ПРОИЗВОДНЫЕ АНИЛИНПИРИМИДИНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
ANILINE PYRIMIDINE DERIVATIVES AND USE THEREOF

Ссылка на родственные заявки
Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет и преимущество в соответствии с заявкой на выдачу патента Китая №201510419018.X, поданной 16 июля 2015 г. на рассмотрение в Государственное ведомство по интеллектуальной собственности Китая, полное раскрытие которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящая заявка относится к производным анилинопиримидина в качестве ингибиторов EGFR, их фармацевтически приемлемым солям, и содержащим их фармацевтическим композициям, и способам или применениям для лечения опосредованных EGFR заболеваний с их использованием.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), также известный как HER1 или ErbB1, представляет собой рецептор клеточной пролиферации и передачи сигналов эпидермального фактора роста (EGF). EGFR относится к представителю семейства рецепторов ErbB, которое включает в себя EGFR (ErbB-1), HER2/c-neu (ErbB-2), HER3 (ErbB-3) и HER4 (ErbB-4). EGFR представляет собой трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой, составляющей 170 кДа, который принадлежит к тирозинкиназному рецептору.
EGFR расположен на поверхности клеточных мембран и активируется связыванием с лигандами, включая в себя EGF и TGFα. Будучи активированным, EGFR
подвергается переходу из мономера в димер. Димер включает в себя не только связывание двух идентичных молекул рецептора (гомодимеризация), но также связывание других представителей семейства тирозинкиназных рецепторов, ассоциированных с EGF (HER) (гетеродимеризация). EGFR может активировать свои внутриклеточные киназные пути после димеризации, приводя к фосфорилированию ключевых тирозиновых остатков во внутриклеточном домене и стимуляции многих внутриклеточных сигнальных путей, вовлеченных в клеточную пролиферацию и выживаемость.
Во многих солидных опухолях наблюдаются высокие или аномальные уровни экспрессии EGFR. EGFR ассоциирован с пролиферацией опухолевых клеток, ангиогенезом, инвазией опухолей, метастазированием и ингибированием апоптоза. Возможные механизмы включают в себя следующие: усиленная нисходящая передача сигналов, вызванная высокими уровнями экспрессии EGFR; продолжительная активация EGFR, вызванная увеличенными уровнями экспрессии мутантных рецепторов или лигандов EGFR; усиленный эффект аутокринных петель; разрушение механизмов отрицательной регуляции рецепторов; и активация аберрантных сигнальных путей и т.д. Избыточные уровни экспрессии EGFR играют важную роль в прогрессировании злокачественных опухолей. Например, избыточные уровни экспрессии EGFR были обнаружены в глиоците, злокачественной опухоли почки, злокачественной опухоли легкого, злокачественной опухоли предстательной железы, злокачественной опухоли поджелудочной железы, злокачественной опухоли молочной железы и других тканях.
Аберрантная экспрессия EGFR и Erb-B2 играет ключевую роль в трансформации и росте опухолей. В случае злокачественной опухоли легкого EGFR экспрессируется в 50% случаях немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), и его экспрессия ассоциирована с неблагоприятным прогнозом. Два фактора делают EGFR и представителей его семейства главными кандидатами таргетной терапии. Два типа низкомолекулярных ингибиторов, нацеленно воздействующих на EGFR, гефитиниб и эрлотиниб, уже одобрены FDA (Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств) США для лечения пациентов с распространенным NSCLC, которые не
ответили на традиционную химиотерапию.
Данные клинических исследований ранних фаз указывают на то, что 10% пациентов с NSCLC характеризовались ответом на гефитиниб и эрлотиниб. Молекулярный биологический анализ показывает, что в большинстве случаев отвечающие на лекарственные средства пациенты несут специфические мутации в кодирующих EGFR генах: на долю делеции аминокислот в положениях 747-750 в экзоне 19 приходится 45% мутаций, и 10% мутаций происходят в экзонах 18 и 20. Наиболее распространенные активирующие EGFR мутации (L858R и delE746_A750) приводят к увеличению аффинности по отношению к низкомолекулярным ингибиторам тирозинкиназы (TKI) и уменьшению аффинности по отношению к аденозинтрифосфату (АТР) по сравнению с EGFR дикого типа (WT). Мутация Т790М представляет собой точечную мутацию в экзоне 20 EGFR, которая приводит к приобретенной резистентности к лечению с помощью гефитинибом или эрлотинибом. Недавнее исследование показывает, что комбинация мутаций L858R и Т790М характеризуется более сильной аффинностью по отношению к АТР, чем L858R отдельно, и TKI представляют собой АТР-конкурентные киназные ингибиторы, и это, тем самым, приводит к сниженной скорости связывания между TKI и киназными доменами.
Краткое описание настоящего изобретения
Согласно одному аспекту настоящая заявка относится к соединению, представленному формулой (I), или его фармацевтически приемлемой соли:
где:
6
X выбран из группы, состоящей из NR и О;
1
2
1-4
R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, С
алкила и циано;
3
1-4
1-4
R выбран из группы, состоящей из C алкила и C алкокси;
4
R выбран из группы, состоящей из [2-(диметиламино)этил](метил)амино, (2-гидроксиэтил)(метил)амино и морфолин-4-ила;
5
1-4
1-3
1-3
R выбран из группы, состоящей из водорода, C алкила и C алкоксиС алкила;
6
1-4
R выбран из группы, состоящей из водорода и C алкила.
Согласно одному варианту осуществления настоящей заявки представлено соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль, где:
6
X выбран из группы, состоящей из NR и О;
1
2
1-4
R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена и C алкила;
3
1-4
R представляет собой C алкокси;
4
R выбран из группы, состоящей из [2-(диметиламино)этил](метил)амино, (2-гидроксиэтил)(метил)амино и морфолин-4-ила;
5
1-4
1-3
1-3
R выбран из группы, состоящей из водорода, C алкила и C алкоксиС алкила;
6
1-4
R выбран из группы, состоящей из водорода и C алкила.
Согласно одному варианту осуществления настоящей заявки представлено соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль, где:
6
X выбран из группы, состоящей из NR и О;
1
2
R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, хлора, брома, фтора и метила;
3
R представляет собой метокси;
4
R выбран из группы, состоящей из [2-(диметиламино)этил](метил)амино, (2-гидроксиэтил)(метил)амино и морфолин-4-ила;
5
R выбран из группы, состоящей из водорода и метоксиметила;
6
R выбран из группы, состоящей из водорода и метила.
Согласно одному варианту осуществления настоящей заявки соединения формулы (I) настоящей заявки включают в себя следующие соединения или
фармацевтически приемлемые соли:
или
Согласно другому аспекту настоящая заявка относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение, представленное формулой (I), как раскрыто в настоящем описании, или его фармацевтически приемлемую соль и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или наполнителей. Необязательно,
фармацевтическая композиция настоящей заявки может дополнительно содержать один или несколько дополнительных терапевтических средств.
Согласно другому аспекту настоящая заявка относится к способу лечения опосредованного EGFR заболевания, причем способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, соединения формулы (I) настоящей заявки или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции, содержащей его.
Согласно еще одному аспекту настоящая заявка относится к применению соединения формулы (I) согласно настоящей заявки или его фармацевтически приемлемой соли, или содержащей их фармацевтической композиции в производстве лекарственного средства для лечения опосредованного EGFR заболевания.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящей заявки опосредованное EGFR заболевание выбрано из заболеваний, опосредованных активирующей мутацией EGFR-L858R.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящей заявки опосредованное EGFR заболевание выбрано из заболеваний, опосредованных активирующей мутация EGFR-T790M. Согласно некоторым вариантам осуществления опосредованное EGFR заболевание выбрано из заболеваний, опосредованных двойными активирующими мутациями EGFR-L858R+EGFR-T790M.
Подробное описание вариантов изобретения
Определения
Если не отмечено иное, используемые в настоящем описании термины и выражения обладают следующими значениями. Конкретный термин или выражение не должны рассматриваться как неопределенные или неясные, если это конкретно не определено, а должны пониматься согласно их общему значению. Используемые в описании торговые наименования относятся к соответствующим продуктам или их активным ингредиентам.
m-n
Используемый в настоящем описании «C» означает, что фрагмент содержит
1-4
m-n атомов углерода. Например, «С алкил» означает, что алкил содержит 1-4 атомов углерода.
1-4
Используемая в настоящем описании область числовых значений относится к каждому целому числу в пределах представленных диапазонов. Например, «С» означает, что группа может содержать 1 атом углерода, 2 атома углерода, 3 атома углерода или 4 атома углерода.
Термин «гало» или «галоген» относится к фтору, хлору, брому или йоду.
Термин «циано» относится к -CN группе.
Термин «алкил» относится к неразветвленной или разветвленной насыщенной алифатической углеводородной группе, состоящей из атомов углерода и атомов водорода, присоединенной к остатку молекулы при помощи простой связи. Неограничивающие примеры алкила включают в себя без ограничения метил, этил, пропил, 2-пропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил и т.п.
Термин «алкокси» относится к «-О-алкильной» группе.
Термин «фармацевтически приемлемый» относится к таким соединениям, веществам, композициям и/или лекарственным формам, которые по результатам тщательной медицинской оценки подходят для применения при контакте с тканями людей и животных без избыточной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблем или осложнений в соответствии с приемлемым соотношением польза/риск.
Например, соль, образованная с неорганической кислотой, соль, образованная с органической кислотой, соль, образованная с кислотной аминокислотой и т.п., может быть указана как фармацевтически приемлемая соль.
Используемая в настоящем описании фармацевтически приемлемая соль может быть синтезирована из исходного соединения, содержащего кислотный радикал и основный радикал традиционным химическим способом. В целом, способ получения такой соли включает в себя: осуществление взаимодействия таких соединений в форме свободного основания со стехиометрически соответствующей кислотой в воде или органическом растворителе или смеси воды и органического растворителя.
Некоторые соединения настоящей заявки могут существовать в
несольватированной форме или сольватированной форме, включая гидратную форму. В целом, сольватированная форме является сравнительной с несольватированной формой, и они обе предусмотрены настоящей заявкой. Некоторые соединения настоящей заявки могут существовать в полиморфной или аморфной форме.
Некоторые соединения настоящей заявки могут содержать асимметрический углеродный атом (оптический центр) или двойную связь. Рацематы, диастереоизомеры, геометрические изомеры и отдельные изомеры включены в объем настоящей заявки.
Графические представления для рацемических, амбискалемических и скалемических или энантиомерно чистых соединений в настоящем описании получены от Maehr, J. Chem. Ed. 1985, 62: 114-120. Если не указано иное, клиновидную связь и пунктирную связь использовали для обозначения абсолютной конфигурации стереоскопического центра. Если соединения настоящего описания содержат олефиновую двойную связь или другой геометрически несимметричный центр, если не отмечено иное, они содержат Е-, Z-геометрически изомеры. Подобным образом, все таутомерные формы включены в объем настоящей заявки.
Соединения настоящей заявки могут обладать особыми геометрическими изомерными или стереоизомерными формами. Все такие соединения предусмотрены в настоящей заявке, включая цис- и транс-изомеры, (-)- и (+)-энантиомеры, (R)- и (S)-энантиомеры, диастереоизомеры, (D)-изомеры, (L)-изомеры и их рацемические смеси и другие смеси, такие как энантиомерно или диастереоизомерно-обогащенная смесь. Все такие смеси включены в объем настоящей заявки. Заместители, такие как алкил, могут содержать дополнительные асимметрический углеродные атомы. Такие изомеры и их смеси включены в объем настоящей заявки.
Оптически активные (R)- и (S)-изомеры и D- и Z-изомеры могут быть получены с применением хирального синтеза или хиральных реагентов, или другой традиционной методикой. Если необходим один энантиомер конкретного соединения настоящей заявки, этот энантиомер может быть получен асимметрическим синтезом или способом дериватизации с хиральным вспомогательным элементом, причем способ предусматривает разделение смеси диастереоизомеров и отщепление вспомогательных групп с получением требуемого чистого энантиомера. Альтернативно, если молекула
содержит щелочную функциональную группу (такую как амино) или кислотную функциональную группу (такую как карбоксил), диастереоизомерная соль может быть образована молекулой и соответствующей оптически активной кислотой или основанием, а затем диастереоизомер расщепляли методом фракционной кристаллизации или хроматографии, что хорошо известно из области техники, тем самым восстанавливая чистый энантиомер. Кроме того, разделение энантиомера и диастереоизомера обычно достигали методом хроматографии с применением хиральной неподвижной фазы или необязательно в сочетании со способом химической дериватизации (например, с применением амина с получением карбаматной соли).
3
125
14
Соединение настоящей заявки может содержать атомные изотопы в ненатуральном соотношении при одном или нескольких атомах, которые составляют соединение. Например, атомными изотопами могут быть дейтерий (D), тритий (Н), йод-125 (I), углерод-14 (С) и т.п. Все превращения, образованные всеми изотопами для соединения настоящей заявки, независимо от того радиоактивными или нет, предусмотрены в настоящей заявке.
Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к таким носителям, которые не оказывают существенного раздражения на организм и не ослабляют биологическую активность и природу активного соединения. «Фармацевтически приемлемый носитель» относится к инертному веществу, которое вводили с активным ингредиентом и оно эффективно для введения активного ингредиента, и включает в себя без ограничения любое из следующих веществ, которые приемлемы для применения у людей или животных (например, домашнего скота) и одобрены Государственным управлением по контролю качества медикаментов и продуктов питания: глиданты, подсластители, разбавители, консерванты, красители/красящие вещества, вкусовые добавки, поверхностно-активные вещества, смачивающие средства, диспергирующие вещества, разрыхлители, суспендирующие средства, стабилизаторы, изотонические средства, растворители или эмульгаторы. Неограничивающие примеры носителей включают в себя карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и крахмалы, производные целлюлозы, желатин, растительное масло и полиэтиленгликоль и т.п. Другая информация относительно носителей может ссылаться на Remington: The
Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2005), содержимое которого включено в настоящее описание посредством ссылки.
Термин «наполнитель» обычно относится к носителю, разбавителю и/или среде, используемой для составления эффективной фармацевтической композиции.
Что касается фармацевтического или фармакологического активного вещества, термин «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» относится к количеству лекарственного препарата или средства, которое является не токсичным, но достаточным для достижения требуемого эффекта. Что касается описанного в настоящем документе перорального состава, «эффективное количество» для активного вещества в композиции относится к количеству, необходимому для достижения требуемого эффекта в комбинации с другим активным веществом в композиции. Определение эффективного количества отличается от человека к человеку и зависит от возраста и общего состояния реципиента, а также конкретного активного вещества. Эффективное количество в конкретном случае может быть определено специалистом настоящей области техники путем традиционных испытаний.
Термин «активный ингредиент», «терапевтические средство», «активное вещество» или «активное средство» относится к химической структурной единице, которая применима для эффективного лечения целевых нарушений, заболеваний или состояний.
Термин «пациент» или «субъект» включает в себя людей и животных, например, млекопитающих (таких как приматы, крупный рогатый скот, лошади, свиньи, собаки, кошки, мыши, крысы, кролики, козы, овцы и птицы).
Конкретные варианты осуществления
Согласно одному аспекту настоящая заявка относится к соединению, представленному формулой (I), или его фармацевтически приемлемой соли:
где:
6
X выбран из группы, состоящей из NR и О;
1
2
1-4
R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, С алкила и циано;
3
1-4
1-4
R выбран из группы, состоящей из С алкила и С алкокси;
4
R выбран из группы, состоящей из [2-(диметиламино)этил](метил)амино, (2-гидроксиэтил)(метил)амино и морфолин-4-ила;
5
1-4
1-3
1-3
R выбран из группы, состоящей из водорода, С алкила и C алкоксиС алкила;
6
1-4
R выбран из группы, состоящей из водорода и С алкила.
Согласно одному варианту осуществления настоящей заявки представлено соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль, где:
6
X выбран из группы, состоящей из NR и О;
1
2
1-4
R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена и С алкила;
3
1-4
R представляет собой С алкокси;
4
R выбран из группы, состоящей из [2-(диметиламино)этил](метил)амино, (2-гидроксиэтил)(метил)амино и морфолин-4-ила;
5
1-4
1-3
1-3
R выбран из группы, состоящей из водорода, С алкила и C алкоксиС алкила;
6
1-4
R выбран из группы, состоящей из водорода и С алкила.
Согласно одному варианту осуществления настоящей заявки представлено соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль, где:
6
X выбран из группы, состоящей из NR и О;
1
2
R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, хлора, брома, фтора и метила;
3
R представляет собой метокси;
4
R выбран из группы, состоящей из [2-(диметиламино)этил](метил)амино, (2-гидроксиэтил)(метил)амино и морфолин-4-ила;
5
R выбран из группы, состоящей из водорода и метоксиметила;
6
R выбран из группы, состоящей из водорода и метила.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящей заявки соединения формулы (I) настоящей заявки включают в себя следующие соединения или их фармацевтически приемлемые соли:
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящей заявки фармацевтически приемлемые соли соединений формулы (I) настоящей заявки включают в себя следующие гидрохлоридные соли соединений:
или
Согласно другому аспекту настоящая заявка относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение, представленное формулой (I), или его фармацевтически приемлемую соль, и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или наполнителей. Фармацевтическая композиция настоящей заявки дополнительно может включать в себя одно или несколько дополнительных терапевтических средств.
Согласно еще одному аспекту настоящая заявка относится к способу лечения опосредованного EGFR заболевания, причем способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, соединения формулы (I) настоящей заявки или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции, содержащей его.
Согласно еще одному аспекту настоящая заявка относится к применению соединения формулы (I) согласно настоящей заявке или его фармацевтически приемлемой соли, или содержащей их фармацевтической композиции, в производстве лекарственного средства для лечения опосредованного EGFR заболевания.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящей заявки опосредованное EGFR заболевание выбрано из заболеваний, опосредованных активирующей мутацией EGFR-L858R.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящей заявки опосредованное EGFR заболевание выбрано из заболеваний, опосредованных активирующей мутацией EGFR-T790M.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящей заявки опосредованное EGFR заболевание выбрано из заболеваний, опосредованных двойными активирующими мутациями EGFR-L858R+EGFR-T790M.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящей заявки опосредованное EGFR заболевание представляет собой злокачественную опухоль; злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из следующего: злокачественная опухоль яичника, злокачественная опухоль шейки матки, злокачественная опухоль толстой и прямой кишки, злокачественная опухоль молочной железы, злокачественная опухоль поджелудочной железы, глиома, глиобластома, меланома, злокачественная опухоль предстательной железы, лейкоз, лимфома, неходжкинская лимфома, злокачественная опухоль желудка, злокачественная опухоль легкого, гепатоцеллюлярная злокачественная опухоль, злокачественная опухоль желудка, стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта, злокачественная опухоль щитовидной железы, холангиокарцинома, злокачественная опухоль эндометрия, злокачественная опухоль почки, анапластическая крупноклеточная лимфома, острый миелоидный лейкоз, множественная миелома, меланома и мезотелиома; злокачественная опухоль легкого может быть выбрана из немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, аденокарциномы легкого и плоскоклеточного рака легкого.
Фармацевтическую композицию согласно настоящей заявке можно получить путем комбинирования соединения согласно настоящей заявке или его соли с подходящим фармацевтически приемлемым носителем, и можно составить, например, в виде твердых, полутвердых, жидких или газообразных составов, таких как таблетки, пилюли, капсулы, порошки, гранулы, пасты, эмульсии, суспензии, растворы, суппозитории, инъекции, средства для ингаляции, гели, микросферы, аэрозоли и тому подобное.
Типичные пути введения соединения согласно настоящей заявке или его фармацевтически приемлемой соли, или содержащей их фармацевтической композиции включают в себя без ограничения пероральное, ректальное, чресслизистое или энтеральное введение или местное, трансдермальное, ингаляционное, парентеральное, сублингвальное, интравагинальное, интраназальное, внутриглазное, интраперитонеальное, внутримышечное, подкожное или внутривенное введение.
Фармацевтическую композицию согласно настоящей заявке можно получить
посредством хорошо известных способов в настоящей области техники, таких как общепринятый способ смешивания, способ растворения, способ гранулирования, способ нанесения сахарной оболочки, способ перемалывания, способ эмульгирования и способ лиофилизации и т.д.
Для перорального введения активное соединение можно смешивать с фармацевтически приемлемыми носителями, известными в настоящей области техники, для получения фармацевтической композиции. С помощью указанных носителей соединения согласно настоящей заявки можно ввести в состав таблеток, пилюль, пастилок, таблеток в сахарной оболочке, капсул, жидкости, гелей, сиропа или суспензий и тому подобного, для перорального введения пациентам.
Твердую пероральную композицию можно получить с помощью общепринятого способа смешивания, наполнения или прессования. Например, ее можно получить посредством следующего способа: активное соединение смешивают с твердыми вспомогательными веществами; необязательно полученную смесь перемалывают и другие подходящие вспомогательные вещества добавляют при необходимости; затем смесь обрабатывают с получением гранул, так чтобы получить сердцевину таблеток или покрытых сахарной оболочкой таблеток. Подходящие вспомогательные вещества включают в себя без ограничения адгезивные средства, разбавители, разрыхлители, смазывающие средства, способствующие скольжению средства, подсластители и/или ароматизаторы и т.д., такие как микрокристаллическая целлюлоза, растворы глюкозы, слизь гуммиарабика, растворы желатина, сахароза и/или крахмальные пасты; тальк, крахмал, стеарат магния, стеарат кальция и/или стеариновая кислота; лактоза, сахароза, крахмал, маннит, сорбит и/или дикальцийфосфат; кремнезем; поперечно-сшитая карбоксиметилцеллюлоза натрия, прежелатинизированный крахмал, крахмалгликолят натрия, альгиновая кислота, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, метилцеллюлоза, агар, карбоксиметилцеллюлоза и/или поперечно-сшитый поливинилпирролидон и т.д. Необязательно на сердцевину покрытой сахарной оболочкой таблетки можно нанести оболочки посредством хорошо известных в общей фармацевтической практике способов, и, в частности, используют нанесение кишечнорастворимой оболочки.
Фармацевтическая композиция также является подходящей для парентерального введения, например, стерильные растворы, суспензии или лиофилизированные продукты в адекватной форме одноразовой дозы.
Согласно некоторым вариантам осуществления соединение формулы (I) согласно представленному в настоящем документе описанию или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить любыми подходящими путями и способами, например, с помощью перорального или парентерального (т.е. внутривенного) введения. Терапевтически эффективные количества соединения формулы (I) составляют от приблизительно 0,0001 до 20 мг/кг массы тела в день, например, от 0,001 до 10 мг/кг массы тела в день.
Согласно некоторым вариантам осуществления кратность приема дозы соединения формулы (I) определяют в соответствии с потребностями отдельного пациента, и она может составлять, например, один или два раза в день, или больше раз в день. Введение может являться прерывистым, например, с периодом, составляющим несколько дней, во время которого пациент получает суточную дозу соединения формулы (I), за которым следует период, составляющий несколько дней, в течение которого пациент не получает суточную дозу соединения формулы (I).
Соединения настоящей заявки могут быть получены различными способами синтеза, хорошо известными специалистам настоящей области техники, включая изложенные выше конкретные варианты осуществления, варианты осуществления, образованные объединением конкретных вариантов осуществления с другими химическими способами синтеза, и эквивалентные альтернативы, известные специалисту настоящей области техники. Конкретные варианты осуществления включают в себя без ограничения примеры настоящей заявки.
Химическую реакцию конкретного варианта осуществления настоящей заявки проводили в подходящем растворителе, и растворитель должен быть подходящим для химических изменений настоящей заявки и их требуемых реагентов и материалов. Для получения соединений настоящей заявки специалисту настоящей области техники иногда необходимо модифицировать или выбрать стадию синтеза или реакционный процесс на основании настоящих вариантов осуществления.
Согласно конкретному варианту осуществления часть соединений формулы (I) настоящей заявки может быть получена специалистом в области органического синтеза стандартными способами согласно следующей схеме 1:
6
4
Начиная с соединения формулы (II) и соединения формулы (III) сначала проводили реакцию замещения между аминогруппой на бензольном кольце соединения формулы (II) и атомом хлора на пиримидине соединения формулы (III), а затем соединение формулы (IV) формирует карбонильную группу и образует кольцевую структуру с получением соединения формулы (V), которое затем присоединяется к R с получением соединения формулы (VI). Осуществляли взаимодействие атома хлора на пиримидиновом кольце соединения формулы (VI) с аминогруппой на бензольном кольце соединения формулы (VII) с получением соединения формулы (VIII), которое затем присоединялось к R боковой цепи с получением соединения формулы (IX). Нитрогруппу соединения формулы (IX) восстанавливали до аминогруппы, которая
затем образовывала амидную связь с соединением формулы (XI) с получением соединения формулы (I-а) в виде конечного продукта.
Часть соединений формулы (I) настоящей заявки также может быть получена специалистом в области органического синтеза стандартными способами согласно следующей схеме 2:
Начиная с соединения формулы (XII) и соединения формулы (III) сначала проводили реакцию замещения между аминогруппой на бензольном кольце соединения формулы (XII) и атомом хлора на пиримидине соединения формулы (III), а затем метил удаляли из соединения формулы (XIII) с получением соединения формулы (XIV), которое затем формирует карбонильную группу и образует кольцевую структуру с получением соединения формулы (XV). Реакция замещения между атомом хлора на пиримидиновом кольце соединения формулы (XV) и аминогруппой на бензольном
4
кольце соединения формулы (VII) проходила с получением соединения формулы (XVI), которое затем присоединялось к R боковой цепи с получением соединения формулы (XVII). Нитрогруппу соединения формулы (XVII) восстанавливали до аминогруппы, которая затем образовывала амидную связь с соединением формулы (XI) с получением соединения формулы (I-b) в виде конечного продукта.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящей заявки специалисты настоящей области техники могут получать соединения настоящей заявки согласно стадиям схемы 1 или схемы 2 без их строгого соблюдения. Принимая во внимание структуру конечного продукта, порядок стадий на схеме 1 или схеме 2 может меняться, и стадии могут быть добавлены или пропущены, которые также находятся в пределах объема настоящей заявки.
Для ясности примеры использовали для дополнительной иллюстрации настоящей заявки, и их не следует рассматривать как определение или ограничение объема настоящей заявки.
Используемые в настоящей заявке растворители являются коммерчески доступными и могут быть использованы без дополнительной очистки. Все действия, включающие в себя чувствительные к влаге и/или кислороду эксперименты, проводили в атмосфере азота в предварительно высушенной стеклянной посуде. Если не отмечено иное, все вещества получали из коммерчески доступных источников и использовали без дополнительной очистки. Проводимый в настоящей заявке метод колоночной хроматографии выполняли на силикагеле (200-300 меш), полученным от Qingdao Haiyang Chemical CO., LTD. Метод тонкослойной хроматографии проводили с использованием предварительно покрытых хроматографических пластинок, закупленных у Е. Merck (силикагель 60PF254, 0,25 мм). Используемым прибором для ядерного магнитно-резонансного спектроскопического анализа являлся резонансный спектрометр Varian VNMRS-400. Химический сдвиг упоминался относительно внутреннего стандарта, тетраметилсилана (TMS=δ 0,00). Данные спектра Н-ЯМР регистрировали в следующем формате: число протонов, спектр пика (s, синглет; d, дублет; t, триплет; q, квартет; m, мультиплет), константа связи (выражена в Гц).
В настоящей заявке использовали следующие аббревиатуры: DMF означает
2
3
N,N-диметилформамид; NMP означает N-метилпирролидон; DCM означает дихлорметан; РЕ означает петролейный эфир; ЕА означает этилацетат; МеОН означает метанол; Pd(dba) означает трис(дибензилиденацетон)дипалладий; TsOH означает пара-толуолсульфоновую кислоту; BINAP означает (±)-2,2'-бис-(дифенилфосфино)-1,1'-бинафтил.
Соединения были названы вручную или при помощи программного обеспечения ChemDraw. Для коммерчески доступных соединений использовали их названия, представленные в каталогах поставщиков.
ПРИМЕРЫ
Целью следующих конкретных примеров является облегчение более четкого понимания и осуществления настоящей заявки специалистами настоящей области техники. Их не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящей заявки и они являются только иллюстративными примерами и типичными образцами настоящей заявки.
Пример 1:
N-(2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-4-метокси-5-(4-(3-метил-2-оксо-2,3-дигидро-1H-бензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)фенил)акриламида гидрохлорид
1
Стадия 1: N-(2-хлорпиримидин-4-ил)бензол-1,2-диамин
Орто-фенилендиамин (3,24 г, 30 ммоль) и 2,4-дихлорпиримидин (4,47 г, 30 ммоль) диспергировали в безводном этаноле (60 мл), туда добавляли диизопропилэтиламин (7,74 г, 60 ммоль) и полученную смесь нагревали до температуры образования флегмы в течение 3 часов. Полученную смесь концентрировали под вакуумом с удалением растворителя, а остаток растворяли в дихлорметане (100 мл), промывали водой, а затем насыщенным солевым раствором, и концентрировали под вакуумом с удалением растворителя. Полученный остаток отделяли методом колоночной хроматографии (ЕА:РЕ=1:2) с получением указанного соединения (5,32 г, 80%).
1
3
H ЯМР (CDCl): δ 8.08 (1Н, d, J=5.6 Гц), 7.20-7.12 (2Н, m), 6.85-6.78 (2Н, m), 6.74 (1H, s), 6.24 (1Н, d, J=5.6 Гц), 3.82 (2Н, br).
Стадия 2: 1-(2-хлорпиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
1
N-(2-хлорпиримидин-4-ил)фенил-1,2-диамин (2,21 г, 10 ммоль) растворяли в DMF (15 мл), туда добавляли карбонилдиимидазол (2,43 г, 15 ммоль) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Полученную смесь выливали в воду (50 мл) и перемешивание продолжали в течение 10 минут. Затем полученную смесь подвергали фильтрации на всасывающем фильтре и фильтрационный кек промывали водой (30 мл * 3) и сушили с получением указанного соединения (2,23 г, 90%).
1
6
Н ЯМР (DMSO-d): δ 11.64 (1Н, br), 8.78 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.43 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.26 (1Н, d, J=7.6 Гц), 7.22-7.10 (3Н, m).
Стадия 3: 1-(2-хлорпиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
1-(2-Хлорпиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он (600 мг, 2,43 ммоль) диспергировали в безводном DMF (10 мл) и охлаждали в бане с ледяной водой. Туда добавляли гидрид натрия (116 мг, 60%, 2,90 ммоль) и полученную смесь перемешивали в течение 1 часа. Затем по каплям добавляли йодметан (345 мг, 2,43 ммоль) и перемешивание продолжали в течение 1 часа. Реакционный раствор выливали в воду (50 мл), полученную смесь перемешивали в течение 30 минут, а затем подвергали фильтрации на всасывающем фильтре и фильтрационный кек промывали водой (30 мл * 3) и сушили с получением указанного соединения (459 мг, 72%).
1
6
H ЯМР (DMSO-d): δ 8.79 (1H, d, J=5.6 Гц), 8.44 (1Н, d, J=6.0 Гц), 8.29 (1Н, d, J=8.0 Гц), 7.30-7.28 (2Н, m), 7.24-7.19 (1H, m), 3.39 (3Н, s).
Стадия 4:
1-(2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она пара-толуолсульфонат
1-(2-Хлорпиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он (459 мг, 1,76 ммоль), 4-фтор-2-метокси-5-нитроанилин (360 мг, 1,93 ммоль) и моногидрат пара-толуолсульфоновой кислоты (551 мг, 2,89 ммоль) диспергировали в 2-пентаноле (10 мл) и реакционную смесь перемешивали всю ночь при 105°С. После охлаждения смесь подвергали фильтрации на всасывающем фильтре и фильтрационный кек трижды промывали небольшим количеством 2-пентанола и сушили с получением указанного соединения (440 мг, 43%).
1
3
Н ЯМР (CDCl): δ 10.95 (1Н, br), 8.49 (1Н, d, J=7.6 Гц), 8.39 (1Н, d, J=7.2 Гц), 8.21 (1H, d, J=7.2 Гц), 7.87 (2Н, d, J=8.4 Гц), 7.68 (1H, d, J=8.4 Гц), 7.28-7.23 (2Н, m), 7.04 (2Н, d, J=7.6 Гц), 6.91-6.85 (2Н, m), 3.92 (3Н, s), 3.46 (3Н, s), 2.38 (3Н, s).
Стадия 5:
1-(2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)
пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
1
1
2
1-(2-(4-Фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она пара-толуолсульфонат (440 мг, 0,76 ммоль) растворяли в NMP (5 мл). К этому добавляли диизопропилэтиламин (206 мг, 1,59 ммоль) и N,N,N-триметилэтан-1,2-диамин (116 мг, 1,14 ммоль) и реакционную смесь перемешивали всю ночь при 85°С. Реакционный раствор охлаждали, а затем выливали в воду (50 мл). Затем смесь подвергали фильтрации на всасывающем фильтре, фильтрационный кек промывали небольшим количеством метанола и сушили с получением указанного соединения (326 мг, 88%).
1
3
H ЯМР (CDCl): δ 8.92 (1H, s), 8.51 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.27 (1Н, d, J=7.6 Гц), 7.82 (1H, d, J=5.6 Гц), 7.47 (1Н, s), 7.29-7.19 (1H, m), 7.17-7.13 (1Н, m), 7.04 (1Н, d, J=7.6 Гц), 6.69 (1Н, s), 3.98 (3Н, s), 3.47 (3Н, s), 3.27 (2Н, t, J=7.2 Гц), 2.89 (3Н, s), 2.88 (2Н, t, J=7.2 Гц), 2.26 (6Н, s).
Стадия 6:
1-(2-(5-амино-4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метоксифениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
1-(2-(4-((2-(Диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он (326 мг, 0,66 ммоль) растворяли в метаноле (10 мл) и туда добавляли Pd/C (10%, 30 мг). После трех замен воздушной атмосферы на водородную систему перемешивали всю ночь в атмосфере
водорода, а затем подвергали фильтрации на всасывающем фильтре. Продукт легко окислялся и таким образом полученный фильтрат быстро концентрировали под вакуумом, а затем сразу подавали на следующую стадию реакции.
Стадия 7:
N-(2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-4-метокси-5-(4-(3-метил-2-оксо-2,3-дигидро-1H-бензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)фенил)акриламида гидрохлорид
1-(2-(5-Амино-4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метоксифениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он, полученный на предыдущей стадии, растворяли в безводном дихлорметане (10 мл), туда добавляли диизопропилэтиламин (129 мг, 1,00 ммоль) и охлаждали в бане с ледяной водой. К системе в течение 15 минут медленно по каплям добавляли раствор акрилоилхлорида (60 мг, 0,66 ммоль) в безводном дихлорметане (2 мл). После перемешивания в течение дополнительных 15 минут реакционный раствор выливали в петролейный эфир (50 мл) и перемешивали в течение 10 минут. Полученную смесь подвергали фильтрации на всасывающем фильтре, а фильтрационный кек промывали петролейным эфиром. Полученный неочищенный продукт отделяли методом колоночной хроматографии (DCM:МеОН=20:1) с получением указанного соединения (164 мг, 45% выхода за две стадии).
1
6
Н ЯМР (DMSO-d): δ 10.15 (1Н, br), 9.72 (1H, br), 8.70 (1Н, s), 8.41 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.16-8.12 (2Н, m), 7.67 (1Н, d, J=5.6 Гц), 7.22-7.12 (2Н, m), 6.99-6.92 (3Н, m), 6.19 (1H, dd, J=2.0 Гц, 17.2 Гц), 5.68 (1Н, dd, J=2.0 Гц, 10.4 Гц), 3.77 (3Н, s), 3.34 (3Н, s), 3. 28 (4Н, br), 2.72 (6Н, s), 2.60 (3Н, s).
Пример 2:
N-(2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-4-метокси-5-(4-(2-оксо-2,3-дигидробензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)фенил)акриламида гидрохлорид
Стадия 1:
1-(2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она пара-толуолсульфонат
Указанное соединение получали из 1-(2-хлорпиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она и 4-фтор-2-метокси-5-нитроанилина способом, подобным описанному способу на стадии 4 примера 1.
1
6
Н ЯМР (DMSO-d): δ 11.47 (1Н, s), 9.12 (1H, s), 8.62 (1H, d, J=8.4 Гц), 8.50 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.16-8.14 (1Н, m), 7.82 (1Н, d, J=5.6 Гц), 7.47-7.40 (3Н, m), 7.15-7.09 (3Н, m), 7.04 (1H, d, J=7.6 Гц), 6.95-6.91 (1H, m), 3.96 (3Н, s), 2.27 (3Н, s).
Стадия 2:
1-(2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
Указанное соединение получали из
1-(2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она пара-толуолсульфоната способом, подобным описанному способу на стадии 5 примера 1.
1
6
Н ЯМР (DMSO-d): δ 11.39 (1Н, s), 8.72 (1Н, s), 8.42 (1H, d, J=5.6 Гц), 8.12-8.03 (2Н, m), 7.68 (1Н, d, J=5.6 Гц), 7.11-7.07 (1Н, m), 7.02-7.00 (1Н, m), 6.88-6.84 (1Н, m), 6.81 (1Н, s), 3.87 (3Н, s), 3.28 (2Н, t, J=6.8 Гц), 2.85 (3Н, s), 2.46 (2Н, t, J=6.8 Гц), 2.15 (6Н, s).
Стадия 3:
N-(2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-4-метокси-5-(4-(2-оксо-2,3-дигидро-1H-бензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)фенил)акриламида гидрохлорид
Указанное соединение получали из 1-(2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино) пиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она способом, подобным описанным способам на стадиях 6 и 7 примера 1.
1
Н ЯМР (MeOD): δ 8.46 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.28 (1Н, s), 8.14 (1H, d, J=8.4 Гц), 7.70 (1Н, d, J=5.6 Гц), 7.12-7.06 (2Н, m), 7.03-7.99 (1H, m), 6.97 (1Н, s), 6.51-6.38 (2Н, m), 5.83-5.80 (1Н, m), 3.97 (3Н, s), 3.45 (2Н, br), 3.21 (2Н, br), 2.81 (6Н, s), 2.71 (3Н, s).
Пример 3:
N-(5-(5-хлор-4-(3-метил-2-оксо-2,3-дигидро-1H-бензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)-2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-4-метоксифенил) акриламида гидрохлорид
1
Стадия 1: N-(2,5-дихлорпиримидин-4-ил)бензол-1,2-диамин
Указанное соединение получали из 2,4,5-трихлорпиримидина и орто-фенилендиамина способом, подобным описанному способу на стадии 1 примера 1.
1
3
Н ЯМР (CDCl): δ 8.18 (1H, s), 7.46 (1Н, dd, J=1.6 Гц, 7.2 Гц), 7.15-7.11 (2Н, m), 6.91-6.86 (2Н, m), 3.67 (2Н, br).
Стадия 2: 1-(2,5-дихлорпиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
1
N-(2,5-дихлорпиримидин-4-ил)бензол-1,2-диамин (100 мг, 0,39 ммоль) растворяли в этилацетате (5 мл), туда добавляли диизопропилэтиламин (151 мг, 1,17 ммоль) и охлаждали в бане с ледяной водой. Затем частями добавляли трифосген (71 мг, 0,24 ммоль). Полученную смесь оставляли нагреваться естественным образом до комнатной температуры и перемешивание продолжали в течение 1 часа. Добавляли насыщенный раствор бикарбоната натрия (10 мл) и перемешивание продолжали в течение 10 минут. Смесь экстрагировали этилацетатом (20 мл*2) и органические фазы объединяли, промывали насыщенным солевым раствором и концентрировали под вакуумом с удалением растворителя с получением указанного соединения (105 мг, 95%).
1
6
H ЯМР (DMSO-d): δ 11.44 (1H, br), 9.16 (1H, s), 7.20-7.04 (4Н, m).
Стадия 3:
1-(2,5-дихлорпиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
Указанное соединение получали из 1-(2,5-дихлорпиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она способом, подобным описанному способу на стадии 3 примера 1.
1
3
Н ЯМР (CDCl): δ 8.80 (1Н, s), 7.27-7.23 (2Н, m), 7.18-7.16 (1Н, m), 7.06 (1H, d, J=8.0 Гц), 3.48 (3Н, s).
Стадия 4:
1-(5-хлор-2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
2
3
1-(2,5-Дихлорпиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он (50 мг, 0,17 ммоль), 4-фтор-2-метокси-5-нитроанилин (63 мг, 0,34 ммоль), BINAP (11 мг, 0,017 ммоль) и карбонат цезия (110 мг, 0,34 ммоль) диспергировали в безводном толуоле (5 мл). После барботирования газообразного азота в течение 20 минут добавляли Pd(dba) (8 мг, 0,008 ммоль). Система взаимодействовала в течение 1 часа в микроволновом реакторе (100 Вт, 100°С) и ее концентрировали под вакуумом с удалением растворителя. Полученный остаток отделяли методом колоночной хроматографии (DCM - DCM : ЕА=20:1) с получением указанного соединения (54 мг, 72%).
1
3
H ЯМР (CDCl): 9.31 (1Н, s), 8.02 (1Н, s), 8.55 (1Н, d, J=8.2 Гц), 7.33 (1Н, d, J=13.6 Гц), 7.25 (1Н, d, J=7.2 Гц), 7.21-7.16 (2Н, m), 6.78 (1Н, d,J=12.0 Гц), 3.97 (3Н, s), 3.43 (3Н, s).
Стадия 5:
1-(5-хлор-2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
Указанное соединение получали из 1-(5-хлор-2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она способом, подобным описанному способу на стадии 5 примера 1.
1
3
Н ЯМР (CDCl): δ 8.88 (1H, s), 8.59 (1Н, s), 7.69 (1H, s), 7.25-7.19 (2Н, m), 7.16-7.14 (1Н, m), 7.05 (1Н, d, J=7.2 Гц), 6.65 (1Н, s), 3.95 (3Н, s), 3.49 (3Н, s) 3.25 (2Н, t, J=7.2 Гц), 2.56 (3Н, s), 2.54 (2Н, t, J=7.2 Гц), 2.25 (6Н, s).
Стадия 6:
1-(2-(5-амино-4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метоксифениламино)-5-хлорпиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
1-(5-Хлор-2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он (320 мг, 0,61 ммоль), железный порошок (139 мг, 2,48 ммоль) и хлорид аммония (50 мг, 0,93 ммоль) диспергировали в смешанном растворе из этанола/воды (8 мл/4 мл). Систему энергично перемешивали при 80°С в течение 3 часов, охлаждали, а затем фильтровали, и органический растворитель удаляли под вакуумом. К результату добавляли воду (20 мл) и полученную смесь экстрагировали этилацетатом (20 мл*3). Полученную
органическую фазу промывали насыщенным солевым раствором и концентрировали под вакуумом с удалением растворителя с получением указанного соединения, которое использовали сразу на следующей стадии реакции.
Стадия 7:
N-(5-(5-хлор-4-(3-метил-2-оксо-2,3-дигидро-1H-бензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)-2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-4-метоксифенил) акриламида гидрохлорид
Указанное соединение получали из 1-(5-хлор-2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она способом, подобным описанному способу на стадии 7 примера 1.
1
6
H ЯМР (DMSO-d): δ 10.15 (1Н, br), 9.68 (1Н, br), 9.05 (1Н, s), 8.66 (1Н, s), 8.11 (1H, s), 7.23-7.20 (1Н, m), 7.15-7.09 (2Н, m), 7.05-6.99 (2Н, m), 6.89 (1Н, s), 6.41 (1H, dd, J=2.0 Гц, 16.8 Гц), 5.70 (1Н, dd, J=2.0 Гц, 10.0 Гц), 3.79 (3Н, s), 3.35 (3Н, s), 3.28 (2Н, br), 2.65 (6Н, s), 2.55(5Н, s).
Пример 4:
N-(5-(5-хлор-4-(2-оксо-2,3-дигидро-1H-бензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)-2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-4-метоксифенил)акриламида гидрохлорид
Стадия 1:
1-(5-хлор-2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
Указанное соединение получали из 1-(2,5-дихлорпиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она и 4-фтор-2-метокси-5-нитроанилина способом, подобным описанному способу на стадии 4 примера 3.
1
3
Н ЯМР (CDCl): 9.24 (1Н, d, J=8.0 Гц), 8.68 (1Н, s), 8.45 (1Н, s), 7.83 (1Н, s), 7.34 (1Н, s), 7.22-7.10 (3Н, m), 6.78 (1Н, d, J=12.0 Гц), 4.02 (3Н, s).
Стадия 2:
1-(5-хлор-2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
1
3
Н ЯМР (CDCl): δ 8.94 (1H, s), 8.66 (1H, s), 8.38 (1Н, br), 7.84 (1Н, s), 7.23-7.13 (4Н, m), 4.05 (3Н, s), 3.56 (2Н, br), 3.08 (2Н, br), 2.89 (3Н, s) 2.69 (6Н, s).
Указанное соединение получали из 1-(5-хлор-2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она способом, подобным описанному способу на стадии 5 примера 1.
Стадия 3:
N-(5-(5-хлор-4-(2-оксо-2,3-дигидро-1H-бензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)-2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-4-метоксифенил)акриламида
гидрохлорид
Указанное соединение получали из 1-(5-хлор-2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она способом, подобным описанным способам на стадиях 6 и 7 примера 3.
1
3
Н ЯМР (CDCl): δ 12.20 (1H, br), 9.35 (1Н, br), 9.17 (1Н, br), 8.64 (1Н, s), 8.41 (1Н, br), 7.69 (1Н, s), 7.21-7.16 (1Н, m), 7.13-7.07 (3Н, m), 6.67 (1Н, s), 6.42 (1Н, dd, J=1.6 Гц, 16.8 Гц), 5.71 (1H, d, J=11.6 Гц), 3.84 (3Н, s), 3.24 (2Н, br), 3.08 (2Н, br), 2.72 (9Н, br).
Пример 5:
N(2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-4-метокси-5-(4-(2-оксобензо[d]оксазол-3(2H)-ил)пиримидин-2-иламино)фенил)акриламида гидрохлорид
Стадия 1: 2-хлор-N-(2-метоксифенил)пиримидин-4-амин
Указанное соединение получали из орто-метоксианилина и 2,4-дихлорпиримидина способом, подобным описанному способу на стадии 1 примера 1.
1
3
H ЯМР (CDCl): δ 8.14 (1H, d,J=5.6 Гц), 7.83 (1H, br), 7.27 (1H, m), 7.17-7.13 (1H, m), 7.04-6.99 (1H, m), 6.96-6.94(1H, m), 6.63-6.62 (1H, d, J=6.0 Гц), 3.89 (3Н, s).
Стадия 2: 2-(2-хлорпиримидин-4-иламино)фенол
2-Хлор-N-(2-метоксифенил)пиримидин-4-амин (100 мг, 0,42 ммоль) растворяли в безводном дихлорметане (3 мл) и охлаждали в бане с ледяной водой. Медленно по каплям добавляли раствор (2,5 мл, 2,12 ммоль) трибромида бора в дихлорметане, полученную смесь оставляли нагреваться естественным образом до комнатной температуры и перемешивание продолжали в течение 2 часов. Реакцию гасили добавлением насыщенного раствора хлорида аммония, а затем смесь экстрагировали дихлорметаном (20 мл*3). Органические фазы объединяли и промывали насыщенным солевым раствором, а растворитель удаляли под вакуумом с получением указанного соединения (84 мг, 89%).
1
6
Н ЯМР (DMSO-d): δ 9.85 (1H, s), 9.31 (1Н, s), 8.07 (1Н, d, J=6.0 Гц), 7.57 (1H, br), 7.05-7.01 (1Н, m), 6.93(1Н, d, J=8.0 Гц), 6.84-6.80 (1Н, m), 6.66 (1Н, br).
Стадия 3: 3-(2-хлорпиримидин-4-ил)бензо[d]оксазол-2(3H)-он
Указанное соединение получали из 2-(2-хлорпиримидин-4-иламино)фенола способом, подобным описанному способу на стадии 2 примера 3.
1
6
Н ЯМР (DMSO-d): δ 8.87 (1H, d,J=5.6 Гц), 8.25-8.19 (2Н, m), 7.49(1Н, d, J=7.6 Гц), 7.39-7.30 (2Н, m).
Стадия 4:
3-(2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)бензо[d]оксазол-2(3H)-она пара-толуолсульфонат
Указанное соединение получали из 3-(2-хлорпиримидин-4-ил)бензо[d]оксазол-2(3H)-она способом, подобным описанному способу на стадии 4 примера 1.
1
6
Н ЯМР (DMSC-d): δ 10.83 (1Н, br), 9.23 (1Н, s), 8.59 (1H, d, J=5.6 Гц), 8.24 (1Н, br), 7.64 (1Н, d, J=5.6 Гц), 7.47-7.43 (4Н, m), 7.31-7.24 (1Н, m), 7.19-7.14 (1Н, m), 7.1Ц2Н, d, J=8.0 Гц), 3.97 (3Н, s), 2.28 (3Н, s).
Стадия 5:
3-(2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)бензо[d]оксазол-2(3H)-он
Указанное соединение получали из 3-(2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)бензо[d]оксазол-2(3H)-она пара-толуолсульфоната способом, подобным описанному способу на стадии 5 примера 1.
1
3
Н ЯМР (CDCl): δ 8.86 (1Н, s), 9.23 (1Н, s), 8.57 (1Н, d,J=5.6 Гц), 8.24-8.22 (1H, m), 7.74 (1Н, d, J=5.6 Гц), 7.48 (1H, s), 7.29-7.25 (2Н, m), 6.72 (1H, s), 4.01 (3Н, s), 3.29 (2Н, t, J=7.2 Гц), 2.89 (3Н, s), 2.57 (2Н, t, J=7.2 Гц), 2.27 (6Н, s).
Стадия 6:
N-(2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-4-метокси-5-(4-(2-оксобензо[d]оксазол-3(2H)-ил)пиримидин-2-иламино)фенил)акриламида гидрохлорид
Указанное соединение получали из 3-(2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)бензо[d]оксазол-2(3H)-она способом, подобным описанным способам на стадиях 6 и 7 примера 1.
1
3
H ЯМР (CDCl): δ 12.21 (1Н, br), 9.51 (1Н, br), 9.22 (1H, s), 8.55 (1H, d, J=5.6 Гц), 8.25 (1H, d, J=8.0 Гц), 7.51 (1H, s), 7.26 (1Н, s), 7.23-7.16 (4Н, m), 6.72 (1Н, s), 6.31 (1Н, dd, J=2.0 Гц, 16.8 Гц), 5.67 (1Н, dd, J=2.0 Гц, 10.4 Гц,), 3.90 (3Н, s), 3.29 (2Н, br), 3.13 (2Н, br), 2.76 (9H, br).
Пример 6:
N-(2-((2-гидроксиэтил)(метил)амино)-4-метокси-5-(4-(3-метил-2-оксо-2,3-дигидро-1H-бензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)фенил)акриламид
Стадия 1:
1-(2-(4-((2-гидроксиэтил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
Указанное соединение получали из 2-(метиламино)этанола способом, подобным
описанному способу на стадии 5 примера 1.
1
3
H ЯМР (CDCl): δ 8.97 (1Н, s), 8.52 (1H, d, J=6.0 Гц), 8.26 (1Н, J=7.2 Гц), 7.83 (1Н, d, J=5.6 Гц), 7.56 (1Н, s), 7.27-7.23 (1Н, m), 7.18-7.16 (1Н, m), 7.04 (1H, J=7.2 Гц), 6.70 (1Н, s), 4.00 (3Н, s), 3.79-3.76 (2Н, m), 3.48 (3Н, s), 3.40 (2Н, t, J=7.2 Гц), 2.84 (3Н, s).
Стадия 2:
N-(2-((2-гидроксиэтил)(метил)амино)-4-метокси-5-(4-(3-метил-2-оксо-2,3-дигидро-1H-бензо[d]|имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)фенил)акриламид
Указанное соединение получали из 1-(2-(4-((2-гидроксиэтил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она способом, подобным описанным способам на стадиях 6 и 7 примера 1.
1
3
Н ЯМР (CDCl): δ 9.30 (1Н, s), 9.03 (1Н, s), 8.52 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.32 (1Н, d, J=8.0 Гц), 7.80 (1H, d, J=5.6 Гц), 7.46 (1Н, s), 7.18-7.14 (1Н, m), 7.08-7.03 (1H, m), 7.01-6.95 (1H, m), 6.77 (1Н, s), 6.34-6.32 (2Н, m), 5.65-5.63 (1Н, m), 3.87 (3Н, s), 3.77-3.74 (2Н, m), 3.45 (3Н, s), 2.99 (2Н, t, J=4.8 Гц), 3.75 (3Н, s).
Пример 7:
(Е)-N-(2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-4-метокси-5-(4-(3-метил-2-оксо-2,3-дигидро-1H-бензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)фенил)-4-метоксибут-2-енамид
Указанное соединение получали из 1-(2-(5-амино-4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метоксифениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она и (E)-4-метоксибут-2-еноила хлорида способом, подобным описанному способу на стадии 7 примера 1.
1
3
Н ЯМР (CDCl): δ 12.32 (1H, br), 9.24 (1Н, br), 9.17 (1H, br), 8.52 (1H, d, J=5.6 Гц), 8.31 (1H, d, J=8.0 Гц), 7.80 (1H, d, J=5.6 Гц), 7.49 (1Н, br), 7.19-7.10 (2Н, m), 6.99-6.96 (2Н, m), 6.90-6.84 (1H, m), 6.72 (1Н, s), 4.14 (2Н, d, J=3.2 Гц), 3.90 (3Н, s), 3.45 (3Н, s), 3.40 (3Н, s), 3.38-3.35 (2Н, m), 3.12-3.08 (2Н, m), 2.80 (6Н, s), 2.74 (3Н, s).
Пример 8:
N-(4-метокси-5-(4-(3-метил-2-оксо-2,3-дигидробензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)-2-морфолинофенил)акриламид
Стадия 1:
1-(2-(2-метокси-4-морфолино-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
Указанное соединение получали из
1-(2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она пара-толуолсульфоната и морфолина способом, подобным описанному способу на стадии 5 примера 1.
1
3
Н ЯМР (CDCl): δ 9.10 (1Н, s), 8.54 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.27 (1Н, d, J=8.0 Гц), 7.85 (1Н, d, J=5.6 Гц), 7.59 (1Н, s), 7.27-7.24 (1H, m), 7.19-7.17 (1Н, m), 7.05 (1Н, d, J=8.0 Гц), 6.65 (1Н, s), 4.04 (3Н, s), 3.91-3.89 (4Н, m), 3.49 (3Н, s), 3.10-3.08 (4Н, m).
Стадия 2:
N-(4-метокси-5-(4-(3-метил-2-оксо-2,3-дигидробензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)-2-морфолинофенил)акриламид
Указанное соединение получали из 1-(2-(2-метокси-4-морфолино-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она способом, подобным описанным способам на стадиях 6 и 7 примера 1.
1
3
Н ЯМР (CDCl): δ 9.37 (1H, s), 8.55 (1H, d, J=5.6 Гц), 8.48 (1Н, s), 8.34 (1Н, d, J=8.0 Гц), 7.81 (1Н, d, J=5.6 Гц), 7.46 (1Н, s), 7.20-7.16 (1H, m), 7.10-7.06 (1Н, m), 7.01-6.99 (1H, m), 6.79 (1Н, s), 6.36-6.22 (2Н, m), 5.75-5.72 (1H, m), 3.91-3.88 (7Н, m), 3.46 (3Н, s), 2.90 (4Н, t, J=4.8 Гц).
Пример 9:
N-(2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-4-метокси-5-(4-(5-метил-2-оксо-2,3-дигидробензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)фенил)акриламида гидрохлорид
1
Стадия 1: N-(2-хлорпиримидин-4-ил)-4-метилбензол-1,2-диамин
Указанное соединение получали из 4-метилбензол-1,2-диамина и 2,4-дихлорпиримидина способом, подобным описанному способу на стадии 1 примера 1.
1
3
Н ЯМР (CDCl): δ 8.06 (1Н, d, J=6.0 Гц), 7.00 (1H, d, J=8.0 Гц), 6.77 (1Н, s), 6.66 (1Н, s), 6.62 (1Н, d, J=8.0 Гц), 6.21 (1H, d, J=6.0 Гц), 3.79 (2Н, br), 2.31 (3Н, s).
Стадия 2: 1-(2-хлорпиримидин-4-ил)-5-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
1
Указанное соединение получали из N-(2-хлорпиримидин-4-ил)-4-метилбензол-1,2-диамина и карбонилдиимидазола способом, подобным описанному способу на стадии 2 примера 1.
1
3
Н ЯМР (CDCl): δ 8.62 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.47 (1H, d, J=5.6 Гц), 8.34 (1Н, d, J=8.4 Гц), 7.97 (1Н, s), 7.03 (1H, d, J=8.4 Гц), 6.91 (1Н, s), 2.42 (3Н, s).
Стадия 3:
1-(2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-5-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она пара-толуолсульфонат
Указанное соединение получали из 1-(2-хлорпиримидин-4-ил)-5-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она и 4-фтор-2-метокси-5-нитроанилина способом, подобным описанному способу на стадии 4 примера 1.
1
6
Н ЯМР (DMSO-d): δ 11.39 (1Н, s), 9.04 (1Н, s), 8.61 (1Н, d, J=8.4 Гц), 8.49 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.04-8.02 (1Н, m), 7.82 (1Н, d, J=5.6 Гц), 7.49-7.41 (3Н, m), 7.11 (2Н, d, J=8.0 Гц), 6.93 (1Н, s), 6.87 (1Н, s), 6.76-6.74 (1Н, m), 3.97 (3Н, s), 2.33 (3Н, s), 2.29 (3Н, s).
Стадия 4:
1-(2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-5-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
Указанное соединение получали из 1-(2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-5-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она пара-толуолсульфоната и диизопропилэтиламина способом, подобным описанному способу на стадии 5 примера 1.
1
3
H ЯМР (CDCl): δ 8.92 (1Н, s), 8.50 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.30 (1Н, br), 8.11 (1Н, d,J=8.0 Гц), 7.78 (1H, d, J=5.6 Гц), 7.45 (1Н, s), 6.94 (1Н, d, J=8.0 Гц), 6.89 (1H, s), 6.70 (1Н, s), 3.98 (3Н, s), 3.31 (2Н, t, J=6.8 Гц), 2.88 (3Н, s), 2.61 (2Н, t, J=6.8 Гц), 2.40 (3Н, s), 2.31 (6Н, s).
Стадия 5:
N-(2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-4-метокси-5-(4-(5-метил-2-оксо-2,3-дигидробензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)фенил)акриламида гидрохлорид
Указанное соединение получали из 1-(2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино) пиримидин-4-ил)-5-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она способом, подобным описанным способам на стадиях 6 и 7 примера 1.
1
Н ЯМР (MeOD): δ 8.32 (1Н, d, J=6.0 Гц), 7.91 (1Н, d, J=8.0 Гц), 7.61 (1Н, d, J=5.6 Гц), 6.87-6.84 (2Н, m), 6.78 (1H, s), 6.70 (1Н, d, J=8.0 Гц), 6.40-6.26 (2Н, m), 5.73-5.70 (1Н, m), 3.86 (3Н, s), 3.26 (2Н, br), 2.93 (2Н, br), 2.61 (3Н, s), 2.59 (6Н, s), 2.22 (3Н, s).
Пример 10:
N-(2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-5-(4-(5-фтор-3-метил-2-оксо-2,3-дигидробензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)-4-метоксифенил)акриламида гидрохлорид
1
Стадия 1: N-(2-дихлорпиримидин-4-ил)-4-фторбензол-1,2-диамин
Указанное соединение получали из 2,4-дихлорпиримидина и 4-фторбензол-1,2-диамина способом, подобным описанному способу на стадии 1 примера 1.
1
3
Н ЯМР (CDCl): δ 8.06 (1H, d, J=6.0 Гц), 7.06-7.03 (1H, m), 6.71 (1H, s), 6.52-6.44 (2Н, m), 6.14 (1Н, d, J=6.0 Гц), 3.94 (2Н, br).
Стадия 2: 1-(2-хлорпиримидин-4-ил)-5-фтор-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
1
Указанное соединение получали из N-(2-дихлорпиримидин-4-ил)-4-фторбензол-1,2-диамина и карбонилдиимидазола способом, подобным описанному способу на стадии 2 примера 1.
1
6
Н ЯМР (DMSO-d): δ 11.81 (1Н, s), 8.77 (1Н, d, J=6.0 Гц), 8.40 (1H, d, J=6.0 Гц), 8.24-8.21 (1H, m), 7.03-6.96 (2Н, m).
Стадия 3:
1-(2-хлорпиримидин-4-ил)-5-фтор-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
Указанное соединение получали из 1-(2-хлорпиримидин-4-ил)-5-фтор-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она способом, подобным описанному способу на стадии 3 примера 1.
1
6
Н ЯМР (DMSO-d): δ 8.77 (1H, d, J=5.6 Гц), 8.38 (1H, d, J=5.6 Гц), 8.23-8.19 (1H, m), 7.29 (1Н, d, J=8.8 Гц), 7.04-7.00 (1H, m), 3.36 (3H, s).
Стадия 4:
5-фтор-1-(2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она пара-толуолсульфонат
Указанное соединение получали из 1-(2-хлорпиримидин-4-ил)-5-фтор-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она и 4-фтор-2-метокси-5-нитроанилина способом, подобным описанному способу на стадии 4 примера 1, и его сразу использовали на следующей стадии реакции.
Стадия 5:
1-(2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-5-фтор-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
Указанное соединение получали из 5-фтор-1-(2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она пара-толуолсульфоната способом, подобным описанному способу на стадии 5 примера 1.
1
3
H ЯМР (CDCl): δ 8.86 (1H, s), 8.50 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.24-8.21 (1Н, m), 7.81 (1H, d, J=5.6 Гц), 7.42 (1H, s), 6.86-6.81 (1Н, m), 6.76 (1Н, dd, J=2.8 Гц, 8.0 Гц), 6.69 (1Н, s), 3.98 (3Н, s), 3.44 (3Н, s), 3.29 (2Н, t, J=12 Гц), 2.89 (3Н, s), 2.57 (2Н, t, J=7.2
Гц), 2.27 (6Н, s).
Стадия 6:
N-(2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-5-(4-(5-фтор-3-метил-2-оксо-2,3-дигидробензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)-4-метоксифенил)акриламида гидрохлорид
Указанное соединение получали из 1-(2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино) пиримидин-4-ил)-5-фтор-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она способом, подобным описанным способам на стадиях 6 и 7 примера 1.
1
6
H ЯМР (DMSC-d): δ 10.26 (1Н, s), 9.78 (1Н, s), 8.74 (1Н, s), 8.43 (1H, d, J=6.0 Гц), 8.17 (2Н, s), 7.70 (1Н, d, J=6.0 Гц), 7.22 (1Н, dd, J=2.4 Гц, 8.8 Гц), 7.06-6.99 (1Н, m), 6.97 (1Н, s), 6.79-6.75 (1Н, m), 6.21 (1Н, dd, J=2.0 Гц, 16.8 Гц), 5.71-5.68 (1H, m), 3.80 (3Н, s), 3.63-3.57 (2Н, m), 3.34 (3Н, s), 3.16-3.09 (2Н, m), 2.75 (6Н, s), 2.63 (3Н, s).
Пример 11:
N-(2-((2-(диметилтино)этил)(метил)амино)-5-(4-(5-фтор-2-оксо-2,3-дигидробензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)-4-метоксифенил)акриламида гидрохлорид
Стадия 1:
5-фтор-1-(2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она пара-толуолсульфонат
Указанное соединение получали из 1-(2-хлорпиримидин-4-ил)-5-фтор-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она и 4-фтор-2-метокси-5-нитроанилина способом, подобным описанному способу на стадии 4 примера 1.
1
6
Н ЯМР (DMSO-d): δ 11.68 (1Н, s), 9.24 (1H, s), 8.64 (1H, d, J=8.0 Гц), 8.51 (1Н, d, J=6.0 Гц), 8.23 (1Н, br), 7.83 (1H, d, J=6.0 Гц), 7.48 (2Н, d, J=8.0 Гц), 7.43 (1Н, d, J=8.0 Гц), 7.12 (2Н, d, J=8.0 Гц), 6.94-6.91 (1Н, m), 6.80-6.75 (1Н, m), 3.98 (3Н, s), 2.29 (3Н, s).
Стадия 2:
1-(2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-5-фтор-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
Указанное соединение получали из 5-фтор-1-(2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она пара-толуолсульфоната способом, подобным описанному способу на стадии 5 примера 1.
1
6
Н ЯМР (DMSO-d): δ 8.83 (1H, s), 8.47 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.26 (1H, s), 8.23-8.17 (1Н, m), 7.77-7.68 (2Н, m), 6.99-6.94 (2Н, m), 6.77-6.72 (1Н, m), 3.99 (3Н, s), 3.63 (2Н, m),
3.19-3.15 (2Н, m), 2.88 (3Н, s), 2.66 (6Н, s).
Стадия 3:
N-(2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-5-(4-(5-фтор-2-оксо-2,3-дигидробензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)-4-метоксифенил)акриламида гидрохлорид
Указанное соединение получали из 1-(2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-5-фтор-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она способом, подобным описанным способам на стадиях 6 и 7 примера 1.
1
3
Н ЯМР (CDOD): δ 8.45 (1H, dd, J=2.4 Гц, 5.6 Гц), 8.17-8.12 (1Н, m), 7.73-7.69 (2Н, m), 7.22 (1Н, d, J=8.0 Гц), 6.95 (1Н, d, J=3.6 Гц), 6.88-6.83 (1Н, m), 6.77-6.71 (1Н, m), 6.44-6.42 (1Н, m), 5.84-5.81 (1Н, m), 3.97 (3Н, s), 3.49-3.46 (2Н, m), 3.23 (2Н, m), 2.84 (6Н, s), 2.71 (3Н, s).
Пример 12:
N-(4-метокси-2-(метил(2-(метиламино)этил)амино)-5-(4-(3-метил-2-оксо-2,3-дигидробензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)фенил)акриламида гидрохлорид
Стадия 1:
трет-бутил-2-((5-метокси-4-(4-(3-метил-2-оксо-2,3-дигидробензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)-2-нитрофенил)(метил)амино)этил(метил)карбамат
Указанное соединение получали из 1-(2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она пара-толуолсульфоната и трет-бутил-2-(метиламино)этилкарбамата способом, подобным описанному способу на стадии 5 примера 1.
1
3
Н ЯМР (CDCl): δ 8.94 (1H, s), 8.51 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.26 (1Н, d, J=7.2 Гц), 7.80 (1Н, d,J=5.6 Гц), 7.48 (1Н, s), 7.24-7.22 (1Н, m), 7.17-7.15 (1H, m), 7.03 (1Н, d, J=7.2 Гц), 6.76 (1H, s), 4.01 (3Н, s), 3.47-3.37 (5Н, m), 3.31-3.23 (2Н, m), 2.91 (3Н, s), 2.83 (3Н, s), 1.44 (9Н, s).
Стадия 2:
трет-бутил-2-((2-акриламидо-5-метокси-4-(4-(3-метил-2-оксо-2,3-дигидробензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)фенил)(метил)амино)этил(метил)карбамат
Указанное соединение получали из трет-бутил-2-((5-метокси-4-(4-(3-метил-2-оксо-2,3-дигидробензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)-2-нитрофенил)(метил)амино)этил(метил)карбамата способом, подобным описанным способам на стадиях 6 и 7 примера 1.
1
3
H ЯМР (CDCl): δ 9.37 (1H, br), 8.67 (1H, br), 8.54 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.34 (1Н, d, J=7.6 Гц), 7.79 (1Н, d, J=5.6 Гц), 7.43 (1Н, s), 7.19-7.15 (1Н, m), 7.08-7.04 (1H, m), 6.98 (1H, d,J=7.6 Гц), 6.79 (1Н, s), 6.35 (2Н, d, J=2.4 Гц), 5.69-5.72 (1H, m), 3.89 (3Н, s), 3.45 (3Н, s), 3.40-3.37 (2Н, m), 3.00-2.85 (2Н, m), 2.85 (3Н, s), 2.70 (3Н, s), 1.47 (9Н, s).
Стадия 3:
N-(4-метокси-2-(метил(2-(метиламино)этил)амино)-5-(4-(3-метил-2-оксо-2,3-дигидробензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)фенил)акриламида гидрохлорид
Ацетилхлорид (0,3 мл, 1,7 ммоль) медленно по каплям добавляли к безводному метанолу (3 мл), охлажденному при помощи внешней бани с ледяной водой, и перемешивание продолжали в течение 1 часа.
Трет-бутил-2-((2-акриламидо-5-метокси-4-(4-(3-метил-2-оксо-2,3-дигидробензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)фенил)(метил)амино)этил(метил)карбамат (100 мг, 0,166 ммоль) диспергировали в безводном метаноле (2 мл), а затем добавляли в вышеуказанный раствор хлороводорода в метаноле. Систему оставляли нагреваться естественным образом до комнатной температуры и перемешивали всю ночь, а затем концентрировали под вакуумом с удалением растворителя. Проводили метод колоночной хроматографии на силикагеле (DCM:МеОН=20:1) с получением указанного соединения (78 мг, 93%).
1
3
Н ЯМР (CDOD): δ 8.45 (1H, d, J=5.6 Гц), 8.19 (2Н, d, J=6.0 Гц), 7.77 (1Н, d, J=5.6 Гц), 7.21-7.16 (2Н, m), 7.09-7.05 (1Н, m), 6.95 (1H, s), 6.50-6.36 (2Н, m), 5.80 (1H, dd, J=2.0 Гц, 6.0 Гц), 3.96 (3Н, s), 3.45 (3Н, s), 3.35 (4Н, br), 2.73 (3Н, s), 2.72 (3Н, s).
Пример 13:
N-(2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-4-метокси-5-(4-(3-метил-2-оксо-2,3-дигидро-1H-бензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)фенил)акриламид
1-(2-(5-Амино-4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метоксифениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он (82 г), полученный на стадии 6 примера 1, добавляли к THF (800 мл) и воде (80 мл), и смесь перемешивали до растворения. К этому по каплям медленно добавляли 3-хлорпропионилхлорид (24,8 г). После того, как при помощи TLC отметили исчезновение исходного вещества, добавляли триэтиламин (358,2 г) и реакционную систему нагревали до 65°С. После завершения реакции реакционный раствор концентрировали досуха и остаток растворяли в 1 л дихлорметана, а затем дважды разделяли при помощи воды (500 мл). Органические фазы собирали и концентрировали с получением 88 г неочищенного продукта. Полученный неочищенный продукт отделяли методом колоночной хроматографии (DCM:МеОН=20:1) с получением 62,5 г указанного соединения.
+
ESI-MS [М+Н]: 517.2677.
1
6
Н ЯМР (DMSO-d): δ 10.05 (1Н, s), 8.67 (1Н, s), 8.5 (1Н, s), 8.44 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.12 (1H, d, J=7.6 Гц), 7.13 (2Н, m), 6.9 (1H, t, J=6.4 Гц), 7.7 (1Н, d, J=5.6 Гц), 7.05 (1Н, s), 6.4 (1Н, dd, J=10.15 Гц, 16.9 Гц), 6.21 (1H, dd, J=1.6 Гц, 16.9 Гц),5.72 (1H, brd, J=11.50 Гц), 3.77 (3Н, s), 3.35 (3Н, s), 2.91 (2Н, t, J=5.65 Гц), 2.75 (3Н, s), 2.34 (2Н, t, J=5.7 Гц), 2.21 (6Н, s).
Пример 14:
N-(5-(4-(5-хлор-3-метил-2-оксо-2,3-дигидро-1H-бензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)-2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-4-метоксифенил) акриламида гидрохлорид
1
Стадия 1: 4-хлор-N-(2-хлорпиримидин-4-ил)бензол-1,2-диамин
Указанное соединение получали из 2,4-дихлорпиримидина и 4-хлор-1,2-фенилендиамина способом, подобным описанному способу на стадии 1 примера 1.
1
6
Н ЯМР (DMSO-d): δ 9.14 (1H, s), 8.05 (1Н, d, J=6.0 Гц), 7.06 (1Н, d, J=8.4 Гц), 6.80 (1Н, s), 6.56 (1Н, dd, J=2.8 Гц, 8.0 Гц), 6.35 (1Н, s), 5.32 (2Н, br s).
Стадия 2: 5-хлор-1-(2-хлорпиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
1
Указанное соединение получали из 4-хлор-N-(2-хлорпиримидин-4-ил)бензол-1,2-диамина и N,N'-карбонилдиимидазола способом, подобным описанному способу на стадии 2 примера 1.
1
6
Н ЯМР (DMSO-d): δ 11.79 (1Н, br s), 8.79 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.39 (1H, d, J=6.0 Гц), 8.21 (1H, d, J=8.8 Гц), 7.23 (1H, dd, J=2.0 Гц, 8.4 Гц), 7.12 (1H, s).
Стадия 3:
5-хлор-1-(2-хлорпиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
Указанное соединение получали из 5-хлор-1-(2-хлорпиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она способом, подобным описанному способу на стадии 3 примера 1.
1
6
Н ЯМР (DMSO-d): δ 8.78 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.38 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.19 (1Н, d, J=8.8 Гц), 7.45 (1Н, s), 7.23 (1H, d, J=8.8 Гц), 3.36 (3Н, s).
Стадия 4:
5-хлор-1-(2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
Указанное соединение получали из 5-хлор-1-(2-хлорпиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она и 4-фтор-2-метокси-5-нитроанилина способом, подобным описанному способу на стадии 4 примера 1.
1
6
Н ЯМР (DMSO-d): 9.23 (1Н, s), 8.61 (1Н, d,J=8.0 Гц), 8.54 (1H, d, J=5.6 Гц), 8.22 (1Н, d, J=8.0 Гц), 7.82 (1Н, d, J=5.6 Гц), 7.44-7.41 (2Н, m), 7.02 (1Н, dd, J=2.0 Гц, 8.4 Гц), 3.97 (3Н, s), 3.37 (3Н, s).
Стадия 5:
5-хлор-1-(2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
Указанное соединение получали из 5-хлор-1-(2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она способом, подобным описанному способу на стадии 5 примера 1.
1
3
Н ЯМР (CDCl): δ 8.84 (1Н, s), 8.49 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.19 (1Н, d, J=8.4 Гц), 7.79 (1H, d, J=5.6 Гц), 7.42 (1Н, s), 7.09 (1Н, dd, J=2.4 Гц, 8.8 Гц), 7.00 (1H, s), 6.69 (1Н, s), 3.98 (3Н, s), 3.43 (3Н, s) 3.29 (2Н, t, J=7.2 Гц), 2.89 (3Н, s), 2.56 (2Н, t, J=7.2 Гц),
2.27 (6Н, s).
Стадия 6:
1-(2-(5-амино-4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метоксифениламино)пиримидин-4-ил)-5-хлор-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
5-Хлор-1-(2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он (1,00 г) и цинковую пыль (1,24 г, 18,97 ммоль) диспергировали в смешанном растворе из дихлорметана/метанола (15 мл/15 мл). По каплям добавляли 20 мл насыщенного раствора хлорида аммония при комнатной температуре и полученную смесь перемешивали в течение 10 минут, а затем фильтровали. К фильтрату добавляли воду (30 мл) и полученную смесь экстрагировали дихлорметаном (30 мл*3). Полученную органическую фазу промывали насыщенным солевым раствором и концентрировали под вакуумом с удалением растворителя с получением указанного соединения, которое сразу использовали на следующей стадии реакции.
Стадия 7:
N-(5-(4-(5-хлор-3-метил-2-оксо-2,3-дигидро-1H-бензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)-2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-4-метоксифенил) акриламида гидрохлорид
Указанное соединение получали из 1-(2-(5-амино-4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метоксифениламино)
пиримидин-4-ил)-5-хлор-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она способом, подобным описанному способу на стадии 7 примера 1.
1
6
H ЯМР (DMSO-d): δ 10.42 (1Н, br s), 9.82 (1Н, s), 8.78 (1H, s), 8.44 (1H, d, J=5.6 Гц), 8.18 (1H, s), 8.13 (1H, s), 7.66 (1H, d, J=5.6 Гц), 7.38 (1H, d, J=2.4 Гц), 7.13-7.06 (1H, m), 6.99-6.96 (2H, m), 6.20 (1H, dd, J=2.0 Гц, 16.8 Гц), 5.69 (1H, dd, J=2.0 Гц, 10.0 Гц), 3.80 (3Н, s), 3.36-3.30 (7H, m), 2.75 (6H, s), 2.63 (3Н, s).
Пример 15:
N-(5-(4-(5-бром-3-метил-2-оксо-2,3-дигидро-1H-бензо[d]имидазол-1-ил)пиримидин-2-иламино)-2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-4-метоксифенил)акриламида гидрохлорид
1
Стадия 1: 4-бром-N-(2-хлорпиримидин-4-ил)бензол-1,2-диамин
Указанное соединение получали из 2,4-дихлорпиримидина и 4-бром-1,2-фенилендиамина способом, подобным описанному способу на стадии 1 примера 1.
1
6
Н ЯМР (DMSO-d): δ 9.13 (1Н, s), 8.05 (1Н, d, J=6.0 Гц), 7.01 (1Н, d, J=8.8 Гц), 6.94 (1H, d, J=2.4 Гц), 6.69 (1Н, dd, J=2.0 Гц, 8.4 Гц), 6.38 (1Н, s), 5.31 (2Н, br s).
Стадия 2: 5-бром-1-(2-хлорпиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
1
Указанное соединение получали из 4-бром-N-(2-хлорпиримидин-4-ил)бензол-1,2-диамина и N,N'-карбонилдиимидазола способом, подобным описанному способу на стадии 2 примера 1.
1
6
H ЯМР (DMSO-d): δ 11.81 (1Н, br s), 8.79 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.40 (1H, d, J=5.6 Гц), 8.17 (1H, d, J=8.8 Гц), 7.37 (1H, dd, J=2.0 Гц, 8.8 Гц), 7.26 (1H, d, J=2.0 Гц).
Стадия 3:
5-бром-1-(2-хлорпиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
Указанное соединение получали из 5-бром-1-(2-хлорпиримидин-4-ил)-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она способом, подобным описанному способу на стадии 3 примера 1.
1
6
H ЯМР (DMSO-d): δ 8.81 (1Н, d, J=6.0 Гц), 8.42 (1Н, d, J=8.0 Гц), 8.19 (1H, d, J=8.4 Гц), 7.60 (1Н, d, J=2.0 Гц), 7.41 (1Н, dd, J=2.0 Гц, 8.4 Гц), 3.40 (3Н, s).
Стадия 4:
5-бром-1-(2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
Указанное соединение получали из 5-бром-1-(2-хлорпиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она и 4-фтор-2-метокси-5-нитроанилина способом, подобным описанному способу на стадии 4 примера 1.
1
6
Н ЯМР (DMSO-d): 9.22 (1Н, s), 8.61 (1Н, d, J=8.4 Гц), 8.54 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.17 (1H, d, J=8.0 Гц), 7.82 (1H, d, J=5.6 Гц), 7.53 (1Н, d, J=2.0 Гц), 7.43 (1H, d, J=
13.2 Гц), 7.44-7.41 (2Н, m), 7.14 (1Н, dd, J=2.0 Гц, 13.2 Гц), 3.97 (3Н, s), 3.37 (3Н, s).
Стадия 5:
5-бром-1-(2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
Указанное соединение получали из 5-бром-1-(2-(4-фтор-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она способом, подобным описанному способу на стадии 5 примера 1.
1
3
Н ЯМР (CDCl): δ 8.85 (1Н, s), 8.50 (1Н, d, J=5.6 Гц), 8.15 (1Н, d, J=8.4 Гц), 7.79 (1Н, d, J=6.0 Гц), 7.42 (1Н, s), 7.24 (1Н, dd, J=2.0 Гц, 8.4 Гц), 7.15 (1, d, J=2.0 Гц), 6.69 (1Н, s), 3.98 (3Н, s), 3.44 (3Н, s) 3.30 (2Н, t, J=6.8 Гц), 2.90 (3Н, s), 2.58 (2Н, t, J=7.2 Гц), 2.28 (6Н, s).
Стадия 6:
1-(2-(5-амино-4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метоксифениламино)пиримидин-4-ил)-5-бром-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он
5-Бром-1-(2-(4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метокси-5-нитрофениламино)пиримидин-4-ил)-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-он (1,00 г) и цинковую пыль (1,24 г, 18,97 ммоль) диспергировали в смешанном растворе из дихлорметана/метанола (15 мл/15 мл). По каплям добавляли 20 мл насыщенного раствора хлорида аммония при комнатной температуре и полученную смесь
перемешивали в течение 10 минут, а затем фильтровали. К фильтрату добавляли воду (30 мл) и полученную смесь экстрагировали дихлорметаном (30 мл*3). Полученную органическую фазу промывали насыщенным солевым раствором и концентрировали под вакуумом с удалением растворителя с получением указанного соединения, которое использовали сразу на следующей стадии.
Стадия 7:
N-(5-(4-(5-бром-3-метил-2-оксо-2,3-дигидро-1H-бензо[d]имидазол-1-ил) пиримидин-2-иламино)-2-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-4-метоксифенил)акриламида гидрохлорид
Указанное соединение получали из 1-(2-(5-амино-4-((2-(диметиламино)этил)(метил)амино)-2-метоксифениламино) пиримидин-4-ил)-5-бром-3-метил-1H-бензо[d]имидазол-2(3H)-она способом, подобным описанному способу на стадии 7 примера 1.
1
6
Н ЯМР (DMSO-d): δ 10.23 (1H, br s), 9.82 (1Н, br s), 8.75 (1H, s), 8.44 (1H, d, J=5.2 Гц), 8.20 (1H, s), 8.05 (1H, s), 7.65 (1H, d, J=5.2 Гц), 7.49 (1H, d, J=2.0 Гц), 7.08 (1H, d, J=8.4 Гц), 7.00-6.96 (2H, m), 6.21 (1H, dd, J=2.0 Гц, 17.2 Гц), 5.71 (1H, dd, J=1.6 Гц, 10.4 Гц), 3.80 (3Н, s), 3.36 (3Н, s), 3.29-3.24 (2H, m), 3.16 (3Н, s), 2.76-3.68 (2H, m), 2.65 (6H, s).
In vitro испытание активности
1. Способ in vitro ферментативного анализа
EGFR или EGFR-киназу (T790M, L858R) экспрессировали и очищали с помощью экспрессионной системы на основе клеток насекомых или приобретали в качестве коммерчески доступных продуктов.
Платформу для испытания активностей EGFR или EGFR-киназы (Т790М, L858R) разрабатывали на основе способа гомогенной флуоресценции с временным
3
2
50
3+
разрешением (HTRF), предоставленного Cisbio Inc., и использовали для определения активностей соединений. Соединения разбавляли при 10-кратном градиенте с помощью 100% DMSO с начальной концентрацией, составляющей 1 мкМ. Отбирали 4 мкл каждой концентрации и добавляли к 96 мкл рабочего буфера (50 мМ HEPES (рН 7,0), 0,02% NaN, 0,01% BSA, 0,1 мМ ортованадата, 5 мМ MgCl, 50 нМ SEB, 1 мМ DTT). Отбирали 2,5 мкл смеси и добавляли к 384-луночному планшету (OptiPlate-384, PerkinElmer) и затем добавляли 2,5 мкл киназы. После тщательного перемешивания путем центрифугирования добавляли 5 мкл АТР и субстрат тирозинкиназы (ТК)-биотин, чтобы инициировать реакцию. 384-луночный планшет инкубировали в термостате при 23°С в течение определенного периода времени и затем реакцию завершали путем добавления 5 мкл меченного Eu-криптатом антитела к ТК и 5 мкл стрептавидина-ХЕ665. Значения флуоресценции считывали на устройстве Envision (PerkinElmer) после инкубации в термостате в течение 1 часа. Значения IC соединений рассчитывали с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5.0.
2. Анализ клеточной пролиферации
2
50
Клетки немелкоклеточного рака легкого человека NCI-H1975 культивировали в среде культивирования RPIM-1640, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% смесью пенициллина со стрептомицином, в термостате для клеток (37°С, 5% СО). Клетки высевали в 96-луночный планшет с плотностью, составляющей 2000 клеток на лунку (объем: 195 мкл), и культивировали в течение ночи. На следующий день добавляли соединения. В частности, соединения разбавляли при 3-кратном градиенте с начальной концентрацией, составляющей 10 мМ. Отбирали 4 мкл каждой концентрации и добавляли в 96 мкл среды культивирования. Затем отбирали 5 мкл смеси и добавляли к среде культивирования клеток (конечная концентрация DMSO составляла 0,1%, объем./объем.). После обработки в течение 72 часов среду аспирировали и добавляли 30 мкл реагента CellTiter-Glo (Promega). Сигналы флуоресценции считывали на устройстве Envison (Perkin Elmer) и значения IC соединений для ингибирования клеточной пролиферации рассчитывали с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5.0.
2
Клеточную линию плоскоклеточной карциномы человека А431 культивировали в DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% смесью пенициллина со стрептомицином, в термостате для клеток (37°С, 5% СО). В испытаниях соединений концентрация находящегося на дне субстрата составляла 0,6%. Клетки
50
ресуспендировали с помощью 0,3% легкоплавкого агара и затем высевали в 96-луночный планшет с плотностью, составляющей 2000 клеток на лунку (100 мкл). Соединения разбавляли при 3-кратном градиенте с начальной концентрацией, составляющей 10 мМ. Обирали 2 мкл каждой концентрации и добавляли к 98 мкл среды культивирования и затем 5,3 мкл смеси добавляли к среде культивирования клеток (конечная концентрация DMSO составляла 0,1%, объем./объем.). После обработки в течение одной недели (7 дней) добавляли 20 мкл реагента CellTiter-Blue (Promega) и планшет инкубировали при 37°С в течение 4 часов. Сигналы флуоресценции считывали на устройстве Envison (Perkin Elmer) и значения IC соединений для ингибирования клеточной пролиферации рассчитывали с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5.0.
NT: не испытано; AZD9291 получали согласно описанию в примере 28 в международной патентной публикации WO 2013014448.
Как видно из приведенных выше экспериментальных результатов, в отношении ферментативной активности соединения согласно настоящей заявке показали хороший
ингибирующий эффект на EGFR, особенно на двойной мутант EGFR-L858R/T790M. Данные WT/DM показали, что соединения согласно настоящей заявке характеризуются требуемой селективностью. Что касается экспериментальных результатов исследования жизнеспособности клеток, соединения согласно настоящей заявке показали хороший ингибирующий эффект на клеточную линию немелкоклеточного рака легкого человека NCI-H1975 и клеточную линию плоскоклеточной карциномы человека А431.
Фармакокинетический анализ
Здоровых взрослых самцов крыс подвергали внутрижелудочному введению однократной дозы исследуемых соединений в дозе, составляющей 10 мг/кг, вместе с 20% сульфобутилэфир-β-циклодекстрином в качестве вспомогательного вещества. Перед экспериментом животные голодали в течение ночи, и период голодания продолжался от 10 часов перед введением до 4 часов после введения. Через 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 и 24 часа после внутрижелудочного введения проводили забор образцов крови. Приблизительно 0,3 мл цельной крови собирали из ретроорбитального венозного синуса и помещали в пробирки, содержащие гепарин в качестве антикоагулянта. Образцы центрифугировали при 4°С и 4000 об/мин в течение 5 мин. Плазму переносили в центрифужные пробирки и хранили при -80°С до проведения анализа. Концентрации исследуемых соединений в образцах плазмы анализировали с помощью невалидированной жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Данные зависимости концентрации в плазме от времени для отдельных животных анализировали с использованием программного обеспечения WinNonlin (Professional Edition, версия 6.3; Pharsight Company). Некомпартментную модель вводили в анализ концентрации. Рассчитывали фармакокинетические параметры исследуемых соединений.