Способ иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения в фиксаторах
METHOD OF IMMUNOHISTOCHEMICAL ANTIGENS DETECTION IN PREPARATIONS OF PRODUCTIVE AND NON-PRODUCTIVE ANIMALS ORGANS OF LONG-TERM STORAGE IN FIXTURES

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области иммуногистохимии, в частности к способу иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения в фиксаторах, и может быть использовано для детекции субпопуляции клеток с помощью мультимерной безбиотиновой системы детекции путем окрашивания гистологических срезов тканей или органов на специфические антигены.
Уровень техники
Известен классический способ иммуногистохимического выявления антигенов, заключающийся в использовании специальных предметных стекол покрытых адгезивом «Поли-L-лизин», депарафинизации и регидратации препаратов обычным способом, путем перемещения предметных стекол по рабочим растворам: (ксилол 5 мин, ксилол 5 мин, спирт 96° 5 мин, спирт 96° 3 мин, спирт 70° 3 мин, промыть в дистиллированной воде), инкубировать при комнатной температуре в 0,3% растворе перекиси водорода (Hydrogen Peroxide Block) в течение 10 минут, промыть стекла в PBS (Tween 20х) буфере, провести тепловую демаскировку антигенов в цитратном буфере (рН 6.0), в микроволновой печи при высокой мощности (чтобы не было кипения) в течение 10 минут, охладить стекла в микроволновой печи в течение 20 минут, промыть стекла в водопроводной воде 1 минуту, затем промыть в PBS (Tween 20х) буфере дважды по 3 минуты, внести фосфатный буфер (Protein Block (рН 7,6) содержащий 0,5% БСА (бычья сыворотка) и 0,5% казеина), инкубировать 10 минут при комнатной температуре, стряхнуть излишки раствора, нанести на стекла первичное антитело и инкубировать при комнатной температуре 30 минут, промыть стекла в PBS (Tween 20х) буфере, нанести вторичные антитела (Complement №1 (кролик-анти-мышь) или (HRP Conjugate №2 (козьи-антикроличьи) меченные HRP), инкубировать 10 минут при комнатной температуре, промыть стекла в PBS (Tween 20х) буфере, добавить вторичное антитело, инкубировать при комнатной температуре 15 минут, промыть стекла в PBS (Tween 20х) буфере, сделать раствор из DAB Substrate (1 мл) и DAB Chromogen (20 мкл), добавить раствор хромогена, инкубировать при комнатной температуре 5 мин, промыть стекла в PBS (Tween 20х) буфере, провести контрастирующую подкраску гематоксилином (если требуется) в течение 1 минуты, промыть водопроводной водой, промыть в 2 сменах 96° спирта перенести в ксилол на 5 минут и заключить препарат под покровное стекло (см. Методики фирм изготовителей, вложенные в наборы антител и буферов и мультимерных наборов для визуализации (см. REVEAL BIOTIN-FREE POLYVALENT DAB; Spring Bioscience (США), www.springbio.com, дата производства 2013 г.).
Способ имеет ряд недостатков: антитела предназначены только для исследований биоптатов взятых от человека и фиксация материала должна проводиться не более 48 часов.
51
Известна группа изобретений относящихся к области иммунологии и медицины и касается способа выявления аутоиммунного ответа против белка 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазы, способа диагностики миопатии, а также способа определения целесообразности продолжения терапии статинами у субъекта, включающих выявление аутоантитела, распознающего указанный белок. Предложен также набор для диагностики миопатии. Группа изобретений обеспечивает возможность определить и выявить аутоантитела у субъекта с мышечной болью и слабостью, при этом выявляется необходимость прекращения терапии статинами и необходимость начала иммуносупрессивной терапии (см. патент RU 2574932, МПК G01N 33/573).
Недостатком группы изобретений является исследование биоптатов взятых только от человека.
Известен способ иммуногистохимического выявления цитоархитектоники эндокринной части поджелудочной железы от 10 хищных птиц (беркута, сокола-сапсана, балобана, Турецкого стервятника, красного ястреба). Было выделено три типа островков: тип смешанных островков, состоящих, в основном из глюкагон (А)-секретирующих клеток. Тип "В" смешанных островков с преимущественным содержанием инсулин (В)-секретирующих клеток и типа М смешанных островков (Тип М), состоящих из разного количества глюкагон, инсулин и соматостатин (D)-секретирующих клеток. Последние были далее охарактеризованы в тип I, II или III в соответствии с распределением клеток трех типов клеток. А и D клеток были также беспорядочно разбросанные в экзокринной части поджелудочной железы.
Результаты этого исследования позволяют предположить, что классическая концепция распределения у птиц островков, содержащих или А или В клеток - это не применимо у хищных птиц, и показывает отклонения у них в развитии механизмов эволюционной адаптации к пищевым привычкам (см. AN IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY OF THE ENDOCRINE PANCREAS IN RAPTORS / Palmieri C, Shivaprasad H.L. // Res Vet Sci. 2014 Dec; 97(3):58791. DOI: 10.1016/j.rvsc.2014.10.011. Epub 2014 Nov 4).
Недостатком данного способа является то, что антитела предназначены только для исследований биоптатов взятых от птиц.
Известен способ изучения закономерностей распределения панкреатических островков в поджелудочной железе от четырех видов животных (крыс, собак, свиней и обезьяны), а также, выявление иммуногистохимических клеток панкреатических островков различных типов, их характеристики и количества, при этом гистологическое исследование проводят на срезах окрашенных гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование с использованием поликлональных антител кролика (рАb) против инсулина, глюкагона, панкреатического полипептид (РР), соматостатина, хромогранина, кератина, бомбезина и гастрина, и мышиные моноклональные антитела (mAb) против синаптофизина, Leu-7 и на пролиферирующий ядерный антиген (PCNA) с использованием кроличьих антител в иммунопероксидазной (РАР) и стрептавидин/пероксидазой (StreptABC/HRP) реакций. Положительные иммуногистохимические реакции наблюдались в панкреатических островках всех видов животных со всеми антителами, за исключением анти-бомбезина и анти-гастрина. Наши результаты показали, что: 1) у каждого вида отмечается видовое структурное строение островков в поджелудочной железе, 2) каждый вид представляет собой характерное распределение клеток, продуцирующих различные гормоны. 3) иммунореактивность иммуногистохимических маркеров варьирует между видами и/или возрастом.
Сравнительное иммуногистохимическое исследование полезно для ответов на вопросы, которые важны для понимания механизмов которые регулируют интегрированные функции эндокринной части поджелудочной железы (см. A comparative immunohistochemical study of pancreatic islets in laboratory animals (rats, dogs, minipigs, nonhuman primates / Wieczorek G, Pospischil A, Perentes E. // Exp Toxicol Pathol. 1998 Jim; 50(3): 151-72).
Способ имеет ряд недостатков: антитела предназначены только для исследований биоптатов взятых от лабораторных животных и фиксация материала должна проводиться не более 48 часов.
Известен также способ селективного выявления микроглии в препаратах головного мозга кроликов, включающий использование стрептавидина. Способ заключается в депарафинизации и регидратации препаратов обычным методом, затем промывают стекла в течение 5 минут в дистиллированной воде и проводят тепловое демаскирование антигенов в модифицированном цитратном буфере. Эту обработку осуществляют в пароварке или в сосуде Хелендахела в течение 25 минут, или применяют другие приборы - автоклав, скороварку, микроволновую печь, водяную баню - изменив сроки инкубации в растворе в зависимости от типа использованного прибора. Охлаждают стекла в остывающем буфере в течение 15-20 минут. Остывшие предметные стекла промывают дистиллированной водой для удаления остатков буфера и помещают в стаканчик с 3% перекисью водорода на 5-10 минут для блокировки эндогенной пероксидазы, удаляют из срезов перекись водорода путем промывки в дистиллированной воде, после чего предметные стекла переносят в 0,01 М фосфатно-солевой буфер на 5-7 минут. Создают гидрофобный барьер вокруг срезов для препятствия растекания реагентов по всему предметному стеклу и уменьшения объема используемых в дальнейшем дорогостоящих реагентов. Для этого необходимо аккуратно промокнуть стекло вокруг срезов фильтровальной бумагой (для образования сухого поля) и обвести область расположения срезов гидрофобным фломастером. Сразу после этого, не допуская подсыхания срезов, на них нанести необходимое количество (100-200 мкл.) блокировочного раствора - 5% раствора бычьего сывороточного альбумина на ФСБ и оставить при комнатной температуре на 10 минут. Удалить излишек блокировочного раствора без промывки, нанести на срезы необходимое количество поликлональных козьих антител к белку Iba-1 (разведение 1:200). После этого поместить стекла во «влажные камеры» (можно использовать любые пластиковые коробки с крышками, например чашки Петри, на дно которых положить влажную фильтровальную бумагу и стеклянные палочки) и оставить в термостате при 27°С на 12-14 часов или на ночь. На этом завершается обработка препаратов в 1-й день, что занимает около 2-3 часов (в зависимости от числа одновременно обрабатываемых препаратов). На следующий день обработку препаратов начинают с извлечения контейнеров из термостата. Далее необходимо смыть антитела промывочным буфером и поместить стекла в стаканчик с аналогичным буфером на 5-7 минут. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов, нанести на срезы необходимое количество вторичных антикозьих биотинилированных антител (разведение 1:200) и поставить в термостат при 27°С на 60 минут. Смыть вторичные антитела промывочным буфером и поместить стекла в стаканчик с ФСБ на 5-7 минут. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов, нанести на срезы необходимое количество стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой и поставить в термостат при 27°С на 30 минут, затем смыть конъюгат стрептавидина промывочным буфером и поместить стекла в стаканчик с одним из этих буферов на 5-7 минут. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой предметное стекло вокруг срезов, нанести необходимое количество рабочего раствора 3,3-диаминобензидина. В течение 1-3 минут происходит образование окрашенного продукта гистохимической реакции (этот процесс желательно контролировать под микроскопом, чтобы остановить реакцию до появления неспецифического фона). Смыть раствор хромогена и промыть препараты в 2-3 порциях дистиллированной воды по 3-5 минут в каждой. При необходимости препараты можно докрасить гематоксилином Майера в течение 0,5 минут с подсинением в щелочной воде (1 капля 10% аммиака на 100 мл дистиллированной воды). Обезводить препараты в этаноле восходящей крепости, просветлить в ксилоле обычным образом и заключить в полистирол (пермаунт) (см. Выявление микроглии в препаратах головного мозга, длительное время хранившихся в растворе формалина / Е.Г. Сухорукова, М.С. Захряпин, Н.М. Аничков, Д.Э. Коржевский // Морфология. 2012. Т. 142. №5. С. 68-70.).
Данный способ позволяет селективно выявлять микроглию в препаратах головного мозга только лабораторных животных (кроликов), находившихся в растворе формалина свыше 2 месяцев.
2
2
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип, является способ окрашивания срезов, включающий проведение иммуногистохимических реакций, причем депарафинированные и регидратированные срезы обрабатывают 3% раствором НО в течение 10-12 мин. для блокирования эндогенной пероксидазы, затем срезы подвергают высокотемпературной обработке в 0,01 М цитратном буфере (рН 6,0) в течение 40-45 мин. Инкубацию срезов с первичными антителами на C-kit(CD117), a-SMA, инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид проводят во влажной камере при температуре 27°С в течение 24-26 часов. Со вторыми козьими антителами инкубацию проводят в течение 60 минут во влажной камере при температуре 27°С, после инкубации применяют высокочувствительную систему визуализации Reveal biotin-free polyvalent DAB (SpringBioScience, США). Микроскопию срезов проводят на световом микроскопе Olympus ВХ45 со встроенным фотоаппаратом (см. Цитоархитектоника эндокриноцитов поджелудочной железы крупного рогатого скота в постнатальном онтогенезе / О.В. Дилекова // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - №3. - с. 542; C-KIT/SCF-R эндокриноцитов поджелудочной железы крупного рогатого скота / О.В. Дилекова // Вестник АПК. - 2015. - №1 - с. 29-33).
Недостатком данного способа является выявление и изучение антигенов в материале полученного только от крупного рогатого скота в постнатальном онтогенезе.
Раскрытие изобретения
3
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения в фиксаторах путем проведения иммуногистохимического окрашивания гистологических срезов, полученных от крупного рогатого скота, мелкого рогатого скота, свиней, собак и кошек из материала стандартного размера (1 см) который фиксируется в формалине от 1 года до 2 лет, обладающего качеством выявления антигенов.
Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к высокому качеству выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения.
2
2
2
2
Технический результат достигается с помощью способа иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения в фиксаторах, включающий обработку поверхности предметного стекла для наклеивания срезов адгезивом на основе яичного белка и глицерина в соотношении 2:1, депарафинирование и регидратацию срезов, обработку 3% аптечной НО в течение 10 минут, инкубирование стекол в 0,01 М цитратном буфере при рН 6,0 для демаскировки антигенов в пароварке в течение 40-45 минут, инкубирование стекол со срезами с первичными антителами во «влажной камере» при температуре 27°С в течение 24 часов, со вторичными антителами инкубирование проводят в течении 60 минут во «влажной камере» при температуре 27°С, после чего применяют высокочувствительную систему визуализации Reveal biotin-free polyvalent DAB, микроскопию срезов проводят на световом микроскопе со встроенным фотоаппаратом, при этом после депарафинизации и регидратации, срезы опускают на 5 минут в чистую емкость с дистиллированной водой, затем срезы помещают в НO на 10-12 минут, после работы пароварки, содержащей цитратный буфер в течение 40-45 минут, при этом стекла из пароварки не вынимают в течение 20 минут после прекращения ее работы, после этого промывают срезы дистиллированной водой, затем помещают в буфер (Твин 20х), далее для образования сухого поля срезы промакивают одноразовыми бумажными полотенцами, причем делают гидрофобный слой специальными маркерами, далее наносят блокировочный раствор, в качестве которого используют 5% бычий сывороточный альбумин, на 10-12 минут, при этом не допуская подсыхания, наносят первичные антитела и ставят в термостат при 27°С на 24-26 часов во «влажной камере», через 14-15 часов смывают первичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5-7 минут, при этом срезы промакивают одноразовыми полотенцами, далее на срезы наносят вторичные антитела и ставят в термостат на 1-2 часа во «влажной камере» при температуре 27°С, далее смывают вторичные антитела, при этом используют хромоген на безбиотиновой системе детекции, и окрашивают в течение 3 минут, смывают хромоген в трех порциях дистиллированной воды по 5-7 минут, докрашивают срезы гематоксилином Майера 5-7 минут, далее ополаскивают стекла в дистиллированной воде и опускают в щелочную воду на 10-15 секунд.
2
2
Таким образом, технический результат достигается с помощью способа иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения в фиксаторах и включающий покрытие предметных стекол адгезивом на основе яичного белка и глицерина в соотношении 2:1, депарафинизацию и регидратацию (обычным способом), ополаскивание в дистиллированной воде в течение 5 минут, инкубирование стекол в пароварке в цитратном буфере (рН 6,0) в течение 40-45 минут в стаканах из химического стекла, при этом, после прекращения работы пароварки стекла в ней оставляют для остывания на 20 минут, далее срезы промывают дистиллированной водой (2 смены) для смывания остатков буфера, помещают в 3% аптечную НO на 10-12 минут. Далее стекла промывают в дистиллированной воде и помещают в буфер (Твин 20х) на 10-12 минут. После буфера стекла вокруг срезов аккуратно промакивают одноразовыми бумажными полотенцами, делают вокруг срезов гидрофобный слой специальным маркером для иммуногистохимических исследований, не допуская подсыхания срезов и наносят на срезы блокировочный раствор - 5% бычий сывороточный альбумин на 10 минут, затем опять подсушивают одноразовыми бумажными полотенцами, наносят первичные антитела и ставят в термостат при 27°С на 24-26 часов. (Для того чтобы не подсыхали срезы, стекла укладываются на пластиковый планшет срезами вверх, и под стекла подкладывают смоченные дистиллированной водой одноразовые бумажные полотенца. Сверху планшет накрывают прозрачной пленкой вырезанной из скоросшивателя. Таким образом, жидкость не испаряется). На следующий день, через 14-15 часов смывают первичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут, промакивают одноразовыми бумажными полотенцами и наносят на срезы вторичные антитела и ставят в термостат при температуре 27°С на 1 час или на 1 час 15 минут. Затем смывают вторичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут, наносят на срезы безбиотиновую систему детекции с хромогеном на 3 минуты, после чего смывают хромоген в 3-х порциях дистиллированной воды по 5 минут каждая порция, докрашивают срезы гематоксилином Майера 5-7 минут, удаляют излишки красителя путем ополаскивания стекол в дистиллированной воде и опускают препараты в щелочную воду (1 мл ХЧ 100% аммиака на 300 мл воды) и ополаскивают в течение 10-15 секунд (до посинения срезов), после чего обезвоживают препараты в этаноле восходящей крепости, просветляют в карболксилоле в течение 5 минут, и в 2 сменах ксилола по 5 минут, после чего заключают в полистирол или другую синтетическую среду.
Сущность способа иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных, длительного хранения в фиксаторах, заключается в следующем.
Проводят обработку поверхности предметного стекла для среза адгезивом на основе яичного белка и глицерина в соотношении 2:1 (для приклеивания срезов), депарафинизацию и регидратацию срезов, ополаскивание стекол со срезами в дистиллированной воде в течение 5 минут. Затем следует демаскировка антигенов в пароварке в цитратном буфере 40-45 минут в стаканах из химического стекла. После прекращения работы пароварки стекла из нее не вынимают 20 минут. Далее стекла со срезами промывают дистиллированной водой (для смывания остатков буфера) в 2-х сменах, помещают в 3% аптечную перекись водорода на 10-12 минут, после чего срезы промывают в дистиллированной воде и помещают в буфер (Твин 20х) на 10 минут. Затем вынимают стекла из буфера и вокруг срезов аккуратно промакивают стекло одноразовыми бумажными полотенцами и делают вокруг срезов гидрофобный слой специальным маркером для иммуногистохимических реакций. После этого, не допуская подсыхания срезов наносят на них блокировочный раствор - 5% бычий сывороточный альбумин на 10 минут, затем опять подсушивают одноразовыми бумажными полотенцами и наносят первичные антитела, после чего ставят стекла в термостат при 27°С на 24-26 часов (для того чтобы не подсыхали срезы стекла укладываются на планшет из пластика, под стекла подкладывают смоченные дистиллированной водой одноразовые бумажные полотенца и сверху накрывают прозрачной пленкой вырезанной из скоросшивателя. Таким образом, жидкость не испаряется). Через 14-15 часов смывают первичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут, промакивают срезы одноразовыми бумажными полотенцами и наносят на срезы вторичные антитела и предметные стекла ставят в термостат при 27°С на 1 час - 1 час 15 минут. После пройденного времени вторичные антитела смывают буфером (Твин 20х) 5 минут и наносят на срезы хромоген на 3 минуты. Далее хромоген смывают в 3-х порциях дистиллированной воды по 5 минут. Докрашивают срезы гематоксилином Майера в течение 5-7 минут, затем споласкивают в дистиллированной воде (для смывания остатков буфера), после чего опускают стекла в щелочную воду и ополаскивают 10-15 секунд (до посинения).
Краткое описание чертежей и иных материалов
На фиг. 1 дан способ иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения в фиксаторах, А - эндокриноциты в эндокринном островке поджелудочной железы свиньи. Ув. × 1000. Плохое качество (окрашивание клеток и межклеточного пространства и ациноцитов железы).
На фиг. 2 – то же, a-SMA маркер поджелудочной железы собак. Ув. × 1000. Плохое качество (фоновое окрашивание ядер островка и цитоплазмы ациноцитов железы).
На фиг. 3 – то же, a-SMA маркер поджелудочной железы собак. Ув. × 1000
На фиг. 4, тоже, А - эндокриноциты в эндокринном островке поджелудочной железы свиньи. Ув. × 1000.
На фиг. 5 – то же, C-kit маркер поджелудочной железы овцы. Ув. × 1000.
На фиг. 6 и то же, В - эндокриноциты в эндокринном островке поджелудочной железы крупного рогатого скота. Ув. × 1000.
На фиг. 7 – то же, В - эндокриноциты в эндокринном островке поджелудочной железы крупного рогатого скота. Ув. × 1000. Плохое качество (интенсивное фоновое окрашивание).
На фиг. 8 и то же, C-kit маркер поджелудочной железы овцы. Ув. × 1000. Плохое качество (слабая экспрессия маркера и фоновое окрашивание ацинусов).
Осуществление изобретения
Примеры конкретного выполнения способа иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения в фиксаторах.
Пример 1. Исследования проводят на базе Научно-диагностического и лечебного ветеринарного центра ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» в гистологической лаборатории.
2
2
При проведении иммуногистохимических реакций со стекол классическим гистологическим методом срезы приклеивают к стеклу без адгезива (для избегания фонового окрашивания структур среза) (см. фиг. 1, 2), удаляют парафин (депарафинизация и регидратация): 2 порции ксилола по 5 минут, 2 порции спирта 96% по 5 минут, полоскание в 70% спирте, полоскание в дистиллированной воде, затем стекла помещают в 3% аптечную НО на 10 мин, в котором происходит блокировка эндогенной пероксидазы. В пароварке в стакане из химического стекла проводят тепловую демаскировку антигенов в цитратном буфере рН 6,0 в течении 40 минут, где происходит разрыв SH-мостиков белка, которые образуются при фиксации формалином, обнажаются рецепторы клетки, промывают дистиллированной водой для смывания остатков буфера (2 смены), далее помещают в буфер (Твин 20х) на 10 минут, затем срезы аккуратно промокают фильтровальной бумагой для образования сухого поля, наносят на них блокировочный раствор - 5% бычий сывороточный альбумин на 10 минут. Немного подсушивают фильтровальной бумагой, наносят первичные антитела и ставят в термостат при 27°С на 24 часа.
На следующий день смывают первичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут. Промокают срезы фильтровальной бумагой (но не сушить). Далее на срезы необходимо нанести вторичные антитела поставить в термостат при 27°С на 1 час. Далее смыть вторичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут. Затем нанести конъюгированный стрептавидин на 5 минут, а затем его смыть буфером (Твин 20х). Затем нанести хромоген на 5 минут. Далее смыть хромоген в 2-х порциях дистиллированной воды по 5 минут. Затем докрасить срезы гематоксилином Майера 5 минут, после чего опустить стекла в щелочную воду (на 100 мл дистиллированной воды 1 мл ХЧ 100% аммиака и полоскать 10 сек). Далее по классической гистологической схеме стекла ополаскивают в 70% спирте 1 минуту, затем проводят через 2 смены 96% спирта по 3 минуты, далее опускают в карболксилол на 5 минут, после чего проводят через 2 смены ксилола по 5 минут и заключают в полистирол или другую синтетическую среду.
Данный способ иммуногистохимического выявления антигенов при вышеуказанных параметрах имеет ряд недостатков: после температурной демаскировки антигенов в цитратном буфере происходит отскакивание срезов со стекол, вокруг срезов происходит растекание реагентов, (см. фиг. 1, 2),что приводит к их большому расходованию, из-за большой плотности фильтровальной бумаги не происходит быстрого впитывания реагентов вокруг срезов при их промакивании, из-за большой плотности фильтровальной бумаги при ее контакте со срезами происходит их отскакивание со стекла.
2
2
2
2
Пример 2. Проводят аналогично примера №1, но предметные стекла обрабатывают адгезивом на основе яичного белка и глицерина в соотношении 2:1, срезы помещают на 10 минут в 3% аптечную НO, после их инкубации в стаканах из химического стекла, причем инкубирование стекол проводят в 0,01 М цитратном буфере при рН 6,0 для демаскировки антигенов в пароварке в течение 40 минут. После прекращения работы пароварки, стекла не вынимают из пароварки в течение 20 минут. Затем их промывают дистиллированной водой для смывания остатков буфера (2 смены). После НO срезы промывают в дистиллированной воде. Далее помещают в буфер (Твин 20х) на 10 минут, после чего срезы аккуратно промакивают одноразовыми бумажными полотенцами для образования сухого поля вокруг срезов, но стекла при этом вынимают из буфера поочередно, во избежание подсыхания срезов (если реакция проводится на 3-х и более стекол, при однократном вынимании сразу всех стекол, происходит подсыхание срезов, что приводит к их порче). Далее вокруг срезов делают гидрофобный слой маркером для иммуногистохимических реакций (для предотвращения растекания реактивов). Не допуская подсыхания срезов, наносят на них блокировочный раствор - 5% бычий сывороточный альбумин на 10 минут. Затем со срезов удаляют блокировочный раствор путем подсушивания их одноразовыми бумажными полотенцами (не допуская подсыхания срезов). Затем наносят первичные антитела и ставят в термостат при 27°С на 24 ч, причем для того чтобы не подсыхали срезы стекла укладывают на планшет из пластика, под стекла подкладывают смоченные одноразовыми бумажные полотенца дистиллированной водой и сверху накрывают прозрачной пленкой, таким образом, жидкость не испаряется и создается «влажная камера». На следующий день смывают первичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут. Опять промакивают одноразовыми бумажными полотенцами (но не сушат). Наносят на срезы вторичные антитела и опять ставят в термостат при 27°С на 1 ч, после чего смывают вторичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут. Наносят на срезы хромоген содержащий безбиотиновую систему детекции антител на 3 минуты. Затем смывают хромоген в 3-х порциях дистиллированной воды по 5 минут. Докрашивают срезы гематоксилином Майера в течение 5 минут. Ополаскивают срезы в дистиллированной воде (для удаления излишка красителя) и опускают препараты в щелочную воду и ополаскивают 10 секунд (до посинения). Далее по классической гистологической схеме препараты ополаскивают в 70% спирте 1 минуту, затем проводят через 2 смены 96% спирта по 3 минуты, далее опускают в карболксилол на 3 минуты, затем проводят через 2 смены ксилола по 5 минут и заключают в полистирол или другую синтетическую среду.
Этот способ позволяет производить иммуногистохимическое окрашивание гистологических срезов, срезы не отскакивают со стекол и нет фонового окрашивания среза (см. фиг. 3, 4).
2
2
2
2
Пример 3. Проводят аналогично примера №1 и 2, но предметные стекла обрабатывают адгезивом на основе яичного белка и глицерина в соотношении 2:1, срезы помещают на 12 минут в 3% аптечную НО, после их инкубации в стаканах из химического стекла, причем инкубирование стекол проводят в 0,01 М цитратном буфере при рН 6,0 для демаскировки антигенов в пароварке, в течение 45 минут. После прекращения работы пароварки стекла не вынимают из пароварки 20 минут. Затем промывают дистиллированной водой для смывания остатков буфера (2 смены). После НО срезы промывают в дистиллированной воде. Далее помещают в буфер (Твин 20х) на 10 минут, после чего срезы аккуратно промакивают также одноразовыми бумажными полотенцами для образования сухого поля вокруг срезов, но стекла при этом вынимают из буфера поочередно, во избежание подсыхания срезов (если реакция проводится на 3-х и более стекол, при однократном вынимании сразу всех стекол, происходит подсыхание срезов, что приводит к их порче). Далее вокруг срезов делают гидрофобный слой маркером для иммуногистохимических реакций (для предотвращения растекания реактивов). Не допуская подсыхания срезов, наносят на них блокировочный раствор - 5% бычий сывороточный альбумин на 12 минут. Затем со срезов удаляют блокировочный раствор путем подсушивания их одноразовыми бумажными полотенцами (не допуская подсыхания срезов). Затем наносят первичные антитела и ставят в термостат при 27°С на 26 часов, при этом для того чтобы не подсыхали срезы стекла укладываются на планшет из пластика, под стекла подкладывают смоченные одноразовыми бумажные полотенца дистиллированной водой и сверху накрывают прозрачной пленкой, таким образом, жидкость не испаряется и создается «влажная камера». Через 14-15 часов смывают первичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут, снова промакивают одноразовыми бумажными полотенцами (но не сушат). Наносят на срезы вторичные антитела и опять ставят в термостат при 27°С на 1 час 15 минут, после чего смывают вторичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут. Наносят на срезы хромоген содержащий безбиотиновую систему детекции антител на 3 минуты. Затем смывают хромоген в 3-х порциях дистиллированной воды по 7 минут. Докрашивают срезы гематоксилином Майера в течение 7 минут. Ополаскивают срезы в дистиллированной воде (для удаления излишка красителя) и опускают препараты в щелочную воду и ополаскивают 15 секунд (до посинения). Далее по классической гистологической схеме препараты ополаскивают в 70% спирте 1 минуту, затем проводят через 2 смены 96% спирта по 3 минуты, далее опускают в карболксилол на 3 минуты, затем проводят через 2 смены ксилола по 5 минут и заключают в полистирол или другую синтетическую среду.
Этот способ по примеру 3, проведенный при вышеуказанных параметрах, также позволяет производить иммуногистохимическое окрашивание гистологических срезов, при этом срезы не отскакивают со стекол и нет фонового окрашивания среза (см. фиг. 5, 6).
2
2
Пример 4. Проводят аналогично примера №1, но стекла имеют фабричное покрытие адгезивом «поли-L-лизин». Срезы помещают на 10-20 минут в 3% аптечную НО, после их нахождения в пароварке, где они инкубировались в цитратном буфере 40-55 минут в стаканах из химического стекла. После прекращения работы пароварки стекла не вынимают из нее в течение 20-30 минут. Затем промывают дистиллированной водой для смывания остатков буфера (3 смены). После перекиси водорода срезы промывают в дистиллированной воде. Далее помещают в буфер (Твин 20х) на 10-20 минут. Срезы аккуратно промакивают одноразовыми бумажными полотенцами. Далее вокруг срезов делают гидрофобный слой маркером для иммуногистохимических реакций. Не допуская подсыхания срезов, наносят на них блокировочный раствор - 5% бычий сывороточный альбумин на 10-20 минут. Затем опять подсушивают одноразовыми бумажными полотенцами (не допуская подсыхания срезов). Наносят первичные антитела и ставят в термостат при 27°С на 24-48 часов. После инкубации срезов с первичными антителами стекла опускают в буфер (Твин 20х) на 5 минут для смывания антител. Затем промакивают срезы одноразовыми бумажными полотенцами (но не сушат). Наносят на срезы вторичные антитела и ставят в термостат при 27°С на 1-2 часа. Смывают вторичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут. Наносят на срезы специальный хромоген с безбиотиновой системой детекции на 5-10 минут. Смывают хромоген в 3-х порциях дистиллированной воды по 7-10 минут. Докрашивают срезы гематоксилином Майера 7-10 минут. Опускают препараты в щелочную воду и ополаскивают 15-20 секунд (до посинения). Далее по классической гистологической схеме препараты ополаскивают в 70% спирте 1 минуту, затем проводят через 2 смены 96% спирта по 3 минуты, далее опускают в карболксилол на 5 минут, затем проводят через 2 смены ксилола по 5 минут и заключают в полистирол.
Данный способ не позволяет проводить иммуногистохимические окрашивания гистологических срезов, так как: происходит частичное отскакивание срезов со стекол покрытых адгезивом «поли-L-лизин», при инкубации срезов в термостате происходит быстрое подсыхание реактивов и срезов, при окрашивании хромогеном в течение 5-10 минут происходит сильное фоновое окрашивание срезов, при переносе срезов из гематоксилина Майера непосредственно в щелочную воду (без ополаскивания в дистиллированной воде), происходит выпадение красителя в виде хлопьев синего цвета, без окрашивания основных структур клеток (см. фиг. 7, 8).
Таким образом, наиболее оптимальными являются примеры №2 и 3, так как способ по предлагаемому изобретению с предлагаемыми параметрами по примерам 2 и 3, позволяет проводить иммуногистохимические окрашивания гистологических срезов, полученных от крупного рогатого скота, мелкого рогатого скота, свиней, собак и кошек, из материала стандартного размера (1 см3) который фиксировался в формалине от 1 года до 2 лет с проведением качественного выявления антигенов.
Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями, имеет следующие преимущества:
- качество выявления антигенов у домашних продуктивных и непродуктивных животных;
- возможность производить иммуногистохимическое окрашивание гистологических срезов, при этом срезы не отскакивают со стекол и нет фонового окрашивания среза.