СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЯЖЕСТИ ЗАБОЛЕВАНИЯ У БОЛЬНЫХ БРОНХОЛЕГОЧНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ
METHOD FOR DETERMINING SEVERITY IN PATIENTS WITH BRONCHOPULMONARY DISEASES

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для определения степени тяжести бронхолегочных заболеваний.
Развитие воспаления при бронхолегочных заболеваниях зависит от продолжительности рекрутирования клеток из кровеносного русла в слизистую бронхов и активации этих клеток. Центральная роль при этом в месте воспаления отводится механизмам регуляции жизнеспособности клеток. Существуют две формы гибели клеток - некроз и апоптоз. Первая - клеточной гибели, вызванная воздействием вредоносных факторов, приводящих к нарушению целостности клеточной мембраны, в результате чего клетка лизируется и ее содержимое изливается в межклеточное пространство. Некроз клеток обычно сопровождается развитием воспаления. Апоптоз - особый тип запрограммированной гибели клеток путем разделения их на части ("апоптозные тельца"), которые впоследствии фагоцитируются соседними клетками разного типа, что не ведет к развитию воспаления. Указанные формы повреждения или альтерации клеток имеют большое значение как в гомеостазе, так и при патологических состояниях организма. Принято считать, что если клетка умирает вследствие некроза, то возможность фармакологического вмешательства не может дать положительного результата, даже если идет только начальная стадия повреждения. Однако, по мнению профессора B.C. Новикова (Программированная клеточная гибель / B.C.Новиков. - СПб: Наука, 1996), наибольшую терапевтическую результативность при ингибировании реализации клеточного коллапса (апоптоза) можно достичь при раннем и комплексном применении фармакологических средств.
Известен способ определения степени тяжести бронхолегочного заболевания - бронхиальная астма (Беспалова И.Д., Черногорюк Г.Э., Волков В.Т. RU 2277710 C1 от 2006.06.10), заключающийся в определении маркеров воспаления в биологических жидкостях организма, с помощью определения реакции «кожного окна». Полученные мазки, через 12 и 24 часа, фиксируют метанолом и окрашивают по Нохту. Определяют число нейтрофилов и макрофагов, подсчитывая от 100 до 500 клеток в каждом мазке и при процентном содержании нейтрофилов 57,78±4,40 и 32,35±3,61 через 12 и 24 часов соответственно определяют первую степень активности воспалительного процесса, а при процентном содержании нейтрофилов 62,56±5,50 через 12 часов, и 40,88±6,22 через 24 часа определяют вторую степень активности воспаления.
Недостаток способа заключается в том, что он травматичен, так как в качестве маркеров воспаления в биологических жидкостях организма используют скарифицированный участок кожи больных, трудоемок для исследователя и длителен.
+
Известен способ оценки эффективности антибактериальной терапии Chlamydophila pneumoniae у больных бронхиальной астмой (Федоров Г.Н., Григорьева В.Н., Петушкова Т.Н. RU 2230319 C1 от 2004.06.10). При этом в качестве маркеров воспаления в биологических жидкостях организма используют периферическую кровь больных, в которой методом непрямой иммунофлуоресценции определяют субпопуляционный состав лимфоцитов. При содержании CD4-лимфоцитов менее 36,67% и СD95-лимфоцитов менее 57,95% через 3-4 недели после окончания лечения антибактериальную терапию, направленную на эрадикацию возбудителя, считают эффективной.
Недостатками этого способа являются:
- отсутствие данных о состоянии местного иммунитета больных;
- субъективность полученных данных, т.к. результаты в большой степени зависят от квалификации специалиста, выполняющего его;
- высокая затратность в связи с использованием для выявления субпопуляций клеток моноклональных антител.
6
Наиболее близким к предлагаемому нами способу относится оценка апоптоза нейтрофилов у больных сепсисом, сопровождающимся острым респираторным дистресс-синдромом (Fialkow L., Filho L.F., Bozzetti M.C., Milani A.R., Filho E.M.R., Ladniuk R.M., Pierozan P., de Moura R.M., Prollal J.C., Vachon E., Downey G.P. Neutrophil apoptosis: a marker of disease severity in sepsis and sepsis-induced acute respiratory distress syndrome Critical Care. - 2006, 10(6):R155). При данном способе нейтрофилы изолируются из периферической крови больных путем добавления декстрана и использования специфического градиентного по плотности раствора, после осаждения клетки отмываются дважды от указанных растворов, их концентрация доводится до 1×10 клеток на 1 мл среды RPMI, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 mM L-глутамин, 100 мг/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина, после инкубации в течение 24 ч, производится окраска нейтрофилов по Гимзе и дается оценка состояния клеток по идентификации изменения ядра в 500 клетках (конденсация хроматина и уменьшение структуры ядер), которая выражается в виде процентного соотношения. При этом установлена зависимость степени апоптоза нейтрофилов больных сепсисом от тяжести течения заболевания.
Недостатком данного способа является то, что данный метод фиксирует только системные нарушения у пациентов, а при назначении терапии больным бронхолегочными заболеваниями, необходимо исследовать состояние клеток не только системного кровотока, но и непосредственно органа-мишени (легких). Известно, что в органе-мишени клетки достигают последней стадии функционального созревания, которое, в конечном итоге, приводит к инициации процесса их гибели. Помимо этого к недостаткам указанного способа относится длительный период инкубирования клеток, для которого используются дополнительные реактивы, а также определение апоптотической активности только нейтрофилов, без учета других клеток.
Задачей заявляемого технического решения является получение высокой точности данных, упрощение и ускорения способа.
Поставленная задача решается тем, что в способе диагностики тяжести заболевания у больных бронхолегочными заболеваниями, включающем отбор исследуемого материала, выделение из него клеточной субстанции, подготовку ее к исследованию, определение величины альтерации клеток путем оценки их апоптоза согласно изобретению в качестве исследуемого материала используют индуцированную мокроту (ИМ) больного, в клеточной субстанции дополнительно определяют величину альтерации клеток путем некроза, при этом показатели апоптоза и некроза определяют при двух и более обследованиях с интервалом в 1-3 суток, полученные показатели выражают в виде апоптотического индекса (АИ) и индекса некроза (ИН), рассчитывают индекс альтерации клеток (ИАК) по формуле:
ИАК=ИН/АИ, где
ИН - индекс некроза;
АИ - апоптотический индекс;
при этом степень тяжести заболевания у больных определяют на основании значения показателя ИАК и диагностируют тяжелую степень течения бронхолегочного заболевания при показателях ИАК от 05 до 1,0, среднюю от более 1,0 до 1,3 и легкую степень течения при показателях от более 1,3 до 1,7
Сущность способа поясняется следующей последовательностью операций:
В качестве материала для исследования используют индуцированную мокроту (ИМ) больных бронхолегочными заболеваниями. ИМ получают после ингаляции 3-5% стерильного гипертонического солевого раствора с помощью компрессионного небулайзера "Omron CX-3" (Япония). Затем ИМ с помощью стерильного одноразового шприца (5 или 10 мл) переносят в пробирки. Для диспергирования и гомогенизации мокроты используют 0,1% раствор дитиотреитола, который добавляют к мокроте в соотношении 1:1. Затем смесь встряхивают в течение 10 минут и фильтруют через нейлоновую марлю. Отфильтрованную ИМ центрифугируют при 1200 об/мин в течение 10 минут, затем супернатант сливают, а взвесь клеток промывают 3 раза в растворе Хенкса без фенолового красного путем центрифугирования при 1200 об/мин по 10 минут.
Исследование мокроты проводится не позднее 3-х часов после получения материала, на протяжении всего этого времени образцы хранятся при температуре +4°C.
4
Для определения некроза к клеточной взвеси добавляют из расчета 1:2 раствор 0.1% Triton Х-100, 0.08 N HCl, 0.15М NaCl, осторожно смешивают и оставляют на 15 сек, затем вносят из расчета 1:2 холодный раствор красителя акридинового оранжевого 5 мг/мл, на основе цитратного буфера (pH 6.0), включающего 1 mM EDTA-Na, 0.15М NaCl, 0.2M NaPO, 0.1M. После окраски в течение 5-10 мин готовят препараты и немедленно анализируют под люминесцентным микроскопом.
Для определения апоптоза, после смешивания клеточной взвеси с раствором тритона (состав раствора указан выше), клетки фиксируют 4% параформальдегидом на основе дистиллированной воды, включающим 1% какодилата натрия и 1% хлорида натрия, затем окрашиваются специфическим красителем Hoechst 33342 (5 mM) для выявления апоптоза в течение 15 мин и анализируются под люминесцентным микроскопом.
Повреждение (альтерацию) клеток индуцированной мокроты оценивают путем просмотра препаратов под люминесцентным микроскопом с возбуждающими фильтрами ФС, СС, ЭС и запирающим фильтром типа ЖС=18+ЖС=19 с использованием иммерсионного водного объектива. Результаты получают на основании оценки цвета, интенсивности и морфологии флуоресцирующих клеток. В случае оценки альтерации клеток путем некроза подсчитывают 100 клеток, из них определяют % клеток желтого цвета, включивших краситель - акридиновый оранжевый, и выражают в виде индекса некроза (ИН). Апоптотическую активность клеток выражают в виде апоптотического индекса (АИ) - % клеток зеленого цвета, включивших краситель Hoechst 33342, и с наличием морфологических признаков апоптоза - измененных ядер, состоящих из 3 и более элементов, и уменьшенной цитоплазмы.
Вычисляют индекс альтерации клеток (ИАК) по формуле: ИАК=ИН/АИ, где ИН - показатель некроза; АИ - апоптотический индекс.
Сравнивают индекс альтерации клеток больных в период обострения с показателем ИАК здоровых лиц (контроль). Снижение ИАК фагоцитов ИМ у больного, по сравнению со значениями здоровых доноров, свидетельствует о нарушении местной защиты в органе-мишени. Диагностируют тяжелую степень течения бронхолегочного заболевания при показателях ИАК от 05 до 1,0, среднюю от более 1,0 до 1.3 и легкую степень течения при показателях от более 1.3 до 1.7
Основанием для определения эффективности предлагаемого способа оценки бронхолегочных заболеваний послужили результаты исследования индуцированной мокроты больных внебольничной пневмонией (ВП), бронхиальной астмой (БА) легкой, средней и тяжелой степени в процессе стационарного лечения в пульмонологическом отделении Главного госпиталя Тихоокеанского флота (г.Владивосток) и терапевтического отделения ДВОМЦ (г.Владивосток). Клинический диагноз бронхолегочных заболеваний устанавливался на основании общепринятых критериев. Оценка тяжести состояния больных на момент поступления проводилась по критериям, предложенным Л.И.Дворецким в 1996 году (Окороков А.Н. Диагностика болезней органов дыхания / А.Н.Окороков. - М.: Мед. лит., 2000. - 448 с.). В исследование были включены больные с легким течением заболевания - 60 (38,7%), со средне-тяжелым - 48 (37,4%) и тяжелым 22 (23,9%) человек. Группу контроля составили 20 практически здоровых лиц, не имеющих в анамнезе хронической бронхолегочной патологии, не болевших острыми заболеваниями в течение 6 месяцев. При этом ИАК у здоровых лиц равен 2,0.
Исследование показателей альтерации клеточных факторов местного иммунитета (МИ) больных бронхолегочными заболеваниями позволило выявить отчетливые изменения их значений по сравнению с таковыми для здоровых лиц. Самое низкое значение ИАК отмечалось в период обострения у больных с тяжелым течением ВП (в 2,7 раза) и БА (в 2,6 раза). При этом отмечено четкое различие значений ИАК в зависимости от степени тяжести заболеваний, чем тяжелее протекает заболевание, тем ниже показатель ИАК. Наиболее низкие значения ИАК отмечались у больных ВП, что указывало на несостоятельность местных факторов защиты легких при этом заболевании.
Примеры конкретного выполнения.
Пример №1
Больные с диагнозом внебольничная пневмония (ВП) находились на консервативном стационарном лечении пульмонологического отделения Главного госпиталя Тихоокеанского флота. ВП диагностировалась при сочетании вновь возникших инфильтративных изменений на рентгенограмме легких и нижеперечисленных клинических признаков (Torres, 1997): а) кашель; б) гнойный или слизисто-гнойный характер мокроты; в) хрипы при аускультации или признаки уплотнения легочной ткани; г) одышка или тахипноэ; д) лейкоциты периферической крови >10000 или <4500 в мл или >10% палочкоядерных нейтрофилов. С учетом того, что больные, включенные в исследование, были одного пола, возраста и не имели сопутствующих заболеваний, тяжесть течения ВП оценивалась на основании выраженности клинических проявлений по критериям, разработанными Дворецким Л.И. (1996). Пациентам проведено исследование МИ по предлагаемой методике. Данные представлены в таблице 1.
Таблица 1
Показатели альтерации клеток индуцированной мокроты (ПАК) у больных ВП
ПАК
ВП первой степени тяжести n=26
ВП второй степени тяжести n=18
ВП третьей степени тяжести n=10
Контрольная группа, n=20
ИН, %
96±6,8
59±3,8
49±3,5
45,2±2,4
АИ, %
70,01±6,8
54±4,6
66,7±5,2
22,5±1,6
ИАК
1,4
1,1
0,7
2,0
По значениям ИАК, представленным в таблице, в период обострения, больных ВП можно распределить по степеням тяжести заболевания. У больных первой (легкой) степени ВП значение ИАК составило 1.4, второй (средней) 1,1, тогда как у больных третьей (тяжелой) степени заболевания 0,7.
Пример №2
Больные с диагнозом бронхиальная астма (БА) различной степени тяжести заболевания находились на консервативном стационарном лечении терапевтического отделения ДВОМЦ. Для постановки диагноза БА, определения степени ее тяжести были использованы рекомендации адаптированного к российским условиям консенсуса (GINA, 2002 г.), оценку клинического течения БА проводили по изменению дневных и ночных симптомов, измеряемых в баллах по специальной шкале от 0 до 5, частоты и длительности обострений заболевания, показателям функций внешнего дыхания. Пациентам проведено исследование МИ по предлагаемой методике. Данные представлены в таблице 2.
Таблица 2
Показатели альтерации клеток индуцированной мокроты (ПАК) у больных БА
ПАК
БА, легкая степень тяжести заболевания n=16
БА, средняя степень тяжести заболевания n=14
БА, тяжелая степень тяжести заболевания n=8
Контрольная группа, n=20
ИН, %
42,3±2,4
44,6±3,4
39,3±1,6
45,2±2,4
АИ, %
28,8±1,8
37,3±1,8
43,7±3,4
22,5±1,6
ИАК
1,5
1,2
0,9
2,0
Таким образом, по значениям ИАК в период обострения больных БА можно распределить по степеням тяжести заболевания. Так, у больных легкой степени заболевания БА значение ИАК составило 1,5, средней - 1,2, а тяжелой - 0,9.