Выделение свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина в онтогенезе растений хлопчатника

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН ____________________________________2009, том 52, №2________________________________

БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ

УДК 581.1:577.1

М.А.Бабаджанова, А.К.Мирзорахимов, М.П.Бабаджанова*, Ш.А.Эсаналиева*, член-корреспондент АН Республики Таджикистан К.А.Алиев* ВЫДЕЛЕНИЕ СВОБОДНЫХ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦИКЛА КАЛЬВИНА В ОНТОГЕНЕЗЕ РАСТЕНИЙ ХЛОПЧАТНИКА

К настоящему времени большим количеством экспериментальных данных доказано, что ферменты цикла Кальвина могут образовывать мультиферментные комплексы с различным числом ферментов - от двух до восьми, и, следовательно, эти комплексы будут различаться по молекулярной массе и функциональным свойствам [1-3].

Из листьев хлопчатника были выделены свободные мультиферментные комплексы с молекулярной массой 520 и 240 кД [4]. Мультиферментный комплекс с молекулярной массой 240 кД был выделен в денатурирующих условиях, как и комплекс из листьев шпината с молекулярной массой 284 кД [5]. Разные величины молекулярных масс мультиферментных комплексов, выделенных в денатурирующих условиях из листьев шпината и хлопчатника, могут быть обусловлены как спецификой объектов, так и различиями в методике выделения и очистке комплексов. Денатурирующие условия при выделении мультиферментных комплексов были использованы по аналогии с изменениями условий в клетке (pH, ионной силы, концентрации различных метаболитов, температуры и т.д.), когда происходит диссоциация белков олигомеров на составляющие их компоненты [6, 7].

При сравнительном исследовании онтогенетических изменений функциональной активности мультиферментных комплексов с молекулярной массой 520 и 240 кД обнаружено, что наибольшие величины ферментативных активностей комплексы проявляли в фазах бутонизации и цветения растений [4]. Для хлопчатника наиболее высокие величины интенсивности фотосинтеза, содержания водорастворимых белков и активности ферментов карбоксили-рующей фазы фотосинтеза - рибозофосфатизомеразы (РФИ, КФ 5.3.1.6); фосфорибулокиназы (ФРК,КФ2.7.1.19) и рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (РБФК/О, КФ 4.1.1.39) характерны также для этих фаз развития растений [8-10].

Ранее [4, 11] при выделении из листьев хлопчатника в фазах бутонизации и цветения мультиферментного комплекса в обычных щадящих условиях на профиле элюции свободных белков при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе суммарный белок выходил в виде двух отчётливых пиков, резко различавшихся по содержанию белка. Фракция с наибольшим содержанием белка представляла собой мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД. У фракции с меньшим содержанием белков нами не были определены ни величина молекулярной массы, ни ферментативные активности.

В работе [12] установлено, что свободные мультиферментные комплексы цикла Альвина элюировались в широком диапазоне концентраций KCL - 0-600 мМ. Молекулярная масса мультиферментных комплексов составляла от 200 до 1000 кД. Для того чтобы показать, что эти мультиферментные комплексы существуют in vivo в неочищенных хлоропластных экстрактах, не имеют артефактное происхождение, не являются результатом процедуры выделения и очистки, был проведён иммунноблот-анализ. Aнализ показал, что ферменты цикла Альвина в неочищенных хлоропластных экстрактах образуют мультиферментные комплексы в самых разнообразных сочетаниях. ^оме того, антитела реагировали со своими ферментами и в мультиферментном комплексе, выделенном при нативном nAAr -электрофорезе [5, 12].

Нами были выделены мультиферментные комплексы в онтогенезе растений, исследованы и сравнены активности трёх ферментов: рибозофосфатизомеразы (РФИ, KФ 5.3.1.6), фосфорибулокиназы (ФР^ KФ2.7.1.19), рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы

(РБФ^О, KФ 4.1.1.39) во всех отчётливых пиках, полученных при ионообменной хроматографии свободных белков из листьев хлопчатника.

Материал и методы исследований

Растения хлопчатника (Gossypium hirsutum L.) сорта 108-Ф выращивали в полевых условиях с выполнением всех агротехнических мероприятий на экспериментальном участке Института физиологии растений и генетики AH Республики Таджикистан.

Объектом исследования служили наиболее фотосинтетически активные листья - 3-4-ый сверху (15-25-дневного возраста), взятые у растений в фазах 5-6-ти настоящих листьев, массовой бутонизации и цветения.

Получение ферментных препаратов и их очистка. При выделении свободного мультиферментного комплекса фрагменты листьев (50 г) без срединной жилки выдерживали при -5°С в течение 30 мин., затем измельчали и гомогенезировали в охлаждённой фарфоровой ступке с 75 мл 0.1М Трис-HCL буфера, рН 8.5, содержащего 10 мМ дитиотрейтола (ДТТ), 10 мМ MgCl2, 5 мМ ^3,TA, 10 мМ NaHCO3, 20 мМ NaCL и 1% поливинилпирролидон, 25000 (ПВП) (буфер A). Гомогенат фильтровали через капроновую ткань и центрифугировали в течение 30 мин при 15000 g на центрифуге с охлаждением марки K-24 (VEB MLV, «Medizin technic», Германия); осадок отбрасывали. Супернатант наносили на колонку с молекулярным ситом Сефадекс G-50 (60*2 см), уравновешенную буфером того же состава, с которым растирали листья, но при pH 8.0 и без ПВП (буфер Б). Элюат фракционировали сульфатом аммония. Фракцию белков, осаждённых при 35-50%-ом насыщении сульфатом аммония, подвергали очистке сначала на колонке с сефадексом G-150 (45*2.5 см), затем на колонке с ДЭAЭ-целлюлозой (20*3 см) в условиях, подробно описанных в работе [10].

Количественное определение содержания белка. Содержание белка определяли с реактивом Бенедикта [11].

Определение активности рибозофосфатизомеразы. Активность РФИ определяли по методу [12, с.84].

Определение активности фосфорибулокиназы При определении активности ФРК использовали метод[12, с. 89].

Определение карбоксилазной активности рибулозобисфосфаткарбоксилазы/ ок-сигеназы. Карбоксилазную активность РБФК/О определяли спектрофотометрически по методике, описанной Романовой [12, с. 51]. Аналитический диск-электрофорез в 7.5%-ном ПААГ использовали для определения гомогенности ферментных препаратов и их молекулярных масс.

Результ а ты и их обсуждение

При ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе свободных белков, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф в фазе 5-6 настоящих листьев, суммарный белок выходил в виде одного отчётливого пика (рис. 1), а в фазах массовой бутонизации и цветения белки элюировались в виде двух отчётливых пиков, резко различавшихся по содержанию белка (рис.2). При выделении свободного мультиферментного комплекса из листьев хлопчатника в фазе массового цветения профиль элюции белков был идентичен. Фракции с наибольшим содержанием белков из обоих пиков брали для определения молекулярной массы и

активности ферментов.

Рис.1. Профиль элюции белков (1), выделенных их листьев хлопчатника в фазе 5-6 настоящих листьев, при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе с линейным градиентом №С1 (2) после гель-хроматографии на Sephadex 0-150.

Рис.2. Профиль элюции белков (1), (2), выделенных их листьев хлопчатника в фазе бутонизации, при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе с линейным градиентом №С1 (2) после гель-хроматографии на Sephadex 0-150.

123456789 10

Номер фракции

Молекулярная масса белка из первого пика составляла 520±20 кД, а белка из второго пика - 480±15 кД.

Таблица 1

Ферментативная активность мультиферментных комплексов с различными величинами мо-

лекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника

Мол.м., Тип активности Субстрат Активность в различные фазы развития, мкмоль продукта/

кД 5-6 настоящих листьев бутонизация цветение

520 рибозофосфатизо- рибозо-5- 2673 ± 16 3080± 18 3376±20

480 меразная (РФИ) фосфат не обнаружен 3041± 17 3345 ±20

520 фосфорибулокиназная рибозо-5- 3490±21 4185±26 4432 ± 28

480 (ФРК) фосфат + АТФ не обнаружен 3597± 21 3794 ± 25

520 рибулозо-5- 3122±19 3604 ± 24 3715 ±23

480 фосфат + АТФ не обнаружен 3412±20 3518±22

520 рибулозобисфосфат- рибозо-5- 1.38 ± 0.01 1.92 ± 0.01 2.33 ± 0.01

480 карбоксилазная (РБФК) фосфат + АТФ не обнаружен 1.68 ± 0.01 2.11 ± 0.01

520 480 РБФ 1.14 ± 0.01 не обнаружен 1.55 ± 0.01 1.45 ± 0.01 1.86 ± 0.01 1.74 ± 0.01

Из представленных в табл. 1 данных видно, что во все фазы развития растений активности ФРК и РБФК/О мультиферментных комплексов были выше при использовании рибозо-5-фосфата + АТФ, а не в присутствии собственных субстратов - рибулозо-5-фосфата + АТФ и

ей

И

ч

и

ю

и

к

К

СР

и

«

о

о

500

400

300

о 200 £

100

РБФ. По сравнению с фазой 5-6 настоящих листьев в фазе массовой бутонизации активность РФИ мультиферментного комплекса с молекулярной массой 520 кД возросла на 16%. Величина активности ФРК этого мультиферментного комплекса при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата + АТФ была выше на 20%, а в присутствии собственного субстрата рибулозо-5-фосфата + АТФ - на 15%. Карбоксилазная активность мультиферментного комплекса в присутствии рибозо-5-фосфата + АТФ увеличилась на 39%, при использовании же собственного субстрата РБФ - на 36%. В фазах массовой бутонизации и цветения обнаружен мультиферментный комплекс с молекулярной массой 480 кД.

По сравнению с фазой бутонизации в фазе цветения активность РФИ у обоих мульти-ферментных комплексов увеличилась на 10%. Активность ФРК у обоих мультиферментных комплексов в присутствии рибозо-5-фосфата + АТФ возросла на 6%, в присутствии собственного субстрата активность мультиферментных комплексов увеличилась на 3%. Активность же РБФК/О с молекулярной массой 520 кД независимо от субстрата была выше на 2021%, а мультиферментного комплекса с молекулярной массой 480 кД в присутствии собственного субстрата - также увеличилась на 20%, а при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата + АТФ - на 26%.

Таким образом, независимо от величины молекулярной массы ферментативная активность мультиферментных комплексов была наибольшей в фазе цветения растений.

В фазах бутонизации и цветения мультиферментные комплексы почти не различались между собой по активности РФИ. Активность ФРК мультиферментного комплекса с молекулярной массой 520 кД была выше активности мультиферментного комплекса с молекулярной массой 480 кД в присутствии рибозо-5-фосфата + АТФ на 16-17%, а при использовании собственного субстрата рибулозо-5-фосфата + АТФ - на 6%. По карбоксилазной активности мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД превосходил мультиферментный комплекс с молекулярной массой 480 кД в присутствии рибозо-5-фосфата + АТФ в фазе бутонизации на 14%, а в фазе цветения - на 10%. Активность РБФК/О мультиферментного комплекса с молекулярной массой 520 кД при использовании собственного специфического субстрата РБФ на обоих фазах развития растений была выше активности мультиферментного комплекса с молекулярной массой 480 кД на 6-7%.

Из приведенных в табл. 2 данных видна чёткая зависимость кинетических параметров РБФК/О (Утах, Кт) от её структурной организации. Свободная РБФК/О, выделенная из листьев шпината [13], имела восемь больших (Ь) и восемь малых ^) субъединиц Ь^8 и обладала в сравнении с РБФК/О, встроенной в мультиферментный комплекс и имевшей структуру Ь^4, вдвое меньшим сродством (Кт) к своему субстрату РБФ и в пять раз меньшую максимальную скорость (Утах) в расчёте на один активный центр.

Таблица 2

Структурная организация и функциональные свойства свободной РБФК/О и встроенной в

мультиферментные комплексы

Объекты Мол.м., кД Структура Субстрат V max АЦ/сек Km,

шпинат [13] хлопчатник [14] 520 520 520 свободная Ьв S8 свободный МФК L2S4 свободный МФК L2S4 РБФ І.57 7.І3 8.43 0.І4 0.07 0.08

Vmax мкмоль продукта/

хлопчатник [4, І5, Іб] 240 свободный МФК РБФ І.9б 0.0б

520 й ы нК 4 д S О ^ сч бо М L2 о в с РБФ рибозо-5-фосфат +АТФ 2.53 3.32 0.07 0.05

б40 мембрано- связанный МФК РБФ рибозо-5-фосфат +АТФ 3.7б 5.9І 0.05 0.04

Сравнение кинетических параметров РБФК/О из листьев хлопчатника [14,16], встроенной в различные мультиферментные комплексы, показало, что с увеличением молекулярной массы мультиферментных комплексов возрастали и максимальная скорость карбоксилаз-ной реакции, и сродство фермента к субстрату. Следует отметить, что наибольшие величины Утях и наименьшие величины Кт достигались при использовании в качестве субстрата рибо-зо-5-фосфата + АТФ, а не РБФ. Повышение рибозо-5-фосфатом- субстратом первого фермента комплекса величины Утях последующих реакций и снижение величины Кт для субстратов второй и третьей реакций данной метаболической цепи является проявлением координированных регуляторных эффектов [16,17].

Представленные в табл. 2 данные свидетельствуют о функциональной значимости диссоциативного и координированного механизмов регуляции активности РБФК/О, встроенных в мультиферментные комплексы с различной величиной молекулярной массы.

На основании представленных в настоящей статье и полученных нами ранее экспериментальных данных [4] можно считать, что онтогенетическая зависимость образования муль-тиферментных комплексов цикла Кальвина с различными функциональными свойствами

І55

обусловлена возрастанием потребности эпигенетических процессов в ассимилятах, особенно в период формирования репродуктивных органов.

Таджикский национальный университет, Поступило 18.09.2008 г.

*

Институт физиологии растений и генетики АН Республики Таджикистан

ЛИТЕРАТУРА

1. Романова А.К., Павловец В.В. - Физиология растений, 1997, т. 44, с. 264-274.

2. Gontero B., Lebreton S., Graciet E. - Ann. Plant. Reviews. Ads.Mc. Manus M.T., Laing W. et Allan A.Sheffield. Acad.Press., 2002, v. 7, p. 120-150.

3. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П., Бабаджанова М.П. - Физиология растений, 2000. т. 47, №1, с. 2736.

4. Бабаджанова М.П., Бабаджанова М.А., Алиев К.А. - Физиология растений. 2006, т. 53, с. 38-44.

5. Rault M., Guidici-Orticoni M.-T. et. al. - Eur. J. Biochemistry, 1993, v. 217, p. 1065-1073.

6. Курганов Б.И. Физико-химическиие механизмы регуляции активности ферментов. М.: Наука, 1992. 62 с. (46-ое Баховское чтение).

7. Ермаков Г.Л.- Биохимия, 1993, т. 58, вып.5, с. 659-674.

8. Якубова М.М., Юлдашев Х.Ю. - Научн.докл.высшей школы, серия биол.наук. 1984, с. 60-63.

9. Бабаджанова М.А., Гиясов Т.Д. - Докл.АН Тадж. ССР. 1984, т. 27, № 9, с, 533-536.

10. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П. - Докл. АН Тадж. ССР. 1989, т. 29, с. 120-123.

11. Бабаджанова М.П., Бабаджанова М.А., АлиевК.А. - Физиология растений. 2002, т. 49, с. 663-667.

12. Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов. М.: Наука, 1980, 158 с.

13. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Внеш., 1980, 272 с.

14. Gontero B., Mulliert G. - Eur. J. Biochemistry, 1993, v. 217, p. 1075-1082.

15. Бабаджанова М.А. Исследование процессов регенерации и карбоксилирования акцептора СО2 в связи с фотосинтетической продуктивностью растений: Автореф. дис. докт. биол. наук. Душанбе, 1990, с. 40.

16. Бабаджанова М.П. - Изв. АН РТ, 2001, №. 1, с. 137-146.

17. Бабаджанова М.П. Свободные и мембраносвязанный мультиферментные комплексы цикла Кальвина и регуляция их ферментативных активностей: Автореф. дис. докт. биол.наук. Душанбе, 2003, с. 45.

М.А.Бобочонова, А.К.Мирзорахимов, М.П.Бобочонова, Ш.А.Эсаналиева, ^.А.Алиев ЧУДОКУНИИ МА^МУИ МУЛТИФЕРМЕНТ^ОИ ОЗОДЙ ДАВРАИ КАЛВИН ДАР ОНТОГЕНЕЗИ РАСТАНИИ ПАХТА

Дар мак;ола натичаи тадк;ик;отх,о оиди х,осилшавии мачмуи мултиферментх,ои даври Калвин дар онтогенези них,олх,ои пахта тадкик шуданд.

Аз руи натичах,ои бадастовардашуда вобастагии х,осилшавии мултиферментх,о, массаи молекулавй ва хосиятх,ои функсионалй аз даврах,ои инкишофи растаних,о ошкор карда шуд.

M.A.Babadzhanova, A.K.Mirzorakhimov, M.P.Babadzhanova, Sh.Esanalieva, K.A.Aliev EXTRACTION OF THE CALVIN CYCLE FREE MULTIENZYME COMPLEXES IN ONTOGENESIS OF COTTON PLANTS

This article presents the results of investigation of the formation of Calvin cycle multienzyme complexes in ontogenesis pf plants. It was determined, that multi-enzyme complexes differing by values of molecular mass and functional properties are formed in dependence of the phase of plant development.