Влияние перевиваемой опухоли на функциональную активность генома клеток крови и костного мозга в организме-опухоленосителе

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ EXPERIMENTAL ИССЛЕДОВАНИЯ INVESTIGATIONS

Коллектив авторов, 1998 УДК 616.006.04:575.113

В. И. Минаев, И. П. Шабалкии, А. С. Ягу бое,

П. И. Шабалкии

ВЛИЯНИЕ ПЕРЕВИВАЕМОЙ ОПУХОЛИ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ГЕНОМА КЛЕТОК КРОВИ И КОСТНОГО МОЗГА В ОРГАНИЗМЕ-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕ

Лаборатория молекулярно-биологических методов исследования

Эффективность лечения острого лейкоза во многом определяется чувствительностью лейкемической популяции к терапии, а также ранней диагностикой и прогнозом течения заболевания. Чтобы получить точную информацию о характере болезни пациента, необходимо использовать для различных аналитических методов биоматериал больного. Например, для цитологической оценки костномозгового кроветворения, как правило, используют мазки костного мозга, полученные путем прижизненного пунктирования грудины. Однако в последнее время в клинической практике лечения лейкоза наметилась тенденция брать в качестве биоматериала для анализа в основном периферическую кровь больного. Несмотря на то что гуманность данного способа взятия биопроб по сравнению с пунктированием очевидна, анализ мазков крови как одного из главных цитологических показателей при терапии лейкозов вызывает сомнение. Известно, что костный мозг — центр кроветворения, продуцирующий различные форменные элементы крови, ответственные за выполнение определенных функций в организме. Проникая через костномозговой барьер в кровеносное русло, они выполняют какое-то время свою работу, после чего погибают. Обычно в единицу времени «рождается» и «погибает» одинаковое число клеток крови, что и является основным кинетическим законом нормального кроветворения. Однако при острых лейкозах часто наблюдается дисбаланс этих процессов: трансформированные клетки в течение какого-то времени задерживаются костномозговым барьером в костном мозге, что влияет на клинические проявления и течение лейкоза [1]. Это значит, что если анализировать динамику течения заболевания только по периферической

V.I.Minayev, l.P.Shabalkin, A.S.Yagubov,

P.I.Shabalkin

TRANSPLANTED TUMOR EFFECT ON FUNCTIONAL ACTIVITY OF BLOOD AND BONE MARROW CELL GENOME IN TUMOR-BEARING BODY

Laboratory for Molecular Biological Study

Treatment efficacy in acute leukemia to a high degree depends upon leukemic population response to therapy, early diagnosis and accurate prognosis of disease course. Analysis of patients’ biological material is needed to have accurate information about the disease. For instance, cytological study of bone marrow hemopoiesis in leukemic patients is performed by smears from sternum biopsy aspirates, though it becomes a common practice to use peripheral blood instead of bone marrow. In spite of the undoubted convenience of the use of such material, blood analysis findings may hardly be considered the main cytological parameters to evaluate efficacy of therapy in leukemia. The bone marrow is the center of hemopoiesis that produces formed elements of blood responsible for certain functions in the body. They penetrate from bone marrow into circulation to perform their duties for a certain time and to die. As usual, equal numbers of blood cells are born and die in a time unit which is the basic kinetic law of normal hemopoiesis. There is a dysbalance of these processes in leukemia, i.e. transformed cells are retained for some time in bone marrow which influences disease manifestation and course [1]. This means that if leukemia diagnosis and monitoring are performed by peripheral blood only, there is always a period of time during which leukemia proceeds unnoticeable for the clinician because the transformed cells have not yet overcome the bone marrow barrier. We attempted to study the effect of transplanted leukemic populations on blood and bone marrow cells of the tumor bearing body.

Materials and Methods. We administered 6xl06 tumor cells (leukemia L-1210) and lxlO6 cells (leukemia p-388) respectively in 0.2 and 0.3 ml of medium 199 intraperitoneally to DBA mice. Analysis was

Экспериментальные исследования

крови, то в течение какого-то промежутка времени развитие лейкоза может протекать незаметно для клинициста, так как трансформированные клетки будут отсутствовать в крови. Высказанная точка зрения побудила нас проверить экспериментальным путем влияние перевиваемых популяций лейкозных клеток на клетки крови и костного мозга организма-опухоленосителя.

Материал и методы. Исследования были проведены на мышах линии ЭВА, которым внутрибрюшинно вводили 6 • 106 опухолевых клеток (лейкоз Ь-1210) и 1 • 106 клеток (лейкоз р-388) в 0,2 и 0,3 мл среды 199 соответственно. Анализировали мазки крови и костного мозга животных-опухоленосителей (опыт) и интактных животных (контроль). В каждом эксперименте использовано по 10 животных (6 — опыт; 4 — контроль). Препараты обрабатывали по описанной ранее методике [3]. В эксперименте использовали метод оценки функциональной активности генома клетки [3, 6], основанный на цитофотометрическом анализе популяции клеток при окраске ядер по Фельгену (окраска на ДНК) и нафтоловым желтым 5 (окраска на гистоны). В качестве критерия оценки функционального состояния клеток предложен показатель Кфаген — коэффициент функциональной активности генома клетки, который выведен из отношения величин гистон/ДНК после определения оптической плотности окрашенного ядра. Так как гистоны участвуют в изменении функциональной активности генома клетки [2, 8], то коэффициент дает возможность изучить количественный состав популяции клеток, находящихся по функциональной активности своего генома в том или ином состоянии. На основе полученных данных строили гистограммы распределения клеток в зависимости от значений Кфаген. Для оценки степени отклонения исследуемой популяции органа/ткани животного-опухоленосителя от контроля использован показатель С, выраженный в процентах. Данный показатель определяли, исходя из площади гистограммы опыта и площади гистограммы контроля при одинаковом количестве проанализированных клеток. Так как площадь гистограммы оценивается как сумма площадей прямоугольников, одна из сторон которых одинакова для опыта и контроля (один и тот же размер шага на оси абсцисс координат гистограмм, условно принятый за единицу), то фактически общий показатель С складывается из суммы показателей (С1 и С2), где О — количество клеток опыта С конкретной величиной Кфаген, превышающих число клеток контроля с такими же значениями Кфаген в пределах гистограммы контроля; Сг — число клеток опыта, величина Кфаген которых не имеет аналогичных значений в контроле.

Все данные были статистически обработаны с использованием критерия Стыодента при р< 0,05.

Результаты и обсуждение. Из данных таблицы следует, что как лейкоз Ь-1210, так и лейкоз р-388 оказывает влияние на популяцию клеток костного мозга живот-ных-опухоленосителей. Это выражается в статистически значимом различии между опытом и контролем по среднему значению величины Кфаген. Так, если у интактных животных величина Кфаген костного мозга имеет значение: при Ь-1210 — 0,91(0,88-5-0,91), а при лейкозе р-388 — 1,38(1,30-8-1,46), то у животных-опухоленосителей значение Кфаген костного мозга возрастает до величины 1,21(1,17-5-1,25) при лейкозе Ь-1210 и до 1,73(1,68-^1,78) при лейкозе р-388. Более того, различие по показателю

С, т. е. по процентному числу клеток, отклоняющихся от нормы ПО величине Кфаген, в популяции клеток костного мозга животных-опухоленосителей имеет величину, равную 69% (Ь-1210) и 45% (р-388), причем для популяции клеток костного мозга животных-опухоленосителей характерно увеличение в ней количества клеток с высокими значениями Кфаген. Например, при лейкозе р-388 (см. рисунок) в пределах гистограммы нормы в разрядах 1,4—2,1 доля клеток костного мозга животных-опухоле-носителей на 39% превышает процентное число клеток

performed in blood and bone marrow smears from tumor-bearing (test) and intact animals (control). Ten animals (6 test and 4 control) were used in every experiment. The specimens were prepared as described previously [3]. The analysis was performed by evaluation of cell genome functional activity [3,6]. The method implicates cytophotometric analysis of cell populations using Foelgen (DNA) and naphthol yellow (his-tone) staining. Coefficient of cell genome functional activity (Cragen) was used as a criterion of evaluation which was defined as ratio of his-tone/DNA optical density values. Since the histones contribute to alteration of cell genome functional activity [2,8], the coefficient is a useful tool to make a quantitative evaluation of cell population fractions in different functional state. Bar diagrams of cell distribution with respect to Cragen were constructed basing on the analysis findings. To measure deviation of the tested population in a tumor-bearer from that in a normal animal we used a C percentage parameter. This parameter was calculated by areas of test and control diagrams for equal cell numbers. Since the diagram area is the total of areas of test and control rectangles with one equal side (the same step size on the x axis conventionally taken as unit), the C is the sum of Cj and C2, where C| is the number of test cells with a certain Cfagen value in excess of the number of control cells with the same Cragen within the control diagram; Cl is the number of test cells having Cragen values not found in the control.

Statistical analysis of data was performed using the Student test at /><0.05.

Results and Discussion. The tabulated results of our study show that leukemias L-1210 and p-388 influenced bone marrow cell populations from tumor-bearing animals. The influence manifested itself as a statistically significant difference between the test and control specimens in mean Cfagen values. Intact animals presented with bone marrow Cfagen 0.91 (0.88-0.91) in L-1210 and 1.38 (1.30-1.46) in p-388 versus 1.21 (1.17-1.25) in L-1210 and 1.73 (1.68-1.78) in p-388. Besides, the difference in C, i.e. percentages of cells with abnormal Cfagen in bone-marrow cell population from tumor-bearing mice were 69% (L-1210) and 45% (p-388) and the bone marrow cell populations from tumor-bearers presented with a marked increase in the number of cells with high Cfagen values. For instance, for leukemia p-388 (see the figure) the number of bone marrow cells from tumor-bearing animals was 39% higher as compared to normal cells in positions 1.4-2.1 within the normal diagram. This is suggestive of bone marrow cell transformation due to changed gene expression in normal cells under the effect of tumor cells in tumor-bearing mice [4,5,7]. It also seems that the change in cell genome functional activity as assessed by Cfagen is a reflection of this process. The following observation is of interest: the difference between the control and test specimens in Cfagen discovered by analysis of peripheral blood was not statistically significant both for L-1210 and p-388. E.B.Vladimirskaya and N.A.Torubarova [1] related this phenomenon to selective retention of dividing transformed cells in bone marrow. The last circumstance seems to account for the absence of differences in Cfagen values between the test and control peripheral blood specimens. Interestingly that the difference in Cfagen between blood and bone marrow cells from normal mice was not statistically significant which renders Cfagen to be a characteristic of normal hemopoiesis.

In summary, symptoms of the effect of leukemic cell population on hemopoiesis are first of all related to changes in bone marrow cell genome functional activity in the tumor-bearing body. Peripheral blood is not rec-

Experimental investigations

нормы. Это, по-видимому, говорит о том, что под влиянием опухолевых клеток в популяции клеток костного мозга животного-опухоленосителя происходит трансформация клеток, обусловленная изменением в нормальных клетках экспрессии генов [4, 5, 7]. Отражением этого процесса, очевидно, и является обнаруженное нами по критерию Кфаген изменение функциональной активности генома клеток в костном мозге животиых-опу-холеносителей. Среди других полученных нами данных обращает на себя внимание одно обстоятельство: при анализе периферической крови по показателю Кфаген различие между контролем и опытом статистически недостоверно как в эксперименте с перевиваемым лейкозом Ь-1210, так и с лейкозом р-388. По мнению Е. Б. Владимирской и Н. А. Торубаровой [1], это связано с избирательной задержкой в костном мозге делящихся трансформированных клеток. Последнее обстоятельство, по-видимому, и определяет отмеченное выше отсутствие в периферической крови различий между контролем и опытом по величине Кфаген. Интересно, что в норме различие по Кфаген между клетками крови и костного мозга статистически недостоверно, что характеризует критерий Кфаген как показатель, отражающий в организме закон нормального кроветворения. На основании представленных данных можно заключить, что симптомы, свидетельствующие о влиянии популяции лейкозных клеток на систему кроветворения, связаны

Таблица Table

Влияние популяции опухолевых клеток на изменение

величины Кфаген и показателя С в клетках крови

и костного мозга мыши

Effect of tumor cell population on Cfagen

and С in murine blood and bone marrow cells

Тип опухоли Величина Кфаген

кровь костный мозг

Перевиваемый

лейкоз L-1210:

Transplantable

leukemia L-1210:

контроль

control 0,93

опыт/test 0,94

С/С 14 69

Перевиваемый

лейкоз р-388:

Transplantable

leukemia р-388:

контроль

control 1,28

опыт/test 1,34

С/С 18 45

Tumor type blood bone marrow

Cfagen

A

x

X X X X X X

X XX X XX X X X X X

X X X

X X X

X X X

X X X

 X X

  X X X

  X  X X

     X

«xxx >

1,5 1,7 1,9 2,1 2,3 2,5

Рисунок. Влияние перевиваемого лейкоза р-388 на распределение КЛеТОК КОСТНОГО МОЗГа МЫШИ ПО ВеЛИЧИНе Кфаген.

По оси абсцисс — значения Кфаген; по оси ординат — частота распределения клеток с определенным значением Кфаген.

Кружки — костный мозг интактных животных; крестики — костный мозг животных-опухоленосителей.

Figure. Effect of transplantable leukemia p-388 on bone marrow cell distribution with respect to Cfagen.

Numerals on the x axis show Cfagen values, numerals on the у axis show the number of cells.

Circles represent bone marrow from intact mice, crosses represent bone marrow from tumor-bearing mice.

ommended for analysis of therapy efficacy and acute leukemia course due to low diagnostic and prognostic sensitivity as compared to bone marrow.

в первую очередь с изменением функциональной активности генома клеток костного мозга организма-опухоле-носителя. Периферическая кровь из-за низкой диагностической и прогностической чувствительности менее пригодна дня оценки эффективности терапии и динамики течения острого лейкоза, чем костный мозг.

ЛИТЕРА ТУРА /REFERENCES

1. Владимирская Е. Б., Торубарова Н. А. Острые лейкозы и гипоплазии кроветворения у детей. — М., 1985.

2. Георгиев Г. П. Гены высших организмов и их экспрессия. — М., 1989.

3. Шабалкин И. П., Ягубов А. С. //Вестн. ОНЦ РАМН. — 1995. — № 4.— С. 14—17.

4. Шабалкин И. П. // Там же. — 1997. — № 2. — С. 59—63.

5. Шабалкин И. П., Ягубов А. С. //Там же. — № 3. — С. 25—33.

6. Шабалкин И. П. //Цитология. — 1998.—№ 1. — С. 107—116.

7. Шелепов В. П., Моисеев В. J1., Чекулаев В. А. и др. //Там же. — 1988. — № 9.— С. 1152.

8. Шестопалов Б. В. //Молекул, биол. — 1988. — Т. 22. — С. 331—337.

Поступила 26.02.98 / Submitted 26.02.98

15

10

0,7 0,9 1,1 1,3