Выделение регуляторных пептидов нейтрофильного происхожденияи оценка их иммуномодулирующей активности в отношении макрофагов

ленные как без микробов-ассоциантов, так и в ассоциации с Р.т1гаЬ1Ш, К.рпеитотае и ЕАеса^, а также штаммы С^паШш в ассоциации с Е.соН и S.saprophy-йсш, и C.amycolatum - с Е.соН. В ходе проведенного нами исследования установлено, что апоптогенный эффект носил дозозависимый характер.

Результаты исследования, выполненные на мышах с использованием микробной взвеси СогупеЬайе-гшт поп diphtheriae, показали, что гибель большинства клеток перитонеальных макрофагов происходит в результате апоптоза. При развитии клеточной гибели путем апоптоза в поле зрения микроскопа наблюдали характерные для него изменения: уменьшение размеров клетки, конденсация цитоплазмы, разделение хроматина на ряд округлых телец. При апопто-зе, в отличие от некроза, сохраняется структурная целостность мембран, тогда как при некрозе нарушена целостность цитоплазматических и ядерных мембран.

При изучении потенциальной апоптогенной активности микробных взвесей Corynebacterium поп diph-Лете установлено, что процесс апоптоза наблюдали в результате действия всех изученных штаммов ко-ринебактерий (С.pseudotuberculosis, С.хегс^, C.amyco-Ышт, C.striatum). Сравнительная оценка результатов показала, что наиболее выраженный (:>2) апоптоген-ный эффект наблюдали у штаммов, выделенных в ассоциации с другими микроорганизмами (69,5 ± 6,2 %), в отличие от штаммов, присутствовавших в монокультуре (49,3 ±7,2 % ).

Наиболее высокое апоптогенное действие среди всех исследованных штаммов было выявлено у C.amyco-Ьшт (73,0±7,6 %), выделенного в диагностически значимом количестве в ассоциации с Е.соН. Самый низкий апоптогенный эффект - у штамма С.хегсж (45,0 ±7,6 %), выделенного в монокультуре. Штамм C.amycolatum об-

ладал одинаково высоким апоптогенным действием на клетки как в монокультуре, так и в сочетании с другими недифтерийными коринебактериями. В то же время наблюдали снижение (t>2) показателей апоптоза C.amycolatum в сочетании со штаммами S.aureus (48,0± 7,1 %), S.pyogenes (47,0±7,0 %) и E.coli (54,5±6,8 %).

У штамма C.xerosis, обладавшего низкой апопто-генной активностью (45±7,6 %), в сочетании с другими микроорганизмами показатели апоптоза достоверно (t>2) увеличивались: с S.pyogenes (74,5±6,0 %), E.coli (68,6±6,7 %), C.pseudotuberculosis (73,0±6,4 %) и C.amycolatum (77,3±5,8 %). Показатели апоптоген-ной активности в отношении макрофагов мышей у штаммов C.pseudotuberculosis и C.striatum, исследованных как в монокультуре, так и в сочетании с другими микроорганизмами, достоверно не отличались между собой.

Обсуждение. Результаты исследований свидетельствовали об угнетающем действии штаммов Coryneba-cterium non diphtheriae на фагоцитарные клетки чувствительных к ним мышей. Наиболее значимыми индукторами, способными активировать процессы развития программированной клеточной гибели in vitro, могут быть факторы патогенности Corynebacterium non diphtheriae, оказывающие токсическое воздействие: поверхностные антигены, cord-фактор, нейрами-нидаза, N-ацетилнейраминидаза, а также адгезины (ге-магглютинин, гидрофобин и ферменты с транссиали-дазной активностью).

Выявленный синергетический характер апопто-генного действия на фагоцитарные клетки штаммов недифтерийных коринебактерий и условно-патогенных микроорганизмов обусловливает, по-видимому, развитие воспалительных заболеваний на фоне формирующегося дисбаланса микрофлоры.

ВЫДЕЛЕНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ НЕЙТРОФИЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ОЦЕНКА ИХ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ В ОТНОШЕНИИ МАКРОФАГОВ

И.А. Беспалова, Е.П. Дорошенко, Р.В. Писанов, Н.Д. Омельченко, И.А. Иванова, А.К. Киселева, А.В. Филиппенко, Л.В. Судьина

ФГУЗ «Ростовский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов межклеточного взаимодействия, участвующих, главным образом, в формировании и регуляции защитных реакций организма при внедрении патогенов и нарушении целостности тканей, а также в регуляции ряда нормальных физиологических функций.

Значение цитокинов для жизнедеятельности организма трудно переоценить. Они необходимы на всех этапах иммунного ответа, участвуя как в неспецифическом звене защиты организма от инфицирую-

щих микроорганизмов, так и в формировании специфического иммунитета. Накопленные к настоящему времени знания позволяют рассматривать их как общую систему гомеостатической регуляции клеточной функции, как часть сложнейшей цепи взаимосвязанных сигналов, обеспечивающих сходную работу различных систем в живом организме. Наряду с выполнением своих специфических функций внутри иммунной системы цитокины способны осуществлять и межсистемные связи (А.С. Симбирцев и др., 2004; Smith R.S., 1991).

НАЦИОНАЛЬНЫЕ ПРИОРИТЕТЫ РОССИИ. 2011. № 2 (5). СПЕЦИАЛЬНЫЙ ВЫПУСК

Один и тот же цитокин может продуцироваться различными по происхождению типами клеток организма и действовать на многие типы клеток, вызывая различные эффекты в зависимости от вида клеток-мишеней.

В последние годы фагоцитарная система стала рассматриваться не только как центральное звено неспецифической защиты от инфекционных заболеваний, но и как иммунорегуляторная система, играющая важную роль в формировании противоинфекци-онного (в том числе и противочумного) иммунитета (Маянский, Маянский, 1983; Щепеткин и др., 1994). Несколько десятилетий назад начались исследования по изучению регуляторной роли нейтрофилов (Нф), которые ранее рассматривались только как эф-фекторные клетки (И.И. Долгушин и др., 1990-1997; Г.И. Васильева и др., 1998).

Нами был предложен способ получения комплекса регуляторных пептидов, синтезированных Нф экспериментальных животных (нейтрофилокинов), и изучена его иммунорегуляторная роль в процессе формирования противочумного иммунитета (Г.И. Васильева и др., 2004). Было проведено гель-хроматографическое разделение комплекса на колонке с сефадексом (Pharmacia) и получены отдельные фракции нейтрофи-локинов с разнонаправленной биологической активностью в отношении иммунокомпетентных клеток (Г.И. Васильева и др., 2008).

Цель данного исследования - выделение с помощью быстрой жидкостной хроматографии белков фракций нейтрофилокинов, обладающих хелперной и супрессорной активностями в отношении макрофагов экспериментальных животных.

Появление новых методологических подходов позволило нам применить этот метод для разделения препаратов комплексов нейтрофилокинов на анио-нообменных и катионообменных смолах.

Для получения комплекса нейтрофилокинов выделяли Нф перитонеального экссудата у экспериментальных животных после асептического воспаления, вызванного 0,1 %-ным раствором гликогена. Нф вымывали из брюшной полости обогащенной средой 199. В полученном экссудате содержалось до 96 % Нф. Жизнеспособность клеток, оцененная в тесте с трипано-вым синим, составляла 96-98 %. Средой 199 доводили концентрацию Нф до 106 кл/мл, инкубировали в чашках Петри в течение часа. Затем экссудат сливали и монослой обрабатывали индуктором нейтрофи-локинов - убитой 2-суточной культурой Yersinia pes-tis EV-76, выращенной на агаре Хоттингера при 28°С (25 м.к. на Нф). После 4 ч инкубации при 37 °С в атмосфере 5 % СО2 супернатанты отделяли центрифугированием культуральных жидкостей. Надосадочную жидкость сливали и концентрировали комплекс ней-трофилокинов осаждением сульфатом аммония до 80 %-ного насыщения. Сформировавшийся в течение ночи при 4 °С осадок осаждали центрифугированием (Г.И. Васильева и др., 2004). Полученный комплексный препарат цитокинов фракционировали на катионо- и анио-нообменных смолах.

Полученные фракции оценивали по их способности модулировать фагоцитарную активность Мф перитонеального экссудата экспериментальных животных. Постановку реакции фагоцитоза осуществляли

по ранее описанной методике (М.Р. Кроткова, 1971). Поглотительную активность фагоцитов оценивали по следующим показателям: проценту активных фагоцитов (ПАФ) - отношению активных фагоцитов с захваченными микробами к числу подсчитанных; фагоцитарному индексу ФИ1 и ФИ4 - числу микробов в одном фагоците через 1 и 4 ч инкубаций соответственно, а переваривающую - по индексу завершенности фагоцитоза (ИЗФ) - отношению разности между ФИ1 и ФИ4 к ФИ1.

Для разделения протеинов была применена хро-матографическая система Biologic DuoFlow Pathfinder 80 System производства фирмы Bio-Rad. В качестве анионообменнника использовали UnoQ1, а в качестве катионообменника - UnoS1 (Bio-Rad). Элюцию с UnoQ1 проводили 25мМ трис-хлоридным буфером, рН 8,1 в градиенте от 0 до 1М KCl, а с UnoS1 - 25 мМ HEPES буфером, рН 7,1 в аналогичном градиенте. Данный прибор позволяет фиксировать кривые выхода вещества при заданных разных длинах волн. Несомненным достоинством этого метода является то, что процесс разделения занимает мало времени - менее получаса.

Разделением комплекса нейтрофилокинов на ани-онообменной и катионообменной смолах с помощью указанной хроматографической системы было получено по 14 фракций.

Анализ результатов проведенного нами химического анализа полученных препаратов выявил, что все фракции не содержат углеводов и нуклеиновых кислот, а являются продуктами полипептидной природы. Фракции различаются по количеству входящих в их состав белков. Максимальное количество белка обнаружено в 1, 2 и в 10-12 фракциях в первом случае и в 1, 2 и 8, 9 - во втором, что совпадает с пиками на графиках элюции.

При электрофоретическом разделении в поли-акриламидном геле с последующей окраской кумас-си голубым фракций, полученных на катионообмен-ной смоле, визуализировались пептиды с м.м. от 11 до 85 кДа, а фракций, выделенных на анионообменной, -пептиды с м.м. от 12,3 до 67 кДа (рассчитано с помощью лицензионной программы Quantity One).

Исследование влияния полученных фракций нейт-рофилокинов на поглотительную и переваривающую способности Мф в отношении возбудителя чумы выявило их различную иммунорегуляторную активность. Фракции № 11-13, полученные на катионообменной смоле, проявляли супрессорные свойства в отношении поглотительной и киллерной способности Мф, в то время как фракции № 4-10 стимулировали эти активности. Препараты, полученные на анионообменной смоле, также по-разному влияли на фагоцитоз микробных клеток чумного микроба перитонеальными Мф: фракции № 4-6 обладали хелперной активностью, а № 8-10, 13 - супрессорной.

Таким образом, использование нового метода разделения комплексов нейтрофилокинов на анионо-обменных и катионообменных смолах с помощью быстрой жидкостной хроматографии белков позволило нам получить фракции регуляторных пептидов, обладающих разнонаправленными активностями в отношении эффекторной функции Мф. Так как именно в Мф определяется результат взаимодействия чумно-

го микроба с макроорганизмом, регуляция этого процесса остается одной из важных проблем. Препараты, полученные в результате проведенных исследований,

могут быть использованы для коррекции иммунопатологических реакций, возникающих при экспериментальной чуме.

СИМБИОЗ ЛАКТОБАЦИЛЛ ПОЛОСТИ РТА С МИКРОБИОТОЙ ЧЕЛОВЕКА

Ю.В. Червинец, В.М. Червинец, А.М. Самоукина, Е.С. Михайлова, Е.АБеляева ГБОУ ВПО «Тверская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, г. Тверь

Цель - определение симбиотических отношений лактобацилл, выделенных из полости рта, с микро-биотой человека.

Материалы и методы. Материалом для исследования служило содержимое зубо-десневых карманов, зубного налета, соскоба со слизистой оболочки щек и языка 200 здоровых людей разных возрастных групп (мужчин - 80, женщин - 120). Все здоровые люди на момент обследования были клинически здоровы, не имели в анамнезе инфекционных и соматических заболеваний желудочно-кишечного тракта и других систем органов.

Культивирование осуществляли как в анаэробных условиях с использованием микроанаэростата и системы GasPak+, в эксикаторе со свечой при повышенном содержании CO2, так и в аэробном режиме. Инкубировали в течение 24-48 часов при температуре 37 °С. После инкубации определяли культуральные, морфологические, тинкториальные свойства микроорганизмов по традиционной методике.

Грамположительные палочки, не образующие спор, короткие и длинные с закругленными концами, некоторые расположены в цепочку, размером 2-5 мкм, выросшие на средах MRS в анаэробных условиях, в виде колоний S-формы 1-2 мм, выпуклых, гладких, светло-желтого или белого цвета с ровными краями, идентифицировали, используя тест-систему api 50 CH «bio Mérieux» (Франция). Результаты всех реакций обозначали цифровыми кодами согласно инструкции. Вид микроорганизма определяли соответственно цифровому профилю, используя программу API WEB для ПК. Штаммы не подвергались генно-инженерным воздействиям. Определение вида лактобацилл проводили по разработанному методу, основанному на видоспеци-фичности у лактобацилл района ДНК, предшествующего оперону F0F1 АТФ-синтазы, т.е. определяли участок, ответственный за синтез F0F1 АТФ-синтазы - ответственного фермента энергетического метаболизма в клетке (Е.У. Полуэктова и др., 2010).

Для изучения симбиотических отношений лак-тобацилл, выделенных из полости рта, с микробиотой человека были использованы следующие методики.

1. Исследование антагонистической активности лактобацилл в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры проводили с помощью метода перпендикулярных штрихов (Л.П. Блинкова, 2003).

2. Биосовместимость исследуемых лактобацилл с представителями нормофлоры, а также пробиоти-ческими штаммами лактобацилл и бифидобактерий

определялась методом совместного культивирования на твердой питательной среде (Н.А. Глушанова, 1999).

3. Определение ферментов патогенности лактобацилл (лецитиназной, казеинолитической, желати-назной, нуклеазной, каталазной, гемолитической, ан-тилизоцимной активности) определяли по методике О.В. Агаповой и др., 1999.

4. Отношение к антимикробным препаратам (качественная) проводили в соответствии с методиками, рекомендованными Научно-исследовательским центром фармакотерапии (НИЦФ) ww.nicf.spb.ru

Результаты. Из полости рта было выделено 10 штаммов лактобацилл, биохимическая и генетическая идентификация подтвердила, что 5 из них принадлежали к виду L.fermentum, 4 - L.rhamnosus, а 1 штамм идентифицирован как L.plantarum.

Все 10 изолятов лактобацилл проявили антагонизм ко всем индикаторным культурам условно-патогенных и патогенных бактерий: Candida albicans ATCC 885-653, Salmonella typhimurium 415, Shigella sonnei I фазы 941, Bacillus subtilis 534 из коллекции музейных культур НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, г. Москва; Escherichia coli 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus 209 из государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Зоны подавления роста всех культур составили более 20 мм.

Для изучения симбиотических отношений лактобацилл полости рта с представителями нормофло-ры были использованы аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, выделенные от здоровых людей: 7 штаммов рода Streptococcus, 6 штаммов -Enterococcus, 8 штаммов - Escherichia, 5 штаммов -Staphylococcus, 5 штаммов - Lactobacillus, а также анаэробные: 8 штаммов Bifidobacterium, 6 штаммов - Euba-cterium, 5 штаммов - Actinomyces, 6 штаммов - Peptococ-cus, 7 штаммов - Peptostreptococcus. В качестве пробио-тических штаммов служили выделенные из препарата линекс Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium infan-tis, Enterococcus faecium. Выявлено, что 2 штамма лак-тобацилл проявили антагонистическую активность к 1 штамму Streptococcus. Антагонистических отношений между другими представителями нормофлоры и выделенными из препарата линекс бактериями, Lacto-bacillus acidophilus, Bifidobacterium infantis, Enteroco-ccus faecium, и исследуемыми штаммами лактобацилл выявлено не было.

При исследовании 10 антагонистически активных штаммов лактобацилл обнаружено отсутствие ас-