ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛА К CD151 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА
USE OF CD 151 ANTIBODIES FOR TREATING CANCER

Настоящее изобретение относится к новому применению антител к CD 151, способных ингибировать рост опухолей, причем указанные антитела являются, в частности, мышиными, химерными или гуманизированными моноклональными антителами. В соответствии с частным вариантом, изобретение относится к применению этих антител или их функциональных фрагментов в качестве лекарственных препаратов для профилактического и/или терапевтического лечения рака. Изобретение относится также к продуктам и/или композициям, содержащим такие антитела, ассоциированные, например, с противораковыми антителами и/или с противораковыми агентами, или конъюгированные с токсинами, и к их применению для профилактического и/или терапевтического лечения некоторых видов рака.
CD 151, называемый также PETA-3 или SFA-1, представляет собой мембранный белок, относящийся к семейству тетраспанинов (Boucheix et Rubinstein, 2001, Cell Mol. Life Sci.58, 1189-1205; Hemler, 2001, J.Cell Biol. 155, 1103-1107). У людей CD 151 имеет 253 аминокислоты и содержит 4 мембранных фрагмента и 2 внеклеточных домена ЕС1 (18 аминокислот, последовательность [40-57]) и ЕС2 (109 аминокислот, последовательность [113-221]), называемых также внеклеточными петлями. Следует отметить, однако, что для CD 151 на сегодняшний день идентифицированы два варианта нуклеотидной последовательности, а именно, один, включающий нуклеотиды А и С соответственно в положениях 395 и 409 (SEQ ID No.1) [Fitter et al., Blood 86(4), 1348-1355] и второй, включающий в тех же положениях нуклеотиды G и T вместо нуклеотидов А и С [Hasegawa et al., 1996, J.Virol. 70(5), 3258-3263]. В этой связи может наблюдаться мутация на уровне пептидной последовательности, а именно, мутация остатков К (Lys) и P (Pro) соответственно в положениях 132 и 137 в остатки R (Arg) и S (Ser) [Fitter et al., 1995, Blood 86(4), 1348-1355/Hasedawa et al., 1996, J.Virol. 70(5), 3258-3263].
CD151 суперэкспрессируется в различных раковых клетках, как, например, в клетках рака легких [Tokuhara et al., 2001, Clin.Cancer Res. 7, 4109-4114], толстой кишки [Hashida et al., 2003, Br.J.Cancer 89, 158-167], предстательной железы [Ang et al., 2004, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 13, 1717-1721] или поджелудочной железы [Gesierich et al., 2005, Clin.Cancer Res. 11, 2840-2852].
Использование мышей с нокаутом, не экспрессирующих CD 151, и антител к CD 151 и миРНК для блокирования функционирования in vitro и экспрессии CD 151 в клетках различного типа, позволило продемонстрировать, что CD 151 задействован в разнообразных процессах, связанных с раком, таких как клеточная адгезия (Nishiuchi et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 1939-1944; Winterwood et al., 2006, Mol. Biol. Cell 17, 2707-2721), подвижность клеток (Kohno et al.,2002, Int. J. Cancer 97, 336-343), клеточная миграция (Yauch et al., 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-2765; Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820; Penas et al., 2000, J. Invest. Dermatol. 114, 1126-1135; Klosek et al., 2005, Biochem. Biophys. Res. Commun. 336, 408-416), клеточная инвазия (Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343; Shiomi et al., 2005, Lab. Invest. 85, 1489-1506; Hong et al., 2006, J. Biol. Chem. 281, 24279-24292) и ангиогенез (Yanez-Mo et al., 1998, J. Cell Biol. 141, 791-804; Sincock et al., 1999, J. Cell Sci. 112, 833-844; Takeda et al., 2006, Blood).
Одним из отличительных свойств тетраспанинов является способность их к ассоциации друг с другом, а также с большим числом других поверхностных молекул с образованием структурированных макромолекулярных комплексов. Внутри этих комплексов каждый тетраспанин специфически ассоциируется с одной или несколькими поверхностными молекулами, образуя, таким образом, первичные комплексы, состоящие из одного тетраспанина и одной молекулы-партнера. Тетраспанины могут организовывать особые микродомены плазматической мембраны, внутри которых они по-видимому рекрутируют своих молекулярных партнеров, которые могли бы сочетаться по функциональному признаку. Совокупность взаимодействий, в которых участвуют тетраспанины, называют «тетраспаниновой сетью» или «Тетраспанином Web».
CD 151 взаимодействует на поверхности клеток с различными мембранными белками. В частности, были обнаружены очень стабильные комплексы, резистентные к действию некоторых детергентов, с интегринами, являющимися рецепторами ламининов, более конкретно, с интегринами α3β1 или α6β4, предпочтительным лигандом которых является ламинин 5 (Yauch et al., 1998, Mol. Diol. Cell 9, 2751-2765; Lammerding et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci USA 100, 7616-7621). Эта ассоциация вовлекает внеклеточные домены белка CD151 и интегринов. Последовательность QRD [194-196] белка CD 151, локализованная в петле ЕС2, очень важна в этой ассоциации, поскольку мутация этого сайта приводит к потере взаимодействия с некоторыми интегринами (Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309). С другой стороны, в опухолевых клетках были обнаружены третичные функциональные комплексы CD151/интегрин α6β4/с-Met (рецептор HGF) (Klosek et al. 2005, Biochem. Biophys. Res. Commun. 336, 408-416). Ингибирование экспрессии CD 151 обработкой клеток при помощи интерференции РНК приводит к ингибированию роста и миграции клеток, индуцируемой HGF.
Взаимодействия внутри самой клетки CD 151 с другими тетраспанинами, необходимые для формирования сети тетраспанинов, по-видимому зависят от мембранных и цитоплазмических участков CD151, поскольку было доказано, что делеция петли ЕС2 не разрушает ассоциацию CD 151 с другими тетраспанинами (Berditchevski, 2001, J. Cell Sci. 114, 4143-4151).
CD 151 способен регулировать процессы адгезии, миграции и инвазии клеток путем модулирования различных сигнальных путей, таких как, например, путь фосфоинозитидов через ассоциацию с Р14-киназой (Yauch et al., 1998, Mol. Diol. Cell 9, 2751-2765), сигнальный путь с-Jun через фосфорилирование FAK, Src, h38-MAPK и JNK (Hong et al., 2006), фосфорилирование интегринов с помощью PKC (Zhang et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 2500-25013), активацию GNPаз семейства Rho (Shigeta et al., 2003, J. Cell Biol. 163, 165-176).
Взаимодействия гомофильного типа между клетками также ответственны за увеличение клеточной подвижности и экспрессии металлопротеиназы ММР-9 (Hong et al., 2006). Эти межклеточные взаимодействия CD151-CD151 вызывают активацию с-Jun посредством фосфорилирования FAK, Src, p38-MAPK и JNK.
На сегодняшний день, несмотря на привлекательность белка CD151, было выделено единственное антитело для использования с терапевтической целью, а именно, моноклональное антитело 50-6.
Моноклональное антитело 50-6 (изотип IgG1), направленное против CD 151, было выделено у мыши путем субстратной иммунизации с использованием человеческих клеток эпидермоидной карциномы НЕр-3 (Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820).
Антитело 50-6 способно игибировать in vitro миграцию клеток человека цервикальной карциномы HeLa, трансфицированных с целью суперэкспрессии CD 151, и клеток НЕр-3, и ангиогенез на модели неоваскуляризации хориоаллантойной мембраны, индуцированной bFGF (basic fibroblast growth factor). Оно ингибирует in vivo метастазирование, индуцированное инокуляцией клеток HEp-3 на 2 моделях куриного эмбриона (Testa et al, 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820). В этих моделях ингибирующая активность антитела 50-6 определяется измерением активности белка huPA (human urokinase-type plasminogen activator) в экстрактах легких. Согласно авторам этот анализ отражает наличие клеток человека в легких. После анализа снижение метастазирования (разрастание клеток НЕр-3 в легких куриных эмбрионов), индуцированное антителом 50-6, оценивается, по сравнению с контрольным антителом, как 74% на модели, названной «спонтанное метастазирование», в которой за инокуляцией клеток следует инъекция антитела, и как 57% на модели, названной «экспериментальное метастазирование», в которой клетки и антитело совместно инокулированы. Согласно авторам, противоопухолевые свойства антитела 50-6, наблюдаемые in vivo, не связаны, по всей видимости, с цитостатическим или цитотоксическим эффектом, поскольку не доказано никакого действия на пролиферацию in vitro клеток НЕр-3.
Гибридома, продуцирующая антитело 50-6, находится в АТСС под номером CRL-2696 (гибридома, депонированная первоначально под номером 50-6 [РТА-227]).
В соответствии с общим аспектом, настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного антитела или одного из его функциональных фрагментов, способного связываться с белком CD 151 и таким образом ингибировать рост опухоли, для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака.
Множество экспериментальных исследований доказали главную роль тетраспанинов в образовании метастаз, действуя либо в качестве супрессоров, либо в качестве промоторов метастаз. Таким образом, трансфекция тетраспанинов, таких как CD9, CD63 или CD82, снижает метастатический потенциал линий раковых клеток. И наоборот, экспрессия тетраспанинов CD151 и Co-029 по-видимому производит обратный эффект. Следовательно, эти 2 тетраспанина являются, по-видимому, промоторами метастазирования. Эти результаты согласуются с различными клиническими исследованиями, которые показали, что во многих раковых клетках (рака молочных желез, легкого, пищевода, желудка, печени, поджелудочной железы, толстой кишки, предстательной железы, меланомы…), CD9 и CD82 меньше экспрессируются на стадии первичных опухолей, если происходит метастазирование, и снижение их экспрессии предсказывает более низкую продолжительность жизни. При раке легкого суммарное снижение экспрессии CD9 и CD82 коррелируется с более высоким метастатическим потенциалом по сравнению с тем, когда экспрессия одного из этих двух антигенов уменьшена.
Множество проведенных ранее исследований показало, что суперэкспрессия CD151 ассоциируется с агрессивностью некоторых видов рака, таких как рак легких, толстой кишки и предстательной железы, и может рассматриваться как фактор плохого прогноза (Tokuhara et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7, 4109-4114; Hashida er al., 2003, Br.J. Cancer 89, 158-167; Ang et al., 2004, Cancer Epidermiol. Biomarkers Prev. 13, 1717-1721). В этих случаях средняя продолжительность жизни действительно меньше у пациентов, опухоль которых экспрессирует CD151, по сравнению с пациентами, опухоль которых не экспрессирует CD151.
Суперэкспрессия CD151 в различных опухолевых линиях клеток человека (HeLa, RPMI14788, A172, HT1080), индуцированная трансфекцией соответствующего гена, провоцирует увеличение подвижности, миграции и инвазии трансфицированных клеток (Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820); Kohno et al, 2002, Int. Cancer 97, 336-343). Эти процессы ингибируются в присутствии антитела против CD151.
2
2
В соответствии с другим аспектом, функциональные фрагменты антител согласно изобретению состоят, например, из фрагментов Fv, scFv (sc - простая цепь (simple chaine)), Fab, F(ab'), Fab', scFv-Fc или диател, или из любого фрагмента, полу-период жизни которого можно было бы увеличить путем химической модификации, такой как введение поли(алкилен)гликоля, такого как поли(этилен)гликоль («ПЭГликозилирование»)(ПЭГликозилированные фрагменты называют Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')-PEG или Fab'-PEG) (“PEG” согласно английской номенклатуре Poly(Ethylene)Glycol), или путем включения в липосому, микросферы или PLGA, причем указанные фрагменты способны как правило проявлять активность, даже частичную, того антитела, из которого они получены.
Предпочтительно, указанные функциональные фрагменты представляют собой или включают частичную последовательность тяжелой или легкой вариабельной цепи антитела, из которого они получены, причем указанная частичная последовательность достаточна, чтобы сохранить такую же специфичность связывания, которая присуща антителу, из которого она получена, и достаточную афинность, предпочтительно, равную, по меньшей мере, 1/100, более предпочтительно, 1/10 афинности антитела, из которого она получена.
Такой функциональный фрагмент содержит не менее 5 аминокислот, предпочтительно, 10, 15, 25, 50 и 100 последовательных аминокислот последовательности антитела, из которого он получен.
2
Предпочтительно, эти функциональные фрагменты являются фрагментами типа Fv, scFv, Fab, F(ab'), F(ab'), scFv-Fc или диателами, которые обладают обычно такой же специфичностью связывания, как и антитело, из которого они получены. В соответствии с настоящим изобретением фрагменты антитела согласно изобретению могут быть получены из антител, которые описаны выше, такими способами, как переваривание ферментами, такими как пепсин или папаин и/или расщепление дисульфидных мостиков путем химического восстановления. С другой стороны, фрагменты антитела согласно изобретению могут быть получены методами генетических рекомбинаций, также хорошо известных специалисту, или же путем пептидного синтеза с помощью, например, автоматических пептидных синтезаторов, таких как синтезаторы, поставляемые фирмой Applied.
Согласно аспекту изобретения, используемое антитело представляет собой мышиное моноклональное антитело.
Под антителами согласно изобретению понимают также химерные или гуманизированные антитела.
Под химерным антителом понимают антитело, которое содержит натуральный вариабельный участок (легкую цепь и тяжелую цепь), происходящий из антитела заданного типа, ассоциированного с константными участками легкой и тяжелой цепи антитела типа, гетерологичного по отношению к указанному заданному типу.
Антитела или их фрагменты химерного типа, используемые согласно изобретению, могут быть получены с использованием методов генетической рекомбинации. Например, химерное антитело может быть получено путем клонирования рекомбинантной ДНК, содержащей промотор и последовательность, кодирующую вариабельный участок моноклонального антитела, не относящегося к человеку, в частности, мыши, согласно изобретению, и последовательность, кодирующую константный участок антитела человека. Химерным антителом согласно изобретению, кодируемым таким рекомбинантным геном, является, например, химера мышь/человек, причем специфичность этого антитела детерминируется вариабельным участком, полученным из ДНК мыши и ее изотипа, детерминируемого константным участком ДНК человека. Для знакомства с методами получения химерных антител можно сослаться, например, на документ Verhoeyn и сотр. (BioEssays, 8:74, 1988).
Под гуманизированными антителами понимают антитело, которое содержит участки CDRs, полученные из антитела, не относящегося к человеку, а другие части молекулы антитела получены из одного (или нескольких) антител человека. Кроме того, некоторые остатки сегментов скелета (называемые FR) могут быть модифицированы для сохранения афинности связывания (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988).
Гуманизированные антитела или их функциональные фрагменты могут быть получены известными специалисту способами (такими, например, которые описаны в документах Singler et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-42, 1992; Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992). Такие гуманизированные антитела предпочитают использовать в способах профилактического и/или терапевтического лечения in vivo. Другие способы гуманизирования также известны специалисту, такие как, например, способ “CDR Grafting”, описанный PDL, являющийся объектом изобретения патентов ЕР 0451261, ЕР 0682040, ЕР 0939127, ЕР 0 566647 или же патентов US 5530101, US 6180370, US 5585089 US 5693761. Можно также назвать патенты US 5639641 или же 6054297, 5886152 и 5877293.
В настоящем изобретении неожиданно и совершенно неочевидно для специалиста впервые предложено применять антитело к CD151, описанное выше, или один из его функциональных фрагментов, способное ингибировать пролиферацию опухолевых клеток и развитие первичной опухоли, независимо от его способности ингибировать ангиогенез и/или образование метастаз.
Таким образом, антитела, описанные в настоящей заявке, обладают способностью ингибировать на очень ранней стадии развитие опухолей.
Эта противоопухолевая активность антител согласно изобретению является новым и неожиданным свойством для антитела, направленного к CD151, поскольку ни одно антитело к CD151, описанное на сегодняшний день, не обладает активностью этого типа. Таким образом, антитела согласно изобретению имеют свойство, отличающееся и дополнительное по отношению к антителам, ранее описанным, в частности, по отношению к антителу 50-6, поскольку противоопухолевые свойства этого антитела не связаны с действием на пролиферацию опухолевых клеток.
Этот результат свидетельствует также о том, что впервые обнаружена связь между CD151 и развитием первичной опухоли и даже пролиферацией опухолевых клеток in vivo. Действительно, на сегодняшний день описаны только про-метастатические и про-ангиогенные активности CD151.
Беспорядочная пролиферация клеток какого-либо органа или ткани является одним из первых этапов образования раковой опухоли. Опухолевые клетки являются клетками, которые не способны более подвергаться нормальному контролю роста клеток внутри данного органа или ткани. Рост опухоли имеет экспоненциальную динамику, при этом опухолевые клетки начинают чрезмерно размножаться под воздействием факторов роста и ангиогенеза.
Согласно главному аспекту, изобретение относится к применению по меньшей мере одного антитела к CD151, или одного из его функциональных фрагментов, способного ингибировать развитие первичной опухоли и пролиферацию опухолевых клеток.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного антитела или одного из его функциональных фрагментов, способного связываться с белком CD151, для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения первичных опухолей.
Кроме того, авторы изобретения предполагают, не основываясь однако на какой-либо теории, что применение антитела против CD151 для лечения рака представляет интерес не только в связи с ингибированием ангиогенеза, но также в связи с ингибированием активности CD151, стимулирующей метастазирование.
Таким образом, настоящее изобретение относится к применению антитела, описанного выше, или одного из его функциональных фрагментов, способного ингибировать активность указанного белка CD151, стимулирующую метастазирование внутри опухолевых клеток.
Более конкретно, авторы считают, что это ингибирование проявляет себя в ингибировании различных этапов метастатического процесса, в частности, клеточной адгезии, миграции клеток и/или клеточной инвазии.
Классическими этапами указанной стимулирующей активности, более конкретно, разрастания опухоли и метастатических процессов, являются следующие:
1) инвазия клеток первичной опухоли в соединительные ткани, которая влечет за собой расщепление с помощью протеолитических ферментов (таких как металлопротеиназы) базальной мембраны и внеклеточного матрикса, состоящих из структурных белков, таких как ламинин, коллаген или фибронектин,
2) миграция опухолевых клеток через ткани в циркулирующий поток крови,
3) прилипание к стенкам сосудов и задержка в органе,
4) выход из сосуда (новый этап инвазии) и адаптация к новой окружающей среде (пролиферация и ангиогенез).
Миграция клеток имеет существенное значение в процессе эмбрионального развития. Несмотря на то, что миграция клеток играет меньшую роль у взрослых, некоторые типы клеток, такие как лимфоциты, макрофаги и фибробласты, продолжают перемещаться в процессе иммунного ответа, воспаления и заживления раны у взрослых для сохранения гомеостаза. Однако при патологии миграция опухолевых клеток способствует главным образом развитию опухолей на метастатической стадии. Некоторое число хемотаксических факторов ответственны за эту миграцию, этими факторами являются производные либо опухолевых клеток, либо клеток-хозяев. Среди таких факторов следует назвать факторы роста (в частности, факторы роста, которые стимулируют ангиогенез), пептиды, разрушающие коллаген, адгезивные белки, такие как ламинин и фибронектин.
Согласно частному аспекту настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного антитела против CD151 или одного из его функциональных фрагментов, способного ингибировать клеточную миграцию опухолевых клеток.
Инвазия является главным признаком злокачественности опухоли: она выходит за границы своего места происхождения и распространяется в близлежащие и отдаленные ткани. Инвазивный характер выражается в потере свойств, обычно присущих клетке: обычно клетки большинства тканей прилипают друг к другу за счет структур, называемых десмосами, за счет адгезивных молекул; в эпителии клетки прилипают также и к базальной мембране, которая лимитирует глубину эпителия. Опухолевые клетки теряют эти нормальные качества и приобретает новые. Связи между ними ослабляются и клетки высвобождаются друг от друга. Они приобретают подвижность, которая им позволяет открепиться от первоначального местоположения, проникнуть (захватить) в соседние ткани, следуя иногда за волокнами соединительной ткани. Для эпителиев, как правило, ограничиваемых базальной мембраной, и для карцином, которые из них возникли, эта мембрана становится первым препятствием, которое надо преодолеть. Она изменяется и растворяется под действием ферментов (протеаз, катепсина), секретируемых опухолевыми клетками. Подобная деструкция базальной мембраны иногда усиливается под действием ферментов, которые секретируются в нормальных условиях белыми глобулами, но которые отклонились от своей обычной активности. Все эти биологические и молекулярные модификации в поведении клеток являются условием инвазии.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного антитела к CD151 или одного из его функциональных фрагментов, способного ингибировать клеточную инвазию опухолевых клеток.
Клетки организма прилипают друг к другу и к внеклеточному матриксу, окружающему их. Клеточная адгезия носит убиквитарный характер, участвуя в большинстве физиологических клеточных процессов, таких как выживаемость, пролиферация и дифференцировка клеток, и также участвуя в различных патологических ситуациях, таких как, например, рак и метастазирование. Различные белки клеточной поверхности вовлечены в клеточную адгезию, такие как кадерины или интегрины.
Предпочтительно, применение согласно изобретению заключается, главным образом, в ингибировании клеточной адгезии.
Согласно еще одному аспекту, настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного антитела к CD151 или одного из его функциональных фрагментов, способного ингибировать клеточную адгезию опухолевых клеток.
Как указано выше, белок CD151 относится к семейству тетраспанинов и поэтому содержит 2 внеклеточных домена ЕС1 (18 аминокислот, последовательность [40-57]) и ЕС2 (109 аминокислот, последовательность [113-221]), называемые также внеклеточными петлями.
Согласно настоящему изобретению используемые антитела способны связываться по меньшей мере с одним эпитопом, находящимся во внеклеточном домене. Предпочтительно, указанное антитело связывается на уровне петель ЕС1 и/или ЕС2.
Более конкретно, согласно предпочтительной форме осуществления изобретения, предлагается применение по меньшей мере одного антитела к CD151 или одного из его функциональных фрагментов, способного связываться с одним эпитопом, находящимся во внеклеточной петеле 1 (ЕС1) и/или 2 (ЕС2), предпочтительно, в петле ЕС2, соответствующим соответственно аминокислотам 40-57 (SEQ ID No6) и 113-221 (SEQ ID No4) белка CD151.
Петля ЕС1 [40-57] содержит 18 аминокислот и имеет теоретическую массу 2002,2 Да.
Петля ЕС2 [113-221] включает сайт N-гликозилирования (остаток Asn 159) и 6 остатков цистеина, образующих 3 дисульфидных мостика. Структурная модель петли ЕС2 тетраспанинов, в частности, CD151, предложена на основе трехмерной структуры петли ЕС2 тетраспанина CD81 (Seigneuret et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 40055-40064). Согласно этой модели тетраспанины имеют общий остов, относительно устойчивый и состоящий из 3 α-спиралей, и один специфический вариабельный домен. В CD151 этот остов по-видимому состоит из участков [113-157] и [209-221] и вариабельного домена участка [158-208].
Вариабельный домен петли ЕС2 по-видимому задействован, более конкретно, в специфических взаимодействиях CD151 с белками семейства интегринов. Эксперименты с направленной мутацией доказали, в частности, важность участка [193-208], более конкретно, трипептида QRD[194-196] и остатка цистеина в положении 192, в ассоциации CD151 с некоторыми интегринами, являющимися рецепторами ламинина, такими как интегрины α3β1 или α3β4 (Kazarov et al., 2002, J. Cell. Biol. 158, 1299-1309).
194-196
Более предпочтительно, настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного антитела к CD151 или одного из его функциональных фрагментов, способного связываться с эпитопом участка ЕС2, включающим по меньшей мере аминокислоты глутамин, аргинин и аспартат, соответственно в положениях 194, 195 и 196 (QRD) белка CD151.
Согласно другому аспекту, изобретение заключается главным образом в применении по меньшей мере одного антитела к CD151 или одного из его функциональных фрагментов, которое представляет собой моноклональное антитело.
Следует иметь ввиду, что термин «моноклональное антитело» означает антитело, выделенное из популяции практически гомогенных антител. Более конкретно, индивидуальные антитела одной популяции являются идентичными, за исключением нескольких возможных мутаций, которые могут естественно произойти, но доля которых в популяции минимальна. Иначе говоря, моноклональное антитело представляет собой гомогенное антитело, являющееся продуктом пролиферации только одного клеточного клона (например, гибридомы, эукариотической клетки-хозяина, трансфекцированной молекулой ДНК, кодирующей гомогенное антитело, прокариотической клетки-хозяина, трансфекцированной молекулой ДНК, кодирующей гомогенное антитело, и т.д.), и которое обычно характеризуется тяжелыми цепями одного и того же класса и под-класса и легкими однотипными цепями. Моноклональные антитела обладают высокой специфичностью и направлены только к одному антигену. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые традиционно включают различные антитела, направленные против различных детерминант или эпитопов, каждое моноклональное антитело направлено только к одному эпитопу антигена.
Согласно конкретному варианту осуществления изобретения, используемое моноклональное антитело выбирают из антител TS151 и TS151r. В дальнейшем описании обозначения TS151r и TS151R являются взаимозаменяемыми.
Следовательно, настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного антитела к CD151 или одного из его функциональных фрагментов, при котором указанное антитело представляет собой антитело TS151 и/или антитело TS151r.
Более конкретно, антитело TS151 характеризуется тем, что оно включает по меньшей мере:
- 3 CDRs тяжелой цепи CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 соответственно последовательности SEQ ID No.7, 8 и 9; и
- 3 CDRs легкой цепи CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 соответственно последовательности SEQ ID No.11, 12 и 13.
Согласно другому варианту осуществления, антитело TS151 характеризуется тем, что оно включает одну тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID No.10, и одну легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID No.14.
В представленную ниже таблицу 1 сведены указанные элементы.
Таблица 1
Антитело
Легкая цепь
Тяжелая цепь
SEQ ID No
TS151
CDR-H1
7
CDR-H2
8
CDR-H3
9
CDR-L1
11
CDR-L2
12
CDR-L3
13
полная (вариа-бельный домен)
10
полная (вариа-бельный домен)
14
Что касается антитела TS151r, то оно характеризуется тем, что включает по меньшей мере:
- 3 CDRs тяжелой цепи CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 соответственно последовательности SEQ ID No.15,16 и 17; и
- 3 CDRs легкой цепи CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 соответственно последовательности SEQ ID No.19,20 и 21.
Согласно другому варианту осуществления, антитело TS151r характеризуется тем, что оно включает одну тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID No.18, и одну легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID No.22.
В представленную ниже таблицу 2 сведены указанные элементы.
Таблица 2
Антитело
Легкая цепь
Тяжелая цепь
SEQ ID No
TS151r
CDR-H1
15
CDR-H2
16
CDR-H3
17
CDR-L1
19
CDR-L2
20
CDR-L3
21
полная (вариа-бельный домен)
18
полная (вариа-бельный домен)
22
Согласно другому варианту осуществления, в таблице 3, представленной ниже, объединены нуклеотидные последовательности антител TS151 и TS151r.
Таблица 3
Антитело
Легкая цепь
Тяжелая цепь
SEQ ID No
TS151
CDR-H1
23
CDR-H2
24
CDR-H3
25
CDR-L1
27
CDR-L2
28
CDR-L3
29
полная (вариа-бельный домен)
26
полная (вариа-бельный домен)
30
TS151r
CDR-H1
31
CDR-H2
32
CDR-H3
33
CDR-L1
35
CDR-L2
36
CDR-L3
37
полная (вариа-бельный домен)
34
полная (вариа-бельный домен)
38
Получение указанных антител подробно описано в примере 1. Эти 2 антитела направлены к различным эпитопам, поскольку TS151 хорошо распознает белок CD151, когда он ассоциирован с интегринами или находится в свободном виде на поверхности клетки (Chometon et al., 2006, Exp. Cell Res. 312, 983-995), в то время как антитело TS151r не распознает комплексы CD151-интегрины (Serru et al., 1999, Biochem. J. 340, 103-111; Geary et al., 2001, Tissue Antigenes 58, 141-153; Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309; Sterk et al., 2002, J. Cell Sci. 115, 1161-1173). Эпитоп, узнаваемый TS151r, локализован в петле ЕС2 и содержит остатки Q194, R195 D196 (Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309). Следовательно, это антитело, по крайней мере частично, направлено к сайту CD151, участвующему во взаимодействиях с интегринами. Остаток С192, повидимому, также сам участвует в распознавании CD151 при помощи TS151r (Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309). Эпитоп антитела TS151, хотя и отличается от эпитопа антитела TS151r, точно не определен.
Обработка кератиноцитов человека (линия клеток эпителия НаСаТ) антителом TS151r приводит к потере контакта клетка-клетка, к перегруппировке цитоскелета, внутриклеточному перераспределению интегрина α6β4 и увеличению миграции клеток на ламинине 1 (Chometon et al., 2006, Exp. Cell Res. 312, 983-995).
Более конкретно, предпочтительно используемое антитело представляет собой антитело TS151.
Предпочтительно, использование антител против CD151 в рамках лечения рака особенно оправдывается в случае рака, раковые клетки которого суперэкспрессируют тот же рецептор CD151.
К таким формам рака относится рак толстой кишки [Hashida et al., Br. J. Cancer 89 (2003): 158-167], рак легкого, предпочтительно, немелкоклеточный рак легкого [Tokuhara et al., Clin. Cancer Res. 7 (2001): 4109-4114], рак предстательной железы [Ang et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers 13 (2004):1717-1721] и рак поджелудочной железы [Gesierich et al., Clin. Cancer Res. 11(2005):2840-2852].
Таким образом, настоящее изобретение относится к применению антитела, описанного выше, для лечения рака, причем раком предпочтительно является рак толстой кишки, легкого, предстательной железы или поджелудочной железы.
Изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала соединение, представляющее собой антитело или одно из его производных соединений или функциональных фрагментов, предпочтительно, с добавлением фармацевтически приемлемого эксперимента и/или носителя.
Более конкретно, изобретение относится к применению антитела согласно изобретению для получения фармацевтической композиции, дополнительно содержащей по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.
В настоящем описании под фармацевтически приемлемым носителем понимают соединение или комбинацию соединений, входящее в фармацевтическую композицию, не вызывающее побочные реакции, и позволяющее, например, облегчить введение активного соединения или соединений, увеличить продолжительность его жизни и/или его эффективность в организме, увеличить его растворимость в растворе или способствовать его консервации. Эти фармацевтически приемлемые носители хорошо известны и могут быть применены специалистом в зависимости от природы и способа введения выбранного активного соединения или соединений.
Предпочтительно, эти соединения вводят системным путем, в частности, внутривенным путем, внутримышечным, внутрикожным, внутрибрюшинным или подкожным путем или пероральным путем. Более предпочтительно, композицию, содержащую антитела согласно изобретению, вводят в несколько приемов, разделенных во времени.
Способы их введения, дозировку и оптимальные галеновые формы могут определяться в зависимости от критериев, которые учитываются при выработке лечения, подходящего для пациента, таких как, например, возраст или масса тела пациента, тяжесть его общего состояния, толерантность к лечению и выявленные побочные эффекты.
Согласно изобретению предлагается композиция для лечения рака, отличающаяся тем, что она содержит в качестве действующего начала по меньшей мере одно антитело к CD151 или один из его функциональных фрагментов, способное связываться с белком CD151.
Согласно изобретению предлагается композиция для лечения рака, отличающаяся тем, что она содержит в качестве действующего начала по меньшей мере одно антитело к CD151 или один из его функциональных фрагментов, способное связываться с белком CD151 и/или ингибировать его активность, стимулирующую метастазирование.
Согласно изобретению предлагается также композиция для лечения рака, отличающаяся тем, что она содержит в качестве действующего начала по меньшей мере одно антитело к CD151 или один из его функциональных фрагментов, способное ингибировать развитие первичных опухолей.
Согласно другому аспекту изобретения предлагается композиция, содержащая по меньшей мере одно антитело к CD151 или один из его функциональных фрагментов, причем по меньшей мере одно антитело представляет собой моноклональное антитело, выбранное из антител TS151 или TS151r.
Согласно другому аспекту изобретения, предлагается композиция, которая содержит комбинацию антител TS151 и TS151r или их функциональные фрагменты.
Из литературы известно, что белок CD151 суперэкспрессируется в раковых опухолях, в частности, в карциномах толстой кишки [Hashida et al., Br. J. Cancer 89 (2003): 158-167], в раковых опухолях немелкоклеточного рака легкого [Tokuhara et al., Clin. Cancer Res. 7 (2001): 4109-4114], раковых опухолях предстательной железы [Ang et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers 13 (2004):1717-1721] и раковых опухолях поджелудочной железы [Gesierich et al., Clin. Cancer Res. 11(2005):2840-2852].
Разумеется, этот список дан в качестве иллюстрации и любая раковая опухоль должна рассматриваться как гиперэкспрессирующая белок CD151 и, следовательно, она может быть объектом лечения в соответствии с настоящим изобретением.
Другим дополнительным вариантом осуществления изобретения является композиция, описанная выше, которая дополнительно содержит цитотоксический/цитостатический агент и/или моноклональное антитело в качестве комбинированного продукта для одновременного, раздельного или разнесенного во времени применения.
Следовательно, настоящее изобретение относится также к композиции, описанной выше, отличающейся тем, что она дополнительно содержит по меньшей мере один цитотоксический/цитостатический агент и/или один клеточный токсин и/или один радиоактивный элемент и/или одно моноклональное антитело в качестве комбинированного продукта для одновременного, раздельного или разнесенного во времени применения.
Под «одновременным применением» понимают введение двух соединений композиции согласно изобретению, включенных в одну и ту же фармацевтическую форму.
Под «раздельным применением» понимают введение в одно и то же время двух соединений композиции согласно изобретению, включенных в отдельные фармацевтические формы.
Под «применением, разнесенным во времени» понимают последовательное введение двух соединений композиции согласно изобретению, каждое из которых находится в отдельной фармацевтической форме.
Как правило, композиция согласно изобретению значительно увеличивает эффективность лечения рака. Иначе говоря, терапевтический эффект антитела согласно изобретению неожиданно усиливается при введении цитотоксического агента. Другое существенное преимущество, вытекающее из композиции согласно изобретению, касается возможности использовать более низкие эффективные дозы активного начала, и это позволяет избежать или снизить риск появления побочных эффектов, в частности, побочного эффекта от цитотоксического агента. Кроме того, композиция согласно изобретению, по-видимому, позволяет более быстро достичь ожидаемого терапевтического эффекта.
Под «терапевтическими противораковыми агентами» или «цитотоксическими агентами» следует понимать вещество, которое при введении пациенту лечит или предупреждает развитие рака у пациента. В качестве неограничивающего примера таких агентов можно назвать «алкилирующие» агенты, антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики, митотические ингибиторы, ингибиторы хроматиновой функции, анти-ангиогенезные агенты, антиэстрогены, антиандрогены или иммуномодуляторы.
Такие агенты перечислены, например, в справочнике VIDAL на странице, посвященной канцерологии и гематологии в колонке «Цитотоксические средства», эти цитотоксические соединения, названные со ссылкой на этот документ, цитируются в данном описании в качестве предпочтительных цитотоксических средств.
К «алкилирующим средствам» относится любое вещество, которое может сочетаться ковалентной связью или алкилировать любую молекулу, предпочтительно, нуклеиновую кислоту (например, ДНК), внутри клетки. В качестве примера этих алкилирующих агентов можно назвать горчичные газы, такие как мехлорэтамин, хлолрамбуцил, мелфалан, хлоргидрат, пипоброман, преднимустин, двунатриевый фосфат или эстрамустин; оксазафосфорины, такие как циклофосфамид, алтретамин, трофосфамид, сульфофосфамид или ифосфамид; азиридины или этиленимины, такие как тиотепа, триэтиленамин или альтретамин; нитрозомочевины, такие как кармустин, стрептозоцин, фотемустин или ломустин; алкилсульфонаты, такие как бисульфан, треосульфан или импросульфан; триазены, такие как дакарбазин; или же комплексы на основе платины, такие как цисплатина, оксалиплатина или карбоплатина.
К «антиметаболитам» относятся вещества, которые блокируют рост клеток и/или клеточный метаболизм, противодействуя некоторым видам активности, как правило, синтезу ДНК. В качестве примера антиметаболита можно отметить метотрексат, 5-фторурацил, флоксуридин, 5-фтордеоксиуридин, капецитабин, цитарабин, флударабин, цитозинарабинозид, 6-меркаптопурин (6-МР), 6-тиогуанин (6-TG), хлордезоксиаденозин, 5-азацитидин, гемцитабин, кладрибин, деоксикоформицин и пентостатин.
К «противоопухолевым антибиотикам» относятся соединения, которые могут предупреждать или ингибировать синтез ДНК, РНК и/или белков. Примеры таких противоопухолевых антибиотиков включают доксорубицин, даунорубицин, идарубицин, валрубицин, митоксантрон, дактиномицин, митрамицин, пликамицин, митомицин С, блеомицин и прокарбазин.
«Митотические ингибиторы» нарушают нормальное развитие клеточного цикла и митоза. Как правило, ингибиторы микротрубочек или «таксоиды», такие как плакситаксел и доцетаксел, способны ингибировать митоз. Алкалоиды винка, такие как винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин, также способны ингибировать митоз.
К «ингибиторам хроматиновой функции» или «ингибиторам топоизомераз» относятся вещества, которые ингибируют нормальную функцию белков, моделирующих хроматин, таких как топоизомераза I и II. Примеры таких ингибиторов включают, в отношении топоизомеразы I, камптотецин и его производные, такие как иринотекан или топотекан, а в отношении топоизомеразы II этопозид, фосфат этопозида и тенипозид.
К «анти-ангиогенезным агентам» относится любое лекарство, соединение, вещество или агент, который ингибирует рост кровеносных сосудов. Примеры анти-ангиогенезных агентов включают, без ограничения, разоксин, маримастат, батимастат, приномастат, таномастат, иломастат, CGS-27023A, галофугинон, COL-3, неовастат, BMS-275291, талидомид, CDC 501, DMXAA, L-651582, скваламин, эндостатин, SU5416, SU6668, интерферон-альфа, EMD121974, интерлейкин-12, IM862, ангиостатин и витаксин.
К «антиэстрогенам» или «антиэстрогенным агентам» относится любое вещество, которое уменьшает, антагонизирует или ингибирует действие эстрогена. Примеры таких агентов включают тамоксифен, торемифен, ралоксифен, дролоксифен, иодоксифен, анастрозол, летрозол и эксеместан.
К «антиандрогенам» или «антиандрогенным агентам» относится любое вещество, которое уменьшает, антагонизирует или ингибирует действие андрогена. Примерами антиандрогенов являются флутамид, нилутамид, бикалутамид, сприронолактон, ципротеронацетат, финастерид и цимитидин.
Иммуномодуляторами являются вещества, которые стимулируют иммунную систему. Примеры таких иммуномодуляторов включают интерфероны, интерлейкины, такие как альдеслейкин, ОСТ-43, денилейкин дифтитокс или интерлейкин-2, факторы некроза опухоли, такие как тазонермин, или другие типы иммуномодуляторов, такие как лентинан, сизофиран, роквинимекс, пидотимод, пегадемаза, тимопентин, поли I:C, или левамизол в комбинации с 5-флуоурацилом.
Для получения более подробных сведений специалист может обратиться к учебнику, изданному Французской Ассоциацией преподавателей терапевтической химии, названному «работа по терапевтической химии», том 6, «Перспективные противоопухолевые лекарственные средства для лечения раков, издание ТЕС & DOC, 2003».
Предпочтительные моноклональные антитела выбирают из выделенных антител, способных специфически ингибировать тирозин-киназную активность рецепторов IGF-IR, EGFR, HER2/neu, cMET, VEGFR, VEGF и т.д. (или любое другое известное специалисту противоопухолевое антитело), или их функциональных фрагментов и их производных, способных ингибировать пролиферативную и/или антиапоптозную и/или ангиогенную и/или активность, индуцирующую распространение метастаз, промотируемую указанными рецепторами.
В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, комбинированный продукт в композиции согласно изобретению отличается тем, что указанный цитотоксический агент химически сочетается с указанным антителом для одновременного применения.
В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанная композиция согласно изобретению отличается тем, что указанный цитотоксический/цитостатический агент выбирают из ингибиторов или стабилизаторов веретена, предпочтительно, винорелбина и/или винфлунина и/или винкристина.
Для облегчения сочетания указанного цитотоксического агента с указанным антителом согласно изобретению можно, в частности, ввести промежуточные молекулы между двумя сочетающимися соединениями, такие как поли(алкилен)гликоли, например, полиэтиленгликоль, или же аминокислоты, или согласно другому варианту осуществления, использовать активные производные указанных цитотоксических агентов, в которые могли бы быть введены группы, способные взаимодействовать с указанным антителом согласно изобретению. Эти методы сочетания хорошо известны специалисту и в настоящем описании подробно не рассматриваются.
Согласно другому аспекту, изобретение относится к композиции, отличающейся тем, что по меньшей мере одно из указанных антител или одно из его функциональных производных или фрагментов, конъюгировано с клеточным токсином и/или с радиоактивным элементом.
Предпочтительно, указанный токсин представляет собой токсин энтеробактерий, в частности, экзотоксин А Pseudomonas.
131
90
199
100
67
217
211
Радиоактивными элементами (или радиоизотопами), предпочтительно, конъюгированными с антителом, используемыми в медицине, являются радиоизотопы, которые испускают гамма-лучи, предпочтительно, иод, иттрий, золото, палладий, медь, висмут и сурьма. В медицине могут быть также использованы радиоизотопы, испускающие бета- и альфа-лучи.
Под токсином или радиоактивным элементом, конъюгированным по меньшей мере с одним антителом или с одним из его функциональных фрагментов согласно изобретению, понимают любое средство, позволяющее связать указанный токсин или указанный радиоактивный элемент по меньшей мере с одним антителом, в частности, методом ковалентного сочетания между двумя соединениями с введением или без введения связующей молекулы.
Среди агентов, обеспечивающих химическую (ковалентную), электростатическую или не ковалентную связь всех или части элементов в конъюгате, можно отметить, более конкретно, бензохинон, карбодиимид, еще более конкретно, EDC (1-этил-3-[3-диметиламинопропил]-карбодиимид гидрохлорид), дималеимид, дитиобиснитробензойную кислоту (DTNB), N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат(SATA), связующие агенты (bridging), имеющие одну или несколько фенилазидных групп, взаимодействующих с ультрафиолетовым излучением (УФ), и, предпочтительно, N-[4-(азидосалициламино)бутил]-3'-(2'-пиридилдитио)пропионамид (APDP), N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) и 6-гидразиноникотинамид (HYNIC).
Другой вариант сочетания, относящийся специально к радиоактивным элементам, может заключаться в использовании бифункционального хелатирующего агента, связывающего ионы.
Среди этих халатирующих агентов можно отметить хелаты, производные EDTA (этилендиаминотетрауксусной кислоты) или DTPA (диэтилентриаминопентауксусной кислоты), которые были разработаны для связывания металлов, особенно радиоактивных металлов, и иммуноглобулинов. Так, DTPA и ее производные можно заместить разными группами в углеродной цепи с целью увеличения стабильности и жесткости комплекса лиганд-металл (Krejcarek et al., (1977); Brechdiel et al., (1991); Gansow (1991); патент USA 4831175).
Например, DTPA (диэтилентриаминопентауксусная кислота) и ее производные, которая уже давно очень широко применяется в медицине и биологии либо в свободной форме, либо в форме комплекса с ионом металла, обладает замечательным свойством образовывать стабильные хелаты с ионами металлов и связываться с белками, представляющими терапевтический или диагностический интерес, такими как антитела, расширяя арсенал радио-иммуноконъюгатов, используемых в лечении рака (Meases et al., (1984); Gansow et al. (1990)).
Настоящее изобретение относится дополнительно к композиции согласно изобретению для получения лекарственного средства.
Таким образом, настоящее изобретение относится, более конкретно, к применению композиции, описанной выше, для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака. Из всех видов рака, которые можно предупредить и/или лечить, предпочтительны рак толстой кишки, рак легких, рак предстательной железы или рак поджелудочной железы.
Кроме того, согласно особенно новому и преимущественному аспекту осуществления, настоящее изобретение относится к применению композиции, описанной выше, для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения первичных опухолей.
Изобретение относится также к применению антитела согласно изобретению для получения лекарственного средства, предназначенного для целенаправленной доставки биологически активного соединения к клеткам, экспрессирующим или гиперэкспрессирующим рецептор CD151.
В настоящем описании под биологически активным соединением понимают любое соединение, способное модулировать, в частности, ингибировать, клеточную активность, в частности, рост клеток, их пролиферацию, транскрипцию или трансдукцию гена.
Другие характеристики и преимущества изобретения будут понятны из следующего описания, включающего примеры и фигуры, представленные ниже.
ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг. 1 изображает нуклеотидные и белковые последовательности белка CD151, на которых показаны петли ЕС1 и ЕС2.
Фиг. 2 является схемой, иллюстрирующей структуру тетраспанинов, составляющих белок CD151, более конкретно, две внеклеточные петли ЕС1 и ЕС1.
Фиг. 3 показывает результаты сравнения PBS/контрольное антитело на ортотопической модели А549.
6
Фиг. 4 показывает результаты оценки противоопухолевой активности антитела TS151 in vivo на ортотопической модели. Мышам с подавленным иммунитетом (n=10) прививали путем внутриплеврального введения 1·10 клеток А549. Спустя семь дней после прививки мышей обрабатывали антителом TS151 интраперитональным введением с начальной дозой 500 мкг, а затем обрабатывали два раза в неделю в течение 5 недель дозой 250 мкг антитела на мышь. Животным контрольной партии вводили PBS в соответствии с той же схемой введения.
Фиг. 5 иллюстрирует экспрессию молекулы CD151 у пациентов, больных раком предстательной железы. Каждая буква соответствует изучению одного пациента и для каждого пациента верхняя панель соответствует нормальной ткани, прилегающей к опухоли, а нижняя панель соответствует опухолевой ткани.
Фиг. 6 иллюстрирует экспрессию молекулы CD151 у пациентов, больных раком легкого. Каждая буква соответствует изучению одного пациента и для каждого пациента верхняя панель соответствует нормальной ткани, прилегающей к опухоли, а нижняя панель соответствует опухолевой ткани.
Фиг. 7 иллюстрирует активность in vivo антител TS151 и TS151R на модели ксенотрансплантата РС3. Мышам линии Swiss Nude (n=6) трансплантировали подкожно клетки РС3. Спустя пять дней после трасплантации клеток мыши получали путем интраперитонального введения (i.p.) исследуемые антитела в начальной дозе 2 мг/мышь, а затем вводили два раза в неделю эти же антитела в дозе 1 мг/мышь. Размер опухоли определяли по формуле π/6 × длина × ширина × толщина и для статистической оценки результатов использовали тест Манна и Уитни (Mann et Whitney).
Фиг. 8 иллюстрирует результат оценки специфичности антител TS151 и TS151R для человеческой формы CD151 по методу вестерн-блот.
Фиг. 9 иллюстрирует ингибирование адгезии клеток А549 на лиминине 5.
А) Ингибирование клеточной адгезии разными антителами к интегринам.
В) Ингибирование клеточной адгезии комбинацией TS151/антитело к интегрину α3.
Пример 1: Генерирование антител TS151r и TS151
Генерирование антитела TS151r
7
7
7
Для генерирования антител TS151r мышей линии BALB/c иммунизировали интраперитональным путем при помощи 10 клеток HeLa. После 3-кратной иммунизации и последнего повторного вливания клетки мыши-самки были слиты с клетками миеломы P3X63AG8 согласно классическим способам, описанным Kohler и Mistein (5·10 клеток самки / 3·10 клеток миеломы). Супернатанты гибридом, полученные в результате слияния, были скринированы на их способность распознавать клетки HeLa методом проточной цитометрии, затем по их способности к иммунопреципитации CD151 из лизата клеток HeLa, получаемого в присутствии детергента Brij 97, и к ко-иммунопреципитации CD9. Оказалось, что антитела TS151r обладают этими разными свойствами.
Генерирование антитела TS151
7
7
7
7
Для получения антител TS151 мышей линии BALB/c иммунизировали интраперитональным путем при помощи 10 клеток Jukat, затем 10 HEL (2 иммунизации). После последнего повторного вливания с помощью белковых комплексов, содержащих белок ADAM10, полученных из лизатов клеток Jurkat и HEL, клетки самки были слиты с клетками миеломы P3X63AG8 согласно классическим способам, описанным Kohler и Mistein (5·10 клеток самки / 3·10 клеток миеломы). Супернатанты гибридом, полученные в результате слияния, были скринированы на их способность распознавать клетки Jurkat и HeLa путем проточной цитометрии. Антитела TS151 были затем отобраы по их способности к иммунопреципитации CD151 из лизата клеток, полученного в присутствии детергента Brij 97, и к ко-иммунопреципитации других тетраспанинов.
Пример 2: Оценка in vivo противоопухолевой активности антител TS151 и TS151r на ортотопической модели А549
Материал и метод
6
После проверки на экспрессирование белка CD151 (данные не представлены), клетки линии А549, приобретенные в АТСС, культивировали рутинным способом в среде F12K, содержащей 10 мМ глутамина и 10% SVF. Эти клетки делились в течение 2 суток перед прививкой с тем, чтобы они находились в экспоненциальной фазе роста. Для проведения прививки 7-недельные мыши с подавленным иммунитетом были анестезированы и затем им вводили 1·10 клеток А549 интрапарентеральным путем. Первичная опухоль быстро развивалась и за 4 дня захватила структуры, соседние с местом инъекции, включающие средостение, легкие и диафрагму. Для лучшего моделирования болезни начало лечения было осуществлено только спустя 7 дней после имплантации клеток, произведенной интраперитональным путем. После вливания начальной дозы 500 мг/мышь очищенное антитело TS151 вводили 2 раза в неделю в течение 5 недель в дозе 250 мкг/мышь. Группу мышей, получавших PBS, использовали в качестве контроля, поскольку опыты, осуществленные выше, показали, что введение контрольного изотипа IgG1 не оказало никакого эффекта на продолжительность жизни животных.
Фиг. 3, использующая предварительные данные, показывает специфичность активности, наблюдаемой с использованием антитела против CD151. Так, обработка животных мышиным иммуноглобулином IgG1 (mIgG1), используемым в качестве контрольного изотипа, показывает, что последний не оказал никакого действия на продолжительность жизни животных, которым вливали PBS, используемый в качестве носителя указанных антител.
Оценочным параметром этой модели является продолжительность жизни животных, а противоопухолевая активность выражена путем расчета параметра Т/С% = средняя продолжительность жизни обработанных животных/средняя продолжительность жизни животных в контрольной группе Х 100. Было установлено, что значение Т/С%, выше или равное 125% означает, что продукт активен.
Результаты
Фиг. 4 показывает противоопухолевую активность антитела TS151, рассчитанное значение Т/С% которой составляет 140%.
Пример 3: Сравнение противоопухолевой активности in vivo антител TS151 и 50-6 на ортотопической модели А549
Материал и метод
Используемый протокол был идентичен протоколу вышеописанного примера 2.
Результаты
Полученные данные ясно говорят о том, что антитело TS151 обладает противоопухолевой активностью, которая отчетливо выше активности, проявляемой антителом 50-6, который как таковой имеет показатель Т/С%, равный лишь 118, т.е. ниже порогового значения, равного 125% (данные не представлены).
Полученные результаты, а именно, показатель Т/С%, рассчитанный, как описано выше, представлены в следующей таблице 4:
Таблица 4
антитело TS151
антитело 50-6
Т/С%
140
118
Пример 4: Изучение экспрессии молекулы CD151
Экспрессия белка CD151 была исследована иммуногистохимическим анализом на образцах ткани человека, взятой у пациента, больного раком предстательной железы или раком легкого. У этих же пациентов были взяты пластинки нормальных тканей, близлежащих к опухоли, и использовались для определения уровня экспрессии в опухолевых тканях по сравнению с нормальными тканями.
Для этих опытов были использованы пластинки тканевого матрикса “Tissue array”, выпускаемые в продажу. После депарафинирования осуществляли демаскировку антигенов при 30°С при помощи ферментного раствора, содержащего пепсин (Labvision ref. AP-9007-005). После этой стадии осуществляли стадию удаления эндогенных пероксидаз путем инкубирования срезов в 3% растворе перекиси водорода (Sigma) в воде. Насыщение неспецифичных центров осуществляли с использованием раствора Ultra-V-Block (Labvision ref. TA-125-UB) и введение метки осуществляли с помощью мышиного антитела против CD151, выпускаемого в продажу (Serotech, ref. MCA 1856), используемого в конечной концентрации 5 мкг/мл. Контрольное мышиное антитело изотипа IgG1 (DakoCytomation, ref. X0931) использовали в эксперименте в качестве отрицательного контроля. Обнаружение меток проводили при помощи системы для обнаружения Envision Dual Link (DakoCytomation, ref. К4061) и стандартного препарата DAB, субстратом пероксидазы являлся S3309 DakoCytomation.
Результаты, представленные на фигуре 5, показывают, что у многих пациентов в процессе развития опухоли предстательной железы наблюдалась суперэкспрессия молекулы CD151. Эта суперэкспресиия может быть очень значительной у 20% исследованных пациентов (пациенты А и С) или умеренной (пациенты А и D). Следует отметить, что, за исключением эндотелиальных клеток, соответствующие нормальные простатические ткани не экспрессировали или мало экспрессировали CD151, а в случае экспрессии она была ограничена, по-видимому, структурами гландулярного типа. Пациент Е имеет пример опухоли, не экспрессирующей CD151.
В случае рака легких (Фиг. 6) экспрессия от умеренной (пациент А) до сильной (пациент В) наблюдалась на уровне некоторых клеток нормальной легочной ткани. Однако опухолевая ткань имеет очень большую плотность высокомеченых клеток (пациенты А и В). Пациент С имеет пример опухоли, не экспрессирующей CD151.
Пример 5: Действие антител TS151 и TS151R на рост in vivo опухоли РС3, имплантированной под кожу мыши Nude
6
3
С учетом результатов, полученных иммуногистохимическим анализом на тканевом матриксе «tissue array» предстательной железы, была осуществлена оценка антител против CD151 на ксенотрансплантате опухоли РС3. Линия клеток РС3 представляла собой линию клеток андрогеннезависимого рака предстательной железы, приобретенную в АТСС и выращенную в среде F12K+10% SVF+L-Глутамин. Для проведения анализа имплантировали 5·10 клеток РС3 в правый бок мыши Swiss Nude. Спустя пять дней после имплантации животных рандомизировали по размеру опухоли и делили на 3 сравниваемые группы. Размер опухоли у группы животных, подвергшихся трансплантации, составил от 41 до 47 мм (размер рассчитывали по формуле π/6 × длина × ширина × толщина) в день 0 обработки. Затем животные получали тестируемые очищенные антитела или PBS. Дозы антител и частота вливаний были следующими: начальная доза антител 2 мг/доза; поддерживающая доза 1 мг/2 раза в неделю.
Результаты, представленные на фиг. 7, показывают, что два тестируемых антитела (TS151 и TS151R) ведут себя сравнительно одинаково и ингибируют очень сильно рост опухоли РС3, имплантированной подкожно мышам Swiss Nude. В приведенную ниже таблицу сведены статистические данные проведенных испытаний.
Таблица 5
Д0
Д3
Д7
Д10
Д14
Д17
Д20
Д24
Д28
Д31
Д35
Конт-роль/ TS151
Манн-Уитни (Вилкок-сон)
р= 0,132
р= 0,937
р= 0,065
р= 0,589
р= 0,002
р= 0,002
р= 0,002
р= 0,002
р= 0,002
р= 0,002
р= 0,002
Конт-роль/ TS 151R
Манн-Уитни (Вилкок-сон)
р= 0,485
р= 0,180
р= 0,180
р= 0,589
р= 0,240
р= 0,026
р= 0,004
р= 0,002
р= 0,002
р= 0,002
р= 0,002
Проведенные параллельно испытания, представленные на фигуре 8, показывают, что антитела TS151 и TS151R специфически распознают молекулу CD151 человека без какой либо перекрестной реакции с мышиным рецептором. Это наблюдение позволяет предположить, что активность, наблюдаемая на модели ксенотрансплантата у мыши Nude, может быть приписана только прямому действию на трансплантат человеческой ткани и, следовательно, исключает какую-либо интерференцию антител TS151 и TS151R с клетками стромы или с эндотелиальными мышиными клетками. Кроме того, TS151 и TS151R являются двумя мышиными IgG1 и, следовательно, как это известно специалисту, маловероятно, чтобы наблюдаемая активность была связана с эффекторными функциями типа ADCC и CDC, которые опосредованы, более конкретно, антителами типа мышиного IgG2a у мышей.
Таким образом, совокупность этих результатов согласуется с механизмом действия, непосредственно связанным с ингибированием пролиферации опухолевых клеток in vivo антителами TS151 и TS151R.
Пример 6: Специфичность антител TS151 и TS151r
Специфичность антител TS151 и TS151r оценивалась методом Вестерн-блот анализа. Лизаты человеческой и мышиной ткани легкого, поджелудочной железы и толстой кишки (Biochain, 10 мкг общих белков), а также возрастающие количества клеточного лизата НТ-29 (10, 20 и 50 мкг общих белков) наносили на 4-12% полиакриламидный гель (BioRad). После электрофореза (не восстановительные условия) белки переносили на поверхность нитроцеллюлозной мембраны. После этого мембраны инкубировали в присутствии очищенных антител TS151 и TS151r, затем в присутствии поликлонального антитела кролика к Ig мыши, меченого пероксидазой (GE Healthcare), затем обнаруживали метки по типу ECL.
Антитела TS151 и TS151r обладают специфичностью в отношении человеческой формы Cd151, как об этом свидетельствует факт распознавания CD151, установленный путем Вестерн-блот анализа, в лизатах клеток НТ-29 и различных тканей человека (Фиг. 8). Отсутствие реакции на мышиный белок CD151 в лизатах различных тканей, взятых у мышей, подтверждает специфичность антител TS151 и TS151r в отношении человеческой формы Cd151.
Пример 7: Ингибирование клеточной адгезии
Исследования адгезии опухолевых клеток к ламинину 5, лиганду интегринов α3β1 и α6β4, с которыми может ассоциироваться Cd151, осуществляли на 96-луночном планшете. После иммобилизации ламинина 5 (Chemicon, 200 мкл, концентрация 1 мкг/мл) в течение 1 часа при температуре 37°С, лунки заполняли BSA с концентрацией 2 мг/мл (200 мкл, 1 час при температуре 37°С). Суспензию клеток А549 метили с помощью 5-хлорметилфлуоресцеин ацетата (CMFDA, Invitrogen), затем добавляли их из расчета 100000 клеток (100 мкл) на лунку в присутствии или отсутствие антитела (100 мкл). После инкубирования при 37°С в течение 15, 30 или 60 минут клетки, не подвергшиеся адгезии, удаляли. После считывания хемилюминесценции с помощью люминометра (Mithras, Berthold) определяли процентное содержание клеток, не подвергшихся адгезии, с помощью серии клеток, меченых CMFDA. Антитело TS151 против Cd151 и антитела Р1В5 против интегрина α3, NKI-Go3 против интегрина α6 и ASC-3 (Chemicon) против интегрина β4 оценивались при конечной концентрации 20 мкг/мл. Антитело 9G4, направленное против белка мембраны Escherichia coli, использовали в качестве изотипического контроля.
Антитело Р1В5 против интегрина α3 ингибирует адгезию клеток А549 к лиминину 5 (Фиг. 9А), в то время как антитела NKI-Go3 против интегрниа α6 и ASC-3 против интегрина β4 не ингибируют адгезию клеток А549 к этому же лиганду. Однако отмечено снижение ингибирования с течением времени. Так, ингибирование, индуцированное Р1В5, составляет более 90% в течение 15 минут, но потом снижается приблизительно до 20% спустя 1 час. Ассоциация антитела Р1В5 с антителом NLI-Go3 против интегрина α6 или с антителом ASC-3 против интегрина β4 позволяет сохранить высокий уровень ингибирования адгезии спустя 1 час; это ингибирование превышает 90% при ассоциации с антителом против α6 и около 70% при комбинации с антителом против β4. Эти результаты доказывают, что клетки А549 адгезивны к ламинину 5, в первый период, благодаря интегрину α3β1, затем, во второй период, благодаря интегрину α6β4.
Антитело TS151 против Cd151 не ингибирует адгезию клеток А549 к лиминину 5, если оно используется как единственное (Фиг. 9В). При комбинации TS151 с Р1В5 был определен ее эффект в отношении адгезии клеток А549 и его сравнивали с ранее указанными комбинациями. Эта комбинация TS151/Р1В5 показала результат, сравнимый с ассоциацией антител против α6/против α3 и против β4/против α3. Так, было отмечено сохранение ингибирования адгезии на уровне 80% спустя 1 час. Антитело TS151 по-видимому способно ингибировать адгезию клеток А549 благодаря антагонистическому действию на интегрин α6β4.