СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ОКСИДОВ И СУЛЬФИДОВ В ТКАНЯХ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ
METHOD FOR DETECTION OF EXTRACELLULAR OXIDES AND SULFIDES IN TISSUES OF CARDIOVASCULAR SYSTEM

Изобретение относится к области раздела биоминералогии - медицинской минералогии и может быть использовано:
- в медицине, при исследовании болезней связанных с воспалениями, нарушением тканевого дыхания, разложением белков.
в фармакологии, для выявления ятрогенных болезней, вызванных различными лекарственными наполнителями.
в биофизике (магнитобиологии), для объяснения механизма биомедицинских эффектов, производимых электромагнитными полями в организме человека.
- в минералогии, поскольку значительно расширяют температурно-барометрические, временные и окислительно-восстановительные рамки оксидного и сульфидного минералообразования.
- в биохимии, коллоидной химии и т.д.
Известные исследования ведутся на субклеточном уровне и/или ограничиваются магнитометрической аппаратурой. Все они не учитывают возможности присутствия в организме внеклеточных магнитных веществ:
ферромагнетиков и парамагнетиков.
Известным и самым распространенным способом обнаружения ферромагнитных оксидов в тканях является метод изотермического остаточного намагничивания, заключающийся в измерении общего объема ферромагнитного материала в тканях (Kirschvink, J.L., Kobayashi-Kirschvink, A., Woodford, B.J. Magnetite biomineralization in the human brain (1992) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 89 (16), pp.7683-7687).
Известен способ выявления оксидов в тканях методом Мессбауэровской спектроскопии, заключающийся в резонансном поглощении γ-квантов атомными ядрами, позволяющий определить валентное состояние исследуемых атомов и установить природу химической связи элементов в минералах (J.Galazka-Friedman, E.R.Bauminger, A.Friedman, D.Koziorowski, К.Szlachta. Human nigral and liver iron - comparison by Mössbauer spectroscopy, electron microscopy and ELISA. (2005) Hyperfine Interact, 165, pp 285-288). Недостатками известных магнитометрических аналогов является узкий диапазон диагностики минералов, т.к. метод чувствителен только к ферромагнетикам, высокая себестоимость анализа, т.к. кроме специальной аппаратуры и высокопрофессионального штата сотрудников, для анализа необходимы немагнитные инструменты, стеклянные ножи, магнитоэкранируемое помещение очищенное от магнитной пыли и частиц, кроме того, для заморозки тканей необходим жидкий азот. Также недостатками является отсутствие визуализации взаимоотношений между тканью и минералом, отсутствие информации о форме и размерах магнитных кристаллов, низкая производительность анализа в единицу времени из-за сложной пробоподготовки.
Известным способом выявления оксидов железа в тканях является метод электронной микроскопии, часто применяющийся совместно с магнитометрическими исследованиями, заключающийся в изучении минеральных зерен, размером менее 1 микрона в электронных микроскопах различных типов, чаще всего просвечивающего типа, в которых изображение получается при прохождении электронов через объект. (Methotrexate-Modified Superparamagnetic Nanoparticles and Their Intracellular Uptake into Human Cancer Cell. (2005), Langmuir, 21, pp 8858-8864). Недостатками этого способа является низкая производительность и высокая стоимость анализа из-за сложной и очень дорогой многоступенчатой пробоподготовки (изготовление специального, очень дорогого гистологического препарата для электронной микроскопии), высокой стоимости прибора и необходимости участия в исследовании высокопрофессионального обслуживающего персонала, а также невозможность изготовить гистологический препарат в том случае, если размеры минералов превышают 0,2 микрона. В таком случае препарат разрывается этими зернами и/или ломается кварцевый нож, а алмазные ножи очень дороги и широко не используются. Недостатками также является невозможность исследования на микродифрактометрической приставке к электронному микроскопу крупных (более 0.2 микрона) минеральных зерен и небольшие размеры исследуемой площади, т.к. диаметр сетки, на которой укреплен гистологический препарат, 2 мм.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа обнаружения внеклеточных оксидов и сульфидов в тканях сердечно-сосудистой системы с целью изучения минеральных неорганических включений в тканях во всем из многообразии, в том числе диа- и парамагнетиков, для изучения морфологии, структуры, состава кристаллов оксидов и сульфидов и их агрегатов, выявления характера взаимодействия этих минеральных фаз с окружающими тканями, а также выявления механизма биомедицинских эффектов, производимых электромагнитными полями в организме человека.
Способ обнаружения внеклеточных оксидов и сульфидов в тканях сердечно-сосудистой системы включает высушивание выдержанной в формалине ткани на воздухе при комнатной температуре в течение 1-3 дней с последующим быстрым разрезанием (желательно поперек коллагеновых волокон) тонким алмазным диском, быстрым высушиванием и полировкой на плотной бумаге или на стекле с помощью алмазной пасты, с последующим изучением полированной поверхности аншлифа в отраженном свете поляризационного микроскопа, с анализом форм выделения и минеральных фаз, возможным благодаря высокой отражательной способности оксидов и сульфидов.
Объектами применения изобретения являются кальцинированные и не кальцинированные ткани кардиоваскулярной системы: в основном клапаны и участки восходящих аорт кардиобольных, ткани миокарда, эндокарда, перикарда. Исследуемый материал может быть как биопсийным, так и аутопсийным. Фрагменты тканей фиксируются в 12% растворе формалина в течение 1-2 недель, затем высушиваются на воздухе в течение 1-2 дней. Для приготовнения аншлифа высушенная ткань быстро разрезается с помощью максимально тонкого алмазного диска, сразу промокается, чтобы избежать разбухания коллагена, быстро обсушивается, с применением теплового вентилятора и полируется несколько минут (2-5 мин) на плотной бумаге или на стекле с помощью алмазной пасты. Полученные аншлифы изучаются с помощью любого поляризационного микроскопа в отраженном свете. Метод исследования минералов в отраженном свете (минераграфический) используется для визуального наблюдения непрозрачных объектов в отраженном свете в светлом и темном полях. Объекты диагностируются по различной величине поглощения, отражению или двойному лучепреломлению.
Примеры осуществления изобретения.
Пример 1. Обнаружение внеклеточных оксидов в тканях сердечно-сосудистой системы.
Для исследования на предмет обнаружения оксидов в восходящей аорте был выбран образец ткани аорты размером 1 см, отобранный ранее для биопсийных исследований и содержащийся в 10-12% формалине.
Образец был высушен в течение 2 суток на воздухе при комнатной температуре. После высушивания образец разрезали тонким алмазным диском, сразу промокнули бумажной салфеткой, чтобы избежать разбухания коллагена и деформации ровной поверхности, подсушили в течение 30 минут и отполировали на плотной бумаге с помощью алмазной пасты. В результате минераграфического исследования полученного аншлифа восходящей аорты на оптическом микроскопе AXIOSKOP 40 фирмы ZEISS были обнаружены неравномерно распределенные в стенке аорты оксиды. Распределение зерен оксидов было подчинено структурам и текстурам кальцинатов, а также органогенным структурам и было слоистым (фиг.1), гнездовидным (фиг.2) или беспорядочно-вкрапленным.
Пример 2. Обнаружение внеклеточных сульфидов в тканях сердечно-сосудистой системы.
Для выявления возможности образования внеклеточных сульфидов в тканях кардиоздоровых людей был изготовлен аншлиф из аутопсийной ткани восходящей аорты кардиоздорового человека. Для этого ткань извлекли из формалина, высушили в течение 3 дней при комнатной температуре на воздухе, быстро разрезали на тонком алмазном диске, промокнули бумажной салфеткой, досушили в течение 30-40 минут и отполировали на стекле с помощью тонкой алмазной пасты. При изучении аншлифа с помощью микроскопа AXIOSKOP 40 фирмы ZEISS были обнаружены многочисленные рассеянные зерна сульфида меди (фиг.3).
Пример 3. Обнаружение внеклеточных сульфидов в некальцинированных тканях сердечных клапанов.
Для решения вопроса о присутствии оксидов и сульфидов в патогенных тканях сердечно-сосудистой системы не затронутых кальцинозом, был изготовлен аншлиф из биопсийного сердечного клапана. Для этого извлеченный из формалина клапан был высушен при комнатной температуре на воздухе в течение 2 дней, быстро разрезан с помощью тонкого алмазного диска и сразу высушен, сначала с помощью бумажной салфетки, а потом с помощью теплового вентилятора в течение 40 минут. Затем ровная поверхность среза полировалась с помощью алмазной пасты на плотной бумаге в течение 5 минут. При изучении аншлифа на оптическом микроскопе в отраженном свете были обнаружены зерна оксидов и единичное зерно сульфида меди (фиг.4), на основании чего был сделан вывод о том, что кристаллы оксидов и сульфидов являются первыми минералами, образующимися в процессе патологической минерализации тканей сердечно-сосудичстой системы. Кристаллы апатита при этом, если и присутствуют, то только наноразмерные, не различимые с помощью оптического микроскопа.
Преимуществами заявленного изобретения является низкая себестоимость вследствие отсутствия специальной сложной и дорогой аппаратуры для изготовления и последующего исследования аншлифа, большая площадь исследования, по сравнению с электронно-микроскопическим исследованием. Высокая производительность способа заключается в быстром изготовлении аншлифа с простым и легким последующим описанием. На изготовление одного аншлифа уходит не более 10-15 минут. Заявленное изобретение позволяет изучать крупные, более 0,2 микрона, внеклеточные кристаллы и зерна оксидов и сульфидов, в отличие от исследований методом электронной микроскопии, широкий круг минералов с повышенной отражательной способностью и различными магнитными свойствами. Заявленное изобретение позволяет визуализировать исследования на макро- и микроуровнях и, в определенных случаях, выявить взаимоотношения костного и органического вещества в ткани.