СПОСОБ УНИЧТОЖЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ И УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
METHOD FOR ELIMINATION OF PATHOGENIC AND OPPORTUNISTIC MICROORGANISMS

Изобретение относится к области фотодинамической терапии, в частности к применению фотодинамической терапии при селективном уничтожении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (бактерий и грибковых организмов).
В настоящее время рассматривается возможность применения фотодинамической терапии (ФДТ) при инфекционных и неонкологических заболеваниях. Проблема инфекционных заболеваний остается одной из главных во многих областях медицины. Сегодня наиболее агрессивными и устойчивыми к антибактериальным препаратам являются широко распространенные патогены, такие как Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Helicobacter pylori, Mycobacterium tuberculosis. Устойчивость данных возбудителей инфекционных заболеваний к антибиотикам и необходимость проведения системного лечения создают множество вторичных проблем. По-прежнему ведутся поиски антимикробного средства, целевым образом доставляемого в очаг поражения и взаимодействующего только с возбудителем инфекционного заболевания, но не с тканями и клетками организма-хозяина. В данном контексте таким средством представляется ФДТ.
Известно более 400 веществ, обладающих свойствами фотосенсибилизаторов, среди которых производные хлоринов, анилинов, бензопорфиринов, нафтало- и фталоцианинов. Анилиновые красители - органические соединения, образующиеся при окислении анилина или его солей; широко используются в гистологической технике, в высоких концентрациях обладают бактерицидным действием.
В патенте на изобретение РФ №2345753, МПК A61N 1/06 для лечения угревой сыпи в качестве антисептической маски применяют композицию, содержащую 5%-ную синтомициновую эмульсию, серу, левомицетин, норсульфазол и/или стрептоцид, кислоту салициловую, кислоту бензойную, кислоту борную, кислоту лимонную, бриллиантовый зеленый.
Бриллиантовый зеленый относится к группе анилиновых красителей; максимум поглощения 440 и 650 нм. Является высокоактивным и быстродействующим антисептиком, особенно в отношении грамположительных бактерий. В основе бактерицидного действия лежит выраженное сродство с фосфорнокислыми группами нуклеопротеидов, входящими в состав генома микроорганизмов (Селиванов Е.В. Красители в биологии и медицине: Справочник. - Барнаул: Азбука, 2003. - 40 с.).
У метода имеется ряд существенных недостатков. Во-первых, для достижения результата метод предполагает обработку кожи больного в три этапа, во-вторых, препараты для лечения угревой сыпи содержат множество компонентов различного спектра действия.
В патенте РФ №2235568, МПК A61N 5/067 описан способ лечения хронического тонзиллита с помощью 0,01-0,1% водного раствора метиленового синего или хлорофиллипта и оптического излучения с длинами волн от 625 до 700 нм и от 840 до 1270 нм. Для достижения выраженного терапевтического эффекта в данном способе предложено проводить процедуры по фотовоздействию в течение 10-15 дней, что не всегда целесообразно.
Способ обладает недостатком, указанным ранее, - используемые высокие концентрации метиленового синего способны причинить вред нормальной микрофлоре и собственным клеткам организма, особенно в сочетании с оптическим излучением.
Метиленовый синий представляет собой органический основной тиазиновый краситель. В медицине используется в качестве антисептика или антидота при отравлении цианидами, угарным газом и сероводородом. Метиленовый синий применяют в дерматологии для обработки ран и при гнойно-воспалительных заболеваниях, в урологии для промываний при воспалении мочевого пузыря. Метиленовый синий обладает большим окислительно-восстановительным потенциалом; максимум поглощения составляет 600-670 нм (Селиванов Е.В. Красители в биологии и медицине: Справочник. - Барнаул: Азбука, 2003. - 40 с.).
Альтернативой или дополнением к существующим фотосенсибилизаторам могут стать наночастицы различной природы и структуры.
32
36
9
9
2
2
5
3
3
4
2
В патенте РФ №2176505, МПК А61Р 31/12 предложено водорастворимое противовирусное и антибактериальное лекарственное средство широкого спектра действия на основе комплекса препаратов ионного серебра и ионного золота с тиазиновым красителем (метиленовый синий) при следующем мольном соотношении: N,N'-тетраметилтиазин:Ag:Au=2:1:1, отвечающим составу: CHNOSClAgAu. Синтез препарата был осуществлен следующим образом: при мольном соотношении реагентов N,N'-тетраметилтиазина нитрат:Ag:Au:CHOH=2:1:1:1 в воде растворяли метиленовый синий (N,N'-тетраметилтиазина хлорид), который переводился в нитратную форму добавлением раствора нитрата серебра (AgNO). Затем осадок AgCl фильтровали, и к полученному раствору нитрата метиленового синего вновь добавляли раствор нитрата серебра, затем препарат ионного золота (AuCl или HAuCl·3НО) и этиловый спирт, нагрев проводили до температуры 80-95°С, с последующим направлением реакционной массы, содержащей 10-20 вес.% твердых реагентов на распылительную сушилку или вакуумный ротационный испаритель.
Однако получение данного лекарственного вещества представляет определенные технические трудности, также не обсуждается возможность применения данного средства при фотодинамической терапии.
Наиболее близким к предлагаемому решению является способ фотодинамической терапии гаймороэтмоидита, согласно которому в верхнечелюстную пазуху вводят 10 мл раствора фотосенсибилизатора, раствора метиленового синего в разведении 0,5 мкмоль/л. После чего вводят в пазуху световод, соединенный с лазерным аппаратом. Спустя 10 мин после введения раствора фотосенсибилизатора в пазуху, не удаляя его, облучают слизистую оболочку верхнечелюстной пазухи и клеток решетчатого лабиринта длиной волны 0,67 мкм, мощностью 20 мВт в течение 10 мин. Способ позволяет сократить время сеанса лечения за счет применения минимальной концентрации фотосенсибилизатора метиленового синего, достигнув при этом максимального антибактериального эффекта фотодинамической терапии (см. патент на изобретение РФ №2317121, МПК A61N 5/067).
Недостатком данного способа является то, что используемая концентрация метиленового синего была достаточно высока и способна не только уничтожить патогенные бактерии, но и негативно повлиять на нормальный микробный состав кожи и полости рта пациента.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа для эффективной и селективной инактивации патогенных и условно-патогенных микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных.
Технический результат заключается в отсутствии негативного влияния на нормальную микрофлору и собственные клетки организма за счет применения композиции, содержащей наночастицы диоксида титана, метиленовый синий или/и бриллиантовый зеленый, в сочетании с оптическим излучением.
Поставленная задача решается тем, что в способе уничтожения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов одновременно обрабатывают область, содержащую микроорганизмы, композицией фотосенсибилизатора и фотокатализатора, выдерживают в течение периода времени, необходимого для эффективного связывания композиции с клетками микроорганизмов; затем воздействуют на указанную область оптическим излучением с длинами волн, соответствующими максимуму поглощения фотосенсибилизатора и фотокатализатора и плотностью мощности для активации композиции, при этом в качестве фотосенсибилизатора используют метиленовый синий и/или бриллиантовый зеленый, а в качестве фотокатализатора используют наночастицы диоксида титана.
2
Воздействие осуществляют широкополосным светом, лазерным или светодиодным оптическим излучением. Длины волн излучения выбирают в диапазоне от 390 до 440 нм и от 600 до 670 нм. Плотность мощности излучения выбирают в диапазоне от 15 до 50 мВт/см. Длительность облучения составляет от 1 до 30 мин. Оптимальной является концентрация метиленового синего от 0,0025 до 0,0001%, бриллиантового зеленого составляет от 0,000125 до 0,00001%. Концентрация наночастиц диоксида титана составляет от 0,1 до 0,01%. Период времени, необходимый для эффективного связывания композиции с клетками микроорганизмов, составляет от 10 до 20 мин.
Изобретение поясняется чертежами:
фиг.1 иллюстрирует влияние светодиодного излучения (405; 625 нм) на микроорганизмы: а) Р. acnes б) S. epidermidis метициллин-чувствительный штамм; в) S. epidermidis метициллин-устойчивый штамм;
фиг.2 отражает влияние светодиодного излучения (405; 625 нм) на микроорганизмы S. aureus;
фиг.3 показывает изменение численности микроорганизмов под действием широкополосного света: a) Micrococcus halobius; 6) Staphylococcus lugdunensis.
2
Способ осуществляется следующим образом. Композицию, содержащую наночастицы диоксида титана (концентрация от 0,1 до 0,01%), метиленовый синий (концентрация от 0,0025 до 0,0001%) или/и бриллиантовый зеленый (концентрация от 0,00001 до 0,000125%), вводят в область, содержащую патогенные или условно-патогенные микроорганизмы. Выжидают достаточное количество времени (10-20 мин), чтобы композиция веществ успела связаться с клетками микроорганизмов. Затем проводят облучение указанной области широкополосным светом, лазерным или светодиодным излучением с длинами волн одновременно из двух диапазонов: 390-440 нм и 600-670 нм, плотностью мощности от 15 до 50 мВт/см в течение 1-30 мин.
Способ был опробован в условиях in vitro. Для создания асептических условий иммунологический полистирольный 96-луночный планшет помещают в стеклянный или пластиковый корпус. Источник излучения располагают над ячейками планшета. При постановке опытов используют суточную культуру исследуемого штамма. Из разведения микроорганизмов 10000 мк/мл 0,1 мл взвеси вносят в 0,9 мл раствора фотосенсибилизатора, инкубируют в течение 10-20 мин без доступа света. Из конечного разведения, а также из раствора фотосенсибилизатора бактериальную взвесь в объеме 0,2 мл вносят в ячейки планшета. Воздействие излучения проводят на бактериальные клетки во взвеси, находящейся в соответствующих ячейках, последовательно увеличивая время облучения. После воздействия взвеси бактерий переносят на чашки Петри с плотной питательной средой и равномерно распределяют по поверхности стерильным шпателем. Учет результатов проводят путем подсчета числа колониеобразующих единиц (КОЕ) через 24-72 часа после анаэробной инкубации при 37°С. Контролем служат взвеси бактерий, не обработанные сенсибилизатором и не подвергнутые облучению.
Настоящее изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами, но ими не ограничивается.
Примеры 1. Чувствительность микроорганизмов к действию излучения после обработки различными концентрациями фотосенсибилизаторов.
2
2
2
2
В качестве объекта исследования использовали патогенные (Propionibacterium acnes), условно-патогенные (Staphylococcus aureus, S. epidermidis) микроорганизмы и бактерии из состава нормальной микрофлоры кожи (S. lugdunensis, S. hominis, Micrococcus halobius). В качестве фотосенсибилизатора использовали водные растворы метиленового синего с концентрациями 0,0025; 0,0001; 0,00025%. Фотокатализатором служила суспензия наночастиц диоксида титана (TiO) в концентрации 0,1; 0,02; 0,01%. При работе с метиленовым синим использовали светодиодный источник красного излучения λ=660±10 нм, плотность мощности излучения 40 мВт/см. При работе с наночастицами TiO использовали светодиодный источник синего излучения λ=405±20 нм, плотность мощности излучения 31,5 мВт/см. Облучение бактериальных взвесей проводили в течение 15 мин.
Результаты испытаний сведены в табл.1.
Таблица 1
Действие излучения на число КОЕ бактерий, %
Вид бактерий
Контроль (физ. p-p)
Метиленовый синий, %
Наночастицы TiO<sub>2</sub>, %
0,0025
0,0001
0,00025
0,1
0,02
0,01
Р. acnes
97.56±2.32
35.54±4.23
73.33±3.30
90.85±4.15
48.22±4.22
42.14±2.96
67.61±3.13
S. aureus
97.88±2.12
37.40±2.14
75.95±2.28
81.57±2.75
72.03±3.12
75.70±0.17
93.55±2.49
S. epidermidis
96.72±3.21
42.91±2.84
56.36±2.96
80.62±3.41
65.71±3.21
80.09±3.12
87.43±2.37
S. hominis
97.26±2,86
78.75±3.14
75.45±4.10
95.26±3.84
25.72±3.92
73.45±3.10
71.41±2.42
S. lugdunensis
97.78±2.22
66.58±3.73
62.83±4.16
94.78±2.32
31.24±2.81
62.38±4.61
45.93±2.48
Micrococcus halobius
97.83±0.17
68.79±0.16
64.47±0.19
98.83±0.11
26.20±0.15
59.27±2.39
66.62±0.15
Используемые концентрации метиленового синего и диоксида титана повышают чувствительность микроорганизмов к действию светодиодного излучения.
Примеры 2. Фотодинамическая инактивация микроорганизмов, возбудителей угревой сыпи, сенсибилизированных метиленовым синим и наночастицами диоксида титана.
2
2
Модельным патогенным микроорганизмом выбран вид Propionibacterium acnes, который является возбудителем угревой сыпи человека. Микроорганизмы выращивали в анаэробных условиях в специальном контейнере с газовой смесью CO:N=9:1 при температуре 37°С на тиогликолиевой среде. В качестве представителя условно-патогенной флоры, сопутствующей акне, использовали вид Staphylococcus epidermidis (метициллин-чувствительный и метициллин-устойчивый штаммы).
2
2
2
Использован источник красного излучения с максимумом спектра испускания 625±15 нм и плотностью мощности примерно 33 мВт/см, источник синего излучения с максимумом спектра испускания 405±20 нм и плотностью мощности примерно 31,5 мВт/см. В качестве фотосенсибилизатора выбран 0,0025% водный раствор метиленового синего. Фотокатализатором служила суспензия наночастиц диоксида титана (TiO) в концентрации 0,02%. Результаты экспериментов показаны на фиг.1. Фотодинамическое воздействие с использованием комбинации метиленового синего и наночастиц диоксида титана демонстрирует выраженный угнетающий эффект на рост бактериальных клеток.
Примеры 3. Фотодинамическое воздействие на стафилококки, сенсибилизированные бриллиантовым зеленым и наночастицами диоксида титана.
В третьей группе примеров в качестве модельных микроорганизмов использованы различные виды стафилококков: S. aureus (патогенный), S. epidermidis (условно-патогенный) и S. hominis (сапрофитный). Была проверена чувствительность данных микроорганизмов к действию различных концентраций бриллиантового зеленого (0,000125; 0,00007; 0,00001%) по изменению числа КОЕ (табл.2).
Таблица 2
Действие различных концентраций красителя бриллиантового зеленого на число КОЕ стафилококков, %
Вид бактерий
Контроль (физ. р-р)
Бриллиантовый зеленый, %
0,000125
0,00007
0,00001
S. aureus
98.56±2.24
48.24±4.72
82.14±2.96
97.61±3.39
S. epidermidis
96.88±3.12
56.03±3.43
85.70±0.17
93.52±2.49
S. hominis
99.72±0.21
45.71±3.21
80.09±3.12
95.55±4.45
Для проведения эксперимента по фотодинамическому воздействию использовали параметры излучения, описанные в примерах 2. В качестве рабочей концентрации бриллиантового зеленого выбирано значение 0,00007%.
Чувствительность микроорганизмов S. aureus к фотодинамическому воздействию с такими параметрами показана на фиг.2. Композиция на основе бриллиантового зеленого и наночастиц диоксида титана проявляет высокие бактерицидные свойства при использовании светодиодного излучения с длинами волн 405±20 и 625±15 нм.
2
Примеры 4. Влияние широкополосного света на микроорганизмы - представители нормальной микрофлоры кожи человека, сенсибилизированные наночастицами TiO.
Объектом исследования служили бактерии видов Micrococcus halobius и Staphylococcus lugdunensis - предствители нормальной микрофлоры кожи человека.
2
В качестве источника света используют галогеновую лампу с диапазоном длин волн от 380 до 800 нм, мощностью 150 Вт. В ходе эксперимента варьировали время облучения от 5 до 15 мин. Используют 0,01% суспензию наночастиц TiO.
Результаты экспериментов представлены на фиг.3. Наночастицы диоксида титана в концентрации 0,01% при использовании широкополосного света не проявляют выраженной антимикробной активности по отношению к таким представителям нормальной микрофлоры кожи как Micrococcus halobius и Staphylococcus lugdunensis.
При действии излучения на фотокатализатор возникают различные активные радикалы (гидроксидный радикал, супероксидный анион, перекись водорода), которые являются токсичными для биологических объектов. В свою очередь, поглощение кванта света фотосенсибилизатором приводит к переходу его молекул в возбужденное триплетное состояние. Молекула фотосенсибилизатора в триплетном состоянии взаимодействует с молекулярным кислородом и переводит его в возбужденное синглетное состояние. Синглетный кислород обладает высокой способностью к окислению биологических молекул.
При одновременном использовании как фотокатализатора, так и фотосенсибилизатора в сочетании с излучением соответствующего спектрального состава, антимикробный эффект обеспечивается множественным токсическим действием вышеупомянутых активных радикалов (гидроксидный радикал, супероксидный анион, перекись водорода, сигнглетный кислород).
Кроме того, авторы полагают, что при одновременном введении фотокатализатора и фотосенсибилизатора в область, содержащую микроорганизмы, эффективность фотодинамического - фотокаталитического воздействия будет увеличиваться за счет синергетического взаимодействия данных фотохимически активных веществ. Наночастицы диоксида титана имеют пористую разветвленную поверхность, способную сорбировать молекулы фотодинамических красителей, тем самым увеличивая эффективность электронного возбуждения при воздействии света и пленение дополнительных электронов для увеличения эффективности фотокаталитического действия. При облучении такой системы «частица-краситель» количество генерируемых радикалов увеличивается. Присутствие системы «частица-краситель» в микроокружении бактериальной клетки или на поверхности клеточной стенки обеспечит ее разрушение в результате активных окислительных процессов.