ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ХРОНИЧЕСКИХ ПАТОЛОГИЙ МОЗГА ИШЕМИЧЕСКОГО ГЕНЕЗА
DIAGNOSTIC KIT OF REAGENTS FOR DETECTING CHRONIC PATHOLOGIES OF THE BRAIN OF ISCHEMIC GENESIS

Область техники
Изобретение относится к средствам диагностики, а именно к методу, устройству и набору реагентов для скоростного выявления хронических состояний головного мозга млекопитающих, в частности, хронической ишемии, эндотоксической и цитотоксической эдемы (отека мозга), развивающихся при сосудистых и травматических поражениях головного мозга, а также риска повторных ишемических событий. Изобретение может применяться при диспансеризации или первичном осмотре пациентов, ранее перенесших черепно-мозговую травму, инсульт или микроинсульт, и позволит проводить наиболее оптимальные лечебные мероприятия в неврологии, травматологии, и спортивной медицине.
Уровень техники
Инсульт, а также другие острые и хронические патологии головного мозга ишемического генеза, представляют собой серьезную угрозу здоровью и жизни людей. Важность ранней и высокоспецифичной диагностики этих состояний трудно переоценить; от правильного диагноза зависит скорость, тяжесть и другие параметры восстановления пациента. Особенно важно диагностировать ишемический инсульт в первые три-шесть часов с начала заболевания для возможности проведения тромболитической терапии. Несмотря на достигнутые успехи, до сих пор существует необходимость в новых, объективных средствах диагностики риска повторения острой фазы ишемии на фоне хронической патологии, а также возникновения связанных с ними эндотоксической и цитотоксической эдемы (отека мозга) и последующих заболеваний малых сосудов. Диагностика подобных состояний в основном основана на методах нейровизуализации, таких как компьютерная томография и магнитно-резонансная томография (МРТ), необходимых для выявления пораженных участков мозга и степени их повреждения. По некоторым оценкам, до 40% пациентов с инсультом в Великобритании не могут быть вовремя продиагностированы радиологическими методами из-за противопоказаний, нестабильности состояния или недоступности оборудования (Hand PJ et al. (2005) J Neurol Neurosurg Psychiatry 76: 1525-1527). Во многих других странах проблема с доступностью оборудования стоит гораздо более остро, и, соответственно, процент таких пациентов выше. Отдельной проблемой является диагностика и предсказание последствий для транзиторных ишемических атак (ТИА) или микроинсультов, с симптомами, длящимися от часа до 24 часов. Во многих случаях у пациентов, перенесших инсульт или ТИА, регистрируется по крайней мере один повторный инсульт в течение короткого промежутка времени. Игнорирование симптомов ТИА пациентом может привести к развитию хронических патологий головного мозга. Несмотря на понимание роли некоторых факторов, определяющих развитие повторных или хронических инсультов, таких как наличие атеросклероза, повышенного артериального давления или сахарного диабета, в настоящее время пока отсутствует возможность мониторинга состояния больного с такими предшествующими факторами, особенно на фоне хронического инсульта, при помощи недорогих биохимических тестов для быстрой и эффективной оценки рисков повторных инсультов.
Из уровня техники известно несколько иммуноактивных биомаркеров, предполагаемых для диагностики инсульта или ТИА в дополнение к имеющимся средствам нейровизуализации (Bazarian JJ, et al. PLoS One 2014, 9, e94734; Wang KK, et al. J Neurotrauma 2016, 33,1270-1277; Сорокина ЕГ, и др., Ж. Неврологии Психиатр 2010,110, 30-35; Guaraldi F, et al. J Clin Med 2015, 4, 1025-1035), однако ни один из них пока не нашел применения в клинической практике, в основном по причине недостаточной специфичности. Аналогично, на сегодняшний день на рынке не существует эффективных средств для прогнозирования развития хронических инсультов или микроинсультов. Поэтому крайне актуальной остается проблема создания специфического недорогого экспресс-теста для выявления хронической ишемии, особенно в ассоциации с отеком головного мозга (эндотоксической или цитотоксической эдемой). Данное изобретение обладает рядом свойств, необходимых для решения поставленной задачи, и поэтому может расширить арсенал средств, применяемых для выявления хронических поражений головного мозга и риска повторных ишемических событий.
Сущность изобретения
Известно, что уровни циркулирующих в крови фрагментов нейрорецепторов НМДА могут быть использованы как диагностический инструмент для клинической оценки пациентов, перенесших инсульт или ТИА. НМДА-рецепторы являются подклассом ионотропных рецепторов глутамата, селективно связывающих N-метил-D-аспартат (НМДА). Целью настоящего изобретения является создание метода и устройства для быстрого и удобного выявления хронических состояний головного мозга млекопитающих ишемического генеза, в частности, риска повторного инсульта или микроинсульта, отсроченной хронической ишемии, связанной с формированием отека мозга, при сосудистых или травматических поражениях головного мозга, приводящих к гибели клеток нервной ткани. Для решения указанной задачи был получен и экспериментально протестирован гибридный пептид, образующийся при патологических условиях в виде единого фрагмента двух фрагментов субъединиц нейрорецепторов НМДА (возможность образования таких гибридов была описана в заявке WO /2002/012892).
Особенностью данного изобретения является то, что в качестве диагностического маркера используются патологические антитела, вырабатывающиеся на гибридные фрагменты нейрорецепторов НМДА. Определение уровня антител на собственные белковые фрагменты (аутоантител) предпочтительно для хронических патологий, поскольку эффективное образование антител происходит в ответ на повторяющееся появление антигена в кровотоке. Уровень специфических аутоантител на нейрорецепторы НМДА будет коррелировать со степенью тяжести и размером повреждения структур головного мозга. В данном изобретении гибридный пептид образован из двух разных антигенных фрагментов и поэтому позволяет детектировать антитела к двум разным субъединицам НМДА рецептора.
Один из вариантов изобретения включает в себя набор реагентов (комплект реагентов) для диагностики хронической патологии мозга млекопитающего ишемического генеза, включающий гибридный пептид, имеющий по меньшей мере 90% идентичность по всей длине с последовательностью SEQ ID NO: 1 (приведенной в Перечне последовательностей), и иммобилизованный на твердом носителе, а также реагент для определения присутствия аутоантител к вышеупомянутому гибридному пептиду в биологической жидкости млекопитающего, имеющий сродство к иммуноглобулинам млекопитающего. Таким образом, гибридный пептид по настоящему изобретению включает в себя как последовательность SEQ ID NO: 1, так и последовательности, достаточно близкие к SEQ ID NO: 1, и содержащие вставки, замены или делеции аминокислот, не нарушающие, или почти не нарушающие, функциональные свойства гибридного полипептида, такие как аффинность к аутоантителам, распознающим субъединицы НМДА рецептора. В качестве биологической жидкости млекопитающего может быть использована кровь, плазма крови, сыворотка крови, спинномозговая жидкость, слюна, пот, пары дыхания или другие жидкости организма, содержащие антитела. Примерами хронических патологий мозга ишемического генеза являются хроническая ишемия, повторные и отсроченные инсульты или микроинсульты.
В предпочтительном варианте изобретения реагентом для определения присутствия аутоантител является агент, специфически связывающий константный участок молекул антител млекопитающего, конъюгированный с агентом визуализации. Примером такого агента выступает белок А, выделенный с поверхности клеточной стенки золотистого стафилококка, и имеющий высокую аффинность к константному участку тяжелой цепи (Fc-домену) IgG. Также, таким агентом может выступать фрагмент антитела, распознающего константный участок тяжелой цепи IgG. Для облегчения последующей детекции на тест-полоске в предпочтительном варианте изобретения такой агент конъюгируют с агентом визуализации. Конъюгация предпочтительно происходит через образование ковалентной связи между двумя агентами, но может осуществляться другим способом при условии образования стабильного функционального комплекса. Агентом визуализации может выступать наночастица золота, органический краситель, магнитная наночастица, углеродная нанотрубка или флуоресцентный нанокристалл.
В предпочтительном варианте изобретения твердый носитель, на котором иммобилизован гибридный пептид, представляет собой мембрану из нитрата целлюлозы.
Некоторые варианты изобретения также включают в себя диагностическую тест-полоску для ускоренного выявления хронической патологии мозга ишемического генеза, имеющую по меньшей мере три зоны, расположенных последовательно, а именно, зону нанесения образца, зону реакции и зону детекции, причем зона нанесения образца способна впитывать биологическую жидкость млекопитающего и направлять ее к зонам реакции и детекции под действием капиллярных сил; зона детекции содержит тестовую линию, на которой иммобилизован гибридный пептид, имеющий по меньшей мере 90% идентичности по всей длине с последовательностью SEQ ID NO: 1; а зона реакции, расположенная между зонами нанесения образца и детекции, содержит реагент для определения присутствия аутоантител к вышеупомянутому гибридному пептиду в биологической жидкости млекопитающего, имеющий сродство к иммуноглобулинам млекопитающего. В предпочтительном варианте изобретения реагентом для определения присутствия аутоантител является агент, специфически связывающий константный участок молекул антител млекопитающего, конъюгированный с агентом визуализации, а в качестве агента визуализации может выступать наночастица золота, органический краситель, магнитная наночастица, углеродная нанотрубка или флуоресцентный нанокристалл.
Некоторые варианты изобретения также включают в себя способ идентификации пациентов с хроническими патологиями мозга ишемического генеза, включающий отбор образца биологической жидкости млекопитающего, нанесение этого образца биологической жидкости на диагностическую тест-полоску по настоящему изобретению в зону нанесения образца, и определение наличия агента визуализации на тестовой линии в зоне детекции диагностической тест-полоски. В предпочтительном варианте изобретения наличие агента визуализации на тестовой линии определяется в течение 15 или менее минут после нанесения образца биологической жидкости на диагностическую тест-полоску.
Технический результат настоящего изобретения заключается в том, что данное изобретение помогает решить проблему быстрой и объективной оценки состояния пациента с хроническим поражением мозга ишемического генеза и подозрением на повторный инсульт. Выделен, проанализирован и протестирован новый гибридный пептид, образованный с помощью слияния двух фрагментов субъединиц нейрорецепторов НМДА, обладающих антигенными потенциалами. Описано устройство, позволяющее быстро и удобно тестировать аутоантитела, присутствующие в крови пациента и распознающие гибридный пептид. Наличие таких антител указывает на наличие определенных структурных поражений мозга и служит индикатором массированной гибели клеток нервной ткани. Описанный подход расширяет доступный инструментарий, используемый при диспансеризации или первичном осмотре пациентов, ранее перенесших черепно-мозговую травму, инсульт или микроинсульт, и позволит проводить наиболее оптимальные лечебные мероприятия.
Определения и термины
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Термин «антитело» эквивалентен термину «иммуноглобулин» и означает гликопротеин, образующийся в ответ на введение в организм млекопитающего бактерий, вирусов или других антигенов, состоящий из двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепи, соединенных дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов - СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. VH и VL-области могут быть далее подразделены на гипервариабельные участки, именуемые областями, определяющими комплементарность (H-CDR и L-CDR), разделенные более консервативными областями. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном (то есть, антигенсвязывающую часть антитела). Константные области тяжелых цепей имеют достаточно консервативные аминокислотные последовательности, обладающие высокой степенью гомологии для всех молекул антител одного класса. Константные участки молекулы иммуноглобулина могут содержать разные комбинации доменов из константных областей тяжелых и/или легких цепей; в некоторых вариантах изобретения под константным участком следует понимать Fc-регион молекулы иммуноглобулина, который состоит из димера, образованного СН2 и СН3 доменами двух тяжелых цепей. Fc-регион опосредует эффекторные функции антитела, то есть взаимодействие молекулы иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включающими различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки). Термин «аутоантитела» в настоящем описании обозначает молекулы антител, которые выработались в организме млекопитающего в ответ на антигены, образованные из белков собственного организма (аутоантигены). Аутоантитела могут вырабатываться в ответ на аутоантигены, которые в норме не присутствуют в кровотоке, например, на гибридные фрагменты нейрорецепторов, или в ответ на гибридные белки или пептиды, образованные слиянием двух или более белковых фрагментов.
Реагентом, который имеет сродство к иммуноглобулинам, может являться любое химическое вещество, способное специфически связываться с иммуноглобулинами и образовывать новый комплексный объект. При этом, данный реагент не должен ингибировать связывание иммуноглобулинов с их специфическими антигенами (реакцию антитело-антиген).
Используемый здесь термин «процент идентичности двух последовательностей» определяется числом положений идентичных аминокислот в этих двух последовательностях с учетом числа пробелов и длины каждого пробела, которые необходимо ввести для оптимального сопоставления двух последовательностей путем выравнивания. Процент идентичности равен числу идентичных аминокислот в данных положениях с учетом выравнивания последовательностей, разделенному на общее число положений, и умноженному на 100. Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей может быть определен с помощью бесплатной программы NCBI Protein BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
Краткое описание рисунков
Рис. 1. Упрощенная структура диагностической тест-полоски в пластиковом корпусе. 1 - накладка-фильтр для нанесения образца биологической жидкости, 2 - накладка, содержащая детектирующий реагент и образующая зону реакции, 3 - нитроцеллюлозная мембрана, образующая зону детекции, 4 - адсорбентная накладка, 5 - лунка для нанесения образца, 6 - тестовая линия, образованная иммобилизованным гибридным пептидом, 7 - контрольная линия, образованная иммобилизованными антителами, распознающими константные участки молекул антител, 8 - корпус пластиковой кассеты, покрывающий диагностическую тест-полоску.
Рис. 2. Результаты экспресс-диагностики хронической патологии мозга после легкой ЧМТ. Пациент_№1 - левая часть рисунка (А), Пациент_№2 - правая часть рисунка (Б). Уровень аутоантител при хронической ишемии мозга был определен с помощью диагностической тест-полоски (верхняя часть рисунка). У обоих пациентов подтверждено образование цитотоксической эдемы при помощи МРТ (нижняя часть рисунка). Обозначения: 11 - контрольная полоса, 12 - тестовая полоса.
Подробное раскрытие изобретения
Ключевым моментом патогенеза ишемического инсульта является нейротоксичность и иммуноэксайтотоксичность - каскад патобиохимических изменений, которые могут привести к необратимому повреждению нервной ткани по механизму апоптоза. Например, характерный для ишемии недостаток поступления кислорода и глюкозы может вызывать нарушение работы клеточных ионных насосов (которыми являются ионотропные глутаматные рецепторы) и избыточное поступление в клетку ионов Na+, что вызывает повышение внутриклеточного осмотического давления и соответственно чрезмерное поступление воды в клетку. Это является причиной образования цитотоксического отека головного мозга. Вместе с этим, гибель клеток головного мозга приводит к высвобождению в биологические жидкости пациента специфических для центральной нервной системы (ЦНС) молекул, например, пептидных фрагментов нейрорецепторов. Эти фрагменты проникают через гематоэнцефалический барьер и попадают в кровь пациента, где могут быть зарегистрированы. Заявителями было обнаружено, что значительные количества фрагментов нейрорецепторов НМДА появляются при ишемических атаках, которые специфичны для области поражения эндогенной или цитотоксической эдемой. Нейротоксичность активирует сериновые протеазы, которые расщепляют НМДА рецепторы на короткие пептиды, некоторые из которых обладают иммунной активностью. При тяжелых или хронических поражениях нервной ткани концентрация таких иммуноактивных пептидов становится достаточно большой, для того чтобы после попадания в кровоток инициировать аутоиммунный ответ - выработку аутоантител на эти пептиды. Таким образом, как фрагменты нейрорецепторов НМДА, так и аутоантитела на них, могут служить маркерами гибели клеток нервной ткани (апоптоза). Эффективное образование аутоантител требует постоянного притока иммуноактивных гибридных фрагментов НМДА рецепторов в кровоток и может происходить бессимптомно у лиц с предшествующими факторами (атеросклероз, гипертензия, диабет) (Gonzalez-Garda et al. J Neurol Sci. 2017; 375:324-330). Было установлено, что обнаруживаемые концентрации НМДА аутоантител появляются в крови на третьи- седьмые сутки после попадания пептидных фрагментов в кровь (Dambinova S et al., Clin Chem, 2003 Oct; 49(10): 1752-62). Вместе с этим, аутоантитела персистируют в кровотоке в течение длительного времени (от нескольких недель до месяцев), и поэтому они потенциально являются более надежным и удобным индикатором наличия патологии.
Определение наличия в крови аутоантител к нейрорецепторам НМДА может быть использовано для оперативного обследования пациентов с подозрением на инсульт или ТИА, а также для оценки симптоматического ТИА. Наиболее эффективная выработка аутоантител происходит в случае образования цитотоксической эдемы, когда происходит необратимая гибель клеток нервной ткани посредством апоптоза. В этом случае велика вероятность возникновения повторных ишемических атак, а также развития хронической ишемии. В настоящее время диагностика цитотоксической эдемы осуществляется только при помощи диффузионной спектральной томографии, что требует времени, значительных инструментальных ресурсов и финансовых затрат. В данном изобретении описано создание устройства (диагностической тест-полоски) для предсказания значительных поражений нервной ткани при помощи обнаружения аутоантител к нейрорецепторам НМДА в крови пациентов с использованием латеральной проточной иммунохроматографии.
Ключевым аспектом создания подобного устройства является выбор антигена для эффективной и специфической детекции аутоантител. Авторами изобретения были проанализированы различные фрагменты нейрорецепторов НМДА, циркулирующих в крови пациентов, имеющих значительные поражения нервной ткани, а также проанализирована способность этих фрагментов вызывать аутоиммунный ответ. Такая способность определяется степенью схожести пептидных эпитопов фрагментов НМДА с другими белковыми эпитопами, которые распознаются иммунной системой организма млекопитающего и не воспринимаются как чужеродные. Также, иммуногенность пептида определяется его сродством к рецепторам главного комплекса гистосовместимости; такое сродство позволяет индуцировать Т-клеточный иммунный ответ и образование IgG антител на пептиды. Процедура поиска и анализа пептидных фрагментов нейрорецепторов в крови пациентов была описана в Dambinova S et al., Biomarkers for Traumatic Brain Injury, 2012, Royal Society of Chemistry (SN - 978-1-84973-389-2), p.66-86. Кратко, белковые фрагменты, изолированные из синаптических мембран коры головного мозга, использовались для продукции поликлональных антител. Далее эти антитела использовались для скрининга плазмы или сыворотки пациентов с хроническими патологиями головного мозга. Аффинно-очищенные из плазмы пациентов пептиды идентифицировались с помощью методов масс спектрометрии. Далее идентифицированные пептиды, относящиеся к фрагментам глутаматных рецепторов, синтезировались и верифицировались на предмет эффективного связывания с IgG антителами, изолированными из крови пациентов. Таким образом были селектированы наиболее иммуногенные пептиды.
Было обнаружено, что в крови пациентов, имеющих значительные поражения нервной ткани, могут присутствовать пептидные фрагменты двух субъединиц нейрорецепторов НМДА, а именно, субъединиц NR2A (продукт гена GRIN2A) и NR2B (продукт гена GRIN2B) в разных концентрациях. Более того, неожиданно было обнаружено присутствие в крови пациентов определенных гибридных пептидов, возникающих посредством слияния более мелких пептидов, образованных из NR2A и NR2B. Такие гибридные пептиды часто являются более иммуногенными по сравнению с пептидами, образованными из только одной из субъединиц, поскольку слияние двух пептидов из разных субъединиц может приводить к образованию неоантигенов. Для создания простой, эффективной и специфической тест-системы для детекции аутоантител заявителями были выделены, очищены и проанализированы различные гибридные пептиды, присутствующие в крови пациентов с хроническими патологиями головного мозга. В частности, был селектирован гибридный пептид, сконструированный путем объединения двух участков субъединиц NR2A и NR2B, как обладающий значительным антигенным потенциалом. Получившийся пептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (приведена в Перечне последовательностей). Таким образом, данный пептид может служить для определения наличия аутоантител как на фрагменты NR2A, так и NR2B.
Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Ключевыми параметрами тест-системы на НМДА аутоантитела будут являться специфичность, минимальный уровень детекции аутоантител, простота использования и интерпретации результата, стоимость, надежность. Оптимальный уровень этих параметров можно получить при реализации тест-системы на основе латеральной проточной иммунохроматографии. В этом случае для определения аутоантител используется диагностическая тест-полоска, имеющая по меньшей мере три зоны, расположенные последовательно, а именно, зону нанесения образца, зону реакции и зону детекции, причем зона нанесения образца, изначально сухая, способна впитывать биологическую жидкость млекопитающего и направлять ее к зонам реакции и детекции под действием капиллярных сил. Различные варианты реализации такой конструкции известны специалистам и могут быть использованы в настоящем изобретении. В качестве образца, например, могут быть использованы несколько капель свежеотобранной крови пациента (20-80 мкл). Образец помещают в зону нанесения образца, при этом жидкость мигрирует через специальную накладку-фильтр к зоне реакции. Материал специальной накладки может быть подобран для осуществления фильтрации крови и оптимизации фонового сигнала способами, известными специалистам, например, с помощью материалов из стекловолокна. Зона реакции содержит агент, способный специфически связывать константный участок молекул антител иммуноглобулина, при этом данный агент конъюгирован с агентом визуализации и способен мигрировать под действием капиллярных сил к зоне детекции после связывания с молекулой иммуноглобулина. При хронических поражениях головного мозга происходит постоянная выработка фрагментов нейрорецепторов НМДА и их последующее поступление в кровоток. Это приводит к развитию зрелого иммунного ответа на иммуногенные пептиды с образованием иммуноглобулинов класса G (IgG) в крови пациента. Поэтому, в предпочтительном варианте изобретения, в зоне реакции используется агент, способный специфически связывать константный участок молекул антител IgG. Таким агентом, например, может служить белок А, выделенный с поверхности клеточной стенки золотистого стафилококка, и имеющий высокую аффинность к константному участку тяжелой цепи IgG. Для удобства детекции, в предпочтительном варианте изобретения, белок А был конъюгирован с агентом визуализации методами, известными специалистам. В качестве агента визуализации может быть использовано вещество, способное испускать обнаруживаемое излучение, либо у которого можно вызвать испускание обнаруживаемого излучения (например, посредством радиоактивного распада, химической реакции, возбуждения флуоресценции, возбуждения спинового резонанса и так далее). В разных вариантах изобретения таким агентом может служить наночастица золота, фермент (например, пероксидаза хрена), органический краситель или флуоресцентный нанокристалл (квантовая точка), а также другие подобные агенты, известные специалистам. Визуализация сигнала в зоне детекции может происходить при освещении дневным светом широкого спектра или посредством использования узкоспектральных источников. В предпочтительном варианте изобретения белок А был конъюгирован с молекулой стрептавидина при помощи малеимидной функциональной группы; кроме того, были использованы коммерчески доступные биотинилированные наночастицы золота. В результате, финальная конъюгация «белок А - наночастица золота» осуществлялась с помощью высокоаффинного взаимодействия биотин-стрептавидин.
Образованные в зоне реакции комплексы «аутоантитело IgG - белок А - наночастица золота» далее мигрируют в зону детекции под действием капиллярных сил. В предпочтительном варианте изобретения зона детекции представляет собой мембрану из нитрата целлюлозы с порами, достаточными для прохождения данного комплекса. Примеры таких мембран известны специалистам. В некоторых вариантах изобретения использовались мембраны от следующих производителей: Sartorius (CN95, CN 140), Millipore (HF 90, HF 120, HF 180) или MDI (mdi70, mdi10u). В предпочтительном варианте изобретения мембрана содержит по меньшей мере две полосы, тестовую и контрольную, предпочтительно расположенных перпендикулярно потоку жидкости. Тестовая полоса образована при помощи иммобилизации на мембране выбранного гибридного пептида с последовательностью SEQ ID NO: 1, или идентичной ей по меньшей мере на 90%. Для иммобилизации пептида на мембране могут быть использованы различные методы, известные специалистам. В предпочтительном варианте изобретения иммобилизация на мембране осуществлялась при помощи конъюгации пептида с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Гибридный пептид может быть конъюгирован с БСА при помощи малеимидной функциональной группы, с использованием коммерчески доступной комбинации малеимид-БСА. Далее, комплекс пептид-БСА непосредственно наносился на мембрану в районе тестовой полосы и связывался с мембраной в процессе высушивания.
Контрольная полоса расположена дальше от тестовой линии по потоку жидкости и образована при помощи иммобилизации на мембране поликлональных анти-lgG антител методами, известными специалистам. Мигрирующий из зоны реакции комплекс «аутоантитело IgG - белок А - наночастица золота» сначала может провзаимодействовать с иммобилизованным гибридным пептидом, при условии, если аутоантитело имеет сродство к этому пептиду. Несвязавшиеся комплексы мигрируют далее до контрольной полосы, где происходит связывание иммобилизованных анти-IgG антител с данными комплексами. Соответственно, при проявлении только контрольной полосы результат теста считается отрицательным. Визуализация связывания будет осуществляться при помощи используемого агента визуализации, при этом, природа агента визуализации будет определять способ, по которому будет происходить детекция. В предпочтительном варианте изобретения используемые наночастицы золота имеют хорошие оптические свойства; при связывании на полосе и освещении дневным светом они окрашивают полосу в темно-золотистый цвет и позволяют производить детекцию визуально, без помощи дополнительного оборудования. Интенсивность сигнала будет пропорциональна концентрации специфических антител к пептиду, присутствующих в образце. Наконец, в конце зоны детекции находится адсорбентная накладка, которая поддерживает ток жидкости вдоль мембраны по направлению от зоны нанесения образца к зоне детекции и предотвращает противоток. Упрощенная структура диагностической тест-полоски в одном из вариантов изобретения показана на Рис. 1.
Описанный вариант реализации изобретения позволяет проводить полуколичественный анализ содержания аутоантител, специфичных к иммобилизованному пептиду. Интенсивность и скорость проявления тестовой полосы будет определяться концентрациями антител в образце и может сравниваться с окраской полос на референс-карте, специально разработанной для определенного набора реагентов. Построение референс-карты можно производить при помощи титрования образца специально полученных поликлональных антител к гибридному пептиду.
Примеры использования изобретения
Пример 1. Результат определения антител к гибридному пептиду с помощью экспресс-диагностики при хронической ишемии мозга (с подтвержденной цитотоксической эдемой).
Женщина, 77 лет, поступила в неврологическое отделение №1 Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова (ПСПбГМУ) с жалобами после легкой ЧМТ. Были определены факторы риска в виде гипертонической болезни, сахарного диабета второго типа, распространенного атеросклероза. Неврологический статус: 1) Умеренное нарушение когнитивных функций; 2) Двусторонняя пирамидная недостаточность; 3) Корешковый синдром L4-L5 справа; 4) Полиневропатический синдром с укорочением вибрационной чувствительности и выпадением ахилловых рефлексов.
Был сделан диагностический экспресс-тест при помощи тест-полоски по настоящему изобретению, а также МРТ головного мозга в режиме Т2 FLAIR (Рис. 2А). На снимках МРТ была обнаружена цитотоксическая эдема (проявляется в виде светлых областей). Диагностический экспресс-тест показал наличие двух полос (Рис. 2А).
Пример 2. Результат определения антител к гибридному пептиду с помощью экспресс-диагностики при хронической ишемии мозга (с подтвержденной цитотоксической эдемой).
Женщина, 83 лет, поступила в неврологическое отделение №1 ПСПбГМУ с жалобами на шаткость при ходьбе, скованность при движениях в конечностях, периодические ощущения потемнения в глазах, головокружения, дрожь во всем теле, отеки стоп. Ранее госпитализировалась в ПСПбГМУ с диагнозом Дисциркуляторная энцефалопатия III ст., синдром сосудистого паркинсонизма. Были определены факторы риска в виде гипертонической болезни и распространенного атеросклероза. Неврологический статус: 1) умеренное нарушение когнитивных функций; 2) псевдобульбарный синдром; 3) синдром паркинсонизма; 4) двусторонняя пирамидная недостаточность; 5) нарушение статики и динамики в поясничном отделе позвоночника.
Был сделан диагностический экспресс-тест при помощи тест-полоски по настоящему изобретению, а также МРТ головного мозга в режиме Т2 FLAIR (Рис. 2Б). На снимках МРТ была обнаружена цитотоксическая эдема (проявляется в виде светлых областей и точек). Диагностический экспресс-тест показал наличие двух полос (Рис. 2Б).
Пример 3. Пилотное исследование пациентов ПСПбГМУ с помощью диагностических тест-полосок по настоящему изобретению.
В исследовании приняло участие 10 человек с установленным рабочим диагнозом «Дисциркуляторная энцефалопатия/Хроническое нарушение мозгового кровообращения (ХНМК)», что согласно Международной Классификации Болезней соответствует шифру I67 (I67.2 Церебральный атеросклероз, I67.4 Гипертензивная энцефалопатия, I67.8 Другие уточненные поражения сосудов мозга). Диагноз подтверждался клиническими (неврологический осмотр), нейро-психологическими (шкалы MMSE, FAB) и инструментальными методами исследования (нейровизуализация, дуплексное сканирование), принимали участие 3 мужчин и 7 женщин, средний возраст 68,3 лет. Всем участникам исследования проводилась магнитно-резонансная томография (МРТ) в режимах Т1, Т2, Т2 FLAIR, DWI, GRE, а также другие методы обследования, направленные на поиск потенциальных факторов риска нарушений мозгового кровообращения. Таким образом, атеросклероз брахиоцефальных и церебральных артерий был выявлен у 7 пациентов, гипертоническая болезнь - у 5 пациентов, сахарный диабет - у 2 пациентов, аритмии - у 2 пациентов. У двух пациентов диагностировано сочетание трех факторов риска. Контрольную группу составили 12 относительно здоровых добровольцев, подобранных с учетом среднего возраста, идентичного среднему возрасту тестовой группы пациентов.
При поступлении в стационар у пациентов бралась капиллярная кровь, 80 мкл образца помещались в специальное окошко экспресс-теста, добавлялось 10 мкл фосфатного буфера. В течение 30 минут (в среднем 15 минут) наблюдали развитие иммунохроматографической реакции в виде появления на экране экспресс-теста контрольной С-полоски и тестовой Т-полоски. У восьми из десяти пациентов с диагнозом «Хроническое нарушение мозгового кровообращения/Дисциркуляторная энцефалопатия» экспресс-тест показал положительный результат. В контрольной группе из 12 пациентов тестовая полоса проявилась только в одном случае. Таким образом, предварительные испытания диагностических тест-полосок по настоящему изобретению показали чувствительность около 80% и специфичность около 93%.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.