Способ повышения эффективности вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с повторными неэффективными попытками имплантации
METHOD OF INCREASING EFFECTIVENESS OF AUXILIARY REPRODUCTIVE TECHNOLOGIES IN PATIENTS WITH REPEATED NON-EFFECTIVE ATTEMPTS OF IMPLANTATION

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии и патологической анатомии, предназначено для прогнозирования рецептивности эндометрия и наступления беременности в программе ЭКО.
Проблемы реализации репродуктивного потенциала женщин России, рост количества бесплодных семей, а также случаев невынашивания беременности, ухудшение здоровья детей и подростков диктуют необходимость разработки и внедрения в акушерско-гинекологическую практику новых медицинских технологий.
Повторные неэффективные попытки имплантации (НПИ) остаются одной из актуальных и нерешенных проблем репродуктивной медицины. Несмотря на непрекращающийся поиск подходов, направленных на повышение результативности программ вспомогательных репродуктивных технологий, консенсуса в определении оптимальной тактики ведения пациенток с НПИ нет. Под НПИ подразумеваются клинические ситуации, в которых несколько программ переносов эмбрионов не завершаются наступлением клинической беременности [1, 2]. Однако общепринятых критериев для постановки этого диагноза на сегодняшний день нет. Согласно Консорциуму Европейского Общества Репродукции и Эмбриологии Человека (ESHRE) определение НПИ звучит как отсутствие плодного яйца при ультразвуковом исследовании в сроке 5 недель гестации в 3 программах вспомогательных репродуктивных технологий при условии переноса эмбрионов высокого качества или припереносе более 10 эмбрионов суммарно [3]. Безусловно, помимо качества эмбрионов, на процесс имплантации большое влияние оказывают и другие факторы, как рецептивность эндометрия и иммунологические аспекты.
Предложены многочисленные диагностические и терапевтические методы, направленные на повышение эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с НПИ. Среди них наиболее известными являются: предимплантационный генетический скрининг, вспомогательный хэтчинг, гистероскопия, определение рецептивности эндометрия методом ERA (endometrial receptivity array) с последующим персонифицированным переносом эмбрионов, иммуномодулирующая терапия, применение гранулоцитарного колониестимулирующего фактора роста и даже использование ооцитов донора [4-7]. Однако данные о результативности таких подходов противоречивы, и консенсуса в определении оптимальной тактики ведения пациенток с НПИ нет.
В последнее время в доступной литературе появились данные о положительном влиянии внутриматочной перфузии аутологичной плазмой крови, обогащенной тромбоцитами (platelet-rich plasma), на исход циклов вспомогательных репродуктивных технологий [8]. Обогащенная тромбоцитами плазма крови (ОТПК) содержит различные факторы роста, включая фибробластный фактор роста (FGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VGEF), трансформирующий фактор роста (TGF), инсулиноподобный фактор pocral, II (IGF-I, II), соединительнотканный фактор роста (CTGF) и интерлейкин-8 (IL-8). Терапевтический эффект ОТПК активно используется при тяжелых повреждениях нервов, алопеции, остеоартрите, тендините, повреждении миокарда [9-13]. Несмотря на успешный опыт применения ОТПК в некоторых областях медицины данные о целесообразности ее использования в гинекологии и репродуктологии ограничиваются единичными отчетами.
До 70-х годов 20 века тромбоциты рассматривались исключительно как клетки гемостаза, однако в 1974 году Ross и соавторы опубликовали данные о том, что в активированной интактными тромбоцитами плазме крови значительно повышается митогенная активность, причем тромбоциты являются основным источником пролиферативного эффекта. Эти результаты дали мощный толчок для переоценки функциональных возможностей тромбоцитов. Вскоре с помощью субклеточного фракционирования вальфа-гранулах тромбоцитов был выделен тромбоцитарный фактор роста (Witte, 1978; Kaplan, 1979). В последующие 20 лет в этих альфа-гранулах были определены трансформирующий фактор роста b (TGFb) (Assoian et al. 1983), инсулиноподобный фактор роста (IGF)-1, (Karey, Sirbasku, 1989), основной фибробластный фактор роста (bFGF) (Brunner et al. 1993) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) (Banks et al. 1998) [14-16].
Несмотря на многолетние вдохновляющие результаты применения ОТПК в челюстно-лицевой хирургии, травматологии, стоматологии, косметологии, трихологии и других областях медицины, попытки использования этой методики в гинекологии и репродуктологии появились совсем недавно[13, 18, 19].
Так, в 2015 году Chang и соавторы представили данные об эффективности внутриматочной перфузии для стимуляции роста эндометрия у 5 пациенток, перенесших отмену переноса эмбрионов ввиду резистентного «тонкого» эндометрия. После лечения у всех пациенток отмечен адекватный рост эндометрия и зарегистрировано наступление клинической беременности[20].
Известно исследование Nazari и соавторов, в котором 18 женщин с ПНИ перенесли внутриматочную перфузию 0,5 мл ОТПК за 48 часов до переноса эмбрионов. У 16 женщин наступила клиническая беременность, 1 беременность перестала развиваться на раннем сроке [21].
Данное техническое решение проблемы, как наиболее близкое к заявленному по техническому существу и достигаемому результату, принято в качестве его прототипа.
Недостатком данного метода является недостаточность экспрессии факторов роста в эндометрии у пациенток с ПНИ, что снижает эффективности вспомогательных репродуктивных технологий.
Задачей изобретения является повышение экспрессии факторов роста в эндометрии у пациенток с ПНИ и повышение, тем самым, эффективности вспомогательной репродуктивной технологии в целом.
Сущность заявленного технического решения выражается в следующей совокупности существенных признаков..
Согласно изобретения способ повышения эффективности вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с повторными неэффективными попытками имплантации, включающий использование препаратов, включающих фактор роста, характеризуется тем, что в качестве препарата, включающего фактор роста используют аутологичную обогащенную тромбоцитами плазму крови, при этом подготовку эндометрия пациентки проводят по стандартизованному протоколу заместительной гормональной терапии на фоне мониторинга роста эндометрия, с 3/4 дня цикла назначают эстрадиолавалерат 2 мг 2 раза в день и трансдермальную форму эстрадиола в стартовой дозе 1,25 г 2 раза в день а в качестве поддержки лютеиновой фазы используют микронизированный прогестерон вагинально в суточной дозе 90 мг и масляный раствор прогестерона 1% - 1 мл внутримышечно один раз в день, причем перенос жизнеспособных эмбрионов производят на 6 сутки назначения прогестерона, а на 10/11 день цикла после ультразвуковой оценки толщины эндометрия проводят внутриматочную перфузию 1,0-1,5 мл аутологичной плазмы крови, обогащенной тромбоцитами, с помощью инсеминационного катетера.
Кроме того, дополнительно дозу трансдермальной формы эстрадиола увеличивают до 2,5 г 2 раза в день,
Заявленная совокупность существенных признаков обеспечивает достижение технического результата, который заключается в том, что внутриматочная перфузия ОТПК повышает экспрессию факторов роста в эндометрии, что приводит к повышению толщины эндометрия и повышению
вероятности успешного результата вспомогательной репродуктивной технологии.
Сущность заявляемого технического решения поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлен график размаха показателей толщины эндометрия на 10 день цикла (а - до проведения внутриматочной перфузии, 6 - в день переноса эмбрионов (после проведения внутриматочной перфузии), на фиг. 2 - результативность переноса эмбрионов в группах исследования и контроля.
2
Для подтверждения применимости и эффективности заявленного способа было проведено открытое проспективное рандомизированное пилотное исследование для оценки влияния внутриматочной перфузии аутологичной плазмы, обогащенной тромбоцитами, на эффективность переноса размороженных эмбрионов. После проведения этико-правовой экспертизы в исследование было включено 90 пациенток, в возрасте от 20 до 39 лет. Критериями включения являлись: указание на 2 и более неэффективные попытки имплантации в программах переноса эмбрионов вне зависимости от фактора бесплодия; нормальный кариотип обоих супругов; качество перенесенных эмбрионов на 5 сутки развития - АА, АВ в классификации Д. Гарднера, 1999. Были определены следующие критерии исключения: индекс массы тела - 30 кг/м и более; наличие маточного фактора: - аномалии развития половых органов и состояния после их коррекции; «тонкий эндометрий» - толщина эндометрия в день переноса эмбрионов менее 7 мм; верифицированные в предыдущих беременностях хромосомные аномалии плода.
Формирование двух групп сравнения проводилось на основании блоковой рандомизации с рандомным размером блоков: группа исследования: N=45; группа контроля: N=45.
Подготовка эндометрия всех пациенток проводилась по стандартизованному протоколу заместительной гормональной терапии на фоне мониторинга роста эндометрия. С 3/4 дня цикла назначение эстрадиолавалерат 2 мг 2 раза в день итрансдермальная форма эстрадиола в стартовой дозе 1,25 г 2 раза в день с последующим возможным увеличением до 2,5 г 2 раза в день. В качестве поддержки лютеиновой фазы использовался микронизированный прогестерон вагинально в суточной дозе 90 мг и масляный раствор прогестерона 1%-1 мл внутримышечно один раз в день. Перенос жизнеспособных эмбрионов хорошего качества производился на 6 сутки назначения прогестерона. В группе исследования на 10/11 день цикла после ультразвуковой оценки толщины эндометрия проводилась внутриматочная перфузия 1,0-1,5 мл аутологичной плазмы крови, обогащенной тромбоцитами, с помощью инсеминационного катетера. Приготовление обогащенной тромбоцитами плазмы крови выполнялось по унифицированной методике с использованием лицензированного оборудования (пробирки и центрифуга) «PlasmoliftingTM». Пробирки Plasmolifting™ содержат антикоагулянт (гепарин натрия) и специализированный сепарационный гель, посредством которого тромбоциты при центрифугировании отделяются от других компонентов крови (патент №2494788). В группе контроля внутриматочных вмешательств не проводилось. Ультразвуковая оценка толщины эндометрия в динамике выполнялась на 10/11 день менструального цикла и в день планируемого переноса эмбрионов. Первичные оцениваемые показатели: толщина эндометрия, частота наступления клинической беременности (регистрация отчетливого сердцебиения по данным ультразвукового исследования), частота имплантации. Вторично оцениваемые показатели: самопроизвольное прерывание беременности при сроке до 12 недель беременности, безопасность, переносимость и воспроизводимость методики.
2
Для статистических сравнений использовали как параметрические, так и непараметрические критерии. Параметрические критерии: F - критерий Снедекора-Фишера и критерии Левина для проверки равенства дисперсий, t - критерий Стюдента - при равенстве дисперсий и критерий Уэлча - в случае статистически значимо различающихся дисперсий. Непараметрические критерии: Манна-Уитни (U), Муда (на основе статистики χ). Колмогорова-Смирнова (KS). Ориентировались на P-значения, полученные методом Монте-Карло.
В соответствии с современными рекомендациями сравнение данных основывали не только на Р-значениях, но и на 95%-х ДИ для разности сравниваемых средних значений и для отношения шансов. Для анализа счетных данных (локализация и VAPS) также использовалась программа StatXact-8.
Основные демографические, анамнестические и клинические характеристики пациенток обеих групп представлены в Таблице 1.
Обе группы были гомогенными по своей структуре. Данные анамнеза достоверно не отличались у женщин обеих клинических групп (p>0,05). Возраст пациенток варьировал от 24 до 39 лет и в среднем составил 35,4±0,5 лет в основной и 34,2±0,6 года в группе сравнения (U: р=0,74). Средний индекс массы тела обследованных женщин составил 21,60±2,44 и статистически не различался в группах исследования и контроля (р=0,97). При сопоставлении характеристик менструального цикла между пациентками обследованных групп статистически значимых отличий не было выявлено. Продолжительность бесплодия варьировала от 1,0 до 16 лет, в среднем составила 7,45±0,54 лет. Первичное бесплодие отмечено у 43 из 90 (47,8%), вторичное - у 47 пациенток (52,2%). Среднее количество проведенных циклов ВРТ составило 4,26±1,25 (3;9). Среднее количество эмбрионов на перенос достоверно не отличалось (1,50 vs 1,53). Из анамнеза средние значения суммарной дозы рекомбинантных гонадотропинов, количества полученных ооцитов, доли ооцитов на стадии метафазы II, плотности оплодотворения, доли эмбрионов, достигших стадии развития бластоцисты, а также количество перенесенных эмбрионов не отличались в сравниваемых клинических группах. Осуществлялся перенос только морфологически качественных эмбрионов.
Для возможности оценки влияния внутриматочной перфузии аутологичной плазмой, обогащенной тромбоцитами, на толщину эндометрия, проведен анализ данных ультразвукого исследования на 10 день цикла - до применения предложенной методики-, и в день переноса. На 10 день цикла средняя толщина эндометрия в группах исследования и контроля составила 7,73±0,86 и 7,71±0,81 см, соответственно. Статистически значимых различий не получено (χ2=0,669, р=0,86). В день проведения эмбриотрансфера средняя толщина эндометрия в группе исследования составила 11,18±01,40, в то время как в группе контроля - 9,31±0,80. Таким образом, в группе исследования отмечена достоверно большая толщина эндометрия в день проведения эмбриотрансфера в сравнении с группой контроля (χ2=47,78; р<0,001). По результатам анализа отношения шансов можно утверждать, что исследуемая методика влияет на показатель М-эхо (OR=2.91, 95% CI 1.37-7.21; р<0,05). Графическое отображение изменения толщины эндометрия представлено на фиг. 1
Проведена статистическая обработка исходов лечения бесплодия. Достоверно более высокая частота наступления клинической беременности отмечена в группе исследования (53,3% vs 26,6%) (χ2=6,667, OR=3.14, 95% CI 1.30-7,59, p<0,01). Частота имплантации в группе исследования составила 40,5%, что также превосходит данный показатель в группе контроля - 20,9% (OR - 2.58, 95% CI 1.20-5.52, р<0,05). В отношении частоты прерывания беременности в сроке до 12 недель при межгрупповом анализе статистически значимых различий не получено (χ2 с поправкой Йейтса = 0,225, OR=1,0, 95% CI 0,15-6,42, р>0,05). Результативность программы переноса размороженных эмбрионов в группах исследования и контроля представлены на фиг. 2.
Основными достоинствами заявленного способа являются доступность, переносимость и минимальная инвазивность. При применении аутологичной ОТПК невозможно спровоцировать иммунную реакцию у пациентки, что определяет высокую степень безопасности метода. Внутриматочная перфузия ОТПК является безопасным, легко переносимым и воспроизводимым методом
У пациенток с ПНИ целесообразно назначение внутриматочной перфузии аутологичной плазмой крови, обогащенной тромбоцитами, в заявленной последовательности операций, что гарантирует повышение эффективности переноса размороженных эмбрионов и успешность репродуктивных действий.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. European IVF-Monitoring Consortium (EIM) for the European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE) et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2012: results generated from European registers by ESHRE // Hum. Reprod. 2016. Vol. 31, №8. P. 1638-1652.
2. Farquhar C. et al. Twenty years of Cochrane reviews in menstrual disorders and subfertility // Hum. Reprod. 2013. Vol. 28, №11. P. 2883-2892.
3. Thornhill A.R. et al. ESHRE PGD Consortium "Best practice guidelines for clinical preimplantation genetic diagnosis (PGD) and preimplantation genetic screening (PGS)". // Hum. Reprod. 2005. Vol. 20, №1. P. 35-48.
4. Simon A., Laufer N. Repeated implantation failure: clinical approach. // Fertil. Steril. 2012. Vol. 97, №5. P. 1039-1043.
5. Rinehart J. Recurrent implantation failure: definition. // J. Assist. Reprod. Genet. 2007. Vol. 24, №7. P. 284-287.
6. Margalioth E.J. et al. Investigation and treatment of repeated implantation failure following IVF-ET. // Hum. Reprod. 2006. Vol.21, №12. P. 3036-3043.
7. Potdar N., Gelbaya Т., Nardo L.G. Endometrial injury to overcome recurrent embryo implantation failure: a systematic review and meta-analysis. // Reprod. Biomed. Online. 2012. Vol. 25, №6. P. 561-571.
8. Farimani M, Bahmanzadeh M., Poorolajal J. A New Approach Using Autologous Platelet-Rich Plasma (PRP) to Treat Infertility and To Improve Population Replacement Rate. // J. Res. Health Sci. 2016. Vol. 16, №3. P. 172-173.
9. da Silva R.T., Heidrich F. Therapy with Use of Platelet-Rich Plasma in Orthopedics and Sports Traumatology: Literature Review, Evidence and Personal Experience. Springer Berlin Heidelberg, 2014. P. 153-170.
10. Perez A.G.M. et al. Challenges and a Feasible Strategy for Studies and Standardization of Platelet-Rich Plasma. 2014. P. 119-138.
11. Cancela A.M. et al. Use of Platelet-Rich Plasma (PRP) in Treating Chronic Wounds. 2014. P. 281-288.
12. Platelet-Rich Plasma / ed. Lana J.F.S.D. et al. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, 2014.
13. Noronha J.C. Platelet-Rich Plasma: Clinical Experience. 2014. P. 203-213.
14. Rodrigues A.A. et al. Platelet-Rich Plasma and Tissue Engineering. 2014. P. 139-151.
15. Lana J.F. et al. Platelet Rich Plasma and Its Growth Factors: The State of the Art. 2014. P. 1-59.
16. Textor J. Platelet-Rich Plasma (PRP) as a Therapeutic Agent: Platelet Biology, Growth Factors and a Review of the Literature. 2014. P. 61-94.
17. Marx R.E. Platelet-rich plasma (PRP): what is PRP and what is not PRP? // Implant Dent. 2001. Vol. 10, №4. P. 225-228.
18. Weglein A., Sampson S., Aufiero D. Platelet Rich Plasma Practical Use in Non-Surgical Musculoskeletal Pathology. 2014. P. 187-201.
19. da Silva R.T., Heidrich F. Therapy with Use of Platelet-Rich Plasma in Orthopedics and Sports Traumatology: Literature Review, Evidence and Personal Experience. 2014. P. 153-170.
20. Chang Y. et al. Autologous platelet-rich plasma promotes endometrial growth and improves pregnancy outcome during in vitro fertilization. // Int. J. Clin. Exp. Med. 2015. Vol. 8, №1. P. 1286-1290.
21. Nazari L. et al. Effects of autologous platelet-rich plasma on implantation and pregnancy in repeated implantation failure: A pilot study. // Int. J. Reprod. Biomed. (Yazd, Iran). 2016. Vol. 14, №10. P. 625-628.
22. Reghini M.F.S. et al. Inflammatory response in chronic degenerative endometritis mares treated with platelet-rich plasma. // Theriogenology. 2016. Vol. 86, №2. P. 516-522.