СРЕДСТВО ДЛЯ ОЧИСТКИ ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ ОТ НЕФТИ И ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОЙ МИНЕРАЛИЗАЦИИ СРЕДЫ
AGENT FOR CLEANING OF CONTAMINATED SOILS FROM OIL AND POLYCYCLIC AROMATIC CARBOHYDRATES UNDER CONDITIONS OF HIGH MEDIUM MINERALISATION

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для очистки почвы от загрязнения нефтью и полициклическими ароматическими углеводородами в условиях засоления путем внесения микробного консорциума.
Наиболее опасными компонентами нефти являются полициклические ароматические углеводороды, которые характеризуются наименьшим деградационным потенциалом, высокой токсичностью, мутагенным и канцерогенным действием [1, 2]. При этом нефтяное загрязнение почвы часто сопровождается засолением из-за поступления в нее высокоминерализованных пластовых вод, что ведет к ингибированию активности почвенных микроорганизмов [3].
Известны штаммы микроорганизмов Pseudomonas alcaligenes MEV B-8278 [4] и Pseudomonas stutzeri MEV-S1 B-8277 [5], осуществляющие наряду с деструкцией нефти и нефтепродуктов утилизацию полициклических ароматических углеводородов. Однако данные бактерии не способны к росту и разрушению углеводородов в условиях засоления.
Известны консорциумы микроорганизмов Rhodococcus sp.Bkmac-1500D, Rh. maris AC-1501D, Rh. erythropolis AC-1502D, Pseudomonas stutzeri BKM B-1972 D, Candida sp.BKM-y-2778 D [6]; Rhodococcus ruber BKM Ac-1513 Д, Rhodococcus erythropolis BKM Ac-1514Д [7]; Acinetobacter calcoaceticus Baumann et al. штамм 279 ВКПМ-B-7179, Pseudomonas fluorescens Stanier et al. штамм 325 ВКПМ-В-7152, Alcaligenes faecalis Castellani et Chalmers штамм 404 ВКПМ-В-7180 [8]; Candida maltosa ВКПМ У-2256, Candida maltosa ВКПМ У-2257 [9], которые могут деградировать нефть и алифатические углеводороды в присутствии засоления. Однако данные микробные консорциумы не способны к деструкции полициклических ароматических углеводородов.
Известен консорциум Sacharomyces sp., Pseudomonas sp.[10], способный к росту и деструкции нефти в условиях засоления, а также к деградации полициклических ароматических углеводородов - антрацена и нафталина, однако не проверена утилизация антрацена и нафталина и ее скорость при засолении среды.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому решению является консорциум микроорганизмов Rhodococcus sp.BKM Ac-2532Д, Rhodococcus sp.BKM Ас-2533Д, Pseudomonas sp.BKM Ac-2387Д, Pseudomonas putida BKM Ас-2380Д [11], разрушающий нефть и полициклические ароматические углеводороды - нафталин и фенантрен в присутствии соли (NaCl), однако его недостатком является узкий диапазон солености работы биопрепарата (до 3% NaCl) и неизвестность скорости деструкции полициклических ароматических углеводородов.
Задачей создания изобретения является создание средства - нефтеокисляющего консорциума микроорганизмов с высокой скоростью деструкции широкого спектра полициклических ароматических углеводородов и способностью расти при повышенных концентрациях соли (NaCl до 7%).
Вышеуказанная задача решается средством для очистки загрязненных почв от нефти и полициклических ароматических углеводородов в условиях повышенной минерализации среды, представляющим собой консорциум бактерий Rhodococcus sp.SMB37, Rhodococcus sp.SMB38, Arthrobacter sp.SMB32, Microbacterium sp.SMB33, Thalassospira sp.SMB34, Halomonas sp.SMB31 и «Salinicola socius» SMB35.
Данное микробное сообщество является естественной природной ассоциацией, выделенной из техногеннозасоленной почвы, загрязненной углеводородами. Бактерии консорциума связаны между собой протокооперативными отношениями, в связи с чем возможно совместное промышленное культивирование микроорганизмов. Состав консорциума стабилен во времени. Соотношение штаммов может варьировать в зависимости от условий культивирования микробного сообщества, но на средах с углеводородами в культуре доминируют Rhodococcus sp.SMB37, Rhodococcus sp.SMB38, «Salinicola socius» SMB35. Основная особенность препарата состоит в том, что составляющий его микробный консорциум может развиваться в минерализованной (NaCl до 7%) среде и утилизировать нефть и полициклические ароматические углеводороды.
Полученный консорциум штаммов бактерий хранится в коллекции Лаборатории химического мутагенеза Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН под коллекционным номером SMB3.
Описание штаммов бактерий, входящих в состав консорциума
Штамм Rhodococcus sp.SMB37
Морфологические и культуральные признаки
Клетки грамположительные, неподвижные. При развитии бактериальная культура характеризуется жизненным циклом кокк-палочка-кокк.
На полноценной агаризованной среде образует непрозрачные выпуклые с ризоидным краем колонии бледно-розового цвета.
Физиолого-биохимические признаки
Аэроб. Хемоорганотроф. В состав клеточной стенки входят миколовые кислоты. Гидролизует крахмал. Не способен к гидролизу желатина и мочевины. Оксидазный тест отрицательный, каталазный тест положительный. Использует в качестве источника углерода арабинозу, ксилозу, мальтозу, маннит с образованием кислоты. Способен к росту в диапазоне концентрации NaCl от 0 до 10%. Рост возможен при рН 6-9. Не нуждается в дополнительных факторах роста.
По сиквенсу 16S рДНК наиболее близок к виду R. rhodochrous, однако отличается от него устойчивостью к высоким концентрациям соли и способностью использовать нафталин в качестве единственного источника углерода и энергии.
Штамм Rhodococcus sp.SMB38
Морфологические и культуральные признаки
Клетки грамположительные, неподвижные. При развитии бактериальная культура характеризуется жизненным циклом кокк-палочка-кокк.
На полноценной агаризованной среде образует непрозрачные выпуклые с ровным краем колонии розового цвета.
Физиолого-биохимические признаки
Аэроб. Хемоорганотроф. В состав клеточной стенки входят миколовые кислоты. Гидролизует мочевину. Не способен к гидролизу крахмала. Оксидазный тест отрицательный, каталазный тест положительный. Использует в качестве источника углерода галактозу, лактозу, маннит с образованием кислоты. Способен к росту в диапазоне концентрации NaCl от О до 10%. Не нуждается в дополнительных факторах роста.
По сиквенсу 16S рДНК наиболее близок к виду R. jostii, однако отличается от него устойчивостью к высоким концентрациям соли, способностью использовать нафталин в качестве единственного источника углерода и энергии и гидролизовать мочевину.
Штамм Arthrobacter sp.SMB32
Морфологические и культуральные признаки
Клетки грамположительные, неподвижные. В молодых культурах палочки неправильной формы, при развитии культуры распадаются на мелкие кокки. Спор не образуют.
На полноценной агаризованной среде образует округлые, выпуклые, с ровным краем, белые, с возрастом желтеющие колонии.
Физиолого-биохимические признаки
Аэроб. Хемоорганотроф. Миколовые кислоты в составе клеточной стенки не обнаружены. Оксидазный тест отрицательный, каталазный тест положительный.
По сиквенсу 16S рДНК наиболее близок к виду A. nicotianae.
Штамм Microbacterium sp.SMB33
Морфологические и культуральные признаки
Клетки палочковидные, грамположительные, подвижные. При развитии бактериальной культуры жизненный цикл кокк-палочка-кокк отсутствует. Спор не образуют.
На полноценной агаризованной среде образует округлые, выпуклые, светло-зеленые колонии.
Физиолого-биохимические признаки
Аэроб. Хемоорганотроф. Желатину и крахмал не гидролизует. Образует кислоту из глюкозы. Оксидазный тест отрицательный, каталазный тест положительный.
По сиквенсу 16S рДНК наиболее близок к виду М. maritypicum.
Штамм Thalassospira sp.SMB34
Морфологические и культуральные признаки
Клетки изогнутые палочковидные, грамотрицательные, подвижные за счет полярного жгутика. Спор не образуют.
На полноценной агаризованной среде образует округлые, блестящие, гладкие, с ровным краем колонии бежевого цвета.
Физиолого-биохимические признаки
Хемоорганотроф. Оксидазный и каталазный тесты положительные. Не гидролизует крахмал, желатин и мочевину. Фенилаланиндезаминазной и β-галактозидазной активностями не обладает, восстанавливает нитрат до нитрита. Способен к росту в присутствии соли (NaCl до 8%).
По сиквенсу 16S рДНК наиболее близок к виду Thalassospira lucentensis, однако отличается от него способностью восстанавливать нитрат и устойчивостью к высоким концентрациям соли.
Штамм Halomonas sp.SMB31
Морфологические и культуральные признаки
Клетки палочковидные, грамотрицательные, подвижные за счет полярного жгутика. Спор не образуют.
На полноценной агаризованной среде образует округлые, выпуклые, с ровным краем колонии палевого цвета.
Физиолого-биохимические признаки
Аэроб. Хемоорганотроф. Оксидазный тест отрицательный. Каталазная реакция положительная. Не гидролизует желатину, крахмал и мочевину. Образует кислоту из глюкозы, инозита, маннита, сахарозы, сорбита. Способен к росту в диапазоне концентраций NaCl от 3 до 30%, с оптимумом при 3-10%. Рост возможен при рН 6-7. Не нуждается в дополнительных факторах роста.
По сиквенсу 16S рДНК наиболее близок к виду Н. taeanensis, однако отличается от него диапазоном концентраций хлорида натрия и рН, в которых возможен рост культуры, способностью гидролизовать твин 80 и мочевину, способностью восстанавливать нитрат.
Штамм «Salinicola socius» SMB35
Морфологические и культуральные признаки
Клетки палочковидные, грамотрицательные, подвижные за счет полярного жгутика. Спор не образуют.
На полноценной агаризованной среде образует округлые, выпуклые, с ровным краем колонии желтого цвета.
Физиолого-биохимические признаки
Аэроб. Хемоорганотроф. Каталазная реакция положительная, оксидазная реакция отрицательная. Гидролизует крахмал, желатин и мочевину. Образует кислоту из глюкозы, маннита, сорбита. Способен к росту в диапазоне концентраций NaCl от 0.5 до 30%, с оптимумом при 3-10%. Диапазон рН среды роста - 6.0-8.0. Не нуждается в дополнительных факторах роста.
По сиквенсу 16S рДНК наиболее близок к видам родов семейства Halomonadaceae (роды Halomonas, Cobetia и Chromohalobacter), однако существенно отличается от них единственным, полярно расположенным жгутиком, широким диапазоном концентраций хлорида натрия, при которых возможен рост, отрицательной оксидазной реакцией, отсутствием способности восстанавливать нитрат до нитрита, способностью гидролизовать желатину, крахмал и твин-80.
Преимуществом консорциума бактерий Rhodococcus sp.SMB37, Rhodococcus sp.SMB38, Arthrobacter sp.SMB32, Microbacterium sp.SMB33, Thalassospira sp.SMB34, Halomonas sp.SMB31 и «Salinicola socius» SMB35 является высокая скорость деструкции полициклических углеводородов и способность расти при повышенных концентрациях соли (NaCl до 7%).
Исследованный консорциум предложен для очистки почвы от нефти и полициклических ароматических углеводородов впервые, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии предлагаемого консорциума критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».
Пример 1
Предлагаемый бактериальный консорциум был выделен из почвы, отобранной с глубины 5-10 см на территории промышленных солеразработок калийного комбината ОАО «Уралкалий» (г.Березники, Пермский край), следующим образом:
4
3
4
2
2
4
2
4
2
2
2
3
4
2
4
2
1.0 г почвы вносили в 250 мл минеральной среды Раймонда следующего состава (г/л): NHNO - 2.0, MgSO×7НО - 0.2, KHPO - 2.0, NaHPO - 3.0, CaCl×6НО - 0.01, NaCO - 0.1, дополненную 1% раствором MnSO×2HO - 2 мл/л среды и 1% раствором FeSO×7НО - 1 мл/л среды, NaCl - 60 г/л среды; рН среды - 7.3. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали нафталин (1 г/л среды). Инкубация проводилась 2 недели на термостатируемой качалке УВМТ-12-250 при 100 об/мин и 28°С. Консорциум бактерий был получен путем многократных пересевов (более 10) накопительной культуры и культивирования при вышеперечисленных условиях.
Для установления состава консорциума чистые культуры бактерий выделяли на полноценной агаризованной среде Раймонда (5 г/л триптона, 2.5 г/л дрожжевого экстракта в качестве ростовых субстратов и 15 г/л агара «Difco») в присутствии 3% NaCl.
Пример 2
7
Консорциум бактерий Rhodococcus sp.SMB37, Rhodococcus sp.SMB38, Arthrobacter sp.SMB32, Microbacterium sp.SMB33, Thalassospira sp.SMB34, Halomonas sp.SMB31 и «Salinicola socius» SMB35, выращенный на минеральной среде Раймонда с нафталином (см. пример 1), вносили в почву с разной степенью засоления (3%, 5% и 7% NaCl), загрязненную нефтью в дозе 1%, из расчета 10 клеток на 1 грамм почвы. Через 20 дней весовым методом оценивали содержание нефти в почве и с использованием хромато-масс-спектрометра Agilent 6890N (Agilent Technology, США) измеряли концентрацию полициклических ароматических углеводородов.
В почве с внесением бактериального консорциума отмечена большая убыль нефти (табл.1). Наибольшее отличие в содержании нефти между почвами с внесением и без внесения консорциума наблюдалось при минерализации 7%, так, если в почве без внесения консорциума утилизация нефти составила 0%, то с внесением - 26.8%.
Результаты воздействия предлагаемого консорциума на деструкцию полициклических ароматических углеводородов представлены в таблице 2. Показано, что за 20 суток утилизация нафталина составила от 93.3% до 95.7%, антрацена - от 46.6% до 62.0%, за это же время степень деградации нафталина и антрацена аналогом (Андреева и др., RU 2272071 С2, 20.03.2006) составила 50%. Изобретение также отличается от прототипов большим спектром утилилизируемых полициклических ароматических углеводородов.
Таблица 1
Степень деструкции нефти в почве (%)
Варианты опыта
Степень засоленности почвы
NaCl 3%
NaCl 5%
NaCl 7%
Почва без внесения консорциума
9.0
6.6
0
Почва с внесением консорциума
21.3
21.5
26.8
Таблица 2
Степень деструкции полициклических углеводородов в нефтезагрязненной почве (%)
Углеводороды
Степень засоленности почвы
NaCl 3%
NaCl 5%
NaCl 7%
нафталин
95.7
94.4
93.3
бифенил
55.2
57.1
45.9
аценафтен
57.5
55.7
50.5
фенантрен
45.3
53.5
39.5
антрацен
53.0
62.0
46.6
Таким образом, предлагаемый консорциум может быть использован для очистки почвы от нефти, а также полициклических ароматических углеводородов (нафталина, бифенила, аценафтена, фенантрена, антрацена) в условиях засоления.
Использованная литература
1. Atlas R.M. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental perspective // Microbiolgical reviews. 1981. V.45. P.180-209.
2. Пиковский Ю.И. Природные и техногенные потоки углеводородов в окружающей среде. M.: Изд-во МГУ, 1993. 207 с.
3. Солнцева Н.П. Общие закономерности трансформации почв в районах добычи нефти (формы проявления, основные процессы, модели) // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. M.: Наука, 1988. С.23-42.
4. Патент РФ №2228953 С2, 2004.
5. Патент РФ №2228952 С2, 2004.
6. Патент РФ №2023686 C1, 1994.
7. Патент РФ №2174496 С2,2001.
8. Патент РФ №2107722 C1, 1998.
9. Патент РФ №2114174 C1, 1998.
10. Патент РФ №2272071 С2, 2006.
11. Патент РФ №2312891 C1, 2007 - прототип.