Способ выделения свободных и экзосомальных микроРНК из слюны
METHOD OF EXTRACTING FREE AND EXOSOMAL MICRO-RNA FROM SALIVA

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам выделения различных рибонуклеиновых кислот, в частности микро-РНК, из биологических жидкостей, а именно слюны.
Из уровня техники известен способ выделения микро-РНК описан в патенте «Выделение циркулирующих микро-РНК» [US 9896683, 20.02.2018]. Данный способ включает следующие стадии выделения микро-РНК из любых биологических жидкостей (кровь, плазма или сыворотка, моча, спинномозговая жидкость, или другая биологическая жидкость, полученная от человека): расщепление белковых компонентов образца с помощью лизисного буфера, содержащего фермент «протеиназа К» в присутствии хаотропных солей и детергентов; выделение (органическая экстракция) микро-РНК из образца с помощью щелочной смеси фенол : хлороформ в соотношении компонентов от 6:1 до 1:1 при рН 7-9, предпочтительнее при рН 8,0; выделение экстрагированной РНК из образца методами очистки и концентрирования.
Данный подход имеет следующие недостатки, а именно: не уточняется порядок работы с образцами, полученными на ватных палочках путем соскоба с тыльной стороны щеки; не предлагаются дополнительные меры по обеспечению более продолжительной сохранности образца при комнатной температуре; не уточняется порядок работы с экзосомальной фракцией микро-РНК, используются высоко токсичные реагенты
Также известен способ диагностики гепатоцеллюлярной карциномы при помощи анализа экзосомальной микро-РНК в плазме крови [US 20110223607 A1, 15.09.2011], включающий получение образца биологической жидкости от субъекта, определение уровней содержания микро-РНК, выбранной из группы miR-16, miR-195, и miR-199a в образце, и диагностику гепатоцеллюлярной карциномы путем сравнения полученных значений содержания микро-РНК с референсными значениями. Экзосомальные микро-РНК выделяют из плазмы крови, полученной путем центрифугирования образца цельной крови.
Способ имеет следующие недостатки: требует проведения инвазивной процедуры забора крови с дальнейшим немедленным (в течение часа после забора) центрифугированием. Описанная в патенте технология также не указывает, как следует выделять наряду с экзосомальной фракцией микро-РНК свободные молекулы микро-РНК.
Наиболее близким аналогом по отношению к предлагаемому изобретению является изобретение "Методы диагностики рака поджелудочной железы" [WO 2016113233 A1, 21.07.2016]. Способ диагностики риска развития опухоли поджелудочной железы включает определение в образце слюны субъекта уровня экспрессии не менее одной микро-РНК, выбранной из группы miR-21, miR-23а и miR-23b, и дальнейшее сравнение с референсными значениями.
Описанный способ имеет следующие недостатки: не предназначен для одновременной оценки уровней экспрессии как свободной, так и экзосомальной микро-РНК.
Техническим результатом заявленного способа является возможность выявлять в образцах слюны, собранных с помощью сваба (ватной палочки) и высушенных при комнатной температуре в течение 6-12 часов, свободные и экзосомальные микро-РНК с возможностью длительного хранения при температурах от -80°С до +40°С.
Вышеприведенный технический результат достигается благодаря тому, что заявленный способ включает следующие стадии: забор материала ватной палочкой; подготовка материала к длительному хранению; выделение экзосом из образца методом последовательного ультрацентрифугирования; выделение из супернатанта стадии ультрацентрифугирования свободных микро-РНК методом центрифугирования на колонках, и выделение экзосомальных микро-РНК из осадка стадии ультрацентрифугирования методом центрифугирования на колонках.
Заявляемый способ может быть осуществлен следующим образом.
Забор материала осуществляют следующим образом: ватную палочку помещают в ротовую полость на 45 секунд, после чего палочку вытаскивают и помещают в чистый бумажный конверт.
Подготовку материала к длительному хранению осуществляют следующим образом: после того, как закончен забор материала, на ватную палочку капают одну каплю раствора ингибитора РНК-аз (раствор поливинилсульфоновой кислоты в концентрации 15 мг/мл), далее каплю стабилизирующего клетки раствора раствора (раствор 20% метанола и деионизированной воды, 0,5 М ацетата натрия и 5% уксусной кислоты). Поместить ватную палочку в конверт и оставить сохнуть при комнатной температуре в течение 6 часов. В таких условиях конверт может храниться в течение 120 дней при температурах от -80 С до +40 С.
Далее для выделения фракции экзосомальных микро-РНК проводят выделение экзосом, с этой целью проводят следующие действия: 1) ватную палочку извлекают из контейнера, помещают в физиологический раствор объем 500 мкл на 1 час; 2) проводят последовательное центрифугирование в режиме 2000 g и 10000 g; 3) проводят ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 30I (ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 2-х часов; 4) надосадочную жидкость собирают в отдельную пробирку и исследуют методом лазерной корреляционной спектроскопии на предмет наличия частиц экзосомального размера с целью убедиться, что все частицы экзосомального размера осели в процессе центрифугирования.
Для выделение фракции свободных микро-РНК к надосадочной жидкости, образовавшейся на последнем (четвертом) этапе выделения экзосом, добавляют 5 мкл протеиназы К, инкубируют при 56 С в течение 1 часа, далее наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000 g, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды, далее колонку оставляют на 10 минут при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 3000 g, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы (Exiqon), когда к 8 мкл образца добавляют 8 мкл реагента и инкубируют в течение 1 часа при температуре 60 С, после чего реакцию останавливают нагреванием до 95 градусов в течение 5 минут.
Для выделения фракции экзосомальных микро-РНК проводят аналогичные манипуляции с осадком, полученном на последнем (четвертом) этапе выделения экзосом. К осадку добавляют 5 мкл протеиназы К, инкубируют при 56 С в течение 1 часа, далее наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000 g, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды, далее колонку оставляют на 10 минут при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 3000 g.
Далее с целью выявления отдельных типов микроРНК проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в режиме реального времени на приборе 7500 Applied Biosystems с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с заболеваниями гепатобилиарной системы, например, микро-РНК-141, микро-РНК-200а, микро-РНК-200 с, микро-РНК-203, микро-РНК-205, микро-РНК-214, микро-РНК-17-3р, микро-РНК-106а, микро-РНК-146, микро-РНК-155, микро-РНК-191, микро-РНК-192, микро-РНК-301а, микро-РНК-326, микро-РНК-331-3р, микро-РНК-432, микро-РНК-438, микро-РНК-574-3р, микро-РНК-625, микро-РНК-92а, микро-РНК-584, микро-РНК-517с, микро-РНК-378, микро-РНК-520f, микро-РНК-142-5р, микро-РНК-451, микро-PHK-518d, микро-РНК-29а, микро-РНК-650, микро-РНК-151, микро-РНК-19b, микро-РНК-29с.
Затем при помощи программного обеспечения, поставляемого производителем оборудования (GenEx 6.1 - qPCR Data Analysis Software, bioMCC, 29.02.2016) вычисляют количество каждой из исследуемых микроРНК, выделенной из каждой фракции, полученные данные приводятся в формате таблицы.
Пример 1: у здорового донора (мужчина 30 лет, негроидная раса) в амбулаторных условиях производят забор 2 мл крови в пробирку ЭДТА К2 (забор возможен в любую пробирку, где в качестве антикоагулянта используется ЭДТА) и забор образца слюны, поместив ватную палочку (сваб) на тыльную сторону щеки и совершив в течение 45 с круговые движения. Затем на палочку капают каплю ингибитора РНКаз (раствор поливинилсульфоновой кислоты в концентрации 15 мг/мл) и затем каплю стабилизирующего клетки раствора (раствор 20% метанола и деионизированноый воды, 0,5 М ацетата натрия и 5% уксусной кислоты), после чего ватную палочку помещают в бумажный конверт и оставляют при комнатной температуре на 6 часов. Кровь сразу после забора центрифугирует в течение 5 минут на 1200 g, отбирают в чистую пробирку плазму и оставляют при комнатной температуре на 6 часов.
По истечение 6 часов (когда высохла ватная палочка) приступают к выделению свободных и экзосомальных микро-РНК из образцов плазмы крови и слюны.
Сначала ватную палочку извлекают из конверта и помещают в физиологический раствор объем 500 мкл на 1 час. Далее проводят последовательное центрифугирование в режиме 2000 и 10000 g, после чего осуществляют ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 30I (ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 2-х часов, полученную надосадочную жидкость собирают в отдельную пробирку для дальнейшего выделения свободных микро-РНК. В осадке, полученном после проведения всех этапов центрифугирования, содержатся экзосомы.
Параллельно запускается выделение экзосом аналогичным образом из плазмы крови: проводят последовательное центрифугирование в режиме 2000 и 10000 g, после чего полученную после чего осуществляют ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 30I (ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 2-х часов, полученную надосадочную жидкость собирают в отдельную пробирку для дальнейшего выделения свободных микро-РНК. В осадке, полученном после проведения всех этапов центрифугирования, содержатся экзосомы.
Далее к осадку, полученному в одной пробирке от образца плазмы и в другой от образца слюны, добавляют 5 мкл протеиназы К, инкубируют при 56 С в течение 1 часа, далее наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000 g, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды, далее колонку оставляют на 10 минут при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 3000 g.
Параллельно аналогичную манипуляцию проводят с супернатантом, содержащим свободные микро-РНК, полученным при выделении экзосом из плазмы крови и слюны, т.е. к образцам добавляют 5 мкл протеиназы К, инкубируют при 56 С в течение 1 часа, далее наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000 g, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды, далее колонку оставляют на 10 минут при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 3000 g.
Следующим этапом для всех образцов (экзосомы из плазмы крови, свободные микро-РНК из плазмы крови, экзосомы из слюны, свободные микро-РНК из слюны) проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы (Exiqon), когда к 8 мкл образца добавляют 8 мкл реагента и инкубируют в течение 1 часа при температуре 60 С, после чего реакцию останавливают нагреванием до 95 градусов в течение 5 минут.
Далее с целью выявления отдельных типов микроРНК проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в режиме реального времени на приборе 7500 Applied Biosystems с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с заболеваниями гепатобилиарной системы.
Пример 2: у здорового донора (женщина 18 лет, европеоидная раса) в амбулаторных условиях производят забор 2 мл крови в пробирку ЭДТА К2 (забор возможен в любую пробирку, где в качестве антикоагулянта используется ЭДТА) и забор образца слюны, поместив ватную палочку (сваб) на тыльную сторону щеки и совершив в течение 45 с круговые движения. Затем на палочку капают каплю ингибитора РНКаз (раствор поливинилсульфоновой кислоты в концентрации 15 мг/мл) и затем каплю стабилизирующего клетки раствора (раствор 20% метанола и деионизированноый воды, ацетата натрия и уксусной кислоты), после чего ватную палочку помещают в бумажный конверт и оставляют при комнатной температуре на 6 часов. Кровь сразу после забора центрифугирует в течение 5 минут на 1200 g, отбирают в чистую пробирку плазму и оставляют при комнатной температуре на 6 часов.
По истечение 6 часов (когда высохла ватная палочка) приступают к выделению свободных и экзосомальных микро-РНК из образцов плазмы крови и слюны.
Сначала ватную палочку извлекают из конверта и помещают в физиологический раствор объем 500 мкл на 1 час. Далее проводят последовательное центрифугирование в режиме 2000 и 10000 g, после чего осуществляют ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 2-х часов, полученную надосадочную жидкость собирают в отдельную пробирку для дальнейшего выделения свободных микро-РНК. В осадке, полученном после проведения всех этапов центрифугирования, содержатся экзосомы.
Параллельно запускается выделение экзосом аналогичным образом из плазмы крови: проводят последовательное центрифугирование в режиме 2000 и 10000 g, после чего полученную после чего осуществляют ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 30I (ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 2-х часов, полученную надосадочную жидкость собирают в отдельную пробирку для дальнейшего выделения свободных микро-РНК. В осадке, полученном после проведения всех этапов центрифугирования, содержатся экзосомы.
Далее к осадку, полученному в одной пробирке от образца плазмы и в другой от образца слюны, добавляют 5 мкл протеиназы К, инкубируют при 56 С в течение 1 часа, далее наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000 g, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды, далее колонку оставляют на 10 минут при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 3000 g.
Параллельно аналогичную манипуляцию проводят с супернатантом, содержащим свободные микро-РНК, полученным при выделении экзосом из плазмы крови и слюны, т.е. к образцам добавляют 5 мкл протеиназы К, инкубируют при 56 С в течение 1 часа, далее наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000 g, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды, далее колонку оставляют на 10 минут при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 3000 g.
Следующим этапом для всех образцов (экзосомы из плазмы крови, свободные микро-РНК из плазмы крови, экзосомы из слюны, свободные микро-РНК из слюны) проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы (Exiqon), когда к 8 мкл образца добавляют 8 мкл реагента и инкубируют в течение 1 часа при температуре 60 С, после чего реакцию останавливают нагреванием до 95 градусов в течение 5 минут.
Далее с целью выявления отдельных типов микроРНК проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в режиме реального времени на приборе 7500 Applied Biosystems с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с заболеваниями гепатобилиарной системы.
Пример 3: у мужчины 65 лет (монголоидная раса, диагностирована гепатоцеллюлярная карцинома на фоне цирроза вследствие гепатит С) в амбулаторных условиях производят забор 2 мл крови в пробирку ЭДТА К2 (забор возможен в любую пробирку, где в качестве антикоагулянта используется ЭДТА) и забор образца слюны, поместив ватную палочку (сваб) на тыльную сторону щеки и совершив в течение 45 с круговые движения. Затем на палочку капают каплю ингибитора РНКаз (раствор поливинилсульфоновой кислоты в концентрации 15 мг/мл) и затем каплю стабилизирующего клетки раствора (раствор 20% метанола и деионизированноый воды, 0,5 М ацетата натрия и 5% уксусной кислоты), после чего ватную палочку помещают в бумажный конверт и оставляют при комнатной температуре на 6 часов. Кровь сразу после забора центрифугирует в течение 5 минут на 1200 g, отбирают в чистую пробирку плазму и оставляют при комнатной температуре на 6 часов.
По истечение 6 часов (когда высохла ватная палочка) приступают к выделению свободных и экзосомальных микро-РНК из образцов плазмы крови и слюны.
Сначала ватную палочку извлекают из конверта и помещают в физиологический раствор объем 500 мкл на 1 час. Далее проводят последовательное центрифугирование в режиме 2000 и 10000 g, после чего осуществляют ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 2-х часов, полученную надосадочную жидкость собирают в отдельную пробирку для дальнейшего выделения свободных микро-РНК. В осадке, полученном после проведения всех этапов центрифугирования, содержатся экзосомы.
Параллельно запускается выделение экзосом аналогичным образом из плазмы крови: проводят последовательное центрифугирование в режиме 2000 и 10000 g, после чего полученную после чего осуществляют ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 2-х часов, полученную надосадочную жидкость собирают в отдельную пробирку для дальнейшего выделения свободных микро-РНК. В осадке, полученном после проведения всех этапов центрифугирования, содержатся экзосомы.
Далее к осадку, полученному в одной пробирке от образца плазмы и в другой от образца слюны, добавляют 5 мкл протеиназы К, инкубируют при 56 С в течение 1 часа, далее наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000 g, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды, далее колонку оставляют на 10 минут при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 3000 g.
Параллельно аналогичную манипуляцию проводят с супернатантом, содержащим свободные микро-РНК, полученным при выделении экзосом из плазмы крови и слюны, т.е. к образцам добавляют 5 мкл протеиназы К, инкубируют при 56 С в течение 1 часа, далее наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000 g, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды, далее колонку оставляют на 10 минут при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 3000 g.
Следующим этапом для всех образцов (экзосомы из плазмы крови, свободные микро-РНК из плазмы крови, экзосомы из слюны, свободные микро-РНК из слюны) проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы (Exiqon), когда к 8 мкл образца добавляют 8 мкл реагента и инкубируют в течение 1 часа при температуре 60 С, после чего реакцию останавливают нагреванием до 95 градусов в течение 5 минут.
Далее с целью выявления отдельных типов микроРНК проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в режиме реального времени на приборе 7500 Applied Biosystems с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с заболеваниями гепатобилиарной системы.