Апробация тест-системы для одновременного ПЦР-анализа пяти пародонтопатогенных микроорганизмов в биологическом образце

МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ПАРОКСИЗМАЛЬНОЙ ФОРМЫ ФИБРИЛЛЯЦИИ ПРЕДСЕРДИЙ У МУЖЧИН С МЕТАБОЛИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ

влияние на увеличение частоты возникновения па- тельность и частоту возникновения атипичных бес-роксизмов фибрилляции предсердий, их продолжи- симптомных пароксизмов.

1. Особенности течения рецидивирующей фибрилляции предсердий у пациентов с метаболическим синдромом /С.К. Кононов, О.В. Соловьев, Е.Л. Онучина и др. //Вятский медицинский вестник. - 2009. - № 1. - С. 13-17.

2. Оценка факторов риска развития фибрилляции предсердий у пациентов с метаболическим синдромом /Е.Л. Онучина, О.В. Соловьев, С.Г. Онучин и др. //Клиническая медицина. - 2012. - № 1. - С. 72-76.

3. Аракелян, М.С. Корригируемые и некорригируемые факторы риска в прогнозировании рецидивирования фибрилляции предсердий у больных артериальной гипертензией /М.С. Аракелян, Н.Г. Потешкина, П.А. Могутова //Российский кардиологический журнал. - 2012. - № 6. -С. 34-38.

4. The relevance of the association between inflammation and atrial fibrillation /J.M. Alegret, G. Aragons, R. Elosua et al. //Eur. J. Clin. Invest. - 2013. -V. 43, N 4. - Р. 324-331.

5. Usefulness of matrix metalloproteinase-9 plasma levels to identify patients with preserved left ventricular systolic function after acute myocardial infarction who could benefit from eplerenone /N. Kampourides, D. Tziakas, G. Chalikias et al. //Am. J. Cardiol. - 2012. - V. 110, N 8. - Р. 1085-1091.

6. Total and interatrial epicardial adipose tissues are independently associated with left atrial remodeling in patients with atrial fibrillation /S.Y. Shin, H.S. Yong, H.E. Lim et al. //J. Cardiovasc. Electrophysiol. - 2011. - V. 22, N 6. - Р. 647-655.

Изучались характеристики коммерческой тест-системы «Мультидент-5» для одновременного анализа ДНК 5 пародон-топатогенных микроорганизмов в условиях классической ПЦР-лаборатории.

Цель исследования - оценка целесообразности использования метода в клинической практике.

Материалы и методы. Проведена ПЦР-диагностика возбудителей пародонтита в биологическом материале 30 пациентов.

Результаты. Установлено, что тест предоставляет возможность получения качественной или полуколичественной картины патогенной микрофлоры ротовой полости у больных пародонтитом, как при первичном освидетельствовании, так и в динамике противомикробной терапии. Можно рекомендовать использование диагностикума в стоматологической практике, однако постановка методики требует навыков работы в области молекулярно-генетических исследований.

Заключение. Интерпретация и клиническое заключение по результатам генотипирования должны формулироваться в тесном контакте между лабораторным генетиком и врачами-клиницистами.

Ключевые слова: ПЦР-диагностика; пародонтит.

Volkov A.N.

Kemerovo State University,

Kemerovo State Medical Academy, Kemerovo

APPROBATION OF TEST SYSTEM FOR SIMULTANEOUS PCR ANALYSIS OF FIVE PARODONTOPATOGENIC MICROORGANISMS IN BIOLOGICAL SAMPLE

We studied the characteristics of a commercial test system «Multident-5» for simultaneous DNA analysis of 5 parodontopat-hogenic microorganisms in classical PCR laboratory conditions.

The aim of the study was to assess the expediency of using the method in clinical practice.

Materials and methods. PCR diagnostics of periodontitis pathogens in biological material of 30 patients was performed. Results. It has been established that the test provides an opportunity to obtain a qualitative or semi-quantitative analysis of pathogenic microflora content in the oral cavity of patients with periodontitis, as in the primary examination, and in the dynamics of antimicrobial therapy. We can recommend the use of diagnostic kit in dental practice, but execution of technique requires skills in molecular genetic studies.

Conclusion. Interpretation and clinical judgment based on the results of genotyping should be formulated in close cooperation between the laboratory genetics and clinicians.

Key words: PCR diagnostics; periodontitis.

ЛИТЕРАТУРА:

Волков А.Н.

ФГБОУ ВПО «Кемеровский государственный университет», ГБОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия»,

г. Кемерово

14

T. 13 № 4 2014

Medicine

in Kuzbass

в Кузбассе

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Болезни пародонта, наряду с кариесом зубов и его осложнениями, являются самыми распространенными стоматологическими заболеваниями у населения России. В ряде случаев патологии связаны с инфицированием ротовой полости специфической группой патогенных микроорганизмов, вызывающих гингивит и пародонтит. Несвоевременное выявление и неадекватная терапия данных заболеваний становятся причиной значительного ухудшения здоровья, качества жизни, связаны с дальнейшими материальными затратами граждан и государства [1].

Наиболее современным и точным методом диагностики многих инфекционных заболеваний является ПЦР -анализ. В отличие от классических схем выявления патогенов, основанных на бактериальном посеве биологического образца из пораженной области, ПЦР-диагностика является краткосрочным и высокопроизводительным методом, не требующим больших трудозатрат [2]. Оборудование для проведения такого анализа имеется в распоряжении многих ЛПУ Кемеровской области. Вместе с тем, выявление патогенных микроорганизмов в стоматологии до сих пор не стало рутинной процедурой. Одной из причин может быть неосведомленность врачей-стоматологов о возможностях современной ПЦР -диагностики и существующих тест-системах.

Одним из наиболее удачных технических решений, на наш взгляд, является диагностикум «Муль-тидент-5» (ООО НПФ «Генлаб») для выявления 5 пародонтопатогенных микроорганизмов в одной пробирке методом мультипраймерной ПЦР. Система характеризуется невысокой стоимостью, простотой исполнения, отсутствием особых требований к оборудованию лаборатории. Однако опубликованных данных об информативности, надежности данной системы и ее полезности в клинической практике на сегодняшний день нет.

В связи с этим, целью работы является апробация коммерческого набора «Мультидент-5» для ДНК-диагностики возбудителей заболеваний пародонта в условиях современной ПЦР-лаборатории и оценка целесообразности использования его в практической стоматологии.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование были включены 30 пациентов (18 мужчин и 12 женщин) с установленным диагнозом «пародонтит». Возраст обследованных колебался в пределах 32-54 года при среднем значении 47 ± 2,3 лет.

Биологический материал (соскобы из десневого желобка) у участников забирались в соответствии с рекомендациями разработчика тест-системы «Муль-

Корреспонденцию адресовать:

ВОЛКОВ Алексей Николаевич,

650029, г. Кемерово, ул. Ворошилова, 22а, ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России.

Тел.: 8 (3842) 73-48-56; +7-905-949-32-85. E-mail: volkov alex@rambler.ru

в Кузбассе

Medicine

in Kuzbass

T. 13 № 4 2014

тидент-5» (http://rugenlab.ru). Основные манипуляции осуществлялись в ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия Минздрава России». Выделение ДНК выполняли с использованием реагента «Реалекс» ООО НПФ «Генлаб».

Выполнены две серии экспериментов. На начальном этапе проводили выявление ДНК пародонтопа-тогенных микроорганизмов у 20 однократно обследованных пациентов с целью оценки информативности тест-системы «Мультидент-5». На втором этапе проведены повторные постановки ПЦР-анализа возбудителей у 10 пациентов, проходивших лечение, до и после антибиотикотерапии. В данном случае оценивалась возможность использования тест-системы для мониторинга стоматологического здоровья больных пародонтитом в динамике терапии. Нумерация образцов в каждой серии экспериментов была независимая.

Генотипирование проводилось с применением наборов реагентов «Мультидент-5» производства ООО НПФ «Генлаб» методом мультипраймерной полимеразной цепной реакции на амплификаторах Bio-Rad C1000 и «Терцик» с электрофоретической схемой детекции результата. Все процедуры проводились строго согласно указанным в комплектах реагентов инструкциям производителя (http://rugenlab.ru).

Полученные электрофореграммы фотодокументи-ровались и анализировались с привлечением специалистов ООО НПФ «Генлаб».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На основании анализа результатов постановок ПЦР с использованием тест-системы «Мультидент-5» удалось заключить, что разработанный диагностикум позволяет успешно идентифицировать одновременно 5 патогенов ротовой полости человека, вызывающих пародонтит: Porphyromonas gingivalis (Pgi), Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aac), Treponema denticola (Td), Bacteroides forsythus (Bfo) и Prevotella intermedia (Pin) (рис. 1). Анализ литературы показал, что Porphyromonas gingivalis, Actino-bacillus actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia и Bacteroides forsythus являются надежными маркерами пародонтита у взрослых [3] и ассоциированы с прогрессированием заболевания [4]. Treponema den-ticola, наряду с некоторыми другими патогенами, относится к группе «предполагаемых» участников патологического процесса [5]. Высокая частота встречаемости у больных пародонтитом данных возбудителей и их агрессивность побудили исследователей разработать алгоритмы выявления ДНК именно данной группы патогенов. При этом, как правило, происходит раздельное генотипирование отдельных микроорганизмов [6, 7], что увеличивает трудозатраты, время анализа и его стоимость.

В настоящее время на российском рынке диагнос-тикумов для ПЦР -анализа имеются тест-системы для раздельного генотипирования клинически наиболее значимых возбудителей пародонтита. Так, ООО НПФ

— —I

15

АПРОБАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО ПЦР-АНАЛИЗА

ПЯТИ ПАРОДОНТОПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБРАЗЦЕ

«Литех» с 2013 года выпускает панель «Дентоскрин», включающую в себя батарею тестов для выявления в отдельных пробирках следующих микроорганизмов: Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingiva-lis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans (согласно ранее принятой номенклатуре — Actinobacillus actinomycetemcomitans), Treponema denticola, Prevotel-la intermedia, Fusobacterium nucleatum (http://www. lytech.ru). С другой стороны, компания «Hain Li-fescience» (Германия) реализует в России набор реагентов «Micro-Ident» для единовременного молекулярно-генетического определения 5 пародонтопатогенных бактерий: Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Treponema denticola, Tanne-rella forsythia (согласно ранее принятой номенклатуре — Bacteroides forsythus), Prevotella intermedia. Данный набор остается достаточно дорогим и сложнее в постановке, чем традиционные ПЦР -диагнос-тикумы. Кроме того, имеются данные о некоторых расхождениях результатов выявления микроорганизмов с использованием «Micro-Ident» и других тестов, включая традиционный бактериологический посев [8]. Новый, расширенный формат данного диагностику-ма «Micro-IDent plusll» увеличивает список объектов выявления до 11.

Можно заключить, что тест-система «Мультидент-5» обладает достаточно высокой информативностью, позволяя единовременно выявлять ДНК пяти наиболее значимых пародонтопатогенных микроорганизмов в одной пробе. При этом система проста в исполнении, так как опирается на традиционный ПЦР-анализ и последующую детекцию продуктов с помощью электрофореза в агарозном геле.

Все возбудители, выявляемые с помощью набора «Мультидент-5», являются условными патогенами, т.е. могут присутствовать в ротовой полости здоровых людей без патологических последствий. Клинически значимые концентрации для них — около 104 ед/мл, более низкие значения соответствуют норме. С учетом этого, разработан положительный контрольный образец (К+) (рис. 1). Яркость ампликонов в контрольном образце является ориентировочной и соответствует клиническому уровню ДНК возбудителя в пробе. В тех образцах, где уровень флуоресценции слабее контроля, можно констатировать наличие возбудителя на доклиническом уровне. Там, где флуоресценция на уровне контрольной полосы — результат пограничный. Если яркость полосы ампликона заметно интенсивнее контроля, ответ должен быть положительным.

Таким образом, из представленных образцов №№ 29, 33, 44 положительны по соответствующим возбудителям. В № 24 помимо однозначно положительных Pgi (Porphyromonas gingivalis) и Td (Treponema denticola) есть исчезающе слабая полоса Bfo (Bacteroides forsythus) — ее не учитывают. В № 19 однозначно положительны Td, Bfo и Pin, а Aac (Ac-

Рисунок 1

Результаты выявления ДНК пародонтопатогенных микроорганизмов с помошью тест-системы «Мультидент-5» у больных пародонтитом

Л+ ж т ни Н4* »

tinobacillus actinomycetemcomitans) находится на границе нормы. В этом случае можно засчитать Aac как положительный ответ, так как общая картина норме не соответствует, а для дальнейшего лечения важно знать полный спектр возбудителей. В № 9 и № 17 полосы Pin и Bfo светимостью на уровне контрольных или бледнее. Такая картина соответствует норме, поэтому допускается отрицательное заключение.

Самый непростой для вынесения заключения случай — № 4. Как видно, только яркость Td чуть больше контрольной, а у всех остальных ампликонов — на уровне или чуть менее контрольных. Однако, учитывая, что в этом образце обнаруживаются одновременно четыре возбудителя, возможна постановка положительного заключения по всем четырем возбудителям.

Хотя тест «Мультидент-5», строго говоря, дает качественное описание патогенной микрофлоры, но некоторую приблизительную количественную оценку вынести все-таки можно. Возможна формулировка заключения на основании полуколичественной оценки яркости ампликонов в плюсах:

+ — светимость ниже контрольной, т.е. возбудитель есть, но его концентрация находится в пределах нормы, лечить не нужно;

++ — светимость на уровне контрольной, возбудитель на грани нормы (норма — 104 ед/мл), лечение по обстоятельствам, в зависимости от выраженности симптоматики;

+++ — светимость заметно выше контрольной, но ниже максимальной — это выраженная патология, соответствует примерно 105 ед/мл, требуется терапия; ++++ — светимость очень сильная, это соответствует количеству возбудителя от 106 ед/мл и выше, требуется терапия.

В приведенном примере ответы в плюсах будут выглядеть так:

Сведения об авторах:

ВОЛКОВ Алексей Николаевич, канд. биол наук, доцент, ФГБОУ ВПО КГУ; ст. науч. сотрудник, ЦНИЛ, ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России, г. Кемерово, Россия.

16

T. 13 № 4 2014

Medicine

in Kuzbass

ОЛ&Эицина

в Кузбассе

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

№4 — обнаружено: Pgi ++ Td ++ Bfo ++ Pin ++ №9 — обнаружено: Bfo + Pin ++

№ 17 — обнаружено: Pin ++

№ 19 — обнаружено: Aac ++ Td +++ Bfo +++ Pin +++ № 24 — обнаружено: Pgi +++ Td +++

№ 29 — обнаружено: Pin +++

№ 33 — обнаружено: Td +++ Bfo ++++

№ 44 — обнаружено: Aac ++++ Td +++ Bfo +++ Pin +++

Однако надо иметь в виду, что давать полуколичественную оценку результатам генотипирования можно только в том случае, если есть хороший контакт и взаимопонимание с врачами-пародонтолога-ми и возможность объяснить им, что ответы в один и два плюса соответствуют норме и даются исключительно для полноты картины. Если возможностей для объяснений нет, эту систему интерпретации лучше не применять во избежание лечения пациентов с нормофлорой (таких как № 9 и № 17) антибиотиками.

Как видно, использование системы «Мультидент-5» позволяет дать развернутую картину микробиоценоза при пародонтите, интерпретация результата не является сложной и будет понятна врачам-кли-ницистам при условии их взаимодействия с лабораторным генетиком.

На следующем этапе нашего исследования была проанализирована полезность рассматриваемой тест-системы для оценки эффективности противомикробной терапии у больных пародонтитом (рис. 2). У ряда пациентов с установленным диагнозом дважды осуществляли забор образцов — до лечения антибиотиками и после. Как видно, у пациента № 1 на начальном этапе обнаружено высокое содержание Porphyromonas gingivalis. После лечения присутствие возбудителя не установлено, что свидетельствует о высокой эффективности терапии. У пациента № 2 при первичном освидетельствовании выявлены Porp-hyromonas gingivalis, Treponema denticola и Bacte-roides forsythus, причем два из них присутствуют в большом количестве, обследуемый нуждается в терапии. После цикла приема антибиотиков наиболее значимые возбудители устранены. Тем не менее, Bac-teroides forsythus сохранился, в дальнейшем врачу-стоматологу будет необходимо принять решение о целесообразности и способе дальнейшего лечения в зависимости от общей клинической картины.

У пациента № 4 выявлен тот же спектр возбудителей, что и в предыдущем случае, доминирующим является один — Porphyromonas gingivalis. После воздействия антибиотиков Treponema denticola не обнаружена, а концентрация Porphyromonas gingiva-lis и Bacteroides forsythus достигла доклинического уровня. Как в первом случае, у пациента № 7 на начальном этапе обнаружен единственный возбудитель Porphyromonas gingivalis. Но лечение оказалось не столь эффективным. Повторный ПЦР-анализ показал присутствие патогена, по меньшей мере, в кли-

Рисунок 2

Результаты повторного выявления ДНК пародонтопатогенных микроорганизмов с помошью тест-системы «Мультидент-5» у больных пародонтитом до и после лечения

Примечание: М - маркер молекулярного веса, д - до лечения, п - после лечения.

Гш,

ЙГс

TJ

Ли

Ч I п д в Д  И п К-

Ж Hri IW it!

нически значимой концентрации. В данном случае, вероятно, целесообразно продолжить лечение.

Очевидно, полезность диагностикума «Мульти-дент-5» существенно возрастает при мониторинге стоматологического здоровья больных пародонтитом в динамике противомикробной терапии.

В задачи исследования также входило выявление возможных ошибок, неточностей, ведущих к получению некорректных результатов, а также артефактов, связанных с ограничениями самой тест-системы.

Одним из обнаруженных слабых мест методики является невозможность в некоторых случаях получить все ожидаемые продукты ПЦР. Так, было неоднократно замечено, что наиболее эффективно амп-лифицируются короткие участки ДНК (рис. 3).

Как видно, при постановке контрольных образцов (К+) образовались ампликоны, соответствующие Porphyromonas gingivalis и Actinobacillus actinomyce-temcomitans. При этом в положительном контрольном образце ожидалось образование пяти типов ампли-конов (рис. 1, 2). Соответственно, в клинических образцах выявлены только два микроорганизма: № 1 — Porphyromonas gingivalis, № 4 — Porphyromonas gingivalis и Actinobacillus actinomycetemcomitans. Образцы № 3 и № 5 по результатам анализа не содержат возбудителей. Однако в данных условиях такой результат может быть ложноотрицательным, и все изученные пробы потенциально могут содержать Treponema denticola, Bacteroides forsythus и Prevotella intermedia в любом соотношении.

Возможные причины получения неожиданного результата — это ухудшение качества одного или нескольких реагентов из ПЦР-смеси. Известно, что при длительной эксплуатации и частом замораживании-размораживании реагентов Taq-полимераза теряет ак-

Information about authors:

VOLKOV Aleksey Nikolayevich, candidate of biological sciences, docent, Kemerovo State University; senior research assistant, Central research laboratory, Kemerovo State Medical Academy, Kemerovo, Russia.

О'Йййя#та

в Кузбассе

Medicine

in Kuzbass

T. 13 № 4 2014

17

АПРОБАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО ПЦР-АНАЛИЗА

ПЯТИ ПАРОДОНТОПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБРАЗЦЕ

Рисунок 3

Некорректные результаты ПЦР

при постановке методики «Мультидент-5»

Примечание: К- - отрицательный контрольный образец.

тивность и(или) точность работы. В таких условиях может ухудшаться и качество праймеров. Кроме того, реагенты естественным образом портятся по истечении срока годности.

Чтобы исключить обсуждаемую проблему, можно рекомендовать пользователям уменьшить количество циклов заморозки-разморозки реактивов за счет аликвотирования, т.е. приготовления небольших порций из общего исходного объема. В идеале, можно подготовить полные ПЦР-смеси в отдельных ПЦР-пробирках, а затем, по мере необходимости, размораживать их и вносить ДНК непосредственно перед постановкой ПЦР.

Следует уделять особое внимание контрольным образцам и выполнять их постановку с каждой серией исследуемых проб. При обнаружении некорректного результата в положительном контрольном образце серию выбраковывают и поднимают вопрос о

ЛИТЕРАТУРА:

целесообразности дальнейшего использования реагентов из данной партии.

Очевидно, для устранения указанных проблем, точного соблюдения всех технических регламентов и получения корректных результатов при использовании тест-системы «Мультидент-5» все работы должны проводиться специалистами, имеющими теоретическую подготовку и большой практический опыт в области молекулярно-генетической диагностики.

ВЫВОДЫ:

1. Тест-система «Мультидент-5» обладает высокой информативностью, позволяя выявлять ДНК пяти наиболее клинически значимых возбудителей пародонтита в одном биологическом образце.

2. Использование диагностикума допускает вынесение клинического заключения на основании качественной и полуколичественной оценки результатов генотипирования.

3. «Мультидент-5» может успешно использоваться как для постановки первичного диагноза, так и при мониторинге стоматологического здоровья больных пародонтитом в динамике противомикробной терапии.

4. Для получения корректных результатов ПЦР-ди-агностики с использованием «Мультидент-5» все работы должны проводиться специалистами, имеющими теоретическую подготовку и практический опыт в области молекулярно-генетической диагностики.

5. Интерпретация и клиническое заключение по результатам генотипирования микроорганизмов с помощью рассматриваемого диагностикума должны формулироваться в тесном контакте между лабораторным генетиком и врачами-клиницистами.

1. Безрукова, А.П. Пародонтология /А.П. Безрукова. - М.: ЗАО «Стоматологический научный центр», 1999. - 336 с.

2. Лопухов, Л.В. Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике /Л.В. Лопухов, М.В. Эйдельштейн //Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2000. - № 3. - С. 96-106.

3. Van Winkelhoff, A.J. Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus and other putative periodontal pathogens in subjects with and without periodontal destruction /A.J. Van Winkelhoff, B.G. Loos, W.A. Van der Reijden //J. Clin. Periodontol. - 2002. - V. 29. - P. 1023-1028.

4. Haffajee, A.D. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases /A.D. Haffajee, S.S. Socransky //Periodontol. - 1994. - V. 5. -P. 78-111.

5. Haffajee, A.D. Association of Eubacterium nodatum and Treponema denticola with human periodontitis lesions /A.D. Haffajee, R.P. Teles, S.S. Socransky //Oral Microbiol. Immunol. - 2006. - V. 21. - P. 269-282.

6. Ibrahim, R.O. The effectiveness of adjunctive systemic antibiotics to non surgical therapy in chronic periodontitis patients /R.O. Ibrahim, O. Shaker //J.

Am. Science. - 2012. - V. 8(12). - P. 374-383.

7. Метод ПЦР «в реальном времени» для анализа количественного и качественного соотношений микробиоценоза пародонтального кармана /О.А. Зорина, А.А. Кулаков, О.А. Борискина и др. //Стоматология. - 2011. - № 3. - С. 31-33.

8. Comparison between polymerase chain reaction-based and checkerboard DNA hybridization techniques for microbial assessment of subgingival plaque samples /A.D. Haffajee, T. Yaskell, G. Torresyap et al. //J. Clin. Periodontol. - 2009. - V. 36. - P. 642-649.

18

T. 13 № 4 2014 ме^с1п^