УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО КОНТРОЛЯ В РЕАЛЬНОМ МАСШТАБЕ ВРЕМЕНИ МНОЖЕСТВА АМПЛИФИКАЦИЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ
DEVICE FOR SIMULTANEOUS MONITORING IN REAL TIME SCALE OF NUCLEIC ACID AMPLIFICATIONS

Настоящее изобретение относится к устройствам для качественного и количественного анализа нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), которые могут быть использованы в медицинской практике при диагностике инфекционных, онкологических и генетических заболеваний человека и животных, в исследовательских целях при молекулярно-биологических, генетических исследованиях, при мониторинге экспрессии генов. В устройстве использован метод полимеразной цепной реакции (ПНР) в реальном времени.
Для реализации метода ПЦР исследуемые образцы после соответствующей подготовки вносятся в пробирки, содержащие реакционной смеси с флуоресцентными красителями. Затем пробирки помещаются в устройство, содержащее термоциклер, обеспечивающий проведение ПЦР, и флуоресцентный детектор, на выходе которого получаются сигналы флуоресцентных красителей, по которым оценивается количество продуктов ПЦР на любой стадии реакции.
Основными этапами анализа нуклеиновых кислот являются амплификация в циклическом режиме (например, от 60 до 95°С) и плавление в режиме изменения температуры образцов (с шагом 0,5 или 1°С).
м
Кривая плавления ДНК исследуемых образцов (графическое изображение зависимости флуоресценции от температуры образца) может быть получена путем регистрации дискретных сигналов флуоресценции красителя, который связан с двойной цепью ДНК исследуемого образца. Когда температура достигает значения плавления двухцепочечной ДНК Т, наблюдается значительное изменение флуоресценции. Значение температуры плавления является функцией длины и соотношения нуклеотидов GC/AT последовательности ДНК. Кривая плавления ДНК может быть получена на основе эффекта гашения флуоресценции зонда праймером, несущим нефлуоресцирующий гаситель флуоресценции. Кривая плавления ДНК однозначно характеризует продукт биохимической реакции, используется для сравнения специфических нуклеотидных последовательностей и обнаружения нуклеотидных замен в исследуемых последовательностях нуклеиновых кислот.
В устройствах для качественного и количественного анализа нуклеиновых кислот методом ПЦР традиционными исполнительными элементами устройства автоматического управления температурным режимом являются элементы Пельтье. Наиболее распространенные элементы Пельтье обладают размерами 40×40 мм. Элементы Пельтье имеют тепловой контакт с теплопроводящим элементом термоциклера, в который устанавливаются пробирки. Для устройства, имеющего 32 или 96 пробирок, необходимо использовать 2 или 6 элементов Пельтье, при этом затруднительно подобрать элементы Пельтье с равной тепловой производительностью. Для измерения неоднородности и выравнивания температуры теплопроводящего элемента можно использовать контактные датчики. Однако контактные датчики имеют значительные недостатки: такие датчики обладают значительной массой и, помещенные в пробирки, вносят искажения теплового поля, соединительные провода создают дополнительные неудобства, количество контактных датчиков ограничено.
м
В предлагаемом устройстве для измерения неоднородности и выравнивания температуры теплопроводящего элемента используются бесконтактные датчики в виде пробирок для ПЦР на основе гасимых флуоресцентных зондов. Интенсивность излучения таких зондов увеличивается при увеличении температуры. Температура плавления Тзонда соответствует максимальному значению на пике дифференциальной кривой плавления. Для зондов вблизи температуры плавления коэффициент температурной зависимости флуоресценции имеет значительную величину (порядка 10% /°С). С целью повышения однородности температуры теплопроводящего элемента и установленных в нем пробирок с реакционными смесями в предлагаемом устройстве температура плавления зондов используется для предварительного определения отклонения значения температуры каждой пробирки от среднего значения, формирования сигналов управления устройством автоматического управления температурным режимом для каждого элемента Пельтье
Известен патент на систему и способ для обработки кривой плавления ДНК (DIFFERENTIAL DISSOCIATION AND MELTING CURVE PEAK DETECTION, патент США №0037117 A1, кл. G06F 19/00, G06F 15/00, Feb. 05.02.2009 г.).
В этой системе для улучшения вида кривой плавления и определения температуры плавления использованы микропроцессоры (например, общего назначения, цифровые сигнальные процессоры, программируемые контроллеры), выполняющие операции дифференцирования, фильтрации и обнаружения одного или несколько пиков.
m
Температура плавления T, соответствующая максимальному значению на пике дифференциальной кривой плавления, характеризует продукт биохимической реакции. Образцу с несколькими продуктами амплификации соответствует кривая плавления с несколькими пиками.
Недостаток этой системы и способа для обработки кривой плавления заключается в том, что результаты определения температуры плавления используются только для характеристики продуктов биохимической реакции в исследуемых пробах, при этом отсутствуют технические решения приборного обеспечения получения кривой плавления.
Известен способ гомогенной детекции по меньшей мере одного продукта одноцепочечной амплификации (патент на изобретение РФ №2460804 МПК C12Q 1/68, С12Р 19/34, C12N 15/11, опубл. 10.09.2012. Бюл. №25).
m
В этом способе температура плавления праймеров, зондов и ампликонов Tозначает температуру, при которой половина исследуемого вещества существует в двухцепочечной, а половина в одноцепочечной форме.
Соответствующие этому изобретению гасимые флуоресцентные зонды, предпочтительно, содержат флуорофор на одном своем конце и нефлуоресцирующую гасящую группу на другом конце.
Недостаток этого способа заключается в том, что анализ кривых плавления дает возможность различить продукты и получить количественную характеристику их концентраций, при этом отсутствуют технические решения приборного обеспечения получения кривой плавления.
Известен способ детекции специфических нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных замен с помощью ПЦР в режиме реального времени с эффектом гашения флуоресценции зонда праймером (патент на изобретение РФ №2451086, МПК C12Q 1/68, опубл. 20.05.2012. Бюл. №14).
м
В этом способе используется детекция специфических нуклеотидных последовательностей с помощью ПЦР в режиме реального времени с эффектом гашения флуоресценции зонда праймером. Для этого выполняется выделение нуклеиновых кислот из исследуемых образцов, подбор соответствующих олигонуклеотидных зондов и праймеров, ПЦР-амплификация одного или более необходимых целевых участков нуклеотидной последовательности, анализ кривых плавления зондов после проведения ПЦР. После амплификации кривые плавления получают путем начальной инкубации 2 мин при 45°С и последующем повышением температуры на 1°С каждые 10 сек до 80°С с постоянной детекцией флуоресценции на каналах FAM, JOE, ROX и Су5. Пространственное разделение флуорофора и гасителя в результате плавления комплекса зонд-ДНК-мишень приводит к увеличению флуоресценции. После завершения амплификации проводят анализ кривых плавления F от Т. Идентификацию продуктов амплификации осуществляют по значениям Т, соответствующим пикам кривых плавления на графике dF/dT от Т.
Описанный способ решает задачу повышения эффективности и расширении возможностей анализа специфических нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных полиморфизмов с помощью метода ПЦР-РВ за счет применения эффекта гашения флуоресценции зонда праймером, несущим нефлуоресцирующий гаситель флуоресценции.
m
Этот известный способ обладает следующим основным недостатком: результаты его реализации получены помощью известной системы ПЦР в режиме реального времени и не используются для улучшения параметров этой системы. Другим недостатком является значительная погрешность определения температуры плавления T, которая обусловлена дискретностью повышения температуры на 1°С каждые 10 сек, шумом и дрейфом нулевой линии при детекции флуоресценции зонда.
Известен патент на прибор и метод для автоматизированной термообработки образцов жидкостей (патент США №8797526, В2, кл. G01N 1/10, 05.08.2014 г.). Прибор содержит термоблок, оснащенный системой контроля температуры и контейнером для множества пробирок с образцами, при этом конструкция контейнера обеспечивает термический контакт контейнера с установленными в нем пробирками. Контейнер имеет тепловой контакт через плиту основания с верхней поверхностью термоэлектрического элемента (элемента Пельтье). Нижняя поверхность термоэлектрического элемента соединена с теплообменником (радиатором). Выше ячеек с образцами расположена нагревательная плита с нагревательным элементом (термокрышка). В отверстиях термокрышки расположены оптоволоконные световоды возбуждения и приема излучения.
В некоторых исполнениях устройство управления, предназначенное для контроля автоматической термообработки образцов, построено в виде микропроцессорного контроллера, выполняющего машинно-считываемую программу, состоящую из команд на производство операций в соответствии с заранее составленной последовательностью шагов.
В некоторых исполнениях используется несколько термоэлектрических устройств, работающих на основе эффекта Пельтье. В некоторых исполнении прибор может использоваться для термообработки образцов в соответствии с кривыми плавления.
Недостаток этого прибора и метода заключается в отсутствии технических решений задачи измерения и корректировки неравномерности температур в пробирках.
Известно устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества амплификации нуклеиновой кислоты (патент на изобретение РФ №2304277, МПК G01N 21/63, опубл. 10.08.2007 г. Бюл. №22).
Устройство содержит термоциклер с теплопроводящим элементом, термокрышку, устройство автоматического управления температурным режимом и оптическую систему. В теплопроводящем элементе имеются углубления для пробирок с реакционными смесями. Оптическая система включает источник излучения, волоконно-оптические световоды для передачи света возбуждения от источника и излучения флуоресценции из пробирок и детектор. Световоды выполнены в виде оптических волокон с коаксиально расположенной центральной частью для передачи света возбуждения и периферийной частью для сбора флуоресценции. Центральная часть световода апертурно согласована с количеством реакционной смеси в пробирках.
Недостаток этого устройства заключается в отсутствии технических решений задачи измерения и корректировки неравномерности температур в пробирках.
Ближайшим из известных по технической сущности и назначению является устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества амплификации нуклеиновой кислоты (патент на изобретение РФ №2418289, МПК G01N 21/64, опубл. 10.05.2011. Бюл. №13).
Известное устройство решает задачу сокращения времени анализа, повышения чувствительности устройства и уменьшения необходимого для проведения ПЦР количества реакционной смеси.
Это устройство состоит из амплификатора, включающего в себя устройство для термоциклирования (термоциклер) с секцией проб, флуориметрического детектора с источником излучения и приемником излучения, микропроцессорного устройства управления и персонального компьютера с программным обеспечением.
Устройство содержит термоциклер, включающий теплопроводящий элемент с расположенными в нем углублениями для пробирок с реакционными смесями, термокрышку и устройство автоматического управления температурным режимом, а также оптическую систему, включающую источник излучения, коаксиальные волоконно-оптические световоды для передачи света возбуждения от источника и излучения флуоресценции из пробирок, и детектор для детектирования флуоресценции, центральная передающая свет.возбуждения часть световода апертурно согласована с количеством реакционной' смеси в пробирках, установленных в углублениях теплопроводящего элемента, при этом объем пробирок соответствует максимальному объему реакционной смеси, между пробирками и термокрышкой установлена сменная теплоизолирующая перегородка с отверстиями.
m
Недостатком известного устройства можно признать отсутствие технических решений для повышения однородности температуры теплопроводящего элемента с расположенными в нем углублениями для пробирок с реакционными смесями и для уменьшения погрешности определения температуры плавления Tобразцов, которая обусловлена дискретностью повышения температуры, шумом и дрейфом нулевой линии при детекции флуоресценции зонда.
Предлагаемое изобретение решает задачу повышения однородности температуры теплопроводящего элемента с расположенными в нем углублениями для пробирок с реакционными смесями, уменьшения погрешности количественных измерений в результате амплификации в, циклическом режиме и уменьшения погрешности определения температуры плавления исследуемых образцов в каждой пробирке.
Указанная задача решается за счет того, что известное устройство, содержащее термоциклер, включающий теплопроводящий элемент с расположенными в нем углублениями для пробирок с реакционными смесями, термокрышку, теплоизолирующую перегородку и устройство автоматического управления температурным режимом, оптическую систему, включающую источник излучения, коаксиальный волоконно-оптический световод для передачи света возбуждения от источника к пробиркам и от пробирок с реакционными смесями к детектору для детектирования флуоресценции, и детектор для детектирования флуоресценции, а также микропроцессорное устройство управления и персональный компьютер с программным обеспечением, снабжено корректирующей системой, содержащей базу данных, аппроксимирующее устройство, устройство определения тепловых параметров пробирок и устройство корректировки, при атом реакционные смеси могут содержать флуоресцентные зонды или исследуемые образцы, вход базы данных связан с выходом оптической системы, база данных соединена двухсторонней связью с аппроксимирующим устройством, устройством определения тепловых параметров пробирок и устройством корректировки, а выход базы данных соединен с входом устройства автоматического управления температурным режимом и входом персонального компьютера.
База данных обеспечивает сохранение дискретных сигналов кривой плавления F от Т каждой пробирки, производной кривой плавления dF/dT от Т и сигналов ПЦР в реальном времени, поступающих с выхода детектора и с выходов других устройств корректирующей системы, передачу сохраненных сигналов управления устройству автоматического управления температурным режимом для корректировки неоднородности температуры теплопроводящего элемента, а также передачу сохраненных сигналов на вход персонального компьютера для наблюдения сигналов на экране монитора.
Аппроксимирующее устройство обеспечивает выполнение операции аппроксимации сохраненной в базе данных производной кривой плавления dF/dT от Т каждой пробирки непрерывной функцией, например, полиномом или производной сигмоидальной функции, а также сохранение непрерывной функции в базе данных.
Устройство определения температурных параметров пробирок обеспечивает выполнение операции определения значений температурных параметров каждой пробирки, а также обеспечивает сохранение этих значений в базе данных. »
Устройство корректировки выполняет операции формирования сигнала, соответствующего среднему значению температурных параметров всех пробирок, сохраненных в базе данных, определения отклонения температурных параметров каждой пробирки от среднего значения, формирования сигналов корректировки температуры для устройства автоматического управления температурным режимом, соответствующих среднему значению отклонения температурных параметров во всех кластерах пробирок, количество которых равно количеству элементов Пельтье, а также сохранение сигналов управления в базе данных.
Устройство корректировки выполняет операции формирования сигналов корректировки температуры для устройства автоматического управления температурным режимом, соответствующих нескольким зондам, отличающимся температурой плавления и аппроксимацию этих сигналов полиномом первого или более высокого порядков.
Устройство автоматического управления температурным режимом выполняет операцию корректировки температуры теплопроводящего элемента.
Устройство корректировки обеспечивает выполнение операции определения значений среднеквадратического отклонения температурных параметров каждой пробирки от среднего значения.
Предлагаемое устройство после корректировки температуры теплопроводящего элемента обеспечивает выполнение операции определения значений пороговых циклов сигналов ПЦР в реальном времени от исследуемых проб в каждой пробирке, которые используются при количественных измерениях.
Предлагаемое устройство после корректировки температуры теплопроводящего элемента обеспечивает определение температуры плавления исследуемых проб в каждой пробирке.
Изобретение поясняется чертежами, на которых представлены:
на фиг. 1 - принципиальная схема заявляемого устройства для одновременного контроля множества амплификаций нуклеиновой кислоты;
на фиг. 2 -графики дискретных сигналов кривой плавления зонда (Ряд 1, левая ось - относительная интенсивность флуоресценции) и производной кривой плавления зонда (Ряд 2, правая ось - относительная интенсивность производной флуоресценции) на входе аппроксимирующего устройства. Горизонтальная ось - температура°С;
на фиг. 3 - графики аппроксимирующей функции (Ряд 1, левая ось - относительная интенсивность сигнала) и ее производной (Ряд 2, правая ось - относительная интенсивность сигнала) на выходе аппроксимирующего устройства. Горизонтальная ось -температура°С;
на фиг. 4 - пример гистограммы температурных параметров пробирок;
на фиг. 5 - пример гистограммы температуры пробирок.
Заявленное устройство (фиг. 1) содержит термоциклер 1 с секцией проб 2, оптическую систему 3, включающую источник излучения 4 и детектор флуоресценции 5, микропроцессорное устройство управления 6, персональный компьютер 7 с программным обеспечением и корректирующую систему 8.
Оптическая система 3 состоит из источника излучения 9, двух двухлинзовых конденсоров 10 и 11, между линзами которых установлены интерференционные светофильтры возбуждения 12 и эмиссии 13, фотоприемника 14 и световодного жгута 15.
Термоциклер 1 содержит термокрышку 16, теплопроводящий элемент 17 с расположенными в нем углублениями для пробирок с реакционными смесями, между термокрышкой 16 и теплопроводящим элементом 17 установлена сменная теплоизолирующая перегородка 18. Термоциклер 1 содержит также устройство автоматического управления температурным режимом 19.
Корректирующая система 8 содержит базу данных 20, аппроксимирующее устройство 21, устройство определения тепловых параметров 22 и устройство корректировки 23.
Оптическая система 3 соединена с микропроцессорным устройством управления 6, корректирующей системой 8 и базой данных 20.
Микропроцессорное устройство управления 6 соединено с персональным компьютером 7, термоциклером 1 и устройством автоматического управления температурным режимом 19.
Выходы корректирующей системы 8 и базы данных 20 соединены с входами термоциклера 1, устройства автоматического управления температурным режимом 18 и персонального компьютера 7.
База данных 20 соединена двухсторонней связью с аппроксимирующим устройством 21, устройством определения тепловых параметров 22 и устройством корректировки 23.
Все или некоторые функциональные устройства корректирующей системы предлагаемого устройства могут быть выполнены в виде интегральных микросхем. Работает предлагаемое устройство следующим образом.
В углубления теплопроводящего элемента устанавливаются пробирки с реакционными смесями, которые содержат флуоресцентные зонды или исследуемые образцы.
Дискретные сигналы кривой плавления каждой пробирки F от Т, производной кривой плавления dF/dT от Т и сигналы ПЦР в реальном времени исследуемых образцов поступают с выхода детектора в базу данных и сохраняются в ней. Графики кривой плавления и производной кривой плавления одной из пробирок с флуоресцентным зондом представлены на фиг. 2.
Сигналы производной кривой плавления зонда из базы данных с помощью аппроксимирующего устройства используются для выполнения операций аппроксимации производных сигналов непрерывной функцией, например, полиномом или производной сигмоидальной функции.
(1)
В качестве примера результат аппроксимации производной кривой плавления зонда dF/dT от Т полином второго порядка F может быть представлен в виде формулы 1:
где величины А и В - коэффициенты полинома, С - постоянная составляющая.
Графики аппроксимирующей функции на выходе аппроксимирующего устройства представлены на фиг. 3.
(1)
В качестве примера результат аппроксимации производной кривой плавления зонда dF/dT от Т производной сигмоидальной функции F может быть представлен в виде формулы 2:
m
где F - интенсивность (размах) участка плавления;
m
T- дробное значение температуры плавления;
k - коэффициент, который определяется наклоном кривой.
1
2
Слагаемые ƒ+ƒ * Т учитывают смещение, а также линейную зависимость нулевой линии производной от температуры. Отрицательное значение производной дает возможность получить ее графики в области положительных величин.
Аппроксимирующая функция сохраняется в базе данных.
Графики аппроксимирующей функции на выходе аппроксимирующего устройства представлены на фиг. 3 (Ряд 1).
(2
В устройстве определения тепловых параметров пробирок данные непрерывной функции в виде полинома, сохраненные в базе данных, используются для выполнения операций вычисления производной непрерывной функции F.
(2)
Диапазон температур непрерывной этой функции ограничен, исходя из критерия нелинейности производной непрерывной функции F, которая может быть представлена в виде формулы 3:
m
(2)
Тепловой параметр каждой пробирки Tможет быть представлен как результат вычисления нулевого значения производной непрерывной функции F=0 в виде формулы 4:
Графики производной аппроксимирующей функции на выходе аппроксимирующего устройства представлены на фиг. 3 (Ряд 2).
m
В устройстве определения тепловых параметров пробирок данные непрерывной функции в виде производной сигмоидальной функции, сохраненные в базе данных, используются без дополнительных вычислений: температурные параметры принимаются равными значениям T, определенным при аппроксимации по формуле 2.
Значения температурных параметров всех пробирок сохраняются в базе данных. Температурные параметры пробирок с повышенными температурами имеют меньшие значения по сравнению с температурными параметрами пробирок с пониженными температурами. Пример гистограммы температурных параметров 32 пробирок представлен на фиг. 4. Видно, что за счет краевого эффекта пробирки A1, А8, D1 и D8 имеют максимальные значения температурных параметров.
Сохраненные в базе данных значения температурных параметров всех пробирок с помощью устройства корректировки используются для выполнения операций определения среднего значения температурных параметров всех пробирок, сохраненных в базе данных, определения отклонения значения температуры каждой пробирки от среднего значения и среднеквадратическое отклонение (СКО) пробирок, формирования сигналов корректировки температуры для устройства автоматического управления температурным режимом, соответствующих среднему значению отклонения температурных, параметров пробирок во всех кластерах, количество которых равно количеству элементов Пельтье, а также сохранение сигналов управления в базе данных.
При этом значение СКО может служить критерием начальной неравномерности тепловых параметров пробирок.
Все выполненные операции могут быть применены к сигналам нескольких зондов с другими температурами кривых плавления для формирования сигналов корректировки температуры в диапазоне рабочих температур. При этом сигналы корректировки формируются путем выполнения операции аппроксимации температуры плавления нескольких зондов полиномом первого или более высокого порядков.
Сигналы корректировки используются в устройстве автоматического управления температурным режимом для значительного уменьшения различия средних значений температуры пробирок кластеров, относящихся к разным элементам Пельтье. Для этого в' устройстве автоматического управления температурным режимом сигнал управления микропроцессорного устройства управления каждого элемента Пельтье изменяется согласно соответствующему сигналу корректировки.
После выполнения корректировки температуры с помощью устройства автоматического управления температурным режимом предлагаемое устройство может использоваться для повторного выполнения операций определения отклонения значения температуры каждой пробирки от среднего значения и значения СКО температурных параметров пробирок. При этом значение СКО может служить критерием остаточной неравномерности тепловых параметров пробирок.
Сигналы с выходов детектора, микропроцессорного устройства управления и базы данных корректирующей системы поступают на входы персонального компьютера для наблюдения сигналов на экране монитора.
После выполнения корректировки температуры с помощью устройства автоматического управления температурным режимом предлагаемое устройство может использоваться с для выполнения операций определения значений пороговых циклов сигналов ПЦР в реальном времени от исследуемых проб в каждой пробирке, которые используются при количественных измерениях.
Уменьшение погрешности количественных измерений достигается за счет повышения однородности температуры теплопроводящего элемента в циклическом режиме, при этом уменьшается разброс значений пороговых циклов исследуемых проб.
После выполнения корректировки температуры с помощью устройства автоматического управления температурным режимом предлагаемое устройство может использоваться для определения температуры плавления исследуемых образцов в каждой пробирке.
Пример гистограммы температуры пробирок представлен на фиг. 5. Видно, что за счет краевого эффекта пробирки A1, А8, D1 и D8 имеют более низкие значения температуры по сравнению с пробирками в центральной части теплопроводящего элемента. При этом повторно определенные значения отклонения температуры каждой пробирки от среднего значения зондов могут использоваться в качестве поправок для уменьшения погрешности определения температуры плавления исследуемых образцов в каждой пробирке.
Аппроксимация производной кривой плавления полиномом или производной сигмоидальной функции позволяет значительно уменьшить погрешность определения температуры плавления: исключается погрешность дискретизации, усредняется влияние шумов и компенсируется дрейф нулевой линии.
Предлагаемое устройство позволяет повысить однородность температуры теплопроводящего элемента с расположенными в нем углублениями для пробирок с реакционными смесями, уменьшить погрешность количественных измерений в циклическом режиме и уменьшить погрешность определения температуры плавления исследуемых образцов в каждой пробирке.
Источники информации
1. Патент США №0037117 A1. Differential dissociation and melting curve peak detection. МПК G06F 19/00, G06F 15/00, 05.02.2009 r.
2. Патент на изобретение РФ №2460804. Способ гомогенной детекции по меньшей мере одного продукта одноцепочечной амплификации. МПК C12Q 1/68, С12Р 19/34, C12N 15/11, опубл. 10.09.2012 г. Бюл. №25.
3. Патент на изобретение РФ №2451086. Способ детекции специфических нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных замен с помощью ПЦР в режиме реального времени с эффектом гашения флуоресценции зонда праймером. МПК C12Q 1/68, опубл. 20.05.2012 г. Бюл. №14.
4. Патент США №8797526 В2. Instrument and method for the automated thermal treatment of liquid samples, кл. G01N 1/10, 05.08,2014 г.
5. Патент на изобретение РФ №2304277. Устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества амплификации нуклеиновой кислоты. МПК G01N 21/63, опубл. 10.08.2007 г. Бюл. №22.
6. Патент на изобретение РФ №2418289. Устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества амплификации нуклеиновой кислоты МПК G01N 21/64, опубл. 10.05.2011 г. Бюл. №13.