УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЭСТЕРАЗ В РАСТВОРАХ

Полезная модель относится к области аналитической биохимии, более конкретно, к устройствам для определения активности эстераз в биологических тканях и растворах и может найти применение в медицинской диагностике, в том числе, при селективном анализе эстераз в биологических тканях, растворах, цельной крови и др.
Известно устройство для селективного анализа биологически активных соединений в растворах, содержащее измерительный блок, реакционные ячейки, пробоотборник и средства для подачи растворов в измерительный блок и в реакционные ячейки (см. Till Т. Bachman et al. Biosensors &, Bioelectronics, 2000, 15, с. 193).
Недостатками известного устройства являются сравнительно малая точность измерений, недостаточная чувствительность и воспроизводимость результатов измерений, а также сложность автоматизации процесса селективного анализ.а биологически активных соединений в биологических растворах и технологических средах.
Наиболее близким техническим решением является устройство для селективного анализа биологически активных соединений в растворах, содержащее измерительный блок с проточным биосенсорным анализатором, программируемый стрип с реакционными ячейками, снабженными набором реагентов, средства для подачи анализируемых растворов в реакционные ячейки и в измерительный блок и микропроцессор для программирования их работы (см. положительное решение от 07.02.2003 г. по заявке на ПМ №2003100360, 2003г. - прототип).
Основным недостатком такого устройства является невозможность анализа низких концентраций эстераз в биологических растворах по причине малой чувствительности проточного биосенсорного анализатора, выполненного на основе электрохимической измерительной ячейки с платиновым рабочим электродом.
Решаемой задачей является создание полуавтоматического переносного или автоматического стационарного анализатора для эффективного определения в биологических тканях и растворах эстераз - индикаторов нейротоксичности при использовании в практике медицинской диагностики и экологического мониторинга.
Указанная задача решается тем, что в устройстве для определения активности эстераз в растворах, содержащем измерительный блок с проточным биосенсорным анализатором, программируемый стрип с реакционными ячейками, снабженными набором реагентов, средства для подачи анализируемых растворов в реакционные ячейки и измерительный блок и микропроцессор для программирования их работы, согласно полезной модели, реакционные ячейки программируемого стрипа снабжены компонентами буферного раствора, стоп раствора для остановки ферментативной реакции, ингибиторами и субстратами эстераз, проточный биосенсорный анализатор содержит электрохимическую измерительную ячейку, рабочий электрод которой выполнен из проводящего материала, модифицированного ферментом для окисления образующегося в ходе анализа фенола, а электрод сравнения выполнен преимущественно хлорсеребряным, причем электрический выход измерительного блока через преобразователь и усилитель соединен с первым входом микропроцессора, второй вход которого соединен с выходом блока переключения режимов, а выход микропроцессора соединен с входом индикатора результатов измерений.
Кроме того, средства для подачи анализируемых растворов в реакционные ячейки, последовательного переноса растворов и отбора их в измерительный блок могут быть выполнены с возможностью автоматического выполнения программы измерений.
Кроме того, выход микропроцессора может быть дополнительно соединен с входом персонального компьютера для пересчета аналитического отклика на активность эстераз и отображения результатов анализа в цифровой или графической форме.
Такое выполнение устройства позво.11яет персоналом обычной квалификации рещить поставленную задачу создания полуавтоматического переносного ила автоматического стационарного анализатора для эффективного определения в биологических тканях и растворах эстераз - индикаторов нейротоксичности, в том числе, при селективном анализе эстераз в цельной крови.
В предложенном устройстве используется известный метод определения активности эстераз, основанный на их способности гидролизовать субстраты с вьщелением фенола. Для измерения образующегося в ходе ферментативной реакции фенола используется проточный электрохимический элемент, рабочий электрод которого выполнен из проводящего материала, модифицированного ферментом, катализирующим окисление образующегося в ходе анализа фенола, а опорный электрод - преимущественно хлорсеребряным.
Наличие в анализаторе стандартного пронумерованного набора реагентов в ячейках программируемого стрипа для проведения анализа активности эстераз в исследуемом растворе позволяет сравнительно просто проводить указанные измерения уровней активности эстераз - индикаторов нейротоксичности при оценке содержания опасных соединений в биологических тканях и растворах в практике медицинской диагностики.
Микропроцессор устройства в режиме работы полуавтоматического переносного анализатора обеспечивает анализ результатов измерений, оставляя оператору загрузку пронумерованных реакционных ячеек программируемого стрипа растворами и реагентами в соответствии с программой конкретных измерений биологически активных соединений в растворах, а в режиме автоматического стационарного анализатора - только первичную загрузку ячеек стрипа.
На фиг. 1 приведена блок схема конкретного варианта выполнения устройства. На фиг.2 представлена схема программируемого стрипа для определения активности нейротоксичной эстеразы в исследуемом образце.
Устройство (фиг.1) для определения активности эстераз в растворах содержит измерительный блок 1 с проточным биосенсорным анализатором, программируемый стрип 2 с реакционными ячейками 3, снабженными набором реагентов, пробоотборник 4 для подачи анализируемых растворов в реакционные ячейки и измерительный блок 1 и микропроцессор 5 для программирования работы устройства.
Проточный биосенсорный анализатор измерительного блока 1 содержит электрохимическую измерительную ячейку с центральным графитовым электродом 6, модифицированным тирозиназой, и периферийным хлорсеребряньш электродом 7. Электрический выход измерительного блока 1 через преобразователь 8 и усилитель 9 соединен с первым входом микропроцессора 5, второй вход которого соединен с выходом блока 10 переключения режимов, а выход микропроцессора 5 соединен с входом жидкокристаллического индикатора 11 результатов измерений и, дополнительно, с входом персонального компьютера 12.
Подачу анализируемых растворов в реакционные ячейки 3, последовательный перенос растворов и отбор их в измерительный блок 1, в случае портативного переносного варианта выполнения устройства, можно осуществлять вручную, а в случае автоматического стационарного варианта устройства, указанные операции могут быть выполнены с возможностью автоматического выполнения программы измерений.
При этом устройство должно иметь механизм для позиционирования пробоотборника 4 по осям координат по программе от микропроцессора 5. Кроме того устройство должно также иметь гидравлически соединенные перистальтический насос, сливную емкость, емкость буферного раствора и распределительную емкость с регулятором уровня раствора (не показаны). Устройство в обоих случаях может быть выполнено с автономным питанием, а для стационарного варианта также с питанием от сети.
Реакционные ячейки программируемого стрипа для определения активности нейротоксичной эстеразы в исследуемом образце снабжены компонентами буферного раствора, стоп раствора для остановки ферментативной реакции, ингибиторами и субстратом этой эстеразы. При этом ячейки в программируемом стрипе размещены преимущественно в виде прямоугольной матрицы с заранее разнесенными по ячейкам биоактивными реагентами в твердом или жидком состоянии для анализа конкретного типа биологически активных соединений.
На фиг. 2 схематически изображен программируемый 12-луночный стрип, предназначенный для определения нейротоксичной эстеразы.
Реагенты в ячейках стрипа при этом находятся в жидком состоянии, стандартизованы по количеству и расположены в порядке их применения справа налево следующим образом.
Ячейки 1,2 - буферный раствор на основе «Трис с комплексонами рН 8,0. Ячейки 3,4 - специфические ингибиторы (время инкубации 20 мин.). Ячейки 5,6 - субстрат - фенил валерат (время инкубации 30 мин). Ячейки 7,8 - стоп-раствор на основе лаурилсульфата натрия.
Ячейки 9,10 - разбавитель на основе фосфата натрия с неорганическими солями, рН 7,0. Ячейки 11,12- калибровочный раствор фенола.
В качестве блока отображения результатов измерений в предложенном устройстве могут использоваться жидкокристаллический индикатор для передачи количественной информации, цветные светодиоды для качественной оценки результатов измерений в полевых условиях  персональный компьютер для дополнительного анализа результатов измерений.
Для иглы пробоотборника используется стальной шприц диаметром 0,8 мм, в качестве стрипа - 12-луночный стрип фирмы «Labsistem, преобразователь выполнен на базе - AD820AR, микропроцессор - на базе ADuC824QS.
Предложенное устройство работает следующим образом.
На примере измерения активности нейротоксичной эстеразы в растворе измерительный цикл начинается после внесения оператором с помощью пипетки в реакционные ячейки 1,2 с буферными растворами исследуемого биологического препарата или раствора в количестве около 20 мкл.
Предварительно на второй вход микропроцессора 5 от блока 10 переключения режимов оператор подает команду на выполнение конкретной программы измерений, например, программы измерения активности нейротоксичной эстеразы цельной крови.
После этого растворы из ячеек 1,2 автоматически или вручную последовательно и попарно в количестве 100 - 200 мкл переносят на первом этапе в ячейки 3,4 со специфическими ингибиторами (параоксон, мипафокс), где они инкубируются в течение фиксированного времени (20 мин); затем на втором этапе исследуемые растворы переносят в ячейки 5,6 с субстратом фенил валератом, где они инкубируются 30 мин; после этого на третьем этапе растворы переносят в ячейки 7,8 со стоп - раствором на основе лаурилсульфата натрия и на четвертом этапе растворы переносят в ячейки 9,10 с разбавителем на основе фосфата натрия с неорганическими солями при рН 7,0.
Затем указанные растворы из ячеек 9,10 последовательно направляют с помощью пробоотборника 4 в электрохимическую измерительную ячейку проточного биосенсорного анализатора измерительного блока 1 с центральным графитовым и периферийным хлорсеребряным электродами 6,7.
Формируемый на выходе блока 1 электрический сигнал, пропорциональный количеству накопившегося в ячейках 9,10 фенола, поступает через преобразователь 8 ток напряжение и усилитель 9 на первый вход микропроцессора 5, запрограммированного на указанный тип анализа. На выходе микропроцессора 5 после пересчета формируются выходные сигналы, характеризующие результаты измерений для их отображения на жидкокристаллическом индикаторе 11 или мониторе персонального компьютера 12.
После проведения указанных операций измерения активности нейротоксичной эстеразы производят калибровку устройства по известным концентрациям раствора фенола из ячеек 11,12. Для выполнения новых измерений, в том числе по иной программе, программируемый стрип заменяют на новый, измерительный тракт, проточный биосенсорный анализатор измерительного блока и пробоотборник промывают буферным раствором.
Активность эстеразы в исследуемой пробе рассчитывается микропроцессором 5 по разности сигналов в ячейках 9 и 10 по отношению сигналов от измеряемых проб и ранее измеренной контрольной пробы по фенолу. На дисплее индикатора результатов измерений 11 или на мониторе персонального компьютера 12 появляется информация об активности нейротоксичной эстеразы в исследуемом образце.
Фосфорорганические соединения и карбаматы широко применяются в промышленности, сельском хозяйстве, в быту в качестве пестицидов. Некоторые из этих веш;еств обладают сильным токсическим действием на людей и животных, поэтому проблема анализа токсического воздействия соединений данного класса и подобных им приобретает особое значение д.ля охраны здоровья населения и окружающей среды. Предложенное устройство позволяет с высокой чувствительностью и избирательностью проводить трудновыполнимые измерения активности эстераз - индикаторов нейротоксичности в биологических тканях и растворах, в том числе, цельной крови, тканях мозга, нервной ткани и др.