Исследование транскрипции ДНК-матриц с пирофосфатными межнуклеотидными связями

УДК 577.113.6 + 577.212.2

ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАНСКРИПЦИИ ДНК-МАТРИЦ С ПИРОФОСФАТНЫМИ МЕЖНУКЛЕОТИДНЫМИ СВЯЗЯМИ

О.Н. Королева, В.Л. Друца*

Химико-энзиматическим методом получены фрагменты ДНК, содержащие в заданной позиции пирофосфатную межнуклеотидную группировку. Изучено влияние указанной модификации на характер транскрипции соответствующих модифицированных матриц РНК-полимеразой Escherichia coli. В экспериментах по транскрипции in vitro показано, что такая группировка не блокирует процесса элонгации, однако эффективность считывания матрицы ниже, чем в случае природного аналога, что, возможно, связано с кратковременной задержкой фермента в области модификации.

Экспрессия генов часто регулируется на уровне элонгации цепи РНК (одного из этапов процесса транскрипции), осуществляемой РНК-полимеразой [1]. В частности, для РНК-полимеразы E. coli накоплено значительное количество экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что фермент может замедлять продвижение вдоль ДНК-матрицы или останавливаться вблизи некоторых структурных элементов, например, палиндромных участков [2-6]. Для изучения механизма таких явлений важно иметь системы с искусственными стоп-сигналами. Очень перспективными с этой точки зрения представляются ДНК-матрицы, содержащие модифицированные звенья. Несмотря на то, что в последнее время в литературе описано множество различных модификаций [7], существует очень мало данных о влиянии большинства из них на процесс элонгации.

Известно, что РНК-полимераза способна без остановки прочитывать участки матричной цепи, содержащие остатки урацила, О-6-метилгуанина, 8-ок-согуанина [8], в то время как апуриновые звенья, одноцепочечные разрывы, остатки дигидроурацила, циклобутанпиримидиновые димеры и моноаддукт псоралена вызывают кратковременную задержку фермента [9-11]. Эффективными стоп-сигналами являются псораленовые поперечные сшивки и 5-пропинилцитозин [11, 12]. Практически нет данных о влиянии на элонгацию модификаций по фосфоди-эфирной связи.

Ранее нами были получены фрагменты ДНК, имеющие в строго заданных позициях ди-, три- и

тетрафосфатные межнуклеотидные связи [13, 14]. Такие соединения в дальнейшем нашли широкое применение в области исследования ряда белков нуклеинового обмена [15, 16]. В частности, было показано, что трифосфатные межнуклеотидные группировки служат стоп-сигналом для большинства широко известных ДНК-полимераз, в то время как матрицы c ди-фосфатными (пирофосфатными) межнуклеотидными группировками способны считываться этими ферментами, хотя и с меньшей эффективностью [16].

В настоящей работе с использованием специально сконструированных ДНК-матриц изучено влияние пирофосфатной межнуклеотидной группировки на характер синтеза РНК, осуществляемого РНК-поли-меразой E. coli.

Экспериментальная часть

В работе использовали: трис, ЭДТА, водорастворимый карбидиимид [1-этил-3-(3-диметиламинопро-пил)-карбодиимид] ("Merck", Германия), гАТР, rGTP, rCTP, rUTP ("Boehringer", Германия), [y-32P]ÄTP и

32

[a- P]UTP ("Amersham", Англия и "Изотоп", Обнинск). Динуклеотид rUpC любезно предоставлен докт. хим. наук С.М. Женодаровой (НИИ биофизики РАН, Пущино-на-Оке).

Были использованы также препараты ферментов: Т4-полинуклеотидкиназа (КФ 2.7.1.78, 10 ед. акт./мкл.), ДНК-лигаза фага Т4 (КФ 2.7.7.7, 15 ед.акт./мкл) производства фирмы "Fermentas", Литва; РНК-полимераза E. coli, холофермент (1-2 мкг/мкл, 8 ед. акт./мкл) производства фирмы "Sigma", США.

* Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ Использованные сокращения: ПААГ - полиакрила-мидный гель.

Пирофосфатаза из каллуса табака (1 ед.акт./мкл) выделена, как описано в работе [17]. За единицу активности фермента принимали количество микромолей ATP, превращенного в АМР за 1 мин при 37°С.

Синтез олигонуклеотидов TCGAAATCGAAG ("12А"), ТСОАААТСОААОр ("12Ар"), AATTCTTCGA ("10"), TTTCGACTTCGA ("12Т") описан ранее [18].

5'-Фосфорилирование олигонуклеотидов с помощью Т4-полинуклеотидкиназы и ATP, а также введение 5'-[32Р]-метки осуществляли по стандартным методикам [19].

Индуцируемое водорастворимым карбодиимидом лигирование олигонуклеотидов "12Ар" или "12А" с декануклеотидом "р 10" (0,2 о.е., 2х10-4 М каждого) осуществляли в 10 мкл буфера, содержащего 0,05 М 2-морфолиноэтансульфонат (pH 6,1), 0,02 М карбодии-мид, при 0°, в течение 48 ч, как описано ранее [18].

Для получения 34-звенных матриц реакцию энзи-матического лигирования олигонуклеотидов "22(Р)" или "22(РР)" (100 пмоль) с 2-кратным мольным избытком "р12Т" проводили ДНК-лигазой фага Т4, как описано ранее [18]. Продукты лигирования выделяли электрофорезом в 15%-м ПААГ, содержащем 8 М мочевину.

Обработку 5'-[32Р]-меченых олигонуклеотидов "р22(РР)" и "р22(Р)" пирофосфатазой из каллуса табака осуществляли в 10 мкл буфера, содержащего

0,05М ацетат натрия (рН 5,5), 0,01 М меркаптоэта-нол, 1 пмоль олигонуклеотида, 1 ед. акт. фермента, при 50° в течение 12 ч. Реакционные смеси анализировали электрофорезом в 20%-м ПААГ.

Стимулируемую праймером транскрипцию проводили в 10 мкл буфера, содержащего 40 мМ трис-HCl (pH 8,0), 10 мМ MgCl2, 100 мМ KCl, 0,1 мМ ЭДТА,

2 32

четыре рибонуклеозидтрифосфата (2,5 мкМ), а-[ P]-UTP (5 мкКи), ДНК-матрицу ["22(РР)", "22(Р)", "34(РР)" или "34(Р)", 40 нМ], РНК-полимеразу (200 нМ, 8 ед. акт.) и праймер rUpC (100 мкМ), при 37°, варьируя время инкубации (1, 3, 5, 10, 15, 20, 30 мин). Реакцию останавливали добавлением 8 мкл 90% формамида, содержащего 50 мМ ЭДТА и красители-маркеры ксиленцианол и бромфеноловый синий.

Электрофорез в 15 и 20%-м денатурирующем ПААГ проводили в пластинах (25*25*0,04 см) в трис-боратном буфере (рН 8,3), содержащем 8 М мочевину, при напряжении 1 кВ.

Результаты и их обсуждение

В качестве матриц для изучения катализируемой РНК-полимеразой E. coli элонгации были использованы олигонуклеотиды "22(РР)" и "34(РР)", содержащие в строго определенной позиции пирофосфатную межнуклеотидную связь (рис. 1). Матрица "22(РР)" и ее природный аналог "22(Р)", необходимый для проведения контрольных экспериментов, были получены

РНКП

TCGAAATCGAAGX AATT-CTTCGA

AGCTTC - TTAAXGAAGCTAAAGCT

I

"22(Р)", "22(РР)"

р TTTCGACTTCGA, Т4 ДНК-лигаза

TCGAAATCGAAGX ААТТ- СТТС GATTT CGACTTCGA AGCTTCAGC TTTAGCTTC - TTAAXGAAGCTAAAGCT

"34 (Р)", "34 (РР)"

UC---------*

AGCTTCTTAA X GAAGCTAAAGCT

РНКП

UC---------

AGCTTCAGCTTTAGCTTCTTAA X GAAGCTAAAGCT

X =

0

II

-О-Р -

1

о

о

о

-О-Р -О-Р-

I I

О" О"

"22(Р>", "34 (Р)"

"22(РР)" , "34 (РР)"

Рис. 1. Схема конструирования 22- и 34-звенных ДНК-матриц, использованных в транскрипции. Знаком "х" указано положение модифицируемой межнуклеотидной связи. Вертикальными стрелками указаны места стыковки олигонуклеотидов, лигируемых под действием карбодиимида или ДНК-лигазы. Пунктирными горизонтальными стрелками указано направление стимулируемой праймером гИрС транскрипции под действием

РНК-полимеразы

а б в

Рис. 2. Электрофоретический анализ в 20% ПААГ реакционных смесей при конструировании матриц "22(Р)" (а), "22(РР)" (б), "34(Р)" (в), "34(РР)" (г). Цифры слева - указывают положение олигонуклео-тидов соответствующей длины. ХС - положение красителя-маркера ксиленцианола

химическим "сшиванием" (лигированием) частично самокомплементарных 12- и 10-звенных олигонуклео-тидов водорастворимым карбодиимидом по ранее разработанным методикам [18]. Синтез 34-звенных матриц осуществлялся путем энзиматического лигирова-ния соответствующих 22-звенных фрагментов с олиго-нуклеотидом "р12Т". Продукты реакций выделяли электрофорезом в 15%-м ПААГ (рис. 2). Первичную структуру полученных олигонуклеотидов подтверждали секвенированием по Максаму-Гилберту [20].

Для доказательства наличия пирофосфатной связи в соединении "22(РР)" нами была использована пи-рофосфатаза из каллуса табака. Согласно литературным данным этот фермент способен гидролизовать Р1,Р3-дизамещенную трифосфатную группировку на 5'-конце мРНК [21], монозамещенные рибонуклеозид-5'-ди- и трифосфаты (ADP, ATP, ppGpp) [17]. Кроме того, в нашей лаборатории было показано [22], что субстратами фермента (хотя и с меньшей эффективностью) могут служить Р1-, Р2 -дизамещенные пиро-фосфаты дезокси ряда, в которых заместителями могут быть моно- или олигонуклеотидные фрагменты. Однако оптимальные условия гидролиза подобных соединений пока еще не найдены. Поэтому в настоящей работе при анализе соединения "22(РР)" были использованы предложенные ранее методики [16, 21] с незначительными изменениями. В частности, реакцию гидролиза проводили в условиях, способствующих денатурации двутяжевых комплексов (при повышенной температуре, 50°), с существенным увеличением времени инкубации (12-16 ч). Как показано на

рис. 3, 5'-[32Р]-меченое соединение "22(РР)" расщепляется с образованием 5'-[32Р]-меченого 12-звенного олигонуклеотида с эффективностью около 40%, в то время как "22(Р)" остается интактным. После выделения из реакционной смеси оставшегося нерасщеп-ленным "22(РР)" и повторной обработки пирофосфа-тазой наблюдается аналогичная картина расщепления. Неполное расщепление "22(РР)" может объясняться, с одной стороны, тем, что часть олигонуклеотида в этих условиях находится в составе дуплекса, который является плохим субстратом фермента, а с другой -относительно низкой активностью использованного препарата фермента, который, по-видимому, быстро инактивируется при повышенных температурах.

Для исследования матричных свойств модифицированных ДНК-дуплексов с пирофосфатными меж-нуклеотидными звеньями были проведены эксперименты по транскрипции, индуцируемой динуклеотид-ным праймером in vitro, на матрицах "22(РР)" и "34(РР)". В контрольных экспериментах использовали соответствующие природные матрицы-аналоги "22(Р)" и "34(Р)". Следует отметить, что РНК-поли-мераза в отсутствие сигналов транскрипции (промоторов) способна начинать транскрипцию только с конца матриц. Были выбраны условия "замедленной" транскрипции, при которых инициаторный динуклео-тидный праймер rUpC, комплементарный 3'-конце-вым участкам матриц, присутствует в высокой концентрации (0,1 мМ), а концентрация трифосфатов понижена (0,025 мМ) [23]. Типичные результаты

К а б в

! I

Рис. 3. Электрофоретический анализ в 20%-м ПААГ продуктов обработки олигонуклеотидов "22(Р)" (б) и "22(РР)" (г) пирофосфатазой из каллуса табака. Колонки а и в - соответствующие исходные соединения. Колонка "К" - смесь олигонуклеотидов - маркеров длины

а Ь н г с) а

ХС

ВРВ-4*

i' " ü-'i-'i-, " У- Ж'sfivi"-

Рис. 4. Электрофоретический анализ в 20%-м ПААГ продуктов транскрипции матриц "22(Р)" (а), "22(РР)" (б), "34(Р)" (в), "22(РР)" (г) под действием РНК-полимеразы в присутствии гИрС и смеси четырех ШТР после 15 мин инкубации. Колонки К1 и К2 - олигонуклеотиды-маркеры длины. Остальные обозначения указаны в подписи к рис.2

приведены на рис. 4 (а-г). Размер полученных транс-криптов во всех случаях свидетельствует о полном копировании матриц. Наблюдаемая гетерогенность продуктов связана с присоединением нескольких (в основном одного-двух) "нематричных" звеньев с 3'-конца, что характерно для РНК-полимеразы E. coli [9]. При этом не наблюдалось формирования укороченных продуктов, которые соответствовали бы остановке РНК-полимеразы вблизи пирофосфатных связей: 10-звенных в случае "22(РР)" и 22-звенных в случае "34(РР)".

Во всех случаях копирование модифицированных матриц происходило с меньшей эффективностью, чем в случае немодифицированных. Из кинетики накопления 22-звенных транскриптов (рис. 5) видно, что наибольшие различия для двух матриц наблюдаются в начальный период инкубации, в то время как на более поздних стадиях, по-видимому, происходит "насыщение" матриц РНК-продуктом с образованием гибридного РНК-ДНК-дуплекса, который не участвует повторно в реакции копирования.

Полученные результаты дают основание предполагать, что РНК-полимераза на некоторое время задерживается вблизи пирофосфатных звеньев без диссоциации промежуточного комплекса, а затем продолжает транскрипцию до конца матрицы. Однако такая остановка не может быть зафиксирована в условиях проведения эксперимента. По данным литературы период полужизни

50-

,а

g 2 а(

р (н к

н о и

н о

<а tr К

3

20"

и

"22(1')"

/

Г

Ü2(PP)"

К)

15

б

20' 15 ' 30

Рис. 5. Стимулируемая праймером гИрС транскрипция матриц "22(Р)" (а —в)и "22(РР)" (г — е): а - электрофоретический анализ реакционных смесей после 1, 3, 5 мин инкубации матриц "22(Р)" (а —в) и "22(РР)" (г — е) с РНК-полимеразой в присутствии гИрС и смеси гМТР; б - зависимость накопления полноразмерного продукта транскрипции матриц "22(Р)" и "22(РР)" от времени инкубации с РНК-полимеразой

остановленных вблизи модификаций комплексов может варьировать в диапазоне от нескольких секунд до нескольких десятков минут [4, 11].

Эти результаты аналогичны данным, полученным нами ранее для некоторых ДНК-полимераз [16]. Согласно этим данным, пирофосфатная группировка не препятствует процессу репликации, но при этом модифицированная матрица менее эффективна, чем ее природный аналог.

а

Таким образом, в настоящей работе показано, что ми группировками, что позволяет использовать такие РНК-полимераза E. coli способна транскрибировать модифицированные матрицы как аналоги природных ДНК-дуплексы с пирофосфатными межнуклеотидны- в экспериментах по тражкртц™.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 01-04-48616).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Nudler E. // J. Mol. Biol. 1999. 288. P. 1.

2. Uptain S., Kane C., ChamberlinM. // Ann. Rev. Biochem. 1997. 66.

P. 117.

3. Artsimovitch I., LandickR. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. 97.

P. 7090.

4. YangM.-T., Gardner J.F. // Nucl. Acids Res. 1991. 19. P. 1671.

5. АйвазашвилиВ.А., БибилашвилиР.Ш., ВартикянР.М., Кутате-

ладзе Т.А. // Молекул. биол. 1981. 15. С. 915.

6. Mote J., Reines D. // J.Biol.Chem. 1998. 273. P. 16843.

7. Lyer R.P., Roland A., Zhou W, Ghosh K.// Curr. Opin. Mol. Theor

1999. 1. P. 344.

8. Zhou W., Doetsch P.W. // Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 1993. 90.

P. 6601.

9. Liu J., Doetsh P. W. // Biochem. 1996. 35. P. 14999.

10. Viswanathan A., Doetsch P.W. // J. Biol. Chem. 1998. 273. P. 21276.

11. Liu J., Doetsch P.W. // Nucl. Acids Res. 1998. 26. P. 1707.

12. Shi Y., Gamper H., Van Houten B., Hearst J.E. // J. Mol. Biol. 1988. 199. P. 277.

13. Пурмаль А.А., Друца В.Л., Шабарова З.А. // Биоорг. хим. 1984.

10. С. 394.

14. Пурмаль А.А., Друца В.Л., Шабарова З.А. // Биоорг. хим. 1988.

14. С. 1183.

15. Пурмаль А.А., Виноградова М.Н., Елов А.А., Громова Е.С., Друца В.Л., Метелев В.Г., Холодков О.А., Бурьянов Я.И., Шабарова З.А., ПрокофьевМ.А. // ДАН СССР 1984. 276. С. 992.

16. ДруцаВ.Л., БеднарекП.З., Королева О.Н. // Биоорг хим. 1994.

20. С. 1206.

17. Shinshi H., Miwa M., Kato K., Nogushi M., Matsushima T., Sugima T. // Biochemistry. 1976. 15. P. 2185.

18. Королева О.Н., Потапов В.К., Грязнов С.М., Орецкая Т.С., Метелев В.Г., Шабарова З.А. // Молек. биол. 1986. 20. C. 489.

19. Маниатис Т., Фрич Э., СэмбрукД. // Молекулярное клонирова-

ние. М., 1984.

20. Maxam A.M., Gilbert W.// Meth. Enzymol. 1980. 65. P. 499.

21. Shimamoto K., Kodama Y., Hashimoto J., Miura K. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. 74. P. 2734.

22. ПурмальА.А. Дис. ... канд. хим. наук. М., 1984.

23. Королева О.Н., Друца В.Л., Шабарова З.А. // Биополимеры и клетка. 1985. 1. С. 307.

Поступила в редакцию 24.12.02

AN INVESTIGATION OF TRANSCRIPTION OF THE DNA MATRICES CONTAINING PYROPHOSPHATE INTERNUCLEOTIDE MOIETIES O.N. Koroleva, V.L. Drutsa

DNA fragments, containing pyrophosphate internucleotide groups, were prepared by chemical-enzymatic approach. The effects of this modification on transcription with RNA polymerase of Escherichia coli were studied. By in vitro transcription experiments it has been shown, that RNA polymerase could bypass pyrophosphate group, although the transcription of modified DNA fragments was less efficient then that of natural ones, indicating a possibility of a brief pausing of the enzyme at the modification site.