ШТАММ БАКТЕРИИ THIOBACILLUS THIOPARUS, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПРОМЫШЛЕННЫХ ОБОРОТНЫХ ВОД ОТ ТИОЦИАНАТ-ИОНА
THE BACTERIA STRAIN THIOBACILLUS THIOPARUS DESIGNED FOR PURIFICATION OF INDUSTRIAL RETURN WATER FROM THIOCYANATE ION

Изобретение относится к биотехнологии и к биологическим способам обработки загрязненных тиоцианат-ионами промышленных сточных вод. Штамм может быть использован в биотехнологических схемах очистки металлургических предприятий.
Очистка промышленных стоков металлургических предприятий от тиоцианат-иона являются необходимой для уменьшения негативного воздействия на окружающую среду и использования стоков в водообороте. Наиболее перспективными для очистки загрязненных экосистем являются биологические методы, так как они позволяют избежать вторичного загрязнения стоков реагентами, которые применяются для разрушения тиоцианат-иона [Akcil A. Destruction of cyanide in gold mill effluents: biological versus chemical treatments // Biotechnology Advances. 2002. V. 21. P. 501-511].
Pseudomonas paucimobilis
Известен способ по биодеградации цианидов и тиоцианатов. Стоки, содержащие до 11.5 мг/л цианидов и до 110 мг/л тиоцианатов, обезвреживали, используя штамм и нитрифицирующие бактерии в составе активного ила. При попытке использовать данный консорциум бактерий для обезвреживания высоких концентраций CN- (100 мг/л) оказалось, что степень обезвреживания цианида была низкой - около 43 % [Akcil A. Destruction of cyanide in gold mill effluents: biological versus chemical treatments // Biotechnology Advances. 2002. V. 21. P. 501-511.].
Недостатком предложенного способа являются невысокие концентрации тиоцианата в обрабатываемых стоках.
Pseudomonas. putida
Pseudomonas. putida
,
P. putida
P. stutzeri
Известен комбинированный бактериально-химический способ обезвреживания цианидов и их производных, который позволяет обезвреживать пульпы и растворы с высокими концентрациями цианида, тиоцианата и других их производных, одновременно обеспечивая снижение концентрации токсикантов до ПДК с использованием консорциума гетеротрофных штаммов 21 и 18 [Патент RU на изобретение №2226548 МПК С12N 1/20, опубл. 10.04.2004, КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS STUTZERI № 18 И PSEUDOMONAS PUTIDA № 21, ДЕСТРУКТИРУЮЩИЙ CN- И SCN- ПРИ ВЫСОКИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ, [Патент RU на изобретение № 2245850 МПК C02F 3/34, опубл. 10.02.2005, СПОСОБ ОЧИСТКИ ПРОМЫШЛЕННЫХ СТОКОВ ОТ ЦИАНИДОВ И ТИОЦИАНАТОВ]. Предлагаемый способ включает две стадии обработки – химическую и микробиологическую. Химическая стадия обработка пульпы или раствора проводится метабисульфитом щелочного металла и позволяет снизить содержание цианида до остаточной концентрациии 5.3-19.1 мг/л. Микробиологическая стадия проводится с целью снижения концентрации цианидов и тиоцианатов до ПДК (0.05мг/л) с помощью консорциума бактерийвключающего штаммы 21 и 18. Бактерии способны расти при концентрации цианида до 30 мг/л и тиоцианата – до 6 г/л.
Недостатком предложенного способа является использование консорциума органотрофных микроорганизмов для которых необходимо использование органического субстрата.
Fusarium oxysporum
Ralstonia eutropha
Bosea thiooxidans
Pseudomonas stutzeri
Spumella
Microbacterium schleiferi
Acinetobacter
Acinetobacter venetianus
Pseudomonas fluorescens
Candida humulis
Kazakhstania
Cuprivadus necator
Известен способ биологической очистки сточных вод от цианидов и тиоцианатов, разработанный компанией BIOMIN South Africa (Pty) Limited (технология ASTER™). В микробных сообществах реакторов промышленных установок доминируют такие микроорганизмы как , , , OC-10, sp., 118, sp. ST-01, L17, KDK8, , sp., [www.biomin.co.za/aster].
Недостатком предложенного способа также является необходимость использования органического субстрата (мелассы).
Thiobacillus
Известен консорциум микроорганизмов, который осуществлял деструкцию тиоцианата в биореакторе без внесения органического субстрата [Watts, M. P., Spurr, L. P., Gan, H. M., & Moreau, J. W. Characterization of an autotrophic bioreactor microbial consortium degrading thiocyanate // Applied Microbiology and Biotechnology. 2017. V 101. Is. 14. P. 5889–5901]. Среди тиоцианат деструктирующих микроорганизмов в консорциуме доминировали штаммы р. .
Недостатком консорциума является то, что процесс деструкции проводился в периодическом режиме.
Наиболее близким по сущности и достигаемому результату является штамм бактерии Thiobacillus thioparus, который предлагается использовать в очистке стоков от тиоцианата [Патент TW 201242909, 2012-11-01 Publication of TW201242909A].
Недостатком штамма и используемого способа является необходимость предварительного наращивания штамма на питательной среде и его внесение в загрязненные стоки, что усложняет технологию очистки и требует использования дополнительного оборудования для его культивирования.
Технической проблемой изобретения является получение устойчивого высокоактивного штамма бактерии способного разлагать тиоцианат-ион в сточных водах промышленных предприятий.
Thiobacillus thioparus
Техническая проблема решается за счет выделения автотрофного штамма бактерий , способного к деструкции тиоцианат-иона.
Штамм был депонирован в НБЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика (далее ВКПМ). Свидетельство о депонировании № В - 13779 от 14.10.2020.
Штамм был выделен из промышленного реактора.
Полученный штамм характеризуется следующими признаками:
Температура культивирования штамма составляет 20-38ºС (оптимум 30ºС), рН 5,0-9,0 (оптимум 6,5-7,0).
Морфологическая характеристика - форма клеток - палочки, при росте в жидкой среде образует агрегаты бурого цвета размером 0,5-1 мм.
Отношение к кислороду - аэроб.
В качестве энергетического субстрата для роста используют тиосульфат и тиоцианат-иона.
Полезное свойство, в связи с которым культура депонируется - способность к деструкции тиоцианат-иона.
Условия культивирования - минеральная среда следующего состава:
Сульфат аммония – 1 г/л, аммофос – 0.4 г/л, KOH – 0.1 г/л, роданид калия - 2 г/л или тиосульфат натрия - 5 г/л.
Условия хранения - сохраняется путем пересевов на среде культивирования или в замороженном виде при -80°С.
Thiobacillus thioparus
Thiobacillus thioparus
Анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК позволил отнести штамм к виду , так как сходство последовательности с типовым штаммомDSM 505 – 98,93%.
Способность штамма к снижению содержания тиоцианат-иона, присутствующих в сточной воде изучали в лабораторных и промышленных испытаниях. Результаты приведены в примерах ниже.
ПРИМЕР 1.
Thiobacillus thioparus
Исследование способности штамма бактерий к деструкции тиоцианат-иона в чистой культуре, изображено на фиг.1.
Были проведены эксперименты по деструкции тиоцианат-иона штаммом при выращивании на орбитальном шейкере в колбах Эрленмейера со 100 мл питательной среды. На фиг.1 представлены результаты деструкции тиоцианат-иона штаммом Thiobacillus thioparus к деструкции тиоцианат-иона в чистой культуре при росте на минеральной среде.
Было показано, что штамм за 5 суток практически полностью разрушал 1,3 г/л тиоцианат-иона. При этом при внесении в среду дополнительного количества тиоцианат-иона он быстро разрушался.
ПРИМЕР 2.
Thiobacillus thioparus
Мониторинг штамма бактерий в процессе деструкции тиоцианат-иона в лабораторных и промышленных реакторах.
Мониторинг штамма в лабораторных и промышленных биореакторах деструкции тиоцианат-иона был проведен с использованием метагеномного анализа фрагментов гена 16S рРНК с помощью высокопроизводительного секвенирования на платформе Illumina MiSeq. Были отобраны образцы жидкой фазы и твердых носителей из лабораторных и промышленных реакторов. Из полученных образцов пульп из реакторов выделяли ДНК для проведения секвенирования фрагментов гена 16S рРНК. Для выделения ДНК биомассу отделяли от твердой и жидкой части пульпы центрифугированием. Для этого образцы пульпы центрифугировали сначала при 1000 об/мин в течении 15 мин, чтобы отделить твердую часть пульпы. Супернатант использовали для осаждения биомассы путем центрифугирования при 3000 об/мин. в течении 1 часа. Полученный осадок биомассы ацидофильных микроорганизмов промывали, центрифугируя при 3000 об/мин. в течение 30 мин., раствором следующего минерального состава (г/л): (NH4)2SO4 – 1,0; аммофос – 0,4; KOH – 0,1; MgSO4 × 7H2O – 0,5 с рН ~7.5. Образец ресуспендировали в 300 мкл лизирующего буфера (0,15 M NaCl, 0,1 M Na2-EDTA, pH 8,0), содержащего 15 мг/мл лизоцима. До выделения ДНК буфер с лизированной биомассой хранили при -20°С в пластиковых пробирках с завинчивающимися крышками. ДНК выделяли фенол-хлороформным методом [T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p. 545.]. Библиотеки для секвенирования были приготовлены в соответствии с ранее описанным протоколом [Fadrosh D.W., Ma B., Gajer P., Sengamalay N., Ott S., R.M. Brotman R.M., Ravel J. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform, Microbiome. 2014. 2:6. DOI: 10.1186/2049-2618-2-6.]. В качестве универсальных использовались праймеры Pro341F (5'-CCTACGGGNBGCASCAG-3') и Pro805R (5'-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3'), которые позволяют амплифицировать вариабельные участки генов 16S рРНК V3 и V4. Для дальнейшего секвенирования полученные ампликоны разделялись с помощью электрофореза в агарозном геле, вырезанные из геля ампликоны очищались с помощью набора для очистки ДНК из геля и реакционных смесей Cleanup Standard (Евроген, Россия). Секвенирование проводилось при помощи набора реагентов, обеспечивающего длину прочтения 300 нуклеотидов с каждого конца ампликона. Первичная обработка (фильтрация и демультиплексирование) полученных прочтений производилось при помощи ПО CLC Genomics Workbench 7.5 (Qiagen, США). Полученные данные были обработаны с помощью онлайн сервиса SILVAngs (https://www.arb-silva.de/ngs/). Для каждого образца было проанализировано около 10000 тыс. фрагментов средней длиной 486 нуклеотида.
Было установлено, что при проведении процесса в проточном режиме как в реакторах с внесением в среду органического субстрата (1 г/л мелассы), так и без внесения органики, во всех пробах были выявлены последовательности гена 16S рРНК штамма. Их доля составляла от 12 до 76%. При этом не были выявлены в значительном количестве последовательности других групп микроорганизмов, способных к деструкции тиоцианат-иона.
Thiobacillus thioparus
Это указывает на то, что при ведении процесса в проточном режиме в нестерильных условиях штамм играет значительную роль в деструкции тиоцианат-иона и способен доминировать в популяции в различных условиях, что приводит к эффективному разложению тиоцианат-иона.