ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО MUS MUSCULUS L. 3F9 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, ПРИГОДНЫХ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ СИСТЕМЕ ФОРМАТА "СЭНДВИЧ" ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКА VP35 ВИРУСА МАРБУРГ, И МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА 3F9, ПРОДУЦИРУЕМЫЕ УКАЗАННЫМ ШТАММОМ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК
STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS MUS MUSCULUS L3F9 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SUITABLE FOR USE IN "SANDWITCH" IMMUNOENZYMOMETRIC SYSTEM FORMAT FOR DETECTING VP35 PROTEIN OF MARBURG VIRUS AND 3F9 MONOCLONAL ANTIBODIES PRODUCED BY SAID STRAIN OF HYBRID CELLS

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицинской вирусологии и иммунологии, может быть использовано для проведения иммунодиагностики геморрагической лихорадки Марбург (ГЛМ). Вирус Марбург (ВМ), вместе с вирусом Эбола, относится к семейству филовирусов, вызывает у людей геморрагическую лихорадку с высоким уровнем летальности среди заболевших, как показали эпидемиологические исследования во время самой большой вспышки в 2004-2005 гг. в Анголе [1, 2]. Природный резервуар и переносчики не известны, эффективные средства специфической профилактики отсутствуют. Потенциал аэрозольной передачи высок и риск распространения среди человеческой популяции в разных регионах мира возможен [3, 4, 5]. Попытки получения вакцины на основе инактивированного вируса не принесли результата [6]. В настоящее время идет поиск подходов к созданию вакцины на основе векторов доставки генов филовирусных белков [7]. Кофактор полимеразы - белок VP35 (структурный белок вириона) является необходимым элементом процессов транскрипции и репликации, в которых он непосредственно взаимодействует с РНК - зависимой РНК-полимеразой [8, 9]. Для процесса сборки полноценного нуклеокапсида обязательно присутствие белка VP35 [10, 11]. Аналогичный белок вируса Эбола (ВЭ) действует как антагонист интерферона, то есть способен подавлять противовирусный эффект ИФН - системы хозяина [12, 13]. При исследовании протективной активности белков ВЭ, было показано, что иммунодефицитные мыши линии C57BL/6 выживали только после предварительной иммунизации альфавирусными репликономи, несущими белки VP40, VP30, VP24 и VP35. Мышам BALB/c для защиты от инфекции было достаточно трех белков, без участия VP35 [14]. Белок VP35 филовирусов является одним из трех мажорных компонетов, составляя 24,5% (VP40 - 37,7% и NP - 17%, соответственно) от массы вириона [15]. Белок VP35 вызывает образование антител, наряду с нуклеопротеином (NP) и матриксным белком VP40, в организме людей, переболевших ГЛМ [16]. ВМ появляется в крови инфицированных морских свинок и обезьян Масаса mulatta на 4 сутки от заражения и может быть обнаружен методом иммуноферментного анализа (ИФА) [17]. Показано высокое содержание ВМ в слюне и выделениях экспериментально зараженных морских свинок [18]. В настоящее время в России нет коммерчески доступных ИФА тест-систем по экспрессному выявлению антигена ВМ для контроля за импортированными животными для зоопарков и исследовательских целей и туристами, прибывшими из стран Африки с симптомами, подобными при ГЛМ. Препараты очищенных моноклональных антител (МКА) могут служить основой такой системы самостоятельно или как подтверждающий тест к ПЦР-диагностике, которая в России также пока не разработана.
Известны коллекции мышиных гибридом, продуцирующих МКА к ВМ (штамм Musoke) [21] и к ВМ (штамм Рорр) [22].
Однако ни одна из них не имеет гибридом, продуцирующих МКА к белку VP35. Из описанных в литературе ИФА тест-систем в формате "сэндвич" [17, 22, 23, 24] для выявления ВМ нет системы на основе МКА к белку VP35.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм гибридных клеток животных Mus museums L. M1/N-10G9, продуцирующих в течение 30 изученных пассажей in vitro моноклональные антитела к структурному белку GP вируса Марбург, штамм Рорр, относящиеся к изотипу IgG, пригодные для приготовления на их основе диагностикумов для специфического выявления вируса Марбург с помощью иммуноферментного анализа (патент РФ №2186107, МПК С12N 5/18, опубл. 27.07.2002 г.).
Однако продуцируемые указанным штаммом гибридных клеток моноклональные антитела специфичны к поверхностному белку, которым является гликопротеин GP с молекулярной массой (ММ) 125 кДа, который содержится в малых количествах, недостаточных для качественной диагностики.
Техническим результатом предлагаемого технического решения является получение такого штамма гибридных клеток Mus museums L., продуцирующих специфические МКА к белку VP35 ВМ (штамм Рорр) и МКА 3F9, получаемые на основе указанного штамма гибридных клеток, которые имели бы уникальную особенность выявлять белок VP35 ВМ в иммуноферментной системе формата "сэндвич" с возможностью использования одновременно как в качестве "захватывающих" антиген, так и в качестве "индикаторных", меченных биотином, что обеспечит повышение достоверности ИФА при лабораторных исследованиях ВМ и при конструировании тест-систем для выявления антигена.
Указанный технический результат достигается путем создания штамма гибридных клеток животного Mus musculus L. 3F9, депонированного в Коллекции клеточных культур ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора, являющегося продуцентом моноклональных антител, специфичных к белку VP35 вируса Марбург (штамм Рорр).
Указанный технический результат достигается также путем использования моноклональных антител 3F9, продуцируемых штаммом гибридных клеток животного Mus musculus L. 3F9, относящихся к субклассу иммуноглобулинов IgGl, имеющих тяжелую 55 кДа и легкую 25 кДа цепи и обладающих уникальной особенностью выявления белка VP35 вируса Марбург (штамм Рорр) в иммуноферментной системе формата "сэндвич" с одновременным их использованием как в качестве "захватывающих" антиген, так и в качестве "индикаторных", меченных биотином. Антигенный эпитоп для МКА 3F9, продуцируемых данным штаммом локализован между 252 и 278 аминокислотными остатками.
Также возможно использование МКА в иммунофлуоресцентном и иммуноферментном методах для выявления ВМ в инфицированных клетках и тканях.
Штамм получают путем слияния клеток мышиной p3-X63/Ag8.653 (NS/1) миеломы с клетками селезенок мышей BALB/c, иммунизированных очищенным, концентрированным, инактивированным препаратом ВМ, полученным из плазмы крови инфицированных морских свинок [19] и инактивированным димером этиленимина до 0,17%, как описано [20].
Заявляемый штамм гибридных клеток Mus museums L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 3F9 получен в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора Российской Федерации и депонирован в Коллекции клеточных культур ГНЦ ВБ "Вектор". Авторское название гибридомной клеточной линии -3F9.
Заявляемый штамм гибридных клеток входит в состав коллекции ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», состоящей из 21 гибридомной клеточной линии, из которых 5 продуцируют МКА к белку VP35 вируса Марбург (штамм Рорр).
Родословная штамма. Штамм гибридных клеток получен путем слияния клеток мышиной p3-X63/Ag8.653 (NS/1) миеломы с клетками селезенок мышей BALB/c, иммунизированных очищенным, концентрированным, инактивированным препаратом ВМ. В качестве сливающего агента использовали 45% раствор полиэтиленгликоля фирмы "Sigma" с молекулярным весом 1300-1600 кДа по методу [26]. Клетки после слияния выращивали в селективной среде ГАТ в 96-луночных культуральных планшетах. В качестве фидерных клеток использовали перитонеальные макрофаги беспородных мышей. Гибридомы, стабильно продуцирующие специфические МКА, клонировали 3 раза. Выход позитивных клонов в последнем клонировании составил 100%. Число пассажей к моменту депонирования: 7-10 пассажей.
Маркерные признаки и методы их оценки. Штамм секретирует мышиные иммуноглобулины субкласса IgGl (имеющие тяжелую 55 кДа и легкую 25 кДа цепи), специфически взаимодействующие с белком VP35 ВМ (антигенный эпитоп между 252 и 278 аминокислотными остатками). Анализ мышиных иммуноглобулинов проводят методом ИФА, используя в качестве антигена инактивированный ВМ (штамм Рорр) или рекомбинатный белок VP35 (полученный в результате биосинтеза в клетках E.coli на основе плазмидной конструкции, включающей полный ген VP35 ВМ, как описано [27] и антитела против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена.
Контаминация бактериями и грибами не обнаружена.
Культуральные свойства. Среда для культивирования DMEM/F12 с глугамином, пиридоксином, Hepes (ФГУН ГНЦ ВБ ″Вектор″ Роспотребнадзора). Содержание фетальной сыворотки, оптимизированной для гибридом (HyClone, USA) в ростовой среде - 10%. В среду также добавляют 80-160 мкг/мл сульфата гентамицина
Штамм является монослойно-суспензионной культурой, в которой до 20% клеток находится в суспензии, не прикрепляясь к поверхности посуды для культивирования. Клетки с поверхности культуральной посуды удаляются раствором трипсина/версена=1/1 (объем/объем). Посевная доза 200 тысяч кл/мл. Частота пассирования через 3-4 суток. Индекс пролиферации - не менее 5. Культивирование гибридом в организме животного. Самкам мышей BALB/c (виварий ГНЦВБ "Вектор") предварительно вводят внутрибрюшинно 0,3-0,5 мл пристана (Sigma). Через 2-4 недели животным прививают внутрибрюшинно 10 млн гибридных клеток. Асцитическая опухоль формируется на 7-10 день. Гибридома прививается в 100% случаев. От одного животного можно получить 3-5 мл асцитической жидкости, содержащей МКА.
Характеристика полезного продукта. Типирование гибридомных иммуноглобулинов проведено методом твердофазного ИФА с использованием моноспецифических мышиных антител («Sigma», США). МКА относятся к субклассу IgGl, имеют тяжелую 55 кДа и легкую 25 кДа цепи. Они специфически взаимодействуют с нативным белком VP35 ВМ (32 кДа) и рекомбинатным белком VP35 (38 кДа) в реакции иммуноблота. В ИФА титр МКА в асците составляет 1:656100. Стабильная продукция МКА сохраняется на протяжении не менее 10 пассажей in vitro при непрерывном культивировании. Из одного миллилитра асцитической жидкости можно получить 3-5 мг очищенных МКА.
Криоконсервирование. Среда для замораживания - среда ДМЕМ(М) - 50%, фетальная сыворотка - 40%, диметилсульфоксид - 10%. 1-1,5 мл клеточной суспензии переносят в пластиковые криопробирки и помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок 1 см. Контейнер вносят в пары жидкого азота и через 18-24 часа пробирки переносят в жидкий азот. Размораживание проводят, опуская пробирки в воду с температурой 37-41°С. Клетки разводят средой ДМЕМ(М) и центрифугируют при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в ростовой среде и клетки переносят в культуральные флаконы в концентрации 200-300 тысяч в миллилитре. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 60-80% (по результатам окрашивания 0,25% трипановым синим). Каждая ампула содержит не менее 10 млн/мл клеток.
Изобретение поясняется графическим материалом, представленным на фиг.1-3. На фиг.1 представлена электрофореграмма очищенного МКА 3F9 и антигенов, где:
1 - препарат очищенного МКА 3F9 (1 мкл), стрелками обозначены цепи иммуноглобулинов:
т - тяжелая цепь (55 кДа); л - легкая цепь (25 кДа);
2 - очищенный рекомбинатный белок VP35 (10 мкл);
3 - препарат вируса Марбург (10 мкл), стрелками обозначены вирусные белки;
4 - значения молекулярного веса белковых маркеров.
На фиг.2 представлен иммуноблот МКА 3F9 с нативными и рекомбинантными белками VP35 вируса Марбург, где:
1 - препарат вируса Марбург (10 мкл), стрелкой обозначен вирусный белок VP35;
2 - препарат вируса Эбола (отрицательный контроль на антиген);
3 - лизат E.coli. (отрицательный котроль для рекомбинатного белка);
4 - очищенный рекомбинатный белок VP35 (10 мкл) обозначен стрелкой;
все полоски мебраны обработаны препаратом очищенных МКА 3F9 в разведении 1:500;
5 - значения молекулярного веса белковых маркеров.
На фиг.3 изображен график титрования антигена вируса Марбург и рекомбинантного белка VP35 парой МКА 3F9 и 3F9*, где: исходная концентрация препаратов антигенов по СФ 1 мг/мл, первая точка титрования в разведении 1:400 соответствует концентрации 2500 нг/мл; 3F9* - индикаторные МКА меченные биотином;
в качестве отрицательного контроля использовали захватывающие антиген МКА 1С7, специфичные к белку VP35 вируса Эбола [28]; концентрация МКА для "захвата" антигенов - 10 мкг/мл; концентрация индикаторных МКА, меченных биотином - 1 мкг/мл.
Методика получения заявляемого штамма.
Штамм гибридных клеток Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 3F9 получают следующим образом. Самок мышей BALB/c (виварий ГНЦ ВБ "Вектор"), массой 15-20 г, иммунизируют по схеме, которая приведена ниже в таблице.
Для слияния используют соотношение 3/1 селезеночных клеток мышей и клеток мышиной миеломы NS/1. Смесь клеток центрифугируют, супернатант тщательно удаляют и к клеточному осадку добавляют 0,4 мл 45% раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 1300-1600.
Таблица
Схема иммунизации
дни
раствор для разведения антигена
доза антигена (мкг/мышь)
область инъекции
0
полный адьювант Фрейнда
10
внутрибрюшинно
7
неполный адьювант Фрейнда
10
внутрибрюшинно
11
физиологический раствор
33
внутривенно
12
физиологический раствор
45
внутривенно
14
Гибридизация
(забор селезенки)
Смесь центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин. После 3 мин паузы слой ПЭГ медленно разбавляют 5 мл раствора версена, после чего осадок ресуспендируют. Затем клетки снова осаждают (10 мин при 1000 об/мин) и осадок растворяют в ростовой среде. Клетки распределяют в пять 96-луночных микроплат (Costar) по 100 мкл в лунку. Селекцию гибридных клеток проводят в среде ГАТ, состоящей из питательной среды ДМЕМ(М), в которую добавлены 10% фетальной сыворотки коров (Gipco), 0,1 мМ гипоксантина, 0,04 мМ тимидина и 0,01 мМ аминоптерина.
Отбор специфических гибридов проводят методом иммуноферментного анализа (ИФА). В лунки микроплат (ВНИИМедПолимер) в качестве антигена сорбируют 100-200 нг очищенного ВМ. Места неспецифического связывания насыщают 0,5% раствором казеина (ICN). Затем в лунки переносят по 100 мкл культуральной среды исследуемых гибридом и инкубируют 45 мин при 37°С. После инкубации лунки промывают 3-5 раз физиологическим раствором, содержащим 0,05% твин-20 (Sigma). Далее в планшеты вносят по 100 мкл антивидового конъюгата (иммуноглобулины кролика против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена) и выдерживают 45 мин при 37°С. Планшеты промывают и проводят ферментативную реакцию. Результаты анализа определяют на спектрофотометре "Multiscan" (Финляндия) при длине волны 492 нм. Полученный гибридный штамм дважды клонируют методом предельных разведений, переводят в массовую культуру и замораживают в жидком азоте. Приведенные ниже примеры подробно раскрывают полезные свойства объекта изобретения.
Пример 1. Культивирование гибридных клеток штамма Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 3F9, продуцирующих МКА к белку VP35 ВМ в организме животных, мышей BALB/c.
Мышам BALB/c (виварий ГНЦВБ "Вектор"), весом 20-22 г, не менее чем за 10 дней до прививки гибридомных клеток вводят внутрибрюшинно по 0,3-0,5 мл пристана. Культивируемые клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста, стерильно центрифугируют 5-10 мин при 1000 об/мин на центрифуге ОПН-3. Надосадок удаляют, а осадок клеток суспензируют в стерильном растворе Эрла или Хенкса. Самкам мышей BALB/c (виварий ГНЦВБ "Вектор") весом 20-22 г внутрибрюшинно вводят каждой по 1 мл клеточной суспензии, содержащей не менее 10 млн гибридомных клеток. Через 7-10 дней животных усыпляют и в асептических условиях из брюшной полости извлекают 3-5 мл асцитической жидкости. Клетки из асцитической жидкости отделяют центрифугированием и используют для дальнейшего перевивания гибридомы, а в надосадочной жидкости определяют титр МКА с помощью иммуноферментного анализа, как описано выше.
Пример 2. Выделение очищенных моноклональных антител, продуцируемых гибридными культивируемыми клетками штамма Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 3F9.
Один объем асцитической жидкости, содержащей МКА, разводят 4 объемами 0,6 М ацетатного буфера (0,04 М лимонной кислоты, 0,2 М натрия ацетата), pH 4,0 и доводят pH до 4,5 с помощью 0,1 N раствора едкого натра. К разведенному образцу добавляют по каплям, с постоянным перемешиванием, каприловую кислоту из расчета 25 мкл на 1 мл раствора и инкубируют ночь при +4°С. Затем центрифугируют 30 мин при 8000 g и осадок удаляют, а надосадок смешивают с 10-кратным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и устанавливают pH 7, 4 раствором 1,0 N едкого натра. Равный объем насыщенного раствора сульфата аммония добавляют к этому раствору, встряхивают и выдерживают ночь при +4°С или 30 мин при +20-25°С. Центрифугируют 15 мин при 5000 g. Надосадок сливают, а осадок растворяют в ФСБ, pH 7,4. Остатки сульфата аммония удаляют путем диализа против 50-100 объемов ФСБ, pH 7,4. Электрофорез очищенного препарата МКА проводили по методу, описаному в работе [31] в прерывистой буферной системе с использованием 12-15% полиакриламидного геля с 0,1% додецилсульфата натрия в трис-глициновом буфере. Разделяющий гель содержал 0, 0625М трис-HCl (pH 8, 8), 0,1% SDS, 10(15)% акриламид, 1% N,N-метиленбисакриламид. Препарат МКА (1 мкл) наносили на дорожку в объеме 30 мкл буфера, содержащем 0, 0625М трис-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 5% 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин, 0,01% бромфеноловый синий. Перед нанесением буфер, содержащий МКА, прогревали 3 мин при 95°С. Электрофорез вели в режиме 10 В/см. Окраску геля проводили при помощи Кумасси G-250. Очищенный препарат МКА 3F9 в виде электрофореграммы представлен на фиг 1.
Пример 3. Определение методом ИФА специфического взаимодействия МКА, продуцируемых гибридными клетками штамма Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 3F9 с вирусом Марбург или рекомбинатным белком VP35.
2
3
ИФА проводили на полистироловых планшетах. Антиген в рабочем разведении (очищенный и инактивированный ВМ или рекомбинатный белок VP35) сорбировали в ФСБ, pH 7, 4 в объеме 100 мкл/лунка на планшеты. Места неспецифического связывания насыщали при 37°С 45 минут 0,5% раствором казеина в буфере ТСБ-Твин (0.145 М хлористого натрия, 20 mМ Трис-HCl, 5 mМ PMSF (Sigma), 0,1% Tween-20 (Serva), рН-7,4) и затем инкубировали с очищенными МКА 45 минут при 37°С. Специфическое связывание МКА с антигеном выявляли антивидовыми меченными пероксидазой антителами против IgG мыши. Далее добавляли хромоген, 0,1% О-фенилендиамин, в цитратно-фосфатном буфере (0,2 М лимонной кислоты, 0,5 М NaНРO, pH 5,0) с 0,03% перекиси водорода). Останавливали реакцию добавлением 100 мкл на лунку 1 N НСl и измеряли оптическую плотность образцов на спектрофотометре "Multiscan" с использованием светофильтра с максимумом пропускания 492 нм. В качестве отрицательного и положительного контроля использовали гомологичные нормальную (неиммунную) и гипериммунную сыворотки, соответственно.
Пример 4. Выявление в иммуноблоте взаимодействия МКА, продуцируемых гибридными клетками штамма Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 3F9 с белком VP35 ВМ (штамм Рорр) и рекомбинатным белком VP35.
Вирусные белки и рекомбинатный белок VP35 после 12% ПААГ-электрофореза были перенесены на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore, США). Места неспецифического связывания насыщали 0,5% раствором казеина в буфере ТСБ-Твин (0,145 М хлористого натрия, 20 mМ Трис-НСl, 5 mM PMSF (Sigma), 0.1% Tween-20 (Serva), рН-7,4) при 37°С 2 часа. Затем отдельные полоски мембраны инкубировали с очищенными МКА 4 часа при 20-22°С. Специфическое связывание антител, взаимодействующих с вирусными белками, выявляли с помощью конъюгата антивидовых антител против IgG мыши, меченных пероксидазой хрена. В качестве отрицательного контроля использовали полоски мембраны с перенесенными после электрофореза инактивированным вирусом Эбола [28] и лизатом E.coli., также обработанными МКА 3F9. Результаты представлены на фиг 2.
Пример 5. Приготовление конъюгатов антител с биотином.
3
Для биотинилирования моноклональных иммуноглобулинов использовали следующую методику: готовили свежий раствор NSB(N-hydroxysuccinimidobiotin), для этого растворяли 2 мг биотина в 0,5 мл ДМСО и доводили объем до 2 мл. Затем готовили раствор очищенных МКА (в 0,1М NaHCO pH 9,0) в концентрации 1 мг/мл. Раствор NSB капельно добавляли к раствору МКА в объемном соотношении 1/1 и инкубировали при комнатной температуре в течение 4 часов. Затем доводили объем раствора до 1 мл 0,05М фосфатным буфером (PBS) с pH 7, 0, содержащем 0,15М натрия хлорида и 0,1% азида натрия. Диализовали против фосфатного буфера. Процесс включения биотина в иммуноглобулины контролировали титрованием меченых МКА на антигене, иммобилизованном на пластик, с конъюгатом пероксидазы со стрептовидином.
Пример 6. Конкурентный ИФА формата "сэндвич" для выявления нативного белка VP35 ВМ, (штамм Рорр) и рекомбинатного белка VP35. В лунках высокосорбционных полистироловых планшетов ('Testiks" или "Nunc") сорбировали очищенные МКА 3F9 в 0,5 М карбонатном буфере (pH 9,0) в объеме 100 мкл в рабочей концентрации (10 мкг/мл) при 22°С в течение 12 ч. Места для неспецифического связывания антител на планшетах насыщали 0,5% раствором казеина и выдерживали при 37°С в течение 30 минут. Титрование антигена проводили с разведения 1:400 двухкратным шагом в течение ночи при 4°С или при 37°С в течение часа. Затем в лунки планшетов вносили конъюгаты МКА 3F9 с биотином в рабочих разведениях (1 мкг/мл), выдерживали при 37°С в течение часа и, после 3-х кратной отмывки лунок, вносили в них конъюгат стрептавидина с пероксидазой. Специфическое связывание антител, меченных биотином, с конъюгатом выявляли жидкой субстратной системой ТМБ (3,3', 5,5' -Tetramethylbenzidine, Sigma) по 10 мкл на лунку. Выдерживали планшеты 30 мин в темноте, останавливали реакцию добавлением 100 мкл на лунку 1N соляной кислоты и измеряли оптическую плотность образцов на спектрофотометре "Uniscan" при длине волны 450 нм. Положительным считали результат измерения ОП в лунке, превышающий в 2 раза таковой для лунки с отрицательным контролем. Для отрицательного контроля связывания антител с антигеном использовали в качестве "захватывающих" антиген МКА 1С7, специфичные к белку VP35 вируса Эбола [27]. График титрования антигенов представлен на фиг.3.
Вышеприведенные свойства штамма гибридных клеток Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 3F9 (авторское название клеточной линии 3F9) позволяют заключить, что впервые на основе мышиной миеломы получена гибридома Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 3F9 - продуцент МКА к белку VP35 вируса Марбург. Штамм гибридных клеток обеспечивает получение мышиных моноклональных иммуноглобулинов класса IgGl в количестве 3-5 мг очищенных антител из миллилитра асцитической жидкости. Очищенные МКА специфично реагировали в ИФА с вирусом Марбург и рекомбинатным белком VP35 (титр МКА составлял 1:656100 и 1:1822500, соответственно); выявляли в иммуноблоте вирус-ассоциированный белок VP35 и рекомбинатный белок VP35 (полученный в результате биосинтеза в клетках E.coli на основе плазмидной конструкции, включающей полный ген VP35 ВМ). Антигенный эпитоп для МКА 3F9, продуцируемых данным штаммом локализован между 252 и 278 аминокислотными остатками. Использование МКА 3F9 в ИФА в формате "сэндвич" одновременно как в качестве "захватывающих" антиген, так и в качестве "индикаторных", меченных биотином, позволяет выявлять нативный и рекомбинатный белки с чувствительностью менее 1 нг/мл. Использование данных препаратов МКА и рекомбинатного белка VP35 в качестве положительного контроля на антиген позволит эффективно выявлять случаи ГЛМ на территории России в формате ИФА "сэндвич".
Вышеуказанные свойства штамма Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 3F9 (авторское название клеточной линии 3F9) отличают его от всех описанных ранее гибридом, продуцирующих МКА к белкам ВМ.
Источники информации
1. WHO report, 7 November 2005. The largest and deadliest outbreak of Marburg haemorrhagic fever on record.
2. Towner JS, Khristova ML, Sealy TK, Vinscent MJ, Erickson BR, Bawiec DA, Hartman AL, Comer JA, Zaki SR, Stroner U, Gomes da Silva F, del Castillo, Rollin PE, Ksiazek, TG, Nichol ST. / Marburgvirus genomics and association with a large hemorrhagic fever outbreak in Angola. J Virol 2006. 80(13):6497-516.
3. Луб М.Ю., Сергеев А.Н., Пьянкова О.Г., Пьянков О.В., Петрищенко В.А. Котляров Л.А. Клинико-вирусологические характеристики заболевания морских свинок, аэрогенно-инфицированных вирусом Марбург./ Журнал "Вопросы вирусологии", №3, 1995. Том 40, с.119-121.
4. Луб М.Ю., Сергеев А.Н., Пьянков О.В., Пьянкова О.Г., Петрищенко В.А. Котляров Л.А. / Некоторые патогенетические характеристики заболевания обезьян, аэрогенно-инфицированных вирусом Марбург./ Журнал "Вопросы вирусологии", №4, 1995. С.158-161.
5. Беланов Е.Ф., Мунтянов В.П., Крюк В.Д., Соколов А.В., Бормотов Н.И, Пьянков О.В., Сергеев А.Н. / Сохранение инфекционности вируса Марбург на контаминированных поверхностях и в аэрозоле. / Журнал "Вопросы вирусологии", 1996, №1. С.32-34.
6. Ignatyev GM, Agafonov АР, Streltsova NA, Kashentseva EA. / Inactivated Marburg virus elicits a nonprotective immune response in Rhesus monkeys. / J of Biotechnology 44. 1996. p.111-118.
7. Swenson D, Wang D, Luo M, Warfield KL, Woraratanadharm J, Holman DH, Dong JY, Pratt WD. / Complete protection of nonhuman primates against multistrain Ebola and Marburg virus infections. // Clin Vaccine Immunol. 2008. 15(3):460-7.
8. Muhlberger E, Lotfering B, Klenk HD, Becker S. / Three of the four nucleocapsid proteins of Marburg virus, NP, VP35, and L, are sufficient to mediate replication and transcription of Marburg virus-specific monocistronic minigenomes. / J Virol. 1998. 72(11):8756-64.
9. Moller P, Pariente N, Klenk HD, Becker S. / Homo-oligomerization of Marburg VP35 is essential for its function in replication and transcription. / J Virol 2005. 79(23): 14876-86.
10. Becker S, Rinne C, Hofsass U, Klenk HD, Muhlberger E. / Interections of Marburg virus nucleocapsid proteins. / Virology 1998. 249:406-417.
11. DiCarlo A, Moller P, Lander A, Kolesnikova, Becker S. / Nucleocapsid formation and RNA synthesis of Marburg virus is dependent on two coiled coil motifs in the nucleoprotein. / Virol 2007. 24;4:105.
12. Basler CF, Mikilasova A, Martinez-Sobrido L, Paragas J, Muhlberger E, Bray M, Klenk HD, Palese P, Garcia-Sastre A. / The Ebola virus VP35 protein inhibits activation of interferon regulatory factor 3. / J Virol. 2003 Jul; 77(14):7945-56.
13. Bray M. / The role of the Type I interferon response in the resistence of mice to filovirus infection. / Gen Virol 2001. 82(6):1365-73.
14. Wilson JA, Bray M, Bakken R, Hart MK. / Vaccine potential of Ebola virus VP24, VP30, VP35 and VP40 proteins. / J Virology 2001. 286(2):384-390.
15. Elliott LH, Kiley MP, McCormick JB. / Descriptive analysis of Ebola virus protein. / Virology 1985. 147, pp.l69-176.
16. Becker S, Feldmann H, Will C, Slenczka W. / Evidence for occurrence of filovirus antibodies in humans and imported monkeys: do subclinical filovirus infections occur worldwide? / J Med Microbiol Immunol (1992);181:43-55.
17. Кизимов H.B., Луб М.Ю., Черный Н.Б., Беланов Е.Ф. / Использование иммуноферментного анализа (ИФА) для обнаружения антигена вируса Марбург./ Межведомственная конференция 7-8 апреля 1993 "Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций". Кольцово.
18. Чепурнова Т.С., Писанко В.А., Бакулина Л.Ф., Жуков В.А., Чепурнов А.А. / Определение содержания вируса Марбург в крови и выделениях экспериментально инфицированных животных. / Вопросы вирусологии N2. 2000, с.18-20.
19. Букреев А.А., Скрипченко А.А., Гусев Ю.М., Фролов В.Г., Кандрушин Е.В., Красницкая И.М., Шестопалов A.M. / Перспективный метод препаративной наработки и очистки вируса Марбург./ Журнал "Вопросы вирусологии", №4, 1995. С.161-165.
20. Mitchel SW, McCormick JB. Phisicochemical inactivation of Lassa, Ebola and Marburg viruses and effect on clinical laboratory analyses. / J Clin Microbiol 1984. 20(3), pp.486-489.
21. Hevey M, Negley D, Geisbert J, Jahrling P, Schmaljohn A. / Antigenicity and vaccine potential of Marburg virus glycoprotein expressed by baculovirus recombinants. / Virology 239. 1997, pp.206-216.
22. Ручко С.В., Лебедев B.H., Пащенко Ю.И., Борисевич Г.В., Семенова И.С., Хамитов Р.А., Максимов В.А., Фирсова И.В., Петровский А.В. / Получение и изучение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к структурному гликопротеину вируса Марбург./ Журнал "Вопросы вирусологии", №6, 2001. С.21-24.
23. Владыко А.С., Чепурнов А.А., Быстрова С.И., Лемешко Н.Н., Лукашевич И.С. / Выявление антигена вируса Марбург методом твердофазного иммуноферментного анализа. / Журнал "Вопросы вирусологии", №5, 1991. С.419-421.
24. Saijo M, Georges-Courbor MC, Fukushi S, Mizutani T, Philippe M, Georges AJ, Kurane I, Morikawa S. / Marburgvirus nucleoprotein-capture enzyme-linked immunosorbent assay using monoclonal antibodies to recombinant nucleoprotein: detection of autothentic Marburgvirus. / J Infect. Dis, 2006. 59, pp.323-325.
25. Getter ML, Margulies DH, ScharfFMD. A simple method for polyethylene glycol promoted hybridization of mouse myeloma cells. /Somat Cell Genet 1977. V3, pp.231-236.
26. A.B.Сорокин, Е.И.Казачинская, A.B.Качко, A.B.Иванова, A.A.Букреев, И.А.Разумов. / Сравнительное исследование антигенных и иммуногенных свойств природного и рекомбинантного белков VP35 вируса Марбург./ Вопросы вирусологии. N5. 1999, с.206-213.
27. Казачинская Е.И., Перебоев А.В., Чепурнов А.А., Беланов Е.Ф., Разумов И.А. Моноклональные антитела к вирусу Эбола: получение, характеризация и изучение перекрестной реактивности с вирусом Марбург./ Вопросы вирусологии. N3. 2000, с.40-44.
28. Чепурнов А.А., Мерзликин Н.В., Рябчикова Е.И., Чепурнова Т.С., Волчков В.Е., Истомина Н.И., Кузьмин В.А., Воробьева М.С./ Получение очищенного вируса Эбола. // Журнал "Вопросы вирусологии". №6, 1994. С.254-257.
29. Остерман А.А. / Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. //Москва, 1981. С.37-64.