Способ создания физиологического уровня физической нагрузки, в эксперименте
METHOD FOR CREATING PHYSIOLOGICAL LEVEL OF PHYSICAL ACTIVITY, EXPERIMENTALLY

Изобретение относится к медицине, а именно к нормальной физиологии, геронтологии и может быть использовано для разработки методик физических нагрузок и тренировок у пожилых людей, а также для продления периода активного долголетия.
Физическая нагрузка является одним из наиболее распространенных факторов, с которым организм человека неизбежно встречается в повседневной жизни. Доказано, что физическая нагрузка благоприятно воздействует на физиологические функции всего организма. Умеренные физические тренировки, соответствующие физиологическому уровню, способствуют продлению периода активного долголетия, тогда как при физическом перенапряжении возможны изменения со стороны различных органов и систем, среди которых особое место занимает система гемостаза. Особенно подвержены таким осложнениям люди пожилого возраста.
В 2011 году был открыт хемокин CCL11 в плазме крови, который индуцирует апоптоз нейронов головного мозга. Доказано, что у людей с возрастом от 40 лет и далее по сравнению с молодыми людьми концентрация хемокина CCL11 в плазме крови последовательно повышается. Кроме того, обнаруживается повышенная концентрация хемокина CCL11 и при многих острых патологических состояниях: инфаркте миокарда, инсульте головного мозга, тромбоэмболии легочной артерии (ТЭЛА). Увеличение концентрации хемокина CCL11 и растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) в плазме крови, вызванное превышением физиологического уровня физической нагрузки, может служить маркером тромбинемии и синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС).
Поэтому в настоящее время актуальной проблемой является создание физиологических режимов физических нагрузок для людей пожилого возраста, направленных на улучшение качества жизни и ее продолжительности и не приводящих к повышению концентрации хемокина CCL11 и РФМК в плазме крови.
Известен способ искусственного старения, в эксперименте, разработанный Saul A. Villeda et al. (Villeda S.A., Luo J., Mosher K.I. et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 2011; 477:90-94. Doi: 10.1038/nature 10357) путем введения плазмы крови от старых мышей молодым мышам. При этом было зарегистрировано ингибирование нейрогенеза у молодых мышей. В последующих экспериментах данными авторами с помощью иммуногистохимического анализа было показано, что после внутрибрюшинного введения хемокина CCL11, регистрировалось снижение нейрогенеза, а также ухудшение процессов обучения и памяти, что позволяет считать хемокин CCL11 одним из главных возрастных факторов.
Известным способом невозможно определение достоверного физиологического уровня физической нагрузки, так как мышей принудительно подвергали искусственному старению.
Наиболее близким по достигаемому техническому результату является способ физических тренировок в эксперименте, описанный Lezi Е. et al. (Lezi Е., Burns J.M., Swerdlow R.H. Effect of high-intensity exercise on aged mouse brain mitochondria, neurogenesis, and inflammation. Neurobiol Aging. 2014; 35 (11):2574-2583. Doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2014.05.033). Физическим интенсивным тренировкам подвергались старые мыши-самцы в возрасте 21 месяца на протяжении 8 недель в режиме 5 дней в неделю. Для тренировок использовалась беговая дорожка, содержащая электрическую сетку, которая подавала электрический стимул в пределах 0,2 мА, длительностью 200 мс, с частотой 1 Гц остановившемся мышам. Физическая тренировка проводилась 2 раза в день и состояла из бега-разминки в течение 10 минут со скоростью 15 м/мин и основной нагрузки в течение 30 мин со скоростью 18 м/мин. В последующие недели тренировок разминка была сокращена до 5 мин со скоростью 15 м/мин. Основная нагрузка в течение 8 недель проводилась в течение 30 мин с еженедельным увеличением скорости от 21 м/мин до 26 м/мин. По данным авторов концентрация хемокина CCL11 в плазме крови не изменялась по сравнению с контрольной группой.
Недостатком известного способа является отсутствие доказательной базы соответствия предлагаемой физической нагрузки физиологическим параметрам, а также отсутствие подтверждения изменений со стороны других органов и систем.
Авторы предлагают эффективный способ создания физиологического уровня физической нагрузки в эксперименте, позволяющий не допускать повышения концентрации хемокина CCL11 и РФМК в плазме крови.
Техническим результатом заявляемого способа является снижение факторов риска путем физических нагрузок, соответствующих физиологическому уровню, при котором не наблюдается увеличения концентрации хемокина CCL11 и РФМК в плазме крови.
Технический результат достигается тем, что крысам-самцам создают физиологический режим физической нагрузки, заключающийся в принудительной физической тренировке в тредбане в течение 2 часов в режиме 3 раза в неделю: понедельник, среда, пятница со скоростью 6-8 м/мин в течение 30 дней.
Способ осуществляют следующим образом.
Режимы физических тренировок, приводящие к адаптивным и дизадаптивным реакциям со стороны системы гемостаза и концентрации хемокина CCL11 и РФМК в плазме крови, найдены экспериментальным путем.
2
В экспериментах использовался тредбан, представляющий собой барабан из плексигласового стекла диаметром 1 м без сквозной оси, для исключения фиксации животных на ней. Тредбан был разделен на 10 индивидуальных полых секций. Каждая секция имеет отверстия для вентиляции и удаления экскрементов, а также дверцу для обслуживания отсека. Размер каждой секции тредбана определялся, исходя из норм содержания животных, т.е. не менее 1-2 см горизонтальной поверхности беговой дорожки на 1 г массы тела животного. Тредбан через редуктор приводится в движение электродвигателем, снабженным реостатом, при помощи которого возможно изменять скорость вращения барабана.
Эксперименты по изучению влияния различных режимов физических тренировок на концентрацию хемокина CCL11 и РФМК в плазме крови были проведены на 40 старых крысах-самцах Wistar в возрасте 20-21 недели, массой 350-400 г. Животные были размещены в клетках с полубарьерной системой в экологически контролируемых условиях с 12- часовым светлым и 12- часовым темным циклом, комнатная температура составляла 22,5±0,2°С и влажность составляла 50-60%. Пресная водопроводная вода и корм находились в свободном доступе.
Животные были разделены на 4 группы и составляли одну контрольную группу и первую, вторую и третью опытные группы по 10 крыс-самцов в каждой группе.
В первой опытной группе животные подвергались ежедневным 2-часовым физическим тренировкам в тредбане путем принудительной ходьбы со скоростью 6-8 м/мин в течение 30 дней.
Во второй опытной группе животные подвергались 2-часовым физическим тренировкам в режиме 3 раза в неделю: понедельник, среда, пятница в тредбане путем принудительной ходьбы со скоростью 6-8 м/мин в течение 30 дней.
В третьей опытной группе животные подвергались ежедневным 8-часовым физическим тренировкам в тредбане путем принудительной ходьбы со скоростью 6-8 м/мин в течение 30 дней.
В контрольной группе животные находились в аналогичных условиях и не подвергались физическим тренировкам.
Животные контрольной группы и опытных групп помещались в индивидуальные секции тредбана.
Физические тренировки проводились в вечернее время с 16 до 24 часов, что соответствует времени бодрствования крыс.
По истечении 30 дней осуществляли забор крови для получения плазмы у животных опытных 1, 2, 3 групп и у контрольной группы. Перед забором крови предварительно производили наркотизацию животных путем внутрибрюшинного введения раствора телазола из расчета 14 мг/кг массы животного. Через 5 минут после инъекции препарата у фиксированных к малому операционному столику животных осуществляли оценку болевой чувствительности путем сдавливания корня хвоста, по которой оценивали степень наркотизации животного. При удовлетворительной наркотизации животного проводили вскрытие брюшной полости и выделение печеночного синуса. Для получения плазмы кровь в объеме 5-6 мл получали путем забора из печеночного синуса в одноразовый полистироловый градуированный шприц с широкой иглой, содержащий антикоагулянт. В качестве антикоагулянта использовали трехзамещенный 5,5-водный цитрат натрия в концентрации 3,8% (0,11 М). Кровь с цитратом натрия смешивалась в соотношении 9:1. Пробирки закрывали полихлорвиниловыми крышками и переворачивали для перемешивания их содержимого с частотой одно перемешивание в течение двух секунд, десять раз. Кровь центрифугировали на протяжении 20 мин при скорости 3000 об/мин на центрифуге типа СМ-50. Полученную таким образом плазму переносили при помощи автоматической пипетки в полистироловые градуированные центрифужные пробирки и использовали для оценки концентрации хемокина CCL11 и концентрации РФМК. Образцы плазмы, используемые для определения концентрации РФМК, находились в работе в течение часа. Образцы плазмы, используемые для определения концентрации хемокина CCL11, замораживали при температуре минус 80°С. Данные образцы находились в работе в течение недели. Перед процедурой анализа образцы помещали в комнатные условия.
Для определения концентрации хемокина CCL11 в плазме крови использовали набор для определения Эозинофильного хемотаксического фактора (ECF) методом иммуноферментного анализа (ИФА) для крыс. Набор предназначен для количественного определения ECF сэндвич-методом ИФА в плазме крови. Микропланшет в наборе сорбирован антителами, специфическими к ECF. Стандарты или образцы добавляют в определенные лунки планшета с антителами, конъюгированными с биотином и специфичными к ECF. Затем авидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (HRP) добавляют в каждую лунку планшета и проводят инкубацию. После добавления тетраметилбензидина гидрохлорида (ТМБ) Substrate цвет изменяется только в лунках, содержащих ECF, антитела с биотином и авидин с пероксидазой хрена. Ферментативная реакция прекращается добавлением раствора серной кислоты. Оптическую плотность измеряют фотометрическим методом на длине волны 450±10 нм. Концентрацию ECF в образцах рассчитывают в соответствии со стандартной калибровочной кривой.
Для определения концентрации РФМК использовали орто-фенантролиновый тест, который осуществляли с помощью набора реагентов РФМК™-тест, флаконный (фирма «Технология-Стандарт», Россия). Тест основан на оценке времени появления в исследуемом образце бедной тромбоцитами цитратной плазмы, содержащей растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК), зерен фибрина после добавления к ней раствора орто-фенантролина. Орто-фенантролин способен вызывать паракоагуляцию в результате коагуляции РФМК плазмы крови, в состав которых входят фибрин-мономер, дис-А-фибрин, фибриноген, а также продукты фибринолиза (Баркаган З.С., Момот А.П., Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. / М., Изд-во: «Ньюдиамед-АО», 2001. - 170-172 С.). Тест является высокочувствительным и позволяет полуколичественно определять концентрацию олигомеров фибрина в плазме крови. Орто-фенантролиновый тест способен выявить скрытую тромбинемию и внутрисосудистое свертывание крови при увеличении РФМК в плазме крови.
Для статистической обработки результатов исследования использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Данные непараметрических совокупностей представлены в виде медианы (Me) и квартилей [25% и 75%]. Для всех тестов статистически достоверными считались различия, уровень значимости которых отвечал условию р<0,05.
Результаты исследований представлены в примерах 1, 2 и 3.
Пример 1.
Результаты проведенного иммуноферментного анализа показали, что у животных первой опытной группы по сравнению с контрольной группой концентрация хемокина CCL11 в плазме крови достоверно не отличалась и составляла 398,7 нг/мл [296,99-599,27] и 537,4 нг/мл [497,51-705,44] соответственно (р=0,2). Концентрация РФМК в плазме достоверно отличалась от контрольной группы и составляла 11,0 [3,0-16,5] и 3,0 [3,0-3,0] соответственно (р=0,04).
Пример 2.
Результаты проведенного иммуноферментного анализа показали, что у животных второй опытной группы по сравнению с контрольной группой концентрация хемокина CCL11 в плазме крови достоверно не отличалась и составляла 560,3 нг/мл [441,28-648,09] и 537,4 нг/мл [497,51-705,44] соответственно (р=0,1). Концентрация РФМК в плазме достоверно не отличалась от контрольной группы и составляла 3,0 [3,0-3,0] и 3,0 [3,0-3,0] соответственно (р=0,8).
Пример 3.
Результаты проведенного иммуноферментного анализа показали, что у животных третьей опытной группы по сравнению с контрольной группой концентрация хемокина CCL11 в плазме крови достоверно отличалась и составляла 860,8 нг/мл [846,99-937,05] и 537,4 нг/мл [497,51-705,44] соответственно (р=0,005). Концентрация РФМК в плазме крови достоверно отличалась от контрольной группы и составляла 15,0 [12,0-21,0] и 3,0 [3,0-3,0] соответственно (р=0,007).
Таким образом, экспериментальным путем выявлено, что подбор и соблюдение физиологических режимов физической нагрузки позволяет исключить физическое перенапряжение, приводящее к увеличению концентрации хемокина CCL11 и РФМК в плазме крови, что может служить фактором риска возникновения многих острых патологических состояний, таких как инфаркт миокарда, инсульт головного мозга или тромбоэмболии легочной артерии (ТЭЛА).
Заявляемый способ позволяет снизить факторы риска изменений со стороны различных органов при физической нагрузке путем создания физиологических режимов физической нагрузки, не допускающих увеличение концентрации хемокина CCL11 и РФМК в плазме крови.
Концентрацию хемокина CCL11 и РФМК в плазме крови возможно использовать в качестве маркера превышения физиологического уровня физической нагрузки при разработке методик физических тренировок для пожилых людей, улучшения качества жизни и продления периода активного долголетия.