СУБСТРАТЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
SUBSTRATES OF NUCLEIC ACIDS WITH ENZYMATIC ACTIVITY

Включение посредством перекрестной ссылки
Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент Австралии 2011903686, поданной 9 сентября 2011 года, содержание которой в полной мере включено в настоящий документ посредством перекрестной ссылки.
Область техники
Настоящее изобретение относится, в основном, к области нуклеиновых кислот с ферментативной активностью. Более конкретно, настоящее изобретение относится к субстратам для нуклеиновых кислот с ферментативной активностью и способам, использующим эти субстраты.
Предпосылки настоящего изобретения
Различные молекулы нуклеиновых кислот с ферментативной или каталитической активностью были открыты за последние 20 лет. РНК-ферменты ("рибозимы") встречаются в природе, но могут быть искусственно сконструированы для специфического связывания и модификации целевого РНК-субстрата. Технологии модификации молекул in vitro способствовали открытию и разработке многих других каталитических нуклеиновых кислот, в том числе дезоксирибонуклеиновых кислот, которые часто называют "дезоксирибозимами", "ДНК ферментами" или "ДНКзимами". Были открыты созданные in vitro ДНКзимы и/или рибозимы, которые обладают способностью катализировать широкий ряд реакций, включая расщепление нуклеиновых кислот, лигирование нуклеиновых кислот, замещение атома водорода в молекуле порфирина металлом и формирование углерод-углеродных связей, эфирных связей или амидных связей.
В частности, были описаны ДНКзимы и рибозимы, которые специфически расщепляют определенные последовательности нуклеиновых кислот после гибридизации путем спаривания оснований по Уотсону-Крику. ДНКзимы способны к расщеплению молекул РНК или ДНК. Рибозимы также способны к расщеплению целевых последовательностей как РНК, так и ДНК. ДНКзимы "10-23" и "8-17" способны к расщеплению субстратов нуклеиновых кислот в местах специфических фофсфодиэфирных связей в РНК для создания продуктов реакции, которые имеют 2', 3'-циклические фосфатные и 5'-гидроксильные группы. Примеры дезоксирибозимов (ДНКзимов), которые могут лигировать продукты с 2', 3'-циклическими фосфатными и 5'-гидроксильными группами, включают лигазы "7Ζ81" и "7Ζ48".
Совсем недавно были описаны многокомпонентные нуклеиновые кислоты с ферментативной активностью (Multi-component Nucleic Acid enzymes) (МНКзимы), которые обладают способностью к самосборке из двух или более олигонуклеотидных компонентов (также называемых в настоящем документе "компоненты рибозимов") в присутствии посредника сборки МНКзима (например, молекулы-мишени, которая должна быть детектирована).
Разнообразная природа каталитических нуклеиновых кислот способствовала их применению в различных областях. Ключевым элементом успешного применения каталитических нуклеиновых кислот является их способность модифицировать соответствующий субстрат. В общем, субстрат является в значительной степени комплементарным гибридизующимся плечам каталитической нуклеиновой кислоты и содержит специфическую последовательность или мотив последовательности в сайте каталитического действия. Характер взаимодействия между данной каталитической нуклеиновой кислотой и ее субстратом определяет то, насколько эффективно фермент выполняет свои функции и/или каталитически модифицирует свой субстрат, и, таким образом, является одним из основных факторов при проектировании какой-либо системы, которая использует каталитические нуклеиновые кислоты.
Каталитические нуклеиновые кислоты применяются в области in vitro диагностики для детектирования нуклеиновых кислот, белков и малых молекул. Эти области применения часто включают амплификацию либо мишени, либо сигнала для формирования достаточного сигнала для надежного детектирования аналита, представляющего интерес.
Способы, в которых применяют каталитические нуклеиновые кислоты, требуют использования субстратов, модифицирующихся с достаточной скоростью каталитической реакции, чтобы обеспечить эффективное обнаружение различий сверх фонового шума. Различные способы могут требовать применения различных температур реакций, и, таким образом, существует потребность в субстратах, эффективно модифицирующихся (например, расщепляющихся) при требуемых температурах. Такие способы как те, которые используют МНКзимы и ДНКзимы, позволяют проведение мультиплексного анализа многочисленных мишеней одновременно в ходе одной реакции, но способность мультиплексировать и устанавливать различия между многочисленными мишенями зависит от существования подходящего ряда субстратов, как правило, по меньшей мере одного на каждую мишень. Число субстратов, известных в данной области техники, которые модифицируются (например, расщепляются) с высокой степенью эффективности, в настоящее время не является достаточным для массового мультиплексирования.
Субстраты для ДНКзимов и МНКзимов, ранее известные в данной области техники, были получены путем скрининга многочисленных возможных субстратов для того, чтобы эмпирическим путем определить те субстраты, которые расщеплялись наиболее эффективно. Часто этот скрининг проводили с использованием большого количества ДНКзимов, действие которых было направлено на расщепление теоретически возможных сайтов расщепления, расположенных вдоль всей длины иРНК. Этот скрининг обычно проводили при физиологических условиях (температура и ионная сила, состав и рН буферов). Это отклонение в сторону нахождения эффективно расщепленных последовательностей иРНК при физиологических условиях имеет место, потому что такие исследования были направлены на изучение вариантов терапевтического применения ДНКзимов в качестве ингибиторов экспрессии РНК in vivo. Такие исследования предоставляют ряд трудоемких протоколов для эмпирического анализа большого числа предполагаемых субстратов, направленного на нахождение тех немногих, которые эффективно расщеплены (см., например, Cairns et al., 1999 Nat Biotech 17:480-486). Эти исследования привели к ограниченному набору принципов конструирования для отбора эффективно расщепленных субстратов, и во многих случаях принципы были ориентированных на конструкцию ДНКзима, а не субстрата, так как ДНКзим может легко корректироваться, тогда как иРНК - не может. Один из распространенных принципов, полученных на основании этих исследований, заключается в важности точной последовательности R-Y-рибонуклеотидного мотива в сайте расщепления субстрата с эффективностью расщепления в следующем порядке: GU≥AU>GC>>>АС.
Эффективность расщепления полноразмерной иРНК в условиях in vitro не является абсолютным показателем эффективности расщепления в клеточной среде, поскольку последняя содержит рибонуклеарные белки и другие факторы, влияющие на результаты, которые сложно имитировать в условиях in vitro.
Принципы конструирования, созданные в прошлом, находят некоторое применение в отборе сайтов, расположенных вдоль длинной молекулы иРНК, которая может эффективно расщепляться ДНКзимами и МНКзимами при физиологических условиях, но обладают ограниченной возможностью прогнозирования того, какие субстраты будут расщепляться с эффективностью, достаточной для использования в области in vitro диагностики. In vitro диагностика может требовать применения условий, значительно отличающихся от физиологических условий, которые обычно определяются при скрининге и используются для создания ограниченных принципов конструирования субстрата, которые существуют в данной области техники.
Есть необходимость в создании набора принципов, или мотивов последовательностей, для последовательностей субстратов, которые прогнозируют с высокой степенью определенности, будет ли субстрат эффективно расщепляться МНКзимом или ДНКзимом в условиях, подходящих для применений in vitro диагностики. Существует также потребность в создании субстратов для каталитических нуклеиновых кислот со свойствами, которые способствуют улучшению каталитической функции нуклеиновых кислот. Эти свойства могут включать, например, способность улучшать каталитическую функцию нуклеиновых кислот в диапазоне условий и/или способность к расширению числа мишеней, которые могут быть одновременно детектированы в реакции мультиплексирования.
Краткое описание настоящего изобретения
Несмотря на то, что были предприняты многочисленные попытки установить мотив последовательности или набор принципов конструирования, которые бы позволяли неизменно получать эффективные последовательности субстратов, на данный момент не было идентифицировано никакой эффективной последовательности или набора принципов. Настоящее изобретение предусматривает серию принципов, которые способствуют разработке новых эффективно расщепляющихся субстратов. Настоящее изобретение, таким образом, представляет субстраты для каталитических нуклеиновых кислот с ферментативной активностью, обладающие такими свойствами, которые повышают каталитическую функцию нуклеиновых кислот, тем самым отвечая потребности, существующей в данной области техники.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
В первом аспекте настоящее изобретение представляет изолированный полинуклеотидный субстрат для каталитической нуклеиновой кислоты с ферментативной активностью, при этом вышеуказанный полинуклеотидный субстрат содержит последовательность N-N-N-N-N-N-N-N-rR-rY-N-N-N-N-N-N-N, где
rR является пуриновым рибонуклеотидом;
rY является пиримидиновым рибонуклеотидом;
1
15
каждый из N-N является нуклеотидом;
5
13
шесть или более из N-N являются цитозиновыми нуклеотидами; и
9
15
менее чем три из N-N являются гуаниновыми нуклеотидами.
В одном варианте осуществления первого аспекта полинуклеотидный субстрат содержит или состоит из последовательности, определяемой любой из SEQ ID NO: 25-27, 29-30, 33, 72-90 или 172-175.
5
13
В одном варианте осуществления первого аспекта семь или более или восемь или более из N-N являются цитозиновыми нуклеотидами.
5
13
В одном варианте осуществления первого аспекта семь или более из N-N являются цитозиновыми нуклеотидами, а полинуклеотидный субстрат содержит или состоит из последовательности, определяемой любой из SEQ ID NO: 29, 73, 76-80, 82-83, 85-90 или 172-175.
5
13
В одном варианте осуществления первого аспекта восемь из N-N являются цитозиновыми нуклеотидами, а полинуклеотидный субстрат содержит или состоит из последовательности, определяемой любой из SEQ ID NO: 76, 77, 80, 83 или 87.
4
13
В одном варианте осуществления первого аспекта семь или более или восемь или более из N-N являются цитозиновыми нуклеотидами.
4
13
В одном варианте осуществления первого аспекта семь или более из N-N являются цитозиновыми нуклеотидами, а полинуклеотидный субстрат содержит последовательность, заданную любой из SEQ ID NO: 27, 29, 73, 76-83, 85-90 или 172-175.
4
13
В одном варианте осуществления первого аспекта восемь из N-N являются цитозиновыми нуклеотидами, а полинуклеотидный субстрат содержит или состоит из последовательности, определяемой любой из SEQ ID NO: 76, 77, 79-80, 82-83, 87, 88 или 90.
4
12
В одном варианте осуществления первого аспекта шесть или более, семь или более или восемь или более из N-N являются цитозиновыми нуклеотидами.
4
12
В одном варианте осуществления первого аспекта семь или более из N-N являются цитозиновыми нуклеотидами, а полинуклеотидный субстрат содержит или состоит из последовательности, определяемой любой из SEQ ID NO: 27, 29, 73, 76, 77, 79-83, 85-88, 90 или 172-175.
4
12
В одном варианте осуществления первого аспекта восемь из N-N являются цитозиновыми нуклеотидами, а полинуклеотидный субстрат содержит или состоит из последовательности, определяемой любой из SEQ ID NO: 76, 77, 80, 83, 87 или 88.
5
12
В одном варианте осуществления первого аспекта шесть или более, семь или более или восемь или более из N-N являются цитозиновыми нуклеотидами.
5
12
В одном варианте осуществления первого аспекта семь или более из N-N являются цитозиновыми нуклеотидами, а полинуклеотидный субстрат содержит или состоит из последовательности, определяемой любой из SEQ ID NO: 29, 73, 76, 77, 80, 83, 85-88 или 172-175.
5
12
В одном варианте осуществления первого аспекта восемь из N-N являются цитозиновыми нуклеотидами, а полинуклеотидный субстрат содержит или состоит из последовательности, определяемой любой из SEQ ID NO: 76, 77, 80, 83, или 87.
1
2
8
9
В одном варианте осуществления первого аспекта любой один или несколько из N, N, N и/или N являются цитозиновыми нуклеотидами.
8
9
В одном варианте осуществления первого аспекта N и N являются цитозиновыми нуклеотидами, а полинуклеотидный субстрат содержит или состоит из последовательности, определяемой любой из SEQ ID NO: 25-26, 29-30, 72-90 или 172-175.
9
15
В одном варианте осуществления первого аспекта два, один или ни один из N-N являются гуаниновыми нуклеотидами.
9
15
В одном варианте осуществления первого аспекта один или ни один из N-N являются гуаниновыми нуклеотидами, а полинуклеотидный субстрат содержит или состоит из последовательности, определяемой любой из SEQ ID NO: 25-27, 29-30, 33,72-80, 82-90 или 172-175.
9
15
В одном варианте осуществления первого аспекта ни один из N-N не является гуаниновым нуклеотидом, а полинуклеотидный субстрат содержит или состоит из последовательности, определяемой любой из SEQ ID NO: 25, 26, 30, 33, 72, 75, 77-80, 84-85 или 89.
1
15
В одном варианте осуществления первого аспекта более десяти, более одиннадцати, более двенадцати или более тринадцати из N-N являются пиримидиновыми нуклеотидами.
1
15
В одном варианте осуществления первого аспекта одиннадцать, двенадцать, или более двенадцати из N-N являются пиримидиновыми нуклеотидами, а полинуклеотидный субстрат содержит или состоит из последовательности, определяемой любой из SEQ ID NO: 25-27, 29, 33, 73-90 или 173-175.
1
15
В одном варианте осуществления первого аспекта тринадцать или четырнадцать из Ν-Ν являются пиримидиновыми нуклеотидами, а полинуклеотидный субстрат содержит или состоит из последовательности, определяемой любой из SEQ ID NO: 75, 77-80, 82-85 или 88-89.
1
14
В одном варианте осуществления первого аспекта более восьми, более девяти, более десяти или одиннадцать из Ν-Ν являются цитозиновыми нуклеотидами.
1
14
В одном варианте осуществления первого аспекта десять или одиннадцать из N-N являются цитозиновыми нуклеотидами, а полинуклеотидный субстрат содержит или состоит из последовательности, определяемой любой из SEQ ID NO: 33, 76-80, 82-83, 85, 87, 88 или 89.
1
14
В одном варианте осуществления первого аспекта одиннадцать из N-N являются цитозиновыми нуклеотидами, а полинуклеотидный субстрат содержит или состоит из последовательности, определяемой любой из SEQ ID NO: 77-79.
В одном варианте осуществления первого аспекта полинуклеотидный субстрат дополнительно содержит детектируемую метку для детектирования полинуклеотидного субстрата.
В одном варианте осуществления первого аспекта полинуклеотидный субстрат дополнительно содержит детектируемую часть и часть гасителя флуоресценции, где детектируемый эффект, обеспечиваемый детектируемой частью, повышается или понижается после модификации полинуклеотидного субстрата вышеуказанной каталитической нуклеиновой кислотой с ферментативной активностью.
В одном варианте осуществления первого аспекта пуриновый рибонуклеотид содержит гуанин.
В одном варианте осуществления первого аспекта пиримидиновый рибонуклеотид содержит урацил.
В одном варианте осуществления первого аспекта часть полинуклеотидного субстрата, которая связывается с указанной каталитической нуклеиновой кислотой с ферментативной активностью, имеет температуру плавления (Tm) от 50°С до 90°С, от 50°С до 65°С, от 50°С до 60°С, от 52°С до 58°С, от 66°С до 76°С, от 68°С до 76°С, от 64°С до 70°С, от 70°С до 76°С, от 70°С до 75°С, от 72°С до 76°С, 52°С, 58°С, 64°С, 66°С, 68°С, 70°С, 72°С или 76°С.
В одном варианте осуществления первого аспекта каталитической нуклеиновой кислотой с ферментативной активностью является
(i) многокомпонентная нуклеиновая кислота с ферментативной активностью (МНКзим), и вышеуказанная часть связывается по меньшей мере с одним субстратным плечом вышеуказанного МНКзима; или
(ii) ДНКзим.
В одном варианте осуществления первого аспекта полинуклеотидный субстрат способен подвергаться каталитической модификации МНКзимом.
В одном варианте осуществления первого аспекта полинуклеотидный субстрат способен подвергаться каталитической модификации ДНКзимом.
В одном варианте осуществления первого аспекта полинуклеотидный субстрат содержит детектируемую метку для детектирования способом флуоресцентной спектроскопии, поверхностного плазмонного резонанса, масс-спектроскопии, ЯМР, электронно-спинового резонанса, поляризационной флуоресцентной спектроскопии, циркулярного дихроизма, иммунохимического анализа, хроматографии, радиометрии, электрохимических измерений, фотометрии, сцинтиграфии, электронных методов, УФ-спектроскопии, спектроскопии в видимой области спектра или инфракрасной спектроскопии, ферментативными способами или любой их комбинацией.
В одном варианте осуществления первого аспекта полинуклеотидный субстрат содержит детектируемую метку для детектирования методом флуоресцентной спектроскопии.
В одном варианте осуществления первого аспекта полинуклеотидный субстрат содержит детектируемую метку для детектирования методом резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).
Во втором аспекте настоящее изобретение представляет изолированный полинуклеотидный субстрат для каталитической нуклеиновой кислоты с ферментативной активностью, при этом вышеуказанный полинуклеотидный субстрат содержит или состоит из последовательности, определяемой SEQ ID NO: 28.
В одном варианте осуществления второго аспекта каталитической нуклеиновой кислотой с ферментативной активностью является МНКзим, содержащий пару олигонуклеотидных компонентов рибозимов, при этом вышеуказанная пара содержит или состоит из SEQ ID NO: 15 и 8, SEQ ID NO: 93 и 94 или SEQ ID NO: 114 и 115.
В одном варианте осуществления второго аспекта каталитической нуклеиновой кислотой с ферментативной активностью является ДНКзим, содержащий или состоящий из последовательности, определяемой SEQ ID NO: 138.
В третьем аспекте настоящее изобретение представляет способ детектирования присутствия по меньшей мере одной мишени, включающий
(a) получение двух или более олигонуклеотидных компонентов рибозимов, где по меньшей мере первый олигонуклеотидный компонент рибозима и второй олигонуклеотидный компонент рибозима осуществляют самосборку в присутствии вышеуказанной мишени с формированием по меньшей мере первой каталитически активной многокомпонентной нуклеиновой кислоты с ферментативной активностью (МНКзима);
(b) получение изолированного полинуклеотидного субстрата по первому или второму аспекту, где вышеуказанный полинуклеотидный субстрат способен подвергаться модификации вышеуказанным первым МНКзимом, где вышеуказанная модификация вышеуказанного полинуклеотидного субстрата вышеуказанным МНКзимом обеспечивает детектируемый эффект;
(c) приведение в контакт вышеуказанных двух или более олигонуклеотидных компонентов рибозимов с образцом, предположительно содержащим вышеуказанную мишень при условиях, позволяющих
(1 )самосборку вышеуказанного по меньшей мере первого МНКзима и
(2) каталитическую активность вышеуказанного по меньшей мере первого МНКзима; и
(d) детектирование вышеуказанного детектируемого эффекта. В одном варианте осуществления третьего аспекта мишенью является посредник сборки МНКзимов.
В одном варианте осуществления третьего аспекта мишенью является нуклеиновая кислота.
В одном варианте осуществления третьего аспекта мишенью является нуклеиновая кислота, которая гибридизуется с одним или более сенсорными плечами вышеуказанного МНКзима по правилу комплементарности оснований.
В одном варианте осуществления третьего аспекта нуклеиновую кислоту выбирают из группы, состоящей из ДНК, метилированной ДНК, алкилированной ДНК, РНК, метилированной РНК, микроРНК, siRNA, shRNA, тРНК, иРНК, snoRNA, stRNA, smRNA, пре-микроРНК и первичная микроРНК, другие некодирующие виды РНК, рибосомальная РНК, их производные, ампликоны или любая их комбинация.
В одном варианте осуществления третьего аспекта нуклеиновая кислота является амплифицированной.
В одном варианте осуществления третьего аспекта амплификация включает один или несколько следующих видов: полимеразная цепная реакция (ПЦР), амплификация с замещением цепей (SDA), изотермическая амплификация с формированием петель (LAMP), амплификация по типу катящегося кольца (RCA), транскрипционно-опосредованная амплификация (ТМА), самоподдерживающаяся репликация последовательностей (3SR), амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот, (NASBA) или полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР).
В одном варианте осуществления третьего аспекта полинуклеотидный субстрат гибридизуется с субстратными плечами вышеуказанного МНКзима при температуре от 50°С до 90°С, от 50°С до 65°С, от 50°С до 60°С, от 52°С до 58°С, от 66°С до 76°С, от 68°С до 76°С, от 64°С до 70°С, от 70°С до 76°С, от 70°С до 75°С, от 72°С до 76°С, 52°С, 58°С, 64°С, 66°С, 68°С, 70°С, 72°С или 76°С.
В одном варианте осуществления третьего аспекта способ дополнительно включает получение
(a) двух или более дополнительных олигонуклеотидных компонентов рибозимов, способных к самосборке в присутствии различных мишеней с формированием второго каталитически активного МНКзима; и
(b) по меньшей мере одного дополнительного полинуклеотидного субстрата;
где вышеуказанный дополнительный полинуклеотидный субстрат способен подвергаться модификации вышеуказанным вторым МНКзимом в присутствии вышеуказанных различных мишеней.
В одном варианте осуществления третьего аспекта дополнительный полинуклеотидный субстрат не способен подвергаться модификации вышеуказанным первым МНКзимом.
В одном варианте осуществления третьего аспекта детектирование на этапе (d) включает применение флуоресцентной спектроскопии, поверхностного плазмонного резонанса, масс-спектроскопии, ЯМР, электронно-спинового резонанса, поляризационной флуоресцентной спектроскопии, циркулярного дихроизма, иммунохимического анализа, хроматографии, радиометрии, электрохимических измерений, фотометрии, сцинтиграфии, электронных методов, УФ-спектроскопии, спектроскопии в видимой области спектра или инфракрасной спектроскопии, ферментативных способов или любой их комбинации.
В одном варианте осуществления третьего аспекта детектирование на этапе (d) включает применение флуоресцентной спектроскопии.
В одном варианте осуществления третьего аспекта детектирование на этапе (d) включает детектирование эффекта, детектируемого с помощью FRET.
В одном варианте осуществления третьего аспекта каталитический центр вышеуказанного МНКзима содержит ДНК или ее аналог.
В четвертом аспекте настоящее изобретение представляет применение изолированного полинуклеотидного субстрата первого или второго аспектов в качестве субстрата для каталитической нуклеиновой кислоты с ферментативной активностью.
В одном варианте осуществления четвертого аспекта каталитическая нуклеиновая кислота с ферментативной активностью является многокомпонентной нуклеиновой кислотой с ферментативной активностью (МНКзимом),
при этом вышеуказанный МНКзим, содержит по меньшей мере два или более олигонуклеотидных компонента рибозимов, где по меньшей мере первый олигонуклеотидный компонент рибозима и второй олигонуклеотидный компонент рибозима осуществляют самосборку в присутствии посредника сборки МНКзима с формированием каталитически активной многокомпонентной нуклеиновой кислоты с ферментативной активностью (МНКзима), где каждых из вышеуказанных по меньшей мере первый и вышеуказанный второй олигонуклеотидный компонент рибозима включает часть, представляющую собой субстратное плечо, часть, представляющую собой каталитический центр, и часть, представляющую собой сенсорное плечо;
где после самосборки, части вышеуказанных первого и второго олигонуклеотидных компонентов рибозимов, представляющие собой сенсорные плечи, действуют как сенсорные плечи МНКзима, части первого и второго олигонуклеотидных компонентов рибозимов, представляющие собой субстратные плечи, действуют как субстратные плечи МНКзима, а части первого и второго олигонуклеотидных компонентов рибозимов, представляющие собой каталитический центр, действуют как каталитический центр МНКзима;
и где сенсорные плечи МНКзима взаимодействуют с вышеуказанным посредником сборки МНКзимов таким образом, чтобы сохранить первый и второй олигонуклеотидные компоненты рибозимов близко расположенными для ассоциации их соответствующих частей, представляющих собой каталитические ядра, для формирования каталитического ядра МНКзима, при этом указанный каталитический центр способен к модификации указанного полинуклеотидного субстрата, и где вышеуказанные субстратные плечи вышеуказанного МНКзима входят в контакт с вышеуказанным полинуклеотидным субстратом таким образом, что указанный каталитический центр указанного МНКзима может модифицировать вышеуказанный полинуклеотидный субстрат.
В одном варианте осуществления третьего или четвертого аспекта, часть каждого из вышеуказанных олигонуклеотидных компонентов рибозимов, представляющая собой каталитический центр, содержит ДНК или ее аналог.
В одном варианте осуществления четвертого аспекта, посредник сборки является мишенью, которая должна быть идентифицирована, детектирована или количественно определена.
В одном варианте осуществления третьего или четвертого аспекта, первый и второй олигонуклеотидные компоненты рибозимов содержат соответствующие последовательности, заданные следующими:
SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58 и SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64 и SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66 и SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 58 и SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 99; SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 104 и SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106 и SEQ ID NO: 107; SEQ ID NO: 108 и SEQ ID NO: 109; SEQ ID NO: ПО и SEQ ID NO: 111; SEQ ID NO: 112 и SEQ ID NO: 113; SEQ ID NO: 116 и SEQ ID NO: 117; SEQ ID NO: 118 и SEQ ID NO: 119; SEQ ID NO: 120 и SEQ ID NO: 121; SEQ ID NO: 122 и SEQ ID NO: 119; SEQ ID NO: 155 и SEQ ID NO: 156; SEQ ID NO: 157 и SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 159 и SEQ ID NO: 160; SEQ ID NO: 168 и SEQ ID NO: 169; SEQ ID NO: 179 и SEQ ID NO: 180; SEQ ID NO: 181 и SEQ ID NO: 182; SEQ ID NO: 183 и SEQ ID NO: 184 или SEQ ID NO: 185 и SEQ ID NO: 186.
В одном варианте осуществления третьего или четвертого аспекта вышеуказанный олигонуклеотидный субстрат и вышеуказанный первый и второй олигонуклеотидные компоненты рибозимов задаются комбинацией последовательностей, которые указаны в таблице 6, 8, 10, 13, 16, 20, 22 и/или 24.
В одном варианте осуществления четвертого аспекта каталитическая нуклеиновая кислота с ферментативной активностью является ДНКзимом, и ДНКзим и олигонуклеотидный субстрат задаются комбинацией последовательностей, которые указаны в таблице 15.
В одном варианте осуществления четвертого аспекта мишенью является нуклеиновая кислота, которая гибридизуется с одним или несколькими сенсорными плечами вышеуказанного МНКзима по правилу комплементарности оснований.
В одном варианте осуществления четвертого аспекта полинуклеотидный субстрат гибридизуется с указанной каталитической нуклеиновой кислотой с ферментативной активностью при температуре от 50°С до 90°С, от 50°С до 65°С, от 50°С до 60°С, от 52°С до 58°С, от 66°С до 76°С, от 68°С до 76°С, от 64°С до 70°С, от 70°С до 76°С, от 70°С до 75°С, от 72°С до 76°С, 52°С, 58°С, 64°С, 66°С, 68°С, 70°С, 72°С или 76°С.
В пятом аспекте настоящее изобретение представляет набор, содержащий изолированный полинуклеотидный субстрат по первому или второму аспекту.
В одном варианте осуществления пятого аспекта, набор дополнительно содержит каталитическую нуклеиновую кислоту с ферментативной активностью, способную к каталитической модификации вышеуказанного полинуклеотидного субстрата.
В одном варианте осуществления пятого аспекта каталитическая нуклеиновая кислота с ферментативной активностью является многокомпонентной нуклеиновой кислотой с ферментативной активностью (МНКзимом).
В шестом аспекте настоящее изобретение представляет набор, содержащий изолированный полинуклеотидный субстрат первого или второго аспектов и ряд олигонуклеотидных компонентов рибозимов, предназначенных для сборки многокомпонентной нуклеиновой кислоты с ферментативной активностью (МНКзима), способной к детектированию по меньшей мере одной мишени, где вышеуказанный МНКзим способен к каталитической модификации полинуклеотидного субстрата.
В одном варианте осуществления шестого аспекта вышеуказанный олигонуклеотидный субстрат и вышеуказанный ряд олигонуклеотидных компонентов рибозимов задаются комбинацией последовательностей, которые указаны в таблице 6, 8, 10, 13, 16, 20, 22 и/или 24.
В седьмом аспекте настоящее изобретение представляет комплект, содержащую твердую подложку, связанную с полинуклеотидным субстратом по первому или второму аспекту.
1
15
В одном варианте осуществления первого или с третьего по седьмой аспекты любой один или несколько из N-N являются дезоксирибонуклеотидами.
1
15
В одном варианте осуществления первого или с третьего по седьмой аспекты любой один или несколько из N-N являются рибонуклеотидами.
1
15
В одном варианте осуществления первого или с третьего по седьмой аспекты все из N-N являются дезоксирибонуклеотидами.
1
15
В одном варианте осуществления первого или с третьего по седьмой аспекты все из N-N являются рибонуклеотидами.
1
15
В одном варианте осуществления первого или с третьего по седьмой аспекты, N-N представляют смесь дезоксирибонуклеотидов и рибонуклеотидов.
В одном варианте осуществления седьмого аспекта комплект содержит ряд различных твердых подложек, связанных с рядом различных полинуклеотидных субстратов.
В одном варианте осуществления первого, второй, четвертого или пятого аспекта каталитическая нуклеиновая кислота с ферментативной активностью является ДНКзимом.
В одном варианте осуществления первого, второй, четвертого или пятого аспекта каталитическая нуклеиновая кислота с ферментативной активностью является рибозимом.
В одном варианте осуществления первого, второго, четвертого или пятого аспекта каталитическая нуклеиновая кислота с ферментативной активностью является многокомпонентной нуклеиновой кислотой с ферментативной активностью (МНКзимом).
В одном варианте осуществления вышеупомянутых аспектов каталитическая нуклеиновая кислота с ферментативной активностью способна к модификации полинуклеотидного субстрата путем расщепления.
В одном варианте осуществления первого, второго или пятого аспекта каталитическая нуклеиновая кислота с ферментативной активностью является МНКзимом, содержащим первый и второй олигонуклеотидные компоненты рибозимов, и вышеуказанный олигонуклеотидный субстрат и вышеуказанный первый и второй олигонуклеотидные компоненты рибозимов задаются комбинацией последовательностей, которые изложены в таблице 6, 8, 10, 13, 16, 20, 22 и/или 24.
В одном варианте осуществления первого, второго или пятого аспекта каталитическая нуклеиновая кислота с ферментативной активностью является ДНКзимом, и ДНКзим и олигонуклеотидный субстрат задаются комбинацией последовательностей, которые изложены в таблице 15.
В одном варианте осуществления первого, второго или пятого аспекта полинуклеотидный субстрат способен к гибридизации с указанной каталитической нуклеиновой кислотой с ферментативной активностью за счет спаривания комплементарных оснований.
В одном варианте осуществления четвертого аспекта полинуклеотидный субстрат гибридизуется с указанной каталитической нуклеиновой кислотой с ферментативной активностью за счет спаривания комплементарных оснований.
В одном варианте осуществления третьего и четвертого аспектов полинуклеотидный субстрат гибридизуется с вышеуказанным МНКзимом за счет спаривания комплементарных оснований.
В одном варианте осуществления первого, второй, пятого и шестого аспектов полинуклеотидный субстрат способен к гибридизации с вышеуказанным МНКзимом за счет спаривания комплементарных оснований.
В одном варианте осуществления вышеупомянутых аспектов, часть изолированного полинуклеотидного субстрата связывается по меньшей мере с одним субстратным плечом вышеуказанного МНКзима.
В одном варианте осуществления вышеупомянутых аспектов, полинуклеотидный субстрат является универсальным субстратом, который может связываться и каталитически модифицироваться несколькими отличными типами каталитических нуклеиновых кислот с ферментативной активностью.
В одном варианте осуществления вышеупомянутых аспектов полинуклеотидный субстрат является универсальным субстратом, который может связываться и каталитически модифицироваться несколькими отличными типами многокомпонентных нуклеиновых кислот с ферментативной активностью (МНКзим).
В одном варианте осуществления вышеупомянутых аспектов по меньшей мере один из вышеуказанных олигонуклеотидных компонентов рибозимов, посредник сборки или субстрат содержит ДНК или ее аналог.
В одном варианте осуществления третьего и шестого аспектов модификация представляет собой расщепление полинуклеотидного субстрата МНКзимом.
Краткое описание графических материалов
Сейчас будут описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, только в качестве примера, со ссылкой на прилагаемые фигуры, где:
На фигуре 1 представлена диаграмма, изображающая типичную конструкцию многокомпонентной нуклеиновой кислоты (МНКзим). В качестве типичного раскрытия МНКзим содержит два олигонуклеотидных компонента (компонент А рибозима и компонент В рибозима), которые самостоятельно собираются в присутствии посредника сборки. Когда два компонента рибозимов собираются в присутствии посредника сборки, формируется каталитически активный МНКзим, который способен к модификации (например, расщеплению или лигированию) субстрата. Два компонентных компонента рибозимов имеют (i) сенсорные плечи, которые связываются с посредником сборки, (ii) субстратные плечи, которые связывают субстрат, и (iii) частичные последовательности каталитического ядра. Присутствие молекулы посредника сборки (например, последовательности нуклеиновой кислоты-мишени) представляет собой "входящий" сигнал, который управляет сборкой компонентов рибозимов высоко-специфическим образом, который поддается модуляции. В некоторых вариантах осуществления посредником сборки может быть, например, последовательность нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующая в тестируемом образце. В других вариантах осуществления посредник сборки может быть, например, синтетическим олигонуклеотидом добавленным в среду для того, чтобы направлять самосборку компонентов рибозимов в присутствии детектируемой частицы или явления. Модификация субстрата собранным МНКзимом может обеспечить "детектируемый эффект", который может быть детектирован и/или оценен количественно. Например, когда субстрат имеет двойную метку флуорофором (F) и гасителем флуоресценции (Q), расщепление этого "репортерного субстрата" активным МНКзимом разделяет флуорофор и гаситель флуоресценции, приводя к сопутствующему увеличению флуоресценции.
На фигуре 2 представлена блок-схема, демонстрирующая типичные области применения способов детектирования мишеней с применением МНКзимов. МНКзимы могут применяться для (1) прямого детектирования; (2) детектирования созданных ампликонов, например, способами ПЦР, SDA, LAMP, RCA, ТМА, 3SR или NASBA, либо в процессе, либо после амплификации мишеней; и (3) инициации каскада реакций амплификации сигнала.
На фигуре 3 представлено изображение типичных МНКзимов и способа детектирования мишени с применением МНКзимов, которые расщепляют субстраты, привязанные к подложке. В этом варианте осуществления МНКзим формируется только в присутствии посредника сборки (мишени). В тех случаях, когда МНКзим расщепляет привязанный субстрат между флуорофором и гасителем флуоресценции, генерируется сигнал. Как показано на фигуре, в результате расщепления между флуорофором F и гасителем флуоресценции Q наблюдается усиление флуоресценции. В целом, может быть разработан такой способ, при котором либо флуорофор F, либо гаситель флуоресценции Q могут оставаться прикрепленными к подложке после расщепления. Область (i): показанная подложка имеет только один тип субстрата (субстрат 1), привязанный к ней. Область (ii): многочисленные типы субстрата могут быть привязаны в различных позициях. Каждый субстрат может расщепляться только МНКзимом, образованным в присутствии специфического посредника сборки МНКзима, - на этой фигуре мишени 1 и 2 способствуют самосборке МНКзимов 1 и 2, соответственно. Таким образом, в этом примере МНКзим 1 осуществляет самосборку только в присутствии мишени 1 и расщепляет только субстрат 1. Сходным образом, МНКзим 2 осуществляет самосборку только в присутствии мишени 2 и расщепляет только субстрат 2. Сигнал может быть локализован путем позиционирования субстрата на поверхности, таким образом, позволяя выполнение специфического детектирования различных посредников сборки. Типичный количественный анализ в области (И) требует использования двух определенных последовательностей субстратов.
На фигуре 4 показан типичный количественный анализ, использующий продукты каталитически модифицированного субстрата в качестве компонентов посредника сборки МНКзима. При осуществлении такой стратегии инициирующий МНКзим (Mt) формируется в присутствии мишени (Т). Инициирующий МНКзим (Mt) расщепляет первый субстрат (S1) для создания первого компонента посредника сборки (S1f), который направляет формирование первого каскадного МНКзима (каскадный МНКзим Mc1). В этом примере первый каскадный МНКзим (Mc1) содержит два компонента рибозимов и три компонента посредника сборки, называемые F1, F2 и S1f. Mc1 может расщеплять дополнительный субстрат (S2), таким образом, высвобождая дополнительный компонент посредника сборки (S2f), который направляет формирование второго каскадного МНКзима (каскадный МНКзим Мс2). В этом примере второй каскадный МНКзим (Мс2) содержит два компонента рибозимов и три компонента посредника сборки, называемые F3, F4 и S2f. Мс2 может затем расщеплять большее количество первого субстрата (S1), таким образом, создавая большее количество первого компонента посредника сборки (S1f). Это ведет к формированию дополнительного первого каскадного МНКзима (Mc1), приводя, таким образом, к созданию каскада реакций амплификации. Этот типичный количественный анализ требует двух определенных последовательностей субстратов.
На фигуре 5 представлен график, иллюстрирующий значения Ct, полученные в результате qПЦР с использованием МНКзима с применением ряда различных универсальных субстратов для детектирования человеческого гена TFRC. Типы универсальных субстратов, используемых в реакции, указаны по шкале X (где "2" означает субстрат 2 (Sub2), "3" означает субстрат 3 (Sub3) и т.д.). Тот же самый набор праймеров и геномная ДНК использовались для всех реакций, и все компоненты рибозимов имели одинаковые мишень-сенсорные области и каталитические домены. Единственными различиями между реакциями были субстрат-сенсорные плечи компонентов рибозимов и флуоресцентно меченные универсальные субстраты. Таким образом, разница в значениях Ct между реакциями коррелирует с эффективностью расщепления универсальных субстратов. Более низкие значения Ct указывают на меньшее число циклов, необходимых для достижения порогового уровня флуоресценции, и поэтому указывают на более эффективно расщепленные универсальные субстраты.
На фигуре 6 представлены графики, иллюстрирующие соотношения "сигнал/шум", являющиеся результатом МНКзим-опосредованного расщепления ряда универсальных субстратов в изотермическом формате. Мишенью был синтетический олигонуклеотид. Соотношение "сигнал/шум" рассчитывали из нормализованных данных по флуоресценции, собранных во время реакции расщепления в диапазоне температур реакции. Типы универсальных субстратов, используемых в реакции, указаны по шкале X (где "2" означает Sub2, "3" означает Sub3 и т.д.). На фигуре 6 (i) различные колонки данных относятся к результатам, полученным для различных температур реакций (как указано в легенде к графику 52°С, 54°С, 56°С и 58°С). На фигуре 6 (i) проиллюстрировано соотношение "сигнал/шум" на оси Y. На фигуре 6 (ii) проиллюстрировано стандартное отклонение для среднего соотношения "сигнал/шум" при всех четырех тестированных температурах, а различные серии субстратов обозначены различной штриховкой столбцов.
На фигуре 7 представлены графики, иллюстрирующие линейные графики амплификации, получаемые в результате qΠЦΡ с использованием МНКзимов с применением ряда различных универсальных субстратов для детектирования ряда генов человека. Каждую комбинацию субстратов и мишеней использовали при температуре отжига а) 52°С или b) 58°С. Универсальные субстраты, которые тестировались с каждым геном, обозначены символами, расположенными в левом верхнем углу каждой диаграммы, и представляли собой (i) Sub3 и Sub61 с CYP2C9, (ii) Sub6, Sub72, Sub74 и Sub79 с TP53, (iii) Sub60, Sub61 и Sub79 с B2M, (iv) Sub49 и Sub75 с HMBS, (v) Sub2, Sub72 и Sub80 с TFRC и (iv) Sub55, Sub80 и Sub88 с RPL13a. Одинаковый набор праймеров и геномную ДНК использовали для всех реакций с каждым отличным геном, и все компоненты рибозимов имели одинаковые каталитические домены и мишень-сенсорные области, соответствующие определенному гену. Единственные различия между реакциями заключались в субстрат-сенсорных плечах компонентов рибозимов и флуоресцентно меченных универсальных субстратах. Таким образом, разница в форме графика амплификации и в значениях Ct между реакциями для одинаковых генов коррелирует с эффективностью расщепления универсальных субстратов. Более крутые кривые и боле низкие значения Ct свидетельствуют о меньшем количестве циклов, необходимом для достижения порогового уровня флуоресценции, и поэтому указывают на более эффективно расщепленные универсальные субстраты.
На фигуре 8 представлены графики, иллюстрирующие соотношение "сигнал/шум", являющиеся результатом ДНКзим-опосредованного расщепления ряда универсальных субстратов в изотермическом формате. Соотношение "сигнал/шум" рассчитывалось на основании нормализованных данных по флуоресценции, полученных в ходе реакции расщепления в диапазоне температур реакций. Тип универсальных субстратов, используемых в реакции, указан на оси X (где "2" означает Sub2, "3" означает Sub3 и т.д.). На фигуре 8 (i) различные колонки данных относятся к результатам, полученным для различных температур реакций (как указано в легенде к графику - от 50°С до 60°С), с соотношением "сигнал/шум" по оси Y. На фигуре 8 (ii) колонки данных относятся к стандартному отклонению для среднего соотношения "сигнал/шум" при всех шести тестированных температурах, а различные серии субстратов обозначены различной штриховкой столбцов.
На фигуре 9 представлены графики, иллюстрирующие линейные графики амплификации в ходе qΠЦΡ с использованием МНКзимов, выполненной с рядом различных универсальных субстратов (Sub44, Sub55, Sub61, Sub65, Sub72 и Sub74) для исследования неспецифической расщепляющей активности с подгруппой компонентов рибозимов (сконструированных таким образом, чтобы их субстратные сенсорные плечи были комплементарны Sub44, Sub55, Sub72 и Sub74) для детектирования человеческого гена RPL13a. Каждый универсальный субстрат тестировали индивидуально с применением пар компонентов рибозимов, сконструированных таким образом, чтобы связываться с полной комплементарностью с другими субстратами для того, чтобы определить, может ли сигнал быть детектирован. Компоненты рибозимов, комплементарные (i) Sub72, (ii) Sub74, (iii) Sub55 и (iv) Sub44, тестировали со всеми субстратами. В области (а) нижняя строка таблицы показывает субстрат, к которому компоненты рибозимов в эксперименте проявляли полную комплементарность. Остальные строки таблицы показывают выравнивание последовательностей других субстратов, тестируемых в каждом эксперименте, при этом различия между последовательностями нижнего субстрата и других субстратов обозначены серыми и подчеркнутыми буквами. В области (b) показаны линейные графики амплификации. Нормализованная флуоресценция (ось у) представлена на графике по отношению к числу циклов (ось х). Отдельные кривые амплификации отмечены с правой стороны графика, указывая то, какая кривая амплификации относится к каждому субстрату. Пороговая флуоресценция обозначена сплошной горизонтальной линии выше оси x. Возрастающий уровень сигнала выше пороговой флуоресценции указывает на расщепление универсального субстрата.
На фигуре 10 представлены графики, иллюстрирующие соотношение "сигнал/шум", являющиеся результатом опосредованного ДНКзимом расщепления каждого универсального субстрата индивидуально, с ДНКзимами, сконструированными таким образом, чтобы связываться с полной комплементарностью с другими субстратами, в изотермическом формате. Нормализованное соотношение "сигнал/шум" рассчитывалось на основании стандартизованных данных по флуоресценции, полученных при температурах реакций (i) 52°С или (ii) 58°С. Типы универсальных субстратов, которые применялись в реакции, указаны на оси х. Различные колонки данных относятся к результатам расщепления для каждого ДНКзима, как указано в легенде к графику, с соотношением "сигнал/шум", указанным на оси у.
На фигуре 11 показаны экспоненциальные графики амплификации, получаемые в результате амплификации при температуре 52°С (область (i)) или 58°С (область (ii)) для двух мультиплексных реакций qΠЦΡ с использованием МНКзимов Multipex 1, использующей субстраты серии 1 (Sub2, Sub3, Sub4, Sub6 и Sub7) и Multipex 2, использующей субстраты серий 2 и 3 (Sub55, Sub01, Sub74, Sub79 и Sub80). Обе мультиплексные реакции оценивали гены человека TFRC, HPRT, ТР53, RPL13a и CYP2C9 в одном реакционном сосуде. Для каждого отличного гена, оцененного в двух мультиплексных форматах, одинаковые наборы праймеров и геномная ДНК использовались при обеих температурах и для всех универсальных субстратов, и все компоненты рибозимов имели одинаковые каталитические домены и мишень-сенсорные области соответствующие определенному гену. Единственная разница между реакциями заключалась в субстрат-сенсорных плечах компонентов рибозимов и флуоресцентно меченных универсальных субстратах. Универсальные субстраты, которые тестировались для каждого гена, указаны в верхнем левом углу каждого графика. Графики амплификации для Multipex 1 (крестики) и Multipex 2 (кружочки) перекрывались, чтобы обеспечить возможность прямого сравнения между двумя мультиплексными реакциями при двух различных концентрациях ДНК, 100 нг (график с крестиками и кружочками, приведенный слева) и 391 пг (график с крестиками и кружочками, приведенный справа). Разница в форме графиков амплификации коррелировала с эффективностью расщепления универсальных субстратов. Более крутые кривые и меньшие значения Ct свидетельствуют о меньшем количестве циклов, необходимых для достижения порогового уровня флуоресценции, и поэтому указывают на более эффективно расщепленные универсальные субстраты.
Определения
В настоящем документе используются определенные термины, которые должны иметь значения, изложенные ниже.
В контексте настоящего документа формы единственного числа включают множественное число, если из контекста явно не следует иное. Например, термин "полинуклеотидный субстрат" также включает множество полинуклеотидных субстратов.
Термин "содержащий" обозначает "включающий главным образом, но не обязательно исключительно". Кроме того, разные варианты слова "содержащий", такие как "содержат" и "содержит", имеют соответственно различные значения.
Употребление термина "приблизительно" в настоящем документе в отношении излагаемого цифрового значения включает излагаемое цифровое значение и цифровые значения, находящиеся в диапазоне плюс-минус десять процентов от излагаемого значения.
Употребление термина "от...до" в настоящем документе в отношении диапазона цифровых значений охватывает цифровые значения в каждой конечной точке диапазона. Например, полинуклеотид длиной от 10 до 20 нуклеотидов включает полинуклеотид длиной 10 нуклеотидов и полинуклеотид длиной 20 нуклеотидов.
Термины "полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота" употребляются взаимозаменяемо в настоящем документе и обозначают одно- или двух-цепочечный полимер дезоксирибонуклеотидных и/или рибонуклеотидных оснований и/или их аналогов, производных, вариантов, фрагментов или комбинаций, включая без ограничений ДНК, метилированную ДНК, алкилированную ДНК, РНК, метилированную РНК, микроРНК, siRNA, shRNA, иРНК, тРНК, snoRNA, stRNA, smRNA, пре-микроРНК и первичную микроРНК, другие некодирующие виды РНК, рибосомальную РНК, их производные, их ампликоны или любые их комбинации. В качестве неограничивающего примера, источник нуклеиновой кислоты может быть выбран из группы, состоящей из источников синтетического происхождения, происхождения из организма млекопитающих, человеческого, животного, растительного, грибного, бактериального, вирусного, архейного происхождения или любой их комбинации.
Термин "олигонуклеотидный" типично обозначает сегмент ДНК или ДНК-содержащей молекулы нуклеиновой кислоты, или РНК или РНК-содержащей молекулы, или их комбинации. Олигонуклеотид может, таким образом, содержать или состоять из дезоксирибонуклеотидных и/или рибонуклеотидных оснований и/или их аналогов, производных, вариантов, фрагментов или комбинаций, включая без ограничений ДНК, метилированную ДНК, алкилированную ДНК, РНК, метилированную РНК, микроРНК, siRNA, shRNA, иРНК, тРНК, snoRNA, stRNA, smRNA, пре-микроРНК и первичную микроРНК, другие некодирующие виды РНК, рибосомальную РНК, их производные, их ампликоны или любые их комбинации. Примеры олигонуклеотидов включают последовательности-мишени нуклеиновых кислот; субстраты, например, такие, которые могут быть модифицированы ДНКзимом или МНКзимом с расщепляющей, лигазной или другой ферментативной активностью; праймеры, такие как те, которые используются для амплификации мишени in vitro с применением таких способов как ПЦР; и компоненты МНКзимов включая без ограничений компоненты рибозимов и посредники сборки.
Термин "пиримидиновый нуклеотид" охватывает любой нуклеотид, содержащий пиримидиновое основание, включая без ограничений цитозин, тимин и урацил. Пиримидиновый нуклеотид может содержать молекулу сахара рибозы (т.е. "пиримидиновый рибонуклеотид") или молекулу сахара дезоксирибозы (т.е. "пиримидиновый дезоксирибонуклеотид").
Термин "пуриновый нуклеотид" охватывает любой нуклеотид, содержащий пуриновое основание, включая без ограничений аденин и гуанин. Пуриновый нуклеотид может содержать молекулу сахара рибозы (т.е. "пуриновый рибонуклеотид") или молекулу сахара дезоксирибозы (т.е. "пуриновый дезоксирибонуклеотид").
Термины "нуклеиновая кислота с ферментативной активностью", "каталитическая нуклеиновая кислота", "нуклеиновая кислота с каталитической активностью" и "каталитическая нуклеиновая кислота с ферментативной активностью" используются в настоящем документе взаимозаменяемо и обозначают ДНК или ДНК-содержащую молекулу или комплекс, или РНК или РНК-содержащую молекулу или комплекс, или их комбинацию, являющуюся гибридной молекулой ДНК-РНК или комплексом, которые могут связывать по меньшей мере один субстрат и катализировать модификацию (такую как лигирование или расщепление) по меньшей мере одного субстрата. Нуклеотидные остатки в каталитических нуклеиновых кислотах могут включать основания А, С, G, Τ и U, а также их производные и аналоги. Вышеуказанные термины включают унимолекулярные нуклеиновые кислоты с ферментативной активностью, которые могут содержать одну молекулу ДНК или ДНК-содержащую молекулу (также известную в данной области техники как "ДНК фермент", "дезоксирибозим" или "ДНКзим") или РНК или РНК-содержащую молекулу (также известную в данной области техники как "РНК фермент" или "рибозим") или их комбинацию, представляющую собой гибридную молекулу ДНК-РНК, которая может узнавать по меньшей мере один субстрат и катализировать модификацию (такую как лигирование или расщепление) по меньшей мере одного субстрата. Вышеуказанные термины включают нуклеиновые кислоты с ферментативной активностью, которые содержат молекулу ДНК или ДНК-содержащий комплекс или молекулу РНК или РНК-содержащий комплекс или их комбинацию, представляющую собой гибридный комплекс ДНК-РНК, который может узнавать по меньшей мере один субстрат и катализировать модификацию (такую как лигирование или расщепление) по меньшей мере одного субстрата. Термины "нуклеиновая кислота с ферментативной активностью", "каталитическая нуклеиновая кислота", "нуклеиновая кислота с каталитической активностью" и "каталитическая нуклеиновая кислота с ферментативной активностью" включаютв свое определение МНКзимы.
Термины "МНКзим" и "многокомпонентная нуклеиновая кислота с ферментативной активностью" в контексте настоящего документа имеют одинаковые значения и относятся к двум или более олигонуклеотидным последовательностям (например, компонентам рибозимов), которые только в присутствии посредника сборки МНКзима (например, мишени) формируют активную нуклеиновую кислоту с ферментативной активностью, которая способна к каталитической модификации субстрата. МНКзимы могут катализировать ряд реакций, включая расщепление субстрата, лигирование субстратов и другие ферментативные модификации субстрата или субстратов. Типичный МНКзим, содержащий компонент А рибозима и компонент В рибозима, который обладает расщепляющей активностью, показан на фигуре 1. МНКзимы с эндонуклеазной или расщепляющей активностью также известны как "расщепляющие МНКзимы". Со ссылкой на фигуру 1, компоненты А и В рибозимов каждый связываются с посредником сборки (например, с целевой последовательностью ДНК или РНК) путем спаривания оснований по Уотсону-Крику. МНКзим формируется только если сенсорные плечи компонентов А и В рибозимов гибридизуются рядом друг с другом на посреднике сборки. Субстратные плечи МНКзима входят в контакт с субстратом, модификация (например, расщепление) которого катализируется каталитическим центром МНКзима, сформированным за счет взаимодействия каталитических доменов компонентов А и В рибозимов. Расщепление химерного ДНК/РНК репортерного субстрата приведено в качестве примера на графическом материале. МНКзим расщепляет субстрат между флуорофором и парой гаситель флуоресценции/краситель, генерируя, таким образом, сигнал. Термины "многокомпонентная нуклеиновая кислота с ферментативной активностью" и "МНКзим" включают двухсоставные структуры, состоящие из двух молекул, или трехсоставные структуры, состоящие из трех молекул нуклеиновых кислот, или другие структуры с большим числом составных элементов, например сформированные четырьмя или более молекулами нуклеиновых кислот.
Следует понимать, что термины "МНКзим" и "многокомпонентная нуклеиновая кислота с ферментативной активностью" в контексте настоящего документа охватывают все известные МНКзимы и модифицированные МНКзимы, включая те, которые раскрыты в любом одном или нескольких документах публикаций патентов РСТ под номерами WO/2007/041774, WO/2008/040095, WO 2008/122084, и родственных публикациях патентов США под номерами 2007-0231810, 2010-0136536 и 2011-0143338 (содержание каждого из этих документов включено в настоящий документ в полном объеме путем ссылки). Неограничивающие примеры МНКзимов и модифицированных МНКзимов, которые охватываются терминами "МНКзим" и "многокомпонентная нуклеиновая кислота с ферментативной активностью", включают МНКзимы с расщепляющей каталитической активностью (которые приведены в качестве примера в настоящем документе), разобранные или частично собранные МНКзимы, содержащие один или несколько ингибиторов, МНКзимы, содержащие один или несколько аптамеров ("апта-МНКзимы"), МНКзимы, содержащие одно или несколько усеченных сенсорных плеч и, опционально, один или несколько стабилизирующих олигонуклеотидов, МНКзимы, содержащие один или несколько ингибиторов активности, неактивные проферменты многокомпонентной нуклеиновой кислоты (MNAi) и МНКзимы с лигазной каталитической активностью ("МНКзим-лигазы"), каждый из которых подробно описан в одном или нескольких из документов WO/2007/041774, WO/2008/040095, WO 2008/122084, US 2007-0231810, US 2010-0136536 и/или US 2011-0143338.
В контексте настоящего документа термины "компонент рибозима", "составной компонент рибозима", "рибозимный компонент", "компонентный олигонуклеотид", "олигонуклеотидный компонент" и "олигонуклеотидный частичный энзим" относятся к ДНК-содержащему или РНК-содержащему или ДНК-РНК-содержащему олигонуклеотиду, два или более из которых только в присутствии посредника сборки МНКзима, которые описаны в настоящем документе, вместе могут формировать "МНКзим." В определенных предпочтительных вариантах осуществления один или несколько компонентов рибозимов, а предпочтительно по меньшей мере два, могут содержать три области или домена "каталитический" домен, который формирует часть, являющуюся каталитическим центром, которое катализирует модификацию; домен, представляющий "сенсорное плечо", который может ассоциироваться и/или связываться с посредником сборки; и домен, представляющий "субстратное плечо", который может ассоциироваться и/или связываться с субстратом. Иллюстрации этих областей или доменов показаны на фигуре 1. Компоненты рибозимов могут содержать по меньшей мере один дополнительный компонент, включая без ограничений аптамер, и называются в настоящем документе "апта-компонент рибозима". Компонент рибозима может содержать многочисленные компоненты, включая без ограничений компонент рибозима с усеченным сенсорным плечом и компонент, представляющий стабилизирующее плечо, который стабилизирует структуру МНКзима за счет взаимодействия с посредником сборки или субстратом.
Термины "молекула-посредник сборки", "посредник сборки", "молекула-посредник сборки МНКзимов" и "посредник сборки МНКзимов" в контексте настоящего документа относятся к элементам, которые могут способствовать самосборке компонентов рибозимов для формирования каталитически активного МНКзима путем взаимодействия с сенсорными плечами МНКзима. В контексте настоящего документа посредники сборки могут способствовать сборке МНКзимов, которые обладают расщепляющей, лигазной или другой ферментативной активностью. В предпочтительных вариантах осуществления посредник сборки необходим для самосборки МНКзима. Посредник сборки может содержать одну молекулу, или может содержать два или более "компонента посредника сборки", которые могут гибридизоваться или связываться с сенсорными плечами одного или нескольких олигонуклеотидных "компонентов рибозимов". Посредником сборки может быть мишень. Мишенью может быть нуклеиновая кислота, выбранная из группы, состоящей из ДНК, метилированной ДНК, алкилированной ДНК, РНК, метилированной РНК, микроРНК, siRNA, shRNA, тРНК, иРНК, snoRNA, stRNA, smRNA, пре-микроРНК и первичной микроРНК, других некодирующих видов РНК, рибосомальной РНК, их производных, ампликонов или любой их комбинации. Нуклеиновая кислота может быть амплифицирована. Амплификация может включать один или несколько следующих видов: полимеразная цепная реакция (ПЦР), амплификация с замещением цепей, изотермическая амплификация с формированием петель, амплификация по типу катящегося кольца, транскрипционно-опосредованная амплификация, самоподдерживающаяся репликация последовательностей, лигазная цепная реакция, амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот, или полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР).
"Компонентом посредника сборки" является молекула, которая может применяться для контроля сборки активных МНКзимов или способствовать переходу их неактивных компонентов МНКзима в активные МНКзимы.
Термин "мишень" в контексте настоящего документа включает любой натуральный или синтетический элемент, компонент или аналит, который должен быть детектирован, идентифицирован или количественно определен с применением способа, который использует определенную нуклеиновую кислоту с ферментативной активностью, такую как МНКзим(-ы), с или без дополнительного этапа амплификации и/или каскада. Поэтому мишени охватывают самый широкой диапазон детектируемых элементов, компонентов или аналитов, для которых требуется применение способов сенситивного детектирования, идентификации и/или количественного определения. Некоторые типичные мишени включают, но без ограничений, нуклеиновую кислоту, белок, полипептид, пептид, гликопротеины, липиды, липопротеины, целые организмы, клетки, вирусы, бактерии, археи, дрожжи, грибы, антитела, метаболиты, патогены, токсины, загрязняющие вещества, яды, малые молекулы, полимеры, ионы металлов, соли металлов, прионы или любые их производные, части или комбинации. Другие мишени также рассматриваются для применения в настоящем документе. Следует понимать, что мишень может также быть посредником сборки или компонентом посредника сборки.
"Детектируемый эффект" является эффектом, который может быть детектирован или оценен количественно, как признак того, что модификация субстрата/субстратов имела место. Величина эффекта может быть показателем количества вводного фактора, такого как посредник сборки (например, мишень). Детектируемый эффект может быть детектирован с помощью различных способов, включая флуоресцентную спектроскопию, поверхностный плазмонный резонанс, масс-спектроскопию, ядерно-магнитный резонанс (ЯМР), электронно-спиновый резонанс, поляризационную флуоресцентную спектроскопию, циркулярный дихроизм, иммунохимический анализ, хроматографию, радиометрию, фотометрию, сцинтиграфию, электронные методы, спектроскопию в УФ или видимой части спектра или инфракрасную спектроскопию, ферментативные способы или любую их комбинацию.
Термины "полинуклеотидный субстрат" и "субстрат" в контексте настоящего документа включают любой одно- или двух-цепочечный полимер из дезоксирибонуклеотидных или рибонуклеотидных оснований, или их аналогов, производных, вариантов, фрагментов или комбинаций, включая, но без ограничений, ДНК, метилированную ДНК, алкилированную ДНК, РНК, метилированную РНК, микроРНК, siRNA, shRNA, иРНК, тРНК, snoRNA, stRNA, smRNA, пре-микроРНК и первичную микроРНК, другие некодирующие виды РНК, рибосомальную РНК, их производные, их ампликоны или любую их комбинацию (включая смесь полимеров дезоксирибонуклеотидных и рибонуклеотидных оснований), которые могут узнаваться, подвергаться воздействию или модификации ферментом, включая каталитическую нуклеиновую кислоту с ферментативной активностью. "Полинуклеотидный субстрат" или "субстрат" может быть модифицирован путем различных видов ферментативной активности, включая без ограничений расщепление или лигирование. Модификация "полинуклеотидного субстрата" или "субстрата" может производить "детектируемый эффект" для осуществления мониторинга каталитической активности фермента.
"Репортерный субстрат" в контексте настоящего документа является субстратом, который особым образом адаптирован к тому, чтобы способствовать измерению либо исчезновения субстрата, либо появления продукта в связи с катализируемой реакцией. Репортерные субстраты могут присутствовать в растворе в свободном состоянии или в связанном (или быть "привязанными"), например, с поверхностью, или с другой молекулой. Репортерный субстрат может быть мечен любым из большого разнообразия средств, включая, например, флуорофоры (с одним или несколькими дополнительными компонентами или без дополнительных компонентов, таких как гасители флуоресценции), радиоактивные метки, биотин (например, биотинилирование) или хемилюминесцентные метки.
В контексте настоящего документа "генерическим субстратом" или "универсальным субстратом" является субстрат, например, репортерный субстрат, который узнается и подвергается каталитическому воздействию ряда МНКзимов, каждый из которых может узнавать различный посредник сборки. Применение таких субстратов способствует разработке отдельных видов количественного анализа для детектирования, идентификации или количественного определения широкого ряда посредников сборки с применением структурно родственных МНКзимов, все из которых узнают универсальный субстрат. Каждый из этих универсальных субстратов может быть независимо мечен одной или несколькими метками. В предпочтительных вариантах осуществления независимо детектируемые метки применяются для мечения одного или нескольких универсальных субстратов, чтобы обеспечить возможность создания удобной системы для независимого или одновременного детектирования разнообразных посредников сборки с применением МНКзимов. В некоторых вариантах осуществления субстраты, расщепленные МНКзимами могут быть восстановлены, и, следовательно, переработаны, с применением МНКзим- или ДНКзим-лигазы. В некоторых вариантах осуществления субстрат(-ы), расщепленные или дотированные МНКзимами, могут дополнительно применяться в качестве компонентов или модуляторов дополнительного МНКзима(-ов) или ДНКзима(-ов).
В некоторых вариантах осуществления "универсальные субстраты" могут быть привязаны к твердой подложке в различных позициях для получения субстратной матрицы. В таких вариантах осуществления привязанные универсальные субстраты могут быть все мечены одинаковым флуорофором. В определенных случаях каждый универсальный субстрат может расщепляться только МНКзимом, сформированным в присутствии специфической молекулы посредника сборки МНКзима, и сигнал может быть локализован путем позиционирования субстрата на поверхности, таким образом, позволяя выполнить специфическое детектирование различных посредников сборки.
Термин "продукт" относится к новой молекуле или молекулам, которые получены в результате ферментативной модификации субстрата. В контексте настоящего документа термин "продукт расщепления" относится к новой молекуле, полученной в результате расщепляющей или эндонуклеазной активности фермента. Термин "продукт дотирования" относится к новой молекуле, полученной в результате лигирования субстратов под действием фермента.
В контексте настоящего документа применение терминов "температура плавления" и "Tm" в отношении полинуклеотидного субстрата настоящего изобретения следует понимать как ссылку на температуру плавления (Tm), рассчитанную с применением правила Уоллеса, согласно которому Tm=2°С(А+Т)+4°C(G+C) (см. Wallace et al, (1979) Nucl. Acids Res. 6(11):3543-3558), если определенно не указано иное.
В контексте настоящего документа термин "основание" следует понимать как охватывающий целый рибонуклеотид или дезоксирибонуклеотид, к которому присоединено основание.
Сокращения
Следующие сокращения используются в настоящем документе и по всей спецификации:
МНКзим: многокомпонентная нуклеиновая кислота с ферментативной активностью, или состоящая из нескольких частей нуклеиновая кислота с ферментативной активностью;
ДНКзим: дезоксирибонуклеиновая кислота с ферментативной активностью;
Рибозим: рибонуклеиновая кислота с ферментативной активностью;
Компонент рибозима: компонент рибозима, содержащий олигонуклеотид
ПЦР: полимеразная цепная реакция;
qПЦР: количественная ПЦР в реальном времени;
2
NF-HO: вода без нуклеаз;
LNA: запертая нуклеиновая кислота;
F: флуорофор;
Q: гаситель флуорисценции;
N=А, С, T/U, G или любой их аналог;
N' = любой нуклеотид, комплементарный N, или способный формировать пару оснований с N;
x
(N): любое число нуклеотидов N;
x
(N'): любое число нуклеотидов Ν';
W: А или Т;
R: A, G или АА;
rN: любой рибонуклеотид;
x
(rN): любое число rN;
rR: рибонуклеотид А или G;
rY: рибонуклеотид С или U;
M: А или С;
H: А, С или T/U;
D: G, А или T/U;
JOE или 6-JOE: 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметоксифлюоресцеин;
FAM или 6-FAM: 6-карбоксифлюоресцеин.
BHQ1: гаситель флуорисценции Black Hole Quencher 1
BHQ2: гаситель флуорисценции Black Hole Quencher 2
IB: Iowa Black FQ
IBR: Iowa Black RQ
shRNA: короткая шпилечная РНК
siRNA: короткая интерферирующая РНК
иРНК: информационная РНК
тРНК: транспортная РНК
snoRNA: малая ядрышковая РНК
stRNA: малая временная РНК
smRNA: малая модулирующая РНК
пре-микроРНК: предшественник микроРНК
первичная микроРНК: первичная микроРНК
UV: ультрафиолетовые лучи
Подробное описание наглядных вариантов осуществления
Следует изначально понимать, что фигуры и примеры, представленные в настоящем документе, будут приведены в качестве примера, а не ограничения настоящего изобретения и различных вариантов его осуществления.
Существует потребность в создании каталитических субстратов нуклеиновых кислот, обладающих такими свойствами, которые способствуют улучшению каталитической функции нуклеиновых кислот. В частности, многие области применения, в которых используются МНКзимы и ДНКзимы, значительно выиграют от получения новых семейств универсальных субстратов, имеющих повышенную способность к каталитической модификации различными МНКзимами с одинаковыми или определенными специфичностями в отношении мишеней. Например, эти семейства субстратов были бы полезны для повышения эффективности и/или точности мультиплексных количественных видов анализа с участием МНКзимов. Дополнительные универсальные субстраты особенно полезны в тех областях применения, где субстратные матрицы создаются за счет привязывания субстратов к твердым подложкам.
8
9
Настоящее изобретение представляет набор принципов для получения универсальных олигонуклеотидных субстратов с более высокой вероятностью их эффективной каталитической модификации (например, расщепления) в широком диапазоне температур с улучшенными характеристиками при повышенных температурах. Эти принципы включают без ограничений любой один или несколько из следующих пунктов: (i) семь или более цитозиновых нуклеотидов в составе десяти оснований окружают два центральных рибонуклеотида; (ii) основания непосредственно прилегающие к двум центральным рибонуклеотидам, являются цитозинами (N и N); (iii) общее содержание пиримидинов в олигонуклеотидном субстрате более 64%; (iv) общая Tm олигонуклеотидного субстрата составляет 66°С или более, что применимо, если температура реакции для каталитической модификации (например, расщепления) олигонуклеотидного субстрата нуклеиновой кислотой с ферментативной активностью выше 50°С; и/или (v) в 10 основаниях, окружающих два центральных рибонуклеотида, содержится низкое число гуаниновых нуклеотидов (например, три, два, один или ни одного).
Разработка этих принципов способствовала разработке субстратов для каталитических нуклеиновых кислот с ферментативной активностью с характеристиками, которые повышают каталитические функции нуклеиновых кислот. Было обнаружено, что каталитическая модификация нуклеотида/нуклеотидов в составе субстрата, являющегося мишенью для данной нуклеиновой кислоты с ферментативной активностью, может быть повышена за счет присутствия определенных специфических нуклеотидов вблизи тех, которые подвергаются каталитической модификации.
Соответственно, определенные аспекты настоящего изобретения относятся к полинуклеотидным субстратам для каталитических нуклеиновых кислот с ферментативной активностью. Полинуклеотидные субстраты могут содержать серию пиримидиновых нуклеотидов в направлении 5' (т.е. против хода транскрипции) и/или 3' (т.е. по ходу транскрипции) от нуклеотида/-ов, каталитически модифицированных нуклеиновой кислотой с ферментативной активностью, которая целенаправленно воздействует на субстрат. Пиримидиновые нуклеотиды могут быть цитозиновыми нуклеотидами.
Другие аспекты настоящего изобретения относятся к применению полинуклеотидных субстратов, описываемых в настоящем документе в качестве субстратов для нуклеиновых кислот с ферментативной активностью (например, ДНКзима, рибозима или МНКзима). В определенных вариантах осуществления субстраты применяются в качестве субстратов для МНКзимов. В определенных вариантах осуществления субстраты применяются в качестве субстратов для ДНКзимов.
Дополнительные аспекты настоящего изобретения относятся к способам детектирования молекулы-мишени. Способы включают модификацию полинуклеотидного субстрата, описанного в настоящем документе, для получения детектируемого эффекта. В определенных вариантах осуществления способы включают модификацию полинуклеотидного субстрата с применением МНКзима, который способен к детектированию мишени.
Дополнительные аспекты настоящего изобретения относятся к наборам, содержащим один или несколько полинуклеотидных субстратов, описанных в настоящем документе. Наборы могут содержать нуклеиновую кислоту с ферментативной активностью, способную к каталитической модификации субстрата/-ов. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота с ферментативной активностью может быть МНКзимом.
1. Субстрат/-ы для каталитических нуклеиновых кислот с ферментативной активностью
Настоящее изобретение представляет полинуклеотидные субстраты для каталитических нуклеиновых кислот с ферментативной активностью. Настоящее изобретение также представляет семейства субстратов, члены которого обладают повышенной способностью к каталитической модификации различными нуклеиновыми кислотами (например, МНКзимами) с одинаковыми или определенными специфичностями в отношении мишеней.
Полинуклеотидные субстраты содержат по меньшей мере один мотив последовательности, который может быть модифицирован каталитической нуклеиновой кислотой с ферментативной активностью. Не существует никакого ограничения в отношении определенных типов каталитических нуклеиновых кислот с ферментативной активностью, которые могут модифицировать полинуклеотидный субстрат настоящего изобретения. Мотив последовательности может содержать любой один или несколько из по меньшей мере одного ДНК нуклеотида, по меньшей мере одного РНК нуклеотида, по меньшей мере одного аналога ДНК нуклеотида и по меньшей мере одного аналога РНК нуклеотида.
Неограничивающие примеры подходящих мотивов последовательностей включают такие, которые узнаются и модифицируются ДНКзимами (например, ДНКзимами 10-23; ДНКзимами 8-17; ДНКзим-лигазами "7Z81", "7Z48" и "7Q10"; ДНКзимами "UV1C", участвующими в фотореверсии тимидиновых димеров, ДНКзимами "DAB22", образующими углерод-углеродные связи; и их производные), рибозимы (например, молотоголовые рибозимы; гомодимерные рибозимы, гетеродимерные рибозимы; и их производные) и МНКзимы (см., например, МНКзимы, описанные в публикациях патентов РСТ под номерами WO/2007/041774, WO/2008/040095 и WO 2008/122084, и родственных публикациях патентов США под номерами 2007-0231810, 2010-0136536, и 2011-0143338; каждый из которых включен в настоящий документ в полном объеме посредством ссылки на него).
Неограничивающие примеры подходящих мотивов последовательностей включают представленные в таблице 1 (см. в графической части).
Было показано, что каталитические нуклеиновые кислоты допускают только определенные модификации в области, которая формирует каталитический центр (Perreault et al, 1990 Nature 344(6266): 565-7.; Perreault et al, 1991 Biochemistry 30(16): 4020-5; Zaborowska et al, 2002 J Biol Chem. 277(43): 240617-22; Cruz et al, 2004 Chem Biol. Jan;l 1(1): 57-6; Silverman, 2004 Chem Biol. Jan;l 1(1): 7-8). Примеры последовательностей, отвечающих за каталитическую активность ДНКзимов, перечислены в таблице 2 (см. в графической части).
Полинуклеотидные субстраты могут содержать многочисленные мотивы последовательностей. Мотивы могут узнаваться и модифицироваться одним типом каталитических нуклеиновых кислот с ферментативной активностью. Альтернативно, различные мотивы последовательностей в субстрате могут узнаваться и модифицироваться различными типами каталитических нуклеиновых кислот с ферментативной активностью.
Как указано выше, полинуклеотидные субстраты настоящего изобретения содержат по меньшей мере один мотив последовательности, способный к модификации каталитической нуклеиновой кислотой с ферментативной активностью. В некоторых вариантах осуществления нуклеотиды, расположенные вблизи мотива последовательности, являются пиримидиновыми нуклеотидами. Например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более нуклеотидов, предшествующих и/или следующих за мотивом последовательности могут быть пиримидиновыми нуклеотидами. Любой один или несколько из пиримидиновых нуклеотидов может быть цитозиновым нуклеотидом.
В других вариантах осуществления мотиву последовательности непосредственно предшествует и/или непосредственно за ним следует (т.е. в непрерывной последовательности) один или несколько пиримидиновых нуклеотидов. Например, мотиву последовательности может непосредственно предшествовать и/или непосредственно за ним может следовать последовательность из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более пиримидиновых нуклеотидов. Любой один или несколько из пиримидиновых нуклеотидов может быть цитозиновым нуклеотидом.
В дополнительных вариантах осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10, или более нуклеотидов в числе десяти нуклеотидов, расположенных в направлении 5' (т.е. против хода транскрипции) и/или числе десяти нуклеотидов, расположенных в направлении 3' (т.е. по ходу транскрипции) относительно мотива последовательности, являются пиримидиновыми нуклеотидами. Любой один или несколько из пиримидиновых нуклеотидов может быть цитозиновым нуклеотидом.
В еще других дополнительных вариантах осуществления более 9, более 10, или более 11 нуклеотидов полинуклеотидного субстрата могут быть цитозиновыми нуклеотидами. Например, субстрат может содержать или состоять из 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более 15 нуклеотидов, и 9, 10, 11 или более 11 из этих нуклеотидов могут быть цитозиновыми нуклеотидами.
Дополнительно или альтернативно, менее 5, менее 4, менее 3 или менее 2 нуклеотидов полинуклеотидного субстрата могут быть гуаниновыми нуклеотидами. Например, субстрат может содержать или состоять из 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более 15 нуклеотидов, и 4, 3, 2, 1 или ни один из этих нуклеотидов могут быть гуаниновыми нуклеотидами.
Никаких определенных ограничений не существует относительно длины полинуклеотидного субстрата настоящего изобретения. Например, субстрат может иметь менее 100, 75, 50, 40, 30, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 нуклеотидов в длину. Например, субстрат может иметь от 5 до 30, от 10 до 15, от 10 до 20, от 10 до 25, от 10 до 30, от 16 до 23, от 16 до 21, от 16 до 18, от 18 до 21, от 18 до 23 или от 21 до 23 нуклеотидов в длину.
Полинуклеотидный субстрат настоящего изобретения может быть сконструирован таким образом, чтобы иметь специфическую температуру плавления (Tm), которая рассчитывается с применением правила Уоллеса, согласно которому Tm=2°С(А+Т)+4°C(G+C) (см. Wallace et al, (1979) Nucl. Acids Res. 6(11):3543-3558). В определенных вариантах осуществления субстрат может узнаваться и подвергаться каталитической модификации МНКзимом, и Tm оснований, которые связываются субстратным плечом/плечами компонентов рибозимов МНКзима, может быть от приблизительно 52°С до приблизительно 76°С, от приблизительно 55°С до приблизительно 75°С, от приблизительно 60°С до приблизительно 70°С, от приблизительно 65°С до приблизительно 70°С, от приблизительно 64°С до 68°С или от 64°С до 70°С (рассчитывается с применением правила Уоллеса).
В других вариантах осуществления субстрат может узнаваться и подвергаться каталитической модификации МНКзимом или ДНКзимом, и Tm оснований, которые связываются субстратным плечом/плечами компонентов рибозимов МНКзима, может быть от 68°С до 90°С, от 66°С до 76°С, от 68°С до 76°С, от 64°С до 70°С, от 70°С до 76°С, от 70°С до 75°С, от 72°С до 76°С, 52°С, 58°С, 64°С, 66°С, 68°С, 70°С, 72°С или 76°С.
Только в качестве неограничивающего примера полинуклеотидный субстрат настоящего изобретения может содержать последовательность, заданную любой одной или несколькими из SEQ ID NO: 25-27, 29-30, 72-90 или 172-175. В определенных вариантах осуществления полинуклеотидный субстрат может состоять из последовательности, определяемой любой одной или несколькими из SEQ ID NO: 25-27, 29-30, 72-90 или 172-175.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный субстрат настоящего изобретения может содержать последовательность, определяемую SEQ ID NO: 28. В других вариантах осуществления полинуклеотидный субстрат может содержать последовательность, определяемую SEQ ID NO: 28.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидные субстраты настоящего изобретения способны подвергаться каталитической модификации МНКзимом, содержащим два олигонуклеотидных компонента рибозимов. Последовательности полинуклеотидного субстрата и олигонуклеотидных компонентов рибозимов могут представлять собой любую специфическую комбинацию трех последовательностей (которые описываются SEQ ID NO), как показано в таблице 6, 8, 10, 13, 16, 20, 22 и/или 24.
В других вариантах осуществления полинуклеотидные субстраты настоящего изобретения способны подвергаться каталитической модификации ДНКзимом. Последовательности полинуклеотидного субстрата и ДНКзима могут представлять собой любую специфическую пару последовательностей (которые описываются SEQ ID NO), как показано в таблице 15 (см. в графической части).
Полинуклеотидные субстраты настоящего изобретения могут содержать одну или несколько замен, таких как аналоги, производные, модифицированные или измененные основания, рибонуклеотиды, изменения сахара или фосфатного остова, различные делеции, вставки, замены, дупликации или другие модификации или любые их комбинации, хорошо известные специалистам в данной области техники.
Неограничивающие примеры добавок или замен включают LNA фосфорамидит, 4-ацетилцитидин, 5-(карбоксигидроксиметил)уридин, 2'-O-метилцитидин, 5-карбоксиметиламинометил тиоуридин, дигидроуридин, 2'-O-метилпсевдоуридин, бета-О-галактозилквеозин, 2'-O-метилгуанозин, инозин, N6-изопентениладенозин, 1-метиладенозин, 1-метилпсевдоуридин, 1-метилгуанозин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанозин, 2-метиладенозин, 2-метилгуанозин, 3-метилцитидин, 5-метилцитидин, Ν6-метиладенозин, 7-метилгуанозин, 5-метиламинометилуридин, 5-метоксиаминометил-2-тиоуридин, бета-D-маннозилметилуридин, 5-метоксикарбонилметилуридин, 5-метоксиуридин, 2-метилтио-N6-изопентениладенозин, N-((9-бета-рибофуранозил-2-метилтиопурин-6-ил)карбамоил)треонин, N-((9-бета-рибофуранозилпурин-6-ил)N-метил-карбамоил)треонин, метиловый эфир уридин-5-оксиуксусной кислоты, уридин-5-оксиуксусная кислота (v), вибутоксазин, псевдоуридин, квеозин, 2-тиоцитидин, 5-метил-2-тиоуридин, 2-тиоуридин, 4-тиоуридин, 5-метилуридин, N-((9-бета-D-рибофуранозилпурин-6-ил)карбамоил)треонин, 2'-O-метил-5-метилуридин, 2'-O-метилуридин, вибутозин, 3-(3-амино-3-карбоксипропил)уридин, бета-О-арабинозил уридин и бета-О-арабинозил тимидин.
Неограничивающие примеры производных включают функционально эквивалентные нуклеиновые кислоты или нуклеотиды, включая любые молекулы слияния, произведенные интегрально (например, с помощью рекомбинантных средств) или добавленные после синтеза (например, с помощью химических средств). Такие слияния могут содержать олигонуклеотиды настоящего изобретения с РНК или ДНК, добавленные или конъюгированные с полипептидом (например, пуромицином или другим полипептидом), небольшой молекулой (например, псораленом), микроносителем или наноносителем или антителами.
Неограничивающие примеры аналогов включают соединения, имеющие физическую структуру, родственную молекуле или остатку ДНК или РНК, и могут быть способны к формированию водородной связи с остатком ДНК или РНК или их аналогом (т.е. способны к отжигу с остатком ДНК или РНК или их аналогом для формирования пары оснований), но такое связывание не настолько необходимо для вышеуказанного соединения для того, чтобы описываться термином "аналог". Такие аналоги могут обладать различными химическими и биологическими свойствами по отношению к рибонуклеотидному или дезоксирибонуклеотидному остатку, с которым они являются структурно родственными. Метилированные йодированные, бромированные или биотинилированные остатки являются примерами аналогов. Были описаны активные ДНКзимы, которые содержат аналоги нуклеотидов, включая дезоксиинозин, C-5-иммидазол дезоксиуридин, 3-(аминопропинил)-7-деаза-дАТФ, 2'-O-метил-РНК, 2'O-метил-кэп-структуру. Другие аналоги также могут быть совместимы с каталитической активностью ДНКзимов и МНКзимов. Изменение каталитической нуклеиновой кислоты с ферментативной активностью, например, путем замены одного основания другим, путем замены аналога на основание или изменения сахарного компонента или фосфодиэфирного остова, может быть процессом, не представляющим сложности для специалиста в данной области. Например, изменения могут быть произведены в ходе синтеза, или путем модификации специфических оснований после синтеза. Эмпирическая проверка каталитических нуклеиновых кислот, содержащих изменения, такие как изменения оснований или аналоги оснований, позволяет проводить оценку влияния измененных последовательностей, или специфических аналогов, на каталитическую активность. Аналоги оснований А, С, G, Τ и U известны в данной области техники, и подгруппа аналогов приведена в таблице 3 (см. в графической части).
Полинуклеотидные субстраты настоящего изобретения могут содержать дополнительные элементы, такие как меченные нуклеиновые кислоты, наночастицы, микрочастицы, белки, антитела, РНК, ДНК, аналоги нуклеиновых кислот, белки, гликопротеины, липопротеины, пептидные нуклеиновые кислоты, запертые нуклеиновые кислоты, химеры пептидиов-нуклеиновых кислот или любую их комбинацию. Наночастицы могут быть наночастицами золота.
Полинуклеотидные субстраты настоящего изобретения могут быть каталитически модифицированы каталитической нуклеиновой кислотой с ферментативной активностью. Неограничивающие примеры возможных каталитических модификаций включают расщепление нуклеиновых кислот, лигирование нуклеиновых кислот, фосфорилирование нуклеиновых кислот, кэпппирование нуклеиновых кислот, аденилирование аминокислот, синтез кофакторов, РНК полимеризацию, направленную на матрицу полимеризацию, конъюгацию РНК-белка, альдольную реакцию, окисление спирта, восстановление альдегида, синтез пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, алкилирование, синтез амидов, синтез мочевины, формирование пептидных связей, синтез пептидил-РНК, перенос ацильных групп, аминоацилирование, карбонатный гидролиз, фосфоротиоатное алкилирование, замещение атома водорода в молекуле порфирина металлом, формирование углерод-углеродных связей, формирование наночастиц Pd, изомеризация дифенила, формирование эфирных связей, формирование амидных связей, ДНК-дегликозилирование, фотореверсия тиминовых димеров и расщепление фосфорамидата.
В определенных областях применения может быть желательно детектировать продукт/-ы, являющиеся результатом каталитической модификации полинуклеотидных субстратов настоящего изобретения. Этого можно достигнуть с применением любого числа стандартных методик, известных в данной области техники.
Например, субстрат может содержать детектируемую часть и часть, являющуюся гасителем флуорисценции, где после модификации вышеуказанного субстрата каталитической нуклеиновой кислотой, детектируемый эффект, обеспечиваемый указанной детектируемой частью, повышается или понижается. Детектируемый эффект может быть детектирован методом флуоресцентной спектроскопии, поверхностного плазмонного резонанса, масс-спектроскопии, ЯМР, электронно-спинового резонанса, поляризационной флуоресцентной спектроскопии, циркулярного дихроизма, иммунохимического анализа, хроматографии, радиометрии, электрохимических измерений, фотометрии, сцинтиграфии, электронных методов, УФ-спектроскопии, спектроскопии в видимой области спектра или инфракрасной спектроскопии, ферментативных способов или любой их комбинации.
Дополнительно или альтернативно, продукт/-ы, являющиеся результатом каталитической модификации полинуклеотидных субстратов настоящего изобретения, могут быть детектированы на основании их размера (например, путем стандартного электрофореза), путем секвенирования нуклеиновых кислот, флуоресцентного резонансного переноса энергии, хемилюминесценции, потенциометрии, масс-спектрометрии, плазмонного резонанса, колориметрии, поляриметрии, проточной цитометрии, сканометрии и ДНК секвенирования или любой их комбинации.
Продукт/-ы нуклеиновых кислот, являющиеся результатом каталитической модификации полинуклеотидных субстратов настоящего изобретения, могут быть амплифицированы, чтобы способствовать детектированию с применением таких методов как, например полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Полинуклеотидные субстраты настоящего изобретения могут узнаваться и модифицироваться каталитическими нуклеиновыми кислотами с ферментативной активностью (например, МНКзимами), сконструированными для детектирования мишени, которая отличается от субстрата, который должен быть модифицирован ферментом. Соответственно, полинуклеотидные субстраты настоящего изобретения могут быть "генерическими" или "универсальными" субстратами, которые узнаются и подвергаются каталитическому воздействию ряда каталитических нуклеиновых кислот с ферментативной активностью (например, ряда МНКзимов), каждый из которых способен узнавать различную мишень. Применение таких субстратов может способствовать разработке отдельных видов анализа для детектирования, идентификации или количественного определения широкого ряда мишеней с применением каталитических нуклеиновых ферментов, которые узнают универсальный субстрат. Каждый из универсальных субстратов может быть независимо мечен одной или несколькими метками. В определенных вариантах осуществления независимо детектируемые метки могут применяться для того, чтобы метить один или несколько универсальных субстратов, чтобы обеспечить возможность независимого или одновременного детектирования разнообразных мишеней с применением МНКзимов. Например, серия универсальных субстратов может быть использована в реакции мультиплексирования, позволяя проводить одновременное детектирование многочисленных мишеней.
Полинуклеотидные субстраты настоящего изобретения могут быть получены связанными, прикрепленными или привязанными к нерастворимой или твердой подложке для применения в различных областях применения (например, в ферментативных каскадах или любых других каскадах передачи сигнала). Подложка может быть нерастворимым материалом или матриксом, который удерживает субстрат и предотвращает его свободное перемещение в основном объеме реакционной смеси. Такие подложки используются в данной области техники для иммобилизации или локализации субстратов, включая нуклеиновые кислоты-мишени. Специалисту, для которого предназначено настоящее изобретение, будет понятно, что подложка может быть выбрана из широкого ряда матриц, полимеров и т.п.в различных формах, включая гранулы, удобные для применения в микроколичественном анализе, а также другие материалы, совместимые с реакционными условиями. В определенных предпочтительных вариантах осуществления подложкой может быть пластиковый материал, такой как пластиковые гранулы или брикеты, или материал лунки или пробирки, в которой проводится определенный количественный анализ. В определенных вариантах осуществления подложкой может быть микроноситель или наноноситель. Прикрепление субстрата к подложке может произведено таким образом, что после модификации (например, расщепления) субстрата каталитической нуклеиновой кислотой (например, МНКзимом), часть модифицированного субстрата остается прикрепленный к подложке, а другая освобождается для свободного перемещения в основном объеме реакционной смеси, отдельно от той части, которая остается прикрепленный.
2. Типичные способы
Полинуклеотидные субстраты настоящего изобретения могут применяться в различных возможных областях применения, использующих каталитические нуклеиновые кислоты, которые узнают/модифицируют субстраты.
Например, субстраты могут применяться в областях применения, которые включают ДНКзимы (например, ДНКзимы 10-23; ДНКзимы 8-17; ДНКзим-лигазы "7Z81", "7Z48" и "7Q10"; ДНКзимы "UV1C", участвующие в фотореверсии тимидиновых димеров, ДНКзимы "DAB22", образующие углерод-углеродные связи; и их производные), рибозимы (например, молотоголовые рибозимы; гомодимерные рибозимы, гетеродимерные рибозимы; и их производные) и/или МНКзимы.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения субстраты могут применяться в качестве субстратов для МНКзимов. Характеристики МНКзимов и различные области, в которых применяются МНКзимы, подробно описаны в публикациях патентов РСТ под номерами WO/2007/041774, WO/2008/040095 и WO 2008/122084, и родственных публикациях патентов США под номерами 2007-0231810, 2010-0136536, и 2011-0143338 (содержание каждого из этих документов включено в настоящий документ во всей своей полноте путем ссылки).
МНКзимы способны к самосборке из двух или более олигонуклеотидных компонентов, которые также называются в настоящем документе компонентами рибозимов. Олигонуклеотиды компонентов рибозимов осуществляют самосборку в присутствии посредника самосборки МНКзима для формирования МНКзима. Поэтому МНКзимы являются каталитическими нуклеиновыми кислотами с ферментативной активностью. В некоторых вариантах осуществления присутствие МНКзима может быть детектировано, и указывает на присутствие мишени, поскольку МНКзим формируется только в присутствии мишени, где мишень содержит посредник сборки.
В предпочтительных вариантах осуществления структуры МНКзима основываются на одном или нескольких ДНКзимах и/или рибозимах. Более предпочтительны те структуры МНКзима, которые основываются на определенной структуре ДНКзима. В настоящее время предпочтительными структурами являются те, которые основаны на ДНКзимах, включая ДНКзимы 10-23 и 8-17. В различных вариантах осуществления МНКзимы содержат любой или оба рибонуклеотидные основания и дезоксирибонуклеотидные основания. В более предпочтительных вариантах осуществления структура МНКзима основывается по меньшей мере частично на структуре ДНКзима. В других предпочтительных вариантах осуществления МНКзимы содержат по меньшей мере некоторые дезоксирибонуклеотидные основания или их аналоги. В более предпочтительных вариантах осуществления каталитический центр МНКзима содержит одно или несколько дезоксирибонуклеотидных оснований или их аналогов. В еще более предпочтительных вариантах осуществления одно или несколько дезоксирибонуклеотидных оснований или их аналогов вовлечены в катализ субстрата. В других вариантах осуществления по меньшей мере одно дезоксирибонуклеотидное основание, или его аналог, в каталитическом ядре улучшает каталитическую активность. В еще других вариантах осуществления наблюдается строгое требование к включению по меньшей мере одного дезоксирибонуклеотидного основания, или его аналога, в каталитический центр МНКзима для того, чтобы катализ происходил с измеримой скоростью, относительно скорости катализа при применении сравнимого МНКзима, не содержащего дезоксирибонуклеотидное основание.
МНКзимы могут содержать одну или несколько замен, таких как аналоги, производные, модифицированные или измененные основания, рибонуклеотиды, изменения сахара или фосфатного остова, различные делеции, вставки, замены, дупликации или другие модификации или любые их комбинации, хорошо известные специалистам в данной области техники. Такие модификации, замены, делеции, вставки и т.д. могут быть произведены в сенсорном и/или субстратном плечах и/или в частях, представляющих собой каталитический центр, таким образом, что молекула сохраняет каталитическую активность. Замены и модификации в плечах, которые связывают субстрат или посредник сборки, могут быть вполне допустимы и, фактически, являются основанием, позволяющим обеспечить приспособление молекул к различным субстратам/посредникам сборки. Например, модификация сенсорных плеч позволит обеспечить приспособление к различным посредникам сборки, тогда как модификация субстратных плеч позволит обеспечить приспособление к различным субстратам.
МНКзим может содержать дезоксирибонуклеотиды, или рибонуклеотиды, или даже оба вида соединений. МНКзимы, содержащие по меньшей мере один и, более предпочтительно, все дезоксирибонуклеотидные олигонуклеотидные компоненты являются предпочтительными. Также предпочтительными являются МНКзимы, содержащие по меньшей мере одно дезоксирибонуклеотидное основание или его аналог, в каталитическом ядре МНКзима. Даже более предпочтительны те варианты осуществления, где такое основание необходимо для каталитической активности.
Сборка и разборка МНКзима может также контролироваться за счет изменения микроокружения. Примеры таких изменений включают без ограничений температуру, тип и концентрацию двухвалентных катионов, концентрацию солей, рН, добавки и присутствие или отсутствие критических компонентов, необходимых для сборки и/или осуществления активности активного МНКзима. Соответственно, сборка разобранных или частично собранных МНКзимов в каталитически активный МНКзим в присутствии посредника сборки может быть предотвращена путем модуляции микроокружения, таким образом, обеспечивая "молекулярный переключатель".
Базовый пример структуры МНКзима показан на фигуре 1. Показанная структура содержит компонент А рибозима и компонент В рибозима, сенсорные плечи (i) которых спарились по принципу комплементарности оснований с молекулой посредника сборки МНКзима, например молекулой-мишенью ДНК или РНК. Компоненты А и В рибозимов за счет взаимодействия с посредником сборки позволили частичным каталитическим ядрам (iii) непосредственно сблизиться, формируя, таким образом, единый каталитический центр. Субстратные плечи (ii) МНКзима провзаимодействовали и спарились по принципу комплементарности оснований с субстратом, изображенным здесь как репортерный субстрат. Таким образом, произошла самосборка МНКзима, и этому процессу способствовало присутствие молекулы посредника сборки МНКзима. В отсутствие посредника сборки, МНКзим не формируется. Модификация (в данном случае, расщепление) полинуклеотидного субстрата настоящего изобретения катализируется каталитическим центром МНКзима в сайте модификации МНКзима (например, сайте расщепления в субстрате, который отмечен крестиком (X)). Полинуклеотидный субстрат в этом определенном варианте осуществления содержит детектируемую часть, имеющую детектируемый сигнал, например флуорофор F, и часть, являющуюся гасителем флуорисценции Q, оказывающую гасящий эффект на детектируемый сигнал F за счет действия гасителя флуориценции Q. После расщепления в сайте расщепления МНКзима, наблюдается существенное усиление детектируемого сигнала, здесь - флуоресценции, которое при желании может быть легко детектировано и оценено количественно.
Можно также понять, что фигура 1 изображает пример базового способа применения МНКзимов для детектирования мишени, которая в некоторых вариантах осуществления содержит посредник сборки. Более конкретно, компонент А рибозима и компонент В рибозима показаны на фигуре 1, где каждый содержит часть, представляющую собой субстратное плечо (ii), часть, представляющую собой каталитический центр, (iii), и часть, представляющую собой сенсорное плечо (i). В присутствии мишени части, представляющие собой сенсорные плечи компонент А рибозима и компонент В рибозима, могут начать гибридизоваться и связываться по принципу комплементарности оснований с комплементарными частями мишени, например, последовательности ДНК или РНК. После такого контактирования с мишенью МНКзим осуществляет самосборку, формируя каталитический центр, который может модифицировать субстрат, который связывается субстратными плечами. Предпочтительно присутствие МНКзима детектируется за счет детектирования или измерения каталитической активности. Субстратные плечи таким образом собранного МНКзима могут контактировать с полинуклеотидным субстратом настоящего изобретения за счет взаимодействия между комплементарными последовательностями, расположенными на субстратных плечах, и субстратом. После того, как субстрат таким образом входит в контакт с субстратными плечами, каталитический центр может стимулировать модификацию (например, расщепление) субстрата, который, в свою очередь, может быть измерен или детектирован, прямо или косвенно.
Специалист в данной области легко поймет, что способы, описанные в настоящем документе, могут включать амплификацию мишени перед, в ходе или после осуществления каталитической активности МНКзима. Такая амплификация мишени находит определенное применение в вариантах осуществления настоящего изобретения, где количество мишени, которое должно быть детектировано, идентифицировано или оценено количественно, становиться достаточным для того, чтобы обеспечить сигнал, который в противном случае может не детектироваться. Такая амплификация может включать один или несколько из полимеразной цепной реакции (ПЦР), амплификации с замещением цепей (SDA), изотермической амплификации с формированием петель (LAMP), амплификации по типу катящегося кольца (RCA), транскрипционно-опосредованной амплификации (ТМА), самоподдерживающейся репликация последовательностей (3SR), амплификации, основанной на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA) или полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР).
На фигуре 2 представлены типичные области применения способов для детектирования мишени с применением МНКзимов. Стратегия 1 приводит пример МНКзимов, адаптированных для детектирования мишеней, включая ДНК, РНК и белки. Как было описано выше (см. описание к фигуре 1), МНКзим, состоящий из двух отдельных олигонуклеотидов с последовательностями узнавания как для мишени, так и для субстрата, формируется когда олигонуклеотиды узнают и связывают мишень. Субстрат, например, репортерный субстрат, модифицируется за счет каталитического действия МНКзима и вызывает генерирование детектируемого сигнала, либо непосредственно (стратегия 1), в ходе или после амплификации мишени (стратегия 2), или посредством сигнального каскада (стратегия 3). В некоторых вариантах осуществления амплификация мишени и сигнала происходит одновременно или последовательно.
Стратегия 2 на фигуре 2 приводит пример применения МНКзима, адаптированного к контролю аккумуляции ампликонов в ходе или после in vitro амплификации нуклеиновых кислот-мишеней. Методы in vitro-амплификации последовательностей нуклеиновых кислот известны в данной области техники. Они включают методы, опосредованные ДНК полимеразой, такие как полимеразная цепная реакция ("ПНР") (см., например, патент США №4683202; патент США №4683195; патент США №4800159; патент США №4965188; патент США №5176995), амплификация с замещением цепей ("SDA"), амплификация по типу катящегося кольца ("RCA"), полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) и изотермическая амплификация с формированием петель ("LAMP"). Другие методы амплификации мишени опосредованы РНК полимеразой, например, транскрипционно-опосредованная амплификация ("ТМА"), самоподдерживающаяся репликация последовательностей ("3SR") и амплификация, основанная на репликации последовательности нуклеиновой кислоты ("NASBA"). Продукты амплификации ("ампликоны"), полученные при проведении ПЦР, ОТ-ПЦР, SDA, RCA и LAMP, состоят из ДНК, тогда как ампликоны РНК получают при проведении ТМА, 3SR и NASBA.
Еще раз ссылаясь на стратегию 2, представленную на фигуре 2, МНКзим, который узнает и модифицирует полинуклеотидный субстрат настоящего изобретения, может применяться в сочетании со способами амплификации мишени, которые включают, например, вышеупомянутые ПЦР, ОТ-ПЦР, SDA, RCA, LAMP, ТМА, 3SR и NASBA. Аккумуляция ампликонов, полученная методом ПЦР с применением либо асимметричны, либо симметричных соотношений праймеров может контролироваться с применением МНКзимов. Примеры 1, 2, 4, 6, 8 и 9 настоящей спецификации демонстрируют детектирование ПЦР-ампликонов в режиме реального времени с использованием МНКзимов, которые каталитически модифицируют различные полинуклеотидные субстраты настоящего изобретения.
Снова ссылаясь на стратегию 2, представленную на фигуре 2, нуклеиновая кислота-мишень может быть амплифицирована в соответствии с процедурой амплификации этой нуклеиновой кислоты (т.е. ДНК или РНК). Предпочтительно, применяются стандартные способы амплификации in vitro. Созданные в ходе амплификации ампликоны могут служить целевыми посредниками сборки для МНКзима. Активность МНКзима, которая становится детектируемой путем модификации полинуклеотидного субстрата настоящего изобретения МНКзимом, указывает на присутствие мишени. Специалисту в данной области будет понятно, что количественные анализы такого характера могут проводиться в одном сосуде в условиях, которые допускают как амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени, так и сборку и каталитическую активность МНКзима. Дополнительно или альтернативно, они могут проводится после или в процессе амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, путем забора образцов в конце или в ходе реакции амплификации.
Стратегия 3, представленная на фигуре 2, демонстрирует обзор способа применения МНКзима для инициации амплификации сигнала за счет применения сигнального каскада. Пример 3 настоящей спецификации демонстрирует изотермическое прямое детектирование мишени с применением МНКзимов, которые каталитически модифицируют различные полинуклеотидные субстраты настоящего изобретения, которые также могут использоваться для инициации сигнального каскада.
Специалисту, для которого предназначено настоящее изобретение, будет понятно, что способы или протоколы, которые комбинируют амплификацию мишени с активностью каталитической нуклеиновой кислоты, могут требовать применения специфических условий реакции (например, таких, которые описанные в примерах 1, 2, 4, 6, 8 и 9 настоящей спецификации). Предпочтительно, условия реакции должны быть совместимы и с полимеразной активностью (для амплификации), и с каталитической модификацией нуклеиновой кислотой субстрата (для детектирования). Протоколы для определения условий для одновременной каталитической активности и полимеразной активности при высокой температуре, как, например, в ходе ПЦР, были описаны для ДНКзимов. Влияние факторов, включая длину плеч ДНКзима, буферы, температуру, концентрацию двухвалентных ионов и эффекты добавок, известно в данной области техники. ДНК-ферменты подходят для применения в комбинации со стратегиями амплификации in vitro. Например, они не подвергаются необратимой денатурации при воздействии высоких температур в ходе амплификации.
В определенных вариантах осуществления полинуклеотидный субстрат настоящего изобретения, способный к узнаванию и модификации МНКзимом, может быть связанным, прикрепленным или привязанными к нерастворимой или твердой подложке. Например, со ссылкой на фигуру 3, область (i), показан типичный способ для детектирования мишени с применением МНКзима и полинуклеотидного субстрата настоящего изобретения, закрепленного на подложке. В этом варианте осуществления субстрат предпочтительно является субстратом, в котором детектируемая часть содержит детектируемый сигнал, например флуорофор, и часть, являющуюся гасителем флуорисценции, которая снижает или ликвидирует детектируемый сигнал, при этом детектируемая часть и часть, являющаяся гасителем флуорисценции, субстрата остаются в непосредственной близости, например, до модификации субстрата (например, путем расщепления). Субстрат прикреплен к подложке. Предпочтительно подложкой является нерастворимый материал или матрица, которая удерживает субстрат и предотвращает его свободное перемещение в основном объеме реакционной смеси. Прикрепление субстрата к подложке может быть разработано таким образом, чтобы после модификации (например, путем расщепления) субстрата МНКзимом, либо детектируемая часть, либо часть, являющаяся гасителем флуорисценции, но не обе, оставались прикрепленными к подложке, тогда как другая высвобождалась для перемещения в основном объеме реакционной смеси, отдельно от той части, которая остается прикрепленной. Таким образом, в примере, касающемся расщепления, детектируемый сигнал значительно усиливается после того как часть, являющаяся гасителем флуорисценции, и детектируемая часть разделяются после расщепления. В варианте осуществления, показанном на фигуре 3, область (i), флуорофор-содержащая детектируемая часть остается прикрепленной после расщепления. Положительным моментом этого является обеспечение возможности локализации сигнала на подложке, но, в определенных случаях, флуорофор/-ы могут высвобождаться в раствор. В дополнительном варианте осуществления, где, например, возникает лигирование, гаситель флуорисценции может быть лигирован с флуорофором, таким образом, приводя к снижению детектируемого сигнала.
В определенных вариантах осуществления многочисленные универсальные субстраты могут быть привязаны к твердой подложке в различных позициях для получения субстратной матрицы. Со ссылкой на фигуру 3, область (ii), два субстрата могут быть закреплены в определенных положениях на твердой поверхности. Каждый универсальный субстрат может быть расщеплен только МНКзимом, сформированным в присутствии специфической молекулы посредника сборки МНКзимов (например, мишени 1 или мишени 2), и сигнал может быть локализован путем позиционирования субстрата на поверхности (позиция 1 или позиция 2), таким образом, позволяя проводить специфическое детектирование различных посредников сборки. В таких вариантах осуществления привязанные универсальные субстраты могут все быть мечены одинаковым флуорофором. В других вариантах осуществления привязанные универсальные субстраты могут быть мечены различными флуорофорами. Стратегия, описанная на фигуре 3 (ii), может быть расширена для создания универсальных субстратных матриц с многочисленными различными универсальными субстратами, прикрепленными в определенных положениях на твердую поверхность. В таких вариантах осуществления увеличение числа универсальных субстратов, доступных для применения в матрицах, может обеспечивать преимущество, позволяя создавать более сложные матрицы. Такие универсальные матрицы универсальных субстратов могут быть полезны для применения в высоко-мультиплексном анализе целевых аналитов. Настоящее изобретение представляет дополнительные универсальные субстраты с характеристиками, которые могут увеличивать функцию каталитической активности, которая может быть полезна для совершенствования возможности производить все более сложный анализ с применением МНКзимов.
В определенных вариантах осуществления полинуклеотидный субстрат настоящего изобретения может узнаваться и модифицироваться МНКзимом для получения посредника сборки, компонента посредника сборки или компонент рибозима для второго отличного МНКзима.
Со ссылкой на фигуру 4, инициирующий МНКзим (Mt) может быть сформирован в присутствии мишени (Т). Инициирующий МНКзим (Mt) расщепляет (первый) полинуклеотидный субстрат настоящего изобретения (S1) для создания первого компонента посредника сборки (S1f), который направляет формирование первого каскадного МНКзима (каскадный МНКзим Mc1). В этом примере первый каскадный МНКзим (Mc1) содержит два компонента рибозимов и три компонента посредника сборки, называемые F1, F2 и S1f. Mc1 может расщеплять дополнительный субстрат (S2), таким образом, высвобождая дополнительный компонент посредника сборки (S2f), который направляет формирование второго каскадного МНКзима (каскадный МНКзим Мс2). В этом примере второй каскадный МНКзим (Мс2) содержит два компонента рибозимов и три компонента посредника сборки, называемые F3, F4 и S2f. Мс2 может затем расщеплять большее количество первого субстрата (S1), таким образом, создавая большее количество первого компонента посредника сборки (S1f). Это ведет к формированию дополнительного первого каскадного МНКзима (Mc1), приводя, таким образом, к созданию каскада реакций амплификации. Специалисту, для которого предназначено настоящее изобретение, будет понятно, что фигура 4 демонстрирует, что три компонента посредника сборки необходимы для того, чтобы способствовать сборке активного МНКзима. Большее или меньшее число компонентов посредника сборки может применяться в сходной схеме.
Специалист в данной области легко поймет, что способы, описанные в настоящем документе, могут быть оптимизированы с применением различных экспериментальных параметров в целях оптимизации детектирования, идентификации и/или количественного определения мишени и/или узнавания и каталитической модификации полинуклеотидного субстрата настоящего изобретения каталитической нуклеиновой кислотой (например, МНКзимом или ДНКзимом). Определенные экспериментальные параметры, которые подвергаются оптимизации, и уровень такой оптимизации, будут зависеть от определенного применяемого способа и определенной мишени и/или субстрата, участвующих в анализе. Такие параметры включают без ограничений время, температуру, концентрацию солей, детергентов, катионов и других реагентов, включая без ограничений диметилсульфоксид (DMSO), и длину, комплементарность, содержание GC и точку плавления (Tm) нуклеиновых кислот.
В некоторых вариантах осуществления, например, те способы, которые включают детектирование вариации последовательностей и/или детектирование метилированной ДНК, экспериментальные параметры, и предпочтительно включающие температуру, при которой осуществляется способ, могут быть оптимизированы таким образом, чтобы различить связывание нуклеиновой кислоты, являющейся компонентом МНКзима, с нуклеиновой кислотой-мишенью, которая содержит или не содержит вариации последовательности или метилированный нуклеотид, соответственно. Температура, при которой такие способы могут осуществляться, может находиться в диапазоне от приблизительно 20°С до приблизительно 96°С, от приблизительно 20°С до приблизительно 75°С, от 20°С до приблизительно 60°С или от приблизительно 20 до приблизительно 55°С.
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
В некоторых вариантах осуществления оптимизированные реакции для применения на практике способов применения МНКзимов и ДНКзимов представлены в настоящем документе. В таких оптимизированных реакциях каталитическая активность повышается на значение до 10, 20 или 30% по сравнению с неоптимизированными реакциями. Более предпочтительные условия реакции улучшают каталитическую активность на по меньшей мере 35% или 40%, и предпочтительно до 50% или более. В еще более предпочтительных вариантах осуществления, оптимизированные реакции сопровождаются повышением каталитической активности на более 50% и до 66%, 75% или даже 100%. В еще более предпочтительных вариантах осуществления, полностью оптимизированные способы осуществления реакции позволят получить 100, 200 или даже 300% или более высокое повышение каталитической активности. Другие предпочтительные условия реакции могут улучшить каталитическую активность на значение до 1000% или более, по сравнению со способами, применяемыми с неоптимизированными условия реакции. Высоко предпочтительным условием реакции для оптимизации способов, представленных в настоящем документе, является включение определенных дивалентных катионов. На каталитическую активность большинства нуклеиновых кислот с ферментативной активностью может оказывать влияние концентрация дивалентных катионов. Предпочтительные оптимизированные реакции оптимизированы для одного или нескольких из катионов Ва, Sr, Mg, Са, Ni, Со, Mn, Zn и Pb.
В некоторых вариантах осуществления применение полинуклеотидных субстратов настоящего изобретения в количественных анализах, выполняемых с участием нуклеиновых кислот с ферментативной активностью (например, МНКзимов или ДНКзимов), может повышать детектируемый эффект (например, усиление или ослабление флуоресцентного сигнала), являющийся результатом каталитической модификации субстрата под действием фермента, выше уровня детектируемого эффекта, достигнутого с применением известного субстрата при выполнении одинаковых видов количественного анализа при одинаковых условиях. Например, детектируемый эффект может быть повышен на более чем 2%, более чем 3%, более чем 4%, более чем 5%, более чем 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40% или более чем на 50% по сравнению с известным субстратом. В определенных вариантах осуществления детектируемым эффектом является флуоресцентный сигнал.
В некоторых вариантах осуществления способы настоящего изобретения включают применение полинуклеотидного субстрата для МНКзима в комбинации с МНКзимом, содержащим два олигонуклеотидных компонента рибозимов. Последовательности полинуклеотидного субстрата и олигонуклеотидных компонентов рибозимов могут представлять собой любую специфическую комбинацию трех последовательностей (которые описываются SEQ ID NO), как показано в таблице 6, 8, 10, 13, 16, 20, 22 и/или 24.
В некоторых вариантах осуществления способы настоящего изобретения включают применение полинуклеотидного субстрата в комбинации с ДНКзимом. Последовательности полинуклеотидного субстрата и ДНКзима могут быть представлены любой специфической парой последовательностей (которые описываются SEQ ID NO), как показано в таблице 15.
3. Наборы
В настоящем документе также представлены наборы, содержащие один или несколько полинуклеотидных субстратов настоящего изобретения.
Наборы могут содержать дополнительные реактивы для применения на практике способов, раскрытых в настоящем документе. Например, наборы могут содержать один или несколько каталитических нуклеиновых кислот, способных к узнаванию и модификации субстрата. Неограничивающие примеры подходящих каталитических нуклеиновых кислот включают ДНКзимы (например, ДНКзимы 10-23; ДНКзимы 8-17; ДНКзим-лигазы "7Z81", "7Z48" и "7Q10"; ДНКзимы "UV1C", участвующие в фотореверсии тимидиновых димеров, "DAB22" ДНКзимы, образующие углерод-углеродные связи; и их производные), рибозимы (например, молотоголовые рибозимы; гомодимерные рибозимы, гетеродимерные рибозимы; и их производные) и МНКзимы.
Наборы настоящего изобретения могут являться "разделенными" наборами. Термином "разделенный набор" называется любой набор, в котором реактивы представлены в отдельных контейнерах, таких как, например, небольшие стеклянные контейнеры, пластиковые контейнеры или пластиковые или бумажные полоски. Такие контейнеры могут позволить производить эффективное перемещение реактивов из одного отделения в другое, избегая перекрестного загрязнения образцов и реактивов, и/или позволить производить добавление агентов или растворов из каждого контейнера из одного отделения в другое количественным образом. Такие наборы могут также включать контейнер, который будет принимать образец для тестирования, контейнер, который содержит реактивы, которые будут использоваться в количественном анализе, контейнеры, которые содержат реактивы для отмывания, и контейнеры, которые содержат реактив для детектирования.
В определенных вариантах осуществления наборы содержат один или несколько полинуклеотидных субстратов настоящего изобретения и ряд олигонуклеотидных компонентов рибозимов, сконструированных для сборки МНКзима, способного к узнаванию и каталитической модификации полинуклеотидного субстрата в присутствии мишени. Мишень может действовать как посредник сборки, стимулируя сборку олигонуклеотидных компонентов рибозимов в каталитически активный МНКзим, способный к узнаванию и модификации полинуклеотидного субстрата.
В некоторых вариантах осуществления наборы содержат полинуклеотидный субстрат настоящего изобретения и МНКзим, содержащий два олигонуклеотидных компонента рибозимов. Последовательности полинуклеотидного субстрата и олигонуклеотидных компонентов рибозимов могут представлять собой любую специфическую комбинацию трех последовательностей (которые описываются SEQ ID NO), как показано в таблице 6, 8, 10, 13, 16, 20, 22 и/или 24.
В других вариантах осуществления наборы содержат полинуклеотидный субстрат настоящего изобретения и ДНКзим. Последовательности полинуклеотидного субстрата и ДНКзим могут представлять собой любую специфическую пару последовательностей (которые описываются SEQ ID NO), как показано в таблице 15.
Отдельные олигонуклеотидные компоненты рибозимов могут присутствовать в одном и том же контейнере. Альтернативно, отдельные олигонуклеотидные компонент/ы рибозимов могут присутствовать в отдельных контейнерах. Следует понимать, что не все компоненты для всех МНКзимов, предназначенных для применения в данном способе, обязательно должны быть представлены в наборе, поскольку такие компонент/-ы могут быть получены в процессе каскада реакций.
В других вариантах осуществления компоненты для дополнительных каталитических нуклеиновых кислот, с, например, расщепляющей или лигазной активностью, могут также формировать часть наборов настоящего изобретения. В еще других вариантах осуществления наборы настоящего изобретения могут включать ДНКзимы или их компоненты.
Наборы настоящего изобретения могут включать инструкции по применению набора компонентов для осуществления желаемых способов.
Наборы и способы настоящего изобретения могут применяться в сочетании с автоматизированным оборудованием и системами для анализа, включая, но без ограничений, машины для проведения ПЦР в режиме реального времени.
Наборы настоящего изобретения могут включать дополнительные реактивы для проведения реакций амплификации мишени (например, ПЦР) включая, например, олигонуклеотидные праймеры, буферы, ионы магния, полимеразные ферменты и тому подобные.
Наборы настоящего изобретения могут содержать один или несколько комплектов, содержащих одну или несколько твердых подложек и один или несколько полинуклеотидных субстратов настоящего изобретения. Одна или несколько твердых подложек могут быть связаны с одним или несколькими полинуклеотидными субстратами. В определенных вариантах осуществления наборы могут содержать один или несколько ансамблей, содержащий ряд различных твердых подложек. Ряд различных твердых подложек может быть связан с рядом различных полинуклеотидных субстратов настоящего изобретения.
Примеры
В следующих примерах тестировалась способность МНКзимов на основе ДНКзима 10-23 и ДНКзимов 10-23 эффективно расщеплять универсальные субстраты. Тестируемые универсальные субстраты включали некоторые из тех, которые были ранее известны в данной области техники (таблица 4, приведенная в графической части), и новые субстраты, сконструированные в соответствии либо со всеми принципами, либо с поднабором принципов конструирования по настоящему изобретению (таблица 5, приведенная в графической части). Эти примеры демонстрируют устойчивость, что продемонстрировано эффективным расщеплением в диапазоне условий, универсальных субстратов, сконструированных в соответствии со всеми или с поднабором принципов конструирования по настоящему изобретению.
Пример 1: Применение универсальных субстратов с МНКзимами в количественной ПЦР (цПЦР) в режиме реального времени при температуре отжига 52°С.
МНКзимы могут применяться для контроля амплификации нуклеиновых кислот-мишеней в режиме реального времени с использованием in vitro способов амплификации мишеней, таких как ПЦР, называемой qΠЦΡ с использованием МНКзимов. Дополнительно, мониторинг в реальном времени в ходе qΠЦΡ с использованием субстратов с МНКзимами, меченых парами флуорофора и гасителя флуоресценции, создает кривую, на которой пороговую линию, произвольного уровня флуоресценции, можно поместить над экспоненциальной фазой реакций, получая значение, которое может называться Ct (порог цикла). Реакции, которые дают меньшее значение Ct, свидетельствуют о более эффективном расщеплении специфического субстрата, поскольку такие реакции достигают порогового цикла быстрее. В данном примере амплификацию и детектирование выполняют одностадийным способом, где ПЦР-амплификация и МНКзим-опосредованное детектирование происходят одновременно в одной пробирке. Количество времени, необходимое для достижения порогового значения флуоресценции, измеренного по получаемому значению Ct, может зависеть от последовательности универсального субстрата.
В этом примере ранее известные универсальные субстраты из серии 1 (Sub2, Sub3, Sub6 и Sub7, см. таблицу 4) сравнивают с новыми улучшенными универсальными субстратами, серии 2 (Sub44, Sub45, Sub46, Sub49, Sub55 и Sub60, см. таблицу 5), которые являются объектом настоящего изобретения, для определения обладают ли субстраты серии 2 таким же, более высоким или более низким уровнем активности в ПЦР в режиме реального времени по сравнению с субстратами серии 1. Уровень активности определяли с помощью Ct, полученным для каждой реакции, содержащей отдельные субстраты в ходе ПЦР в режиме реального времени.
1.1. Олигонуклеотиды компонентов рибозимов
В экспериментах, проведенных для измерения эффективности расщепления ранее известных универсальных субстратов (таблица 4) и новых универсальных субстратов (таблица 5) в режиме реального времени, все олигонуклеотиды компонентов А и В рибозимов сконструировали с сенсорными плечами, комплементарными такой же последовательности человеческого гена RPLPO. Последовательности компонентов А и В рибозимов перечислены ниже от 5' к 3', где подчеркнутые основания гибридизуются с соответствующим субстратом. "-Р" означает 3'-фосфорилирование олигонуклеотида.
1.2. Репортерные субстраты

Репортерные субстраты для данного примера показаны ниже с помощью последовательности от 5' к 3'. Основания, обозначенные строчными буквами, представляют РНК, а основания, обозначенные прописными буквами, представляют ДНК. В настоящем примере в субстраты, отличные от Sub60, вводили концевые метки в виде фрагмента, являющегося 6-FAM, на 5'-конце и фрагмента, являющегося гасителем флуорисценции, на 3'-конце. Молекулой гасителя флуорисценции была либо Black Hole Quencher 1 (указана буквой "В" в названии субстрата ниже), либо Iowa Black FQ (указана буквами "IB" в названии субстратов ниже). Sub60 имел концевую метку фрагментом, являющимся гасителем флуорисценции, на 5'-конце и фрагментом, являющимся FAM, на 3'-конце (за счет того, что 5'-терминальным основанием является "G", который известен своей способностью гасить флуоресценцию F AM). Расщепление субстратов контролировали при 510-530 нм (длина волны излучения FAM на CFX96 (BioRad)) с длиной волны возбуждения 450-490 нм (диапазон длины волны возбуждения F AM на CFX96 (BioRad)).
1.3. ПЦР-праймеры для амплификация RPLPO
Целевой ПЦР-ампликон в данном примере был получен в результате ПЦР-амплификации in vitro человеческой геномной ДНК с применением олигонуклеотидных ПЦР-праймеров, перечисленных ниже. Последовательности праймеров приведены от 5' к 3'.
1.4. Последовательность-мишень
Последовательностью-мишенью для этого примера был ПЦР-ампликон гена RPLPO, полученный в результате ПЦР-амплификации in vitro человеческой геномной ДНК, экстрагированной из клеток К562.
1.5. Компоненты реакции: Амплификация и детектирование последовательности-мишени
2
2
2
ПЦР-амплификацию и детектирование последовательности-мишени в режиме реального времени выполняли в общем объеме реакционной смеси 25 мкл. Все реакции проводили в системе ПЦР с детектированием в режиме реального времени CFX96 (Bio-Rad). Параметры цикла являлись 95°С в течение 10 минут, 10 циклов при 95°С в течение 15 секунд и при 60°С в течение 30 секунд (-1°С на цикл для последней температуры), 40 циклов при 95°С в течение 15 секунд и при 52°С в течение 60 секунд (данные собирали на этапе, проводившемся при 52°С). Реакции разрабатывались с субстратами и ассоциированными с ними компонентами рибозимов, которые показаны в таблице 6 (см. в графической части). Каждый набор условий реакции повторяли дважды и он содержал 80 нМ 5RPLPO и 400 нМ 3RPLPO, 200 нМ каждого из компонента А рибозима и компонента В рибозима, 200 нМ субстрата, 8 мМ MgCl, 200 мкМ каждого из dNTP, 10 единиц ингибитора РНКазы RiboSafe (Bioline), 1 × Immobuffer (Bioline), 2 единицы Immolase (Bioline) и либо матрицу геномной ДНК (50 нг), либо ДНК-несодержащую мишень (НО без нуклеаз (NF-НО)). Отдельные реакции разрабатывались для тестирования каждого субстрата с соответствующими ему компонентами рибозимов. Одинаковые ПЦР-праймеры использовались для всех реакций, и все компоненты рибозимов имели одинаковые мишень-определяющие области. Поэтому любые различия в эффективности реакций будут связаны с различиями в эффективности расщепления субстратов.
1.6. Результаты: Амплификация мишени и расщепление репортерного субстрата
Каждая реакция qПЦР с использованием МНКзимов, содержащая геномную ДНК человека, с различным субстратом в каждой реакции, показала увеличение флуоресценции с течением времени при детектировании RPLPO из геномной ДНК человека в режиме реального времени. Для всех субстратов флуоресценция контрольной ДНК-несодержащей мишени была ниже, чем в реакциях, содержащих ДНК-мишень. Это демонстрирует, что увеличение флуоресценции, полученной в мишень-содержащих реакциях, связано с мишень-зависимой сборкой каталитически активных МНКзимов, которые затем расщепляли один из универсальных репортерных субстратов.
Все субстраты серии 1 и 2 пересекали порог давая значение Ct, как видно из таблицы 7. Субстраты серии 1 имели значения Ct в диапазоне от 16,9 (Sub6) до 18,4 (Sub3 и Sub7), а субстраты серии 2 имели значения Ct в диапазоне от 17,1 (Sub55) до 19,2 (Sub45). Это означает, что субстраты серии 2 высоко активны и очень хорошо сопоставимы с субстратами серии 1 при протестированных условиях реакций. Эти результаты демонстрируют, что, в среднем, субстраты, которые расщеплялись с наибольшей эффективностью (т.е. с самым низким Ct), включали те, которые имели наибольшее число пиримидинов в восьми основаниях, окружающих рибонуклеотиды в составе субстрата (выделены подчеркиванием в таблице 7, приведенной в графической части).
Пример 2: Применение универсальных субстратов с qΠЦΡ с использованием МНКзимов при температуре отжига 58°С.
МНКзимы могут применяться для контроля амплификации нуклеиновых кислот-мишеней в режиме реального времени с использованием in vitro способов амплификации мишеней, таких как ПЦР. Более того, мониторинг в реальном времени в ходе qΠЦΡ с использованием субстратов с МНКзимами, меченых парами флуорофора и гасителя флуоресценции, создает кривую, на которой пороговую линию, произвольного уровня флуоресценции, можно поместить над экспоненциальной фазой реакций, получая значение, которое может называться Ct (порог цикла). Реакции, которые дают меньшее значение Ct, свидетельствуют о более эффективном расщеплении специфического субстрата, поскольку такие реакции достигают порогового цикла быстрее. В данном примере амплификацию и детектирование выполняют одностадийным способом, где ПЦР-амплификация и МНКзим-опосредованное детектирование происходят одновременно в одной пробирке. При всех одинаковых других условия реакции значение Ct может зависеть от последовательности универсального субстрата. Температура отжига/детектирования для qΠЦΡ с использованием МНКзимов, используемая в данной области, составляет от 50 до 54°С. Такая температура продиктована тем фактом, что для универсальных субстратов, известных в данной области, существовало ограничение температуры, при которой они эффективно расщеплялись, при этом 54°С являлось верхним пределом для универсальных субстратов серии 1. Существует необходимость в универсальных субстратах, которые расщепляются при более высоких температурах, для обеспечения большей гибкости в конструировании праймеров и компонентов рибозимов, которые отжигаются при более высоких температурах. Такая гибкость конструирования для праймеров и компонентов рибозимов может принести большую пользу для многих вариантов применения, таких как представляющие интерес генетические мишени, у которых высокий процент оснований G и С в их последовательности, которые требуют более высоких температур реакции и, следовательно, компоненты рибозимов и праймеры с более высокими Тт для специфического детектирования.
4
13
8
9
Исследование эффективности расщепления субстратов, основанное на характеристиках субстратов серии 1 и 2, приводит к разработке принципов для содействия в третьем раунде конструирования субстратов, приводящих к получению субстратов серии 3. Данные принципы включали без ограничений (i) семь или более цитозиновых нуклеотидов в десяти основаниях, окружающих рибонуклеотиды (N-N), (ii) основания, непосредственно примыкающие к рибонуклеотидам, являются цитозинами (N и N) (iii) общее содержимое субстрата включает > 64% пиримидинов и (iv) общая Tm олигонуклеотида составляет 66°С или выше (где данный последний принцип применим, только если температура реакции для расщепления субстрата выше 50°С).
В этом примере универсальные субстраты серии 1 (Sub2, Sub3 и Sub6) сравниваются с универсальными субстратами серии 2 (Sub44, Sub 45, Sub46, Sub60T и Sub55) и субстратами серии 3 (Sub01, Sub65, Sub72, Sub73, Sub74, Sub75, Sub77, Sub79, Sub80, Sub82, Sub83, Sub84, Sub85, Sub86, Sub87, Sub88, Sub89 и Sub90) для сравнения эффективности расщепления в ПЦР в реальном времени при 58°С для подтверждения того, что принципы конструирования создают универсальные субстраты с высокой вероятностью применимости в qПЦР с использованием МНКзимов при повышенной температуре. Уровень эффективности расщепления определяли путем измерения значения Ct для реакций, содержащих различные универсальные субстраты.
2.1. Олигонуклеотиды компонентов рибозимов
В экспериментах, проведенных для измерения эффективности расщепления универсальных субстратов серий 1, 2 и 3 в ПЦР в реальном времени, все олигонуклеотиды компонентов А и В рибозимов сконструировали с сенсорными плечами, комплементарными одной и той же последовательности человеческого гена TFRC. Последовательности компонентов А и В рибозимов перечислены ниже от 5' к 3', где подчеркнутые основания гибридизуются с соответствующим им универсальным субстратом. "-Р" означает 3'-фосфорилирование олигонуклеотида.
2.2. Репортерные субстраты

Репортерные субстраты для данного примера показаны ниже с помощью последовательности от 5' к 3'. Основания, обозначенные строчными буквами, представляют РНК, а основания, обозначенные прописными буквами, представляют ДНК. В настоящем примере в субстраты вводили концевые метки в виде фрагмента, являющегося 6-FAM, на 5' конце (обозначенного с помощью "F" в названии приведенных ниже субстратов) и фрагмента, являющегося гасителем флуоресценции Iowa Black FQ, на 3' конце (обозначенного с помощью "IB" в названии приведенных ниже субстратов). Последовательность Sub60 модифицировали с включением "Т" на 5'-конце, что позволило ввести концевую метку 6-FAM на 5'-конце. Субстрат-связывающая последовательность компонента рибозимов А не изменилась, и поэтому эффективность расщепления сравнима с последовательностью Sub60 в примере 1, в которой отсутствует дополнительный "Т" на 5'-конце. Расщепление субстратов контролировали при 510-530 нм (длина волны излучения FAM на CFX96 (BioRad)) с длиной волны возбуждения 450-490 нм (диапазон длины волны возбуждения FAM на CFX96 (BioRad)).
2.3. Последовательность-мишень и ПЦР-праимеры для амплификации TFRC
Последовательность-мишень в данном примере являлась ПЦР-ампликоном гена TFRC, полученным путем in vitro амплификации человеческой геномной ДНК, извлеченной из клеточной линии IM9 (Promega), с применением олигонуклеотидных ПЦР-праймеров, перечисленные ниже. Последовательность, выделенная жирным шрифтом, в рамках последовательности праймера соответствует универсальной метке (U1 или U2), которая повышает Tm праймера, не оказывая влияния на специфичность праймера по отношению к гену-мишени. Эта метка улучшает эффективность амплификации в ходе ПЦР-реакций. Последовательности праймеров приведены от 5' к 3'.
2.4. Компоненты реакции: Амплификация и количественное определение последовательности-мишени
ПЦР-амплификацию и детектирование последовательности-мишени в режиме реального времени выполняли в общем объеме реакционной смеси 25 мкл. Все реакции проводили в системе ПЦР с детектированием в режиме реального времени CFX96 (Bio-Rad). Реакции разрабатывали с субстратами и ассоциированными с ними компонентами рибозимов, приведенными в таблице 8 (см. в графической части). Параметрами цикла являлись 95°С в течение 2 минут, 50 циклов при 95°С в течение 15 секунд и при 58°С в течение 60 секунд (данные собирали на этапе, проводившемся при 58°С).
2
2
Каждый набор условий реакции повторяли дважды и он содержал 40 нМ 5TFRC_U1, 200 нМ 3TFRC U2, 200 нМ каждого из компонента А рибозима и компонента В рибозима, 200 нМ субстрата, 8 мМ MgCl, 200 мкМ каждого из dNTP, 10 единиц ингибитора рибонуклеазы RiboSafe RNase inhibitor (Bioline), 1 × Immobuffer (Bioline), 2 единицы ДНК-полимеразы MyTaqHS™ (Bioline) и либо матрицу геномной ДНК (50 нг), либо никакой мишени (NF-HO).
2.5. Результаты: Амплификация мишени и расщепление репортерного субстрата
Каждая реакция qiiUP с использованием МНКзимов, содержащая геномную ДНК человека, показала увеличение флуоресценции с течением времени при детектировании TFRC из геномной ДНК человека в режиме реального времени. Во всех реакциях флуоресценция контроля без ДНК-мишени была ниже, чем флуоресценция в реакциях, содержащих ДНК-мишень. Это демонстрирует, что увеличение флуоресценции, полученной в мишень-содержащих реакциях, связано с мишень-зависимой сборкой каталитически активных МНКзимов, которые затем расщепляли один из универсальных репортерных субстратов.
Сравнение значений Ct для каждого универсального субстрата (фигура 5 и таблица 9) показало, что все субстраты серии 1 (Sub2, Sub3 и Sub6) и все субстраты серии 2 (Sub44, Sub45, Sub46 и Sub60T) имеют значения Ct>27, тогда как другие субстраты серии 2 и все протестированные субстраты серии 3 (Sub55, Sub61, Sub65, Sub72, Sub73, Sub74, Sub75, Sub77, Sub79, Sub80, Sub82, Sub83, Sub84, Sub85, Sub86, Sub87, Sub88, Sub89 и Sub90) имели значения Ct менее 27. Это указывает на то, что последний из перечисленных универсальных субстратов серии 2 и все протестированные универсальные субстраты серии 3 продемонстрировали повышенную эффективность реакции расщепления МНКзимов при более высокой температуре гибридизации/детектирования, чем та, которая ранее была возможна для qПЦР с использованием МНКзимов. Такая улучшенная эффективность расщепления теперь позволяет проводить эффективное и надежное детектирование мишени с применением qПЦР с использованием МНКзимов при более высокой температуре, чем та, которая была возможна ранее. Это может также быть полезно при применении таких композиций ДНК-полимераз, которые требуют применения более высоких температур для амплификации.
4
13
8
9
Следует отметить важность природы нуклеотидной последовательности этих эффективно расщепляющихся субстратов и близость специфических нуклеотидов к рибонуклеотидам субстратов. Данные особенности составляют основу совокупности руководящих принципов, которые приводят к получению универсальных субстратов, которые с более высокой вероятностью эффективно расщепляются при повышенных температурах. Данные принципы конструирования включают без ограничений (не все могут оказаться необходимыми) (i) семь или более цитозиновых нуклеотидов в десяти основаниях, окружающих рибонуклеотиды (N-N); (ii) основания, непосредственно примыкающие к рибонуклеотидам, являются цитозинами (N и N); (iii) общее содержимое субстрата включает > 64% пиримидинов; (iv) общая Tm олигонуклеотида составляет 66°С или выше (где данный последний принцип применим, только если температура реакции для расщепления субстрата выше 50°С) (таблица 9). Кроме того, наблюдалось, что полезный эффект имеет низкое число гуаниновых нуклеотидов (например, три, два, один или ни одного) в 10 основаниях, окружающих рибонуклеотиды.
Все универсальные субстраты, представленные на фигуре 5, имевшие Ct<27 при температуре отжига 58°С, нарушали три или более из этих принципов конструирования (см. таблицу 9 в графической части).
Пример 3: Применение универсальных субстратов с МНКзимами в формате, обеспечивающем прямое детектирования нуклеиновой кислоты-мишени.
4
13
8
9
Исследование эффективности расщепления субстратов, основанное на характеристиках субстратов серии 1 и 2, приводит к разработке принципов для содействия в третьем раунде конструирования субстратов, серии 3. Данные принципы включали без ограничений (i) семь или более цитозиновых нуклеотидов в десяти основаниях, окружающих рибонуклеотиды (N-N), (ii) основания, непосредственно примыкающие к рибонуклеотидам, являются цитозинами (N и N) (iii) общее содержимое субстрата включает > 64% пиримидинов и (iv) общая Tm олигонуклеотида составляет 66°С или выше (где данный последний принцип применим, только если температура реакции для расщепления субстрата выше 50°С).
МНКзимы могут применяться для прямого детектирования нуклеиновых кислот-мишеней в изотермической реакции без амплификации мишени. Этот способ прямого детектирования мишени может применяться для оценки эффективности расщепления субстратов. Компоненты рибозимов были сконструированы для тестирования эффективности расщепления ряда универсальных субстратов в сочетании с прямым детектированием гена TFRC в диапазоне различных температур. В этом примере ранее известные универсальные субстраты серии 1 (Sub2, Sub3 и Sub6) сравнивались с универсальными субстратами серии 2 (Sub44, Sub45, Sub46, Sub49, Sub55 и Sub60T) и субстратами серии 3 (Sub61, Sub65, Sub72, Sub73, Sub74, Sub75, Sub77, Sub79, Sub80, Sub82, Sub83, Sub84, Sub85, Sub86, Sub87, Sub88, Sub89 и Sub90) для определения, будут ли принципы конструирования, полученные на основании анализа субстратов серий 1 и 2 полезны в разработке субстратов серии 3, которые расщепляются с одинаковым или более высоким уровнем активности по сравнению с субстратами серий 1 и 2. Уровень эффективности расщепления определялся по расчету отношения "сигнал/шум" (на основании результатов "тестовой" реакции, включающей реакцию с матрицей и контрольную реакцию без матрицы) через 10 минут в диапазоне температур 52, 54, 56 и 58°С.Стандартное отклонение для отношений "сигнал/шум" в этом диапазоне температур также рассчитывалось как показатель устойчивости субстратов в отношении температуры.
3.1. Олигонуклеотиды компонентов рибозимов
В экспериментах, проведенных для измерения эффективности расщепления универсальных субстратов серий 1, 2 и 3, описанных в таблицах 4 и 5, с применением прямого детектирования мишени, все олигонуклеотиды компонентов рибозимов А и В сконструировали с сенсорными плечами, комплементарными одной и той же последовательности человеческого гена TFRC. Последовательности компонентов А и В рибозимов перечислены ниже от 5' к 3', где подчеркнутые основания гибридизуются с субстратом. "-Р" означает 3'-фосфорилирование олигонуклеотида.
3.2. Репортерные субстраты

Репортерные субстраты в данном примере показаны ниже с помощью последовательности от 5' к 3'. Основания, обозначенные строчными буквами, представляют РНК, а основания, обозначенные прописными буквами, представляют ДНК. В настоящем примере в субстраты вводили концевые метки в виде фрагмента, являющегося 6-FAM, на 5' конце (обозначенного с помощью "F" в названии приведенных ниже субстратов) и фрагмента, являющегося гасителем флуоресценции Iowa Black FQ, на 3' конце (обозначенного с помощью "IB" в названии приведенных ниже субстратов). Расщепление субстратов контролировали в диапазоне 510-530 нм (диапазон длин волн излучения FAM на CFX96 (BioRad)) с возбуждением в диапазоне 450-490 нм (диапазон длин волн возбуждения FAM на CFX96 (BioRad)).
3.3. Последовательность-мишень
Последовательность-мишень в данном примере являлась синтетическим олигонуклеотидом AF-TFRC с последовательностью от 5' к 3', приведенной ниже. Данная последовательность-мишень обладает той же последовательностью, что и участок гена TFRC.
3.4. Компоненты реакции: прямое изотермическое обнаружение последовательности-мишени
2
2
Детектирование последовательности-мишени измеряли с помощью увеличения флуоресцентного сигнала, вызванного расщеплением репортерного субстрата каталитически активным МНКзимом. Общий объем всех реакций составлял 25 мкл, и все реакции проводили в системе детектирования ПЦР в реальном времени CFX96™ (BioRad), при этом каждую комбинацию компонентов рибозимов и субстратов (см. таблицу 10 в графической части) тестировали при 52°С, 54°С, 56°С, 58°С и 60°С. Считывание флуоресценции для каждой реакции запрограммировали через 1 секунду в течение первых 50 циклов, а затем запрограммировали считывание через 25 секунд в течение следующих 50 циклов. Все реакционные смеси содержали 1 × ПЦР-буфера II (Applied Biosystems), 10 мМ MgCl, и 0,2 мкМ компонент рибозима А и компонент рибозима В, и 0,2 мкМ субстрата (тестировали в комбинациях, приведенных в таблице 10). Каждую реакцию проводили в двух повторностях, либо как "тест" с 10 нМ последовательности-мишени (AF-TFRC), либо нематричный контроль (NF- НО).
3.5. Результаты: прямое изотермическое обнаружение последовательности-мишени
Каждая реакция с каждым универсальным субстратом показала увеличение флуоресценции с течением времени для реакций, содержащих синтетическую матрицу AF-TFRC (последовательность-мишень, соответствующую части гена TFRC). Для всех субстратов флуоресценция нематричного контроля являлась более низкой, чем флуоресценция в реакциях, содержащих последовательность-мишень. Это демонстрирует, что увеличение флуоресценции, полученной в реакциях, содержащих мишень, связана с мишень-зависимой сборкой каталитически активных МНКзимов, которые затем расщепляли универсальный репортерный субстрат.
Для каждой реакции первоначальные результаты наблюдения флуоресценции, полученные от CFX96, нормализовали путем деления каждого результата наблюдения на значение, полученное для парной нематричной реакции при первом считывании. Затем данный нормализованный результат использовали для расчета значения "сигнал/шум" приблизительно на 10-й минуте путем деления тестовых результатов наблюдения на нематричные результаты наблюдения. Данный расчет выполняли для каждого субстрата при каждой температуре реакции. Значение "сигнал/шум" обеспечивает измерение эффективности расщепления субстратов (фигура 6, (i)), при этом высокое отношение "сигнал/шум" указывает на эффективное расщепление. Стандартное отклонение отношения "сигнал/шум" для каждого субстрата в диапазоне температур также рассчитали и представляли в виде гистограммы для определения субстратов со стабильно высокой активностью в тестируемом диапазоне температур (фигура 6, (ii)). Низкое значение данного стандартного отклонения указывает на минимальное изменение уровней "сигнал/шум" между температурами. Это дает основание полагать, что данные субстраты являются устойчивыми в отношении температуры.
Анализ отношения "сигнал/шум" для каждого субстрата в диапазоне температур (фигура 6, (i)) показывает, что субстраты серии 1 (Sub2, Sub3 и Sub6) обладали более высоким отношением "сигнал/шум" при более низких измеренных температурах. Однако эффективность расщепления данных субстратов резко снизилась при повышении температуры реакции до 58°С. Аналогичная картина наблюдалась для подгруппы субстратов серии 2 (Sub44, Sub45, Sub46 и Sub60T). Субстрат серии 2, Sub49, являлся малоэффективным при более низких температурах и немного более эффективным при более высоких, но в целом обладал более низким отношением "сигнал/шум", чем другие субстраты. Субстрат серии 2, Sub60T, показал снижение отношения "сигнал/шум" при повышении температуры, и в целом более низкое отношение "сигнал/шум" при более низких температурах, чем большинство других субстратов серий 1 и 2. Другой субстрат серии 2 (Sub55) и подгруппа субстратов серии 3 (Sub61, Sub65, Sub74, Sub79, Sub80, Sub82, Sub83, Sub84, Sub85, Sub86, Sub87, Sub88, Sub89 и Sub90) показали высокие уровни флуоресценции и, следовательно, эффективно расщеплялись при всех тестируемых температурах. Субстраты серии 3, Sub73, Sub75 и Sub77, показали примерно одинаковое значение "сигнал/шум" при тестируемых температурах, однако общий уровень "сигнал/шум" являлся низким. Все три данные субстрата дали хорошие результаты со сравнительно низкими значениями Ct при тестировании с помощью qПЦP с использованием МНКзимов (смотри пример 2). Сравнение данных для данных субстратов для примеров 2 и 3 может указывать на то, что при использовании постоянной температуры в диапазоне от 52 до 58°С оборот данных субстратов является более низким, влияя таким образом на эффективность расщепления. Такой сниженный оборот субстратов может зависеть от скорости диссоциации расщепленных продуктов. В примере 2 расщепленные продукты будут отделяться от субстратных плечей с компонентами рибозимов по меньшей мере один раз в цикл при повышении температуры до выше 90°С в рамках профиля термоциклирования ПЦР.
В целом, субстраты, которые соответствуют принципам конструирования (таблица 9), показали более высокое отношение "сигнал/шум" в тестируемом диапазоне температур, чем субстраты, которые выходили за пределы данных принципов (фигура 6, (i)). В частности реакции с Sub55, Sub01, Sub65, Sub72, Sub74, Sub79, Sub80, Sub82, Sub83, Sub84, Sub85, Sub86, Sub87, Sub88, Sub89 и Sub90 показали высокие значения "сигнал/шум" при каждой тестируемой температуре, демонстрируя, что данные субстраты являются устойчивыми в диапазоне температур. Данное улучшение дополнительно обнаружилось при расчете стандартного отклонения для отношения "сигнал/шум" при всех температурах для каждого субстрата (фигура 6, (ii)). Данная мера вариабельности в паре с абсолютными значениями "сигнал/шум" указывала на то, что в тестируемом диапазоне температур субстрат серии 2 Sub55, и субстраты серии 3, Sub01, Sub65, Sub74, Sub79, Sub80, Sub82, Sub83, Sub85, Sub86, Sub87, Sub88, Sub89 и Sub90 обладали высоким отношением "сигнал/шум" с небольшой вариабельностью в широком диапазоне температур. Существовали три субстрата серии 3, Sub65, Sub72 и Sub84, которые соответствовали только трем из четырех принципам конструирования и два из них, Sub72 и Sub84, обладали несколько большим стандартным отклонением "сигнал/шум", чем субстраты серии 3, которые соответствовали всем четырем принципам конструирования, как указано в таблице 9.
Субстраты, которые обладали значениями "сигнал/шум" меньшими, чем 1,6 при 3 или более температурах (Sub60, Sub73, Sub75 и Sub77) не считались устойчивыми в отношении тестируемого диапазона температур.
Эти данные позволяют предположить, что при соблюдении всех данных четырех принципов конструирования (таблица 9), в целом, получают субстраты, которые расщепляются эффективно и устойчиво в диапазоне температур.
4
13
Изучение последовательности наиболее успешных субстратов из серий 2 и 3 показывает, что данным субстратам присущи общие черты. Субстраты, которые обладают небольшой вариацией между отношениями "сигнал/шум" при всех тестируемых температурах (фигура 6, (i) и (ii)), как правило, содержали семь или более цитозиновых нуклеотидов в пределах оснований N-N. Это указывает на то, что центральная область, то есть 10 оснований, окружающих рибонуклеотиды, оказывает значительное влияние на активность субстрата. К тому же наблюдали, что небольшое число гуаниновых нуклеотидов (например, три, два, один или ни одного) в 10 основаниях, окружающих рибонуклеотиды, также является полезным.
Пример 4: Применение универсальных субстратов с qПЦР с использованием МНКзимов, при температурах отжига 52°С и 58°С.
МНКзимы могут применяться для контроля амплификации нуклеиновых кислот-мишеней в режиме реального времени, применяя in vitro способы амплификации мишеней, такие как ПЦР. Дополнительно, контроль в реальном времени в ходе qΠЦΡ с применением субстратов с МНКзимами, меченных парами флуорофоров и гасителя флуоресценции, создает кривую, которая может показывать эффективность реакции посредством ее значения Ct и крутизны (скорость реакции). В данном примере амплификация и детектирование выполняются одностадийным способом, где ПЦР-амплификация и МНКзим-опосредованное детектирование происходят одновременно в одной пробирке. Скорость получения сигнала (измеряется с помощью Ct и крутизны кривых реакции) при различных температурах отжига, таких как 52°С и 58°С (температура, данные которой собирали), может зависеть от последовательности универсального субстрата.
Температура отжига/детектирования для qПЦР с использованием МНКзимов, применяемая в данной области, составляет от 50 до 54°С. Данная температура продиктована тем фактом, что универсальные субстраты, известные в данной области, обладали ограничением на температуру, при которой они эффективно расщеплялись, при этом 54°С является верхним пределом для универсальных субстратов серии 1. Существует необходимость для универсальных субстратов, которые расщепляются при более высоких температурах, чтобы обеспечить большую гибкость в конструировании праймеров и компонентов рибозимов, которые отжигаются при более высоких температурах. Такая гибкость конструирования для праймеров и компонентов рибозимов принесла бы большую пользу для многих вариантов применения, таких как представляющие интерес генетические мишени, у которых высокий процент оснований G и С в их последовательности, которые требуют компоненты рибозимов и праймеры с более высокими температурами плавления (Tm) для специфического детектирования. Полезность универсальных субстратов значительно увеличилась бы, если бы существовали субстраты, которые эффективно расщепляются в диапазоне температур 52-58°С.
В данном примере компоненты рибозимов, соответствующие универсальным субстратам серий 1, 2 и 3, сконструированы для воздействия на ряд генов, как показано в таблице 11 (см. в графической части). Специалисту в данной области должно быть понятно, что любая последовательность гена или транскрипт гена, или любой другой продукт амплификации нуклеиновой кислоты может использоваться в качестве мишени, описываемой в данном документе. Каждую комбинацию компонентов рибозимов и ассоциированных с ними универсальных субстратов тестировали при температурах отжига 52°С и 58°С в qПЦР. Результаты данного сравнения определят, обеспечат ли субстраты серии 1, 2 и 3, ориентированные на различные гены и при различных температурах отжига, одинаковый, более высокий или более низкий уровень эффективности расщепления в ПЦР в реальном времени. Уровень эффективности расщепления определяли путем измерения значений Ct и рассмотрения крутизны кривых реакции для реакций, содержащих различные универсальные субстраты.
4.1. Олигонуклеотиды компонентов рибозимов
В экспериментах, проводимых для измерения эффективности расщепления универсальных субстратов в ПЦР в реальном времени, сконструировали олигонуклеотиды компонентов А и В рибозимов с сенсорными плечами, комплементарными человеческим CYP2C9, ТР53, В2М, HMBS, RPL13a или TFRC генам. Последовательности компонентов А и В рибозимов перечислены ниже от 5' к 3', где подчеркнутые основания гибридизуются с субстратом. "-Р" означает 3' фосфорилирование олигонуклеотида.
4.2. Репортерные субстраты
В настоящем примере, в субстраты вводили концевые метки в виде флуорофора на 5'-конце и концевые метки в виде фрагмента, являющегося гасителем флуоресценции, на 3'-конце. На таблице 12 показаны комбинации субстрат - флуорофор/гаситель. Некоторые субстраты тестировали с несколькими конкретными комбинациями флуорофор/гаситель. Расщепление субстратов контролировали при различных длинах волн излучения и возбуждения (см. таблицу 12 в графической части).
Репортерные субстраты, тестируемые в данном примере, показаны ниже с помощью последовательности от 5' к 3'. Основания, обозначенные строчными буквами, представляют РНК, а основания, обозначенные прописными буквами, представляют ДНК.
4.3. Последовательность-мишень и ПЦР-праймеры для амплификации CYP2C9, ТР53, В2М, HMBS, TFRC и RPL13a генов
Человеческую геномную ДНК, извлеченную из клеточной линии IM9 (Promega), использовали в качестве матрицы для амплификации in vitro генов-мишеней. Ампликоны получали с помощью qΠЦΡ, применяя олигонуклеотидные ПЦР-праймеры, перечисленные ниже. Последовательности праймеров приведены от 5' к 3'. Последовательность, выделенная жирным шрифтом в последовательностях праймеров, соответствует универсальной метке (U1, U2 или U3), которая увеличивает Tm праймера, не влияя на специфичность праймера по отношению к гену-мишени. Данная метка повышает эффективность амплификации в ПЦР-реакциях.
4.4. Компоненты реакции: Амплификация и количественное определение последовательности-мишени
ПЦР-амплификацию и детектирование последовательности-мишени в режиме реального времени выполняли в общем объеме реакционной смеси 25 мкл. Все реакции проводили в системе детектирования ПЦР в реальном времени CFX96 (Bio-Rad). Реакции разрабатывали с субстратами и ассоциированными с ними компонентами рибозимов, которые приведены в таблице 13 в графической части. Параметрами циклов являлись;
1) 95°С в течение 2 минут, 50 циклов 95°С в течение 15 секунд и 52°С в течение 60 секунд (данные собирали на этапе, проводившемся при 52°С), либо
2) 95°С в течение 2 минут, 50 циклов 95°С в течение 15 секунд и 58°С в течение 60 секунд (данные собирали на этапе, проводившемся при 58°С).
2
2
Каждый набор условий реакции повторяли дважды и он содержал 40 нМ прямого праймера и 200 нМ обратного праймера, 200 нМ каждого из компонента А рибозима и компонента В рибозима, 200 нМ субстрата, 8 мМ MgCl, 200 мкМ каждого dNTP, 10 единиц ингибитора РНКазы RiboSafe (Bioline), 1 × Immobuffer (Bioline), 2 единицы ДНК-полимеразы MyTaqHS™ (Bioline) и либо матрицу геномной ДНК (100 нг), либо в нем отсутствовала мишень (NF-HO).
4.5. Результаты: Амплификация мишени и расщепление репортерного субстрата
Каждая реакция qΠЦΡ с использованием МНКзимов, содержащая геномную ДНК человека, показала увеличение флуоресценции с течением времени для детектирования в режиме реального времени генов CYP2C9, ТР53, В2М, HMBS, RPL13a и TFRC, при температурах отжига как 52°С, так и 58°С (фигура 7). Для всех универсальных субстратов флуоресценция контроля, не содержащего ДНК-мишени, была ниже, чем флуоресценция в реакциях, содержащих ДНК-мишень. Это показывает, что увеличение флуоресценции, полученной в реакциях, содержащих мишень, связано с мишень-зависимой сборкой каталитически активных МНКзимов, которые затем расщепляли один из универсальных репортерных субстратов.
Результаты детектирования генов CYP2C9 и ТР53 с помощью qПЦР с использованием МНКзимов показали, что все протестированные универсальные субстраты работали эквивалентно при 52°С с разницей менее чем 0,5 Ct между субстратами и аналогичными наклонами кривых амплификации (таблица 14 и фигура 7, (i)a и (ii)a соответственно). Протестированные субстраты серии 1 (Sub3 и Sub6) работали хуже при более высокой температуре в 58°С, чем протестированные субстраты серии 3 (Sub61, Sub72, Sub74 и Sub79), с разницей более чем 1 Ct между субстратами и значительно более слабым наклоном кривых амплификации для Sub3 и Sub6, указывающим на менее эффективную реакцию (таблица 14 и фигура 7, (i)b и (ii)b соответственно). Эти данные показывают, что улучшенная конструкция данных субстратов серии 3 (Sub61, Sub72, Sub74 и Sub79) приводит к более эффективному расщеплению при 58°С, и что такая улучшенная работа при повышенных температурах не препятствует эффективному расщеплению данных субстратов более низкой температуре.
Результаты детектирования генов В2М и HMBS с помощью qΠЦΡ с использованием МНКзимов показали, что все протестированные универсальные субстраты работали эквивалентно при 52°С с разницей только приблизительно 0,5 Ct между субстратами и аналогичными наклонами кривых амплификации (таблица 14 и фигура 7, (iii)a и (iv)a соответственно). Протестированные субстраты серии 2 (SubóO и Sub49) работали хуже при более высокой температуре в 58°С, чем протестированные субстраты серии 3 (Sub61, и Sub75, и Sub79) с разницей более чем 1 Ct между субстратами и более слабым наклоном кривых амплификации для Sub60 и Sub49, указывающим на менее эффективную реакцию (таблица 14 и фигура 7, (iii)b и (iv)b соответственно). Эти данные показывают, что улучшенная конструкция данных субстратов серии 3 (Sub61, Sub75 и Sub79) приводит к более эффективному расщеплению при 58°С, но что такая улучшенная работа при повышенных температурах не препятствует эффективному расщеплению данных субстратов при более низкой температуре. Лучшая работа субстратов серии 3 по сравнению с субстратами серии 2 при 58°С объясняется тем фактом, что субстраты серии 3 следуют всем принципам конструирования высокоактивных субстратов, а субстраты серии 2 не следуют (смотри таблицу 9).
Результаты детектирования гена TFRC с помощью qПЦР с использованием МНКзимов показали, что все протестированные универсальные субстраты работали эквивалентно при 52°С с разницей только приблизительно 0,5 Ct между субстратами и аналогичными наклонами кривых амплификации (таблица 14 и фигура 7, (v)a). Оба протестированных субстрата серии 3 (Sub72 и Sub80) работали лучше при 58°С, чем протестированный субстрат серии 1 (Sub2) с разницей более чем 1 Ct между субстратами и более слабым наклоном кривой амплификации для Sub2, указывающим на менее эффективную реакцию (таблица 14 и фигура 7, (v)b). Субстрат серии 3, Sub80, работал лучше при 58°С, чем субстрат серии 3, Sub72, с разницей больше чем 1 Ct между субстратами. Sub80 следует всем принципам конструирования высокоактивных субстратов, a Sub72 не следуют (смотри таблицу 9)·
Результаты детектирования гена RPL13a с помощью qΠЦΡ с использованием МНКзимов показали, что при 52°С субстрат серии 2 Sub55 и субстрат серии 3 Sub88 работали лучше, чем субстрат серии 3 Sub80 (таблица 14 и фигура 7, (vi)a). При 58°С субстрат серии 3 Sub80 и субстрат серии 2 Sub55 работали одинаково, и оба данных субстрата работали лучше, чем субстрат серии 3 Sub88 (таблица 14 и фигура 7, (vi)b). Субстрат серии 2 Sub55 отвечает всем принципам конструирования высокоактивных субстратов (смотри таблицу 9) и, как предполагается, следовательно, будет работать эффективно. Субстрат серии 3 Sub88 также отвечает всем принципам конструирования высокоактивных субстратов (таблица 9), но работал не столь эффективно, как Sub55. В целом, принципы конструирования показывают высокую вероятность получения субстратов, которые эффективно расщепляются в условиях qΠЦΡ с использованием МНКзимов.
В целом, с рядом различных последовательностей-мишеней субстраты серии 1, 2 и 3 работали сопоставимо в qΠЦΡ с использованием МНКзимов, работали при 52°С. При 58°С субстраты серии 3 превзошли субстраты серии 1 и 2, за исключением субстрата серии 2 Sub55, который, как объяснялось выше, соответствует всем принципам конструирования высокоактивных субстратов. Эти данные показывают, что принципы конструирования, в целом, создают субстраты, которые являются устойчивыми и эффективно расщепляются в диапазоне температур в рамках протоколов термоциклирования, применяемых для цПЦР.
∧
Следует отметить, что некоторые из субстратов серии 3, обозначенные с помощью () в таблице 14 (см. в графической части), обладают очень высокими Tm и, следовательно, при более низких температурах их оборот расщепленного субстрата может быть хуже, и следовательно, даже при том, что активность сопоставима с другими субстратами, конечное значение флуоресценции ниже.
Пример 5: Применение универсальных субстратов с ДНКзимами
ДНКзим 10-23 является мономолекулярной структурой, которая может непосредственно связываться с и модифицировать последовательность субстрата. ДНКзим 10-23 является полезным в диагностическом применении in vitro. Благодаря сходству в каталитической области ДНКзим 10-23 может связываться и расщеплять субстраты, расщепляемые с помощью МНКзима на основе 10-23 ДНКзима. В отличие от МНКзим, ДНКзим не нуждается в последовательности-мишени для образования активного центра, и, следовательно, связывание и последующее расщепление субстрата ДНКзимом 10-23 не зависит от последовательности-мишени и не использует расщепленный каталитический центр. Способность соответствующих ДНКзимов 10-23 расщеплять универсальные субстраты серии 1 (Sub2, Sub3 и Sub6), универсальные субстраты серии 2 (Sub44, Sub45, Sub49, Sub55 и Sub60T) и универсальные субстраты серии 3 (Sub61, Sub72, Sub73, Sub74, Sub75, Sub77, Sub79, Sub80, Sub84, Sub85, Sub86, Sub87, Sub88 и Sub89) измеряли для того, чтобы определить, приводят ли принципы конструирования по настоящему изобретению к разработке субстратов, которые могут расщепляться ДНКзимом 10-23 с высокой активностью и устойчиво в диапазоне температур.
5.1. Олигонуклеотиды ДНКзима 10-23
Серию ДНКзимов 10-23 сконструировали с сенсорными плечами, комплементарными субстратам, описанным выше и представленным в таблицах 4 и 5. Последовательности ДНКзимов перечислены ниже от 5' к 3', где подчеркнутые основания гибридизуются с субстратом, и основания, выделенные курсивом, образуют каталитический центр. Некоторые последовательности ДНКзимов, приведенные ниже, содержат дополнительный G на самых концах 5' и 3' (например, Dz55). Данные дополнительные основания не гибридизуются с субстратами и не влияют на эффективность, с которой ДНКзим расщеплял субстрат.
5.2. Репортерные субстраты

В настоящем примере в субстраты вводили концевые метки в виде фрагмента, являющегося 6-FAM, на 5' конце (обозначенного с помощью "F" в названии приведенных ниже субстратов) и фрагмента, являющегося гасителем флуоресценции Iowa Black FQ, на 3' конце (обозначенного с помощью "IB" в названии приведенных ниже субстратов). Расщепление субстратов контролировали в диапазоне 510-530 нм (диапазон длин волн излучения FAM на CFX96 (BioRad)) с возбуждением в диапазоне 450-490 нм (диапазон длин волн возбуждения FAM на CFX96 (BioRad)). Репортерные субстраты для данного примера показаны ниже с помощью последовательности от 5' к 3'. Основания, обозначенные строчными буквами, представляют РНК, а основания, обозначенные прописными буквами, представляют ДНК.
5.3. Компоненты реакции: Расщепление субстрата с помощью ДНКзима при температурах от 50°С до 60°С
2
2
2
Расщепление субстрата измеряли по увеличению флуоресцентного сигнала, вызванного связыванием и последующим расщеплением с помощью соответствующего ДНКзима. Отдельные реакции разрабатывали для измерения расщепления каждого субстрата с помощью соответствующего ДНКзима (олигонуклеотиды, приведенные в таблице 15 в графической части). Реакционные смеси содержали 1 × ПЦР-буфера II (Applied Biosystems), 10 мМ MgCl, 200 нМ субстрата и NF-HO в общем объеме 25 мкл. Каждую реакцию проводили в двух повторностях, либо как "тестовую" (добавление 1 нМ ДНКзима), либо как "контрольную" (добавление NF-НО) реакцию. Реакции проводили в системе детектирования ПЦР в реальном времени CFX96™ (BioRad) при 50, 52, 54, 56, 58 и 60°С. Считывание флуоресценции для каждой реакции запрограммировали через 1 секунду в течение первых 50 циклов, а затем запрограммировали считывание через 25 секунд в течение следующих 50 циклов.
5.5. Результаты: Расщепление субстрата с помощью ДНКзима при различных температурах
Каждая тестовая реакция, включающая ДНКзимы с соответствующими субстратами, показала увеличение флуоресценции с течением времени. Увеличение флуоресценции воды отсутствовало только в контрольных реакциях (без добавления ДНКзима). Это демонстрирует, что увеличение флуоресценции, полученное в ДНКзим-содержащих реакциях, происходило вследствие связывания и последующего каталитического расщепления репортерного субстрата с помощью ДНКзима.
По каждой совокупности данных субстрата (тестовые и контрольные реакции), исходные результаты наблюдений флуоресценции экспортировали в Excel (Microsoft), дублирующие значения усредняли и затем нормализовали. Нормализацию проводили путем деления каждого усредненного результата наблюдения на усредненное значение реакции без ДНКзима при первом считывании реакций, содержащих одинаковый субстрат (например, усредненные данные тестовых реакций для Sub61 делили на усредненную флуоресценцию в цикле 1 контрольной реакции без ДНКзима для Sub61; усредненные данные контрольных реакций без ДНКзима для Sub61 делили на усредненную флуоресценцию в цикле 1 контрольной реакции без ДНКзима для Sub61). Эти нормализованные данные затем использовали для расчета отношения "сигнал/шум" приблизительно на 10 минуте после начала реакции, путем деления нормализованной флуоресценции тестовой реакции на 10 минуте на нормализованную флуоресценцию реакции без ДНКзима на 10 минуте. Данный расчет отношения "сигнал/шум" проводили для каждой комбинации ДНКзима и субстрата и при каждой тестируемой температуре. Значение "сигнал/шум" затем представляли в виде гистограммы для сравнения эффективности расщепления каждого субстрата соответствующим ДНКзимом при различных температурах (фигура 8, (i)). Стандартное отклонение отношения "сигнал/шум" для каждого субстрата в диапазоне температур также рассчитали и представляли в виде гистограммы для определения субстратов со стабильным отношением "сигнал/шум" в тестируемом диапазоне температур (фигура 8, (ii)). Это говорит о том, что данные субстраты являются устойчивыми в отношении температуры.
В связи с ошибкой эксперимента отсутствуют данные для Sub2 при 54°С или для Sub79 при 58°С, однако это оказывает минимальное влияние на общую интерпретацию данных.
Анализ отношения "сигнал/шум" для каждого субстрата (фигура 8, (i)) показывает, что субстраты серии 1 (Sub2, Sub3 и Sub6) обладали высоким отношением "сигнал/шум" при более низких измеренных температурах. Однако эффективность расщепления данных субстратов резко снизилась при повышении температуры реакции. Аналогичная картина наблюдалась для подгруппы субстратов серии 2 (Sub44, Sub45, Sub49 и Sub60T). Другой субстрат серии 2 (Sub55), и большинство протестированных субстратов серии 3 (Sub61, Sub72, Sub74, Sub75, Sub79, Sub80, Sub84, Sub85, Sub86, Sub87, Sub88 и Sub89) показали высокое отношение "сигнал/шум" при всех протестированных температурах. Субстраты серии 3 Sub73 и Sub77 обладали равномерно низким отношением "сигнал/шум" при всех протестированных температурах, указывая на то, что хотя новые принципы конструирования обеспечивают хорошую вероятность конструирования устойчивых субстратов (83% успешных результатов для данного применения), все же будут существовать некоторые последовательности, которые отвечают данным принципам, но которые являются непригодными для диагностического применения подгруппы МНКзимов и/или ДНКзимов. Результаты для Sub73 и Sub77 также доказывают, что способы, использующие ДНКзимы для массового скрининга потенциальных последовательностей субстратов с целью обнаружения таких, которые подходят для диагностического применения МНКзимов, могут пропускать обнаружение субстратов, которые являлись бы устойчивыми и эффективно расщеплялись с помощью МНКзимов при применении в qПЦР, и наоборот (смотри пример 2 для успешного использования Sub73 и Sub77 в qПЦР с использованием МНКзимов, фигура 5).
В целом, большинство субстратов, которые соответствуют всем принципам конструирования (таблица 9), показали большее отношение "сигнал/шум" в тестируемом диапазоне температур, чем субстраты, которые выходили за пределами одного или нескольких из данных принципов конструирования (фигура 8, (i)). Более конкретно, реакции с Sub55, Sub61, Sub72, Sub74, Sub75, Sub79, Sub80, Sub84, Sub85, Sub86, Sub87, Sub88 и Sub89 показали высокие значения "сигнал/шум" при каждой протестированной температуре, демонстрируя, что данные субстраты являются устойчивыми в диапазоне температур. Это улучшение дополнительно обнаружилось при расчете стандартного отклонения для отношения "сигнал/шум" при всех температурах для каждого субстрата (фигура 8, (ii)). Данная мера вариабельности указывала на то, что в тестируемом диапазоне температур субстрат серии 2, Sub55, и субстраты серии 3, Sub61, Sub72, Sub74, Sub75, Sub79, Sub80, Sub82, Sub83, Sub85, Sub86, Sub87, Sub88 и Sub89, обладали подобным отношением "сигнал/шум" при протестированных температурах, демонстрируя, что они являются устойчивыми субстратами в широком диапазоне температур. Отметим, что хотя Sub60T, Sub73 и Sub77 демонстрируют низкое стандартное отклонение для отношения "сигнал/шум" в диапазоне температур, абсолютное отношение "сигнал/шум" является очень низким при всех температурах, что исключает данные субстраты из устойчивых в данном применении.
Пример 6: Тестирование на неспецифическое расщепление универсальных субстратов с помощью qΠЦΡ с использованием МНКзимов.
МНКзимы могут применяться для контроля амплификации нуклеиновых кислот-мишеней в режиме реального времени, применяя in vitro способы амплификации мишеней, такие как ПЦР. Амплификацию и детектирование выполняют одностадийным способом, где ПЦР-амплификация и МНКзим-опосредованное детектирование происходят одновременно в одной пробирке. Множественные мишени можно амплифицировать и детектировать в одном реакционном сосуде, применяя компоненты рибозимов с мишень-сенсорными плечами, специфичными к отдельным мишеням. Компоненты рибозимов для детектирования первой мишени будут связываться с и расщеплять первый субстрат, компоненты рибозимов для детектирования второй мишени будут связываться с и расщеплять второй субстрат и так далее. Для того, чтобы детектирование мишеней являлось специфическим, не может происходить неспецифическое расщепление субстрата с помощью компонентов рибозимов, сконструированных для расщепления любого другого субстрата в реакционной смеси.
4
13
8
9
Степень комплементарности субстрат-сенсорных плечей в компонентах рибозимов МНКзимов с другими субстратами, присутствующими в реакции, влияет на специфичности связывания. Полная комплементарность оснований, ближайших к рибонуклеотидам, является более решающей для специфического расщепления. Принципы конструирования для создания эффективно расщепляющихся универсальных субстратов включают ограничения вокруг состава последовательности универсальных субстратов, т.е. семь или более цитозиновых нуклеотидов в десяти основаниях, окружающих рибонуклеотиды (N-N); основания, непосредственно примыкающие к рибонуклеотидам, являются цитозинами (N и N); общее содержание субстрата включает > 64% пиримидинов. Данные ограничения могут приводить к подобиям в последовательности субстрата вблизи рибонуклеотидов и, возможно, приводить в результате к неспецифическому расщеплению универсального субстрата с помощью частично соответствующих компонентов рибозимов, особенно в мультиплексном формате, где присутствует целый ряд универсальных субстратов с ассоциированными с ними компонентами рибозимов в одной реакционной смеси. Если субстрат расщепляется неспецифическим образом с помощью частично соответствующих компонентов рибозимов, сконструированных для специфического расщепления второго субстрата, то данная конкретная комбинация субстратов не может подходить для применения в мультиплексном формате.
В данном примере, универсальные субстраты Sub44, Sub55, Sub61, Sub65, Sub72 и Sub74 тестировали на активность неспецифического расщепления с помощью компонентов рибозимов, ассоциированных с Sub44, Sub55, Sub72 и Sub74. Это включало тестирование каждого универсального субстрата отдельно с парами компонентов рибозимов, сконструированными для связывания с полной комплементарностью с другими субстратами с целью пронаблюдать, детектировался ли сигнал в формате qΠЦΡ с использованием МНКзимов. Для данного теста выбрали компоненты рибозимов для Sub72 и Sub74, так как их соответствующие субстраты различаются только тремя основаниями (фигура 9, (i)a и (ii)а). Компоненты рибозимов для Sub55 выбрали для тестирования с Sub61 и Sub65, так как они очень сходны в центральной области вокруг рибонуклеотидов (N4-N13) (фигура 9, (iii)a). Компоненты рибозимов для Sub44 выбрали в качестве контроля, поскольку они менее подобны другим субстратам (фигура 9, (iv)a).
6.1. Олигонуклеотиды компонентов рибозимов
В экспериментах, проводимых для тестирования на неспецифическое расщепление с помощью некомплементарных компонентов рибозимов, сконструировали олигонуклеотиды компонентов А и В рибозимов с мишень-сенсорными плечами, комплементарными человеческому гену RPL13a, и субстрат-сенсорными плечами, комплементарными каждому из универсальных субстратов, как указано выше. Последовательности компонентов А и В рибозимов приведены ниже, от 5' к 3', где подчеркнутые основания гибридизуются с субстратом. "-Р" означает 3' фосфорилирование олигонуклеотида.
6.2. Репортерные субстраты

В настоящем примере в субстраты вводили концевые метки в виде фрагмента, являющегося 6-FAM, на 5' конце (обозначенного с помощью "F" в названии приведенных ниже субстратов) и фрагмента, являющегося гасителем флуоресценции Iowa Black FQ, на 3' конце (обозначенного с помощью "IB" в названии приведенных ниже субстратов). Расщепление субстратов контролировали при 530 нм (длина волны излучения FAM) с возбуждением при 485 нм (длина волны возбуждения FAM). Репортерные субстраты для данного примера показаны ниже с помощью последовательности от 5' к 3'. Основания, обозначенные строчными буквами, представляют РНК, а основания, обозначенные прописными буквами, представляют ДНК.
6.3. Последовательность-мишень и ПЦР-праймеры для амплификации RPL13a
Последовательность-мишень в данном примере являлась ПЦР-ампликоном гена RPL13a, полученным путем in vitro ПЦР-амплификации геномной ДНК человека, выделенной из клеточной линии IM9 (Promega) с применением олигонуклеотидных ПЦР-праймеров, перечисленные ниже. Репортерные субстраты для данного примера показаны ниже с помощью последовательности от 5' к 3'.
6.4. Компоненты реакции: Амплификация и измерение специфического и неспецифического расщепления универсальных субстратов
2
2
ПЦР-амплификацию и детектирование последовательности-мишени в режиме реального времени выполняли в общем объеме реакционной смеси 25 мкл. Все реакции проводили в системе для qΠЦΡ Мх3005Р (Мх3005Р QPCR system) (Stratagene). Параметрами циклов являлись 95°С в течение 2 минут, 40 циклов при 95°С в течение 15 секунд и при 52°С в течение 60 секунд (данные собирали при 52°С). Реакции разрабатывали с субстратами и компонентами рибозимов, приведенными в таблице 16 (см. в графической части). Каждый набор условий реакции тестировали дважды и он содержал 40 нМ 5RPL13a и 200 нМ 3RPL13a, 200 нМ компонента рибозимов А, 200 нМ компонента рибозимов В, 200 нМ субстрата, 8 мМ MgCl, 200 мкМ каждого dNTP, 10 единиц RNasin (Promega), 1 x Immobuffer (Bioline), 2 единицы ДНК-полимеразы MyTaqHS™ (Bioline) и либо матрицу геномной ДНК (50 нг), либо в нем отсутствовала мишень (NF-HO).
6.5. Результаты: Измерение специфического и потенциального неспецифического расщепления с помощью МНКзима
Увеличение флуоресценции присутствовало во всех реакциях, которые содержали геномную ДНК и универсальный субстрат с компонентами рибозимов, у которых субстрат-сенсорные плечи являлись полностью комплементарными универсальному субстрату (т.е. реакции, тестирующие на специфическое расщепление). Флуоресценция контролей без ДНК-мишеней была ниже, чем флуоресценция в реакциях, тестирующих на специфическое расщепление, демонстрируя, что увеличение флуоресценции в реакциях, тестирующих на специфическое расщепление, являлось следствием мишень-зависимой сборки каталитически активных МНКзимов, которые затем расщепляли полностью комплементарные универсальные репортерные субстраты.
Увеличение флуоресценции отсутствовало в любой реакции, тестирующей перекрестную реактивность (фигура 9, (i)b - (iv)b). Это демонстрирует, что компоненты рибозимов, сконструированные для расщепления данных близкородственных универсальных субстратов, расщепляли только субстраты, с которыми они обладали полной комплементарностью. Эти данные показывают, что данные универсальные субстраты являются сочетаемыми в анализах мультиплексной qΠЦΡ с использованием МНКзимов.
Пример 7: Тестирование на неспецифическое расщепление универсальных субстратов с помощью ДНКзимов
ДНКзим 10-23 является мономолекулярной структурой, которая может непосредственно связываться с и модифицировать последовательность субстрата. В отличие от МНКзима, ДНКзим 10-23 не нуждается в последовательности-мишени для образования активного центра, и, следовательно, связывание и последующее расщепление субстрата ДНКзимом 10-23 не зависит от последовательности-мишени или наличия расщепленного каталитического центра.
4
13
8
9
Степень комплементарности сенсорных плечей ДНКзимов с субстратом влияет на специфичность связывания. Полная комплементарность оснований, ближайших к рибонуклеотидам, является более решающей для специфического расщепления. Принципы конструирования для создания эффективно расщепляющихся универсальных субстратов включают ограничения вокруг состава последовательности универсальных субстратов, т.е. семь или более цитозиновых нуклеотидов в десяти основаниях, окружающих рибонуклеотиды (N-N); основания, непосредственно примыкающие к рибонуклеотидам, являются цитозинами (N и N); общее содержание субстрата включает > 64% пиримидинов. Эти ограничения могут приводить к подобиям в последовательности субстрата вблизи рибонуклеотидов и, возможно, приводить в результате к неспецифическому расщеплению универсального субстрата с помощью частично соответствующих ДНКзимов, особенно в мультиплексном формате, где присутствует целый ряд универсальных субстратов с ассоциированными с ними ДНКзимами в одной реакционной смеси. Если субстрат расщепляется неспецифическим образом с помощью частично соответствующих ДНКзимов, сконструированных для специфического расщепления второго субстрата, то данная конкретная комбинация субстратов не может подходить для применения в мультиплексном формате.
В данном примере, универсальные субстраты Sub55, Sub61, Sub72, Sub74, Sub75, Sub79, Sub80 и Sub85 и ассоциированные с ними ДНКзимы 10-23 тестировали на активность неспецифического расщепления. Это включало тестирование каждого универсального субстрата отдельно с ДНКзимами, сконструированными для связывания с полной комплементарностью со всеми другими субстратами с целью пронаблюдать, может ли детектироваться сигнал в изотермическом формате детектирования. Данные субстраты выбирали для тестирования, поскольку они обладают сходными последовательностями в различных областях субстрата.
7.1. Олигонуклеотиды ДНКзимов 10-23
ДНКзимы 10-23, применяемые в экспериментах, которые проводили для тестирования на неспецифическое расщепление с помощью некомплементарных ДНКзимов, перечислены ниже от 5' к 3', где подчеркнутые основания гибридизуются с субстратом, а основания, выделенные курсивом, образуют каталитический центр. Некоторые последовательности ДНКзимов, приведенные ниже, содержат дополнительный G на самых концах 5' и 3'. Эти дополнительные основания не гибридизуются с последовательностью субстрата и не влияют на эффективность, с которой ДНКзим расщеплял субстрат.
7.2. Репортерные субстраты

В настоящем примере в субстраты вводили концевые метки в виде фрагмента, являющегося 6-FAM, на 5' конце (обозначенного с помощью "F" в названии приведенных ниже субстратов) и фрагмента, являющегося гасителем флуоресценции Iowa Black FQ, на 3' конце (обозначенного с помощью "IB" в названии приведенных ниже субстратов). Расщепление субстратов контролировали в диапазоне 510-530 нм (диапазон длин волн излучения FAM на CFX96 (BioRad)) с возбуждением в диапазоне 450-490 нм (диапазон длин волн возбуждения FAM на CFX96 (BioRad)). Репортерные субстраты для данного примера показаны ниже с помощью последовательности от 5' к 3'. Основания, обозначенные строчными буквами, представляют РНК, а основания, обозначенные прописными буквами, представляют ДНК.
7.3. Компоненты реакции: Измерение специфического и потенциального неспецифического расщепления универсальных субстратов с помощью ДНКзима при 52°С и 58°С
2
2
2
Расщепление универсальных субстратов измеряли путем контроля флуоресцентного сигнала, вызванного связыванием и последующей модификацией субстрата с помощью ДНКзима. Расщепление универсального субстрата с помощью ДНКзима приведет к отделению флуорофора и гасителя, с получением увеличения флуоресценции. Все реакции, как указано в таблице 17 (см. в графической части), содержали 1х ПЦР-буфера II (Applied Biosystems), 10 мМ MgCl, 200 нМ субстрата и NF-HO в общем объеме 25 мкл. Каждую реакцию проводили в двух повторностях, либо как "тестовую" (добавление 10 нМ ДНКзима), либо как "контрольную" (добавление NF-HO) реакцию. Реакции проводили в системе детектирования ПЦР в реальном времени CFX96™ (BioRad) при 52 и 58°С. Считывание флуоресценции для каждой реакции запрограммировали через 1 секунду в течение первых 50 циклов, а затем запрограммировали считывание через 25 секунд в течение следующих 50 циклов.
7.5. Результаты: Измерение специфического и потенциального неспецифического расщепления универсальных субстратов с помощью ДНКзима
Увеличение флуоресценции присутствовало в каждой "тестовой" реакции, содержащей ДНКзимы и полностью комплементарные им субстраты. Увеличение флуоресценции отсутствовало в любой реакции, которая не содержала ДНКзим (без добавления ДНКзима). Это демонстрирует, что увеличение флуоресценции, полученное в ДНКзим-содержащих "тестовых" реакциях, происходило вследствие связывания и последующего каталитического расщепления репортерного субстрата с помощью ДНКзима.
По каждой совокупности данных субстрата (тестовые и контрольные реакции), исходные результаты наблюдений флуоресценции экспортировали в Excel (Microsoft), дублирующие значения усредняли и затем нормализовали. Нормализацию проводили путем деления каждого усредненного результата наблюдения на усредненное значение реакции без ДНКзима после первого считывания реакций, содержащих одинаковый субстрат (например, усредненную флуоресценцию тестовой реакции для Sub61 делили на усредненную флуоресценцию в цикле 1 (по истечении первых 8 секунд) реакции без ДНКзима для Sub61; усредненную флуоресценцию контрольной реакции без ДНКзима для Sub61 делили на усредненную флуоресценцию в цикле 1 контрольной реакции без ДНКзима). Эти нормализованные данные затем использовали для расчета отношения "сигнал/шум" на 10 минуте, путем деления тестовой нормализованной флуоресценции на 10 минуте на нормализованную флуоресценцию без ДНКзима на 10 минуте. Данный расчет отношения "сигнал/шум" проводили для каждой температуры. Отношение "сигнал/шум" затем представляли в виде гистограммы для сравнения эффективности расщепления каждого универсального субстрата с помощью каждого ДНКзима при различных тестируемых температурах (фигура 10, (i) и (ii)).
Некоторые реакции с различными комбинациями субстратов и некомплементарных ДНКзимов показали несколько повышенный уровень флуоресценции по сравнению с парной контрольной реакцией без ДНКзима. Данный сигнал не увеличивался с течением времени и, следовательно, не свидетельствует о расщеплении универсального субстрата с помощью некомплементарного ДНКзима. Графики детектирования, показывающие данную горизонтальную фоновую флуоресценцию, все показывали отношение "сигнал/шум" менее чем 1,2. Считалось, что любая реакция, демонстрирующая "сигнал/шум" выше 1,2, следовательно, либо (i) показывает расщепление универсального субстрата (либо специфическое, либо неспецифическое), либо (ii) показывает, что конкретная комбинация субстрата и некомплементарного ДНКзима создает уровень фонового шума, который не будет отличаться от специфического расщепления в мультиплексном формате.
Все комбинации универсальных субстратов с полностью соответствующими им ДНКзимами показали высокие отношения "сигнал/шум" (выше порогового значения 1,2) при обеих тестируемых температурах (фигура 10, (i) и (ii)).
Неспецифическое расщепление универсальных субстратов Sub61, Sub74, Sub75, Sub79 и Sub80 с помощью любого некомплементарного ДНКзима при обеих температурах отсутствовало (фигура 10, (i) и (ii)).
При 52°С некоторые универсальные субстраты расщеплялись с помощью ДНКзимов, которые не полностью соответствовали субстрату (когда расщепление определяется как отношение "сигнал/шум" выше порога 1,2, как описано выше). Комбинациями, демонстрирующими неспецифическое расщепление являлись Sub85, неспецифически расщепляемый с помощью Dz55, Sub72, неспецифически расщепляемый с помощью Dz74 и Dz85, и Sub55, неспецифически расщепляемый с помощью Dz85 (фигура 10, (i)).
Неспецифическое расщепление Sub55 с помощью Dz85 можно было бы ожидать, так как Sub55 и Dz85 отличаются только четырьмя основаниями. Выравнивание Sub55 с Dz85 показывает, что несовпадение четырех оснований находится на дистальном конце 3' субстратного плеча, далеко от критической области, примыкающей к рибонуклеотидам (таблица 18). Дополнительно, одно из 4 оснований является несовпадением G/T, которое, как известно в данной области, связывается с некоторой аффинностью, хотя и слабее, чем пары А/Т и G/C. Неспецифическое расщепление Sub85 с помощью Dz55 также может ожидаться, так как Sub85 и Dz55 отличаются только пятью основаниями, и данное несовпадение пяти оснований обнаруживается на дистальном конце 3' субстратного плеча, далеко от критической области, примыкающей к рибонуклеотидам (таблица 18). Однако в отличие от вышеописанного обратного сценария, несовпадения G/T отсутствуют и, следовательно, по-видимому, Sub85 не расщепляется так эффективно, как обратная комбинация Sub55 и Dz85. Неспецифическое расщепление Sub72 с помощью Dz74 можно было бы ожидать, так как Sub72 и Sub74 отличаются только 3 основаниями. Выравнивание Sub72 с Dz74 показывает, что два несовпадения, ближайших к рибонуклеотидам, являются несовпадениями G/T (Таблица 18). Это также объясняет, почему Sub74 не расщепляется с помощью Dz72, поскольку двумя несовпадениями являются С/А и находятся очень близко к рибонуклеотидам, и этого достаточно для отключения расщепления субстрата с помощью ДНКзима (таблица 18). Неспецифическое расщепление Sub72 с помощью Dz85 можно объяснить выравниванием последовательностей в таблице 18 (см. в графической части), которое показывает, что несовпадающие основания являются главным образом G/T, и следовательно, это приведет к связыванию и расщеплению Sub72 с помощью Dz85. Опять же, обратную ситуацию, при которой Dz72 неспецифически расщепляет Sub85, ожидать нельзя, поскольку соответствующие несовпадения становятся более дестабилизирующими С/А несовпадениями, которые вероятно не приведут к достаточно сильному связыванию между ДНКзимом и субстратом, чтобы привести к расщеплению.
Повышение температуры реакции до 58°С создало более строгие условия для гибридизации олигонуклеотидов и привело к исчезновению почти всего неспецифического расщепления, наблюдаемого при 52°С (фигура 10, (ii)). Единственной комбинацией универсального субстрата и ДНКзима, которая показала неспецифическое расщепление при 58°С, являлся Sub55, расщепляемый неспецифически с помощью Dz85. Данную неспецифичность следовало ожидать, так как Sub55 и Dz85 отличаются только четырьмя основаниями, и данное несовпадение четырех оснований находится на дистальном конце субстратного плеча, далеко от критической области, примыкающей к рибонуклеотидам, и одним из несовпадений является G/T (таблица 18). Несмотря на то, что существует только три основания, различных между Sub72 и Sub74, данное несовпадение трех оснований встречается в критической области, близкой к рибонуклеотидам, и, следовательно, является более критическим для специфичности и будет более дестабилизирующим при более высоких температурах, которые создают более жесткие условия для связывания олигонуклеотидов.
Данные результаты демонстрируют, что принципы конструирования создают универсальные субстраты, которые можно эффективно мультиплексировать в диапазоне температур для вариантов применения, вовлекающих ДНКзимы 10-23. Существует необходимость в некоторой оптимизации температуры реакции для получения достаточной точности связывания для некоторых комбинаций субстратов, но в целом данные принципы создают наборы субстратов, которые можно мультиплексировать. Специалисту в данной области очевидно, что длину субстратных плечей и связывающих плечей ДНКзима можно регулировать для создания более точного связывания при более низких и более высоких температурах.
Пример 8: Применение универсальных субстратов в мультиплексной qΠЦΡ с использованием МНКзимов для количественного определения пяти различных нуклеиновых кислот-мишеней в мультиплексной реакции при температурах отжига 52°С или 58°С.
Несколько мишеней можно одновременно амплифицировать и детектировать в режиме реального времени, применяя in vitro способы амплификации мишеней, такие как количественная ПЦР. Дополнительно, амплификацию мишеней можно одновременно контролировать в режиме реального времени в одной мультиплексной реакции, которая содержит несколько уникальных МНКзимов. Каждый МНКзим можно конструировать с сенсорными плечами, специфичными к одной мишени, и субстратными плечами, специфичными к уникальному представителю серии универсальных субстратов. Каждую мишень можно детектировать индивидуально, если каждый из серии универсальных субстратов помечен отличающимся флуорофором. Амплификацию и детектирование нескольких мишеней выполняют одностадийным способом, где ПЦР-амплификация и МНКзим-опосредованное детектирование происходят одновременно в одной пробирке. Контроль в режиме реального времени создает кривую амплификации, которая может показывать эффективность реакции посредством формы кривой (крутизна и скорость достижения горизонтального участка).
Температура отжига/детектирования qПЦР с использованием МНКзимов, применяемая в данной области составляет от 50 до 54°С. Данная температура продиктована тем, что универсальные субстраты, известные в данной области, имели ограничение температуры, при которой они эффективно расщеплялись, при этом 54°С является верхним пределом для эффективного расщепления универсальных субстратов серии 1. Существует потребность в панели универсальных субстратов, которые могут комбинироваться в мультиплексной реакции и эффективно расщепляться при более высоких температурах. Это не только позволяет повысить гибкость при конструировании праймеров и компонентов рибозимов, которые отжигаются при более высоких температурах, и воздействие на матрицы, богатые G/C, но также позволит мультиплексировать детектирование путем qΠЦΡ с использованием МНКзимов с другими химическими анализами в режиме реального времени, хорошо известными в данной области, такими как TaqMan , в котором стандартная температура отжига/детектирования колеблется 60-65°С. Полезность универсальных субстратов значительно увеличилась бы, если бы существовали субстраты, которые хорошо работали вместе в более широком диапазоне температур.
В данном примере проводили две мультиплексные реакции, при этом обе содержали МНКзимы, сконструированные для детектирования пяти различных мишеней, а именно человеческих генов TFRC, HPRT, ТР53, RPL13a и CYP2C9. В мультиплексной реакции 1 каждый МНКзим-мишень конструировали для расщепления одного из универсальных субстратов серии 1, Sub2, Sub3, Sub4, Sub6 и Sub7, и в мультиплексной реакции 2 каждый МНКзим-мишень конструировали для расщепления одного из улучшенных универсальных субстратов серии 2 или 3, Sub55, Sub61, Sub74, Sub79 и Sub80. Следует понимать, что в соответствии с данным способом можно использовать любое число мишеней, и что специалисты в данной области могут конструировать соответствующие компоненты рибозимов для детектирования любой мишени.
Данные две мультиплексные реакции сравнивали для определения эффективности расщепления каждого набора универсальных субстратов путем изучения формы кривой (крутизна и скорость достижения горизонтального участка). В данном примере амплификацию и детектирование сравнивают при температуре, благоприятной для всех субстратов, 52°С, и температуре за пределами эффективного диапазона для серии субстратов 1, 58°С.
8.1. Олигонуклеотиды компонентов рибозимов
Последовательности компонентов А и В рибозимов для каждой мишени перечислены ниже от 5' к 3'. Для каждой мишени компоненты рибозимов конструировали для применения с одним из исходных универсальных субстратов серии 1 и одним из новых улучшенных субстратов из серии 3. В следующих последовательностях подчеркнутые основания гибридизуются с субстратом. "-Р" означает 3' фосфорилирование олигонуклеотида.
8.2. Репортерные субстраты
В данном примере в каждой мультиплексной реакции пять различных универсальных субстратов применяли вместе в одной реакционной камере. Каждый универсальный субстрат в каждой мультиплексной реакции метили одним из пяти различных флуорофоров. В настоящем примере в субстраты вводили концевые метки в виде флуорофора на 5'-конце и концевые метки в виде фрагмента, являющегося гасителем флуоресценции, на 3'-конце (таблица 19). Расщепление субстратов контролировали при различных длинах волн возбуждения и излучения (см. таблицу 19 в графической части).
Репортерные субстраты, протестированные в данном примере, показаны ниже с помощью последовательности от 5' к 3'. Основания, обозначенные строчными буквами, представляют РНК, а основания, обозначенные прописными буквами, представляют ДНК.
8.3 Последовательности-мишени и ПЦР-праймеры для амплификации генов CYP2C9, ТР53, HPRT, TFRC и RPL13a
ПЦР ампликоны-мишени для всех пяти генов получали путем in vitro амплификации ДНК человека, выделенной из клеточной линии IM9 (Promega). Ампликоны получали с применением олигонуклеотидных ПЦР-праймеров, перечисленных от 5' к 3' ниже. Последовательность, выделенная жирным шрифтом, соответствует универсальной метке (Ш, U2 или U3), которая увеличивает Tm праймера, не влияя на специфичность праймера по отношению к гену-мишени. Данная метка повышает эффективность амплификации в ПЦР-реакциях.
8.4. Компоненты реакции: Амплификация и детектирование последовательностей-мишеней в мультиплексном формате qHIIP с использованием МНКзимов
2
2
Амплификацию и детектирование последовательностей-мишеней в режиме реального времени выполняли в общем объеме реакционной смеси 25 мкл. Все реакции проводили в системе детектирования ПЦР в реальном времени CFX96 (Bio-Rad). Параметрами циклов являлись либо 1) 95°С в течение 2 минут, 40 циклов при 95°С в течение 15 секунд и при 52°С в течение 60 секунд; либо 2) 95°С в течение 2 минут, 40 циклов при 95°С в течение 15 секунд и при 58°С в течение 60 секунд. Данные флуоресценции собирали на этапе, проводившемся либо при 52°С, либо при 58°С.Каждая мультиплексная реакция проводилась в двух повторностях и содержала 10 мМ MgCl, 200 мкМ каждого dNTP, 10 единиц ингибитора РНКазы Ribosafe (Bioline), 1 × Immobuffer (Bioline), 2 единицы MyTaqHS (Bioline). Обозначение компонентов рибозимов, праймеров и субстратов и их соответствующие концентрации являлись такими, которые перечислены в таблице 20. Реакции содержали либо матрицу ДНК (100 нг или 391 пг), либо контроль без мишени (NF-HO).
Мультиплексные реакции разрабатывали с праймерами, субстратами и ассоциированными с ними компонентами рибозимов, приведенными в таблице 20 в графической части (мультиплексная реакция 1 или мультиплексная реакция 2). Для обеих мультиплексных реакций применяли одинаковые ПЦР-праймеры, и все компоненты рибозимов обладали одинаковыми мишень-распознающими участками. Любые различия в эффективности реакций, детектирующих одну и ту же мишень, следовательно, будут объясняться различиями в эффективности расщепления субстратов.
8.5. Результаты: Амплификация мишени и расщепление репортерного субстрата в мультиплексном формате qΠЦΡ с использованием МНКзимов
Каждая мультиплексная реакция, содержащая геномную ДНК человека, показала увеличение флуоресценции с течением времени при детектировании в режиме реального времени генов CYP2C9, ТР53, HPRT, RPL13a и TFRC. Для всех реакций флуоресценция контроля без ДНК являлась ниже, чем флуоресценция в реакциях, содержащих ДНК-мишень. Это демонстрирует, что увеличение флуоресценции, полученной в реакциях, содержащих мишень, связано с мишень-зависимой сборкой каталитически активных МНКзимов, которые затем расщепляли один из универсальных субстратов.
Графики амплификации генов CYP2C9, ТР53, HPRT, RPL13a и TFRC при 52°С показали, что мультиплексная реакция 2 (фигура 11, (i)), которая использовала новые улучшенные универсальные субстраты серии 2 и 3, имела более крутые кривые, которые достигали горизонтального участка быстрее, чем те, которые наблюдались для мультиплексной реакции 1 (фигура 11, (i)), которая использовала универсальные субстраты серии 1. Существовало только небольшое различие в графиках амплификации для детектирования TFRC с помощью Sub2 по сравнению с Sub74 при 52°С. Специалисту в данной области будет понятно, что все графики амплификации мультиплексной реакции 1, использующей субстраты серии 1 по сравнению с субстратами серии 2 и 3, достаточно хорошего качества, чтобы полностью приниматься в данной области для детектирования данных мишеней.
Графики амплификации генов CYP2C9, ТР53, HPRT, RPL13a и TFRC при 58°С показали, что мультиплексная реакция 2 (фигура 11, (ii)), которая использовала новые улучшенные универсальные субстраты серии 2 и 3, имела значительно более крутые кривые и достигала горизонтального участка существенно быстрее, чем мультиплексная реакция 1 (фигура 11, (ii)), которая использовала универсальные субстраты серии 1. Дополнительно, специалист в данной области должен сознавать, что кривые амплификации, полученные с использованием Sub2, Sub3, Sub6 и Sub7 в мультиплексной реакции 1, могут не иметь достаточного качества для устойчивого детектирования мишеней, и следовательно, могут не являться в целом приемлемыми в данной области.
В целом, новые субстраты серии 2 и 3 показывают улучшение качества, и следовательно, устойчивость данных мультиплексных реакций при температурах, используемых в настоящее время в реакциях qΠЦΡ с использованием МНКзимов, и позволяют проводить мультиплексное детектирование при температуре, значительно превышающей ранее эффективную. Новые принципы конструирования повышают вероятность конструирования универсальных субстратов, которые увеличивают возможность мультиплексирования при температурах, используемых в настоящее время для qПЦР с использованием МНКзимов, и которые дают устойчивые данные при более высоких температурах реакции.
Пример 9: Применение универсальных субстратов, сконструированных для функционирования при различных температурах с МНКзимами в ПЦР в реальном времени.
С использованием нового ряда принципов конструирования изобрели новую серию высокоактивных субстратов для применения с ДНКзимом 10-23 или МНКзимом на основе ДНКзима 10-23.
МНКзимы могут специально создаваться для получения выявляемого эффекта посредством расщепления или лигирования субстрата при различных температурах. Эффективностью и жесткостью каталитической активности МНКзима или ДНКзима можно управлять, изменяя температуру реакции. Другим способом оптимизации эффективности и жесткости каталитической активности является модификация Tm и/или длины субстрата (субстратов) и соответствующих компонентов рибозимов или соответствующего ДНКзима. Tm субстрата можно повысить добавлением нуклеотидов к 5' и/или 3' концам последовательности субстрата. Данные изменения можно выполнять в рамках принципов конструирования. Нуклеотиды, выбранные для такого удлинения, также могут оказывать воздействие на Тт.Добавление дополнительных G или С оснований к 3' или 5' концу окажет большее влияние на Tm, чем добавлением дополнительных А или Τ оснований. Аналогичным образом, Tm субстратов можно снижать путем удаления нуклеотидов с 3' или 5' конца. Компоненты рибозимов МНКзимов и ДНКзимы можно усекать или удлинять для соответствия скорректированной последовательности субстрата.
В данном примере длину и состав оснований субстрата серии 2, Sub55, модифицировали с получением ряда производных субстратов с различными Tm (см. таблицу 21 в графической части). Модификации включали усечение субстрата путем удаления от одного до трех нуклеотидов с каждого из 5' и 3' концов; удлинение субстрата путем добавления нуклеотидов как на 5', так и 3' конец. Эффект добавления различных нуклеотидов для получения такого удлинения также тестировался путем конструирования субстратов с дополнительными либо А, либо С нуклеотидами на 5' и 3' концах. Полученные субстраты затем тестировали в реакции qΠЦΡ с использованием МНКзимов для оценки гибкости конструирования производных субстратов и их полезности в диапазоне температур. ПЦР-амплификацию и МНКзим-опосредованное детектирование проводили одностадийным способом, где ПЦР-амплификация и МНКзим-опосредованное детектирование происходят одновременно в одной пробирке. Эффективность расщепления субстратов может измеряться с помощью значения Ct, получаемого при нескольких температурах отжига. Реакции, которые дают меньшее значение Ct, показывают более эффективное расщепление специфического субстрата, поскольку такие реакции быстрее достигают порогового цикла.
9.1. Олигонуклеотиды компонентов рибозимов
В экспериментах, проводимых для измерения степени каталитической активности Sub55 и его производных, описанных в таблице 21, сконструировали олигонуклеотиды компонентов А и В рибозимов с мишень-сенсорными плечами, комплементарными гену TFRC человека. Последовательности компонентов А и В рибозимов перечислены ниже от 5' к 3', где подчеркнутые основания гибридизуются с субстратом. "-Р" означает 3' фосфорилирование олигонуклеотида.
9.2. Репортерные субстраты
В настоящем примере в субстраты вводили концевые метки в виде фрагмента, являющимся Quasar 670, на 5' конец и фрагмента, являющегося BHQ2, на 3' конец. Расщепление субстратов контролировали при 665 нм (длина волны излучения Quasar 670) с возбуждением при 635 нм (длина волны возбуждения Quasar 670). Репортерные субстраты, тестируемые в данном примере, показаны ниже с помощью последовательности от 5' к 3'. Основания, обозначенные строчными буквами, представляют РНК, а основания, обозначенные прописными буквами, представляют ДНК.
9.3. Последовательность-мишень и ПЦР-праймеры для амплификации TFRC
Последовательностью-мишенью в данном примере являлся ПЦР-ампликон, полученный путем in vitro амплификации человеческой геномной ДНК, извлеченной из клеточной линии IM9 (Promega) с использованием олигонуклеотидных ПЦР-праймеров, перечисленных ниже. Последовательности праймеров приведены от 5' к 3'.
9.4. Компоненты реакции: Амплификация и детектирование последовательности-мишени
Амплификацию и детектирование последовательности-мишени в режиме реального времени выполняли в общем объеме реакционной смеси 25 мкл. Все реакции проводились в системе для qПЦР Мх3005Р (Мх3005Р QPCR system) (Stratagene/Agilent). Параметры циклов изменялись в отношении температуры отжига (подчеркнуто, как следует ниже), и составляли либо,
1) 95°С в течение 10 минут, 5 циклов при 95°С в течение 15 секунд и при 55°С в течение 30 секунд, 50 циклов при 95°С в течение 15 секунд и при 50°С в течение 60 секунд, либо
2) 95°С в течение 10 минут, 5 циклов при 95°С в течение 15 секунд и при 55°С в течение 30 секунд, 50 циклов при 95°С в течение 15 секунд и при 52°С в течение 60 секунд, либо
3) 95°С в течение 10 минут, 5 циклов при 95°С в течение 15 секунд и при 55°С в течение 30 секунд, 50 циклов при 95°С в течение 15 секунд и при 55°С в течение 60 секунд, либо
4) 95°С в течение 10 минут, 5 циклов при 95°С в течение 15 секунд и при 55°С в течение 30 секунд, 50 циклов при 95°С в течение 15 секунд и при 60°С в течение 60 секунд.
2
2
Все данные флуоресценции собирали при температуре отжига. Реакции разрабатывали с субстратами и ассоциированными с ними компонентами рибозимов, приведенными в таблице 22 (см. в графической части). Каждый набор условий реакции проводили дважды и он содержал 40 нМ 5TFRC, 200 нМ 3TFRC, 200 нМ каждого из компонента А рибозима и компонента В рибозима, 200 нМ субстрата, 8 мМ MgCl, 200 мкМ каждого dNTP, 10 единиц Rnasin (Promega), 1 × Immobuffer (Bioline), 1 единицу Immolase (Bioline) и либо матрицу геномной ДНК (100 нг),-либо в нем отсутствовала мишень (NF-HO). Разрабатывали отдельные реакции для тестирования каждого субстрата с соответствующими ему компонентами рибозимов. Одинаковые ПЦР-праймеры применяли для всех реакций, и все компоненты рибозимов обладали одинаковыми мишень-распознающими участками. Любые различия в эффективности реакций, следовательно, будут объясняться различиями в эффективности расщепления субстратов при различных температурах.
9.5. Результаты: Амплификация мишени и расщепление репортерного субстрата
Каждая реакция, содержащая геномную ДНК человека, показала увеличение флуоресценции с течением времени при детектировании гена TFRC в режиме реального времени с использованием Sub55 и различных производных. Флуоресценция контроля без ДНК-мишени была ниже, чем флуоресценция в реакциях, содержащих ДНК-мишень. Это демонстрирует, что увеличение флуоресценции, полученной в мишень-содержащих реакциях, связано с мишень-зависимой сборкой каталитически активных МНКзимов, которые затем расщепляли один из универсальных субстратов.
Эффективность реакций, измеряемая с помощью Ct, зависела от совместимости температуры реакции (температуры отжига/расщепления) и Tm субстрата, используемого в реакции. Различные производные Sub55 обладают различной длиной и нуклеотидными составами и, таким образом, различными температурами плавления (Tm) и, следовательно, должны показывать разные результаты при различных тестируемых температурах отжига (50, 52, 55 и 60°С). Результаты, приведенные в таблице 23, показывают Ct для каждого субстрата при различных температурах реакции. Значения Ct, выделенные жирным шрифтом, показывают субстрат (субстраты), которые работали наиболее эффективно при указанных температурах.
При более низких температурах более короткий субстрат (Sub55(18)) работал лучше (обладал наименьшим значением Ct). С увеличением температуры отжига субстраты с увеличенной длиной и, следовательно, Tm, работали оптимально. Специалист в данной области может получить производные субстратов, которые могут эффективно расщепляться при выбранной температуре реакции, путем удлинения или укорачивания субстратных плечей на 5'- и/или 3'-концах, и/или изменения нуклеотидного состава на 5'- и 3'-концах субстрата.
Пример 10: Применение универсальных субстратов в qΠЦΡ с использованием МНКзимов при температуре отжига 58°С.
МНКзимы могут применяться для контроля амплификации нуклеиновых кислот-мишеней в режиме реального времени с использованием in vitro способов амплификации мишеней, таких как ПЦР. Более того, мониторинг в реальном времени в ходе qΠЦΡ с использованием субстратов с МНКзимами, меченых парами флуорофора и гасителя флуоресценции, создает кривую, на которой пороговую линию, произвольного уровня флуоресценции, можно поместить над экспоненциальной фазой реакций, получая значение, которое может называться Ct (порог цикла). Реакции, которые дают меньшее значение Ct, свидетельствуют о более эффективном расщеплении специфического субстрата, поскольку такие реакции достигают порогового цикла быстрее. В данном примере амплификацию и детектирование выполняют одностадийным способом, где ПЦР-амплификация и МНКзим-опосредованное детектирование происходят одновременно в одной пробирке. При всех одинаковых других условия реакции значение Ct может зависеть от последовательности универсального субстрата. Температура отжига/детектирования для цПЦР с использованием МНКзимов, используемая в данной области, составляет от 50 до 54°С. Такая температура продиктована тем фактом, что для универсальных субстратов, известных в данной области, существовало ограничение температуры, при которой они эффективно расщеплялись, при этом 54°С являлось верхним пределом для универсальных субстратов серии 1. Существует необходимость в универсальных субстратах, которые расщепляются при более высоких температурах, для обеспечения большей гибкости в конструировании праймеров и компонентов рибозимов, которые отжигаются при более высоких температурах. Такая гибкость конструирования для праймеров и компонентов рибозимов может принести большую пользу для многих вариантов применения, таких как представляющие интерес генетические мишени, у которых высокий процент оснований G и С в их последовательности, которые требуют более высоких температур реакции и, следовательно, компоненты рибозимов и праймеры с более высокими Tm для специфического детектирования.
4
13
8
9
Исследование эффективности расщепления субстратов, основанное на характеристиках субстратов серии 1 и 2, приводит к разработке принципов для содействия в третьем раунде конструирования субстратов, приводящих к получению субстратов серии 3. Данные принципы включали без ограничений (i) семь или более цитозиновых нуклеотидов в десяти основаниях, окружающих рибонуклеотиды (N-N), (ii) основания, непосредственно примыкающие к рибонуклеотидам, являются цитозинами (N и N) (iii) общее содержимое субстрата включает > 64% пиримидинов и (iv) общая Tm олигонуклеотида составляет 66°С или выше (где данный последний принцип применим, только если температура реакции для расщепления субстрата выше 50°С).
В данном примере универсальный субстрат серии 2, Sub59, сравнивают с субстратом серии 3, Sub77, для сравнения эффективности расщепления в ПЦР в реальном времени при 58°С для подтверждения того, что принципы конструирования создают универсальные субстраты с высокой вероятностью применимости в qΠЦΡ с использованием МНКзимов при повышенной температуре. Уровень эффективности расщепления определяли путем измерения значения Ct для реакций, содержащих различные универсальные субстраты.
10.1. Олигонуклеотиды компонентов рибозимов
В экспериментах, проведенных для измерения эффективности расщепления универсальных субстратов серии 2 и серии 3 в ПЦР в реальном времени, все олигонуклеотиды компонентов рибозимов А и В сконструировали с сенсорными плечами, комплементарными одной и той же последовательности гена TFRC человека. Последовательности компонентов рибозимов А и В перечислены ниже от 5' к 3', где подчеркнутые основания гибридизуются с соответствующим им универсальным субстратом. "-Р" означает 3' фосфорилирование олигонуклеотида.
10.2. Репортерные субстраты

Репортерные субстраты для данного примера показаны ниже с помощью последовательности от 5' к 3'. Основания, обозначенные строчными буквами, представляют РНК, а основания, обозначенные прописными буквами, представляют ДНК. В настоящем примере в субстраты вводили концевые метки в виде фрагмента, являющимся 6-FAM, на 5' конце (обозначенного с помощью "F" в названии приведенных ниже субстратов) и фрагмента, являющегося гасителем флуоресценции Iowa Black FQ, на 3' конце (обозначенного с помощью "IB" в названии приведенных ниже субстратов). Расщепление субстратов контролировали при 530 нм (длина волны излучения FAM на Мх3005Р (Stratagene)) с возбуждением при 485 нм (длина волны возбуждения FAM на Мх3005Р (Stratagene)).
10.3. Последовательность-мишень и ПЦР-праймеры для амплификации TFRC
Последовательность-мишень в данном примере являлась ПЦР-ампликоном гена TFRC, полученным путем in vitro амплификации человеческой геномной ДНК, извлеченной из клеточной линии IM9 (Promega), с применением олигонуклеотидных ПЦР-праймеров, перечисленные ниже. Последовательности праймеров приведены от 5' к 3'.
10.4. Компоненты реакции: Амплификация и количественное определение последовательности-мишени
2
2
ПЦР-амплификацию и детектирование последовательности-мишени в режиме реального времени выполняли в общем объеме реакционной смеси 25 мкл. Все реакции проводили в системе для qΠЦΡ Мх3005Р (Мх3005Р QPCR system) (Stratagene). Реакции разрабатывали с субстратами и ассоциированными с ними компонентами рибозимов, приведенными в таблице 24 (см. в графической части). Параметрами циклов являлись 95°С в течение 2 минут, 40 циклов при 95°С в течение 15 секунд и при 58°С в течение 60 секунд (данные собирали на этапе, проводившемся при 58°С). Каждый набор условий реакции повторяли дважды и он содержал 40 нМ 5 TFRC и 200 нМ 3TFRC, 200 нМ каждого из компонента А рибозима и компонента В рибозима, 200 нМ субстрата, 8 мМ MgCl, 200 мкМ каждого dNTP, 10 единиц RNasin (Promega), 1 × Immobuffer (Bioline), 2 единицы ДНК-полимеразы MyTaqHS™ (Bioline) и либо матрицу геномной ДНК (50 нг), либо в нем отсутствовала мишень (NF-HO).
10.5. Результаты: Амплификация мишени и расщепление репортерного субстрата
Каждая реакция цПЦР с использованием МНКзимов, содержащая геномную ДНК человека, показала увеличение флуоресценции с течением времени при детектировании TFRC из геномной ДНК человека в режиме реального времени. Во всех реакциях флуоресценция контроля без ДНК-мишени была ниже, чем флуоресценция в реакциях, содержащих ДНК-мишень. Это демонстрирует, что увеличение флуоресценции, полученной в мишень-содержащих реакциях, связано с мишень-зависимой сборкой каталитически активных МНКзимов, которые затем расщепляли один из универсальных репортерных субстратов.
Реакции с субстратом серии 2, Sub59, показали усредненное значение Ct 28,5, в то время как реакции с субстратом серии 3, Sub77, показали усредненное значение Ct 26,5.
4
13
8
8
8
Следует отметить, что Sub59 и Sub77 обладают одинаковыми Tm и %С/Т, но различаются количеством цитозинов в центральной области N-N и составом N. В центральной области, окружающей рибонуклеотиды, в Sub77 находится цитозин в положении N, что, по-видимому, привело к повышению эффективности расщепления по сравнению с Sub59, на что указывает более низкое значение Ct (26,5). Sub59 содержит тимин в положении N и дополнительный цитозин на дистальном конце 5' плеча, что привело к реакции со сниженным расщеплением и, следовательно, более высокому значению Ct (28,5).
4
13
8
9
Следует отметить важность природы нуклеотидной последовательности эффективно расщепляющегося субстрата и близость специфических нуклеотидов к рибонуклеотидам субстратов. Данные особенности составляют основу совокупности руководящих принципов, которые приводят к получению универсальных субстратов, которые с более высокой вероятностью эффективно расщепляются при повышенных температурах. Данные принципы конструирования включают без ограничений (не все могут оказаться необходимыми) (i) семь или более цитозиновых нуклеотидов в десяти основаниях, окружающих рибонуклеотиды (N-N); (ii) основания, непосредственно примыкающие к рибонуклеотидам, являются цитозинами (N и N); (iii) общее содержимое субстрата включает > 64% пиримидинов; (iv) общая Tm олигонуклеотида составляет 66°С или выше (где данный последний принцип применим, только если температура реакции для расщепления субстрата выше 50°С) (таблица 25). Следует ожидать ранее полученное значение Ct для субстрата серии 3, Sub77, так как данный субстрат удовлетворяет всем данным принципам конструирования, в то время как Sub59 удовлетворяет только двум из данных принципов конструирования (см. таблицу 25 в графической части).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Международная публикация РСТ № WO/2007/041774
Международная публикация РСТ № WO/2008/040095
Международная публикация РСТ№ WO/2008/122084
Патент США №4683202
Патент США №4683195
Патент США №4800159
Патент США №4965188
Патент США №5176995
Публикация США №2007-0231810
Публикация США №2010-0136536
Публикация США №2011-0143338
Cairns, M.J, Hopkins, Т.М., Witherington, G., Wang, L. and Sun, L (1999) Target site selection for an RNA-cleaving catalytic DNA. Nat. Biotech. 17: 480-486.
Cruz, R.P., Withers, J.В. and Li, Y. (2004) Dinucleotide junction cleavage versatility of 8-17 deoxyribozyme. Chem Biol. Jan; 11(1): 57-67.
Perreault, J., Labuda, D., Usman, N., Yang, J. and Cedergren, R. (1991) Relationship between 2'-hydroxyls and magnesium binding in the hammerhead RNA domain: a model for ribozyme catalysis. Biochemistry 30(16): 4020-5.
Perreault, J., Wu, T., Cousineau, В., Ogilvie, K. and Cedergren, R. (1990) Mixed deoxyribo- and ribo-oligonucleotides with catalytic activity. Nature 344(6266): 565-7.
x
Silverman, S. (2004) Breaking up is easy to do (if you're a DNA enzyme that cleaves RNA). Chem Biol. Jan; 11(1): 7-8.Wallace, R.B., Shaffer, J., Murphy, R.F., Bonner, J., Hirose, T. and Itakura K. (1979) Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to φ174 DNA: the effect of single base pair mismatch. Nucl. Acids Res. 6(11): 3543-3558.
Zaborowska, Z., Furste, J., Erdmann, V. and Kurreck, J. (2002) Sequence requirements in the catalytic core of the "10-23" DNA enzyme. J Biol Chem. 277(43): 240617-22.