовый набор "SMART™ PCR cDNA", Clontech), 0,5 мкл полимеразной смеси "TAQ PLUS precision polymerase mix" (Stratagene) и 11,5 мкл деионизованной воды. Режимы ПЦР: 95°С в течение 1 минуты, затем 7 циклов: 95°С, 15 секунд - 65°С, 1 минута - 72°С, 8 минут, а затем 1 цикл: 95°С, 15 секунд - 65°С, 1 минута- 72°С, 10 минут.
Полученную амплифицированную ДНК затем лигировали в вектор pCR™-TOPO™ и клонировали в ТОР10 клетки Е.coli с использованием готового набора "ТОРО™ ТА kit" (Invitrogen) согласно инструкции поставщика. Клоны называли в пор дке их выделени  и позиционировани  в размерном геле (например, А2-1, А2-2 и т.д.).
Скрининг и предварительна  идентификаци  кДНК из кофейное зерна.
Первую серию белых колоний, полученной в библиотеке Dav-1, подвергали скринингу с целью определени  сначала размера каждой вставки путем амплификации ПЦР вставки, использу  праймеры Т3 и Т7, примыкающие к участку клонировани , и проверки амплифицированных ПЦР фрагментов гель-электрофорезом.
Каждую колонию белого цвета ресуспендировали в 200 мкл стерильной воды, к 10-30 мкл полученной суспензии добавл ли 5 мкл 10Х Taq polymerase буфера (Stratagene), I мкл 10 мМ смеси dNTP, 2,5 мкл 20 мкМ праймера Т3, 2,5 мкл 20 мкМ праймера Т7, 1 мкл диметилсульфоксида (DMSO), 0,5 мкл Taq полимеразы (Stratagene) и НзО до конечного объема 50 мкл. Использовали следующую программу ПЦР: 94°С в течение 1 мин, затем 30 циклов: 94°С, 1 мин - 55°С, 1,5 мин - 72°С, 3,5 мин, и заключительный цикл - 7 мин при 72°С. Дл  снижени  уровн  "избыточности", ПЦР вставки одинакового размера подвергали гидролизу рестриктазой Пае III. ПЦР фрагменты с одним и тем же образцом фрагментов Нае III рестрикции далее не изучались. Плазмиды клонов с ПЦР фрагментами >500 п.н. и имеющие уникальные образцы фрагментов Нае III рестрикции очищали с использованием готового набора "Qiawall 8 ultra plasmid kit" (Qiagen) дл  дидезокси-секвенировани  с 5'-конца с помощью соответствующих праймеров секвенировани  Т7 или Т3, кодируемых во фланкирующих вставку последовательност х вектора. Так как вставки напр мую не клонировались, то сначала необходимо было определить 5'-конец каждого клона путем гидролиза очищенной плазмидной ДНК рестриктазой Seal (праймер CDS SMART содержит Sea 1 сайт, что позвол ет определить ориентацию вставки в векторе). Полученные данные о последовательности ДНК впоследствии использовали дл  поиска гомологичных белков в лишенной повторов базе данных GENEBANK с целью получени  предварительной аннотации кДНК каждого клона с применением программы BLASTX™.
Банки кДНК из зерен характеризуютс  высоким уровнем повторов. То есть небольшое число мРНК из зерен обладает необычайно высоким уровнем экспрессии, например, те из них, которые кодируют запасные белки зерна, и поэтому их кДНК в большом изобилии содержатс  в банках кДНК из зерен (White et al., 2000, Plant Physiology, Vol.124, 1582-1594). Поэтому, как только в первой серии секвенировани  кДНК из кофейных зерен были идентифицированы основные изобилующие (повтор ющиес ) кДНК, так сразу понадобилось введение стадии предварительного скрининга вставок, содержащих колонии белого цвета, еще до определени  размера вставок. Четыре последовательности ДНК экспрессировались очень сильно и дл  каждой из этих изобилующих последовательностей были сконструированы следующие специфичные праймеры:
1) белок 2S, контиг 8А 5'-AGCAACTGCAGCAAGGTGGAG-3' и контиг 8В 5'-CGATTTGGCACTGCTGTGGTTC-3' (55°C дл  ПЦР, фрагмент 114 п.н.),
2) белок 2S, контиг 15А 5'-GCCCGTGCTCCTGAACCA-3' и контиг 15В 5'-GTATGGTTGCGGTGGCTGAA-3' (55°C дл  ПЦР, фрагмент 256 п.н.),
3) олеозин 15,5, контиг ЗОА 5'-ACCCCGCTTTTCGTTAT-3' и контиг 30В 5'-TCTGGCTACATCTTGAGTTCT-3' (55°C дл  ПЦР, фрагмент 261 п.н.),
4) белок 11S, контиг 37А 5'-GTTTCCAGACCGCCATCAG-3' и контиг 37В 5'-АТАТССАТССТСТТССААСАСС-3' (59°С дл  ПЦР, фрагмент 261 п.н.).
3
ПЦР дл  этой стадии предварительного скрининга проводили в следующих услови х: 10-30 мкл колоний белого цвета в стерильной НО, 5 мкл 10 х Taq буфера (Stratagene), 1 мкл 10 мМ dNTP, 2,5 мкл каждого праймера (20 мкМ), 1 мкл DMSO, 0,5 мкл Taq полимеразы (Stratagene 10 ед./мкл), стерильную НзО добавл ли до конечного общего объема реакционной смеси 50 мкл. Программа ПЦР предусматривала 1 мин при 94°С, затем 30 циклов: 94°С, 1 мин - 1,5 мин при специфической температуре дл  каждой пары праймеров - 72°С, 2,5 мин, в последним цикле - 7 мин при 72°С.
Секвенирование вставки полноразмерной кДНК и анализ последовательности
Клоны кДНК, чьи неполные последовательности показали начальную гомологию с протеазами и ингибиторами протеаз, были полностью секвенированы по обеим цеп м с применением стратегии "прогулки" стандартными дидезокси праймерами. Последовательности представлены как SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 15. Дл  подтверждени  предварительной аннотации проводили поиск последовательностей, гомологичных полученым полноразмерным последовательност ми, с использованием BLASTX и базы данных GenBank, исключающей повторы белков.
Идентичность последовательностей в парах последовательностей рассчитывали с помощью программы ClustalW™ в модуле MegAlign™ пакета программ Lasergene™ (DNASTAR Inc.). Были выбраны следующие параметры по умолчанию: (1. ПАРАМЕТРЫ МНОЖЕСТВЕННОГО ВЫРАВНИВАНИЯ - Gap penalty (ограничение промежутка) 15,00; Gap length penalty (ограничение длины промежутка) 6,66; Delay divergent Seqs (расход щиес  с задержкой последовательностисти) (%) 30; DNA transition weight (варьирование массы ДНК) 0,5; Protein Weight Matrix (взвешанна  матрица белка) - Gonnet Series; DNA Weight Matrix (взвешенна  матрица ДНК) - ШВ. 2- ПАРАМЕТРЫ ПАРНОГО ВЫРАВНИВАНИЯ - Slow/Accurate (Медленно/Точно) (Gap penalty - 15,00;
Gap length penalty - 6,66; Protein Weight Matrix - Gonnet Series; DNA Weight Matrix - IUB). Используемые последовательности представл ли собой либо полноразмерную нуклеотидную последовательность каждой кДНК, либо полную ORF (open reading frame, открытую рамку считывани ) каждой кДНК.
Таблица 2Процент идентичности между последовательност ми нуклеиновых кислот и аминокислот генов СсСР-1, CcCPI-1, CcAP-1 и СсАР-2 и родственных генов, обнаруженных в банке данных GenBank, исключающем повтор белков, а также белков из WO 02/04617.
Последовательно ста кДНК
Идентичность нуклеотидов (%)
Идентичность белков (%) (ORF)
CcAPl vrs TcAPl
2,9
13,3
CcAPlvrsTcAP2
2,4
9,8
CcAP2vrsTcAPl
55,0
61,5
CcAP2 vrs TcAP2
55,1
61,3
CcCP-1 vs предполагаемой цистеинпротеазы Arabidopsis thaliana (AY070063)
51,8
64,3
CcCP-1 vs цистеинэндопептидазы Glycine max (Z32795)
49,1
61,3
CcCP-1 vs предшественника цистеинпротеазы Vicia sativa (Z99172)
49,0
60,9
CcAP2 vs предшественника специфичной к аспарагиновой кислоте протеазы Lycopersicon esculentum (L46681)
65,9
71,1
CcAP2 vs мРНК предполагаемой специфичной к аспарагиновой кислоте протеазы Ipomoea batatas (AF259982)
71,7
69,6
CcAP2vsNaAP4MPHK дл  специфичной к аспарагиновой кислоте протеазы 4 Nepenthes alata (AB045894)
58,4
66,5
CcCPI-1 vs цистатина Malus x domestica (AY176584)
38,8
45,5
5'RACE ПЦР.
Установлено, что вставка кДНК клона А5-812 содержит интроны. Поэтому дл  подтверждени  кодирующей этот белок последовательности необходимо было выделить новую кДНК, содержащую полноразмерную кодирующую последовательность. Это было сделано с использованием готового набора реактивов дл  амплификации кДНК "SMART™ RACE cDNA amplification Kit" (Clontech). Первую цепь кДНК, используемую дл  5' RACE, получали, как описано выше дл  создани  кДНК библиотек. Был сконструирован специфичный праймер к гену rАР2 (5'-CATATAATATTAAAAGCACCACCCATAA-3') - эта последовательность локализуетс  на рассто нии 92 п.н. от поли (А) "хвоста" клона А5-812. Впоследствии этот специфичный праймер использовали со смесью универсальных праймеров (UPM) из набора CLONTECH в ПЦР при следующих услови х: 2,5 мкл продукта первой цепи кДНК, 5 мкл 10Х Advantage 2 ПЦР буфера (CLONTECH), 1 мкл смеси dNTP (10 мМ), 1 мкл 50Х Advantage 2 полимеразной смеси (CLONTECH), 5 мкл "смеси универсальных праймеров А" (10Х) (CLONTECH), 1 мкл rАР2 (10 мкМ) с добавлением стерильной воды до конечного объема 50 мкл. ПЦР проводили в следующем режиме: 20 циклов - 94°С, 30 сек - 68°С, 30 сек - 72°С, 3 мин, с последующей заключительной реакцией достройки цепи в течение 5 мин при 72°С. Был получен фрагмент длиной примерно 1700 п.н., дл  извлечени  которого из гел  использовали готовый набор "CONCERT™ Rapid Gel Extraction kit" (GibcoBRL). Выделенный фрагмент клонировали в вектор pCR 4-TOPO и трансформировали в Escherichia coli с использованием готового набора дл  клонировани  "Торо-ТА cloning kit" (Invitrogen). Полученную плазмиду очищали с использованием готового набора реактивов дл  экстракции плазмиды ("QIAfilter Plasmid Midi Kit", Qiagen, Франци ) и вставку этой плазмиды секвенировали по двум цеп м.
Установлено, что в ДНК клона А5-442 (AP1) полностью отсутствует 5' область кДНК. Дл  выделени  этой области проводили 5'RACE с использованием готового набора дл  амплификации кДНК "SMART™ RACE cDNA amplification Kit" (Clontech). Был сконструирован специфичный к последовательности праймер rAPl (5'-TGGAGTCACAAGATGTCTCGACGAACTG-3'), размещенный на рассто нии 396 п.н. от поли (А) хвоста. Этот специфичный праймер использовали затем со смесью универсальных праймеров (UPM) из готового набора CLONTECH kit в ПЦР в следующих услови х: 2,5 мкл первой цепи кДНК, 5 мкл 10Х Advantage 2 ПЦР буфера (CLONTECH), 1 мкл смеси dNTP (10 мМ), 1 мкл 50Х Advantage 2 полимеразной смеси (CLONTECH), 5 мкл "смеси универсальных праймеров А" (10Х) (CLONTECH), 1 мкл rAPl с последующим добавлением стерильной воды до конечного объема 50 мкл. Режим циклов ПЦР: 20 циклов по 30 сек при 94°С, 30 сек при 68°С и 3 мин при 72°С с последующей реакцией конечной достройки цепи в течение 5 мин при 72°С. Получен фрагмент длиной около 2000 п.н., извлеченный из гел  с использованием готового набора реактивов дл  быстрой экстракции из гел  "CONCERT™ Rapid Gel Extraction kit" (GibcoBRL). Выделенный фрагмент клонировали в вектор pCR 4-TOPO и трансформировали в Escherichia coli с использованием готового набора дл  клонировани  "Торо-ТА cloning kit" (Invitrogen). Полученную плазмиду затем очищали с использованием готового набора дл  экстракции плазмиды (QIAfilter Plasmid Midi Kit, Qiagen, Франци ) и вставку этой плазмиды секвенировали по двум цеп м.
Получение РНК дл  крупных EST библиотек.
РНК выдел ли из рассеченного зерна и тканей перикарпи  на разных стади х развити  и из молодых листочков с применением описанного ранее метода. Дл  получени  РНК с целью создани  различных EST библиотек (библиотек, содержащих экспрессирующиес  последовательности) использовали следующие сорта и ткани кофе: (1) молодые листочки, один сорт (FRT-32); (2) перикарпий (с 8 различных стадий развити ) от 5 сортов (FRT-32, FRT-31, FRT-400, FRT-4001 и Q121); (3) целые плоды кофейного дерева спуст  22 недели после оплодотворени  (WAF, weeks after fertilisation) от одного сорта (FRT-31); (4) кофейное зерно спуст  18+22 WAF от п ти сортов (FRT-32, FRT-31, FRT-400, FRT-4001 и Q121); (5) кофейное зерно спуст  30 WAF от 5 сортов (FRT-32, FRT-31, FRT-400, FRT-4001 и Q121); (6) кофейное зерно спуст  42 WAF от п ти сортов (FRT-32, FRT-31, FRT-400, FRT-4001 и Q121) и (7) кофейное зерно спуст  46 WAF от 2 сортов (FRT-32 и Q121).
Получение клонов кДНК и анализ последовательности ДНК.
+
+
Клоны кДНК дл  различных EST библиотек получали следующим образом: поли А мРНК выдел ли с использованием готового набора дл  выделени  мРНК "PolyTrack™ mRNA Isolation System" (System TV, Promega) согласно инструкции изготовител  дл  мелкомасштабного выделени . Очищенную поли A мРНК использовали дл  получени  кДНК, которую затем однонаправленно клонировали в векторе на основе фага л мбда, как описано в инструкции к готовому набору дл  создани  библиотеки "ZAP-cDNA™ library construction kit" (кат.# 200450 Stratagene). Протокол массовой эксцизии (вырезание клонируемой ДНК из вектора) предусматривал эксцизию PBlueScript phagemid (плазмидный вектор, встроенный внутрь фага) из вектора Uni-Zap XR (фаговый вектор) и получение колоний белого цвета после посева на 150 мм чашки с LB-ампицилиновым агаром, к которому были добавлены 80 мкл X-gal (20 мг/мл) и 16 мкл IPTG (0,5 М). Единичные колонии отбирали произвольно дл  получени  плазмидной ДНК, которую затем использовали дл  секвенировани  5'-концов вставок кДНК.
Полученные последовательности ДНК  вл ютс  EST последовательност ми (Expressed Seguence Tags=маркеры экспрессирующихс  последовательностей) дл  каждого клона. Затем все данные по EST последовательност м из 7 библиотек сгруппировали "in-silico", создав тем самым уникальную группу последовательностей, названную набор последовательностей "унигенов" (unigene, уникальные гены). Таким образом, кажда  последовательность унигена теоретически соответствует отдельному генетическому продукту. Однако следует заметить, что вследствие того, что многие унигены представл ют собой лишь неполные последовательности кДНК, то вполне веро тно, что некоторые гены могут быть представлены двум  или более унигенами. Предварительную аннотацию набора унигенов проводили с помощью программы автоматического поиска BLAST, в которой поиск последовательности каждого унигена осуществл етс  в базе данных GenBank, исключающей повтор белков. Указанный BLAST подход к поиску позволил получить п ть успешных BLAST "хитов" (hits, "выдачи" с наиболее низкими е-значени ми), которые относились к "унигенной аннотации".
Нозерн-блот анализ.
32
Свежесобранные корневища, молодые листочки, стебель, цветки и плоды на различных стади х развити  [мелкие зеленые плоды (SG), крупные зеленые плоды (LG), желтые плоды (Y) и красные плоды (R)] отбирали от сортов Coffea arabica CCCA2, выращенных в услови х теплиц (25°С, относительна  влажность, 0В, 70%) в Tours, Франци , и Coffea canephora FRT32, выращенных либо в Эквадоре, либо в ICCRI, Индонези . Свежие ткани сразу же замораживали в жидком азоте и выдел ли суммарную РНК из каждой ткани, использу  методику экстракции, описанную выше. 5 мкг суммарной РНК наносили на 1,2% (масса/объем) денатурирующий РНК гель, содержащий формальдегид. Образцы суммарной РНК из каждой растительной ткани нагревали при 65°С в течение 15 мин в присутствии 7 мкл загружающего буфера дл  образцов РНК "RNA Sample Loading Buffer" (без бромистого этиди , Sigma), а затем сразу же помещали на лед на 2 минуты перед последующим нанесением РНК на 1,2% гель. К гелю подводили напр жение 60 вольт в течение 5 часов. Затем гель дважды вымачивали в 10xSSC в течение 20 мин. РНК из гел  переносили в течение ночи за счет капилл рной диффузии на "Positive TM Membrane" (Qbiogene) в 10xSSC; РНК фиксировали на мембране нагреванием в течение 30 мин при 80°С. Зонды готовили с использованием набора "Rediprime™ II random prime labelling system kit" (Amersham) в присутствии (Р) dCTP. Гибридизацию проводили при 65°С в течение 24 ч в растворе дл  гибридизации (5Х SSC, 40 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосос , 5% [масса/объем] SDS и 5х раствор Денхардта). Мембрану промывали дважды в течении 30 мин при 65°С с использованием 2Х SSC, 0,1% SDS (масса/объем) и IX SSC, 0,1% SDS (масса/объем).
Нозерн-блот анализ, представленный на фиг.1, показывает, что ген СсСР-1 цистеинпротеазы кофе экспрессируетс  в плодах кофе С. arabica на всех изучаемых стади х, при этом в желтых плодах уровень экспрессии был несколько выше, чем на других стади х. Не обнаружено экспрессии указанного гена в корневище, стебле или листь х С. arabica. На фиг.2 показан другой нозерн-блот эксперимент по контролю экспрессии СсСР-1 в С. arabica с использованием нового препарата РНК. В этом эксперименте плоды с четырех стадий рассекали дл  выделени  тканей перикарпи  и тканей зерен, соответствующих каждой стадии развити  плодов. Затем из полученных тканей экстрагировали суммарную РНК. Полученные результаты показали такой же временной образец экспрессии СсСР-1 в ходе развити  плодов, но этот новый эксперимент дополнительно показал высокий уровень первичной экспрессии СсСР-1 только в ткан х зерен плодов. В перикарпии плодов кофейного дерева значительной экспрессии гена СсСР-1 не наблюдалось. Этот последний результат подчеркивает роль указанного генетического продукта в эксклюзивном изменении белкового, пептидного и аминокислотного профил  кофейного зерна при нормальных услови х выращивани .
Авторами за вки созданы EST библиотеки из листьев кофейного дерева, а также из тканей зерен и перикарпи , полученных на различных стади х развити  плодов кофейного дерева. Обнаружение EST СсСР-1 в различных библиотеках (показано ниже - см. табл. 3) также показывает, что указанный ген сильно экспрессируетс  в зерне, но не экспрессируетс  в значительной степени в перикарпии или в листь х. Образец экспрессии СсСР-1 в процессе формировани  зерна сходен с характером экспрессии, наблюдаемом дл  возможно гомологичной с ней последовательностью из Vicia sativa (ген CPR4: Fischer, J. et al., 2000. Plant Molecular Biology, 43, 83-101). Эти авторы показали, что CPR4 не обнаруживаетс  нозерн-блоттингом ни в листь х, ни в корневище или стебле, что еще раз подтверждает тот факт, что СсСР-1  вл етс  специфичным дл  кофейного зерна. Вр д ли можно ожидать, что изменени  экспрессии СсСР-1, особенно в зерне, как предлагаетс  здесь, за счет использовани , например, специфичного дл  зерна промотора в антисмысловой конструкции СсСР-1 или сверхэкспрессирующейс  конструкции СсСР-1 могут помешать метаболизму в других ткан х.
Таблица 3
Название гена
Количество EST
 
Зерна 18 нед.
Цельные плоды 22 нед.
Зерна 30 нед.
Зерна 42 нед.
Зерна 46 нед.
Перикарпий
Лист
СсСР-1
0
0
4
0
15
0
0
Оптимальное выравнивание последовательностей в случае СсСР-1 (фиг.2А) показывает, что эта кДНК кодирует цистеинпротеазу.
Нозерн-блот анализ, представленный на фиг.3, показывает, что ген ингибитора цистеинпротеазы CcCPI-1 из кофе экспрессируетс  в плодах С. arabica на всех исследуемых стади х. Однако в противоположность экспрессии, наблюдавшейс  у цистеинпротеазы СсСР-1, ген CcCPI-1 показывает более высокий уровень экспрессии на двух ранних стади х развити  плодов кофе (на стади х мелких зеленых и крупных зеленых плодов), а на двух более поздних стади х формировани  плодов указанный ген экспрессируетс  на более низком уровне. Такой характер экспрессии согласуетс  с существующей гипотезой о том, что белок ингибитора цистеинпротеазы (CcCPI-1) контролирует уровень активности цистеинпротеазы, котора  специфически экспрессируетс  в зерне, тогда как СсСР-1 - в плодах кофейного дерева. Можно ожидать, что контролирующий белок, такой как белок ингибитора цистеинпротеазы, будет экспрессироватьс  раньше, чем его белок-мишень, когда необходимо контролировать уровень активности этого белка-мишени непрерывно, начина  со времени экспрессии белка-мишени. Не обнаружено экспрессии этого гена в корневище, стебле или листь х С. arabica. Примечательно, что сходство образцов экспрессии СсСР-1 и CcCPI-1 согласуетс  с существующей гипотезой о том, что эти белки могут, веро тно, функционально взаимодействовать.
Результаты нозерн-блоттинга (фиг.3) показали, что CcCPI-1 экспрессируетс  на всех стади х в плодах кофейного дерева. Однако указанный эксперимент не позволил определить, происходит ли эта экспресси  в целых плодах или только в перикарпии либо зерне. Экспрессию в листь х также не удалось проконтролировать. Однако экспресси  CcCPI-1 в различных EST библиотеках (показано ниже в табл. 4) показывает, что этот ген экспрессируетс  главным образом только в зерне, в перикарпии или листь х экспрессии указанного гена не обнаружено. Этот результат также предполагает, что CcCPI-1 контролирует уровень активности цистеинпротеазы, котора  специфически экспрессируетс  в зерне, например, СсСР-1.
Таблица 4
Название гена
Количество EST
 
Зерна 18 нед.
Цельные плоды 22 нед.
Зерна 30 нед.
Зерна 42 нед.
Зерна 46 нед.
Перикарпий
Лист
CcCPI-1
0
0
1
0
 
0
0
Нозерн-блот анализ, представленный на фиг.4, показывает, что ген ингибитора цистеинпротеазы CcCPI-1 из кофе экспрессируетс  по-разному в плодах С. canephora (robusta) по сравнению с плодами С. arabica. Во-первых, данные фиг.4 показывают, что ген CcCPI-1 экспрессируетс  в С. arabica несколько раньше. Во-вторых, что более важно, ген CcCPI-1 экспрессируетс  в плодах С. canephora на значительно более высоком уровне. Это различие в экспрессии, веро тно, вли ет на уровень активности цистеинпротеазы, обнаруженной в плодах С. arabica, по сравнению с плодами С. canephora. Поскольку этот класс белков тесно св зан с устойчивостью растений к вредител м, вполне веро тно также, что высокий уровень экспрессии гена CcCPI-1 в С. canephora вносит свой вклад в повышенную устойчивость к заболевани м, зачастую наблюдаемую у сортов "робуста" по сравнению с сортами "арабика".
RT-PCR анализ экспрессии СсСР-1 в процессе прорастани  зерна.
Дл  определени  экспрессии СсСР-1 в процессе прорастани  кофейного зерна плоды кофейного дерева собирали на стадии полного вызревани , ополаскивали водой и удал ли из них перикарпий (каждый плод обычно содержит два зерна). Полученные зерна подсушивали в течение одной недели на открытом воздухе при комнатной температуре. Перед проращиванием с каждого зерна вручную удал ли пергаментную оболочку и серебристую семенную оболочку (эписпермий), затем зерна стерилизовали, опустив их в 1% (масса/объем) раствор гипохлорита натри  на 1 час, после чего дважды промывали стерильной дистиллированной водой. Дл  проращивани  150 стерильных зерен помещали по отдельности в пробирки, содержащие соли Хеллера (Heller, 1953) и 7 г/л агара, и инкубировали при 25°С ежедневно в услови х 8-часового светового дн .
Спуст  2 суток, 3 суток, 5 суток, 1 мес ц и 2 мес ца проращивани  отбирали три партии по дес ть зерен в каждой, сразу же замораживали в жидком азоте и хранили при - 80°С до экстракции РНК. Из зерен, проращиваемых в течение 1 и 2 мес цев, в момент отбора образцов вырезали первичные (зародышевые) корешки и замораживали отдельно от зерен. Было отобрано тридцать стерильных зерен при Т=0 и заморожено дл  последующего использовани  в качестве Т(0) контрол .
4
2
4
4
4 мкг обработанной ДНК-азой суммарной РНК, экстрагированной из каждого образца, использовали дл  синтеза кДНК с применением гексамерных олигонуклеотидов согласно инструкции к готовому набору с обратной транскриптазой "Superscript II Reverse Transcriptase" (Invitrogen, Carlsbad, Ca). Фрагмент гена рибосомального белка кофе L39 амплифицировали в каждом образце кДНК в качестве контрол  стадии синтеза кДНК. ПЦР проводили с использованием 50 мкл реакционных смесей, содержащих 10 мкл разбавленных в соотношении 1/100 растворов кДНК, 1 мкМ каждого праймера, 5 мкл 10Х ПЦР буфера ThermoPol [10 мМ (NH)SO, 2мМ MgSO, 20 мМ Трис-HCl с рН 8,8 при 25°С, 10 мМ КС1 и 0,1% Тритон Х-100] и 2,5 единицы Taq полимеразы (New England Biolabs, Beverly, MA). Режимы ПЦР: 2 мин при 94°С, с последующими 35 циклами: 94°С, 1 мин - 60°С, 1,5 мин - 72°С, 2,5 мин Конечна  стади  достройки цепи - в течение 7 мин при 72°С. Следующие праймеры использовали дл  амплификации методом ПЦР:
СсСР-1 верхний 5'-ACCGAGGAGGAGTTTGAGGCTACG-3' и
СсСР-1 нижний 5'-ACGCTTCCCCCATGAGTTCTTGA-3',
обеспечивших выход продуктов кДНК 726 п.н.
Праймерами к белку Rpl39 были:
А5-1750-верхний 5'-TGGCGAAGAAGCAGAGGCAGA-3'
А5-1750-нижний 5'-TTGAGGGGGAGGGTAAAAAG-3'.
RT-PCR использовали дл  определени  экспрессии СсСР-1 на различных стади х проращивани . Полученные результаты показывают, что транскрипты СсСР-1 обнаруживаютс  в цельном зерне практически на всех исследуемых стади х (фиг.5). Ранее было показано (Fischer, J. et aL, 2000, Plant Molecular Biology, 43, 83-101), что РНК предполагаемого гомолога СсСР-1 - CPR4 из V, sativa - также экспрессируетс  как в зародышевом главном стебле, так и в сем дол х сем н V. sativa в процессе прорастани .
Вестерн-блот анализ
Ткани листьев и плодов дл  анализа получали из Coffea arabica CCCA2, до анализа ткани хранили в замороженном виде при -80°С. Ткани зерна и перикарпи  плодов кофейного дерева на различных стади х их развити  рассекали по отдельности с незначительным, насколько это было возможно, размораживанием перикарпи . Затем эти разные ткани быстро измельчали в тонкий порошок, какой только можно получить с использованием жидкого азота в предварительно замороженной лабораторной ступке с пестиком. Белковый экстракт из указанной ткани готовили по модифицированной версии методики экстракции, описанной Tanaka et al., 1986 (Plant Physiology, 81, 802-806). Использовали следующие буферы:
буфер Танака:
сахароза - 0,7 М
трис-HCl, рН 8 - 0,5 М
об.
об.
Р-меркаптоэтанол - 2% (/)
NaCl - 0,1 M
Перед использованием вышеуказанного буфера добавл ли:
ЭДТУ - до 5 мМ
PMSF - до 2 мМ
Буфер дл  загрузки в гель:
об.
об.
Глицерин - 15% (/)
об.
об.
β-меркаптоэтанол - 2% (/)
об.
об.
SDS - 3% (/)
трис-HCl, рН 6,8 - 62,5 мМ.
Несколько сотен миллиграммов замороженных измельченных в порошок тканей добавл ли к 650 мкл буфера Танака. Белки экстрагировали добавлением одного объема трис-насыщенного фенола, рН 8 (т.е. фенола, насыщенного раствором 10 мМ трис-HCl, рН 8). Каждый образец интенсивно перемешивали в течение 20 мин, а затем центрифугировали 20 мин при комнатной температуре при 13000g. После центрифугировани  белки присутствуют в фенольной фазе. Образцы 20 мкл сохран ли дл  анализа (см. ниже), а остальное количество белков в фенольной фазе осаждали преципитацией в течение ночи при -20С с последующим добавлением п ти объемов метанола, содержащего 0,1 М ацетата аммони . После этого образцы центрифугировали 20 мин при комнатной температуре при 13000g, и полученные осадки промывали дважды в 500 мкл метанола, содержащего 0,1 М ацетата аммони . Затем осадки ресуспендировали в 30 мкл буфера дл  загрузки в гель до проведени  количественной оценки белков.
Белок в 20 мкл образцах фенольной фазы также осаждали преципитацией, как описано выше, и полученный осадок ресуспендировали в буфере дл  образцов из готового набора дл  анализа белков "BioRad dc Protein assay Kit". Количественную оценку суммарного белка в этом образце проводили с использованием готового набора "BioRad dc Protein assay Kit" согласно инструкции поставщика. После этого все основные образцы доводили до 5 мкг/мкл добавлением буфера дл  загрузки в гель.
Образцы, содержащие примерно 50 мкг белка каждый, раздел ли электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле (12% трис-глицин, Novex Invitrogen™). Затем белки переносили электро-блоттингом на PVDF мембрану по стандартной методике. Неспецифические участки св зывани  на мембране блокировали инкубацией мембраны в 10% растворе сухого обезжиренного молока в TBS буфере (BioRad™) в течение одного часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С. Блоттированные белки были тестировали в течение двух часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С с поликлональным антителом (разбавление 1/5000 е в 10% растворе сухого обезжиренного молока в TBS), наработанным дл  предполагаемого гомолога - CPR4 из Vicia sativa, которые были любезно предоставлены A.Schlereth и K.Muntz из Institut fur Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK, Институт генетики и изучени  культурных растений, Германи ; A.Schlereth, C.Becker, C.Horstmann, J.Tiedmarm and K.Muntz 2000, Journal of Experimental Botany, 51: 1423-1433). Затем мембрану трижды промывали в течение 20 минут в TBS +0,1% Tween 20 буфере, после чего инкубировали в течение одного часа с вторым антителом, меченым пероксидазой хрена (Ig кролика против антигенов козы, Immunopure, Pierce). Затем мембрану дважды промывали в течение 20 минут в TBS +0,1% Tween 20 буфере и один раз в течение 20 минут в TBS. Присутствие фермента, св занного со вторым антителом, визуализировали хемилюминесцентным обнаружением с использованием усиливающей системы ECL+ system (Amersham Life Science) согласно инструкций поставщика.
Полученные результаты показывают, что полипептид примерно 41 кДа, который точно соответствует предполагаемой молекул рной массе полипептида-предшественника СсСР-1 (43735 Да), обнаруживаетс  на всех изучаемых стади х созревани  кофейного зерна, но только не в ткан х перикарпи  (фиг.6). Характер экспрессии этого белка схож с характером экспрессии мРНК СсСР-1 (фиг.2). Другой полипептид примерно 22 кДа также обнаруживаетс  на стади х желтых и красных плодов кофейного дерева, но в меньших количествах, чем полипептид 41 кДа. Размер этого второго полипептида совпадает с предполагаемым размером зрелой формы СсСР-1 (25239 Да). Предполагаемый размер зрелого СсСР-1 после процессинга определ ли путем белкового выравнивани  между полноразмерной последовательностью ORF СсСР-1 и последовательностью предсказанной зрелой формы CPR4 (Vicia sativa - №доступ # Z99172, идентичность с СсСР-1 = 60,9%). N-концевой сайт процессинга полипептида CRP4 при генерации зрелой формы был спрогнозирован на основе сравнени  последовательности с другими полипептидами, типа CPR папаина (J. Fischer, С. Becker, S. Hillmer, С. Horstmann, В. Neubohn, A. Schlereth, V. Senyuk, A. Shutov and К. Muntz, 2000, Plant Molecular Biology, 43, 83-101). Интересно, что, в противоположность представленным здесь результатам, согласно которым в процессе формировани  зерна обнаруживаютс  и предшественник, и зрелые формы СсСР-1, в развивающихс  семенах, а также в процессе прорастани  сем н V. sativa была обнаружена только зрела  форма полипептида CPR4 (Fischer et al., 2000).
RT-PCR анализ экспрессии гена в сорте робуста FRT-32.
Изолировали различные ткани FRT-32 и суммарную РНК экстрагировали из этих тканей описанным ранее методом. кДНК получали из обработанной ДНК-азой суммарной РНК, как описывалось выше дл  RT-PCR экспериментов с кДНК арабики. Затем проводили специфичные ПЦР в услови х, описанных выше дл  RT-PCR экспериментов с кДНК арабики. Специфические услови  амплификации и использованные праймеры к олигонуклеотидам привод тс  в подписи к фигуре дл  каждого эксперимента.
CcCPI-1.
а) оптимальное выравнивание CcCPI-1 (фиг.6А), показывающее, что эта кДНК кодирует ингибитор цистеинпротеазы.
б) Данные RT-PCR по экпрессии CcCPI-1 (фиг.7) в арабике и робусте. ПЦР проводили, как описано ранее; режимы реакций и используемые ПЦР праймеры указаны в подписи к фигуре. Эти данные подтверждают и расшир ют представленные ранее данные об экспрессии в арабике, которые показывают, что CcCPI-1 экспрессируетс  только в зерне, а не в перикарпии. Слаба  экспресси  этого гена обнаружена также в цветках (результат, который не удалось определить нозерн-блот анализом). Методом RT-PCR определена также экспресси  в робусте (фиг.7). Образец этой экспрессии такой же, что и в арабике, за исключением того, что в цветках или на стадии мелких зеленых зерен никакой экспрессии не было обнаружено. Отсутствие экспрессии в робусте на стадии мелких зеленых зерен отмечалось также и в случае других генов, т.е. в этом плане ген CcCPI-1 не  вл етс  уникальным.
Таблица 5Частота встречаемости генов ингибитора цистеинпротеаз CPI-2, CPI-3 и С в различных EST библиотеках.
Название гена
Количество EST
 
Зерна 18 нед.
Цельные плоды 22 нед.
Зерна 30 нед.
Зерна 42 нед.
Зерна 46 нед.
Перикарпий
Лист
CcCPI-2
0
2
12
0
1
1
0
CcCPI-3
0
0
1
0
2
0
0
CcCPI-4
0
0
1
о
0
0
6
CcCPI-2
а) оптимальное выравнивание CcCPI-2 (фиг.8), показывающее, что эта кДНК кодирует ингибитор цистеинпротеазы.
б) Данные RT-PCR по экпрессии CcCPI-2 (фиг.9) в арабике и робусте. ПЦР проводили, как описано выше; используемые ПЦР праймеры указаны в подписи к фигуре. Эти данные показывают, что CcCPI-2 экспрессируетс  во всех ткан х, поэтому белковый продукт этого гена, веро тно, играет важную роль в контроле одной или более цистеинпротеаз, присутствующих в этих ткан х. Количество ESTs каждой библиотеке, приведенное в табл. 5 (см. выше), позвол ет предположить, что CPI-2 может экспрессироватьс  в зерне (семени) спуст  30 недель после оплодотворени  в большей степени, чем в листь х, перикарпии или зерне спуст  46 недель после оплодотворени .
CcCPI-3
а) оптимальное выравнивание CcCPI-3 (фиг.10), показывающее, что эта кДНК кодирует ингибитор цистеинпротеазы.
б) Данных RT-PCR по экспрессии этого ингибитора цистеинпротеазы на сегодн шний день не имеетс . Однако экспресси  этого гена "in silico", если судить по количеству ESTs в каждой библиотеке (табл. 5, см. выше), указывает на то, что CcCPI-3 экспрессируетс  в кофейном зерне (присутствует в библиотеках зерен "Зерна 30w" и "Зерна 46w", т.е. спуст  30 и 46 недель). Отсутствие ESTs указанного гена в перикарпии, листь х или целых плодах кофейного дерева позвол ет предположить, что этот ген, веро тно,  вл етс  специфичным дл  кофейного зерна геном.
CcCPI-4
а) Оптимальное выравнивание CcCPI-4 (фиг.11), показывающее, что эта кДНК кодирует ингибитор цистеинпротеазы.
б) Данные RT-PCR по экспрессии CcCPI-4 (фиг.12) в арабике и робусте. ПЦР проводили, как описано выше, используемые ПЦР праймеры указаны в подписи к фигуре. Полученные данные показывают, что указанный ген значительно экспрессируетс  в арабике в листь х, цветках и зерне на стадии красных плодов. Так как тщательный анализ исходного гел  (панель А: арабика) показывает, что в случае мелких зеленых плодов и перикарпи  крупных зеленых зерен в белковых полосах обнаруживаютс  также нечеткие п тна, то можно предположить, что указанный ген также может слабо экспрессироватьс  в арабике в зернах и перикарпии на всех изучаемых стади х формировани  плодов. Данные, полученные дл  робусты, показывают, что указанный ген значительно экспрессируетс  в листь х, цветках, мелких зеленых и крупных зеленых зернах. Только один EST дл  CcCPI-4 был обнаружен в библиотеках зерен или перикарпи  (табл. 5, см. выше), что указывает на то, что экспресси  этого гена в зерне и/или перикарпии  вл етс  относительно низкой или ограничиваетс  небольшими определенными участками в указанных двух ткан х.
В каждом случае генов ингибитора цистеинпротеазы (CPI) предполагаетс , что сверхэкспресси  или подавление экспрессии этих генов в процессе формировани  зерен (т.е. под контролем очень сильного, специфичного дл  зерна, промотора, такого как промотор 11 S в кофе), будет измен ть белковый, пептидный и аминокислотный профили в зрелых зернах (а также уровень предшественников аромата).
Прорастание зерен и RT-PCR анализ
Стерилизованное, высушенное кофейное зерно С. arabica CCCA2 (с удаленными пергаментной и серебристой семенной оболочками) помещали по одному в пробирки, содержащие 10 мл твердой питательной среды Хеллера HI 5 и 7 г/л агара, и инкубировали ежесуточно при 25°С в течение 8-часового светового дн . Спуст  2 суток, 3 суток, 5 суток, 1 мес ц и 2 мес ца проращивани  отбирали по три зерна и удал ли из них первичный (зародышевый) корешок, если таковой имелс , а затем зерна и корешки сразу же замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С до проведени  экстракции РНК. Контролем служили таким же способом высушенные и стерилизованные, но не проросщие зерна (ТО). Экстракцию РНК из образцов зерен проводили, как описывалось ранее. Обработанную ДНК-азой суммарную РНК, экстрагированную из каждого образца, использовали дл  синтеза кДНК с использованием олиго-(с1Т)2о в качестве праймера в соответствии с инструкцией изготовител  к готовому набору обратной транскриптазы "Superscript II Reverse Transcriptase kit" (Invitrogen, Carlsbad, CA). Затем проводили ПНР с использованием аликвот каждой из реакционных смесей с кДНК. (50 мкл реакционных смесей содержали 10 мкл разбавленных в соотношении 1/10 растворов кДНК, 1 мкМ каждого праймера, 5 мкл 10Х ПЦР буфера ThermoPol, 200 мкМ dNTP и 2 единицы Taq полимеразы (New England Biolabs, Beverly, MA). Режимы циклов были следующими: 2 мин при 94°С, затем 40 циклов: 94°С, 1 мин - 54°С, 1,5 мин - 72°С, 2,5 мин. Конечна  стади  достройки цепи продолжалась 7 мин при 72°С. ПЦР праймерами служили:
CP-4KDDL61: 5'-GAAGAACTCATGGGGAACAGGAT-3',
CP-4KDDL345: 5'-TTATTCAAACCATCACAGGAGGAG-3'
Геномна  ПЦР и секвенирование ДНК очищенных ПЦР фрагментов.
Геномную ДНК п ти различных сортов кофе (FRT-07, FRT-19, FRT-32, CCCA2 и GPFA57) использовали в ПЦР, описанной выше в экспериментах по изучению экпрессии методом RT-PCR в проращиваемом зерне. Были получены ПЦР продукты предполагаемого размера, и эти фрагменты очищали из гел . Затем амплифицированную методом ПЦР ДНК подвергали второму раунду амплифицикации методом ПЦР и полученные в этой реакции последовательности ДНК секвенировали с использованием тех же праймеров, которые использовались дл  амплификации.
Выделение и характеристика гена цистеинпротеазы СсСР-4
С использованием коллекции ESTs,  полученных с РНК, выделенных из кофейного зерна на различных стади х его развити , ткани перикарпи  на различных стади х развити  кофейного зерна и из листьев, авторам насто щей за вки удалось выделить полноразмерную кДНК, кодирующую цистеинпротеазу кофе, котора  имеет С-концевую KDDL последовательность. Эту кДНК авторы назвали СсСР-4 (KDDL) (фиг.14). Выравнивание белка, кодируемого этой кДНК, с другими высокогомологичными цистеинпротеазами растений показано на фиг.15. Данные этого выравнивани  и соответствующие поиски с помощью программы BLAST четко показывают, что белок, кодируемый последовательностью СсСР-4 (KDDL) кофе,  вл етс  членом семейства растений KDEL, содержащего цистеинпротеазы (фиг.15). Прецизионна  идентичность СсСР-4 (KDDL) и большинства гомологичных последовательностей из базы данных приводитс  в таблицах 6А и 6В.
Таблица 6АИдентичность аминокислотной последовательности СсСР-4 (KDDL) цистеинпротеазы Coffea canephora аминокислотным последовательност м большинства гомологичных последовательностей из GenBank
Цистеинпротеаза Coffea canephora
Название гена (номер доступа)
% идентичности белка
 
Dacus carrota (JC7787)
73
 
Vignamungo(P12412)
69
СсСР-4 (KDDL)
Glycibe max Cysl(AB092555)
70
 
Glycibe max Cys2(AB092557)
68
 
Vicia sativa (Z34895)
64
Таблица 6ВИдентичность последовательности нуклеиновых кислот (кДНК) СсСР-4 (KDDL) цистеинпротеазы Coffea canephora последовательност м нуклеиновых кислот большинства гомологичных последовательностей из GenBank
Цистеинпротеаза Coffea canephora
Название гена (номер доступа)
% идентичности ДНК
 
Dacus carrota (JC7787)
55
 
Vigna mungo (PI 2412)
61
СсСР-4 (KDDL)
Glycibe max Cysl(AB092555)
49
 
Glycibe max Cys2(AB092557)
62
 
Vicia sativa (Z34895)
60
Отсюда очевидно, что полученна  последовательность СсСР-4 KDDL кофе имеет одно важное отличие от почти всех других последовательностей, показанных на фиг.15, а именно она не содержит предполагаемой последовательности, определ ющей задержку (retention) белка в эндоплазматическом ретикулуме (ER) - С-концевую KDEL последовательность, а содержит только вариант этой последовательности - KDDL. На основе изучени  способности вариантов С-концевой KDEL последовательности определ ть задержку белка в ER растительных клеток Denecke et al. (Denecke J., De Rycke R., Botterman J., 1992, EMBO J. 11, 2345-2355) ранее показали, что С-концевые варианты, такие как SDEL, KDDL, KDEI и KDEV, могут вызывать полную потерю функции задержки белка эндоплазматическим ретикулумом. Таким образом, присутствие последовательности KDDL в кофейном гомологе растительной KDEL цистеинпротеазы было полной неожиданностью. На табл. 7 показано, что униген, содержащий кДНК СсСР-4 (KDDL), имеет 21 ESTs. Поэтому авторы насто щей за вки изучили впоследствии последовательность других ESTs в этом унигене и установили, что семь из этих ESTs содержат положительные данные о последовательности KDDL участка. Из этих семи последовательностей кДНК шесть содержали KDDL последовательность, а одна - KDEL последовательность. Авторами за вки был выделен клон кДНК с С-концевой последовательностью KDEL и получена полноразмерна  последовательность этого неполного клона кДНК. Полученные последовательности ДНК и белка показаны на фиг.16 и 17, соответственно.
Таблица 7Количество EST в унигене. содержащем полноразмерную кДНК СсСР-4 (KDDL)
Цистеин-протеаза Название
Униген
Количество EST
 
 
Зерна 18w
Целые плоды 22 w
Зерна 30 w
Зерна 42w
Зерна 46w
Перикарпий
Лист
СсСР-4
125103
0
0
8
0
13
0
0
кДНК, кодирующа  последовательность СсСР-4 (KDEL), показанную на фиг.16, представл ет собой только часть кДНК, т.е. только фрагмент длиной 817 п.н. против 1336 п.н. полноразмерной кДНК СсСР-4 (KDDL) клона. Неполна  кДНК СсСР-4 (KDEL) содержит 8 однонуклеотидных замен по сравнению с эквивалентной последовательности, обнаруженной в кДНК клоне СсСР-4 (KDDL), хот  только две из этих нуклеотидных замен привод т к изменению аминокислотной последовательности открытой рамки считывани  (фиг.17). В 3' нетранслируемой области имеютс  3 четкие нуклеотидные замены. В дополнение к этому имеетс  также вставка из 12 нуклеотидов в 3' нетранслируемой области СсСР-4 (KDEL) кДНК последовательности, котора , веро тно, находитс  внутри микросателлитной области. Приведенные данные говор т о наличии двух различных и крайне важных молекул рных маркеров дл  двух аллелей гена СсСР-4 кофе, один из которых представл ет собой SNP, ассоциированный с функционально важным KDEL участком, а второй  вл етс  микросателлитным маркером, ассоциированным с 3' нетранслируемой областью указанного гена. Последний момент очень важен, поскольку микросателлитные последовательности обычно рассматриваютс  как генетические маркеры с высокой вариабельностью, и поэтому вполне веро тно, что, использу  эту содержащую микросателлит область, можно обнаружить и другие аллели указанного гена.
С целью изучени  распределени  двух аллелей гена СсСР-4, идентифицированного выше в различных сортах арабики и робусты, небольшой участок геномной последовательности, укрывающей СсСР-4 ген, амплифицировали методом ПЦР из п ти различных генотипов. Из каждого образца геномной ДНК были получены ПЦР фрагменты предполагаемого размера (207 пар оснований); полученные ПЦР продукты очищали из гел , а затем повторно амплифицировали в цел х получени  достаточного количества ДНК дл  пр мого секвенировани  ДНК ПЦР продукта. Результаты, полученные в ходе реакций секвенировани , представлены на фиг.18. Хроматограммы секвенировани  п ти последовательностей показывают, что два исследуемых сорта арабики четко содержат KDEL последовательности, а три исследуемых сорта робусты - KDDL последовательности. Это результат предполагает, что KDDL аллель, веро тно, ограничиваетс  сортами робусты и не может быть обнаружен в сортах арабики. Хот  в изучаемых трех сортах робусты не было обнаружено KDEL последовательности, открытие одной KDEL последовательности в Comell EST библиотеке показывает, что этот аллель может существовать, по меньшей мере, в некоторых клонах некоторых сортов робусты.
Экспрессию гена СсСР-4 изучали с применением нозерн-блот и RT-PCR анализов. На фиг.19 показан результат, полученный в эксперименте с нозерн-блот анализом с использованием РНК, экстрагированной из кофейного зерна и перикарпи  на различных стади х развити , а также РНК, выделенной из корневища, молодых листочков, стеблей и цветков разных сортов арабики. Данные, полученные с использованием зонда СсСР-4 (KDDL), имеющего примерно 98% гомологии с известной ДНК последовательностью СсСР-4 (KDEL) аллел , показали, что СсСР-4 экспрессируетс  только в зерне. В перикарпии или в корневище, стебле, цветках и листь х его экспрессии не наблюдалось. Вследствие очень высокого уровн  идентичности между двум  аллел ми высказано предположение о том, что зонд СсСР-4 (KDDL) будет гибридизироватьс  с транскриптами этих двух аллелей. Аналогичный эксперимент с использованием RT-PCR анализа также вы вил такой же профиль экспрессии гена СсСР-4.
Экспрессию СсСР-4 изучали также в цельных зернах в процессе их проращивани  с применением RT-PCR анализа. В этом эксперименте использовали праймеры, которые  вл ютс  общими и дл  СеСР-4 KDEL, и дл  СсСР-4 KDDL аллелей. Результаты указанного эксперимента показаны на фиг.20. Транскрипты СсСР-4 были обнаружены на всех изучаемых стади х прорастани , хот  уровень транскриптов, веро тно, несколько снижалс  в 3-суточных образцах, а затем вновь начинал повышатьс  по мере прогрессировани  прорастани  (самый высокий уровень отмечен в 1- и 2-мес чных образцах).
Ling et al. (Ling J.-Q., Kojima Т., Shiraiwa M. and Takahara H., 2003, Biochim. Biophys. Acta, 1627,129-139) удалось выделить из сем долей соевых бобов две кДНК, кодирующие KDEL-содержащие цистеинпротеазы. Эти две кДНК имели 93,5% сходство на уровне ДНК и экспрессировались в корн х, цветках и в семенах в процессе их развити . В формирующихс  или зрелых семенах их экспрессии не наблюдалось по результатам нозерн-блоттинга, хот  экспресси  была обнаружена в зрелых бобах. кДНК, кодирующа  KDEL-содержащую цистеинпротеазу, была также выделена из моркови (SakutaC., Oda A., Konishi M., Yamakawa S., Kamada H. and Satoh S., 2001, Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 2243-2248). Транскрипты этого гена были обнаружены в зрелых высушенных семенах и в целых прорастающих семенах на 2 и 3 сутки после пропитки водой. Экспрессии этого гена в других ткан х моркови или в процессе развити  сем н не наблюдалось. Другой KDEL-содержащий белок и соответствующа  ему кДНК были выделены из V. sativa (Fischer J., Becker С., Hillmer S., Horstmann C., Neubohn В., Schlereth A., Senyuk V., Shutov A. and Muntz K., 2000, Plant Molecular Biol., 43, 83-101). С помощью нозерн-блоттинга транскрипты этого гена были обнаружены в сем дол х в процессе прорастани , но не в главной оси зародыша прорастающих сем н. В созревающих семенах, зрелых семенах или в листь х и корн х транскрипты не были обнаружены.
Представленные здесь результаты показывают, что цистеинпротеаза (СР) KDEL-типа из кофе про вл ет некоторые новые и неожиданные особенности. Во-первых, авторы за вки открыли, что кофейное зерно робуста экспрессирует СР ген KDEL-типа, который имеет одну единственную мутацию в последовательности, кодирующей область KDEL, что приводит к изменению от KDEL к KDDL. Основыва сь на данных Denecke et al. (1992), можно было ожидать, что это частное изменение в последовательности, св занной с задержкой бека в ER, изменит клеточную локализацию и/или контроль белка СсСР-4 (KDDL) робусты. Авторы за вки выдвинули предположение о том, что присутствие транскрибируемой копии гена СсСР-4 (KDDL) может продуцировать значительное изменение пептидного/аминокислотного профил  в кофейном зерне сортов с СсСР-4 (KDEL) последовательностью. Авторы за вки также показали, что цистеинпротеаза KDEL типа из кофе, показывающа  ожидаемую экспрессию в процессе прорастани  зерна, неожиданно экспрессируетс  также и на всех изученных стади х развити  зерна. Как отмечалось выше, до насто щего времени в опубликованной литературе нет четких данных, доказывающих значительную экспрессию цистеинпротеазы KDEL типа в других растени х в процессе развити  сем н, хот  ее транскрипты были обнаружены в зрелых семенах моркови (Sakuta et al., 2001).
Вновь обнаруженные свойства цистеинпротеазы KDEL типа из кофе, представленные выше, веро тно, оказывают важное вли ние на пептидный и аминокислотный профили в зрелых зернах арабики и робусты и, тем самым, измен ют этот пул критических предшественников кофейного аромата. Принима  во внимание, что транскрипты цистеинпротеазы KDEL типа присутствуют в зрелом кофейном зерне, представл етс  также возможным, что белок KDEL типа может активироватьс  в процессе влажной обработки кофе и, тем самым, измен ть в дальнейшем пептидный/аминокислотный профиль кофейного зерна после влажной обработки. Описанные эксперименты привели к созданию молекул рных маркеров (SNP и микросателлитный маркер), которые могут использоватьс  в классической селекционной работе по выведению сортов кофе со специфическими аллел ми гена цистеинпротеазы KDEL типа (которые будут вызывать сопутствующие изменени  белкового/пептидного/аминокислотного профилей). Например, можно селекционировать сорта робусты, которые будут иметь только KDEL аллель СсСР-4. Далее, с применением методов генетической модификации можно направленно измен ть активность цистеинпротеазы KDEL типа в кофе или других растени х путем специфичной сверхэкспрессии цистеинпротеаз KDEL или KDDL типа в семенах. Альтернативно: можно снижать уровень цистеинпротеазы KDEL типа с применением антисмысловой, смысловой или PHKi технологий. В обоих случа х белковый/пептидный/аминокислотный пул во вновь выведенных трансформированных растени х будет измен тьс , привод  к новым профил м белковых/пептидных/аминокислотных пулов предшественников аромата.
Нозерн-блот анализ, представленный на фиг.13, показывает, что ген СсАР-2 специфичной к аспарагиновой кислоте протеазы кофе экспрессируетс  как в зерне, так и перикарпии плодов кофейного дерева сорта С. arabica на всех изучаемых стади х развити  плодов. Ген СсАР-2 про вл ет также относительно высокую экспрессию в корневище. При более длительной экспозиции пленок при авторадиографии экспресси  СсАР-2 может быть обнаружена также в ткан х стеблей, листьев и цветков С. arabica.
СсАР-1 и СсАР-2
На фиг.21 и 22 показано, что каждый из СсАР-1 и СсАР-2 кодирует специфичную к аспарагиновой кислоте протеазу.
Сверхэкспресси  и неполна  экспресси  последовательностей генов протеаз CcCP-1, СсСР-4, СсАР-1 и СсАР-2 и ингибиторов протеаз CcCPI-1,2,3 и - 4 в кофейных зернах.
Предполагаетс , что основной профиль запасных белков и аминокислотный/пептидный профиль могут измен тьс  в зрелом кофейном зерне в результате изменени  (либо повышени , либо снижени ) экспрессии одного или более указанных генов.
Представл ющие интерес методы сверхэкспрессии гена хорошо известны из уровн  техники. Эти методы заключаютс  в создании химерного гена по трем основным компонентам:
1) по последовательности промотора на 5' конце гена, предпочтительно специфичного промотора сем н, которые начали примен ть в последнее врем , такие как, например, специфичный промотор кофейных зерен, описанный Marraccini et al.(Marraccini et al., 1999, Molecular cloning of the complete US storage protein gene of Coffea arabica and promoter analysis in transgenic tobacco plants=Молекул рное клонирование гена суммарного запасного белка US Coffea arabica и анализ промотора в трансгенных растени х табака. Plant Physiol. Biochem., Vol.37, 273-282, и WO 99/026688);
2) по полноразмерной кодирующей последовательности экспрессируемого гена;
3) по 3' контролирующей области, например, 3' области гена нопалинсинтазы из Т-ДНК Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens.
Затем химерный ген может быть клонирован в трансформационный вектор Agrobacterium tumefaciens, а этим вектором может быть трансформирован штамм Agrobacterium tumefaciens дл  его использовани  при трансформации кофе, котора  подробна трансформации, описанной Leroy et al., 2000 (Leroy et al., 2000, Genetically modified coffee plants expressing the Bacillus thuringiensis cry1Ac gene for resistance to leaf minor. = Генетически модифицированные кофейные деревь , экспрессирующие ген Bacillus thuringiensis cry1Ac с устойчивостью к образованию слабого листа. Plant Cell Reposts, 19, 382-389). Затем растени  со стабильными вставками трансформации можно скринировать с целью отбора сем н таких растений, которые сверхэкспрессируют специфические гены, используемые в эксперименте по трансформации, особенно в зрелых семенах, с применением таких методов, как методы обнаружени  сверхэкспрессии гена или сверхэкспрессии активности белков по сравнению с семенами псевдотрансформированных растений.
Например, высоковалифицированный специалист в данной области может создать рекомбинантную конструкцию, состо щую из (1) самой длинной промоторной последовательности гена 11S кофе, описанной Marraccini et al. (1999), (2) полноразмерной последовательности кДНК гена СсСР-1 или СсСР-4 (KDDL) без поли (А) "хвоста" и (3) известной последовательности терминации транскрипции, такой как хорошо изученный терминатор нопалина. Представл етс  также возможным, что повышенный уровень сверхэкспрессии рекомбинантных конструкций может быть результатом замены 5' некодирующей области СсСР-4 или других последовательностей кДНК на 5' кодирующую область гена 11S кофе или 5' некодирующие области других сильных специфических промоторов сем н либо кофе, либо других соответствующих разновидностей растений. Затем последовательности рекомбинантного гена могут быть встроены в соответствующий участок вектора Agrobacterium Т-ДНК, описанный Leroy et al. Сконструированный таким образом Т-ДНК вектор можно вводить в соответствующий штамм Agrobacterium, например, в штамм, описанный Leroy et al., а содержащий Т-ДНК штамм Agrobacterium можно использовать дл  трансформации кофе согласно методу, подробному описанному Leroy et al.
Из уровн  техники хорошо известно, что экспресси  известных последовательностей гена может понижатьс  или полностью блокироватьс  антисмысловой супрессией и экспрессией гена с использованием фрагментов нуклеиновых кислот, составл ющих лишь часть полной кодирующей области гена, и нуклеиновыми кислотами, которые не имеют 100% идентичности последовательностей с супрессируемым геном. В этом случае последовательности, выбранные дл  конкретного эксперимента антисмысловой супрессии или косупрессии, будут замен ть полноразмерный ген в представленной выше схеме конструировани  химерного гена. Полученные химерные конструкции антисмысловой супрессией или косупрессией можно клонировать в трансформационный вектор Agrobacterium tumefaciens и им трансформировать штамм Agrobacterium tumefaciens в цел х его испльзовани  дл  трансформации кофе, как описано выше. Затем растени  со стабильными трансформационными вставками можно скринировать дл  отбора растений с пониженной экспрессией специфических генных последовательностей, используемых в семенах трансформированных растений. Пониженную экспрессию можно обнаружить такими методами, как нозерн-блоттинг, RT-PCR с неполной и/или полной количественной оценкой.
Другой метод снижени  или подавлени  экспрессии гена в растени х предусматривает использование небольших фрагментов раскрытых здесь последовательностей гена дл  продуцировани  РНК сайленсинга сиспользованием интерферирующей РНК (PHKi, см., например, Hannon G.J., 2002, Nature, Vol.418, 244-251;
Tang et al., 2003, Genes Dev, Vol.17, 49-63). Согласно этому подходу, небольшие участки одной или более раскрытых здесь последовательностей можно клонировать в трансформационный вектор Agrobacterium tumefaciens, как описано выше, который содержит специфичный дл  сем н промотор и соответствующую 3' регул торную область. Эта нова  встраиваема  последовательность дл  PHKi должна конструироватьс  таким образом, чтобы продуцируема  РНК формировала РНК структуру in vivo, что приведет к образованию небольших двунитевых РНК в трансформированных клетках, при этом последовательности этих небоьших двунитевых РНК будут инициировать распад гомологичных им мРНК в указанных трансформированных клетках.
Скрипит естественно происход щих мутаций в генах СсСР-1. СсСР-4, CcAP-1,СсАР-2, CcCPI-1, CcCPI-2, CcCPI-3, CcCPI-4 и создание новых мутаций в указанных генах.
Раскрытые здесь последовательности могут использоватьс  д л скрининга природных попул ций аллельных вариантов указанных генах. Это может осуществл тьс  путем использовани  последовательностей СсСР-1, СсСР-4, СсАР-1, СсАР-2, CcCPI-1, CcCPI-2, CcCPI-3, CcCPI-4 в качестве зондов при поиске естественно возникших ПДРФ (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) в геномной ДНК из различных сортов кофе. Более высокопроизводительным методом обнаружени  аллельных вариантов  вл етс  применение технологии скрининга мутаций, св занной с TILLING-методом (Till B.J., et al., 2003, Large scale discovery of induced point mutations with highthroughput TILLING. = Крупномасштабное обнаружение индуцируемых точечных мутаций с помощью высокопроизводительного TILLING-метода. Genome Research, Vol.13, 524-530). В этом случае выделенна  и клонированнна  одна кака -нибудь специфическа  последовательность гена, например, из раскрытых здесь СсСР-1, СсСР-4, СсАР-1, СсАР-2, CcCPI-1, CcCPI-2, CcCPI-3, CcCPI-4 последовательностей, при скрининге мутаций, св занном с TILLING-методом, может использоватьс  дл  идентификации вариантов последовательностей между клонированной последовательностью и соответствующей последовательностью кДНК или геномной последовательностью в различных сортах. Использу  пары ПЦР праймеров, кодирующих сегментов ДНК из 700-1100 пар оснований известного клонированного гена, можно сканировать дл  вы влени  естественно возникших изменений в его последовательност х в различных сортах. В идеальном случае один или более вариантов последовательностей может коррелировать также с конкретным фенотипическим изменением, идентифицирующим, тем самым, генетический маркер этого фенотипического варианта.
Кроме того, использу  раскрытые здесь последовательности СсСР-1, СсСР-4, СсАР-1, СсАР-2, CcCPI-1, CcCPI-2, CcCPI-3 и.CcCPI-4, можно применить полный TILLING-метод дл  создани  и обнаружени  новых мутантов по указанным генам и получить, таким образом, растени , содержащие эти специфические мутации. Например, использу  полный TILLING-метод, можно вывести кофейные деревь , которые будут иметь специфические мутации, такие как, например, миссенс-мутации (привод щие к подстановке несоответствующей аминокислоты в белковую цепь) в кодирующей последовательности, котора  инактивирует представл ющий интерес ген-мишень.