Применение пептидных микрочипов для эпитопного картирования и иммунодиагностики инфекционных заболеваний

Применение пептидных микрочипов для эпитопного картирования и иммунодиагностики инфекционных заболеваний*

М.А. Хижнякова, аспирантка, В.А. Фёдорова, д.м.н., профессор, С.С. Зайцев, соискатель, Саратовский НИВИ РАСХН; В.Л. Мотин, к.б.н., профессор, Университет Техаса, г. Галвестон, США

Инфекционные заболевания — это группа болезней, возбудителями которых являются патогенные микроорганизмы, такие, как бактерии, вирусы, паразиты и грибы. Быстрое распространение возбудителей инфекций, способных стать причиной эпидемий, ставит инфекционные болезни на одно из первых мест в структуре заболеваемости и смертности человека и животных.

Своевременная, чувствительная, мультиплексная и высокоточная диагностика инфекций является одной из важнейших стратегий в предотвращении распространения возбудителей и поддержании постоянного контроля над инфекционными заболеваниями.

Одним из новейших методов диагностики инфекционных заболеваний —метод пептидного микрочипа. В его основе лежит принцип специфического взаимодействия антигена и антитела. Этот подход применяется в иммунодиагностике, становление которой формировалось от реакции агглютинации на стекле, в которой определяемым объектом первоначально служили цельные клетки бактерий, а потом отдельные антигены, до более чувствительного твёрдофазного имму-ноферментного анализа — ТИФА (ELISA — от англ. Ensyme-Linked Immunosorbent Assay).

Схема постановки ELISA предполагает несколько стадий. Сначала проводят иммобилизацию антигенов на твёрдой фазе (подложке или сенситине). После этого инкубируют сенсибилизированные антигены с тестируемой сывороткой. Если в исследуемом образце присутствуют антитела, комплементарные сорбированным на подложке антигенам, то между ними будет образовываться специфическое связывание. Сформировавшийся комплекс антиген — антитело выявляется антивидовыми антителами, ковалентно сшитыми с ферментом. Конъюгированный фермент вступает с хромогенным субстратом в цветную реакцию, интенсивность которой учитывается визуально при сравнении со стандартами или по оптической плотности на ридере.

Принцип постановки ELISA положен в основу метода пептидного микрочипа, являющегося одним из важнейших инструментов геномики и протеомики. Наиболее значимое преимущество метода заключается в использовании отдельных пептидов антигенов в реакции специфического взаимодействия антигенов и антител. Таким образом, метод пептидного микрочипа позволяет на молекулярном уровне выявить специфическое связывание антител с индивидуальными эпитопами гомологичных антигенов (рис.). Немаловажным достоинством пептидного микрочипа выступает способность тестировать клинические образцы на множество мишеней (от нескольких десятков до сотен тысяч и более) в одном анализе, что является весьма перспективным для иммунодиагностики.

В 1984 г. H.M. Geysen с соавторами [1] для картирования эпитопов иммунологически важного белка VP1 вируса ящура создали первый прототип микрочипа с рекомбинантными пептидами, иммобилизованными на полиэтиленовых пластинах, положив, таким образом, начало развитию нового направления иммунодиагностики. Совершенствование технологии позволило увеличить количество наносимых пептидов, благодаря чему в 1992 г. R. Frank [1] разработал методику SPOT, использующую поэтапный твердофазный пептидный синтез (SPPS) и позволяющую синтезировать до 20 отдельных пептидов на 1 см2 поверхности мембраны. В то же время S.P. Fodor с соавторами [1] применил фотолитографический подход, что позволило нанести 1024 пептида на 1,6 см2, используя стеклянную платформу в качестве иммобилизующей подложки. В 2002 г. X.L. Gao [1] удалось усовершенствовать технологию пептидных микрочипов без использования литографии. Современные пептидные микрочипы позволяют проводить мультиплексные анализы с тысячами образцов и предполагают роботизировать проведение анализа с использованием двух основных методов: синтеза на 2D поверхностях аминофункциональных мембран или амини-рованном полипропилене и на специальных стеклянных слайдах. Первый метод наиболее востребован в поэтапной SPOT-технологии, так как длина пептида ограничена числом аминокислот (примерно 40). Второй метод предполагает ко-

* Работа выполнена при частичной поддержке проектов HDTRA 1-11-1-0032, Subaward N0. 12-096, ФЦП

Рис. - А. Слайд с иммобилизованными пептидами; Б. Последовательности различных пептидов, иммобилизованных на слайде; В. Инкубация пептидов с анализируемой сывороткой, содержащей палитру антител; Г. Специфическое взаимодействие антител с эпитопами гомологичных пептидов

валентную иммобилизацию на подготовленных стеклянных слайдах, включающую в себя три типа иммобилизации: регион-специфический, сайт-специфический и неориентированный. Наиболее точным из перечисленных типов является сайт-специфическая иммобилизация, в которой чётко определено место связывания пептида с подложкой [1].

Наиболее востребованной областью применения пептидных микрочипов в современной медицине, ветеринарии и научной деятельности является эпитопное картирование антигенов. Этот процесс позволяет не только определять специфичность отдельных пептидов антигенов, но и выявлять функцию каждого пептида в белковой структуре возбудителей инфекций, являясь, таким образом, эффективным инструментом протеомного анализа.

Так, применение пептидных микрочипов позволило определить пептид, содержащий имму-нодоминантный CD8 Т-клеточный эпитоп белка YopE Yersinia pestis, обеспечивающий защиту мышиных биомоделей от заражения лёгочной чумой [2]. Методом пептидного микрочипа были обнаружены 36 пептидов иммуногенных белков MOMP и HSP60 Chlamydia trachomatis, образующих комплекс с антителами мышиных биомоделей трёх линий, иммунизированных элементарными тельцами хламидий. Таким образом, были определены иммунодоминантные хламидийные пептиды, являющиеся перспективными в создании вакцин нового поколения [3]. Также удалось выявить пептид C. trachomatis, rMOMP-187, вызывающий высокий уровень Th1 ответа у биомоделей. Данный пептид был предложен в качестве кандидата для создания эффективной вакцины против хламидийной инфекции [4].

Эпитопное картирование антигенов возбудителей других инфекционных заболеваний

позволило обнаружить В-клеточные эпитопы к вирусу иммунодефицита человекоподобных обезьян, который является моделью ВИЧ [5]. С помощью пептидного микрочипа были определены Т-клеточные эпитопы, иммунодоми-нантные к Mycobacterium tuberculosis [6]. Данная технология позволила выявить доминантные в иммунном ответе эпитопы белков, консервативных для многих субтипов вируса гриппа. Так был синтезирован комплекс из шести пептидных эпитопов для последующего тестирования в качестве вакцины, которая защищала рекомбинантных мышей даже от субтипа H5N1. Ожидается, что данный вакцинный препарат окажется эффективным против будущих поколений вируса и не потребует ежегодной ревакцинации [7].

Технология пептидного микрочипа может быть адаптирована для использования в ТИФА с применением микропланшетов в качестве твёрдой фазы. Данная модификация успешно применена для выявления протективных Т- и B-клеточных эпитопов вируса ящура [8].

Благодаря возможности одновременной идентификации возбудителей различных заболеваний технология пептидного микрочипа является одной из самых перспективных и востребованных для совершенствования иммунодиагностики. Так, микрочип с использованием рекомбинантных пептидов, представляющих основные антигены вирусов гепатита В, С, иммунодефицита человека, Эпштейна-Барра, а также возбудителя сифилиса, был сконструирован на стеклянном слайде, на котором одновременно обнаруживали антитела к этим инфекциям [9]. Данный вариант анализа показал высокую чувствительность и специфичность. Только с помощью технологии микрочипов удалось одновременно детектировать Toxoplasma gondii, вирусы краснухи, герпеса 1- и 2-го типа и цитомегаловирус [10]. Пептидные микрочипы были использованы для выявления диагностически значимых пептидов Echinococcus granulosa [10]. Технология пептидного микрочипа также предложена для иммунодиагностики вируса ящура. Применение пептида, образующего комплекс со специфическими антителами, гомологичными к антигенам возбудителя, позволило обнаруживать вирус в 80% сывороток коров, больных ящуром [11]. Необходимо отметить, что полную пептидную последовательность белков вируса ящура и многих других инфекций сейчас предлагают синтезировать коммерческие фирмы, например Pepperprint.

Вследствие вышеизложенного следует заключить, что на сегодняшний день технология пептидных микрочипов внедряется в современную лабораторную практику и имеет несравнимый потенциал в клинических исследованиях и иммунодиагностике, становясь незаменимым инструментом геномного и протеомного анализа.

Литература

1. Uttamchandani М., Yao S. Peptide microarrays: Next generation biochips for detection, diagnostics and high-throughput screening // Current Pharmaceutical Design. 2008. Vol. 14. P. 1—11.

2. Lin J.S., Szaba F.M., Kummer L.W., Chromy B.A., Smiley S.T. Yersiniapestis YopE contains a dominant CD8 T cell epitope that confers protection in a mouse model of pneumonic plague // The Journal of Immunology. 2011. Vol. 187. P. 897-904.

3. Teng A., Cruz-Fisher M.I., Cheng C., Pal S., Sun G., Ralli-Jain P., Molina D.M., Feigner P.L., Liang X., de la Maza L.M. Proteomic identification of inmiunodominant chlamydial antigens in a mouse model // Journal of Proteomics. 2012.

4. Taha M.A., Singh S.R., Dennis V.A. Biodegradable PLGA85/15 nanoparticles as a delivery vehicle for Chlamydia trachomatis recombinant MOMP-187 peptide // Nanotechnology. 2012. Vol 23 (32). P. 325-101.

5. Neuman de Vegvar H.E., Amara R.R., Steinman L., Utz P.J., Robinson H.L., Robinson W.H. Microarray profiling of antibody responses against simian-human immunodeficiency virus: postchallenge convergence of reactivities independent of host histocompatibility type and vaccine regimen // J. Virol. 2003. Vol. 77 (20). P. 11125—11138.

6. Gaseitsiwe S., Valentini D., Malidavifar S., Reilly M., Ehr-nst A., Maeurer M. Peptide microarray-based identification of

Mycobacterium tuberculosis epitope binding to HLA-DRB 1*0101, DRB 1*1501, and DRB1 *0401 // Clinical and vaccine immunology.

2010. Vol. 17 (1). P. 168-175.

7. AdarY., Singer Y., Levi R., Tzehoval E., Perk S., Banet-Noach C., Nagar S., ArnonR., Ben-YedidiaT. Auniversalepitope-based influenza vaccine and its efficacy against H5N1 // Vaccine.

2009. Vol. 27 (15). P. 2099-2107.'

8. Ma L.N., Zhang J., Chen H.T., Zhou J.H., Ding Y.Z., Liu Y.S. An overview on ELISA techniques for FMD // Virology Journal.

2011. Vol. 4 (8). P. 419.

9. DuburcqX., Olivier C., Malingue F., Desmet R., Bouzidi A., Zhou F., Auriault C., Gras-Masse H., Melnyk O. Peptide-protein microarrays for the simultaneous detection of pathogen infections // Bioconjug. 2004. Vol. 15. P. 307-316.

10. Natesan M., Ulrich R.G. Protein microarrays and biomarkers of infectious disease // International journal of molecular sciences.

2010. Vol. 11 (12). P. 5165-5183.

11. Yang M., Clavijo A., Li M., Hole K., Holland H., Wang H., Deng M.Y. Identification of a major antibody binding epitope in the non-structural protein 3D of foot-and-mouth disease virus in cattle and the development of a monoclonal antibody with diagnostic applications // J. Immunol. Methods. 2007. Vol. 321 (1-2). P. 174-181.