Способ неинвазивного определения уровней продукции активных форм кислорода адипоцитами эпикардиальной жировой ткани у пациентов с ишемической болезнью сердца и коронарным атеросклерозом
METHOD FOR NON-INVASIVE DETERMINATION OF PRODUCTION LEVELS OF REACTIVE OXYGEN FORMS BY ADIPOCYTES OF EPICARDIAL ADIPOSE TISSUE IN PATIENTS WITH CORONARY HEART DISEASE AND CORONARY ATHEROSCLEROSIS

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и может быть использовано для неинвазивного определения высокого или низкого уровней продукции активных форм кислорода адипоцитами эпикардиальной жировой ткани, что позволяет усовершенствовать стратификацию пациентов с ишемической болезнью сердца и коронарным атеросклерозом по степени риска сердечно-сосудистых осложнений и направлено на выделение группы пациентов, нуждающихся в интенсивной коррекции кардиоваскулярных факторов риска и диспансерном наблюдении для предотвращения быстропрогрессирующего и осложненного течения заболевания.
Окислительный стресс, характеризующийся чрезмерным образованием активных форм кислорода и снижением антиоксидантной защиты, является одним из ключевых звеньев развития атеросклероза и сердечно-сосудистой патологии, ассоциированной с метаболическими нарушениями и ожирением [1-3].
Ключевая роль в патогенезе ишемической болезни сердца и коронарного атеросклероза отводится также избыточному накоплению эпикардиальной жировой ткани,  что объясняется высокой метаболической и гуморальной активностью этого жирового депо, ускоряющей процессы атерогенеза [4]. В сравнении с подкожной жировой тканью, эпикардиальная жировая ткань обладает более высоким потенциалом к продукции активных форм кислорода, что связывается с более высокой экспрессией компонентов NADPH gp91 phox и p47phox [5].
В силу того, что до настоящего времени не ясно, какой именно из имеющихся  факторов риска (ожирение, артериальная гипертония, нарушения метаболизма глюкозы/инсулина, дислипидемия) и какие варианты их сочетаний могут оказывать наиболее значимое воздействие на интенсивность процессов оксидативного стресса и атерогенеза, установление этих факторов, а также выделение группы пациентов, характеризующихся высоким уровнем продукции активных форм кислорода адипоцитами эпикардиальной жировой ткани, позволит усовершенствовать стратификацию больных с ишемической болезнью сердца и коронарным атеросклерозом по степени кардиометаболического риска, обосновать необходимость их тщательного наблюдения и коррекции с целью предотвращения прогрессирующего и осложненного течения заболевания.
Известный способ определения активных форм кислорода в адипоцитах эпикардиальной жировой ткани требует проведения инвазивного хирургического вмешательства с забором интраоперационных биоптатов этого жирового депо и выделением энзиматическим методом адипоцитов  [6,7], что является существенным недостатком, ограничивающим использование этого способа в клинике.
Несмотря на то, что активация процессов перекисного окисления липидов является значимым фактором для осложненного течения ИБС и коронарного атеросклероза, референсные значения продукции активных форм кислорода до сих пор не определены. Анализ результатов патентного поиска и источников в мировой научно-медицинской литературе показал, что до настоящего времени неинвазивные способы оценки продукции активных форм кислорода адипоцитами в эпикардиальной жировой ткани не разработаны.
Задачей изобретения является создание способа, позволяющего неинвазивно определять уровень продукции активных форм кислорода в адипоцитах эпикардиальной жировой ткани у пациентов с ишемической болезнью сердца и коронарным атеросклерозом.
Для неинвазивного определения уровней продукции активных форм кислорода адипоцитами эпикардиальной жировой ткани были установлены предикторы -  содержание в сыворотке крови адипонектина и значения постпрандиальных уровней глюкозы и инсулина и построена модель линейной регрессии, позволяющая прогнозировать различный уровень тканевой выработки активных форм кислорода:
Уровень продукции АФК ЭЖТ = 254 х ППГ +19 х ППИ - 42 х Адипо,
где АФК ЭЖТ – активные формы кислорода, продуцируемые адипоцитами эпикардиальной жировой ткани, усл.ед.; ППГ – постпрандиальная гликемия, ммоль/л;                           ППИ – постпрандиальная инсулинемия, μЕд/мл, Адипо – сывороточный адипонектин, мг/мл.
2
Уровень значимости предложенной модели р=0,003, скорректированный коэффициент детерминации R = 0,517, зависимая переменная АФК ЭЖТ и одна из независимых переменных, а именно постпрандиальная гликемия, имеют нормальное распределение (р=0,080), две другие независимые переменные (постпрандиальная инсулинемия и содержание в крови адипонектина) в модели имеют распределения, отличные от нормального.
Поскольку в выборке распределение зависимой переменной - уровней продукции АФК адипоцитами эпикардиальной жировой ткани  - было нормальным, за его пороговую величину принимали среднее значение, которое составило 1850,98 усл.ед. Расчетный уровень продукции АФК ЭЖТ у пациентов считали высоким, если он превышал обозначенную пороговую величину. Расчетный уровень продукции АФК ЭЖТ менее 1850,98 усл.ед. считали низким.
Техническим результатом предлагаемого в качестве изобретения способа является неинвазивное определение уровня (высокий или низкий) продукции адипоцитами эпикардиальной жировой ткани активных форм кислорода у пациентов с ишемической болезнью сердца и коронарным атеросклерозом, для чего у каждого нового такого пациента выполняют определение содержания в сыворотке крови адипонектина и постпрандиальных уровней глюкозы и инсулина, без необходимости проведения интраоперационного забора эпикардиальной жировой ткани и без выполнения трудоемкой экспериментальной методики.
Существенные признаки предлагаемого изобретения проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и неочевидные для специалиста.
Идентичной совокупности признаков не обнаружено в патентной и научно-медицинской литературе.
Предлагаемый в качестве изобретения способ может быть использован в практическом здравоохранении для усовершенствования диагностики, повышения точности диагностики, а также выбора и корректировки тактики лечения больных.
Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности «новизна», «изобретательский уровень», «промышленная применимость».
Изобретение будет понятно из следующего описания.
Предлагаемый способ основан на результатах клинического исследования. В исследование включены 19 пациентов (14 мужчин и 5 женщин) в возрасте 53-72 года со стабильной ИБС и коронарным атеросклерозом, госпитализированных в клиники Научно-исследовательского института кардиологии для проведения операции аорто-коронарного шунтирования. Критериями включения являлись диагноз ИБС и наличие выраженного коронарного атеросклероза, диагноз был выставлен в предыдущую госпитализацию на основании данных анамнеза, объективного обследования, инструментальных и лабораторных методов, всем пациентам была проведена коронарная ангиография. Критериями исключения являлись острые атеросклеротические осложнения в течение последних 6 мес; любое воспалительное заболевание; хроническая болезнь почек выше С3б; онкологические, гематологические и иммунные заболевания. Пациенты находились на регулярной кардиоактивной терапии, приближающейся к оптимальной. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании после беседы и ответов на вопросы. Протокол исследования был одобрен комитетом по биомедицинской этике НИИ кардиологии.
2
Проводили антропометрические измерения с расчетом индекса массы тела: вес (кг)/рост (м)и забор крови из локтевой вены с последующим биохимическим определением содержания в сыворотке адипонектина, постпрандиальных уровней глюкозы и инсулина.
2
2
4
2
2
4
2
4
5
6
Материалом для исследования явились экспланты эпикардиальной жировой ткани массой 0,2-1 г. Забор эксплантов у пациентов осуществлялся в ходе плановой операции АКШ, проводимой по показаниям. Образцы ЭЖТ забирали одномоментно до подключения аппарата искусственного кровообращения при помощи острого скальпеля без использования электрокоагуляции (2 образца). Образцы помещали в среду М199 и в течение 15 мин доставляли в лабораторию. Выделение клеток жировой ткани осуществляли энзиматически, стерильно в ламинарном шкафу стI-го класса защиты (БАВп-01-«Ламинар-с»-1,5, ЗАО «Ламинарные системы», г. Миасс, Россия). Ткань измельчали, инкубировали 35-40 мин при температуре 37°С и постоянном мягком перемешивании (10 об/мин) в 5 мл стерильного раствора коллагеназы I типа («ПанЭко», Россия) 1 мг/мл в буфере Кребса-Рингера (2 mM D-глюкозы, 135 mM NaCl, 2,2 mM CaCl·2HO, 1,25 mM MgSO·7HO, 0,45 mM KHPO, 2,17 mM NaHPO, 25 mM HEPES, 3,5% BSA, 0,2 mM аденозина). Для нейтрализации коллагеназы добавляли буфер Кребса-Рингера в соотношении 1:1. Клеточную суспензию фильтровали через нейлоновый фильтр (Falcon™Cell strainer, диаметр пор 100 мкм), трехкратно промывали теплым буфером Кребса-Рингера.  Для изменения количества активных форм кислорода в ячейки 96-луночного планшета добавляли по 5×10 адипоцитов в 200 μl раствора Кребса-Рингера (1,25×10 cell/ml), которые инкубировали в течении 30 минут в присутствии 125 μM 2,3-дигидродихлорофлуоресцеина диацетата (DCF-DA) в микропланшетном ридере при 37°C (INFINITE 200M microplate spectrophotometer; Tecan, Austria). Измеряли свечение DCF при длинах волн возбуждения/излучения λex = 500 и λem = 530 соответственно. Накопление активных форм кислорода адипоцитами верифицировали микроскопически.
На основании полученных результатов построена модель линейной регрессии предикторов – содержания в сыворотке крови адипонектина и постпрандиальных уровней глюкозы и инсулина - на уровень продукции активных форм кислорода адипоцитами эпикардиальной жировой ткани:
Уровень продукции АФК ЭЖТ = 254 х ППГ +19 х ППИ - 42 х Адипо,
где АФК ЭЖТ – активные формы кислорода, продуцируемые адипоцитами эпикардиальной жировой ткани, усл.ед.; ППГ – постпрандиальная гликемия, ммоль/л; ППИ – постпрандиальная инсулинемия, μЕд/мл, Адипо – сывороточный адипонектин, мг/мл
Таким образом, на основании данных статистического анализа можно сделать вывод о том, что предлагаемый способ позволяет неинвазивно, лишь с использованием определения биохимических маркеров крови – адипонектина и постпрандиальных гликемии и инсулинемии – определять высокий или низкий уровень продукции активных форм кислорода адипоцитами эпикардиальной жировой ткани.
Пример 1.
Пациент Л., 67 лет, поступил в плановом порядке в отделение атеросклероза и хронической ИБС для проведения аорто-коронарного шунтирования по поводу многососудистого стенозирующего атеросклероза коронарных артерий.
Жалобы: ангинозные боли соответствуют  III ФК.
Из анамнеза: давящие боли за грудиной при небольшой физической нагрузке беспокоят в течение 5 лет, выполнена коронароангиография – выявлено многососудистое поражение коронарного русла, рекомендовано оперативное лечение в объеме аорто-коронарного шунтирования. Фоновые заболевания: гипертоническая болезнь, среди других факторов риска – дислипидемия, повышенная гликемия натощак, избыточная масса тела при наличии абдоминального ожирения.
2
Объективно: общее состояние удовлетворительное, индекс массы тела 28,4 кг/м, окружность талии 107 см, толщина эпикардиальной жировой ткани – 4,3 мм, АД 152/74 мм рт.ст, HbA1c 5,7%.
Содержание адипонектина в сыворотке крови – 4,62 мг/мл, постпрандиальная гликемия – 7,9 ммоль/л, постпрандиальная инсулинемия – 32,31 μЕд/мл.
Проведено исследование согласно предлагаемому способу:
Уровень продукции АФК ЭЖТ = 254 х 7,9 + 19 х 32,31 – 42 х 4,62.                                                      Расчетное значение уровня продукции АФК адипоцитами эпикардиальной жировой ткани составило 2426,45 усл.ед, что расценивается как высокий уровень, поскольку значительно превышает пороговое значения этого показателя.
Таким образом, в данной клинической ситуации на фоне сочетания нескольких факторов сердечно-сосудистого риска (гипертоническая болезнь, избыточная масса тела, абдоминальное ожирение, повышенная гликемия натощак, дислипидемия) у пациента определяется высокий уровень продукции активных форм кислорода адипоцитами эпикардиальной жировой ткани, в силу чего высока вероятность быстрой прогрессии атеросклероза и развития сердечно-сосудистых осложнений. Такой пациент для профилактики осложненного течения заболевания нуждается в диспансерном наблюдении, проведении оптимальной медикаментозной терапии и  коррекции всех имеющихся факторов риска (абдоминального ожирения, дислипидемии и латентных нарушений метаболизма глюкозы), что будет способствовать предупреждению развития кардиоваскулярных осложнений у этого пациента.
Пример 2.
Пациентка Ч, 64 года, поступила в плановом порядке в отделение атеросклероза и хронической ИБС для проведения аорто-коронарного шунтирования по поводу стенозирующего атеросклероза коронарных артерий.
Жалобы: на давящие боли за грудиной при ходьбе, быструю утомляемость, слабость, одышку при быстрой ходьбе, лабильный уровень АД
Из анамнеза: одышка и чувство стеснения за грудиной при физической нагрузке – в течение последнего года, ухудшение состояния в течение 3-х месяцев. По результатам коронароангиографии выявлен многососудистый стенозирующий атеросклероз коронарных артерий, рекомендовано оперативное лечение в объеме аорто-коронарного шунтирования. Фоновые заболевания: гипертоническая болезнь, дислипидемия, ожирение I ст. (по абдоминальному типу).
2
Объективно: общее состояние удовлетворительное, индекс массы тела 31,2 кг/м, окружность талии 105 см, толщина эпикардиальной жировой ткани – 4,8 мм, АД 117/67 мм рт.ст, гликемия натощак 4,8 ммоль/л, HbA1c 5,4%.
Содержание адипонектина в сыворотке крови – 9,92 мг/мл, постпрандиальная гликемия – 4,6 ммоль/л, постпрандиальная инсулинемия – 17,12 μЕд/мл.
Проведено исследование согласно предлагаемому способу:
Уровень продукции АФК ЭЖТ = 254 х 4,6 + 19 х 17,12 – 42 х 9,92.                                                     Расчетное значение уровня продукции АФК ЭЖТ составило 1077,0 усл.ед., что ниже порогового значения этой зависимой переменной.
Таким образом, в данной клинической ситуации, несмотря на наличие у пациентки нескольких факторов сердечно-сосудистого риска (гипертоническая болезнь, ожирение I ст. по абдоминальному типу, дислипидемия), прогнозируют низкий уровень продукции активных форм кислорода адипоцитами эпикардиальной жировой ткани, что уменьшает суммарный кардиоваскулярный риск у этой пациентки и снижает вероятность быстрой прогрессии атеросклероза с развитием сердечно-сосудистых осложнений.
Предлагаемый в качестве изобретения способ апробирован на 19 пациентах и  позволяет неинвазивно, лишь с использованием определения биохимических маркеров крови – адипонектина и постпрандиальных гликемии и инсулинемии прогнозировать различный уровень продукции активных форм кислорода адипоцитами эпикардиальной жировой ткани, что позволяет усовершенствовать стратификацию сердечно-сосудистого риска пациентов с ишемической болезнью сердца и коронарным атеросклерозом, выделить среди них тех, кто имеет наиболее высокий риск быстрой прогрессии атеросклероза и развития сердечно-сосудистых осложнений, требующий коррекции тактики их ведения.
Источники информации:
Journal of Clinical Investigation
1. Furukawa S., Fujita T., Shimabukuro M., Iwaki M., Yamada Y., Nakajima Y. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. . 2004;114:1752–1761. doi: 10.1172/JCI21625;
Aging Male
2. Wonisch W., Falk A., Sundl I., Winklhofer-Roob B.M., Lindschinger M. Oxidative stress increases continuously with BMI and age with unfavourable profiles in males. . 2012;15:159–165. DOI:10.3109/13685538.2012.66943;
3. Gutiérrez-Cuevas, J.; Sandoval-Rodriguez, A.; Meza-Rios, A.; Monroy-Ramírez, H.C.; Galicia-Moreno, M.; García-Bañuelos, J.; Santos, A.; Armendariz-Borunda, J. Molecular Mechanisms of Obesity-Linked Cardiac Dysfunction: An Up-Date on Current Knowledge. Cells 2021, 10, 629. https://doi.org/ 10.3390/cells10030629
Nat Rev Cardiol
4. Iacobellis, G. Epicardial adipose tissue in contemporary cardiology.  (2022). https://doi.org/10.1038/s41569-022-00679-9
5. Sacks HS, Fain JN, Cheema P, Bahouth SW, Garrett E, Wolf RY, Wolford D, Samaha J. Depot-specific overexpression of proinflammatory, redox, endothelial cell, and angiogenic genes in epicardial fat adjacent to severe stable coronary atherosclerosis. Metab Syndr Relat Disord. 2011 Dec;9(6):433-9. doi: 10.1089/met.2011.0024.
6. Naryzhnaya, N.V., Koshelskaya, O.A., Kologrivova, I.V., Kharitonova, O.A.; Evtushenko, V.V.; Boshchenko, A.A. Hypertrophy and Insulin Resistance of Epicardial Adipose Tissue Adipocytes: Association with the Coronary Artery Disease Severity. Biomedicines 2021, 9, 64. https://doi.org/10.3390/biomedicines9010064;
7. Talior I, Yarkoni M, Bashan N, Eldar-Finkelman H. Increased glucose uptake promotes oxidative stress and PKC-δ activation in adipocytes of obese, insulin-resistant mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2003;285(2):E295−E302. doi: 10.1152/ajpendo.00044.2003