КОМПОНЕНТЫ ЭНТЕРОКОККОВЫХ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК И ИХ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ ПРИМЕНЕНИЯ
COMPONENTS OF ENTEROCOCCAL CELL WALLS AND THEIR ANTIBACTERIAL APPLICATION

Настоящее изобретение относится к компонентам энтерококковых клеточных стенок и к их применению для профилактики и терапии бактериальной инфекции. Для целей настоящего изобретения все ссылки, цитируемые в настоящем документе, включены в полном объеме.
Область техники, к которой относится изобретение
Enterococcus faecalis,
Enterococcus faecium
Enterococcus faecalis
Существует по меньшей мере 15 видов энтерококков, но только два из них обычно связаны с клинической инфекцией, а именно  который ответствен за 80% инфекций, вызываемых энтерококками, и . Грамположительная бактерия является природным обитателем желудочно-кишечного тракта млекопитающих и обычно обнаруживается в почве, сточных водах, воде и пищевых продуктах, часто вследствие фекального загрязнения (Klare, I., Werner, G. and Witte,W. Contrib. Microbiol. 2001, 8, 108-22).
Энтерококки являются важными нозокомиальными патогенами, вызывающими разнообразные инфекции, в том числе нозокомиальную бактериеимию, эндокардит, а также инфекции мочевых путей, инфекции операционных ран и инфекции чужеродными телами.
Чувствительные штаммы этих бактерий могут быть обработаны ампициллином и ванкомицином. Тем не менее, некоторые энтерококки имеют присущее им свойство резистентности к антибиотикам на основе β-лактама (некоторым пенициллинам и фактически всем цефалоспоринам), а также ко многим аминогликозидам. В последние два десятилетия особенно вирулентными штаммами Enterococcus, которые являются устойчивыми к ванкомицину (ванкомицин-устойчивый Enterococcus, или VRE), появились в нозокомиальных инфекциях госпитализированных пациентов, в частности, в Соединенных Штатах. Это повышение энтерококковых штаммов, устойчивых к множественным антибиотикам, подчеркивает необходимость улучшения понимания этого патогенеза инфекции (Murray, B. E. N. Engl. J. Med. 2000, 342, 710-721; Theilacker, C, Krueger,W. A., Kropec, A. and Huebner, J. Vaccine 2004, 22 Suppl 1, S31-8).
Тейхоевые кислоты могут быть обнаружены в клеточной стенке грамположительных бактерий, таких как Staphylococci, Streptococci, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium и Listeria, и, по-видимому, простираются до поверхности пептидогликанового слоя. Тейхоевые кислоты не обнаруживаются в грамотрицательных бактериях. Они могут быть ковалентно связаны с N-ацетилмурамовой кислотой пептидогликанового слоя, с липидами цитоплазматической мембраны или с концевым D-аланином в тетрапептидных поперечных сшивках между звеньями N-ацетилмурамовой кислоты.
Основная функция тейхоевых кислот заключается в обеспечении жесткости клеточной стенки привлечением (аттрагированием) катионов, таких как магний и натрий. Тейхоевые кислоты являются обычно, но не всегда, замещенными остатками сложных эфиров D-аланина, придающими этой молекуле цвиттерионные свойства. Эти цвиттерионные тейхоевые кислоты являются предположительными лигандами для toll-подобных рецепторов 2 и 4. Тейхоевые кислоты способствуют также регуляции роста клеток ограничением способности аутолизинов разрывать β(1-4)-связь между N-ацетилглюкозамином и N-ацетилмурамовой кислотой. Тейхоевые кислоты служат сайтом прикрепления некоторых паразитов. Деструкция этих бактерий и высвобождение тейхоевой кислоты в кровоток может вызывать лихорадку, сужение кровеносных сосудов и, возможно, шок и последующую смерть. Тейхоевая кислота может также использоваться бактериями для прикрепления к слизистым оболочкам.
Липотейхоевая кислота (LTA) является главным компонентом клеточной стенки грамположительных бактерий. Она состоит из тейхоевых кислот, длинных цепей глицерол- или рибитолфосфата и прикреплена к липидному бислою посредством глицерида. LTA, связанная с мишенями, может взаимодействовать с циркулирующими в кровотоке антителами и активировать каскад комплемента для индукции феномена пассивного иммунного убивания.
Тейхоевые кислоты и липотейхоевые кислоты считаются сильными экзогенными пирогенами, т.е. они принадлежат к веществам, которые могут приводить к лихорадочной реакции у человека после бактериальной инфекции грамположительными бактериями. Наиболее вероятно, что они распознаются toll-подобным рецептором TLR-2, который экспрессируется на моноцитах и дендритных клетках, B- и T-лимфоцитах и макрофагах. Кроме того, они приводят к экскреции цитокинов и, следовательно, являются одним из факторов для воспалительной реакции после такой инфекции.
Вследствие их антигенных свойств, было сделано предположение, что они являются представляющими интерес кандидатами для развития синтетических вакцин.
В документе US 7011826 описана вакцина для профилактики молочнокислого ацидоза (лактатацидоза) у позвоночного, причем указанная вакцина содержит по меньшей мере один выделенный микроорганизм, или его фрагмент или его фрагменты, где указанный микроорганизм способен продуцировать молочную кислоту в кишечнике указанного позвоночного и где указанный микроорганизм выбран из группы, состоящей из: Clostridium-подобных видов, Prevotella-подобных видов, Bacteroides-подобных видов, Enterococcus-подобных видов, видов Selenomonas.
Для более эффективных подходов для эффективного лечения и/или профилактики инфекции у позвоночных, вызываемой, по меньшей мере частично, энтерококками, необходимы новые антигенные бактериальные мишени, которые могли бы быть использованы как в новых, так и в улучшенных подходах вакцинации, а также в развитии и получении соответствующих вакцин.
Для поиска углеводных факторов вирулентности и развития альтернативных способов лечения, таких как гликоконъюгатные вакцины, для борьбы с энтерококковыми инфекциями, настоящее изобретение предоставляет новые капсульные полисахариды, липотейхоевые кислоты клеточной стенки и липотейхоевые кислоты, выделенные из клеточной стенки энтерококков.
Таким образом, целью настоящего изобретения в его первом аспекте является использование компонента энтерококковой клеточной стенки, состоящего из
и его модифицированных производных, и их фармацевтически приемлемых солей.
Этот компонент энтерококковой клеточной стенки (в дальнейшем называемый "энтерококковым антигеном") обеспечивает новую антигенную мишень для развития более эффективных стратегий для эффективного лечения и/или профилактики инфекции в позвоночных животных, вызываемой, по меньшей мере частично, энтерококками, делает возможными улучшенные стратегии вакцинации и делает возможными развитие и получение соответствующих вакцин, таких как гликоконъюгатные вакцины.
Согласно настоящему изобретению термин "модифицированное производное" или “модифицированные производные" включает химически или ферментативно модифицированные энтерококковые антигены в соответствии с формулой I, представленной выше, где указанное модифицированное производное сохраняет его функцию в виде энтерококковой антигенной детерминанты и/или сохраняют эту функцию до той же самой степени или по существу до той же самой степени, что и энтерококковый антиген в соответствии с формулой I. Предпочтительно, указанное модифицированное производное проявляет количественно увеличенную иммунологическую реакцию в сравнении с немодифицированным энтерококковым антигеном. Такое увеличение этой иммунологической реакции может быть детектировано иммунологическими анализами, известными в данной области.
Примерами модифицированных производных являются, предпочтительно, соединения формулы I, которые модифицированы для включения линкерной группы для связывания или конъюгирования с другими химическими частицами. Эти линкерные группы известны в существующем уровне техники и обычно являются иммунологически неактивными, т.е. не мешают иммунологическим свойствам энтерококкового антигена. Другие модификации включают присоединение химических молекулярных частиц к энтерококковому антигену для несения детектируемой метки, таких как хелатообразующие группы или ферментативные группы. Кроме того, может быть добавлен пептид (например, His) или другие "метки" или "маркеры" для возможности очистки и/или применения этого энтерококкового антигена в диагностических анализах.
1
18
3
2
2
3
2
6
4
3
2
6
4
2
2
2
Наконец, этот энтерококковый антиген может включать химические модификации, например, в кольцах сахарных компонентов этого энтерококкового антигена, где этот антиген может быть модифицирован для замены существующей боковой группы любым из Н, незамещенного, монозамещенного или полизамещенного C-C-алкила, где указанный алкил может быть прямым, разветвленным или циклическим, алкенила, остатка незамещенного, монозамещенного или полизамещенного арила или гетероарила, незамещенной, монозамещенной или полизамещенной бензильной группы, ацильной группы, такой как формил, ацетил, трихлорацетил, фумарил, малеил, сукцинил, бензоил, или разветвленной или замещенной гетероатомом или арилом ацильной группы, алкокси-заместителя, такого как -OMe, -OEt, -OnPr, -iPr, -OnBu, -OiBu, -OsecBu, -OtBu, алкильная группа которых может быть разветвленной, прямой или циклической, алкильной группой, связанной через атом серы, такой как -SMe, -SEt, или сульфонильной группой, такой как -SOH, -SOMe, -SOCF, -SOCHCH или SOCHCHBr, или азотного заместителя, такого как NH, NHR, -NRR' (где R, R' = алкил, алкенил или арил, описанные выше), NC или -NO, или фтора, хлора, брома, иода, -CN или гетерозаместителя. Как упоминалось выше, эти производные предпочтительно включают для улучшения растворимости этого антигена, увеличения иммунологического действия указанного антигена (предпочтительно количественного) и/или для возможности связывания этого соединения с другими частями молекулы, например, для связывания с поверхностью (такой как лунка или чип), и/или для использования в диагностических анализах.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения компонента энтерококковой клеточной стенки по настоящему изобретению, где указанный способ предусматривает выделение указанного компонента энтерококковой клеточной стенки из бактериальной фракции, или предусматривает синтез указанного антигена по меньшей мере частично посредством химического синтеза. Выделение может включать очистку указанного компонента клеточной стенки из бактериальных фракций для освобождения по существу от всех бактериальных компонентов, но включает также выделение в виде части некоторых бактериальных фракций, таких как фракции клеточной стенки, включающие другие части этой клеточной стенки, описанные здесь.
Кроме того, другой аспект изобретения относится к антителу, предпочтительно, моноклональному антителу или его антигенному фрагменту, который специфически распознает энтерококковый антиген по настоящему изобретению. Термин "антитело" должен включать как моноклональные, так и поликлональные антитела, рекомбинантные антитела или их фрагменты, такие как Fab и т.п., а также антитела человека и гуманизированные антитела.
Кроме того, другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения антитела по настоящему изобретению, предусматривающему иммунизацию млекопитающего, предпочтительно кролика, компонентом энтерококковой клеточной стенки по настоящему изобретению или фармацевтической композицией по настоящему изобретению и, предпочтительно, вакциной по настоящему изобретению. Соответствующие способы известны квалифицированному в данной области специалисту и описаны в существующем уровне техники.
Кроме того, еще один аспект изобретения относится к способу получения антитела по изобретению, предусматривающему получение гибридомных клеток, продуцирующих указанное антитело в виде моноклонального антитела, или предусматривающему рекомбинантное продуцирование указанного антитела в клетке-хозяине. Соответствующие способы известны квалифицированному в данной области специалисту и описаны в существующем уровне техники.
Кроме того, еще один важный аспект настоящего изобретения относится к применению энтерококкового антигена по изобретению в качестве антигена в получении антител, которые являются специфическими в отношении указанного антигена.
Кроме того, другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один энтерококковый антиген по изобретению и/или по меньшей мере одно антитело по изобретению, вместе с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом.
Особенно предпочтительной является фармацевтическая композиция по изобретению, где указанная композиция содержит компонент клеточной стенки по формуле I, а именно WTA.
E. faecalis
Далее, предпочтительной является фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, где указанная композиция получена в виде вакцины, в частности, против инфекций, вызываемых энтерококками, в частности, устойчивыми против инфекций энтерококками, такими как штаммы VRE, предпочтительно . Наиболее предпочтительной является фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, где указанный компонент клеточной стенки в соответствии с формулой I представлен в гликоконъюгатной вакцине. Этот WTA по изобретению (присутствующий либо в виде одного антигена, либо в экстракте или бактерии, как описано здесь) используется предпочтительно для энтерококковой вакцины, либо для активной, либо для пассивной иммунизации.
Таким образом, согласно настоящему изобретению обеспечена фармацевтическая композиция и, в частности, вакцина, для профилактики энтерококковых инфекций у позвоночного, причем указанная фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере один новый энтерококковый антиген согласно настоящему изобретению, необязательно, вместе с фармацевтически приемлемым носителем, адъювантами и/или разбавителем.
E. faecalis
E. faecalis
Обычно, эта вакцина может содержать живые или мертвые интактные клетки по меньшей мере одного энтерококкового штамма, предпочтительно , содержащие энтерококковый антиген этого изобретения. Более часто, эта вакцина содержит клеточный лизат по меньшей мере одного из указанных энтерококковых штаммов, содержащих энтерококковый антиген или энтерококковые антигены. Даже более часто, эта вакцина содержит необработанную смесь энтерококкового антигена или очищенного энтерококкового антигена или очищенных энтерококковых антигенов, предпочтительно . Еще более часто, эта вакцина содержит фракцию клеточной стенки и связанных белков в качестве энтерококкового антигена по меньшей мере одного из указанных энтерококковых штаммов. Эта вакцина может также состоять из комбинации одного из этих компонентов. Наиболее предпочтительной является гликоконъюгатная вакцина, содержащая энтерококковый антиген по настоящему изобретению. Другой аспект относится к фармацевтической композиции или вакцине, где этот включенный энтерококковый антиген был получен, по меньшей мере частично, посредством химического синтеза. Способы очистки выбранных бактериальных фракций, содержащих энтерококковые антигены, известны квалифицированному в данной области специалисту и дополнительно описаны в настоящем описании.
Обычно, этим позвоночным животным является моногастрическое, травоядное или жвачное животное с однокамерным желудком или субъект-человек. Более типично, это позвоночное животное выбрано из группы, состоящей из человека, примата-не человека, мышиных, бычьих, овечьих, лошадиных, свиных, козлиных, заячьих, птичьих, кошачьих и собачьих. Более типично, это позвоночное животное выбрано из группы, состоящей из человека, овечьих, верблюдовых, свиных, бычьих, лошадиных или собачьих.
Фармацевтическая композиция может быть получена для введения внутримышечным, подкожным, локальным или другим парентеральным способом. Обычно, микроорганизмы по настоящему изобретению являются симбионтами по природе. Таким образом, пероральное введение обычно не является эффективным способом вакцинации, и, вследствие этого, предпочтительным является введение внутримышечным, подкожным, локальным или другим парентеральным способом. Эта вакцина может также включать цитокины, такие как: G-CSF, GM-CSF, интерлейкины или фактор некроза опухолей альфа, используемые по отдельности или в комбинации.
Фармацевтическая композиция может также включать адъювант. Более конкретно, этот адъювант выбран из группы, состоящей из полного/неполного адъюванта Фрейнда, адъюванта Montenide Macrol, забуференного фосфатом солевого раствора и эмульсий маннанового масла, сапонинов (QuiLA), декстрана (декстрансульфата, ДЭАЭ-декстрана), соединений алюминия (Imject Alum), N-ацетилглюкозамил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамина (адъюванта Gerbu). Более типично, этот адъювант выбран из группы, описанной в Vaccine 1995, vol 13, p 1203; 1993 vol 11 p 293; и 1992 vol 10 p 427, описания которых включены здесь посредством ссылки.
Кроме того, еще один важный аспект настоящего изобретения относится к компоненту энтерококковой клеточной стенки (энтерококковому антигену) по настоящему изобретению, антителу по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению для применения в лечении заболеваний, таких как бактериальные инфекции, в частности энтерококковая инфекция, таких как нозокомиальная бактериеимия, эндокардит, инфекции мочевых путей, инфекции операционных ран и инфекции чужеродными телами.
E. faecalis.
Кроме того, еще один важный аспект настоящего изобретения относится к применению компонента энтерококковой клеточной стенки по настоящему изобретению, антитела по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по изобретению (т.е. энтерококковых антигенов) для лечения против бактериальных инфекций согласно настоящему изобретению или для приготовления лекарственного средства против бактериальных инфекций, в частности энтерококковой инфекции, такой как нозокомиальная бактериеимия, эндокардит, инфекции мочевых путей, инфекции операционных ран и инфекции чужеродными телами, в частности, вызываемых устойчивыми к антибиотикам энтерококками, такими как штаммы VRE, такими как
Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения обеспечен способ индуцирования иммунной реакции против по меньшей мере одного энтерококкового штамма, содержащего энтерококковый антиген по настоящему изобретению, в позвоночном животном, причем указанный способ предусматривает введение указанному животному иммунологически эффективного количества вакцины по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по изобретению.
Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики бактериальной инфекции у позвоночного животного, предусматривающему введение указанному позвоночному животному терапевтически эффективного количества компонента энтерококковой клеточной стенки по изобретению, антитела по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению.
E. faecalis.
Предпочтительным является способ по изобретению, в котором указанной бактериальной инфекцией является энтерококковая инфекция, такая как нозокомиальная бактериеимия, эндокардит, инфекции мочевых путей, инфекции операционных ран и инфекции чужеродными телами, и, в частности, является вызываемой устойчивыми к антибиотикам энтерококками, такими как штаммы VRE, и предпочтительно
Настоящее изобретение описано в следующих предпочтительных не ограничивающих примерах со ссылкой на сопутствующие фигуры, в которых
1
E. faecalis
Фиг. 1 показывает H-ЯМР-спектры капсульных полисахаридов, выделенных из : a) - штамм типа 2, b) - штамм типа 5. Буквы относятся к остаткам углеводов, показанным на фиг. 2, и арабские цифры относятся к протонам в соответствующих остатках.
f
Фиг. 2 показывает химическую структуру повторяющегося звена капсульного полисахарида, выделенного из штамма типа 5, обладающего высокосходной структурой, лишенной О-ацетильной группы в положении С-5 β-D-Gal.
1
E. faecalis
Фиг. 3 показывает H-ЯМР-спектр липотейхоевых кислот, выделенных из штамма 12030 . Буквы относятся к остатку глицерина и остаткам глюкозы в койибиозе (Фиг. 4) и арабские цифры относятся к протонам в соответствующих остатках. Пики для протонов, принадлежащих к остаткам глюкозы, замененных аланином, обнаружены при приблизительно 4,4 и 4,65 м.д.
E. faecalis
Фиг. 4 показывает химические структуры различных повторяющихся звеньев липотейхоевых кислот, выделенных из штамма 12030 .
1
E. faecalis
Фиг. 5 показывает H-ЯМР-спектр тейхоевой кислоты стенки (WTA) согласно изобретению, выделенной из . Буквы относятся к сахарному остатку (фиг. 6).
E. faecalis
Фиг. 6 показывает химическую структуру повторяющегося звена WTA, выделенной из , согласно настоящему изобретению.
Примеры
Капсульные полисахариды
E. faecalis
1
l3
1
1
1
13
Капсульные полисахариды штаммов типа 2 и типа 5  (Maekawa S., Yoshioka M., and Kumamoto Y. Microbiol Immunol. 1992, 36, 671-81) получали ферментной обработкой пептидогликана лизоцимом и мутанолизином. Примесные нуклеиновые кислоты и белки удаляли расщеплением РНКазой, ДНКазой и Протеинкиназой К. Этот материал фракционировали гель-проникающей хроматографией (гель-фильтрацией) (GPC) на Sephacryl S-400 и материал с большой молекулярной массой наносили на колонку Sepharose Q и элюировали линейным градиентом на NaCl. Выделенные полисахариды исследовали анализом на сахар, одномерной (H и C), и двухмерной гомонуклеарной Η-Η (COSY, TOCSY и NOESY) и гетеронуклеарной H-C (HMQC, HMQC-TOCSY и HMBC) спектроскопией магнитного резонанса (ЯМР). Все 1D и 2D спектры регистрировали с использованием спектрометра Bruker DRX Avance 600 МГц.
1
3
3
H1,Н2
H1,Н2
f
p
f
H-ЯМР-спектр капсульных полисахаридов из типа 2 (фиг. 1а) показывал два аномерных сигнала (остаток А, [J<2 Гц]; остаток B, [J=7,8 Гц], которые идентифицировали как β-D-Gal и β-D-Glc, соответственно. Кроме того, идентифицировали широкий сигнал при d 5,4, который относили к протону Н-5 β-D-Galвследствие замены при С-5 О-ацетильной группой. Кроме того, дублет при δ 1,3 относили к метильной группе, принадлежащей к остатку молочной кислоты. Последовательность этих остатков в повторяющихся звеньях устанавливали с использованием экспериментов NOESY и HMBC.
E. faecalis
f
В капсульных полисахаридах, выделенных из штамма типа 5 , O-ацетильная группа при С-5 D-Gal отсутствовала (фиг. 2).
E. faecalis
Таким образом, данное изобретение выявило присутствие двух новых капсульных полисахаридов в .
Липотейхоевые кислоты
E. faecalis
Липотейхоевые кислоты из штамма 12030  (Hufnagel, M., Hancock, L. E., Koch, S., Theilacker, C, Gilmore, M. S. and Huebner, J. J. Clin. Microbiol. 2004, 42, 2548-57) получали разрушением бактериальных клеток стеклянными гранулами, с последующей экстракцией н-бутанолом. После разделения фаз водную фазу лиофилизировали и ресуспендировали в стартовом буфере хроматографии. Гидрофобную хроматографию (HIC) выполняли на октил-сефарозе. Фосфорсодержащие фракции, элюирующиеся около 50% 50% PrOH, объединяли и повторно лиофилизировали до полного испарения элюента.
1
E. faecalis
Н-ЯМР-спектр липотейхоевых кислот из штамма 12030  (фиг. 3) показывал два аномерных сигнала, которые были идентифицированы как замещенные в положении С-2, и концевые остатки глюкозы, соответственно. Кроме того, сигнал при δ 5,4 относили к протону Н-2 остатка глицерина. Это сильное снятие защиты этого протона вызвано заменой в положении С-2 остатком аланина. Дублет при δ 1,6 относили к метильной группе, принадлежащей к остатку аланина. Кроме того, идентифицировали сигналы, характерные для жирных кислот.
Эти результаты ЯМР подтверждали некоторые из структур липотейхоевых кислот, предложенных Wicken and Baddiley (Wicken, A. J. and Baddley, J. Biochem J. 1963, 87, 54-62), а именно, 1,3-поли(глицеролфосфат), и 1,3-поли(глицеролфосфат), замещенный в положении С-2 остатков глицерина аланином, или койибиозой (фиг. 4). Кроме того, замена аланином была локализована в положениях С-6 обеих глюкоз в остатке койибиозы (фиг. 4), с установлением новой структуры липотейхоевой кислоты в энтерококках.
Тейхоевые кислоты стенки (WTA)
E. faecalis
WTA согласно настоящему изобретению выделяли из бактериальных клеточных стенок . Смесь полисахаридов фракционировали и очищали при помощи GPC (Sephacryl S-200) и анионообменной хроматографии (Sepharose Q).
1
31
1
31
p
Композиционные анализы идентифицировали Glc, Gal, GlcNAc, GalNAc и рибит в качестве основных компонентов WTA. Н-ЯМР-спектр WTA показывал в аномерном районе пять основных пиков (фиг. 5). Р-ЯМР показывал один сигнал, который относили к фосфатной группе, связывающей мостиковой связью рибит и Gal(Н, P HMQC ЯМР-эксперимент).
E. faecalis
Последовательность этих остатков в повторяющихся звеньях WTA  согласно этому изобретению показана на фиг. 6.