Проба Кумбса, исследование на ретровирусы и гемобартонеллёз при анемии у кошек

ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ

Проба Кумбса, исследование на ретровирусы и гемобартонеллёз при анемии у кошек

Цель: исследовать связь между результатами пробы Кумбса, исследования на гемобартонеллёз и ретровирусные инфекции и анемией у кошек.

Методы: для клинического анализа крови, пробы Кумбса (включая оценку постоянной аутоагглютинации и исследование на избранные инфекционные болезни: гемобартонеллёз, вирусный лейкоз/иммунодефицит кошек) брали образцы крови, полученные от 60 анемичных кошек и 60 кошек без анемии.

Результаты: связь между инфекцией или положительной пробой Кумбса и анемией не обнаружена. У кошек с анемией значительно чаще встречалась аутоагглютинация при низкой температуре (Р < 0,0001), чем у кошек без анемии (21,7 и 0 %), но статистическая значимость, принятая за < 0,0025, при сравнении животных с анемией (40,4 и 21,7 % положительных при 4 °С и 37 °С соответственно) и без анемии (20 и 3,3 % положительных при 4 °С и 37 °С соответственно, Р = 0,021 и Р = 0,004) не была достигнута. У кошек с иммуноопосредованной гемолитической анемией вероятность постоянной холодной агглютинации была значительно выше (Р < 0,0001), как и вероятность положительной пробы Кумбса при 37 °С с поливалентной сывороткой (Р < 0,0001), иммуноглобулином (1д) G (Р < 0,00001) или любой антисывороткой (Р < 0,0001). Гемо-бартонеллёз и ретровирусные инфекции обнаруживались редко.

Клиническая значимость: кошек с подозрением на иммуноопосредо-ванную гемолитическую анемию необходимо исследовать на постоянную гемагглютинацию при 4 С, а также сделать пробу Кумбса при 37 °С, однако положительные результаты возможны и при других формах анемии. Параллельно с проверкой на наличие гемолиза у кошек с анемией следует всегда определять эритроцитарные антитела.

S. Tasker, J.K. Murray, T.G. Knowles and M.J. Day

Journal of Small Animal Practice (2010) 51, 192-199 DOI: 10.1111/j.1748-5827.2009.00869.x

ВВЕДЕНИЕ

Анемия кошек часто встречается в клинической практике и может иметь много разных причин (Weingart and others 2004). Одной из причин является гемолиз в результате связывания антител и/или комплемента с поверхностью эритроцитов (Switzer and Jain 1981). У кошек такой иммуноопосредованный гемолиз (ИОГ) часто развивается вторично в результате какого-либо заболе-

вания, например гемобартонеллёза, вирусного лейкоза, вирусного иммунодефицита, инфекционного перитонита, новообразований (например, лимфопролиферативных или миелопролиферативных), применения лекарств, например пропилтио-урацила или метимазола, системной красной волчанки, гломерулонеф-рита, изоэритроза новорождённых или переливания несовместимой крови (Scott and others 1973, Peterson and others 1984, Werner and Gor-

man 1984, Zulty and Kociba 1990, Day 1996, Person and others 1997, Bucheler 1999, GunnMoore and others 1999, Piek and others 2003, Weingart and others 2004, Lenard and others 2007, Tasker and others 2009).

Однако анемия у кошек с инфекционными заболеваниями не обязательно имеет иммуноопосредован-ную природу, поскольку при гемо-бартонеллёзе анемия не всегда сопровождается аутоагглютинацией или положительной пробой Кумбса (Willi and others 2006a), тогда как у кошек с вирусным лейкозом возможна апластическая анемия, чистая аплазия эритроцитарного ростка или миелодиспластический синдром (Hisasue and others 2000, 2001, Weiss 2006a,b). Природа анемии при вирусном иммунодефиците изучена хуже, однако анемия часто сопровождает это заболевание (Arjona and others 2000, Fujino and others 2009).

Ранее считалось, что первичная ИОА, когда лежащая в основе этиология не определена, редка у кошек (по сравнению с собаками), однако недавние публикации заставляют предположить обратное (Husbands and others 2002, Kohn and others 2006). Диагноз ИОА обычно основывается на обнаружении аутоагглютинации вследствие связанных с поверхностью эритроцитов антител или комплемента в пробе Кумбса, хотя бы частично (Wardrop

2005), в то время как описаны случаи ложноотрицательных и ложноположительных результатов пробы Кумбса при ИОА (Honeckman and others 1996, Wardrop 2005, Morley and others 2008). Сохраняющаяся аутоагглютинация эритроцитов после промывания физиологическим раствором с фосфатным буфером, которая обычно предшествует полной пробе Кумбса, также указывает на присутствие антител, связанных с поверхностью

эритроцитов (Warman and others 2008), и используется как дополнительный критерий диагностики ИОА как у кошек (Kohn and others

2006), так и у собак (Klag and others 1993, Burgess and others 2000, Wilkerson and others 2000, Grundy and Barton 2001, Carr and others

2002, Mason and others 2003, Warman and others 2008). Сохраняющаяся аутоагглютинация после промывки является более точной формой исследования агглютинации в физиологическом растворе, широко применяющемся на практике для дифференциации истинной аутоагглютинации и формирования эритроцитарных столбиков.

Критерии диагноза ИОА, описанные в литературе, варьируют, но обычно включают множественные факторы, например анемию, положительную пробу Кумбса, аутоагглютинацию, регенеративную анемию и/или признаки гемолиза (Slap-pendel 1979, Klag and others 1993, Reimer and others 1999, Burgess and others 2000, Wilkerson and others 2000, Grundy and Barton 2001, Carr and others 2002, Mason and others

2003, Weinkle and others 2005, Overmann and others 2007, Warman and others 2008). ИОА у кошек исследована недостаточно. В одном исследовании (Kohn and others 2006) для подтверждения диагноза ИОА использовали положительную пробу Кумбса или постоянную аутоагглютинацию эритроцитов. Исследованиям на собаках и кошках препятствует отсутствие метода диагностики, который можно использовать в качестве «золотого стандарта» (Morley and others 2008). Лишь в одном предыдущем перспективном исследовании специально оценивались результаты пробы Кумбса у кошек (Dunn and others 1984), однако природа антител, связанных с эритроцитами, у 40 кошек определена лишь частично в связи с использованием ограниченного количества реактивов Кумбса. В более позднем исследовании (Kohn and others 2006) пробу Кумбса проводили с набором реактивов, но на небольшой выборке кошек без анемии (14). Целью настоящего перспектив-

ного исследования было проведение полной пробы Кумбса и оценка постоянной аутоагглютинации у большой группы животных с анемией и без. Связь между анемией, положительной пробой Кумбса, постоянной аутоагглютинацией, ретровирусной инфекцией и гемобортонел-лёзом исследовали на 60 кошках с анемией и 60 без анемии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клинический анализ крови

Для исследования брали кровь кошек с ЭДТА, доставленную в лабораторию для клинического анализа. Каждый образец исследовали на автоматическом анализаторе Cell Dyn 3700 (Эбботт, Иллинойс, США). Для подсчёта лейкоцитарной формулы и оценки морфологии эритроцитов, в том числе наличия сфероцитов, готовили мазки крови и окрашивали их по Райту. Кроме того, по мазку проверяли результат автоматического подсчёта тромбоцитов, если последний был низким (количество тромбоцитов обозначали как низкое, нормальное и высокое). Пробы крови отбирали у 60 кошек с анемией (которую определяли как концентрация гемоглобина [Hb] < 8 г/дл; нормальный диапазон 8-15 г/дл) и 60 кошек без анемии (Hb > 8 г/дл). Для кошек моложе года анемию определяли как концентрацию Hb < 6 г/дл в соответствии с опубликованными стандартными значениями для котят (Jacobs and others 2000).

Проба Кумбса

Пробу Кумбса проводили через

24 часа после сбора образцов крови. Кровь с ЭДТА суспендировали в избытке холодного фосфатно-солевого буфера (10х) рН 7,4, 0,1 М) и центрифугировали (3500 об/мин.,

3 мин.). Надосадочную жидкость и лейкоцитарную плёнку удаляли, а затем снова суспендировали эритро-цитарный осадок в фосфатно-солевом буфере и центрифугировали. Эритроциты трижды промывали холодным фосфатно-солевым буфером (4 °С). Затем готовили 2,5 % суспензию осадка промытых эритроцитов

в фосфатно-солевом буфере. Приготовляли серийные разведения (от 1:5 до 1:10 240) поливалентного кошачьего реактива Кумбса в фосфатно-солевом буфере (АйСиЭн Флоу, Бейзингсток, Великобритания), ан-тикошачьего иммуноглобулина G Fc, антикошачьего IgM Fc и антико-шачьего IgA Fc (Нордик Лаборато-риз, Тилберг, Нидерланды) (объём

25 мкл в микропланшетах с круглодонными лунками). Антитела против кошачьего комплемента C3b для данного исследования достать не удалось, поскольку европейские поставщики, у которых он закупался ранее (Kohn and others 2006), перестали производить этот продукт. В четыре лунки планшета вносили только фосфатно-солевой буфер и использовали в качестве отрицательного контроля. В каждую лунку вносили 25 мкл 2,5 % суспензии эритроцитов и перемешивали её, постукивая планшетом по столу. Два планшета инкубировали в течение часа при 4 °C или 37 °C. Планшеты рассматривали на наличие агглютинации и записывали титр, термическую активность и класс антител. Если агглютинация присутствовала в контрольных лунках с буфером, результаты пробы Кумбса считали не подлежащими интерпретации при данной температуре вследствие аутоагглютинации.

Породные, половые, возрастные характеристики и клинические данные

Копии историй болезни каждой кошки получали у лечащего ветеринарного врача. Записывали возраст, породу и пол, а также окончательный диагноз, если последний был установлен достоверно. Для постановки диагноза ИОА требовалось (1) наличие анемии, определённой по концентрации гемоглобина, (2) признаки гемолиза (гемо-глобинемия или гемоглобинурия при отсутствии холестаза), (3) отсутствие прочих причин разрушения эритроцитов или кровопоте-ри и, при наличии, (4) доказательство отклика на терапию иммуносупрессорами. Если недостаток информации в истории болезни не

позволял поставить окончательный диагноз, этот случай классифицировали как неустановленный. Каждый случай, в котором удавалось поставить окончательный диагноз, относили в одну из следующих категорий, примерно как было описано ранее (Morey and others 2008): новообразования, желудочно-кишечные заболевания, панкреатит, инфекционные заболевания, неопухолевые заболевания костного мозга, ИОА, прочие внутренние незаразные заболевания и хирургические заболевания. ИОА классифицировали как первичную при отсутствии лежащих в основе причин (ретровирусная инфекция или гемобартонеллёз, прочие инфекции, новообразования, переливание крови в прошлом, введение препаратов, способных вызывать ИОА, и др.), для исключения которых животных тщательно исследовали, как описывалось ранее (Kohn and others 2006). Если удавалось определить первопричину, ИОА классифицировали как вторичную.

Исследование на гемобартонеллёз и ретровирусные инфекции

Оставшуюся кровь с ЭДТА (не менее 0,1 мл) хранили при температуре -20 °С. ДНК экстрагировали с помощью готовых имеющихся в продаже наборов (DNeasy, Кай-аген, Кроули, Великобритания) и ставили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) на все три вида гемо-бартонелл кошек: Mycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma haemominutum и Candidatus Mycoplasma turicensis, как описано ранее (Peters and others 2008). Кроме того, образцы исследовали на провирусы лейкоза и иммунодефицита методом ПЦР (Pinches and others 2006). Кроме того, все образцы исследовали с помощью набора для ПЦР на наличие кошачьей рДНК 28S в качестве внутреннего контроля (Pinches and others 2006) для подтверждения наличия доступной для амплификации ДНК в образцах. Также включали соответствующие положительные (от кошек с диагностированной ин-

фекцией) и отрицательные (от здоровых кошек) контроли на каждого возбудителя, как при экстракции ДНК, так и при циклах ПЦР для выявления каких-либо проблем при экстракции/ПЦР или контаминации.

Статистический анализ

Данные вводили в базу данных (Excel 2002, Microsoft Ltd, Рединг, Великобритания) и экспортировали в статистическую программу (Статистический пакет для социологии, Уокинг, Великобритания). Анализировали описательные данные о результатах пробы Кумбса и диагнозах у всех 120 кошек, участвовавших в исследовании. Для сравнения категорийных переменных использовали метод хи-квадрата, при необходимости, с точной статистикой. Сравнивали данные о постоянной аутоагглютинации, результатах пробы Кумбса, наличии гемобарто-неллёза, вирусного лейкоза или иммунодефицита у кошек с анемией и без. Изучали связь между положительной пробой Кумбса при разных температурах и/или постоянной аутоагглютинацией. Сравнивали категории заболеваний, наличие возбудителей гемобартонеллёза, вирусного лейкоза и иммунодефицита у кошек с постоянной аутоагглютинацией и без, а также у кошек с положительной и отрицательной пробой Кумбса.

При анализе результатов пробы Кумбса при 4 °С кошек с сохраняющейся при 4 °С аутоагглютинацией исключали из анализа, поскольку в этих случаях нельзя было подтвердить специфичность реактива. При анализе результатов пробы Кумбса учитывали положительный результат при любом титре при 4 и 37 °C, только при 4 °C и только при 37 °C, каждый с любой антисывороткой. Титры от 160 и выше оценивали отдельно. Для учёта многократных анализов вводили поправку Бонфер-рони. Статистическая значимость была P < 0,0025 при сравнении животных с анемией и без и P < 0,0009 при сравнении животных с постоянной аутоагглютинацией при 4 °C и без, а также с положительным и

отрицательным результатом пробы Кумбса.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Категории болезни, результаты пробы Кумбса, результаты исследования на гемобартонеллёз и ретровирусные инфекции

У 14 из 120 животных (11,7 %) диагноз не был установлен, а в одном случае ко времени забора крови животное было признано клинически здоровым. Количество случаев в каждой категории болезни между группами животных с анемией и без показано в табл. 1. Из 120 кошек у 13 (10,8 %) была постоянная аутоагглютинация в контрольных лунках с буфером при 4 °C, что препятствовало определению титров в пробе Кумбса при 4 °С из-за аутоагглютинации во всех лунках с опытными пробами. Аутоагглютинации в контрольных лунках с буфером при 37 °C не было ни у одной кошки. В пробе Кумбса с поливалентной сывороткой при 4 °C у 96 кошек (80 %) был получен отрицательный результат, а у 11 кошек (9,2 %) - положительный с титрами

10 (n = 4), 20 (n = 3), 160 (n = 2) и 320 (n = 2). С антисывороткой к IgG при 4 °С у 103 кошек (85,8 %) получены отрицательные результаты, а у 4 кошек (3,34 %) - положительные при титрах 640 (n = 2), 1280 (n = 1) и 2560 (n = 1). С антисывороткой к IgM при 4 °С у 79 кошек (65,8 %) получены отрицательные результаты, тогда как у 28 (23,3 %) - положительные при титрах 10 (n = 7), 20 (n = 12), 40 (n = 3), 80 (n = 4), 320 (n = 1) и 5120 (n = 1). Антисыворотка к IgA использовалась для пробы Кумбса только в 99 случаях, когда объём сыворотки крови был достаточным. С антисывороткой IgA при 4 °С у 84 кошек (84,8 %) получены отрицательные результаты, а у 7 (7,07 %) - положительные с титрами 10 (n = 4), 20 (n = 2) и 40 (n = 1). У 8 кошек не удалось определить титры IgA из-за агглютинации в контрольных лунках с буфером.

В пробе Кумбса с поливалентной антисывороткой при 37 °С у

Таблица 1. Категории болезней в соответствии с наличием или отсутствием анемии

Категория болезни Число животных в категории

Различные терапевтические болезни 42 из 120

Инфекционные болезни 13 из 120

Новообразования 11 из 120

ИГА 11 из 120

Желудочно-кишечные заболевания 8 из 120

Панкреатит 7 из 120

Хирургические заболевания 7 из 120

Неопухолевые заболевания костного мозга 6 из 120

Диагноз не установлен 14 из 120

Клинически здоровые 1 из 120

105 кошек (87,5 %) был получен отрицательный результат, а у 15 (12,5 %) - положительный при титрах 5 (п = 1), 10 (п = 1), 20 (п = 2), 40 (п = 4), 80 (п = 4), 160 (п = 2) и 320 (п = 1). С антисывороткой к IgG при 37 °С у 106 кошек (88,3 %) получены отрицательные результаты, а у 14 (11,6 %) - положительные при титрах 20 (п = 2), 80 (п = 2), 160 (п = 2), 320 (п = 2), 640 (п = 1) и 1280 (п = 3).

С антисывороткой к ^М при 37 °С у 119 кошек (99,2 %) получены отрицательные результаты и только у 1 кошки (0,8 %) - положительный (титр 160). Ни у одной кошки из 99, исследованной с антисывороткой к ^А при 37 °С, не получено положительного результата.

Все 120 образцов исследовали методом ПЦР на гемобартонеллёз и ретровирусные инфекции. Амплификация внутреннего контроля, рДНК 288, была успешной во всех 120 образцах; 13 образцов дали положительную реакцию на Candi-datus M. haemominutum, но отрицательную на M. haemofelis или Candidatus M. turicensis. Два образца были положительными на провирус иммунодефицита кошек, а восемь - на провирус лейкоза.

Сравнение животных с анемией и без

При сравнении животных с анемией и без не было обнаружено значительных различий в породном (77,6 % беспородных + 22,4 % по-

родистых кошек и 58,6 % беспородных + 41,4 % породистых), половом (56,1 % котов + 43,9 % кошек и 35,1 % котов + 64,9 % кошек) или возрастном составе (медиана [пределы] 5 [0,3-17] лет и 6 [0,2-16] лет) (полные данные не показаны). Медиана [диапазон] НЬ была 4,9 [1,5-7,8] г/л в группе кошек с анемией и 11,5 [8-15] г/дл в группе без анемии. Обнаружено значительное различие в частоте постоянной аутоагглютинации при 4 °С между кошками с анемией (13 из 60; 21,7 % положительных) и без анемии (0 из 60 положительных) (Р < 0,0001). В таблице 2 представлен анализ сравнительных результатов пробы Кумбса у животных с анемией и без, когда любая аг-

Таблица 2. Сравнение результатов пробы Кумбса у животных с анемией и без

Положительный результат пробы Кумбса* Кошки с анемией** Кошки без анемии Значение Р***

С любой антисывороткой при 4 °С и/или 37 °С 19 из 47 (40,4 %) 12 из 60 (20 %) 0,021

С любой антисывороткой только при 4 °С 19 из 47 (40,4 %) 12 из 60 (20 %) 0,021

С любой антисывороткой только при 37 °С 13 из 60 (21,7 %) 2 из 60 (3.3 %) 0,004

С поливалентной антисывороткой только при 4 °С 9 из 47 (19,1 %) 2 из 60 (3,3 %) 0,010

С антисывороткой к 1дС только при 4 °С 2 из 47 (4,3 %) 2 из 60 (3,3 %) 0,100

С антисывороткой к 1дМ только при 4 °С 17 из 47 (36,2 %) 11 из 60 (18,3 %) 0,037

С антисывороткой к 1дА только при 4 °С 4 из 32 (12,5 %) 3 из 59 (5,1 %) 0,236

С поливалентной антисывороткой только при 37 °С 13 из 60 (21,7 %) 2 из 60 (3,3 %) 0,004

С антисывороткой к 1дС только при 37 °С 12 из 60 (20 %) 2 из 60 (3,3 %) 0,008

С антисывороткой к 1дМ только при 37 °С 1 из 60 (1,7 %) 0 из 60 (0 %) 0,100

С антисывороткой к 1дА только при 37 °С 0 из 40

*При этих анализах положительным результатом считали агглютинацию при любом титре.

** В анализ результатов пробы Кумбса при 4 °С было включено только 47 кошек в связи с исключением 13 животных из-за постоянной аутоагглютинации при данной температуре. В анализ результатов при 37 °С включены все 60 кошек. Антисыворотка IgA antiserum использовалась не при всех пробах Кумбса в связи с недостаточным объёмом проб.

*** Значения Р для сравнения кошек. Только Р « 0,0025 можно считать значимыми в связи с коррекцией критического значения Р для отражения множественных сравнений, поэтому значительного различия при эти анализах не обнаружено.

Значение Р не удалось вычислить для антисыворотки IgA при 37 °C, так как ни в одной группе не было положительной реакции.

глютинация при любом титре рассматривалась как положительная. У кошек с анемией обнаружена тенденция к положительной пробе Кумбса при 37 °С (Р = 0,004) и положительная реакция с поливалентной антисывороткой при 37 °С (Р = 0,004), однако результаты не были статистически значимыми. Увеличение порога, если положительным считать титр 160 и выше, увеличивало значение Р (данные не показаны) для каждой реакции.

Из 13 проб с положительным результатом исследования на Candi-datus M. Haemominutum 10 были получены от кошек без анемии, а

3 - от анемичных кошек, при этом значительного различия между группами не выявлено (Р = 0,075). Пороговое число циклов ПЦР в реальном времени у кошек с инфекцией Candidatus M. haemominu-tum и анемией статистически не отличались от такового у кошек без анемии (среднее ± СО: 32,6 ±4,1 по сравнению с 27,9 ± 4,6, данные не показаны). В двух образцах был обнаружен провирус иммунодефицита кошек, один из которых был от анемичной кошки, а второй - от кошки без анемии. Из восьми образцов с положительной реакцией на провирус лейкоза кошек два были получены от анемичных животных, а шесть - от животных без анемии, без значительных различий между двумя группами (Р = 0,0272). Пороговое число циклов ПЦР в реальном времени при анализе на провирус лейкоза кошек у анемичных и нормальных животных значительно не отличалось (25,7 ± 10,8 и 31,9 ± 7,5, данные не показаны).

Дальнейшее описание кошек с диагнозом

иммуноопосредованной гемолитической анемии

ИГА была диагностирована у

11 кошек. Возраст (медиана [диапазон] этих животных был 2,5 (0,5-14) лет (данные по п = 10). Семь животных (63,6 %) были котами (4 кастрированные) и 3 (27,3 %) - кошками (две кастрированные), а в одном случае пол не указан. Восемь

кошек (72,7 %) были беспородными, 1 (9,1 %) была британской короткошёрстной, а в одном случае порода была не указана. У 9 кошек была первичная ИГА, а у 2 - вторичная вследствие инфекции Candida-tus M. haemominutum и сопутствующего новообразования ЖКТ. У всех кошек с ИГА реакция при

4 °С была положительной: у 9 наблюдалась постоянная аутоагглютинация, а в 2 случаях зарегистрирована положительная проба Кумбса с поливалентной антисывороткой (титры 20 или 160), антисывороткой к ^М (титры 20 или 40) и IgG (титр 640, только 1 кошка). Положительная проба Кумбса при 37 °С была у 9 из 12 кошек с ИГА с поливалентной антисывороткой (титры 20 -2 кошки, 40- 3, 80 - 2 и 160- 2 кошки), с антисывороткой к IgG (титры 80 - 2 кошки, 160 - 2, 320 - 3 и 1280 -1 кошка) и антисывороткой к ^М (титр 160, только 1 кошка).

Связь между положительной пробой Кумбса при разных температурах и постоянной аутоагглютинацией

У кошек с постоянно наблюдавшейся агглютинацией при 4 °С вероятность положительной пробы Кумбса была выше (с любой антисывороткой при любом титре) при 37 °С (9 из 13; 69,2 %), чем вероятность отрицательной (4 из 105;

3,8 %) (Р < 0,0001). Если пренебречь кошками с постоянной аутоагглютинацией при 4 °С, у животных с положительной пробой Кумбса при

4 °С вероятность положительной реакции при 37 °С была также выше (6 из 6; 100 %), чем отрицательной (25 из 101; 24,8 %) (Р < 0,0001).

Статистическая значимость всё ещё достигалась при учёте титров 160 и выше (данные не показаны).

Сравнение кошек с постоянной аутоагглютинацией и без

Между разными категориями болезней обнаружено значительное различие в числе кошек с постоянной аутоагглютинацией при 4 °С (Р < 0,0001) (табл. 3). Оценка вклада каждой болезни методом хи-квадрата показала, что за значимое раз-

личие ответственна категория ИГА (Р < 0,0001), при этом 9 из 11 кошек (81,8 %) с ИГА имели постоянную аутоагглютинацию при 4 °С.

Связи между постоянной аутоагглютинацией при 4 °С и результатами исследования на Candidatus M. haemomintum, провирусы лейкоза или иммунодефицита методом ПЦР не обнаружено (Р = 1,000).

Сравнение кошек с положительными и отрицательными результатами пробы Кумбса

Между разными категориями болезней было обнаружено значительное различие в числе кошек со следующими результатами пробы Кумбса при 37 °С: положительная реакция с любой антисывороткой при любом титре (Р < 0,0001), положительная реакция с любой антисывороткой при титре 160 и выше (Р < 0,0001), положительная реакция с поливалентной антисывороткой при любом титре (Р < 0,0001), положительная реакция с антисывороткой к IgG при любом титре (Р < 0,0001) и положительная реакция с антисывороткой к IgG при титре не менее 160 (Р < 0,0001) (табл. 3). Оценка вклада каждой из категорий болезней в результаты статистического анализа методом хи-квадрата также показала, что ИГА (табл. 3) была ответственна за значительное различие (Р < 0,0001) в каждом из этих случаев. Отмечена тенденция к значимому различию (Р = 0,002) между разными категориями болезней в числе кошек с положительными результатами пробы Кумбса с поливалентной антисывороткой при 4 °С при любом титре, но ни одно из сравнений других показателей реакции Кумбса и категорий болезней не дало значимых значений Р (0,008-0,476, данные не показаны).

Связи между положительной пробой Кумбса при любом титре или с титром от 160 и выше и положительным результатом ПЦР на Candidatus M. haemominutum, провирусы лейкоза и иммунодефицита не выявлено (Р - от 0,034 до 1,000).

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании представлено первое перспективное описание полной пробы Кумбса в большой группе кошек с анемией и без.

Только у кошек с анемией (13 из 60) отмечена постоянная аутоагглютинация эритроцитов при 4 °С, при этом была выявлена значимая связь между анемией и постоянной агглютинацией при низкой температуре. Обнаружение такой агглютинации проводится в рамках пробы Кумбса и указывается отдельно от реакций со специфическими антисыворотками (Dunn and others 1984, Kohn and others 2006). Аутоагглютинация при низкой температуре у этих 13 кошек препятствовала дальнейшему учёту результатов пробы Кумбса (со специфическими антисыворотками) при этой температуре, поэтому их пришлось исключить из статистического анализа результатов пробы Кумбса при 4 °С.

Вероятно, с этим была связана невозможность выявления значимой связи между анемией и положительными результатами пробы Кумбса при 4 °С и/или 37 °С в группах животных с анемией и без, так как кошки с постоянной аутоагглютинацией при низкой температуре были исключены и из этого анализа,

несмотря на положительную пробу Кумбса при 37 °С в некоторых случаях. Известно, что аутоагглютинация при низкой температуре указывает на присутствие агглютинирующих антител IgM, элюирующихся с поверхности эритроцитов при более высокой температуре, как было отмечено у 13 анемичных кошек в настоящем исследовании, поскольку при параллельном исследовании при 37 °С аутоагглютинация отсутствовала. Холодовые агглютинины, по определению, сильнее реагируют при 4 °С, чем при более высоких температурах (Gehrs and Friedberg 2002). Клиническое значение такой холодной агглютинации широко обсуждалось, так как это явление наблюдается in vitro, но не при физиологических температурах. Действительно, ни у одной из кошек в настоящем исследовании не было симптомов заболевания, обусловленного присутствием холодовых агглютининов (например, некроз кончиков ушей или хвоста), что ставит под вопрос их роль в патогенезе анемии.

У людей с болезнью холодовых агглютининов последние активны, по крайней мере, до температуры 30 °С (Rosse and Adams 1980, Gehrs and Friedberg 2002, Petz 2008). Хотя это не было частью данного исследова-

ния, интересно было бы провести более полное исследование термической реактивности кошачьих холодовых агглютининов. Однако недавнее исследование, в котором оценивались результаты пробы Кумбса при инфекции M. haemofelis у кошек (Tasker and others 2009), показало, что холодовые агглютинины у этих животных не были активны при комнатной температуре (18-20 °C), что позволяет предположить узкий температурный диапазон их активности. Возможно, такие холодовые агглютинины не играют роли в патогенезе, а возникают в результате развития анемии, вероятно, из-за изменений мембран эритроцитов при их повреждении или гемолизе. Хотя статистическая значимость не была достигнута из-за необходимости приведения к критическому значению Р для многократных анализов, среди кошек с анемией отмечена большая тенденция к положительной пробе Кумбса с любой антисывороткой и поливалентной антисывороткой (в обоих случаях P = 0,004) при 37 °C. Возможно, такие тепловые антитела или комплемент участвуют в патогенезе анемии, так как они активны при физиологических температурах.

Несмотря это, у некоторых кошек без анемии проба Кумбса так-

Табл. 3. Сравнение категорий болезней, показывающее значимое различие в постоянной аутоагглютинации и пробе Кумбса

Категории болезней Постоянная аутоагглютинация при 4 °С Проба Кумбса с любой антисывороткой при 37 °С/ поливалентной антисывороткой при 37 °С, любой титр Проба Кумбса с любой антисывороткой при 37 °С/ антисывороткой к 1дС при 37 °С, титры » 160 Проба Кумбса с антисывороткой к IgG при 37 °С, любой титр

Положит. Отриц. Положит. Отриц. Положит. Отриц. Положит. Отриц.

Разные терапевтические заболевания 0 42 0 42 0 42 0 42

Инфекционные заболевания 2 11 2 11 1 12 2 11

Новообразования 2 9 1 10 1 10 1 10

ИГА 9 2 9 2 6 5 8 3

Желудочно-кишечные заболевания 0 8 0 8 0 8 0 8

Панкреатит 0 7 2 5 2 5 2 5

Хирургические болезни 0 7 0 7 0 7 0 7

Неопухолевые заболевания костного мозга 0 6 0 6 0 6 0 6

ИГА - иммуноопосредованная гемолитическая анемия. Цифры указывают число кошек в каждой категории; для всех категорий реакции обнаружено значимое различие (все Р < 0,0001) в числе кошек в разных категориях болезни. Путём статистического анализа методом хи-квадрата было обнаружено, что за различия во всех случаях ответственна ИГА. Значимыми считали только значения Р « 0,0009, чтобы критическое значение Р отражало множественные сравнения.

же была положительной. В настоящем исследовании у 20 % кошек без анемии выявлена положительная проба Кумбса с любой антисывороткой при 4 °C; в большинстве случаев (у 10 животных из 12) это было обусловлено реакциями IgM (± IgA) в низких титрах (< 80), но у двух кошек выявлены реакции IgG (± поливалентная сыворотка) в высоких титрах. Только у двух (3,3 %) кошек без анемии проба Кумбса была положительной при 37 °C, и у этих животных отмечена реакция с поливалентной антисывороткой и анти-IgG в высоких титрах. Это были те же две кошки с реакциями при 4 °C в высоких титрах, и обеим из них диагностировали панкреатит (см. ниже). Значение положительной пробы Кумбса или присутствия постоянной аутоагглютинации без анемии неизвестно. Холо-довые агглютинины в низких титрах описаны у 20 % здоровых кошек без анемии в предыдущем исследовании (Dunn and others 1984). Однако в последней работе Kohn and others (2006) не найдено доказательств присутствия холодовых или тепловых агглютининов у

5 здоровых и 9 больных кошек без анемии. Значительное число кошек без анемии с положительной пробой Кумбса, иногда с высокими титрами, может быть обусловлено большим числом кошек без анемии в нашей выборке или отражать тот факт, что все, кроме одного из 60 животных без анемии, были больными, в отличие от других исследований, проводившихся на здоровых кошках. Также следует отметить, что представленные здесь данные относятся к реактивам и методикам, использующимся для пробы Кумбса в нашей лаборатории, и прямая экстраполяция результатов, полученных в других лабораториях, использующих другие реактивы и методики, может оказаться невозможной. Например, наша проба Кумбса может оказаться чувствительнее, поэтому число положительных реакций (или реакций при более высоких титрах) у животных без анемии будет больше. Хотя статистическую зависимость по-

казать не удалось, следует отметить, что у 5 из 7 кошек с панкреатитом в настоящем исследовании результат пробы Кумбса был положительным; у 3 были обнаружены низкие титры холодовых агглютининов (у 1 из этих кошек была анемия с Hb 5,98 г/дл), а 2 других были единственными кошками с тепловыми агглютининами в отсутствии анемии (в высоком титре и в сочетании с высоким титром холодовых агглютининов). О связи между панкреатитом и положительной пробой Кумбса у кошек ранее не сообщалось, и это требует дальнейшего изучения, хотя у животных с панкреатитом в настоящем исследовании не было признаков гемолиза. Связь панкреатита с гемолитической анемией была выявлена у человека (Druml and others 1991) и в экспериментах на грызунах (Saruc and others 2007), а также описана у собак с гемолизом вследствие бабе-зиоза (Mohr and others 2000).

Обнаружена взаимосвязь между анемией и результатами пробы Кумбса в том смысле, что у кошек с положительной пробой Кумбса при 37 °C была выше вероятность постоянной аутоагглютинации и положительной пробы Кумбса при 4 °C. ^hn and others (2006) сообщили, что у всех кошек с положительной пробой Кумбса в данном исследовании (все с диагнозом ИГА) она была положительной при 4 °C и при 37 °C. Хотя это можно интерпретировать как доказательство действенности пробы Кумбса только при одной температуре, мы обнаружили у ряда кошек положительную реакцию только при 4 °C, в том числе у 2 кошек с ИГА (одна с постоянной аутоагглютинацией и другая с положительной реакцией с антисывороткой к IgM). У обеих кошек были признаки гемолиза без признаков холестаза или кро-вопотери, и обе отвечали на лечение преднизолоном. Важно, что результаты недавнего исследования на 65 собаках с ИГА, в котором было всего 10 случаев положительной пробы Кумбса только при 4 °C (Warman and others 2008), позволяют предположить большое значение исследования при 4 °C при подозрении на

ИГА. В предыдущих работах по исследованию ИГА у кошек нет постоянного описания класса и титра антител, связанных с эритроцитами, и статистического анализа. В одной статье описывается наличие IgG, IgM или обеих молекул на поверхности эритроцитов 12 собак с ИГА (Werner and Gorman 1984), тогда как в другой работе показано присутствие IgG у кошек с первичной ИГА, хотя реактив с кошачьими IgM не использовался (Person and others 1997). Kohn and others (2006) сообщили, что у кошек с ИГА результат определения IgG или IgG в сочетании с IgM был чаще всего положительным, а положительный результат исследования только на IgM получен лишь в 1 случае из 18. В нашем исследовании у кошек с ИГА обнаружена большая вероятность аутоагглютинации при низкой температуре, кроме того, получены положительные результаты пробы Кумбса при 37 °С с любой ан-тивысороткой, с поливалентной антисывороткой или только IgG, что также подтверждает рекомендацию исследовать кровь на постоянную аутоагглютинацию при 4 °С, а также ставить пробу Кумбса при 37 °С при подозрении на ИГА.

Наше исследование - одно из первых, в котором определялось наличие связанных с эритроцитами IgA у кошек. Сообщалось, что связанные с эритроцитами IgA обнаруживаются у большинства собак с ИГА при анализе чувствительным ИФА-методом

или вторичной ИГА у кошек, однако ни один из этих методов не был информативным. В настоящем исследовании частота случаев ИГА была слишком низкой, чтобы определить корреляцию первичного или вторичного заболевания с какими-либо особенностями пробы Кумбса, описанную у собак (Warman and others 2008).

У одной из двух кошек с ИГА, развившейся вторично в результате основного заболевания, обнаружена инфекция Candidatus M. haemomin-utum. Этот микроорганизм считается слабо патогенным (Foley and Pedersen 2001) и обнаруживается у 20 % кошек в Великобритании (Tasker and others 2003). У этой кошки имелась постоянная аутоагглютинация и положительная проба Кумбса при 37 °С с поливалентными антисыворотками и IgG.

Исследования с экспериментальной инфекцией патогенным штаммом M. haemofelis показали связь между такими результатами пробы Кумбса (постоянная агглютинация при низкой температуре и тепловые реактивные антитела IgG), анемией и паразитемией при оценке методом количественной ПЦР, хотя такая связь не показана для Can-didatus M. haemominutum (Tasker and others 2009). Тем не менее инфекция Candidatus M. haemomi-nutum может быть связана с анемией (George and others 2002, De Lorimier and Messick 2004); в настоящем исследовании эти случаи поддавались соответствующему лечению ИГА вследствие гемобарто-неллёза. Таким образом, представляется благоразумным рекомендовать исследование на гемобартонел-лёз во всех случаях гемолитической анемии у кошек. Гемобартонеллёз и ретровирусные инфекции были обнаружены лишь у нескольких кошек, несмотря на использование чувствительной методики ПЦР и тот факт, что эти возбудители являются известной причиной анемии у кошек, в том числе ИГА (Piek and others 2003, Kohn and others 2006). Candidatus M. turicensis или M. haemofelis не обнаружены ни у одной кошки, несмотря на то, что

предыдущие работы подтверждают их встречаемость в Великобритании (Tasker and others 2003, Willi and others 2006b), хотя их распространённость - низкая (Peters and others 2008).

Инфекции вирусами лейкоза и иммунодефицита кошек не сопровождались анемией, несмотря на то, что оба возбудителя способны её вызывать (Shelton and Linenberger 1995). В данном исследовании не проводили серологическое исследование на вирус лейкоза и иммунодефицита для подтверждения диагноза, так как в большинстве случаев отсутствовала сыворотка для сравнения. Ретроспективная оценка историй болезни позволила получить некоторые серологические данные; однако эти серологические исследования не всегда проводились одновременно с ПЦР, поэтому интерпретация расходящихся результатов сложна. По информации из историй болезни, ни у одной из кошек не зарегистрировано положительного результата серологического исследования и отрицательного результата исследования методом ПЦР. У обеих кошек с провирусом иммунодефицита обнаружены антитела к нему. У 2 из 8 кошек с провирусом лейкоза результат серологического исследования был положительным, однако у 5 остальных -отрицательным. У 2 кошек с положительным результатом серологического исследования на вирусный лейкоз выявлена большая концентрация копий провируса (Ct 18.1 и

18.8 по сравнению с 26.6-36.9), что согласуется с результатами исследования Pinches and others (2006). Вероятно, кошки с положительным результатом ПЦР на провирус лейкоза и отрицательным результатом серологического исследования были заражены вирусом лейкоза в прошлом, но у них развился иммунный ответ, подавивший виремию и образование антигенов (Torres and others 2005, Pinches and others 2006). Даже при включении в анализ всех кошек с положительной реакцией на провирус лейкоза связи между вирусным лейкозом и анемией не обнаружено.

Ограничения текущего исследования включают тот факт, что сбор данных последующего наблюдения не был объективным, и не позволяют точно описать отклик на терапию. Это было бы особенно полезно в качестве дополнительного критерия дифференциации первичной (вероятно, отвечающей только на терапию иммуносупрессорами) от вторичной ИГА, хотя в настоящем исследовании прочие случаи вторичной ИГА у кошек с диагнозом первичной ИГА были тщательно исключены. Кроме того, текущая терапия не всегда была записана в истории болезни на момент отправки образцов для пробы Кумбса, таким образом, на результат последней могла влиять иммуносупрессивная терапия. При планировании будущих исследований возможности применения пробы Кумбса при ИГА у кошек было бы желательным учесть эти ограничения. В заключение, в этом исследовании была зафиксирована связь между ИГА и постоянной аутоагглютинацией при низкой температуре, а также между ИГА и определёнными положительными реакциями при пробе Кумбса (с любой антивысороткой, с поливалентной антисывороткой и антисывороткой к IgG) при 37 °C, что подтверждает рекомендацию исследовать кровь кошек с подозрением на ИГА на наличие аутоагглютинации при 4 °C, а также ставить пробу Кумбса при 37 °C. Отрицательные результаты этих исследований свидетельствуют об очень низкой вероятности ИГА. Однако описанные положительные реакции не являются специфичными на ИГА, поскольку постоянная аутоагглютинация при 4 °C наблюдалась также у кошек с другими формами анемии, как и положительная проба Кумбса при 37 °C; последняя зарегистрирована также у двух кошек без анемии. Таким образом, при подозрении на иммуноопосре-дованную анемию результаты исследования на антитела, связанные с эритроцитами, всегда следует интерпретировать параллельно с документальным подтверждением гемолиза. Причина наличия антител,

связанных с эритроцитами, у кошек с другими формами анемии заслуживает дальнейшего исследования. Гемобартонеллёз и ретровирусные инфекции встречались редко и не были главной причиной анемии в данной выборке кошек.

Благодарности

Это исследование финансировалось грантом общества защиты животных BSAVA, и мы выражаем большую признательность за поддержку. Авторы благодарят E. Crawford, S. Cue и K. Papasouliotis за анализы крови и K. Egan за получение некоторых образцов. Мы также выражаем признательность коллегам за помощь, в особенности из ветеринарной школы Бристольского университета (A. Harvey, I. Battersby, R. Dean, R. Giles, M. Good-fellow, S. Warman, F. Rizzo, S. Rudd и S. Wills). Мы также благодарим S. Warman и K. Papasouliotis за полезные обсуждения.

Позиция J. Murray финансируется обществом защиты кошек, и мы выражаем им большую признательность за поддержку.

Литература

Arjona A., Escolar E., Soto I., Barquero N., Martin D. & Gomez-Lucia E. (2000) Seroepidemiological survey of infection by feline leukemia virus and immunodefi cien-cy virus in Madrid and correlation with some clinical aspects. Journal of Clinical Microbiology 38, 3448-3449 Bardill B., Mengis C., Tschopp M. & Wuillemin W.A. (2003) Severe IgA-mediated auto-immune haemolytic anaemia in a 48-yr-old woman. European Journal of Haematology 70, 60-63 Barker R.N., Gruffydd-Jones T.J. & Elson C.J. (1993) Red cell-bound immunoglobulins and complement measured by an enzyme-linked antiglobulin test in dogs with autoimmune haemolysis or other anaemias. Research in Veterinary Science 54, 170-178 Bucheler J. (1999) Fading kitten syndrome and neonatal isoerythrolysis. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice 29, 853-870 Burgess K., Moore A., Rand W. & Cotter S.M. (2000) Treatment of immune-mediated hemolytic anemia in dogs with cyclophosphamide. Journal of Veterinary Internal Medicine 14, 456-462 Carr A.P, Panciera D.L. & Kidd L. (2002) Prognostic factors for mortality and thromboembolism in canine immune-mediated hemolytic anemia: a retrospective study of 72 dogs. Journal of Veterinary Internal Medicine 16, 504-509

Day M.J. (1996) Diagnostic assessment of the feline immune system part II. Feline Practice 24, 14-25 De Lorimier L.P & Messick J.B. (2004) Anemia associated with ‘Candidatus mycoplasma haemominutum’ in a feline leukemia virus-negative cat with lymphoma. Journal of the American Animal Hospital Association 40, 423-427

Druml W., Laggner A.N., Lenz K., Grimm G. & Sch-neeweiss B. (1991) Pancreatitis in acute hemolysis. Annals of Hematology 63, 39-41 Dubarry M., Charron C., Habibi B., Bretagne Y & Lambin P (1993) Quantitation of immunoglobulin classes and subclasses of autoantibodies bound to red cells in patients with and without hemolysis. Transfusion 33, 466-471

Dunn J.K., Searcy G.P & Hirsch V.M. (1984) The diagnostic signifi cance of a positive direct antiglobulin test in anaemic cats. Canadian Journal of Comparative Medicine 48, 349-353 Foley J.E. & Pedersen N.C. (2001) ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’, a low-virulence epierythro-cytic parasite of cats. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 51, 815-817 Fujino Y, Horiuchi H., Mizukoshi F, Baba K., Goto-Koshino Y. Ohno K. & Tsujimoto H. (2009) Prevalence of hematological abnormalities and detection of infected bone marrow cells in asymptomatic cats with feline immunodefi ciency virus infection. Veterinary Microbiology 136, 217-225

Gehrs B.C. & Friedberg R.C. (2002) Autoimmune hemolytic anemia. American Journal of Haematology 69, 258-271

George J.W., Rideout B.A., Griffey S.M. & Pedersen N.C.

(2002) Effect of preexisting FeLV infection or FeLV and feline immunodefi ciency virus coinfection on pathogenicity of the small variant of Haemobartonella felis in cats. American Journal of Veterinary Research 63, 1172-1178 Grundy S.A. & Barton C. (2001) Infl uence of drug treatment on survival of dogs with immune-mediated hemolytic anemia: 88 cases (1989-1999). Journal of the American Veterinary Medical Association 218, 543-546 Gunn-Moore D.A., Day M.J., Graham M.E., Cue S.M. & Harbour D.A. (1999) Immune-mediated haemolytic anaemia in two sibling cats associated with mul-ticentric lymphoblastic infi ltration. Journal of Feline Medicine and Surgery 1, 209-214 Hisasue M., Nishigaki K., Katae H., Yuri K., Mizuno T, Fujino Y, Setoguchi A., Hasegawa A., Watari T, Masu-da K., Ohno K. & Tsujimoto H. (2000) Clonality analysis of various hematopoietic disorders in cats naturally infected with feline leukemia virus. Journal of Veterinary Medical Science 62, 1059-1065 Hisasue M., Okayama H., Okayama T, Suzuki T, Mizuno T, Fujino Y, Naganobu K., Hasegawa A., Watari T, Mat-suki N., Masuda K., Ohno K. & Tsujimoto H. (2001) Hematologic abnormalities and outcome of 16 cats with myelodysplastic syndromes. Journal of Veteri-

nary Internal Medicine 15, 471-477 Honeckman A.L., Knapp D.W. & Reagan W.J. (1996) Diagnosis of canine immune-mediated hematological disease. Compendium of Continuing Education for the Practising Veterinarian 18, 113-125 Husbands B.D., Smith S.A. & Weiss D.J. (2002) Idiopathic immune-mediated hemolytic anemia (IMHA) in 25 cats. Journal of Veterinary Internal Medicine 16, 350 Jacobs R.M., Lumsden J.H. & Taylor J.A. (2000) Canine and feline reference values. In: Kirk’s Current Veterinary TherapyXIII Small Animal Practice. Eds J.D. Bonagura, W.B. Saunders, Philadelphia, PA, USA. pp 1207-1227 Klag A.R., Giger U. & Shofer FS. (1993) Idiopathic immune-mediated hemolytic anemia in dogs: 42 cases (1986-1990). Journal of the American Veterinary Medical Association 202, 783-738 Kohn B., Weingart C., Eckmann V, Ottenjann M. & Leibold W

(2006) Primary immune-mediated hemolytic anemia in 19 cats: diagnosis, therapy, and outcome (1998-2004). Journal of Veterinary Internal Medicine 20, 159-166

Lenard Z.M., Foster S.F, Tebb A.J., Russell N.J., O’haraA.J. & Lester N.V (2007) Lymphangiosarcoma in two cats. Journal of Feline Medicine and Surgery 9, 161-167 Mason N., Duval D., Shofer F.S. & Giger U. (2003) Cyclophosphamide exerts no benefi cial effect over prednisone alone in the initial treatment of acute immune-mediated hemolytic anemia in dogs: a randomized controlled clinical trial. Journal of Veterinary Internal Medicine 17, 206-212 Mohr A.J., Lobetti R.G. & Van der Lugt J.J. (2000) Acute pancreatitis: a newly recognised potential complication of canine babesiosis. Journal of the South African Veterinary Association 71, 232-239 Morley P, Mathes M., Guth A. & Dow S. (2008) Antierythrocyte antibodies and disease associations in anemic and nonanemic dogs. Journal of Internal Medicine 22, 886-892 Overmann J.A., Sharkey L.C., Weiss D.J. & Borjesson D.L.

(2007) Performance of 2 microtiter canine Coombs’ tests. Veterinary Clinical Pathology 36, 179-183

Person J.M., Sicard M. & Pellerin J.L. (1997) Autoimmune haemolytic anaemia in the cat: clinical and immunopathological study of fi ve cases. Revue de Medicine Veterinaire 148, 107-114 Peters I.R., Helps C.R., Willi B., Hofmann-Lehmann R. & Tasker S. (2008) The prevalence of three species of feline haemoplasmas in samples submitted to a diagnostics service as determined by three novel real-time duplex PCR assays. Veterinary Microbiology 126,142-150 Peterson M.E., Hurvitz A.I., Leib M.S., Cavanagh PG. & Dutton R.E. (1984) Propylthiouracil-associated hemolytic anemia, thrombocytopenia, and antinuclear antibodies in cats with hyperthyroidism. Journal of the American Veterinary Medical Association 184, 806-808 Petz L.D. (2008) Cold antibody autoimmune hemolytic anemias. Blood Reviews 22, 1-15

Piek C.J., Dekker A., Junius G., Slappendel R. J. S TeskeE.

(2003) Idiopathic immune-mediated hemolytic anemia (IMHA) in cats: differentiation from secondary IMHA and outcome of treatment. 13th European College of Veterinary Internal Medicine Conference, Uppsala, Sweden. Pinches M.D.G., Helps C.R., Gruffydd-Jones TJ., Egan K., Jarrett O. S Tasker S. (2007) Diagnosis of feline leukaemia virus infection by semi-quantitative real-time polymerase chain reaction. Journal of Feline Medicine and Surgery 9, 8-13 Reimer M.E., Troy G.C. S Warnick L.D. (1999) Immune-mediated hemolytic anemia: 70 cases (1988-1996). Journal of the American Animal Hospital Association 35, 384-391 Reusser P., Osterwalder B., Burri H. S Speck B. (1987) Autoimmune hemolytic anemia associated with IgA-diagnostic and therapeutic aspects in a case with long-term follow-up. Acta Haematologica 77, 53-56 Rosse W.F S Adams J.P (1980) The variability of hemolysis in the cold agglutinin syndrome. Blood 56, 409-416 Saruc M., Yuceyar H., Turkel N., Ozutemiz O., Tuzcuoglu I., Ayhan S., Yuce G., Coker I. S Huseyino A. (2007) The role of heme in hemolysis-induced acute pancreatitis. Medical Science Monitor 13, BR67-BR72 Scott D.W., Schultz R.D., Post J.E., Bolton G.R. S Baldwin C.A. (1973) Autoimmune haemolytic anaemia in the cat. Journal of the American Animal Hospital Association 9, 530-539 Shelton G.H. S Linenberger M.L. (1995) Hematologic abnormalities associated with retroviral infections in the cat. Seminars in Veterinary Medicine and Surgery (Small Animal) 10, 220-233 Slappendel, R. J. (1979) The diagnostic signifi cance of the direct antiglobulin test (DAT) in anemic dogs. Veteri-

nary Immunology and Immunopathology 1, 49-59 Switzer J.W. & Jain N.C. (1981) Autoimmune hemolytic anemia in dogs and cats. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice 11, 405-420 Tasker, S., Binns, S. H., Day, M. J., Gruffydd-Jones, T J., Harbour D.A., Helps C.R., Jensen W.A., Olver C.S. & Lappin M.R. (2003) Use of a PCR assay to assess prevalence and risk factors for Mycoplasma haemofelis and ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’ in cats in the United Kingdom. Veterinary Record 152, 193-198 Tasker S., Peters I.R., Papasoulotis K., Cue S.M., Willi B., Hofmann-Lehmann R., Gruffydd-Jones TJ., Knowles T.G., Day M.J. & Helps C.R. (2009) Description of outcomes of experimental infection with feline haemo-plasmas: copy numbers, haematology, coombs’ testing and blood glucose concentrations. Veterinary Microbiology, 39, 323-332 Torres A.N., Mathiason C.K. & Hoover E.A. (2005) Reexamination of feline leukemia virus: host relationships using real-time PCR. Virology 332, 272-283 Wardrop K.J. (2005) The Coombs’ test in veterinary medicine: past, present, future. Veterinary Clinical Pathology 34, 325-334 Warman S.M., Murray J.K., Ridyard A., Eastwood J., Silva S. & Day M.J. (2008) Pattern of Coombs’ test reactivity has diagnostic signifi cance in dogs with immune-mediated haemolytic anaemia. Journal of Small Animal Practice 49, 525-530 Weingart C., Giger U. & Kohn B. (2004) Whole blood transfusions in 91 cats: a clinical evaluation. Journal of Feline Medicine and Surgery 6, 139-148 Weinkle T.K., Center S.A., Randolph J.F., Warner K.L., Barr S.C. & Erb H.N. (2005) Evaluation of prognostic factors, survival rates, and treatment protocols for

immune-mediated hemolytic anemia in dogs: 151 cases (1993-2002). Journal of the American Veterinary Medical Association 226, 1869-1880 Weiss D.J. (2006a) Aplastic anemia in cats-clinico-pathological features and associated disease conditions (1996-2004). Journal of Feline Medicine and Surgery 8, 203-206 Weiss D.J. (2006b) Evaluation of dysmyelopoiesis in cats: 34 cases (1996-2005). Journal of the American Veterinary Medical Association 228, 893-897 Werner L.L. S Gorman N.T. (1984) Immune-mediated disorders of cats. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice 14, 1039-1064 Wilkerson M.J., Davis E., Shuman W., Harkin K., Cox J. Ъ Rush B. (2000) Isotype-specifi c antibodies in horses and dogs with immune-mediated haemolytic anaemia. Journal of Veterinary Internal Medicine 14, 190-196 Willi B., Boretti FS., Baumgartner C., Tasker S., Wenger B., Cattori V, Meli M.L., Reusch C.E., Lutz H. S HofmannLehmann R. (2006a) Prevalence, risk factor analysis, and follow-up of infections caused by three feline hemoplasma species in cats in Switzerland. Journal of Clinical Microbiology 44, 961-969 Willi B., Tasker S., Boretti F.S., Doherr M.G., Cattori V, Meli M.L., Lobetti R.G., Malik R., Reusch C.E., LutzH. S Hofmann-Lehmann R. (2006b) Phylogenetic analysis of «Candidatus Mycoplasma turicensis» isolates from pet cats in the United Kingdom, Australia, and South Africa, with analysis of risk factors for infection. Journal of Clinical Microbiology 44, 4430-4435 Zulty J.C. S Kociba G.J. (1990) Cold agglutinins in cats with haemobartonellosis. Journal of the American Veterinary Medical Association 196, 907-910