СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ ФИКОБИЛИПРОТЕИНОВ В КАЧЕСТВЕ ОПТИЧЕСКИХ СЕНСОРОВ ЛОКАЛЬНОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ В ЖИВЫХ КЛЕТКАХ И ТКАНЯХ
METHOD FOR APPLICATION OF PHYCOBILIPROTEINS AS OPTICAL SENSORS OF LOCAL TEMPERATURE IN LIVING CELLS AND TISSUES

Область техники
in vivo
Изобретение относится к биотехнологии. Более подробно изобретение относится к технологиям, в частности к методикам определения температуры растворов и локальной температуры клеток и тканей. Группа изобретений может найти свое применение в качестве методики расширения функциональных возможностей  микроскопии, метода FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy), микроскопии сверхвысокого разрешения (SIM и STORM).
Уровень техники
Терморегуляция - важнейший физиологический процесс в организме, регулирующийся на молекулярном уровне. Температура оказывает влияние на состояние и динамику молекул. Изменение температуры тела в целом или локальные изменения температуры на уровне отдельных клеток и тканей может происходить в ответ на различные стимулы и может применяться в качестве индикатора различных процессов, в том числе ассоциированных с патологическими состояниями организма, например изменения уровня экспрессии специфичных генов, активности ферментов, активацию ионных каналов и т.д. Так, известно, что развитие злокачественных новообразований, локализованные и системные инфекции, а также другие патологические состояния организма сопровождается повышенным тепловыделением [doi: 10.1111/j.1600-0609.1986.tb01749.x; doi: 10.1016/0002-9610(69)90090-7]. В последние годы активно ведется поиск способов детекции изменения температуры внутри клеток и тканей. Такие способы могут найти применение в диагностике ряда заболевания, в том числе ранней диагностики опухолей, а также для тестирования и определения цитотоксичности новых фармпрепаратов.
Из уровня техники известен ряд подходов к измерению температуры внутри клеток на основе флуоресцентных термосенсоров, которые можно разделить на несколько групп по способу детекции изменения температуры: измерение интенсивности фосфоресценции, измерение интенсивности флуоресценции, измерение интенсивности люминесценции, измерение времени жизни флуоресценции, вычисление отношения времени жизни флуоресценции к интенсивности флуоресценции, вычисление соотношения интенсивности флуоресценции двух или более молекул, измерение анизотропии флуоресценции, вычисление нормализованной флуоресценции, использование двухфотонной флуоресцентной микроскопии и квантовых точек и др. В качестве материалов термосенсоров используются комплексы металлов и флуоресцентных красителей, наноалмазы, нанокластеры золота, квантовые точки, наночастицы, флуоресцентные белки, красители и трейсеры, доставляемые внутрь клетки посредством липосом, физического контакта микропипетки с клеткой, интернализации клеткой из окружающей среды, микроинъекций, трансфекции, вирусов, инъекции мРНК, эндоцитоза [doi: 10.1007/s00424-018-2113-4]. Известные из уровня техники решения, касающиеся внутриклеточного определения температуры на основе измерения времени жизни флуоресценции [doi: 10.1016/j.snb.2017.06.041, doi: 10.1371/journal.pone.0117677, doi: 10.1002/anie.201306366, и doi: 10.1021/ac402128f] предлагают использовать либо инвазивные методы доставки термосенсора в клетки, например микроинъекции, либо интернализацию клетками комплексов на основе полиакриламидного полимера или эндоцитоз кластеров золота AuNC, которые накапливаются в эндосомах и лизосомах. Применение инвазивных методов доставки термосенсора, использование токсичных или влияющих на метаболизм клеток агентов в качестве термосенсоров не влияет на точность измерения температуры внутри клетки, но отражается на интерпретации взаимосвязи изменения внутриклеточной температуры и процессов, стимулировавших изменение температуры, что осложняет применение таких термосенсоров для индикации специфических внутриклеточных процессов и диагностики патологических состояний организма.
Наиболее близкое решение по отношению к заявляемому способу, известное из уровня техники, раскрыто в патентом документе US 7413341 B1 «Imaging methods» («Методы визуализации»), который защищает способ локального определения температуры в одной или нескольких точках образца, содержащего флуорофор, например, флуоресцентный краситель, флуоресцентные наночастицы или флуоресцентный белок, в месте, измерения температуры. При этом флуорофор, применимый в данном изобретении должен обеспечивать излучение стоксовой флуоресценции и антистоксовой флуоресценции. А определение температуры осуществляется по интенсивности антистоксовой и стоксовой флуоресценции с использованием распределения Больцмана, в случае, если концентрация флуорофора в точке измерения неизвестна и с использованием калибровочной кривой зависимости температуры от интенсивности анти-стоксовой флуоресценции, если концентрация флуорофора в точке измерения образца известна. В качестве образцов для измерения температуры по данному способу могут быть использованы отдельные клетки, несколько клеток или ткани. При этом в документе не раскрыта чувствительность и точность измерения температуры по данному способу. Недостатками данного способа является низкая чувствительность и точность определения температуры по интенсивности флуоресценции и зависимость от концентрации, существенный вклад в получаемые значения интенсивности флуоресценции, на основе которых определяется температура, вносят конструкционные особенности образца.
Раскрытие изобретения
В заявляемом изобретении предложено использование флуоресцентных пигмент-белковых комплексов - фикобилипротеинов - в качестве оптических температурных сенсоров. Получение информации о температуре локального окружения белка-сенсора осуществляется с помощью время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии и микроскопии. При этом регистрируются спектрально-временные характеристики флуоресценции фикобилипротеинов при возбуждении квантами с энергией, не превышающей энергию уровня S0-S1 поглощения - так называемая «антистоксова флуоресценция». Такой режим фотовозбуждения позволяет селективно регистрировать оптический ответ конформационно-активных хромофоров с отличным от основного состояния временем жизни с помощью время-разрешенной спектрофлуориметрии в импульсном режиме. Данный способ регистрации флуоресценции может быть использован для получения функциональных изображений клеток и тканей, оценки их метаболического состояния и исследования влияния факторов среды и различных воздействий.
Фикобилипротеины широко применяются в биолюминесцентных методах анализа за счет высокой фотостабильности и квантового выхода флуоресценции, а также низкой токсичности для живых организмов. На основе представлений о структуре данных пигмент-белковых комплексов и конформационной подвижности хромофоров предлагается использование этих белков для визуализации локальной температуры с возможностью высокого пространственного разрешения.
Задачей изобретения является разработка оптического способа измерения локальной температуры с высокой точностью (от 0,1°С до 0,3°С) и возможностью измерения с высоким пространственным разрешением (до 300 нм) в биологических средах (клетках и тканях), содержащих фикобилипротеины в различных конформационных состояниях. Анализ гетерогенности распределения конформационных состояний и связанных с ними спектрально-кинетических параметров осуществляется за счет регистрации кинетики затухания антистоксовой флуоресценции фикобилипротеинов в клетках и тканях.
Техническим результатом, достигаемым заявленным изобретением, является обеспечение возможности функциональной визуализации локальной температуры клеток и тканей за счет использования явления конформационной подвижности хромофоров фикобилипротеинов, время жизни флуоресценции которых при возбуждении инфракрасным светом от 750 до 790 нм зависит от локальной температуры.
Генетический материал, кодирующий апо-формы фикобилипротеинов и необходимый для синтеза билиновых хромофоров фикобилипротеинов, доставляется в клетки с помощью стандартных трансфекционных агентов, благодаря чему в клетках экспрессируются холо-формы белков. Для визуализации функционального состояния клеточных ассоциаций и тканей могут быть использованы химерные конструкции (коньюгаты) фикобилипротеинов и специфических антител.
Заявляемый способ характеризуется надежностью, простотой интерпретации результатов, возможностью работать с тканями на значительной глубине благодаря способности фикобилипротеинов (фикоцианина и аллофикоцианина) флуоресцировать и возбуждаться в диапазонах длин волн, прозрачных для клеток и тканей (длины волн флуоресценции 600-750 нм, длины волн возбуждения антистоксовой флюоресценции - 750-790 нм; фиг. 1), отсутствием необходимости дополнительных расходных материалов и специальных навыков персонала, что позволит быстро и широко внедрить его в практику.
Применение фикобилипротеинов в качестве оптических сенсоров локальной температуры в живых клетках и тканях включает следующие шаги:
1. Проведение контрольных калибровочных исследований на фикобилипротеинах в растворе натрий-фосфатного буфера с pH 7,8 или в буферном растворе, соответствующем по составу и параметрам среде целевого образца, в диапазоне температур от 10 до 45°С методом импульсной время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии (фиг. 2);
2. Окрашивание клеток или тканей за счет: (1) доставки генетического материала, позволяющего клеткам самостоятельно синтезировать хромофоры и белковую матрицу флуоресцентных белков; или (2) добавления в культуральную среду конъюгатов фикобилипротеинов с антителами, специфическими к рецепторам на поверхности плазматической мембраны целевых клеток.
3. Проведение измерений кинетики затухания антистоксовой флуоресценции фикобилипротеинов, находящихся в клетках и тканях, с помощью время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии или микроскопии (фиг. 2 и фиг. 3) и определение значения температуры по калибровочной кривой.
Фикобилипротеины фикоцианин и аллофикоцианин представляют собой водорастворимые белки, состоящие из субъединиц с молекулярной массой около 17 кДа. Взаимодействие хромофора и белковой матицы обуславливает специфической для различных типов фикобилипротеинов спектр флуоресценции в диапазоне от 600 до 750 нм. Такие значения энергий квантов флуоресценции являются оптимальными для получения флуоресцентных изображений клеток и тканей, так как совпадают с «окном прозрачности» биологических тканей. Хромофор фикобилипротеинов связан с белковой матрицей за счет ковалентной связи со специфическим остатком цистеина. Высокий квантовый выход флуоресценции (и времена жизни возбужденного состояния порядка 1.5 нс) достигаются за счет поддержания планарной структуры хромофора за счет нековалентных взаимодействий хромофора в локальном окружении белковой матрицы. Такие белок-хромофорные взаимодействия могут значительно изменяться в зависимости от внешних условий и, соответственно, чувствительны к локальному окружению хромофора, что определяет возможность наблюдения за состоянием белка и конформационной подвижностью хромофора с помощью оптических методов. Денатурирующие воздействия способны значительно менять конформацию белка и связанного хромофора, что сопровождается изменениями времени жизни флуоресценции фикобилипротеинов. В нормальных условиях фикобилипротеины характеризуются значительной стабильностью и гомогенностью наблюдаемых распределений спектрально-временных характеристик. Однако, наши экспериментальные данные показывают, что даже при нормальных условиях часть популяции хромофоров может находиться в измененном состоянии за счет флуктуаций тепловой энергии окружающей среды, вероятно, вызывающих изменения белок-белковых контактов между субъединицами фикобилипротеинов. Визуализация таких особых состояний хромофоров возможна за счет селективного возбуждения флуоресценции квантами с низкой энергией. При этом возбуждаются электронные переходы в колебательно-возбужденных состояниях хромофоров, которые, по всей видимости обладают большей конформационной подвижностью и, соответственно, более короткими временами жизни возбужденного состояния. Заселенность таких состояний и, соответственно, интенсивность антистоксовой флуоресценции зависит от температуры среды. Анализ спектрально-временных характеристик антистоксовой флуоресценции фикобилипротеинов показывает, что именно время жизни является наиболее чувствительным параметром для детектирования нетипичных конформационных состояний хромофоров, поэтому использование импульсной флуориметрии открывает новые возможности для использования этих флуоресцентных пигмент-белковых комплексов для решения задач биологического имиджинга и регистрации локальной температуры.
Для получения калибровочной зависимости времени жизни флуоресценции от температуры белки могут выделяться из природных источников или нарабатываться в бактериальной системе экспрессии по стандартной методике, например, описанной в статье [doi: 10.1007/s10529-008-9644-2].
0
1
Полученные таким образом фикобилипротеины характеризуются следующими параметрами: для альфа-фикоцианина характерный диапазон поглощения (переход S-S) от 500 до 750 нм с максимумом поглощения 623 нм и спектра флуоресценции от 600 до 800 нм с максимумом интенсивности флуоресценции на 645 нм, для альфа-аллофикоцианина характерный диапазон спектра поглощения от 500 до 750 нм с максимумом поглощения 626 нм и спектра флуоресценции от 600 до 800 нм с максимумом интенсивности флуоресценции на 640 нм. Различные конформационные состояния хромофоров фикобилипротеинов характеризуются отличающимися длинами волн поглощения и эмиссии флуоресценции, величинами квантовых выходов флуоресценции и временами жизни возбужденных состояний, благодаря чему раствор фикобилипротеинов обладает гетерогенностью. В спектрах поглощения и флуоресценции можно выделить два состояния: «красное» (длинноволновое) и «синее» (коротковолновое). При возбуждении антистоксовой флуоресценции квантами низкоэнергетического излучения с длиной волны приблизительно 750 нм наблюдается более селективное возбуждение красных (длинноволновых) состояний хромофоров фикобилипротеинов, благодаря чему спектры эмиссии флуоресценции смещаются на несколько нм в красную область для альфа-субъединиц фикоцианина и аллофикоцианина (фиг. 1).
Флуоресценция различных состояний хромофора характеризуется различиями в временах затухания флуоресценции, которые можно детектировать методами время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии, например методом счета одиночных фотонов с помощью гибридных детекторов со следующими характеристиками: квантовой эффективностью детекции эмиссии образца в диапазоне длин волн от 600 до 750 нм не менее 10%, разбросом времени детектирования фотонов не более 180 пс. При использовании метода счета одиночных фотонов должно быть использовано импульсное возбуждающее лазерное излучение с частотой импульсов до 80 МГц, длительностью импульса не более 30 пс, длиной волны излучения от 750 до 790 нм и энергией одиночного импульса не менее 10 пДж. Полученные с помощью метода счета одиночных фотонов кинетики затухания флуоресценции аппроксимируют суммой одной или двух затухающих экспоненциальных функций, подбирая свободные параметры модели так, чтобы значение суммы квадратов расхождений экспериментальных данных и экспоненциальной функции было минимальным.
0
1
При возбуждении стоксовой флуоресценции высокоэнергетическими квантами (энергия кванта больше энергии S-S) возбуждается преимущественно синяя форма хромофора с временами жизни флуоресценции 1600±500 пс, поэтому в кинетике затухания флуоресценции выявляется только одна компонента. В отличие от обычной стоксовой флуоресценции фикобилипротеинов, в кинетике затухания антистоксовой флуоресценции существуют две компоненты с характерными временами 300±100 пс и 1600±500 пс, амплитуды которых, а также среднее характерное время жизни флуоресценции линейно зависят от температуры среды (фиг. 2). Для калибровки зависимости характерных времен жизни флуоресценции от температуры должен быть использован раствор фикобилипротеина в натрий-фосфатном буфере с pH 7,8 в концентрации не более 10 мкг на мл, чтобы значение оптической плотности не превышало 0,1 оптических единиц для предотвращения эффектов перепоглощения флуоресценции.
Калибровка получена для диапазона от 10 до 45°С с шагом 0,1°С при стабилизации необходимой температуры с помощью термостатируемого кюветного отделения, стенки которого представляют из себя элементы Пельтье с системой водяного охлаждения. Запись каждой кинетики начиналась после достижения необходимой температуры раствора, определяемой с помощью термопары, погруженной в белковый раствор.
За счет своей известной структуры фикобилипротеины могут быть использованы в качестве генетически кодируемых температурных сенсоров в культурах животных клеток и тканях. Для использования в клетках нужно трансфецировать клеточную линию или первичную культуру согласно стандартным протоколам (желательная эффективность трансфекции больше 10%). Возможна также разработка стабильных клеточных линий, экспрессирующих фикобилипротеины, с применением стандартных методик, принятых в лабораторной практике, например методом трансдукции на основе вирусных векторов. Для стабильной экспрессии белков в животных клетках генетический материал, необходимый для получения холо-форм фикобилипротеинов альфа-фикоцианина и альфа-аллофикоцианина [doi: 10.1007/s10529-008-9644-2], может быть оптимизирован для использования кодонов искусственного гена, например, с помощью популярных программ Codon optimizer [doi: 10.1016/s1046-5928(03)00213-4] и OPTIMIZER [doi: 10.1093/nar/gkm219]. Кроме того, методика поддерживает также измерение температуры клеток или тканей, окрашенных фикобилипротеинами, например с помощью стандартных методик мечения клеточной поверхности антителами к специфическим или неспецифическим антигенам, включая обработку клеток или тканей антителами, меченными молекулами биотина, и последующую окраску стрептавидин-фикобилипротеином, например, стрептавидин-аллофикоцианином. Пример стандартной методики окраски клеточной поверхности стрептавидин-аллофикоцианином представлен в работе [doi: 10.1002/stem.1233].
После модификации клеток генетическим материалом, позволяющим экспрессировать холо-формы фикобилипротеинов, или окраски клеток возможно измерение их температуры путем измерения кинетик затухания антистоксовой флуоресценции фикобилипротеинов. Измерение температуры возможно при использовании спектрометра с возможностью измерения время-разрешенных характеристик флуоресценции (фиг. 2), если не требуется получить пространственную картину распределения температур в клетке, что может быть использовано для проточной флуоресцентной цитометрии. В этом случае, требования к лазерному оборудованию и детектору будут аналогичными требованию для оборудования для получения калибровки времен затухания флуоресценции от температуры, изложенной выше, а значение среднего характерного времени затухания флуоресценции, полученного с помощью экспоненциального анализа экспериментальной кинетики затухания флуоресценции, будет однозначно указывать на среднюю температуру области образца, с которой детектировался флюоресцентный сигнал, согласно калибровочной зависимости, полученной ранее для раствора флуоресцентных белков.
Также возможно использование клеток и тканей для измерения методом время-разрешенной флуоресцентной микроскопии (FLIM) (фиг. 3) для изучения пространственного распределения локальной температуры. Тогда применяются следующие технологические требования: 1) Наличие время-разрешенного флуоресцентного микроскопа (FLIM) (допускается также использование обычного флуоресцентного микроскопа с приставкой FLIM) с длиной волны возбуждения импульсного лазера от 750 до 790 нм; 2) Длительность импульса лазера не должна превышать 30 пс; 3) Частота импульсов лазера не должна быть больше 80 МГц; 4) Мощность лазера должна быть не менее 1 мВт; 5) Наличие детектора время-коррелированного счета фотонов с возможностью детекции эмиссии образца в диапазоне длин волн от 600 до 750 нм, разбросом времени прохождения не более 180 пс и квантовой эффективностью не менее 10%; 6) Синхронизация лазера и детектора через модуль для время-коррелированного счета одиночных фотонов; 7) Программное обеспечение для управления детектором время-коррелированного счета фотонов, сбора и анализа данных с возможностью экспорта данных времен затухания флуоресценции по каждому пикселю; 8) Желательна видеокарта с поддержкой CUDA для более быстрого анализа FLIM изображений.
Полученные с помощью время-разрешенной флуоресцентной микроскопии изображения обрабатываются таким образом, что экспоненциальные функции аппроксимируют кинетики затухания флуоресценции в каждом пикселе изображения, благодаря чему определяются значения характерных времен затухания флуоресценции в каждом отдельном пикселе. Каждое значение времени сопоставляется с калибровочной зависимостью характерного времени затухания флуоресценции от температуры, которая была получена заранее в контрольных экспериментах, благодаря чему может быть решена обратная задача, и значение времени жизни возбужденного состояния может быть однозначно представлено в виде соответствующей температуры. Преобразованное таким образом изображение является картой распределения значений локальной температуры фикобилипротеинов в окружении клеток или тканей.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежами.
На фиг. 1 представлен спектр антистоксовой флуоресценции хромофора фикоцианина при однофотонном возбуждении 770 нм.
На фиг. 2 представлена схема спектрофлуориметра для измерения кинетики затухания флуоресценции в растворе фикобилипротеинов при возбуждении антистоксовой флуоресценции, а также получения калибровки характерных времен жизни флуоресценции от температуры.
На фиг. 3 представлена схема время-разрешенного флуоресцентного микроскопа для получения температурных изображений клеток и тканей.
Осуществление изобретения
Готовят раствор фикобилипротеина посредством растворения 0,5 мг фикобилипротеина в 1 мл натрий-фосфатного буфера (pH 7,8) при температуре 25°С. Полученный раствор помещают под микроскоп или в спектральную установку и облучают лазером с параметрами частоты излучения от 10 до 80 МГц и длиной волны излучения от 750 до 790 нм в течение одной минуты для возбуждения флуоресценции образца. Регистрируют сигнал флуоресценции в диапазоне длин волн от 600 до 750 нм с отношением "сигнал-шум" не менее 10. Строят кривую кинетики затухания флуоресценции. Осуществляют аппроксимацию экспериментальных данных моделью из двух состояний. Определяют соотношения амплитуд и вкладов компонент с временами жизни флуоресценции 300±100 пс и 1600±500 пс. Затем по известным методикам готовят биологические образцы: клетки или ткани, экспрессирующие фикобилипротеины или окрашенные фикобилипротеинами и белковыми конструкциями на их основе. С использованием микроскопа или спектральной установки проводят измерение время-разрешенного сигнала антистоксовой флуоресценции. Для этого образец облучают лазером с параметрами частоты излучения от 10 до 80 МГц и длиной волны от 750 до 790 нм в течение не менее минуты и не более десяти минут. Регистрируют время разрешенный флуоресцентный сигнал в диапазоне длин волн от 600 до 750 нм с отношением "сигнал-шум" не менее 10. Строят кинетические кривые затухания флуоресценции и определяют соотношение амплитуд и вкладов компонент с временами жизни флуоресценции 300±100 пс и 1600±500 пс. С использованием калибровочной кривой определяют локальную температуру. Для приложений требующих исследование морфологии объектов и распределения неоднородностей локальной температуры: получение пространственной карты распределения кинетик затухания антистоксовой флуоресценции в режиме конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с пространственным разрешением не менее 400 нм.
Ниже представлены детальные примеры, описание которых не ограничивает возможные применения заявляемого изобретения, а демонстрирует возможность осуществления изобретения с достижением заявляемого технического результата.
Пример 1.
Построение калибровочной кривой зависимости времени жизни флуоресценции от температуры для альфа-фикоцианина
Escherichia coli
Получение плазмиды с кДНК фикоцианина, добавление плазмиды для генетической модификации культуры клеток бактерии , экспрессия белка в модифицированной культуре, а также выделение и очистку проводят по стандартной методике, например используют методику, описанную в статье [doi: 10.1007/s12010-007-8000-7]. Для измерений используют 1 мл раствора альфа-фикоцианина в 10 мМ натрий-фосфатном буфере с pH 7,8 в концентрации 10 мкг на мл.
Кинетики затухания флуоресценции регистрируют с помощью детектора, коррелированного по времени счета одиночных фотонов HPM-100-07C со сверхвысоким соотношением «сигнал-шум» и разбросом времени детектирования единичного фотона менее 20 пс (Becker & Hickl, Германия) и монохроматора ML-44 (Solar LS, Беларусь) на длине волны 670 нм (фиг. 1). Антистоксову флуоресценцию возбуждают лазерным импульсным излучением при 770 нм (частота 80 МГц, время полуширины импульса 150 фс, мощность излучения 685 мВт), полученным с использованием режима «signal» фемтосекундного параметрического генератора TOPOL (ООО «Авеста-Проект», Россия), способного генерировать лазерный луч с длиной волны от 680 до 2400 нм, с накачкой фемтосекундным Yb-лазером ТЕМА-150 (ООО «Авеста-Проект», Россия). Лазерный луч расфокусируют на образце с помощью рассеивающей линзы до диаметра примерно 0,6 см, для предотвращения нелинейных оптических эффектов (двухфотонного поглощения). Флуоресценцию образца детектируют перпендикулярно возбуждающему пучку. Чтобы избежать регистрации рассеянного излучения лазера, используют краевой коротковолновый светофильтр (Thorlabs, США) с пропусканием не менее 80 % до 750 нм (и менее 1 % после 750 нм). Температуру образца во время экспериментов поддерживают на постоянном уровне с помощью системы Qpod 2e с магнитной мешалкой (Quantum Northwest, Liberty Lake, WA, США), способной поддерживать температуру кюветного отделения с точностью 0,05°С. Запись каждой кинетики затухания флуоресценции начинают после достижения необходимой температуры раствора, определяемой с помощью термопары, погруженной в белковый раствор. Измерения проводят в кварцевой кювете 10 x 10 мм. Время накопления сигнала при каждой температуре составляет приблизительно 1 минуту. Получение и обработка данных проводится с помощью программного обеспечения SPCM и SPCImage (Becker & Hickl, Германия). Полученные кинетики затухания флуоресценции при разных температурах аппроксимируют двумя затухающими экспоненциальными функциями, так, чтобы значение суммы квадратов расхождений экспериментальных данных и экспоненциальной функции было минимальным. С помощью этой процедуры определяют соответствующие характерные кинетические компоненты (время жизни возбужденного состояния) и величины соответствующих амплитуд компонент кинетики. Полученные в экспериментах зависимости в дальнейшем используют для определения локальной температуры с помощью измерения времени жизни флуоресценции альфа-фикоцианина с точностью не менее 0,1°С.
Пример 2.
Картирование температуры клеток HEK293, меченных альфа-аллофикоцианином, с помощью время разрешенной флуоресцентной микроскопии
Клетки HEK293 обрабатывают поликлональными биотинилированными антителами кролика CABT-L347R (Creative Diagnostics, США) и окрашивают стрептавидин-аллофикоцианином по стандартной технологии: клетки промывают натрий-фосфатным буфером, содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина, добавляют антитела в конечной концентрации 1 мкг на мл и инкубируют в течение 20 минут при 4°С, после чего еще раз промывают и окрашивают стрептавидин-аллофикоцианином (eBioscience, США), разведенным в 500 раз, в течение 20 минут при +4°С. После проведения окрашивания клетки инкубируют 2 часа при +37°С в атмосфере 5% углекислого газа в среде F12/DMEM с 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 15 мМ HEPES.
Измерения проводят с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse Ti2-U (США), модифицированного мультифотонным гальваносканером FLIM DCS-120 (Becker & Hickl, Германия) c детектором время-коррелированного счета фотонов HMP-100-40 (Becker & Hickl, Германия) со следующими характеристиками: эффективность детекции в диапазоне от 600 до 750 нм не менее 10 %, разброс времени прохождения 180 пс. Получение и обработку данных осуществляют с помощью программного обеспечения SPCM и SPCImage (Becker & Hickl, Германия) для управления детектором время-коррелированного счета фотонов, сбора и анализа данных с возможностью экспорта данных времен затухания флуоресценции по каждому пикселю. Измерения клеток проводят при температуре +37°С. Полученные кинетики затухания флуоресценции аппроксимируют двумя затухающими экспоненциальными функциями, для каждого пикселя так, чтобы значение суммы квадратов расхождений экспериментальных данных и экспоненциальной функции было минимально. Для более быстрой обработки данных расчет производят на компьютере с видеокартой с поддержкой графических ядер CUDA. Значения характерных времен затухания флуоресценции экспортируют для каждого пикселя в виде общей матрицы, после чего значения пересчитывают с учетом заранее полученной калибровки для альфа-аллофикоцианина в 10 мМ натрий-фосфатном буфере с pH 7,8 в концентрации 10 мкг на мл по методике, аналогичной методике из Примера 1, и визуализируют в виде наложения температурной карты на конфокальное изображение клетки с помощью программного обеспечения Origin (США).