Вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы и способ получения пуринового нуклеотида с его использованием
VARIANT OF PHOSPHORIBOSYL PYROPHOSPHATE AMIDOTRANSFERASE AND METHOD OF PRODUCING PURINE NUCLEOTIDE USING IT

[Область техники]
Настоящее изобретение относится к варианту фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, включающему его микроорганизму, способу получения пуринового нуклеотида с его использованием, композиции для продуцирования пуринового нуклеотида, способу увеличения продуцирования пуринового нуклеотида или применению варианта фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы.
[Предшествующий уровень техники]
Вещество нуклеиновых кислот 5'-инозинмонофосфат (далее в настоящем документе IMP) является промежуточным соединением метаболической системы биосинтеза нуклеиновых кислот, используемым в различных областях (например, в лекарственных средствах, различных областях медицинского применения и т.д.). Кроме того, наряду с 5'-гуанинмонофосфатом (далее в настоящем документе GMP) IMP является веществом, широко применяемым в качестве приправы пищевых продуктов или пищевой добавки. Известно, что IMP сам воспроизводит мясной вкус и аромат и, подобно GMP, усиливает вкус и аромат моноглутамата натрия (MSG), и в связи с этим он привлек внимание в качестве вкусовой нуклеиновокислотной приправы для пищевых продуктов.
Способы получения IMP могут включать способ ферментативного разложения рибонуклеиновой кислоты, выделенной из дрожжевых клеток, способ химического фосфорилирования инозина, полученного в результате ферментации (Agri. Biol. Chem., 36, 1511(1972) и др.), способ культивирования микроорганизма, непосредственно продуцирующего IMP, и выделения IMP из культуральной среды и т.д. Среди этих способов наиболее широко применяют способ, в котором используют микроорганизм, способный непосредственно продуцировать IMP.
Кроме того, способы получения GMP включают способ превращения 5'-ксантиловой кислоты (5'-ксантозин монофосфата; далее названного как ХМР), получаемого путем микробной ферментации, в GMP с использованием коринеформного микроорганизма, и способ превращения ХМР, продуцируемого путем микробной ферментации, в GMP с использованием Escherichia coli. В соответствии со способами, когда ХМР продуцируется и затем превращается в GMP, тогда необходимо усилить продуктивность ХМР, который представляет собой предшественник реакции превращения во время микробной ферментации, и требуется предотвратить утрату GMP, который уже был продуцирован путем реакции превращения, а также продуцированного ХМР.
В то же самое время, ферменты в своем природном состоянии не всегда демонстрируют оптимальные свойства с точки зрения активности, стабильности, субстратной специфичности в отношении оптических изомеров и т.п., которые требуются при промышленном применении. Таким образом, были предприняты различные попытки в отношении улучшения ферментов путем вариаций их аминокислотных последовательностей и т.п, таким образом, что они становятся подходящими для предполагаемого применения. Среди них в некоторых случаях для улучшения функции ферментов были применены рациональное конструирование и сайт-направленный мутагенез ферментов. Однако недостатки этих способов состоят в том, что информация о структуре целевого фермента является недостаточной, или неясна корреляция структуры и функции, и поэтому их невозможно применять эффективно. В этой связи, сообщалось, что активность фермента можно повысить путем усовершенствования фермента способом направленного развития, в котором для получения ферментов с желаемыми признаками проводят скрининг библиотеки вариантов ферментов, сконструированной посредством случайной модификации генов, кодирующих эти ферменты.
[Подробное описание изобретения]
[Техническая задача]
Авторы настоящего изобретения провели обширные исследования для получения пуринового нуклеотида с высоким выходом при помощи способа продуцирования пуринового нуклеотида путем микробной ферментации, и они идентифицировали вариант белка, обладающий высокой продуктивностью в отношении пуринового нуклеотида, что привело к осуществлению настоящего изобретения.
[Техническое решение]
Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить полинуклеотид, кодирующий вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить вектор, включающий полинуклеотид.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить микроорганизм, продуцирующий пуриновый нуклеотид, который содержит вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы или вектор.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения пуринового нуклеотида, включающий стадию культивирования микроорганизма рода Corynebacterium в среде.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить композицию для продуцирования пуринового нуклеотида, содержащую вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы в соответствии с настоящим изобретением.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ увеличения продуцирования пуринового нуклеотида, включающий вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы в соответствии с описанием настоящего изобретения.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить применение варианта фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы для продуцирования пуринового нуклеотида.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить применение полинуклеотида для продуцирования пуринового нуклеотида.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить применение микроорганизма рода Corynebacterium для продуцирования пуринового нуклеотида.
[Полезные эффекты]
Когда вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы в соответствии с настоящим изобретением используют для культивирования микроорганизма рода Corynebacterium, можно продуцировать пуриновый нуклеотид с высоким выходом. Кроме того, полученный пуриновый нуклеотид может применяться не только для кормов для животных или добавок в корма для животных, но также для различных продуктов, таких как продукты питания для людей или пищевые добавки, приправы, лекарственные средства и т.п.
[Лучший вариант осуществления изобретения]
Далее следует подробное описание. При этом соответствующие описания и воплощения, раскрытые в данной заявке на изобретение, также могут применяться в отношении других описаний и воплощений. То есть, все комбинации различных элементов, раскрытых в данной заявке на изобретение, оказываются в объеме настоящей заявки на изобретение. Кроме того, объем настоящей заявки на изобретение не ограничен конкретным описанием, приведенным ниже.
Для достижения вышеприведенных задач в аспекте описания настоящего изобретения предложен вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, имеющий полипептид, включающий замену одной или более чем одной аминокислоты в аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2. Конкретно, в описании настоящего изобретения предложен вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, имеющий полипептид, включающий замену одной или более чем одной аминокислоты в аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2, где замена аминокислоты включает замену аминокислоты в положении 2 и/или замену аминокислоты в положении 445 от N-конца в соответствии с SEQ ID NO: 2.
В еще одном аспекте в соответствии с описанием настоящего изобретения предложен вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, где 1) аминокислота в положении 2 заменена на метионин, 2) аминокислота в положении 445 заменена на аргинин или 3) аминокислота в положении 2 заменена на метионин и аминокислота в положении 445 заменена на аргинин от N-конца аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2.
Используемый здесь термин "фосфорибозилпирофосфатамидотрансфераза" относится к ферменту, который играет важную роль в биосинтезе пурина. В отношении задач в соответствии с описанием настоящего изобретения фермент относится к белку, вовлеченному в продукцию пуриновых нуклеотидов.
В описании настоящего изобретения SEQ ID NO: 2 относится к аминокислотной последовательности, обладающей активностью фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы. Конкретно, SEQ ID NO: 2 представляет собой последовательность белка, обладающего активностью фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, который кодируется геном purF. Аминокислотная последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2 может быть получена из NCBI GenBank, который представляет собой общедоступную базу данных. Например, но без ограничений, аминокислотная последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2 может быть получена из рода Corynebacterium (Corynebacterium sp.) и может включать любую последовательность, обладающую той же самой активностью, как активность вышеприведенной аминокислотной последовательности без ограничений. Кроме того, объем аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2 может включать аминокислотную последовательность, обладающую активностью фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы в соответствии с SEQ ID NO: 2, или аминокислотную последовательность, обладающую с ней 80% или более чем 80% гомологией или идентичностью, но не ограничиваясь ей. Конкретно, аминокислотная последовательность может включать аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2 или аминокислотную последовательность, обладающую 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более чем 99% гомологией или идентичностью с аминокислотной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 2. Аминокислотная последовательность, обладающая гомологией или идентичностью, может представлять собой последовательность за исключением последовательности, имеющей 100% идентичность, из вышеприведенного диапазона, или может представлять собой последовательность, обладающую менее чем 100% идентичностью. Кроме того, понятно, что белок, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую делецию, модификацию, замену или добавление некоторых аминокислот, также находится в объеме настоящего изобретения, а также обладает гомологией или идентичностью, и демонстрирует эффективность, соответствующую эффективности вышеприведенного белка.
Используемый здесь термин "вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы" может использоваться взаимозаменяемо с вариантом полипептида, обладающим способностью продуцировать пуриновый нуклеотид, продуцирующим пуриновый нуклеотид вариантом полипептида, вариантом полипептида, продуцирующим пуриновый нуклеотид, вариантом полипептида, обладающим активностью фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, вариантом фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы и т.п.
Вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы может включать изменение(я) в положении 2 и/или в положении 445 от N-конца в аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2. Вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы может иметь замену еще одной аминокислоты(кислот) для аминокислоты(кислот) в положении 2 и/или в положении 445 в аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2 и увеличенной активностью по сравнению с последовательностями, включающими аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2 или немодифицированную фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазу, полученную из микроорганизма дикого типа. Такой вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы подразумевает варианты, имеющие изменение аминокислоты в положении 2 или в положении 445 от N-конца в SEQ ID NO: 2, и/или аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более чем 99% гомологией или идентичностью с SEQ ID NO: 2, как описано выше.
Например, вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы может иметь 1) замену аминокислоты в положении 2 на метионин, 2) замену аминокислоты в положении 445 на аргинин или 3) замену аминокислоты в положении 2 на метионин и замену аминокислоты в положении 445 на аргинин в аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2, и может обладать усиленной фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазной активностью по сравнению с полипептидом, включающим аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2, но не ограничивается ими.
В отношении задач в соответствии с настоящим изобретением микроорганизм, включающий вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, обладает более высокой продуктивностью в отношении пуринового нуклеотида, чем микроорганизм дикого типа, чем микроорганизм, включающий дикий тип фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, или чем микроорганизм, не включающий вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы. Настоящее изобретение является важным потому, что продуцирование пуринового нуклеотида микроорганизмами может быть увеличено за счет использования варианта фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы в соответствии с настоящим изобретением, тогда как штамм дикого типа рода Corynebacterium не способен продуцировать пуриновые нуклеотиды или даже несмотря на продукцию пуриновых нуклеотидов, способен продуцировать их в следовых количествах.
Конкретно, вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы может включать аминокислотную последовательность, имеющую замену еще одной аминокислоты(кислот) в положении 2 и/или в положении 445 на аминокислоту(ы). Конкретно, вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы может состоять из полипептида, включающего (1) замену аминокислоты в положении 2 на метионин, (2) замену аминокислоты в положении 445 на аргинин или (3) замену аминокислоты в положении 2 на метионин и замену аминокислоты в положении 445 на аргинин от N-конца в аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2. Кроме того, вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы может включать аминокислотную последовательность, где еще одна аминокислота(кислоты) в положении 2 и/или в положении 445 от N-конца в аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2 заменена/заменены на аминокислоту(кислоты), или аминокислотную последовательность, имеющую с ней 80% или более чем 80% гомологию или идентичность, но не ограничивается ими. Конкретно, вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы в соответствии с описанием настоящего изобретения может включать полипептид, обладающий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более чем 99% гомологией или идентичностью с аминокислотной последовательностью, имеющей замену аминокислоты в положении 2 на метионин или замену аминокислоты в положении 445 на аргинин в аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2. Кроме того, понятно, что белок, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую делецию, модификацию, замену или добавление других аминокислотных последовательностей, отличных от аминокислотной последовательности с заменами в положениях 2 и/или 445, также оказывается в объеме настоящего изобретения, поскольку он обладает гомологией или идентичностью и демонстрирует эффективность, соответствующую эффективности вышеприведенного белка.
Другими словами, хотя в описании настоящего изобретения приведен 'белок или полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную конкретной SEQ ID NO:', понятно, что белок, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую делецию, изменение, замену, консервативную замену или добавление нескольких аминокислот, также может быть использован в описании настоящего изобретения, пока он обладает активностью, идентичной или соответствующей активности полипептида, имеющего аминокислотную последовательность соответствующей SEQ ID NO:. Например, пока белок обладает активностью, идентичной или соответствующей активности варианта фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, он не исключает добавление последовательности, встречающуюся в природе мутацию, молчащую мутацию или его консервативную замену, которые не изменяют функцию белка, до и после аминокислотной последовательности. Понятно, что белок, имеющий такое добавление последовательности или мутацию, также попадает в объем настоящего изобретения.
"Консервативная замена" обозначает замену аминокислоты на еще одну аминокислоту, обладающую похожими структурными и/или химическими свойствами. Эта аминокислотная замена как правило может быть осуществлена на основе сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природе. Например, положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают глутаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту; ароматические аминокислоты включают фенилаланин, триптофан и тирозин; и гидрофобные аминокислоты включают аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, тирозин и триптофан.
Таким образом, в описании настоящего изобретения "вариант" дополнительно может включать консервативную замену и/или модификацию одной или более чем одной аминокислоты в 'белке или полипептиде, имеющем аминокислотную последовательность, представленную конкретной SEQ ID NO:'. Например, некоторые варианты могут включать варианты, в которых один или более чем один фрагмент, такой как N-концевая лидерная последовательность или трансмембранный домен, удалены. Еще один вариант может включать варианты, в которых фрагмент удален с N-и/или С-конца зрелого белка. Этот вариант также может включать другие модификации, включающие делецию или добавление аминокислот, которые оказывают минимальные действия на свойства и вторичную структуру полипептида. Например, полипептид может быть конъюгирован с сигнальной (или лидерной) последовательностью на N-конце белка, которая котрансляционно или посттрансляционно направляет перемещение белка. Этот полипептид также может быть конъюгирован с еще одной последовательностью или линкером для легкости идентификации, очистки или синтеза полипептида. Термин "вариант" может быть использован взаимозаменяемо с модификацией, модифицированным белком, модифицированным полипептидом, мутантом, мутеином, дивергентом и.т.п, и любой из терминов может быть использован без ограничения до тех пор, пока он используется в смысле модификации.
Гомология и идентичность обозначают степень родства между двумя заданными аминокислотными последовательностями или нуклеотидными последовательностями, и могут выражаться в процентах. Термины гомология и идентичность часто могут быть использованы взаимозаменяемо друг с другом.
Гомология или идентичность последовательности консервативного полинуклеотида или полипептида могут быть определены при помощи стандартного алгоритма выравнивания, используемого со штрафами за пропуски по умолчанию, определенными в используемой программе. По существу, гомологичные или идентичные последовательности могут гибридизоваться в умеренных или высокой степени строгости условиях вдоль всей своей последовательности или по меньшей мере приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80% или приблизительно 90% от всей длины. В отношении полинуклеотидов, которые должны подвергаться гибридизации, также можно рассматривать полинуклеотиды, включающие вырожденный кодон вместо кодона.
Как правило, поскольку кодон определяет, какая аминокислота должна кодироваться, кодон образуется путем спаривания тринуклеотидных последовательностей. Существует больше типов кодонов по сравнению с кодоном кодируемой аминокислоты, и тип продуцируемой аминокислоты отличается в зависимости от комбинации кодонов. Трансляция начинается с инициирующего кодона, и первая транслируемая аминокислота может представлять собой fMet. Как правило, трансляции предшествует транспортирование fMET на кодон мРНК, соответствующий последовательности atg ДНК. Тем не менее, трансляции может предшествовать транспортирование fMET, когда первая ДНК ORF (открытой рамки считывания) мРНК представляет собой gtg или ttg. То есть, инициирующий кодон может представлять собой atg, gtg или ttg.
Обладают ли две полинуклеотидные или полипептидные последовательности гомологией, сходством или идентичностью, может быть определено, например, при помощи известного компьютерного алгоритма, такого как программа "FASTA", с использованием параметров по умолчанию, как в Pearson et al. (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444, и, альтернативно, определено путем использования алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), внедренного в программу Needleman пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (версия 5.0.0 или более поздняя) (включающая программный пакет GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, и [CARILLO ETA/.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Например, гомология, сходство или идентичность могут быть определены с использованием BLAST или ClustalW от National Center for Biotechnology Information (Национальный центр биотехнологической информации).
Гомология, сходство или идентичность полинуклеотидов или полипептидов могут быть определены путем сравнения информации о последовательностях с использованием компьютерной программы GAP, например Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48: 443, как раскрыто в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Кратко, программа GAP определяет сходство по количеству совпадающих символов (т.е. нуклеотидов или аминокислот), которые являются аналогичными, деленному на общее количество символов в самой короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать: (1) матрицу унарного сравнения (содержащую значение 1 для идентичности и 0 для отсутствия идентичности) и взвешенную матрицу сравнения (или матрицу замен EDNAFULL (EMBOSS версия NCBI NUC4.4)) в соответствии с Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745, как описано Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) штраф 3,0 за каждый пропуск и дополнительно штраф 0,10 за каждый символ в каждом пропуске (или штраф за внесение пропуска 10, штраф за удлинение пропуска 0,5); и (3) отсутствие штрафа за концевые пропуски. Таким образом, используемый здесь термин "гомология" или "идентичность", обозначает сходство между последовательностями.
Вследствие вырожденности кодона ясно, что также может быть включен полинуклеотид, транслируемый в вариант полипептида, имеющий замену еще одной аминокислоты(кислот) в положении 2 и/или в положении 445 от N-конца аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2 на аминокислоту(кислоты), или вариант полипептида, обладающий с ней гомологией или идентичностью. Кроме того, путем гибридизации в строгих условиях с зондом, полученным из известной последовательности гена, например, последовательности, комплементарной всей или части нуклеотидной последовательности, полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, включающий аминокислотную последовательность, где (1) аминокислота в положении 2 заменена на метионин, (2) аминокислота в положении 445 заменена на аргинин или (3) аминокислота в положении 2 заменена на метионин и аминокислота в положении 445 заменена на аргинин в аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2, может быть включена без ограничения.
Используемый здесь термин "полинуклеотид" относится к цепи ДНК или РНК, имеющей длину больше определенной, в качестве нуклеотидного полимера, который представляет собой длинную цепь из нуклеотидных мономеров, соединенных ковалентными связями, и конкретней, к полинуклеотидному фрагменту, кодирующему полипептид.
Полинуклеотид, кодирующий вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы в соответствии с описанием настоящего изобретения, может включать любую полинуклеотидную последовательность без ограничения, а также он кодирует вариант полипептида, обладающий активностью фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы в соответствии с описанием настоящего изобретения. В описании настоящего изобретения ген, кодирующий аминокислотную последовательность фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, представляет собой ген purF, и в частности, ген может быть получен из Corynebacterium stationis, но не ограничен им.
В частности, вследствие вырожденности кодона или принимая во внимание кодоны, предпочтительные с точки зрения микроорганизма, в которых допускается экспрессия полипептида, различные модификации могут быть проведены в кодирующей области полинуклеотида в соответствии с настоящим изобретением в объеме, который не меняет аминокислотную последовательность полипептида. Любая полинуклеотидная последовательность может быть включена без ограничения до тех пор, пока она кодирует вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, имеющий замену еще одной аминокислоты в положении 2 или в положении 445 в аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2 на аминокислоту. Например, полинуклеотид в соответствии с описанием настоящего изобретения может включать последовательность, имеющую некоторым образом модифицированную последовательность в SEQ ID NO: 1, но не ограничивается ей.
Кроме того, путем гибридизации в строгих условиях с зондом, полученным из известной последовательности гена, например, последовательности, комплементарной всей или части нуклеотидной последовательности, может быть включена без ограничения последовательность, кодирующая белок, обладающий активностью варианта фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, имеющая замену еще одной аминокислоты в положении 2 или в положении 445 в аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2 на аминокислоту. "Строгие условия" подразумевают условия, которые обеспечивают возможность для специфической гибридизации между полинуклеотидами. Такие условия подробно описаны в литературе (например J. Sambrook et al. выше). Строгие условия могут включать условия, при которых гены, имеющие высокую гомологию или идентичность, например, гены, имеющие 40% или более чем 40%, в частности 85% или более чем 85%, 90% или более чем 90%, конкретней 95% или более чем 95%, еще конкретней 97% или более чем 97%, в частности 99% или более чем 99% гомологию или идентичность, способны гибридизоваться друг с другом, и гены, имеющие меньшую гомологию или идентичность, не способны гибридизоваться друг с другом, или условия, которые представляют собой обычные условия промывания для Саузерн гибридизации, например концентрация соли и температура, соответствующие 60°С, 1×SSC, 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), в частности 60°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, конкретней 68°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, однократно, в частности, дважды или трижды.
Гибридизация требует того, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарные последовательности, хотя ошибки спаривания между основаниями возможны в зависимости от строгости условий гибридизации. Термин "комплементарность" используется для описания соответствия между нуклеотидными основаниями, которые способны гибридизоваться друг с другом. Например, в отношении ДНК аденозин комплементарен тимину, и цитозин комплементарен гуанину. Соответственно, описание настоящего изобретения также может включать выделенные фрагменты нуклеиновой кислоты, комплементарные полноразмерным последовательностям, а также по существу похожие последовательности нуклеиновой кислоты.
m
m
В частности, полинуклеотид, обладающий гомологией или идентичностью, может быть обнаружен при помощи условий гибридизации, включающих стадию гибридизации при T 55°С, и путем использования вышеописанных условий. Кроме того, величина T может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но не ограничивается ими, и может надлежащим образом контролироваться специалистом в данной области техники в зависимости от задачи.
Подходящая строгость условий для гибридизации полинуклеотидов зависит от длины полинуклеотидов и степени комплементарности, и переменные хорошо известны в области техники (смотри Sambrook et al., выше 9.50-9.51, 11.7-11.8).
В настоящем изобретении ген, кодирующий аминокислотную последовательность варианта фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, представляет собой ген purF, и кодирующий ее полинуклеотид является таким, как описано выше.
В настоящем изобретении полинуклеотид, кодирующий вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, также является таким, как описано выше.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, или вектор, включающий полинуклеотид.
Используемый здесь термин "вектор" подразумевает конструкцию ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего желаемый полипептид, который функционально связан с подходящей контрольной последовательностью, таким образом, что желаемый полипептид экспрессируется в подходящем хозяине. Контрольные последовательности могут включать промотор для управления транскрипцией, определенную операторную последовательность для контроля над такой транскрипцией, последовательность, кодирующую подходящий связывающий рибосому сайт на мРНК, и последовательность для контроля прекращения транскрипции и трансляции. После трансформации в подходящем хозяине вектор может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина, или может встраиваться в сам геном.
Вектор, используемый в настоящем изобретении, может быть не ограничен конкретным образом при условии, что вектор реплицируется в клетке хозяине, и может быть использован любой вектор, известный в области техники. Примеры обычно используемого могут включать природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора может использоваться pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A и т.п, и в качестве плазмидного вектора могут быть использованы векторы, основанные на pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET и т.п. В частности, может быть использован вектор pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC и т.п.
Например, полинуклеотид, кодирующий желаемый полипептид, может быть встроен в хромосому при помощи вектора для хромосомного встраивания в клетку. Встраивание полинуклеотида в хромосому может быть осуществлено с использованием любого способа, известного в области техники, например путем гомологичной рекомбинации, но не ограничиваться им. Дополнительно может быть включен маркер для селекции для подтверждения встраивания вектора в хромосому. Маркер для селекции используется для отбора клеток, трансформированных вектором, т.е. для подтверждения того, встроилась ли желаемая молекула нуклеиновой кислоты, и могут быть использованы маркеры, способные обеспечить отбираемые фенотипы, такие как лекарственная устойчивость, ауксотрофность, устойчивость к цитотоксическим агентам и экспрессия поверхностных белков. В условиях, когда обрабатывают селективным агентом, только клетки, способные экспрессировать селективные маркеры, могут выживать или экспрессировать другие фенотипические признаки, и, таким образом, могут быть отобраны трансформированные клетки.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен микроорганизм, продуцирующий пуриновый нуклеотид, где микроорганизм включает вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, или полинуклеотид, кодирующий вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы. В частности, микроорганизм, включающий вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, и/или кодирующий его полинуклеотид может представлять собой микроорганизм, полученный путем трансформации вектором, включающим полинуклеотид, но не ограничивается им.
Используемый здесь термин "трансформация" относится к способу введения вектора, который включает полинуклеотид, кодирующий желаемый белок, в клетку хозяина, таким образом, что белок, кодируемый полинуклеотидом, способен экспрессироваться в клетке хозяине. Не имеет значения, встроен ли трансформированный полинуклеотид в хромосому клетки хозяина и расположен в ней или расположен вне хромосомы, если трансформированный полинуклеотид может экспрессироваться в клетке хозяине. Кроме того, полинуклеотид может включать ДНК и РНК, кодирующие желаемый белок. Полинуклеотид может быть встроен в любой форме, тогда как полинуклеотид может быть введен в клетку хозяина и экспрессироваться в ней. Например полинуклеотид может быть встроен в клетку хозяина в форме экспрессирующейся кассеты, которая представляет собой генетическую конструкцию, включающую все элементы, требующиеся для ее автономной экспрессии. Экспрессирующаяся кассета может включать промотор, сигнал прекращения транскрипции, сайт связывания с рибосомой и сигнал прекращения трансляции, которые могут быть функционально связаны с полинуклеотидом. Экспрессирующаяся кассета может находиться в форме экспрессирующегося вектора, осуществляющего саморепликацию. Кроме того, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина сам по себе, будучи функционально связанным с последовательностью, требующейся для экспрессии в клетке хозяине, но не ограничиваясь ей.
Далее, термин "функционально связанный" относится к функциональной связи между последовательностью гена и промоторной последовательностью, которая инициирует и опосредует транспорт полинуклеотида, кодирующего желаемый полипептид описания настоящего изобретения.
Используемый здесь термин "микроорганизм, включающий вариант полипептида", или "микроорганизм, включающий вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы", обозначает микроорганизм, полученный путем обеспечения продукции пуринового нуклеотида для микроорганизма, в природе обладающего слабой продуктивностью в отношении пуринового нуклеотида, или родительского штамма, не обладающего продуктивностью в отношении пуринового нуклеотида. Этот микроорганизм может представлять собой микроорганизм, экспрессирующий вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, имеющий полипептид, включающий замену одной или более чем одной аминокислоты в аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2, где замена аминокислоты может включать замену аминокислоты в положении 2 на метионин и/или замену аминокислоты в положении 445 на аргинин от N-конца в соответствии с SEQ ID NO: 2. Кроме того, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, экспрессирующий вариант полипептида, где микроорганизм обладает активностью фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы вследствие замены еще одной аминокислоты(кислот) в положении 2 и/или в положении 445 в аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2 на аминокислоту(кислоты), но не ограничиваясь им.
Микроорганизм может представлять собой клетку или микроорганизм, который может включать полинуклеотид, кодирующий вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, или может быть трансформирован вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, для его экспрессии, и в отношении задач описания настоящего изобретения клетка-хозяин или микроорганизм может представлять собой любой микроорганизм до тех пор, пока он включает вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы для продукции пуринового нуклеотида.
В настоящем изобретении микроорганизм, продуцирующий пуриновый нуклеотид, может быть использован взаимозаменяемо с продуцирующим пуриновый нуклеотид микроорганизмом или микроорганизмом, обладающим продуктивностью в отношении пуринового нуклеотида.
В отношении задач настоящего изобретения "пуриновый нуклеотид" обозначает нуклеотид, включающий пуриновую структуру. Его пример может включать IMP, ХМР или GMP, но не ограничиваться ими.
В частности, термин "IMP (5'-инозинмонофосфат)" представляет собой основное вещество нуклеиновой кислоты, состоящее из следующей Химической формулы 1:
[Химическая формула 1]
IMP имеет название в соответствии с IUPAC (Международный союз теоретической и прикладной химии) 5'-инозинмонофосфат или 5'-инозиновую кислоту, и широко используется в продуктах питания в качестве усилителя аромата вместе с ХМР или GMP.
Термин "GMP (5'-гуанинмонофосфат)" представляет собой основное вещество нуклеиновой кислоты, состоящее из следующей Химической формулы 2:
[Химическая формула 2]
GMP имеет название IUPAC [(2R,3S,4R,5R)-5-(2-амино-6-оксо-1,6-дигидро-9H-пурин-9-ил)-3,4-дигидрокситетрагидро-2-фуранил]метилдигидрофосфат и также называется как 5'-гуанидиновая кислота, 5'-гуаниловая кислота или гуаниловая кислота.
GMP в форме его соли, такой как гуанилат натрия, двузамещенный гуанилат калия и гуанилат кальция, широко используется в качестве пищевой добавки. При использовании в качестве добавки вместе с IMP GMP демонстрирует синергитическое действие для усиления аромата. GMP может быть получен путем превращения из ХМР, но не ограничивается этим. В соответствии с подтвержденным в одном из воплощений настоящего изобретения, вариант полипептида в соответствии с настоящим изобретением может увеличивать продукцию ХМР, и вследствие увеличенной продукции ХМР может быть осуществлено превращение в GMP, и его продукция может быть увеличена. Соответственно, понятно, что GMP также включен в объем описания настоящего из обретения.
Термин "ХМР (5'-ксантозин монофосфат)" представляет собой промежуточное вещество пуринового метаболизма и состоит из следующей Химической формулы 3. ХМР имеет название IUPAC 5'-инозинмонофосфат или 5'-ксантиловая кислота ХМР может быть получен из IMP при помощи IMP дегидрогеназы, или ХМР может быть превращен в GMP путем действия GMP синтетазы. Кроме того, ХМР может быть получен из ХТР при помощи дезоксирибонуклеозидтрифосфатпирофосфогидролазы, которая представляет собой фермент, обладающий активностью ХТРазы.
[Химическая формула 3]
Используемый здесь термин "микроорганизм, продуцирующий пуриновый нуклеотид", может представлять собой микроорганизм, в котором осуществлена генетическая модификация, или активность увеличена для продукции желаемого пуринового нуклеотида, включающий все микроорганизмы дикого типа или микроорганизм, в котором осуществлена природная или искусственная генетическая модификация, и микроорганизм может представлять собой микроорганизм, в котором конкретный механизм ослаблен или усилен путем встраивания экзогенного гена или путем усиления или инактивации активности эндогенного гена В отношении задач в соответствии с описанием настоящего изобретения микроорганизм, продуцирующий пуриновый нуклеотид, может быть охарактеризован как микроорганизм, который включает вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, обладая увеличенной продуктивностью желаемого пуринового нуклеотида, и, в частности, микроорганизм может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium. В частности, в описании настоящего изобретения микроорганизм, продуцирующий пуриновый нуклеотид, или микроорганизм, обладающий продуктивностью в отношении пуринового нуклеотида, может представлять собой микроорганизм, в котором некоторые из генов, вовлеченных в путь биосинтеза пуринового нуклеотида, усилены или ослаблены, или некоторые из генов, вовлеченных в путь деградации пуринового нуклеотида, усилены или ослаблены. Например, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, в котором экспрессия гена purA, кодирующего аденилосукцинатсинтазу, ослаблена. Кроме того, эксспрессия guaB, который представляет собой ген, кодирующий инозин-5'-монофосфатдигидрогеназу, представленную в пути деградации IMP, может регулироваться в зависимости от пуринового нуклеотида. В частности, когда пуриновый нуклеотид представляет собой IMP, тогда экпрессия guaB может быть ослаблена, или когда пуриновый нуклеотид представляет собой ХМР или GMP, тогда экспрессия guaB может быть усилена, но его экспрессия не ограничивается этим.
Используемый здесь термин "микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий пуриновый нуклеотид", относится к микроорганизму рода Corynebacterium, который обладает продуктивностью в отношении пуринового нуклеотида как в природе, так вследствие мутации. В частности, используемый здесь микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий продуктивностью в отношении пуринового нуклеотида, может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, который обладает улучшенной продуктивностью в отношении пуринового нуклеотида вследствие усиленной активности гена purF, кодирующего фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазу. Конкретней, используемый здесь микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий продуктивностью в отношении пуринового нуклеотида, относится к микроорганизму рода Corynebacterium, который обладает улучшенной продуктивностью в отношении пуринового нуклеотида вследствие включения варианта фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы или кодирующего его полинуклеотида, или вследствие трансформации вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы. 'Микроорганизм рода Corynebacterium, который обладает улучшенной продуктивностью в отношении пуринового нуклеотида', относится к микроорганизму, обладающему улучшенной продуктивностью пуринового нуклеотида по сравнению с родительским штаммом до трансформации или немодифицированным микроорганизмом. 'Немодифицированный микроорганизм' относится к самому штамму дикого типа или микроорганизму, который не включает вариант белка, продуцирующего пуриновый нуклеотид, или микроорганизму, который не трансформирован вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы.
Используемый здесь "микроорганизм рода Corynebacterium" может представлять собой, в частности, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium stationis и т.п, но не ограничиваясь ими.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения пуринового нуклеотида, включающий стадию культивирования микроорганизма рода Corynebacterium, продуцирующего пуриновый нуклеотид в среде. Например, способ в соответствии с настоящим изобретением дополнительно может включать стадию выделения пуринового нуклеотида из микроорганизма или среды после стадии культивирования.
В способе стадия культивирования микроорганизм может быть осуществлена при помощи известной периодической культуры, непрерывной культуры, подпитываемой культуры и т.п, но не ограничиваясь ими. В этой связи условия культивирования не ограничены конкретным образом, но оптимальный рН (например от рН 5 до рН 9, в частности, от рН 6 до рН 8, и конкретно рН 6,8) может быть скорректирован путем использования основного соединения (например гидроксида натрия, гидроксида калия или аммиака) или кислого соединения (например ортофосфорной кислоты или серной кислоты). Аэробные условия могут поддерживаться путем добавления в культуру кислорода или содержащей кислород газовой смеси. Температура культивирования может поддерживаться на уровне от 20°С до 45°С, и, в частности, от 25°С до 40°С, и культивирование может быть осуществлено в течение от приблизительно 10 часов до приблизительно 160 часов, но не ограничиваясь этим. Пуриновый нуклеотид, продуцируемый путем культивирования, может быть секретирован в среду или может оставаться в клетках.
Кроме того, в используемой культуральной среде в качестве источника углерода сахара и углеводы (например глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, мелассы, крахмал и целлюлоза), масла и жиры (например соевое масло, масло семян подсолнечника, арахисовое масло и кокосовое масло), жирные кислоты (например пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота), спирты (например глицерин и этанол), органические кислоты (например уксусная кислота) и т.п,. могут быть использованы индивидуально или в смеси, но источник углерода не ограничивается ими. В качестве источника азота азотсодержащее органическое соединение (например пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, мальтозный экстракт, кукурузный экстракт, соевая мука и мочевина), или неорганическое соединение (например сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония) и т.п., могут быть использованы индивидуально или в смеси, но не ограничиваясь ими. В качестве источника фосфора первичный кислый фосфат калия, вторичный кислый фосфат калия, соответствующие им натрийсодержащие соли и т.п. могут быть использованы индивидуально или в смеси, но не ограничиваясь ими. Среда также может включать не заменимые способствующие росту вещества, такие как другие соли металлов (например, сульфат магния или сульфат железа), аминокислоты и витамины.
Способ выделения пуринового нуклеотида, продуцируемого в культуральной среде, в соответствии с описанием настоящего изобретения заключается в сборе желаемого пуринового нуклеотида из культуральной среды с использованием подходящего способа, известного в области техники, в соответствии со способом культивирования. Например может быть использовано центрифугирование, фильтрование, анионообменная хроматография, кристаллизация, HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) и т.п, и желаемый пуриновый нуклеотид может быть выделен из среды или микроорганизма с использованием подходящего способа, известного в области техники.
Кроме того, стадия выделения может включать процесс очистки. Процесс очистки может быть осуществлен с использованием подходящего способа, известного в области техники. Таким образом, выделенный пуриновый нуклеотид может представлять собой очищенную форму или жидкость для ферментации микроорганизма, включающую пуриновый нуклеотид (Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008).
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена композиция для продуцирования пуринового нуклеотида, содержащая вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы.
Композиция для продуцирования пуринового нуклеотида относится к композиции, способной продуцировать пуриновый нуклеотид при помощи полинуклеотида в соответствии с настоящим изобретением. Например, композиция содержит полинуклеотид и дополнительно может содержать без ограничения сущность, способную использовать полинуклеотид. Полинуклеотид может быть в форме, включенной в вектор таким образом, чтобы экспрессировать ген, функционально связанный, для введения в клетку-хозяина.
Кроме того, композиция может дополнительно содержать любой подходящий эксципиент, обычно используемый в композиции для продукции пуринового нуклеотида. Такой эксципиент может представлять собой, например консервант, увлажнитель, диспергирующий агент, суспендирующий агент, буфер, стабилизатор или изотонический агент, но не ограничивается ими.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ увеличения продуцирования пуринового нуклеотида, включающий стадию культивирования варианта фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы в микроорганизме рода Corynebacterium.
Термины "вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы", "микроорганизм рода Corynebacterium", "культура", "гомосерин или L-аминокислота, производная гомосерина" являются такими, как описано выше.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение варианта фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы для продуцирования пуринового нуклеотида, или приготовления композиции для продуцирования пуринового нуклеотида.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение полинуклеотида для продуцирования пуринового нуклеотида, или приготовление композиции для продуцирования пуринового нуклеотида.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение микроорганизма рода Corynebacterium для продуцирования пуринового нуклеотида, или приготовление композиции для продуцирования пуринового нуклеотида.
[Способ в соответствии с изобретением]
Далее настоящее изобретение будет описано подробней со ссылкой на примеры. Тем не менее, специалисту в данной области техники, которому предназначено описание настоящего изобретения, понятно, что эти примеры приведены исключительно для задач иллюстрации, и не предполагается, что объем описания настоящего изобретения ограничен этими примерами.
Пример 1: Получение штамма, продуцирующего IMP, основанного на диком типе
Штаммы дикого типа рода Corynebacterium не могут продуцировать IMP, или могут продуцировать IMP в очень малых количествах. Таким образом, штамм, продуцирующий IMP, получали на основе дикого типа Corynebacterium stationis АТСС6872. В частности, штамм, продуцирующий IMP, получали путем ослабления активности purA, который кодирует аденилосукцинатсинтетазу, и активности guaB, который кодирует 5'-инозиновой кислоты дигидрогеназу.
Пример 1-1: Получение штамма с ослабленным purA
Для получения штамма, в котором стартовый кодон purA изменен, сначала получали встраиваемый вектор, содержащий purA. Для клонирования гена purA во встраиваемом векторе осуществляли PCR (полимеразаная цепная реакция) с использованием геномной ДНК Corynebacterium stationis АТСС6872 в качестве матрицы и праймеров в соответствии с SEQ ID NO: 3 и 4 и SEQ ID NO:5 и 6 в течение 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 с, отжига при 55°С в течение 30 с, и удлинения при 72°С в течение 2 мин. PCR осуществляли с использованием двух фрагментов ДНК, полученных при помощи вышеупомянутой PCR в качестве матрицы, и праймеров в соответствии с SEQ ID NO:3 и 6 в течение 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 с, отжига при 55°С в течение 30 с и удлинения при 72°С в течение 2 мин с получением фрагмента ДНК. Полученный фрагмент ДНК расщепляли ферментом рестрикции XbaI и клонировали в вектор pDZ (Корейский патент No. 10-0924065 и Публикация международного патента No. 2008-033001), который расщепляли тем же самым ферментом. Вектор, полученный при помощи вышеприведенного способа, обозначен как pDZ-purA-a1t.
Рекомбинантный вектор pDZ-purA-a1t трасформировали в штамм Corynebacterium stationis АТСС6872 путем электропорации, и затем штаммы, в которых вектор встроен в хромосому путем гомологичной рекомбинации, отбирали на среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Отобранные таким образом первичные штаммы подвергали вторичному кроссоверу, и затем отобранные штаммы подвергали секвенированию, таким образом отбирая окончательный штамм, в который введена мутация. Этот штамм обозначили как ATCC6872-purA(a1t).
Пример 1-2: Получение штамма, ослабленного по guaB
Для получения штамма, в котором стартовый кодон guaB изменен, сначала получали встраиваемый вектор, содержащий guaB. Для клонирования гена guaB во встраиваемый вектор PCR осуществляли с использованием геномной ДНК Corynebacterium stationis АТСС6872 в качестве матрицы и праймеры в соответствии с SEQ ID NO: 7 и 8 и SEQ ID NO: 9 и 10. PCR также осуществляли с использованием вышеприведенных продуктов PCR в качестве матрицы и праймеры в соответствии с SEQ ID NO: 7 и 10. Полученный фрагмент ДНК клонировали тем же самым образом, как в примере 1-1. Полученный вектор обозначен как pDZ-guaB-a1t.
Рекомбинантный вектор pDZ-guaB-a1t трасформировали в штамм АТСС6872-purA(a1t), полученный в примере 1-1, путем электропорации, и затем штаммы, в которых вектор встроен в хромосому путем гомологичной рекомбинации, отбирали на среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Отобранные таким образом первичные штаммы подвергали вторичному кроссоверу, и затем отобранные штаммы подвергали секвенированию, таким образом отбирая окончательный штамм, в который введена мутация.
Окончательно отобранный штамм, продуцирующий IMP, основанный на диком типе Corynebacterium stationis АТСС6872, обозначили как CJI9088.
Пример 1-3: Титриметрический анализ ферментации CJI9088
2 мл среды для посевной культуры дозировали в тестируемые пробирки, имеющие диаметр 18 мм, и автоклавировали под давлением. Каждую из АТСС6872 и CJI9088 инокулировали и инкубировали при 30°С в течение 24 ч с встряхиванием, используя в качестве посевных культур. 29 мл ферментируемой среды дозировали во встряхиваемые колбы Эрленмейера объемом 250 мл и автоклавировали под давлением при 121°С в течение 15 мин, и 2 мл посевной культуры инокулировали и инкубировали в течение 3 суток. Культуральные условия корректировали в отношении скорости вращения 170 об./мин, температуры 30°С и рН 7,5.
После завершения культивирования продукцию IMP измеряли при помощи HPLC (SHIMAZDU LC20A), и результаты культивирования приведены в следующей таблице 3. Следующие результаты свидетельствуют о том, что штаммы, ослабленные в отношении purA- и guaB, обладают продуктивностью в отношении IMP.
- Среда для посевной культуры: 1% глюкоза, 1% пептон, 1% мясной экстракт, 1% дрожжевой экстракт, 0,25% хлорид натрия, 100 мг/л аденин, 100 мг/л гуанин, рН 7,5
- Ферментируемая среда: 0,1% глутамат натрия, 1% хлорид аммония, 1,2% сульфат магния, 0,01% хлорид кальция, 20 мг/л сульфата железа, 20 мг/л сульфата марганца, 20 мг/л сульфата цинка, 5 мг/л сульфата меди, 23 мг/л L-цистеина, 24 мг/л аланина, 8 мг/л никотиновой кислоты, 45 мкг/л биотина, 5 мг/л тиамин соляной кислоты, 30 мг/л аденина, 1,9% ортофосфорной кислоты (85%), 2,55% глюкозы, 1,45% фруктозы
Пример 2: Идентификация варианта, усиленного по фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазе
Для усиления активности фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, которая представляет собой первый фермент на пути биосинтеза IMP, для улучшения продуктивности в отношении IMP, получали библиотеку мутантов purF, который представляет собой ген, кодирующий фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазу, и идентифицировали мутацию, усиливающую продуктивность IMP.
Пример 2-1: Получение вектора, содержащего purF
Для получения библиотеки мутантов purF сначала получали рекомбинантный вектор, содержащий purF. PCR осуществляли с использованием геномной ДНК Corynebacterium stationis ATCC6872 в качестве матрицы и праймеров в соответствии с SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, и продукт PCR клонировали в вектор Е. coli pCR2.1 с использованием набора для клонирования ТОРО Cloning Kit (Invitrogen) с получением pCR-purF.
Пример 2-2: Получение библиотеки мутантов purF
Библиотеку мутантов purF получали на основе вектора, полученного в примере 2-1. Библиотеку получали с использованием набора для PCR с пониженной точностью (clontech Diversify PCR Random Mutagenesis Kit). В условиях, при которых могут возникать мутации, PCR осуществляли с использованием праймеров в соответствии с SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14. В частности, в условиях, когда может возникать от 0 до 3 мутаций на 1000 п.о., предварительное нагревание осуществляли при 94°С в течение 30 с, а затем 25 циклов по 94°С в течение 30 с и 68°С в течение 1 мин 30 с. Полученный таким образом продукт PCR подвергали PCR с использованием мегапраймера (от 500 нг до 125 нг) в течение 25 циклов при 95°С в течение 50 с, 60°С в течение 50 с и 68°С в течение 12 мин, и затем обрабатывали DpnI, и трансформировали в Е. coli DH5α и распределяли на твердой среде LB, содержащей канамицин (25 мг/л). Отбирали 20 видов трансформированных колоний и затем получали плазмиды, которые затем анализировали путем секвенирования. В результате подтвердили, что мутации были введены по различным сайтам с частотой 2 мутации/кб. Приблизительно 20000 трансформированных колоний Е. coli отбирали, и из них экстрагировали плазмиды, и обозначали как библиотека pTOPO-purF.
Пример 2-3: Оценка полученной библиотеки и отбор штаммов
Библиотеку pTOPO-purF, полученную в примере 2-2, трасформировали в штамм CJI9088, полученный в примере 1, путем электропорации, и затем распределяли на питательной среде, содержащей 25 мг/л канамицина, с получением 10000 колоний, в которые встроен мутантный ген. Колонии обозначали CJI9088_pTOPO_purF(mt)1 - CJI9088_pTOPO_purF(mt)10000.
- Питательная среда: 1% пептон, 1% мясной экстракт, 0,25% хлорид натрия, 1% дрожжевой экстракт, 2% агар, рН 7,2
Каждую из полученных 10000 колоний, инокулированных в 200 мкл среды для посевной культуры, автоклавировали под давлением, и выращивали в 96-луночном планшете с глубокими лунками с встряхиванием при 30°С и 1200 об./мин в течение 24 ч с использованием шейкера для микропланшет (TAITEC), и затем использовали в качестве посевной культуры. 290 мкл ферментируемой среды, автоклавированный под давлением, дозировали в 96-луночный планшет с глубокими лунками, и 20 мкл каждой из посевных культур инокулировали в нее, а затем выращивали с встряхиванием в тех же самых условиях, как описанные выше, в течение 72 ч.
Для анализа продукции 5'-инозиновой кислоты в культуральную среду после завершения культивирования 3 мкл культурального супернатанта переносили в 96-луночный УФ-планшет, каждая из лунок которого содержит 197 мкл дистиллированной воды. Затем микропланшетный ридер использовали для осуществления встряхивания в течение 30 с, и спектрофотометр использовали для измерения оптической плотности при 25°С и 270 нм и сравнивали с оптической плотностью штамма CJI9088 для отбора 50 колоний мутантного штамма, демонстрирующих увеличение оптической плотности на 10% или больше. Другие колонии демонстрировали похожую или уменьшенную оптическую плотность по сравнению с контролем.
Оптические плотности для 50 отобранных штаммов измеряли тем же самым образом, как выше, для повторного определения продуцируемых количеств 5'-инозиновой кислоты. Отобрали два штамма CJI9088_pTOPO_purF(mt)201 и CJI9088_pTOPO_purF (mt)5674, которые демонстрировали значительное улучшение продуктивности в отношении 5'-инозиновой кислоты по сравнению с штаммом CJI9088.
Пример 2-4: Идентификация мутации путем секвенирования
Для идентификации мутаций генов в мутантных штаммах, каждый из штаммов CJI9088_pTOPO_purF(mt)201 и CJI9088_pTOPO_guaB(mt)5674 подвергали PCR с использованием праймеров в соответствии с SEQ ID NO: 15 и 16, а затем секвенировали. Их гены purF сравнивали с генами АТСС6872 и штаммов CJI9088, содержащих дикий тип гена purF.
В результате обнаружили, что оба штамма включают мутацию гена purF в различных сайтах.
В частности, подтвердили, что штамм CJI9088_pTOPO_purF(mt)201 имеет мутационную замену валина в положении 2 на метионин в аминокислотной последовательности purF, представленной SEQ ID NO: 2, и штамм CJI9088_pTOPO_purF(mt)5674 имеет мутационную замену глицина в положении 445 на аргинин в аминокислотной последовательности purF, представленной SEQ ID NO: 2.
В следующих примерах 3 и 4 исследовали, влияют ли вышеприведенные мутации на продуцирование IMP микроорганизмом рода Corynebacterium.
Пример 3: Исследование продуктивности CJI088 в отношении IMP
Мутации, идентифицированные в примере 2, вводили в CJI9088, который представляет собой штамм, полученный из АТСС6872, продуцирующий IMP, и исследовали продуктивность в отношении IMP.
Пример 3-1: Получение встраиваемого вектора, содержащего мутацию purF
Для введения в штаммы мутации, выбранной в примере 2, получали встраивающийся вектор. Вектор для введения мутации purF получают следующим образом.
PCR осуществляли с использованием геномной ДНК АТСС6872 в качестве матрицы и праймеры в соответствии с SEQ ID NO: 17 и 18 и SEQ ID NO: 19 и 20. PCR осуществляли путем денатурации при 94°С в течении 5 мин, и затем в течение 20 циклов при 94°С в течение 30 с, при 55°С в течение 30 с, при 72°С в течение 1 мин, а затем полимеризации при 72°С в течение 5 мин. PCR осуществляли с использованием каждого из получающихся в результате фрагментов ДНК в качестве матрицы и праймеров в соответствии с SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 20. Получающийся в результате фрагмент ДНК расщепляли при помощи XbaI. С использованием Т4 лигазы фрагмент ДНК клонировали в линейный вектор pDZ, который был расщеплен ферментом рестрикции XbaI, и, таким образом, получали pDZ-purF(V2M). PCR осуществляли с использованием праймеров в соответствии с SEQ ID NO: 21 и 22 и SEQ ID NO: 23 и 24 тем же самым образом, как выше. PCR осуществляли с использованием каждого из получающихся в результате фрагментов ДНК в качестве матрицы и праймеров в соответствии с SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 24. Получающийся в результате фрагмент ДНК расщепляли при помощи XbaI. С использованием Т4 лигазы фрагмент ДНК клонировали в линейный вектор pDZ, который расщепляли ферментом рестрикции XbaI, и, таким образом, получали pDZ-purF(G445R).
Пример 3-2: Введение мутанта в штамм CJI9088 и оценка
CJI9088 трансформировали каждым из векторов pDZ-purF(V2M) и pDZ-purF(G445R), полученных в примере 3-1, и штаммы, в которых вектор встроен в хромосому путем гомологичной рекомбинации, отбирали на среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Отобранные таким образом первичные штаммы подвергали вторичному кроссоверу для отбора штаммов, в которые введена мутация интересующего гена. Введение мутации гена в окончательно трансформированные штаммы проверяли при помощи PCR с использованием праймеров в соответствии с SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, и затем осуществляли секвенирование для подтверждения введения мутации в штаммы. В частности, штамм, в который введена мутация V2M гена purF, обозначен как CJI9088_purF_m1, а штамм, в который введена мутация G445R гена purF, обозначен как CJI9088_purF_m2. Далее, для получения мутантного штамма, имеющего обе мутации V2M и G445R, штамм Cn9088_purF_m1 трансформировали вектором pDZ-purF(G445R), и колонии получали тем же самым образом, как выше. При помощи анализа путем секвенирования полученных колоний отбирали штамм, в который введены обе мутации V2M и G445R гена purF, и обозначили как CJI9088_purF_m1m2.
В соответствии с приведенными ниже результатами штамм CJI9088_purF_m1 или CJI9088_purF_m2, имеющий мутацию V2M или мутацию G445R в гене purF, демонстрировал концентрацию IMP 0,15 г/л (128%) или 0,09 г/л (117%), соответственно, свидетельствуя об улучшении по сравнению с контрольным штаммом CJI9088. Кроме того, штамм CJI9088_purF_m1m2, имеющий обе мутации V2M и G445R, демонстрировал улучшение концентрации IMP на 0,31 г/л (159%), свидетельствуя о том, что когда включены обе мутации, тогда наиболее эффективное улучшение может быть достигнуто в отношении концентрации IMP.
Пример 4: Исследование продуктивности в отношении IMP в продуцирующем IMP штамме, полученном из АТСС6872
Для исследования действия мутанта purF, который идентифицировали в примере 2, на основе штамма, продуцирующего высокую концентрацию IMP, мутант вводили в CJI0323 (идентификационный №КССМ12151Р, Корейский патент No. 10-1904675), который представляет собой штамм, продуцирующий высокую концентрацию IMP, и исследовали продуктивность в отношении IMP.
Пример 4-1: Введение мутанта в штамм CJI0323 и оценка
CJI0323 трансформировали каждым из векторов pDZ-purF(V2M) и pDZ-purF(G445R), полученных в примере 3-1, и штаммы, в которые вектор встроен в хромосому путем гомологичной рекомбинации, отбирали на среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Отобранные таким образом первичные штаммы подвергали вторичному кроссоверу для отбора штаммов, в которые введена мутация интересующего гена. Введение мутации гена в окончательно трансформированные штаммы исследовали при помощи PCR с использованием праймеров в соответствии с SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, и затем осуществляли секвенирование для подтверждения введения мутации в штаммы. В частности, штамм, в который введена мутация V2M гена purF, обозначен как CJI0323_purF_m1, и штамм, в который введена мутация G445R гена purF, обозначен как CJI0323_purF_m2. Кроме того, для получения мутантного штамма, имеющего обе мутации V2M и G445R, штамм CJI0323_purF_m1 трансформировали вектором pDZ-purF(G445R), и колонии получали тем же самым образом, как изложено выше. При помощи анализа путем секвенирования полученных колоний отбирали штамм, в который введены обе мутации V2M и G445R гена purF, и обозначили как CJI0323_purF_m1m2.
CJI0323_purF_m1, обозначенный как CJI2353, депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов 10 сентября 2018 года в соответствии с рекомендациями Будапештского договора, и ему присвоен идентификационный номер KCCM12316P. Кроме того, полученный CJI0323_purF_m2, названный как CJI2354, расположен в Корейском центре культур микроорганизмов 10 сентября 2018 года, в соответствии с рекомендациями Будапештского договора, и ему присвоен идентификационный номер KCCM12317P.
В соответствии с приведенными ниже результатами штамм CJI0323_purF_m1 или CJI0323_purF_m2, имеющий мутацию V2M или мутацию G445R в гене purF, демонстрировал концентрацию IMP 1,9 г/л (119%) или 0,95 г/л (109%), соответственно, свидетельствуя об улучшении по сравнению с контрольным штаммом CJI0323. Кроме того, штамм CJI0323_purF_m1m2, имеющий обе мутации V2M и G445R, демонстрировал улучшение концентрации IMP на 3,33 г/л (134%), свидетельствуя о том, что когда включены обе мутации, может быть достигнуто наиболее эффективное улучшение концентрации IMP.
Пример 5: Исследование продуктивности в отношении 5'-ксантиловой кислоты мутантом purF
Для исследования действия мутанта purF, который идентифицировали в примере 2, на основе штамма, продуцирующего ХМР, мутант вводили в KCCM10530 (Публикация Корейского патента №10-2005-0056670), который представляет собой штамм, продуцирующий высокую концентрацию ХМР, и исследовали продуктивность в отношении ХМР.
Пример 5-1: Введение мутанта в штамм KCCM10530 и оценка
KCCM10530 трансформировали каждым из векторов pDZ-purF(V2M) и pDZ-purF(G445R), полученных в примере 3-1, и штаммы, в которых вектор встроен в хромосому путем гомологичной рекомбинации, отбирали на среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Отобранные таким образом первичные штаммы подвергали вторичному кроссоверу для отбора штаммов, в которых введена мутация интересующего гена. Введение мутации гена в окончательно трансформированные штаммы исследовали при помощи PCR с использованием праймеров в соответствии с SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, и затем осуществляли секвенирование для подтверждения введения мутации в штаммы. В частности, штамм, в который введена мутация V2M гена purF, обозначен как KCCM10530_purF_m1, и штамм, в который введена мутация G445R гена purF, обозначен как KCCM10530_purF_m2. Кроме того, для получения мутантного штамма, имеющего обе мутации V2M и G445R, штамм KCCM10530_purF_m1 трансформировали вектором pDZ-purF(G445R), и колонии получали тем же самым образом, как выше. При помощи анализа путем секвенирования полученных колоний отобрали штамм, в который введены обе мутации V2M и G445R гена purF, и он обозначен как KCCM10530_purF_m1m2.
KCCM10530_purF_m1 был назван СТХ1681, депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов 10 сентября 2018 года в соответствии с рекомендациями Будапештского договора, и ему присвоен идентификационный номер KCCM12312P. Кроме того, полученный KCCM10530_purF_m2 был назван CJX1682, депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов 10 сентября 2018 года в соответствии с рекомендациями Будапештского договора, и ему присвоен идентификационный номер KCCM12313P.
В соответствии с нижеприведенными результатами штамм KCCM10530_purF_m1 или KCCM10530_purF_m2, имеющий мутацию V2M или мутацию G445R в гене purF, демонстрировал концентрацию ХМР 1,77 г/л (115%) или 0,8 г/л (107%), соответственно, что свидетельствует об улучшении по сравнению с контрольным штаммом KCCM10530. Кроме того, штамм KCCM10530_purF_m1m2, имеющий обе мутации V2M и G445R, демонстрировал улучшение концентрации ХМР на 2,36 г/л (120%), что свидетельствует о том, что когда включены обе мутации, тогда может быть достигнуто наиболее эффективное улучшение в отношении концентрации ХМР.
На основе вышеприведенного описания специалисту в данной области техники понятно, что настоящее изобретение может быть внедрено в отличающейся конкретной форме без изменения его технической сущности или существенных характеристик. Таким образом, понятно, что вышеприведенные воплощения являются не ограничивающими, а иллюстративными во всех своих аспектах. Объем настоящего изобретения определен в формуле изобретения, а не предшествующем ей описании, и, таким образом, предполагается, что все изменения и модификации, которые оказываются в пределах и границах формулы изобретения, или эквивалентов таких пределов и границ, охвачены формулой изобретения.