Средство, обладающее противоклоногенной активностью в отношении опухолевых клеток человека
MEANS OF ANTI-CLONOGENIC ACTIVITY IN RESPECT OF TUMOR HUMAN CELLS

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средства, обладающего противоклоногенной активностью в отношении опухолевых клеток человека.
Молекулярно-клеточные механизмы и факторы, влияющие на резистентность опухолей к химио- и радиотерапии,  представляют большой интерес для современной медицины. Их изучение может открыть эффективные пути для искусственного модулирования реакций опухолей и нормальных тканей на облучение и химиофармпрепараты, что должно иметь практическую значимость для терапии рака. При этом исследование регуляторных ферментов, способствующих выживанию и адаптации раковых клеток, представляется особенно перспективным.
К таким ферментам, несомненно, относится так называемая киназа гликогенсинтазы 3 (GSK-3), которая является одним из ключевых компонентов сигнальных путей регуляции энергетики, пролиферации и подвижности (миграции) нормальных, стволовых и злокачественных клеток [1, 2]. Известно, что этот фермент вовлечен в процессы онкогенеза, инвазии и метастазирования опухолей, а также в механизмы устойчивости раковых клеток к апоптозу и химиотерапии [2, 3]. В настоящее время активно обсуждается, что некоторые ингибиторы GSK-3 могли бы использоваться в борьбе с онкологическими заболеваниями [3]. Однако опубликованные результаты модельных исследований по данной теме достаточно противоречивы: в одних случаях ингибиторы GSK-3 оказывали противоопухолевые эффекты (подавление инвазии и пролиферации раковых клеток и пр.) [4-8], в других, напротив, способствовали росту опухоли [9-11].
В этом аспекте интересным является возможность выявления противоклоногенных свойств в отношении опухолевых клеток человека у нового, недавно разработанного ингибитора GSK-3 – 2-Гидрокси-3-[5-(морфолин-4-илметил) пиридин-2-ил]-1Н-индол-5-карбонитрила в виде свободного основания, цитратной и солянокислой соли, описанного в заявках WO 03/082853 /A61P19/10, опубл. 22.10.2008/, US12/125,619 /A61P3/10, опубл. 26.11.2009/,  US 12/596020 /C07D413/06, опубл. 11.11.2010/, RU2009138136 /C07D401/04 , опубл. 27.05.2011/. Данное соединение обладает фармакологической активностью, демонстрируя ингибирующий эффект в отношении GSK3. Предлагаемое соединение можно применять для лечения болезни Альцгеймера, деменций, хронических и острых нейродегенеративных заболеваний, биполярных расстройств, шизофрении, сахарного диабета, потери волос, расстройств, связанных с костной тканью и онкологических заболеваний.
Задачей изобретения является расширение арсенала средств,  обладающих противоклоногенной активностью в отношении опухолевых клеток человека. Технический результат заключается  в том, что применение предлагаемого соединения в онкологии обеспечивает подавление клоногенности опухолевых клеток человека.
Для решения поставленной задачи и для достижения заявляемого технического результата предлагается средство, обладающее противоклоногенной активностью в отношении опухолевых клеток человека, и представляющее собой  соединение 2-Гидрокси-3-[5-(морфолин-4-илметил) пиридин-2-ил]-1Н-индол-5-карбонитрил формулы (I):
Новым в предлагаемом изобретении является то, в качестве средства, подавляющего колониеобразующую способность (клоногенность) опухолевых клеток человека, может применяться соединение 2-Гидрокси-3-[5-(морфолин-4-илметил) пиридин-2-ил]-1Н-индол-5-карбонитрил. Для специалиста эти свойства явным образом не вытекают из уровня техники.
Предметом предлагаемого изобретения является средство, обладающее помимо ряда полезных фармакологических свойств противоклоногенной активностью в отношении опухолевых клеток человека.
Сущность изобретения поясняется примером конкретного выполнения.
Пример. Исследован эффект изучаемого соединения на колониеобразующую способность опухолевых клеток человека. Целью исследований было изучение влияния предлагаемого соединения на клоногенный потенциал опухолевых культур MCF-7 и HBL-100 и нормальных клеток человека.
В качестве основного метода исследования был выбран тест на клоногенность, поскольку способность отдельных раковых клеток формировать стабильные колонии (клоны) in vitro, как правило, коррелирует с их туморогенностью и устойчивостью к цитотоксическим (терапевтическим) воздействиям in vivo [12], а также с процентом стволовых раковых клеток в клеточном пуле, что имеет прямое отношение к степени агрессивности растущей опухоли и (не) эффективности клинической терапии.
Объектом данного исследования явилось соединение, а также культуры распластанных клеток, происходящие из охарактеризованных опухолевых линий MCF-7 и HBL-100 (карциномы молочной железы человека) [13, 14]. Для сравнения эффектов препарата часть работы была сделана на культуре «нормальной» (нетуморогенной) клеточной линии, такой как эпителий эмбриональной почки человека (линия 293) [15].
В данной работе использовались три линейные культуры эпителиальных клеток:
(I) MCF-7 – раковые клетки, происходящие из карциномы молочной железы человека;
(II) HBL-100 – клетки, изначально происходящие из нормального эпителия молочной железы человека, которые теперь проявляют свойства злокачественных клеток;
(III) 293 – клеточная линия почечного эпителия эмбриона человека.
Эти клеточные культуры были получены из Онкологического Центра РАМН (Москва) и все время хранились в крио-ампулах, помещенных в жидкий азот.
2
2
Размораживание клеточных культур проводили стандартно: быстрый фазовый переход лед-жидкость при 37°С, затем резкое охлаждение до +4°С, разведение суспензии клеток в охлажденной среде DMEM с последующим центрифугированием (1500 об/мин) для отмывки от «крио-среды» (90% фетальной телячьей сыворотки + 10% ДМСО). Осадок размороженных и промытых клеток ресуспендировали в среде роста (DMEM с добавлением 10%-ной телячьей фетальной сыворотки, 2 моль/л L-глютамина, 10000 IU/мл пенициллин/стрептомицина), и затем полученную суспензию сажали в культуральные пластиковые флаконы или чашки Петри из расчета 10 тыс. клеток/см. Культуры прикрепленных и распластанных клеток выращивались во влажной камере инкубатора с 5%-ным углекислым газом (СО) при 37°С; среда роста менялась каждые 3 дня. Динамику роста, плотность и морфологию клеток периодически оценивали путем просмотра на инвертированном микроскопе. После разморозки клетки проводили, как минимум, через 1 пассаж: при образовании монослоя клетки снимали с пластика с помощью раствора Трипсин/Версен, промывали и снова рассаживали в разведении 1:3 или 1:4. Для обработки предлагаемым препаратом брали клеточные культуры, достигшие 65-70% конфлуэнтности и демонстрирующие нормальную морфологию эпителиальных клеток.
Концентрированный раствор исследуемого соединения (200 мкМ) был приготовлен в физиологическом растворе и в ДМСО соответственно. Водный раствор для стерилизации пропускали через шприцевой фильтр (Ø пор = 0,22 мкМ). Микрообъемы (5 - 200 мкл) таких свежеприготовленных стерильных растворов добавлялись в среду роста к клеткам, чтобы с учетом разведения получить нужные концентрации веществ (0,5 - 20 мкМ) в инкубационной среде.
2
2
Клетки каждой культуры инкубировались с изучаемым соединением в течение 24 или 72 часов в СО-инкубаторе при 37°С. Затем клетки из каждой временной точки снимались Трипсин/Версеном, подсчитывались их концентрации в суспензиях, и готовились серийные разведения клеточных суспензий. Строго лимитированные количества клеток рассаживались в чашки Петри из расчета (1 тыс. или 2 тыс. клеток на чашку) с параллельными пробами (3 чашки на каждую точку), и рост колоний продолжался 10 дней в СО-инкубаторе при 37°С со сменой среды на 5-й день. Размеры, плотность и морфология вырастающих из одной клетки колоний контролировались путем периодических просмотров на инвертированном микроскопе. На 10-й день выросшие в чашках Петри колонии клеток фиксировались 96% этанолом (5 мин) и сразу обрабатывались специальным синим красителем «кристалл-фиолетовый» (5 мин) для визуализации многоклеточных колоний. После отмывки (водой) от красителя и высушивания чашек все окрашенные препараты анализировались под микроскопом, и на дне каждой чашки фломастером отмечались колонии, содержащие не менее 50 клеток. Затем отмеченные колонии тщательно подсчитывались во всех параллельных пробах, и определялся процент выросших колоний относительно количества колоний в контроле (необработанные клетки), принимаемом за 100%.
Статистическую обработку результатов проводили стандартными методами с применением t-критерия Стьюдента. Гистограммы, демонстрирующие эффекты изучаемого соединения на процент выросших клеточных колоний, строили в графическом редакторе «Origin», включающем программу усреднения данных всех параллельных измерений с приведением разброса (± среднее квадратичное отклонение). При анализе эффектов исследуемого соединения достоверность отличий от контроля оценивали с помощью программы ANOVA.
Эффекты исследуемого соединения на опухолевые клетки MCF-7
Периодическое просматривание образцов клеток под инвертированным микроскопом не выявило каких-либо драматических эффектов исследуемого соединения на морфологию распластанных клеток-мишеней MCF-7. Некоторое видимое ухудшение морфологии (ретракция цитоплазмы с нарушением межклеточных контактов) имело место только при высокой концентрации изучаемого соединения (20 мкМ) и после самого долгого срока инкубации (72 часа). Это свидетельствует об относительно слабой цитотоксичности препаратов.
Регулярные наблюдения за динамикой митозов (скорость деления клеток) не обнаружили явных цитостатических эффектов у исследуемого соединения (т.е. данный препарат не тормозил пролиферацию клеток MCF-7 в первые 24-60 ч инкубации по сравнению с необработанным контролем).
Типичная картина выросших в чашках Петри (зафиксированных и окрашенных синим) колоний опухолевых клеток MCF-7 показана на Фиг. 1-3.
Статистически обработанные результаты подсчета колоний представлены в виде столбчатых гистограмм на Фиг. 4. Результаты исследований согласно усредненным данным 2-х серий экспериментов, что 5 мкМ исследуемого соединения в случае 72-часовой инкубации достоверно (в ~20 раз, т.е. до 5%) снижал клоногенность клеток MCF-7. При этом 24-часовая инкубация клеток с такой же концентрацией (5 мкМ) исследуемого соединения приводила всего лишь к 2-кратному (до ~40-50%) снижению процента выросших колоний. Более высокая концентрация (20 мкМ)  значительно  больше (в ~40-50 раз, т.е. примерно до 2-2,5%) подавляла клоногенность MCF-7 после 24 - или 72-часовой инкубации (Фиг.4). Исследование действия низких концентраций (1 мкМ) исследуемого соединения показало только незначительное недостоверное (на ~30-35%) подавление роста колоний.
Эффекты исследуемого соединения на опухолевые клетки HBL-100
Визуальный анализ на инвертированном микроскопе не выявил никакого влияния изучаемого соединения на морфологию клеток HBL-100. Даже относительно высокие (10 мкМ) концентрации исследуемого соединения и долгие (72 часа) сроки инкубации не вызывали заметных изменений в морфологии обработанных клеток. Это может говорить как о слабой цитотоксичности исследуемого соединения, так и о высокой устойчивости клеточной культуры HBL-100. Также не наблюдалось какого-либо цитостатического эффекта изучаемого соединения на эти клетки (т.е. препарат не тормозил пролиферации данной культуры).
Две серии экспериментов с изучаемым соединением, которое добавлялось к клеткам HBL-100 в концентрациях 0,5 или 10 мкМ, не выявили каких либо эффектов на клоногенность этой клеточной культуры даже в случае самых длительных (72 часа) сроков инкубации (Фиг. 5). Таким образом, в отличие от ситуации с другой опухолевой линией – MCF-7, клетки HBL-100 никак не реагируют на изучаемое соединение.
Эффекты исследуемого соединения на неопухолевые клетки 293
Изучаемое соединение не изменяло морфологию клеток линии 293 даже в случае высоких (20 мкМ) концентраций препарата и длительного (72 часа) периода инкубации. Это свидетельствует о низком уровне (или об отсутствии) цитотоксичности препарата. Не наблюдалось торможения деления в образцах клеток линии 293, обработанных изучаемым соединением.
Согласно усредненным данным 2-х серий независимых экспериментов, только высокая (20 мкМ) концентрация исследуемого соединения достоверно (в ~ 5-8 раз: до 20% при 24-часовой инкубации и до 12% при 72-часовой инкубации) снижала клоногенность клеток линии 293 относительно контроля (Фиг. 6). Однако более низкие концентрации (1 или 5 мкМ) исследуемого соединения уже не оказывали никакого влияния на количество выросших колоний клеток линии 293 (Фиг. 6).
Таким образом, изучаемое соединение в концентрациях 5 и 20 мкМ значительно подавляло клоногенность опухолевых клеток MCF-7. При этом степень подавления клоногенности коррелировала с продолжительностью инкубации этих клеток с данным препаратом.
Исследуемое соединение, даже в максимальных концентрациях (20 мкМ) и при продолжительных периодах инкубации (72 часа), не снижал клоногенного потенциала опухолевой линии клеток HBL-100.
В случае длительных сроков инкубации (72 часа) высокие концентрации (20 мкМ) исследуемого соединения оказывали подавляющий эффект на клоногенность неопухолевых клеток линии 293. Однако этот эффект был заметно слабее, чем на опухолевых клетках линии MCF-7.
Тот факт, что исследуемое соединение подавляло клоногенность опухолевой клеточной линии MCF-7 клеток сильнее, чем неопухолевой линии 293, может означать некоторую полезную избирательность цитотоксического действия этого препарата.
Предлагаемое изобретение расширяет арсенал средств, обладающих противоклоногенной активностью в отношении опухолевых клеток человека.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
[1] Phukan S, Babu VS, Kannoji A, Hariharan R, Balaji VN. GSK3β: role in therapeutic landscape and development of modulators. Br J Pharm  2010; 160: 1-19.
[2] Luo J. Glycogen synthase kinase 3 β (GSK3β) in tumorigenesis and cancer chemotherapy. Cancer Lett 2009; 273: 194-200.
[3] Osolodkin DI, Palyulin VA, Zefirov NS. Glycogen synthase kinase 3 as an anticancer drug target: novel experimental findings and trends in the design of inhibitors. Curr Pharm Design 2013; 19: 665-679.
[4] Rinnab L, Schutz SV, Diesch J, Schmid E, Kufer R, Hautmann RE, Spindler KD, Cronauer MV. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 in androgen-responsive prostate cancer cell lines: are GSK inhibitors therapeutically useful? Neoplasia  2008; 10, 624-633.
[5] Gos A, Al-Husein B, Katsanevas K, Steinbach A, Lou U, Sabbineni H, DeRemer DL, Somanath PR. Targeting Src-mediated Tyr216 phosphorylation and activation of GSK-3 in prostate cancer cells inhibit prostate cancer progression in vitro and in vivo. Oncotarget 2014; 5, 775-787.
[6] Azoulay-Alfaguter I, Elya R, Avrahami L, Katz A, Eldar-Finkelman H. Combined regulation of mTORC1 and lysosomal acidification by GSK-3 suppresses autophagy and contributes to cancer cell growth. Oncogene 2014; doi: 10.1038/onc.2014.390. [Epub ahead of print].
[7]  Vincent EE, Elder DJ, O’Flaherty L, Pardo OE, Dzien P, Phillips L, Morgan C, Pawade J, May MT, Sohail M, Hetzel MR, Seckl MJ, Tavare JM. Glycogen synthase kinase 3 protein kinase activity is frequently elevated in human non-small cell lung carcinoma and supports tumour cell proliferation. PloS One 2014; 9(12):e114725. doi: 10.1371/journal.pone.0114725.  eCollection 2014.
[8] Yoshino Y, Suzuki M, Takahashi H, Ishioka C. Inhibition of invasion by glycogen synthase kinase-3 beta inhibitors through dysregulation of actin re-organization via down-regulation of WAVE2. Biochem Biophys Res Commun 2015; doi: 10.1016/j.bbrc.2015.06.142. [Epub ahead of print].
[9] Jiang Y, Dai J, Zhang H, Sottnik JL, Keller JM, Escott KJ, Sanganee HJ, Yao Z, McCauley LK, Keller ET. Activation of the Wnt pathway through AR79, a GSK3b inhibitor, promotes prostate cancer growth in soft tissue and bone. Mol Cancer Res 2013; 11, 1597-1610.
[10] Koo J, Yue P, Gal AA, Khuri FR, Sun SY. Maintaining glycogen synthase kinase-3 activity is critical for mTOR kinase inhibitors to inhibit cancer cell growth. Cancer Res 2014; 74, 2555-2568.
[11] Marchand B, Arsenault D, Raymond-Fleury A., Boisert FM, Boucher MJ. Glycogen synthase kinase-3 (GSK3) inhibition induces prosurvival autophagic signals in human pancreatic cancer cells. J Biol  Chem  2015; 290, 5592-5605.
[12] Kabakov AE, Kudryavtsev VA, Gabai VL. Methods of cell survival or death determination. Methods Mol Biol 2011; 787, 231-244.
[13] Levenson AS, Jordan VC. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res 1997; 57, 3071-3078.
[14] Gaffney EV. A cell line (HBL-100) established from human breast milk. Cell Tissue Res 1982; 227, 563-568.
[15] Graham FL, Smiley J, Russel WC, Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from adenovirus type 5. J Gen Virol 1977, 36, 59-74.