СПОСОБ БЕЗДЕТЕРГЕНТНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЗИКУЛ НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНОЙ БАКТЕРИИ
PROCESS FOR DETERGENT-FREE PRODUCTION OF OUTER MEMBRANE VESICLES OF A GRAM-NEGATIVE BACTERIUM

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области медицинской микробиологии и области вакцин. В частности настоящее изобретение относится к способу бездетергентного получения везикул наружной мембраны (OMV) грамотрицательных бактерий для использования в вакцинах, к OMV, которые могут быть получены указанным способом, и к фармацевтической композиции, содержащей такие OMV. Настоящее изобретение также относится к применению OMV согласно настоящему изобретению в качестве лекарственного средства, в частности для применения в способе индукции иммунного ответа.
Уровень техники изобретения
Neisseria meningitidis представляет собой патоген человека, который может вызывать острый менингит и септицемию с уровнем смертности около 15% [Girard et al., 2006]. На менингит серогруппы B приходится 30-40% случаев менингита в Северной Америке [Sharip et al., 2006; Kaplan et al., 2006] и до 80% в некоторых европейских странах [Trotter et al., 2007; Gray et al., 2006], но, несмотря на это вакцина, обладающая широким спектром защитного действия, до сих пор не создана. Эффективные вакцины против других серогрупп были разработаны на основе капсульного полисахарида, конъюгированного с белком-носителем [Snape et al., 2008]. Этот подход оказался неприменимым для серогуппы B из-за слабой иммуногенности и проблем, связанных с вызываемыми иммунизацией аутоиммунными реакциями [Finne et al., 1983]. На сегодняшний день вакцинами на основе везикул наружной мембраны (OMV) являются только вакцины, с помощью которых успешно контролируются эпидемии, вызываемой серогруппой B, например, в Норвегии, на Кубе и в Новой Зеландии [Bjune et al., 1991; Thornton et al., 2006; Martin et al., 1998; Sierra et al., Fredriksen et al., 1991].
OMV выделяются из наружной мембраны грамотрицательных бактерий и состоят из фосфолипидного (ФЛ) бислоя, который содержит белки наружной мембраны, липополисахаридные (ЛПС) и периплазматические компоненты [Deatherage et al., 2009]. Белок PorA был идентифицирован как главный протективный антиген в OMV, но он является высоковариабельным у циркулирующих штаммов серогруппы B, что усложняет разработку вакцины [Saukkonen et al., 1989; Martin et al., 2006]. По этой причине в Национальном институте общественного здравоохранения и окружающей среды (Rijks Instituut voor Volksgezondheid en Milieu (RIVM)) (Билтховен, Нидерланды) разработали OMV-вакцину на основе генетически модифицированных штаммов N. meningitidis, экспрессирующих несколько субтипов PorA. Эта мультвалентная OMV-вакцина первоначально была получена с использованием 2 тривалентных PorA штаммов, экспрессирующих в общей сложности 6 субтипов PorA [van der Ley et al., 1995; Claassen et al., 1996], и она показала функциональную иммуногенность в фазе II клинических испытаний. Чтобы обеспечить необходимый охват для штаммов серогруппы B, циркулирующих во всем мире, был добавлен третий тривалентный штамм [van den Dobbelsteen et al., 2007].
OMV-вакцины обычно получают путем экстракции детергентом (способ выделения dOMV) для удаления ЛПС и увеличения высвобождения везикул. ЛПС N. meningitidis является высоко токсичным, но его остаточные количества (приблизительно 1%) необходимы для поддержания структуры везикулы и повышения эффективности иммунного ответа против PorA [Arigita et al., 2005; Arigita et al., 2003; Steeghs et al., 2004]. При сбалансированной концентрации детергента способ выделения dOMV обеспечивает эти условия, однако существуют серьезные недостатки. Вместе с ЛПС детергентом удаляются ФЛ, а также липопротеины, которые способствуют иммуногенности, такие как фактор H связывающий белок [Koeberling et al., 2009; Koeberling et al., 2008]. Возникающий в результате иммунный ответ направлен против конкретного субтипа PorA, не вызывая перекрестной защиты [Morley et al., 2001; van der Voort et al., 1996]. Кроме того, избирательное удаление ЛПС и ФЛ изменяет нативную структуру везикул и стимулирует их агрегацию [Hoist et al., 2009; Cametti et al., 2008]. Обработка детергентом необходима, для того чтобы уменьшить токсичность ЛПС, но она имеет нежелательные побочные эффекты, которые усложняют разработку вакцин.
Бездетергентные способы выделения OMV с сохранением всех ЛПС приводят не только к получению везикул с сохраненной нативной структурой, но также к получению вакцин, которые по своей природе являются токсичными при использовании их в парентеральной иммунизации [Hoist et al., 2009]. Описано два бездетергентных способа выделения. Способ получения нативных OMV (nOMV) [Zollinger et al., 1979; Патент США US6558677] включает такие же стадии, как при получении dOMV, но со стадией бездетергентной экстракции, и в способе получения надосадочных OMV (sOMV) [Post et al., 2005; Devoe et al., 1973; Hoekstra et al., 1976] для выделения OMV, спонтанно высвобождающихся из культурального супернатанта, используется ультрафильтрация или ультрацентрифугирование без экстракции. nOMV-вакцины показали обнадеживающие результаты у животных и людей, но высокое содержание ЛПС ограничило применимость этих вакцин интраназальным применением [Guthrie et al., 2004; Katial et al., 2002; Saunders et al., 1999; Drabick et al., 1999]. Доклинические данные о sOMV-вакцинах ограничиваются единственным исследованием на мышах, в котором сообщается о перекрестной защите против набора штаммов серогруппы B, которая не была обнаружена в случае dOMV, однако возможные различия в токсичности и стабильности не рассматривались [Ferrari et al., 2006]. Процесс получения sOMV связан с дополнительными трудностями, так как он имеет очень низкий выход OMV, для создания на его основе практически применимого способа [Post et al., 2005; Devoe et al., 1973].
Открытие в RIVM (Билтховен) мутантных штаммов lpxL1 [van der Ley et al., 2001] дало решение проблемы токсичности ЛПС. Удаление lpxL1 ослабляет токсичность ЛПС, сохраняя при этом адъювантную активность, необходимую для иммунного ответа [Koeberling et al., 2008; van der Ley et al., 2001; Fisseha et al., 2005; van de Waterbeemd et al., 2010].
Однако для клинических испытаний или НПП производства nOMV/sOMV необходим надежный крупномасштабный производственный процесс, в котором стадия экстракции ЭДТА необходима для обеспечения высокого выхода, но который на сегодняшний день вызывает нежелательные эффекты, такие как лизис бактерий [Prachayasittikul et al., 2010]. Вызываемое лизисом высвобождение ДНК является проблемой для крупномасштабного производства, так как процедуры удаления, такие как только ультрацентрифугирование, имеют ограниченную производительность.
Соответственно, так как доступные на сегодняшний день способы получения sOMV и nOMV или имеют низкий выход и/или низкую степень чистоты и/или ограничены лабораторным масштабом, то существует потребность в улучшенных способах получения бактериальных OMV, в частности в способах, применимых в промышленных масштабах.
Описание изобретения
Неожиданно было показано, что OMV могут быть получены без использования детергента с высоким выходом и высокой степенью чистоты способом, который может быть осуществлен в любом масштабе.
Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к способу бездетергентного получения бактериальных везикул наружной мембраны (OMV) для использования в вакцинах, включающему стадии:
a) культивирование популяции грамотрицательных бактерий до фазы стационарного роста;
b) в момент времени по меньшей мере примерно через 1 час после начала фазы стационарного роста, инкубацию бактерий, полученных на стадии a), в среде с доведенным или имеющимся значением pH выше примерно 7,5 или выше 8,0, и имеющей концентрацию металл хелатирующего агента, предпочтительно ЭДТА, от примерно 1 до 100 мМ, для экстрагирования OMV; и
c) извлечение OMV, экстрагированных на стадии b), где извлечение включает по меньшей мере удаление бактерий из OMV.
Предпочтительно, момент времени после начала фазы стационарного роста примерно 1 час представляет собой момент времени от 1 до 9 часов, более предпочтительно, от 1 до 8 часов, от 1 до 7 часов, от 1 до 6 часов, от 2 до 5 часов, от 2 до 4 часов, от 2 до 3,5 часов или от 2, до 3,5 часов.
Предпочтительно, в любом из способов в соответствии с настоящим изобретением OMV стерилизуют, предпочтительно путем стерилизации фильтрованием, предпочтительно с использованием фильтра с размером пор менее чем примерно 0,3 микрометра. Предпочтительно, стерилизацию проводят во время стадии c); потери в выходе значительно уменьшаются, благодаря осуществлению стадии b) в соответствии с настоящим изобретением. Стерилизация фильтрованием, также именуемая стерильной фильтрации, означает здесь фильтрование представляющего интерес химического соединения через фильтр, предпочтительно с размером пор от примерно 0,5 до 0,2 микрометров, так чтобы фильтрат, содержащий представляющее интерес химическое соединение, не содержал никаких микроорганизмов, или чтобы количество микроорганизмов в фильтрате было уменьшено до приемлемо низкого уровня.
Используемый в настоящем изобретении термин «бездетергентный» предпочтительно означает, что никакой детергент не добавляется и/или не используется во время стадии экстракции любого из способов согласно настоящему изобретению; более предпочтительно, никакой детергент не добавляется и/или не используется совсем при осуществлении любого из способов согласно настоящему изобретению. Если детергент используется, например, в качестве вспомогательного средства в виде агента уменьшающего пенообразование, такого как антивспениватели от компании Sigma-Aldrich (каталожные номера A6426, A5633, A5757, A8011 или A5758), или молекулы с сопоставимой функцией от других производителей, во время культивирования популяции, то считается, что это находится в пределах объема способа согласно настоящему изобретению. Также возможно, что в растворе, используемом в способе согласно настоящему изобретению, неустранимо присутствуют незначительные следовые количества детергента, например, следовые количества детергента в комплексной среде для культивирования; в этом случае также считается, что такое неустранимое присутствие находится в пределах объема способа согласно настоящему изобретению.
Используемый в настоящем изобретении термин «детергент» предпочтительно означает агент, предпочтительно реагент, который обладает свойствами поверхностно-активного вещества, и при контакте с бактерией способен экстрагировать белок из этой бактерии. Детергент может быть анионным, катионным, неионным (имеющим суммарный заряд равный нулю, также известный как цвиттерионный) или этилоксилатом. Предпочтительно, антипенный агент, т.е. агент, который уменьшает или предотвращает образование пены в промышленных технологических жидкостях, такой как антивспениватели от компании Sigma-Aldrich (каталожные номера A6426, A5633, A5757, A8011 или A5758), не входит в определение детергента. Культивирование популяции грамотрицательных бактерий в любом из способов согласно настоящему изобретению может быть выполнено любым способом, известным специалисту в данной области техники. Предпочтительная культуральная среда представляет собой среду с определенным химическим составом, предпочтительно такую, как описано в Baart et al., 2007. Температура может быть любой температурой в диапазоне от примерно 30 до примерно 40°C. Значение pH может быть любым значением pH в диапазоне от примерно 5,5 до 8,5. Предпочтительно, условия культивирования включают культивирование при температуре примерно 35°C при значении pH 7,2 с аэрацией. Культивирование можно проводить в несколько стадий, включая, без ограничений, прекультивирование или инокуляцию посевного материала и основное культивирование. Культивирование можно проводить в любом масштабе, включая, без ограничений, культивирование во встряхиваемой колбе, культивирование в малом масштабе или крупномасштабное культивирование (включая непрерывное, периодическое, подпитываемое или твердофазное культивирование) в лаборатории или промышленных ферментерах. Предпочтительно, объем культуры составляет по меньшей мере примерно 10 л, более предпочтительно, по меньшей мере примерно 20 л, 40 л, 60 л, 80 л, 100 л, 200 л, 300 л, 400 л, 500 л, 800 л, 1500 л, 5000 л, 10000 л, 20000 л или 40000 л.
Используемый в настоящем изобретении термин «популяция бактерий» относится к по меньшей мере двум бактериям, предпочтительно принадлежащим к одному роду или виду.
Предпочтительно, OMV получают из грамотрицательной бактерии, имеющей генетическую модификацию, приводящую к тому, что бактерия продуцирует ЛПС, модифицированный таким образом, чтобы иметь пониженную токсичность. Предпочтительно, грамотрицательная бактерия имеет ЛПС с пониженной токсичностью, где ЛПС (или его компонент липид A (LA)) модифицирован таким образом, чтобы иметь пониженную токсичность. Под ЛПС, который модифицирован таким образом, чтобы иметь пониженную токсичность, здесь понимается ЛПС, модифицированный таким образом, чтобы иметь токсичность меньшую, чем токсичность соответствующего ЛПС дикого типа. Предпочтительно, модифицированный ЛПС имеет менее чем примерно 90, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 или 0,2% токсичности соответствующего ЛПС дикого типа. Токсичность ЛПС дикого типа и различных модифицированных ЛПС с пониженной токсичностью может быть определена с помощью любого подходящего анализа, известного из уровня техники. Предпочтительным анализом для определения токсичности, т.е. биологической активности ЛПС, является WEHI тест индукции ФНО-альфа в клеточной линии макрофагов MM6 [Espevik and Niessen, 1986, J.Immunol. Methods 95: 99-105; Ziegler-Heitbrock et al., 1988, Int. J. Cancer 41: 456-461].
Тем не менее, хотя предпочтительным является, чтобы ЛПС грамотрицательной бактерии (или его LA компонент) имел пониженную токсичность, также является предпочтительным, чтобы ЛПС сохранял по меньшей мере часть иммуностимулирующей активности, т.е. адъювантную активность. Таким образом, ЛПС с пониженной токсичностью грамотрицательной бактерии, используемый в настоящем изобретении, предпочтительно имеет по меньшей мере примерно 10, 20, 40, 80, 90 или 100% иммуностимулирующей активности соответствующего ЛПС дикого типа, где иммуностимулирующая активность определяется путем измерения выработки по меньшей мере одного цитокина или экспрессии по меньшей мере одной костимулирующий молекулы при совместном культивировании дендритных клеток (ДК) с грамотрицательной бактерией, продуцирующей ЛПС с пониженной токсичностью, как описано в Примере 3 Международной заявки на патент WO 2005/107789. Цитокин, продуцируемый ДК, предпочтительно выбирается из ИЛ-12, ИЛ-10, ФНО-α, ИЛ-6 и ИЛ-1β, и костимулирующая молекула, экспрессируемая ДК, предпочтительно выбирается из CD40 и CD86.
Грамотрицательные ЛПС, имеющие пониженную токсичность компонента липид A, но сохраняющие (частично) адъювантную активность, могут, например, быть получены из генетически модифицированных грамотрицательных патогенов, как описано в WO02/09746. Генетически модифицированные грамотрицательные патогены, продуцирующие ЛПС с пониженной токсичностью компонента липид A, но сохраняющие (частично) свою адъювантную активность, включают в себя, например, грамотрицательные бактерии, имеющие одну или несколько генетических модификаций, которые снижают или полностью подавляют экспрессию одного или нескольких генов, выбранных из генов lpxL1 и lpxL2 или их гомологов (ранее известных как htrB и msbB, см., например, WO00/26384; US5997881), гена lpxK, кодирующего липид A 4'-киназу, или его гомологов (см. также ниже); и генетические модификации, которые оказывают влияние на экспрессию одного или нескольких гетерологичных генов lpxE и pagL. Предпочтительными генетическими модификациями являются модификации, которые снижают или полностью подавляют экспрессию одного или нескольких генов, выбранных из генов lpxL1 и lpxL2 или их гомологов. Предпочтительным ЛПС с пониженной токсичностью компонента липид A, но сохраняющего (частично) свою адъювантную активность, является ЛПС, описанный в Международной заявке на патент WO00/26384, и является ЛПС с липидом A, имеющими уменьшенное количество вторичных ацильных цепей на молекулу ЛПС по сравнению с соответствующей немодифицированной молекулой ЛПС, и имеющим по меньшей мере одну вторичную ацильную цепь, связанную с первичной ацильной цепью на восстанавливающем конце глюкозамин-дисахарида; предпочтительно, указанный липид A имеет такое же количество первичных ацильных цепей, что и немодифицированная молекула ЛПС, и/или указанный липид A имеет вторичную ацильную цепь на первичной ацильной цепи в положении 2 глюкозамина на восстанавливающем конце глюкозамин-дисахарида, и/или указанный ЛПС представляет собой ЛПС, у которого вторичная ацильная цепь представляет собой лауроильную цепь, и/или указанный липид A имеет фосфоэтаноламин, присоединенный к фосфатной группе на восстанавливающем конце, и/или указанный липид A, имеющий молекулярную структуру:
-1
-1
2
Используемый в настоящем изобретении термин «фаза стационарного роста» означает фазу культивирования, при которой скорость роста замедляется в результате истощения питательных веществ и/или накопления токсичных продуктов. Эта фаза, например, наступает, когда бактерии начинают исчерпывать определенные источники питательных веществ, которые ранее были доступными. Фаза стационарного роста, предпочтительно, представляет собой период культивирования, во время которого скорость роста бактерий близка к или равна скорости гибели бактерий. Предпочтительно, скорость роста бактерий замедляется до значения ниже 0,1. Более предпочтительно, скорость роста бактерий изменяется от значения примерно 0,3-0,5 до значения ниже 0,1, еще более предпочтительно, от значения примерно 0,40±0,10 ч (экспоненциальный рост) до значения 0,00±0,10 ч (стационарный рост). Наступление фазы стационарного роста может быть определено специалистом в данной области техники доступными способами, включающими в себя без ограничений мониторинг роста бактерий путем регулярного измерения оптической плотности и измерения сухой массы, или путем измерения истощения питательных веществ, таких как источники углерода, такие как глюкоза, источники азота, такие как аминокислоты или аммоний, или путем мониторинга потребления кислорода или выделения CO.
2
2
Предпочтительно, наступление фазы стационарного роста определяют путем определения по меньшей мере одного из двух параметров: максимальная скорость потребления кислорода и максимальная скорость выделения CO. Поэтому предпочтительно, чтобы по меньшей мере один из двух параметров: максимальная скорость потребления кислорода и максимальная скорость выделения CO контролировались непрерывно по меньшей мере во время стадии культивирования.
Наступление стационарной фазы может быть индуцировано пассивно, например, при периодическом культивировании при истощении питательных веществ. Наступление стационарной фазы может быть индуцировано активно, например, путем уменьшения количества питательных веществ в питательной среде при подпитываемом культивировании, путем изменения значения pH или путем остановки или уменьшения подачи питательной среды или кислорода. После наступления стационарной фазы бактерии предпочтительно поддерживаются в тех же условиях культивирования, которые существовали при наступлении стационарной фазы, такие как температура, концентрация кислорода, встряхивание, значение pH и т.д. Предпочтительно, после момента времени по меньшей мере примерно через 1 час после наступления фазы стационарного роста, как указано ранее в настоящем описании, бактерии или культуру, содержащую бактерии, охлаждают до температуры ниже примерно 20°C, более предпочтительно, ниже примерно 15°C, 10°C, 8°C, 6°C, более 5°C, 4°C, 3°C, 2°C или ниже примерно 1°C. После охлаждения бактерии или культура, содержащая бактерии, могут храниться при температуре ниже 20°C, как указано ранее в настоящем описании. Бактерии могут храниться при температуре ниже -20°C, более предпочтительно, при температуре ниже -80°C, -135°C или ниже -150°C; однако, предпочтительно, чтобы бактерии или культура, содержащая бактерии, не охлаждалась до температуры, которая могла бы вызвать замораживание (частичное) культуры бактерий, например, температурных значений ниже 0°C, так как это может вызвать лизис бактерий.
После момента времени по меньшей мере примерно через 1 час после наступления фазы стационарного роста, как указано ранее в настоящем описании, полученные бактерии инкубируют в среде, содержащей металл хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА, для экстрагирования OMV. Металл хелатирующий агент может представлять собой любой металл хелатирующий агент, известный специалисту в данной области техники. Предпочтительно, металл хелатирующий агент является одним или по меньшей мере одним выбранным из группы, состоящей из полиамино-карбоновых кислот, например, нитрилотриуксусной кислоты (НТА), диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ДТПА), этиленгликоль тетрауксусной кислоты (ЭГТА), 1,2-бис(o-аминофенокси)этан-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (BAPTA), этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Предпочтительно, металл хелатирующий агент представляет собой ЭДТА. Инкубация может проводиться в любом масштабе. Настоящее изобретение предполагает, что бактерии из нескольких различных культур инкубируют в одной среде, содержащей металл хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА, для экстрагирования OMV. Предпочтительно, объем инкубации составляет по меньшей мере примерно 10 л, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 20 л, 40 л, 60 л, 80 л, 100 л, 200 л, 300 л, 400 л, 500 л, 800 л, 1500 л, 5000 л, 10000 л, 20000 л или 40000 л. Бактерии могут быть приведены в контакт со средой, содержащей металл хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА, при помощи любых способов, известных специалисту в данной области техники. Например, бактерии могут быть выделены из культуральной среды при помощи центрифугирования и затем приведены в контакт со средой, содержащей металл хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА, например, путем ресуспендирования в среде, содержащей металл хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА. Предпочтительно, культуральная среда постепенно заменяется средой, содержащей металл хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА. Предпочтительно, полученные при культивировании бактерии сначала концентрируют путем микрофильтрации. Предпочтительно, объем культуры уменьшается в 2 раза, более предпочтительно, в 3 раза, более предпочтительно, в 4 раза, более предпочтительно, в 5 раз, более предпочтительно, в 6 раз, более предпочтительно, в 7 раз, более предпочтительно, в 9 раз, более предпочтительно, в 10 раз. Концентрированную бактериальную суспензию затем подвергают диафильтрации. Предпочтительно, культуральная среда постепенно заменяется буфером, имеющим необходимое для экстракции значение pH. Используемый здесь термин «диафильтрация» означает микрофильтрацию с постоянным объемом, при которой первая среда, содержащая целевое химическое соединение, путем непрерывного диализа заменяется второй средой, так, чтобы целевое химическое соединение после диафильтрации находилось во второй среде. То есть, среда культуральной среды, таким образом, постепенно заменяется другой подходящей средой, предпочтительно, 100 мМ Трис-HCl с pH 8,6. Концентрацию и диафильтрацию можно проводить одновременно или последовательно. Когда они выполняются одновременно, вторая среда является средой с необходимым для экстракции значением pH, и содержащей металл хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА, или забуференной средой с необходимым значением pH, к которой соответствующее количество металл хелатирующего агента, предпочтительно ЭДТА, добавляют непосредственно после диафильтрации; предпочтительно, вторая среда содержит буферный агент, такой как Трис-HCl, в концентрации от примерно 10 мМ до 250 мМ, со значением pH выше, чем примерно 7,5, предпочтительно, как указано ниже, к которой добавляется от примерно 1 мМ до 100 мМ металл хелатирующего агента, предпочтительно ЭДТА. Диафильтрацию предпочтительно проводят до тех пор, пока первая среда полностью не заменится второй средой; этот процесс может занимать по меньшей мере от 1 до 4 часов или более. Диафильтрацию можно проводить с использованием любой подходящей мембраны, известной специалисту в данной области техники. Предпочтительно использовать элементы из полых волокон с размером пор 0,2 микрометра.
Среда, содержащая металл хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА, может представлять собой любую среду, подходящую для экстракции OMV. Предпочтительно, эта среда не содержит детергент. Предпочтительно, среда, содержащая металл хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА, дополнительно содержит буферный агент или смесь буферных агентов; примерами буферных агентов являются, без ограничений, Трис и фосфат. Предпочтительной средой является 100 мМ Трис-HCl, pH 8,6 с 10 мМ ЭДТА.
Предпочтительно, среда, содержащая металл хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА, имеет концентрацию металл хелатирующего агента, предпочтительно ЭДТА, от примерно 1 до 100 мМ. Предпочтительно, эта концентрация находится в диапазоне от примерно 1 до 50 мМ, более предпочтительно, от примерно 1 до 25 мМ, от 2 до 25 мМ, от 3 до 25 мМ, от 4 до 25 мМ, от 5 до 25 мМ или от 5 до 20 мМ, и наиболее предпочтительно, от примерно 5 до 15 мМ, например, примерно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15 мМ. Предпочтительно, металл хелатирующий агент представляет собой агент, указанный ранее в настоящем описании, более предпочтительно, металл хелатирующий агент представляет собой ЭДТА. Предпочтительно, среда имеет предпочтительное значение концентрации металл хелатирующего агента, предпочтительно ЭДТА, после того, как бактерии были приведены в контакт со средой. Концентрация металл хелатирующего агента, предпочтительно ЭДТА, в среде может регулироваться. Регулировка может осуществляться в любое время при контактировании бактерий со средой или во время инкубации бактерий в среде и может проводиться более одного раза и может проводиться непрерывно и/или автоматически. Специалисту в данной области техники известно как регулировать концентрацию металл хелатирующего агента в среде, например, путем измерения концентрации металл хелатирующего агента и путем добавления соответствующего количества металл хелатирующего агента или в виде твердого вещества или в виде раствора. Когда металл хелатирующий агент представляет собой ЭДТА, ЭДТА может находиться в любой форме, например, в форме кислоты или в форме одной из солей ЭДТА, известных специалисту в данной области техники, или в виде смеси нескольких форм ЭДТА.
Предпочтительно, среда, содержащая металл хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА, имеет значение pH выше, чем примерно 7,5. Предпочтительно, значение pH среды, содержащей металл хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА, выше, чем примерно 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4 или 9,5. Более предпочтительно, значение pH среды находится в диапазоне от примерно 7,5 до 9,5, более предпочтительно, от примерно 8,0 до 9,0, более предпочтительно, от примерно 8,2 до 8,8, более предпочтительно, от примерно 8,4 до 8,7. Наиболее предпочтительно, значение pH среды, содержащей металл хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА, составляет примерно 8,6. Предпочтительно, значение pH представляет собой предпочтительное значение после того, как бактерии были приведены в контакт со средой, содержащей металл хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА. Значение pH среды, содержащей металл хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА, может регулироваться. Регулировка может осуществляться в любое время при контактировании бактерий со средой или во время инкубации бактерий в среде и может проводиться более одного раза и может проводиться непрерывно и/или автоматически. Специалисту в данной области техники известно как регулировать значение pH среды, например, путем измерения значения pH и добавления подходящей кислоты или основания в среду, содержащую металл хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА.
Предпочтительная среда для экстрагирования OMV представляет собой среду со значением pH выше, чем примерно 7,5, в которой концентрация металл хелатирующего агента, предпочтительно ЭДТА, составляет от примерно 5 до 15 мМ; более предпочтительно, значение pH составляет примерно 8,6, и концентрация металл хелатирующего агента, предпочтительно ЭДТА, составляет от примерно 5 до 15 мМ; предпочтительно, среда содержит в качестве буферного агента Трис-HCl, например 100 мМ.
После инкубации бактерий в среде, содержащей металл хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА, для экстрагирования OMV, OMV извлекают путем по меньшей мере удаления бактерий из OMV. Удаление бактерий из OMV может быть проведено с помощью любых способов, известных специалисту в данной области техники. Примерами способов удаления являются, без ограничений, фильтрация с размером пор 0,5-0,2 мкм, центрифугирование или любой другой способ (спонтанного) осаждения бактерий. Предпочтительным способом удаления бактерий из OMV является периодическое или непрерывное центрифугирование, в зависимости от масштаба процесса, например, периодическое центрифугирование для объемов до примерно 100 л, и непрерывное центрифугирование для объемов более примерно 100 л.
После извлечения или одновременно с извлечением препарат OMV может быть очищен. Очистка может включать любые способы, известные специалисту в данной области техники. Предпочтительно, используют по меньшей мере один способ из следующей группы: ультрафильтрация, как описано ранее в настоящем описании, и/или диафильтрация для замены среды, например, чтобы удалить металл хелатирующий агент из экстракционной среды и/или чтобы сконцентрировать препарат OMV; деградация нуклеиновых кислот, таких как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК), которая может быть проведена ферментативно с использованием одной или нескольких подходящих нуклеаз, предпочтительно с использованием нуклеазы Benzonase (Merck, Нидерланды); осветление путем фильтрации, предпочтительно с использованием фильтра с размером пор от примерно 0,5 мкм до 1,0 мкм; гель-фильтрация (такая как, эксклюзионная хроматография, материал колонки Сефароза 6 Fast Flow, OMV извлекают из исключенного объема колонки); стерильная фильтрация, как описано ранее в настоящем описании. Предпочтительно, используют по меньшей мере стерильную фильтрацию. Предпочтительно, используют более одного способа очистки. Предпочтительно, последовательно используют следующие способы: ультрафильтрация (например, с пороговым значением массы 100 или 300 кДа), диафильтрация (например, с пороговым значением массы 100 или 300 кДа), ферментативная деградация нуклеиновых кислот, осветление, гель-фильтрация и стерильная фильтрация, хотя и не обязательно в этом порядке. Предпочтительный способ согласно настоящему изобретению не включает ультрацентрифугирование.
2+
Деградация нуклеиновых кислот с использованием нуклеазы Benzonase предпочтительно проводится в буфере со значением pH 8,4+/-0,4, содержащем от примерно 0,1 до 10 единиц Benzonase на мл, и от примерно 1 до 10 мМ Mg при температуре от 4°C до 37°C в течение 1-20 часов.
Предпочтительно, в любом из способов согласно настоящему изобретению популяция грамотрицательных бактерий включает виды родов Neisseria, Bordetella, Haemophilus, Actinobacillus или Pasteurella; более предпочтительно, виды родов Neisseria или Bordetella; еще более предпочтительно, популяция грамотрицательных бактерий включает виды Neisseria lactamica, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Bordetella pertussis или Pasteurella multocida; еще более предпочтительно, вид Neisseria meningitidis, предпочтительно серогруппу B Neisseria meningitidis или Bordetella pertussis.
Предпочтительно, популяция грамотрицательных бактерий включает грамотрицательную бактерию, имеющую одну или несколько мутаций, которые снижают или полностью подавляют экспрессию генного продукта. Предпочтительно, генный продукт выбран из группы, состоящей из cps, ctrA, ctrB, ctrC, ctrD, exbB, exbD, frpB, galE, htrB, msbB, lpbB, lpxK, lpxL1, nmb0033, opA, opC, rmpM, phoP, pilC, pmrE, pmrF, porA, porB, siaA, siaB, siaC, said, synA, synB, sync, tbpA и tbpB или их гомологов; многие из этих мутаций описаны в Международной заявке на патент WO02/09746. Предпочтительно, генный продукт выбран из группы, состоящей из cps, генных продуктов биосинтеза липида A, включая lpxL1, rmpM, porA, porB и opA. Предпочтительно, грамотрицательная бактерия имеет по меньшей мере мутации, которые снижают или полностью подавляют экспрессию lpxL1, предпочтительно, такие, которые описаны в Международной заявке на патент WO00/26384. Предпочтительно, грамотрицательная бактерия имеет по меньшей мере мутации, которые снижают или полностью подавляют экспрессию как lpxL1, так и rmpM. Предпочтительно, lpxL1 имеет по меньшей мере примерно 30% идентичности по последовательности, более предпочтительно, по меньшей мере примерно 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности по последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. Наиболее предпочтительно, lpxL1 является идентичным аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
Предпочтительно, rpmM имеет по меньшей мере примерно 30% идентичности по последовательности, более предпочтительно, по меньшей мере примерно 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности по последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2. Наиболее предпочтительно, rpmM является идентичным аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
Предпочтительно, грамотрицательная бактерия является штаммом Neisseria meningitidis, который является репликой или производным изолята H44/76 Neisseria meningitidis серогруппы B [Holten et al., 1979; van den Dobbelsteen et al., 2007].
Следует понимать, что реплики и/или производные любого штамма в соответствии с настоящим изобретением охватываются настоящим изобретением. Термин «реплика» относится к биологическому материалу, который представляет собой практически не измененную копию материала, такого как материал, продуцируемый ростом микроорганизмов, например, ростом бактерий в культуральной среде. Термин «производное» относится к материалу, созданному из биологического материала, который существенно модифицирован, чтобы иметь новые свойства, например, вызываемые наследственными изменениями в генетическом материале. Эти изменения могут происходить либо спонтанно, либо быть результатом применения химических и/или физических агентов (например, агентов мутагенеза) и/или происходить в результате применения технологий рекомбинантных ДНК, известных из уровня техники. При упоминании в описании штамма, «производного» от другого штамма следует понимать, что имеются в виду как «реплики» этого штамма, так и «производные» этого штамма, при условии, что производный штамм может быть использован для индуцирования иммунного ответа против грамотрицательной бактерии в способе настоящего изобретения, такой как Neisseria meningitidis.
В настоящем изобретении процент идентичности предпочтительно определяется путем вычисления отношения: количество идентичных нуклеотидов/аминокислот в последовательности, деленное на длину всех нуклеотидов/аминокислот минус длины любых пробелов. В соответствии с настоящим изобретением множественное выравнивание последовательностей ДНК проводят с использованием любого подходящего для выравнивания последовательностей пакета программного обеспечения, доступного специалисту в данной области техники. Минимальная длина релевантной аминокислотной последовательности, имеющей уровень идентичности 30% или выше, должна составлять, предпочтительно, примерно 40 аминокислот, более предпочтительно, примерно 50, 70, 100, 150, 170, 200, 210, 220, 230, 240 или более аминокислот, и в случае lpxL1, более предпочтительно, примерно 50, 70, 100, 150, 170, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 295 или более аминокислот. Предпочтительно, идентичность по последовательности вычисляют по всей длине последовательности SEQ ID NO: 1 или 2.
В настоящем изобретении подразумевается, что экспрессия включает в себя любой этап, вовлеченный в синтез полипептида, включая, без ограничений, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.
nd
Для того чтобы снизить или полностью подавить экспрессию генного продукта, указанного ранее в настоящем описании, специалист в данной области техники имеет множество доступных хорошо известных средств. Для специалиста в данной области техники стандартной практикой является выбор адекватной стратегии введения соответствующей модификации в полинуклеотид с целью снизить или полностью подавить экспрессию функционального генного продукта. Например, способы мутагенеза in vitro описаны в Sambrook et al. (Molecular cloning, A laboratory Manual., 2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1989). Соответствующие способы являются также коммерчески доступными в форме наборов (например, набор для сайт-направленного мутагенеза Quikchange от компании Stratagene, La Jolla, USA). Делеция полинуклеотида может быть выполнена, например, при помощи технологии замещения гена, которая хорошо известна специалисту в данной области техники.
Предпочтительно, популяция грамотрицательных бактерий включает в себя несколько видов грамотрицательных бактерий, таких, чтобы несколько серотипов антигенов экспрессировались и в конечном итоге попадали в препарат OMV. Более предпочтительно, чтобы виды грамотрицательных бактерий экспрессировали несколько серотипов антигена. Когда популяция бактерий включает в себя Neisseria meningitidis, эта популяция, предпочтительно, включает в себя вид Neisseria meningitidis, экспрессирующий несколько серотипов антигена porA; более предпочтительно, популяция бактерий включает в себя несколько видов Neisseria meningitidis, и каждый вид экспрессирует несколько серотипов антигена porA. Предпочтительно, популяция грамотрицательных бактерий включает в себя три тривалентных porA штамма Neisseria meningitidis, в общей сложности экспрессирующих 9 субтипов PorA [van der Ley et al., 1995; Claassen et al., 1996; van den Dobbelsteen et al., 2007].
Грамотрицательная бактерия, которая предпочтительно представляет собой штамм Neisseria meningitidis, который является репликой или производным изолята H44/76 Neisseria meningitidis серогруппы B, может экспрессировать антиген, который является чужеродным для указанной грамотрицательной бактерии. OMV согласно настоящему изобретению, полученные из указанной грамотрицательной бактерии, будут содержать указанный чужеродный антиген. Таким образом, OMV согласно настоящему изобретению могут использоваться в качестве средства с адъювантной активностью и могут успешно использоваться для лечения заболеваний или состояний, связанных с указанным чужеродным антигеном. Антиген, который является чужеродным для грамотрицательной бактерии, может представлять собой любой антиген и может быть одним или по меньшей мере одним, выбранным из группы, состоящей из белка NadA, гепарин связывающего белка, поверхностного антигена лихорадки Ку, антигена Chlamydia, пертактина, коклюшного токсина, 92 кДа антигена, fim2, fim3, дермонекротического токсина, фактор H связывающего белка, полисахаридов из Neisseria meningitidis серогруппы A, C, W135 или Y, поверхностного антигена Chlamydia, дифтерийного анатоксина, ослабленного или инактивированного полиовируса, столбнячного анатоксина, полисахарида Haemophilus influenzae b или аутоантигенов, связанных с заболеваниями, в которые могут быть вовлечены аутоиммунные реакции, такими как болезнь Альцгеймера и опухолевые антигены.
Чужеродный антиген может быть экспрессирован при помощи любых способов, известных специалисту в данной области техники; предпочтительно, чужеродный антиген направлен на OMV. Предпочтительно, чужеродный антиген или его часть является слитым с или включенным в состав porA Neisseria meningitidis серогруппы B или его части.
В объеме настоящего изобретения возможно путем культивирования или иным способом получить несколько видов грамотрицательных бактерий, каждый из которых экспрессирует один или несколько антигенных серотипов, и экстрагировать OMV одновременно из одной или нескольких объединенных популяций указанных бактерий. Также в объем настоящего изобретения входит экстракция OMV отдельно от популяций бактерий, и затем, предпочтительно, объединение препаратов OMV. Также в объеме настоящего изобретения различные виды грамотрицательных бактерий культивируют совместно в одной смешанной популяции или раздельно в индивидуальных популяциях или даже в сочетании индивидуальных и смешанных популяций.
Препарат OMV, который может быть получен любым из способов согласно настоящему изобретению, в целях удобства может быть сохранен для последующего использования или в лиофилизированной форме или в виде раствора или виде замороженного раствора. В любом из способов согласно настоящему изобретению одно или несколько химических соединений могут быть добавлены в препарат OMV, например, (коллоидный) стабилизатор, такой как сахароза, для предотвращения агрегации и/или консервант, такой как тиомерсал, для предотвращения роста микроорганизмов.
Препарат OMV, который может быть получен любым из способов согласно настоящему изобретению, с успехом может быть использован для получения лекарственного средства, предпочтительно, лекарственного средства для лечения менингита, предпочтительно, указанное лекарственное средство представляет собой вакцину против инфекции Neisseria meningitidis. Таким образом, любой из способов согласно настоящему изобретению может дополнительно включать в себя стадию объединения OMV с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом, таким как носитель, адъювант, стабилизирующий агент, осмотический агент, буферный агент и/или диспергирующий агент. Кроме того, в любом из способов согласно настоящему изобретению OMV могут быть объединены с другим антигеном для получения смешанной вакцины, предпочтительно, с антигенами, содержащими белки наружной мембраны из Neisseria meningitidis серогруппы B или из других грамотрицательных патогенов, включая, без ограничений, белок NadA, гепарин связывающий белок, поверхностный антиген лихорадки Ку, пертактин, коклюшный токсин, 92 кДа антиген, fim2, fim3, дермонекротический токсин, фактор H связывающий белок, полисахариды из Neisseria meningitidis серогруппы A, C, W135 или Y, предпочтительно конъюгированные с подходящим фармацевтически приемлемым белком-носителем, поверхностный антиген Chlamydia, дифтерийный анатоксин, ослабленный или инактивированный полиовирус, столбнячный анатоксин, полисахарид Haemophilus influenzae b, предпочтительно конъюгированный с подходящим фармацевтически приемлемым белком-носителем.
Вакцинация применяется для профилактической защиты от патогенов или для лечения заболеваний, возникающих в результате патогенной инфекции.
В соответствии с настоящим изобретением адъюванты включают любое вещество или химическое соединение, которое при использовании в комбинации с антигеном для иммунизации пациента, предпочтительно млекопитающего, предпочтительно человека, стимулирует иммунную систему, вызывая тем самым усиление или облегчение возникновения иммунного ответа против антигена, предпочтительно, не вызывая специфичный иммунный ответ на сам адъювант. Предпочтительные адъюванты усиливают иммунный ответ против данного антигена по меньшей мере в 1,5, 2, 2,5, 5, 10 или 20 раз по сравнению с иммунным ответом, вызываемым против антигена, в тех же условиях, но без адъюванта. Тесты для определения статистического среднего значения усиления иммунного ответа против данного антигена, вызываемого адъювантом в группе животных или людей, по сравнению с соответствующей контрольной группой известны в данной области техники. Адъювант предпочтительно может усиливать иммунный ответ против по меньшей мере двух различных антигенов.
Фармацевтический носитель может быть любым совместимым нетоксичным веществом, пригодным для доставки активного ингредиента субъекту. Примерами фармацевтически приемлемых носителей для интраназальной доставки являются вода, забуференные физиологические растворы, глицерин, полисорбат 20, кремофор EL и водная смесь каприлового/капринового глицерида, которые могут быть забуференными для обеспечения нейтрального значения pH среды. Примерами фармацевтически приемлемых носителей для парентеральной доставки являются стерильный забуференный 0,9% раствор NaCl или 5% раствор глюкозы в некоторых случаях с добавлением 20% альбумина. Препараты для парентерального введения должны быть стерильными. Парентеральное введение активных ингредиентов осуществляется в соответствии с известными способами, например, путем инъекции или инфузии, подкожно, внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, внутриартериально или непосредственно внутрь пораженных тканей. Композиции настоящего изобретения предпочтительно вводят путем болюсной инъекции. При пероральном введении активный ингредиент может вводиться в виде жидких лекарственных форм, таких как эликсиры, сиропы и суспензии. Жидкие лекарственные формы для перорального введения могут содержать краситель или вкусо-ароматическую добавку для повышения комфортности приема для пациента. Способы получения парентерально, перорально или интраназально вводимых композиций хорошо известны из уровня техники и более подробно описаны в различных источниках, включая, например, Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980) (включено путем ссылки полностью во всех отношениях).
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к OMV, которые могут быть получены любым из способов согласно первому аспекту настоящего изобретения. Предпочтительно, указанные OMV являются продуктом, непосредственно полученным любым из способов согласно первому аспекту настоящего изобретения.
Препарат OMV, который может быть получен любым из способов согласно настоящему изобретению, с успехом может быть использован для получения лекарственного средства, предпочтительно, лекарственного средства для лечения менингита, предпочтительно, указанное лекарственное средство представляет собой вакцину против инфекции Neisseria meningitidis. Предпочтительно, указанный препарат OMV является продуктом, непосредственно полученным любым из способов согласно первому аспекту настоящего изобретения. Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей OMV, которые могут быть получены любым из способов согласно настоящему изобретению, и фармацевтически приемлемый эксципиент, такой как носитель, адъювант, стабилизирующий агент, осмотический агент, буферный агент и/или диспергирующий агент, как описано ранее в настоящем описании. Предпочтительно, указанные OMV являются продуктом, непосредственно полученным любым из способов согласно первому аспекту настоящего изобретения. Так как настоящее изобретение относится к OMV, которые сами обладают адъювантной активностью, предпочтительная фармацевтическая композиция не содержит дополнительный адъювант, кроме OMV, обладающих адъювантной активностью.
Фармацевтическая композиция может быть использована в качестве вакцины. Эта вакцина может быть использована для иммунизации (повышения иммунного ответа) или вакцинации пациента, предпочтительно млекопитающего, предпочтительно человека. В фармацевтической композиции OMV могут быть объединены с другим антигеном для получения смешанной вакцины, т.е. в комбинации с вакцинами против Neisseria meningitidis серогруппы A, C, W135 или Y, пневмококковой инфекции, дифтерии, коклюша, полиомиелита, РСВ или столбняка.
Настоящее изобретение также относится к OMV, которые могут быть получены любым из способов согласно настоящему изобретению, для применения в качестве лекарственного средства, предпочтительно в лечении менингита. Предпочтительно, указанные OMV являются продуктом, непосредственно полученным любым из способов согласно первому аспекту настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также относится к применению OMV, которые могут быть получены любым из способов согласно настоящему изобретению, для получения лекарственного средства, предпочтительно, для лечения менингита. Предпочтительно, указанное лекарственное средство представляет собой вакцину против инфекции Neisseria meningitidis. Предпочтительно, указанные OMV являются продуктом, непосредственно полученным любым из способов согласно первому аспекту настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также относится к способу индуцирования у пациента иммунной реакции, предпочтительно, против Neisseria meningitidis, включающему введение указанному пациенту OMV, которые могут быть получены любым из способов согласно настоящему изобретению, или введение указанному пациенту фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, предпочтительно вакцины против инфекции Neisseria meningitidis. Предпочтительно, указанные OMV являются продуктом, непосредственно полученным любым из способов согласно первому аспекту настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также относится к применению OMV согласно настоящему изобретению или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению для индуцирования у пациента иммунной реакции, предпочтительно, против Neisseria meningitidis, включающему в себя введение указанному пациенту OMV согласно настоящему изобретению или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.
В этом описании изобретения и формуле изобретения глагол «содержать» и его спряжения используется в неограничивающем смысле и означает, что элементы, следующие за этим словом, являются включенными, но элементы, которые конкретно не упомянуты, при этом не исключаются. Кроме того, упоминание элемента в единственном числе не исключает возможности того, что имеется в виду более одного элемента, если из контекста явно не следует, что имеется в виду один и только один элемент. Таким образом, единственное число, как правило, означает «по меньшей мере, один». Термин «примерно» или «приблизительно» при использовании по отношению к числовому значению (например, примерно 10) предпочтительно означает, что это значение может представлять собой данное значение (10) с отклонением на 0,1% от этого значения в большую или меньшую сторону.
Приведенная в настоящем изобретении информация о последовательностях не должна интерпретироваться настолько узко, чтобы требовать включения ошибочно идентифицированных оснований. Специалист в данной области техники способен определить такие ошибочно идентифицированные основания и знает, как исправить такие ошибки. В случае ошибок последовательности, последовательность полипептида, получаемого путем экспрессии гена, присутствующего в изоляте H44/76 Neisseria meningitidis серогруппы B, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую этот полипептид, должна иметь преимущественное значение.
Все патентные и литературные ссылки, цитируемые в настоящем описании, включены в него путем ссылки полностью.
Настоящее изобретение далее описывается путем приведения следующих примеров, которые не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения.
nd
Если не указано иное, то при осуществлении настоящего изобретения используются стандартные общепринятые способы молекулярной биологии, вирусологии, микробиологии или биохимии. Такие методы описаны в Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2 edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press; в Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; в томах 1 и 2 Ausubel et al., (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA; и в томах I и II Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (UK); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait editor); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins, eds.).
Описание чертежей
Фиг.1. Обычное содержание PorA тривалентных суммарных OMV из трех различных тривалентных штаммов RL NonaMen, вместе экспрессирующих 9 таких же субтипов PorA, как штаммы HP NonaMen [van den Dobbelsteen et al., 2007], но с дополнительными делециями в генах rmpM и lpxL1. Изображены тривалентные суммарные OMV из штаммов RL16215, RL10124 и RL1416, соответственно, содержащие PorA с приблизительной массой 41 кДа. Обычное содержание PorA в тривалентных суммарных OMV из штаммов RL NonaMen составляет 60-80% от общего содержания белка.
Фиг.2. Функциональная иммуногенность вакцин RL NonaMen у кроликов при 2 различных дозах (7,5 и 15 мкг/PorA) с добавлением и без добавления адъюванта AlPO4. Сыворотки перед иммунизацией отбирали в день D=0, а сыворотки после иммунизации отбирали после трех иммунизаций. Все три вакцины показали значительно более высокие бактерицидные титры в день D=43, чем в день D=0, при этом не наблюдалось значительного эффекта, связанного с дозой или адъювантом. Эти результаты свидетельствуют о том, что RL 7,5 мкг/PorA содержит достаточное количество антигена, и что отсутствует необходимость в использовании адъювантов, когда вакцину получают описанным здесь способом.
Последовательности
Таблица 1
Последовательности, приведенные в списке последовательностей
SEQ ID NO:
Тип последовательности
Генный продукт
1
Полипептид
Neisseria meningitidis lpxL1
2
Полипептид
Neisseria meningitidis rpmM
Примеры
Пример 1: Масштабируемое производство нонавалентной OMV-вакцины против Neisseria meningitidis серотипа B с улучшенным выходом и чистотой
Приведенный ниже пример осуществляли в технологической культуре объемом 40 л, но он является полностью масштабируемым до по меньшей мере 800 л.
Три различных штамма Neisseria meningitidis серогруппы B, полученных из штамма H44/76 [Fredriksen et al., 1991], с дополнительными делециями в генах cps, porB, rmpM и lpxL1 [Van de Waterbeemd et al., 2010], каждый из которых экспрессирует 3 уникальных субтипа PorA [Van den Dobbelsteen et al., 2007], а именно:
P1.7,16/P1.5-1,2-2/P1.19,15-1 для штамма RL16.2.15;
P1.5-2,10/P12-1,13/P1.7-2,4 для штамма RL10.12.4 и
P1.22,14/P1.7-1,1/P1.18-1,3,6 для штамма RL14.1.6,
хранили при температуре -135°C в качестве маточных посевных серий. Маточные посевные серии оттаивали и наращивали во встряхиваемых колбах в 150 мл среды с определенным химическим составом [Baart et al., 2007], разделяли на аликвоты во время экспоненциального роста и хранили при температуре -135°C после добавления глицерина для получения рабочего посевного материала.
Встряхиваемую колбу для первичного прекультивирования со средой роста с определенным химическим составом [Baart et al., 2007] инокулировали замороженным рабочим посевным материалом, чтобы обеспечить одинаковые начальные условия для каждой производственной партии. Во время экспоненциального роста всю первичную прекультуру использовали для инокуляции вторичной прекультуры, которую выращивали в 3 л среды с определенным химическим составом [Baart et al., 2007] в биореакторе. Во время роста вторичной прекультуры температуру поддерживали на уровне 35°C, и концентрацию растворенного кислорода поддерживали на уровне 30% путем изменения скорости перемешивания и добавления чистого кислорода в поток воздуха над свободным пространством над жидкостью. Во время экспоненциального роста 1 л биомассы из вторичной прекультуры переносили в 40 л среды с определенным химическим составом [Baart et al., 2007]. Технологическую культуру выращивали в биореакторе с контролируемой температурой 35°C, контролируемым при помощи фосфорной кислоты значением pH 7,2 и антипенным агентом. Концентрацию растворенного кислорода поддерживали на уровне 30% путем сочетания переменной скорости перемешивания и изменения потока воздуха через барботажное устройство.
Наступление фазы стационарного роста определяли при помощи периодического измерения ОП. Все 40 л технологической культуры последовательно собирали путем переноса в смесительный резервуар после 3 часов стационарного роста, чтобы обеспечить оптимальный баланс между выходом OMV и высвобождением ДНК в результате лизиса бактерий. Собранную технологическую культуру сначала охлаждали до 20°C, затем уменьшали объем с 40 л до 6 л при помощи микрофильтрации через элементы из полых волокон с размером пор 0,2 мкм. Получившийся в результате концентрированный продукт подвергали диафильтрации 2 объемами (12 л) 100 мМ Трис-HCl буфера с pH 8,6, чтобы довести значение pH биомассы до 8,4±0,4. Концентрированный раствор 100 мМ ЭДТА добавляли до конечной концентрации 10 мМ, чтобы инициировать экстрагирование OMV с последующей инкубацией в течение 30 мин. при температуре 20°C в смесительном резервуаре при перемешивании со скоростью 100 об./мин. Биомассу отделяли от экстракта OMV путем параллельного порционного центрифугирования на полувысокой скорости (6 емкостей по 1 л; 30 мин; 4°C; 20000×g); супернатант сохраняли. Порционное центрифугирование при необходимости может быть заменено непрерывным центрифугированием при промышленном масштабе производства. Супернатанты объединяли, и любые остаточные патогены или другие частицы удаляли с помощью глубинного фильтрования через элемент с размером пор, уменьшающимся от изначального 0,5 мкм до конечного размера пор 0,2 мкм.
2+
Свободный от патогенов экстракт OMV или хранили при температуре 4°C в течение нескольких недель, или сразу использовали для дальнейшей переработки. Сначала объем уменьшали в 12 раз до 0,5 л при помощи ультрафильтрации с пороговым значением массы 100 кДа и затем диафильтрации 2 объемами (1 л) 100 мМ Трис-HCl буфера с pH 8,6 для удаления ЭДТА. Любую геномную ДНК, присутствующую в неочищенных OMV, расщепляли на фрагменты менее 1000 п.н. при помощи 1000 Ед./л (конечная концентрация) нуклеазы Benzonase (Merck) в присутствии кофактора Mg (инкубация при температуре 21°C в течение 18 часов). Любой осадок, который мог образоваться во время обработки Benzonase, удаляли с помощью осветляющего фильтра (1,2-0,5 мкм) перед очисткой неочищенных OMV на колонке для гель-фильтрации, заполненной материалом Сефароза 6 Fast Flow (GE Healthcare), для удаления ДНК и малых молекул из OMV и замены буфера на буфер для хранения (10 мМ Трис-HCl pH 7,4 с 3% (мас./об.) сахарозы). Тривалентные суммарные OMV затем стерилизовали путем фильтрации через элемент с размером пор 0,2 мкм и разбавляли буфером для хранения (10 мМ Трис-HCl pH 7,4 с 3% (мас./об.) сахарозы) до концентрации PorA 1 мг/мл. При этой концентрации суммарные OMV можно надежно хранить при температуре 4°C в течение по меньшей мере 6 месяцев без потери качества (таблица 2).
Увеличение выхода, достигнутое путем сбора технологической культуры через 3 часа после наступления фазы стационарного роста и проведения экстрагирования OMV при значении pH 8,6, составило 2,7 раза, и оно может быть еще увеличено до 6,3 раз (таблица 3) если проводить сбор через 9 часов после наступления стационарного роста и модифицировать способ для улучшения его производительности по удалению ДНК (т.е., при использовании 10000 Ед./л Benzonase общий выход вышеописанного способа составил 30±4 мг тривалентного PorA на литр технологической культуры, что эквивалентно 1338 человеческим дозам по 7,5 мкг на субтип PorA). Этот выход PorA был получен с общей эффективностью процесса выделения и очистки 33±7%. Стерильная фильтрация была включена в это расчет, и это подчеркивает, что описанный способ приводит к высокой эффективности и воспроизводимости фильтрования (92%±4%, таблица 4), по сравнению со стандартными способами. Стандартные способы либо используют консерванты [тиомерсалат; Fredriksen et al., 1991 и Claasen et al., 1996], для предотвращения потерь выхода, связанных со стерильной фильтрацией, либо включают в себя этапы способа с механическим сдвигом, чтобы уменьшить размер OMV и повысить эффективность [RIVM 2007 NonaMen: Van den Dobbelsteen et al., 2007 и Zollinger et al., 2010]. Кроме того, тривалентные суммарные OMV из вышеупомянутых штаммов имели более высокую чистоту PorA по сравнению с OMV из других штаммов и способов [Zollinger et al., 2010, Патент США US6558677 (фиг.5); Fredriksen et al., 1991]. Обычное содержание тривалентных PorA составило 60-80% от общего содержания белка (фиг.2). Несмотря на высокое содержание ЛПС, наблюдалась низкая токсичность. Это стало возможным, благодаря делеции lpxL1, которая ослабляет токсичность ЛПС [Van de Waterbeemd et al., 2010].
4
Тривалентные суммарные OMV из вышеперечисленных штаммов были пропорционально смешаны, чтобы получить нонавалентные суммарные OMV, и затем разбавлены буфером для хранения до конечной концентрации нонавалентного PorA 0,135 мг/мл (7,5 мкг на субтип PorA на дозу; без адъюванта) и до конечной концентрации нонавалентного PorA 0,270 мг/мл (15 мкг на субтип PorA на дозу; без адъюванта и с адъювантом AlPO). Эти три различные вакцины разделяли на аликвоты по 0,5 мл и хранили при температуре 4°C до парентерального введения кроликам в дни 1, 15 и 29.
Все вакцины показали значительно более высокие бактерицидные титры в день D=43, чем в день D=0, при этом не наблюдалось значительного эффекта, связанного с дозой или адъювантом. Эти результаты свидетельствуют о том, что RL 7,5 мкг/PorA содержит достаточное количество антигена, и что отсутствует необходимость в использовании адъювантов, когда вакцину получают способом настоящего изобретения. Кроме того, OMV-вакцины вызывали перекрестную защиту, основанную на других антигенах, отличных от только PorA, что показано высокими бактерицидными титрами против ΔporA штамма HI5 (фиг.2).
Таблица 2
Анализ различных тривалентных OMV при длительном хранении
RL16215 тривалентный суммарный продукт
RL10124 тривалентный суммарный продукт
RL1416 тривалентный суммарный продукт
Анализ
Единицы
t=0
t=6 месяцев
t=12 месяцев
t=0
t=6 месяцев
t=12 месяцев
t=0
t=6 месяцев
t=12 месяцев
Концентрация общего белка
мг/мл
1,31
1,26
1,27
1,16
1,09
1,07
1,68
1,88
1,6
Процент PorA
% от общего белка
70
62
72
65
79
82
65
64
66
Процент агрегации
%
1,2
3,7
1,0
2,4
0,0
0,0
7,0
2,0
0,0
Диаметр частиц
d.нм
79
77
80
70
70
71
67
81
77
Таблица 3
Выходы OMV и ДНК, полученные при различных значениях времени сбора (в часах после наступления стационарного роста) и pH (экстрагирующего ЭДТА буфера). Результаты вычисляли с использованием прогностических моделей, полученных из результатов экспериментального плана исследования. В результатах #1-#3 значения времени сбора и pH были оптимизированы для самого низкого (#1) или самого высокого (#2) возможного выхода OMV и для самого высокого выхода OMV с ограничением выхода ДНК (#3). Результаты #4-#8 были получены с предопределенными значениями для времени сбора и фиксированными значениями pH. Выход определяли в мг/л неочищенного экстракта.
Оптимизация цели
Значение
Результаты
Примечания
Выход OMV
Выход ДНК
Время сбора
pH
Выход OMV
Выход ДНК
Выход OMV относительно #1
#1
Минимальный
-
1,0
7,4
35±17
11±8
-
Самый низкий возможный выход OMV, без ограничения выхода ДНК
#2
Максимальный
-
9,0
9,0
227±17
80±9
6,5-кратный
Самый высокий возможный выход OMV, без ограничения выхода ДНК
#3
Максимальный
0 мкг
3,3
8,4
99±11
0±10
2,8-кратный
Самый высокий возможный выход OMV, с поддержанием низкого выхода ДНК
#4
-
-
1,0
8,6
54±15
7±7
1,5-кратный
Предопределенные значения, без установленных целей выхода
#5
-
-
3,0
8,6
95±12
-2±10
2,7-кратный
#6
-
-
5,0
8,6
137±11
9±12
3,9-кратный
#7
-
-
7,0
8,6
179±12
39±10
5,1-кратный
#8
-
-
9,0
8,6
221±15
90±7
6,3-кратный
Таблица 4
Эффективность стерильной фильтрации трех последовательных партий суммарных OMV. Наблюдались незначительные потери (<10%), которые в основном были связаны с мертвым объемом стерильного фильтра
Параметр
Партия 1
Партия 2
Партия 3
Среднее
Выход тривалентных PorA до стерильной фильтрации (мг)
1553
1404
1308
1422±124
Выход тривалентных PorA после стерильной фильтрации (мг)
1420
1229
1257
1302±103
Эффективность стерильной фильтрации (%)
91%
88%
96%
92±4%
Список литературных источников
1. Girard MP, Preziosi MP, Aguado MT, Kieny MP. A review of vaccine research and development: meningococcal disease. Vaccine 2006; 24(22): 4692-700.
2. Sharip A, Sorvillo F, Redelings MD, Mascola L, Wise M, Nguyen DM. Populationbased analysis of meningococcal disease mortality in the United States: 1990-2002. Pediatr Infect Dis J 2006; 25(3): 191-4.
3. Kaplan SL, Schutze GE, Leake JA, Barson WJ, Halasa NB, Byington CL, et al. Multicenter surveillance of invasive meningococcal infections in children. Pediatrics 2006; 118(4): e979-84.
4. Trotter CL, Chandra M, Cano R, Larrauri A, Ramsay ME, Brehony C, et al. A surveillance network for meningococcal disease in Europe. FEMSMicrobiol Rev 2007; 31(1): 27-36.
5. Gray SJ, Trotter CL, Ramsay ME, Guiver M, Fox AJ, Borrow R, et al. Epidemiology of meningococcal disease in England and Wales 1993/94 to 2003/04: contribution and experiences of the Meningococcal Reference Unit. J Med Microbiol 2006; 55(Pt 7): 887-96.
6. Snape MD, Perrett KP, Ford KJ, John TM, Pace D, Yu LM, et al. Immunogenicity of a tetravalent meningococcal glycoconjugate vaccine in infants: a randomized controlled trial. Jama 2008; 299(2): 173-84.
7. Morley SL, Pollard AJ. Vaccine prevention of meningococcal disease, coming soon? Vaccine 2001; 20(5-6): 666-87.
8. Finne J, Leinonen M, Makela PH. Antigenic similarities between brain components and bacteria causing meningitis. Implications for vaccine development and pathogenesis. Lancet 1983; 2(8346): 355-7.
9. Bjune G, Hoiby EA, Gronnesby JK, Arnesen O, Fredriksen JH, Halstensen A, et al. Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lancet 1991; 338(8775): 1093-6.
10. Thornton V, Lennon D, Rasanathan K, O'Hallahan J, Oster P, Stewart J, et al. Safety and immunogenicity of New Zealand strain meningococcal serogroup B OMV vaccine in healthy adults: beginning of epidemic control. Vaccine 2006; 24(9): 1395-400.
11. Martin DR, Walker SJ, Baker MG, Lennon DR. New Zealand epidemic of meningococcal disease identified by a strain with phenotype B:4:P1.4. J Infect Dis 1998; 177(2): 497-500.
12. Sierra GV, Campa HC, Varcacel NM, Garcia IL, Izquierdo PL, Sotolongo PF, et al. Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann 1991; 14(2): 195-207, discussion 208-10.
13. Fredriksen JH, Rosenqvist E, Wedege E, Bryn K, Bjune G, Froholm LO, et al. Production, characterization an control of MenB-vaccine "Folkehelsa": an outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease. NIPH Ann 1991; 14(2): 67-79, discussion 79-80.
14. Deatherage BL, Lara JC, Bergsbaken T, Rassoulian Barrett SL, Lara S, Cookson BT. Biogenesis of bacterial membrane vesicles. Mol Microbiol 2009; 72(6): 1395-407.
15. Saukkonen K, Leinonen M, Abdillahi H, Poolman JT. Comparative evaluation of potential components for group B meningococcal vaccine by passive protection in the infant rat and in vitro bactericidal assay. Vaccine 1989; 7(4): 325-8.
16. Martin DR, Ruijne N, McCallum L, O'Hallahan J, Oster P. The VR2 epitope on the PorA PI.7-2,4 protein is the major target for the immune response elicited by the strain-specific group B meningococcal vaccine MeNZB. Clin Vaccine Immunol 2006; 13(4): 486-91.
17. van der Ley P, van der Biezen J, Poolman JT. Construction of Neisseria meningitidis strains carrying multiple chromosomal copies of the porA gene for use in the production of a multivalent outer membrane vesicle vaccine. Vaccine 1995; 13(4): 401-7.
18. Claassen I, Meylis J, van der Ley P, Peeters C, Brons H, Robert J, et al. Production, characterization and control of a Neisseria meningitidis hexavalent class 1 outer membrane protein containing vesicle vaccine. Vaccine 1996; 14(10): 1001-8.
19. de Kleijn E, van Eijndhoven L, Vermont C, Kuipers B, van Dijken H, Rumke H, et al. Serum bactericidal activity and isotype distribution of antibodies in toddlers and schoolchildren after vaccination with RIVM hexavalent PorA vesicle vaccine. Vaccine 2001; 20(3-4): 352-8.
20. van den Dobbelsteen GP, van Dijken HH, Pillai S, van Alphen L. Immunogenicity of a combination vaccine containing pneumococcal conjugates and meningococcal PorA OMVs. Vaccine 2007; 25(13): 2491-6.
21. Arigita C, Luijkx T, Jiskoot W, Poelen M, Hennink WE, Crommelin DJ, et al. Welldefined and potent liposomal meningococcal B vaccines adjuvated with LPS derivatives. Vaccine 2005; 23(43): 5091-8.
22. Arigita C, Kersten GF, Hazendonk T, Hennink WE, Crommelin DJ, Jiskoot W. Restored functional immunogenicity of purified meningococcal PorA by incorporation into liposomes. Vaccine 2003; 21(9-10): 950-60.
23. Steeghs L, Tommassen J, Leusen JH, van de Winkel JG, van der Ley P. Teasing apart structural determinants of 'toxicity' and 'adjuvanticity': implications for meningococcal vaccine development. J Endotoxin Res 2004; 10(2): 113-9.
24. Koeberling O, Giuntini S, Seubert A, Granoff DM. Meningococcal outer membrane vesicle vaccines derived from mutant strains engineered to express factor Hbinding proteins from antigenic variant groups 1 and 2. Clin Vaccine Immunol 2009; 16(2): 156-62.
25. Koeberling O, Seubert A, Granoff DM. Bactericidal antibody responses elicited by a meningococcal outer membrane vesicle vaccine with overexpressed factor Unbinding protein and genetically attenuated endotoxin. J Infect Dis 2008; 198(2): 262-70.
26. van der Voort ER, van der Ley P, van der Biezen J, George S, Tunnela O, van Dijken H, et al. Specificity ofhumanbactericidal antibodies against PorA PI.7,16 induced with a hexavalent meningococcal outer membrane vesicle vaccine. Infect Immun 1996; 64(7): 2745-51.
27. Hoist J, Martin D, Arnold R, Huergo CC, Oster P, O'Hallahan J, et al. Properties and clinical performance of vaccines containing outer membrane vesicles from Neisseria meningitidis. Vaccine 2009; 27(Suppl. 2): B3-12.
28. Cametti C. Polyion-induced aggregation of oppositely charged liposomes and charged colloidal particles: the many facets of complex formation in low density colloidal systems. Chem Phys Lipids 2008; 155(2): 63-73.
29. Zollinger WD, Mandrell RE, Griffiss JM, Altieri P, Berman S. Complex of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenic in man. J Clin Invest 1979; 63(5): 836-48.
30. Post DM, Zhang D, Eastvold JS, Teghanemt A, Gibson BW, Weiss JP. Biochemical and functional characterization of membrane blebs purified from Neisseria meningitidis serogroup B. J Biol Chem 2005; 280(46): 38383-94.
31. Devoe IW, Gilchrist JE. Release of endotoxin in the form of cell wall blebs during in vitro growth of Neisseria meningitidis. JExpMed 1973; 138(5): 1156-67.
32. Hoekstra D, van der Laan JW, de Leij L, Witholt B. Release of outer membrane fragments from normally growing Escherichia coli. Biochim Biophys Acta 1976; 455(3): 889-99.
33. Guthrie T, Wong SY, Liang B, Hyland L, Hou S, Hoiby EA, et al. Local and systemic antibody responses in mice immunized intranasally with native and detergent extracted outer membrane vesicles from Neisseria meningitidis. Infect Immun 2004; 72(5): 2528-37.
34. Katial RK, Brandt BL, Moran EE, Marks S, Agnello V, Zollinger WD. Immunogenicity and safety testing of a group B intranasal meningococcal native outer membrane vesicle vaccine. Infect Immun 2002; 70(2): 702-7.
35. Saunders NB, Shoemaker DR, Brandt BL, Moran EE, Larsen T, Zollinger WD. Immunogenicity of intranasally administered meningococcal native outer membrane vesicles in mice. Infect Immun 1999; 67(1): 113-9.
36. Drabick JJ, Brandt BL, Moran EE, Saunders NB, Shoemaker DR, Zollinger WD. Safety and immunogenicity testing of an intranasal group B meningococcal native outer membrane vesicle vaccine in healthy volunteers. Vaccine 1999; 18(1-2): 160-72.
37. Ferrari G, Garaguso I, Adu-Bobie J, Doro F, Taddei AR, Biolchi A, et al. Outer membrane vesicles from group B Neisseria meningitidis delta gna33 mutant: proteomic and immunological comparison with detergent-derived outermembrane vesicles. Proteomics 2006; 6(6): 1856-66.
38. van der Ley P, Steeghs L, Hamstra HJ, ten Hove J, Zomer B, van Alphen L. Modification of lipid A biosynthesis in Neisseria meningitidis lpxL mutants: influence on lipopolysaccharide structure, toxicity, and adjuvant activity. Infect Immun 2001; 69(10): 5981-90.
39. Fisseha M, Chen P, Brandt B, Kijek T, Moran E, Zollinger W. Characterization of native outer membrane vesicles from lpxL mutant strains of Neisseria meningitides for use in parenteral vaccination. Infect Immun 2005; 73(7): 4070-80.
40. Van de Waterbeemd B, Streefland M, van der Ley P, Zomer B, van Dijken H, Martens D, Wijffels R, van der Pol L. Improved OMV vaccine aginst Neisseria meningitidis using gentically engineered strains and dtergent-free purification process. Vaccine 2010; 28: 4810-4816.
41. Prachayasittikul, Z et al. EDTA-induced membrane fluidization and destabilization: biophysical studies on artificial lipid membranes. Acta Biochim Biophys Sin 2007; 39(11): 901-913.
42. Holten, E., Serotypes of Neisseria meningitidis isolated from patients in Norway during the first six months of 1978. J Clin Microbiol, 1979. 9(2): p. 186-188.
43. Baart, G.J., et al. Scale-up for bulk production of vaccine against meningococcal disease. Vaccine, 2007. 25(34): p. 6399-408.