ИНСТРУМЕНТЫ, МОДУЛИ И СПОСОБЫ ДЛЯ УЛУЧШЕННОГО ОБНАРУЖЕНИЯ ОТРЕДАКТИРОВАННЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ЖИВЫХ КЛЕТКАХ

1. Способ обогащения отредактированных клеток во время CRISPR редактирования, включающий
трансформирование клеток с помощью одного или более векторов, содержащих индуцибeльный промотор, управляющий транскрипцией кодирующей последовательности CRISPR нуклеазы, и индуцибeльный промотор, управляющий транскрипцией последовательности направляющей нуклеиновой кислоты, и последовательность донорной ДНК;
разбавление трансформированных клеток до такой концентрации клеток, чтобы по существу сингулировать трансформированные клетки на субстрате;
выращивание клеток на субстрате для 2-200 удвоений;
инициирование редактирования путем индукции индуцибeльных промоторов, управляющих транскрипцией направляющей нуклеиновой кислоты и CRISPR нуклеазы;
выращивание редактированных клеток с формированием колоний; и
отбор и объединение медленно растущих колоний на субстрате, где клетки из медленно растущих колоний обогащены отредактированными клетками.
2. Способ по п. 1, где индуцибeльный промотор, управляющий экспрессией каждой из направляющей нуклеиновой кислоты и CRISPR нуклеазы, является одним и тем же индуцибeльным промотором.
3. Способ по п. 2, где индуцибeльный промотор представляет собой промотор pL.
4. Способ по п. 1, где все из кодирующей последовательности CRISPR нуклеазы, последовательности направляющей нуклеиновой кислоты и последовательности донорной ДНК расположены на одном векторе.
5. Способ по п. 1, где кодирующая последовательность CRISPR нуклеазы расположена на одном векторе, и последовательность направляющей нуклеиновой кислоты и последовательность донорной ДНК расположены на другом векторе.
6. Способ по п. 1, где последовательность донорной ДНК дополнительно содержит изменяющую PAM последовательность.
7. Способ по п. 1, где один или более векторов дополнительно содержат ген для селектируемого маркера.
8. Способ по п. 7, дополнительно включающий добавление селективных агентов в субстрат для отбора селектируемых маркеров на одном или более векторах.
9. Способ по п. 7, где присутствует два вектора, и каждый вектор имеет различный ген для селектируемого маркера.
10. Способ по п. 1, где вектор-двигатель дополнительно содержит рекомбинационную систему.
11. Способ по п. 1, где субстрат выбран из агаровой пластины и устройства со сплошными стенками.
12. Способ обогащения отредактированных клеток во время CRISPR редактирования, включающий
трансформирование клеток с помощью одного или более векторов, содержащих промотор, управляющий транскрипцией кодирующей последовательности CRISPR нуклеазы, индуцибeльный промотор, управляющий транскрипцией последовательности направляющей нуклеиновой кислоты, ковалентно связанной с последовательностью донорной ДНК;
разбавление трансформированных клеток до такой концентрации клеток, чтобы по существу сингулировать трансформированные клетки на субстрате;
выращивание по существу сингулированных трансформированных клеток на субстрате до тех пор, пока по существу сингулированные трансформированные клетки не образуют колонии;
инициирование редактирования путем индукции индуцибeльного промотора, управляющего транскрипцией направляющей нуклеиновой кислоты;
выращивание редактированных клеток для формирований колоний; и
отбор и объединение медленно растущих колоний, где клетки из медленно растущих колоний обогащены отредактированными клетками.
13. Способ по п. 12, где индуцибeльный промотор представляет собой промотор pL.
14. Способ по п. 12, где все из кодирующей последовательности CRISPR нуклеазы, последовательности направляющей нуклеиновой кислоты, ковалентно связанной с последовательностью донорной ДНК, расположены на одном векторе.
15. Способ по п. 12, где кодирующая последовательность CRISPR нуклеазы расположена на одном векторе, и последовательность направляющей нуклеиновой кислоты и последовательность донорной ДНК расположены на другом векторе.
16. Способ по п. 12, где последовательность донорной ДНК дополнительно содержит изменяющую PAM последовательность.
17. Способ по п. 12, где редактированные клетки представляют собой клетки млекопитающих.
18. Способ по п. 12, где редактированные клетки представляют собой клетки дрожжей.
19. Способ по п. 12, где редактированные клетки представляют собой бактериальные клетки.
20. Способ по п. 19, где один или более векторов дополнительно содержат рекомбинационную систему.
21. Способ по п. 12, где субстрат выбран из агаровой пластины и устройства со сплошными стенками.
22. Способ по п. 21, где устройство со сплошными стенками представляет собой устройство изоляции/индукции/нормализации со сплошной стенкой (SWIIN).
23. Способ обогащения отредактированных клеток во время CRISPR редактирования, включающий
трансформирование клеток с помощью одного или более векторов, содержащих промотор, управляющий транскрипцией кодирующей последовательности CRISPR нуклеазы, индуцибeльный промотор, управляющий транскрипцией последовательности направляющей нуклеиновой кислоты, ковалентно связанной с последовательностью донорной ДНК, и ген для селектируемого маркера;
разбавление трансформированных клеток до такой концентрации клеток, чтобы по существу сингулировать трансформированные клетки на устройстве со сплошными стенками;
выращивание по существу сингулированных трансформированных клеток на субстрате до тех пор, пока по существу сингулированные трансформированные клетки не образуют колонии;
инициирование редактирования путем индукции индуцибeльного промотора;
выращивание редактированных клеток для формирований колоний; и
отбор и объединение медленно растущих колоний, где клетки из медленно растущих колоний обогащены отредактированными клетками.
24. Способ по п. 23, где промотор, управляющий транскрипцией последовательности направляющей нуклеиновой кислоты, представляет собой промотор pL.
25. Способ по п. 23, где устройство со сплошными стенками представляет собой устройство изоляции/индукции/нормализации со сплошной стенкой (SWIIN).
26. Способ по п. 23, где каждый из одного или более вектора, содержит селектируемый маркер, и способ дополнительно включает добавление селективных агентов в субстрат для отбора одного или более векторов.
27. Способ по п. 23, где CRISPR нуклеаза представляет собой MADзимную нуклеазу.
28. Способ по п. 23, дополнительно включающий объединение колоний предельного размера.
29. Способ по п. 28, дополнительно включающий подвергание объединенных колоний предельного размера другому циклу трансформации, разбавления, роста, редактирования и роста до колоний предельного размера.
30. Способ по п. 23, где трансформированные клетки представляют собой клетки млекопитающих.
31. Способ по п. 23, где трансформированные клетки представляют собой бактериальные клетки, и один или более векторов дополнительно содержат рекомбинационную систему.