Выделение, культивирование и дифференцировка мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из жировой ткани крыс Rattus norvegicus и хомяков Mesocricetus auratus

Выделение, культивирование и дифференцировка мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из жировой ткани крыс Rattus norvegicus и хомяков Mesocricetus auratus

М.Н. Катина 1, Р.Ф. Гайфуллина 1, З.Г. Хаятова 2, Ч.Ч. Эмене 1, А.А. Ризванов 1

1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань

2 Казанский государственный медицинский университет, Казань

Isolation, culture and differentiation of rat (Rattus norvegicus) and hamster (Mesocricetus auratus) adipose derived multipotent mesenchymal stromal cells

M.N. Katina 1, R.F. Gaifullina 1, Z.G. Hayatova2, ChCh. Emene 1, A.A. Rizvanov1

1 Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan

2 Kazan State Medical University, Kazan

Клеточная терапия различных заболеваний представляется в последние годы все более перспективным направлением в медицине. Для терапевтических целей возможно получать аутогенные стволовые клетки из жировой ткани. Для доклинических исследований клеточной терапии заболеваний требуются модели заболеваний на животных, однако чаще всего применяемые крысы и мыши не способны к развитию целого ряда актуальных заболеваний, которые могут быть смоделированы на сирийских хомяках. При анализе литературных данных не было обнаружено каких-либо сведений о получении и исследовании свойств стволовых клеток хомяков, что важно для разработки методов клеточной терапии с применением моделей заболеваний у этих животных. В данном исследовании впервые получены стволовые клетки из жировой ткани сирийских хомяков, описана их морфология, свойства и потенциал дифференцировки в различных направлениях. Показано, что эти клетки аналогичны мультипотентным мезенхимным стромальным клеткам по их способности к дифференцировке в остеогенном и адипогенном направлении. Также показана способность клеток дифференцироваться в нейрогенном направлении.

Ключевые слова: мультипотентные мезенхимные

стромальные клетки, мультипотентная диффренцировка, адипогенез, остеогенез, нейрогенез, сирийские хомяки.

Cell therapy of various diseases is one of the most perspective fields in modern medicine. Adipose derived autological stem cells can be obtained for therapeutic purposes. Animal model of human diseases are essential for cell therapy research. However, the most frequently used laboratory animals, such as rats and mice, can't suffer the whole rate of common diseases of modern society. At the same time Syrian hamsters can provide scientists with an appropriate animal models of these diseases. Nevertheless, we couldn't find any data on hamsters' stem cells isolation and their characteristics. In this study we first isolated Syrian hamster's adipose derived stem cells, characterized their morphology, features and differential potential in several ways. These cells are much alike multipotent mesenchymal stromal cells and can go through osteogenic and, adipogenic differentiation. We have also shown that these cells can differentiate in neurogenic way.

Key words: multipotent mesenchymal stromal cells, multipotent differentiation, adipogenesis, osteogenesis, neurogenesis, Syrian hamsters.

Клеточная терапия различных заболеваний представляется в последние годы все более перспективным направлением в медицине и биотехнологии. Стволовые и прогениторные клетки для терапевтических целей могут быть выделены из различных органов и тканей. Так, они обнаружены в кроветворном костном мозге, эпидермисе, нервной, мышечной, костной и жировой ткани, в небольших количествах содержатся и в периферической крови. В клинической практике для получения аутогенных стволовых клеток возможно использование аспиратов из жировой ткани и костного мозга. Благодаря тому, что процедуры изъятия ткани при этом малотравматичны и не ведут к образованию косметического или функционального дефекта, возможно одномоментное взятие довольно большого объема образца, что позволяет в более короткие сроки получить необходимое количество клеток [1]. Жировая ткань состоит в основном из зрелых адипоцитов — клеток, мало-

е-таП: rizvanov@gmail.com

способных к пролиферации. Прогениторные клетки, за счет которых происходит обновление жировой ткани, содержатся в периваскулярной зоне мелких сосудов и составляют так называемую стромально-васкулярную фракцию. Эти клетки довольно гетеро-генны, представлены перицитами, фибробластами, преадипоцитами, а также мультипотентными мезенхимными стромальными клетками (ММСК), способными дифференцироваться в адипогенном, остеогенном, хондрогенном, миогенном и фиброгенном направлениях [2]. Дифференцировочный потенциал их в некоторой степени схож с так называемыми мезенхимными стволовыми клетками — клетками мезенхимы эмбриона, способными дифференцироваться в различные клетки соединительной ткани и кроветворные клетки. Однако ММСК жировой ткани являются клетками взрослого организма и не способны к дифференцировке в кроветворном направлении [3]. Считается, что ММСК являются наиболее

удобным и безопасным материалом для клеточной терапии и тканевой инженерии.

Прежде чем новый препарат или метод лечения войдет в широкую клиническую практику, он должен пройти целый ряд доклинических (in vitro и in vivo) и клинических исследований. Крысы и мыши — одни из самых «популярных» лабораторных животных, позволяющих моделировать ряд заболеваний и патологических состояний человека. Другие грызуны, как, например, сирийские хомяки также применяются в доклинических исследованиях. Их частое использование обусловлено простотой содержания, быстрым размножением и развитием, а также рядом анатомических и физиологических особенностей организма. Такие особенности их иммунной системы, как высокая чувствительность к вирусному онкогенезу [4], наличие иммунопривилегированных защечных мешков, необычные характеристики молекулы главного комплекса гистосовместимости и Т-клеток, делают этих животных незаменимыми при исследованиях в области иммунологии и онкологии. Также хомяки подвержены таким инфекционным заболеваниям человека, как лейшманиоз, токсоплазмоз, сифилис [5], микоплазменная инфекция. Сирийские хомяки — единственные животные, у которых возможно развитие спонтанного тромбоза [6]. На сирийских хомяках моделируется эпилепсия, кар-диомиопатия, они являются недорогой и легко воспроизводимой моделью таких широко распространенных заболеваний, как атеросклероз, сахарный диабет и кариес [7].

Тем не менее, мы не обнаружили каких-либо литературных данных об исследовании клеток хомяков, которые могли бы использоваться для терапии вышеуказанных заболеваний в моделях на животных.

Одним из наиболее достоверных способов определения принадлежности той или иной культуры клеток к популяции ММСК является исследование их способности к дифференцировке в различных направлениях. ММСК in vitro могут дифференцироваться в остеобласты,хондробласты, адипоциты, а также под действием некоторых факторов могут проходить «трансдиффренцировку» в клетки немезенхимного ряда, такие как нейроны [8], гепатоци-ты [9] и др.

Мы исследовали дифференцировочный потенциал ММСК жировой ткани хомяков в сравнении с ММСК жировой ткани крыс. Результаты данной работы и сделанные выводы позволят эффективно исследовать возможности апробации клеточной терапии ряда заболеваний человека на моделях с применением сирийских хомяков.

Материал и методы

Выделение и культивирование ММСК. ММСК были выделены из подкожной и висцеральной жировой ткани взрослых самцов крыс Rattus norvegicus линии Wistar и сирийских хомяков Mesocricetus auratus (Питомник лабораторных животных «ПУЩИНО», РФ). Животные содержались на стандартном рационе вивария и имели свободный доступ к воде. Содержание и использование лабораторных животных соответствовало правилам, принятым в КФУ, рекомендациям местного этического комитета и национальным законам [10]. Животным выполнялась декапитация 2с целью избежать влияния наркотизирующего средства на ход и результаты эксперимента.

Все манипуляции по выделению ткани и работы с культурами клеток проводились в стерильных условиях при ламинарном токе воздуха.

Стромально-васкулярная фракция клеток была получена по стандарной методике [11] в результате инкубации жировой ткани с 0,2% раствором колла-геназы краба (Биолот, Россия) в DPBS в течение 1 ч при 37°С и постоянном покачивании. Полученные клетки культивировали на среде a-MEM (Пан-Эко, Россия) с добавлением 10% сыворотки плодов коров (FBS, ПанЭко, Россия), 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина (ПанЭко, РФ) и 1 нг/мл основного фактора роста фибробластов человека (FGF2, Sigma, США). Не прикрепившиеся к пластику клетки были удалены через 48 ч при смене среды. Культуры клеток поддерживались в течение пяти пассажей. Пересев осуществляли с помощью 0,25% раствора трипсина-EDTA (Gibco, США).

Дифференцировка ММСК. Для исследования способности полученных клеточных культур к диф-ференцировке клетки третьего пассажа были высеяны на 12-луночные планшеты по 30 тыс. клеток на лунку и инкубировались в ростовой среде a-MEM с добавлением 1 нг/мл FGF2 до получения монослоя (48 ч). В дальнейшем для индукции дифференци-ровки клеточные культуры инкубировали со специальными средами. Дифференцировку осуществляли в трех направлениях: в остеогенном, адипогенном и нейрогенном.

Для остеогенной дифференцировки использовали среду a-MEM с добавлением 10% FBS, 100 нМ дексаметазона (Sigma, США), 0,5 uM 2-фосфата аскорбиновой кислоты (Sigma, США), 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина (ПанЭко, Россия). В качестве контрольной среды использовали среду a-MEM с добавлением 10% FBS, 0,5 uM 2-фосфата аскорбиновой кислоты, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина. С 10 сут. инкубации в среду для остеогенной дифференцировки, так же, как и в контрольную среду, добавляли 0,2 uM раствора p-глицерофосфата (Sigma, США) [11].

Для индукции адипогенной дифференцировки использовали среду DMEM High glucose (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% FBS, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина,

1 uM дексаметазона, 100 uM индометацина (Sigma, сШа), 500 uM 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX, Sigma, США) и 10 ug/ml инсулина (Sigma, США). С 10 сут. среду заменяли на поддерживающую, отличающуюся отсутствием дексаметазона, индомета-цина и IBMX. В качестве контрольной среды на всех этапах использовали DMEM High glucose с добавлением 10% FBS, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина [11].

Для нейрогенной дифференцировки посев клеток осуществляли на лунки, покрытые поли^-лизином. Использовали дифференцировочную среду NBM (Neural basal media, Gibco, США) с добавлением 1% FBS, 5% лошадиной сыворотки (Биолот, Россия), добавок N2 и B27 (Invitrogen, США), 10 мкг/мл трансферрина (Sigma, США), 60 мкМ путресцина (Sigma, США), 25 мкг/мл инсулина, 0,02 мкМ прогестерона (Sigma, США), 0,5 мкМ ретиноевой кислоты (Sigma, США), антибиотика и 10 нг/мл нейро-трофического фактора мозга (BDNF, Sigma, США).

Контрольной средой послужила среда a-MEM с добавлением 10% сыворотки плодов коров (FBS), 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина,

2 mM L-глутамина [12].

Анализ диффренцировки. Осуществляли ежедневное прижизненное наблюдение за культурами клеток с помощью инвертированного микроскопа AxioObserver Z1 (Carl Zeiss, Германия) методами фазово-контрастной и световой микроскопии.

Для установления факта дифференцировки в определенных направлениях на 20 сут. инкубации с дифференцировочными средами культуры клеток фиксировали охлажденным метанолом в течение 20 мин при -20°С, проводили цитохимическое окрашивание и использовали иммунофлуоресцент-ный метод определения экспрессии специфических белков.

Для определения минерализации, являющейся признаком остеогенной дифференцировки, использовали реакцию Vаn Kossa с 2% нитратом серебра. Эта реакция основана на связывании ионов серебра с фосфатными группами. Полученное соединение подвергается фотохимической деградации (в тече-

Результаты

До начала процедуры индукции дифференцировки ММСК крысы и хомяка 5 пассажа имели типичную для этих клеток фибробластоподобную форму. При культивировании ММСК крысы и хомяка в остеогенной среде наблюдали изменение формы клеток с веретеновидной на кубическую, свойственную остеобластам. Реакция Vаn Kossa выявила наличие значительных минеральных отложений в культурах ММСК как крысы, так и хомяка (рис. 1А, В), в то время как в культурах, инкубировавшихся в контрольной среде, таковых не наблюдалось (рис. 1Б, Г).

В культурах ММСК крысы и хомяка с 10—12 сут. инкубации со средой для адипогенной дифференци-ровки отмечали появление жировых микровезикул в цитоплазме клеток при витальной микроскопии. В последующем при окрашивании фиксированных культур Oil Red O на 20 сут. инкубации в культурах ММСК наблюдали большое количество клеток с морфологией, типичной для адипоцитов (рис. 2А, В): обилие жировых везикул различных размеров, окрашенных Oil Red O в красный цвет, и эксцентрично расположенное ядро. В клеточных культурах, инкубированных в контрольной среде,

ние 1 ч при ярком освещении) с выделением ионов серебра, придающим минеральным депозитам серокоричневый цвет.

Для выявления дифференцировки в адипоген-ном направлении использовали качественную реакцию на нейтральные жиры с красителем Oil Red O (Sigma, США), окрашивающим жировые включения в красный цвет. Ядра клеток докрашивали раствором гематоксилина (Sigma, США).

Факт нейрогенной дифференцировки определяли по экспрессии нейрональных маркёров, таких как ß3-тубулин, глиофибриллярный кислый белок GFAP, нейрофиламент L. Применяли иммунофлуо-ресцентный метод с использованием специфических антител к вышеуказанным белкам (Santa Cruz, США, sc-51670, sc-9065, sc-25652, соответственно) и вторичных антител, конъюгированных с флуо-рохромами Alexa 488 и 555 (Invitrogen, США) в соответствии с инструкциями фирм-производителей. Для окрашивания ядер использовали DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole). Микроскопию выполняли на инвертированном флуоресцентном микроскопе AxioOberver.ZI (Carl Zeiss, Германия).

признаков адипогенной дифференцировки не выявили (рис. 2Г, Б).

При флуоресцентной микроскопии культур клеток, подвергнутых нейрогенной дифференцировке и окрашенных с применением антител к белкам, специфическим для нервной ткани, наблюдали появление положительно окрашенных колоний (рис. 3Б) и отдельных крупных клеток (рис. 3А, В) с нейроноподобной морфологией и наличием большого количества длинных тонких отростков. Следует отметить, что в то время как вышеописанные клетки и их колонии в культуре ММСК хомяка встречались довольно часто (рис. 4), в культуре клеток крысы их было обнаружено значительно меньше (рис. 5). Вероятно, это указывает на более высокую способность ММСК хомяков к нейрогенной дифференцировке при культивировании на применяемой дифференцировочной среде или недостаточную ее оптимизацию для дифферен-цировки ММСК крысы. Клетки, экспрессирующие нейральные маркеры, также в единичных экземплярах встречались в культурах клеток, инкубированных с контрольной средой, что указывает на выраженную гетерогенность популяции ММСК жировой ткани.

Антитела, использовавшиеся в работе

Характеристика антигена Характеристика антитела по данным производителя

Р3-тубулин - компонент микротрубочек, специфичный для нейронов Моноклональные IgG1 мыши к р3-тубулину человека, мыши и крысы. sc-51670, Santa Cruz, США. Использованное разведение 1:100

GFAP - глиофибриллярный кислый белок - промежуточный филамент, экспрессируемый во многих клетках нервной системы, преимущественно в астроцитах, эпендимоцитах и некоторых других Поликлональные IgG кролика к GFAP человека, мыши и крысы. sc-9065, Santa Cruz, США. Использованное разведение 1:100

Нейрофиламент L - промежуточный филамент, один из основных компонентов цитоскелета нейронов, обеспечивающий нормальный рост аксонов Поликлональные IgG кролика к нейрофиламенту L человека, мыши и крысы. sc-9065, Santa Cruz, США. Использованное разведение 1:100

Рис. 1.

ММСК жировой ткани после индукции остеогенной дифференцировки в течение 20 сут.:

А - ММСК хомяка, остеогенная дифференцировка;

Б - ММСК хомяка, контроль;

В - ММСК крысы, остеогенная дифференцировка;

Г - ММСК крысы, контроль.

Окраска: реакция Van Kossa

Рис. 2.

ММСК жировой тканипосле индукции адипогенной дифференцировки в течение 20 сут.:

А - ММСК хомяка, адипогенная дифференцировка;

Б - ММСК хомяка, контроль;

В - ММСК крысы, адипогенная дифференцировка;

Г - ММСК крысы, контроль.

Окраска: Oil Red O, гематоксилин

Рис. 3.

ММСК жировой ткани хомяков после индукции нейрогенной дифференцировки в течение 20 сут.:

А, Б - экспрессия в3-тубулина [зеленый); В - экспрессия в3-тубулина [красный) и нейрофиламента-і [зеленый);

Г - нейроноподобная клетка в культуре.

А, Б, В - иммунфлуоресцентная микроскопия;

Г - фазово-контрастная микроскопия. Окраска ядер: DAPI

Рис. 4. ММСК жировой ткани после индукции нейрогенной дифференцировки в течение SO сут.: А - ММСК хомяка, нейрогенная дифференцировка; Б - ММСК крысы, нейрогенная дифференцировка; В - ММСК хомяка, контроль; Г - ММСК крысы, контроль; Д - ММСК хомяка, нейрогенная дифференцировка; Е - ММСК крысы, нейрогенная дифференцировка;

Ж - ММСК хомяка, контроль; З - ММСК крысы, контроль. Флуоресцентная микроскопия.

А-Г - рЗ-тубулин (красный) и GFAP (зеленый); Д-З - $3-тубулин (красный) и нейрофиламент-L (зеленый). Окраска ядер: DAPI

Обсуждение

В результате проведенного исследования определен потенциал к дифференцировке ММСК жировой ткани крыс и хомяков. Впервые получены и охарактеризованы ММСК жировой ткани хомяков. Показана способность ММСК хомяков дифференцироваться in vitro в клетки мезенхимного ряда (успешно индуцирована остеогенная и адипогенная диффе-ренцировка), возможность трансдифференцировки в немезенхимном направлении (факт нейрогенной дифференцировки определен на основании экспрессии клетками белков, специфичных для нервной ткани). Полученные данные позволят в дальнейшем успешно моделировать ряд заболеваний человека на крысах и хомяках и исследовать возможности кле-

точной терапии с применением аллогенной трансплантации стволовых клеток при различных патологиях.

Благодарности

Выполнение данного научного исследования финансируется за счёт государственного контракта ФЦП Министерства образования и науки Российской Федерации № 16.552.11.7008 и грантами РФФИ (12-04-01028-а, 12-04-31607). Работа частично выполнена на оборудовании Федерального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (ФЦКП ФХИ) и Научно-образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Терских В.В. Биологические особенности и терапевтический потенциал стромальных клеток жировой ткани. В: Пластическая хирургия и косметология, 2010: 613—22.

2. Повещенко О.В., Ким И.И., Ульянов Е.В. и др. Способы выделения и условия культивирования мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, полученной из различных источников. Бюллетень СО РАМН 2008; 5: 90—5.

3. Bobis S J., Majka M. Mesenchymal stem cells: characteristics and clinical applications. Folia Histochem. Cytobiol. 2006; 44(4): 215-30.

4. Thomas M.A., Spencer J.F., La Regina M.C. et al. Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors. Cancer Res. 2006; 66(3): 1270-6.

5. Kajdacsy-Balla A., Howeedy A., Bagasra O. Syphilis in the Syrian hamster. A model of human venereal and congenital syphilis. Am. J. Pathol. 1987; 126(3): 599-601.

6. McMartin D.N., Dodds W.J. Animal model of human disease: atrial thrombosis in aged Syrian hamsters. Am. J. Pathol. 1982; 107(2): 277-9.

7. Susan V., Gibson D., Brady A.G. et al., editors. Syrian hamsters: viral, parasitic, and noninfectious diseases. Labarotary animal medicine and science seriese II. Alabama: University of South Alabama; 2000.

8. Глушкова Т.Г., Маркова В.И. Нейрогенная дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток. Морфологические ведомости 2011; 1: 132-5.

9. Talens-Visconti R., Bonora A., Jover R. et al. Hepatogenic differentiation of human mesenchymal stem cells from adipose tissue in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. World J. Gastroenterol. 2006; 12(36): 5834-45.

10. Генин А. М., Капланский А.С. Биоэтические правила проведения исследований на человеке и животных в авиационной, космической и морской медицине. Авиакосмическая и экологическая медицина 2001; 4: 14-20.

11. Bunnell B.A., Flaat M., Gagliardi C. et al. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods 2008; 45(2): 115-20.

12. Sanchez-Ramos J., Song S., Cardozo-Pelaez F. et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Exp. Neurol. 2000; 164(2): 247-56.

Поступила 10.08.2012