СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГИПОКСИИ ПАРЕНХИМЫ ПОЧЕК ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНТРААБДОМИНАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ
METHOD FOR DIAGNOSTICS OF HYPOXIA OF KIDNEY PARENCHYMA IN EXPERIMENTAL INTRAABDOMINAL HYPERTENSION

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике и нефрологии, и может быть использовано для диагностики гипоксии паренхимы почек при интраабдоминальной гипертензии.
Уровень техники
Гипоксия паренхимы почек играет ключевую роль в развитии повреждения почек при интраабдоминальной гипертензии (ИАГ) [Villa G. et al. The Pathophysiological Hypothesis of Kidney Damage during Intra-Abdominal Hypertension // Front Physiol. 2016. V. 7.]. Острое повреждение почек (ОПП) – важное звено патогенеза синдрома интраабдоминальной гипертензии (СИАГ) – нарушения функции органа или системы органов, возникающее или усугубляющееся на фоне ИАГ [Kirkpatrick A. W. et al. Intra-abdominal hypertension and the abdominal compartment syndrome: updated consensus definitions and clinical practice guidelines from the World Society of the Abdominal Compartment Syndrome // Intensive Care Med. 2013. V. 39. № 7. P. 1190–1206.]. В связи с более низкими показателями артериального давления, и более высокими показателями нормального интраабдоминального давления (ИАД), по сравнению с взрослыми, СИАГ у детей может развиваться при менее выраженном подъёме ИАД [Thabet F. C. et al. Incidence, Risk Factors, and Prognosis of Intra-Abdominal Hypertension in Critically Ill Children: A Prospective Epidemiological Study // J Intensive Care Med. 2016. V. 31. № 6. P. 403–408]. Особую категорию больных с ИАГ представляют новорожденные. Неонатальный период является сложным моментом адаптации организма ребенка к постнатальным условиям существования, сопряжен с морфо - функциональной незрелостью различных органов и систем новорожденного, и ограничением их компенсаторных возможностей. При этом, у детей данного возраста почки являются наиболее чувствительными органами к ИАГ, что обусловлено морфофункциональными особенностями мочевыделительной системы этой категории пациентов  [Bezerra C. T. de M., Vaz Cunha L. C., Libório A. B. Defining reduced urine output in neonatal ICU: importance for mortality and acute kidney injury classification // Nephrol Dial Transplant. 2013. V. 28. № 4. P. 901–909.; Ricci Z., Ronco C. Neonatal RIFLE // Nephrol Dial Transplant. 2013. V. 28. № 9. P. 2211–2214.].  Совершенствование диагностики и тактики ведения СИАГ позволило снизить смертность взрослых пациентов c СИАГ с 80 до 37% [Carr J. A. Abdominal compartment syndrome: a decade of progress // J. Am. Coll. Surg. 2013. V. 216. № 1. P. 135–146.; De Waele J. et al. Abdominal decompression for abdominal compartment syndrome in critically ill patients: a retrospective study // Acta Clin Belg. 2010. V. 65. № 6. P. 399–403.; Vidal M. G. et al. Incidence and clinical effects of intra-abdominal hypertension in critically ill patients // Crit. Care Med. 2008. V. 36. № 6. P. 1823–1831]. Однако, среди пациентов детского возраста смертность от СИАГ остаётся на стабильном уровне в 40-60% [Ejike J. C. et al. Outcomes of children with abdominal compartment syndrome // Acta Clin Belg. 2007. V. 62 Suppl 1. P. 141–148.; Pearson E. G. et al. Decompressive laparotomy for abdominal compartment syndrome in children: before it is too late // J. Pediatr. Surg. 2010. V. 45. № 6. P. 1324–1329].
На данный момент основой диагностики острого повреждения почек является изменение уровня сывороточного креатинина. Однако, этот показатель имеет ограниченную чувствительность, и не позволяет получить информацию об этиологии, прогнозе повреждения почек, молекулярных особенностях его течения и ответе пациента на лечение [Waikar S. S. et al. Imperfect Gold Standards for Kidney Injury Biomarker Evaluation // J Am Soc Nephrol. 2012. V. 23. № 1. P. 13–21.]. Повреждение почек может происходить и без подъема уровня сывороточного креатинина. При повреждении и утрате одних нефронов, их функцию могут компенсировать здоровые нефроны. Это позволяет поддерживать нормальную функцию почек даже при персистирующем повреждении, однако уровень креатинина в сыворотке будет также подвержен минимальным изменениям [Haase M., Kellum J. A., Ronco C. Subclinical AKI--an emerging syndrome with important consequences // Nat Rev Nephrol. 2012. V. 8. № 12. P. 735–739.; Huen S. C., Parikh C. R. Molecular phenotyping of clinical AKI with novel urinary biomarkers // Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2015. P. 309. № 5. V. F406-413.]. Такая картина существенно осложняет своевременную диагностику ОПП в группах риска, таких как дети с ИАГ. Ключом к решению этой проблемы могут стать новые методы ранней диагностики повреждения почек, которые позволят своевременно выявлять показания для ренопротективной терапии.
Представляется возможным использовать маркеры гипоксии в диагностике ранних этапов повреждения почек при ИАГ. Ключевым маркером, регулирующим ответ тканей почек на гипоксию является HIF-1а (hypoxia-inducible factor 1a) [Nangaku M., Eckardt K.-U. Hypoxia and the HIF system in kidney disease // J. Mol. Med. 2007. V. 85. № 12. P. 1325–1330.]. Одним из его эффектов является стимуляция экспрессии VEGF (vascular endothelial growth factor), который в паренхиме почек оказывает протективное действие [Claesson-Welsh L. VEGF receptor signal transduction – A brief update // Vascular Pharmacology. 2016. V. 86. P. 14–17; Joory K. D. et al. Vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) expression in normal human tissues // Lymphat Res Biol. 2006. V. 4. № 2. P. 73–82.]. VEGF-A стимулирует рост эндотелия кровеносных сосудов, VEGF-С – рост эндотелия лимфатических сосудов, что в конечном итоге, способствует нормализации трофики тканей и уменьшению воспаления паренхимы [Hasegawa S. et al. Vascular endothelial growth factor-C ameliorates renal interstitial fibrosis through lymphangiogenesis in mouse unilateral ureteral obstruction // Lab. Invest. 2017. V. 97. № 12. P. 1439–1452.; Wang X. L. et al. Promoting inflammatory lymphangiogenesis by vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) aggravated intestinal inflammation in mice with experimental acute colitis // Braz J Med Biol Res. 2016. V. 49. № 5.].
Известен способ оценки состояния почек у детей с хронической болезнью почек, находящихся на гемодиализе (Hamed EA, El-Abaseri TB, Mohamed AO, Ahmed AR, El-Metwally TH. Hypoxia and oxidative stress markers in pediatric patients undergoing hemodialysis: cross section study. BMC Nephrol. 13.10.2012.;13:136), согласно которому оценивают ряд показателей, среди которых в т.ч. концентрация биомаркеров гипоксии HIF-1a и VEGF в сыворотке крови. Было показано, что, по сравнению с контрольной группой, данные маркеры были достоверно повышены как до, так и после диализа. Была обнаружена корреляция между содержанием VEGF и пирувата в сыворотке крови, и между содержанием HIF-1a в сыворотке, пероксида в сыворотке, антиоксидантной активностью плазмы и индексом оксидативного стресса.
Недостатком известного способа является то, что в данном исследовании биомаркеры гипоксии HIF-1a и VEGF использовались для оценки состояния почек у детей с хроническим, а не острым повреждением почек. Механизмы острого и хронического гипоксического повреждения почек и адаптации к нему существенно отличаются, что может сказываться на концентрации маркеров гипоксии в биологических жидкостях. Маркеры измерялись у пациентов, находящихся на гемодиализе, что не позволяет сделать выводы о возможности их использования в ранней диагностике повреждения почек. Не исследовалось содержание VEGF-C, который является индуктором лимфангиогенеза. Концентрация данных биомаркеров измерялась только в сыворотке крови. Результаты не сопоставлялись с морфологическими изменениями.
Известен также способ диагностики повреждения почечной паренхимы у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом (патент РФ №2442982), согласно которому проводят исследование VEGF-А в моче детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом до коррекции рефлюкса, увеличение его концентрации свыше 140 пг/мл свидетельствует о повреждении почек.
Недостатком известного способа также является то, что VEGF-А использовался для оценки состояния почек у детей с хроническим, а не острым повреждением почек. Механизмы повреждения почек при ИАГ и пузырно-мочеточниковом рефлюксе отличаются, что может сказываться на концентрации маркеров гипоксии в биологических жидкостях. Не исследовалось содержание HIF-1a и VEGF-C. Не установлено корреляции с изменениями почечного кровотока при допплерографии. Не произведено верификации повреждения почек морфологическим исследованием.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению (прототипом) является способ диагностики состояния почек у детей с интраабдоминальной гипертензией, вызванной хирургической коррекцией гастрошизиса и врождённой диафрагмальной грыжи (Morozov D, Morozova O, Pervouchine D, Severgina L, Tsyplakov A, Zakharova N, et al. Hypoxic renal injury in newborns with abdominal compartment syndrome (clinical and experimental study). Pediatr Res. 2018; 83(2):520–6.), заключающийся в измерении содержания в сыворотке и моче пациентов биомаркеров VEGF, π-GST и MCP-1. Было показано, что несмотря на снижение внутрибрюшного давления к 10-ому дню после операции, восстановление функции почек и снижение сывороточного креатинина, биомаркеры VEGF, π-GST и MCP-1 оставались повышенными, указывая на персистирующее повреждение почек. На крысиной модели интраабдоминальной гипертензии была продемонстрирована связь между повышением VEGF, π-GST и MCP-1 в сыворотке и гистологическими изменениями в паренхиме почек.
Однако в данном способе не описаны диагностические признаки (концентрации биомаркеров), на основании которых можно судить о наличии гипоксии паренхимы почек при интраабдоминальной гипертензии на ранних этапах поражения почек. В исследовании не измерялась концентрация отдельных типов VEGF (VEGF-A, -C), которые обладают разными биологическими эффектами и клетками-мишенями, а также HIF-1a – одного из основных маркеров гипоксии. Кроме того, на концентрацию VEGF в сыворотке может повлиять множество факторов, так как ИАГ приводит к гипоксии во многих органах. Перечисленные факторы снижаютчувствительность данного способа при определении гипоксии паренхимы конкретно почек при ИАГ.
Технической проблемой, на решение которой направлено изобретение, является разработка способа диагностики гипоксии паренхимы почек при экспериментальной ИАГ.  На данный момент не существует стандартизованной модели экспериментальной ИАГ. Наличие стандартизированного метода диагностики гипоксии паренхимы почек может упростить использование нестандартных моделей при исследовании влияния ИАГ на организм, позволяя точно верифицировать гипоксическое повреждение почек – органа, наиболее чувствительного к повышению внутрибрюшного давления.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является обеспечение диагностики гипоксии почек при экспериментальной интраабдоминальной гипертензии путем определения концентрации HIF-1a и VEGF-C в почечном гомогенате лабораторного животного с помощью твердофазного иммуноферментного анализа.
Технический результат достигается за счет реализации способа, включающего определение концентрации биомаркеров HIF-1a и VEGF-C в гомогенате ткани почек крыс с экспериментальной интраабдоминальной гипертензией и при значениях концентраций HIF-1a выше 13,6 нг/мл и VEGF-C выше 168,3 пг/мл, диагностируют гипоксию паренхимы почек.
Возможность диагностики гипоксии паренхимы почек с помощью HIF-1a и VEGF-C была подтверждена экспериментально на новорождённых крысах линии Wistar со смоделированной интраабдоминальной гипертензией разной тяжести и длительности.
Осуществление изобретения
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Ткани почки гомогенизируют выбранным методом (механическая гомогенизация замороженных тканей при помощи ступки и пестика на льду, гомогенизитора Даунса, ультразвуковая гомогенизация и пр.) в натрий-фосфатном буфере (PBS) из расчёта 100 мг тканей почки на 1000 µл буфера. В буфер рекомендовано добавлять блокаторы протеаз во избежание потерь определяемых маркеров в процессе пробоподготовки. После гомогенизации образцы центрифугируют 5 мин 10000 x g. Отбирают супернатант, в случае, если исследование провести сразу невозможно, образцы супернатанта замораживают при -80°C. Полученный супернатант исследуют методом твёрдофазного иммуноферментного анализа с использованием стандартизованных наборов для определения HIF-1a и VEGF-C в пробах. Концентрация HIF-1a >13,6 нг/мл и VEGF-C >168,3 пг/мл в почечном гомогенате указывает на наличие гипоксии паренхимы почек.
Были проведены экспериментальные исследования на новорождённых крысах линии Wistar со смоделированной интраабдоминальной гипертензией разной тяжести и длительности.
Эксперимент был проведён на 50 новорождённых крысах Wistar (возраст 10-12 дней), которые были разделены на 5 групп по 10 особей в каждой: группы 1 и 2 с легкой ИАГ длительностью 5 и 10 дней соответственно, группы 3 и 4 с тяжелой ИАГ длительностью 5 и 10 дней соответственно, и 5 группу сравнения. Моделирование ИАГ на крысах достигалось введением стерильного вазелина в брюшную полость до заданного уровня ИАД под контролем интравезикальной манометрии: 9±2 мм рт. ст. в группе лёгкой ИАГ, 17±2 мм рт. ст. в группах тяжёлой ИАГ.  В контрольной группе крысам проводилась пункция брюшной полости без последующего введения вазелина. Измерение содержания VEGF-C и HIF-1a в почечном гомогенате животных проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью наборов Rat VEGF-C ELISA (Bender MedSystems, Австрия) и ELISA Kit for HIF-1A SEA798Ra (Cloud-Clone Corp., США). Измерение концентрации биомаркеров проведено на иммуноферментном анализаторе StatFax2100 (США).  Был проведён морфологический и морфометрический анализ почечных срезов крыс.
к
к
Была показана возможность использовать биомаркеры HIF-1a и VEGF-C для диагностики гипоксии паренхимы почек при интраабдоминальной гипертензии. Наличие гипоксии было ассоциировано с достоверным повышением в почечном гомогенате концентраций HIF-1a (в группах 2-4; p<0,05) и VEGF-C (в группах 1-4; p<0,05), а также с характерными для гипоксии изменениями в паренхиме почек в виде: отёка и венозного полнокровия паренхимы, расширение мочевых пространств гломерул и собирательных трубочек, гидропии эпителия канальцев разной степени выраженности, регистрируемыми при морфологическом и морфометрическом исследовании. За пороговое значение нормы принят 95 перцентиль концентрации маркеров в почечном гомогенате в контрольной группе: HIF-1a -13,6 нг/мл, VEGF-C -168,3 пг/мл. Концентрация HIF-1a и VEGF-C выше указанных значений указывает на наличие гипоксии паренхимы почек. При сравнении показателей маркеров в группах с экспериментальной ИАГ одинаковой длительности, но разной тяжести, достоверных отличий не обнаружено (тест Краскилла-Уолеса, p>0,05).
Таким образом, гипоксия паренхимы почек в группах с ИАГ подтверждена высокой концентрацией биомаркеров гипоксии HIF-1a (>13,6 нг/мл), VEGF-C (>168,3 пг/мл) в почечном гомогенате и характерными морфологическими изменениями в почках.
Примеры реализации изобретения
Случай 1 (контрольная группа). Крысе в возрасте 15 дней, массой 13 г под ингаляционным наркозом произведена пункция брюшной полости без введения объём-образующего препарата. На 5 день после манипуляции концентрация биомаркеров в почечном гомогенате составила: VEGF-C 129,5 нг/мл, HIF-1a 7,55 пг/мл. При морфологическом исследовании патологических изменений паренхимы почек не выявлено.
Случай 2 (лёгкая ИАГ длительностью 5 дней). Крысе в возрасте 15 дней, массой 14 г под ингаляционным наркозом и под контролем интравезикальной манометрии в брюшную полость введен стерильный вазелин до показателя ИАД 11 мм рт. ст.  На 5 день после манипуляции концентрация биомаркеров в почечном гомогенате составила: VEGF-C - 215 нг/мл, HIF-1a - 18,5 пг/мл. При морфологическом исследовании паренхимы почек выявлены: венозное полнокровие паренхимы и отёк интрестиция, гидропия эпителия единичных канальцев.
Случай 3 (лёгкая ИАГ длительностью 10 дней). Крысе в возрасте 15 дней, массой 13 г под ингаляционным наркозом и под контролем интравезикальной манометрии в брюшную полость введен стерильный вазелин до показателя ИАД 10 мм рт. ст.  На 10 день после манипуляции концентрация биомаркеров в почечном гомогенате составила: VEGF-C - 230 нг/мл, HIF-1a - 25,8 пг/мл. При морфологическом исследовании паренхимы почек выявлены: венозное полнокровие паренхимы и отёк интрестиция, гидропия эпителия канальцев.
Случай 4. (тяжелая ИАГ длительностью 5 дней). Крысе в возрасте 15 дней, массой 15 г под ингаляционным наркозом и под контролем интравезикальной манометрии в брюшную полость введен стерильный вазелин до показателя ИАД 17 мм рт. ст.  На 5 день после манипуляции концентрация биомаркеров в почечном гомогенате составила: VEGF-C - 376,4 нг/мл, HIF-1a - 16,2 пг/мл. При морфологическом исследовании паренхимы почек выявлены: венозное полнокровие паренхимы и отёк интрестиция, расширение мочевых пространств гломерул, гидропия эпителия канальцев (в т.ч. баллонная дегенерация эпителия).
Случай 5. (тяжелая ИАГ длительностью 10 дней). Крысе в возрасте 15 дней, массой 14 г под ингаляционным наркозом и под контролем интравезикальной манометрии в брюшную полость введен стерильный вазелин до показателя ИАД 16 мм рт. ст.  На 10 день после манипуляции концентрация биомаркеров в почечном гомогенате составила: VEGF-C - 267,5 нг/мл, HIF-1a - 124,5 пг/мл. При морфологическом исследовании паренхимы почек выявлены: венозное полнокровие паренхимы и отёк интрестиция, расширение мочевых пространств гломерул и собирательных трубочек, гидропия эпителия канальцев (в т.ч. баллонная дегенерация эпителия).
Следует отметить, что определение уровней HIF-1а и VEGF-С в моче является перспективным способом диагностики гипоксии паренхимы почек. Однако, сбор мочи новорождённых экспериментальных животных затруднен. Учитывая тесную связь концентрации маркеров в почечном гомогенате и моче [Глыбочко и др., Новые возможности диагностики и прогнозирования течения хронического обструктивного пиелонефрита у детей, 2009; Морозова, Патогенетическое обоснование принципов диагностики, прогнозирования развития и профилактики хронического обструктивного пиелонефрита у детей в периоперационном периоде, 2010], представляется возможным экстраполировать динамику изменений концентрации биомаркеров в почечном гомогенате на изменение их концентраций в моче и использовать мочевые концентрации VEGF-C и HIF-1a для диагностики гипоксии паренхимы почек у детей с ИАГ.