КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИФИДОСОДЕРЖАЩЕЙ ПРОДУКЦИИ
CONSORTIUM OF STRAINS USED TO OBTAIN BIFIDO-CONTAINING PRODUCT

Изобретение относится к пищевой, биотехнологической и медицинской, косметической промышленности, в частности используется для приготовления кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов.
В связи с неблагоприятными экологическими условиями, стрессами, длительной антибактериальной, лучевой и химиотерапией, дисбиозами, возникающими вследствие перенесенных заболеваний, увеличивается количество людей страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. Для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, обладающим пробиотическим действием, так и пищевым продуктам, содержащим представителей нормальной микрофлоры кишечника - бифидобактерии.
Наиболее типичными для организма человека являются пять видов бифидобактерии - B.bifidum, B.longum, B.adolescentis, B.breve, B.infantis. С наибольшей частотой в биоценозе обнаруживаются виды B.bifidum и B.longum (до 75%). Вид B.adolescentis встречается в основном у взрослых людей, виды B.breve и B.infantis - преимущественно у детей грудного возраста.
Известны зарубежные моно- и комплексные препараты-эубиотики и кисломолочные продукты, включающие в свой состав бифидобактерии видов B.bifidum, B.lonqum, B.adolescentis, B.breve (патент №2336886, патент №2411008, Франция; патент №637297, Швейцария; патент №2134179, патент №2421066 ФРГ; патент №05227946, патент №0430642, Япония; патент №4645667, США).
У нас в стране для приготовления бактерийных препаратов и продуктов лечебно-диетического питания применяют отечественные штаммы бифидобактерий видов B.bifidum №1,791,792, ВКПМ S-1257, Ac-1578; B.lonqum B379M, B.adolescentis MC-42, В.breve 79-119, В.infantis 79-43 (авторское свидетельство №343588, патент РФ №2215028, патент РФ №1347221, патент РФ №849779, патент РФ №2108383, патент РФ №2152993, патент РФ №2216589, патент РФ №863639, патент РФ №2078814, патент РФ №2111248).
Качество лечебных продуктов и препаратов во многом обусловлено свойствами штамма-продуцента, его специфической активностью и технологичностью. Использование многоштаммовых композиций позволит суммировать полезные свойства, присущие отдельным штаммам, заселять организм человека теми из них, которые наиболее физиологичны для каждого индивидуума. Это делает возможным разработку комплексных продуктов лечебного питания и бактерийных препаратов, способных обеспечить высокую колонизационную резистентность организма человека, восстанавливать его нарушенную микрофлору и способствовать снижению заболеваемости.
Задачей настоящего изобретения являлось получение консорциума штаммов Bifidobacterium bifidum B-UH, Bifidobacterium longum B-NH, имеющего высокую биологическую активность, стабильное кислотообразование, способного хорошо расти при культивировании в искусственных питательных средах и молоке, устойчивого к условиям внешней среды и обладающего антагонистической активностью по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре.
Консорциум получен путем сочетания двух штаммов, относящихся к видам бифидобактерий, наиболее часто встречающимся в организме человека, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum.
Штамм Bifidobacterium bifidum B-UH выделен от здорового ребенка грудного возраста, депонирован в ВКПМ, ФГУП ГосНИИгенетика, коллекционный номер Ас-1875.
Штамм Bifidobacterium longum B-NH выделен от здорового ребенка грудного возраста, депонирован в ВКПМ, ФГУП ГосНИИгенетика, коллекционный номер Ас-1876.
Заявляемый консорциум штаммов Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum может быть использован при производстве кисломолочной продукции, заквасок, ферментированных пищевых продуктов, например: квас, пиво и т.п., неферментированных пищевых продуктов, например: соки, напитки и т.п. Так же консорциум штаммов бифидобактерий может широко использоваться для производства гигиенических и косметических средств, например: кремов, лосьонов, салфеток, мыла, присыпок, тампонов, питательных масок, гелей, женских прокладок, косметического молочка, различных пудр и т.д. Кроме того, консорциум штаммов бифидобактерий может быть применен в производстве бактериальных препаратов, в виде свечей, пероральных и других средств.
Техническим результатом заявленного изобретения является консорциум штаммов Bifidobacterium bifidum B-UH, Bifidobacterium longum B-NH, используемый в качестве биологически активного вещества для получения кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов. Консорциум штаммов обладает биологически и технологически значимыми свойствами, такими как кислотообразующая активность, способность наращивать микробную биомассу в различных питательных средах. Консорциум антагонистически активен по отношению к патогенным и условно-патогенной микроорганизмам.
Культурально-морфологические признаки консорциума.
Клетки штаммов консорциума бифидобактерий представляют собой грам+ полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2-х концах, склонные к образованию скоплений. В полужидких питательных средах растут по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Отдельно выросшие колонии в Бифидум-среде имеют удлиненную и шарообразную форму. Логарифмическая фаза роста заканчивается к 12-16 часам культивирования.
Физиолого-биохимические признаки консорциума.
Неподвижные, бесспоровые анаэробы. Оптимальная температура выращивания - (38±1)°C, pH питательных сред - 7.2-7,4. Каталазу не образуют, желатину не разжижают. Сбраживают глюкозу с образованием уксусной и L+ молочной кислоты без образования газа, закисляя среду выращивания до pH 4,2-3,4. Консорциум штаммов активно размножается на средах разного состава, а так же в молоке, сквашивая его к 12-18 часам культивирования. Это позволит широко использовать консорциум штаммов бифидобактерий в различных технологических процессах (Таблица 1).
Таблица 1.
Накопление микробной массы (КОЕ/мл lg 10) и активность кислотообразования (в градусах Тернера) консорциума штаммов бифидобактерий в динамике развития при культивировании в гидролизатно-молочной питательной среде (ГМ), Бифидум-среде (БФ) и молоке (М).
ПИТАТЕЛЬНАЯ
ВРЕМЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ
СРЕДА
12 ч
24 ч
48 ч
КОЕ
°T
КОЕ
°T
КОЕ
°T
ГМ
8,6
98
9,8
146
7,2
194
БФ
8,0
88
8,8
118
7,0
162
М
8,4
82
9,2
110
7,6
156
Таблица 2.
Антагонистическая активность штаммов Bifidobacterium bifidum B-UH, Bifidobacterium longum B-NH по отдельности и в составе консорциума
Штамм
Зона задержки роста тест-культур мм/M±m
Sh.sonnei
Sh.flexneri
E.coli
S.aureus
Pr.vulgaris
В.bifidum B-UH
22±2,0
25±1,8
18±1,6
20±1,2
25±1,4
В.longum B-NH
28±1,6
22±1,4
20±2,2
16±1,8
26±1,2
Консорциум
34±0,8
28±2,2
32±1,8
32±1,4
36±1,6
Консорциум штаммов бифидобактерий способен наращивать микробную массу в питательных средах, сквашивать молоко в короткие сроки культивирования, проявлять специфическую активность. Это делает возможным его использование в приготовлении кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов.
Пример №1. Получение и использование консорциума для приготовления кисломолочного продукта
1-ый пассаж
Лиофилизированные штаммы Bifidobacterium bifidum B-UH, Bifidobacterium longum B-NH в количестве 0,1 г сухой биомассы (1 доза) вносят по отдельности в среду выращивания и титруют методом десятикратных разведении до 10<sup>-7-9</sup>. Выращивают при температуре (38±1)°C до появления отдельных колоний в последнем разведении. Или 1 дозу сухой биомассы каждого штамма вносят в 20-30 мл питательной среды. Культивируют до получения биомассы с содержанием клеток микроорганизмов не менее 10<sup>8</sup>/мл.
2-ой пассаж
Выращенную культуру каждого из штаммов объемом не более 10% вносят в среду накопления и культивируют при температуре (38±1)°C до получения биомассы с содержанием микробных тел не менее 10<sup>8</sup>/мл.
3-ий пассаж (продукт)
Полученную биомассу каждого из штаммов смешивают, получая консорциум, и в объеме не более 5% вносят в стерильное молоко и культивируют до образования сгустка. Получают готовый кисломолочный продукт с нежным вкусом густой однородной консистенции с
содержанием не менее в 1 мл 10 живых бифидобактерий.
Пример №2. Получение и использование консорциума для приготовления ферментированных и неферментированного пищевых продуктов
1-ый пассаж
Лиофилизированные штаммы Bifidobacterium bifidum B-UH, Bifidobacterium longum B-NH в количестве 0,1 г сухой биомассы (1 доза) вносят по отдельности в среду выращивания и титруют методом десятикратных разведении до 10<sup>-7-9</sup>. Выращивают при температуре (38±1)°C до появления отдельных колоний в последнем разведении. Или 1 дозу сухой биомассы каждого штамма вносят в 20-30 мл питательной среды. Культивируют до получения биомассы с содержанием клеток микроорганизмов не менее 10<sup>7</sup>/мл.
2-ой пассаж
Выросшую культуру каждого из штаммов объемом не более 10% вносят в среду накопления и культивируют при температуре (38±1)°C до получения биомассы с содержание микробных тел не менее 10<sup>7</sup>/мл.
Получение ферментированного или неферментированного пищевого продукта
Полученную биомассу смешивают, получая консорциум, вносят в пищевое сырье (молоко, соки, пиво, квас и пр.), перемешивают и разливают в емкости. В результате получают продукт с титром клеток микроорганизмов не менее 10<sup>6</sup> в 1 мл.
Пример №3. Получение и использование консорциума штаммов бифидобактерий для приготовления биологически активной добавки
Получение жидкой биологически активной добавки (БАД)
Штаммы микроорганизмов Bifidobacterium bifidum B-UH, Bifidobacterium longum B-NH 1-2- их пассажей (пример 1) смешивают, получая консорциум, вносят в питательную среду объемом не более 5%, выращивают до получения биомассы с содержанием микробных тел в 1 мл не менее 10<sup>8</sup> и разливают в емкости. В результате получают биологически активную добавку, которая представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10<sup>8</sup>/мл содержанием штаммов микроорганизмов.
Получение сухой биологически активной добавки (БАД)
В жидкую биологически активную добавку вносят защитные среды высушивания (сахароза 80% и желатина 8% в объеме 10-12%, обезжиренное молоко до 20%). Полученную суспензию разливают по 1-5 мл (1-5 доз) в ампулы или пенициллиновые флаконы, замораживают при t (40-45)°C и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученная сухая биологически активная добавка в 1 дозе содержит не менее 10<sup>7</sup> живых клеток микроорганизмов.
Пример №4. Получение и использование консорциума штаммов бифидобактерий для приготовления бактерийного препарата
8
7
Штаммы Bifidobacterium bifidum B-UH, Bifidobacterium longum B-NH 1-2-их пассажей (пример 1) вносят по отдельности в питательную среду объемом не более 5%, выращивают при температуре (38±1)°C до получения микробной массы с содержанием микроорганизмов не менее 10/мл. Выращенную биомассу смешивают, получая консорциум штаммов, добавляют защитные среды высушивания (сахароза 80% и желатина 8% в объеме 10-12%, обезжиренное молоко до 20%). Полученную суспензию разливают по 1-5 мл (1-5 доз) в ампулы или пенициллиновые флаконы, замораживают при t (40-45)°C и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат (консорциум) в 1 дозе содержит 10 живых клеток микроорганизмов. Согласно НТД на препараты нормальной микрофлоры человека допускается содержание в 1 дозе не менее 10 живых клеток микробных тел.
Пример №5. Получение и использование консорциума штаммов для приготовления гигиенических и косметических средств.
8
Штаммы Bifidobacterium bifidum B-UH, Bifidobacterium longum B-NH 1-2-их пассажей (пример 1) вносят по отдельности в питательную среду объемом не более 5%, выращивают при температуре (38±1)°C до получения микробной массы с содержанием живых клеток не менее 10/мл.
Получение продукта: выросшую биомассу смешивают, получая консорциум, и вводят в состав крема или мыла в количестве не более 1%.
Пример №6. Получение и использование консорциума штаммов бифидобактерий для приготовления закваски
7
Лиофилизированные штаммы Bifidobacterium bifidum B-UH, Bifidobacterium longum B-NH в количестве 0,1 г (1 доза) сухой биомассы вносят по отдельности в 20-30 мл питательной среды. Выращивают до получения биомассы с содержанием микроорганизмов не менее 10/мл.
8
Получение закваски. Выросшую культуру штаммов микроорганизмов смешивают, получая консорциум, и объемом не более 10% вносят в среду накопления. Культивируют при температуре (38±1)°C до получения биомассы (закваски) с содержанием микробных тел не менее 10/мл.
Таким образом, предлагаемый консорциум активно размножается в питательных средах с накоплением производственной биомассы в короткие сроки культивирования, сквашивает молоко с образованием сгустка, обладает специфической активностью.
Полученный консорциум можно рекомендовать для приготовления кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, биологически активных добавок, бактерийных препаратов, гигиенических и косметических средств.
Клиническая эффективность консорциума проводилась в составе жидкой биологически активной добавки - «Нормофлорин Д» на базе Московской медицинской Академии имени И.М.Сеченова. Под наблюдением находились 40 взрослых людей с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК) - язвенный колит, Болезнь крона, хронический колит. Больные, наряду с базисной терапией, получали «Нормофлорин Д» по 1 столовой ложке перед едой в течение 30 дней. Контрольная группа людей не принимали «Нормофлорин Д». В результате у больных на фоне получения биодобавки «Нормофлорин Д» отмечено значительное снижение отрицательных проявлений диспепсического синдрома (тошнота, отрыжка, снижение аппетита), абдоминального синдрома (вздутие живота, метеоризм, частота и характер стула). Нежелательные явления при приеме «Нормофлорин Д» не наблюдались.