УСТРОЙСТВО ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ ДВУХСЛОЙНОЙ КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ
DEVICE FOR FORMATION OF A TWO-LAYER CELLULAR MODEL

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к биотехнологии, а именно, к тканевой инженерии, и может быть использовано для культивирования и/или формирования многослойных клеточных моделей со статическим и/или динамическим движением ростовой среды.
В частности, заявляемое изобретение может быть использовано для формирования двухслойных клеточных моделей из различных типов клеток, например, модели плаценты, с последующим изучением процессов фетоплацентарного барьера in vitro. Устройство позволяет имитировать на микроуровне структуру и функцию плаценты и моделировать перенос питательных веществ от матери к плоду.
Заявляемое решение может быть использовано в более широкой области для изучения миграции клеток или совместимости культивирования нескольких типов клеток, а также для исследования влияния различных химических веществ на клетки в условиях in vitro.
Уровень техники
Из уровня техники известны различные устройства, позволяющие создавать модели плаценты с помощью пористых мембранных элементов для последующего ее изучения. При этом такие устройства делятся на два типа - со статическим и динамическим движением ростовой среды (в т.ч. микрожидкостные или микрофлюидные устройства).
6
6
В частности, из статьи Blundell С, Tess ER, Schanzer AS, Coutifaris С, Su EJ, Parry S, Huh D. A microphysiological model of the human placental barrier. Lab Chip. 2016 Aug 2;16(16):3065-73. doi: 10.1039/c6lc00259e. PubMed PMID: 27229450; PubMed Central PMCID: PMC4970951 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4970951/) известно микрофлюидное устройство (микропланшет или платформа) для моделирования физиологического биомолекулярного транспорта через модель плацентарного барьера. Платформа позволяет имитировать данную специализированную ткань in vitro посредством совместного культивирования клеток человеческого трофобласта и эндотелиальных клеток плода человека в физиологически значимой пространственной структуре с возможностью воспроизведения характерной архитектуры плацентарного барьера человека. В частности, устройство представляет собой раздельную микрожидкостную двухслойную систему, состоящую из двух близко расположенных микроканалов, разделенных тонкой полупроницаемой мембраной с размерами пор 1 мкм, позволяющих культивировать человеческие трофобласты и человеческие плацентарные ворсинчатые эндотелиальные клетки на противоположных сторонах мембраны в условиях динамического потока. Верхний и нижний слои микроустройства изготовлены из полидиметилсилоксана (PDMS) с использованием стандартных методов мягкой литографии. Размеры микроканала составляли 1 мм (ширина) × 1,5 см (длина) × 135 мкм (высота). В верхнем слое полидиметилсилоксана выполнено отверстие диаметром 1 мм для обеспечения жидкостного доступа к верхнему и нижнему микроканалам. Для создания плацентарного барьера нижний канал заполняли суспензией трипсинизированных HPVEC (4×10 клеток/мл) после чего устройство переворачивали и инкубировали при 37°С в течение 1 часа, чтобы обеспечить прикрепление клеток к мембране. В течение этого периода входные и выходные отверстия устройства были заблокированы для предотвращения нежелательного конвективного движения культуральной среды в микроканалах. После прикрепления HPVEC устройство переворачивали и заполняли верхний микроканал клетками BeWo, суспендированными в DMEM / F-12K, в концентрации 4×10 клеток/мл с последующей инкубацией клеток при 37°С в течение 1 часа. Далее проводили исследования барьерной функции полученной модели плацентарного барьера, для чего микроустройство подключали к шприцевым насосам, которые генерировали непрерывный поток культуральной среды в верхнем и нижнем микроканалах при объемном расходе 100 мкл /час.
Данное устройство позволяет в статическом режиме (с заблокированными входными и выходными каналами) формировать исходную модель плацентарного барьера с последующим изучением ее свойств в динамическом режиме течения ростовой среды. Однако такая система не позволяет проводить прижизненную оценку морфологии клеток с помощью световой микроскопии, а также не позволяет контролировать изменение трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) многослойной модели, поэтому целостность барьера может быть оценена только после фиксации клеток, связанной с их гибелью, либо косвенно с помощью оценки транспорта веществ через слой клеток.
2
В данной статье также представлено описание возможности формирования модели плацентарного барьера с использованием стандартных вставок Трансвелл (Transwell) со статическим размещением ростовой среды. Вставки Transwell с размерами пор 0,4 мкм и площадью поверхности мембраны 0,33см размещали в 24-луночном планшете, покрывали раствором фибронектина человека (0,1 мг / мл в PBS). Для клеточного посева вставку сначала инвертировали, а каплю суспензии HPVEC (50000 клеток/вставку) помещали на основную поверхность мембранной вставки, после чего клеточную культуру инкубировали в течение 1 часа для прикрепления клеток к поверхности мембраны. После адгезии HPVEC вставку промывали и помещали обратно в лунку, а базальное отделение заполняли эндотелиальной средой. Затем апикальную камеру вставки заполняли клеточной суспензией BeWo (50000 клеток/вставку), инкубировали в течение 1 часа и промывали, чтобы засеять верхнюю часть мембраны клетками трофобласта.
Однако данный метод имеет ряд недостатков. В частности, в процессе формирования модели плацентарного барьера вставку Трансвелл переворачивают, высевая сначала клетки на ее внешней стороне, затем на внутренней, что увеличивает шанс контакта стерильных поверхностей с окружающими нестерильными поверхностями. При этом сам процесс формирования клеточной модели связан с периодическим контактом клеток с воздушной средой без жидкой ростовой среды, что может приводить к гибели клеток. Кроме того, клетки на внешнюю сторону мембраны вставки Трансвелл наносятся в виде суспензии в капле ростовой среды. Это приводит к тому, что по краям капли и, соответственно, мембраны находится меньшее количество клеток, чем в центре, поэтому при дальнейшем росте формируется неравномерный монослой клеток с более редким расположением клеток по периметру мембраны.
Другие известные из уровня техники модели формирования плацентарного барьера из клеточных культур для последующего изучения их транспортной функции, основанные на использовании вставок Transwell, характеризуются преимущественно наличием монокультуры трофобластных клеток (Techniques to study human placental transport. Sastry BV, Adv Drug Deliv Rev. 1999 Jun 14; 38 (1): 17-39; Have we neglected the role of fetal endothelium in transplacental transport? Elad D, Levkovitz R, Jaffa AJ, Desoye G, Hod M. 2014 Jan;15(1):122-6. doi: 10.1111/tra.12130. Epub 2013 Nov 8. [PubMed]). Следовательно, существующие модели Transwell не имитируют многослойную структуру плацентарного барьера, не обеспечивая вклад эндотелиальных клеток в физиологическую барьерную функцию. Кроме того, условия статической культуры в этих моделях не воссоздают среду динамического потока плаценты in vivo, которая, влияет на клеточные фенотипы в плацентарном барьере.
Из патента CN 202003576 известно устройство для формирования модели плацентарного барьера in vitro со статическим размещением ростовой среды, представляющее собой корпус, в котором расположено, по меньшей мере, одно культуральное отверстие - ячейка, в которой размещены две мембраны из поликарбоната, одна из которых - нижняя, предназначена для слоя эндотелиальных клеток, вторая -верхняя, предназначена для формирования слоя трофобластов. Расстояние между мембранами составляет 3-5 мм для обеспечения возможности формирования двухслойной клеточной модели плаценты. Корпус снабжен крышкой. Отверстие для культивирования клеточной модели имеет цилиндрическую форму. Мембрана для эндотелиальных клеток представляет собой округлое чашеобразное тело, верхняя поверхность которого больше поверхности основания. Мембрана для трофобластов представляет собой цилиндрическое тело. Эндотелиальные клетки размещают на соответствующих мембранах с последующим культивированием до образования двухслойной клеточной модели с последующим изучением ее свойств.
Недостатками известного решения является большое количество зависимых элементов, требующих индивидуального исполнения. Кроме того, в устройстве используется две мембраны для двух типов клеток (трофобласта и эндотелия), которые располагаются на некотором расстоянии друг от друга, а между слоями клеток в процессе их культивирования присутствует компартмент с жидкой ростовой средой. Объем данного компартмента значительно больше, чем в условиях реальной плаценты, что создает условия для диффузии и разбавления транспортируемых веществ в ростовой среде и делает модель менее реалистичной. Кроме того, эндотелиальные клетки на нижней мембране обращены верхним (апикальным) краем к верхней мембране, на которой растут клетки трофобласта. При изучении транспорта различных веществ через данный барьер значимо увеличивается расстояние между клетками, а само вещество проходит оба слоя клеток в направлении от апикального к базальному концу клетки. В условиях организма транспорт веществ происходит от апикального к базальному краю клетки трофобласта и от базального к апикальному краю клетки эндотелия, что не отражено в предлагаемом устройстве. Кроме того, данное устройство не позволяет выполнить перенос клеток в микрофлюидное устройство для изучения влияния динамического потока ростовой среды на свойства клеток.
Из статьи Levkovitz R, Zaretsky U, Gordon Z, Jaffa AJ, Elad D. In vitro simulation of placental transport: part I. Biological model of the placental barrier. Placenta. 2013 Aug;34(8):699-707. doi: 10.1016/j.placenta.2013.03.014. Epub 2013 Jun 10. PubMed PMID: 23764139 (http://www.placentajournal.org/article/S0143-4004(13)00167-7/fulltext) известно устройство для создания двухслойной клеточной модели плацентарного барьера, представляющее собой специальную культуральную лунку для совместного культивирования двух типов клеток. Устройство включает цилиндрический держатель из поликарбоната и съемную амниотическую мембрану, размещаемую в держателе герметично с помощью уплотнительных колец. Эти лунки обеспечивают прямой контакт среды с культивируемыми клетками с обеих сторон мембраны, позволяют вращать лунки во время процедуры совместного культивирования клеток и могут быть разобраны для установки мембраны с культивируемыми клетками в проточной камере для дальнейших экспериментов.
Однако данный метод также имеет ряд недостатков. В качестве мембраны для высаживания клеток используется амниотическая мембрана, получаемая из зрелых человеческих плацент, что приводит к невозможности стандартизации разных серий экспериментов, поскольку мембраны могут отличаться составом. Также мембрана фиксируется в ячейке уникальной конструкции, что исключает возможность переноса мембраны из ячейки в устройства с динамическим потоком иной конструкции. Кроме того, конструкция ячейки со стороны клеток, имитирующих трофобласт, предполагает, что клетки либо наносятся в виде суспензии в капле среды, что приводит к упомянутым ранее проблемам, либо путем полного заполнения камеры ячейки, и тогда клетки контактируют не только с мембраной, но и с горизонтальными поверхностями ячейки, не предназначенными для роста клеток.
Наиболее близким к заявляемому является решение, представленное в US 5272083, касающееся культурального устройства, имеющего отделяемую поверхность роста клеток или тканей, и способа его использования. В одном из вариантов осуществления изобретения устройство состоит из культурального стакана и двух конических подвесок, выполненных с возможностью установки в стакане, и имеющих цилиндрическую нижнюю часть, предназначенную для закрепления клеточной ячейки с полупроницаемой мембраной. При этом конические подвески в процессе формирования двухслойной клеточной модели используют последовательно. Сначала клеточную ячейку с мембраной закрепляют на первой подвеске с последующим формированием первого монослоя клеток на одной стороне мембраны. После образования первого монослоя клеток ячейку отсоединяют от первой подвески, переворачивают и вставляют во вторую подвеску с возможностью формирования второго монослоя клеток на противоположной стороне мембраны, при этом первый монослой клеток обращен вниз, а второй клеточный слой будет формироваться на обращенной вверх стороне мембраны.
Недостатками известного решения является большое количество мелких элементов, требующих индивидуального исполнения. Кроме того, для выращивания клеточных слоев с двух сторон от мембраны необходимо отсоединение мелкого элемента с мембраной от опорного элемента и его переворачивание с повторным присоединением к опорному элементу. Это увеличивает риск повреждения сформированных слоев клеток и контаминации микроорганизмами, а также увеличивает затрачиваемое время при одновременной работе с несколькими мембранами. Кроме того, данное устройство не позволяет выполнить перенос клеток в микрофлюидное устройство для изучения влияния динамического потока ростовой среды на свойства клеток.
Раскрытие изобретения
Техническая проблема, решаемая настоящим изобретением, заключается в преодолении перечисленных выше недостатков посредством разработки устройства для формирования многослойной/двухслойной клеточной модели, которое обеспечивало бы высадку клеток на противоположных сторонах пористой мембраны из культурального пластика (вставки Трансвелл), их совместное культивирование до момента образования каждым типом клеток сплошного монослоя с последующим изучением сформированной клеточной модели in vitro, в т.ч. в динамическом режиме ростовой среды.
В частном варианте реализации изобретение позволяет создавать модель плаценты с последующим изучением ее фетоплацентарного барьера в статическом или динамическом режиме ростовой среды, возможностью оценки целостности барьера, образованного слоем клеток, имитирующих эндотелий, пористой мембраной из культурального пластика и слоем клеток, имитирующих трофобласт, а также изучением газового обмена в плаценте и др.
Техническим результатом изобретения является повышение технологичности как процесса формирования двухслойной клеточной модели при упрощении конструкции устройства и снижения риска повреждения сформированных слоев клеток и их контаминации микроорганизмами, так и процесса проведения последующих исследований сформированной клеточной модели за счет использования стандартных культуральных вставок Трансвелл. Технологичность процесса формирования двухслойной клеточной модели обеспечивается в т.ч. за счет исключения операций сбора/разбора устройства, необходимых для изменения положения мембраны для обеспечения процесса формирования первого и второго монослоев на противоположных сторонах мембраны.
2
5
8
2
Поставленная задача решается тем, что устройство для формирования, по меньшей мере, двухслойной клеточной модели на пористой мембране культуральной вставки (Трансвелла, Transwell), с размещением, по меньшей мере, одного слоя с внутренней стороны и, по меньшей мере, одного слоя с внешней стороны мембраны, включает пластину (плату), снабженную, по меньшей мере, одним сквозным отверстием, для герметичного размещения в нем Трансвелла с обеспечением выступа части Трансвелла за пределы поверхности пластины для возможности захвата Трансвелла при его извлечении из отверстия, при этом пластина выполнена толщиной, обеспечивающей возможность размещения мембраны Трансвелла внутри отверстия с разделением полости отверстия на две части - одна из которых предназначена непосредственно для размещения Трансвелла с возможностью формирования слоя клеточной модели на внутренней стороне мембраны (внутри Трансвелла), а вторая предназначена для размещения среды с клетками для формирования слоя клеточной модели на внешней стороне мембраны, при этом вторая часть полости имеет форму, исключающую выливание среды при переворачивании пластины для формирования слоя клеточной модели на внутренней стороне мембраны (внутри Трансвелла). В качестве культуральной вставки использован Трансвелл с пористой мембраной из культурального пластика с площадью от 0,143 до 4,67 см, диаметром пор от 0,4 до 8,0 мкм, плотностью пор от 1×10 до 1×10 пор на 1 см.
Пластина (плата) имеет толщину, не менее высоты Трансвелла. Трансвеллы в отверстии размещены на глубине, равной не менее половины высоты Трансвелла.
Для обеспечения герметичного размещения Трансвеллов отверстия имеют ступенчатое уменьшение диаметра со стороны установки Трансвелла по направлению к противоположной стороне пластины с, по меньшей мере, двумя ступенями, при этом вторая ступень, является опорной (упорной) поверхностью при размещении в отверстии Трансвелла, а первая ступень обеспечивает образование кольцевого зазора между внешней поверхностью Трансвелла и внутренней поверхностью соответствующей части отверстия, при этом высота кольцевого зазора выполнена от 2 мм до 8 мм, а ширина от 1 мм до 10 мм. Часть отверстия между первой и второй ступенями имеет диаметр, обеспечивающий плотную посадку нижней части Трансвелла, и протяженность, равную  высоты Трансвелла или меньше. Для обеспечения возможности центрирования Трансвелла в процессе его установки в отверстии пластины между ступенями в стенке отверстия выполнены протяженные выемки в форме полуцилиндров с размещением их осей параллельно оси отверстия. Количество выемок выполнено, по меньшей мере, три, которые расположены на равноудаленном расстоянии друг от друга. Выемки выполнены протяженностью (высотой) от  до  высоты Трансвелла.
Пластина выполнена из ПДМС, при этом устройство снабжено каркасом для пластины для обеспечения прочности устройства. Каркас может быть выполнен из полистирола, поликарбоната, металла или сплавов металлов. Каркас выполнен с возможностью размещения в емкости для выращивания клеточной модели, например, чашке Петри, и снабжен выемками для удобства захвата при размещении устройства в емкости.
Устройство может быть снабжено опорными элементами, размещенными на поверхности пластины со стороны установки Трансвелла и имеют высоту, превышающую высоту выступа Транвелла (исключающую касание торцов Трансвеллов с дном емкости при размещении в ней устройства для формирования клеточной модели).
Полость для размещения среды с клетками для формирования на внешней стороне мембраны слоя клеточной модели имеет форму цилиндра, переходящего в усеченный конус, или полусферы или другой каплевидной формы, и объем, равный не менее половины объема Трансвелла, при этом диаметр входного отверстия в данную полость составляет от 0,5 мм до 3,0 мм.
Устройство может быть снабжено цилиндрическими выемками, расположенными на поверхности пластины со стороны полости для размещения среды с клетками для формирования слоя клеточной модели на внешней стороне мембраны, при этом цилиндрические выемки выполнены сообщающимися с упомянутой полостью, и имеют глубину от 1 мм до 3 мм.
Предлагаемое устройство обладает рядом преимуществ перед аналогичными.
В устройстве могут использоваться любые стандартизованные типы Трансвеллов. Культуральные вставки Трансвелл производятся фирмой Corning и являются стандартизованными элементами для культивирования клеток на мембранах во многих научных исследованиях. Использование вставок Трансвелл в устройстве позволяет стандартизовать условия роста клеток, что обеспечивает воспроизводимость результатов и возможность перекрестного сравнения результатов различных исследователей;
Кроме того, изобретение позволяет масштабировать процесс с использованием в эксперименте от 3 и более вставок Трансвелл. Стандартные вставки Трансвелл в зависимости от площади мембраны компонуются на пластине в единую плашку по 6-96 вставок. Если в эксперименте необходимо использовать меньшее количество вставок, то для устройства подходят вставки Трансвелл, вырезанные из общей плашки, что позволяет использовать одну плашку для нескольких экспериментов;
Устройство является простым в использовании, требует минимум манипуляций для получения двухслойных клеточных моделей на противоположных сторонах мембраны. В известных способах для прикрепления клеток к внешней стороне мембраны вставку Трансвелл переворачивают дном вверх и клетки наносят на мембрану в виде суспензии в капле ростовой среды. После прикрепления клеток вставку необходимо отмыть и поместить дном вниз в подставку для Трансвеллов и заполнить ячейку подставки ростовой средой. В заявляемом устройстве нет необходимости в переносе Трансвелла в новую подставку, поскольку устройство можно перевернуть, и культуральная среда останется в ячейке под клетками, удерживаемая силами поверхностного натяжения.
Цилиндрическая форма ячейки для культуральной среды (отверстия в пластине), расположенной с внешней стороны от вставки Трансвелл, позволяет достичь более равномерного прикрепления клеток по всей площади мембраны, по сравнению с методом, согласно которому клетки наносят на мембрану в виде суспензии в капле ростовой среды.
Заявляемое устройство обеспечивает минимальный контакт оператора со стерильными поверхностями вставок Трансвелл. Использование вставки Трансвелл без предлагаемого устройства для выращивания не менее чем двух слоев клеток на разных сторонах мембраны требует последовательного переворачивания самой вставки, что увеличивает вероятность ее контакта с поверхностями вставки. При установке же в предлагаемое устройство Трансвелл оказывается плотно закрепленным в отверстии пластины и изолированным от соприкосновения с другими поверхностями, а переворачивание устройства осуществляется оператором посредством его контакта с корпусом (каркасом) устройства.
Кроме того, устройство можно повторно использовать для новой серии экспериментов после отмывки и стерилизации, заменив вставки Трансвелл на новые.
Устройство обеспечивает возможность извлечения Трансвеллов со сформированной на ее мембране клеточной моделью из устройства со статическим режимом ростовой среды с последующей установкой Трансвеллов с клетками в микрофлюидные устройства с динамическим течением ростовой среды.
Устройство можно комбинировать с другими устройствами для ручного или автоматического измерения целостности монослоя по трансэпителиальному электрическому сопротивлению (TEER), например, устройством EVOM, Teer.
Устройство можно устанавливать в стандартные внешние емкости для работы, например, в чашки Петри.
Заявляемое устройство является простым в изготовлении.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлен общий вид устройства с вырезанным фрагментом, обеспечивающим визуализацию его внутренней части; на фиг. 2 схематично представлен вид сверху на сквозное ступенчатое отверстие в пластине, предназначенное для размещения емкости с пористой мембранной вставкой (в частном варианте реализации может быть использована мембранная вставка Трансвелл, далее по тексту Трансвелл), на которую высаживают клетки для формирования клеточной модели; на фиг. 3 - продольный разрез части устройства в области размещения одного отверстия в пластине без Трансвелла, на котором показаны элементы, характеризующие внутреннюю поверхность отверстия; на фиг. 4 - продольный разрез части устройства в области размещения одного отверстия в пластине с установленным в отверстии Трансвеллом, показывающий пример расположения пористой мембраны Трансвелла в отверстии, делящей полость отверстия на две части; на фиг. 5 представлен вид сверху на устройство со стороны установки Трансвеллов в отверстиях пластины; на фиг. 6 - вид на устройство снизу со стороны выполненных в пластине входных отверстий для подачи среды для культивирования клеток (со стороны пластины, противоположной стороне установки Трансвеллов); на фиг. 7 и фиг. 9 представлены трехмерные виды устройства с разрезом в плоскости, проходящей через оси нескольких отверстий в платине (в вертикальной плоскости), где часть отверстий заполнены вставками Трансвелл; на фиг. 8 и фиг. 10 представлены разрезы устройства в плоскости, проходящей через оси нескольких отверстий в пластине (в вертикальной плоскости), где все отверстия пластины заполнены вставками Трансвелл, при этом на одной из вставок Трансвелл показан процесс заполнения ее средой с клетками или культуральной средой; на фиг. 11 и 12 представлены трехмерные виды комплекта, состоящего из чашки Петри и размещенного в ней заявляемого устройства с вырезанным фрагментом, обеспечивающим визуализацию внутренней части устройства, показывающие в графическом виде процесс посадки клеток на обе стороны мембраны Трансвелла.
Позициями на чертежах обозначены: 1 - пластина; 2 - сквозное ступенчатое отверстие в пластине 1; 3 - Трансвелл; 4 - емкость для установки в ней заявляемого устройства в процессе культивирования клеток на мембране Трансвелла (например, чашка Петри); 5 - мембрана Трансвелла; 6 - внутренняя сторона мембраны 5 Трансвелла 3; 7 - внешняя (наружная) сторона мембраны 5 Трансвелла 3; 8 - вход для подачи клеток/среды в полость, образованную сквозным ступенчатым отверстием 2 в пластине 1 со стороны, противоположной стороне размещения Трансвеллов 3; 9 - выемка, например, цилиндрическая выемка, в пластине со стороны, противоположной стороне размещения Трансвеллов 3, с образованием полости, сообщающейся с полостью ступенчатого отверстия 2 через вход 8; 10 - первая ступень внутренней полости ступенчатого отверстия пластины 1 (размещенная ближе к стороне пластины, предназначенной для размещения Трансвеллов); 11 - вторая ступень внутренней полости ступенчатого отверстия пластины 1; 12 - выемки со стороны внутренней поверхности ступенчатого отверстия 2; 13 - цилиндрическая поверхность первой ступени внутренней полости ступенчатого отверстия 2; 14 - цилиндрическая поверхность второй ступени внутренней полости ступенчатого отверстия 2; 15 - опорные элементы для установки заявляемого устройства в емкости 4 (например, чашке Петри), размещенные на стороне пластины, на которой размещены Трансвеллы; 16 - каркас для пластины 1; 17 - выемки со стороны боковой поверхности каркаса для удобства захвата заявляемого устройства при установке/извлечении из емкости 4; 18 - полость в сквозном ступенчатом отверстии, предназначенная непосредственно для размещения Трансвелла, с возможностью формирования слоя клеточной модели на внутренней стороне мембраны (внутри Трансвелла); 19 - полость в сквозном ступенчатом отверстии, предназначенная для размещения среды с клетками и формирования слоя клеточной модели на внешней стороне мембраны Трансвелла.
Осуществление изобретения
Для наилучшего понимания сущности заявляемого изобретения ниже представлен перечень терминов, используемых в настоящем описании.
«ПДМС» - Полидиметилсилоксан (ПДМС) - химическое соединение, линейный полимер диметилсилоксана, газопроницаемый эластичный органический материал, который может использоваться для изготовления различных изделий путем заливки в соответствующую оснастку (форму), последующего отверждения и извлечения из оснастки (формы).
«Клеточная модель» - клетки животного, в том числе человеческого, происхождения, выращиваемые (культивируемые) в условиях in vitro для изучения любых показателей жизнедеятельности клеток при созданных условиях культивирования.
«Пластина» - конструктивный элемент заявляемого устройства, предназначенный для плотной установки в нем емкостей типа Трансвелл, имеющий толщину, достаточную для установки в теле пластины указанной емкости. При выполнении пластины из ПДМС обеспечивается возможность плотного размещения в ее отверстиях Трансвеллов без использования отдельных герметизирующих элементов, а также данный материал позволяет равномерно заполнить полость литьевой формы в процессе изготовления пластины.
5
8
2
«Трансвелл» - емкость для выращивания клеток или клеточных моделей, которые используются в микрофлюидных устройствах при проведении исследований клеточных моделей. Трансвеллы имеют форму цилиндра или усеченного конуса, объем от 100±25 мкл до 1,5±0,15 мл, верхний диаметр от 4,26±0,50 мм до 24±0,5 мм, нижний диаметр от 4,26±0,50 мм до 24±0,5 мм, высоту от 6±0,5 мм до 20±0,5 мм, дно выполнено в виде пористой мембраны с диаметром пор от 0,4 до 8,0 мкм и плотностью пор от 1×10 до 1×10 пор на 1 см. Трансвеллы могут быть выполнены из полиэстера, поликарбоната или политетрафторэтилена. Из уровня техники известны Трансвеллы фирмы Corning Inc. В материалах настоящего изобретения Трансвелл указан как частный случай использования емкости с пористой мембраной для формирования на ней клеточной модели, например, модели плаценты.
«Мембрана» - пористая пластина для культивирования клеточных сред, структур, тканей.
«Каркас» - внутренняя и/или наружная несущая конструкция, способная обеспечивать прочность и устойчивость размещенного в нем объекта - в заявляемом решении пластины, например, из ПДМС.
«Емкость» - сосуд, чаша, контейнер или резервуар или любое другое устройство, выполненное с возможностью размещения в нем заявляемого устройства с клетками и культуральной средой. Для осуществления процесса культивирования до формирования клеточной модели и последующего изучения полученной модели.
«Культуральная среда» - жидкость или гель сложного состава, предназначенные для поддержания роста микроорганизмов, клеток животных или человека.
Остальным терминам и выражениям придается обычное для своего контекста значение, известное специалистам в данной сфере. Однако настоящее изобретение не следует ограничивать выбранной специальной терминологией. Специалисты в соответствующей области должны понимать, что можно использовать и другие термины, равно как и другие известные из уровня техники средства и методы для реализации изобретения.
Ниже представлено более подробное описание заявляемого изобретения, которое наглядно демонстрирует возможность создания модели плаценты посредством формирования на одной стороне пористой мембраны из культурального пластика (например, Трансвелла) слоя клеток, имитирующего эндотелий, на противоположной стороне мембраны - слоя клеток, имитирующих трофобласт. При этом представленный пример не ограничивает настоящее изобретение созданием только модели плаценты, а лишь демонстрирует возможность его осуществления. С помощью заявляемой конструкции также можно получать любые клеточные модели, включая модель кишечника, кожи, печени, сердца, кровеносного и лимфатического сосуда, мозга, лимфатического узла, глаза, но не ограничиваясь указанными вариантами.
2
2
Устройство для формирования многослойной, в частном варианте осуществления - двухслойной, клеточной модели на пористой мембране культуральной вставки (Трансвелла, Transwell), выполнено в виде пластины 1 (платы) из ПДМС, снабженной сквозными ступенчатыми отверстиями 2, выполненными с возможностью плотного и герметичного размещения в них Трансвеллов 3. Пластина 1 выполнена толщиной не менее высоты Трансвелла 3, при этом поверхность ступенчатого отверстия имеет профиль, позволяющий размещать Трансвеллы 3 таким образом, чтобы, нижняя часть Трансвелла была расположена внутри пластины, а верхняя часть Трансвелла выступала над поверхностью пластины, при этом под мембраной Трансвелла в пластине оставалась полость, которая бы обеспечивала возможность размещения в ней среды для формирования с внешней стороны мембраны Трансвелла слоя клеточной модели (фиг. 1, фиг. 11, фиг. 12). При этом выступ над поверхностью пластины 1 имеет величину Y, обеспечивающую удобство захвата Трансвелла 3 при его извлечении из отверстия 2 (фиг. 4). Мембрана 5 Трансвелла имеет внутреннюю сторону 6, и внешнюю сторону 7, обращенную к входному отверстию 8 (фиг. 4). В конкретном варианте реализации устройства был использован Трансвелл с пористой мембраной из культурального пластика с площадью от 0,143 до 4,67 см, диаметром пор от 0,4 до 8,0 мкм, плотностью пор от 1×105 до 1×108 пор на 1 см.
Пластина 1 может содержать любое необходимое для исследований количество отверстий 2 для установки Трансвеллов 3 с мембраной 5. В представленных на фигурах примерах реализации изобретения пластина содержит восемь отверстий 2.
Сквозные отверстия 2 имеют ступенчатое уменьшение диаметра в направлении от стороны установки Трансвелла 3 в пластину 1 к противоположной стороне пластины. При этом для обеспечения технологичности процесса производства заявляемого устройства профиль ступенчатого отверстия имеет, по меньшей мере, три части, где первая часть представляет собой цилиндр большего диаметра (поз. 13 на фиг. 3, 4), вторая часть -цилиндр меньшего диаметра (поз. 14 на фиг. 3, 4), третья часть может иметь различную форму внутренней поверхности, обеспечивающую ее функциональное назначение - возможность формировать слой клеточной модели на внешней стороне 7 мембраны 5 Трансвелла 3. Таким образом, первая ступень 10 образована при сопряжении первой части отверстия со второй, вторая ступень 11 - при сопряжении второй части отверстия 2 с третьей частью. Внутренняя поверхность последней части имеет форму, исключающую выливание среды при переворачивании пластины 1 в процессе формирования слоя клеточной модели на внешней стороне 7 мембраны Трансвелла. При этом в одном из вариантов осуществления изобретения с целью упрощения технологического процесса формирования упомянутых отверстий 2 форма внутренней поверхности данной части отверстия (полость 19) может представлять собой цилиндр, переходящий в усеченный конус, имеющий отверстие диаметром от 0,5 мм до 3,0 мм, служащее входом 8 для подачи клеток/среды в полость 19. Такая конфигурация третьей части отверстия 2 исключает выливание среды через отверстие, являющееся входом 8 при переворачивании пластины 1. Объем третьей части отверстия может быть равен или быть меньше, чем половина объема Трансвелла 3. Отверстие 8, в свою очередь, выполнено сопряженным с цилиндрической выемкой 9, предназначенной для сбора среды случайно не попавшей через вход 8 в полость 19 отверстия 2.
В одном из вариантов осуществления изобретения первая цилиндрическая часть отверстия может иметь высоту (глубину) от 1 мм до 3 мм (примерно 1/3 от высоты Трансвелла 3), и диаметр больше наружного диаметра Трансвелла, для обеспечения образования зазора X между внутренней поверхностью данной цилиндрической части и наружной поверхностью Трансвелла 3 (Фиг. 4). Величина зазора определяется исходя из наливаемого объема среды в Трансвелл 3. Внутренняя поверхность 14 второй цилиндрической части отверстия 2 является упорной для Трансвелла 3, а ступень 11 является опорной поверхностью для торца Трансвелла 3 при его размещении в отверстии 2. Таким образом, вторая часть отверстия 2 (между первой 10 и второй 11 ступенями) имеет диаметр, обеспечивающий плотную посадку Трансвелла 3, и протяженность (высоту), равную  высоты Трансвелла 3.
Для обеспечения возможности центрирования Трансвелла 3 в процессе его установки в отверстие 2 пластины 1, между ступенями 10 и 11 в стенке второй части отверстия 2 выполнены протяженные выемки 12, например, в форме полуцилиндров с размещением их осей параллельно оси отверстия 2 на равноудаленном расстоянии друг от друга. Количество выемок может варьироваться - от трех и более, а их протяженность (высота) составляет от  до  высоты Трансвелла 3 (Фиг. 2, 3). Данные выемки 12 и геометрия отверстия второй части отверстия облегчают установку Трансвелла 3 в отверстие 2, что позволяет избежать деформации Трансвелла 3, а также обеспечивают плотную фиксацию Трансвелла 3 в отверстии 2 за счет плотного контакта части боковой поверхности Трансвелла с соответствующим участком цилиндрической части отверстия 2.
Таким образом, первая и вторая части отверстия 2 предназначены непосредственно для размещения Трансвелла 3, на мембрану которого с внутренней стороны 6 высаживают один тип клеток для формирования модели плаценты, а третья часть отверстия предназначена для культивирования второго типа клеток, которые высаживают на внешнюю сторону 7 мембраны 5.
Также, пластина 1 снабжена опорными элементами 13, размещенными на ее поверхности со стороны установки Трансвелла 3, которые имеют высоту, превышающую высоту выступа Y Транвелла 3 (Фиг. 3, Фиг. 4), и исключающую касание торцов Трансвелла 3 с дном емкости 4 (например, чашкой Петри) при размещении в ней устройства. Опорные элементы 13 могут являться частью пластины 1 (вариант выполнения пластины с опорными элементами в виде единой детали) или быть выполнены в виде отдельных элементов, фиксируемых на поверхности пластины.
В конкретном варианте осуществления изобретения пластина 1 выполнена из ПДМС, достаточно эластичного материала, поэтому для придания жесткости и прочности пластина 1 снабжена каркасом 14, который может быть выполнен из полистирола, поликарбоната, металла или сплавов. Форма каркаса 14 обеспечивает возможность его размещения в емкости для выращивания клеточной модели, например, в чашке Петри. Каркас имеет выемки 15 для удобства захвата устройства при его размещении в емкости.
Ниже представлено описание технологии изготовления заявляемого устройства.
Пластину для размещения Трансвеллов изготавливают из полидиметилсилоксана (ПДМС). Формирование рельефа пластины из ПДМС может производиться любыми известными из уровня техники способами, например, с помощью фотолитографи, метода лазерной абляции, «мягкой» литографии (микропечати), горячей штамповки микрошаблона и другими. Кроме того, могут использоваться различные комбинации методов.
Предпочтительным является изготовление пластины с использованием двух литьевых форм. В одном из вариантов осуществления пластина из ПДМС может быть изготовлена с помощью оснастки, которая содержит основу (корпус) в виде объемной детали из двух частей, снабженной, по меньшей мере, одним отверстием для заливки формовочного материала, при этом обе части оснастки выполнены с конструктивными элементами, обеспечивающими возможность формирования в пластине из ПДМС отверстий и пазов требуемой формы. Полость оснастки через отверстие для заливки заполняют жидким формовочным материалом (ПДМС). Каркас 16 (фиг. 1), который предварительно размещают в оснастке, и который обеспечивает жесткость и прочность конструкции, предпочтительно выполняют из оптически прозрачного материала (полистирола, поликарбоната) и изготавливают путем фрезерной обработки. Возможны и другие известные из уровня техники варианты формирования пластины и каркаса. После чего полученную пластину комплектуют культуральными вставками Трансвелл и емкостью с крышкой, например, чашкой Петри.
Ниже представлено описание использования заявляемого устройства для моделирования плаценты in vitro на основе сокультивирования клеточных линий.
Устройство перед использованием находится в стерильном состоянии в емкости, например в чашке Петри. При этом устройство размещают в чашке Петри таким образом, чтобы опорные элементы 15 оказались на дне чашки (фиг. 10, фиг. 12). Через входы 8 вводят среду (клетки) для размещения на наружной стороне 7 мембраны 5. Если необходимо, делают выдержку по времени перед дальнейшими манипуляциями, при этом можно закрыть крышку чашки Петри. Чтобы ввести среду (клетки) в Трансвеллы 3 на внутреннюю сторону 6 мембраны 5, необходимо перевернуть каркас 16 на 180 градусов (фиг. 8). Для удобного выполнения этой процедуры предназначены выемки 17 каркаса 16 (фиг. 1). После введения клеточных сред на стороны мембраны 5 закрывают крышку чашки Петри.
В зависимости от целей исследования, такие манипуляции по вводу сред на различные стороны мембран 5 Трансвеллов 3 можно повторять, формируя многослойные структуры на мембранах.
Способ получения модели плаценты состоит из этапов, которые включают: посев клеток, имитирующих эндотелий, на одну из сторон пористой мембраны из культурального пластика в ростовой среде для эндотелиальных клеток до момента адгезии клеток; посев клеток, имитирующих трофобласт, на противоположную сторону мембраны в ростовой среде для клеток трофобласта до момента адгезии клеток; совместное культивирование клеток, имитирующих трофобласт, и клеток, имитирующих эндотелий, до момента образования каждым типом клеток сплошного монослоя; оценку целостности барьера, образованного слоем клеток, имитирующих эндотелий, пористой мембраной из культурального пластика и слоем клеток, имитирующих трофобласт.
Пример конкретного выполнения.
2
6
2
Было изготовлено устройство для моделирования плаценты in vitro на основе сокультивирования клеточных линий, представляющее собой пластину из ПДМС, размещенную в каркасе из поликарбоната (см. фиг. 1). Устройство характеризовалось следующими параметрами: диаметр 87 мм высота 15.5 мм, количество отверстий для размещения Трансвеллов 8 шт., параметры отверстия пластины соответствовали геометрии Трансвеллов 96-луночного культурального планшета. В устройстве были использованы Трансвеллы производства компании Corning Inc с площадью поверхности мембраны 0,143 см, диаметром пор 1,0 мкм, плотностью пор 1,6×10 пор на 1 см;
Для получения модели плаценты клетки, имитирующие эндотелий, высевали на внешнюю поверхность мембраны культуральной вставки Трансвелл до момента адгезии, а затем клетки, имитирующие трофобласт, высевали на внутреннюю поверхность мембраны культуральной вставки Трансвелл. В вариантах осуществления изобретения пористую мембрану из культурального пластика перед высеванием клеток покрывали с одной или обеих сторон внеклеточным матриксом. В качестве внеклеточного матрикса использовали коллаген, ламинин, фибронектин, витронектин, желатин или комбинацию указанных компонентов.
2
При проведении исследований в качестве клеток, имитирующих эндотелий, использовали первичные эндотелиальные клетки пупочной вены человека (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC), эндотелиальные клетки сосудов плаценты человека (Human Placental Vascular Endothelial Cells, HPVEC). В качестве клеток, имитирующих трофобласт, использовали клетки хориокарциномы клеточных линий BeWo, BeWo b30, JAR или Jeg-3, а также первичные клетки трофобласта. При этом клетки, имитирующие эндотелий и трофобласт, высевали в виде суспензии в ростовой среде для эндотелиальных клеток из расчета от 20000 до 250000 клеток на 1 см поверхности пористой мембраны из культурального пластика.
В качестве ростовой среды для клеток эндотелия в случае клеток HUVEC использовали смесь, содержащую культуральную среду 199,8±4 ммоль/л L-глутамина, 25±2 мМ HEPES, 1±0,5% смеси пенициллина и стрептомицина в соотношении от 1:2 до 2:1, 1±0,5 мМ пирувата натрия, от 10 до 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 5±1 ЕД/мл гепарина и 100±10 мкг/мл добавки для роста эндотелиальных клеток (Endothelial Cell Growth Supplement, ECGS). В качестве ростовой среды для клеток трофобласта в случае линии Jeg-3 использовали смесь, содержащую культуральную среду DMEM, от 10 до 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 100±10 мкг/мл стрептомицина, 100±10 Ед/мл пенициллина, 2±1 ммоль/л L-глутамина, 1,0±0,5% заменимых аминокислот, 10±1 мМ пирувата натрия. В качестве ростовой среды для клеток трофобласта в случае линий BeWo и BeWo b30 использовали смесь, содержащую культуральную среду DMEM/F-12K, от 10 до 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 1,0±0,5% L-глутамина, 1±0,5% смеси пенициллина и стрептомицина в соотношении от 1:2 до 2:1.
Культуральные вставки Трансвелл после адгезии клеток, имитирующих трофобласт, и клеток, имитирующих эндотелий, помещали в культуральный планшет для вставок Трансвелл, ячейки которого заполняли ростовой средой для эндотелиальных клеток, а сама вставка Трансвелл заполнялась средой для клеток трофобласта. Культуральные вставки Трансвелл после адгезии клеток, имитирующих трофобласт, и клеток, имитирующих эндотелий, помещали в микрофлюидное устройство, заполненное ростовой средой для эндотелиальных клеток, а сама вставка Трансвелл заполнялась средой для клеток трофобласта.
Оценку целостности барьера, образованного слоем клеток, имитирующих эндотелий, пористой мембраной из культурального пластика и слоем клеток, имитирующих трофобласт, проводили по полученным результатам измерения трансэпителиального электрического сопротивления (Transepithelial Electrical Resistance, TEER).
В результате были получены модели плаценты в культуральном планшете для вставок Трансвелл и в микрофлюидном устройстве, образующие состоятельный клеточный барьер, что было подтверждено измерением значений TEER. Среднее значение TEER (стандартное отклонение) составило 3783 (142) Ом для модели плаценты в культуральном планшете для вставок Трансвелл и 3810 (166) Ом для модели плаценты в микрофлюидном устройстве, что подтверждает образование состоятельного сплошного клеточного барьера, который позволит использовать его при изучении проницаемости барьера для различных веществ. Полученные модели плаценты могут быть использованы в медицине для изучения газового обмена в плаценте, задержки роста плода, преэклампсии, дифференцировки трофобласта, влияния напряжения сдвига при движении среды на эндотелий и трофобласт, гормональной активности трофобласта, транспорта препаратов через фетоплацентарный барьер и их метаболизма, работы транспортеров органических анионов и катионов, моноаминов, монокарбоксилатов, нуклеотидов, углеводов, аминокислот, витаминов, взаимодействия фетоплацентарного барьера и вирусов и для других целей.