Подходы к оценке пригодности аналитических методик при проведении экспертизы качества лекарственных средств

Л.И. Митькина, Е.Л. Ковалева

ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ ПРИГОДНОСТИ АНАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДИК ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ЭКСПЕРТИЗЫ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Л.И. Митькина, Е.Л. Ковалева

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России, Москва

Резюме: В статье приведены характеристики аналитических методик, применяемых в анализе лекарственных средств для определения подлинности, посторонних примесей, растворения, количественного содержания, необходимые для включения в отчет о валидации аналитических методик регистрационного досье на лекарственное средство. Даны рекомендации по определению характеристик методик с использованием различных методов анализа, способов их оценки и критерии пригодности.

Ключевые слова: лекарственные средства, аналитическая методика, валидация

Approaches to evaluation of analytical methods suitability when performing medicines quality evaluation L.I. Mifkina, E.L. Kovaleva

Abstract: The article describes characteristics of the analytical methods used in analysis of medicines to perform identification, impurities, dissolution, assay tests to be included in the report on the validation of analytical methods of the drug registration dossier. Recommendations for the characterization techniques using different methods of analysis, methods for their evaluation and eligibility criteria were provided.

Key words: medicines, analytical method, validation

Экспертиза качества с целью регистрации лекарственных препаратов для медицинского применения, подтверждения государственной регистрации, внесения изменений в регистрационное досье или внесения фармацевтической субстанции, не используемой в производстве лекарственных средств (ЛС), в Государственный реестр лекарственных средств, предусматривает экспертизу качества образцов ЛС и экспертизу фармацевтической части регистрационного досье. При проведении лабораторной экспертизы качества образцов устанавливается их соответствие требованиям нормативной документации и воспроизводимость аналитических методик. Наряду с экспериментальной проверкой методик должна быть проведена также теоретическая экспертиза на основе данных по их валидации [1].

Митькина Лидия Ивановна, начальник Управления экспертизы ЛС № 2 Центра экспертизы и контроля ГЛС ФГБУ«Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России Mitkina@regmed.ru

Ковалева Елена Леонардовна, заместитель директора Центра экспертизы и контроля ГЛС ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России ^ valeva@regmed.ru

В соответствии с современным уровнем требований, предъявляемых к аналитическим методикам, применяемым в анализе ЛС, методики должны быть валидированы, т. е. отвечать соответствующим критериям пригодности [2].

Согласно ГОСТ Р 52361-2005 «Контроль объекта аналитический. Термины и определения» [3] оценка пригодности методики анализа вещества [материала] (уа11с1а1:юп) -это подтверждение на основе представления объективных свидетельств того, что методика анализа вещества [материала] может быть применена для конкретного объекта или группы объектов.

Валидация аналитических методик, применяемых в анализе ЛС, описана в Американской фармакопее [4], государственных фармакопеях Украины [5], Республики Беларусь [6], Республики Казахстан [7] и различных руководствах [8, 9]. Указанные статьи и руководства составлены с учетом рекомендаций Международной конференции по гармонизации технических требований к регистрации ЛС для человека (1СН) [10].

Оценка пригодности методики анализа включает определение характери-

стик методики и проверку выполнения требований при использовании данной методики.

Аналитическую методику оценивают по характеристикам: специфичность, предел обнаружения, предел количественного определения, аналитическая область, линейность, правильность, прецизионность, устойчивость. Данные характеристики выбираются с учетом назначения методики. Специфичность - это способность аналитической методики давать правильный результат определения вещества в присутствии сопутствующих компонентов.

Предел обнаружения - это наименьшее количество (концентрация) определяемого вещества в пробе, которое может быть приближенно оценено с использованием валидируемой методики. Предел количественного определения - это наименьшее количество (концентрация) вещества в образце, которое может быть количественно оценено с использованием валидиру-емой методики с требуемой правильностью и прецизионностью. Аналитическая область методики и ее линейность. Аналитическая область методики - это интервал концентраций, активности и т.п., в кото-

ром получаемые результаты имеют приемлемый уровень правильности и прецизионности.

Правильность методики количественного определения характеризуется отклонением среднего результата определений, выполненных с ее использованием, от значения, принимаемого за истинное.

Прецизионность методики характеризуется рассеянием результатов, получаемых с ее использованием, относительно величины среднего результата. Мерой такого рассеяния является величина стандартного отклонения результата отдельного определения. В регистрационном досье приводят данные по внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности. Устойчивость валидируемой методики - это способность сохранять найденные для нее в оптимальных условиях характеристики при вероятных небольших отклонениях от этих условий проведения анализа.

Рассмотрим, какие характеристики должны быть приведены для методик определения подлинности, посторонних примесей, растворения, однородности дозирования и количественного определения с учетом применяемого метода.

Подтверждение

подлинности

лекарственного

вещества

При идентификации применяемые методики должны быть специфичными. Подлинность лекарственного вещества в субстанции или препарате устанавливают в сравнении со стандартным образцом (хроматографические методы, спектрометрия), по положению характерных максимумов (минимумов) в спектре образца, с помощью качественных реакций на функциональную группу.

При использовании методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и газовой хроматографии (ГХ) время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора должно соответствовать

времени удерживания основного пика на хроматограмме раствора стандартного образца.

При использовании метода тонкослойной хроматографии (ТСХ) пятно на хроматограмме испытуемого раствора по положению, поглощению/ цвету и размеру должно соответствовать пятну на хроматограмме раствора стандартного образца.

При спектроскопических определениях спектры испытуемого и стандартного образца должны иметь максимумы (минимумы) при одних и тех же длинах волн, возможно сравнение ИК-спек-тра образца с прилагаемым рисунком. При отсутствии стандартного образца указывают положения максимумов и минимумов с возможными предельными отклонениями.

При проведении качественной реакции должно быть показано отсутствие характерного эффекта на плацебо.

Методики определения посторонних примесей

Методика определения посторонних примесей должна быть специфичной, обладать достаточной чувствительностью, при количественном определении должна быть линейной в аналитической области, иметь удовлетворительную прецизионность и давать правильные результаты. Специфичность хроматографических методик подтверждается разделением посторонних примесей и действующего вещества и разделением между примесями. В оценке пригодности хроматографической системы в методиках ВЭЖХ и ГХ должно быть приведено разрешение R между пиками или коэффициент p/v между пиками примеси и действующего вещества (p/v -коэффициент - это отношение высоты пика примеси к высоте низшей точки кривой, разделяющей пики примеси и основного вещества относительно экстраполированной базовой линии). В методике ТСХ на хроматограмме раствора для проверки пригодности хроматографической системы,содержащего действующее вещество и примесь (например, продукт распада), должно наблюдаться полное разделение пятен.

Для проверки разделительной способности системы могут использоваться образцы субстанций, подвергнутые, с целью накопления в них примесей, воздействию экстремальных условий (света, температуры, влажности) или химически модифицированные любым подходящим способом. Идентификацию примесей проводят сравнением времен удерживания со стандартным образцом примеси (факторов удерживания Rf в ТСХ), по относительному времени удерживания (по значению Rs в ТСХ).

В методах, основанных на определении оптической плотности или визуально определяемой окраски, оптическая плотность при определенной длине волны или появляющаяся окраска после проведения химической реакции должна быть обусловлена присутствием определяемой примеси. Так, в растворах глюкозы, не поглощающей в ультрафиолетовой области, определяют примесь 5-гидроксиметилфурфурола, имеющего поглощение при длине волны 284 нм; определение 4-аминофенола в парацетамоле, 2,6-диметиланилина в препаратах лидокаина основано на образовании окрашенных соединений по первичной аминогруппе указанных примесей.

При отсутстви количественных расчетов (оценка содержания примесей сравнением площадей в методе ВЭЖХ, сравнение окраски испытуемого раствора с эталоном и др.) чувствительность методики характеризуется пределом обнаружения (ПО), при количественных расчетах - пределом количественного определения (ПКО).

В методиках ВЭЖХ и ГХ определение ПО и ПКО проводят по соотношению сигнал/шум, которое должно быть указано в проверке пригодности хроматографической системы. Устанавливают минимальное количество (концентрацию) определяемого вещества в пробе, при котором величина отношения аналитического сигнала к уровню шумов для ПО находится в пределах от 3 до 2, для ПКО - 10:1. В методике указывают, пики менее какой величины не учитывают.

При спектрофотометрическом

определении посторонних примесей

ПО или ПКО находят по уравнению ПО = 3,3 X S/b или ПКО = 10 X S/b, соответственно,

где: S - стандартное отклонение аналитического сигнала;

Ь - коэффициент чувствительности, представляющий собой отношение аналитического сигнала к определяемой величине (тангенс угла наклона калибровочной кривой).

Для методик с визуальной оценкой результата анализа проводят испытания образцов с различными известными количествами (концентрациями) определяемого вещества и устанавливают минимальное значение, при котором вещество может быть обнаружено. В методике ТСХ на хроматограмме раствора для проверки пригодности хроматографической системы должно быть четко видно пятно. Рекомендуется, чтобы в нем содержалось в 2 раза меньшее количество вещества, чем на хроматограмме раствора сравнения с наименьшим содержанием вещества, аналогично при оценке окраски в сравнении с эталоном - эталон сравнения должен содержать как минимум вдвое большее количество, чем предел обнаружения. Аналитическая область методики и ее линейность. Методики определения посторонних примесей должны быть применимы в интервале от «Предела количественного определения» или «Предела обнаружения» до 200%, относительных от допустимого содержания определяемой примеси. Аналитическая область методики может быть установлена по диапазону экспериментальных данных, удовлетворяющих линейной зависимости. Линейность валидируемой методики в аналитической области проверяют экспериментально измерением аналитических сигналов (оптическая плотность в методиках спектрофотометрического определения, площадь пика - в методиках ВЭЖХ, ГХ) для не менее чем пяти проб с различными количествами (или концентрациями) определяемого вещества. Экспериментальные данные обрабатывают методом наименьших квадратов с использованием линейной модели. В данных по валидации ука-

зывают параметры линейной зависимости и коэффициент корреляции г. В большинстве случаев используют линейные зависимости, отвечающие условию |г|£ 0,99, и только при анализе следовых количеств |г|£ 0,9.

В отдельных случаях линейная зависимость устанавливается лишь после математического преобразования (например, логарифмирования). Прецизионность. В методиках определения посторонних примесей относительное стандартное отклонение площади пика примеси, как правило, не должно превышать ± 10% (иногда ± 15 %).

Методики определения содержания

действующего вещества

в тестах «Растворение»,

«Однородность

дозирования»,

«Количественное

определение»

Данные методики относятся к методикам количественного определения действующего вещества. Они должны быть специфичны в отношении определяемого вещества, т.е. должно быть экспериментально подтверждено, что присутствие сопутствующих веществ не влияет непредусмотренным образом на результат анализа. Оценку специфичности валидируемой методики обычно проводят путем анализа модельных смесей известного состава, содержащих определяемое вещество. В хроматографических методах специфичность подтверждается разделением веществ, при спектрофотометрическом определении показывают отсутствие поглощения плацебо при выбранной длине волны.

К величине аналитической области методик предъявляются следующие требования:

- методики количественного определения должны быть применимы в интервале от 80 до 120% от номинального значения определяемой величины;

- методики оценки однородности до-

зирования должны быть применимы в интервале от 70 до 130% от номинальной содержания действующего вещества;

- методики количественного определения, используемые при проведении теста «Растворение», обычно должны быть применимы в пределах от 50 до 120 % от ожидаемой концентрации действующего вещества в среде растворения.

Прецизионность оценивается для любой методики количественного определения по результатам не менее 3 определений для каждого из 3 уровней определяемых величин (нижнего, среднего и верхнего), лежащих в пределах аналитической области методики. Для обеспечения приемлемого уровня прецизионности широко применяемых в настоящее время методик определения ВЭЖХ хроматографическая колонка должна обладать достаточной эффективностью, пики должны иметь по возможности правильную форму.Для проверки пригодности хроматографической системы оценивают эффективность хроматографической колонки, фактор асимметрии пика, относительное стандартное отклонение площади пика. В методиках количественного определения действующего вещества относительное стандартное отклонение площади пика не должно превышать ±2 %.

Правильность. Валидируемая методика признается правильной, если значения, принимаемые за истинные, лежат внутри доверительных интервалов соответствующих средних результатов анализов, полученных экспериментально по данной методике. При этом максимально допустимая относительная неопределенность методики [11] для субстанций не должна превышать допуска отклонения в содержании (в%, как правило, ±1 %), а для лекарственных препаратов составлять не более 0,32*В (если допуск в содержании действующего вещества составляет ±10%, то максимально допустимая относительная неопределенность методики не должна превышать ±3,2 %).

Для оценки правильности методик количественного определения применимы следующие подходы:

а) анализ с использованием валидиру-емой методики стандартных образцов или модельных смесей с известным содержанием (концентрацией) определяемого вещества;

б) сравнение результатов, полученных с использованием валидируемой методики и образцовой методики (например, фармакопейной), правильность которой ранее установлена;

в) рассмотрение результатов изучения линейности валидируемой методики: если свободный член в уравнении линейной зависимости статистически достоверно не отличается от нуля, то использование такой методики дает результаты, свободные от систематической ошибки.

При использовании хроматографических методов необходимой процедурой, включаемой в валидируемую

методику, является проверка пригодности хроматографической системы. Возможность небольших отклонений от условий проведения методики (например, в составе подвижной фазы, или замена производителя хроматографической колонки), не влияющих на ее характеристики, показывает устойчивость методики.

При изменении технологии получения, состава лекарственного средства или изменении ранее утвержденной методики анализа проводят ревалидацию (повторную валидацию) методик.

Представление результатов валидации

Протокол валидации аналитической методики должен содержать:

- ее полное описание, достаточное для воспроизведения и отражающее все условия, необходимые для выполнения анализа;

- оцениваемые характеристики;

- результаты статистической обработки данных, полученных экспериментально при разработке или проверке валидируемой методики;

- иллюстративные материалы, такие как рисунки хроматограмм, спектров, кривых титрования;

- заключение о пригодности вали-дируемой методики для включения в нормативную документацию. Материалы валидации отдельных аналитических методик, включаемых в проект нормативной документации, представляют в виде объединенного отчета о валидации.

Литература

1. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 26 августа

2010 г. № 750 н «Об утверждении правил проведения экспертизы лекарственных средств для медицинского применения и формы заключения комиссии экспертов».

2. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 ноября

2011 г. № 1413 н «Об утверждении методических рекомендаций по содержанию и оформлению необходимых документов, из которых формируется регистрационное досье на лекарственный препарат для медицинского применения в целях его государственной регистрации».

3. ГОСТ Р 52361-2005. Контроль объектов аналитический. Термины и определения.

4. <1225> «Validation of compendial procedures» USP 34/NF 29.

5. 2.2.N.2. Валидация аналитических методик и испытаний. Государственная фармакопея Украины, первое издание, дополнение 2. Харьков, 2010.

6. 5.3.3. Валидация аналитических методик испытаний. Государственная фармакопея республики Беларусь, том 1, Минск, 2006.

7. Валидация аналитических методик и испытаний. Государственная фармакопея республики Казахстан, 1-е издание, Астана, 2008.

8. Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств. Под ред. Н.В. Юргеля, А.Л. Младенцева, А.В. Бурдейна, М.А. Гетьмана, А.А. Малина, Фармацевтическая промышленность. М, 2007.

9. Валидация аналитических методик для производителей лекарств. Типовое руководство предприятия по производству лекарственных средств, подготовленное Федеральным союзом фармпроизво-дителей Германии (ВАН). Пер. Ж. И. Аладышевой, О. Р. Спицкий. Под ред. В. В. Береговых. Изд. «Литтерра». М, 2008.

10. СРМР/ІСН/З812/95. Note for guidance on validation of analytical procedures: text and methodology. London. June 1995.

11. Гризодуб А. И., Леонтьев Д.А., Денисенко Н. В. и др. Стандартизованная процедура валидации методик количественного анализа лекарственных средств методом стандарта//Фармаком. 2004. № З. С. З-17.