НАНОТРУБОЧНЫЙ НОСИТЕЛЬ ДЛЯ ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА КЛЕТОК И СПОСОБ ЕГО ИЗГОТОВЛЕНИЯ
NANOTUBE CARRIER FOR ELECTRIC STIMULATION OF CELL GROWTH AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF

Настоящее изобретение относится к области стимулирования роста клеток живых организмов, а точнее к устройствам и способам электрического управления процессом роста клеток и тканей путем непосредственного приложения к тканям и клеткам электрического поля или тока. Настоящее изобретение относится к устройствам осуществления управлением роста клеток и тканей и способам создания данных устройств.
Известен способ электрической стимуляции роста клеток и тканей, использующий систему планарных электродов, создающих поля, которые могут быть локализованы преимущественно в той области организма, где необходимо приложение электрического поля и тока [1]. Данные электроды могут быть сделаны из проводящего полимера, являющегося биодеградируемым. Таким образом, данные электроды могут быть имплантированы в организм с терапевтическими целями, без необходимости дополнительного хирургического вмешательства для удаления электродов после окончания лечения. Способ включает в себя, по крайней мере, один электрод, по крайней мере, одну клетку, осуществление контакта электрода с, по меньшей мере, одной клеткой и приложение напряжения к электроду, обеспечивающее доставку эффективной величины заданного электрического поля или тока к, по крайней мере, одной клетке, тем самым обеспечивая регулирование физиологических процессов или рост по крайней мере одной клетки.
Принципиальным недостатком данного способа является то, что всего один электрод осуществляет контакт, по крайней мере, с одной из клеток. В связи с этим, происходит контакт одного массивного электрода с одной и более клеткой. Минимизировать необходимые энергии, стимулирующие ускорение физиологических процессов и скорости роста, можно за счет осуществления распределенного контакта множества электродов с мембраной одной клетки, что позволяет повысить эффективность управления физиологическими процессами, происходящими при росте клетки, за счет формирования множества наноразмерных контактов, локализующих и усиливающих на своих концах электрическое поле.
Аналогом способа изготовления нанотрубочного носителя для осуществления электрической стимуляции клеток является способ приготовления нанотрубочно-белкового композита, который описан в работе [2] для создания нейронального электрода при изучении механизмов дифференциации и электрической стимуляции нейрональных клеток. При этом нанотрубки служат как упрочняющий и проводящий материал, позволяющий одновременно стимулировать и исследовать результаты дифференциации нейронов.
Недостатком данного способа, как и носителя в целом, является дополнительное усложнение конструкции за счет формирования защитного кольца на поверхности проводящих пленок. Данная конструкция не обеспечивает длительного роста клеток и требует постоянной замены культуральной среды. При этом использование серебряной пасты в качестве контактных электродов нарушает стерильность и биосовместимость всего носителя в целом.
Известны также способы изготовления тонкопленочных транзисторов на основе полупроводниковых сеток углеродных нанотрубок [3, 4, 5]. В данных работах описаны частные случаи известного метода производства тонкопленочных транзисторов на основе углеродных нанотрубок. Недостатком данных структур и способа в целом является применение различного типа оснований, биосовместимость которых не является подтвержденной или топология которых не может вызывать распластывание и закрепление клеток. В частности, в [4] основанием является мембрана из пористого оксида алюминия. В [3, 5] используется в качестве основания кремний, обладающий токсичными свойствами для биологических объектов. Также к недостаткам следует отнести принцип уменьшения проводимости сформированных сеток за счет увеличения количества нанотрубок или уменьшения количества контактов. В пределе данные структуры предназначены для обеспечения максимальной проводимости, сравнимой с металлической, тем самым уменьшая потенциальный эффект от электрической стимуляции за счет локализации электрического поля в областях контактов нанотрубок или на их концах.
Прототипом предложенного в изобретении носителя и способа его изготовления является система для направленного роста клеток [6]. Система направленного роста клеток включает подложку, слой для культивирования и среду для культивирования. Слой для культивирования находится на подложке. Слой для культивирования включает, по меньшей мере, одну пленку из углеродных нанотрубок, содержащую множество углеродных нанотрубок, ориентированных преимущественно вдоль одного направления. Культуральная среда покрывает культуральный слой и содержит, по крайней мере, один фактор роста. Данная система позволяет проводить культивирование клеток в заданных объемах, при этом сама система может обеспечивать возможность подведения к ней электрических сигналов.
Тем не менее, применение данной системы, требующей наличия подложки, нанотрубок и культуральной среды и ограничивается необходимостью использования емкостей для культивирования клеток. Более того, преимущественная ориентация нанотрубок определяет направление роста тканей, но не обеспечивает равномерный контакт с клетками растущей ткани в непосредственной области поврежденного участка ткани. Данного недостатка можно избежать, если использовать систему, обеспечивающую факторы роста, связанные с электрической стимуляцией роста клеток. Более того, принципиально для ориентированного роста клеток необходимо формирование перепадов высот на поверхности величиной более 10 нм, тогда как высота структур, сформированных их одиночных нанотрубок, составляет 1 нм и не влияет на направление роста клеток на поверхности модифицированного основания.
Таким образом, существует необходимость в формировании систем электрической стимуляции роста клеток, обеспечивающих возможность интеграции в состав биологических компонентов в комплексе с биодеградируемыми материалами для ускорения роста клеток и регенерации тканей посредством электрического стимулирования.
Задача изобретения - усовершенствование устройств культивации клеток, а также создание биосовместимых электропроводящих систем для электрической стимуляции роста клеток и регенерации тканей.
Технический результат изобретения заключается в предложении нанотрубочного носителя для электрической стимуляции роста клеток и регенерации тканей in vitro, позволяющего подводить внешнее электрическое поле к клеточной мембране с использованием одиночного проводящего электрода диаметром от 1 до 10 нм и обеспечивающего пониженное энергопотребление в процессе функционирования.
Это достигается тем, что структура состоит из основания в виде покровного стекла, на котором неупорядоченно расположен массив проводящих углеродных нанотрубок и их пучков металлического или полупроводникового типа диаметром от 1 до 10 нм, и плотностью, обеспечивающей перколяцию сетки и, следовательно, общую электропроводность сетки, а также, по крайней мере, двух подводящих биосовместимых электродов, обеспечивающих подведение внешнего электрического поля или тока.
Способ изготовления нанотрубочного носителя для электрической стимуляции роста клеток включает в себя выбор основания в виде покровного стекла, формирование на поверхности основания перколированной сетки нанотрубок, нанесение, по крайней мере, двух подводящих биосовместимых электродов к нанотрубкам. Нанотрубки могут быть непосредственно выращены на поверхности основания, осаждены методом диэлектрофореза или из коллоидного раствора с поверхностно-активными веществами. При этом нанотрубки удерживаются на поверхности за счет сил Ван-дер-Ваальса. При этом поверхностно-активные вещества должны быть биосовместимыми, например ДНК или белки (альбумин). При этом при использовании перколированных сеток нанотрубок выбор основания не является существенным, ввиду повышения адгезии и распластывания клеток за счет усиления адгезии со стороны нанотрубок, модифицирующих основание.
Влияние электрической стимуляции на ускоренное заживление тканей и рост клеток исследуется несколько десятилетий, начиная с семидесятых годов прошлого столетия. Основная проблема традиционных методов подведения внешнего электрического поля заключается в том, что отсутствует возможность локализовать поле в области заживления: в общем случае электрической стимуляции подвергается значительная площадь организма. С увеличением площади воздействия и расстояния от пораженного участка увеличивается и мощность электромагнитного поля, необходимая для приложения эффективной напряженности электрического поля к заданной клетке.
Решение данной проблемы может быть найдено при использовании имплантируемых электродов, локализующих электрическое поле в необходимом участке организма. Таким образом, используя имплантируемые электроды малого размера, можно добиться стимулирования регенерации пораженных участков при меньших амплитудах напряженности электрического поля и меньших частотах генерации сигнала. Тем не менее, подобные инвазивные методы требуют использования биодеградируемых материалов, оказывающих минимальное механическое воздействие на окружающие органы и ткани.
Настоящее изобретение описывает структуру для электрического управления процессом роста клеток и тканей путем непосредственного приложения к тканям и клеткам электрического поля или тока на нанометровом уровне. Нанотрубочный носитель в изобретении включает в себя нанотрубки, использование которых обеспечивает высокую проводимость, высокую локализацию электрического поля, высокую удельную поверхность, биосовместимость и биодеградацию электродов.
2
Применение углеродных нанотрубок в качестве материала для ускорения пролиферации (роста) клеток при проведении лабораторных исследований, наращивания биологической массы и заживления и регенерации тканей посредством электрического стимулирования обусловлено несколькими уникальными свойствами нанотрубок. Во-первых, нанотрубки обладают высокой удельной поверхностью (до 2600 м/г), обусловленной их геометрией [7]. Данное свойство позволяет рассматривать их как наилучший каркасный материал для наращивания биологической массы. Во-вторых, нанотрубки обладают высокой проводимостью: идеальные нанотрубки обладают баллистическим транспортом носителей заряда, что позволяет передавать по ним высокие плотности токов с минимальными потерями. Также нанотрубки обладают высокими прочностными свойствами, что в перспективе может быть использовано для упрочнения биологических тканей, в частности при регенерации костей. Последние исследования в области биосовместимости нанотрубок демонстрируют также возможность окислительного ферментативного расщепления нанотрубок, позволяющего разлагать нанотрубки с использованием естественных механизмов иммунной защиты человека при дополнительной функционализации углеродных нанотрубок и/или введении биологических ферментов, например пероксидазы [8].
Использование перколированных сеток из углеродных нанотрубок позволяет минимизировать площадь контактной области и увеличить плотность электродов, осуществляющих контакт с мембраной одной клетки. При этом использование нанотрубок диаметром 1 нм, что на порядок меньше предлагаемых размеров нанотрубок в [6], позволяет также на порядок снизить прикладываемые напряжения при сохранении той же величины напряженности электрического поля. Прикладываемые напряжения к структуре могут находиться диапазоне от 0,1 мВ до 1000 мВ.
Предлагаемая в изобретении структура, включая основание, нанотрубки, контактные площадки и подводящие электроды, полностью выполнена из биосовместимых материалов и может быть использована при длительных процессах роста клеток при электрической стимуляции. При этом структура, основанием которой является стандартное покровное стекло, полностью размещается в шестилуночном планшете или чашке Петри, что делает ее более надежной при проведении экспериментов и не требует разработки дополнительных лабораторных регламентов по работе с носителем, в отличие от структуры, предложенной в [2].
На фиг.1 представлена схема нанотрубочного носителя с углеродными нанотрубками для электрической стимуляции роста клеток в соответствии с формулой изобретения:
1 - основание;
2 - нанотрубки;
3 - подводящий элеткрод.
На фиг.2 представлено изображение сетки однослойных углеродных нанотрубок на поверхности покровного стекла (изображение получено в атомно-силовом микроскопе).
На фиг.3 представлено изображение клеток фибробластов эмбриона человека, выращенных на поверхности сетки однослойных углеродных нанотрубок на оксиде кремния с системой подводящих электродов.
На фиг.4 представлена схема нанотрубочного носителя с углеродными нанотрубками на гибком основании для электрической стимуляции клеток и регенерации ткани:
1 - гибкое основание;
2 - функционализированные нанотрубки;
3 - подводящий интегрованный в основание элеткрод.
-2
Нанотрубочный носитель для электрической стимуляции роста клеток состоит из основания в виде покровного стекла, расположенных на нем наноструктур правильной геометрической формы, отличающихся тем, что наноструктуры выполнены в виде углеродных нанотрубок диаметром от 1 до 10 нм, и из не менее двух подводящих к нанотрубкам биосовместимых электродов. Данные размеры обеспечивают достаточную гибкость нанотрубок. Нанотрубки на большей части своей длины прикреплены к основанию силами Ван-дер-Ваальса. Нанотрубки могут быть расположены регулярно или неупорядоченно на основании с плотностью не менее 2 мкм, обеспечивающей перколяцию сетки нанотрубок, а следовательно, обеспечивающей формирование, по крайней мере, одного канала проводимости между подводящими по меньшей мере двумя электродами. Длина нанотрубок как одиночных, так и в пучках, может варьироваться от 1 мкм до 10 мкм. Длина меньше 1 мкм не позволяет обеспечить закрепление нанотрубок на поверхности, производство нанотрубок длиной выше 10 мкм приводит к возникновению в них дефектов, которые могут вносить дополнительное рассеяние в проводимость нанотрубки. Нанотрубки могут быть однослойными и многослойными. Нанотрубки могут быть функционализированы биосовместимыми веществами для формирования коллоидного водного раствора и/или биодеградации после проведения роста клеток.
2
Основание может быть выполнено в виде кристаллического или аморфного стекла. Основание может быть выполнено из композитного, керамического материала, обеспечивающего биологическую совместимость. Особенностью основания является то, что его шероховатость не может превышать 1 нм на площади 1 мкм.
Нанотрубки могут быть функционализированы дополнительно поверхностно-активными веществами или белками. Подводящие электроды могут быть выполнены из биосовместимого проводящего материала или композита.
2
Способ изготовления нанотрубочного носителя для электрической стимуляции роста клеток заключается в следующем. На первом этапе происходит выбор и подготовка основания с шероховатостью поверхности 1 нм на площади 1 мкм. Основание может быть выполнено в виде кристаллической (кварц) или аморфной стеклянной подложки. Основание может быть изготовлено из композитного, керамического материала, обеспечивающего биологическую совместимость.
8
На основании формируется сетка из углеродных нанотрубок, состоящая, по крайней мере, из одной нанотрубки. Если сетка формируется из больше чем одной нанотрубки, то она может быть перколирована для обеспечения непрерывного электрического контакта или нанотрубки могут не формировать непосредственного геометрического контакта друг с другом, но должны обеспечивать передачу тока через среду для культивирования клеток (электролит). При этом повышение электростимулирующего воздействия обеспечивается не за счет протекания больших плотностей токов, а за счет формирования высоких плотностей линий напряженности электрического поля, величина которого может доходить до 10 В/см на концах нанотрубок. Данным фактом заявленная структура существенно отличается от структур, предложенных в [3-5], задача которых минимизировать электрические потери, вызванные контактом между нанотрубками. Нанотрубки могут быть непосредственно выращены на поверхности основания, осаждены методом диэлектрофореза, из коллоидного раствора спирта или воды с поверхностно-активными веществами. При этом нанотрубки удерживаются на поверхности за счет сил Ван-дер-Ваальса. Для увеличения адгезии основание со сформированной сеткой нанотрубок может быть подвержено термической обработке при температуре от 150 до 800°С. При этом термическая обработка может быть проведена как на воздухе, так и в вакууме. Формирование подводящих электродов к перколированной сетке нанотрубок осуществляется нанесением проводящего биосовместимого материала с использованием традиционных методов: литографии, капельным методом, нанесением из геля. Материал проводящих электродов может быть: золото, платина, проводящий полимер, биосовместимые композиты на основе белков и нанотрубок и другие.
Пример 1. Пример конкретного выполнения нанотрубочного носителя для электрической стимуляции роста клеток in vitro.
2
6
2
В нанотрубочном носителе могут быть использованы однослойные углеродные нанотрубки как одиночные, так и в виде пучков, диаметром от 1 нм до 10 нм. Нанотрубки могут быть нанесены на поверхность основания, в качестве которого выбрано покровное стекло, расположенное на дне стеклянной или пластиковой чашки Петри, многолуночного планшета. При этом поверхностная плотность нанотрубок должна обеспечивать формирование перколяционной сетки. Нанотрубки могут быть осаждены методом диэлектрофореза из коллоидного раствора спирта (фиг.2) или из водного раствора с ПАВ. Концентрация нанотрубок в растворе составляет не менее 1 мг/л. Раствор наносится на поверхность в количестве, достаточном для образования проводящей сетки. В частности, на 1 см поверхности покровного стекла может быть нанесено не менее 2 мл раствора. В случае проведения электрофореза прикладываемое напряжение должно обеспечивать напряженность электрического поля не менее 10 В/м. При этом нанотрубки удерживаются на поверхности за счет сил Ван-дер-Ваальса. На основании также одним из методов магнетронного, термического или другого метода вакуумного испарения наносится тонкая пленка подводящих биосовместимых электродов, обладающих максимальной проводимостью, в частности золото, с расстоянием между электродами 1 см. Результирующее сопротивление нанотрубочного носителя может находится в диапазоне не менее 100 и не более 100000 Ом/см.
Для подвода внешнего электрического поля или тока могут быть использованы внешние бесконтактные методы передачи переменного электрического поля или электропроводящие зонды, обеспечивающие омический контакт с электродами на нанотрубочном носителе. При этом  зонды должны быть сделаны из биосовместимого электропроводящего материала, например золота, серебра, титана, нанотрубочного композита и др. Электроды могут быть сделаны не из биосовместимого материала, но быть покрыты им для обеспечения омического контакта с электродами на нанотрубочной структуре. В частности, могут быть использованы золотые электроды диаметром 0,2 мм.
В частности, полученный описанным выше способом носитель был использован для электрической стимуляции роста фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ) (фиг.3). ФЭЧ были помещены на нанотрубочный носитель, размещенный в чашке Петри, и залиты соответствующей питательной средой. Используемые напряжения стимуляции: 10, 50, 100, 200, 500, 5000 мВ. Было продемонстрировано увеличение индекса пролиферации на 25% клеток при напряжении между золотыми электродами до 100 мВ.
Таким образом, предложен нанотрубочный носитель для электрической стимуляции роста клеток и регенерации тканей, позволяющий подводить внешнее электрическое поле посредством распределенной системы электродов диаметром от 1 нм к клеточной мембране, что устраняет недостатки, присущие прототипу.
Источники информации
1. Патент US 2010/0160999 A1, A61N 1/04, 2010. Electrical stimulation of cell and tissue growth with two - and thee-dimensionally patterned electrodes.
2. Kam N.W., Jan E., Kotov N.A. Electrical stimulation of neural stem cells mediated by humanized carbon nanotube composite made with extracellular matrix protein. // Nano Lett. 2009. - V.9. -N.1. - P.273-278.
3. Snow E.S., Novak J.P., Campbell P.M., Park D. Random networks of carbon nanotubes as an electronic material. // Applied Physics Letters. 2003. - Vol.82. - N.13. - P.2145-2147.
4. Hu L., Hecht D.S., Gruner G. Percolation in Transparent and Conducting Carbon Nanotube Networks. //Nano Letters. 2004. - V.4. - Iss. 12, p.2513-2517.
5. Peng G, Tisch U, Haick H. Detection of Nonpolar Molecules by Means of Carrier Scattering in Random Networks of Carbon Nanotubes: Toward Diagnosis of Diseases via Breath Samples. // Nano Lett. 2009. - V.9. N4. - P.1362-1368.
6. Патент US 2010/0144004 A1, C12N 13/00, C12M 1/00, C12N 5/02. 2010. Cell culture system, cell culture substrate thereof and culture method thereof - прототип.
7. Yin Y.F., Mays T, McEnanaey B. Adsorption of nitrogen in carbon nanotube arrays. // Langmuir. - 1999. - N.15. P.8714-8718.
8. Kagan V.E, Konduru N.V., Feng W., Alien B.L., Conroy J., Volkov Y., Vlasova I.I., Belikova N.A., Yanamala N., Kapralov A., Tyurina Y.Y., Shi J., Kisin E.R., Murray A.R., Franks J., Stolz D., Gou P., Klein-Seetharaman J., Fadeel В., Star A., Shvedova A.A. Carbon nanotubes degraded by neutrophil myeloperoxidase induce less pulmonary inflammation. // Nature Nanotechnol. - 2010. - V.5. - N.5. P.354-359.