Возможность сохранения некоторых групп микроорганизмов в кишечнике красного калифорнийского гибрида (Eisenia fetida Andrei Bouche)

имели форму прямых палочек, как правило одиночных или в парах. В конце фазы замедленного роста наблюдали появление проспор, спорулирующих клеток и отдельно лежащих спор. Образующиеся эллипсоидальные споры располагались в материнской клетке терминально, несколько расширяя ее. Клетки имели размеры 2-2,3 х 9,3-16,6 мкм. Окраска по Граму положительная.

Все штаммы являются термофилами с диапазоном роста от 37 до 75°С и оптимумом 5 8-61°С (рис.3). Диапазон рН от 6,0 до 10,5, оптимум рН 7,0-8,5 Оптимальной концентрацией NaCI (г/л) для роста культур являлась 2-5 т/л, диапазон роста от 0 до 50 г/л.

Бактерии способны в аэробных условиях утилизировать широкий спектр органических соединений: арабинозу, ксилозу, рибозу, глюкозу, маннит, фруктозу, рамнозу, раффинозу, сахарозу, инозит, глутамат, лактат, пируват, ацетат, пептон, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина, крахмал и углеводороды. Галактоза, дульцит, манноза, сорбит, лактоза, мальтоза, глицерин и гликолят не использовались. Организм способен к брожению на глюкозе и сахарозе, не сбраживали глутамат, лактат, пируват, рибозу, рамнозу, пептон, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина, крахмал и целлюлозу. Тесты на каталазу и оксидазу положительные; не продуцировали аммиак, индол.

Анаэробный рост проверяли на среде со след. субстратами: глутаматом, лактатом, пирува-том, рибозой, глюкозой, сахарозой, рамнозой, пептоном, д/э, гидролизатом казеина, крахмалом и целлюлозой по 1 г/л. За счет брожения могут развиваться штаммы Н5, Т4 на глюкозе, сахарозе (3-х суточные).

Молекулярный анализ с использованием генов 16S рРНК выделенных культур показал, что выделенные штаммы Н5, S3, Т4 и Т5 относятся к роду AnoxibaciUus и наиболее близки к А. flavithermus (97, 97,97 и 96 % соответственно). Содержание ГЦ составило от 43,8 до 44,6 мол. %, что близко к соответствующим значениям для видов рода Anoxybacillus. Гомология ДНК выделенных штаммов между собой составила 95-99 мол. %. Уровень геномного сходства штаммов Н5 и Т4 с типовыми штаммами A. flavithermus DSM 2641т и A, pmhchmensis К1тнаходится в диапазоне от 28 до 47 %, что свидетельствует о родстве исследованных организмов на уровне рода, но недостаточен для отнесения штаммов Н5 и Т4 к ранее описанным видам рода Anoxybacillus. Таким образом, выделенные штаммы по совокупности свойств (размер клеток, окраска колоний, способность к использованию галактозы и мальтозы, способность к росту при более высоких температурах и низкий уровень гомологии ДНК) могут быть отнесены к роду Anoxybacillus и образуют в его составе новый вид Anoxybacillus mongolieusis

Таким образом, показано, что среди культивируемых видов, выделенных из щелочных гидротерм Бурятии и Монголии, преобладают как широко распространенные термофильные алка-лотолерантные бациллы, так и новые виды аэробных и факультативно-анаэробных алкалото-лерантных умеренно термофильных бактерий, способных использовать широкий спектр органических субстратов.

Работа была выполнена при финансовой поддержке проекта молодых ученых СО РАН «Разнообразие и функционирование микробного сообщества в щелочных водных экосистемах Забайкалья» и интеграционного проекта СО РАНМ24.

О.Ф. Вятчина,Д.И. Стом, О.С. Рыкова, В.А. Быбин, А.В, Кононова

г. Иркутск

Возможность сохранения некоторых групп микроорганизмов в кишечнике красного калифорнийского гибрида (Eisema fetida Andrei Bouche)'

The ability of different groups of microorganisms to survive and keep itself in intestines of Red californian hybrid (Eis-enia fetida Andrei Bouche) is investigated. It is shown, that oil-destroing strain of Yarrowia lipofytica is capable to keep itself in intestines of earthworm during 8 days, and Rhodococcus erythropolis only within a day. Bacillus thuringiensis collects in intestines of earthworms, becomes a dominating component of bacteria! auto flora, keeps toxin formation ability; don V bring harm to an animal ft is revealed, that Streptomyces sp. spores keep ability to germinate after passage through the intestinal path of a worm. Staphylococcus sp. strain is capable to reserve itself in intestines of a worm untill 2 months.

Исследована способность микроорганизмов разных групп выживать и сохраняться в кишечнике красного калифорнийского гибрида (Eisenia fetida Andrei Bouche). Показано, что нефте-разрушающий штамм Yarrowia lipolytica способен сохраняться в кишечнике червя в течение 8

* Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №05-04-97237.

121

суток, a Rhodococcus erythropolis только в течение суток. Bacillus thuringiensis накапливается в кишечнике дождевых червей, становится доминирующим компонентом бактериальной аутоф-лоры, сохраняет способность к токсинообразованию, не принося вреда животному. Выявлено, что споры Streptomyces sp. сохраняют способность к прорастанию после пассажа через кишечный тракт червя. Штамм Staphylococcus sp. способен резервироваться в кишечнике червя до 2 месяцев.

Изучение взаимосвязей между микроорганизмами и беспозвоночными животными, обитающими в почве, является важным направлением почвенно-биологических исследований [6]. Деструкция отмирающей биомассы растительного и животного происхождения осуществляется в почве благодаря сбалансированной деятельности сапротрофного зоомикробного комплекса. При всей очевидности того, что роль микробного фактора в сапротрофном зоомикробном комплексе велика, функции конкретных микроорганизмов и механизмы их взаимодействия с организмом животного изучены недостаточно (2, 3, 4]. Большое значение в процессах трансформации органического вещества принадлежит дождевым червям. Эти животные поглощают значительное количество опада и вовлекают его в почву [2]. Прямое взаимодействие микроорганизмов с беспозвоночными возможно при потреблении последними пищи, населенной микробами, в пищеварительном тракте и экскрементах животного [б].

Целью настоящей работы явилось изучение способности микроорганизмов накапливаться в кишечнике дождевых червей и оставаться жизнеспособными после пассажа через кишечник.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования служили особи красного калифорнийского гибрида (Eisenia fetida Andrei Bouche). Для пассажа через организм червей использовали штаммы, входящие в состав нефтеразрушающего препарата деворойл: Rhodococcus erythropolis, Yarrowia lipolytica (культуры представлены И.А. Борзенковым). Также для исследования были взяты энтомопатогенный штамм Bacillus thuringiensis ssp. alesti [4], штамм Streptomyces sp.t выделенный из почвы и Staphylococcus sp.

Для микробиологических исследований брали червей, которых предварительно выдерживали голодными в течение двух суток в чашках Петри с увлажненной фильтровальной бумагой. Для инокуляции червей применяли различные методы. Пероральное введение суспензии (0,03 мл) проводили при помощи стерильного инсулинового шприца. При использовании метода свободного скармливания червей подсаживали в чашки Петри со стерильной целлюлозой, обработанной 1 мл суспензии соответствующей культуры. Целлюлоза использовалась как носитель микроорганизмов [3]. Инокуляцию червей Streptomyces sp. проводили двумя способами: per os и контактным способом. В течение опыта особей содержали в чашках Петри с увлажненной фильтровальной бумагой без внесения корма. На 1-е, 4-е, 5-е, 7-е, 8-е, 10-е, 30-е и 60-е сутки опыта производили асептическое вскрытие червей.

Для выделения нефтеразрушающих штаммов R. erythropolis и Y. lipolytica отпрепарированную ткань эпителия переднего, среднего и заднего отделов кишечника вместе с содержимым помещали в стерильную ступку и растирали с 1 мл физиологического раствора, содержащего твин-20. Использовали 1%-ный и 0,1%-ный растворы твина-20. Затем объем гомогената доводили до 5 мл. Посев производили из исходного разведения на питательную среду следующего состава (%): KNO, - 0,40; MgS04 - 0,08; КН2Р04 - 0,06; Na2HP04 - 0,14; гексадекан - 1; агар-агар- 2; рН 7,2-7,3.

Для изоляции энтомопатогенных штаммов В, thuringiensis содержимое кишечника высевали на РПА, для селективного выделения штамма Staphylococcus sp. - на РПА с 5% NaCl.

Для выделения стрептомицета использовали среду Гаузе №! следующего состава (г/л): крахмал растворимый - 20,0; KNO-, - 1,0; К2НРО<, - 0,5; MgS04x7 Н20 - 0,5; NaCl - 0,5; FeS04x7 Н20 - следы; агар-агар - 20; рН 7,2-7,4.

Микробиологическому анализу подвергали копролиты червей, выброшенные животными на соответствующие сутки опыта. Параллельно осуществляли вскрытие голодных червей, не подвергавшихся инокулированию, содержащихся в стерильных чашках Петри.

Для определения количества жизнеспособных клеток (спор) в исследуемых субстратах использовали метод серийных разведений с последующим высевом на соответствующие элективные среды [5]. Посевы инкубировали при температуре 28-30°С.

Результаты и обсуждение

Использование методики количественного учета микроорганизмов после обычно применяемой подготовки образца не позволило изолировать из кишечника красного калифорнийского

122

гибрида {Eisenia fétida Andrei Bouche) нефтеразрушающие штаммы, что, вероятно, связано с высокой степенью адгезии клеток этих бактерий к кишечному эпителию. В связи с этим была применена механическая обработка анализируемого материала (5-мин. растирание в ступке) с использованием 1%- и 0,1%-ного раствора твина-20. Оптимальным для выделения исследуемых культур оказалось применение 1%-ного раствора твина-20.

Полученные данные свидетельствуют о том, что кишечник червя является неблагоприятной средой для нефтеразрушающего штамма R. erythropolis. При пероральном введении 0,03 мл од-косуточной суспензии R. erythropolis штамм был обнаружен только на 1-е сутки опыта. Титр культуры составил в переднем отделе кишечника - 2,15±0,39х105, в среднем - 8,38+0,75x1 о\ в заднем - 4,96+0,14х 104 КОЕ/г (табл. 1). Тенденция уменьшения количества клеток R. erythropolis от переднего к заднему отделу кишечника червя, вероятно, связана с их частичным перевариванием. Следует отметить, что для штамма R. erythropolis, прошедшего пассаж через кишечный тракт червя, характерна низкая скорость роста на элективной среде. Для культивирования необходимо от 32 до 36 суток. В ходе опыта выявлены некоторые специфические особенности взаимодействия R. erythropolis и дождевых червей. После инокуляции черви выделяли защитную жидкость желтого цвета.

Таблица 1

Динамика численности клеток Rhodococcus erythropolis в кишечнике красного калифорнийского гибрида

Отдел кишечника Титр, КОЕ/г

] -е сутки 5-сутки 8-е сутки

Передний 2,15£Û,39x 10J - -

Средний 8,38+0,75x10" - -

Задний 4,96+0,14x10" - . -

Нефтеразрушающие дрожжи У Иро1уйса сохранялись в кишечнике червя более длительное время - в течение 8-ми суток. На 1-е сутки опыта тигр культуры составил в переднем отделе кишечника 1,41±0,24х105, в среднем - 1,28±0,23х104, в заднем - 3,84+0,73x104 КОЕ/г. На 5-е сутки инкубации червей У. Иро1уИса была выделена только из переднего отдела кишечника, на 8-е - из переднего и заднего отделов кишечника (табл. 2). Полученные данные свидетельствуют о том, дрожжи частично утилизируются червями, в то же время после периода некоторой адаптации начинается их размножение, что выражается в увеличении титров культуры на 8-е сутки опыта (табл. 2). Следует отметить, что при выделении штамма У Иро1уНса из кишечника червя время инкубации составило 28 суток.

Таблица 2

Динамика численности клеток Уагго^'т Цро1уйса в кишечнике красного калифорнийского гибрида

Отдел кишечника г Титр, КОЕ/г

i -е сутки 5-е сутки 8-е сутки

Передний 1,4!±0.24у105 7,26±0,87х 10" 8,41 ±0,93x104

Средний 1,28+0,23x104 - -

Задний 3,84+0,73x10* - 9,83+0,79x104

В. thurmgiensis сохранялся в кишечнике красного калифорнийского гибрида на протяжении 60-ти суток опыта. На первые сутки инкубации червей жизнеспособные споры культуры были обнаружены в переднем и среднем отделах кишечника. Титр составил 8,97±0,72х104 и 3,80±0,65хЮ3 КОЕ/г, соответственно. На 8-е сутки В. ¡}гигйщ1егш8 был обнаружен во всех отделах кишечника червя (табл. 3). На 20-е сутки содержания животных из переднего отдела В. //шп>^/<?/ш5 не был изолирован, в среднем и заднем отделах кишечника отмечалось значительное увеличение титра исследуемого штамма (табл. 3). К 60-м суткам опыта произошло снижение количества жизнеспособных спор В. 0тгпщ1ет'15 в среднем отделе до 8,50±0,68*Ю3, а в заднем - до 4,20±0,63* 102 КОЕ/г (табл. 3).

123

Динамика численности клеток штамма Bacillus thuringiemis ssp. alesti 6-12 кс в кишечнике красного калифорнийского гибрида

Отдел кишечника Титр. КОЕ/г

1 -е сутки 8-е сутки 20-е сутки 60-е сутки

Передний 8,97±0,72х!04 8,54±0,73хЮ? -

Средний 3,8040,65x10' 1,30±0,18х]03 8,50±0,76х103 8,50±0,68хЮ2

Задний - 1.280,23±х104 7,69±0,62хЮ4 4,20±0,63*!03.

Следует отметить, что штамм В. thuringiensis ssp. alesti 6-12 кс после пассажа через кишечный тракт червя сохранил способность к токсинообразованию.

Streptomyces sp., инокулированный в организм червя контактным способом, сохранялся в кишечном тракте красного калифорнийского гибрида в течение 4-х суток. При этом титр жизнеспособных спор исследуемого штамма стрептомицета снижался в кишечном тракте червей от переднего к заднему отделу. Так, количество жизнеспособных спор Streptomyces sp. в переднем отделе кишечника на 1-е сутки инкубации животных составило 8,40+0,76x103, на 4-е -2,72±0,46х 104, в среднем на 1-е - 1,80+0,31х10\ на 4-е - 7,00±0,58х10* КОЕ/г. В заднем отделе кишечника титр составил на 1-е сутки опыта 0,8+0,14х 103 КОЕ/мл. При высеве содержимого заднего отдела кишечника на 4-е сутки были выделены единичные колонии, что не позволило определить титр стрептомицета. На 8-е сутки инкубации червей исследуемый штамм Streptomyces sp. не был выделен.

Во втором варианте опыта червям перорально вводили 0,03 мл водной суспензии Streptomyces sp. с титром 1,2±0,19*104 КОЕ/мл. На 1-е сутки опыта титр культуры составил в переднем отделе кишечника 1,40+0,25* 104, в среднем - l,50±0,27*io\ в заднем -1,30±0,26х Ю1 КОЕ/г. При высеве содержимого кишечника на 4-е и 7-е сутки, а также при высеве копролитов червей выросли единичные точечные колонии исследуемого штамма стрептомицета.

Уменьшение количества жизнеспособных спор Streptomyces sp. от переднего отдела кишечника к заднему связано с их частичным перевариванием. Полученные нами данные согласуются с исследованиями JT.M. Полянской, Н.И. Бабкиной и др. по изучению «поведения» актино-мицетов в кишечном тракте дождевых червей и кивсяков при поедании животными стрептоми-цетных спор [7].

Следует отметить, что в переднем отделе кишечника преобладали колонии основного типа: округлые, с белым хорошо развитым воздушным мицелием (ВМ) и с синим субстратным мицелием (СМ). При высеве содержимого среднего и заднего отделов кишечника наблюдалась диссоциация культуры стрептомицета. Это выражалось в таких морфологических характеристиках колонии, как цвет ВМ, интенсивность и распределение пигмента по поверхности колонии. По-видимому, в среднем и заднем отделах кишечника стрептомицеты испытывают наибольший стресс, что увеличивает их изменчивость.

Staphylococcus sp. отличался от других исследуемых штаммов спосбностью к длительному существованию в кишечнике Eisenia fetida Andrei Bouche при достаточно высоких титрах. После введения в кишечник червей 0,03 мл суспензии односуточной культуры с титром 4,95±0,89х 108 КОЕ/мл выявлена следующая динамика численности клеток Staphylococcus sp. в переднем, среднем, заднем отделах кишечника и в копролитах. На 1-е сутки после инокуляции червей из содержимого переднего и среднего отделов кишечника Staphylococcus sp. не был выделен, что, по-видимому, связано с частичным перевариванием клеток исследуемого штамма. Однако часть клеток Staphylococcus sp. сохраняется и размножается, о чем свидетельствует титр жизнеспособных клеток в заднем отделе кишечника, составляющий 1,50+0,29х]0кКОЕ/г, В копролитах титр Staphylococcus sp. был достаточно высоким и составил 2,00±0,36х 105 КОЕ/г (табл. 4).

К 7 суткам опыта исследуемый штамм был обнаружен во всех отделах кишечника (табл. 4). В заднем отделе кишечника численность клеток Staphylococcus sp. увеличилась до 6,67±0,93хЮ9 КОЕ/г. В копролитах, выброшенных червем на 7-е сутки, исследуемый штамм не был обнаружен.

124

Динамика численности клеток Staphylococcus sp. в кишечнике красного

калифорнийского гибрида

Сутки Титр Staphylococcus sp., KOEfr

передний отдел кишечника средний отдел кишечника задний отдел кишечника Копролиты

1 - - 1,50±0,29х108 2,00±0,36х105

7 3,33±0,57x10ю 1,00+0,14x10е 6.67+0,93 х 10' -

10 2,33±0,42х10ч 2,67±0,5Ы0'° 1,33±0,24х109 1,00±0,I5X10}

}0 2,00±0,38хЮ9 2,00+0,38x109 1,00+0,19x10*' -

60 1,66+0,27x10Ч 1,0010,25x10' 2,00±0,2|х109 1,00±0,12х 10]

На 10-е сутки произошло снижение количества жизнеспособных клеток Staphylococcus sp. в переднем и заднем отделах кишечника до 2.33+0,42х К)9 и lf33±0,24xlО9 КОЕ/г, соответственно. В среднем отделе титр культуры увеличился на порядок и составил 2,67±0,5 IxlO10 КОЕ/г, В ко пролитая червя численность Staphylococcus sp. был значительно ниже, чем в кишечнике -1,00±0,15х 103 КОЕ/мл (табл. 4).

К 30 суткам опыта отмечалось снижение титра изучаемой культуры во всех отделах кишечника животного. В среднем отделе кишечника титр уменьшился на порядок (табл. 4). В копро-литах Staphylococcus sp. не был выявлен.

После содержания червей в течение 60-ти суток в переднем отделе кишечника титр Staphylococcus sp. снизился незначительно (табл. 4). В среднем отделе титр уменьшился в 2 раза по сравнению с данными 30-х суток и составил 1,00±0,25х109 КОЕ/г, в заднем отделе, напротив, наблюдалось двукратное увеличение количества жизнеспособных клеток исследуемого штамма. При этом в копролитах титр Staphylococcus sp. был ниже на несколько порядков и составил 1,00+0,12x10-'КОЕ/г (табл. 4).

Интересным представляется тот факт, что в копролитах, выбрасываемых червем, резко снижается численность клеток Staphylococcus sp. по сравнению с кишечником, в связи, с чем организм красного калифорнийского гибрида (Eisenia fetida Andrei Bouche) можно рассматривать как санитарный барьер, ограничивающий распространение микроорганизма в окружающей среде.

Таким образом, организм червя может служить резервуаром для искусственно внесенных микроорганизмов. Нефтеразрушающие микроорганизмы, сохраняясь в кишечном тракте, могут способствовать повышению эффективности применения препаратов, используемых для очистки почв от нефтезагрязнения. Способность В. thuringiensis аккумулироваться в кишечнике дождевых червей и сохранять способность к токсинообразованию позволяет делать вывод, что комплекс «энтомопатогенные бактерии - дождевые черви» может быть использован для решения проблемы более эффективного и рационального использования микроорганизмов для регулирования численности почвообитающий насекомых-вредителей.

Литература

1. Андерсон Дж.М. Почвенная фауна северной Европы/ Дж.М. Андерсон, Ф. ИнесоаМ:Наука, - 1987. - C.1R.

2. Битюцкий Н.П. Роль дождевых червей в минерализации органических соединений азота в почве / Н-П. Би-тюцкий, И.Н. Лапшина, Е.И.Лукина и др.// Почвоведение. - 2002. - № 10. - С. 1242-1250,

3. Вызов Б.А, Актином пнет ы в пище, кишечнике и экскрементах почвенных многоножек Pahyiuhx C.L. Koch / Б.А, Вызов, Б.А, Зспова Г.М, Бабкина НИ. и др. //Микробиология. - J993.~T.62. Вып. 5. - С. 916-927.

4. Вятчина О.Ф. Штаммы Bacillus thunngiensis. выделенные при эпизоотии лиственничной мухи (Hyiemyia iaricicota) в Камчатской области/ О.Ф. Вятчина//Сибирский экологический журнал. - 2004. - № 4. - С, 501-506.

5. Егоров Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: учеб. пособие / под ред. Н.С. Кгоро-еэ. - М.: Изд-во МГУ, 1995. - 224 с.

6. Полянская Л.М. Судьба актнномнцетов в кишечном тракте почвенных беспозвоночных животных, поедающих споры стрентомицетов / Л.М. Полянская, Н.И. Бабкина, Г.М. Зенова и др.// Микробиология. - 1996. -T.65. №4. - С. 560-565.

7. Стебаев И,В. Почвенные организмы как компопагты биогеоценоза / И-ti, Стебаев. М.: Наука, 1984. - С.З.

8. Стриганова Б.Р. Питание почвенных сзлрофагов/Б.Р. Стригановэ. М.; Наука, I9-S0. - 244с.

125