ШТАММ БАКТЕРИЙ SALMONELLA ENTERICA (ВКШМ-Б-849М) В КАЧЕСТВЕ КОНТРОЛЬНОГО ШТАММА ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ОПРЕДЕЛЕНИИ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ
SALMONELLA ENTERICA BACTERIAL STRAIN (VKSHM-B-849 M) AS A CONTROL STRAIN FOR MICROBIOLOGICAL AND MOLECULAR GENETIC STUDIES IN DETERMINING ANTIBIOTIC RESISTANCE

Изобретение относится к микробиологии (бактериологии), а именно к разделу определения устойчивости микроорганизмов к антимикробным препаратам и молекулярной детекции механизмов резистентности, и может быть использовано в микробиологии в качестве контрольного штамма для контроля устойчивости микроорганизмов к цефазолину (I-III поколение), ципрофлоксацину, энрофлоксацин, доксициклину, тетрациклину, спектиномицину, флорфениколу и триметоприму и молекулярно-генетических исследований, а так же в качестве контрольного для идентификации соответствующих генов устойчивости к тем же антимикробным препаратам (mdsABC, gyrA (S83Y), tetA, tetR, аасб-1y, dfrA14).
Похожими свойствами обладает штамм Haemophilus influenza АТСС 49247, который обладает резистентностью к ампициллину, а так же штамм Enterococcus faecalis АТСС 51299 с высокой степенью устойчивости к аминогликозидам, являющиеся контрольными для детекции специфических механизмов резистентности. Однако данные штаммы могу быть использованы для исследования узкого спектра устойчивости. Задачей изобретения является получение штамма, обладающего резистентностью к нескольким антимикробным средствам, подтвержденными молекулярно-генетическими исследованиями с выявлением соответствующих участков резистентности.
У штамма выявлены следующие биохимические механизмы устойчивости к антибиотикам различных классов:
- модификация мишени действия - обуславливается генами dfrA14, gyrA(S83Y);
- инактивация антибиотика - обуславливается геном ААС(6')-1у;
- активное выведение антибиотика из микробной клетки (эффлюкс) -обуславливается генами tetA, tetR, mdsABC.
+
В плазмидных контигах штамма были обнаружены гены резистентности к тетрациклинам: tetA, tetR, данные гены в комплексе представляет собой белковую трансмембранную транспортную систему, осуществляющую выведение (эффлюкс) тетрациклинов из бактериальной клетки путем активного транспорта. Эффлюкс система tetA относится к суперсемейству основных транспортеров MFS (major facilitator superfamily), использующих для транспорта антибиотиков энергию протонового градиента или градиента ионов Na[10]. Приобретенный ген dfrA14 объясняет наблюдаемую устойчивость к триметоприму. Изолят демонстрирует устойчивость к фторхинолонам, которая обеспечена мутацией в хромосомном гене gyrA (S83Y). Штамм имеет приобретенный ген аасб-Гу, который ассоциирован с резистентностью к аминогликозидам [1].
Таким образом система высокопроизводительного полногеномного секвенирования не выявила ни одного гена антибиотикорезистентности, который не имел бы соответствующего микробиологического признака антибиотикорезистентности.
При помощи программы BLASTx (выравнивание на аминокислотные последовательности генов резистентности и генов orf5, qaceAl из базы UniProt) идентифицированы генные кассеты и 3'-CS. С помощью программы IntegronFinder обнаружен интегрон 2 класса (фиг. 1)
В дополнение к генам антибиотикорезистентности при изучении штамма обнаружена плазмида, ассоциированная с оперонами вирулентности, ответственными за опосредованное иерсиниабактином поглощение железа. Этот оперон состоит из 11 генов (irp1, irp2, ybtA, ybtE, ybtP, ybtQ, ybtS, ybtT, ybtU, ybtX) [2] Так же данная плазмида имеет одинаковый набор токсин-антитоксиновых систем (PemK/PemI, CcdB/CcdA, VapC/VapB) и несет ген, кодирующий протеазу ClpE, которая также рассматривается как фактор вирулентности [3].
Таким образом, обнаруженная плазмида в значительной степени определяет фенотип штамма и обеспечивает его несколькими факторами вирулентности. Кроме того, системы токсин-антитоксин обеспечивают большую стабильность идентифицированной плазмиды в клетке.
Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению является штамм SALMONELLA ENTERICA SUBSP. ENTERICA SEROVAR TYPHI в качестве контрольного для фенотипических и молекулярных исследований при диагностике брюшного тифа, однако он характеризуется устойчивостью высокого уровня только к фторхинолонам, обусловленной двумя мутациями в хромосомном гена gyrA вида. Предлагаемый в качестве изобретения штамм имеет стабильные параметры множественной резистентности, как с микробиологической, так и с молекулярно-генетической составляющей, что позволяет его более широкое использование.
Изобретение направлено на разработку контрольного штамма Salmonella enterica ВКШМ-Б-849М, необходимого для обеспечения достоверного определения микробиологической устойчивости к антимикробным средствам с подтвержденным наличием устойчивых генетических детерминант резистентности.
Задача настоящего изобретения - референтный штамм, стабильно сохраняющий микробиологические свойства, содержащие гены, нуклеотидная последовательность которых специфична для вида, подвида, биовара, и создание на их основе комплекта контрольных препаратов ДНК для контроля генно-диагностических и микробиологических исследований.
Штамм депонирован во «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» под номером ВКШМ-Б-849М.
Штамм бактерий Salmonella enterica ВКШМ-Б-849М для микробиологических и молекулярно-генетических исследований в качестве контрольного штамма для контроля устойчивости микроорганизмов к цефазолину (I-III поколение), ципрофлоксацину, энрофлоксацин, доксициклину, тетрациклину, спектиномицину, флорфениколу и триметоприму и молекулярно-генетических исследований, а так же в качестве контрольного для идентификации соответствующих генов устойчивости к тем же антимикробным препаратам (mdsABC, gyrA (S83Y), tetA, tetR, аасб-1y, dfrA14).
Таксономия и описание штамма: семейство Enterobacteriaceae род Salmonella вид Salmonella enterica серовар Infantis.
Штамм сальмонелл Salmonella enterica ВКШМ-Б-849М природный, выделен из биологического материала.
Характеристика штамма Salmonella enterica ВКШМ-Б-849М.
Культурально-морфологические свойства штамма - грамотрицательные подвижные палочки без спор и капсул.
Патогенные свойства: штамм патогенный для человека, 4 группа патогенности согласно СП 1.2.036-95 и СП 1.3.2322-08 (с изм. от 29.06.2011).
Культуральные свойства
Через 18-24 час культивирования при температуре (37±1)°С штамм формирует:
- на среде Эндо бледно-розовые, прозрачные, круглые, плоские, с ровными краями колонии, диаметром 2-3 мм;
- на висмут-сульфит-агаре - круглые, плоские с ровными краями, черные с металлическим блеском и почернением среды под колонией, диаметром 1,5-2 мм;
- на XLD-arape - круглые, плоские, с ровными краями, бесцветные (в цвет ага-ра) с черным центром колонии, диаметром 2-3 мм;
- на хромогенном агаре образуют сиреневые, характерные для сальмонелл колонии, диаметром 2-3 мм;
- на жидких питательных средах и полужидком МПА (0,3%) наблюдается диффузное помутнение среды.
При использовании метода серийных разведений руководствовались следующими методическими рекомендациями: МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»; VET01-А4 Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals, Approved Standard - Fourth Edition.
Особенности штамма: mdsABC, gyrA (S83Y), tetA, tetR, аасб-1y, dfrA14 Для поиска генов антибиотикорезистентности в бактериальном геноме использовали сервис ResFinder и базы данных Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation, The Comprehensive Antibiotic Resistance Database и NCBI Bacterial Antimicrobial Resistance Reference Gene Database. Подтверждено наличие генетических факторов резистентности mdsABC, gyrA (S83Y), tetA, tetR, аасб-ly, dfrA14.
Данные, полученные при помощи NGS на Miseq, и данные функциональных микробиологических тестов хорошо согласуются между собой (таблица 1).
Молекулярный механизм устойчивости - элементы устойчивости к антимикробным препаратам mdsABC, gyrA (S83Y), tetA, tetR, аасб-1y, dfrA14.
Стабильность наличия генетических детерминант устойчивости контрольного штамма Salmonella enterica ВКШМ-Б-849М подтверждалась повторным секвенированием ДНК штамма и анализом нуклеотидной последовательности после хранения штамма в течение 6 месяцев в лиофилизированном виде в ампулах под вакуумом при температуре 2-8°С. Изобретение реализуется следующим образом.
Пример 1
Контроль качества определения механизма устойчивости к антимикробным препаратам, ассоциированных с генами устойчивости (mdsABC, gyrA (S83Y), tetA, tetR, аасб-1y, dfrA14).
Выделение геномной ДНК из жидкой суточной бактериальной культуры Salmonella enterica проводили методом сорбции на силикагеле с использованием набора АмплиПрайм ДНК-сорб-В (ФБУН ЦНИИЭ) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию ДНК измеряли на флуориметре QuantiFluor ONE dsDNA System (Promega Corporation, США).
Подготовку библиотек проводили с использованием набора для NGS Nextera XT DNA Sample Preparation Kit, набора индексов Nextera XT Index Kit, магнитных шарики для очистки ампликонов (Agencourt AMPure ХР, Beckman Coulter, США), набор реагентов для секвенирования MiSeq Reagent Kit v2/v3 согласно стандартному протоколу производителя. Секвенирование геномов исследуемых штаммов и контрольного штамма проводили на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeq Reagent Kit v2/v3 (США).
Поиск генетических факторов, обеспечивающих резистентность к антибиотикам, вели при помощи нескольких ресурсов: онлайн-ресурс ResFinder, находящегося на сервере Центра геномной эпидемиологии Датского технического университета; база данных Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation, база данных The Comprehensive Antibiotic Resistance Database.
Аннотация геномов была выполнена с помощью сервера RAST на открытой платформе для сравнительного анализа геномов SEED.
Контрольный штамм Salmonella enterica ВКШМ-Б-849М проявлял заявленные свойства: стабильно обнаруживались элементы устойчивости к антимикробным препаратам mdsABC, gyrA (S83Y), tetA, tetR, аасб-1y, dfrA14
Пример 2
При использовании метода серийных разведений руководствовались следующими методическими рекомендациями: МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»; VET01-А4 Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals, Approved Standard - Fourth Edition.
Использовали микрометод серийных разведений, т.е. с использованием стерильных 96-ти луночных планшетов и величине конечного объема 100 мкл.
В качестве питательной среды использовали бульон Мюллера-Хинтона с добавлением ионов кальция и магния. Планшеты инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Учет результатов проводили визуально, сравнивая рост микроорганизма в присутствии АБП с ростом культуры в ячейке без АБП. За минимальную подавляющую концентрацию принимали концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста исследуемого штамма.
Контрольный штамм относился к категории «Устойчивый» к цефазолину (I-III поколение), ципрофлоксацину, энрофлоксацин, доксициклину, тетрациклину, спектиномицину, флорфениколу и триметоприму уровень устойчивости расценивался как высокий.
Для обеспечения достоверной идентификации устойчивых к антимикробным препаратам микроорганизмов необходимо проводить контроль качества на каждом этапе исследования материала. Предлагаемый штамм обладает стабильными свойствами, позволяющими контролировать этап определения механизма устойчивости микробиологическими и молекулярно-генетическими методами.
Литературные источники
1. Ramirez M.S., Tolmasky М.Е. Aminoglycoside modifying enzymes. Drug Resist Updat. 2010; 13(6):151-71. doi: 10.1016/j.drup.2010.08.003.
2. Aviv et al. (2014) A unique megaplasmid contributes to stress tolerance and pathogenicity of an emergent Salmonella enterica serovar Infantis strain. Environmental Microbiology, 16(4), 977-994.
3. Jiang, L., Olesen, I., Andersen, Т., Fang, W., & Jespersen, L., 2010. Survival of Listeria monocytogenes in simulated gastrointestinal system and transcriptional profiling of stress-and adhesion-related genes. Foodborne Pathog. Dis. 7(3), 267-274.