БЕССЫВОРОТОЧНАЯ СТАБИЛЬНАЯ ТРАНСФЕКЦИЯ И ПРОДУКЦИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ЧЕЛОВЕКА В КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ ЧЕЛОВЕКА

1. Способ получения иммортализованной клеточной линии человека, стабильно трансфицированной последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей ген, кодирующий целевой белок человека, или его производное, или его мутант, промотор и сигнал полиаденилирования (полиА) гормона роста быка, где указанный промотор и сигнал полиA связаны с 5'- и 3'-концом гена, кодирующего указанный целевой белок человека соответственно, где способ включает трансфекцию иммортализованной линии клеток-хозяев человека в бессывороточных условиях вектором трансфекции, содержащим указанную последовательность нуклеиновой кислоты и начало репликации.
2. Способ по п.1, в котором целевой белок человека представляет собой белок плазмы человека, выбранный из факторов свертывания крови, таких, как фактор IX, фактор VIII (дикого типа и с делецией B-домена), фактор VII/VIIa и фактор фон Виллебранда (vWF), факторов роста, таких, как эритропоэтин, колониестимулирующих факторов (CSF), таких, как гранулоцитстимулирующий фактор (G-CSF), макрофаг CSF (M-CSF) и гранулоцит-макрофаг CSF (GM-CSF), цитокины, такие, как интерлейкины, ингибиторы протеаз, такие, как альфа-1-антитрипсин (A1AT) и химотрипсин, транспортные белки, такие, как гормоны, белки с ингибиторным или регуляторным действием и их производные и мутанты, предпочтительно белок человека выбран из фактора IX, фактора VIII, включая фактор VIII дикого типа и фактор VIII с делецией B-домена, фактора VII/VIIa, G-CSF, vWF и A1AT, наиболее предпочтительно белок человека представляет собой фактор IX свертывания крови, кодируемый п.о. 939-2324 SEQ ID NO:1, A1AT человека, кодируемый п.о. 973-2259 SEQ ID NO:2, фактор VIII дикого типа, показанный в SEQ ID NO:9, фактор VIII человека с делецией B-домена, кодируемый п.о. 783-5162 SEQ ID NO:3, фактор VII/VIIa, кодируемый SEQ ID NO:13 и 14, G-CSF, кодируемый SEQ ID NO:15, 16 и 17, или vWF, кодируемый SEQ ID NO:18.
3. Способ по п.1 или 2, в котором в векторе трансфекции
(i) промотор выбран из вирусных промоторов, промоторов генов «домашнего хозяйства» и тканеспецифических промоторов, предпочтительно промотор представляет собой промотор CMV с интроном A или без такового, промотор SV40, промотор EF-1альфа, промотор HSV TK и т.д., наиболее предпочтительным промотором является промотор CMV; и/или
(ii) начало репликации обеспечивает репликацию и амплификацию плазмиды в бактериях;
(iii) вектор дополнительно несет, по меньшей мере, один ген маркера селекции, предпочтительно выбранный из генов резистентности к гигромицину, резистентности к неомицину, резистентности к аминогликозидфосфотрансферазе (neo, G418, APH), резистентности к блеомицину (флео, блео, зеоцину) и резистентности к ксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазе (XGPRT, gpt), и/или находится под контролем промотора, как определено в (i) выше; и/или
(iv) вектор дополнительно несет один или более иных регуляторных элементов, предпочтительно выбранных из сайтов сплайсинга, сайтов рекомбинации, сайтов полиА, энхансеров, сайтов мультиклонирования и прокариотических последовательностей плазмид.
4. Способ по п.3, в котором вектор трансфекции несет промотор CMV, ген гигромицина, последовательность полиA и представляющий интерес ген и предпочтительно происходящий из вектора пкДНК3.1, имеющего последовательность SEQ ID NO:4 или 5.
5. Способ по п.1 или 2, в котором иммортализованная клеточная линия человека
(i) способна быть трансфицирована и культивироваться в бессывороточных условиях; и/или
(ii) интегрирует аденовирусные последовательности в свой геном; и/или
(iii) выбрана из группы клеток почек, мочевого пузыря, печени, легких, сердечной мышцы, гладкой мышцы, яичников и желудочно-кишечного тракта, предпочтительно клеточной линии почек человека; и/или
(iv) не способна экспрессировать прионный белок человека.
6. Способ по п.5, в котором клетки почек представляют собой фетальные клетки почек человека, предпочтительно фетальные клетки почек человека, выбранные из клеток 293 (ATCC CRL-1573; DSM ACC 305), клеток 293T (DSM ACC 2494), клеток FreeStyle 293 (клетки 293F; Invitrogen R79007), предпочтительно клетки 293F (фирма Invitrogen R79007).
7. Способ по п.6, в котором клеточная линия представляет собой 293F, а вектор трансфекции происходит от пкДНК3.1, вектор предпочтительно кодирует фактор IX свертывания крови человека, представленный п.о. 939-2324 SEQ ID NO:l, A1AT человека кодируется п.о. 973-2259 SEQ ID NO:2, фактор VIII дикого типа человека, представленный в SEQ ID NO:9, или фактор VIII человека с делецией B-домена, показанный в SEQ ID NO:3, FVII/FVIIa, G-CSF, включая G-CSFb, показанный в SEQ ID NO:27, или фактор фон Виллебранда.
8. Способ по п.1 или 2, в котором бессывороточная трансфекция проводится в суспензионной культуре без сыворотки с катионным трансфекционным агентом или фосфатом кальция, предпочтительно с липофектамином 2000 CD (Invitrogen).
9. Способ по п.1 или 2, который дополнительно включает отбор стабильно трансфицированных клеток предпочтительно по продуктивности, активности и качеству продуцированного рекомбинантного белка.
10. Стабильно трансфицированная иммортализованная клеточная линия человека, получаемая способом по пп.1-9.
11. Клеточная линия по п.10, получаемая способом по пп.4-9, предпочтительно клеточная линия представляет собой 293F, а вектор трансфекции происходит от пкДНК3.1.
12. Способ рекомбинантной продукции целевого белка человека, или его производного, или мутанта, который включает культивирование иммортализованной клеточной линии человека, определенной в п.10 или 11.
13. Способ по п.12, в котором целевой белок человека представляет собой фактор IX свертывания крови человека, показанный п.о. 939-2324 SEQ ID NO:l, A1AT человека, кодируемый п.о. 973-2259 SEQ ID NO:2, фактор VIII дикого типа человека, показанный в SEQ ID NO:9, или фактор VIII человека с делецией B-домена, показанный в SEQ ID NO:3, FVII/FVIIa, G-CSF, включая G-CSFb, показанную в SEQ ID NO:27, или фактор фон Виллебранда.
14. Способ по п.12 или 13, который дополнительно включает стадии концентрирования рекомбинантного белка человека из культурального бульона, и/или очистки белка, и/или удаления прионов.
15. Способ по п.12 или 13, в котором продукция белка человека осуществляется в бессывороточных условиях.
16. Вектор трансфекции, содержащий начало репликации и последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую ген, кодирующий целевой белок человека, или его производное, или мутант, как определено в пп.1-4.
17. Вектор трансфекции по п.16, который представляет собой вектор пкДНК3.1, содержащий ген, кодирующий целевой белок, выбранный из группы, состоящей из белка фактора IX свертывания крови человека, A1AT человека, фактора VIII свертывания крови человека, включая его дикий тип и мутанты с делецией B-домена, G-CSF, включая его формы a, b и c, FVII/VIIa, включая его формы a и b, и vWF, где предпочтительно указанный вектор трансфекции имеет последовательность нуклеиновой кислоты, показанную в SEQ ID NO:1, 2, 3 или 22.