СПОСОБ БИОСИНТЕЗА L-ЛИЗИНА
METHOD L-LYSINE BIOSYNTHESIS

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения L-лизина, применяемого для балансировки кормов животных, в пищевой промышленности для балансировки состава пищевых продуктов и в медицинской промышленности для приготовления аминокислотных смесей парентерального питания.
Известны способы получения L-лизина на основе микробиологического синтеза, предусматривающие культивирование с использованием различных штаммов-продуцентов Corynebacterium и Brevibacterium. Источником углерода в питательных средах служит меласса, технический сахар, техническая глюкоза. В качестве ростового фактора (источника аминного азота) используются кукурузный экстракт, кислотные гидролизаты белково-витаминного концентрата (БВК) и биомассы продуцента. Известные в России способы получения L-лизина, реализованные в промышленных масштабах, ориентированы на использование мелассы и гидролизатов БВК, а конечным продуктом являлся жидкий концентрат лизина (ЖКЛ) или высушенный на отрубях концентрат кормового лизина (ККЛ).
Однако на территории России в настоящее время практически все углеводсодержащее сырье непищевого назначения для микробиологической промышленности труднодоступно или дорого. В связи с этим целесообразно использование технологий, работающих на нетрадиционном сырье.
Известен способ получения L-лизина, описанный в патенте США №4,411,991 (1983 г.), в котором предлагается использовать гидролизат концентрированной молочной сыворотки в качестве источника редуцирующих веществ (РВ). Недостатком данного способа является низкое содержание РВ в полученном гидролизате, и как следствие, низкая концентрация лизина.
Известен способ получения L-лизина, описанный в Journal of Fermentation and Bio-engineering. Vol.86, №2, 180-184. 1998. Регулирование метаболической активности осуществляется внесением в культуральную жидкость лейцина так, чтобы текущая концентрация лейцина поддерживалась на уровне 0,1 г/л. Недостатком данного способа является использование генно-инженерных штаммов-продуцентов лизина, биомасса которых запрещена в ЕЭС для использования в комбикормах с/х животных.
Наиболее близким к предлагаемому способу по регулированию биосинтеза лизина в процессе культивирования является патент США №2107097, в котором описан способ биосинтеза лизина на ферментационных средах, предусматривающий приготовление ферментационной среды с углеводной, белковой и солевой частями, культивирование в ферментере на основной ферментационной среде штамма-продуцента с внесением дополнительной ферментационной среды (подпитки) в ходе процесса культивирования, при поддержании величины рН, температуры культивирования, аэрации и перемешивания на питательных средах с глюкозой в качестве источника углеводов с использованием лейцин-ауксотрофного штамма Corynebacterium, где регулирование метаболической активности происходит путем внесения подпитки, содержащей источник углеводов и белка, по концентрации лейцина в культуральной жидкости. Весь процесс биосинтеза проводят при лимитирующей концентрации углеводов в питательной среде 5-35 г/л.
К недостаткам данного способа относятся использование кристаллической глюкозы и низкая концентрация L-лизина в культуральной жидкости, что является следствием периодического способа ведения процесса культивирования.
Задачей настоящего изобретения является биосинтез L-лизина на основе питательных сред, содержащих ферментолизат крахмала как источник углеводов, позволяющий получать высокую концентрацию L-лизина в культуральной жидкости.
Поставленная задача достигается тем, что
2
- биосинтез лизина осуществляют на ферментационных средах с углеводной, белковой и солевой частями; культивирование штамма-продуцента проводят в ферментере на основной ферментационной среде с внесением дополнительной питательной среды (подпитки) в ходе процесса биосинтеза, при поддержании величины рН, температуры культивирования, аэрации и перемешивания; а в качестве сырья для приготовления основной ферментационной среды и подпитки используют ферментолизат крахмала, который получают из крахмалсодержащего растительного сырья или крахмалсодержащих отходов пищевой промышленности; ферментолизат крахмала вносят в ферментацонную среду в количестве 8-15% по глюкозе, и проводят культивирование с использованием штамма-продуцента Corynebacterium glutamicum BKM Ac-2577 D (BIGOR 55); в ферментер загружают 1/3 от его рабочего объема основную питательную среду, содержащую 2,5-7,5% источника органического азота (ростовой фактор), аммоний сернокислый 3,5-6,5%, соли магния и фосфора 0,05-0,4%, тиамин и биотин 0,05-0,6 мг/л и 10-20% посевного материала из посевного аппарата, выращенного в две стадии, проводят культивирование при рН 6,5-7,5, температуре 28-32°C, и условиях аэрации и перемешивания, обеспечивающих скорость массопередачи кислорода не менее 5 г O/л*час; через 8-16 часов от начала культивирования начинают подачу подпитки, в которой концентрация всех компонентов в 2-3,5 раза больше, чем в основной питательной среде, поддерживая концентрацию РВ в среде на уровне 4-8%; после достижения максимального (рабочего) объема жидкости в ферментере через 60-66 часов культивирования производят отбор культуральной жидкости (КЖ) в количестве 10-15% от максимального объема и передают ее в отдельный аппарат, где в процессе биосинтеза в течение 6-12 часов происходит дображивание РВ; процесс отбора культуральной жидкости проводят многократно каждые 6-12 часов в течение 350-500 часов роста; дображивание (процесс биосинтеза) проводят при тех же параметрах процесса, что и в основной ферментации (кроме подачи подпитки, она отсутствует) в течение 6-12 часов.
Сущность предлагаемого способа получения L-лизина заключается в следующем:
- на основе ферментолизата крахмала готовят основную ферментационную среду: ферментолизат крахмала вносят в количестве 8-15% по глюкозе, 2,5-7,5% источника органического азота (ростового фактора), аммоний сернокислый 3,5-6,5%, соли магния и фосфора 0,05-0,4%, тиамин и биотин 0,05-0,6 мг/л и подпитку (дополнительную ферментационную среду), содержащую компоненты ферментационной среды, концентрированные в 2-3,5 раза, и стерилизуют их;
- биосинтез L-лизина осуществляется с использованием штамма-продуцента лизина Corynebacterium glutamicum BKM Ac-2577 D (BIGOR 55). Штамм получен мутагенезом из родительского штамма В5200 (ВКПМ ГосНИИгенетика) в компании ООО ПКФ «БИГОР». Культура Corynebacterium glutamicum BKM Ac-2577 D BIGOR 55 имеет генетические маркеры: leu и horn ауксотрофность и амилоэтилцистеин-резистентность, облигатный аэроб, грамположительна, спор не образует. Клетки в виде палочек неправильной формы, размером 0,3-1,0×1,5-4,7 мкм, неподвижные. Располагаются одиночно или в парах, часто V-образно;
- засев основной ферментационной питательной среды производят 10-20% посевного материала со второй стадии выращивания посевного материала;
- полунепрерывный процесс биосинтеза ведут с непрерывной подачей подпитки, начиная с 8-16 час культивирования, при этом метаболическая активность штамма-продуцента, ауксотрофного по лейцину, регулируется за счет поддержания ингибирующей концентрации РВ в культуральной жидкости 4-8% по глюкозе, а содержание лейцина поддерживается в культуральной жидкости 0,1-0,2 г/л за счет ростового фактора, входящего в состав подпитки;
- по заполнении аппарата до максимального объема через 60-66 часов культивирования, и далее каждые 6-12 час, многократно - в течение 350-500 часов, часть культуральной жидкости в количестве 10-15% от максимального объема КЖ перекачивают в стерильный аппарат, где поддерживается оптимальная для биосинтеза величина рН 6,7-7,4 подачей аммиачной воды. В этом аппарате происходит процесс биосинтеза в течение 6-12 часов, обеспечивающий дображивание РВ, из КЖ после дображивания затем выделяют лизин.
Сущность предлагаемой технологии раскрывается, но не исчерпывается в приведенных примерах.
Пример 1
Ферментацию проводят в ферментере емкостью 10 л, снабженном системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, автоматической подачей дополнительных питательных сред.
2
Начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5 г O/л*час.
Процесс биосинтеза, обеспечивающий дображивание (потребление остаточных редуцирующих веществ до концентрации не выше 0,8%), проводят в аппарате Биофло, емкостью 1 л, снабженном системами рН-статирования, термостатирования, аэрации, перемешивания.
Штамм-продуцент L-лизина Corynebacterium glutamicum BIGOR 55, выращенный на агаризованной среде Хоттингера при 30°C в течение суток, переносят в посевные колбы со стерильной питательной средой следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 25,0
Кукурузный экстракт - 40,0
Аммоний сернокислый - 4,0
Натрий хлористый - 10,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Засев колб производят при начальном значении рН 7,0-7,3.
При температуре 30°C выращивают на качалке в колбах в течение 18 часов. Посевной материал из колб в количестве 10% переносят в аппарат, емкостью 1 л, предварительно заполненный 450 мл стерильной питательной среды следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 50,0
Кукурузный экстракт - 45,0
Аммоний сернокислый - 20,0
Калий фосфорнокислый - 1,5
Магний сернокислый - 0,7
Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Засев аппарата производят при начальном значении рН 7,0-7,3.
Культивирование ведут при 30°C в течение 8 часов.
Готовый посевной материал со второй стадии в количестве 10% от начального объема питательной среды в рабочем ферментере стерильно перекачивают перистальтическим насосом в рабочий ферментер.
Объем рабочего ферментера - 10 л. Аппарат стерилизуют с 3 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 80,0
Кукурузный экстракт - 25,0
Аммоний сернокислый - 35,0
Магний сернокислый - 0,5
Калий фосфорнокислый - 4,0
Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Через 8 часов культивирования включают подачу подпитки следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 280,0
Кукурузный экстракт - 87,5
Аммоний сернокислый - 122,5
Магний сернокислый - 1,75
Калий фосфорнокислый - 14,0
Пеногаситель Пропинол Б-400 - 3,5
витамины:
Тиамин - 0,175 мг/л
Биотин - 2,1 мг/л
Подпитку подают в ферментер со скоростью, величина которой меняется по специально составленному алгоритму, выходя к 60 часам на постоянное значение, которое поддерживается в течение всего процесса ферментации.
Через 60 часов 0,85 л культуральной жидкости (КЖ), что составляет 10% от объема КЖ в ферментере, перекачивают в стерильный аппарат емкостью 1 л, снабженный системами рН-статирования, термостатирования, перемешивания, аэрации, для проведения процесса биосинтеза, обеспечивающего дображивание редуцирующих веществ. Каждые 6 часов из аппарата емкостью 1 л сливают 0,85 л культуральной жидкости и вносят следующую порцию из основного аппарата (периодический слив) и передают на стадию выделения лизина.
Культивирование в основном аппарате ведется в течение 350 часов. Общий слив за 350 часов - 50,6 л с концентрацией лизина 100 г/л (по лизину монохлоргидрату).
Пример 2
Ферментацию проводят в ферментере емкостью 10 л, снабженном системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, автоматической подачей дополнительных питательных сред.
2
Начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5-6 г/O/л*час.
Процесс биосинтеза, обеспечивающий дображивание РВ, проводят в аппарате Биофло, емкостью 2 л, снабженном системами рН-статирования, термостатирования, аэрации, перемешивания.
Штамм-продуцент L-лизина Corynebacterium glutamicum BIGOR 55, выращенный на агаризованной среде Хоттингера при 30°C в течение суток, переносят в посевные колбы со стерильной питательной средой следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 25,0
Кукурузный экстракт - 40,0
Аммоний сернокислый - 4,0
Натрий хлористый - 10,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Засев колб производят при начальном значении рН 7,0-7,3.
При температуре 30°C выращивают на качалке в колбах в течение 20 часов. Посевной материал из колб в количестве 10% переносят в аппарат, емкостью 1 л, предварительно заполненный 600 мл стерильной питательной среды следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 50,0
Кукурузный экстракт - 45,0
Аммоний сернокислый - 20,0
Калий фосфорнокислый - 1,5
Магний сернокислый - 0,7
Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л.
Засев аппарата производят при начальном значении рН 7,0-7,3.
Культивирование ведут при 30°C в течение 12 часов.
Готовый посевной материал со второй стадии в количестве 20% от начального объема питательной среды в рабочем ферментере стерильно перекачивают перистальтическим насосом в рабочий ферментер.
Объем рабочего ферментера - 10 л.
Аппарат стерилизуют с 3 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала по глюкозе - 150,0
Кукурузный экстракт - 75,0
Аммоний сернокислый - 65,0
Калий фосфорнокислый - 4,0
Магний сернокислый - 0,5
Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Через 16 часов культивирования включают подачу подпитки, следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала - 300,0
Кукурузный экстракт - 150,0
Аммоний сернокислый - 130,0
Калий фосфорнокислый - 8,0
Магний сернокислый - 2,0
витамины:
Тиамин - 0,1 мг/л
Биотин - 1,2 мг/л
Подпитку подают в ферментер со скоростью, величина которой меняется по специально составленному алгоритму, выходя к 66 часам на постоянное значение, которое поддерживается в течение всего процесса ферментации.
Через 66 часов 1,275 л культуральной жидкости, что составляет 15% от объема КЖ в ферментере, перекачивают в стерильный аппарат емкостью 2 л, снабженный системами рН-статирования, термостатирования, перемешивания, аэрации, для дображивания РВ. Каждые 12 часов из аппарата емкостью 2 л сливают 1,275 л культуральной жидкости и вносят следующую порцию КЖ из основного аппарата (периодический слив).
Культивирование в основном аппарате ведется в течение 500 часов. Общий слив за 500 часов - 55,6 л с концентрацией лизина 115 г/л (по лизину монохлоргидрату).
Пример 3
Ферментацию проводят в ферментере емкостью 10 л, снабженном системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, автоматической подачей дополнительных питательных сред.
2
Начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5 г O/л*час.
Дображивание проводят в аппарате Биофло, емкостью 1 л, снабженном системами рН-статирования, термостатирования, аэрации, перемешивания.
Штамм-продуцент L-лизина Corynebacterium glutamicum BIGOR 55, выращенный на агаризованной среде Хоттингера при 30°C в течение суток, переносят в посевные колбы со стерильной питательной средой следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала по глюкозе - 25,0
Пептон - 28,0
Дрожжевой экстракт - 12,0
Аммоний сернокислый - 4,0
Натрий хлористый - 10,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Засев колб производят при начальном значении рН 7,0-7,3.
При температуре 30°C выращивают на качалке в колбах в течение 18 часов. Посевной материал из колб в количестве 10% переносят в аппарат, емкостью 1 л, предварительно заполненный 300 мл стерильной питательной среды следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала по глюкозе - 50,0
Пептон - 31,5
Дрожжевой экстракт - 13,5
Аммоний сернокислый - 20,0
Калий фосфорнокислый - 1,5
Магний сернокислый - 0,7
Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Засев аппарата производят при начальном значении рН 7,0-7,3. Культивирование ведут при 30°C в течение 8 часов.
Готовый посевной материал со второй стадии в количестве 10% от начального объема питательной среды в рабочем ферментере стерильно перекачивают перистальтическим насосом в рабочий ферментер.
Объем рабочего ферментера - 10 л. Аппарат стерилизуют с 3 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала по глюкозе - 80
Пептон - 17,5
Дрожжевой экстракт - 7,5
Аммоний сернокислый - 35,0
Калий фосфорнокислый - 1,5
Магний сернокислый - 0,7
Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин -0,6 мг/л
Через 8 часов культивирования включают подачу подпитки следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала - 280,0
Пептон - 61,25
Дрожжевой экстракт - 26,25
Аммоний сернокислый - 122,5
Калий фосфорнокислый - 14,0
Магний сернокислый - 3,5
витамины:
Тиамин - 0,175 мг/л
Биотин - 2,1 мг/л
Подпитку подают в ферментер со скоростью, величина которой меняется по специально составленному алгоритму, выходя к 60 часам на постоянное значение, которое поддерживается в течение всего процесса ферментации.
Через 60 часов 0,85 л культуральной жидкости, что составляет 10% от объема КЖ в ферментере, перекачивают в стерильный аппарат емкостью 1 л, снабженный системами рН-статирования, термостатирования, перемешивания, аэрации, для дображивания редуцирующих веществ. Каждые 6 часов из аппарата емкостью 1 л сливают 0,85 л культуральной жидкости и вносят следующую порцию из основного аппарата (периодический слив) и передают на стадию выделения лизина.
Культивирование в основном аппарате ведется в течение 350 часов. Общий слив за 350 часов - 51,4 л с концентрацией лизина 100 г/л (по лизину монохлоргидрату).
Пример 4
Ферментацию проводят в ферментере емкостью 10 л, снабженном системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, автоматической подачей дополнительных питательных сред.
2
Начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопере-дачи кислорода 5-6 г/O/л*час.
Дображивание проводят в аппарате Биофло, емкостью 2 л, снабженном системами рН-статирования, термостатирования, аэрации, перемешивания.
Штамм-продуцент L-лизина Corynebacterium glutamicum BIGOR 55, выращенный на агаризованной среде Хоттингера при 30°C в течение суток, переносят в посевные колбы со стерильной питательной средой следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 25,0
Ферментолизат глютена - 20,0
Растительный экстракт - 20,0
Аммоний сернокислый - 4,0
Натрий хлористый - 10,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Засев колб производят при начальном значении рН 7,0-7,3.
При температуре 30°C выращивают на качалке в колбах в течение 20 часов. Посевной материал из колб в количестве 10% переносят в аппарат, емкостью 1 л, предварительно заполненный 600 мл стерильной питательной среды следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала по глюкозе - 50,0
Ферментолизат глютена - 22,5
Растительный экстракт - 22,5
Аммоний сернокислый - 20,0
Калий фосфорнокислый - 1,5
Магний сернокислый - 0,7
Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Засев аппарата производят при начальном значении рН 7,0-7,3. Культивирование ведут при 30°C в течение 12 часов.
Готовый посевной материал со второй стадии в количестве 20% от начального объема питательной среды в рабочем ферментере стерильно перекачивают перистальтическим насосом в рабочий ферментер.
Объем рабочего ферментера - 10 л.
Аппарат стерилизуют с 3 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала по глюкозе - 150,0
Ферментолизат глютена - 37,5
Растительный экстракт - 37,5
Аммоний сернокислый - 45,0
Аммоний фосфорнокислый - 0,4
Магний сернокислый - 0,3
Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Через 16 часов культивирования включают подачу подпитки, следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 300,0
Ферментолизат глютена - 75,0
Растительный экстракт - 75,0
Аммоний сернокислый - 130,0
Калий фосфорнокислый - 8,0
Магний сернокислый - 2,0
витамины:
Тиамин - 0,1 мг/л
Биотин - 1,2 мг/л
Подпитку подают в ферментер со скоростью, величина которой меняется по специально составленному алгоритму, выходя к 66 часам на постоянное значение, которое поддерживается в течение всего процесса ферментации.
Через 66 часов 1,275 л культуральной жидкости, что составляет 15% от объема КЖ в ферментере, перекачивают в стерильный аппарат емкостью 2 л, снабженный системами рН-статирования, термостатирования, перемешивания, аэрации, для дображивания РВ. Каждые 12 часов из аппарата емкостью 2 л сливают 1,275 л культуральной жидкости и вносят следующую порцию КЖ из основного аппарата (периодический слив).
Культивирование в основном аппарате ведется в течение 500 часов. Общий слив за 500 часов - 56,2 л с концентрацией лизина 115 г/л (по лизину монохлоргидрату).
Осуществлен способ культивирования L-лизина, обеспечивающий получение КЖ с концентрацией лизина перед выделением не ниже 100 г/л (по лизину-монохлоргидрату).
Этот результат достигнут благодаря использованию в качестве источника углеводов для приготовления питательных сред (основной и подпитки) ферментолизата крахмала, полученного из возобновляемого растительного крахмалсодержащего сырья.
Регуляция биосинтеза лизина ингибирующими концентрациями компонентов питательной среды и подача подпитки с постоянной скоростью по концентрации РВ в культуральной жидкости позволяет вести процесс биосинтеза в течение длительного времени без снижения скорости синтеза лизина.
Использование нового штамма-продуцента, полученного без применения рекомбинантных технологий, допускает применение биомассы продуцента в составе белково-витаминных кормовых добавок.