КОНЪЮГИРОВАННЫЕ ИММУНОГЛОБУЛИНЫ С C-КОНЦЕВЫМ ЛИЗИНОМ

1. Способ получения конъюгированного иммуноглобулина, где способ включает
инкубацию иммуноглобулина с микробной трансглутаминазой и функциональным агентом, содержащим ацил-донорный субстрат,
а) где иммуноглобулин содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток после С-концевого лизина,
b) где ацил-донорный субстрат содержит остаток глутамина, и
c) где функциональным агентом является терапевтический агент или диагностический агент,
где микробная трансглутаминаза катализирует конъюгацию С-концевого лизина иммуноглобулина с остатком глутамина ацил-донорного субстрата в функциональном агенте, тем самым обеспечивая получение конъюгированного иммуноглобулина.
2. Способ получения конъюгированного иммуноглобулина, где способ включает
i) инкубацию иммуноглобулина с микробной трансглутаминазой и ацил-донорным субстратом,
а) где иммуноглобулин содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток после С-концевого лизина, и
b) где ацил-донорный субстрат содержит остаток глутамина, и
где микробная трансглутаминаза катализирует конъюгацию С-концевого лизина иммуноглобулина с остатком глутамина ацил-донорного субстрата, и
ii) конъюгацию функционального агента с реакционноспособной группой ацил-донорного субстрата, где функциональным агентом является терапевтический агент или диагностический агент,
тем самым обеспечивая получение конъюгированного иммуноглобулина.
3. Способ по п.2, где реакционноспособная группа ацил-донорного субстрата конъюгирована с функциональным агентом клик-реакцией.
4. Способ по п.1 или 2, где С-концевой лизин представляет лизин 447 (K447) в тяжелой цепи иммуноглобулина.
5. Способ по п.1 или 2, где иммуноглобулин содержит один аминокислотный остаток после С-концевого лизина, и один аминокислотный остаток после С-концевого лизина представляет глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, тирозин, триптофан, серин, треонин, цистеин, аспарагин, глутамин или гистидин.
6. Способ по п.1 или 2, где иммуноглобулин содержит один аминокислотный остаток после С-концевого лизина, и где один аминокислотный остаток после С-концевого лизина не включает пролин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, лизин или аргинин.
7. Способ по п.1, где функциональный агент, содержащий ацил-донорный субстрат, соответствует одной из формул (I) или (II)
(Z)m-Gln-(L)n-(Y)
(I)
(Y)-(L)n-Gln-(Z)m
(II),
где Z представляет карбоксибензилокси (CBZ) группу или аминокислотный остаток;
Gln представляет остаток глутаминовой кислоты;
каждый L независимо представляет прямой или разветвленный линкер из 1-20 атомов углерода, где один или более атомов углерода могут быть необязательно и независимо заменены атомом азота, кислорода или серы, и где каждый атом углерода и азота может быть необязательно замещен; или каждый L необязательно и независимо представляет аминокислотный остаток;
m равно целому числу от 0 до 5;
n равно целому числу от 0 до 5; и
Y является функциональным агентом.
2
2
2
2
2
3
8. Способ по п.7, где функциональный агент, содержащий ацил-донорный субстрат, соответствует формуле (I), и где Z представляет CBZ группу; L представляет молекулу полиэтиленгликоля (ПЭГ)(-O((CH))-), этиламин (-NH((CH))-) или пропиламин (-NH((CH))-); и n равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5.
9. Способ по п.7, где функциональный агент, содержащий ацил-донорный субстрат, соответствует формуле (I), где Z представляет CBZ группу, и L представляет аминокислоту.
10. Способ по п.9, где L является Gly; m равно 1; и n равно 0.
11. Способ по п.9, где L является Gly; m равно 1; и n равно 1.
12. Способ по п.7, где функциональный агент, содержащий ацил-донорный субстрат, соответствует формуле (II), где Z представляет CBZ группу; m равно 1; n равно 1, 2 или 3; и, по меньшей мере, один L является Gly.
13. Способ по п.2, где ацил-донорный субстрат соответствует одной из формул (III) или (IV):
(Z)m-Gln-(L)n-(Х)
(III)
(Х)-(L)n-Gln-(Z)m
(IV),
где Z представляет карбоксибензилокси (CBZ) группу или аминокислотный остаток;
Gln представляет остаток глутаминовой кислоты;
каждый L независимо представляет прямой или разветвленный линкер из 1-20 атомов углерода, где один или более атомов углерода могут быть необязательно и независимо заменены атомом азота, кислорода или серы, и где каждый атом углерода и азота может быть необязательно замещен; или каждый L необязательно и независимо представляет аминокислотный остаток;
m равно целому числу от 0 до 5;
n равно целому числу от 0 до 5; и
Х является реакционноспособной группой.
2
2
2
2
2
3
14. Способ по п.13, где ацил-донорный субстрат соответствует формуле (III), и где Z представляет CBZ группу; где L представляет молекулу полиэтиленгликоля (ПЭГ)(-O((CH))-), этиламин (-NH((CH))-) или пропиламин (-NH((CH))-); и n равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5.
15. Способ по п.13, где ацил-донорный субстрат соответствует формуле (III), где Z представляет CBZ группу, и L представляет аминокислоту.
16. Способ по п.15, где L является Gly; m равно 1; и n равно 1.
17. Способ по п.15, где L является Gly; m равно 1; и n равно 0.
18. Способ по п.13, где ацил-донорный субстрат соответствует формуле (IV), где Z представляет CBZ группу; m равно 1; n равно 1, 2 или 3; и, по меньшей мере, один L является Gly.
3
19. Способ по п.13, где Х представляет реакционноспособную группу, выбранную из группы, состоящей из (1R,8S,9s)бицикло[6.1.0]нон-4-ин-9-илметанола(BCN),  (DBCO), транс-циклооктена (TCO), азидо (N), алкина, тетразина метилциклопропена, норборнена, гидразида/гидразина и альдегида.
20. Способ по п.1 или 2, где терапевтический агент представляет антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, химиотерапевтический препарат, лекарственный препарат, радиоактивный агент, цитотоксический агент, антибиотик, небольшую молекулу, нуклеиновую кислоту или полипептид.
21. Способ по п.1 или 2, где диагностический агент представляет флуорофор, флуоресцентный краситель, радионуклид или фермент.
22. Способ по п.1 или 2, где иммуноглобулин имеет два аминокислотных остатка после С-концевого лизина, включающих первый аминокислотный остаток после С-концевого лизина и второй аминокислотный остаток после С-концевого лизина.
23. Способ по п.22, где первый аминокислотный остаток после С-концевого лизина представляет любой аминокислотный остаток, за исключением аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты или пролина, и второй аминокислотный остаток после С-концевого лизина выбран из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, метионина, валина, серина, пролина, треонина, аланина, тирозина, гистидина, глутамина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, триптофана и глицина.
24. Способ по п.23, где первый аминокислотный остаток после С-концевого лизина представляет лизин или аргинин.
25. Способ по п.1 или 2, где иммуноглобулин имеет три аминокислотных остатка после С-концевого лизина, включающих первый аминокислотный остаток после С-концевого лизина, второй аминокислотный остаток после С-концевого лизина и третий аминокислотный остаток после С-концевого лизина, где третий аминокислотный остаток после С-концевого лизина выбран из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, метионина, валина, серина, пролина, треонина, аланина, тирозина, гистидина, глутамина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, триптофана и глицина.
26. Способ по п.1 или 2, где иммуноглобулин имеет четыре аминокислотных остатка после С-концевого лизина, включающих первый аминокислотный остаток после С-концевого лизина, второй аминокислотный остаток после С-концевого лизина, третий аминокислотный остаток после С-концевого лизина и четвертый аминокислотный остаток после С-концевого лизина, где четвертый аминокислотный остаток после С-концевого лизина выбран из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, метионина, валина, серина, пролина, треонина, аланина, тирозина, гистидина, глутамина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, триптофана и глицина.
27. Способ по п.1 или 2, где иммуноглобулин имеет пять аминокислотных остатков после С-концевого лизина, включающих первый аминокислотный остаток после С-концевого лизина, второй аминокислотный остаток после С-концевого лизина, третий аминокислотный остаток после С-концевого лизина, четвертый аминокислотный остаток после С-концевого лизина и пятый аминокислотный остаток после С-концевого лизина, где пятый аминокислотный остаток после С-концевого лизина выбран из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, метионина, валина, серина, пролина, треонина, аланина, тирозина, гистидина, глутамина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, триптофана и глицина.
28. Способ по п.1 или 2, где иммуноглобулин имеет менее 9 аминокислотных остатков после С-концевого лизина, и где последний аминокислотный остаток после С-концевого лизина выбран из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, метионина, валина, серина, пролина, треонина, аланина, тирозина, гистидина, глутамина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, триптофана и глицина.
29. Способ по п.1 или 2, где иммуноглобулин имеет менее 13 аминокислотных остатков после С-концевого лизина, и где последний аминокислотный остаток после С-концевого лизина выбран из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, метионина, валина, серина, пролина, треонина, аланина, тирозина, гистидина, глутамина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, триптофана и глицина.
30. Способ по пп.1 или 2, где микробная трансглутаминаза является микробной трансглутаминазой бактерии Streptomyces mobarensis.
31. Способ по п.1 или 2, где иммуноглобулин представляет иммуноглобулин IgG1.
32. Способ по п.1 или 2, где иммуноглобулин представляет иммуноглобулин IgG2, IgG3 или IgG4.
33. Способ по п.1 или 2, где иммуноглобулин представляет иммуноглобулин IgA1, IgA2 или IgM, которые не содержат хвостовую область.
34. Способ по п.1 или 2, где иммуноглобулин представляет иммуноглобулин IgD или IgE.
35. Способ по любому из предшествующих пунктов, где иммуноглобулин представляет человеческий иммуноглобулин или гуманизированный иммуноглобулин.
36. Способ по любому из предшествующих пунктов, где иммуноглобулин представляет химерный иммуноглобулин, или не является человеческим иммуноглобулином.
37. Способ по любому из предшествующих пунктов, где иммуноглобулин содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи.
38. Способ по любому из предшествующих пунктов, где соотношение функционального агента к иммуноглобулину составляет от 1:1 до 2:1.
39. Конъюгированный иммуноглобулин, содержащий иммуноглобулин и функциональный агент, где
а) иммуноглобулин содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток после С-концевого лизина,
b) функциональный агент содержит ацил-донорный субстрат, где ацил-донорный субстрат содержит остаток глутамина, и
с) функциональный агент является терапевтическим агентом или диагностическим агентом,
где С-концевой лизин иммуноглобулина конъюгирован с остатком глутамина ацил-донорного субстрата функционального агента.
40. Конъюгированный иммуноглобулин, содержащий иммуноглобулин и функциональный агент, где
а) иммуноглобулин содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток после С-концевого лизина,
b) С-концевой лизин конъюирован с остатком глутамина в ацил-донорном субстрате, где ацил-донорный субстрат дополнительно содержит реакционноспособную группу, и
с) реакционоспособная группа конъюгирована с функциональным агентом, где функциональный агент является терапевтическим агентом или диагностическим агентом.
41. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где С-концевой лизин представляет лизин 447 (K447) в тяжелой цепи иммуноглобулина.
42. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где иммуноглобулин содержит один аминокислотный остаток после С-концевого лизина, и где один аминокислотный остаток после С-концевого лизина представляет глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, тирозин, триптофан, серин, треонин, цистеин, аспарагин, глутамин или гистидин.
43. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где иммуноглобулин содержит один аминокислотный остаток после С-концевого лизина, и где один аминокислотный остаток после С-концевого лизина не является пролином, аспарагиновой кислотой, глутаминовой кислотой, лизином или аргинином.
44. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39, где функциональный агент, содержащий ацил-донорный субстрат, соответствует одной из формул (I) или (II)
(Z)m-Gln-(L)n-(Y)
(I)
(Y)-(L)n-Gln-(Z)m
(II,)
где Z представляет карбоксибензилокси (CBZ) группу или аминокислотный остаток;
Gln представляет остаток глутаминовой кислоты;
каждый L независимо представляет прямой или разветвленный линкер из 1-20 атомов углерода, где один или более атомов углерода могут быть необязательно и независимо заменены атомом азота, кислорода или серы, и где каждый атом углерода и азота может быть необязательно замещен; или каждый L необязательно и независимо представляет аминокислотный остаток;
m равно целому числу от 0 до 5;
n равно целому числу от 0 до 5; и
Y является функциональным агентом.
2
2
2
2
2
3
45. Конъюгированный иммуноглобулин по п.44, где функциональный агент, содержащий ацил-донорный субстрат, соответствует формуле (I), и где Z представляет CBZ группу; L представляет молекулу полиэтиленгликоля (ПЭГ) (-O((CH))-), этиламин (-NH((CH))-) или пропиламин (-NH((CH))-); и n равно 0, 1, 2 или 3.
46. Конъюгированный иммуноглобулин по п.44, где функциональный агент, содержащий ацил-донорный субстрат, соответствует формуле (I), где Z представляет CBZ группу, и L представляет аминокислоту.
47. Конъюгированный иммуноглобулин по п.46, где m равно 1; и n равно 0.
48. Конъюгированный иммуноглобулин по п.46, где L является Gly; m равно 1; и n равно 1.
49. Конъюгированный иммуноглобулин по п.44, где функциональный агент, содержащий ацил-донорный субстрат, соответствует формуле (II), где Z представляет CBZ группу; m равно 1; n равно 1, 2 или 3; и, по меньшей мере, один L является Gly.
50. Конъюгированный иммуноглобулин по п.40, где ацил-донорный субстрат соответствует одной из формул (III) или (IV)
(Z)m-Gln-(L)n-(X)
(III)
(X)-(L)n-Gln-(Z)m
(IV),
где Z представляет карбоксибензилокси (CBZ) группу или аминокислотный остаток;
Gln представляет остаток глутаминовой кислоты;
каждый L независимо представляет прямой или разветвленный линкер из 1-20 атомов углерода, где один или более атомов углерода могут быть необязательно и независимо заменены атомом азота, кислорода или серы, и где каждый атом углерода и азота может быть необязательно замещен; или каждый L необязательно и независимо представляет аминокислотный остаток;
m равно целому числу от 0 до 5;
n равно целому числу от 0 до 5; и
Х является реакционноспособной группой.
2
2
2
2
2
3
51. Конъюгированный иммуноглобулин по п.50, где ацил-донорный субстрат соответствует формуле (III), и где Z представляет CBZ группу; L независимо представляет молекулу полиэтиленгликоля (ПЭГ) (-O((CH))-), этиламин (-NH((CH))-) или пропиламин (-NH((CH))-); и n равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5.
52. Конъюгированный иммуноглобулин по п.50, где ацил-донорный субстрат соответствует формуле (III), где Z представляет CBZ группу, и L представляет аминокислоту.
53. Конъюгированный иммуноглобулин по п.52, где m равно 1; и n равно 0.
54. Конъюгированный иммуноглобулин по п.52, где L является Gly; m равно 1; и n равно 1.
55. Конъюгированный иммуноглобулин по п.50, где ацил-донорный субстрат соответствует формуле (IV), где Z представляет CBZ группу; m равно 1; n равно 1, 2 или 3; и, по меньшей мере, один L является Gly.
3
56. Конъюгированный иммуноглобулин по п.50, где Х представляет реакционноспособную группу, выбранную из группы, состоящей из (1R,8S,9s)бицикло[6.1.0]нон-4-ин-9-илметанола(BCN),  (DBCO), транс-циклооктена (TCO), азидо (N), алкина, тетразина метилциклопропена, норборнена, гидразида/гидразина и альдегида.
57. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где терапевтический агент представляет антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, химиотерапевтический препарат, лекарственный препарат, радиоактивный агент, цитотоксический агент, антибиотик, небольшую молекулу, нуклеиновую кислоту или полипептид.
58. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где диагностический агент представляет флуорофор, флуоресцентный краситель, радионуклид или фермент.
59. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где иммуноглобулин имеет два аминокислотных остатка после С-концевого лизина, включающих первый аминокислотный остаток после С-концевого лизина и второй аминокислотный остаток после С-концевого лизина.
60. Конъюгированный иммуноглобулин по п.59, где первый аминокислотный остаток после С-концевого лизина представляет любой аминокислотный остаток, за исключением аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты или пролина, и второй аминокислотный остаток после С-концевого лизина выбран из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, метионина, валина, серина, пролина, треонина, аланина, тирозина, гистидина, глутамина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, триптофана и глицина.
61. Конъюгированный иммуноглобулин по п.60, где первый аминокислотный остаток после С-концевого лизина представляет лизин или аргинин.
62. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где иммуноглобулин имеет три аминокислотных остатка после С-концевого лизина, включающих первый аминокислотный остаток после С-концевого лизина, второй аминокислотный остаток после С-концевого лизина и третий аминокислотный остаток после С-концевого лизина, где третий аминокислотный остаток после С-концевого лизина выбран из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, метионина, валина, серина, пролина, треонина, аланина, тирозина, гистидина, глутамина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, триптофана и глицина.
63. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где иммуноглобулин имеет четыре аминокислотных остатка после С-концевого лизина, включающих первый аминокислотный остаток после С-концевого лизина, второй аминокислотный остаток после С-концевого лизина, третий аминокислотный остаток после С-концевого лизина и четвертый аминокислотный остаток после С-концевого лизина, где четвертый аминокислотный остаток после С-концевого лизина выбран из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, метионина, валина, серина, пролина, треонина, аланина, тирозина, гистидина, глутамина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, триптофана и глицина.
64. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где иммуноглобулин имеет пять аминокислотных остатков после С-концевого лизина, включающих первый аминокислотный остаток после С-концевого лизина, второй аминокислотный остаток после С-концевого лизина, третий аминокислотный остаток после С-концевого лизина, четвертый аминокислотный остаток после С-концевого лизина и пятый аминокислотный остаток после С-концевого лизина, где пятый аминокислотный остаток после С-концевого лизина выбран из группы состоящий из фенилаланина, лейцина, изолейцина, метионина, валина, серина, пролина, треонина, аланина, тирозина, гистидина, глутамина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, триптофана и глицина.
65. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где иммуноглобулин имеет менее 9 аминокислотных остатков после С-концевого лизина, и где последний аминокислотный остаток после С-концевого лизина выбран из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, метионина, валина, серина, пролина, треонина, аланина, тирозина, гистидина, глутамина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, триптофана и глицина.
66. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где иммуноглобулин имеет менее 13 аминокислотных остатков после С-концевого лизина, и где последний аминокислотный остаток после С-концевого лизина выбран из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, метионина, валина, серина, пролина, треонина, аланина, тирозина, гистидина, глутамина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, триптофана и глицина.
67. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где иммуноглобулин представляет иммуноглобулин IgG1.
68. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где иммуноглобулин представляет иммуноглобулин IgG2, IgG3 или IgG4.
69. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где иммуноглобулин представляет иммуноглобулин IgA1, IgA2 или IgM, которые не содержат хвостовую область.
70. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где иммуноглобулин представляет иммуноглобулин IgD или IgE.
71. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где иммуноглобулин представляет человеческий иммуноглобулин или гуманизированный иммуноглобулин.
72. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где иммуноглобулин представляет химерный иммуноглобулин, или не является человеческим иммуноглобулином.
73. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где иммуноглобулин содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи.
74. Конъюгированный иммуноглобулин по п.73, где отсутствует внутримолекулярное сшивание между двумя тяжелыми цепями иммуноглобулина.
75     75. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где соотношение функционального агента к иммуноглобулину составляет от 1:1 до 2:1.
76. Конъюгированный иммуноглобулин по п.39 или 40, где функциональный агент представляет антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, и где иммуноглобулин и функциональный агент связываются с одним и тем же антигеном или связываются с различными антигенами.
77. Нуклеиновая кислота, кодирующая конъюгированный иммуноглобулин по любому из пп.39-76.
78. Плазмида, содержащая нуклеиновую кислоту по п.77.
79. Выделенная клетка, содержащая плазмиду по п.78.
80. Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгированный иммуноглобулин по любому из пп.39-76 и фармацевтически приемлемый носитель.
81. Конъюгированный иммуноглобулин, полученный способом по любому из пп.1-38.