ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНАЯ СБОРКА ФРАГМЕНТОВ ДНК

1. Способ сборки фрагментов ДНК, включающий,
(а) предоставление молекулы первой ДНК, содержащей последовательность Козак;
(b) предоставление молекулы второй ДНК, содержащей последовательность Козак на одном конце и шестирамочную стоп-последовательность на другом конце;
(с) предоставление молекулы третьей ДНК, содержащей шестирамочную стоп-последовательность;
(d) предоставление молекулы четвертой ДНК, содержащей последовательность линейного вектора; и
(e) сборка продукта вектора с использованием ДНК-фрагментов стадий (а), (b), (c) и (d) в присутствии, по крайней мере, одной рекомбиназы.
2. Способ по п. 1, в котором ДНК-фрагменты получают с использованием ПЦР-амплификации или прямого синтеза ДНК.
3. Способ сборки фрагментов ДНК, включающий,
(а) расщепление молекулы первой ДНК, по крайней мере, одним ферментом рестрикции типа II, в котором продукт расщепления молекулы первой ДНК содержит последовательность Козак;
(b) расщепление молекулы второй ДНК, по крайней мере, одним ферментом рестрикции типа II, в котором продукт расщепления молекулы второй ДНК содержит последовательность Козак на одном конце и шестирамочную стоп-последовательность на другом конце;
(c) расщепление молекулы третьей ДНК, по крайней мере, одним ферментом рестрикции типа II, в котором продукт расщепления молекулы третьей ДНК содержит шестирамочную стоп-последовательность;
(d) расщепление молекулы четвертой ДНК, по крайней мере, одним ферментом рестрикции типа II, в котором продукт расщепления молекулы четвертой ДНК содержит последовательность вектора; и
(e) сборку продукта вектора с использованием ДНК-фрагментов стадий (а), (b), (c) и (d) в присутствии, по крайней мере, одной рекомбиназы.
4. Способ по п. 1, включающий также обработку продуктов расщепления стадий (а), (b), (c) и (d) ферментом с экзонуклеазной активностью от 3' к 5'.
5. Способ по п. 1, в котором техника ДНК амплификации не применяется.
6. Способ по п. 1, в котором полимеразная цепная реакция не применяется.
7. Способ по п. 1, в котором фермент рестрикции типа II выбирают из группы, состоящей из AcuI, BciVI, BmrI, BseRI, BsrDI, BtsI, MlyI и их комбинаций.
8. Способ по п. 1, в котором молекула четвертой ДНК содержит летальный ген.
9. Способ по п. 8, в котором летальным геном является ccdB.
10. Способ по п. 1, в котором последовательность Козак содержит трехрамочную стоп-последовательность на своем 5' конце.
11. Способ по п. 1, в котором последовательность Козак выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NOS 1-43, 64-74 и им комплементарных.
12. Способ по п. 10, в котором трехрамочную стоп-последовательность выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NOS 44-62 и им комплементарных.
13. Способ по п. 1, в котором шестирамочную стоп-последовательность выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NOS 75-80 и им комплементарных.
14. Способ по п. 1, в котором рекомбиназу выбирают из группы, состоящей из Int, Cre, Flp, IHF, Xis, γδ, Tn3 резолвазы, Hin, Gin, Cin, Fis, TndX, XerC, XerD и Res.
15. Способ по п. 1, в котором продукт расщепления молекулы четвертой ДНК включает селективный маркер и селективный маркер выбирают из группы, состоящей из генов устойчивости к канамицину и ампициллину.
16. Система сборки фрагментов ДНК, включающая
(а) ДНК-фрагмент 1, вырезанный из молекулы первой ДНК с использованием, по крайней мере, одного фермента рестрикции типа II, в котором ДНК-фрагмент 1 содержит последовательность Козак;
(b) ДНК-фрагмент 2, вырезанный из молекулы второй ДНК с использованием, по крайней мере, одного фермента рестрикции типа II, в котором ДНК-фрагмент 2 содержит последовательность Козак на одном конце и шестирамочную стоп-последовательность на другом конце;
(c) ДНК-фрагмент 3, вырезанный из молекулы третьей ДНК с использованием, по крайней мере, одного фермента рестрикции типа II, в котором ДНК-фрагмент 3 содержит шестирамочную стоп-последовательность;
(d) ДНК-фрагмент 4, вырезанный из молекулы четвертой ДНК с использованием, по крайней мере, одного фермента рестрикции типа II, в котором ДНК-фрагмент 4 содержит последовательность вектора; и
(e) по меньшей мере, одну рекомбиназу для сборки продукта вектора с использованием ДНК-фрагментов 1, 2, 3 и 4.
17. Система по п. 16, дополнительно содержащая фермент с экзонуклеазной активностью от 3' к 5'.
18. Система по п. 16, в которой фермент рестрикции типа II выбирают из группы, состоящей из AcuI, BciVI, BmrI, BseRI, BsrDI, BtsI, MlyI и их комбинаций.
19. Система по п. 16, в которой рекомбиназу выбирают из группы, состоящей из Int, Cre, Flp, IHF, Xis, γδ, Tn3 резолвазы, Hin, Gin, Cin, Fis, TndX, XerC, XerD и Res.
20. Система по п. 16, в которой ДНК-фрагмент 4 содержит селективный маркер и селективный маркер выбирают из группы, состоящей из генов устойчивости к канамицину и ампициллину.