РОСТОВАЯ КАМЕРА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Полезная модель относится к устройствам для выделения и выращивания микроорганизмов и может быть использована для культивирования микроорганизмов в естественной среде обитания или в условиях, имитирующих естественные.
Бактерии, которые растут на стандартных питательных средах, составляют лишь малую часть от общего разнообразия, которое существует в природе. Некоторые микроорганизмы из проб окружающей среды не растут на широко используемых питательных средах в лабораторных условиях, то есть представляют «некультивируемые» виды, которые способны размножаться лишь в естественной среде обитания. Таким образом, понятие «некультивируемые» микроорганизмы подразумевает, что данный вид микроорганизмов способен расти лишь в естественной среде обитания.
«Некультивируемые» микроорганизмы - источники вторичных метаболитов, веществ, обладающих эффективностью против бактерий. Находясь в своей естественной среде (в основном, в почве), микроорганизмы синтезируют антибиотики в качестве средства выживания в борьбе за существование. Таким образом, скрининг природного разнообразия веществ, продуцируемых бактериями, - один из наиболее перспективных методов для обнаружения новых химических веществ. Так, например, поиск новых антибиотиков бактериального происхождения - одно из перспективных направлений современной медицины.
Изучение антимикробного потенциала, а также обнаружение новых уникальных соединений стало возможным с открытием новых методов культивирования «некультивируемых» микроорганизмов, одним из которых является культивирование в камере изоляции in situ - диффузионной камере. В камере клетки ведут себя так же, как и в естественной среде обитания: внутри камеры вид растет так же, как в природных условиях. Метод культивирования с использованием диффузионной камеры имеет существенное отличие от традиционного культивирования. Этот метод не требует знаний о компонентах среды, необходимых для выращивания исследуемых организмов. В природной среде по определению содержится все, что требуется для роста микроорганизмов, населяющих эту среду. Это подтверждено успешно проведенными испытаниями.
Известно устройство для культивирования или выделения микроорганизма [патент US 9249382 В2, МПК С12 М1/00; С12М 1/12; С12М 1/26, опубл. 02.02.2016 г.], выполненное в форме шайбы с пустым пространством внутри, содержащее первую полупроницаемую мембрану, прикрепленную к верхней поверхности конструкции, и вторую полупроницаемую мембрану, прикрепленную к нижней поверхности конструкции. В сущности, мембраны прикреплены к верхней и нижней части металлического диска с центральным отверстием так, что закрывают это отверстие сверху и снизу. Обе мембраны могут иметь одинаковый размер пор - примерно от 0,2 мкм до 10,0 мкм. Как вариант, мембраны могут иметь разный размер пор, вторая мембрана может иметь размер пор в пределах от 0,00001 мкм до 10,0 мкм. При этом полупроницаемая мембрана, имеющая больший размер пор, помещается в контакт с окружающей средой, содержащей выделяемый или культивируемый микроорганизм - эта мембрана является проницаемой для проникновения микроорганизма. Устройство содержит расположенную внутри шайбы, в пространстве между мембранами, среду, которая обеспечивает рост микроорганизмов. Среда содержит желатинирующий агент, в том числе агар.
Устройство размещается в естественной окружающей среде, содержащей микроорганизм, и позволяет микроорганизму проникать через поры в мембране в среду во внутреннем полом пространстве устройства и образовывать в нем колонии. При этом микроорганизм представляет собой ранее неизвестный микроорганизм. Таким образом, с помощью устройства методом «микробной ловушки» происходит выделение из окружающей среды новых неизвестных микроорганизмов.
При этом достоинство известного устройства заключается в том, что оно обеспечивает выращивание не только неизвестных микроорганизмов, но и ранее непригодных для культивирования («некультивируемых») микроорганизмов. При внесении устройства в природные условия (или имитирующие их условия) через поры мембран происходит диффузия и устанавливается химическая связь между клетками и компонентами окружающей среды. В природных условиях микроорганизмы обеспечиваются естественными для них питательными веществами и факторами роста.
К недостаткам такой диффузионной камеры следует отнести ненадежность крепления мембран и, как следствие, ненадежность конструкции в целом. Мембраны приклеиваются после заполнения внутреннего пространства средой, что зачастую происходит в полевых условиях. Такая конструкция легко может разрушиться в условиях окружающей природной среды, так как мембраны контактируют с окружающей средой (в том числе с почвой, водой). К недостаткам следует отнести и неудобство конструкции для последующего подсчета выращенных микроорганизмов.
Наиболее близким техническим решением является устройство для крупномасштабного параллельного выращивания некультивируемых видов, названная чипом изоляции (или iChip) [Lewis K. Uncultured microorganisms as a source of secondary metabolites / K. Lewis, S. Epstein // J Antibiot. - 2010. - P. 468-476]. Чип представляет собой сборку прямоугольных пластин. Сборка содержит центральную пластину, состоящую из двух секций, которая размещена в корпусе, выполненном из двух симметричных пластин, снабженных бортиками. При этом у одной из пластин на внутренней стороне имеются выступы, а у другой - выемки (соответствующие пазы под выступы). По обеим сторонам центральной пластины размещены четыре мембраны с размером пор 0,03 мкм.
Центральная пластина, а также пластины корпуса имеют по 2 массива ячеек -отверстий с диаметром 1 мм, по 192 отверстия в каждом массиве. Размеры массивов таковы, что каждый полностью покрывается стандартной 25- или 47-миллиметровой полупроницаемой мембраной. Пластины изготовлены из гидрофобного пластика - полиоксиметилена, мембраны - из поликарбоната. Все пластины по углам, а также в середине с каждого края имеют отверстия под винты. Сборка скрепляется винтами.
Сквозные отверстия диаметром 1 мм в центральной пластине заполняются средой с агаром и служат для размещения микроорганизмов. В пластинах корпуса такие же отверстия служат для обеспечения контакта с окружающей средой.
Перед сборкой стерильная центральная пластина погружается в суспензию клеток из окружающей среды с добавлением агара. В результате погружения каждое сквозное отверстие захватывает объем суспензии, содержащий определенное количество клеток - происходит фиксация клеток в сквозных отверстиях. Число клеток зависит от степени разбавления и может составлять в среднем одну клетку на каждое отверстие. После захвата каждая клетка попадает в агаровую пробку, которая образуется после того, как агар затвердевает. Таким образом, клетки находятся в отдельных «ловушках», то есть в соответствующих сквозных отверстиях и отделены друг от друга.
Затем мембраны размещают с обеих сторон центральной пластины на каждый массив сквозных отверстий. Мембраны предотвращают миграцию клеток из агаровых пробок. Наконец, накладываются верхняя и нижняя пластины и с помощью отвертки затягиваются винты для скрепления конструкции. Содержимое каждого сквозного отверстия с агаровыми пробками преобразует сборку в комбинацию 384 миниатюрных диффузионных камер, содержащих в среднем одну клетку на каждое сквозное отверстие.
Устройство обеспечивает выращивание неизвестных микроорганизмов, а также ранее непригодных для культивирования («некультивируемых») микроорганизмов. Для этого внутреннее пространство устройства заполняют агаром, смешанным с микроорганизмами из изучаемой среды обитания. Чип изоляции возвращается в естественные условия обитания изучаемых микроорганизмов. При внесении устройства в природные условия (или имитирующие их условия) через поры обеих мембран происходит диффузия и устанавливается химическая связь между клетками и компонентами окружающей среды. Однако, при этом полупроницаемые мембраны отделяют микроорганизмы от окружающей среды и препятствуют их миграции наружу. При инкубации микроорганизмов в чипе изоляции в природных условиях происходит обеспечение их естественными питательными веществами и факторами роста через отверстия в верхней и нижней пластинах. Чипы инкубируют в естественной среде в течение двух недель. После инкубации центральная пластина может быть изучена под высокомощным микроскопом для подсчета колоний. Агаровые пробки стерильно извлекаются и используются для дальнейшего анализа: подсчета колоний, выделения ДНК и секвенирования гена 16S рРНК с целью идентификации выделенных видов, других исследований.
Таким образом, за счет использования центральной пластины с ячейками, устройство-прототип представляет собой, по сути, массив миниатюрных диффузионных камер, и может быть использовано для крупномасштабного параллельного выращивания некультивируемых видов. Технология культивирования с использованием чипа изоляции обеспечивает более продуктивное микробное восстановление по сравнению с первым аналогом (диффузионной камерой). Обеспечивается возможность выращивания чистых культур в одну стадию, так как клетки изначально разделены друг от друга в ячейках центральной пластины. А при использовании диффузионной камеры требуется стадия выделения чистой культуры, часто не одна стадия, а трудоемкий процесс.
Конструкция устройства-прототипа обеспечивает точный захват малых выборок за счет малого диаметра ячеек центральной пластины и позволяет быстро сканировать содержимое нескольких камер - ячеек.
К достоинствам устройства-прототипа также следует отнести надежное крепление сборки, которое обеспечивает надежность конструкции в целом.
Недостатком устройства-прототипа является неудобное скрепление пластин из-за необходимости завинчивания винтов. При этом сами пластины маленькие (до 7 см по длине), что и обусловливает сложность процесса сборки. Указанный недостаток существенно затрудняет сборку в полевых условиях.
Задачей полезной модели является упрощение сборки устройства при сохранении надежности фиксации конструкции.
Технический результат достигается тем, что в ростовой камере для культивирования микроорганизмов, содержащей покрытую полупроницаемыми мембранами с обеих сторон центральную пластину с отверстиями для заполнения средой, обеспечивающей рост микроорганизма, размещенную в несплошном проницаемом корпусе, между верхней пластиной, имеющей массив отверстий, бортики и выступы, и нижней пластиной, имеющей массив отверстий, бортики и пазы, корпус камеры имеет круглую форму и дополнительно снабжен цилиндрической крышкой с отверстием в центре, с внутренней стороны внешнего бортика крышки расположен, по меньшей мере, один выступ для фиксации крышки, причем центральная пластина снабжена расположенными напротив друг друга двумя большими выступами, верхняя пластина с отверстиями снабжена крестовиной в центре, на внешней поверхности бортика верхней пластины по всей высоте размещены четыре прямоугольных выступа, на бортике нижней пластины выполнены два выреза для фиксации соответственных выступов центральной пластины, от каждого выреза снаружи бортика выполнены боковые пазы для фиксации выступа на бортике крышки, причем с внутренней стороны бортика нижней пластины выполнены пазы для фиксации соответственных выступов бортика верхней пластины.
При этом с внутренней стороны внешнего бортика по нижнему краю крышка дополнительно снабжена выступом для фиксации крышки, расположенным напротив первого выступа для фиксации крышки. Центральная пластина дополнительно снабжена расположенными напротив друг друга двумя малыми выступами. Нижняя пластина дополнительно снабжена сочлененным с основным бортиком внутренним бортиком, по высоте равным толщине центральной пластины и имеющим два выреза для фиксации соответственных больших выступов центральной пластины, и два выреза для фиксации соответственных малых выступов центральной пластины.
Заявляемая ростовая камера показана на фиг. 1 и фиг. 2.
На фиг. 1 представлено в аксонометрии схематичное изображение сборки устройства.
На фиг. 2 представлен чертеж фиксатора ростовой камеры - вид сверху.
Ростовая камера выполнена в форме шайбы, имеющей несплошные верхнюю и нижнюю поверхности, и является сборно-разборным устройством с коаксиально расположенными деталями. Ростовая камера содержит (фиг. 1) корпус 1 с крышкой 2, внутри размещены центральная пластина 3, помещенная между мембраной 4 и мембраной 5, и фиксатор 6. Для камеры используют стандартные 47-миллиметровые полупроницаемые мембраны из поликарбоната с размером пор 0,03 мкм (размер пор может колебаться в пределах от 0,000001 мкм до 10,0 мкм).
Центральная пластина 3 - круглая пластина с ячейками (размер отверстия в ячейке 0,8×0,8 мм). Центральная пластина 3 снабжена расположенными напротив друг друга двумя большими выступами 7 и двумя малыми выступами 8, также расположенными противоположно.
Дно 9 фиксатора 6 (фиг. 1 и фиг. 2) выполнено в форме круглой пластины с ячейками (размер отверстия в ячейке 0,8×0,8 мм). Фиксатор 6 имеет кольцеобразный бортик 10, на внешней поверхности которого во всю высоту бортика симметрично размещены четыре прямоугольных выступа 11. В центре фиксатора размещена крестовина 12. С наружной стороны дна 9 фиксатора, между фиксатором 6 и центральной пластиной 3 размещается тонкая полупроницаемая мембрана 4.
Дно 13 корпуса 1 - это круглая пластина с ячейками (размер отверстия в ячейке 0,8×0,8 мм). Внутри корпуса 1, на дне 13 размещается полупроницаемая мембрана 5. Корпус 1 имеет внешний бортик 14 и сочлененный с ним внутренний бортик 15. Внутренний бортик 15 выполнен значительно ниже, чем внешний бортик 14, и по высоте равен толщине центральной пластины 3. Оба бортика прорезаны до дна корпуса в двух местах: в этих двух прямоугольных вырезах 16, расположенных напротив друг друга, фиксируются соответственно большие выступы 7 центральной пластины 3. На наружной поверхности внешнего бортика 14 от каждого выреза 16 выполнены боковые пазы 17 для фиксации крышки 2. С внутренней стороны внешнего бортика 14 сверху и до уровня внутреннего бортика выполнены четыре прямоугольных паза 18 для фиксации соответственных выступов 11 фиксатора.
На внутренней поверхности внутреннего бортика 15 выполнены напротив друг друга два прямоугольных паза 19 для фиксации малых выступов 8 центральной пластины.
Бортик 10 фиксатора по высоте ниже внешнего бортика 14 корпуса так, что при помещении фиксатора в корпус верхние края бортиков находятся на одном уровне.
Цилиндрическая крышка 2 имеет круглое отверстие 20 в центре. При этом диаметр отверстия 20 чуть больше длины перекладины крестовины 12. Крышка 2 соответственно имеет внешний бортик 21 и со стороны отверстия внутренний бортик 22. С внутренней стороны внешнего бортика 21 по его нижнему краю напротив друг друга расположены два прямоугольных выступа 23 для фиксации крышки.
Сборку ростовой камеры (фиг. 1) осуществляют в следующем порядке: вначале в корпус 1 на дно 13 вкладывают или приклеивают (клей наносят по периметру), полупроницаемую мембрану 5, затем сверху вкладывают центральную пластину 3, удерживая ее пальцами одной руки за оба больших выступа 7. Центральная пластина 3 размещается в корпусе 1 так, что в двух прямоугольных вырезах 16 корпуса помещаются большие выступы 7 центральной пластины 3. Малые выступы 8 центральной пластины соответственно размещаются в двух прямоугольных пазах 19 на внутренней поверхности внутреннего бортика 15 корпуса. При этом центральная пластина 3 контактирует с мембраной 5, расположенной на дне 13 корпуса, - ложится на нее. Затем, поверх центральной пластины 3 укладывается вторая полупроницаемая мембрана 4. Эта мембрана 4 также может быть приклеена снаружи по периметру к дну 9 фиксатора 6. После этого, удерживая фиксатор 6 за крестовину 12, его сверху помещают на центральную пластину 3 (поверх мембраны 4) так, чтобы выступы 11 фиксатора разместились в соответствующих им четырех прямоугольных пазах 18 на внутренней стороне внешнего бортика 14 корпуса. Таким образом, сверху центральная пластина 3 контактирует с мембраной 4, расположенной с наружной стороны дна 9 фиксатора.
Сборка накрывается крышкой 2. Крышка 2 одевается движением сверху вниз, при этом выступы 23 крышки помещаются в вырезы 16 внешнего бортика 14 корпуса. Крышка фиксируется поворотом против часовой стрелки. Причем в положении фиксации выступы 23 крышки размещаются (защелкнуты) в боковых пазах 17, отходящих от вырезов 16.
Разборку устройства производят в обратном порядке. Крышка 2 поворачивается по часовой стрелке, при этом выступы 23 крышки попадают в вырезы 16 на внешнем бортике 14 корпуса 1. Затем крышка снимается. Вынимается за крестовину 12 фиксатор 6. Удерживая пальцами одной руки за большие выступы 7, вынимают центральную пластину 3 из корпуса 1. Мембраны снимают стерильным пинцетом после выемки центральной пластины.
Изготавливают ростовую камеру на 3D-принтере с использованием нитей из поли(DL-лактида) производства компании SEM (г. Королев). Ростовая камера может быть использована многократно. Мембраны одноразовые, стандартные.
Подготовка камеры для микробной инкубации начинается со стерилизации ее пластиковых деталей в этиловом спирте с последующей сушкой в ламинарном боксе и промыванием в стерильной воде. Затем подготавливают среду, обеспечивающую рост микроорганизма. Для этого из лунки, выкопанной в почве, отбирается 1 мерная ложка почвы, из которой убираются растительные остатки и механические примеси (камни, посторонние предметы). Затем 1 г из этой отобранной порции почвы помещают в 100 мл воды и тщательно взбалтывают, потом дают отстояться в течение 1 минуты. Отдельно готовят желеобразный 0,1% агар: для этого 0,1 г сухого агара заливают 100 мл воды, перемешивают и доводят до кипения (до прозрачного состояния). После чего охлаждают до теплого состояния (температура около 45°C). Отбирают 1 инсулиновый шприц (1 мл) суспензии почвы, приготовленной как описано ранее, и переносят ее в емкость с готовым агаром, взбалтывают. Часть подготовленной таким образом среды с агаром выливают в чашку Петри, заполняя ее на 3/4.
Устройство работает следующим образом (фиг. 1). В подготовленную среду опускают центральную пластину 3 ростовой камеры и добиваются заполнения средой с агаром всех ячеек. Далее на дно 13 корпуса 1 ростовой камеры кладут или приклеивают мембрану 5 и сверху на нее помещают центральную пластину 3. Затем доводят до конца сборку устройства так, как описано ранее. Таким образом, центральная пластина, заполненная средой с агаром, оказывается размещенной (зафиксированной) между двумя полупроницаемыми мембранами: мембраной 5 на дне корпуса и мембраной 4 на дне фиксатора.
Далее ростовую камеру помещают в выкопанную лунку - ту же, откуда брали почву для среды, и засыпают почвой. Точку погружения отмечают опознавательными знаками. Оставляют ростовую камеру в почве на 2 недели. Спустя 2 недели камеру извлекают, помещают в контейнер и засыпают ее почвой - той же, в которой камера инкубировалась эти две недели, и транспортируют в лабораторию.
Далее ростовую камеру разбирают и проводят анализ содержимого ячеек центральной пластины - агаровые пробки стерильно извлекаются и используются для дальнейшего анализа. При этом колонии (предполагается, что в одной ячейке одна колония) извлекают из ячеек центральной пластины стерильной булавкой на питательную среду. Культивированные в ростовой камере микроорганизмы далее продолжают выращивать в лабораторных условиях, подбирая для этого питательные среды.
После использования камеру промывают в воде в разобранном виде и стерилизуют с помощью этилового 95% спирта.
Таким образом, особенности конструкции ростовой камеры позволяют использовать ее для выращивания некультивируемых микроорганизмов в естественных условиях их обитания. Для крупномасштабного культивирования проводят параллельную инкубацию нескольких ростовых камер, что позволяет выделить десятки чистых (ранее неизвестных) микробных культур. При этом при анализе выращенных в камере в агаровой среде микроорганизмов могут быть обнаружены новые виды и новые биологически активные вещества.
Ячейки центральной пластины обеспечивают разделение колоний различных микроорганизмов и облегчают дальнейшее культивирование, подсчет и проведение других исследований. Выросшие колонии можно легко удалить с помощью стерильных зубочистки или скрепки, после чего поместить, например, в лунку планшета для микротитрования.
Конструкция ростовой камеры обладает высокими эксплуатационными качествами, сочетает в себе удобство процесса сборки и надежность крепления, что обеспечивается за счет форм и взаимного расположения поверхностей и их элементов - соответственных пазов и выступов на деталях конструкции. В том числе, простота и удобство процесса сборки обеспечивается наличием больших выступов на центральной пластине и крестовины на фиксаторе, конструкция быстро и надежно фиксируется крышкой.
В целом преимущества предложенной конструкции позволяют сократить время сборки, снизить трудоемкость - нет необходимости завинчивания большого количества винтов, все это позволяет проводить сборку в полевых условиях. Следует также отметить, что заявленная ростовая камера расширяет очень незначительный арсенал технических средств, предназначенных для выращивания ранее непригодных для культивирования («некультивируемых ») микроорганизмов.
Предложенное техническое решение было изготовлено на опытных образцах и отработано с положительными результатами.