СПОСОБ МНОГОМЕРНОЙ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
MULTIDIMENSIONAL THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY METHOD

Способ относится к одному из наиболее простых, эффективных и экономичных вариантов жидкостной хроматографии - тонкослойной хроматографии (ТСХ), которая активно развивается в направлении повышения разрешающей способности и экспрессности. Изобретение может быть использовано в аналитической химии, например, при анализе красителей, аминокислот, витаминов, липидов.
Наиболее четкое и общепринятое определение многомерной хроматографии в настоящее время предложено Дж.К.Гиддингсом. Оно включает выполнение двух условий: во-первых, компоненты смеси подвергаются двум или более разделениям, в которых их движение зависит от различных факторов и, во-вторых, компоненты, которые полностью разделены в одном из первых разделений, должны оставаться разделенными до завершения процесса [1].
Известен способ двумерной ТСХ [2, 3], в котором анализируемую пробу наносят в угол пластинки и осуществляют разделение с использованием первой подвижной фазой (ПФ), затем пластинку поворачивают на 90° против часовой стрелки и проводят разделение с использованием второй ПФ.
Наиболее близким к заявленному изобретению (прототипом) является способ трехмерной ТСХ [4], в котором анализируемую пробу наносят в левый нижний угол стандартной квадратной пластинки и осуществляют разделение первой жидкой ПФ. Затем (после высушивания) пластинку поворачивают на 90° против часовой стрелки и проводят разделение с использованием второй ПФ и, наконец, после высушивания пластинку вновь также поворачивают против часовой стрелки и проводят разделение третьей жидкой ПФ.
Основным недостатком прототипа является значительная продолжительность анализа, определяемая последовательным проведением трех разделений анализируемой пробы на всю длину пластинки.
Другим недостатком этого способа является сложность подбора оптимальных жидких ПФ для эффективного разделения на одной пластинке проб, содержащих большое количество соединений различных классов. В ряде случаев такой подбор ПФ затруднителен.
Целью предлагаемого способа многомерной ТСХ является повышение селективности хроматографического разделения и сокращение продолжительности анализа.
Поставленная цель достигается тем, что в способе многомерной тонкослойной хроматографии ТСХ, включающем нанесение анализируемой пробы в угол пластинки и ее первое разделение одной жидкой подвижной фазой ПФ на группы соединений методом линейной ТСХ с получением хроматограммы, высушивание пластинки и последующие разделения методом линейной ТСХ с использованием для каждого разделения различных ПФ, движущихся в направлении, ориентированном под углом к направлению движения ПФ при первом разделении, отличающийся тем, что на полученной хроматограмме выделяют зоны групп плохо разделенных соединений, после высушивания разрезают пластинку перпендикулярно направлению движения ПФ при первом разделении на прямоугольные пластинки, содержащие эти зоны, последующие разделения проводят одновременно на указанных разрезанных пластинках, а указанный угол при проведении всех последующих разделений составляет 90°.
Экспериментатор анализирует полученную на пластинке после первого разделения первичную хроматограмму и, используя имеющиеся данные о возможной природе анализируемых компонентов, полученном первом разделении и известных в ТСХ закономерностях для разделения проб различного класса соединений, принимает решение о последующем дополнительном разделении всех или некоторых групп соединений первичной хроматограммы, используя для каждой выделенной группы свою оптимальную ПФ. Отметим, что выбор зон определяли известной природой анализируемого образца, поставленной задачей и известными закономерностями ТСХ. Методы оптимизации ПФ разработаны в ТСХ (см., например, [5]). После решения о дополнительном анализе групп соединений на первичной хроматограмме, которые подлежат последующим разделениям, экспериментатор вырезает, например, используя ножницы (для пластинок с металлической или полимерной подложкой), ряд пластинок прямоугольной формы, каждая из которых содержит слева зону, подлежащую дальнейшему разделению ПФ, отличной от первоначальной. Выделенная часть пластинки расположена перпендикулярно к направлению движения ПФ в первом разделении. Полученные подобным образом прямоугольные пластинки ТСХ, содержащие группы соединений, полученные при первом разделении, используют для дополнительного независимого разделения данных групп соединений, используя для разделения каждой группы соединений наиболее подходящую ПФ. Подобный подход позволяет получить улучшенное разделение без заметного увеличения времени анализа (по сравнению с известным методом двумерной ТСХ).
Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.
Пример 1.
Реализации четырехмерной ТСХ.
Для проведения эксперимента использована традиционная методика планарной хроматографии и традиционные прямоугольные камеры для ТСХ. Используемая хроматографическая камера представляла собой стеклянный прямоугольный параллелепипед (размером 135×75×145 мм), полый внутри. Исследование проводили на пластинках ТСХ с открытым адсорбционным слоем силикагеля.
В качестве разделяемых соединений использована смесь 21 красителя: сиба-Ф II, индофенол, ариабел красный, судан синий, судан II, диметил-аминоазобензол, метиловый оранжевый, бромфеноловый красный, кислотный красный, метаниловый желтый, бромтимоловый синий, ксилен ханолл ФФ, нейтральный голубой, кристаллический фиолетовый, акридин оранжевый, розалинин I, метиловый красный, флуоресцин, тимоловый синий, бромфеноловый синий, метиленовый синий.
Анализируемую пробу объемом 2 мкл наносили в угол пластинки на расстоянии 15 мм от каждого края с помощью микрошприца М-1Н на линию старта. Компоненты смеси разделяли на пластинках размером 100×100 мм (адсорбент силикагель, на алюминиевой подложке - ПТСХ-АФ-В-УФ, ИМИД, Россия). Высота уровня ПФ в камере составляла 6 мм.
f
f
f
Первое разделение исследуемой смеси красителей проводили с использованием в качестве ПФ раствора толуола и этанола (6.5:3.5, ν:ν - в объемном соотношении). Далее пластинку вынимали из камеры и высушивали, используя поток горячего воздуха (60°C) в течение 30 с. После первого разделения пробы на полученной хроматограмме были выделены три последовательно расположенные зоны хроматограммы, содержащие три группы частично разделенных соединений: а) группу соединений, характеризующуюся в данных условиях низким значением сорбционной емкости (высокое значение величины удерживания R(0.6-0.9)); б) группу соединений, характеризующуюся средним (среднее значение R(0.3-0.6)); в) группу соединений, характеризующуюся высоким значением сорбционной емкости (низкое значение R(0-0.3)). В способе 4-мерной хроматографии дополнительное разделение проводят для трех участков хроматограмм с целью их более детального разделения хроматографических зон, каждая из которых может содержать два и более компонента анализируемой смеси или получения экспериментального хроматографического дополнительного доказательства того, что первичное разделенные зоны содержат только один компонент. Схема реализации способа приведена на Фиг.1.
Каждую из трех прямоугольных пластинок, которые были получены при разрезании первоначальной хроматографической пластинки перпендикулярно направлению движения ПФ при первом разделении, помещали в отдельную камеру, содержащую ПФ, наиболее подходящую для разделения данной группы соединений. Все прямоугольные пластинки проявляли ПФ, движущейся под углом 90° по отношению к направлению первого проявления исследуемой пробы. Далее пластинки с разделенными компонентами высушивали потоком подогретого воздуха (60°С) в течение 30 с. Полученные хроматограммы приведены на Фиг.2.
Хроматографические зоны разделенных соединений на прямоугольных пластинках детектировали с помощью видеоденситометра (ИМИД, Россия), а полученные изображения обрабатывали, используя компьютерную программу Sorbfil Videodensitometer.
f
В таблице 1 приведены полученные данные о величинах удерживания R, эффективности (число теоретических тарелок) N и продолжительности разделения компонентов, входящих в состав анализируемой смеси способом четырехмерной ТСХ.
Таблица 1
Хроматографические характеристики разделенных компонентов анализируемой смеси (способ четырехмерной ТСХ)
Этап разделения
Подвижная фаза
Наименование и номер компонента
Величина удерживания, R<sub>f</sub>
Эффектив-ность, N
Продолжительность этапа, мин
Первое разделение исследуемой пробы
Толуол-этанол (6.5:3.5, ν:ν)
1. Метиловый красный
0.50
2670
1
2.Сиба-Ф II
0.48
2960
38
3.Флуоресцин
0.57
3370
Последующие разделения отдельных групп первого разделения на прямоугольных пластинках
4. Бромтимоловый синий
0.50
5260
2*
Этанол-уксусная кислота (9:1, ν:ν)
5. Кристаллический фиолетовый
0.65
8800
6.Метаниловый желтый
0.68
1310
7. Бромфеноловый синий
0.27
3530
8.Метиловый синий
0.35
4420
9.Ксилен ханол
0.59
1530
36
10. Акридин оранжевый
0.06
2500
11. Нейтральный голубой
0.83
3660
12. Бромтимоловый синий
0.85
270
3*
Ацетон
13. Бромфеноловый красный
0.07
1250
13
14. Кислотный красный
0.55
3430
15. Метиловый оранжевый
0.12
290
16. Индофенол
0.08
80
17. Ариабел красный
0.15
180
18. Судан синий
0.19
1030
4*
Толуол
19. Судан II
0.31
960
21
20. Диметил-аминоазобензол
0.39
1270
21. Розалинин I
0.47
2520
* этапы 2, 3, 4 осуществляются одновременно и независимо.
Как следует из приведенных в таблице данных, применение предложенного способа позволило получить достаточно полное разделение сложной смеси красителей. Для каждой группы разделяемых соединений была использована оптимальная ПФ, необходимая для их полного разделения. Погрешность измерений эффективности, оцененная с использованием методики, описанной в монографии [6], составляет 6-8%.
Для оценки нового метода авторами проведено сопоставление четырехмерной ТСХ с методом трехмерной ТСХ [2]. При проведении разделения методом трехмерной хроматографии вначале проявляли анализируемую смесь с использованием в качестве ПФ раствора толуола и этанола (6.5:3.5, ν:ν); затем пластинку вынимали из камеры и высушивали потоком горячего воздуха. После первого проявления пластинку поворачивали на 90° и проявляли, используя одну из следующих ПФ: а) этанол и уксусная кислота (9:1, ν:ν), б) ацетон, в) толуол. После проведения второго проявления пластинку вынимали и высушивали потоком подогретого воздуха (60°C) в течение 30 сек. Затем пластинку вновь поворачивали на 90° и проводили третье разделение, используя одну из тех же ПФ. После завершения разделения пластинку вынимали и высушивали потоком подогретого воздуха (60°C). При проведении разделения методом трехмерной ТСХ указанные выше ПФ использовали в различной комбинации с целью получения оптимального разделения. Применение различных вариантов трехмерной ТСХ не позволило разделить многокомпонентную смесь красителей, различных по своим физико-химическим свойствам. Даже в оптимальном варианте трехмерной ТСХ три компонента анализируемой смеси оказались не разделенными. Однако, как уже отмечалось выше, эта смесь была разделена методом четырехмерной ТСХ.
Важно отметить, что по сравнению с трехмерной четырехмерная ТСХ позволяет реализовать более быстрое разделение. Время, необходимое для проведения полного разделения, соответствует времени проведения двух этапов разделения, так как пластинки ТСХ после первого разделения и разрезания проявляют одновременно и независимо в трех камерах с использованием трех различных ПФ, что сокращает продолжительность анализа.
В проведенных разделениях продолжительность полного анализа смеси красителей (21 компонент) по способу четырехмерной ТСХ составила 74 мин (продолжительность первого и второго этапов, см. табл.1), а по способу трехмерной ТСХ та же смесь была проанализирована за 95 мин (что примерно на 26% больше), при этом несколько компонентов смеси остались неразделенными.
Пример 2.
Реализация трехмерной ТСХ
Проведение эксперимента осуществляли в условиях, аналогичных примеру 1.
В качестве разделяемых соединений использована смесь 5 пигментов - красителей для полимеров: темно-фиолетовый, ярко-оранжевый, желтый, темно-красный, фиолетовый.
Нанесение анализируемой пробы аналогично примеру 1.
Разделение компонентов осуществляли аналогично примеру 1.
f
f
Первое разделение смеси красителей проводили с использованием в качестве ПФ раствора толуола и 1,1-дихлорметана (в объемном соотношении 7.5:2.5). Высушивание пластинки осуществляли аналогично примеру 1. После первого разделения пробы на полученной хроматограмме были выделены две последовательно расположенные зоны хроматограммы, содержащие две группы частично разделенных соединений: а) группу соединений, характеризующуюся в данных условиях низкой адсорбционной способностью (высокое значение R(0.5-0.9)); б) группу соединений, характеризующуюся высоким значением сорбционной емкости (низкое значение R(0-0.5)).
Разделение каждой из двух прямоугольных пластинок осуществляли аналогично примеру 1. Полученные хроматограммы приведены на Фиг.3. Высушивание пластинок с разделенными компонентами осуществляли аналогично примеру 1.
Детектирование и обработку зон разделенных соединений осуществляли аналогично примеру 1.
f
В таблице 2 приведены полученные данные о величинах удерживания R, эффективности (число теоретических тарелок) N и продолжительности разделения компонентов, входящих в состав анализируемой смеси способом трехмерной ТСХ.
Таблица 2
Хроматографические характеристики разделенных компонентов анализируемой смеси (способ трехмерной ТСХ)
Этап разделе-ния
Подвижная фаза
Наименование и номер компонента
Величина удерживания, R<sub>f</sub>
Эффектив-ность, N
Продолжитель-ность этапа, мин
Первое разделение исследуемой пробы
Толуол-1,1-дихлорметан (7.5:2.5, ν:ν)
1<sub>1</sub>. Темно-фиолетовый
0.02
550
1
1<sub>2</sub>. Темно-фиолетовый
0.77
1670
28
2. Ярко-оранжевый
0.08
1960
Последующие разделения отдельных групп первого разделения на прямоугольных пластинках
тетрагидрофуран-бензол (9:1, ν:ν)
3<sub>1</sub>. Фиолетовый
0.23
1260
3<sub>2</sub>. Фиолетовый
0.56
1800
3<sub>3</sub>. Фиолетовый
0.81
1310
2*
4<sub>1</sub> Желтый
0.35
1530
17
4<sub>2</sub>. Желтый
0.61
1420
4<sub>3</sub>. Желтый
0.68
1530
3*
1,1-дихлорметан-бензол (3:1)
5<sub>1</sub>. Темно-красный
0.09
1500
23
5<sub>2</sub>. Темно-красный
0.25
1660
5<sub>3</sub>. Темно-красный
0.51
1270
5<sub>4</sub>. Темно-красный
0.58
1250
5<sub>5</sub>. Темно-красный
0.67
1430
* этапы 2, 3 осуществляются одновременно и независимо.
Как следует из приведенных в таблице данных, применение предложенного способа позволило получить достаточно полное разделение сложной смеси пигментов красителей. Для каждой группы разделяемых соединений была использована оптимальная ПФ, необходимая для их полного разделения. Погрешность измерений эффективности, оцененная аналогично примеру 1, составляет 6-8%.
Данная смесь пигментов была разделена в работе [4] с использованием метода трехмерной ТСХ, с изменением состава ПФ, а также направлением движения ПФ перед каждым последующим проявлением. В таблице 3 приведен сравнительный анализ двух вариантов трехмерной ТСХ.
Таблица 3
Сравнительная характеристика двух вариантов трехмерной ТСХ.
Характеристика
Способы трехмерной ТСХ
Известный способ (прототип)
Заявляемый способ
Продолжительность полного анализа смеси пигментов
104 мин
51 мин (уменьшение примерно на 50%)
Общее количество разделенных зон
11
14 (увеличение примерно на 27%)
Таким образом, приведенные в таблице 3 данные позволяют сделать вывод о том, что новый вариант трехмерной ТСХ обеспечивает наиболее полное разделение компонентов смеси (14 по сравнению с 11). Важно отметить также, что использование нового способа трехмерной ТСХ позволяет сократить продолжительность примерно на 50% по сравнению с ранее известным вариантом трехмерной ТСХ при разделении одной и той же смеси.
Пример 3.
Реализация пятимерной ТСХ
Проведение эксперимента осуществляли в условиях, аналогичных примеру 1.
В качестве разделяемых соединений использована смесь 25 красителя: сиба-Ф II, индофенол, ариабел красный, судан синий, судан II, судан IV, азур II, диметил-аминоазобензол, бенгальская роза, нейтральный красный, бромкрезоловый зеленый, бромфеноловый синий, феноловый красный, ксиленовый оранжевый, оранжевый Ж, метаниловый желтый, нейтральный голубой, флуорексон, ксиленцианол FF, тимоловый синий, родамин Ж, бриллиантовый зеленый, метиловый красный, розалинин II, щелочной голубой.
Нанесение анализируемой пробы аналогично примеру 1.
Разделение компонентов осуществляли аналогично примеру 1.
f
f
f
Первое разделение исследуемой смеси красителей проводили с использованием в качестве ПФ раствора толуола и этанола (в объемном соотношении 7:3). Высушивание пластинки осуществляли аналогично примеру 1. После первого разделения пробы на полученной хроматограмме были выделены четыре последовательно расположенные зоны хроматограммы, содержащие четыре группы частично разделенных соединений: а) группу соединений, характеризующуюся в данных условиях низкой адсорбционной способностью (высокое значение R(0.8-0.9)); б) группу соединений, характеризующуюся средним значением сорбционной емкости (средние значение R(0.6-0.8) и (0.3-0.6)); в) группу соединений, характеризующуюся высоким значением сорбционной емкости (низкое значение R(0-0.3).
Разделение каждой из четырех прямоугольных пластинок осуществляли аналогично примеру 1. Полученные хроматограммы приведены на Фиг.4. Высушивание пластинок с разделенными компонентами осуществляли аналогично примеру 1.
Детектирование и обработку зон разделенных соединений осуществляли аналогично примеру 1.
f
В таблице 4 приведены полученные данные о величинах удерживания R, эффективности (число теоретических тарелок) N и продолжительности разделения компонентов, входящих в состав анализируемой смеси способом трехмерной ТСХ.
Как показывают приведенные в табл.4 данные, продолжительность разделения анализируемых соединений с помощью способа пятимерной ТСХ занимает 74 мин, при этом достигается полное разделение смеси на индивидуальные компоненты.
Как следует из приведенных в таблице данных, применение предложенного способа позволило получить достаточно полное разделение сложной смеси красителей. Для каждой группы разделяемых соединений была использована оптимальная ПФ, необходимая для их полного разделения. Погрешность измерений эффективности, оцененная аналогично примеру 1, составляет 6-8%.
При решении сложных аналитических задач после первого разделения пробы выделяют большее количество зон групп плохо разделенных соединений и путем разрезания получают соответствующее количество прямоугольных пластинок для последующих разделений, после проведения которых и обнаружения на хроматограмме какой-либо прямоугольной пластинки частично разделенных соединений продолжают дополнительные разделения этих соединений с применением более подходящих жидких ПФ, т.е. любой этап (кроме первого) повторяется до получения наилучшего разделения.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что предложенный способ многомерной тонкослойной хроматографии характеризуется более высокой разделяющей способностью и высокой экспрессностью по сравнению с известными методами, что хорошо согласуется с общими теоретическими положениями ТСХ.
Таблица 4
Хроматографические характеристики разделенных компонентов анализируемой смеси (способ пятимерной ТСХ)
Этап разделе-ния
Подвижная фаза
Наименование и номер компонента
Величина удерживания, R<sub>f</sub>
Эффектив-ность, N
Продолжитель-ность этапа, мин
Первое разделение исследуемой пробы
1
Толуол-этанол (7:3, ν:ν)
1. Нейтральный голубой
0.46
1670
38
2. Оранжевый Ж
0.65
1960
3. Щелочной голубой
0.38
2370
4. Флуоресцин
0.21
1980
Последующие разделения отдельных групп первого разделения на прямоугольных пластинках
2*
Этанол-уксусная кислота (9:1, ν:ν)
5. Бромфеноловый синий
0.07
1260
36
6. Тимоловый синий
0.33
1800
7. Ксиленцианол FF
0.50
1310
2*
Ацетонитрил- хлороформ (50:50, ν:ν)
8. Бриллиантовый зеленый
0.23
1500
21
9. Родамин Ж
0.46
1660
10. Метиловый красный
0.66
1270
11. Нейтральный красный
0.56
1250
12. Бромкрезоловый зеленый
0.71
1900
4*
Дихлорметан-бутилацетат-метанол (40:40:20, ν:ν)
13. Розалинин
0.2
530
31
14. Ксиленовый оранжевый
0.26
720
15. Оранжевый Ж
0.53
1980
16. Судан IV
0.22
650
17. Феноловый красный
0.60
1800
18. Азур II
0.16
500
19. Бенгальская роза
0.51
1900
5*
Толуол
20. Сиба Ф II
0.02
180
21
21. Индофенол
0.11
290
22. Ариабел красный
0.19
1030
23. Судан синий
0.30
1160
24. Судан II
0.40
1500
25. Диметил-аминоазобензол
0.54
1370
* этапы 2, 3, 4, 5 осуществляются одновременно и независимо.
Источники информации
1. Giddings, J. Calvin. Unified separation science. New York, John Wiley and Sons, Inc., 1991. 320 P.
2. Красиков В.Д. Основы планарной хроматографии. СПб.: Химиздат, 2005, 232 с.
3. Сумина Е.Г., Штыков С.Н., Тюрина Н.В. Тонкослойная хроматография. Теоретические основы и практическое применение. Саратов: Изд-во Саратовского ун-та. 2006, 112 с.
4. Березкин В.Г., Кулакова Н.Ю. Трехмерная тонкослойная хроматография. Журнал физической химии. 2009. Т.83, №11. С.2153-2157.
5. Гейсс Ф. Основы тонкослойной хроматографии. Т.1, 2. - М.: Изд-е Научного совета по хроматографии РАН, 1999, - 405; 348 с.
6. Калмановский В.И. Метрология для химиков. Учеб. пособие. Н.Новгород: Ю.А.Николаев, 2007, 132 с.