НОВЫЕ МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
NEW LACTIC ACID BACTERIA AND APPLICATION THEREOF

Область техники
Настоящее изобретение относится к Lactobacillus plantarum NK3 и Bifidobacterium longum NK49, которые представляют собой новые молочнокислые бактерии, и, более конкретно, к композиции, содержащей новые молочнокислые бактерии, которые подходят для предотвращения и лечения женских менопаузальных расстройств.
Уровень техники
Кишечные микроорганизмы, которые находятся в живом организме, можно классифицировать для каждого индивидуума, и известно, что указанные микроорганизмы участвуют в различных метаболических процессах в кишечнике. В частности, кишечные микроорганизмы, которые имеют отношение к ожирению, являются одной из хорошо известных областей, и сообщалось, что у людей с ожирением кишечные микроорганизмы активно участвуют в метаболизме углеводов, жиров, аминокислот и тому подобного. Кроме того, такие вещества, как бутират или ацетат, которые образуются в результате метаболизма кишечных микроорганизмов, являются важными факторами для иммунитета кишечника, а так же, как известно, защищают живой организм от заражения патогенами посредством регуляции продукции хелперных Т-клеток или реакции с рецептором 43 G-белка (GPR43) и т.д. Более того, было отмечено, что кишечные микроорганизмы являются причиной различных заболеваний в дополнение к заболеваниям толстого кишечника, таким как воспалительное заболевание кишечника или рак толстой кишки.
В недавнем исследовании организма человека была предпринята попытка поиска корреляции между уровнями гормонов и кишечными микроорганизмами у женщин в пременопаузе и постменопаузе, но данное исследование просто подтвердило степень уменьшения общего количества микроорганизмов, а не определило конкретное изменение в микроорганизмах.
Однако данное исследование показывает, что гормональные изменения вызывают изменение кишечных микроорганизмов, таким образом, сообщают, что кишечные микроорганизмы влияют на регуляцию эстрогена в живом организме через энтерогепатическое кровообращение.
Известно, что высокий уровень эстрогена in vivo увеличивает частоту возникновения рака груди, а низкий уровень эстрогена, как известно, увеличивает частоту возникновения остеопороза, и поэтому считается важным контролировать соответствующий уровень эстрогена в организме. Однако такой контроль становится сложной проблемой в период менопаузы у женщин. Соответственно, существует потребность в исследованиях по регулированию эстрогена, вида женского гормона, посредством взаимодействия между живым организмом и кишечными микроорганизмами, и в дальнейшем лечении менопаузальных расстройств у женщин и облегчении симптомов менопаузы.
[Ссылка на область техники]
[Непатентный документ]
(Непатентный документ 1) Sexually Transmitted Diseases, November 2006, vol 33, No. 11, 663-665.
(Непатентный документ 2) Bacteria and the Fate of Estrogen in the Environment 2017, vol 24, Issue 6
Подробное описание изобретения
Техническая задача
Задачей настоящего изобретения является обеспечение новых молочнокислых бактерий, Lactobacillus plantarum и Bifidobacterium longum.
Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение композиции для предотвращения или лечения женских менопаузальных расстройств, содержащей новые молочнокислые бактерии.
Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение пищевого продукта, имеющего лечебную функцию, для предотвращения или облегчения женских менопаузальных расстройств, содержащего новые молочнокислые бактерии.
Техническое решение
В одном из аспектов для решения указанных задач в настоящем изобретении предложены Lactobacillus plantarum NK3 (учреждение депонирования: Корейский центр культур микроорганизмов (KCCM), дата депонирования: 4 августа 2017 г., и учетный номер: KCCM12089P).
Lactobacillus plantarum NK3 согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что представляет собой новую молочнокислую бактерию Lactobacillus plantarum, которая выделена и идентифицирована из кимчи, которое является традиционным ферментированным пищевым продуктом.
Последовательность 16S рДНК для идентификации и классификации Lactobacillus plantarum NK3 согласно настоящему изобретению идентична SEQ ID NO: 1, приложенной к настоящему описанию. Таким образом, Lactobacillus plantarum NK3 согласно настоящему изобретению может содержать 16S рДНК согласно SEQ ID NO: 1.
По результатам анализа последовательности 16S рДНК SEQ ID NO: 1, данная последовательность на 99% гомологична последовательности общеизвестных штаммов Lactobacillus plantarum, тем самым демонстрируя наивысшую молекулярную филогенетическую связь с Lactobacillus plantarum. Таким образом, молочнокислая бактерия была идентифицирована как Lactobacillus plantarum, которая затем была названа Lactobacillus plantarum NK3 и депонирована в KCCM 4 августа 2017 г. (учетный номер: KCCM12089P).
Lactobacillus plantarum NK3 согласно настоящему изобретению представляет собой грамположительную бактерию, и ее клеточная форма представляет собой палочку. Более конкретно, физиологические свойства Lactobacillus plantarum NK3 можно проанализировать в соответствии с обычным способом в данной области техники, и его результаты показаны в Таблице 2 ниже. В частности, Lactobacillus plantarum NK3 может использовать следующие вещества в качестве источника углерода: L-арабинозу, D-рибозу, D-галактозу, D-глюкозу, D-фруктозу, D-маннозу, маннит, сорбит, α-метил-О-маннозид, N-ацетил-глюкозамин, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, целлобиозу, мальтозу, лактозу, мелибиозу, сахарозу, трегалозу, мелецитозу, гентиобиозу, D-туранозу и глюконат.
В другом аспекте для решения указанных задач в настоящем изобретении предложены Bifidobacterium longum NK49 (учреждение депонирования: Корейский центр культур микроорганизмов (KCCM), дата депонирования: 4 августа 2017 г., и учетный номер: KCCM12088P).
Bifidobacterium longum NK49 согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что является новой молочнокислой бактерией Bifidobacterium longum, которую выделили и идентифицировали из фекалий человека.
Последовательность 16S рДНК для идентификации и классификации Bifidobacterium longum NK49 согласно настоящему изобретению идентична SEQ ID NO: 2, приложенной к настоящему описанию. Таким образом, Bifidobacterium longum NK49 согласно настоящему изобретению может включать 16S рДНК согласно SEQ ID NO: 2.
По результатам анализа последовательности 16S рДНК SEQ ID NO: 2, данная последовательность на 99% гомологична последовательности общеизвестных штаммов Bifidobacterium longum, тем самым демонстрируя наивысшую молекулярную филогенетическую связь с Bifidobacterium longum. Таким образом, молочнокислая бактерия была идентифицирована как Bifidobacterium longum, которая затем была названа Bifidobacterium longum NK49 и депонирована в KCCM 4 августа 2017 г. (учетный номер: KCCM12088P).
Bifidobacterium longum NK49 согласно настоящему изобретению представляет собой грамположительную бактерию, и ее клеточная форма представляет собой палочку. Более конкретно, физиологические свойства Bifidobacterium longum NK49 можно проанализировать в соответствии с обычным способом в данной области техники, и его результаты показаны в Таблице 3 ниже. В частности, Bifidobacterium longum NK49 в качестве источника углерода может использовать следующие вещества: L-арабинозу, D-рибозу, D-ксилозу, D-галактозу, D-глюкозу, D-фруктозу, маннит, сорбит, α-метил-D-глюкозид, эскулин, салицин, мальтозу, лактозу, мелибиозу, сахарозу, рафинозу и D-туранозу.
В еще одном аспекте для решения указанных задач в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения женских менопаузальных расстройств, содержащая Lactobacillus plantarum NK3 KCCM12089P, Bifidobacterium longum NK49 KCCM12088P или их смесь.
В настоящем изобретении «женское менопаузальное расстройство» относится ко всем заболеваниям, которые возникают во время менопаузы, что проявляется как признак потери женских репродуктивных функций. Когда наступает менопауза, количество или цикл менструаций становится нерегулярным вследствие утраты функций яичников, и менструация прекращается вследствие снижения секреции фолликулярного гормона (эстрогена) в течение от нескольких месяцев до трех лет, что приводит к воздействию на вегетативный нервный центр промежуточного мозга и вызывает атрофию вегетативной нервной системы, вызывая тем самым менопаузальные расстройства. Кроме того, нарушение функции передней доли гипофиза ускоряет функции коры надпочечников, вызывая маскулинизацию, и влияние гормонов щитовидной железы приводит к нарушению функций щитовидной железы, что приводит к нарушениям, характерным для менопаузы, таким как ожирение и т.д. Например, это нарушение функции может привести к таким симптомам, как приливы, пальпитация (сердцебиение сильнее обычного, вызывающее шум в сердце), головокружение, шум в ушах, высокое кровяное давление, проблемы с пищеварением, головная боль, потеря памяти, депрессия и т.д., а также увеличение массы тела, ожирение, остеопороз и т.д.
В частности, штаммы Lactobacillus plantarum NK3 и Bifidobacterium longum NK49, содержащиеся в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, могут быть смешаны в соотношении от 1:1 до 4:1 колониеобразующих единиц (КОЕ), но не ограничиваясь этим.
В одном примере настоящего изобретения было подтверждено, что каждый из штаммов Lactobacillus plantarum NK3 или Bifidobacterium longum NK49, а также смесь этих штаммов оказывают влияние на женские менопаузальные расстройства, и, в частности, было подтверждено, что смесь, в которой Lactobacillus plantarum NK3 и штаммы Bifidobacterium longum NK49 смешаны в соотношении от 1:1 до 4:1 КОЕ, демонстрирует эффект улучшения показателей остеопороза на уровне, аналогичном группе положительного контроля, получавшей эстрадиол, аналогичный эстрогену (ФИГ. 1-3 и Таблица 4) и демонстрирует эффект улучшения показателей ожирения (ФИГ. 4-5 и Таблица 6).
«Lactobacillus plantarum NK3» согласно настоящему изобретению является такой, как описано выше.
В частности, Lactobacillus plantarum NK3 и Bifidobacterium longum NK49 KCCM12088P, содержащиеся в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, могут представлять собой живые организмы указанных бактерий, мертвые организмы указанных бактерий, культуру указанных бактерий, лизат указанных бактерий или экстракт указанных бактерий, соответственно, но любой тип Lactobacillus plantarum NK3 можно применять без ограничений, если он может обеспечить профилактический или терапевтический эффект в отношении женских менопаузальных расстройств.
В настоящем изобретении термин «живой организм бактерии» может относиться к организму бактерии, который является живым, и «мертвый организм бактерии» может обозначать организм бактерии, который стерилизован тиндализацией, нагреванием, повышением давления, обработкой лекарственными средствами и т.д.
В настоящем изобретении термин «культура» может также относиться к продукту, полученному путем культивирования молочнокислых бактерий в общеизвестной жидкой или твердой среде, и может представлять собой концепцию, охватывающую новые молочнокислые бактерии, описанные в настоящем изобретении.
В настоящем изобретении термин «лизат» может также относиться к гидролизату, полученному путем модификации живого или мертвого организма бактерии, или к продукту, полученному путем лизиса живого или мертвого организма бактерии посредством химической или физической силы, такой как гомогенизация, ультразвуковая обработка и т.д.
В настоящем изобретении термин «экстракт» может также относиться к продукту, полученному экстракцией живого организма бактерии, мертвого организма бактерии, его лизата, его культуры или их смеси посредством различных способов экстракции, известных в данной области техники, и представляет собой концепцию, охватывающую все материалы, которые могут быть получены переработкой или обработкой полученного экстракта другими способами после экстракции.
«Bifidobacterium longum NK49» согласно настоящему изобретению является такой, как описано выше.
В частности, Bifidobacterium longum NK49, содержащиеся в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, могут представлять собой живые организмы указанных бактерий, мертвые организмы указанных бактерий, культуру указанных бактерий, лизат указанных бактерий или экстракт указанных бактерий, но любой тип Lactobacillus plantarum NK3 можно применять без ограничений, если он может обеспечить профилактический или терапевтический эффект в отношении женских менопаузальных расстройств.
В настоящем изобретении женские менопаузальные расстройства могут включать вазомоторные симптомы, такие как потоотделение, покраснение лица и тому подобное; психические заболевания, такие как депрессия, тревожность и тому подобное; заболевания мочевыводящих путей, такие как сухость влагалища, атрофия влагалища, недержание мочи и тому подобное; метаболические заболевания, такие как ожирение, гипертония, диабет и тому подобное; старение кожи и остеопороз, и, в частности, остеопороз, ожирение или депрессию, но не ограничиваются ими.
В одном примере согласно настоящему изобретению, в результате введения Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 или их смеси животной модели с индуцированным остеопорозом, было подтверждено, что масса матки и бедренной кости увеличивается на аналогичном уровне относительно группы, получавшей эстрадиол, аналогичный эстрогену (ФИГ. 1 и 2), в то время как длина бедренной кости возвращается к длине, аналогичной нормальной группе (ФИГ. 3). Было также подтверждено, что активность фермента щелочной фосфатазы (ЩФ) находится на уровне, аналогичном группе, получавшей дозу эстрадиола, и активность фермента ЩФ, концентрация остеокальцина, фосфора и кальция возвращаются к аналогичным нормальной группе по сравнению с контрольной группой животной модели с удаленными яичниками.
Кроме того, в одном примере согласно настоящему изобретению в результате введения Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 или их смеси животной модели с индуцированным ожирением было показано, что потеря массы происходит на уровне, аналогичном группе, которой вводили эстрадиол, и было подтверждено, что экспрессия SREBP-1c ингибируется, и экспрессия PGC-1α индуцируется вместе с активностью АМРК (ФИГ. 5) по сравнению с контрольной группой животной модели с удаленными яичниками, тем самым подтверждая подавление ожирения (Таблица 6).
Более того, в одном примере согласно настоящему изобретению в результате введения Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 или их смеси животной модели с депрессией, вызванной стрессом ограничения, было подтверждено, что концентрация кортикостерона, который является гормоном, индуцированным стрессом, уменьшается (ФИГ. 6), и поведенческие показатели симптомов депрессии улучшаются (ФИГ. 7-9), тем самым демонстрируя действие на депрессию.
Приведенные выше результаты предполагают, что новые молочнокислые бактерии и их смесь в соответствии с настоящим изобретением обладают эффектом лечения и улучшения женских менопаузальных расстройств, на уровне, аналогичном эстрогену.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть приготовлена в виде фармацевтической дозированной формы с применением способа, хорошо известного в данной области техники, для обеспечения быстрого, замедленного или пролонгированного высвобождения ее активного ингредиента после введения млекопитающему. При приготовлении лекарственной формы фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель в той степени, в которой данный носитель не подавляет активность новых молочнокислых бактерий.
Фармацевтически приемлемый носитель может включать обычно используемые носители, например, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло и тому подобные, но не ограничивается перечисленным. Кроме того, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может содержать разбавитель или вспомогательное вещество, такое как наполнитель, увеличитель массы, связующее вещество, увлажнитель, разрыхлитель, поверхностно-активное вещество и т.д., или другие фармацевтически приемлемые добавки.
Дозировка фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению должна представлять собой фармацевтически эффективное количество. «Фармацевтически эффективное количество» может относиться к количеству, достаточному для предотвращения или лечения женских менопаузальных расстройств при разумном соотношении польза/риск, применимом к медицинскому лечению. Специалист в данной области может выбирать различные уровни эффективной дозы в соответствии с такими факторами, как способ получения препарата, состояние и масса тела пациента, пол пациента, возраст и степень заболевания, лекарственная форма, способ и период введения, скорость экскреции, чувствительность ответа и т.д. Эффективное количество может варьироваться в зависимости от пути удаления, применения вспомогательного вещества и возможности применения с другими лекарственными средствами, как известно специалистам в данной области техники.
2
11
Однако в случае препарата для перорального введения для достижения предпочтительного эффекта композицию согласно настоящему изобретению в целом можно вводить взрослому человеку в количестве от 0,0001 до 100 мг/кг в день, предпочтительно от 0,001 до 100 мг/кг в день в расчете на 1 кг массы тела. При введении препарата, как указано выше, Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 или их смесь согласно настоящему изобретению можно вводить в количестве от 1×10КОЕ/кг до 1×10 КОЕ/кг в день. Такое введение может быть осуществлено раз в сутки или несколько раз в сутки при разделении препарата. Дозировка ни в каком аспекте не ограничивает объем настоящего изобретения.
Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно вводить млекопитающим, таким как мыши, домашний скот, люди и т.д., различными путями. В частности, фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно вводить перорально или парентерально (например, применять или вводить внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно), но предпочтительно можно вводить перорально. Твердый препарат для перорального введения может включать порошок, гранулы, таблетку, капсулу, мягкую капсулу, пилюлю и тому подобное. Жидкий препарат для перорального введения может включать суспендирующий агент, жидкость для внутреннего применения, эмульсию, сироп, аэрозоль и тому подобное, но также может включать различные вспомогательные вещества, например увлажнитель, подсластитель, вкусоароматическую добавку, консервант и тому подобное в дополнение к воде и жидкому парафину, которые часто применяют как простые разбавители. Препарат для парентерального введения можно применять в виде лекарственной формы препарата для наружного применения и стерилизованного препарата для инъекций, такого как стерилизованный водный раствор, жидкость, неводный растворитель, суспендирующий агент, эмульсия, глазные капли, глазная мазь, сироп, суппозиторий, аэрозоль и т.д. согласно соответствующим общепринятым способам, и предпочтительно может быть использован при приготовлении фармацевтической композиции в форме крема, геля, пластыря, спрея, мази, лейкопластыря, лосьона, линимента, глазной мази, глазных капель, пасты или припарки, но не ограничиваясь перечисленным. Препарат для местного применения может быть в безводной или водной форме в зависимости от клинического назначения. В качестве неводного растворителя и суспендирующего агента можно применять пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, сложный эфир для инъекций, такой как этилолеат, и тому подобное. Основа для суппозитория может включать витепсол, макрогол, твин 61, масло какао, лаурин, глицерожелатин и тому подобное.
В еще одном аспекте для решения указанных задач в настоящем изобретении предложен способ предотвращения или лечения женских менопаузальных расстройств, включающий стадию введения субъекту Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 или их смеси.
В настоящем описании термины «Lactobacillus plantarum NK3», «Bifidobacterium longum NK49», «введение», «соотношение смешивания новых штаммов», «женские менопаузальные расстройства» и тому подобные являются такими, как описано выше.
Субъект может относиться к животному и, как правило, к млекопитающему, лечение которого с применением новых молочнокислых бактерий согласно настоящему изобретению может оказать благотворное действие. Предпочтительный пример этого субъекта может включать приматов, таких как люди. Кроме того, эти субъекты могут включать всех субъектов, имеющих симптом женских менопаузальных расстройств или имеющих риск появления этого симптома.
В еще одном аспекте в настоящем изобретении предложен пищевой продукт, имеющий лечебную функцию, для предотвращения или облегчения женских менопаузальных расстройств, содержащий Lactobacillus plantarum NK3 KCCM12089P, Bifidobacterium longum NK49 KCCM12088P или их смесь.
В настоящем изобретении термины «Lactobacillusplantarum NK3», «Bifidobacterium longum NK49», «соотношение смешивания новых штаммов», «женские менопаузальные расстройства» и тому подобные являются такими, как описано выше.
Пищевой продукт, имеющий лечебную функцию, с упором на модулирующую организм функцию пищевого продукта, представляет собой пищевой продукт, которому придают дополнительный эффект оказания действия и экспрессии с определенной целью, с применением физических, биохимических и биотехнологических способов. Ингредиент данного пищевого продукта, имеющего лечебную функцию, разрабатывают и обрабатывают таким образом, чтобы он в полной мере выполнял модулирующую организм функцию in vivo, которая участвует в защите живого организма, регулировке ритма организма, предотвращении заболевания и восстановлении после болезни, и может содержать пищевые добавки, подсластители или функциональное сырье, которые можно употреблять в пищу.
В случае применения Lactobacillus plantarum NK3 или Bifidobacterium longum NK49 согласно настоящему изобретению в качестве пищевого продукта, имеющего лечебную функцию, (или добавки с лечебной функцией для напитков), новые молочнокислые бактерии могут быть добавлены в него в исходном виде, использованы совместно с другими пищевыми продуктами или пищевыми ингредиентами, или подходящим образом использованы в соответствии с общепринятыми способами. Количество Lactobacillus plantarum NK3 или Bifidobacterium longum NK49 для смешивания может быть соответствующим образом определено в зависимости от цели их применения (предотвращение, лечение, улучшение или терапевтическое действие).
Пищевой продукт, имеющий лечебную функцию, может содержать различные питательные вещества, витамины, минералы (электролиты), вкусоароматические добавки, такие как синтетические вкусоароматические добавки, натуральные вкусоароматические добавки и тому подобные, красители и усилители (сыр, шоколад и т.д.), пектиновую кислоту и ее соли, органическую кислоту, защитные коллоидные загустители, агенты-регуляторы уровня рН, стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирт, насыщающие углекислотой агенты, используемые в газированных напитках, и тому подобное. Кроме того, пищевой продукт, имеющий лечебную функцию, согласно настоящему изобретению может содержать мякоть для приготовления напитков на основе фруктов и овощей. Данные ингредиенты можно применять по отдельности или в комбинации, и соотношение добавок обычно выбирают в диапазоне от 0,001 до 50 частей по массе в расчете на общую массу композиции.
Нет никаких особых ограничений в отношении типов пищевых продуктов, пищевой продукт, имеющих лечебную функцию. Пищевые продукты, в которые могут быть добавлены Lactobacillus plantarum NK3 или Bifidobacterium longum NK49, могут включать колбасу, мясо, хлеб, шоколад, закуски, конфеты, кондитерские изделия, рамен, пиццу, другую лапшу, жевательные резинки, молочные продукты, включая мороженое, различные супы, напитки, чаи, лечебные напитки, алкогольные напитки, витаминные комплексы и тому подобное. В случае приготовления напитков жидкие ингредиенты, которые добавляют к напиткам в дополнение к новым молочнокислым бактериям, могут включать различные вкусоароматические добавки, натуральные углеводы или тому подобное в качестве дополнительных ингредиентов, которые содержатся и в обычных напитках, но не ограничиваясь перечисленным. Вышеупомянутые природные углеводы могут представлять собой моносахарид (например, глюкозу, фруктозу и т.д.), дисахарид (например, мальтозу, сахарозу и т.д.) и полисахарид (например, обычный сахар, такой как декстрин, циклодекстрин и т.д.), а также сахарный спирт, такой как ксилит, сорбит, эритрит и т.д.
В еще одном аспекте в настоящем изобретении предложено применение Lactobacillus plantarum NK3 KCCM12089P, Bifidobacterium longum NK49 KCCM12088P или их смеси для получения лекарственного средства для лечения женских менопаузальных расстройств.
В еще одном аспекте в настоящем изобретении предложена композиция для применения для лечения женских менопаузальных расстройств, содержащая Lactobacillus plantarum NK3 KCCM12089P, Bifidobacterium longum NK49 KCCM12088P или их смесь.
В еще одном аспекте в настоящем изобретении предложено применение Lactobacillus plantarum NK3 KCCM12089P, Bifidobacterium longum NK49 KCCM12088P или их смеси для лечения женских менопаузальных расстройств.
В настоящем изобретении термины «Lactobacillusplantarum NK3», «Bifidobacterium longum NK49», «живой организм бактерии, мертвый организм бактерии, культура, лизат или экстракт штаммов», «соотношение смешивания штаммов», «женские менопаузальные расстройства» и тому подобные являются такими, как описано выше.
Численные значения, описанные в настоящем описании, как указано выше, следует интерпретировать как включающие диапазон их эквивалентов, если не указано иное.
Положительные результаты
Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 или их смесь, которые представляют собой новые молочнокислые бактерии согласно настоящему изобретению, оказывает превосходный терапевтический эффект на женские менопаузальные расстройства. Таким образом, новые молочнокислые бактерии согласно настоящему изобретению можно применять в качестве композиции для предотвращения или лечения женских менопаузальных расстройств.
Краткое описание графических материалов
LP на чертежах указывает результаты для Lactobacillus plantarum NK3, a BP указывает на результаты Bifidobacterium longum NK49.
ФИГ. 1 представляет собой график, демонстрирующий эффект увеличения массы матки в отношении Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 и их смеси, которые представляют собой новые молочнокислые бактерии.
ФИГ. 2 представляет собой график, демонстрирующий эффект увеличения массы бедренной кости в отношении Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 и их смеси, которые представляют собой новые молочнокислые бактерии.
ФИГ. 3 представляет собой график, демонстрирующий эффект восстановления длины бедренной кости в отношении Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 и их смеси, которые представляют собой новые молочнокислые бактерии.
ФИГ. 4 представляет собой график, демонстрирующий способность ингибирования ожирения в отношении Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 и их смеси, которые представляют собой новые молочнокислые бактерии.
ФИГ. 5 представляет собой изображение, демонстрирующее эффект увеличения активности АМРК в отношении Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 и их смеси, которые представляют собой новые молочнокислые бактерии.
ФИГ. 6 представляет собой график, демонстрирующий действие на концентрации кортикостерона в отношении Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 и их смеси, которые представляют собой новые молочнокислые бактерии.
ФИГ. 7 представляет собой график, демонстрирующий эффект облегчения депрессии посредством эксперимента с приподнятым крестообразным лабиринтом (ЕРМ) в отношении Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 и их смеси, которые представляют собой новые молочнокислые бактерии.
ФИГ. 8 представляет собой график, демонстрирующий эффект облегчения депрессии посредством теста вынужденного плавания (FST) в отношении Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 и их смеси, которые представляют собой новые молочнокислые бактерии.
ФИГ. 9 представляет собой график, демонстрирующий эффект облегчения депрессии посредством теста подвешивания за хвост (TST) в отношении Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 и их смеси, которые представляют собой новые молочнокислые бактерии.
Варианты реализации изобретения
Далее настоящее изобретение будет описано подробно с помощью предпочтительных примеров для лучшего понимания настоящего изобретения. Однако следующие примеры представлены только с целью иллюстрации настоящего изобретения, и, таким образом, настоящее изобретение не ограничивается ими.
Пример 1: Выделение и идентификация молочнокислых бактерий
(1) Выделение молочнокислых бактерий из человеческих фекалий Человеческие фекалии помещали в жидкую среду GAM и суспендировали (бульон
GAM; Nissui Pharmaceutical, Япония). После этого отбирали супернатант и пересаживали в агаровую среду BL (Nissui Pharmaceutical, Япония), а затем инкубировали в анаэробных условиях при 37°С в течение примерно 48 часов, после чего из него выделяли колониеобразующие штаммы.
(2) Выделение молочнокислых бактерий из кимчи
Кимчи из капусты, кимчи из редиса или кимчи из зеленого лука измельчали, соответственно, после чего измельченный супернатант отбирали и пересаживали в агаровую среду MRS (Difco, США), а затем инкубировали в анаэробных условиях при 37°С в течение примерно 48 часов, после чего из него выделяли колониеобразующие штаммы.
(3) Идентификация выделенных молочнокислых бактерий Физиологические свойства и последовательности 16S рДНК штаммов, выделенных
из человеческих фекалий или кимчи, были проанализированы для идентификации видов, к которому относились штаммы, и затем штаммам присваивали названия. Названия штаммов, присвоенные молочнокислым бактериям, представляют собой такие, как приведены в Таблице 1 ниже. В частности, молочнокислые бактерии, выделенные из кимчи, включали пять видов Lactobacillus plantarum (номера 1-5 в Таблице 1), пять видов Lactobacillus brevis (номера 6-10 в Таблице 1), 5 видов Lactobacillus sakei (номера 11-15 в Таблице 1) и 5 видов Lactocacillus curvatus (номера 16-20 в Таблице 1). Молочнокислые бактерии, выделенные из человеческих фекалий, включали пять видов Lactobacillus rhamnosus (номера 21-25 в Таблице 1), пять видов Lactobacillus plantarum (номера 26-30 в Таблице 1), пять видов Lactobacillus reuteri (номера 31-35 в Таблице 1), четыре вида Lactobacillus johnsonii (номера 36-39 в Таблице 1), три вида Lactobacillus mucosae (номера 40-42 в Таблице 1), три вида Bifidobacterium adolescentis (номера 43-45 в Таблице 1), и пять видов Bifidobacterium longum (номера 46-50 в Таблице 1).
(4) Физиологические свойства новой молочнокислой бактерии Lactobacillus plantarum NK3
Из штаммов, описанных в Таблице 1 выше, было подтверждено, что Lactobacillus plantarum NK3 (учетный номер KCCM12089P) представляет собой грамположительную палочку. Кроме того, было показано, что 16S рДНК Lactobacillus plantarum NK3 имеет последовательность SEQ ID NO: 1. В результате сравнения последовательности 16S рДНК Lactobacillus plantarum NK3 с помощью поиска BLAST, штамм Lactobacillus plantarum, имеющий такую же последовательность 16S рДНК не был обнаружен, и было подтверждено, что последовательность на 99% гомологична последовательности 16S рДНК общеизвестного штамма, Lactobacillus plantarum. Из физиологических свойств Lactobacillus plantarum NK3 способность использования источника углерода анализировали с помощью теста ферментации сахара с применением набора API 50 CHL. Результаты представлены в Таблице 2 ниже. В Таблице 2 ниже «+» указывает, что способность использования источника углерода является положительной, а «-» указывает, что способность использования источника углерода является отрицательной.
(5) Физиологические свойства новой молочнокислой бактерии Bifidobacterium longum NK49
Из штаммов, описанных в Таблице 1 выше, было подтверждено, что Bifidobacterium longum NK49 (учетный номер KCCM12088P) представляет собой грамположительную палочку. Кроме того, было показано, что 16S рДНК Bifidobacterium longum NK49 имеет последовательность SEQ ID NO: 2. В результате сравнения последовательности 16S рДНК Bifidobacterium longum NK49 с помощью поиска BLAST, штамм Bifidobacterium longum, имеющий такую же последовательность 16S рДНК не был обнаружен, и было подтверждено, что последовательность на 99% гомологична последовательности 16S рДНК общеизвестного штамма Bifidobacterium longum. Из физиологических свойств Bifidobacterium longum NK49 способность использования источника углерода анализировали с помощью теста ферментации сахара с применением набора API 50 CHL. Результаты представлены в Таблице 3 ниже. В Таблице 3 ниже «+» указывает, что способность использования источника углерода является положительной, а «-» указывает, что способность использования источника углерода является отрицательной.
Пример 2: Терапевтический эффект молочнокислых бактерий на остеопороз на животной модели
(1) Подготовка животной модели с остеопорозом и введение молочнокислых бактерий
9
Эксперимент проводили с применением шести мышей C57BL/6 (самки, 21-23 г и возраст 6 недель) на группу после акклиматизации в лаборатории в течение одной недели. После анестезии мышей изофлураном у них удаляли яичники, чтобы получить животную модель с остеопорозом. Через неделю после удаления яичников Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49, их смесь 1:1 или смесь 4:1 (соотношение LP:BL составляет 4:1 и такое же, как показано ниже), которые представляют собой новые молочнокислые бактерии, вводили перорально в суточном количестве 1×10 КОЕ в течение шести дней в неделю в течение пяти недель. Кроме того, 17β-эстрадиол (PC) вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мкг/кг/день экспериментальным животным из группы положительного контроля, а группе плацебо и экспериментальной группе с удаленными яичниками перорально вводили физиологический раствор вместо лекарственных средств.
На следующий день после завершения введения молочнокислых бактерий экспериментальных животных умерщвляли, а затем у них собирали кровь, бедренную кость, толстую кишку, матку и печень для определения показателей остеопороза.
(2) Определение показателей остеопороза
Остеокальцин в крови измеряли с помощью набора системы R&D ELISA (Миннеаполис, Миннесота, США); Са и Р измеряли с помощью реагентов ASAN Ca-Lq и реагентов AS AN Pi-Lq от Asan Pharmaceutical Co., Ltd, соответственно; и активность щелочной фосфатазы (ЩФ) измеряли с помощью набора для колориметрического анализа активности щелочной фосфатазы (Sigma, США).
(3) Результаты экспериментов
В результате выращивания животной модели с удаленными яичниками, как описано выше, в течение шести недель, соответствующая животная модель показала уменьшение массы матки (ФИГ. 1), уменьшение массы бедренной кости (ФИГ. 2) и увеличение длины бедренной кости (ФИГ. 3). Однако в отношении групп, которым вводили Lactobacillus plantarum NK3 (LP), Bifidobacterium longum NK49 (BL), их смесь 1:1 (M1:1) и их смесь 4:1 (LP:BL=4:1, М4:1), было подтверждено, что масса матки и бедренной кости увеличивается на уровне, аналогичном группе, получавшей эстрадиол, аналогичный эстрогену (ФИГ. 1 и 2), и длина бедренной кости восстанавливается (ФИГ. 3).
Кроме того, в результате выращивания животной модели с удаленными яичниками в течение шести недель, как описано в Таблице 4 ниже, соответствующая животная модель имела тенденцию демонстрировать увеличение активности щелочной фосфатазы (ЩФ), увеличение концентрации фосфора (Р) и остеокальцина, и снижение кальция (Са) в крови. Между тем, в отношении групп, которым вводили Lactobacillus plantarum NK3 (LP), Bifidobacterium longum NK49 (BL), их смесь 1:1 (M1:1) и их смесь 4:1 (М4:1) согласно настоящему изобретению, было подтверждено, что активность щелочной фосфатазы (ЩФ) и концентрация остеокальцина, фосфора и кальция восстанавливаются на уровне, аналогичном уровню группы, получавшей дозу эстрадиола.
Приведенные выше результаты предполагают, что новые молочнокислые бактерии и их смесь в соответствии с настоящим изобретением обладают эффектом лечения остеопороза, который является одним из симптомов женских менопаузальных расстройств, на уровне, аналогичном эстрогену.
Пример 3: Влияние молочнокислых бактерий на уменьшение ожирения на животной модели
(1) Подготовка животной модели с индуцированным ожирением и введение молочнокислых бактерий
9
Эксперимент проводили с применением шести мышей C57BL/6 (самки, 21-23 г и возраст 6 недель) на группу после акклиматизации в лаборатории в течение одной недели, как описано выше в пункте (1) Примера 2. После анестезии мышей изофлураном и удаления у них яичников, полученных мышей выращивали в течение шести недель для создания животной модели с ожирением, демонстрирующей значительное увеличение массы тела. Через неделю после удаления яичников Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49, их смесь 1:1 или смесь 4:1, которые представляют собой новые молочнокислые бактерии, вводили перорально в суточном количестве 1×10 КОЕ в течение шести дней в неделю в течение пяти недель. Кроме того, 17β-эстрадиол (PC) вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мкг/кг/день экспериментальным животным из группы положительного контроля, а группе плацебо и экспериментальной группе с удаленными яичниками перорально вводили физиологический раствор вместо лекарственных средств.
На следующий день после завершения введения молочнокислых бактерий экспериментальных животных умерщвляли, а затем у них собирали кровь, бедренную кость, толстую кишку, матку и печень для определения показателей ожирения. Массу тела измеряли один раз в неделю.
(2) Определение активности AMPK
Активность AMPK в печени измеряли методом иммуноблоттинга. В частности, выделенную печень помещали в буфер для лизиса для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA, Pierce, Rockford, IL, США), измельчали и центрифугировали при 10000 g в течение 10 минут для получения супернатанта. Этот супернатант подвергали гель-электрофорезу в 10% SDS-PAGE и переносили на мембрану. После реакции с антителами AMPK, р-AMPK и β-актина в течение ночи при 4°С полученный продукт подвергали реакции с вторичным антителом и промывали. Затем полученный продукт подтверждали посредством проявления цвета с помощью реагента с повышенной хемилюминесценцией (ECL).
(3) Измерение экспрессии SREBP-1c и PGC-1α
Экспрессию фактора транскрипции 1с, связывающего регуляторный элемент стерола (SREBP-1c), и гамма-коактиватора 1-альфа рецептора, активируемого пролифератором пероксисом (PGC-1α), измеряли с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (кПЦР).
В частности, мРНК экстрагировали из печени, выделенной из животной модели, с применением набора для экстракции мРНК Qiagen, а затем проводили кПЦР с применением готовой смеси агентов SYBER с термоциклером Takara. Термоциклирование выполняли в следующих условиях с применением праймеров, приведенных в Таблице 5 ниже: активацию ДНК-полимер азы проводили при 95°С в течение 30 секунд, а затем многократно амплифицировали 40 раз, подвергая взаимодействию при 95°С с интервалом 15 секунд и при 60°С с интервалом 30 секунд. Количество окончательно экспрессируемых генов рассчитывали в сравнении с β-актином.
(4) Результаты экспериментов
В результате выращивания животной модели с удаленными яичниками, как описано выше, в течение шести недель, соответствующая животная модель показала значительное увеличение массы тела. Между тем, в отношении групп, которым вводили Lactobacillus plantarum NK3 (LP), Bifidobacterium longum NK49 (BL), их смесь 1:1 (M1:1) и их смесь 4:1 (М4:1) согласно настоящему изобретению, было подтверждено, что потеря массы тела происходит на уровне, аналогичном уровню группы, получавшей дозу эстрадиола, который, в частности, меньше набора массы нормального животного без удаленных яичников (ФИГ. 4).
Кроме того, в результате выращивания животной модели с удаленными яичниками в течение шести недель активность AMPK была снижена (ФИГ. 5), в то время как экспрессия SREBP-1c была индуцирована, а экспрессия PGC-1α ингибирована, как показано в Таблице 6 ниже. Однако в отношении групп, которым вводили Lactobacillus plantarum NK3 (LP), Bifidobacterium longum NK49 (BL), их смесь 1:1 (M 1:1) и их смесь 4:1 (М4:1) согласно настоящему изобретению, активность AMPK была на уровне, аналогичном уровню группы, получавшей эстрадиол (ФИГ. 5), который был выше, чем у контрольной группы с удаленными яичниками. Кроме того, было подтверждено, как показано в Таблице 6 ниже, что экспрессия SREBP-1c ингибируется, а экспрессия PGC-1α индуцируется согласно настоящему изобретению по сравнению с моделью мыши с удаленными яичниками, тем самым подтверждая подавление ожирения.
Приведенные выше результаты предполагают, что новые молочнокислые бактерии и их смесь в соответствии с настоящим изобретением обладают эффектом уменьшения ожирения или набора массы тела, который является одним из симптомов женских менопаузальных расстройств, на уровне, аналогичном эстрогену.
Пример 4: Терапевтический эффект молочнокислых бактерий на депрессию на животной модели
(1) Подготовка модели мыши с депрессией, вызванной стрессом ограничения Модель мыши с депрессией фиксировали на устройстве для обеспечения стресса
9
ограничения цилиндрической формы размером 3×10 см таким образом, что мышь совсем не имела возможность двигаться в нем. Затем мышам обеспечивали стресс ограничения по 12 часов каждой в течение двух дней подряд. Со следующего дня вводили Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 или их смесь (NK3, NK49, MIX: 1×10 КОЕ/мышь) в течение пяти дней для определения показателей депрессивного поведения на следующий день после последнего введения.
(2) Измерение концентрации кортикостерона в плазме
В отношении модели мыши с депрессией, вызванной стрессом ограничения, полученной как описано выше, концентрация гормона стресса кортикостерона в плазме была значительно выше, чем в контрольной группе, что подтверждает, что животная модель подходит для этого эксперимента. В случае введения Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 или их смеси (MIX) было подтверждено, что концентрация кортикостерона в плазме становится низкой (ФИГ. 6).
(3) Эксперимент с приподнятым крестообразным лабиринтом (ЕРМ)
Устройство для эксперимента с приподнятым крестообразным лабиринтом представляло собой устройство из черного плексигласа, в котором два открытых рукава (30×7 см) и два закрытых рукава (30×7 см) со стенками высотой 20 см расположены на высоте 50 см над полом, каждый из которых отходит от центральной платформы на 7 см. Движение мыши в приподнятом крестообразном лабиринте зарегистрировали после помещения в комнату с высоко установленной в ней видеокамерой с яркостью 20 люкс.
В частности, мышь C57BL/6 (самец, 19-22 г) помещали в середину приподнятого крестообразного лабиринта с головой, направленной к открытому рукаву. Время, проведенное в открытых и закрытых рукавах, и количество входов в них измеряли в течение пяти минут. Время, проведенное в открытых рукавах (ОТ) от общего времени испытания, рассчитывали как [время, проведенное в открытых рукавах / (время, проведенное в открытых рукавах (ОТ) + время, проведенное в закрытых рукавах)] × 100. Входы в открытые рукава (ОЕ) рассчитывали как [входы в открытые рукава / (входы в открытые рукава+входы в закрытые рукава)] × 100, и их результаты показаны на ФИГ. 7.
По результатам измерения соотношения времени, проведенного в открытых рукавах (ОТ), и входов в открытые рукава (ОЕ), как показано на ФИГ. 7, группы, получавшие Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 или их смесь (MIX), продемонстрировали значение, значительно превышающее значение группы мышей с индуцированным стрессом ограничения, не получавшей дозу, таким образом подтверждая, что симптомы тревоги облегчаются у мышей, получавших дозу штаммов.
(4) Тест вынужденного плавания (FST)
Резервуар для воды высотой 40 см и диаметром 20 см заполняли на 30 см водой с температурой 25±1°С в соответствии с общеизвестным способом Porsolt et al. (1997), после чего каждую из экспериментальных мышей помещали в резервуар с водой и оставляли в нем в течение шести минут, из которых первые две минуты считали временем адаптации без проведения измерений, а затем в течение последних четырех минут измеряли время неподвижности экспериментального животного (в данном случае неподвижность означает состояние, когда мышь стоит вертикально и неподвижно плавает в воде, за исключением малейшего движения, удерживая над водой только голову). Результаты измерения показаны на ФИГ. 8.
По результатам измерения соотношения неподвижных мышей, как показано на ФИГ. 8, группы, получавшие Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 или их смесь (MIX), продемонстрировали значительно более низкое значение, чем группы мышей с индуцированным стрессом ограничения, не получавшие дозу, таким образом подтверждая облегчение внезапного депрессивного состояния у мышей, которые отказываются от выживания, при введении данных штаммов.
(5) Тест подвешивания за хвост (TST)
Согласно общепринятому способу Stem et al. (1985) приспособление прикрепляли примерно на 1 см от конца хвоста мыши, а затем подвешивали на расстоянии 50 см от земли. Затем измеряли время неподвижности экспериментального животного, в общей сложности в течение шести минут, и его результаты показаны на ФИГ. 9.
По результатам измерения соотношения неподвижных мышей, как показано на ФИГ. 9, группы, получавшие Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 или их смесь (MIX), продемонстрировали значительно более низкое значение, чем группы мышей с индуцированным стрессом ограничения, не получавшие дозу, таким образом подтверждая облегчение депрессивного состояния мышей при введении данных штаммов.
Приведенные выше результаты предполагают, что новые молочнокислые бактерии и их смесь в соответствии с настоящим изобретением обладают эффектом уменьшения депрессии, которая является одним из симптомов женских менопаузальных расстройств.
Учетная информация молочнокислых бактерий
Авторы настоящего изобретения депонировали Lactobacillus plantarum NK3 с целью получения патента в Корейский центр культур микроорганизмов, сертифицированное учреждение депонирования (адрес: Yurim B/D, 45, Hongjenae 2ga-gil, Seodaemun-gu, Seoul, Republic of Korea) 4 августа 2017 г. и получили учетный номер KCCM12089P.
Кроме того, авторы настоящего изобретения депонировали Bifidobacterium longum NK49 с целью получения патента в Корейский центр культур микроорганизмов, сертифицированное учреждение депонирования (адрес: Yurim B/D, 45, Hongjenae 2ga-gil, Seodaemun-gu, Seoul, Republic of Korea) 4 августа 2017 г. и получили учетный номер KCCM12088P.
Промышленная применимость
Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 или их смесь, которые представляют собой новые молочнокислые бактерии согласно настоящему изобретению, обладают эффектом лечения женских менопаузальных расстройств, например, лечения остеопороза, уменьшения ожирения или облегчения депрессии, и таким образом, их можно применять в качестве композиции для предотвращения или лечения женских менопаузальных расстройств, и можно ожидать, что они будут полезны в смежной области получения лекарственных средств и пищевых продуктов.
--->
<110>    UNIVERSITY-INDUSTRY COOPERATION GROUP OF KYUNG
HEE UNIVERSITY
<120>    Новые молочнокислые бактерии и их применение
<130>    P19014-NVP
<150>    KR 10-2018-0132834
<151>    2018-11-01
<160>    8
<170>    KoPatentIn 3.0
<210>    1
<211>    1436
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    NK3 16s рДНК
<400>    1
gcaagtcgaa cgaactctgg tattgattgg tgcttgcatc atgatttaca
tttgagtgag         60
tggcgaactg gtgagtaaca cgtgggaaac ctgcccagaa gcgggggata
acacctggaa        120
acagatgcta ataccgcata acaacttgga ccgcatggtc cgagcttgaa
agatggcttc        180
ggctatcact tttggatggt cccgcggcgt attagctaga tggtggggta
atggctcacc        240
atggcaatga tacgtagccg acctgagagg gtaatcggcc acattgggac
tgagacacgg        300
cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgaa
agtctgatgg        360
agcaacgccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa actctgttgt
taaagaagaa        420
catatctgag agtaactgtt caggtattga cggtatttaa ccagaaagcc
acggctaact        480
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt
attgggcgta        540
aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc tttcggctca
accgaagaag        600
tgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca
tgtgtagcgg        660
tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg
gtctgtaact        720
gacgctgagg ctcgaaagta tgggtagcaa acaggattag ataccctggt
agtccatacc        780
gtaaacgatg aatgctaagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca
gctaacgcat        840
taagcattcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat
tgacgggggc        900
ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagctac gcgaagaacc
ttaccaggtc        960
ttgacatact atgcaaatct aagagattag acgttccctt cggggacatg
gatacaggtg       1020
gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc
aacgagcgca       1080
acccttatta tcagttgcca gcattaagtt gggcactctg gtgagactgc
cggtgacaaa       1140
ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg
gctacacacg       1200
tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga actcgcgaga gtaagctaat
ctcttaaagc       1260
cattctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat
cgctagtaat       1320
cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg
cccgtcacac       1380
catgagagtt tgtaacaccc aaagtcggtg gggtaacctt ttaggaacca
gccgcc           1436
<210>    2
<211>    1342
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    NK49 16s рДНК
<400>    2
ggctttgctt ggtggtgaga gtggcgaacg ggtgagtaat gcgtgaccga
cctgccccat         60
acaccggaat agctcctgga aacgggtggt aatgccggat gctccagttg
atcgcatggt        120
cttctgggaa agctttcgcg gtatgggatg gggtcgcgtc ctatcagctt
gacggcgggg        180
taacggccca ccgtggcttc gacgggtagc cggcctgaga gggcgaccgg
ccacattggg        240
actgagatac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc
acaatgggcg        300
caagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atggaggcct tcgggttgta
aacctctttt        360
atcggggagc aagcgagagt gagtttaccc gttgaataag caccggctaa
ctacgtgcca        420
gcagccgcgg taatacgtag ggtgcaagcg ttatcccgga attattgggc
gtaaagggct        480
cgtaggcggt tcgtcgcgtc cggtgtgaaa gtccatcgct taacggtgga
tccgcgccgg        540
gtacgggcgg gcttgagtgc ggtaggggag actggaattc ccggtgtaac
ggtggaatgt        600
gtagatatcg ggaagaacac caatggcgaa ggcaggtctc tgggccgtta
ctgacgctga        660
ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg
ccgtaaacgg        720
tggatgctgg atgtggggcc cgttccacgg gttccgtgtc ggagctaacg
cgttaagcat        780
cccgcctggg ggagtacggc cgcaaggcta aaactcaaag aaattgacgg
gggcccgcac        840
aagcggcgga gcatgcggat taattcgatg caacgcgaag aaccttacct
gggcttgaca        900
tgttcccgac ggtcgtagag atacggcttc ccttcggggc gggttcacag
gtggtgcatg        960
gtcgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc
gcaaccctcg       1020
ccccgtgttg ccagcggatt atgccgggaa ctcacggggg accgccgggg
ttaactcgga       1080
ggaaggtggg gatgacgtca gatcatcatg ccccttacgt ccagggcttc
acgcatgcta       1140
caatggccgg tacaacggga tgcgacgcgg cgacgcggag cggatccctg
aaaaccggtc       1200
tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaaggc ggagtcgcta
gtaatcgcga       1260
atcagcaacg tcgcggtgaa tgcgttcccg ggccttgtac acaccgcccg
tcaagtcatg       1320
aaagtgggca gcacccgaag cc
1342
<210>    3
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    SREBP-1c прямой праймер
<400>    3
agctgtcggg gtagcgtctg
20
<210>    4
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    SREBP-1c обратный праймер
<400>    4
gagagttggc acctgggctg
20
<210>    5
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    PGC-1a прямой праймер
<400>    5
ccgccacctt caatccagag
20
<210>    6
<211>    22
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    PGC-1a обратный праймер
<400>    6
caagttctcg atttctcgac gg
22
<210>    7
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    b-актин прямой праймер
<400>    7
tgtccacctt ccagcagatg t
21
<210>    8
<211>    23
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    b-актин обратный праймер
<400>    8
agctcagtaa cagtccgcct aga
23
<---