ВАКЦИНА IPV-DPT
IPV-DPT VACCINE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к комбинированной вакцине, в частности к комбинированной вакцине, содержащей инактивированный штамм Сэбин вируса полиомиелита (sIPV), и к способу ее получения.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Полиомиелит представляет собой инфекционное заболевание, вызываемое вирусом полиомиелита. Вирусы полиомиелита инфицируют человека пероральным путем, пролиферируют в кишечнике и проникают в центральную нервную систему через кровь. Пролиферация в крупных двигательных нейронах вирусов полиомиелита, которые проникли в центральную нервную систему, вызывает дегенерацию и некроз нейронов, способствуя развитию острого периферического паралича конечностей. Более того, когда вирус полиомиелита поражает мозговой дыхательный центр, может наступить смерть от дыхательного паралича. Вакцины от полиомиелита широко используются для подавления возникновения полиомиелита, который вызывает такие тяжелые симптомы.
Используется два типа вакцин от полиомиелита: пероральные живые вакцины от полиомиелита и инактивированные вакцины от полиомиелита. Пероральные живые вакцины от полиомиелита представляют собой вакцины, в которых используются ослабленные штаммы вируса полиомиелита (штаммы Сэбина). Ослабленные штаммы вируса полиомиелита, которые вводят перорально, вызывают нормальные инфекции. Вирусы полиомиелита из пероральных живых вакцин от полиомиелита хорошо растут в кишечнике, приводя к формированию местного иммунитета в кишечнике. Кроме того, когда вирусы полиомиелита из пероральной живой вакцины от полиомиелита попадают в кровь и вызывают виремию, это также стимулирует продукцию антител в крови. Однако из-за того, что способность ослабленных штаммов вируса полиомиелита пролиферировать в центральной нервной системе очень мала, они обычно не вызывают паралич. В организме вакцинированного вирусы полиомиелита из пероральной живой вакцины от полиомиелита размножаются и выделяются с фекалиями от 4 до 6 недель после вакцинации. Экскретируемые вирусы инфицируют людей вокруг вакцинированного, у которых имеется слабый иммунитет или нет иммунитета к полиомиелиту, давая иммунитет или оказывая потенцирующий эффект таким же образом, как у вакцинированного.
Однако в рамках повторного роста в организме вакцинированного или в рамках повторного роста в организме человека, инфицированного экскретируемыми вирусами, ослабленный штамм вируса полиомиелита из пероральной вакцины от полиомиелита иногда дает развитие мутаций в высоковирулентном направлении. В очень редких обстоятельствах такие мутанты вызывают паралич, ассоциированный с вакциной.
Инактивированная вакцина от полиомиелита представляет собой вакцину, которая утратила свою инфективность посредством инактивации вируса полиомиелита формалином. Так как инактивированная вакцина от полиомиелита никогда не размножается в организме вакцинированного и не поражает людей вокруг вакцинированного, она не вызовет паралича, ассоциированного с вакциной. Ранее для получения инактивированных вакцин от полиомиелита использовали высоковирулентные штаммы, но также в последнее время были осуществлены успехи в разработке ослабленных штаммов (штаммов Сэбина) (Biologicals 34, 151-154 (2006); Dev. Bil. Basel. Karger 105, 163-169 (2001), Clinical Virology 30, № 5, 336-343 (декабрь 2002 года)). Отчасти худший рост ослабленных штаммов (штаммов Сэбина) в отличие от высоковирулентных штаммов рассматривался как недостаток.
Вакцины, которые содержат защитный антиген Bordetella pertussis, анатоксин дифтерии и анатоксин столбняка, широко используются в качестве комбинированных вакцин от дифтерии-столбняка-коклюша.
Известны поливалентные вакцины, состоящие из бесклеточной вакцины от коклюша, анатоксина дифтерии, анатоксина столбняка и инактивированного вируса полиомиелита (Опубликованный перевод Японии публикации РСТ № 2000-504032).
Клетки Vero представляют собой пассированные клетки почек зеленых макак. Так как эти клетки имеют выраженную чувствительность к различным типам вирусов, они широко используются в культивировании вирусов. Способ получения вакцины энтеровируса типа 71, описанный в литературе, включает культивирование клеток Vero на микроносителе и использование культивированных клеток Vero для выращивания энтеровируса 71 (“Optimization of microcarrier cell culture process for the inactivated enterovirus type 71 vaccine development,” Suh-Chin Wu, et al.: Vaccine 22, 3858-3864 (2004)). Также были описаны общие условия культивирования клеток с использованием микроносителя (Microcarrier cell culture principles & methods: Pharmacia LKB, Biotechnology, 1988).
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В указанных обстоятельствах существует потребность в способе получения комбинированной вакцины, содержащей инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита (sIPV) и также содержащей защитный антиген B. pertussis, анатоксин дифтерии и анатоксин столбняка (DPT), где такой способ включает стадию получения вируса полиомиелита штамма Сэбина с высоким титром.
Авторы изобретения провели обширные исследования с целью решения вышеуказанной проблемы. В результате авторы изобретения обнаружили, что высокий титр штамма Сэбина вируса полиомиелита может быть получен культивированием в присутствии от примерно 4 г/л до примерно 6 г/л микроносителя, клеток Vero, инокулированных штаммом Сэбина вируса полиомиелита. После проведения повторных исследований на основании таких открытий авторы изобретения в конечном счете пришли к настоящему изобретению.
Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает:
(1) Способ получения комбинированной вакцины, содержащей
(A) инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита,
Bordetella pertussis
(B) защитный антиген ,
(C) анатоксин дифтерии и
(D) анатоксин столбняка,
где способ включает (a) стадию культивирования в присутствии от примерно 4 г/л до примерно 6 г/л микроносителя клеток Vero, инокулированных штаммом Сэбина вируса полиомиелита.
(2) Способ по п.(1) выше, дополнительно включающий:
(b) стадию инфицирования клеток Vero штаммом Сэбина вируса полиомиелита;
(c) стадию, представляющую возможность вирусу полиомиелита пролифелировать;
(d) стадию восстановления вирусной жидкости, содержащей вирус полиомиелита; и
(e) стадию инактивации вируса полиомиелита.
(3) Способ по п.(1) выше, в котором микроноситель имеет концентрацию примерно 5 г/л.
(4) Способ по п.(1) выше, в котором микроносителем является декстрановый микроноситель.
(5) Способ по п.(1) выше, в котором стадию выращивания клеток Vero (стадия (a)) проводят в масштабе по меньшей мере примерно 3 литра.
(6) Способ по п.(1) выше, в котором стадию выращивания клеток Vero (стадия (a)) проводят в масштабе по меньшей мере примерно 30 литров.
(7) Способ по п.(2) выше, дополнительно включающий
(d-2) стадию очистки вирусной жидкости.
(8) Способ по п.(7) выше, в котором стадия очистки (стадия (d-2)) включает:
(i) преобразование вирусной жидкости, восстановленной на стадии (d), в осадок путем ультрацентрифугирования;
(ii) обработку ультразвуком ресуспензии осадка и
(iii) очистку колоночной хроматографией.
(9) Способ по п.(8) выше, в котором очистку колоночной хроматографией (iii) проводят только один раз.
(10) Вакцина, полученная способом по п.(1) выше.
(11) Способ по п.(1) выше, в котором стадию культивирования клеток Vero (стадия (a)) проводят в масштабе по меньшей мере примерно 3 литра.
(12) Способ по п.(1) выше, в котором стадию культивирования клеток Vero (стадия (a)) проводят в масштабе по меньшей мере примерно 30 литров.
Путем культивирования в присутствии от примерно 4 г/л до примерно 6 г/л микроносителя клеток Vero для инокуляции штаммом Сэбина вируса полиомиелита можно получить высокий титр штамма Сэбина вируса полиомиелита. С использованием высокого титра штамма Сэбина вируса полиомиелита может быть эффективно получен инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита. Следовательно, способ получения комбинированной вакцины, который включает стадию культивирования в присутствии от примерно 4 г/л до примерно 6 г/л микроносителя клеток Vero, которые будут инокулированы штаммом Сэбина вируса полиомиелита (способ получения по настоящему изобретению), является применимым в качестве способа для эффективного получения комбинированных вакцин, содержащих инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
5
5
5
5
Фиг.1 представляет собой график, показывающий кривые роста клеток Vero при культивировании клеток Vero путем метода микроносителя. Здесь “3L” указывает исходное количество клеток примерно 2×10 клеток/мл (низкая концентрация) и 3 г/л микроносителя. “3H” указывает исходное количество клеток примерно 10×10 клеток/мл (высокая концентрация) и 3 г/л микроносителя. “5L” указывает исходное количество клеток примерно 2×10 клеток/мл (низкая концентрация) и 5 г/л микроносителя. “5H” указывает исходное количество клеток примерно 10×10 клеток/мл (высокая концентрация) и 5 г/л микроносителя.
5
5
5
Фиг.2 представляет собой график, показывающий титр инфективности (титры вируса) вируса полиомиелита типа I, полученный в клетках Vero, культивируемых в различных условиях. Здесь “3L” представляет собой тип I вируса полиомиелита, полученный в клетках Vero, культивируемых из исходного количества клеток примерно 2×10 клеток/мл (низкая концентрация) на 3 г/л микроносителя. “5L” указывает тип I вируса полиомиелита, полученный в клетках Vero, культивируемых из исходного количества клеток примерно 2×10 клеток/мл (низкая концентрация) на 5 г/л микроносителя. “5H” указывает тип I вируса полиомиелита, полученный в клетках Vero, культивируемых из исходного количества клеток примерно 10×10 клеток/мл (высокая концентрация) на 5 г/л микроносителя. “Контр.” указывает тип I вируса полиомиелита, выращенного с использованием клеток почек зеленых макак.
Настоящее изобретение обеспечивает способ получения комбинированной вакцины, содержащей инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита (sIPV) вместе с защитным антигеном B. pertussis, анатоксином дифтерии и анатоксином столбняка (DPT), где такой способ включает стадию получения высокого титра штамма Сэбина вируса полиомиелита.
Изобретение более подробно описано ниже.
1. Инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита
(1) Штамм Сэбина вируса полиомиелита
В настоящем описании “штамм Сэбина вируса полиомиелита” относится к штамму вируса полиомиелита, полученному из ослабленного штамма вируса полиомиелита, выделенного Dr. Albert B. Sabin (см., например, Sabin A.B., Boulger L.R.: “History of Sabin attenuated poliovirus oral live vaccine strains,” J. Biol. Standard 1, 115-118 (1973)).
1
Штамм Сэбина вируса полиомиелита включает штаммы Сэбина вируса полиомиелита типа I, штаммы Сэбина вируса полиомиелита типа II и штаммы Сэбина вируса полиомиелита типа III. Примеры штаммов Сэбина вируса полиомиелита типа I включают штаммы LSc и 2ab. Примеры штаммов Сэбина вируса полиомиелита типа II включают штаммы P712, Ch и 2ab. Примеры штаммов Сэбина вируса полиомиелита типа III включают штаммы Leon и 12ab.
(2) Инактивация
В настоящем описании “инактивация” вируса относится к устранению инфицирующей способности вируса. Способы инактивации включают, но не ограничиваются, физические методы (например, методы, включающие использование рентгеновского излучения, нагревания или ультразвука) и химические методы (например, методы, включающие использование формалина, ртути, спирта или хлора).
Инактивация вируса полиомиелита может быть проведена известным методом (см., например, Biologicals 34, 151-154 (2006)). Например, инактивация может быть проведена обработкой вируса полиомиелита формалином.
(3) Иммуногенность инактивированных штаммов Сэбина вируса полиомиелита
Два вирусных антигена, известных как D-антигены и C-антигены, обычно присутствуют в смеси с инактивированными штаммами Сэбина вируса полиомиелита. D-антигены представляют собой целые вирусные частицы. Антитела к D-антигенам обладают способностью нейтрализовать инфективность живых вирусов и действуют как защитные антитела. C-антигены, называемые дефектными частицами, представляют собой частицы, не имеющие РНК сердцевинной нуклеиновой кислоты и части вирусных белков целой вирусной частицы; такие частицы являются полыми в центре. Антитела к C-антигенам обладают небольшой или совсем не обладают способностью нейтрализовать инфективность живых вирусов. Следовательно, когда в качестве вакцины должен использоваться инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита, требуются D-антигены.
Существует три типа вирусов полиомиелита: тип I, тип II и тип III. Иммунитет к инфекции вирусом полиомиелита является специфичным к трем типам вирусов - типу I, типу II и типу III; тот перекрестный иммунитет, который может существовать между типами, является минимальным. D-антигены инактивированного типа I, типа II и типа III штаммов Сэбина вируса полиомиелита обладают иммуногенностью, способной к продукции нейтрализующих антител для соответственно типа I, типа II и типа III диких штаммов (высоковирулентных) вируса полиомиелита. Иммуногенность D-антигенов инактивированных штаммов Сэбина вируса полиомиелита отличается для каждого из типов I, II и III; следовательно, количество D-антигена, требуемое для получения достаточного количества антител для нейтрализации типа I, типа II и типа III диких штаммов (высоковирулентных) вируса полиомиелита, отличается в зависимости от типа вируса.
Как упомянуто выше, существует три типа вируса полиомиелита - тип I, тип II и тип III, каждый из которых вызывает один и тот же полиомиелит. Следовательно, когда инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита используется в качестве вакцины (инактивированная вакцина от полиомиелита), он должен иметь иммуногенность, способную давать достаточно антител для нейтрализации диких штаммов (высоковирулентных штаммов) вируса полиомиелита каждого из типов I, II и III. Более того, желательно для иммуногенности быть близкой к иммуногенности инактивированной вакцины от полиомиелита от высоковирулентных штаммов, которые для нее использовали. Для проявления такой иммуногенности вакцина предпочтительно содержит инактивированные штаммы Сэбина вируса полиомиелита типа I, типа II и типа III в соотношении по массе соответствующего D-антигена, предпочтительно (2-4):(80-120):(80-120) и наиболее предпочтительно (примерно 3):(примерно 100):(примерно 100). Инактивированные штаммы Сэбина вируса полиомиелита, используемые в настоящем изобретении, путем включения типов I, II и III в специфическом соотношении, как указано выше, проявляют иммуногенность, сходную с таковой инактивированных вакцин от полиомиелита из высоковирулентных штаммов (например, вакцина Соук).
2. Получение инактивированных штаммов Сэбина вируса полиомиелита
Инактивированные штаммы Сэбина вируса полиомиелита, подходящие для применения в настоящем изобретении, могут быть получены способом, описанным ниже.
Во-первых, клетки Vero культивируют в присутствии от примерно 4 г/л до примерно 6 г/л микроносителя, посредством чего получают клетки для культивирования вируса полиомиелита. Полученные культивируемые клетки для вируса полиомиелита инокулируют посевным материалом вируса (штамм Сэбина вируса полиомиелита) и вирусы культивируют, получая штамм Сэбина вируса полиомиелита, который пролиферирует. Полученный штамм Сэбина вируса полиомиелита инактивируют для получения инактивированного штамма Сэбина вируса полиомиелита. Может быть получен инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита, который соответствует использованному посевному материалу вируса (штаммы Сэбина типа I, штаммы Сэбина типа II или штаммы Сэбина типа III). Вирусы могут быть сконцентрированы и/или очищены до или после инактивации вируса.
Как упомянуто выше, инактивированная вакцина от полиомиелита должна быть способна давать достаточно антител для нейтрализации диких штаммов (высоковирулентных штаммов) каждого из типов I, II и III. Однако D-антигены инактивированных вирусов полиомиелита штаммов Сэбина имеют иммуногенность, которая различается между типами I, II и III. Соответственно, инактивированная вакцина от полиомиелита, обладающая иммуногенностью, способной давать достаточно антител для нейтрализации диких штаммов (высоковирулентных штаммов) каждого из типов I, II и III, может быть получена путем регуляции количества содержащихся инактивированных вирусов полиомиелита типа I, типа II и типа III.
Клетки Vero
Клетки Vero представляют собой пассированные клетки почек зеленых макак (Cercopithecus aethiops) и хранятся в American Type Culture Collection (ATCC). Клетки Vero широко используются для культивирования вирусов, так как они имеют фибробластическую морфологию, обладают широкой чувствительностью к различным типам вирусов и легко поддерживаются в качестве пассированных клеток. Клетки Vero, которые известны как доступные от ATCC, включают ATCC № CCL-81 и CRL-1587.
Микроноситель
В настоящем описании “микроноситель” относится к носителю, который имеет поверхности, к которым прикрепляются клетки, и допускает проведение культивирования клеток в суспендированном состоянии в жидкой среде. Микроноситель не является предметом с каким-либо определенным ограничением в отношении материала, формы и размера при условии, что это носитель с поверхностью, к которой прикрепляются клетки, и который допускает культивирование клеток, проводимое в суспендированном состоянии в жидкой среде.
Примеры материала микроносителя включают декстран, желатин, коллаген, полистирол, полиэтилен, полиакриламид, стекло и целлюлозу. В качестве материала микроносителя предпочтительным является декстран.
Примеры формы микроносителя включают сферическую (шарики) и дисковидную формы. Микроноситель предпочтительно имеет сферическую форму.
Сферический микроноситель имеет размер, например, от примерно 0,01 до примерно 1 мм, предпочтительно от примерно 0,05 до примерно 0,5 мм и более предпочтительно от примерно 0,1 до примерно 0,3 мм.
Микроноситель может быть пористым.
Примеры сферических микроносителей, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают Cytodex 1 (торговое наименование), Cytodex 3 (торговое наименование) и Cytopore (торговое наименование) (все продукты GE Healthcare Biosciences). Примеры дисковидных микроносителей включают Cytoline 1 (торговое наименование) и Cytoline 2 (торговое наименование) (оба продукта GE Healthcare Biosciences). Примеры пористых микроносителей включают Cytopore (торговое наименование), Cytoline 1 (торговое наименование) и Cytoline 2 (торговое наименование) (все продукты GE Healthcare Biosciences). Микроноситель, используемый в настоящем изобретении, является наиболее предпочтительно сферическим декстрановым микроносителем. Сферическим декстрановым микроносителем является предпочтительно Cytodex 1 (торговое наименование), Cytodex 3 (торговое наименование) или Cytopore (торговое наименование), более предпочтительно Cytodex 1 (торговое наименование) или Cytodex 3 (торговое наименование) и наиболее предпочтительно Cytodex 1 (торговое наименование).
Культивирование клеток Vero
В настоящем изобретении клетки Vero выращивают культивированием в присутствии от примерно 4 г/л до примерно 6 г/л микроносителя. Концентрация микроносителя составляет предпочтительно от примерно 4,5 г/л до примерно 5,5 г/л и более предпочтительно примерно 5 г/л.
Вышеописанную стадию выращивания клеток Vero проводят в масштабе в отношении жидкого объема предпочтительно по меньшей мере 3 литра, более предпочтительно по меньшей мере 30 литров и наиболее предпочтительно по меньшей мере 150 литров. Стадию выращивания клеток Vero проводят в масштабе не более 1000 литров.
Когда клетки Vero культивируют в присутствии микроносителя, используемой культуральной средой может быть, например, среда ME(Science, 122, 501 (1952)), среда DME (Virology, 8, 396 (1959)), среда RPMI 1640 (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)) или среда 199 (Proceedings of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)), которые содержат от примерно 5 до примерно 20 об.% сыворотки телят или бычьей эмбриональной сыворотки. Культуральной средой предпочтительно является среда DME, более предпочтительно среда DME, содержащая сыворотку телят, и наиболее предпочтительно среда DME, содержащая примерно 5 об.% сыворотки телят. Среду можно, при необходимости, менять в течение периода культивирования клеток. pH составляет предпочтительно от примерно 6 до примерно 8, более предпочтительно от примерно 6,5 до примерно 7,5 и наиболее предпочтительно примерно 7. Культивирование обычно проводят при температуре от примерно 35ºC до примерно 40ºC в течение периода от примерно 5 до 9 дней. Если необходимо, во время культивирования могут проводиться аэрация и перемешивание. Концентрация растворенного кислорода (DO) во время культивирования клеток составляет предпочтительно от примерно 60 до примерно 90%, более предпочтительно от примерно 70 до примерно 80% и наиболее предпочтительно примерно 75%.
4
5
5
5
Количество клеток Vero в среде в начале культивирования в присутствии микроносителя (исходное количество клеток) может быть установлено, как необходимо относительно таких факторов, как тип среды, тип микроносителя, масштаб культивирования. Исходное количество клеток составляет предпочтительно от 2×10 клеток/мл до 10×10 клеток/мл и наиболее предпочтительно от 2×10 клеток/мл до 10×10 клеток/мл.
Культивирование вируса полиомиелита
Культивирование вируса полиомиелита может проводиться путем инокуляции культивированных клеток Vero штаммом Сэбина вируса полиомиелита (посевной материал вируса) и культивирования вируса полиомиелита в клетках. Культивирование инфицированных клеток может проводиться таким же образом, как вышеописанное культивирование клеток Vero. Средой, используемой для культивирования вируса полиомиелита, является предпочтительно среда 199, более предпочтительно среда 199, содержащая бикарбонат натрия, и наиболее предпочтительно среда 199, содержащая 0,3% масс./об. карбоната натрия.
Температура инкубации во время культивирования вируса составляет предпочтительно от примерно 30ºC до примерно 38ºC, более предпочтительно от примерно 32ºC до примерно 36ºC и наиболее предпочтительно от примерно 33ºC до примерно 35ºC. Период культивирования вируса составляет предпочтительно от примерно 1 до примерно 5 дней, более предпочтительно от примерно 2 до примерно 4 дней и наиболее предпочтительно примерно 3 дня. Культивирование вируса может быть закончено с использованием цитопатических эффектов вируса полиомиелита (округление клеток, инфицированных вирусом полиомиелита, и отделение клеток от микроносителя) в качестве индикатора.
Штамм Сэбина вируса полиомиелита, который культивируют с использованием первично культивированных клеток почек зеленой макаки, может быть использован в качестве посевного материала вируса.
Восстановление вирусной жидкости, содержащей вирус полиомиелита
После завершения культивирования вируса микроноситель удаляют и вирусную жидкость, содержащую вирус полиомиелита (иногда называемую в настоящем описании как “жидкость вируса полиомиелита”), восстанавливают.
Удаление микроносителя может проводиться посредством, например, тефлонового сита (например, имеющего размер пор 120 мкм). Так как вирус полиомиелита остается присутствующим (прикрепленным) на микроносителе, оставшемся на сите, такой оставшийся вирус полиомиелита может быть восстановлен путем промывки с помощью, например, среды культивирования вируса.
Полученная жидкость вируса полиомиелита может быть отфильтрована с использованием фильтровальной мембраны (например, фильтровальной мембраны 0,2 мкм) или подобного для удаления обломков клеток.
Жидкость вируса полиомиелита может быть сконцентрирована и и/или очищена до или после инактивации.
Иллюстративные примеры способа концентрирования включают ультрафильтрацию, ультрацентрифугирование и диализ. Способом концентрирования является предпочтительно ультрафильтрация или ультрацентрифугирование. Более предпочтительно проводить и ультрафильтрацию, и ультрацентрифугирование и еще более предпочтительно проводить ультрафильтрацию с последующим ультрацентрифугированием.
Мембраной, используемой в ультрафильтрации, может быть мембрана для ультрафильтрации, используемая для концентрирования вирусов. Мембрана для ультрафильтрации имеет отсечку молекулярной массы, которая составляет предпочтительно примерно 100 кДа. Мембрана для ультрафильтрации является предпочтительно сделанной из материала, такого как полиэфирсульфон.
Концентрирование вируса полиомиелита путем ультрацентрифугирования может проводиться путем подвергания жидкости вируса полиомиелита 4 часам центрифугирования при 4ºC и 100000 g для получения осадка. Осадок может быть ресуспендирован в, например, фосфатном буфере. Также возможно размолоть массу агрегированных вирусов путем обработки ресуспензии осадка ультразвуком. Обработка ультразвуком может проводиться с использованием коммерчески доступного прибора, такого как Insonator модель 200 M (Kubota). Условия обработки ультразвуком должны быть достаточными для разрушения массы агрегированных вирусов и могут быть выбраны, как необходимо для таких факторов, как сосуд, используемый при обработке ультразвуком, мощность ультразвука и концентрация ресуспензии. Условия обработки ультразвуком проиллюстрированы путем обработки при 200 Вт в течение периода от примерно 3 до 10 минут. Даже когда проводят такую обработку ультразвуком, штамм Сэбина вируса полиомиелита не теряет своей иммуногенности, что позволяет использовать его преимущественно в качестве вакцины вируса полиомиелита.
Методы очистки включают, но не ограничиваются, методы, которые используют физические характеристики очищаемого вещества, такие как размер, плотность и коэффициент осаждения, и методы, которые используют химические или физико-химические реакции (например, абсорбцию-десорбцию). Иллюстративные примеры методов очистки включают центрифугирование по градиенту плотности, фильтрацию (включая ультрафильтрацию), ионообменную колоночную хроматографию, аффинную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию и высаливание. Методом очистки является предпочтительно колоночная хроматография, более предпочтительно ионообменная колоночная хроматография и наиболее предпочтительно DEAE-ионообменная колоночная хроматография. Количество раз очистки, осуществляемой колоночной хроматографией, не является предметом какого-либо определенного ограничения. А именно, очистка колоночной хроматографией может проводиться повторно до достижения требуемой чистоты. Однако с точки зрения эффективности продукции и других вопросов предпочтительно проводить такую очистку в несколько стадий, если возможно.
Концентрирование и очистку предпочтительно проводят путем преобразования жидкости вируса полиомиелита в осадок с помощью ультрацентрифугирования, обработки ультразвуком ресуспензии полученного осадка, затем очистки колоночной хроматографией. Кроме того, с точки зрения эффективной продукции предпочтительно проводить очистку колоночной хроматографией только один раз. Путем осуществления преобразования жидкости вируса полиомиелита в осадок с помощью ультрацентрифугирования, обработки ультразвуком ресуспензии осадка и очистки колоночной хроматографией только один раз жидкость вируса полиомиелита может быть эффективно и адекватно сконцентрирована и очищена.
Инактивация вируса полиомиелита
Инактивация вируса полиомиелита может быть проведена обычно используемым методом. Специфически вирус полиомиелита может быть инактивирован путем добавления к жидкости вируса полиомиелита инактиватора, таким образом вызывая реакцию между вирусом полиомиелита и инактиватором. Инактиватором предпочтительно является формалин. Условия инактивации не являются предметом какого-либо определенного ограничения до тех пор, пока вирус полиомиелита инактивируется. Во избежание остаточного наличия недостаточно инактивированного вируса полиомиелита период инактивационной обработки составляет обычно от примерно 2 до примерно 4 раз, предпочтительно от примерно 2,5 до примерно 3,5 раз и более предпочтительно примерно 3 раза, больше продолжительности периода, в течение которого подтверждается инактивация вируса полиомиелита.
Например, когда в качестве инактиватора используют формалин, добавляемое количество составляет предпочтительно от примерно 0,001 до примерно 0,1% масс./об., более предпочтительно от примерно 0,005 до примерно 0,05% масс./об. и наиболее предпочтительно примерно 0,01% масс./об. Температура инактивации составляет наиболее предпочтительно примерно 37ºC. Период инактивации может также варьироваться в зависимости от типа инактиватора, концентрации инактиватора и температуры инактивации. Например, когда в качестве инактиватора используется примерно 0,01% масс./об. формалина и температура инактивации составляет примерно 37ºC, период инактивации составляет предпочтительно от примерно 8 до примерно 16 дней, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 14 дней и наиболее предпочтительно примерно 12 дней. Когда используют примерно 0,01% масс./об. формалина и температура инактивации составляет примерно 37ºC, штамм Сэбина вируса полиомиелита обычно инактивируется в течение 4 дней.
B. pertussis
3. Анатоксин дифтерии, защитный антиген  и анатоксин столбняка (DPT)
B. pertussis
Защитный антиген , анатоксин дифтерии и анатоксин столбняка, используемые в настоящем изобретении, не являются предметом какого-либо определенного ограничения.
B. pertussis
B. pertussis
B. pertussis
B. pertussis
Corynebacterium diphtheriae
Clostridium tetani
Защитный антиген , анатоксин дифтерии и анатоксин столбняка являются коммерчески доступными в виде комбинированных вакцин от дифтерии-коклюша-столбняка (таких, как производимые Takeda Chemical Industries, Ltd., the Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University (Biken), и the Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute (Kaketsuken)). Альтернативно, защитный антиген , анатоксин дифтерии и анатоксин столбняка могут быть получены известными способами. Специфически защитный антиген  может быть получен путем, например, экстракции, выделения и очистки иммунной антигенной фракции из культуральной среды штаммов  фазы I (Tohama штамм) с использованием физико-химического метода, такого как фракционирование в сульфате аммония/центрифужное фракционирование по градиенту плотности в сахарозе, затем снижение оставшейся вирулентности формалином. Анатоксин дифтерии может быть получен, например, очисткой и концентрированием токсина, продуцируемого  (штамм Park-Williams № 8) с использованием физико-химического метода, такого как колоночная хроматография, с последующей детоксикацией формалином. Анатоксин столбняка может быть получен, например, очисткой и концентрированием токсина, продуцируемого  (штамм Harvard) с использованием физико-химического метода, такого как колоночная хроматография, с последующей детоксикацией формалином.
B. pertussis
B. pertussis
Защитный антиген  содержит токсин коклюша (PT антиген), нитеобразный гемагглютинин (FHA антиген), белок наружной мембраны (69 кДа антиген) и фимбрии (также называемые FB антиген, агглютиноген (FGG)). Защитный антиген  не должен обязательно содержать каждый из вышеуказанных антигенов, пока он содержит по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два и более предпочтительно по меньшей мере три из этих антигенов. Антитела для этих защитных антигенов защищают организм-хозяина от коклюша.
4. Комбинированная вакцина
B. pertussis
B. pertussis
Комбинированная вакцина по настоящему изобретению содержит инактивированные штаммы Сэбина вируса полиомиелита, защитный антиген , анатоксин дифтерии и анатоксин столбняка. Как упомянуто выше, защитный антиген , анатоксин дифтерии и анатоксин столбняка являются доступными коммерчески в виде комбинированной вакцины от дифтерии-столбняка-коклюша. Следовательно, комбинированная вакцина по настоящему изобретению также может быть получена путем смешивания инактивированных штаммов Сэбина вируса полиомиелита вместе с комбинированной вакциной от дифтерии-столбняка-коклюша.
Инактивированные штаммы Сэбина вируса полиомиелита могут быть получены путем смешивания инактивированных штаммов Сэбина вируса полиомиелита типа I, инактивированных штаммов Сэбина вируса полиомиелита типа II и инактивированных штаммов Сэбина вируса полиомиелита типа III. Как упомянуто выше, инактивированные штаммы Сэбина вируса полиомиелита содержат тип I, тип II и тип III инактивированных штаммов Сэбина вируса полиомиелита в соотношении на основании количества их соответствующих D-антигенов предпочтительно (2-4):(80-120):(80-120) и наиболее предпочтительно (примерно 3):(примерно 100):(примерно 100).
B. pertussis
B. pertussis
Защитный антиген , анатоксин дифтерии и анатоксин столбняка могут включаться в комбинированную вакцину по изобретению в любых количествах, которые эффективны для профилактики коклюша, дифтерии и столбняка. Специфически такие соответствующие количества могут быть такими же, как соответствующие количества в вышеупомянутых коммерчески доступных комбинированных вакцинах от дифтерии-столбняка-коклюша. В случае когда на иммуногенность защитного антигена , анатоксина дифтерии и/или анатоксина столбняка влияет инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита и другие ингредиенты, комбинированная вакцина, эффективная для профилактики каждой из целевых болезней, может быть получена путем подходящей регуляции соответствующего содержания.
Комбинированная вакцина по изобретению может быть получена и использована обычными средствами. Специфически производство и применение могут проводиться, как описано выше.
Комбинированная вакцина по изобретению может быть получена в виде инъекции обычным способом. Такую инъекцию получают в соответствии со способом, который сам по себе известен в области техники, таким как растворение, суспендирование или эмульгирование вышеуказанных веществ в стерильной водной или масляной жидкости, обычно используемой в инъекциях. Примеры водных жидкостей для инъекций, которые могут быть использованы, включают физиологический раствор и изотонические растворы, содержащие глюкозу или некоторые другие добавки. Инъекционным раствором, который получают, обычно заполняют подходящие ампулы или шприцы.
Комбинированная вакцина по изобретению также может необязательно включать фармацевтические добавки, такие как консерванты, антиоксиданты и комплексообразующие вещества. Иллюстративные примеры консервантов включают тимеросал и 2-феноксиэтанол. Иллюстративные примеры комплексообразующих веществ включают этилендиаминтетрауксусную кислоту и гликолевый эфир диаминтетрауксусной кислоты.
Комбинированная вакцина по изобретению может дополнительно содержать добавки. Иллюстративные примеры добавок включают гидроксид алюминия, фосфат алюминия и хлорид алюминия.
B. pertussis
B. pertussis, C. diphtheriae и C. tetani
B. pertussis, C. diphtheriae и C. tetani
Diplococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis
Haemophilus influenzae
В добавление к инактивированному штамму Сэбина вируса полиомиелита, защитному антигену , анатоксину дифтерии и анатоксину столбняка, комбинированная вакцина по изобретению также может включать другие иммуногенные ингредиенты. Иллюстративные примеры таких иммуногенных ингредиентов включают иммуногенные ингредиенты для вирусов или бактерий, иных, чем вирус полиомиелита, . Примеры таких иммуногенных ингредиентов включают анатоксины, ослабленные вирусы, инактивированные вирусы, белки, пептиды, полисахариды, липополисахариды, липопептиды и их комбинации. Примеры вирусов и бактерий, иных, чем вирус полиомиелита,  включают вирусы гриппа, вирус кори, вирус эпидемического паротита, вирус краснухи, вирус герпеса, вирус оспы, вирус бешенства, вирус человеческого иммунодефицита, вирус гепатита, , бацилла брюшного тифа и  тип b.
Комбинированная вакцина по настоящему изобретению может вводиться парентерально, например путем подкожной инъекции или внутримышечной инъекции и предпочтительно путем подкожной инъекции.
B. pertussis
Количество разовой дозы комбинированной вакцины по изобретению может быть выбрано особым образом в соответствии с различными условиями, такими как возраст и масса тела предполагаемого вакцинируемого. Специфически разовая доза может содержать, например, по меньшей мере 4 международные единицы защитного антигена , примерно 15 Lf анатоксина дифтерии, примерно 2,5 Lf анатоксина столбняка, от примерно 2 до примерно 4 единиц (предпочтительно примерно 3 единицы) инактивированного вируса полиомиелита Сэбина типа I (D-антиген основной), от примерно 80 до примерно 120 единиц (предпочтительно примерно 100 единиц) инактивированного вируса полиомиелита Сэбина типа II (D-антиген основной) и от примерно 80 до примерно 120 единиц (предпочтительно примерно 100 единиц) инактивированного вируса полиомиелита Сэбина типа III (D-антиген основной).
Кратность введения комбинированной вакцины по изобретению в качестве исходной иммунизации может быть, например, две или три дозы с интервалом 3-8 недель. Когда комбинированную вакцину по изобретению вводят дважды в качестве исходной иммунизации, желательно вводить также комбинированную вакцину от дифтерии-коклюша-столбняка (вакцина DPT) с интервалом 3-8 недель. В качестве повторной иммунизации комбинированная вакцина по изобретению может быть введена еще раз с интервалом по меньшей мере 6 месяцев после исходной иммунизации (например, от 12 до 18 месяцев после завершения исходной иммунизации).
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение более полно проиллюстрировано ниже с помощью примеров, хотя примеры не ограничивают рамки изобретения.
Справочный пример 1: Получение рабочего банка клеток производителя для вирусов вакцины от полиомиелита
Банк консервированных клеток для получения вирусов для вакцины от полиомиелита получали методикой, описанной ниже, из клеток Vero, полученных от ATCC.
(i) Получение главного банка клеток (MCB)
2
Замороженные клетки в ампуле, полученной от ATCC (CCL 81 Vero, F-6573; номер пассажа 124) оттаивали и переносили в пустую 4-унциевую колбу (колба имеет емкость 154 мл и поверхность для роста клеток 54 см). Пятнадцать миллилитров среды для роста клеток (DME (Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Sigma, каталожный № D5523), содержащей 5 об.% сыворотки телят, 0,075% бикарбоната натрия, 20 мкг/мл эритромицина и 100 мкг/мл канамицина (окончательные концентрации)) добавляли по каплям в 4-унциевые колбы, содержащие клетки, в течение периода примерно 5 минут. Колбу, содержащую клетки и среду для роста клеток, стационарно культивировали при 36ºC (одна 4-унциевая колба, пассаж 125). На следующее утро среду для роста клеток заменяли 15 мл свежей культуры и снова проводили стационарное культивирование при 36ºC. На 6 день после начала стационарного культивирования культуры выносили субкультуру (из одной 4-унциевой колбы в четыре 4-унциевые колбы, пассаж 126). Метод субкультивирования проводили, как указано далее.
Метод субкультивирования
(1) Сливают культуральную среду.
(2) Помещают 5 мл 0,25% раствора трипсина для субкультивирования в 4-унциевую колбу.
(3) Смачивают поверхности клеток в течение примерно 1 минуты, затем сливают 0,25% раствор трипсина для субкультивирования.
(4) Помещают 4-унциевую колбу в покой при 36ºC и ждут для открепления клеток от стеклянной поверхности.
(5) Когда клетки начинают открепляться, добавляют 5 мл среды для роста клеток и вызывают открепление всех клеток путем пипетирования.
(6) Суспендируют клетки гомогенно путем дополнительного пипетирования, затем переносят среду для роста клеток в центрифужную пробирку.
(7) Центрифугируют в течение 5 минут при 600 об/мин, сливают надосадочную жидкость и однородно распределяют осажденные клетки в примерно 8 мл свежей среды для роста клеток путем пипетирования.
(8) Добавляют 2 мл суспензии клеток в каждую из четырех новых 4-унциевых колб (в каждой из которых распределено 13 мл свежей среды для роста клеток).
(9) Помещают четыре 4-унциевые колбы в покой при 36ºC и проводят культивирование клеток.
Состав 0,25% раствора трипсина для субкультивирования был следующим.
*1
5% трипсина, 50 мл/л
5% поливинилпирролидона (90 K), 20 мл/л
*2
0,247 моль эдетата натрия, 56 мл/л
*3
EK, 2 мл/л
*4
Жидкость для разведения трипсина, 872 мл/л
*1: Использовали трипсин из свиной поджелудочной железы, и он имел активность 1:300.
*2: Состав 0,247 моль эдетата натрия был следующий:
2
Эдетат натрия-2Na·2HO, 91,95 г/л
NaOH, 9,88 г/л
*3: Состав EK был следующий:
Лактобионат эритромицина, 10000 мкг/мл
Сульфат канамицина, 50000 мкг/мл
*4: Состав жидкости для разведения трипсина был следующий:
NaCl, 8000 мг/л
KCl, 400 мг/л
2
4
2
NaHPO·12HO, 150 мг/л
2
4
KHPO, 60 мг/л
2
7
Субкультивирование последовательно проводили таким же методом (хотя, так как площадь поверхности культивирования увеличилась в примерно 3-4 раза в одном пассаже, культуральные флаконы и обрабатываемые объемы жидкости различались) с интервалами 3-6 дней, таким образом получая клетки пассажа 129 (номер пассажа увеличивается на один каждый раз после проведения субкультивирования). Клетки культивируемого пассажа 129 обрабатывали трипсином в колбах 33 SR (Small Roux flasks: культуральные колбы, имеющие объем 727 мл и площадь поверхности роста клеток 156 см) таким же образом, как во время субкультивирования, и проводили центрифугирование, после которого осадок ресуспендировали до концентрации примерно 1,5×10 клеток/мл в криоконсервированной среде (DME (Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Sigma, каталожный № D5523), содержащей 10% диметилсульфоксида (ДМСО), 10 об.% сыворотки телят, 0,075% бикарбоната натрия, 20 мкг/мл эритромицина и 100 мкг/мл канамицина (окончательные концентрации)). Один миллилитр вышеуказанной суспензии клеток распределяли в ампуле, температуру снижали до -32ºC в медленном морозильнике (со скоростью охлаждения примерно 1ºC/мин), затем переносили в жидкий азот и консервировали. Клетки пассажа 129, полученные, как описано выше, использовали в качестве главного банка клеток (MCB).
(ii) Получение рабочего банка клеток производителя (Manufacturer's Working Cell Bank (MWCB))
С использованием основного банка клеток (MCB), полученных и законсервированных в разделе (i) выше, проводили стадии от оттаивания клеток в ампуле до выращивания клеток субкультивированием до пассажа 134 в целом таким же точным образом, который использовали для получения основного банка клеток (MCB) в (i) выше (хотя, т.к. количество исходных клеток было выше, количество обрабатываемой жидкости и тип и количество культуральных колб отличались). Клетки пассажа 134 консервировали в жидком азоте таким же образом, как клетки основного банка (MCB). Полученные таким образом клетки пассажа 134 использовали в качестве рабочего банка клеток производителя (MWCB).
Пример 1: Получение клеток для продукции вирусов вакцины от полиомиелита
(i) Стадия стационарного культивирования
2
Одну ампулу рабочего банка клеток производителя (MWCB), полученных и законсервированных в ссылочном примере 1 выше (клетки пассажа 134), оттаивали таким же образом, как в получении основного банка клеток (MCB) и рабочего банка клеток производителя (MWCB) в ссылочном примере 1, и клетки стационарно культивировали в течение 7 дней (пассаж 135) в трех колбах LR (Large Roux flasks, которые представляют собой культуральные колбы, имеющие емкость примерно 1540 мл и площадь поверхности роста клеток примерно 274 см). Субкультивирование проводили до 7 дня с начала стационарного культивирования, после чего объем культивирования увеличивали до 18 LR колб (пассаж 136) и проводили стационарное культивирование. Стационарное культивирование и их субкультивирование проводили таким же способом, как в получении основного банка клеток (MCB) и получении рабочего банка клеток производителя (MWCB) в ссылочном примере 1 выше.
Затем проводили 7 дней стационарного культивирования в 40-кюветной клеточной фабрике (Cell Factory) (Nunc, каталожный № 139446) (пассаж 137). На 7 день затем проводили субкультивирование с последующим началом стационарной культуры, в добавление к чему проводили 7 дней стационарного культивирования в четырех 40-кюветных клеточных фабриках (пассаж 138).
(ii) Стадия культивирования микроносителя
Затем клетки 138 пассажа, полученные на стадии стационарного культивирования в (i) выше, обрабатывали трипсином и центрифугировали таким же образом, как во время субкультивирования в (i) выше, и осажденные клетки однородно распределяли путем пипетирования в 1000 мл среды для роста клеток для культивирования микроносителя (DME (Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Sigma, каталожный № D5523) содержащей 5 об.% сыворотки телят (Thermo Trace), 0,11% бикарбоната натрия, 0,1% фруктозы, 20 мкг/мл эритромицина и 100 мкг/мл канамицина (окончательные концентрации)). Суспензию клеток заранее напитывали фосфатным буферным раствором (PBS), затем смешивали с микроносителем (Cytodex 1 (торговое наименование); GE Healthcare Biosciences), уравновешенным средой для роста клеток для культивирования микроносителя (использовали 5 г/л Cytodex 1 (торговое наименование), на основании массы перед набуханием), и культивирование проводили в трех 50-литровых культуральных сосудах при 37ºC, pH 7,15 и при перемешивании. Начиная со 2 дня культивирования, половину среды для роста клеток последовательно замещали один раз в сутки свежей средой для роста клеток. Клетки, выращенные в течение 7 дней, использовали в качестве клеток (пассаж 139) для получения вирусов вакцины от полиомиелита.
Пример 2: Получение инактивированной вакцины от полиомиелита типа I
(i) Стадия культивирования вируса
-3
50
Непосредственно перед инокуляцией посеянных вирусов в клетки для получения вируса вакцины от полиомиелита, полученные в примере 1 (пассаж 139), перемешивание останавливали и клеткам позволяли осесть, затем один раз промывали с использованием сбалансированного солевого раствора Earl's (EBSS), содержащего 0,075% бикарбоната натрия, 20 мкг/мл эритромицина и 100 мкг/мл канамицина (окончательные концентрации). После удаления надосадочной жидкости из 5 мл среды для роста клеток, собранной вместе с микроносителем, объем снова доводили до 5 мл путем добавления 0,25% раствора трипсина, таким образом открепляя клетки от шариков и способствуя их суспендированию. Затем определяли количество клеток, на основании чего оценивали количество клеток для полного 50-литрового культурального сосуда. Ослабленные посеянные вирусы Сэбина типа I (штаммы LSc, 2ab) инокулировали в концентрации примерно 10 CCID на ячейку. После инокуляции посеянных вирусов в культуральный сосуд немедленно вливали 50 л среды для культивирования вирусов (M199 (среда 199), содержащей 0,3% бикарбоната натрия, 20 мкг/мл эритромицина и 100 мкг/мл канамицина (окончательные концентрации)). Используемые посеянные вирусы были вирусами, которые культивировали заранее при примерно 33,3ºC с использованием первично культивированных клеток почек африканской зеленой макаки, затем упаковывали в небольшие партии и криоконсервировали при -70ºC.
Культивирование вируса проводили при 34±1ºC в течение 3 дней. С использованием цитопатических эффектов вируса полиомиелита (округление клеток, инфицированных вирусом полиомиелита, с последующим откреплением клеток от микроносителя) в качестве индикатора культивирование вируса останавливали, когда от микроносителя откреплялись от 95 до 100% клеток. После завершения культивирования вируса микроноситель удаляли с помощью тефлонового сита (размер отверстий 120 мкм) и восстанавливали суспензию вируса. Микроноситель, оставшийся на сите, промывали один раз примерно 3 л среды для культивирования вируса на 50-л культуральный сосуд. Полученную промывную жидкость добавляли для восстановления суспензии вируса, таким образом получая “жидкость вируса полиомиелита типа I”.
(ii) Стадия концентрирования/очистки вируса
2
Примерно 150 л жидкости вируса полиомиелита типа I, полученной в (i) выше, пропускали через 0,2 мкм фильтровальную мембрану (Pall Corporation, SLK7002NRP) для удаления обломков клеток. Фильтрат концентрировали до 1,2 л с помощью мембраны для ультрафильтрации (Sartorius, PESU (полиэфирсульфон) 100 кДа, 0,1 м, 3051466801E--SG). Концентрированную вирусную жидкость преобразовывали в осадок путем 4 часов ультрацентрифугирования при 6ºC и 100000 g, и после этого осадок ресуспендировали в 0,1 моль/л фосфатного буфера (PB) (осадок из одной центрифужной пробирки (примерно 100 мл) ресуспендировали в 5 мл PB). Ресуспензию осадка встряхивали в течение ночи при 4ºC, затем обрабатывали ультразвуком (Kubota, Insonator модель 200 M) в течение 8 минут при 200 В, таким образом разрушая массу агрегированных вирусов. Затем после 30 минут центрифугирования при 15000 об/мин собирали надосадочную жидкость. Полученную таким образом надосадочную жидкость очищали с помощью DEAE Sepharose CL-6B (торговое наименование, GE Healthcare Biosciences; GE 17-0710-05). В качестве элюата использовали фосфатный буфер (PB) 0,1 моль/л. Отслеживали поглощение при 280 нм и первый пик получали как “очищенную жидкость вируса полиомиелита типа I”. Рассчитывали поглощение при 260/280 нм для пика образца и подтверждали, что он больше 1,5 (поглощение при 260/280 нм для полных частиц вируса полиомиелита составляет от 1,6 до 1,7).
(iii) Стадия инактивации
Очищенную жидкость вируса полиомиелита типа I, полученную в (ii) выше, разводили примерно 10-кратного количества разводящим раствором для преактивации (M199, содержащая 5% аминоуксусной кислоты (окончательная концентрация), но не содержащая кальция, магния, фенольного красного или бикарбоната натрия), пропускали через 0,2 мкм фильтровальную мембрану (Pall Corporation, SLK7002NRP) и удаляли массу агрегированных вирусов. После получения фильтрата быстро начинали инактивацию таким образом, чтобы избежать повторной агрегации вирусов. За час до начала инактивации фильтрат и формалин, разведенные 1:200, раздельно нагревали до 37ºC. При тщательном перемешивании фильтрата формалин добавляли до окончательной концентрации 1:4000, смесь нагревали до 37ºC и начинали инактивацию. Во время обработки формалином осуществляли гомогенную инактивацию вируса путем перемешивания смеси дважды в день - один раз в первой половине дня и один раз во второй половине дня. Предполагая, что недостаточно инактивированные вирусы приклеятся к пробке сосуда и к определенным специфическим местам в сосуде, пробку меняли в дни 2 и 4 после начала инактивации и сам сосуд меняли на 6 день. Кроме того, предполагая, что вирусы агрегируют во время стадии инактивации, в 6 день инактивации проводили фильтрацию с использованием 0,2 мкм фильтровальной мембраны (Pall Corporation, SLK7002NRP). Стадию обработки формалином останавливали через 12 дней. На 12 день свободный формалин в вирусной жидкости, обработанной формалином, нейтрализовали сульфитом натрия (добавляли до концентрации 0,0264 моль/л), после чего в качестве стабилизатора добавляли эдетат натрия (0,0009 моль/л), таким образом получая партию материала “инактивированной вакцины от полиомиелита типа I”.
(iv)
Количество D-антигена измеряли непрямым методом ELISA с использованием антител, имеющих высокую специфичность к типу и D-антигену. Непрямой метод ELISA начинали покрытием микропланшета в качестве первичного антитела моноклональным антителом (мышиным), специфичным для D-антигенов того же типа, что и анализируемый антиген. Затем анализируемый антиген разводили и помещали на него. Затем кроличье моноклональное антитело того же типа, что и анализируемое, помещали на него в качестве вторичного антитела, в добавление к чему на него помещали меченное HRPO антикроличье антитело IgG, вызывая реакцию. После реакции проводили окрашивание с использованием раствора o-фенилендиамина и измеряли поглощение при 492 нм. Количество D-антигена (оцениваемого антигена) определяли путем сравнения измеренного поглощения для оцениваемого антитела и измеренного поглощения для контрольного антигена путем количественного анализа в параллельных линиях.
Пример 3: Получение инактивированной вакцины от полиомиелита типа II
С помощью использования ослабленных штаммов Сэбина типа II (штаммы P712, Ch, 2ab) вместо ослабленных штаммов Сэбина типа I (штаммы LSc, 2ab) партию материала “инактивированной вакцины от полиомиелита типа II” получали таким же образом, как в примере 2.
Пример 4: Получение инактивированной вакцины от полиомиелита типа III
1
С помощью использования ослабленных штаммов Сэбина типа III (штаммы Leon, 12ab) вместо ослабленных штаммов Сэбина типа I (штаммы LSc, 2ab) партию материала “инактивированной вакцины от полиомиелита типа III” получали таким же образом, как в примере 2.
B. pertussis
Пример 5: Получение защитного антигена
Bordetella pertussis
(1) Культивирование
B. pertussis
Штаммы фазы I  (штамм Tohama) культивировали, вращая при 30-34ºC в течение 20-24 часов в среде Cohen-Wheeler. B. pertussis, выращенные на среде Cohen-Wheeler, затем выращивали на среде Stainer-Scholte при 30-34ºC в течение 48-68 часов.
Культуру концентрировали до 1/10-й исходного объема путем ультрацентрифугирования и надосадочную жидкость и бактериальные клетки разделяли центрифужным разделением.
(2) Получение токсина коклюша
Затем 1 моль/л фосфатного буфера (pH 8) добавляли к надосадочной жидкости, полученной в (1) выше, так, чтобы довести объем до 1/10-й исходного объема, затем добавляли 25% масс./об. раствора ацетата кальция для доведения концентрации до от 0,1 до 2,0% масс./об. и фильтрованием получали фильтрат, содержащий токсин коклюша (иммунный антиген). Фильтрат пропускали через колонку посредством SP колоночной хроматографии (уравновешенный раствор: 0,1 моль/л фосфатного буфера (pH 6,0) и адсорбированный токсин коклюша элюировали 0,415 моль/л фосфатного буфера (pH 7,0)), таким образом фракционируя раствор, содержащий токсин коклюша. Затем раствор, содержащий токсин коклюша, пропускали через колонку посредством гель-колоночной хроматографии (уравновешенный раствор: 0,025 моль/л раствора фосфата натрия (pH 8,7), содержащий 0,25 моль/л хлорида натрия), затем фильтровали (размер отверстий 0,2 мкм), давая раствор чистого токсина коклюша (PT антиген).
(3) Получение нитеобразного гемагглютинина
Бактериальные клетки, выделенные в (1) выше, диспергировали в 0,05 моль/л фосфатного буфера (pH 8,0), содержащего 1 моль/л хлорида натрия, затем проводили центрифужное разделение для повторного разделения надосадочной жидкости и бактериальных клеток. 25% масс./об. раствора ацетата кальция добавляли к заново разделенной надосадочной жидкости до концентрации от 0,1 до 2,0% масс./об., затем проводили фильтрацию, получая раствор, содержащий нитеобразный гемагглютинин (иммунный антиген). Фильтрат концентрировали с помощью сульфата аммония, затем очищали центрифугированием по градиенту плотности, таким образом фракционируя чистый нитеобразный гемагглютинин (FHA антиген).
(4) Получение белка наружной мембраны
Бактериальные клетки, заново разделенные в (3) выше, диспергировали в 0,01 моль/л фосфатном буфере (pH 7,0), содержащем 0,145 моль/л хлорида натрия, и нагревали при 60ºC в течение 90 минут, после чего надосадочную жидкость и бактериальные клетки снова повторно разделяли путем центрифужного разделения. Затем к повторно разделенной надосадочной жидкости снова добавляли 1 моль/л фосфатного буфера (pH 8,0) так, чтобы довести объем до 1/10-й, после чего 25% масс./об. раствора ацетата кальция добавляли до концентрации от 0,1 до 2,0% масс./об. и проводили фильтрацию, посредством чего получали фильтрат, содержащий белок наружной мембраны (иммунный антиген). Раствор, содержащий белок наружной мембраны (иммунный антиген), подвергали SP колоночной хроматографии (уравновешенный раствор: 0,1 моль/л фосфатного буфера (pH 6,0)) и собирали жидкость, которую пропускали через колонку. Затем жидкость пропускали через колонку путем гель-колоночной хроматографии (уравновешенный раствор: 0,025 моль/л раствора фосфата натрия (pH 8,7), содержащий 0,25 моль/л фосфата натрия), затем фильтровали (размер отверстий 0,2 мкм), таким образом получая белок наружной мембраны (антиген 69K).
(5) Получение фимбрий (агглютиноген (AGG))
0,1 моль/л фосфатного буфера (pH 8,0), содержащего 1 моль/л хлорида натрия, добавляли к остатку, оставшемуся после получения раствора, содержащего белок наружной мембраны в (4) выше в количестве 1/10-й количества надосадочной жидкости, после чего проводили фильтрацию, получая фильтрат, содержащий фимбрии (иммунный антиген). Полученный раствор, содержащий фимбрии, концентрировали сульфатом аммония, затем очищали центрифугированием по градиенту плотности, таким образом фракционируя чистые фимбрии (FB антиген).
(6) Получение защитного антигена (ослабление вирулентности)
В виде чистого раствора иммунного антигена получали раствор, содержащий PT антиген, FHA антиген, 69 кДа антиген и FB антиген, полученные в разделах (2)-(5) выше, смешивали таким образом, чтобы комбинированная вакцина DPT, полученная в примере 8 ниже, включала уровни антигенов 1,89 мкг PT антигена, 3,00 мкг FHA антигена, 0,76 мкг 69K антигена и 0,36 мкг FB антигена на 0,5 мл вакцины. К чистому раствору иммунного антигена добавляли формалин (от 0,2 до 0,5 об.%) и, если необходимо, гидрохлорид лизина до концентрации не более 1% масс./об., после чего раствор нагревали при 37-41ºC в течение по меньшей мере 7 дней, чтобы вызвать ослабление вирулентности, таким образом получая раствор защитного антигена коклюша. Избыток формалина и гидрохлорида лизина удаляли ультрафильтрацией, получая партию материала защитного антигена коклюша.
Пример 6: Получение анатоксина дифтерии
Corynebacterium diphtheriae
(1) Культивирование
C. diphtheriae
(штамм Park-Williams № 8) культивировали на среде Loeffler's при 32,0-34,0ºC в течение 5 дней.
(2) Получение токсина дифтерии
Сульфат аммония добавляли к культуральной жидкости, полученной в (1) выше, после чего надосадочную жидкость фильтровали (размер отверстий 0,45 мкм). Полученный фильтрат пропускали через колонку фенил-гидрофобной колоночной хроматографии (уравновешенный раствор: 0,01 моль/л раствора фосфата натрия (pH 6,5), содержащего 1,25 моль/л сульфата аммония). Полученный таким образом раствор токсина пропускали через колонку DEAE ионообменной колоночной хроматографии (уравновешенный раствор: 0,01 моль/л фосфатного буфера (pH 7,0)), затем пропускали через колонку гелевой колоночной хроматографии (уравновешенный раствор: 0,1 моль/л фосфатного буфера (pH 7,0), содержащего 0,145 моль/л хлорида натрия), посредством чего фракционируя токсин дифтерии. Его использовали в качестве чистого раствора токсина.
(3) Преобразование токсина дифтерии в анатоксин
Затем к чистому раствору токсина, полученному в (2) выше, добавляли гидрохлорид лизина до концентрации не более 1% масс./об., добавляли формалин до концентрации 0,3 об.% и раствор нагревали при 38,0-40,0ºC в течение 21 дня, таким образом преобразуя токсин в анатоксин.
(4) Получение анатоксина дифтерии
После преобразования в анатоксин в (3) выше избыток формалина и гидрохлорида лизина удаляли ультрафильтрованием, таким образом получая анатоксин дифтерии.
Пример 7: Получение анатоксина столбняка
Clostridium tetani
(1) Культивирование
C. tetani
(Harvard 47-A) культивировали в среде из печени при 34,5-36,5ºC в течение 5 дней.
(2) Получение токсина столбняка
Сульфат аммония добавляли к культуре, полученной в (1) выше, до концентрации 1,25 моль/л на литр культуры. Затем культуру пропускали через колонку фенил-гидрофобной колоночной хроматографии (уравновешенный раствор: 0,01 моль/л фосфата натрия (pH 6,5), содержащего 1,25 моль/л сульфата аммония). Полученный раствор токсина пропускали через колонку DEAE ионообменной колоночной хроматографии (уравновешенный раствор: 0,01 моль/л фосфатного буфера (pH 7,5)), после чего раствор пропускали через колонку гель-колоночной хроматографии (уравновешенный раствор: 0,004 моль/л фосфатного буфера (pH 7,0), содержащего 0,145 моль/л хлорида натрия), таким образом фракционируя токсин столбняка. Его использовали в виде раствора чистого токсина.
(3) Преобразование токсина столбняка в анатоксин
Затем к раствору чистого токсина, полученному в вышеуказанном (2), добавляли формалин до концентрации 0,3 об.%, pH корректировали до 7,0 и раствор нагревали до 39ºC в течение 15-23 дней, таким образом преобразуя токсин в анатоксин.
(4) Получение анатоксина столбняка
После преобразования в анатоксин в (3) выше избыток формалина и гидрохлорида лизина удаляли ультрафильтрованием, таким образом получая анатоксин столбняка.
Пример 8: Получение комбинированной вакцины
(i) Получение комбинированной инактивированной вакцины от полиомиелита
Партию материала инактивированной вакцины от полиомиелита типа I, инактивированной вакцины от полиомиелита типа II и инактивированной вакцины от полиомиелита типа III, полученных в примерах 2, 3 и 4 выше, смешивали со средой 199 (M199), 2-феноксиэтанолом (окончательная концентрация 0,5 об.%) и хлоридом алюминия (окончательная концентрация 0,09 масс./об.) таким образом, чтобы установить относительные уровни соответствующих D-антигенов 3:100:100. Полученную смесь доводили до pH 7 с помощью гидроксида натрия или соляной кислоты, таким образом получая комбинированную инактивированную вакцину от полиомиелита.
(ii) Получение комбинированной вакцины DPT
B. pertussis
Партии материала защитного антигена , анатоксина дифтерии и анатоксина столбняка, полученные в примерах 5, 6 и 7 выше, смешивали со средой 199 (M199), 2-феноксиэтанолом (окончательная концентрация 0,5 об.%) и хлоридом алюминия (окончательная концентрация 0,24% масс./об.). Полученную смесь доводили до pH 7 гидроксидом натрия и соляной кислотой, таким образом получая комбинированную вакцину DPT.
(iii) Получение комбинированной вакцины
Комбинированную инактивированную вакцину от полиомиелита, полученную в (i) выше, и комбинированную вакцину DPT, полученную в (ii) выше, смешивали в равных количествах, таким образом получая комбинированную вакцину.
Пример 9: Стабильность комбинированной вакцины
Комбинированную вакцину, полученную в примере 8, оценивали проведением ускоренного теста при 25ºC. Стабильность оценивали по тестам эффективности в отношении каждого из вирусов.
(1) Исследование эффективности осажденной чистой вакцины от коклюша
B. pertussis
Использовали тестируемый образец, стандартную вакцину от коклюша и штамм  18323. Тестируемый образец и стандартную вакцину разводили, из полученных разведений затем получали всего по меньшей мере 3 серийных разведения в подходящих логарифмически равных интервалах 4 раза или более. Для каждого разведения использовали одну группу по меньшей мере из шестнадцати 4-недельных мышей. Каждому животному вводили 0,5 мл разведения в виде одной интраперитонеальной инъекции. Через двадцать один день после иммунных инъекций для провокации в головной мозг каждого животного вводили 0,025 мл суспензии бактериальных клеток, после чего животных наблюдали в течение 14 дней и подсчитывали количество смертей. Из статистической обработки и сравнения результатов исследования тестируемый образец должен иметь эффективность по меньшей мере 8 единиц/мл.
(2) Исследование эффективности осажденного анатоксина дифтерии
Использовали тестируемый образец, контрольный осажденный анатоксин дифтерии и подходящий раствор токсина. Разведение тестируемого образца и контроля проводили физиологическим раствором; разведение раствора токсина проводили 0,017 моль/л раствора фосфатного буфера/хлорида натрия (pH 7,0), содержащего 0,2% масс./об. желатина. Тестируемый образец и контроль, оба, разводили, создавая серийные разведения с логарифмически равными интервалами. С использованием одной группы по меньшей мере десяти 5-недельных мышей для каждого разведения тестируемого образца и контроля каждому животному подкожно вводили 0,5 мл. Через четыре-шесть недель после иммунных инъекций у каждого животного брали кровь и измеряли титр антитоксина крови. Из статистической обработки и сравнения результатов исследования тестируемый образец должен иметь эффективность по меньшей мере 47 единиц/мл.
(3) Исследование эффективности осажденного анатоксина столбняка
50
Использовали тестируемый образец, контрольный осажденный анатоксин столбняка и подходящий раствор токсина. Разведение исследуемого образца и контроля проводили физиологическим раствором; разведение раствора токсина проводили 0,017 моль/л раствора фосфатного буфера/хлорида натрия (pH 7,0), содержащего 0,2% масс./об. желатина. Тестируемый образец и контроль разводили, создавая серийные разведения с логарифмически равными интервалами. С использованием одной группы по меньшей мере из десяти 5-недельных мышей для каждого разведения исследуемого образца и контроля каждому животному вводили одну подкожную инъекцию 0,5 мл. Через четыре-шесть недель после иммунных инъекций каждой мыши вводили примерно 100 LD токсина и наблюдали в течение 4 дней. Из статистической обработки и сравнения результатов исследования исследуемый образец должен иметь эффективность по меньшей мере 27 единиц/мл.
(4) Исследование иммуногенности у крыс
50
2
2
4
Использовали тестируемый образец, контроль для исследования эффективности IPV, стандартную сыворотку для каждого типа и штаммы Сэбина вируса полиомиелита (типа I, II и III) для провокаций тестов нейтрализации. Тестируемый образец и контроль разводили, получая разведения с логарифмически равными интервалами. Одну группу по меньшей мере из десяти 8-недельных самок крыс Wister использовали для каждого разведения. Каждому животному вводили внутримышечно 0,5 мл в область бедра задней лапы. Через двадцать один день после инокуляции у каждого животного отдельно получали кровь и собранную сыворотку затем нагревали при 56ºC в течение 30 минут. Сыворотку для каждого животного и стандартную сыворотку помещали по меньшей мере в две ячейки для каждой сыворотки и двукратно серийно разводили средой MEM. Кроме того, соответствующие ячейки инокулировали примерно 100 CCID с нейтрализующими вирус суспензиями соответствующих типов. Затем все планшеты помещали в 36±1ºC CO инкубатор в течение 3 часов, затем позволяли взаимодействовать в течение ночи при примерно 4ºC. Суспензию клеток, содержащую 1×10 клеток, на следующий день добавляли к каждой ячейке и культивировали в инкубаторе 36±1ºC CO в течение 7 дней. После завершения культивирования исследовали CPE для каждой ячейки, рассчитывали соотношение разведения сыворотки в момент 50% нейтрализации и обратное этому считали как нейтрализующий титр антител. После статистической обработки и сравнения результатов исследования исследуемый образец должен иметь эффективность, равную или выше таковой контроля.
Результаты для ускоренного теста показаны в таблице 1. В качестве контрольной IPV использовали партию 04C (Japan Polio Research Institute).
<b>Таблица 1</b>
Спецификация
В начале исследо-вания
1 месяц
2 месяца
3 месяца
Инактивиро-ванная вакцина от полиомиелита типа I
Равная или выше контрольной IPV
1,7
1,7
1,5
2,1
Инактивиро-ванная вакцина от полиомиелита типа II
Равная или выше контрольной IPV
2,1
2,0
1,6
1,5
Инактивиро-ванная вакцина от полиомиелита типа III
Равная или выше контрольной IPV
20,3
12,3
5,9
6,0
Осажденная чистая вакцина от коклюша
8 единиц/мл
15,8
13,8
14,6
27,3
Осажденный анатоксин дифтерии
47 единиц/мл
97,9
109,3
85,9
102,9
Осажденный анатоксин столбняка
27 единиц/мл
72,3
88,6
105,5
79,4
Пример 10: Культивирование клеток Vero с использованием метода микроносителя и культивирование вируса полиомиелита
(i) Культивирование клеток Vero
3
Клетки, которые субкультивировали в стационарной культуре, начиная с рабочего банка клеток Vero (MWCB93), открепляли с помощью раствора трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина, 0,14 M ЭДТА), затем центрифугировали при 600 об/мин в течение 10 минут и впоследствии суспендировали в среде для роста клеток (среда Dulbecco's modified Eagle (DME), содержащая 5 об.% сыворотки телят, 0,11% бикарбоната натрия (NaHCO), 0,1% фруктозы, 20 мкг/мл эритромицина и 100 мкг/мл канамицина).
Микроноситель (Cytodex 1 (торговое наименование)) пропитывали в PBS (-), стерилизовали в автоклаве при 121ºC в течение 15 минут, затем замещали средой для роста клеток и использовали.
3
Биореакторы Celligen Plus и Celligen, производимые New Brunswick Scientific, использовали в качестве культурального оборудования. Микроноситель и суспензию клеток добавляли в биореактор, после чего добавляли среду для роста клеток до конечного объема 4,8 л (в случае биореактора Celligen, 3,5 л) и проводили культивирование при температуре 37,0ºC, концентрации растворенного кислорода (DO) 15%, pH 7,15 и скорости вращения 35-50 об/мин. Смену среды с использованием среды для роста клеток, содержащей NaHCO в концентрации 0,15% в качестве обменной среды, проводили непрерывно со 2 дня культивирования со скоростью примерно 4 л/день (в случае биореактора Celligen общее количество среды меняли один раз через день). Количество клеток измеряли с использованием счетчика Coulter (торговое наименование).
5
5
5
5
6
Результаты культивирования клеток показаны на фиг.1 (биореакторы Celligen использовали только в исследованиях 3H). При концентрации носителя 3 г/л количество клеток достигало максимума на 7 день при низком количестве исходного количества клеток (3L, примерно 2×10 клеток/мл) и достигало максимума на 8 день при высокой концентрации исходного количества клеток (3H, примерно 10×10 клеток/мл), после чего оно снижалось. При концентрации носителя 5 г/л количество клеток увеличивалось в течение периода 11 дней при низкой концентрации исходного количества клеток (5L, примерно 2×10 клеток/мл), но количество клеток снижалось к 12 дню. В случае низкой концентрации исходного количества клеток общее количество клеток при концентрации носителя 5 г/л было больше на 10 день, чем общее количество клеток при уровне носителя 3 г/л, но различия не были большими. При концентрации носителя 5 г/л и высокой концентрации исходного количества клеток (5H, примерно 10×10 клеток/мл) количество клеток все еще увеличивалось на 9 день с количеством клеток в этой точке примерно 2,8×10 клеток/мл, представляя собой увеличение примерно 2,7 раз от исходного количества клеток.
(ii) Культивирование вируса полиомиелита
3
3
Тип I вируса полиомиелита (IS-90C) использовали в качестве посеянного вируса. В последний день измерения количества клеток клетки промывали 4-кратным объемом (на основании культивирующей емкости биореактора) EBSS, содержащего 0,075% NaHCO. Затем посеянный вирус разводили в 1 литре M-199 (E) среды, содержащей 0,3% NaHCO, 20 мкг/мл эритромицина и 100 мкг/мл канамицина (среда для роста вирусов). Полученное разведение вируса затем инокулировали в промытые клетки и добавляли среду для культивирования вируса до культивирующей емкости соответствующих биореакторов. Культивирование вирусов проводили при температуре культивирования 33,3ºC, 15% растворенного кислорода (DO), pH 7,40 и скорости вращения 35-50 об/мин. Культивирование вируса останавливали, когда клетки полностью откреплялись от микроносителя из-за цитопатических эффектов (CPE) вируса, тогда же собирали вирусную жидкость. Собранную вирусную жидкость криоконсервировали при -80ºC.
В этом исследовании культивирование вируса начинали в последний день измерения соответствующих кривых роста клеток, показанных на фиг.1.
3
3
10
50
-7
-8,5
Измерение титра вируса проводили, как указано далее. Клетки GMK-2, культивируемые в течение 3 дней в роллерной пробирке, дважды промывали 1 мл HBSS, содержащего 0,075% NaHCO, 200 ед./мл пенициллина и 200 мкг/мл стрептомицина, после чего добавляли 1 мл жидкости, поддерживающей клетки (среда M-199, содержащая 0,1% альбумина бычьей сыворотки, 0,225% NaHCO, 200 ед./мл пенициллина и 200 мкг/мл стрептомицина). Исследуемую вирусную жидкость серийно разводили 0,5 log с помощью жидкости, поддерживающей клетки, и 0,2 мл 10-10 вирусной жидкости на пробирку инокулировали в 5 пробирок при каждом уровне разведения. После инокуляции культивирование проводили в течение 7 дней в 36ºC инкубаторе. Титр инфективности (CCID/0,2 мл) рассчитывали по методу Reed & Muench на основании наблюдения цитопатических эффектов (CPE) на 7 день.
6
10
50
На фиг.2 показаны титры инфективности (вирусные титры) вируса полиомиелита типа I, полученные в клетках Vero, культивируемых в различных условиях. В результате культивирования вируса более высокий уровень инфекционности получали в системе, имеющей концентрацию носителя 5 г/л и высокую концентрацию исходного количества клеток (5H); такая система на 9 день достигала плотности клеток 2,8×10 клеток/мл. Системы, расположенные в соответствии с размером титров инфективности в нисходящем порядке, представляют собой 5H, 5L и 3L. Такие результаты согласуются с общим количеством клеток. Кроме того, по сравнению с вирусной жидкостью, полученной культивированием клеток почек зеленых макак в качестве контроля, в системе 5H получали титр инфективности более чем в 10 раз выше. Титры вирусов, показанные на фиг.2 (logCCID/0,2 мл), составляли, 8,18 в системе 3L, 8,51 в системе 5L, 8,59 в системе 5H и 7,50 в Контр. (Контроль).
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
Высокоактивные штаммы Сэбина вируса полиомиелита могут быть получены культивированием в присутствии от примерно 4 г/л до примерно 6 г/л микроносителя клеток Vero, инокулированных штаммом Сэбина вируса полиомиелита. Инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита может быть эффективно получен с использованием высокоактивного штамма Сэбина вируса полиомиелита. Следовательно, способ получения комбинированной вакцины, который включает стадию культивирования клеток Vero, инокулированных штаммом Сэбина вируса полиомиелита в присутствии от примерно 4 г/л до примерно 6 г/л микроносителя (способ получения по настоящему изобретению) является применимым в качестве способа эффективного получения комбинированных вакцин, содержащих инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита. Кроме того, так как комбинированная вакцина по настоящему изобретению способна эффективно подавлять развитие полиомиелита, коклюша, дифтерии и столбняка, она является применимой в качестве вакцины от полиомиелита, дифтерии и столбняка.