Распространение генов комплекса immune evasion cluster и других факторов вирулентности у Staphylococcus aureus

Распространение генов комплекса Immune evasion cluster и других факторов вирулентности у Staphylococcus aureus

В.В. Гостев1, А.Е. Гончаров2, М.А. Грачева3, С.В. Сидоренко1

1 ФГБУ «НИИ детских инфекций ФМБА России», Санкт-Петербург, Россия

2 ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И.Мечникова» Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия

3 ООО «Рош Диагностика Рус», Москва, Россия

В горизонтальном переносе генов вирулентности у Staphylococcus aureus значительную роль играют бактериофаги семейства Siphoviridae. Так, фаги интегразной группы 3 переносят гены стафилокиназы (sak), ингибитора системы комплемента (scn), ингибитора хемотаксиса лейкоцитов (chp), энтеротоксинов А и Р (sea, sep). Перечисленные гены обеспечивают защиту бактерий от действия неспецифического иммунитета хозяина и объединяются в Immune Evasion Cluster - IEC (кластер уклонения от иммунитета). Распространение различных типов IEC, а также генов других факторов вирулентности (seb, lukSF, tsst) было изучено среди изолятов MRSA (n=231) и MSSA (n=60) различных agr групп. Комплекс IEC был выявлен у 99% S. aureus. Среди MRSA преобладали изоляты, относящиеся к agr I - 94% (218), среди них IEC типа D был выявлен у 65% (151); у 15% (35) изолятов выявлены F/A типы (sak, chp, scn, sea/sep),

типы E и В, нетипируемые варианты выявлены у 13% (29). Проведенное полногеномное секве-нирование изолята MRSA с типом D показало, что IEC локализован в интактном профаге (40 тыс. п.н.). Гены tsst были обнаружены у 7% (16) изолятов MRSA, генов lukSF и seb обнаружено не было. Среди MSSA, напротив, были выявлены изоляты, относящиеся к различным адг-группам, но преобладали agr I c элементами IEC следующих типов: E (18%, 11), B (25%, 15), D (13%, 8). MSSA, относящиеся к agr II, имели IEC A/F (8%, 5), IEC B (8%, 5). У 20% (12) был выявлен seb и у 5% (3) обнаружены гены lukSF, которые всегда были ассоциированы с IEC E типа. Не выявлено зависимости между принадлежностью стафилококков к различным agr группам и IEC-типам или наличием lukSF, seb и tsst.

Ключевые слова: комплекс IEC (Immune evasion cluster), MRSA, MSSA, PVL, agr-типирование, вирулентность.

Distribution of Immune Evasion Cluster Genes and Genes Encoding Other Virulence Factors among Staphylococcus aureus

V.V. Gostev1, A.E. Goncharov2, M.A. Grachyova3, S.V. Sidorenko1

1 Research Institute of Pediatric Infections, Saint-Petersburg, Russia

2 North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov, Saint-Petersburg, Russia

3 LLC «Roche Diagnostics Rus», Moscow, Russia

Siphoviridae family bacteriophages are known to play a major role in horizontal transfer of virulence genes among Staphylococcus aureus. Integrase group 3 phages trans-

Контактный адрес:

Сергей Владимирович Сидоренко

Эл. почта: sidorserg@niidi.ru

fer genes encoding staphylokinase (sak), staphylococcal complement inhibitor (scn), chemotaxis-inhibitor protein (chp), enterotoxins A and P (sea, sep). These genes protect bacteria from host innate immunity and jointly referred as to Immune Evasion Cluster (IEC). Distribution of different IEC types as well as genes encoding other virulence factors (seb, lukSF, tsst) was studied among

MRSA (n=231) and MSSA (n=60) isolates belonging to different agr groups. IEC was found in 99% of S. aureus isolates. The most prevalent among MRSA isolates were agr I (94%), of which IEC type D was detected in 65%; IEC types F/A (sak, chp, scn, sea/sep), types E and B were found in 15%; non-typing variants were revealed in 13% of isolates. Genome-wide sequencing of a MRSA isolate with IEC type D showed that IEC is located in the intact prophage (40 kbp). Tsst genes were found in 7% (16) of MRSA isolates; there were no lukSF and seb genes detected. In contrast, isolates from different agr groups

were found in MSSA; however, isolates from agr I group were predominant and had the following IEC types: E (18%), B (25%), and D (13%). MSSA isolates from agr II group had IEC types A/F (8%) and type B (8%). Seb gene was detected in 20% of isolates; lukSF genes were found in 5% of isolates and associated with IEC type E. No relationship between agr groups and IEC types or presence/ absence of lukSF, seb and tsst genes was determined.

Key words: immune evasion cluster (IEC), MRSA, MSSA, PVL, agr typing, virulence.

Введение_

Staphylococcus aureus традиционно относят к условным патогенам, инфекции кожи и мягких тканей - наиболее частые нозологические формы, вызываемые S. aureus, однако он может вызывать инфекционные процессы практически любой локализации. По сравнению с другими представителями этого рода золотистый стафилококк обладает существенно более широким набором факторов вирулентности [1-2]. На сегодняшний день у S. aureus описано 16 различных адгезинов, 8 экзо-энзимов, 4 гемолизина, 20 энтеротоксинов, а также эксфолиативные токсины, экзотоксины, лейкоци-дины [2]. Некоторые из перечисленных факторов опосредуют развитие специфических поражений тканей и характерной клинической картины. Так, энтеротоксины вызывают тяжелый гастроэнтерит, токсин синдрома токсического шока активирует экспрессию интерлейкинов (ИЛ-1 и ИЛ-2) и фактора некроза опухолей, что и приводит к развитию токсического шока [3-5]. Порообразующий токсин - лейкоцидин Пантона-Валентайна (Panton-Valentine leukocidin, PVL), лизирующий лейкоциты, моноциты и макрофаги, участвует в развитии геморрагических явлений в различных тканях и некротизирующих пневмоний [6-7].

Факторы, защищающие бактерии от действия системы врожденного иммунитета хозяина, учитывая их общую функциональную направленность, предлагается объединять в одну группу, охватив 38 таких факторов, описанных на сегодняшний день [8]. В эту группу включают и факторы, входящие в состав недавно охарактеризованного комплекса IEC (Immune evasion cluster) [9]. В IEC могут входить: стафилокиназа (ген sak), обладающая фибринолитической активностью, активирующая плазминоген и инактивирующая a-дефензины [10]; ингибитор активации комплемента, блокирующий СЗ-конвертазу (ген scn), [11]; ингибитор хемотаксиса лейкоцитов (ген chp) [12]; активатор Т-клеточного звена иммунитета, обладающий свой-

ствами суперантигена и обуславливающий мощную активацию T-клеток, что приводит к развитию токсического шока (ген sea); энтеротоксин Р (ген sep), также обладающий свойствами суперантигена. Описано 7 типов IEC комплекса (A - G), различающихся по составу входящих в них факторов вирулентности [9].

Многие детерминанты патогенности закодированы в стафилококковых профагах семейства Siphoviridae, которые могут входить в состав островков патогенности в структуре геномов S. aureus [13]. Как правило, один профаг привносит в хромосому только одну какую-либо детерминанту вирулентности (например, фаг Ф-PVL), однако существуют фаги, которые встраивают сразу несколько генов. Примером таких вирусов служат бактериофаги интегразной группы 3, несущие описанный выше IEC комплекс, и встраивающиеся в ген в-гемолизина (hlb) в уникальном локусе, «разрывая» его на две части. Считается, что бактериофаги, несущие IEC, в отличие от других вирусов, выявляются у 90% S. aureus, выделенных от человека, и проявляют необычно высокую степень стабильности в геноме бактериальной клетки [14], однако детали распространения разных типов IEC и возможность его ассоциации с другими факторами вирулентности изучены недостаточно.

Говоря о патогенности, нельзя не упомянуть о регуляторных системах S. aureus, участвующих в контроле экспрессии генов - детерминант вирулентности. Одна из таких систем - agr (Accessory gene regulator), регулирующая, как экспрессию различных генов домашнего хозяйства, так и многих факторов вирулентности, и участвующая в реакциях quorum sensing. Эта система состоит из пяти генов (agrABCD и d-гемолизин), при этом область agrD - agrC генов имеет вариабельную структуру. По вариабельным участкам выделяют четыре группы agr (I-IV) и множество типов, именно на этом основано agr-типирование [15-16]. В ряде работ была продемонстрирована связь agr групп/ типов с принадлежностью S. aureus к различным

генетическим линиям, а также связь с наличием разных факторов вирулентности [17-18]. В ранних работах даже высказывалось мнение о взаимосвязи стафилококков agr группы II со снижением чувствительности к гликопептидам [19]. В нашем исследовании в качестве дифференцировки изолятов мы использовали этот вариант типирования.

Целью настоящей работы была оценка распространения среди MRSA и MSSA разных типов IEC-комплекса и таких факторов вирулентности как lukSF, tsst и seb.

Материалы и методы исследования

Бактериальные изоляты. В работу включены изоляты MRSA (n=231) и MSSA (n=60), выделенные от больных с разными формами стафилококковых инфекций, включая носителей. Штаммы были собраны в 2011-2012 гг. из 9 регионов страны. В исследовании использованы следующие контрольные штаммы: S. aureus NCTC 8325 (hlb+, sak+, chp+, scn+), S. aureus CCUG 47167 (PVL+), S. aureus SMI Sa778 (tsst+), S. aureus SMI Sa774 (sea+).

Идентификация культур. Идентификацию

S. aureus проводили на MALDI-TOF масс-спектрометре «Microflex LT» (Bruker Daltonics, Германия). Дифференцировку MRSA и MSSA проводили по уровню чувствительности к цефокситину (FOX), в соответствии с критериями CLSI 2011-2012, детекцию гена mecA осуществляли методом ПЦР.

ПЦР типирование. Выделение тотальной бактериальной ДНК проводили с помощью наборов «ДНК-сорб Б» (АмплиСенс, Россия). Подбор прай-меров, а также расчет мультиплексных сетов, множественные выравнивания и оценку специфичности осуществляли соответственно в Oligo v.7.0, ClustalW и NCBI BLAST. В качестве мишеней для ПЦР были выбраны следующие гены IEC: chp, scn, sak, sea, sep, а также гены других факторов вирулентности: tsst, lukS и lukF (PVL), seb. Детекцию IEC и PVL проводили в мультиплексных реакциях, детекция остальных мишеней была в моноплек-сном варианте. Комбинации праймеров и их концентрации в реакционных смесях, а также размеры ампликонов представлены в табл. 1. Праймеры Seap амплифицируют оба энтеротоксина (А и Р), поэтому дополнительно детектировали sep, а agr -типиро-вание проводили по [20]. Праймеры синтезированы в ЗАО «Евроген» (Россия). Для ПЦР использовали готовые мастермиксы «HS-ScreenMix» (ЗАО «Евроген») в конечном объеме 25 мкл на реакцию/ мультиплекс. Амплификацию проводили в термо-циклере «Терцик» («ДНК-Технология», Россия). Для всех ПЦР, за исключением мультиплекса IEC 2, был подобран следующий температурный

протокол: предварительная денатурация при 95 °С - 5 мин., далее 32 цикла: 95 °С - 10 с, 50 °С - 10 с (для мультиплекса IEC 2 этот этап изменен: 56 °С -15 с), 72 °С - 20 с, финальная элонгация при 72 °С -5 мин.

Полногеномное секвенирование. В работе частично представлены результаты секвенирова-ния (локус профага с комплексом IEC) одного клинического изолята SA0077. Полногеномное секвенирование проводили на приборе «GS Junior» («454/Roche») с приготовлением библиотек случайных фрагментов ДНК (ShotGun) по стандартному протоколу Rapid Library.

Результаты и обсуждение

IEC и agr-типирование. Проведенное agr-типирование показало гомогенную структуру популяции MRSA, подавляющее большинство изолятов относилось к agr I группы (94%). Среди MSSA были выявлены agr II (28%), agr III (9%), agr IV (5%), но преобладали agr I группы (56%). Как отмечалось ранее, разные agr-группы могут быть ассоциированы с определенными факторами вирулентности. Так, в работе [17] авторы, используя различные методы молекулярного типирования, выявили следующие особенности. Изоляты S. aureus, принадлежащие к agr I, представляли собой весьма разнородную группу, куда входили внутри-и внебольничные изоляты, архаичные варианты MRSA и редкие спорадические штаммы; agr II-III групп авторы описывают как преимущественно внутрибольничные эпидемические клоны MRSA. И, наконец, agr IV -достаточно редкая группа, имеющая сходство с agr I.

Дальнейшей нашей задачей было определить зависимость между различными типами IEC и принадлежностью стафилококков к agr группам. Результаты agr и IEC-типирования представлены в табл. 2. Так, гены комплекса IEC были обнаружены у 99% стафилококков из всей выборки, и только у трех изолятов MRSA они не детектировались. Среди MRSA agr I преобладали IEC, относящиеся к D типу (65%); изоляты, обладающие полным комплексом генов, F и A типы, составили соответственно 15 и 0,4%. Стоит отметить, что такие стафилококки были выделены преимущественно от больных с тяжелыми формами инфекций. Типы E и B были определены соответственно у 9 и 1% изолятов. Не классифицированные варианты IEC, положительные только по sak или по двум генам sak и sea, обнаружены у 3% MRSA. Среди MRSA, относящихся к II-IV группам agr, на долю которых приходится 6%, встречаются преимущественно также IEC с D типом (5,4%). Тип С не был выявлен.

Таблица 1. Праймеры и мультиплексы, использованные в работе

Название Последовательность праймеров 5'-3' Ампликон, п.н.* c** Мишень

Детекция mecA

Mec-F Mec-R AAGTTTGCATAAGATCTATAA ATTTATGTATGGCATGAGTAA IEC Мультиплекс i 672 0,6 mecA, маркер MRSA

Chp-F Chp-R AACCGTTTCCTACAAATGAAG TTACATAAGATGATTTAGACT 318 0,8 chp, ингибитор хемотаксиса

Scin-F Scin-R TGTTTAAACTTCCAGTAGCTA AATCTATACTTGCGGGAACTTTAGC IEC Мультиплекс 2 192 0,4 scn, ингибитор комплемента

Seap-F Seap-R AGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAATG TGTCCTTGAGCACCAAATAAATCG 611 0,8 sea/sep энтеротоксины А, Р

Tsst-F Tsst-R ACCACCCGTTTTATCGCTTGAAC AACACAGATGGCAGCATCAGC 348 0,4 tsst, токсический шок

Sak-F Sak-R ACCTTTGTAATTAAGTTGAATCCAG CTATTAAACCTGGGACTACACTTAC PVL мультиплекс 3 250 0,6 sak, стафилокиназа

Pvl1-F Pvl1-R GCATGAGTAACATCCATATT CCCATTAGTACACAGTGGTT 120 0,6 /ukS-субъединица PVL

Pvl2-F Pvl2-R TTCAACATCCCAACCAATTT AATACTCAAAGCTGCTGGAA Детекция seb 349 0,6 /ukF-субъединица PVL

Seb-F Seb-R AACCAGATCCTAAACCAGATGAG GGTGCAGGCATCATGTCATAC Детекция sep 604 0,6 seb, энтеротоксин В

SEP-F SEP-R AATCATAACCAACCGAATCA TCATAATGGAAGTGCTATAA 500 0,6 sep, энтеротоксин P [9]

Примечание: * - пар нуклеотидов; ** - конечная концентрация каждого праймера в реакционной смеси, мкмоль.

Несколько иначе выглядит распределение IEC у MSSA. Так, у стафилококков agr I группы превалировали B (25%) и E (18%) типы IEC. Изоляты, принадлежащие к agr II (28%), имели различные комплексы IEC (E, C, D, A), но преимущественно типировались как B (8%) и F (8%). Среди MSSA agr III группы выявлены B, D и E типы IEC и один изо-лят, положительный по генам sak; chp не классифицирован. Не было выявлено комбинации генов sep, sak и scn (G-тип) ни среди MRSA, ни среди MSSA. Следовательно, у MSSA доминирующими комплексами IEC выступают B и E типы, причем последний, как будет отмечено ниже, наиболее часто ассоциирован с другими факторами вирулентности.

Таким образом, не выявлено прямой зависимости между наличием IEC и принадлежностью S. aureus к определенной agr группе. Однако четко

прослеживается один доминирующий кластер MRSA, относящийся к agr I и имеющий IEC D. В исследовании van Wamel W. c соавт. [9] распределение IEC отличается: так, в частности у изоля-тов S. aureus, относящихся к agr I, чаще выявлялся B тип (19%), F тип не обнаруживался. Среди agr II преимущественно типировались стафилококки с IEC C типа (12%).

Строение наиболее часто встречающегося D-типа IEC было полностью подтверждено проведенным полногеномным секвенированием изолята SA0077 (схема). IEC входит в структуру интак-тного профага (40 тыс. п.н.), который встроен в ген бета-гемолизина, представленный в виде двух частей размером 240 и 870 п.н. Рассматриваемый комплекс имеет неизмененные гены scn, sak и sea, ген вирусной интегразы int (1038 п.н.) относится к

Таблица 2. Результаты agr-типирования и детекции IEC

Изоляты

Группа agr

IEC

% (n)1

Источники выделения

MRSA mecA+ FOX(R) n=231

II

III

IV

D

F E

A

scn, sak, sea scn, chp, sak, sep sak, scn

sak, sea scn, chp, sak sak

scn, chp, sak, sea

4

65 (151) Различные2

15 (34) Ожоговые раны, сепсис

9 (19) Остеомиелиты, флегмоны, пневмонии, сепсис, абсцессы

2 (5) Различные

1 (3) Различные

1 (2) Различные

0,4 (1) Ожоговая рана

1 (3) Различные

D scn, sak, sea E sak, scn D scn, sak, sea

5 (11) Различные

0,4 (1) Рана, остеомиелит

0,4 (1) Нет данных

MSSA mecA~ FOX (S) я=60

I

II

III

IV

B

E

D

scn, chp, sak sak, scn

scn, sak, sea

25

13

Носители, кровь/сепсис5

Носители, носоглотка, мокрота, пневмония, раны, остеомиелит

Рана, остеомиелит

F B E C D A

scn, chp, sak, sep scn, chp, sak sak, scn scn, chp scn, sak, sea scn, chp, sak, sea

7 (4) Различные

8 (5) Абсцессы, различные 7 (4) Носители, носоглотка 3 (2) Носители, носоглотка 1,6 (1) Носитель, носоглотка 1,6 (1) Нет данных

B D

E

scn, chp, sak scn, sak, sea sak, scn sak, chp

3 (2) Носители, носоглотка, кожа

3 (2) Различные

1,6 (1) Носитель, носоглотка

1,6 (1) Носитель, носоглотка

E

sak, scn

5

Носитель, носоглотка

Примечание: 1 - данные представлены в %, в скобках - абсолютные значения; 2 - наиболее распространенный тип 1ЕС среди MRSA; 3 - неклассифицированные варианты; 4 - результаты ПЦР по всем пяти генам 1ЕС отрицательные; 5 - только один изолят в этой группе был выделен из крови при сепсисе.

тип

гены

I

3

B

III группе, и степень нуклеотидной гомологии при сравнении с другими геномами S. aureus составляет при выравнивании в BLAST 92-100%. Как было продемонстрировано в работе C. Goerke и соавт. [21], такие фаги широко распространены, как среди изолятов, колонизирующих носоглотку носителей, так и среди инвазивных изолятов и встречаются среди важнейших генетических линий S. aureus. Считавшееся ранее утверждение, что гемолизин-продуцирующие стафилококки могут быть маркером инвазивности, стоит теперь интерпретировать по-другому: как видно, исчезновение функции гемолиза связано с наличием профага, который, в свою очередь, несет дополнительные потенции для развития инфекционного процесса.

Бактериофаги являются для прокариот важным механизмом обмена генетической информацией, при этом выступая как векторы и как элементы, привносящие новые функциональные возможности. Конечно, при этом неизбежен «биологический компромисс» между механизмами защиты от лизо-генных фагов, а с другой стороны, наоборот, он необходим для интеграции вируса [13, 21]. Именно поэтому у S. aureus имеется выраженная регуляция этого процесса: во-первых, исследования показывают, что разные генетические линии обладают своими уникальными паттернами генов, в том числе и IEC, обуславливающих «уход» от действия иммунной системы (т.е. внутри каждой линии существует своя фаговая селекция); во-вторых, при попадании

orf

lytA

5'

'' êfl ;

г---J \

#

Структурные гены фага, модули лизогении, морфогенеза и лизиса

У

х i.----

0,24 1,2 0,35 1,5 0,49

2,20 0,78

27 1 0,87

Длина локусов, тыс. п. н.

Схема строения IEC D-типа изолята MRSA SA0077 по данным полногеномного секвенирования Примечание. Комплекс генов scn, sak и sea (серая заливка) входит в состав профага, который встроен в ген hlb (две части: hlb1, hlb2). Пунктирными линиями обозначены участки локализации генов chp (IEC - A, B, C, F) и sep (IEC - F, G). Прямоугольные участки (без заливки) соответствуют структурным генам профага. Гены lytA - фаговые амидазы участвуют в процессах перестройки пептидогликана при лизисе, orf - не охарактеризованные фаговые гены, int - интеграза (ген, участвующий в процессе интеграции вируса в хромосому). Черные стрелки указывают точки отжига специфических праймеров, использованных в исследовании. Схема составлена на основе анализа и аннотаций, полученных с помощью PHAST PHAge Search Tool (http://phast. wishartlab.com/).

в новую среду (например, при смене хозяина) стафилококкам необходимы механизмы, повышающие адаптационный потенциал. Этот факт подтверждается тем, что у «ветеринарных» S. aureus отсутствует IEC, но при смене хозяина на человека происходит интеграция вирусов [8, 14, 22].

Типирование lukSF, tsst и seb. Известно, что MSSA и MRSA различаются, как по принадлежности к различным генетическим линиям (клональ-ности), так и по спектру детерминант вирулентности, причем оказывается, что госпитальные MRSA фенотипически часто оказываются менее вирулентными [1, 23]. Ситуация кардинальным образом изменилась с появлением в 1990 гг. внебольнич-ных MRSA в человеческой популяции - community acquired MRSA (CA-MRSA). CA-MRSA обладают отличительной чертой - это высокая вирулентность наряду с отсутствием ассоциированной антибиоти-корезистентности. Одним из маркерных признаков CA-MRSA является наличие токсина PVL [24]. На сегодняшний день CA-MRSA (PVL+) распространены во многих странах мира, например в США циркулирует клон USA300, в странах Европы - кло-нальный комплекс 80 [25-26]. Неблагоприятными регионами можно считать страны Азии, где частота выявления CA-MRSA достигает 30-40%. В географически близких к России регионах Европы, в частности в Польше [27] и Латвии [28] также

описаны случаи внебольничных инфекций MRSA (PVL+). Данные о распространении CA-MRSA в России немногочисленные, но первые сообщения были с Дальнего Востока [29-30]. В настоящем исследовании MRSA (lukSF+) не выявлены. Из других генов вирулентности у MRSA были выявлены только tsst (7,2%) и в большинстве случаев они ассоциированы с Е-типом 1ЕС комплекса (табл. 3). Все MRSA tsst (+) были выделены из одного региона и относились к agr I.

В отличие от MRSA, среди MSSA были выявлены изоляты, имеющие все рассматриваемые гены вирулентности. Так, были выявлены стафилококки с lukSF, все они были ассоциированы с Е-типом 1ЕС (5%), но относились к agr II и IV. Подобные изоля-ты представляют определенный интерес, поскольку они могут являться источником распространения такого опасного фактора. В целом, частота выделения рассматриваемых стафилококков, по данным различных авторов, колеблется в пределах 5-30%. Так, например, в США частота встречаемости MSSA (PVL+), выделенных из носоглотки здоровых людей, составляет не более 5% [31-32]. Противоположная ситуация наблюдается в странах Азии, где этот показатель достигает 30% [33]. Конечно, как отмечалось выше, наибольшую тревогу вызывают CA-MRSA (PVL+), которые циркулируют на всех континентах. В проведенном иссле-

Таблица 3. Типирование PVL, tsst, seb и ассоциации с IEC

Изоляты Группа agr ТипIEC Гены вирулентности % (n) Источники выделения

E tsst 6 (13) Остеомиелиты, флегмоны

MRSA I B tsst 1 (2) Носоглотка

D tsst 0,4 (1) Рана, остеомиелит

B seb 15 (9) Носители, кровь/сепсис

I E seb 1,6 (1) Носители, носоглотка

D tsst 3 (2) Рана, остеомиелит

MSSA E tsst 1,6 (1) Мокрота, пневмония

II B seb 3 (2) Абсцессы

E lukS, lukF(PVL) 3 (2) Носители, носоглотка

III B tsst 3 (2) Носители, носоглотка, кожа

IV E lukS (PVL) 1,6 (1) Носитель, носоглотка

довании обращает на себя внимание также высокая доля seb-позитивных MSSA (20%). Стафилококки, имеющие seb, относились к agr I и II группы и имели IEC B-типа (18%) или E-типа (1,6%). Здесь стоит отметить, что ген seb встречается только среди изолятов c вышеуказанными IEC, в структуре этих комплексов отсутствует энтеротоксин А. Действительно, если проанализировать сравнительную патогеномику S. aureus, то можно обратить внимание, что оба рассматриваемых энтеротоксина не встречаются вместе в одной стафилококковой хромосоме [2]. Ген токсического шока (tsst) был выявлен у нескольких изолятов (8%), относящихся к различным agr-группам (I, III) и имеющих разные типы IEC (E, D, B).

Как видно, исходя из сравнения частоты встречаемости IEC, lukSF, tsst и seb у MRSA и MSSA, последние проявляют выраженную гетерогенность, а также имеют в популяции значительно больше факторов вирулентности. Это может быть объяснено разной биологической стратегией выживания этих двух групп стафилококков. Так, в популяции человека MSSA крайне разнообразны и образуют мультиклональные структуры, при этом ассоциированы они с различными факторами вирулентности, селекция штаммов в данном случае носит неопределенный характер. Экологической нишей MRSA преимущественно выступает стационарная среда, где условия относительно постоянны, но при этом такие стафилококки накапливают детерминанты устойчивости к антибактериальным препаратам, что опосредовано селекцией штаммов. Иными словами, MRSA биологически выгоднее аккумулиро-

вать резистентность, но при этом лимитироваться в наборе значимых факторов вирулентности, хотя такая точка зрения остается дискуссионной.

Заключение

Таким образом, среди MRSA и MSSA превалируют изоляты, принадлежащие к I группе agr. Среди MRSA подавляющее большинство изолятов имеет 1ЕС D типа (отсутствует ген скр). Этот комплекс закодирован в профаге, который имеет характерное для этой группы вирусов строение, что было продемонстрировано на примере секве-нированного изолята SA0077. Комплексы 1ЕС F- и А-типов встречались преимущественно среди изолятов MRSA, выделенных от больных с тяжелыми формами инфекций. G-тип 1ЕС не был выявлен у исследуемых стафилококков. Нами было отмечено также, что Е-тип 1ЕС ассоциирован с наличием дополнительных генов вирулентности, в частности с tsst у MRSA и lukSF у MSSA. Количественное и качественное сравнение факторов вирулентности у MRSA и MSSA показало, что последние, несмотря на немногочисленную выборку, имеют гетерогенную структуру, и среди них были lukSF-, seb- и tsst-положительные изоляты. В работе не выявлено зависимости между принадлежностью стафилококков к различным agr группам и конкретными 1ЕС типами, либо связи с рассматриваемыми факторами вирулентности. Распространение различных детерминант вирулентности и частота встречаемости MSSA (lukSF+), а также их молекулярная эпидемиология требуют детального изучения.

Литература

1. Watkins R.R., David M.Z, Salata R.A. Current concepts on the virulence mechanisms of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. J Med Microbiol 2012; 61:117993.

2. Virulence factors of pathogenic bacteria database (VFDB). In: http://wwwmgcaccn/cgi-bin/VFs/compvfsc gi?Genus=Staphylococcus.

3. Papageorgiou A.C., Acharya K.R. Microbial superantigens: from structure to function. Trends Microbiol 2000; 8(8):369-75.

4. McCormick J.K., Yarwood J.M., Schlievert P.M. Toxic shock syndrome and bacterial superantigens: an update. Annu Rev Microbiol 2001; 55:77-104.

5. Dinges M.M., Orwin P.M., Schlievert P.M. Exotoxins of Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Rev 2000; 13(1):16-34.

6. Lina G., Piemont Y., Godail-Gamot F., et al. Involvement of Panton-Valentine leukocidin-producing Staphylo-coccus aureus in primary skin infections and pneumonia. Clin Infect Dis 1999; 29(5):1128-32.

7. Labandeira-Rey M., Couzon F., Boisset S., et al. Staphylococcus aureus Panton-Valentine leukocidin causes necrotizing pneumonia. Science 2007; 315(5815):1130-3.

8. McCarthy A.J., Lindsay J.A. Staphylococcus aureus innate immune evasion is lineage-specific: a bioinfomatics study. Infect Genet Evol 2013; 19C:7-14.

9. van Wamel W.J., Rooijakkers S.H., Ruyken M., van Kessel K.P., van Strijp J.A. The innate immune modulators staphylococcal complement inhibitor and chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus are located on beta-hemolysin-converting bacteriophages. J Bacteriol 2006; 188(4):1310-5.

10. Jin T., Bokarewa M., Foster T., Mitchell J., Higgins J., Tarkowski A. Staphylococcus aureus resists human defensins by production of staphylokinase, a novel bacterial evasion mechanism. J Immunol 2004; 172(2):1169-76.

11. Ricklin D., Tzekou A., Garcia B.L., et al. A molecular insight into complement evasion by the staphylococcal complement inhibitor protein family. J Immunol 2009; 183(4):2565-74.

12. de Haas C.J., Veldkamp K.E., Peschel A., et al. Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent. J Exp Med 2004; 199(5):687-95.

13. Canchaya C., Proux C., Fournous G., Bruttin A., Brussow H. Prophage genomics. Microbiol Mol Biol Rev 2003; 67(2):238-76.

14. McCarthy A.J., Witney A.A., Lindsay J.A. Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated. Front Cell Infect Microbiol 2012; 2:6.

15. Novick R.P. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Mol Microbiol 2003; 48(6):1429-49.

16. Francois P., Koessler T., Huyghe A., et al. Rapid Staphylococcus aureus agr type determination by a novel

multiplex real-time quantitative PCR assay. J Clin Microbiol 2006; 44(5):1892-5.

17. Goerke C,. Esser S., Kummel M., Wolz C. Staphylococcus aureus strain designation by agr and cap polymorphism typing and delineation of agr diversification by sequence analysis. Int J Med Microbiol 2005; 295(2):67-75.

18. Collery M.M., Smyth D.S., Tumilty J.J., Twohig J.M., Smyth C.J. Associations between enterotoxin gene cluster types egcl, egc2 and egc3, agr types, enterotoxin and enterotoxin-like gene profiles, and molecular typing characteristics of human nasal carriage and animal isolates of Staphylococcus aureus. J Med Microbiol 2009, 58(Pt 1):13-25.

19. Sakoulas G., Eliopoulos G.M., Moellering R.C., et al. Staphylococcus aureus accessory gene regulator (agr) group II: is there a relationship to the development of intermediate-level glycopeptide resistance? J Infect Dis 2003; 187(6):929-38.

20. Gilot P., Lina G., Cochard T., Poutrel B. Analysis of the genetic variability of genes encoding the RNA III-activating components Agr and TRAP in a population of Staphylococcus aureus strains isolated from cows with mastitis. J Clin Microbiol 2002; 40(11):4060-7.

21. Goerke C., Pantucek R., Holtfreter S., et al. Diversity of prophages in dominant Staphylococcus aureus clonal lineages. J Bacteriol 2009; 191(11):3462-8.

22. Verkaik N.J., Benard M., Boelens H.A., et al. Immune evasion cluster-positive bacteriophages are highly prevalent among human Staphylococcus aureus strains, but they are not essential in the first stages of nasal colonization. Clin Microbiol Infect 2011; 17(3):343-8.

23. Goering R.V., Shawar R.M., Scangarella N.E., et al: Molecular epidemiology of methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus isolates from global clinical trials. J Clin Microbiol 2008; 46(9):2842-7.

24. David M.Z., Daum R.S. Community-associated methi-cillin-resistant Staphylococcus aureus: epidemiology and clinical consequences of an emerging epidemic. Clin Microbiol Rev 2010; 23(3):616-87.

25. Rolo J., Miragaia M., Turlej-Rogacka A., et al. High genetic diversity among community-associated Staphylococcus aureus in Europe: results from a multicenter study. PLoS ONE 2012; 7(4):e34768.

26. Li M., Diep B.A., Villaruz A.E., et al. Evolution of virulence in epidemic community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Proc Natl Acad Sci U S A 2009; 106(14):5883-8.

27. Bogut A., Koziol-Montewka M., Baranowicz I., et al. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus (CA-MRSA) in Poland: further evidence for the changing epidemiology of MRSA. New Microbiol 2008; 31(2):229-34.

28. Miklasevics E., Haeggman S., Balode A., et al. Report on the first PVL-positive community acquired MRSA strain in Latvia. Euro Surveill 2004; 9(11):29-30.

29. Baranovich T., Potapov V., Yamamoto T. The first isolation of Panton-Valentine leukocidin (PVL) positive community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus

aureus (CA-MRSA) in Russia. Euro Surveill 2007; 12(3):E070315 070314.

30. Baranovich T., Zaraket H., Shabana I.I., Nevzorova V., Turcutyuicov V., Suzuki H. Molecular characterization and susceptibility of methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus isolates from hospitals and the community in Vladivostok, Russia. Clin Microbiol Infect 2010; 16(6):575-82.

31. Kuehnert M.J., Kruszon-Moran D., Hill H.A., et al. Prevalence of Staphylococcus aureus nasal colonization in the United States, 2001-2002. J Infect Dis 2006; 193(2):172-9.

32. Munckhof W.J., Nimmo G.R., Schooneveldt J.M., et al. Nasal carriage of Staphylococcus aureus, including community-associated methicillin-resistant strains, in Queensland adults. Clin Microbiol Infect 2009; 15(2):149-55.

33. Severin J.A., Lestari E.S., Kuntaman K., et al: Unusually high prevalence of panton-valentine leukocidin genes among methicillin-sensitive Staphylococcus aureus strains carried in the Indonesian population. J Clin Microbiol 2008; 46(6):1989-95.