Исследование пленочных матриксов из резорбируемых полигидроксиалканоатов различного химического состава in vivo: реакция тканей и кинетика биоразрушения

Исследование пленочных матриксов из резорбируемых полигидроксиалканоатов различного химического состава in vivo: реакция тканей и кинетика биоразрушения

Е.И. Шишацкая1, Е.Д. Николаева 2, А.В. Горева 2, К.Д. Бригкхам 3, Т.Г. Волова 1, Э.Д. Синкси3

1 Сибирский федеральный университет, Красноярск

2 Институт биофизики СО РАН, Красноярск

3Массачусетский технологический институт, Массачусетс, Кембридж, США

An in vivo study of pha matrices of different chemical composition: tissue reaction and biodegradation

E.I. Shishatskaya 1, E.D. Nikolaeva 2, A.V. Goreva 2, C.J. Brigham 3, T.G. Volova 1, A.J. Sinskey 3

1 Institute of modern biology and biotechnology, Siberian Federal University, Krasnoyarsk, Russia

2 Institute of Biophysics SB RAS, Krasnoyarsk, Russia

3 Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, USA

Исследовано «семейство» пленочных матриксов, изготовленных из разрушаемых полигидроксиалканоатов, различного химического состава. Независимо от состава матриксов и длительности контакта с внутренней средой организма, не наблюдали отклонений в поведении животных, их росте и развитии, а также функции крови. Реакция тканей на полигидроксиалканоаты (ПГА) всех типов в целом сопоставима с реакцией на полилактид, но существенно менее выражена на ранних сроках после имплантации. Ответ тканей на имплантацию ПГА всех типов характеризуется непродолжительным (до 2 нед) посттрав-матическим воспалением с образованием на 30—60 сут. фиброзных капсул толщиной менее 100 мкм, которые в сроки 180 сут. в ходе обратного развития истончаются до 40—60 мкм. Различий в реакциях на матриксы из гомополимера 3-гидроксимасляной кислоты (П3ГБ), сополимеров 3-гидроксимасляной и 4-гидроксимасляной кислот (П3ГБ/4ГБ), 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот (П3ГБ/3ГВ), 3-гидроксимасляной и 3-гидроксигекса-новой кислот (П3ГБ/3ГГ) на уровне тканей и целого организма не выявлено. В реакции тканей на исследованные ПГА активное участие принимают макрофаги и гигантские клетки инородных тел. Наиболее активно разрушаемыми ПГА определены матриксы из сополимеров, содержащие 3-гидркосигексаноат и 4 гидроксибутират. Следующими и более медленно разрушаемыми были матриксы из сополимера П3ГБ/3ГВ, и самыми устойчивыми — матриксы из П3ГБ. Более медленная разрушаемость ПГА матриксов сопровождалась более поздним развитием гиганто-клеточной реакции. По разрушаемости исследуемые матриксы из ПГА находятся в ряду: П3ГБ/3ГГ — П3ГБ/4ГБ — П3ГБ/ГВ — П3ГБ.

Ключевые слова: разрушаемые полимерные матриксы, полигидрокисалканоаты, подкожная имплантация, реакция тканей, разрушаемость.

The study addresses consequences of subcutaneous implantation of film matrices prepared from different PHAs to laboratory animals. No negative effects of subcutaneous implantation of PHA matrices on physiological and biochemical characteristics of the animals were determined. Independently of the matrices composition and duration of the contact with the internal environment of the organism we did not observe any deviations in the behavior of animals, their growth and development, as well as blood functions. Response of the tissues to PHA matrices was comparable with the response to polylactide, but substantially less expressed at the earlier time periods after implantation. Tissues response to implantation of PHA of all types is characterized by short-term (up to 2 weeks) post-traumatic inflammation with formation of fibrous capsules by 30th—60th days with the thickness less than 100 microns, which get thinner down to 40—60 microns by 180th day as the result of involution. No differences in response of tissues and the whole organism were observed for the matrices produced from the homopolymer of 3-hydroxybutyric acid (P3HB), copolymers of 3-hydroxybutyric and 4-hydroxybutyric acids (P3HB/4HB), 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyvalerianic acids (P3HB/3HV), 3-hydroxybutyric and 3-hydroxyhexanoate acids (P3HB/3HH). Macrophages and foreign-body giant cells actively participate in the response of the tissues to PHAs. In the studied conditions matrices from the copolymers containing 3-hydroxyhexanoate and 4 hydroxybutyrate were determined as more actively degraded PHA. The next less degraded matrices were matrices from the copolymer of P3HB/3HV and the most resistant were P3HB matrices. The slower degradation of PHA matrices was accompanied by delayed development of giant-cells response. The studied PHA matrices can be placed in the following range by their degradation: P3HB/3HH — P3HB/4HB — P3HB/HV - P3HB.

Key words: degradable polymer matrices, polyhydro-xyalkanoates, PHAs, subcutaneous implantation, tissue reaction, degradation.

Освоение новых биосовместимых материалов, необходимых для современных реконструктивных медико-биологических технологий, является актуальной проблемой биотехнологии. Активно развиваемый в настоящее время новейший подход — создание «биоискусственных» тканей и органов, развитие которого делает необходимой разработку новых функциональных материалов [1, 2]. Открытие и изучение

е-та11:БЫзЬ^Бкауа@1пЬох.ги

полигидроксиалканоатов (ПГА) — биосовметимых резорбируемых полиэфиров микробиологического происхождения, явилось значимым событием для биотехнологии новых материалов. Особо ценным в ПГА является возможность синтеза полимеров различного состава, образованных мономерами с различной длиной С-цепи. В зависимости от соотношения мономеров базовые свойства ПГА могут

изменяться в достаточно широких пределах [3—5]. Однако наличие в ПГА, помимо гидроксимасляной кислоты, которая является естественным метаболитом клеток высших животных и человека [6], других мономеров, делает необходимым проверку биосовместимости материала в полном объеме. Нельзя не отметить при этом, что для подтверждения биосовместимости новых материалов и изучения закономерностей взаимодействия с организмом in vivo на этапе доклинических исследований необходимы длительные и сложные эксперименты на лабораторных животных. Однако опубликованные результаты медико-биологических исследований сополимерных ПГА весьма отрывочны. Особенно мало информации и результатов исследования ПГА, выполненных на животных. В доступной литературе представлены единичные работы этого плана. В работе X.-H. Qu с соавт. (2006) в сравнительном аспекте исследована реакция тканей на подкожную имплантацию полимера молочной кислоты (ПМК), поли-3-гидркосибутирата (П3ГБ) и сополимеров 3-гидрксибутирата с 3-гидркосигексаноатом (П3ГБ/3ГГ). Тканевая реакция на имплантацию включала двухнедельный воспалительный ответ, который был более выраженным в месте имплантации ПМК и П3ГБ [7]. В работе J. Zhou с соавт. (2010) авторы исследовали тканевую реакцию на имплантаты из сополимера П3ГБ/3ГГ. Характер тканевой реакции был несколько отличным от предыдущей работы. В целом, отмечая отсутствие неблагоприятных реакций в виде нагноения, отторжения и некрозов на сроках до 2 нед. после операции, показана высокая плотность в окружающих тканях клеток воспалительного ряда при имплантации П3ГБ/3ГГ [8]. В работе T.H. Ying с соавт. (2008) изучены биорезорбция и тканевый ответ на подкожную имплантацию матриксов из нетканого волокна, сформированного ультратонкими волокнами из гомополимера П3ГБ, сополимеров П3ГБ/3ГГ и П3ГБ/4ГБ [9]. Отмечено, что сополимер П3ГБ/4ГБ через 4 нед. разрушился и присутствовал в виде мелких фрагментов, вокруг которых сформировалась тонкая фиброзная капсула; через 12 нед. капсула истончилась, клетки воспаления не определялись. Эта картина аналогична наблюдаемой другими авторами [10—12] в ходе изучения реакции тканей на имплантацию П4ГБ. Однако, оценивая тканевую реакцию на другие типы ПГА (П3ГБ/3ГГ и П3ГБ/4ГБ), авторы отметили, что снижения количества клеток воспалительного ряда не наблюдали. Как результат воспаления вокруг этих имплантатов сформировалась фиброзная капсула, а вокруг медленно разрушающегося имплантата из П3ГБ количество макрофагов продолжало возрастать на сроке 12 нед., что привело к формированию плотной фиброзной капсулы. Эти немногочисленные работы не дают исчерпывающего ответа на вопрос о характере взаимодействия полимерных изделий из ПГА различного химического состава с тканями, силе и длительности реакции тканей на инородное тело и клеточной реакции на имплантаты.

В серии работ Института биофизики СО РАН в сравнительном аспекте исследована биологическая совместимость двух типов ПГА (гомогенного П3ГБ и сополимеров П3ГБ/3ГВ) в виде шовных волокон, имплантированных внутримышечно [13—15], объемных имплантатов для замещения модельных дефектов костной ткани [16, 17] и микрочастиц, которые были

имплантированы лабораторным животным внутримышечно [18, 19], распределены в тканях внутренних органов при внутривенном введении [20, 21]. Не обнаружено негативного влияния исследованных типов ПГА на общее самочувствие и развитие животных, систему периферической крови, биохимические показатели крови, ткани в местах имплантации. Важно отметить, что оба типа ПГА показали высокую биосовместимость и соответствие требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям медицинского назначения [22, 23]. В нашей недавней работе биологически совместимые 5 типов ПГА: гомополимер 3-гидроксимасляной кислоты, сополимеры 3-гидроксимасляной и 4-гидроксимасляной кислот, 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот, 3-гидроксимасляной и 3-гидроксигексановой кислот — были исследованы в культуре фибробла-стов мыши линии NIH 3T3 [24]. По результатам окрашивания культивируемых клеток флуоресцентным зондом на ДНК DAPI и в МТТ-тесте показано, что все представленные типы ПГА не проявляют цитотоксичности при прямом контакте с клетками, обладают высокой биосовместимостью; по адгезивным свойствам и способности поддерживать пролиферацию фибробластов сопоставимы с полистиролом и превосходят ПМК.

Цель настоящей работы — исследование биологической совместимости и динамики биоразрушения пленочных матриксов из ПГА различного химического состава при имплантации лабораторным животным на срок 180 сут.

Материал и методы

Матриксы получены из растворов высокоочи-щенных ПГА различного химического состав: гомополимер 3-полигидроксибутират (П3ГБ), и сополимеры 3-гидроксибутирата и 3-гидроксивалерата (П3ГБ/3ГВ) с включением 3ГВ от 8,6 до 27,6 мол. %, 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата (П3ГБ/3ГГ) с включением 3ГГ 7 и 18 мол. %, 3-гидроксибутирата и 4-гидроксибутирата (П3ГБ/4ГБ) с включением 4ГБ от 8,7 до 24,3 мол. %. Процедура получения образцов, их характеристики и способы изготовления пленочных матриксов нами подробно описаны ранее [24]. Характеристика матриксов представлена в табл. 1.

Для исследования реакции организма, реакции крови и местной реакции тканей, а также динамики биоразрушения полимерные пленочные матриксы были имплантированы половозрелым крысам линии Вистар (самки массой 180—200 г) на срок 180 сут. Общее число животных 105, по 15 в каждой группе. Распределение животных по группам было следующим: 5 экспериментальных групп (матриксы из ПГА различного химического состава) и 2 контрольные (1 группа — интактные животные, 2-я — группа положительный контроль, матрикс из ПМК, Sigma). Матриксы размером 10x10 мм и толщиной 0,05—0,08 мм были имплантированы подкожно. Техника операции: под ингаляционным наркозом (диэтиловый эфир) в асептических условиях выполняли разрез (длиной

2 см) кожи спины, кожа правого края разреза отслаивалась для формирования подкожного «кармана» глубиной 1 см. Кожу отслаивали от подлежащих тканей и фасции спины, в карман вводили по 3 имплантата; разрез ушивали шелковой нитью наглухо.

Таблица 1. Характеристики пленочных матриксов, изготовленных из ПГА различного химического состава

Показатель Тип 2D матрикса, состав мономеров

П3ГБ

Средневесовая мол. масса, Ми, кДа 652 ООО 634 ООО 6О3 ООО 587 ООО 315 ООО

Среднечисловая мол. масса, Мп, кДа 144889 285 586 2О8 65О 2О3 819 152 174

Полидисперсность,ПД 4,5 2,22 2,89 2,88 2,О7

Степень кристалличности, Сх, % 76 43 5О 45 35

Температура плавления, Тпл., °С 179,7 172 162 157 158

Температура термической деградации, Т дегр, °С 273 268 266 263 24О

Контактный краевой угол смачивания водой, 0 град 7О,О±О,4 57,4±О,6 6О,3±2,8 62,5±2,О 6О,9±1,6

Среднее арифметическое отклонение профиля (шероховатость), Яа, нм 93,2ОО 92,9О9 98,682 - 99,12

Среднеквадратичная шероховатость, Яд, нм 1О9,39О 113,О62 1О7,931 - 111,1

Примечание: ПЗГБ — гомополимер З-полигидроксибутират; ПЗГБ/4ГБ — сополимер З-гидроксибутирата и 4-гидроксибутирата; ПЗГБ/ЗГВ — сополимер З-гидроксибутирата и З-гидроксивалерата; ПЗГБ/ЗГГ — сополимер З-гидроксибутирата и З-гидроксигексаноата.

В ходе экспериментах в сроки 10, 30, 60, 90 и 180 сут. передозировкой ингаляционного наркоза выводили из эксперимента по три животных каждой группы, забирали для анализов кровь и имплантаты с фрагментами окружающих тканей. В периферической крови с использованием общепринятых методов определяли СОЭ, содержание гемоглобина и форменных элементов.

Для исследований местной реакции на имплантаты образцы тканей с полимерными матриксами иссекали из подкожной ткани и фиксировали в 10% формалине. После заключения материала в парафин изготовливали срезы толщиной 4—6 мкм. Оценивали общую реакцию тканей (окраска гематоксилин-эозином) и процессы развития коллагеновых волокон (окраска пикрофуксином по Ван-Гизону). С использованием Image Analysis System «Carl Zeiss Jena» (Германия) проводили анализ изображений и морфометрические исследования срезов. Оценивали выраженность и длительность воспаления, динамику образования и толщину фиброзной капсулы (ТК), ее клеточный состав, а также время развития и созревания коллагеновых волокон. Об активности клеточных элементов судили по среднему их количеству в поле зрения при анализе 15 полей зрения.

Для изучения кинетики разрушения матриксов in vivo регистрировали остаточное содержание полимера в тканях в динамике эксперимента. С использованием хроматографа для гель-проникающей хроматографии «Waters Breeze System» (Waters, США) исследовали молекулярную массу и молекулярномассовое распределение ПГА относительно полисти-роловых стандартов (Sigma, США). Значение средней молекулярной массы полимера рассчитывали по формуле:

M=E Щ  Mi / N), где Ni — количество молекул массы /; N — общее количество молекул; Mi — масса молекул длины /.

Вес средней молярной массы полимера определяли:

MB = Е (wt  M) где wi — доля массы (wi = Ni Mi / Е (Ni  Mi).

Полидисперсность, позволяющую оценить соотношение в полимере фрагментов с различной степенью полимеризуемости, вычисляли из соотношения:

ПД = M / M .

^ в ' н

Убыль веса образцов рассчитывали по отношению конечного веса к исходному (Х, %):

Х = — x100,

Х

где Х1 и Х2 — вес образца, соответственно, до и после испытаний, мг.

Результаты обработаны статистически общепринятыми методами [25] с использованием программы Microsoft Excel. Для получения данных рассчитывали среднее арифметическое, среднеквадратичное отклонение, ошибку среднего арифметического. Достоверность отличия средних значений проверяли по U-критерию Манна — Уитни (уровень значимости 0,05).

Результаты и обсуждение

В ходе исследования все животные в 5 экспериментальных группах, которым были имплантированы 2D матриксы из полимеров различного химического состава, были здоровы и активны, равномерно прибавляли в весе. Достоверных изменений по сравнению с контрольными группами обнаружено не было. Относительные массы внутренних органов у животных всех экспериментальных групп также не отличались от таковых в контроле. Макроскопические исследования внутренних органов животных наблюдения каких-либо отклонений не выявили.

Показатели общего анализа крови в контрольных и опытных группах находились в пределах физиологических величин и не отличались существенно у животных экспериментальных групп относительно контролей. Незначительное повышение количества лейкоцитов (от 10 до 12,5—13,0х109/л) и уровня СОЭ (до 3,0—3,5) отмечены на 10 сут. после оперативного вмешательства во всех группах у оперированных животных относительно интактного контроля. При этом повышение количества лейкоцитов у животных в группе положительного контроля (ПМК) и во всех экспериментальных группах относительно интакт-ного контроля статистически значимы (р > 0,05). Однако проявление лейкоцитоза на данном сроке у животных, которым были имплантированы матриксы из ПМК, было достоверно выше по сравнению со всеми остальными группами. Повышенное содержание лейкоцитов у этих животных сохранялось на более поздних сроках (30 сут. после операции). Достоверное повышение СОЭ отмечено только на первом наблюдаемом сроке и только у животных в группе положительного контроля относительно других групп. Далее показатель стабилизировался в границах физиологической нормы у всех животных. В целом, сдвиги в лейкоцитарной формуле крови экспериментальных животных всех групп на всех сроках наблюдения статистически значимо не изменялись.

Заживление ран у животных в экспериментальных группах, аналогично положительного контроля, происходило первичным натяжением. Ни у одного животного не обнаружено явлений отторжения имплантатов, нагноения, расхождения швов и других нежелательных явлений. Гистологические исследования реакции тканей на подкожную имплантацию пленочных матриксов из ПГА различного химического состава существенных отличий и неблагоприятных проявлений не выявили. Все матриксы находились в месте имплантации, были окружены тонкой фиброзной капсулой. Вокруг всех типов имплантатов по периферии в окружающей фиброзно-мышечной ткани некрозов, кровоизлияний, гранулем и выраженного отека не было отмечено. Реакция тканей на оперативное вмешательство и последующую имплантацию полимерных матриксов в общих чертах протекала по обычной схеме, характерной для раневого процесса и реакции на инородное тело, включая стадии травматического воспаления, образования соединительной ткани, формирования и перестройки рубца [26].

Микроскопическая картина в месте имплантации экспериментальных матриксов всех типов на 10 сут. после операции (рис. 1) характеризовалась отсутствием отека тканей вокруг имплантатов, которые были макрофагами и лимфоцитами, нейтрофилами и фибробластами. Отмечено начало формирования фиброзной капсулы и обильная макрофагально-фибробластическая инфильтрация на границе с ПГА-матриксами. Сопоставление результатов, полученных при имплантации матриксов из ПГА, с реакцией тканей на матрикс, изготовленный из ПМК, показало, что начальная реакция тканей на контрольный материал была более выраженной по сравнению с реакцией на экспериментальные матриксы; количество нейтрофилов и лимфоцитов вокруг имплантата сравнения (ПМК) было выше (табл. 2). Следов разрушения матриксов из ПГА не отмечено.

П3ГБ/3ГГ (7 мол. %) ПМК

Рис. 1. Пленочные матриксы, изготовленные из полимеров различного химического состава через 10 сут. после имплантации.

Окраска гематоксилин и эозин. Маркер 25 мкм

Через 30 сут. после имплантации вокруг матриксов всех типов сформировались тонкие фиброзные капсулы (рис. 2). Прорастание соединительной ткани в имплантат не отмечено. По периферии в окружающей фиброзно-мышечной ткани некрозов, кровоизлияний, лимфо-гистиоцитарной инфильтрации и отека не наблюдалось. Капсула характеризовалась наличием небольшого количества макрофагов и фибробластов, располагающихся на внутренней поверхности капсулы, на границе с пленкой. Определялись единичные гигантские клеток инородных тел (ГКИТ), лежащие в толще внутренней поверхности капсулы. Минимальная толщина капсулы в эти сроки (22,48±4,16 мкм) определялась вокруг имплантатов из гомополимерного П3ГБ; максимальная (42,36±3,43) — вокруг сополимеров П3ГБ/4ГБ. Более плотная и сформированная капсула характерна для контрольного ПМК (56,75±4,5 мкм). Клеточная инфильтрация капсул, формирующихся вокруг матриксов из всех типов ПГА, возросла преимущественно за счет фибробластов и активных макрофагов; отмечено в небольших количествах присутствие в окружающих тканях клеток воспаления (нейтро-филов и лимфоцитов). В капсуле вокруг контрольного матрикса из ПМК количество нейтрофилов и лимфоцитов было выше в несколько раз. Отмечено также присутствие большого количества ГКИТ, являющихся, как известно, одним из основных агентов биорезорбции ПМК, а также и ПГА. Дегенерации матриксов из ПГА в виде появления трещин или фрагментации не было отмечено.

Существенных отличий в состоянии тканей и структуре фиброзных капсул вокруг экспериментальных ПГА-матриксов спустя 60 сут. после имплантации не отмечено, за исключением увеличения количества ГКИТ и снижения количества клеток воспаления (табл. 2, рис. 3).

Таблица 2. Морфометрические показатели реакции тканей на имплантацию 2D матриксов из полимеров различного химического состава

Время, сут. Толщина Кол-во макрофагов+

Тип матрикса капсулы, мкм фибробластов (поле/зр) ГКИТ Нейтрофилы Лимфоциты

П3ГБ 10 - 20,64±2,31 0 16 24

(100%) 30 22,48±4,16 29,36±3,42 1 14 16

60 48,23±6,6 45,50±5,85 5 4 12

90 43,56±5,93 83,56±6,87 8 2 15

180 28,09±3,28 71,93±0,98 7 0 8

П3ГБ/4ГБ (10 мол. %) 10 - 33,14±4,32 0 12 18

30 42,36±3,43 55,50±4,40 2 11 17

60 40,67±5,98 70,79±8,0 12 6 12

90 76,08±8,37 103,79±9,74 7 3 6

180 38,71±3,11 100,93±10,84 6 0 4

П3ГБ/3ГВ 10 - 31,00±4,19 0 9 20

(13 мол. %) 30 35,99±3,70 43,36±5,14 3 11 16

60 52,49±6,4 68,43±7,19 5 5 9

90 78,17±9,46 70,14±6,19 8 0 12

180 35,49±4,63 81,29±9,21 9 0 7

П3ГБ/3ГВ (27 мол. %) 10 - 45,21±6,06 0 8 18

30 33,69±5,5 67,00±7,65 2 12 23

60 51,68±6,51 70,64±8,0 4 4 14

90 60,76±7,0 87,14±9,45 11 1 8

180 32,00±4,68 98,43±10,45 9 0 8

П3ГБ/3ГГ 10 - 35,21±4,66 0 12 21

(7 мол. %) 30 37,59±5,5 54,00±5,65 5 6 24

60 59,25±6,51 75,64±8,70 14 8 16

90 54,21±6,06 82,14±7,45 10 3 9

180 42,00±5,68 79,43±8,45 6 1 4

ПМК 10 - 45,21±6,66 3 32 43

(100%) 30 56,75±4,5 84,00±7,65 18 23 56

60 78,25±8,51 95,64±10,70 24 16 40

90 87,21±12,0 89,14±9,45 14 8 29

180 32,00±5,68 67,43±7,45 5 2 8

Примечание: Аббревиатуры аналогичны табл. 1; ГКИТ — гигантские клетки инородных тел.

П3ГБ/3ГГ (7 мол. %) ПМК

Рис. 2. Пленочные матриксы, изготовленные из полимеров различного химического состава через 30 сут. после имплантации. Окраска гематоксилин-эозин.

Маркер 40 мкм

Рис. 3. Пленочные матриксы, изготовленные из полимеров различного химического состава через 60 сут. после имплантации. Окраска гематоксилин и эозин.

Маркер 40 мкм

Сформированные капсулы в основном были представлены фибробластами и коллагеновыми волокнами; отмечено наличие сосудов микроциркуляторного русла; в их структуре преобладали коллагеновые волокна зрелого типа. В отличие от реакции тканей на ПГА, в тканях вокруг матрикса из ПМК отмечено увеличение количества клеток всех типов, а также увеличение толщины фиброзной капсулы. В зоне,

окружающей матриксы, по-прежнему регистрировали большое количество активных макрофагов. Видимые повреждения матриксов из П3ГБ/4ГБ и П3ГБ/3ГГ, среди таковых — выраженная шероховатость поверхности, появление трещин в толще матриксов и вакуолизация. Матрикс, изготовленный из ПМК, выглядел более деструктурированным, в тканях присутствовало значительное количество кристаллизованной остаточной полимерной массы.

Спустя 90 сут. после имплантации (рис. 4). отмечено возрастание толщины фиброзных капсул вокруг всех типов матриксов, однако капсулы были не грубыми, а их толщина не превышала 100 мкм. Капсулы характеризуется наличием ярко выраженной двухслойности, внутренний слой занимает 1/3 толщины, представлен рыхлой фиброзной тканью с большим количеством макрофагов, фибробластов и ГКИТ. Наружная поверхность представлена плотной фиброзной тканью в виде пучков коллагеновых волокон и прилегающих к ним фиброцитов. Капсулы характеризуются высокой зрелостью коллагена с наличием фиброцитов во внешнем слое, внутренний — представлен тонким слоем фибробластов с макрофагами, молодой фиброзной тканью с умеренной инфильтрацией лейкоцитами. Наружная поверхность представлена плотной фиброзной тканью в виде пучков коллагеновых волокон и прилегающих к ним фиброцитов, с обеднением клеточного состава инфильтрата. Характерной реакцией тканей на имплантацию матриксов из ПГА было увеличение количества ГКИТ на фоне значительного снижения нейтрофильно-лимфоцитарной инфильтрации. Матриксы были существенно деструктурированы.

ПЗГБ ' ПЗГБ/4ГБ

П3ГБ/3ГГ (7 мол. %) ПМК

Рис. 4. Пленочные матриксы, изготовленные из полимеров различного химического состава через 90 сут. после имплантации.

Окраска гематоксилин и эозин.

Маркер 40 мкм

Через 180 сут. после имплантации вокруг ПГА-матркисов зафиксировано значительное (в 1,5—2,3 раза) истончение капсул (рис. 5 и табл. 2) по сравнению со сроком 90 сут. Однако количество активных макрофагов в тканях, примыкающих к имплантатам, по-прежнему оставались на высоком уровне. Среди фибробластических элементов преобладали «зрелые» клетки. Клетки воспалительного ряда не определялись. В периферических частях капсулы наблюдали образование зрелой соединительной ткани в виде пучков коллагеновых волокон и прилегающих к ним фиброцитов. За исключением П3ГБ, практически все матриксы были сильно разрушены и фрагментированы. Остаточное содержание матриксов из П3ГБ/3ГГ, П3ГБ/4ГБ и ПМК — минимально в виде обрывков деструктурированных пленок и небольших фрагментов.

ПЗГБ

Уг

ПЗГБ/4ГБ

. ^ 'Л

ПЗГБ/ЗГВ

ч.

ПЗГБ/ЗГВ (27,6 мол. %) ЦТ

ПЗГБ/ЗГГ

Рис. 5. Пленочные матриксы, изготовленные из полимеров различного химического состава через 180 сут. после имплантации. Окраска гематоксилин и эозин.

Маркер 40 мкм

Полученные результаты показали, что матриксы, изготовленные из всех исследованных типов ПГА, биосовместимы и реакция на них со стороны окружающих тканей умеренная, при этом не выявлено существенных отличий и не отмечено, что П3ГБ вызывает более выраженный тканевой ответ по сравнению с другими типами исследованных ПГА. Нельзя не отметить, однако, что в цитированных работах [7, 8, 11] ничего не сказано о процедуре экстракции образцов ПГА и степени химической чистоты исследованных образцов. Вместе с тем, это весьма существенный момент, так как даже следовое присутствие в полимере остаточных количеств макромолекул, присутствующих в биомассе бактерий, из которой выделяют ПГА, может вызвать пирогенные, воспалительные реакции, активировать ферментные системы крови и пр. Поэтому в наших исследованиях в клеточных культурах и в экспериментах на животных использованы только высокоочищенные

образцы ПГА, не содержащие каких-либо примесей органической природы [ЭЭ, Э7, ЭВ].

Следующая задача включала изучение кинетики разрушения матриксов, изготовленных из ПГА in vivo. На рис. 6 показано изменение веса матриксов в ходе 1ВО сут. подкожной имплантации.

Наиболее активно разрушался контрольный матрикс из ПМК. Дефекты его поверхности видны на сроке 1О сут. (см. рис. 1);его остаточная масса через ЗО сут. не превышала 6О%, через 6О сут. определялась на уровне 36%; спустя 9О сут. — около 1О—15 % от исходных значений. Через 1ВО сут. остаточная масса матрикса из ПМК была следовой. Следующими, активно разрушаемыми были матриксы, полученные из сополимеров ПЗГБ/ЗГГ и ПЗГБ/4ГБ. Через ЗО сут. их остаточная масса составила порядка 75—8О % от исходной; через 9О сут. — ЗО и 33 %; к концу эксперимента (1ВО сут.), 1О и ЗО%, соответственно. Разрушение матриксов, изготовленных из сополимеров ПЗГБ/ЗГВ (включение 3-гидркосивлаерата 13 и З7,6 мол. %) происходило практически одинаково и было менее замедленным по сравнению с выше описанными сополимерами.

% от исходной

100 1 *

90

S0 •  •

Т0  #

60 50 й 4

40 • * •

30

20 *

10

0 •

0 ) 30 60 90

120

ПЗГБ

ПЗГБ/ЗГВ

ПЗГБ/4ГБ (107 мол.%

ПЗГБ/ЗГГ

150 1S0

Время, сут.

- ПЗГБ/ЗГВ (13 мол. %) ПМК

Рис. 6. Изменение веса полимерных матриксов в ходе 180-суточной подкожной имплантации

Mw от исходной, кДа 1000

S00

600

400

200

0

LOLl

0

30

60

90

ПЗГБ

П3ГБ/4ГВ

ПЗ ГБ/4 ГБ

120 150 1S0

Время, сут.

г ПЗГБ/ЗГВ

Рис. 7. Динамика молекулярной массы полимерных матриксов в ходе 180-суточной подкожной имплантации

Так, через 90 сут. их остаточная масса составила порядка 40%, а через 180 сут. — 30—35% от исходной. Наиболее устойчивы к разрушению матриксы из П3ГБ, заметное разрушение которых (на уровне 25%) зафиксировано на сроке 90 сут, а через 180 сут. остаточная масса этого типа матрикса составила 45% от исходной величины. Более медленная разрушаемость ПГА матриксов сопровождалась более поздним развитием гиганто-клеточной реакции в месте их имплантации. По разрушаемости исследуемые матриксы из ПГА находятся в ряду: П3ГБ/3ГГ — П3ГБ/4ГБ — П3ГБ/ГВ - П3ГБ.

Для анализа закономерностей биодеградации высокомолекулярных соединений информативными являются исследования динамики молекулярной массы полимера, включая определение ряда показателей (Ми, Мп, ПД). С использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии в динамике эксперимента показано изменение Ми у матриксов из всех типов ПГА и контрольного ПМК (рис. 7).

Выполненные эксперименты позволяют заключить, что все типы исследованных высокоочищенных образцов ПГА не вызывают негативных реакций при имплантации животным, обладают высокой биологической совместимостью и пригодны для биомедицинского применения.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Штильман М.И. Полимеры медико-биологическокого назначения. М: Академкнига; 2006.

2. Хенч Л., Джонс Д. Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей. Серия «Мир биологии и медицины». М.: Техносфера; 2007.

3. Volova T.G. Polyhydroxyalkanoates — plastic materials of the 21st century: production, properties, application. NY: Nova Science Pub; 2004: 7.

4. Волова Т.Г., Севастьянов В.И., Шишацкая Е.И. Полиоксиал-каноаты — биоразрушаемые полимеры для медицины. Красноярск: «Платина»; 2006.

5. Sudesh K., Abe H., Doi Y. Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters. Prog. Polym. Sci. 2000; 25: 1503-55.

6. Hocking P., Marchessault R. Chemistry and technology of biodegradable polymers tG. Griffin (Ed.). Glasgow: Blackie; 1994.

7. Qu X.-H., Wu Q., Zhang K.-Y. Et al In vivo studies of poly(3-

hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) based polymers: Biodegradation and tissue reactions. Biomaterials 2006; 27:

3540-8.

8. Zhou J., Peng S.-W., Wang Y.-Y. et al. The use of poly93-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) scaffolds for tarsal repair in eyelid reconstruction in the rat. Biomaterials 2010; 31: 7512-8.

9. Ying T.H., Ishii D., Mahara A. et al. Scaffolds from electrospun

polyhydroxyalkanoate copolimers: Fabrication, characterization,

bioabsorbtion and tissue response. Biomaterials 2008; 29: 1307-17.

10. Williams D.F., Martin D.P., Horowitz D.M. et al. PHA applications: addressing the price performance issue. I. Tissue engineering. Int. J. Biol. Macromol. 1999; 25 :111-21.

11. Williams S.F., Martin D.P. Applications of PHAs in medicine and pharmacy. In: A. Steinbuchel, editor. Series of biopolymers in 10 vol. 2002; 4: 91-121.

12. Williams S.F., Martin D.P. Applications of PHAs in Medicine and Pharmacy. In: A. Steinbuchel, editor. Biopolymers. 2004; 4: 91-103.

13. Шишацкая Е.И., Волова Т.Г., Гордеев С.А. и др. Биодеградация шовных нитей на основе полиоксиалканоатов в биологических средах. Перспективные материалы 2002; 2: 56-62.

14. Volova T.G., Shishatskaya E.I., Sevastianov V.I. et al. Results of biomedical investigations of PHB and PHB/PHV fibers. Biochemical Engin. J. 2003; 16(2): 125-33.

15. Shyshatskaya E.I., Volova T.G., Efremov S.N. et al. Tissue response to the implantation of biodegradable polyhydroxyalkanoate sutures. J. Mat. Sci. 2004; 15 (6): 719-28.

16. Shyshatskaya E.I., Khlusov I.A., Volova T.G. A hybrid PHB-hydroxyapatite composite for biomedical application: production, in vitro and in vivo investigation. J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 2006; 17(5): 481-98.

17. Шишацкая Е.И. Биосовместимые и функциональные свойства гибридного композита полигидроксибутират/гидроксиапатит. Вестник трансплантологии и искусственных органов 2006; 3: 34-8.

18. Shishatskaya E.I., Goreva A.V., Voinova O.N. et al.

Tissue reaction to intramascular injection of resorbable polymer microparticles. Bulletin of experimental biology and medicine 2007; 144(6): 786-90.

19. Shishatskaya E.I., Voinova O.N., Goreva A.V. et al.

Biocompatibility of polyhydroxybutyrate microspheres: in vitro and in vivo evaluation. J. Mat. Sci. 2008; 19(6): 2493-502.

20. Шишацкая Е.И., Горева А.В., Калачева Г.С. и др. Распределение и резорбция полимерных микрочастиц в тканях внутренних органов лабораторных животных при внутривенном введении. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2009; 11: 542-46.

21. Shishatskaya E.I., Goreva A.V., Kalacheva G.S. et al.

Biocompatability and resorption of intravenously administered polymer

microparticles in tissue of internalorgans of laboratory animals. J. Biomat. Sci. 2011; 22: 2185-203.

22. Шишацкая Е.И., Волова Т.Г., Гительзон И.И. Исследование токсикологических свойств полиоксиалканоатов в эксперименте in vivo. Доклады РАН 2002; 383 (4): 565-7.

23. Shyshatskaya E.I., Volova T.G. А comparative investigation of biodegradable polyhydroxyalkanoate films as matrices for in vitro cell cultures. J. Mat. Sci. 2004; 15(8): 915-23.

24. Николаева Е.Д., Шишацкая Е.И., Мочалов К.Е. и др. Сравнительное исследование клеточных носителей, полученных из резорбируемых полигидроксиалканоатов различного химического состава. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2011; 6(4): 54-63.

25. Лакин Г.Ф. Биометрия: учебное пособие для вузов. М.: Высшая школа; 1990.

26. Шехтер А.Б, Серов В.В. Воспаление и регенерация. М.: Медицина; 1995.

27. Sevastianov V.I., Perovа N.V., Shishatskaya E.I. et al. Production of purified polyhydroxyalkanoates (PHAs) for applications in contact with blood. J. Biomat. Sci. 2003; 14: 1029-42

28. Shishatskaya E.I. Biomedical investigation, application of PHA. Macromol. Sympos. 2008; 269: 65-81.

Поступила 24.01.2012