БИОМАРКЕРЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СВЯЗАННОГО С ИМПЛАНТОМ РИСКА ПОВТОРНОЙ ОПЕРАЦИИ С ИМПЛАНТОМ ИЗ-ЗА АСЕПТИЧЕСКОГО РАСШАТЫВАНИЯ
BIOMARKERS FOR DIAGNOSING IMPLANT-RELATED RISK OF REPEATED IMPLANT SURGERY DUE TO ASEPTIC LOOSENING

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение, в общем, относится к области связанного с имплантом риска повторной операции, в частности, связанного с имплантом риска повторной операции, не вызванной инфекцией или реакцией металла на металле. Согласно настоящему изобретению предложены способы диагностики связанного с имплантом риска повторной операции, применение наборов для таких диагностических целей и композиции для применения в лечении связанного с имплантом риска повторной операции, в частности, связанного с имплантом риска повторной операции, не вызванной инфекцией или реакцией металла на металле.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В мире ежегодно проводят приблизительно 1,5 миллиона операций по тотальному замещению тазобедренного сустава (тотальная артропластика тазобедренного сустава - ТНА). Это число вероятно возрастет в мире до приблизительно 3 миллионов в год в пределах следующего десятилетия. Кроме того, другие типы имплантов и замен суставов, как, например, колена, плеча, стопы, голеностопа, кисти, запястья, локтя, черепно-челюстно-лицевого и зубов, также используются в возрастающих количествах.
Протезы для ТНА часто состоят из двух компонентов. Искусственный карман или вертлужный компонент (Фиг. 3) располагается в подготовленной полости в вертлужной впадине таза (Фиг. 2 и 3). Он соединяется с бедреным компонентом, состоящим из головки бедра, присоединенной к бедренной ножке (Фиг. 3), которая вводится в подготовленную полость в костном мозге бедра. Существует много вариаций обоих компонентов, и они могут удерживаться цементами или без них. Целями ТНА являются увеличение подвижности, улучшение функции тазобедренного сустава и ослабление боли. Тем не менее, несмотря на успех в качестве хирургической процедуры, ТНА все еще рассматривается как лечение последней надежды, так как она требует резекции всей головки бедра. Именно это большое изменение бедра часто делает сложной повторную операцию по замене.
В то время как процедура ТНА имеет выживаемость протезов 90% или более у пожилых (которые обычно не переживают имплант), время жизни имплантов значительно короче у молодых, более активных пациентов. В результате более молодые пациенты сталкиваются с перспективой многих сложных повторных операций за их время жизни. Типично протез тазобедренного сустава работает в течение по меньшей мере 15-20 лет до необходимости замены. Ожидаемая частота отказов протезных имплантов за первые 10 лет составляет приблизительно 3-5%, и частота отказов увеличивается в течение следующих 10 лет. В Норвегии данные 2012 г. демонстрируют то, что повторные операции составляют 8,5% всех операций по протезированию тазобедренного сустава.
Остеолиз и последующее асептическое расшатывание сустава, которые оба классифицируются как условия зарождения патологии, являются самыми обычными причинами для повторной операции на суставе. На ранней стадии данное состояние типично ассоциировано с микродвижением на поверхности контакта импланткость, вызывающим прогрессирующее разрушение кости. Исходно данное состояние часто является безболезненным и, из-за этого бессимптомного интервала, потеря костного вещества может быть существенной перед тем, как пациенты обратятся за помощью. К данному моменту условия для процедуры повторной операции могут быть неблагоприятными, и ожидаемое время жизни для нового протеза снижается. Кроме того, если зарождение патологии диагностируется до прогрессирования до более острой патологии, тогда состояние может быть благоприятным для лечения, например, с использованием противовоспалительных лекарственных средств. Если лечение является успешным, может не потребоваться дальнейший переход с использованием процедуры повторной операции.
Таким образом, существует потребность в способах, которые обеспечивают диагностику ранней стадии расшатывания импланта, т.е. зарождения патологии, даже у бессимптомных пациентов.
Кроме того, также имеется потребность в рентабельных способах, которые обеспечивают идентификацию пациентов, которые подвергаются риску повторной операции; т.е. идентификации тех пациентов, которые нуждаются в лечении.
Диагностические и прогностические биомаркеры имеют потенциал давать ранний, точный и неинвазивный диагноз данных нежелательных результатов, а также помогать разрабатывать вмешательства для предупреждения некоторых из этих осложнений, особенно асептического расшатывания, смещения импланта и остеолиза. В целом ряде исследований было приведено обсуждение применения биомаркеров для диагностики асептического расшатывания.
Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2016; 9(2): 1954-1960 свидетельствует о том, что морфология и активность остеокластов в периферической крови и уровни экспрессии МСР-1 можно использовать для ранней постановки диагноза асептического расшатывания после тотального замещения тазобедренного сустава.
В Int. Orthop. 2013 Jun; 37(6): 1025-1031 дается ссылка на исследование, показывающее то, что у пациентов с асептическим расшатыванием протеза имелось значительное изменение плазматического уровня многих биомаркеров, включая PICP, OPG, TNF-α (фактор некроза опухолей-альфа), NTX, RANKL и IL-1β (интерлейкин-1бета).
В J Arthroplasty. 2005 Dec; 20(8): 1049-54 продемонстрировано то, что и IL-6 (интерлейкин-6), и IL-8 ассоциированы с асептическим расшатыванием.
Даже несмотря на то, что в предшествующем уровне техники обсуждались подходящие биомаркеры для диагностики расшатывания импланта после тотального замещения тазобедренного сустава, все еще существует потребность в дополнительных биомаркерах и, в частности, в биомаркерах, которые легко выявляются на ранней стадии расшатывания импланта даже у бессимптомных пациентов.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения удовлетворили данную потребность посредством идентификации биомаркеров и, в частности, кальпротектина, S100A8 и S100A9, которые обеспечивают постановку диагноза расшатывания импланта на ранней стадии даже у бессимптомных пациентов.
Способы по изобретению
Согласно настоящему изобретению в первом аспекте предложен способ диагностирования связанного с имплантом риска повторной операции, включающий следующие стадии:
- предоставление биологического образца от субъекта с имплантом;
- выявление в данном биологическом образце уровня по меньшей мере одного полипептида, выбранного из группы, состоящей из кальпротектина, S100A8 и S100A9;
где биологический образец представляет собой синовиальную жидкость, предпочтительно синовиальную жидкость из места импланта.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению по меньшей мере один полипептид представляет собой один полипептид, выбранный из группы, состоящей из кальпротектина, S100A8 и S100A9. В другом воплощении согласно настоящему изобретению по меньшей мере один полипептид представляет собой два полипептида, причем каждый выбран из группы, состоящей из кальпротектина, S100A8 и S100A9; причем два данных полипептида не являются идентичными. В другом воплощении согласно настоящему изобретению по меньшей мере один полипептид представляет собой три полипептида, причем каждый выбран из группы, состоящей из кальпротектина, S100A8 и S100A9; причем три данных полипептида не являются идентичными.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению уровень по меньшей мере одного полипептида меньше 4 мг/л указывает на диагноз отсутствия связанного с имплантом риска повторной операции, как, например, на стабильный имплант.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению больший или равный 4 мг/л уровень по меньшей мере одного полипептида указывает на диагноз связанного с имплантом риска повторной операции.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению субъект, у которого диагностирован связанный с имплантом риск повторной операции, представляет собой субъекта, страдающего либо от зарождения патологии, либо от острой патологии.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению уровень находится в интервале 1-50 мг/л, как, например, в интервале 4-50 мг/л, 5-50 мг/л, 6-50 мг/л, 7-50 мг/л или 8-50 мг/л по меньшей мере одного полипептида, указывая на связанный с имплантом риск повторной операции и, в частности, на зарождение патологии.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению уровень находится в интервале 1-50 мг/л, как, например, в интервале 5-50 мг/л, 10-50 мг/л, 20-50 мг/л, 30-50 мг/л, 1-45 мг/л, 1-40 мг/л, 1-35 мг/л, 1-30 мг/л или 1-25 мг/л по меньшей мере одного полипептида, указывая на связанный с имплантом риск повторной операции и, в частности, на зарождение патологии.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению зарождение патологии выбрано из группы, состоящей из асептического расшатывания, смещения импланта, остеолиза и/или их любой комбинации.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению уровень по меньшей мере одного полипептида больше 50 мг/л, как, например, больше 55 мг/л, больше 60 мг/л, больше 70 мг/л, больше 80, больше 90 мг/л или больше 100 мг/л указывает на острую патологию.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению уровень по меньшей мере одного полипептида больше 50 мг/л представляет собой уровень 51 -1000 мг/л, 55-1000 мг/л, 60-1000 мг/л, 70-1000 мг/л, 80-1000 мг/л, 90-1000 мг/л, 100-1000 мг/л, 51-900 мг/л, 51-850 мг/л, 51-800 мг/л, 51-700 мг/л, 51-650 мг/л, 51-600 мг/л, 51-550 мг/л или 51-500 мг/л.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению острая патология выбрана из группы, состоящей из инфекции, ассоциированной с имплантом, и реакции металла не металле, в частности, инфекции, ассоциированной с имплантом.
Согласно конкретным воплощениям инфекция, ассоциированная с имплантом, выбрана из группы, состоящей из септического расшатывания, хронической инфекции сустава, биопленочной инфекции и/или их любой комбинации.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению способ предназначен для осуществления диагностики зарождения патологии.
Согласно конкретным воплощениям связанный с имплантом риск повторной операции, в частности, зарождение патологии, выбран из группы, состоящей из воспалительного заболевания сустава, остеопороза, асептического расшатывания, синовита/синовиального воспаления, износа и обломков частиц, неправильного выравнивания импланта, перелома, ALVAL, стабильности сустава и/или импланта, включая нестабильность одного или обоих.
Согласно конкретным воплощениям данный способ не предназначен для диагностики острой патологии.
Согласно другим конкретным воплощениям данный способ предназначен для диагностики связанного с имплантом риска повторной операции, который не вызван ассоциированной с имплантом инфекцией. Ассоциированная с имплантом инфекция предпочтительно выбрана из группы, состоящей из септического расшатывания, хронической инфекции сустава, биопленочной инфекции и/или их любой комбинации.
Согласно конкретным воплощениям данный способ предназначен для диагностики связанного с имплантом риска повторной операции, которая не вызвана реакцией металла на металле.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению данный способ дополнительно включает стадию сравнения уровня по меньшей мере одного полипептида в биологическом образце с уровнем по меньшей мере одного полипептида в контрольном образце. Данный контрольный образец предпочтительно представляет собой образец синовиальной жидкости от субъекта, не страдающего от связанного с имплантом риска повторной операции.
Согласно конкретным воплощениям субъект, подлежащий диагностике, не может проявлять каких-либо заметных симптомов, с которыми ассоциирован связанный с имплантом риск повторной операции.
Согласно конкретным воплощениям субъект, подлежащий диагностике, представляет собой бессимптомного субъекта.
Согласно конкретным воплощениям субъект, подлежащий диагностике, не имеет каких-либо симптомов связанного с имплантом риска повторной операции.
Согласно конкретным воплощениям биологический образец представляет собой синовиальную жидкость, отобранную в месте импланта.
Согласно конкретным воплощениям имплант представляет собой имплант сустава. Согласно конкретным воплощениям имплант представляет собой протез. Согласно конкретным воплощениям имплант представляет собой протез сустава. Согласно конкретным воплощениям имплант представляет собой протез тазобедренного сустава, и биологический образец представляет собой синовиальную жидкость тазобедренного сустава. Согласно другим конкретным воплощениям имплант представляет собой протез колена, и биологический образец предпочтительно представляет собой синовиальную жидкость коленного сустава.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению по меньшей мере один полипептид, подлежащий выявлению, представляет собой S100A9. В одном воплощении согласно настоящему изобретению по меньшей мере один полипептид, подлежащий выявлению, представляет собой кальпротектин. В одном воплощении согласно настоящему изобретению по меньшей мере один полипептид, подлежащий выявлению, представляет собой S100A8.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению уровень по меньшей мере одного полипептида выявляется подходящим анализом для выявления по меньшей мере одного полипептида в образце синовиальной жидкости, предпочтительно данным анализом является иммунохроматографический анализ или анализ ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), более предпочтительно, анализ ELISA.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению уровень по меньшей мере одного полипептида выявляется в анализе ELISA, причем данный анализ ELISA включает следующие стадии:
- введение биологического образца на твердую подложку, покрытую моноклональными антителами, специфичными в отношении кальпротектина, S100A8 или S100A9;
- удаление части биологического образца, которая не связывается с моноклональными антителами, от твердой подложки;
- введение на твердую подложку конъюгата фермента, содержащего меченные ферментом поликлональные антитела, специфичные в отношении кальпротектина, S100A8 или S100A9, причем фермент предпочтительно представляет собой щелочную фосфатазу;
- удаление части конъюгата фермента, которая не связывается с кальпротектином, S100A8 или S100A9;
- введение на твердую подложку субстрата фермента; причем данный субстрат фермента содержит субстрат для конъюгата фермента, причем данный субстрат фермента предпочтительно представляет собой п-нитрофенилфосфат; и
- измерение количества субстрата фермента, который был подвергнут ферментативной обработке конъюгатом фермента за заданное количество времени после введение субстрата фермента на твердую подложку;
причем данная твердая подложка предпочтительно представляет собой планшет для микротитрования.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению диагноз основан исключительно на выявленном уровне по меньшей мере одного полипептида.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению предоставляются по меньшей мере два биологических образца, причем данные два биологических образца происходят от разных субъектов; причем указанные субъекты имеют имплант; при условии, что по меньшей мере один из указанных субъектов страдает от зарождения патологии. Уровень по меньшей мере одного полипептида, выбранного из группы, состоящей из кальпротектина, S100A8 и S100A9, выявляется в биологических образцах; причем данные биологические образцы представляют собой синовиальную жидкость.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению данный способ дополнительно включает группировку и распределение субъектов согласно диагнозу, идентификацию прогрессирующих и непрогресирующих, проведение возможностей лечения и идентификацию ответа на лечение.
Применение набора
Согласно настоящему изобретению во втором аспекте предложено применение набора для осуществления диагностики связанного с имплантом риска повторной операции у субъекта с имплантом, причем данный набор подходит для выявления уровня по меньшей мере одного полипептида, выбранного из группы, состоящей из кальпротектина, S100A8 и S100A9, в биологическом образце; где данный биологический образец представляет собой синовиальную жидкость, предпочтительно отобранную в месте импланта.
В предпочтительном воплощении второй аспект изобретения относится к применению набора для осуществления диагностики связанного с имплантом риска повторной операции у субъекта с имплантом согласно способу по первому аспекту настоящего изобретения.
В одном воплощении согласно второму аспекту изобретения данный набор представляет собой набор для проведения анализа ELISA или набор для проведения иммунохроматографического анализа.
В предпочтительном воплощении согласно второму аспекту изобретения данный набор представляет собой набор для проведения анализа ELISA.
В предпочтительном воплощении согласно второму аспекту изобретения данный набор представляет собой набор для проведения анализа ELISA, причем данный анализ ELISA включает следующие стадии:
- введение биологического образца на твердую подложку, покрытую моноклональными антителами, специфичными в отношении кальпротектина, S100A8 и S100A9;
- удаление части биологического образца, которая не связывается с моноклональными антителами, от твердой подложки;
- введение на твердую подложку конъюгата фермента, содержащего меченные ферментом поликлональные антитела, специфичные в отношении кальпротектина, S100A8 или S100A9, причем фермент предпочтительно представляет собой щелочную фосфатазу;
- удаление части конъюгата фермента, которая не связывается с кальпротектином, S100A8 или S100A9;
- введение на твердую подложку субстрата фермента; причем данный субстрат фермента содержит субстрат для конъюгата фермента, причем данный субстрат фермента предпочтительно представляет собой п-нитрофенилфосфат; и
- измерение количества субстрата фермента, который был подвергнут ферментативной обработке конъюгатом фермента за заданное количество времени после введение субстрата фермента на твердую подложку;
причем данная твердая подложка предпочтительно представляет собой планшет для микротитрования.
В одном воплощении согласно второму аспекту данного изобретения набор для проведения анализа ELISA содержит:
твердую подложку, покрытую моноклональными антителами, специфичными в отношении кальпротектина, S100A8 или S100A9;
- по меньшей мере один промывочный раствор;
- конъюгат фермента, содержащий меченные ферментом поликлональные антитела, специфичные в отношении кальпротектина, S100A8 или S100A9, причем данный фермент предпочтительно представляет собой щелочную фосфатазу; и
- субстрат фермента, причем данный субстрат фермента содержит субстрат для конъюгата фермента, причем данный субстрат фермента предпочтительно представляет собой п-нитрофенилфосфат.
Композиция для применения
Согласно настоящему изобретению в третьем аспекте предложена композиция для применения в лечении субъекта, у которого был диагностирован связанный с имплантом риск повторной операци, согласно способу по п. 1, причем данная композиция содержит по меньшей мере один агент, выбранный из группы, состоящей из антиостеолитического средства, противовоспалительного средства и их любой комбинации.
В одном воплощении согласно третьему аспекту изобретения у субъекта, подлежащего лечению, было диагностировано зарождение патологии.
В другом воплощении согласно третьему аспекту изобретения данная композиция содержит по меньшей мере один агент, который подходит для лечения состояния, которое связано с нежелательным высоким уровнем TNFα и/или нежелательным высоким уровнем IL1β.
В другом воплощении согласно третьему аспекту изобретения данная композиция содержит по меньшей мере один агент, выбранный из группы, состоящей из бифосфонатов, ацетаминофенов, NSAID (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство), диклофенака, макролидов, тетрациклинов, амфениколов, цефалоспоринов, сульфонамидов, триметопримов, линкозамидов, аминогликозидов, квинолонов, тиграциклинов, ванкомицина и аналогов ванкомицина, гентамицина, глюкозаминов, хондроитинов, аспирина, кортизона и их любой комбинации.
В другом воплощении согласно третьему аспекту изобретения субъект, подлежащий лечению, не может демонстрировать каких-либо заметных симптомов, с которыми ассоциирован связанный с имплантом риск повторной операции.
В другом воплощении согласно третьему аспекту изобретения субъект, подлежащий лечению, представляет собой бессимптомного субъекта.
В другом воплощении согласно третьему аспекту изобретения субъект, подлежащий лечению, не имеет каких-либо симптомов связанного с имплантом риска повторной операции.
В другом воплощении согласно третьему аспекту изобретения субъект, подлежащий лечению, страдает от зарождения патологии.
В другом воплощении согласно третьему аспекту изобретения связанный с имплантом риск повторной операции представляет собой либо острую патологию, либо зарождение патологии; и у субъекта, подлежащего лечению, не была диагностирована острая патология.
В другом воплощении согласно третьему аспекту изобретения у субъекта, подлежащего лечению, был диагностирован связанный с имплантом риск повторной операции, который не вызван ассоциированной с имплантом инфекцией. В одном воплощении ассоциированная с имплантом инфекция выбрана из группы, состоящей из септического расшатывания, хронической инфекции сустава, биопленочной инфекции и/или их любой комбинации.
В другом воплощении согласно третьему аспекту изобретения у субъекта, подлежащего лечению, был диагностирован связанный с имплантом риск повторной операции, который не вызван реакцией металла на металле.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1 иллюстрирует здоровый тазобедренный сустав.
Фиг. 2 иллюстрирует здоровый тазобедренный сустав по сравнению с изношенным суставом с оголенной бедренной костью, которая может находиться в прямом контакте с костью таза.
Фиг. 3 иллюстрирует имплант для тотального замещения тазобедреного сустава.
Фиг. 4А иллюстрирует протез тазобедреного сустава, демонстрирующий асептическое расшатывание (стрелки).
Фиг. 4В иллюстрирует смещенный протез тазобедреного сустава.
Фиг. 5 иллюстрирует результаты Примера 1 и дает обзор состояний, которые могут быть диагностированы способом по настоящему изобретению. Группа «с отсутствием риска повторной операции» представляет пациентов со стабильными имплантами, которые не нуждаются в лечении. Группа «с риском повторной операции» представляет пациентов с имплантами, которые вероятно нуждаются в лечении. Кроме того, группа «с риском повторной операции» подразделяется на две подгруппы. Группа «с зарождением патологии» представляет пациентов, страдающих от ранней стадии расшатывания. Данная группа может подвергаться лечению лекарственным средством, посредством этого, увеличивая вероятность избежания повторного хирургического вмешательства. Группа «острой патологии» представляет пациентов, страдающих от поздней стадии расшатывания и вероятно испытывающих немедленную потребность в повторном хирургическом вмешательстве. Каждое число на абсциссе относится к образцу от одного пациента. Числа на оси Y относятся к количеству кальпротектина (мг/л) в каждом образце.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Если конкретно не определено в данном документе, все использованные технические и научные термины имеют то же самое значение, которое обычно понятно специалисту в областях биохимии и биологии.
Все способы и материалы, аналогичные или эквивалентные способам и материалам, описанным в данном документе, могут использоваться в воплощении на практике или в тестировании настоящего изобретения, причем в данном документе описываются подходящие способы и материалы. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые в данном документе, включаются посредством ссылки во всей их полноте. В случае конфликта, настоящее описание изобретения, включая определения, будет иметь преимущество.
Когда в данном документе утверждается числовая граница или интервал, конечные точки являются включенными. Также все значения и подинтервалы, находящиеся в пределах числовой границы или интервала, являются конкретно включеными, как если бы это было прямо изложено.
В мире ежегодно проводят приблизительно 1,5 миллиона операций по тотальному замещению тазобедренного сустава (тотальная артропластика тазобедренного сустава - ТНА). Ожидаемая частота отказов протезных имплантов за первые 10 лет составляет приблизительно 3-5%, и частота отказов увеличивается в течение следующих 10 лет. Остеолиз и последующее асептическое расшатывание сустава, которые оба принадлежат к группе «зарождения патологии», являются самыми обычными причинами для повторной операции на суставе. На ранней стадии данное состояние типично ассоциировано с микродвижением на поверхности контакта имплант-кость, вызывающем прогрессирующее разрушение кости. Исходно данное состояние часто является безболезненным и, из-за этого бессимптомного интервала, потеря костного вещества может быть существенной перед тем, как пациенты обратятся за помощью. К данному моменту условия для поцедуры повторной операции могут быть неблагоприятными, и ожидаемое время жизни для нового протеза снижается. Таким образом, существует потребность в способах, которые обеспечивают диагностику ранней стадии расшатывания импланта даже у бессимптомных пациентов.
Кроме того, также имеется потребность в рентабельных способах, которые обеспечивают идентификацию пациентов, которые подвергаются риску повторной операции; т.е. в отделении пациентов, которые нуждаются в лечении, от пациентов со стабильным имплантом, которые не нуждаются в лечении.
Авторы настоящего изобретения удовлетворили данную потребность посредством идентификации биомаркеров и, в частности, кальпротектина, S100A8 и S100A9, которые обеспечивают постановку диагноза расшатывания импланта на ранней стадии даже у бессимптомных пациентов.
Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к способу диагностирования связанного с имплантом риска повторной операции, включающему следующие стадии:
- предоставление биологического образца от субъекта с имплантом;
- выявление в данном биологическом образце уровня по меньшей мере одного полипептида, выбранного из группы, состоящей из кальпротектина, S100A8 и S100A9;
где биологический образец представляет собой синовиальную жидкость, предпочтительно синовиальную жидкость из места импланта.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению биологический образец представляет собой синовиальную жидкость, отобранную в месте импланта, например, синовиальную жидкость от искусственного сустава.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению имплант представляет собой имплант сустава. В другом воплощении согласно настоящему изобретению имплант представляет собой протез, такой как протез сустава и, в частности, протез тазобедренного сустава.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению имплант представляет собой протез тазобедренного сустава, и биологический образец представляет собой синовиальную жидкость тазобедренного сустава.
Кальпротектин принадлежит к семейству белков S100. Данное название возникает из-за того, что они являются устойчивыми к осаждению сульфатом аммония, таким образом, что они являются растворимыми даже в на 100 процентов насыщенном (таким образом, S100) растворе сульфата аммония. Общей характеристикой данных белков является то, что они могут связывать кальций и цинк и, посредством этого, становятся устойчивыми к ферментативной деградации; это особенно верно для кальпротектина.
2+
Кальпротектин представляет собой комплекс белков млекопитающих S100A8 и S100A9. Каждый из S100A8 и S100A9 содержит два сайта связывания Са, и кальпротектин способен связывать всего четыре иона кальция на димер или восемь ионов кальция на тетрамер. Связывание кальция индуцирует конформационное изменение в комплексе, которое улучшает его аффинность в отношении переходных металлов и стимулирует образование тетрамера. С каждым димером кальпротектина S100A8-S100A9 могут связываться максимум два иона переходных металлов. Данное секвестрирование металлов обеспечивает противомикробные свойства комплекса.
Согласно конкретным воплощениям по меньшей мере один полипептид, подлежащий выявлению, представляет собой кальпротектин. Согласно конкретным воплощениям по меньшей мере один полипептид, подлежащий выявлению, представляет собой S100A8. Согласно конкретным воплощениям по меньшей мере один полипептид, подлежащий выявлению, представляет собой S100A9.
Специалист в данной области легко узнает как выявлять кальпротектин и его мономеры в биологическом образце. В WO 2013/132347, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей ее полноте, раскрыто применение анализа ELISA для определения концентрации кальпротектина в биологическом образце. Альтернативой применению анализа ELISA является хорошо известный иммунохроматографический анализ (LFA).
В одном воплощении согласно настоящему изобретению уровень по меньшей мере одного полипептида выявляется подходящим анализом для выявления по меньшей мере одного полипептида в образце синовиальной жидкости, предпочтительно данным анализом является иммунохроматографический анализ или анализ ELISA, более предпочтительно - анализ ELISA.
В случае анализа ELISA данный анализ предпочтительно включает следующие стадии:
- введение биологического образца на твердую подложку, покрытую моноклональными антителами, специфичными в отношении кальпротектина, S100A8 и S100A9;
- удаление части биологического образца, которая не связывается с моноклональными антителами, от твердой подложки;
- введение на твердую подложку конъюгата фермента, содержащего меченные ферментом поликлональные антитела, специфичные в отношении кальпротектина, S100A8 или S100A9, причем фермент предпочтительно представляет собой щелочную фосфатазу;
- удаление части конъюгата фермента, который не связывается с кальпротектином, S100A8 или S100A9;
- введение на твердую подложку субстрата фермента; причем данный субстрат фермента содержит субстрат для конъюгата фермента, причем данный субстрат фермента предпочтительно представляет собой п-нитрофенилфосфат; и
- измерение количества субстрата фермента, который был подвергнут ферментативной обработке конъюгатом фермента за заданное количество времени после введение субстрата фермента на твердую подложку;
причем данная твердая подложка предпочтительно представляет собой планшет для микротитрования.
Кальпротектин составляет вплоть до 60% от содержания растворимого белка цитозоля нейтрофила. Именно количество секретированного кальпротектина, S100A8 и/или S100A9 подлежит выявлению, а не внутриклеточное содержание в интактных клетках, присутствующих в образце. Таким образом, существенным является то, чтобы образцы, содержащие клетки, не подвергались обработке, которая вызвала бы высвобождение внутриклеточного кальпротектина, S100A8 и/или S100A9.
Таким образом, в одном воплощении согласно настоящему изобретению по меньшей мере один полипептид, подлежащий выявлению, представляет собой кальпротектин, S100A8 и/или S100A9, который был секретирован клетками. В другом воплощении согласно настоящему изобретению по меньшей мере один полипептид, подлежащий выявлению, не представляет собой кальпротектин, S100A8 и/или S100A9, который был частью внутриклеточного содержимого интактных клеток в момент отбора проб.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению диагноз основан только на выявленном уровне по меньшей мере одного полипептида.
Термин «субъект» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к животному и, в частности, к млекопитающему, такому как человек. В одном воплощении согласно настоящему изобретению, субъект, подлежащий диагностике, представляет собой бессимптомного субъекта, такого как бессимптомное животное и, в частности, бессимптомное млекопитающее, такое как бессимптомный человек. Бессимптомный человек, например, может представлять собой бессимптомного пациента.
В контексте настоящего изобретения термин «имплант» относится к медицинскому импланту, который имплантируется в живой организм, как, например, людям. Медицинский имлант представяет собой созданное человеком устройство, в отличие от трансплантата, который представляет собой трансплантированную биомедицинскую ткань.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению термин «имплант» относится к ортопедическому импланту. Ортопедический имплант представляет собой медицинское устройство, изготовленное для замены отсутствующего сустава или кости, или для поддержки поврежденной кости. Медицинский имплант типично изготовляют с использованием нержавеющей стали и титановых сплавов для прочности, и пластмассовое покрытие, которое делается на нем, действует в качестве искусственного хряща. Внутренняя фиксация представляет собой операцию в ортопедии, которая включает хирургическое внедрение имплантов с целью ремонта кости. Среди самых обычных типов медицинских имплантов находятся шпильки, стержни, винты и пластинки, используемые для заякоривания сломанных костей во время их заживления.
В одном предпочтительном воплощении термин «имплант» относится к медицинскому устройству, изготовленному для замены отсутствующего сустава, такому как протез сустава, и, в частности, протез тазобедренного сустава.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению меньший 4 мг/л уровень по меньшей мере одного полипептида указывает на диагноз отсутствия связанного с имплантом риска повторной операции, т.е. на стабильный имплант. Если у пациента не диагностирован связанный с имплантом риск повторной операции, данный имплант является стабильным, и дополнительная медицинская проверка не является необходимой.
В контексте настоящего изобретения любая ссылка на конкретное количество по меньшей мере одного полипептида (например, меньше, чем 4 мг/л) относится к конкретному количеству, измеренному посредством набора для ELISA для кальпротектина (ALP (щелочная фосфатаза)) CALPROLAB™. Данный набор для ELISA для кальпротектина (ALP) CALPROLAB™ описывается далее в Примере 1. Другими словами, если говорится, что образец содержит 4 мг/л кальпротектина, данный образец содержит 4 мг/л кальпротектина при измерении набором для ELISA для кальпротектина (ALP)) CALPROLAB™, на который дается ссылка в Примере 1.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению уровень, больший или равный 4 мг/л по меньшей мере одного полипептида, указывает на диагноз связанного с имплантом риска повторной операции. Уровень по меньшей мере одного полипептида относится к уровню, измеренному набором для ELISA для кальпротектина (ALP)) CALPROLAB™, на который дается ссылка в Примере 1. Пациенты, страдающие от связанного с имплантом риска повторной операции, имеют повышенный риск расшатывания импланта и должны направляться к специалисту для дополнительной медицинской проверки.
Дополнительная медицинская проверка может выявлять, находится ли пациент на ранней стадии расшатывания, т.е. зарождения патологии, или острой патологии. В то время как острая патология требует повторного хирургического вмешательства, пациенты, имеющие зарождение патологии, могут получать преимущество от лекарственной терапии. Если лекарственная терапия не является успешной, на более поздней стадии может потребоваться повторное хирургическое вмешательство.
В контексте настоящего изобретения подразумевается то, что термин «повторное хирургическое вмешательство» означает замену импланта, т.е. замену протеза.
Таким образом, в другом воплощении согласно настоящему изобретению субъект, у которого диагностирован связанный с имплантом риск повторной операции, представляет собой субъекта, страдающего либо от зарождения патологии, либо от острой патологии (см. Фиг. 5).
Неожиданно, авторы настоящего изобретения открыли то, что результаты способа диагностирования связанного с имплантом риска повторной операции также могут указывать на то, страдают ли пациенты, страдающие от связанного с имплантом риска повторной операции, от ранней стадии расшатывания, т.е. зарождения патологии, или от острой патологии.
Таким образом, в другом воплощении согласно настоящему изобретению уровень по меньшей мере одного полипептида в интервале 4-50 мг/л указывает на зарождение патологии. Термин «зарождение патологии» относится к ранней стадии расшатывания протеза, которое потребует повторной операции с имплантом при оставлении без лечения. Это состояние типично ассоциировано с микродвижением на поверхности контакта имплант-кость, вызывающим прогрессирующее разрушение кости. Исходно данное состояние часто является безболезненным и, из-за этого бессимптомного интервала, потеря костного вещества может быть существенной перед тем, как пациенты обратятся за помощью. Асептическое расшатывание (Фиг. 4А), смещение импланта (Фиг. 4В), остеолиз и/или их любая комбинация являются примерами условий зарождения патологии.
Асептическое расшатывание характеризуется плохо васкуляризованной соединительной тканью, в которой доминируют фибробласты и макрофаги. Затем секреция провоспалительных факторов, желатиназ и протеаз способствует околопротезному остеолизу и поломке импланта сустава. Асептическое расшатывание может быть результатом неадекватной исходной фиксации, механической потери фиксации с течением времени или биологической потери фиксации, вызванной индуцированным частицами остеолизом вокруг импланта.
Термин «остеолиз», в общем, относится к общей проблеме для замещений искусственными суставами, как, например, тотальных замещений тазобедренного сустава, тотальных замещений коленного сустава и тотальных замещений плечевого сустава. Существует несколько биологических механизмов, которые могут приводить к остеолизу. При тотальном замещении тазобедренного сустава общепринятое объяснение остеолиза включает частицы износа (изношенная контактная поверхность искусственного шарика и кармана сустава). По мере того как организм пытается вычистить данные частицы износа (типично состоящие из пластмассы и металла), он запускает аутоиммунную реакцию, которая вызывает рассасывание живой ткани кости. Сообщали о том, что остеолиз происходит уже через 12 месяцев после имплантации, и он обычно является прогрессирующим.
Термин «смещение» обычно относится к смещению импланта. Смещение протеза тазобедренного сустава, главным образом, происходит в первые 3 месяца после вставки, главным образом, из-за неполного образования рубца и расслабленных мягких тканей. Заживление мягких тканей, поврежденных или разрезанных во время хирургического вмешательства занимает от восьми до двенадцати недель. На протяжении данного периода шарик тазобедренного сустава может выйти из кармана. Шанс этого уменьшается при вырезании меньшего количества ткани, если вырезанная ткань восстанавливается, и если используются шарики головки большего диаметра. Смещения, происходящие от 3 месяцев до 5 лет после вставки обычно происходят из-за неправильного положения компонентов или дисфункции ближних мышц.
В одном воплощении зарождение патологии выбрано из группы, состоящей из воспалительного заболевания суставов, остеопороза, асептического расшатывания, синовита/синовиального воспаления, износа и обломков частиц, неправильного выравнивания импланта, перелома, ALVAL, стабильности сустава и/или ипланта, включая нестабильность одного или обоих.
Согласно некоторым воплощениям воспалительное заболевание сустава выбрано из группы, состоящей из следующих: болезнь Стилла, развивающаяся у взрослых, анкилозирующий спондилит, боль в спине, болезнь Бехчета, бурсит, болезнь отложения кристаллов кальция пирофосфата (CPPD), синдром канала запястья, хондромаляция надколенника, синдром хронической усталости, комплексный регионарный болевой синдром, периодические синдромы, ассоциированные с криопирином (CAPS), остеохондроз, врожденная дисплазия тазобедренного сустава, болезнь Элерса-Данлоса, семейная средиземноморская лихорадка, фибромиалгия, инфекционная эритема, гигантоклеточный артериит, подагра, гемохроматоз, инфекционный артрит, воспалителный артрит, воспалительное заболевание кишечника, ювенильный артрит, ювенильный дерматомиозит (JD), ювенильный идиопатический артрит (JIA), ювенильная склеродермия, болезнь Кавасаки, волчанка, болезнь Лайма, смешанное поражение соединительной ткани, миозит (вкл. полимиозит, дерматомиозит), остеоартрит, остеопороз, болезнь Паджета, палиндромный ревматизм, надколенно-бедренный болевой синдром, детские ревматические заболевания, детская SLE (системная красная волчанка), ревматическая полимиалгия, псевдоподагра, псориатический артрит, феномен Рейно, реактивный артрит, рефлекторная симпатическая дистрофия, синдром Рейтера, ревматическая лихорадка, ревматизм, ревматоидный артрит, слеродермия, болезнь Шегрена, стеноз позвоночного канала, спондилоартрит, системный ювенильный идиопатический артрит, системная красная волчанка, системная красная волчанка у детей и подростков, системный склероз, височный артериит, тендинит, васкулит и гранулематоз Вегенера.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению уровень по меньшей мере одного полипептида в интервале 4-50 мг/л, как, например, 5-50 мг/л, 10-50 мг/л, 20-50 мг/л или 30-50 мг/л указывает на зарождение патологии. В другом воплощении согласно настоящему изобретению уровень по меньшей мере одного полипептида в интервале 1-45 мг/л, 1-40 мг/л, 1-35 мг/л, 1-30 мг/л или 1-25 мг/л указывает на зарождение патологии.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению уровень по меньшей мере одного полипептида больше 50 мг/л указывает на острую патологию. Острая патология типично представляет собой состояние, которое в клинике классифицируется как ассоциированная с имплантом инфекция и/или реакция металла на металле. Пациенты, страдающие от острой патологии, нуждаются в немедленном повторном хирургическом вмешательстве.
Термин «инфекция, ассоциированная с имплантом» относится к состоянию, типично вызываемому бактериями, которые прикрепляются к поверхности импланта и затем образуют биопленку в месте имплантации. Образование биопленки происходит в несколько этапов, начиная с быстрого прикрепления к поверхности, с последующей многослойной пролиферацией бактериальных клеток и межклеточным прикреплением во внеклеточном полисахаридном матриксе.
Образование биопленок на медицинских устройствах представляет три главные проблемы. Во-первых, бактериальные сообщества на данных поверхностях представляют собой резервуар бактерий, которые могут выделяться в организм, приводя к хронической инфекции. Во-вторых, биопленочные бактерии являются высокоустойчивыми к обработке антибиотиками; следовательно, как только образуются данные бактериальные сообщества, их крайне трудно устранять традиционными противомикробными терапиями. Наконец, так как ответы хозяина и противомикробные терапии часто не способны устранять бактерии, растущие в биопленке, может продуцироваться хронический воспалительный ответ в месте биопленки.
Если прикрепление бактерий происходит до регенерации ткани, защитные механизмы хозяина часто не могут предупреждать колонизацию поверхности некоторыми видами бактерий, которые способны образовать защитный слой биопленки. Следовательно, ингибирование бактериальной адгезии является важным для предупреждения ассоциированной с имплантом инфекции, так как биопленка является исключительно устойчивой как в отношении иммунной системы, так и антибиотиков. Следовательно, для успеха с ортопедическими имплантами материалы имплантов должны быть обитаемыми для клеток, образующих кость (благоприятствуя прикреплению остеобластов), мешать образованию мягкой соединительной ткани (мешая адгезии фибробластов) и быть противоинфекционными (противодействия бактериальной адгезии).
В одном воплощении согласно настоящему изобретению ассоциированная с имплантом инфекция выбрана из группы, состоящей из септического расшатывания, хронической инфекции сустава, биопленочной инфекции и/или любой их комбинации.
Термин «реакция металла на металле» типично относится к условиям, относящимся к высвобождению крошечных металлических частиц или ионов металла из-за износа имплантов, вызывая боль и нарушение здоровья. Причины данных нарушений остаются противоречивыми и могут включать и факторы конструкции, и технические факторы, и факторы, связанные с иммунными ответами пациента (реакции аллергического типа).
В другом воплощении согласно настоящему изобретению уровень по меньшей мере одного полипептида больше 55 мг/л, как, например, больше 60 мг/л, больше 70 мг/л, больше 80 мг/л, больше 90 мг/л или больше 100 мг/л, указывает на острую патологию. В другом воплощении согласно настоящему изобретению уровень по меньшей мере одного полипептида 51-1000 мг/л, 55-1000 мг/л, 60-1000 мг/л, 70-1000 мг/л, 80-1000 мг/л, 90-1000 мг/л, 100-1000 мг/л, 51-900 мг/л, 51-850 мг/л, 51-800 мг/л, 51-700 мг/л, 51-650 мг/л, 51-600 мг/л, 51-550 мг/л или 51-500 мг/л указывает на диагноз острой патологии, как, например, на диагноз инфекции, ассоциированной с имплантом.
Согласно настоящему изобретению предложен новый и легкий способ разделения пациентов на две или более чем две группы и их подгруппы. Характеристика по группам и подгруппам представляет интерес, так как она может функционировать в качестве нового распределения пациентов на группы отвечающих на терапию и не отвечающих на терапию, а также использоваться для повышенной диагностической чувствительности и специфичности.
Таким образом, в одном воплощении согласно первому аспекту настоящего изобретения данный способ дополнительно включает группировку и распределение субъекта на группы согласно его диагнозу, идентификацию прогрессирующих и не прогрессирующих, проведение опций лечения и идентификацию ответа на лечение.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению данный способ предназначен для осуществления диагностики зарождения патологии.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению данный способ не предназначен для осуществления диагностики острой патологии.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению данный способ предназначен для осуществления диагностики связанного с имплантом риска повторной операции, которая не вызвана инфекцией, ассоциированной с имплантом.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению данный способ предназначен для осуществления диагностики связанного с имплантом риска повторной операции, которая не вызвана реакцией металла на металле.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению данный способ дополнительно включает стадию сравнения уровня по меньшей мере одного полипептида в биологическом образце с уровнем по меньшей мере одного полипептида в контрольном образце. Данный контрольный образец предпочтительно представляет собой образец синовиальной жидкости от субъекта, не страдающего от связанного с имплантом риска повторной операции.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению предоставляются по меньшей мере два биологических образца, полученных от разных субъектов; причем указанные субъекты имеют имплант; при условии, что по меньшей мере один из указанных субъектов страдает от зарождения патологии. Уровень по меньшей мере одного полипептида, выбранного из группы, состоящей из кальпротектина, S100A8 и S100A9, выявляется в биологических образцах, представляющих собой синовиальную жидкость.
Второй аспект настоящего изобретения относится к набору для осуществления диагностики связанного с имплантом риска повторной операции у субъекта с имплантом, причем данный набор подходит для выявления уровня по меньшей мере одного полипептида, выбранного из группы, состоящей из кальпротектина, S100A8 и S100A9, в биологическом образце; где данный биологический образец представляет собой синовиальную жидкость, предпочтительно отобранную из места импланта.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению данный набор предназначен для осуществления диагностики связанного с имплантом риска повторной операции у субъекта с имплантом согласно способу по первому аспекту настоящего изобретения.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению данный набор представляет собой набор для проведения анализа ELISA или набор для проведения иммунохроматографического анализа.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению данный набор представляет собой набор для проведения анализа ELISA, где данный анализ ELISA включает следующие стадии:
- введение биологического образца на твердую подложку, покрытую моноклональными антителами, специфичными в отношении кальпротектина, S100A8 и S100A9;
- удаление части биологического образца, которая не связывается с моноклональными антителами, от твердой подложки;
- введение на твердую подложку конъюгата фермента, содержащего меченные ферментом поликлональные антитела, специфичные в отношении кальпротектина, S100A8 или S100A9; причем фермент предпочтительно представляет собой щелочную фосфатазу;
- удаление части конъюгата фермента, которая не связывается с кальпротектином, S100A8 или S100A9;
- введение на твердую подложку субстрата фермента; причем данный субстрат фермента содержит субстрат для конъюгата фермента, причем данный субстрат фермента предпочтительно представляет собой п-нитрофенилфосфат; и
- измерение количества субстрата фермента, которое было подвергнуто ферментативной обработке конъюгатом фермента за заданное количество времени после введение субстрата фермента на твердую подложку;
причем данная твердая подложка предпочтительно представляет собой планшет для микротитрования.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению данный набор представляет собой набор для проведения анализа ELISA, где данный анализ ELISA включает:
твердую подложку, покрытую моноклональными антителами, специфичными в отношении кальпротектина, S100A8 или S100A9;
- по меньшей мере один промывочный раствор;
- конъюгат фермента, содержащий меченные ферментом поликлональные антитела, специфичные в отношении кальпротектина, S100A8 или S100A9, причем данный фермент предпочтительно представляет собой щелочную фосфатазу; и
- субстрат фермента, причем данный субстрат фермента содержит субстрат для конъюгата фермента, причем данный субстрат фермента предпочтительно представляет собой п-нитрофенилфосфат.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению данный набор представляет собой набор для проведения анализа ELISA, где данный анализ ELISA включает следующие стадии:
- введение биологического образца на твердую подложку, покрытую связывающими группировками, такими как антитела и, в частности, моноклональные антитела, специфичные в отношении кальпротектина, S100A8 и S100A9;
- удаление части биологического образца, которая не связывается со связывающими группировками, от твердой подложки;
- введение на твердую подложку конъюгата фермента, содержащего меченные ферментом связывающие группировки, такие как поликлональные антитела, специфичные в отношении кальпротектина, S100A8 или S100A9; причем фермент предпочтительно представляет собой щелочную фосфатазу;
- удаление части конъюгата фермента, которая не связывается с кальпротектином, S100A8 или S100A9;
- введение на твердую подложку субстрата фермента; причем данный субстрат фермента содержит субстрат для конъюгата фермента, причем данный субстрат фермента предпочтительно представляет собой п-нитрофенилфосфат; и
- измерение количества субстрата фермента, которое было подвергнуто ферментативной обработке конъюгатом фермента за заданное количество времени после введение субстрата фермента на твердую подложку;
причем данная твердая подложка предпочтительно представляет собой планшет для микротитрования.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению данный набор представляет собой набор для проведения анализа ELISA, где данный анализ ELISA включает следующие стадии:
- введение биологического образца на твердую подложку, покрытую связывающими группировками (причем данные связывающие группировки предпочтительно не являются мечеными), такими как антитела и, в частности, моноклональные антитела, специфичные в отношении кальпротектина, S100A8 или S100A9;
- удаление части биологического образца, которая не связывается со связывающими группировками, от твердой подложки;
- введение меченых связывающих группировок, специфичных в отношении кальпротектина, S100A8 или S100A9; причем данные меченые связывающие группировки способны продуцировать выявляемый сигнал, пропорциональный концентрации по меньшей мере одного полипептида, подлежащего выявлению;
- удаление части меченых связывающих группировок, которая не связывается с кальпротектином, S100A8 или S100A9;
- измерение выявляемого сигнала для определения уровня по меньшей мере одного полипептида, подлежащего выявлению в биологическом образце.
В одном предпочтительном воплощении связывающие группировки, которые предпочтительно являются немечеными, представляют собой моноклональные антитела, и меченые связывающие группировки представляют собой поликлональные антитела.
rd
Подходящие твердые подложки являются хорошо известными в данной области. Однако одной особенно подходящей подложкой является MaxiSorp™, производимая Nunc A/S и описанная в патенте Соединенных Штатов №4980299, выданном Batz et al., использующая синтетические смолы, такие как полистирол, Luran, полипропилен или поливинилхлорид. Для таких твердых подложек в данной области известны разные форматы; одним особенно подходящим форматом является применение микролуночного планшета с 96 лунками. Дополнительные твердые подложки описываются, например, в D. Wild & W. Kusnezow, «Separation Systems» в The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., 3 ed., Elsevier, Amsterdam, 2005), ch. 10, pp.179-185, включенной в данный документ посредством этой ссылки.
Покрытие твердой подложки связывающими группировками типично проводится способами, известными в данной области. Особенно предпочтительным буфером для покрытия твердой подложки немеченым моноклональным антителом против S100A9 является 0,1 М цитрат натрия, рН 6,0. Типично для покрытия твердой подложки моноклональное антитело используется в концентрации от примерно 1 до 4 пг/мл, предпочтительно примерно 2 пг/мл, в буфере, таком как цитратный буфер, описанный выше. Предпочтительно твердая подложка покрывается паронепроницаемой адгезивной пленкой и хранится при температуре от примерно 0°С до примерно 8°С, предпочтительно при примерно 4°С, в течение периода инкубации от примерно 6 часов до нескольких недель. Предпочтительно период инкубации составляет примерно от 2 до 3 суток. В качестве альтернативы, твердая подложка может храниться при температуре от примерно 9°С до примерно 37°С.
Перед проведением сэндвич-иммуноанализа ELISA твердую подложку промывают для удаления избытка несвязанных антител. Типично твердую подложку промывают традиционным промывочным буфером, таким как фосфатно-солевой буферный раствор. Типично твердую подложку промывают от трех до четырех раз перед проведением анализа.
Термин «связывающая группировка» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к молекуле, комплексу или агрегату, который специфично или селективно связывается с молекулой-, клеткой-, частицей-, тканью- или агрегатом-мишенью. Таким образом, связывающая группировка в отношении кальпротектина относится к молекуле, комплексу или агрегату, который специфично или селективно связывается с кальпротектином. Аналогично, связывающая группировка в отношении S100A8 относится к молекуле, комплексу или агрегату, который специфично или селективно связывается с S100A8, а связывающая группировка в отношении S100A9 относится к молекуле, комплексу или агрегату, который специфично или селективно связывается с S100A9.
5
-1
Термин «специфичное связывание» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к специфичному распознаванию одной молекулы по сравнению с существенно меньшим распознаванием других молекул. Примеры специфичного связывания включают взаимодействия антитело-антиген, взаимодействия фермент-субстрат и тому подобные, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях связывающая группировка может иметь собственную равновесную константу ассоциации (КА) в отношении мишени не меньше, чем примерно 10 М при условиях окружающей среды, таких как рН от примерно 6 до примерно 8 и температура, варьирующая от примерно 0°С до примерно 37°С.
В одном воплощении связывающие группировки представляют собой антитела, фрагменты антител, биспецифичные или другие многовалентные антитела, или другие молекулы или соединения на основе антител. Однако также можно использовать другие связывающие группировки, известные в данной области, такие какаптамеры, авимеры или нацеливающие пептиды.
Термин «антитело» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к иммуноглобулину, который специфично связывается с и, посредством этого, определяется как комплементарный конкретной организации другой молекулы. Антитело может быть моноклональным или поликлональным и может быть получено методиками, которые хорошо известны в данной области, такими как иммунизация хозяина и отбор сыворотки (поликлональное) или посредством получения непрерывной линии гибридных клеток и сбора секретированного белка (моноклональное), или посредством клонирования и экспрессии нуклеотидных последовательностей или их мутагенизированных версий, кодирующих по меньшей мере аминокислотные последовательности, требующиеся для специфичного связывания природных антител. Антитела могут включать полный иммуноглобулин или его фрагмент, причем иммуноглобулины включают разные классы и изотипы, такие как IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3, IgM. Функциональные фрагменты антитела могут включать части антитела, способные сохранять связывание с аналогичной аффинностью по отношению к полноразмерному антителу (например, Fab, Fv и F(ab')2 или Fab'). Кроме того, агрегаты, полимеры и конъюгаты иммуногобулинов или их фрагменты можно использовать, когда это уместно, при условии, что по существу поддерживается аффинность связывания в отношении конкретной молекулы.
Согласно настоящему изобретению предложен новый и простой способ разделения пациентов на две или более чем две группы и их подгруппы. Классификация на группы и подгруппы представляет интерес, так как она может функционировать как новое разделение пациентов на группы отвечающих и не отвечающих на терапию.
Таким образом, третий аспект настоящего изобретения относится к композиции для применения в лечении субъекта, у которого был диагностирован связанный с имплантом риск повторной операции, согласно способу по п. 1, причем данная композиция содержит по меньшей мере один агент, выбранный из группы, состоящей из антиостеолитического агента, противовоспалительного агента и любой их комбинации.
В одном воплощении согласно третьему аспекту настоящего изобретения у субъекта, подлежащего лечению, было диагностировано зарождение патологии, предпочтительно согласно способу по первому аспекту настоящего изобретения.
В одном воплощении согласно третьему аспекту настоящего изобретения композиция содержит по меньшей мере один агент, который подходит для лечения состояния, которое связано с нежелательно высоким уровнем TNFα и/или нежелательно высоким уровнем IL1β.
В одном воплощении согласно третьему аспекту настоящего изобретения композиция содержит по меньшей мере один агент, выбранный из группы, состоящей из бисфосфонатов, ацетаминофенов, NSAID, диклофенака, макролидов, тетрациклинов, амфениколов, цефалоспоринов, сульфонамидов, триметопримов, линкозамидов, аминогликозидов, квинолонов, тиграциклинов, ванкомицина и аналогов ванкомицина, гентамицина, глюкозаминов, хондроитинов, аспирина, кортизона и их любой комбинации.
В одном воплощении согласно третьему аспекту настоящего изобретения субъект, подлежащий лечению, представляет собой бессимптомного субъекта. В другом воплощении субъект, подлежащий лечению, не имеет каких-либо симптомов связанного с имплантом риска повторной операции. В другом воплощении субъект, подлежащий лечению, страдает от зарождения патологии.
В одном воплощении согласно третьему аспекту настоящего изобретения связанный с имплантом риск повторной операции представляет собой либо острую патологию, либо зарождение патологии; и у субъекта, подлежащего лечению, ранее не диагностировали острую патологию.
В одном воплощении согласно третьему аспекту настоящего изобретения у субъекта, подлежащего лечению, диагностировали «связанный с имплантом риск повторной операции, которая не вызвана ассоциированной с имплантом инфекцией». Ассоциированная с имплантом инфекция предпочтительно выбрана из группы, состоящей из септического расшатывания, хронической инфекции суставов, биопленочной инфекции и/или их любой комбинации.
В одном воплощении согласно третьему аспекту настоящего изобретения у субъекта, подлежащего лечению, диагностировали «связанный с имплантом риск повторной операции, которая не вызвана реакцией металла на металле».
Данное изобретение будет далее подробно описано со ссылкой на следующий пример.
Пример 1
НАБОР для измерения уровней кальпротектина в образце
ELISA на кальпротектин CALPROLABTM (ALP) представляет собой количественный анализ для измерения кальпротектина в образцах. Данный набор для анализа имеется в продаже.
Принцип анализа:
В ELISA образцы и стандарты инкубируются в отдельных лунках для микротитрования, покрытых моноклональными антителами, которые связываются с кальпротектином. После инкубации и промывки лунок связанному кальпротектину дают реагировать с меченными ферментом иммуноаффинно очищенными антителам, специфичными в отношении кальпротектина. После данной реакции количество фермента, связавшегося в лунках для микротитрования, которое определяется инкубированием с субстратом для фермента с образованием окрашенного продукта, является пропорциональным количеству кальпротектина в образце или стандарте. Интенсивность окрашивания определяется по поглощению с использованием планшет-ридера ELISA, и она является пропорциональной концентрации кальпротектина в стандартах и образцах. Данный анализ калибруют с использованием кальпротектина, очищенного из экстракта лейкоцитов.
Реактивы, поставляемые с набором:
МТР Покрытый планшет для микротитрования: 12 полосок, 8 лунок на полоску, покрытые аффинно очищенными моноклональными мышиными антителами, специфичными в отношении кальпротектина. Данный паншет хранят в запечатанном мешке с осушителем.
DIL 5× Буфер для разведения образца (конц. 5×) ***: 1 × 20 мл, 5× концентрат, подлежащий разведению дистиллированной/деионизированной водой; рН 8,0 плюс/минус 0,2, раствор желтого цвета, бутыль с синей крышкой.
WASH BUF 20× *: 1 × 50 мл, 20× концентрат, подлежащий разведению дистиллированной/деионизированной водой, для промывки лунок для микротитрования; рН 7,8 плюс/минус 0,2, прозрачный раствор, бутыль с белой крышкой.
ЕС EXTR BUF 2,5× Экстракционный буфер (конц. 2,5×) **: 2 × 90 мл, 2,5× концентрат, подлежащий разведению дистиллированной/деионизированной водой; рН 8,0 плюс/минус 0,2, прозрачный раствор, бутыли с белыми крышками.
CAL A-F Стандарты кальпротектина ***: 6 флаконов с 1 мл, готовы к применению; раствор желтого цвета, флаконы с крышками разного цвета:
CTR LOW CTR HIGH Контроли с «низким» и «высоким» содержанием кальпротектина ***: 2 флакона с 1,0 мл, готовых к применению; раствор желтого цвета; Контр. с низким содержанием: флакон с коричневой крышкой; Контр. с высоким содержанием: флакон с пурпурной крышкой.
CONJ Конъюгат фермента ****: 13 мл меченных щелочной фосфатазой, иммуноаффинно очищенных поликлональных кроличьих антител против кальпротектина, готовых к применению; раствор красного цвета, 25 мл пробирка для реактивов Dynex с белой крышкой.
SUB pNPP Раствор субстрата фермента (pNPP): 13 мл, готовый к применению; раствор от прозрачного до слегка желтого, непрозрачная бутыль с желтой крышкой. Данная бутыль содержит стабилизированные пеллеты.
Примечание: при использовании прибора Dynex субстрат перед проведением анализа должен быть перенесен в 25 мл пробирку для реактивов Dynex.
* Содержит 0,1% катона
** Содержит меньше 0,1% азида натрия
*** Содержит 0,1% катона и меньше 0,1% азида натрия
**** Содержит 0,02% метилизотиазолона и 0,02% бромнитродиоксана
Синовиальные образцы от пациентов с имплантом
Синовиальные образцы отбирали у 37 пациентов во время повторного хирургического вмешательства с использованием иглы. Хирургом был сделан клинический диагноз на основе его/ее наблюдения во время повторного хирургического вмешательства. Синовиальные образцы немедленно замораживали до температуры -20°С.
Данные образцы затем оттаивали на льду. Оттаявшие образцы затем подвергали дальнейшему приготовлению согласно методике, описанной ниже.
Получение реактивов
Все реактивы, образцы и контроли доводятся до комнатной температуры перед началом прогона анализа.
2,5× экстракционный буфер разводили добавлением от 1 части (20 мл) до 1,5 частей (30 мл) дистиллированной/деионизированной воды в чистом сосуде до конечного объема 50 мл и хорошо перемешивали.
5× концентрированный буфер для разведения образца разводили добавлением от 1 части (20 мл) до 4 частей (80 мл) дистиллированной/деионизированной воды в чистом сосуде до конечного объема 100 мл. Разведенный буфер для разведения образца хорошо перемешивали.
20× концентрированный промывочный раствор разводили добавлением от 1 части (10 мл) до 19 частей (190 мл) дистиллированной/деионизированной воды в чистом сосуде до конечного объема 200 мл и хорошо перемешивали.
Данные сосуды с меткой стандарта A-F, а также контроли содержат 1,0 мл каждого готового к применению раствора. Концентрация кальпротектина напечатана на этикетке каждого сосуда. Стандарт с наивысшей концентрацией (пробирка F) был опущен с получением надежной стандартной кривой в интересующем интервале концентрации кальпротектина и с оставлением места для дополнительного стандарта (пробирка со стандартом С с 50%-ным разведением) в данном интервале.
Пробирка с конъюгатом фермента содержит 13 мл меченных щелочной фосфатазой (ALP), иммуноаффинно очищенных кроличьих антител против кальпротектина в буфере с 20 стабилизаторами, консервантами и инертным красным красителем. Данный раствор готов к применению.
Бутыль с раствором субстрата фермента содержит 13 мл раствора п-нитрофенилфосфата. Данный раствор готов к применению.
Измерение уровней кальпротектина в синовиальных образцах от пациентов с имплантом
1) Синовиальные образцы сначала разводили 1:100 в 1× экстракционном буфере и хорошо перемешивали на вибромешалке. Затем данные образцы подвергали дополнительному разведению 1:10 в буфере для разведения образца и хорошо перемешивали на вибромешалке, с получением конечного коэффициента разведения 1:1000.
2) 100 мкл каждого стандарта, контроля и разведенного синовиального образца добавляли в подходящие лунки микропланшета. Стандарты добавляли параллельно по четыре, а образцы добавляли в тройных повторностях.
3) Данный планшет покрывали запечатывающей фольгой и инкубировали при комнатной температуре в течение 40 минут на горизонтальном шейкере для планшетов при 600 об./мин.
4) В конце времени инкубации жидкость удаляли, и лунки промывали добавлением 300 мкл промывочного раствора в каждую лунку. Данную процедуру повторяли, пока не было проведено всего три промывки. После каждой стадии промывки планшет переворачивали и постукивали им по поглощающему материалу для удаления любого остающегося промывочного раствора. На последней из трех стадий промывки заботились об удаления любого избытка жидкости.
5) В каждую лунку добавляют 100 мкл раствора конъюгата фермента.
6) Планшет покрывают запечатывающей фольгой и инкубируют при комнатной температуре в течение 40 минут на горизонтальном шейкере для планшетов при 600 об./мин.
7) Стадии промывки, как описано в пункте 4), повторяют три раза с 300 мкл промывочного раствора на лунку.
8) В каждую лунку добавляют 100 мкл раствора субстрата фермента.
9) Планшет инкубируют при комнатной температуре (без встряхивания) в течение 25 минут при защите от света.
10) Значения оптической плотности (ОП) при 405 нм считываются с использованием ридера для ELISA.
11) Стандартную кривую получают на основе оптических измерений стандартов кальпротектина и известной концентрации кальпротектина в каждом стандартном образце.
12) Концентрация кальпротектина в синовиальных образцах рассчитывается на основе стандартной кривой, полученной в пункте 11).
Результаты «связанный с имплантом риск повторной операции» (таблица 1)
37 образцов от пациентов с имплантом анализировали в отношении CRP (С-реактивный белок) и кальпротектина. Результаты представлены в Таблице 1. Фраза «клинический диагноз» относится к правильному клиническому диагнозу. Опытный диагноз устанавливается на основе на выявленных уровней кальпротектина в синовиальных образцах от пациентов. Если уровень кальпротектина больше или равен 4 мг/л, данный пациент имеет связанный с имплантом риск повторной операции. Однако, если уровень кальпротектина меньше 4 мг/л, данный пациент не имеет связанного с имплантом риска повторной операции. Фраза «опыт (4 мг/л)» указывает, дает ли опытный диагноз правильный результат по сравнению с фактическим клиническим диагнозом. TN (истинно отрицательный) относится к ситуации, где и опытный и клинический диагноз заключает то, что у пациента нет риска связанного с имплантом риска повторной операции (диагностический анализ дает правильный результат). TP (истинно положительный) относится к ситуации, где и опытный, и клинический диагноз заключает то, что у пациента есть риск связанного с имплантом риска повторной операции (диагностический анализ дает правильный результат). FN (ложно отрицательный) относится к ситуации, где опытный диагноз неправильно заключает то, что у пациента нет риска связанного с имплантом риска повторной операции (диагностический анализ дает неправильный результат). FP (ложно положительный) относится к ситуации, где опытный диагноз неправильно заключает то, что у пациента есть риск связанного с имплантом риска повторной операции (диагностический анализ дает неправильный результат). Все из асептического расшатывания, смещения, септического расшатывания и реакции металла на металле ассоциированы с риском связанного с имплантом риска повторной операции. Истинно положительные и истинно отрицательные результаты представлены на Фиг. 5.
Общее число истинно положительных пациентов: 26
Общее число ложно положительных пациентов: 1
Общее число ложно отрицательных пациентов: 1
Общее число истинно отрицательных пациентов: 9
Чувствительность:
(Общее число истинно положительных пациентов) / (Общее число ложно отрицательных пациентов + Общее число истинно положительных пациентов)
Чувствительность = 26/(1+26) = 0,963
Специфичность:
(Общее число истинно отрицательных пациентов) / (Общее число ложно положительных пациентов + Общее число истинно отрицательных пациентов)
Специфичность = 9/(1+9) = 0,9
Прогностическое значение отрицательного результата:
(Общее число истинно отрицательных пациентов) / (Общее число ложно отрицательных пациентов + Общее число истинно отрицательных пациентов)
Прогностическое значение отрицательного результата = 9/(1+9) = 0,9
Прогностическое значение положительного результата: (Общее число истинно положительных пациентов) / (Общее число ложно положительных пациентов + Общее число истинно положительных пациентов)
Прогностическое значение положительного результата = 26(1+26) =0,963
Точный критерий Фишера дает значение р меньше, чем 0,0001 (α равно 0,05).
Результаты «зарождение патологии» (таблица 2)
37 образцов от пациентов с имплантом анализировали в отношении CRP и кальпротектина. Результаты представлены в Таблице 2. Фраза «клинический диагноз» относится к правильному клиническому диагнозу. Опытный диагноз устанавливается на основе на выявленных уровней кальпротектина в синовиальных образцах от пациентов. Если уровень кальпротектина находится в интервале 4-50 мг/л, данный пациент имеет указание зарождения патологии. Фраза «опыт (4-50 мг/л)» указывает, дает ли опытный диагноз правильный результат по сравнению с правильным клиническим диагнозом. TN (истинно отрицательный) относится к ситуации, где и опытный, и клинический диагноз заключает то, что пациент не имеет указания зарождения патологии. TP (истинно положительный) относится к ситуации, где и опытный, и клинический диагноз заключает то, что пациент имеет указание зарождения патологии (диагностический анализ дает правильный результат). FN относится к ситуации, где опытный диагноз неправильно заключает то, что пациент не имеет указания зарождения патологии (диагностический анализ дает неправильный результат). FP относится к ситуации, где опытный диагноз неправильно заключает то, что пациент имеет указание зарождения патологии (диагностический анализ дает неправильный результат).
Общее число истинно положительных пациентов: 14
Общее число ложно положительных пациентов: 2
Общее число ложно отрицательных пациентов: 6
Общее число истинно отрицательных пациентов: 15
Чувствительность:
(Общее число истинно положительных пациентов) / (Общее число ложно отрицательных пациентов + Общее число истинно положительных пациентов)
Чувствительность = 14/(6+14) = 0,7
Специфичность:
(Общее число истинно отрицательных пациентов) / (Общее число ложно положительных пациентов + Общее число истинно отрицательных пациентов)
Специфичность = 15/(2+15) = 0,882
Прогностическое значение отрицательного результата:
(Общее число истинно отрицательных пациентов) / (Общее число ложно отрицательных пациентов + Общее число истинно отрицательных пациентов)
Прогностическое значение отрицательного результата = 15/(6+15) = 0,714
Прогностическое значение положительного результата:
(Общее число истинно положительных пациентов) / (Общее число ложно положительных пациентов + Общее число истинно положительных пациентов)
Прогностическое значение положительного результата = 14/(2+14)=0,875
Точный критерий Фишера: двухстороннее значение р, равное 0,0001.