Способ получения набора флуоресцирующих риккетсиальных и коксиеллезного диагностикумов и их применение для серологической диагностики риккетсиозов и коксиеллеза, способ серологической диагностики
METHOD FOR PRODUCING A SET OF FLUORESCENT RICKETTSIAL AND QUERY FEVER DIAGNOSTICUMS AND USE THEREOF FOR SEROLOGICAL DIAGNOSIS OF RICKETTSIOSIS AND QUERY FEVER, A SEROLOGICAL DIAGNOSTIC TECHNIQUE

Способ получения набора флуоресцирующих риккетсиальных и коксиеллезного диагностикумов и их применение для серологической диагностики риккетсиозов и коксиеллеза, способ серологической диагностики
Область техники
Изобретение относятся к области биотехнологии и медицинской микробиологии и касаются способа получения набора флуоресцирующих препаратов риккетсий и коксиелл для выявления специфических антител в сыворотке крови человека, применение этого набора для осуществления серологической диагностики риккетсиозов и коксиеллеза.
Предшествующий уровень техники
Полиморфная картина клинических проявлений при риккетсиозах и коксиеллезе, подострое и бессимптомное течение инфекционного процесса создают большие трудности в распознавании заболеваний, поэтому решающее значение в диагностике этих заболеваний приобретают лабораторные, и в первую очередь серологические методы исследования.
Выбор метода лабораторной диагностики обуславливается такими факторами как специфичность, чувствительность, и простота выполнения.
Сравнительный анализ используемых методов серодиагностики риккетсиозов и коксиеллеза: реакции агглютинации (РА), реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), реакции связывания комплемента (РСК), реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ), иммунофлуоресцентного анализа (ИФА) свидетельствует о том, что самыми чувствительными, специфичными и достаточно экспрессными  из них являются ИФА и РНИФ.
Однако диагностика риккетсиозов и коксиеллеза с помощью РНИФ не обеспечивает выявления  полного спектра образующихся антител, так как применяемые в иммунофлуоресцентном анализе фиксированные на предметном стекле корпускулярные антигены риккетсий и коксиелл, реагируют с антителами за счет доступных поверхностных антигенных структур клеток и учет результатов необходимо проводить по морфологическим особенностям возбудителя и наличию краевой флуоресценции микробной клетки (Барбан П.С., Пшеничнов Р.А., Пантюхина А.Н., Ившина И.Б. Иммунофлуоресцентнй анализ.Свердловск: УрО АН СССР.1988. 176 с.; Патент RU 2557951. «Способ получения мультиплексного диагностикума», Тарасевич И.В., Пантюхина А.Н., Вакштейн М.С., Дежуров С.В.
19
2
Недостатком РНИФ является ее низкая специфичность, обусловленная как взаимодействиями белок-белок ингредиентов (наведенная неспецифическая иммунофлуоресценция), так и наличием на наружной мембране риккетсиальных клеток антигенных структур, перекрестно-реагирующих с антигенными эпитопами других возбудителей группы риккетсиозов, а также наличием антигенов, общих с антигенными структурами других микроорганизмов таких как: Proteus vulgaris OX, Proteus vulgaris OX.Постановка РНИФ затруднительна из-за многоэтапности методики и необходимости введения дополнительных реагентов и промываний. Еще одним отрицательным фактором РНИФ является большой расход корпускулярных антигенов риккетсий и коксиелл, что обусловливает высокую стоимость этого метода исследований.
Известно, что растворимые антигены риккетсий и коксиелл широко используются в диагностической работе благодаря простоте их получения, выявлению всего спектра специфических антител и более высокой серологической активности по сравнению с корпускулярными антигенами (Здродовский П.Ф., Голиневич Е.М., «Учение о риккетсиях и риккетсиозах», М., 1972., с. 495).
.
Однако, растворимые антигены риккетсий и коксиелл, не применяются в иммунофлуоресцентном анализе, так как фиксированные растворимые антигены на стекле располагаются диффузно и при взаимодействии с флуоресцирующими антителами даютгомогенное свечение всего мазка, не позволяя оценить результаты исследований
Исходя из этого, для ранней диагностики риккетсиозов и коксиеллеза, повышения специфичности и чувствительности иммунофлуоресцентного анализа необходимо получить растворимые антигены риккетсий и коксиелл в корпускуляризованной форме, что позволит проводить оценку результатов реакции в формате одноэтапного микроиммунофлуоресцентного анализа.
Новая возможность появилась с развитием разработок по получению и использованию в микробиологии сорбентов.
Известен способ связывания растворимых антигенов риккетсий группы сыпного тифа и группы клещевой пятнистой лихорадки путем обработки носителя сорбентом - полиакриламидного геля или растворимого крахмала или сефарозы 4В, смесью, состоящей из фосфолипидного антигенного комплекса риккетсий и 0,5% раствора полиметилметакрилата в хлороформе, в соотношении носителя и указанной смеси 1:1. Однако этот сорбент пригоден для иммобилизации лишь фосфолипидных антигенных комплексов риккетсий, и не сорбирует белковые антигены риккетсий, поскольку последние не растворяются в хлороформе. (Тупицын А.В. Тимашева О.А., Горовиц Э.С., «Способ получения иммуносорбента». Авторское свидетельство SU №1007676, 1976).
Классическим методом иммобилизации растворимых антигенов риккетсий и коксиелл является сенсибилизация их на формалинизированных эритроцитах барана (Мисенжников А.В., Лазаревич С.Н., «К вопросу о приготовлении гемосенсибилизирующего антигена из риккетсий сибирика. Актуальные вопросы теоретической и прикладной иммунологии. Пермь, 1994. - с. 26-27; Токаревич Н.К. «Биологические аспекты взаимоотношения коксиелл Бернета и организма млекопитающего как основа совершенствования и специфической профилактики Ку-лихорадки». Автореферат д.м.н., Санкт-Петербург, 1997, с. 46; ).
Однако такой сорбент не может быть использован в иммунофлуоресцентном анализе в формате реакции микроиммунофлуоресценции, так как нагруженные антигенами эритроциты ровным слоем распределяются на предметном стекле как в опыте, так и в контроле, что не позволяет оценить результат реакции.
Наиболее близким к предлагаемому способу по технологической сущности является ИФА + МФА в формате мультиплексного анализа (Wang L. et al. «Nanoparticles for multiplex diagnostics and imaging», Nanomedicine, 2006. V. 1, №4, р. 413-426).
При этой разновидности ИФА + МФА органические полимеры или неорганические материалы (магноиммуносорбенты, полистироловые микросферы, микрошарики, латексы и др.) применяют в качестве матрицы для сорбции аналитов (антигенов, антител, синтетических пептидов, олигонуклеотидов и др.).
Способ осуществляется следующим образом: окрашивают флуорофорами, например, полистироловые микросферы 5,6 мкм; затем присоединяют связующие аналиты (олигонуклеопротеиды, антитела, пептиды и др.); добавляют суспензии микросфер к исследуемым образцам (плазма, сыворотка, кровь и др.); добавляют детектирующий агент и флуоресцентную метку (смесь стрептовидина и фикоэритрина). Во время измерения в проточной ячейке анализатора Luminex в проточной жидкости каждая микросфера подвергается облучению двумя лазерами (зеленым и красным) с разной длиной волны и флуоресцентный сигнал, испускаемый флурофорами, регистрируется фотодетекторами прибора. Таким образом, анализируется одновременно тип микросферы и наличие (концентрация) искомого аналита на соответствующем типе частиц.
Недостатком способа является необходимость использования специального дорогостоящего оборудования и труднодоступных полистироловых микроплат, а также потеря времени на их сенсибилизацию, отмывание, многоэтапность метода, создание программы исследования и длительную расшифровку результатов. Этот метод пригоден только для высокоспециализированных, но не для практических лабораторий.
Раскрытие изобретения
Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение - получение набора флуоресцирующих риккетсиальных и коксиеллезного диагностикумов, а именно флуоресцирующих диагностикумов риккетсий группы сыпного тифа (R.prowazekii, R. typhi), риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (R.sibirica, R.conorii) и рода coxiella (C.burnetii) на основе их белково-липополисахаридного комплекса и, их применение для одновременной одноэтапной серологической диагностики риккетсиозов и коксиеллеза, а также создание способа серологической диагностики с использованием прямого метода флуоресцирующих антигенов (пМФАг) при сохранении высокой чувствительности и специфичности за счет придания корпускуляризованной формы белково-липополисахаридному комплексу и увеличения числа антигенных детерминант на ее поверхности.
Технический результат достигается за счет того, что создан способ получения набора флуоресцирующих риккетсиальных и коксиеллезного диагностикумов, включающий приготовление флуоресцирующего сорбента путем очистки формалинизированных лактобактерий от компонентов защитной среды высушивания с последующей меткой их неорганическими флуорохромами, получение белково-липополисахаридных комплексов из корпускулярных антигенов риккетсий группы сыпного тифа или группы клещевой пятнистой лихорадки или или рода Coxiella путем выделения из них активных белково-липополисахаридых комплексов сочетанными методами ультразвуковой дезинтеграции корпускул антигенов и хроматографии, после чего соединеняют посредством связующего реагента выделенные белково-липополисахаридные комплексы с флуоресцирующим сорбентом и получают конечный продукт - набор флуоресцирующих риккетсиальных и коксиеллезных диагностикумов из перечисленных.
При этом белково-липополисахаридные комплексы получают из корпускулярных антигенов риккетсий группы сыпного тифа - R.prowazekii или R. typhi; или группы клещевой пятнистой лихорадки R.sibirica или R.conorii; или рода Coxiella - C.burnetii. А в качестве флуоресцирующего сорбента используют лактобактерии с концентрацией не менее 1х109 клеток/мл, меченые неорганическими флуорохромами. В качестве связующего реагента флуоресцирующего сорбента с белково-липополисахаридным комплексом используют танин или карбодиамид водорастворимый в объемном соотношении флуоресцирующего сорбента и раствора танина или карбодиимида 1:1. В данном способе флуоресцирующий сорбент со связующим реагентом смешивают с раствором белково-липополисахаридных комплексов с концентрацией белка не менее 0,5 мг/мл при их объемном соотношении 1:1. При этом флуоресцирующй сорбент инкубируют с белково-липополисахаридным комплексом в течение 1 ч при температуре 43°С. Каждый флуоресцирующий риккетсиальный и коксиеллезный диагностикум из набора представляет собой лиофильно высушенную из объема 0,5 мл взвесь флуоресцирующих лактобактерий, ковалентно связанных посредством связующего реагента с белково-липополисахаридными комплексами риккетсий группы сыпного тифа R.prowazekii или R. typhi или риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки R.sibirica или R.conorii, или рода Coxiella C.burnetii.
Заявлено применение созданного набора флуоресцирующих риккетсиальных и коксиеллезного диагностикумов для серологической диагностики риккетсиозов и коксиеллеза для выявлния заболеваний группы сыпного тифа - эпидемического вшивого сыпного тифа и эндемического блошиного сыпного тифа, группы клещевой пятнистой лихорадки - клещевого риккетсиоза Северной Азии, или астраханской пятнистой лихорадки и рода коксиелл - Q лихорадки, а также для сероиммунологического мониторинга населения в эндемических очагах.
Создан также способ серологической диагностики риккетсиозов и коксиеллеза с использованием набора флуоресцирующих риккетсиальных и коксиеллезного диагностикумов, который заключается в том, что постановку реакции флуоресцирующих диагностикумов и испытуемых сывороток проводят в формате прямого метода, на предметных стеклах с лунками, расположенными в два горизонтальных ряда, при этом во все лунки первого горизонтального ряда вносят испытуемую сыворотку в диагностическом титре с разведением 1:40, а во все лунки второго ряда - очищенную воду, затем последовательно в вертикальные ряды обоих горизонтальных рядов, в сыворотку первого горизонтального ряда и очищенную воду второго горизонтального ряда, вносят созданные флуоресцирующие диагностикумы, причем в 1-ый горизонтальный ряд - R.prowazekii, во 2-ой - R. typhi, в третий -R. sibirica, в четвертый - R.conorii и в пятый - C.burnetii, причем взаимодействие антигенов диагностикумов с антителами исследуемой сыворотки проводят перемешивая путем постукивания по подложке и дальнейшего размещения во влажную камеру с температурй 37°С на 60 мин., затем мазки высушивают и просматривают под иммерсионным объективом флуоресцентного микроскопа, оценку результатов проводят по четырехкрестовой системе и документирование осуществляют путем сохранения предметных стекол с мазками или сохранением фото с микроскопа на usb-носителе, при выявлении положительной реакции в лунках, проводят полуколичественный анализ, используя флуоресцирующий диагностикум, с которым сыворотка показала положительную реакцию, при этом, в лунки предметных стекол вносят разведения испытуемой сыворотки с 1:20 до 1:1280, начиная с максимального, затем в лунки предметных стекол добавляют этот флуоресцирующий диагностикум, далее, как и в первом эксперименте, взаимодействие антигенов флуоресцирующих диагностикумов с антителами исследуемой сыворотки проводят перемешивая постукиванием по подложке предметного стекла и дальнейшего размещения во влажную камеру с температурй 37°С на 60 мин., затем мазки высушивают и просматривают под иммерсионным объективом флуоресцентного микроскопа, оценку результатов проводят также по четырехкрестовой системе, документирование осуществляют также путем сохранения предметных стекол с мазками или сохранением фото с микроскопа на usb-носителе.
Краткое описание фигур
На фиг. 1.
Представлено получение флуоресцирующего сорбента.
А-представлены формалинизированные лактобактерии, являющиеся матрицей для сорбции аналитов - белково-липополисахаридных комплексов риккетсиальных и коксиеллезных антигенов;
В-формула неорганического флуорохрома - изотиоцианата флуоресцеина (ФИТЦ), использующегося для окрашивания лактобактерий;
С-флуоресцирующий сорбент, полученный после окрашивания ФИТЦ (фото).
На фиг. 2.
Представлено получение флуоресцирующего сорбента с активированными группами.
А-флуоресцирующий сорбент;
В-формула связующего реагента (танина), используемого для присоединения к флуоресцирующему сорбенту белково-липополисахаридного комплекса;
С-активированный флуоресцирующий сорбент, содержащий активные гидроксильные и карбоксильные группы.
На фиг. 3.
Схематически изображено приготовление флуоресцирующего диагностикума.
А-активированный флуоресцирующий сорбент;
В-присоединение белково-липополисахаридных комплексов риккетсий группы сыпного тифа (R.prowazekii, R. typhi), риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (R.sibirica, R.conorii) и рода Сoxiella (C.burnetii) к активированному флуоресцирующему сорбенту;
С-конечные продукты флуоресцирующих диагностикумов:
- флуоресцирующий диагностикум R.prowazekii,
- флуоресцирующий диагностикум R. typhi,
- флуоресцирующий диагностикум R.sibirica,
- флуоресцирующий диагностикум R.conorii,
- флуоресцирующий диагностикум C.burnetii.
На фиг. 4.
Продемонстрирован результат применения флуоресцирующих дагностикумов из набора со специфической гомологичной сывороткой. Результат визуальной оценки реакции при просмотре во флуоресцентном микроскопе.
А - фото отрицательного результата - отсутствие специфических антител в исследуемой сыворотке. Поля зрения заполнены изолированными корпускулами флуоресцирующего диагностикума;
В - фото положительного результата - в исследуемой сыворотке присутствуют специфические антитела, в титре 1:640.
В поле зрения агглютинаты, содержащие более 50 корпускул флуоресцирующего диагностикума - положительная реакция, оцениваемая на 4+.
Аналогичные положительные и отрицательные результаты получены при постановке с любым диагностикумом из набора.
На фигуре 5.
Представлена типичная хроматограмма, полученная на заключительной стадии обработки и очистки корпускулярных суспензий риккетсий группы сыпного тифа (Rickettsia prowazekii / R.typhi).Продемонстирован профиль элюции cупернатантов после ультразвуковой обработки суспензии риккетсий, показано разделение дезинтегрантана четыре фракции (I, II, III, IV). Серологическая специфическая активность была сосредоточена в первой фракции и соответствовала в РНГА 1:64, в остальных фракциях серологическая активность отсутствовала. Для определения состава полученной первой фракции проведена оценка содержания белка и бактериальных липополисахаридов. Содержание белка составило 0,9 мг/мл, содержание бактериальных липополисахаридов 42 920 ЕЭ/мл, специфическая активность в РНГА -1128. Исходя из полученных данных первая фракция была названа белково-липополисахаридным комплексом.
На оси Х отмечены объем элюента, прошедшего через колонку, в млв мл; ось Y - оптическая плотность (детекция при длине волны 280 нм).
На фиг. 6.
tm
Белковые профили белково-липополисахаридного комплекса Rickettsia prowazekii, полученные в результате электрофорез в SDS-ПААГ и окрашивания EZBlueGelStainingReagent (Sigma-Aldrich, США). Использован маркер молекулярного масса ab115832 (Abcam, Великобритания). В образце были детектированы белки с Мw 18, 29, 57, 105, 121 кДа.
На фиг. 7.
Представлена типичная хроматограмма, полученная на заключительной стадии обработки и очистки корпускулярных суспензий риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (Rickettsia sibirica, R.conorii).Продемонстирован профиль элюции cупернатантов после ультразвуковой обработки суспензии риккетсий, показано разделение дезинтегрантана четыре фракции (I, II, III). Серологическая специфическая активность была сосредоточена в первой фракции и соответствовала в РНГА 1:128, в остальных фракциях серологическая активность отсутствовала. Для определения состава полученной первой фракции проведена оценка содержания белка и бактериальных липополисахаридов. Содержание белка составило 1,4 мг/мл, содержание бактериальных липополисахаридов 60150 ЕЭ/мл.
Исходя из данных первая фракция была названа белково- полученных липополисахаридным комплексом.
На оси Х отмечены объем элюента, прошедшего через колонку, в млв мл; ось Y - оптическая плотность (детекция при длине волны 280 нм).
На фиг. 8.
Rickettsia sibirica
tm
Белковые профили белково-липополисахаридного комплекса , полученные в результате электрофорез в SDS-ПААГ и окрашивания EZBlueGelStainingReagent (Sigma-Aldrich, США). Использован маркер молекулярного масса ab115832 (Abcam, Великобритания). В образце были детектированы белки с Мw 18, 29, 57, 105, 121 кДа.
На фиг. 9.
Представлена типичная хроматограмма, полученная на заключительной стадии обработки и очистки корпускулярных суспензий Coxiella burnetii. Продемонстирован профиль элюции cупернатантов после ультразвуковой обработки суспензии риккетсий, показано разделение дезинтегрантана две фракции (I, II). Серологическая специфическая активность была сосредоточена в первой фракции и соответствовала в РНГА 1:128, в остальных фракциях серологическая активность отсутствовала. Для определения состава полученной первой фракции проведена оценка содержания белка и бактериальных липополисахаридов. Содержание белка составило 1,1 мг/мл, содержание бактериальных липополисахаридов 26 990 ЕЭ/мл. Исходя из полученных данных первая фракция была названа белково- полученных липополисахаридным комплексом.
На оси Х отмечены объем элюента, прошедшего через колонку, в млв мл; ось Y - оптическая плотность (детекция при длине волны 280 нм).
На фиг. 10.
Представлены белковые профили белково-липополисахаридного комплекса Coxiella burnetii, полученные в результате электрофорез в SDS-ПААГ и окрашивания EZBluetmGelStainingReagent (Sigma-Aldrich, США). Использован маркер молекулярного веса - Wide Range Protein Molecular Weight Marker (кат. номер BSM0661, Bio Basic, Канада). В образце были детектированы белки с Мw 15, 65, 85, 120 кДа.
Реализация изобретения
Заявляемое изобретение направлено на создание набора флуоресцирующих диагностикумов, предназначенных для одновременного выявления специфических антител в сыворотке крови людей к разным антигенам риккетсий и коксиелл патогенных для человека. Предложенный способ серологической диагностики с помощью набора флуоресцирующих диагностикумов менее труемомок, является доступным и методологически простым способом, не требующим больших затрат для осуществления анализа. Введение набора флуоресцирующих диагностикумов в практику для клинико-диагностических лабораторий медицинских учреждений Минздрава РФ и Центров Роспотребнадзора РВ является надежным способом диагностики риккетсиозов группы сыпного тифа (эпидемический сыпной тиф и эндемический сыпной тиф), риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки (сибирский клещевой тиф и астраханская клещевая лихорадка) и коксиеллеза. Проведение диагностики инфекций риккетсиозной этиологии и коксиеллеза проводилась в соответствующими нормативными документами (см. Список литературы 15-19).
Способ приготовления флуоресцирующих риккетсиальных и коксиеллезного диагностикумов состоит из следующих этапов:
1. Получение флуоресцирующего сорбента:
1.1. очистка лактобактерий,
1.2. формалинизация лактобактерий,
1.3. получение флуоресцирующего сорбента.
2. Получение белково-липополисахаридного комплекса риккетсий и коксиелл:
2.1. приготовление лиофилизированных культур корпускул риккетсий группы сыпного тифа (R.prowazekii, R. typhi), риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (R.sibirica, R.conorii) и рода coxiella (C.burnetii),
2.2. дезинтеграция культур риккетсий и коксиелл с помощью ультразвукового дезинтегратора Soni Prep 150 Plus,
2.3. разделение дезинтеграта риккетсий и коксиелл с использованием хроматографа Akta Explorer 10 и выделение специфически активного белково-липополисахаридного комплекса,
3. Приготовление флуоресцирующих диагностикумов (фиг. 1):
3.1. получение флуоресцирующих сорбентов с активированными группами,
3.2. сенсибилизация танизированных флуоресцирующих сорбентов белково-липополисахаридным комплексом,
3.3. получение флуоресцирующих диагностикумов.
Пример 1.
Получение флуоресцирующего сорбента.
1.1. Очистка лактобактерий.
В качестве матрицы для сорбента использовали лактобактерии Lactobacillus fermentum 90T-C4, однако в работе можно использовать и другие штаммы лактобактерий: Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp., Brueckii subsp. lactis, Lactobacillus paracasei и Lactobacillus rhamnosus.
Лактобактерии выделяют из препарата «Лактобактерин» путем трехкратного центрифугирования при 3000об/мин в течение 25 мин при температуре 23°С для удаления защитной среды для высушивания.
1.2.Формалинизация лактобактерий.
9
Осадки лактобактерий ресуспендировали в 50 мл 0,9 % растворе хлорида натрия рН 7,0. В полученную биомассу лактобактерий добавляют нейтральный формалин до конечной концентрации 10% и выдерживают 7 суток при температуре 6-8°С. Осаждение биомассы проводят на центрифуге при 3000об/мин в течение 25 мин при температуре 23°С. Отмывание биомассы проводят в 0,9% растворе хлорида натрия при 3000об/мин в течение 25 мин. Осадок ресуспендируют в рабочем растворе - 0,9% раствора хлорида натрия - 70%, карбонатно-бикарбонатного буфера рН 9,0 - 30%. Выход взвеси формалинизированных лактобактерий - сорбента 50 мл с концентрацией 10 клеток /мл.
1.3. Получение флуоресцирующего сорбента.
9
Для окрашивания применяли неорганические флуоресцентные красители: изотиоцианат флуоресцеина, полупроводниковые коллоидные наночастицы разного цвета флуоресценции - нанокристаллы. В описываемом опыте для окрашивания к полученной взвеси формалинизированных лактобактерий добавляли флуоресцентный краситель - изотиоцианат флуоресцеина из расчета 2 мг на 10х10 лактобактерий.
-6
Конъюгацию смеси проводили в течении 18 часов при температуре 23°С при постоянном перемешивании. Аналогичным образом проводили метку нанокристаллами, за исключением того, что нанокристаллы добавляли к формалинизированным лактобактериям 10 ml с концентрацией наночастиц 5,4 х 10.
По истечении времени конъюгации проводили осаждение флуорисцирующего сорбента и отмывание их от непрореагировавшего флуорохрома путем 3-хкратного осаждения методом центрифугирования в 0,9% растворе хлорида натрия при 3000 об/мин в течение 25 мин. и осадок ресуспендировали в 0,9% растворе хлорида натрия. Выход флуоресцирующего сорбента - 45мл. Хранили при температуре 6-8°С.
Пример 2.
Получение белково-липополисахаридного комплекса риккетсий и коксиелл.
2.1. Приготовление лиофилизированных культур риккетсий группы сыпного тифа (R.prowazekii, R. typhi), риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (R.sibirica, R.conorii) и рода коксиелл (C.burnetii).
Исходным материалом для получения белково-липополисахаридного комплекса служили лиофилизированные корпускулярные антигены Rickettsia prowazekii, R.sibirica, которые получали по безэфирному методу включающему культивирование R. prowazekii и R.sibirica в развивающихся куриных эмбрионах, извлечении инфицированных желточных оболочек из куриных эмбрионов, инактивирование 0,4% формалином и гомогенизацию при 5000об/мин в течение 3 мин, сочетанное использование низкоскоростного -1500об/мин в течение 5 мин и высокоскоростного -10000об/мин - в течение 30 мин0 центрифугирований с последующим удалением мелкодисперсионных частиц методом микрофильтрации.
Корпускулярные антигены R. typhi, R.conorii и Coxiella burnetii получали по эфирной технологии (П.Ф.Здродовский и Е.М.Голиневич.
«Учение о риккетсиях и риккетсиозах», М., 1972, с. 114-117), включающей культивирование риккетсий и коксиелл в развивающихся куриных эмбрионах, извлечение инфицированных желточных оболочек и из измельчение с помощью стеклянных бус, трехкратную обработку полученной взвеси эфиром, а выделенную водную фазу подвергали длительному центрифугированию в течение 2-х часов при 3000 об/ мин с последующим ресуспендированием осадка в забуференном 0,9%растворе натрия хлорида с добавлением формалина до 0,2%.
2.2 Дезинтеграция культур риккетсий и коксиелл с помощью ультразвукового дезинтегратора Soni Prep 150 Plus.
Для этого содержимое ампул с корпускулярными антигенами ресуспендировали в буферном растворе (10 mM трис-HCl, 0,5 М хлорида натрия,10% изопропанола, рН 7,5) и обрабатывали с помощью ультразвукового дезинтегратора Soni Prep 150 Plus (Великобритания) при частоте 23 кГц и амплитуде 112 шестикратно по 5 мин. Осаждение неразрушенных клеток проводили путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 20 мин при температуре 23°С.
2.3. Разделение дезинтеграта риккетсий и коксиелл с использованием хроматографа Akta Explorer 10 и выделение специфически активного белково-липополисахаридного комплекса.
Дезинтеграт подвергали эксклюзионной хроматографии с использованием хроматографа Akta Explorer 10 (Швеция) при температуре 4°С. На колонке с размером 10 х 300мм фракционировали дезинтеграт в буферном растворе рН 7,5 (10mM трис-HCl, 0,5 М хлорида натрия, 10% изопропанола).
Хроматограммы разделения белково-липополисахаридных комплексов риккетсий и коксиелл приведены на фигурах 5, 7, 9.
Качественный анализ выделенного белково-липополисахаридного комплекса представлен на фигурах 6, 8, 10.
Первая фракция содержала серологически активный белково-липополисахаридный комплекс, остальные фракции не обладали серологической активностью.
Выделенные белково-липополисахаридные комплексы соответствовали нижеследующим требованиям:
- белково-липополисахаридный комплекс должен иметь рН - 7,2-7,4;
- он не должен содержать корпускул в реакции с флуоресцирующими иммуноглобулинами соответствующей специфичности;
- должен иметь специфическую активность в РНГА с соответствующими диагностикумами не ниже 1:32;
- содержание белка в белково-липополисахаридном комплексе -не менее 0,5 мг/мл;
- количество липополисахаридного (ЛПС) комплекса должно быть не менее 25000 ЕЭ/мл.
Пример 3.
Приготовление флуоресцирующих диагностикумов.
3.1. Получение флуоресцирующих сорбентов с активированными группами (фиг. 2).
N
N
В качестве связующего реагента использовали гидролизованные танины (сложные эфиры галловой кислоты или родственных ей дигалловой и тригалловой кислот с многоатомным спиртом - глюкозой) или водорастворимые карбодиимиды (-(3-Dimethylaminopropyl)-′-ethylcarbodiimide hydrochloride).
1
Для этого 2 мл 1%-ной взвеси флуоресцирующего сорбента осаждали и отмывали в 2 мл 0,9% раствора хлорида натрия рН 7,0 два раза путем центрифугирования в течение 25 мин при 3000 об/мин. Осадок ресуспендировали в 2 мл 0,9% раствором хлорида натрия рН 7,2. Затем к 2 мл отмытого флуоресцирующего сорбента добавляли 2 мл раствора танина на 0,9% растворе хлорида натрия рН 7,2 до концентрации 1:20000, смесь оставляли на 15 мин при температуре 23°С при периодическом перемешивании. Осаждение смеси проводили путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 25 мин при температуре 23°С. Отмывку смеси проводили трижды в 0,9% растворе хлорида натрия рН 7, 0 при 3000 об/минв течение 25 мин при температуре 23°С. Выход танизированного флуоресцирующего сорбента - 2 мл.
N
N
Получение флуоресцирующих сорбентов c активированными группами с использованием водорастворимого карбодиимида (-(3-Dimethylaminopropyl)-'-ethylcarbodiimide hydrochloride) проводили аналогичным способом, только концентрация карбодиимида составляла 1:2000.
3.2. Соединение флуоресцирующих сорбентов c активированными группами белково-липополисахаридных комплексов.
Для этого 2 мл танизированного флуоресцирующего сорбента соединяли с 2 мл раствора белково-липополисахаридного комплекса с концентрацией по белку 0,5 мг/мл и инкубировали при температуре 43°С в течение 1 часа при периодическом перемешивании.
3.3. Получение флуоресцирующих диагностикумов (фиг. 3).
.
По истечении времени инкубации смесь центрифугировали в течение 25 мин при 3000 об/мини отмывали0,9% раствором хлорида натрия рН 7,0После чего готовили конечную концентрацию флуоресцирующих диагностикумов равную 0,5%. Хранили при температуре 6-8°С.
Пример 4.
Изготовление флуоресцирующих диагностикумов риккетсий группы сыпного тифа (Rickettsia prowazekii и R. typhi).
4.1. Получение флуоресцирующего диагностикумаRickettsia prowazekii проводили в соответствии с изложенными выше этапами технологического процесса.
риккетсиозов
Использовали лиофилизированный корпускулярный антиген Rickettsia prowazekii (штамм «Брейнль», № регистрации 1, взятый из «Коллекции возбудителей боррелиоза, бруцеллеза, клостридиозов, коклюша, лептоспирозов. легионеллезов, микоплазмозов, , туляремии и хламидиозов» Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации), который получали по безэфирному методу, включающему культивирование R. prowazekii и R.sibirica в развивающихся куриных эмбрионах, извлечении инфицированных желточных оболочек из куриных эмбрионов, инактивирование 0,4% формалином и гомогенизацию при 5000об/мин в течение 3 мин, сочетанное использование низкоскоростного (1500об/мин в течение 5 мин) и высокоскоростного (10000об/мин в течение 30 мин 0 центрифугирований с последующим удалением мелкодисперсионных частиц методом микрофильтрации.
Содержимое ампул с корпускулярным антигеном ресуспендировали в буферном растворе (10 mM трис-HCl, 0,5 М хлорида натрия,10% изопропанола, рН 7,5) и обрабатывали с помощью ультразвукового дезинтегратора при частоте 23 кГц и амплитуде 112 шестикратно по 5мин. Осаждение неразрушенных клеток проводили путем центрифугирования при 10000 об/мин в течение 10 мин при температуре 23°С. Для выделения белково-липополисахаридного комплекса дезинтеграт наносили на колонку (10 х300мм), заполненную сорбентом Superdex 200 и уравновешенную буферным раствором 10mM трис-HCl, 0,5 М хлорида натрия,10% изопропанола рН 7,5.
Белково-липополисахаридный комплекс элюировался в первой фракции с концентрацией белка 0,5 - 1,4 мг/мл.
Белковый антиген соответствовал следующим требованиям: фракция - рН 7,3, корпускулы при просмотре с флуоресцирующими иммуноглобулинами к риккетсиям группы сыпного тифа не выявлялись; специфическая активность в РНГА с эритроцитарным сыпнотифозным антигенным диагностикумом соответствовала 1: 64.
9
Ранее готовили 50 мл флуоресцирующего сорбента. С этой целью содержимое 10 флаконов с «Лактобактерином» ресуспендировали в 50 мл 0,9% раствора хлорида натрия рН 7,0, осаждали при центрифугировании при 3000об/мин в течение 25 мин при температуре 23°С для удаления защитной среды для высушивания.Затем трехкратно отмывали в 0,9% растворе хлорида натрия рН 7,0 при этих же параметрах. Осадки ресуспендировали в 50 мл 0,9 % растворе хлорида натрия рН 7,0, в полученную биомассу лактобактерий добавляли нейтральный формалин до конечной концентрации 10% и выдерживали 7 суток. Осаждение биомассы проводили на центрифуге при 3000 об/мин в течение 25 мин при температуре 23°С. Отмывание биомассы проводили в 0,9% растворе хлорида натрия при 3000 об/мин в течение 25 мин. Осадок ресуспендировали в рабочем растворе (0,9% раствора хлорида натрия - 70%, карбонатно-бикарбонатного буфера рН 9,0 - 30%). Выход взвеси формалинизированных лактобактерий - 45 мл с концентрацией 10 /мл.
9
К полученной взвеси добавляли флуоресцентный краситель - изотиоцианат флуоресцеина из расчета 2 мг на 10х10 корпускул сорбента. Конъюгацию смеси проводили в течении 18 часов при температуре 23°С при постоянном перемешивании. По истечении времени конъюгации проводили осаждение флуорисцирующего сорбента и отмывание от непрореагировавшего флуорохрома путем 3-х кратного осаждения методом центрифугирования в 0,9% растворе хлорида натрия при 3000 об/мин в течение 25 мин и осадок ресуспендировали в расчетном количестве 0,9% раствора хлорида натрия, необходимом для получения 1% концентрации флуоресцирующего сорбента. Выход флуоресцирующего сорбента - 40 мл. Хранили при температуре 6-8°С.
9
1
.
Метку флуоресцирующего сорбента нанокристаллами проводили аналогичным образом с той разницей, что концентрацию нанокристаллов брали из расчета 10 ml на 10 корпускул флуоресцирующего сорбента. Для приготовления флуоресцирующего диагностикума R.prowazekii отбирали 2 мл 1%-ной взвеси флуоресцирующего сорбента осаждали и отмывали в 2мл 0,9% раствором хлорида натрия рН 7,0 два раза путем центрифугирования в течение 25 мин 3000 об/мин.Осадок ресуспендировали в 2 мл 0,9% раствором хлорида натрия рН 7,2. К 2мл отмытого флуоресцирующего сорбента добавляли 2 мл раствора танина на 0,9% растворе хлорида натрия рН 7,2 до концентрации 1:20000 , смесь оставляли на 15 мин при температуре 23°С при периодическом перемешивании. Осаждение смеси проводили путем центрифугирования при 3000об/мин в течение 25 мин при температуре 23°С. Отмывку смеси проводили трижды в 0,9% растворе хлорида натрия рН 7, 0 при 3000об/минв течение 25 мин при температуре 23°С. Выход танизированного флуоресцирующего сорбента 1,8 мл. Затем 1,8мл танизированного флуоресцирующего сорбента соединяли с 1,8 мл раствора белково-липополисахаридного комплекса с концентрацией по белку 0,5мг/мл и инкубируют при температуре 43°С в течение 1ч. После инкубации смесь центрифугировали в течение 25 мин при 3000 мини отмывали0,9% раствором хлорида натрия рН 7,0После чего готовили конечную концентрацию флуоресцирующих диагностикумов 0,5%. Хранили при температуре 6-8°С (фиг. 4).
Характеристика выделенного белково-липополисахаридного комплекса R.prowazekii: белковый антиген соответствовал следующим требованиям: фракция - рН 7,3; корпускулы при просмотре с флуоресцирующими иммуноглобулинами к риккетсиям группы сыпного тифа не выявлялись; специфическая активность в РНГА с эритроцитарным сыпнотифозным антигенным диагностикумом соответствовала 1:64. Хроматограмма белково-липополисахаридного комплекса приведена на фигуре 5.
Качественная характеристика белково-липополисахаридных комплексов группы сыпного тифа в SDS-ПААГ приведена на фиг. 6.
Качественную оценку полученных антигенных субстанций риккетсий группы сыпного тифа (R. prowazekii и R. typhi) проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по известной методике (ОФС 1.2.1.0023.15. «Электрофорез в полиакриламидном геле»).Затем гель окрашивали с использованием реагента EZ Blue Gel Staining Reagent (Sigma-Aldrich, США).
Типичный вариант белкового профиля белково-липополисахаридного комплекса группы сыпного тифа приведен на фигуре 6.
Количественное определение белка в полученных антигенных комплексах оценивали спектрофотометрически по методу Брэдфорд (ОФС.1.2.3.0012.15. «Определение белка»). Количественное определение бактериальных липополисахаридов оценивали с использованием турбидиметрического кинетического ЛАЛ-теста (ОФС.1.2.4.0006.15. «Бактериальные эндотоксины»). Содержание белка в полученной антигенной субстанции, определенное по методу Брэдфорд, составляло от 0,9 до 1,4 мг/мл; содержание бактериальных липополисахаридов, определенное с использованием метода кинетического турбидиметрического ЛАЛ-теста, составило 42 920 ЕЭ/мл.
Таким образом, полученные результаты подтвердили присутствие в растворимых очищенных белково-липополисахаридных субстанциях Rickettsia prowazekii как белков, так и бактериальных липополисахаридов.
Результаты опытов по исследованию сывороток к риккетсиям группы сыпного тифа с помощью флуоресцирующего диагностикума R.prowazekii приведены в таблице № 1 и 2.
Аналогичным образом готовили и исследовали флуоресцирующие антигены из других риккетсий группы сыпного тифа (R. typhi), риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (R.sibirica и R.conorii) и коксиелл Бернета (C.burnetii).
Пример 4.2.
Изготовление флуоресцирующего диагностикума R. typhi.
Использовали лиофилизированный корпускулярный антиген R. typhi
(штамм «Исаханян» № регистрации 37, взятый из той же «Коллекции», как и штамм с номером регистрации №1), полученный по методу Здродовского П.Ф. и Голиневич Е.М. «Учение о риккетсиях и риккетсиозах. Корпускулярные антигены риккетсий», М., 1972. с 114-117.Корпускулярные антигены R. typhi, получали по эфирной технологии (П.Ф.Здродовский и Е.М.Голиневич. «Учение о риккетсиях и риккетсиозах», М., 1972, с. 114-117), включающей культивирование риккетсий и коксиелл в развивающихся куриных эмбрионах, извлечение инфицированных желточных оболочек и измельчение с помощью стеклянных бус, трехкратную обработку полученной взвеси эфиром, а выделенную водную фазу подвергали длительному центрифугированию в течение 2-х часов при 3000об/мин с последующим ресуспендированием осадка в забуференном 0,9%растворе натрия хлорида с добавлением формалина до 0,2%.
Содержимое ампул с лиофилизированным антигеном R. typhi
ресуспендировали в буферном растворе (10mM трис-HCl, 0,5 М хлорида натрия, 10% изопропанола, рН 7,5) и обрабатывали с помощью ультразвукового дезинтегратора с последующей эксклюзивной хроматографией на колонке с Superdex 200.
Флуоресцирующий диагностикум R. typhi готовили как и изложено в примере 1.
Характеристика белково-липополисахаридного комплекса R.typhi: рН 7,2, не содержала корпускул, специфическая активность в РНГА 1: 64- 1:128.
Хроматограмма и белковые профили R. typhi в SDS ПААГ были аналогичными c хроматограммой и белковыми профилями R.prowazekii.
Установлено, что содержание белка в полученной антигенной субстанции, определенное по методу Брэдфорд, составляло от 0,9 до 1,4 мг/мл; содержание бактериальных липополисахаридов, определенное с использованием метода кинетического турбидиметрического ЛАЛ-теста, составило более 42 950 ЕЭ/мл.
При качественном анализе было подтверждено наличие в очищенных белково-липополисахаридных субстанциях Rickettsia typhi как белков, так и бактериальных липополисахаридов.
Результаты опытов по исследованию сывороток к риккетсиям группы сыпного тифа с помощью флуоресцирующих диагностикума R. typhi приведены в таблице № 1 и 2.
Пример 5.
Изготовление флуоресцирующего диагностикума риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки ( R.sibirica и R. conorii).
5.1. Получение флуоресцирующего диагностикумаR.sibirica.
Использовали лиофилизированный корпускулярный антиген R.sibirica (штамм «Нецветаев», № регистрации 52, взятый из той же «Коллекции», как и штамм с номером регистрации №1), полученный по безэфирному методу, включающему культивирование R.sibirica в развивающихся куриных эмбрионах, извлечение инфицированных желточных оболочек из куриных эмбрионов, инактивирование их 0,4% формалином и гомогенизацию при 5000об/мин в течение 3 мин, сочетанное использование низкоскоростного (1500об/мин в течение 5 мин) и высокоскоростного (10000об/мин в течение 30 мин), центрифугирований с последующим удалением мелкодисперсионных частиц методом микрофильтрации.
Содержимое ампул с лиофилизированным антигеном риккетсий сибирика ресуспендировали в буферном растворе (10 mM трис-HCl, 0,5 М хлорида натрия,10% изопропанола, рН 7,5) и обрабатывали с помощью ультразвукового дезинтегратора с последующей эксклюзивной хроматографией на колонке с Superdex 200. Флуоресцирующий диагностикум риккетсий сибирика готовили, как и изложено в примере 1.
Выделенные белково-липополисахаридные комплексы R.sibirica имели рН 7,3, не содержали корпускул, специфическая активность в РНГА равна 1:32 - 1:64. Качественный анализ выделенного белково-липополисахаридного комплекса R.sibirica проводили как изложено в примере 1. Содержание белка в полученных антигенных субстанциях, определенное по методу Брэдфорд, составляло от 0,5 до 1,4 мг/мл; содержание бактериальных липополисахаридов, определенное с использованием метода кинетического турбидиметрического ЛАЛ-теста, составляло более 60 150 ЕЭ/мл.
Таким образом, полученные результаты подтвердили присутствие в растворимых очищенных белково-липополисахаридных субстанциях R. sibirica как белков, так и бактериальных липополисахаридов.
Типичные профили хроматограмм и белкового состава R.sibirica приведены на фигуре 7 и 8.
Результаты опытов по исследованию сывороток к риккетсиям группы клещевой пятнистой лихорадки с помощью флуоресцирующего диагностикума R.sibirica приведены в таблице № 1 и 2.
Пример 5.2.
Получение флуоресцирующего диагностикума R. conorii.
Использовали лиофилизированный корпускулярный антиген R.conorii (штамм «Севастополь», № регистрации 122, взятый из той же «Коллекции», как и штамм с номером регистрации №1)), полученный по методу Здродовского П.Ф. и Голиневич Е.М. «Учение о риккетсиях и риккетсиозах. Корпускулярные антигены риккетсий», М., 1972. с 114-117. Корпускулярные антигены R. conorii, получали по эфирной технологии П.Ф.Здродовский и Е.М. Голиневич. «Учение о риккетсиях и риккетсиозах», М., 1972, с. 114-117, включающей культивирование риккетсий и коксиелл в развивающихся куриных эмбрионах, извлечение инфицированных желточных оболочек и измельчение с помощью стеклянных бус, трехкратную обработку полученной взвеси эфиром, а выделенную водную фазу подвергали длительному центрифугированию в течение 2-х часов при 3000об/мин с последующим ресуспендированием осадка в забуференном 0,9%растворе натрия хлорида с добавлением формалина до 0,2%.
Содержимое ампул с лиофилизированным антигеном R.conorii ресуспендировали в буферном растворе (10 mM трис-HCl, 0,5 М хлорида натрия,10% изопропанола, рН 7,5) и обрабатывали с помощью ультразвукового дезинтегратора с последующей эксклюзивной хроматографией на колонке с Superdex 200. Флуоресцирующий диагностикум R.conorii готовили, как изложено в примере 1.
Выделенный белково-липополисахаридный комплекс R.сonorii имеет рН 7,3,не содержал корпускул, специфическая активность в РНГА - 1:32 - 1:64. Качественный анализ выделенного белково-липополисахаридного комплекса R. conorii проводили как изложено в примере 1. Содержание белка в полученных антигенных субстанциях, определенное по методу Брэдфорд, составляло от 0,5 до 1,4 мг/мл; содержание бактериальных липополисахаридов, определенное с использованием метода кинетического турбидиметрического ЛАЛ-теста, составляло выше 60 150 ЕЭ/мл.
Таким образом, полученные результаты подтвердили присутствие в растворимых очищенных белково-липополисахаридных субстанциях R. sibirica и R.conorii как белков, так и бактериальных липополисахаридов.
Результаты опытов по исследованию сывороток к риккетсиям группы клещевой пятнистой лихорадки с помощью флуоресцирующего диагностикума R.conorii приведены в таблице № 1 и 2.
Пример 6.
Изготовление флуоресцирующего диагностикума С.burnetii.
Использовали лиофилизированный корпускулярный антиген С.burnetii (штамм «Грита, № регистрации 13», взятый из той же «Коллекции», как и штамм с номером регистрации №1)). Корпускулярные антигены С.burnetii получали по эфирной технологии (П.Ф.Здродовский и Е.М.Голиневич. Учение о риккетсиях и риккетсиозах. Корпускулярные антигены риккетсий М., 1972, с.114-117), включающей культивирование риккетсий и коксиелл в развивающихся куриных эмбрионах, извлечение инфицированных желточных оболочек и из измельчение с помощью стеклянных бус, трехкратную обработку полученной взвеси эфиром, а выделенную водную фазу подвергали длительному центрифугированию в течение 2-х часов при 3000 об/ мин с последующим ресуспендированием осадка в забуференном 0,9%растворе натрия хлорида с добавлением формалина до 0,2%.
Содержимое ампул с лиофилизированным антигеном коксиелл Бернета ресуспендировали в буферном растворе (10mM трис-HCl, 0,5 М хлорида натрия,10% изопропанола, рН 7,5) и обрабатывали с помощью ультразвукового дезинтегратора с последующей эксклюзивной хроматографией на колонке с Superdex 200. Флуоресцирующий диагностикумС.burnetii готовили, как и изложено в примере 1.
Выделенный белково-липополисахаридный комплекс С.burnetii имеет рН 7,2, содержал корпускулы и растворимый антиген, специфическая активность в РНГА - 1:128 - 1:256. Качественный анализ выделенного белково-липополисахаридного комплекса С.burnetii проводили как изложено в примере 1. Содержание белка в полученной антигенной субстанции, определенное по методу Брэдфорд, составило от 0,9 до 1,1 мг/мл; содержание бактериальных липополисахаридов, определенное с использованием метода кинетического турбидиметрического ЛАЛ-теста, составило выше 26990 ЕЭ/мл.
Coxiella burnetii
Таким образом, полученные результаты подтвердили присутствие в очищенной белково-липополисахаридной субстанции  как белков, так и бактериальных липополисахаридов.
Типичный вариант профилей хроматограмм и электрофореза в ПААГ представлен на фигурах 9 и 10.
Результаты опытов по исследованию сывороток к с помощью флуоресцирующего диагностикума С.burnetii приведены далее в таблице № 1 и 2.
Таким образом, по разработанному способу был приготовлен набор флуоресцирующих диагностикумов: R.prowazekii, R. typhi, ,R.sibirica, R.conorii и C.burnetii, проведены исследования со стандартными и испытуемыми сыворотками, в которых была установлена их высокая активность и специфичность, что послужило основанием для применения флуоресцирующих диагностикумов в качестве набора для выявления антител при риккетсиозах и коксиеллезе в формате одновременной, одноэтапной реакции микроиммунофлуоресценции.
Пример 7.
Способ проведение серологической диагностики с использованием созданного набора флуоресцирующих диагностикумов.
Все полученные флуоресцирующие диагностикумы использовали для проведения одноэтапной реакции микроиммунофлуоресценции.
В основе реакции микроиммунофлуоресценции ( прямой метод флуоресцирующих антигенов - пМФАг) лежит специфическое взаимодействие флуоресцирующих диагностикумов непосредственно с гомологичными антителами сыворотки крови на предметном стекле. С этой целью в лунки предметных стекол вносят сыворотку крови человека в разведениях и добавляют флуресцирующий диагностикум. Взаимодействие антигена с антителами происходит в течение 60 мин при температуре 37±1°С во влажной камере. По истечении этого времени препараты высушивают при комнатной температуре и просматривают и оценивают под иммерсионным объективом флуоресцентного микроскопа (объектив 100 х, окуляр 10х).
Способ состоит из двух этапов.
7.1. Качественный анализ (скрининг сывороток) с последующим определением титра антител (полуколичественный анализ).
7.2. Регистрация и интерпретация результатов.
7.1. Качественный анализ (скрининг сывороток) с последующим определением титра антител (полуколичественный анализ).
7.1.1. Постановка реакции
Необходимое количество предметных стекол с лунками размещали на пластиковых подложках с бортиками (крышка от планшетов для иммунологических реакций).
Готовили из сывороток, исследуемых на риккетсии и коксиеллез, разведения 1 : 40 на стерильном 0,9% растворе хлорида натрия.
Готовили разведения контрольных положительной и отрицательной сывороток 1:40 на стерильном 0,9% растворе хлорида натрия.
Для приготовления разведения сывороток 1:40 необходимо к 390 ml стерильного 0,9% раствора хлорида натрия добавить 10 ml цельной сыворотки.
При этом при скрининге на одно предметное стекло с 10-ю лунками потребуется 55 ml флуоресцирующего диагностикума одного вида.
Внесение испытуемых и контрольных образцов сывороток.
На одном предметном стекле исследовали одну испытуемую сыворотку с постановкой контроля диагностикума.
1 ряд предметного стекла:
- во все лунки первого ряда под №№ 1-5 вносили по 5 ml испытуемой сыворотки в разведении 1:40,
- во все лунки второго ряда под №№ 6-10 вносили 5 ml очищенной воды.
После этого:
- в обелунки первого вертикального ряда предметного стекла добавляли по 5 ml флуоресцирующего диагностикума R.prowazekii,
- в обе лунки второго вертикального ряда предметного стекла - по 5 ml флуоресцирующего диагностикума R.typhi,
- в обе лунки третьего вертикального ряда предметного стекла - по 5 ml флуоресцирующего диагностикума R.sibirica,
- в обе лунки четвертого вертикального ряда предметного стекла - по 5 ml флуоресцирующего диагностикума R.conorii,
- в обе лунки пятого вертикального ряда предметного стекла - по 5 ml флуоресцирующего диагностикума C.burnetii.
7.1.2. Условия взаимодействия ингредиентов
Ингредиенты реакции перемешивали путем осторожного постукивания по пластиковой подложке. Затем подложки с предметными стеклами помещали во влажную камеру при температуре (37±1)°С на 60 мин. Взаимодействие специфических антител с флуоресцирующим диагностикумом происходило во влажной камере. По истечении времени подложки с препаратами доставали из влажной камеры и высушивали в термостате или при комнатной температуре (20±2)°С. Высохшие препараты оценивали под иммерсионным объективом флуоресцентного микроскопа (объектив 100 х, окуляр 10 х), просматривая не менее 10 полей зрения.
В положительных сыворотках, выявленных в скрининге, определяли  титр специфических антител к риккетсиям и коксиеллам.
7.1.3. Определение титра антител (полуколичественный анализ)
Для этого количество предметных стекол с 8-ю лунками, соответствующее количеству выявленных положительных сывороток, размещали на пластиковых подложках с бортиками.
В планшете для иммунологических реакций готовили двукратные последовательные разведения выбранных исследуемых сывороток с 1:20 до 1:1280 на очищенной воде. Для этого в первую горизонтальную лунку планшета для иммунологических реакций  вносили 95 ml очищенной воды, а в остальные свободные лунки горизонтального ряда вносили по 50 ml очищенной воды. Испытуемую сыворотку в объеме 5 ml вносили в первую лунку планшета. После тщательного перемешивания автопипеткой переносили 50 ml разведенной испытуемой сыворотки из первой лунки во вторую, из второй переносили 50 ml в третью и т.д.
В лунки 8-и луночного предметного стекла вносили по 5 ml каждого разведения испытуемой сыворотки, начиная с 1:1280 , а в 8-ю лунку вносили 5 ml очищенной воды для контроля на отсутствие спонтанной агглютинации флуоресцирующего диагностикума. Затем во все лунки добавляли по 5 ml флуоресцирующего диагностикума, с которым были получены положительные результаты. На отдельном стекле ставили контроль с положительной и отрицательной сыворотками.
7.1.4. Условия взаимодействия ингредиентов.
Ингредиенты реакции перемешивали путем осторожного постукивания по пластиковой подложке. Затем подложки с предметными стеклами помещали во влажную камеру при температуре (37±1)°С на 60 мин. Взаимодействие специфических антител с флуоресцирующим диагностикумом происходило во влажной камере. По истечении времени подложки с препаратами доставали из влажной камеры и высушивали в термостате или при комнатной температуре (20±2)°С. Высохшие препараты оценивали под иммерсионным объективом флуоресцентного микроскопа (объектив 100 х, окуляр 10 х), просматривая не менее 10 полей зрения.
7.2. Регистрация и интерпретация результатов.
Учет результатов вели либо визуально, либо с помощью фотодокументирования на основе оценки интенсивности специфического свечения и величины агглютинатов, просматривая под иммерсионным объективом флуоресцентного микроскопа (объектив 100 х, окуляр 10 х), не менее 10 полей зрения.
Оценку результатов проводили визуально по модифицированной 4-х крестовой системе:
- четыре креста (4+) - все просмотренные поля зрения заполнены крупными и большими агглютинатами, содержащими от 30 риккетсий или коксиелл и больше в агглютинате, среди которых встречаются единичные, отдельно расположенные меченые риккетсии или коксиеллы;
- три креста (3+) - все просмотренные поля зрения заполнены агглютинатами средней величины (от 15 до 29 риккетсий или коксиелл в агглютинате), между ними расположены более мелкие агглютинаты и изолированные меченые риккетсии или коксиеллы;
- две креста (2+) - все поля зрения заполнены агглютинатами малой величины (от 5 до 14 риккетсий или коксиелл в агглютинате), и изолированными мечеными риккетсиями или коксиеллами;
- один крест (1+) -все просмотренные поля зрения заполнены мелкими агглютинатами (от 2 до 4 риккетсий или коксиелл в агглютинате) и множеством изолированных меченых риккетсий или коксиелл;
- минус - во всех просмотренных полях наблюдаются изолированные меченые риккетсии или коксиеллы.
За титр сыворотки в пМФАг принимали наибольшее разведение исследуемой сыворотки к риккетсиям или коксиеллам, при котором интенсивность агглютинация оценивается не ниже, чем на 3+. При этом учитывали, что за счет добавления равного объема флуоресцирующего диагностикума, разведение сыворотки удваивается.
Результаты исследований сывороток в пМФАг были задокументированы при фотографировании препаратов во флуоресцентном микроскопе и выведены на экран персонального компьютера и сохранены на USB-носителе.
Пример 8.
Сравнительная оценка результатов реакции непрямой флуоресценции (РНИФ) и прямого метода флуоресцирующих антигенов (пМФАг).
Исследование проводили с сыворотками людей, перенесших риккетсиозы группы сыпного тифа (эпидемический сыпной тиф, эндемический сыпной тиф), риккетсиозы группы клещевой пятнистой лихорадки (клещевой риккетсиоз Северной Азии, астраханскую пятнистую лихорадку). коксиеллез.
Результаты исследований сведены в таблицы 1 и 2.
Результаты исследования иммунофлуоресцентной активности флуоресцирующих диагностикумов R.prowazekii, R.typhi, R. conorii, R.sibirica, C. burnetii с сыворотками людей, переболевших ранее риккетсиозами и коксиеллезом.
Как видно из представленных в таблице 1 данных, флуоресцирующие диагностикумы группы сыпного тифа и взаимодействали в пМФАг с сыворотками людей, переболевших болезнью Брилля-Цинссера и эндемическим сыпным тифом в больших титрах (1,3 раза), чем в РНИФ, что свидетельствовало о более высокой чувствительности. В таблице 1 приведены результаты исследования иммунофлуоресцентной активности флуоресцирующих диагностикумов R.prowazekii, R.typhi, R. conorii, R.sibirica, C. burnetii с сыворотками людей, переболевших ранее риккетсиозами и коксиеллезом.
Таблица 1
Исследуемые сыворотки
Количество
Флуоресцирующие диагностикумы
Средний геометрический титр антител в серологических реакциях
пМФАг
РНИФ
Сыворотки людей, переболевших  болезнью Брилля -Цинссера
13
Флуоресцирующий диагностикум R.prowazekii
1:275,4Х=5,8± 0,2
1:212,3Х=5,42±0,17
Сыворотки людей, переболевших эндемическим (крысиным) сыпным тифом
11
ФлуоресцирующийдиагностикумR. typhi
1:266,1Х=5,75±0,4
1:223,9Х=5,5±0,16
Сыворотки людей, переболевших астраханской пятнистой лихорадкой
9
Флуоресциру-ющий диагностикум R.conorii
1:133Х=4,75±0,5
1:120Х=4,6±0,32
Сыворотки людей, переболевших клещевым риккетсиозом Северной Азии
7
Флуоресциру-ющий диагностикум R.sibirica
1:169,8Х=5,1±0,6
1:158,5Х=5,0±0,12
Сыворотки людей, переболевших Q-лихорадкой
12
Флуоресциру-ющий диагностикум С. burnetii
1:173 Х=5,13±0,38
1:173 Х=5,13±0,38
Сопоставимые результаты иммунофлуоресцентного тестирования исследуемых сывороток пациентов, перенесших болезнь Брилля - Цинссера и эндемический сыпной (блошиный) тиф с использованием флуоресцирующих диагностикумов к R.prowazekii и к R. typhi, показали значительную степень серологического сродства между возбудителями группы сыпного тифа, которое обусловлено генетически, а также наличием общих белков среди R. typhi и R.
(Walker D.H. and Xue-jie yu (2005). Progress in rickettsial genome analysis from pioneering of rickettsia prowazekii to the recent rickettsia typhi.Ann.N.Y. Acad.Sci. 1063: 13-25.)
При исследовании сывороток к риккетсиям группы клещевой пятнистой лихорадки (сыворотки людей, переболевших клещевым сыпным тифом Северной Азии и астраханской пятнистой лихорадкой) с помощью флуоресцирующих диагностикумов были отмечены аналогичные закономерности. Флуоресцирующие диагностикумы R.sibirica и R.conorii реагировали лишь с сыворотками, гомологичными групповыми сыворотками, но не взаимодействовали с гетерологичными сыворотками.
При сопоставлении результатов иммунофлуоресцентного тестирования сывороток пациентов, перенесших клещевой сыпной тиф Северной Азии и Астраханскую пятнистую лихорадку с применением флуоресцирующих диагностикумов к R.sibirica и R.conorii показана значительная степень серологического сродства, проявляющаяся в частичной внутригрупповой дифференциации сывороток группы клещевой пятнистой лихорадки. Внутригупповые перекрестные реакции обусловлены наличием на внешней поверхности R.sibirica и R.conorii общего белка rОmpA, а также перекрестной реактивностью ЛПС (Fournier P.-E., Roux V. and Raoult D. Phylogenetic analysis of spotted fever group rickettsia by study of the outer surface protein rOmpA. International Jornal of Systematic Bacteriology, 1998,48, p. 839-849).
При исследовании сывороток людей, переболевших Q лихорадкой, в пМФАг с флуоресцирующим диагностикумом коксиелл Бернета были установлены титры, сопоставимые с РНИФ.
Таким образом, было установлено, что флуоресцирующие диагностикумы R.prowazekii, R.typhi, R. conorii, R.sibirica, C. burnetii являются чувствительными и по активности превышают или соответствуют препаратам сравнения - РНИФ, позволяют в одноэтапном методе в одной постановке выявлять значимые для России риккетсиозы и коксиеллез.
Специфичность флуоресцирующих диагностикумов R.prowazekii, R.typhi, R. conorii, R.sibirica, C. burnetii оценивали с риккетсиозными сыворотками разной специфичности, а также сыворотками доноров и людей, больных различными соматическими заболеваниями. Результаты исследований приведены в таблице 2.
Таблица 2
Исследование специфичности флуоресцирующих диагностикумов R.prowazekii, R.typhi, R. conorii, R.sibirica, C. burnetii с сыворотками человека.
№№ пп
Исследуемые сыворотки крови и количество сывороток
Средний геометрический титр антител в сыворотках
Флуоро диагностикум R.prowazekii
Флуородиагно-стикумR. typhi
Флуоро диагностикум R. sibirica
Флуоро-диагностикум R.conorii
Флуоро-диагностикум С. burnetii
1
Сыворотки людей, переболевших везикулезным риккетсиозом- 58
-
-
-
-
-
2
Сыворотки условно здоровых людей (доноров)-38
-
-
-
-
-
3
Сыворотки людей с различными соматическими заболеваниями -41
-
-
-
-
-
4
Стандартная сыворотка к риккетсиям Провачека
1:640
1:320
-
-
-
5
Стандартная сыворотка к риккетсиям тифи
1:160
1:320
-
-
6
Стандартная сыворотка к риккетсиям сибирика
-
-
1:160
1:160
-
7
Стандартная сыворотка к риккетсиям конори
-
-
1 :160
1:320
-
8
Стандартная сыворотка к коксиеллам Бернета
-
-
-
-
1 : 640
Из данных, представленных в таблице 2, следует, что флуоресцирующие диагностикумы R.prowazekii, R.typhi, R.sibirica, R. conorii, C. burnetii не реагируют в пМФАг в диагностическом титре (1:40) ни с гетерологичными сыворотками, ни с сыворотками доноров и людей, больных различными соматическими заболеваниями, что свидетельствует о их высокой специфичности.
(
Таким образом, показано, что созданные флуоресцирующие диагностикумы из набора: R.prowazekii или R. typhi или R.conorii или R.sibirica или С. burnetii обладают высокой чувствительностью и специфичностью, что свидетельствует о полной корреляции с данными «золотого стандарта» иммунофлуоресценции - РНИФ  Fournier PE, Marrie TJ, Raoult D (1998) Diagnosis of Q fever. J Clin Microbiol 36:1823-1834; van der Hoek W. et al. (2012). Epidemic Q Fever in Humans in the Netherlands. In: Toman R., Heinzen R., Samuel J., Mege JL. (eds) Coxiella burnetii: Recent Advances and New Perspectives in Research of the Q Fever Bacterium. Advances in Experimental Medicine and Biology, vol 984, section 17.5.6. Springer, Dordrecht) и, следовательно, могут быть применены для использования в практическом здравоохранении в виде набора для диагностики заболеваний группы сыпного тифа (эпидемического (вшивого) сыпного тифа и эндемического (блошиного) сыпного тифа), группы клещевой пятнистой лихорадки (клещевого риккетсиоза Северной Азии , астраханской пятнистой лихорадки)  и коксиеллеза (Q лихорадки).
Как показали проведенные исследования, использование предлагаемых флуоресцирующих диагностикумов позволяет выявлять широкий спектр образуемых в организме специфических антител (белково-липополисахаридный комплекс риккетсиальной или коксиеллезной клеток), является одноэтапным, сокращает время проведения анализа за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов анализа (фиксирование препаратов для РНИФ, многоэтапность, внесение реагентов на разных этапах постановки и удаление непрореагировавших ингредиентов путем промывания мазков), а также важным моментом является отсутствие наведенной флуоресценции реакции.
Пример 9.
Состав заявляемого набора.
В состав набора входят следующие компоненты, упакованные в коробку:
1.Лиофилизированный флуоресцирующий диагностикум R.prowazekii - 1 ампула в объеме 0,5 мл;
2. Лиофилизированный флуоресцирующий диагностикум R. typhi - 1 ампула в объеме 0,5 мл;
3. Лиофилизированный флуоресцирующий диагностикум R.sibirica - 1 ампула в объеме 0,5 мл;
4. Лиофилизированный флуоресцирующий диагностикум R.conorii - 1 ампула в объеме 0,5 мл;
5. Лиофилизированный флуоресцирующий диагностикум С. burnetii - 1 ампула в объеме;
Постановка пМФАг с предлагаемым набором для диагностики риккетсиозов и коксиеллеза в практическом отношении доступна для клиническо-диагностических лабораторий медицинских учреждений и лабораторий Центров Роспотребнадзора, так как технологически проста в применении, демонстративна и может быть задокументирована на USB-носителях или сохранена в виде препарата.
Все приведенные примеры подтверждают, что поставленная задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, а именно, получение набора флуоресцирующих риккетсиальных и коксиеллезного диагностикумов, а именно флуоресцирующих диагностикумов риккетсий группы сыпного тифа (R.prowazekii, R. typhi), риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (R.sibirica, R.conorii) и рода coxiella (C.burnetii) на основе их белково-липополисахаридного комплекса и, их применение для одновременной одноэтапной серологической диагностики риккетсиозов и коксиеллеза, а также создание способа серологической диагностики с использованием прямого метода флуоресцирующих антигенов (пМФАг) при сохранении высокой чувствительности и специфичности за счет придания корпускуляризованной формы белково-липополисахаридному комплексу и увеличения числа антигенных детерминант на ее поверхности, решена.
Технический результат и эффект достигается за счет использования в качестве сорбента флуоресцирующих лактобактерий, а в качестве активного вещества белково-липополисахаридного комплекса, соединением последнего посредством связующего реагента с флуоресцирующим сорбентом с образованием корпускуляризованных форм, что ведет к повышению специфичности и чувствительности, стандартности флуоресцирующих риккетсиальных и коксиеллезного диагностикумов, проведении диагностики в формате одноэтапной реакции микроиммунофлуоресценции, сокращении времени проведения анализа за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов анализа (фиксирование препаратов для МФА, многоэтапность, внесение реагентов на разных этапах постановки и удаление непрореагировавших ингредиентов путем промывания мазков), а также повышения специфичности реакции за счет отсутствия наведенной флуоресценции.
et all .
Кроме того, применение набора в разработанной реакции позволит проводить дифференциальные исследования при смешанных инфекциях: например, коксиеллеза и астраханской пятнистой лихорадки, клещевого риккетсиоза Северной Азии и коксиеллеза, клещевого риккетсиоза сибири и боррелиоза (Joris KoetsveldSerological and molecular evidence for spotted fever group Rickettsia and Borrelia burgdorferi sensu lato co-infections in The Netherlands. Ticks Tick Borne Dis 2016 Mar 17;7 (2):371-7. Epub 2015 Dec 17).
Результатом решения технической задачи является также раннее выявление специфических антител в реакции микроиммунофлуоресценции, расширение диапазона исследований за счет одновременной диагностики с одним набором риккетсиозов и коксиеллеза, что является необходимым при выполнении постановлений и рекомендаций Главного санитарного врача РФ и Министра здравоохранения РФ (Приказ МЗ РФ от 26.11.1998г № 312 «Об усилений мероприятий по профилактике эпидемического сыпного тифа и борьбе с педикулезом» с приложениями 1 и 2 - МУ «Выявление больных эпидемическим сыпным тифом или болезнью Брилля-Цинссера, МУ «Клиника, диагностика и лечение эпидемического сыпного тифа и болезни Брилля-Цинссера»; СП 3.1.7.2811-10 «Профилактика коксиеллеза (лихорадки Ку)», утверждены постановлением Главного государственного санитарного врача РФ Г.Г.Онищенко от 28.12.2010г. №181,зарегистрированы в Минюсте России 21.03.2014г. № 20201; МУК 4.2.3115-13 « Лабораторная диагностика внебольничных пневмоний», утверждены и «введены в действие Главным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 21.10.2013г.; МУ 3.1.2.3047-13 «Эпидемиологический надзор за внебольничными пневмониями», утверждены и введены в действие Главным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 10.01.2013г.).
Промышленная применимость
Все приведенные примеры также подтверждают промышленную применимость данного изобретения.
Список литературы
1. Барбан П.С., Пшеничнов Р.А., Пантюхина А.Н., Ившина И.Б. «Иммунофлуоресцентный анализ», Свердловск: УрО АН СССР, 1988, с. 176.
2. Патент RU 2557951. Способ получения мультиплексного диагностикума/ Авторы: Тарасевич И.В., Пантюхина А.Н., Вакштейн М.С., Дежуров С.В.
3. Здродовский П.Ф., Голиневич Е.М. «Учение о риккетсиях и риккетсиозах», М., 1972. 495 с.
4. Тупицын А.В. Тимашева О.А., Горовиц Э.С. «Способ получения иммуносорбента», Авт. свидетельство №1007676.
5. Мисенжников А.В., Лазаревич С.Н., «К вопросу о приготовлении гемосенсибилизирующего антигена из риккетсий сибирика», «Актуальные вопросы теоретической и прикладной иммунологии», Пермь, 1994. - с. 26-27.
6. Токаревич Н.К. «Биологические аспекты взаимоотношения коксиелл Бернета и организма млекопитающего как основа совершенствования диагностики и специфической профилактики Ку-лихорадки», Автореферат д.м.н., Санкт-Петербург, 1997, с. 46.
7. Wang L. et al. «Nanoparticles for multiplex diagnostics and imaging», Nanomedicine, 2006, V. 1, №4. р. 413-426.
8. Патент RU 2062110 С1 №2062110. Способ получения диагностикума риккетсиозного Провачека, корпускулярного/ Авторы: Петров В.Ф., Пантюхина А.Н., Александрова Л.В., заявка №93039399/14, 1993.08.03.
9. Заявка на выдачу патента RU №94020953 «Способ получения диагностикума риккетсиального сибирика, корпускулярного» Пантюхина А.Н., Александрова Л.В., Петров В.Ф., Тарасевич И.В., Яблонская В.А.,
10. Fournier PE, Marrie TJ, Raoult D, 1998. «Diagnosis of Q fever. J Clin Microbiol», 36:1823 -1834.
11. Van der Hoek W. et al., 2012, «Epidemic Q Fever in Humans in the Netherlands». Toman R., Heinzen R., Samuel J., Mege JL. (eds) «Coxiella burnetii: Recent Advances and New Perspectives in Research of the Q Fever Bacterium». Advances in Experimental Medicine and Biology, vol 984, section 17. 5. 6. Springer, Dordrecht.
12. Walker D.H. and Xue-jie, 2005, «Progress in rickettsial genome analysis from pioneering of rickettsia prowazekii to the recent rickettsia typhi»,Ann. N.Y. Acad. Sci. 1063, 13-25.
13. Fournier P. E., Roux V. and Raoult D., 1998, «Phylogenetic analysis of spotted fever group rickettsia by study of the outer surface protein rOmpA», International .Jornal of Systematic Bacteriology, 48, 839-849.
et all,
14. Joris Koetsveld«Serological and molecular evidence for spotted fever group Rickettsia and Borrelia burgdorferi sensu lato co-infections in The Netherlands» Ticks Tick Borne Dis, 2016, Mar 17;7(2):371-7. Epub, 2015, Dec 17.
15. Приказ МЗ Р Ф от 26.11.1998 г №312 «Об усилений мероприятий по профилактике эпидемического сыпного тифа и борьбе с педикулезом» с приложениями 1 и 2 - МУ «Выявление больных эпидемическим сыпным тифом или болезнью Брилля-Цинссера», МУ « Клиника, диагностика и лечение эпидемического сыпного тифа и болезни Брилля-Цинссера».
16. СП 3.1.7.2811-10 «Профилактика коксиеллеза (лихорадки Ку)», утверждены постановлением Главного государственного санитарного врача РФ Г.Г.Онищенко от 28.12.2010г. №181, зарегистрированы в Минюсте России, 21.03.2014 г. №20201.
17. МУК 4.2.3115-13, «Лабораторная диагностика внебольничных пневмоний», утверждены и «введены в действие Главным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко, 21.10.2013 г.
18. МУ 3.1.2.3047-13, «Эпидемиологический надзор за внебольничными пневмониями», утверждены и введены в действие Главным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко, 10.01.2013 г.
19. МУ 3.1.1755-03, «Организация эпидемиологического надзора за клещевым риккетсиозом. Профилактика инфекционных заболеваний»,
Дата введения 2003-09-28, утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко, 28 сентября 2003 г