Способ определения чувствительности облигатно-анаэробных микроорганизмов в биопленке к антимикробным средствам
METHOD FOR DETERMINATION OF SENSITIVITY OF OBLIGATE ANAEROBIC MICROORGANISMS IN BIOFILM TO ANTIMICROBIAL MEANS

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, лабораторной диагностике, клинической микробиологии, и может быть использовано для определения чувствительности микроорганизмов в биопленке к антибиотикам и другим антимикробным средствам в различных концентрациях при выборе лечения гнойно-воспалительных заболеваний полости рта и челюстно-лицевой области (ЧЛО).
Известен кассетный микрометод определения чувствительности анаэробных бактерий к антибиотикам, предложеннный нами в 1991 г., который предполагал разведение антибиотиков в разогретой агаризованной 1,5-2% питательной среде с добавлением 5% крови и гемина, которая заливалась в лунки триацетатных микрокассет. Микрокассеты помещали в чашку Петри, засевали инокулюм исследуемых культур и помещали в анаэростат при 37°С на 5-7 суток. Способ удобен для культивирования анаэробных бактерий, в том числе пародонтопатогенной группы и успешно применяется до настоящего времени (Царев В.Н., Ушаков Р.В., Пожарская В.О., Ипполитов Е.В. Принципы антибактериальной профилактики и терапии в стоматологии / в кН.: «Микробиология, вирусология и иммунология полости рта (Учебник для стоматологических факультетов медицинских вузов)». - М.: ГЭОТАР-Медиа. - 2013. - С. 300-331; Царев В.Н. Лабораторная диагностика анаэробной (клостридиальной) инфекции. / в кН.: «Руководство по медицинской микробиологии». //Под ред. Лабинской А.С., Костюковой Н.Н. -М.: Бином. - 2013. - Книга 3. - Т. 1. - С. 439-454).
Известен способ определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам при лечении гнойно-воспалительного заболевания (патент RU 2262533 от 20.10.2005, «Способ определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам при лечении гнойно-воспалительного заболевания», Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова).
Способ включает забор гнойного отделяемого из очага гнойного воспаления челюстно-лицевой области, культивирование в сахарном бульоне не менее двух часов, введение стандартных дисков с исследуемыми антибиотиками и инкубирование в течение не менее двух часов. Результат оценивают по степени мутности содержимого в пробе, считая, что чем меньше мутность, тем выше чувствительность. Способ позволяет определить чувствительность микроорганизма к антибиотикам без выделения чистой культуры (то есть в смеси разных видов), то есть с меньшей затратой времени.
Данная система позволяет культивировать смесь микроорганизмов, но также не позволяет получить биопленку, так как не обеспечивает движения жидкости, не имеет твердой подложки (стекло не годится), она не пригодна для воспроизведения роста пародонтопатогенных бактерий, которые требуют использования анаэростата с определенным газовым составом, а следовательно, не позволяет выявить чувствительность к антимикробным средствам именно парадонтопатогенных микроорганизмов, которые не растут без формирования биопленки.
Наиболее близким техническим решением является тест-система «АБ-АН» для определения чувствительности облигатно-анаэробных микроорганизмов к антибиотикам (Косинец А.Н., и др. Витебский государственный медицинский университет, 2011 г.).
Разработана тест-система «АБ-АН» однократного использования, которая служит для определения чувствительности облигатно-анаэробных микроорганизмов к антибиотикам в полужидкой среде после 18-24 ч инкубации в анаэробных условиях. Учет чувствительности возможен визуально или инструментально с помощью анализатора иммуноферментного Ф300ТП и компьютера с программным обеспечением «Sensitiv».
В культуральную среду добавляется бактериальная взвесь, которая затем вносится в лунки планшета, содержащие лиофильно высушенные антибиотики (пенициллин, амоксициллин + клавуланат, тикарциллин + клавуланат, цефокситин, имипенем, меропенем, клиндамицин, хлорамфеникол, метронидазол, моксифлоксацин, амоксициллин, тикарциллин). После инкубации производится визуальный или инструментальный учет. Резистентные штаммы растут в лунке, вызывая помутнение среды; в случае если штамм чувствителен к антибиотику, среда остается прозрачной.
АБ планшет содержит 96 лунок (12 колонок и 8 рядов, по 2 ряда - 24 лунки для определения чувствительности одного штамма микроорганизма). Всего планшет позволяет определять чувствительность четырех микроорганизмов к 12 антибиотикам.
Таким образом, разработанная «АБ-АН» система характеризуется большим разнообразием антибиотиков, относительной дешевизной, простотой в изготовлении и эксплуатации, что позволит в дальнейшем найти широкое применение для определения чувствительности штаммов анаэробных возбудителей хирургической инфекции в бактериологических лабораториях различного профиля.
Однако данная система также не позволяет культивировать биопленку анаэробных бактерий и проводить определение чувствительности смеси микроорганизмов, находящихся на биопленке.
Таким образом, недостатками известных способов, является отсутствие возможности получить смешанную биопленку из пародонтального кармана или воспалительного очага и оценить чувствительность ее компонентов (представителей анаэробной микрофлоры, в том числе пародонтопатогенных видов) к антибиотикам и другим антимикробным средствам.
Задачей изобретения является оценка чувствительности к антимикробным средствам смеси микроорганизмов, формирующих биопленку, выделенных из гнойно-воспалительного очага (и находящихся в смешанной биопленке).
Технический результат предложенного способа заключается в том, что за счет создания газовых анаэробных и температурных условий и колебательных движений питательной жидкости с пародонтопатогенными или иными анаэробными видами, находящимися в виде биопленки в присутствии антибиотиков, растворенных в жидкой питательной среде, достигается эффект точной конкретной информации о чувствительности облигатно-анаэробных микроорганизмов в биопленке к антимикробным средствам.
Способ позволяет определить чувствительность микроорганизма в составе биопленки к антибиотикам без выделения чистой культуры, то есть при моделировании условий полости рта и с меньшей затратной времени.
Кроме того, определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам в биопленке является более точным и корректным, так как пародонтопатогенные виды нередко не растут в виде чистой культуры без микробов-симбионтов. При традиционном посеве, как правило, выявляется рост именно представителей симбионтов - стрептококков, коринебактерий и др. представителей нормальной флоры и выбор антибиотика по чувствительности последних для лечения пародонтита является грубой диагностической ошибкой.
При использовании всех рассмотренных выше аналогов и прототипа биопленка не образуется и значительная часть микроорганизмов, в том числе представители пародонтопатогенных видов, погибают, а в питательной среде с антибиотиком остаются другие микроорганизмы, чаще сапрофиты и представители стабилизирующей микрофлоры, играющие защитную роль в полости рта. Поэтому получаемый в прототипе результат оценки чувствительности к микроорганизмам не оправдан для выбора лечения гнойно-воспалительных заболеваний полости рта, вызываемых пародонтопатогенными видами, так как приводит к кардинально неверному результату определения чувствительности.
В заявленном способе с помощью подложки из полимерных материалов и колебательных движений жидкости (питательной среды), в которой находится биопленка получают возможность определить чувствительность всего комплекса микроорганизмов биопленки.
Заявленный способ включает забор гнойного отделяемого из очага гнойного воспаления челюстно-лицевой области, культивирование его в жидкой питательной среде, содержащей сердечно-мозговой бульон BHI, или LIM, или АС, 0,01% менадиона, 0,1% гемина и антибактериальный препарат, на твердой подложке в лунках планшета из полиметилакрилата или полиуретана или триацетата, при этом планшет с посевами помещают в анаэростат, установленный в орбитальный культиватор, создающий движение жидкой фазы и формирование биопленки микроорганизмов, причем культивирование осуществляют в режиме 60-120 качательных движений в минуту при температуре 37°С в течение 2 суток, результат оценивают по характерным признакам формирования биопленки, считая ниличие биопленки признаком устойчивости к антибактериальному препарату в данной концентрации.
Дальнейшее культивирование осуществляется в условиях анаэробиоза (80% азота, 10% углекислого газа, 10% водорода) и движения жидкости, создаваемого на автоматическом приборе-культиваторе.
Анаэростат помещают в орбитальный шейкер-термостат или культиватор, создающий движение жидкой фазы среды и формирование биопленки микроорганизмами, устойчивыми к данному антибиотику и в данной концентрации (-ях). Культивирование осуществляют в режиме: 60-120 качательных движений в минуту, температура культивирования 37°С, продолжительность - 2 суток.
Результат оценивают на стереомикроскопе (или сканирующем электронном микроскопе) по характерным признакам формирования биопленки, считая наличие биопленки признаком устойчивости к препарату в данной концентрации.
Таким образом разработан способ выявления чувствительности к антимикробным средствам комплекса микроорганизмов полости рта в биопленке, культивируемых в строго анаэробных и температурных условиях на подложке, погруженных в лунки с жидкой питательной средой и антимикробным средством в условиях колебательных движений платформы (то есть движущаяся тест-система), что позволяет при инкубации 48-часов в анаэробных условиях получить полноценный рост смеси микроорганизмов (включая возбудителей) в виде биопленки и оценить выраженность задержки роста комплекса микрофлоры в биопленке под действием изучаемых антимикробных средств, планируемых для лечения больного. Учет чувствительности возможен визуально-инструментально с помощью стереомикроскопа или сканирующего электронного микроскопа, что сокращает время диагностики.
Способ иллюстрируется следующим образом.
Забор материала стандартным ватным тампоном. Перенос материала на тампоне в культуральную среду путем механического распределения на подложке или на дне планшета, содержащего лиофильно высушенные антибиотики (оптимально - 24 препарата, используемые при лечении пародонтита и анаэробных инфекций челюстно-лицевой области), где в указанных условиях формируется биопленка.
Планшет содержит 96 лунок (12 колонок и 8 рядов, по 2 ряда - 24 лунки для определения чувствительности биопленки одного пациента). В качестве препаратов выбора используют: ампициллин, амоксициллин, амоксициллин + клавуланат, цефалексин, цефтриаксон, цефепим, имипенем, меропенем, линкомицин, клиндамицин, хлорамфеникол, метронидазол, ципрофлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, гемифлоксацин, доксициклин, эритромицин, рокситромицин, спирамицин, кларитромицин, азитромицин, фузидин, линезолид).
Всего 96-луночковый планшет позволяет определять чувствительность биопленки 2-х пациентов к 24 антибиотикам или делать вариации по концентрации препаратов по традиционной схеме разведения для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК).
При необходимости определения МПК какого-либо антибактериального препарата предварительно готовят его разведения по стандартной схеме от 125 до 0,12 мкг/мл и, соответственно, получают полужидкие среды с несколькими разными разведениями, расположенными по убывающей концентрации.
Посевы на полужидких средах, содержащих сердечно-мозговой бульон BHI или LIM, или АС, 0,01% менадиона, 0,1% гемина и разведения антибактериального препарата, помещают в анаэростат с газовым составом: 80% азота, 10% водорода и 10% углекислого газа, обеспечивающим рост облигатно-анаэробных и микроаэрофильных видов бактерий, относящихся к пародонтопатогенной группе.
Анаэростат помещают в орбитальный шейкер-культиватор, создающий движение жидкой фазы двухфазной среды и формирование биопленки микроорганизмами, устойчивыми к данному антибиотику и в данной концентрации (-ях). Культивирование осуществляют в режиме: 60-120 качательных движений в минуту, температура культивирования 37°С, продолжительность - 2 суток.
Учет результатов проводят на стереомикроскопе или электронном сканирующем микроскопе, позволяющем различить морфологию микробов и архитектонику биопленки.
Результаты исследования
Наличие роста биопленки на поверхности плотной подложки в полужидкой питательной среде регистрируют следующим образом:
1. При наличии смешанной биопленки микроорганизмы, входящие в ее состав, считаются устойчивыми к данному антибактериальному препарату.
2. При наличии отдельных колоний только эти виды считаются устойчивыми.
3. При отсутствии признаков какого-либо роста (биопленка, отдельные колонии) - все микроорганизмы биопленки считаются чувствительными к данному антибактериальному препарат. Нет роста, вся смесь чувствительна к антимикробным средствам.
При необходимости для идентификации микроорганизмов, входящих в состав биопленки, проводят дальнейшее культуральное исследование с определением биохимических свойств выделенных штаммов или используют современные молекулярные методы идентификации (ПЦР и др.).
Способ был апробирован на добровольцах.
Пример №1
Больной А. 45 лет, диагноз: хронический пародонтит средней степени тяжести, фаза обострения; пародонтальный абсцесс. Взято гнойное содержимое при вскрытии абсцесса, сделан посев для моделирования биопленки и проведена оценка ее чувствительности к 24 различным антимикробным средствам-антибиотикам предлагаемым способом: ампициллин, амоксициллин, амоксициллин + клавуланат, цефалексин, цефтриаксон, цефепим, имипенем, меропенем, линкомицин, клиндамицин, хлорамфеникол, метронидазол, ципрофлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, гемифлоксацин, доксициклин, эритромицин, рокситромицин, спирамицин, кларитромицин, азитромицин, фузидин, линезолид.
Полученные через два дня результаты исследования показали, что смешанная биопленка, образовавшаяся в лунках планшета, присутствует в лунках с препаратами: ампициллин, амоксициллин, цефалексин, линкомицин, клиндамицин, эритромицин, рокситромицин, спирамицин, фузидин (биопленка устойчива), но отсутствует в лунках с препаратами: амоксициллин + клавуланат, цефалексин, цефтриаксон, цефепим, имипенем, меропенем, хлорамфеникол, метронидазол, левофлоксацин, моксифлоксацин, гемифлоксацин, доксициклин, кларитромицин, азитромицин, фузидин, линезолид (биопленка чувствительна).
Рекомендовано для лечения использовать комбинацию амоксициллин + клавунат и метронидазол.
Пример №2
Больная М. 26 лет, с диагнозом агрессивный генерализованный пародонтит. Безуспешное лечение антибиотиками группы линкосамидов (линкомицин) не дало положительных результатов и нами была проведена оценка чувствительности биопленки пародонтального (десневого) кармана больной к 24 антибиотикам.
Полученные через два дня результаты исследования показали, что смешанная биопленка, образовавшаяся в лунках планшета, присутствует в лунках с препаратами: ампициллин, амоксициллин, амоксициллин + клавуланат, цефалексин, цефтриаксон, цефепим, линкомицин, клиндамицин, метронидазол, ципрофлоксацин, доксициклин, эритромицин, рокситромицин, спирамицин, кларитромицин, кларитромицин (биопленка устойчива), но отсутствует в лунках с препаратами: имипенем, меропенем, хлорамфеникол, левофлоксацин, моксифлоксацин, гемифлоксацин, линезолид (биопленка чувствительна).
Рекомендовано для лечения использовать один из препаратов фторхинолонового ряда 3 поколения (левофлоксацин) или 4 поколения (моксифлоксацин, гемифлоксацин).
Кроме того, у больной М. было проведено исследование МПК препарата из группы фторхинолонов - гатифлоксацина. Для определения МПК из навески препарата готовили разведения по стандартной схеме в диапазоне от 125 мкг до 0,12 мкг/мл, которые вносили в лунки в пластиковом планшете и высушивали с таким расчетом, чтобы конечные концентрации в лунках при внесении питательной среды составили от 125 мкг/мл до 0,12 мкг/мл. Затем инокулировали трехвидовую биопленку, включающую Streptococcus sanguis, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, заливали питательной средой и через 48 часов культивирования в заданных условиях (температура, анаэробиоз, движение жидкой фазы среды) учитывали результат на стереомикроскопе.
Установлено, что в диапазоне от 125 мкг до 0,48 мкг/мл рост биопленки отсутствовал. В концентрации 0,24 мкг/мл наблюдались отдельные фрагменты биопленки, представленные стрептококками (Streptococcus sanguis), а в концентрации 0,12 мкг/мл отмечался выраженный рост трехвидовой биопленки.
Следовательно, МПК гатифлоксацина (минимальная концентрация, при которой полностью отсутствует рост микробов) в отношении пародонтопатогенной биопленки составила 0,48 мкг/мл.
Таким образом, разработанный предложенный способ определения чувствительности облигатно-анаэробных микроорганизмов к антимикробным средствам в смешанной биопленке дает возможность изучения любого разнообразия антибиотиков или иных антимикробных препаратов, заявленный способ иллюстрирует высокую точность и конкретность получения медицинской информации об изучаемом антимикробном средстве, его пригодности для лечения больного в короткие сроки (2 дня вместо недели), простоту в изготовлении и эксплуатации, что позволит в дальнейшем найти широкое применение этого способа для определения чувствительности штаммов анаэробных и пародонтопатогенных возбудителей анаэробной инфекции в бактериологических лабораториях различного профиля. Учитывая важную роль парадонтопатогенных анаэробных микроорганизмов в патогенезе (развитии) не только заболеваний полости рта, но и сердечно-осудистой и желудочно-кишечной патологии, способ может применяться в лабораторной диагностике выбора лекарственных средств различными подразделениями клиники.