КОНЪЮГАТЫ ОЛИГОМЕРА ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЛИ ЕЕ СОЛИ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
CONJUGATES OF OLIGOMER OF HYALURONIC ACID OR SALT THEREOF, METHOD FOR PRODUCTION THEREOF AND USE THEREOF

Область техники
Настоящее изобретение относится к конъюгатам гиалуроновой кислоты или ее соли, способу их получения и их применению.
Посредством таких конъюгатов можно иммобилизировать олигомеры гиалуроновой кислоты с возможностью их высвобождения в их исходной, нативной форме.
Уровень техники
Гиалуроновая кислота представляет собой гликозаминогликан, состоящий из двух повторяющихся сахаридных циклов β-(1,3)-D-глюкуроновой кислоты и β-(1,4)-N-ацетил-D-глюкозамина.
4
6
-1
Она характеризуется высокой молекулярной массой от 5⋅10 до 5⋅10 г⋅моль, которая зависит от способа ее выделения и исходного материала. Этот очень гидрофильный полисахарид является водорастворимым в форме соли во всем диапазоне pH. Он образует часть соединительных тканей, кожи, синовиальной жидкости суставов, он играет важную роль в ряде биологических процессов, таких как гидратация, организация протеогликанов, клеточная дифференцировка, пролиферация и ангиогенез.
Связывание олигомеров гиалуроновой кислоты (ГК)
Как указано выше, нативная гиалуроновая кислота является линейным полисахаридом, который разлагается в организме достаточно быстро. Первые весомые попытки получения гиалуроновой кислоты с разветвленной структурой были описаны в 2008 г. Toemmeraase K. (WO 2008/014787). Этот документ относится к связыванию аминогруппы деацетилированной гиалуроновой кислоты с высокой молекулярной массой с концевым аномерным центром олигомера гиалуроновой кислоты посредством восстановительного аминирования. Авторы другого патентного документа, Hacker М., Saraf A., Mikos A.G., WO 2008/115799, действовали аналогичным образом в случае связывания концевого аномерного центра олигомера ГК с полиэтиленимином. Для обеспечения сильной связи используют восстановительное аминирование, которое превращает аминогликозиды в гидролитически очень устойчивые вторичные амины. Реакция происходит в слабоосновной среде и при повышенной температуре, и цианоборгидрид натрия используют в качестве восстанавливающего средства. Полученные конъюгаты использовали для инкапсуляции ДНК или мезенхимальных стволовых клеток, причем только гексамер указывают в качестве олигомера гиалуроновой кислоты. Другая возможность была раскрыта в статье в Eur. J. Org. Chem. 2011, 5617-25. Здесь аминогруппа образуется в положении 6 глюкозаминной части олигомера ГК, причем аминогруппа затем реагирует при умеренных условиях с NHS-сложными эфирами карбоновых кислот, связанных с углеродными нанотрубками. Связывание концевого аномерного центра гиалуроновой кислоты с низкой молекулярной массой посредством диамино- или полиаминолинкера при помощи восстановительного аминирования раскрыто Xu (WO 2007/101243). Полученные субстраты использовали для инкапсулирования активных веществ. Другая возможность была раскрыта Carter (US 2012/0277416), где фосфолипиды связывали с концевым аномерным центром олигомера ГК. На первой стадии производное олигомера с амином в положении 1 получали посредством восстановительного аминирования, затем его конъюгировали с активной карбоксильной группой фосфолипида. Полученные конъюгаты проявляли широкий диапазон биологических активностей. Аналогичная процедура связывания с олигомером ГК с аминогруппой на восстановленном аномерном конце была опубликована Siiskonen в 2013 г., где маркер 2-аминоакридон связывали. Указанный конъюгат использовали для изучения биораспределения фрагментов гиалуроновой кислоты в цитозоле.
Недостатком вышеуказанных способов является тот факт, что они обеспечивают образование конъюгатов олигомеров или полимеров ГК, которые не позволяют их дальнейшее высвобождение в нативной форме. Причиной этого является тот факт, что все известные на данный момент способы связывания аминов с концевым аномерным центром связаны с восстановлением, т.е. с необратимым изменением концевого цикла, который остается навсегда открытым и не позволяет обратное высвобождение олигомера в нативной форме. Ситуация показана на следующей схеме 1:
Объект настоящего изобретения
Вышеуказанные недостатки преодолеваются конъюгатами олигомеров ГК с общими формулами I, II, III или IV согласно настоящему изобретению, которые позволяют такое обратное высвобождение олигомеров ГК в нативной форме.
Объектом настоящего изобретения является конъюгат олигомера гиалуроновой кислоты или ее соли, соответствующий любой из общих формул I, II, III или IV,
или
где
3
6
2
R представляет собой COOR или CHOH,
4
3
R представляет собой OH или NHCOCH,
6
+
+
+
2+
+
R представляет собой H или выбран из группы, содержащей любой из ионов щелочных металлов или ионов щелочноземельных металлов, предпочтительно Na, K, Mg или Li;
5
1
30
1
30
1
30
R выбран из группы, содержащей C-Cалкил, C-Cалкиларил или C-Cалкилгетероарил, необязательно содержащий один или несколько одинаковых или различных гетероатомов, выбранных из группы, содержащей N, O, S,
X представляет собой O или NH-группу;
3
6
4
1
2
когда R представляет собой COOR, тогда R представляет собой OH, R представляет собой H, R представляет собой остаток олигомера гиалуроновой кислоты;
3
4
2
1
2
3
когда R представляет собой CHOH, тогда R представляет собой NHCOCH, R представляет собой OH, R представляет собой остаток олигомера гиалуроновой кислоты;
4
6
-1
5
-1
субстрат представляет собой полисахарид, предпочтительно он выбран из группы, содержащей гиалуроновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль с молекулярной массой в диапазоне от 10 до 10 г⋅моль, предпочтительно 10 г⋅моль.
Структура полученных конъюгатов зависит в большой степени от характера заместителя X. Если X представляет собой кислородный мостик -O-, в основном присутствует иминоформа. Если X представляет собой азотный мостик -NH-, преобладающей формой является амино с бета-конфигурацией.
Остаток олигомера гиалуроновой кислоты в конъюгате согласно настоящему изобретению имеет 1-17 сахаридных циклов, причем сахаридный цикл выбран из группы, состоящей из β-(1,3)-D-глюкуроновой кислоты и β-(1,4)-N-ацетил-D-глюкозамина.
2
2
1
30
1
30
1
30
5
5
Согласно другому варианту осуществления конъюгаты олигомера гиалуроновой кислоты с общими формулами I и II, определенными выше, можно получать способом настоящего изобретения, сущностью которого является то, что на первой стадии олигомер гиалуроновой кислоты реагирует на его концевом аномерном центре в положении 1 с избытком диаминолинкера общей формулы HN-X-R-X-NH, где R выбран из группы, содержащей C-Cалкил, C-Cалкиларил или C-Cалкилгетероарил, который необязательно содержит один или несколько одинаковых или различных гетероатомов, выбранных из группы, содержащей N, О, S, а X представляет собой O или NH-группу; в слабо кислой среде при pH в диапазоне от 3 до 6,99, предпочтительно при pH в диапазоне от 3 до 6, более предпочтительно от 5 до 6, после чего выделяют конъюгаты олигомера гиалуроновой кислоты-диаминолинкера с общими формулами V и VI
1
6
где заместители R-R являются такими, как определено выше.
Осуществление первой стадии реакции показано на схеме 2 ниже.
Схема 2:
Реакция происходит при избытке диаминолинкера, который статистически исключает в значительной мере модификацию на обоих концах линкера.
2
4
Неожиданно обнаружили, что данная реакция происходит только в присутствии некоторого количества слабой кислоты и воды. Если условия были нейтральными или основными, никакой успешной реакции не наблюдали. Если присутствовала сильная кислота, такая как HCl или HSO, происходило разложение олигомеров ГК.
Слабокислотную среду с pH в диапазоне от 3 до 6,99 обеспечивают добавлением карбоновой кислоты в реакционную среду, предпочтительно уксусной кислоты, пропановой кислоты или молочной кислоты, более предпочтительно уксусной кислоты.
Количество кислоты находится в диапазоне от 5 до 30 эквивалентов, предпочтительно в диапазоне от 10 до 15 эквивалентов, относительно мольного количества дисахарида гиалуроновой кислоты в качестве субстрата.
Кроме того, количество диаминолинкера находится в диапазоне от 5 до 30 эквивалентов, предпочтительно 10 эквивалентов, относительно мольного количества дисахарида гиалуроновой кислоты в качестве субстрата.
Кроме того, первая стадия происходит при температуре от 10 до 40°C, предпочтительно при температуре 20°C, в течение 24-150 часов, предпочтительно 60-80 часов.
Затем происходит вторая стадия реакции, на которой конъюгаты олигомера гиалуроновой кислоты - диаминолинкера с общими формулами V и VI, как определено выше, реагируют по меньшей мере с одной альдегидной группой субстрата в воде или в смеси воды и смешиваемого с водой органического растворителя, который выбран из группы, содержащей этанол, изопропанол, метанол или диметилсульфоксид.
Кроме того, вторую стадию проводят при температуре от 10 до 40°C, а также предпочтительно при 20°C, в течение 24-150 часов, предпочтительно 60-80 часов.
3
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления способа настоящего изобретения конъюгаты олигомера гиалуроновой кислоты - диаминолинкера, соответствующие общим формулам V и VI, как определено выше, приводят в реакцию в соответствии со способом и условиями, указанными выше, с по меньшей мере одной альдегидной группой субстрата в присутствии восстанавливающего средства, которое предпочтительно выбрано из группы, содержащей цианоборгидрид (NaBHCN) или пиколинборан, с образованием конъюгатов с общими формулами III и IV, где субстрат связывается гидролитически очень сильной связью.
Количество восстанавливающего средства находится в диапазоне от 0,1 до 5 эквивалентов, предпочтительно 3 эквивалентов, относительно мольного количества дисахарида гиалуроновой кислоты.
Обе вышеописанные возможности связывания субстрата путем аминирования или восстановительного аминирования показаны на схеме 3
Схема 3
Неожиданно, что при восстановительном аминировании, при котором образуются конъюгаты с общими формулами III и IV (смотрите схему выше), восстановление происходит по существу только по связи субстрат-линкер, что происходит из-за компромиссных условий, таких как температура реакции, время, количество восстанавливающего средства, и не наблюдали восстановления связи олигомер-линкер, которая также в принципе имеет характер восстановительного имина.
Попытки связывания концевого аномерного центра олигомера ГК с конъюгатом субстрата-линкера не были успешными даже при более высоких температурах, когда происходило расщепление олигомеров ГК
Таким образом, при получении конечного конъюгата необходимо связывать двухфункциональный линкер сначала с олигомером.
Из вышеуказанных фактов следует, что при получении конъюгатов согласно настоящему изобретению, было необходимо найти условия реакции, которые наконец нашли в относительно узком диапазоне (pH в области слабой кислоты, осторожное восстановление…). Конечные конъюгаты с общими формулами I, II, III, IV обеспечивают при сравнении с растворами, известными до этого, высвобождение олигомеров гиалуроновой кислоты в их исходной нативной форме, что важно в отношении их биологической активности. Необходимое условие состоит в том, чтобы субстрат содержал альдегидные группы, которые можно достаточно легко получать химической модификацией, например, окислением в случае полисахаридов, содержащих OH-группы.
Реализация решений, раскрытых в настоящем изобретении, не является сложной технологически и не требует использования дорогостоящих химических веществ, растворителей или процедур выделения.
Как уже описано выше, конъюгат согласно настоящему изобретению обеспечивает высвобождение:
Возможность обратимой иммобилизации является очень важной в случаях, где необходимо сохранять исходную структуру олигомеров ради их биологической активности или биосовместимости. Известно, что некоторые типы олигомеров ГК проявляют биологическую активность, например, к раковым клеткам. Полученные системы проявляли повышенную биологическую активность относительно выбранных линий раковых клеток.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения конъюгаты с общими формулами I-IV, как определено выше, предпочтительно используют в качестве носителей биологически активных олигомеров в фармацевтике и биомедицине, или возможно их использовать для получения материалов с противораковым действием.
+
+
+
+
Выражение «фармацевтически приемлемая соль» при использовании в настоящем документе означает соли конъюгатов ГК согласно настоящему изобретению, которые безопасны и эффективны для применения в организме и характеризуются желаемой биологической активностью. Фармацевтически приемлемые соли включают предпочтительно ионы щелочных металлов или щелочноземельных металлов, более предпочтительно Na, K, Mg или Li.
Выражение «полисахарид» означает полисахарид, такой как гиалуроновая кислота, ее фармацевтически приемлемая соль, крахмал, гликоген, целлюлоза и пр., которые содержат по меньшей мере одну альдегидную группу после окисления их OH-групп.
Выражение «конъюгат» означает соединение, которое образуется путем связывания двух или более химических соединений посредством ковалентной связи. Конъюгат согласно настоящему изобретению образуется путем связывания олигомера ГК и линкера, давая конъюгат олигомера ГК-линкера, а затем путем их связывания с субстратом, т.е. полисахаридом, предпочтительно гиалуроновой кислотой, при этом образуя конъюгат олигомера ГК-линкера-субстрата.
Выражение «олигомер гиалуроновой кислоты» означает олигомер гиалуроновой кислоты, содержащий попеременно повторяющиеся сахаридные циклы β-(1,3)-D-глюкуроновой кислоты и β-(1,4)-N-ацетил-D-глюкозамина. Предпочтительно, число сахаридных циклов составляет от 2 до 18.
Выражение «остаток олигомера гиалуроновой кислоты» означает по меньшей мере один сахаридный цикл олигомера гиалуроновой кислоты, который представляет собой β-(1,4)-N-ацетил-D-глюкозамин или β-(1,3)-D-глюкуроновую кислоту.
Когда концевой сахаридный цикл, связанный с линкером посредством его аномерного центра, представляет собой β-(1,3)-D-глюкуроновую кислоту, указанный сахаридный цикл представляет собой β-(1,4)-N-ацетил-D-глюкозамин.
Когда концевой сахаридный цикл, связанный с линкером посредством его аномерного центра, представляет собой β-(1,4)-N-ацетил-D-глюкозамин, указанный сахаридный цикл представляет собой β-(1,3)-D-глюкуроновую кислоту.
Когда остаток олигомера гиалуроновой кислоты содержит более одного сахаридного цикла, сахаридные циклы β-(1,3)-D-глюкуроновой кислоты и β-(1,4)-N-ацетил-D-глюкозамина повторяются попеременно.
Выражение «избыток» означает количество диаминолинкера, которое больше, чем один эквивалент, относительно мольного количества дисахарида гиалуроновой кислоты в качестве субстрата.
Выражение «выделяют» означает, что после окончания реакции реакционную смесь нейтрализуют и осадившийся продукт реакции отфильтровывают и сушат.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 показан ход ингибирования роста иммортализованных раковых клеток в процентах относительно непораженного контроля.
Примеры
Выражение эквивалент (экв.), используемое в настоящем документе, относится к дисахариду гиалуроновой кислоты, если не указано другое. Проценты означают массовые проценты, если не указано другое.
4
6
-1
Молекулярная масса исходной гиалуроновой кислоты (источник: CPN spol. s r.o., Долни Доброуч, Чехия) представляет собой среднемассовую молекулярную массу в диапазоне от 10 до 10 г⋅моль и была измерена SEC-MALS.
Олигомеры гиалуроновой кислоты, содержащие 2-18 сахаридных циклов, получали путем ферментативного разложения полимера с высокой молекулярной массой.
DS = степень замещения = 100% * (мольное количество связанного замещенного или модифицированного дисахарида) / (мольное количество всех дисахаридов)
Пример 1. Получение ГК-альдегида, окисленного в положении 6 глюкозаминовой части
Окисление гиалуроновой кислоты
3
3
Водный раствор NaClO (0,5 экв.) постепенно добавляли в однопроцентный водный раствор гиалуроновой кислоты (1 г, 200 кДа), содержащий 1% NaCl, TEMPO (0,01 экв.) и NaHCO (5 экв.), в атмосфере азота. Смесь перемешивали в течение 12 часов при температуре 0°C, затем 0,1 г этанола добавляли и смесь перемешивали еще 1 час. Полученный раствор затем разбавляли дистиллированной водой до 0,2% и диализировали относительно смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO) 3 раза по 5 литров (раз в день) и относительно дистиллированной воды 7 раз по 5 литров (дважды в день). Затем полученный раствор выпаривали и анализировали.
DS 10% (определенный из ЯМР)
1
2
2
H-ЯМР (DO) 5,26 (s, 1H, полимер-CH(OH))
2
2
1
13
HSQC (DO) перекрестный сигнал 5,26 частей на миллион (H) - 90 частей на миллион (C) (полимер-CH(OH))
Пример 2. Получение конъюгата октасахарида ГК (ГК-8) с дигидразидадипатом
3
Октасахарид ГК растворяли в воде в концентрации 5%. Затем добавляли дигидразидадипат (6 эквивалентов) и уксусную кислоту (15 эквивалентов) и смесь перемешивали при температуре 20°C в течение 72 часов при pH 4. Полученную смесь нейтрализовали при помощи NaHCO и повторно осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.
1
2
H-ЯМР (DO) 4,24 (d, J=9,7 Гц, 1H, -O-CH-NH-бета), нет сигнала исходного концевого аномерного центра (-O-CH-OH альфа)
Пример 3. Получение конъюгата трисахарида ГК (ГК-3) с дигидразидадипатом
3
Трисахарид ГК (оканчивающийся глюкуроновой кислотой) растворяли в воде в концентрации 7%. Затем добавляли дигидразидадипат (25 эквивалентов) и уксусную кислоту (25 эквивалентов) и смесь перемешивали при температуре 10°C в течение 150 часов при pH 6. Полученную смесь нейтрализовали при помощи NaHCO и повторно осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.
1
2
H-ЯМР (DO) 4,11 (d, J=8,8 Гц, 1H, -O-CH-NH-бета), нет сигнала исходного концевого аномерного центра (-O-CH-OH альфа)
Пример 4. Получение конъюгата октадека ГК (ГК-18) с дигидразидадипатом
3
Октадекасахарид ГК (оканчивающийся глюкозамином) растворяли в воде в концентрации 5%. Затем добавляли дигидразидадипат (15 эквивалентов) и уксусную кислоту (20 эквивалентов) и смесь перемешивали при температуре 40°C в течение 24 часов при pH 5. Полученную смесь нейтрализовали при помощи NaHCO и повторно осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.
1
2
H-ЯМР (DO) 4,10 (d, J=8,7 Гц, 1H, -O-CH-NH-бета).
Пример 5. Получение конъюгата декасахарида ГК (ГК-10) с O,O'-1,3-пропандиилбисгидроксиламином
3
Декасахарид ГК растворяли в воде в концентрации 3%. Затем добавляли O,O'-1,3-пропандиилбисгидроксиламин (5 эквивалентов) и молочную кислоту (5 эквивалентов) и смесь перемешивали при температуре 20°C в течение 100 часов при pH 6. Полученную смесь нейтрализовали при помощи NaHCO и повторно осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.
1
2
H-ЯМР (DO) 7,53 (d, J=5,3 Гц, 1H, -O-CH=N-Z-изомер), 6,89 (d, J=6,0 Гц, 1H, -O-CH=N-Е-изомер).
Пример 6. Получение конъюгата тетрасахарида ГК (ГК-4) с терефталоилдигидразидом
3
Тетрасахарид ГК растворяли в воде в концентрации 3%. Затем добавляли терефталоилдигидразид (5 эквивалентов) и пропановую кислоту (6 эквивалентов) и смесь перемешивали при температуре 20°C в течение 100 часов при pH 6. Полученную смесь нейтрализовали при помощи NaHCO и повторно осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.
1
2
H-ЯМР (DO) 4,12 (d, J=8,8 Гц, 1H, -O-CH-NH-бета).
Пример 7. Связывание конъюгата ГК-8 - дигидразидадипата (пример 2) с гиалуроновой кислотой, окисленной в положении 6 до альдегида (пример 1), восстановительным аминированием
5
-1
0,01 г конъюгата, полученного согласно примеру 2, растворяли в воде в концентрации 2%. Затем добавляли 0,01 г производного гиалуроновой кислоты, содержащего альдегид (молекулярная масса 6×10 г⋅моль), и 5 эквивалентов пиколинборана. Смесь перемешивали при температуре 20°C в течение 24 часов. Полученную смесь осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.
1
2
2
H-ЯМР (DO) 2,85, 3,12 (m,m диастереотопическая пара, 2H, -NH-CH-полимер)
2
DOSY-ЯМР (DO) 4,24 (d, J=9,7 Гц, 1H, -O-CH-NH-бета) имел такую же подвижность, как гиалуроновая кислота с высокой молекулярной массой, и сигналы диастереотопических водородов 2,85 и 3,12.
Пример 8. Связывание конъюгата ГК-3 - дигидразидадипата (пример 3) с гиалуроновой кислотой, окисленной в положении 6 до альдегида (пример 1), восстановительным аминированием
4
-1
0,01 г конъюгата, полученного согласно примеру 3, растворяли в воде в концентрации 2%. Затем добавляли 0,01 г производного гиалуроновой кислоты, содержащего альдегид (молекулярная масса 2×10 г⋅моль), и 0,3 эквивалента цианоборгидрида натрия. Смесь перемешивали при температуре 10°C в течение 72 часов. Полученную смесь осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.
1
2
2
H-ЯМР (DO) 2,89, 3,04 (m,m диастереотопическая пара, 2H, -NH-CH-полимер)
2
DOSY-ЯМР (DO) 4,11 (d, J=8,8 Гц, 1H, -O-CH-NH-бета) имел такую же подвижность, как гиалуроновая кислота с высокой молекулярной массой, и сигналы диастереотопических водородов 2,89 и 3,04.
Пример 9. Связывание конъюгата ГК-8 - дигидразидадипата (пример 2) с гиалуроновой кислотой, окисленной в положении 6 до альдегида (пример 1), без восстановления
4
-1
0,1 г конъюгата, полученного согласно примеру 2, растворяли в смеси воды / ДМСО в отношении 1/1 в концентрации 2%. Затем добавляли 0,1 г производного гиалуроновой кислоты, содержащего альдегид (молекулярная масса 2×10 г⋅моль). Смесь перемешивали при температуре 20°C в течение 72 часов. Полученную смесь осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.
1
2
H ЯМР (DO) 7,48 (m, 1H, -N=CH-полимер)
2
DOSY-ЯМР (DO) 4,24 (d, J=9,7 Гц, 1H, -O-CH-NH-бета) имел такую же подвижность, как гиалуроновая кислота с высокой молекулярной массой, и сигнал 7,48.
Пример 10. Связывание конъюгата ГК-18 - дигидразидадипата (пример 4) с гиалуроновой кислотой, окисленной в положении 6 до альдегида (пример 1), без восстановления
4
-1
0,1 г конъюгата, полученного согласно примеру 4, растворяли в воде в концентрации 2%. Затем добавляли 0,1 г производного гиалуроновой кислоты, содержащего альдегид (молекулярная масса 2×10 г⋅моль). Смесь перемешивали при температуре 10°C в течение 100 часов. Полученную смесь осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.
1
2
H-ЯМР (DO) 7,47 (m, 1H, -N=CH-полимер)
2
DOSY-ЯМР (DO) 4,25 (d, J=9,7 Гц, 1H, -O-CH-NH-бета) имел такую же подвижность, как гиалуроновая кислота с высокой молекулярной массой, и сигнал 7,47.
Пример 11. Связывание конъюгата ГК-10 - O,O'-1,3-пропандиилбисгидроксиламина (пример 5) с гиалуроновой кислотой, окисленной в положении 6 до альдегида (пример 1), без восстановления
4
-1
0,01 г конъюгата, полученного согласно примеру 5, растворяли в воде в концентрации 2%. Затем добавляли 0,01 г производного гиалуроновой кислоты, содержащего альдегид (молекулярная масс 2×10 г⋅моль). Смесь перемешивали при температуре 20°C в течение 48 часов. Полученную смесь осаждали посредством изопропилового спирта. Готовый твердый продукт сушили под вакуумом.
2
DOSY-ЯМР (DO) 7,53 (d, J=5,3 Гц, 1H, -O-CH=N-Z-изомер), 6,89 (d, J=6,0 Гц, 1H, -O-CH=N-Е-изомер) имел такую же подвижность, как гиалуроновая кислота с высокой молекулярной массой.
Пример 12. Биологическое тестирование конъюгата, полученного согласно примеру 8
Определение жизнеспособности линии А2058 после обработки конъюгатом, полученным согласно примеру 8.
2
Клеточную линию, культивируемую при стандартных условиях (средний DMEM с 10% FBS, 37°C, 5% CO), высеивали в 4 96-луночных культуральных планшета с плотностью 5000 клеток на лунку и инкубировали в 200 мкл среды в течение 24 часов. Затем культуральную среду заменяли на свежую среду, содержащую конъюгат (пример 8) в концентрациях 1000, 100 и 10 мкг/мл. Среду для контрольных клеток заменяли на свежую среду без конъюгата. Сразу после обработки жизнеспособность клеток измеряли в первом планшете посредством МТТ-теста. Вкратце, 20 мкл раствора МТТ (5 мг/мл) добавляли к клеткам и вместе их инкубировали в течение 2,5 часов в темноте при 37°C. После инкубации культуральную среду отсасывали и монослой клеток лизировали смесью ДМСО и изопропанола (1:1) с 10% Triton Х-100. Полученный цвет в отдельных лунках планшета измеряли посредством спектрометра для планшетов (оптическая плотность при 570 нм с поправкой при 690 нм). Это измерение повторяли на других планшетах также каждые 24 часа. Конечную жизнеспособность рассчитывали как отношение оптической плотности образца в данное время и во время T0.
А2058 представляет собой иммортализованную клеточную линию, полученную из меланомы человека, она очень инвазивна, и по этой причине ее часто используют в качестве модели онкогенеза и метастазирования.
Результаты ингибирования роста клеток в процентах показаны на фиг. 1, где ясно, что ингибирование роста клеток повышается по экспоненте со временем из-за воздействия конъюгата согласно настоящему изобретению.