СПОСОБ ОБРАБОТКИ СПЕРМЫ, АППАРАТ И СВЯЗАННЫЕ КОМПОЗИЦИИ СРЕД
METHOD FOR SPERM TREATMENT, DEVICE AND RELATED MEDIUM COMPOSITIONS

Область техники
В целом, настоящее описание относится к обработке спермы и, более конкретно, относится к способам, системам и композициям, подходящим для манипуляции соотношения жизнеспособной спермы, несущей X-хромосому, к жизнеспособной сперме, несущей Y-хромосому, по меньшей мере в одной популяции спермы, и подходящим для консервации полученной подвергнутой манипуляции популяции спермы.
Уровень техники
Хромосомный набор мужских гаплоидных гамет определяет пол потомства млекопитающих. Более конкретно, оплодотворение ооцита спермой, несущей Y-хромосому, приводит к рождению потомства мужского пола, а оплодотворение спермой, несущей X-хромосому, приводит к рождению потомства женского пола. Хотя для предварительного определения пола потомства млекопитающих был исследован ряд технологий, только сортировка посредством проточной цитометрии получила широкое признание на рынке.
Проточные цитометры, модифицированные для сортировки спермы, обнаруживают относительные различия в содержании ДНК в сперме, несущей Х-хромосому, и сперме, несущей Y-хромосому. Чтобы определить содержание ДНК в сперме, популяцию спермы обычно стехиометрически окрашивают ДНК-селективным флуоресцентным красителем, который связывается с ядерной ДНК. Один такой ДНК-селективный флуоресцентный краситель хехст 33342, иногда называемый хехст бисбензимид 33342, можно применять в достаточных количествах для дифференциации небольших вариаций ядерной ДНК без проявления токсичности, присущей другим красителям.
Эти относительные различия между спермой, несущей Х-хромосому, и спермой, несущей Y-хромосому, обычно представляют собой небольшие вариации. У крупного рогатого скота, например, у быков голштинской породы различие в содержании ДНК составляет примерно 3,8%, а у быков джерсейской породы - примерно 4,1%. Вследствие неуточненной природы стехиометрического окрашивания ДНК, эти небольшие различия трудно установить. Образцы спермы, даже образцы в пределах одной породы, могут сильно различаться по концентрации, pH, подвижности и морфологии. Таким образом, условия окрашивания, которые хорошо работали в одних обстоятельствах, могут обеспечивать более слабое или более сильное окрашивание других образцов спермы, даже образцов спермы, полученных от той же породы или даже от того же животного. Форма спермы создает дополнительные трудности в разделении клеток, несущих Х-хромосому, от клеток, несущих Y-хромосому. В частности, головки спермы, которые содержат ядерную ДНК, у большинства видов имеют форму, напоминающую весло. Эта геометрия обеспечивает наличие еще одного искажающего эффекта посредством создания разных уровней флуоресцентного излучения под разными углами, и эти различия превосходят детектируемые различия в сперме, несущей хромосомы X и Y. Большинство проточных цитометров для сортировки спермы включают боковой детектор для определения ориентации спермы и ориентирующее сопло для обеспечения более равномерной ориентации спермы.
Несмотря на эти трудности, хехст 33342 можно применять в нетоксичных концентрациях. К сожалению, способ окрашивания наносит ущерб не способным к регенерации, чувствительным ко времени клеткам. В частности, равномерное окрашивание посредством хехст 33342 требует инкубации при повышенных температурах и повышенных значениях pH, и как повышение температуры спермы, так и повышение pH спермы способствуют повреждению спермы. После окрашивания давление, испытываемое спермой в проточном цитометре, может привести к дополнительному повреждению спермы, а связанные с этим сдвиговые силы могут обеспечить большее повреждение.
Ограниченная продолжительность жизни спермы часто требует замораживания для хранения и транспортировки. Внутриклеточные жидкости, включая воду, во время этого способа удаляют из клетки, чтобы уменьшить объем внутриклеточных жидкостей, которые замерзают. В противном случае внутриклеточные жидкости будут кристаллизоваться и увеличивать объем по сравнению с жидкостью. Это расширение вызывает внутриклеточное напряжение и механическое повреждение спермы и снижает фертильность спермы. Для этой цели может быть пригоден ряд криопротекторов, наиболее распространенным из которых является глицерин. Однако даже глицерин имеет ряд недостатков. Например, глицерин обладает по меньшей мере определенной степенью токсичности для спермы, эффект которой может стать более выраженным при увеличении количества глицерина. Кроме того, глицерин может быть гиперосмотическим для спермы, что может привести к некоторой степени шока для спермы, к которой был добавлен глицерин. Такие гиперосмотические свойства могут привести к быстрому сжатию или расширению спермы, вступающей в контакт с глицерином, в результате разницы в концентрации растворенного вещества с другой стороны клеточной мембраны спермы. Такое быстрое сжатие и расширение может привести к повреждению спермы. Такие токсичность и повреждение могут иметь комбинированный эффект, особенно для отсортированной спермы, которая пострадала в результате разрушающих стадий окрашивания и сортировки.
Однако наиболее часто в коммерческих условиях польза от замораживания отсортированной спермы, в целом, превосходит негативное влияние причиненного ущерба, и для минимизации неблагоприятного воздействия глицерина на сперму были разработаны определенные методики. В одном примере, глицерин может быть объединен со спермой при пониженных температурах для смягчения токсического воздействия глицерина на сперму. Для этой цели могут быть получены наполнители или другие среды, содержащие глицерин, с применением многостадийного способа, включающего две или более фракции наполнителя. В частности, наполнители спермы могут содержать фракцию «А» без глицерина и фракцию «В» с глицерином. Фракции «А» и «В» позволяют вводить наполнитель спермы в две или более стадии, например, за первой стадией, на которой фракцию А добавляют к сперме, например, отобранной по полу сперме, которая может находиться при комнатной температуре, следует вторая стадия, на которой сперму и фракцию A охлаждают до более низкой температуры, и фракцию В, содержащую глицерин, добавляют при такой более низкой температуре. Кроме того, чтобы уменьшить гиперосмотическое действие глицерина на клетки спермы, фракцию В можно добавлять в несколько стадий, возможно, чтобы снизить шок для клеток спермы, подвергая клетки спермы действию пониженных количеств глицерина на каждой стадии добавления глицерина. Как описано в международной заявке WO/200137655, например, сперма с добавлением наполнителя может быть повторно сконцентрирована центрифугированием и суспендированием в наполнителе для замораживания, иногда называемом наполнитель «AB», который имеет содержание глицерина, составляющее половину его содержания во фракции «B».
Краткое описание изобретения
Определенные варианты реализации заявленного изобретения кратко изложены ниже. Эти варианты реализации не предназначены для ограничения объема заявленного изобретения, но вместо этого служат в качестве кратких описаний возможных форм изобретения. Настоящее изобретение может охватывать разнообразные формы, отличающиеся от этих кратких описаний.
Один широкий вариант реализации, описанный в настоящем документе, относится к композиции среды для окрашивания спермы, которая включает буфер, ДНК-селективный краситель; и криопротектор. Криопротектор может представлять собой сахарный спирт, такой как этиленгликоль; глицерин; эритрит; треит; арабит; рибит; ксилит; сорбит; галактит; идит; волемит; фуцит; инозит; глицилглицит или любую комбинацию сахарных спиртов. В качестве альтернативы, криопротектор может представлять собой гликоль, такой как пропиленгликоль, бутантриол или их комбинации. Криопротектор в среде для окрашивания может иметь концентрацию объем/объем (об./об.) от примерно 0,1% до примерно 1%; от примерно 1% до примерно 2%; от примерно 2% до примерно 3%; от примерно 3% до примерно 4%; от примерно 2% до примерно 4%; или от примерно 1,5% до примерно 3%. Буфер может представлять собой любой из HEPES ((4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота)), бикарбоната натрия, MOPS ((3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота)), TRIS (трис(гидроксиметил)аминометан), TES (2-[[1,3-дигидрокси-2-(гидроксиметил)пропан-2-ил]амино]этансульфоновая кислота), TALP (раствор Тироде, альбумин, лактат, пируват), TCA (трихлоруксусная кислота), PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) молоко, его производные или их комбинации. ДНК-селективный краситель может представлять собой ДНК-селективный флуоресцентный краситель, такой как хехст 33342, который можно подавать в концентрации от примерно 10 мкМ до примерно 200 мкМ, от примерно 20 мкМ до примерно 100 мкМ, от примерно 30 мкМ до примерно 70 мкМ. Среда для окрашивания спермы может содержать инкубированную композицию среды для спермы, инкубированную при температуре от примерно 30°С до примерно 39°С, от примерно 32°С до примерно 37°С или при температуре примерно 34°С.
Другой широкий вариант реализации настоящего изобретения, описанный в настоящем документе, относится к способу обработки спермы, в котором криопротектор вводят на более ранних стадиях, чем предполагалось ранее. Образец спермы, содержащий жизнеспособную сперму, несущую Х-хромосому, и жизнеспособную сперму, несущую Y-хромосому, окрашивают средой для окрашивания и приводят в контакт с проточной жидкостью в потоке. Среда для окрашивания и/или проточная жидкость содержат криопротектор. Способ можно продолжить манипуляцией соотношения жизнеспособной спермы, несущей Y-хромосому, к жизнеспособной сперме, несущей Y-хромосому, в образце спермы с образованием по меньшей мере одной подвергнутой манипуляции популяции спермы. Некоторые варианты реализации могут дополнительно включать стадию сбора подвергнутой манипуляции популяции спермы в среду для сбора, иногда называемую жидкостью для захвата или жидкостью для сбора. В некоторых вариантах реализации каждая из среды для окрашивания, проточной жидкости и среды для сбора включает некоторое количество криопротектора. Некоторые варианты реализации могут дополнительно включать стадию криоконсервации/замораживания подвергнутого манипуляции образца спермы. Криопротектор может представлять собой многоатомный спирт, низкомолекулярный амид или метиламид; в одном варианте реализации многоатомный спирт представляет собой сахарный спирт, такой как этиленгликоль; глицерин; эритрит; треит; арабит; рибит; ксилит; сорбит; галактит; идит; волемит; фуцит; инозит; глицилглицит или любую комбинацию сахарных спиртов. В другом варианте реализации многоатомный спирт может представлять собой гликоль, такой как пропиленгликоль, бутантриол или их комбинации.
При наличии в среде для окрашивания криопротектор может иметь об./об. или масса/объем (масс./об.) концентрацию от примерно 0,1% до примерно 1%; от примерно 1% до примерно 2%; от примерно 2% до примерно 3%; от примерно 4% до примерно 5%; от примерно 2% до примерно 4%; примерно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%; или от примерно 1,5% до примерно 3%.
При наличии в проточной жидкости криопротектор может иметь об./об. или масс./об. концентрацию от примерно 0,1% до примерно 6%; от примерно 0,1% до примерно 2%; от примерно 2% до примерно 4%; от примерно 4% до примерно 6%; от примерно 1% до примерно 2%; от примерно 2% до примерно 3%; примерно 3%; от примерно 3% до примерно 4%; от примерно 4% до примерно 5%; от примерно 5% до примерно 6%; от примерно 2% до примерно 6%; примерно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%; или от примерно 3% до примерно 5%. При наличии в среде для сбора криопротектор может иметь об./об. или масс./об. концентрацию от примерно 1% до примерно 2% криопротектора по объему; от примерно 2% до примерно 4% криопротектора по объему; от примерно 4% до примерно 6% криопротектора по объему; от примерно 3% до примерно 5% криопротектора по объему; примерно 1%, 2%, 3%, 4% или 5% криопротектора по объему; от примерно 3,5% до примерно 5,5% криопротектора по объему или концентрацию примерно 4,5% по объему.
В конкретных вариантах реализации широкого способа криопротектор можно добавлять более чем в одну из среды для окрашивания, проточной жидкости, среды для сбора. Криопротектор может присутствовать в различных количествах в каждой из среды для окрашивания, проточной жидкости, среды для сбора. В одном варианте реализации концентрация криопротектора увеличивается, в случае его присутствия, на каждой последующей стадии, на которой присутствует криопротектор. Аналогичным образом, в вариантах реализации, в которых подвергнутый манипуляции образец спермы разбавляют в наполнителе для замораживания для реализации замораживания, и когда криопротектор добавляют более чем в одну из среды для окрашивания, проточной жидкости, среды для сбора, криопротектор может присутствовать в наполнителе для замораживания в об./об. или масс./об. концентрации менее 6%. В таком варианте реализации криопротектор может присутствовать в наполнителе для замораживания в об./об. или масс./об. концентрации от примерно 1% до примерно 6%, от примерно 3% до примерно 5%, от примерно 3,5% до примерно 5,5%, примерно 3,5%, от примерно 4% до примерно 5% или в концентрации примерно 4,5%.
Один широкий вариант реализации, описанный в настоящем документе, относится к системе манипуляции с образцом спермы в присутствии криопротектора. Система включает источник образца, содержащий образец спермы, и источник проточной жидкости, содержащий проточную жидкость, содержащую криопротекторную добавку. Структура доставки жидкости образует коаксиальный поток образца спермы из источника образца, окруженного проточной жидкостью из источника проточной жидкости, и направляет коаксиальный поток через участок проведения измерения. Источник электромагнитного излучения освещает сперму в участке проведения измерения, и, по меньшей мере, один детектор генерирует сигналы в ответ на такое освещение. Анализатор определяет характеристики спермы на основе сигналов, генерируемых по меньшей мере одним детектором.
В некоторых вариантах реализации системы манипуляции с образцом спермы структура для доставки жидкости содержит сопло, такое как ориентирующее сопло. В то время как в других вариантах реализации структура для доставки жидкости содержит проточный канал, такой как кювета или микрожидкостной чип. Некоторые варианты реализации системы включают необходимые компоненты для формирования, загрузки и отклонения капель от коаксиального потока, в то время как в других вариантах реализации фоторазрушающий (т.е. абляционный) лазер повреждает выбранную сперму в коаксиальном потоке.
Криопротектор присутствует в проточной жидкости, если такая система может представлять собой сахарный спирт, такой как этиленгликоль; глицерин; эритрит; треит; арабит; рибит; ксилит; сорбит; галактит; идит; волемит; фуцит; инозит; глицилглицит или любую комбинацию сахарных спиртов. В качестве альтернативы, криопротектор может представлять собой гликоль, такой как пропиленгликоль, бутантриол или их комбинации. Криопротектор может присутствовать в проточной жидкости в об./об. или масс./об. концентрации от примерно 0,1% до примерно 6%; от примерно 0,1% до примерно 2%; от примерно 2% до примерно 4%; от примерно 4% до примерно 6%; от примерно 1% до примерно 2%; от примерно 2% до примерно 3%; от примерно 3% до примерно 4%; от примерно 4% до примерно 5%; от примерно 5% до примерно 6%; от примерно 2% до примерно 6%; или от примерно 3% до примерно 5%.
Еще один широкий вариант реализации, описанный в настоящем документе, относится к способу обработки спермы, в котором криопротектор вводят на более ранних стадиях, чем предполагалось ранее. Образец спермы, содержащий жизнеспособную сперму, несущую Х-хромосому, и жизнеспособную сперму, несущую Y-хромосому, окрашивают средой для окрашивания, содержащей ДНК-селективный краситель, и вводят в поток проточной жидкости. Окрашенную сперму в образце спермы затем подвергают воздействию источника электромагнитного излучения, который вызывает детектируемый ответ ДНК-селективного красителя. Затем детектируемый ответ ДНК-селективного красителя детектируют и осуществляют манипуляцию соотношения жизнеспособной спермы, несущей Х-хромосому, к жизнеспособной сперме, несущей Y-хромосому, чтобы сформировать по меньшей мере одну подвергнутую манипуляции популяцию спермы. По меньшей мере, одну подвергнутую манипуляции популяцию спермы собирают в одном или более сосудах для сбора, содержащих среды для сбора. В этом широком способе одна или более из среды для окрашивания, проточной жидкости и среды для сбора содержат криопротектор.
Криопротектор может представлять собой сахарный спирт, такой как этиленгликоль; глицерин; эритрит; треит; арабит; рибит; ксилит; сорбит; галактит; идит; волемит; фуцит; инозит; глицилглицит или любую комбинацию сахарных спиртов. В качестве альтернативы, криопротектор может представлять собой гликоль, такой как пропиленгликоль, бутан триол или их комбинации.
При наличии в среде для окрашивания криопротектор может иметь об./об. или масс./об. концентрацию от примерно 0,1% до примерно 1%; от примерно 1% до примерно 2%; от примерно 2% до примерно 3%; от примерно 4% до примерно 5%; от примерно 2% до примерно 4%; или от примерно 1,5% до примерно 3%.
При наличии в проточной жидкости криопротектор может иметь об./об. или масс./об. концентрацию менее 6%; менее 5%; менее 4%; менее 3%; менее 2%; менее 1%; от примерно 0,1% до примерно 6%; от примерно 0,1% до примерно 2%; от примерно 2% до примерно 4%; от примерно 4% до примерно 6%; от примерно 1% до примерно 2%; от примерно 2% до примерно 3%; от примерно 3% до примерно 4%; от примерно 4% до примерно 5%; от примерно 5% до примерно 6%; от примерно 2% до примерно 6%; или от примерно 3% до примерно 5%.
Аналогичным образом, при наличии в среде для сбора криопротектор может иметь об./об. или масс./об. концентрацию от примерно 1% до примерно 2%; от примерно 2% до примерно 4%; от примерно 4% до примерно 6%; от примерно 3% до примерно 5%; от примерно 3,5% до примерно 5,5%; или концентрацию примерно 4,5.
Криопротектор может присутствовать в различных количествах в каждой из среды для окрашивания, проточной жидкости, среды для сбора. В одном варианте реализации концентрация криопротектора увеличивается, в случае его присутствия, на каждой последующей стадии, на которой присутствует криопротектор.
В вариантах реализации, в которых подвергнутый манипуляции образец спермы разбавляют в наполнителе для замораживания для реализации замораживания, и когда криопротектор добавляют более чем в одну из среды для окрашивания, проточной жидкости, среды для сбора, криопротектор может присутствовать в наполнителе для замораживания в об./об. или масс./об. концентрации менее 6%. В таком варианте реализации криопротектор может присутствовать в концентрации от 1% до 6%, от 3,5% до 5,5%, от 4% до 5% или в концентрации примерно 4,5%.
Еще один широкий вариант реализации, описанный в настоящем документе, относится к способу замораживания/криоконсервации подвергнутой манипуляции популяции спермы, собранной в смеси, которая включает криопротектор. Один из таких вариантов реализации включает приведение окрашенного образца спермы в контакт с проточной жидкостью в потоке; манипуляция соотношения жизнеспособной спермы, несущей Х-хромосому, к жизнеспособной сперме, несущей Y-хромосому, с образованием по меньшей мере одной подвергнутой манипуляции популяции спермы; сбор подвергнутого манипуляции образца спермы в присутствии криопротектора; концентрирование собранного образца спермы; повторное суспендирование концентрированного образца спермы в наполнителе для замораживания; и замораживание повторно суспендированного образца спермы. Способ может дополнительно включать стадию охлаждения спермы в течение периода менее 90 минут. Кроме того, стадия сбора смеси дополнительно включает: сбор смеси в емкость, которая содержит от примерно 5 мл до примерно 50 мл среды для сбора. В некоторых вариантах реализации стадия сбора смеси дополнительно включает сбор отсортированного образца спермы из проточного цитометра до заполнения емкости до примерно от 60% до примерно 90% вместимости емкостей. В дополнительных вариантах реализации стадию концентрирования собранной смеси осуществляют в емкости. В еще одном дополнительном варианте реализации стадия концентрирования собранного образца спермы непосредственно следует за стадией сбора подвергнутого манипуляции образца спермы, в присутствии криопротектора без какого-либо дополнительного разбавления, происходящего между указанными стадиями. Наполнитель для замораживания в данном варианте реализации может составлять менее 6% об./об. или масс./об. криопротектора; от 3,5 до 5,5% об./об. или масс./об. криопротектора; или от 4 до 5% об./об. или масс./об. криопротектора. В дополнительном варианте реализации стадия манипуляции соотношения жизнеспособной спермы, несущей Х-хромосому, к жизнеспособной сперме, несущей Y-хромосому, для формирования по меньшей мере одной подвергнутой манипуляции популяции спермы может включать либо формирование капель, которые, как ожидается, будут содержать выбранную сперму, либо отклонение этих капель для сбора или фотоповреждение выделенной спермы в потоке.
Дополнительный аспект настоящего изобретения включает применение спермы, обработанной с применением любого из способов, описанных в настоящем документе, для оплодотворения ооцита. Такое оплодотворение может быть достигнуто путем приведения обработанной спермы в контакт с ооцитом. Данный вариант реализации настоящего изобретения охватывает применение любых способов оплодотворения in vitro (ЭКО), известных в данной области техники, или любых способов искусственного оплодотворения, известных в данной области техники, для достижения оплодотворения.
В отношении любого и всех вариантов реализации настоящего изобретения, раскрытых в настоящем документе, включая вышеупомянутые варианты реализации, проточная жидкость, среда для окрашивания или среда для сбора могут содержать любой из вышеупомянутых криопротекторов в об./об. или масс./об. концентрации, составляющей менее 8%; менее 7%; 6%; менее 6%; менее 5%; 4,5%; менее 4%; менее 3%; менее 2%; или менее 1%.
Кроме того, отношении любого и всех вариантов реализации настоящего изобретения, раскрытых в настоящем документе, включая вышеупомянутые варианты реализации, проточная жидкость, среда для окрашивания или среда для сбора могут содержать любой из вышеупомянутых криопротекторов в любой из следующих концентраций: от 10 мМ до 1000 мМ; от 10 мМ до 500 мМ; от 10 мМ до 300 мМ; от 10 мМ до 200 мМ; от 10 мМ до 150 мМ; менее 1000 мМ; менее 900 мМ; менее 800 мМ; менее 700 мМ; менее 600 мМ; менее 500 мМ; менее 400 мМ; менее 300 мМ; менее 200 мМ; менее 150 мМ; менее 100 мМ; менее 50 мМ; или менее 25 мM.
В дополнительном варианте реализации настоящего изобретения криопротектор для применения в любом из вышеупомянутых вариантов реализации, содержащийся в среде для окрашивания, в проточной жидкости, в жидкости для захвата или в среде для замораживания, может содержать эритрит. В дополнительном варианте реализации эритрит находится в концентрации от примерно 10 до 300 мМ, от примерно 15 до 250 мМ, от примерно 25 до 125 мМ, от примерно 40 до 80 мМ, от примерно 0,01 до 1000 мМ, от примерно 0,01 до 400 мМ, примерно 35 мМ, примерно 65 мМ, примерно 135 мМ, примерно 270 мМ, примерно 400 мМ, от 400 до 1000 мМ, от 400 до 500 мМ или от 400 до 600 мМ.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 иллюстрирует схему проточного цитометра для проведения манипуляции с образцом спермы в соответствии с некоторыми вариантами реализации, описанными в настоящем документе.
Фиг. 2 иллюстрирует графическое представление параметров, полученных в проточном цитометре при проведении манипуляции с образцом спермы в соответствии с различными вариантами реализации, описанными в настоящем документе.
Фиг. 3 иллюстрирует графическое представление параметров, полученных в проточном цитометре при проведении манипуляции с образцом спермы в соответствии с различными вариантами реализации, описанными в настоящем документе.
Фиг. 4 иллюстрирует графическое представление параметров сортировки, полученных в проточном цитометре при сортировке спермы в соответствии с различными вариантами реализации, описанными в настоящем документе.
Фиг. 5-7 иллюстрируют альтернативные варианты применения криопротектора на различных стадиях обработки образца спермы.
Фиг. 8 иллюстрирует вариант реализации, включающий замораживание образца спермы.
На фиг. 9 показаны отношения максимального сигнала к минимальному, полученные при применении проточной жидкости, содержащей различные количества глицерина.
На фиг. 10 показана подвижность спермы после оттаивания, отсортированной с применением различных количеств глицерина в проточной жидкости.
На фиг. 11 показана жизнеспособность после оттаивания и процент интактных акросом (PIA) спермы, отсортированной с применением различных количеств глицерина в проточной жидкости.
На фиг. 12 показаны отношения максимального сигнала к минимальному (PVR), полученные при применении проточной жидкости, содержащей различные количества глицерина.
На фиг. 13 показана подвижность после оттаивания, жизнеспособность и PIA спермы, отсортированной с применением различных количеств глицерина в проточной жидкости.
На фиг. 14 показана сходимость подвижности после оттаивания, жизнеспособности и PIA спермы, отсортированной с применением различных количеств глицерина в проточной жидкости.
На фиг. 15 показана подвижность после оттаивания, жизнеспособность и PIA спермы, отсортированной с применением различных количеств глицерина в проточной жидкости.
На фиг. 16 показана сходимость подвижности после оттаивания, жизнеспособности и PIA спермы, отсортированной с применением различных количеств глицерина в проточной жидкости.
На фиг. 17 показана подвижность после оттаивания, жизнеспособность и PIA спермы, отсортированной с применением различных гликолей в проточной жидкости.
На фиг. 18 показана сходимость подвижности после оттаивания, жизнеспособности и PIA спермы, отсортированной с применением различных гликолей в проточной жидкости.
На фиг. 19 показана подвижность после оттаивания спермы, отсортированной с применением различных количеств глицерина в проточной жидкости.
На фиг. 20 показана жизнеспособность после оттаивания и PIA спермы, отсортированной с применением различных количеств глицерина в проточной жидкости.
На фиг. 21 показана подвижность после оттаивания спермы, отсортированной с применением различных гликолей в проточной жидкости.
На фиг. 22 показана жизнеспособность после оттаивания и PIA спермы, отсортированной с применением различных гликолей в проточной жидкости.
На фиг. 23 показана подвижность через 0 часов после оттаивания для спермы, отсортированной с применением 3% глицерина в проточной жидкости и криоконсервированной в среде, имеющей различные концентрации глицерина.
На фиг. 24 показана жизнеспособность и PIA через 0 часов после оттаивания для спермы, отсортированной с применением 3% глицерина в проточной жидкости и криоконсервированной в среде, имеющей различные концентрации глицерина.
На фиг. 25 показана подвижность через 3 часа после оттаивания для спермы, отсортированной с применением 3% глицерина в проточной жидкости и криоконсервированной в среде, имеющей различные концентрации глицерина.
На фиг. 26 показана жизнеспособность и PIA через 3 часа после оттаивания для спермы, отсортированной с применением 3% глицерина в проточной жидкости и криоконсервированной в среде, имеющей различные концентрации глицерина.
На фиг. 27 показана сходимость подвижности после оттаивания для спермы, отсортированной с применением 3% глицерина в проточной жидкости и криоконсервированной в среде, имеющей различные концентрации глицерина.
На фиг. 28 показана сходимость жизнеспособности после оттаивания и PIA для спермы, отсортированной с применением 3% глицерина в проточной жидкости и криоконсервированной в среде, имеющей различные концентрации глицерина.
На фиг. 29 показана подвижность через 0 часов после оттаивания, жизнеспособность и PIA для спермы, отсортированной с применением различных количеств глицерина в проточной жидкости и криоконсервированной в среде, имеющей различные концентрации глицерина.
На фиг. 30 показана подвижность через 3 часа после оттаивания, жизнеспособность и PIA для спермы, отсортированной с применением различных количеств глицерина в проточной жидкости и криоконсервированной в среде, имеющей различные концентрации глицерина.
На фиг. 31 показана сходимость подвижности после оттаивания, жизнеспособности и PIA для спермы, отсортированной с применением различных количеств глицерина в проточной жидкости и криоконсервированной в среде, имеющей различные концентрации глицерина.
На фиг. 32 показаны результаты ЭКО с применением спермы, отсортированной либо при наличии глицерина в проточной жидкости, либо при отсутствии в проточной жидкости.
На фиг. 33 показана подвижность после оттаивания, PIA, сходимость и жизнеспособность спермы, отсортированной либо при наличии глицерина в проточной жидкости, либо при отсутствии в проточной жидкости.
На фиг. 34 показаны показатели зачатия для спермы, отсортированной либо при наличии глицерина в проточной жидкости, либо при отсутствии в проточной жидкости.
На фиг. 35 показана подвижность после оттаивания, жизнеспособность и PIA для отсортированной спермы, замороженной с AB, полученной с помощью криоконсерванта, или с AB, полученной с 100% об./об. глицерина.
На фиг. 36 показана подвижность после оттаивания, жизнеспособность и PIA для спермы, отсортированной при наличии глицерина в жидкости для захвата и проточной жидкости либо при отсутствии в жидкости и проточной жидкости.
На фиг. 37 показана подвижность спермы в капрогене (Caprogen) с глицерином и в капрогене с различными концентрациями эритрита.
Способы реализации изобретения
Сперма может быть получена или предоставлена путем получения образца спермы или раствора спермы, который содержит сперматозоиды. Как используется повсеместно, термин «сперма» относится к единственному или множественному числу мужской репродуктивной клетки, тогда как «образец спермы» относится к жидкости-носителю в дополнение к содержащейся в ней сперме. Примеры образцов спермы включают чистую семенную жидкость или сперму, разбавленную в другом растворе, таком как разбавитель или буфер, и включают замороженную оттаявшую сперму. Образец спермы может быть получен в том же месте, где осуществляют остальные стадии, или может быть разбавлен в подходящем разбавителе спермы для транспортировки к сортировочной установке. После получения сперму можно поддерживать при комнатной температуре, охлажденной или даже замороженной в подходящем разбавителе для последующего применения. Сперма для окрашивания и сортировки может быть получена у млекопитающего или может представлять собой сперму, полученную из хранилища, например, замороженная или охлажденная пробирка, полученная из хранилища. В качестве альтернативы, замороженная или разбавленная сперма может быть объединена.
Образец спермы может происходить от млекопитающих, таких как млекопитающие, отличающиеся от человека, перечисленные Wilson, D.E. и Reeder, D.M., Mammal Species of the World. Smithsonian Institution Press, (1993), полное содержание которого включено в настоящую заявку посредством ссылки. Во время сбора, оттаивания или даже объединения можно проверить концентрацию, pH, подвижность и/или морфологию спермы. Кроме того, до реализации дополнительных стадий обработки можно добавлять антибиотики.
После получения сперму можно необязательно стандартизировать до предварительно определенной концентрации и/или до предварительно определенного значения рН. Используемый в настоящем документе термин «стандартизация» можно понимать как действие, выполняемое для того, чтобы привести различные характеристики эякулята в предварительно определенный диапазон или приблизиться к указанному предварительно определенному диапазону. Хотя бычий эякулят, например, может сильно различаться по pH и концентрации спермы, стадия стандартизации концентрации спермы или pH может включать добавление буфера высокой емкости, который служит для стандартизации pH, и буфера против склонности эякулятов к закислению с течением времени.
Каждая величина из предварительно определенных концентрации и рН может быть специфичной для разных видов или даже для разных пород животных в пределах вида. В одном варианте реализации сперма может быть объединена с исходным разбавителем в форме буфера с высокой емкостью или с разбавителем, имеющим большую буферную емкость рН. Подходящие разбавители могут включать цитрат TRIS, цитрат натрия, бикарбонат натрия, HEPES, TRIS, TEST, MOPS, KMT, TALP, их производные и их комбинации. Любой разбавитель, содержащий буфер с высокой емкостью для буферизации рН, также можно применять, и его можно применять в комбинации с дополнительными компонентами, которые способствуют жизнеспособности спермы. В качестве примера добавки белок может быть включен в форме яичного желтка, молока, липопротеинов, лецитина, казеина или альбумина или других источников белка. Источник энергии также может быть включен в форме моносахарида, такого как фруктоза, глюкоза или манноза, или даже дисахарида или трисахарида. Кроме того, антиоксиданты и антибиотики можно применять в исходном разбавителе для повышения жизнеспособности спермы.
+
Для исходного разбавителя может быть задан предварительно определенный pH для стандартизации pH всех полученных образцов спермы, например, pH от примерно 6,8 до 7,4. В одном варианте реализации разбавитель доводят до рН 7,2. Кроме того, со временем семенная жидкость может становиться все более кислой, возможно, вследствие наличия белков в семенной жидкости или вследствие наличия кислых продуктов метаболизма или побочных продуктов мертвых или умирающих клеток. Начальный разбавитель вводит достаточно свободных сайтов связывания протонов (то есть Н), чтобы поддерживать рН вблизи заданной целевого значения. Даже в свете естественной склонности к тому, что сперма со временем становится более кислой, исходный разбавитель обеспечивает средство стабилизации pH на всех дополнительных стадиях обработки.
Начальный наполнитель может содержать добавки с целью поддержания здорового состояния спермы. Первоначальный наполнитель может включать антибиотики для предотвращения размножения бактерий. В качестве неограничивающих примеров, тилозин, гентамицин, линкомицин, линкоспектин, спектиномицин, пенициллин, стрептомицин и их комбинации могут быть включены в исходный наполнитель.
Для уменьшения свободных радикалов и окислительного стресса в исходный наполнитель также могут быть включены антиоксиданты. Хотя настоящее обсуждение касается применения антиоксидантов в исходном разбавителе, следует понимать, что антиоксиданты могут быть включены в несколько стадий способа сортировки спермы, независимо или в комбинации, как описано в международной заявке на патент WO2012167151, полное содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки. Неограничивающий список антиоксидантов, которые могут быть включены, включает: каталазу, СОД, имитатор СОД, глутатион, глутатионредуктазу, глутатионпероксидазу, пируват, капроновую кислоту, меркаптоэтанол, ВНТ, липоевую кислоту, флавины, хинины, витамин К (и другие витамеры), витамин В12, витамеры витамина В12, витамин Е (и родственные витамеры), токоферолы, токотриенолы, а-токоферил, альфа-кетоглутарат (АКГ), малоновый диальдегид (МДА), асимметричный диметиларгинин (АДМА) и их биологически активные производные и их комбинации.
Концентрация антиоксидантов может находиться в диапазоне от 0,01 мг/мл до 0,5 мг/мл, и в качестве неограничивающих примеров перечисленные выше антиоксиданты могут быть предложены в концентрации от 0,01 мг/мл до 5,0 мг/мл; от 0,01 мг/мл до 0,25 мг/мл; от 0,01 мг/мл до 0,5 мг/мл; от 0,01 мг/мл до 1 мг/мл; от 0,01 мг/мл до 2,5 мг/мл; от 0,01 мг/мл до 5 мг/мл; от 0,05 мг/мл до 0,1 мг/мл; от 0,05 мг/мл до 1,0 мг/мл; от 0,05 мг/мл до 2,5 мг/мл; от 0,1 мг/мл до 0,25 мг/мл; от 0,1 мг/мл до 0,5 мг/мл; от 0,1 мг/мл до 1 мг/мл; от 0,1 мг/мл до 2,5 мг/мл; от 0,1 мг/мл до 5 мг/мл; от 0,15 мг/мл до 0,45 мг/мл; от 0,15 мг/мл до 0,5 мг/мл; от 0,25 мг/мл до 0,35 мг/мл; от 0,25 мг/мл до 0,5 мг/мл; от 0,25 мг/мл до 1 мг/мл; от 0,25 мг/мл до 2,5 мг/мл; от 0,25 мг/мл до 5 мг/мл; от 0,35 мг/мл до 0,5 мг/мл; от 0,35 мг/мл до 1 мг/мл; от 0,35 мг/мл до 2,5 мг/мл; от 0,35 мг/мл до 5 мг/мл; от 0,5 мг/мл до 1 мг/мл; от 0,5 мг/мл до 2,5 мг/мл; от 0,5 мг/мл до 5 мг/мл; от 1 мг/мл до 2,5 мг/мл; и от 1 мг/мл до 5 мг/мл.
В качестве одного примера, образец спермы может быть разведен в буфере с высокой емкостью в соотношениях от 1:1 до 1:10. Полученная смесь будет иметь концентрацию спермы во много раз ниже естественных концентраций спермы для определенного вида. Разбавленную сперму можно центрифугировать для повторного концентрирования спермы. Центрифугирование спермы и удаление супернатанта позволяет повторно концентрировать сперму до предварительно определенной концентрации. Предварительно определенная концентрация может быть выбрана на основании дополнительных стадий обработки спермы. Например, в случае сортировки по половому признаку бычью сперму можно повторно концентрировать от примерно 2400 миллионов спермы на мл до примерно 500 миллионов спермы на мл для имитации естественного диапазона концентраций при замене компонентов семенной плазмы на разбавитель. Другие концентрации, такие как примерно от 1400 миллионов спермы на мл до примерно 2100 миллионов спермы на мл, или примерно от 1700 миллионов спермы на мл до примерно 2100 миллионов спермы на мл, также могут быть достигнуты для дальнейшей обработки.
В одном варианте реализации концентрация спермы и рН могут обеспечить единую исходную точку для дальнейшей обработки. Например, относительно постоянные рН и концентрация могут обеспечить большую предсказуемость при окрашивании спермы, например, с помощью ДНК-селективного красителя. Если каждый образец доводить до одинаковых предварительно определенных значений рН и концентрации, для каждого нового отбора может потребоваться меньшее количество испытаний, чтобы обеспечить надлежащее окрашивание для сортировки по полу.
Популяция спермы будет включать как сперму, несущую Х-хромосому, так и сперму, несущую Y-хромосому. Кроме того, каждая из спермы, несущей Х-хромосому, и спермы, несущей Y-хромосому, будет включать жизнеспособную и нежизнеспособную сперму. Жизнеспособной спермой можно считать сперму с неповрежденными мембранами, в то время как нежизнеспособной спермой можно считать сперму с поврежденными мембранами. Различие между жизнеспособной спермой и нежизнеспособной спермой при обычной сортировке спермы определяют включением гасящего красителя, который проникает в сперму с поврежденной мембраной. Сперма, которая имеет склонность отмирать или погибать, поглощает гасящий краситель и генерирует флуоресцентные сигналы, отличные от остальной популяции спермы, тогда как сперма, имеющая неповрежденные мембраны, имеет склонность быть жизнеспособной и предотвращать поглощение гасящего красителя. Жизнеспособная сперма в соответствующей дозировке, как правило, будет способна достигать оплодотворения при искусственном осеменении, в то время как нежизнеспособная сперма или сперма с поврежденной мембраной может быть неспособна достичь оплодотворения при искусственном оплодотворении или будет иметь значительно сниженную способность к осуществлению этого. Тем не менее, некоторая сперма, способная к оплодотворению, может иметь поврежденные мембраны, а некоторая сперма с неповрежденными мембранами может быть неспособна к оплодотворению.
Будучи стандартизированной или нет, сперма может быть окрашена средой для окрашивания для введения ДНК-селективного красителя. На стадии окрашивания по меньшей мере часть популяции спермы инкубируют со средой для окрашивания и ДНК-селективным флуоресцентным красителем для стехиометрического окрашивания содержимого ДНК каждой клетки в популяции спермы. Хехст 33342 имеет склонность быть менее токсичным, чем другие ДНК-селективные красители. Носитель для доставки этого красителя может быть в форме модифицированного буфера TALP, доведенного до pH примерно 7,4. Хехст 33342 описан в патенте США 5135759, и обычно его применяют для этой цели. Однако также можно применять другие красители-возбудители УФ-излучения, а также возбудители видимого света, флуоресцентные полиамиды, флуоресцентные последовательности нуклеотидов и специфичные к полу антитела.
Сперма в естественном состоянии часто не является легко проницаемой для таких красителей. Чтобы получить однородное окрашивание, первая стадия окрашивания может включать инкубацию по меньшей мере части популяции спермы при повышенной температуре в среде для окрашивания (иногда называемой в настоящем документе «буфером для окрашивания») при повышенном рН в дополнение к красителю. Примеры подходящих окрашивающих растворов могут представлять собой TALP, TES-TRIS, цитрат TRIS, цитрат натрия или среду на основе HEPES, каждая из которых описана в WO 2005/095960, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки. Неограничивающий пример модифицированного TALP, описанного в WO 2001/37655, который включен в настоящую заявку посредством ссылки, проиллюстрирован в таблице 1.
Таблица 1. Концентрация ингредиентов модифицированного TALP буфера
Ингредиент
Концентрация
NaCl
KC1
NaHPО<sub>4</sub>
NaHCО<sub>3</sub>
MgCL<sub>2</sub>6H<sub>2</sub>О
0,4mM
Пируват Na
Глюкоза
Лактат Na
HEPES
Бычий сывороточный альбумин
3,0 мг/мл
6
6
6
6
6
В качестве одного примера, популяция спермы или часть популяции спермы может быть разбавлена средой для окрашивания от 640xl0 до 40xl0 спермы/мл до примерно от 320х10 до 80х10 спермы/мл или до примерно 160х10 спермы/мл в буфере. ДНК-селективный флуоресцентный краситель можно добавлять к сперме, суспендированной в буфере, в концентрации примерно от 10 мкМ до 200 мкМ; от примерно от 20 мкМ до 100 мкМ или от примерно от 30 мкМ до 70 мкМ. pН буфера может составлять от примерно 6,8 до 7,9; от примерно 7,1 до 7,6; или примерно 7,4, чтобы помочь обеспечить равномерное окрашивание ядерной ДНК. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что рН можно повысить при добавлении NaOH и снизить при добавлении HCl. Необязательно в окрашивающий раствор могут быть включены ранее окрашенные антиоксиданты и концентрации.
Популяцию спермы можно инкубировать при температуре от 30 до 39°С, примерно от 32 до 37°С или примерно 34°С. Период инкубации может варьироваться от примерно 20 минут до примерно трех часов, от примерно 30 минут до примерно 90 минут или от примерно 45 минут до примерно 60 минут. В качестве одного примера, популяцию спермы можно инкубировать в течение примерно 45 минут при 34°С. Даже в пределах одного вида концентрация спермы и рН и другие факторы, влияющие на окрашиваемость, могут варьироваться от животного к животному. Специалисты в данной области техники могут оценить незначительные изменения для инкубации спермы между видами и даже между породами или животными одной и той же породы для достижения равномерного окрашивания без чрезмерного окрашивания популяции спермы.
В дополнение к ДНК-селективному флуоресцентному красителю можно применять гасящий краситель для проникновения через сперму с поврежденной мембраной и гашения генерируемых ей сигналов. Можно понимать, что гасящий краситель включает красители, которые иначе связываются со спермой с поврежденной мембраной. Возможно эти красители легче проникают в сперму с поврежденной мембраной, так как мембраны разрушаются или становятся все более пористыми. Также возможно, что гасящие красители легко проникают во все мембраны спермы, и что здоровая сперма активно выкачивает гасящие красители быстрее, чем сперма с поврежденной мембраной. В любом случае сперма, с которой связываются гасящие красители, включает большую часть погибшей и погибающей спермы, хотя не обязательно всю погибшую и погибающую сперму. Погашенные сигналы, производимые спермой с поврежденной мембраной, связанной с гасящим красителем, достаточно отличаются от сигналов здоровой спермы, поэтому они могут быть удалены из дальнейшего анализа и сортировки, применяемой к жизнеспособной сперме.
В одном варианте реализации предварительно выполняют вторую стадию окрашивания, на которой дополнительно снижают концентрацию спермы и вводят гасящий краситель. рH второй среды для окрашивания может быть нацелен на достижение целевого pH в конечном образце спермы. Неограничивающие примеры двухстадийных способов окрашивания описаны в опубликованной международной заявке PCT WO 2011/123166 и международной заявке PCT/US12/58008, полное описание обеих из которых включено в настоящую заявку посредством ссылки.
В другом варианте реализации гасящий краситель и ДНК-селективный краситель наносят совместно в одном разведении. В этом варианте реализации гасящий краситель инкубируют вместе с ДНК-селективным красителем при повышенной температуре в окрашивающем растворе. В качестве примера, среда для окрашивания может представлять собой модифицированный TALP с рН 7,4. Однако можно применять другие красители, включая TES-TRIS, цитрат TRIS, цитрат натрия или среду на основе HEPES, содержащую селективный для ДНК краситель и гасящий краситель, и pH может варьироваться примерно от 7,0 до 7,8. В одном варианте реализации может существовать синергия, когда сперму стандартизируют при повышенном pH примерно 7,2 перед окрашиванием при pH 7,4. Таким образом, pH, который воздействует на сперму, остается в постоянном диапазоне с минимальными изменениями. Поскольку среда для окрашивания и исходный разбавитель обладают высокой буферной емкостью, полагают, что можно избежать естественной склонности спермы к закислению с течением времени.
В одном варианте реализации, независимо от применения одностадийного или двухстадийного протокола окрашивания, криопротектор может быть включен в стадию или стадии окрашивания. Следует понимать, что применяемый в настоящем документе термин «криопротектор» относится к веществу, которое защищает клетки или биологическую ткань от повреждения при замерзании. Криопротекторы могут включать те вещества, которые действуют для удаления внутриклеточной воды, чтобы предотвратить повреждение, связанное с образованием и расширением внутриклеточного льда. Такое действие может быть вызвано увеличением концентрации растворенного вещества в клетках. Вещества, которые защищают клетки и ткани от других типов повреждений, таких как осмотический шок и охлаждение, но не замораживание, не считаются криопротекторами. В качестве нескольких примеров, источники липопротеинов, фосфолипидов, лецитина и тому подобных, такие как яичный желток, экстракт яичного желтка, молоко, экстракт молока, казеин, альбумин, лецитин и холестерин, не являются криопротекторами, как термин применяется в настоящем документе. Кроме того, источники энергии, такие как моносахариды, дисахариды и трисахариды, не являются криопротекторами, применяемыми в настоящем документе.
Криопротекторы, которые могут быть включены на стадии окрашивания, включают ряд сахарных спиртов и гликолей. В качестве неограничивающих примеров сахарные спирты, такие как этиленгликоль; глицерин; эритрит; треит; арабит; рибит; ксилит; сорбит; галактит; идит; волемит; фуцит; инозит; глицилглицит и их комбинации, могут быть включены в качестве криопротектора, вводимого во время окрашивания. В патенте США 3185623, полное содержание которого включено в настоящую заявку посредством ссылки, описан ряд углеводных спиртов (то есть сахарных спиртов или альдитов), которые могут быть подходящими криопротекторами, применимыми в настоящем изобретении. Кроме того, в качестве криопротектора могут быть включены гликоли, такие как пропиленгликоль, бутантриол. Многие такие криопротекторы являются токсичными для спермы при определенных концентрациях и температурах. Глицерин, например, обычно добавляют в сперму после охлаждения спермы до температуры 5°C, особенно из-за этой токсичности. Неожиданно, как более подробно описано в примерах, было показано, что присутствие криопротектора на стадии окрашивания улучшает подвижность после оттаивания замороженной впоследствии спермы и улучшает сортировку спермы. Это является особенно удивительным и неожиданным результатом, учитывая тот факт, что окрашивание спермы с целью сортировки по полу обычно проводят при температуре выше 34°C.
Криопротектор можно обеспечить во время стадии окрашивания, например, в среде для окрашивания, при об./об. или масс./об. концентрации от примерно 0,1% до примерно 5%. Например, окрашенный образец спермы для дальнейшей обработки, такой как сортировка в проточном цитометре, может содержать криопротектор в об./об. или масс./об. концентрации от примерно 0,1% до примерно 1%; от примерно 1% до примерно 2%; от примерно 2% до примерно 3%; от примерно 3% до примерно 4%; от примерно 2% до примерно 4%; или от примерно 1,5% до примерно 3%.
Краситель может быть дополнен антиоксидантом в ранее описанных диапазонах концентраций. В некоторых вариантах реализации повышенное давление может увеличивать количество свободных радикалов и окислительный стресс, испытываемый при окрашивании спермы. Соответственно, антиоксиданты могут служить для нейтрализации свободных радикалов и уменьшения окислительного стресса, испытываемого окрашиваемой спермой. Неограничивающий перечень антиоксидантов, которые могут быть включены в способ окрашивания, включает: каталазу, СОД, имитатор СОД, глутатион, глутатионредуктазу, глутатионпероксидазу, пируват, капроновую кислоту, меркаптоэтанол, ВНТ, липоевую кислоту, флавины, хинины, витамин К (и другие витамеры), витамин В12, витамеры витамина В12, витамин Е (и родственные витамеры), токоферолы, токотриенолы, а-токоферил, альфа-кетоглутарат (АКГ), малоновый диальдегид (МДА), асимметричный диметиларгинин (АДМА) и их биологически активные производные и их комбинации. Можно применять любую из ранее описанных концентраций.
Стадия или стадии окрашивания могут необязательно включать компоненты для снижения подвижности или дыхания спермы во время окрашивания. В качестве нескольких примеров, стадия или стадии окрашивания могут снижать дыхание спермы путем включения добавок или путем уменьшения и/или уменьшения воздействия определенных веществ на сперму. В частности, можно применять краситель с низким содержанием сахара, в котором присутствует только остаточный уровень фруктозы, сахарозы, глюкозы или другого сахара. Аналогичным образом, дыхание спермы может быть снижено путем окрашивания под парциальным давлением азота или углекислого газа, чтобы вытеснить кислород в красителе. В качестве альтернативы к красителю могут быть добавлены вещества, которые имеют определенные соотношения калия и натрия, которые имеют тенденцию снижать дыхание спермы. В качестве другой альтернативы, на стадии или стадиях окрашивания могут быть добавлены фторид или фторид натрия, чтобы снизить дыхание спермы.
Будучи стандартизированной или нет, и будучи окрашенной на одной стадии или на двух стадиях, популяция спермы может быть отсортирована с помощью инструмента для сортировки частиц, такого как проточный цитометр, в том числе, без ограничения, цитометр «струя в воздухе», проточный цитометр с кюветой или микрожидкостной чип. Со ссылкой на фиг. 1, проиллюстрирован проточный цитометр (10) «струя в воздухе», хотя сортировку можно осуществлять с помощью микрожидкостных чипов или других типов проточных цитометров, включая проточный цитометр с закрытыми камерами и цитометры, содержащие абляционные лазеры. Проточный цитометр (10) включает источник клеток (12) для создания потока образца спермы, такого как поток окрашенного образца спермы, для сортировки. Скорость, с которой образец спермы поступает в сопло (14), может быть принята по скорости потока образца и может определяться давлением пробы. Поток окрашенного образца спермы осаждают в сопле (14) и вводят или вливают в жидкий поток (16) проточной жидкости (18). Проточную жидкость (18) можно подавать с помощью источника проточной жидкости (20), таким образом, источник клеток (12) подает сперму в проточную жидкость (18), они одновременно поступают через сопло (14). Проточную жидкость (18) можно подавать со скоростью потока, который определяют давлением проточной жидкости.
Тогда как проточная жидкость из предшествующего уровня техники, применяемая в проточной цитометрии, обычно содержала фосфатный буферный раствор (PBS), возможно, дополненный бычьим сывороточным альбумином (BSA), при сортировке спермы в качестве проточной жидкости добавляли цитрат натрия, цитрат TRIS или лимонную кислоту для сохранения здоровья спермы во время способа сортировки. Как описано в международной заявке на патент WO 99/33956, все содержимое которой включено в настоящую заявку посредством ссылки, в качестве проточных жидкостей могут быть включены подходящие буферы. В определенных вариантах реализации настоящего изобретения проточную жидкость из предшествующего уровня техники дополняют криопротектором. Как описано выше, криопротекторы относятся к веществам, которые защищают клетки или биологическую ткань от замораживания, и могут включать те вещества, которые действуют для удаления внутриклеточной воды, чтобы предотвратить повреждение, связанное с образованием и расширением внутриклеточного льда. Такое действие может быть вызвано увеличением концентрации растворенного вещества в клетках. Вещества, которые защищают клетки и ткани от других типов повреждений, таких как осмотический шок и охлаждение, но не замораживание, не считаются криопротекторами.
Криопротекторы включают ряд сахарных спиртов и гликолей, описанных выше. В качестве неограничивающих примеров сахарные спирты, такие как этиленгликоль; глицерин; эритрит; треит; арабит; рибит; ксилит; сорбит; галактит; идит; волемит; фуцит; инозит; глицилглицит и их комбинации могут быть включены в проточную жидкость в качестве криопротектора. Кроме того, гликоли, такие как пропиленгликоль, бутантриол, могут быть включены в проточную жидкость в качестве криопротектора. Неожиданно, как описано более подробно в примерах, было показано, что присутствие криопротектора в проточной жидкости улучшает подвижность после оттаивания замороженной впоследствии спермы и улучшает сортировку спермы. Неожиданно, как видно из примера 1, модификация сортировочного инструмента путем включения криопротектора в проточную жидкость в соответствии с некоторыми вариантами реализации настоящего изобретения улучшила разрешение сортировки, а это означает, что производительность, пропускная способность и чистота могут одновременно улучшаться в различной степени.
В некоторых вариантах реализации один и тот же криопротектор можно применять как на стадии окрашивания, так и в проточной жидкости. В качестве неограничивающего примера такого варианта реализации глицерин может быть предложен в первой об./об. или масс./об. концентрации на стадии окрашивания и во второй об./об. или масс./об. концентрации в проточной жидкости. В одном варианте реализации первая об./об. или масс./об. концентрация, обеспечиваемая во время окрашивания, может быть ниже, чем вторая об./об. или масс./об. концентрация, обеспечиваемая в проточной жидкости. Таким образом, клетки спермы, подвергающиеся способу сортировки спермы, могут быть подвергнуты постепенному увеличению относительной концентрации проточной жидкости. В качестве альтернативы, количество криопротектора, присутствующего в среде для окрашивания и в проточной жидкости, может быть скоординировано таким образом, что в течение любого способа осуществления манипуляции с образцом спермы по окончании этой манипуляции достигают предварительно определенной концентрации криопротектора. В альтернативных вариантах реализации криопротектор может быть включен только в одну из проточной жидкости и среды для окрашивания.
В некоторых вариантах реализации криопротектор в проточной жидкости может быть предложен в концентрациях от примерно 0,1% об./об. или масс./об. до примерно 6% об./об. или масс./об. Например, окрашенный раствор спермы для дальнейшей обработки, такой как сортировка в проточном цитометре, может содержать криопротектор в об./об. или масс./об. концентрации от примерно 0,1% до примерно 2%; от примерно 2% до примерно 4%; от примерно 4% до примерно 6%; от примерно 1% до примерно 2%; от примерно 2% до примерно 3%; от примерно 3% до примерно 4%; от примерно 4% до примерно 5%; от примерно 5% до примерно 6%; от примерно 2% до примерно 6%; или от примерно 3% до примерно 5%.
Специалисты в данной области техники могут оценить, что описанный вариант реализации относится к формирующему каплю проточному цитометру «струя в воздухе», но что проточная жидкость, содержащая добавку криопротектора, обеспечивает те же преимущества в других системах сортировки, таких как системы, в которых применяют смену жидкости, системы, применяющие фотоповреждающие лазеры, и в микрожидкостных чипах.
Во время операции сортировки спермы проточная жидкость (18) образует поток жидкости, коаксиально окружающий образец спермы, содержащий окрашенную сперму, которая выходит из сопла (14) в отверстие сопла (22). Благодаря наличию осциллятора (24), которым можно точно управлять с контроллера (26) осциллятора, можно создавать волны давления внутри сопла (14) и передавать их жидкостям, выходящим из сопла (14) через отверстие (22) сопла. В ответ на волны давления поток жидкости (16), выходящий из отверстия сопла (22), в конечном итоге образует ровные капли (28) с точными интервалами. Частотой и в некоторой степени формой сформированных капель можно управлять с помощью частоты движения капель и амплитуды движения капель, подаваемых на осциллятор (24) или контроллер (26) осциллятора.
Каждая образованная таким образом капля удерживает проточную жидкость и образец спермы, которые ранее составляли часть потока жидкости (16). Поскольку окрашенная сперма окружена потоком жидкости (16) или проточной жидкой средой, капли (28) в идеале содержат индивидуально изолированную сперму. Однако концентрация образца, давление образца и другие параметры прибора определяют частоту, с которой несколько клеток будут регулярно находиться в одной капле, а также процент капель, содержащих сперму.
Проточный цитометр (10) служит для сортировки капель на основе характеристик спермы, которая, по прогнозам, содержится в каплях. Этого можно достичь с помощью системы (30) восприятия клеток, соединенной с анализатором (36). Система (30) восприятия клеток включает в себя, по меньшей мере, один датчик (32), реагирующий на клетки, содержащиеся в потоке жидкости (16). В качестве одного примера, две ортогональные трубки фотоумножителя (PMT) могут быть встроены в проточный цитометр для сортировки спермы для обнаружения флуоресценции при 0 и 90 градусах, хотя легко можно применять другие конфигурации датчиков, такие как описанные в WO2010/021627, который включен в настоящую заявку посредством ссылки.
Система (30) восприятия клеток передает данные в анализатор (36), которые могут вызывать действие в зависимости от относительного присутствия или относительного отсутствия характеристики клеток в потоке жидкости (16). Определенные характеристики, такие как относительное содержание ДНК в сперме, могут быть обнаружены путем возбуждения источником электромагнитного излучения (34), таким как лазер, генерирующий пучок излучения, на который реагирует окрашенная сперма. Источником (34) электромагнитного излучения может быть лазер, работающий на длине волны УФ-излучения, например на длине волны примерно 355 нм. Примером такого лазера может быть Vanguard 350 (доступный от Spectra-Physics), который работает при 350 мВт. Для формирования профиля луча лазера, разделения луча более чем на один поток или уменьшения мощности луча в потоке можно применять различную оптику. Неограничивающие примеры такой оптики можно найти в WO/2004/104178 и WO/2001/85913, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки.
Характеристики отдельной спермы, в частности наличие Х-хромосомы или Y-хромосомы, можно определить по детектируемой флуоресценции, создаваемой в ответ на источник электромагнитного излучения (34). В частности, конфигурации системы (30) восприятия клеток могут быть связаны с анализатором (36) для обеспечения разнообразной флуоресценции в пласте, такой как прямая флуоресценция события, боковая флуоресценция события или величина рассеяния, связанного с событием. Анализатор (36) может включать письменные инструкции для анализа сигналов, генерируемых одним или несколькими датчиками (32) в системе (30) восприятия клеток. ДНК-селективный флуоресцентный краситель стехиометрически связывается с ДНК спермы. Поскольку сперма, несущая Х-хромосому, содержит больше ДНК, чем сперма, несущая Y-хромосому, сперма, несущая Х-хромосому, может связывать большее количество ДНК-селективного флуоресцентного красителя, чем сперма, несущая Y-хромосому. Таким образом, измеряя флуоресценцию, испускаемую связанным красителем при возбуждении, можно различить сперматозоиды, несущие Х, и сперматозоиды, несущие Y. Различия, например, сперма, которая является жизнеспособной или нежизнеспособной, могут быть дифференцированы анализатором (36) в дополнение к ориентированной и неориентированной сперме в соответствии с логикой сортировки, включающей области гейтирования.
Как только анализатор дифференцирует сперму на основе характеристики спермы, капли, захватывающие сперматозоиды, несущие Х-хромосому, могут быть заряжены положительно и, таким образом, отклоняться в одном направлении, тогда как капли, захватывающие сперматозоиды, несущие Y-хромосому, могут быть заряжены отрицательно и, таким образом, отклоняться в другом направлении, и пустой поток (то есть капли, которые не увлекают частицу или клетку или увлекают нежелательные или несортируемые клетки) может быть оставлен незаряженным и, таким образом, собран от неотклоненного потока во всасывающую трубку или тому подобное. В качестве альтернативы, одну из спермы, несущей Х-хромосому, или спермы, несущей Y-хромосому, можно собрать, а другую отбросить с пустым потоком.
В результате проточный цитометр (10) действует для отделения окрашенной спермы, заставляя капли (28), содержащие сперму, направляться в одну или несколько емкостей (40) для сбора. Емкости (40) для сбора могут представлять собой пробирки для сбора, такие как пробирки для центрифугирования или пробирки Falcon. В одном варианте реализации одна или более емкостей для сбора содержат 50 мл пробирку для центрифугирования. Одна или более емкостей для сбора могут включать среду для сбора, которая одновременно смягчает клетки в отклоненных каплях от удара о дно емкости и включает компоненты для сохранения здоровья отсортированных клеток спермы. В качестве примера, жидкость для захвата, содержащую TRIS-цитрат и яичный желток, можно применять с некоторыми вариантами реализации настоящего изобретения. Другие жидкости для захвата, которые можно применять в определенных вариантах реализации, включают цитрат TRIS, цитрат натрия, бикарбонат натрия, HEPES, TRIS, TEST, MOPS, KMT, TALP, их производные и их комбинации. Тем не менее, другие разбавители, содержащие буфер для буферизации рН, также могут быть применены, и их можно применять в комбинации с дополнительными компонентами, которые способствуют жизнеспособности спермы после сортирующего устройства. В качестве примера добавки белок обычно включают в жидкость для захвата в форме яичного желтка. Однако другие формы белка, такие как молоко, липопротеины, лецитин, казеин или альбумин или другие источники белка, можно применять в качестве альтернативы или даже применять в сочетании с яичным желтком. В одном варианте реализации заменитель яичного желтка, такой как фосфолипид, доступный из соевого лецитина, можно применять вместо яичного желтка. Источник энергии также может быть включен в форме моносахарида, такого как фруктоза, глюкоза или манноза, или даже дисахарида или трисахарида. Кроме того, антиоксиданты и антибиотики можно применять в исходном разбавителе для повышения жизнеспособности спермы.
В одном варианте реализации среда для сбора включает криопротектор. Криопротекторы, подходящие для добавления в среду для сбора, включают ряд сахарных спиртов и гликолей, описанных выше. В качестве неограничивающих примеров сахарные спирты, такие как этиленгликоль; глицерин; эритрит; треит; арабит; рибит; ксилит; сорбит; галактит; идит; волемит; фуцит; инозит; глицилглицит и их комбинации могут быть включены в жидкость для захвата в качестве криопротектора. Кроме того, гликоли, такие как пропиленгликоль, бутантриол, могут быть включены в жидкость для захвата в качестве криопротектора.
В некоторых вариантах реализации сбор подвергнутого манипуляции образца спермы в среде для сбора может быть первым случаем приведения спермы в контакт с криопротектором. В некоторых вариантах среда для окрашивания и/или проточная жидкость включают криопротектор в дополнение к среде для сбора. В других вариантах реализации среда для окрашивания и/или проточная жидкость содержат криопротектор, тогда как среда для сбора не содержит. В каждом из указанных вариантов реализации сперму, собранную в среде для сбора, собирают в смеси, которая включает как сперму, так и криопротектор, благодаря присутствию криопротектора в среде для сбора, или в качестве альтернативы из-за любых количеств криопротектора, присутствующего в среде для окрашивания или проточной жидкости, которые собирают с подвергнутой манипуляции или собранной спермой.
В вариантах реализации, где криопротектор присутствует в среде для сбора и, по меньшей мере, в одной другой жидкости, такой же криопротектор можно применять в среде для сбора, как в среде для окрашивания и/или проточной жидкости. В качестве неограничивающего примера такого варианта реализации глицерин может быть предложен в первой об./об. или масс./об. концентрации на стадии окрашивания и во второй об./об. или масс./об. концентрации в проточной жидкости. В одном варианте реализации первая об./об. или масс./об. концентрация, обеспечиваемая во время окрашивания, может быть ниже, чем вторая об./об. или масс./об. концентрация, обеспечиваемая в проточной жидкости. Таким образом, клетки спермы, подвергающиеся способу сортировки спермы, могут подвергаться постепенному увеличению относительной концентрации проточной жидкости. В качестве альтернативы количество криопротектора, присутствующего в среде для сбора, может быть скоординировано с количеством криопротектора, присутствующего в среде для окрашивания и/или в проточной жидкости, поэтому в течение способа осуществления манипуляции с образцом спермы предварительно определенной концентрации криопротектора достигают в конце этой манипуляции. В альтернативных вариантах реализации криопротектор может быть включен только в одну из проточной жидкости, среды для окрашивания и среды для сбора.
В некоторых вариантах реализации криопротектор может быть предложен в среде для сбора в об./об. или масс./об. концентрации от примерно 1% до примерно 2%; от примерно 2% до примерно 4%; от примерно 4% до примерно 6%; от примерно 3% до примерно 5%; от примерно 3,5% до примерно 5,5%; или примерно 4,5%.
В одном варианте реализации криопротектор добавляют в жидкость для захвата, но не в проточную жидкость или стадию(и) окрашивания. В другом варианте реализации криопротектор добавляют к любым двум из жидкости для захвата, проточной жидкости и стадии(й) окрашивания. В еще одном варианте реализации криопротектор добавляют к каждой из жидкости для захвата, проточной жидкости и красителю. В качестве неограничивающего примера варианта реализации, в котором криопротектор добавляют более чем на одном этапе обработки, глицерин может быть добавлен в первой об./об. или масс./об. концентрации на стадии окрашивания и во второй об./об. или масс./об. концентрации в проточной жидкости. В одном варианте реализации первая об./об. или масс./об. концентрация, обеспечиваемая во время окрашивания, может быть ниже, чем вторая об./об. или масс./об. концентрация, обеспечиваемая в проточной жидкости. Таким образом, клетки спермы, подвергающиеся способу сортировки спермы, можно подвергать постепенному увеличению относительной концентрации проточной жидкости. В качестве неограничивающего примера варианта реализации, в котором криопротектор добавляют в каждую из жидкости для захвата, проточной жидкости и на стадии (стадиях) окрашивания, глицерин может быть добавлен в первой об./об. или масс./об. концентрации на стадии окрашивания, второй об./об. или масс./об. концентрации в проточной жидкости и в третьей об./об. или масс./об. концентрации в жидкости для захвата. В одном варианте реализации об./об. или масс./об. концентрация криопротектора может увеличиваться на каждой последующей стадии, на которой его вводят. Например, первая концентрация криопротектора на стадии окрашивания может быть более низкой, чем вторая концентрация криопротектора в проточной жидкости и третья концентрация криопротектора в жидкости для захвата. Постепенное введение криопротектора в частности может оказывать положительное воздействие на способность спермы в конечном итоге выживать при возможном замораживании и оттаивании или может улучшить здоровье жизнеспособной спермы, которую в конечном итоге замораживают и оттаивают.
В альтернативном варианте реализации отклоняющие пластинки (38) и другие компоненты, необходимые для формирования капель, такие как осциллятор (24) или контроллер осциллятора (26), могут быть заменены фоторазрушающим лазером, иногда также упоминаемым как лазерная абляция. В таком варианте реализации анализатор (36) и контроллер (42) могут взаимодействовать при запуске фоторазрушающего лазера, отрегулированного на попадание в клетки в потоке (16) жидкости во втором участке после источника (34) электромагнитного излучения на основе классификация клеток. Такой лазер может работать на другой длине волны по сравнению с источником (34) электромагнитного излучения или на более высокой мощности, чтобы гарантировать удаление, дезактивирование и лишение клеток спермы способности к оплодотворению. В вариантах реализации, в которых применяют такой фоторазрушающий лазер, все еще применяют среду для окрашивания и проточную жидкость и могут дополнительно применять среду для сбора. В соответствии с некоторыми вариантами реализации настоящего изобретения любая из среды для окрашивания, проточной жидкости и среды для сбора, при наличии, может включать криопротектор.
В дополнительной альтернативе конкретные аспекты настоящего изобретения можно в равной степени применять в микрожидкостных чипах. В качестве одного примера для микрожидкостных чипов, такие как описанных в международных заявках WO 2011/097032 и WO 2011/097032, каждая из которых включена в настоящую заявку посредством ссылки, включение проточной жидкости, содержащей криопротектор может также быть благоприятным. Аналогичным образом, в вариантах реализации, которые включают применение проточных каналов на микрожидкостных чипах, все еще применяют среду для окрашивания и можно дополнительно применять проточную жидкость и среду для сбора. В соответствии с некоторыми вариантами реализации настоящего изобретения любая из среды для окрашивания, проточной жидкости и среды для сбора при наличии может включать криопротектор.
Фиг. 2 иллюстрирует характерную двумерную диаграмму боковой флуоресценции и прямой флуоресценции из проточного цитометра «струя в воздухе» окрашенной спермы, которую может генерировать анализатор (36). Визуальное представление данных оператор может применять для получения обратной связи, относящейся к образцу, подвергаемому сортировке, и для графической демонстрации определенных аспектов логики данной сортировки. Например, R1 можно рассматривать как область гейтирования, которую можно применять к логике сортировки проточного цитометра. Дополнительный числовой вывод может быть представлен на дисплее анализатора (36). Такой числовой вывод может быть осуществлен в форме измеренных параметров сортировки, таких как частота событий, частота отказов, скорость сортировки, эффективность сортировки или процентное содержание частиц в любой области или гейте. R1 проиллюстрирован как область, которую можно считать живой ориентированной областью, поскольку границы R1 включают две плотные популяции клеток, которые отражают близкородственную популяцию спермы, несущей Х-хромосому, и популяцию спермы, несущей Y-хромосому. R2 представляет собой область гейтирования, расположенную вокруг нежизнеспособной спермы или спермы с поврежденной мембраной, флуоресценцию которых гасят гасящим красителем. Хотя можно применять различную логику сортировки, две стратегии, относящиеся к R1 и R2, могут представлять собой первую стадию в логике сортировки, посредством которой все события, попадающие в R1, принимаются для дальнейшей обработки или гейтирования. В качестве альтернативы все события, выходящие за пределы R2, принимаются для дальнейшей обработки или гейтирования.
Фиг. 3 иллюстрирует одномерный график в форме гистограммы, который может быть создан анализатором (36) и сгенерирован в графическом представлении для оператора. Данные, проиллюстрированные на фиг. 3, могут представлять число появлений пиковых интенсивностей сигнала от боковой или прямой флуоресценции в течение определенного периода. В случае спермы, несущая Х-хромосому сперма и несущая Y-хромосому сперма склонны иметь пиковые интенсивности, которые варьируются от 2 до 5%, в зависимости от вида, и это различие отражается в бимодальном распределении пиковых интенсивностей, показанных на фиг. 2. Поскольку сперма, несущая Х-хромосому, и сперма, несущая Y-хромосому, как правило, имеют разные величины флуоресценции, каждый из пиков представляет или сперму, несущую Х-хромосому, или сперму, несущую Y-хромосому. Основываясь на логике сортировки, применяемой в анализаторе (36), популяция клеток на гистограмме может представлять собой только те клетки, которые были определены как жизнеспособные ориентированные клетки, такие как клетки, попадающие в R1 на фиг. 2, или они могут представлять клетки, которые не были определены как мертвые или нежелательные, такие как каждое событие, кроме тех, которые попадают в R2. Разнообразие параметров сортировки может быть получено из информации, содержащейся в этой гистограмме. Например, уровень различимости между двумя пиками может указывать на то, как может выглядеть отсортированная чистота. Фиг. 3 дополнительно иллюстрирует измерения относительной интенсивности в самой низкой точке между двумя группами, которую можно рассматривать как значение V и вторую относительную интенсивность на пике или пиках гистограммы на P. Визуальный осмотр гистограммы может дать оператору представление о том, как работает проточный цитометр, но выполняемые компьютером инструкции для определения значения P, значения V и отношения V к P не были реализованы в коммерческих устройствах для сортировки спермы. Отношение минимального сигнала к максимальному можно периодически определять по мере измерения параметра сортировки периодически в ходе сортировки. Отношение минимального сигнала к максимальному, хотя и не обязательно полностью определяющее чистоту сортировки, может обеспечить средство быстрой оценки значений чистоты, либо автоматически при выполнении письменной инструкции в анализаторе (36), либо вручную при визуальном осмотре оператором. В качестве альтернативы обратное отношение, а именно отношение максимального сигнала к минимальному дает информацию, аналогичную обратной величине.
Обращаясь к фиг. 4, анализатор (36) может генерировать второй бимодальный график в ответ на сигналы, полученные системой восприятия клеток (30). Бимодальный график может представлять первую ось, иллюстрирующую пиковое значение интенсивности прямого сигнала флуоресценции или пиковую интенсивность бокового сигнала флуоресценции. Аналогично фиг. 3, данные, проиллюстрированные на фиг. 4, можно ограничить таким образом, чтобы были включены только события, попадающие в R1 на фиг. 2. В качестве альтернативы, в случае спермы все события, которые не попадают в гейт мертвых клеток R2, также могут отображаться.
R3 может представлять собой гейт X-сортировки для сбора спермы, несущей Х-хромосому. Термин «гейт X-сортировки» в настоящем документе можно применять взаимозаменяемо с термином «X-гейт». Со ссылкой на фиг. 4, это может продемонстрировать, как изменение размеров областей гейтирования может повлиять на эффективность, чистоту и производительность. Если расширить область R3, можно увидеть, что каждую секунду большее количество спермы будет отсортировано как сперма, несущая Х-хромосому, что приводит к более высокой эффективности сортировки и более высокой производительности. Однако расширение гейта или области R3 будет включать события, имеющие повышенную вероятность наличия спермы, несущей Y-хромосому. Чтобы увеличить чистоту сортированной спермы, область R3 может быть уменьшена и/или перемещена от области Y-хромосомы. Чем меньше событий попадает в гейт X-сортировки, тем меньшее количество спермы будет отсортировано в популяции спермы, несущей Х-хромосому, и которая с большей вероятностью фактически является спермой, несущей Х-хромосому, что означает, что чистота собранной спермы может быть увеличена. Тем не менее, как эффективность с точки зрения собранных клеток, так и производительность с точки зрения сортировки в секунду, снизится, так как в область R3 попадает меньше событий и отклоняется больше совпадающих событий. Кроме того, по мере изменения других параметров прибора, проиллюстрированные диаграммы на фиг. 2, фиг. 3 и фиг. 4 могут измениться по форме и характеру. Например, повышение давления образца или скорости потока образца может привести к снижению отношения минимального сигнала к максимальному или может иным образом уменьшить бимодальное различие между спермой, несущей Х-хромосому, и спермой, несущей Y-хромосому.
Обработанную сперму затем можно объединить и заморозить в соответствии с известными способами для обычной или отобранной по полу спермы. В качестве одного примера, для способов замораживания, описанных в международной заявке на патент WO/200137655, полностью включенной в настоящую заявку посредством ссылки, конкретные варианты реализации описанного изобретения, в которых криопротектор вводят в способы сортировки спермы на более ранних стадиях, например, во время или окрашивания, в проточную жидкость или даже в жидкость для захвата, могут быть особенно благоприятными. В качестве альтернативы включение криопротектора в одну или более ранних стадий может быть включено в новый способ замораживания.
В одном варианте реализации собранную отсортированную сперму можно охлаждать до температуры примерно 5°C или до другой подходящей температуры охлаждения на основе спермы конкретного вида. В качестве альтернативы сперму можно собирать в емкость для сбора, которая уже охлаждена. В зависимости от размера емкости для сбора собранную сперму можно объединять с дополнительными емкостями для сбора. Объединенные емкости для сбора можно центрифугировать и удалять супернатант. В соответствии с некоторыми предыдущими способами выделенную сперму ресуспендируют во фракции А (или фракции, не содержащей криопротекторов) разбавителя, и фракцию В (или фракции, содержащей криопротектор), имеющую двойную требуемую концентрацию криопротектора, добавляют к фракции А в равном объеме. В некоторых предыдущих способах фракцию В добавляли в двух равных объемах с интервалом примерно 15 минут, в то время как в других способах фракцию В вводили в форме постоянного капельного потока.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения криопротекторы включены в различные среды на стадиях окрашивания, сортировки и сбора, что может уменьшить или даже устранить необходимость охлаждения подвергнутого манипуляции образца спермы перед повторным концентрированием. Кроме того, включение криопротектора в различные стадии окрашивания и сортировки может устранить необходимость применения модели фракций «А» и «В».
Обращаясь к фиг. 5, иллюстрируемый вариант реализации настоящего изобретения относится к способу, в котором криопротекторы добавляют к множеству сред во время обработки спермы, например, в среду для окрашивания, проточную жидкость и в среду для сбора. На стадии (510) способ начинают со стадии окрашивания образца спермы в среде для окрашивания. Образец спермы может представлять собой чистую семенную жидкость или сперму, разбавленную в другом растворе, таком как описано ранее. В качестве примера, образец спермы может быть стандартизирован путем разбавления и повторного концентрирования способом, описанным ранее. В качестве альтернативы образец спермы может иметь форму чистой семенной жидкости или чистой семенной жидкости, разбавленной буфером и/или с добавлением антибиотиков.
Будучи стандартизированным или нет, ДНК-селективный флуоресцентный краситель может представлять собой хехст 33342, поставляемый в модифицированном буфере TALP (таблица 1). Стадия окрашивания сама по себе может быть выполнена в одном разведении, которое дополнительно включает гасящий краситель. В качестве альтернативы, стадия 510 может быть выполнена в двух разведениях, таких как первое разведение в модифицированном TALP, содержащем ДНК-селективный флуоресцентный краситель, с последующим вторым разведением в модифицированном TALP, содержащем гасящий краситель. Следует понимать, что в соответствии с этим примером можно применять другие ДНК-селективные флуоресцентные красители и другие гасящие красители. Для осуществления задач данного варианта реализации каждый будет называться средой для окрашивания.
6
6
6
6
6
6
Независимо от достижения посредством одного или двух разведений, образец спермы может быть разведен до величины от 640xl0 до 40xl0 спермы/мл, от примерно 320xl0 до 80xl0 спермы/мл, до примерно 160x10 спермы/мл или до примерно 120x10 спермы/мл в среде для окрашивания. ДНК-селективный флуоресцентный краситель можно добавлять сперме, суспендированной в среде для окрашивания в концентрации от примерно 10 мкМ до 200 мкМ; от примерно 20 мкМ до 100 мкМ или от примерно 30 мкМ до 70 мкМ. РН среды для окрашивания может составлять от примерно 6,8 до 7,9; от примерно 7,1 и 7,6; или примерно 7,4. В случае применения двух разведений второе разведение может быть выполнено при или около того же pH, что и первое разведение, или при низком pH, таком как от 5,0 до 6,0 или примерно при 5,5. Необязательно, ранее описанные антиоксиданты и концентрации могут быть включены в среду для окрашивания. Образец спермы можно инкубировать при 30-39°С, примерно 32-37°С или примерно 34°С. Период инкубации может варьироваться от примерно 20 минут до примерно трех часов, от примерно 30 минут до примерно 90 минут или от примерно 45 минут до примерно 60 минут.
На стадии 512 можно увидеть, что среда для окрашивания, применяемая на стадии 510, включает первое количество криопротектора. Криопротектор может представлять собой подходящий сахарный спирт, такой как этиленгликоль; глицерин; эритрит; треит; арабит; рибит; ксилит; сорбит; галактит; идит; волемит; фуцит; инозит; глицилглицит или их комбинации. Криопротектор может также представлять собой подходящий гликоль, такой как пропиленгликоль, бутантриол или их комбинации. Следует понимать, что выбранный криопротектор может быть специфичным для вида животного или, возможно, даже для породы. В качестве примера, глицерин может быть выбран в случае бычьей спермы и путем выполнения стадий, показанных в фиг. 5, токсичность глицерина может быть снижена. Следует понимать, что можно применять другие подходящие криопротекторы, если они подходят для консервации образца спермы, и что стадии на фиг. 5 могут аналогичным образом смягчить токсическое действие этих криопротекторов.
Первое количество криопротектора может представлять собой об./об. или масс./об. концентрацию криопротектора в среде для окрашивания, составляющую от примерно 0,1% до примерно 5%; от примерно 0,1% до примерно 1%; от примерно 1% до примерно 2%; от примерно 2% до примерно 3%; от примерно 3% до примерно 4%; от примерно 2% до примерно 4%; или от примерно 1,5% до примерно 3%.
После окрашивания образец спермы можно приводить в контакт с проточной жидкостью на стадии 520. Стадия приведения образца спермы в контакт может быть связана с обработкой образца спермы, например посредством проточной цитометрии с применением проточного цитометра «струя в воздухе» или аналогичным способом с применением микрожидкостного чипа. В одном варианте реализации стадия приведения образца спермы в контакт с проточной жидкостью происходит в проточном цитометре «струя в воздухе», как описано со ссылкой на фиг. 1. Однако следует понимать, что стадия 520 не ограничивается обработкой в проточном цитометре «струя в воздухе», а скорее охватывает любой способ обработки спермы, в котором содержащий сперму образец спермы вступает в контакт с проточной жидкостью. В качестве неограничивающего примера, сортировка с помощью микрожидкостного чипа обычно требует установления коаксиального потока образца и проточной жидкости через проточный канал. В случае спермы образец спермы должен проходить через один или несколько проточных каналов в ламинарном потоке, в то время как он окружен проточной жидкостью, чтобы фокусировать местоположение клеток спермы и предотвращать их касание внутренней части проточного канала. Ламинарные потоки образца спермы и проточной жидкости в каждом канале будут предотвращать или, по меньшей мере, сводить к минимуму любое смешивание образца спермы и проточной жидкости при поддержании контакта жидкостей.
На стадии 522 можно увидеть, что проточная жидкость, применяемая на стадии 520, содержит второе количество криопротектора. Криопротектор может представлять собой тот же, что и криопротектор в среде для окрашивания. В качестве альтернативы криопротектор может представлять собой другой криопротектор, такой как подходящий сахарный спирт, включая этиленгликоль; глицерин; эритрит; треит; арабит; рибит; ксилит; сорбит; галактит; идит; волемит; фуцит; инозит; глицилглицит или их комбинации, или подходящий гликоль, такой как пропиленгликоль, бутантриол или их комбинации. Проточная жидкость может содержать второе количество криопротектора от примерно 0,1% до примерно 2% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 2% до примерно 4% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 4% до примерно 6% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 1% до примерно 2% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 2% до примерно 3% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 3% до примерно 4% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 4% до примерно 5% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 5% до примерно 6% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 2% до примерно 6% криопротектора по об./об. или масс./об.; или от примерно 3% до примерно 5% криопротектора по об./об. или масс./об. В одном варианте реализации второе количество криопротектора в проточной жидкости является примерно таким же, как первое количество криопротектора, обнаруженного в среде для окрашивания. В альтернативном варианте реализации второе количество криопротектора в проточной жидкости больше, чем об./об. или масс./об. концентрация по сравнению с первым количеством криопротектора в среде для окрашивания. В еще одном варианте реализации об./об. или масс./об. концентрация криопротектора как в среде для окрашивания, так и в проточной жидкости может быть скоординирована для достижения необходимой концентрации криопротектора.
На стадии 530 образец спермы подвергают манипуляции. В одном варианте реализации образец спермы подвергают манипуляции для получения подвергнутого манипуляции образца спермы, имеющего манипулированное соотношение жизнеспособной спермы, несущей Х-хромосому, к жизнеспособной сперме, несущей Y-хромосому. Стадия манипуляции может быть выполнена путем физического разделения подмножества клеток, как, например, в варианте реализации образования капель, описанном выше со ссылкой на фиг. 1. Но стадия манипуляции не является настолько ограниченной и включает смену жидкости или отвод клеток в проточные каналы микрожидкостных чипов. В качестве альтернативы, фоторазрушающий лазер можно применять в сочетании с поточным цитометром «струя в воздухе» или микрожидкостным чипом для разрушения выбранных клеток спермы в образце спермы с получением подвергнутого манипуляции образца спермы с манипулированным соотношением жизнеспособной спермы, несущей Х-хромосому, к жизнеспособной сперме, несущей Y-хромосому. В качестве альтернативы, образец спермы можно подвергать манипуляции на основании других характеристик. В качестве одного примера образец спермы можно пропускать через проточный цитометр для отделения предположительно жизнеспособной спермы от спермы с поврежденными мембранами.
Один вариант реализации способа, изображенный на фиг. 5, заканчивают на получении подвергнутого манипуляции образца спермы на стадии 530, в то время как другие варианты реализации способа продолжают на стадии сбора подвергнутого манипуляции образца 540 спермы и/или на стадии замораживания подвергнутого манипуляции образца 550 спермы. В одном варианте реализации способ на фиг. 5 необязательно продолжают на стадии 540, на которой подвергнутый манипуляции образец спермы собирают в среде для сбора. В случае проточной цитометрии среда для сбора может быть описана как жидкость для захвата, расположенная в сосуде для сбора или в пробирке, в которую отводят выбранную сперму. Как можно понять из стадии 542, среда для сбора в этом варианте реализации также необязательно содержит количество криопротектора, которое можно считать третьим количеством криопротектора. Опять же, криопротектор может представлять собой тот же, что и криопротектор в среде для окрашивания и/или в проточной жидкости. В качестве альтернативы криопротектор может представлять собой другой криопротектор, такой как подходящий сахарный спирт, включая этиленгликоль; глицерин; эритрит; треит; арабит; рибит; ксилит; сорбит; галактит; идит; волемит; фуцит; инозит; глицилглицит или их комбинации, или подходящий гликоль, такой как пропиленгликоль, бутантриол или их комбинации. Среда для сбора может содержать третье количество криопротектора от примерно 1% до примерно 2% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 2% до примерно 4% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 4% до примерно 6% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 6% до примерно 8% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 3% до примерно 7% криопротектора по об./об. или масс./об.; или от примерно 3,5% до примерно 5,5% криопротектора по об./об. или масс./об.
В конкретных вариантах реализации настоящего изобретения криопротектор включен только в проточную жидкость и не присутствует в среде для окрашивания или среде для сбора. В другом варианте реализации настоящего изобретения криопротектор включен в проточную жидкость, в среду для окрашивания и в среду для замораживания, но не включен в среду для сбора.
В одном варианте реализации способ переходит от стадии 530 манипуляции с образцом спермы непосредственно к стадии 550 замораживания подвергнутого манипуляции образца спермы. Например, в случае манипуляции с образцом спермы с применением микрожидкостного чипа может не требоваться применение среды для сбора, поскольку не образуются капли, которые требуют смягчения среды для сбора. Однако предусмотрены варианты реализации, в которых среду для сбора применяют в связи с манипуляцией с образцом спермы с применением микрожидкостного чипа.
Для способа, воплощенного на фиг. 5, замораживание на стадии 550 может быть достигнуто с помощью обычного способа, такого как описанный в WO/200137655. Только в качестве примера, один такой способ может начинаться с разбавления подвергнутого манипуляции образца спермы для замораживания во фракции А. В качестве альтернативы подвергнутый манипуляции образец спермы можно собрать в среде для сбора, включающей разбавитель фракции А на стадии 540 сбора. Только в качестве примера фракция А может содержать разбавитель цитрат TRIS с 20% яичного желтка. Другие подходящие разбавители могут включать цитрат натрия, трис[гидроксиметил]аммометан и TES (N-трис[гидроксиметил]метил-2-аминоэтансульфоновую кислоту) и буферы глутамата натрия; молоко; HEPES- забуференную среду; и любую их комбинацию.
Стадию 550 замораживания можно продолжать охлаждением подвергнутого манипуляции образца спермы. Подвергнутый манипуляции образец спермы может быть охлажден до температуры примерно от 8°С до 4°С. В одном конкретном примере подвергнутый манипуляции образец спермы может быть охлажден до примерно 5°С. После охлаждения фракцию В можно добавлять в одну или несколько стадий, и затем подвергнутый манипуляции образец спермы может быть повторно концентрирован. Повторное концентрирование может включать центрифугирование подвергнутого манипуляции образца спермы с образованием осадка и ресуспендирование спермы в конечном разбавителе, иногда называемом разбавителем AB. В качестве одного примера, разбавитель AB может иметь концентрацию криопротектора, которая составляет половину концентрации криопротектора во фракции В. В качестве неограничивающего примера, эта концентрация может составлять примерно 6% в случае глицерина. Другие способы замораживания предложены для применения согласно варианту реализации, изображенному на фиг. 5. В частности, некоторые способы замораживания, описанные ниже, могут обеспечить синергизм со способом обработки, изображенным на фиг. 5.
Способ, изображенный на фиг. 6, в значительной степени отражает способ, изображенный на фиг. 5, за исключением того, что в среду для окрашивания добавлен криопротектор. На стадии (610) способ начинают со стадии окрашивания образца спермы в среде для окрашивания. Образец спермы может представлять собой чистую семенную жидкость или сперму, разбавленную в другом растворе, таком как описано ранее. В качестве примера, образец спермы может быть стандартизирован путем разбавления и повторного концентрирования способом, описанным ранее. В качестве альтернативы образец спермы может иметь форму чистой семенной жидкости или чистой семенной жидкости, разбавленной буфером и/или с добавлением антибиотиков.
Будучи стандартизированным или нет, ДНК-селективный флуоресцентный краситель может представлять собой хехст 33342, поставляемый в модифицированном буфере TALP (таблица 1). Стадия окрашивания сама по себе может быть выполнена в одном разведении, которое дополнительно включает гасящий краситель. В качестве альтернативы, стадия 510 может быть выполнена в двух разведениях, таких как первое разведение в модифицированном TALP, содержащем ДНК-селективный флуоресцентный краситель, с последующим вторым разведением в модифицированном TALP, содержащем гасящий краситель. Следует понимать, что в соответствии с этим примером можно применять другие ДНК-селективные флуоресцентные красители и другие гасящие красители. Для осуществления задач данного варианта реализации каждый будет называться средой для окрашивания.
6
6
6
6
6
6
Независимо от достижения посредством одного или двух разведений, образец спермы может быть разведен до величины от 640xl0 до 40xl0 спермы/мл, от примерно 320xl0 до 80xl0 спермы/мл, до примерно 160x10 спермы/мл или до примерно 120×10 спермы/мл в среде для окрашивания. ДНК-селективный флуоресцентный краситель можно добавлять сперме, суспендированной в среде для окрашивания в концентрации от примерно 10 мкМ до 200 мкМ; от примерно 20 мкМ до 100 мкМ или от примерно 30 мкМ до 70 мкМ. РН среды для окрашивания может составлять от примерно 6,8 до 7,9; от примерно 7,1 и 7,6; или примерно 7,4. В случае применения двух разведений второе разведение может быть выполнено при или около того же pH, что и первое разведение, или при низком pH, таком как от 5,0 до 6,0 или примерно при 5,5. Необязательно, ранее описанные антиоксиданты и концентрации могут быть включены в среду для окрашивания. Образец спермы можно инкубировать при 30-39°С, примерно 32-37°С или примерно 34°С. Период инкубации может варьироваться от примерно 20 минут до примерно трех часов, от примерно 30 минут до примерно 90 минут или от примерно 45 минут до примерно 60 минут.
После окрашивания образец спермы можно приводить в контакт с проточной жидкостью на стадии 620. Стадия приведения образца спермы в контакт может быть связана с обработкой образца спермы, например посредством проточной цитометрии с применением проточного цитометра «струя в воздухе» или аналогичным способом с применением микрожидкостного чипа. В одном варианте реализации стадия приведения образца спермы в контакт с проточной жидкостью происходит в проточном цитометре «струя в воздухе», как описано со ссылкой на фиг. 1. Однако следует понимать, что стадия 620 не ограничивается обработкой в проточном цитометре «струя в воздухе», а скорее охватывает любой способ обработки спермы, в котором содержащий сперму образец спермы вступает в контакт с проточной жидкостью. В качестве неограничивающего примера, сортировка с помощью микрожидкостного чипа обычно требует установления коаксиального потока образца и проточной жидкости через проточный канал. В случае спермы образец спермы должен проходить через один или несколько проточных каналов в ламинарном потоке, в то время как он окружен проточной жидкостью, чтобы фокусировать местоположение клеток спермы и предотвращать их касание внутренней части проточного канала. Ламинарные потоки образца спермы и проточной жидкости в каждом канале будут предотвращать или, по меньшей мере, сводить к минимуму любое смешивание образца спермы и проточной жидкости при поддержании контакта жидкостей.
На стадии 622 можно увидеть, что проточная жидкость, применяемая на стадии 620, включает первое количество криопротектора, который может представлять собой подходящий сахарный спирт, включая этиленгликоль; глицерин; эритрит; треит; арабит; рибит; ксилит; сорбит; галактит; идит; волемит; фуцит; инозит; глицилглицит или их комбинации, или подходящий гликоль, такой как пропиленгликоль, бутантриол или их комбинации. Первое количество криопротектора в проточной жидкости может составлять от примерно 0,1% до примерно 2% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 2% до примерно 4% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 4% до примерно 6% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 1% до примерно 2% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 2% до примерно 3% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 3% до примерно 4% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 4% до примерно 5% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 5% до примерно 6% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 2% до примерно 6% криопротектора по об./об. или масс./об.; или от примерно 3% до примерно 5% криопротектора по об./об. или масс./об. В одном варианте реализации второе количество криопротектора в проточной жидкости в проточной жидкости является примерно таким же, как первое количество криопротектора, обнаруженного в среде для окрашивания. В альтернативном варианте реализации второе количество криопротектора в проточной жидкости больше, чем об./об. или масс./об. концентрация по сравнению с первым количеством криопротектора в среде для окрашивания.
На стадии 630 образец спермы подвергают манипуляции. В одном варианте реализации образец спермы подвергают манипуляции для получения подвергнутого манипуляции образца спермы, имеющего манипулированное соотношение жизнеспособной спермы, несущей Х-хромосому, к жизнеспособной сперме, несущей Y-хромосому. Стадия манипуляции может быть выполнена путем физического разделения подмножества клеток, как, например, в варианте реализации образования капель, описанном выше со ссылкой на фиг. 1. Но стадия манипуляции не является настолько ограниченной и включает смену жидкости или отвод клеток в проточные каналы микрожидкостных чипов. В качестве альтернативы, фоторазрушающий лазер можно применять в сочетании с поточным цитометром «струя в воздухе» или микрожидкостным чипом для разрушения выбранных клеток спермы в образце спермы с получением подвергнутого манипуляции образца спермы с манипулированным соотношением жизнеспособной спермы, несущей Х-хромосому, к жизнеспособной сперме, несущей Y-хромосому. В качестве альтернативы, образец спермы можно подвергать манипуляции на основании других характеристик. В качестве одного примера образец спермы можно пропускать через проточный цитометр для отделения предположительно жизнеспособной спермы от спермы с поврежденными мембранами.
Один вариант реализации способа, изображенный на фиг. 6, заканчивают на получении подвергнутого манипуляции образца спермы на стадии 630, в то время как другие варианты реализации способа продолжают на стадии 640 сбора подвергнутого манипуляции образца спермы и/или на стадии 650 замораживания подвергнутого манипуляции образца спермы. В одном варианте реализации способ на фиг. 6 необязательно продолжают на стадии 640, на которой подвергнутый манипуляции образец спермы собирают в среде для сбора. В случае проточной цитометрии среда для сбора может быть описана как жидкость для захвата, расположенная в сосуде для сбора или в пробирке, в которую отводят выбранную сперму. Как можно понять из стадии 642, среда для сбора также необязательно содержит количество криопротектора, которое можно считать вторым количеством криопротектора. Криопротектор может представлять собой тот же, что и криопротектор в проточной жидкости. В качестве альтернативы криопротектор может представлять собой другой криопротектор, такой как подходящий сахарный спирт, включая этиленгликоль; глицерин; эритрит; треит; арабит; рибит; ксилит; сорбит; галактит; идит; волемит; фуцит; инозит; глицилглицит или их комбинации, или подходящий гликоль, такой как пропиленгликоль, бутантриол или их комбинации. Среда для сбора может содержать второе количество криопротектора от примерно 1% до примерно 2% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 2% до примерно 4% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 4% до примерно 6% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 6% до примерно 8% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 3% до примерно 7% криопротектора по об./об. или масс./об.; или от примерно 3,5% до примерно 5,5% криопротектора по об./об. или масс./об.
В одном варианте реализации способ переходит от стадии 630 манипуляции с образцом спермы непосредственно к стадии 650 замораживания подвергнутого манипуляции образца спермы. Например, в случае манипуляции с образцом спермы с применением микрожидкостного чипа может не требоваться применение среды для сбора, поскольку не образуются капли, которые требуют смягчения среды для сбора. Однако предусмотрены варианты реализации, в которых среду для сбора применяют в связи с манипуляцией с образцом спермы с применением микрожидкостного чипа.
Для способа, воплощенного на фиг. 6, замораживание на стадии 650 может быть достигнуто с помощью обычного способа, такого как описанный в WO/200137655. Только в качестве примера, один такой способ может начинаться с разбавления подвергнутого манипуляции образца спермы для замораживания во фракции А. В качестве альтернативы подвергнутый манипуляции образец спермы можно собрать в среде для сбора, включающей разбавитель фракции А на стадии 540 сбора. Только в качестве примера фракция А может содержать разбавитель цитрат TRIS с 20% яичного желтка. Другие подходящие разбавители могут включать цитрат натрия, трис[гидроксиметил]аммометан и TES (N-трис[гидроксиметил]метил-2-аминоэтансульфоновую кислоту) и буферы глутамата натрия; молоко; HEPES- забуференную среду; и любую их комбинацию.
Стадию 650 замораживания можно продолжать охлаждением подвергнутого манипуляции образца спермы. Подвергнутый манипуляции образец спермы может быть охлажден до температуры примерно от 8°С до 4°С. В одном конкретном примере подвергнутый манипуляции образец спермы может быть охлажден до примерно 5°С. После охлаждения фракцию В можно добавлять в одну или несколько стадий, и затем подвергнутый манипуляции образец спермы может быть повторно концентрирован. Повторное концентрирование может включать центрифугирование подвергнутого манипуляции образца спермы с образованием осадка и ресуспендирование спермы в конечном разбавителе, иногда называемом разбавителем AB. В качестве одного примера, разбавитель AB может иметь концентрацию криопротектора, которая составляет половину концентрации криопротектора во фракции В. В качестве неограничивающего примера, эта концентрация может составлять примерно 6% об./об. или масс./об. в случае глицерина. Другие способы замораживания предложены для применения согласно варианту реализации, изображенному на фиг. 6. В частности, некоторые способы замораживания, описанные ниже, могут обеспечить синергизм со способом обработки, изображенным на фиг. 6.
Способ, изображенный на фиг. 7, отличается от способа, изображенного на фиг. 5, тем, что проточная жидкость не дополнена криопротектором. На стадии (710) способ начинают со стадии окрашивания образца спермы в среде для окрашивания. Образец спермы может представлять собой чистую семенную жидкость или сперму, разбавленную в другом растворе, таком как описано ранее. В качестве примера, образец спермы может быть стандартизирован путем разбавления и повторного концентрирования способом, описанным ранее. В качестве альтернативы образец спермы может иметь форму чистой семенной жидкости или чистой семенной жидкости, разбавленной буфером и/или с добавлением антибиотиков.
Будучи стандартизированным или нет, ДНК-селективный флуоресцентный краситель может представлять собой хехст 33342, поставляемый в модифицированном буфере TALP (таблица 1). Стадия окрашивания сама по себе может быть выполнена в одном разведении, которое дополнительно включает гасящий краситель. В качестве альтернативы, стадия 510 может быть выполнена в двух разведениях, таких как первое разведение в модифицированном TALP, содержащем ДНК-селективный флуоресцентный краситель, с последующим вторым разведением в модифицированном TALP, содержащем гасящий краситель. Следует понимать, что в соответствии с этим примером можно применять другие ДНК-селективные флуоресцентные красители и другие гасящие красители. Для осуществления задач данного варианта реализации каждый будет называться средой для окрашивания.
6
6
6
6
6
6
Независимо от достижения посредством одного или двух разведений, образец спермы может быть разведен до величины от 640×l0 до 40×l0 спермы/мл, от примерно 320×l0 до 80×l0 спермы/мл, до примерно 160×10 спермы/мл или до примерно 120×10 спермы/мл в среде для окрашивания. ДНК-селективный флуоресцентный краситель можно добавлять сперме, суспендированной в среде для окрашивания, в концентрации от примерно 10 мкМ до 200 мкМ; от примерно 20 мкМ до 100 мкМ или от примерно 30 мкМ до 70 мкМ. РН среды для окрашивания может составлять от примерно 6,8 до 7,9; от примерно 7,1 и 7,6; или примерно 7,4. В случае применения двух разведений второе разведение может быть выполнено при или около того же pH, что и первое разведение, или при низком pH, таком как от 5,0 до 6,0 или примерно при 5,5. Необязательно, ранее описанные антиоксиданты и концентрации могут быть включены в среду для окрашивания. Образец спермы можно инкубировать при 30-39°С, примерно 32-37°С или примерно 34°С. Период инкубации может варьироваться от примерно 20 минут до примерно трех часов, от примерно 30 минут до примерно 90 минут или от примерно 45 минут до примерно 60 минут.
На стадии 712 можно увидеть, что среда для окрашивания, применяемая на стадии 710, включает первое количество криопротектора. Криопротектор может представлять собой подходящий сахарный спирт, такой как этиленгликоль; глицерин; эритрит; треит; арабит; рибит; ксилит; сорбит; галактит; идит; волемит; фуцит; инозит; глицилглицит или их комбинации. Криопротектор может также представлять собой подходящий гликоль, такой как пропиленгликоль, бутантриол или их комбинации. Следует понимать, что выбранный криопротектор может быть специфичным для вида животного или, возможно, даже для породы. В качестве примера, глицерин может быть выбран в случае бычьей спермы и путем выполнения стадий, показанных в фиг. 7, токсичность глицерина может быть снижена. Следует понимать, что можно применять другие подходящие криопротекторы, если они подходят для консервации образца спермы, и что стадии на фиг. 7 могут аналогичным образом смягчить токсическое действие этих криопротекторов.
Первое количество криопротектора может представлять собой об./об. или масс./об. концентрацию криопротектора в среде для окрашивания, составляющую от примерно 0,1% до примерно 5%; от примерно 0,1% до примерно 1%; от примерно 1% до примерно 2%; от примерно 2% до примерно 3%; от примерно 3% до примерно 4%; от примерно 2% до примерно 4%; или от примерно 1,5% до примерно 3%.
После окрашивания образец спермы можно приводить в контакт с проточной жидкостью на стадии 720. Стадия приведения образца спермы в контакт может быть связана с обработкой образца спермы, например посредством проточной цитометрии с применением проточного цитометра «струя в воздухе» или аналогичным способом с применением микрожидкостного чипа. В одном варианте реализации стадия приведения образца спермы в контакт с проточной жидкостью происходит в проточном цитометре «струя в воздухе», как описано со ссылкой на фиг. 1. Однако следует понимать, что стадия 720 не ограничивается обработкой в проточном цитометре «струя в воздухе», а скорее охватывает любой способ обработки спермы, в котором содержащий сперму образец спермы вступает в контакт с проточной жидкостью. В качестве неограничивающего примера, сортировка с помощью микрожидкостного чипа обычно требует установления коаксиального потока образца и проточной жидкости через проточный канал. В случае спермы образец спермы должен проходить через один или несколько проточных каналов в ламинарном потоке, в то время как он окружен проточной жидкостью, чтобы фокусировать местоположение клеток спермы и предотвращать их касание внутренней части проточного канала. Ламинарные потоки образца спермы и проточной жидкости в каждом канале будут предотвращать или, по меньшей мере, сводить к минимуму любое смешивание образца спермы и проточной жидкости при поддержании контакта жидкостей.
На стадии 730 образец спермы подвергают манипуляции. В одном варианте реализации образец спермы подвергают манипуляции для получения подвергнутого манипуляции образца спермы, имеющего манипулированное соотношение жизнеспособной спермы, несущей Х-хромосому, к жизнеспособной сперме, несущей Y-хромосому. Стадия манипуляции может быть выполнена путем физического разделения подмножества клеток, как, например, в варианте реализации образования капель, описанном выше со ссылкой на фиг. 1. Но стадия манипуляции не является настолько ограниченной и включает смену жидкости или отвод клеток в проточные каналы микрожидкостных чипов. В качестве альтернативы, фоторазрушающий лазер можно применять в сочетании с поточным цитометром «струя в воздухе» или микрожидкостным чипом для разрушения выбранных клеток спермы в образце спермы с получением подвергнутого манипуляции образца спермы с манипулированным соотношением жизнеспособной спермы, несущей Х-хромосому, к жизнеспособной сперме, несущей Y-хромосому. В качестве альтернативы, образец спермы можно подвергать манипуляции на основании других характеристик. В качестве одного примера образец спермы можно пропускать через проточный цитометр для отделения предположительно жизнеспособной спермы от спермы с поврежденными мембранами.
Один вариант реализации способа, изображенный на фиг. 7, заканчивают на получении подвергнутого манипуляции образца спермы на стадии 730, в то время как другие варианты реализации способа продолжают на стадии 740 сбора подвергнутого манипуляции образца спермы и/или на стадии 750 замораживания подвергнутого манипуляции образца спермы. В одном варианте реализации способ на фиг. 7 необязательно продолжают на стадии 740, на которой подвергнутый манипуляции образец спермы собирают в среде для сбора. В случае проточной цитометрии среда для сбора может быть описана как жидкость для захвата, расположенная в сосуде для сбора или в пробирке, в которую отводят выбранную сперму. Как можно понять из стадии 742, среда для сбора в этом варианте реализации также необязательно содержит количество криопротектора, которое можно считать третьим количеством криопротектора. Опять же, криопротектор может представлять собой тот же, что и криопротектор в среде для окрашивания и/или в проточной жидкости. В качестве альтернативы криопротектор может представлять собой другой криопротектор, такой как подходящий сахарный спирт, включая этиленгликоль; глицерин; эритрит; треит; арабит; рибит; ксилит; сорбит; галактит; идит; волемит; фуцит; инозит; глицилглицит или их комбинации, или подходящий гликоль, такой как пропиленгликоль, бутантриол или их комбинации. Среда для сбора может содержать третье количество криопротектора от примерно 1% до примерно 2% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 2% до примерно 4% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 4% до примерно 6% криопротектора по об./об. или масс./об.; от примерно 3% до примерно 7% криопротектора по об./об. или масс./об.; или от примерно 3,5% до примерно 5,5% криопротектора по об./об. или масс./об; или примерно 4,5% криопротектора по об./об. или масс./об.
В одном варианте реализации способ переходит от стадии 530 манипуляции с образцом спермы непосредственно к стадии 750 замораживания подвергнутого манипуляции образца спермы. Например, в случае манипуляции с образцом спермы с применением микрожидкостного чипа может не требоваться применение среды для сбора, поскольку не образуются капли, которые требуют смягчения среды для сбора. Однако предусмотрены варианты реализации, в которых среду для сбора применяют в связи с манипуляцией с образцом спермы с применением микрожидкостного чипа.
Для способа, воплощенного на фиг. 7, замораживание на стадии 750 может быть достигнуто с помощью обычного способа, такого как описанный в WO/200137655. Только в качестве примера, один такой способ может начинаться с разбавления подвергнутого манипуляции образца спермы для замораживания во фракции А. В качестве альтернативы подвергнутый манипуляции образец спермы можно собрать в среде для сбора, включающей разбавитель фракции А на стадии 540 сбора. Только в качестве примера фракция А может содержать разбавитель цитрат TRIS с 20% яичного желтка. Другие подходящие разбавители могут включать цитрат натрия, трис[гидроксиметил]аминометан и TES (N-трис[гидроксиметил]метил-2-аминоэтансульфоновую кислоту) и буферы глутамата натрия; молоко; HEPES- забуференную среду; и любую их комбинацию.
Стадию 750 замораживания можно продолжать охлаждением подвергнутого манипуляции образца спермы. Подвергнутый манипуляции образец спермы может быть охлажден до температуры примерно от 8°С до 4°С. В одном конкретном примере подвергнутый манипуляции образец спермы может быть охлажден до примерно 5°С. После охлаждения фракцию В можно добавлять в одну или несколько стадий, и затем подвергнутый манипуляции образец спермы может быть повторно концентрирован. Повторное концентрирование может включать центрифугирование подвергнутого манипуляции образца спермы с образованием осадка и ресуспендирование спермы в конечном разбавителе, иногда называемом разбавителем AB. В качестве одного примера, разбавитель AB может иметь концентрацию криопротектора, которая составляет половину концентрации криопротектора во фракции В. В качестве неограничивающего примера, эта концентрация может составлять примерно 6% об./об. или масс./об. в случае глицерина. Другие способы замораживания предложены для применения согласно варианту реализации, изображенному на фиг. 7. В частности, некоторые способы замораживания, описанные ниже, могут обеспечить синергизм со способом обработки, изображенным на фиг. 7.
Фиг. 8 иллюстрирует новый способ замораживания спермы, который можно применять в сочетании с любым из описанных выше способов сортировки или систем, в которых криопротектор вводят в способ манипуляции популяции спермы. В качестве неограничивающих примеров образец спермы можно подвергать манипуляции, чтобы изменить соотношение жизнеспособной спермы, несущей Х-хромосому, к жизнеспособной сперме, несущей Y-хромосому, с помощью проточного цитометра «струя в воздухе» или с применением микрожидкостного чипа. Механизм манипуляции с образцом спермы может представлять собой изменение направления капли, изменение жидкости, фоторазрушение с помощью лазера или других средств.
Независимо от средств, применяемых для манипуляции с образцом спермы, стадию 810 начинают со сбора подвергнутого манипуляции образца спермы в смеси, которая включает криопротектор. Криопротектор может присутствовать в емкости до получения подвергнутого манипуляции образца спермы, криопротектор может присутствовать в образце спермы до манипуляции.
Как описано ранее, в одном варианте реализации сперму окрашивают в среде для окрашивания, которая включает криопротектор. Аналогичным образом, во время манипуляций с образцом спермы сперму можно приводить в контакт с проточной жидкостью, содержащей криопротектор. Независимо от того, окрашены ли они в среде для окрашивания, которая включает криопротектор, или отсортированы в системе, которая включает проточную жидкость с криопротектором, или оба, криопротектор оставляют в образце спермы и собирают на стадии 810 вместе с клетками спермы, подвергнутыми манипуляции.
В вариантах реализации, в которых сперму собирают при достаточной концентрации криопротектора, способ замораживания может быть упрощен, чтобы пропустить или изменить стадии, которые были необходимы ранее для осуществления постепенного введения криопротектора в сперму. Например, в одном варианте реализации подвергнутая манипуляции сперма, контактирующая со средой для окрашивания, содержащей глицерин, проточной жидкостью или жидкостью для захвата, может быть взята непосредственно из сортирующего устройства, сконцентрирована посредством центрифугирования, ресуспендирована в криопротекторе и затем криоконсервирована. В дополнительном варианте реализации после ресуспендирования в криопротекторе сперму выдерживают в течение времени выдерживания менее 24 часов, менее 8 часов, менее 4 часов, 2 часов, менее 2 часов или менее 1 часа до криоконсервации. В еще одном дополнительном варианте реализации сперму охлаждают в течение времени выдерживания. В конкретном варианте реализации настоящего изобретения сперму приводят в контакт с проточной жидкостью, содержащей 3% глицерина (об./об. или масс./об.), концентрированной центрифугированием, ресуспендируют в криопротекторе, содержащем 4,5% глицерина (об./об. или масс./об), и затем криоконсервируют. Таким образом, вышеупомянутые варианты реализации не включают стадии охлаждения спермы и добавления криопротектора к охлажденной сперме до стадии концентрирования спермы.
Настройки и условия для примеров 1-10
Настройки сортирующего устройства - весь анализ сортировки и сортировку выполняли на модифицированном устройстве для сортировки спермы MoFlo-SX (Beckman Coulter, Brea California) с применением аппаратных обновлений Genesis для цифровой обработки (доступно от CytonomeST, Boston, Massachusetts) и специального программного обеспечения для сортировки спермы. Программное обеспечение для сортировки Genesis включает функцию регистрации параметров, которая записывает средние значения для различных параметров, таких как Частота событий (в кГц), Скорость сортировки (в кГц), Частота отказов (в кГц), количество мертвой спермы (частота событий мертвой спермы, деленное на частоту событий – в %), количество склонных к выживанию клеток (частота событий склонной к выживанию спермы, деленное на частоту событий – в %), X-гейтированное количество (как процент склонной к выживанию спермы, выбранной для сбора) и соотношение максимального сигнала к минимальному (PVR). Массовая сортировка относится к применению Х-гейтированного количества, которое включает как сперму, несущую Х-хромосому, так и сперму, несущую Y-хромосому, для получения спермы, которую обрабатывают способом сортировки, но не выбирают по полу, исходя из опыта, согласно которому качество спермы после сортировки и замораживания не зависит от пола, а массовая сортировка происходит примерно в два раза быстрее, чем сортировка по полу. Проточную жидкость под давлением подают либо из стерильного мешка с проточной жидкостью внутри резервуара под давлением с воздушной головкой, либо из мешка или открытого стакана с проточной жидкостью, питающей прецизионную систему доставки жидкости SheathMaster ™ (CytonomeST), где давление приложено к камере под давлением небольшого объема. В обоих случаях скорость проточной жидкости точно контролируется давлением воздуха, контролируемым пробоотборной станцией MoFlo. Проточная жидкость на основе TRIS для коммерческого производства семенной жидкости определенного пола применяли для всей сортировки.
Периодический способ замены проточной жидкости – Несколько объемов проточной жидкости на основе TRIS, каждая из которых содержит определенное количество глицерина, помещали в стерильные мешки или открытые стаканы и применяли для подачи в устройство для сортировки из резервуара под давлением или из системы доставки жидкости SheathMaster ™ соответственно. Концентрация глицерина для каждой проточной жидкости известна из ее композиции.
Окрашивание спермы - 160 миллионов на мл свежеэякулированной бычьей спермы окрашивают с применением 65 мМ Хехст 33342 в модифицированном TALP в течение 60 минут при 34°C, охлаждают до комнатной температуры и разбавляют посредством 1/3 объема того же модифицированного TALP с добавлением 8 % об./об. осветленного яичного желтка для создания конечной концентрации спермы, составляющей 120 миллионов спермы на миллилитр, и концентрации яичного желтка, составляющей 2% об./об., затем фильтруют через фильтр Partec 50 микрон.
Центрирование спермы для стабилизации/измерения PVR - PVR (отношение максимального сигнала к минимальному) представляет собой объективное измерение одномерного графика, графически изображенного на графическом пользовательском интерфейсе компьютера Genesis, с которого управляют устройством для сортировки. Одномерный график на фиг. 3 иллюстрирует частоту событий, имеющих различные интенсивности флуоресценции в прямом направлении. Представление в форме правильно выровненного окрашенного образца спермы соответствует двум перекрывающимся кривым с одинаковым количеством событий при двух разных интенсивностях пиков (два максимума), а также место где две кривые начинают перекрываться, и количество образцов из каждой из две кривые являются примерно одинаковыми (один локальный минимум примерно в равной степени удален между двумя максимумами). Локальный минимум можно назвать долиной (V), в то время как два локальных максимума можно назвать пиками (P), значение P, используемое в примере, является средним из значений интенсивности двух пиков. Порядковые значения для P и V были определены в программном обеспечении, из которого был рассчитан PVR по следующему уравнению: ((P-V)/P)* 100. Перед анализом обученный оператор выполнял центрирование устройства для сортировки, чтобы скорректировать положение оптики, сопла для сортировки спермы и наконечника, а также детектора прямой флуоресценции (FAF) и детектора боковой флуоресценции (SAF). Кроме того, к FAF и SAF следует применять соответствующее усиление сигнала.
Анализ зарегистрированных данных для PVR - программное обеспечение для работы устройства для сортировки Genesis обеспечивает расчет PVR в реальном времени. Для каждых 25000 событий PVR рассчитывали и буферизовали как необработанное значение, в то время как 100 последовательных необработанных измерений значения PVR усредняли. Среднее значение PVR может быть записано (зарегистрировано) по требованию оператора. Как правило, работа проточного цитометра с более низкой частотой событий обеспечивает улучшенные коэффициенты PVR благодаря повышенной точности измеренных значений отдельных событий (сперма), вызванных более узким поперечным сечением потока образца. Центрирование сначала оптимизировали для сортировки со скоростью 40000 событий в секунду, гейт сортировки (примеры которых обозначены как R1, R3 и R4 на фиг. 4) применяли для одновременного сбора живых Х-, и живых Y-несущих популяций (массовая сортировка), и устройство для сортировки работало без какой-либо дополнительной модификации в течение периода времени, соответствующего от 500000 до 700000 отсортированных клеток, перед запросом среднего значения, гарантируя, что зарегистрированные параметры являются репрезентативным средним. После запроса среднего значения при 40000 событий в секунду, оператор понижал давление окрашенного образца спермы, чтобы установить новое давление, которое определило частоту событий примерно 30000, и гейт сортировки, применяемый одновременно для живых Х- и Y-содержащих популяций (массовая сортировка), и устройство для сортировки работало без какой-либо дополнительной модификации в течение периода времени, соответствующего от 500000 до 700000 отсортированных клеток, перед запросом среднего значения. То же самое повторяли для образца, обрабатываемого со скоростью 20000 событий в секунду. Затем давление образца увеличивали, чтобы установить среднюю частоту событий 40000 в секунду, после чего следовало центрирование (если необходимо) и три последовательных измерения, как указано выше. Это осуществляли последовательно через некоторое время, а зарегистрированные данные затем анализировали.
Пример 1
В таблице 2 приведены варианты обработки для примера 1.
Таблица 2
Стандарт.
Окраши-вание
Захват
Объем сорти-ровки
Сорти-ровка
Охлаждение
Замора-живание
Конт-роль
Поддержи-вающая среда (1:3)
TALP 2% EY (120 млн/мл)
TRIS A (3,5мл)
20 мл
0% Глицерин об./об. SF
среда для замораживания (12% Глицерин об./об.) (1:1)
AB (6% Глицерин об./об.) (4 млн/пробирка)
T1
TRIS A (7,0мл)
40 мл
0% Глицерин об./об. SF
-
T2
TRIS A (7,0мл)
40 мл
1% Глицерин об./об. SF
-
T3
TRIS A (7,0мл)
40 мл
2% Глицерин об./об. SF
-
T4
TRIS A (7,0мл)
40 мл
4% Глицерин об./об. SF
-
T5
TRIS A (7,0мл)
40 мл
8% Глицерин об./об. SF
-
1. Один эякулят получали у быка.
2. Проверяли качество эякулята (QC) на подвижность и оценивали морфологию и концентрацию клеток спермы.
3. Эякулят стандартизировали путем объединения с поддерживающей средой (физиологический солевой раствор и буфер с яичным желтком и питательными веществами) в соотношении 1:3 соответственно. и затем окрашивали в соответствии с вышеописанной процедурой окрашивания.
4. Контрольную проточную жидкость (SF) подключали к проточному цитометру, и отработанную жидкость собирали в предварительно взвешенную пробирку в течение 3 минут.
5. Жидкость в пробирке взвешивали для определения скорости потока каждой конкретной проточной жидкости.
6. Окрашенный образец помещали в устройство для сортировки и проверяли задержку образования капель.
7. Зарегистрированные данные проточного цитометра собирали для 1 миллиона спермы с разбивкой по полу при 30000, 20000 и 40000 eps (events per second – событий в секунду).
8. После сбора зарегистрированных данных осуществляли массовую сортировку 1 пробирки для сбора объемом не более 20  мл.
9. Для групп обработки стадии 7 и 8 повторяли с применением каждой проточной жидкости для обработки, описанной выше в таблице 2.
10. После сбора зарегистрированных данных проводили массовую сортировку 1 пробирки для сбора, подлежащей обработке, объемом не более 40 мл.
11. Все пробирки для сбора помещали в холодное помещение на 90 минут.
12. 20 мл среды для замораживания (12% об./об. глицерина) добавляли к контролю (добавление в две стадии).
13. Все пробирки для сбора центрифугировали, и декантировали супернатант.
3
14. Соответствующий объем АВ (6% об./об. глицерина) добавляли в каждую пробирку для сбора, чтобы довести концентрацию спермы в 1/4 см пробирке для искусственного оплодотворения (AI straw) до 4 миллионов клеток/пробирка.
15. Разведенную сперму держали в холодной комнате в течение ночи.
16. Сперму помещали в пробирки и криоконсервировали.
17. Стадии 1-16 повторяли еще два раза с применением эякулятов от того же быка.
18. PVR оценивали для контроля и каждой обработки. Результаты показаны на фиг. 9. Подвижность спермы (IVOS II), жизнеспособность (PI) и PIA (PNA) также оценивали через 0 и 3 часа после оттаивания. Результаты показаны на фигурах 10 и 11, соответственно.
Пример 2
Вместо периодического способа замены проточной жидкости, описанного выше, в примере 2 применяли следующий способ градиента проточной жидкости для замены проточной жидкости.
Способ градиента проточной жидкости для замены проточной жидкости - стакан 1, обеспечивающий проточную жидкость в систему доставки жидкости SheathMaster ™, содержащей бычью проточную жидкость, содержащую 0% глицерина, перемешивают с помощью магнитной мешалки. Бычью проточную жидкость, содержащую 6 об./об. глицерина (820 мМ) в стакане 2 медленно перекачивали в стакан 1 с помощью перистальтического насоса, обеспечивающего непрерывно увеличивающуюся концентрацию глицерина в стакане 1 в течение примерно 3 часов, где конечная концентрация глицерина составляла примерно 5,5% об./об. (750мм). Концентрацию глицерина через промежутки времени определяли путем измерения осмолярности проточной жидкости, выходящей из сопла, и сравнения измерения с соответствующей стандартной кривой. Типичная кривая для глицерина в проточной жидкости представляет собой процентное содержание глицерина (G) = (измеренный мОсм (X) - 300) / 161, или, иначе говоря, каждое увеличение на 161 мОсм соответствует увеличению концентрации глицерина на 1% (об./об.).
1. Свежие эякуляты получали от трех быков.
2. Проверяли качество эякулята, стандартизировали и окрашивали в соответствии с методиками, описанными в примере 1.
3. Стакан, содержащий проточную жидкость с 0% глицерина, подключали к системе доставки жидкости проточного цитометра. Жидкость постоянно перемешивали с помощью магнитной мешалки.
4. Окрашенный образец спермы помещали в проточный цитометр и проверяли задержку образования капель.
5. 1 миллион спермы сортировали по полу при 20000 eps, затем 30000 eps и, наконец, 40000 eps.
6. Проточную жидкость, содержащую 6% об./об. глицерина, перекачивали перистальтическим насосом в проточную жидкость, содержащую 0% глицерина, со средней скоростью потока 204 г/ч.
7. Зарегистрированные данные проточного цитометра непрерывно собирали при различной частоте событий до тех пор, пока проточная жидкость, содержащая 6,0% об./об. глицерина, была доступна.
8. PVR рассчитывали для каждого контрольного образца и образца для обработки. Результаты показаны на фиг. 12.
Пример 3
В таблице 3 приведены варианты обработки для примера 3.
Таблица 3
Стандарт.
Окраши-вание
Сбор (Объем)
ОБ. сортиров-ки
Сортировка
Охлаждаю-щая среда
Время охлаждения
Заморажи-вание
Контроль
Среда хранения (1:3)
TALP 2% EY (120 млн/мл)
TRIS A (3,5мл)
20 мл
0% Глицерин об./об. SF
Среда для заморажива-ния (12% Глицерин об./об.) (1:1)
90 минут
COLD AB
T1
TRIS A (7,0мл)
40 мл
3,5% Глицерин об./об. SF
-
90 минут
T2
TRIS A (7,0мл)
40 мл
3,5% Глицерин об./об. SF
-
30 минут
T3
TRIS A (7,0мл)
40 мл
3,5% Глицерин об./об. SF
-
0 минут
T4
TRIS A (7,0мл)
40 мл
3,5% Глицерин об./об. SF
-
0 минут
RT AB
1. Эякуляты получали от 10 быков.
2. Проверяли качество эякулята, стандартизировали и окрашивали в соответствии с методиками, описанными в примере 1.
3. 1 пробирку для сбора с объемом не более 20 мл подвергали массовой сортировке.
Контроль – Пробирки помещали в холодное помещение на 90 минут.
К контролю добавляли 20 л среды для замораживания (12% об./об. глицерина) (добавление в 2 стадии).
4. Повторяли стадию 3. 4 пробирки для сбора с объемом не более 40 мл подвергали массовой сортировке с применением проточной жидкости, содержащей 3,5% глицерина об./об. (SF).
Обработка 1 - Пробирки помещали в холодное помещение на 90 минут.
Обработка 2 - Пробирки помещали в холодное помещение на 30 минут.
Обработка 3 - Хранили при комнатной температуре до готовности к центрифугированию.
Обработка 4 - Хранили при комнатной температуре до готовности к центрифугированию.
5. Все пробирки для сбора центрифугировали, и декантировали супернатант.
3
6. Соответствующий объем холодной АВ (6% об./об. глицерина) добавляли в каждую пробирку для сбора, чтобы довести концентрацию спермы в 1/4 см пробирке для искусственного оплодотворения до 4 миллионов клеток/пробирка, за исключением добавления АВ комнатной температуры к обработке 4.
7. Разбавленную сперму хранили в холодном помещении в течение ночи.
8. Клетки спермы помещали в пробирки и криоконсервировали (3 пробирки на обработку с 4 млн клеток/пробирка).
9. Подвижность через 0 и 3 часа (IVOS), жизнеспособность (PI) и PIA (PNA) оценивали после оттаивания. Результаты представлены на фиг. 13. Сходимость (3ч/0ч) для подвижности, жизнеспособности и PIA представлены на фиг. 14.
Пример 4
В таблице 4 приведены варианты обработки для примера 4.
Таблица 4
Стандарт.
Окраши-вание
Сбор (Объем)
ОБ. сортиров-ки
Сортировка
Охлаждаю-щая среда
Время охлаждения
Заморажива-ние
Контроль
Среда хранения (1:3)
TALP 2% EY (120 млн/мл)
TRIS A (3,5мл)
20  мл
0% Глицерин об./об. SF
Среда для заморажива-ния (12% Глицерин об./об.) (1:1)
90 минут
AB (6% Глицерин об./об.)
T1
TRIS A (7,0мл)
40 мл
3,0% Глицерин об./об. SF
-
90 минут
AB (5% Глицерин об./об.)
T2
TRIS A (7,0мл)
40 мл
3,0% Глицерин об./об. SF
-
0 минут
AB (5% Глицерин об./об.)
T3
TRIS A (7,0мл)
40 мл
5,0% Глицерин об./об. SF
-
90 минут
AB (5% Глицерин об./об.)
T4
TRIS A (7,0мл)
40 мл
5,0% Глицерин об./об. SF
-
0 минут
AB (5% Глицерин об./об.)
1. Эякуляты получали от пяти быков.
2. Проверяли качество эякулята, стандартизировали и окрашивали в соответствии с методиками, описанными в примере 1.
3. 1 пробирку для сбора с объемом не более 20 мл подвергали массовой сортировке.
Контроль - пробирки для сбора помещали в холодное помещение на 90 минут.
20 мл среды для замораживания (12% об./об. глицерина) добавляли к контролю (добавление в 2 стадии).
Все пробирки для сбора центрифугировали, и декантировали супернатант.
3
Соответствующий объем АВ (6% об./об. глицерина) добавляли в каждую пробирку для сбора, чтобы довести концентрацию спермы в 1/4 см пробирке для искусственного оплодотворения до 4 миллионов клеток/пробирка.
4. Подключали проточную жидкость, содержащую 3,0% глицерина (SF), и нагнетали давление в резервуаре.
5. 2 пробирки для сбора с объемом не более 40 мл подвергали массовой сортировке:
Обработка 1 - пробирки для сбора помещали в холодное помещение на 90 минут.
Обработка 2 - пробирки для сбора помещали в холодное помещение на 0 минут.
6. Подключали проточную жидкость, содержащую 5.0% глицерина, и нагнетали давление в резервуаре.
7. 4 пробирки для сбора с объемом не более 40 мл подвергали массовой сортировке:
Обработка 3 - пробирки для сбора помещали в холодное помещение на 90 минут.
Обработка 4 - пробирки для сбора помещали в холодное помещение на 0 минут.
Все пробирки центрифугировали, и декантировали супернатант.
AB (5% об./об. глицерина) добавляли в каждую пробирку до конечной концентрации 4 млн спермы в пробирке.
8. Разбавленную сперму хранили в холодном помещении в течение ночи.
9. Клетки спермы помещали в пробирки и криоконсервировали.
10. Подвижность через 0 и 3 часа (IVOS), жизнеспособность (PI) и PIA (PNA) оценивали после оттаивания. Результаты представлены на фиг. 15. Сходимость (3ч/0ч) для подвижности, жизнеспособности и PIA представлены на фиг. 16.
Пример 5
В таблице 5 приведены варианты обработки для примера 5.
Таблица 5
Стандарт.; окрашивание
Объем сбора
Объем сортировки
Концентриро-вание в SF (Нормализовано по глицерину)
Время охлаждения
Криопротектор для замораживания
Глицерин (контроль)
Среда хранения (1:3); TALP 2% EY (120 млн/мл)
TRIS A (7,0 мл)
40 мл
3,5% Глицерин об./об. SF
0 минут
5%Глицерин об./об. AB
Этиленгликоль
TRIS A (7,0мл)
40 мл
3,5% EG об./об. SF
0 минут
5%Глицерин об./об. AB
Пропиленгликоль
TRIS A (7,0мл)
40 мл
3,5% PG об./об. SF
0 минут
5%Глицерин об./об. AB
Эритрит
TRIS A (7,0мл)
40 мл
3,5% Эритрита об./об. SF
0 минут
5%Глицерин об./об. AB
Эритрит
TRIS A (7,0мл)
40 мл
5,0% Эритрита об./об. SF
0 минут
5%Глицерин об./об. AB
1. Эякуляты получали от четырех быков.
2. Проверяли качество эякулята, стандартизировали и окрашивали в соответствии с методиками, описанными в примере 1.
3. Подключали контрольную проточную жидкость, и нагнетали давление в резервуаре с проточной жидкостью.
4. Окрашенный образец помещали в устройство для сортировки и проверяли задержку образования капель.
5. 1 пробирку для сбора объемом не более 40 мл подвергали массовой сортировке с применением проточной жидкости (SF), содержащей 3,5% об./об. глицерина.
6. 1 пробирку для сбора объемом не более 40 мл подвергали массовой сортировке с применением SF, содержащей 3,5% об./об. этиленгликоля.
7. 1 пробирку для сбора объемом не более 40 мл подвергали массовой сортировке с применением SF, содержащей 3,5% об./об. пропиленгликоля
8. 1 пробирку для сбора объемом не более 40 мл подвергали массовой сортировке с применением SF, содержащей 3,5% об./об. эритрита.
9. 1 пробирку для сбора объемом не более 40 мл подвергали массовой сортировке с применением SF, содержащей 5,0% об./об. эритрита.
10. Все пробирки центрифугировали, и осуществляли декантацию.
11. AB, содержащую 5% об./об. глицерина, добавляли в каждую пробирку в количестве, необходимом для получения 4 млн спермы в пробирке.
12. Разбавленную сперму хранили в холодном помещении в течение ночи.
13. Клетки спермы помещали в пробирки и криоконсервировали.
14. Подвижность (IVOS), жизнеспособность (PI) и PIA (PNA) оценивали через 0 и 3ч после оттаивания. Результаты представлены на фиг. 17. Сходимость (3ч/0ч) для подвижности, жизнеспособности и PIA представлены на фиг. 18.
Пример 6
В таблице 6 приведены варианты обработки для примера 6.
Таблица 6
Стандарт.
Окраши-вание
Объем сбора
Объем сортировки
Глицерин в проточной жидкости
Время охлаждения
Криопротектор для замораживания
Контроль
среда хранения (1:3)
TALP 2% EY (120 млн/мл)
TRIS A (3,5мл)
20  мл
0,0% Глицерин об./об. SF
90 минут + среда для замораживания (12% Глицерин об./об.)
6,0% Глицерин об./об. AB
Контроль 2
TRIS A (7,0мл)
40 мл
3,0% Глицерин об./об. SF
0 минут
5,0% Глицерин об./об. AB
T1
TRIS A (7,0мл)
40 мл
1,0% Глицерин об./об. SF
0 минут
1,0% Глицерин об./об. AB
T2
TRIS A (7,0мл)
40 мл
3,0% Глицерин об./об. SF
0 минут
3,0% Глицерин об./об. AB
T3
TRIS A (7,0мл)
40 мл
5,0% Глицерин об./об. SF
0 минут
5,0% Глицерин об./об. AB
T4
TRIS A (7,0мл)
40 мл
7,0% Глицерин об./об. SF
0 минут
7,0% Глицерин об./об. AB
1. Свежие эякуляты получали от четырех быков.
2. Проверяли качество эякулята, стандартизировали и окрашивали в соответствии с методиками, описанными в примере 1.
3. Подключали контрольную проточную жидкость, и нагнетали давление в резервуаре с проточной жидкостью.
4. 1 пробирку для сбора объемом не более 40 мл подвергали массовой сортировке с применением проточной жидкости (SF), содержащей 0,0% об./об. глицерина (Контроль).
10. Контрольные пробирки помещали в холодное помещение на 90 минут, и добавляли 20 мл среды для замораживания (12% об./об. глицерина) (добавление в 2 стадии).
11. Все пробирки центрифугировали, и осуществляли декантацию.
12. Достаточное количество AB добавляли в каждую пробирку для получения 4 миллиона спермы в пробирке:
AB 6,0% об./об. глицерина (Контроль)
AB 1,0% об./об. глицерина (T1)
AB 3,0% об./об. глицерина (T2)
AB 5,0% об./об. глицерина (T3 и Контроль 2)
AB 7,0% об./об. глицерина (T4)
13. Разбавленную сперму хранили в холодном помещении в течение ночи.
14. Клетки спермы помещали в пробирки и криоконсервировали.
15. Подвижность через 0 и 3 ч после оттаивания (IVOS II) представлена на фиг. 19. Жизнеспособность (PI) и PIA (PNA) через 0 и 3 ч после оттаивания представлены на фиг. 20.
Пример 7
На таблице 7 приведены варианты обработки для примера 7.
Таблица 7
Стандарт.
Окрашивание
Объем сбора
Объем сортировки
Полиол в проточной жидкости
Время охлаждения
Криопроте-ктор для заморажи-вания
Контроль
среда хранения (1:3)
TALP 2% EY (120 млн/мл)
TRIS A (3,5мл)
20  мл
0,0% Глицерин об./об. SF
90 минут + среда для замораживания (12% Gly)
6,0% Глицерин об./об. AB
Контроль 2
TRIS A (7,0мл)
40 мл
3,0% Глицерин об./об. SF
0 минут
5,0% Глицерин об./об. AB
T1
TRIS A (7,0мл)
40 мл
1,0% Пропиленгликоль об./об. SF
0 минут
1,0% Пропиленгликоль об./об. AB
T2
TRIS A (7,0мл)
40 мл
3,0% Пропиленгликоль об./об. SF
0 минут
3,0% Пропиленгликоль об./об. AB
T3
TRIS A (7,0мл)
40 мл
5,0% Пропиленгликоль об./об. SF
0 минут
5,0% Глицерин об./об. AB
T4
TRIS A (7,0мл)
40 мл
7,0% Пропиленгликоль об./об. SF
0 минут
7,0% Глицерин об./об. AB
1. Свежие эякуляты получали от четырех быков.
2. Проверяли качество эякулята, стандартизировали и окрашивали в соответствии с методиками, описанными в примере 1.
3. Подключали контрольную проточную жидкость, и нагнетали давление в резервуаре с проточной жидкостью.
4. 1 пробирку для сбора с объемом не более 20 мл подвергали массовой сортировке с применением проточной жидкости (SF), содержащей 0,0% об./об. глицерина (Контроль)
5. 1 пробирку для сбора с объемом не более 40 мл подвергали массовой сортировке с применением SF, содержащей 3,0% об./об. глицерина (Контроль 2)
6. 1 пробирку для сбора с объемом не более 40 мл подвергали массовой сортировке с применением SF, содержащей 1,0% об./об. пропиленгликоля (T1)
7. 1 пробирку для сбора с объемом не более 40 мл подвергали массовой сортировке с применением SF, содержащей 3,0% об./об. пропиленгликоля (T2)
8. 1 пробирку для сбора с объемом не более 40 мл подвергали массовой сортировке с применением SF, содержащей 5,0% об./об. пропиленгликоля (T3)
9. 1 пробирку для сбора с объемом не более 40 мл подвергали массовой сортировке с применением SF, содержащей 7,0% об./об. пропиленгликоля (T4)
10. Контрольные пробирки помещали в холодное помещение на 90 минут и добавляли 20 мл среды для замораживания (12% об./об. глицерина) (добавление в 2 стадии).
11. Все пробирки центрифугировали, и осуществляли декантацию.
12. Достаточное количество АВ добавляли в каждую пробирку для получения 4 млн спермы в пробирке:
AB, содержащая 6,0% об./об. глицерина (Контроль)
AB, содержащая 5,0% об./об. глицерина (Контроль 2)
AB, содержащая 1,0% об./об. пропиленгликоля (T1)
AB, содержащая 3,0% об./об. пропиленгликоля (T2)
AB, содержащая 5,0% об./об. пропиленгликоля (T3)
AB, содержащая 7,0% об./об. пропиленгликоля (T4)
13. Разбавленную сперму хранили в холодном помещении в течение ночи.
14. Клетки спермы помещали в пробирки и криоконсервировали.
15. Подвижность через 0 и 3 ч после оттаивания (IVOS II) представлена на фиг. 21. Жизнеспособность (PI) и PIA (PNA) через 0 и 3 ч после оттаивания представлены на фиг. 22.
Пример 8
В таблице 8 приведены варианты обработки для примера 8.
Таблица 8
Стандарт.
Окрашивание
Объем сбора
Объем сортировки
Глицерин в проточной жидкости
Время охлаждения
Криопротектор для замораживания
T1
Среда хранения (1:3)
TALP 2% EY (120 млн/мл)
TRIS A (7,0мл)
40 мл
3.0% Глицерин об./об. SF
0 минут
3,0% Глицерин об./об. AB
T2
3,5% Глицерин об./об. AB
T3
4,0% Глицерин об./об. AB
T4
4,5% Глицерин об./об. AB
T5
5,0% Глицерин об./об. AB
T6
5,5% Глицерин об./об. AB
T7
6,0% Глицерин об./об. AB
1. Свежие эякуляты получали от четырех быков.
2. Проверяли качество эякулята, стандартизировали и окрашивали в соответствии с методиками, описанными в примере 1.
3. Подключали контрольную проточную жидкость, и нагнетали давление в резервуаре с проточной жидкостью.
4. Окрашенный образец помещали в проточный цитометр и проверяли задержку образования капель.
5. 7 пробирок для сбора с объемом не более 40 мл подвергали массовой сортировке с применением проточной жидкости, содержащей 3,0% глицерина (SF).
6. Все пробирки центрифугировали, и осуществляли декантацию.
7. Достаточное количество АВ добавляли в каждую пробирку для получения 4 млн спермы в пробирке:
AB, содержащая 3,0% об./об. глицерина (T1)
AB, содержащая 3,5% об./об. глицерина (T2)
AB, содержащая 4,0% об./об. глицерина (T3)
AB, содержащая 4,5% об./об. глицерина (T4)
AB, содержащая 5,0% об./об. глицерина (T5)
AB, содержащая 5,5% об./об. глицерина (T6)
AB, содержащая 6,0% об./об. глицерина (T7)
8. Разбавленную сперму хранили в холодном помещении в течение ночи.
9. Клетки спермы помещали в пробирки и криоконсервировали.
10. Подвижность через 0 и 3 ч (визуально и IVOS II) представлена на фиг. 23 и 25. Жизнеспособность (PI) и PIA (PNA) через 0 и 3 ч представлены на фиг. 24 и 26. Сходимость (3ч/0ч) для подвижности представлена на фиг. 27. Сходимости для жизнеспособности и PIA представлены на фиг. 28.
Пример 9
В таблице 9 приведены варианты обработки для примера 9.
Таблица 9
Объем сбора
Объем сортировки
Проточная жидкость
Время охлаждения
Среда замораживания
Криопротектор для замораживания
Время хранения до заморажива-ния
Контроль 1
TRIS A (3,5мл)
20  мл (15 млн)
0% Глицерин об./об. SF
90 минут
Да (12% об./об. глицерина)
6,0% Глицерин об./об. AB
2 часа
Контроль 2
В течение ночи
T1
Нет
2 часа
T2
TRIS A (7,0мл)
40 мл (30 млн)
3,0% Глицерин об./об. SF + АКГ (0,0875мг/мл)
0 минут
4,5% Глицерин об./об. AB
В течение ночи
1. Свежие эякуляты получали от 10 быков.
2. Проверяли качество эякулятов, стандартизировали и окрашивали в соответствии с методиками, описанными в примере 1.
3. Подключали контрольную проточную жидкость, и нагнетали давление в резервуаре с проточной жидкостью.
4. 2 пробирки для сбора с объемом не более 20 мл (или 15 млн спермы) подвергали массовой сортировке с применением проточной жидкости, содержащей 0,0% об./об. глицерина (SF).
5. Пробирки помещали в холодное помещение на 90 минут, и добавляли 20  мл среды для замораживания (12% об./об. глицерина) (добавление в 2 стадии).
6. Подключали проточную жидкость для обработки, и нагнетали давление в резервуаре с проточной жидкостью
7. Окрашенный образец помещали в проточный цитометр и проверяли задержку образования капель.
8. 1 пробирку для сбора с объемом не более 40 мл (или 30 млн спермы) подвергали массовой сортировке с применением SF, содержащей 3,0% об./об. глицерина + альфа-кетоглутарат (АКГ).
9. Все пробирки центрифугировали, и осуществляли декантацию.
10. AB добавляли в каждую пробирку:
1200 мкл AB, содержащей 6,0% об./об. глицерина (Контроль 1 и Контроль 2)
1200 мкл AB, содержащей 4,5% об./об. глицерина (T1 и T2)
11. Сперму для контроля 1 и T1 выдерживали в AB в течение 2 часов, и затем криоконсервировали в пробирках для искусственного оплодотворения (2 пробирки на обработку с 4 млн спермы/пробирка).
12. Контроль 2 и T2 выдерживали в AB в течение ночи, и затем криоконсервировали в пробирках для искусственного оплодотворения (2 пробирки на обработку с 4 млн спермы/пробирка).
13. Подвижность через 0 и 3 часа (визуально и IVOS), жизнеспособность (PI), PIA (PNA) и сходимость (0ч/3ч) оценивали после оттаивания. Подвижность через 0 ч (визуально и IVOS), жизнеспособность и PIA представлены на фиг. 29. Подвижность через 3 ч (визуально и IVOS), жизнеспособность и PIA представлены на фиг. 30. Сходимость (3ч/0ч) для подвижности, жизнеспособности и PIA представлены на фиг. 31.
Пример 10
В таблице 10 приведены варианты обработки для примера 10.
Таблица 10
Стан-дарт.
Окрашива-ние
Объем сбора
Объем сортировки
Глице-рин в SF
АКГ
Время охлаж-дения
Среда замораживания
Криопро-тектор для заморажи-вания
Время хранения до замо-раживания
T1- Конт-роль
среда хранения (1:3)
TALP 2% EY (120 млн/мл)
TRISA (3,5мл)
20  мл (15 млн, спермы)
0% об./об.
Нет
90 минут
Да (12% об./об. глице-рина)
6,0% Глице-рин об./об. AB
2 часа
T2-3% глицерин SF
TRISA (7,0мл)
40 мл (30 млн, спермы)
3% об./об.
Да(0,0875 мг/мл)
0 минут
Нет
4,5% Глице-рин об./об. AB
2 часа
1. Свежие эякуляты получали от трех быков.
2. Проверяли качество эякулята, стандартизировали и окрашивали в соответствии с методиками, описанными в примере 1.
3. Подключали проточную жидкость для обработки 1 (Контроль) (без глицерина), и нагнетали давление в резервуаре с проточной жидкостью.
4. 4 контрольные пробирки для сбора с объемом не более 20 мл (или 15 млн спермы) подвергали массовой сортировке.
5. Пробирки помещали в холодное помещение на 90 минут, и добавляли 20 мл среды для замораживания (12% об./об. глицерина) (добавление в 2 стадии).
6. Подключали проточную жидкость для обработки 2 (3% об./об. глицерина с АКГ), и нагнетали давление в резервуаре.
7. 2 пробирки для сбора с объемом не более 40 мл (или 30 млн спермы) подвергали массовой сортировке.
8. Затем все пробирки центрифугировали и подвергали декантации. Осадок для T1 (4 пробирки) объединяли. Осадок для Т2 (2 пробирки) объединяли.
9. AB добавляли в каждую пробирку:
AB, содержащую 6,0% об./об. глицерина, к обработке 1
AB, содержащую 4,5% об./об. глицерина, к обработке 2
10. Разбавленную сперму выдерживали в AB в течение 2 часов, и затем криоконсервировали в пробирках для искусственного оплодотворения (4 млн спермы/пробирка).
11. 200 ооцитов на обработку затем оплодотворяли посредством ЭКО. Результаты ЭКО представлены на фиг. 32.
Пример 11
Пример 11 состоит из полевого испытания для проверки степени зачатия, достигнутой с разделенной по полу семенной жидкостью, отсортированной с применением проточной жидкости, содержащей 3% об./об. глицерина и 0,0875мг/мл альфа-кетоглутарата. Применяли 5 самцов-производителей и более 3000 телок (до 3-й лактации), получивших от 1 до 3 искусственных осеменений 90% семенной жидкостью женского пола.
Результаты примера 11 представлены на фиг. 33 и 34. На фиг. 33 показана подвижность после оттаивания, PIA, сходимость и жизнеспособность спермы, применяемой в полевых испытаниях. На фиг. 34 показаны достигнутые показатели зачатия.
Пример 12
В Примере 12 проверена эффективность разбавленного раствора глицерина («криоконсервант»), который при смешивании с рассчитанным количеством TRIS A (TRIS + 20% яичного желтка) превращается в AB, устраняя необходимость в применении чистого глицерина в лабораториях по сортировке спермы.
В таблице 11 приведены варианты обработки для примера 12.
Таблица 11
Глицерин (об/об)
Граммы TRIS A
Граммы исходного раствора глицерина
AB всего
EY %
мОсм
20%
32,761
9,959
42,720
13,9
1077 мОсм
45%
40,183
4,937
45,120
17,5
1084 мОсм
65%
43,325
3,715
47,040
18,3
1085 мОсм
100%
47,628
2,772
50,400
19,1
1090 мОсм
1. Пять эякулятов получали от быка.
2. Проверяли качество эякулята, стандартизировали и окрашивали в соответствии с методиками, описанными в примере 1.
3. 4 пробирки для сбора подвергали массовой сортировке с применением проточной жидкости, содержащей 3,0% об./об. глицерин + альфа-кетоглутарат (АКГ).
4. Пробирки помещали в холодное помещение на 15 минут.
5. Все пробирки центрифугировали, и осуществляли декантацию, и осадки объединяли.
6. Осадки разделяли на 5 пробирок, содержащих AB с 4,5% глицерина, с получением следующего:
Контроль – получали с применением чистого глицерина (100% об./об.)
Обработка 1 – получали с применением 20% криоконсерванта
Обработка 2 - получали с применением 45% криоконсерванта
Обработка 3 - получали с применением 65% криоконсерванта
7. Сперму выдерживали в течение ночи и замораживали.
8. Подвижность (визуально и IVOS), жизнеспособность (PI) и PIA (PNA) определяли через 0 и 3 ч.
Результаты примера 12 представлены на фиг. 35, которые показывают благотворный эффект при применении АВ в криоконсерванте (разбавленный глицерин) вместо 100% об./об. глицерина.
Пример 13
В таблице 12 приведены варианты обработки для примера 13.
Таблица 12
Глицерин в жидкости для сбора об./об.
Объем сортировки
Глицерин в SF об./об.
Время охлаждения
Среда замораживания
Криопротектор
Контроль
0%
20  мл(15 млн)
0%
90 минут
Да (12% об./об. глицерина)
6,0% Глицерин AB
Глицерин в жидкости для сбора
2,4%
40 мл(30 млн)
3%
15 минут
Нет
4,5% Глицерин AB
1. Эякуляты получали от 8 быков.
2. Проверяли качество эякулята, стандартизировали и окрашивали в соответствии с методиками, описанными в примере 1.
3. Контроль - Проточную жидкость (0,0% глицерина) применяли на устройстве для сортировке A для быков 1-4, и на устройстве для сортировки В для быков 5-8.
1 пробирку для сбора объемом не более 20 мл (или 15 млн) для одного быка подвергали массовой сортировке в Tris A (0,0% глицерин, без АКГ).
Пробирки помещали в холодное помещение на 90 минут. Среду для замораживания (12% об./об. глицерина) добавляли после охлаждения.
4. Обработка - проточную жидкость, содержащую 3,0% глицерина и 0,0875 мг/мл АКГ, применяли на устройстве для сортировки В для быков 1-4, и на устройстве для сортировки A для быков 5-8.
1 пробирку для сбора объемом не более 40 мл (или 30 млн) для одного быка подвергали массовой сортировке в жидкости для захвата, содержащей 2,4% об./об. глицерина.
Пробирку помещали в холодное помещение на 15 минут.
5. Все пробирки центрифугировали, и осуществляли декантацию.
6. В контрольные пробирки и пробирки обработки соответственно добавляли:
AB, содержащую 6,0% глицерина, в контрольные пробирки
AB, содержащую 4,5% глицерина в пробирки обработки
7. Сперму выдерживали в АВ в течение 12 часов (в течение ночи), и затем замораживали.
8. Определяли подвижность, визуально и IVOS, жизнеспособность (PI) и PIA (PNA) через 0 и 3 ч. Сходимость рассчитывали для каждого параметра.
Результаты для примера 13 представлены на фиг. 36.
Пример 14
Пример 14 демонстрирует, что эритрит до 400 мМ можно применять в свежем бычьем разбавителе с хорошей поддержкой подвижности бычьей спермы в течение 4-дневного периода. Это осуществимо с «обычной» (несортированной) спермой, окрашенной Хехст 33342 (для облегчения CASA с применением флуоресценции).
Свежий разбавитель представлял собой среду, подобную капрогену, которая содержит 5% (об./об.) яичного желтка, и которую барботируют газообразным азотом перед разбавлением спермы.
Капроген с глицерином является одной из сред, сравниваемых в этом примере, и состоит из следующих компонентов:
Трехосновный дигидрат цитрата натрия, 20,0 граммов, моногидрат лимонной кислоты, 0,25 граммов, глицин, 10,0 граммов, D-(+)-глюкоза, 3,0 граммов, безводный двухосновный фосфат калия, 0,609 граммов, н-гексановая кислота (капроновая кислота), 0,231 мл, цианокобаламин, 0,250 граммов, динатрия дигидрат альфакетоглутарата, 0,35 граммов, дигидрат трегалозы, 0,750 граммов, глицерин, 10,0 мл, сульфат стрептомицина, 0,150 граммов, гентамицин, 0,500 граммов, тилозин, 0,100 граммов, линкомицин, 0,300 граммов, спектиномицин, 0,500 граммов, куриный яичный желток, 5,0 мл.
Капроген с добавлением эритрита представляет собой другую среду, сравниваемую в данном примере, и состоит из следующих компонентов:
Трехосновный дигидрат цитрата натрия, 20,0 граммов, моногидрат лимонной кислоты, 0,225 граммов, глицин, 8,653 граммов, D-(+)-глюкоза, 2,50 граммов, безводный двухосновный фосфат калия, 0,609 граммов, натриевая соль н-гексановой кислоты (капроновая кислота) 0,276 граммов, цианокобаламин, 0,250 граммов, динатрия дигидрат альфакетоглутарата, дигидрат трегалозы, 0,750 граммов, 0,35 граммов, эритрит, 14,64 граммов, сульфат стрептомицина, 0,150 граммов, гентамицин, 0,500 граммов, тилозин, 0,100 граммов, линкомицин, 0,300 граммов, спектиномицин, 0,500 граммов, куриный яичный желток, 5,0 мл.
В капрогене с добавлением глицерина концентрация глицина составляет 135 ммоль, и концентрация глицерина составляет 135 ммоль. Контрольную среду 1 готовили с теми же концентрациями, в то время как баланс тестируемой среды (среда 2-7) выполняли со следующими концентрациями, как показано в таблице 13:
Таблица 13
Концентрация добавленных компонентов среды
Глицерин
Глицин
Эритрит
Среда
мМоль
мМоль
мМоль
1
135
135
0
2
0
135
0
3
0
135
35
4
0
135
65
5
0
135
135
6
0
135
270
7
0
135
400
3
Свежие бычьи эякуляты от 5 быков разводили до 160 миллионов спермы на мл в окрашивающем TALP в сочетании с ДНК-красителем Хехст 33342, инкубировали 60 минут при 34°C (в качестве стандартного окрашивания для сортировки спермы XY). После окрашивания сперму в TALP разводили в соответствующей среде до новой концентрации 15 миллионов спермы на мл и помещали в 0,25 смпробирки, герметично закрывали и держали в горизонтальном положении при 18°C в течение 4 дней. Каждый день одну пробирку со спермой нагревали в течение 15 минут при 34°С, и содержимое в количестве примерно 200 микролитров из пробирки объединяли со 100 микролитрами свежей среды, идентичной указанной тестовой среде, применяемой для хранения спермы. Сперму анализировали на флуоресцентной CASA (Hamilton Thome IVOS II) с применением УФ-освещения. Средняя общая и прогрессивная подвижность для 5 быков обобщена в таблице 14 и на фиг. 37.
Таблица 14
Номер среды
Дни хранения
1
2
3
4
Общаяподвиж-ность
Прогрес-сивнаяподвиж-ность
Общаяподвиж-ность
Прогрес-сивнаяподвиж-ность
Общаяподвиж-ность
Прогрес-сивнаяподвиж-ность
Общаяподвиж-ность
Прогрес-сивнаяподвиж-ность
1
89%
75%
66%
47%
62%
47%
37%
25%
2
74%
68%
68%
53%
56%
45%
46%
37%
3
73%
65%
65%
57%
59%
48%
42%
31%
4
73%
65%
69%
55%
52%
41%
33%
26%
5
68%
61%
73%
56%
45%
38%
38%
27%
6
78%
70%
63%
52%
50%
42%
43%
29%
7
69%
57%
65%
44%
44%
29%
53%
34%
Этот тест показывает, что 135 мМ глицерин благотворно влияет на поддержание подвижности спермы в течение не более 4 дней, и что замена глицерина на эритрит в свежей среде с капрогеном обеспечивает аналогичную поддержку подвижности спермы, при этом благотворное влияние эритрита проявляется в периоде более 4-дней.
Пример 15
Пример 15 демонстрирует, что для увеличения продолжительности хранения отсортированной бычьей спермы до девяти дней при 17°C, глицерин в стандартной рецептуре капрогена может быть полностью заменен эритритом, чтобы обеспечить более длительное время хранения спермы при сравнении визуально и подвижности CASA. Стандартный капроген (с глицерином) называется «CaproGLY», а капроген, содержащий эритрит - «CaproERY».
Приготовление среды в объеме 100 мл: 95 мл соответствующего рабочего раствора среды смешивали с 5 мл яичного желтка, перемешивали в течение 15 минут, выдерживали в течение ночи при 4°С, центрифугировали в течение 60 минут при 1200 G в 50 мл пробирках Falcon (осветляли). В день применения газообразный азот барботировали через осветленную среду в течение 15 минут. В таблице 15 показаны свойства 2 сред.
Таблица 15.
pH
мОсм
мМ глицин
мМ глицерин
мМ эритрит
CaproGLY
7,01
512
133
133
CaproERY
7,03
482
120
120
Сортировку спермы следует проводить в двух свежих разбавителях: свежие эякуляты от 3 быков джерсейской породы подвергали массовой сортировке в соответствии со стандартными запатентованными способами сортировки по полу, раскрытыми в других патентах. Вкратце, сперму промывали, концентрировали и ресуспендировали в Hepes, буферизованном цитратом TRIS разбавителе, для нормализации концентрации до примерно 1200 спермы на мл, и pH примерно 7,15. Каждый 1 мл окрашивания содержит: 0,150 мл раствора спермы (примерно 160 миллионов спермы), 64 наномоль Хехст 33342 в 8 микролитрах, 592 мл окрашивающего TALP и 100 наномоль пищевого красителя FD&C. Образец инкубировали в пробирке для образцов объемом 4 мл при 34°C в течение 60 минут, после чего добавляли 0,25 мл 8% (об./об.) TALP с яичным желтком, который разбавил сперму до примерно 120 миллионов на мл и обеспечил конечную концентрацию яичного желтка, составляющую 2% для образца, подлежащего сортировке.
3
Свежеокрашенную сперму подвергают массовой сортировке с частотой событий примерно 40000 в секунду, где массовая сортировка означает сбор склонной к выживанию спермы, содержащей как X, так и Y-хромосомы, ясно, что отсортированная сперма эквивалентна по качеству стандартной отсортированной сперме, но не обогащенной по полу. 80 миллионов спермы от каждого из 3 быков джерсейской породы сортировали в жидкости для захвата с TRIS A, охлаждали в течение минимум 90 минут в холодном шкафу (обычная температура 4-7°C), смешивали в равных объемах с раствором TRIS В, не содержащим желток, концентрировали центрифугированием и извлечением осадка спермы и определением конечной концентрации (концентрированной спермы) в диапазоне 100-115 миллионов спермы на мл. Затем 3 объема CaproGLY и CaproERY объединяли с 1 объемом концентрированной спермы до конечной получаемой концентрации примерно 20-24 миллионов на мл (примерно 5,0-5,5 миллионов спермы на 0,25 см пробирку).
3
Приготовленную сперму заполняли в пробирки объемом 0,25 см, герметично закрывали и хранили в горизонтальном положении при 17°С в течение не более девяти дней. В указанные дни испытаний пробирку открывают и зрительно проверяют на подвижность (подсчитывают с помощью глаз специалиста с применением анализа под микроскопом на стадии нагревания), общую подвижность CASA и прогрессивную подвижность CASA с применением системы Hamilton Thome IVOS. В дополнение к пробирке, по 0,5 мл каждого из шести образцов хранили в пробирке для образцов объемом 4 мл при 17°C, для сравнения на восьмой день.
В таблице 16 приведены средние подвижности для трех быков джерсейской породы в разные дни.
Таблица 16
Обработка
День
Хранение
Визуальная подвижность
Общая подвижность CASA
Прог. подвижность CASA
CASA прог/общ
CaproERY
1
Пробирка
68%
76%
55%
72%
CaproGLY
1
Пробирка
68%
73%
53%
73%
CaproERY
2
Пробирка
61%
66%
51%
77%
CaproGLY
2
Пробирка
58%
61%
44%
72%
CaproERY
3
Пробирка
71%
73%
48%
65%
CaproGLY
3
Пробирка
68%
64%
45%
69%
CaproERY
4
Пробирка
67%
68%
48%
71%
CaproGLY
4
Пробирка
51%
51%
35%
68%
CaproERY
7
Пробирка
63%
59%
45%
76%
CaproGLY
7
Пробирка
33%
39%
29%
74%
CaproERY
8
Пробирка
55%
52%
35%
68%
CaproGLY
8
Пробирка
23%
16%
4%
28%
CaproERY
8
Пробирка
65%
61%
55%
89%
CaproGLY
8
Пробирка
31%
30%
11%
38%
CaproERY
9
Пробирка
47%
42%
34%
81%
CaproGLY
9
Пробирка
20%
9%
2%
23%
Приведенные выше результаты показывают, что при соблюдении принципа равной молярности глицина и сопутствующего полиола (глицерина или эритрита) полное замещение глицерина эритритом обеспечивает сопоставимый с капрогеном разбавитель свежей семенной жидкости, который является таким же хорошим или лучшим, чем приготовленный с глицерином. Если время хранения превышает 4 дня, эритрит лучше сохраняет качество, что проявляется в подвижности. Также оказалось, что хранение в пробирках может быть лучше, чем в пробирках для искусственного оплодотворения.
Пример 16
Пример 16 демонстрирует, что отсортированная по полу сперма, хранящаяся в среде капроген с применением эритрита вместо глицерина, способна обеспечить ряд беременностей, аналогично стандартному капрогену.
Чтобы предварительно оценить возможные результаты фертильности с применением CaproERY в качестве замены в условиях, в которых CaproGLY демонстрировал хороший эффект, небольшое количество (примерно 145) телок оплодотворяли в четырех периодах времени, и по сравнению с данными от тех же быков на тех же фермах с применением отсортированной по полу спермы, хранящейся в CaproGLY. Как правило, телок оплодотворяли свежей разведенной семенной жидкостью в течение 1-2 дней со дня сортировки и получения состава.
В таблице 17 ниже приведены результаты для исследования CaproERY в полевых условиях.
Общее количество оплодотворяемых телок
Всего беременных
Процент беременности
CaproGLY
277
159
57,4%
CaproERY
145
77
53,1%
В этом полевом исследовании не применяли раздельную обработку, для каждой обработки не было равномерно распределенного количества трубок, и оно не было равномерно распределено между быками и фермами. Соответственно, относительные номинальные значения (57,4% против 53,1%) статистически не отличаются. Оба значения находятся в пределах стандартного диапазона, наблюдаемого для CaproGLY в течение 40-месячного периода времени, и, соответственно, CaproERY обеспечивает одинаковую фертильность.
Пример 17
Пример 17 демонстрирует, что эритрит можно применять (с глицином или без него) в проточной жидкости для сортировки спермы или в разбавителях для замораживания в концентрациях от 15 до 110 мМоль, и он аналогичен или лучше стандартной контрольной среды, не содержащей эритрит.
В стандартной сортировке бычьей спермы применяли проточную жидкость, содержащую 68 мМ фруктозы, 80 мМ цитрат и 243 мМ TRIS при рН 6,80 и осмолярности 290-300 мОсм. (Контрольная проточная жидкость). Объединение 80 объемов такой контрольной проточной жидкости с 20 объемами свежего яичного желтка с последующим осветлением приводит к получению КОНТРОЛЬНОГО охлаждающего раствора под названием TRIS A («Фракция А»). Объединение 88 объемов TRIS A с 12 объемами чистого глицерина приводит к получению раствора, который называется TRIS В («Фракция B»). В случае стандартной сортировки спермы «Фракция B» необязательно может не содержать яичного желтка и может называться «Фракция В, не содержащая яиц», все еще содержащая 12 объемов чистого глицерина.
В таблице 18 показаны миллимолярные концентрации компонентов, применяемых в этом тесте, где контрольная среда не содержит глицин или эритрит, а тестовые образцы содержат различные количества эритрита и в некоторых случаях глицина. PH всех сред составлял 6,70-6,75, а осмолярность составляла 290-305 мОсм.
Таблица 18
Визуально подвижность
Концентрации в мМ при замораживании
0 ч
3 ч
Эритрит
Глицин
Фруктоза
Цитрат
TRIS
Контроль
36%
27%
0
0
54
64
194
A
42%
34%
51
50
30
35
106
В
40%
24%
108
0
30
36
109
С
42%
31%
53
46
30
35
105
D
42%
36%
35
34
30
43
130
E
54%
35%
25
0
51
45
138
F
37%
31%
14
14
30
63
190
G
41%
40%
25
0
30
61
186
Визуально подвижность
Концентрация (мМ) в проточной жидкости
0 ч
3 ч
Эритрит
Глицин
Фруктоза
Цитрат
TRIS
Контроль
35%
23%
0
0
68
80
243
H
35%
28%
62
0
61
33
102
I
47%
28%
35
35
8
75
235
J
47%
37%
65
0
8
72
223
Те же два быка применяли для каждого из двух испытаний, и качество после оттаивания определяли в то же время. Первый тест проводили с неокрашенной несортированной спермой аналогично стандартному «обычному замораживанию». Второй тест проводили с применением разных проточных жидкостей для сортировки спермы.
3
В первом тесте сравнивали контроль (стандартную среду) с 7 альтернативными средами (A-G) с композициями, включающими различные количества эритрита и в некоторых случаях глицин. 10 миллилитров спермы каждого быка в концентрации 100 миллионов спермы на миллилитр охлаждали в стандартной TRIS A (контрольная среда) в течение 90 минут от комнатной температуры до примерно 4-6°C. Затем образцы разделяли на аликвоты по 1 миллилитру, и добавляли 0,5 мл холодной среды TEST-B, выдерживали в течение 15 минут перед добавлением дополнительных 0,5 мл среды TEST-B. Это привело к получению конечной концентрации спермы 50 миллионов на мл. Эти образцы загружали в пробирки для криоконсервации объемом 0,25 см и замораживали способом контролируемого отложения инея, который обычно применяют для замораживания обычной семенной жидкости.
Концентрации глицерина в среде TEST-B всегда составляли 6,0% (об./об.), что приводило к получению конечных концентраций глицерина 3,0% (об./об.). Все среды TEST-B содержали 0% яичного желтка, что приводило к получению конечной концентрации яичного желтка 10% (об./об.). Концентрации химических компонентов в момент замораживания показаны в таблице (КОНТРОЛЬ против A-G). В этих условиях сперму охлаждали в стандартном количестве яичного желтка (20%), криоконсервируя их в 1/2 от стандартного количества яичного желтка и глицерина. Результаты визуальной оценки подвижности показывают, что в таких условиях контроля все 7 сред, содержащих эритрит, поддерживали криоконсервацию также или лучше, чем контроль без какого-либо количества эритрита. Результаты показывают, что при замораживании бычьей спермы можно применять не более примерно 110 мМ эритрита, при этом оптимальные результаты замораживания достигали при применении 15-50 мМ эритрита.
3
Во втором тесте сравнивали контрольную (стандартную) проточную жидкость с тремя альтернативными проточными жидкостями (H-J). Составы всех проточных жидкостей приведены в таблице. После сортировки все образцы обрабатывали идентично стандартной сортировке спермы. Объем 3,5 мл жидкости для захвата (TRIS A) помещали в каждую пробирку для сбора, а отсортированную сперму сортировали в пробирку для сбора с объемом 20 мл. Затем этот объем жидкости охлаждали в течение 90 минут до примерно 4-6°C, затем добавляли равный объем холодной фракции В, не содержащей яиц. Клетки спермы концентрировали центрифугированием и удалением супернатанта и ресуспендировали во фракции TRIS AB, содержащей яичный желток, приготовленной путем смешивания равных объемов фракции A и фракции В. Клетки готовили при 18 млн на мл и замораживали в пробирках объемом 0,25 см способом контролируемого отложения инея, который обычно применяют для замораживания обычной семенной жидкости (такой же, как указано выше).
Результаты показывают, что в проточной жидкости может присутствовать до 60 мМ эритрита, что может быть полезным для качества спермы в стандартном способе обработки спермы после сортировки.
Как можно легко понять из вышеизложенного, основные концепции настоящего изобретения могут быть реализованы различными способами. Настоящее изобретение включает многочисленные и разнообразные варианты реализации обработки спермы, включая, но не ограничиваясь этим, наилучший вариант реализации изобретения.
Таким образом, конкретные варианты реализации или элементы изобретения, раскрытые в описании или изображенные на фигурах или в таблицах, сопровождающих эту заявку, не предназначены для ограничения, но должны расцениваться скорее как наглядные примеры многочисленных и разнообразных вариантов реализации, в общем входящих в объем изобретения, или эквивалентов, входящих в объем применительно к любому конкретному элементу изобретения. Кроме того, определенное описание одного варианта реализации или элемент изобретения не могут в явной форме описывать все возможные варианты реализации или элементы; многие альтернативы в неявном виде раскрыты в описании и на фигурах.
Следует понимать, что каждый элемент аппарата или каждая стадия способа могут быть описаны термином "аппарат" или термином "способ". Такие термины могут быть заменены при желании для конкретизации широкого охвата, выраженного неявным образом, право на который предоставлено данному изобретению. В качестве одного примера, следует понимать, что все стадии способа могут быть описаны как действие, средства для выполнения этого действия или как элемент, выполняющий это действие. Аналогичным образом, каждый элемент аппарата может быть описан как физический элемент или действие, которому способствует этот физический элемент. В качестве одного примера, следует понимать, что описание "устройства для сортировки" включает в себя описание действия "сортировки" - оговоренного явным образом или неявным - и, напротив, при наличии фактического описания действия "сортировки", такое описание следует понимать как включающее в себя описание "устройства для сортировки" и даже "средств сортировки". Следует понимать, что такие альтернативные термины для каждого элемента или стадии явным образом включены в описание.
Кроме того, применительно к использованию каждого термина следует понимать, что, если только его применение в данной заявке не противоречит такому толкованию, общепринятые словарные определения следует понимать как включенные в описание для каждого термина, в значении, указанном во втором издании словаря "Random House Webster's Unabridged Dictionary", при этом каждое определение настоящим включено в данную заявку посредством ссылки.
Более того, для целей настоящего изобретения, артикли неопределенной формы перед объектом относятся к единственному или множественному числу этого объекта. Таким образом, артикли неопределенной формы, фразы "один или более" и "по меньшей мере один" можно применять взаимозаменяемо в настоящем документе.
Подразумевается, что все числовые величины модифицированы термином "примерно", независимо от того, указано ли это в явной форме или нет. Для осуществления задач настоящего изобретения диапазоны могут быть выражены как составляющие от "примерно" одной конкретной величины до "примерно" другой конкретной величины. Когда выражен такой диапазон, другой вариант реализации включает от одной конкретной величины до другой конкретной величины. Перечисление числовых диапазонов посредством конечных величин включает все числовые величины, находящиеся в пределах этого диапазона. Числовой диапазон от одного до пяти включает в себя, например, числовые величины 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5 и так далее. Также следует понимать, что конечные величины каждого диапазона являются значимыми как в отношении другой конечной величины, так и независимо от другой конечной величины. Когда величина выражена в виде приближенного значения путем применения предшествующего слова "примерно", следует понимать, что конкретная величина образует другой вариант реализации.
Раздел "Уровень техники" данной патентной заявки предоставляет изложение области техники, к которой относится изобретение. Этот раздел также может включать или содержать пересказ определенных патентов США, патентных заявок, публикаций или предмета заявленного изобретения, полезных применительно к информации, задачам или проблемам, относящимся к состоянию технологии, к которой относится изобретение. Не предполагается, что любой патент США, патентная заявка, публикация, утверждение или другая информация, процитированная или содержащаяся в данном документе, должны быть интерпретированы, истолкованы или восприняты как известный уровень техники по отношению к изобретению.
Формула изобретения, изложенная в настоящей заявке, тем самым включена в настоящее описание посредством ссылки, и заявитель в явно выраженной форме оставляет за собой право полностью или частично применять это включенное содержание такой формулы изобретения в качестве дополнительного описания для поддержки любого пункта или всех пунктов формулы изобретения или любого из ее элементов или компонентов, и заявитель также в явно выраженной форме оставляет за собой право перемещать любую часть содержания или все включенное содержание такой формулы изобретения или любой его элемент или компонент из описания в формулу изобретения или наоборот, при необходимости для определения объекта, для которого испрашивается защита посредством данной заявки или посредством любой последующей заявки или продолжающей заявки, выделенной заявки или частично продолжающей заявки, или для получения любого преимущества, уменьшения выплат на ее основании, или для соответствия патентному законодательству, правилам или нормативным положениям любой страны или любого договора, и такое содержание, включенное посредством ссылки, должно сохраняться на протяжении всего рассмотрения этой заявки, включая любую последующую продолжающую заявку, выделенную заявку или частично продолжающую заявку или любую заявку на переиздание патента или расширение объема притязаний.