Способ окраски нервных волокон на гистологическом препарате

Удалось показать, что на конформационную структуру продуктов холестеринового обмена можно активно воздействовать и изменять интенсивность ферментативного процесса синтеза либо деградации холестерина. Нами установлено, что уже на 5-6 неделе беременности в ворсинках хориона начинается синтез 5а-холестанола (рис. 5), активность превращения которого на этом этапе выражена слабо. По мере нарастания сроков плацентации эмбриона реакция на 5а-холестанолдегидрогеназу становится интенсивнее. У женщин , перенесших ОРВИ, активность 5а-холестанолдегидрогеназы снижается. Степень активности 5а-холестанола зависит по-видимому от конформационной структуры холеста-нола. Предварительное облучение субстрата лазерными лучами резко снижает интенсивность холеста-нолдегидрогеназной реакции (рис. 6). Во втором и, особенно, в третьем триместрах в симпласте хориальных ворсинок выявляется активная реакция на сквалендегидрогеназу, что свидетельствует о высоком уровне синтеза холестерина в плаценте беременной (рис. 7). На самом последнем этапе образования холестерина мы встречаемся с синтезом 7-дигидрохолестерина, присутствие которого нам удалось установить в хориальном симпласте, по активной реакции на 7-дигидрохолестериндегидрогеназу. Молекула 7-дигидрохолестерина весьма лабильна, также как и 5а-холестанола, что позволило нам прибегнуть к возможному конформационному изменению ее путем облучения лучами лазера до проведения гистохимической реакции.

После такого воздействия реакция на дигидрохо-лестериндегидрогеназу резко снижается (рис. 8). Подобные изменения возможны и в организме беременной, когда наличие вирусных токсинов могут

изменять конформационную структуру субстрата и нарушить синтез холестерина, что и отмечено нами при гриппе и герпесе у беременных.

Второй комплекс исследований касается превращения холестерина в сторону образования половых гормонов: прогестерона, эстриола, андрогенов. На этом пути мы сталкиваемся, прежде всего, с окислением молекулы холестерина и образованием крайне необходимого для синтеза гормонов промежуточного продукта деградации холестерина дегидроэпиандро-стендиола.

Нами разработаны реакции выделения в плаценте беременных как холестеролдегидрогеназы (рис. 9-11), так и дегидроэпиандростендиолдегидрогеназы (рис. 12). Обе эти реакции легко могут подвергаться изменениям в своей интенсивности под влиянием токсических продуктов инфицирования вирусами в результате чего начинает страдать как синтез прогестерона, так и эстрогенов. Таким образом, фето плацентарная недостаточность развивается у беременной, по-видимому, вследствие глубоких конфор-мационных изменений промежуточных продуктов холестеринового обмена на пути формирования гормонов в плаценте под влиянием вирусных токсинов, присутствующих вследствие заболевания верхних дыхательных путей, особенно в первом или втором триместрах беременности.

ЛИТЕРАТУРА

1. Физер Л. Синтезы органических препаратов. -М.: Издатинлит, 1956.- Вып. 7.- С. 72.

2. Стероиды: Пер. с англ./ Л.Физер, М.Физер.-М., 1964.

3. Chevreul M. Note sur le sucre de diabetes// Ann. Chim. (Paris).- 1815.- Vol. 95.- P. 319.

УДК: 611-018.83:611.2 В.И.Кириченко, М.Т.Луценко, В.Я.Ерофеев СПОСОБ ОКРАСКИ НЕРВНЫХ ВОЛОКОH НА ГИСТОЛОГИЧЕСКОМ ПРЕПАРАТЕ

РЕЗЮМЕ

Разработан высокоселективный метод выявления нервных волокон и чувствительных нервных окончаний в органах дыхательной системы, основанный на использовании комплексной соли ионов Со2+' Способ позволяет получить более полную и четкую картину распределения нервных структур во всех тканевых компонентах легких.

SUMMARY

V.I. Kirichenko, M.T. Lutsenko, V.Ya. Erofeev

NERVE FIBER DYING TECHNIQUE ON MICROSCOPIC SECTIONS

Highly selective method for showing nerve fibers and sensitive nerve endings in respira-

tory system organs, based on complex Co2+ ion salt. The method allows to show nerve structure distribution in all lung tissue elements.

Изобретение относится к медицине, а именно к нейрогистологии [1]. В литературе отсутствуют данные о применении соединений кобальта для визуализации структур периферической нервной системы во внутренних органах [2].

Цель настоящего исследования - разработка метода избирательного выявления нервных структур легких (сплетений, одиночных нервных волокон, рецепторных приборов) с помощью комплексного соединения кобальта в сочетании с диметилсульфоксидом (ДМСО).

Материалом в данной работе являлись легкие взрослых крыс (n=70), кроликов (n=5) и человека (использовался постоперационный материал 2-х больных).

Приготовление исходных растворов.

а) 5%-ный раствор глюкозы: 5 г глюкозы растворить в 95 мл дистиллированной воды, профильтровать и охладить до 10-15°С;

б) 10%-ный раствор нейтрального формалина: к 10 мл нейтрального формалина добавить 90 мл дистиллированной воды. Хранить при комнатной температуре.

в) 0,3-0,6% раствор сульфида натрия:1-2 г Na2S^9H2O растворить в 98-99 мл дистиллированной воды и добавить по каплям концентрированную азотную кислоту до pH 7,3-7,4. Температура раствора комнатная;

г) 260 мМ раствор азотнокислого кобальта:

0,378 г Co (NO3)26H2O растворить в 5 мл дистиллированной воды, профильтровать и охладить до 10-15

°С;

д) 88 мМ раствор цистеина: 0,54 г цистеина основания растворить в 5 мл дистиллированной воды, профильтровать и охладить до 10-15°С. Следует учесть, что реакционная способность цистеина падает и поэтому необходимо применять по возможности свежий реактив. Вместо цистеина с таким же успехом может быть использован восстановленный глу-татион (88 мМ). Глутаминовая кислота и глутамин дают результаты несколько хуже;

е) комплекс кобальт-цистеина: слить одинаковые количества растворов "г" и "д", профильтровать и охладить до 10-15 °С.

Конечные концентрации ингредиентов составляют: азотнокислого кобальта - 130 мМ, цистеина - 44 мМ. Раствор при этом темнеет и приобретает коньячный цвет, а pH его находится в пределах 3,4-3,6. Этим раствором можно пользоваться. Однако для ускорения диффузии к комплексу необходимо добавить диметилсульфоксид в количестве 1-2%.

Практическое исполнение метода

Сразу же после забоя животного (путем декапи-тации или введения воздуха в ушную вену) вскрыва-

ют грудную клктку, в области правого желудочка сердца делают надрез и в легочную артерию вводят канюлю, надетую на шприц. Канюлю закрепляют с помощью шелковой лигатуры. Одновременно пересекают легочные вены с целью создания свободного оттока.

Затем легкие осторожно перфузируют в течение 2-3 минут 5%-ным раствором охлажденной глюкозы до освобождения органа от крови. Кусочек легкого человека, резецированный во время операции, также отмывают от крови, инъецируя глюкозу в долевую или сегментарную артерию. После окончания перфузии легкие вместе с сердцем извлекают из грудной клетки и в трахеобронхиальное дерево (у человека -интрабронхиально) вводят 5-10 мл охлажденного кобальт-цистеинового комплекса. Трахею перевязывают и весь органокомплекс помещают в стаканчик с этой же жидкостью.Через 15-20 минут воздухоносные пути освобождают от раствора соли кобальта промыванием 5%-ной глюкозой.

В систему легочной артерии (у человека в долевую или сегментарную) вводят 30-70 мл раствора сульфида натрия и помещают весь органокомплекс в эту же жидкость на 15-20 мин. При этом легкое темнеет и приобретает мраморный вид. Все перфузион-ные мероприятия следует проводить с большой осторожностью во избежание разрыва сосудов или бронхов, что неизменно приводит к отрицательным результатам. Далее сосудистую систему легких отмывают от сульфида натрия 5%-ным раствором глюкозы и перфузируют с целью фиксации 10%-ным нейтральным формалином, в который и помещают орган на 2-24 часа.

Срезы толщиной 20-40 мкм изготавливают на замораживающем микротоме, наклеивают на предметные стекла, высушивают, обезвоживают, заключают в бользам и изучают под световым микроскопом. Возможна также докраска препаратов общегистологическими красителями. Со временем препараты бледнеют и выцветают. Для длительного сохранения гистологической картины и усиления контраста нервных структур срезы перед заключением после тщательной, но не долгой (вымывается сульфид кобальта) промывки в дистиллированной воде помещали в 0,1-0,2%-ный раствор азотнокислого серебра, промывали в нескольких порциях дистиллированной воды и обрабатывали в течение 15-20 минут при температуре 37°С в проявляющей жидкости нашей модификации следующего состава:

25%-ный гуммиарабик - 24 мл;

Проявитель - 9 мл;

10%-ное азотнокислое серебро - 0,3 мл.

Приготовление физического проявителя: лимонная кислота СбИ807И20 - 5,5г, дистиллированная вода - 92 мл, гидрохинон - 2,0 г. Раствор необходимо фильтровать.

После проявления срезы промывали в дистиллированной воде, обезвоживали и заключали в канадский бальзам.

Рис. Кольцевидно-сплетениевидная аффрентная формация с обширным рецепторным прибором в утолщеной межальвеолярной перегородке. Легкое нормальной крысы. Об. 90 нмм., ок. 7. Микрофото.

Результат. Конечный продукт реакции черного цвета, представленный сульфидом кобальта или металлическим серебром, селективно маркирует нервные структуры во всех тканевых компонентах легких. При этом фон остается совершенно светлым. Лишь иногда в стенках кровеносных сосудов окрашиваются коллагеновые волокна и выпадает неспецифический осадок в интерстициальной ткани легких. Однако этот феномен имеет место только в случае использования старого цистеина или же при разрыве кровеносных сосудов во время перфузии.

Метод позволяет избирательно выявлять нервные сплетения в интерстициальной ткани легкого, одиночные нервные проводники, характеризующиеся многократным дихотомическим ветвлением, рецепторные приборы различной сложности в соединительнотканной основе легких и в стенках альвеол, а также в оболочках кровеносных сосудов (рис.). Спо-

соб обладает большим разрешением и выявляет довольно тонкие (порядка 0,2-0,4 мкм) нервные волокна во всех отделах легких. Согласно нашим данным метод позволяет маркировать кальциевые каналы, поскольку ионы Со2+ являются их блокаторами. Об этом же свидетельствуют наши эксперименты на крысах с внутрибрюшинным введением изоптина (верапамила), также являющегося блокаторами Са -каналов. При этом прокраска нервных структур резко снижается.

Таким образом, предлагаемый кобальт-сульфидный (КС) метод для изучения нервных структур легких отличается высокой селективностью, прост в использовании, не требует больших количеств солей благородных металлов и позволяет получить полную картину организации нервного аппарата органа. При соответствующей модификации способ может быть использован для выявления нервных приборов других органов.

Формула изобретения

Способ окраски нервных волокон на гистологическом препарате путем импрегнации в растворе, содержащем азотнокислый кобальт, и осаждение кобальта сульфидом натрия, отличающийся тем, что с целью улучшения контраста нервных структур в органах импрегнацию проводят при 10-15°С и pH 3,53,8 раствором, дополнительно содержащим цистеин и диметилсульфоксид при следующих соотношениях компонентов, мас. %:

азотнокислый кобальт - 12,0-13,0;

цистеин - 44-65;

диметилсульфоксид - 1-2;

вода - остальное.

При этом осаждение проводят 0,3-0,6%-ным раствором сульфида натрия с pH 7,3-7,4.

ЛИТЕРАТУРА

1. А.с. 1675726, СССР, Способ окраски нервных волокон на гистологическом препара-те/В.И.Кириченко, М.Т.Луценко, В.Я.Ерофеев//Бюл.-1991.-№33.

2. Ромейс Б. Микроскопическая техника. М.: Мир- 1953.