Способ создания экспериментальной модели грибкового кератита у кроликов
METHOD FOR CREATING EXPERIMENTAL MODEL OF FUNGAL KERATITIS AMONG RABBITS

Изобретение относится к медицине, а именно офтальмологии и предназначено для имитации грибкового кератита у кроликов в экспериментальных условиях для последующего изучения патологического процесса и разработки способов его лечения.
До настоящего времени грибковые кератиты не имели широкого распространения на территории Российской Федерации, однако в последние годы участились случаи их выявления в офтальмологической практике. Традиционно ведущими инфекционными возбудителями кератитов является бактериальная флора и вирус герпеса, случаи кератомикоза фиксировались до недавнего времени в единичных случаях [Давлетшина Н.И., Самойлов А.Н. Эпидемиология и методы лечения грибковых кератитов. Вестник офтальмологии. 2020;136(4):138-145.]. По этой причине данная группа кератитов диагностируется несвоевременно, этиологическое лечение назначается также с опозданием [Самойлов А.Н., Давлетшина Н.И. Анализ этиологии и антимикробной чувствительности возбудителей грибковых кератитов в серии клинических случаев. Офтальмохирургия. 2020;(1):71-76.]. Отсутствие противогрибковых офтальмологических растворов, осложняет течение болезни, зачастую приводя к перфорации роговицы, миграции инфекции в глубокие структуры глаза. Экстренная сквозная пересадка роговицы без соответствующей антимикробной санации очага грибковой инфекции чревата ранним отторжением трансплантата [Sun CQ, Lalitha P, Prajna NV, Karpagam R, Geetha M, O'Brien KS, Oldenburg CE, Ray KJ, McLeod SD, Acharya NR, Lietman TM; Mycotic Ulcer Treatment Trial Group. Association between in vitro susceptibility to natamycin and voriconazole and clinical outcomes in fungal keratitis. Ophthalmology. 2014;121(8):1495-1500.]. На сегодняшний день грибковые кератиты изучены недостаточно, тяжело контролируются, создание воспроизводимых экспериментальных моделей кератомикозов на животных может способствовать изучению механизмов заражения, течения патологического процесса и разработке методик лечения.
Для отработки оптимальных параметров лечения грибковых поражений роговицы необходимо создание экспериментальной модели грибкового кератита на животных. Одна из основных проблем экспериментальной медицины - выбор вида животных, на которых будут проводиться исследования. Для изучения инфекционного процесса на глазах выбраны кролики. Все эксперименты in vivo, описанные в данной работе, одобрены локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» МЗ РФ (заседание № 1 от 4 февраля 2020 года).
Известны способы получения грибковых кератитов у экспериментальных животных при помощи инстилляции грибковых изолятов и создания вспомогательных условий для инвазии инфекционного агента и формирования воспаления, близкого к клиническому.
Известен отечественный запатентованный способ моделирования грибкового кератита у кроликов (Патент RU №2346338 С2, МПК G09B 23/28, A61F 9/00 - 10.02.2009, Бюл. № 4). Производят скарификацию эпителия всей поверхности роговицы, после чего надевают на глаз предварительно инфицированную дрожжевыми грибами мягкую контактную линзу и сшивают веки на 3-8 сут. Метод позволяет достичь развития клинической картины грибкового кератита с контролируемыми стадиями процесса.
Аналогом метода является способ того же назначения, включающий моделирование грибкового кератита на кроликах посредством интракорнеального введения 0,1 мл клеточной взвеси грибков (2,5× клеток/мл) [Schreiber, W., Olbrisch, A., Vorwerk, C., Koenig, W., Behrens-Baumann, W. Combined topical fluconazole and corticosteroid treatment for experimental Candida albicans keratomycosis. Investigative ophthalmology & visual science, 44(6): 2634-2643].
Методика индуцированного кератомикоза от группы исследователей из Китая обладает рядом преимуществ: обнаружена оптимальная концентрация грибковой суспензии в сравнительных исследованиях, путь заражения близок к естественному, однако требует применения недоступных контактных линз из парафильма [Zhu, Jiang-li et al. Experimental model of Fusarium solani keratitis in rats. International journal of ophthalmology. 2011; 4(4): 371-376.].
Одна из первых методик экспериментальной инициации кератомикоза принадлежит группе исследователей из США и опубликована в 1999 г. Основное преимущество способа - его ранняя разработка, ценно тем, что уже на заре изучения проблемы грибковых кератитов авторы предпринимали способы патоморфологического исследования. За день до эксперимента производили субконъюнктивальную инъекцию триамциналона лабораторным кроликам, на следующий день производилась скарификация эпителия в центре роговицы, инстилировали стандартизованный изолят Candida albicans, устанавливали контактную линзу и проводили тарзорафию на 24 часа. Через 1 сутки снимали швы и удаляли контактную линзу [O'day D. M., Head W.S., Robinson R.D., Yang R.D et al. Contact lens-induced infection - a new model of Candida albicans keratitis. Investigative ophthalmology & visual science,1999; 40(7): 1607-1611. Accessed 27.08.2020].
Fusarium solani
Моделирование кератомикозов с применением меченых флуоресцеином грибов  в концентрации 30 мкг/мл и 90 мкг/мл обеспечивает раннее выявление грибкового кератита, однако требует специального материально-технического оснащения [Zhang H, Wang L, Li Z, et al. A novel murine model of Fusarium solani keratitis utilizing fluorescent labeled fungi. Exp Eye Res., 2013;110:-112.].
Fusarium solani
3
4
5
Модель лабораторного грибкового кератита, опубликованная в 2004 году, предусматривает внутрибрюшинное введение экспериментальным мышам циклофосфамида в дозе 180 мг/кг массы тела за 5, 3 и 1 день до инстиляции инокулятов. Создавали поверхностную рану роговицы в виде сетки путем скарификации роговицы с помощью иглы для подкожных инъекций. Инстилировали 5 мкл инокулята  (10х, 10х, 10х КОЕ), далее массировали закрытые веки для распределния грибков. Через 3 дня получали клиническую картину кератомикоза [Tzu G. Wu, Victor V. Keasler, Bradley M. Mitchell, Kirk R. Wilhelmus, Immunosuppression Affects the Severity of Experimental Fusarium solani Keratitis. The Journal of Infectious Diseases, 2004; 190(1): 192-198].
Метод инфицирования кандидозным кератитом подразумевает инстиляции гентамицина сульфата 0,5% 2 раза в сутки или глазных капель хлорамфеникола 0,2% без консервантов. Суспензию грибов вводили непосредственно в роговицу через канюлю 27G [Rabbit Model of Candida Keratomycosis. M.MotschmannW.Behrens-Baumann. Handbook of Animal Models of Infection. Experimental Models in Antimicrobial Chemotherapy, 1999, Pages 697-707].
Fusarium spp.
Fusarium solani
6
Объединяющее преимущество всех методов заключается в заявленной авторами надежности воспроизведения методов. Однако не все способы легко применимы в осуществлении: для ряда исследовательских моделей необходимо оснащение экспериментальной операционной дорогостоящим микроскопом, в некоторых случаях применяются травматичные методики, как интрастромальные инъекции и тарзорафия. Мы, так же как и большинство исследователей, производили скарификацию эпителия роговицы и применяли контактные линзы. Как показала практика, для развития стромального грибкового кератита у экспериментального животного обязательна предварительная подготовка микробиома. По этой причине наша методика отличается однократным применением 5% спиртового раствора формалина и инстиляций дексаметазона на этапе подготовки к заражению, а также применением 99% концентрата димексида в момент орошения роговицы кролика клинической суспензией Для приготовления инокулюма использованы чистые, 5 суточные культуры грибов , выросшие на плотной питательной среде Сабуро. Инокулят предварительно растерт в ступке. В стерильном изотоническом растворе хлорида натрия приготовлена взвесь микроорганизмов с конечной плотностью 1,0×10 клеток/мл, что соответствует 0,5 MF (измерение денситометром согласно данным изготовителя стандартов мутности bioMerieux).
Задачей заявляемого изобретения является разработка малотравматичной достоверно воспроизводимой экспериментальной модели грибкового кератита у кроликов, позволяющий расширить возможности для исследования патологического процесса и разработки местного этиотропного лечения.
Fusarium spp.
Техническим результатом заявленного изобретения является достоверно производимый стромальный грибковый кератит, вызванный клинической суспензией , являющимся основным эндемичным этиологическим фактором кератомикозов.
6
6
Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что под местной анестезией 0,4% оксибупрокаина на роговицу накладывают смоченный в 5% спиртовом растворе формалина стерильный диск из гемостатической губки размером 10×10 мм, надевают мягкую контактную линзу на 24 часа, на следующий день снимают мягкую контактную линзу и диск гемостатической губки, далее на поверхность роговицы в течение 3 дней инстилируют 0,1% раствор дексаметазона 4 раза в сутки, на 3-ий день под местной инфильтрационной анестезией производят скарификацию эпителия роговицы размером 10×10 мм, инстилируют на роговицу 2-3 капли 99% концентрата димексида, далее производится обильное орошение конъюнктивальной поверхности 10 КОЕ/мл клинической суспензией грибковых изолятов Fusarium spp., включающей фрагменты мицелия, на внутреннюю поверхность мягкой контактной линзой наносят 0,2-0,3 мл этой же суспензии, надевают мягкую контактную линзу на роговицу, в последующие дни через 1 день за 3-4 подхода производят дополнительное орошение роговицы, отодвинув мягкую контактную линзу, 99% димескидом, свежей клинической суспензией грибковых изолятов Fusarium spp. 10 КОЕ/мл.
Преимуществом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является достоверность воспроизведения, не инвазивные методы локальной подготовки, усиление результативности при помощи инстиляций медицинских растворов.
Детали, признаки, а также преимущества настоящего изобретения следует из нижеследующего описания реализации заявленного технического решения с использованием фигур, на которых показано:
Фиг.1 - здоровая роговица испытуемого кролика перед началом экспериментального заражения;
Фиг.2 - результат аппликации стерильной гемостатической губки в 5% спиртовом растворе формалина под мягкой контактной линзой в течение 1 суток: смешанная инъекция сосудов конъюнктивы, обильное слизистое отделяемое, эпителиопатия, выраженный роговичный синдром;
Fusarium spp
Фиг.3 - вид роговицы под мягкой контактной линзой сразу после инфицирования клинической суспензией грибковых изолятов . вместе с их мицелием;
Fusarium spp
Фиг.4 - стромальный кератит у кролика в результате экспериментального заражения роговицы кролика клинической суспензией грибковых изолятов . по описанной методике;
Фиг.5 - оптическая когерентная томография роговицы кролика с инфильтратом стромы роговицы, полученным в ходе эксперимента.
Способ осуществляется следующим образом.
6
Fusarium spp
Fusarium spp
Производится экспозиция в 5% спиртовом растворе формалина диск размером 10×10 мм простерилизованной гемостатической губки. Под местной анестезией 0,4% оксибупрокаина губка устанавливается на поверхность роговицы, надевается обычная мягкая контактная линза на 24 часа. На следующий день диск гемостатической губки и мягкая контактная линза снимаются. В течение последующих 3 дней производятся инстиляции 0,1 % дексаметазона 4 раза в сутки в исследуемый глаз. На 3-ий день инстиляций дексаметазона под местной анестезией 0,4% оксибупрокаина производится скарификация эпителия стерильным микрохирургическим лезвием в оптической зоне 10×10 мм. Инстилируется 2-3 капли 99% концентрата димексида. Выжидается 20-30 минут для испарения лишнего объема лекарственных средств. Промывание роговицы и конъюнктивальной полости 0,1% р-ром дексаметазона. Далее производится обильное орошение конъюнктивальной поверхности 10 КОЕ/мл клинической суспензии грибковых изолятов ., включающей фрагменты мицелия, на внутреннюю поверхность мягкой контактной линзы наносится 0,2-0,3 мл этой же суспензии. Мягкая контактная линза надевается на роговицу. В последующие дни через 1 день в 3-4 подхода производится дополнительная контаминация суспензией ., включающей фрагменты мицелия под местной анестезией под мягкой контактной линзой, не снимая ее с роговицы. Предварительно перед дополнительным заражением инстилируется 1 капля 99% концентрата димексида и 2-3 капли 0,1 % дексаметазона. В результате мероприятий на 8-ой-10-ый день получают грибковый стромальный кератит с глубиной поражения более 300 мкм по данным оптической когерентной томографии роговицы.
Изобретение направлено на устранение вышеописанных недостатков и достоверное воспроизведение грибкового кератита с причинением меньших страданий экспериментальному животному.
Всего провели эксперимент на 15 кроликах.
Способ поясняется следующим экспериментальным примером.
Пример 1.
Aspergillus flavus
Penicillium expansum
S. aureus
Enterobacteriaceae
2
2
1
1
Кролик (Фиг.1), при стартовом культуральном исследовании мазков конъюнктивы и роговицы правого глаза выявлен  10 КОЕ/мл,  10 КОЕ/мл,  10 КОЕ/мл,  10 КОЕ/мл. Роговица инфицирована по описанной методике.
На 1-ый день производится экспозиция в 5% спиртовом растворе формалина диск размером 10×10 мм простерилизованной гемостатической губки. Под местной анестезией 0,4% оксибупрокаина губка устанавливается на поверхность роговицы, надевается обычная мягкая контактная линза на 24 часа. На следующий день диск гемостатической губки и мягкая контактная линза снимаются.
После обработки роговицы 5% спиртовым раствором формалина развилась клиническая картина химического ожога конъюнктивы и роговицы: смешанная инъекция сосудов конъюнктивы, обильное слизистое отделяемое, эпителиопатия, выраженный роговичный синдром (Фиг.2). Бактериологический и микологический посев мазка отделяемого конъюнктивальной полости, забранного в этот день, роста микрофлоры не выявил.
6
В течение последующих 3 дней производятся инстиляции 0,1 % дексаметазона 4 раза в сутки в исследуемый глаз. На 3-ий день инстиляций дексаметазона под местной анестезией 0,4% оксибупрокаина производится скарификация эпителия стерильным микрохирургическим лезвием в оптической зоне 10×10 мм. Инстилируется 2-3 капли 99% концентрата димексида. Выжидается 20-30 минут для испарения лишнего объема лекарственных средств. Промывание роговицы и конъюнктивальной полости 0,1% раствором дексаметазона. Далее производится обильное орошение конъюнктивальной поверхности 10 КОЕ/мл клинической суспензии грибковых изолятов Fusarium spp. (Фиг.3), включающей фрагменты мицелия, на внутреннюю поверхность мягкой контактной линзы наносится 0,2-0,3 мл этой же суспензии. Мягкая контактная линза надевается на роговицу. Дополнительное орошение суспензией проводилось через 1 день в 4 подхода.
Результатом вышеописанного алгоритма явился стромальный кератит (Фиг.4) с глубиной поражения более 300 мкм по данным оптической когерентной томографии роговицы (Фиг.5).
Fusarium spp
Применение спиртового раствора формалина позволяет полностью санировать конъюнктивальную полость экспериментальных животных, что подтверждено культуральными данными, получить химический ожог легкой степени и инициировать асептическое воспаление. Инстиляции дексаметазона позволяют достичь местный иммунодефицит и предотвратить самостоятельную санацию условно-патогенного . Применение димексида при электронной микроскопии соскобов с роговицы показало повышение адгезии грибковой культуры к боуменовой оболочке и эпителию, что в результате повысило результативность контаминации. Отсутствие мягкой контактной линзы приводит к самопроизвольной санации даже при выполнении вышеописанных условий.
Таким образом, заявленная методика позволяет произвести грибковый кератит у кроликов с минимализацией травмы у экспериментальных животных, формалин обеспечивает предварительное обеззараживание конъюнктивальной полости, дополнительное применение дексаметазона подавляет защитные механизмы местного иммунитета, а димексид способствует повышению адгезии мицелии грибов в клинической суспензии.