СПОСОБ ПРОГНОЗА РЕЗУЛЬТАТА ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ И ПЕРЕНОСА ЭМБРИОНОВ (ЭКО И ПЭ)
METHOD OF PREDICTING RESULT OF EXTRACORPORAL FERTILISATION AND EMBRYO TRANSFER (ECF AND ET)

Область применения - медицина, а именно акушерство и гинекология, репродуктология.
Вспомогательные репродуктивные технологии в последние десятилетие стали ведущим методом лечения бесплодия. Основой для этих методов является процедура экстракорпорального оплодотворения преовуляторных фолликулов и перенос дробящихся эмбрионов в полость матки (ЭКО и ПЭ). Эффективность данного метода составляет 37-38% наступивших беременностей на перенос эмбрионов и на протяжении последних лет не имеет тенденции к улучшению (данные РАРЧ 2004-2008 г). Учитывая высокую стоимость метода и достаточно низкую результативность, появляется необходимость в прогнозе результата ЭКО и ПЭ для определения реальных шансов наступления беременности в каждом конкретном случае. А как следствие, оценке целесообразности проведения ЭКО и ПЭ и оптимизации тактики ведения пациенток как на этапе подготовки к ЭКО и ПЭ, так и на этапе проведения программы ЭКО и ПЭ [1, 2, 3].
Уровень техники
Аналоги
Известен способ оценки развития ооцитов путем исследования маркеров в фолликулярной жидкости, полученной во время пункции фолликулов и аспирации их содержимого при проведении программы ЭКО и ПЭ, с целью определения исходов программы. Сущность данного исследования заключается в том, что в фолликуллярной жидкости определяют более высокие уровни инсулиноподобного фактора роста (ИФР) и низкие интерлейкина-1, что свидетельствуют о благоприятном прогнозе для наступления беременности [4].
Недостатками способа является отсутствие четких критериев - при каких значениях исследуемых маркеров следует думать о неблагоприятном исходе программы ЭКО, что снижает точность и информативность данного способа. Кроме того, данное исследование проведено в группе пациенток без патологии со стороны репродуктивной системы, показанием для проведения программы ЭКО был мужской фактор бесплодия, в связи с чем оплодотворение in vitro осуществлялось с помощью интрацитоплазматической инъекции сперматозоида, в то время как основными показаниями к проведению программы экстракорпорального оплодотворения является трубное бесплодие. Также отсутствуют сведения о пациентках, которым перенос эмбрионов не производился в связи с нарушенным оплодотворением in vitro.
Известен способ прогнозирования исходов программы ЭКО и ПЭ, описанный Зосимовским А.Ю. в 1997 г.
Сущность способа состоит в том, что при осуществлении программы ЭКО у женщин без аутоиммунных заболеваний проводят диагностику антифосфолипидного синдрома. С этой целью для иммуноморфологического исследования проводят биопсию эндометрия на 8-11 день менструального цикла у женщин, перенесших неудачную попытку экстракорпорального оплодотворения. Материал для иммуноморфологического исследования помещают в жидкий азот, затем готовят серийные срезы толщиной 5 микрон в криостате. Полученные срезы обрабатывают по прямому методу Кунса иммунными люминисцирующими сыворотками против С3 фракции комплемента человека, фибриногена и иммуноглобулинов классов А, М, G. Интенсивность люминесценции оценивают визуально по трехкрестовой шкале (+ - слабая, ++ - умеренная, +++ - сильная). Определение циркулирующих антифосфолипидных антител в крови проводят иммуноферментным твердофазным методом (Falcon et al., 1991). Циркуляция антифосфолипидных антител приводит к образованию и нарушению элиминации иммунных комплексов у женщин и является неблагоприятным прогнозом исхода экстракорпорального оплодотворения [5].
Однако данный способ является трудоемким, невозможным для использования и прогноза исхода у женщин с завершенной программой ЭКО. Кроме этого, диагностика, необходимая для выявления антифосфолипидных антител, а также терапия, направленная на элиминацию соответствующих иммунных комплексов, должны выполняться своевременно (на этапе подготовки женщины к программе ЭКО).
Известен еще один способ прогнозирования исходов программы ЭКО и ПЭ, описанный Сагамоновой К.Ю. в 2002 году.
Сущность способа заключается в раздельной аспирации ооцитов и фолликулярной жидкости из правого и левого яичника при трансвагинальной пункции. В полученной фолликулярной жидкости определяют активность протеолитических ферментов - кислых пептид-гидролаз. При уровне пептид-гидролаз выше 75 мг/мл прогнозируют благоприятный исход ЭКО и ПЭ [6].
Существенным недостатком данного способа является невозможность его применения до начала протокола ЭКО и ПЭ. Прогноз определяется лишь на финальном этапе программы и соответственно не дает возможность провести подготовку к протоколу, или своевременно принять решение о нецелесообразности выполнения ЭКО и ПЭ. Кроме этого, данный способ оценивает лишь состояние ооцитов и не затрагивает при оценке вероятности беременности такие важные факторы, как состояние эндометрия, матки и маточных труб.
Прототип - способ прогнозирования исходов программы ЭКО, описанный в автореферате дисс. д.м.н. B.C.Корсака, 1999 г.
Сущность способа состоит в том, что на этапе индукции суперовуляции вне зависимости от протокола ее проведения в качестве значений ультразвуковых критериев назначения ХГ приняты: средний диаметр большинства фолликулов в когорте, равный 17 мм, и толщина эндометрия 8 мм без ограничения их максимальных значений. Это параметры, определяющие благоприятный прогноз в отношении исхода программы ЭКО, т.е. оказывающие наиболее выраженное влияние на частоту наступления беременности [7].
Данный способ обладает рядом несовершенств:
- способ не исключает определенной доли субъективизма в измерении УЗ параметров;
- способ невозможно применить до начала протокола ЭКО.
- способ не учитывает состояние эндометрия, труб, гормональный статус, что снижает его точность.
Указанные недостатки могут быть устранены в заявляемом изобретении.
Сущность изобретения
Цель изобретения заключается в разработке способа прогноза результата экстрокорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ЭКО и ПЭ) у пациенток с трубно-перитонеальным генезом бесплодия на основе данных анамнеза и молекулярно-генетического анализа.
Поставленная цель достигается с помощью вычисления прогностического индекса, который позволяет определить вероятность наступления беременности у каждой конкретной пациентки в результате ЭКО и ПЭ. Очевидным преимуществом метода является возможность его применения до начала протокола ЭКО.
Способ осуществляют следующим образом: у пациенток с трубно-перитонеальным генезом бесплодия производят сбор анамнеза. Особое внимание уделяется возрасту, перенесенным инфекциям, выполненным операциям и предшествующим беременностям.
2
Следующим этапом выполняют гинекологическое ультразвуковое исследование согласно протоколу. Исследование необходимо выполнять в I фазу менструального цикла (2-5 дни менструального цикла). Особое внимание необходимо обратить на объем яичников и количество антральных фолликулов. Если объем самого крупного яичника менее 3 см и (или) кол-во антральных фолликулов менее 5 (в 2 яичниках) или 3 (в единственном яичнике), то такую ситуацию расценивают как снижение овариального резерва.
Далее осуществляют взятие биологического материала для выделения ДНК. Образцы ДНК получают из клеток буккального эпителия, используя набор реагентов и протокол для выделения ДНК из различного биологического материала фирмы НПО "ДНК-Технология" (Россия) - «Проба-Рапид». Далее на полученных образцах проводят полимеразную цепную реакцию в режиме "реального времени" с использованием комплектов реагентов и протоколов фирмы НПО "ДНК-Технология" (Россия). Детекцию результатов осуществляют на приборе ДТ-96, производства НПО "ДНК-Технология". Анализ результатов ПЦР обеспечивается программным обеспечением прибора ДТ-96.
Полученные данные вводят формулу для расчета прогностического индекса Р:
Р=0,06×Х1+0.58×Х2+0.66×Х3-1.12×Х4+1.1×Х5-1.0×Х6-2.31,
где X1 - возраст (полных лет).
Х2- заболевания, передающиеся половым путем, в анамнезе (если было - 1, если не было - 0).
Х3 - удаление одной или обеих труб в анамнезе (если было - 1, если не было - 0).
Х4 - прерывание беременности в анамнезе (регресс, выкидыш, аборт) (если было - 1, если не было - 0).
Х5 - снижение овариального резерва (по данным УЗИ) (если есть - 1, если нет - 0).
Х6 - мутация гена MTFHR С677Т (если есть - 1, если нет - 0).
Const=-2.31
Если Р<-0.21, то исход благоприятный.
Если Р>0.11, то исход неблагоприятный.
Если - 0,21<Р<0.11, то исход неопределенный.
Чувствительность алгоритма 81%.
Специфичность 70%.
Эффективность 75%.
Пример 1
Пациентка Ар-ва, 33 лет, история болезни №82/88 (2009 г). Была направлена в ФГУ «НИИ ОММ Минздравсоцразвития РФ» для проведения ЭКО и ПЭ.
Из анамнеза:
1. Брак 1, зарегистрирован в 2003 г. Бесплодие в течение 7 лет. Беременностей не было. ИППП в анамнезе не было.
2. Оперативное лечение:
В 2007 г. лапаротомия, консервативная миомэктомия, двухсторонняя резекция яичников.
В 2009 г. лапароскопия, сальпингоовариолизис, адгезиолизис, сальпингонеостомия.
После оперативного лечения беременность не наступила.
При УЗИ (на 2 д.м.ц.) выявлено: матка нормальной величины и структуры. М-ЭХО - 3 мм, линейное. Правый яичник 30×21×24, в структуре содержит более 5 антральных фолликулов диаметром до 6 мм. Левый яичник 29×17×21, в структуре содержит более 5 антральных фолликулов диаметром до 6 мм.
Заключение: УЗИ соответствует дню менструального цикла, овариальный резерв сохранен.
У пациентки взят соскоб буккального эпителия при помощи стерильного зонда и помещен в пробирку с реактивом «Проба-Рапид». Пробирка передана в лабораторию для молекулярно-генетического анализа (все этапы выполнялись согласно инструкции по применению комплекта реагентов для выделения ДНК «Проба-Рапид»).
В результате анализа определено, что у пациентки нормальный вариант гена MTHFR С677Т (генотип С/С).
Полученные данные вставлены в формулу:
Р=(0,06×32+0.58×0+0.66×0+1.12×0+1.1×0+1.0×0)-2.31=-0.39.
Значение Р<-0.21 соответствует благоприятному прогнозу.
Пациентке было проведено стандартное обследование в соответствии с приказом №67 Министерства здравоохранения РФ.
15.03.2010 года была начата контролируемая овариальная гиперстимуляция яичников по короткому протоколу препаратами: Бусерелин-спрей, Пурегон. В качестве триггера овуляции на 11 д.м.ц. использовали Прегнил в дозировке 100000 МЕ.
26.03.2010 года при трансвагинальной пункции было получено 10 ооцитов из правого яичника и 6 ооцитов из левого яичника.
29.03.2010 года (на 3 сутки после пункции фолликулов) был осуществлен перенос трех эмбрионов на стадии развития 8 бластомеров.
В качестве посттрансферной поддержки был назначен препарат Утрожестан в дозировке 600 мг/сутки интравагинально.
13.04.2010 г. был выполнен анализ В-ХГЧ, который составил 342,0, что соответствует положительному тесту на беременность.
20.04.2010 г. при УЗИ в полости матки обнаружено 1 плодное яйцо.
В сроке 40 недель беременности пациентка успешно родоразрешилась способом операции кесарево сечение. Родился живой доношенный мальчик весом 3780, длиной 55 см.
Пример 2
Пациентка Тр-ва И.И., 36 лет, история болезни №129/114 (2009 г). Была направлена в ФГУ «НИИ ОММ Минздравсоцразвития РФ» для проведения ЭКО и ПЭ.
Из анамнеза:
1. Брак 2, зарегистрирован в 2002 г. Бесплодие вторичное в течение 10 лет.
ИППП в анамнезе не было.
В 2000 г. была трубная беременность слева.
2. Оперативное лечение:
В 2000 г. лапаротомия, сальпингэктомия слева.
В 2008 г. лапароскопия, сальпингоовариолизис, адгезиолизис. Правая труба не проходима.
Заключение: бесплодие вторичное трубно-перитонеальное.
Рекомендовано ЭКО и ПЭ.
При УЗИ (на 2 д.м.ц.) выявлено: матка нормальной величины и структуры (55×48×53). М-ЭХО - 3,4 мм, линейное. Правый яичник 28×24×22, в структуре содержит 5 антральных фолликулов диаметром до 6 мм. Левый яичник 30x26x20, в структуре содержит 5 антральных фолликулов диаметром до 6 мм.
Заключение: УЗИ соответствует дню менструального цикла, овариальный резерв сохранен.
У пациентки взят соскоб буккального для молекулярно-генетического анализа (все этапы выполнялись согласно инструкции по применению комплекта реагентов для выделения ДНК «Проба-Рапид»).
В результате анализа определено, что у пациентки гетерозиготная мутация гена MTHFR С677Т (генотип С/Т).
Полученные данные вставлены в формулу:
Р=(0,06×36+0.58×0+0.66×1-1.12×0+1.1×0+1.0×1)-2.31=1,51.
Значение Р>0,11 соответствует неблагоприятному прогнозу.
Пациентке было проведено стандартное обследование в соответствии с приказом №67 Министерства здравоохранения РФ.
01.04.2009 года была начата контролируемая овариальная гиперстимуляция яичников по короткому протоколу препаратами: Бусерелин-спрей, Пурегон. В качестве триггера овуляции на 11 д.м.ц. использовали Прегнил в дозировке 10000 МЕ.
13.04.2009 года при трансвагинальной пункции было получено 4 ооцита из правого яичника и 3 ооцита из левого яичника.
16.04.2009 года (на 3 сутки после пункции фолликулов) был осуществлен перенос трех эмбрионов на стадии развития 8 бластомеров.
В качестве посттрансферной поддержки был назначен препарат Утрожестан в дозировке 600 мг/сутки интравагинально.
01.05.2009 г. был выполнен анализ В-ХГЧ, результат которого составил 7,0, что соответствует отрицательному тесту на беременность.
08.05.2009 г. при контрольном УЗИ данных за беременность нет.
Пример 3
Пациентка Кон-ва С.Э., 34 лет, история болезни №112/108 (2010) была направлена в ФГУ «НИИ ОММ Минздравсоцразвития РФ» для проведения ЭКО и ПЭ.
Из анамнеза:
1. Брак 1, зарегистрирован в 2002 г. Бесплодие вторичное в течение 8 лет.
В 2001 году была маточная беременность, которая завершилась самопроизвольным выкидышем в сроке 6-7 нед.
В 2009 году был выявлен уреоплазмоз - санирован.
2. Оперативное лечение: не выполнялось.
При УЗИ (на 2 д.м.ц.) выявлено: матка нормальной величины и структуры (54×39×50). М-ЭХО - 2,5 мм, линейное. Правый яичник 34×21×29, в структуре содержит более 5 антральных фолликулов диаметром до 6 мм. Левый яичник 22×16×20, в структуре содержит более 3 антральных фолликулов диаметром до 6 мм.
Заключение: УЗИ соответствует дню менструального цикла, овариальный резерв сохранен.
У пациентки взят соскоб буккального эпителия при помощи стерильного зонда и помещен в пробирку с реактивом «Проба-Рапид». Пробирка передана в лабораторию для молекулярно-генетического анализа (все этапы выполнялись согласно инструкции по применению комплекта реагентов для выделения ДНК «Проба-Рапид»).
В результате анализа определено, что у пациентки есть мутация гена MTHFR С677Т (генотип С/Т).
Полученные данные вставлены в формулу:
Р=(0,06×34+0.58×1+0.66×0-1.12×1+1.1×0+1.0×1)-2.31=-0.19.
Значение -0,21<Р<0.11 соответствует неопределенному прогнозу.
Пациентке было проведено стандартное обследование в соответствии с приказом №67 Министерства здравоохранения РФ.
25.03.2010 года была начата контролируемая овариальная гиперстимуляция яичников по короткому протоколу препаратами: Декапептил-дейли, Гонал-Ф. В качестве триггера овуляции на 11 д.м.ц. использовали Прегнил в дозировке 100000 МЕ.
05.04.2010 года при трансвагинальной пункции было получено 7 ооцитов из правого яичника и 7 ооцитов из левого яичника.
10.04.2010 года (на 5 сутки после пункции фолликулов) был осуществлен перенос двух эмбрионов на стадии развития бластогциста.
В качестве посттрансферной поддержки был назначен препарат Утрожестан в дозировке 600 мг/сутки интравагинально.
24.04.2010 г. был выполнен анализ В-ХГЧ, который составил 330,0, что соответствует положительному тесту на беременность.
30.04.2010 г. при УЗИ в полости матки обнаружено 1 плодное яйцо.
В сроке 39 недель беременности пациентка успешно родоразрешилась. Родился живой доношенный мальчик весом 3320, длиной 51 см.
Таким образом, данный способ позволяет спрогнозировать результат ЭКО и ПЭ у женщин с бесплодием на этапе подготовки к проведению программы, что дает возможность своевременно, не причиняя вреда здоровью и без лишних материальных затрат определить тактику ведения пациентки. А следовательно, повысить результативность программы ЭКО и ПЭ.
Источники информации
1. Никитина А.А., Демидова Е.М., Садекова О.Н. и др. Роль некоторых генетических полиморфизмов в невынашивании беременности. Проблемы репродукции 2007; 6: 83-89.
2. Макацария А.Д., Бицадзе В.О., Акинышина С.В. Тромбозы и тромбоэмболии в акушерско-гинекологической практике. - М.: МИА 2007.
3. Кулаков В.И. Лечение женского и мужского бесплодия. - М.: МИА 2008.
4. Mendoza С, Ruiz-Requena Е., Ortega Е., Cremades N., Martinez F., Bemabeu R., Greco, E., Tesarik, J.Follicular fluid markers ofoocyte developmental potential. // Hum. Reprod. - 2002-17 - 1017-1022.
5. Патент RU 2118822 C1, 10.09.1998.
6. Патент RU (11) 2193777 (13) C2, 27.11.2002.
7. КОРСАК B.C. Экстракорпоральное оплодотворение в терапии бесплодия. Авт. дисс. докт. мед. наук. - Спб., 1999, с.13. RU 2013989 C1.