Особенности регенерации клоновых подвоев вишни in vitro

4. Лапин П.И., Сиднева С.В. Оценка степени подмерзания видов растений // Древесные растения Главного ботанического сада АН СССР. М.: Наука, 1975. С. 18-19.

5. Методические указания по прохождению учебной практики для студентов специальности 260500 -«Садово-парковое и ландшафтное строительство» / сост. А.Н. Лебедев, Е.В. Золотарева, М.Ф. Цой. Орел: ОрелГАУ, 2003. 31 с.

6. Павленкова Г.А. Перспективные виды рода Спирея (Spiraea L.) генофонда дендрария ВНИИСПК для зеленого строительства Орловской области // Селекция и сорторазведение садовых культур. 2018. Т. 5. № 2. С. 51-54.

7. Плотникова Л.С. Методика фенологических наблюдений за интродуцированными древесными растениями // Методика фенологических наблюдений в ботанических садах СССР. М.: Изд-во ГБС, 1972. С. 40-46.

8. Плотникова Л.С. Спирея в природе и культуре // Лесохозяйственная информация. 2014. № 4. С. 54-58.

9. Попова В.Т., Дорофеева В.Д. Оценка интродукции некоторых видов рода Spiraea L. в дендрарии ВГЛТА и перспективы их использования в озеленении // Лесотехнический журнал. 2013. № 1 (9). С. 59-68.

10. Смирнова З.И. Перспективы использования многочисленных видов и сортов спирей в городском озеленении // Вестник Университета Правительства Москвы. 2018. № 1 (39). С. 57-61.

11. Шпитальная Т.В., Македонская Н.В., Котов А.А., Алехна А.И. Оценка возможности использования в зеленом строительстве Беларуси весеннецветущих деревьев и кустарников // Научное обеспечение устойчивого развития плодоводства и декоративного садоводства: мат-лы Междунар. научно-практ. конф., посвящ. 125-летию ВНИИЦиСК и 85-летию Ботанического сада «Дерево Дружбы». 2019. С. 440-445.

12. Шульгина В.В. Род Таволга - Spiraea L. // Деревья и кустарники СССР / под ред. С.Я. Соколова. Т.3. М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1954. С. 286-332.

УДК 634.23:581.143.6 https://www.doi.org/10.24411/2500-0454-2020-11232

ОСОБЕННОСТИ РЕГЕНЕРАЦИИ КЛОНОВЫХ ПОДВОЕВ ВИШНИ IN VITRO

Пронина И.Н., к.с.-х.н. Матушкина О.В., к.с.-х.н.

ФГБНУ «ФНЦ им. И.В. Мичурина», Мичуринск, Россия, invitro82@yandex.ru Аннотация

На всех этапах культивирования у клоновых подвоев вишни прослеживается генотипическая реакция. Снижение содержания 6-БАП в питательной среде до 0,1 мг/л позволило решить проблему витрификации. На этапе собственно микроразмножения для культивирования подвоя П-7 целесообразно использовать среду Кворина-Лепуавра. Микропобеги подвоя вишни ВЦ-13 можно культивировать как на среде Кворина-Лепуавра, так и Мурасиге-Скуга, а подвоя ВСЛ-2 - на Мурасиге-Скуга. Наивысшие показатели укореняемости отмечались у подвоя ВСЛ-2 на питательных средах Мурасиге-Скуга и Кворина-Лепуавра, в то время как у подвоя вишни ВЦ-13 на среде Мурасиге-Скуга (макросоли)+Хеллера (микросоли), а у П-7 -Мурасиге-Скуга.

Ключевые слова: клональное микроразмножение, эксплант, собственно микроразмножение, ризогенез, вишня

IN VITRO REGE NERATION FEATURES OF CHERRY CLONAL ROOTSTOCKS

Pronina I.N., candidate of agricultural sciences Matushkina O.V., candidate of agricultural sciences

FSBSI"I. V. Michurin Federal Scientific Center", Michurinsk, Russia Abstract

The genotypic response is observed in clonal rootstocks of cherry Reducing the content at all stages of cultivation. 6-BAP reduction to 0.1 mg/l in nutrient medium allowed to solve the problem of vitrification. At the stage of micropropagation proper, for the cultivation of the rootstock P-7 it is advisable to use medium of Quoirin-Lepoivre. The microshoots of cherry VC-13 can be cultivated both on Quoirin-Lepoivre medium and on MS medium, but as for VSL-2 cherry rootstock, it can be cultivated only on MS medium.

The highest indexes of rooting were recorded in rootstock VSL-2 on MS medium and on QL medium, whereas VS-13 rootstock exhibited the best results on MS medium (macrosalts)+Heller (microsalts) and P-7 rootstok-MS medium.

Key words: clonal miccropropagation, explant, actual micropropagation, rhizogenesis, cherry

Введение

Одним из важнейших элементов интенсификации отрасли садоводства является производство сертифицированного посадочного материала, количество которого у нас в стране ограничено, особенно применительно к косточковым культурам, в связи с массовым распространением вирусными, микоплазменными, грибными и бактериальными заболеваниями. Внедрение в питомниководство новейших методов размножения, в частности, метода культуры изолированной ткани, в сочетании с хемотерапией позволяет не только решить проблему оздоровления, но и получать большое количество вегетативно размножаемого материала, используемого для закладки базисных маточников.

В связи с этим целью исследований являлось изучение особенностей регенерации перспективных клоновых подвоев вишни in vitro.

Материалы и методика

Объекты исследований: клоновые вишни ВЦ-13, ВСЛ-2, П-7.

Для введения в культуру in vitro в качестве исходного материала использовали растущие верхушки длиной 3-5 см в фазе активного роста (май-июнь). Стерилизацию растительных объектов проводили раствором моющего средства «Белизна», разбавленного дистиллированной водой в соотношении 1:3 в течение 4-5 минут.

Анализ этапа введения меристемы в культуру проводили по 4 фазам: 1 - приобретение апексами зеленого цвета; 2 - слабый линейный рост, раскрытие 2-3 примордий; 3 - образование розетки с листьями и почками; 4 - формирование конгломератов почек и микропобегов длиной свыше 15 мм. Окончательная оценка опытов - по количеству мериклонов. Этап пролиферации оценивали по количеству конгломератов, пригодных к клонированию и подсчитывали коэффициент размножения путем деления количества микропобегов на количество эксплантов. Оценка процесса ризогенеза проводили в динамике путем подсчета количества микропобегов с корнями. В конце опыта (при переносе в нестерильные условия) анализировали количество основных корней и их длину.

Условия культивирования: температура воздуха +24±2 °C, освещенность 2-3 тыс. лк, продолжительность фотопериода 16 ч. Статистическая обработка экспериментальных данных осуществлялась методом дисперсионного анализа по Доспехову Б.А. (1985) с оценкой наименьшей существенной разницы (НСР05) и с помощью t-критерия Дункана (при этом наличие одинаковых букв при цифровых показателях указывает на отсутствие различий при Р=0,05).

Результаты и их обсуждение

Метод клонального микроразмножения является одним из самых перспективных способов вегетативного размножения растений, позволяющий наиболее полно реализовать потенциал растительного организма к размножению. Несмотря на то, что данный метод разработан в настоящее время применительно к 2400 видам (Куликов И.М., Высоцкий В.А., 2005) и этот список продолжается увеличиваться, для многих растений очень сложно добиться массовой регенерации, т. к. зависит не только от генотипических особенностей растений, но и химических факторов культивирования.

Введение в культуру in vitro проводили в фазу активного роста побегов. Регенерационная способность, вводимых в культуру in vitro эксплантов клоновых подвоев вишни, через 3 месяца культивирования варьировала, в зависимости от генотипа от 50,0 % (ВСЛ-2) до 66,6 % (П-7) (таблица 1).

Таблица 1 - Регенерационная способность меристематических тканей вишни через 3 месяца культивирования

Подвой Регенерировало всего, % Количество эксплантов, готовых к клонированию, % Коэффициент размножения, шт./экспл.

ВСЛ-2 50,0 bc 18,4 c 1,6

ВЦ-13 56,4 b 54,5 a 2,7

П-7 66,6 a 35,9 b 2,5

НСР05 0,8

У подвоев вишни через 3 месяца культивирования формировались конгломераты, состоящие из почек и микропобегов, которые можно клонировать. Максимальный коэффициент размножения отмечался у подвоев ВЦ-13 и П-7, который был в 1,5-1,7 раза выше, чем у ВСЛ-2.

Морфогенез подвоев вишни в культуре in vitro осложняется такой проблемой, как витрификация микропобегов, даже на среде с низким содержанием 6-БАП (рисунок 1).

Рисунок 1 - Количество витрифицированных клонов подвоев вишни на среде с БАП 0,5 мг/л

При этом уровень обводнения был отмечен у 40,0-46,1 % клонов. Вследствие которого микропобеги становятся прозрачными, а листовые пластинки часто недоразвиты и скручены в трубочку, а основание стебля сильно разрастается (Матушкина О.В. и др., 2012). При субкультивировании витрифицированных микропобегов у растений теряется способность к ветвлению и укоренению. Снижение содержания 6-БАП до 0,1 мг/л позволило решить данную проблему для подвоев П-7 и ВЦ-13, а для ВСЛ-2 снизить до 2,7 %.

Морфогенез в культуре изолированной ткани зависит и от минерального состава питательной среды. Культивирование эксплантов вишни на этапе собственно микроразмножения на питательных средах Мурасиге-Скуга (МС), Кворина-Лепуавра (QL), Мурасиге-Скуга (макросоли) и Хеллера (микросоли) (МС + Х), а также с комплексным водорастворимым веществом Мастер (М4), показало генотипическую реакцию на минеральный фактор питательной среды (таблица 2). Так, например, для культивирования подвоя П 7 целесообразно использовать среду Кворина-Лепуавра, на которой наблюдалось увеличение как количества микропобегов, пригодных для укоренения, на 59,082,0 %, так и коэффициента размножения в 1,2-1,5 раз. В то время как микропобеги подвоя вишни ВЦ-13 можно культивировать как на среде Кворина-Лепуавра, так и Мурасиге-Скуга (разница не существенна), а подвоя ВСЛ-2 -на Мурасиге-Скуга. Использование комплексного водорастворимого вещества Мастер и питательной среды Мурасиге-Скуга (макросоли)+Хеллера (микросоли) оказалось не целесообразным.

Таблица 2 - Влияние питательной среды на регенерацию подвоев вишни

Подвой Питательная среда Количество микропобегов, пригодных для укоренения, % Коэффициент размножения, шт./экспл.

П-7 МС 36,6 b 3,7

QL 95,6 a 5,6

МС + Х 33,8 bc 4,7

М4 13,6 d 3,6

НСР05 1,0

ВСЛ-2 МС 48,4 a 5,1

QL 33,3 b 6,0

МС + Х 20,9 c 7,1

М4 33,3 b 4,5

НСР05 0,8

ВЦ-13 МС 38,7 a 5,2

QL 37,2 ab 5,4

МС + Х 20,3 c 4,9

М4 20,8 c 7,4

НСР05 1,3

Одной из проблем в процессе клонального микроразмножения является укоренение полученных микропобегов. Наряду с ауксином, первостепенное значение на данном этапе также отводится минеральному составу питательной среды. Культивирование микропобегов подвоев вишни на тех же средах, но разбавленных в 2 раза по содержанию макросолей, также свидетельствует о генотипической реакции исследуемых клоновых подвоев вишни: лучшей ризогеннной активностью характеризуеся клоновый подвой ВСЛ-2 (таблица 3).

Таблица 3 - Влияние минерального состава питательной среды на укореняемость подвоев вишни

Подвой Питательная среда Укореняемость через ... недель, % Количество корней, шт./раст. Длина корней, см

2 3 5

ВСЛ-2 1/2МС 46,7 93,3 93,3 ab 7,6 4,0

1/2QL 49,0 89,4 96,7 a 4,2 3,4

1/2 МС + Х 20,0 43,3 46,6 c 2,9 2,3

М2 16,7 30,0 40,0 c 2,3 2,8

НСР05 1,6 0,9

ВЦ-13 1/2МС 20,0 33,3 33,3 b 1,7 6,4

1/2QL 0,0 1,7 33,3 b 1,5 5,9

1/2 МС + Х 43,3 46,7 56,7 a 2,7 3,4

М2 16,7 16,7 23,3 bc 2,7 3,3

НСР05 Fфакт<Fтабл 1,1

П-7 1/2МС 30,0 50,0 70,0 a 2,1 9,2

1/2QL 0,0 0,0 25,0 c 2,0 6,7

1/2 МС + Х 33,3 33,3 46,7 b 5,3 2,4

М2 26,7 33,3 33,3 bc 1,6 2,7

НСР05 1,4 1,8

Начало корнеобразования у всех изучаемых подвоев на большинстве исследуемых питательных средах наблюдалось уже через 2 недели культивирования. Наивысшие показатели укореняемости через 5 недель культивирования отмечались у подвоя ВСЛ-2 на питательных средах Мурасиге-Скуга (93,3 %) и Кворина-Лепуавра (96,7 %), что на 46,7-56,7 % больше, чем на средах Мурасиге-Скуга (макросоли)+Хеллера (микросоли) и с комплексным водорастворимым веществом Мастер.

Процессы корнеобразования у подвоя вишни ВЦ-13 лучше протекали на питательной среде Мурасиге-Скуга (макросоли)+Хеллера (микросоли), на которой уже через 2 недели культивирования укоренилось 4,3 % микропобегов, в то время как на среде Кворина-Лепуавра начало корнеобразования наблюдалось только через 3 недели и составило всего лишь 1,7 %.

Микропобеги клонового подвоя вишни П-7 лучше укоренялись на питательной среде Мурасиге-Скуга, где процент укореняемости через 5 недель культивирования составил 70,0 %, а на среде Кворина-Лепуавра только 25,0 %. Во всех отмеченных вариантах отмечалось и лучшее развитие корневой системы.

Использование комплексного водорастворимого вещества Мастер на этапе ризогенеза для всех изучаемых подвоев вишни также, как и на этапе пролиферации, оказалось не целесообразным. На данной питательной среде у всех подвоев наблюдалось каллусобразование, что вероятно и повлияло на низкие показатели ризогенеза.

Выводы

На всех этапах культивирования у клоновых подвоев вишни прослеживается генотипическая реакция. Регенерационная способность, вводимых в культуру in vitro эксплантов варьировала, в зависимости от генотипа от 50,0 % (ВСЛ-2) до 66,6 % (П 7). Максимальный коэффициент размножения отмечался у подвоев ВЦ-13 и П-7. Снижение содержания 6-БАП в питательной среде до 0,1 мг/л позволило решить проблему витрификации у подвоев П-7 и ВЦ-13, а у ВСЛ-2 снизить до 2,7 %. На этапе собственно микроразмножения для культивирования подвоя П-7 целесообразно использовать среду Кворина-Лепуавра, на которой наблюдалось увеличение как количества микропобегов, пригодных для укоренения, на 59,0-82,0 %. Микропобеги подвоя вишни ВЦ-13 можно культивировать как на среде Кворина-Лепуавра, так и Мурасиге-Скуга, а подвоя ВСЛ-2 - на Мурасиге-Скуга. Наивысшие показатели укореняемости отмечались у подвоя ВСЛ-2 на питательных средах Мурасиге-Скуга (93,3 %) и Кворина-Лепуавра (96,7 %), в то время как у подвоя вишни ВЦ-13 на среде Мурасиге-Скуга (макросоли)+Хеллера (микросоли), а у П-7 -Мурасиге-Скуга. Использование комплексного водорастворимого вещества Мастер как на этапе пролиферайии, так и ризогенеза оказалось не целесообразным.

Литература

1. Куликов И.М., Высоцкий В.А. Биотехнологические приемы в садоводстве и развитие идей И.В. Мичурина // Плодоводство и ягодоводство России: Сб. науч. тр. ВСТИСП, 2005. Т. 13. С. 3-17.

2. Матушкина О.В., Пронина И.Н., Ткачев Е.Н. Витрификация побегов in vitro: анатомическое строение и возможные пути решения этой проблемы // Достижения науки и техники АПК. 2012. №. 9. С. 58-60.