Влияние концентрации Vent ДНК-полимеразы на динамику реакции амплификации ДНК по механизму катящегося кольца

УДК 577.213.32

ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ VENT ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ НА ДИНАМИКУ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ ДНК ПО МЕХАНИЗМУ КАТЯЩЕГОСЯ КОЛЬЦА

Ю.Ф. Мытницкая, В.В. Заякин

Разработка метода амплификации ДНК с помощью реакции по механизму катящегося кольца является перспективным подходом для молекулярной ДНК-диагностики. Изучалась эффективность использования в этой реакции термостабильной Vent ДНК-полимеразы. Установлено, что этот фермент может обеспечить активное накопление продуктов амплификации. Однако при снижении соотношения содержания циклизующейся пробы к количеству полимеразы наблюдается разрушение первоначально синтезированной ДНК. Предполагается, что это связано с преобладанием экзонуклеазной реакции над полимеразной в этих условиях.

Ключевые слова: амплификация по механизму катящегося кольца, Vent ДНК-полимераза, флуоресценция в реальном времени, экзонуклеазная активность.

Разработка новых ДНК-технологий является одним из основных направлений развития методологических подходов современной фундаментальной и прикладной молекулярной биотехнологии, основанных на различных методах амплификации нуклеиновых кислот. Наиболее разработаны многочисленные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР) Используемая в нашей работе реакция амплификации по механизму катящегося кольца или реакция кольцевой амплификации (РКА) является сравнительно новой по сравнению с ПЦР - методами и поэтому применяется редко. Эту реакцию можно проводить в режиме реального времени, как и современные варианты ПЦР в реальном времени, основанных на количественной детекции флуоресцентного сигнала, который увеличивается пропорционально количеству ПЦР-продукта [5, с. 186]. Следовательно, ход протекания РКА можно регистрировать в каждый момент времени [6, с. 1028]. Как некоторые другие методы ПЦР, реакция РКА может проводиться с детекцией по конечной точке, но в отличие от ПЦР она не требует циклического изменения температуры, проводится в изотермическом режиме и имеет еще ряд преимуществ [8, с. 2340].

В связи с особенностями РКА, к используемым в ней ДНК-полимеразам предъявляются некоторые специальные требования, в частности, помимо термостойкости, они должны обладать достаточно высокой вытесняющей активностью и процессивностью. Эффективность ДНК-полимераз, производимых российскими фирмами, практически не изучена в реакции амплификации катящегося кольца. Целью нашей работы было изучить особенности РКА с использованием Vent ДНК-полимеразы фирмы СибЭнзим (Россия).

Материалы и методы

Схема реакции амплификации по механизму катящегося кольца представлена на рисунке 1. На первом этапе олигонуклеотидная проба за счет комплементарного взаимодействия концов со специфической матрицей образует кольцо, которое сшивается ДНК-лигазой. На втором этапе происходит собственно амплификация - начиная с праймера, комплементарного к кольцу, синтезируется длинная цепь ДНК с постепенным вытеснением ДНК, образовавшейся на предыдущем обороте. На образовавшейся ДНК с участием второго праймера происходит синтез второй комплементарной цепи с вытеснением ранее синтезированных фрагментов. Общее количество синтезированной ДНК лавинообразно возрастает, что обеспечивает рост флуоресценции связывающего с ДНК красителя SYBR Green I.

Рис. 1. Схема реакции амплификации по механизму катящегося кольца.

В данной работе в качестве матрицы для проведения лигазной реакции использовались искусственно синтезированные нуклеотидные последовательности длиной 35 нуклеотидов и замыкаемые в кольцо олигонуклеотидные пробы длиной 87 нуклеотидов и два праймера длиной 25 и 27 нуклеотидов.

Реакцию лигирования кольца проводили с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (СибЭнзим, Новосибирск) при 37 градусах в течение 2 - 3 часов.

Реакцию амплификации проводили с использованием детектирующего амплификатора АНК-32 производства фирмы «ДНК-технология», Россия. Реакция проводилась при 75°С в течение 3 часов. Стандартная реакционная смесь содержала 20 mM Tris-HCl (pH 8.8 при 25°C); 10 mM KCl; 10 mM (N^SO^ 2 mM MgSO4; 0.1% Тритон X-100; 300 мкМ каждого dNTP; 12,5 пМ каждого праймера, [3, с. 66; 4, с. 14-18]. Использовали Vent ДНК полимеразу (СибЭнзим, Новосибирск). Окончательный объем смеси составлял 25 мкл. В качестве интеркалирующего красителя использовался SYBR Green I, при прохождении реакции наблюдалось повышение уровня флуоресценции.

Продукты реакции дополнительно анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле и обрабатывали с помощью системы гель-документирования GelDoc и программного обеспечения Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, США). В качестве калибровочных маркеров использовали 100 bp +1.5 Kb DNA Ladder (СибЭнзим, Новосибирск).

Результаты и их обсуждение.

Применение Taq ДНК-полимеразы позволяет в ходе ПЦР синтезировать ампликоны длиной до 4-6 тыс. пар нуклеотидов. Вероятность ошибки при встраивании того или иного нуклеотида при этом находится на уровне 0,01-0,001 % [1, с. 17; 4, с. 22], так как Taq ДНК-полимераза не обладает корректирующей 3'-экзонуклеазной активностью. Точность синтеза Vent ДНК-полимеразы значительно выше, чем у Taq- полимеразы благодаря наличию корректирующей активности (от 24 до 57 ошибок на 1 х 106 присоединенных нуклеотидов) [3, с. 66]. Vent ДНК-полимеразу применяют также для получения продуктов длиной порядка 10 тыс.пар нуклеотидов ввиду ее высокой процессивности [2].

Использование способности Vent ДНК-полимеразы расплетать ДНК-дуплекс на пути следования полимеразы при температурах выше 55 °C - обеспечивает дополнительные возможности при проведении ПЦР. Также Vent ДНК-полимеразу из Thermococcus litoralis можно использовать при необходимости клонирования ампликонов для удаления 3'-выступающих или заполнения 3 - «спрятанных» концов ДНК [7, с. 240].

Для работы Vent ДНК-полимеразы рекомендуется 0,2 мМ концентрация каждого из четырех используемых dNTP, в то время как для эффективной работы Taq ДНК-полимеразы достаточно 50 мкМ каждого dNTP. Интервал концентраций 20-200 мкМ выбирают для установления оптимального баланса между эффективностью, специфичностью и точностью работы ДНК-полимераз. Точность уменьшается при концентрации dNTP много меньше константы Михаэлиса, либо когда концентрация одного из dNTP ниже по сравнению с остальными тремя [2].

На рисунках 2 - 5 показаны результаты амплификации при различном соотношении матрицы, циклизующейся пробы и Vent ДНК-полимеразы. На рисунке 2 количество циклизующейся пробы в реакционной смеси примерно 1012 молекул, а в реакциях,

представленных на остальных рисунках в 100 раз меньше. Количество Vent ДНК-полимеразы в реакциях, результаты которых показаны на рисунках 2 и 3, составляет 0,06 единицы, на рисунке 4 - 0,04 ед., а на рисунке 5 - 0,03 ед. Кривые на каждом рисунке отвечают разным количествам матрицы от единичных (1 - 3 копии) до 1010. На шкале абсцисс длительность эксперимента выражена в условных единицах, 200 единиц соответствуют 15 мин.

Рис. 2. Кривые накопления флюоресцентного сигнала в режиме реального времени при проведении ПЦР с 0,06 ед. Vent ДНК-полимеразы

le j.............:............  '........:............ Ff1 JO. 10.14; ,rl RÜUVuil' 10x10 ....................j^rr^Xi

tc J............-............ 1 1........................ ............../....................

4Г1 • •ri : / /

-I I............:............ I I............:............ ...........'!..... )!'  I rV...................... " ..............................

GO ! M I l\\ v /""^V .MtJfeti,,.

'О ccj : 1

4 I M I : -I. J ; J. J............•............ ' > : m \ y.j............\............ H / it n

T1 РГ1 I I............:............ к 1............:............ -ri : :o j I I............*' "•у^пи' J ....... ............

Рис. 3. Кривые накопления флюоресцентного сигнала в режиме реального времени при проведении ПЦР с 0,06 ед. Vent ДНК-полимеразы и циклизующейся пробой, разбавленной

в 100 раз

Рис. 4. Кривые накопления флюоресцентного сигнала в режиме реального времени при проведении ПЦР с 0,04 ед. Vent ДНК-полимеразы и циклизующейся пробой, разбавленной

в 100 раз

проведении ПЦР с 0,03 ед. Vent ДНК-полимеразы и циклизующейся пробой, разбавленной

в 100 раз

При сравнении рисунков видно, что при максимальном количестве полимеразы и циклизующейся пробы, кривые выходят на плато. Высота плато и скорость первоначального подъема зависят от количества матрицы. При 100-кратном уменьшении количества циклизующейся пробы ход кривых резко меняется - наблюдается четко выраженный пик с последующим падением флуоресценции. Уменьшение количества полимеразы до 0.04 единиц делает этот пик еще более выраженным (рис.4). Дальнейшее уменьшение количества полимеразы до 0.03 единиц опять меняет ход кривых (рис.5). Их форма в целом опять становится как на рисунке 3, но подъем начинается гораздо позже, идет медленнее и большинство кривых не успевает выйти на плато.

Падение кривых после пика на рисунках 3 и 4 соответствует падению флуоресценции, что может быть вызвано разрушением ДНК, образовавшейся при амплификации. Это предположение подтверждается результатами электрофореза - ДНК на электрофореграммах в эти моменты времени отсутствует.

Для объяснения такой необычной динамики накопления продуктов амплификации можно предложить гипотезу, что при изменении соотношений количества фермента, циклизующейся пробы и матрицы изменяется соотношение полимеразной и экзонуклеазной

активности. Преобладание экзонуклеазной активности может приводить к разрушению ДНК и исчезновению флуоресцентного сигнала. Это подтверждается также уменьшением или исчезновением пиков на кривых при увеличение концентрации dNTP, и, наоборот, их проявлению при уменьшении концентрации dNTP.

Таким образом, обнаруженные закономерности свидетельствуют о необходимости тщательно подбирать и соблюдать условия амплификации при использовании Vent ДНК-полимеразы. Вместе с тем, по-видимому, эта полимераза обладает хорошей вытесняющей активностью и процессивностью и может успешно использоваться при разработке новых методов на основе реакции амплификации по механизму катящегося кольца.

The rolling circle amplification of DNA is one of the new approaches for the development of molecular methods for DNA-diagnostics. The efficiency of the thermostable Vent DNA polymerase in this reaction was studied in this work. We found that this enzyme may provide active accumulation of amplification products. However, when the ratio of the cyclized probe content was reduced as compared with the amount of polymerase, we can observe the destruction of the originally synthesized DNA. It is anticipated that this may occur due to the predominance of exonuclease activity above the polymerase activity under these conditions.

Key words: rolling circle amplification, Vent DNA polymerase, fluorescence in real time, exonuclease activity.

Список литературы

1. Антонова О. С., Рудницкая Г. Е., Тупик А. Н., Буляница А. Л., Евстрапов А. А., Курочкин В. Е. Полимеразная цепная реакция: приборная и методическая реализация. Обзор аналитических характеристик // Научное приборостроение. 2011. Т. 21. № 4. 160 с.

2. Охапкина С. С., Акишев А. Г., Дегтярев С. X. Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) и ее применение // Библиотека научных трудов СибЭнзим. 2014. URL: http://sciencerussian.sibenzyme.com/papers/popularabout/using-pcr (дата обращения: 10.11.2014).

3. Alkami Quick Guide for PCR [электронный ресурс]: A laboratory reference for the polymerase chain reaction // Alkami Biosystems. 1999. URL: http://www.gene-quantification.de/quick-guide-pcr.pdf (дата обращения: 9.11.14).

4. Dieffenbach, C.W., Dragon, E.A., Dveksler, G.S.. Setting up a PCR laboratory. In: PCR Primer, A laboratory Manual. NY.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1995. Р. 186.

5. Edwards K., Logan J., Saunders N. Real-time PCR: An Essential Guide // Emerg Infect Dis. 2005. №11 (1). P.185-186.

6. Higuchi R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions // Biotechnology. 1993. №11. Р. 1026-1030.

7. Sambrook J., Russel D. W. Molecular Cloning. NY.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001. P. 2100.

8. Wang B., Potter S. J., Lin Y. Rapid and Sensitive Detection of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus by Rolling Circle Amplification // J. of Clin. Microbiology. 2005. Vol. 43. №5. Р. 2339 - 2344.

Об авторах

Мытницкая Ю.Ф. - аспирант 3 года обучения кафедры биологии естественно-географического факультета Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского, mytnickaya_yulia@mail.ru

Заякин В.В. - доктор биологических наук, профессор кафедры биологии Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского, iyanam1@yandex.ru