СПОСОБ ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗА МОЧИ НА ГЕНЫ БЕТА-ЛАКТАМНОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ УРОПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ У БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН С ПИЕЛОНЕФРИТОМ
METHOD FOR RAPID ANALYSIS OF URINE ON GENES OF BETA-LACTAM RESISTANCE OF UROPATHOGENIC ENTEROBACTERIA IN PREGNANT WOMEN WITH PYELONEPHRITIS

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной медицине, и может быть использовано для экспресс анализа мочи на гены бета-лактамной резистентности уропатогенных энтеробактерий у беременных женщин с пиелонефритом.
Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) относятся к наиболее распространенным инфекционным заболеваниям в акушерстве и гинекологии. В отсутствие своевременной антибактериальной терапии ИМП могут приводить к появлению серьезных осложнений, таких как анемия, артериальная гипертензия, преждевременные роды, рождение детей с низкой массой тела. Возбудителями ИМП в подавляющем большинстве случаев являются уропатогенные энтеробактерии - бактерии семейства Enterobacteriaceae, главным образом, Escherichia coli и Klebsiella spp.
В настоящее время выявление значимой бактериурии и определение чувствительности выявленных уропатогенов к антибиотикам основываются на культивировании пробы мочи. Лечение ИМП начинается эмпирически и в последующем корректируется, если необходимо, на основании результатов культурального исследования мочи. Во время беременности выбор препаратов для терапии тяжелых форм ИМП (пиелонефрита и уросепсиса) ограничен бета-лактамными антибиотиками, такими как пенициллины и цефалоспорины. Однако, высокая резистентность энтеробактерий к бета-лактамным антибиотикам может приводить к неблагоприятным клиническим исходам, ввиду неэффективности применяемого антибиотика. Кроме того, широкое использование эмпирической терапии в условиях высокой резистентности к данным антибиотикам способствует дальнейшему росту резистентности. В связи с этим ограничение использования эмпирической терапии в пользу этиотропной (направленной на конкретного возбудителя) с учетом профиля его антибиотикорезистентности является актуальной клинической и эпидемиологической задачей.
Известен способ определения возбудителя ИМП и его чувствительности к антибиотикам, заключающийся в культуральном исследовании пробы мочи. Сначала производят количественный посев мочи в питательные среды для определения клинической значимости выявленного возбудителя и получения чистой культуры возбудителя для дальнейшего анализа. Далее осуществляют идентификацию выделенного возбудителя с применением биохимических, спектрометрических и других методов (в зависимости от возбудителя и возможностей лаборатории). После этого определяют чувствительность возбудителя к антибиотикам с применением диско-диффузионного метода или метода серийных разведений (Определение чувствительности к антимикробным препаратам. EUCAST 2018).
Недостатки культурального исследования мочи заключаются в трудоемкости и длительности - в целом, анализ занимает 48-72 часа. Кроме того, накопленные к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что прогнозирование клинической эффективности антимикробных препаратов на основе оценки фенотипа (антибиотикограммы) менее информативно, чем ее прогнозирование на основе выявления генотипа (набора генов резистентности) данного патогена. Существенным недостатком также является то, что в современных условиях повсеместного внедрения молекулярно-биологических исследований в клиническую лабораторную диагностику не все учреждения имеют лаборатории для бактериологических исследований.
Известен способ исследования мочи, получивший распространение в последние годы, в котором сначала производят количественный посев мочи в питательные среды для определения клинической значимости выявленного возбудителя. После этого исследуют культуру молекулярно-биологическими методами, например, методом ПЦР, для идентификации возбудителя и выявления генов резистентности. Данный способ позволяет сократить продолжительность анализа примерно на 24 часа (Tuite Ν, Reddington K, Barry Τ, Zumla A, Enne V. Rapid nucleic acid diagnostics for the detection of antimicrobial resistance in Gram-negative bacteria: Is it time for a paradigm shift? Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2014; 69:1729-33). Данный способ исследования мочи мы взяли в качестве ближайшего аналога - прототипа изобретения.
Недостатком способа, тем не менее, остается значительная продолжительность анализа и наличие этапа количественного культурального исследования мочи.
Технический результат заявляемого способа заключается в исключении этапа культурального исследования мочи и, как следствие, значительном сокращении времени исследования, а также возможности применения в учреждениях, не располагающих условиями для бактериологических исследований, но выполняющих ПЦР-исследования.
5
Указанный технический результат достигается в способе экспресс анализа мочи на гены бета-лактамной резистентности уропатогенных энтеробактерий у беременных женщин с пиелонефритом, включающем исследование мочи методом ПЦР, в котором проводят исследование пробы мочи на ДНК энтеробактерий методом количественной ПЦР в реальном времени и при выявлении клинически значимого количества уропатогенных энтеробактерий ≥5×10 ГЭ/мл проводят ПЦР-анализ той же пробы ДНК на гены бета-лактамаз СТХ-М, ТЕМ и DHA и при обнаружении как минимум одного из генов СТХ-М, ТЕМ, DHA делают вывод о бета-лактамной резистентности уропатогенных энтеробактерий.
Для выявления клинически значимого количества уропатогенных энтеробактерий использован метод количественной ПЦР. Сразу же после получения положительного результата количественного ПЦР-исследования производят ПЦР-анализ этого же образца ДНК на гены резистентности к бета-лактамным антибиотикам. Весь анализ занимает 3-4 часа.
4
Способ иллюстрируется чертежом, где представлен результат ROC-анализа способности количественного ПЦР-теста на ДНК энтеробактерий выявлять бактериурию ≥10 КОЕ/мл
Этапы разработки состояли из решения следующих задач. Сначала были разработаны критерии клинически значимого количества ДНК уропатогенных энтеробактерий, выявляемых при ПНР-исследовании. Для этого был использован статистический метод ROC-анализ (ROC - receiver operating characteristic). В качестве референтных положительных образцов использовали первичные пробы мочи с культурально подтвержденной значимой бактериурией (n=95). В качестве референтных отрицательных образцов использовали первичные пробы мочи (n=849) от пациенток без значимой бактериурии и без признаков ИМП. Все пробы мочи были параллельно протестированы методом количественной ПЦР в реальном времени с использованием ранее опубликованных праймеров и зондов для выявления бактерий семейства Enterobacteriaceae (табл. 1).
4
Значимая бактериурия определяется как ≥10 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл при культуральном анализе (Bartoletti R, Johansen ТЕВ, Naber KG, Pickard RS, Tenke P, Wagenlehner F, et al. Guidelines on Urological Infections. European Association of Urology 2015:237-57).
5
Оптимальный порог ROC-кривой (чертеж) составил ≥5×10 геномных эквивалентов (ГЭ)/мл, эта величина была взята за показатель значимой бактериурии для ПЦР-исследования. Чувствительность и специфичность ПЦР-метода для определения значимой бактериурии с данным порогом в сравнении с количественным культуральным исследованием мочи составили 99% и 100%, соответственно.
Следующим этапом был фенотипический и генетический анализ на бета-лактамную резистентность. С применением фенотипического (диско-диффузионного) метода было протестировано 116 изолятов уропатогенных энтеробактерий. Эти же изоляты, а также все первичные пробы мочи, из которых их выделили, с применением метода ПЦР протестировали на гены бета-лактамаз, определяющих резистентность к амоксициллину/клавуланату и цефалоспоринам широкого спектра. ПЦР проводили с использованием опубликованных праймеров (табл. 1).
Фенотипически резистентность к амоксициллину/клавуланату и/или цефалоспоринам широкого спектра действия была выявлена у 32 изолятов -29 Е. coli, 2 К. pneumoniae и 1 K. oxytoca. В 31 из этих изолятов были выявлены гены исследуемых типов беталактамаз (СТХ-М, ТЕМ, DHA) по отдельности или в сочетаниях (табл. 2). Остальные генетические детерминанты резистентности не были обнаружены ни в одной исследуемой пробе. Совпадение результатов тестирования изолятов уропатогенов и первичных проб мочи составило 100%.
Из 32 штаммов с фенотипом резистентности к бета-лактамам в 31 были обнаружены гены резистентности (как минимум один из генов СТХ-М, ТЕМ, DHA), и чувствительность, таким образом, составила 97% (табл. 3).
В 9 штаммах были обнаружены гены резистентности, но при этом фенотипически они были чувствительны к бета-лактамам. Таким образом, специфичность составила 89%.
Из 40 штаммов, содержащих гены резистентности, только 31 проявили резистентный фенотип к бета-лактамам, и прогностическая значимость положительных результатов составила 78%).
Прогностическая значимость отрицательных результатов была очень высокой (99%): из 76 штаммов, в которых генов резистентности не выявлялись, 75 не имели резистентного фенотипа.
Диагностические характеристики теста на присутствие генов беталактамаз для определения фенотипической резистентности уропатогенных энтеробактерий представлены в табл. 3.
Таким образом, на основании результата ПЦР-анализа на присутствие генов бета-лактамаз делается предположение об эффективности бета-лактамных антибиотиков:
1. Гены бета-лактамаз СТХ-М, ТЕМ и DHA не обнаружены - с большой долей вероятности лечение амоксициллином/клавулановой кислотой и цефалоспоринами будет эффективным;
2. Обнаружены гены бета-лактамаз СТХ-М и/или ТЕМ и/или DHA - с большой долей вероятности лечение амоксициллином/клавулановой кислотой и цефалоспоринами будет неэффективным.
Способ осуществляют, например, следующим образом.
5
У беременных женщин с пиелонефритом берут пробу мочи и проводят исследование этой пробы на ДНК энтеробактерий методом количественной ПЦР в реальном времени с использованием известных праймеров (табл.1). При выявлении клинически значимого количества энтеробактерий ≥5×10 ГЭ/мл проводят последующий ПЦР-анализ той же пробы ДНК на гены бета-лактамаз СТХ-М, ТЕМ и DHA и при обнаружении как минимум одного из генов СТХ-М, ТЕМ, DHA делают вывод о бета-лактамной резистентности уропатогенных энтеробактерий, что свидетельствует о том, что с большой долей вероятности лечение амоксициллином/клавулановой кислотой и цефалоспоринами будет неэффективным.
Способ подтверждается следующими примерами.
5
Пример 1. В пробе мочи методом количественной ПЦР выявлена ДНК Е. coli в количестве 5,2×10 ГЭ/мл (значимое количество). Проведен последующий ПЦР-анализ той же пробы ДНК на гены бета-лактамаз СТХ-М, ТЕМ и DHA с использованием соответствующих праймеров в табл. 1. Обнаружен резистентный генотип ТЕМ, что свидетельствует о высокой вероятности того, что лечение бета-лактамными антибиотиками будет неэффективным.
5
Пример 2. В пробе мочи методом количественной ПЦР выявлена ДНК K. pneumoniae в количестве 5,0×10 ГЭ/мл (значимое количество). Проведен последующий ПЦР-анализ той же пробы ДНК на гены бета-лактамаз СТХ-М, ТЕМ и DHA с использованием праймеров в соответствии с табл. 1. Обнаружены гены СТХ-М и ТЕМ, свидетельствует о высокой вероятности того, что лечение бета-лактамными антибиотиками будет неэффективным.
5
Пример 3. В пробе мочи методом количественной ПЦР выявлено 6,0×10 ГЭ/мл значимого количества Е. coli. Проведен последующий ПЦР-анализ той же пробы ДНК на гены бета-лактамаз СТХ-М, ТЕМ и DHA с использованием праймеров в соответствии с табл. 1. Обнаружен резистентный генотип DHA, свидетельствует о высокой вероятности того, что лечение бета-лактамными антибиотиками будет неэффективным.
Как указывалось ранее, из 116 изолятов уропатогенных энтеробактерий, исследованных заявляемым способом экспресс-анализа, в 32 случаях подтвердилась бета-лактамная резистентность, что позволило назначить своевременное эффективное лечение. Во всех случаях для экспресс анализа потребовалось от 3 до 4 часов.
Способ позволяет значительно сократить время исследования до 3-4 часов и может рассматриваться как экспресс-анализ. Способ не требует этапа культурального исследования мочи, может быть применен в учреждениях, не располагающих условиями для бактериологических исследований, но выполняющих ПЦР-исследования.