ОДНОЦЕПОЧЕЧНАЯ МОЛЕКУЛА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, ИНГИБИРУЮЩАЯ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА ПРОРЕНИНА ИЛИ ГЕНА РЕЦЕПТОРА ПРОРЕНИНА, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID MOLECULE INHIBITING EXPRESSION OF PRORENIN GENE OR PRORENIN RECEPTOR GENE, AND USE THEREOF

Область техники, к которой относится изобетение
[0001] Настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая ингибирует экспрессию гена проренина или гена рецептора проренина, композиции, содержащей то же самое, и ее применение.
Предыдущий уровень техники
[0002] Ренин-ангиотензиновая система (RAS) в основном участвует в регулировании артериального давления и поддержании электролитного баланса (циркулирующая RAS), играет роль в дифференцировке и пролиферации клеток, восстановления тканей и т.п. в локальных частях органов (тканевая RAS). При диабетической ретинопатии и хориоидальной неоваскуляризации активация тканевой RAS участвует в патологии кровеносных сосудов, поскольку она стимулирует сигнальный путь через рецептор ангиотензина 1 типа и индуцирует экспрессию связанных с воспалением молекул, таких как VEGF, MCP-1, ICAM-1 и т.п.
[0003] Проренин, который считается всего лишь неактивным предшественником ренина, связывается с общим рецептором трансмембранного типа для ренина и проренина (ATP6AP2, АТФаза, перенос Н+, лизосомальный дополнительный белок 2, также описанный как «рецептор проренина» в настоящем описании), тем самым приобретая способность связываться с ангиотензиногеном, вызывает активацию тканевой RAS, одновременно вызывает активацию ERK в качестве внутриклеточного сигнала, опосредованного рецептором проренина, тем самым также индуцируя VEGF и MCP-1. Эту активацию тканевой RAS и независимую от RAS активацию внутриклеточной сигнализации посредством рецептора проренина в совокупности называют рецептор-ассоциированной прорениновой системой (RAPS).
Как указано выше, известно, что RAPS глубоко задействована в воспалении и ангиогенезе глазной ткани через два разных действия, и считается, что вмешательство в RAPS имеет важное значение как терапевтическая стратегия глазных заболеваний, сопровождающихся воспалением или ангиогенезом.
[0004] В качестве методики ингибирования экспрессии гена, например, известна РНК-интерференция (RNAi). Ингибирование экспрессии гена посредством РНК-интерференции в целом выполняют, например, посредством введения короткой двухцепочечной молекулы РНК в клетку или т.п. Указанная выше двухцепочечная молекула РНК в целом называется миРНК (малая интерферирующая РНК). В то время как были проведены исследования различных генов с использованием миРНК, они связаны с проблемами возможной нестабильности крови и побочных эффектов вследствие иммунного ответа и т.п., и необходимо предоставление более эффективной молекулы нуклеиновой кислоты.
[0005] В последние годы автор настоящего изобретения недавно разработал более эффективную одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, заменяющую миРНК (патентные документы 1, 2, непатентный документ 1).
Список документов
Патентные документы
[0006] Патентный документ 1: WO 2012/005368
патентный документ 2: WO 2012/017919
Непатентный документ
[0007] непатентный документ 1: Hamasaki et al., PLoS ONE, 7(8), e42655, doi:10.1371, 2012
Краткое изложение настоящего изобретения
Задачи, решаемые посредством изобретения
[0008] Настоящее изобретение направлено на то, чтобы предоставить молекулу нуклеиновой кислоты, эффективную для лечения заболеваний, включающих экспрессию гена проренина или гена рецептора проренина, и лекарственное средство, использующее то же самое.
Средства решения задач
[0009] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты, в которой область, содержащая нуклеотидную последовательность, нацеленная на конкретную частичную последовательность гена проренина или гена рецептора проренина, и область, содержащая комплементарную последовательность ее цепи, связаны с использованием конкретного линкера, в значительной степени ингибирует экспрессию гена проренина или гена рецептора проренина, а также улучшает патологию в животной модели увеита, что привело к созданию настоящего изобретения.
[0010] Соответственно, настоящее изобретение показано ниже.
[1] Одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты, ингибирующая экспрессию гена проренина или гена рецептора проренина, содержащая только область (X), линкерную область (Lx) и область (Xc),
при этом указанная выше линкерная область (Lx) имеет ненуклеотидную структуру, содержащую по меньшей мере один из пирролидинового скелета и пиперидинового скелета, и
одна из указанной выше области (X) и указанной выше области (Xc) содержит ингибирующую экспрессию последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, состоящую по меньшей мере из 18 непрерывных нуклеотидов в любой нуклеотидной последовательности, выбранной из последовательности, комплементарной части гена проренина, представленной следующими SEQ ID №: 1-5:
(SEQ ID №: 1) 5’-UGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3’
(SEQ ID №: 2) 5’-UUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3’
(SEQ ID №: 3) 5’-UGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3’
(SEQ ID №: 4) 5’-UAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3’
(SEQ ID №: 5) 5’-AUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3’
и последовательность, комплементарную части гена рецептора проренина, представленную следующими SEQ ID №: 6-11:
(SEQ ID №: 6) 5’-UUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3’
(SEQ ID №: 7) 5’-AAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3’
(SEQ ID №: 8) 5’-UUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3’
(SEQ ID №: 9) 5’-UAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3’
(SEQ ID №: 10) 5’-AAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3’
(SEQ ID №: 11) 5’-UUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3’, и
другая содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную ингибирующую экспрессию последовательность.
[2] Молекула нуклеиновой кислоты вышеуказанной [1], в которой область (X), линкерная область (Lx) и область (Xc) расположены в этом порядке с 3'-стороны к 5'-стороне, и число оснований (X) указанной выше области (X) и число оснований (Xc) указанной выше области (Xc) удовлетворяют условиям следующей формулы (1) или формулы (2):
X>Xc... (1)
X=Xc... (2).
[3] Молекула нуклеиновой кислоты вышеуказанной [2], в которой число оснований (X) указанной выше области (X) и число оснований (Xc) указанной выше области (Xc) удовлетворяют условиям следующей формулы (3):
X-Xc=1, 2 или 3... (3).
[4] Молекула нуклеиновой кислоты любой вышеуказанной [1]-[3], в которой число оснований (Xc) указанной выше области (Xc) составляет 19-30.
[5] Молекула нуклеиновой кислоты любой вышеуказанной [1]-[4], в которой указанная выше линкерная область (Lx) представлена следующей формулой (I):
[0011]
[0012] в которой
1
2
2
X и X каждый представляют собой независимо H, O, S или NH;
1
2
2
Y и Y каждый представляют собой независимо простую связь, CH, NH, O или S;
3
R представляет собой атом водорода или заместитель, связанный с C-3, C-4, C-5 или C-6 на кольце A,
1
a
a
a
b
a
2
L представляет собой алкиленовую цепь, состоящую из n атомов, и атом водорода на атоме углерода алкилена может быть замещен или не быть замещен на OH, OR, NH, NHR, NRR, SH или SR, или
1
L представляет собой эфирную цепь, полученную посредством замещения по меньшей мере одного атома углерода на указанной выше алкиленовой цепи на атом кислорода,
1
1
1
1
1
при условиях, что: когда Y представляет собой NH, O или S, атом, связанный с Y в L, представляет собой углерод, атом, связанный с OR в L, представляет собой углерод, и атомы кислорода не примыкают друг к другу;
2
c
c
d
c
2
L представляет собой алкиленовую цепь, состоящую из m атомов, и атом водорода на атоме углерода алкилена может быть замещен или не быть замещен на OH, ORc, NH, NHR, NRR, SH или SR, или
2
L представляет собой эфирную цепь, полученную посредством замещения по меньшей мере одного атома углерода на указанной выше алкиленовой цепи на атом кислорода,
2
2
2
2
2
при условиях, что: когда Y представляет собой NH, O или S, атом, связанный с Y в L, представляет собой углерод, атом, связанный с OR в L, представляет собой углерод, и атомы кислорода не примыкают друг к другу;
a
b
c
d
R, R, R и R каждый представляют собой независимо заместитель или защитную группу;
l представляет собой 1 или 2;
m представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 30;
n представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 30;
в кольце A один атом углерода, не являющийся C-2 на указанном выше кольце A, может быть замещен азотом, кислородом или серой,
указанное выше кольцо A может содержать двойную углерод-углеродную связь или двойную углерод-азотную связь,
1
2
указанные выше области (Xc) и (X) каждая связаны с указанной выше линкерной областью (Lx) через -OR- или -OR-,
1
2
1
2
при этом R и R может присутствовать или может не присутствовать, и когда они присутствуют, R и R каждый представляют собой независимо нуклеотидный остаток или указанную выше структуру (I).
[6] Молекула нуклеиновой кислоты любой вышеуказанной [1]-[5], в которой указанная выше линкерная область (Lx) представлена следующими формула (I-4a) или (I-6a):
[0013]
[0014] [7] Молекула нуклеиновой кислоты любой вышеуказанной [1]-[6], которая представляет собой молекулу РНК.
[8] Молекула нуклеиновой кислоты любой вышеуказанной [1]-[7], содержащая по меньшей мере один модифицированный остаток.
[9] Молекула нуклеиновой кислоты любой вышеуказанной [1]-[8], содержащая метящее вещество.
[10] Молекула нуклеиновой кислоты любой вышеуказанной [1]-[9], содержащая стабильный изотоп.
[11] Молекула нуклеиновой кислоты любой вышеуказанной [1]-[10], в которой в общей сложности число оснований составляет не менее 38.
[12] Молекула нуклеиновой кислоты любой вышеуказанной [1]-[11], представленная следующей структурой:
5’-CCUAUCUUCGACAACAUCAUCCC-Lx-GGGAUGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3’
5’-GGAAUUUCCACUAUAUCAACCCC-Lx-GGGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3’
5’-GGGAAUUUCCACUAUAUCAACCC-Lx-GGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3’
5’-CCUUCAUCCGAAAGUUCUACACC-Lx-GGUGUAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3’
5’- GUUCUACACAGAGUUUGAUCGCC-Lx-GGCGAUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3’
5’-GUUGUUUUCCGAAAUGGAAAUCC-Lx-GGAUUUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3’
5’-GUUUUCCGAAAUGGAAAUUGGCC-Lx-GGCCAAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3’
5’-CCUAUAACCUUGCAUAUAAGUCC-Lx-GGACUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3’
5’-CCCUAUAACCUUGCAUAUAAGCC-Lx-GGCUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3’
5’-GGAGAAUGCAGUUCCUUUUAGCC-Lx-GGCUAAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3’ или
5’-GGGCUAAUAUGGAUACUAAAACC-Lx-GGUUUUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3’.
[13] Ингибитор экспрессии гена проренина или гена рецептора проренина, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты любой вышеуказанной [1]-[12].
[14] Лекарственное средство, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты любой вышеуказанной [1]-[12].
[15] Терапевтическое средство для заболевания глаз, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты любой вышеуказанной [1]-[12].
[16] Агент вышеуказанной [15], в котором заболевание глаз выбрано из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, увеита и возрастной макулярной дегенерации.
[17] Агент вышеуказанной [15], в которой заболевание глаз выбрано из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, увеита, возрастной макулярной дегенерации и глаукомы.
[18] Способ ингибирования экспрессии гена проренина или гена рецептора проренина, включающий применение молекулы нуклеиновой кислоты любой вышеуказанной [1]-[12].
[19] Способ вышеуказанной [18], включающий этап введения указанной выше молекулы нуклеиновой кислоты в клетку, ткань или орган.
[20] Способ вышеуказанной [19], в которой указанное выше выполняют in vitro.
[21] Молекула нуклеиновой кислоты любой вышеуказанной [1]-[12] для применения в ингибировании экспрессии гена проренина или гена рецептора проренина.
[22] Применение молекулы нуклеиновой кислоты любой вышеуказанной [1]-[12] для выработки ингибитора экспрессии гена проренина или гена рецептора проренина.
[Результат изобретения]
[0015] В соответствии с молекулой нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, экспрессию гена проренина или гена рецептора проренина можно в значительной степени ингибировать in vivo. Вследствие этого молекула нуклеиновой кислоты может быть перспективным кандидатом на терапевтическое лекарственное средство для заболевания, затрагивающего рецептор-ассоциированную прорениновую систему (RAPS), например, заболеваний глаз, таких как диабетическая ретинопатия, увеит, возрастная макулярная дегенерация и т.п. Кроме того, молекула может быть перспективным кандидатом на терапевтическое лекарственное средство для заболеваний глаз, таких как диабетическая ретинопатия, увеит, возрастная макулярная дегенерация, глаукома и т.п.
Краткое Описание чертежей
[0016] На фиг.1 показаны схематические виды, иллюстрирующие пример молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения.
Фиг. 2 представляет собой график, показывающий относительное значение уровня экспрессии гена проренина в примерах настоящего изобретения.
Фиг. 3 представляет собой график, показывающий относительное значение уровня экспрессии гена рецептора проренина в примерах настоящего изобретения.
Фиг. 4 представляет собой график, показывающий относительное значение уровня экспрессии человеческого гена рецептора проренина в примерах настоящего изобретения.
Фиг. 5 представляет собой график, показывающий относительное значение уровня экспрессии мышиного гена рецептора проренина в примерах настоящего изобретения.
Фиг. 6 представляет собой график, показывающий относительное значение уровня экспрессии крысиного гена рецептора проренина в примерах настоящего изобретения.
Фиг. 7 представляет собой график, показывающий относительное значение уровня экспрессии человеческого ген проренина в примерах настоящего изобретения.
Фиг. 8 представляет собой график, показывающий относительное значение уровней экспрессии генов CCL2/MCP-1, ICAM-1, IL-6, TNF-α в примерах настоящего изобретения.
На фиг. 9 показана устойчивость к нуклеазе одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты (A) и ингибирующее экспрессию действие на рецептор белка проренина одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты (B) в примерах настоящего изобретения.
На фиг. 10 показаны микрофотограммы стекловидного тела (A-D, F, G) и графики, показывающие количество лейкоцитов (E, H) в примерах настоящего изобретения.
Фиг. 11 представляет собой график, показывающий относительное значение уровней экспрессии генов провоспалительных цитокинов в примерах настоящего изобретения.
На фиг. 12 показаны микрофотограммы сетчатки (A-C), график, показывающий относительное значение длины наружного сегмента фоторецептора (D), и результаты иммуноблот-анализа родопсина (E) в примерах настоящего изобретения.
На фиг. 13 показаны микрофотограммы стекловидного тела (A-D), график, показывающий число лейкоцитов (E) и графики, показывающие относительное значение уровней экспрессии генов провоспалительных цитокинов (F-I) в примерах настоящего изобретения.
На фиг. 14 показан график, показывающий результаты измерения площади CNV (A) и микрофотограммы CNV (B-D) в примерах настоящего изобретения.
[Описание вариантов осуществления]
[0017] Если не указано иное, термины, используемые в настоящем описании, означают то, что обычно подразумевается ими в данной области техники.
[0018] 1. Молекула нуклеиновой кислоты для ингибирования экспрессии гена проренина или гена рецептора проренина
(1) Ингибирующая экспрессию последовательность и комплементарной последовательность
Молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения представляет собой, как указано выше, одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, ингибирующую экспрессию гена проренина или гена рецептора проренина, и характеризуется содержащейся ингибирующей экспрессию последовательностью гена проренина или гена рецептора проренина, содержащую нуклеотидную последовательность, состоящую по меньшей мере из 18 непрерывных нуклеотидов в любой нуклеотидной последовательности, выбранной из последовательности, комплементарной части гена проренина, представленной следующими SEQ ID №: 1-5 и последовательности, комплементарной части гена рецептора проренина, представленной следующими SEQ ID №: 6-11 (называемых «r нуклеотидной последовательностью»):
(SEQ ID №: 1) 5’-UGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3’
(SEQ ID №: 2) 5’-UUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3’
(SEQ ID №: 3) 5’-UGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3’
(SEQ ID №: 4) 5’-UAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3’
(SEQ ID №: 5) 5’-AUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3’
(SEQ ID №: 6) 5’-UUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3’
(SEQ ID №: 7) 5’-AAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3’
(SEQ ID №: 8) 5’-UUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3’
(SEQ ID №: 9) 5’-UAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3’
(SEQ ID №: 10) 5’-AAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3’
(SEQ ID №: 11) 5’-UUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3’
[0019] Указанная выше ингибирующая экспрессию последовательность может представлять собой, например, последовательность, состоящую из указанной выше r нуклеотидной последовательности, или последовательность, содержащую указанную выше r нуклеотидную последовательность. Когда указанная выше ингибирующая экспрессию последовательность представляет собой последовательность, содержащую r нуклеотидную последовательность, один или более нуклеотидов добавляют к 5’-концу и/или 3’-концу r нуклеотидной последовательности. В этом случае, поскольку ингибирующая экспрессию последовательность в целом комплементарна гену проренина или гену рецептора проренина, являющемуся мишенью (здесь «комплементарный» является такой, как это определено для указанной ниже комплементарной последовательности). С другой стороны, как упомянуто ниже, нуклеотиду (последовательность), не являющемуся ингибирующей экспрессию последовательностью в области (X или Xc), содержащей ингибирующую экспрессию последовательность в молекуле нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, не требуется быть комплементарным целевому гену.
[0020] Длина указанной выше ингибирующей экспрессию последовательности не ограничена конкретно и представляет собой, например, длину 18-32 нуклеотида, предпочтительно длину 19-30 нуклеотидов, более предпочтительно длину 19, 20, 21 нуклеотид. В настоящем изобретении, например, диапазон числовых значений числа оснований раскрывает все положительные целые числа, находящиеся в диапазоне. Например, указание «1-4 оснований» означает раскрытие любого из «1, 2, 3, 4 оснований» (здесь и далее то же самое).
[0021] Одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения дополнительно содержит комплементарную последовательность, соединенную с комплементарной нитью указанной выше ингибирующей экспрессию последовательности.
[0022] Не требуется, чтобы указанная выше комплементарная последовательность была полностью комплементарна, поскольку она может быть соединена с комплементарной нитью указанной выше ингибирующей экспрессию последовательности в физиологических условиях в намеченной клетке. То есть указанная выше комплементарная последовательность может представлять собой последовательность, имеющую 100% комплементарность в области перекрывания с указанной выше ингибирующей экспрессию последовательностью. В качестве альтернативы, она может быть комплементарна, например, на 90% - 100%, 93% - 100%, 95% - 100%, 98% - 100%, 99% - 100% или т.п.
[0023] Когда указанная выше ингибирующая экспрессию последовательность имеет r нуклеотидную последовательность в нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID №: n (n=1-11), указанные выше комплементарные последовательности содержат последовательности, комплементарные r нуклеотидным последовательностям в нуклеотидных последовательностях, показанных в следующих SEQ ID №: n+11 (называемых «s нуклеотидная последовательность»):
(SEQ ID №: 12) 5’-CCUAUCUUCGACAACAUCAUC-3’
(SEQ ID №: 13) 5’-GGAAUUUCCACUAUAUCAACC-3’
(SEQ ID №: 14) 5’-GGGAAUUUCCACUAUAUCAAC-3’
(SEQ ID №: 15) 5’-CCUUCAUCCGAAAGUUCUACA-3’
(SEQ ID №: 16) 5’-GUUCUACACAGAGUUUGAUCG-3’
(SEQ ID №: 17) 5’-GUUGUUUUCCGAAAUGGAAAU-3’
(SEQ ID №: 18) 5’-GUUUUCCGAAAUGGAAAUUGG-3’
(SEQ ID №: 19) 5’-CCUAUAACCUUGCAUAUAAGU-3’
(SEQ ID №: 20) 5’-CCCUAUAACCUUGCAUAUAAG-3’
(SEQ ID №: 21) 5’-GGAGAAUGCAGUUCCUUUUAG-3’
(SEQ ID №: 22) 5’-GGGCUAAUAUGGAUACUAAAA-3’
[0024] Указанная выше комплементарная последовательность может представлять собой, например, последовательность, состоящую из указанной выше s нуклеотидной последовательности, или последовательности, содержащей указанную выше s нуклеотидную последовательность.
[0025] Длина указанной выше комплементарной последовательности не ограничена конкретно и представляет собой, например, длину 18-32 нуклеотида, предпочтительно длину 19-30 нуклеотидов, более предпочтительно длину 19, 20, 21 нуклеотид.
[0026] Указанная выше ингибирующая экспрессию последовательность и указанная выше комплементарная последовательность каждая могут представлять собой, например, молекулу РНК, состоящую только из рибонуклеотидных остатков, или молекулу РНК, содержащую помимо рибонуклеотидных остатков дозоксирибонуклеотидный остаток. Когда урациловый (U) остаток замещен дозоксирибонуклеотидным остатком, он необязательно замещен либо dT, либо dU.
[0027] (2) Одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
В молекуле нуклеиновой кислоты настоящего изобретения область, содержащая указанную выше ингибирующую экспрессию последовательность, и область, содержащая указанную выше комплементарную последовательность, опосредованно связаны через линкерную область. Порядок связывания области, содержащей указанную выше ингибирующую экспрессию последовательность, и области, содержащую указанную выше комплементарную последовательность, не ограничена конкретно и, например, сторона 5’-конца указанной выше ингибирующей экспрессию последовательности и сторона 3’-конца указанной выше комплементарной последовательности могут быть связаны через линкерную область, или сторона 3’-конца указанной выше ингибирующей экспрессию последовательности и сторона 5’-конца указанной выше комплементарной последовательности могут быть связаны через линкерную область. Предпочтительным является первое.
[0028] Указанная выше линкерная область может быть составлена из, например, нуклеотидных остатков, может быть образована ненуклеотидными остатками, или может быть образована как нуклеотидными остатками, так и ненуклеотидными остатками. Предпочтительно, указанная выше линкерная область состоит из ненуклеотидного остатка.
[0029] При том, что конкретные примеры одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения показаны ниже, настоящее изобретение ими не ограничивается.
(Одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты шпилечного типа)
В одном предпочтительном варианте осуществления одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения представляет собой молекулу, в которой область 5’-стороны и область 3’-стороны взаимно соединены комплементарными нитями с образованием двухцепочечной структуры (стеблевой структуры). Это также можно назвать формой кшРНК (малая шпилечная РНК или короткая шпилечная РНК). кшРНК имеет шпилькообразную структуру и в целом одну стеблевую область и одну петлевую область.
[0030] Молекула нуклеиновой кислоты в этой форме содержит только область (X), линкерную область (Lx) и область (Xc), и имеет структуру, в которой указанная выше область (X) и указанная выше область (Xc), обладающие комплементарной структурой, связаны посредством указанной выше линкерной области (Lx). Конкретно, одна из указанной выше области (X) и указанной выше области (Xc) содержит указанную выше ингибирующую экспрессию последовательность, а другая содержит указанную выше комплементарную последовательность. Вследствие этого они могут формировать стеблевую структуру между указанной выше областью (X) и указанной выше областью (Xc) посредством внутримолекулярного отжига, и указанная выше линкерная область (Lx) становится петлевой структурой.
[0031] Указанная выше молекула нуклеиновой кислоты может иметь указанную выше область (Xc), указанную выше линкерную область (Lx) и указанную выше область (X) от 5’-стороны к 3’-стороне в этом порядке, или от 3’-стороны к 5’-стороне в этом порядке. Предпочтительным является первое. При том, что указанная выше ингибирующая экспрессию последовательность может быть размещена в любой из указанной выше области (X) и указанной выше области (Xc), она предпочтительно размещена на стороне после указанной выше комплементарной последовательности, то есть на 3’-стороне, нежели указанная выше комплементарной последовательность. Вследствие этого, когда указанная выше молекула нуклеиновой кислоты имеет указанную выше область (Xc), указанную выше линкерную область (Lx) и указанную выше область (X) от 5’-стороны к 3’-стороне в этом порядке, указанная выше ингибирующая экспрессию последовательность предпочтительно размещена в указанной выше области (X).
[0032] Один вариант осуществления молекулы нуклеиновой кислоты в этой форме в схематическом рисунке Фиг. 1. Фиг. 1(A) представляет собой схематический чертеж схемы порядка каждой области, Фиг. 1(B) представляет собой схематический чертеж, демонстрирующий, что указанная выше молекула нуклеиновой кислоты образует двойную нить в указанной выше молекуле. Как показано на Фиг. 1(B), указанная выше молекула нуклеиновой кислоты образует двойную нить между указанной выше областью (Xc) и указанной выше областью (X), а указанная выше Lx область имеет петлевую структуру в соответствии со своей длиной. Фиг. 1 показывает исключительно порядок указанных выше областей и взаимное расположение каждой области, формирующей двойную нить, а, например, длина каждой области, форма указанной выше линкерной области (Lx) и т.п этим не ограничиваются.
[0033] В указанной выше молекуле нуклеиновой кислоты число нуклеотидов в указанной выше области (Xc) и указанной выше области (X) не ограничено конкретно. При том, что примеры длины каждой области показаны ниже, настоящее изобретение ими не ограничивается.
[0034] Нижняя граница числа нуклеотидов в указанной выше области (X) составляет, например, 19, предпочтительно 20. Верхняя его граница составляет, например, 50, предпочтительно 30, более предпочтительно 25. Конкретные примеры числа нуклеотидов в указанной выше области (X) составляют 19-50, предпочтительно 19-30, более предпочтительно 19-25.
[0035] Нижняя граница числа нуклеотидов в указанной выше области (Xc) составляет, например, 19, предпочтительно 20. Верхняя его граница составляет, например, 50, предпочтительно 30, более предпочтительно 25. Конкретные примеры числа нуклеотидов в указанной выше области (Xc) составляют 19-50, предпочтительно 19-30, более предпочтительно 19-25.
[0036] Область, содержащая указанную выше ингибирующую экспрессию последовательность (X или Xc), может быть образована только указанной выше ингибирующей экспрессию последовательностью или может содержать указанную выше ингибирующую экспрессию последовательность. Число нуклеотидов в указанной выше ингибирующей экспрессию последовательности является таким, как указано выше. Область, содержащая указанную выше ингибирующую экспрессию последовательность, может дополнительно иметь добавочную последовательность на 5’-стороне и/или 3’-стороне указанной выше ингибирующей экспрессию последовательности. Добавочная последовательность предпочтительно добавлена к стороне указанной выше линкерной области (Lx). Как описано выше, когда молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения имеет указанную выше область (Xc), указанную выше линкерную область (Lx) и указанную выше область (X) в этом порядке от 5’-стороны к 3’-стороне, указанная выше ингибирующая экспрессию последовательность предпочтительно размещена в указанной выше области (X), и в этом случае добавочная последовательность добавлена к 5’-стороне указанной выше ингибирующей экспрессию последовательности. Число нуклеотидов в указанной выше добавочной последовательности составляет, например, 1-31 нуклеотид, предпочтительно 1-21 нуклеотид, более предпочтительно 1-11 нуклеотидов, особенно предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидов.
Когда область, содержащая указанную выше ингибирующую экспрессию последовательность (одну из X и Xc) имеет добавочную последовательность на стороне указанной выше линкерной области (Lx), область, содержащая указанную выше комплементарную последовательность (другую из X и Xc), также содержит последовательность, комплементарную добавочной последовательности на стороне указанной выше линкерной области (Lx).
[0037] Отношение между количеством нуклеотидов (X) в вышеупомянутой области (X) и количеством нуклеотидов (Xc) в вышеупомянутой области (Xc) удовлетворяет, например, условиям следующих (1) или (2). В первом случае, в частности, оно удовлетворяет, например, условиям следующего (4). Например, молекула нуклеиновой кислоты, схематически показанная на фиг.1 (B), удовлетворяет условиям следующего (1):
X>Xc... (1)
X-Xc=1-10, предпочтительно 1, 2 или 3,
более предпочтительно 1 или 2... (4)
X=Xc... (2)
[0038] Указанная выше линкерная область (Lx) предпочтительно представляет собой структуру, не содержащую самоотжига в самой области.
[0039] Когда указанная выше область (Lx) содержит нуклеотидный остаток, как указано выше, ее длина не ограничена конкретно. Указанная выше линкерная область (Lx) предпочтительно имеет длину, например, допускающую формирование двойной нити указанной выше областью (X) и указанной выше областью (Xc). Нижняя граница числа нуклеотидов в указанной выше линкерной области (Lx) составляет, например, 1, предпочтительно 2, более предпочтительно 3, а верхняя его граница составляет, например, 100, предпочтительно 80, более предпочтительно 50.
[0040] Общая длина указанной выше молекулы нуклеиновой кислоты не ограничена конкретно. В указанной выше молекуле нуклеиновой кислоты нижняя граница общего указанного выше числа нуклеотидов (число нуклеотидов общей длины), когда указанная выше линкерная область (Lx) содержит нуклеотидный остаток, составляет, например, 38, предпочтительно 42, более предпочтительно 50, дополнительно предпочтительно 51, особенно предпочтительно 52, а верхняя его граница составляет, например, 300, предпочтительно 200, более предпочтительно 150, дополнительно предпочтительно 100, особенно предпочтительно 80.
В указанной выше молекуле нуклеиновой кислоты нижняя граница общего числа нуклеотидов, за исключением указанной выше линкерной области (Lx) составляет, например, 36, предпочтительно 38. Верхняя его граница составляет, например, 100, предпочтительно 80, более предпочтительно 60, дополнительно предпочтительно 50. Конкретные примеры полной длины числа нуклеотидов составляют, например, 36-100, предпочтительно 38-80, более предпочтительно 42-60, дополнительно предпочтительно 42-50.
[0041] В более предпочтительном варианте осуществления одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения имеет указанную выше линкерную область (Lx) с ненуклеотидной структурой.
[0042] Указанная выше ненуклеотидная структура не ограничена конкретно и, например, можно упомянуть полиалкиленгликоль, пирролидиновый скелет, пиперидиновый скелет и т.п. В качестве указанного выше полиалкиленгликоля можно упомянуть, например, полиэтиленгликоль.
[0043] В качестве указанного выше пирролидинового скелета, например, можно упомянуть скелет производного пирролидина, в котором один или более углеродов, составляющих 5-членное кольцо пирролидина, замещены. Когда углерод замещен, он представляет собой предпочтительно, например, атом углерода не являющийся C-2 углеродом. Указанный выше углерод может быть, например, замещен кислородом или серой. Указанный выше пирролидиновый скелет также может содержать, например, в 5-членном кольце пирролидина, например, двойную углерод-углеродную связь или двойную углерод-азотную связь. В указанном выше пирролидиновом скелете углерод и азот, составляющие 5-членное кольцо пирролидина, могут быть связаны, например, с водородом или указанным ниже заместителем. Указанная выше линкерная область (Lx) может быть связана с указанной выше областью (X) и указанной выше областью (Xc), например, посредством любой группы указанного выше пирролидинового скелета. Она представляет собой любой один атом углерода или азота указанного выше 5-членного кольца, предпочтительно, углерод в 2-позиции (C-2) или азот указанного выше 5-членного кольца. Примеры указанного выше пирролидинового скелета включают пролиновый скелет, пролиноловый скелет и т.п. Указанный выше пролиновый скелет и пролиноловый скелет и т.п. также превосходны по безопасности, поскольку они представляют собой, например, вещества, присутствующие в живых организмах и их восстановителях.
[0044] В качестве указанного выше пиперидинового скелета можно упомянуть, например, скелет производного пирролидина, в которой один или более углеродов, составляющие 6-членное кольцо пиперидина, замещены. Когда углерод замещен, он представляет собой, предпочтительно, например, атом углерода, не являющийся C-2 углеродом. Указанный выше углерод может быть, например, замещен азотом, кислородом или серой. Указанный выше пиперидиновый скелет также может содержать, например, в 6-членном кольце пиперидина, например, двойную углерод-углеродную связь или двойную углерод-азотную связь. В указанном выше пиперидиновом скелете углерод и азот, составляющие 6-членное кольцо пиперидина, могут быть связаны, например, с группой водорода или указанным ниже заместителем. Указанная выше линкерная область (Lx) может быть связана с указанной выше областью (X) и указанной выше областью (Xc), например, посредством любой группы указанного выше пиперидинового скелета. Она представляет собой любой один атом углерода или азота указанного выше 6-членного кольца, более предпочтительно, углерод в 2-позиции (C-2) или азот указанного выше 6-членного кольца.
[0045] Указанная выше линкерная область может быть образована, например, ненуклеотидным остатком, имеющим только указанную выше ненуклеотидную структуру, или может содержать ненуклеотидный остаток, имеющий указанную выше ненуклеотидную структуру и нуклеотидный остаток.
[0046] Указанная выше линкерная область представлена, например, следующей формулой (I):
[0047]  [0048] В указанной выше формуле (I), например,
1
2
2
X и X каждый представляют собой независимо H, O, S или NH;
1
2
Y и Y каждый представляют собой независимо простую связь, CH2, NH, O или S;
3
R представляет собой атом водорода или заместитель, связанный с C-3, C-4, C-5 или C-6 на кольце A,
1
a
a
b
a
2
L представляет собой алкиленовую цепь, состоящую из n атомов, и атом водорода на атоме углерода алкилена может быть замещен или не быть замещен на OH, ORa, NH, NHR, NRR, SH или SR, или
1
L представляет собой эфирную цепь, полученную посредством замещения по меньшей мере одного атом углерода на указанную выше алкиленовой цепи на атом кислорода,
1
1
1
1
1
при условиях, что: когда Y представляет собой NH, O или S, атом, связанный с Y в L, представляет собой углерод, атом, связанный с OR в L, представляет собой углерод, а атомы кислород не примыкают друг к другу;
2
c
c
c
d
c
2
L представляет собой алкиленовую цепь, состоящую из m атомов, и атом водорода на атоме углерода алкилена может быть замещен или не быть замещен на OH, OR, NH, NHR, NRR, SH, или SR, or
L2 представляет собой эфирную цепь, полученную посредством замещения по меньшей мере одного атома углерода на указанной выше алкиленовой цепи на атом кислорода,
2
2
2
2
2
при условиях, что: когда Y представляет собой NH, O, или S, атом, связанный с Y в L, представляет собой углерод, атом, связанный с OR в L, представляет собой углерод, а атомы кислород не примыкают друг к другу;
a
b
c
d
R, R, R и R каждый представляют собой независимо заместитель или защитную группу;
l представляет собой 1 или 2;
m представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 30;
n представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 30;
в кольце A один атом углерода, не являющийся C-2 на указанном выше кольце A, может быть замещен азотом, кислородом или серой,
указанное выше кольцо A может содержать двойную углерод-углеродную связь или двойную углерод-азотную связь,
1
2
указанные выше области (Xc) и (X) каждая связаны с указанной выше линкерной областью (Lx) посредством -OR- или -OR-,
1
2
1
2
при этом R и R могут присутствовать или могут не присутствовать, и когда они присутствуют, R и R каждый представляют собой независимо нуклеотидный остаток или указанную выше структуру (I).
1
2
1
1
1
2
2
[0049] В указанной выше формуле (I), например, X и X каждый представляют собой независимо H, O, S или NH. В указанной выше формуле (I) «X представляет собой H2» означает, что X образует CH2 (метиленовую группу) вместе с атомом углерода, с которым связан X. То же самое применимо к X.
1
2
2
[0050] В указанной выше формуле (I) Y и Y каждый представляют собой независимо простую связь, CH, NH, O или S.
[0051] В указанной выше формуле (I) в кольце A l представляет собой 1 или 2. Когда l=1, кольцо A представляет собой 5-членное кольцо, например, указанный выше пирролидиновый скелет. Указанный выше пирролидиновый скелет представляет собой, например, пролиновый скелет, пролиноловый скелет или т.п., и примерами которых являются его двухвалентные структуры. Когда l=2, кольцо А представляет собой 6-членное кольцо, например, указанный выше пиперидиновый скелет. В кольце A один атом углерода, не являющийся C-2 на кольце A, может быть замещен азотом, кислородом или серой. Кольцо А может содержать в кольце A двойную углерод-углеродную связь или двойную углерод-азотную связь. Кольцо А представляет собой кольцо, например, L типа или D типа.
3
3
3
[0052] В указанной выше формуле (I) R представляет собой атом водорода или заместитель, связанный с C-3, C-4, C-5 или C-6 на кольце A. Когда R представляет собой указанный выше заместитель, заместитель R может представлять собой одно, или множество, или отсутствовать, а когда он находится во множестве, они могут представлять собой то же самое или отличаться.
3
4
4
4
5
4
2
[0053] Заместитель R представляет собой, например, галоген, OH, OR, NH, NHR, NRR, SH, SR или оксогруппу(=O) и т.п.
4
5
3
[0054] Например, R и R каждый представляют собой независимо заместитель или защитную группу, и могут представлять собой то же самое или отличаться. Примеры указанного выше заместителя включают галоген, алкил, алкенил, алкинил, галоалкил, арил, гетероарил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкенил, циклоалкилалкил, циклилалкил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, аминоалкил, гетероциклилалкенил, гетероциклилалкил, гетероарилалкил, силил, силилоксиалкил и т.п. Здесь и далее применяется то же самое. Заместитель R может быть среди этих перечисленных заместителей.
3
4
[0055] Указанная выше защитная группа представляет собой, например, функциональную группу, которая инактивирует высокоактивную функциональную группу. Примеры защитной группы включают известные защитные группы. В отношении указанной выше защитной группы, например, описание в литературе (J.F.W. McOmie, «Protecting Groups in Organic Chemistry», Prenum Press, London and New York, 1973) может быть включено в данном документе. Указанная выше защитная группа не ограничена конкретно, и ее примеры включают трет-бутилдиметилсилильную группу (TBDMS), бис(2-ацетооксиэтилокси)метильную группу (ACE), триизопропилсилилоксиметильную группу (TOM), 1-(2-цианоэтокси)этильную группу (CEE), 2-цианоэтоксиметильную группу (CEM), толилсульфонилэтоксиметильную группу (TEM) и диметокситритильную группу (DMTr). Когда R представляет собой OR, указанная выше защитная группа не ограничена конкретно, и ее примеры включают TBDMS группу, ACE группу, TOM группу, CEE группу, CEM группу и TEM группу. Здесь и далее применяется то же самое.
1
a
a
a
b
a
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
[0056] В указанной выше формуле (I) L представляет собой алкиленовую цепь, состоящую из n атомов. Атом(атомы) водорода на указанном выше атом(атомах) углерода алкилена может быть замещен или не быть замещен, например, на OH, OR, NH, NHR, NRR, SH или SR. В качестве альтернативы, L может представлять собой эфирную цепь, полученную посредством замещения по меньшей мере одного атома углерода на указанной выше алкиленовой цепи на атом кислорода. Указанная выше полиэфирная цепь представляет собой, например, полиэтиленгликоль. Когда Y представляет собой NH, O или S, атом, связанный с Y в L, представляет собой углерод, атом, связанный с OR в L, представляет собой углерод, а атомы кислорода не примыкают друг к другу. То есть, например, когда Y представляет собой O, этот атом кислорода и атом кислорода в L не примыкают друг к другу, и атом кислорода в OR и атом кислорода в L не примыкают друг к другу.
2
c
c
c
d
c
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
[0057] В указанной выше формуле (I) L представляет собой алкиленовую цепь, состоящую из m атомов. Атом(атомы) водорода на указанном выше атом(атомах) углерода алкилена может быть замещен или не быть замещен, например, на OH, OR, NH, NHR, NRR, SH или SR. В качестве альтернативы, L2 может представлять собой эфирную цепь, полученную посредством замещения по меньшей мере одного атома углерода на указанной выше алкиленовой цепи на атом кислорода. Когда Y представляет собой NH, O или S, атом, связанный с Y в L, представляет собой углерод, атом, связанный с OR в L, представляет собой углерод, а атомы кислорода не примыкают друг к другу. То есть, например, когда Y представляет собой O, этот атом кислорода и атом кислорода в L не примыкают друг к другу, и атом кислорода в OR и атом кислорода в L не примыкают друг к другу.
1
2
[0058] n L и m L не ограничены конкретно, и нижняя граница каждого из них может представлять собой 0, например, а верхняя граница того же самого не ограничена конкретно. Например, n и m установлены соответствующим образом в зависимости от желаемой длины указанной выше линкерной области (Lx). Например, с точки зрения стоимости производства, выхода и т.п., n и m каждый представляют собой предпочтительно от 0 до 30, более предпочтительно от 0 до 20, и еще более предпочтительно от 0 до 15. n и m могут представлять собой то же самое (n=m) или отличаться. n+m составляет, например, от 0 до 30, предпочтительно от 0 до 20, и более предпочтительно от 0 до 15.
a
b
c
d
[0059] R, R, R и R каждый представляют собой, например, независимый заместитель или защитную группу. Примеры указанного выше заместителя и указанной выше защитной группы представляют собой то же самое, как и указанные выше.
[0060] В указанной выше формуле (I) атомы водорода, например, каждый независимо может быть замещен на галоген, такой как Cl, Br, F или I.
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
[0061] Указанные выше области (Xc) и (X) связаны с указанной выше линкерной областью (Lx) посредством -OR- или -OR-, соответственно. R и R могут присутствовать или могут не присутствовать. Когда R и R присутствуют, R и R каждый представляют собой независимо нуклеотидный остаток или структуру, представленную указанной выше формулой (I). Когда R и/или R представляют собой/представляет собой указанный выше нуклеотидный остаток, указанная выше линкерная область (Lx) образована, например, указанным выше ненуклеотидным остатком, имеющим структуру указанной выше формулы (I), за исключением нуклеотидного остатка R и/или R, и указанным выше нуклеотидным остатком(остатками). Когда R и/или R представляют собой/представляет собой структуру, представленную указанной выше формулой (I), структура указанной выше линкерной области (Lx) является такой, как, например, два или более указанных выше ненуклеотидных остатков, имеющих структуру указанной выше формулы (I), связанные друг с другом. Число структур указанной выше формулы (I) может составлять, например, 1, 2, 3 или 4. Когда линкерная область (Lx) содержит множество указанных выше структур, структуры указанной выше (I) предпочтительно непосредственно связаны. С другой стороны, когда R и R не присутствуют, указанная выше линкерная область (Lx) состоит из указанного выше ненуклеотидного остатка, имеющего структуру только указанной выше формулы (I).
1
2
[0062] Комбинация указанных выше областей (Xc) и (X) с указанными выше -OR- и -OR- не ограничена конкретно, и может представлять собой, например, любое из следующих состояний:
Состояние (1):
2
1
Указанные выше области (Xc) и (X) связаны со структурой указанной выше формулы (I) посредством -OR- и -OR-, соответственно.
Состояние (2)
1
2
Указанные выше области (Xc) и (X) связаны со структурой указанной выше формулы (I) посредством -OR- и -OR-, соответственно.
[0063] Примеры структуры указанной выше формулы (I) включают структуры следующих формул (I-1)-(I-9). В следующих формулах n и m представляют собой то же самое, что и в указанной выше формуле (I). В следующих формулах q представляет собой целое число от 0 до 10.
[0064]
[0065] В указанных выше формулах (I-1) - (I-9) n, m и q не ограничены конкретно, и являются такими, как описано выше. Их конкретные примеры включают указанную выше формулу (I-1), в которой n=8, указанную выше (I-2), в которой n=3, указанную выше формулу (I-3), в которой n=4 или 8, указанную выше (I-4), в которой n=7 или 8, указанную выше формулу (I-5), в которой n=3 и m=4, указанную выше (I-6), в которой n=8 и m=4, n=5 и m=4, указанную выше формулу (I-7), в которой n=8 и m=4, указанную выше (I-8), в которой n=5 и m=4, n=8 и m=4, и указанную выше формулу (I-9), в которой q=1 и m=4. Один вариант осуществления (n=8) указанной выше формулы (I-4) показан в следующей формуле (I-4a), и один вариант осуществления (n=5, m=4) указанной выше формулы (I-6) показан в следующей формуле (I-6a).
[0066]
[0067] В особенно предпочтительном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения имеет любую из следующих структурных формул.
(SEQ ID №: 65-Lx-SEQ ID №: 23)
5’-CCUAUCUUCGACAACAUCAUCCC-Lx-GGGAUGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3’
(SEQ ID №: 66-Lx-SEQ ID №: 24)
5’-GGAAUUUCCACUAUAUCAACCCC-Lx-GGGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3’
(SEQ ID №: 67-Lx-SEQ ID №: 25)
5’-GGGAAUUUCCACUAUAUCAACCC-Lx-GGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3’
(SEQ ID №: 68-Lx-SEQ ID №: 26)
5’-CCUUCAUCCGAAAGUUCUACACC-Lx-GGUGUAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3’
(SEQ ID №: 69-Lx-SEQ ID №: 27)
5’-GUUCUACACAGAGUUUGAUCGCC-Lx-GGCGAUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3’
(SEQ ID №: 70-Lx-SEQ ID №: 28)
5’-GUUGUUUUCCGAAAUGGAAAUCC-Lx-GGAUUUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3’
(SEQ ID №: 71-Lx-SEQ ID №: 29)
5’-GUUUUCCGAAAUGGAAAUUGGCC-Lx-GGCCAAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3’
(SEQ ID №: 72-Lx-SEQ ID №: 30)
5’-CCUAUAACCUUGCAUAUAAGUCC-Lx-GGACUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3’
(SEQ ID №: 73-Lx-SEQ ID №: 31)
5’-CCCUAUAACCUUGCAUAUAAGCC-Lx-GGCUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3’
(SEQ ID №: 74-Lx-SEQ ID №: 32)
5’-GGAGAAUGCAGUUCCUUUUAGCC-Lx-GGCUAAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3’
(SEQ ID №: 75-Lx-SEQ ID №: 33)
5’-GGGCUAAUAUGGAUACUAAAACC-Lx-GGUUUUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3’,
в которых Lx представляет собой любую из указанных выше линкерных областей. Предпочтительно, Lx имеет структуру вышеуказанной формулы (I), более предпочтительно, любую из вышеуказанных формул (I-1)-(I-9), еще более предпочтительно, вышеуказанной формулы (I-4a) или (I-6a), особенно предпочтительно, вышеуказанной формулы (I-6a).
Среди них особенно предпочтительной является одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты, состоящая из нуклеотидных последовательностей, показанных в SEQ ID №: 72-Lx-SEQ ID №: 30, SEQ ID №: 73-Lx-SEQ ID №: 31 и SEQ ID №: 74-Lx-SEQ ID №: 32.
[0068] Составные звенья молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения не ограничены конкретно, и можно упомянуть нуклеотидные остатки. Примеры указанных выше нуклеотидных остатков включают рибонуклеотидный остаток и дозоксирибонуклеотидный остаток. Указанный выше нуклеотидный остаток может представлять собой, например, нуклеотидный остаток, который является немодифицированным (немодифицированный нуклеотидный остаток) или нуклеотидный остаток, который был модифицирован (модифицированный нуклеотидный остаток). Посредством конфигурирования молекулы нуклеиновой кислоты для включения вышеупомянутого модифицированного нуклеотидного остатка, например, можно улучшить устойчивость молекулы нуклеиновой кислоты к нуклеазе, что позволит улучшить стабильность молекулы нуклеиновой кислоты. Кроме того, в дополнение к указанному выше нуклеотидному остатку молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения дополнительно может содержать, например, ненуклеотидный остаток.
[0069] В молекуле нуклеиновой кислоты настоящего изобретения составное звено каждой из областей, не являющейся указанным выше линкером, представляет собой предпочтительно указанный выше нуклеотидный остаток. Каждая из указанных выше областей образована, например, любым из следующих остатков (1)-(3):
(1) немодифицированный нуклеотидный остаток(остатки)
(2) модифицированный нуклеотидный остаток(остатки)
(3) немодифицированный нуклеотидный остаток(остатки) и модифицированный нуклеотидный остаток(остатки).
[0070] В молекуле нуклеиновой кислоты настоящего изобретения составное звено указанной выше линкерной области не ограничено конкретно, и его примеры включают указанные выше нуклеотидные остатки и указанные выше ненуклеотидные остатки. Указанная выше линкерная область может быть образована, например, только указанным выше нуклеотидным остатком, только указанным выше ненуклеотидным остатком, или как указанным выше нуклеотидным остатком, так и указанным выше ненуклеотидным остатком. Указанная выше линкерная область образована, например, любым из следующих остатков (1)-(7):
(1) немодифицированный нуклеотидный остаток(остатки)
(2) модифицированный нуклеотидный остаток(остатки)
(3) немодифицированный нуклеотидный остаток(остатки) и модифицированный нуклеотидный остаток(остатки)
(4) ненуклеотидный остаток(остатки)
(5) ненуклеотидный остаток(остатки) и немодифицированный нуклеотидный остаток(остатки)
(6) ненуклеотидный остаток(остатки) и модифицированный нуклеотидный остаток(остатки)
(7) ненуклеотидный остаток(остатки), немодифицированный нуклеотидный остаток(остатки) и модифицированный нуклеотидный остаток(остатки).
[0071] Примеры молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения включают молекулы, состоящие только из указанных выше нуклеотидных остатков; и молекулы, содержащие указанный выше ненуклеотидный остаток(остатки) в дополнение к указанным выше нуклеотидным остаткам. В молекуле нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, например, указанные выше нуклеотидные остатки могут представлять собой только указанные выше немодифицированные нуклеотидные остатки; только указанные выше модифицированные нуклеотидные остатки; или как указанный выше немодифицированный нуклеотидный остаток(остатки), так и указанный выше модифицированный нуклеотидный остаток(остатки), как описано выше. Когда указанная выше молекула нуклеиновой кислоты содержит и указанный выше немодифицированный нуклеотидный остаток(остатки), и указанный выше модифицированный нуклеотидный остаток(остатки), число указанного выше модифицированного нуклеотидного остатка(остатков) не ограничено конкретно, и составляет, например, «один к нескольким», конкретно, например, 1 к 5, предпочтительно 1 к 4, более предпочтительно 1 к 3, и наиболее предпочтительно 1 или 2. Когда молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит указанный выше ненуклеотидный остаток(остатки), число указанного выше ненуклеотидного остатка(остатков) не ограничено конкретно, и составляет, например, «один к нескольким», конкретно, например, 1-8, 1-6, 1-4, 1, 2 или 3.
[0072] Когда указанная выше молекула нуклеиновой кислоты содержит, например, указанный выше модифицированный рибонуклеотидный остаток(остатки) в дополнение к указанным выше немодифицированным рибонуклеотидным остаткам, число указанного выше модифицированного рибонуклеотидного остатка(остатков) не ограничено конкретно и составляет, например, «один к нескольким», конкретно, например, 1 к 5, предпочтительно 1 к 4, более предпочтительно 1 к 3, и наиболее предпочтительно 1 или 2. Указанный выше модифицированный рибонуклеотидный остаток, в противоположность указанному выше немодифицированному рибонуклеотидному остатку, может представлять собой, например, указанный выше дезоксирибонуклеотидный остаток, полученный посредством замещения остатка рибозы остаток на остаток дезоксирибозы. Когда указанная выше молекула нуклеиновой кислоты содержит, например, указанный выше дезоксирибонуклеотидный остаток(остатки) в дополнение к указанному выше немодифицированному рибонуклеотидному остатку(остатки), число указанного выше дезоксирибонуклеотидного остатка(остатков) не ограничено конкретно, и составляет, например, «один к нескольким», конкретно, например, 1 к 5, предпочтительно 1 к 4, более предпочтительно 1 к 3 и наиболее предпочтительно 1 или 2.
2
13
15
17
18
33
34
36
[0073] Молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения может содержать, например, метящее вещество, и может быть мечена указанным выше метящим веществом. Указанное выше метящее вещество не ограничено конкретно и может представлять собой, например, флуоресцентное вещество, краситель, изотоп или т.п. Примеры указанного выше метящего вещества включают: флуорофоры, такие как пирен, TAMRA, флюоресцеин, краситель Cy3 и краситель Cy5. Примеры указанного выше красителя включают красители Alexa, такие как Alexa 488. Примеры указанного выше изотопа включают стабильные изотопы и радиоизотопы. Среди них стабильные изотопы являются предпочтительными. Например, указанные выше стабильные изотопы имеют низкий риск воздействия излучением и они не требуют специального оборудования. Таким образом, стабильные изотопы превосходны в управляемости и могут способствовать снижению затрат. Более того, например, указанный выше стабильный изотоп не изменяет физических свойств меченного им соединения и, таким образом, обладает отличным свойством в качестве индикатора. Вышеупомянутый стабильный изотоп не ограничен конкретно, и его примеры включают H, C, N, O, O, S, S, и S.
2. Нуклеотидный остаток, образующий одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты
[0074]
В качестве своих компонентов указанный выше нуклеотидный остаток содержит, например, сахар, основание и фосфат. Указанный выше нуклеотидный остаток может представлять собой, например, рибонуклеотидный остаток или дозоксирибонуклеотидный остаток, как описано выше. Указанный выше рибонуклеотидный остаток имеет, например, в качестве сахара остаток рибозы; а в качестве основания аденин (A), гуанин (G), цитозин (C) или урацил (U). Указанный выше дезоксирибозный остаток имеет, например, остаток дезоксирибозы в качестве сахара; и аденин (A), гуанин (G), цитозин (C) или тимин (T) в качестве основания.
[0075] Указанный выше нуклеотидный остаток может представлять собой немодифицированный нуклеотидный остаток или модифицированный нуклеотидный остаток. Указанные выше компоненты указанного выше немодифицированного нуклеотидного остатка представляют собой то же самое или по существу то же самое, что и, например, компоненты нуклеотидного остатка природного происхождения. Предпочтительно, компоненты представляют собой то же самое или по существу то же самое, что и компоненты нуклеотидного остатка природного происхождения в организме человека.
[0076] Указанный выше модифицированный нуклеотидный остаток представляет собой, например, нуклеотидный остаток, полученный посредством модифицирования указанного выше немодифицированного нуклеотидного остатка. Например, указанный выше модифицированный нуклеотидный остаток может быть таким, чтобы был модифицирован любой из компонентов указанного выше немодифицированного нуклеотидного остатка. В настоящем изобретении «модификация» означает, например, замещение, добавление и/или делецию любого из указанных выше компонентов; и замещение, добавление и/или делецию атома(атомов) и/или функциональной группы(групп) в указанном выше компоненте(компонентах). Это тоже может называться «модификацией». Примеры указанного выше модифицированного нуклеотидного остатка включают нуклеотидные остатки природного происхождения и искусственно модифицированные нуклеотидные остатки. Что касается вышеупомянутых модифицированных нуклеотидных остатков естественного происхождения, можно упомянуть, например, Limbach et al. (Limbach et al., 1994, Summary: the modified nucleosides of RNA, Nucleic Acids Res. 22: pp. 2183 to 2196). Указанный выше модифицированный нуклеотидный остаток может представлять собой, например, остаток альтернативного указанного выше нуклеотида.
[0077] Примеры модификации указанного выше нуклеотидного остатка включают модификацию рибозофосфатной основы (здесь и далее называемой «рибофосфатная основа»).
[0078] В указанной выше рибофосфатной основе, например, остаток рибозы может быть модифицирован. В указанном выше остатке рибозы, например, углерод в 2’-позиции может быть может модифицирован. Конкретно, например, гидроксильная группа, связанная с углеродом в 2’-позиции, может быть замещена на водород или галоген, такой как фтор. Посредством замещения гидроксильной группы, связанной с указанным выше углеродом в 2’-позиции, на водород, можно заменить остаток рибозы на дезоксирибозу. Указанный выше остаток рибозы может быть замещен на ее стероизомер, например, и может быть замещен, например, на остаток арабинозы.
[0079] Указанная выше рибофосфатная основа может быть замещена, например, на нерибофосфатную основу, имеющую нерибозный остаток и/или нефосфат. Указанная выше нерибофосфатная основа может представлять собой, например, указанную выше рибофосфатную основу, модифицированную, чтобы не иметь заряд. Примеры альтернативы, полученной посредством замещения рибофосфатной основы на указанную выше нерибофосфатную основу в указанном выше нуклеотиде, включают морфолино, циклобутил и пирролидин. Другие примеры указанной выше альтернативы включают мономерные остатки искусственных нуклеиновых кислот. Конкретные его примеры включают PNA (пептидную нуклеиновую кислоту), LNA (закрытую нуклеиновую кислоту) и ENA (2’-O,4’-C-этилен-мостиковую нуклеиновую кислоту). Среди них PNA является предпочтительной.
[0080] В указанной выше рибофосфатной основе, например, фосфатная группа может быть модифицирована. В указанной выше рибофосфатной основе фосфатная группа в ближайшем соседстве с остатком сахара называется «α-фосфатная группа». Указанная выше α-фосфатная группа заряжена отрицательно, а электрические заряды распределяются равномерно по двум атомам кислорода, которые не связаны с остатком сахара. Среди четырех атомов кислорода в указанной выше α-фосфатной группе два атома кислорода, не связанных с остатком сахара в фосфодиэфирной связи между нуклеотидными остатками здесь и далее называются «несвязывающими кислородами». С другой стороны, два атома кислорода, которые связаны с остатком сахара в фосфодиэфирной связи между указанными выше нуклеотидными остатками нуклеотидных остатков, здесь и далее называются «связывающими кислородами». Например, указанная выше α-фосфатная группа предпочтительно модифицирована для того, чтобы не быть заряженной, или для асимметричного распределения заряда между вышеупомянутым несвязывающим кислородом.
[0081] В указанной выше фосфатной группе, например, указанный выше несвязывающий кислород(кислороды) может быть замещен. Указанный выше кислород(кислороды) может быть замещен, например, на любой атом, выбранный из S (серы), Se (селена), B (бора), C (углерода), H (водорода), N (азота) и OR (R представляет собой алкильную группу или арильную группу), и замещение на S является предпочтительным. Предпочтительно, чтобы оба указанных выше несвязывающих кислорода были замещены, например, и более предпочтительно, чтобы оба несвязывающих кислорода были замещены на S. Примеры указанной выше модифицированной фосфатной группы включают фосфотиоаты, фосфодитиоаты, фосфоселенаты, борофосфаты, эфир борофосфатов, гидрофосфонаты, фосфорамидаты, алкил- или арилфосфонаты и фосфотриэфиры. В частности, является предпочтительным фосфодитиоат, в котором оба указанных выше несвязывающих кислорода замещены на S.
[0082] В указанной выше фосфатной группе, например, указанный выше связывающий кислород(кислороды) может быть замещен. Указанный выше кислород(кислороды) может быть замещен, например, на любой атом, выбранный из S (серы), C (углерода) и N (азота). Примеры указанноой выше модифицированной фосфатной группы включают: мостиковые фосфорамидаты, возникающие в результате замещения на N; мостиковые фосфотиоаты, возникающие в результате замещения S; и мостиковые метиленфосфонаты, возникающие в результате замещения C. Предпочтительно, замещение указанного выше связывающего кислорода(кислородов) выполняют, например, по меньшей мере в одном из нуклеотидных остатков 5’-конца и нуклеотидных остатков 3’-конца молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Когда замещение выполняют на 5’-стороне, замещение на C является предпочтительным. Когда замещение выполняют на 3’-стороне, замещение на N является предпочтительным.
[0083] Указанная выше фосфатная группа может быть замещена, например, на указанный выше не содержащий фосфат линкер. Указанный выше линкер может содержать силоксан, карбонат, карбоксиметил, карбамат, амид, тиоэфир, этиленоксидный линкер, сульфонат, сульфонамид, тиоформацеталь, формацеталь, оксим, метиленамино, метиленметилимино, метиленгидразо, метилeндиметилгидразо, метиленоксиметилимино или т.п. Предпочтительно, линкер может содержать метилeнкарбониламино группу и метилeнметилимино группу.
[0084] В молекуле нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, например, по меньшей мере один из нуклеотидного остатка на 3’-конце и нуклеотидный остаток на 5’-конце может быть модифицирован. Например, может быть модифицирован нуклеотидный остаток на одном из 3’-конца и 5’-конца, или могут быть модифицированы нуклеотидные остатки на обоих 3’-конце и 5’-конце. Указанная выше модификация может быть такой, например, как описано выше, и предпочтительно модифицировать фосфатную группу(группы) на конце(концах). Например, модифицирована может быть указанная выше фосфатная группа целиком, или может быть модифицирован один или более атомов в указанной выше фосфатной группе. В первом случае, например, замещена или удалена может быть фосфатная группа целиком.
[0085] Модификация указанного выше нуклеотидного остатка(остатков) на конце(концах) может представлять собой, например, добавление любой другой молекулы. Примеры указанной выше другой молекулы включают функциональные молекулы, такие как метящие вещества, как описано выше, и защитные группы. Примеры указанных выше защитных групп включают S (серу), Si (кремний), B (бор), и группы, содержащие сложные эфиры. Функциональные молекулы, такие как указаны выше, метящие вещества можно применять, например, при определении и т.п. Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения.
[0086] Указанная выше другая молекула может быть, например, добавлена к фосфатной группе указанного выше нуклеотидного остатка или может быть добавлена к указанной выше фосфатной группе или указанному выше остатку сахара посредством спейсера. Например, концевой атом указанного выше спейсера может быть добавлен или замещен одним из двух указанных выше связывающих кислородов указанной выше фосфатной группы или O, N, S или C остатка сахара. Участок связывания в указанном выше остатке сахара предпочтительно представляет собой, например, C в 3’-позиции, C в 5’-позиции или любой связанный с ним атом. Например, указанный выше спейсер может также быть добавлен или замещен на концевой атом указанного выше альтернативного нуклеотида, такого как PNA.
2
n
2
n
2
n
2
n
2
2
n
2
2
[0087] Указанный выше спейсер не ограничен конкретно, и его примеры включают -(CH)-, -(CH)N-, -(CH)O-, -(CH)S-, O(CHCHO)CHCHOH, сахара с удаленным азотистым основанием, амид, карбокси, амин, оксиамин, оксиимин, тиоэфир, дисульфид, тиомочевину, сульфонамид и морфолино, а также биотиновые реагенты и флюоресцеиновые реагенты. В указанных выше формулах n представляет собой положительное целое число, а n=3 или 6 является предпочтительным.
2
[0088] Другие примеры указанной выше молекулы для добавления к концу включают красители, интеркалирующие агенты (напр., акридины), агенты, образующие поперечные связи (напр., псорален, митомицин C), порфирины (TPPC4, тексафирин, сапфирин), полициклические ароматические углеводороды (напр., феназин, дигидрофеназин), искусственные эндонуклеазы (напр., EDTA), липофильные носители (напр., холестерин, холевая кислота, адамантан-уксусная кислота, 1-пиренмасляная кислота, дигидротестостерон, 1,3-Бис-O (гексадецил)глицерин, геранилоксигексильную группу, гексадецилглицерин, борнеол, ментол, 1,3-пропандиол, гептадецильную группу, пальмитиновую кислоту, миристиновую кислоту, O3-(олеил)литохолевую кислоту, O3-(олеоил)холевую кислоту, диметокситритил или феноксатиин), пептидные комплексы (напр., пептид Antennapedia, пептид Tat), алкилирующие агенты, фосфат, амино, меркапто, PEG (напр., PEG-40K), MPEG, [MPEG], полиамино, алкил, замещенный алкил, радиоактивные метки, ферменты, гаптены (напр., биотин), агенты, улучшающие транспорт/абсорбцию (напр., аспирин, витамин Е, фолиевая кислота), и синтетические рибонуклеазы (напр., имидазол, бисимидазол, гистамин, имидазольные кластеры, акридин-имидазольные комплексы, Eu3+ комплексы тетраазамакроциклов).
2
2
2
2
2
2
2
2
2
[0089] В молекуле нуклеиновой кислоты настоящего изобретения указанный выше 5’-конец может быть, например, модифицирован группой фосфорной кислоты или аналогом группы фосфорной кислоты. Примеры указанной выше группы фосфорной кислоты включают 5’-монофосфат ((HO)(O)P-O-5’); 5’-дифосфат ((HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’); 5’-трифосфат ((HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’); кэп 5’-гуанозина (7-метилированный или неметилированный, 7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’); кэп 5’-аденозина (Appp); кэп-структура любого модифицированного или немодифицированного нуклеотида (N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’); 5’-монотиофосфат (фосфородитиоат: (HO)(S)P-O-5’); 5’-дитиофосфат (фосфородитиоат: (HO)(HS)(S)P-O-5’); 5’-фосфоротиоат((HO)(O)P-S-5’); замещенный серой монофосфат, дифосфат и трифосфаты (напр., 5’-α-тиотрифосфат, 5’-α- тиотрифосфат и т.п.); 5’-фосфороамидаты ((HO)(O)P-NH-5’, (HO)(NH)(O)P-O-5’); 5’-алкилфосфонаты (напр., RP(OH)(O)-O-5’, (OH)(O)P-5’-CH, где R представляет собой алкил (напр., метил, этил, изопропил, пропил или т.п.)); и 5’-алкилэфирфосфонаты (напр., RP(OH)(O)-O-5’, где R представляет собой алкиловый эфир (напр., метоксиметил, этоксиметил или т.п.)).
[0090] В указанном выше нуклеотидном остатке указанное выше основание не ограничено конкретно. Указанное выше основание может представлять собой, например, природное основание или неприродное основание. Указанное выше основание может представлять собой, например, основание, полученное естественным способом или синтетическое основание. Как указано выше, можно применять основание, например, общее основание, его модифицированный аналог и т.п.
[0091] Примеры указанного выше основания включают: пуриновые основания, такие как аденин и гуанин; и пиримидиновые основания, такие как цитозин, урацил и тимин. Другие примеры указанных выше оснований включают инозин, тимин, ксантин, гипоксантин, нубуларин, изогуанизин и туберцидин. Примеры указанных выше оснований также включают: 2-аминоаденин, производные алкила, такие как 6-метилированный пурин; производные алкила, такие как 2-пропилированый пурин; 5-галоурацил и 5-галоцитозин; 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин; 6-азоурацил, 6-азоцитозин и 6-азотимин; 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 5-галоурацил, 5-(2-аминопропил)урацил, 5-аминоаллилурацил; 8-галогенированный, аминированный, тиолированный, тиоалкилированный, гидроксилированный, и другие 8-замещенные пурины; 5-трифторметилированный и другие 5-замещенные пиримидины; 7-метилгуанин; 5-замещенные пиримидины; 6-азапиримидины; N-2, N-6 и O-6 замещенные пурины (включая 2-аминопропиладенин); 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин; дигидроурацил; 3-деаза-5-азацитозин; 2-аминопурин; 5-алкилурацил; 7-алкилгуанин; 5-алкилцитозин; 7-деазааденин; N6,N6-диметиладенин; 2,6-диаминопурин; 5-амино-аллил-урацил; N3-метилурацил; замещенные 1,2,4-триазолы; 2-пиридинон; 5-нитроиндол; 3-нитропиррол; 5-метоксиурацил; урацил-5-оксиуксусную кислоту; 5-метоксикарбонилметилурацил; 5-метил-2-тиоурацил; 5-метоксикарбонилметил-2-тиоурацил; 5-метиламинометил-2-тиоурацил; 3-(3-амино-3-карбоксипропил)урацил; 3-метилцитозин; 5-метилцитозин; N4-ацетилцитозин; 2-тиоцитозин; N6-метиладенин; N6-изопентиладенин; 2-метилтио-N6-изопентениладенин; N-метилгуанин; и O-алкилированные основания. Примеры пуринов и пиримидинов включают примеры, раскрытые в патенте США № 3687808, «Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering», с. 858-859, изданной Kroschwitz J. I, John Wiley & Sons, 1990, и Englisch et al, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, vol. 30, p. 613.
[0092] Другие примеры указанного выше модифицированного нуклеотидного остатка включают таковые, не имеющие основания, т.е. таковые, имеющие рибофосфатную основу с удаленным азотистым основанием. Кроме того, как указано выше, можно применять модифицированный нуклеотидный остаток, например, таковые, описанные в предварительной заявке США № 60/465665 (дата подачи заявки: 25 апреля 2003 года) и Международная заявка № PCT/US04/07070 (дата подачи заявки: 8 марта 2004 года) и эти документы включены в данную заявку посредством ссылки.
3. Способ синтеза молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения
[0093]
Способ синтеза молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения не ограничен конкретно, и можно использовать традиционно известный метод. Примеры указанного выше способа синтеза включают способы синтеза в соответствии с методиками генной инженерии и методиками химического синтеза. Примеры методики генной инженерии включают: способы синтеза, использующие транскрипцию in vitro; способы, использующие вектор; способы, выполняемые с использованием ПЦР-кассеты и т.п. Указанный выше вектор не ограничен конкретно, и его примеры включают невирусные векторы, такие как плазмида, и вирусные векторы. Указанные выше способы химического синтеза не ограничены конкретно, и их примеры включают фосфорамидитный способ и H-фосфонатный способ. Указанные выше способы химического синтеза можно выполнять, например, используя имеющийся в продаже автоматизированный синтезатор нуклеиновых кислот. В указанных выше способах химического синтеза в основном применяют амидит. Указанный выше амидит не ограничен конкретно. Примеры имеющихся в продаже амидитов включают РНК фосфорамидиты (2’-O-TBDMSi, торговое название, Samchully Pharm. Co., Ltd.), ACE амидит и TOM амидит, CEE амидит, CEM амидит и TEM амидит и т.п.
4. Экспрессионный вектор
[0094]
Когда молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения состоит исключительно из немодифицированного рибонуклеотидного остатка, она также может быть представлена в виде вектора, кодирующего молекулу нуклеиновой кислоты в экспрессируемом состоянии (Экспрессионный вектор настоящего изобретения) в виде предшественника молекулы нуклеиновой кислоты. Экспрессионный вектор настоящего изобретения характерно содержит ДНК, кодирующую вышеупомянутую молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в клетке-мишени при регуляции функционального промотора. Экспрессионный вектор настоящего изобретения характеризуется тем, что он содержит промотор, функционально связанный с указанной выше ДНК, и другие конфигурации никоим образом не ограничены. Вектор, подлежащий вставке с вышеупомянутой ДНК, не ограничен конкретно и, например, можно использовать общие векторы, такие как вирусный вектор, невирусный вектор и т.п. Указанный выше невирусный вектор представляет собой, например, плазмидный вектор. Можно ингибировать экспрессию гена проренина или гена рецептора проренина в клетке посредством введения экспрессируонного вектора в клетку-мишень (клетку, имеющую вышеупомянутый ген проренина и ген рецептора проренина) с использованием известного метода переноса гена per se.
5. Ингибитор экспрессии
[0095]
Ингибитор экспрессии настоящего изобретения представляет собой препарат, который ингибирует экспрессию гена проренина или гена рецептора проренина и характеризуется тем, что он содержит вышеупомянутую молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в качестве активного ингредиента.
[0096] Ингибитор экспрессии настоящего изобретения предусматривает стадию введения вышеупомянутой молекулы нуклеиновой кислоты отдельно или вместе с фармакологически приемлемым носителем, например, для мишени, в которой присутствуют указанные выше ген проренина и ген рецептора проренина. Указанную выше стадию введения проводят, например, посредством введения в контакт указанной выше молекулы нуклеиновой кислоты с указанным выше объектом введения. Примеры указанного выше объект введения также включают клетки, ткани и органы человека, животных, не являющихся человеком, таких как млекопитающие, не являющиеся людьми, т.е. Млекопитающие за исключением людей. Указанное выше введение можно выполнять, например, in vivo или in vitro.
6. Терапевтическое средство для заболеваний глаз
[0097]
Рецептор проренин-проренин глубоко вовлечен в воспаление и ангиогенез в глазной ткани через два разные действия активации RAS ткани и активации независимого от RAS внутриклеточной передачи сигнала (обобщенно называемой рецептор-ассоциированная прорениновая система (RAPS)). Вследствие этого, лекарственное средство, содержащее в качестве активного ингредиента молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, является эффективным для лечения заболеваний глаз, вовлекающих RAPS (напр., диабетической ретинопатии, увеита, возрастной макулярной дегенерации и т.д.) поскольку оно ингибирует RAPS. Кроме того, лекарственное средство, содержащее в качестве активного ингредиента молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, является эффективным для лечения диабетической ретинопатии, увеита, возрастной макулярной дегенерации или глаукомы. «Лечение» в данном случае используют в значении, охватывающем профилактику и отсрочку наступления заболевания, улучшения заболевания и улучшения прогноза.
[0098] В качестве лекарственного средства настоящего изобретения эффективное количество молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно использовать отдельно или также можно составить в виде фармацевтической композиции вместе с любым носителем, например, фармацевтически приемлемым носителем.
[0099] Примеры фармацевтически приемлемого носителя включают, без ограничения, такие эксципиенты как сахароза, крахмал и т.п., связующие вещества, такие как целлюлоза, метилцеллюлоза и т.п., разрыхлители, такие как крахмал, карбоксиметилцеллюлоза и т.п., любриканты, такие как стеарат магния, аэрогель и т.п., ароматизаторы, такие как лимонная кислота, ментол и т.п., консерванты, такие как натрия бензоат, натрия бисульфит и т.п., стабилизаторы, такие как лимонная кислота, натрия цитрат и т.п., суспендирующие средства, такие как метилцеллюлоза, поливинилпирролидон и т.п., диспергирующие средства, такие как поверхностно-активное вещество и т.п., разбавители, такие как вода, физиологический солевой раствор и т.п., базисный воск и т.п.
[0100] Для облегчения введения молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в клетку-мишень фармацевтический препарат настоящего изобретения может дополнительно содержать реагент для введения нуклеиновой кислоты. В качестве реагента для введения нуклеиновой кислоты можно применять катионные липиды, такие как ателоколлаген; липосому; наночастицу; липофектин, липофектамин, DOGS (Transfectam), DOPE, DOTAP, DDAB, DHDEAB, HDEAB, полибрен, или поли(этиленимин) (PEI) и т.п.
[0101] В одном предпочтительном варианте осуществления фармацевтический препарат настоящего изобретения может представлять собой фармацевтическую композицию, в которой молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения инкапсулирована в липосоме. Липосома представляет собой микроскопическую замкнутую везикулу, имеющую внутреннюю фазу, окруженную одним или более липидными бислоями, и обычно может содержать водорастворимое вещество во внутренней фазе и липофильное вещество в липидном бислое. В данном случае при использовании термина «инкапсулированый» молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения может содержаться во внутренней фазе липосомы или в липидном бислое. Липосомой для применения в настоящем изобретении может быть однослойная пленка или многослойная пленка. Размер частиц липосомы можно соответственно выбирать в пределах диапазона, например, 10-1000 нм, предпочтительно 50-300 нм. Учитывая эффективность доставки в ткань-мишень, размер частиц может составлять, например, 200 нм или менее, предпочтительно 100 нм или менее.
[0102] Способы иникапсулирования водорастворимого соединения, такого как нуклеиновая кислота, в липосому, включают, без ограничения, метод липидной пленки (вихревой метод), метод испарения обратной фазы, метод удаления поверхностно-активного вещества, метод замораживания-оттаивания, метод дистанционной загрузки и т.п., и соответственно можно выбрать любой метод.
[0103] Фармацевтический препарат настоящего изобретения можно вводить местно в глаза млекопитающего. В частности, желательно его вливать по капле в глаза.
[0104] Препараты, подходящие для местного введения в глаза включают глазные капли (водные глазные капли, неводные глазные капли, суспензию глазных каплей, эмульсию глазных каплей и т.д.), мазь, лосьон, крем и т.п. Когда агент настоящего изобретения представляет собой глазные капли, соответственно можно использовать основу. Основы для использования для глазных капель включают фосфатный буфер, буфер Хэнкса, физиологический солевой раствор, перфузионную текучую среду, искусственную слезную жидкость и т.п.
[0105] Когда фармацевтический препарат настоящего изобретения представляет собой препарат для местного введения в глаза, при необходимости можно выбирать и добавлять, например, буферное средство, изотоническое средство, солюбилизирующее средство, консервант, определяющее вязкость основание, комплексообразующее средство, фактор охлаждающего действия, регулятор pH, антиоксидант и т.п.
Примеры буферного средства включают фосфатное буферное средство, боратное буферное средство, цитратное буферное средство, тартратное буферное средство, ацетатное буферное средство, аминокислоту и т.п.
Примеры изотонического средства включают такие сахариды, как сорбитол, глюкозу, маннитол и т.п., многоатомные спирты, такие как глицерин, пропиленгликоль и т.п., соли, такие как натрия хлорид и т.п., борную кислоту и т.п.
Примеры солюбилизирующего средства включают неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат (напр., полисорбат80), полиоксиэтиленовое гидрогенизированное касторовое масло, тилоксапол, плюроник и т.п., многоатомные спирты, такие как глицерин, макрогол и т.д. и т.п.
Примеры консерванта включают соли четвертичного аммония, такие как бензалкония хлорид, бензетония хлорид, цетилпиридиния хлорид и т.п., параоксибензоаты, такие как метил p-гидроксибензоат, этилпарагидроксибензоат, пропил p-гидроксибензоат, бутил p-гидроксибензоат и т.п., бензиловый спирт, сорбиновую кислоту и ее соли (соль натрия, соль калия и т.п.), тимеросал (торговое название), хлорбутанол, натрия дигидроацетат и т.п.
Примеры определяющего вязкость основания включают водорастворимые полимеры, такие как поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль, поли(виниловый спирт) и т.п., целлюлозы, такие как гидроксиэтилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрия карбоксиметилцеллюлоза и т.п. И т.д.
Примеры комплексообразующего средства включают натрия эдетат, лимонную кислоту и т.п.
Примеры фактора охлаждающего действия включают l-ментол, борнеол, камфору, эвкалиптовое масло и т.п.
Примеры регулятора pH включают натрия гидроксид, калия гидроксид, натрия карбонат, гидрокарбонат натрия, борную кислоту или ее соли (боракс), соляную кислоту, лимонную кислоту или ее соли (натрия цитрат, натрия дигидроцитрат и т.д.), фосфорную кислоту или ее соли (динатрийгидрофосфат, калийдигидрофосфат и т.д.), уксусную кислоту или ее соли (натрия ацетат, аммония ацетат и т.д. и т.п.), винную кислоту или ее соли (натрия тартрат и т.д.)
Примеры антиоксиданта включают натрия бисульфит, высушенный натрия сульфит, натрия пиросульфит, концентрат смешанных токоферолов и т.п.
[0106] Содержание молекул нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в фармацевтической композиции настоящего изобретения составляет, например, приблизительно 0,1-100 мас.% всей фармацевтической композиции.
Когда фармацевтической композицией настоящего изобретения является липосомный препарат, молярное отношение молекул нуклеиновой кислоты настоящего изобретения к липосомам составляет в целом 1/100000-1/10000. Содержание липосом, инкапсулирующих молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, содержащихся в липосомном препарате, отдельно не ограничено, при условии, что оно составляет количество, в котором липосомные частицы не составляют агрегаты и могут использоваться достаточно эффективно, и в целом составляет 10-100 мМ.
[0107] Доза фармацевтического препарата настоящего изобретения варьирует в зависимости от цели введения, способа введения, типа расстройства глазной поверхности, размера поражения, состояния объекта введения (пол, возраст, масса тела и т.п.). Когда фармацевтический препарат настоящего изобретения каплями вводят в глаза взрослого человека, предпочтительно вводить в целом 0,01-1000 мкг, предпочтительно 0,05-100 мкг, более предпочтительно 0,1-50 мкг, в виде разовой дозы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения от одного до 10 раз, предпочтительно 5-10 раз в день.
[0108] Далее настоящее изобретение будет подробно описано со ссылкой на примеры и т.п. Однако следует заметить, что настоящее изобретение никоим образом ими не ограничено.
[Примеры]
[0109] (Пример 1) Ингибирующее экспрессию действие гена проренина или гена рецептора проренина за счет одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты в клетке HCC1954
(1) Синтез одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты
Одноцепочечные молекулы нуклеиновых кислот, показанные ниже, синтезировали на основе фосфорамидитного метода с помощью синтезатора нуклеиновых кислот ABI3900 (торговое название, Applied Biosystems). В указанном выше синтезе EMM амидит (WO 2013/027843) использовали в виде РНК амидита (далее так же). Обычным методом указанный выше амидит лишали защиты. Синтезированные одноцепочечные молекулы нуклеиновых кислот очищали с помощью HPLC и соответственно лиофилизировали.
[0110] Каждую из одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот, имеющих последовательность, ингибирующую экспрессию гена проренина, показанную в указанных выше SEQ ID №: 1-5 (PH-0001-h-p, PH-0002-h-p, PH-0003-h-p, PH-0004-h-p, PH-0005-h-p), и одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот, имеющих последовательность, ингибирующую экспрессию гена рецептора проренина, показанную в указанных выше SEQ ID №: 6-11 (PH-0001-hmr-pr, PH-0002-hmr-pr, PH-0001-hm-pr, PH-0002-hm-pr, PH-0003-hm-pr, PH-0001-h-pr), синтезировали, как указано выше, в виде одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот. В каждой одноцепочечной молекуле нуклеиновой кислоты Lx представляет собой линкерную область Lx, и следующие структурные формулы получали, используя L-пролин диамид амидит. В каждой последовательности подчеркнута последовательность, ингибирующая экспрессию гена проренина или гена рецептора проренина человека.
PH-0001-h-p (SEQ ID №: 65-Lx-SEQ ID №: 23)
5’-CCUAUCUUCGACAACAUCAUCCC-Lx-GGGAUGAUGUUGUCGAAGAUAGGGG-3’
PH-0002-h-p (SEQ ID №: 66-Lx-SEQ ID №: 24)
5’-GGAAUUUCCACUAUAUCAACCCC-Lx-GGGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCU-3’
PH-0003-h-p (SEQ ID №: 67-Lx-SEQ ID №: 25)
5’-GGGAAUUUCCACUAUAUCAACCC-Lx-GGGUUGAUAUAGUGGAAAUUCCCUU-3’
PH-0004-h-p (SEQ ID №: 68-Lx-SEQ ID №: 26)
5’-CCUUCAUCCGAAAGUUCUACACC-Lx-GGUGUAGAACUUUCGGAUGAAGGUG-3’
PH-0005-h-p (SEQ ID №: 69-Lx-SEQ ID №: 27)
5’-GUUCUACACAGAGUUUGAUCGCC-Lx-GGCGAUCAAACUCUGUGUAGAACUU-3’
PH-0001-hmr-pr (SEQ ID №: 70-Lx-SEQ ID №: 28)
5’-GUUGUUUUCCGAAAUGGAAAUCC-Lx-GGAUUUCCAUUUCGGAAAACAACAG-3’
PH-0002-hmr-pr (SEQ ID №: 71-Lx-SEQ ID №: 29)
5’-GUUUUCCGAAAUGGAAAUUGGCC-Lx-GGCCAAUUUCCAUUUCGGAAAACAA-3’
PH-0001-hm-pr (SEQ ID №: 72-Lx-SEQ ID №: 30)
5’-CCUAUAACCUUGCAUAUAAGUCC-Lx-GGACUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA-3’
PH-0002-hm-pr (SEQ ID №: 73-Lx-SEQ ID №: 31)
5’-CCCUAUAACCUUGCAUAUAAGCC-Lx-GGCUUAUAUGCAAGGUUAUAGGGAC-3’
PH-0003-hm-pr (SEQ ID №: 74-Lx-SEQ ID №: 32)
5’-GGAGAAUGCAGUUCCUUUUAGCC-Lx-GGCUAAAAGGAACUGCAUUCUCCAA-3’
PH-0001-h-pr (SEQ ID №: 75-Lx-SEQ ID №: 33)
5’-GGGCUAAUAUGGAUACUAAAACC-Lx-GGUUUUAGUAUCCAUAUUAGCCCAU-3’
[0111]
[0112] (2) Измерение уровня экспрессии гена проренина и гена рецептора проренина
Указанную выше каждую одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты растворяли в дистиллированной воде для инъекции (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) до 20 мкмоль/л.
[0113] В качестве клетки использовали клетку HCC1954 (ATCC). В качестве среды использовали RPMI-1640, содержащую 10% FBS (Invitrogen). Условия культивирования составляли 37°C, 5% CO2.
4
[0114] Сначала клетки высевали в 24-луночный планшет по 1×10 клеток/400 мкл среды/лунку и культивировали в течение 24 часов. После этого клетки трансфицировали указанной выше одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты, используя реагент для трансфекции Липофектамин RNAiMAX (Invitrogen) в соответствии с протоколом, приложенным к указанному выше реагенту для трансфекции. Конкретно, трансфекцию выполняли путем помещения композиции в лунку следующим образом. В следующих композициях (A) представляет собой указанный выше реагент для трансфекции, (B) представляет собой Opti-MEM (Invitrogen), (C) представляет собой 20 мкмоль/л указанного выше раствора одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты. Итоговую концентрацию указанной выше одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты в указанной выше лунке установили 10 нмоль/л.
[0115] Таблица 1
(Композиция в лунку: мкл)
бульон для культивирования 400
(A)+(B) 50
(B)+(C) 50
500
[0116] После трансфекции клетки в указанных выше лунках культивировали в течение 24 часов, а затем собирали РНК, используя ISOGENII (NIPPON GENE) в соответствии с поставляемым с ним протоколом. Впоследствии из указанной выше РНК синтезировали кДНК, используя набор для синтеза первой нити кДНК с использованием транскрипции (Roche) в соответствии с поставляемым с ним протоколом. Затем, как показано ниже, выполняли ПЦР, используя в качестве матрицы указанную выше синтезированную кДНК, и измеряли уровень экспрессии гена проренина, уровень экспрессии гена рецептора проренина и уровень экспрессии внутреннего стандарта, гена GAPDH. Уровень экспрессии указанного выше гена проренина и уровень экспрессии гена рецептора проренина нормировали со ссылкой на уровень экспрессии указанного выше гена GAPDH.
[0117] Указанную выше ПЦР выполняли, используя в качестве реагента LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche), а в качестве инструмента LightCycler 480 (Roche) (далее так же). Указанные выше ген проренина, ген рецептора проренина и ген GAPDH амплифицировали, используя следующие наборы праймеров, соответственно.
Набор праймеров для ПЦР для гена проренина
(SEQ ID №: 34) 5’-GCTTTCTCAGCCAGGACATC-3’
(SEQ ID №: 35) 5’-TGGGAGATGATGTTGTCGAA-3’
Набор праймеров для ПЦР для гена рецептора проренина
(SEQ ID №: 36) 5’-TCGTACCCTTTGGAGAATGC-3’
(SEQ ID №: 37) 5’-GAGCCAACTGCAAAACAACA-3’
набор праймеров для гена GAPDH
(SEQ ID №: 38) 5’-GGAGAAGGCTGGGGCTCATTTGC-3’
(SEQ ID №: 39) 5’-TGGCCAGGGGTGCTAAGCAGTTG-3’
[0118] В качестве контроля также измеряли уровень экспрессии гена в отношении клеток, подвергаемых таким же процедурам трансфекции, как в описании выше за исключением того, что не добавляли указанный выше раствор одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты (C), а добавляли указанный выше (A) и указанный выше (B), так чтобы общее количество (A) и (B) составляло бы 100 мкл (макет).
[0119] Что касается уровня экспрессии гена проренина и уровня экспрессии гена рецептора проренина после нормирования, относительное значение в клетке, в которую вводили каждую одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, определяли на основе уровня экспрессии в клетках контроля (макет), принятого за 1.
[0120] (3) Результаты
Результаты измерения уровня экспрессии гена проренина показаны на Фиг. 2, и результаты измерения уровня экспрессии гена рецептора проренина показаны на Фиг. 3. Одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения продемонстрировала сильную ингибирующую активность экспрессии гена.
[0121] (Пример 2) Ингибирующее действие на экспрессию гена рецептора проренина
Одноцепочечные молекулы нуклеиновых кислот, показанные в SEQ ID №: 70 и SEQ ID №: 28, и SEQ ID №: 71 и SEQ ID №: 29 и имеющие ингибирующую экспрессию последовательность гена рецептора проренина человека, мыши или крысы, и одноцепочечные молекулы нуклеиновых кислот, показанные в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30, SEQ ID №: 73 и SEQ ID №: 31, и SEQ ID №: 74 и SEQ ID №: 32 и имеющие ингибирующую экспрессию последовательность гена рецептора проренина человека или мыши, подтвердили ингибирующее действие на экспрессию гена рецептора проренина в культивируемых клетках, полученных у человека, мыши и крысы.
[0122] (1) Измерение уровня экспрессии гена рецептора проренина
В качестве клеток использовали полученную у человека клетку hTERT-RPE (ATCC), полученную у мыши клетку Neuro-2a (ECACC), клетку крысы Rat-1 (ATCC). В качестве каждой среды использовали среду DMEM/F12, E-MEM, DMEM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) содержащую 10% FBS. Условия культивирования составляли 37°C, 5% CO2.
[0123] Сначала клетки высевали в 96-луночный планшет по 1×104 клеток/80 мкл среды/лунку и культивировали в течение 24 часов. После этого клетки трансфицировали указанной выше одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты, используя реагент для трансфекции Липофектамин RNAiMAX (Invitrogen) в соответствии с протоколом, приложенным к указанному выше реагенту для трансфекции. Конкретно, трансфекцию выполняли путем помещения композиции в лунку следующим образом. В следующих композициях (A) представляет собой указанный выше реагент для трансфекции, (B) представляет собой Opti-MEM (Invitrogen), (C) представляет собой 20 мкмоль/л указанного выше раствора одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты. Итоговую концентрацию указанной выше одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты в указанной выше лунке установили 0,5 нмоль/л.
[0124] Таблица 2
(Композиция в лунку: мкл)
бульон для культивирования 80
(A)+(B) 10
(B)+(C) 10
100
[0125] После трансфекции клетки в указанных выше лунках культивировали в течение 24 часов, кДНК синтезировали из РНК, используя SuperPrep Cell Lysis & RT (TOYOBO) в соответствии с приложенным протоколом. Затем, как показано ниже, выполняли ПЦР, используя в качестве матрицы указанную выше синтезированную кДНК, и измеряли уровни экспрессии гена рецептора проренина и гена HPRT1 внутреннего стандарта. Уровень экспрессии указанного выше гена рецептора проренина нормировали со ссылкой на уровень экспрессии указанного выше гена HPRT1.
[0126] В указанной выше ПЦР в качестве реагента использовали GoTaq qPCR Master Mix (Promega), а в качестве инструмента использовали StepOne Plus (Life Techonologies). Ген рецептора проренина и ген HPRT1 амплифицировали, используя следующие наборы праймеров.
Набор праймеров для ПЦР для гена рецептора проренина человека
(SEQ ID №: 40) 5’-AGGCAGTGTCATTTCGTACC-3’
(SEQ ID №: 41) 5’-GCCTTCCCTACCATATACACTC-3’
Набор праймеров для ПЦР для гена HPRT1 человека
(SEQ ID №: 42) 5’-ACCCCACGAAGTGTTGGATA-3’
(SEQ ID №: 43) 5’-AAGCAGATGGCCACAGAACT-3’
Набор праймеров для ПЦР для гена рецептора проренина мыши
(SEQ ID №: 44) 5’-TGGTCGTTCTCCTGTTCTTTC-3’
(SEQ ID №: 45) 5’-ACCCTGGCGATCTTAATATGC-3’
Набор праймеров для ПЦР для гена HPRT1 мыши
(SEQ ID №: 46) 5’-CAAACTTTGCTTTCCCTGGT-3’
(SEQ ID №: 47) 5’-CAAGGGCATATCCAACAACA-3’
Набор праймеров для ПЦР для гена рецептора проренина крысы
(SEQ ID №: 48) 5’-TGTGGGCAACCTATTCCACC-3’
(SEQ ID №: 49) 5’-AGCTGACGCAATGTGACTGA-3’
Набор праймеров для ПЦР для гена HPRT1 крысы
(SEQ ID №: 50) 5’-GCAGACTTTGCTTTCCTTGG-3’
(SEQ ID №: 51) 5’-TCCACTTTCGCTGATGACAC-3’
[0127] В качестве контроля также измеряли уровень экспрессии гена (макет) в отношении клеток, подвергаемых таким же процедурам трансфекции, как в описании выше, за исключением того, что не добавляли указанный выше раствор РНК (C) и что добавляли указанный выше (A) и (B), так чтобы общее количество (A) и (B) составляло бы 20 мкл.
[0128] Что касается уровней экспрессии нормированного гена проренина, относительное значение уровня экспрессии в клетке, в которую вводили каждую одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, определяли на основе уровня экспрессии в клетках контроля (макет) равного 1.
[0129] (2) Результаты
Результаты измерения уровня экспрессии гена рецептора проренина человека показаны на Фиг. 4, результаты уровня экспрессии гена рецептора проренина мыши показаны на Фиг. 5, и результаты измерения уровня экспрессии гена рецептора проренина крысы показаны на Фиг. 6. В каждой клетке одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения продемонстрировала сильное ингибирующее экспрессию гена действие.
[0130] (Пример 3) Ингибирующее действие на экспрессию гена проренина
Одноцепочечные молекулы нуклеиновых кислот, показанные в SEQ ID №: 65 и SEQ ID №: 23, SEQ ID №: 66 и SEQ ID №: 24, SEQ ID №: 67 и SEQ ID №: 25, SEQ ID №: 68 и SEQ ID №: 26, и SEQ ID №: 69 и SEQ ID №: 27 и имеющие ингибирующую экспрессию последовательность гена проренина человека, подтвердили ингибирующее экспрессию действие на ген проренина в полученных у человека культивированных клетках.
[0131] (1) Измерение уровня экспрессии гена проренина
В качестве клетки использовали полученные у человека клетку hTERT-RPE (ATCC). В качестве среды использовали DMEM/F12, содержащую 10% FBS. Условия культивирования составляли 37°C, 5% CO2.
4
[0132] Сначала клетки высевали в 24-луночный планшет по 2×10 клеток/400 мкл среды/лунку и культивировали в течение 24 часов. После этого клетки трансфицировали указанной выше одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты, используя реагент для трансфекции Липофектамин RNAiMAX (Invitrogen) в соответствии с протоколом, приложенным к указанному выше реагенту для трансфекции. Конкретно, трансфекцию выполняли путем помещения композиции в лунку следующим образом. В следующих композициях (A) представляет собой указанный выше реагент для трансфекции, (B) представляет собой Opti-MEM (Invitrogen), (C) представляет собой 20 мкмоль/л указанного выше раствора одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты. Итоговую концентрацию указанной выше одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты в указанной выше лунке установили 0,5 нмоль/л.
[0133] Таблица 3
(Композиция в лунку: мкл)
бульон для культивирования 400
(A)+(B) 50
(B)+(C) 50
500
[0134] После трансфекции клетки в указанных выше лунках культивировали в течение 24 часов и собирали РНК, используя ISOGENII (NIPPON GENE) в соответствии с приложенным протоколом. Затем из указанной выше РНК синтезировали кДНК, используя GoScript Reverse Transcriptase Kit (Promega) в соответствии с приложенным протоколом. Затем, как показано ниже, выполняли ПЦР, используя в качестве матрицы указанную выше синтезированную кДНК, и измеряли уровень экспрессии гена проренина, а в качестве внутреннего стандарта уровень экспрессии гена HPRT1. Указанный выше уровень экспрессии гена проренина нормировали со ссылкой на уровень экспрессии указанного выше гена HPRT1.
[0135] В указанной выше ПЦР в качестве реагентов использовали GoTaq qPCR Master Mix (Promega) и THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (TOYOBO), а в качестве инструмента использовали StepOne Plus (Life Techonologies). Для измерения уровня экспрессии указанного выше гена проренина использовали Taqman Assay (Life Techonologies), и ген HPRT1 амплифицировали, используя следующий набор праймеров.
Набор праймеров для ПЦР для гена HPRT1 человека
(SEQ ID №: 42) 5’-ACCCCACGAAGTGTTGGATA-3’
(SEQ ID №: 43) 5’-AAGCAGATGGCCACAGAACT-3’
[0136] В качестве контроля также измеряли уровень экспрессии гена (макет) в отношении клеток, подвергаемых таким же процедурам трансфекции, как в описании выше, за исключением того, что не добавляли указанный выше раствор одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты (C) и что добавляли указанный выше (A) и указанный выше (B), так чтобы общее количество (A) и (B) составляло бы 100 мкл.
[0137] Что касается уровня экспрессии гена проренина после нормирования, относительное значение в клетке, в которую вводили каждую одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, определяли на основе уровня экспрессии в клетках контроля (макет), принятого за 1.
[0138] (2) Результаты
Результаты показаны на Фиг. 7. Одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения продемонстрировала сильное действие, ингибирующее экспрессию гена.
[0139] (Пример 4) Ингибирующее воспаление действие в мышиной модели, в которой развился индуцированный эндотоксином увеит
PH-0001-hm-pr, одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30, имеющей ингибирующую последовательность экспрессии генов рецептора проренина мыши и человека, подтвердили для ингибирующего воспаление действия в мышиной модели, в которой развился индуцированный LPS увеит.
[0140] (1) Введение одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты в мышиную модель с индуцированным эндотоксином увеитом
Указанную выше одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты растворяли в PBS до 30, 100, 300 мкМ. После растворения раствор одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты (1 мкл) в каждой концентрации вводили мышам интравитреально, используя инъекционную иглу 33 калибра, с анестезией пентобарбиталом. В качестве отрицательного контроля использовали то же самое количество PBS. В каждой группе введения использовали 6 самцов мышей (C57BL/6J, в возрасте от 6 до 8 недель). Через 24 часа после введения одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты внутрибрюшинно вводили LPS (0,2 мг), растворенный в 100 мкл PBS.
[0141] (2) Измерение уровня экспрессии гена цитокина воспаления
Через 6 часов после введения LPS мышей подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации, отделяли сетчатку и собирали РНК, используя TRIzol (Life technologies) в соответствии с приложенным протоколом. Затем из указанной выше РНК синтезировали кДНК, используя GoScript Reverse Transcriptase Kit (Promega) в соответствии с приложенным протоколом. Затем, как показано ниже, выполняли ПЦР, используя в качестве матрицы указанную выше синтезированную кДНК, и измеряли уровни экспрессии генов CCL2/MCP-1, ICAM-1, IL-6, TNF-α и уровень экспрессии гена GAPDH в качестве внутреннего стандарта. Указанный выше уровень экспрессии каждого гена нормировали со ссылкой на уровень экспрессии указанного выше гена GAPDH.
[0142] В указанной выше ПЦР в качестве реагента использовали GoTaq qPCR Master Mix (Promega), а в качестве инструмента использовали StepOne Plus (Life Techonologies). В ПЦР каждого гена использовали следующие наборы праймеров.
Набор праймеров для ПЦР для гена CCL2/MCP-1 мыши
(SEQ ID №: 52) 5’-TTGGCTCAGCCAGATGCA-3’
(SEQ ID №: 53) 5’-CCTACTCATTGGGATCATCTTGC-3’
Набор праймеров для ПЦР для гена ICAM-1 мыши
(SEQ ID №: 54) 5’-CCTGTTTCCTGGCTCTGAAG-3’
(SEQ ID №: 55) 5’-GTCTGCTGAGACCCCTCTTG-3’
Набор праймеров для ПЦР для гена IL-6 мыши
(SEQ ID №: 56) 5’-CACAGAGGATACCACTCCCAACA-3’
(SEQ ID №: 57) 5’-TCCACGATTTCCCAGAGAAACA-3’
Набор праймеров для ПЦР для гена TNF-α мыши
(SEQ ID №: 58) 5’-GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT-3’
(SEQ ID №: 59) 5’-CGATCACCCCGAAGTTCAGTA-3’
Набор праймеров для ПЦР для гена GAPDH мыши
(SEQ ID №: 60) 5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’
(SEQ ID №: 61) 5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’
[0143] Что касается уровня экспрессии каждого гена после нормирования, относительное значение уровня экспрессии в каждой группе введения определяли на основе уровня экспрессии в группе отрицательного контроля (группе введения PBS), принятого за 1.
(3) Результаты
Результаты показаны на Фиг. 8. В каждой группе PH-0001-hm-pr в качестве одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30, продемонстрировала ингибирующее действие на экспрессию генов провоспалительных цитокинов. То есть для одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения подтверждено ингибирование начала воспаления при увеите посредством ингибирования экспрессии гена рецептора проренина.
[0144] (Пример 5) Устойчивость к нуклеазе и ингибирующее экспрессию действие на рецептор белка проренина
Одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30 и имеющую ингибирующую последовательность экспрессии генов рецептора проренина мыши и человека, подтвердили на устойчивость к нуклеазе. Кроме того, ингибирующее экспрессию действие на рецептор белка проренина в полученных у человека культивированных клетках подтвердили с помощью иммуноблот-анализа.
[0145] (1) Устойчивость к нуклеазе
Одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30, инкубировали при 37°C в присутствии 0,5 единицы микрококковой нуклеазы (Takara Bio Inc.). Через 5, 15 и 30 минут после начала реакции в реакционный раствор для прекращения реакции добавляли раствор EDTA, проводили электрофорез, используя 15% гель TBE, и гель окрашивали SYBR safe (Life Technologies). В качестве контроля использовали двухспиральную молекулу нуклеиновой кислоты ((P)RR-миРНК), в которой смысловая нить представляет собой последовательность оснований, показанную в SEQ ID №: 19, а антисмысловая нить представляет собой последовательность оснований, показанную в SEQ ID №: 8.
[0146] (2) Ингибирующее экспрессию действие на рецептор белка проренина
В качестве клетки использовали пигментную эпителиальную клетку сетчатки человека (RPE, hTERT-RPE1) (ATCC). В качестве среды использовали DMEM/F12 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), содержащую 10% FBS (Life Technologies). Условия культивирования составляли 37°C, 5% CO2.
[0147] Одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30 (1nM), трансфицировали, используя реагент для трансфекции Реагент Липофектамин RNAiMAX (Life Technologies) и в соответствии с приложенным протоколом. После трансфекции клетки культивировали в течение 24 часов. Через 3, 6, 12, 18 и 24 часа после начала культивирования клетки собирали. Иммуноблот-анализ проводили следующим образом. Собранные клетки лизировали в SDS буфере, содержащем смесь ингибиторов протеаз (Roche), и белки разделяли с помощью SDS-PAGE, используя 10% гель, и переносили на мембрану PVDF (Merck Millipore). Мембрану блокировали путем погружения в TBS, содержащий 5% снятое молоко, и вводили в реакцию с первичным антителом. В качестве первичного антитела использовали антитело против рецептора проренина (Sigma-Aldrich), и антитело против β актина (Medical & Biological Laboratories). В качестве вторичного антитела для хемилюминисцентного обнаружения использовали конъюгат пероксидазы с противомышиным или противокроличьим антителом IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Для обнаружения сигнала использовали усиленную хемолюминисценицию (Western Lightning Ultra). В качестве контроля использовали одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую следующую структурную формулу (Контроль-PshRNA), в которой Lx имеет структуру указанной выше формулы (I-6a).
(SEQ ID №: 76-Lx-SEQ ID №: 62)
5’-UACUAUUCGACACGCGAAGUUCC-Lx-GGAACUUCGCGUGUCGAAUAGUAUU-3’
[0148] (3) Результаты
Результаты устойчивости к нуклеазе показаны на Фиг. 9A, а результаты ингибирующего экспрессию действия на рецептор белка проренина с помощью иммуноблот-анализа показаны на Фиг. 9B. Хотя контроль ((P)RR-миРНК) был полностью разрушен микрококковой нуклеазой через 5 минут, одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты, показанная в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30 ((P)RR-PshRNA) не распалась даже через 30 минут и продемонстрировала устойчивость к нуклеазе (Фиг. 9 A). Кроме того, результаты иммуноблот-анализа показывают, что одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30 ((P)RR-PshRNA), ингибирует экспрессию рецепторного белка проренина (Фиг. 9 B).
[0149] (Пример 6) ингибирующее острое воспаление действие в мышиной модели с индуцированным эндотоксином увеитом
Одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30 и имеющей последовательность, ингибирующую экспрессию генов рецептора проренина мыши и человека, подтвердили на ингибирующее острое воспаление действие. Используя мышиную модель с индуцированным LPS увеитом в качестве мышиной модели с острым воспалением, измеряли число лейкоцитов, прилипших к кровеносному сосуду сетчатки, и число лейкоцитов, проникших в стекловидную полость рядом с оптическим диском. Кроме того, для исследования молекулярного механизма, с помощью которого одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты ингибирует клеточный ответ, измеряли уровни экспрессии генов цитокинов воспаления. Кроме того, в мышиной модели с индуцированным эндотоксином увеитом воспалительный сигнал индуцирует распад родопсина вследствие активации системы убиквитин-протеасома, которая сокращает внешний сегмент фоторецептора. Вследствие этого для исследования защитного действия на фоторецептор одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты проводили измерение длины наружного сегмента фоторецептора и иммуноблот-анализ родопсина.
[0150] (1) Введение одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты в мышиную модель с индуцированным эндотоксином увеитом
Одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30, растворяли в PBS до 100 мкМ. После растворения раствор одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты (1 мкл) вводили мышам (C57BL/6J, в возрасте от 6 до 8 недель) в стекловидное тело, используя инъекционную иглу 33 калибра (CLEA Japan) с анестезией пентобарбиталом. В качестве контроля использовали то же самое количество PBS или контроля-PshRNA (SEQ ID №: 76 и SEQ ID №: 62), растворенного в PBS до 100 мкМ. Через 24 часа после введения полученных с помощью Escherichia coli LPS (Sigma-Aldrich) (0,2 мг), растворенных в 100 мкл PBS, вводили внутрибрюшинно мышам, которым ввели одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30, или контроль-PshRNA. Используя полученное стекловидное тело, через 6 часов после введения LPS измеряли уровни экспрессии генов цитокинов воспаления. Через 24 часа после введения LPS количественно определили лейкоциты, которые прилипли к сетчатке, и лейкоциты, которые проникли в стекловидное тело, а также измеряли длину внешнего сегмента фоторецептора, и проводили иммуноблот-анализ с родопсином.
[0151] (2) Измерение уровня экспрессии гена цитокина воспаления посредством количественной ПЦР в реальном времени
Через 6 часов после введения LPS мышей подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации и отделяли сетчатку. За счет способа, описанного в документе (Kanda, A., Noda, K., Saito, W. & Ishida, S. (Pro)renin receptor is associated with angiogenic activity in proliferative diabetic retinopathy. Diabetologia 55, 3104-3113, 2012), из клетки выделяли общую РНК, используя SuperPrep Cell Lysis & RT Kit для количественной ПЦР (TOYOBO), и из тканей сетчатки, используя TRIzol (Life Technologies) и GoScrip Reverse Transcriptase (Promega), и синтезировали кДНК за счет проведения реакции обратной транскрипции, используя олиго dT праймер. Используя в качестве матрицы указанную выше синтезированную кДНК, проводили количественную ПЦР в реальном времени и измеряли уровни экспрессии генов IL-6, CCL2/MCP-1, ICAM-1 и tNF-α. Эти гены являются известными типичными генами, обычно вовлеченными в модели как острого, так и хронического воспаления. Кроме того, аналогично измеряли уровни экспрессии гена рецептора проренина и внутреннего стандартного гена GAPDH. Уровень экспрессии каждого из указанных выше генов нормировали со ссылкой на уровень экспрессии указанного выше гена GAPDH. В указанной выше количественной ПЦР в реальном времени в качестве реагента использовали GoTaq qPCR Master Mix (Promega), а в качестве инструмента использовали StepOne plus System (Life Technologies). Те же самое наборы праймеров, что и в Примере 4, использовали для ПЦР генов IL-6, CCL2/MCP-1, ICAM-1, TNF-α и GAPDH. Для ПЦР гена рецептора проренина использовали следующий набор праймеров.
Набор праймеров для ПЦР для гена проренина
(SEQ ID №: 63) 5’-CTGGTGGCGGGTGCTTTAG-3’
(SEQ ID №: 64) 5’-GCTACGTCTGGGATTCGATCT-3’
[0152] (3) Количественное определение лейкоцитов, прилипших к сетчатке
В соответствии с описанным в документе способом (Kanda, A., Noda, K., Oike, Y. & Ishida, S. Angiopoietin-like protein 2 mediates endotoxin-induced acute inflammation in the eye. Lab Invest 92, 1553-1563, 2012), систему кровеносных сосудов сетчатки и прилипшие лейкоциты фотографировали, используя перфузионное мечение флуоресцинизотиоцианатом (FITC), соединенным с конканавалин лектином (Con A; Vector Laboratories). конкретно, через 24 ч после введения LPS под анестезией вскрывали грудную полость мыши, и в левый желудочек вводили канюлю. После инъекции PBS для удаления эритроцитов и неприлипших лейкоцитов проводили перфузию конъюгированного с FITC Con A. После извлечения глазных яблок готовили плоские гистологические срезы сетчатки. Плоские гистологические срезы визуализировали под флуоресцентным микроскопом (BZ-9000, Keyence), и подсчитывали общее число окрашенных Con A прилипших лейкоцитов на сетчатку.
[0153] (4) Количественное определение проникших в стекловидное тело лейкоцитов
В соответствии с описанным в документе способом (Kanda, A., Noda, K., Oike, Y. & Ishida, S. Angiopoietin-like protein 2 mediates endotoxin-induced acute inflammation in the eye. Lab Invest 92, 1553-1563, 2012), подсчитывали число лейкоцитов, проникших в стекловидную полость. конкретно, ткань сетчатки фиксировали и погружали в парафин с помощью обычного метода. готовили три 5-мкм среза со 100-мкм интервалами. Делали так, чтобы средний срез проходил через глазной нерв. Все срезы окрашивали HE (гематоксилином и эозином), и подсчитывали число клеток в стекловидной полости.
[0154] (5) Измерение длины наружного сегмента фоторецептора и иммуноблот-анализ родопсина
Длину внешнего сегмента фоторецепторов измеряли следующим образом. После фиксации глазных яблок мышей при 4°C, используя 4% параформальдегид, их погружали в парафин, и готовили срезы. Срезы окрашивали HE, и измеряли длину внешнего сегмента фоторецепторов в 4 точках на задней части сетчатки. Две точки на обоих концах глазного нерва были разнесены на 200 мкм и 500 мкм. Относительное значение длины внешнего сегмента фоторецептора у мыши с индуцированным эндотоксином увеитом, которой ввели одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30 или Контроль-PshRNA, определяли на основе длины внешнего сегмента фоторецептора у нормальной мыши (Контроль), принятой за 1. Иммуноблот-анализ родопсина проводили способом, аналогичным способу в примере 5 за исключением того, что ткань сетчатки лизировали в SDS буфере, содержащем смесь ингибиторов протеаз (Roche), а в качестве первичного антитела использовали антитело против родопсина (Merck Millipore) и антитело против β актина (Medical & Biological Laboratories).
[0155] (6) Результаты
Микрофотограммы лейкоцитов, прилипших к сетчатке, показаны на Фиг. 10 A-D (A и B: введение контроля, C и D: введение одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30). Стрелки обозначают лейкоциты, прилипшие к системе кровеносных сосудов сетчатки с воспалением. Масштабная линейка составляет 100 мкМ. Результаты количественного определения лейкоцитов, прилипших к сетчатке, показаны на Фиг. 10 E. Одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30, ингибировала адгезию лейкоцитов в сетчатке с индуцированным эндотоксином увеитом (Фиг. 10 A-E).
Микрофотограммы лейкоцитов, проникших в стекловидное тело, показаны на Фиг. 10 F и G (F: введение контроля, G: введение одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30). Стрелки обозначают проникшие лейкоциты. Масштабная линейка составляет 30 мкМ. Результаты количественного определения лейкоцитов, проникших в стекловидное тело, показаны на Фиг. 10 H. Лейкоцитарная инфильтрация в переднюю часть оптического диска уменьшилась за счет введения одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30 (Фиг. 10 F-H).
Результаты измерения уровня экспрессии гена цитокина воспаления показаны на Фиг. 11. Уровни экспрессии генов IL-6, CCL2/MCP-1, ICAM-1 и TNF-α были выше у мышей с индуцированным эндотоксином увеитом (EIU), которым вводили PBS или контроль (Контроль-PshRNA), чем у нормальных мышей (Контроль) без введения (Фиг. 11 A-D). Кроме того, у мышей с индуцированным эндотоксином увеитом, которым ввели одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30 ((P)RR-PshRNA), экспрессия цитокина воспаления и рецептора проренина ((P)RR/Atp6ap2) значительно уменьшалась (Фиг. 11 A-E).
Результаты измерения длины наружного сегмента фоторецептора и иммуноблот-анализ родопсина показаны на Фиг. 12 (RPE представляет собой пигментный эпителий сетчатки, OS представляет собой внешний сегмент, IS представляет собой внутренний сегмент, ONL представляет собой внешний ядерный слой, INL представляет собой внутренний ядерный слой). У мышей с индуцированным эндотоксином увеитом (EIU), которым ввели одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30 ((P)RR-PshRNA), было замедлено уменьшение длины внешнего сегмента фоторецептора (ФИГ. 12 A-D), и было замедлено уменьшение родопсина (Фиг. 12 E).
[0156] (Пример 7) Ингибирующее хроническое воспаление действие в мышиной модели индуцированного стрептозотоцином диабета 1 типа
В последние годы диабетическая ретинопатия считается воспалительным заболеванием. Вследствие этого, используя мышиную модель индуцированного стрептозотоцином диабета 1 типа, подтвердили ингибирующее хроническое воспаление действие одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30. Проводили измерение уровней экспрессии генов провоспалительных цитокинов и количественное определение лейкоцитов, прилипших к кровеносному сосуду сетчатки.
[0157] (1) Введение одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты в мышиную модель индуцированного стрептозотоцином диабета 1 типа
Стрептозотоцин (Sigma) (60 мг/кг массы тела), растворенный в растворе лимонной кислоты, последовательно вводили в течение 4 дней путем внутрибрюшинной инъекции мышам (C57BL/6J в возрасте от 6 до 8 недель) (CLEA Japan). Мышей с концентрацией глюкозы в плазме, превышающей 250 мг/дл на 7 день после введения стрептозотоцина, считали диабетическими и использовали для последующего эксперимента. Через 2 месяца после введения стрептозотоцина одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30, растворяли в PBS до 100 мкМ, и раствор (1 мкл) вводили в стекловидное тело мыши, используя инъекционную иглу 33 калибра с анестезией пентобарбиталом. В качестве контроля использовали то же самое количество PBS или Контроля-PshRNA (SEQ ID №: 76 и SEQ ID №: 62), растворенного в PBS до 100 мкм. Через 24 часа после введения измеряли уровни экспрессии генов цитокинов воспаления. Кроме того, количественно определили лейкоциты, которые прилипли к сетчатке через 48 часов после введения.
[0158] (2) Измерение уровня экспрессии гена цитокина воспаления посредством количественной ПЦР в реальном времени
С помощью способа, аналогичного способу в примере 6, измеряли уровни экспрессии генов IL-6, CCL2/MCP-1, ICAM-1, TNF-α и GAPDH.
[0159] (3) Количественное определение лейкоцитов, прилипших к сетчатке
С помощью способа, аналогичного способу в примере 6, количественно определили лейкоциты, которые прилипли к сетчатке.
[0160] (4) Результаты
Микрофотограммы лейкоцитов, прилипших к сетчатке, показаны на Фиг. 13 A-D (A и B: введение контроля, C и D: введение одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30). Масштабная линейка составляет 100 мкМ. Результаты количественного определения лейкоцитов, прилипших к сетчатке, показаны на Фиг. 13 E. Введение одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30, значительно уменьшало число лейкоцитов (Фиг. 13 A-E).
Результаты измерения уровня экспрессии гена цитокина воспаления показаны на Фиг. 13 F-I (Контроль представляет собой уровень экспрессии нормальной мыши без введения PBS или нуклеиновой кислоты). Экспрессия генов IL-6, CCL2/MCP-1, ICAM-1 и TNF-α у диабетической мыши, которой ввели одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30 ((P)RR-PshRNA), значительно подавлялась по сравнению с экспрессией у диабетической мыши, которой ввели PBS или контроль (Контроль-PshRNA).
[0161] (Пример 8) Ингибирующее ангиогенез действие в мышиной модели с индуцированной лазером CNV
Ингибирующее ангиогенез действие одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30 и имеющей последовательность, ингибирующую экспрессию генов рецептора проренина мыши и человека, подтвердили в мышиной модели с индуцированной лазером CNV.
[0162] (1) Введение одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты в мышиную модель с индуцированной лазером CNV (хориоидальная неоваскуляризация)
Мышей C57BL/6J (самцов в возрасте от 6 до 8 недель) (CLEA Japan) анестезировали с помощью внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала (0,05 мг/г массы тела), и зрачки расширяли 5% фенилэфрина гидрохлоридом и 5% тропикамидом. используя ND:YAG 532-mn лазер (Novus Spectra; Lumenis) проводили лазерную фотокоагуляцию с помощью системы подачи луча на основе щелевой лампы, используя в качестве контактных линз защитное стекло. Каждый глаз облучали четырьмя лазерными пятнами, окружающими глазной нерв (180 мВт, 75 мкм, 100 мс), и создали мышиную модель CNV (хориоидальная неоваскуляризация). Немедленно после лазерной фотокоагуляции в стекловидное тело вводили раствор одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты (1 мкл), полученной посредством растворения в PBS до 100 мкм, используя инъекционную иглу 33 калибра. В качестве контроля использовали то же самое количество PBS или Контроль-PshRNA (SEQ ID №: 76 и SEQ ID №: 62), растворенной в PBS до 100 мкм. Разрыв мембраны Бруха подтверждали появлением воздушных пузырьков во время лазерного повреждения. Из исследования исключали глаза с кровотечением из стекловидного тела, кровотечением из сетчатки или субретинальным кровотечением.
[0163] (2) Количественное определение индуцированной лазером CNV
Мышей подвергали эвтаназии за счет передозировки анестезии через 7 дней после лазерной фотокоагуляции, и глазные яблоки извлекали и фиксировали 4% параформальдегидом в течение 1 часа. После удаления переднего глазного сегмента и нервной сетчатки четыре участка радиально иссекали для выравнивания комплекса сосудистой оболочки-пигментного эпителия сетчатки для получения плоских препаратов сосудистой оболочки глаза. Плоские препараты сосудистой оболочки глаза погружали в PBS, содержащий 5% козью сыворотку и 1% Triton X-100, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего инкубировали вместе с меченым флуоресценцией излектином-B4 при 4°C в течение ночи. Плоские препараты сосудистой оболочки глаза рассматривали в флуоресцентный микроскоп (Biorevo, Keyence), и измеряли площадь CNV, используя программное обеспечение для микроскопа (анализатор BZ-II).
[0164] (3) Результаты
Результаты измерения площади CNV показаны на Фиг. 14A, а микрофотограммы CNV показаны на Фиг. 14B-D. Площадь CNV в сетчатке, в которую ввели одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID №: 72 и SEQ ID №: 30 ((P)RR-PshRNA), была значительно небольшой по сравнению с площадью с PBS или контролем (Контролем-PshRNA).
[0165] Хотя настоящее изобретение было описано выше со ссылкой на иллюстративные варианты осуществления, настоящее изобретение никоим образом ими не ограничено. Различные изменения, которые могут быть понятны специалистам в данной области, могут быть сделаны в конфигурации и характеристиках настоящего изобретения без выхода за рамки настоящего изобретения.
[0166] Содержание, раскрытое в любой публикации, процитированной в настоящем описании, включая патенты и патентные заявки, включено настоящим во всей полноте посредством ссылки, в той степени, в которой они были раскрыты в настоящем описании.
Промышленная применимость
[0167] В соответствии с одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты настоящего изобретения экспрессия гена проренина или гена рецептора проренина может быть ингибирована. Вследствие этого, настоящее изобретение является эффективным в качестве терапевтического средства для заболеваний, вызванных экспрессией гена проренина или гена рецептора проренина, например, увеита, диабетической ретинопатии и т.п.
Данная заявка основана на патентной заявке № 2015-257713 поданной в Японии (дата подачи заявки: 29 декабря 2015 года), содержание которой полностью включено в настоящее описание.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION HOKKAIDO UNIVERSITY
TOKYO MEDICAL UNIVERSITY
BONAC CORPORATION
<120>  ОДНОЦЕПОЧЕЧНАЯ МОЛЕКУЛА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, ИНГИБИРУЮЩАЯ
ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА ПРОРЕНИНА ИЛИ ГЕНА РЕЦЕПТОРА ПРОРЕНИНА, И
ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
<130>  092542
<150>  JP 2015-257713
<151>  2015-12-29
<160>  76
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  ингибирующая экспрессию последовательность
<400>  1
ugauguuguc gaagauaggg g                                                21
<210>  2
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  ингибирующая экспрессию последовательность
<400>  2
uugauauagu ggaaauuccc u                                                21
<210>  3
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  ингибирующая экспрессию последовательность
<400>  3
ugauauagug gaaauucccu u                                                21
<210>  4
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  ингибирующая экспрессию последовательность
<400>  4
uagaacuuuc ggaugaaggu g                                                21
<210>  5
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  ингибирующая экспрессию последовательность
<400>  5
aucaaacucu guguagaacu u                                                21
<210>  6
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  ингибирующая экспрессию последовательность
<400>  6
uuccauuucg gaaaacaaca g                                                21
<210>  7
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  ингибирующая экспрессию последовательность
<400>  7
aauuuccauu ucggaaaaca a                                                21
<210>  8
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  ингибирующая экспрессию последовательность
<400>  8
uuauaugcaa gguuauaggg a                                                21
<210>  9
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  ингибирующая экспрессию последовательность
<400>  9
uauaugcaag guuauaggga c                                                21
<210>  10
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  ингибирующая экспрессию последовательность
<400>  10
aaaaggaacu gcauucucca a                                                21
<210>  11
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  ингибирующая экспрессию последовательность
<400>  11
uuaguaucca uauuagccca u                                                21
<210>  12
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность, комплементарная ингибирующей экспрессию
последовательности
<400>  12
ccuaucuucg acaacaucau c                                                21
<210>  13
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность, комплементарная ингибирующей экспрессию
последовательности
<400>  13
ggaauuucca cuauaucaac c                                                21
<210>  14
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность, комплементарная ингибирующей экспрессию
последовательности
<400>  14
gggaauuucc acuauaucaa c                                                21
<210>  15
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность, комплементарная ингибирующей экспрессию
последовательности
<400>  15
ccuucauccg aaaguucuac a                                                21
<210>  16
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность, комплементарная ингибирующей экспрессию
последовательности
<400>  16
guucuacaca gaguuugauc g                                                21
<210>  17
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность, комплементарная ингибирующей экспрессию
последовательности
<400>  17
guuguuuucc gaaauggaaa u                                                21
<210>  18
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность, комплементарная ингибирующей экспрессию
последовательности
<400>  18
guuuuccgaa auggaaauug g                                                21
<210>  19
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность, комплементарная ингибирующей экспрессию
последовательности
<400>  19
ccuauaaccu ugcauauaag u                                                21
<210>  20
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность, комплементарная ингибирующей экспрессию
последовательности
<400>  20
cccuauaacc uugcauauaa g                                                21
<210>  21
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность, комплементарная ингибирующей экспрессию
последовательности
<400>  21
ggagaaugca guuccuuuua g                                                21
<210>  22
<211>  21
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность, комплементарная ингибирующей экспрессию
последовательности
<400>  22
gggcuaauau ggauacuaaa a                                                21
<210>  23
<211>  25
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  23
gggaugaugu ugucgaagau agggg                                            25
<210>  24
<211>  25
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  24
gggguugaua uaguggaaau ucccu                                            25
<210>  25
<211>  25
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  25
ggguugauau aguggaaauu cccuu                                            25
<210>  26
<211>  25
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  26
gguguagaac uuucggauga aggug                                            25
<210>  27
<211>  25
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  27
ggcgaucaaa cucuguguag aacuu                                            25
<210>  28
<211>  25
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  28
ggauuuccau uucggaaaac aacag                                            25
<210>  29
<211>  25
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  29
ggccaauuuc cauuucggaa aacaa                                            25
<210>  30
<211>  25
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  30
ggacuuauau gcaagguuau aggga                                            25
<210>  31
<211>  25
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  31
ggcuuauaug caagguuaua gggac                                            25
<210>  32
<211>  25
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  32
ggcuaaaagg aacugcauuc uccaa                                            25
<210>  33
<211>  25
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  33
gguuuuagua uccauauuag cccau                                            25
<210>  34
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  34
gctttctcag ccaggacatc                                                  20
<210>  35
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  35
tgggagatga tgttgtcgaa                                                  20
<210>  36
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  36
tcgtaccctt tggagaatgc                                                  20
<210>  37
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  37
gagccaactg caaaacaaca                                                  20
<210>  38
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  38
ggagaaggct ggggctcatt tgc                                              23
<210>  39
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  39
tggccagggg tgctaagcag ttg                                              23
<210>  40
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  40
aggcagtgtc atttcgtacc                                                  20
<210>  41
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  41
gccttcccta ccatatacac tc                                               22
<210>  42
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  42
accccacgaa gtgttggata                                                  20
<210>  43
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  43
aagcagatgg ccacagaact                                                  20
<210>  44
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  44
tggtcgttct cctgttcttt c                                                21
<210>  45
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  45
accctggcga tcttaatatg c                                                21
<210>  46
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  46
caaactttgc tttccctggt                                                  20
<210>  47
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  47
caagggcata tccaacaaca                                                  20
<210>  48
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  48
tgtgggcaac ctattccacc                                                  20
<210>  49
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  49
agctgacgca atgtgactga                                                  20
<210>  50
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  50
gcagactttg ctttccttgg                                                  20
<210>  51
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  51
tccactttcg ctgatgacac                                                  20
<210>  52
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  52
ttggctcagc cagatgca                                                    18
<210>  53
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  53
cctactcatt gggatcatct tgc                                              23
<210>  54
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  54
cctgtttcct ggctctgaag                                                  20
<210>  55
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  55
gtctgctgag acccctcttg                                                  20
<210>  56
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  56
cacagaggat accactccca aca                                              23
<210>  57
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  57
tccacgattt cccagagaaa ca                                               22
<210>  58
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  58
ggtgcctatg tctcagcctc tt                                               22
<210>  59
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  59
cgatcacccc gaagttcagt a                                                21
<210>  60
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  60
aggtcggtgt gaacggattt g                                                21
<210>  61
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  61
tgtagaccat gtagttgagg tca                                              23
<210>  62
<211>  25
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  62
ggaacuucgc gugucgaaua guauu                                            25
<210>  63
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  63
ctggtggcgg gtgctttag                                                   19
<210>  64
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  64
gctacgtctg ggattcgatc t                                                21
<210>  65
<211>  23
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  65
ccuaucuucg acaacaucau ccc                                              23
<210>  66
<211>  23
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  66
ggaauuucca cuauaucaac ccc                                              23
<210>  67
<211>  23
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  67
gggaauuucc acuauaucaa ccc                                              23
<210>  68
<211>  23
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  68
ccuucauccg aaaguucuac acc                                              23
<210>  69
<211>  23
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  69
guucuacaca gaguuugauc gcc                                              23
<210>  70
<211>  23
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  70
guuguuuucc gaaauggaaa ucc                                              23
<210>  71
<211>  23
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  71
guuuuccgaa auggaaauug gcc                                              23
<210>  72
<211>  23
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  72
ccuauaaccu ugcauauaag ucc                                              23
<210>  73
<211>  23
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  73
cccuauaacc uugcauauaa gcc                                              23
<210>  74
<211>  23
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  74
ggagaaugca guuccuuuua gcc                                              23
<210>  75
<211>  23
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  75
gggcuaauau ggauacuaaa acc                                              23
<210>  76
<211>  23
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты
<400>  76
uacuauucga cacgcgaagu ucc                                              23
<---