2
2
СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ C1rs ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА
2
2
METHOD AND KIT FOR IMMUNE-ENZYME FUNCTIONAL ACTIVITY ASSAY ON C1rs SUBCOMPONENTS OF FIRST COMPONENT OF HUMAN COMPLEMENT

2
2
Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Субкомпоненты C1r и C1s, синтезируемые в организме в равных количествах и представляющие собой зимогены протеиназ, образуют прочный Ca-зависимый тетрамерный комплекс C1rs, связанный с субкомпонентом C1q также Ca-зависимым образом и формирующий с ним компонент C1. При связывании C1 с иммунным комплексом происходит активация протеиназ C1r и C1s. Активация этих ферментов - существенный этап инициации каскада активации комплемента по классическому пути, поэтому их функциональный дефицит может быть причиной различного рода патологических состояний организма.
2
2
2
2
2
2
Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Однако имеющиеся на сегодня методы иммуноферментного анализа белков комплемента позволяют определять лишь их содержание как антигена. Тем не менее наиболее информативным является оценка функциональной активности этих белков, которая и характеризует развитие патологического процесса. Известен способ определения функциональной активности компонентов C1rs [1], который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета иммуноглобулина G, затем внесение в лунки микропланшета сыворотки морской свинки в присутствии этилендиаминтетраацетата натрия для сорбции на иммуноглобулине только субкомпонента C1q. После освобождения лунок микропланшета от жидкости и их промывки в лунки вносят буферный раствор с ионами кальция, анализируемые пробы, содержащие комплекс C1rs с неизвестной активностью, и псевдоглобулиновую фракцию сыворотки человека (супернатант после осаждения эуглобулинов сыворотки диализом против дистиллированной воды при pH 5,5) в качестве источника компонентов С4, С2 и С3. При проведении инкубации для активации комплемента происходит ковалентное связывание C3b на сорбированном иммуноглобулине в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого комплекса C1rs. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С3 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3-фракции иммуноглобулинов G, конъюгированных с ферментом.
Недостатком этого способа является трудность получения иммунохимически чистых препаратов иммуноглобулина G человека и плохое сохранение активирующей способности при хранении.
2
2
Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность комплекса C1rs комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата для использования в качестве активатора классического пути комплемента.
2
2
2
2
2
2
Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели аптечного препарата дерината, представляющего собой дезоксирибонуклеат натрия, хорошо сохраняемый в обычных условиях, затем внесение в лунки микропланшета сыворотки морской свинки в присутствии этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) для сорбции на деринате только субкомпонента C1q. После освобождения лунок микропланшета от жидкости и их промывки в лунки вносят буферный раствор с ионами кальция, анализируемые пробы, содержащие комплекс C1rs с неизвестной активностью, и псевдоглобулиновую фракцию сыворотки человека (супернатант после осаждения эуглобулинов сыворотки диализом против дистиллированной воды при pH 5,5) в качестве источника компонентов С4, С2 и С3. При проведении инкубации для активации комплемента происходит ковалентное связывание C3b в лунках микропанели в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого комплекса C1rs. Количество связавшегося в результате активации компонента С3 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3-фракции иммуноглобулинов G, конъюгированных с ферментом. Тем самым достигается определение функциональной активности C1rs иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.
2
2
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа определения функциональной активности комплекса C1rs комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов.
2
2
2
2
2
2
2+
2+
2
2+
Пример 1. Определение функциональной активности субкомпонентов C1rs первого компонента комплемента человека. Аптечный препарат дерината в 0,15 М NaCl в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°C. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, pH 7,4 (VBSE), содержащим 0,15 М NaCl, 50 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора VBSE и 1,25 мкл сыворотки морской свинки. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C и отмывки вероналовым буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Ca и 0,5 мМ Mg (VBS*), в лунки микропанели вносят по 100 мкл раствора VBS, содержащего 15 мкл псевдоглобулиновой фракции сыворотки человека (супернатант после осаждения эуглобулинов сыворотки диализом против дистиллированной воды при pH 5,5 - реагент R1) и анализируемую пробу, содержащую комплекс C1rs с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, двукратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, (ЗФР-Т) и осушения микропанели в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента С3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, отмывки ЗФР-Т и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера с ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 5-10 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Функциональную активность C1rs рассчитывают по стандартной кривой (см. чертеж).
2
2
2
2
Пример 2. Набор для определения функциональной активности субкомпонентов C1rs первого компонента комплемента человека содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом и C1q морской свинки, конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту С3 комплемента человека, реагент R1, субстратный буфер и стандарт с известной активностью C1rs.
2
2
2
2
2
Из приведенных на чертеже результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от активности C1rs с коэффициентом корреляции R=0,995, что позволяет достоверно определять функциональную активность C1rs описанным способом с использованием описанного набора.
ЛИТЕРАТУРА
2
2
Козлов Л.В., Колесникова Е.А., Дьяков В.Л. Способ определения функциональной активности субкомпонентов C1rs первого компонента комплемента человека. Патент РФ 2251698. Бюл. № 13. 10.05.2005.