Динамика субпопуляций тимоцитов при регенерации тимуса после облучения

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl peptides // Vaccine. -2007. - Vol. 25. - P. 4515-4520.

14. Muller-AnstettM. A., Muller P., Albrecht T. et al. Staphylococcal peptidoglycan co-localizes with Nod2 and TLR2 and activates innate immune response via both receptors in primary murine keratinocytes // PLoS One. - 2010. - Vol. 5. - P. e13153.

15. OpitzB., Forster S., Hocke A. C. et al. Nodl-mediated endothelial cell activation by Chlamydophila pneumoniae // Circ. Res. - 2005. - Vol. 96. - P. 319-326.

16. OpitzB., PuschelA., Beermann W. et al. Listeria monocytogenes activated p38 MAPK and induced IL-8 secretion in a nucleotidebinding oligomerization domain 1-dependent manner in endothelial cells // J. Immunol. - 2006. - Vol. 176. - P. 484-490.

17. Pashenkov M. V., Popilyuk S. F., Alkhazova B. I. et al. Muropeptides trigger distinct activation profiles in macrophages and dendritic cells // Int. Immunopharmacol. - 2010. - Vol. 10. - P. 875-882.

18. Schwandner R., DziarskiR., Wesche H. et al. Peptidoglycan- and lipoteichoic acid-induced cell activation is mediated by toll-like

receptor 2 // J. Biol. Chem. - 1999. - Vol. 274. - P. 1740617409.

19. Takeuchi O., Hoshino K., Kawai T. et al. Differential roles of TLR2 and TLR4 in recognition of gram-negative and gram-positive bacterial cell wall components // Immunity. - 1999. - Vol. 11. - P. 443-451.

20. Ting J. P., Duncan J. A., Lei Y. How the noninflammasome NLRs function in the innate immune system // Science. - 2010. - Vol. 327. - P. 286-290.

21. Travassos L. H., Girardin S. E., Philpott D. J. et al. Toll-like receptor 2-dependent bacterial sensing does not occur via peptido-glycan recognition // EMBO Rep. - 2004. - Vol. 5. - P. 10001006.

22. Voss E., Wehkamp J., Wehkamp K. et al. NOD2/CARD15 mediates induction of the antimicrobial peptide human beta-defensin-2 // J. Biol. Chem. - 2006. - Vol. 281. - P. 2005-2011.

Поступила 26.07.12

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 615.849.12.03:616.438].015.44.076.9

А. Н. Митин, В. В. Комогорова, М. М. Литвина, С. В. Шевелев, Н. И. Шарова, А. А. Ярилин

ДИНАМИКА СУБПОПУЛЯЦИй ТИМОЦИТОВ ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ ТИМУСА ПОСЛЕ ОБЛУЧЕНИЯ

ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России

Исследовали в динамике восстановление популяций и субпопуляций тимуса мышей после общего Y-облучения в дозе 4 Гр. В наибольшей степени ионизирующей радиацией поражается популяция кортикальных CD4+CD8+-тимоцитов, в результате чего изменяется соотношение клеток различных стадий развития в период максимального опустошения органа (на 5-е сутки). Затем общая численность тимоцитов и практически повторяющая ее численность CD4+CD8+-клеток восстанавливаются с двухволновой кинетикой: к 10-м суткам достигается экстренное восстановление, за которым следует вторичная атрофия с минимальным содержанием клеток на 20-е сутки, после чего реализуется окончательное восстановление. двухволновая кинетика, выраженная менее отчетливо, характерна для всех фракций тимоцитов, кроме двух субпопуляций CD-CD8-клеток - DN2 (CD44+CD25+) и DN3 (CD44-CD25+). Вероятно, эти субпопуляции служат источником экстренного восстановления, и их истощение является причиной вторичной атрофии. для периодов опустошения тимуса под прямым влиянием облучения (на 5-е сутки) и на пике вторичной атрофии (на 20-е сутки) характерно снижение соотношения тимоцитов, слабо и сильно экспрессирующих рецепторный комплекс CD3-TCR (CD3lo/CD3hi). Это изменение проявляется также на 60-е сутки после облучения, что рассматривается как ранний признак лучевого старения тимуса.

Ключевые слова: у-облучение, тимус, тимоциты, регенерация, лучевое старение A.N. Mitin, V.V. Komogorova, M.M. Lytvyna, S.V Shevelev, N.I. Sharova, A.A. Yarilin

DYNAMICS OF POPULATIONS THYMOCYTES DURING THE REGENERATION OF THE THYMUS AFTER IRRADIATION

Investigated the dynamics of the recovery of the populations and subpopulations of mice after the General Y-irradiation in the dose of 4 Gy. To the greatest degree of ionizing radiation affects the population of the cortical of CD4+CD8+ thymocytes, as a result of which the ratio changes of the cells of different stages of development in the period of devastation body (5 per day). Then the total number of thymocytes and practically repeated the number of CD4+CD8+ cells is restored with two-wave kinetics: the 10 days is achieved by «emergency» recovery, followed by the secondary atrophy with a minimum content of cells for 20 days, after which implemented the «final» recovery. Double wavelengths kinetics, expressed as clearly, it is characteristic for all factions thymocytes in addition to the two sub-CD-CD8 - cell - DN2 (CD44+CD25+) and DN3 (CD44-CD25+). Probably, these subpopulations are a source of emergency recovery, and their depletion is the cause of secondary atrophy. For periods of devastation thymus under the direct influence of irradiation (5 days) and at the peak of secondary atrophy (20 day) is characteristic of the ratio of thymocytes, weakly and strongly expressing receptor complex CD3-TCR (CD3lo/CD3hi). This change is also evident in the 60 days after the irradiation, which is seen as an early sign of a «radiation» of aging of the thymus.

Keywords: y-irradiation, thymus, thymocytes, regeneration, radiation aging

- 297 -

ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2012

Пострадиационная регенерация тимуса в общих чертах изучена в работах 60 - 70-х годов прошлого века. Тогда, в частности, было показано, что изменение общей численности лимфоидных клеток тимуса - тимоцитов - после общего облучения описывается двухфазной кривой, включающей экстренное восстановление с пиком около 10 сут, за которым следуют вторичная атрофия с пиком на 20-е сутки и окончательное восстановление к концу 1-го месяца после общего облучения [11]. Для объяснения такой динамики регенерации тимуса был осуществлен тщательный экспериментальный анализ с использованием трансплантации клеток костного мозга (конгенных или несущих хромосомную метку) и экранирования тимуса, оценкой пролиферации различных клеток тимуса и т. д. На этой основе был сделан вывод о том, что в ранние сроки после облучения восстановление тимуса осуществляется за счет внутренних резервов органа в виде локализующихся в нем клеток-предшественников, а вторичная атрофия тимуса является следствием быстрого исчерпания этих резервов [6, 8, 9, 11-13]. Пролиферативную активность клеток-предшественников, мигрирующих из костного мозга, регистрируют лишь начиная с 10-х суток после облучения [12]. С 14-х суток эти клетки становятся основным источником восстановления тимуса [8]. Таким образом, начиная с этого срока восстановление тимуса осуществляется за счет нормальных процессов тимопоэ-за, источником которого служат костномозговые клетки-предшественники [13].

В последующие десятилетия исследователи фактически не возвращались к этой теме. Между тем существует практическая потребность в ее более детальном изучении, что связано со все более широким применением общего облучения организма при трансплантации аллогенного костного мозга, когда от полноценности функционирования тимуса зависит эффективность восстановления популяции T-лимфоцитов и связанных с ними иммунологических функций [5]. Современная методическая база позволяет изучить состояние многочисленных субпопуляций тимоцитов в регенерирующем тимусе, формирование в нем T-клеточного рецептора (TCR) и клонального разнообразия T-лимфоцитов.

Данное исследование предпринято с целью детального анализа численности и соотношения клеток тимуса, относящихся к разным стадиям развития и разным субпопуляциям, в процессе пострадиационной регенерации тимуса.

Материалы и методы. Объектом исследования служили мыши линии C57B1/6, самки массой 18-20 г, полученные из питомника РАМН "Столбовая".

Мышей облучали у-лучами 137Cs на установке "Стебель" в дозе 4 Гр. Забой мышей и исследование тимуса проводили через 5, 10, 12, 20, 30 и 60-е сутки после облучения. Контролем служили мыши соответствующего возраста и того же помета, что и мыши, облученные в соответствующие сроки. В табл. 1, 2 и на рис. 1, 3, 4, 6, 7 в качестве нулевой точки в исследованиях представлены усредненные данные контролей для разных сроков после облучения, а при нормировании показателей относительно контроля результаты опытов делили на значения контролей для соответствующих сроков исследования.

Тимус извлекали, освобождали от соединительной ткани, суспензировали в среде RPMI 1640. Численность клеток в органе определяли путем подсчета в камере Горяева. Суспензии

Таблица 1

Восстановление в динамике численности (в млн) тимоцитов, относящихся к основным популяциям, после общего у-облучения мышей в дозе 4 Гр

Популяция Пока- затель Без облучения Сутки после облучения

5-е 10-е 12-е 20-е 30-е 60-е

CD4-CD8- M 2,33 0,87 0,75 0,38 0,17 2,07 3,11

SD 1,08 0,20 0,25 0,10 0,05 0,97 1,10

CD4+CD8+ M 88,11 5,04 70,64 25,91 27,73 84,20 88,47

SD 35,38 0,71 10,41 2,74 5,07 9,17 26,85

CD4+CD8- M 14,08 0,91 3,41 4,47 5,56 10,59 16,97

SD 4,60 0,01 1,01 0,40 1,15 1,28 2,05

CD4-CD8+ M 5,98 0,93 2,07 2,56 2,17 2,47 5,15

SD 3,65 0,32 0,38 0,60 0,69 0,84 0,74

Таблица 2

восстановление в динамике численности (в млн) клеток, относящихся к субпопуляциям CD4-CD8--тимоцитов, после общего у-облучения мышей в дозе 4 Гр

Субпопуля- ция Пока- затель Без облучения Сутки после облучения

5-е 10-е 12-е 20-е 30-е 60-е

CD44+CD25- M 1,27 0,29 0,80 0,52 0,31 1,18 2,69

SD 0,66 0,18 0,39 0,26 0,07 0,38 0,65

CD44+CD25+ M 0,51 0,14 0,03 0,01 0,03 0,55 0,37

SD 0,44 0,13 0,01 0,01 0,01 0,11 0,05

CD44-CD25+ M 1,02 0,44 0,18 0,07 0,06 2,12 0,61

SD 0,47 0,18 0,02 0,04 0,05 0,41 0,03

CD44-CD25- M 1,75 0,48 0,65 0,93 0,68 1,93 1,51

SD 1,17 0,33 0,30 0,51 0,17 0,34 0,81

Митин Александр Николаевич - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. дифференцировки лимфоцитов; тел. 8(499) 617-79-19, e-mail: mitin@inbox.ru.

обрабатывали моноклональными антителами (АТ), меченными различными флюорохромами - FITC (флюоресцеина изотиоцианат), PE (фикоэритрин), APC (алофикоцианин), PerCP-Cy5.5 (белковый комплекс пиридинхлорофилл-цианин5.5). Использовали следующие комбинации моноклональных АТ, а также препараты для изотипических контролей фирмы "eBioscience" (США):

анти^3-АРС + анти-CD4-FITC + анти-CD8-PerCP-Cy5.5;

анти-CD4-FITC + анти-CD8-PerCP-Cy5.5 + анти^25-APC + анти^44-РЕ;

анти-ySTCR-APC + анти-CD4-FITC + анти-CD8-PerCP-Cy5.5.

Клетки инкубировали с моноклональными АТ в присутствии 0,1% NaN3 в течение 30 мин при 4°С. Трижды отмытые клетки фиксировали параформальдегидом ("Sigma", США). Проточную лазерную цитометрию клеток осуществляли на проточном цитометре BD FACSCanto™ II ("Becton Dickinson", США) в стандартном режиме. Анализ данных проводили с помощью программного обеспечения BD FACSDiva и FCS Express.

Данные по численности клеток статистически обрабатывали с помощью общепринятых методов вариационной статистики; результаты выражали в виде M ± SD, где M - средняя арифметическая, SD - стандартное отклонение.

Результаты и обсуждение. Показатели общей клеточно-сти и основных популяций тимоцитов в течение 2 мес после у-облучения в дозе 4 Гр представлены в табл. 1. Динамика изменения общей численности клеток тимуса (см. рис. 1) показывает, что восстановительные процессы осуществляются

- 298 -

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

Рис. 1. Изменения в динамике общего количества (в млн) клеток тимуса после облучения мышей в дозе 4 Гр (M ± SD).

Здесь и на рис. 3, 4, 6, 7: по оси абсцисс - сутки после облучения.

в два этапа. После значительного падения количества клеток, фиксируемого на 5-е сутки, происходит чрезвычайно быстрое их восстановление, почти до нормы к 10-м суткам, после чего наблюдается вторичная атрофия органа с повторным падением численности клеток к 20-м суткам. К 30-м суткам завершается восстановление общего количества тимоцитов, сохраняющееся на нормальном уровне к 60-м суткам.

Облучение оказывает сильное влияние на соотношение основных субпопуляций тимоцитов, оцениваемых по экспрессии корецепторов CD4 и CD8 (рис. 2). На 5-е сутки после облучения изменяется соотношение CD4+CD8+ (DP - double-positive)- и CD4-CD8- (DN - double-negative)-клеток: доля первых

снижается с 80 до 65%, тогда как содержание вторых возрастает с 2,12 до 11,22%. Процентное содержание CD4+CD8--тимоцитов практически не меняется, а содержание CD4-CD8+-клеток возрастает с 5,44% в контроле до 12% на 5-е сутки.

При рассмотрении изменения регенерации названных популяций тимоцитов в динамике оказывается, что кривая восстановления наиболее многочисленной популяции клеток тимуса - CD4+CD8+ (ЭР)-тимоцитов практически повторяет суммарную кривую восстановления (см. рис. 3, а). Кривые восстановления наименее зрелых CD4-CD8- (DN)-клеток и самых зрелых SP (single-positive)-клеток популяций CD4+CD8+ и CD4+CD8+ очень сходны и отличаются от кривой восстановления CD4+CD8+-клеток (см. рис. 3, б). Для них характерен подъем на 10-е сутки примерно вдвое меньший, чем в случае CD4+CD8+-клеток. Слабее всего он выражен для популяции DN-клеток. Затем следует падение уровня всех типов клеток, продолжающееся не до 20-х, а до 12-х суток, после чего начинается рост количества клеток, достигающий исходного уровня к 30-м (в случае популяций CD4-CD8- и CD4+CD8-) или к 60-м (в случае CD4-CD8+-клеток) суткам. На 30-е сутки регистрируется существенное отставание темпа восстановления CD4-CD8+-тимоцитов. Несмотря на особенности динамики восстановления основных популяций тимоцитов, их процентное соотношение приближается к норме уже к 10-м суткам после облучения и практически совпадает с контролем на 60-е сутки (см. рис. 2).

Сходная динамика характерна для минорной популяции тимоцитов, несущих TCR у5-типа, которые покидают тимус, не задерживаясь в нем, сразу после экспрессии рецептора. Для этих клеток также характерны экстренное восстановление к 10-м суткам и вторичная атрофия, но выражены они

CD4

5-е

00

а

и

CD4

10-е

CD4

30-е

CD4

Рис. 2. Гистограммы типа дот-блот экспрессии корецепторов CD4 и CD8 на тимоцитах в разные сроки после облучения мышей в дозе 4 Гр. На гистограммах отражен уровень флюоресценции, вызванной окрашиванием моноклональными АТ, меченными флюорохромами: по оси абсцисс -анти-СБ4^1ТС; по оси ординат - анти-СБ8-РегСР-Су5.5. Здесь и на рис. 5 цифры в квадрантах соответствуют проценту клеток соответствующего фенотипа; над графиками указаны сутки после облучения.

- 299 -

ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012

слабо, примерно в такой же степени, как для SP-тимоцитов (рис. 4). Раннее вовлечение yST-клеток в восстановление тимуса описано при его регенерации после облучения [8] или введения кортикостероидов [7].

Особого внимания заслуживает популяция юных DN-тимоцитов, поскольку она содержит клетки-предшественники, способные при введении в тимус обеспечить его репопуляцию, т. е. заселение клетками и их нормальную дифференцировку [9]. Популяцию DN-клеток разделяют на четыре субпопуляции (DN1-DN4) в зависимости от комбинации мембранных молекул CD44 и CD25 [3]. На 5-е сутки после облучения существенно снижается процентное содержание DNl-клеток, тогда как процент клеток, относящихся к трем другим субпопуляциям, несколько возрастает (рис. 5); как отмечено выше, процентное содержание всей популяции DN-тимоцитов в этот срок выше исходного.

По характеру пострадиационного восстановления, особенно в первые две декады, попарно сходными оказываются субпопуляции самых юных - CD44+CD25- (DN1)- и самых зрелых - CD44-CD25- (ВЫ4)-клеток этой популяции, а также двух промежуточных по степени зрелости субпопуляций

- CD44+CD25+(DN2) и CD44-CD25+(DN3) (рис. 6). В первом случае наблюдается рост численности клеток к 10-м суткам с последующим снижением их содержания до 20-х суток, после чего численность клеток возрастает к 60-м суткам, превосходя уровень необлученного контроля. Особенно интенсивный рост численности характерен для DNl-клеток; это ранние костномозговые предшественники T-лимфоцитов

- ETP (от early T-cell progenitors), только что мигрировавшие из костного мозга. DN4-клетки представляют собой последнюю стадию развития CD4-CD8--тимоцитов; это клетки-

CD4+ 8 — — CD4 8+ CD4 8'

Рис. 3. Восстановление в динамике численности клеток основных популяций тимуса - CD4+CD8+ (а), CD4-CD8-, CD4+CD8-, CD4-CD8+ (б) после облучения мышей в дозе 4 Гр.

Здесь и на рис. 4 и 6 по оси ординат - абсолютное количество клеток на орган, нормированное относительно необлученных контролей для соответствующих сроков (M ± SD).

предшественники, в которых реализуется перестройка гена a-цепи TCR (TCRA), после чего на клетках экспрессируется рецепторный комплекс TCR-CD3. Субпопуляции, промежуточные по степени зрелости, не подвергаются экстренному восстановлению и последующей вторичной атрофии. Их численность минимальна в период 12-20 сут после облучения, после чего она возрастает - в случае ВЫ2-клеток до субнормального уровня, а в случае БЮ-клеток - до нормального. При этом численность б№-клеток резко увеличивается к 30-м суткам, превосходя уровень нормы, а затем снижается до нормы или слегка ниже ее.

Клетки, экспрессирующие рецепторный комплекс TCR-CD3, включают все популяции тимоцитов, кроме CD4-CD8-. До завершения положительной селекции уровень экспрессии CD3 низок, после ее завершения он значительно возрастает [9]. СВ3ы-тимоциты представляют собой практически зрелые T-клетки. К ним относятся небольшая часть DP-тимоцитов, а также все SP-клетки. У интактных мышей соотношение клеток фенотипов CD3l0 и CD3hi составляет примерно 5:1. В процессе пострадиационного восстановления наблюдаются циклические изменения этого соотношения от минимального (3:1 - 3,5:1) на 5, 20 и 60-е сутки до максимального (примерно 7:1) на 12-е и 30-е сутки (рис. 7). То обстоятельство, что низкое соотношение CD3lo/CD3hi характерно для периодов с низким общим содержанием тимоцитов, а высокое - для периодов с высокой клеточностью, а также данные об абсолютной численности тех и других клеток свидетельствуют о том, что СВ31о-тимоциты наиболее чувствительны как к действию радиации, так и к факторам, вызывающим вторичную атрофию после 10-х суток (они же первыми снижаются в количестве при возрастной инволюции). Кривые восстановления численности СВ3ы-клеток и общего уровня тимоци-тов, перестроивших ген TCRA (по не представленным здесь данным ПЦР), практически полностью совпадают, что свидетельствует о значительном перекрывании этих клеточных фракций.

Подытоживая представленный материал, можно разделить период реакции тимуса на облучение в сублетальной дозе на четыре этапа:

1) опустошение лимфоидной составляющей тимуса за счет значительного снижения численности всех субпопуляций тимоцитов (в наибольшей степени - DP-клеток) - до 5-х суток;

2) экстренное восстановление всех популяций тимоцитов (максимально - DP-клеток) - до 10-х суток;

3) вторичная атрофия тимуса с относительным преобладанием зрелых форм тимоцитов и нормализацией T-лимфопоэза - до 20-х суток;

4) окончательное восстановление тимуса с нормализацией численности и соотношения субпопуляций тимоцитов -до 30-60-х суток.

Рис. 4. Восстановление в динамике численности тимоцитов, несущих TCR у5-типа, после облучения мышей.

- 300 -

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

8

Ci

о

iTi

Cl

Ci

о

Контроль

CD44

12-е

СМ4

60-е

CD44

cd+4

20-е

CD44

1П-о

Рис. 5. Гистограммы типа дот-блот экспрессии молекул CD44 и CD25 на DN-тимоцитах в разные сроки после облучения мышей.

На гистограммах отражен уровень флюоресценции, вызванной окрашиванием моноклональными АТ, меченными флюорохромами: по оси абсцисс - анти-CD44-PE; по оси ординат - анти-CD25-APC (экспрессию оценивали в гейте CD4-CD8-клеток).

Известно, что способностью к репопуляции тимуса обладают лишь те тимоциты, на которых еще не экспрессирован рецепторный комплекс (т. е. CD3-CD4-CD8-клетки), причем в наибольшей степени это свойство выражено у клеток фенотипа CD441oCD24MCD25+, т. е. у DN3-тимоцитов [9]. Очевидно, что именно эти клетки являются наиболее вероятными кандидатами на роль источников экстренного восстановления тимуса после облучения. Численность клеток, обеспечивающих эту фазу восстановления, на пике регенерации должна не увеличиваться, а снижаться, что служит предпосылкой последующей вторичной атрофии.

Если мы обратимся к кривым пострадиационной динамики тимоцитов (см. рис. 3, 4, 6), то увидим, что подъем численности клеток на 10-е сутки характерен для всех субпопуляций тимоцитов, кроме двух - DN2 (CD3-CD4-CD8-CD44+CD25+) и DN3 (CD3-CD4-CD8-CD44-CD25+), причем вторая субпопуляция - именно та, которая уже упоминалась как в наибольшей степени способная репопулировать тимус. Относительное обеднение DN-фракции тимоцитов именно этими субпопуляциями отмечается на 10-20-е сутки; почти полное их исчезновение (снижение процента

клеток в 10 раз по сравнению с таковым необлученного контроля) наблюдается на 12-е сутки после облучения, т. е. в начальный период вторичной атрофии (см. рис. 5). Абсолютная численность DN2- и DN3-клеток начинает возрастать лишь после 20-х суток, когда включается процесс окончательного восстановления тимуса. Важно, что на этих стадиях происходят подготовка (DN2) и реализация (DN3) перестройки всех генов TCR, кроме TCRA, и осуществляется р-селекция (DN3).

Можно было бы ожидать, что численность самых юных тимоцитов ETP (CD3-CD4-CD8-CD44+CD25-) также должна снижаться на 10-е и 12-е сутки, тогда как мы видим повышение их уровня к 10-м суткам. Это можно объяснить срабатыванием гомеостатического механизма, обусловливающего усиление притока ETP из костного мозга в тимус в ответ на снижение численности периферических T-клеток [2].

Приведенные выше данные дают основание считать, что в основе вторичной атрофии тимуса после сублетального облучения лежит истощение DN2- и DN3-субпопуляций тимоцитов, а условием окончательной регенерации тимуса

- 301 -

ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2012

Рис. 6. Восстановление в динамике численности клеток в субпопуляциях СЭ4-С08-тимоцитов.

CD44+CD25-, CD44+CD25+, CD44'CD25+, CD44'CD25' - после облучения мышей.

Рис. 7. Соотношение клеток, слабо и сильно экспрессирующих CD3 (CD3h‘/CD3l°), в тимусе мышей в разные сроки после облучения.

По оси ординат - процент тимоцитов с высоким (не окрашены) и низким (окрашены черным) уровнем экспрессии CD3. Цифры обозначают проценты клеток данного типа от общего числа тимоцитов.

служит восстановление численности клеток этих субпопуляций в результате дифференцировки костномозговых предшественников, мигрирующих в тимус.

Результаты анализа кривых восстановления численности популяций и субпопуляций тимоцитов в интервале между 20-ми и 60-ми сутками (период окончательного восстановления) как будто свидетельствуют о нормализации всех основных показателей. Для промежутка между 30-ми и 60-ми сутками характерен "овершют" - превышение некоторыми показателями уровня нормы на 30-е сутки с нормализацией на 60-е сутки, что нередко наблюдается при восстановлении численности клеток крови после лучевого поражения. В случае тимоцитов это относится к субпопуляциям DN3 и DN4, а также к yST-клеткам. В последнем случае на 60-е сутки численность клеток оказывается ниже исходной. Наоборот, численность CD4-CD8+-тимоцитов и DNl-клеток продолжает достаточно активно нарастать в рассматриваемом временном интервале.

Известно, что облучение ускоряет возрастное старение тимуса [4]. Для того чтобы судить о том, отражают ли изменения, наблюдаемые на поздних этапах пострадиационного восстановления, лучевое старение тимуса, логично сопоставить их с изменениями соответствующих показателей в возрастном контроле. Однако в наших опытах, поставленных на молодых мышах, за 2-месячный срок сколько-нибудь закономерные возрастные изменения численности и соотношения субпопуляций тимуса не успели проявиться.

Единственный показатель, определявшийся нами в данной работе, который, на наш взгляд, ближе всего соответствует представлениям о лучевом старении тимуса, - снижение соотношения тимоцитов, слабо и сильно экспрессирующих рецепторный комплекс (CD31o/CD3hi). С возрастом доля CD31o-клеток, как и DP-тимоцитов, в состав которых они входят, закономерно снижается [1]. Как видно из рис. 7, в период между 30-ми и 60-ми сутками происходит снижение данного соотношения в результате повышения содержания CD3hi-клеток и снижения - CD31o-клеток. Аналогичные изменения характерны для атрофии тимуса, вызванной любыми причинами. В нашем случае такие же изменения наблюдаются при атрофии, вызванной облучением как таковым (на 5-е сутки), и при вторичной атрофии (на 20-е сутки). Можно предположить, что указанные сдвиги, наблюдаемые на 60-е сутки, являются предвестником возрастной атрофии, ускоряемой облучением.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ярилин А. А. Возрастные изменения тимуса и T-лимфоцитов // Иммунология. - 2003. - Т 24, № 2. - С. 117-128.

2. Carlow D. A., Gossens K., Naus S. et a1. PSGL-1 function in immunity and steady state homeostasis // Immunol. Rev. - 2009.

- Vol. 230. - P. 75-96.

3. Godfrey D. I., Kennedy J., Suda T., Zlotnik A. A developmental pathway involving four phenotypically and functionally distinct subsets of CD3-CD4-CD8- triple-negative adult mouse thymocytes defined by CD44 and CD25 expression // J. Immunol. -1993. - Vol. 150. - P. 4244-4252.

4. Hirokawa K., Sado T. Radiation effects on regeneration and T-cell-inducing function of the thymus // Cell. Immunol. - 1984.

- Vol. 84. - P. 372-379.

5. Hochberg E. P., Chillemi A. C., Wu C. J. et al. Quantitation of T-cell neogenesis in vivo after allogeneic bone marrow transplantation in adults // Blood. - 2001. - Vol. 98. - P. 1116-1121.

6. Kadish J. L., Basch R S. Hematopoietic thymocyte precursors. III. A population of thymocytes with the capacity to return ("home") to the thymus // Cell. Immunol. - 1977. - Vol. 30. - P. 12-24.

7. Kong F. K., Chen C. L., Cooper M. D. Reversible disruption of thymic function by steroid treatment // J. Immunol. - 2002. - Vol. 168. - P. 6500-6505.

8. Matsuzaki G., Yoshikai Y., Kishihara K., Nomoto K. Expression of T cell antigen receptor genes in the thymus of irradiated mice after bone marrow transplantation // J. Immunol. - 1988. - Vol. 140. - P. 384-387.

9. Scollay R, Wilson A., D’Amico A. Developmental status and reconstitution potential of subpopulations of murine thymocytes // Immunol. Rev. - 1988. - Vol. 104. - P. 81-120.

10. Swat W., Dessing M., Baron A. et al. Phenotypic changes accompanying positive selection of CD4+CD8+-thymocytes // Eur. J. Immunol. - 1992. - Vol. 22. - P. 2367-2372.

11. Takada A., Takada Y., Ghestner C. H., Ambrus J. L. Biphasic pattern of thymus regeneration after whole-body irradiation // J. Exp. Med. - 1969. - Vol. 129. - P. 445-456.

12. Takada A., Takada A., Takada Y. Proliferation of donor marrow and thymus cells in the myeloid and lymphoid organs of irradiated syngeneic host mice // J. Exp. Med. - 1973. - Vol. 137. - P. 543-546.

13. Yarilin A. A. Radiation-induced damage of thymocytes and thymic stromal cells. Manifestations and after-effects // Physiol. Gen. Biol. Rev. - 1995. - Vol. 10. - P. 1-58.

Поступила 17.05.12

- 302 -