ШТАММ THERMITHIOBACILLUS TEPIDARIUS ДЛЯ ДООКИСЛЕНИЯ ЭЛЕМЕНТАРНОЙ СЕРЫ В ОСТАТКАХ БИООКИСЛЕНИЯ СУЛЬФИДНОГО ЗОЛОТОМЫШЬЯКОВОГО КОНЦЕНТРАТА
THERMITHIOBACILLUS TEPIDARIUS STRAIN FOR REGULATORY ELEMENTARY SULFUR OXIDATION IN RESIDUES OF BIOXIDATION OF GOLDEN SULFIDE CONCENTRATE

Изобретение относится к микробиологии и биогидрометаллургической технологии извлечения золота из упорных сульфидных концентратов, содержащих пирротин, арсенопирит, пирит, антимонит.
Ассоциации ацидофильных умеренно термофильных и термотолерантных микроорганизмов используются для переработки золотомышьяковых сульфидных руд в ЮАР, Австралии, Гане, Китае и США.
Известен ряд ацидофильных ассоциаций умеренно термофильных микроорганизмов, выделенных из промышленных реакторов микробного окисления сульфидных концентратов.
Acidithiobacillus caldus
Leptospirillum ferrooxidans
Thiobacillus caldus
Leptospirillum ferrooxidans
Известна микробная ассоциация, осуществляющая процесс биоокисления пирит-арсенопиритных концентратов при температурах 40-45°С, которая включает представителей и [D.E.Rawlings, N.J.Coram, M.N.Garduer and S.M.Deane. and are widely distributed in continuous flow biooxidation tanks used to treat variety of metal containing ores and concentrate. In: Biohydrometallurgy and the Environment toward the Mining of the 21 st century. (R.Amils, A.Ballester, Eds.), Part A. IBS, 1999, Elsevier, p.777-786].
Thiobacillus ferrooxidans, Leptospirillium ferrooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans, Ferroplasma acidiphilum
Известна железосульфоокисляющая ацидофильная ассоциация бактерий [Патент RU на изобретение №2256712, МПК С22B 11/00, опубл. 20.07.2005, Способ переработки первичных золотосульфидных руд].
Leptospirillum ferriphilum
Acidithiobacillus caldus
Ferroplasma acidiphilum
Sulfobacillus benefaciens
Известна микробная ассоциация, осуществляющая процесс биоокисления кобальтового пиритного концентрата при температурах 35-46°С, включающая железо- и сероокисляющих микроорганизмов , , , [D.H.R. Morin and P. d’Hugues, Bioleaching of a cobalt containing pyrite in stirred reactors: a case study from laboratory scale to industrial application. In: Biomining (D.E. Rawlings, B.D. Johnson, Eds.), 2007, Springer, p. 35–55.].
Ferroplasma
Известны микробные ассоциации, выделенные из промышленных реакторов фабрик, расположенных в ЮАР и КНР, в которых осуществлялось биоокисление золотомышьяковых концентратов при 45°С [van Hille R.P., van Wyk N., Harrison S.T.L. Review of microbial ecoclogy of BIOX reactors illustrates the dominance of the genus in many commercial reactors. In: Proceed. 19th Int. Biohydrometallurgy Symp. (IBS 2011) (Guanzhou Q., Tao J., Wending Q., Xueduan L., Yu Y., Haidong W. Changsha, Eds.), Central South University Press, 2011. P. 1021].
Недостатком известных ассоциаций микроорганизмов является низкая скорость окисления ими элементарной серы, которая образуется в процессе биоокисления сульфидных концентратов, что приводит к повышению расхода цианида на стадии извлечения золота из остатков биооксиления.
Наиболее близким по сущности и достигаемому результату к заявленному изобретению является ассоциация микроорганизмов применяемая в технологии MesoTherm – комбинированном процессе биоокисления, использующем мезофильные ацидофильные бактерии на первичной стадии окисления, и термофильные ацидофильные бактерии для достижения почти полного конечного окисления сульфидной серы при температуре 65–80°C. Применение двухстадийной технологии MesoTherm при переработке упорных концентратов позволило снизить расход цианида на 50%, до 8 кг/т - 10 кг/т, по сравнению с расходом 20 кг/т при выщелачивании продукта традиционного мезофильного процесса BIOX [P.C. van Aswegen, J. van Niekerk, W. Olivier. The BIOXΤΜ process for the treatment of refractory gold concentrate, In: Biomining (D.E. Rawlings, B.D. Johnson, Eds.), 2007, Springer, P. 1–35].
Недостатком используемой ассоциации ацидофильных термофильных микроорганизмов является необходимость применения материалов повышенной коррозионной стойкости для изготовления реакторов и повышения расходов на аэрацию для снабжения сероокисляющих микроорганизмов кислородом и диоксидом углерода.
Технической проблемой изобретения является селекция нейтрофильного микроорганизма, предназначенного для доокисления элементарной серы, содержащейся в остатках биоокисления сульфидного золотомышьякового концентрата, содержащего пирротин, арсенопирит, пирит и антимонит.
Thermithiobacillus tepidarius
Техническая проблема решается за счет выделения из реакторов золотоизвлекательной фабрики сероокисляющего штамма , предназначенного для доокисления элементарной серы в остатках биоокисления сульфидного золотомышьякового концентрата.
Thermithiobacillus tepidarius
Штамм был депонирован в НБЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика (далее ВКПМ).  справка о депонировании № 13778 от 14.10.2020.
Thermithiobacillus tepidarius
Технический результат заключается в выделении штамма , который благодаря своим свойствам способен доокислять элементарную серу, содержащуюся в остатках биоокисления сульфидного золотомышьякового концентрата, содержащего пирротин, арсенопирит, пирит и антимонит, что позволяет избежать применение материалов повышенной коррозионной стойкости для изготовления реакторов и повышения расходов на аэрацию для снабжения сероокисляющих микроорганизмов кислородом и диоксидом углерода, что требуется при использовании для доокисления серы термофильными ацидофильными микроорганизмами.
Штамм был выделен из промышленного реактора доокисления биокека золотомышьякового концентрата.
Полученный штамм характеризуется следующими признаками:
Температура культивирования штамма составляет 20-52°С (оптимум 45ºС), рН 5,0-8,0 (оптимум 6,5-7,0).
Морфологическая характеристика - форма клеток - палочки.
Отношение к кислороду - аэроб. Является автотрофом.
В качестве субстрата для роста используют тиосульфат, тетратионат, элементарную серу, биокек пирротин содержащего пирит-арсенопиритного концентрата.
Условия культивирования - минеральная среда следующего состава:
4
4
2
2
4
2
4
2
4
6
NHCl – 0,40 г/л, MgSO × 7 HO – 0,80 г/л, KHPO – 4,00 г/л, KHPO – 4,00 г/л, KSO - 3.00 г/л
Культуральные признаки.
Рост на жидкой среде сопровождается помутнением.
Генотипические характеристики:
Thermithiobacillus tepidarius
Thermithiobacillus tepidarius DSM 3134
Thermithiobacillus tepidarius
Анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК позволил отнести штамм к виду , так как сходство последовательности гена 16S рРНК штамма с геном 16S рРНК типового штамма вида– 99,45%, что указывает на принадлежность к виду .
Условия хранения - сохраняется путем пересевов на среде культивирования или в замороженном виде при -80°С.
Способность штамма доокислять элементарную серу, содержащуюся в остатках биоокисления сульфидного золотомышьякового концентрата, изучали в лабораторных и промышленных испытаниях. Результаты приведены в примере ниже.
Thermithiobacillus tepidarius
Мониторинг штамма бактерий в процессе деструкции тиоцианата в лабораторных и промышленных реакторах.
4
2
4
4
2
2
Мониторинг штамма в лабораторных и промышленных биореакторах для доокисления биокека был проведен с использованием метагеномного анализа фрагментов гена 16S рРНК с помощью высокопроизводительного секвенирования на платформе Illumina MiSeq. Были отобраны образцы жидкой фазы и твердых носителей из лабораторных и промышленных. Из полученных образцов пульп из реакторов выделяли ДНК для проведения секвенирования фрагментов гена 16S рРНК. Для выделения ДНК биомассу отделяли от твердой и жидкой части пульпы центрифугированием. Для этого образцы пульпы центрифугировали сначала при 1000 об/мин в течение 15 мин, чтобы отделить твердую часть пульпы. Супернатант использовали для осаждения биомассы путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 1 часа. Полученный осадок биомассы ацидофильных микроорганизмов промывали, центрифугируя при 3000 об/мин в течение 30 мин, раствором следующего минерального состава (г/л): (NH)SO – 1,0; аммофос – 0,4; KOH – 0,1; MgSO × 7HO – 0,5 с рН ~7,5. Образец ресуспендировали в 300 мкл лизирующего буфера (0,15 M NaCl, 0,1 M Na-EDTA, pH 8,0), содержащего 15 мг/мл лизоцима. До выделения ДНК буфер с лизированной биомассой хранили при -20°С в пластиковых пробирках с завинчивающимися крышками. ДНК выделяли фенол-хлороформным методом [T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p. 545]. Библиотеки для секвенирования были приготовлены в соответствии с ранее описанным протоколом [Fadrosh D.W., Ma B., Gajer P., Sengamalay N., Ott S., R.M. Brotman R.M., Ravel J. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform, Microbiome. 2014. 2:6. DOI: 10.1186/2049-2618-2-6]. В качестве универсальных использовались праймеры Pro341F (5'-CCTACGGGNBGCASCAG-3') и Pro805R (5'-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3'), которые позволяют амплифицировать вариабельные участки генов 16S рРНК V3 и V4. Для дальнейшего секвенирования полученные ампликоны разделялись с помощью электрофореза в агарозном геле, вырезанные из геля ампликоны очищались с помощью набора для очистки ДНК из геля и реакционных смесей Cleanup Standard (Евроген, Россия). Секвенирование проводилось при помощи набора реагентов, обеспечивающего длину прочтения 300 нуклеотидов с каждого конца ампликона. Первичная обработка (фильтрация и демультиплексирование) полученных прочтений производилось при помощи ПО CLC Genomics Workbench 7.5 (Qiagen, США). Полученные данные были обработаны с помощью онлайн сервиса SILVAngs (https://www.arb-silva.de/ngs/). Для каждого образца было проанализировано около 10000 тыс. фрагментов средней длиной 486 нуклеотида.
Thermithiobacillus tepidarius
Было установлено, что при проведении процесса в проточном режиме в нестерильных условиях во всех пробах были выявлены последовательности гена 16S рРНК штамма. Их доля составляла от 11 до 32%. При этом не были выявлены в значительном количестве последовательности других групп микроорганизмов, способных к окислению серы. Это указывает на то, что при ведении процесса в проточном режиме в нестерильных условиях, штамм играет наиболее значительную роль в доокислении элементарной серы в биокеках и способен доминировать в популяции в различных условиях.