СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МОРСКИХ СИНЕ- ЗЕЛЕНЫХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ
METHOD OF PRODUCTION OF BACTERIOLOGICALLY PURE CULTURES OF MARINE BLUE-GREEN MICROALGAE

Изобретение относится к альгологии и микробиологии, а именно к способам выделения бактериологически чистых культур морских сине-зеленых микроводорослей.
В настоящее время большое внимание уделяется разработкам тест-систем по оценке токсичности компонентов экосистем морских водоемов, для чего необходимо выделение чистых культур водных организмов, в частности микроводорослей. Стандартная процедура заключается в выделении и выращивании альгологически чистых культур микроводорослей, из которых затем выбираются наиболее перспективные для биотестирования. Однако выделенные культуры микроводорослей всегда оказываются загрязненными бактериальной микрофлорой, спорами и мицелием грибов, что мешает проведению дальнейших исследований, искажает их результаты. Очистка от бактерий представляет собой очень трудоемкий процесс, т.к. между водорослями и бактериями существуют плотные биоценотические связи. Слизистые  оболочки водорослей служат источником питания и укрытиями для микроорганизмов. Такая тесная связь определяет трудности разделения таких сообществ на изолированные культуры: водорослей и бактерий. Получение бактериологически чистых культур микроводорослей - это предпосылка для успешных исследований, разработки тест-систем по оценке токсичности компонентов экосистем морских водоемов и других научных работ.
Известен способ выделения аксенических культур микроводорослей методом агаровых пластинок (Вассер С.П., Кондратьева Н.В., Масюк Н.П. и др. Водоросли. Справочник. - Киев: Наукова думка, 1989. - 608 с.) (1), в котором микроводорослевую суспензию вносят в чашку Петри и микробиологической петлей равномерно распределяют по поверхности мясопептонного агара (МПА) с последующей инкубацией в термостате. Затем отдельные микроколонии, выросшие на поверхности мясопептонного агара, снимают стерильными инструментами вместе с кусочками плотной питательной среды и вносят в пробирки с соответствующими стерильными элективными питательными средами для накопления биомассы водорослей. Аксенические культуры водорослей получают с помощью многократного повторного рассева на поверхности МПА в стерильных условиях.
Известный способ имеет ограниченный круг применения. Например, при выделении аксенических культур морских сине-зеленых водорослей не удается добиться их полной свободы от бактерий, т.к. последние прочно связаны с сильно развитыми слизистыми оболочками этих микроводорослей. Процесс разделения их трудоемок, длителен и порой неэффективен, требует многократного пересева.
В другом способе очистки культур от бактерий и других микроорганизмов проводят облучение культур микроводорослей ультрафиолетовым светом (Квитко К.В. Получение культур отдельных клеток хлореллы // Исследования по генетике. - Л.: Изд-во Ленинградского университета, 1961. - Вып.1. - С.50-54) (2). Однако этот способ недостаточно эффективен, т.к. не удается добиться полной свободы водорослей от бактерий и грибов. При этом длительность ультрафиолетового облучения не должна превышать 10 мин, т.к. более длительное ультрафиолетовое облучение оказывает мутагенное действие и может вызвать необратимые генетические изменения облучаемой культуры.
Наиболее близким к предложенному способу является выбранный в качестве прототипа способ очистки культур от бактерий и других микроорганизмов (в частности, грибов) с помощью химической стерилизации путем обработки в 0.1% феноле и 1.0% этиловом спирте. (Экологическая физиология морских планктонных водорослей. Киев: Издательство «Наукова думка», 1971, с.5-22) (3).
Однако химическая стерилизация микроводорослей также не позволяет получить полностью  бактериологически чистые культуры микроводорослей.
Заявляемый способ решает задачу повышения эффективности выделения бактериологически чистой культуры морских сине-зеленых микроводорослей.
Поставленная задача достигается тем, что способ получения бактериологически чистых культур морских  сине-зеленых микроводорослей состоит из химической стерилизации культур микроводорослей путем обработки в растворе стерильной морской воды, содержащей 0.1% фенола и 1.0% этилового спирта, и дополнительного облучения ультрафиолетовым светом в течение 9-10 мин, а затем обработки антибиотиками и фунгицидом, причем в качестве антибиотиков используют левомицетин и ампициллин в количестве по 50 мкг/мл каждого, а в качестве фунгицида используют нистатин в количестве 25 мкг/мл.
Дополнительная обработка микроводорослей после  химической стерилизации вначале облучением ультрафиолетовым светом, а затем антибиотиками и фунгицидом, позволяет добиться получения бактериологически чистой культуры микроводорослей.
При этом использование в качестве антибиотиков левомицетина в количестве 50 мкг/мл и ампициллина в количестве 50 мкг/мл, а в качестве фунгицида - нистатина в количестве 25 мкг/мл позволяет добиться, с одной стороны, практически полного отсутствия бактерий в культуре морских сине-зеленых микроводорослей, а с другой стороны, избежать снижения скорости роста и ингибирования деления микроводорослей.
В результате проведенного анализа уровня техники не обнаружен аналог, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения, а определение прототипа из выявленных аналогов позволило выявить совокупность существенных по отношению к техническому результату отличительных признаков.
Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "новизна".
При дополнительном поиске других решений, относящихся к предлагаемому способу, указанных отличительных признаков не обнаружено. Таким образом, заявленное изобретение соответствует условию "изобретательский уровень".
Способ осуществляется следующим образом.
Очистку альгологически чистых культур морских сине-зеленых микроводорослей от бактерий проводят в 3 этапа. 1 этап - это проведение химической стерилизации. Для этого применяют такие антисептики, как фенол и этиловый спирт в концентрации 0.1 и 1.0%, соответственно. Водоросли выдерживают в стерильной морской воде с указанными выше антисептиками в течение 4-5 ч. На 2-м этапе проводят 9-10-минутное облучение культур водорослей ультрафиолетовым светом (облучатель бактерицидный ОБН - 150,2 лампы по 30 Вт) в чашках Петри на расстоянии от источника облучения в 50 см. На 3-м этапе проводят обработку водорослей антибиотиками и фунгицидом в следующей оптимальной комбинации: левомицетин в концентрации 50 мкг/мл, ампициллин в концентрации 50 мкг/мл и нистатин в концентрации 25 мкг/мл.
Наличие бактериальной микрофлоры контролировали путем пересева из жидких культур морских сине-зеленых микроводорослей на  агаризованные или жидкие питательные чреды. Контролировали рост  мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, плесневых грибов и дрожжей.
При определении мезофильных аэробных и факультативно- анаэробных  микроорганизмов в жидкой культуре микроводорослей исследование проводили согласно ГОСТ 10444.15-94.
При определении мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных  микроорганизмов на агаризованных питательных средах, по 1 куб. см культуры сине-зеленых водорослей высевали в две параллельные чашки Петри. Посевы заливали по ГОСТ 26670 одной из питательных агаризованных сред и инкубации при температуре 30°С.
При определении мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных  микроорганизмов на жидких питательных средах  по 1 куб. см культуры сине-зеленых водорослей высевали в две колбы или пробирки с одной из жидких питательных сред по ГОСТ 26670. Соотношение между количеством высеваемой культуры водорослей и питательной среды от 1:5 до 1:7. Посевы инкубировали при температуре 30±1°С в течение 72±3 ч в аэробных условиях.
После инкубирования посевов на агаризованных питательных средах в чашках Петри учитывали наличие или отсутствие колоний микроорганизмов. В жидких питательных средах отмечали наличие или отсутствие видимых признаков роста (газообразование, появление мути, осадок).
Если очевидного роста бактерий через три дня инкубации не было, считали маловероятным, что образец водорослей,  добавленный в культуральную среду, содержит бактерии.  Однако за культурой продолжали наблюдать в течение 7-10 дней, так как в ней могли присутствовать медленно растущие виды. Выводы о чистоте культур делали при отсутствии колоний микроорганизмов или видимых признаков их роста.
При определении плесневых грибов и дрожжей в жидкой культуре микроводорослей исследование проводили согласно ГОСТ 10.444.88.
0
По 1 куб. см культуры водорослей высевали в две чашки Петри со средой Сабуро с антибиотиками. Посевы термостатировали при температуре 24±1С в течение 5 суток. По окончании инкубации отмечали наличие или отсутствие видимых признаков роста. Колонии дрожжей и плесневых грибов разделяли визуально (дрожжи образуют крупные выпуклые блестящие колонии с гладкой поверхностью и ровным краем, плесневые грибы образуют мицелий различной окраски).
При отсутствии мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, плесневых грибов и дрожжей считали жидкую культуру микроводорослей бактериологически  стерильной.
Способ поясняется следующими примерами.
Пример 1 (контроль). Пробы воды и соскобы микроскопических водорослей с прибрежных камней для последующего выделения из них культур микроводорослей отбирали в период активной вегетации (май-июнь) основных видов микроводорослей в Азовском и Черном морях. Вначале выращивали накопительные смешанные культуры микроводорослей, для чего к отобранным пробам добавляли среду Бристоля в модификации Голлербаха, смесь микроэлементов и почвенный экстракт в определенных пропорциях. Накопительные культуры микроводорослей получали методом посева смешанной культуры в колбы с жидкими питательными средами, предназначенными для лабораторного культивирования различных водорослей (зеленые, азотфиксирующие и неазотфиксирующие сине-зеленые). Время культивирования водорослей составляло в среднем 3-4 недели.
Из накопительной культуры, с использованием микробиологических методов пересевов и разведений, получали альгологически чистые культуры. Накопительная культура стерильно высевалась на чашку Петри с агаризованной питательной средой. Чашки помещали на свет для роста водорослей. Из колонии выросших водорослей петлей переносили часть культуры вновь на жидкую среду или в пробирки со скошенной агаризованной средой. Культивирование микроводорослей осуществляли на питательных средах Тамия, Ягужинского, Гусевой и Уолна. Среды являются универсальными для всех видов водорослей и позволяют получить разделяемые культуры микроводорослей физиологически активными. Для разделения микроводорослей использовали стеклянный шпатель и рассев путем втирания в поверхность питательной среды. Это позволяет разбить смесь микроводорослей на единичные клетки, что сохраняет их целостность, а следовательно, значительно облегчает и ускоряет процесс выделения чистых культур.
В результате работ были выделены альгологически чистые культуры следующих сине-зеленых микроводорослей: Oscillatoria laetevirens, Spirulina tenussima и  Snowella rosea.  Далее проводили очистку каждой из полученных культур микроводорослей от бактерий путем химической стерилизации (1). С этой целью применяли такие антисептики, как фенол и этиловый спирт в концентрации 0.1 и 1.0%, соответственно. Водоросли выдерживали в стерильной морской воде с указанными выше антисептиками в течение 4-5 ч (таблица 1, опыт 1).
Проверку чистоты полученных культур водорослей проводили контрольными посевами их жидких культур на ту из вышеперечисленных агаризованных питательных сред, на которой наблюдался лучший рост данной культуры. При этом был зафиксирован рост микрофлоры. Таким образом, химическая стерилизация не позволила получить абсолютно чистые культуры водорослей. Данные приведены в таблице 1, опыт 1.
Таблица 1
Рост микрофлоры в культурах морских сине-зеленых микроводорослей в опытах с разными методами стерилизации
№
Хим. стерилизация
УФ-облучение
Антибиотики, мкг/мл
Фунгицид,нистатин, мкг/мл
Бактериа-льный и грибной рост
левомицетин
тетрациклин
эритромицин
ампициллин
1
+
-
-
-
-
-
-
+
2
+
+
-
-
-
-
-
+
3
+
+
50
-
-
-
-
+
4
+
+
50
50
-
-
-
+
5
+
+
50
50
50
-
-
+
6
+
+
50
50
50
50
-
+
7
+
+
-
-
-
-
25
+
8
-
-
50
50
50
50
25
+
9
+
-
50
50
50
50
25
+
10
-
+
50
50
50
50
25
+
11
+
+
50
50
-
-
25
+
12
+
+
-
50
50
-
25
+
13
+
+
-
50
-
50
25
+
14
+
+
50
-
-
50
25
-
15
+
+
50
50
-
50
25
-
16
+
+
50
50
50
50
25
-
17
+
+
90
50
50
50
25
-
18
+
+
50
50
50
90
25
-
19
+
+
90
50
50
90
25
-
20
+
+
90
90
50
90
25
-
Пример 2. Культуры выделенных морских сине-зеленых микроводорослей подвергали сначала химической стерилизации (процедура описана выше), а затем  проводили десятиминутное облучение культур водорослей ультрафиолетовым светом (облучатель бактерицидный ОБН - 150) в чашках Петри на расстоянии от источника облучения в 50 см (опыт 2). Проверку чистоты полученных после химической стерилизации и ультрафиолетового облучения культур микроводорослей проводили контрольными посевами жидких культур на вышеперечисленные агаризованные питательные среды. При этом был зафиксирован рост микрофлоры. Данные приведены в таблице 1, опыт 2.
Таким образом химическая стерилизация и облучение культур микроводорослей ультрафиолетовым светом не позволили получить бактериологически чистые культуры микроводорослей.
Пример 3. Культуры выделенных морских сине-зеленых микроводорослей подвергали сначала химической стерилизации, затем  проводили десятиминутное облучение культур водорослей ультрафиолетовым светом, как описано в примерах 1-2, а затем подвергали обработке антибиотиком левомицетином в концентрации 50 мкг/мл в соответствующей питательной жидкой среде. Результаты приведены в  таблице 1, опыт 3.
Примеры 4-20. Опыты  проводили аналогично описанным выше, т.е. культуры выделенных микроводорослей  подвергали сначала химической стерилизации, затем проводили десятиминутное облучение культур водорослей ультрафиолетовым светом, а затем подвергали обработке различными концентрациями антибиотиков и фунгицида в соответствующей питательной жидкой среде. Результаты приведены в таблице 1, опыты 4-20.
Были апробированы разные концентрации и разные виды антибиотиков и фунгицидов (таблица 1). После каждой обработки проводили проверку чистоты полученных культур водорослей контрольными посевами из жидких культур на агаризованную питательную среду. Таким образом, были подобраны антибиотики, и фунгицид, а также их концентрации, после обработки которыми, при контрольных посевах на агаризованные питательные среды не было зафиксировано роста микрофлоры. Использовали антибиотики - левомицетин (50 и 90 мкг/мл), тетрациклин (50 и 90 мкг/мл), эритромицин (50 мкг/мл), ампициллин (50 и 90 мкг/мл), а также фунгицид - нистатин в количестве 25 мкг/мл. Кроме того, были проведены опыты с сериями проб морских сине-зеленых микроводорослей, обработанных антибиотиками и фунгицидом, но не подвергнутых предварительно химической стерилизации и/или обработкой ультрафиолетовым светом (опыты 8-10). Только обработка левомицетином в концентрации 50 мкг/мл в комбинации с ампициллином 50 мкг/мл и нистатином 25 мкг/мл, выполненная после химической стерилизации и облучения культур ультрафиолетовым светом, позволила добиться практически полного отсутствия бактериального роста в течение нескольких пересевов.
Были апробированы и более высокие концентрации используемых антибиотиков, позволившие добиться 100% отсутствия бактериальной микрофлоры, однако такие концентрации снижали скорость роста и ингибировали деление микроводорослей. Результаты исследований приведены в таблице 1.
Из таблицы следует, что эффект, связанный с полным освобождением морских сине-зеленых микроводорослей от сопутствующей микрофлоры с сохранением жизнедеятельности микроводорослевых клеток, достигается при выполнении химической стерилизации, облучении культур ультрафиолетовым светом, а затем обработке микроводорослей антибиотиками и фунгицидом при следующем минимальном соотношении компонентов: левомицетин 50 мкг/мл, ампициллин 50 мкг/мл, а также фунгицид, нистатин в количестве 25 мкг/мл.
Таким образом, поэтапный способ химической стерилизации альгологически чистой культуры морских сине-зеленых микроводорослей с ультрафиолетовым облучением и дальнейшим добавлением определенных концентраций и композиций антибиотиков и фунгицидов, позволил получить бактериологически чистые культуры микроводорослей, которые могут быть использованы при проведении физиолого-биохимического, цитологического и генетического изучения микроводорослей и других научных исследований. В частности, бактериологически чистые культуры морских сине-зеленых микроводорослей можно использовать для разработки тест-систем на основе флуоресценции микроводорослей по оценке токсичности компонентов экосистем морских водоемов.
Использование заявляемого способа позволяет повысить эффективность выделения бактериологически чистых культур микроводорослей. Этот способ надежен, т.к. позволяет получать бактериологически чистые культуры морских сине-зеленых микроводорослей независимо от источника выделения и степени их бактериальной обсемененности.