СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЯЩУРА И ВАКЦИНА ПРОТИВ ЯЩУРА
METHOD FOR PRODUCTION OF FOOT-AND-MOUTH DISEASE VACCINE, AND FOOT-AND-MOUTH DISEASE VACCINE

Группа изобретений относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Изобретения могут быть использованы при изготовлении вакцины против ящура.
Известны способ изготовления вакцины против ящура типа А и моновалентная вакцина против ящура типа А (см. RU 2143 921 С1, 10.01.2000).
Способ изготовления данной вакцины включает репродукцию вирусного антигена в суспензионной культуре клеток ВНК-21, очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей, инактивацию вируса, концентрирование полученного антигена и последующее соединение концентрата антигена с адъювантом. Полученная вакцина содержит авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных компонентов вируса ящура типа А, гель гидроокиси алюминия, сапонин и поддерживающую среду.
Известны способ изготовления моновалентной эмульсионной вакцины против ящура типа А, типа О, типа С, типа Азия-1 и моновалентные вакцины против ящура типа А, типа О, типа С, типа Азия-1 (см. Инструкцию по изговлению и контролю вакцины моновалентной эмульсионной против ящура типа А, типа О, типа С, типа Азия-1 (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21), утв. ГУВ Госкомиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам 24.01.1991). Способ изготовления данных вакцин также включает репродукцию вирусного антигена в суспензионной культуре клеток ВНК-21, очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей, инактивацию вируса, концентрирование полученного антигена и последующее соединение концентрата антигена с адъювантом. Каждая из полученных моновакцин содержит авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных компонентов вируса ящура типа А, или типа О, или типа С, или типа Азия-1, гель гидроокиси алюминия, сапонин и поддерживающую среду.
Известны способ изготовления поливалентной вакцины и вакцина поливалентная против ящура (см. Вакцина противоящурная трехвалентная из вируса «O»-«А»-«С», культивируемого на эпителии языка крупного рогатого скота. Технические условия ТУ 10-09-25-89, утв. Зам. Начальника Главного управления ветеринарии 11.12.1989, введены с 01.01.1990). Данная вакцина является смесью моновалентных вакцин трех типов, для ее изготовления используют моновалентную вакцину против ящура типа О (ТУ 10-19-403-87), моновалентную вакцину против ящура типа А (ТУ 10-19-404-87), моновалентную вакцину против ящура типа С (ТУ 45-21-1528-84).
Наиболее близким аналогом является способ изготовления вакцины против ящура типа О, включающий культивирование вирусного антигена в суспензионной культуре клеток ВНК-21 в течение 10-15 часов при 36-37°С, причем культивирование прекращают при достижении количества мертвых клееток 90-95%, после чего вирус ящура подвергают инактивации, очищают от балластных примесей, концентрируют полученный антиген и соединяют концентрат антигена с адъювантом. Вакцина, полученная данным способом, содержит авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных компонентов (146S+75S) вируса ящура типа О, гель гидроокиси алюминия, сапонин и поддерживающую среду (см. RU 2212895 С1, 27.09.2003).
Недостатком известных способов изготовления вакцины является негарантированный уровень полученного антигенного материала в связи с оценкой его количества методом определения (146S+75S)-компонентов, т.к. капсид вируса 75S, как неполная структура антигена, склонна к разрушению до капсомеров 12S при температурных колебаниях и других физико-химических факторах.
Задачей настоящей группы изобретений является разработка способа изготовления вакцины против ящура, позволяющего повысить уровень полученного антигенного материала в виде 146S - иммуногенного компонента при культивировании вируса ящура, а также разработка высокоиммуногенной вакцины против ящура, полученной данным способом.
Поставленная задача в части способа решается тем, что в способе изготовления вакцины против ящура, включающем культивирование вирусного антигена в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36-37°С, очистку вирусной суспензии от балластных примесей, инактивацию, концентрирование полученного антигена вируса ящура и соединение концентрата антигена с адъювантом, согласно изобретению, начиная с 6-8 часов культивирования вирусного антигена через каждые 2 часа определяют процент мертвых клеток, и при достижении его уровня 95% и выше осуществляют дальнейшее культивирование в течение 2-8 часов в зависимости от типа вируса.
Поставленная задача решается также тем, что:
- в качестве вирусного антигена используют вирус ящура типа А, и/или вирус ящура типа О, и/или вирус ящура типа Азия-1;
22
1
1
- в качестве вируса ящура типа А используют штамм А №550, а в качестве вируса ящура типа О используют штамм O Manisa или штамм O №1618, а в качестве вируса ящура типа Азия-1 используют штамм Шамир;
- после окончания процесса культивирования вирусного антигена к нему добавляют хлороформ до конечной концентрации 0,7-0,9%;
- очистку вирусной суспензии осуществляют путем сепарирования. Поставленная задача в части вакцины решается тем, что вакцина, полученная заявленным способом, содержит авирулентный и очищенный антигенный материал вируса ящура типа А, и/или вируса ящура типа О, и/или вируса ящура типа Азия-1 в эффективном количестве 146S-компонента, гель гидроокиси алюминия, сапонин и поддерживающую среду.
При этом поставленная задача в части вакцины решается также тем, что:
22
- в качестве авирулентного и очищенного антигенного материала вируса ящура типа А вакцина содержит авирулентный и очищенный антигенный материал штамма вируса ящура А №550 в количестве не менее 0,8 мкг 146S-компонента в вакцинальной дозе;
1
- в качестве авирулентного и очищенного антигенного материала вируса ящура типа О вакцина содержит авирулентный и очищенный антигенный материал вируса ящура O Manisa в количестве не менее 1,6 мкг 146S -компонента в вакцинальной дозе;
1
- в качестве авирулентного и очищенного антигенного материала вируса ящура типа О вакцина содержит авирулентный и очищенный антигенный материал вируса ящура O №1618 в количестве не менее 1,5 мкг 146S -компонента в вакцинальной дозе;
- в качестве авирулентного и очищенного антигенного материала вируса ящура типа Азия-1 вакцина содержит авирулентный и очищенный антигенный материал вируса ящура Азия-1 (Шамир) в количестве не менее 1,5 мкг 146S-компонента в вакцинальной дозе;
- вакцина содержит гель гидроокиси алюминия, сапонин и поддерживающую среду при следующем количестве в вакцинальной дозе:
гель гидроокиси алюминия
0,5-1,4 мл
сапонин
1,5-2,5 мг
поддерживающая среда
до 2 мл
Кроме того, поставленная задача в части вакцины решается тем, что поливалентная вакцина, полученная заявленным способом, содержит авирулентный и очищенный антигенный материал, по меньшей мере, двух типов вируса ящура, выбранных из вируса ящура типа А, вируса ящура типа О и вируса ящура типа Азия-1, гель гидроокиси алюминия, сапонин и поддерживающую среду.
Техническим результатом заявленной группы изобретений является повышение уровня накопления антигенного материала, оцениваемого по содержанию 146S-компонента вируса ящура, а также то, что вакцина, полученная предлагаемым способом, обладает высокой иммуногенностью и обеспечивает надежную защиту животных от ящура.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
22
Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура А №550, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36°С. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 2 часов.
Установлено, что в течение 2-8 часов вирус ящура продолжает развиваться в погибших клетках, более того в это время окончательно формируется его белковая оболочка, ответственная за антигенные свойства, и в несколько раз увеличивается «урожай» вируса.
Затем в биореактор добавляют хлороформ до конечной концентрации 0,7% и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 4°С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию.
Очистка вирусной суспензии путем добавления хлороформа и последующее сепарирование позволяют максимально избавиться от фрагментов клеток и балластных белков, являющихся реактогенными факторами.
Осадок, содержащий фрагменты клеток и хлороформ, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию.
Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30°С.
Необходимое содержание 146S-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 146S-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 0,8 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта.
Полученную вакцину расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Пример 2.
1
Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура О Manisa, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 37°С. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 6 часов. После этого в биореактор добавляют хлороформ до конечной концентрации 0,7% и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 8°С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. Осадок, содержащий фрагменты клеток и хлороформ, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию.
Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуре до 30°С.
Необходимое содержание 146S-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 146S-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 1,6 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта. Полученную вакцину расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Сравнение показателей вируса ящура при разных сроках его культивирования отражено в табл. 1.
Пример 3.
1
Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура О №1618, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 37°С. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 7 часов. После этого в биореактор добавляют хлороформ до конечной концентрации 0,7% и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 8°С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. Осадок, содержащий фрагменты клеток и хлороформ, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуре до 30°С. Необходимое содержание 146S-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 146S-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 1,5 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта.
Полученную вакцину расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Пример 4.
Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура Азия-1 (Шамир), который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 37°С. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 8 часов. После этого в биореактор добавляют хлороформ до конечной концентрации 0,7% и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 10°С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. Осадок, содержащий фрагменты клеток и хлороформ, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию.
Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуре до 30°С.
Необходимое содержание 146S-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 146S-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 1,5 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта. Полученную вакцину расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Пример 5.
Формирование поливалентной вакцины.
Для изготовления поливалентной вакцины после накопления сырья по всем валентностям их смешивают перед добавлением сапонина. Остальные операции проводят аналогично примерам 1-4.
Пример 6.
Моновалентная вакцина против ящура типа А, полученная по описанному выше способу (пример 1), содержит в вакцинальной дозе:
- авирулентный и очищенный антигенный
материал вируса ящура А<sub>22</sub> №550
0,8 мкг 146S-компонента
- гель гидроокиси алюминия
0,5 мл
- сапонин
1,5 мг
- поддерживающая среда
до 2 мл
Пример 7.
Моновалентная вакцина против ящура типа О, полученная по описанному выше способу (пример 2), содержит в вакцинальной дозе:
- авирулентный и очищенный антигенный
материал вируса ящура O<sub>1</sub> Manisa
1,6 мкг 146S-компонента
- гель гидроокиси алюминия
0,8 мл
- сапонин
2,0 мг
- поддерживающая среда
до 2 мл
Пример 8.
Моновалентная вакцина против ящура типа О, полученная по описанному выше способу (пример 3), содержит в вакцинальной дозе:
- авирулентный и очищенный антигенный
материал вируса ящура O<sub>1</sub> №1618
1,5 мкг 146S-компонента
- гель гидроокиси алюминия
1,2 мл
- сапонин
2,3 мг
- поддерживающая среда
до 2 мл
Пример 9.
Моновалентная вакцина против ящура типа Азия-1, полученная по описанному выше способу (пример 4), содержит в вакцинальной дозе:
- авирулентный и очищенный антигенный
материал вируса ящура Азия-1 (Шамир)
1,5 мкг 146S-компонента
- гель гидроокиси алюминия
1,3 мл
- сапонин
2,5 мг
- поддерживающая среда
до 2 мл
Пример 10.
Бивалентная вакцина против ящура типов А и О, полученная по описанному выше способу (пример 5), содержит в вакцинальной дозе:
- авирулентный и очищенный антигенный
материал вируса ящура А<sub>22</sub> №550
0,8 мкг 146S-компонента
- авирулентный и очищенный антигенный
материал вируса ящура O<sub>1</sub> Manisa
1,6 мкг 146S-компонента
- гель гидроокиси алюминия
1,2 мл
- сапонин
2,5 мг
- поддерживающая среда
до 2 мл
Пример 11.
Бивалентная вакцина против ящура типов А и О, полученная по описанному выше способу (пример 5), содержит в вакцинальной дозе:
- авирулентный и очищенный антигенный
материал вируса ящура А<sub>22</sub> №550
0,8 мкг 146S-компонента
- авирулентный и очищенный антигенный
материал вируса ящура O<sub>1</sub> №1618
1,5 мкг 146S-компонента
- гель гидроокиси алюминия
1,3 мл
- сапонин
2,5 мг
- поддерживающая среда
до 2 мл
Пример 12.
Бивалентная вакцина против ящура типов О и Азия-1, полученная по описанному выше способу (пример 5), содержит в вакцинальной дозе:
- авирулентный и очищенный антигенный
материал вируса ящура O<sub>1</sub> Manisa
1,6 мкг 146S-компонента
- авирулентный и очищенный антигенный
материал вируса ящура Азия-1 (Шамир)
1,5 мкг 146S-компонента
- гель гидроокиси алюминия
1,4 мл
- сапонин
2,5 мг
- поддерживающая среда
до 2 мл
Пример 13.
Бивалентная вакцина против ящура типов А и Азия 1, полученная по описанному выше способу (пример 5), содержит в вакцинальной дозе:
- авирулентный и очищенный антигенный
материал вируса ящура А<sub>22</sub> №550
0,8 мкг 146S-компонента
- авирулентный и очищенный антигенный
материал вируса ящура Азия-1 (Шамир)
1,5 мкг 146S-компонента
- гель гидроокиси алюминия
1,2 мл
- сапонин
2,5 мг
- поддерживающая среда
до 2 мл
Пример 14.
Трехвалентная вакцина против ящура типов А, О и Азия-1, полученная по описанному выше способу (пример 5), содержит в вакцинальной дозе:
- авирулентный и очищенный антигенный
материал вируса ящура А<sub>22</sub> №550
0,8 мкг 146S-компонента
- авирулентный и очищенный антигенный
материал вируса ящура O<sub>1</sub> №1618
1,5 мкг 146S-компонента
- авирулентный и очищенный антигенный
материал вируса ящура Азия-1 (Шамир)
1,5 мкг 146S-компонента
- гель гидроокиси алюминия
1,4 мл
- сапонин
2,0 мг
- поддерживающая среда
до 2 мл
Изготовленные вакцины прошли испытание методами, рекомендованными Международным Эпизоотическим бюро (МЭБ), которые установили их полное соответствие требованиям МЭБ, предъявляемым к вакцинам против ящура.
Таким образом, заявленный способ изготовления вакцины против ящура позволяет увеличить количество антигенного материала по 146S-компоненту при культивировании вируса ящура, а полученная по данному способу вакцина против ящура является безвредной, авирулентной и иммуногенной.