УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ КОНВЕКЦИОННОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Полезная модель относится к области молекулярной биологии и биотехнологиям и предназначена для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), а именно конвекционной ПЦР. Устройство может быть использовано при проведении ДНК-диагностики, в том числе в полевых условиях, в медицине, ветеринарии, санитарно-эпидемиологических исследованиях для обнаружения возбудителей опасных инфекций, включая возможные биотеррористические атаки, в криминалистике для идентификации преступников, в пищевой промышленности при выявлении продуктов питания из генетически модифицированных организмов, определении качества сырья и т.д.
ПЦР представляет собой хорошо известный технологический процесс для амплификации специфических последовательностей нуклеиновых кислот. Процесс ПЦР состоит из трех основных этапов: денатурации, отжига праймеров и элонгации (удлинения), которые проходят в реакционной смеси в пробирке при разных температурах. Требуемые температуры на стадии денатурации обычно находится в диапазоне между 90°C и 97°. Требуемые температуры для отжига праймеров зависят от структуры используемого праймера и состава реакционной смеси. Как правило, температура отжига составляет от 35°C до 65°C. Температура на стадии удлинения обычно составляет около 72°C. Для проведения ПЦР обычно необходима циклическая смена температур от 10 до 50 раз. Реакционная смесь для проведения ПЦР обычно содержит ДНК-матрицу с которой копируются фрагменты ДНК; термостабильную полимеразу; праймеры, ограничивающие амплифицируемый фрагмент; дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTPs) для построения амплифицируемых фрагментов; в качестве растворителя используется вода. Также реакционная смесь может содержать стабилизирующие вспомогательные вещества, соли для поддержания ионной силы раствора и зонды для детекции результатов полимеразной цепной реакции в реальном времени. Классическую ПЦР проводят путем циклического изменения температуры пробирки с помощью программируемого термостата (ДНК-амплификатора или термоциклера) (Европейский патент EP 0488769 A2). Недостатком данного способа является сложность устройства, определяемая необходимостью точного поддержания температуры в динамическом режиме и использования полупроводникового охладителя. Также классические амплификаторы имеют высокий уровень энергопотребления и значительную продолжительность работы из-за невозможности мгновенного изменения температуры термостатируемого блока и пробирки. Продолжительность классической полимеразной цепной реакции состоящей из 30 циклов составляет от 1 до 2-х часов. Результаты ПЦР обнаруживают путем проведения электрофореза ДНК и последующего окрашивания или в режиме реального времени - путем добавления в реакционную смесь интеркалирующего красителя или зондов и измерения уровня флуоресценции в ходе реакции.
Другим способом является конвекционная ПЦР. Ее обычно проводят путем постоянного нагрева нижней части реакционного сосуда до температуры денатурации ДНК (около 95°C) и постоянного поддержания температуры верхней части реакционного сосуда на уровне, достаточном для отжига праймеров (от 35°C до 65°C). В результате этого появляются конвекционные потоки смеси из-за различной плотности охлажденной и нагретой жидкости и циклическое изменение температуры реакционной смеси, происходит при контакте со стенками пробирки с различной температурой в ходе конвекционного перемещения жидкости. Скорость изменения температур реакционной смеси в конвекционной ПЦР очень высока и продолжительность реакции обычно составляет от 5 до 60 мин. Результаты ПЦР обнаруживают путем проведения электрофореза ДНК и последующего окрашивания или в режиме реального времени - путем добавления в реакционную смесь интеркалирующего красителя или зондов и измерения уровня флуоресценции в ходе реакции (Патент США US 20130109021).
Основной проблемой при проектировании устройств для проведения конвекционной ПЦР является организация одновременного поддержания различных температур в реакционном сосуде. При этом должно обеспечиваться достаточное для протекания реакции время нахождения молекул ДНК в разных температурных зонах.
Известно устройство для выполнения изотермической ПЦР (патент US 20050074782; МПК C12M 1/34, C12P 19/34, C12M 1/38, C12Q 1/68, C12M 1/02, C12M 1/36; опубл. 07.04.2005), содержащее пробирку с раствором биомолекул, плоский источник тепла, находящийся в нижней части сосуда, и источник охлаждения, находящийся в верхней части сосуда. Недостатком, обусловленным конструкцией данного устройства, является сплошное нагревание нижней части реакционного сосуда, что усложняет формирование конвекционных потоков и приводит к затруднению перемешивания жидкости и нарушению протекания реакции во всем объеме.
Наиболее близким к заявляемому по технической сути является устройство для выполнения изотермической ПЦР (патент US 2013019021; МПК B01L 7/00; опубл. 02.05.2013), содержащее пробирку с реакционной смесью, верхний и нижний элементы, которые могут нагревать или охлаждать, при этом сквозное отверстие верхнего и глухое отверстие нижнего элемента образуют канал, в который вставляется реакционный сосуд. Недостатком данного устройства является то, что классическая ячейка Бенара, используемая в данном техническом решении, характеризуется "турбулентным хаосом" и наличием "мертвых зон", что затрудняет перемещение жидкости и не обеспечивает достаточное для протекания реакции время нахождения молекул ДНК в разных температурных зонах, что нарушает равномерность протекания процесса.
Задачей заявляемой полезной модели является создание устройства для проведения конвекционной ПЦР, способного поддерживать различные температурные режимы в различных зонах реакционной ячейки с одновременным обеспечением перемещения реагента через эти зоны со скоростью, необходимой для протекания реакции в каждой из них.
Технический результат полезной модели состоит в формировании упорядоченных конвекционных потоков, обеспечивающих протекание ПЦР с сохранением высокой специфичности реакции.
Заявляемый технический результат достигается за счет того, что устройство для проведения конвекционной полимеразной цепной реакции, состоит из реакционной ячейки и нижнего нагревающего элемента, при этом нижний нагревающий элемент имеет сквозное отверстие, образующее канал, в который вставляется реакционная ячейка, а соотношение диаметра реакционной ячейки и ее высоты составляет 3:1 до 1:7 и толщина нагревательного элемента по крайней мере равна или меньше ½ высоты реакционной ячейки.
Техническая сущность предлагаемой полезной модели поясняется чертежом, на котором схематично приведен вид устройства сбоку (фиг. 1). Устройство содержит реакционную ячейку 1 для реакционной смеси, нижний нагревающий элемент 2.
Заявляемое устройство работает следующим образом. В реакционную ячейку 1 помещают реакционную смесь, при этом осуществляют кольцевой нагрев нижней части с помощью нагревающего элемента 2 до температуры денатурации ДНК, верхняя же часть ячейки охлаждается при помощи потока воздуха. При этом в реакционной ячейки появляются тороидальные конвекционные потоки, обеспечивающие необходимую смену температур реакционной смеси. Для установления тороидальных конвекционных потоков соотношение диаметра реакционной ячейки и ее высоты от 3:1 до 1:7. Нагревающий элемент представляет из себя пластину с отверстием, изготовленную из материала с высокой теплопроводностью (например, металла), постоянная температура которого поддерживается посредством температурного контроллера и электрического нагревателя (например, пленочного, полупроводникового, графитового, керамического или проволочного). Температура нагревающего элемента поддерживается постоянной на уровне необходимом для денатурации ДНК.
Также данное устройство может быть дополнено верхним охлаждающим элементом (фиг. 2). В данном случае устройство содержит реакционную ячейку 1 для реакционной смеси, верхний охлаждающий элемент 2, нижний нагревающий элемент 3 и теплоизолирующую вставку 4. Нагревающий элемент представляет из себя пластину с отверстием, изготовленную из материала с высокой теплопроводностью (например, металла). Таким образом увеличивается теплоотдача верхней части реакционной ячейки за счет лучшего теплоотвода.
Температура в нижней части реакционной ячейки зависит от толщины нагревателя, его температуры и теплопроводности стенок реакционной ячейки. Температура в верхней части реакционной ячейки зависит от площади контакта с охлаждающей средой (воздухом), ее температуры и теплопроводности стенок реакционного сосуда. В реакционной ячейке таким образом формируется градиент температуры от высокой в нижней части до низкой в верхней части. При этом площадь нагрева должна быть, по крайней мере, равна или меньше площади охлаждаемой части реакционной ячейки, что определяется толщиной нагревающего элемента и высотой реакционной ячейки. В противном случае происходит перегрев реакционной ячейки и в верхней ее части температура превышает необходимую для отжига праймеров, что препятствует протеканию ПЦР. В реакционной смеси, содержащей матрицу ДНК, олигонуклеотидные праймеры, зонды, dNTPs, буферный раствор для ПЦР, термостабильную полимеразу образуются конвекционные потоки за счет изменения плотности при нагреве в нижней части и охлаждения в верхней части через стенки реакционной ячейки, при этом температура реакционной смеси в нижней части достигает температуры денатурации ДНК, а в верхней части температуры отжига праймеров. Температуру в верхней части реакционной смеси можно менять (для оптимизации отжига праймеров) путем изменения взятого объема смеси. Эмпирическим путем выявлено, что соотношение геометрических размеров нагревателя и реакционной ячейки, указанные выше позволяют достичь градиента температур, необходимого для протекания реакции с разными типами матрицы и праймеров с различными температурами отжига в широких пределах.
Таким образом, в данном устройстве происходит кольцевой нагрев нижней части реакционный ячейки, что ускоряет формирование конвекционных потоков и их упорядочивание, обеспечивая протекание ПЦР с сохранением высокой специфичности и скорости протекания реакции по всему объему реакционной смеси.