Ферменты антиоксидантной системы клетки в условиях засухи

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН _2016, том 59, №7-8_

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

УДК 581.1

Член-корреспондент АН Республики Таджикистан К.Алиев, А.К.Мирзорахимов, Р.С.Бобохонов*, С.Х.Ашуров**, Б.М.Сабуров ФЕРМЕНТЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ КЛЕТКИ В УСЛОВИЯХ ЗАСУХИ

Институт ботаники, физиологии и генетики растений АН Республики Таджикистан, Таджикский аграрный университет им. Ш.Шотемура, Худжандский государственный университет им. академика Б.Гафурова

Показано, что при возрастании почвенной засухи, в зависимости от степени устойчивости к стрессу, листья картофеля сортов Таджикистан и Пикассо различаются по величине потери воды. С прекращением полива в начальный период засухи потеря воды у исследуемых сортов незначительно снижается и составляет у сорта Пикассо спустя 7 дней - 26%, а через 9 дней -35.6%. Устойчивый и продуктивный сорт Таджикистан имел небольшой водный дефицит - 16%. Под воздействием водного дефицита активность ферментов глутатионредуктазы (ГР) и аскорбатпероксидазы (АскП) изменялась по-разному, у исследованных генотипов - сортов. Показатели активности ГР и АскП в листьях картофеля сорта Таджикистан при усилении засухи возрастали и, наоборот, у неустойчивого сорта Пикассо в этих же условиях наблюдалось ингибирование активности этих ферментов.

Ключевые слова: антиоксидант, относительное содержание воды, засуха, устойчивость растений, антиоксидантные ферменты.

В последние годы интенсивно изучаются физиолого-биохимические и молекулярные основы устойчивости растений к воздействию различных стрессоров (засухи, засоления, температуры и т.д.). Это стало особенно актуальным в связи с глобальным изменением климата, провоцирующим засушливость и засолённость почвы, которые губительно влияют на продуктивность сельскохозяйственных растений.

Засуха и засоление приводят к усиленному образованию активных форм кислорода (АФК), продуктом которого являются супероксид-анион-радикал (О2-), гидроксильный радикал (-ОН) и перекись водорода (Н2О2) [1].

В работе [2] показано, что накопление АФК имеется также и в хлоропластах, из-за отсутствия баланса скорости переноса электронов и активности ферредоксин-никотинамидадениндинуклеотидфосфат-оксидредуктазы (НАДФ.Н-редуктазы) в условиях стресса. Установлено, что детоксикация АФК связана с активацией антиокислительной системы, как ферментативной, так и неферментативной, в которой участвуют низкомолекулярные компоненты (аскорбат, глутатион, а-токоферол, каротиноиды). Разрушение Н2О2 осуществляется в реакциях

Адрес для корреспонденции: Алиев Курбон. 734063, Республика Таджикистан г. Душанбе, ул. Айни, 299/2, Институт ботаники, физиологии и генетики растений АН РТ. E-mail: lab.gen@mail.ru

аскорбат/глутатионового цикла с участием ферментов аскорбатпероксидазы (АскП), каталазы. Последние имеют низкое родство с перекисью водорода [3]. С помощью этих механизмов происходит детоксикация и удаление образующихся токсических продуктов. Отмечено, что активность этих систем-механизмов имеет генотипические различия и варьирует также в процессе развития растений в нормальных условиях, но особенно ярко проявляются при воздействии стрессоров [4].

В связи с этим важно было выявить существование конкурентных механизмов устойчивости и продуктивности растений. Для этого необходимо оценить эффективность работы антиокислительных систем у разных по устойчивости и продуктивности растений в условиях стресса.

Целью исследований явилось сравнительное изучение действия водного дефицита у разных генотипов (клон-гибридов) картофеля, отличающихся по уровню устойчивости и продуктивности.

Матералы и методы исследований

Объектами исследования служили растения картофеля (Solanum tuberosum L.): устойчивый к засухе сорт Таджикистан и неустойчивый к засухе сорт Пикассо. Растения выращивались в сосудах, объёмом 10 л, в торфо-почвенной смеси в соотношении 1:1. После появления всходов вносили азотные удобрения и поливали, согласно рекомендации «Международного центра картофеля» (CIP).

После появления 3-4 листьев, растения опытного варианта прекращали поливать. Контрольные растения поливали через день, поддерживая влажность почвы на уровне 70% от полной её влаго-ёмкости.

Третий лист сверху использовали для анализа через 5, 7 и 9 дней после прекращения полива. Влажность почвы у опытного варианта на 5, 7 и 9-й день засухи составила 60, 52 и 44%.

Активность ферментов определяли в гомогенатах, полученных из листьев (0.5 г). Листья охлаждали до 20°С и быстро растирали в 3 мл буфера, содержащего 0.01 мМ трис-НС1-буфер (рН=7-8), 0.005 мМ MgCl2, 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0.01 М NaCl.

Гомогенат фильтровали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. В суперна-танте определяли активность ферментов. Активность НАДФ Н зависимый ферродоксин - НАДФ+ -оксидоредуктазы определяли при 25°С. Реакционная смесь: 20 мМ трис-НС1-буфер (рН=8.0), 10 мМ NaCL, 2 мМ MgCl, 0.02 мМ дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) в качестве акцептора Н+) и в 100 мкл супернатантf определяли оптическую плотность проб, измеряли в темноте при 610 нм, до начала и после экспозиции в течение 30 с. Контролем служили пробы без НАДФ Н (неферментативное восстановление ДХФИФ). Активность рассчитывали в микромолях восстановленного ДХФИФ/г сырой массы.

Активность аскорбатпероксидазы определяли в супернатанте, по скорости окисления аскорбиновой кислоты, полученной экстракцией с буфером, содержащим 0.1М HEPES-KOH-буфер (рН=7.0), 1мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0.5 мМ аскорбиновой кислоты и супер-натант 100 мкл центрифугировали при 2000 об/мин, в течение 15 мин., общий объём реакционной смеси составил 2 мл.

Измерение проводили на спектрометре Spekol II (Швеция) при 298 нм с добавлением перекиси водорода (Н2О2) и через 20 сек фиксировали уменьшение величины поглощения. Контролем слу-

жило неферментативное окисление аскорбиновой кислоты е=0.80 мМ/см. Активность рассчитали в микромолях окисленной аскорбиновой кислоты (г.сырой массы/мин.).

Образование малонового диальдегида (МДА) определяли с помощью тиобарбитуровой кислоты ТБК [5].

Инкубационная смесь: 0.2-0.3 г растительного материала растирали в ступке с 2 мл 0.1% три-хлоруксусной кислотой (ТХУ). Гомогенат центрифугировали в течение 5 минут при 3000 об/мин.

К 1 мл супернатанта добавили 4 мл 0.5% ТБК в 20% ТХУ. Смесь нагревали на водяной бане 30 мин., охлаждали во льду и центрифугировали при 3000 об/мин. в течение 10 мин. Оптическую плотность измеряли при 532 и 600 нм. Концентрацию МДА рассчитывали после вычитания неспецифического поглощения при 600 нм. Использовали коэффициент экстинции £=1.56-105 м/см и выражали в мкмоль/г сырой массы.

Результаты исследований и их обсуждение

Для создания почвенной засухи растения-регенеранты выращивали в торфо-почвенной смеси в соотношении 1:1. Данные, представленные в табл. 1, показывают, что на начальной стадии в листьях исследуемых растений картофеля происходила незначительная потеря воды и наблюдались различия в зависимости от степени устойчивости сортов.

Таблица 1

Относительное содержание воды (ОСВ) в листьях картофеля при продолжительной засухе

Сорт Продолжительность засухи, дни Водный дефицит, %

0 5 7 9 0 5 7 9

Таджикистан 0.87 0.84 0.72 0.64 - 4.6 14.7 16.1

Пикассо 0.85 0.76 0.63 0.53 - 14.8 26.1 35.6

По мере возрастания засухи, через 5-7 дней показатели ОСВ резко снижались. Так, у сорта Таджикистан, спустя 5 дней после начала засухи, этот показатель составил - 0.84%, а после 7-9 дней наблюдалось наибольшее снижение этого показателя по сравнению с 5 дневной засухой, и составил 0.72 и 0.64% соответственно. У сорта Пикассо показатель ОСВ составил 0.76%, и после 7-9 дней усиления засухи снижение составило 0.63 и 0.53%, соответственно. Водный дефицит растений сортов Таджикистан изменялся незначительно и спустя 7-9 дней составил 14.7-16.1%, соответственно. У сорта Пикассо показатель ОСВ изменялся значительно больше по мере повышения засухи, и водный дефицит составлял 14.8%, а после 7-9 дневной засухи - 26.1 и 35.6%, соответственно. Данные опыта указывают, что при возрастании почвенной засухи, листья картофеля в показателях потери воды имели различия, в зависимости от устойчивости сортов к стрессу.

Обычно действие стрессового фактора водного дефицита связывают с активностью фермента глутатионредуктазы. Как показывают результаты табл. 2, под влиянием засухи (7-9-дневной) активность глутатионредуктазы (ГР) у сорта Пикассо снижалась на 27-36%, а при 5-дневной засухе активность фермента была на уровне контроля.

Таблица 2

Активность глутатионредуктазы в листьях картофеля при продолжительной засухе

Сорт Продолжительность засухи, дни Активность, %

0 5 7 9 0 5 7 9

Таджикистан 105.5 126.4 132.5 137.8 100 119.8 125.5 133.1

Пикассо 103.4 96.2 70.9 61.8 100 98.3 72.2 63.8

В то же время у сорта Таджикистан активность ГР во всех периодах засухи увеличивалась. Так, при 5-дневной засухе активность ГР увеличивалась на 120%, после 7-дневной - 125%, при 9-дневной - 127%. Примерно такие же результаты были получены при определении активности аскорбатпероксидазы (АскП). В листьях испытуемых сортов активность АскП у контрольных растений практически была одинаковой (табл. 3). Возрастание активности АскП наблюдалось у сорта Таджикистан после 7-9-дневной засухи. При кратковременной засухе (5-дневной) активность АскП практически была такой же, как у контрольных растений. Активность АскП у сорта Пикассо, наоборот, снижалась по мере возрастания засухи. Так, при 5-дневной засухе активность АскП снижалась на 22.2%, при 7-дневной на 24.6%, при 9-дневной на 27% по сравнению с контрольными растениями.

Таблица 3

Активность аскорбатпероксидазы (мкмоль/мг белка) в листьях картофеля при продолжительной засухе

Сорт Продолжительность засухи, дни Активность АскП, %

0 5 7 9 0 5 7 9

Таджикистан 29.4 18.4 25.3 26.8 100 16.5 15.3 8,9

Пикассо 28.2 16.9 18.8 17.4 100 22.2 24.6 26.8

Снижение активности ГР и АскП при засухе отрицательно сказывалась на продукции перекисьного окисления липидов (ПОЛ), который измеряется по образованию малонового диальдегида (МДА). Как видно из данных табл. 4, по мере возрастания засухи интенсивность образования МДА увеличивалась, но у разных сортов это происходит по-разному. Под влиянием засухи (5 дней) у сорта Таджикистан содержание МДА было близко к контролю. По мере возрастания засухи (7-9 дней), накопление МДА незначительно увеличивалось и составило 12-24%, соответственно по отношению к контрольным растениям.

Таблица 4

Содержание МДА в листьях картофеля при продолжительной засухе

Сорт Продолжительность засухи, дни Активность МДА, %

0 5 7 9 0 5 7 9

Таджикистан 114.8 117.7 123.5 133.9 100 112.7 116.4 124.4

Пикассо 111.1 135.4 159.2 179.1 100 122.4 155.4 173.8

При возрастании засухи у сорта Пикассо накопление МДА увеличивалось во всех вариантах опыта. При 5-дневной засухе накопление МДА составило 122%, при 7-дневной - 155% и при 9-дневной - 174% по отношению к контролю.

Полученные данные свидетельствуют о том, что у устойчивого и продуктивного сорта Таджикистан наблюдается относительно низкий водный дефицит, что характеризует толерантность этого сорта к стрессу. По мере увеличения водного дефицита у этого сорта наблюдается небольшая скрученность листьев, являющаяся морфологическим признаком адаптивности растений к стрессу и, несомненно, этот признак можно использовать как индикатор устойчивости.

Заключение

На основании полученных результатов можно заключить, что при возрастании почвенной засухи листья изученных сортов картофеля по показателям потери воды имеют различия в зависимости от степени устойчивости сортов к стрессу. Устойчивый и продуктивный сорт Таджикистан имел небольшой водный дефицит до (16%), в то время как у неустойчивого сорта Пикассо водный дефицит в этих же условиях был высоким и составлял от 26 до 37% соответственно.

Под воздействием водного дефицита активность ГР и АскП у исследованных сортов изменялась по-разному. Показатели активности ГР и АскП в листьях картофеля сорта Таджикистан при усилении засухи возрастали незначительно, причем значительное усиление было отмечено после 7 и 9 дней засухи и, наоборот, у неустойчивого сорта Пикассо по мере возрастания засухи наблюдалось значительное ингибирование активности этих ферментов.

В связи с этим следует отметить, что у устойчивого сорта наблюдалось координированное взаимоодействие активности ГР и АскП, которая поддерживала степень перекисного окисления липидов (ПОЛ) близкой к контрольным растениям. Такое скоординированное усиление активности этих ферментов поддерживало незначительное накопление МДА в условиях засухи, особенно на первых этапах действия стрессора (5-7-дневной засухи) и при дальнейшем усилении засухи (9 дней), спровоцировало усиление МДА, хотя в незначительном количестве.

Поступило 08.06.2016 г.

ЛИТЕРАТУРА

1. Киямова З.С., Давлятназарова З.Б. Ашуров С.Х., Алиев К. Активность супероксиддисмутазы у разночуствительных генотипов картофеля к солевому стрессу. - Изв. АН РТ. Отд. биол. и мед. н., 2013, №1, с. 40-45.

2. Давлятназарова З.Б., Киёмова З.С., Шукурова М., Каспарова И.С., Алиев К.А., и др. Биохимические аспекты устойчивости разночувствительных генотипов картофеля к солевому стрессу. - Изв. АН РТ. Отд. биол. и мед. н., 2012, №3, с. 43-49.

3. Мерзляк М.Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки. Итоги науки и техники. Сер. Физиология растений. - М.: ВИНИТИ, 1989, т.6, 168 с.

4. Норкулов Н.Х., Давлятназарова З.Б., Шукурова М.Х., Ашуров С.Х., Файзиева С.А. Влияние теплового шока и последующей почвенной засухи на активность окислительных систем растений картофеля. - Изв. АН РТ. Отд. биол. и мед. н., 2014, №4 (188), с. 29-35.

5. Давлятназарова З.Б., Шукурова М.Х., Алиев К. Влияние салициловой кислоты на активность про-оксидантов у растений картофеля. Фенольные соединения: Фундаментальные и прикладные аспекты. - Сб. Мат-лы IX Межд. симп. - М.:, 20-25 апреля 2015 г., с. 262-265.

^.Алиев, А.К.Мирзорахимов, Р.С.Бобохонов*, С.Х.Ашуров**, Б.М.Сабуров

ФЕРМЕНТНОЙ системаи антиоксидантии нучайра ва МУНОФИЗАТИ РАСТАНИНО ДАР ШАРОИТИ ХУШКЙ

Институти ботаника, физиология ва генетикаи растении Академияи илмхои Цумхурии Тоцикистон, *Донишгох,и аграрии Тоцикистон ба номи Ш.Шотемур, **Донишгохи давлатии Хуцанд ба номи академик Б.Рафуров

Аз натичахои ба даст омада бармеояд, ки навъхои ба шароити номусоид тобовар ва серхосил дорои хусусияти нисбатан ками талафоти об мебошанд, ки ин устуворнокии ин навъхоро нисбат ба стресс тавсиф менамояд. Дар зери таъсири норасогии об фаъолнокии ферментхои глутатионредуктаза (ГР) ва аскорбатпероксидаза (АскП) дар генотипхои (навъхои) омухташуда ба таври гуногун тагйир ёфтанд. Нишондихандахои фаъолнокии ГР ва АскП дар баргхои картошкаи навъи Точикистон хангоми шиддатёбии хушкй зиёд гардиданд ва ин холат баъд аз 7 ва 9 рузи хушкй ба кайд гирифта шуд. Бар акс, дар навъи ба хушки ноустувори Пикассо вобаста ба шиддатёбии хушкй паст шудани фаъолнокии ин ферментхо мушохида гардид.

Калимахои калиди: антиоксидантуо, мщдори нисбии об, хушкй, устувории растаниуо, ферментной антиоксидантй.

K.Aliyev, A.K.Mirzorakhimov, R.S.Bobokhonov*, S.Kh.Ashurov**, B.M.Saburov ENZYMES OF ANTIOXIDANT SYSTEM OF THE CELL PROTECTION OF PLANTS IN DROUGHT CONDITIONS

Institute of Botany, Plant Physiology and Genetics, Academy of Sciences of the Republic of Tajikistan,

Sh.Shotemur Tajik Agricultural University, B.Gafurov KhudjandState University

The results show that sustainable and productive varieties is relatively low the loss of water that characterizes the tolerance of this variety to the stress. Under the influence of water deficiency, the activity of GR and ASCP in genotypes (varieties) changed in different ways. The activity of GR and ASCP in the leaves of Tajikistan potato varieties in the amplification of the drought after 7 and 9 days increased, and the gain was and, conversely, varieties of Picasso as increased drought was observed in the inhibition of the activity of these enzymes.

Key words: antioxidants, relatively of water contents, drought, resistant, plants, antioxidant enzymes.