Иммуногистохимическое определение триптазы тучных клеток и иммуноглобулина e в ткани носовых полипов

УДК 616.211-006.5

иммуногистохимическое определение триптазы тучных клеток и иммуноглобулина E в ткани носовых полипов

С. Е. Сендерович

Башкирский государственный медицинский университет, г. Уфа

Работа посвящена проблеме полипозного риносинусита (ПРС). На основании проведенного имму-ногистохимического исследования образцов полипозной ткани 40 больных и биоптатов слизистой носа 15 здоровых лиц контрольной группы установлена активация тучных клеток, играющая важную роль на ранних стадиях ПРС и при сопутствующей непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов. Доказано, что кроме дегрануляцию тучных клеток в процессе формирования носовых полипов, в том числе при аспириновой триаде, имеет значение и ^-опосредованный механизм.

Ключевые слова: полипозный риносинусит, иммуногистохимическое исследование, триптаза, иммуноглобулин Е.

Введение

Одной из наиболее распространенных форм ЛОР-патологии человека является полипозный риносинусит (ПРС), в развитии которого имеют значение измененная реактивность парасимпатической нервной и иммунной систем, гиперчувствительность и неполноценность рецепторного аппарата слизистой полости носа и околоносовых пазух, дефекты мембран клеток и другие факторы [4, 6, 11]. Вне зависимости от этого узловым звеном патогенеза ПРС является дегрануляция тучных клеток. В результате повышается сосудистая проницаемость, развивается стойкий отек тканей и формируются полипы, инфильтрируемые в дальнейшем эозинофилами [5, 10, 13].

Основным событием, мотивирующим тучные клетки на выброс медиаторов при аллергической патологии, считают связывание аллергена с аллергенспецифиче-скими иммуноглобулинами класса Б (^Б) и фиксацией образовавшегося комплекса 128

на Fcs-рецепторах тучных клеток подсли-зистого слоя слизистой носа [2, 4]. Однако на практике указанное, как правило, не коррелирует с повышением уровня сывороточных ^Б у больных полипозным риносину-ситом, что обусловило необходимость уточнения роли последних при этом заболевании.

Учитывая, что основными медиаторами, высвобождаемыми при дегрануляции клеток, являются гистамин, кинины, простагландин D2, лейкотриены (В4 и С4) и триптаза [2], они могут выступать в качестве соответствующих маркеров. Среди них одним из наиболее информативных является триптаза, для детекции которой в тканях может использоваться иммуногистохимический метод (ИГХ) [7].

Цель исследования — установить характер взаимосвязей между наличием ^Е на мембранах тучных клеток измененной слизистой при ПРС и степенью их секреторной активности.

Пермский медицинский журнал

2010 том XXVII № 5

Материалы и методы

ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования послужили образцы полипозной ткани, выделенной в ходе полипэктомии у 40 больных поли-позным риносинуситом в возрасте от 15 до 65 лет, госпитализированных в оторинола-рингологическое отделение МУ ГКБ № 5 г. Уфы.

Клинически у всех пациентов наблюдалось затруднение носового дыхания, причем у 28 (70%) человек более затрудненным был выдох, а у 12 (30%) — вдох. Нарушение обоняния отмечалось у 37 (92,5%) больных. Патологическое отделяемое из носа выявлялось у 35 (87,5%) пациентов. Оно носило слизистый характер у 14 (35%) пациентов, серозный — у 16 (40%), слизисто-гнойный — у 3 (7,5%) и гнойный — у 2 (5%) больных. Приступы чихания и зуда в носу отмечались у 21 (52,5%) больного. Риноскопически у 32 (80%) пациентов имело место двустороннее и лишь у 8 (20%) больных — одностороннее поражение слизистой носа полипоз-ным процессом. По степени распространенности у 30 (75%) пациентов констатирована IV стадия заболевания, у 8 (20%) — III стадия, у 2 (5%) больных — II стадия. Эозинофи-лия крови зафиксирована только у 8 (20%) пациентов.

В качестве контроля исследованы био-птаты здоровой слизистой носа 15 лиц, прооперированных по поводу деформации перегородки носа. Образцы полипозной ткани исследовали иммуногистохимическим методом. Использовались поликлональные антитела anti-IgE epsilon (Хема, Россия), моно-клональные антитела Mast Cell Tryptase (BioGenex) и набор реагентов для иммуно-гистохимического окрашивания срезов тканей с использованием пероксидазной метки (Хема, Россия).

На микропрепараты после фиксации в охлажденном ацетоне и обработки реагентом для блокирования неспецифического

связывания антител наносили соответствующие антитела, инкубировали, отмывали. Затем последовательно наносили меченые ан-тиглобулиновые антитела, конъюгированные с биотином, инкубировали и отмывали. Образовавшиеся поверхностные комплексы визуализировали стрептавидин-пероксидазой с увеличением х400 на микроскопе (CarlZeiss, Германия) после докрашивания препарата. Результат документировали с помощью программы «ВидеоТесТ-Морфология 5.2» (ООО «ВидеоТесТ», Россия). О концентрации искомых компонентов в тканях судили по оптической плотности, оцениваемой по числу точек изображения (пикселей), принадлежащих объекту, в одном поле зрения при увеличении х400.

Уровень общих иммуноглобулинов класса E определяли в сыворотке крови обследованных иммуноферментным методом в соответствии с рекомендациями производителя («Вектор-Бест», Россия) на ИФА-ридере «Униплан» («Пикон», Россия) с использованием светофильтра 450 нм.

Полученные результаты статистически обрабатывали с помощью программы «Statistica 6.0». Нормальность распределения определяли тестом Колмогорова — Смирнова, для проверки достоверности различий переменных больных и здоровых применяли Ьтест для независимых выборок, а также непараметрические аналоги — тест Манна — Уитни и парный тест Уилкоксона, ранговый дисперсионный анализ проводили по Крас-кел — Уоллису. Корреляционные связи между измеряемыми переменными оценивали с помощью коэффициента корреляции Пирсона. Связи дихотомических и ранжируемых переменных определяли с помощью рангового коэффициента корреляции Спирмена.

Результаты и их обсуждение

Установлено, что оптическая плотность комплексов триптаза-антитело в поле зрения (ИГХ) в срезах полипозной ткани больных

ПРС была существенно выше, чем в препаратах слизистой здоровых (0,472±0,01 и 0,460±0,01 ед.; p=0,004) (рис. 1). Наибольших значений этот показатель достигал у пациентов с непереносимостью нестероидных противовоспалительных средств (НПВС), входящих в аспириновую триаду (ПРС, бронхиальная астма, непереносимость НПВС), и составлял в среднем 0,48±0,08 ед. Показана обратная зависимость данного критерия от длительности заболевания (коэффициент Спирмена — 0,31).

Концентрация поверхностных комплексов (ИГХ), сформированных ^Е, в срезах по-липозной ткани больных ПРС также была значимо выше, чем в препаратах слизистой здоровых (медианы 0,48 (0,47—0,5) ед. и 0,46 (0,36—0,47) ед. соответственно; p=0,003) (рис. 2). Наибольших значений этот показатель достигал у пациентов с сопутствующей непереносимостью НПВС ^=0,2). При этом у больных, ранее получавших системную терапию глюкокортикостероидами, он был ниже и составлял 0,43 (0,39—0,47) ед. ^=0,39).

Значимых отличий в содержании ^Е в сыворотке крови больных и здоровых выявлено не было.

Роль ^Е в развитии полипозного рино-синусита в настоящее время не считается до-

Рис. 1. Триптаза тучных клеток ^с ор1) в препаратах из полипозной ткани больных и из слизистой здоровых лиц

Рис. 2. Щ ^ ор1) в полипозной ткани больных и слизистой носа здоровых

казанной. Многочисленные исследования показывают, что значимых отличий в содержании их в сыворотке больных и здоровых не обнаруживается [8, 10]. Полипоз носа обычно не развивается у больных с атопи-ческой формой ринита и атопической бронхиальной астмой [6]. В связи с этим распространено мнение, что ^-опосредованный механизм активации тучных клеток вообще не может иметь значения в патогенезе ПРС. Вместе с тем известно, что фиксация комплексов антиген-^Е на высокоаффинных рецепторах (Fcs-рецепторы I типа — Fcs М) тучных клеток приводит к их дегрануляции с выбросом гистамина, триптазы, простаглан-дина D2, лейкотриенов (Б4 и C4), то есть всех тех медиаторов, которые играют решающую роль в процессе формирования носовых полипов. В результате проведенного иммуно-гистохимического исследования тканей «шокового органа», а именно слизистой носа и околоносовых пазух, было установлено, что максимальное количество триптазы тучных клеток обнаруживается в носовых полипах на начальной стадии заболевания и при ас-пириновой триаде. Подобные изменения сочетались с повышенным содержанием ^Е в полипозной ткани, которое достигало максимальных значений при сопутствующей не-

Пермский медицинский журнал

2010 том XXVII № 5

переносимости НПВС, но снижалось в результате стероидной терапии.

Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) при аспириновой триаде являются одним из факторов, способствующих как сужению бронхов, так и развитию стойкого отека слизистой носа. Неселективные НПВП блокируют фермент циклоокси-геназу, способствуя тому, что из арахидоно-вой кислоты под воздействием липооксиге-назы образуются лейкотриены, вызывающие дальнейшие реакции. В развитии данного заболевания имеет значение активация цис-теинилового лейкотриенового каскада, которая, возможно, связана с полиморфизмом гена ЦГС4-синтазы, обнаруживаемого примерно у 70% пациентов [1].

Полученные нами данные служат основанием для пересмотра роли реагинов в патогенезе ПРС, в том числе и при аспириновой триаде, поскольку в литературе имелись лишь единичные сообщения об обнаружении специфических ^Е к дериватам аспирина [3].

Работа выполнена в соответствии с Федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 гг., в рамках реализации мероприятия № 1.2.1. Государственный контракт П385 от 30.07.2009 г.

Вывод

Выявленные факты свидетельствуют о том, что активация тучных клеток играет важную роль на ранних стадиях ПРС и при сопутствующей непереносимости НПВС.

Среди механизмов, запускающих дегра-нуляцию тучных клеток в процессе формирования носовых полипов, в том числе при аспириновой триаде, имеет значение и ^Е-опосредованный механизм. Дальнейшее изучение этого механизма может стать основой для разработки новых направлений лечения полипозного риносинусита.

Библиографический список

1. Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы/^1оЬа1 Initiative for Asthma.— 2006.— 106 с.

2. Клинические рекомендации по диагностике и лечению аллергического ринита/

A. С. Лопатин, И. С. Гущин, А. В. Емельянов///Consilium medicum.— 2001.— Прил. 3344.

3. Княжеская Н. П. Аспириновая бронхиальная астма и антагонисты лейкотриенов/ Н. П. Княжеская///Русский медицинский журнал.— 2000.— Т. 8.— № 12.— С. 515— 522.

4. Лолор-мл. Г. Клиническая иммунология и аллергология/Г Лолор-мл., Т. Фишер, Д. Адельман.— М.: Практика, 2000.— 806 с.

5. Муминов А. И. Полипозные риносину-ситы/А. И. Муминов, М. С. Плужников, С. В. Рязанцев.— Ташкент, 1990.

6. Пискунов Г. З. Дифференциальный подход в лечении хронического полипозно-го риносинусита/Г З. Пискунов, Р. Г. Мира-кян//Российская ринология.— 2008.— № 2.— С. 4—18.

7. Руководство по иммуногистохимиче-ской диагностике опухолей человека/ С. В. Петров, Н. Т. Райхлин, М. Виберг и др.— Казань, 2004.

8. Bernstein J. M. Role of allergy in nasal polyposis: a review//. M. Bernstein, J. Gorfien,

B. Noble//Otolaryngol. Head Neck Surg.— 1995.— Vol. 113.— № 6.— P. 724—732.

9. Gevaert Ph. Eosinophilic inflammation: causative factors, triggers and mechanisms// Российская ринология.— 2006.— № 2.—

C. 29—30.

10. Immunologic factors in patients with chronic polypoid sinusitis/5. Nikakhlagh, M. Ghafourian-Boroujerdnia, N. Saki et al.// Niger J. Med.— 2009.— Oct.— Dec.— P. 380—383.

11. McClay J. E. Nasal Polyps// E. McClay// American Journal of Rhinology and Allergy.- 2008.- № 10.- P. 23-31.

12. Overexpression of leukotriene C4 synthase in bronchial biopsies from patients with aspirin-intolerant asthma/A. S. Cowburn, K. Sladek, J. Soja et al.//J. Clin. Invest.-1998.- Vol. 101.- P. 834-846.

13. Pawankar R. Novel concepts on the pathogenesis of nasal polyps/R. Pawankar// Российская ринология.- 2006.- № 2.-С. 31.

S. E. Senderovich

IMMUNOHISTOCHEMICAL DETERMINATION OF MAST CELL TRYPTASE AND IMMUNOGLOBULIN E IN NASAL POLYP TISSUES

The paper deals with the problem of polypous rhinosinusitis (PRS). Immuno-histochemical investigation of polypous tissue samples of 40 patients and nasal mucosa bioptates of 15 healthy subjects of control group was performed. Elevated amount of mast cell tryptase (0,472±0,01 and 0,460±0,01 units of optic density, respectively; p=0,004) reaching maximal values at initial PRS stages and in

accompanying nonsteroid antiinflammatory drug intolerance (NAID) (0,48±0,08 units) as compared to healthy nasal mucosa was revealed. Heightened immunoglobulin E levels in polypous tissue (median 0,48 (0,47-0,5) units in comparison with 0,46 (0,36-0,47) units in the control; p=0,003) also reaching maximum in aspirin triad (R=0,2), but falling as a result of systemic steroid therapy (0,43 (0,39-0,47) units; R=0,39) were displayed. Mast cell activation is playing an important role at the early PRS stages and in accompanying NAID intolerance. It was proved that besides mast cell degranulation, IgE-mediated mechanism is also essential during formation of nasal polipi including cases of aspirin triad.

Keywords: polypous rhinosinusitis, immunohistochemical investigation, triptase, immunoglobulin.

Контактная информация: Сендерович Софья Ефимовна, аспирант кафедры лабораторной диагностики Башкирского государственного медицинского университета, 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 93, тел. 8 (347) 223-42-34

Материал поступил в редакцию 22.06.2010