СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ КОСТНОГО МОЗГА ДЛЯ ВНУТРИСОСУДИСТОГО ВВЕДЕНИЯ
METHOD TO EXTRACT STEM CELLS FROM BONE MARROW FOR INTRAVASCULAR INTRODUCTION

Изобретение относится к регенераторной терапии в области кардиологии, в частности к разработке способов сепарации костного мозга для получения максимального количества жизнеспособных стволовых клеток с целью внутрисосудистого введения для регенерации органа.
Выделение мононуклеарной фракции костного мозга (МФКМ) для экспериментальных целей известно с 1960-х гг. Именно в МФКМ обнаружены все известные до настоящего времени стволовые клетки человека, а именно: гемопоэтические стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, эндотелиальные стволовые клетки и другие. В течение последних лет МФКМ стали использовать для регенераторной терапии прежде всего в кардиологии. С 2002 года немецкие кардиологи (Strauer BE, Brehm M, Zeus Т et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circ 2002; 106:1913-1918 Strauer BE, Brehm M, Zeus Т et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circ 2002; 106:1913-1918) начали применять МФКМ для лечения кардиологических больных, преимущественно при инфаркте миокарда.
Первое исследование по оценке регенераторной терапии с помощью МФКМ проведено в 2004 г. Германии. - TOPCARE-AMI (Transplantation Of Progenitor Cells And Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction) (2001-2003, Германия). Результаты исследования показали полезность использования МФКМ при лечении острого инфаркта миокарда: у больных улучшалась фракция изгнания, лучше восстанавливалась работа левого желудочка сердца. В 2010 году опубликованы результаты большого контролируемого исследования STAR-heart study: аутологичные мононуклеары костного мозга, полученные с помощью градиентного центрифугирования с фиколлом, вводились больным с сердечной недостаточностью с фракцией изгнания 35% и меньше. Через 5 лет отмечено улучшение показателей сократимости миокарда и выживаемость в исследовательской группе по сравнению с контролем (консервативное лечение без введения мононуклеаров) (Strauer B.E., Yousef M., Schannwell C.M. The acute and long-term effects of intracoronary Stem cell Transplantation in 191 patients with chronic heart failure: the STAR-heart study. European Journal of Heart Failure 2010. - V12. - p.721-729).
К 2011 году уже проведено более 30 пилотных и рандомизированных, плацебо контролируемых исследований. Наиболее значимые из них: MAGIC, BOOST, TOPCARE-AMI, REPAIR-AMI, ASTAMI, STAR-heart и другие. Результаты этих исследований в подавляющем большинстве свидетельствуют в пользу применения МФКМ для лечения кардиологических больных. Практически во все работах, посвященных клеточной терапии в кардиологии, выделение МФКМ проводилось с помощью фиколла.
Известен способ выделения стволовых клеток с помощью магнитного сортинга, который позволяет получить отдельные пулы стволовых клеток, к которым имеются моноклональные антитела с фиксированными на них атомами железа. Магнитный сортинг позволяет получить максимально чистые пулы клеток, что важно в научно-исследовательской работе. Однако для больных с тяжелым поражением органа, например сердца, важно получить максимально возможное число стволовых клеток, которые будут обеспечивать регенерацию не только кардиомиоцитов, но и сосудов проводящей системы сердца, элементов стромы и внеклеточного матрикса. Поэтому важно получение всего спектра стволовых клеток, которые задействованы в регенерации. Причем наиболее ранние стволовые клетки могут не иметь поверхностных маркеров, или они неизвестны, следовательно, эти стволовые клетки невозможно выделить методом магнитного сортинга.
Известен способ выделения МФКМ с помощью желатина, который предполагает первичное осаждение эритроцитов с помощью указанных веществ в течение 1,5-3 часов без центрифугирования до образования тромбоцитарно-лейкоцитарной пленки (Инструкция по выделению, консервированию и применению лейкоцитарной массы. Москва, 1969), что существенно увеличивает время окончательного выделения МФКМ и делает практически невозможным одновременное проведение реваскуляризации миокарда и введение аутологичных клеток костного мозга (МФКМ) во время одной процедуры. Кроме того, раствор желатина - белковый продукт животного происхождения, на который описаны анафилактические реакции. (Б.А. Барышев. Кровезаменители. Справочник для врачей. СПб. 2001. - с.15-19).
Применение способов-аналогов, в том числе с использованием ГЭК для выделения МФКМ, выявило существенные недостатки этих способов в виде больших потерь различных пулов стволовых клеток. Причем часть стволовых клеток, в том числе гематопоэтических, определена среди эритроцитов, располагающихся на разных уровнях под лейкоцитарно-лимфоцитарной пленкой. Эта часть, по нашим данным, составляет от 25 до 50% всех гемопоэтических стволовых клеток и именно эта часть клеток удаляется вместе с эритроцитами при использовании всех способов-аналогов и способа-прототипа выделения стволовых клеток. Все указанные выше способы-аналоги и способ-прототип использовались, чтобы подготовить стволовые клетки костного мозга для криоконсервации с последующим длительным хранением их до момента требования. Поэтому основное требование к ним было максимальное удаление эритроцитов, так как они резко ухудшают результаты криохранения образцов костного мозга. Однако, если выделяемые стволовые клетки предполагается не консервировать, а использовать этому же пациенту сразу после их выделения внутрисосудисто, то степень удаления эритроцитов из смеси МФКМ становится не принципиальной, а расположенные среди эритроцитов стволовые клетки, имеющие активные молекулы адгезии на своей поверхности, проходя через микроциркуляторное русло пораженного органа, эффективно фиксируются к эндотелию сосудов, проникают в ткани и обеспечивают в дальнейшем его регенерацию. Объем плазмы, который остается в предлагаемом способе вместе с МФКМ и частью эритроцитов, будет на порядок больше, чем в способах-аналогах и способе-прототипе, так как полученная взвесь клеток вводится внутрисосудисто. Принципиально важным при таком способе введения становится полное удаление жира, костных отломков и тромбов, так как это может привести к фатальной эмболии периферического русла сосудов.
Наиболее близким по технической сущности является выделение мононуклеарной фракции крови и костного мозга по методу Boyum (Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Lab. Investig. - 1968. - Vol.21 - Suppl.97, p.1-9). Принцип метода основан на различии в плавучей плотности форменных элементов крови. Смесь полисахарида фиколла и рентгеноконтрастного вещества изопак или верографин создает градиент плотности, который позволяет при центрифугировании разделить клетки периферической крови и костного мозга на мононуклеарную фракцию, в которую входят лимфоциты, моноциты и стволовые клетки, и фракцию, содержащую гранулоциты и эритроциты. Клетки мононуклеарной фракции обладают меньшей, чем фиколл, плотностью и располагаются над ним. Плотность эритроцитов больше и они проходят через фиколл, опускаясь на дно пробирки.
6
Методика: мононуклеарную фракцию выделяют из гепаринизированного костного мозга (20 ME гепарина/мл для костного мозга). Костный мозг разводят физиологическим раствором (рН 7,2) в соотношении 1:5. Разведенный костный мозг центрифугируют в градиенте плотности фиколл-верографин, плотность 1,077 г/мл (Хейфиц Л.Б., Абалкин В.А. Разделение форменных элементов крови человека в градиенте плотности верографин-фиколл // Лаб. дело, 1973. - 10. - С.579-581) при 400g в течение 30 мин в специальной пробирке с пробкой. Полученную путем забора стерильной пипеткой мононуклеарную фракцию трижды отмывают в ЗФФР (физиологический раствор, забуференный с помощью фосфатно-солевого буфера) и ресуспендируют в среде RPMI-1640 (Flow Laboratories, Англия) в концентрации 10 клеток в 1 мл. Жизнеспособность клеток, определяемая по методу окрашивания с трипановым синим, не превышает 96%. Для обеспечения стерильности такой открытой системы все манипуляции с клеточным материалом проводят в специально оборудованных стерильных помещениях.
К недостаткам способа можно отнести следующие.
1. Невозможно соблюдение полной стерильности, учитывая негерметичность системы.
Исходно этот способ был предложен для лабораторных исследований. В исследовании ASTAMI имел место 1 случай сепсиса из-за инфицирования материала в процессе выделения АМКМ.
2. Использование токсичных реактивов вынуждает троекратно отмывать полученную МФКМ в физиологическом растворе перед использованием у пациентов, что не гарантирует полного отмывания и не гарантирует отсутствия негативного влияния токсичных веществ на потенциальные способности стволовых клеток.
3. Одновременно при отмывке происходит удаление полезных продуктов стволовых клеток костного мозга - факторов роста, цитокинов, хемокинов, которые играют положительную роль для регенерации тканей.
4. Выделенные с помощью фиколла стволовые клетки производят колонии, образующие единицы в среде альфа-МЭМ хуже, чем стволовые клетки, выделенные другими способами, т.е. они теряют часть своих потенциальных возможностей, которые в дальнейшем важны для регенерационной терапии.
5. Достаточно трудоемкий метод; на выделение стволовых клеток уходит от 3 до 5 часов и требуется достаточно опытный персонал, так как даже минимальное нарушение технологии выделения приводит к потери практически всех стволовых клеток.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа выделения максимального количества жизнеспособных стволовых клеток из костного мозга в закрытой (стерильной) системе без применения токсичных веществ для внутрисосудистого введения полученного клеточного материала.
Технический результат заключается в увеличении количества жизнеспособных стволовых клеток костного мозга при осуществлении разработанного способа, а также усиления кровоснабжения и регенерации органов и тканей при внутрисосудистом введении.
Разработанный способ обеспечивает использование паракринного эффекта мононуклеаров костного мозга и безопасность внутрисосудистого введения полученного клеточного материала.
В предлагаемом способе не используются токсичные вещества для выделения МФКМ. Гидроксиэтилкрахмал - один из широко используемых кровезаменителей (9).
Все факторы роста, цитокины и хемокины, продуцируемые клетками, входящими в состав мононуклеарной фракции, при использовании предлагаемого способа сохраняются и в дальнейшем вводятся вместе с полученным клеточным материалом. Жизнеспособность стволовых клеток в предлагаемом способе - 98% и выше, что также говорит о наиболее щадящем режиме выделения стволовых клеток (в прототипе этот показатель не выше 96%). Применение предлагаемого способа выделения стволовых клеток из костного мозга для внутрисосудистого введения позволяет избежать потерь стволовых клеток или они сведены к минимуму. Система остается замкнутой в течение всего периода выделения МФКМ, что обеспечивает полную стерильность на всех этапах выделения.
Сущность способа заключается в следующем.
Костный мозг, полученный в операционной при пункции плоских костей (грудины, подвздошных костей) в объеме 140 мл, стабилизированный с помощью раствора гепарина (15-30 ед на 1 мл костного мозга) в стерильных условиях вводится в основной пластиковый гематологический контейнер, соединенный трубками с двумя контейнерами №1 и №2; в него добавляется Гидроксиэтилкрахмал в объеме 1:2. Система герметизируется в операционной. На первом этапе проводится центрифугирование указанной взвеси с ускорением 700g в течение 15 мин, после чего с помощью фракционатора медицинского компонентов крови проводится удаление примесей жира и плазмы в контейнер №1, а МФКМ, часть супернатанта и эритроцитов, примыкающих к линии разделения 2-х сред, переводится в контейнер-спутник №2. При этом в основном контейнере остаются сладжированные эритроциты и костные фрагменты. На втором этапе для редукции полученного объема проводят второе центрифугирование клеточной взвеси в режиме 900g в течение 15 мин для получения окончательного объема суспензии (60 мл), для этого после центрифугирования удаляют часть супернатанта в контейнер №1. Таким образом, от момента эксфузии костного мозга и герметизации его в операционной до момента введения клеточного материала в сосудистое русло пациента сохраняется стерильность полученного образца. В конце процедуры выделения блокируются (запаиваются) трубки, соединяющие основной контейнер с контейнерами №1 и №2. Для внутрисосудистого введения используется клеточный материал из контейнера №2.
ПРИМЕР ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБА
Костный мозг, полученный в операционной при пункции плоских костей (грудины, подвздошных костей) в объеме 140 мл, стабилизированный с помощью раствора гепарина (25-30 ед на 1 мл костного мозга), вводится в основной пластиковый гематологический контейнер, соединенный трубками с двумя контейнерами №1 и №2; в него добавляется 6% гидроксиэтилкрахмал в объеме 1:2 (1 часть гидроксиэтилкрахмала и 2 части костного мозга). Система герметизируется в операционной. Проводится центрифугирование указанной взвеси с ускорением 700g в течение 15 мин, после чего с помощью фракционатора медицинского компонентов крови проводится удаление примесей жира и плазмы в контейнер №1, а мононуклеарную фракцию костного мозга, часть супернатанта и эритроцитов, примыкающих к линии разделения двух сред, переводится в контейнер №2, при этом в основном контейнере остаются сладжированные эритроциты и костные фрагменты. Для окончательного выделения МФКМ с оставлением необходимого объема плазмы (60 мл) необходимо второе центрифугирование клеточной взвеси в режиме 900g в течение 15 мин. В конце процедуры выделения блокируются (запаиваются) трубки, соединяющие основной контейнер с контейнерами. Для исследования клеточности полученного материала часть его (2 мл) может быть отдельно запаяна в ближайшей части одной из соединительных трубок. Таким образом, контрольная проба может быть взята на исследование без вскрытия основного контейнера, что является дополнительным положительным элементом предлагаемого способа. Для внутрисосудистого введения используется клеточный материал из контейнера №2. Разработанный способ выделения МФКМ подходит только для внутрисосудистого введения в любой орган при аутологичном использовании: в сердце, в печень, в почки. Возможен не только внутриартериальный способ введения, но и внутривенный, например, через пупочную вену в систему воротной вены печени.
Ограничения: данный способ не подходит для целей консервации стволовых клеток, для интрамиокардиального введения полученной взвеси МФКМ, для целей аллогенной трансплантации.
Оценка количества ядросодержащих клеток, количества мононуклеаров, количества стволовых гемопоэтических клеток (CD34+) с помощью проточной цитофлюориметрии в пробах при сравнительном выделении мононуклеаров с помощью предлагаемого способа и способа-прототипа показали сопоставимость полученных результатов, причем показатели по цитозу, количеству мононуклеаров и количеству гематопоэтических клеток оказалось лучше в предлагаемом способе (таблица 1), при этом время, затраченное на выделение МФКМ, с помощью способа-прототипа составило от 3 до 4 ч, а с помощью предлагаемого способа - 45 мин.
Пациент Н. и/б №17140 с/о
Прототип
Предлагаемый способ
Количество ядросодержащих клеток (в 1 л)
18,2×10<sup>9</sup>
28,4×10<sup>9</sup>
Количество мононуклеаров (в 1 л)
3,36×10<sup>9</sup>(18,5%)
6,5×10<sup>9</sup>(22,8%)
Количество CD 34+(в 1 л)
1,1×10<sup>7</sup> (0,6%)
2,6×10<sup>7</sup> (0,8%)
Абсолютное число клеток CD34+ в 50 мл взвеси
5,5×10<sup>6</sup>
13×10<sup>6</sup>
Жизнеспособность
96%
98%
Пациент П. и/б №18131 с/о
прототип
Предлагаемый способ
Количество ядросодержащих клеток (в 1 л)
9,36×10<sup>9</sup>
10,1×10<sup>9</sup>
Количество мононуклеаров (в 1 л)
1,05×10<sup>9</sup>(11,23%)
1,28×10<sup>9</sup>(12,76%)
Количество CD34+ (в 1 л)
3,1×10<sup>7</sup>(0,3%)
6,6×10<sup>7</sup>(0,61%)
Абсолютное число клеток CD34+ в 50 мл взвеси
1,5×10<sup>6</sup>
3,3×10<sup>6</sup>
Жизнеспособность
95%
100%
КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИМЕРЫ.
Пример 1. Больной В. 68 лет (и/б №17821 с/о). В 2001 году больному выполнена операция: аорто-коронарное шунтирование. В 2004 году в связи с рецидивом стенокардии была выполнена внутрикоронарная трансплантация МФКМ для целей регенерации микроциркулярного русла коронарных артерий. Выделение МФКМ осуществлялось вышеописанным способом. Через 1 год отмечено отчетливое уменьшение зоны недостаточного кровоснабжения левого желудочка по данным однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ); при этом имело место отчетливое улучшение клинического состояния: уменьшилось количество приступов стенокардии напряжения, исчезли приступы стенокардии в покое, улучшилась толерантность к физической нагрузке. Пациент перешел из IV во II функциональный класс стенокардии напряжения. Улучшение продолжается в течение 3 лет наблюдения.
Пример 2. Больной Ж. История болезни №1831 с/о 2004 г. Страдал ишемической болезнью сердца в течение 5 лет. При госпитализации имел III функциональный класс стенокардии напряжения. При ОФЭКТ выявлена зона гипоперфузии миокарда. При коронарографии обнаружена окклюзия огибающей коронарной артерии. Выполнить коронарную ангиопластику невозможно из-за окклюзии на большом протяжении. Во время коронарографии выполнено введение МФКМ в левую коронарную артерию (40 мл) и 20 мл в правую коронарную артерию. Процедуру больной перенес хорошо. Каких-либо изменений терапии или других процедур не было. Через 6 мес. существенно уменьшились приступы стенокардии напряжения, они возникают только при большой физической нагрузке. Контрольная ОФЭКТ выявила существенное улучшение перфузии миокарда.
Всего к 1 сентября 2011 года 170 больным выполнено введение МФКМ в коронарное русло. Осложнений не было. Клинически положительный результат подтвердился в виде уменьшения функционального класса стенокардии и сердечной недостаточности отмечают 97% больных. Инструментальное подтверждение уменьшения площади критической ишемии миокарда при оценке с помощью позитронно-эмиссионной томографии и однофотонной эмиссионной компьютерной томографии при наблюдении в динамике получено у 90% больных. У всех больных с хронической сердечной недостаточностью по данным эхокардиографии отмечалось улучшение сократительной способности миокарда. Эти данные показывают, что эффект внутрисосудистого введения МФКМ связан с усилением процессов кровоснабжения и регенерации в миокарде. Через 1 год положительный эффект сохраняется у 80% больных, через 5 лет - более чем у 60% больных.