КОМПЛЕКС

1. Ковалентно связанный комплекс, содержащий фактор фон Виллебранда или его варианты (VWF) и фактор VIII или его варианты (фактор VIII), и указанный комплекс содержит компонент, увеличивающий полупериод существования, при условии, что он не является гетеродимерной Fc-конструкцией слияния с одним Fc мономером, связанным с VWF, и другим Fc мономером, связанным с фактором VIII.
2. Ковалентно связанный комплекс по п. 1, в котором ковалентная связь не образована компонентом, увеличивающим полупериод существования.
3. Ковалентно связанный комплекс по п. 1 или 2, в котором фактор VIII модифицирован таким образом, что он образует дисульфидный мостик с VWF.
4. Ковалентной комплекс по п. 3, в котором фактор VIII модифицирован путем замещения природной аминокислоты на остаток цистеина или путем вставки остатка цистеина, который образует дисульфидный мостик с остатком цистеина из VWF.
5. Комплекс по п. 4, отличающийся тем, что встречающаяся в природе аминокислота, которая замещена в факторе VIII, выбрана из аминокислоты в домене а3 фактора VIII.
6. Комплекс по п. 4 или 5, отличающийся тем, что встречающаяся в природе аминокислота, которая замещена в факторе VIII, расположена в пределах аминокислот от 1653 до 1660 или в пределах аминокислот от 1667 до 1674 или в пределах аминокислот от 1675 до 1688 в домене а3 фактора VIII, или цистеин вставлен в последовательность аминокислот от 1653 до 1660, или аминокислот от 1667 до 1674 или аминокислот от 1675 до 1688 в домене а3 фактора VIII.
7. Комплекс по п. 3, отличающийся тем, что встречающаяся в природе аминокислота, которая замещена в факторе VIII, расположена в С-концевой области.
8. Комплекс по п. 3, в котором VWF модифицирован путем замены природной аминокислоты на остаток цистеина, или путем вставки остатка цистеина, который образует дисульфидный мостик с остатком цистеина, введенным в фактор VIII.
9. Комплекс по п. 8, в котором встречающаяся в природе аминокислота в VWF представляет собой аминокислоту в домене D' или в домене D3, или в котором вставка остатка цистеина расположена в домене D' или домене D3.
10. Комплекс по п. 8 или 9, в котором остаток цистеина вставлен в домен TIL', домен Е', домен VWD3, домен С8-3, домен TIL-3 или домен Е-3, или природная аминокислота в VWF, которая замещена остатком цистеина, представляет собой остаток в домене TIL', домене Е', домене VWD3, домене С8-3, домене TIL-3 или в домене Е-3.
11. Комплекс по п. 1, в котором VWF содержит или состоит из домена связывания с фактором VIII.
12. Комплекс по п. 1, в котором фактор VIII модифицирован таким образом, чтобы он содержал один или несколько доменов VWF.
13. Комплекс по п. 12, в котором фактор VIII модифицирован таким образом, чтобы он содержал С-концевой СК-домен фактора фон Виллебранда.
14. Комплекс по п. 13, в котором фактор VIII модифицирован таким образом, чтобы он содержал также VWF домены С6 или С5 и С6, С3-С6, или любой один или несколько доменов от С1 до С6, или их варианты.
15. Комплекс по п. 12, в котором фактор VIII содержит остатки от 2724 до 2812 из SEQ ID NO: 2 или их вариант, при условии, что сохраняется остаток цистеина 2773 (или его эквивалент).
16. Комплекс по п. 13, отличающийся тем, что С-концевой домен VWF присоединен к фактору VIII с помощью расщепляемого линкера.
17. Комплекс по п. 16, отличающийся тем, что расщепляемый линкер содержит один из сайтов расщепления тромбином фактора VIII.
18. Комплекс по п. 17, в котором линкерная последовательность содержит дополнительные аминокислотные остатки, создающие пептид достаточной длины, чтобы позволить осуществление внутримолекулярного взаимодействия фактора VIII и фактора фон Виллебранда с помощью доменов а3 и D'D3,
соответственно.
19. Комплекс по любому из пп. 12-18, в котором фактор VIII модифицирован на своем С-конце или на своем N-конце, или в пределах В-домена фактора VIII, или путем частичной или полной замены В-домена фактора VIII.
20. Комплекс по п. 12, в котором фактор VIII модифицирован таким образом, чтобы содержать D'D3 домен из VWF или его фрагменты.
21. Комплекс по п. 20, в котором фактор VIII модифицирован путем частичной или полной замены его В-домена на D'D3-домен фактора фон Виллебранда или его фрагменты или варианты.
22. Комплекс по п. 21, в котором фактор VIII содержит остатки от 746 до 1241 из SEQ ID NO: 2 или их варианты или фрагменты в своем В-домене, или вместо своего В-домена, или вместо части своего В-домена.
23. Комплекс по п. 19, в котором фактор VIII экспрессируется в виде двухцепочечной молекулы с доменом D'D3 фактора фон Виллебранда, представляющего амино-конец легкой цепи фактора VIII.
24. Комплекс по п. 19, в котором дополнительная линкерная последовательность вставлена между областью D'D3 из VWF и доменов легкой цепи фактора VIII.
25. Комплекс по п. 1, в котором фактор VIII является генно-инженерным фактором VIII.
26. Комплекс по п. 25, отличающийся тем, что в сконструированном факторе VIII имеется полная или частичная делеция В-домена, фактор VIII представляет собой мутантный фактор VIII, или полипептид, слитый с компонентом, увеличивающим полупериод существования.
27. Комплекс по п. 1, отличающийся тем, что VWF представляет собой форму VWF с пролонгированным полупериодом существования.
28. Комплекс по п. 27, отличающийся тем, что форма VWF с пролонгированным полупериодом существования является генно-инженерным слитым белком VWF с компонентом, увеличивающим полупериод существования.
29. Комплекс по любому из пп. 26-28, отличающийся тем, что
компонент, увеличивающий полупериод существования, выбран из следующего: альбумин или его варианты или фрагменты, константная область иммуноглобулина и его части и варианты, например, фрагмент Fc или его варианты, сольватированные случайные цепи с большим гидродинамическим объемом (например, XTEN или PAS), афамин или его варианты, альфа-фетопротеин или его варианты, витамин D-связывающий белок или его варианты, трансферрин или его варианты, карбокси-концевой пептид (СТР) из β-субъединицы хорионического гонадотропина человека, полипептиды или липиды, способные связываться в физиологических условиях с альбумином или константными областями иммуноглобулинов.
30. Комплекс по любому из пп. 1, 2 или 27, отличающийся тем, что полупериод существования VWF увеличен путем химической модификации, например, путем присоединения полиэтиленгликоля (пегилирование), гликозилированного ПЭГ, гидроксиэтилкрахмала (ГЭКилирование), полисиаловых кислот, эластиноподобных полипептидов, гепарозановых полимеров или гиалуроновой кислоты.
31. Комплекс по п. 1, отличающийся тем, что VWF экспрессируется в виде мономера, или тем, что VWF экспрессируется в виде димера.
32. Комплекс по п. 1, отличающийся тем, что VWF образует мультимер.
33. Комплекс по п. 1, отличающийся тем, что ковалентная связь создается путем использования одного или нескольких химически синтезированных сшивающих агентов.
34. Комплекс по п. 1, отличающийся тем, что фактор VIII и фактор фон Виллебранда связаны более чем одной ковалентной дисульфидной связью или пептидом или белковоподобным линкером.
35. Способ получения ковалентного комплекса фактора VIII и фактора фон Виллебранда по любому из пп. 1-32, или по п. 34, содержащий ко-экспрессию фактора VIII и фактора фон Виллебранда в эукариотической клеточной линии.
36. Применение ковалентного комплекса по любому из пп. 1-34 для изготовления лекарственного средства для лечения или профилактики нарушений свертываемости крови.
37. Применение по п. 36, отличающееся тем, что нарушением свертываемости крови является гемофилия А или болезнь Виллебранда.
38. Фармацевтическая композиция, содержащая комплекс по любому из пп. 1-34.