СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ МОДИФИКАЦИИ ЦЕЛЕВОГО ЛОКУСА

1. Способ серийной модификации целевого локуса в клетке, включающий:
(а) обеспечение клетки, содержащей целевой локус, причем целевой локус содержит первую кассету селекции, содержащую: (1) нуклеиновую кислоту, кодирующую первый селективный маркер, функционально связанный с первым промотором; и (2) первый сайт распознавания нуклеазы для первого нуклеазного агента, причем первый сайт распознавания нуклеазы расположен в кодирующей области первого селективного маркера или в любой не кодирующей белок области первого селективного маркера;
(b) введение в клетку:
(i) первого нуклеазного агента или полинуклеотида, кодирующего первый нуклеазный агент, причем первый нуклеазный агент индуцирует одно- или двухцепочечный разрыв в первом сайте распознавания нуклеазы; и
(ii) первого нацеливающего вектора, содержащего первую полинуклеотидную вставку, фланкированную первым гомологичным плечом, соответствующим первому целевому сайту, расположенному в целевом локусе, и вторым гомологичным плечом, соответствующим второму целевому сайту, расположенному в целевом локусе, причем первая полинуклеотидная вставка содержит вторую кассету селекции, содержащую: (1) нуклеиновую кислоту, кодирующую второй селективный маркер, функционально связанный со вторым промотором; и (2) второй сайт распознавания нуклеазы для второго нуклеазного агента,
при этом первый селективный маркер и второй селективный маркер отличаются друг от друга,
при этом первый нуклеазный агент отличается от второго нуклеазного агента, и
при этом второй сайт распознавания нуклеазы расположен в кодирующей области второго селективного маркера или в любой не кодирующей белок области второго селективного маркера; и
(c) идентификацию модифицированной клетки, содержащей первую полинуклеотидную вставку в целевом локусе, при этом модифицированная клетка обладает активностью второго селективного маркера, но не обладает активностью первого селективного маркера.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий один или несколько дополнительных раундов интеграции полинуклеотидных вставок, причем используемые в способе нацеливающие векторы чередуют использование первого селективного маркера, содержащего первый сайт распознавания нуклеазы для первого нуклеазного агента, и второго селективного маркера, содержащего второй сайт распознавания нуклеазы для второго нуклеазного агента.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором этап идентификации (с) включает:
(i) культивирование клетки в условиях, позволяющих идентифицировать клетки, не обладающие активностью первого селективного маркера; или
(ii) идентификацию по меньшей мере одной клетки, содержащей первую полинуклеотидную вставку, интегрированную в первый и второй целевые сайты.
4. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором этап идентификации (с) выполняют посредством анализа определения модификации аллеля (MOA).
5. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором первая кассета селекции на этапе (а) фланкирована первым целевым сайтом и вторым целевым сайтом.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором первый селективный маркер или второй селективный маркер придает устойчивость к антибиотику,
необязательно причем антибиотик представляет собой G418, гигромицин, бластицидин, неомицин или пуромицин, и
необязательно причем первый селективный маркер придает устойчивость к неомицину, а второй селективный маркер придает устойчивость к гигромицину, или первый селективный маркер придает устойчивость к гигромицину, а второй селективный маркер придает устойчивость к неомицину.
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором первый селективный маркер или второй селективный маркер функционально связан с индуцируемым промотором, и экспрессия селективного маркера является токсичной для клетки,
необязательно причем первый селективный маркер или второй селективный маркер содержит гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазу (HGPRT) или тимидинкиназу вируса простого герпеса (HSV-TK).
8. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором совместное использование первого нацеливающего вектора с первым нуклеазным агентом приводит к повышению эффективности нацеливания по сравнению с использованием только первого нацеливающего вектора,
необязательно причем эффективность нацеливания первого нацеливающего вектора увеличивается по меньшей мере в два раза по сравнению с использованием только первого нацеливающего вектора.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором первый сайт распознавания нуклеазы расположен в интроне, экзоне, промоторе, регуляторной области промотора или энхансерной области первого селективного маркера, а второй сайт распознавания нуклеазы расположен в интроне, экзоне, промоторе, регуляторной области промотора или энхансерной области второго селективного маркера.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором этап (b) включает введение в клетку полинуклеотида, кодирующего первый нуклеазный агент, и при этом:
(I) полинуклеотид, кодирующий первый нуклеазный агент, содержит экспрессионную конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую первый нуклеазный агент, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая данный нуклеазный агент, функционально связана с активным в клетке промотором; или
(II) полинуклеотид, кодирующий первую нуклеазу, содержит мРНК, кодирующую данный нуклеазный агент.
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором первый нуклеазный агент или второй нуклеазный агент представляет собой:
(I) нуклеазу с «цинковыми пальцами» (ZFN);
(II) эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN);
(III) мегануклеазу; или
(IV) белок (Cas), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), и гидовую РНК (гРНК).
12. Способ по п. 11, в котором первый нуклеазный агент или второй нуклеазный агент представляет собой нуклеазу с «цинковыми пальцами» (ZFN), а первый сайт распознавания нуклеазы или второй сайт распознавания нуклеазы содержит любую из SEQ ID NO: 9-12.
13. Способ по п. 11, в котором первый нуклеазный агент или второй нуклеазный агент представляет собой белок Cas и гРНК, причем белок Cas представляет собой Cas9, и причем гРНК содержит:
(a) РНК коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR), (крРНК), нацеленную на первый сайт распознавания нуклеазы или второй сайт распознавания нуклеазы, причем первый сайт распознавания нуклеазы или второй сайт распознавания нуклеазы непосредственно фланкирован последовательностью мотива, прилежащего к протоспейсеру (PAM); и
(b) трансактивирующую РНК CRISPR (тракрРНК),
необязательно причем целевой локус содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1.
14. Способ по п. 13, в котором гРНК содержит любую из SEQ ID NO: 13-20.
15. Способ по п. 13 или 14, в котором гРНК содержит SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8,
необязательно причем гидовая РНК содержит SEQ ID NO: 3 или 7.
16. Способ по любому из пп. 13-15, в котором первый нуклеазный агент содержит белок Cas и первую гРНК, второй нуклеазный агент содержит белок Cas и вторую гРНК, и первая гРНК и вторая гРНК отличаются друг от друга.
17. Способ по п. 12, в котором первый селективный маркер придает устойчивость к неомицину, первый нуклеазный агент представляет собой нуклеазу с «цинковыми пальцами», и первый сайт распознавания нуклеазы содержит SEQ ID NO: 9 или 10, и при этом второй селективный маркер придает устойчивость к гигромицину, второй нуклеазный агент представляет собой нуклеазу с «цинковыми пальцами», и второй сайт распознавания нуклеазы содержит SEQ ID NO: 11 или 12.
18. Способ по любому из пп. 13-16, в котором первый селективный маркер придает устойчивость к неомицину, и первый нуклеазный агент представляет собой белок Cas9 и гидовую РНК, содержащую любую из SEQ ID NO: 13-16, и при этом второй селективный маркер придает устойчивость к гигромицину, и второй нуклеазный агент представляет собой белок Cas9 и гидовую РНК, содержащую любую из SEQ ID NO: 17-20,
необязательно причем первый селективный маркер придает устойчивость к неомицину, и первый нуклеазный агент представляет собой белок Cas9 и гидовую РНК, содержащую SEQ ID NO: 13, и при этом второй селективный маркер придает устойчивость к гигромицину, и второй нуклеазный агент представляет собой белок Cas9 и гидовую РНК, содержащую SEQ ID NO: 17.
19. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором:
(I) первый целевой сайт и второй целевой сайт непосредственно смежны с первым сайтом распознавания нуклеазы; или
(II) первый целевой сайт и второй целевой сайт расположены на расстоянии от около 10 нуклеотидов до около 14 т. п. н. от первого сайта распознавания нуклеазы.
20. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором:
(I) суммарная длина первого гомологичного плеча и второго гомологичного плеча составляет по меньшей мере около 10 т. п. н.; и/или
(II) каждое из первого гомологичного плеча и второго гомологичного плеча находится в диапазоне от около 5 т. п. н. до около т. п. н. 100; и/или
(III) первый нацеливающий вектор составляет по меньшей мере около 10 т. п. н. или от около 20 т. п. н. до около 300 т. п. н.; и/или
(IV) длина первой полинуклеотидной вставки находится в диапазоне от около 5 т. п. н. до около 300 т. п. н.
21. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором первая полинуклеотидная вставка дополнительно содержит первый интересующий полинуклеотид,
необязательно причем первый интересующий полинуклеотид включает человеческий полинуклеотид.
22. Способ по п. 21, в котором первый интересующий полинуклеотид включает полинуклеотид, кодирующий область Т-клеточного рецептора,
необязательно причем Т-клеточный рецептор представляет собой Т-клеточный альфа-рецептор, и
необязательно причем первый интересующий полинуклеотид содержит по меньшей мере один генный сегмент вариабельной области и/или генный сегмент соединительной области локуса Т-клеточного альфа-рецептора.
23. Способ по п. 21, в котором первый интересующий полинуклеотид содержит геномную нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина,
необязательно причем первый интересующий полинуклеотид содержит нереаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина.
24. Способ по п. 21, в котором первый интересующий полинуклеотид содержит геномную нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого иммуноглобулина,
необязательно причем геномная нуклеотидная последовательность содержит нереаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи λ и/или κ человека, или причем геномная нуклеотидная последовательность содержит реаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи λ и/или κ человека.
25. Способ по п. 21, в котором первый интересующий полинуклеотид содержит по меньшей мере один аллель заболевания.
26. Способ по п. 21, в котором первый интересующий полинуклеотид содержит:
(I) нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной или ортологичной нуклеотидной последовательности в геноме клетки; или
(II) экзогенную нуклеотидную последовательность.
27. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором первый нацеливающий вектор сконструирован для возможности удаления последовательности длиной от около 5 т. п. н. до около 3 млн п. н. из целевого локуса.
28. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором интеграция первой полинуклеотидной вставки в целевой локус приводит к нокауту, нокину, точечной мутации, перестановке доменов, перестановке экзонов, перестановке интронов, перестановке регуляторных последовательностей, перестановке генов или их комбинации.
29. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором клетка, полученная данным способом, содержит генетическую модификацию, включающую замену в целевом локусе эндогенной нуклеотидной последовательности интересующим экзогенным полинуклеотидом.
30. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором целевой локус находится в геноме клетки или расположен в векторе в клетке.
31. Способ по п. 30, в котором целевой локус включает локус иммуноглобулина.
32. Способ по п. 30, в котором целевой геномный локус включает локус Т-клеточного рецептора, необязательно причем локус Т-клеточного рецептора представляет собой локус Т-клеточного альфа-рецептора.
33. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором одно- или двухцепочечный разрыв, индуцированный первым нуклеазным агентом, нарушает активность первого селективного маркера.
34. Способ по п. 33, в котором инсерция первой полинуклеотидной вставки в целевой локус нарушает активность первого селективного маркера.
35. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором клетка представляет собой эукариотическую клетку, необязательно причем клетка представляет собой клетку млекопитающего, необязательно причем клетка представляет собой:
(I) клетку не относящегося к человеку млекопитающего;
(II) плюрипотентную клетку;
(III) человеческую индуцированную плюрипотентную стволовую клетку;
(IV) фибробласт человека;
(V) не относящуюся к человеку эмбриональную стволовую (ЭС) клетку;
(VI) эмбриональную стволовую (ЭС) клетку мыши или эмбриональную стволовую (ЭС) клетку крысы;
(VII) гемопоэтическую стволовую клетку;
(VIII) нейрональную стволовую клетку; или
(IX) клетку грызуна.
36. Способ по п. 35, в котором клетка представляет собой ЭС-клетку мыши или ЭС-клетку крысы.
37. Способ по п. 36, дополнительно включающий:
(d) введение клетки, полученной на этапе (с), в эмбрион-хозяин на стадии до образования морулы для получения модифицированного эмбриона-хозяина; и
(е) имплантацию модифицированного эмбриона-хозяина в организм суррогатной матери для получения поколения F0, происходящего от клетки, полученной на этапе (с).