Исследование физической адсорбции панкреатической и микробной рибонуклеаз на поверхность пирографита методом атомно-силовой микроскопии

УДК 577.322

О. А. Коновалова, Н. В. Калачева

ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИЧЕСКОЙ АДСОРБЦИИ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ И МИКРОБНОЙ РИБОНУКЛЕАЗ НА ПОВЕРХНОСТЬ ПИРОГРАФИТА МЕТОДОМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ

Ключевые слова: РНКазы А, РНКазa Bacillus pumilus, гидрофобная поверхность пирографита, атомно-силовая микроскопия.

Методом атомно-силовой микроскопии проведено сравнительное изучение физической адсорбции РНКазы А и РНКазы Bacillus pumilus на гидрофобную поверхность пирографита. Показано, что эффективность и характер адсорбции РНКаз на поверхность пирографита зависят от pH, электростатических свойств и структуры белка.

Keywords: RNase A, RNase Bacillus pumilus, hydrophobic surface ofpyrolytic graphite, atomic force microscopy.

A comparative study of the physical adsorption of RNase A and RNase Bacillus pumilus onto a hydrophobic surface of pyrolytic graphite was performed by atomic force microscopy. It is shown that the effectiveness and nature of the adsorption of RNase onto a surface ofpyrographite depend on pH, electrostatic properties and structure of the protein.

Введение

Одним из современных методов исследования структуры поверхности на молекулярном уровне является атомно-силовая микроскопия (АСМ), позволяющая успешно анализировать характер сорбции и кон-формацию различных веществ, в том числе белковой природы, на атомарно ровной поверхности [1]. Объектом настоящей работы являются РНКазы, которые по-прежнему привлекают внимание исследователей в качестве инструмента направленного воздействия на нуклеиновые кислоты опухолевых клеток, и клеток, инфицированных вирусом [2].

Изучение адсорбции белков на различные поверхности помогает понять особенности их функционирования при контакте с клеточной мембраной и внутриклеточными мишенями. Кроме того, в основе создания многих биосенсоров лежит закрепление биологически активных молекул, например ферментов или антител, на твердых субстратах. Однако взаимодействие белков с поверхностями, как правило, сопровождается изменением их свойств и конформации. Знание особенностей физической адсорбции биологически активных молекул на различные поверхности позволит обеспечить максимальную эффективность работы биосенсора.

Белки являются амфифильными макромолекулами. Характер связывания белка с поверхностью определяется структурой и свойствами материала подложки. Основными характеристиками адсорбирующей поверхности являются ее энергетические и электрохимические свойства (в простейшем случае, степень гидро-фобности или гидрофильности). Пирографит - наиболее подходящий материал подложки для изучения гидрофобных взаимодействий белков методом АСМ, так как его поверхность гидрофобная и атомарно-гладкая. Адсорбция белка на поверхность пирографита осуществляется преимущественно за счет взаимодействия незаряженных радикалов аминокислот белка с гидрофобными участками подложки.

В работе нами исследовалась кинетика адсорбции панкреатической РНКазы (РНКаза А) и РНКазы Bacillus pumilus (биназа) на поверхность пирографита. Проведен анализ зависимости степени заполнения

белком поверхности пирографита Q от времени сорбции Д1 Оптимизированы программы обработки изображений, написанные с помощью MATLAB R2009b, для расчета степени покрытия белком поверхности по АСМ-изображениям, полученным в режимах топографии и фазового контраста.

Экспериментальная часть

Биназа (КФ 3.1.27.1) секретируется грамположи-тельными спорообразующими почвенными бактериями Bacillus pumilus Аминокислотная последовательность биназы состоит из 109 аминокислотных остатков, молекулярная масса - 12300 Да [3]. Пространственная структура биназы определена с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (PDB ID: 1BUJ). В экспериментах использовали электрофоретически гомогенный препарат мономера биназы, полученный по методике, описанной в работе [4].

BP-РНКаза (КФ 3.1.27.5), или панкреатическая РНКаза A (РНКаза А), впервые выделена из поджелудочной железы быка Bos taurus [5]. Аминокислотная последовательность BP-РНКазы включает 124 аминокислотных остатка, молекулярная масса -13680 Да. Пространственная структура BP-РНКазы определена с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (PDB ID: 7RSA). В экспериментах использовали кристаллический препарат мономера нативной BP-РНКазы (Serva, Германия).

Подготовка образцов и визуализация адсорбированных РНКаз на пиролитическом графите

Ферментные препараты растворяли в 0.1 М натрий-фосфатном буфере до концентраций 1, 5, 10, 50 мкг/мл (pH 7.2) и 0.1 М фосфатно-цитратном буфере до концентрации 5 мкг/мл (H 4.4) Площадь используемых в качестве подложки свежесколотых поверхностей пирографита составляла 0.5 см2. РНКазы наносились на поверхность скола в объеме 20 мкл. Время контакта фермента с пирографитом составляло 30 сек, 60 cек, 2 мин и 5 мин при pH 7.2 и 2 мин при pH 4.4, после чего пирографит промы-

вали бидистиллированной водой и высушивали на воздухе.

Визуализацию адсорбированных РНКаз на поверхности пирографита проводили на атомно-силовых микроскопах Solver P47H, сканер 50x50 мкм и Solver Pro, сканер 3x3 мкм. Поверхность сканировали на воздухе при комнатной температуре в полуконтактном режиме стандартными кремниевыми кантилеверами NSG11 и NSG10S (радиус 10 нм), используя 3 методики: постоянной амплитуды, фазового контраста и сигнала рассогласования. Размер получаемых сканов: 2x2 мкм, 5x5 мкм, 10x10 мкм. Разрешение: 512x512 точек.

Расчет степени сорбции РНКаз на поверхности пирографита

Степень заполнения РНКазами поверхности: Р=Г/Г0, где Г - количество сорбата (в нашем случае -РНКазы), сорбированного за период времени At, Г0 -площадь поверхностного контакта раствора и сорбента (вещество, на котором происходит сорбция).

Оценка степени заполнения белком поверхности пирографита Q (%) от времени сорбции At проводилась по программам, написанным с помощью MATLAB R2009b.

Расчёт электростатических параметров рибонуклеаз

Для расчёта суммарного заряда в долях заряда электрона (e) и величины дипольного момента в Деба-ях (Д) использовали веб-ресурс Protein Dipole Moments Server, который был создан сотрудниками Института-Вайцмана [6]. В качестве исходных данных использовались аминокислотные последовательности и файлы пространственных структур мономерных форм РНКаз, которые были взяты из базы данных макромолекуляр-ных биологических объектов Protein Data Bank: BP-РНКаза (PDB ID: 7RSA) [7]; биназа (PDB ID: 1BUJ) [8].

Для получения отчетливой визуализации поверхности пирографита с адсорбированными молекулами белка была определена оптимальная концентрация растворов РНКаз, которая составила 10 мкг/мл. При исследовании кинетики адсорбции РНКаз на поверхности пирографита были получены АСМ-изображения адсорбированных молекул РНКазы A (рис. 1а) и бина-зы (рис. 1б) в зависимости от времени контакта с поверхностью пирографита At: 30 сек, 2 мин, 5 мин.

Анализ полученных АСМ-изображений позволил выявить в адсорбции РНКаз следующие особенности. Биназа при концентрации 10 мкг/мл после 30 сек контакта с пирографитом визуализировалась в виде плотного слоя овальных и слегка продолговатых структур, которые со временем становились более вытянутыми и переходили в плотные образования с характерными отверстиями разной величины (2 мин). Изображения поверхности показывают организованную структуру белков, которая имеет тенденцию к упорядочиванию в сетевую структуру с отверстиями круглой формы. Образование отверстий, возможно, связано с тем, что в процессе испарения воды молекулы белка стремятся к более плотной упаковке [9].

При адсорбции РНКаз А (в тех же условиях и при такой же концентрации) на подложке пирографита формировались распластанные образования вытянутой

формы, которые со временем приобретали форму неоднородных хлопьеобразных структур, среди которых также имели место поры.

Здсвк г мим 5 мин

Рис. 1 - АСМ-изображения адсорбированных молекул РНКазы А (а) и биназы (б), полученных в режиме топографии, в зависимости от времени контакта с поверхностью пирографита (30 сек., 2 мин., 5 мин. при рН раствора 7.2). Концентрация фермента 10 мкг/мл. Размер кадров 2x2 мкм

Адсорбция белков на незаряженную поверхность пирографита осуществляется преимущественно за счет вандерваальсовых сил притяжения неполярных радикалов белка к гидрофобным участкам подложки, что, как известно, может сопровождаться кон-формационными изменениями молекул белка.

Исследование кинетики адсорбции панкреатической и микробной РНКаз на пирографите Р от времени сорбции Д1 показало, что степень заполнения поверхности пирографита биназой со временем практически не меняется и составляет 50-70%. В то время как у РНКазы А имеется тенденция к увеличению заполнения поверхности со временем (рис.2).

70 60 50

. 10 о

30 20 10

0 12 3 4 5

Д1,МИМ

Рис. 2 - Степень заполнения белком поверхности пирографита О в зависимости от времени А1 при концентрации 10 мкг/мл. Время взаимодействия препаратов РНКаз с пирографитом составляло 30 с, 60 с, 2 мин. и 5 мин., рН раствора 7.2

Если сравнить АСМ-изображения РНКаз, адсорбированных на пирографите (рис.1), то очевидно, что биназа более эффективно адсорбируется на подложке по сравнению с панкреатической РНКа-зой. Об этом же свидетельствуют и количественные расчеты площади поверхности, занимаемой адсорбированными препаратами (рис.2). Вероятнее всего,

это связано с особенностью структуры микробной РНКазы. Отсутствие цистеина в гуанилспецифических РНКазах микробного происхождения, и, как следствие, невозможность образования дисульфидных связей, компенсируется наличием у них сильного гидрофобного ядра [10]. Частичное разворачивание белковой глобулы биназы в процессе ее адсорбции на пирогра-фит создает благоприятные условия для взаимодействия неполярных остатков аминокислот белка с гидрофобной поверхностью пирографита, что повышает эффективность связывания её с подложкой. В отличие от биназы структуру панкреатической РНКазы стаби-лируют четыре дисульфидных связи.

Визуализация адсорбции РНКаз на незаряженную гидрофобную поверхность пирографита при двух различных рН раствора (4,4 и 7,2) представлена на рис. 3.

0.8 о.е 1,0 и м

2) ЖШ

"а

|>Н 4.4

pH 7.2

Рис. 3 - АСМ - изображения адсорбированных молекул РНКазы А (1) и биназы (2) на пирографите, полученных в режиме топографии, при двух различных pH раствора: 4.4 и 7.2. Время контакта фермента с пирографитом 2 мин при концентрации 5 мкг/мл. Размер кадров 1x1 мкм

Наблюдаемый различный характер сорбции РНКаз на подложке можно объяснить различиями, обусловленными суммарным зарядом белков и его распределением на поверхности белковой глобулы (дипольным моментом). РНКаза А и биназа - щелочные белки. При понижении рН (от изоэлектрической точки) суммарный положительный заряд РНКаз повышается. Согласно нашим расчетным данным при рН 4.4 заряды РНКазы А и биназы составляют 9,15е и 7,43е соответственно. При рН 7,2 заряды РНКаз значительно ниже (у РНКазы А - 3,74е, у биназы - 4,73е). Таким образом, РНКаза А при рН 7.2 имеет наименьший заряд и, как

следствие, её молекулы испытывают наименьшее отталкивание друг от друга. При этом на гидрофобной поверхности пирографита наблюдается агрегация её молекул (рис.3), которая, вероятнее всего, связана с наличием у РНКазы А значительно большего дипольного момента (545 D), чем у биназы (225 D) [11]. Дипольный момент характеризует асимметрию распределения отрицательных и положительных зарядов в белковой молекуле и определяет наиболее вероятную пространственную ориентацию растворенных молекул белка по отношению друг к другу. При случайных столкновениях молекулы РНКазы А ориентируются таким образом, что вследствие электростатического взаимодействия образуют на поверхности пирографита агрегаты. При pH 4.4 высокий заряд на молекуле РНКазы А препятствует их агрегации. У биназы заряд распределён более равномерно, и агрегация молекул отсутствует независимо от pH. В результате наблюдаются более организованные структуры.

Вывод

Анализ АСМ-изображений показал, что на гидрофобной поверхности пирографита микробная РНКаза адсорбируется эффективнее, чем панкреатическая. Сорбция РНКаз на незаряженной подложке зависит от pH, электростатических свойств и структуры белка.

Литература

[1] D.J.Muller, Journal Clin Pathol., 68, 257-299 (2002).

[2] О.А.Шкляева, Н.Л.Миронова, Е.М.Малкова, Е.И. Ряб-чикова, М.А.Зенкова, В.В. Власов, Докл. РАН, 420, 1, 134 - 138 (2008).

[3] G.A.Aphanasenko, S.M.Dudkin, L.B.Kaminir, I.B.Leshchinskaya, E.S.Severin, FEBS Lett., 97, 77-80 (1979).

[4] И.А.Голубенко, Н.П.Балабан, И.Б.Лещинская, Т.И.Волкова, Г.И.Клейнер, Н.К.Чепурнова, Г.А.Афанасенко, С.М. Дудкин, Биохимия. 44, 640-648 (1979).

[5] F.M.Richards, H.W.Wyckoff, New York : Academic Press, 4, 647-806 (1971).

[6] S.Boussaad, Chemical physics letters, 280, 397-403 (1997).

[7] M.Bernfield, Annual Review of Biochemistry, 68, 729-777

[8] C.E.Felder, Nucleic Acids Res., 35, W512-W521

[9] A.Wlodawer, Biochemistry, 27, 2705-2717

[10] M.Ya. Reibarkh, FEBS Lett., 431. 250-254

[11]О.А.Коновалова, Н.В.Калачева, Ф.В.Ширшиков, М.Х.Салахов, Российские нанотехнологии, 6, 7-8, 122125

© О. А. Коновалова, канд. физ.-мат.. наук, доц. каф. технологического оборудования медицинской и легкой промышленности КНИТУ, olga.konovalova@bk.ru; Н. В. Калачева, ст. науч. сотр. Институт фундаментальной медицины и биологии, К(П)ФУ, nvkalacheva@ya.ru.

© О. А. Konovalova, candidate of physical and mathematical sciences, Associate Professor of the Department Technological equipment of medical and light industry, KNRTU, olga.konovalova@bk.ru; N. V. Kalacheva, Senior researcher, Kazan (Volga Region) State University, the Institute of fundamental medicine and biology, Senior researcher, Kazan (Volga Region) State University, the Institute of fundamental medicine and biology,