Способ получения гидроксиапатит-коллагенового композита
METHOD FOR HYDROXYAPATITE-COLLAGENE COMPOSITE PRODUCTION

Изобретение относиться к медицине, в частности к восстановительной хирургии, а точнее к способу получения материала в виде гидроксиапатит-коллагенового биокомпозита, пригодного, например, для заполнения костных дефектов и/или формирования костных имплантатов с заранее заданными размерами и формой.
3
Задача решается гомогенизацией гидроксиапатит-коллагеновой смеси в ультразвуковом поле с частотой (22÷44) кГц, плотностью мощности (1÷10) Вт/см в течение (10÷100) с. Из полученного продукта формируют тело и подвергают лиофильной сушке с образованием биокомпозита пористой структуры с заданными размерами и формой.
Успех любой костно-пластической операции во многом определяется качеством используемого для пластики материала. Поиски такого материала продолжаются по настоящее время, приводя к появлению аллотрансплантатов - имплантов из композиции костной стружки с цианакрилатом, ускоренно полимеризующимся под действием ультразвуковых хирургических инструментов (Николаев Г.А., Лощилов B.И. Ультразвуковая технология в хирургии. М., "Медицина", 1980. - 271 C., Лукьяновский В.А., Белов А.Д, Беляков И.М. "Болезни костной системы животных" М., "Колос", 1984, 256 с.), коммерчески выпускаемых ксеноимплантатом - материалов, полученные из костей крупного рогатого скота ("Endobon" (Германия), "Bio-Oss" (Швейцария), "OsteoGraf N" (США) и ряда других (Островский, А.В. Остеопластические материалы в современной пародонтологии и имплантологии. Новое в стоматологии. 1999. №6. С. 39-52). В клинической практике используются также композиционные материалы на основе гидроксиапатита и бычьего коллагена («Колаост», «Гапкол», «Колапол») как в России (Абоянц Р.К., Истранов Л.П., Истранова Е.В., Курдюмов С.Г. Изделия из коллагена с гидроксиапатитом, Клинический опыт и проблемы коллагенопластики. М., 1999, с. 165-187), так и за рубежом ("Biostite", "Collagraft").
В качестве недостатков этих материалов отмечается возникающие в некоторых случаях аллергические реакции (Абоянц Р.К., Истранов Л.П., Истранова Е.В., Курдюмов С.Г. Изделия из коллагена с гидроксиапатитом, Клинический опыт и проблемы коллагенопластики. М., 1999. С. 165-187), причем не выяснена причина их возникновения, поскольку до настоящего времени состав композитов недостаточно изучен.
Широкое использование аллотрансплантатов, наиболее часто применяемых в настоящее время в клинике, сопряжено с целым рядом недостатков. Среди основных - технические и экономические сложности, связанные с забором, стерилизацией, консервацией, транспортировкой трупного материала; значительное снижение механической прочности пересаженной кости; возможное нагноение, встречающееся в среднем в 4-10% случаев (Имамалиев А.С. Гомопластика суставных концов костей. Изд. 2, 1975. 304 с.). В связи с этим в настоящее время проводится интенсивный поиск новых материалов, пригодных для замещения костных дефектов. Разрабатываются и апробируются имплантанты из различных сплавов металлов, пластмасс, керамики, углерода и др.
При современном развитии оперативной техники требуются материалы, обладающие высокой остеогенной потенцией, способные к биодеградации и замещению новообразованной костной тканью. Создаваемые остеоиндуктивные материалы должны быть просты в получении, постоянно доступны и в удобной для клинического применения консистенции, что позволяло бы хирургу заполнять зоны дефектов различной конфигурации.
Сравнение результатов лечения костной патологии с замещением дефекта деминерализованным матриксом и препаратами на основе гидроксиапатита в клинической практике показало преимущество препаратов на основе гидроксиапатита.
Задача соответствия требованиям остеопластики решается в достаточной степени созданием пористого композита из синтетического гидроксиапатита и коллагена. Такой композит относительно легко стандартизуем, а его пористая структура позволяет нагрузить его требуемыми в каждом конкретном случае лекарственными веществами.
Существует множество способов приготовления коллаген-гидроксиапатитовых или подобных комплексов.
Так, например, пористые гранулы с регулируемым размером частиц для регенерации костной ткани получают из смеси ортофосфата магния и биологического гидроксиапатита из деминерализованных костей крупного рогатого скота, а также 1-3%-ный раствора альгината натрия в дистиллированной воде и отверждаемого насыщенным раствором хлорида кальция. Авторы утверждают, что полученные гранулы обладают биосовместимостью, биодеградабельностью, остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами и способны полностью замещаться костной тканью. (Полежаева Л.К. Пористые микросферы на основе биофосфатов кальция и магния с регулируемым размером частиц для регенерации костной ткани. Патент РФ №2497548, 2013).
A.R. Vaccaro предложил биоинженерную конструкцию для замещения костных дефектов из пористых матриксов гранулированных биокерамических материалов на основе гидроксиапатита или из натуральных кораллов Acropora sp., Porites sp, насыщенных культурой аутологичных мультипотентных клеток, выделенных из костного мозга (Vaccaro A.R. The Role of the Osteoconductive Scaffold in Synthetic Bone Graft // Orthopedics, 2002, V. 25, №5, Suppl., P. s571-s578; Louisia S., Stromboni M., Meunier A., Sedel L, Petite H. Coral grafting supplemented with bone marrow. J Bone Joint Surg [Br], 1999; V. 81-B, №4, P. 719-724). Однако биокерамические материалы в организме плохо рассасываются, и их остатки оказываются замурованными в костную ткань, что делает ее менее прочной (Сергеева Н.С., Франк Г.А., Свиридова И.К., Кирсанова В.А., Ахмедова С.А., Антохин А.И. Роль аутогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в тканеинженерных конструкциях на основе натуральных кораллов и синтетических биоматериалов при замещении костных дефектов у животных. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2009, т. IV, №4, с. 56-64). Кроме того, керамику на основе гидроксиапатита можно использовать только для замещения участков костей, не несущих значительных механических нагрузок, что обусловлено хрупкостью материала и его высокой чувствительностью в напряженном состоянии к биокоррозии в физиологических жидкостях организма, приводящей к разрушению имплантата (Баринов С.М. Керамические и композиционные материалы на основе фосфатов кальция для медицины. Успехи химии, 2010, 79(1), с. 15-32). Высокая пористость естественных кораллов обусловливает хрупкость материала. По этой причине, подобные конструкции рекомендовано использовать либо для восстановления дефектов губчатой костной ткани, либо в сочетании с металлическими пластинами, несущими опорную функцию (Demers С., Hamdy C.R., Corsi K., Chellat F., Tabrizian M., Yahia L. Natural coral exoskeleton as a bone graft substitute: A review. Bio-Medical Materials and Engineering, 2002, V. 12, №1, P. 15-35).
Баринов С.М. и др. предложили использовать для замещения дефектов костной ткани пористый композиционный материал, содержащий хитозан и трикальцийфосфатные наполнители в виде гранул или порошка из брушита, монетита, тетракальцийфосфата, гидроксиапатита, карбонатгидроксиапатита или их смеси. По утверждению авторов, биокомпозит обеспечивает заполнение костных дефектов различной формы и размера, а содержащиеся в губке кальцийфосфатные наполнители совместно с хитозаном создают благоприятные условия для формирования естественной костной ткани человека. (Баринов С.М., Смирнов В.В., Федотов А.Ю., Комлев В.С., Фадеева И.В., Сергеева Н.С., Свиридова И.К., Кирсанова В.А., Ахмедова С.А. Пористый композиционный материал на основе хитозана для заполнения костных дефектов. Патент RU №2412711, 2011).
Анализ известных данных о материалах для заполнения дефектов костей свидетельствует, что наиболее востребованным является пористый биокомпозит, содержащий коллаген и гидроксиапатит. Получают его синтезом гидроксиапатита на гидрогелевой коллагеновой матрице и сшивкой волокон коллагена. Процесс удобно реализовать в гидродинамическом диспергаторе роторно-пульсационного типа в процессе последовательной загрузки компонентов, после чего материал может быть залит в форму и лиофильно высушен (Горшенев В.Н., Телешев А.Т., Ершов Ю.А., Казиев Г.З., Колесов В.В., Склянчук Е.Д. Способ получения пористого костного биокомпозита. Патент РФ №2482880, 2012).
Композиционный материал для восстановления дефектов костной ткани получают, также смешивая реконструированный коллаген с водным раствором глюкозы, до набухания с последующим нагреванием до 35-45°С, гомогенизируя полученную суспензию, добавляя суспензию наногидроксиапатита в водном растворе глюкозы с последующей гомогенизацией полученного композита и стерилизацией композиционного материала (Сафоян А.А., Нестеренко В.Г., Суслов А.П., Нестеренко С.В. Композиционный материал для восстановления дефектов костной ткани. Способ его получения и применение. Патент РФ №2476236, 2012).
Предложена инъекционная композиция для костной пластики, включающая коллаген и гидроксиапатиты, водорастворимые производные целлюлозы и воду, а также, при необходимости, антибиотик или антисептик (Басченко Ю.В., Маклакова И.А., Багров С.Н. Патент РФ №2155049, 2000).
Следует, однако, отметить, что процесс образования костной ткани еще не до конца исследован. В частности, до сих пор неясно, какое влияние оказывает коллаген на процесс биоминерализации. К настоящему времени исследователи сходятся во мнении, что на процесс биоминерализации в основном влияют неколлагеновые белки, а коллаген выполняет, главным образом, роль каркаса. Полагают также, что коллаген не только исполняет роль каркаса при образовании костной ткани, но и "управляет" этим процессом (Nudelman F., Pieterse K., George A., Bomans P.Н.Н., Friedrich Н., Brylka L.J., Hilbers P.A.J., Gijsbertus de With& Sommerdijk N.A.J. M. The role of collagen in bone apatite formation in the presence of hydroxyapatite nucleation inhibitors. Nature Materials 2010 9, p. 1004-1009).
Микрогранулы удобно получать ультразвуковым диспергированием раствора коллагена в вазелиновое масло и последующим обезжириванием микрогранул (Сапожникова А.И., Акопян В.Б., Каспарьянц С.А., Смирнова Л.П., Дьяконова Е.Б. Способ получения микроносителей для культивирования клеток. Патент РФ №2007451, 1994). Метод содержит нежелательную стадию, связанную с применением масла, требующую его последующей отмывки, однако, может быть полезен в сочетании с известными приемами получения биокомпозитов.
Новые способы получения и применения биокомпозитов для восстановления дефектов костной ткани увеличивают необходимое разнообразие существующих методов и материалов, что облегчает выбор наиболее подходящего из них для решения той или иной конкретной задачи остеопластики (Huc A.R., Allard R.L., Christian L. Chavrier Method of preparing collagen products US 4451397 A, 1982, E.P., Fuhge P. Process for the production of a bonded collagen fiber sheet US 4621631 A, 1986; Nevo Z., Itay S. Repair of cartilage and bones, US 4642120 A, 1987; Schmidt K. Complex for inducing bone growth in the mastoid cavity US 5916553 A; Lynn L.H. Huang, Gin-Mol Liu Process for preparing porous collagen matrix from connective tissue US 7498412 B2, 2009, Sommerich R.E., Macomber. R. Collagen device and method of preparing the same US 8795710 B2. 2008, Schaufler A. Method of preparing a collagen sponge, a device for extracting a part of a collagen foam, and an elongated collagen sponge US 20020153632 A1 и ряд других).
Имеющиеся данные свидетельствуют также об активирующем влиянии внутримышечных инъекций суспензии аллогенного ГАП на метаболизм соединительной ткани, основным компонентом которой является коллаген. Введение аллогенного ГАП позволяет более эффективно регулировать гомеостаз и управлять процессами регенерации при лечении заболеваний опорно-двигательного аппарата (Власов М.Ю. Влияние внутримышечных инъекций суспензии гидроксиапатита на метаболизм соединительной ткани. Вестник СамГУ. - Естественнонаучная серия, 2002, №4 (26), с. 157-161).
Требованиям остеопластики в достаточной степени соответствует пористый композит из синтетического гидроксиапатита и коллагена. Такой композит относительно легко стандартизуем, а его пористая структура позволяет нагрузить его требуемыми в каждом конкретном случае лекарственными веществами.
Описан способ (прототип) получения пористого коллаген-гидроксиапатитового биокомпозита, который включает синтез гидроксиапатита на гидрогелевой коллагеновой матрице и сшивку волокон коллагена, который ведут в гидродинамическом диспергаторе роторно-пульсационного типа в процессе последовательной загрузки компонентов, а также разлив в форму и лиофильную сушку готового биокомпозита. На первой стадии загружают дробленую обезжиренную свиную шкуру и подготовленную воду и обрабатывают при гидромодуле 4-5 в течение 25-35 мин и температуре не выше 81°С до получения гидрогеля коллагена, затем, не прерывая процесса, в диспергатор загружают порошок фосфата кальция моногидрата в количестве 4,5-5,0 М и обрабатывают в течение 8-12 мин при температуре не выше 71°С и в диспергатор дробно вводят 3,0-3,3 М гидроксида кальция, суспендированного в 1-2 л воды, обрабатывают в течение 25-35 мин при температуре не выше 77°С. Сшивку волокон коллагена проводят при гидромодуле 20-25, температуре 55-56°С в течение 90-120 мин, затем полученную пульпу разливают в форму и подвергают лиофильной сушке при температуре коллектора -50°С. Технический результат состоит в получении дисперсии гидроксиапатита в коллагеновом гидрогеле с экспоненциальным распределением твердых фракций размером от менее 0,05 мкм до 1,0 мкм (Горшенев В.Н., Телешев А.Т., Ершов Ю.А., Казиев Г.З., Колесов В.В., Склянчук Е.Д. Способ получения пористого костного биокомпозита. Патент РФ №2482880, 2012). Способ сложен, и, кроме того, использование РПА для проведения в нем операций с суспензиями твердых частиц быстро выводит РПА из строя.
Целью настоящего изобретения является способ получения гидроксиапатит-коллагенового композита.
Поставленная цель достигается синтезом гидроксиапатита конденсационным способом с использованием гидроакустического преобразователя по реакции
4
2
2
10
4
6
2
2
6СаНРO×НO+4Са(ОН)→Са(РО)(ОН)+12НО.
5
3
При этом на входы гидроакустического преобразователя (Пономарев В.Г., Смирнов В.Ф., Саруханов Р.Г., Смирнова Н.Л. Гидродинамический преобразователь. SU №1131553, 1983 г.), при комнатной температуре, под давлением 4⋅10 Па, превышающем порог кавитации, одновременно подавали водный раствор гидрата монофосфата кальция с концентрацией 149 г/л и суспензию гидроксида кальция с концентрацией 29,7 г/л. С выхода гидроакустического преобразователя готовый продукт через промежуточную буферную емкость поступал на систему разделения - ультразвуковой самоочищающийся фильтр (Акопян В.Б., Ершов Ю.А. Основы взаимодействия ультразвука с биологическими объектами. М.: Издательство Юрайт, 2016, 223 с.) для удаления остатков аммиака до нейтральных рН, смешивался с коллагеном, и гидроксиапатит-коллагеновая смесь гомогенизировалась в ультразвуковом поле (Акопян В.Б., Рухман А.А., Давидов Е.Р., Мордвинова Е.М. Способ получения эмульсий и суспензий. Патент РФ №2342188, 2007) с частотой (22÷44) кГц, плотностью мощности (1÷10) Вт/см, в течение (10÷100) с, после чего формировалось тело с заданными параметрами и подвергалось лиофильной сушке.
Изобретение поясняется примерами, которые, однако, не носят ограничивающего характера.
Пример 1 (по прототипу в оптимальном режиме)
Загружают дробленую обезжиренную свиную шкуру с водой при гидромодуле 4-5 в роторно-пульсационный аппарат и обрабатывают в течение 25-35 мин и температуре не выше 81°С до получения гидрогеля коллагена, затем, не прерывая процесса, в диспергатор загружают порошок фосфата кальция моногидрата в количестве 4,5-5,0 М и обрабатывают в течение 8-12 мин при температуре не выше 71°С, после чего в диспергатор дробно вводят 3,0-3,3 М гидроксида кальция, суспендированного в 1-2 л воды, и обрабатывают в течение 25-35 мин при температуре не выше 77°С. Сшивку волокон коллагена проводят при гидромодуле 20-25, температуре 55-56°С в течение 90-120 мин. Полученную пульпу разливают в форму и подвергают лиофильной сушке. Конечный продукт представляет собой дисперсию гидроксиапатита в коллагеновом гидрогеле с экспоненциальным распределением твердых фракций от менее 0,05 мкм до 1,0 мкм.
Пример 2 по предлагаемой заявке
Синтез гидроксиапатита осуществляли конденсационным способом с использованием гидроакустического преобразователя по реакции
4
2
2
10
4
6
2
2
6СаНРO×НO+4Са(ОН)→Са(РО)(ОН)+12НО.
5
3
При этом на входы гидроакустического преобразователя при комнатной температуре, под давлением 4⋅10 Па, превышающем порог кавитации, одновременно подавали водный раствор гидрата монофосфата кальция с концентрацией 149 г/л и суспензию гидроксида кальция с концентрацией 29,7 г/л. С выхода гидроакустического преобразователя готовый продукт через промежуточную буферную емкость поступал на систему разделения - ультразвуковой самоочищающийся фильтр для удаления остатков аммиака до нейтральных рН, смешивался с коллагеном и гидроксиапатит-коллагеновая смесь гомогенизировалась в ультразвуковом поле с частотой (22÷44) кГц, плотностью мощности (1÷10) Вт/см в течение (10÷100) с, после чего из полученной дисперсии гидроксиапатита в коллагеновом гидрогеле с распределением твердых фракций (0,05÷1,0) мкм формировалось тело с заданными параметрами и подвергалось лиофильной сушке с образованием биокомпозита пористой структуры.
Следует отметить:
- (22÷44) кГц - частоты ультразвука, разрешенные для технологического применения (Голямина И.П. Ультразвук. Маленькая энциклопедия, 1979, 400 с.);
3
3
- при более низких чем 1 Вт/см плотностях мощности и/или при длительности воздействия менее 10 сек, эффект применения ультразвука становится пренебрежимо малым, при более высоких чем 10 Вт/см плотностях мощности и/или при длительности воздействия более 100 сек температура в реакционной среде повышается до значений, сравнимых с температурой денатурации коллагена (тропоколлаген, как известно, плавится при ~40°С, а температура денатурации фибриллярного коллагена составляет ~65°С. Ignat'eva N.Y., Lunin V.V., Majorova A.F., Mudretsova S N., Bagratashvili V.N., Sobol E.N. Sviridov A.P. A thermo-analytical study of cartilaginous tissues. Mendeleev Commun., 2000, 10, pp. 223-224).
Из приведенных примеров следует, что в результате использования предложенного изобретения удается сократить длительность процесса формирования гидроксиапатит-коллагенового композита, а совокупность отличительных признаков описываемого изобретения обеспечивает достижение указанного результата.
Для заявленного изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в изложенной формуле, подтверждена возможность осуществления с помощью описанных в заявке средств и методов. Следовательно, заявленное изобретение соответствуют условию "промышленная применимость".
В результате проведенного анализа уровня техники источник, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения, не обнаружен, следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "новизна".
Дополнительный поиск известных решений показал, что заявленные способ и устройство не вытекают для специалиста явным образом из известного уровня техники, поскольку применение ультразвуковых технологических приемов позволяет легко и быстро получать гидроксиапатит-коллагеновый композит. Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "изобретательский уровень".