СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ ПЛАЦЕНТАРНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ
METHOD FOR PREDICTION OF PLACENTAL INSUFFICIENCY DEVELOPMENT

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к клинико-лабораторной диагностике в области определения полиморфизмов ДНК, и может быть использовано для прогнозирования развития плацентарной недостаточности (ПН), на раннем сроке беременности (с 8-й акушерской недели гестации).
Уровень техники
Плацентарная недостаточность (ПН) - это синдром, обусловленный морфофункциональными изменениями в плаценте, при прогрессировании которых развивается задержка роста плода (ЗРП), нередко сочетающаяся с внутриутробной гипоксией. ПН является наиболее частой причиной нарушений состояния плода во время беременности и обуславливает невынашивание беременности в 50-77% случаев [Акушерство: национальное руководство / под ред. Э.К. Айламазяна, В.И. Кулакова, В.Е. Радзинского, Г.М. Савельевой. - М: ГЭОТАР-Медиа, 2014].
В условиях принятия мер, направленных на улучшение репродуктивного здоровья населения, за последнее время существенно уменьшилась доля ПН инфекционного генеза, а также ПН, обусловленной существованием у матери экстрагенитальных заболеваний. При этом относительно стабильным остается процент первичной ПН, в основе которой лежат идиопатические нарушения формирования плаценты: недостаточная инвазия цитотрофобласта, неполная перестройка спиральных артерий, нарушение созревания ворсинчатого дерева и сосудистого русла ворсин. Особенностью данного типа ПН также является то, что вышеупомянутые изменения происходят задолго до момента клинической манифестации синдрома. В связи с этим необходим поиск новых диагностических подходов, направленных на выявление эндогенных факторов риска ПН и способных прогнозировать перинатальный исход еще на ее ранних сроках, что позволит своевременно выбрать верную акушерскую тактику.
Из уровня техники известны способы прогнозирования развития ПН путем определения у матери SNP генов, кодирующих белки системы гемостаза, белки-участники антиоксидантных систем, ангиогенные факторы, белки, задействованные в регуляции артериального давления.
Так, полиморфизм гена VEGFA (ключевого белка ангиогенеза с множественными биологическими эффектами) неоднократно служил предметом исследования в работах, посвященных акушерской патологии. В частности, оценивалась связь мутаций G(-l 154)А, С(-2578)А, С(-936)Т, G(-634)C с привычным невынашиванием беременности (включая ранние и поздние выкидыши), гестозом [Song G. G., Kim J. Н., Lee Y. H. Associations between vascular endothelial growth factor gene polymorphisms and pre-eclampsia susceptibility: a meta-analysis //Immunological investigations. - 2013. - Vol. 42(8). P. 749-762].
Существует альтернативная гипотеза, согласно которой расстройства кровообращения в системе мать-плацента-плод, такие как стаз, тромбоз и инфаркт, возникающие вследствие аномалий реологии крови, являются ключевыми причинами, приводящими к ПН [Макацария А.Д., Бицадзе В.О., Акинынина С.В. Применение низкомолекулярного гепарина в акушерской, гинекологической и онкологической практике // Consilium Medicum. - 2005. - №07. - URL: http://con-med.ru/magazines/consilium_medicum/consilium_medicum-07-2005/primenenie_nizkomolekulyarnogo_geparina_v_akusherskoy_ginekologicheskoy_i_onkolo gicheskoy_praktike/ (дата обращения: 20.10. 2014)]. К наследственным аномалиям компонентов системы гемостаза, рассматривающимся в качестве этиологического фактора осложнений беременности, обусловленных ПН, относятся FVLeiden мутация, полиморфизм 20210G>A гена протромбина, полиморфизмы генов системы метаболизма фолата и метионина, G(-455)A гена фибриногена, 4G/5G гена PAI-1 а также их сочетания [Abou-Nassar К., Carrier М., Ramsay Т., Rodger М. A. The association between antiphospholipid antibodies and placenta mediated complications: a systematic review and metaanalysis // Thromb Res. - 2011. - T. 128, №1. - C. 77-85; Pattison N. S., Chamley L. W., Birdsall M., Zanderigo A. M., Liddell H. S., McDougall J. Does aspirin have a role in improving pregnancy outcome for women with the antiphospholipid syndrome? A randomized controlled trial // Am J Obstet Gynecol. - 2000. - T. 183, №4. - C. 1008-1012].
Несмотря на большое количество исследований, единого мнения о вышеперечисленных SNP как о факторе риска развития ПН нет. Во-первых, в условиях низкой распространенности данных мутаций в популяции, изолированное исследование неблагоприятных перинатальных исходов, обусловленных ПН (а не невынашивания беременности в целом), является затруднительным. Во-вторых, большинство результатов, в том числе полученных при мета-анализе, как правило, значимы на уровне статистической тенденции. Этим, а также низким уровнем доказательности самих исследований и высокой стоимостью поиска генетических вариантов, объясняется отсутствие в современных отечественных и зарубежных рекомендациях обязательного обследования на носительство врожденных дефектов системы гемостаза женщин с клиническими проявлениями ПН в анамнезе (ЗРП, преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты, острая и хроническая гипоксия плода).
Наиболее вероятно, что гиперкоагуляция, повышение тонуса сосудистой стенки, усиление оксидативного стресса, являются вторичными по отношению к аномалии дифференциации трофобласта и патологической плацентации, в формировании которой задействованы как материнский, так и плодовый компоненты системы.
Подтверждением данного факта являются результаты ряда близнецовых исследований, в которых было выявлено, что, наряду с конкордантностью, ПН обладает и дискордантностью: то есть значимое влияние оказывает не только генотип матери, но и генотип плода. Этому соответствует и то, что по результатам многолетних исследований, прогностическая значимость не была доказана ни для одного из вышеупомянутых маркеров матери [Williams P. J., Pipkin F. В. The genetics of pre-eclampsia and other hypertensive disorders of pregnancy //Best practice & research Clinical obstetrics & gynaecology. - 2011. - T. 25. - №. 4. - C. 405-417].
Таким образом, основным недостатком уже существующих методов прогнозирования развития ПН является отсутствие учета влияния генотипа плода. Генотипирование плода в целях прогнозирования развития ПН было впервые использовано в заявляемом способе и не имеет близких по содержанию аналогов. Разработанный способ является безопасным и быстрым, позволяет определить акушерскую тактику уже на 8-й неделе беременности. Известные ранее способы исследования генома плода относятся к методам инвазивной пренатальной диагностики (биопсия хориона, амниоцентез, кордоцентез), т.е. повышают риск прерывания беременности, либо они подразумевают использование секвенирования нового поколения, что значительно увеличивает стоимость и трудоемкость проведения исследования.
Также большинство вышеуказанных генетических предикторов не задействованы на всех этапах патогенеза ПН, в отличие от урокиназного активатора плазминогена (син. -урокиназа) [Роль системы урокиназного активатора плазминогена в развитии плаценты и патогенезе плацентарной недостаточности / Д.Б. Лозинская, А.В. Балацкий, Е.Б. Ларина и др. // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2017. - Т. 16, №3. - С. 61-67.].
Актуальность изобретения состоит в том, что прогностическая значимость для генетических полиморфизмов плода, а именно полиморфизмов гена урокиназы, впервые была доказана в рамках системной концепции, когда ПН является патологией, вклад в формирование которой вносится и материнским и плодовым генетическим компонентом.
Раскрытие изобретения
Техническая проблема, решаемая посредством заявляемого изобретения, заключается в устранении недостатков, таких как отсутствие учета влияния генотипа плода и участие в отдельных звеньях патогенеза ПН. Техническая проблема реализуется за счет создания способа прогнозирования развития ПН при помощи определения генотипа плода по полиморфизму гена урокиназы rs4065 (С/Т), обеспечивающего высокий уровень статистической достоверности.
Техническая проблема решается способом прогнозирования развития плацентарной недостаточности, включающим проведение исследование плазмы крови беременной женщины, выделение из нее внеклеточной ДНК с последующим определением генотипа плода по rs4065 гена PLAU; при выявлении генотипа СС у плода беременную женщину относят к группе риска развития ПН.
Проблема также решается способом прогнозирования плацентарной недостаточности по фетальной ДНК в крови матери, включающим:
- выделение ДНК из плазмы крови беременной женщины с получением трех аликвот;
- проведение цифровой ПЦР аликвоты №3 с количественным определением аллелей (по SNP) гена PLAU rs4065 и расчетом их соотношения;
- при отсутствии аллеля Т делают вывод о наличии у плода и матери генотипа СС;
- при получении отношения числа аллелей С и Т более 1 делают вывод о наличии у матери генотипа СТ или СС, а у плода генотипа СС или СТ соответственно;
- при получении отношения числа аллелей С и Т, равного 1 делают вывод о наличии у плода и матери генотипа СТ;
- при отсутствии аллеля С делают вывод о наличии у плода и матери генотипа ТТ;
- при получении отношения числа аллелей С и Т менее 1 делают вывод о наличии у матери генотипа СТ или ТТ, а у плода генотипа ТТ или СТ соответственно;
- определение фракции фетальной ДНК по результатам цифровой ПЦР аликвоты
№3;
- при этом аликвоты №1 и №2 используют для верификации полученных результатов, для этого:
- из аликвоты №1 удаляют материнскую ДНК путем обработки эндонуклеазой рестрикции, чувствительной к метилированию;
- проводят цифровую ПЦР аликвот №1 и №2 с определением числа копий гена RASSF1A,
- определяют фракцию фетальной ДНК по соотношению чисел копий гена RASSF1 А, полученных в результате измерений в аликвотах №1 и №2.
- если расхождение между значениями фракции фетальной ДНК, вычисленными по результатам измерений аликвоты №3 и аликвот №1 и №2 не превышает 10% от большего значения, результаты измерений по пункту 2 считают достоверными.
Проблема решается также тест-системой, предназначенной для реализации заявляемого способа, включающей праймеры и зонды, специфичные к полиморфизму rs4065 гена PLAU.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлены результаты ПЦР в реальном времени по гену АСТВ для подтверждения полноты рестрикции (пример 1).
На фиг. 2 представлены результаты цифровой ПЦР чипа №1.1 по гену RASSF1A (пример 1).
На фиг. 3 представлены результаты цифровой ПЦР чипа №2.1 по гену RASSF1A (пример 1).
На фиг. 4 показаны результаты цифровой ПЦР чипа №3.1 по полиморфизму гена PLAU rs4065 (пример 1).
На фиг. 5 представлены результаты ПЦР в реальном времени по гену АСТВ для подтверждения полноты рестрикции (пример 2).
На фиг. 6 показаны результаты цифровой ПЦР чипа №1.1 по гену RASSF1A (пример 2). Пациентка С.
На фиг. 7 показаны результаты цифровой ПЦР чипа №2.1 по гену RASSF1A (пример 2).
На фиг. 8 показаны результаты цифровой ПЦР чипа №3.1 по полиморфизму гена PLAU rs4065 (пример 2).
На фиг. 9 представлены результаты ПЦР в реальном времени по гену АСТВ для подтверждения полноты рестрикции (пример 3).
На фиг. 10 показаны результаты цифровой ПЦР чипа №1.1 по гену RASSF1A (пример 3).
На фиг. 11 показаны результаты цифровой ПЦР чипа №2.1 по гену RASSF1A (пример 3).
На фиг. 12 показаны результаты цифровой ПЦР чипа №3.1 по полиморфизму гена PLAU rs4065 (пример 3).
Осуществление изобретения
Проведенный анализ связи данных генотипирования с клиническим исходом у 223 человек (44 пациентки с ПН, 101 пациентка без ПН, 56 новорожденных детей пациенток с ПН, 23 новорожденных детей пациенток без ПН, из них комбинаций "мать-новорожденный" для одного клинического наблюдения - 20 в группе с ПН и 19 в группе без ПН, в остальных случаях каждому клиническому наблюдению соответствовало молекулярно-генетическое исследование только материнской составляющей системы или только плодовой) показал, что
1. Среди новорожденных, чей антенатальный период был осложнен плацентарной недостаточностью достоверно реже встречается генотип СТ- ТТ гена PLAU (69,1% vs. 95,7%, р=0,0046).
2. При учете как материнского, так и плодового генотипа, свое прогностическое значение сохраняет наличие у плода протективного генотипа ТТ rs4065 гена PLAU, тогда как ассоциация с развитием плацентарной недостаточности материнских полиморфизмов теряется.
Таким образом, была обоснована антенатальная оценка генотипа плода по полиморфизму rs4065 гена PLAU как способ прогнозирования ПН.
Заявляемый способ прогнозирования развития плацентарной недостаточности включает:
- получение образца периферической крови беременной женщины;
- выделения плазмы крови из образца путем центрифугирования образца крови;
- выделение ДНК из плазмы крови с получением раствора с выделенной ДНК;
- отбор аликвоты №1 из полученного раствора с проведением рестрикции эндонуклеазой, чувствительной к метилированию;
- проведение ПЦР в реальном времени пробы из аликвоты №1, обработанной эндонуклеазой, гена АСТВ для подтверждения успешной рестрикции;
- проведение цифровой ПЦР:
1) аликвоты №1, обработанной эндонуклеазой, гена RASSF1 А;
2) аликвоты №2 из исходного раствора с выделенной ДНК гена RASSF1 А;
3) аликвоты №3 из исходного раствора с выделенной ДНК по полиморфизму гена PLAU rs4065;
- подсчет фракции фетальной ДНК путем деления концентрации ДНК, полученной при цифровой ПЦР аликвоты №1 с поправкой на добавленный объем жидкости при проведении рестрикции, на концентрацию ДНК, полученную в результате цифровой ПЦР аликвоты №2, по формуле:
R
2
R
1
2
F=k*C,/C, где F - фракция фетальной ДНК, определенная по гену RASSF1A; C - концентрация ДНК в аликвоте №1, к - поправка на добавленный объем жидкости при рестрикции; С - концентрация ДНК в аликвоте №2;
- анализ данных цифровой ПЦР аликвоты №3:
1) в случае, если при анализе не обнаружено сигнала от аллеля Т, то считают, что генотип матери и плода - СС, пациента относят к группе риска развития плацентарной недостаточности;
2) в случае, если обнаружены сигналы от аллелей С и Т, то необходимо воспользоваться формулой:
P
c
т
c
т
F=(C-C)/(C+C),
P
с
т
где F - фракция фетальной ДНК, определенная по полиморфизму гена PLAU rs4065; С - концентрация аллеля С; С - концентрация аллеля Т;
Р
R
P
R
при схождении значений F и F (разница между результатами не превышает 10% от большего значения; 10% является инструментальной погрешностью при проведении цифровой ПЦР на чипах) считают, что генотип матери - СТ, а плода - СС, пациента относят к группе риска развития плацентарной недостаточности (нужно отметить, что F не всегда отражает истинную фракцию, в тех случаях, когда фракции не сходятся, истинной фракцией является именно значение F);
3) во всех остальных случаях пациентку не относят к группе риска развития плацентарной недостаточности.
Процесс центрифугирования проводят в условиях достаточных для осаждения форменных элементов крови и получения плазмы. Предпочтительно проводить центрифугирование в течение 10 минут при 3000 g со средней скоростью разгона и низкой скоростью торможения; не рекомендуется отбирать нижний слой плазмы (10% от общего объема плазмы у дна пробирки).
Выделение ДНК из плазмы крови осуществляют с использованием набора реагентов, обеспечивающих полное выделение генетического материала из образца и предназначенным для выделения внеклеточной ДНК из плазмы.
Предпочтительно для проведения рестрикции использовать эндонуклеазу BstFN I, продолжительность рестрикции необходимо рассчитать, исходя из предполагаемой концентрации ДНК в растворе и активности фермента, указанной производителем.
Проведение цифровой ПЦР рекомендуется производить в соответствии с рекомендациями производителя оборудования для проведения цифровой ПЦР и с использованием реагентов, подходящих для данного оборудования, используемого для проведения цифровой ПЦР, например, из набора QuantStudio™ 3D Digital PCR 20К Chip Kit v2 (Thermo Fisher Scientific, США) с применением аллель-специфичных
гидролизуемых зондов.
Ниже приведены последовательности праймеров и зондов:
PLAU_F: 5'-TGGTTGTCATTTTTGCAGTAGAGTC-3'
PLAU_R: 5'-GGCCTATGCCTGAGGGTAAAG-3'
PLAU_prC: 5'-ROX-AAGCTATTGTCGTTCGCCCTGGTGG-BHQ2-3'
PLAU_prT: 5'-Cy5-AAGCTATTGTCGTTCACCCTGGTGGG-BHQ3-3'
Тест-система, предназначенная для прогнозирования развития плацентарной недостаточности, включает праймеры и зонды, специфичные к полиморфизму rs4065 гена PLAU. Указанные праймеры и зонды могут быть добавлены в реакционную смесь для проведения цифровой ПЦР.
Ниже представлен вариант осуществления заявляемого способа, которое не ограничивает объем притязаний заявляемого изобретения, а демонстрирует возможность осуществления изобретения с достижением заявляемого технического результата.
1) Забор 5 мл крови у пациента в пробирку, содержащую ЭДТА для предотвращения коагуляции. Пробирку с кровью необходимо хранить при температуре 4°С не более чем 4 часа до осуществления дальнейших операций для предотвращения потерь генетического материала вследствие действия нуклеаз плазмы.
2) Пробирку с кровью центрифугировали в течение 10 минут при 3000g со средней скоростью разгона и низкой скоростью торможения.
3) По завершении центрифугирования отбирали 2 мл плазмы в отдельную пробирку, при этом избегали забора из нижнего слоя плазмы.

4) Выделяли внеклеточную ДНК из плазмы при помощи набора QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкцией.

™
™
В одном из вариантов осуществления данного этапа в пробирку на 15 мл вносили пипеткой 200 мкл QIAGEN Протеиназы К, затем в эту же пробирку вносили 2 мл плазмы из исследуемого образца. Отдельно готовили carrier РНК в ACL буфере. Для этого в отдельную пробирку вносили 1,8 мл буфера ACL и 5,6 мкл carrier РНК, предварительно растворенную в AVE буфере в соответствии с указаниями на упаковке и перемешивали на вортексе в течение 30 с. В исходную пробирку на 15 мл, содержащую исследуемую плазму и QIAGEN Протеиназу К, вносили 1,6 мл carrier РНК в ACL буфере. Пробирку с полученной смесью закрывали крышкой и перемешивали вортексированием 30 с. Затем пробирку инкубировали 30 мин при температуре 60°С на термостате (EppendorfThermoStat Plus, США) для лизирования всех белковых компонентов плазмы. После инкубирования добавляли 3,6 мл буфера АСВ к лизату, закрывали пробирку крышкой и перемешивали содержимое вортексированием в течение 30 с. Далее пробирку инкубировали 5 мин на льду. Далее к вакуумному насосу присоединяли колонку QIAmp Mini column, к которой затем присоединяли расширитель на 20 мл. После инкубирования на льду содержимое пробирки аккуратно переливали в расширитель колонки. Затем включали вакуумный насос. Когда жидкость полностью проходила через колонку, вакуумный насос отключали и доводили давление до 0 мбар. После этого удаляли расширитель колонки. Крышку колонки оставляли открытой. Далее в колонку пипеткой добавляли 600 мкл буфера ACW1, включали вакуумный насос. Когда жидкость полностью проходила через колонку, вакуумный насос отключали и доводили давление до 0 мбар. Затем в колонку вносили пипеткой 750 мкл буфера ACW2, включали вакуумный насос. Когда жидкость полностью проходила через колонку, вакуумный насос отключали и доводили давление до 0 мбар. После этого в пробирку вносили пипеткой 750 мкл этанола (96-100%) и включали вакуумный насос. Когда жидкость полностью проходила через колонку, вакуумный насос отключали и доводили давление до 0 мбар. Далее колонку закрывали крышкой, отсоединяли от вакуумного насоса, помещали в пустую пробирку на 2 мл и центрифугировали при скорости 14.000 об./мин в течение 3 мин. Колонку помещали в новую пустую пробирку на 2 мл (прошлую пробирку выбрасывали), открывали крышку и инкубировали при температуре 56°С в течение 10 мин на термостате (Eppendorf ThermoStat Plus, США), чтобы высушить мембрану колонки. Далее колонку помещали в чистую пробирку на 1,5 мл (прошлую пробирку выбрасывали) и аккуратно пипеткой вносили 60 мкл буфера AVE в центр мембраны колонки, затем инкубировали при комнатной температуре 3 мин. Затем колонку в пробирке центрифугировали при скорости 14.000 об./мин в течение 1 мин, чтобы элюировать нуклеиновые кислоты. В случае, если к проведению дальнейшего анализа приступают не сразу, то выделенную ДНК хранят при температуре -80°С.
5) Из раствора с выделенной ДНК отбирали 3 аликвоты.
Аликвота №1 - 15,2 мкл; аликвота №2 - 15,7 мкл; аликвота №3 - 15,7 мкл. В свободное от манипуляций время все аликвоты хранили при температуре 4°С.
6) В аликвоте №1 проводили рестрикцию в соответствии со следующей методикой.
™
К аликвоте №1 добавляли 1 мкл эндонуклеазы BstFN I (СибЭнзим, Россия) и 1,8 мкл буфера (Buffer Y 10Х concentrate, СибЭнзим, Россия). Смесь перемешивали вортексированием 30 с, а затем центрифугировали при скорости 6000 об./мин в течение 10 с. Пробирку помещали в амплификатор (Eppendorf Mastercycler gradient), на котором устанавливали программу: 60°С 40 мин (для проведения рестрикции) - 80°С 20 мин (для инактивации фермента).
7) Для проверки полноты рестрикции проводили ПЦР в реальном времени по гену АСТВ.
Подготовили 3 пробирки с оптически прозрачными крышками объемом 0,1 мл. В каждую из них вносили по 12,5 мкл TaqMan Maxima Probe qPCR Master Mix (2X) (Thermo Fisher Scientific, США), 0,75 мкл зондов на АСТВ (Actin 243Т, А260 3,3 ОЕ/мл, 1:10), по 1 мкл праймеров на АСТВ (ACT F 46 нмоль/мл, 1:10; ACT R 47 нмоль/мл, 1:10), 8,75 мкл дистиллированной стерильной воды. В 1-ю из 3 пробирок вносили 2 мкл раствора из аликвоты №1, подвергшейся рестрикции. Во 2-ю пробирку вносили 2 мкл дистиллированной стерильной воды (отрицательный контроль). В 3-ю пробирку вносили 2 мкл раствора любой геномной ДНК, не подвергавшейся рестрикции. Пробирки с растворами центрифугировали при скорости 6000 об./мин в течение 1 мин. Затем их вносили в амплификатор для ПЦР в реальном времени Applied Biosystems 7500 FAST Real-Time PCR System, на котором выставляли программу: денатурация (95°С, 10 мин) - 1 цикл, денатурация (95°С, 15 с), отжиг (60°С, 1 мин) и элонгация (70°С, 1 мин) - 60 циклов, конечная элонгация (70°С, 5 мин) - 1 цикл. По прошествии амплификации убеждались, что в пробирке с исследуемым образцом не обнаружено следов гена АСТВ, т.е. считали, что рестрикция прошла успешно.
8) Готовили смеси для цифровой ПЦР.
Для этого брали 3 пробирки на 1,5 мл. В каждую пробирку вносили по 17,4 мкл QuantStudio™ 3D Digital PCR Master Mix v2. В пробирки №1 и №2 вносили по 1,74 мкл заранее подготовленной смеси: по 2,08 мкл праймеров на RASSF1A (RSF F 48 нмоль/мл, 1:10; RSF R 51 нмоль/мл, 1:10), 1,39 мкл зондов на RASSF1A (RSF dsgnT А260 2,2 ОЕ/мл, 1:10) и 13,92 мкл дистиллированной стерильной воды. В пробирку №3 вносили 1,74 мкл заранее подготовленной смеси: по 1,39 мкл каждого праймера на PLAU rs4065 (последовательности указаны выше, 100 нмоль/мл), 1,04 мкл каждого зонда на PLAU rs4065 (последовательности указаны выше, 100 нмоль/мл) и 14,97 мкл дистиллированной стерильной воды. Затем в пробирку №1 вносили 15,7 мкл ДНК из аликвоты №1, подвергшейся рестрикции; в пробирку №2 - 15,7 мкл ДНК из аликвоты №2; в пробирку №3 - 15,7 мкл ДНК из аликвоты №3. Пробирки с растворами центрифугировали при скорости 6000 об./мин в течение 10 с.
9) Подготовили 6 чипов для цифровой ПЦР (QuantStudio™ 3D Digital PCR Chip v2) При помощи QuantStudio™ 3D Digital PCR Chip Loader на чипы №1.1 и №1.2
вносили раствор из пробирки №1; на чипы №2.1 и №2.2 - раствор из пробирки №2; на чипы №3.1 и №3.2 - раствор из пробирки №3. Для этого вносили по 14,5 мкл смеси на каждый чип из соответствующей пробирки в съемный пластиковый дозатор QuantStudio™ 3D Digital PCR Chip Loader механической пипеткой, избегая образования пузырьков воздуха, а затем запускали дозирование нажатием на центральную кнопку QuantStudio™ 3D Digital PCR Chip Loader. Сразу же после дозирования матрицу чипа покрывали иммерсионной жидкостью из шприца, чтобы предотвратить испарение. Затем опускали и удерживали 15 с механическую ручку QuantStudio™ 3D Digital PCR Chip Loader с заранее вставленной крышкой от чипа (QuantStudio™ 3D Digital PCR Chip Lid v2). После этого в отверстие на крышке чипа аккуратно вводили иммерсионную жидкость из шприца, пока все содержимое шприца не заполнялось иммерсионной жидкостью и не оставалось лишь пузырька воздуха размером с отверстие на крышке чипа. Далее с неприклеевшейся части крышки снимали защитную пленку и надавливали на 15 с, пока чип не будет плотно закрыт.Затем чип откладывали в сторону, накрывали его поверхность железной пластиной из комплекта поставки. Только после этого переходили к дозированию и подготовке следующего чипа.
10) Проводили амплификацию 6 подготовленных чипов.
Для этого чипы переносили в амплификатор (ProFlex™ 2х Flat PCR System), установленный под углом 11 и накрывали мягкими накладками из комплекта поставки для лучшего соприкосновения с нагревательными элементами. В программе амплификатора устанавливали следующие параметры: денатурация (96°С, 10 мин) - 1 цикл, денатурация (98°С, 30 с), отжиг (63°С, 1 мин) и элонгация (70°С, 1 мин) - 60 циклов, удерживание при 10°С не дольше 24 ч. Затем запускали процесс амплификации.
11) Считывали результаты цифровой ПЦР на QuantStudio™ 3D Digital PCR Instrument. Для этого чипы после амплификации последовательно вносили в считывающее гнездо QuantStudio™ 3D Digital PCR Instrument. Результаты цифровой ПЦР считывали и обрабатывали в автоматическом режиме программным обеспечением системы.
12) Проводили анализ результатов цифровой ПЦР чипов №1.1, №1.2, и №2.1, №2.2. На облачном сервисе (QuantStudio™ 3D AnalysisSuite) в личном кабинете оператора записывали концентрации ДНК, копий/мкл (предварительно отмечали в системе, что зонды дают сигнал в канале FAM). Чипам №1.1 и №1.2 в системе давали одинаковое название для более точного определения концентрации ДНК в образце, то же самое справедливо для чипов №2.1 и №2.2. Для определения фракции фетальной ДНК по гену RASSF1A полученные концентрации подставляли в выражение:
R
1
2
R
1
2
F=l,184*C/C, где F - фракция фетальной ДНК, определенная по гену RASSF1A; С - концентрация ДНК в чипах №1.1 и №1.2 с поправкой на добавленный объем жидкости при рестрикции; С - концентрация ДНК в чипах №2.1 и №2.2.
13) Проводили анализ результатов цифровой ПЦР чипов №3.1 и №3.2.
На облачном сервисе (QuantStudio™ 3D AnalysisSuite) в личном кабинете оператора записывали концентрации ДНК, копий/мкл (предварительно отмечали в системе, что зонды на аллель С подают сигнал в канале FAM, а зонды на аллель Т - в канале VIC). Чипам №3.1 и №3.2 в системе давали одинаковое название для более точного определения концентрации ДНК в образце.
14) В случае, если при анализе не обнаруживали сигнала от аллеля Т, т.е. при отсутствии исследуемом образце аллеля Т по полиморфизму гена PLAU rs4065, считали, что генотип матери и плода - СС, пациента относили к группе риска развития плацентарной недостаточности;
P
c
т
c
т
P
с
т
P
R
15) В случае, если обнаруживали сигналы от аллелей С и Т, то для определения фракции фетальной ДНК по полиморфизму гена PLAU rs4065 полученные концентрации подставляли в выражение F=(C-C)/(C+C), где F - фракция фетальной ДНК, определенная по полиморфизму гена PLAU rs4065; С - концентрация аллеля С; С - концентрация аллеля Т. При схождении значений F и F (разница между результатами не превышает 10% от большего значения; 10% является инструментальной погрешностью при проведении цифровой ПЦР на чипах) считали, что генотип матери - СТ, а плода - СС, пациента относили к группе риска развития плацентарной недостаточности.
16) Во всех остальные случаях пациента не относили к группе риска развития плацентарной недостаточности.
17) Составляли заключение о принадлежности пациента к группе риска развития плацентарной недостаточности.
Пример 1.
Пациентка Н., 37 лет. Срок беременности составляет 12 недель. У пациентки был проведен забор 5 мл периферической крови. Были проведены выделение внеклеточной ДНК крови, отбор аликвот и рестрикция с последующим подтверждением ее полноты в соответствии с методикой, описанной в настоящем патенте. На фиг. 1 представлены результаты ПЦР в реальном времени для подтверждения полноты рестрикции.
После подтверждения полноты рестрикции был проведен анализ методом цифровой ПЦР в соответствии с методикой, описанной в настоящем патенте. На фиг. 2, 3 и 4 графически представлены результаты цифровой ПЦР чипов №1.1, №2.1 и №3.1 соответственно.
P
c
т
c
т
По информации представленной на фиг. 4 можно сделать вывод, что в исследуемом образце присутствуют сигналы как от аллеля С, так и от аллеля Т. Таким образом, для определения принадлежности пациента к группе риска развития плацентарной недостаточности применяют формулу F=(C-C)/(C+C).
Концентрации ДНК, полученные в ходе анализа методом цифровой ПЦР, концентрация ДНК в аликвоте №1 с поправкой на добавленный объем жидкости при рестрикции, а также результаты определения фракции фетальной ДНК как по гену RASSF1A, так и по полиморфизму гена PLAU rs4065 представлены в таблице 1.
P
R
По данным, представленным в таблице 1, вынесли заключение о принадлежности пациентки к группе риска развития плацентарной недостаточности, т.к. наблюдается схождение значений F и F. Генотип матери - СТ. Генотип плода - СС.
Пример 2.
Пациентка С, 35 лет. Срок беременности составляет 11 недель. У пациентки был проведен забор 5 мл периферической крови. Были проведены выделение внеклеточной ДНК крови, отбор аликвот и рестрикция с последующим подтверждением ее полноты в соответствии с методикой, описанной в настоящем патенте. На фиг. 5 представлены результаты ПЦР в реальном времени для подтверждения полноты рестрикции.
После подтверждения полноты рестрикции был проведен анализ методом цифровой ПЦР в соответствии с методикой, описанной в настоящем патенте. На фиг. 6, 7 и 8 графически представлены результаты цифровой ПЦР чипов №1.1, №2.1 и №3.1 соответственно.
По информации представленной на фиг. 8 можно сделать вывод, что в исследуемом образце присутствует сигнал только от аллеля С (сигнал в канале FAM). Поэтому выносится заключение о принадлежности пациентки к группе риска развития плацентарной недостаточности, в подсчете фракции фетальной ДНК нет необходимости. Генотип матери - СС. Генотип плода - СС.
Пример 3.
Пациентка П., 26 лет. Срок беременности составляет 10 недель. У пациентки был проведен забор 5 мл периферической крови. Были проведены выделение внеклеточной ДНК крови, отбор аликвот и рестрикция с последующим подтверждением ее полноты в соответствии с методикой, описанной в настоящем патенте. На фиг. 9 представлены результаты ПЦР в реальном времени для подтверждения полноты рестрикции.
После подтверждения полноты рестрикции был проведен анализ методом цифровой ПЦР в соответствии с методикой, описанной в настоящем патенте. На фиг. 10, 11 и 12 графически представлены результаты цифровой ПЦР чипов №1.1, №2.1 и №3.1 соответственно.
P
c
т
c
т
По информации представленной на фиг. 12 можно сделать вывод, что в исследуемом образце присутствуют сигналы как от аллеля С, так и от аллеля Т. Таким образом, для определения принадлежности пациента к группе риска развития плацентарной недостаточности применяют формулу F=(C-C)/(C+C).
Концентрации ДНК, полученные в ходе анализа методом цифровой ПЦР, концентрация ДНК в аликвоте №1 с поправкой на добавленный объем жидкости при рестрикции, а также результаты определения фракции фетальной ДНК как по гену RASSF1A, так и по полиморфизму гена PLAU rs4065 представлены в таблице 2.
Основываясь на данных, представленных в таблице 2, выносится заключение о том, что пациентка не относится к группе риска развития плацентарной недостаточности, т.к. фракции фетальной ДНК, определенные по RASSF1A и по полиморфизму гена PLAU rs4065, не совпадают. Генотип матери - СТ. Генотип плода - СТ.
Таким образом, экспериментальные данные подтверждают возможность получения прогнозных оценок развития плацентарной недостаточности с высокой степенью достоверности уже на 8 неделе беременности и снижение вероятности ложно-отрицательных результатов при постановке диагноза, поскольку данные получены с участием пациенток с клинически манифестной ПН. Преимущество заявляемого способа состоит в том, что у беременных на основании высокочувствительных современных лабораторных маркеров производится прогнозирование развития ПН. В клинической практике это позволит снизить количество неблагоприятных перинатальных исходов за счет своевременного выявления беременных группы риска и начала адекватных лечебно-профилактических мероприятий.