КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛЕЙ
COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSING AND TREATING CANCER

Родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 61/307338, поданной 23 февраля 2010, и предварительной заявки на патент США № 61/308791, поданной 26 февраля 2010, которые вводятся в настоящую заявку в качестве ссылки в полном объеме.
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к рассматриваемым в настоящем описании композициям, которые могут быть использованы для диагностики и лечения опухоли у млекопитающих, и к способам применения таких композиций.
Предшествующий уровень техники
CA Cancel J. Clin.
В Соединенных Штатах, злокачественные опухоли (рак), после болезней сердца, являются вторым лидирующим заболеванием, приводящим к летальному исходу (Boring et al.,  43:7 (1993)). Рак характеризуется увеличением числа патологических или опухолевых клеток, происходящих от нормальной ткани, которая пролифирирует с образованием опухолевой массы и инвазией смежных тканей такими неопластическими опухолевыми клетками, а также с образованием злокачественных клеток, которые, в конечном счете, распространяются через систему кровообращения или лимфатическую систему в региональные лимфоузлы и в периферические области по механизму, называемому метастазированием. При раке клетки пролиферируют в условиях, при которых нормальные клетки расти не могут. Само раковое заболевание проявляется в различных формах широкого ряда, характеризующихся различной степенью инвазивности и агрессивности.
В попытках выявления эффективных клеточных мишеней для диагности рака и противораковой терапии были проведены исследования по идентификации трансмембранных или каких-либо других мембраносвязанных полипептидов, которые специфически экспрессируются на поверхности раковых клеток одного или нескольких конкретных типов по сравнению с одной или несколькими нормальными не раковыми клетками. В большинстве случаев, такие мембраносвязанные полипептиды в большом количестве экспрессируются на поверхности раковых клеток, и не экспрессируются на поверхности не раковых клеток. Идентификация таких связанных с опухолью полипептидов-антигенов клеточной поверхности дает возможность специфически разрушать раковые клетки-мишени путем проведения терапии с использованием антител. В этой связи следует отметить, что терапия на основе антител оказалась очень эффективной для лечения некоторых раковых опухолей. Так, например, герцептин (HERCEPTIN) и ритуксан (RITUXAN) (оба этих антитела поставляются компанией Genentech Inc., South San Francisco, California) представляют собой антитела, которые с успехом применялись для лечения рака молочной железы и не ходжкинской лимфомы, соответственно. Более конкретно, HERCEPTIN представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, которое было получено методами рекомбинантных ДНК, и которое селективно связывается с внеклеточным доменом протоонкогена рецептора эпидермального фактора роста 2 человека (HER2). Сверхэкспрессия белка HER2 наблюдалась в 25-30% случаев заболеваний первичным раком молочной железы. RITUXAN представляет собой генетически сконструированное химерное моноклональное антитело «мышь/человек», направленное против антигена CD20, находящегося на поверхности нормальных и злокачественных В-лимфоцитов. Оба эти антитела рекомбинантно продуцируются в клетках СНО.
Несмотря на упомянутые выше успехи в противораковой терапии млекопитающих, необходимость в получении дополнительных диагностических и терапевтических средств, способных детектировать присутствие опухоли у млекопитающих, и эффективно ингибировать рост опухолевых клеток, соответственно, остается особенно актуальной. В соответствии с этим, целью настоящего изобретения является идентификация полипептидов, а именно, мембраносвязанных полипептидов, которые преимущественно экспрессируются на раковых клетках одного или нескольких типов, но, в основном, не экспрессируются на нормальных клетках или каких-либо других раковых клетках; и применение таких полипептидов и кодирующих их нуклеиновых кислот для получения композиций согласно изобретению, которые могут быть использованы в терапии и в диагностике рака у млекопитающих.
Краткое описание сущности изобретения
В настоящей заявке, заявителями была впервые описана идентификация клеточных полипептидов (и кодирующих их нуклеиновых кислот или фрагментов), которые в более высокой степени экспрессируются на поверхности раковой(ых) клетки(ок) одного или нескольких типов, чем на поверхности нормальных не-раковых клеток одного или нескольких типов. Эти полипептиды были названы в настоящем описании опухолеассоциированными антигенными полипептидами-мишенями (полипептидами «TAT»), и было высказано предположение, что они могут служить в качестве эффективных мишеней для терапии и диагностики рака у млекопитающих.
В соответствии с этим, в одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, которая кодирует опухолеассоциированный антигенный полипептид-мишень или его фрагмент (полипептид «ТАТ»).
В некоторых аспектах изобретения выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, и альтернативно, по меньшей мере примерно на 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична (а) последовательности молекулы ДНК, кодирующей полноразмерный полипептид ТАТ, имеющий описанную в настоящем описании аминокислотную последовательность, аминокислотную последовательность полипептида ТАТ, не содержащую описанного в настоящем описании сигнального пептида, внеклеточный домен трансмембранного полипептида ТАТ с описанным в настоящем описании сигнальным пептидом или без этого сигнального пептида, или любой другой конкретно определенный фрагмент аминокислотной последовательности описанного в настоящем описании полноразмерного полипептида ТАТ или (b) последовательности комплемента молекулы ДНК, описанной в (a).
В других аспектах изобретения выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, и альтернативно, по меньшей мере примерно на 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична (а) последовательности молекулы ДНК, содержащей описанную в настоящем описании кодирующую последовательность кДНК полноразмерного полипептида ТАТ, описанную в настоящем описании последовательность, кодирующую полипептид ТАТ без сигнального пептида, описанную в настоящем описании последовательность, кодирующую внеклеточный домен трансмембранного полипептида ТАТ с описанным в настоящем описании сигнальным пептидом или без этого сигнального пептида, или описанную в настоящем описании последовательность, кодирующую любой другой конкретно определенный фрагмент аминокислотной последовательности описанного в настоящем описании полноразмерного полипептида ТАТ, или (b) последовательности комплемента молекулы ДНК, описанной в (a).
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид ТАТ, у которого трансмембранный домен либо делетирован, либо инактивирован, или последовательность, комплементарную такой кодирующей нуклеотидной последовательности, где трансмембранный(е) домен(ы) такого (таких) полипептида(ов) описан(ы) в настоящей заявке. Поэтому, в настоящем изобретении рассматриваются растворимые внеклеточные домены описанных в настоящем описании полипептидов ТАТ.
В других аспектах настоящее изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, которые гибридизуются (a) с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид ТАТ, имеющий описанную в настоящем описании полноразмерную аминокислотную последовательность, описанную в настоящем описании аминокислотную последовательность полипептида ТАТ без сигнального пептида; внеклеточный домен трансмембранного полипептида ТАТ с описанным в настоящем описании сигнальным пептидом или без этого сигнального пептида; или описанный в настоящем описании любой другой конкретно определенный фрагмент аминокислотной последовательности полноразмерного полипептида ТАТ; или (b) с последовательностью комплемента нуклеотидной последовательности, описанной в (a). В соответствии с этим, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к описанным в настоящем описании фрагментам последовательности, кодирующей полноразмерный полипептид TAT, или к комплементарной ей последовательности, которые могут быть использованы, например, в качестве гибридизационных зондов, применяемых, например, в качестве диагностических зондов, ПЦР-праймеров, антисмысловых олигонуклеотидных зондов, или к фрагментам, которые кодируют полноразмерный полипептид ТАТ, и могут, но необязательно, кодировать полипептид, содержащий сайт связывания с антителом против полипептида ТАТ. Такие фрагменты нуклеиновой кислоты обычно имеют длину по меньшей мере примерно 5 нуклеотидов, и альтернативно, по меньшей мере примерно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 или 1000 нуклеотидов, где слово «примерно» в этом контексте описания означает указанную длину нуклеотидной последовательности плюс/минус 10% от указанной длины. Кроме того, такие фрагменты нуклеиновой кислоты обычно состоят из последовательно расположенных нуклеотидов, происходящих от полноразмерной последовательности, кодирующей полипептид ТАТ, или от комплементарной ей последовательности. Следует отметить, что новые фрагменты нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид ТАТ, или комплементарной ей последовательности, могут быть определены рутинным способом путем выравнивания нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид ТАТ, с другими известными нуклеотидными последовательностями с применением любых различных хорошо известных программ выравнивания последовательностей, что позволяет установить, является(ются) ли фрагмент(ы) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид ТАТ, или комплементарной ей последовательности, новым(и). Все эти новые фрагменты нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид ТАТ, или комплементарных им последовательностей, рассматриваются в настоящей заявке. Также рассматриваются фрагменты полипептида ТАТ, кодируемые этими фрагментами нуклеотидной молекулы, предпочтительно, фрагменты полипептида ТАТ, содержащие сайт связывания с анти-ТАТ антителом.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам TAT, кодируемым любой из идентифицированных вышевыделенных последовательностей нуклеиновой кислоты.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду ТАТ, содержащему аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, и альтернативно, по меньшей мере примерно на 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности описанного в настоящем описании полипептида ТАТ, имеющего полноразмерную аминокислотную последовательность, описанной в настоящем описании аминокислотной последовательности полипептида ТАТ без сигнального пептида; описанному в настоящем описании внеклеточному домену трансмембранного белка полипептида ТАТ, содержащего или не содержащего указанный сигнальный пептид; аминокислотной последовательности, кодируемой любой из описанных в настоящем описании последовательностей нуклеиновой кислоты; или любому другому конкретно определенному фрагменту аминокислотной последовательности описанного в настоящем описании полноразмерного полипептида ТАТ.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду ТАТ, содержащему аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с комплементом молекулы ДНК, кодирующей (a) полипептид TAT, имеющий описанную в настоящем описании полноразмерную аминокислотную последовательность, (b) описанную в настоящем описании аминокислотную последовательность полипептида TAT без сигнального пептида, (с) описанный в настоящем описании внеклеточный домен трансмембранного белка полипептида ТАТ, содержащего или не содержащего сигнальный пептид, (d) аминокислотную последовательность, кодируемую любой из описанных в настоящем описании последовательностей нуклеиновой кислоты, или (e) любой другой конкретно определенный фрагмент описанной в настоящем описании аминокислотной последовательности полноразмерного полипептида ТАТ.
В конкретном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду TAT, который не содержит N-концевой сигнальной последовательности и/или инициирующего метионина, и кодируется нуклеотидной последовательностью, кодирующей описанную выше аминокислотную последовательность. В настоящей заявке также описаны способы получения такого полипептида, где указанные способы включают культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор, который содержит соответствующую кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты, в условиях, подходящих для экспрессии полипептида ТАТ, и выделение полипептида ТАТ из клеточной культуры.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду TAT, у которого трансмембранный домен либо делетирован, либо инактивирован. В настоящей заявке также описаны способы получения такого полипептида, где указанные способы включают культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор, который содержит соответствующую кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты, в условиях, подходящих для экспрессии полипептида ТАТ, и выделение полипептида ТАТ из клеточной культуры.
E. coli
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к векторам, содержащим ДНК, кодирующую любой из описанных в настоящем описании полипептидов. Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, содержащим любой из таких векторов. Так, например, клетками-хозяевами могут быть клетки CHO, клетки  или дрожжевые клетки. Настоящее изобретение также относится к способу получения любого из описанных в настоящем описании полипептидов, где указанный способ включает культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии нужного полипептида, и выделение нужного полипептида из клеточной культуры.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным химерным полипептидам, содержащим любой из описанных в настоящем описании полипептидов TAT, слитых с гетерологичным (не являющимся полипептидом TAT) полипептидом. Примерами таких химерных молекул являются любой из описанных в настоящем описании полипептидов TAT, слитых с гетерологичным полипептидом, таким как, например, последовательность эпитопа-метки или Fc-область иммуноглобулина.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается, предпочтительно, специфически, с любым из вышеописанных или нижеописанных полипептидов. Указанным антителом является, но необязательно, моноклональное антитело, фрагмент антитела, химерное антитело, гуманизированное антитело, одноцепочечное антитело или антитело, которое конкурентно ингибирует связывание антитела против полипептида ТАТ с его соответствующим антигенным эпитопом. Антитела согласно изобретению могут быть, но необязательно, конъюгированы с рост-ингибирующим средством или с цитотоксическим средством таким как токсин, включая, например, майтанзиноид или калихеамицин, антибиотик, радиоактивный изотоп, нуклеолитический фермент или т.п. Антитела согласно изобретению могут продуцироваться, но необязательно, в клетках CHO или в бактериальных клетках, и предпочтительно, ингибируют рост или пролиферацию клеток, с которыми они связываются, или индуцируют гибель этих клеток. В диагностических целях, антитела согласно изобретению могут быть детектируемо помечены, присоединены к твердому носителю или т.п.
E. coli
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к векторам, содержащим ДНК, кодирующую любое из вышеописанных антител. Так, например, настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, содержащим любой из указанных векторов. Такими клетками-хозяевами могут быть, например, клетки CHO, клетки  или дрожжевые клетки. Настоящее изобретение также относится к способу получения любого из описанных в настоящем описании антител, где указанный способ включает культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии нужного антитела, и выделение указанного нужного антитела из клеточной культуры.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей описанный в настоящем описании полипептид ТАТ, описанный в настоящем описании химерный полипептид ТАТ или описанное в настоящем описании анти-ТАТ антитело в комбинации с носителем. Указанным носителем является, но необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к промышленному изделию, включающему контейнер и рассматриваемую композицию, содержащуюся в контейнере, где указанная композиция может содержать описанный в настоящем описании полипептид ТАТ, описанный в настоящем описании химерный полипептид ТАТ или описанное в настоящем описании анти-ТАТ антитело. Такое изделие может также включать, но необязательно, этикетку, прикрепленную к контейнеру, или вкладыш в упаковке, вложенной в контейнер, где имеются инструкции по применению рассматриваемой композиции для терапии или диагностики опухоли.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению описанного в настоящем описании полипептида TAT, описанного в настоящем описании химерного полипептида TAT или описанного в настоящем описании антитела против полипептида ТАТ для получения лекарственного препарата, который может быть использован для лечения состояния, восприимчивого к полипептиду TAT, химерному полипептиду TAT или антителу против полипептида TAT.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к любому выделенному антителу, содержащему одну или несколько описанных в настоящем описании последовательностей CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 или CDR-H3, или к любому антителу, которое связывается с тем же эпитопом, с которым связывается любое из указанных антител.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования роста клеток, которые экспрессируют полипептид TAT, где указанный способ включает приведение в контакт указанных клеток с антителом, которое связывается с полипептидом ТАТ, где связывание антитела с полипептидом TAT приводит к ингибированию роста клеток, экспрессирующих полипептид TAT. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, клеткой является раковая клетка, а связывание антитела против полипептида TAT приводит к гибели клеток, экспрессирующих полипептид TAT. Антителом является, но необязательно, моноклональное антитело, фрагмент антитела, химерное антитело, гуманизированное антитело или одноцепочечное антитело. Антитела, используемые в способах согласно изобретению, могут быть, но необязательно, конъюгированы с рост-ингибирующим средством или цитотоксическим средством, таким как токсин, включая, например, майтанзиноид или калихеамицин, антибиотик, радиоактивный изотоп, нуклеолитический фермент или т.п. Антитела, используемые в способах согласно изобретению, могут, но необязательно, продуцироваться в клетках CHO или в бактериальных клетках.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу терапевтического лечения млекопитающего с раковой опухолью, содержащей клетки, экспрессирующие полипептид ТАТ, где способ включает введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела, которое связывается с полипептидом ТАТ, для эффективного терапевтического лечения опухоли. Антителом является, но необязательно, моноклональное антитело, фрагмент антитела, химерное антитело, гуманизированное антитело или одноцепочечное антитело. Антитела, используемые в способах согласно изобретению, могут быть, но необязательно, конъюгированы с рост-ингибирующим средством или цитотоксическим средством, таким как токсин, включая, например, майтанзиноид или калихеамицин, антибиотик, радиоактивный изотоп, нуклеолитический фермент или т.п. Антитела, используемые в способах согласно изобретению, могут, но необязательно, продуцироваться в клетках CHO или в бактериальных клетках.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу определения присутствия полипептида ТАТ в образце, который, как предполагается, содержит полипептид ТАТ, где способ включает обработку образца антителом, которое связывается с полипептидом ТАТ (или приведение в контакт образца с антителом) и определение или детектирование связывания антитела против полипептида ТАТ в образце, где наличие такого связывания указывает на присутствие полипептида ТАТ в образце. Указанный образец может содержать, но необязательно, клетки (которые могут быть раковыми клетками), которые, как предполагается, экспрессируют полипептид ТАТ. Антитело, используемое в указанном способе, может быть, но необязательно, детектируемо помечено, присоединено к твердому носителю или т.п.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу диагностики присутствия опухоли у млекопитающего, где способ включает детектирование уровня экспрессии гена, кодирующего полипептид ТАТ (a) в тест-образце клеток ткани, выделенных у указанного млекопитающего, и (b) в контрольном образце известных нормальных не-раковых клеток ткани того же происхождения или того же типа, где более высокий уровень экспрессии полипептида ТАТ в тест-образце по сравнению с контрольным образцом указывает на присутствие опухоли у млекопитающего, у которого был взят указанный тест-образец.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу диагностики присутствия опухоли у млекопитающего, где указанный способ включает (a) приведение в контакт тест-образца, содержащего клетки ткани, выделенные у млекопитающего, с антителом, которое связывается с полипептидом ТАТ, и (b) детектирование образования комплекса «антитело-полипептид ТАТ» в указанном тест-образце, где образование комплекса указывает на присутствие опухоли у млекопитающего. Используемое антитело может быть, но необязательно, детектируемо помечено, присоединено к твердому носителю или т.п., и/или тест-образец клеток ткани берут у индивидуума с подозрением на раковую опухоль.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики клеточно-пролиферативного расстройства, связанного с изменением, предпочтительно, с повышением уровня экспрессии или активности полипептида ТАТ, где указанный способ включает введение индивидууму, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества антагониста полипептида ТАТ. Предпочтительным клеточно-пролиферативным расстройством является рак, а антагонистом полипептида ТАТ является антитело против полипептида ТАТ или антисмысловой олигонуклеотид. Эффективное лечение или профилактика клеточно-пролиферативного расстройства может быть достигнуто в результате непосредственного уничтожения клеток или ингибирования роста клеток, экспрессирующих полипептид ТАТ, или подавления активности полипептида ТАТ, стимулирующей рост клеток.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу связывания антитела с клеткой, которая экспрессирует полипептид ТАТ, где указанный способ включает приведение в контакт клетки, экспрессирующей полипептид ТАТ, с указанным антителом, в условиях, подходящих для связывания антитела с указанным полипептидом ТАТ, и благоприятствующих такому связыванию. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, антитело метят молекулой или соединением, которые являются подходящими для качественного и/или количественного определения локализации и/или уровня связывания антитела с клеткой.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу доставки цитотоксического или диагностического средства в клетку, которая экспрессирует полипептид ТАТ, где способ включает получение цитотоксического или диагностического средства, конъюгированного с антителом, которое связывается с указанным полипептидом ТАТ, с образованием конъюгата «антитело-средство», и обработку указанной клетки конъюгатом «антитело-средство». Антителом является, но необязательно, моноклональное антитело, фрагмент антитела, химерное антитело, гуманизированное антитело или одноцепочечное антитело.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению полипептида ТАТ, нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид ТАТ, или вектора или клетки-хозяина, содержащих указанную нуклеиновую кислоту, или антитела против полипептида ТАТ, для получения лекарственного препарата, который может быть использован для (i) терапии или диагностики рака или опухоли, или (ii) лечения или профилактики клеточно-пролиферативного расстройства.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования роста раковой клетки, где рост указанной раковой клетки по меньшей мере частично зависит от рост-потенцирующего действия полипептида ТАТ (где полипептид ТАТ может экспрессироваться либо самой раковой клеткой, либо клеткой, которая продуцирует полипептид(ы), обладающий(е) потенцирующим действием на рост раковых клеток), где указанный способ включает приведение в контакт полипептида ТАТ с антителом, которое связывается с полипептидом ТАТ, что приводит к ингибированию рост-потенцирующей активности полипептида ТАТ, и в свою очередь, к ингибированию роста раковой клетки. Предпочтительно, чтобы рост раковых клеток полностью ингибировался. Еще более предпочтительно, чтобы связывание антитела с полипептидом ТАТ индуцировало гибель раковых клеток. Указанным антителом является, но необязательно, моноклональное антитело, фрагмент антитела, химерное антитело, гуманизированное антитело или одноцепочечное антитело. Антитела, используемые в способах согласно изобретению, могут быть, но необязательно, конъюгированы с рост-ингибирующим средством или цитотоксическим средством, таким как токсин, включая, например, майтанзиноид или калихеамицин, антибиотик, радиоактивный изотоп, нуклеолитический фермент или т.п. Антитела, используемые в способах согласно изобретению, могут, но необязательно, продуцироваться в клетках CHO или в бактериальных клетках.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу терапевтического лечения опухоли у млекопитающего, где рост указанной опухоли по меньшей мере частично зависит от рост-потенцирующего действия полипептида ТАТ, где способ включает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела, которое связывается с полипептидом ТАТ, и тем самым ингибирует рост-потенцирующую активности указанного полипептида ТАТ, что позволяет осуществлять эффективное терапевтическое лечение опухоли. Антителом является, но необязательно, моноклональное антитело, фрагмент антитела, химерное антитело, гуманизированное антитело или одноцепочечное антитело. Антитела, используемые в способах согласно изобретению, могут быть, но необязательно, конъюгированы с рост-ингибирующим средством или цитотоксическим средством, таким как токсин, включая, например, майтанзиноид или калихеамицин, антибиотик, радиоактивный изотоп, нуклеолитический фермент или т.п. Антитела, используемые в способах согласно изобретению, могут, но необязательно, продуцироваться в клетках CHO или в бактериальных клетках.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к нижеследующим пунктам возможных притязаний, которые могут быть заявлены в настоящей заявке или в будущих заявках:
1. Выделенная нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична (a) молекуле ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, (b) молекуле ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, в которой отсутствует сигнальный пептид, (c) молекуле ДНК, кодирующей внеклеточный домен полипептида SEQ ID NO:2 вместе с его сигнальным пептидом, (d) молекуле ДНК, кодирующей внеклеточный домен полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (e) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, (f) полноразмерной кодирующей нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, или (g) комплементу (a), (b), (c), (d), (e) или (f).
2. Выделенная нуклеиновая кислота, имеющая (а) нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, (b) нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, в которой отсутствует сигнальный пептид, (c) нуклеотидную последовательность, которая кодирует внеклеточный домен полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальный пептид, (d) нуклеотидную последовательность, которая кодирует внеклеточный домен полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (e) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, (f) полноразмерную кодирующую область нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, или (g) комплемент (a), (b), (c), (d), (e) или (f).
3. Выделенная нуклеиновая кислота, которая гибридизуется (а) с нуклеиновой кислотой, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, (b) с нуклеиновой кислотой, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, в которой отсутствует сигнальный пептид, (c) с нуклеиновой кислотой, кодирующей внеклеточный домен полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальный пептид, (d) с нуклеиновой кислотой, кодирующей внеклеточный домен полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (e) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, (f) с полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, или (g) с комплементом (a), (b), (c), (d), (e) или (f).
4. Нуклеиновая кислота по пункту 3, где гибридизацию осуществляют в жестких условиях.
5. Нуклеиновая кислота по пункту 3, которая имеет длину по меньшей мере примерно 5 нуклеотидов.
6. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по пунктам 1, 2 или 3.
7. Вектор экспрессии по пункту 6, где указанная нуклеиновая кислота функционально присоединена к регуляторным последовательностям, распознаваемым клеткой-хозяином, трансформированной указанным вектором.
8. Клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по пункту 7.
E. coli
9. Клетка-хозяин по пункту 8, которая представляет собой клетку CHO, клетку  или дрожжевую клетку.
10. Способ получения полипептида, включающий культивирование клетки-хозяина по пункту 8, в условиях, подходящих для экспрессии указанного полипептида, и выделение указанного полипептида из клеточной культуры.
11. Выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична (a) полипептиду SEQ ID NO:2, (b) полипептиду SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (c) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальный пептид, (d) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (e) полипептиду, кодируемому нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, или (f) полипептиду, кодируемому полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1.
12. Выделенный полипептид, имеющий (a) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, (b) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, в которой отсутствует сигнальная пептидная последовательность, (c) аминокислотную последовательность внеклеточного домена полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальная пептидная последовательность, (d) аминокислотную последовательность внеклеточного домена полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальная пептидная последовательность, (e) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, или (f) аминокислотную последовательность, кодируемую полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1.
13. Химерный полипептид, содержащий полипептид по пункту 11 или 12, слитый с гетерологичным полипептидом.
14. Химерный полипептид по пункту 13, где указанным гетерологичным полипептидом является последовательность эпитопа-метки или Fc-область иммуноглобулина.
15. Выделенное антитело, которое связывается с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична (a) полипептиду SEQ ID NO:2, (b) полипептиду SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (c) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальный пептид, (d) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (e) полипептиду, кодируемому нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, или (f) полипептиду, кодируемому полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1.
16. Выделенное антитело, которое связывается с полипептидом, имеющим (a) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, (b) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, в которой отсутствует сигнальная пептидная последовательность, (c) аминокислотную последовательность внеклеточного домена полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальная пептидная последовательность, (d) аминокислотную последовательность внеклеточного домена полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальная пептидная последовательность, (e) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, или (f) аминокислотную последовательность, кодируемую полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1.
17. Антитело по пункту 15 или 16, которое представляет собой моноклональное антитело.
18. Антитело по пункту 15 или 16, которое представляет собой фрагмент антитела.
19. Антитело по пункту 15 или 16, которое представляет собой химерное или гуманизированное антитело.
20. Антитело по пункту 15 или 16, которое конъюгировано с рост-ингибирующим средством.
21. Антитело по пункту 15 или 16, которое конъюгировано с цитотоксическим средством.
22. Антитело по пункту 21, где указанное цитотоксическое средство выбрано из группы, состоящей из токсинов, антибиотиков, радиоактивных изотопов и нуклеолитических ферментов.
23. Антитело по пункту 21, где указанным цитотоксическим средством является токсин.
24. Антитело по пункту 23, где указанный токсин выбран из группы, состоящей из майтанзиноида, калихеамицина и ауристатина.
25. Антитело по пункту 23, где указанным токсином является майтанзиноид.
26. Антитело по пункту 15 или 16, которое продуцируется в бактериях.
27. Антитело по пункту 15 или 16, которое продуцируется в клетках CHO.
28. Антитело по пункту 15 или 16, индуцирующее гибель клеток, с которыми оно связывается.
29. Антитело по пункту 15 или 16, которое является детектируемо меченым.
30. Выделенная нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело по пункту 15 или 16.
31. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по пункту 30, функционально присоединенную к регуляторным последовательностям, распознаваемым клеткой-хозяином, трансформированной указанным вектором.
32. Клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по пункту 31.
E. coli
33. Клетка-хозяин по пункту 32, которая представляет собой клетку CHO, клетку  или дрожжевую клетку.
34. Способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по пункту 32, в условиях, подходящих для экспрессии указанного антитела, и выделение указанного антитела из клеточной культуры.
35. Композиция, содержащая (a) полипептид по пункту 11, (b) полипептид по пункту 12, (c) химерный полипептид по пункту 13, (d) антитело по пункту 15, или (e) антитело по пункту 16, в комбинации с носителем.
36. Композиция по п.35, где указанным носителем является фармацевтически приемлемый носитель.
37. Промышленное изделие, включающее (a) контейнер; и (b) композицию по п.35, содержащуюся в указанном контейнере.
38. Промышленное изделие по п.37, которое также включает этикетку, прикрепленную к контейнеру, или вкладыш в упаковке, вложенной в указанный контейнер, где имеются инструкции по применению указанной композиции для терапии или диагностики раковой опухоли.
39. Способ ингибирования роста клетки, экспрессирующей белок, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична (a) полипептиду SEQ ID NO:2, (b) полипептиду SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (c) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальный пептид, (d) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (e) полипептиду, кодируемому нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, или (f) полипептиду, кодируемому полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный способ включает приведение в контакт указанной клетки с антителом, которое связывается с указанным белком, где указанное связывание указанного антитела с указанным белком приводит к ингибированию роста указанной клетки.
40. Способ по пункту 39, где указанное антитело представляет собой моноклональное антитело.
41. Способ по пункту 39, где указанное антитело представляет собой фрагмент антитела.
42. Способ по пункту 39, где указанное антитело представляет собой химерное или гуманизированное антитело.
43. Способ по пункту 39, где указанное антитело конъюгировано с рост-ингибирующим средством.
44. Способ по пункту 39, где указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим средством.
45. Способ по пункту 44, где указанное цитотоксическое средство выбрано из группы, состоящей из токсинов, антибиотиков, радиоактивных изотопов и нуклеолитических ферментов.
46. Способ по пункту 44, где указанным цитотоксическим средством является токсин.
47. Способ по пункту 46, где указанный токсин выбран из группы, состоящей из майтанзиноида, калихеамицина и ауристатина.
48. Способ по пункту 46, где указанным токсином является майтанзиноид.
49. Способ по пункту 39, где указанное антитело продуцируется в бактериях.
50. Способ по пункту 39, где указанное антитело продуцируется в клетках CHO.
51. Способ по пункту 39, где указанной клеткой является раковая клетка.
52. Способ по пункту 51, где указанную раковую клетку также подвергают лучевой терапии или обрабатывают химиотерапевтическим средством.
53. Способ по пункту 51, где указанная раковая клетка выбрана из группы, состоящей из раковой клетки молочной железы, раковой клетки прямой и ободочной кишки, раковой клетки легких, раковой клетки яичника, раковой клетки центральной нервной системы, раковой клетки печени, раковой клетки мочевого пузыря, раковой клетки поджелудочной железы, раковой клетки шейки матки, клетки меланомы и клетки лейкоза.
54. Способ по пункту 51, где указанная раковая клетка экспрессирует указанный белок на более высоком уровне по сравнению с нормальной клеткой, происходящей от той же самой ткани.
55. Способ по пункту 39, который приводит к гибели указанной клетки.
56. Способ по пункту 39, где указанный белок имеет (a) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, (b) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, в которой отсутствует сигнальная пептидная последовательность, (c) аминокислотную последовательность внеклеточного домена полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальная пептидная последовательность, (d) аминокислотную последовательность внеклеточного домена полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальная пептидная последовательность, (e) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, или (f) аминокислотную последовательность, кодируемую полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1.
57. Способ терапевтического лечения млекопитающего, имеющего раковую опухоль, содержащую клетки, экспрессирующие белок, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична (a) полипептиду SEQ ID NO:2, (b) полипептиду SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (c) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальный пептид, (d) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (e) полипептиду, кодируемому нуклеотидной последовательностью, SEQ ID NO:1, или (f) полипептиду, кодируемому полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, где указанный способ включает введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела, которое связывается с указанным белком, что позволяет осуществлять эффективное лечение указанного млекопитающего.
58. Способ по пункту 57, где указанное антитело представляет собой моноклональное антитело.
59. Способ по пункту 57, где указанное антитело представляет собой фрагмент антитела.
60. Способ по пункту 57, где указанное антитело представляет собой химерное или гуманизированное антитело.
61. Способ по пункту 57, где указанное антитело конъюгировано с рост-ингибирующим средством.
62. Способ по пункту 57, где указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим средством.
63. Способ по пункту 62, где указанное цитотоксическое средство выбрано из группы, состоящей из токсинов, антибиотиков, радиоактивных изотопов и нуклеолитических ферментов.
64. Способ по пункту 62, где указанным цитотоксическим средством является токсин.
65. Способ по пункту 64, где указанный токсин выбран из группы, состоящей из майтанзиноида, калихеамицина и ауристатина.
66. Способ по пункту 64, где указанным токсином является майтанзиноид.
67. Способ по пункту 57, где указанное антитело продуцируется в бактериях.
68. Способ по пункту 57, где указанное антитело продуцируется в клетках CHO.
69. Способ по пункту 57, где указанную опухоль также подвергают лучевой терапии или обрабатывают химиотерапевтическим средством.
70. Способ по пункту 57, где указанная опухоль представляет собой опухоль молочной железы, опухоль прямой и ободочной кишки, опухоль легких, опухоль яичника, опухоль центральной нервной системы, опухоль печени, опухоль мочевого пузыря, опухоль поджелудочной железы или опухоль шейки матки.
71. Способ по пункту 57, где указанная раковая клетка указанной раковой опухоли экспрессирует указанный белок на более высоком уровне по сравнению с нормальной клеткой, происходящей от той же самой ткани.
72. Способ по пункту 57, где указанный белок имеет (a) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, (b) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, в которой отсутствует сигнальная пептидная последовательность, (c) аминокислотную последовательность внеклеточного домена полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальная пептидная последовательность, (d) аминокислотную последовательность внеклеточного домена полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальная пептидная последовательность, (e) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, или (f) аминокислотную последовательность, кодируемую полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1.
73. Способ определения присутствия белка в образце, предположительно, содержащем указанный белок, где указанный белок имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична (a) полипептиду SEQ ID NO:2, (b) полипептиду SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (c) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальный пептид, (d) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (e) полипептиду, кодируемому нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, или (f) полипептиду, кодируемому полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, где указанный способ включает обработку указанного образца антителом, которое связывается с указанным белком, и детектирование связывания указанного антитела с указанным белком в указанном образце, где связывание указанного антитела с указанным белком является показателем присутствия указанного белка в указанном образце.
74. Способ по пункту 73, где указанный образец содержит клетку, предположительно, экспрессирующую указанный белок.
75. Способ по пункту 74, где указанной клеткой является раковая клетка.
76. Способ по пункту 73, где указанное антитело является детектируемо меченым.
77. Способ по пункту 73, где указанный белок имеет (a) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, (b) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, в которой отсутствует сигнальная пептидная последовательность, (c) аминокислотную последовательность внеклеточного домена полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальная пептидная последовательность, (d) аминокислотную последовательность внеклеточного домена полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальная пептидная последовательность, (e) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, или (f) аминокислотную последовательность, кодируемую полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1.
78. Способ диагностики опухоли у млекопитающего, где указанный способ включает определение уровня экспрессии гена, кодирующего белок, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична (a) полипептиду SEQ ID NO:2, (b) полипептиду SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (c) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальный пептид, (d) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (e) полипептиду, кодируемому нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, или (f) полипептиду, кодируемому полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, в тест-образце клеток ткани, взятых у указанного млекопитающего, и в контрольном образце известных нормальных клеток, происходящих от той же самой ткани, где более высокий уровень экспрессии указанного белка в тест-образце, по сравнению с контрольным образцом, является показателем присутствия опухоли у млекопитающего, у которого был взят этот тест-образец.
in situ
79. Способ по пункту 78, где стадия определения уровня экспрессии гена, кодирующего указанный белок, включает использование олигонуклеотида в гибридизации  или в ОТ-ПЦР-анализе.
80. Способ по пункту 78, где стадия определения уровня экспрессии гена, кодирующего указанный белок, включает использование антитела в иммуногистохимическом анализе или в вестерн-блот-анализе.
81. Способ по пункту 78, где указанный белок имеет (a) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, (b) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, в которой отсутствует сигнальная пептидная последовательность, (c) аминокислотную последовательность внеклеточного домена полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальная пептидная последовательность, (d) аминокислотную последовательность внеклеточного домена полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальная пептидная последовательность, (e) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, или (f) аминокислотную последовательность, кодируемую полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1.
82. Способ диагностики опухоли у млекопитающего, где указанный способ включает приведение в контакт тест-образца клеток ткани, взятых у указанного млекопитающего, с антителом, которое связывается с белком, имеющим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична (a) полипептиду SEQ ID NO:2, (b) полипептиду SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (c) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальный пептид, (d) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (e) полипептиду, кодируемому нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, или (f) полипептиду, кодируемому полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и детектирование образования комплекса указанного антитела с указанным белком в тест-образце, где образование комплекса является показателем присутствия опухоли у указанного млекопитающего.
83. Способ по пункту 82, где указанное антитело является детектируемо меченым.
84. Способ по пункту 82, где указанный тест-образец клеток ткани берут у индивидуума с подозрением на раковую опухоль.
85. Способ по пункту 82, где указанный белок имеет (a) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, (b) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, в которой отсутствует сигнальная пептидная последовательность, (c) аминокислотную последовательность внеклеточного домена полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальная пептидная последовательность, (d) аминокислотную последовательность внеклеточного домена полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальная пептидная последовательность, (e) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, или (f) аминокислотную последовательность, кодируемую полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1.
86. Способ лечения или профилактики клеточно-пролиферативного расстройства, связанного с повышением уровня экспрессии или активности белка, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична (a) полипептиду SEQ ID NO:2, (b) полипептиду, SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (c) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальный пептид, (d) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (e) полипептиду, кодируемому нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, или (f) полипептиду, кодируемому полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный способ включает введение индивидууму, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества антагониста указанного белка, что позволяет осуществлять эффективное лечение или профилактику указанного клеточно-пролиферативного расстройства.
87. Способ по пункту 86, где указанным клеточно-пролиферативным расстройством является рак.
88. Способ по пункту 86, где указанным антагонистом является антитело против полипептида TAT или антисмысловой олигонуклеотид.
89. Способ связывания антитела с клеткой, которая экспрессирует белок, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична (a) полипептиду SEQ ID NO:2, (b) полипептиду SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (c) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальный пептид, (d) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (e) полипептиду, кодируемому нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1, или (f) полипептиду, кодируемому полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, где указанный способ включает приведение в контакт указанной клетки с антителом, которое связывается с указанным белком, что приводит к связыванию антитела с указанным белком, и тем самым, к связыванию указанного антитела с указанной клеткой.
90. Способ по пункту 89, где указанное антитело представляет собой моноклональное антитело.
91. Способ по пункту 89, где указанное антитело представляет собой фрагмент антитела.
92. Способ по пункту 89, где указанное антитело представляет собой химерное или гуманизированное антитело.
93. Способ по пункту 89, где указанное антитело конъюгировано с рост-ингибирующим средством.
94. Способ по пункту 89, где указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим средством.
95. Способ по пункту 94, где указанное цитотоксическое средство выбрано из группы, состоящей из токсинов, антибиотиков, радиоактивных изотопов и нуклеолитических ферментов.
96. Способ по пункту 94, где указанным цитотоксическим средством является токсин.
97. Способ по пункту 96, где указанный токсин выбран из группы, состоящей из майтанзиноида, калихеамицина и ауристатина.
98. Способ по пункту 96, где указанным токсином является майтанзиноид.
99. Способ по пункту 89, где указанное антитело продуцируется в бактериях.
100. Способ по пункту 89, где указанное антитело продуцируется в клетках CHO.
101. Способ по пункту 89, где указанной клеткой является раковая клетка.
102. Способ по пункту 101, где указанную раковую клетку также подвергают лучевой терапии или обрабатывают химиотерапевтическим средством.
103. Способ по пункту 101, где указанная раковая клетка выбрана из группы, состоящей из раковой клетки молочной железы, раковой клетки прямой и ободочной кишки, раковой клетки легких, раковой клетки яичника, раковой клетки центральной нервной системы, раковой клетки печени, раковой клетки мочевого пузыря, раковой клетки поджелудочной железы, раковой клетки шейки матки, клетки меланомы и клетки лейкоза.
104. Способ по пункту 103, где указанная раковая клетка экспрессирует указанный белок на более высоком уровне по сравнению с нормальной клеткой, происходящей от той же самой ткани.
105. Способ по пункту 89, который приводит к гибели указанной клетки.
106. Применение нуклеиновой кислоты по любому из пунктов 1-5 или 30 для получения лекарственного препарата для терапевтического лечения или диагностики рака.
107. Применение нуклеиновой кислоты по любому из пунктов 1-5 или 30 для получения лекарственного препарата для лечения опухоли.
108. Применение нуклеиновой кислоты по любому из пунктов 1-5 или 30 для получения лекарственного препарата для лечения или профилактику клеточно-пролиферативного расстройства.
109. Применение вектора экспрессии по любому из пунктов 6, 7 или 31 для получения лекарственного препарата для терапевтического лечения или диагностики рака.
110. Применение вектора экспрессии по любому из пунктов 6, 7 или 31 для получения лекарственного препарата для лечения опухоли.
111. Применение вектора экспрессии по любому из пунктов 6, 7 или 31 для получения лекарственного препарата для лечения или профилактики клеточно-пролиферативного расстройства.
112. Применение клетки-хозяина по любому из пунктов 8, 9, 32 или 33 для получения лекарственного препарата для терапевтического лечения или диагностики рака.
113. Применение клетки-хозяина по любому из пунктов 8, 9, 32 или 33 для получения лекарственного препарата для лечения опухоли.
114. Применение клетки-хозяина по любому из пунктов 8, 9, 32 или 33 для получения лекарственного препарата для лечения или профилактики клеточно-пролиферативного расстройства.
115. Применение полипептида по любому из пунктов 11-14 для получения лекарственного препарата для терапевтического лечения или диагностики рака.
116. Применение полипептида по любому из пунктов 11-14 для получения лекарственного препарата для лечения опухоли.
117. Применение полипептида по любому из пунктов 11-14 для получения лекарственного препарата для лечения или профилактики клеточно-пролиферативного расстройства.
118. Применение антитела по любому из пунктов 15-29 для получения лекарственного препарата для терапевтического лечения или диагностики рака.
119. Применение антитела по любому из пунктов 15-29 для получения лекарственного препарата для лечения опухоли.
120. Применение антитела по любому из пунктов 15-29 для получения лекарственного препарата для лечения или профилактики клеточно-пролиферативного расстройства.
121. Применение композиции по любому из пунктов 35 или 36 для получения лекарственного препарата для терапевтического лечения или диагностики рака.
122. Применение композиции по любому из пунктов 35 или 36 для получения лекарственного препарата для лечения опухоли.
123. Применение композиции по любому из пунктов 35 или 36 для получения лекарственного препарата для лечения или профилактики клеточно-пролиферативного расстройства.
124. Применение промышленного изделия по любому из пунктов 37 или 38 для получения лекарственного препарата для терапевтического лечения или диагностики рака.
125. Применение промышленного изделия по любому из пунктов 37 или 38 для получения лекарственного препарата для лечения опухоли.
126. Применение промышленного изделия по любому из пунктов 37 или 38 для получения лекарственного препарата для лечения или профилактики клеточно-пролиферативного расстройства.
127. Способ ингибирования роста клетки, где рост указанной клетки по меньшей мере частично зависит от рост-потенцирующего действия белка, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична (a) полипептиду SEQ ID NO:2, (b) полипептиду SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (c) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальный пептид, (d) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (e) полипептиду, кодируемому нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, или (f) полипептиду, кодируемому полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный способ включает приведение в контакт указанного белка с антителом, которое связывается с указанным белком, что приводит к ингибированию роста указанной клетки.
128. Способ по пункту 127, где указанной клеткой является раковая клетка.
129. Способ по пункту 127, где указанный белок экспрессируется указанной клеткой.
130. Способ по пункту 127, где связывание указанного антитела с указанным белком приводит к подавлению активности указанного белка, направленной на усиление роста клеток.
131. Способ по пункту 127, где связывание указанного антитела с указанным белком приводит к гибели указанной клетки.
132. Способ по пункту 127, где указанное антитело представляет собой моноклональное антитело.
133. Способ по пункту 127, где указанное антитело представляет собой фрагмент антитела.
134. Способ по пункту 127, где указанное антитело представляет собой химерное или гуманизированное антитело.
135. Способ по пункту 127, где указанное антитело конъюгировано с рост-ингибирующим средством.
136. Способ по пункту 127, где указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим средством.
137. Способ по пункту 136, где указанное цитотоксическое средство выбрано из группы, состоящей из токсинов, антибиотиков, радиоактивных изотопов и нуклеолитических ферментов.
138. Способ по пункту 136, где указанным цитотоксическим средством является токсин.
139. Способ по пункту 138, где указанный токсин выбран из группы, состоящей из майтанзиноида, калихеамицина и ауристатина.
140. Способ по пункту 138, где указанным токсином является майтанзиноид.
141. Способ по пункту 127, где указанное антитело продуцируется в бактериях.
142. Способ по пункту 127, где указанное антитело продуцируется в клетках CHO.
143. Способ по пункту 127, где указанный белок имеет (a) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, (b) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, в которой отсутствует сигнальная пептидная последовательность, (c) аминокислотную последовательность внеклеточного домена полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальная пептидная последовательность, (d) аминокислотную последовательность внеклеточного домена полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальная пептидная последовательность, (e) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, или (f) аминокислотную последовательность, кодируемую полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1.
144. Способ терапевтического лечения опухоли у млекопитающего, где рост указанной опухоли по меньшей мере частично зависит от рост-потенцирующего действия белка, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична (a) полипептиду SEQ ID NO:2, (b) полипептиду SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (c) внеклеточному домену полипептида к SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальный пептид, (d) внеклеточному домену полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальный пептид, (e) полипептиду, кодируемому нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, или (f) полипептиду, кодируемому полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, где указанный способ включает приведение в контакт указанного белка с антителом, которое связывается с указанным белком, что позволяет осуществлять эффективное лечение указанной опухоли.
145. Способ по пункту 144, где указанный белок экспрессируется клетками указанной опухоли.
146. Способ по пункту 144, где связывание указанного антитела с указанным белком приводит к подавлению активности указанного белка, направленной на усиление роста клеток.
147. Способ по пункту 144, где указанное антитело представляет собой моноклональное антитело.
148. Способ по пункту 144, где указанное антитело представляет собой фрагмент антитела.
149. Способ по пункту 144, где указанное антитело представляет собой химерное или гуманизированное антитело.
150. Способ по пункту 144, где указанное антитело конъюгировано с рост-ингибирующим средством.
151. Способ по пункту 144, где указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим средством.
152. Способ по пункту 151, где указанное цитотоксическое средство выбрано из группы, состоящей из токсинов, антибиотиков, радиоактивных изотопов и нуклеолитических ферментов.
153. Способ по пункту 151, где указанным цитотоксическим средством является токсин.
154. Способ по пункту 153, где указанный токсин выбран из группы, состоящей из майтанзиноида, калихеамицина и ауристатина.
155. Способ по пункту 153, где указанным токсином является майтанзиноид.
156. Способ по пункту 144, где указанное антитело продуцируется в бактериях.
157. Способ по пункту 144, где указанное антитело продуцируется в клетках CHO.
158. Способ по пункту 144, где указанный белок имеет (a) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, (b) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, в которой отсутствует сигнальная пептидная последовательность, (c) аминокислотную последовательность внеклеточного домена полипептида SEQ ID NO:2, в котором присутствует сигнальная пептидная последовательность, (d) аминокислотную последовательность внеклеточного домена полипептида SEQ ID NO:2, в котором отсутствует сигнальная пептидная последовательность, (e) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, или (f) аминокислотную последовательность, кодируемую полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1.
159. Выделенное антитело, которое связывается с тем же эпитопом, с которым связывается антитело по любому из пунктов 15 - 29.
160. Антитело по пункту 159, которое представляет собой моноклональное антитело.
161. Антитело по пункту 159, которое представляет собой фрагмент антитела.
162. Антитело по пункту 159, которое представляет собой химерное или гуманизированное антитело.
163. Антитело по пункту 159, которое конъюгировано с рост-ингибирующим средством.
164. Антитело по пункту 159, которое конъюгировано с цитотоксическим средством.
165. Антитело по пункту 164, где указанное цитотоксическое средство выбрано из группы, состоящей из токсинов, антибиотиков, радиоактивных изотопов и нуклеолитических ферментов.
166. Антитело по пункту 164, где указанным цитотоксическим средством является токсин.
167. Антитело по пункту 166, где указанный токсин выбран из группы, состоящей из майтанзиноида, калихеамицина и ауристатина.
168. Антитело по пункту 166, где указанным токсином является майтанзиноид.
169. Антитело по пункту 159, которое продуцируется в бактериях.
170. Антитело по пункту 159, которое продуцируется в клетках CHO.
171. Антитело по пункту 159, индуцирующее гибель клеток, с которыми оно связывается.
172. Антитело по пункту 159, которое является детектируемо меченым.
173. Антитело по пункту 159, содержащее по меньшей мере одну из гипервариабельных областей любого антитела по пунктам 15-29.
174. Гибридомная клетка, продуцирующая моноклональное антитело, которое связывается с полипептидом ТАТ.
175. Способ идентификации антитела, которое связывается с эпитопом, связанным с любым антителом по пунктам 15-29, где указанный способ включает определение способности тестируемого антитела блокировать связывание с любым антителом по пунктам 15-29, где способность указанного тестируемого антитела блокировать связывание указанного любого антитела по пунктам 15-29 с полипептидом TAT по меньшей мере на 40% и при равной концентрации антител указывает на то, что данное тестируемое антитело обладает способность связываться с эпитопом, связанным с указанным любым антителом по пунктам 15-29.
Другие варианты настоящего изобретения будут очевидны специалистам исходя из описания настоящей заявки.
Краткое описание графического материала
На фигуре 1 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:1) кДНК TAT419, где SEQ ID NO:1 представляет собой клон, обозначенный в настоящем описании «DNA96945». Предполагаемые старт- и стоп-кодоны подчеркнуты.
На фигуре 2 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2) полипептида TAT419, происходящего от кодирующей последовательности SEQ ID NO:1, представленной на фигуре 1.
На фигуре 3 представлены аминокислотные последовательности полноразмерной легкой цепи моноклонального антитела 5E9 мыши (SEQ ID NO:3) и вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела 5E9 мыши (SEQ ID NO:5).
На фигуре 4 представлены аминокислотные последовательности полноразмерной тяжелой цепи моноклонального антитела 5E9 мыши (SEQ ID NO:4) и вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела 5E9 мыши (SEQ ID NO:6).
На фигуре 5 представлены аминокислотные последовательности полноразмерной легкой цепи гуманизированного антитела hu5E9.v1 (SEQ ID NO:13) и вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела hu5E9.v1 (SEQ ID NO:15).
На фигуре 6 представлены аминокислотные последовательности полноразмерной тяжелой цепи гуманизированного антитела hu5E9.v1 (SEQ ID NO:14) и вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела hu5E9.v1 (SEQ ID NO:16).
На фигуре 7 представлена аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела hu5E9.v2 (SEQ ID NO:17).
in vitro
На фигуре 8 проиллюстрировано  уничтожение клеток UACC257X2.2 с использованием различных концентраций PBS (PBS), контрольного антитела, конъюгированного с токсином vc-MMAE, которое не связывается с полипептидом TAT419 на поверхности живых клеток (Ctr1-vc-MMAE), и моноклонального антитела 5E9 мыши, конъюгированного с токсином vc-MMAE (5E9-vc-MMAE).
in vivo
На фигуре 9 проиллюстрирована  эффективность терапевтического лечения, проводимого с использованием различных концентраций hu5E9.v1-vc-MMAE (hu5E9.v1-MMAE), лишь одного носителя (носитель), или MMAE-конъюгированного контрольного антитела, которое не связывается с полипептидом TAT419 (Ctr1-vc-MMAE), и которое направлено против ксенотрансплантатов UACC257X2.2 у мышей “nude”.
Подробное описание изобретения
I. Определения
Используемые в настоящем описании термины «полипептид TAT» и «TAT», за которыми следуют численные обозначения, означают различные полипептиды, где полное обозначение (то есть, TAT/номер) относится к специфическим полипептидным последовательностям, описанным в настоящей заявке. Термины «TAT/номер полипептида» и «TAT/номер», где используемое в настоящем описании слово «номер» означает фактическое численное обозначение, охватывают нативные полипептидные последовательности, варианты полипептидов, фрагменты полипептидов с нативной последовательностью и варианты таких полипептидов (которые также определены в настоящей заявке). Описанные в настоящем описании полипептиды TAT могут быть выделены из различных источников, например, из тканей человека или из другого источника, либо они могут быть получены рекомбинантными методами или методами синтеза. Термин «полипептид TAT» означает каждый отдельный описанный в настоящем описании полипептид ТАТ/номер. В настоящей заявке, все описания, которые относятся к «полипептиду ТАТ», включают каждый отдельно взятый полипептид, а также их комбинацию. Так, например, описание получения, очистки, происхождения, образования антител или их агонистов или антагонистов, образования TAT-связывающих полипептидов или их агонистов или антагонистов, образования TAT-связывающих органических молекул или их агонистов или антагонистов, введения содержащих их композиций, лечения заболеваний с их использованием и т.п. относится к каждому отдельному полипептиду согласно изобретению. Термин «полипептид TAT» также включает описанные в настоящем описании варианты полипептидов TAT/номер. В одном из вариантов изобретения, последовательность полипептида TAT419 представлена как SEQ ID NO:2.
«Полипептид с нативной последовательностью TAT» включает полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, как и соответствующий природный полипептид TAT. Такие полипептиды TAT с нативной последовательностью могут быть выделены из природного источника, либо они могут быть получены рекомбинантными методами или методами синтеза. Термин «полипептид TAT с нативной последовательностью», в частности, охватывает природные усеченные или секретируемые формы специфического полипептида TAT (например, последовательность внеклеточного домена), природные варианты (например, альтернативно сплайсированные формы) и природные аллельные варианты полипептида. В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанные в настоящем описании полипептиды TAT с нативной последовательностью представляют собой зрелые полипептиды или полноразмерные полипептиды с нативной последовательностью, содержащие полноразмерные аминокислотные последовательности, представленные в описании графического материала. В описании графического материала, старт- и стоп-кодоны (если они указаны) показаны жирным шрифтом и подчеркнуты. Остатки нуклеиновой кислоты, обозначенные «N» или «Х» в описании графического материала, представляют собой любые остатки нуклеиновой кислоты. Хотя полипептиды TAT, указанные в описании графического материала, начинаются с метиониновых остатков, обозначенных в данном описании как положение аминокислоты 1, однако следует отметить, что в качестве начального аминокислотного остатка для полипептидов TAT могут быть использованы и другие метиониновые остатки, расположенные выше или ниже от положения аминокислоты 1, как показано в описании графического материала.
«Внеклеточный домен» или «ECD» полипептида TAT представляет собой форму полипептида TAT, в основном, не содержащего трансмембранных и цитоплазматических доменов. Обычно, ECD полипептида TAT составляет менее 1% от указанных трансмембранных и/или цитоплазматических доменов, предпочтительно, менее, чем 0,5% таких доменов. Следует отметить, что любой из трансмембранных доменов, идентифицированных для полипептидов TAT согласно изобретению, идентифицируют в соответствии с критериями, обычно применяемыми специалистами для идентификации гидрофобного домена такого типа. Точные границы трансмембранного домена могут варьироваться, но наиболее вероятно, что они отличаются не более, чем примерно на 5 аминокислот у любого конца первоначально идентифицированного домена. Поэтому, внеклеточный домен полипептида TAT может содержать, но необязательно, примерно 5 или менее аминокислот на любой стороне пограничной области «трансмембранный домен/внеклеточный домен», идентифицированой как описано в примерах или в описании настоящей заявки, и такие полипептиды, содержащие или не содержащие присоединенный к ним сигнальный пептид, и нуклеиновая кислота, кодирующая эти полипептиды, входят в объем настоящего изобретения.
Предполагаемая локализация «сигнальных пептидов» описанных в настоящем описании различных полипептидов TAT может быть указана в описании настоящей заявки и/или в описании графического материала. Однако следует отметить, что С-концевая граница сигнального пептида может варьироваться, но наиболее вероятно, что она отличается не более, чем примерно на 5 аминокислот с любой стороны С-концевой границы сигнального пептида первоначально идентифицированного в настоящей заявке, где указанная С-концевая граница сигнального пептида может быть идентифицирована в соответствии с критериями, обычно применяемыми специалистами для идентификации элемента аминокислотной последовательности такого типа (например, Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6 (1997) and von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)). Кроме того, также известно, что в некоторых случаях, отщепление сигнальной последовательности от секретированного полипептида не является полностью равномерным, что приводит к образованию более, чем одной секретируемой молекулы. Такие зрелые полипептиды, в которых сигнальный пептид отщепляется в пределах не более, чем примерно 5 аминокислот с любой стороны от С-концевой границы сигнального пептида, идентифицированного в настоящей заявке, и полинуклеотиды, кодирующие такие полипептиды, входят в объем настоящего изобретения.
Термин «вариант полипептида TAT» означает полипептид TAT, предпочтительно, активный полипептид TAT, определенный в настоящем описании и имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80% идентична полноразмерной последовательности нативного полипептида TAT, описанного в настоящей заявке; последовательности полипептида TAT, не содержащего сигнального пептида, описанного в настоящей заявке; последовательности внеклеточного домена полипептида TAT, содержащего или не содержащего сигнальный пептид, описанный в настоящей заявке; или последовательности любого другого фрагмента полноразмерного полипептида TAT, описанного в настоящей заявке (такого как полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, которая представляет собой лишь часть полноразмерной последовательности, кодирующей полноразмерный полипептид TAT). Такими вариантами полипептида TAT являются, например, полипептиды TAT, в которых один или несколько аминокислотных остатков добавлены или делетированы у N- или С-конца полноразмерной нативной аминокислотной последовательности. Обычно, вариант полипептида TAT имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, и альтернативно, по меньшей мере примерно на 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности полноразмерного нативного полипептида TAT, описанного в настоящей заявке; последовательности полипептида TAT, не содержащего сигнального пептида, описанного в настоящей заявке; последовательности внеклеточного домена полипептида TAT, содержащего или не содержащего сигнальный пептид, описанный в настоящей заявке; или последовательности любого другого конкретно определенного фрагмента полноразмерного полипептида TAT, описанного в настоящей заявке. Обычно, варианты полипептида TAT имеют длину по меньшей мере примерно 10 аминокислот или, альтернативно, по меньшей мере примерно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 аминокислот или более. Варианты полипептидов TAT имеют, но необязательно, не более, чем одну консервативную аминокислотную замену по сравнению с нативной последовательностью полипептида TAT, и альтернативно, не более, чем 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 консервативных аминокислотных замен по сравнению с нативной последовательностью полипептида TAT.
«Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей» полипептида TAT, идентифицированного в настоящей заявке, определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в конкретной полипептидной последовательности TAT, после выравнивания этих последовательностей и введения в них «пробелов», если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, причем какие-либо консервативные замены не рассматриваются как часть идентичных последовательностей. Выравнивание, осуществляемое для определения процента идентичности аминокислотных последовательностей, может быть проведено различными методами, известными специалистам, например, с использованием общедоступных компьютерных программ, таких как программы BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалист в данной области может самостоятельно определить соответствующие параметры выравнивания, включая использование любых алгоритмов, необходимых для достижения оптимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако, в целях настоящего изобретения, % идентичности аминокислотных последовательностей вычисляют с применением компьютерной программы ALIGN-2, используемой для сравнения последовательностей, где полный исходный код программы ALIGN-2 приводится в патенте США № 7160985, который вводится в настоящее описание посредством ссылки. Компьютерная программа ALIGN-2, используемая для сравнения последовательностей, была разработана фирмой Genentech, Inc. и указанный исходный код был зарегистрирован в документации для пользователей в Ведомстве по копирайту США, Вашингтон, D.C., 20559, под регистрационным номером U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Программа ALIGN-2 является общедоступной программой, поставляемой фирмой Genentech, Inc., South San Francisco, California, либо она может быть составлена на основе исходного кода. Программа ALIGN-2 должна быть составлена для применения в операционной системе UNIX, предпочтительно, в цифровой системе UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей были установлены в программе ALIGN-2 и не изменялись.
В случае, когда для сравнения аминокислотных последовательностей используется программа ALIGN-2, то % идентичности данной аминокислотной последовательности А с данной аминокислотной последовательностью В (которая альтернативно может быть названа данной аминокислотной последовательностью А, имеющей или составляющей определенный % идентичности с данной аминокислотной последовательностью В) вычисляют следующим образом:
·
100  Х/Y
где Х представляет собой число аминокислотных остатков, которые были оценены как полностью соответствующие при выравнивании последовательностей с использованием программы ALIGN-2, с помощью которой проводили сравнение последовательностей А и В, и где Y представляет собой полное число аминокислотных остатков в последовательности В. При этом, следует отметить, что если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, то % идентичности аминокислотной последовательности А с аминокислотной последовательностью В не равен % идентичности аминокислотной последовательности В с аминокислотной последовательностью А.
Термин «вариант полинуклеотида TAT» или «последовательность нуклеиновой кислоты варианта TAT» означает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид TAT, предпочтительно, активный полипептид TAT, определенный в настоящем описании и имеющую последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере примерно на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерную последовательность нативного полипептида TAT, описанную в настоящей заявке; полноразмерную последовательность нативного полипептида TAT, не содержащего сигнального пептида, описанного в настоящей заявке; внеклеточный домен полипептида TAT, содержащий или не содержащий сигнальный пептид, описанный в настоящей заявке; или последовательность любого другого фрагмента полноразмерного полипептида TAT, описанного в настоящей заявке (такого как полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, которая представляет собой лишь часть полноразмерной последовательности, кодирующей полноразмерный полипептид TAT). Обычно, вариант полинуклеотида TAT имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере примерно на 80%, и альтернативно, по меньшей мере примерно на 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерную последовательность нативного полипептида TAT, описанного в настоящей заявке; полноразмерную последовательность нативного полипептида TAT, не содержащего сигнального пептида, описанного в настоящей заявке; внеклеточный домен полипептида TAT, содержащего или не содержащего сигнальную последовательность и описанного в настоящей заявке; или последовательность любого другого фрагмента полноразмерного полипептида TAT, описанного в настоящей заявке. Эти варианты не содержат нативную нуклеотидную последовательность.
Обычно, полинуклеотидные варианты TAT имеют длину по меньшей мере примерно 5 нуклеотидов и, альтернативно, по меньшей мере примерно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 или 1000 нуклеотидов, где в контексте настоящего описания, термин «примерно» означает указанную длину нуклеотидной последовательности плюс/минус 10% от указанной длины.
«Процент (%) идентичности последовательностей нуклеиновой кислоты», то есть, последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующей TAT и идентифицированной в настоящей заявке, определяют как процент нуклеотидов в последовательности-кандидате, которые идентичны нуклеотидам в представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты TAT, после выравнивания этих последовательностей и введения в них “пробелов”, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательностей. Выравнивание, осуществляемое для определения процента идентичности последовательностей нуклеиновой кислоты, может быть проведено различными методами, известными специалистам, например, с использованием общедоступных компьютерных программ, таких как программы BLAST, BLAST-2, ALIGN или MegAlign (DNASTAR). Однако, в целях настоящего изобретения, % идентичности последовательностей нуклеиновой кислоты вычисляют с применением компьютерной программы ALIGN-2, используемой для сравнения последовательностей, где полный исходный код программы ALIGN-2 представлен в патенте США № 7160985, который вводится в настоящее описание посредством ссылки. Компьютерная программа ALIGN-2, используемая для сравнения последовательностей, была разработана фирмой Genentech, Inc. и указанный исходный код был зарегистрирован в документации для пользователей в Ведомстве по копирайту США, Вашингтон, D.C., 20559, под регистрационным номером U.S. Copyright Registration No TXU510087. Программа ALIGN-2 является общедоступной программой, поставляемой фирмой Genentech, Inc., South San Francisco, California, либо она может быть составлена на основе исходного кода. Программа ALIGN-2 должна быть составлена для применения в операционной системе UNIX, предпочтительно, в цифровой системе UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей были установлены в программе ALIGN-2 и не изменялись.
В случае, когда для сравнения последовательностей нуклеиновой кислоты используется программа ALIGN-2, то % идентичности данной последовательности нуклеиновой кислоты С с данной последовательностью нуклеиновой кислоты D (которая альтернативно может быть названа данной последовательностью нуклеиновой кислоты С, имеющей или составляющей определенный % идентичности с данной последовательностью нуклеиновой кислоты D) вычисляют следующим образом:
·
100  W/Z
где W представляет собой число нуклеотидов, которые были оценены как полностью идентичные при выравнивании последовательностей с использованием программы ALIGN-2, с помощью которой проводили сравнение последовательностей С и D, и где Z представляет собой общее число нуклеотидов в последовательности D. При этом, следует отметить, что если длина последовательности нуклеиновой кислоты C не равна длине последовательности нуклеиновой кислоты D, то % идентичности последовательности нуклеиновой кислоты С с последовательностью нуклеиновой кислоты D не равен % идентичности нуклеиновой кислоты D с последовательностью нуклеиновой кислоты С.
В других вариантах осуществления изобретения, полинуклеотидными вариантами TAT являются молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид TAT, и которые обладают способностью гибридизоваться, предпочтительно, в жестких условиях гибридизации и промывки, с нуклеотидными последовательностями, кодирующими описанный в настоящем описании полноразмерный полипептид TAT. Вариантами полипептида TAT могут быть полипептиды, кодируемые полинуклеотидным вариантом TAT.
Термин «полноразмерная кодирующая область», если он относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид TAT, означает нуклеотидную последовательность, кодирующую полноразмерный полипептид TAT согласно изобретению (который часто локализуется между старт- и стоп-кодонами, включительно, как показано в прилагаемом графическом материале). Термин «полноразмерная кодирующая область», если он относится к нуклеиновой кислоте, депонированной в ATCC, означает часть кДНК, кодирующую полипептид TAT и встроенную в вектор, депонированный в ATCC (который часто локализуется между старт- и стоп-кодонами, включительно, как показано в прилагаемом графическом материале).
in situ
Термин «выделенный», если он относится к различным описанным в настоящем описании полипептидам TAT, означает полипептид, который был идентифицирован и выделен и/или очищен от компонентов его природного окружения. Контаминирующими компонентами его природного окружения являются материалы, негативно влияющие на диагностическую или терапевтическую эффективность данного полипептида, и такими компонентами могут быть ферменты, гормоны и другие белковые или не-белковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, указанный полипептид может быть очищен (1) до степени, достаточной для введения по меньшей мере 15 остатков в N-концевую или внутреннюю часть аминокислотной последовательности с помощью секвенатора, снабженного центрифужным сосудом, или (2) до гомогенности, что может быть подтверждено путем электрофореза в ДСН-ПААГ в восстанавливающих или в невосстанавливающих условиях с окрашиванием кумасси синим или, предпочтительно, серебром. Термин «выделенный полипептид» включает полипептид  в рекомбинантных клетках, если отсутствует по меньшей мере один компонент этого полипептида TAT, присутствующий в его природном окружении. Однако, обычно, выделенный полипептид может быть получен по меньшей мере в одной стадии очистки.
«Выделенная» нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид TAT, или другая нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая была идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной примесной молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно связана в природном источнике нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, имеет форму или структуру, отличающиеся от формы или структуры природной молекулы. Следовательно, выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид, отличаются от конкретной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид и присутствующей в природных клетках. Однако, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, включает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид и содержащиеся в клетках, которые обычно экспрессируют полипептид, где, например, молекула нуклеиновой кислоты присутствует в хромосоме в положении, отличающемся от положения этой нуклеиновой кислоты в природных клетках.
Термин «регуляторные последовательности» означает последовательности ДНК, необходимые для экспрессии функционально присоединенной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Регуляторными последовательностями, подходящими для прокариотов, являются, например, промотор, необязательно, операторная последовательность и сайт связывания с рибосомой. Эукариотические клетки, как известно, используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.
Нуклеиновая кислота является «функционально присоединенной», если она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Так, например, ДНК для пре-последовательности или секреторной лидерной последовательности является функционально присоединенной к ДНК полипептида, если она экспрессируется как пре-белок, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально присоединены к кодирующей последовательности, если они влияют на транскрипцию данной последовательности; а сайт связывания с рибосомой функционально присоединен к кодирующей последовательности, если он расположен в положении, благоприятствующем трансляции. Вообще говоря, термин «функционально присоединенный» означает, что последовательности ДНК, связанные друг с другом, являются смежными, а в случае секреторной лидерной последовательности, они являются смежными и расположены в одной рамке считывания. Однако, энхансеры необязательно должны быть смежными. Связывание осуществляется посредством лигирования в подходящих рестрикционных сайтах. Если эти сайты отсутствуют, то такие синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры используются в соответствии с общепринятой практикой.
«Жесткость условий реакции гибридизации» может быть легко определена средним специалистом в данной области, и обычно она вычисляется эмпирически в зависимости от длины зонда, температуры промывки и концентрации соли. В основном, чем длиннее зонды, тем выше должна быть температура гибридизации, и чем короче зонды, тем ниже должна быть температура. Гибридизация обычно зависит от способности денатурированной ДНК к повторному отжигу, если комплементарные цепи присутствуют в среде, температура которой ниже их температуры плавления. Чем выше степень желаемой гомологии между зондом и гибридизуемой последовательностью, тем выше должна быть относительная температура. Из этого следует, что более высокие относительные температуры создают более жесткие условия реакции, а более низкие температуры создают менее жесткие условия реакции. Более подробное описание и объяснение условий жесткости реакций гибридизации можно найти в руководстве Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
«Условия жесткости» или «условия высокой жесткости», определенные в настоящей заявке, могут быть установлены как условия, которые включают (1) промывку при низкой ионной силе и высокой температуре, например, промывку 0,015 M хлоридом натрия/0,0015 M цитратом натрия/0,1% додецилсульфатом натрия при 50°С; (2) использование в процессе гибридизации денатурирующего средства, такого как, формамид, например, 50% (об/об) формамид с 0,1% альбумином бычьей сыворотки/0,1% фиколла/0,1% поливинилпирролидона/50 мМ натрийфосфатного буфера, pH 6,5, с 750 мМ хлорида натрия, 75 мМ цитрата натрия при 42°С; или (3) гибридизацию в течение ночи в растворе, содержащем 50% формамид, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M цитрата натрия), 50 мМ фосфата натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфата натрия, 5 x раствора Денхардта, обработанную ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% ДСН и 10% сульфат декстрана при 42°С с 10-минутной промывкой при 42°С в 0,2 x SSC (хлорид натрия/цитрат натрия), с последующей 10-минутной промывкой в условиях высокой жесткости, состоящей из 0,1 x SSC, содержащего EDTA при 55°С.
«Условия умеренной жесткости» могут быть определены как описано в руководстве Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, и включают использование менее жестких условий промывки и гибридизации (таких как, например, температура, ионная сила и % ДСН), чем условия, описанные выше. Примером условий умеренной жесткости является инкубирование в течение ночи при 37°С в растворе, содержащем 20% формамид, 5 x SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатрийцитрата), 50 мМ фосфата натрия (pH 7,6), 5 x раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 1 x SSC примерно при 37-50°С. Если необходимо адаптировать данные условия к соответствующим параметрам, таким как, длина зонда и т.п., то температура, ионная сила и т.п. могут быть скорректированы способами, известными специалистам.
Используемый в настоящем описании термин «меченый эпитопом» означает химерный полипептид, содержащий полипептид TAT или анти-TAT антитело, слитое с «полипептидом-меткой». Полипептид-метка должна иметь определенное число остатков, достаточное для создания эпитопа, против которого может быть направлено данное антитело, и должна быть достаточно короткой, то есть, такой, чтобы она не влияла на активность полипептида, к которому она присоединена. Кроме того, предпочтительно, чтобы такая полипептид-метка была достаточно уникальной, то есть, такой, чтобы антитело не обладало значительной перекрестной реактивностью с другими эпитопами. Подходящие полипептиды-метки обычно имеют по меньшей мере шесть аминокислотных остатков, а, в основном, примерно 8-50 аминокислотных остатков (предпочтительно, примерно 10-20 аминокислотных остатков).
Используемые в настоящем описании термины «активный» или «активность» относятся к форме(ам) полипептида TAT, который сохраняет биологическую и/или иммунологическую активность природного или нативного TAT, где термин «биологическая активность» означает биологическую функцию (ингибирующую или стимулирующую), сообщаемую нативным или природным TAT, за исключением способности индуцировать продуцирование антитела против антигенного эпитиопа, находящегося на нативном или природном TAT, а термин «иммунологическая активность» означает способность индуцировать продуцирование антитела против антигенного эпитиопа, находящегося на нативном или природном TAT.
Термин «антагонист» используется в настоящем описании в самом широком смысле и включает любую молекулу, которая частично или полностью блокирует, ингибирует или нейтрализует биологическую активность, описанного в настоящем описании нативного полипептида TAT. Аналогичным образом, термин «агонист» используется в настоящем описании в самом широком смысле и включает любую молекулу, которая имитирует биологическую активность описанного в настоящем описании нативного полипептида TAT. Подходящими молекулами агонистов или антагонистов, в частности, являются антитела-агонисты или антагонисты или фрагменты антител, фрагменты или варианты аминокислотных последовательностей нативных полипептидов ТАТ, пептиды, антисмысловые олигонуклеотиды, небольшие органические молекулы и т.п. Методы идентификации агонистов или антагонистов полипептида TAT могут включать приведение в контакт полипептида TAT с молекулой-агонистом или антагонистом, используемой в качестве кандидата, и определение детектируемого изменения одной или нескольких биологических активностей, обычно связанных с полипептидом TAT.
Термины «лечение» или «терапия» или «ослабление симптомов» означают терапевтическое лечение и профилактические или превентивные меры, которые направлены на профилактику или замедление (ослабление) развития патологического состояния или расстройства у индивидуума. Индивидуумом, нуждающемся в лечении, является индивидуум, у которого уже имеется указанное расстройство, а также индивидуум, у которого имеется предрасположенность к развитию такого расстройства, или индивидуум, который нуждается в превентивных мерах по профилактики такого расстройства. Лечение рака у индивидуума или млекопитающего, в опухолях которых экспрессируется полипептид TAT, считается успешным, если после введения терапевтического количества анти-TAT антитела, ТАТ-связывающего олигопептида или ТАТ-связывающей органической молекулы способами согласно изобретению, у данного пациента наблюдается заметное и/или измеримое снижение числа раковых клеток или их отсутствие; снижение размера опухоли; ингибирование (то есть, замедление до некоторой степени, предпочтительно, прекращение) инфильтрации раковых клеток в периферические органы, включая распространение раковых клеток в мягкие ткани и кость; ингибирование (то есть, замедление до некоторой степени, предпочтительно, прекращение) метастазирования опухоли; ингибирование, до некоторой степени, роста опухоли; и/или ослабление, до некоторой степени, одного или нескольких симптомов, связанных с конкретным раковым заболеванием; снижение заболеваемости и смертности, и улучшение качества жизни этих индивидуумов. Анти-TAT антитело или ТАТ-связывающий олигопептид в зависимости от степени его способности предупреждать рост раковых клеток и/или уничтожать уже имеющиеся раковые клетки, может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. Ослабление таких признаков или симптомов может также ощущаться самим пациентом.
Вышеуказанные параметры для оценки эффективности лечения и положительной динамики заболевания могут быть легко определены с помощью рутинных процедур, известных врачу. Что касается лечения рака, то эффективность лечения может быть оценена, например, путем определения времени, прошедшего до прогрессирования заболевания (ТТР), и/или определения скорости ответа (RR). Метастазы могут быть выявлены с помощью анализов на стадии развития опухолей и путем сканирования кости, а также с помощью анализов на уровни кальция и ферментов для определения распространения опухоли в кость. Может быть также проведено сканирование методами компьютерной томографии (КТ) для выявления распространения опухоли в область таза и лимфоузлов. Для выявления метастазов опухоли в легкие и печень, соответственно, может быть сделана рентгенограмма грудной клетки и проведено измерение уровней ферментов в печени известными методами. Другими рутинными методами мониторинга заболевания являются трансректальная ультразвуковая эхография (ТРУЭ) и трансректальная биопсия (ТРБ).
«Постоянное» введение, в отличие от однократного введения, означает введение средства (средств) в непрерывном режиме, что позволяет поддерживать исходное терапевтическое действие (активность) в течение длительного периода времени. «Периодическое» введение означает введение, которое не является непрерывным, а проводится циклами.
«Млекопитающее», которое может быть подвергнуто лечению или ослаблению симптомов рака, или которому может быть проведена диагностика рака, означает любое животное, классифицированное как млекопитающее, включая человека, домашних животных, сельскохозяйственных животных, животных, содержащихся в зоопарках, животных, участвующих в спортивных состязаниях, или животных-компаньонов, таких как собаки, кошки, крупный рогатый скот, лошади, овцы, свиньи, козы, кролики и т.п. Предпочтительным млекопитающим является человек.
Термин «введение в комбинации с» одним или несколькими другими терапевтическими средствами включает одновременное (конкурентное) и последовательное введение в любом порядке.
Используемый в настоящем описании термин «носители» включает фармацевтически приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы, являющиеся нетоксичными для клеток, в которые их вводят, или для млекопитающих, которым вводят эти носители, наполнители или стабилизаторы в используемых дозах и концентрациях. В большинстве случаев, физиологически приемлемым носителем является водный рН-забуференный раствор. Примерами физиологически приемлемых носителей являются буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; полипептид с низкой молекулярной массой (менее, чем примерно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие средства, такие как EDTA; спирты ряда сахаров, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и PLURONICS.
Термин «твердая фаза» или «твердый носитель» означает безводную матрицу, на которую могут быть нанесены, или к которой могут быть присоединены антитело, ТАТ-связывающий олигопептид или ТАТ-связывающая органическая молекула согласно изобретению. Примерами твердых фаз, рассматриваемых в настоящей заявке, являются твердые фазы, полученные частично или полностью из стекла (например, стекла с регулируемым размером пор), полисахаридов (например, агарозы), полиакриламидов, полистирола, поливинилового спирта и силиконов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, в зависимости от контекста описания, твердая фаза может представлять собой лунку аналитического планшета, а в других вариантах осуществления изобретения, такой твердой фазой является колонка для очистки (например, колонка для аффинной хроматографии). Этот термин также включает неоднородную твердую фазу, состоящую из дискретных частиц, например, фазу, описанную в патенте США No. 4275149.
«Липосома» представляет собой небольшую везикулу, состоящую из липидов, фосфолипидов и/или поверхностно-активного вещества различных типов, которые могут быть использованы для доставки лекарственного средства (такого как полипептид ТАТ, антитело против полипептида TAT или ТАТ-связывающий олигопептид) млекопитающему. Компоненты липосомы обычно расположены так, что они образуют бислой, аналогичный липидной структуре биологических мембран.
«Небольшая» молекула или «небольшая» органическая молекула определяется в настоящем описании как молекула, имеющая молекулярную массу примерно ниже 500 Дальтон.
Используемый в настоящем описании термин «эффективное количество» полипептида, антитела, ТАТ-связывающего олигопептида, ТАТ-связывающей органической молекулы или их агонистов или антагонистов, описанных в настоящей заявке, означает количество, достаточное для достижения конкретных целей. «Эффективное количество», в зависимости от конкретной цели, может быть определено эмпирически и рутинным способом.
Термин “терапевтически эффективное количество” означает количество антитела, полипептида, ТАТ-связывающего олигопептида, ТАТ-связывающей органической молекулы или другого лекарственного средства, эффективного для «лечения» заболевания или расстройства у индивидуума или млекопитающего. В случае рака, такое терапевтически эффективное количество лекарственного средства может снижать число раковых клеток; уменьшать размер опухоли; ингибировать (то есть, замедлять до некоторой степени, предпочтительно, прекращать) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать (то есть, замедлять до некоторой степени, предпочтительно, прекращать) развитие метастазов опухоли; ингибировать, до некоторой степени, рост опухоли; и/или ослаблять, до некоторой степени, один или несколько симптомов, связанных с раком. См. определение термина «лечение». Лекарственное средство, до некоторой степени, может предотвращать рост раковых клеток и/или уничтожать раковые клетки, и такое лекарственное средство может иметь цитостатическое и/или цитотоксическое действие.
in vitro
in vivo
«Рост-ингибирующее количество» анти-TAT антитела, полипептида ТАТ, ТАТ-связывающего олигопептида или ТАТ-связывающей органической молекулы представляет собой количество, способное ингибировать рост клеток, в частности, опухоли, например, раковых клеток, либо , либо . «Рост-ингибирующее количество» анти-TAT антитела, полипептида ТАТ, ТАТ-связывающего олигопептида или ТАТ-связывающей органической молекулы, используемое для ингибирования роста опухолевых клеток, может быть определено эмпирически и рутинным способом.
in vitro
in vivo
«Цитотоксическое количество» анти-TAT антитела, полипептида ТАТ, ТАТ-связывающего олигопептида или ТАТ-связывающей органической молекулы представляет собой количество, способное вызывать деструкцию клеток, в частности, опухоли, например, раковых клеток, либо , либо . «Цитотоксическое количество» анти-TAT антитела, полипептида ТАТ, ТАТ-связывающего олигопептида или ТАТ-связывающей органической молекулы, используемое для ингибирования роста опухолевых клеток, может быть определено эмпирически и рутинным способом.
Используемый в настоящем описании термин «антитело» применяется в самом широком смысле, в частности, охватывает, например, отдельные моноклональные анти-TAT антитела (включая агонисты, антагонисты и нейтрализующие антитела), композиции анти-TAT антител, обладающие специфичностью к множеству эпитопов, поликлональные антитела, одноцепочечные анти-ТАТ антитела и фрагменты анти-ТАТ антител (см. ниже), при условии, что они обладают нужной биологической или иммунологической активностью. Используемые в настоящем описании термины «иммуноглобулин (Ig)» и «антитело» являются синонимами.
in situ
«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и выделено и/или очищено от компонентов его природного окружения. Контаминирующими компонентами его природного окружения являются материалы, негативно влияющие на диагностическую или терапевтическую эффективность антитела, и такими компонентами могут быть ферменты, гормоны и другие белковые или не белковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, указанное антитело может быть очищено: (1) на более, чем 95% по массе антитела, как может быть определено методом Лаури, а более предпочтительно, более, чем на 99% по массе антитела, (2) до степени, достаточной для получения, по меньшей мере 15 остатков у N-концевой или внутренней части аминокислотной последовательности, что может быть определено с использованием секвенатора, снабженного центрифужным сосудом, или (3) до гомогенности, что может быть подтверждено с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ в восстанавливающих или в невосстанавливающих условиях с окрашиванием кумасси синим или, предпочтительно, серебром. Термин “выделенное антитело” включает антитело  в рекомбинантных клетках, если отсутствует по меньшей мере один природный компонент этого антитела. Однако, обычно, выделенное антитело может быть получено по меньшей мере в одной стадии очистки.
Основная 4-цепочечная молекула антитела представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей (антитело IgM состоит из 5 основных гетеротетрамерных молекул вместе с дополнительным полипептидом, называемым J-цепью, а поэтому оно содержит 10 антигенсвязывающих сайтов, а секретированные антитела IgA могут полимеризоваться с образованием поливалентных конструкций, содержащих 2-5 основных 4-цепочечных молекул вместе с J-цепью). В случае IgG, 4-цепочечная молекула, в основном, имеет размер примерно 150000 дальтон. Каждая L-цепь связана с Н-цепью одной ковалентной дисульфидной связью, а две Н-цепи связаны друг с другом одной или несколькими дисульфидными связями в зависимости от изотипа Н-цепи. Каждая H- и L-цепь также имеет равномерно расположенные внутрицепьевые дисульфидные мостики. Каждая Н-цепь имеет у своего N-конца вариабельный домен (VH), за которым следуют три константных домена (CH) для каждой из α- и γ-цепей, и четыре CH-домена для изотипов μ и ε. Каждая L-цепь имеет у своего N-конца вариабельный домен (VL), за которым следует константный домен (CL) у его другого конца. VL расположена на одной линии с VH, а CL расположена на одной линии с первым константным доменом тяжелой цепи (CH1). Очевидно, что конкретные аминокислотные остатки образуют пограничную область между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи. Спаривание VH и VL приводит к образованию одного антигенсвязывающего сайта. Структура и свойства антител различных классов описаны, например, в публикации Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6.
L-цепь, происходящая от антитела позвоночных любого вида, может принадлежать к одному из двух четко различаемых типов, называемых каппа и лямбда, исходя из аминокислотных последовательностей их константных доменов. Иммуноглобулины, в зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей (CH), могут быть отнесены к различным классам или изотипам. Существует пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, имеющие тяжелые цепи, обозначаемые α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Классы γ и α также подразделены на подклассы, исходя из относительно небольших различий в последовательностях и функциях CH, например, у человека экспрессируются иммуноглобулины следующих подклассов: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.
Термин “вариабельный” относится к некоторым сегментам вариабельных доменов, которые имеют значительные отличия в последовательностях различных антител. Домен V опосредует связывание с антигеном и определяет специфичность конкретного антитела к конкретному антигену. Однако вариабельность неравномерно распределяется по всем вариабельным доменам, состоящим из 110 аминокислот. Но обычно, области V состоят из относительно инвариантных сегментов, называемых каркасными областями (FR), состоящими из 15-30 аминокислот, отделенных более короткими областями с четко выраженной гипервариабельностью, называемыми «гипервариабельными областями», каждая из которых имеет длину в 9-12 аминокислот. Каждый вариабельный домен нативной тяжелой и легкой цепей содержит четыре FR, имеющих, главным образом, β-складчатую конфигурацию и соединенных тремя гипервариабельными областями, которые образуют петли, соединяющие, а в некоторых случаях, образующие часть β-складчатой структуры. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости друг от друга посредством FR, и, вместе с гипервариабельными областями другой цепи, участвуют в образовании антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Sth. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, но обладают различными эффекторными функциями, такими как участие антитела в антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).
Используемый в настоящем описании термин «моноклональное антитело» означает антитело, полученное от популяции, в основном, гомогенных антител, то есть, отдельных антител, входящих в данную популяцию и являющихся идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются в высокой степени специфическими и направлены против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Помимо своей специфичности, моноклональные антитела обладают тем преимуществом, что они могут быть синтезированы так, чтобы они не содержали примесей других антител. Термин «моноклональный» не означает, что данное антитело должно быть продуцировано каким-либо конкретным методом. Так, например, моноклональные антитела согласно изобретению могут быть получены с помощью гибридомной технологии, впервые описанной Kohler et al. Nature 256:495 (1975), либо они могут быть получены методами рекомбинантных ДНК в клетках бактерий, эукариотических организмов или растений (см., например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» могут быть также выделены из фаговых библиотек антител методами, описанными, например, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).
Используемыми в настоящем описании моноклональными антителами являются, в частности, «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, происходящих от конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, а остальная(ые) цепь(и) идентична(ы) или гомологична(ы) соответствующим последовательностям антител, происходящих от другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они обладают нужной биологической активностью (см. патент США № 4816567 и публикацию Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Представляющими интерес химерными антителами согласно изобретению являются «приматизированные» антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельных доменов, происходящие от последовательностей константной области приматов, не являющихся человеком (например, мартышек, человекообразных обезьян и т.п.), и человека.
«Интактное» антитело представляет собой антитело, содержащее антигенсвязывающий сайт, а также CL и по меньшей мере константные домены тяжелой цепи, CH1, CH2 и CH3. Константные домены могут представлять собой константные домены нативной последовательности (например, константные домены нативной последовательности человека) или варианты их аминокислотных последовательностей. Интактное антитело, предпочтительно, обладает одной или несколькими эффекторными функциями.
2
«Фрагменты антител» содержат часть интактного антитела, предпочтительно, антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела. Примерами фрагментов антител являются Fab-, Fab'-, F(ab')- и Fv-фрагменты; диатела; линейные антитела (см. патент США No. 5641870, пример 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
2
2
В результате гидролиза антител папаином образуются два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых «Fab»-фрагментами, и один оставшийся «Fc»-фрагмент, название которого указывает на его способность легко кристаллизоваться. Fab-фрагмент состоит из полноразмерной L-цепи вместе с доменом вариабельной области H-цепи (VH), и первого константного домена одной тяжелой цепи (CH1). Каждый Fab-фрагмент является одновалентным в отношении связывания с антигеном, то есть, он имеет один антигенсвязывающий сайт. В результате обработки антитела пепсином образуется один крупный F(ab')-фрагмент, который приблизительно соответствует двум связанным дисульфидной связью Fab-фрагментам, обладающим двухвалентной антигенсвязывающей активностью и способностью перекрестно связываться с антигеном. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов присутствием нескольких дополнительных остатков у карбокси-конца домена CH1, включая один или несколько цистеинов, происходящих от шарнирной области антитела. Fab'-SH, используемый в настоящей заявке, представляет собой Fab', в котором цистеиновый(е) остаток(тки) константных доменов имеет свободную тиоловую группу. F(ab')-фрагменты антитела первоначально были получены в виде пар Fab'-фрагментов, которые имеют расположенные между ними шарнирные цистеины. Специалистам также известны другие методы химического связывания фрагментов антител.
Fc-фрагмент содержит карбокси-концевые части обеих Н-цепей, связанных посредством дисульфидных связей. Эффекторные функции антител определяют по последовательностям Fc-области, которые представляют собой также части, распознаваемые Fc-рецепторами (FcR), находящимися на клетках некоторых типов.
«Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, содержащий полноразмерный антиген-распознающий сайт и антигенсвязывающий сайт. Этот фрагмент состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, жестко связанных друг с другом нековалентной связью. После укладки этих двух доменов образуется шесть гипервариабельных петель (по 3 петли, каждая из которых происходит от Н- и L-цепи), которые обеспечивают аминокислотные остатки для связывания с антигеном и сообщают антителу специфичность связывания с антигеном. Однако, даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичных к антигену) обладает способностью распознавать антиген и связываться с ним, хотя и с меньшей аффинностью, чем весь сайт связывания.
«Одноцепочечные Fv-фрагменты», также обозначаемые «sFv» или «scFv», представляют собой фрагменты антитела, которые содержат домены VH и VL антитела, соединенные в одной полипептидной цепи. Предпочтительно, полипептид scFv также содержит между доменами VH и VL полипептидный линкер, который обеспечивает образование scFv со структурой, необходимой для связывания с антигеном. Описание scFv можно найти в работе Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, см. ниже.
Термин «диатела» означает небольшие фрагменты антител, полученные путем конструирования scFv-фрагментов (см. предыдущий абзац) с использованием коротких линкеров (примерно 5-10 остатков) между доменами VH и VL, так, чтобы достигалось межцепьевое, но не внутрицепьевое, спаривание доменов V, с образованием двухвалентного фрагмента, то есть, фрагмента, имеющего два антигенсвязывающих сайта. Биспецифическими диателами являются гетеродимеры двух «перекрестно связанных» scFv-фрагментов, в которых домены VH и VL двух антител присутствуют на различных полипептидных цепях. Диатела более подробно описаны, например, в EP 404097; WO 93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
«Гуманизированные формы» нечеловеческих антител (например, антител грызунов) представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую от нечеловеческого антитела. По большей части, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитело-реципиент), в которых остатки, происходящие от гипервариабельной области данного антитела-реципиента, заменены остатками, происходящими от гипервариабельной области нечеловеческого антитела (донорного антитела), такого как антитело мыши, антитело крысы, антитело кролика или антитело приматов, не являющихся человеком, где указанные антитела обладают нужной специфичностью, аффинностью и связывающей способностью. В некоторых случаях, остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками нечеловеческого антитела. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаруживаются в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Эти модификации вводят для улучшения свойств антитела. В общих чертах, гуманизированное антитело может содержать, в основном, все или по меньшей мере один, а обычно два вариабельных домена, в которых все или почти все гипервариабельные петли соответствуют гипервариабельным петлям нечеловеческого иммуноглобулина, и все или почти все FR представляют собой FR с последовательностью иммуноглобулина человека. Гуманизованное антитело также содержит, но необязательно, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно, области иммуноглобулина человека. Более подробное описание см. у Jones et al. Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature 332:323-329 (1998) и Presta Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).
-7
-8
-9
«Видоспецифическое антитело», например, антитело млекопитающего против IgE человека представляет собой антитело, которое обладает более высокой аффинностью связывания с антигеном, происходящим от млекопитающего первого вида, по сравнению с гомологом антигена, происходящего от млекопитающего второго вида. Обычно, видоспецифическое антитело «специфически связывается» с антигеном человека (то есть, имеет величину аффинности связывания (Kd) не более, чем примерно 1×10 M, предпочтительно, не более, чем примерно 1×10, а наиболее предпочтительно, не более, чем примерно 1×10 M), тогда как аффинность связывания с гомологом антигена, происходящего от млекопитающего второго вида, не являющегося человеком, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 500 раз, или по меньшей мере примерно в 1000 раз ниже аффинности связывания с антигеном человека. Видоспецифическое антитело может представлять собой любое из антител различных типов, определенных выше, но, предпочтительно, таким антителом является гуманизированное антитело или антитело человека.
Термин “остаток вариабельного домена, пронумерованный по Kabat” или “положение аминокислоты, пронумерованное по Kabat” и их варианты означает систему, используемую для нумерации вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи антител, описанной в справочнике по антителам Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). В соответствии с этой системой нумерации, фактическая первичная аминокислотная последовательность может содержать меньшее число или дополнительное число аминокислот, соответствующее укорочененной или удлиненной FR- или CDR-области вариабельного домена. Так, например, вариабельный домен тяжелой цепи может содержать инсерцию одной аминокислоты (остатка 52а в соответствии с нумерацией Kabat) после остатка 52 Н2, и остатки (например, остатки 82а, 82b и 82с и т.п., в соответствии с нумерацией Kabat), встроенные после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерация остатков данного антитела по Kabat может быть осуществлена после выравнивания его последовательности в областях гомологии со “стандартной” последовательностью, пронумерованной по Kabat.
Используемые в настоящем описании термины «по существу, аналогичный» или «по существу, тот же самый» означают достаточно высокую степень сходства между двумя численными величинами (обычно, между одной величиной, соответствующей антителу согласно изобретению, и другой величиной, соответствующей эталонному/сравниваемому антителу), а именно, такую степень сходства, которая позволяла бы специалисту в данной области считать различие между этими двумя величинами несущественным или биологически и/или статистически незначимым с точки зрения их биологических свойств, определяемых указанными величинами (например, величинами Kd). Различия между указанными двумя величинами составляет, предпочтительно, менее, чем примерно 50%, более предпочтительно, менее, чем примерно 40%, еще более предпочтительно, менее, чем примерно 30%, еще более предпочтительно, менее, чем примерно 20%, а наиболее предпочтительно, менее, чем примерно 10% по сравнению с величинами эталонного/сравниваемого антитела.
Термин “аффинность связывания”, по существу, означает силу суммарных нековалентных взаимодействий одного сайта связывания молекулы (например, антитела) с его партнером по связыванию (например, с антигеном). Если это не оговорено особо, то используемый в настоящем описании термин “аффинность связывания” означает природную аффинность связывания, при которой происходит взаимодействие 1:1 между членами пар связывания (например, антитела с антигеном). Аффинность связывания молекулы Х с ее партнером Y, в общих чертах, может называться константой диссоциации (Kd). Аффинность может быть определена стандартными методами, известными специалистам, включая описанные в настоящем описании методы. Низкоаффинные антитела обычно связываются с антигеном с меньшей скоростью и имеют тенденцию легко диссоциироваться, тогда как высокоаффинные антитела обычно связываются с антигеном с большей скоростью и имеют тенденцию оставаться связанными в течение более длительного периода времени. Специалистам в данной области известны различные методы измерения аффинности связывания, и для осуществления настоящего изобретения может быть применен любой из этих методов. Конкретные характерные варианты осуществления изобретения описаны ниже.
125
125
TM
TM
TM
6
-1
-1
~
~
~
on
off
off
on
В одном из вариантов изобретения, «Kd» или «величину Kd» согласно изобретению определяют с помощью анализа на связывание с радиоактивно меченым антигеном (РИА), осуществляемого с использованием Fab-варианта представляющего интерес антитела и его антигена, описанного ниже, где указанный анализ позволяет измерять аффинность связывания Fab с антигеном в растворе путем уравновешивания Fab минимальной концентрацией (I)-меченого антигена в присутствии титрационного набора немеченых антигенов, с последующей иммобилизацией связанного антигена на планшете, сенсибилизированном антителом против Fab-фрагмента (Chen et al. (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881). В целях создания соответствующих условий для анализа, микротитрационные планшеты (Dynex) сенсибилизируют в течение ночи 5 мкг/мл связывающего анти-Fab антитела (Cappel Labs) в 50 мМ карбонате натрия (рН 9,6), а затем блокируют 2%-ным (масс./об.) альбумином бычьей сыворотки в PBS в течение 2-5 часов при комнатной температуре (приблизительно при 23°С). В не-адсорбирующем планшете (Nunc # 269620), 100 пМ или 26 пМ [I]-антигена смешивают с серийными разведениями представляющего интерес Fab (например, в соответствии с оценкой анти-VEGF антитела, Fab-12, Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Затем представляющий интерес Fab инкубируют в течение ночи, однако, для гарантии достижения равновесия, инкубирование может быть проведено в течение более длительного периода времени (например, 65 часов). После этого смеси переносят в планшет для иммобилизации и инкубируют при комнатной температуре (например, в течение одного часа). Затем раствор удаляют и планшет восемь раз промывают 0,1% Твином-20 в PBS. После сушки планшетов добавляют 150 мкл/лунку сцинтилляционной жидкости (MicroScint-20; Packard), и планшеты подсчитывают на гамма-счетчике Topcount (Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого Fab, которые составляют 20% или менее от максимального связывания, отбирают для их использования в анализах на конкурентное связывание. В соответствии с другим вариантом изобретения, Kd или величину Kd измеряют в анализе методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore-2000 или BIAcore-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°С с использованием чипов СМ5 с иммобилизованным на них антигеном при величине единиц отклика (RU), составляющей 10. Вкратце, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщиков. Антиген разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, до 5 мкг/мл (0,2 мкМ), а затем инъецируют при скорости потока 5 мкл/минуту до достижения величины единиц отклика (RU) связанного белка, составляющей 10. После инъекции антигена, для блокирования непрореагировавших групп вводят 1М этаноламин. Для измерения кинетики реакции вводят инъекции двухкратных серийных разведений Fab (0,78 нМ-500 нМ) в PBS, содержащем 0,05% твина 20 (PBST) при 25°С и при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорость ассоциации (k) и скорость диссоциации (k) вычисляют с использованием простой лангмюровской модели связывания 1:1 (BIAcore Evaluation Software version 3.2) при одновременном построении сенсорограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Kd) вычисляют как отношение k/k. См., например, Chen, Y., et al. (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. Если скорость ассоциации превышает 10 М · с, как было определено выше методом поверхностного плазмонного резонанса, то такая скорость ассоциации может быть определена методом гашения флуоресценции, который позволяет измерять увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентного излучения (возбуждение = 295 нм; излучение = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°С для 20 нМ антитела против антигена (в Fab-форме) в PBS, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, как было измерено на спектрометре, таком как спектрофотометр, снабженный ограничителем потока (Aviv Instrumtnts), или на спектрофотометре SLM-Aminco серии 8000 (ThermoSpectronic), снабженном кюветой для перемешивания, содержащей красный краситель.
on
on
off
off
on
on
off
off
on
TM
TM
6
-1
-1
125
125
TM
TM
TM
6
-1
-1
~
~
~
~
~
~
«Скорость ассоциации» («on-rate») или «k» согласно изобретению может быть также определена описанным выше методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore-2000 или BIAcore-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°С с использованием чипов СМ5 с иммобилизованным на них антигеном при величине единиц отклика (RU), составляющей 10. Вкратце, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщиков. Антиген разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, до 5 мкг/мл (0,2 мкМ), а затем инъецируют при скорости потока 5 мкл/минуту до достижения величины единиц отклика (RU) связанного белка, составляющей 10. После инъекции антигена, для блокирования непрореагировавших групп вводят 1М этаноламин. Для измерения кинетики реакции вводят инъекции двукратных серийных разведений Fab (0,78 нМ-500 нМ) в PBS, содержащем 0,05% твина 20 (PBST) при 25°С и при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорость ассоциации (k) и скорость диссоциации (k) вычисляют с использованием простой лангмюровской модели связывания 1:1 (BIAcore Evaluation Software version 3.2) при одновременном построении сенсорограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Kd) вычисляют как отношение k/k. См., например, Chen, Y., et al. (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. Если скорость ассоциации превышает 10 М·с, как было определено выше методом поверхностного плазмонного резонанса, то такая скорость ассоциации может быть определена методом гашения флуоресценции, который позволяет измерять увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентного излучения (возбуждение = 295 нм; излучение = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°С для 20 нМ антитела против антигена (в Fab-форме) в PBS, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, как было измерено на спектрометре, таком как спектрофотометр, снабженный ограничителем потока (Aviv Instrumtnts), или на спектрофотометре SLM-Aminco серии 8000 (ThermoSpectronic), снабженном кюветой для перемешивания. В одном из вариантов изобретения, «Kd» или «величину Kd» согласно изобретению определяют с помощью анализа на связывание с радиоактивно меченым антигеном (РИА), осуществляемого с использованием Fab-варианта представляющего интерес антитела и его антигена, описанного ниже, где указанный анализ позволяет измерять аффинность связывания Fab с антигеном в растворе путем уравновешивания Fab минимальной концентрацией (I)-меченого антигена в присутствии титрационного набора немеченых антигенов, с последующей иммобилизацией связанного антигена на планшете, сенсибилизированном антителом против Fab-фрагмента (Chen et al. (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881). В целях создания соответствующих условий для анализа, микротитрационные планшеты (Dynex) сенсибилизируют в течение ночи 5 мкг/мл связывающего анти-Fab антитела (Cappel Labs) в 50 мМ карбонате натрия (рН 9,6), а затем блокируют 2%-ным (масс./об.) альбумином бычьей сыворотки в PBS в течение 2-5 часов при комнатной температуре (приблизительно при 23°С). В не-адсорбирующем планшете (Nunc # 269620), 100 пМ или 26 пМ [I]-антигена смешивают с серийными разведениями представляющего интерес Fab (например, в соответствии с оценкой анти-VEGF антитела, Fab-12, Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Затем представляющий интерес Fab инкубируют в течение ночи, однако, для гарантии достижения равновесия, инкубирование может быть проведено в течение более длительного периода времени (например, 65 часов). После этого смеси переносят в планшет для иммобилизации и инкубируют при комнатной температуре в течение одного часа. Затем раствор удаляют и планшет восемь раз промывают 0,1% Твином-20 в PBS. После сушки, в эти планшеты добавляют 150 мкл/лунку сцинтилляционной жидкости (MicroScint-20; Packard), и планшеты подсчитывают на гамма-счетчике Topcount (Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого Fab, которые составляют 20% или менее от максимального связывания, отбирают для их использования в анализах на конкурентное связывание. В соответствии с другим вариантом изобретения, Kd или величину Kd измеряют в анализе методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore-2000 или BIAcore-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°С с использованием чипов СМ5 с иммобилизованным на них антигеном при величине единиц отклика (RU), составляющей 10. Вкратце, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщиков. Антиген разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, до 5 мкг/мл (0,2 мкМ), а затем инъецируют при скорости потока 5 мкл/минуту до достижения величины единиц отклика (RU) связанного белка, составляющей 10. После инъекции антигена, для блокирования не прореагировавших групп вводят 1М этаноламин. Для измерения кинетики реакции вводят инъекции двукратных серийных разведений Fab (0,78 нМ-500 нМ) в PBS, содержащем 0,05% твина 20 (PBST) при 25°С и при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорость ассоциации (k) и скорость диссоциации (k) вычисляют с использованием простой лангмюровской модели связывания 1:1 (BIAcore Evaluation Software version 3.2) при одновременном построении сенсорограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Kd) вычисляют как отношение k/k. См., например, Chen, Y., et al. (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. Если скорость ассоциации превышает 10 М·с, как было определено выше методом поверхностного плазмонного резонанса, то такая скорость ассоциации может быть определена методом гашения флуоресценции, который позволяет измерять увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентного излучения (возбуждение = 295 нм; излучение = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°С для 20 нМ антитела против антигена (в Fab-форме) в PBS, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, как было измерено на спектрометре, таком как спектрофотометр, снабженный ограничителем потока (Aviv Instrumtnts), или на спектрофотометре SLM-Aminco серии 8000 (ThermoSpectronic), снабженном кюветой для перемешивания, содержащей красный краситель.
on
on
off
off
on
TM
TM
6
-1
-1
~
~
~
В одном из вариантов изобретения, «скорость ассоциации» («on-rate») или «k» согласно изобретению может быть также определена описанным выше методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore-2000 или BIAcore-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°С с использованием чипов СМ5 с иммобилизованным на них антигеном при величине единиц отклика (RU), составляющей 10. Вкратце, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщиков. Антиген разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, до 5 мкг/мл (0,2 мкМ), а затем инъецируют при скорости потока 5 мкл/минуту до достижения величины единиц отклика (RU) связанного белка, составляющей 10. После инъекции антигена, для блокирования не прореагировавших групп вводят 1М этаноламин. Для измерения кинетики реакции вводят инъекции двукратных серийных разведений Fab (0,78 нМ-500 нМ) в PBS, содержащем 0,05% твина 20 (PBST) при 25°С и при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорость ассоциации (k) и скорость диссоциации (k) вычисляют с использованием простой лангмюровской модели связывания 1:1 (BIAcore Evaluation Software version 3.2) при одновременном построении сенсорограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Kd) вычисляют как отношение k/k. См., например, Chen, Y., et al. (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. Если скорость ассоциации превышает 10 М·с, как было определено выше методом поверхностного плазмонного резонанса, то такая скорость ассоциации может быть определена методом гашения флуоресценции, который позволяет измерять увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентного излучения (возбуждение = 295 нм; излучение = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°С для 20 нМ антитела против антигена (в Fab-форме) в PBS, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, как было измерено на спектрометре, таком как спектрофотометр, снабженный ограничителем потока (Aviv Instrumtnts), или на спектрофотометре SLM-Aminco серии 8000 (ThermoSpectronic), снабженном кюветой для перемешивания.
Используемые в настоящем описании термины «по существу, пониженный» или «по существу, отличающийся» означают достаточно высокую степень различия между двумя численными величинами (обычно, между одной величиной, соответствующей антителу согласно изобретению, и другой величиной, соответствующей эталонному/сравниваемому антителу), а именно, такую степень различия, которая позволяла бы специалисту в данной области считать такое различие между этими двумя величинами статистически значимым с точки зрения их биологических свойств, определяемых указанными величинами (например, величинами Kd, НАМА-ответ). Различия между указанными двумя величинами составляет, предпочтительно, более, чем примерно 10%, более предпочтительно, более, чем примерно 20%, еще более предпочтительно, более, чем примерно 30%, еще более предпочтительно, более, чем примерно 40%, а наиболее предпочтительно, более, чем примерно 50% по сравнению с величинами эталонного/сравниваемого антитела.
Термин «антиген» означает предварительно определенный антиген, с которым может селективно связываться антитело. Антигеном-мишенью может быть полипептид, углевод, нуклеиновая кислота, липид, гаптен или другое природное или синтетическое соединение. Предпочтительным антигеном-мишенью является полипептид. Используемый в настоящем описании термин «акцепторная каркасная область человека» означает каркасную область, содержащую аминокислотную последовательность каркасной области VL или VH, происходящую от каркасной области иммуноглобулина человека, или от консенсусной каркасной области человека. Акцепторная каркасная область человека, «происходящая от» каркасной области иммуноглобулина человека или консенсусной каркасной области человека, может содержать одну и ту же аминокислотную последовательность, либо она может содержать аминокислотную последовательность с уже имеющимися изменениями. Если в аминокислотной последовательности уже имелись изменения, то предпочтительно, чтобы число таких изменений не превышало 5, предпочтительно, 4 или менее, или 3 или менее. Если аминокислотные изменения уже присутствовали в VH, то предпочтительно, чтобы эти изменения были только в трех, двух или в одном из положений 71H, 73H и 78H; так, например, аминокислотными остатками в этих положениях могут быть 71A, 73T и/или 78A. В одном из вариантов изобретения, акцепторная каркасная область VL человека идентична последовательности каркасной области VL иммуноглобулина человека или консенсусной каркасной последовательности человека.
in vitro
Антитела согласно изобретению могут конкурировать за связывание с тем же эпитопом, с которым связывается «второе» антитело. Считается, что моноклональные антитела связываются с «с одним и тем же эпитопом», если каждое антитело блокирует связывание другого антитела на 40% или выше при той же концентрации антитела в стандартном анализе на конкурентное связывание антител .
«Консенсусная каркасная область человека» представляет собой каркасную область, которая содержит наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки, используемые при выборе каркасных последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека. Обычно, последовательности VL или VH иммуноглобулина человека выбирают из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. В основном, подгруппа последовательностей определяется по Kabat и др. В одном из вариантов изобретения, для VL, такой подгруппой является подгруппа каппа I по Kabat и др. В одном из вариантов изобретения, для VH, такой подгруппой является подгруппа III по Kabat и др.
«Консенсусная каркасная область VH подгруппы III» содержит консенсусную последовательность, выделенную из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи подгруппы III по Kabat и др.
«Консенсусная каркасная область VL подгруппы I» содержит консенсусную последовательность, выделенную из аминокислотных последовательностей вариабельной легкой цепи каппа подгруппы I по Kabat и др.
«Немодифицированная каркасная область человека» представляет собой каркасную область человека, имеющую такую же аминокислотную последовательность, как и акцепторная каркасная область человека, например, в ней отсутствуют замены аминокислот человека на нечеловеческие аминокислоты, как и в акцепторной каркасной области человека.
Используемый в настоящем описании термин «модифицированная гипервариабельная область» означает гипервариабельную область, содержащую одну или несколько (например, от одной и примерно до 16) аминокислотных замен.
Используемый в настоящем описании термин «немодифицированная гипервариабельная область» означает гипервариабельную область, имеющую такую же аминокислотную последовательность, как и последовательность нечеловеческого антитела, от которого она происходит, то есть, последовательность, не содержащую одной или нескольких аминокислотных замен.
,
Используемые в настоящем описании термины «гипервариабельная область», «HVR», «HV» или «CDR» означают области вариабельного домена антитела, которые являются в данной последовательности гипервариабельными и/или образуют петли определенной структуры. В общих чертах, указанные антитела содержат шесть гипервариабельных областей; три области в VH (CDR-Н1, CDR-Н2, CDR-Н3) и три области в VL (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). В настоящей заявке используется ряд гипервариабельных областей, который входит в объем настоящего изобретения. Гипервариабельные области (комплементарность-определяющие области (CDR)) по Kabat обладают высокой степенью вариабельности последовательности и находят широкое применение (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Вместо определения гипервариабельных областей по Kabat, Chothia предложил определять гипервариабельные области по локализации структурных петель (Chothia & Lesk, J. Mol.Biol. 196:901-917 (1987)). «Контактные» гипервариабельные области определяют исходя из анализа имеющихся сложных кристаллических структур. Остатки каждой из этих гипервариабельных областей приводятся ниже. Если это не оговорено особо, то используется нумерация по Kabat. Гипервариабельные области расположены, в основном, в следующих положениях: аминокислот 24-34 (CDR-L1), аминокислот 49-56 (CDR-L2), аминокислот 89-97 (CDR-L3), аминокислот 26-35А (CDR-Н1), аминокислот 49-65 (CDR-Н2) и аминокислот 93-102 (CDR-Н3).
Гипервариабельные области могут также содержать «удлиненные гипервариабельные области», а именно: в положениях аминокислот 24-36 (L1) и аминокислот 46-56 (L2) в VL. Остатки вариабельных доменов пронумерованы по системе нумерации Kabat и др., см. выше, для каждого из представленных определений.
«Каркасными» или «FR» остатками являются остатки вариабельных доменов, за исключением остатков гипервариабельных областей, определенных выше.
«Антитело человека» представляет собой антитело, имеющее аминокислотную последовательность, которая соответствует аминокислотной последовательности антитела, продуцируемого у человека, и/или полученного любым из методов продуцирования антител человека, описанных в настоящей заявке. Это определение антитела человека, в частности, исключает гуманизированное антитело, содержащее антигенсвязывающие остатки нечеловеческого антитела.
.
.
Gene
“Аффинно зрелым” антителом является антитело, имеющее одну или несколько модификаций в одной или нескольких CDR, где указанные модификации приводят к повышению аффинности антитела к антигену, по сравнению с родительским антителом, которое не имеет такую(их) модификацию(ий). Предпочтительные аффинно зрелые антитела имеют наномолярные или даже пикомолярные аффинности к антигену-мишени. Аффинно зрелые антитела получают методами, известными специалистам. В публикации Marks et alBio/Technology 10:779-783 (1992) описано созревание аффинности посредством перестановки доменов VH и VL. Неспецифический мутагенез CDR и/или каркасных остатков описан в публикациях Barbas et alProc Nat. Acad. Sci, USA91:3809-3813 (1994); Schier et al.169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol.155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol.154(7):3310-9 (1995); и Hawkins et al., J. Mol. Biol.226:889-896 (1992).
«Блокирующее» антитело или «антитело-антагонист» представляет собой антитело, ингибирующее или снижающее биологическую активность антигена, с которым оно связывается. Предпочтительные блокирующие антитела или антитела-антагонисты, в основном, или полностью ингибируют биологическую активность антигена.
«TAT-связывающий олигопептид» представляет собой олигопептид, который связывается, предпочтительно, специфически, с полипептидом TAT, описанным в настоящей заявке. TAT-связывающие олигопептиды могут быть химически синтезированы стандартным методом синтеза олигопептидов, либо они могут быть получены и очищены рекомбинантным способом. TAT-связывающие олигопептиды обычно имеют длину по меньшей мере примерно 5 аминокислот, альтернативно, по меньшей мере примерно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 аминокислот или более, где указанные олигопептиды обладают способностью связываться, предпочтительно, специфически, с описанным в настоящем описании полипептидом TAT. TAT-связывающие олигопептиды могут быть идентифицированы хорошо известными методами без излишнего экспериментирования. В соответствии с этим, следует отметить, что методы скрининга олигопептидных библиотек на олигопептиды, способные специфически связываться с полипептидом-мишенью, хорошо известны специалистам (см., например, патенты США No 5556762, 5750373, 4708871, 4833092, 5223409, 5403484, 5571689, 5663143; публикации заявок PCT WO 84/03506 и WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol, 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol, 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, and Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol, 2:668).
«TAT-связывающая органическая молекула» представляет собой органическую молекулу, которая отличается от определенного в настоящем описании олигопептида или антитела, и которая связывается, предпочтительно, специфически, с полипептидом TAT, описанным в настоящей заявке. TAT-связывающие органические молекулы могут быть идентифицированы и химически синтезированы известным методом (см., например, публикации заявок PCT NN. WO00/00823 и WO00/39585). TAT-связывающие органические молекулы обычно имеют размер менее, чем примерно 2000 дальтон, альтернативно, менее, чем примерно 1500, 750, 500, 250 или 200 дальтон, где указанные органические молекулы, обладающие способностью связываться, предпочтительно, специфически, с описанным в настоящем описании полипептидом TAT, могут быть идентифицированы хорошо известными методами без излишнего экспериментирования. В соответствии с этим, следует отметить, что методы скрининга библиотек органических молекул на молекулы, способные специфически связываться с полипептидом-мишенью, хорошо известны специалистам (см., например, публикации заявок PCT WO00/00823 и WO00/39585).
-4
-5
-6
-7
-8
-9
-10
-11
-12
Антитело, олигопептид или другая органическая молекула, которые “связываются” с представляющим интерес антигеном, например, с опухолеассоциированным полипептидным антигеном-мишенью, представляют собой антитело, олигопептид или другую органическую молекулу, связывающиеся с антигеном с аффинностью, которая является достаточной для того, чтобы это антитело, этот олигопептид или другую органическую молекулу можно было использовать в качестве диагностического и/или терапевтического средства для доставки в клетку или в ткань, экспрессирующую этот антиген, и чтобы это антитело, олигопептид или другая органическая молекула не обладали бы значительной перекрестной реактивностью с другими белками. В указанных вариантах осуществления изобретения, уровень связывания антитела, олигопептида или другой органической молекулы с белком, который «не является мишенью», составляет менее, чем примерно 10% от уровня связывания антитела, олигопептида или другой органической молекулы с его конкретным белком-мишенью, как было определено с помощью анализа, проводимого с применением клеточного сортинга с активацией флуоресценции (FACS) или радиоиммунопреципитации (РИА). Что касается связывания антитела, олигопептида или другой органической молекулы с молекулой-мишенью, то термин «специфически связывающееся с» или «специфически связывается с» конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде-мишени или «является специфичным к» этому конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени означает, что такое связывание антитела значительно отличается от неспецифического взаимодействия. Специфическое связывание может быть измерено, например, путем определения уровня связывания молекулы по сравнению с уровнем связывания контрольной молекулы, которая, по существу, представляет собой молекулу, имеющую аналогичную структуру, но не обладающую связывающей активностью. Так, например, специфическое связывание может быть определено путем оценки конкурентного связывания с контрольной молекулой, которая является аналогичной данной мишени, например, по избытку немеченой мишени. В этом случае, специфическое связывание обнаруживается в том случае, когда связывание меченой мишени с зондом конкурентно ингибируется избытком немеченой мишени. Используемый в настоящем описании термин «специфически связывающееся с» или «специфически связывается с» конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде-мишени или «является специфичным к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени может, например, означать, что данная молекула имеет Kd по отношению к мишени по меньшей мере примерно 10 M, альтернативно, по меньшей мере примерно 10 M, альтернативно, по меньшей мере примерно 10 M, альтернативно, по меньшей мере примерно 10 M, альтернативно, по меньшей мере примерно 10 M, альтернативно, по меньшей мере примерно 10 M, альтернативно, по меньшей мере примерно 10 M, альтернативно, по меньшей мере примерно 10 M, альтернативно, по меньшей мере примерно 10 M, или более. В одном из вариантов изобретения, термин «специфическое связывание» означает связывание, при котором молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде, но, в основном, не связывается с любым другим полипептидом или полипептидным эпитопом.
in vivo
in vivo
Антитело, олигопептид или другая органическая молекула, которые «ингибируют рост опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид TAT» или «рост-ингибирующие» антитело, олигопептид или другая органическая молекула представляет собой антитело, олигопептид или другую органическую молекулу, которые значимо ингибируют рост раковых клеток, экспрессирующих или сверхэкспрессирующих соответствующий полипептид TAT. Полипептидом TAT может быть трансмембранный полипептид, экспрессируемый на поверхности раковых клеток, либо им может быть полипептид, продуцируемый и секретируемый раковыми клетками. Предпочтительные рост-ингибирующие анти-TAT антитела, олигопептиды или органические молекулы ингибируют рост TAT-экспрессирующих опухолевых клеток более, чем на 20%, предпочтительно, примерно на 20%-50%, а еще более предпочтительно, более, чем на 50% (примерно на 50%-100%), по сравнению с соответствующим контролем, который обычно представляет собой опухолевые клетки, не обработанные тестируемым антителом, олигопептидом или другой органической молекулой. В одном из вариантов изобретения, ингибирование роста может быть измерено при концентрации антитела, составляющей примерно 0,1-30 мкг/мл или примерно 0,5 нм-200 нМ в клеточной культуре, где указанное ингибирование роста определяют через 1-10 дней после обработки опухолевых клеток антителом. Ингибирование роста опухолевых клеток  может быть определено различными методами, описанными ниже в разделе «Экспериментальные примеры». Указанное антитело ингибирует рост , если введение анти-TAT антитела в количестве примерно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг массы тела приводит к снижению размера опухоли или уровня пролиферации опухолевых клеток в течение периода времени примерно от 5 дней до 3 месяцев, предпочтительно, примерно 5-30 дней с момента первого введения антитела.
Антитело, олигопептид или другая органическая молекула, которые «индуцируют апоптоз», представляют собой антитело, олигопептид или другую органическую молекулу, которые индуцируют запрограммированную клеточную гибель, как было определено по связыванию с аннексином V, фрагментации ДНК, сморщиванию клеток, расширению эндоплазматического ретикулума, фрагментации клеток и/или по образованию мембранных везикул (называемых апоптотическими тельцами). Такой клеткой обычно является клетка, сверхэкспрессирующая полипептид ТАТ. Предпочтительной клеткой являются опухолевые клетки, например, клетки предстательной железы, молочной железы, яичника, желудка, эндометрия, легких, почек, толстой кишки, мочевого пузыря. Для оценки клеточных событий, связанных с апоптозом, существуют различные методы. Так, например, транслокация фосфатидилсерина (PS) может быть определена по связыванию с аннексином; фрагментация ДНК может быть оценена по образованию ДНК-лэддера; а конденсация ядра/хроматина вместе с фрагментацией ДНК может быть оценена по любому увеличению гиподиплоидных клеток. Предпочтительно, антителом, олигопептидом или другой органической молекулой, индуцирующими апоптоз, являются антитело, олигопептид или другая органическая молекула, которые, в анализе на связывание с аннексином обнаруживают, предпочтительно, примерно 2-50-кратное, предпочтительно, примерно 5-50-кратное, а наиболее предпочтительно, примерно 10-50-кратное индуцирование связывания с аннексином по сравнению с необработанными клетками.
Термин «эффекторные функции» антитела означает биологические активности, приписываемые Fc-области (Fc-области с нативной аминокислотной последовательностью или Fc-области с измененной аминокислотной последовательностью) антитела, и варьирующиеся в зависимости от изотипа антитела. Примерами эффекторных функций антител являются: связывание с C1q и комплемент-зависимая цитотоксичность; связывание с Fc-рецептором; антитело-зависимая клеточно-опосредуемая цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; ингибирование функции рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора); и активация В-клеток.
in vitro
in vivo
«Антитело-зависимая клеточно-опосредуемая цитотоксичность» или «ADCC» означает форму цитотоксичности, при которой секретируется Ig, связанный с Fc-рецепторами (FcR), присутствующими на некоторых цитотоксических клетках (например, на природных клетках-киллерах (NK), нейтрофилах и макрофагах), что позволяет этим цитотоксическим эффекторным клеткам специфически связываться с антиген-несущими клетками-мишенями и тем самым уничтожать эти клетки-мишени под действием цитотоксинов. Эти антитела «вооружают» цитотоксические клетки и являются абсолютно необходимыми для такого уничтожения. Первичные клетки, опосредующие ADCC, то есть, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Данные, полученные для экспрессии FcR на гемопоэтических клетках, систематизированы в таблице 3 на странице 464 в публикации Ravetch & Kinet Annu. Rev. Immunol. (1991) 9:457-92. Для оценки ADCC-активности представляющей интерес молекулы может быть проведен анализ на ADCC , такой как анализ, описанный в патентах США № 5500362 или 5821337. Эффекторными клетками, подходящими для таких анализов, являются мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и природные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно, ADCC-активность представляющей интерес молекулы может быть оценена , например, на модели животного, такой как модель, описанная Clynes et al. (USA), 95:652-656 (1998).
Термины «Fc-рецептор» или «FcR» используются для описания рецептора, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является FcR человека с нативной последовательностью. Кроме того, предпочтительным FcR является FcR, который связывается с антителом IgG (гамма-рецептор), и рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. Рецепторами FcγRII являются FcγRIIA (“активирующий рецептор”) и FcγRIIB (“ингибирующий рецептор”), которые имеют аналогичные аминокислотные последовательности, отличающиеся, главным образом, своими цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит в своем цитоплазматическом домене активирующий мотив иммунорецептора на основе тирозина (ITAM). Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит в своем цитоплазматическом домене ингибирующий мотив иммунорецептора на основе тирозина (ITIM). (см. обзор М. Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). FcR описаны в публикациях Ravetch & Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994) и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Используемый в настоящем описании термин “FcR” также охватывает и другие FcR, включая FcR, которые будут идентифицированы в будущем. Этот термин также включает рецептор, имеющийся у новорожденных, FcRn, который является ответственным за передачу материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)).
«Эффекторные клетки человека» представляют собой лейкоциты, экспрессирующие один или несколько FcR и обладающие эффекторными функциями. Предпочтительно, указанные клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и обладают эффекторной ADCC-функцией. Примерами лейкоцитов человека, опосредующих ADCC, являются мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), природные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; при этом, предпочтительными являются МКПК и NK-клетки. Эффекторные клетки могут быть выделены из их природного источника, например, из крови.
«Комплемент-зависимая цитотоксичность» или «CDC» означает лизис клеток-мишеней в присутствии комплемента. Активация классического пути комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (соответствующего подкласса), которые связываются с их когнатным антигеном. Для оценки активации комплемента может быть проведен анализ на CDC, например, как описано Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).
Используемые в настоящем описании термины «рак» и «раковый» относятся к физиологическому состоянию млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примерами раковых заболеваний являются, но не ограничиваются ими, карцинома, лимфома, бластома, саркома и лейкоз или лимфоидные злокачественные заболевания. Более конкретными примерами таких раковых заболеваний являются плоскоклеточный рак (например, эпителиальный плоскоклеточный рак), рак легких, включая мелкоклеточный рак легких, не мелкоклеточный рак легких, аденокарцинома легких и плоскоклеточная карцинома легких; рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка или кишечника, включая, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы; глиобластома; рак шейки матки; рак яичника; рак печени; рак мочевого пузыря; рак мочевых путей;, гепатома; рак молочной железы; рак толстой кишки; рак прямой кишки; рак прямой и ободочной кишки; карцинома эндометрия или матки; карцинома слюнных желез; рак почек; рак предстательной железы; рак вульвы; рак щитовидной железы; карцинома печени; карцинома заднего прохода; карцинома пениса; меланома; множественная миелома и В-клеточная лимфома; рак головного мозга, а также рак головы и шеи и связанные с ними метастазы.
Термины «клеточно-пролиферативное расстройство» и «пролиферативное расстройство» означают расстройства, связанные с определенной степенью аномальной пролиферации клеток. В одном из вариантов изобретения, указанным клеточно-пролиферативным расстройством является рак.
Используемый в настоящем описании термин «опухоль» означает все неопластические клетки, подвергающиеся росту и пролиферации, независимо от того, являются ли они доброкачественными или злокачественными, и все предраковые и раковые клетки и ткани.
in vitro
Антителом, олигопептидом или другой органической молекулой, которые «индуцируют гибель клеток», являются антитело, олигопептид или другая органическая молекула, которые превращают жизнеспособные клетки в нежизнеспособные. Такими клетками являются клетки, экспрессирующие полипептид TAT, предпочтительно, клетки, которые, по сравнению с нормальными клетками ткани того же типа, сверхэкспрессируют полипептид TAT. Полипептидом TAT может быть трансмембранный полипептид, экспрессируемый на поверхности раковых клеток, либо им может быть полипептид, продуцируемый и секретируемый раковыми клетками. Предпочтительной клеткой является раковая клетка, например, клетка молочной железы, яичника, желудка, эндометрия, слюнных желез, легких, почек, толстой кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы или мочевого пузыря. Гибель клеток  может быть определена в отсутствии комплемента и иммунных эффекторных клеток для идентификации гибели клеток, индуцированной антитело-зависимой клеточно-опосредуемой цитотоксичностью (ADCC) или комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC). Таким образом, анализ на гибель клеток может быть осуществлен с использованием термоинактивированной сыворотки (то есть, в отсутствии комплемента) и в отсутствии иммунных эффекторных клеток. Способность антитела, олигопептида или другой органической молекулы индуцировать гибель клеток, может быть определена по потере целостности их мембраны, оцениваемой по поглощению ими иодида пропидия (PI), трипанового синего (см. Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)) или 7AAD по сравнению с необработанными клетками. Предпочтительными антителами, олигопептидами или другими органическими молекулами, индуцирующими гибель клеток, являются антитела, индуцирующие поглощение PI в анализе на поглощение PI в клетках BT474.
in situ
in vivo
«TAT-экспрессирующей клеткой» является клетка, которая экспрессирует эндогенный или трансфицированный полипептид TAT на клеточной поверхности или в секретируемой форме. «TAT-экспрессирующая раковая опухоль», представляет собой раковую опухоль, содержащую клетки, которые имеют на своей поверхности полипептид TAT или продуцируют и секретируют полипептид TAT. «TAT-экспрессирующая раковая опухоль», продуцирует, но необязательно, достаточные уровни полипептида TAT на клеточной поверхности, что позволяет анти-TAT антителу, олигопептиду или другой органической молекуле связываться с этим полипептидом и оказывать терапевтическое действие на раковую опухоль. В другом варианте осуществления изобретения, «TAT-экспрессирующая раковая опухоль» продуцирует и секретирует, но необязательно, достаточные уровни полипептида TAT, которые позволяют анти-TAT антителу-антагонисту, олигопептиду-антагонисту или другой органической молекуле-антагонисту связываться с этим полипептидом и оказывать терапевтическое действие на раковое заболевание. В последнем случае, указанным антагонистом может быть антысмысловой олигонуклеотид, который ослабляет, ингибирует или предупреждает продуцирование и секрецию секретируемого полипептида TAT опухолевыми клетками. Раковой опухолью, которая «сверхэкспрессирует» полипептид TAT, является опухоль, которая имеет значительно более высокие уровни полипептида TAT на клеточной поверхности, или продуцирует и секретирует более высокие уровни этого полипептида по сравнению с не-раковыми клетками тканей того же типа. Такая сверхэкспрессия может быть вызвана амплификацией гена или повышением уровня транскрипции или трансляции. Сверхэкспрессия полипептида TAT может быть определена с помощью диагностического или прогностического анализа путем оценки повышения уровней белка TAT, присутствующего на поверхности клетки или секретируемого клеткой (например, с помощью иммуногистохимического анализа с использованием анти-TAT антител, продуцируемых против выделенного полипептида TAT, который может быть получен методами рекомбинантных ДНК из выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид TAT; FACS-анализа и т.п.). Альтернативно или дополнительно, уровни нуклеиновой кислоты или мРНК, кодирующей полипептид TAT, в клетках могут быть измерены посредством флуоресцентной гибридизации  с использованием нуклеиновокислотного зонда, соответствующего TAT-кодирующей нуклеиновой кислоте или ее комплементу (FISH; см. заявку WO98/45479, опубликованную в октябре 1998), с помощью саузерн-блот-анализа, нозерн-блот-анализа или методами на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), такой как количественная ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР). Может быть также проведен анализ на сверхэкспрессию полипептида TAT путем измерения уровня «слущивания» антигена в биологическую жидкость, такую как сыворотка, например, с помощью анализов на основе антител (см. также, например, патент США No. 4933294, выданный 12 июня 1990; заявку WO91/05264, опубликованную 18 апреля 1991; патент США № 5401638, выданный 28 марта 1995; и Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)). Помимо вышеописанных анализов, специалистами в данной области могут быть проведены различные анализы . Так, например, клетки в организме пациента могут быть подвергнуты контактированию с антителом, которое помечено, но необязательно, детектируемой меткой, например, радиоактивным изотопом, а связывание антитела с клеткой данного пациента может быть оценено, например, путем внешнего сканирования на радиоактивность или путем анализа биоптата, взятого у пациента, которому было введено это антитело.
Используемый в настоящем описании термин «иммуноадгезин» означает антитело-подобные молекулы, которые обладают специфичностью связывания гетерологичного белка («адгезина») и эффекторными функциями константных доменов иммуноглобулина. По своей структуре, иммуноадгезины содержат гибрид аминокислотной последовательности, обладающей нужной специфичностью связывания, но не являющейся антиген-распознающей последовательностью и антигенсвязывающим сайтом антитела (то есть, является «гетерологичной»), и последовательности константного домена иммуноглобулина. Адгезиновая часть молекулы иммуноадгезина обычно представляет собой непрерывную аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере сайт связывания с рецептором или лигандом. Последовательность константного домена иммуноглобулина в иммуноадгезине может происходить от любого иммуноглобулина, такого как иммуноглобулин подтипов IgG-1, IgG-2, IgG-3, или IgG-4, IgA (включая IgA-1 и IgA-2), IgE, IgD или IgM.
Используемый в настоящем описании термин «метка» означает детектируемое соединение или композицию, которые непосредственно или опосредованно конъюгированы с антителом, олигопептидом или другой органической молекулой, так, чтобы они образовывали «меченое» антитело, «меченый» олигопептид или другую «меченую» органическую молекулу. Такая метка, сама по себе, может быть детектируемой (например, метки-радиоизотопы или флуоресцентные метки), или, в случае ферментативной метки, она может катализировать химическую модификацию соединения-субстрата или композицию, которая является детектируемой.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
Используемый в настоящем описании термин «цитотоксическое средство» означает вещество, которое ингибирует или предотвращает функционирование клеток и/или вызывает деструкцию клеток. Этот термин включает радиоактивные изотопы (например, At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, Р и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические средства, ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты, антибиотики и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины, происходящие от бактерий, грибов, растений или животных, включая их фрагменты и/или варианты, и различные противоопухолевые или противораковые средства, описанные ниже. Другие цитотоксические средства описаны ниже. Опухолецидное средство вызывает деструкцию опухолевых клеток.
M
TM
Термин «химиотерапевтическое средство» означает химическое соединение, которое может быть использовано для лечения рака. Примерами химиотерапевтических средств являются алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид CYTOXAN; алкисульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (в частности, буллатацин и буллатацинон); дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARINOL); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновая кислота; камптотецин (включая синтетический аналог топотекан) (HYCAMTIN), CPT-11 (иринотекан, CAMPTOSAR); ацетилкамптотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его адозелезиновые, карзелезиновые и бизелезиновые синтетические аналоги); подофиллотоксин; подофиллиновая кислота; тенипозид; криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая его синтетические аналоги, KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотные аналоги горчичного газа, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорофосфамид, экстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид оксида мехлоретамина, мелфалан, новембицин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый аналог горчичного газа; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, в частности, калихеамицин гамма1I и калихеамицин омегаI1 (см., например, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; эсперамицин, а также неокарзиностатиновый хромофор и родственные хромопротеиновые энедииновые антибиотики-хромофоры), аклациномизины, актиномицин, антрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицины, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин ADRIAMYCIN (включая морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, келамицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин и зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин и триметрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн и тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин и флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан и тестолактон; антиадренергические средства, такие как аминоглютетимид, митотан и трилостан; средство, восполняющее недостаток фолиевой кислоты, такое как фролиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демекольцин; диазиквон; эльфорнитин; ацетат эллиптиния; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и анзамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенаузоновая кислота; триазихон; 2,2',2”-трихлортриэтиламин; трихотецены (в частности, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин (ELDISINE; FILDISINE); дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (“Ara-C”); тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел TAXOL (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), не содержащий кремофора ABRAXANET, сконструированный на основе альбумина препарат, состоящий из наночастиц паклитаксела (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), и доксетаксел TAXOTERE (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин (GEMZAR); 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин (VELBAN); платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин (ONCOVIN); оксалиплатин; лейкововин; винорелбин (NAVELBINE); новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (ДМФО); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин (XELODA); фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные всех вышеуказанных соединений, а также комбинации двух или более вышеуказанных соединений, таких как СНОР, где указанное сокращение означает циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизолон, используемые в комбинированной терапии, и FOLFOX, где указанное сокращение означает оксалиплатин (ELOXATIN) в комбинации с 5-FU и лейкововином, применяемые в терапии.
В определение этого термина также входят антигормональные средства, регулирующие, ослабляющие, блокирующие или ингибирующие действие гормонов, которые могут стимулировать рост раковой опухоли, и эти средства часто применяются для системной или общей терапии. Такими средствами могут быть сами гормоны. В качестве примеров могут служить антиэстрогены и селективные модуляторы рецептора эстрогена (SERM), включая, например, тамоксифен (включая тамоксифен NOLVADEX), ралоксифен EVISTA, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен FARESTON; антипрогестероны; ингибиторы рецептора эстрогена (ERD); средства, которые подавляют или ингибируют функции яичника, например, агонисты релизинг-фактора лютенизирующего гормона (LHRH), такие как LUPRON и ацетат лейпролида ELIGARD, ацетат гозерелина, ацетат бузерелина и триптерилин; другие антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалутамид, и ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу и регулируют продуцирование эстрогенов в коре надпочечника, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, ацетат мегестрола MEGASE, эксеместан AROMASIN, форместанин, фадрозол, ворозол RIVISOR, летрозол FEMARA и анастрозол ARIMIDEX. Кроме того, в определение химиотерапевтических средств входят бисфосфонаты, такие как клодронат (например, BONEFOS или OSTAC), этидронат DIDROCAL, NE-58095, золидроновая кислота/золедронат ZOMETA, алендронат FOSAMAX, памидронат AREDIA, тилудронат SKELID или ризедронат ACTONEL, а также троксацитабин (нуклеозидный цитозиновый аналог 1,3-диоксолана); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности, олигонуклеотиды, ингибирующие экспрессию генов путей передачи сигнала, участвующих в пролиферации нежелательных клеток, таких как, например, PKC-альфа, Ralf и H-Ras, и рецептор эпидермального фактора роста (EGF-R); вакцины, такие как вакцина THERATOPE, и вакцина для генной терапии, например, вакцина ALLOVECTIN, вакцина LEUVECTIN и вакцина VAXID; ингибиторы топоизомеразы 1 LURTOTECAN; rmRH ABARELIX; дитозилат лапатиниба (низкомолекулярный двойной ингибитор тирозинкиназы ErbB-2 и EGFR, известный как GW572016); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные всех вышеперечисленных соединений.
in vitro
in vivo
Используемый в настоящем описании термин «рост-ингибирующее средство» означает соединение или композицию, ингибирующие рост клеток, в частности, раковых клеток, экспрессирующих TAT, либо , либо . Таким образом, средством, ингибирующим рост клеток, может быть средство, значительно снижающее процент клеток, экспрессирующих TAT, в фазе S. Примерами средств, ингибирующих рост клеток, являются средства, блокирующие прохождение клеточного цикла (в другой фазе, кроме фазы S), такие как средства, индуцирующие блокирование фазы G1 и фазы М. Классическими средствами, блокирующими фазу М, являются винкаалкалоиды (винкристин и винбластин), таксаны и ингибиторы топоизомеразы II, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Средствами, блокирующими фазу G1, а также блокирующими переход в фазу S, являются, например, ДНК-алкилирующие средства, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлоретамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ara-C. Дополнительную информацию можно найти в публикации The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn & Israel, eds., Chapter 1, entitled “Cell cycle regulation, oncogenes and antineoplastic drugs”, Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), а в частности, на стр.13. Таксаны (паклитаксел и доцетаксел) представляют собой противораковые лекарственные средства, получаемые из дерева тис. Доцетаксел (TAXOTERE, Rhone-Poulenc Rorer), получаемый из Европейского тиса, представляет собой полусинтетический аналог паклитаксела (TAXOL, Bristol-Myers Squibb). Паклитаксел и доцетаксел индуцируют сборку микротрубочек из тубулиновых димеров и стабилизируют микротрубочки путем предупреждения деполимеризации, что приводит к ингибированию митоза клеток.
“Доксорубицин” представляет собой антрациклиновый антибиотик. Доксорубицин имеет полное химическое название (8S-цис)-10-[(3-амино-2,3,6-тридезокси-α-L-ликсо-гексапиранозил)окси]-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-8-(гидроксиацетил)-1-метокси-5,12-нафтацендион.
Термин “цитокин” является общим термином, относящимся к белкам, которые высвобождаются одной клеточной популяцией и которые действуют на другие клетки как межклеточные медиаторы. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины и стандартные полипептидные гормоны. Помимо вышеуказанных определений, понятие “цитокины” также включает гормоны роста, такие как гормон роста человека, N-метионильный гормон роста человека и бычий гормон роста; паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреоид-стимулирующий гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); фактор роста гепатоцитов, фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген; фактор некроза опухоли-α и -β; мюллеровский ингибирующий фактор; пептид, связанный с гонадотропином мыши; ингибин; активин; васкулярный эндотелиальный фактор роста; интегрин; тромбопоэтин (ТРО); факторы роста нервных тканей, такие как NGF-β; тромбоцитарный фактор роста; трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF-α и TGF-β; инсулиноподобный фактор роста-I и -II; эритропоэтин (EPO); факторы, индуцирующие остеогенез; интерфероны, такие как интерферон-α, -β и -γ; колониестимулирующие факторы (CSF), такие как макрофагальный CSF (M-CSF); гранулоцитарный-макрофагальный CSF (GM-CSF); и гранулоцитарный CSF (G-CSF); интерлейкины (IL), такие как IL-1, IL-1а, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; фактор некроза опухоли, такой как TNF-α или TNF-β; и другие полипептидные факторы, включая LIF и лиганд kit (KL). Используемый в настоящем описании термин “цитокин” включает белки, происходящие от природных источников или от рекомбинантной клеточной культуры, и биологически активные эквиваленты цитокинов с нативной последовательностью.
Используемый в настоящем описании термин «вкладыш в упаковку» означает инструкции, которые обычно вложены в предназначенные для продажи упаковки терапевтических продуктов, и в которых имеется информация, касающаяся показаний, способа применения, дозы, способа введения, противопоказаний и/или предупреждений относительно применения таких терапевтических продуктов.
II. Композиции и способы согласно изобретению
Анти-TAT антитела
A.
В одном из своих вариантов осуществления, настоящее изобретение относится к анти-TAT антителам, которые могут быть применены в настоящем описании в качестве терапевтических и/или диагностических средств. Характерными антителами являются поликлональные, моноклональные, гуманизированные, биспецифические и гетероконъюгированные антитела.
1. Поликлональные антитела
2
1
1
Поликлональные антитела, предпочтительно, вырабатываются у животных после множества подкожных (s.c.) или внутрибрюшинных (i.p.) инъекций соответствующего антигена и адъюванта. Они могут использоваться для конъюгирования соответствующего антигена (в частности, если используются синтетические пептиды) с белком, который является иммуногенным для видов, подвергаемых иммунизации. Так, например, указанный антиген может быть конъюгирован с гемоцианином лимфы улитки (KLH), сывороточным альбумином, бычьим тироглобулином или соевым ингибитором трипсина с использованием бифункционального или дериватизирующего средства, например, малеимидобензоилсульфосукцинимидоэфира (конъюгированного посредством цистеиновых остатков), N-гидроксисукцинимида (посредством лизиновых остатков), глутаральдегида, ангидрида янтарной кислоты, SOCl или RN=C=NR, где R и R представляют собой различные алкильные группы.
Животных иммунизируют антигеном, иммуногенными конъюгатами или их производными путем объединения, например, 100 мкг или 5 мкг белка или конъюгата (для кроликов или мышей, соответственно) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и путем подкожной инъекции раствора во множество участков. Через месяц, животных повторно иммунизируют во множество участков путем подкожной инъекции 1/5-1/10 от первоначального количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда. Через 7-14 дней, у животных берут кровь и анализируют сыворотку на титр антител. Затем животных повторно иммунизируют до достижения плато титра. Конъюгаты могут быть также получены в рекомбинантной клеточной культуре в виде гибридных белков. Кроме того, для усиления иммунного ответа могут быть также использованы агрегирующие средства, такие как квасцы.
2. Моноклональные антитела
Моноклональные антитела могут быть получены с применением гибридомной технологии, впервые описанной Kohler et al. Nature, 256:495 (1975), либо они могут быть получены методами рекомбинантных ДНК (патент США № 4816567).
in vitro
Для получения гибридом, мышь или другое подходящее животное-хозяин, такое как хомячок, иммунизируют как описано выше, для вырабатывания у них лимфоцитов, продуцирующих или способных продуцировать антитела, специфически связывающиеся с белком, используемым для иммунизации. Альтернативно, лимфоциты могут быть иммунизированы . После иммунизации, лимфоциты выделяют и подвергают слиянию с миеломной клеточной линией с использованием подходящего средства для слияния, такого как полиэтиленгликоль, в результате чего образуются гибридомные клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
Полученные таким образом гибридомные клетки высевают и культивируют в подходящей культуральной среде, которая, предпочтительно, содержит одно или несколько веществ, ингибирующих рост или выживание не-слитых родительских миеломных клеток (также называемых «партнером по слиянию»). Так, например, если родительские миеломные клетки не содержат фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (HGPRT или HPRT), то селективная культуральная среда для получения гибридом обычно включает гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда НАТ), то есть, вещества, предупреждающие рост HGPRT-дефицитных клеток.
Предпочтительыми миеломными клетками, называемыми партнерами по слиянию, являются клетки, которые способны подвергаться эффективному слиянию и поддерживать стабильное продуцирование высоких уровней антител указанными выбранными антитело-продуцирующими клетками, и являются чувствительными к селективной среде, на которой проводят отбор на неслитые родительские клетки. Педпочтительными миеломными клеточными линиями являются миеломные линии мыши, такие как клеточные линии, происходящие от клеток опухолей мыши МОРС-21 и МРС-11, имеющихся в институте Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, и клетки SP-2 и их производные, например, клетки X63-Ag8-653, имеющиеся в Американской коллекции типовых культур, Manassas, Virginia, USA. Для продуцирования моноклональных антител человека также используются миеломные клеточные линии человека и гетеромиеломные клеточные линии “мышь-человек” (Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984) & Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
in vitro
Культуральную среду для роста гибридомных клеток анализируют на продуцирование моноклональных антител против антигена. Специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых гибридомными клетками, определяют, предпочтительно, путем иммунопреципитации или путем проведения  анализа на связывание, такого как радиоиммуноанализ (РИА) или твердофазный иммунноферментный анализ (ELISA).
Аффинность связывания моноклонального антитела может быть, например, определена с помощью анализа Скэтчарда, описанного Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
in vivo
После идентификации гибридомных клеток, которые продуцируют антитела с нужной специфичностью, аффинностью и/или активностью, клоны могут быть субклонированы путем проведения процедур лимитирующего разведения и культивированы стандартными методами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Подходящими культуральными средами, предназначенными для достижения данной цели, являются, например, среда D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, гибридомные клетки могут быть выращены  в качестве асцитных опухолей у животных, например, путем i.p. инъекции этих клеток мышам.
Моноклональные антитела, секретированные субклонами, соответствующим образом выделяют из культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки путем проведения стандартных процедур очистки антител, таких как, например, аффинная хроматография (например, на белке А или на G-белке-сефарозе), или ионнообменная хроматография, хроматография на гидроксиапатитах, гель-электрофорез, диализ и т.п.
E.coli
ДНК, кодирующая моноклональные антитела, может быть легко выделена и секвенирована в соответствии со стандартными процедурами (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антител мыши). Предпочтительным источником такой ДНК служат гибридомные клетки. После выделения, эта ДНК может быть встроена в векторы экспрессии, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки , обезьяньи клетки COS, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или миеломные клетки, которые, в иных случаях, не продуцируют белок антитела, в результате чего в этих рекомбинантных клетках-хозяевах синтезируются моноклональные антитела. Обсуждение рекомбинантной экспрессии антитело-кодирующей ДНК в бактериях можно найти в статьях Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) и Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).
in vivo
В другом варианте осуществления изобретения, моноклональные антитела или фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, созданных методами, описанными McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). В работе Clackson et al. Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) описано выделение антител мыши и антител человека, соответственно, с использованием фаговых библиотек. В более поздних публикациях описано продуцирование высокоаффинных (порядка нМ) антител человека посредством перестановки генов цепей антитела (Marks et al. Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), а также путем комбинированного инфицирования и рекомбинации , применяемой в качестве стратегии для конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse et al. Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). Таким образом, эти методы являются приемлемой альтернативой традиционной гибридомной технологии получения моноклональных антител, применяемой для выделения моноклональных антител.
ДНК, кодирующая антитело, может быть модифицирована для продуцирования полипептидов химерных или слитых антител, например, путем замены последовательности, кодирующей константные домены (CH и CL) тяжелой цепи и легкой цепи антитела человека, гомологичными последовательностями антител мыши (патент США № 4816567 и Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), или путем присоединения иммуноглобулин-кодирующей последовательности ко всей кодирующей последовательности или ее части для не-иммуноглобулинового полипептида (гетерологичного полипептида). Такие последовательности не-иммуноглобулиновых полипептидов используют для замены константных доменов антитела, либо их используют для замены вариабельных доменов одного антигенсвязывающего сайта антитела для создания химерного двухвалентного антитела, содержащего один антигенсвязывающий сайт, обладающий специфичностью к одному антигену, и другой антигенсвязывающий сайт, обладающий специфичностью к другому антигену.
Антитела человека и гуманизированные антитела
3.
2
Анти-TAT антитела согласно изобретению могут также содержать гуманизированные антитела или антитела человека. Гуманизованные формы нечеловеческих антител (например, антител мыши) представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab') или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, происходящую от нечеловеческого иммуноглобулина. Гуманизованными антителами являются иммуноглобулины человека (антитело реципиента), в которых остатки, происходящие от гипервариабельной области (CDR) данного антитела-реципиента, заменены остатками, происходящими от гипервариабельной области (CDR) нечеловеческого антитела (донорного антитела), такого как антитело мыши, антитело крысы или антитело кролика, обладающее нужной специфичностью, аффинностью и связывающей способностью. В некоторых случаях, остатки каркасной области (Fv) иммуноглобулина человека заменены соответствующими нечеловеческими остатками. Гуманизованные антитела могут также содержать остатки, не обнаруженные в антителе реципиента или в «импортных» последовательностях CDR или каркасной области. В общих чертах, гуманизированное антитело может содержать, в основном, все или по меньшей мере один, а обычно два вариабельных домена, в которых все, или почти все области CDR соответствуют областям нечеловеческого иммуноглобулина, и все или почти все FR представляют собой FR с иммуноглобулиновой консенсусной последовательностью человека. Гуманизованное антитело также содержит, но необязательно, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно, области иммуноглобулина человека [Jones et al. (1986) Nature, 321:522-525; Riechmann et al. (1998) Nature 332:323-329 и у Presta Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].
Методы гуманизации нечеловеческих антител хорошо известны специалистам. Вообще говоря, гуманизированное антитело имеет один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него из источника, не являющегося человеком. Эти нечеловеческие аминокислотные остатки часто называют “импортными” остатками, которые обычно берут из “импортного” вариабельного домена. Гуманизация может быть осуществлена, в основном, методом Винтера (Winter) и сотрудниками [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)], путем замены последовательностей CDR грызунов или CDR-последовательностей соответствующими последовательностями антитела человека. В соответствии с этим, такие “гуманизированные” антитела представляют собой химерные антитела (патент США № 4816567), в которых, в основном, меньшая часть, по сравнению с вариабельным доменом интактного антитела человека, заменена соответствующей последовательностью от нечеловеческого антитела. Фактически, гуманизированные антитела обычно представляют собой антитела человека, в которых некоторые остатки CDR, а возможно, и некоторые остатки FR заменены остатками, происходящими от аналогичных участков антител грызунов.
При создании гуманизированных антител для снижения антигенности и НАМА-ответа (вырабатывания антимышиных антител человека) при использовании данного антитела для терапевтического лечения человека, очень важно выбрать вариабельные домены как легкой, так и тяжелой цепи антитела человека. В соответствии с так называемым методом “подгонки”, последовательность вариабельного домена антитела грызуна скринируют по всей библиотеке известных последовательностей вариабельных доменов антитела человека. Затем, идентифицируют последовательность V-домена антитела человека, которая является наиболее схожей с последовательностью грызунов, и берут в качестве каркасной области (FR) человека для создания гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)). В другом методе используют конкретную каркасную область, происходящую от консенсусной последовательности всех антител человека конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Эта же самая каркасная область может быть использована для нескольких различных гуманизированных антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol, 151:2623 (1993)).
Также важно, чтобы гуманизированные антитела сохраняли высокую аффинность связывания с антигеном и другие желаемые биологические свойства. Для достижения этой цели, в соответствии с предпочтительным методом, гуманизированные антитела получают путем анализа родительских последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с применением трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулина являются общедоступными и известны специалистам. Также существуют компьютерные программы для иллюстрации и представления вероятных трехмерных конформационных структур выбранных последовательностей-кандидатов иммуноглобулина. Изучение такого представления позволяет проанализировать вероятную роль, которую играют данные остатки в функционировании последовательности-кандидата иммуноглобулина, то есть, провести анализ влияния этих остатков на способность иммуноглобулина-кандидата связываться с антигеном. В этом методе, остатки FR могут быть выбраны из последовательностей реципиента и «импортных» последовательностей и объединены, так, чтобы можно было получить антитело с нужными свойствами, такими как повышенная аффинность к антигену(ам)-мишени(ям). В основном, непосредственное и наибольшее влияние на связывание с антигеном оказывают остатки гипервариабельной области.
Рассматриваются также различные формы гуманизированного анти-TAT антитела. Так, например, гуманизированным антителом может быть фрагмент антитела, такой как Fab, который конъюгируют, но необязательно, с одним или несколькими цитотоксическими средствами, с образованием иммуноконъюгата. Альтернативно, гуманизированным антителом может быть интактное антитело, такое как интактное антитело IgG1.
В качестве альтернативы гуманизации могут быть получены антитела человека. Так, например, в настоящее время могут быть получены трансгенные животные (например, мыши), которые после иммунизации будут обладать способностью продуцировать полный репертуар антител человека в отсутствии эндогенно продуцируемого иммуноглобулина. Так, например, указывалось, что гомозиготная делеция гена в области стыка тяжелой цепи антитела (JH) у химерных мышей и у мышей с мутированной зародышевой линией приводит к полному ингибированию продуцирования эндогенного антитела. Перенос массивов генов иммуноглобулина зародышевой линии человека таким мышам с мутированной зародышевой линией приводит к продуцированию антител человека после введения антигена. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993); патенты США No 5545806, 5569825, 5591669 (все от GenPharm); 5545807; и WO 97/17852.
in vitro
Альтернативно, технология фагового представления (McCafferty et al., Nature 348:552-553 [1990]) может быть использована для продуцирования антител человека и фрагментов антител  из наборов генов вариабельного домена иммуноглобулина (V) от неиммунизованных доноров. В соответствии с этим методом, гены домена V антител клонируют с сохранением рамки считывания в мажорный или минорный ген белковой оболочки нитчатого фага, такого как M13 или fd, и представляют на поверхности фаговой частицы как функциональные фрагменты антител. Поскольку нитчатая частица содержит копию одноцепочечной ДНК генома фага, то отбор, проводимый на основе функциональных свойств антитела, также позволяет отбирать ген, кодирующий антитело, обладающее этими свойствами. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства В-клеток. Фаговое представление может быть осуществлено в различных форматах, описанных в публикациях Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Для фагового представления может быть использовано несколько источников V-генных сегментов. В публикации Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) описано выделение разнообразных массивов антител против оксазолона из небольшой рандомизированной комбинаторной библиотеки V-генов, полученной из селезенки иммунизованных мышей. Может быть также сконструирован набор V-генов от неиммунизованных людей-доноров, и могут быть получены антитела против разнообразного массива антигенов (включая аутоантигены), в основном, методами, описанными в публикации Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), или Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). См., также патенты США № 5565332 и 5573905.
in vitro
Как обсуждалось выше, антитела человека могут быть также получены с использованием  активированных В-клеток (см., также патенты США № 5567610 и 5229275).
Фрагменты антител
4.
В некоторых случаях, желательно использовать не полноразмерные антитела, а их фрагменты. Меньший размер фрагментов позволяет обеспечивать быстрый клиренс, что может улучшать доступ к солидным опухолям.
E. coli
E. coli
E.coli
in vivo
in vivo
2
2
2
Для получения фрагментов антител были разработаны различные методы. Традиционно, эти фрагменты образуются в результате протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако эти фрагменты могут продуцироваться непосредственно рекомбинантными клетками-хозяевами. Fab-, Fv- и scFv-фрагменты антител могут экспрессироваться в  и секретироваться из , что облегчает продуцирование этих фрагментов в большом количестве. Фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, обсуждаемых выше. Альтернативно, Fab'-SH-фрагменты могут быть непосредственно выделены из  и химически связаны с образованием F(ab')-фрагментов (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). В соответствии с другим подходом, F(ab')-фрагменты могут быть выделены непосредственно из культуры рекомбинантной клетки-хозяина. Fab- и F(ab')-фрагмент с более длительным временем полужизни , содержащий остатки, связывающиеся с эпитопом рецептора «спасения», описаны в патенте США № 5869046. Специалистам известны и другие методы получения фрагментов антител. В других вариантах осуществления изобретения, выбранным антителом является одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv). См. WO 93/16185, патент США № 5571894 и патент США № 5587458. Fv- и sFv-фрагменты присутствуют только у видов с интактными комбинированными сайтами, не содержащими константных областей, а поэтому, они являются подходящими для снижения уровня неспецифического связывания в процессе их применения . Могут быть сконструированы гибридные sFv-белки с получением гибридного эффекторного белка у амино- или карбокси-конца sFv. См. Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, см. выше. Фрагментом антитела может быть также “линейное антитело”, например, антитело, описанное в патенте США № 5641870. Такие одноцепочечные фрагменты антител могут быть моноспецифическими или биспецифическими.
5. Биспецифические антитела
2
Биспецифическими антителами являются антитела, которые обладают специфичностью связывания по меньшей мере с двумя различными эпитопами. Характерные биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами белка TAT, описанного в настоящей заявке. Другие такие антитела могут представлять собой комбинацию TAT-связывающего сайта с сайтом связывания для другого белка. Альтернативно, ветвь антитела против TAT может быть объединена с ветвью, которая связывается с триггерной молекулой на лейкоцитах, такой как молекула Т-клеточного рецептора (например, CD3) или Fc-рецепторы для IgG (FcγR), такие как FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16), так, чтобы клеточные защитные механизмы были сфокусированы в TAT-экспрессирующих клетках и локализованы в этих клетках. Биспецифические антитела могут быть также использованы для определения локализации цитотоксических средств в клетках, экспрессирующих TAT. Эти антитела имеют TAT-связывающую ветвь и ветвь, которая связывается с цитотоксическим средством (таким как, например, сапорин, антитело против интерферона-α, винкаалкалоид, цепь рицина А, метотрексат или гаптен, меченный радиоактивным изотопом). Биспецифические антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, биспецифические F(ab')-антитела).
В WO 96/16673 описано биспецифическое анти-ErbB2/анти-FcγRIII антитело, а в патенте США No. 5837234 описано биспецифическое анти-ErbB2/анти-FcγRI антитело. Биспецифическое анти-ErbB2/Fcα антитело описано в WO98/02463. В патенте США No. 5821337 описано биспецифическое анти-ErbB2/анти-CD3 антитело.
Методы получения биспецифических антител известны специалистам. Традиционное продуцирование полноразмерных биспецифических антител основано на коэкспрессии двух пар тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулина, где эти две цепи обладают различной специфичностью (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Эти гибридомы (квадромы), из-за рандомизированного набора тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, продуцируют потенциальную смесь из 10 различных молекул антител, из которых только одна молекула имеет “правильную” биспецифическую структуру. Очистка такой “правильной” молекулы, которую обычно осуществляют путем постадийного проведения аффинной хроматографии, представляет определенные трудности и дает низкий выход продукта. Аналогичные процедуры описаны в WO 93/08829 и в публикации Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
В соответствии с другим подходом, вариабельные домены антитела с нужными специфичностями связывания (объединенные сайты “антитело-антиген”) сливают с последовательностям константного домена иммуноглобулина. Такое сливание, предпочтительно, осуществляют с константным доменом тяжелой цепи Ig, содержащим по меньшей мере часть шарнирной области, СН2 и СН3. При этом, предпочтительно, чтобы эта слитая конструкция имела первую константную область тяжелой цепи (СН1), содержащую сайт, необходимый для связывания с легкой цепью, присутствующей по меньшей мере в одной их слитых конструкций. ДНК, кодирующая слитые конструкции тяжелой цепи иммуноглобулина и, если это необходимо, легкой цепи иммуноглобулина, встраивают в отдельные векторы экспрессии и ко-трансфицируют в подходящую клетку-хозяина. Это обеспечивает высокую степень гибкости при коррекции соотношений трех полипептидных фрагментов в тех вариантах осуществления изобретения, в которых неравные содержания трех полипептидных цепей, используемых в данной конструкции, дают оптимальные выходы нужного биспецифического антитела. Однако, можно встраивать кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей в один вектор экспрессии, если экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей при равном соотношении дает высокие выходы, или если такие соотношения не оказывают значительного влияния на выход нужной комбинации цепи.
В предпочтительном варианте такого подхода, биспецифические антитела состоят из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющей первую специфичность связывания, в одной ветви, и гибридной пары “тяжелая цепь-легкая цепь” иммуноглобулина (обеспечивающей вторую специфичность связывания), в другой ветви. Было обнаружено, что такая асимметричная структура облегчает отделение нужного биспецифического соединения от нежелательных комбинаций иммуноглобулиновой цепи, поскольку присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы обеспечивает простой способ его выделения. Этот способ описан в WO 94/04690. Более подробное описание получения биспецифических антител, см., например, у Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
В соответствии со вторым подходом, описанным в патенте США № 5731168, граница между парой молекул антитела может быть сконструирована для максимизации процента гетеродимеров, выделенных из рекомбинантной клеточной культуры. Такая граница, предпочтительно, содержит по меньшей мере часть домена СН3. В этом методе, небольшие боковые цепи одной или нескольких аминокислот в пограничной области первой молекулы антитела заменяют более крупными боковыми цепями (например, тирозина или триптофана). В пограничной области второй молекулы антитела создают компенсирующие «полости», имеющие размер, идентичный или аналогичный размеру более крупной(ых) боковой(ых) цепи(ей), путем замены крупных боковых цепей аминокислот более мелкими боковыми цепями (например, аланина или треонина). Это позволяет увеличить выход гетеродимеров по отношению к другим нежелательным конечным продуктам, таким как гомодимеры.
Биспецифическими антителами являются перекрестно-сшитые антитела или их “гетероконъюгаты”. Так, например, одно из антител в указанном гетероконъюгате может быть связано с авидином, а другое с биотином. Такие антитела были, например, предложены для доставки клеток иммунной системы к нежелательным клеткам (патент США № 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекций (WO 91/00360, WO 92/200373 и ЕР 03089). Антитела-гетероконъюгаты могут быть получены любыми стандартными методами перекрестного сшивания. Подходящие перекрестно-сшивающие средства хорошо известны специалистам и описаны в патенте США № 4676980 наряду с различными методами перекрестного сшивания.
2
Методы продуцирования биспецифических антител из фрагментов антител также описаны в литературе. Так, например, биспецифические антитела могут быть получены путем химического связывания. В работе Brennan et al., Science, 229:81 (1985) описана процедура, в которой интактные антитела подвергают протеолитическому расщеплению с образованием F(ab')-фрагментов. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии средства, образующего дитиоловый комплекс, такого как арсенит натрия, для стабилизации смежных дитиолов и предотвращения образования межмолекулярных дисульфидных связей. Затем полученные Fab'-фрагменты превращают в их тионитробензоатные производные (TNB). После этого, одно из производных Fab'-TNB снова превращают в Fab'-тиол путем восстановления меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого производного Fab'-TNB, в результате чего получают биспецифическое антитело. Такие продуцированные биспецифические антитела могут быть использованы в качестве средств для селективной иммобилизации ферментов.
E.coli
E.coli
in vitro
.,
,
2
Последние достижения в данной области позволяют проводить прямое выделение из  фрагментов Fab'-SH, которые могут быть химически связаны с образованием биспецифических антител. В работе Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) описано продуцирование полностью гуманизированной молекулы F(ab') биспецифического антитела. Каждый Fab'-фрагмент был отдельно секретирован из  и подвергнут прямому химическому связыванию  с образованием биспецифического антитела. Таким образом, полученное биспецифическое антитело обладает способностью связываться с клетками, сверхэкспрессирующими рецептор ErbB2, и с нормальными Т-клетками человека, а также запускает литическую активность цитотоксических лимфоцитов человека против опухоли-мишени молочной железы человека. Были также описаны различные методы получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из рекомбинантной клеточной культуры. Так, например, биспецифические антитела были продуцированы с использованием “лейциновых молний”. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Пептиды лейциновой молнии, происходящие от белков Fos и Jun, были присоединены к Fab'-частям двух других антител путем лигирования генов. Гомодимеры антитела были восстановлены в шарнирной области с образованием мономеров, а затем снова окислены с образованием гетеродимеров антител. Этот метод может быть также использован для продуцирования гомодимеров антитела. Технология “диател”, описанная Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. SciUSA 90:6444-6448 (1993), обеспечивает альтернативный механизм получения фрагментов биспецифического антитела. Эти фрагменты содержат VH, присоединенный к VL посредством линкера, который является слишком коротким для создания пары между двумя доменами одной и той же цепи. В соответствии с этим VL- и VH-домены одного фрагмента вынуждены спариваться с комплементарными VL- и VH-доменами другого фрагмента, образуя тем самым два антигенсвязывающих сайта. Также была описана другая стратегия получения фрагментов биспецифического антитела с использованием одноцепочечных Fv(sFv)-димеров. См. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
Рассматриваются также антитела с более, чем двумя валентностями. Так, например, могут быть получены и триспецифические антитела. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).
6. Гетероконъюгированные антитела
in vitro
Гетероконъюгированные антитела также входят в объем настоящего изобретения. Гетероконъюгированные антитела состоят из двух ковалентно связанных антител. Такие антитела, например, как предполагается, нацеливают клетки иммунной системы на нежелательные клетки [патент США No 4676980], а поэтому они могут быть использованы для лечения ВИЧ-инфекций [WO 91/00360, WO 92/200373 и EP 03089]. Известно, что антитела могут быть получены  методами синтеза белков, включая методы с использованием перекрестно-сшивающих средств. Так, например, иммунотоксины могут быть сконструированы путем проведения реакции дисульфидного обмена или образования тиоэфирной связи. Примерами подходящих реагентов, используемых для этой цели, являются иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат, и такие реагенты описаны, например, в патенте США No 4676980.
7. Поливалентные антитела
n
n
Поливалентное антитело может быть быстрее интернализовано (и/или оно может быстрее подвергаться катаболизму), чем двухвалентное антитело благодаря экспрессии антигена в клетке, с которым связываются антитела. Антителами согласно изобретению могут быть поливалентные антитела (не принадлежащие к классу IgM) с тремя или более антигенсвязывающими сайтами (например, четырехвалентные антитела), которые могут быть легко продуцированы посредством рекомбинантной экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидные цепи данного антитела. Поливалентное антитело может содержать домен димеризации и три или более антигенсвязывающих сайтов. Предпочтительный домен димеризации содержит (или состоит из них) Fc-область или шарнирную область. В этом случае, антитело может содержать Fc-область и три или более антигенсвязывающих сайта, расположенных со стороны амино-конца по отношению к Fc-области. Описанное в настоящем описании предпочтительное поливалентное антитело содержит (или состоит из них) от трех и примерно до восьми антигенсвязывающих сайтов, предпочтительно, четыре антигенсвязывающих сайта. Поливалентное антитело содержит по меньшей мере одну полипептидную цепь (предпочтительно, две полипептидных цепи), где указанная(ые) полипептидная(ые) цепь(и) содержит(ат) два или более вариабельных доменов. Так, например, полипептидная(ые) цепь(и) может (могут) содержать VD1-(X1)-VD2-(X2)-Fc, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен, VD2 представляет собой второй вариабельный домен, Fc представляет собой одну полипептидную цепь Fc-области, X1 и X2 представляют собой аминокислоту или полипептид, а n равно 0 или 1. Так, например, полипептидная(ые) цепь(и) может (могут) содержать: цепь «VH-CH1-гибкий линкер-VH-CH1-Fc-область»; или цепь «VH-CH1-VH-CH1-Fc-область». Поливалентное антитело согласно изобретению также, предпочтительно, содержит по меньшей мере два (предпочтительно, четыре) полипептида вариабельного домена легкой цепи. Описанное в настоящем описании поливалентное антитело может, например, содержать примерно от двух до восьми полипептидов вариабельного домена легкой цепи. Рассматриваемые в настоящем описании полипептиды вариабельного домена легкой цепи содержат вариабельный домен легкой цепи, а также, но необязательно, домен CL.
8. Конструирование антител с эффекторными функциями
1
2
3
4
in vivo
Может оказаться желательным модифицировать антитело согласно изобретению для придания ему эффекторных функций, например, для повышения антиген-зависимой клеточно-опосредуемой цитотоксичности (ADCC) и/или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) антитела. Это может быть достигнуто путем введения одной или нескольких аминокислотных замен в Fc-область антитела. Альтернативно или дополнительно, цистеиновый(е) остаток(ки) может (могут) быть введен(ы) в Fc-область, что будет приводить к образованию межцепьевых дисульфидных связей в этой области. Таким образом, полученное гомодимерное антитело может обладать повышенной способностью к интернализации и/или повышенной способностью к комплемент-опосредуемому уничтожению клеток, и повышенной антитело-зависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC). См. Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) и Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Гомодимерные антитела, обладающие повышенной противоопухолевой активностью, могут быть также получены с использованием гетеробифункциональных перекрестно-сшивающих средств, описанных в публикации Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Альтернативно, может быть сконструировано антитело, имеющее две Fc-области, в результате чего может быть усилен лизис комплемента и повышена ADCC. См. Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Для увеличения времени полужизни антитела в сыворотке, в указанное антитело (а в частности, в его фрагмент) может быть введен эпитоп, связывающийся с рецептором «спасения», например, как описано в патенте США № 5739277. Используемый в настоящем описании термин «эпитоп, связывающийся с рецептором спасения» означает эпитоп Fc-области молекулы IgG (например, IgG, IgG, IgG или IgG), который является ответственным за увеличение времени полужизни молекулы IgG в сыворотке .
Иммуноконъюгаты
9.
Настоящее изобретение также относится к иммуноконъюгатам, содержащим антитело, конъюгированное с цитотоксическим средством, таким как химиотерапевтическое средство, рост-ингибирующее средство, токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или его фрагменты) или радиоактивный изотоп (то есть, радиоактивный конъюгат).
Pseudomonas aeruginosa
Aleurites fordii
Phytolaca americana
Momordica charantia
Sapaonaria officinalis
212
131
131
90
186
14
Химиотерапевтические средства, используемые для получения указанных иммуноконъюгатов, описаны выше. Ферментативно активными токсинами и их фрагментами, которые могут быть использованы для этих целей, являются А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (от ), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модецина, альфа-сарцин, белки , белки диантина, белки  (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор , курцин, кротин, ингибитор , гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. Для продуцирования радиоактивно конъюгированных антител могут быть использованы различные радионуклиды. Примерами таких радионуклидов являются Bi, I, In, Y и Re. Конъюгаты антитела и цитотоксического средства получают с использованием различных бифункциональных белок-связывающих средств, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Так, например, иммунотоксин рицин может быть получен как описано в публикации Vitetta et al. Science, 238:1098 (1987). С-меченная 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминопентауксусная кислота (МХ-DTPA) является характерным хелатообразующим средством для конъюгирования радионуклеотида с антителом. См. WO 94/11026.
В настоящем изобретении также рассматриваются конъюгаты антитела и одного или нескольких низкомолекулярных токсинов, таких как калихеамицин, майтанзиноиды, трихотен и СС1065, и производные этих токсинов, обладающие токсической активностью.
Майтанзин и майтанзиноиды
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, анти-ТАТ антитело (полноразмерное антитело или его фрагменты) согласно изобретению конъюгируют с одной или несколькими молекулами майтанзиноида.
Maytenus serrata
Майтанзиноиды представляют собой митотические ингибиторы, которые действуют посредством ингибирования полимеризации тубулина. Майтанзин был впервые выделен у восточно-африканской землеройки (патент США № 3896111). Затем было обнаружено, что некоторые микробы также продуцируют майтанзиноиды, такие как майтанзинол и сложные эфиры С-3-майтанзинола (патент США № 4151042). Синтетический майтанзинол и его производные и аналоги описаны, например, в патентах США № 4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4308269; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663 и 4371533, которые точно вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Конъюгаты «майтанзиноид-антитело»
5
В попытке улучшения терапевтического индекса, майтанзин и майтанзиноиды были конъюгированы с антителами, специфически связывающимися с антигенами опухолевой клетки. Иммуноконъюгаты, содержащие майтанзиноиды, и их применение в терапии описано, например, в патентах США № 5208020, 5416064 и в Европейском патенте ЕР 0425235В1, которые точно вводятся в настоящее описание посредством ссылки. В публикации Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) описаны иммуноконъюгаты, содержащие майтанзиноид, обозначенный DM1 и связанный с моноклональным антителом C242 против рака прямой и ободочной кишки человека. Было обнаружено, что конъюгат является в высокой степени цитотоксичным против культивированных клеток раковой опухоли толстой кишки, и в анализе на рост опухоли in vivo была продемонстрирована противоопухолевая активность. Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992) были описаны иммуноконъюгаты, в которых майтанзиноид был конъюгирован посредством дисульфидного линкера с антителом A7 мыши, связывающимся с антигеном на клеточных линиях раковой опухоли толстой кишки человека, или с другим моноклональным антителом мыши TA.1, которое связывается с онкогеном HER-2/neu. Цитотоксичность конъюгата TA.1-майтанзиноид была протестирована in vitro на клеточной линии раковой опухоли молочной железы человека SK-BR-3, которая экспрессирует 3×10 поверхностных антигенов HER-2 на клетку. Конъюгат лекарственного средства имеет такую же степень цитотоксичности как и свободное майтанзиноидное лекарственное средство, и такая цитотоксичность может быть увеличена по мере увеличения числа молекул майтанзиноида на молекулу антитела. Конъюгат «A7-майтанзиноид» обладает низкой системной цитотоксичностью у мышей.
Конъюгаты «антитело против полипептида ТАТ-майтанзиноид» (иммуноконъюгаты)
Конъюгаты «анти-ТАТ антитело-майтанзиноид» получают путем химического связывания анти-ТАТ антитела с молекулой майтанзиноида, где указанное связывание не приводит к значительному снижению биологической активности антитела или молекулы майтанзиноида. В среднем, 3-4 конъюгированных молекулы майтанзиноида на молекулу антитела являются эффективными в увеличении цитотоксичности по отношению к клетками-мишеням, но при этом, они не оказывают негативного действия на функцию или растворимость антитела, хотя, предполагается, что даже одна молекула токсина/антитела должна обладать более высокой цитотоксичностью, чем «голое» антитело. Майтанзиноиды хорошо известны специалистам и могут быть синтезированы известными методами, либо они могут быть выделены из природных источников. Подходящие майтанзиноиды описаны, например, в патенте США № 5208020 и в других патентах и в непатентных публикациях, указанных выше. Предпочтительными майтанзиноидами являются майтанзинол и аналоги майтанзинола, имеющие модификации в ароматическом кольце или в других положениях молекулы майтанзинола, такие как различные сложные эфиры майтанзинола.
Для создания конъюгатов «антитело-майтанзиноид» может быть использовано множество линкерных групп, известных специалистам, включая, например, группы, описанные в патенте США № 5208020 или в Европейском патенте ЕР 0425235В1, а также в публикации Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) и в заявке на патент США 10/960602, поданной 8 октября 2004, которые точно вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Конъюгаты «антитело-майтанзиноид», содержащие линкерный компонент SMCC, могут быть получены как описано в заявке на патент США 10/960602, поданной 8 октября 2004. Линкерными группами являются дисульфидные группы, тиоэфирные группы, группы, чувствительные к воздействию кислоты, фотохимически неустойчивые группы, группы, чувствительные к действию пептидазы, или группы, чувствительные к действию эстеразы, описанные в вышеупомянутых патентах, при этом, предпочтительными являются дисульфидные и тиоэфирные группы. Дополнительные линкерные группы описаны и проиллюстрированы в настоящей заявке.
Конъюгаты «антитело-майтанзиноид» могут быть получены с использованием различных бифункциональных белок-связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Для создания дисульфидной связи, особенно предпочтительными связывающими средствами являются N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]) и N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат (SPP).
Линкер может быть присоединен к молекуле майтанзиноида в различных положениях, в зависимости от типа связи. Так, например, сложноэфирная связь может быть образована посредством реакции с гидроксильной группой стандартными методами связывания. Такая реакция может осуществляться в положении С-3, имеющем гидроксильную группу, в положении С-14, модифицированном гидроксиметилом, в положении С-15, модифицированном гидроксильной группой, и в положении С-20, имеющем гидроксильную группу. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанная связь образуется в положении С-3 майтанзинола или его аналога.
Ауристатины и долостатины
В некоторых вариантах осуществления изобретения, иммуноконъюгат содержит антитело согласно изобретению, конъюгированное с долостатином или с пептидным аналогом долостатина или их производными, например, с ауристатинами (патенты США No 5635483, 5780588). Было обнаружено, что долостатины и ауристатины негативно влияют на динамику образования микротрубочек, гидролиз GTP и деление ядер и клеток (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584), и обладают противораковой (патент США 5663149) и противогрибковой активностью (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). Молекулы долостатиновых или ауристатиновых лекарственных средств могут быть присоединены к антителу у N-(амино)-конца или у С-(карбокси)-конца молекулы пептидного лекарственного средства (WO 02/088172).
Характерными вариантами ауристатина являются молекулы лекарственного средства, содержащие присоединенный к N-концу монометилауристатин, DE и DF (то есть, ММАЕ и MMAF) и описанные в публикации Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, представленной 28 марта 2004, где указанная публикации точно и во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Обычно, пептидные молекулы лекарственного средства могут быть получены путем образования пептидной связи между двумя или более аминокислотами и/или пептидными фрагментами. Такие пептидные связи могут быть образованы, например, методом синтеза в жидкой фазе (см. E. Schröder and K. Lübke, “The Peptides”, volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press), хорошо известным специалистам в области пептидного синтеза. Молекулы ауристатиновых/долостатиновых лекарственных средств могут быть получены методами, описанными в патентах США 5635483; 5780588; в публикациях Pettit et al. (1989)J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863; и Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784.
Калихеамицин
1
2
3
1
1
I
I
I
I
I
Cancer Research
Cancer Research
Другой представляющий интерес иммуноконъюгат содержит анти-ТАТ антитело, конъюгированное с одной или несколькими молекулами калихеамицина. Антибиотики семейства калихеамицинов способны продуцировать двухцепочечные ДНК-разрывы в субпикомолярных концентрациях. Описание получения конъюгатов семейства калихеамицинов можно найти в патентах США № 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001, 5877296 (все патенты принадлежат компании American Cyanamid Company). Структурными аналогами калихеамицина, которые могут быть использованы в этих целях, являются, но не ограничиваются ими, γ , α , α , N-ацетил-γ , PSAG и θ  (см. Hinman et al.,  53:3336-3342 (1993), Lode et al.,  58:2925-2928 (1998) и вышеупомянутые патенты США, принадлежащие компании American Cyanamid). Другим противоопухолевым лекарственным средством, с которым может быть конъюгировано антитело, является средство QFA, которое представляет собой антифолат. Калихеамицин и QFA имеют внутриклеточные активные сайты и с трудом проходят через плазматическую мембрану. Поэтому, поглощение этих средств клетками путем интернализации, опосредуемой антителом, приводит к значительному усилению их цитотоксических эффектов.
Другие цитотоксические средства
Другими противоопухолевыми средствами, которые могут быть конъюгированы с анти-ТАТ антителами согласно изобретению, являются BCNU, стрептозоицин, винкристин и 5-фторурацил, семейство средств, известных под общим названием комплекс LL-Е33288, описанный в патентах США № 5053394, 5770710, а также эсперамицины (патент США № 5877296).
Pseudomonas aeruginosa
Aleurites fordii
Phytolaca americana
Momordica charantia
Sapaonaria officinalis
Ферментативно активными токсинами и их фрагментами, которые могут быть использованы в этих целях, являются А-цепь дифтерийного токсина, не связывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (от ), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модецина, альфа-сарцин, белки , белка диантина, белки  (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор , курцин, кротин, ингибитор , гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. См., например, заявку WO 93/21232, опубликованную 28 октября 1993.
В настоящем изобретении также рассматривается иммуноконъюгат, образуемый антителом и соединением, обладающим нуклеолитической активностью (например, рибонуклеазой или ДНК-эндонуклеазой, такой как дезоксирибонуклеаза; ДНКазой).
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
99m
123
Для селективной деструкции опухоли может быть получено антитело, содержащее высокорадиоактивный атом. Для продуцирования радиоактивно конъюгированных анти-ТАТ антител могут быть использованы различные радиоактивные изотопы. Примерами таких радионуклидов являются At, I, I,Y,Re,Re, Sm, Bi, Р, Pb и радиоактивные изотопы Lu. Если указанный иммуноконъюгат используется для диагностики, то он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например, Tc или I, или спин-метку для визуализации методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (известной также как МР-визуализация, МРВ), такую как иод-123, иод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.
99m
123
186
188
111
.
Радиоактивные или другие метки могут быть включены в иммуноконъюгат известными методами. Так, например, пептид может быть синтезирован биологическими методами, либо он может быть синтезирован методом химического синтеза аминокислот с использованием подходящих аминокислотных предшественников, включающих, например, фтор-19 вместо водорода. Такие метки, как Tc или I, Re,Re и In могут быть присоединены посредством цистеинового остатка пептида. Иттрий-90 может быть присоединен посредством лизинового остатка. Для введения иода-123 может быть применен метод IODOGEN (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res.Commun 80:49-57). Другие методы подробно описаны в публикации «Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy» (Chatal, CRC Press 1989).
14
Конъюгаты «антитело-цитотоксическое средство» могут быть получены с использованием различных бифункциональных белок-связывающих средств, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Так, например, иммунотоксин рицин может быть получен как описано в публикации Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Характерным хелатообразующим средством для конъюгирования радионуклеотида с антителом является С-меченная 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминопентауксусная кислота (MX-DTPA). См. W094/11026. Линкером может быть «расщепляемый линкер», облегчающий высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетку. Так, например, могут быть использованы линкер, чувствительный к воздействию кислоты; линкер, чувствительный к воздействию пептидазы; линкер, чувствительный к воздействию света; диметиловый линкер или дисульфидсодержащий линкер (Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992); патент США No. 5208020).
Короче говоря, рассматриваемыми соединениями согласно изобретению являются, но не ограничиваются ими: ADC, полученные с использованием нижеследующих перекрестно-сшивающих реагентов, таких как BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB, и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые являются коммерчески доступными (например, поставляются Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A). См. страницы 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.
Альтернативно, слитый белок, содержащий анти-ТАТ антитело и цитотоксическое средство, может быть получен, например, рекомбинантными методами или методом пептидного синтеза. ДНК может содержать соответствующие области, кодирующие две части конъюгата, либо смежные друг с другом, либо разделенные областью, кодирующей линкерный пептид, который не оказывает негативного влияния на желаемые свойства данного конъюгата.
В еще одном варианте осуществления изобретения, указанное антитело может быть конъюгировано с «рецептором» (таким как стрептавидин) для его предварительного нацеливания на опухоль, где указанный конъюгат «антитело-рецептор» вводят пациенту с последующим удалением несвязанного конъюгата из кровотока с использованием средства для клиренса, а затем вводят “лиганд” (например, авидин), конъюгированный с цитотоксическим средством (например, радионуклеотидом).
Иммунолипосомы
10.
Описанные в настоящем описании анти-TAT антитела могут быть также получены в виде иммунолипосом. «Липосома» представляет собой небольшую везикулу, состоящую из липидов различных типов, фосфолипидов и/или поверхностно-активного вещества, которые могут быть использованы для доставки лекарственного средства млекопитающему. Компоненты липосомы обычно расположены так, что они образуют бислой, аналогичный липидному бислою в биологических мембранах. Липосомы, содержащие антитело, получают методами, известными специалистам, такими как методы, описанные в публикации Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); в патентах США № 4485045 и 4544545; и в заявке WO97/38731, опубликованной 23 октября 1997. Липосомы с увеличенным временем полужизни в кровотоке описаны в патенте США No. 5013556.
Конкретно используемые липосомы, в состав которых входят такие липиды, как фосфатидилхолин, холестерин и ПЭГ-дериватизированный фосфатидилэтаноламин (ПЭГ-ФЭ), могут быть получены методом выпаривания с обратной фазой. Липосомы подвергают экструзии через фильтры с определенным размером пор, в результате чего получают липосомы нужного диаметра. Fab'-фрагменты антитела согласно изобретению могут быть конъюгированы с липосомами, как описано в публикации Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) в результате проведения реакции дисульфидного обмена. Липосома может содержать, но необязательно, химиотерапевтическое средство. См. Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989).
B. TAT-связывающие олигопептиды
TAT-связывающими олигопептидами согласно изобретению являются олигопептиды, которые связываются, предпочтительно, специфически, с полипептидом TAT, описанным в настоящей заявке. TAT-связывающие олигопептиды могут быть химически синтезированы стандартным методом синтеза олигопептидов, либо они могут быть получены и очищены с применением технологии рекомбинантных ДНК. TAT-связывающие олигопептиды обычно имеют длину по меньшей мере примерно 5 аминокислот и альтернативно, по меньшей мере примерно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 аминокислот или более, где указанные олигопептиды обладают способностью связываться, предпочтительно, специфически, с описанным в настоящем описании полипептидом TAT. TAT-связывающие олигопептиды могут быть идентифицированы хорошо известными методами без излишнего экспериментирования. В соответствии с этим, следует отметить, что методы скрининга олигопептидных библиотек на олигопептиды, способные специфически связываться с полипептидом-мишенью, хорошо известны специалистам (см., например, патенты США No 5556762, 5750373, 4708871, 4833092, 5223409, 5403484, 5571689, 5663143; публикации заявок PCT WO 84/03506 и WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol, 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, and Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668).
В соответствии с этим, одним из хорошо известных методов является метод бактериофагового (фагового) представления, позволяющий скринировать крупные олигопептидные библиотеки для идентификации члена(ов) тех библиотек, которые специфически связываются с полипептидом-мишенью. Фаговое представление представляет собой метод, с помощью которого варианты полипептидов представляют как слитые белки с коровым белком на поверхности бактериофаговых частиц (Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science 249: 386). В основе применения метода фагового представления лежит тот факт, что крупные библиотеки селективно рандомизированных вариантов белков (или произвольно клонированных кДНК) могут быть быстро и эффективно отобраны на последовательности, которые связываются с молекулой-мишенью с высокой аффиностью. Представление пептидных (Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378) или белковых (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol, 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363) библиотек на фаге может быть использовано для скрининга миллионов полипептидов или олигопептидов на полипептиды или полипептиды, которые обладают способностью к специфическому связыванию (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). Для отбора фаговых библиотек случайно образующихся мутантов необходимо разработать стратегию конструирования и амплификации большого числа вариантов, процедуру аффинной очистки с использованием рецептора-мишени, и средство для оценки результатов по обогащению связывающихся молекул. Патенты США № 5223409, 5403484, 5571689 и 5663143.
Хотя в большинстве методов фагового представления используется нитчатый фаг, однако, также известны системы фагового представления, в которых используются фаг лямбдоид (WO 95/34683; патент США 5627024), системы фагового представления, в которых используется фаг T4 (Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)) и системы фагового представления, в которых используется фаг T7 (Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); патент США 5766905).
Staphylococcus aureus
Были разработаны многие другие способы улучшения и модификаций, в которых основная концепция фагового представления является новой. Такие способы улучшения позволяют повышать эффективность систем представления с точки зрения скрининга пептидных библиотек на связывание с выбранными молекулами-мишенями, и выявлять функциональные белки, которые могут быть скринированы на нужные свойства. Были разработаны устройства для проведения комбинаторных реакций фагового представления (WO 98/14277), а библиотеки фагового представления были использованы для анализа и регуляции биомолекулярных взаимодействий (WO 98/20169; WO 98/20159) и для оценки свойств стерически затрудненных спиральных пептидов (WO 98/20036). В WO 97/35196 описан способ выделения аффинного лиганда, где библиотеку фагового представления приводят в контакт с одним раствором, в котором лиганд связывается с молекулой-мишенью, и со вторым раствором, в котором аффинный лиганд не связывается с молекулой-мишенью, и где указанный метод позволяет осуществлять селективное выделение связывающихся лигандов. В WO 97/46251 описан метод биопэннинга рандомизированной библиотеки фагового представления с использованием аффинно очищенного антитела, с последующим выделением связывающегося фага, а также метод микропэннинга, который осуществляют в лунках микропланшетов для выделения высокоаффинного связывающегося фага. В литературе также описано применение белка А  в качестве аффинной метки (Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187). В WO 97/47314 описано применение библиотек с вытеснением субстратов для идентификации специфичности к ферменту с использованием комбинаторной библиотеки, которая может представлять собой библиотеку фагового представления. Метод отбора ферментов, подходящих для их использования в детергентах, с применением фагового представления описан в WO 97/09446. Другие методы отбора специфически связывающихся белков описаны в патентах США № 5498538, 5432018, и в WO 98/15833.
Методы получения пептидных библиотек и скрининга этих библиотек также описаны в патентах США № 5723286, 5432018, 5580717, 5427908, 5498530, 5770434, 5734018, 5698426, 5763192 и 5723323.
C. TAT-связывающие органические молекулы
TAT-связывающие органические молекулы представляет собой органические молекулы, которые отличаются от описанных в настоящем описании олигопептидов или антител, и которые связываются, предпочтительно, специфически, с полипептидом TAT, описанным в настоящей заявке. TAT-связывающие органические молекулы могут быть идентифицированы и химически синтезированы известным методом (см., например, публикации заявок PCT № WO00/00823 и WO00/39585). TAT-связывающие органические молекулы обычно имеют размер менее, чем примерно 2000 дальтон, и альтернативно, менее, чем примерно 1500, 750, 500, 250 или 200 дальтон, где указанные органические молекулы, обладающие способностью связываться, предпочтительно, специфически, с описанным в настоящем описании полипептидом TAT, могут быть идентифицированы хорошо известными методами без излишнего экспериментирования. В соответствии с этим, следует отметить, что методы скрининга библиотек органических молекул на молекулы, способные специфически связываться с полипептидом-мишенью, хорошо известны специалистам (см., например, публикации заявок PCT No WO00/00823 и WO00/39585). TAT-связывающими органическими молекулами могут быть, например, альдегиды, кетоны, оксимы, гидразоны, семикарбазоны, карбазиды, первичные амины, вторичные амины, третичные амины, N-замещенные гидразины, гидразиды, спирты, эфиры, тиолы, тиоэфиры, дисульфиды, карбоновые кислоты, сложные эфиры, амиды, мочевины, карбаматы, карбонаты, кетали, тиокетали, ацетали, тиоацетали, арилгалогениды, арилсульфонаты, алкилгалогениды, алкилсульфонаты, ароматические соединения, гетероциклические соединения, анилины, алкены, алкины, диолы, аминоспирты, оксазолидины, оксазолины, тиазолидины, тиазолины, енамины, сульфонамиды, эпоксиды, азиридины, изоцианаты, сульфонилхлориды, диазо-соединения, хлорангидриды или т.п.
Скрининг на анти-TAT антитела, TAT-связывающие олигопептиды и TAT-связывающие органические молекулы с нужными свойствами
D.
Методы получения антител, олигопептидов и органических молекул, связывающихся с полипептидами TAT, описаны выше. При желании, могут быть также выбраны и другие антитела, олигопептиды или другие органические молекулы с определенными биологическими свойствами.
3
in vivo
in vitro
in vivo
in vivo
Рост-ингибирующее действие анти-TAT антитела, олигопептида или другой органической молекулы согласно изобретению может быть оценено методами, известными специалистам, например, с использованием клеток, которые экспрессируют полипептид TAT эндогенно или после трансфекции геном TAT. Так, например, соответствующие опухолевые клеточные линии и TAT-трансфицированные клетки могут быть обработаны моноклональным анти-TAT антителом, олигопептидом или другой органической молекулой согласно изобретению в различных концентрациях в течение нескольких дней (например, 2-7 дней), и окрашены кристаллическим фиолетовым или МТТ, либо проанализированы с помощью некоторых других колориметриических анализов. Другой метод измерения уровня пролиферации может представлять собой сравнение поглощения H-тимидина клетками, обработанными в присутствии или в отсутствии анти-TAT антитела, TAT-связывающего олигопептида или ТАТ-связывающей органической молекулы согласно изобретению. После обработки, клетки собирают, и уровень радиоактивности, включенной в ДНК, подсчитывают в сцинтилляционном счетчике. Соответствующий позитивный контроль включает обработку отобранной клеточной линии рост-ингибирующим антителом, которое, как известно, ингибирует рост такой клеточной линии. Ингибирование роста опухолевых клеток  может быть определено различными методами, известными специалистам. Предпочтительной опухолевой клеточной линией может быть клеточная линия, сверхэкспрессирующая полипептид TAT. Предпочтительно, анти-TAT антитело, TAT-связывающий олигопептид или ТАТ-связывающая органическая молекула ингибирует пролиферацию TAT-экспрессирующих опухолевых клеток  или  примерно на 25-100%, более предпочтительно, примерно на 30-100%, еще более предпочтительно, примерно на 50-100% или 70-100% по сравнению с необработанными опухолевыми клетками, а в одном из вариантов изобретения, при концентрации антитела примерно от 0,5 до 30 мкг/мл. Ингибирование роста может быть измерено при концентрации антитела примерно от 0,5 до 30 мкг/мл или примерно от 0,5 нМ до 200 нМ в клеточной культуре, где указанное ингибирование роста определяют через 1-10 дней после обработки опухолевых клеток антителом. Антитело обладает рост-ингибирующим действием , если введение анти-TAT антитела в количестве примерно от 1 мкг/мл до 100 мг/кг массы тела приводит к уменьшению размера опухоли или к снижению уровня пролиферации опухолевых клеток за период времени примерно от 5 дней до 3 месяцев, предпочтительно, за период времени примерно от 5 до 30 дней после первого введения антитела.
Для отбора анти-TAT антитела, TAT-связывающего олигопептида или ТАТ-связывающей органической молекулы, которые индуцируют гибель клеток, может быть оценена потеря целостности мембраны, как было установлено, например, по поглощению иодида пропидия (PI), трипанового синего или 7AAD по сравнению с контролем. Анализ на поглощение PI может быть осуществлен в отсутствии комплемента и иммунных эффекторных клеток. Опухолевые клетки, экспрессирующие полипептид TAT, инкубируют либо только со средой, либо со средой, содержащей соответствующее анти-TAT антитело (например, примерно 10 мкг/мл), TAT-связывающий олигопептид или ТАТ-связывающую органическую молекулу. Клетки инкубируют в течение 3 дней. После каждой обработки, клетки промывают и разделяют на аликвоты в пробирках (35 мм, 12×75) с плотно закрывающейся крышкой (1 мл на пробирку, 3 пробирки на каждую группу обработки) для удаления скоплений клеток. Затем в пробирки добавляют PI (10 мкг/мл). Образцы могут быть проанализированы на проточном цитометре FACSCAN и с использованием компьютерной программы FACSCONVERT CellQuest (Becton Dickinson). Эти анти-TAT антитела, TAT-связывающие олигопептиды или ТАТ-связывающие органические молекулы, которые индуцируют статистически значимые уровни гибели клеток, как было определено по поглощению PI, могут быть отобраны как анти-TAT антитела, TAT-связывающие олигопептиды или ТАТ-связывающие органические молекулы, индуцирующие гибель клеток.
Для скрининга антител, олигопептидов или других органических молекул, которые связываются с эпитопом на полипептиде TAT, связанном с представляющим интерес антителом, может быть проведен рутинный анализ на перекрестное блокирование, такой как анализ, описанный в руководстве Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Этот анализ может быть осуществлен для того, чтобы определить, связывается ли тестируемое антитело, олигопептид или другая органическая молекула с тем же сайтом или эпитопом, с которыми связывается известное анти-TAT антитело. Альтернативно или дополнительно может быть осуществлено картирование эпитопов известными методами. Так, например, последовательность антитела может быть подвергнута мутагенезу, такому как аланин-сканирующий мутагенез для идентификации контактирующих остатков. Мутантное антитело сначала тестируют на связывание с поликлональным антителом для гарантии «правильной» укладки. В другом методе, пептиды, соответствующие различным областям полипептида TAT, могут быть использованы в анализах на конкурентное связывание с тестируемыми антителами или с тестируемым антителом и с антителом, которое связывается с охарактеризованным или известным эпитопом.
Антитело-зависимая опосредуемая ферментом пролекарственная терапия
(ADEPT)
E.
Антитела согласно изобретению могут быть также использованы в ADEPT в виде антитела, конъюгированного с пролекарство-активирующим ферментом, который превращает пролекарство (например, пептидильное химиотерапевтическое средство, см. WO81/01145) в активное противораковое лекарственное средство. См., например, WO 88/07378 и патент США No. 4975278.
Ферментный компонент иммуноконъюгата, подходящего для ADEPT, включает любой фермент, способный действовать на пролекарство, а именно, превращать такое пролекарство в более активную цитотоксическую форму.
Serratia
Ферментами, которые могут быть использованы в способе согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, щелочные фосфатазы, которые могут быть использованы для превращения фосфатсодержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; арилсульфатазы, которые могут быть использованы для превращения сульфатсодержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; цитозиндезаминаза, которая могут быть использована для превращения нетоксичного 5-фторцитозина в противораковое лекарственное средство, а именно, в 5-фторурацил; протеазы, такие как протеаза , термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие как катепсины В и L), которые могут быть использованы для превращения пептидсодержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; D-аланилкарбоксипептидазы, которые могут быть использованы для превращения пролекарств, содержащих D-аминокислотные заместители; углевод-расщепляющие ферменты, такие как β-галактозидаза и нейраминидаза, которые могут быть использованы для превращения гликозилированных пролекарств в свободные лекарственные средства; β-лактамаза, которая может быть использована для превращения лекарственных средств, дериватизированных β-лактамами, в свободные лекарственные средства; и пенициллин-амидазы, такие как пенициллин V-амидаза или пенициллин G-амидаза, которые могут быть использованы для превращения лекарственных средств, дериватизированных у атомов азота амина феноксиацетильными или фелилацетильными группами, соответственно, в свободные лекарственные средства. Альтернативно, антитела с ферментативной активностью, также известные специалистам как «абзимы», могут быть использованы для превращения пролекарств согласно изобретению в свободные активные лекарственные средства (см., например, Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Конъюгаты «антитело-абзим» могут быть получены, как описано в настоящей заявке для доставки абзима в популяцию опухолевых клеток.
Ферменты согласно изобретению могут быть ковалентно присоединены к анти-TAT антителам методами известными специалистам, например, с применением гетеробифункциональных перекрестносшивающих реагентов, обсуждаемых выше. Альтернативно, слитые белки, содержащие по меньшей мере антигенсвязывающую область антитела согласно изобретению, связанную по меньшей мере с функционально активной частью фермента согласно изобретению, могут быть сконструированы методами рекомбинантных ДНК, известными специалистам (см., например, Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984).
F. Полноразмерные полипептиды TAT
Настоящее изобретение также относится к только что идентифицированным и выделенным нуклеотидным последовательностям, кодирующим полипептиды, которые в настоящей заявке называются полипептидами ТАТ. В частности, кДНК (неполные и полноразмерные), кодирующие различные полипептиды TAT, были идентифицированы и выделены, как подробно описано ниже в примерах.
Как описано ниже в примерах, различные клоны кДНК были депонированы в ATCC. Фактические нуклеотидные последовательности этих клонов могут быть легко определены специалистом путем секвенирования депонированного клона рутинными методами, известными специалистам. Предсказанная аминокислотная последовательность может быть определена из нуклеотидной последовательности рутинными методами. В некоторых случаях, для описанных в настоящем описании полипептидов TAT и кодирующих их нуклеиновых кислот, заявителями было высказано предположение, что рамка считывания лучше всего может быть идентифицирована с помощью имеющейся в настоящее время информации о данной последовательности.
G. Варианты анти-TAT антитела и полипептида ТАТ
Помимо описанных в настоящем описании анти-TAT антител и полноразмерных полипептидов ТАТ с нативной последовательностью также рассматривается получение вариантов анти-TAT антитела и полипептида ТАТ. Варианты анти-TAT антитела и полипептида ТАТ могут быть получены путем введения соответствующих нуклеотидных модификаций в кодирующую ДНК, и/или путем синтеза нужного антитела или полипептида. Следует отметить, что аминокислотные модификации могут влиять на посттрансляционные процессы анти-TAT антитела или полипептида ТАТ, например, изменять число или положения сайтов гликозилирования, или изменять мембрано-заякоривающие свойства.
Модификации могут быть внесены в описанные в настоящем описании анти-TAT антитела и полипептиды ТАТ, например, с применением любых методов и руководств по внесению консервативных и неконсервативных замен, описанных, например, в патенте США No. 5364934. Такими модификациями могут быть замена, делеция или инсерция одного или нескольких кодонов, кодирующих антитело или полипептид, что приводит к изменению аминокислотной последовательности по сравнению с последовательностью природного антитела или полипептида. Такой модификацией является, но необязательно, замена по меньшей мере одного аминокислотного остатка любой другой аминокислотой в одном или нескольких доменах анти-TAT антитела или полипептида ТАТ. Для того, чтобы определить, можно ли встроить, заменить или делетировать аминокислотный остаток без какого-либо негативного воздействия на желаемую активность антитела, может быть проведено сравнение последовательности анти-TAT антитела или полипептида ТАТ с последовательностью гомологичных известных молекул белков для минимизации числа модификаций аминокислотной последовательности, внесенных в области с высокой гомологией. Аминокислотные замены могут быть результатом замены одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей аналогичные структурные и/или химические свойства, такой как замена лейцина серином, то есть, консервативных аминокислотных замен. Инсерции или делеции могут, но необязательно, составлять в пределах примерно от 1 до 5 аминокислот. Допустимые модификации могут быть определены путем систематического введения инсерций, делеций или замен аминокислот в данной последовательности и тестирования полученных вариантов на активность полноразмерной или зрелой нативной последовательности.
Настоящее изобретение также относится к фрагментам анти-TAT антитела и полипептида ТАТ. Такие фрагменты могут иметь усечения у N-конца или у С-конца, либо они могут не содержать внутренних остатков, например, по сравнению с полноразмерным нативным антителом или белком. В некоторых фрагментах отсутствуют аминокислотные остатки, которые не играют важной роли в нужной биологической активности анти-TAT антитела или полипептида ТАТ.
Фрагменты анти-TAT антитела и полипептида ТАТ могут быть получены любыми различными стандартными методами. Нужные пептидные фрагменты могут быть получены методом химического синтеза. Альтернативный метод включает продуцирование фрагментов антитела или полипептида путем ферментативного расщепления, например, путем обработки белка ферментом, который, как известно, расщепляет белки в сайтах, определенных конкретными аминокислотными остатками, или путем гидролиза ДНК подходящими рестриктирующими ферментами, и выделения нужного фрагмента. Еще один подходящий метод включает выделение и амплификацию ДНК-фрагмента, кодирующего нужный фрагмент антитела или полипептида с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Олигонуклеотиды, которые определяют нужные концы ДНК-фрагмента, используются в ПЦР в качестве 5'- и 3'-праймеров. Предпочтительно, фрагменты анти-TAT антитела и полипептида ТАТ обладают по меньшей мере одной биологической и/или иммунологической активностью, аналогичной активности описанного в настоящем описании нативного анти-TAT антитела или полипептида ТАТ.
В конкретных вариантах осуществления изобретения, представляющие интерес консервативные замены представлены в таблице 6 под заголовком «Предпочтительные замены». Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то могут быть введены более существенные замены, называемые в таблице 1 «характерными заменами» или также описанные ниже в разделе, относящемся к классу аминокислот, и полученные продукты могут быть скринированы.
Таблица<b></b>1
Исходные остатки
Характерные замены
Предпочтительные замены
Ala (A)
Val; Leu; Ile
Val
Arg (R)
Lys; Gln; Asn
Lys
Asn (N)
Gln; His; Asp; Lys; Arg
Gln
Asp (D)
Glu; Asn
Glu
Cys (C)
Ser; Ala
Ser
Gln (Q)
Asn; Glu
Asn
Glu (E)
Asp; Gln
Asp
Gly (G)
Pro; Ala
Ala
His (H)
Asn; Gln; Lys; Arg
Arg
Ile (I)
Leu; Val; Met; Ala; Phe; Leu
Норлейцин
Leu (L)
Норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Ile
Lys (K)
Arg; Gln; Asn
Arg
Met (M)
Leu; Phe; Ile
Leu
Phe (F)
Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Leu
Pro (P)
Ala
Ala
Ser (S)
Thr
Thr
Thr (T)
Val; Ser
Ser
Trp (W)
Tyr; Phe
Tyr
Tyr (Y)
Trp; Phe; Thr; Ser
Phe
Val (V)
Ile; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцин
Leu
Значительные изменения функций или иммунологических свойств анти-TAT антитела или полипептида ТАТ могут быть достигнуты путем выбора замен, которые значительно отличаются по своему влиянию на сохранение (а) структуры полипептидного остова в области замены, например, складчатой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в сайте-мишени, или (с) объема боковой цепи. Природные остатки подразделяются на нижеследующие группы по общим свойствам боковых цепей:
(1) гидрофобные остатки: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтральные гидрофильные остатки: Cys, Ser, Thr; Asn; Gln;
(3) кислотные остатки: Asp, Glu;
(4) основные остатки: His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro; и
(6) ароматические остатки: Trp, Tyr, Phe.
Неконсервативные замены представляют собой замены члена одного из этих классов членом другого класса. Такие замены могут быть также введены в области консервативных замен, или, более предпочтительно, в остальные (неконсервативные) области.
Такие модификации могут быть внесены методами, известными специалистам, такими как олигонуклеотид-опосредуемый (сайт-направленный) мутагенез, аланин-сканирующий мутагенез и ПЦР-мутагенез. Для продуцирования варианта ДНК анти-TAT антитела или полипептида ТАТ, клонированная ДНК может быть подвергнута сайт-направленному мутагенезу [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], кластерному мутагенезу [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], рестрикционному мутагенезу [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] или мутагенезу, проводимому другими методами.
Для идентификации одной или нескольких аминокислот по всей последовательности может быть также проведен сканирующий аминокислотный анализ. Предпочтительными сканирующими аминокислотами являются относительно небольшие нейтральные аминокислоты. Такими аминокислотами являются аланин, глицин, серин и цистеин. Обычно, предпочтительной сканирующей аминокислотой для данной группы является аланин, поскольку он элиминирует боковую цепь за бета-углеродом и, очевидно, но с меньшей вероятностью, изменяет конформацию главной цепи данного варианта [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. Аланин также является предпочтительным, поскольку он представляет собой наиболее распространенную аминокислоту. Кроме того, он часто присутствует как в скрытых, так и в открытых положениях [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Если аланиновая замена не дает адекватных количеств варианта, то может быть использована изотерическая аминокислота.
Для повышения устойчивости молекулы к окислению и для предотвращения образования нежелательных перекрестных связей, может быть также заменен любой цистеиновый остаток, не участвующий в поддержании «правильной» конформации анти-TAT антитела или полипептида ТАТ, а обычно, такой заменой является замена цистеина серином. И наоборот, для повышения его стабильности (а в частности, если антителом является его фрагмент, такой как Fv-фрагмент), к анти-TAT антителу или полипептиду ТАТ может (могут) быть добавлена(ы) цистеиновая(ые) связь(и).
Особенно предпочтительным вариантом замены является замена одного или нескольких остатков гипервариабельной области родительского антитела (например, гуманизированного антитела или антитела человека). В общих чертах, полученный(ые) вариант(ы), выбранный(ные) для дальнейшей разработки, будет(ут) способствовать улучшению биологических свойств по сравнению со свойствами родительского антитела, от которого он (они) происходит(ят). Стандартный способ генерирования таких вариантов с заменами предусматривает созревание аффинности с применением метода фагового представления. Для этого, несколько сайтов гипервариабельной области (например, 6-7 сайтов) подвергают мутации для генерирования всех возможных аминокислотных замен в каждом сайте. Полученные таким образом варианты антител могут быть представлены на частицах нитчатого фага в виде одновалентных гибридов с продуктом гена III, упакованных в каждой частице фага М13. Затем, варианты, представленные на фаге, скринируют на их биологическую активность (например, аффинность связывания), как описано в настоящей заявке. Для идентификации сайтов гипервариабельной области, являющихся кандидатами на модификацию, может быть осуществлен аланин-сканирующий мутагенез, который позволяет идентифицировать остатки гипервариабельной области, играющие важную роль в связывании с антигеном. Альтернативно или дополнительно, может оказаться полезным проанализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации контактных участков между антителом и полипептидом TAT человека. Такие контактные остатки и соседние остатки являются кандидатами на замену, осуществляемую в соответствии с разработанными в настоящем описании способами. После получения таких вариантов, панель этих вариантов подвергают скринингу, описанному в настоящей заявке, и антитела, обнаруживающие превосходные свойства в одном или нескольких релевантных анализах, могут быть выбраны для дальнейшего исследования.
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты аминокислотных последовательностей анти-TAT антитела, получают различными методами, известными специалистам. Такими методами являются, но не ограничивается ими, выделение из природного источника (в случае природных вариантов аминокислотных последовательностей) или получение с помощью опосредуемого олигонуклеотидом (или сайт-направленного) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза и кластерного мутагенеза ранее полученного варианта или немодифицированного варианта анти-TAT антитела.
Модификации анти-TAT антител и полипептидов ТАТ
Н.
Ковалентные модификации анти-TAT антител и полипептидов ТАТ входят в объем настоящего изобретения. Одним из типов ковалентной модификации является реакция взаимодействия нужных аминокислотных остатков анти-TAT антитела или полипептида ТАТ с органическим дериватизирующим средством, способным реагировать с выбранными боковыми цепями N- или C- концевых остатков анти-TAT антитела или полипептида ТАТ. Дериватизация с использованием бифункциональных средств может быть осуществлена, например, для проведения перекрестного связывания анти-TAT антитела или полипептида ТАТ с не растворимой в воде матрицей-носителем или с поверхностью, используемых в методе очистки анти-TAT антител, и наоборот. Наиболее часто используемыми перекрестно-связывающими средствами являются, например, 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, N-гидроксисукцинимидоэфиры, например, сложные эфиры, образованные 4-азидосалициловой кислотой; гомобифункциональные имидоэфиры, включая дисукцинимидиловые сложные эфиры, такие как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), бифункциональные малеимиды, такие как бис-N-малеимидо-1,8-октан, и такие средства, как метил-3-[(п-азидофенил)дитио]пропиоимидат.
Другими модификациями являются дезамидирование глутаминильных и аспарагинильных остатков до соответствующих глутамильных и аспартильных остатков, соответственно; гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп серильных или треонильных остатков, метилирование α-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], ацетилирование N-концевого амина и амидирование любых C-концевых карбоксильных групп.
Другой тип ковалентной модификации анти-TAT антитела или полипептида ТАТ, входящей в объем настоящего изобретения, включает изменение характера нативного гликозилирования антитела или полипептида. Термин «изменение характера нативного гликозилирования», используемый в описании настоящего изобретения, означает делецию одной или нескольких углеводных групп, присутствующих в нативной последовательности анти-TAT антитела или полипептида ТАТ (либо путем удаления скрытых сайтов гликозилирования, либо путем удаления гликозильных остатков химическими и/или ферментативными методами) и/или добавление одного или нескольких сайтов гликозилирования, которые отсутствуют в нативной последовательности анти-TAT антитела или полипептида ТАТ. Кроме того, этот термин включает качественные изменения характера гликозилирования нативных белков, приводящие к изменению природы и количества различных присутствующих углеводных групп.
Гликозилирование антител и других полипептидов обычно является либо N-связанным, либо О-связанным. N-связанное гликозилирование означает присоединение углеводной группы к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности «аспарагин-Х-серин» и «аспарагин-Х-треонин», где Х означает любую аминокислоту, за исключением пролина, представляют собой последовательности распознавания для ферментативного присоединения углеводной части к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде способствует созданию потенциального сайта гликозилирования. О-связанное гликозилирование означает присоединение одного из сахаров, таких как N-ацетилгалактозамин, галактоза или ксилоза к гидроксиаминокислоте, главным образом, к серину или треонину, хотя ими могут быть также 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.
Присоединение сайтов гликозилирования к анти-TAT антителу или полипептиду ТАТ обычно осуществляют путем такой модификации аминокислотной последовательности, в результате которой эта аминокислотная последовательность будет содержать одну или несколько вышеописанных трипептидных последовательностей (для сайтов N-связанного гликозилирования). Такая модификация может быть также осуществлена путем добавления к последовательности исходного анти-TAT антитела или полипептида ТАТ одного или нескольких сериновых или треониновых остатков или их замены в такой последовательности исходного антитела или полипептида (для сайтов О-связанного гликозилирования). Аминокислотная последовательность анти-TAT антитела или полипептида ТАТ может быть, но необязательно, изменена посредством ее модификации на уровне ДНК, а в частности, посредством мутации ДНК, кодирующей анти-TAT антитело или полипептид ТАТ, в предварительно выбранных основаниях, в результате чего будут образовываться кодоны, транслирующиеся в нужные аминокислоты.
Другим способом увеличения числа углеводных молекул на анти-TAT антителе или полипептиде ТАТ является химическое или ферментативное присоединение гликозидов к полипептиду. Такие методы описаны в литературе, например, в заявке WO 87/05330, опубликованной 11 сентября 1987, и в публикации Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).
Удаление углеводных групп, присутствующих на анти-TAT антителе или полипептиде ТАТ, может быть осуществлено химически или ферментативно, либо путем мутационной замены кодонов, кодирующих аминокислотные остатки, которые служат в качестве мишеней для гликозилирования. Методы химического дегликозилирования известны специалистам и описаны, например, в публикации Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) и Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). Ферментативное расщепление углеводных молекул на полипептидах может быть осуществлено с использованием различных эндо- и экзогликозидаз, как описано в публикации Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
Другой тип ковалентной модификации анти-TAT антитела или полипептида ТАТ включает связывание антитела или полипептида с одной из различных молекул не-белковых полимеров, таких как, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль или полиоксиалкилены, как описано в патентах США № 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337. Антитело или полипептид могут быть также заключены в приготовленные микрокапсулы, например, методами коацервации или межфазной полимеризации (например, в гидроксиметилцеллюлозную или желатиновую микрокапсулу и полиметилметакрилатную микрокапсулу, соответственно), в системы для доставки коллоидальных лекарственных средств (например, в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такая методика описана в руководстве Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980).
Анти-TAT антитело или полипептид ТАТ согласно изобретению могут быть также модифицированы с образованием химерных молекул, содержащих анти-TAT антитело или полипептид ТАТ, слитые с другим гетерологичным полипептидом или с другой аминокислотной последовательностью.
В одном из вариантов изобретения, такая химерная молекула содержит гибрид анти-TAT антитела или полипептида ТАТ с полипептидной меткой, обеспечивающей наличие эпитопа, с которым может селективно связываться антитело против метки. Эпитопная метка обычно находится у амино- или карбокси-конца анти-TAT антитела или полипептида ТАТ. Присутствие таких меченных эпитопом форм анти-TAT антитела или полипептида ТАТ может быть детектировано с использованием антитела против полипептида-метки. Кроме того, наличие эпитопной метки позволяет легко очищать анти-TAT антитело или полипептид ТАТ методом аффинной очистки с использованием антитела против метки или аффинной матрицы другого типа, которая связывается с эпитопной меткой. Различные полипептиды-метки и их соответствующие антитела хорошо известны специалистам. Примерами являются полигистидиновые метки (поли-his) или метки «поли-гистидин-глицин (поли-his-gly); полипептидная метка HA вируса гриппа и антитело против этого полипептида, 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)], c-myc-метка и антитела против такой метки, 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 и 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; и метка «гликопротеин D (gD) вируса простого герпеса и антитело против такой метки [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Другими полипептидными метками являются Flag-пептид [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; пептид эпитопа KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; пептид эпитопа α-тубулина [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; и метка «пептид белка 10, кодируемого геном T7» [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)].
В альтернативном варианте осуществления изобретения, химерная молекула может содержать слитую конструкцию «анти-TAT антитело или полипептид ТАТ - иммуноглобулин или конкретная область иммуноглобулина». В случае двухвалентной формы химерной молекулы (также называемой «иммуноадгезином»), такой как слитая конструкция с Fc-областью молекулы IgG. Слитые Ig, предпочтительно, включают замену по меньшей мере одной вариабельной области в молекуле Ig на растворимую форму (с делетированным или инактивированным трансмембранным доменом) анти-TAT антитела или полипептида ТАТ. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, гибрид иммуноглобулина включает шарнирную область, CH2 и CH3, или шарнирную область, CH1, CH2 и CH3, молекулы IgG1. Описание продуцирования слитых иммуноглобулинов можно также найти в патенте США No. 5428130, выданном 27 июня 1995.
I. Получение анти-TAT антител и полипептидов ТАТ
In vitro
Ниже описано, главным образом, продуцирование анти-TAT антител или полипептидов ТАТ путем культивирования клеток, трансформированных или трансфицированных вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-TAT антитело или полипептид ТАТ. При этом предусматривается, что для получения анти-TAT антител и полипептидов ТАТ могут быть применены альтернативные методы, хорошо известные специалистам. Так, например, соответствующая аминокислотная последовательность или ее части могут быть продуцированы методом прямого пептидного синтеза на твердой фазе [см. например, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)].  синтез белков может быть осуществлен вручную или автоматически. Автоматический синтез может быть осуществлен, например, на пептидном синтезаторе Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) в соответствии с инструкциями производителей. Различные части анти-TAT антитела или полипептида ТАТ могут быть химически синтезированы отдельно и в комбинации с химическими или ферментативными методами с получением желаемого анти-TAT антитела или полипептида ТАТ.
Выделение ДНК, кодирующей анти-TAT антитело или полипептид ТАТ
1.
ДНК, кодирующая анти-TAT антитело или полипептид ТАТ, может быть получена из библиотеки кДНК, выделенной из ткани, которая, предположительно, содержит мРНК анти-TAT антитела или полипептида ТАТ и экспрессирует такую мРНК на детектируемом уровне. В соответствии с этим, ДНК человека анти-TAT антитела или полипептида ТАТ может быть легко получена из библиотеки кДНК, выделенной из ткани человека. Ген, кодирующий анти-TAT антитело или полипептид ТАТ, может быть также получен из геномной библиотеки или с применением известных методов синтеза (например, автоматизированного синтеза нуклеиновых кислот).
Библиотеки могут быть скринированы с использованием зондов (таких как олигонуклеотиды, состоящие по меньшей мере примерно из 20-80 оснований), сконструированных для идентификации представляющего интерес гена или белка, кодируемого этим геном. Скрининг кДНК или геномной библиотеки с использованием выбранного зонда может быть осуществлен в соответствии со стандартными процедурами, такимм как процедуры, описанные в публикации Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Альтернативным методом выделения гена, кодирующего анти-TAT антитело или полипептид ТАТ, является ПЦР-технология [Sambrook et al., см. выше; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
32
Методы скрининга библиотеки кДНК хорошо известны специалистам. Олигонуклеотидные последовательности, выбранные в качестве зондов, должны иметь длину, достаточную и достаточно точно определенную для минимизации ложноположительных результатов. Олигонуклеотид, предпочтительно, метят так, чтобы он мог быть детектирован после гибридизации с ДНК в библиотеке, подвергаемой скринингу. Методы мечения хорошо известны специалистам и включают использование радиоактивных меток, таких как P-меченый ATP, биотинилирование или ферментативное мечение. Условия гибридизации, включая условия умеренной и высокой жесткости, описаны в руководстве Sambrook et al., см. выше.
Последовательности, идентифицированные в таких методах скрининга библиотек, могут быть подвергнуты сравнению и выравниванию с другими известными последовательностями, депонированными и имеющимися в общедоступных базах данных, таких как GenBank, или в других частных базах данных последовательностей. Идентичность последовательностей (на уровне аминокислот или нуклеотидов) в определенных областях молекулы или по всей полноразмерной последовательности может быть определена методами, известными специалистам и описанными в настоящей заявке.
Нуклеиновая кислота, имеющая белок-кодирующую последовательность, может быть получена путем скрининга выбранной кДНК или геномных библиотек с использованием выведенной аминокислотной последовательности, впервые описанной в настоящей заявке, и если это необходимо, в соответствии со стандартными процедурами удлинения праймеров, описанными в руководстве Sambrook et al., см. выше, для обнаружения предшественников и процессинга промежуточных форм мРНК, которые не могут быть подвергнуты обратной транскрипции в кДНК.
Отбор и трансформация клеток-хозяев
2.
Клетки-хозяева трансфицируют или трансформируют с использованием описанных в настоящем описании векторов экспрессии или клонирующих векторов для продуцирования анти-TAT антитела или полипептида ТАТ, а затем культивируют в стандартной питательной среде, модифицированной, если это необходимо, для индуцирования промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих нужные последовательности. Условия культивирования, такие как среда, температура, рН и т.п. могут быть выбраны специалистом без излишнего экспериментирования. В основном, принципы, протоколы и практические методы максимизации продуктивности клеточных культур можно найти в публикации Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) и Sambrook et al., см. выше.
2
4
Agrobacterium tumefaciens
Методы трансфекции эукариотических клеток и трансформации прокариотических клеток известны среднему специалисту в данной области, например, такими методами являются методы, опосредуемые CaCl, CaPO и липосомами, и электропорация. В зависимости от используемых клеток-хозяев, трансформацию осуществляют стандартными методами, подходящими для таких клеток-хозяев. В случае использования прокариотов, обычно проводят обработку кальцием, а именно хлоридом кальция, как описано в руководстве Sambrook et al., см. выше, или электропорацию. Инфицирование бактерий  проводят для трансформации некоторых клеток растений, как описано в работе Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) и в заявке WO 89/05859, опубликованной 29 июня 1989. В случае использования клеток млекопитающих, не содержащих клеточных стенок, может быть применен метод преципитации фосфатом кальция, описанный Graham и van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Общие аспекты трансфекции систем клеток-хозяев млекопитающих описаны в патенте США No. 4399216. Трансформацию в дрожжах обычно осуществляют методом, описанным Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) и Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Однако для введения ДНК в клетки могут быть применены и другие методы, например, такие как микроинжекция в ядро, электропорация, слияние бактериальных протопластов с интактными клетками, либо методы с использованием поликатионов, например, полибрена, полиорнитина. Различные методы трансформации клеток млекопитающих можно найти в публикациях Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) и Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
Escherichia
E. coli
Enterobacter
Erwinia
Klebsiella
Proteus
Salmonella
Salmonella typhimurium
Serratia
Serratia marcescans
Shigella
Bacilli,
B. subtilis
B. licheniformis
B. licheniformis
Pseudomonas,
P. aeruginosa
Streptomyces
E. coli
tonA
E. coli
tonA ptr3
E. coli
tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanr
E. coli
tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr
E. coli
degP
E. coli
in vitro
Подходящими описанными в настоящем описании клетками-хозяевами для клонирования или экспрессии ДНК в векторах являются прокариотические клетки, дрожжевые клетки или высшие эукариотические клетки. Подходящими прокариотами являются, но не ограничиваются ими, эубактерии, такие как грам-отрицательные или грам-положительные микроорганизмы, например, Enterobacteriaceae, такие как . Различные штаммы  являются общедоступными, такие как  K12 штамм MM294 (ATCC 31446);  X1776 (ATCC 31537);  штамм W3110 (ATCC 27325) и K5 772 (ATCC 53635). Другими подходящими прокариотическими клетками-хозяевами являются Enterobacteriaceae, такие как , например, , , , , , , например, , , например, , и , а также  такие как  и  (например,  41P, описанные в DD 266710, опубликованной 12 апреля 1989),  такие как и . Эти примеры приводятся лишь в иллюстративных, но не ограничивающих целях. Одним из наиболее предпочтительных хозяев или родительских клеток-хозяев является штамм W3110, поскольку он наиболее часто используется в качестве штамма-хозяина для ферментации рекомбинантных продуктов ДНК. Предпочтительно, клетки-хозяева секретируют минимальное количество протеолитических ферментов. Так, например, штамм W3110 может быть модифицирован так, чтобы он имел генетическую мутацию в генах, кодирующих белки, которые являются эндогенными для хозяина, и примерами таких хозяев являются  W3110 штамм 1A2, который имеет полный генотип ;  W3110 штамм 9E4, который имеет полный генотип ;  W3110 штамм 27C7 (ATCC 55244), который имеет полный генотип ;  W3110 штамм 37D6, который имеет полный генотип ;  W3110 штамм 40B4, который представляет собой штамм 37D6 с делеционной мутацией , и который не является резистентным к канамицину; и штамм , имеющий мутантную периплазматическую протеазу и описанный в патенте США No. 4946783, выданном 7 августа 1990. Альтернативно, могут быть применены методы клонирования , например, ПЦР или другие полимеразные реакции нуклеиновой кислоты.
E. coli
E. coli
Полноразмерное антитело, фрагменты антител и слитые белки антител могут быть продуцированы в бактериях, в частности, если отсутствует потребность в гликозилировании и в эффекторых функциях Fc, например, в том случае, если терапевтическое антитело конъюгировано с цитотоксическим средством (например, с токсином), а сам иммуноконъюгат является эффективным для деструкции опухолевых клеток. Полноразмерные антитела имеют более длительное время полужизни в кровотоке. Продуцирование в  является более быстрым и менее дорогостоящим методом. Экспрессия фрагментов антител и полипептидов в бактериях проиллюстрирована, например, в патенте США № 5648237 (Carter et al.), в патенте США № 5789199 (Joly et al.), и в патенте США № 5840523 (Simmons et al.), где описаны последовательности области инициации трансляции (TIR) и сигнальные последовательности для оптимизации экспрессии и секреции, и где указанные патенты вводятся в настоящее описание посредством ссылки. После экспрессии, антитело выделяют из клеточной пасты  в виде растворимой фракции, и такое антитело может быть очищено, например, на колонке с белком А или G-белком, в зависимости от изотипа. Конечная очистка может быть осуществлена способом, аналогичным способу очистки антител, экспрессируемых в клетках СНО.
Saccharomyces cerevisiae.
Schizosaccharomyces pombe
Kluyveromyces
K. lactis
K. fragilis
, K. bulgaricus
K. wickeramii
K. waltii
K. drosophilarum
K. thermotolerans
K. marxianus; yarrowia
Pichia pastoris
Candida; Trichoderma reesia
Neurospora crassa
Schwanniomyces
Schwanniomyces occidentalis
Neurospora, Penicillium
Tolypocladium
Aspergillus
A. nidulans
A. niger
Hansenula
Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis
Rhodotorula
Помимо прокариотов, подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих анти-TAT антитело или полипептид ТАТ, являются эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи. Наиболее часто используемым низшим эукариотическим микроорганизмом-хозяином являются  Другими микроорганизмами являются  (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139383, опубликованный 2 мая 1985); клетки-хозяева  (патент США № 4943529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), такие как, например,  (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2):737-742 [1983]),  (ATCC 12424) (ATCC 16045),  (ATCC 24178),  (ATCC 56500),  (ATCC 36906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), и (EP 402226);  (EP 183070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]);  (EP 244234);  (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); , такие как  (EP 394538, опубликованный 31 октября 1990); и нитчатые грибы, такие как, например, ,  (заявка WO 91/00357, опубликованная 10 января 1991), и клетки-хозяева , такие как  (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) и  (Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). Подходящими также являются, но не ограничиваются ими, метилотропные дрожжи, например, дрожжи, способные расти на метаноле и выбранные из рода, состоящего из ,и . Список конкретных видов, принадлежащих к этому классу дрожжей, можно найти в публикации C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
Spodoptera frugiperda
Aedes aegypti
Aedes albopictus
Drosophila melanogaster
Bombyx mori
Autographa californica
Bombyx mori
Spodoptera frugiperda
Клетки-хозяева, подходящие для экспрессии и гликозилирования анти-TAT антитела или полипептида ТАТ, могут быть получены из многоклеточных организмов. Примерами клеток беспозвоночных являются клетки насекомых, такие как клетки Drosophila S2 и Spodoptera Sf9, а также клетки растений, такие как клеточные культуры хлопчатника, кукурузы, картофеля, сои, петунии, томатов и табака. Были идентифицированы различные бакуловирусные штаммы и варианты, и соответствующие пермиссивные клетки-хозяева насекомых, происходящие от таких хозяев, как  (гусеница),  (комар),  (комар),  (плодовая мушка) и . Ряд вирусных штаммов для трансфекции является общедоступным, например, вариант L-1  NPV и штамм Bm-5  NPV, и такие вирусы могут быть использованы в качестве вируса согласно изобретению, а в частности, для трансфекции клеток .
Однако, наибольший интерес представляют клетки позвоночных, и размножение клеток позвоночных в культуре (культуре ткани) становится рутинной процедурой. Примерами подходящих клеточных линий хозяев млекопитающих являются клетки почек обезьяны CV1, трансформированные вирусом SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); клеточная линия почек эмбриона человека (клетки 293 или 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клетки почек детеныша хомячка (BHK, ATCC CCL 10); клетки яичника китайского хомячка/DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); клетки мыши Сертоли (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почек обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почек африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почек собак (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени лабораторной крысы Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легких человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065); опухолевые клетки молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4; и клеточная линия гепатомы человека (Hep G2).
Клетки-хозяева трансформируют вышеописанными экспрессирующими или клонирующими векторами для продуцирования анти-TAT антитела или полипептида ТАТ и культивируют в стандартной питательной среде, модифицированной, если это необходимо, для индуцирования промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих нужные последовательности.
Отбор и применение реплицирующегося вектора
3.
Для клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии, в реплицирующийся вектор может быть встроена нуклеиновая кислота (например, кДНК или геномная ДНК), кодирующая анти-ТАТ антитело или полипептид ТАТ. Для этого существуют различные векторы, которые являются общедоступными. Этот вектор может быть, например, получен в форме плазмиды, космиды, вирусной частицы или фага. Соответствующая последовательность нуклеиновой кислоты может быть встроена в вектор в соответствии с различными процедурами. В основном, ДНК встраивают в соответствующий(ие) сайт(ы) рестриктирующей эндонуклеазы методами, известными специалистам. Векторными компонентами обычно являются, но не ограничиваются ими, одна или несколько сигнальных последовательностей, ориджин репликации, один или несколько маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции. Конструирование подходящих векторов, содержащих один или несколько из указанных компонентов, осуществляют стандартными методами лигирования, известными специалистам.
Saccharomyces
Kluyveromyces
C. albicans
TAT может быть продуцирован рекомбинантно не только непосредственно, но также и в виде полипептида, слитого с гетерологичным полипептидом, который может представлять собой сигнальную последовательность, или с другим полипептидом, имеющим специфический сайт расщепления у N-конца зрелого белка или полипептида. В общих чертах, указанной сигнальной последовательностью может быть компонент вектора, либо такой последовательностью может быть часть ДНК, кодирующая анти-TAT антитело или полипептид ТАТ, которую встраивают в данный вектор. Сигнальной последовательностью может быть прокариотическая сигнальная последовательность, выбранная, например, из группы, состоящей из лидерной последовательности щелочной фосфатазы, пенициллиназы, lpp или термостабильного энтеротоксина II. Для секреции в дрожжах, сигнальной последовательностью может быть, например, лидерная последовательность дрожжевой инвертазы, лидерная последовательность альфа-фактора (включая лидерные последовательности α-фактора и , причем, вторая из этих последовательностей описана в патенте США № 5010182), или лидерная последовательность кислой фосфатазы, лидерная последовательность глюкоамилазы  (патент EP 362179, опубликованный 4 апреля 1990), или сигнальная последовательность, описанная в заявке WO 90/13646, опубликованной 15 ноября 1990. При экспрессии в клетках млекопитающих, для прямой секреции белка могут быть использованы сигнальные последовательности млекопитающих, такие как сигнальные последовательности, происходящие от секретируемых полипептидов того же самого вида или родственных видов, а также вирусные секреторные лидерные последовательности.
Такие экспрессирующие и клонирующие векторы содержат последовательность нуклеиновой кислоты, способствующую репликации вектора в одной или нескольких выбранных клетках-хозяевах. Такие последовательности различных бактерий, дрожжей и вирусов хорошо известны. Ориджин репликации, происходящий от плазмиды pBR322, является подходящим для большинства грамм-отрицательных бактерий; ориджин плазмиды 2μ является подходящим для дрожжей, а различные вирусные ориджины (SV40, вируса полиомы, аденовируса, VSV или BPV) являются подходящими для клонирования векторов в клетки млекопитающих.
Bacilli
Вектор экспрессии и клонирующий вектор обычно содержат селективный ген, также называемый селективным маркером. Обычно, селективные гены кодируют белки, которые (а) сообщают резистентность к антибиотиками или к другим токсинам, например, к ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, (b) компенсируют дефицит, обусловленный ауксотрофией, или (с) обеспечивают доставку важных питательных веществ, которые не поступают из комплексных сред, например, гена, кодирующего D-аланин-рацемазу для .
trp
trp1
Примером подходящих селективных маркеров для клеток млекопитающих являются маркеры, которые позволяют идентифицировать клетки, компетентные по поглощению нуклеиновой кислоты, кодирующей анти-TAT антитело или полипептид ТАТ, такой как гены DHFR или тимидинкиназы. В случае DHFR дикого типа, подходящей клеткой-хозяином является клеточная линия CHO, дефицитная по DHFR-активности, и такая клеточная линия была получена и размножена как описано в публикации Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Подходящим селективным геном для использования в дрожжах является ген 1, присутствующий в дрожжевой плазмиде YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. Ген  представляет собой селективный маркер для мутантного штамма дрожжей, который не способен расти в присутствии триптофана, например, штамма, депонированного в ATCC № 44076 или РЕР4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
tac
Вектор экспрессии и клонирующие векторы обычно содержат промотор, который, для прямого синтеза мРНК, функционально присоединеняют к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей анти-ТАТ антитело или полипептид ТАТ. Промоторы, распознаваемые различными потенциальными клетками-хозяевами, хорошо известны специалистам. Промоторами, подходящими для использования в прокариотических хозяевах, являются промоторные системы β-лактамазы и лактозы [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], промоторная система щелочной фосфатазы и триптофана (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36776] и гибридные промоторы, такие как промотор  [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Промоторы, используемые в бактериальных системах, также могут содержать последовательность Шайна-Дальгарно (S.D.), функционально присоединенную к ДНК, кодирующей анти-TAT антитело или полипептид ТАТ.
Примерами промоторных последовательностей, подходящих для использования в дрожжевых клетках-хозяевах, являются промоторы 3-фосфоглицерат-киназы [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] или других гликолитических ферментов [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], таких как энолаза, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа, гексокиназа, пируват-декарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфат-изомераза, 3-фосфоглицерат-мутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа.
Другими дрожжевыми промоторами, которые представляют собой индуцибельные промоторы, имеющие дополнительное преимущество, заключающееся в их способности регулировать транскрипцию в определенных условиях культивирования, являются промоторные области генов алкоголь-дегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, гидролитических ферментов, связанных с метаболизмом азота, металлотионеина, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Векторы и промоторы, подходящие для экспрессии в дрожжах, также описаны в ЕР 73657.
Транскрипция анти-TAT антитела или полипептида ТАТ из векторов в клетках-хозяевах млекопитающих регулируется, например, промоторами, полученными из геномов таких вирусов, как вирус полиомы, вирус оспы домашней птицы (заявка UK 2211504, опубликованная 5 июля 1989), аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус коровьей папиломы, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В, а наиболее предпочтительно, обезьяний вирус 40 (SV40); гетерологичными промоторами млекопитающих, например, промотором актина или промотором иммуноглобулина; и промоторами белков теплового шока, при условии, что такие промоторы являются совместимыми с системами клеток-хозяев.
Транскрипция ДНК, кодирующей анти-TAT антитело или полипептид ТАТ, в высших эукариотах, может быть усилена при встраивании в вектор энхансерной последовательности. Энхансерами являются цис-действующие элементы ДНК, обычно, примерно от 10 до 300 п.н., которые, действуя на промотор, усиливают его активность в инициации транкрипции. В настоящее время известно много энхансерных последовательностей, происходящих от генов млекопитающих (генов глобина, эластазы, альбумина, α-фетопротеина и инсулина). Однако, обычно используется энхансер от вируса эукариотической клетки. Примерами является энхансер вируса SV40, локализованный в поздней области ориджина репликации (100-270 п.н.), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомавируса, локализованный в поздней области ориджина репликации, и энхансеры адновируса. Энхансер может быть сплайсирован в вектор в 5'- или 3'-положеннии по отношению к последовательности, кодирующей анти-TAT антитело или полипептид ТАТ, но, предпочтительно, чтобы он находился в 5'-положении от промотора.
Векторы экспрессии, используемые в эукариотических клетках-хозяевах (в дрожжах, грибах, насекомых, растениях, у животных, у человека или в ядро-содержащих клетках, происходящих от других многоклеточных организмов), также содержат последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно расположены со стороны 5'-конца, а иногда, 3'-конца от нетранслируемых областей эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Эти области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибированные в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслированной части мРНК, кодирующей анти-TAT антитело или полипептид ТАТ.
Другие методы, векторы и клетки-хозяева, подходящие для адаптации к синтезу анти-TAT антитела или полипептида ТАТ в рекомбинантных клеточных культурах позвоночных, описаны в публикации Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); в ЕР 117060 и ЕР 117058.
Культивирование клеток-хозяев
4.
TM
Клетки-хозяева, используемые для продуцирования анти-TAT антитела или полипептида ТАТ согласно изобретению, могут быть культивированы в различных средах. Коммерчески доступными средами, подходящими для культивирования клеток-хозяев, являются такие среды, как среда Хэмса F10 (Sigma), минимальная поддерживающая среда ((МЕМ)(Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Sigma). Кроме того, в качестве культуральной среды для культивирования клеток-хозяев может быть использована любая среда, описанная в публикации Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), в патентах США № 4767704, 4657866, 4927762, 4560655 или 5122469; в WO 90/03430; в WO 87/00195 или в патенте США Re.№ 30985. В любую из этих сред могут быть добавлены, если это необходимо, гормоны и/или другие факторы роста (такие как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), соли (такие как хлорид натрия, и фосфат кальция и магния), буферы (такие как HEPES), нуклеотиды (такие как аденозин и тимидин), антибиотики (такие как лекарственное средство GENTAMYCIN), микроэлементы (определенные как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях в микромолярных дозах) и глюкоза или эквивалентный источник энергии. Могут быть также включены любые другие необходимые добавки в соответствующих концентрациях, известных специалистам в данной области. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п., аналогичны условиям, ранее используемым для экспрессии выбранных клеток-хозяев, и известны среднему специалисту в данной области.
5. Детектирование амплификации/экспрессии гена
in situ
Амплификация и/или экспрессия гена может быть измерена в образце непосредственно, например, с применением стандартных методов Саузерн-блоттинга, нозерн-блоттинга для количественной оценки транскрипции мРНК [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], дот-блоттинга (анализа ДНК), или гибридизации  с использованием соответствующим образом помеченного зонда, исходя из описанных в настоящем описании последовательностей. Альтернативно, могут быть использованы антитела, которые могут распознавать специфические дуплексы, включая ДНК-дуплексы, РНК-дуплексы и гибридные дуплексы ДНК-РНК или дуплексы ДНК-белок. Антитела, в свою очередь, могут быть помечены, и может быть проведен анализ, в котором дуплекс присоединяют к поверхности так, чтобы после образования дуплекса на поверхности можно было детектировать присутствие антитела, связанного с дуплексом.
Альтернативно, экспрессия гена может быть измерена иммунологическими методами, такими как иммуногистохимическое окрашивание клеток или тканевых срезов и анализ клеточной культуры или физиологических жидкостей для прямой и количественной оценки экспрессии генного продукта. Антитела, подходящие для иммуногистохимического окрашивания и/или анализа образцов физиологической жидкости, могут быть моноклоенальными или поликлональными, и могут быть получены у любого млекопитающего. В основном, могут быть получены антитела против нативной последовательности полипептида TAT или против синтетического пептида, полученного на основе описанных в настоящем описании последовательностей ДНК, или против экзогенной последовательности, слитой с ДНК TAT и кодирующей эпитоп для специфического антитела.
Очистка анти-TAT антитела и полипептида ТАТ
6.
Формы анти-TAT антитела и полипептида ТАТ могут быть выделены из культуральной среды или из лизатов клеток-хозяев. Если антитела являются мембраносвязанными, то они могут быть выделены из мембраны с использованием подходящего раствора детергента (например, тритона Х-100) или путем ферментативного расщепления. Клетки, используемые для экспрессии анти-TAT антитела или полипептида ТАТ, могут быть подвергнуты дизрупции различными физическими или химическими методами, такими как проведение цикла замораживания-оттаивания, обработка ультразвуком, механическая дизрупция или использование средств для лизиса клеток.
Может оказаться желательной очистка анти-TAT антитела и полипептида ТАТ от рекомбинантных клеточных белков или полипептидов. Подходящими методами очистки являются следующие методы: фракционирование на ионообменной колонке; преципитация этанолом; обращенно-фазовая ВЭЖХ; хроматография на двуокиси кремния или на катионообменной смоле, такой как DEAE; хроматофокусирование; электрофорез в ДСН-ПААГ; преципитация сульфатом аммония; гель-фильтрация с использованием, например, сефадекса G-75; очистка на колонках с белок А-сефарозой для удаления примесей, таких как IgG; и очистка на колонках, образующих хелатные комплексы с металлом, связывающиеся с меченными эпитопом формами анти-TAT антитела и полипептида ТАТ. Могут быть применены различные методы очистки белков, и такие методы известны специалистам и описаны, например, в публикации Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). Выбор стадии(й) очистки зависит, например, от природы используемого способа продуцирования и от конкретно продуцируемого анти-TAT антитела или полипептида ТАТ.
E. coli
C применением техники рекомбинантных ДНК, антитело может быть продуцировано внутри клеток или в периплазматическом пространстве, либо оно может быть непосредственно секретировано в среду. Если в первой стадии антитело продуцируется внутри клеток, то клеточный дебрис или клетки-хозяева или их лизированные фрагменты удаляют, например, путем центрифугирования или ультрафильтрации. В публикации Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) описана процедура выделения антител, которые секретируются в периплазматическое пространство . Вкратце, клеточную пасту оттаивают в присутствии ацетата натрия (рН 3,5), EDTA, и фенилметилсульфонилфторида (PMSF) в течение приблизительно 30 минут. Клеточный дебрис может быть удален путем центрифугирования. Если антитело секретируется в среду, то обычно сначала концентрируют супернатанты, полученные из таких экспрессионных систем, с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрирования белков, например, устройства для ультрафильтрации Amicon или Millipore Pellicon. Для ингибирования протеолиза, в любой из предшествующих стадий может быть использован ингибитор протеазы, такой как PMSF, а для предупреждения размножения случайно вносимых примесных микроорганизмов могут быть использованы антибиотики.
TM
ТМ
Композиция антитела, полученная из клеток, может быть очищена, например, с помощью хроматографии на гидроксиапатитах, гель-электрофореза, диализа и аффинной хроматографии, при этом, предпочтительным методом очистки является аффинная хроматография. Пригодность белка А в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа любого Fc-домена иммуноглобулина, присутствующего в данном антителе. Белок А может быть использован для очистки антител, содержащих тяжелые цепи γ1, γ2 или γ4 иммуноглобулина человека (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Для всех изотипов мыши и для цепи γ3 человека рекомендуется G-белок (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). В качестве матрицы, с которой связывается аффинный лиганд, наиболее часто используется агароза, но могут быть использованы и другие матрицы. Механически стабильные матрицы, такие как стекло с регулируемым размером пор или поли(стиролдивинил)бензол, обеспечивают более высокую скорость потока и позволяют сократить время обработки, чем это может быть достигнуто с использованием агарозы. Если антитело содержит домен CH3, то для его очистки может быть использована смола Bakerbond ABX (J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.). В зависимости от выделяемого антитела могут быть также применены и другие методы очистки белка, такие как фракционирование на ионообменной колонке, преципитация этанолом, обращенно-фазовая ВЭЖХ, хроматография на двуокиси кремния, хроматография на гепарин-сефарозе, хроматография на анионо- или катионообменной смоле (например, на колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, электрофорез в ДСН-ПААГ и преципитация сульфатом аммония.
После проведения любой(ых) предварительной(ых) стадии(й) очистки, смесь, содержащая представляющее интерес антитело и примеси, может быть подвергнута гидрофобной хроматографии при низком рН с использованием элюирующего буфера при рН примерно 2,5-4,5, предпочтительно, при низкой концентрации соли (например, примерно 0-0,25М соли).
J. Фармацевтические композиции
ТМ
ТМ
Терапевтические композиции, содержащие анти-TAT антитела, ТАТ-связывающие олигопептиды, ТАТ-связывающие органические молекулы и/или полипептиды ТАТ, используемые в соответствии с настоящим изобретением, получают в удобных для хранения формах путем смешивания антитела, полипептида, олигопептида или органической молекулы, имеющих нужную степень чистоты, с необязательными физиологически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), с получением лиофилизованных препаратов или водных растворов. Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы в используемых дозах и концентрациях должны быть нетоксичными для реципиентов, и ими являются буферы, такие как ацетат, трис, фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензэтония; фенолоспирт, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные полипептиды (имеющие примерно менее, чем 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие средства, такие как EDTA; средства, придающие тоничность, такие как трегалоза и хлорид натрия; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат; солеобразующие противоионы, такие как натрий; металлокомплексы (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как твин, плюроник или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Антитело, предпочтительно, используют в концентрации 5-200 мг/мл, а более предпочтительно, 10-100 мг/мл.
Описанные в настоящем описании композиции могут также содержать более, чем одно активное соединение, необходимое для лечения конкретного показания, предпочтительно, имеющее дополнительные активности, не оказывающие негативного влияния друг на друга. Так, например, помимо анти-TAT антитела, ТАТ-связывающего олигопептида или ТАТ-связывающей органической молекулы может оказаться желательным включение в одну композицию дополнительного антитела, например, «второго» анти-TAT антитела, которое связывается с другим эпитопом на полипептиде ТАТ, или антитела против некоторых других мишеней, таких как фактор роста, который влияет на рост конкретной раковой опухоли. Альтернативно или дополнительно, указанная композиция может также содержать химиотерапевтическое средство, цитотоксическое средство, цитокин, рост-ингибирующее средство, антигормональное средство и/или кардиопротективное средство. Такие молекулы могут присутствовать в комбинации в количествах, эффективных для применения в нужных целях.
Активные ингредиенты могут быть также заключены в микрокапсулы, полученные, например, методами коацервации или путем межфазной полимеризации, например, в гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и полиметилметакрилатные микрокапсулы, соответственно, в системы для доставки коллоидных лекарственных средств (например, в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такая методика описана в руководстве Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
TM
Могут быть получены препараты пролонгированного высвобождения. Подходящими примерами препаратов пролонгированного высвобождения являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, где указанные матрицы имеют форму готовых изделий, например, пленок или микрокапсул. Примерами матриц пролонгированного высвобождения являются полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, неразлагаемый сополимер этилена-винилацетата, разлагаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT (микросферы для инъекций, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и ацетата лейпролида), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота.
in vivo
Фармацевтические композиции, используемые для введения , должны быть стерильными. Это может быть легко достигнуто путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.
Диагностика и лечение с использованием анти-TAT антител, ТАТ-связывающих олигопептидов и ТАТ-связывающих органических молекул
K.
Для определения экспрессии TAT при раковом заболевании могут быть проведены различные детектирующие анализы. В одном из вариантов изобретения, сверхэкспрессия полипептида TAT может быть оценена с помощью иммуногистохимического анализа (IHC). Залитые в парафин срезы ткани, полученные при биопсии опухоли, могут быть подвергнуты IHC-анализу и оценены по интенсивности окраски белка TAT в соответствии с нижеследующими критериями:
Оценка 0 - окрашивание отсутствует или наблюдается окрашивание мембраны у менее, чем 10% опухолевых клеток.
Оценка 1+ - очень слабое/едва заметное окрашивание мембраны, детектируемое у более, чем 10% опухолевых клеток. При этом, указанные клетки окрашены только в части их мембраны.
Оценка 2+ - слабое или умеренное окрашивание всей мембраны, наблюдаемое у более, чем 10% опухолевых клеток.
Оценка 3+ - умеренное или сильное окрашивание всей мембраны, наблюдаемое у более, чем 10% опухолевых клеток.
Опухоли, проанализированные на сверхэкспрессию TAT и получившие оценки 0 или 1+, могут быть охарактеризованы как опухоли, в которых не наблюдается сверхэкспрессия TAT, а опухоли с оценками 2+ или 3+ могут быть охарактеризованы как опухоли, сверхэкспрессирующие TAT.
TM
TM
Альтернативно или дополнительно, анализы FISH, такие как INFORM (разработанные Ventana Co., Arizona) или PATHVISION (Vysis, Illinois) могут быть осуществлены на фиксированных формалином и залитых в парафин опухолевых тканях для определения уровня сверхэкспрессии TAT (если она присутствует) в опухоли.
in vivo
Сверхэкспрессия или амплификация TAT может быть оценена с помощью детектирующего анализа , например, путем введения молекулы (такой как антитело, олигопептид и органической молекулы), которая связывается с детектируемой молекулой; мечения детектируемой меткой (например, радиоактивным изотопом или флуоресцентной меткой) и наружного сканирования пациента для определения локализации метки.
in vitro
Как было описано выше, анти-TAT антитела, олигопептиды и органические молекулы согласно изобретению, помимо терапевтического применения, могут быть использованы и в других различных целях. Анти-TAT антитела, олигопептиды и органические молекулы согласно изобретению могут быть использованы для диагностики и определения стадии развития раковой опухоли, экспрессирующей полипептид TAT (например, при радиоактивной визуализации). Эти антитела, олигопептиды и органические молекулы могут быть также использованы для очистки или иммунопреципитации полипептида TAT из клеток, для детектирования и количественной оценки полипептида TAT , например, в ELISA-анализе или в вестерн-блот-анализе с уничтожением и элиминацией TAT-экспрессирующих клеток из популяции смешанных клеток, как стадии при очистке других клеток.
В настоящее время, в зависимости от стадии развития рака, лечение рака включает проведение одной или комбинации из нижеследующих курсов терапии, а именно: хирургической операции по удалению раковой ткани, лучевой терапии и химиотерапии. Лечение анти-TAT антителом, олигопептидом и органической молекулой может быть особенно желательным для пожилых пациентов, которые плохо переносят токсическое и побочное действие химиотерапии, и при метастазах, когда лучевая терапия имеет ограниченное применение. Противоопухолевые нацеливающие анти-TAT антитела, олигопептиды и органические молекулы согласно изобретению могут быть использованы для подавления роста TAT-экспрессирующей раковой опухоли после первоначального установления диагноза заболевания или во время рецидива заболевания. В терапевтических целях, анти-TAT антитело, олигопептид или органическая молекула могут быть использованы отдельно или в комбинированной терапии, например, вместе с гормональной терапией, антиангиогенной терапией или терапией с использованием радиоактивно меченых соединений, или вместе с хирургическим вмешательством, криотерапией и/или лучевой терапией. Лечение анти-TAT антителом, олигопептидом или органической молекулой может быть осуществлено в комбинации с другими формами стандартной терапии, либо одновременно со стандартной терапией, либо до или после проведения такой терапии. При лечении рака, а в частности, у пациентов с высоким риском развития данного заболевания, используются такие химиотерапевтические средства, как TAXOTERE (доцетаксел), TAXOL (паклитаксел), эстрамустин и митоксантрон. В способе согласно изобретению, применяемом для лечения или ослабления симптомов рака, пациенту с раком может быть введено анти-TAT антитело, олигопептид или органическая молекула в комбинации с одним или несколькими вышеуказанными химиотерапевтическими средствами. В частности, рассматривается также комбинированная терапия, осуществляемая с использованием паклитаксела и его модифицированных производных (см., например, EP0600517). Анти-TAT антитело, олигопептид или органическую молекулу вводят вместе с терапевтически эффективной дозой химиотерапевтического средства. В другом варианте осуществления изобретения, анти-TAT антитело, олигопептид или органическую молекулу вводят в комбинации с химиотерапией для повышения активности и эффективности химиотерапевтического средства, например, паклитаксела. В справочном руководстве для врачей (PDR) указаны дозы средств, которые были использованы для лечения различных раковых заболеваний. Схемы лечения и введения доз вышеупомянутых химиотерапевтических лекарственных средств, которые являются терапевтически эффективными, зависят от конкретного ракового заболевания, подвергаемого лечению, степени развития данного заболевания, и других факторов, которые известны специалисту в данной области, и которые могут быть определены лечащим врачом.
В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения, пациенту вводят конъюгат, содержащий анти-TAT антитело, олигопептид или органическую молекулу, конъюгированные с цитотоксическим средством. Предпочтительно, иммуноконъюгат, связанный с белком TAT, интернализуется в клетке, что приводит к повышению терапевтической эффективности иммуноконъюгата в отношении уничтожения раковых клеток, с которыми они связываются. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, цитотоксическое средство нацелено на нуклеиновую кислоту раковых клеток или ингибирует ее действие. Примеры таких цитотоксических средств описаны выше, и такими средствами являются майтанзиноиды, калихеамицины, рибонуклеазы и ДНК-эндонуклеазы.
Анти-TAT антитела, олигопептиды, органические молекулы или их конъюгаты с токсинами вводят человеку в соответствии с известными методами, такими как внутривенное введение, например, в виде ударной дозы или путем непрерывного вливания в течение определенного периода времени, а также внутримышечно, внутрибрюшинно, вовнутрь цереброспинальной жидкости, подкожно, внутрисуставно, вовнутрь синовиальной жидкости, интратекально, перорально, местно или путем ингаляции. Предпочтительным является внутривенное или подкожное введение антитела, олигопептида или органической молекулы.
Другие курсы терапии могут быть объединены с введением анти-TAT антитела, олигопептида или органической молекулы. Комбинированное введение включает совместное введение отдельных препаратов или одного фармацевтического препарата и их последовательное введение в любом порядке, предпочтительно, в течение периода времени, за который оба (или все) активных средства одновременно проявляют свою биологичесую активность. При этом, предпочтительно, чтобы такая комбинированная терапия давала синергический терапевтический эффект.
Может также оказаться желательным проведение комбинированного введения анти-TAT антитела или антител, олигопептидов или органических молекул вместе с введением антитела против другого опухолевого антигена, связанного с конкретным раковым заболеванием.
В другом варианте осуществления изобретения, способы терапевтического лечения согласно изобретению включают комбинированное введение анти-TAT антитела (или антител), олигопептидов или органических молекул и одного или нескольких химиотерапевтических средств или рост-ингибирующих средств, включая совместное введение смеси из различных химиотерапевтических средств. Химиотерапевтическими средствами являются фосфат эстрамустина, преднимустин, цисплатин, 5-фторурацил, мелфалан, циклофосфамид, гидроксимочевина и гидроксимочевинные таксаны (такие как паклитаксел и доцетаксел) и/или антрациклиновые антибиотики. Способы получения и схемы введения таких химиотерапевтических средств могут быть проведены в соответствии с инструкциями производителей, либо они могут быть эмпирически подобраны самим специалистом. Способы получения и схемы введения химиотерапевтических средств также описаны в публикации "Chemotherapy Service", Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md (1992).
Антитело, олигопептид или органическая молекула могут быть объединены с противогормональным соединением, например, антиэстрогенным соединением, таким как тамоксифен; антипрогестероновым соединением, таким как онапристон (см. EP 616812) или антиандрогеновым соединением, таким как флутамид, в дозах, обычно применяемых для введения таких молекул. Если раком, подвергаемым лечению, является андроген-зависимый рак, то пациент может быть предварительно подвергнут антиандрогенной терапии, а затем, после того, как рак станет андроген-независимым, пациенту могут быть введены анти-TAT антитело, олигопептид или органическая молекула (и необязательно другие описанные в настоящем описании средства).
Иногда, может также оказаться желательным совместное введение пациенту средства для профилактики сердечно-сосудистых заболеваний (для предупреждения или снижения нарушения функции миокарда, связанного с данной терапией), или одного или нескольких цитокинов. Помимо вышеуказанных терапевтических схем лечения, пациент может быть подвергнут хирургической операции по поводу удаления раковых клеток и/или он может быть подвергнут лучевой терапии, проводимой до, во время или после терапии антителом, олигопептидом или органической молекулой. Подходящими дозами для любых из вышеуказанных совместно вводимых средств являются используемые в настоящем описании дозы, и эти дозы могут быть снижены благодаря комбинированному (синергическому) действию указанного средства и анти-TAT антитела, олигопептида или органической молекулы.
Для профилактики или лечения заболевания, подходящие дозы и схемы введения лекарственного средства могут быть выбраны врачом в соответствии с известными критериями. Соответствующие дозы антитела, олигопептида или органической молекулы зависят от типа заболевания, подвергаемого лечению, как определено выше, тяжести и курса лечения заболевания, независимо от того вводят ли указанное антитело, олигопептид или органическую молекулу в профилактических или терапевтических целях, от проводимого ранее лечения, от истории болезни пациента и его восприимчивости к данному антителу, олигопептиду или органической молекуле и от назначения лечащего врача. Такое антитело, олигопептид или органическая молекула могут быть введены пациенту один раз или несколько раз во время проведения курса лечения. Предпочтительно, антитело, олигопептид или органическую молекулу вводят путем внутривенной инъекции или подкожной инъекции. В зависимости от типа и тяжести заболевания, начальная предварительно установленная доза антитела, вводимого пациенту, составляет примерно от 1 мкг/кг до 50 мг/кг массы тела (например, примерно 0,1-15 мг/кг/дозу), независимо от того, осуществляют ли одноразовое или многократное введение или непрерывную инфузию данного антитела. Схема введения дозы может включать введение первоначальной нагрузочной дозы анти-TAT антитела, составляющей примерно 4 мг/кг, с последующим еженедельным введением поддерживающей дозы, составляющей примерно 2 мг/кг анти-TAT антитела. Однако могут быть проведены и другие схемы введения доз. Типичная суточная доза может составлять примерно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от вышеупомянутых факторов. Для повторного введения в течение нескольких дней или более, в зависимости от состояния, лечение может проводиться до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое подавление симптомов заболевания. Мониторинг эффекта такой терапии может быть легко проведен стандартными методами, с помощью анализов и в соответствии с критериями, известными врачу или другим специалистам в данной области.
В настоящей заявке, помимо введения белка-антитела пациенту, рассматривается также введение антитела методом генной терапии. Такое введение нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, входит в объем термина «введение терапевтически эффективного количества антитела». См., например, заявку WO96/07321, опубликованную 14 марта, 1996, и относящуюся к применению генной терапии для продуцирования внутриклеточных антител.
in vivo
ex vivo
in vivo
ex vivo
in vitro
in vivo
in vitro
ex vivo
Существует два основных способа введения нуклеиновой кислоты (необязательно содержащейся в векторе) в клетки пациента,  и . Для  доставки, нуклеиновую кислоту непосредственно вводят пациенту, а обычно, в участок, в который требуется введение антитела. Для лечения делают забор клеток пациента, а затем в эти выделенные клетки вводят нуклеиновую кислоту, и модифицированные клетки вводят пациенту либо непосредственно, либо, например, в виде капсул в пористых мембранах, которые имплантируют пациенту (см., например, патенты США № 4892538 и 5283187). Существует ряд методов введения нуклеиновых кислот в жизнеспособные клетки. Такие методы могут варьироваться в зависимости от того, вводят ли нуклеиновую кислоту в клетки, культивированные , или ее вводят  в клетки хозяина, для которого они предназначены. Методами, подходящими для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих , являются методы с применением липосом, электропорация, микроинжекция, слияние клеток, метод с применением DEAE-декстрана, метод преципитации фосфатом кальция и т.п. Наиболее часто используемым вектором для доставки гена  является ретровирусный вектор.
in vivo
В настоящее время, предпочтительными методами переноса нуклеиновой кислоты  являются трансфекция вирусными векторами (такими как аденовирсус, вирус простого герпеса I или аденоассоциированный вирус) и липидные системы (подходящими липидами для липид-опосредуемого переноса гена являются, например, DOTMA, DOPE и DC-Chol). Описание используемых в настоящее время протоколов мечения генов и генной терапии можно найти в публикации Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). См. также заявку WO 93/25673 и цитируемые в ней работы.
Объем употребляемого в настоящем описании термина «антитело» могут входить различные формы анти-TAT антител согласно изобретению. Таким образом, антителами являются полноразмерное или интактное антитело, фрагменты антитела, антитело с нативной последовательностью или его аминокислотные варианты, гуманизированные, химерные или слитые антитела, иммуноконъюгаты и их функциональные фрагменты. В слитых антителах, последовательность антитела присоединена к гетерологичной полипептидной последовательности. Антитела могут быть модифицированы в Fc-области для сообщения нужных эффекторных функций. Как обсуждалось более подробно в представленных в настоящем описании разделах, посвященных соответствующим Fc-областям, «голое» антитело, связанное с клеточной поверхностью, может индуцировать цитотоксичность, например, благодаря антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или рекрутинга комплемента в случае комплемент-зависимой цитотоксичности или по некоторым другим механизмам. Альтернативно, если желательно элиминировать или ослабить эффекторную функцию, для минимизации побочных эффектов или осложнений при терапии, то могут быть использованы некоторые другие Fc-области.
in vivo
В одном из вариантов осуществления изобретения, антитело конкурирует за связывание или, по существу, связывается с тем же эпитопом, с которым связываются антитела согласно изобретению. Также рассматриваются антитела, обладающие биологическими свойствами анти-TAT антител согласно изобретению, в частности, включая доставку в опухоль  и любое ингибирование пролиферации клеток, или цитотоксическими свойствами.
Методы продуцирования вышеуказанных антител подробно описаны в настоящей заявке.
in vitro
in vivo
Анти-TAT антитела, олигопептиды и органические молекулы согласно изобретению могут быть использованы для лечения TAT-экспрессирующих раковых опухолей или ослабления одного или нескольких симптомов рака у млекопитающего. Такими раковыми заболеваниями являются рак предстательной железы, рак мочевых путей, рак легких, рак молочной железы, рак толстой кишки и рак яичника, а более конкретно, аленокарцинома предстательной железы, почечно-клеточные карциномы, аденокарциномы прямой и ободочной кишки, аденокарциномы легких, плоскоклеточные карциномы легких и мезотелиома плевры. Термин «рак» включает метастазы любого из вышеупомянутых заболеваний. Указанные антитело, олигопептид или органическая молекула обладают способностью связываться по меньшей мере с частью раковых клеток, экспрессирующих полипептид TAT у млекопитающего. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, антитело, олигопептид или органическая молекула являются эффективными для разрушения или уничтожения TAT-экспрессирующих опухолевых клеток, или ингибирования роста таких опухолевых клеток  или  после связывания антитела, олигопептида или органической молекулы с полипептидом TAT на клетках. Таким антителом является «голое» анти-TAT антитело (не конъюгированное с каким-либо средством). «Голые» антитела, которые обладают цитотоксическими свойствами или свойствами, направленными на ингибирование роста клеток, могут быть также присоединены к цитотоксическому средству, что делает их еще более эффективными в отношении деструкции опухолевых клеток. Цитотоксические свойства могут быть сообщены анти-TAT антителу, например, путем конъюгирования указанного антитела с цитотоксическим средством, с образованием описанного в настоящем описании иммуноконъюгата. Такое цитотоксическое средство или рост-ингибирующее средство, предпочтительно, являются низкомолекулярными. Предпочтительными также являются токсины, такие как калихеамицин или майтанзиноид и его аналоги или производные.
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей анти-TAT антитело, олигопептид или органическую молекулу согласно изобретению и носитель. Для лечения рака, композиции могут быть введены пациенту, нуждающемуся в таком лечении, где указанная композиция может содержать одно или несколько анти-TAT антител, присутствующих в виде иммуноконъюгата или в виде «голого» антитела. В другом варианте осуществления изобретения, указанные композиции могут содержать эти антитела, олигопептиды и органические молекулы в комбинации с другими терапевтическими средствами, такими как цитотоксические средства или рост-ингибирующие средства, включая химиотерапевтические средства. Настоящее изобретение также относится к препаратам, содержащим анти-TAT антитело, олигопептид или органическую молекулу согласно изобретению и носитель. В одном из вариантов антитела, указанным препаратом является терапевтический препарат, содержащий фармацевтически приемлемый носитель.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, кодирующим анти-TAT антитела. Этот термин также охватывает нуклеиновые кислоты, кодирующие цепи H и L, а в частности остатки гипервариабельной области; цепи нуклеиновых кислот, кодирующие антитело с нативной последовательностью, а также их варианты, модификации и гуманизированные варианты антитела.
Настоящее изобретение также относится к способам лечения раковой опухоли, экспрессирующей полипептид TAT, или к ослаблению одного или нескольких симптомов рака у млекопитающего, где указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества анти-TAT антитела, олигопептида или органической молекулы млекопитающему. Терапевтические композиции, содержащие антитело, олигопептид или органическую молекулу, могут быть введены в течение непродолжительного периода времени (однократное введение) либо постоянно в течение длительного периода времени, либо периодически, в зависимости от назначения врача. Настоящее изобретение также относится к способам ингибирования роста клеток, экспрессирующих полипептид TAT, и уничтожение этих клеток.
in vitro
Настоящее изобретение также относится к наборам и промышленным изделиям, содержащим по меньшей мере одно анти-TAT антитело, олигопептид или органическую молекулу. Наборы, содержащие анти-TAT антитела, олигопептиды и органические молекулы, могут быть использованы, например, для анализа на уничтожение TAT-клеток, а также для очистки или иммунопреципитации полипептида TAT из клеток. Так, например, для выделения и очистки TAT, указанный набор может содержать анти-TAT антитело, олигопептид или органическую молекулу, связанные с бусами (например, сефарозными бусами). Могут быть получены наборы, которые содержат антитела, олигопептиды или органические молекулы для детектирования и количественной оценки TAT, например, с помощью ELISA или вестерн-блот-анализа. Такие антитела, олигопептиды или органические молекулы, используемые для детектирования, могут быть связаны с меткой, такой как флуоресцентная или радиоактивная метка.
Промышленные изделия и наборы
L.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к промышленному изделию, содержащему материалы, используемые для лечения TAT-экспрессирующей раковой опухоли. Такое промышленное изделие содержит упаковку, а также этикетку, наклеенную на эту упаковку, или вкладыш, вложенный в такую упаковку. Подходящими упаковками являются, например, бутыли, флаконы, шприцы и т.п. Эти упаковки могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Указанная упаковка содержит композицию, которая является эффективной для лечения ракового заболевания, и может иметь стерильное входное отверстие (например, такой упаковкой может быть пакет для внутривенного введения раствора или сосуд, имеющий пробку, протыкаемую иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере одним активным средством в указанной композиции является анти-TAT антитело, олигопептид или органическая молекула согласно изобретению. На этикетке или во вкладыше, вложенном в упаковку, должно быть указано, что данная композиция используется для лечения рака. Этикетка или вкладыш в упаковку может также содержать инструкции по введению композиции антитела, олигопептида или органической молекулы пациенту, страдающему раковым заболеванием. Кроме того, указанное промышленное изделие может также включать вторую упаковку, содержащую фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, такое изделие может также включать и другие материалы, необходимые с точки зрения промышленного производства и потребителя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
in vitro
in vitro
Настоящее изобретение также относится к наборам, которые могут быть использованы в различных целях, например, для анализов на уничтожение TAT-экспрессирующих клеток, для очистки или иммунопреципитации полипептида TAT из клеток. Для выделения и очистки полипептида TAT, набор может содержать анти-TAT антитело, олигопептид или органическую молекулу, связанные с бусами (например, с сефарозными бусами). Могут быть получены наборы, которые содержат антитела, олигопептиды или органические молекулы, для детектирования и количественной оценки полипептида TAT , например, в ELISA-анализе или в вестерн-блот-анализе. Указанный набор, как и промышленное изделие, содержит упаковку, и этикетку, наклеенную на эту упаковку, или вкладыш, вложенный в такую упаковку. Эта упаковка содержит композицию, включающую по меньшей мере одно анти-TAT антитело, олигопептид или органическую молекулу согласно изобретению. Могут быть также включены и другие упаковки, которые содержат, например, разбавители, буферы и контрольные антитела. Этикетка или вкладыш в упаковку могут содержать описание композиции, а также инструкции по ее применению  или в диагностике.
M. Применение полипептидов ТАТ и нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид ТАТ
Нуклеотидные последовательности (или их комплемент), кодирующие полипептиды TAT, применяются в молекулярной биологии в различных целях, включая их применение в качестве гибридизационных зондов, при картировании хромосом и генов и при получении антисмысловых РНК- и ДНК-зондов. TAT-кодирующая нуклеиновая кислота может быть также использована для получения полипептидов TAT описанными в настоящем описании рекомбинантными методами, где указанные полипептиды TAT могут быть использованы, например, для получения описанных в настоящем описании анти-TAT антител.
32
35
Ген TAT с полноразмерной нативной последовательностью или его частью могут быть использованы в качестве гибридизационных зондов для библиотеки кДНК в целях выделения полноразмерной кДНК ТАТ или других кДНК (например, кДНК, кодирующих природные варианты TAT или TAT других видов), которые имеют нужную последовательность, идентичную описанной в настоящем описании нативной последовательности TAT. Длина зондов составляет, но необязательно, примерно 20-50 оснований. Гибридизационные зонды могут происходить, по меньшей мере частично, от новых областей полноразмерной нативной нуклеотидной последовательности, где указанные области могут быть определены без излишнего экспериментирования, или от геномных последовательностей, включая промоторы, энхансерные элементы и интроны нативной последовательности ТАТ. Так, например, метод скрининга включает выделение кодирующей области гена ТАТ с использованием известной последовательности ДНК с получением отобранного зонда размером примерно 40 оснований. Гибридизационные зонды могут быть помечены различными метками, включая радионуклеотиды, такие как P или S, или ферментативными метками, такими как щелочная фосфатаза, связанная с зондом посредством конъюгирования авидина с биотином. Меченые зонды, имеющие последовательность, комплементарную последовательности гена ТАТ согласно изобретению, могут быть использованы для скринига библиотек кДНК человека, геномной ДНК или мРНК для того, чтобы определить, какие члены указанных библиотек будут гибридизироваться с зондом. Методы гибридизации более подробно описаны ниже в примерах. Аналогичным образом, в качестве зондов могут быть использованы последовательности EST, описанные в настоящей заявке и полученные описанными в настоящем описании методами.
Другими подходящими фрагментами ТАТ-кодирующих нуклеиновых кислот являются антисмысловые или смысловые олигонуклеотиды, содержащие одноцепочечную последовательность нуклеиновой кислоты (либо РНК, либо ДНК), способную связываться с последовательностями мРНК ТАТ-мишени (смысловой) или ДНК ТАТ-мишени (антисмысловой). Антисмысловые или смысловые олигонуклеотиды согласно изобретению содержат фрагмент кодирующей области ДНК ТАТ. Такой фрагмент обычно содержит по меньшей мере примерно 14 нуклеотидов, предпочтительно, примерно 14-30 нуклеотидов. Осуществление дериватизации антисмыслового или смыслового олигонуклеотида на основе последовательности кДНК, кодирующей данный белок, описано, например, Stein и Cohen (Cancer Res.48:2659, 1988) и van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988).
in vivo
Связывание антисмысловых или смысловых олигонуклеотидов с последовательностями нуклеиновой кислоты-мишени приводит к образованию дуплексов, которые блокируют транскрипцию или трансляцию последовательности-мишени по одному из нескольких механизмов, включая усиление степени разложения дуплексов, преждевременную терминацию транскрипции или трансляции, или по другим механизмам. Такие способы входят в объем настоящего изобретения. Таким образом, антисмысловые олигонуклеотиды могут быть использованы для блокирования экспрессии белков ТАТ, где указанные белки ТАТ могут играть определенную роль в индуцировании развития рака у млекопитающих. Антисмысловые или смысловые олигонуклеотиды также содержат олигонуклеотиды, имеющие модифицированные остовы, содержащие сахар-фосфодиэфир (или другие сахарные связи, такие как связи, описанные в WO 91/06629), где указанные сахарные связи являются резистентными к эндогенным нуклеазам. Такие олигонуклеотиды с резистентными сахарными связями являются стабильными  (то есть устойчивыми к ферментативному расщеплению), но сохраняют специфичность последовательности, способной связываться с нуклеотидными последовательностями-мишенями.
'
Предпочтительными внутригенными сайтами для антисмыслового связывания являются область, включающая кодон инициации трансляции/старт-кодон (5'-AUG/5'-ATG) или кодон терминации трансляции/стоп-кодон (5'-UAA, 5'-UAG и 5-UGA/5'-TAA, 5'-TAG и 5-TGA) открытой рамки считывания (ОРС) гена. Эти области представляют собой часть мРНК или гена, которая охватывает примерно 25-50 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов в любом направлении (то есть, в направлении 5' или 3') от кодона инициации или терминации трансляции. Другими предпочтительными областями антисмыслового связывания являются: интроны; экзоны; области стыка интрон-экзон; открытая рамка считывания (ОРС) или «кодирующая область», которая представляет собой область, расположенную между кодоном инициации трансляции и кодоном терминации трансляции; 5'-кэп мРНК, который содержит N7-метилированный гуанозиновый остаток, присоединенный к 5'-концевому остатку мРНК посредством 5'-5'-трифосфатной связи, и включает саму структуру 5'-кэпа, а также первые 50 нуклеотидов, смежные с этим кэпом; 5'-нетранслируемая область (5'UTR), часть мРНК в 5'-направлении от кодона инициации трансляции, включающая, тем самым, нуклеотиды между сайтом 5'-кэпа и кодоном инициации трансляции мРНК или соответствующие нуклеотиды на этом гене; и 3'-нетранслируемая область (3'UTR), часть мРНК в 3'-направлении от кодона терминации трансляции, включающая, тем самым, нуклеотиды между кодоном терминации трансляции мРНК и 3'-концом мРНК или соответствующие нуклеотиды на этом гене.
Конкретными примерами предпочтительных антисмысловых соединений, используемых для ингибирования экспрессии белков ТАТ, являются олигонуклеотиды, содержащие модифицированные остовы или неприродные межнуклеозидные связи. Олигонуклеотидами, имеющими модифицированные остовы, являются олигонуклеотиды, в остове которых сохраняется атом фосфора, и олигонуклеотиды, в остове которых атом фосфора отсутствует. В описании настоящей заявки, а иногда и в литературе могут также рассматриваться модифицированные олигонуклеотиды, которые не имеют атома фосфора в своем межнуклеозидном остове. Предпочтительными модифицированными олигонуклеотидными остовами являются, например, фосфортиоаты, хиральные фосфортиоаты, фосфордитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метилфосфонаты и другие алкилфосфонаты, включая 3'-алкиленфосфонаты, 5'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры, селенофосфаты и боранофосфаты, имеющие обычные 3'-5'-связи, 2'-5'-связанные аналоги этих соединений и соединения, имеющие противоположную полярность, где одной или несколькими межнуклеотидными связями являются 3'-3'-, 5'-5'- или 2'-2'-связи. Предпочтительные олигонуклеотиды, имеющие противоположную полярность, содержат одну 3'-3'-связь у 3'-концевой межнуклеотидной связи, то есть, один инвертированный нуклеозидный остаток, который может не являться основанием (где нуклеотидное основание либо отсутствует, либо вместо него присутствует гидроксильная группа). Также рассматриваются различные соли, смешанные соли и свободные кислотные формы. Репрезентативными патентами США, в которых описано образование фосфорсодержащих связей, являются, но не ограничиваются ими, патенты США №: 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177196; 5188897; 5264423; 5276,019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541306; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361; 5194599; 5565555; 5527899; 5721218; 5672697 и 5625050, каждый из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки.
2
Предпочтительные модифицированные олигонуклеотидные остовы, которые, как указывалось ранее, не включают атом фосфора, представляют собой остовы, образованные посредством короткоцепочечных алкильных или циклоалкильных межнуклеозидных связей, смешанных гетероатомсодержащих и алкильных или циклоалкильных межнуклеозидных связей, или одной или несколькими короткоцепочечными гетероатом-содержащими или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Такими остовами являются остовы, имеющие морфолино-связи (образованные частично из сахарной части нуклеозида); силоксановые остовы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы; метиленформацетильные и тиоформацетильные остовы; рибоацетильные остовы; алкенсодержащие остовы; сульфаматные остовы; метиленимино- и метиленгидразино-остовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы; и другие остовы, имеющие смешанные части, состоящие из компонентов N, O, S и CH. Репрезентативными патентами США, в которых описано получение таких олигонуклеозидов, являются, но не ограничиваются ими, патенты США №: 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 5264562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5610289; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437; 5792608; 5646269 и 5677439, каждый из которых вводится в настоящее описание в качестве ссылки.
В других предпочтительных антисмысловых олигонуклеотидах, то есть в остове, состоящем из нуклеотидных звеньев, сахарные и межнуклеозидные связи заменены новыми группами. Такие звенья оснований были сохранены для гибридизации с соответствующим соединением нуклеиновой кислоты-мишени. Было показано, что одно из таких олигомерных соединений, то есть олигонуклеотид-миметик, обладает превосходными гибридизующими свойствами, и такое соединение называется в настоящем описании нуклеиновой кислотой, связанной с пептидом (PNA). В соединениях PNA, сахар-содержащий остов олигонуклеотида заменен амид-содержащим остовом, в частности, аминоэтилглициновым остовом. Нуклеотидные основания были сохранены и непосредственно или опосредованно присоединены к атомам азота аза-группы амидной части остова. Репрезентативными патентами США, в которых описано получение соединений PNA, являются, но не ограничиваются ими, патенты США № 5539082, 5714331 и 5719262, каждый из которых вводится в настоящее описание в качестве ссылки. Другое описание соединений PNA можно найти у Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
2
2
2
3
2
2
3
2
2
3
3
2
3
2
2
2
Предпочтительные антисмысловые олигонуклеотиды включают фосфортиоатные остовы и/или гетероатом-содержащие остовы, а в частности, -CH-NH-О-CH-, -CH-N(CH)-О-CH- [известные как метиленовый (метилимино) или MMI-остов], -CH-О-N(CH)-CH-, -CH-N(CH)-N(CH)-CH- и -О-N(CH)-CH-CH- [где нативный фосфодиэфирный остов представлен как -О-P-О-CH-], описанные в вышеупомянутом патенте США № 5489677, и амидные остовы, описанные в вышеупомянутом патенте США № 5602240. Предпочтительными также являются антисмысловые олигонуклеотиды, имеющие структуры морфолинового остова и описанные в вышеупомянутом патенте США № 5034506.
1
10
2
10
2
n
m
3
2
n
3
2
n
2
2
n
3
2
n
2
2
n
2
n
3
2
1
10
3
3
3
3
2
3
2
2
3
2
2
2
3
2
2
3
2
2
2
2
Модифицированные олигонуклеотиды могут также содержать одну или несколько замещенных сахарных групп. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат одну из нижеследующих групп во 2'-положении: OH; F; O-алкил, S-алкил или N-алкил; O-алкенил, S-алкенил или N-алкенил; O-алкинил, S-алкинил или N-алкинил; или O-алкил-O-алкил, где алкил, алкенил и алкинил могут представлять собой замещенный или незамещенный С-Cалкил или С-Cалкенил и алкинил. Особенно предпочтительными являются О[(CH)O]CH, О(CH)OCH, О(CH)NH, О(CH)CH, О(CH)ONH, и О(CH)ON[(CH)CH)], где n и m представляют собой число от 1 до примерно 10. Другие предпочтительные антисмысловые олигонуклеотиды содержат одну из нижеследующих групп во 2'-положении: низший С-Cалкил, замещенный низший алкил, алкенил, алкинил, алкарил, аралкил, O-алкарил или O-аралкил, SH, SCH, OCN, Cl, Br, CN, CF, OCF, SOCH, SOCH, ONO, NO, N, NH, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, РНК-расщепляющую группу, репортерную группу, интеркалирующую группу; группу, улучшающую фармакокинетические свойства олигонуклеотида, или группу, улучшающую фармакодинамические свойства олигонуклеотида, и другие заместители с аналогичными свойствами. Предпочтительной модификацией является 2'-метоксиэтокси (2'-О-CHCHOCH, также известная как 2'-О-(2-метоксиэтил) или 2'-МОЕ) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), то есть, алкоксиалкокси-группа. Другой предпочтительной модификацией является 2'-диметиламинооксиэтокси, то есть, группа О(CH)ON(CH), также известная как 2'-DMAOE, и описанная в нижеследующих примерах, и 2'-диметиламиноэтоксиэтокси (также известная как 2'-О- диметиламиноэтоксиэтил или 2'-DMAEOE), то есть, 2'-О-CH-О-CH-N(CH).
2
n
Другими предпочтительными модификациями являются блокированные нуклеиновые кислоты (LNA), в которых 2'-гидроксильная группа связана с 3'- или 4'-атомом углерода сахарного кольца, и тем самым образует бициклическую сахарную группу. Предпочтительной связью является метиленовая группа (-CH-), которая связана мостиковой связью с 2'-атомом кислорода и 4'-атомом углерода, где n равно 1 или 2. LNA и их получение описаны в WO 98/39352 и WO 99/14226.
3
2
2
2
2
2
2
2
2
Другими предпочтительными модификациями являются 2'-метокси (2'-О-CH), 2'-аминопропокси (2'-OCHCHCHNH), 2'-аллил (2'-CH-CH=CH), 2'-О-аллил (2'-О-CH-CH=CH) и 2'-фтор (2'-F). 2'-модификация может присутствовать в арабино-положении (верхнем) или в рибо-положении (нижнем). Предпочтительной 2'-арабино-модификацией является 2'-F. Аналогичные модификации могут быть также сделаны в других положениях олигонуклеотида, предпочтительно, в 3'-положении сахара на 3'-концевом нуклеотиде или в 2'-5'-связанных олигонуклеотидах, и в 5'-положении 5'-концевого нуклеотида. Олигонуклеотиды могут также иметь сахарные миметики, такие как циклобутильные группы, введенные вместо пентофуранозильного сахара. Репрезентативными патентами США, в которых описано получение таких структур модифицированного сахара, являются, но не ограничиваются ими, патенты США №: 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633; 5792747; и 5700920, каждый из которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
3
2
Олигонуклеотиды могут также включать модификации или замены нуклеотидных оснований (часто называемые просто «основаниями»). Используемый в настоящем описании термин «немодифицированные» или «природные» нуклеотидные основания включает пуриновые основания, такие как аденин (A) и гуанин (G), и пиримидиновые основания, такие как тимин (T), цитозин (C) и урацил (U). Модифицированными нуклеотидными основаниями являются другие синтетические и природные нуклеотидные основания, такие как 5-метилцитозин (5-me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил- и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропильные и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинил (-C=C-CH или -CH-C=CH)урацил и цитозин и другие алкинильные производные пиримидиновых оснований, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, 8-амино-, 8-тиол-, 8-тиоалкил-, 8-гидроксил- и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген-, в частности, 5-бром-, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 2-F-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Другими модифицированными нуклеотидными основаниями являются трициклические пиримидины, такие как феноксазинцитидин (1H-пиримидо[5,4-b][1,4]бензоксазин-2(3H)-он), фенотиазинцитидин (1H-пиримидо[5,4-b][1,4]бензотиазин-2(3H)-он), G-сопряженные группы, такие как замещенный феноксазинцитидин (например, 9-(2-аминоэтокси)-H-пиримидо[5,4-b][1,4]бензоксазин-2(3H)-он), карбазолцитидин (2H-пиримидо[4,5-b]индол-2-он), пиридоиндолцитидин (H-пиридо[3',2':4,5]пирроло[2,3-d]пиримидин-2-он). Модифицированными нуклеотидными основаниями также являются основания, в которых пуриновое или пиримидиновое основание заменено другими гетероциклами, например, 7-деазааденин, 7-деазагуанозин, 2-аминопиридин и 2-пиридон. Другими нуклеотидными основаниями являются основания, описанные в патенте США No. 3687808, основания, описанные в The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, и основания, описанные Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613. Некоторые из этих нуклеотидных оснований являются особенно подходящими для повышения аффинности связывания олигомерных соединений согласно изобретению. Такими нуклеотидными основаниями являются 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2-, N-6- и О-6-замещенные пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Было показано, что замещения 5-метилцитозином приводят к повышению стабильности дуплекса нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2°C (Sanghvi et al., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), и такие замены оснований являются предпочтительными, особенно предпочтительными, если они используются в комбинации с модификациями 2'-О-метоксиэтилсахаров. Репрезентативными патентами США, в которых описано получение таких модифицированных нуклеотидных оснований, являются, но не ограничиваются ими, патент США №: 3687808, а также патенты США № 4845205; 5130302; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121 5596091; 5614617; 5645985; 5830653; 5763588; 6005096; 5681941 и 5750692, каждый из которых вводится в настоящее описание в качестве ссылки.
Другими модификациями антисмысловых олигонуклеотидов являются олигонуклеотиды, химически связывающиеся с олигонуклеотидами, в которых одна или несколько групп или конъюгатов усиливают активность олигонуклеотида, улучшают его распеределение в клетках и его поглощение клеткой. Соединения согласно изобретению могут включать конъюгированные группы, ковалентно связанные с функциональными группами, такими как первичные или вторичные гидроксильные группы. Конъюгированными группами согласно изобретению являются интеркалирующие средства, молекулы-репортеры, полиамины, полиамиды, полиэтиленгликоли, полиэфиры, группы, улучшающие фармакодинамические свойства олигомеров, и группы, улучшающие фармакокинетические свойства олигомеров. Типичными конъюгированными группами являются холестерины, липиды, катионные липиды, фосфолипиды, катионные фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители. В контексте настоящего изобретения, группами, улучшающими фармакодинамические свойства, являются группы, улучшающие поглощение олигомера, повышающие резистентность олигомера к разложению, и/или улучшающие последовательность-специфическую гибридизацию с РНК. В контексте настоящего изобретения, группами, улучшающими фармакокинетические свойства, являются группы, улучшающие поглощение олигомера, его распределение, метаболизм или экскрецию. Конъюгированными группами являются, но не ограничиваются ими, липидные молекулы, такие как молекула холестерина (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), холевая кислота (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), тиоэфир, например, гексил-S-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), алифатическая цепь, например, цепь, состоящая из додекандиоловых или ундецильных остатков (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), фосфолипид, например, ди-гексадецил-рац.-глицерин или 1,2-ди-О-гексадецил-рац.-глицеро-3-H-фосфонат триэтиламмония (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), полиаминовая или полиэтиленгликолевая цепь (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) или адамантануксусная кислота (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), пальмитильная группа (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237) или октадециламиновая или гексиламинокарбонилоксихолестериновая группа. Олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть также конъюгированы с активными лекарственными средствами, например, с аспирином, варфарином, фенилбутазоном, ибупрофеном, супрофеном, фенбуфеном, кетопрофеном, (S)-(+)-пранопрофеном, карпрофеном, данзилсаркозином, 2,3,5-трииодбензойной кислотой, флуфенаминовой кислотой, фолиновой кислотой, бензотиадиазидом, хлортиазидом, диазепином, индометацином, барбитуратом, цефалоспорином, сульфасодержащим лекарственным средством, средством против диабета, антибактериальным средством или антибиотиком. Конъюгаты «олигонуклеотид-лекарственное средство» и их получение описаны в заявке на патент США № 09/334130 (поданной 15 июня 1999) и в патентах США № 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241 5391723; 5416203 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941, каждый из которых вводится в настоящее описание в качестве ссылки.
2
2
3
2
2
3
Все положения в данном соединении необязательно должны быть одинаково модифицированы, и фактически, в одно соединение или даже в положение одного нуклеозида, присутствующего в олигонуклеотиде, могут быть введены более, чем одна из вышеупомянутых модификаций. Настоящее изобретение также включает антисмысловые соединения, которые являются химерными соединениями. В контексте настоящего изобретения, «химерными» антисмысловыми соединениями или «химерами» являются антисмысловые соединения, а в частности, олигонуклеотиды, содержащие две или более химически отличающиеся области, каждая из которых состоит по меньшей мере из одного мономерного звена, то есть, нуклеотида, в случае олигонуклеотидного соединения. Эти олигонуклеотиды обычно содержат по меньшей мере одну область, где олигонуклеотид модифицируют в целях сообщения ему повышенной резистентности к разложению нуклеазой, повышенного уровня поглощения клеткой и/или повышенной аффинности связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью. Дополнительная область олигонуклеотида может служить в качестве субстрата для ферментов, способных расщеплять гибриды РНК:ДНК или РНК:РНК. Так, например, РНКаза H представляет собой клеточную эндонуклеазу, которая расщепляет цепь РНК дуплекса РНК:ДНК. Поэтому, активация РНКазы H приводит к расщеплению РНК-мишени, и тем самым, значительно повышает эффективность ингибирования экспрессии гена олигонуклеотидом. Следовательно, в случае химерных олигонуклеотидов, сравнимые результаты часто могут быть получены с использованием более коротких олигонуклеотидов, чем с использованием фосфортиоатных дезоксиолигонуклеотидов, гибридизующихся с той же самой областью-мишенью. Химерные антисмысловые соединения согласно изобретению могут быть получены в виде комплексных структур, состоящих из двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов и/или олигонуклеотидных миметиков, описанных выше. Предпочтительные химерные антисмысловые олигонуклеотиды включают по меньшей мере один 2'-модифицированный сахар (предпочтительно, 2'-О-(CH)-О-CH) у 3'-конца, что сообщает резистентность к нуклеазе, и область, содержащую по меньшей мере 4 смежных 2'-H-сахара, что сообщает активность, направленную на защиту от РНКазы H. Такие соединения также называются гибридами или гэпмерами. Предпочтительные гэпмеры имеют область 2'-модифицированных сахаров (предпочтительно, 2'-О-(CH)-О-CH) у 3'-конца и у 5'-конца, между которыми находится по меньшей мере одна область, имеющая по меньшей мере 4 смежных 2'-H-сахара и предпочтительно, включающая фосфортиоатные связи остова. Репрезентативными патентами США, в которые описано получение таких гибридных структур, являются, но не ограничиваются ими, патенты США № 5013830; 5149797; 5220007; 5256775; 5366878; 5403711; 5491133; 5565350; 5623065; 5652355; 5652356 и 5700922, каждый из которых во всей своей полноте вводятся в настоящее описание в качестве ссылки.
Антисмысловые соединения, используемые в настоящем изобретении, могут быть получены стандартными и рутинными методами, хорошо известными специалистам в области твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза может быть закуплено у нескольких фирм-поставщиков, например, Applied Biosystems (Foster City, Calif). Дополнительно или альтернативно, могут быть использованы и другие средства для такого синтеза, известные специалистам. Хорошо известно, что для получения олигонуклеотидов, таких как фосфортиоаты и алкилированные производные, могут быть применены аналогичные методы. Соединения согласно изобретению могут быть также смешаны, инкапсулированы, конъюгированы или как-либо иначе связаны с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями соединений, например, с липосомами, молекулами, нацеленными на рецептор, препаратами для перорального, ректального или местного введения, или с другими препаратами, улучшающими поглощение, распределение и/или всасывание. Репрезентативными патентами США, в которые описано получение таких препаратов, улучшающих поглощение, распределение и/или всасывание, являются, но не ограничиваются ими, патенты США № 5108921; 5354844; 5416016; 5459127; 5521291; 5543158; 5547932; 5583020; 5591721; 4426330; 4534899; 5013556; 5108921; 5213804; 5227170; 5264221; 5356633; 5395619; 5416016; 5417978; 5462854; 5469854; 5512295; 5527528; 5534259; 5543152; 5556948; 5580575; и 5595756, каждый из которых вводится в настоящее описание в качестве ссылки.
Другими примерами смысловых или антисмысловых олигонуклеотидов являются олигонуклеотиды, ковалентно связанные с органическими молекулами, такими как молекулы, описанные в WO 90/10048, и с другими молекулами, повышающими аффинность связывания олигонуклеотида с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени, такими как поли-(L-лизин). Кроме того, к смысловым или антисмысловым олигонуклеотидам могут быть присоединены интеркалирующие средства, такие как эллиптицин, и алкилирующие средства или комплексы металлов для модификации специфичности связывания указанного антисмыслового или смыслового олигонуклеотида с нуклеотидной последовательностью-мишенью.
4
in vivo
ex vivo
Антисмысловые или смысловые олигонуклеотиды могут быть введены в клетку, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты-мишени, с применением любого метода переноса генов, включая, например, CaPO-опосредованную ДНК-трансфекцию или электропорацию, или с использованием векторов для переноса генов, таких как вирус Эпштейна-Барра. В предпочтительном методе, антисмысловые или смысловые олигонуклеотиды встраивают в подходящий ретровирусный вектор. Клетку, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты-мишени, подвергают контактированию с рекомбинантным ретровирусным вектором, либо , либо . Подходящими ретровирусными векторами являются, но не ограничиваются ими, векторы, происходящие от ретровируса M-MuLV мыши, N2 (ретровируса, происходящего от M-MuLV), или двухкопийных векторов, обозначенных DCT5A, DCT5B и DCT5C (см. WO 90/13641).
Смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды могут быть введены в клетку, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты-мишени, путем образования конъюгата с лиганд-связывающей молекулой, как описано в WO 91/04753. Подходящими лиганд-связывающими молекулами являются, но не ограничиваются ими, рецепторы клеточной поверхности, факторы роста, другие цитокины или другие лиганды, которые связываются с рецепторами клеточной поверхности. При этом, предпочтительно, чтобы конъюгирование с лиганд-связывающей молекулой не оказывало явного негативного воздействия на ее связывание с соответствующей молекулой или с соответствующим рецептором, или не блокировало проникновение смыслового или антисмыслового олигонуклеотида или его конъюгированного варианта в данную клетку.
Альтернативно, смысловой или антисмысловой олигонуклеотид может быть введен в клетку, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты-мишени, путем образования комплекса «олигонуклеотид-липид», как описано в WO 90/10448. Комплекс «смысловой или антисмысловой олигонуклеотид-липид», предпочтительно, диссоциируется в клетке под действием эндогенной липазы.
Антисмысловые или смысловые молекулы РНК или ДНК обычно имеют длину по меньшей мере примерно 5 нуклеотидов, альтернативно, по меньшей мере примерно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 или 1000 нуклеотидов, где в контексте настоящего описания, термин «примерно» означает указанную длину нуклеотидной последовательности плюс/минус 10% от указанной длины.
Зонды могут быть также использованы в ПЦР-технологии в целях генерирования пула последовательностей для идентификации близкородственных ТАТ-кодирующих последовательностей.
in situ
Нуклеотидные последовательности, кодирующие ТАТ, могут быть также использованы для конструирования гибридизационных зондов для картирования гена, кодирующего TAT, и для генетического анализа индивидуумов с генетическими расстройствами. Представленные в настоящем описании нуклеотидные последовательности могут быть картированы на хромосоме и специфических областях хромосомы известными методами, такими как гибридизация , анализ на связывание с известными хромосомным маркерами и гибридизационный скрининг библиотек.
Если ТАТ-кодирующие последовательности кодируют белок, который связывается с другим белком (например, где ТАТ представляет собой рецептор), то TAT может быть использован в анализах для идентификации других белков или молекул, участвующих во взаимодействиях. С помощью таких методов могут быть идентифицированы ингибиторы связывания рецептор/лиганд. Белки, участвующие в таких взаимодействиях, могут быть также использованы для скрининга на пептиды-ингибиторы или небольшие молекулы-ингибиторы или агонисты связывания. Кроме того, рецептор ТАТ может быть использован для выделения коррелирующего(их) лиганда(ов). Могут быть также разаработаны скрининг-анализы для выявления важных соединений, которые имитируют биологическую активность нативного TAT или рецептора TAT. Такие скрининг-анализы включают анализы, подходящие для высокопроизводительного скрининга химических библиотек, что делает их особенно подходящими для идентификации небольших синтетических молекул-кандидатов на лекарственные средства. Рассматриваемыми небольшими молекулами являются синтетические органические или неорганические соединения. Эти анализы могут быть осуществлены в различных форматах, включая анализы на связывание белок-белок, биохимические скрининг-анализы, иммуноанализы и клеточные анализы, которые были хорошо охарактеризованы специалистами.
Нуклеиновые кислоты, которые кодируют TAT или его модифицированные формы, могут быть также использованы для создания трансгенных животных или «нокаут»-животных, которые, в свою очередь, могут быть использованы для разработки и скрининга терапевтически ценных реагентов. Трансгенным животным (например, трансгенной мышью или крысой) является животное, имеющее клетки, содержащие трансген, который был введен животному или его предку на пренатальной стадии развития, например, на стадии развития эмбриона. Трансгеном является ДНК, интегрированная в геном клетки, из которой затем развивается трансгенное животное. В одном из вариантов изобретения, кДНК, кодирующая ТАТ, может быть использована для клонирования геномной ДНК, кодирующей ТАТ в соответствии с хорошо разработанными методами, и геномных последовательностей, используемых для создания трансгенных животных, содержащих клетки, которые экспрессируют ДНК, кодирующую TAT. Методы создания трансгенных животных, а в частности, таких животных, как мыши или крысы, известны специалистам и описаны, например, в патентах США № 4736866 и 4870009. Обычно, конкретные клетки должны быть нацелены на трансген ТАТ, включающий тканеспецифические энхансеры. Трансгенные животные, которые имеют копию трансгена, кодирующего ТАТ и введенного в зародышевую линию животного на стадии развития эмбриона, могут быть использованы для оценки эффекта повышения уровня экспрессии ДНК, кодирующей ТАТ. Такие животные могут быть использованы в качестве тестеров на реагенты, предположительно, сообщающие защиту, например, от развития патологических состояний, связанных с сверхэкспрессией таких реагентов. В соответствии с этим аспектом изобретения, животное обрабатывают указанным реагентом, и снижение случаев развития патологического состояния по сравнению с необработанными животными, несущими данный трансген, будет указывать на возможный терапевтический эффект в лечении данного патологического состояния.
Альтернативно, нечеловеческие гомологи ТАТ могут быть использованы для создания животных, дефектных по ТАТ («нокаут»-животных), которые имеют дефектный или модифицированный ТАТ-кодирующий ген, что обусловлено гомологичной рекомбинацией между эндогенным геном, кодирующим ТАТ, и модифицированной геномной ДНК, кодирующей ТАТ, которые были введены в эмбриональную стволовую клетку животного. Так, например, кДНК, кодирующая ТАТ, может быть использована для клонирования геномной ДНК, кодирующей ТАТ, в соответствии с хорошо известными методами. Часть геномной ДНК, кодирующей ТАТ, может быть делетирована или заменена другим геном, таким как ген, кодирующий селективный маркер, который может быть использован для мониторинга интеграции. Обычно в вектор вводят несколько тысяч пар оснований немодифицированной фланкирующей ДНК (у 5'- и 3'-концов) [см., например, публикации Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987), относящиеся к описанию гомологичных рекомбинантных векторов]. Вектор вводят в эмбриональную стволовую клеточную линию (например, путем электропорации) и отбирают клетки, в которых введенная ДНК подвергается гомологичной рекомбинации с эндогенной ДНК [см., например, Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. Затем отобранные клетки вводят в бластоцист животного (например, мыши или крысы) с получением химер-агрегатов [см., например, Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. Затем химерный эмбрион может быть имплантирован подходящему приемному животному, в результате чего у этой псевдобеременной самки развивается эмбрион, из которого вырастает «нокаут»-животное. Потомство, имеющее гомологичную рекомбинантную ДНК в своих зародышевых клетках, может быть идентифицировано стандартными методами и использовано для выращивания животных, все клетки которого будут содержать гомологичную рекомбинантную ДНК. «Нокаут»-животные могут быть охарактеризованы, например, на их способность вырабатывать резистентность к некоторым патологическим состояниям и на развитие у них патологических состояний вследствие отсутствия полипептида ТАТ.
in vivo
in vivo
Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептиды ТАТ, может быть использована в генной терапии. При применении в генной терапии, гены вводят в клетки для  синтеза терапевтически эффективного генного продукта, например, для замены дефектного гена. Термин «генная терапия» включает стандартную генную терапию, в которой достигается длительный эффект после одной обработки, а также введение генных терапевтических средств, которое представляет собой однократное или повторное введение терапевтически эффективной ДНК или мРНК. Антисмысловые РНК и ДНК могут быть использованы в качестве терапевтических средств для блокирования экспрессии некоторых генов . Было уже показано, что короткие антисмысловые олигонуклеотиды могут быть импортированы в клетки, в которых они действуют как ингибиторы, несмотря на их низкие внутриклеточные концентрации, что обусловлено их ограниченным поглощением клеточной мембраной (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]). Олигонуклеотиды могут быть модифицированы для повышения уровня их поглощения, например, путем замены их отрицательно заряженных фосфодиэфирных групп незаряженными группами.
in vitro
in vivo
in vitro
in vivo
Существует ряд методов введения нуклеиновых кислот в жизнеспособные клетки. Такие методы могут варьироваться в зависимости от того, вводят ли нуклеиновую кислоту в культивированные клетки , или их вводят  в клетки нужного хозяина. Методы, применяемые для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих , включают применение липосом, электропорацию, микроинжекцию, слияние клеток, преципитацию, опосредуемую DEAE-декстраном и фосфатом кальция и т.п. Предпочтительными современными методами переноса генов  являются трансфекция вирусными (обычно ретровирусными) векторами и трансфекция, опосредуемая белками вирусной оболочки-липосомами (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 [1993]). В некоторых случаях может оказаться желательным получение источника нуклеиновой кислоты вместе со средством, которое нацелено на клетки-мишени, таким как антитело, специфичное к мембранному белку клеточной поверхности или к клетке-мишени, а также к лиганду для рецептора на данной клетке-мишени и т.п. При использовании липосом, белки, которые связываются с мембранным белком клеточной поверхности, связанным с эндоцитозом, могут быть использованы для нацеливания и/или для облегчения поглощения, например, ими являются капсидные белки или их фрагменты, обладающие тропизмом по отношению к клеткам конкретного типа, антитела против белков, которые подвергаются интернализации на фазе деления клетки, и белки, которые доставляют нужное срество вовнутрь клетки и увеличивают время полужизни таких внутриклеточных средств. Метод опосредуемого рецептором эндоцитоза описан, например, Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); и Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Описание протоколов мечения генов и генной терапии можно найти у Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992).
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды ТАТ или их фрагменты, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для идентификации хромосомы. В соответствии с этим, в настоящее время существует необходимость в получении новых маркеров хромосом, поскольку, по сравнению с фактически имеющимися данными о последовательностях, существует относительно небольшое число реагентов для мечения хромосом. Каждая молекула нуклеиновой кислоты ТАТ согласно изобретению может быть использована в качестве маркера хромосомы.
Полипептиды и молекулы нуклеиновой кислоты ТАТ согласно изобретению могут быть также использованы в диагностике для типирования ткани, где полипептиды ТАТ согласно изобретению могут дифференциально экспрессироваться лишь в одной, а не в другой ткани, предпочтительно, в пораженной ткани, а не в нормальной ткани того же типа. Молекулы нуклеиновой кислоты ТАТ могут быть использованы для получения зондов для ПЦР, нозерн-блот-анализа, саузерн-блот-анализа и вестерн-блот-анализа.
Настоящее изобретение включает способы скрининга соединений для идентификации тех соединений, которые имитируют полипептид ТАТ (агонисты) или предотвращают действие полипептида ТАТ (антагонисты). Скрининг-анализы на кандидаты лекарственных средств-антагонистов были разработаны для идентификации соединений, которые связываются или образуют комплексы с полипептидами ТАТ, кодируемыми идентифицированными в настоящем описании генами, или как-либо иначе влияют на взаимодействие кодируемых полипептидов с другими клеточными белками, включая, например, ингибирование экспрессии полипептида ТАТ клетками. Такие скрининг-анализы включают анализы, подходящие для крупномасштабного скрининга химических библиотек, а в частности, для идентификации небольших молекул-кандидатов лекарственных средств.
Эти анализы могут быть осуществлены в различных форматах, включая анализы на связывание «белок-белок», биохимические скрининг-анализы, иммуноанализы и клеточные анализы, хорошо охарактеризованные специалистами.
Все анализы на антагонисты обычно предусматривают приведение в контакт лекарственного средства-кандидата с полипептидом ТАТ, кодируемым идентифицированной в настоящем описании нуклеиновой кислотой, в условиях, подходящих для взаимодействия этих двух компонентов, и в течение определенного периода времени, достаточного для такого взаимодействия.
В анализах на связывание, взаимодействие представляет собой связывание, и полученный комплекс может быть выделен из реакционной смеси или детектирован в этой реакционной смеси. В конкретном варианте осуществления изобретения, идентифицированный в настоящем описании полипептид ТАТ, кодируемый геном, или лекарственное средство-кандидат иммобилизуют на твердой фазе, например, на микротитрационном планшете, путем ковалентного или нековалентного связывания. Нековалентное связывание обычно осуществляют путем покрытия твердой поверхности раствором полипептида ТАТ и сушки. Альтернативно, иммобилизованное антитело, например, моноклональное антитело, специфичное к иммобилизуемому полипептиду ТАТ, может быть использовано для его заякоривания на твердой поверхности. Такой анализ осуществляют путем добавления не-иммобилизованного компонента, который может быть помечен детектируемой меткой, к иммобилизованному компоненту, например, поверхности с покрытием, содержащим заякоренный компонент. После завершения реакции, непрореагировавшие компоненты удаляют, например, путем промывки, а затем детектируют комплексы, заякоренные на твердой поверхности. Если исходный неиммобилизованный компонент содержит детектируемую метку, то детектирование метки, иммобилизованной на поверхности, будет указывать на наличие комплекса. Если исходный неиммобилизованный компонент не содержит метки, то образование комплекса может быть детектировано, например, с использованием меченого антитела, специфически связывающегося с иммобилизованным комплексом.
TM
Если соединение-кандидат взаимодейвует, но не связывается с конкретным полипептидом ТАТ, кодируемым идентифицированным в настоящем описании геном, то такое взаимодействие с этим полипептидом может быть проанализировано методами, хорошо известными специалистам в области детектирования взаимодействий «белок-белок». Такие анализы осуществляют традиционными методами, такими как, например, перекрестное связывание, совместная иммунопреципитация и совместная очистка в соответствующих градиентах или на хроматографических колонках. Кроме того, мониторинг взаимодействия «белок-белок» может быть осуществлен с использованием дрожжевой генетической системы, описанной Fields и сотрудниками (Fields and Song, Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)), и как описано Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991). Многие активаторы транскрипции, такие как дрожжевой GAL4, состоят из двух физически дискретных модульных домена, один из которых действует как ДНК-связывающий домен, а другой функционирует как домен активации транскрипции. Дрожжевая экспрессионная система, описанная в вышеупомянутых публикациях (обычно называемая «двухкомпонентной гибридной системой»), имеет указанное преимущественное свойство, и в них используются два гибридных белка, а именно, один белок, в котором белок-мишень присоединен к ДНК-связывающему домену GAL4, и другой белок, в котором активирующие белки-кандидаты присоединены к домену активации. Экспрессия гена-репортера GAL1-lacZ, находящегося под контролем GAL4-активированного промотора, зависит от восстановления GAL4-активности посредством взаимодействия «белок-белок». Колонии, содержащие взаимодействующие полипептиды, детектируют с использованием хромогенного субстрата для β-галактозидазы. Укомплектованный набор (MATCHMAKER) для идентификации белок-белковых взаимодействий между двумя специфическими белками, проводимой с помощью двух-гибридной технологии, поставляется фирмой Clontech. Эта система может быть также применена к картированию доменов белка, участвующих в специфических взаимодействиях белков, а также к точному определению аминокислотных остатков, которые играют основную роль в таких взаимодействиях.
Соединения, которые препятствуют взаимодействию гена, кодирующего идентифицированный в настоящем описании полипептид ТАТ, и других внутриклеточных или внеклеточных компонентов, могут быть протестированы следующим образом: обычно сначала получают реакционную смесь, содержащую продукт гена и внутриклеточный или внеклеточный компонент, в условиях, подходящих для взаимодействия и связывания этих двух продуктов, и в течение определенного периода времени, достаточного для такого взаимодействия и связывания. Для тестирования способности соединения-кандидата ингибировать связывание, реакцию взаимодействия осуществляют в отсутствии и в присутствии тестируемого соединения. Кроме того, к третьей реакционной смеси может быть добавлено плацебо, которое служит в качестве позитивного контроля. Мониторинг связывания (образования комплекса) тестируемого соединения и внутриклеточного или внеклеточного компонента, присутствующего в смеси, осуществляют как описано выше. Образование комплекса в контрольной(ых) реакции(ях) взаимодействия, но не в реакционной смеси, содержащей тестируемое соединение, указывает на то, что такое тестируемое соединение препятствует взаимодействию тестируемого соединения с его партнером по взаимодействию.
Для анализа на антагонисты, полипептид ТАТ может быть добавлен в клетки вместе с соединением, скринируемым на конкретную активность, и способность соединения ингибировать представляющую интерес активность в присутствии полипептида ТАТ указывает на то, что такое соединение является антагонистом полипептида ТАТ. Альтернативно, антагонисты могут быть детектированы путем объединения полипептида ТАТ и потенциального антагониста с рецепторами мембраносвязанного полипептида ТАТ или с рекомбинантными рецепторами в условиях, подходящих для проведения анализа на конкурентное ингибирование. Полипептид TAT может быть помечен, например, радиоактивной меткой, в результате чего число молекул полипептида ТАТ, связанных с рецептором, может быть использовано для оценки эффективности потенциального антагониста. Ген, кодирующий рецептор, может быть идентифицирован различными методами, известными специалистам, например, методами пэннинга лиганда и FACS-сортинга. Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991). Предпочтительно, экспрессионное клонирование применяют в случае, когда полиаденилированную РНК получают из клетки, чувствительной к полипептиду ТАТ, и библиотеку кДНК, созданную из этой РНК, разделяют на пулы и используют для трансфекции клеток COS или других клеток, которые не являются чувствительными к полипептиду ТАТ. Трансфицированные клетки, выращенные на предметных стеклах, обрабатывают меченым полипептидом ТАТ. Полипептид ТАТ может быть помечен различными методами, включая иодирование или включение сайта распознавания для сайт-специфической протеинкиназы. После фиксации и инкубирования, предметные стекла подвергают авторадиографическому анализу. После этого идентифицируют позитивные пулы, и получают субпулы, которые затем повторно трансфицируют с применением интерактивного метода образования субпулов и повторного скрининга, что, в конечном счете, приводит к получению одного клона, кодирующего предполагаемый рецептор.
В альтернативном подходе для идентификации рецептора, меченый полипептид ТАТ может быть подвергнут фотоаффинному связыванию с клеточной мембраной или с препаратами экстрактов, экспрессирующих молекулу рецептора. Перекрестно-связанное соединение разделяют с помощью электрофореза в ПААГ и экспонируют с рентгеновской пленкой. Меченый комплекс, содержащий рецептор, может быть вырезан, разделен на пептидные фрагменты и подвергнут микросеквенированию белка. Аминокислотная последовательность, полученная в результате микросеквенирования, может быть использована для создания серии вырожденных олигонуклеотидных зондов для скрининга библиотеки кДНК для идентификации гена, кодирующего предполагаемый рецептор.
В другом анализе на антагонисты, клетки млекопитающих или мембранный препарат, экспрессирующие рецептор, инкубируют с меченым полипептидом ТАТ в присутствии соединения-кандидата. Затем может быть оценена способность такого соединения усиливать или блокировать данное взаимодействие.
Более конкретными примерами потенциальных антагонистов является олигонуклеотид, который связывается с гибридами «иммуноглобулин-полипептид ТАТ», а в частности, с антителами, включая, но не ограничиваясь ими, поликлональные и моноклональные антитела и их фрагменты, одноцепочечные антитела, антиидиотипические антитела и химерные или гуманизированные варианты таких антител или фрагментов, а также антитела человека и их фрагменты. Альтернативно, потенциальным антагонистом может быть близкородственный белок, например, мутированная форма полипептида ТАТ, которая распознает рецептор, но не влияет на его функцию, и тем самым конкурентно ингибирует действие полипептида ТАТ.
in vivo
in vivo
Другим потенциальным антагонистом полипептида ТАТ является антисмысловая конструкция РНК или ДНК, полученная с применением антисмысловой технологии, в которой, например, антисмысловая молекула РНК или ДНК непосредственно блокирует трансляцию мРНК посредством гибридизации с мРНК-мишенью и предотвращения трансляции белка. Антисмысловая технология может быть применена для регуляции экспрессии гена посредством образования тройной спирали или с использованием антисмысловой ДНК или РНК, и оба эти метода основаны на связывании полинуклеотида с ДНК или РНК. Так, например, 5'-кодирующая часть полинуклеотидной последовательности, которая кодирует описанные в настоящем описании зрелые полипептиды ТАТ, используется для конструирования антисмыслового РНК-олигонуклеотида, имеющего длину примерно 10-40 пар оснований. ДНК-олигонуклеотид конструируют так, чтобы он был комплементарен области гена, участвующей в транскрипции (тройная спираль - см. Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), что позволяет предотвращать транскрипцию и продуцирование полипептида ТАТ. Антисмысловой РНК-олигонуклеотид гибридизуется с мРНК  и блокирует трансляцию молекулы мРНК в полипептид ТАТ (антисмысловой олигонуклеотид - Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Описанные выше олигонуклеотиды могут быть также введены в клетку для экспрессии антисмысловой РНК или ДНК  для ингибирования продуцирования полипептида ТАТ. При использовании антисмысловой ДНК, предпочтительными являются олигодезоксирибонуклеотиды, происходящие от сайта инициации трансляции, например, расположенного примерно между положениями -10 и +10 нуклеотидной последовательности гена-мишени.
Потенциальными антагонистами являются небольшие молекулы, которые связываются с активным центром, с сайтом связывания рецептора или с фактором роста или с другим соответствующим сайтом связывания полипептида TAT, что приводит к блокированию обычной биологической активности полипептида ТАТ. Примерами небольших молекул являются, но не ограничиваются ими, небольшие пептиды или пептид-подобные молекулы, предпочтительно, растворимые пептиды и синтетические не-пептидильные органические или неорганические соединения.
Рибозимы представляют собой молекулы РНК с ферментными свойствами, обладающие способностью катализировать специфическое расщепление РНК. Рибозимы действуют по механизму последовательность-специфической гибридизации с комплементарной РНК-мишенью, с последующим эндонуклеолитическим расщеплением. Сайты специфического расщепления у рибозима в потенциальной РНК-мишени могут быть идентифицированы известными методами. Более подробное описание можно найти, например, у Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), и в публикации заявки PCT № WO 97/33551 (опубликованной 18 сентября 1997).
Молекулы нуклеиновой кислоты в трехспиральной структуре, используемой для ингибирования транскрипции, должны быть одноцепочечными и должны состоять из дезоксинуклеотидов. Нуклеотидный состав этих олигонуклеотидов должен быть таким, чтобы эти олигонуклеотиды стимулировали образование тройной спирали по правилу спаривания оснований Хугстена, которое обычно требует наличия крупных фрагментов, состоящих из пуринов или пиримидинов на одной цепи дуплекса. Более подробно, см, например, публикацию заявки PCT WO 97/33551, указанной выше.
Такие небольшие молекулы могут быть идентифицированы с помощью любого одного или нескольких скрининг-анализов, обсуждаемых выше, и/или любых других методов скрининга, хорошо известных специалистам.
Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид ТАТ, может быть использована в настоящем описании для рекомбинантного продуцирования полипептида ТАТ методами, хорошо известными специалистам и описанными в настоящей заявке. В свою очередь, продуцированные полипептиды ТАТ могут быть использованы для получения анти-ТАТ антител методами, хорошо известными специалистам и описанными в настоящей заявке.
Антитела, специфически связывающиеся с идентифицированым в настоящем описании полипептидом ТАТ, а также другие молекулы, идентифицированые в скрининг-анализах, обсуждаемых ранее, могут быть введены в форме фармацевтических композиций для лечения различных расстройств, включая рак.
Если полипептид ТАТ является внутриклеточным, а в качестве ингибиторов используются целые антитела, то предпочтительными являются интернализующие антитела. Однако, для доставки антитела или его фрагмента в клетки может быть также осуществлена липофекция, либо могут быть использованы липосомы. При использовании фрагментов антител, предпочтительным является наименьший ингибирующий фрагмент, который специфически связывается со связывающим доменом белка-мишени. Так, например, на основе последовательностей вариабельной области антитела могут быть сконструированы пептидные молекулы, сохраняющие способность связываться с последовательностью белка-мишени. Такие пептиды могут быть синтезированы химическим методом и/или продуцированы методами рекомбинантных ДНК. См., например, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993).
Описанный в настоящем описании препарат может также содержать более чем одно активное соединение, необходимое для лечения конкретного состояния, предпочтительно, соединение, обладающее дополнительной активностью, которая не оказывает негативного влияния на другую активность. Альтернативно или дополнительно, указанная композиция может содержать средство, усиливающее ее функцию, например, цитотоксическое средство, цитокин, химиотерапевтическое средство или рост-ингибирующее средство. Такие молекулы обычно присутствуют в комбинации в количестве, эффективном для достижения поставленной цели.
Нижеследующие примеры приводятся лишь в иллюстративных целях, и не должны рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения.
Все патенты и литературные источники, цитируемые в настоящей заявке, вводятся в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Примеры
Коммерчески доступные реагенты, описанные в примерах, были использованы в соответствии с инструкциями производителей, если это не оговорено особо. Источник клеток, идентифицируемых в нижеследующих примерах и во всем описании изобретения по их регистрационным номерам ATCC, был взят из Американской коллекции типовых культур, Manassas, VA.
Пример 1: Оценка профиля экспрессии в ткани с использованием GeneExpress
Частная база данных, содержащая информацию об экспрессии генов (GeneExpress, Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD), была проанализирована в попытке идентифицировать полипептиды (и кодирующие их нуклеиновые кислоты), экспрессия которых значимо и детектируемо активировалась в конкретной(ых) представляющей(их) интерес ткани(ях) опухоли человека по сравнению с другой(ими) опухолью(ями) человека и/или нормальными тканями человека. В частности, анализ базы данных GeneExpress осуществляли с использованием либо доступной компьютерной программы, поставляемой Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD, для работы с базой данных GeneExpress, либо частной компьютерной программы, описанной и разработанной Genentech Inc, для работы с базой данных GeneExpress. Оценку положительных совпадений в данном анализе проводили на основе нескольких критериев, включая, например, тканеспецифичность, опухолеспецифичность и уровень экспрессии в нормальных первичных и/или в нормальных пролиферирующих тканях. Такой анализ на экспрессию с применением мРНК позволил определить, что мРНК, кодирующая полипептид TAT419, значимо, репродуцируемо и детектируемо сверхэкспрессируется в раковых тканях меланомы человека, а не в соответствующей нормальной ткани кожи человека.
in situ
Пример 2: Гибридизация
in situ
Гибридизация  представляет собой эффективный и универсальный метод детектирования и определения локализации последовательностей нуклеиновой кислоты в клеточных или тканевых препаратах. Так, например, можно идентифицировать сайты экспрессии генов, проанализировать распределение транскрипции в тканях, идентифицировать и определять локализацию вирусных инфекций, с последующей модификацией синтеза специфической мРНК и картированием хромосомы.
in situ
in situ
32
32
Гибридизацию  осуществляли в соответствии с оптимизированным вариантом протокола, описанного Lu и Gillett, в Cell Vision 1:169-176 (1994), с использованием ПЦР-генерированных P-меченых рибозондов. Вкратце, фиксированные формалином и залитые в парафин ткани человека разрезали, очищали от парафина, подвергали депротеинизации в протеиназе K (20 г/мл) в течение 15 минут при 37°C, а затем обрабатывали для осуществления гибридизации , описанной Lu и Gillett, см. выше. P-UTP-меченый антисмысловой рибозонд получали из ПЦР-продукта и гибридизовали в течение ночи при 55°C. Предметные стекла погружали в эмульсию Kodak NTB2 для мечения ядер и экспонировали в течение 4 недель.
Синтез
P-рибозонда
32
32
32
2
2
6,0 мкл (125 мКи) P-UTP (Amersham BF 1002, SA<2000 Ки/ммоль) сушили на скоростной вакуумной центрифуге. В каждую пробирку, содержащую осушенный P-UTP, добавляли следующие ингредиенты: 2,0 мкл 5x буфера для транскрипции, 1,0 мкл DTT (100 мМ), 2,0 мкл смеси NTP (2,5 мМ: 10 микрон; 10 мМ GTP, 10 мМ CTP & ATP + 10 мкл HO), 1,0 мкл UTP (50 мкΜ), 1,0 мкл РНКазина, 1,0 мкл матричной ДНК (1 мкг), 1,0 мкл HO, 1,0 мкл РНК-полимеразы (обычно, для ПЦР-продуктов: T3=AS, T7=S).
Пробирки инкубировали при 37°C в течение одного часа. После этого добавляли 1,0 мкл ДНКазы RQ1 и инкубировали при 37°C в течение 15 минут. Затем добавляли 90 мкл TE (10 мМ триса, pH 7,6/1 мМ EDTA, pH 8,0), и смесь наносили пипеткой на бумагу DE81. Остальной раствор загружали в устройство для ультрафильтрации Microcon-50 и центрифугировали по программе 10 (6 минут). Фильтрующее устройство переносили во вторую пробирку и центрифугировали по программе 2 (3 минуты). После последнего центрифугирования в регенерирующей центрифуге добавляли 100 мкл TE. 1 мкл конечного продукта наносили пипеткой на бумагу DE81 и подсчитывали в 6 мл Biofluor II.
Зонд подвергали электрофорезу в геле с TBE/мочевиной. 1-3 мкл зонда или 5 мкл РНК Mrk III добавляли к 3 мкл загрузочного буфера. После нагревания на нагревательном блоке при 95°C в течение трех минут, зонд сразу помещали на лед. Лунки с гелем продували, загружали образец и подвергали электрофорезу при 180-250 вольт в течение 45 минут. Гель заворачивали в обертку Saran и экспонировали с пленкой XAR с помощью усиливающего экрана в холодильнике при -70°C в течение периода времени от одного часа или на протяжении всей ночи.
P-гибридизация
32
A. Предварительная обработка замороженных срезов
2
Предметные стекла вынимали из холодильника, помещали на алюминиевые поддоны и оттаивали при комнатной температуре в течение 5 минут. Эти поддоны помещали на пять минут в инкубатор при 55°C для снижения степени конденсации. Предметные стекла фиксировали в течение 10 минут в 4% параформальдегиде на льду в вытяжном шкафу и промывали в 0,5× SSC в течение 5 минут при комнатной температуре (25 мл 20× SSC + 975 мл HO, соответствующей контролю качества (SQ)). После депротеинизации в 0,5 мкг/мл протеиназы K в течение 10 минут при 37°C (12,5 мкл 10 мг/мл маточного раствора в 250 мл предварительно нагретого не содержащего РНКазы буфера для РНКазы), срезы промывали в 0,5 x SSC в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем срезы подвергали дегидратации в 70%, 95%, 100% этаноле по 2 минуты в каждом.
B. Предварительная обработка залитых в парафин срезов
2
Предметные стекла очищали от парафина, помещали в HO, соответствующую контролю качества (SQ), и два раза промывали в 2× SSC при комнатной температуре, каждый раз по 5 минут. Срезы подвергали депротеинизации в 20 мкг/мл протеиназы K (500 мкл 10 мг/мл в 250 мл не содержащего РНКазы буфера для РНКазы; 37°C, 15 минут) - для эмбриона человека, или 8× протеиназы K (100 мкл в 250 мл буфера для РНКазы, 37°C, 30 минут) - для тканей, фиксированных формалином. Последующую промывку в 0,5× SSC и дегидратацию осуществляли как описано выше.
C. Предварительная гибридизация
Предметные стекла помещали в пластиковый сосуд, содержащий буфер Box (4 x SSC, 50% формамид) - для насыщенной фильтровальной бумаги.
D. Гибридизация
6
32
1,0×10 имп./мин зонда и 1,0 мкл тРНК (50 мг/мл маточного раствора) на предметное стекло нагревали при 95°C в течение 3 минут. Предметные стекла охлаждали на льду и добавляли 48 мкл буфера для гибридизации/предметное стекло. После интенсивного встряхивания, к 50 мкл буфера для прегибридизации/предметное стекло добавляли 50 мкл P-смеси. Предметные стекла инкубировали в течение ночи при 55°C.
E. Промывка
Промывку осуществляли в течение 2×10 минут с использованием 2 x SSC, EDTA при комнатной температуре (400 мл 20 x SSC + 16 мл 0,25M EDTA, Vf=4L), с последующей обработкой РНКазой при 37°C в течение 30 минут (500 мкл 10 мг/мл в 250 мл буфера для РНКазы = 20 мкг/мл). Предметные стекла промывали в течение 2×10 минут с использованием 2 x SSC, EDTA при комнатной температуре. Промывку осуществляли в следующих условиях жесткости: 2 часа при 55°C, 0,1 x SSC, EDTA (20 мл 20 x SSC + 16 мл EDTA, Vf=4L).
F. Олигонуклеотиды
in situ
Анализы  осуществляли на ряде описанных в настоящем описании последовательностях ДНК. Олигонуклеотиды, используемые в этих анализах, были получены так, чтобы они были комплементарны нуклеиновым кислотам (или их комплементам), как показано в прилагаемом графическом материале.
G. Результаты
Что касается TAT419, то в большинстве протестированных нормальных тканях наблюдалась слабая экспрессия или вообще не наблюдалась экспрессия этого полипептида. В противоположность этому, в большинстве протестированных клеток и тканей меланомы человека наблюдалась сильная и количественно воспроизводимая экспрессия TAT419.
Пример 3: Анализ с использованием микромассивов для детектирования активации полипептидов TAT в раковых опухолях
Микромассивы нуклеиновых кислот, часто содержащие тысячи генных последовательностей, были использованы для идентификации дифференциально экспрессированных генов в пораженных тканях по сравнению с их нормальными тканями-аналогами. С использованием микромассивов нуклеиновых кислот, тест-образцы и контрольные образцы мРНК, взятые от образцов тестируемых и контрольных тканей, подвергали обратной транскрипции и метили с получением кДНК-зондов. Затем кДНК-зонды гибридизовали с массивом нуклеиновых кислот, иммобилизованных на твердом носителе. Массив имел такую конфигурацию, при которой последовательность и положение каждого члена массива были известными. Так, например, отбор генов, которые, как известно, экспрессировались при некоторых патологических состояниях, может быть осуществлен на массиве, иммобилизованном на твердом носителе. Гибридизация меченого зонда с конкретным членом массива указывает на то, что в данном образце, от которого происходит этот зонд, экспрессируется данный ген. Если сигнал гибридизации зонда, происходящего от тестируемого образца (пораженной ткани) выше, чем сигнал гибридизации зонда, происходящего от контрольного образца (нормальной ткани), то это указывает на то, что данный ген или гены сверхэкспрессируются в пораженной ткани. Этот результат объясняется тем, что белок, сверхэкспрессируемый в пораженной ткани, может быть использован не только в качестве диагностического маркера, указывающего на наличие патологического состояния, но также и в качестве терапевтической мишени для лечения указанного патологического состояния.
Методика гибридизации нуклеиновых кислот и технология получения микромассивов хорошо известны специалистам. В настоящем примере, получение конкретных нуклеиновых кислот для гибридизации и зондов, приготовление предметных стекол и выбор условий для гибридизации подробно описаны в заявке на патент РСТ PCT/US01/10482, поданной 30 марта 2001, и эта заявка вводится в настоящее описание посредством ссылки.
В настоящем примере, раковые опухоли, происходящие от различных тканей человека, были исследованы на повышение уровней экспрессии генов по сравнению с уровнями экспрессии генов в раковых опухолях, происходящих от тканей других типов и/или от не-раковых тканей человека, в целях идентификации полипептидов, которые сверхэкспрессируются в конкретной(ых) раковой(ых) опухоли(ях). В некоторых экспериментах были получены раковая опухолевая ткань человека и нераковая опухолевая ткань человека того же типа (часто взятая от того же самого пациента), и эти ткани были проанализированы на экспрессию полипептида ТАТ. Кроме того, была получена раковая опухолевая ткань человека, происходящая от ряда других опухолей человека, и эту ткань сравнивали с тканью «универсального» эпителиального контрольного образца, который был получен путем объединения не-раковых тканей человека эпителиального происхождения, включая ткани печени, почек и легких. мРНК, выделенная из объединенных эпителиальных тканей, представляет собой смесь экспрессируемых генных продуктов от различных других эпителиальных тканей, и такая смесь является превосходным негативным контролем, который позволяет проводить количественное сравнение уровней экспрессии генов в опухолях эпителиального происхождения. В экспериментах по гибридизации микромассивов с использованием объединенных контрольных образцов строили линейную кривую по данным двухцветного анализа. Наклон кривой, построенной по данным двухцветного анализа, затем использовали для нормализации отношений (определения отношения тест:контроль) в каждом эксперименте. Нормализованные отношения, полученные из различных экспериментов, сравнивали и использовали для идентификации кластеризации экспрессии генов. Таким образом, объединенный образец «универсального контроля» позволяет не только эффективно определять относительную экспрессию генов путем простого сравнения двух образцов, но также проводить сравнение множества образцов в нескольких экспериментах.
В настоящих экспериментах, нуклеиновокислотные зонды, происходящие от описанных в настоящем описании последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид ТАТ, использовали для создания микромассива, а РНК, происходящую от различных опухолевых тканей, использовали для гибридизации с этими массивами. Величина, полученная исходя из нормализованного отношения: экспериментального отношения, называеттся «пороговым отношением». Значимыми считаются только те величины, которые превышают это пороговое отношение. Значимость отношений оценивали по уровню шума или рассеяния для каждого эксперимента, и обычно, для идентификации генов-кандидатов, которые обнаруживали относительную сверхэкспрессию в опухолевых образцах по сравнению с экспрессией генов в соответствующих нормальных тканях и/или в объединенном нормальном образце эпителия, используемом в качестве универсального контроля, использовали пороговое отношение 1,8×-2× или выше. Отношения генов, идентифицированных таким образом как генов, обнаруживающих относительную сверхэкспрессию в опухолевых образцах, варьировались от 2 до 40 или даже выше. Для сравнения, в контрольном эксперименте, в котором одну и ту же РНК метили каждым цветом и гибридизовали с той же самой РНК, фактически для всех генов с сигналами выше фоновых, наблюдаемое отношение было значимо ниже, чем 1,8×. Это указывает на то, что экспериментальный шум, превышающий 1,8×, был крайне незначительным, и что наблюдаемое изменение кратности 1,8× или выше очевидно является реальным, детектируемым и воспроизводимым различием в уровнях экспрессии между анализируемыми и сравниваемыми образцами.
Данные, полученные из этих экспериментов, продемонстрировали, что полипептид TAT419 значимо, детектируемо и воспроизводимо сверхэкспрессируется в опухолевых тканях меланомы человека и в происходящих от них клеточных линиях по сравнению со сверхэкспрессией в нормальных человеческих тканях или клетках-аналогах и/или в объединенной нормальной эпителиальной контрольной ткани. Как описано выше, эти данные продемонстрировали, что полипептиды TAT419 согласно изобретению могут быть использованы не только в качестве диагностических маркеров, указывающих на наличие одной или нескольких раковых опухолей у человека, но также и в качестве терапевтических мишеней для лечения раковых опухолей, сверхэкспрессирующих полипептид TAT419.
Пример 4: Получение антител, связывающихся с полипептидами TAT419
В этом примере описано получение моноклональных антител, которые могут специфически связываться с TAT419.
Методы продуцирования моноклональных антител известны специалистам и описаны, например, в публикации Goding, см. выше. Иммуногенами, которые могут быть использованы, являются очищенный TAT, слитые белки, содержащие TAT, и клетки, экспрессирующие рекомбинантный ТАТ на клеточной поверхности. Отбор иммуногена может быть осуществлен специалистом без излишнего экспериментирования.
Мышей, таких как Balb/c, иммунизировали иммуногеном ТАТ, эмульгированным в полном адъюванте Фрейнда, и инъецировали подкожно или внутрибрюшинно в количестве 1-100 микрограммов. Альтернативно, иммуноген эмульгировали в адъюванте MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) и инъецировали животным в подушечку задних лап. Затем, через 10-12 дней, иммунизованным мышам дополнительно вводили иммуноген, эмульгированный в выбранном адъюванте. После этого, в течение нескольких недель, мышам также дополнительно вводили инъекции для иммунизации. Пробы сыворотки могут быть периодически получены от мышей путем забора крови из ретроорбитальной области для проведения ELISA-анализа для детектирования анти-ТАТ антител.
После определения соответствующего титра антитела, животным, «позитивным» на антитела, может быть введена последняя внутривенная инъекция ТАТ. Через 3-4 дня, животных умерщвляли и собирали клетки селезенки. Затем, эти клетки селезенки подвергали слиянию (с использованием 35% полиэтиленгликоля) с отобранной клеточной линией миеломы мыши, такой как P3X63AgU.1, имеющейся в ATCC, No. CRL 1597. Полученные слитые клетки продуцировали гибридомные клетки, которые затем могут быть засеяны в 96-луночные планшеты для культивирования тканей, содержащие среду HAT (гипоксантин, аминоптерин и тимидин), для ингибирования пролиферации неслитых клеток, миеломных гибридов и гибридов клеток селезенки.
Гибридомные клетки скринируют в ELISA на реактивность против TAT. Способ определения «позитивных» гибридомных клеток, секретирующих нужные моноклональные антитела против ТАТ, известен специалистам.
Позитивные гибридомные клетки могут быть инъецированы внутрибрюшинно сингенным мышам Balb/c для продуцирования асцитов, содержащих моноклональные анти-ТАТ антитела. Альтернативно, гибридомные клетки могут быть выращены в колбах или в роллер-флаконах для культивирования тканей. Очистка моноклональных антител, продуцируемых асцитами, может быть осуществлена путем преципитации сульфатом аммония, а затем с помощью эксклюзионной гель-хроматографии. Альтернативно, может быть осуществлена аффинная хроматография путем связывания антитела с белком А или с G-белком.
С применением вышеописанного метода был получен ряд отдельных и отличающихся гибридомных клеточных линий, каждая из которых продуцировала моноклональные антитела, которые связываются с полипептидом TAT419. Моноклональные антитела, продуцируемые этими гибридомными линиями, были функциональными, то есть, они связывались с полипептидом TAT419, как было показано в анализе с применением хорошо известных и рутинных методов, таких как вестерн-блот-анализ, ELISA-анализ, FACS-сортинг клеток, экспрессирующих полипептид TAT419 (клеток, трансфицированных для экспрессии полипептида TAT419 на клеточной поверхности, и некоторых меланомных опухолевых клеточных линий человека, экспрессирующих полипептид TAT419) и/или иммуногистохимический анализ.
Пример 5: Молекулярное клонирование легкой и тяжелой цепей (и вариабельной области легких и тяжелых цепей) моноклонального антитела 5E9 мыши против TAT419
L
H
Одно из моноклональных антител мыши против TAT419, полученных как описано выше, обозначено в настоящем описании 5E9. В этом примере описано получение молекул кДНК, кодирующих вариабельные области моноклонального антитела 5E9 мыши против TAT419. Прямые ПЦР-праймеры были сконструированы так, что они обладали специфичностью к нуклеотидной последовательности мРНК, кодирующей начало областей V и V моноклонального антитела 5E9 мыши. Прямые праймеры были сконструированы так, что большинство возможных кодонов для первых 8-9 N-концевых аминокислот гибридизовались с ПЦР-праймером.
8
Anal. Biochem.
L
H
Гибридомные клетки, экспрессирующие моноклональные антитела мыши против TAT419, использовали в качестве источников для мРНК антител вместе с вышеуказанными олигонуклеотидными праймерами. Полноразмерную РНК выделяли из 1×10 клеток в соответствии с процедурой, описанной Chomczynski и Sachhi, 1987  162: 156. Вариабельные домены легкой цепи (V) и вариабельные домены тяжелой цепи (V) амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР с использованием вышеописанных вырожденных N-концевых праймеров вместе с обратными праймерами, которые были сконструированы так, что они гибридизировались с областью в константом домене легкой цепи (CL) и в константом домене 1 тяжелой цепи (CH1), которые являются высококонсервативными для всех видов.
L
H
L
H
Прямые праймеры были специфичными для N-концевой аминокислотной последовательности областей V и V. Соответственно, обратные праймеры LC и HC были сконструированы так, что они гибридизировались с областью в константом домене легкой цепи (CL) и в константом домене 1 тяжелой цепи (CH1), которые является высококонсервативными для всех видов. Полинуклеотидная последовательность вставок была определена рутинными методами секвенирования. Последовательности полноразмерной легкой цепи (SEQ ID NO:3) и полноразмерной тяжелой цепи (SEQ ID NO:4) моноклонального антитела 5E9 мыши представлены на фигурах 3 и 4, соответственно. Аминокислотные последовательности V (SEQ ID NO:5) и V (SEQ ID NO:6) моноклонального антитела 5E9 мыши также представлены на фигурах 3 и 4, соответственно. Дополнительная характеризация этих аминокислотных последовательностей выявила нижеследующие аминокислотные последовательности для различных областей CDR моноклонального антитела 5E9 мыши против TAT419: CDR-L1 (KSSQSLLDSDGKTYLN, SEQ ID NO:7), CDR-L2 (LVSKLDS, SEQ ID NO:8), CDR-L3 (WQGTHFPYT; SEQ ID NO:9), CDR-H1 (GYTFTSYWMQ; SEQ ID NO:10), CDR-H2 (TIYPGDGDTSYAQKFKG; SEQ ID NO:11) и CDR-H3 (WGYAYDIDN; SEQ ID NO: 12).
L
H
L
Амплифицированные кДНК V и V легкой и тяжелой цепей антитела клонировали в векторы экспрессии pRK клеток млекопитающих (Shields et al. 2000 J. Biol. Chem.276: 659-604) Амплифицированную кДНК вариабельной области V легкой цепи клонировали в вектор экспрессии pRK клеток млекопитающих, содержащий константный домен каппа человека, с использованием сайтов для EcoRV и KpnI (pRK.LPG3.HumanKappa; Genentech, South San Francisco, CA). Амплифицированную кДНК вариабельной области VH тяжелой цепи встраивали в вектор экспрессии pRK клеток млекопитающих, кодирующий полноразмерный константный домен IgG1 человека (pRK.LPG4.HumanHC; Genentech), с использованием сайтов для BsiWI и ApaI.
Пример 6: Иммуногистохимический анализ
Антитела против полипептида TAT419 получали как описано выше и использовали в иммуногистохимическом анализе, описанном ниже. Срезы ткани сначала 5 минут фиксировали в ацетоне/этаноле (в замороженном или в залитом парафином виде). После этого срезы промывали в PBS, а затем каждый срез блокировали авидином и биотином (с помощью набора Vector) в течение 10 минут и промывали в PBS. Затем срезы блокировали 10% сывороткой в течение 20 минут и подвергали блоттингу для удаления избытка сыворотки. К срезам в течение 1 часа добавляли «первое» антитело в концентрации 10 мкг/мл, а затем эти срезы промывали в PBS. Затем к срезам в течение 30 минут добавляли биотинилированное «второе» антитело (антитело против «первого» антитела), и срезы промывали PBS. Срезы обрабатывали реагентами набора Vector ABC в течение 30 минут и промывали в PBS. После этого срезы обрабатывали диаминобензидином (Pierce) в течение 5 минут и промывали в PBS. После этого срезы подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином Mayers, покрывали покровным стеклом и визуализировали. Иммуногистохимический анализ может быть также осуществлен как описано в руководстве Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989 and Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997).
Результаты этих анализов показали, что моноклональное антитело, используемое в этих анализах, позволяет идентифицировать экспрессию TAT419, наблюдаемую приблизительно у 90% всех независимо тестируемых образцов раковых клеток первичной меланомы человека, где приблизительно 65% этих образцов обнаруживали умеренную (2+) или высокую (3+) степень экспрессии полипептида TAT419.
Пример 7: Гуманизация моноклональных антител мыши
В этом примере продемонстрирована возможность применения методов гуманизации антитела 5E9 мыши, направленного против TAT419.
E. coli
E. coli
Внеклеточный домен TAT419 экспрессировали в клетках  (негликозилированных) и в виде иммуноадгезина (Fc-гибрида) в клетках CHO (гликозилированных), и очищали стандартными методами. Мышиную гибридому, экспрессирующую антитело 5E9, получали путем иммунизации мышей рекомбинантным внеклеточным доменом TAT419, происходящим от , и идентифицировали по его способности связываться с TAT419-покрытыми планшетами с помощью ELISA.
Клонирование вариабельных доменов 5E9 мыши
L
H
Полноразмерную РНК экстрагировали из гибридомных клеток, продуцирующих 5E9, стандартными методами. Вариабельные домены легкой цепи (VL) и вариабельные домены тяжелой цепи (VH) амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР с использованием вырожденных праймеров для тяжелой и легкой цепей. Прямые праймеры были специфичными для N-концевой аминокислотной последовательности областей V и V. Соответственно, обратные праймеры LC и HC были сконструированы так, что они гибридизировались с областью в константном домене легкой цепи (CL) и в константном домене 1 тяжелой цепи (CH1), которые является высококонсервативными для всех видов. Полинуклеотидная последовательность вставок была определена рутинными методами секвенирования.
Прямое присоединение гипервариабельных областей к акцепторной консенсусной каркасной области человека
Фагмида, используемая в этой работе, представляет собой одновалентный вектор для представления Fab-g3 и состоит из двух открытых рамок считывания, находящихся под контролем одного промотора phoA. Первая открытая рамка считывания состоит из сигнальной последовательности stII, слитой с доменами VL и CH1 акцепторной легкой цепи, а вторая открытая рамка считывания состоит из сигнальной последовательности stII, слитой с доменами VH и CH1 акцепторной тяжелой цепи, за которыми расположен минорный белок P3 оболочки фага.
Домены VL и VH, происходящие от 5E9 мыши, сравнивали путем выравнивания с последовательностями VL каппа I человека (huKI) и с консенсусными последовательностями VH человека подгруппы III (huIII). Для получения CDR-гибрида, гипервариабельные области 5E9 присоединяли к консенсусным акцепторым каркасным областям huKI и huIII с получением «5E9-гибрида», то есть, прямого CDR-гибрида. В домене VL, нижеследующие области были присоединены к акцептору человека: в положениях 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3). В домене VH, области присоединяли в положениях 26-35 (H1), 49-65 (H2) и 93-102 (H3). В работе MacCallum et al. (J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)) были проанализированы кристаллические структуры комплекса «антитело-антиген», и было обнаружено, что положения 49 и 93 тяжелой цепи являются частью контактной области, из чего можно сделать вывод, что при гуманизации антител, эти положения могут быть включены в определение CDR-H2 и CDR-H3.
«5E9-гибрид» получали в виде IgG посредством мутагенеза LC- и HC-экспрессирующих векторов методом Kunkel с использованием отдельных олигонуклеотидов для каждой гипервариабельной области. С использованием мутагенеза Kunkel были также сделаны аминокислотные замены для повышения аффинности или стабильности. «Правильные» клоны идентифицировали путем секвенирования ДНК.
Рандомизация гипервариабельных областей
В каждую гипервариабельную область 5E9-гибрида отдельно вносили разнообразие последовательностей с применением стратегии мягкой рандомизации, которая сохраняет смещение в сторону последовательности гипервариабельной области мыши. Это было осуществлено с использованием стратегии синтеза примесных олигонуклеотидов, впервые описанного Gallop et al., J. Med. Chem. 37: 1233-1251 (1994). Для введения мутации в данное положение гипервариабельной области, в кодон, кодирующий аминокислоту дикого типа, была введена 70-10-10-10-смесь нуклеотидов, в результате чего средняя частота мутаций на каждое положение составляла 50 процентов.
Олигонуклеотиды, подвергнутые мягкой рандомизации, характеризовали по профилю последовательностей гипервариабельных областей мыши, и включали те же самые области, определенные путем прямой гибридизации гипервариабельных областей. Разнообразие аминокислот в положениях в начале последовательности H2 (положение 49) в домене VH, было ограничено аминокислотами A, G, S или T с использованием кодона RGC.
Во избежание рекурентной селекции CDR-привитой последовательности дикого типа, стоп-кодон (TAA) вводили в середину каждой CDR 5E9-гибрида с помощью мутагенеза Kunkel, в результате чего получали 6 различных матриц, каждая из которых имела стоп-кодон, введенный в различные CDR. Рандомизированные олигонуклеотиды были использованы для введения разнообразия в последовательности, а тажке для репарации стоп-кодона в соответствующей матрице.
Генерирование фаговых библиотек
2
Пулы рандомизированных олигонуклеотидов, сконструированные в целях введения разнообразия в каждую гипервариабельную область, описанную выше, отдельно фосфорилировали в 20 мкл реакционных смесей, содержащих 660 нг олигонуклеотида, 50 мМ триса, pH 7,5, 10 мМ MgCl, 1 мМ ATP, 20 мМ DTT и 5 ед. полинуклеотид-киназы в течение 1 часа при 37°C.
2
2
9
Каждый пул фосфорилированных олигонуклеотидов, используемый для введения разнообразия в одну CDR, объединяли с 20 мкг матрицы Kunkel, содержащей соответствующий стоп-кодон. Реакцию осуществляли в 50 мМ триса, pH 7,5, 10 мМ MgCl, в конечном объеме 500 мкл с получением отношения олигонуклеотид: матрица, равного 3. Смесь гибридизовали при 90°C в течение 4 минут, 50°C в течение 5 минут, а затем охлаждали на льду. Затем гибридизированную матрицу (250 мкл) достраивали путем добавления 1 мкл 100 мМ ATP, 10 мкл 25 мМ dNTP (25 мМ каждого из dATP, dCTP, dGTP и dTTP), 15 мкл 100 мМ DTT, 25 мкл 10× TM-буфера (0,5 M триса, pH 7,5, 0,1 M MgCl), 2400 ед. лигазы T4 и 30 ед. полимеразы T7 в течение 3 часов при комнатной температуре. Затем достроенный продукт очищали и подвергали электропорации в клетки SS320, и эти клетки размножали в присутствии хелперного фага M13/KO7, как описано Sidhu et al., Methods in Enzymology 328:333-363 (2000). Размер библиотеки составлял 1-2×10 независимых клонов. Рандомизированные клоны, происходящие от исходных библиотек, секвенировали для оценки качества библиотеки.
Отбор фага
Для отбора фага, внеклеточный домен TAT419, происходящий от СНО (2 мкг/мл), иммобилизовали в PBS на микротитрационных планшетах MaxiSorp (Nunc) в течение ночи при 4°C. Планшеты блокировали в течение 1 часа с использованием казеинового блокатора (Pierce). Фаг собирали из супернатанта культуры и суспендировали в PBS, содержащем 0,5% BSA и 0,05 % твина 20 (PBSBT). После отбора фага, лунки микротитрационного планшета интенсивно промывали PBS, содержащим 0,05% твина 20 (PBST), и связанный фаг элюировали путем инкубирования лунок со 100 мМ HCl в течение 30 минут. Фаг нейтрализовали 1 М трисом, рН 8, и амплифицировали с использованием клеток XL1-Blue и хелперного фага M13/KO7, а затем культивировали в течение ночи при 37°C в 2YT, 50 мкг/мл карбенациллина. Титры фага, элюированного с мишень-содержащей лунки, сравнивали с титрами фага, выделенного из лунки, не содержащей мишени, для оценки уровня обогащения.
Получение Fab и IgG
E. coli
Cancer Res.
В целях экспрессии белка Fab для измерения аффинности, между тяжелой цепью и g3 в векторе фагового представления встраивали стоп-кодон. Клоны переносили в клетки  34B8 и культивировали в полной среде C.R.A.P. при 30°C (Presta et al.  57: 4593-4599 (1997)). Клетки собирали путем центрифугирования, суспендировали в PBS, 100 мкМ PMSF, 100 мкМ бензамидина, 2,4 мМ EDTA, и разрушали в открытом виде с использованием микрофлюидизатора. Fab очищали с помощью аффинной хроматографии на G-белке.
2
Для проведения скрининга, варианты IgG сначала продуцировали в клетках 293. Векторы, кодирующие VL и VH (25 мкг), переносили в клетки 293 с использованием системы FuGene. 500 мкл FuGene смешивали с 4,5 мл среды DMEM, не содержащей FBS, и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. К этой смеси добавляли каждую цепь (25 мкг), и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем переносили в пять колб Т-150 для трансфекции в течение ночи при 37°C в 5% CO. На следующий день, среду, содержащую смесь для трансфекции, удаляли и заменяли 23 мл среды PS04, содержащей 0,1 мл/л микроэлементов (A0934) и 10 мг/л инсулина (A0940). Клетки инкубировали еще 5 дней, а затем среду собирали при 1000 об/мин в течение 5 минут и подвергали стерильной фильтрации через 0,22 мкм-фильтр, связывающийся с белком, присутствующим в небольшом количестве. После добавления 2,5 мл 0,1% PMSF для каждых 125 мл среды, образцы можно хранить при 4°C. IgG очищали с помощью аффинной хроматографии на G-белке.
Определение аффинности
TM
Определение аффинности осуществляли с помощью анализа Скэтчарда и методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore-2000 или A100.
Biacore 2000
Внеклеточный домен TAT419 (гликозилированный) был иммобилизован (приблизительно 100-400 о.е., в 10 мМ ацетата натрия, pH 4,8, на сенсорном чипе CM5), а вариант антитела 5E9 служил в качестве аналита (впрыскиваемого при скорости потока 30 мкл/мин с использованием 2-кратного серийного разведения 4-1000 нМ в PBST). Каждый образец анализировали - при ассоциации в течение 4 минут, и при диссоциации - в течение 10 минут. После каждого впрыска, чип регенерировали 10 мМ глицином, pH 1,7.
Результаты и обсуждение
Акцепторная каркасная область человека, используемая для гуманизации, была получена на основе консенсусного домена VL каппа I человека и консенсусного домена VH человека подгруппы III. Домены VL и VH 5E9 выравнивали с доменами человека каппа I и доменами подгруппы III; причем каждую гипервариабельную область (CDR) идентифицировали и присоединяли к акцепторной каркасной области человека с получением CDR-гибрида, который может экспрессироваться как IgG (5E9-гибрид).
Были получены Fab-представляющие фаговые библиотеки, где в каждую CDR 5E9-гибрида по отдельности было введено разнообразие последовательностей, и такие библиотеки подвергали пэннингу на внеклеточный домен TAT419, происходящий от CHO. Обогащение наблюдалось после второго раунда во всех 6 библиотеках. После 6 раунда, из каждой библиотеки брали клоны для анализа последовательности ДНК, в результате чего были выявлены нужные модификации последовательностей в каждой из шести CDR. Такие модификации последовательностей, идентифицированные в библиотеке, представляют собой модификации, которые приводят к образованию вариантов с улучшенными связывающими свойствами, или просто указывают на аминокислотные замены в положениях, которые не влияют на связывание с внеклеточным доменом TAT419.
Несколько отобранных клонов экспрессировали как Fab и охарактеризовывали на связывание с внеклеточным доменом TAT419 с помощью Biacore. Все клоны связывались с TAT419 на поверхности клеток, а большинство клонов связывались с аффинностью, значительно превышающей аффинность связывания с 5E9-гибридом.
Было показано, что гуманизированное анти-TAT419 антитело, обозначенное в настоящем описании hu5E9.v1 и имеющее аминокислотную последовательность полноразмерной легкой цепи, представленную на фигуре 5 (SEQ ID NO:13), аминокислотную последовательность полноразмерной тяжелой цепи, представленную на фигуре 6 (SEQ ID NO:14), аминокислотную последовательность VL, представленную на фигуре 5 (SEQ ID NO:15); и аминокислотную последовательность VH, представленную на фигуре 6 (SEQ ID NO:16), связывалось с TAT419 на поверхности клеток с большей аффинностью, чем антитело 5E9 мыши, а поэтому такое антитело было выбрано в качестве основного кандидата для последующих разработок. Ниже представлены различные последовательности CDR hu5E9.v1: CDR-L1 (KSSQSLLDSDGKTYLN, SEQ ID NO:7), CDR-L2 (LVSKLDS, SEQ ID NO:8), CDR-L3 (WQGTHFPYT; SEQ ID NO:9), CDR-H1 (GYTFTSYWMQ; SEQ ID NO:10), CDR-H2 (TIYPGDGDTSYAQKFKG; SEQ ID NO:11) и CDR-H3 (WGYAYDIDN; SEQ ID NO:12).
Было также идентифицировано второе гуманизированное анти-TAT419 антитело, обозначенное в настоящем описании hu5E9.v2 и имеющее такую же последовательность VL (SEQ ID NO:15), как и hu5E9.v1, и аминокислотную последовательность VH, представленную на фигуре 7 (SEQ ID NO:17).
Пример 8: Анализы на связывание и картирование эпитопов TAT419
Аффинность связывания различных анти-TAT419 антител может быть определена методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием Pharmacia BIAcore 3000 (BIAcore AB, Uppsala, Sweden) при комнатной температуре (см. например, Morton et al. 1998 Methods in Enzymology, 295, 268-294). Различные анти-TAT419 антитела иммобилизовали на сенсорном чипе (CM5) посредством первичных аминогрупп. Карбоксиметилированную матрицу на поверхности сенсорного чипа активировали путем впрыскивания 20 мл смеси 0,025 M N-гидроксисукцинимида и 0,1 M N-этил-N'(диметиламинопропил)карбоксидиимида при скорости 5 мл/мин. 5-10 мл 10 мг/мл раствора анти-TAT419 антител в 10 мМ ацетата натрия, pH 4,5, впрыскивали при скорости 5 мл/мин. После связывания, незанятые сайты на чипе блокировали путем впрыскивания 20 мл 1M этаноламина, pH 8,5. Рабочим буфером является PBS, содержащий 0,05% полисорбата 20. Для измерения кинетики, двухкратные серийные разведения различных анти-TAT419 антител в рабочем буфере впрыскивали поверх проточных кювет в течение 3 минут при скорости потока 30 мл/мин, и связанное вещество оставляли на 20 минут для диссоциации. Связывающую поверхность регенерировали путем впрыскивания 20 мл 10 мМ глицина-HCl (pH 1,5). Проточную кювету, которая была активирована, но не содержала иммобилизованного антитела, использовали в качестве эталонной кюветы. При этом наблюдалось незначительное неспецифическое связывание вещества с проточной кюветой. Для вычисления кажущейся аффинности связывания, данные анализировали с использованием связывающей модели 1:1 путем построения общей кривой. Одновременно строили кривые констант скорости ассоциации и диссоциации (с помощью оценочной компьютерной программы BIA).
Эпитопы TAT419, связанные с различными моноклональными антителами, описанными выше, определяли с помощью стандартного анализа на конкурентное связывание (Fendly et al. 1990 Cancer Research 50: 1550-1558). Исследования на перекрестное блокирование осуществляли с использованием антител посредством прямой флуоресценции на приборе PANDEX™ Screen Machine для количественной оценки флуоресценции и с использованием интактных клеток, сконструированных так, чтобы они экспрессировали полипептид TAT419.
Selected Methods in Cellular Immunology
6
3
Каждое моноклональное антитело конъюгировали с флуоресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ) в соответствии с хорошо известными процедурами (Wofsy et al. 1980 , p. 287, Eds. Mishel and Schiigi San Francisco: W.J. Freeman Co.). Образцы тестировали как конфлюэнтные монослои TAT419-экспрессирующих клеток, которые обрабатывали трипсином, один раз промывали и ресуспендировали при плотности 1,75×10 клеток/мл в холодном PBS, содержащем 0,5% альбумина бычьей сыворотки (BSA) и 0,1% NaN. Для снижения степени загрязнения перегородок планшета PANDEX™ добавляли латексные частицы в конечной концентрации 1% (IDC, Portland, OR). В лунки планшета PANDEX™ добавляли клеточную суспензию, 20 мкл, и 20 мкл очищенных моноклональных антител (100 мкг/мл - 0,1 мкг/мл), и эти клетки инкубировали на льду в течение 30 минут. В каждую лунку добавляли предварительно определенное разведение ФИТЦ-меченых моноклональных антител в 20 мкл, инкубировали в течение 30 минут и промывали, и флуоресценцию количественно оценивали на приборе PANDEX™ Screen Machine. Считается, что моноклональные антитела имеют общий эпитоп только в том случае, если они блокируют связывание друг друга в равной степени. В этом эксперименте, каждое моноклональное антитело мыши, обозначенное в настоящем описании 5E9 и 3C3, оценивали на связывание с различными эпитопами на клеточной поверхности, экспрессирующей полипептид TAT419. С помощью этого анализа средний специалист в данной области может идентифицировать и другие моноклональные антитела, которые связываются с теми же эпитопами, которые были описаны в настоящей заявке.
Анализ на связывание также проводили для идентификации приблизительной локализации эпитопов. Несколько пептидных вариантов, происходящих от TAT419, экспрессировались в клетках 293. Вестерн-блот-анализы осуществляли с использованием различных описанных в настоящем описании мышиных моноклональных анти-TAT419 антител. Результаты этих анализов продемонстрировали, что мышиное анти-TAT419 антитело 5E9 распознавало клетки 293 и связывалось с клетками 293, экспрессирующими полноразмерный полипептид TAT419, тогда как второе независимое мышиное моноклональное анти-TAT419 антитело не распознавало клетки 293 и не связывалось с клетками 293, экспрессирующими полноразмерный полипептид TAT419, имеющий фрагмент с делетированным N-концом, что позволяет предположить об идентификации двух отдельных различных эпитопов.
Более конкретно, было показано, что некоторые протестированные в настоящем описании мышиные моноклональные анти-TAT419 антитела связываются с эпитопом (или эпитопами), расположенным между 27-ой и 64-й аминокислотой последовательности ТАТ419, представленной в настоящем описании как SEQ ID NO:2. Кроме того, было показано, что другое мышиное моноклональное анти-TAT419 антитело (включая моноклональное антитело 5Е9 мыши и его различные гуманизированные варианты) связывается с эпитопом (или эпитопами), расположенным между 65-ой и 101-й аминокислотой последовательности полипептида TAT419, представленного в настоящем описании как SEQ ID NO:2.
Пример 9: Анти-TAT419 антитела интернализуются клетками, которые экспрессируют полипептид TAT419
Клеточную интернализацию анти-TAT419 антител исследовали на клетках, которые экспрессируют TAT419 на своей поверхности. Для определения поведения антител, которые связываются с TAT419, образцы TAT419-экспрессирующих клеточных линий меланомы инкубировали с различными анти-TAT419 антителами на льду в течение одного часа, а затем фиксировали для окрашивания «вторым» антителом. Таким «вторым» антителом было либо антитело против Cy3 мыши, используемое для моноклонального антитела 5E9 мыши и других моноклональных анти-TAT419 антител мыши, либо антитело против Cy3 человека, используемое для химерных вариантов моноклональных антител мыши. Значимое окрашивание плазматической мембраны моноклональными антителами мыши наблюдалось у TAT419-экспрессирующих клеток под деконволюционным микроскопом, что указывало на образование комплекса «антитело - белок клеточной поверхности».
Blood
Более подробное описание этих методов см. в публикации «Internalization studies» in Polson et al.,  110(2):616-23 (2007), page 618. Immunofluorescence showed cell surface staining and internalization when visualized using Deconvolution Microscopy, 60x Magnification). У контрольных клеток, которые не экспрессировали TAT419, не наблюдалось окрашивания плазматической мембраны. Эти наблюдения сравнивали с клетками, которые выдерживали на льду в течение одного часа, с последующим повышением температуры до 37°C в течение 2 часов. Значимое окрашивание плазматической мембраны и внутренней части клеток наблюдали на TAT419-экспрессирующих клетках с использованием мышиных анти-TAT419 антител 5E9 и 3C3, что указывало на миграцию комплекса «антитело-белок клеточной поверхности» в саму клетку. Поглощение комплекса антитело/TAT419 наблюдалось также после инкубирования в течение ночи.
Окрашивание плазматической мембраны антителом 5E9 осуществляли в течение 1 часа с инкубированием при 4°C, а затем клетки фиксировали и обрабатывали «вторым» антителом, антителом «против Cy3 мыши». Интернализация наблюдалась после 2-часового инкубирования или инкубирования в течение ночи при 37°C, после чего клетки фиксировали и обрабатывали «вторым» антителом.
2
Клетки высевали на предметные стекла 8-луночной камеры (Nalge Nunc Intl.) (приблизительно 100000 клеток/лунку) и инкубировали при 37°C/5% CO в течение 24-48 часов. Анти-TAT419 антитела добавляли в концентрации 2-5 мкг/мл в среду для роста и культивировали в течение ночи или в течение 2 часов вместе с ингибиторами протеазы (50 мкг/мл лейпептина и 5 мкг/мл пепстатина). Эти ингибиторы протеазы предупреждают деградацию «первого» антитела, что позволяет детектировать антитело в лизосомах. Для мечения «живых» клеток, эти клетки инкубировали с антителами при комнатной температуре в течение 45 минут. Затем все клетки промывали, фиксировали в 3% формальдегиде в течение 10 минут, делали проницаемыми с помощью 0,05% сапонина в течение 5-10 минут, и сайты неспецифического связывания антитела блокировали с помощью PBS+1%BSA в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем клетки инкубировали со «вторым» антителом, меченным Alexa-488 (Molecular Probes) при 37°C в течение 1 часа, и промывали, после чего вставленные камеры вынимали для обработки стеклянных предметных стекол клетками. Предметные стекла помещали на VectaShield с DAPI для мечения ядер (Vector Laboratories), после чего их помещали под стеклянные покровные стекла и герметично запаивали прозрачным лаком для ногтей.
Результаты этих анализов продемонстрировали, что описанные в настоящем описании различные анти-TAT419 антитела (включая моноклональное антитело 5E9 мыши, и их различные гуманизированные варианты) связываются с полипептидом TAT419 на поверхности живых клеток, и быстро интернализуются в клетках и локализуются на лизосомах клетки за менее чем 20 часов после добавления антител к этим клеткам. Таким образом, описанные в настоящем описании анти-TAT419 антитела являются превосходными кандидатами на токсины-конъюгаты, которые могут быть использованы для лечения опухолей, экспрессирующих полипептиды TAT419.
Пример 10: Получение конъюгированных с токсином антител, которые связываются с TAT419
Использование конъюгатов «антитело-лекарственное средство» (ADC), то есть, иммуноконъюгатов, для локальной доставки цитотоксических или цитостатических средств, то есть, лекарственных средств для уничтожения или подавления роста опухолевых клеток при лечении рака (Payne (2003) Cancer Cell 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26: 151-172; патент США № 4975278), позволяет осуществлять направленную доставку лекарственного средства в опухоли и обеспечивать их аккумуляцию внутри клеток, тогда как системное введение этих неконъюгированных лекарственных средств может приводить к продуцированию уровней токсичности, которые являются неприемлемыми для нормальных клеток и недостаточными для уничтожения опухолевых клеток (Baldwin et al., 1986, Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, 1985, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review” in Monoclonal Antobodies 84:Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506). Поэтому необходимо добиться максимальной эффективности и минимальной токсичности. Для конструирования этого и улучшения свойств ADC, все усилия были направлены на повышение селективности моноклональных антител (mAb), а также их способности связываться с лекарственным средством и высвобождать указанное средство. Как уже сообщалось, в этих стратегиях были использованы как поликлональные, так и моноклональные антитела (Rowland et al. (1986), Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87). Лекарственными средствами, используемыми в этих методах, являются дауномицин, доксорубицин, метотрексат и виндезин (Rowland et al. (1986), см. выше). Токсинами, используемыми в конъюгатах «антитело-токсин», являются бактериальные токсины, такие как дифтерийный токсин, растительные токсины, такие как рицин, и небольшие молекулы токсинов, такие как гельданамицин (Mandler et al., (2000) J. of the Nat.Cancer Inst. 92 (19):1573-1581; Mandler et al.(2000), Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002), Bioconjugate Chem. 13:786-791), майтанзиноиды (ЕР 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623) и калихеамицин (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342).
В конъюгатах «антитело - лекарственное средство» (ADC) согласно изобретению, антитело (Ab) конъюгировано с одной или несколькими молекулами лекарственного средства (D), например, примерно с 1-20 молекулами лекарственного средства на антитело, посредством линкера (L). ADC, имеющие формулу
р
Ab-(L-D)
могут быть получены несколькими способами, а именно методами органической химии в определенных условиях и с использованием реагентов, известных специалистам, включая: (1) реакцию взаимодействия нуклеофильной группы антитела с двухвалентным линкерным реагентом с образованием Ab-L посредством ковалентной связи с последующим проведением реакции взаимодействия с молекулой лекарственного средства D; и (2) реакцию взаимодействия нуклеофильной группы молекулы лекарственного средства с двухвалентным линкерным реагентом с образованием D-L посредством ковалентной связи с последующим проведением реакции взаимодействия с нуклеофильной группой антитела. Дополнительные методы получения ADC описаны в настоящей заявке.
Линкер может состоять из одного или более линкерных компонентов. Характерными линкерными компонентами являются 6-малеимидокапроил («MC»), малеимидопропаноил («MP»), валин-цитруллин («val-cit»), аланин-фенилаланин («ala-phe»), п-аминобензилоксикарбонил («PAB»), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат («SPP»), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат («SMCC»), и N-сукцинимидил-(4-иодацетил)аминобензоат («SIAB»). Специалистам известны и другие линкерные компоненты, некоторые из которых описаны ниже.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, линкер может содержать аминокислотные остатки. Характерными аминокислотными линкерными компонентами являются дипептид, трипептид, тетрапептид или пентапептид. Характерными дипептидами являются валин-цитруллин (vc или val-cit), аланин-фенилаланин (af или ala-phe). Характерными трипептидами являются глицин-валин-цитруллин (gly-val-cit) и глицин-глицин-глицин (gly-gly-gly). Аминокислотными остатками, которые составляют аминокислотный линкерный компонент, являются природные аминокислотные остатки, а также небольшие аминокислоты и неприродные аминокислотные аналоги, такие как цитруллин. Аминокислотные линкерные компоненты могут быть сконструированы и оптимизированы по их селективности в отношении ферементативного расщепления конкретными ферментами, например, опухоль-ассоциированной протеазой, катепсином В, C и D, или плазминовой протеазой.
Нуклеофильными группами, присутствующими на антителах, являются, но не ограничиваются ими: (i) N-концевые аминогруппы, (ii) аминогруппы боковой цепи, например, лизина, (iii) тиоловые группы боковой цепи, например, цистеина, и (iv) гидроксильные или аминогруппы сахаров, где указанное антитело является гликозилированным. Аминогруппы, тиоловые группы, гидроксильные группы, гидразидные группы, оксимные группы, гидразиновые группы, тиосемикарбазоновые группы, гидразин-карбоксилатные группы и арилгидразидные группы являются нуклеофильными и могут подвергаться реакции взаимодействия с образованием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных молекулах или линкерных реагентах, включая: (i) активные сложные эфиры, такие как NHS-эфиры, HOBt-эфиры, галогенформиаты и галогенангидриды кислот; (ii) алкил- и бензилгалогениды, такие как галогенацетамиды; (iii) альдегиды, кетоны, карбоксильные и малеимидные группы. Некоторые антитела имеют восстанавливаемые межцепьевые дисульфиды, то есть, цистеиновые мостики. Для конъюгирования с линкерными реагентами, антитела могут быть сделаны реакционноспособными путем их обработки восстановителем, таким как DTT (дитиотреитол). Каждый цистеиновый мостик, теоретически, может образовывать два реакционноспособных тиоловых нуклеофила. В антитела могут быть введены дополнительные нуклеофильные группы посредством реакции взаимодействия лизинов с 2-иминотиоланом (реагентом Траута), что будет приводить к превращению амина в тиол. Реакционноспособные тиоловые группы могут быть включены в антитело (или его фрагмент) путем введения одного, двух, трех, четырех или более цистеиновых остатков (например, получения вариантов антител, содержащих один или несколько неприродных цистеиновых аминокислотных остатков).
Конъюгаты «антитело - лекарственное средство» согласно изобретению могут быть также получены путем модификации антитела с введением электрофильных групп, которые могут реагировать с нуклеофильными заместителями на линкерном реагенте или лекарственном средстве. Сахара гликозилированных антител могут быть окислены, например, периодатными окислителями с образованием альдегидных или кетоновых групп, которые могут реагировать с аминогруппой линкерных реагентов или молекул лекарственного средства. Полученные иминовые группы шиффова основания могут образовывать стабильную связь, либо они могут быть восстановлены, например, борогидридными реагентами с образованием стабильных аминовых связей. В одном из вариантов изобретения, реакция взаимодействия углеводной части гликозилированного антитела с галактозооксидазой или с метапериодатом натрия может приводить к образованию карбонильных (альдегидных и кетоновых) групп в белке, которые могут реагировать с соответствующими группами на лекарственном средстве (Hermanson, Bioconjugate Techniques). В другом варианте осуществления изобретения, антитела, содержащие N-концевые сериновые или треониновые остатки, могут реагировать с метапериодатом натрия с образованием альдегида вместо первой аминокислоты (Geoghegan & Stroh (1992), Bioconjugate Chem. 3:138-146; патент США № 5362852). Такой альдегид может взаимодействовать с молекулой лекарственного средства или с линкерным нуклеофилом.
Альтернативно, гибридный белок, содержащий антитело и цитотоксическое средство, может быть получено, например, рекомбинантными методами или методом пептидного синтеза. По своей длине, ДНК может содержать соответствующие области, кодирующие две части конъюгата, либо смежные друг с другом, либо разделенные областью, кодирующей линкерный пептид, который не оказывает негативного влияния на желаемые свойства данного конъюгата.
В еще одном варианте осуществления изобретения, указанное антитело может быть конъюгировано с «рецептором» (таким как стрептавидин) для его предварительного нацеливания на опухоль, где указанный конъюгат «антитело-рецептор» вводят пациенту с последующим удалением несвязанного конъюгата из кровотока с использованием средства для клиренса, а затем вводят «лиганд» (например, авидин), конъюгированный с цитотоксическим средством (например, радионуклеотидом).
Конкретные методы получения конъюгатов «антитело - лекарственное средство» путем связывания токсинов с очищенными антителами хорошо известны специалистам и являются рутинными. Так, например, конъюгирование очищенного моноклонального антитела с токсином DM1 может быть осуществлено следующим образом. Очищенное антитело дериватизировали N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноатом с введением дитиопиридильных групп. Антитело (376,0 мг, 8 мг/мл) в 44,7 мл 50 мМ калийфосфатного буфера (pH 6,5), содержащего NaCl (50 мМ) и EDTA (1 мМ), обрабатывали SPP (5,3 молярных эквивалента в 2,3 мл этанола). После инкубирования в течение 90 минут в атмосфере аргона при комнатной температуре, реакционную смесь подвергали гель-фильтрации на колонке с сефадексом G25, уравновешенной 35 мМ цитрата натрия, 154 мМ NaCl и 2 мМ EDTA. Затем, фракции, содержащие антитело, объединяли и анализировали. Антитело-SPP-Py (337,0 мг с высвобождаемыми 2-тиопиридиновыми группами) разводили вышеуказанным 35 мМ натрийцитратным буфером, pH 6,5, до конечной концентрации 2,5 мг/мл. После этого, к раствору антитела добавляли DM1 (1,7 эквивалента, 16,1 моль) в 3,0 мМ диметилацетамида (ДМА, 3% об/об в конечной реакционной смеси). Реакционную смесь оставляли на 20 часов при комнатной температуре в атмосфере аргона для прохождения реакции. Затем, реакционную смесь загружали на гель-фильтрующую колонку с Sephacryl S300 (5,0 см × 90,0 см, 1,77 л), уравновешенную 35 мМ цитрата натрия, 154 мМ NaCl, pH 6,5. Скорость потока составляла 5,0 мл/мин, и было собрано 65 фракций (каждая по 20,0 мл). Фракции объединяли и анализировали, и число связанных молекул лекарственного средства DM1 на молекулу антитела (р') определяли путем измерения оптической плотности на 252 нм и 280 нм.
Для иллюстрации, конъюгирование очищенного моноклонального антитела с токсином DM1 может быть также осуществлено следующим образом. Очищенное антитело дериватизировали (сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилатом (SMCC, Pierce Biotechnology, Inc) для введения SMCC-линкера. Антитело обрабатывали при концентрации 20 мг/мл в 50 мМ фосфата калия/50 мМ хлорида натрия/2 мМ EDTA, pH 6,5, 7,5 молярными эквивалентами SMCC (20 мМ в ДМСО, 6,7 мг/мл). После перемешивания в течение 2 часов в атмосфере аргона при комнатной температуре, реакционную смесь фильтровали через колонку с сефадексом G25, уравновешенную 50 мМ фосфата калия/50 мМ хлорида натрия/2 мМ EDTA, pH 6,5. Фракции, содержащие антитело, объединяли и анализировали. Затем антитело-SMCC разводили 50 мМ фосфата калия/50 мМ хлорида натрия/2 мМ EDTA, pH 6,5 до конечной концентрации 10 мг/мл и подвергали реакции взаимодействия с 10 мМ раствора DM1 (1,7 эквивалентов соответствует, предположительно, 5 молекулам SMCC/антитело, 7,37 мг/мл) в диметилацетамиде. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере аргона в течение 16,5 часа. Затем реакционную смесь для конъюгирования фильтровали через гель-фильтрующую колонку с сефадексом G25 (1,5×4,9 см) с 1 x PBS при pH 6,5. После этого определяли отношение DM1/антитело (p) путем измерения оптической плотности на 252 нм и 280 нм.
4
4
4
Кроме того, свободный цистеин на выбранном антителе может быть модифицирован бис-малеимидо-реагентом BM(PEO) (Pierce Chemical), в результате чего на поверхности антитела остается непрореагировавшая малеимидо-группа. Это может быть осуществлено путем растворения BM(PEO) в смеси 50% этанола/воды до концентрации 10 мМ и добавления 10-кратного молярного избытка к раствору, содержащему антитело в забуференном фосфатом физиологическом растворе при концентрации приблизительно 1,6 мг/мл (10 микромоль), и эту смесь оставляли на 1 час для прохождения реакции. Избыток BM(PEO) удаляли путем гель-фильтрации в 30 мМ цитрата, pH 6, с 150 мМ NaCl-буфером. Приблизительно 10-кратный молярный избыток DM1 растворяли в диметилацетамиде (ДМА) и добавляли к промежуточному соединению антитело-BMPEO. Для растворения реагента, а именно, молекулы лекарственного средства, может быть также использован диметилформамид (ДМФ). Реакционную смесь оставляли на ночь для прохождения реакции, а затем подвергали гель-фильтрации или диализу в PBS для удаления непрореагировавшего лекарственного средства. Гель-фильтрацию на колонках S200 в PBS проводили для удаления высокомолекулярных агрегатов и получали очищенный конъюгат «антитело-BMPEO-DM1».
Цитотоксические лекарственные средства обычно конъюгировали с антителами часто посредством большого количества лизиновых остатков антитела. Конъюгирование также проводили посредством уже имеющихся или сконструированных тиоловых групп, с получением представляющего интерес антитела. Так, например, цистеиновые остатки были введены в белки методами генной инженерии для создания сайтов ковалентного связывания с лигандами (Better et al. (1994) J. Biol. Chem. 13:9644-9650; Bernhard et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5: 126-132; Greenwood et al. (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255; Tu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867; Kanno et al. (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214; Chmura et al. (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(15):8480-8484; патент США № 6248564). После введения свободного цистеинового остатка в представляющее интерес антитело, токсины могут быть присоединены к этому сайту. Так, например, реагенты «лекарственное средство-линкер», малеимидокапроил-монометилауристатин E (MMAE), то есть, MC-MMAE, малеимидокапроил-монометилауристатин F (MMAF), то есть, МС-MMAF, MC-val-cit-PAB-MMAE или MC-val-cit-PAB-MMAF, растворенные в ДМСО, разводили в ацетонитриле и воде в известной концентрации, и добавляли к охлажденному и дериватизированному цистеином антителу в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS). Примерно через один час добавляли избыток малеимида для гашения реакции, и любую непрореагировашую тиоловую группу антитела кэпировали. Реакционную смесь концентрировали путем ультрафильтрации на центрифуге, после чего конъюгированное с токсином антитело очищали и обессоливали путем элюирования смолой G25 в PBS, а затем фильтровали через 0,2 мкм-фильтры в стерильных условиях, и замораживали для последующего хранения.
Кроме того, анти-TAT419 антитела согласно изобретению могут быть конъюгированы с ауристатиновым и долостатиновым токсинами (такими как MMAE и MMAF) с применением нижеследующего метода. Антитело, растворенное в 500 мМ бората натрия и 500 мМ хлорида натрия при pH 8,0, обрабатывали избытком l00 мМ дитиотреитола (DTT). После инкубирования при 37°C в течение примерно 30 минут, буфер заменяли путем элюирования поверх смолы Сефадекс G25, а затем элюировали PBS с 1 мМ DTPA. Величину тиола/Ab определяли путем измерения концентрации восстановленного антитела, исходя из оптической плотности на 280 нм раствора, и концентрации тиола путем проведения реакции взаимодействия с DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) и измерения оптической плотности на 412 нм. Восстановленное антитело, растворенное в PBS, охлаждали на льду.
Реагент «лекарственное средство - линкер», (1) малеимидокапроил-монометилауристатин E (MMAE), то есть MC-MMAE, (2) MC-MMAF, (3) MC-val-cit-PAB-MMAE, или (4) MC-val-cit-PAB-MMAF, растворенные в ДМСО, разводили в ацетонитриле и воде в известных концентрациях, а затем добавляли к охлажденному восстановленному антителу в PBS. Примерно через один час, добавляли избыток малеимида для гашения реакции, и любые тиоловые группы непрореагировавшего антитела кэпировали. Реакционную смесь концентрировали путем ультрафильтирации на центрифуге, а затем конъюгированное антитело очищали и обессоливали путем элюирования через смолу G25 в PBS, после чего фильтровали через 0,2 мкм-фильтры в стерильных условиях, и замораживали для хранения.
Описанные в настоящем описании анти-TAT419 антитела, конъюгированные с токсином, получали, как описано выше, и тестировали с помощью стандартного FACS-анализа для того, чтобы определить, может ли конъюгирование с токсином влиять на способность антитела к связыванию с полипептидом TAT419 на поверхности TAT419-экспрессирующих клеток. Результаты этих анализов продемонстрировали, что после конъюгирования антител с токсином, какой-либо потери связывания с полипептидом TAT419 не наблюдалось.
In
vitro
Пример 11:  анализ на уничтожение опухолевых клеток
in vitro
Клетки млекопитающих, экспрессирующие представляющий интерес полипептид TAT419, могут быть получены с использованием стандартного вектора экспрессии и с применением стандартных методов клонирования. Альтернативно, многие опухолевые клеточные линии, экспрессирующие представляющие интерес полипептиды TAT419, являются общедоступными, например, они могут быть взяты из ATCC и могут быть рутинно идентифицированы с помощью стандартных ELISA- или FACS-анализов. Моноклональные антитела против полипептида TAT419 (и их конъюгированные с токсином производные) могут быть затем использованы в анализах на определение способности антитела уничтожать клетки, экспрессирующие полипептид TAT419 .
Так, например, клетки, экспрессирующие представляющий интерес полипептид TAT419, получали, как описано выше, и высевали в 96-луночные планшеты. В одном из анализов, конъюгат антитело/токсин (или «голое» антитело) получали путем инкубирования клеток в течение 4 дней. Во втором независимом анализе, клетки инкубировали в течение 1 часа с конъюгатом антитело/токсин (или «голым» антителом), а затем промывали и инкубировали в отсутствии конъюгата антитело/токсин в течение 4 дней. В еще одном независимом анализе, клетки, генетически сконструированые так, чтобы они экспрессировали полипептид TAT419 на своей поверхности (при этом, контрольные клетки не экспрессировали полипептид TAT419), могут быть обработаны конъюгированным с токсином анти-TAT419 антителом, после чего может быть проведено их сравнение. Затем оценивали жизнеспособность клеток с помощью анализа на жизнеспособность клеток CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay, разарботанного фирмой Promega (Cat# G7571). Необработанные клетки служили в качестве негативного контроля.
in vitro
В первом эксперименте и в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, различные концентрации конъюгатов некоторых анти-TAT419 антител с токсином (ADC) MC-vc-PAB-MMAE (включая моноклональное антитело 5E9 мыши и его гуманизированные варианты hu5E9.v1 и hu5E9.v2) тестировали на способность связываться с меланомными клеточными линиями, экспрессирующими полипептид TAT419, такими как 526mel, 537mel, 888mel, 928mel, 1300mel, A375, A2058, COLO829, G361, Hs-294-T, Malme3m, SK23, SKmel5, SKmel5-RC, SKmel28, WM-266-4, UACC257 и UACC257-NC160, и уничтожать эти клетки. Более конкретно, TAT419-экспрессирующие клетки обрабатывали  PBS (в качестве негативного контроля), или конъюгатом контрольного антитела с токсином MC-vc-PAB-MMAE, который не связывается с полипептидом TAT419 (в качестве негативного контроля) или анти-TAT419 антителом, конъюгированным с токсином MC-vc-PAB-MMAE. Результаты этих анализов продемонстрировали, что все протестированные анти-TAT419 антитела, конъюгированные с токсином (включая 5E9, hu5E9.v1 и hu5E9.v2), обладали способностью в значительной степени индуцировать уничтожение клеток, которые являются специфичными к TAT419-мишени, и которые экспрессируют на своей поверхности полипептид TAT419, причем, в случае негативного контроля, какого-либо уничтожения специфических клеток на наблюдалось.
in vitro
В конкретном варианте, который служит в качестве иллюстративного примера результатов этого исследования, клетки UACC257X2.2 (которые экспрессируют полипептид TAT419 на своей поверхности) обрабатывали  различными концентрациями PBS (в качестве негативного контроля) или конъюгатом контрольного антитела с токсином MC-vc-PAB-MMAE, который не связывается с полипептидом TAT419 (Ctrl-vc-MMAE), или антителом 5Е9, конъюгированным с токсином MC-vc-PAB-MMAE (5E9-vc-MMAE), как описано выше. Данные, этих анализов, представленные на фигуре 8, продемонстрировали, что антитело 5Е9, конъюгированное с токсином vc-MMAE, обладает способностью уничтожать клетки, экспрессирующие на своей поверхности TAT419. Сравнительные данные, полученные для различных клеточных линий, экспрессирующих различные количества полипептида TAT419 на своей поверхности, продемонстрировали, что эффективность уничтожения клеток пропорциональна уровню экспрессии TAT419 на клеточной поверхности.
Полученные данные продемонстрировали, что различные анти-TAT419 антитела, используемые в этих анализах (включая 5E9, hu5E9.v1 и hu5E9.v2), обладают способностью связываться с полипептидом TAT419 на клеточной поверхности и индуцировать гибель клеток, с которыми связывается данное антитело.
In
vivo
Пример 12:  анализ на уничтожение опухолевых клеток, проводимый на модели введенного внутрибрюшинно ксенотрансплантата опухоли человека
In vivo
3
активность конъюгатов «антитело-лекарственное средство» может быть определена путем обработки мышей “nude” NCR, которым были имплантированы опухоли человека (так называемые ксенотрансплантаты). В этих исследованиях использовали клеточные линии меланомы человека и опухоли человека, размноженные у мышей путем имплантации им образцов опухоли. В этом исследовании, 10 мышам на группу, каждая из которых имела меланомную опухоль (приблизительно 100-200 мм), вводили i.v. в хвостовую вену дозу 3 мг/кг, и эту дозу снова вводили через 3 недели. Измерение опухолей осуществляли в течение всего периода исследования, а затем брали образцы опухоли, которые фиксировали формалином или быстро замораживали для проведения анализа «TaqMan», а также гистологического анализа.
in vivo
Клеточные линии и опухоли меланомы человека, полученные путем серийного пассирования у мышей “nude”, имплантировали i.р., и во время всего исследования оценивали их рост. После того, как опухоли достигали соответствующего размера, мышам групп обработки вводили дозы конъюгатов «антитело - лекарственное средство». Замедление роста опухолевого ксенотрансплантата по сравнению с ростом опухоли в случае обработки носителем или контрольным антителом, является показателем эффективности лечения. В целом, полученные результаты продемонстрировали специфичность и эффективность конъюгатов «анти-TAT419 антитело - лекарственное средство» у  моделей с ростом опухолей. Объем опухоли измеряли у каждой мыши через 0, 2, 7, 10, 13, 17, 20, 24 и 27 дней после инъекции для определения эффективности каждой обработки в отношении снижения объема опухоли. Кроме того, % выживших животных определяли ежедневно в течение ~30 дней после начала обработки.
in vivo
in vivo
Результаты этих анализов  продемонстрировали, что у мышей, обработанных только носителем или конъюгированным с токсином антителом, не являющимся специфичным к TAT419, наблюдалось лишь небольшое замедление прогрессирования опухоли после обработки. Эти результаты продемонстрировали, что антитела, которые не связываются с полипептидом TAT419, даже если они конъюгированы с токсином, не дают какого-либо специфического (или неспецифического) терапевтического эффекта. В противоположность этому, у большинства животных тест-групп наблюдалось значимое и явное воспроизводимое замедление прогрессирование опухоли после обработки vc-MMAE-конъюгированными анти-TAT419 антителами (включая 5E9, hu5E9.v1 и hu5E9.v2), что указывает на то, что конъюгаты «анти-TAT419 антитело-лекарственное средство» дают специфический  терапевтический эффект у животных с опухолями, экспрессирующими полипептид TAT419.
in vivo
Более конкретно, на фигуре 9 представлены данные, полученные в одном из таких экспериментов, где была проанализирована  терапевтическая эффективность конъюгата гуманизированного антитела hu5E9.v1 с vc-MMAE. Ксенотрансплантаты, полученные от клеточной линии меланомы человека UACC257X2.2 (клеток, экспрессирующих на своей поверхности полипептид TAT419), размножали у мышей “nude”, как описано выше, а затем, этих мышей последовательно обрабатывали только носителем, MMAE-конъюгированным контрольным антителом, которое не связывается с полипептидом TAT419, или различными количествами hu5E9.v1-vc-MMAE, как описано выше. Данные этих анализов продемонстрировали, что конъюгированное с токсином антитело hu5E9.v1-vc-MMAE обладает способностью уничтожать клетки, экспрессирующие на своей поверхности TAT419. Другие данные продемонстрировали, что другие конъюгированные с токсином анти-TAT419 антитела (включая 5E9 и hu5E9.v2) также обладают способностью ингибировать рост опухолевых ксенотрансплантатов, происходящих от ряда различных TAT419-экспрессирующих меланомных клеточных линий, у мышей “nude” по мишень-специфическому и дозозависимому механизму.
in vivo
Полученные данные четко продемонстрировали, что конъюгаты «анти-TAT419 антитело - лекарственное средство» обладают специфическим, значимым и воспроизводимым  терапевтическим действием при лечении опухолей, экспрессирующих полипептид TAT419.
Представленное выше описание является вполне достаточным для практического осуществления настоящего изобретения специалистом в данной области. Объем настоящего изобретения не ограничивается заявленной конструкцией, поскольку заявленный вариант был представлен лишь для иллюстрации некоторых аспектов изобретения, и в объем настоящего изобретения могут быть включены любые конструкции, которые являются функциональным эквивалентом заявленных конструкций. Депонирование материала не должно быть истолковано как допущение того, что представленное в настоящем описании письменное описание является неадекватным для практического осуществления любого аспекта изобретения, включая наилучший вариант его осуществления, и это описание не должно рассматриваться как ограничение объема притязаний. Действительно, исходя из представленного выше описания, специалистом в данной области могут быть сделаны различные модификации, которые, помимо модификаций, проиллюстрированных и описанных в настоящей заявке, также будут входить в объем прилагаемой формулы изобретения.