ШТАММ ВИРУСА ГРИППА A/IIV-Anadyr/177-ma/2009 (H1N1) pdm09, АДАПТИРОВАННЫЙ К ТКАНЯМ ЛЕГКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ
STRAIN OF FLU VIRUS A/IIV-Anadyr/177-ma/2009 (H1N1) pdm09, ADAPTED TO TISSUES OF LIGHT LABORATORY RODENTS

Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано в вирусологических, иммунологических, молекулярно-биологических и фармацевтических методах для изучения биологических свойств пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09, разработки средств и методов лечения и профилактики гриппа, этиологически связанного с вирусом гриппа А (H1N1) pdm09, разработки средств и методов индикации вируса гриппа А (H1N1) pdm09.
Вирус гриппа A (Orthomyxoviridae, Influenza A virus) является этиологическим агентом обширных эпизоотии, эпидемий и пандемий, которые способны протекать с высоким уровнем смертности. Так, эпидемия «испанского гриппа» (1918-1919 гг.), вызванная вирусом гриппа А (H1N1) [1, 2], стала причиной 50-100 млн человеческих смертей по всему миру [3, 4]. Крупная эпидемия «русского гриппа» (1977-1978 гг.) была также вызвана субтипом H1N1 [1, 5].
Вирус гриппа А (H1N1) был впервые изолирован от свиней Ричардом Шоупом в 1931 г. [6, 7]. Первое документированное подтверждение заражения человека «свиным» вариантом гриппа A (Hsw1N1) было сделано чехословацкими учеными в 1958 г. с помощью серологических методов [8]. В июле 1974 г. штамм «свиного» гриппа A/Mayo Clinic/103/1974 (Hsw1N1) был изолирован от больного работника свинофермы (США, штат Миннесота), впоследствии скончавшегося [9]. В январе 1976 г. - на фоне циркуляции сезонного эпидемического гриппа А/H3N2 - на военной базе, расположенной в Форт-Дикс (США, штат Нью-Джерси), возникла эпидемическая вспышка гриппа среди новобранцев (230 случаев заболевания; из них 4 (1.7%) были осложнены пневмонией, 1 (0.4%) летальный), этиологический агент которой был типирован как Hsw1N1 [10]. В феврале 1982 г. штамм вируса гриппа А (Hsw1N1) был изолирован из назофарингеальных смывов четырехлетней девочки (США, штат Невада), страдавшей острым лейкозом, которая была госпитализирована с тяжелой формой пневмонии и спустя 8 сут умерла [11]. Зимой 1986 г. два штамма «свиного» вируса гриппа A (H1N1) были изолированы от больных людей в Швейцарии и один - в Нидерландах [12]. В сентябре 1988 г. вирус гриппа А/H1N1 стал причиной развития ОРЗ, перешедшего в тяжелую пневмонию, и смерти 32-летней женщины на 3-м триместре беременности в США, штат Висконсин [13]. В июле 1991 г. штамм A/Maryland/12/1991 (H1N1) был изолирован из бронхиального секрета 27-летнего зоотехника (США, штат Мериленд), отобранного на 4-е сут после развития бактериальной пневмонии [14]. Штамм A/Hong Kong/1774/1999 (H3N2), изолированный из назофарингеальных смывов больного ребенка в Таиланде в сентябре 1999 г., оказался близок к представителям этого субтипа, циркулирующим среди свиней в Европе [15]. В период 2005-2009 гг. в США были зафиксированы 11 случаев заболевания людей американским генотипом вируса гриппа А (H1N1) свиней [16].
Пандемия гриппа A (H1N1) pdm09 этиологически связана с вариантом вируса гриппа А (H1N1) свиного происхождения, который сумел преодолеть межвидовой барьер. Пандемический вариант вируса представляет собой реассортант двух генотипов субтипа H1N1: т.н. «американского» (ставшего источником сегментов РВ2, РВ1, РА, НА, NP и NS) и «европейского» (NA и М) [1, 17].
В середине марта 2009 г. произошел чрезвычайно высокий и резкий скачок заболеваемости ОРВИ в г. Ла-Глория (Мексика, штат Веракрус), когда заболеваемость составила 60% от населения города. К 12 апреля эпидемия гриппоподобного заболевания докатилась уже до столицы этого штата Мексики - г.Веракрус, где официально было объявлено о превышении эпидемического порога [18]. 14 апреля несубтипируемый ранее штамм от госпитализированного 30 марта в г.Сан-Диего мальчика был субтипирован как вирус гриппа A (H1N1)pdm09 - прототипный штамм A/California/04/09. Дальнейшее распространение этого варианта вируса гриппа А и развитие привело к тому, что 11.06.2009 ВОЗ официально объявила о начале очередной пандемии гриппа.
В РФ с конца апреля 2009 г. МЗСР проведены организационно-методические мероприятия по усилению надзора за активным выявлением случаев инфицирования людей новым штаммов вируса гриппа. Всех лиц с ОРВИ, прибывающих из стран, где зарегистрированы такие случаи, госпитализировали в ИКБ №1 г.Москвы для уточнения диагноза и проведения расширенной диагностики. Предпандемический период включал развитие эпидемического до 11 июня 2009 г. (даты официального объявления 6-го уровня предпандемической опасности); начальный пандемический - с 12 июня по 15 августа 2009 г.; пандемический - с 15 августа 2009 г.
Предпандемический период в ряде регионов России еще сопровождался высокой заболеваемостью детей (Владимир, Ярославль), обусловленной затянувшейся циркуляцией сезонных штаммов вирусов гриппа [19, 20]. В этот период усиление эпиднадзора было направлено, в первую очередь, за состоянием здоровья лиц, пребывающих в Россию из стран, где регистрировали случаи инфицирования новым пандемическим штаммом вируса гриппа A (H1N1)pdm09. Благодаря этому, 21 мая 2009 г. сотрудниками ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России был выявлен первый случай заболевания россиянина, прибывшего из США, а 24 мая - выделен и депонирован в Государственную Коллекцию вирусов РФ (удостоверение ГКВ 2452 с приоритетом 24.05.2009) первый штамм, получивший название A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)pdm09 [21] (на этот штамм был получен патент РФ №2412244 с приоритетом 30.07.2011). Официальное объявление ВОЗ об окончании последней пандемии гриппа поступило 10.08.2010. За этот период в мире грипп стал причиной гибели 18.5 тыс человек.
В настоящее время, вариант вируса гриппа A (H1N1)pdm09 продолжает циркулировать в человеческой популяции в ранге обычного эпидемического варианта наряду с вирусами гриппа В и A (H3N2). В эпидемиологическом сезоне 2010-2011 гг. вирус гриппа A (H1N1)pdm09 доминировал. Таким образом, этот вариант вируса является эпидемически актуальным [22], что определяет необходимость разработки средств его индикации и идентификации, диагностики вызываемого им заболевания, а также поиск эффективных средств и методов защиты.
Задачей настоящего изобретения является получение штамма вируса гриппа A/IIV-Anadyr/177-ma/2009(H1N1)pdm09, адаптированного к тканям легких лабораторных мышей.
Поставленная задача решается штаммом вируса гриппа A/IIV-Anadyr/177-ma/2009 (H1N1)pdm09, адаптированным к тканям легких лабораторных мышей, предназначенным для изучения эффективности противовирусных химиопрепаратов, средств и методов лечения гриппа и связанных с ним пневмоний, на модели экспериментальной пневмонии лабораторных мышей.
Сущность изобретения состоит в том, что в результате многократного пассирования родительского штамма A/IIV-Anadyr/177/2009 (H1N1)pdm09 на моделях развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ), инфицированных в аллантоисную полость, и беспородных лабораторных белых мышей, инфицированных интраназально, получен штамм A/IIV-Anadyr/177-ma/2009(H1N1)pdm09 (аббревиатура «ma» - от англ. «mice-adapted», адаптированный к мышам), который способен активно репродуцироваться в тканях легких лабораторных мышей, вызывая у них летальную пневмонию, что может быть использовано для моделирования in vivo тяжелого течения гриппозной инфекции.
В настоящем изобретении представлены биологические свойства этого вируса. Принадлежность родительского штамма A/IIV-Anadyr/177/2009 (H1N1)pdm09 и адаптированного к тканям легких лабораторных мышей штамма A/IIV-Anadyr/177-ma/2009 (H1N1)pdm09 доказана методом ОТ-ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием универсальных праймеров и зонда, специфических для гена М вируса гриппа А, гена NP и гена H1 пандемического вируса гриппа А / H1N1 pdm09 (Applied Biosystem, USA, № PN4441240C в соответствии с «CDC protocol of real-time RT-PCR for influenza A (H1N1), 28 April 2009»), а также реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с набором референс-сывороток против штаммов: 1. A/swine/1976/1931 (Hsw1N1) (ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России, Санкт-Петербург); 2. A/Califomia/04/2009 (H1N1) pdm09 (ФГБУ«НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России, Москва); 3. A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1) pdm09 (ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России, Москва). В реакции биологической нейтрализации (РН) вирус нейтрализуется иммунной сывороткой к штамму A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1) pdm09 до полного гомологичного титра.
50
50
50

Штамм вируса гриппа A/IIV-Anadyr/177-ma/2009 (H1N1) pdm09 вызывает 100% гибель мышей при интраназальном заражении в дозе 10 ЛД (50%-я летальная доза); обладает инфекционным титром 7.2 lg ТЦИД (50%-я тканевая цитопатическая инфекционная доза) для перевиваемой клеточной линии MDCK и 7.9 lg ЭИД (50%-я эмбриональная инфекционная доза) для РКЭ. Штамм вируса гриппа A/IIV-Anadyr/177-ma/2009 (H1N1) pdm09 чувствителен к Осельтамивиру (Тамифлю), Занамивиру (Релензе), Ингавирину, Арбидолу, Рибавирину (Виразолу) и резистентен к Римантадину (Ремантадину).
Пример выполнения.
В декабре 2009 г. в Центре экологии и эпидемиологии гриппа с Референс-Центром по диагностике гриппа при ФГБУ«НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России из гомогената легких умершего человека был изолирован штамм вируса гриппа A/Anadyr/177/2009 (H1N1) pdm09.
50
Пациент R, мужчина 46 лет, поступил в ГУЗ «Чукотская окружная больница» в тяжелом состоянии (клинический диагноз: пневмония) и умер в результате развития дыхательной недостаточности (ДН) и острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). Посмертный диагноз: двусторонняя (тотальная слева, субтотальная справа) геморрагическая первичная вирусная пневмония. Биопробы легочной ткани были доставлены в ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России без нарушения холодовой цепочки. Доставленный образец был обследован методом ОТ-ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием универсальных праймеров и зонда, специфических для гена М вируса гриппа А, гена NP и гена H1 пандемического вируса гриппа A (H1N1)pdm09 (Applied Вiosystem, USA, № PN4441240C в соответствии с «CDC protocol of real-time RT-PCR for influenza A (H1N1), 28 April 2009»), и был обнаружен генетический материал пандемического гриппа A (H1N1)pdm09. Изоляция штамма осуществлялась на модели РКЭ. Идентификация штамма проводилась методом реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции нейтрализации (РН) с набором типоспецифических антисывороток крысы, ОТ-ПЦР в реальном времени (см. выше) и секвенирования генома вируса. Исходный штамм A/Anadyr/177/2009 (H1N1)pdm09 был использован для получения путем 8-кратного пассирования сначала в РКЭ, а затем 8-кратного пассирования на беспородных лабораторных белых мышах методом интраназального заражения штамма вируса гриппа A/Anadyr/177-ma/2009 (H1N1)pdm09. Использовались беспородные белые мыши женского пола массой 14-16 г. В процессе пассирования исходный штамм значительно увеличил свою тропность к легочной ткани мышей. Адаптированный штамм A/Anadyr/177-ma/2009 (H1N1)dm09 вызывает 100% гибель мышей при интраназальном заражении в дозе 10 ЛД. При этом у мышей развивается геморрагический отек легких. Вирусный генез поражения тканей легких был подтвержден нарастанием титра вируса в ходе инфекции, патологоанатомическими и патоморфологическими исследованиями, а также дозозависимым характером снижения смертности животных и выраженности патологоанатомических признаков инфекции под действием специфических противовирусных препаратов.
Таким образом, штамм пандемического гриппа A/Anadyr/177-ma/2009 (H1N1), dm09 может быть использован для изучения эффективности новых противовирусных химиопрепаратов на модели экспериментальной пневмонии лабораторных мышей.
Родословная штамма A/Anadyr/177-ma/2009 (H1N1), dm09 представлена на рис.1.
Число пассажей штамма A/Anadyr/177-ma/2009 (H1N1), dm09 на момент патентования: 2 пассажа на модели интраназально инокулированных беспородных лабораторных белых мышей.
Характеристика штамма A/Anadyr/177-ma/2009 (H1N1), dm09:
А. Особенностями выделенного штамма являются:
A.1. способность репродуцироваться в тканях легких лабораторных мышей;
А.2. способность вызывать пневмонию лабораторных мышей при интраназальном заражении с четкими клиническими проявлениями: гиперемия, вялость, свалявшаяся шерсть, отечность области носа, кашель, чихание, хрипы при дыхании, водянистые выделения из носа (часто - с примесью крови);
А.3. способность вызывать гибель лабораторных мышей при интраназальном заражении в результате развития вирусной пневмонии.
Рисунок 1. Родословная штамма вируса гриппа A/Anadyr/177 ma/2009 (H1N1), dm09.
Б. Штамм характеризуется:
50
50
50
Б.1. способностью репродуцироваться в культуре клеток MDCK (7.2 lg ТЦИД через 72 ч после инокуляции), в 9-10 дневных РКЭ (7.9 lg ЭИД через 48 ч после инокуляции в аллантоисную полость) и в легких интраназально инфицированных лабораторных мышей (5.1 lg ЛД через 72 ч после инокуляции интраназально);
Б.2. способностью вызывать гемагглютинацию человечески эритроцитов в титре 1:8-1:16 при пассировании в перевиваемой клеточной линии MDCK и легких лабораторных мышей, 1:16-1:32 - в РКЭ;
Б.3. способностью вызывать гемагглютинацию куриных эритроцитов в титре 1:8 при пассировании в перевиваемой клеточной линии MDCK, 1:16-1:32 - в легких лабораторных мышей и в РКЭ;
Б.4. термолабильностью: инактивируется при нагревании в течение 1 ч при 56°С;
Б5. неспособностью вызывать гибель лабораторных мышей и лабораторных крыс при подкожном, внутримышечном и внутрибрюшинном способе введения;

Б6. чувствительностью к Осельтамивиру (Тамифлю), Занамивиру (Релензе), Ингавирину, Арбидолу, Рибавирину(Виразолу) и резистентен к Римантадину (Ремантадину);
Б7. отсутствием контаминации микрофлорой, грибами, другими вирусами.
В. Форма хранения штамма: гомогенат легких инфицированных беспородных белых лабораторных мышей в условиях вакуума замораживают при - 70°С в течение 4-6 ч, затем температуру повышают до 20°С; далее следует досушивание в течении 10-16 ч, закупорка флаконов и облицовка алюминиевыми колпачками.
Литература
1. Щелканов М.Ю., Львов Д.К. Генотипическая структура рода Influenza A vims // Вестник РАМН. - 2011. - №5. - С.19-23.
2. Taubenberger J.K. The origin and virulence of the 1918 «Spanish» influenza virus // Proc. Am. Philos. Soc. - 2006. - V.150. - N 1. - P.86-112.
3. Садов А.А. Эпидемический грипп. - Л., 1927. - 60 с.
4. Johnson N.P., Mueller J. Updating the accounts: global mortality of the 1918-1920 “Spanish” influenza pandemic // Bull. Hist. Med. - 2002. - V.76. - N 1. - P.105-115.
5. Смородинцев А.А., Лузянина Т.Я., Иванова Н.А. Возвращение вируса гриппа А-прим и проблема происхождения пандемических штаммов // Вопросы вирусологии. - 1979. - №1. - С.87-90.
6. Shope R.E. Swine influenza: I. Experimental transmission and pathology // J. Exp.Med. - 1931. - V.54. - P.349-359.
7. Shope R.E. Swine influenza: III. Filtration experiments and etiology // J. Exp. Med. - 1931. - V.54. - P.373-385.
8. Kluska V, Macku M, Mensik J. Demonstration of antibodies against swine influenza viruses in man // Cesk. Pediatr. - 1961. - V.16. - P 408-414.
9. Smith T.F., Burgert E.O. Jr., Dowdle W.R., Noble G.R., Campbell R.J., Van Scoy R.E. Isolation of swine influenza virus from au-topsy lung tissue of man // N. Engl. J. Med. - 1976. - V.294. - P.708-710.
10. Gaydos J.C., Top F.H.Jr., Hodder R.A., Russell P.K. Swine influenza A outbreak, Fort Dix, New Jersey, 1976 // Emerg. Infect. Dis. - 2006. - V.12. - P.23-28.
11. Patriarca P.A., Kendal A.P., Zakowski P.C., Cox N.J., Trautman M.S., Cherry J.D., Auerbach D.M., McCusker J., Belliveau R.R., Kappus K.D. Lack of significant person-to-person spread of swine influenza-like virus following fatal infection in an immunocompromised child // Am. J. Epidemiol. - 1984. - V.119. - P.152-158.
12. De Jong J.C., Paccaud M.F., de Ronde-Verloop P.M., Huffels N.H., Verwei C., Weijers T.F., Bangma P.J., van Kregten E., Kerckhaert J.A., Wicki F. Isolation of swine-like influenza A (H1N1) viruses from man in Switzerland and The Netherlands // Ann. Inst. Pasteur. Virol. - 1988. - V.139. - P.429-437.
13. McKinney W.P., Volkert P., Kauftnan J. Fatal swine influenza pneumonia during late pregnancy // Arch. Intern. Med. - 1990. - V.150. - P.213-215.
14. Wentworth D.E., Thompson B.L., Xu X., Regnery H.L., Cooley A.J., McGregor M.W., Cox N.J., Hinshaw V.S. An influenza A (H1N1) virus, closely related to swine influenza virus, responsible for a fatal case of human influenza // J. Virol. - 1994. - V.68. - P.2051-2058.
15. Gregory V., Lim W., Cameron K., Bennett M., Marozin S., Klimov A., Hall H., Cox N., Hay A., Lin Y.P. Infection of a child in Hong Kong by an influenza A H3N2 virus closely related to viruses circulating in European pigs // J. Gen. Virol. - 2001. - V.82. - P.1397-1406.
16. Shinde V., Bridges С.В., Uyeki T.M., Shu B., Balish A., Xu X., Lindstrom S., Gubareva L.V., Deyde V., Garten R.J., Harris M., Gerber S., Vagasky S., Smith F., Pascoe N., Martin K., Dufficy D., Ritger K., Conover C., Quinlisk P., Klimov A., Bresee J.S., Finelli L. Triple-reassortant swine influenza A (H1) in humans in the United States, 2005-2009 // N. Engl. J. Med. - 2009. - V.360. - N25. - P.2616-2625.
17. Zimmer S.M., Burke D.S. Historical Perspective - Emergence of Influenza A (H1N1) viruses // N. Engl. J. Med. - 2009. - V.361. - P.279-285.
18. CDC. Outbreak of swine-origin Influenza A (H1N1) virus infection: Mexico, March-April 2009 / MMWR. - 2009. - April, 30.
19. Львов Д.К., Бурцева Е.И., Щелканов М.Ю., Прилипов А.Г., Колобухина Л.В., Малышев Н.А., Базарова М.В., Меркулова Л.Н., Дерябин П.Г., Кузьмичев А.Г., Федякина И.Т., Гребенникова Т.В., Усачев Е.В., Садыкова Г.К., Шевченко Е.С., Трушакова С. В., Лаврищева В.В., Альховский С. В., Самохвалов Е.И., Белякова Н.В., Иванова В.Т., Оскерко Т.А., Латышев О.Е., Беляев A.M., Беляев А.Л., Феодоритова Е.Л. Распространение нового пандемического вируса гриппа А (H1N1) v в России // Вопросы вирусологии. - 2010. - Т.55. - №3. - 4-9.
20. Lvov D.K. Molecular ecology of influenza and other emerging viruses in Northern Eurasia: global consequences // In: Materials of International Conference “Emerging influenza viruses (H5N1, H1N1)” (15-16 February, 2010, Marburg, Germany). - Marburg: Koch-Mechnikov Forum, 2010. - P.23.
21. Львов Д.К., Бурцева Е.И., Прилипов А.Г., Базарова М.В., Колобухина Л.В., Меркулова Л.Н., Малышев Н.А., Дерябин П.Г., Федякина И.Т., Садыкова Г.К., Усачев Е.В., Щелканов М.Ю., Шевченко Е.С., Трушакова С.В., Иванова В.Т., Белякова Н.В., Оскерко Т.А., Алипер Т.И. Изоляция 24.05.2009 и депонирование в Государственную коллекцию вирусов (ГКВ N 2452 от 24.05.2009) первого штамма A/Moscow/01/2009 (H1N1) sw1, подобного свиному вирусу А (H1N1) от первого выявленного 21.05.2009 больного в г.Москве // Вопросы вирусологии. - 2009. - Т. 54. - №5. - С.10-14.
22. Львов Д.К., Бурцева Е.И., Прилипов АГ., Богданова B.C., Щелканов М.Ю., Бовин Н.В., Самохвалов Е.И., Федякина И.Т., Дерябин П.Г., Колобухина Л.В., Штыря Ю.А., Шевченко Е.С., Малышев Н.А., Меркулова Л.Н., Базарова М.В., Маслов А.И., Ищенко Н.М., Исхакова Е.А., Альховский С.В., Гребенникова Т.В., Садыкова Г.К., Львов Д.Н., Журавлева М.М., Ямникова С.С., Шляпникова О.В., Поглазов А.Б., Трушакова С.В., Лаврищева В.В., Аристова В.А., Прошина Е.С., Верещагин Н.Н., Кузьмичев А.Г., Яшкулов К.Б., Джамбинов С.Д., Бушкиева Б.Ц., Елисеева С.М., Быстраков С.И., Соколова И.А., Джапаридзе Н.И., Леденев Ю.А., Росоловский А.П., Гареев Р.В., Болдырева В.В., Ананьев В.Ю., Баранов Н.И., Гореликов В.Н., Гарбуз Ю.А., Резник В.И., Иванов Л.И., Здановская Н.И., Сергеева Н.М., Подолянко И.А., Еловский О.В., Громова М.А., Калаева Е.Е., Григорьев С.Н., Еремеева Ю.В., Довгаль М.В., Феделеш И.Ю., Сахарова Е.А., Буртник В.И., Авдошина Л.Н., Шапиро Н.П., Маслов Д.В., Янович В.А., Отт В.А., Лебедев Г.Б. Возможная связь летальной пневмонии с мутациями пандемического вируса гриппа А/H1N1 sw1 в рецептор-связывающем сайте субъединицы НА1 гемагглютинина // Вопросы вирусологии. - 2010. - Т.55. - №4. - С.4-9.