БАКТЕРИАЛЬНЫЙ СЕКРЕТОМ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЛЕЧЕНИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ КОЖИ
BACTERIAL SECRET FOR USE IN TREATMENT OF SKIN DAMAGES

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к новому применению бактериального секретома в области лечения повреждений кожи и, более конкретно, заживления ран. Данное изобретение также относится к косметическим или дерматологическим композициям, содержащим такой бактериальный секретом в качестве активного агента.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Заживление ран представляет собой сложный и динамичный биологический процесс, который включает взаимодействие многих местных и системных факторов при репарации нормальной ткани. Заживление прогрессирует в трех взаимозависимых фазах: гемостаз и воспаление, пролиферация и ремоделирование (General principles of wound healing. Witte MB, Barbul A. Surg Clin North Am. 1997 June; 77(3):509-28.). Пролиферация включает три явно наблюдаемых процесса: грануляция, сокращение и повторная эпителизация.
Во время грануляции наблюдается то, что клетки, участвующие в процессе репарации, пролиферируют и мигрируют к раневому ложу. Например, там находятся макрофаги, фибробласты и эндотелиальные клетки. Макрофаги постоянно высвобождают хемотаксические факторы и факторы роста. Фибробласты строят новый клеточный матрикс, необходимый для роста клеток в основании раны. Это образование каркаса поддерживает миграцию клеток. Наконец, эндотелиальные клетки запускают образование почек сосудов, которые будут основывать новые капилляры, восстанавливая, посредством этого, перфузию и обеспечивая поставку кислорода и питательных веществ, важных для метаболической активности клеток в ране.
Сокращение раны представляет собой механизм уменьшения размера раны, и фибробласты играют ведущую роль в данном сокращении.
Повторная эпителизация заключается в регенерации эпидермиса, который покрывает рану с образованием эффективного барьера против внешней среды, способного становиться пигментированным и восстанавливать его сенсорные и иммунные функции. Она, таким образом, включает клеточные процессы миграции и пролиферации кератиноцитов, но также дифференциацию этого нового эпителия и восстановление базальной мембраны, соединяющей дерму и эпидермис. Когда миграция базальных клеток к центру раны обеспечивает встречу краев раны, происходит волна клеточного митоза для заполнения пространств, оставленных миграцией, и для предоставления клеток для эпителиальной ткани в трехмерной регенерации.
Стадии пролиферации клеток кератиноцитов, фибробластов и эндотелиальных клеток могут рассматриваться как одно из функциональных явлений, демонстрирующих заживляющую активность активного агента. Повышенная пролиферация фибробластов участвовала бы в заживлении глубокой раны (достигающей дермы), тогда как повышенная пролиферация кератиноцитов участвовала бы в повторной эпителизации.
Заживление также накладывает косметические проблемы при дефектах заживления или плохом заживлении, вызывает некрасивые и, главным образом, постоянные видимые отметины, такие как толстые шрамы или келоиды.
Все косметические и дерматологические хирургические процедуры, а также патологические и немедицинские травматические повреждения (царапины, порезы, отскабливания, ожоги) оставляют шрамы. Одним из главных навыков пластических хирургов является контроль образования шрамов.
Например, в течение многих лет против ожоговых рубцов использовали давление, и недавно его объединили с силиконовым полотном, укладываемым непосредственно на рубец.
Сохраняется потребность в предложении новых композиций для стимулирования заживления поврежденной кожи и для улучшения косметического вида рубцов.
Впервые и неожиданно заявитель показал полезные свойства в регенерации ткани и в заживлении повреждений кожи бактериального секретома, полученного из бактериального штамма (или бактерии) LMB64, выделенного из грунтовой воды.
Данная бактерия была описана заявителем в патентной заявке WO 2012/085182. Более конкретно, данная бактерия была описана, как таковая, за ее противовоспалительные активности. Даже более конкретно, были описаны и проиллюстрированы примерами экстракты, названные S0, Е0 и ES0, состоящие из супернатанта культуры, отделенного от биомассы - биомассы лизированных клеток, и супернатант после инкубации культуры при основном рН в течение нескольких часов соответственно. Анализировали только фармакологические активности экстрактов Е0 и ES0, и было показано то, что данные экстракты Е0 и ES0 способны индуцировать цитокины и созревание клеток Лангерганса (для Е0), а также активацию TLR2 (Толл-подобный рецептор 2)/TLR4/TLR5, антагонистов PAR, и индукцию противомикробных пептидов (для ES0). Данные результаты наводили на мысль о применении таких экстрактов в лечении воспалительных заболеваний, таких как прурит, псориаз, экзема или атопический дерматит.
Вопреки всем ожиданиям, заявитель показывает в данном документе то, что секретом, состоящий не из тех же самых компонентов, что вышеупомянутые экстракты ES0 и Е0, но, главным образом, состоящий из биомолекул, секретируемых и выводящихся наружу в супернатант культуры указанной бактерией LMB64, имеет неожиданные заживляющие свойства.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно первому воплощению (1) настоящее изобретение относится к бактериальному секретому непатогенной грамотрицательной бактерии, принадлежащей к классу Betaproteobacteria, подсемейству Neisseriaceae, содержащей 16S рРНК, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 или любую последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 1, для применения в лечении повреждений кожи,
причем указанный секретом вероятно получают или получают способом, включающим следующие стадии:
- а) культивирование указанной бактерии в культуральной среде и при подходящих условиях для ее роста,
- б) разделение жидкости/твердого вещества и выделение жидкой фазы,
- в) получение указанного секретома, содержащего биомолекулы, секретируемые указанной бактерией в жидкую фазу.
Согласно второму воплощению настоящего изобретения бактериальный секретом для применения в лечении повреждений кожи согласно данному изобретению отличается тем, что к жидкой фазе, полученной на стадии б), добавляют основной буфер, и что полученную буферизованную жидкую фазу возможно оставляют в контакте в течение 1-7 часов предпочтительно при температуре от 1 до 6°С.
Бактерия LMB64 была охарактеризована и определена как принадлежащая к классу Betaproteobacteria, подсемейству Neisseriaceae и возможно новому, еще не определенному роду. Анализ последовательности гена, кодирующего 16S рибосомальную РНК (рРНК), сделал возможным помещение данной бактерии близко к родам Chromobacterium, Paludimonas, Lutelia и Glubenkiana, с которыми она имеет 95%-ное сходство последовательности.
Эта непатогенная бактерия является грамотрицательной и была выделена из грунтовой воды.
Более конкретно, бактерия LMB64 является палочковидной с длиной грубо 2,3 мкм (плюс/минус 0,3) и шириной грубо 1,0 мкм (плюс/минус 0,1). Отличительным свойством данной бактерии является присутствие полярного жгутика.
Ген, кодирующий 16S рРНК, был почти полностью секвенирован (1487 п.н., соответствуя последовательности SEQ ID NO: 1). Бактерия LMB64 имеет кольцевую плазмиду из 10948 п.н. Данная плазмида была полностью секвенирована, и данная последовательность представлена в последовательности SEQ ID NO: 2.
Согласно другому воплощению бактерия, из которой происходит секретом по изобретению, содержит по меньшей мере одну плазмиду, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2, или любую последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2, преимущественно по меньшей мере 85%-ную, по меньшей мере 90%-ную, по меньшей мере 95%-ную, даже по меньшей мере 97%-ную и еще более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную идентичность с SEQ ID NO: 2.
Кроме того, бактерия, из которой происходит секретом, представляет собой непатогенную грамотрицательную бактерию, принадлежащую к классу Betaproteobacteria, подсемейству Neisseriaceae, причем указанная бактерия содержит 16S рРНК, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 или любую последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную, даже по меньшей мере 90%-ную, по меньшей мере 95%-ную, по меньшей мере 97%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 1, и указанная бактерия содержит по меньшей мере одну плазмиду, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2, или любую последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2, преимущественно по меньшей мере 85%-ную, по меньшей мере 90%-ную, по меньшей мере 95%-ную, даже по меньшей мере 97%-ную и еще более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2.
В качестве примера такая бактерия представлена штаммом LMB64, который был депонирован от имени заявителя в Национальную коллекцию культур микроорганизмов (CNCM), Институт Пастера, Париж, 8 апреля 2010 г. под номером I-4290.
Имея данную генотипическую информацию, объединенную с характеристиками, касающимися роста в среде, не содержащей серу, и ненитчатую природу данной бактерии, специалист в данной области не имел бы затруднений в нахождении/идентификации другой бактерии, обеспечивая получение секретома по изобретению. Такая идентификация другой бактерии, естественно, генотипически слегка отличной, но обладающей всеми фенотипическими критериями по изобретению в показателях секретома, может быть получена после селекционного исследования, которое никоим образом не является неоспоримым, и это основывается на информации, содержащейся в настоящей заявке, и которая содержится в заявке WO 2012/085182, в сочетании с общими знаниями специалиста в данной области.
В контексте настоящего изобретения «процентная доля идентичности» между двумя последовательностями нуклеиновых кислот относится к процентной доле идентичных нуклеотидов между двумя последовательностями, подлежащими сравнению, полученной после наилучшего выравнивания (оптимального выравнивания), причем данная процентная доля является чисто статистической, и различия между двумя последовательностями распределяются по всей их длине случайным образом. Сравнение последовательностей между двумя последовательностями нуклеиновых кислот обычно делается сравнением данных последовательностей после их оптимального выравнивания, где указанное сравнение можно делать на отрезок или на «окно сравнения». Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может проводиться, помимо сравнения вручную, посредством алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], посредством алгоритма локальной гомологии Needleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], посредством способа поиска сходства Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444] или посредством компьютерной программы, использующей данные алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в программном пакете Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, или программой для сравнения BLAST N или BLAST Р).
Процентная доля идентичности между двумя последовательностями нуклеиновой кислоты определяется сравнением этих двух оптимально выровненных последовательностей, где последовательность нуклеиновой кислоты, подлежащая сравнению, может включать вставки или делеции по сравнению с контрольной последовательностью для оптимального выравнивания между этими двумя последовательностями. Процентная доля идентичности рассчитывается определением числа положений, для которых нуклеотид является идентичным между двумя последовательностями, деля это число идентичных положений на общее число положений в окне сравнения и умножая полученный результат на 100 с получением процентной доли идентичности между двумя данными последовательностями.
Например, можно использовать программу BLAST - "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250), доступную на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, с параметрами по умолчанию (в частности, в отношении параметров «штраф за создание пробела»: 5 и «штраф за удлинение пробела»: 2; причем выбранной матрицей является, например, матрица «BLOSUM 62», предложенная программой). Процентная доля идентичности между двумя последовательностями, подлежащими сравнению, рассчитывается непосредственно программой. Также можно использовать другие программы, такие как программа "ALIGN" или "Megalign" (DNASTAR).
Бактерия по изобретению включает бактерию LMB64, которая содержит по меньшей мере одну плазмиду, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2, или любую последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную или 98%-ную идентичность с указанной последовательностью SEQ ID NO: 2. Другие характеристики указанной бактерии LMB64 будут подробно описаны ниже в примерах.
Кроме того, бактерия LMB64 была депонирована от имени заявителя в Национальную коллекцию культур микроорганизмов (CNCM), Институт Пастера, Париж, 8 апреля 2010 г. под номером I-4290.
Согласно другому воплощению настоящее изобретение также относится к бактериальному секретому для применения в лечении повреждений кожи согласно второму воплощению, отличающемуся тем, что основной буфер выбран из Tris буфера, аргининового буфера и их смесей.
В другом воплощении данное изобретение относится к бактериальному секретому для применения в лечении повреждений кожи согласно одному из предшествующих воплощений, отличающемуся тем, что на стадии б) после разделения жидкость/твердое вещество следует стадия б') осветления жидкой фазы или буферизованной жидкой фазы посредством фильтрования перед стадией в).
В другом воплощении данное изобретение относится к бактериальному секретому для применения в лечении повреждений кожи согласно предшествующему воплощению, отличающемуся тем, что фильтрование проводится с порогом отсечения 0,2 мкм.
Согласно другому воплощению данное изобретение также относится к бактериальному секретому для применения в лечении повреждений кожи согласно одному из предшествующих воплощений, отличающемуся тем, что указанные биомолекулы состоят из пептидов, белков и вторичных метаболитов, секретируемых указанной бактерией.
Другим воплощением настоящего изобретения также является предложение бактериального секретома для применения в лечении повреждений кожи согласно одному из предшествующих воплощений, отличающегося тем, что бактерия содержит по меньшей мере одну плазмиду, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2 или любую последовательность, имеющую по меньшей мере 80%-ную идентичность c SEQ ID NO: 2.
Согласно другому воплощению данное изобретение также относится к бактериальному секретому для применения в лечении повреждений кожи согласно одному из предшествующих воплощений, отличающемуся тем, что бактерия представляет собой бактерию, депонированную в CNCM 8 апреля 2010 г. под номером I-4290.
В общем, термин «секретом» используется для описания всех биомолекул, секретируемых и выделяемых в культуральную среду, и солюбилизируемых в данной среде клеткой, тканью или организмом. В настоящем случае необходимо понимать то, что термин «секретом» относится ко всем биомолекулам, секретируемым и выводимым наружу бактерией LMB64, и это происходит без модификации, повреждения или лизиса бактериальной клетки. Более конкретно, данные биомолекулы, главным образом, состоят из белков, пептидов и вторичных метаболитов, секретируемых и выводимых наружу бактерией в культуральную среду.
Бактерии размножаются делением надвое, т.е. каждая бактерия растет и затем делится на две дочерние клетки, разделенные разделяющей перегородкой, образованной клеточной стенкой. Во время деления ДНК и другие компоненты удваиваются. В клеточном делении участвуют разные ферментативные системы синтеза и деградации.
Бактериальный рост представляет собой упорядоченное увеличение всех компонентов бактерии. Он приводит к увеличению числа бактерий. Во время роста, с одной стороны, имеется обеднение культуральной среды питательными веществами и, с другой стороны, обогащение биомолекулами, секретируемыми и выделяемыми в культуральную среду бактерией и солюбилизируемыми в данной среде, а также побочными продуктами метаболизма.
Следует понимать то, что выражение «культуральная среда» или «среда» относится к любой среде, содержащей по меньшей мере необходимые питательные вещества для бактериального роста и размножения. Бактерии могут быть выращены в жидкой, твердой или полутвердой среде. Предпочтительно культуральная среда представляет собой жидкую среду, обеспечивающую выделение супернатанта культуры, содержащего секретом.
Подходящая культуральная среда содержит питательные вещества, которые стимулируют бактериальный рост и размножение. В общем, подходящая культуральная среда будет содержать воду, источник углерода, источник азота и соли. В качестве иллюстрации конкретная типичная культуральная среда описывается ниже в примерах.
Необходимо понимать то, что выражение «вторичные метаболиты» относится к маленьким молекулам, которые продуцирует, секретирует и выделяет в культуральную среду бактерия по изобретению, в частности, бактерия LMB64. В качестве иллюстрации, такие вторичные метаболиты могут представлять собой растворимые молекулы, такие как бактериоцины, нерибосомные пептиды, сидерофоры, липопептиды или поликетиды, или такие молекулы, как терпены, пиразины, индолы или сульфидные производные. Белки, присутствующие в секретоме, имеют размеры от 10 кДа до 100 кДа, предпочтительно от 18 кДа до 98 кДа и предпочтительно преобладающий белок, размер которого грубо составляет 38 кДа.
На практике секретом бактерии по изобретению, например и в частности, бактерии LMB64, может быть получен из культуры в культуральной среде, обеспечивающей рост, развитие и размножение бактерии (например, бактерии, описанной ниже), просто выделением супернатанта культуры, содержащего секретируемые биомолекулы, составляющие секретом по изобретению. В конкретных показателях, благодаря тому факту, что данные биомолекулы секретируются и выводятся наружу бактерией и солюбилизируются в среде, нет необходимости осуществлять стадию обработки указанных бактерий (механической или химической, индуцирующей полный или частичный лизис клеток, или высвобождение белков или компонентов стенки, мембраны или периплазматического пространства). Компоненты супернатанта культуры (далее секретом) можно выделять из нерастворимых твердых клеточных компонентов любыми способами разделения жидкости/твердого вещества. Более конкретно, посредством методик, известных специалистам в данной области, следовательно, возможно выделять жидкую фракцию, содержащую солюбилизированные биомолекулы, из твердой фракции, содержащей, главным образом, целые клетки и обломки клеток, содержащие белки поверхности и/или белки, локализованные в периплазматическом пространстве бактерии.
В качестве иллюстрации, разделение жидкости/твердого вещества можно осуществлять методикой, выбранной из, например, центрифугирования, осаждения, фильтрации, ультрафильтрации, декантации, осушения.
Предпочтительно разделение жидкости/твердого вещества проводится центрифугированием бактериальной культуры для того, чтобы разделять твердую фазу, т.е. осадок, содержащий клетки и обломки клеток; и жидкую фазу, т.е. супернатант, содержащий растворимые молекулы, т.е. секретом.
Супернатант, т.е. жидкую фазу, можно использовать как таковой или после простого фильтрования для того, чтобы удалять возможно присутствующие обломки клеток и для его стерилизации. Также может рассматриваться его концентрирование, например, посредством диафильтрации. Белки, составляющие секретом, также можно выделять посредством осаждения сульфатом аммония.
Как указано выше, способ получения бактериального секретома по изобретению отличается тем, что в жидкую фазу, полученную на стадии б), добавляют основной буфер, и что полученную буферизованную жидкую фазу возможно оставляют в контакте с таким буфером в течение 1-7 ч, в частности, при низкой температуре, предпочтительно при температуре от 1 до 6°С.
Добавление основного буфера в супернатант улучшает растворимость и/или стабильность белков и пептидов в растворе.
Предпочтительно данный основной буфер представляет собой Tris буфер или аргининовый буфер, или смесь Tris-аргинин. Предпочтительно он представляет собой Tris-аргининовый буфер.
Количество основного буфера, предпочтительно Tris-аргинина, добавленного в жидкую фазу, является таким, что полученная буферизованная жидкая фаза имеет концентрацию аргинина от 100 мМ до 500 мМ и/или концентрацию Tris от 10 мМ до 90 мМ.
рН буферизованной жидкой фазы может составлять от 8 до 12 и предпочтительно от 9 до 11.
Применение основного буфера (Tris, аргинина или Tris-аргинина) обеспечивает стабилизацию белков в растворе и избежание их агрегации на протяжении длительного периода хранения.
Предпочтительный способ культивирования бактерии по изобретению, в частности штамма LMB64, может включать три стадии.
• Первый инокулум может быть может быть получен в колбе Эрленмейера в подходящей среде, содержащей минеральные, белковые и углеводные вещества, подходящие для данной предкультуры.
• Затем получают вторую предферментационную культуру в периодическом режиме во второй среде, аналогичной или идентичной первой среде (или любой эквивалентной среде).
• Наконец, проводят ферментацию в режиме подпитки в среде, идентичной или аналогичной второй среде, для получения высокой плотности клеток.
Стадия центрифугирования затем обеспечивает удаление клеток и обломков клеток и выделение супернатанта культуры.
Данный буферизованный супернатант или буферизованную жидкую фазу можно затем осветлять фильтрованием.
Как показано выше, после стадии б) разделения жидкости/твердого вещества следует стадия б') осветления жидкой фазы или буферизованной жидкой фазы, например, фильтрованием, перед стадией в).
Фильтрование можно осуществлять любыми подходящими способами, обеспечивающими осветление жидкой фазы, или, если это применимо, буферизованной жидкой фазы. Такое осветление фильтрованием удаляет суспендированные частицы, не удаленные во время стадии разделения жидкости/твердого вещества, и направлено на получение прозрачного секретома.
Фильтрование можно проводить любыми способами фильтрации, ультрафильтрации или диафильтрации.
Преимущественно фильтрование проводится фильтрацией через фильтр или фильтр со сменным фильтрующим элементом, имеющий порог отсечения 0,4 мкм, предпочтительно 0,2 мкм. В данном случае бактериальный секретом отличается тем, что секретированные пептиды, белки и вторичные метаболиты имеют размер 0,2 мкм или меньше.
Предпочтительно можно использовать электростатически незаряженные фильтры или предфильтры для того, чтобы избежать какого-либо поглощения биомолекул, ответственных за всю или за часть активности.
Точная природа среды и разных этапов будет описана с большими подробностями в Примерах. Необходимо понимать то, что любая модификация способа, среды или последовательностей этапов, которая была бы очевидной специалисту в данной области в отношении настоящего описания, должна рассматриваться как находящаяся в пределах объема настоящей патентной заявки.
Как упомянуто выше, данное изобретение также касается, в другом воплощении, бактериального секретома для применения в лечении повреждений кожи согласно одному из предшествующих воплощений, отличающегося тем, что данные повреждения кожи выбраны из группы, состоящей из ссадин, ожогов, солнечных ожогов, царапин, порезов, соскобов, швов.
Данное изобретение также относится к бактериальному секретому для применения в лечении повреждений кожи согласно одному из предшествующих воплощений для применения в смягчении дефектов заживления.
Данное изобретение также касается, в другом воплощении, бактериального секретома для применения в лечении повреждений кожи согласно одному из предшествующих воплощений, отличающемуся тем, что данные повреждения кожи возникают после травмы, хирургического вмешательства, дерматологической процедуры или косметической медицинской процедуры.
Преимущественно данное изобретение также относится к бактериальному секретому для применения в лечении повреждений кожи согласно одному из предшествующих воплощений, отличающемуся тем, что он объединяется с солью меди или солью цинка.
В другом воплощении данное изобретение также относится к бактериальному секретому для применения в лечении повреждений кожи согласно одному из предшествующих воплощений, отличающемуся тем, что лечение повреждений кожи состоит в улучшении заживления и репарации кожи.
Данное изобретение дополнительно касается, в другом воплощении, способа косметического лечения для смягчения дефектов заживления кожи, включающего нанесение эффективного количества композиции, содержащей эффективное количество бактериального секретома, как определено в одном из предшествующих воплощений, в комбинации с косметически приемлемым эксципиентом, и приготовленной в подходящей форме для местного нанесения.
Преимущественно данное изобретение также относится к бактериальному секретому для применения в лечении дефектов заживления согласно одному из предшествующих воплощений, отличающемуся тем, что он объединяется с солью меди и/или солью цинка.
Следовательно, данное изобретение, кроме того, касается в другом воплощении применения бактериального секретома, как определено в одном из предшествующих воплощений, для смягчения косметического лечения дефектов заживления кожи. Согласно конкретному воплощению секретом по изобретению используется в комбинации с солью меди и/или солью цинка.
В другом воплощении данное изобретение относится к дерматологической композиции, содержащей бактериальный секретом, как определено в одном из предшествующих воплощений, и подходящий дерматологический эксципиент для местного нанесения. В преимущественном воплощении дерматологическая композиция дополнительно включает соль цинка и/или соль меди.
В другом воплощении данное изобретение дополнительно относится к дерматологической композиции по одному из предшествующих воплощений для применения в лечении повреждений кожи. В преимущественном воплощении дерматологическая композиция дополнительно включает соль цинка и/или соль меди.
В другом воплощении данное изобретение относится к косметической композиции, содержащей бактериальный секретом, как определено в одном из предшествующих воплощений, и подходящий косметический эксципиент для местного применения. Данная косметическая композиция может дополнительно включать соль цинка и/или соль меди.
Наконец, в другом воплощении настоящее изобретение относится к применению косметической композиции согласно предшествующему воплощению для смягчения косметического лечения дефектов заживления кожи.
Согласно одному воплощению данное изобретение относится к бактериальному секретому, как определено в одном из предшествующих воплощений, для местного применения для стимуляции пролиферации фибробластов.
Согласно одному воплощению данное изобретение относится к бактериальному секретому, как определено в одном из предшествующих воплощений, для местного применения для стимуляции пролиферации и/или миграции кератиноцитов.
Согласно одному воплощению данное изобретение относится к бактериальному секретому, как определено в одном из предшествующих воплощений, для местного применения для лечения повреждений кожи.
Согласно одному воплощению данное изобретение относится к бактериальному секретому, как определено в одном из предшествующих воплощений, для местного применения для улучшения заживления и восстановления кожи.
Данное изобретение также относится к композиции для ускорения репарации кожи для того, чтобы восстановить целостность и качество кожи, содержащей в качестве активного начала секретом, определенный в одном из предшествующих воплощений. Более преимущественно данная композиция может дополнительно включать соль меди и/или соль цинка.
Предпочтительно концентрация секретома в композиции по изобретению составляет от 0,05% до 10%. Более предпочтительно она составляет от 0,1% до 5%.
Композиция по изобретению дополнительно включает один или более чем один традиционный дерматологически и/или косметически совместимый эксципиент, известный специалисту в данной области, для того, чтобы получить композицию для местного нанесения, такой как эмульгаторы, загустители, гелеобразующие агенты, водосвязывающие агенты, растекатели, стабилизаторы, красители, отдушки и консерванты.
В настоящем изобретении подразумевается то, что выражение «дерматологически или косметически приемлемый» означает того, который является полезным в приготовлении дерматологической или косметической композиции, который обычно является безопасным, нетоксичным и ни биологически, ни иным образом нежелательным, и который является приемлемым для дерматологического или косметического применения, и, в частности, дерматологического или дермо-косметического применения, в частности, посредством местного нанесения.
Композиции по изобретению преимущественно предназначены для местного нанесения, в частности, на кожу.
Композиция по изобретению может быть получена в виде эмульсии, дисперсии или водного, или масляного лосьона.
В другом конкретном воплощении дерматологическая или косметическая композиция по изобретению включает по меньшей мере одно другое активное начало, более конкретно, по меньшей мере одно увлажняющее активное начало.
Это другое активное начало, таким образом, в частности, может быть выбрано из группы, состоящей из следующих:
• Хорошо известные заживляющие или восстановительные агенты: пантенол, мадекассосид, аллантоин, алоэ вера, мед;
• Противоинфекционные агенты: микроэлементы типа меди-цинка, мед
• Увлажнители и питающие средства: глицерин, масло ши, природные воска, гиалуроновая кислота, жирные кислоты
• Успокаивающие средства: аллантоин, бисаболол, пантенол, эноксолон
• Фильтры УФ (ультрафиолетовое излучение).
Предпочтительно второе активное начало будет представлять собой микроэлемент типа меди-цинка. В данном предпочтительном воплощении композиция по изобретению будет, таким образом, включать секретом и микроэлемент типа меди-цинка.
Как было упомянуто, дерматологическая или косметическая композиция по изобретению, содержащая секретом, может включать соль меди или соль цинка. Предпочтительно соль меди будет представлять собой сульфат меди. Преимущественно соль цинка будет выбрана из оксида цинка и сульфата цинка.
Количество сульфата меди в композиции по изобретению может варьировать от 0,05 до 0,5% масс. композиции, предпочтительно от 0,1 до 0,25% масс. композиции, более предпочтительно - грубо 0,2% масс. композиции.
Количество сульфата цинка в композиции по изобретению может варьировать от 0,05 до 0,5% масс. композиции, предпочтительно от 0,1 до 0,4% масс. композиции, более предпочтительно от 0,1 до 0,2% масс. композиции.
Количество оксида цинка в композиции по изобретению может варьировать от 0,5 до 10% масс. композиции, предпочтительно от 1 до 5% масс. композиции, более конкретно грубо от 2 до 4% масс. композиции.
В одном воплощении данного изобретения рассматривается композиция по любому из предшествующих воплощений, отличающаяся тем, что она дополнительно включает по меньшей мере одно другое активное начало, выбранное из заживляющих средств, противоинфекционных средств, увлажнителей, успокаивающих средств и их смесей. Согласно другому конкретному воплощению по меньшей мере одно другое активное начало будет выбрано из увлажнителей, заживляющих средств, успокаивающих средств и их смесей, предпочтительно увлажнителей. Такое активное начало предпочтительно будет использоваться в дерматологических композициях.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения и заживления повреждений кожи, включающему введение, предпочтительно местное, эффективного количества композиции, содержащей в качестве активного начала секретом по изобретению.
Композиции по изобретению, в частности, предназначены для ухода за кожей, имеющей устойчивые повреждения.
Повреждения кожи могут появляться после травмы или медицинских, или хирургических процедур, независимо от того, являются ли они инвазивными или неинвазивными, куративными или предназначенными для косметических целей.
Инвазивные медицинские или хирургические процедуры включают, например: хирургические процедуры (иссечение, сбривание) со швами или без, криотерапию, лазерную абляцию, умеренный или сильный химический пилинг, швы, мезотерапию или выскабливание.
Посттравматические повреждения кожи, например, после легкого наружного повреждения кожи, включают, например, порезы, царапины, отскабливания и поверхностные ожоги или солнечный ожог.
Поверхностные неинвазивные медицинские процедуры, требующие заживляющего продукта, который ускоряет восстановление кожи и подходит для долговременного применения (пока кожа полностью не восстанавливается), включают, например, легкий химический пилинг, удаление волос лазером и лечения поверхностных сосудов (розовые угри).
Лечение повреждений кожи и слизистых оболочек по изобретению может, в частности, включать лечение порезов, швов, ссадин, соскобов, царапин, шрамов после хирургического вмешательства или косметической дерматологической процедуры, поверхностных ожогов, солнечного ожога.
Настоящее изобретение дополнительно относится к применению косметической композиции по изобретению для улучшения заживления и репарации кожи и, в частности, для смягчения дефектов заживления.
Данное изобретение будет понятнее посредством прочтения приведенных ниже примеров, которые иллюстрируют изобретение без ограничения его объема.
Данные примеры относятся к следующим Фиг.
ФИГ. 1: гель SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) белков секретома.
Полоса 1 (М - маркеры молекулярной массы, лазурный).
Полосы 2-5: (Sec - секретом перед добавлением аргининового буфера) - загрузки 10 мкл, 15 мкл, 20 мкл и 30 мкл соответственно.
Полосы 6-9: (Sec + Arg - секретом после добавления аргининового буфера) - загрузки 10 мкл, 15 мкл, 20 мкл и 30 мкл соответственно.
ФИГ. 2: % стимуляции пролиферации (среднее плюс/минус SEM (стандартная ошибка среднего)) нормальных человеческих фибробластов, обработанных разными продуктами, по сравнению с контрольными клетками (n равно 3 группы доноров).
ФИГ. 3: % стимуляции (среднее плюс/минус SEM) миграции линии клеток кератиноцитов НаСаТ, обработанных разными соединениями, по сравнению с контрольными клетками (n равно 2).
ФИГ. 4: повторная эпителизация раны (среднее плюс/минус SEM) после нанесения в течение 48 ч на экспланты свиных ушей разных продуктов по сравнению с контрольным восстанавливающим кремом (n равно 10 независимых доноров).
Пример 1: культура бактерии LMB64
В качестве неограничивающего примера, предпочтительная культуральная среда содержит хлорид аммония, сульфат магния и дрожжевой экстракт. Также следует отметить, что, как проистекает из заявки WO 2012/085182, среди прочих, можно использовать другие аналогичные среды, и они, таким образом, должны рассматриваться как неотъемлемая часть настоящего описания. Любая адаптация специалистами в данной области также должна рассматриваться как часть данного изобретения.
Типичный способ культивирования описывается ниже. Здесь следует напомнить то, что данный пример служит лишь для иллюстративных целей и ни в коей мере не должен рассматриваться как ограничивающий.
Штамм LMB64 выращивается в три этапа, а именно: исходная инокуляция, предкультивирование (или предферментация) в периодическом режиме и, наконец, культивирование, но в режиме подпитки (добавление глюкозы).
Инокулум: для инокуляции колбы Эрленмейера, содержащей 1000 мл стерильной среды, используется пробирка с WCB (рабочий банк клеток) LMB64. Данную колбу Эрленмейера затем помещают в шейкер-инкубатор и встряхивают. При достижении достаточной плотности клеток бульона, культуру прекращают. Клетки затем охлаждают перед переносом в предферментер.
Предкультивирование: предферментер затем заполняют грубо 16 л среды и затем полностью стерилизуют.
Две сателлитные колбы соединяются с предферментером после стерилизации емкости и затем со следующими дополнительными блоками:
• колба, содержащая стерильный 50%-ный раствор глюкозы. Данный раствор (периодическое предкультивирование с глюкозой) немедленно переносят в культуральную среду для достижения исходной концентрации глюкозы 20 г/л.
• колбу Эрленмейера, содержащую инокулум, описанный выше на стадии Инокулум, инокулируют в предферментере.
2
Запускают предкультивирование и затем автоматически регулируют. В качестве примера можно упомянуть следующие параметры: температура, скорость встряхивания, давление, скорость тока воздуха или PO.
Рост клеток отслеживается измерением оптической плотности при 620 нм. Предкультивирование останавливают охлаждением при достижении ей достаточной плотности.
Культивирование: ферментер затем заполняют 127 л среды, доведенной до рН 7,0, и затем полностью стерилизуют. Три сателлитные колбы используются следующим образом:
• колба, содержащая стерильный раствор глюкозы. Данный раствор немедленно переносится в культуральную среду для достижения исходной концентрации глюкозы 20 г/л.
• колба, содержащая пеногаситель. Данный пеногаситель будет автоматически добавляться на протяжении культивирования для контроля уровня пены в емкости.
• колба с глюкозой для подпитки. Данный раствор будет добавляться на протяжении культивирования для стимулирования роста клеток.
2
Культура запускается и затем регулируется автоматически. В качестве примера также можно упомянуть следующие параметры: температура, рН, встряхивание, давление, скорость тока воздуха, PO.
2
После истощения глюкозы, исходно присутствующей в среде (увеличение уровня PO), запускается добавление подпиточного раствора глюкозы, обеспечивая, таким образом, рост клеток в высокой плотности. Ферментацию прекращают после полного потребления глюкозы. На данной стадии ферментация должна автоматически охлаждаться. На протяжении всего культивирования рост клеток отслеживается измерением оптической плотности при 620 нм. Количество сухой биомассы (г/л), полученной в конце культивирования, определяется с использованием способа взвешивания.
Пример 2: экстракция секретома
Пример ниже приводится в качестве иллюстрации предпочтительного воплощения, но не должен рассматриваться как ограничивающий.
Секретом, в общем, получают после центрифугирования результата стадии культивирования для того, чтобы удалять клетки, поверхностные белки и белки, расположенные в периплазматическом пространстве бактерии. После данной стадии центрифугирования следует добавление в супернатант Tris-аргининового основного буфера. Также возможна последняя стадия фильтрования супернатанта. Любая адаптация специалистами в данной области также должна рассматриваться как часть данного изобретения.
Центрифугирование: линия переноса из ферментера в центрифугу стерилизуется. Ферментационное сусло затем разделяется непрерывным центрифугированием на центрифуге. Центрифугирование проводится со скоростью 150 л/ч (плюс/минус 30 л/ч) со скоростью вращения сосуда 10900 плюс/минус 1000 об./мин. Супернатант отбирается в контейнер, оснащенный одноразовым мешком. Масса супернатанта измеряется на платформе весов.
Добавление аргинина: Tris-аргининовый экстракционный буфер стерилизуют и затем переносят в одноразовый мешок, содержащий супернатант культуры. Необходимо контактное время от 1 до 7 часов. Целевая концентрация Tris и аргинина после добавления в одноразовый мешок грубо составляет 0,3 М L-аргинина и 20 мМ Tris.
Общий объем после добавления экстракционного буфера грубо составляет 240 л.
Фильтрование: проводят два последовательных этапа фильтрования для того, чтобы осветлить супернатант и получить прозрачный, не содержащий микробов секретом. Фильтрование контролируется системой фильтрования/распределения. Одноразовый картридж для глубинного фильтрования помещают в корпус его фильтра. Весь отфильтрованный продукт стерильно выделяют в контейнер, оснащенный одноразовым мешком. Мешок с отфильтрованным продуктом взвешивают на платформе весов и затем хранят при +5°С до распределения.
Гель-электрофорез белков секретома: см. Фиг. 1.
Использовали Bis-Tris SDS-PAGE в геле (4-12%) при денатурирующих и восстанавливающих условиях, выявление кумасси голубым загрузок разных объемов супернатантов культуры (10, 15, 20, 30 мкл соответственно) до и после добавления аргининового буфера. В обоих случаях наблюдаются разные полосы белков размером от 14 до 100 кДа, включая главную полосу грубо 38 кДа.
Пример 3: влияние секретома на пролиферацию нормальных человеческих фибробластов
Использованной методикой является методика включения нуклеотида - 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU) - аналога тимидина - в ДНК клеток S-фазы при 37°С. Данная методика обеспечивает количественное измерение клеток, прогрессирование которых в клеточном цикле является характерным для пролиферирующей клетки (фаза S или синтеза ДНК).
Фибробласты высевают в 96-луночный планшет и затем инкубируют в течение 72 ч в присутствии соединений, подлежащих анализу, EGF (эпидермальный фактор роста) в качестве позитивного контроля и 0,4; 0,6 и 1% секретома. Включение BrdU осуществляется на протяжении последних 24 ч и количественно измеряется с использованием набора для ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) BrdU (№ товара 11647229001, Roche Diagnostics).
% от контроля рассчитывается согласно следующей формуле:
(Значение / среднее контроля) × 100
Стимуляция в % рассчитывается согласно следующей формуле:
Средняя стимуляция в % = (Среднее (Значение / среднее контроля) × 100) - 100
SEM = стандартное отклонение / √n
Статистические анализы проводятся с использованием t-критерия Стьюдента. Данные исследования проводили на 3 группах доноров.
Позитивный контроль - EGF - сильно, значимо и воспроизводимо стимулировал пролиферацию фибробластов на 3 группах доноров (95%-ная стимуляция). Это подтверждает эксперименты. Данные результаты показывают то, что секретом, проанализированный при содержании 0,4%, 0,6% и 1%, значимо стимулировал пролиферацию нормальных человеческих фибробластов. В Таблице 1 ниже обобщаются результаты включения BrdU (среднее плюс/минус SEM) нормальными человеческими фибробластами (посредством ELISA) после 72 ч инкубации в присутствии проанализированных соединений (n равно 3 группы доноров). Результаты показаны на Фиг. 2.
Пример 4: влияние секретома на миграцию линии клеток кератиноцитов НаСаТ
Данные исследования проводили с использованием анализа миграции клеток Oris (Platypus Technologies) согласно стандартному протоколу, рекомендованному изготовителем. Предпочтительно клетки НаСаТ (линия клеток кератиноцитов человека) высевают в 96-луночный планшет. Пробки Oris™ удаляют, и соединения, подлежащие оценке, добавляют в культуральную среду. Инкубация продолжается в течение 24 ч с обеспечением миграции клеток. Затем добавляют проницаемую в клетку флуоресцентную метку для обеспечения визуализации клеток в зоне, ограниченной пробками.
2
Миграция клеток оценивается фотографированием лунок и измерением площади поверхности миграции в мм.
% контроля рассчитывается согласно следующей формуле:
(Значение / среднее контроля) × 100
Стимуляция в % рассчитывается согласно следующей формуле:
Средняя стимуляция в % = (Среднее (Значение / среднее контроля) × 100) - 100
SEM = стандартное отклонение / √n
Статистические анализы проводятся с использованием t-критерия Стьюдента.
Данные исследования проводятся на 6 технических повторностях и в n равно 2 независимых экспериментах.
Позитивные контроли - TGF-b и фетальная телячья сыворотка (FCS) - сильно, значимо и воспроизводимо стимулировали миграцию клеток (51% и 176% стимуляции соответственно). Это подтверждает эксперименты. Результаты показывают то, что секретом, проанализированный в содержании 0,4%, 0,6% и 1%, значимо стимулировал миграцию кератиноцитов НаСаТ. В Таблице 2 ниже обобщаются результаты миграции клеток НаСаТ после 24 ч инкубации с разными соединениями (n равно 2). Данные результаты показаны на Фиг. 3.
Пример 5: влияние секретома на закрытие ран на модели заживления ex vivo
Экспланты кожи свиных ушей поддерживаются в условиях для выживания. В центре осуществляются шестимиллиметровые биопсии, в которых делается 3 мм кольцевая рана. Данная рана повреждает весь эпидермис и верхнюю часть дермы. Продукты, подлежащие оценке, наносятся местно. Через 48 ч биопсии замораживают, и на срезах осуществляется окрашивание гематоксилином-эозином. Кинетика повторной эпителизации оценивается согласно следующему способу:
1) Приписывание балла, определенного от 0 до 3, согласно протоколу, разработанному J. Brandner (Pollok et al., 2010, J Cell Mol Med).
Точное измерение в мкм степени зоны повторной эпителизации из края раны. Для определения значимости применяется ^критерий Стьюдента.
2) Также оценивается морфологический вид на краю раны для того, чтобы оценить качество сохранности ткани.
Препараты продуктов, подлежащих нанесению: секретом добавляли в содержании 0,4; 0,6 и 1% масс. в тот же самый базовый препарат, что и препарат контрольного восстанавливающего крема (крем Cicalfate), анализируемый параллельно. Повторная эпителизация оценивается по сравнению с данным контрольным кремом.
Результаты показывают эффект дозы с использованием секретома на прогрессирование повторной эпителизации раны. Препарат, содержащий 1% секретома, значимо ускоряет прогрессирование закрытия раны по сравнению с контрольным восстанавливающим кремом (p равно 0,043). Кроме того, морфологический анализ тканей показывает превосходную толерантность препаратов, содержащих секретом. Результаты показаны на Фиг. 4.
Типичная композиция: эмульсия типа «масло в воде»
секретом согласно примеру 2:
0,1-5%
глицерин:
1-30%
гексиленгликоль:
0,1-7%
цетеарилглюкозид:
0,1-1%
цетеариловый спирт:
0,9-4%
стеариновая кислота:
0,5-4%
глицерилстеарат:
0,1-4%
растительное масло:
0,1-10%
вода
qs (сколько потребуется до) 100%
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ПЬЕР ФАБР ДЕРМО-КОСМЕТИК
<120>  Бактериальный секретом для применения в лечении повреждений кожи
<130>  B373870PCT D37050
<140> PCT/EP2018/058929
<141> 2018 - 04 - 06
<150>  FR1753012
<151>  2017 - 04 - 06
<160>  2
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  1487
<212>  ДНК
<213>  искусственная
<220>
<223>  Новая бактерия LMB64, класс бета-протеобактерия, происходящая из грунтовых вод
<400>  1
agtttgatca tggctcagat tgaacgcggg cggcatgctt tacacatgca agtcgaacgg       60
cagcacgggc ttcggcctgg tggcgagtgg cgaacgggtg agtaatgcgt cggaacgcgc      120
cgagtagtgg gggataacgc agcgaaagct gtgctaatac cgcatacgta ctgaggtaga      180
aagtggggga ccttcgggcc tcacgctatt cgagcggccg acgtctgatt agctagttgg      240
tggggtaaag gcccaccaag gcgacgatca gtagcgggtc tgagaggatg atccgccaca      300
ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat tttggacaat      360
gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt gtctgaagaa ggccttcggg ttgtaaagga      420
cttttgtccg ggagcaaagc ctgcttgtta ataccgagtg gggatgagag taccggaaga      480
ataagcaccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc aagcgttaat      540
cggaattact gggcgtaaag cgtgcgcagg cggttgtgca agtctgatgt gaaagccccg      600
ggctcaacct gggaacggca ttggagactg cacggctaga gtgcgtcaga ggggggtaga      660
attccacgtg tagcagtgaa atgcgtagag atgtggagga ataccgatgg cgaaggcagc      720
cccctgggat gacactgacg ctcatgcacg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac      780
cctggtagtc cacgccctaa acgatgtcaa ttagctgttg ggggtttgaa tccttggtag      840
cgaagctaac gcgtgaaatt gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaag      900
gaattgacgg ggacccgcac aagcggtgga tgatgtggat taattcgatg caacgcgaaa      960
aaccttacct gctcttgaca tgtaccgaag cctgaagaga tttgggtgtg cccgaaaggg     1020
agcggtaaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag     1080
tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtcattag ttgccatcat ttggttgggc actctaatga     1140
gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttatg     1200
agcagggctt cacacgtcat acaatggtcg gtacagaggg tcgccaagcc gcgaggtgga     1260
gccaatctca gaaagccgat cgtagtccgg atcgcactct gcaactcgag tgcgtgaagt     1320
cggaatcgct agtaatcgca gatcagcatg ctgcggtgaa tacgttcccg ggtcttgtac     1380
acaccgcccg tcacaccatg ggagtggggg ataccagaag tgggtaggct aaccgcaagg     1440
gaggccgctt accacggtat gcttcatgac tggggtgaag tcgtaac                   1487
<210>  2
<211>  10948
<212>  ДНК
<213>  искусственная
<220>
<223>  Новая бактерия LMB64, класс бета-протеобактерия, происходящая из грунтовых вод
<400>  2
gggcgcagca ccatcgccca ggccaaaagc cacccgtgcc gattcggcgg cctgttgctc       60
gcgctcaatg cgctgcgcct ggtcggccaa gtcggcggct tgctgctcgg ccttgcccgc      120
cagggtgtca cgctcgcggg tcagttccgc cacctgctcg gctagggcat cgcgctcggc      180
ctcgatcacc tcaccagcgg ccgccagctc ggcggcttcg ctctgcgcct ggaccaagcg      240
gccctcgacc tcggcgcggg cctgggcggc tgcgcgctcg atctcggcgg caatggcggc      300
ggtcaatgcc tggggcagtt ccggcgcagc agcagcggcc accggccggg cctctcgcca      360
ggcagttaga tgcttgtgaa cggtattcgg gctgccggtg cccaaacgct cgcggatcgc      420
gcggatagtc ggctgctgcc cttcgccgac cagcgcatca gcggcggcgg cgaacgggtg      480
gcccgtgcag aggcccgcgt cgagcagatc gagcagcagg ccgccaaggc ggcacaggcc      540
cacgaagaag cccgcgccgc cgccacgcag gaagcccggc aagtgcaagc cgaacgcgac      600
gaagcccgca aggtggccgc cgaggcgcgc gagcagaccg cgcgcctggc tgggcaactc      660
gaagccctca ccgcgaagga gcgaaaagcc gatgaaagac cgtgaccaca acgaagcgat      720
ggccggcatg tttcaggccg acccccgatt tgccgccgac tatctgcgcc aggtgttggc      780
cgatggcgag cctaccgacg tgcgcgccgg cttgcggcaa atggcggatg tgctgcgcgt      840
cagtcaggcc gccgcgccga ccgattctgc gccttcggcg ggcctctttg accgggccgg      900
cgtgcgctac gaagtggcgt gcgatgtgat cggggcgttg attgcccatt acgccgaaat      960
catgggacgg gaacgcgagc aggcgcagcc gaatgaggcg gttttgcgcg tggccggagc     1020
catgaaggcg gcgctggccg gggagcggga tgatctcgat ccgcgcgata gcgccggcat     1080
cgaggcggcg atttcgcgct atgcgccact ggcgcgccgg ctgtatggcc aggctgaaaa     1140
cgaccacgcc cgccaggaac agcgtcgcgc cgatttcgac caggtgcatg cttcgctggc     1200
cttggagggg ctggccatga gcgcggacga tttggcggtt caggcgctgc tgatccgggg     1260
cgacattacc cacgatgagg cggtgcagtg ctaccgcatc ctgcatcgcc atgcgcggta     1320
aaaccgactg gccgcccgag gtggccggtg tgctgggttt gctcgaatcg cagccgccag     1380
aggcggcgat gctggtgggc tgttttctgg cggcggtagc ccatcccgat catgcggccg     1440
aattggcgat gttcgacaaa ttgccgccag cggcccggat ggtcgtcggg cgatttttcc     1500
tcgtttttct ggcgggcggc ctggacgatg ccgggcgcga aaaactgcat tcgcacatgc     1560
aggcatggtt tgtccgtcag cgccgttttc ggtgaatggc ttgcctcatc cactagggcc     1620
gggcaagggg tgaacagcgg gcgatgctgg cttgcgggac gaccccgcac ccccggaaaa     1680
cttgtcacac accacgcaac tcccgttgct tcgctaaaag ccttgtgccg caaggctttt     1740
agcgaggcga caccgaagac acatcgcggc gacaccgaaa gggccgaacc ggcctaaaac     1800
ccttgctgcg caaggagaac agccgcgctt tcgcgcgcga aagtgcttca aatgcctgtc     1860
ggcatcagca gggtatggat cggcacgccg aaggcgttgg cgatgcgctc caggttgtcc     1920
aaggagatgt ttctgacttg gcgctcgcag tgcgcaacga aggtgcgatg taggccgcac     1980
tcaaaggcga gcgcttcttg tgaccagcct ctttcccggc gtaatcggat catgttggcc     2040
gcgagcacgg cccgcgcgga atgcgcggtt ggtgcgggag gttgagcggc gggagacatg     2100
caaaccagtc tcctgatatg ccgcttttac gtcagccgtg tttaagtcac aatatggttt     2160
tctcatagag aaagacggcg tgacgatggg cagaaaaaca gcaatcaggc gagggggtgc     2220
cgtgttggcc agcctgttga tttgcgcaat tgaaccggtc ggcgcggcct ccctggtcgg     2280
cggtcaaacc gatgattccg tgtgcgacct gggcagcgcg ccacagaacg cccggaagct     2340
gtcggcagcg ggcgacttca tccgcgcgca gtgcaaaaac ggtcaaatgt tggtgggttc     2400
cggcatcgtg cctgccggcg ggtttgactc ggaagtggtg cgcctggcgc gcaccttctg     2460
ccgcatggcg gacattcaga ctcggcgcac gcagggcaac atggccggcc tcgtcatgga     2520
gatcgacgag gtacggtgca tcatcgggaa gttgccgaca tgagaaaagc gatgttggct     2580
ggctttctgg ccgttgtggt ggccaacgtg gttgccgctg agggcggtgc gcccttgcgc     2640
ggcggtgttt gcatcggacc gttccgtggc gctgattccg tcgtgcactg cgagcacatc     2700
ggcaaggtga cgatccgcca gatttacgaa aagggctttc gggtcgttca catgcaggac     2760
gacaagaaca cagccagcta cgttgtgctg gttatcgagg agcaggcgcg atgagggcga     2820
aagcgtggcg gatgctgttt gccgggcggc gctgggtgct ctggcttccc gtgccggcgt     2880
cggtatggct ggcactgccc gaatggcagc acattcccgc catgttgttg ggcggcctga     2940
tcgtgtggat tcccttctgg ctcgcgtggt ggctcagtga tggcttcgcg ggcatgtcca     3000
ggtggccagg aaccggcgca cctgcggtat ctggcggggt gaacccgcac accggcaagc     3060
catgcacggt gtatcaccag ccgtggggag ataccttcgt gggtggagac tgattatttg     3120
attgaggaac gatgacaagg gccagcaaca agctggccct tgtcgttttc tggactgttt     3180
tacccacaac atccgctctg ctgctgaatt ggcggacatg gcaccgagcc gaacgaacag     3240
aacacgcagc aatcccccgg cttggggcgc agcagcgtat ggcaggccgg gcactcgtag     3300
tagaactggc aggcgtccgt gggcatggtt tcctgctgtg cgtggccgca gtgcgggcag     3360
gtcagcacgg attcgagaat gacggcgctc atcgtggcgt tacctctgca cggtggacgg     3420
atagcctgcg ttcgtcgttg ccgaggtcaa cgcttccggc ttggccttgt cggcgtcata     3480
ggtgacggtg gccgttttct tgtcgaaatc gaccttgacg gcgctcacac cgggcacttt     3540
ctccagcgac ttcttgactg tgatcgggca tagctcgcag gtcatgttct gaacggccag     3600
cgtgacggtt ttcggggtgg cggccagcac ggcgagcggc acggcagcca gcagagcaat     3660
cagcagtttg cgcatgggag tctcctttca atagaacagc ggggcgaacc acggcacggc     3720
caacagggca agcaacagca cagtgacgat ccagaacgtc aggcgctgcc gctggcgtgt     3780
gcgcggatca gcgcatggcg tgccgggcgt gcagacctgc ggcaccagat agagcttgcg     3840
gaaggccagt ccgagaaaga gcagcgtcat gccgatgaaa aagggccggt acggctccat     3900
cgcggtcagg ctgccaaccc atgagccacc aatgccaagc accagcagga caagcggccc     3960
gacacagcac accgacgcgc cgatggcggt cagtacgctc acgatcaacg agcttttttc     4020
agtgagtcgt gccatgtcgc tttccttgta cctgtttgcc caagtgttac tctaaatccc     4080
gtacctaagt acggagtcaa gggggtgtga tgggaacaga actgaccatc ggcaagctgg     4140
ctgacgctgc cggggtgaat atcgagacga ttcgctacta ccagcggcgc ggcctgctgg     4200
atgagccgcc taaaccgcca ggggggcatc ggcgctatgc gcctgagcag gcaaaacgtg     4260
tgcgatttat caagcgggca caggcgcttg gtttcacgct ggacgaggta ggcgcgctac     4320
tgaccctgga tgcggcctgc gcctgcggtg agacgcgagc gctggctgtg cgcaagctgg     4380
gtctgatcga gcagaagatg gctgacctcg cggccatgcg gcaggcgctg ggtggattgg     4440
tgcagcagtg tgatgcgggc gacggtggag ccagctgtcc catcatcgac gtgctggcag     4500
gtaattagat gtgttcaaaa aatggtggtt ttctggacac atgccggttt gccctgtcct     4560
gagttgtcct gatgcgttaa agtgttcatt tattcgttca gctttcaatg tggcggaact     4620
gttcatgaat caacgcatcg gctatgcccg cgtttcgacc gacgaccaaa acctagacct     4680
gcaacgggac gcactccggc aggctggatg ctcaaccatt tacgaggaag cagccagcgg     4740
aaagagcgca gcaaggcccg agcttgagca gtgtcggaag gctctccggc ccggcgacac     4800
gcttgtggtg tggcggcttg atcgccttgg gcgcagcctg cccgacctgg tgcagatcgt     4860
ggctgatctt gaacagcgcg gcgtgcattt cgagagcctg accgagaaga tcgagacggg     4920
gagcgcagcg ggtaagctgc aattccatgt tttcgctgca ctcgccgagt tcgagcgcgg     4980
cctgatccgg gagcgaaccc gggcagggct ggatgcagct cgcgcccgtg gccgatccgg     5040
tggacgcaaa ccgaagctgg acgccaagca gatacgccac attaaggcgc tactacgtga     5100
cccgaatacc tgtgttgctg aactcgcccg tgactacggc gtgtcgagaa caactatcta     5160
taaacactgc ggtgtggttc tgccgcgtac agccgatgaa ggggcaatat gacaaaaaag     5220
acaacagcat tcgatgtatt cgagaaatgc gtccaagcag ttcaggctgg tgaactgatc     5280
gaatccgttt ctgcgaagga caaggaattc catttccaga actggtttca gaagcgcctc     5340
cagagcctgt cgatgcactt cgaggggtcg ggtcgcaaca cctacccgga cttctgcttg     5400
gtagagcaca ccgagggcta cgagatcaag ggtttggcat ggcctggccg cgagcgcgac     5460
tacgactcga acagccaagt gccgactggc tatcacaacg gccgtcaaat cttctacgtg     5520
ttcgggcgct accccgcaga cctgtctggc tatgccgatc agggcaacgg ccgcaggcag     5580
tacccggtgg ttgacctcgt ggtctgccac ggcgacttcc tcaacgccga tcacaactac     5640
gtccataaga acaagagcgt aaagggcttt ggcacctacg gcgacatcat gatccgcgac     5700
cggaagatgt acgtcgcgcc gacgccattt gcgctgaccg aaggcaccac tggcctgatg     5760
actttgatcc tgccggagaa cttcggcacc gatgaccgtt accaggtggt cggtaacctc     5820
actcgcgtcg aggcggaaac gctggtggtt ggctacaact ttgacctgcg cacgaacgag     5880
ctgagcgcag agcgcgtgcc caatcccaac gcaggcaccc agcaccgatt cgtggcctac     5940
cggctcaagg atcaagcgag caagcctgtc tccatgactg gcacccaggt gcagcccgac     6000
gagaacaacc tgccggacga cgaatgaaca ccatcaccga caagatcggg ttcgcttacc     6060
cggttgcagc gaccgcgctg gagtgcgact tcccgctggt cgaaatcagc cagatcgccg     6120
agcaggaaag ttggcgaaag gagatcaaca ggccgatcta ccacatccac aagtggtggg     6180
cgaccagact tgggtcggtg tttcgtggca ttacccttgg tgctttgagt cagcctggta     6240
ctgacctctg ggcgcagttc tacaaaacgc acgacctggc cggtaaggta gtgctcgatc     6300
ccttcatggg cagtggcacg acgcttggcg aggccgtcaa gctgggtgcc aaggccatcg     6360
gctgcgacat caacccagtc agtaccttcc tcgtacgtca ggcgttcacg ccggcgtccg     6420
aggcagagct gcgtgccgct ttcgagcggc tggaacgtga cgtggcaccg gagattcggc     6480
gctactacca gacgcgcgat cctaagacgg gcgagctgat tcaggtcttg tactacttct     6540
gggtcaagac ggtgacgacg cccgagggcg aggtaatccc cttgctgtcg cgctacgtgt     6600
tttcacaaga cgcctacccg aagaagaagc cgcgagcgca gatcgtgtgc cctggctgct     6660
ggagtgtgct ggaggatcgc tacgatgcga ctgacctgca ctgccagcac tgcggccacc     6720
agttcaatcc gcaggaaggc ccggccgctg gtcagtacgt caaaaccaag ggcggtcacc     6780
gttaccgcat caaggaacta ctgccaaagg acggtacgcc gccctctcat cgaatgtacg     6840
cgatgatggc cttgcgagcg gatggatcga aggtctatct gccggtgcgg aatgaggact     6900
tggccctcta cgaggaagcc caagaacgcc ttgctacaga ggcactgccg ctgccgaaaa     6960
cctctgttcg acctggccac aacaccgacc aggcgcgcgg ctacaactac acccaatggc     7020
gcgacttctt caatgcgcgc caactgctgt gccttggcct gctgctgcgg gaaatcctga     7080
ccatcgacga cctggcagtg caagagcaga tgctgtgctt gttctccagc accttggagt     7140
tcaacaacct gttttgcagc ttcaagggtg agggaacagg ggccgtgcgg catatgttct     7200
cgaaccacat cctcaagcca gagcgcaccc cgctggagaa ctccgtgtgg ggcactggca     7260
agagcagcgg tacgtttagc acgttgttcg agtctcgcct gctacgtgcg aagcgctacc     7320
tcgatgagcc gttcgagatc gcgttcgagc atgaccagga cggtaaccgc gcaggctcgc     7380
gcaagacggt ggctagccat ccgatccgcg cccgtcgcgt cgaaacctgg ccggaattgg     7440
aggccgcaga tcatggcctg ctgatcctca acggtgacag ctcgaagctg ccggtgcccg     7500
ctggttcggt ggatgccgtg gtgactgatc cgccctactt cgacttcgtt cattactcgg     7560
agttgagcga cttctttttt gcttggctca cccctgtgct gcgccagcgc tatccgtgga     7620
tggcccgcga ggactcgtct gaccaagggg aggtgcagca caaagaccct cgtgtgttcg     7680
cccgtcagct tgcgtcggtg ttcacggagg cgtgccgcgt gcttaaggac gatggagtgt     7740
tggcgttcag cttccaccac tcgcgtgccg agggctgggc ggccatctat gaagcgatca     7800
acaaggcggg cctggccgta gttgcggctc accctgtcca tgccgagctg cgcgcggcaa     7860
gtcccaagac tgcggccaaa gacccgatca gccttgatgc gattctggtg tgtcgcaaaa     7920
aggcgtttgc cctgcaccag tcgcctgcta tccaggatgt ccgccaggct gttgatgcgc     7980
tggcatcacg gctgcaagct gctggccttc gcatctcggc gggtgaccgc ttcgtgatcg     8040
gcgcagcgca aaccttgatt gcacgcgctg ctgatgacat gggcttcgac gagatcaagg     8100
ttgatcttga ggcaattcgg ctggccgtgg ggccaagggc tgcaacatca aaggctgcga     8160
gtgcgtggga tgacgatgtg cccttctgat tggctgcacg gccttgtcgg cgcatgcgtt     8220
ttgatggcag ccgctgcacg caagccgcgt ccctccgcgt aaagttcatt tatacgcaaa     8280
tacgtatttg cgtgatacaa taacgccata ttaatggagg tgcgtaaatg cggactattg     8340
ttgtggctag ccaaaaaggt ggcgtcggca agacaacgat tgcaggtcac ttgggtgtca     8400
tggccgagca gagcaaagag gggccagtgg cgctgatcga cacagaccca caaggctcgc     8460
tcgcgtcctg gtggaatgag cgaaccaatg aggcaccgct gtttgcacgg gtggaaatcg     8520
gcaagctgac cgagcacctt caggcattgt ccaagggtgg catcaagctg gccatcatcg     8580
acaccccgcc ctctgttacg gaaatgattc agcaggtgct ccgcaccgcc gacttggtac     8640
tgatccccac caggccgagt ccgcatgact tgcgcgcggt cggatctacc gtcgaactgg     8700
tggagaacgc aggcaagcga atgatcttcg tcatcaatgg ggcggcacct cgcgcgcgga     8760
tcgcgggtga ggctgccgtg gcgctttcgc agcatggcac ggttgccccc gtgacgctgt     8820
accagcgcac cgacttcgcc agctcgatga tcgacggccg caccgtccag gaaatcgacc     8880
ccaaggggcg gtcggccgaa gaaatcgggc agttgtggaa atacgtatct acacaactgc     8940
gtaaaatttg atataatacg tacatgcgta ttaatggaga tacgtaaatg gctaaaactg     9000
catctttgac tgccggcctg gtggccaaga aaggggaggc gtcccctgct acggttgtcg     9060
cggcacccca ggttcaacct atcgaagtga aggcatcggc gactggcggc ggccgggatt     9120
actacaaggc gttgaccgtc aagttggatc gtgaccgcta cgagagtctg aaaagcatgg     9180
gcgtgaagct ggacaagaag agccaggaaa tctttgtcga ggccctggat ttgtggatga     9240
agtcggccgc tggccagcaa cacgcctaag aggcccctat gcgttcagtg cgctctgccg     9300
tcgaactcgc caaggagttg gccgaaaaag ccaaggcccg ccgcctagcg gcggaaaaga     9360
acgagctggg acttgaaggc ccggcgcagg gcaacgccgg caccactccc agcccggtga     9420
aggttgcggc cgaagtggtg ggcgagcagc cggcacgacg caagggagcg ccgaaagggc     9480
cgcgtggcct gatgccggtg catcatccaa accgcgattt cttcttgtgc gatctgtttg     9540
actacgccct aaaggatgac ggcgtgagca tggaggcccc catcttcacc ttggcaacca     9600
ggccggacac ctctgtttgg cattgggaaa gcaaggatgg gacacgcgcc atcaccgtca     9660
cgccaagcgt gaaggggagg gccacgcagt ttgataagga tttacttatt tacgtagtta     9720
gccagatgac cgaggctatc aatcgcggtc ggcctgatgc gaacaatcga accgtgcgct     9780
ttcgcgtcta tgactacttg gtctcaacca acaagccgac tggcggcaag gagtaccagc     9840
gactggagga tgccctagac aggctgcggg gtacatcgat caagacgaac atcaagacgg     9900
gtggccagcg tgtgaaggaa ggcttcggca tcgtcgatag ctggacgatc atcgagaagg     9960
cccccgacga tgaccgcatg attgccgtcg aggtcacgct ctccaagtgg cttttcaatg    10020
cagtgcaggc ccacgaggtt ctgaccatca acccggacta tttccggctg cgtaagccaa    10080
ttgagcgccg tttgtacgag ctggccagga agcactgtgg cgaccaggcc ttttttgtga    10140
ttgggctgga actgttgcag gacaagtgcg gcagcaagtc ggcactgttc gagttccgcc    10200
gtgccttgcg cgagatcatc aaggccgaca ccttgccaga ctaccgcatg acgcttgatg    10260
acgagaaaga ccaggtgatt ttctacaccc gcgacacgaa gaagctagcg gcgtctaccg    10320
ctctggcccg gcgcttccag tgacgcccaa agtattgacg gtcaatactt cgttatttca    10380
cccatgcggt gttaccgctg cgtgttggac gttcccttga cctagcggcc gaggcagggc    10440
tttcgcgctt tgcattgagc caccaagtgc gtctcgctcc ttcgagcatc aagccctaac    10500
gcgtttcatg tcactttcgc gcacgaaagt cgaggcaaga ggcttgatcg tgtctatcgt    10560
tacatcaccc atgcctgtgg atggacacgt tacatcaccc atgttttctg tggatgggca    10620
cgttacatca cccatacctc acttcgttac atcgcccatg cagcgatttg tggaagcctt    10680
gagcagcaag gctttacgag cgttatccac agccgtaaca cgcgcgcgcg attttttaac    10740
tttataaatc tttaacgcgg ttgcggacaa agcccgcgcc gcctcttggg ggctacgccc    10800
ccgccggctc ctacgggccg caagcggccc tccgcccgcg cttcgcgctc cctcccggca    10860
tccccgaggg gtttcgcttc gctgcacccc tcgcgcttcg cgctcacccg catatcgagg    10920
cccccaaagg gggccggatg gtgccccc                                       10948