Способ диагностики гипотрофии телят (Bos taurus) на основе анализа экспрессии гена провоспалительного цитокина интерлейкина IL1α
METHOD FOR DIAGNOSIS OF CALF MALNUTRITION (BOS TAURUS) BASED ON ANALYSING EXPRESSION OF PRO-INFLAMMATORY CYTOKINE GENE OF INTERLEUKIN IL1Α

Настоящее изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для диагностики гипотрофии телят (Bos taurus).
Среди болезней незаразной этиологии гипотрофии принадлежит особая роль, так как она является широко распространенным заболеванием телят, поросят, ягнят и других видов животных, связанным с нарушением развития и роста их в антенатальном периоде. Экономические потери от данной патологии складываются из гибели молодняка, замедления роста, потерь племенных качеств, ухудшения качества мяса животных и снижения окупаемости кормов (Анохин Б.М. Причины болезней молодняка, диагностика, меры борьбы.- М.: МЭИНФ, 2002. - 191 с; Самохин В.Т. Оптимизация метаболического статуса коров-матерей - основа профилактики неонатальных болезней телят / В.Т. Самохин // Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях: матер, международ. конф., Воронеж, 23-25 сентября 2002 г. - Воронеж: ВГАУ, 2002. - С. 37-38.). Телята-гипотрофики отличаются морфологическим и функциональным недоразвитием различных органов и их систем. Такие животные имеют вес в 1,5-2 раза ниже, чем сверстники. У таких телят помимо уменьшения концентрации гемоглобина и эритроцитов, белков плазмы крови, расстройства водно-электролитного обмена, нарушения нейроэндокринной регуляции резко уменьшается иммунобиологическая реактивность организма и сопротивляемость его к инфекционным заболеваниям. При гипотрофии понижены защитная функция кожи и слизистых оболочек, барьерная роль лимфатических узлов, активность системы фагоцитирующих микро- и макрофагов, субстанций, оказывающих бактерицидное и противовирусное действие - пропердина, лизоцима, комплемента, интерферона (Бояренцев Л.Е. Иммуномодулирующая активность лигаверина при гипотрофии телят / Л.Е. Бояренцев // Ветеринария. - 2002. - №9. - С. 41-44). Гипотрофия-патология плода, проявляющаяся нарушением (сдерживанием, торможением) его развития и возникающая как патофизиологическая реакция на недостаточное снабжение плода кислородом, питательными и биологическими активными веществами или при нарушении их усвояемости. Гипотрофия отражает понятие «физиологическая незрелость» новорожденных. Гипохромная анемия у телят - это патологическое состояние, характеризующееся гипохромией эритроцитов, низким их содержанием, преобладанием микроцитов, анемичностью различной степени видимых слизистых оболочек, анорексией. Анемию предлагается рассматривать как патологию транссиндромальной коморбидной гипотрофии, патогенетически связанную и взаимоотягощающую. Коморбидный профиль заболеваемости с мультисистемной полиорганной недостаточностью является одним из наиболее опасных рисков нарушения гармоничного моделирования организма молодняка сельскохозяйственных животных, вероятность проявления которого возрастает с понижением адаптивности технологий / Д.А. Саврасов / / Актуальные вопросы ветеринарной биологии. 2018. №1 (37). С. 7-10. В результате у телят-гипотрофиков легко развиваются заболевания органов дыхательной системы и желудочно-кишечного тракта, даже вызванные условно-патогенными микроорганизмами. При этой патологии по своим физическим параметрам плод не соответствует размерам, соответствующим для данного срока беременности. Отставание в развитие плода связано с воздействием на материнский организм многообразных стресс-факторов экзогенного и эндогенного происхождения. Ранняя диагностика этого заболевания телят затруднена вследствие широкого набора признаков, характеризующих это состояние. Необходим поиск маркера, который бы отражал общее состояние телят больных гипотрофией.
Известен способ ранней диагностики внутриутробной задержки развития эмбриона и плода у коров (RU 2539015 С1). В способе на ранних сроках гестации проводят ультразвуковое сканирование как эмбриона, так и плода у коров, на основании результатов которого определяют фетометрические показатели эмбриона и плода. В случае выявления на 38-40 дни гестации длины эмбриона в пределах 12-16 мм и диаметра корпуса - 7-9 мм, диагностируют синдром задержки развития эмбриона у коров. В случае выявления на 60-65 дни длины плода в пределах 25-45 мм и диаметра корпуса - 12-16 мм диагностируют синдром задержки развития плода у коров. Способ позволяет на ранних стадиях гестации провести диагностику синдрома внутриутробной задержки развития эмбриона и плода у коров для предотвращения внутриутробной гибели эмбриона, антенатальной гипотрофии плода, интра- и неонатальных болезней у плода и новорожденных телят, родовой и послеродовой патологии у коров-матерей.
Известен способ прогнозирования риска развития гипотрофии у детей, родившихся в сроке сверхранних преждевременных родов, к скорригированному возрасту 6 месяцев (патент RU 2698564 С1). В способе определяют срок восстановления массы тела при рождении (в сутках). Учитывают наличие или отсутствие тяжелой преэклампсии при беременности у женщины. Вычисляют прогностический индекс X по оригинальной расчетной формуле. Способ не применим для прогнозирования гипотрофии у телят.
Известен способ диагностики гипотрофии у телят на основе клинико-гематологических данных и показателей статей туловища (Гипотрофия телят: Диагностика. Профилактика. Лечение. Саврасов Д.А. LAP LAMBERT Academic Publishing. Стр. 77-91), взятый за прототип. В способе определяют физические свойства крови, морфологические свойства крови, биохимические показатели крови, габитус животного.
Недостатком способа является необходимость применения широкого набора методов для идентификации гипотрофии, которые существенно увеличивают как время и трудоемкость анализа, так и стоимость анализа.
Технический результат предлагаемого изобретения - оценка риска развития гипотрофии у телят в течение 4-5 часов после взятие крови.
-ΔΔct
-ΔΔct
Для достижения технического результата в способе диагностики гипотрофии телят, согласно изобретению, из отобранной крови теленка выделяют тотальную РНК, проводят последовательно обратную транскрипцию для получения кДНК, ПЦР в реальном времени с полученной кДНК, рассчитывают экспрессию гена интерлейкина 1α по отношении к экспрессии гена домашнего хозяйства по показателю 2, где ΔΔCt = ΔCt (теленок с подозрением на гипотрофию) - ΔCt (здоровый теленок); ΔCt = Ct (ген интерлейкина 1α) - Ct (ген β-актина) и в случае полученного значения 2 ≥ 1.7 у теленка с вероятностью в 90% диагностируют гипотрофию. Для амплификации участка гена IL1α используют праймеры SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, для амплификации гена домашнего хозяйства (β-актин) используют праймеры SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, а в качестве интеркалирующего красителя в ПЦР используют SYBR Green.
В ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии» были проведены исследования по изучению экспрессии генов цитокинов у телят с гипотрофией. В ходе исследований было выявлено, что у 90% телят с гипотрофией (9 телят из 10) на 2-3 день наблюдалось повышение не менее чем в 1.7 раза экспрессии гена провоспалительного цитокина интерлейкина 1α (IL1α) по отношению к экспрессии этого гена у здоровых телят. Таким образом, данный признак можно использовать в качестве диагностического при оценке рисков развития гипотрофии.
В представленном способе гипотрофию определяют с помощью анализа экспрессии гена провоспалительного цитокина IL1α. Способ осуществляется следующим образом.
-ΔΔct
-ΔΔct
У теленка, из отобранной крови немедленно (в течение 30 минут) осуществляют выделение тотальной РНК любым доступным способ (если изолировать РНК из крови сразу невозможно, то кровь необходимо хранить при -20°С не более двух недель). После чего проводят обратную транскрипцию для получения кДНК. Затем проводят ПЦР в реальном времени с полученной кДНК при этом для амплификации участка гена IL1α используют праймеры SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. Для амплификации гена домашнего хозяйства (β-актин) используют праймеры: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4. В качестве интеркалирующего красителя в ПЦР используют SYBR Green. ПЦР проводят по следующему протоколу: первичная денатурация 95°С - 3 минуты; 38 циклов, включающих денатурацию при 95°С в течение 30 секунд, отжиг праймеров при 58°С в течение 30 секунд, элонгацию цепи при 72°С в течение 30 сек, регистрацию сигнала. Расчет экспрессии гена интерлейкина 1α по отношении к экспрессии гена домашнего хозяйства производится на основе расчета показателя 2, где ΔΔCt = ΔCt (теленок с подозрением на гипотрофию) - ΔCt (здоровый теленок); ΔCt = Ct (ген интерлейкина 1α) - Ct (ген β-актина). Для постановки диагноза необходимо иметь кДНК из крови здоровых телят возрастом 2-3 суток, которая может быть получена ранее и храниться в течение года при -20°С. Если при расчете по формуле 2 было получено значение ≥ 1.7, то теленок с вероятностью в 80% имеет гипотрофию.
Пример.
Из крови теленка возрастом 3 суток была получена кровь, из которой немедленно была изолирована РНК с помощью коммерчески доступного набора «РНК-ЭКСТРАН» (Синтол, Москва) согласно приложенной инструкции. После выделения РНК была проведена обратная транскрипция с использованием набора MMLV RT (Евроген, Россия) согласно приложенной инструкции. Количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени проводили на приборе CFX96 Real-Time PCR Detection System («BioRad», США) с использованием смеси qPCRmix-HS SYBR+LowROX («Евроген», Россия) согласно следующему протоколу: первичная денатурация 95°С - 3 минуты; 38 циклов, включающих денатурацию при 95°С в течение 30 секунд, отжиг праймеров при 58°С в течение 30 секунд, элонгацию цепи при 72°С в течение 30 сек, регистрацию сигнала. В пробирке смешивали: 16 мкл стерильной воды, 5 мкл qPCRmix-HS SYBR+LowROX («Евроген», Россия), 1 мкл праймера SEQ ID NO: 1 в концентрации 5 мкМ, 1 мкл праймера SEQ ID NO: 2 в концентрации 5 мкМ, 2 мкл полученной кДНК. В качестве контроля использовали кДНК из здорового теленка возрастом 3 суток. В ходе проведения ПЦР были получены следующие значения Ct:
Здоровый теленок: IL1α - 31.28, актин - 25.40;
Теленок с подозрением на гипотрофию: IL1α - 29.01, актин - 24.84.
Далее был оценен уровень экспрессии гена IL1α:
ΔCt (здоровый теленок) = 31.28 - 25.40 = 5.88; ΔCt (теленок с подозрением на гипотрофию) = 29.01 - 24.84 = 4.17;
ΔΔCt = 4.17 - 5.88 = -1.71;
-ΔΔct
-(-1.71)
2 = 2 = 3.27
Таким образом, экспрессия гена IL1α в крови теленка с подозрением на гипотрофию была в 3,27 раза выше, чем в крови здорового теленка, что свидетельствует о том, что теленок имеющий подозрение на гипотрофию с 90% вероятностью имеет данное патологическое состояние, поскольку уровень экспрессии гена IL1α был выше более чем в 1.7 раза по сравнению с экспрессией этого гена у здорового теленка.
--->
Перечень последовательностей
<110>ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии
<120>Праймеры для исследования уровня экспрессии гена IL1α
<130>2020
<160>4
<210>1
<211>20
<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<400>1
tcttgggagg actgaggcta 20
<210>2
<211>20
<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<400>2
cagcagcagc aaactgagac 20
<210>3
<211>20
<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<400>3
ctcttccagc cttccttcct 20
<210>4
<211>20
<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<400>4
agcactgtgt tggcgtacag 20
<---