СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕННОГО ТЕХНЕЦИЕМ-99m НАНОКОЛЛОИДА
METHOD OF PRODUCING TECHNETIUM-99m LABELLED NANOCOLLOID

Изобретение относится к медицине, в частности к способу получения радиоактивных препаратов медицинского назначения, которые могут быть использованы для радионуклидной диагностики, в том числе для проведения лимфосцинтиграфии в онкологии.
99m
99m
99m
В существующей мировой практике наноколлоидные препараты, меченные короткоживущим радионуклидом технецием-99m (Tc), достаточно широко используются для проведения диагностических исследований в онкологии, кардиологии, для обнаружения воспалительных заболеваний опорно-двигательного аппарата, нарушений анатомо-морфологической структуры при опухолях, циррозах, гепатитах и других заболеваниях. К числу таких препаратов, серийно выпускаемых в России, относится Tc-Технефит (OOO «Диамед»), представляющий собой коллоидный раствор на основе фитина (солей инозитгексафосфорной кислоты). Кроме того, разработан способ получения наноколлоида для приготовления радиофармпрепаратов на основе сульфида рения [Патент RU №2315624 С2, 27.01.2008]. Данные о наноколлоидных препаратах с Tc, производимых в Европе, представлены в таблице 1 [Чернов В.И., Афанасьев С.Г., Синилкин А.А. и др. Радионуклидные методы исследования в выявлении «сторожевых» лимфатических узлов // Сибирский онкологический журнал. - 2008. Т.28. - №4. - С.5-10].
99m
В Австралии производится меченный технецием-99m наноколлоидный препарат на основе фторида олова, используемый более 20 лет в клинической практике для маркировки белых клеток крови при диагностике инфекций и воспалений [С.Tsopelas. The radiopharmaceutical chemistry of Tc-tin fluoride colloid-labeled-leukocytes // The quarterly journal of nuclear medicine and molecular imaging. - 2005. Vol.49, P.319-324].
nd
Все приведенные наноколлоидные препараты изготавливаются на основе соединений, образующих устойчивые гидрозоли. При этом решающим фактором успеха является не их химический состав, а размер наночастиц. Известно, например, что оптимальный размер частиц для проведения лимфосцинтиграфии составляет 20-100 нм. Такие частицы выводятся из тканей со скоростью, не позволяющей им проникать в кровяное русло. Частицы с размерами менее 20 нм легко проходят в кровяное русло, что препятствует визуализации лимфоузлов [Sampson С.В. Textbook of Radiopharmacy Theory and Practice. Vol.3, 2 ed. London, United Kingdom: Gordon and Breach; 1994: 196]. Наночастицы с размерами более 200 нм (Hepatocis) могут быть использованы для мечения аутолейкоцитов с целью выявления очагов воспалений в кардиологии.
99m
99m
Большая часть из известных наноколлоидных радиофармпрепаратов представляет собой простые неорганические комплексы Tc с сульфидами рения и сурьмы, получаемые по достаточно сложным технологиям. Например, известен способ получения наноколлоида сульфида сурьмы [Lin Y., Zhang X., Li J. et al. Appl. Radiat. Isot, 58 (2003), 347-352], в соответствии с которым на первой стадии газообразный сероводород барботируют через 100 мл дистиллированной воды, охлажденной до 0°С, с последующим введением в этот раствор 5 мл 3,5% раствора поливинилпирролидона. Затем добавляют 10 мл 1% раствора антимонил-тартрата калия. Для удаления избытка сероводорода через образованный гидрозоль пропускают азот. На второй стадии 10 мл полученного наноколлоида сульфида сурьмы смешивают с предварительно подготовленной смесью, состоящей из 60 мл 0,1 М раствора тиоацетомида с 10 мл 1%-ного раствора антимонил-тартрата калия. Далее смесь нейтрализуют до рН 5-6 раствором 0,1 М HCl, нагревают на водяной бане в течение 6 ч и охлаждают до комнатной температуры. И, наконец, на третьей стадии проводят мечение полученного коллоида технецием-99m. С этой целью во флакон с 1,5 мл наноколлоида сурьмы вводят 0,5 мл элюата Tc, добавляют 0,1 мл 0,1 М раствора HCl и кипятят на водяной бане 30 мин с последующим добавлением в охлажденную смесь 0,5 мл ацетатного буфера до нейтральной реакции.
99m
99m
99m
99m
2
2
Примерно столько же стадий включает способ получения Tc-сульфид рениевого наноколлоида [Tsopelas C.J. Nucl. Med., 42 (2001), 3, 460-466]. Вместе с тем проведенные нами предварительные исследования показали, что устойчивые коллоидные соединения могут быть получены более простым способом - путем проведения адсорбции восстановленного Tc на гамма-оксиде алюминия [Скуридин B.C., Стасюк Е.С., Садкин В.Л., Чибисов Е.В., Рогов А.С., Чикова И.В. Изучение статической и динамической адсорбции технеция-99m на оксиде алюминия // Известия ВУЗов, ж. Физика, - 2010. - т.53. - №10/2, - с.294-300]. При этом величина адсорбции радионуклида на поверхности оксида превышает 93%. Для восстановления Tc (VII), присутствующего в исходном элюате Tc, в работе использовалось олово (II) хлорид дигидрат (SnCl·2HO, далее по тексту Sn (II)). Максимум адсорбции наблюдается при рН среды 4-6.
2
3
99m
99
99m
Основными предпосылками для использования гамма-оксидов AlO в качестве «носителя» метки Tc является его более низкая токсичность, чем у сульфидов, в сочетании с хорошими адсорбционными свойствами, доступностью и низкой стоимостью. Достаточно сказать, что именно на этом сорбенте «держится» все мировое производство Мо/Tc-генераторов для медицины.
99m
99m
2
3
2
3
Способов получения меченного Tc наноколлоида гамма-оксида AlO нами в литературе не обнаружено, что и определило задачу разработки метода получения наноколлоида Tc-AlO, приемлемого по своим размерам для проведения лимфосцинтиграфии и других диагностических исследований, и отвечающего следующим требованиям:
- не менее 80% частиц должны иметь размер в интервале 20-100 нм;
- радиохимическая чистота препарата должна быть не менее 90%.
99m
2
3
В соответствии с этим поставленная задача получения наноколлоида Tc-AlO с заданными размерами решается следующим образом. В способе получения меченного технецием-99m наноколлоида в водную суспензию, приготовленную из наноразмерного порошка гамма-оксида алюминия с диаметром частиц 7-10 нм и концентрацией 0,5-0,7 мг/мл, после доведения рН среды до 4-5, вводят элюат технеция-99m, затем в количествах из расчета на 1 мл смеси последовательно вводят аскорбиновую кислоту 0,20-0,25 мг, олово (II) хлорид дигидрат 0,00875-0,0175 мг и желатин 2,5-4,0 мг, полученную смесь нагревают на водяной бане при температуре 70-80°С в течение 30 мин, охлаждают до комнатной температуры в ультразвуковой ванне и проводят стерилизующую фильтрацию.
99m
99m
2
3
2
n
2
2
2
К числу факторов, осложняющих получение целевого наноколлоида Tc-AlO с заданными размерами, относится то, что при восстановлении Tc (VII) оловом (II) дополнительно образуется крупноразмерный коллоид (более 220 нм) типа (-O-TcO-O-SnCl-O-TcO-), где n=2, 3… - число, зависящее от рН раствора [Зайцева Л.Л., Величко А.В., Виноградов И.В. Соединения технеция и области их применения // Итоги науки и техники. - М.: ВИНИТИ, 1984. - Т.9. - С.180]. Кроме того, возможно образование коллоида олова вследствие гидролиза избытка SnCl, протекающего по уравнению: SnCl+HO→Sn(OH)Cl+HCl.
99m
99
99m
99m
99m
99m
Поэтому нами были проведены предварительные исследования по установлению необходимого и достаточного количества Sn (II), обеспечивающего полное восстановление Tc (VII) в элюате из Мо/Tc-генератора. С этой целью в элюат Tc вводили различные количества Sn (II) с последующим определением содержания невосстановленного Tc (VII) методом тонкослойной хроматографии на пластинах силикагеля в среде ацетона [ГФ XII, ч.1, с.468]. Для стабилизации образующегося комплекса Tc (IV) в элюат перед введением Sn (II) добавляли аскорбиновую кислоту из расчета 0,20-0,25 мг на 1 мл элюата. Результаты исследований представлены в таблице 2.
99m
Из них следует, что оптимальному количеству Sn (II) в реакционной смеси, обеспечивающему содержание Tc (VII) менее 10%, соответствует значение в пределах от 0,00875 до 0,0175 мг/мл.
99m
99m
Введение в состав реакционной смеси желатина обусловлено следующим. По химической природе желатин представляет собой биополимер - полидисперсную смесь низкомолекулярных пептидов. Длина молекул желатина составляет в среднем 2850 Å, при диаметре 14 Å. Средний размер межмолекулярных пустот составляет порядка 80-90 Å. Поэтому матричные системы на основе желатина характеризуются наноструктурной организацией, обеспечивающей довольно однородное распределение иммобилизированного вещества и хорошей стерической доступностью молекул для осуществления различных химических процессов, препятствующих в данном случае образованию крупного коллоида олова с Tc [Михайлов О.В. Как склеить «химический кувшин» из осколков. // Природа. - №12, - 2003. - С.17-24]. Содержание желатина в составе известных наноколлоидных препаратов, например, «Наноцис» с размером частиц - 100 нм находится в пределах 2,5-4 мг/мл, что, как подтвердили и наши исследования, достаточно для снижения количества крупного коллоида олова с Tc до приемлемого значения 20%.
Технический результат от предполагаемого изобретения состоит в получении меченного технецием-99m наноколлоида, отвечающего следующим требованиям:
- не менее 80% частиц имеют размер в интервале 20-100 нм;
- относительное содержание частиц с размерами менее 20 нм не превышает 6%;
- радиохимическая чистота радиофармпрепарата составляет более 90% и сохраняется не менее 4 часов.
99m
2
3
Изобретение поясняется Фиг.1, на которой представлена лимфосцинтиграмма крысы через 1 час после введения под кожу животного наноколлоидного радиофармпрепарата Tc-AlO, обозначено: 1 - лимфатический узел, 2 - место введения препарата. Накопление в лимфатическом узле 1,5%.
Сущность изобретения поясняется следующими примерами.
2
3
2
2
99m
Пример 1. Во флакон вместимостью 20 мл вносят навеску гамма-оксида AlO с диаметром частиц 7-10 нм массой ~5 мг и разводят ее в 10 мл воды для инъекций. Затем доводят рН среды 0,05 М раствором HCl до значения 4-5. 2 мл полученной суспензии переносят в отдельный флакон и к ней последовательно добавляют 2 мл элюата Tc с активностью 1,5-2 ГБк, 100 мкл водного раствора аскорбиновой кислоты с концентрацией 10 мг/мл и 10 мкл свежеприготовленного раствора Sn (II) (концентрация 7 мг/мл по SnCl·2HO). После интенсивного перемешивания смесь нагревают на водяной бане (70-80°С) в течение 30 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры в ультразвуковой ванне и фильтрацией через стерилизующий фильтр (0, 22 мкм) в асептических условиях в стерильный флакон.
99m
Радиохимический выход продукта с размером частиц менее 100 нм относительно общей активности приготовленного препарата определяли путем фильтрации исходной смеси через фильтр с диаметром пор 100 нм. Содержание фракции с размерами менее 20 нм контролировали по данным накопления Tc в крови через 1 час после введения препарата экспериментальным животным. В рассмотренном примере введенные количества аскорбиновой кислоты и Sn (II) в пересчете на 1 мл приготовленной смеси соответственно равны 0,25 и 0,0175 мг. Выход продукта с размерами менее 100 нм составил 23%, а фракции менее 20 нм - 6%. Радиохимическая чистота фильтрата равна 76% и остается на этом уровне в течение 4 часов.
Пример 2. Реакционную смесь готовят так же, как и в примере 1, с тем отличием, что после введения свежеприготовленного раствора Sn (II) в смесь добавляют 100 мкл водного раствора желатина с концентрацией 10 мг/мл. Полученную смесь нагревают на водяной бане (70-80°С) в течение 30 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры и фильтрацией через стерилизующий фильтр (0,22 мкм) в асептических условиях в стерильный флакон.
В рассмотренном примере введенные количества аскорбиновой кислоты, Sn (II) и желатина в пересчете на 1 мл приготовленной смеси соответственно равны 0,25; 0,0175 и 2,5 мг. Выход продукта с размерами менее 100 нм составил 83%, а фракции менее 20 нм - 6%. Радиохимическая чистота препарата равна 91% и остается на этом уровне в течение 4 часов.
Пример 3. Реакционную смесь готовят так же, как и в примере 2, с тем отличием, что после введения свежеприготовленного раствора Sn (II) в смесь добавляют 160 мкл водного раствора желатина с концентрацией 10 мг/мл. Полученную смесь нагревают на водяной бане (70-80°С) в течение 30 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры и фильтрацией через стерилизующий фильтр (0,22 мкм) в асептических условиях в стерильный флакон.
В рассмотренном примере введенные количества аскорбиновой кислоты, Sn (II) и желатина в пересчете на 1 мл приготовленной смеси соответственно равны 0,25; 0,0175 и 4,0 мг. Выход продукта с размерами менее 100 нм составил 84%, а фракции менее 20 нм - 6%. Радиохимическая чистота препарата равна 92% и остается на этом уровне в течение 4 часов.
99m
2
3
Из представленных примеров следует, что введение в состав реакционной смеси желатина в количестве 2,5-4,0 мг на 1 мл смеси обеспечивает повышение выхода целевого наноколлоида Tc-AlO с размерами частиц менее 100 нм до 83-84% при радиохимической чистоте продукта 92%.
В целом предлагаемый способ позволяет получать меченный технецием-99 м наноколлоидный препарат на основе гамма-оксида алюминия, пригодный для проведения гамма-сцинтиграфических исследований, о чем свидетельствует лимфосцинтиграмма на фиг.1, полученная через 1 час после введения радиофармпрепарата экспериментальному животному (крысе). Накопление в лимфоузле 1,5%.
Таблица 1
Радиофармпрепарат
Производитель
Размеры частиц
Nanocoll
GE Amersham
<80 нм
<sup>99m</sup>Tc-nanocolloid
GE, Uppsala, Sweden
<80 нм
Nanocis
CIS bio International
~100 нм
Hepatocis
CIS bio International
~500 нм
Microlite
Du Font
~10 нм
Sulfur colloid
CIS bio International
40-10000 нм
Таблица 2
Концентрация Sn (II), мг/мл
0,00875
0,0175
0,035
0,07
0,105
0,14
Содержание Tc(VII), %
10
7
3
0,4
0
0