ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS AETHERIVORANS BKM AC-2610D - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ, СПОСОБ ЕГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКРИЛАМИДА
BACTERIAL STRAIN RHODOCOCCUS AETHERIVORANS OF RUSSIAN CLASSIFICATION OF MICROORGANISMS BKM AC-2610D - PRODUCER OF NITRILE HYDRASE, METHOD OF ITS CULTIVATION AND METHOD OF PRODUCTION OF ACRYLAMIDE

Группа изобретений относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и касается:
- нового штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans с высокой активностью фермента нитрилгидратазы;
- способа его культивирования;
- способа получения концентрированных растворов акриламида с использованием клеток штамма в качестве биокатализатора.
Способность микроорганизмов трансформировать нитрилы карбоновых кислот в соответствующие амиды была описана в литературе еще в начале 70 годов XX века. Фермент нитрилгидратаза, катализирующий подобные реакции, присущ широкому кругу бактерий, относящихся к различным таксономическим группам. Практический интерес по рассматриваемой в данной заявке теме имеют представители рода Rhodococcus [патенты на изобретения ЕР №1689861, ЕР №0362829, US №5179014, JP №63137688, JP №1074996, JP №1171478, SU №1731814, RU №2053300, RU №2196822, RU №2223316, RU №2304165, RU №2385932, CN №101186911, CN №101892228, заявка на изобретение JP №2001069978]. Крупные химические и биотехнологические компании Японии, Кореи, Франции, России, Германии, США и Китая в качестве эффективных биокатализаторов в технологиях получения акриламида используют, в том числе, клетки штаммов данного рода.
Известен штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous М8, ВКПМ S-926 [авторское свидетельство на изобретение SU 1731814], выделенный из почвы производства акрилонитрила, с использованием в качестве селектирующего агента изобутиронитрила. Штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous М8, BRUM S-926 обладал активностью нитрилгидратазы, достигающей 140 ед/мг в отношении изобутиронитрила, 220 ед/мг в отношении ацетонитрила и 150 ед/мг в отношении акрилонитрила.
При культивировании на среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу, а в качестве индуктора - мочевину, данный штамм показывал нитрилгидратазную активность 357 ед/мг. Максимальная концентрация акриламида при использовании биомассы штамма в качестве биокатализатора не превышала 38%, что ограничивает его применение.
Несмотря на глубокие исследования процесса ферментного гидролиза нитрилов до соответствующих амидов и значительные успехи в области селекции штаммов-продуцентов нитрилгидратазы, потребность промышленности в новых биокатализаторах не уменьшается. Это связано, с одной стороны, с эффективностью и экологической безопасностью биотехнологий получения амидов, прежде всего акриламида, с другой - обусловлено высокой стоимостью уже ранее запатентованных штаммов и технологий. В связи с этим в последние годы были выделены новые микроорганизмы - продуценты фермента нитрилгидратазы.
Известен также штамм бактерий Rhodococcus erythropolis Е84 [патент на изобретение RU №2196822], который при выращивании на среде, не содержащей дорогостоящих компонентов, проявлял при 20-25°С активность фермента нитрилгидратазы 240-265 ед/мг, но урожай биомассы был невысоким (3.6 ед оптической плотности при длине волны 540 нм).
Известен также штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 - продуцент фермента нитрилгидратазы [патент на изобретение RU №2403280], активность фермента нитрилгидратазы которого составила 140 ед/мг при 25°С.
Недостатком данного штамма является наличие в среде его культивирования дорогостоящих, нестабильных по составу компонентов, таких как пептон и дрожжевой экстракт, и невысокая нитрилгидратазная активность. Для повышения активности требовалась дополнительная стадия удаления кислорода из культуральной жидкости и активация фермента в течение нескольких суток.
Наиболее близким заявляемому изобретению на новый штамм является штамм бактерий Rhodococcus ruber GT [патент изобретение RU №2223316]. Штамм бактерий Rhodococcus ruber GT отличается быстрым ростом на органоминеральной среде при высокой активности нитрилгидратазы, достигающей 330 ед/мг при 25°С в отношении акрилонитрила. Нитрилгидратаза штамма бактерий Rhodococcus ruber GT термостабильна, применяется для биотехнологического синтеза акриламида гидратацией акрилонитрила в водных растворах.
Однако в питательной среде для культивирования данного штамма содержатся токсичные компоненты.
В данной заявке патентуется также способ культивирования штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D.
Известен способ культивирования штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous J1 - продуцента нитрилгидратазы [патент на изобретение SU №1838408], который одним из первых стал использоваться в промышленности для получения акриламида. В культуральную среду добавляют мочевину или ее производные, используемые в качестве индуктора фермента, а также источник ионов кобальта - хлористый кобальт в концентрации от 5 до 15 мг/л.
При культивировании на данной среде, содержащей ионы кобальта и мочевину в качестве индуктора, штамм проявлял высокую удельную активность фермента нитрилгидратазы - 578 ед/мг.
Однако данный штамм при его культивировании требовал внесения в ростовую среду дорогостоящих компонентов, таких как витамины и пептон.
Известен также способ культивирования мутантного штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous М33, BRUM S-1268, описанный в патенте на изобретение RU №2053300. Данный штамм используют во многих странах как промышленный биокатализатор в процессах получения 30-45% растворов акриламида. Штамм при культивировании на среде без индуктора обладал активностью фермента нитрилгидратазы 457 ед/мг. Однако рост клеток был низким (0.8 г/л по сухой массе). Для получения значительных урожаев (39.5 г/л) активной биомассы (315 ед/мг) потребовалось внесение в питательную среду в процессе культивирования не только мочевины, но и кукурузного экстракта. Однако растительные экстракты, как правило, имеют нестабильный состав, что может приводить к колебанию нитрилгидратазной активности.
Кроме того, для промышленного получения растворов акриламида с концентрацией выше 45% требовалось увеличивать расход биокатализатора на 30% и более.
Наиболее близким к заявляемому изобретению на способ культивирования штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D является способ культивирования штамма бактерий Rhodococcus ruber GT, описанный в патенте на изобретение RU №2223316. Индукция нитрилгидратазы при осуществлении данного способа достигается при выращивании клеток Rhodococcus ruber GTm на минеральной среде, содержащей в качестве индуктора нитрилы или амиды органических кислот, например ацетонитрил или ацетамид, а в качестве источника углерода - глюкозу или другие коммерчески доступные субстраты.
Однако в среде культивирования данного штамма может присутствовать в качестве индуктора - ацетонитрил, который является токсичным, летучим, легко воспламеняемым соединением, имеющим значительную стоимость.
В данной заявке патентуется также способ получения акриламида.
Известен «Биотехнологический способ получения акриламида» [патент на изобретение RU №2468084]. Способ осуществляют путем гидратации акрилонитрила под действием водной суспензии биокатализатора - штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous М-8, ВКПМ S-926, обладающего нитрилгидратазной активностью. Водная суспензия биокатализатора содержит стабилизирующую добавку, в качестве которой используют полиакриловую кислоту в количестве 0.0015-0.015 мас.% и динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты в количестве 0.0005-0.003 мас.%.
Известен также «Усовершенствованный биотехнологический способ получения акриламида» [патент на изобретение RU №2146291]. Для осуществления способа часть акрилонитрила растворяют в водопроводной или дистиллированной воде с рН 6,8-7,8. Затем прибавляют часть биокатализатора, представляющего собой концентрированную водную суспензию биомассы штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous М8, BRUM S-926 или Rhodococcus rhodochrous М33, ВКПМ S-1268. Каждую следующую порцию акрилонитрила растворяют в реакционной смеси после того, как ранее добавленный субстрат полностью или почти полностью вступит в реакцию. Затем добавляют очередную порцию биокатализатора. Процесс проводят при постоянном перемешивании, поддерживая температуру реакции в интервале 20-32°С. Время реакции 4-8 ч. Расход катализатора в пересчете на исходный объем воды 0,25-0,51 г/л. По окончании процесса получают растворы с концентрацией акриламида до 330 г/л.
Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению на способ получения акриламида является способ, описанный в патенте на изобретение RU №2077588. Гидратацию проводят с использованием биомассы штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous М33 ВКПМ 1268 при исходной концентрации акрилонитрила не более 0,1% и поддерживают ее на этом уровне в течение всего процесса. Затем выделяют конечный продукт - акриламид.
Задачей заявляемой группы изобретений является создание нового штамма бактерий, обладающего высокой нитрилгидратазной активностью, для использования в промышленности с целью получения продуктов высокого спроса.
Задачей заявляемого способа культивирования штамма является разработка технологии наработки биомассы заявляемого штамма без излишних затрат, более того, по-возможности, снижение этих затрат по сравнению с существующими аналогичными способами, находящимися в промышленной эксплуатации.
Задачей заявляемого способа получения названного продукта с помощью нового штамма является разработка технологии получения акриламида с гарантированной концентрацией с помощью нового штамма без повышения стоимости процесса и без дополнительной сложности проведения процесса.
Сущность первого заявляемого изобретения: получение нового штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D - продуцента нитрилгидратазы.
Сущность заявляемого способа культивирования штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D характеризуется тем, что клетки штамма засевают на скошенный мясопептонный агар и выращивают в течение 24-48 часов, затем биомассу смывают стерильным физиологическим раствором, рН 7.0-7.4, полученной суспензией засевают первую емкость с питательной средой состава, г/л:
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O
6.06
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
1.3
глюкоза
10.0-20.0
карбамид
2.0-6.0
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1.0
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0.08-0.2
СаС1<sub>2</sub>·2Н<sub>2</sub>O
0.2
СоС1<sub>2</sub>·6Н<sub>2</sub>O
0.01-0.02
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O в виде хелатного комплекса
0.01-0.025
дистиллированная вода
до 1 л
рН 7.0-7.4;
и ведут процесс в течение 24-48 часов при температуре 28-30°С, круговом перемешивании со скоростью 140-160 об/мин до достижения величин оптической плотности суспензии 2-16 единиц при длине волны 540 нм, величине оптического слоя 5 мм, затем полученной суспензией засевают вторую емкость, объем которой в 10-100 раз больше первой емкости, с новой питательной средой состава, г/л:
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O
6.20
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
1.65
глюкоза
20.0-60.0
карбамид
10.0-24.0
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0.8-1.0
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0.08-0.4
соль кальция
0.2-0.6
соль кобальта
0.04-0.085
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O в виде хелатного комплекса
0.025-0.05
дистиллированная вода
до 1 л
рН 7.0-7.4,
доводя величину оптической плотности во второй емкости до 0.1-0.3; продолжают процесс в течение 48-120 часов при температуре 26-31°С, аэрации 0.5-1.0 объем воздуха/объем среды в минуту до достижения величин оптической плотности суспензии 36-40 и рН 7.5-7.8; после чего отделяют полученную биомассу.
Кроме того, заявляется усовершенствование вышеописанного способа культивирования штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D, которое характеризуется тем, что в состав питательной среды во второй емкости в качестве соли кальция может входить на выбор одна из ряда солей:
4
2
СаНРO·2HО,
2
4
2
2
Са(НРO)·2НO,
3
4
2
Са(РO),
2
2
СаС1·2НO,
3
СаСО,
4
CaSO,
3
5
3
2
2
Са(СНO)·3НO,
2
4
2
2
Са(НОСН(СНОН)СОО) НO;
в качестве соли кобальта - одна из солей:
2
2
СоС1·6НO,
4
2
CoSO·7HO.
Сущность заявляемого способа получения акриламида, заключающегося в гидратации акрилонитрила с использованием биомассы штамма рода Rhodococcus, обладающей нитрилгидратазной активностью, с последующим выделением конечного продукта - акриламида, характеризуется тем, что гидратацию проводят при рабочей концентрации акрилонитрила, не превышающей 0,5%, с использованием биомассы штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D из расчета порядка 400-500 г по сухой массе штамма на 1 тонну конечного продукта - акриламида с концентрацией 45-49%.
Технический результат заявляемой группы изобретений.
Штамм бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D отличается ростом на простой органоминеральной среде при высокой нитрилгидратазной активности, достигающей 332 ед/мг при 20°С или 521 ед/мг при 25°С. Нитрилгидрагаза штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D термостабильна.
Штамм выделен из сточных вод производства акриламида и полиакриламида и не подвергался никаким генетическим модификациям. Это особенно важно при его использовании в качестве промышленного биокатализатора, так как законодательства многих стран ограничивают применение генно-модифицированных микроорганизмов.
Разработанный способ культивирования штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D позволяет получить большой урожай с высокой активностью клеток на простой органоминеральной питательной среде, не содержащей в своем составе дорогостоящих индукторов, витаминов, аминокислот и растительных экстрактов. Все компоненты питательной среды коммерчески доступны, что снижает себестоимость промышленного биокатализатора, получаемого на основе заявляемого штамма.
Заявляемый в данной заявке способ получения акриламида путем его синтеза с использованием штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D экономически выгодный. Оптимизированы условия синтеза концентрированных растворов акриламида.
Подробное описание изобретений.
Заявляемый штамм выделен из сточных вод производства акриламида и полиакриламида методом прямого высева на селективной среде.
Заявляемый штамм бактерий Rhodococcus aetherivorans депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ Ac-2610D и характеризуется следующими морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами.
Морфологические свойства: грамположительный штамм с жизненным циклом родококков, неподвижный, спор и капсул не образует, некислотоустойчив, аэроб.
Культуральные свойства: на мясопептонном агаре образует круглые гладкие колонии от желто-оранжевого до красно-оранжевого цвета диаметром 1-2 мм (72-96 часов). При росте на специальных средах диссоциирует на R-,S-, М-формы.
Физиологические свойства: Штамм оксидазаотрицательный, каталаза- и фосфатазаположительный, редуцирует нитраты в нитриты. Гидролизует крахмал, твин 60 и твин 80; целлюлозу, эскулин и ДНК не гидролизует. Растет при рН 5.5-9.5, оптимальное значение рН 7.2±0.2; при температуре 5-45°С, оптимальное значение 29±1°С. В качестве единственного источника углерода использует: целлобиозу, фруктозу, галактозу, глюкозу, мальтозу, маннозу, сахарозу, трегалозу, рибозу, глицерин, маннит, сорбит, но не дульцит и инозит. Штамм растет на салицине, инулине, цитрате, пирувате, сукцинате, фумарате, но не глюконате. Утилизирует мета- и парагидроксибензоевые кислоты, изобутанол, 2,3-бутиленгликоль, моноэтаноламин. Лейцин и ацетамид использует в качестве единственного источника азота.
Патогенность: штамм непатогенный.
На основании перечисленных выше свойств в соответствии с определителем бактерий Берджи. (Определитель бактерий Берджи, М.: Мир, 1997) и анализом полиморфизма длин фрагментов рестрикции для гена 16S рибосомальной рибонуклеиновой кислоты штамм отнесен к роду Rhodococcus виду aetherivorans.
Способ культивирования штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D осуществляют следующим образом.
Клетки штамма Rhodococcus aetherivorans, хранящиеся при температуре 4°С в столбиках с 0.4% агаризованной LB-средой или мясопептонным бульоном, засевают на скошенный мясопептонный агар и выращивают в течение 24-48 часов. Полученную биомассу смывают стерильным физиологическим раствором с рH 7.0-7.4. Полученной суспензией засевают первую емкость, например колбу, с питательной средой состава, г/л:
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O
6.06
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
1.3
глюкоза
10.0-20.0
карбамид
2.0-6.0
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1.0
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0.08-0.2
СаС1<sub>2</sub>·2Н<sub>2</sub>O
0.2
СоС1<sub>2</sub>·6Н<sub>2</sub>O
0.01-0.02
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O в виде хелатного комплекса
0.01-0.025
дистиллированная вода
до 1 л
рН 7.0-7.4;
Процесс ведут в течение 24-48 часов при температуре 28-30°С, круговом перемешивании 140-160 об/мин до достижения величин оптической плотности суспензии 2-16 единиц, измеренной на фотоэлектроколориметре в кювете с толщиной оптического слоя 5 мм при длине волны 540 нм.
Затем полученной суспензией засевают вторую (большую) емкость, объем которой на несколько порядков больше первой емкости, например колбу больших размеров или ферментер, с новой питательной средой состава, г/л:
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O
6.20
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
1.65
глюкоза
20.0-60.0
карбамид
10.0-24.0
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0.8-1.0
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0.08-0.4
соль кальция
0,2-0.6
соль кобальта
0.04-0.085
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O в виде хелатного комплекса
0.025-0.05
дистиллированная вода
до 1 л
рН 7.0-7.4,
4
2
2
4
2
2
3
4
2
2
2
3
4
3
5
3
2
2
2
4
2
2
2
2
4
2
В состав питательной среды во второй емкости в качестве соли кальция входит одна из ряда солей: СаНРO·2НO; Са(НРO)·2НO; Са(РO); СаС1·2НO; СаСO; CaSO; Са(СНО)·3НO; Са(НОСН(СНОН)СОО) НO; а в качестве соли кобальта - одна из солей: СоСl·6HО; CoSO·7HO.
Глюкозу, карбамид и соли кобальта можно вносить в питательную среду в один этап или порциями в процессе роста клеток.
При этом доводят величину оптической плотности во второй емкости до 0,1-0,3 единицы. Продолжают процесс в течение 48-120 часов при температуре 26-31°С, аэрации 0.5-1.0 объем воздуха/объем среды в минуту до достижения величин оптической плотности суспензии 36-40 и рН 7.5-7.8. После окончания процесса биомассу отделяют любым известным способом: центрифугированием, флокуляцией, флотацией, отстаиванием с последующей фильтрацией. В результате осуществления данного способа культивирования штамма Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D урожай клеток составляет 10-18 г/л с активностью фермента нитрилгидратазы 250-332 ед/мг. Биомасса в дальнейшем может быть использована в процессах получения акриламида.
Тест для оценки активности фермента нитрилгидратазы проводят следующим образом: в 0.01 М фосфатном буфере, рН 7.6, готовят суспензию клеток с концентрацией 0.04-0.06 мг клеток (по сухой массе)/мл. В 1 мл суспензии вносят субстрат - акрилонитрил в количестве 25 мкл. Реакцию трансформации проводят на водяной бане при температуре 20-25°С и перемешивании в течение 10 мин. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл 6н. HCI. Бактериальные клетки отделяют центрифугированием. Концентрацию акриламида в надосадочной жидкости определяют спектрофотометрическим методом или методом газовой хроматографии.
За единицу удельной нитрилгидратазной активности (ед/мг) принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ акриламида в единицу времени (1 минута), содержащееся в 1 мг клеток (по сухой массе). За единицу общей нитрилгидратазной активности (ед/мл) принимали количество единиц фермента, содержащееся в 1 мл культуральной жидкости.
Подробно способ получения акриламида осуществляют следующим образом.
Клетки штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D, полученные, как описано в способе культивирования, отделяют от культурального бульона любым известным методом, промывают обессоленной водой, рН 7,0-7,6. Количество воды, необходимой для промывки, составляет 1-10 объемов/объем клеток. Промытые клетки суспендируют в водопроводной или дистиллированной воде, рН 6.8-8.4, из расчета порядка 400-500 г клеток по сухой массе на 1 тонну конечного продукта - 45-49% раствора акриламида в зависимости от планируемой концентрации конечного продукта и времени синтеза. В термостатируемый реактор помещают водную суспензию клеток. Реакцию синтеза акриламида проводят в интервале рН 6,8-8,4. Акрилонитрил вносят в реакционный раствор по мере трансформации так, чтобы его концентрация в растворе не превышала 0.5%. Реакционную массу постоянно перемешивают. Температуру реакционного раствора поддерживают в интервале 10-23°С. Время реакции 5-8 часов. Акриламид и акрилонитрил в реакционном растворе анализируют любым известным методом, например: жидкостной или газовой хроматографией, спектрофотометрией, рефрактометрией. Анализ осуществляют не реже одного раза в час. Процесс останавливают после резкого падения скорости гидролиза акрилонитрила. По окончании процесса клетки биокатализатора отделяют от реакционной массы любым известным способом, например: флокуляцией, фильтрацией, флотацией, центрифугированием. В результате процесса получают растворы с концентрацией акриламида 45-49%.
Пример 1. Выделение штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D - продуцента фермента нитрилгидратазы
Штамм выделен из сточной воды производства акриламида и полиакриламида.
Состав сточной воды:
Акриламид
6.0 г/л
Акрилонитрил
3.3 г/л
Сu<sup>2+</sup>
1.25 мг/л
Zn<sup>2+</sup>
1.93 мг/л
Fe<sup>3+</sup>
0.43 мг/л
Сорбиталь С-20
следы
2
4
2
2
4
4
2
Для выделения штамма была использована селективная среда, представляющая собой агаризованную сточную воду приведенного выше состава с добавлением 0.9 г/л NaHPO·12HO, 0.5 г/л КНРO, 1.0 г/л MgSO·7HO, 0.5 г/л дрожжевого экстракта. На чашки с селективной средой засевали газоном 0.1 мл сточной воды и культивировали в течение 72-96 часов. Выросшие колонии дважды рассевали на мясопептонном агаре для проверки на чистоту, после чего анализировали на способность трансформировать акрилонитрил в акриламид. Для этого исследуемые штаммы выращивали в бактериологических пробирках, объемом 40 мл, заполненных на 1/8 часть средой состава, г/л:
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O
0.9
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
0.5
Глюкоза
20.0
Карбамид
12.0
СоС1<sub>2</sub>·6Н<sub>2</sub>O
0.02
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1.0
Дрожжевой экстракт
1.0
рН 7.0-7.4
Культивирование проводили в течение 2 суток при перемешивании, температуре 28-30°С. Полученную суспензию клеток центрифугировали в течение 1 минуты при 15000 об/мин. Клетки отмывали 0.01 М фосфатным буфером, рН 7.6, ресуспендировали в 1 мл такого же буфера, затем измеряли нитрилгидратазную активность, как описано в тесте. В результате был выделен штамм с активностью нитрилгидратазы 95 ед/мг.
Пример 2. Способ культивирования штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D в лабораторных условиях в колбах Эрленмейера.
Клетки штамма выращивали на скошенном мясопептонном агаре в течение 36 часов при 28°С. Полученную биомассу смывали стерильным физиологическим раствором, рН 7.0-7.4, и засевали для предкультивирования в жидкую питательную среду следующего состава, г/л:
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O
6.06
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
1.3
Глюкоза
12.0
Карбамид
4.0
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1.0
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0.1
СаС1<sub>2</sub>·2Н<sub>2</sub>O
0.2
СоС1<sub>2</sub>·6Н<sub>2</sub>O
0.02
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0.025
Аскорбиновая кислота
0.05
Вода дистиллированная
до 1 л
рН 7,0-7.4.
Предкультивирование проводили в колбах Эрленмейера при 28-30°С, круговом перемешивании 120-160 об/мин в течение 24-48 часов. В результате получали клеточную суспензию с оптической плотностью 4.6 единиц при λ 540 нм, 1=5 мм. Полученную суспензию в количестве 2 мл стерильно засевали в среду для культивирования следующего состава, г/л:
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O
6.20
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
1.65
Глюкоза
40.0
Карбамид
24.0
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1.0
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0.3
СаНРO<sub>4</sub>·2Н<sub>2</sub>O
0.24
СоС1<sub>2</sub>·6Н<sub>2</sub>O
0.06
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0.05
Аскорбиновая кислота
0.10
Вода дистиллированная
до 1 л
рН 7,0-7.4.
Культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 300 мл, заполненных средой на 1/6 часть, в течение 4 суток при круговом перемешивании (160 об/мин), температуре 28-30°С. По окончании культивирования в образцах определяли концентрацию клеток и нитрилгидратазную активность. Урожай клеток за 96 часов культивирования составил 16.0 г/л, удельная нитрилгидратазная активность 332 ед/мг при 20°С и 521 ед/мг при 25°С, общая нитрилгидратазная активность 5312 ед/мл при 20°С и 8336 ед/мл при 25°С. Тест определения активности при 25°С был выполнен для сравнения со штаммом Rhodococcus ruber GT, как наиболее близким к заявляемому.
Для подтверждения масштабируемости процесса культивирования и возможности промышленного использования штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D было проведено его культивирование в ферментере, объемом 3 л.
Пример 3. Культивирование штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D в ферментере.
Посевной материал, представляющий собой суспензию клеток в культуральной среде, готовили в течение 28 часов. Для этого клетки выращивали при круговом перемешивании (160 об/мин), температуре 28-30°С в колбах Эрленмейера объемом 300 мл, заполненных на 1/6 объема средой состава, г/л:
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O
6.06
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
1.3
Глюкоза
12.0
Карбамид
4.0
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1.0
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0.1
СаС1<sub>2</sub>·2Н<sub>2</sub>O
0.2
СоС1<sub>2</sub>·6Н<sub>2</sub>O
0.02
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0.025
ЭДТА
0.05
Вода дистиллированная
до 1 л.
рН 7,0-7.4.
В результате была получена клеточная суспензия с оптической плотностью 6 единиц при λ 540 нм, 1=5 мм. Для засева лабораторного ферментера объемом 3 л (заполнение средой 1.5 л) использовали 100 мл полученной клеточной суспензии.
Состав среды для ферментера, г/л:
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O
6.20
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
1.65
Глюкоза
40.0
Карбамид
22.0
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1.0
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0.25
СаНРO<sub>4</sub>·2Н<sub>2</sub>O
0.24
СоС1<sub>2</sub>·6Н<sub>2</sub>O
0.05
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0.05
ЭДТА
0.10
вода дистиллированная
до 1 л
рН 7,0-7.4.
Культивирование проводили при температуре 28°С, аэрации 0.5-1.0 объем воздуха/объем среды в минуту, постоянном перемешивании 560 об/мин. Периодически, один раз в шесть часов, из ферментера отбирали пробы культуральной жидкости для определения рН, урожая клеток и их нитрилгидратазной активности. Полученные данные представлены в таблице.
Продолжительность ферментации, час
0
6
12
18
24
30
36
42
48
54
60
66
70
рН
7.1 1
6.95
6.91
6.88
6.87
6.88
6.87
6.86
6.85
6.92
6.97
7.06
7.51
Урожай клеток, г/л (по сухой массе)
0.1
0.4
1.3
2.4
3.7
5.5
7.1
8.2
9.9
12.6
13.9
16.4
18.1
Удельная активность нитрилгидратазы, ед/мг
40
34
55
126
185
219
236
249
256
267
274
280
Урожай клеток за 70 часов культивирования составил 18.1 г/л, удельная нитрилгидратазная активность клеток достигла 280 ед/мг (при 20°С) или 440 ед/мг при 25°С, общая нитрилгидратазная активность 5058 ед/мл (при 20°С) или 7964 ед/мл при 25°С.
Пример 4. Получение концентрированного раствора акриламида в лабораторном реакторе с использованием клеток, наработанных культивированием в колбах
В термостатируемый реактор объемом 150 мл, снабженный магнитной мешалкой и термометром, вносили 66.2 г суспензии клеток штамма бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D в водопроводной воде с активностью нитрилгидратазы 270 ед/мг; таким образом, в реакторе содержалось 30 мг (по сухой массе) клеток биокатализатора. Клетки были получены, как описано в примере 2. рН реакционного раствора 7.6. В реактор при постоянном перемешивании и температуре 17-22°С на протяжении всего синтеза подавали 24.2 г акрилонитрила так, чтобы его концентрация в растворе не превышала 0.3%. Акриламид и акрилонитрил в растворе анализировали методом газовой хроматографии с периодичностью один раз в час. Через 7.0 часов синтеза реакцию останавливали из-за падения скорости гидролиза акрилонитрила. Клетки отделяли от реакционного раствора центрифугированием. Концентрация акриламида в растворе составляла 49%, остаточный акрилонитрил отсутствовал.
Для подтверждения возможности использования штамма Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D в процессе промышленного получения акриламида и масштабируемости заявляемой технологии были проведены синтезы акриламида в аппарате, объемом 3 л, являющимся аналогом промышленного реактора.
Пример 5. Синтез концентрированного раствора акриламида в реакторе объемом 3 л с использованием клеток, наработанных культивированием в колбах. В реактор объемом 3 л, снабженный механической мешалкой и рубашкой для съема тепла, термостатируемый в интервале температур 20-22°С, вносили 1.4 л суспензии клеток штамма Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D в обессоленной воде с активностью фермента нитрилгидратазы 254 ед/мг; таким образом, в реакторе содержался 1 г (по сухой массе) клеток биокатализатора. Клетки были получены, как описано в примере 2. рН реакционного раствора 7,4. Акрилонитрил вносили в реакционный раствор по мере трансформации так, чтобы его концентрация, начальная и текущая, не превышала 0.5%. За 5 часов реакции получали раствор акриламида с концентрацией 47%. Далее реакцию останавливали из-за резкого падения скорости гидролиза акрилонитрила.
Пример 6. Получение концентрированного раствора акриламида в реакторе объемом 3 л с использованием клеток, наработанных культивированием в ферментере.
В реактор объемом 3 л, снабженный механической мешалкой и рубашкой для съема тепла, термостатируемый в интервале температур 14-23°С, вносили 1.4 л суспензии клеток штамма Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D в обессоленной воде с активностью нитрилгидратазы 280 ед/мг; таким образом, в реакторе содержался 1 г (по сухой массе) клеток биокатализатора. Клетки были получены, как описано в примере 3. рН реакционного раствора 7,8. Акрилонитрил вносили в реакционный раствор по мере трансформации так, чтобы его концентрация, начальная и текущая, не превышала 0.1%. Акриламид и акрилонитрил в растворе анализировали методом газовой хроматографии с периодичностью один раз в час. Через 7 часов реакцию останавливали из-за падения скорости гидролиза акрилонитрила. Концентрация акриламида в растворе составляла 49%. Остаточный акрилонитрил в растворе отсутствовал.
Настоящая группа изобретений проиллюстрирована более детально вышеописанными примерами, однако из этого не следует, что оно ограничено только этими примерами.