СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ КОРНЕЙ Silene linicola К1601 - ПРОДУЦЕНТА ЭКДИСТЕРОИДОВ
METHOD OF PRODUCING CULTURE OF ISOLATED ROOT Silene linicola K1601-PRODUCER OF ECDYSTEROIDS

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии и может быть использовано в фармацевтической и пищевой промышленности.
Интенсивные исследования по получению вторичных метаболитов из лекарственного растительного сырья и поиску растений, продуцирующих эти вещества, проводятся вследствие широкого спектра их биологической активности, в частности анаболический, адаптогенный, иммуномодулирующий эффекты экдистероидов [1, 2].
Семейство Caryophyllaceae является одним из самых богатых экдистероидсодержащих в мировой флоре и характеризуется разнообразным составом экдистероидов, наличием множества обнаруженных пока только в них новых соединений, высоким содержанием мажорных компонентов экдистероидной суммы. В настоящее время экдистероиды обнаружены более чем в 150 видах рода Silene L., 12 - в Lychnis L. и ряд видов в других родах [1, 3]. Альтернативой известным подходам получения сырья и экстрактов лекарственных растений является культура клеток, тканей и органов растений.
Известны штаммы культивируемых клеток и изолированных корней экдистероидсодержащих растений - Ajuga reptans L. [4, 5], Ajuga turkestanica ()  [6], Serratula tinctoria L. [7], Serratula coronata L. [8]. Однако в литературе нет данных по получению культуры изолированных корней представителей сем. Caryophyllaceae как источников получения экдистероидов.
Наиболее близким к заявляемому является способ получения культуры клеток экдистероидсодержащих видов рода Silene [9], в соответствие с которым показана возможность получения стабильно растущей культуры каллусов представителей рода Silene из различных типов эксплантов. Для этого различные типы эксплантов культивируют на среде Мурасиге и Скуга (MS) с добавлением гормонов (регуляторов роста) - бензиламинопурина 1 мкМ, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты 5 мкМ и гидролизата казеина 1 г/л. При данном способе культивирования индексы роста каллусов Silene linicola корневого происхождения составили по сырой биомассе - 4,1±0,6, по сухой - 4,0±1,3.
Недостатками данного способа являются медленный прирост биомассы, необходимость использования дорогостоящих регуляторов роста для стабильного роста культуры in vitro, незначительный уровень содержания экдистероидов в конечном продукте.
Задачей изобретения является получение генетически и биохимически стабильной культуры изолированных корней Silene linicola, характеризующейся постоянным высоким темпом роста на безгормональных питательных средах и высоким уровнем биосинтеза экдистероидов, свойственных данному виду растения.
Поставленная задача решается созданием новой культуры изолированных корней Silene linicola, обозначенной Silene linicola К1601, и оптимизацией условий их культивирования. Способ получения культуры-продуцента экдистероидов включает культивирование экспланта корня ювенильного растения с добавлением регуляторов роста, отделение трансформированных корней от экспланта и их последующее выращивание на питательной среде. Отличие от прототипа заключается в том, что осуществляют агробактериальный перенос генов Agrobacterium rhizogene, плазмида pRi, штамм R-1601, в корни Silene linicola (синдром hairy root). После трансформации бактериальную среду элиминируют, а стерильные изолированные корни Silene linicola К1601 культивируют на жидкой безгормональной питательной среде Гамборга, причем первые два пассажа культивируют с добавлением к питательной среде 250 мг/л цефотаксима, а все последующие пассажи культивируют с добавлением к питательной среде 500 мг/л гидролизата казеина.
Опытным путем показана возможность создания культуры изолированных корней Silene linicola и биосинтеза в ней экдистероидов, а созданная культура Silene linicola К1601 является альтернативным источником экдистероидов. Усиленному синтезу экдистероидов способствует оптимально подобранный состав питательной среды.
На фиг. 1 показана фотография культуры изолированных корней Silene linicola К1601.
На фиг. 2 приведена ВЭЖХ этанольного экстракта Silene linicola К1601
На фиг. 3 приведены УФ-спектры экдистероидов Silene linicola К1601.
+
+
Культура Silene linicola К1601 получена от вида Silene linicola C.C.Gmelin (сем. Caryophyllaceae), семена которого получены из ботанического сада г. Геттингена (Германия) и интродуцированы в Сибирском ботаническом саду Томского государственного университета. Происхождение культуры Silene linicola К1601 - агробактериальный перенос генов pRi Agrobacterium rhizogenes, штамм R-1601, в корни ювенильных растений Silene linicola.  Характеристика получаемой культуры - тонкие интенсивно ветвящиеся корни, индекс роста по сырой биомассе 14,70,5, по сухой биомассе 13,50,4.
Способ по изобретению осуществляют следующим образом.
На первом этапе проводится бактериальная трансформация эксплантов корня растения Silene linicola. Для получения асептической культуры семена Silene linicola стерилизовали в 20 % растворе «Domestos» с последующим трехкратным промыванием стерильной дистиллированной водой и помещали на 0,6 % агар для проращивания. Условия культивирования семян: фотопериод свет/темнота 16/8, Т=22±2 °С.
Трансформацию проводили по следующей схеме: стерильные проростки делили на лист, гипокотиль, корень, накалывали иголкой инсулинового шприца и инокулировали в течение 24 часов в жидкой питательной среде Мурасиге и Скуга, содержащей суспензию агробактерий A. rhizogenes, штамм R-1601, суточного возраста. После экспозиции инокуляты промывали стерильной средой Мурасиге и Скуга с уменьшенным вдвое содержанием макро- и микроэлементов (½ MS). Для проявления трансформации помещали на агаризованную среду с добавлением 500 мг/л цефотаксима. Через 3 недели, после появления розетки корней, их отделяли, пересаживали на ту же питательную среду с цефотаксимом (500 мг/л), затем кончики корней двукратно пересаживали на агаризованную питательную среду ½  MS с 250 мг/л антибиотика для элиминирования бактерий. В дальнейшем использовали жидкую питательную среду Гамборга. Состав среды Гамборга оптимально сбалансирован по макро-, микросолям и витаминам для биосинтеза экдистероидов в  Silene linicola К1601. Например, в среде Гамборга в 1,5-10 раз меньше содержание макросолей, микросолей и сахарозы, чем в MS. Концентрации же витаминов в среде Гамборга в 2-10 раз больше, в чем в MS.
Пример 1. Изолированные корни переносили на жидкую питательную среду Гамборга с добавление 250 мг/л цефотаксима и культивировали 2 пассажа (период между пассажами - 30 дней) для достижения полной асептичности культуры. После этого культуру изолированных корней переносили на среду Гамборга с добавлением 500 мг/л гидролизата казеина, период между последующими пассажами составлял 45 дней. Для пересадки брали примерно 200 мг сырой биомассы корней и помещали в конические колбы на 250 мл в 100 мл среды. pH доводили до 5,8 до автоклавирования. Условия культивирования: темнота, температура 24±2°С, орбитальный шейкер 90 об./мин. Консервация - на агаризованной питательной среде Гамборга при температуре +17 °С при слабом освещении. Результат положительный (фиг. 1 - 3).
Пример 2. Аналогичен примеру 1, но первый и второй пассажи на жидкую среду Гамборга проводили без добавления цефотаксима в дозировке 250 мг/л. Результат отрицательный. При отсутствии антибиотика в первых пассажах на жидких средах наблюдали появление бактериальной инфекции с частотой 75 %.
Пример 3. Аналогично примеру 1, но культивирование изолированных корней проводили в жидкой питательной среде Гамборга без добавления гиролизата казеина. Результат отрицательный. На данной питательной среде показатели роста сырой и сухой биомассы резко снижались. Результаты представлены в таблице 1.
Таким образом, в результате испытаний способа по изобретению (пример 1) показано, что культура изолированных корней Silene linicola К1601 растет стабильно, образует массу тонких плотно переплетенных корней (фиг. 1). Культура поддерживается с помощью пересадок на свежие питательные среды каждые 45 дней. Согласно данным ВЭЖХ анализа, в процессе культивирования в заявленных условиях происходит активный синтез множества экдистероидов (см. табл. 2). Профиль ВЭЖХ этанольного экстракта изолированных корней Silene linicola К1601 имеет большое сходство с профилем соответствующего экстракта интактных растений по времени удерживания детектируемых веществ (фиг. 2), что подтверждается и характерными УФ-спектрами поглощения (фиг. 3). В экстрактах идентифицированы характерные экдистероиды для видов рода Silene: 20-гидроксиэкдизон, 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон, полиподин В. Содержание 20-гидроксиэкдизона в образцах Silene linicola К1601 составляет 0,18 %. Идентификация других экдистероидов требует дополнительных исследований.
Технический результат - обеспечение постоянного высокого темпа роста изолированных корней Silene linicola К1601 на безгормональных питательных средах при высоком уровне биосинтеза видоспецифичных экдистероидов.
Источники информации
1. Зибарева Л.Н. Фитоэкдистероиды растений семейства Caryophyllaceae. Автореф. дисс. док. хим. наук, Новосибирск, 2003. 247 с.
2. Володина С.О. Экдистероидсодержащие растения: ресурсы и биотехнологическое использование. Дисс. канд. биолог. наук, Сыктывкар, 2006. 166 с.
3. Distribution of phytoecdysteroids in the Caryophyllaceae / L. Zibareva, V. Volodin, Z. Saatov, T. Savchenko, P. Whiting, R. Lafont, L. Dinan // Phytochemistry. - 2004. - V. 64. - №. 2 - P. 499 - 517.
4.  Филлипова В.Н., Володина С.О., Смоленская И.Н., Зоринянц С.Э., Ануфриев Э.Н., Носов А.М., Володин В.В. (2007). Штамм культивированных клеток растений Ajuga reptans. Патент РФ №2296154 от 27.03.2007.
5. Matsumoto T., Tanaka N. Production of ecdysteroid by hairy root cultures of Ajuga reptans var autropurpurea // Agric. Biol. Chem. - 1991- V. 55. - P. 1019-1025.
6. Cheng D.M., Yousef G.G., Grace M.H., Rogers R.B., Gorelick-Feldman J., Raskin I., Lila M.A. In vitro production of metabolism-enchancing phytoecdysteroids from Ajuga turkestanica // Plant Cell Tiss. Organ. Cult. - 2008. - V. 93. - P. 73-83.
7. Delbeque J., Beydon P., Chapuis L. In vitro incorporation of radio labelled cholesterol and mevalonic acid into ecdysteron by hairy root cultures of a plant Serratula tinctoria. // Eur J Entomol. - 1995. - 92:301-307.
8. Филлипова В.Н., Володина С.О., Смоленская И.Н., Зоринянц С.Э., Ковлер Л.А., Ануфриев Э.Н., Носов А.М., Володин В.В. Штамм культивируемых клеток растений Serratula coronata L. Патент РФ №2296155 от 27.03.2007.
9.  Эрст А.А., Зибарева Л.Н. Особенности каллусообразования экдистероидсодержащих видов рода Silene L. (Caryophyllaceae Juss.) в культуре in vitro // Сибирский экологический журнал. - 2013. - № 4. - С. 603-608.
Способ получения культуры
изолированных корней Silene linicola
Таблица 1. Сравнительная оценка прироста сырой и сухой биомассы изолированных корней Silene linicola К1601 при различном составе питательной среды
Таблица 2. Идентификация экдистероидов в этанольных экстрактах Silene linicola К1601
Примечание: НИДЭ -  неидентифицированный экдистероид.