СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ УТРАЧЕННОГО ЗУБА И СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВОССТАНОВИТЕЛЬНОГО МАТЕРИАЛА
METHOD FOR DENTAL RESTORATION AND METHOD FOR MAKING RESTORATION MATERIAL

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Настоящее изобретение относится к способам восстановления области утраченного зуба и способам изготовления восстановительного материала.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Зуб представляет собой орган, состоящий из: эмали в крайнем наружном слое и дентина во внутреннем слое, которые относятся к твердым тканям; одонтобластов, образующих дентин и находящихся внутри слоя дентина; пульпы зуба, заполняющей центральное пространство. Зубы могут утрачиваться вследствие кариеса зубов, пародонтита и подобных заболеваний. С учетом большого значения наличия или отсутствия зубов для внешнего вида и для восприятия вкуса, а также в целях сохранения здоровья и высокого качества жизни были разработаны различные методики восстановления зубов.
[0003] Так, в публикации в J. Dent. Res. (2002, Vol.81 (10), pp.695-700) описана регенерация зубоподобной ткани в результате внутрибрюшинной трансплантации мыши клеток с биоразлагаемым носителем, в частности эпителиальных или мезенхимальных клеток, выделенных из зубного зачатка.
Другой пример: в японской опубликованной заявке на изобретение (JP-A) №2004-331557 предлагается способ регенерации зубного зачатка, в котором клетки зубного зачатка, выделенные из живого организма, выращивают в присутствии физиологически активного вещества, например фактора роста фибробластов. В еще одном патентном документе, JP 2004-357567 А, предлагается способ, предусматривающий, что клетки, по меньшей мере, одного типа, выделенные из клеток зубного зачатка в живом организме, и клетки, способные к дифференцировке с образованием этого типа, выращивают вместе на носителе, содержащем фибрин. При этом носитель позволяет придать формируемому зубному зачатку нужную форму, образуя таким образом «зуб» с уникальной морфологией.
[0004] В WO 2006/129672 описана методика, согласно которой эпителиальные клетки и мезенхимальные клетки, полученные из зубного зачатка, преобразуют в клеточные массы, которые затем помещают в коллагеновый гель, приводя их в тесный контакт друг с другом, и выращивают в этих условиях, создавая таким образом зуб, обладающий уникальным расположением клеток.
[0005] С другой стороны, в документе WO 2003/101503 описан способ, в котором для регенерации зубного зачатка клетки зубного зачатка и клетки, способные к дифференцировке с образованием соответствующего типа, выращивают с механическим стимулированием, а также способ терапии, в котором регенерированный таким образом зубной зачаток трансплантируют в челюстную кость пациента с утраченным или поврежденным зубным зачатком.
Помимо этого в документе JP 2005-013261 А описан искусственный биоматериал с частицами коллоидной окиси кремния, прикрепленными к его поверхности, используемый как имплантационный материал, который внедряют в живой организм.
[0006] Было отмечено, однако, что внедрение винтообразного имплантата из таких материалов, как титан, в современной имплантационной терапии подавляет рост челюстной кости в период роста челюсти и делает невозможным перемещение зуба, что является нежелательным. Кроме того, хотя от регенерированного зуба для обеспечения тех же функций, что и у обычного зуба, требуется такая же нормальная окклюзия, в вышеупомянутых методиках с использованием клеток, выделенных из живого организма, достижение такой окклюзии не было в достаточной степени подтверждено. Следует также учитывать, что нервы периодонтальной связки обладают чувствительностью к повреждающим стимулам в зубах (например, к сжатию), что биологически важно с точки зрения восприятия, например, ощущений от еды. Чтобы регенерированный зуб обладал теми же функциями, что и обычный зуб, необходимо восстановить область утраченного зуба до такой степени, чтобы регенерированный зуб обеспечивал нормальную окклюзию с твердостью, равноценной твердости обычного зуба, и включал в себя нервы, обеспечивающие нормальную чувствительность к стимулам, воздействующим на зуб.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ СРЕДСТВА РЕШЕНИЯ УКАЗАННЫХ ПРОБЛЕМ
[0007] Таким образом, цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ изготовления восстановительного материала для восстановления области утраченного зуба, который обеспечит регенерированному зубу твердость, равноценную твердости обычного зуба, что позволит добиться нормальной окклюзии, и чувствительность к стимулам, равноценную чувствительности обычного зуба; и способ восстановления области утраченного зуба.
[0008] Настоящее изобретение предлагает способ изготовления восстановительного материала, используемого для восстановления области утраченного зуба в полости рта, и способ восстановления области утраченного зуба.
Первый аспект настоящего изобретения предусматривает способ изготовления восстановительного материала, используемого для восстановления области утраченного зуба в полости рта, включающий этапы:
помещают на носитель первую клеточную массу, образованную клетками или клеткой из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, и вторую клеточную массу, образованную другой клеткой или другими клетками из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, при этом одну из мезенхимальных либо эпителиальных клеток получают из зубного зачатка и первую и вторую клеточные массы располагают в тесном контакте друг с другом без смешивания;
выращивают первую и вторую клеточные массы с формированием зачатка восстанавливаемого зуба или целого восстанавливаемого зуба и определяют ориентацию зачатка восстанавливаемого зуба или целого восстанавливаемого зуба, сформированного выращиванием, что позволяет внедрить зачаток восстанавливаемого зуба или целый восстанавливаемый зуб таким образом, чтобы коронковая часть зуба была направлена внутрь полости рта и
используют зубной зачаток или зуб, ориентация которого была определена, в качестве восстановительного материала для получения эквивалента утраченного зуба в области утраченного зуба.
[0009] Второй аспект настоящего изобретения предусматривает способ восстановления области утраченного зуба в полости рта, включающий этапы:
помещают на носитель первую клеточную массу, образованную клетками или клеткой из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, и вторую клеточную массу, образованную другой клеткой или другими клетками из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, при этом одну из мезенхимальных либо эпителиальных клеток получают из зубного зачатка, и первую и вторую клеточные массы располагают в тесном контакте друг с другом, без смешивания;
выращивают первую и вторую клеточные массы с формированием зачатка восстанавливаемого зуба или целого восстанавливаемого зуба и внедряют зачаток восстанавливаемого зуба или целого восстанавливаемого зуба в область утраченного зуба.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0010] На Фиг.1А представлены фотографии внешнего вида зуба примера 2 настоящего изобретения в период экструзии (слева), в период от экструзии до окклюзии (в центре) и в период после окклюзии (справа), которые были сняты под углом 45° относительно места трансплантации в верхней челюсти.
На Фиг.1В представлены фотографии внешнего вида зуба примера 2 настоящего изобретения в период экструзии (слева), в период от экструзии до окклюзии (в центре) и в период после окклюзии (справа), которые были сняты в вертикальном направлении относительно места трансплантации в верхней челюсти.
На Фиг.1C представлены фотографии окклюзии зуба примера 2 настоящего изобретения, снятые в период экструзии (слева), в период от экструзии до окклюзии (в центре) и в период после окклюзии (справа).
На Фиг.1D представлены КТ-изображения внешнего вида зуба примера 2 настоящего изобретения, снятые в период экструзии (слева), в период от экструзии до окклюзии (в центре) и в период после окклюзии (справа).
На Фиг.1Е представлены КТ-изображения в разрезе (Е) зуба примера 2 настоящего изобретения, снятые в период экструзии (слева), в период от экструзии до окклюзии (в центре) и в период после окклюзии (справа).
На Фиг.2А представлен график твердости по Кнупу для эмали зуба после экструзии в примере 2 настоящего изобретения.
На Фиг.2В представлен график твердости по Кнупу для дентина зуба после экструзии в примере 2 настоящего изобретения.
На Фиг.3 представлено окрашенное гематоксилином и эозином изображение регенерированного зуба примера 2 настоящего изобретения непосредственно перед экструзией (при увеличении ×20).
На Фиг.4А представлено окрашенное гематоксилином и эозином изображение, подтверждающее явление костной перестройки в кости у периодонтальной связки (В: сторона сжатия, С: сторона растяжения), которая происходила при приложении ортодонтической силы в примере 2 настоящего изобретения (при увеличении ×20).
На Фиг.4В представлен увеличенный вид стороны сжатия (зона В в черной рамке) на Фиг.4А (при увеличении ×200).
На Фиг.4С представлен увеличенный вид стороны растяжения (зона С в черной рамке) на Фиг.4А (при увеличении ×200). На Фиг.5А представлено иммуноокрашенное изображение экспрессии белка c-Fos в продолговатом мозге, наблюдаемой в отсутствие ортодонтического воздействия в примере 2 настоящего изобретения (при увеличении ×100).
На Фиг.5В представлено иммуноокрашенное изображение экспрессии белка c-Fos в продолговатом мозге, наблюдаемой через 2 часа после применения ортодонтического воздействия в примере 2 настоящего изобретения (при увеличении ×100).
На Фиг.5С представлено иммуноокрашенное изображение экспрессии белка c-Fos в продолговатом мозге, наблюдаемой спустя 48 часов после применения ортодонтического воздействия (при увеличении ×100).
На Фиг.5D представлено иммуноокрашенное изображение экспрессии белка c-Fos в продолговатом мозге, наблюдаемое через 2 часа после вскрытия пульпы зуба (при увеличении ×100).
ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0011] Предусматриваемый настоящим изобретением способ изготовления восстановительного материала относится к способам изготовления материала, используемого для восстановления области утраченного зуба в полости рта, и включает этапы:
помещают на носитель первую клеточную массу, образованную клетками или клеткой из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, и вторую клеточную массу, образованную другой клеткой или другими клетками из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, при этом одну из мезенхимальных либо эпителиальных клеток получают из зубного зачатка и первую и вторую клеточные массы располагают в тесном контакте друг с другом без смешивания;
выращивают первую и вторую клеточные массы с формированием зачатка восстанавливаемого зуба или целого восстанавливаемого зуба (этот этап обозначается ниже как «этап формирования зачатка восстанавливаемого зуба») и
определяют ориентацию зачатка восстанавливаемого зуба или целого восстанавливаемого зуба, сформированного выращиванием, что позволяет внедрить зачаток восстанавливаемого зуба или целый восстанавливаемый зуб таким образом, чтобы коронковая часть зуба была направлена внутрь полости рта (этот этап обозначается ниже как «этап определения ориентации»);
используют зубной зачаток или зуб, ориентация которого была определена, в качестве восстановительного материала для получения эквивалента утраченного зуба в области утраченного зуба.
[0012] Кроме того, предусматриваемый настоящим изобретением способ восстановления области утраченного зуба относится к способам восстановления области утраченного зуба в полости рта и включает этапы:
помещают на носитель первую клеточную массу, образованную клетками или клеткой из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, и вторую клеточную массу, образованную другой клеткой или другими клетками из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, при этом одну из мезенхимальных либо эпителиальных клеток получают из зубного зачатка и первую и вторую клеточные массы располагают в тесном контакте друг с другом без смешивания;
выращивают первую и вторую клеточные массы с формированием зачатка восстанавливаемого зуба или целого восстанавливаемого зуба (этот этап обозначается ниже как «этап формирования зачатка восстанавливаемого зуба»); и
внедряют зачаток восстанавливаемого зуба или целого восстанавливаемого зуба в область утраченного зуба (этот этап обозначается ниже как «этап внедрения»).
[0013] Согласно настоящему изобретению способ изготовления восстановительного материала и способ восстановления области утраченного зуба предусматривают использование в качестве восстановительного материала, внедряемого в область утраченного зуба, зачатка восстанавливаемого зуба или целого восстанавливаемого зуба, которые будут получены на этапе формирования зачатка восстанавливаемого зуба помещением первой клеточной массы и второй клеточной массы на носитель, причем первая и вторая клеточные массы находятся в тесном контакте друг с другом без смешивания. Посредством того, что в область утраченного зуба в качестве восстановительного материала будет внедрен зачаток восстанавливаемого зуба или целый восстанавливаемый зуб, из области внедрения экструдируется эквивалент зуба, приобретший такие длину и твердость, которые обеспечивают окклюзию с зубом-антагонистом, причем в эквивалент зуба могут врастать нервы. В итоге эквивалент зуба может иметь твердость, равноценную твердости обычного зуба, то есть такую же, как у окружающих зубов, может обеспечивать нормальную окклюзию и обладать чувствительностью к стимулам, равноценной чувствительности обычного зуба.
[0014] В настоящем изобретении термин «эквивалент зуба» и подобные ему обозначают зуб, имеющий такие длину и твердость, которые делают возможной окклюзию с зубом-антагонистом после экструзии из области утраченного зуба, в которую был внедрен указанный эквивалент.
В настоящем изобретении выражение «этап формирования зачатка восстанавливаемого зуба» относится как к способу изготовления восстановительного материала, так и к способу восстановления области утраченного зуба.
Далее, слово «этап», используемое в данном документе, подразумевает не только отдельный этап, но и другие этапы, которые не могут быть отчетливо от него отделены и служат достижению ожидаемого эффекта рассматриваемого этапа.
Кроме того, диапазоны, обозначаемые с помощью предлогов «от» и «до», включают в себя также граничные числовые значения, указанные непосредственно после данных предлогов.
Ниже следует описание изобретения.
[0015] В настоящем изобретении термином «зуб» обозначается непрерывная ткань, включающая внутренний слой дентина и наружный слой эмали и обладающая ориентацией, за счет выделения коронки и корня. Ориентация зуба может определяться взаимным расположением его коронки и его корня. Разграничение коронки и корня может подтверждаться визуально на основании их формы, гистологического окрашивания и т.п. Коронка - это часть, в которой присутствуют слои эмали и дентина, тогда как в корне слой эмали отсутствует.
[0016] Специалисты в данной области могут легко распознать дентин и эмаль морфологически путем гистологического окрашивания или аналогичными методами. Эмаль может быть также определена по наличию амелобластов, которое может подтверждаться наличием/отсутствием амелогенина. С другой стороны, дентин может быть определен по наличию одонтобластов, которое может подтверждаться наличием/отсутствием сиалопротеина дентина. Наличие амелогенина и сиалопротеина дентина может быть легко подтверждено известным в данной области способом, например гибридизацией in situ и иммуноокрашиванием антителами и т.п. И, наконец, ориентация зуба может быть определена по расположению коронки и корня. Разграничение коронки и корня может подтверждаться визуально на основе их формы, гистологического окрашивания и т.п.
[0017] В настоящем изобретении термины «зубной зачаток» и «зубная колба» используются для точных обозначений, соответствующих определенным стадиям развития. В данном случае «зубной зачаток» обозначает образование на ранней стадии развития зуба, которое в будущем превратится в зуб и развитие которого включает стадию колбы и стадию «колокола» в соответствии с обычной периодизацией развития зуба и, в частности, предполагает наличие ткани в таком состоянии, в котором не наблюдается аккумуляция дентина и эмали, являющихся характерными составляющими твердых тканей зуба. С другой стороны, «зубная колба» предполагает наличие определенной ткани на переходном этапе от «зубного зачатка» в том смысле, в каком этот термин используется в настоящем изобретении, то есть обозначает стадию, на которой начинается аккумуляция дентина и эмали, характерных для твердых тканей зуба, и предшествующую прорастанию зуба из десны, при котором создаются предпосылки для выполнения типичных функций зуба. Развиваясь из зубного зачатка, зуб проходит стадию колбы, стадию «чаши», раннюю стадию «колокола» и позднюю стадию «колокола». На стадии колбы эпителиальные клетки впячиваются, образуя оболочку вокруг мезенхимальных клеток, и на ранней и поздней стадиях «колокола» эпителиальная часть превращается в наружную эмаль, а из мезенхимальной части начинает формироваться внутренний дентин. Так в результате межклеточного взаимодействия из зубного зачатка между эпителиальными и мезенхимальными клетками формируется зуб.
[0018] В настоящем изобретении термин «мезенхимальная клетка» обозначает клетку, происходящую из мезенхимальной ткани, и «эпителиальная клетка» обозначает клетку, происходящую из эпителиальной ткани. Ниже в настоящем изобретении термин «пародонт» обозначает альвеолярный отросток и периодонтальную связку, образованную преимущественно в наружном слое зуба. Специалисты в данной области могут легко распознать альвеолярный отросток и периодонтальную связку морфологически путем гистологического окрашивания или аналогичными методами.
[0019] На этапе формирования зачатка восстанавливаемого зуба согласно настоящему изобретению помещают на носитель первую клеточную массу, образованную клетками или клеткой из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, и вторую клеточную массу, образованную другой клеткой или другими клетками из мезенхимальных клеток, при этом одну из мезенхимальных либо эпителиальных клеток получают из зубного зачатка, причем первая и вторая клеточные массы находятся в тесном контакте друг с другом без смешивания; после этого первую и вторую клеточные массы выращивают в качестве клеточной культуры с формированием зачатка восстанавливаемого зуба.
Что касается этапа формирования зачатка восстанавливаемого зуба, то соответствующий способ, описанный в документе WO 2006/129672, может применяться в исходном виде без изменений.
1
8
3
8
[0020] Как первую клеточную массу, так и вторую клеточную массу формируют либо исключительно из мезенхимальных клеток, либо исключительно из эпителиальных клеток, и каждая из этих клеточных масс состоит по существу из клеток одного из этих типов. Термин «клеточная масса» обозначает плотное образование, состоящее из клеток, а клетки могут находиться либо в состоянии ткани, либо в состоянии массы (агрегата), приготовленной из одиночных клеток. Выражение «состоит по существу» обозначает минимально возможное включение веществ, отличных от представляющих интерес клеток. Количество клеток, составляющих каждую клеточную массу, различается в зависимости от вида животных, а также от типа, жесткости и размера носителя и может составлять в общем случае от 10 до 10 клеток, предпочтительно от 10 до 10 клеток на одну клеточную массу.
[0021] Что касается мезенхимальных клеток и эпителиальных клеток, используемых в настоящем изобретении, по меньшей мере, клетки одного из этих двух типов могут быть получены из зубного зачатка, благодаря чему они способны воспроизводить расположение клеток в живом организме и эффективно формировать зуб, обладающий специфической структурой и ориентацией. Для большей надежности в формировании зуба как мезенхимальные, так и эпителиальные клетки предпочтительно должны быть получены из зубного зачатка (или зубных зачатков). Зубной зачаток берут предпочтительно на стадии колбы или на стадии «чаши», чтобы клетки были незрелыми и гомогенными с точки зрения их дифференцировки.
[0022] Мезенхимальные клетки, выделяемые из источника, отличного от зубного зачатка, могут быть взяты из других мезенхимальных тканей живого организма и представлять собой, например, предпочтительно клетки костного мозга, не содержащие клеток крови, и мезенхимальные стволовые клетки, более предпочтительно - мезенхимальные клетки из полости рта, клетки костного мозга из челюстной кости, мезенхимальные клетки, отобранные из клеток краниального нервного гребня, мезенхимальные клетки-предшественники, которые могут производить мезенхимальные клетки, и их стволовые клетки.
Эпителиальные клетки, выделяемые из источника, отличного от зубного зачатка, могут быть взяты из других эпителиальных тканей живого организма и представлять собой, например, предпочтительно эпителиальные клетки кожи, слизистой оболочки полости рта и десен, более предпочтительно - незрелые эпителиальные клетки-предшественники, которые при дифференцировке могут, например, подвергаться кератическим или паракератическим изменениям, образуя эпителиальные клетки кожи, слизистой оболочки и подобные им. Примерами таких незрелых эпителиальных клеток-предшественников служат некератинизированные эпителиальные клетки и их стволовые клетки.
[0023] Зубной зачаток и другие ткани могут быть выделены в челюстной кости и подобных источниках у различных животных, например у приматов (людей, обезьян), копытных животных (свиней, коров, лошадей), то есть у млекопитающих; у грызунов (мышей, крыс, кроликов), то есть у мелких млекопитающих; у собак, кошек и т.п. Для отбора зубного зачатка и ткани могут быть без изменений применены условия, обычно используемые для отбора тканей; зубной зачаток или ткань следует выделять в стерильных условиях и хранить в подходящем месте. В качестве зубного зачатка человека может быть использован, например, зубной зачаток третьего моляра, называемого также зубом мудрости, или же зубной зачаток эмбриона, но с точки зрения использования аутогенных тканей использование зубного зачатка зуба мудрости предпочтительно. Если используется зубной зачаток от мыши, его берут предпочтительно на 10-16 день развития эмбриона.
[0024] Подготовку мезенхимальных и эпителиальных клеток из этого зубного зачатка выполняют, разделяя зубной зачаток, выделенный из окружающей его ткани, на мезенхимальную ткань и эпителиальную ткань на основе их формы. В этой процедуре для упрощения выделения тканей могут использоваться ферменты. Примерами ферментов, используемых для такой цели, служат диспаза, коллагеназа и трипсин.
[0025] Мезенхимальные клетки и эпителиальные клетки могут быть приготовлены в виде одиночных клеток соответственно из мезенхимальной ткани и из эпителиальной ткани. Чтобы облегчить диспергирование ткани на одиночные клетки, могут применяться такие ферменты, как диспаза, коллагеназа и трипсин.
2
[0026] В качестве среды для выращивания могут использоваться среды, обычно используемые для выращивания животных клеток, например среда Игла в модификации Дульбекко СИМД (DMEM), к которым для усиления пролиферации клеток может быть добавлена сыворотка, или, в качестве альтернативы, клеточный фактор роста, например фибробластный ФФР (FGF), эпидермальный ЭФР (EGF) или тромбоцитарный ТФР (PDGF), или же известные компоненты сыворотки, например трансферрин. В том случае, если добавляется сыворотка, концентрация может быть соответствующим образом изменена в зависимости от условий выращивания и обычно может составлять 10% от объема. При выращивании клеток могут создаваться обычные в этих случаях условия, например такие, которые используются для выращивания клеток в инкубаторах, - 37°С и 5% СO. При необходимости можно также добавлять антибиотики, например стрептомицин.
[0027] Согласно настоящему изобретению может быть использован носитель, пригодный для выращивания клеток и предпочтительно представляющий собой смесь с указанной выше средой. Примерами такого носителя служат коллаген, агарозный гель, карбоксиметилцеллюлоза, желатин, агар, гидрогель, эластин, фибрин, фибронектин, ламинин, внеклеточные матриксы смешанного состава, полигликолевая кислота ПГК (PGA), полимолочная кислота ПМК (PLA), сополимеры молочной и гликолевой кислот СМГК (PLGA), «Cellmatrix» (торговое наименование, производитель Nitta Gelatin Inc.), «Mebiol Gel» (торговое наименование, производитель Ikeda Scientific Co., Ltd.) и «Matrigel» (торговое наименование, производитель, Beckton, Dickinson and Company), которые также могут применяться в сочетаниях. Эти носители могут обладать достаточной жесткостью для того, чтобы клетки эффективно удерживались в тех местах, где они были помещены на носитель, который может пребывать в форме геля, волокон или твердого тела. С точки зрения облегчения обеспечения требуемой жесткости, а также удерживающей способности из перечисленных носителей предпочтительными являются коллаген, агарозный гель, карбоксиметилцеллюлоза, желатин, агар, гидрогель, «Cellmatrix», «Mebiol Gel», «Matrigel», внеклеточные матриксы смешанного состава, эластин, фибрин, фибронектин и ламинин и их сочетания; наиболее предпочтительны из них коллаген, фибрин, фибронектин, ламинин, внеклеточные матриксы смешанного состава, «Cellmatrix», «Mebiol Gel», «Matrigel» и их сочетания. Эти носители обеспечивают хорошее межклеточное взаимодействие между мезенхимальными и эпителиальными клетками внутри соответствующих клеточных масс и хорошее взаимодействие между клеточными массами. При этом за уровень жесткости, который позволяет удерживать клетки на их местах, может быть принята жесткость, которая обычно применяется в трехмерных культурах, то есть жесткость, обеспечивающая сохранение положения клеток и не препятствующая в то же время их гипертрофии вследствие роста. Такая величина жесткости может быть легко определена.
При этом носители могут иметь толщину, не препятствующую росту внутри них первой и второй клеточных масс, и эта толщина может быть задана в соответствии с размерами данной ткани и подобными параметрами.
[0028] Кроме того, носитель может обладать такой удерживающей способностью, которая позволяет сохранять контактное состояние клеток, не допуская их диспергирования. В данном документе термин «контактное состояние» обозначает плотное (обладающее высокой плотностью) состояние, которое обеспечивает межклеточное взаимодействие внутри каждой клеточной массы и между клеточными массами, причем благодаря состоянию высокой плотности, в котором находится агрегат клеток, оказывается возможным выращивать клетки с такой удерживающей способностью, которая, например, обеспечивает контактное состояние, более сильное, чем простое прикосновение клеток. Например, при использовании коллагена соответствующая жесткость обеспечивается при конечной концентрации от 2 до 3 мг/мл, то есть при концентрации, которая имеет прочность студня от 120 до 250 г, измеренную согласно стандарту JIS-К6503-1996 (как нагрузка, необходимая для сжатия на 4 мм с помощью штока диаметром 12,7 мм). Эта величина прочности студня не является ограничительной, и в качестве носителя по настоящему изобретению могут предпочтительно использоваться и другие типы носителей, если они имеют ту же прочность, определяемую тем же методом измерения. Кроме того, носитель с жесткостью, соответствующей желаемой прочности студня, может быть получен смешиванием одного или более различных носителей.
7
9
8
9
8
8
[0029] Состояние высокой плотности подразумевает такую плотность, которая почти эквивалентна плотности формирования ткани, например в случае клеточных масс она составляет от 5×10 до 1×10 клеток/мл при помещении клеток на носитель, предпочтительно от 1×10 до 1×10клеток/мл, что необходимо для межклеточного взаимодействия без отрицательного воздействия на деятельность клеток, и наиболее предпочтительно - от 2×10 до 8×10 клеток/мл. Чтобы приготовить клеточную массу с такой плотностью клеток, предпочтительно уплотнять и осаждать клетки центрифугированием, поскольку именно таким образом удается достичь высокой плотности без отрицательного воздействия на деятельность клеток. Центрифугирование может выполняться со скоростью вращения, которая соответствует центробежной силе от 300 g до 1200 g, не воздействующей неблагоприятно на выживание клеток, предпочтительно от 500 g до 1000 g, в течение от 3 до 10 минут. Центрифугирование с силой ниже 300 g может создать недостаточное осаждение клеток, и плотность клеток тогда окажется слишком низкой, тогда как центрифугирование с силой выше 1200 g может вызвать повреждение клеток, поэтому оба этих случая не отнесены к предпочтительным.
[0030] В тех случаях, когда высокая плотность клеток обеспечивается центрифугированием, этот процесс обычно выполняют, приготовив суспензию одиночных клеток в контейнере, например пробирке, используемой для центрифугирования клеток, и надосадочную жидкость удаляют как можно более тщательно, оставляя осадок, состоящий из клеток.
В тех случаях, когда осадок подготавливается центрифугированием, его можно поместить непосредственно внутрь носителя. При этом объем иных компонентов, отличных от подготавливаемых клеток (например, среда культуры, буферный раствор, носитель и т.п.), предпочтительно не должен превышать объем клеток и наиболее предпочтительно, чтобы иные компоненты, отличные от подготавливаемых клеток, отсутствовали. В клеточной массе такой высокой плотности клетки находятся в тесном контакте друг с другом, что позволяет эффективно осуществлять межклеточное взаимодействие. В тех случаях, когда клеточную массу с очень низким содержанием компонентов, отличных от подготавливаемых клеток, помещают внутрь носителя, клетки особенно сильно уплотняются благодаря отверждению носителя и аналогичным процессам, создавая состояние, в котором клетки располагаются очень плотно.
[0031] Чем ближе контакт между первой клеточной массой и второй клеточной массой, тем лучше; особенно предпочтительно, чтобы вторая клеточная масса упиралась в первую клеточную массу. Кроме того, чтобы обеспечить еще более тесный контакт между клеточными массами, эффективным будет покрытие первой клеточной массы и второй клеточной массы твердой оболочкой, проницаемой для среды культуры и кислорода. Предпочтительно также при помещении суспензии клеток высокой плотности в раствор использовать раствор, отличающийся от суспензии по вязкости, который вслед за этим может отвердеть, не претерпевая изменений, что позволит сохранить состояние контакта для клеток. В тех случаях, когда первая клеточная масса представляет собой массу мезенхимальных клеток одиночных зубных зачатков, а вторая клеточная масса представляет собой эпителиальную ткань зубного зачатка, предпочтительно поместить эмалевый узелок эпителиальной ткани зубного зачатка так, чтобы он соприкасался с первой клеточной массой, но настоящее изобретение не ограничивается таким подходом.
[0032] Если применяется носитель в форме геля, раствора или подобной форме, помещение клеток на носитель может предусматривать последующий этап отверждения носителя. Для отверждения носителя могут применяться условия, используемые для отверждения носителя в общем случае, без каких-либо изменений. Так, если в качестве носителя используется способный к отверждению состав, например коллаген, отверждение может быть достигнуто при обычно используемых условиях, например при выдерживании при температуре выращивания в течение от нескольких минут до нескольких десятков минут. Это позволит установить между клетками внутри носителя плотную и устойчивую адгезию.
[0033] Время, которое требуется для формирования зачатка восстанавливаемого зуба в процессе выращивания, зависит от количества клеток, помещенных на носитель, от состояния клеточных масс, от условий выращивания, а также от вида животного и может составлять предпочтительно, по меньшей мере, один день, более предпочтительно - не менее 3 дней. Зачаток восстанавливаемого зуба или восстанавливаемый зуб, полученный выращиванием в течение этого времени, может экструдироваться в виде функционального зуба сразу после его внедрения в область утраченного зуба.
Кроме того, если продлить время выращивания, то продолжится процесс формирования зачатка восстанавливаемого зуба, то есть аккумуляция дентина и эмали, формирование коронки и формирование корня. Таким образом, время выращивания при формировании зачатка восстанавливаемого зуба можно регулировать в зависимости от условий выполнения выращивания, вида животного, состояния зачатка восстанавливаемого зуба и т.п. Например, при выращивании органной культуры, описанной ниже, можно переходить к этапу внедрения через 7 дней или в некоторых случаях через 6 дней выращивания. В других случаях в зависимости от состояния зачатка восстанавливаемого зуба или при использовании другого способа выращивания период выращивания может продолжаться более 30 дней или в некоторых случаях более 50 дней, более 100 дней или же более 300 дней.
[0034] Выращивание на носителе может выполняться либо только с носителем, содержащим в себе первую и вторую клеточные массы, либо в присутствии других животных клеток.
Если выращивание на носителе выполняется только с носителем, могут применяться условия, обычно используемые для выращивания животных клеток. В этом случае как общие условия для выращивания животных клеток, так и упомянутые выше условия могут применяться без каких-либо изменений. Однако дополнительно к культуре могут быть добавлены сыворотка млекопитающих и различные факторы, способствующие росту и дифференцировке этих клеток. Такие факторы могут представлять собой, например, (FGF) или костный морфогенетический белок (BMP).
[0035] Кроме того, с точки зрения газообмена и снабжения тканей и клеточных масс питательными веществами и с учетом того, что весь процесс подготовки может осуществляться в условиях in vitro без контакта с другими животными клетками, выращивание на носителе предпочтительно выполняется как выращивание органной культуры. Обычно в органной культуре выращивание осуществляется путем наложения пористой мембраны на среду культуры, подходящую для выращивания животных клеток, и помещения на мембрану первой и второй клеточных масс, внедренных в носитель. Используемая при этом пористая мембрана предпочтительно представляет собой мембрану с большим количеством пор диаметром от 0,3 до 5 мкм. Примерами таких мембран являются «Cell Culture Insert» (торговое наименование) и «Isopore Filter» (торговое наименование). Время выращивания органной культуры может составлять приблизительно от 1 до 7 дней, предпочтительно от 3 до 6 дней.
[0036] Если выращивание на носителе выполняется в присутствии других животных клеток, зуб со специфическим расположением клеток может быть сформирован на ранней стадии под воздействием различных цитокинов и подобных факторов из животных клеток. Выращивание в присутствии других животных клеток может выполняться в условиях in vivo с использованием выделенных или выращенных клеток.
[0037] В качестве животных в этом процессе предпочтительно использовать таких млекопитающих, как люди, свиньи, мыши, причем предпочтительно использовать тот же вид, от которого был получена ткань зубного зачатка, или же другой вид, состояние которого было изменено и приведено к иммунодефициту. Если используется живой организм, к предпочтительным видам трансплантации в организм относятся трансплантация в подпочечную капсулу, в мезентериальную ткань и подкожная трансплантация, которые позволяют органу или ткани, состоящим из животных клеток, развиваться как можно более нормально. Время выращивания в присутствии таких животных клеток может соответственно регулироваться в зависимости от происхождения клеток, условий выращивания, вида животного, в которое была выполнена трансплантация, и т.п., как и в случае органной культуры, описанном выше.
[0038] Благодаря такому этапу формирования зачатка восстанавливаемого зуба может быть получен зубной зачаток или зуб с расположением (структурой) клеток, специфическим для зуба, то есть имеющий дентин внутри и эмаль снаружи. Кроме того, зубной зачаток или зуб будут также предпочтительно характеризоваться нужной ориентацией, то есть будут включать коронку и корень зуба.
Как первая клеточная масса, так и вторая клеточная масса предпочтительно представляют собой массы одиночных клеток, поскольку это позволяет получить агрегат, состоящий из нескольких зубов, обладающих специфическим для зубов расположением клеток. Когда такой агрегат будет получен, перед использованием от него отделяют отдельные зубы.
[0039] На этапе определения ориентации в способе изготовления восстановительного материала по настоящему изобретению происходит определение ориентации зубного зачатка или зуба, полученного на описанном выше этапе формирования зачатка восстанавливаемого зуба, что позволяет внедрять зубной зачаток или зуб в область утраченного зуба таким образом, чтобы коронковая часть зуба была направлена внутрь полости рта.
[0040] Под ориентацией зубного зачатка или зуба понимается ориентация, придаваемая зубному зачатку или зубу при внедрении в область утраченного зуба. Если обнаруживается формирование коронки, обеспечивают, чтобы эта коронка была направлена внутрь полости рта. Если же формирование коронки не обнаружено, обеспечивают, чтобы внутрь полости рта была направлена та часть слоя эпителиальных клеток, которая соответствует коронке, или же слой эпителиальных клеток в зачатке восстанавливаемого зуба. Как вариант, можно обеспечить, чтобы открытая часть слоя эпителиальных/мезенхимальных клеток зачатка восстанавливаемого зуба была направлена в сторону, противоположную полости рта. Если поместить зубной зачаток или зуб в области утраченного зуба согласно его ориентации, определенной, как указано выше, коронка зуба будет направлена внутрь полости рта, благодаря чему ориентация этого зуба будет совпадать с ориентацией окружающих зубов.
[0041] Зубной зачаток или зуб, ориентация которого была определена на этапе определения ориентации, используется в качестве восстановительного материала для получения эквивалента утраченного зуба в области утраченного зуба.
С этой целью восстановительный материал, содержащий зубной зачаток или зуб, после определения ориентации внедряют в область утраченного зуба. После этого зубной зачаток или зуб в восстановительном материале начинает расти в области утраченного зуба и через некоторое время экструдируется в качестве эквивалента зуба. После экструзии острие (бугорок) эквивалента зуба достигает почти того же положения, которое занимают окружающие зубы (линия окклюзии), и не вырастает за пределы этого положения, хотя ситуация может быть различной в зависимости от состояния, размеров и т.п. зубного зачатка или зуба в восстановительном материале. Время, в течение которого зубной зачаток или зуб остается внедренным до экструзии и окклюзии, различается у разных видов животных и зависит от условий, в которых находится внедренный зубной зачаток или зуб.
[0042] После экструзии эквивалент зуба имеет твердость, близкую твердости натурального зуба. Твердость представляет собой показатель, который указывает на степень деформирования дентина и эмали эквивалента зуба при сжатии, истирании и/или подобных процессах, и может определяться измерением твердости по Кнупу. У эмали обычного зуба взрослой мыши твердость по Кнупу составляет от 300 до 600 единиц, предпочтительно от 300 до 500 единиц, а у обычного дентина твердость по Кнупу составляет от 60 до 120 единиц. Эквивалент зуба, получаемый согласно настоящему изобретению, имеет твердость по Кнупу в этих же пределах. Благодаря этому обеспечивается его жевательная функция, аналогичная функции обычного зуба.
[0043] После экструзии эквивалент зуба имеет, помимо эмали и дентина, пульпу зуба и периодонтальную связку, то есть обладает тканевым составом, сходным с составом обычного зуба. Поскольку зуб имеет периодонтальную связку, в него могут врастать нервы, что обеспечивает чувствительность к повреждающим стимулам в зубах, например к сжатию. Такой тканевый состав может быть подтвержден визуально или путем гистологического анализа, иммуноокрашивания, анализа экспрессии генов или аналогичными известными способами.
[0044] Таким образом, восстановительный материал, полученный способом изготовления восстановительного материала по настоящему изобретению, может использоваться как исходный материал эквивалента зуба, длина и твердость которого обеспечивают окклюзию с зубом-антагонистом.
[0045] На этапе внедрения в способе восстановления области утраченного зуба по настоящему изобретению зубной зачаток или зуб, полученный на этапе формирования зачатка восстанавливаемого зуба, описанном выше, внедряют в область утраченного зуба в качестве восстановительного материала.
Что касается направления внедрения, зубной зачаток или зуб предпочтительно помещают так же, как и на этапе определения ориентации в указанном выше способе изготовления восстановительного материала, то есть коронку направляют внутрь полости рта, если сформированная коронка обнаруживается, или же часть слоя эпителиальных клеток, соответствующую коронке, или слой эпителиальных клеток в зачатке восстанавливаемого зуба направляют внутрь полости рта, если формирование коронки не обнаружено. В альтернативном варианте открытую часть слоя эпителиальных/мезенхимальных клеток зачатка восстанавливаемого зуба направляют в сторону, противоположную полости рта. Благодаря этому коронка эквивалента зуба оказывается направленной внутрь полости рта, то есть ориентация эквивалента зуба будет совпадать с ориентацией окружающих зубов.
[0046] На размеры и глубину области утраченного зуба обычно не накладываются ограничения, постольку поскольку эта область образуется в десне при удалении зуба или подобной процедуре. На форму области утраченного зуба также не накладывается ограничений. Как только будет обеспечена возможность внедрить регенерированный зубной зачаток в эту область, все эти параметры могут соответствующим образом регулироваться в зависимости от характера области, вида животного, типа восстанавливаемого зуба и т.п.
Область утраченного зуба обычно располагается в челюстной кости, альвеолярном отростке полости рта и т.п. Если вследствие потери зуба масса альвеолярного отростка уменьшилась, ее можно увеличить регенерацией кости с применением известных способов, используемых клинически для внедрения имплантата, например направленной тканевой регенерацией НТР (GTR). Помещение зубного зачатка или зуба в участок отверстия предпочтительно сопровождается наложением швов или аналогичными приемами согласно обычной методике.
[0047] После этого внедренный в область утраченного зуба зубной зачаток растет и со временем превращается в зуб, проходя этап экструзии в качестве эквивалента зуба. Подобно тому, как это было описано выше для способа изготовления восстановительного материала, острие (бугорок) эквивалента зуба после экструзии достигает почти того же положения, которое занимают окружающие зубы (линия окклюзии), и не вырастает за пределы этого положения, хотя ситуация может быть различной в зависимости от состояния, размеров и т.п. внедренного зубного зачатка. Благодаря этому можно довести длину зуба до такой величины, при которой будет обеспечена окклюзия с зубом-антагонистом. Время, в течение которого зубной зачаток или зуб остается внедренным до экструзии и окклюзии, различается у разных видов животных и зависит от условий, в которых находится внедренный зубной зачаток или зуб.
[0048] Подобно тому, как это было описано выше для способа изготовления восстановительного материала, эквивалент зуба после экструзии имеет твердость, близкую твердости натурального зуба. Твердость представляет собой показатель, который указывает на степень деформирования дентина и эмали эквивалента зуба при сжатии, истирании и/или подобных процессах, и может определяться измерением твердости по Кнупу. У эмали обычного зуба взрослой мыши твердость по Кнупу составляет от 300 до 600 единиц, предпочтительно от 300 до 500 единиц, а у обычного дентина твердость по Кнупу составляет от 60 до 120 единиц. Эквивалент зуба, получаемого согласно настоящему изобретению, имеет твердость по Кнупу в этих же пределах. Благодаря этому обеспечивается его жевательная функция, аналогичная функции обычного зуба.
[0049] Далее, подобно тому, как это было описано выше для способа изготовления восстановительного материала, эквивалент зуба после экструзии имеет помимо эмали и дентина пульпу зуба и периодонтальную связку, то есть обладает тканевым составом, сходным с составом обычного зуба. Поскольку зуб имеет периодонтальную связку, в него могут врастать нервы, что обеспечивает чувствительность к повреждающим стимулам в зубах, например к сжатию. Такой тканевый состав может быть подтвержден визуально или путем гистологического анализа, иммуноокрашивания, анализа экспрессии генов или аналогичными известными способами.
[0050] Способ настоящего изобретения для восстановления области утраченного зуба предусматривает использование зубного зачатка или зуба, восстановленного, как описано выше, поэтому в результате восстановления области утраченного зуба могут быть достигнуты нормальная окклюзия и чувствительность к повреждающим стимулам, равноценные этим же характеристикам обычных зубов. Благодаря этому эквивалент зуба, регенерированный в области утраченного зуба, выполняет функции зуба, и восстановленное состояние может поддерживаться в течение длительного времени.
Это позволяет поддерживать качество жизни, и настоящий способ может быть успешно использован для удовлетворения эстетических потребностей. Кроме того, поскольку удается предотвратить ухудшение здоровья, связанное с наличием в полости рта области утраченного зуба, возможно поддерживать здоровое состояние животных-млекопитающих, например домашнего скота, в том числе коров, лошадей и свиней, и животных домашнего содержания, в том числе собак и кошек.
ПРИМЕРЫ
[0051] Далее будут описаны примеры к настоящему изобретению, однако объем настоящего изобретения ими не ограничивается. Процентное содержание в примерах указано от веса (массы), если не оговорено иное.
[0052] Пример 1
(1) Подготовка эпителиальных и мезенхимальных клеток зубного зачатка
С целью формирования зуба было выполнено восстановление зубного зачатка. Этот эксперимент проводился на мыши.
2+
2+
Ткань зубного зачатка нижнего моляра известным способом выделили из эмбриона мыши линии C57BL/6N (приобретенного у CLEA Japan, Inc.) со сроком эмбрионального развития 14,5 дней под микроскопом. Ткань зубного зачатка нижнего моляра промыли фосфатно-буферным раствором (PBS(-)) без Са/Мg и в течение 12,5 минут обработали при комнатной температуре ферментным раствором, приготовленным добавлением диспазы II (Roche, Мангейм, Германия) к раствору PBS(-) до конечной концентрации 1,2 ед./мл. Затем ткань зубного зачатка трехкратно промыли в среде СИМД (DMEM) (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) с добавлением с 10% сыворотки новорожденных телят (FCS) (JRH Biosciences, Ленекса, Канзас, США). Вслед за этим для диспергирования ткани зубного зачатка добавили раствор ДНКазы I (Takara, Сига, Япония) до конечной концентрации 70 ед./мл, после чего эпителиальную и мезенхимальную ткань зубного зачатка отделили друг от друга с помощью инъекционной иглы 25 калибра (Terumo, Токио, Япония).
[0053] Для получения эпителиальных клеток эпителиальную ткань зубного зачатка, выделенную, как описано выше, трехкратно промыли раствором PBS(-) и двукратно в течение 20 минут обработали при 37°С ферментным раствором, приготовленным с добавлением коллагеназы 1 (Worthington, Лейквуд, Нью-Джерси, США) в PBS(-) до конечной концентрации 100 ед./мл. Клетки собрали осаждением с помощью центрифуги и в течение 5 минут обработали 0,25% раствором трипсина (Sigma) в PBS(-) при 37°С. Далее клетки трехкратно промыли в среде СИМД (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, после чего к ним добавили раствор ДНКазы I до конечной концентрации 70 ед./мл и пипетированием сняли эпителиальные клетки одного зубного зачатка.
Для получения мезенхимальных клеток мезенхимальную ткань зубного зачатка трехкратно промыли раствором PBS(-) и обработали раствором PBS(-), содержащим 0,25% трипсина (Sigma) и 50 ед./мл коллагеназы I (Worthington). К полученному добавили ДНКазу I (Takara) до концентрации 70 ед./мл, после чего пипетированием сняли мезенхимальные клетки одного зубного зачатка.
[0054] (2) Подготовка зачатка восстанавливаемого зуба
Вслед за этим с использованием эпителиальных и мезенхимальных клеток зубного зачатка, приготовленных, как описано выше, было осуществлено восстановление зубного зачатка. Эпителиальные клетки зубного зачатка или мезенхимальные клетки зубного зачатка, суспендированные в среде СИМД (DMEM) (Sigma), поместили в микропробирку 1,5 мл (Eppendorf, Гамбург, Германия) с покрытием силиконовой смазкой, куда были добавлены также 10% эмбриональной телячьей сыворотки FCS (JRH). После этого клетки восстановили осаждением с помощью центрифуги. После центрифугирования надосадочную жидкость среды культуры удалили до максимально возможной степени, после чего центрифугирование выполнили снова и полностью удалили среду культуры, остававшуюся на клеточном осадке, под стереоскопическим микроскопом с помощью микродозатора GELoader 0,5-20 мкл (Eppendorf). После этого клетки диспергировали легким встряхиванием или пипетированием, чтобы получить клетки - материал для подготовки зачатка восстанавливаемого зуба.
4
[0055] В чашку Петри с покрытием силиконовый смазкой по каплям добавили 30 мкл «Cellmatrix» типа I-A (Nitta gelatin, Осака, Япония), чтобы сформировать каплю коллагенового геля. В этот раствор ввели от 0,2 до 0,3 мкл упомянутых выше эпителиальных или мезенхимальных клеток зубного зачатка с помощью микродозатора 0,1-10 (Quality Scientific plastics), чтобы приготовить агрегат клеток (5×10 клеток/агрегат). Чтобы сформировать зачаток восстанавливаемого зуба, таким же образом ввели и эпителиальные клетки, в результате чего в процессе подготовки агрегата клеток они оказались в контакте с агрегатом мезенхимальных клеток зубного зачатка, приготовленных, как указано выше. Это позволило приготовить зачаток, в котором оба вида клеток находились в тесном контакте друг с другом.
2
[0056] Зачаток восстанавливаемого зуба, приготовленный в геле, оставили в СО-инкубаторе на 10 минут для отверждения «Cellmatrix» I-A (Nitta Gelatin). Был приготовлен сосуд с культурой, в котором среда СИМД (DMEM) (Sigma) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки FCS (JRH) находилась в контакте с мембранами «Cell Culture Insert» (полиэтилентерефталатные мембраны с размером пор 0,4 мкм; BD, Франклин-Лейке, Нью-Джерси, США). Агрегат клеток вместе с окружающим его гелем в качестве носителя перенесли в сосуд с культурой на мембрану «Cell Culture Insert» и выращивали там органную культуру в течение 18-24 часов. По завершении этого периода выращивание органной культуры продолжили в «Cell Culture Insert», чтобы проанализировать развитие зуба.
[0057] (3) Методика разделения на отдельные зачатки
2
Со второго по пятый день выращивания органной культуры зачаток восстанавливаемого зуба, в котором развилось несколько зубных зачатков, подвергли хирургическому разделению на отдельные зачатки под стереоскопическим микроскопом с использованием инъекционной иглы и пинцета. В чашку Петри с покрытием силиконовый смазкой по каплям добавили 30 мкл «Cellmatrix» типа I-A (Nitta gelatin, Осака, Япония), чтобы сформировать каплю коллагенового геля. Каждый выделенный отдельно зубной зачаток помещали в этот раствор и оставляли в СO-инкубаторе на 10 минут для отверждения «Cellmatrix» I-A (Nitta Gelatin). Был приготовлен сосуд с культурой, в котором среда СИМД (DMEM) (Sigma) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (JRH) находилась в контакте с мембранами «Cell Culture Insert» (полиэтилентерефталатные мембраны с размером пор 0,4 мкм; BD, Франклин-Лейке, Нью-Джерси, США). Выделенный отдельно зубной зачаток вместе с окружающим его гелем в качестве носителя перенесли в сосуд с культурой на мембрану «Cell Culture Insert» и выращивали там органную культуру в течение 18-24 часов.
[0058] (4) Трансплантация в полость рта
С выделенного отдельно зубного зачатка, приготовленного, как описано выше, хирургическим путем сняли окружающий его гель с использованием инъекционной иглы и пинцета. Выделенный отдельно зубной зачаток трансплантировали в альвеолярный отросток в области первого моляра (М1) в верхней челюсти мыши C57BL/6 возраста от 7 до 10 недель без трансплантации в подпочечную капсулу. В соответствии с настоящим изобретением отдельный зуб в полости рта был доведен до экструзии, чтобы обеспечить выполнение такой функции, как жевание.
[0059] Пример 2
(1) Подготовка выделенного отдельно зубного зачатка
2
Органная культура выращивалась таким же образом, как в Примере 1, этапы (1) и (2), и со второго по пятый день выращивания зачаток восстанавливаемого зуба, в котором развилось несколько зубных зачатков, подвергли хирургическому разделению на отдельные зачатки под стереоскопическим микроскопом с использованием инъекционной иглы и пинцета. Чтобы получить выделенный отдельно зубной зачаток, в чашку Петри с покрытием силиконовый смазкой по каплям добавили 30 мкл «Cellmatrix» типа I-A (Nitta gelatin, Осака, Япония), чтобы сформировать каплю коллагенового геля. Каждый выделенный отдельно зубной зачаток помещали в этот раствор и оставляли в СO-инкубаторе на 10 минут для отверждения «Cellmatrix» I-A (Nitta Gelatin). В приготовленном сосуде с культурой среда СИМД (DMEM) (Sigma) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки FCS (JRH) находилась в контакте с мембранами «Cell Culture Insert» (полиэтилентерефталатные мембраны с размером пор 0,4 мкм; BD, Франклин-Лейке, Нью-Джерси, США). Выделенный отдельно зубной зачаток вместе с окружающим его гелем в качестве носителя перенесли в сосуд с культурой на мембрану «Celt Culture Insert» и выращивали там органную культуру в течение 5 дней. Когда сформировалось несколько зачатков восстанавливаемых зубов, хирургическим путем они были разделены на зачатки, соответствующие отдельным зубам. После выращивания зачатка окружающий его гель сняли хирургическим путем с использованием инъекционной иглы и пинцета и трансплантировали зубной зачаток в альвеолярный отросток в области первого моляра (М1) в верхней челюсти мыши C57BL/6 8-недельного возраста.
[0060] (2) Методика трансплантации в полость рта
За три дня до трансплантации 8-недельной мыши C57BL/6 после ингаляционной анестезии диэтиловым эфиром ввели внутрибрюшинно физиологический раствор в дозе 240 мкл/20 г веса тела, содержащий 5 мг/мл пентобарбитала натрия. Из верхней челюсти мыши под анестезией с помощью щипцов извлекли верхний М1, убедились, что не остался неудаленный корень, и остановили кровотечение гигроскопической ватой. Чтобы обеспечить питание, мышь ежедневно кормили порошкообразной пищей. Чтобы подготовить мышь C57BL/6 без М1, ее наблюдали не менее 3 недель до заживления раны от удаленного зуба.
[0061] Мышь линии C57BL/6 без М1, подготовленную описанным выше способом, подвергли ингаляционной анестезии диэтиловым эфиром и ввели ей внутрибрюшинно физиологический раствор в дозе 240 мкл/20 г веса тела, содержащий 5 мг/мл пентобарбитала натрия. Мышь под анестезией зафиксировали на спине на секционном столе, при этом верхнюю и нижнюю челюсти зафиксировали с помощью резинок или нитей, чтобы рот был широко открыт. В десне у альвеолярного гребня в области верхнего М1 сделали разрез скальпелем и отвернули десну вместе с надкостницей, чтобы обнажить нижнюю челюсть. С помощью прямой дрели со сверхтонкими сверлами подготовили в области нижней челюсти, соответствующей М1, отверстие диаметром 1 мм, не задевая при этом гайморову полость, и в полученное отверстие трансплантировали выделенный отдельно зубной зачаток. После трансплантации рану закрыли периостально-гингивальным лоскутом и зашили нитью с прикрепленной к ней иглой. Чтобы контролировать ориентацию выделенного отдельно зубного зачатка, подготовленного к трансплантации, бугорок этого зубного зачатка пометили метиленовым синим и при трансплантации зачаток установили этой меткой в сторону экструзии. После трансплантации 8-недельную мышь линии C57BL/6 ежедневно кормили порошкообразной пищей.
[0062] Мыши C57BL/6, которой описанным выше способом был трансплантирован индивидуальный зубной зачаток, ввели внутрибрюшинно физиологический раствор в дозе 240 мкл/20 г веса тела, содержащий 5 мг/мл пентобарбитала натрия. Мышь под анестезией зафиксировали на спине на секционном столе, при этом верхнюю и нижнюю челюсти зафиксировали с помощью резинок, чтобы рот был широко открыт. Регенерированный зуб, дистальные области М2 и М3 и соседние участки десны наблюдали до экструзии, непосредственно перед экструзией, непосредственно после экструзии, во время экструзии и в момент, когда зуб достиг поверхности окклюзии. Результаты наблюдения представлены на Фиг.1. На Фиг.1А-1Е левое изображение показывает состояние во время экструзии (от периода до экструзии до момента непосредственно после экструзии); среднее изображение показывает состояния во время периода, протекавшего после экструзии до окклюзии; и правое изображение показывает состояние после окклюзии. На каждом из изображений Фиг.1А-1Е регенерированный зуб представлен в правой части изображения.
[0063] Приблизительно с 20-го по 50-й день после трансплантации можно было наблюдать бугорок регенерированного зуба в области десны, соответствующей М1, что указывает на начало процесса экструзии. С течением времени высота коронки регенерированного зуба увеличивалась, и этот зуб достиг линии окклюзии. Достигнув линии окклюзии, регенерированный зуб оказался в положении бугорково-фиссурного контакта с зубом-антагонистом (см. Фиг.1А-1С).
Эти результаты показывают, что регенерированный зуб оказывается в состоянии устойчивой окклюзии подобно обычному зубу и способен выполнять жевательную функцию.
[0064] (3) Анализ с помощью компьютерной микротомографии
Голову с верхней челюстью, в которую был трансплантирован выделенный отдельно зубной зачаток, удалили и целиком поместили в 4%-ный параформальдегид на фосфатном буфере на 12 часов, после чего выполнили визуализацию методом компьютерной томографии с помощью прибора inspeXio SMX-90CT (производство Shimadzu Corporation). Визуализация выполнялась со следующими параметрами: количество срезов - 600; усредненное - 10; сканов - 1; размер - 512×512; масштаб - 1:50; толщина среза - 1; без коррекции на увеличение жесткости излучения. Данные, полученные посредством компьютерной томографии, были обработаны путем трехмерной реконструкции с помощью программного обеспечения Imaris (производство Zeiss) для подготовки микротомографических изображений в поперечных проекциях.
[0065] В результате микротомографического анализа было установлено, как показано на Фиг.1D и 1Е, что в процессе экструзии регенерированный зуб при формировании корня перемещается в продольном направлении и экструдируется из альвеолярного гребня, после чего достигает линии окклюзии. Между корневым участком и альвеолярным отростком наблюдалась полость, соответствующая периодонтальной связке, и в поперечной проекции просматривается наличие пульповой камеры и открывание апикального отверстия в верхушке корня, как у обычного зуба. Было установлено, что регенерированный зуб достиг бугорково-фиссурного контакта с зубом-антагонистом в состоянии окклюзии. Эти результаты показывают, что в процессе экструзии регенерированный зуб перемещается по альвеолярному отростку в продольном направлении, сохраняя периодонтальную связку и пульповую камеру, и достигает линии окклюзии, как это происходит у обычного зуба.
[0066] Аналогичным образом в голове, помещенной в 4%-ный параформальдегид на фосфатном буфере, вскрыли моляры М3 верхней и нижней челюсти и сделали внутри полости рта известным способом снимки при центральной окклюзии. При этом горизонтальный угол определялся для плоскости между поверхностями окклюзии нижнего М3 и нижнего М1, а вертикальный угол - для перекрытия мезиального щечного бугорка и мезиального язычного бугорка нижнего М1 при виде сбоку.
[0067] В результате было подтверждено, что регенерированный зуб находился в состоянии окклюзии с дистальным бугорком нижнего М1, создавая плоскую поверхность окклюзии с верхними М2 и М3. Это позволило сделать вывод, что регенерированный зуб после экструзии приобрел устойчивую линию окклюзии, необходимую для установления нужного положения нижней челюсти.
[0068] (4) Твердость по Кнупу
После восстановления отдельного зуба, развитие которого в полости рта протекало так, как описано в Примере 2 (1), было выполнено измерение твердости его эмали и дентина по сравнению с таким же зубом не менее чем в трех положениях.
Измерение выполнялось с помощью микротвердомера (НМ-102 производства Mitutoyo Corporation), оборудованного алмазным индентором для измерения твердости по Кнупу в виде четырехугольной пирамиды с вертикальными углами между противоположными гранями 172°30' и 130° (19ВAA061 производства Mitutoyo Corporation). Индентор прижали к регенерированному зубу с нагрузкой 10 г на 10 секунд, чтобы определить твердость по длине большей стороны ромбовидного отпечатка 7,11:1. Регенерированный зуб закрепили на металлической пластине с помощью зубопротезной отверждаемой смолы (Unifast III производства GC CORPORATION). Измерение твердости эмали выполняли для участка, параллельного поверхности земли; измерение твердости дентина выполняли после того, как испытываемую поверхность обнажили разрезанием зуба в горизонтальном направлении с помощью бормашины (ULTIMATE 500 производства NAKANISHI INC.). Результаты измерения твердости по Кнупу приведены на Фиг.2.
[0069] Как показано на Фиг.2, у эмали обычного зуба твердость по Кнупу составляет в среднем 341,083 единиц в возрасте 3 недель, 457,5 единиц в возрасте 6 недель и 436 единиц в возрасте 9 недель, а у эмали регенерированного зуба твердость по Кнупу составила в среднем 469,81 единиц (см. Фиг.2А). У дентина обычного зуба твердость по Кнупу составляет в среднем 66,87 единиц в возрасте 3 недели, 76,53 единиц в возрасте 6 недель, и 88,58 единиц в возрасте 9 недель, тогда как у дентина регенерированного зуба твердость по Кнупу составила в среднем 81,83 единиц (см. Фиг.2В). Таким образом, было признано, что регенерированный зуб обладает необходимой твердостью для выполнения обычной жевательной функции.
[0070] (5) Гистологический анализ
Приблизительно с 20-го по 50-й день после трансплантации можно было наблюдать бугорок регенерированного зуба в области десны, соответствующей М1, что указывало на начало процесса экструзии. Для наблюдения за экструзией удалили верхнюю челюсть перед экструзией, верхнюю челюсть непосредственно до экструзии, верхнюю челюсть непосредственно после экструзии, верхнюю челюсть в процессе экструзии и верхнюю челюсть при достижении зубом линии окклюзии. Верхние челюсти поместили в 4%-ный параформальдегид на фосфатном буфере на 16 часов и декальцинировали в 22,5%-ной муравьиной кислоте в течение 72 часов, после чего залили в парафин известным способом и приготовили срезы толщиной 10 мкм. На каждые две верхних челюсти расходовалось 50 мл декальцинирующей жидкости, и ее полную замену при декальцинации выполняли каждые 48 часов. Гистологический анализ был проведен с помощью окрашивания гематоксилином и эозином известным способом.
[0071] На Фиг.3 показан регенерированный зуб непосредственно перед экструзией (белая стрелка). На Фиг.3 можно видеть структуру ткани, эквивалентную структуре ткани обычного зуба и включающую эмаль, дентин, пульпу и периодонтальную связку. В соответствующих тканях эмаль включает расположенные рядом друг с другом эмалевые призмы, и дентин включает дентинные канальцы. Периодонтальная связка имеет достаточную толщину и обладает структурой, позволяющей амортизировать жевательные нагрузки. Во время экструзии было отмечено, что регенерированный зуб при формировании корня перемещался в продольном направлении и экструдировался из альвеолярного гребня, достигая впоследствии линии окклюзии. Этот процесс не повредил периодонтальную связку, что указывает на то, что регенерированный зуб гармонично сочетается с пародонтом.
[0072] (6) Анализ перестройки кости под действием ортодонтической силы
Поскольку зуб соединен с окружающим его альвеолярным отростком посредством периодонтальной связки, воздействие на зуб ортодонтической силы приведет к передаче механического напряжения окружению через периодонтальную связку. На участке периодонтальной связки, сжимаемом ортодонтической силой, происходит деминерализация кости за счет остеокластов, а на участке периодонтальной связки, претерпевающем растяжение, происходит остеогенез за счет остеобластов, что позволяет сохранить расстояние между зубом и альвеолярным отростком постоянным. Чтобы оценить эти функции периодонтальной связки, к регенерированному зубу была приложена ортодонтическая сила и последующий анализ подтвердил перестройку кости, которая включала появление остеокластов на стороне сжатия и появление остеобластов на стороне растяжения, вызываемые перемещением обычного зуба.
[0073] Из никель-титановой проволоки диаметром 0,012 дюйма (ортодонтическая проволока VIM-NT, круглая, OralCare) приготовили ортодонтические проволоки для буккального перемещения, причем один конец каждой проволоки изогнули в виде петли, которую можно было зацепить за шейку любого резца в верхней челюсти. Мыши C57BL/6, которой описанным выше способом был трансплантирован индивидуальный зубной зачаток, ввели внутрибрюшинно физиологический раствор в дозе 240 мкл/20 г веса тела, содержащий 5 мг/мл пентобарбитала натрия. Мышь под анестезией зафиксировали на спине на секционном столе, при этом верхнюю и нижнюю челюсти зафиксировали с помощью резинок или нитей, чтобы рот был широко открыт. Конец проволоки, противоположный петле, сделали достаточно длинным, чтобы этот конец доставал до дистального участка экструдированного зуба. Петлю ортодонтической проволоки для буккального перемещения зацепили на шейку произвольно выбранного резца в верхней челюсти, закрепив другой конец проволоки с буккальной стороны шейки зуба, предназначенного для ортодонтической терапии. После чего петлю приклеили с помощью UNIFIL FLOW (светоотверждаемая смола производства GC CORPORATION). Конец проволоки, закрепленный с буккальной стороны шейки зуба, передвинули на лингвальную сторону шейки зуба, чтобы создать ортодонтическую силу. Вслед за этим для изучения перестройки кости, вызванной периодонтальной связкой, был выполнен гистологический анализ, который провели на 6 день после ортодонтической терапии, когда перестройка кости наиболее заметна. Результаты представлены на Фиг.4А-4С.
[0074] Чтобы оценить чувствительность периодонтальной связки регенерированного зуба к механическому напряжению, к этому зубу приложили ортодонтическую силу, вызывающую перемещение в буккальном направлении, и исследовали тканевую картину перестройки кости с помощью окрашивания гематоксилином и эозином.
С буккальной стороны было отмечено сжатие периодонтальной связки, при котором волокна периодонтальной связки оказались сжатыми из-за сужения периодонтального пространства (см. область В в черной рамке на Фиг.4А и Фиг.4В). И, напротив, с противоположной, то есть лингвальной, стороны периодонтальное пространство расширилось, вызывая растяжение периодонтальной связки, при котором волокна периодонтальной связки натянулись (см. область С в черной рамке на Фиг.4А и Фиг.4С). Кроме того, поскольку был обнаружен отдельный слой клеток, выровненных вдоль стенки альвеолярного отростка со стороны растяжения периодонтальной связки, был сделан вывод о возникновении остеобластов, из которых формируется кость (см. стрелки на Фиг.4С). Со стороны сжатия, противоположной стороне растяжения, в альвеолярном отростке были обнаружены гигантские многоядерные клетки с несколькими ядрами в одном клеточном теле и полости, образуемые резорбцией костной ткани, из чего был сделан вывод о формировании остеокластов (см. стрелки на Фиг.4В) и костной резорбции.
На основании этого было признано, что в регенерированном зубе механические напряжения, например ортодонтическая сила, вызывают реакцию периодонтальной связки в виде перестройки кости, как и в обычном зубе.
[0075] (8) Анализ болевого раздражения
Хорошо известно, что при проведении ортодонтической терапии и подобных ей мерах воздействия возникает боль из-за сжатия зубов, причем установлено, что эту боль передают главным образом нервы периодонтальной связки и что при этом увеличивается выработка белка с-Fos в нервных клетках каудального подъядра спинномозгового ядра тройничного нерва (в дорсальных рогах спинного мозга) (Byers MR. et al. // Crit Rev Oral Biol Med. 10, 4-39, 1999; Deguchi Т. et al. // J Dent Res. 82:677-681, 2003; Fujiyoshi, Y. et al. // Neuroscience Letters. 283, 205-208, 2000). Кроме того, хорошо известно, что терапия со вскрытием пульпы зуба вызывает боль из-за обнажения зубной пульпы, причем установлено, что, как и в случае боли при ортодонтической терапии, боль передают главным образом нервы зубной пульпы и что при этом увеличивается выработка белка c-Fos в нервных клетках каудального подъядра спинномозгового ядра тройничного нерва (в дорсальных рогах спинного мозга) (Byers MR. et al. // Crit Rev Oral Biol Med. 10, 4-39, 1999; Deguchi T. et al. // J Dent Res. 82:677-681, 2003). Таким образом, для анализа функций нервов в регенерированном зубе восстановленный зуб мыши был подвергнут сжимающему воздействию, подобному тому, которое применяется при ортодонтической терапии, и было выполнено вскрытие пульпы зуба путем высверливания отверстия в дентине с помощью бормашины. При этом было исследовано, вызывают ли эти воздействия увеличение экспрессии белка c-Fos в каудальном подъядре спинномозгового ядра тройничного нерва (в дорсальных рогах спинного мозга).
[0076] Мыши C57BL/6, которой описанным выше способом был трансплантирован индивидуальный зубной зачаток, ввели внутрибрюшинно физиологический раствор в дозе 200 мкл/20 г веса тела, содержащий 5 мг/мл пентобарбитала натрия. Мышь под анестезией зафиксировали на спине на секционном столе.
Через два часа и через 48 часов после активации ортодонтической силы описанным выше способом, а также через два часами после вскрытия пульпы зуба, C57BL/6 подвергли перфузионной фиксации 4%-ным параформальдегидом на фосфатном буфере. Выделенный продолговатый мозг поместили в 4%-ный параформальдегид на фосфатном буфере на 16 часов и заключили в заливочную среду ОСТ (Miles Inc., Непервиль, Иллинойс, США) известным способом, после чего приготовили срезы толщиной 50-мкм с помощью криостата (Leica, Ветцлар, Германия). Приготовленные срезы подвергли иммуноокрашиванию с использованием с-Fos (SANTA CRU Z BIOTECHNOLOGY, INC., Санта-Крус, Калифорния, США) в качестве первичных антител, кроличьего иммуноглобулина G с примесью козьего иммуноглобулина G (CAPPEL, Аврора, Огайо, США) в качестве вторичного антитела и кроличьей пероксидазы-антипероксидазы (CAPPEL, Аврора, Огайо, США) в качестве третичного антитела, после чего было выполнено сравнение экспрессии в спинномозговом ядре тройничного нерва.
[0077] После удаления среды ОСТ для блокирования эндогенной ферментативной активности образец в течение 1 часа выдерживали в 0,3%-ном растворе перекиси водорода в 80% метанола при комнатной температуре. Вслед за этим выполнили блокирование блокирующим раствором (3%-ный раствор козьей сыворотки на трис-буферном разбавителе) при комнатной температуре в течение 1 часа и провели реакцию первичного антитела с образцом при 4°С в течение 72 часов. После промывания образца выполнили блокирование блокирующим раствором при комнатной температуре в течение 1 часа и провели реакцию вторичного антитела с образцом при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывания образца выполнили блокирование блокирующим раствором при комнатной температуре в течение 1 часа и провели реакцию третичного антитела с образцом при комнатной температуре в течение 1 часа. После достаточного промывания к образцу для окрашивания по каплям добавляли раствор субстрата - диаминобензидина/сульфата аммония-никеля (от 0,08 до 0,1% сульфата аммония-никеля с 0,04% диаминобензидина - 0,003% перекиси водорода на трис-буферном разбавителе). После окрашивания срезы в достаточной степени промыли и заключили в глицерол. Наблюдение за образцом вели в прямой микроскоп (Axioimager производства Zeiss). Результаты представлены на Фиг.5.
[0078] В результате, как показано на Фиг.5А, в каудальном подъядре спинномозгового ядра тройничного нерва (в дорсальных рогах спинного мозга) мыши C57BL/6, которая не подвергалась ни ортодонтической терапии регенерированного зуба, ни терапии со вскрытием пульпы зуба, экспрессия белка c-Fos не наблюдалась. В то же время, как показано на Фиг.5В и Фиг.5С, в каудальном подъядре спинномозгового ядра тройничного нерва (в дорсальных рогах спинного мозга) мыши C57BL/6, которая была подвергнута ортодонтической терапии, через 2 часа был обнаружен высокий уровень экспрессии белка c-Fos, и эта экспрессия сохранялось 48 часов после стимулирования, как показано на Фиг.5С. Далее, как показано на Фиг.5D, в каудальном подъядре спинномозгового ядра тройничного нерва (в дорсальных рогах спинного мозга) мыши C57BL/6, у которой вскрывали пульпу регенерированного зуба, через 2 часа был обнаружен высокий уровень экспрессии белка c-Fos. Эти результаты показывают, что нервные волокна, имеющиеся в области периодонтальной связки, воспринимают сжимающее воздействие, вызванное применением ортодонтической терапии к регенерированному зубу, и болевое раздражение и что эти воздействия передаются в центральную нервную систему, как и у обычного зуба.
[0079] Таким образом, было показано, что благодаря применению способа восстановления по настоящему изобретению область утраченного зуба может быть восстановлена настолько, что восстановленный зуб будет иметь твердость, равноценную твердости обычного зуба, сможет обеспечивать нормальную окклюзию и обладать чувствительностью к стимулам, равноценной нормальной чувствительности. [0080] Японская заявка на изобретение Японии №2008-211870 полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
Все источники литературы, патентные заявки и технические стандарты, описанные в настоящем документе, включены в него посредством ссылки в той же степени, как и в случаях, когда имеется явное и специальное указание на то, что конкретный источник литературы, индивидуальная заявка на изобретение или конкретный технический стандарт описаны для включения посредством ссылки.