ИСПЫТАНИЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭНДОСОМАЛЬНОГО ПЕРЕНОСА

1. Испытание для оценки способности высвобождения эндосомой тестовой молекулы,
причем упомянутая тестовая молекула представляет собой клостридиальный нейротоксин или перенаправленную не цитотоксическую протеазу (мишень-направленный ингибитор секреции), в которой природная способность к связыванию не цитотоксической протеазы была модифицирована путем введения связующего лиганда или мишень-направляющей частицы, и
причем упомянутая тестовая молекула обладает способностью к протеолитическому расщеплению и инактивированию белка SNARE;
упомянутое испытание содержит:
i) приведение эукариотной клетки в контакт с тестовой молекулой, которая должна быть оценена на способность высвобождения эндосомой, причем упомянутая эукариотная клетка содержит клеточную мембрану, включающую в себя центр связывания, присутствующий на внешней поверхности клеточной мембраны упомянутой клетки;
ii) инкубирование тестовой молекулы с упомянутой эукариотной клеткой, что, таким образом, допускает:
a) связывание тестовой молекулы и образование связанного комплекса с центром связывания, присутствующим на эукариотной клетке, что позволяет, таким образом, упомянутому связанному комплексу попадать в эукариотную клетку за счет эндоцитоза;
b) формирование одной или более эндосом в упомянутой клетке, причем одна или более эндосом содержит тестовую молекулу; и
c) введение упомянутой тестовой молекулы в цитозоли эукариотной клетки сквозь эндосомальную мембрану одной или более эндосом;
iii) удаление избыточной тестовой молекулы, которая не связана с центрами связывания, присутствующими на эукариотных клетках;
iv) после истечения заданного периода времени, - детектирование количества тестовых молекул, присутствующих в одной или более эндосом, или выявлять количество тестовых молекул, присутствующих в цитозоли упомянутой эукариотной клетки;
v) сопоставление количества тестовых молекул, выявленных на этапе iv), с контрольным значением, причем упомянутое контрольное значение отображает количество тестовых молекул, присутствующих в одной или более эндосомах, или количество тестовых молекул, присутствующих в цитозоли, перед выполнением этапа iv);
vi) расчет параметра высвобождения эндосомы для тестовой молекулы путем определения относительного изменения количества тестовых молекул, которые присутствуют в одной или более эндосом, или путем определения относительного изменения количества тестовых молекул, присутствующих в цитозоли упомянутой эукариотной клетки;
причем этап (iv) содержит детектирование тестовой молекулы, с использованием флуоресцентной метки.
2. Испытание по п. 1, в котором эукариотную клетку выбирают из клетки дрожжей, клетки насекомого, клетки позвоночного животного, клетки млекопитающего, растительной клетки, и грибной клетки.
3. Испытание по любому из предыдущих пунктов, в котором этап инкубирования ii) длится в течение периода времени от 5 минут до 5 дней, например, 1-12 часов или 2-10 часов или 4-8 часов или 6-8 часов.
4. Испытание по любому из предыдущих пунктов, в котором этап детектирования iv) выполняют в течение времени от 5 минут до 5 часов, вслед за этапом iii), например, 15-240 минут или 30-180 минут или 45-150 минут вслед за этапом iii).
5. В качестве испытания для оценки тормозящих эффектов блокирующей молекулы, оказываемых на эндосомальный перенос в эукариотной клетке, упомянутое испытание содержит:
i) приведение эукариотной клетки в контакт с контрольной молекулой, которая связывается с центром связывания, присутствующим на поверхности упомянутой эукариотной клетки, причем упомянутая контрольная молекула представляет собой
клостридиальный нейротоксин или перенаправленную не цитотоксическую протеазу (мишень-направленный ингибитор секреции), в которой природная способность к связыванию не цитотоксической протеазы была модифицирована путем введения связующего лиганда или мишень-направляющая частица, и в которой упомянутая контрольная молекула обладает способностью к протеолитическому расщеплению и инактивированию белка SNARE,
причем упомянутая контрольная молекула образует связанный комплекс с центром связывания, попадает в эукариотную клетку за счет эндоцитоза, в ходе которого образуется эндосома, которая содержит контрольную молекулу, и при этом упомянутая контрольная молекула попадает в цитозоль эукариотной клетки сквозь эндосомальную мембрану эндосомы;
ii) инкубирование контрольной молекулы с упомянутой эукариотной клеткой, что позволяет, таким образом:
a) связывать контрольную молекулу и формировать связанный комплекс с центром связывания, присутствующим на эукариотной клетке, что позволяет, таким образом, упомянутому связанному комплексу попадать в эукариотную клетку за счет эндоцитоза;
b) формировать одну или более эндосом в упомянутой клетке, причем одна или более эндосом содержит контрольную молекулу; и
c) упомянутой контрольной молекуле попадать в цитозоль эукариотной клетки сквозь эндосомальную мембрану одной или более эндосом;
iii) приведение эукариотной клетки в контакт с тестовой молекулой ингибитора, которая подлежит оценке на ее способность к подавлению эндосомального высвобождения контрольной молекулы из эндосом;
iv) после истечения заданного периода времени, детектирование количества контрольных молекул, присутствующей в одной или более эндосомах, или детектирование количества контрольных молекул, присутствующих в цитозоли упомянутой эукариотной клетки;
v) сопоставление количества контрольных молекул, выявленных на этапе iv), с контрольным значением, причем упомянутое контрольное значение отображает количество контрольных молекул, присутствующих в одной или более эндосомах, или количества контрольных молекул, присутствующих в цитозоли, перед выполнением этапа iii);
vi) присвоение параметра ингибирования тестовой молекуле ингибитора, путем определения относительного изменения количества контрольных молекул, которые присутствуют в одной или более эндосомах, или путем определения относительного изменения количества контрольных молекул, присутствующих в цитозоли упомянутой эукариотной клетки;
причем этап (iv) содержит детектирование контрольной молекулы, с использованием флуоресцентной метки.
6. Испытание по п. 5, причем эукариотную клетку выбирают из клетки дрожжей, клетки насекомого, клетки позвоночного животного, клетки млекопитающего, растительной клетки и грибной клетки.
7. Испытание по любому из пп. 5 или 6, причем этап инкубирования ii) длится в течение периода времени от 5 минут до 5 дней, например, в течение 1-12 часов или 2-10 часов или 4-8 часов или 6-8 часов.
8. Испытание по любому из пп. 5-7, причем этап детектирования iv) выполняют в течение времени от 5 минут до 5 часов, вслед за этапом iii), например, в течение 15-240 минут или 30-180 минут или 45-150 минут вслед за этапом iii).
9. Испытание по любому из пп. 5-8, причем этап приведения в контакт ii) выполняют в течение времени от 5 минут до 5 дней, вслед за началом этапа инкубирования ii), например, в течение времени от 30 минут до 12 часов или в течение времени от 30 минут до 10 часов или в течение времени от 30 минут до 8 часов или в течение времени 1-8 часов, вслед за началом этапа инкубирования ii).