ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РНК ВИРУСА БЛЮТАНГА МЕТОДОМ ОТ-ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
TEST-SYSTEM FOR IDENTIFICATION OF RNA VIRUS OF BLUETONGUE BY RT-PCR METHOD IN REAL TIME MODE

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для генодиагностики, а именно для обнаружения РНК вируса блютанга.
Orbivirus,
Reoviridae
Вирус блютанга (ВБ), вызывающий заболевание у домашних и диких жвачных животных, является одним из видов рода  семейства  [1]. Геном вируса состоит из 10-ти сегментов дцРНК, упакованных в икосаэдрический нуклеокапсид, состоящий из семи структурных белков [2]. Десять линейных дцРНК сегментов генома ВБ варьируют по размеру от 3944 п.о. до 822 п.о. (пример для ВБ 8 серотипа) [3]. Они обозначены как сегменты 1-10, в соответствии с уменьшением молекулярной массы. Геном ВБ кодирует 10 белков вируса, каждый белок - одним из сегментов дцРНК [4]. Семь белков (VP1-VP7) являются структурными компонентами вирусной частицы, остальные три (NS1,NS2 и NS3) являются неструктурными белками, которые синтезируются во время репликации вируса в инфицированных клетках. Наименьший из неструктурных белков, NS3, кодируемый 10 сегментом, является четвертым наиболее вариабельным из белков ВБ [3], анализ которого позволил разделить изоляты вируса на несколько кладов [3], однако он считается умеренно консервативным относительно других сегментов. Например, NS3 белок вируса АЧЛ имеет чрезвычайно высокий уровень вариаций, что позволило сгруппировать последовательности 10 сегмента в 3 кластера - альфа, бета и гамма  [5]. Вне Африки вспышек АЧЛ было относительно немного и поэтому отсутствие любого географического группирования вирусов по 10 сегменту отражает ограничение вируса Африканским континентом. NS3 участвует в процессе освобождения частиц ВБ из инфицированной клетки хозяина  [6].
В настоящее время известно о существовании 26-ти генотипов вируса, 25 из которых в антигенном отношении соответствуют 1-24 и 26 серотипам вируса. Данные молекулярной эпидемиологии свидетельствуют о высокой генетической гетерогенности его популяции, которая позволяет разделить вирусы на типы, топотипы, квазитипы. На настоящий момент известно более 300-т вариантов вируса, генетически отличающихся друг от друга.
Существует необходимость совершенствования средств и методов лабораторной диагностики, постановки диагноза при бессимптомном течении болезни и появлении новых генетических вариантов вируса, а именно разработка серогруппспецифической тест-системы для обнаружения РНКвируса блютанга методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени, позволяющей в короткие сроки установить наличие генома возбудителя в образцах биологического материала от инфицированных животных. Трудности в ее разработке обусловлены несколькими факторами: во-первых, это структура генома, так как он представлен 10-ю сегментами дцРНК, и как результат - это известный на данный момент факт частой реассортации вирусов как полевых вариантов, так и полевых с вакцинными, не только внутри одного серотипа, но и между серотипами.
Известен количественный метод ОТ-ПЦР в режиме реального времени для обнаружения вакцинных и/или полевых штаммов ВБ. С того момента, как обнаружение ПЦР-продуктов стало основано на флюоресцентной интенсивности, это значительно увеличило производительность теста и  снизило риск контаминации. Были разработаны два универсальных теста, основанных на ОТ-ПЦР в режиме реального времени, они позволили обнаруживать все серотипы ВБ [7, 8, 9]. Все тест-системы были разработаны за рубежом и на период, когда было известно о существовании только 24 серотипов вируса. Существенным недостатком служит их дороговизна и длительный срок поставки в РФ, а также валидация только с использованием 24 серотипов, что может привести к ложноотрицательным результатам при исследовании материала, содержащего вирус блютанга новых генетических вариантов, или к снижению специфичности наборов.
Целью настоящего изобретения является создание серогруппспецифической тест-системы для РНК обнаружения вируса блютанга в пробах биологического материала, основанной на амплификации 10-го сегмента генома вируса блютанга.
Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая  тест-система для обнаружения генома вируса блютанга путем проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени включает синтетические олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд,  комплементарные участкам консервативного 10-го сегмента, имеющие следующий нуклеотидный состав (5' - 3'):
BTV/10/qf   - ACKggTgCWACgCAAACACA
BTV/10/z   -  FAM - AARgCTgCATTCgCATCgTACGC - BHQ1
BTV/10/qr  - ACRTCATCACgAAACgCTTC
Технический результат заключается в повышении эффективности обнаружения РНК вируса блютанга в образцах различных видов биологического материала, возможность определения серотипа вируса блютанга с помощью ПЦР с этапом обратной транскрипции в режиме реального времени, а также повышение специфичности и чувствительности, сокращение времени проведения работы по определению серотипа вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала.
Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных серогруппспецифических олигонуклеотидных праймеров и ДНК-зонда проводят ОТ-ПЦР в режиме реального времени, позволяющую выявить РНК вируса блютанга 25 серотипов (1-24, 26). Данная система позволяет повысить специфичность и чувствительность реакции.
В основе используемого способа - ПЦР в режиме реального времени, технология гибридизационных зондов TaqMan, контролирующая кинетику ПЦР непосредственно в ходе амплификации с использованием резонансного тушения флуоресценции. Для детекции использовали зонд, несущий флуорофор и тушитель, комплементарный части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмент.
Таблица 1
Серогруппспецифические праймеры и ДНК-зонд для обнаружения РНК вируса блютанга
<b>ПЦР-мишень</b>
<b>праймер/ДНК-зонд</b>
<b>нуклеотидная последовательность 5' - 3' </b>
<b>локализация </b> (NS3 ген, 8 серотип<b>, </b>FJ183383<b>)</b>
10 сегмент
BTV/10/qf
ACKggTgCWACgCAAACACA
212-231
BTV/10/z
AARgCTgCATTCgCATCgTACGC
242-264
BTV/10/qr
ACRTCATCACgAAACgCTTC
266-285
Выбор и анализ серогруппспецифических праймеров и зондов (табл. 1) проводили при помощи пакета прикладных программ «Bio Edit http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/BioEdit_708_062707.zip», «Oligo 6.0» на основании анализа нуклеотидных последовательностей 10-го сегмента референтных штаммов и изолятов 26 (1-26) серотипов вируса, опубликованных в GenBank. В качестве источника флуоресценции на 5' конце зонда применяли краситель FAM, а для тушения флуоресценции на 3' конце BHQ1.
Пример конкретного выполнения
Обнаружение генома вируса блютанга в образцах биологического материала (кровь от инфицированных блютангом животных, культуральный материал вируса, лиофилизированный культуральный материал вируса из музея штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, а также в образцах интактных культур клеток, кровь от интактных животных и культуральный материал гетерологичных вирусов).
Из представленных образцов с использованием реагента Тризол (Invitrogen) и согласно инструкции производителя были выделены нуклеиновые кислоты. Далее препараты нуклеиновых кислот использовали в реакции: 8 мкл образца добавляли к реакционной смеси для денатурации. В пробирку с денатурированной РНК добавляли смесь для реакции обратной транскрипции. Препараты полученных комплементарных ДНК в количестве 10 мкл использовали для постановки собственно ПЦР в режиме реального времени (результаты представлены в таблице 2).
Проведение  реакции обратной транскрипции
В подготовленные пробирки вносят по 7 мкл смеси для денатурации, сверху наслаивают 40 мкл минерального масла. Под масло вносят 8 мкл препарата РНК. Реакцию денатурации проводят при температуре 95°С в течение 5 минут. Далее необходимо заморозить смесь после денатурации, поместив пробирки в штатив с хладагентом.
Готовят смесь для обратной транскрипции, для этого на одну пробу в отдельной пробирке смешивают 9,5 мкл смеси для обратной транскрипции и 0,2 мкл (40 ед) MMLV-ревертазы, смесь перемешивают. В пробирки после денатурации вносят по 9,7 мкл смеси для обратной транскрипции. Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°С в течение 30-ти минут. После окончания реакции препарат кДНК используют для постановки ПЦР.
Проведение  ПЦР в режиме реального времени
3
В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на необходимое количество образцов, для этого на одну пробу добавляют 8 мкл смеси для ПЦР, 7 мкл смеси праймеров и 0,2 мкл (1 ед) Taq-полимеразы. Смесь перемешивают, избегая образования пены, и раскапывают по 15 мкл в пробирки объемом 0,2 см, на поверхность смеси вносят воск в объеме 15 мкл.
В подготовленные для ПЦР пробирки на воск вносят по 10 мкл кДНК.
Профиль реакции:
1. Удержание температуры              95°C    -   3 мин
2. Циклирование
95°C   -   10 c
60°С   -   20 с
72°С   -   15 с
Цикл повторить 5 раз.
3. Циклирование с детекцией 2
95° C   - 10 c
60° С   - 20 с   - Детекция
72° С   - 15 с
Цикл повторить -  40  раз.
Флуоресценцию измеряют по каналу Green при температуре 60°С.
Учет и интерпретация результатов амплификации
t
Результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне пороговой линией (Threshold), что соответствует наличию/отсутствию значения C в соответствующей графе в таблице результатов.
Таблица 2
Результаты обнаружения РНК вируса блютанга методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием серогруппспецифической тест-системы
№ проб
Характеристика биоматериала
Результат ОТ-ПЦР в режиме реального времени
1
культуральный вирус блютанга 1 серотип, RSArrrr/01 (AJ585122) референтный штамм
<b>+</b>
2
культуральный вирус блютанга 2 серотип, RSArrrr/02 (AJ585123) референтный штамм
<b>+</b>
3
культуральный вирус блютанга 3 серотип, RSArrrr/03 (AJ585124) референтный штамм
<b>+</b>
4
культуральный вирус блютанга 4 серотип, RSArrrr/04  (AJ585125) референтный штамм
<b>+</b>
5
культуральный вирус блютанга 5 серотип,  RSArrrr/05 (AJ585126) референтный штамм
<b>+</b>
6
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 6 серотип, RSArrrr/06 (AJ585127)  референтный штамм
<b>+</b>
7
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 7 серотип, RSArrrr/07 (AJ585128)  референтный штамм
<b>+</b>
8
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 8 серотип, RSArrrr/08 (AJ585129)   референтный штамм
<b>+</b>
9
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 9 серотип, RSArrrr/09 (AJ585130)  референтный штамм
<b>+</b>
10
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 10 серотип, RSArrrr/10 (AJ585131)  референтный штамм
<b>+</b>
11
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 11 серотип, RSArrrr/11 (AJ585132) референтный штамм
<b>+</b>
12
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 12 серотип, RSArrrr/12  (AJ585133) референтный штамм
<b>+</b>
13
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 13 серотип, RSArrrr/13  (AJ585134) референтный штамм
<b>+</b>
14
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 14 серотип, RSArrrr/14 (AJ585135) референтный штамм
<b>+</b>
15
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 15 серотип, RSArrrr/15 (AJ585136)  референтный штамм
<b>+</b>
16
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 16 серотип, RSArrrr/16 (AJ585137)  референтный штамм
<b>+</b>
17
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 17 серотип, RSArrrr/17 (AJ585138)  референтный штамм
<b>+</b>
18
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 18 серотип, RSArrrr/18 (AJ585139)  референтный штамм
<b>+</b>
19
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 19 серотип, RSArrrr/19 (AJ585140)  референтный штамм
<b>+</b>
20
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 20 серотип, RSArrrr/20 (AJ585141) референтный штамм
<b>+</b>
21
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 21 серотип, RSArrrr/21 (AJ585142)  референтный штамм
<b>+</b>
22
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 22 серотип, RSArrrr/22 (AJ585143)  референтный штамм
<b>+</b>
23
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 23 серотип, RSArrrr/23 (AJ585144)  референтный штамм
<b>+</b>
24
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 24 серотип, RSArrrr/24  (AJ585145) референтный штамм
<b>+</b>
25
культуральный вирус блютанга 26 серотип, KUW2010/02  (HM590642)
<b>+</b>
26
кровь ягненка, экспериментально инфицированного вирусом блютанга 14-го серотипа, 90-е сутки после заражения
<b>+</b>
27
кровь крупного рогатого скота, инфицированного вирусом блютанга 14-го серотипа
<b>+</b>
28
интактная культура клеток Vero
-
29
интактная культура клеток ВНК-21
-
30
кровь от интактного животного (корова)
-
31
кровь от интактного животного (овца)
-
32
культуральный  вирус ЭГБО, штамм «Нью-Джерси», 1 серотип
-
Таким образом, разработана тест-система, позволяющая с помощью метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени обнаруживать РНК вируса блютанга 25 серотипов (1-24, 26).
Основными преимуществами заявляемого изобретения являются:
- высокая специфичность и чувствительность тест-системы для обнаружения РНК вируса блютанга, благодаря избирательному выявлению уникальной нуклеотидной последовательности 10-го сегмента генома вируса;
- быстрота проведения анализа, благодаря исключению ряда процедур, необходимых для регистрации продуктов амплификации в классической ПЦР;
- простота выполнения методики, исключающая необходимость привлечения высококвалифицированного персонала;
- относительная дешевизна метода, благодаря использованию ОТ-ПЦР в режиме реального времени для идентификации генома возбудителя.
Источники информации
1. The dsRNA viruses/ P.P.C. Mertens// Virus Res. - 2004. -Vol.101. - P.3-13.
2. Bluetongue virus assembly and morphogenesis/ P. Roy, R. Noad// Curr Top Microbiol Immunol. - 2006. - Vol.309. - P.87-116.
3. Sequence analysis of bluetongue virus serotype 8 from the Netherlands 2006 and comparison to other European strains/ S. Maan,  N. S. Maan, N. Ross-smith, C. A. Batten, A. E. Shaw, S. J. Anthony, A. R. Samuel, K. E. Darpel, E. Veronesi, C. A. L. Oura, K. P. Singh, K. Nomikou, A. C. Potgieter, H. Attoui, E. van Rooij, P. van Rijn, K. D. Clercq, F. Vandenbussche, S. Zientara, E. Bre´ard, C. Sailleau, M. Beer, B. Hoffman, P.S. Mellor and P. P. C. Mertens// Virology. - 2008. - Vol. 377. - P.308-18.
5.         Mertens, P.P.C. Assignment of the genome segments of bluetongue virus type 1 to the proteins which they encode/ P.P.C. Mertens, F. Brown and D.V. Sangar// Virology. - 1984. - Vol.135. - P.207-17.
6.         Sailleau, C. Nucleotide sequence comparison of the segments S10 of the nine African horsesickness virus serotypes/ C. Sailleau, S. Moulay and S. Zientara// Arch. Virol. - 1997. - Vol.142. - P.965-78.
7.         Hyatt, A.D. Release of bluetongue virus-like particles from insect cells is mediated by BTV nonstructural protein NS3/NS3a/ A.D. Hyatt, Y. Zhaoand, P. Roy// Virology. - 1993. - Vol.193. - P.592-603.
8. Development and initial evaluation of a real-time RT-PCR assay to detect bluetongue virus genome segment 1/ A.E. Shaw, P. Monaghan, H.O. Alpar, S. Anthony, K.E. Darpel, C.A. Batten, A. Guercio, G. Alimena, M. Vitale, K. Bankowska, S. Carpenter, H. Jones, C.A.L. Oura, D.P. King, H. Elliott, P.S. Mellor, P.P.C. Mertens// http://www.sciencedirect.com/science/journal/01660934. - 2007. -http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_hubEid=1-s2.0-S0166093407X03136&_cid=271147&_pubType=JL&view=c&_auth=y&_acct=C000228598&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=3ce2e4caaf5a1dbc305c242f8e5a2345 P.115-126.
9. Bluetongue virus detection by two real-time RT-qPCRs targeting two different genomic segments/ J.F. Toussaint, C. Sailleau, E. Breard, S. Zientara, K. De Clercq// Journal of Virological Methods. - 2007. - Vol.140. - P.115-123.
10. Rapid detection and quantitation of Bluetongue virus (BTV) using a Molecular Beacon fluorescent probe assay/ G. Orr`u , M. L. Ferrando, M. Meloni, M. Liciardi, G. Savini, P. De Santis// Journal of Virological Methods. - 2006. - Vol.137. - P.34-42.