Индуцированный морфогенез и регенерация in vitro растений ячменя отечественных сортов

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2009, № 3

УДК 633.16:581.085

ИНДУЦИРОВАННЫЙ МОРФОГЕНЕЗ И РЕГЕНЕРАЦИЯ in vitro РАСТЕНИЙ ЯЧМЕНЯ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ СОРТОВ

Е.А. СИДОРОВ, М.А. ЧЕРНОБРОВКИНА, А.Н. НИКОЛАЕВА,

П.Н. ХАРЧЕНКО, С.В. ДОЛГОВ

Изучали влияние генотипа и компонентов питательной среды на процессы каллусообразования, морфогенеза и регенерацию in vitro у трех российских сортов ярового ячменя — Стимул, Виконт и Мамлюк. Наиболее эффективную регенерацию побегов наблюдали при использовании эксплантов сорта Стимул и модифицированной среды Мурасиге-Скуга, содержащей гидролизат казеина (1 г/л), миоинозитол (100 мг/л) и бензиладенин (3,0 мг/л), а также 50-кратное (относительно стандартного) количество ионов Cu2+.

Ключевые слова: ячмень (Hordeum vulgare L.), генотипы, незрелые зародыши, каллусогенез, органогенез, регенерация in vitro.

Key words: barley, genotypes, immature embryos, callusogenesis, organogenesis, regeneration in vitro.

В последние два десятилетия наряду с традиционными селекционными методами при решении ряда проблем выведения высокотехнологичных сортов с повышенной пищевой ценностью все большее значение приобретают технологии рекомбинантных ДНК. Однако использование генноинженерного подхода для получения ценных форм, например, злаковых оказалось весьма проблематичным, так как в целом клетки и ткани однодольных растений с большим трудом поддаются регенерации в культуре in vitro. В частности, культура ячменя в условиях in vitro быстро утрачивает способность к регенерации либо образует альбиносные растения. В определенной степени это обусловлено тем, что только незрелые ткани и клетки строго ограниченного возраста могут эффективно регенерировать. Оптимальные для этих целей ткани и условия неодинаковы не только для разных видов злаков, но и для сортов одного вида, в связи с чем первостепенное значение приобретает наличие эффективного и воспроизводимого протокола регенерации, позволяющего получать интактные зеленые растения с частотой не ниже 70-80 %.

Регенерационная способность растений представляет собой свойство генотипа и различается не только у видов и сортов, но даже у отдельных растений (1-5). В подавляющем большинстве случаев в качестве объекта исследований по регенерации и трансформации ячменя выступают растения модельных сортов Golden Promise и Igri, которые уже давно не фигурируют в селекционных программах, а соответствующие протоколы для сортов, обладающих хозяйственно полезными признаками, требуют значительного усовершенствования. Регенерация любой культуры зависит также от состава питательной среды: подобрав оптимальное соотношение ее компонентов (цитокинины и ауксины, источник углеводов, биологические добавки), можно существенно улучшить регенерацию растений in vitro (6-8). Кроме того, успешное культивирование клеток и тканей in vitro в значительной степени определяется типом экспланта. В настоящее время для ячменя наилучшими эксплантами признаны незрелые зиготические зародыши (9, 10).

В связи с этим целью нашей работы было изучение влияния генотипа и компонентов культуральной среды на индукцию формирования морфогенного каллуса и регенерации растений ячменя.

Методика. В качестве объектов исследования использовали три сорта ярового ячменя селекции Краснодарского НИИ сельского хозяйства — Виконт, Стимул и Мамлюк, различающихся по срокам созревания и

73

направлениям использования. Донорные растения выращивали в факторостатных условиях (день/ночь — 16/8 ч, температура дневная — 18-20 °С, ночная — 14-16 °С) в оранжерее станции искусственного климата «Биотрон» Филиала Института биоорганической химии РАН (г. Пущино) с соблюдением всех необходимых агротехнических режимов.

Колосья донорных растений срезали через 12-15 сут после цветения, зерновки отделяли от стержня и помещали в 70 % (объем/объем) раствор этанола на 1 мин, затем стерилизовали в 30 % растворе (объем/объем) коммерческого препарата «Белизна» (Россия) (содержание хлора около 10 %) в течение 30 мин при интенсивном встряхивании и трижды промывали стерильной дистиллированной водой. Из поверхностно стерилизованных зерновок в асептических условиях под бинокуляром с помощью глазного скальпеля извлекали незрелые зародыши (длиной 0,5-1,5 мм). Для индукции каллусообразования их помещали щитком вверх в чашки Петри на питательную среду.

Базовой для каллусообразования и регенерации служила среда Му-расиге-Скуга (МС) (11), дополненная фитогормонами (цитокинины и ауксины в различных концентрациях), а также биологическими добавками (гидролизат казеина и миоинозитол). Питательные среды автоклавировали (давление — 1,0 атм, температура — 121 °С) в течение 20 мин (предварительно доводили рН питательной среды до значения 5,8 с помощью 1 М КОН). Регуляторы роста и витамины стерилизовали фильтрованием («Mil-lipore», США, диаметр пор 0,22 мкм) и добавляли в остывшую среду.

Каллусы выращивали в темноте при температуре 26 °С, поместив чашки Петри с высаженными эксплантами в термостат. Через 2-3 нед после начала пролиферации каллусной ткани сравнивали частоту и качество каллусообразования. Способность к каллусообразованию оценивали как долю (%) эксплантов, образовавших каллус, от числа высаженных. Морфологию каллуса определяли под световым микроскопом MZ FLIII («Leica Microsystems», Wetzlar, Германия): плотный каллус с гладкой блестящей поверхностью был принят за ориентир высшего качества по морфологическим показателям, мягкий либо рыхлый обводненный полупрозрачный — как ориентир низкого качества.

Через 4-5 нед культивирования на среде для каллусообразования экспланты, сформировавшие морфогенные каллусы, пересаживали в пробирки на среды для регенерации и инкубировали при температуре 24 °С и

16-часовом фотопериоде. Способность к регенерации побегов определяли как долю (%) каллусов с побегами от общего числа каллусов, пересаженных на регенерационную среду. Побеги укореняли на среде МС с уменьшенным вдвое содержанием макросолей, сахарозой (20 г/л) и индолил-масляной кислотой (ИМК, 1 мг/л).

Эксперимент проводили по следующей схеме. Сначала у ячменя трех сортов (Стимул, Виконт и Мамлюк) оценивали каллусообразующую способность на пяти вариантах сред, из которых по существенности различий отбирали лучшую. На эту среду помещали зародыши (из расчета по 100 шт. на каждый вариант регенерационной среды; общее число вариантов также равнялось пяти), затем морфогенные каллусы переносили на разные варианты регенерационных сред. Таким образом, при создании протокола устойчивой системы регенерации всего было использовано 3300 незрелых зародышей (1500 и 1800 шт. — для оценки у трех сортов соответственно каллусообразования и регенерации).

При статистической обработке результатов чашку Петри рассматривали как экспериментальную единицу (число эксплантов — 25 шт.). Каждый вариант опыта включал четыре повторности.

Существенность различий между вариантами оценивали методом дисперсионного анализа с использованием программы AGROS (версия 2.11).

74

Результаты. Состав сред, использованных в эксперименте, приведен в таблице 1. Как известно, успешная регенерация напрямую связана с эффективностью каллусогенеза. Для злаков характерны два типа каллусов — компактный, с гладкой блестящей поверхностью, состоящий из мелких клеток, коричневатый и рыхлый с крупными клетками, белый (второй в отличие от первого в большинстве случаев не способен к регенерации).

1. Состав питательных сред для каллусообразования и регенерации растений у ярового ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк

СЗ

Э

Он

U

U

к

ч

о

U

U

к

К

S

СЗ

н

К

—

о

CN

X

О

3

U

ь

8 к

К >

ц

о й

& к g S

1-н

о

й-

мч

N

Q

н

&

3

К

Он

CM-1 + + 0,025 К а л л у с 30 о о б р а з о в а н и е - - 2,5 - 8 5,8

CM-2 + + 0,025 30 - - 5,0 - - 8 5,8

CM-3 + + 0,025 30 о о 2,5 - - 8 5,8

CM-4 + + 0,025 30 - - 2,5 0,5 - 8 5,8

CM-5 + + 0,025 30 100 1 2,5 0,5 -- 8 5,8

RM-1 + + 0,025 Р е г 30 е н е р а ц и я 3,0 - 8 5,8

RM-2 + + 0,025 30 - - 0,2 2,0 - 8 5,8

RM-3 + + 0,025 30 - - - - 1 8 5,8

RM-4 + + 1,250 30 - - - 3,0 - 8 5,8

RM-5 + + 1,250 30 100 1 - 3,0 - 8 5,8

П р и м е ч а н и е. МС — среда Мурасиге-Скуга, 2,4-Д, 6-БАП и TDZ — соответственно 2,4-

дихлорфеноксиуксусная кислота, 6-бензиламинопурин и тидиазурон; «+» и «-» — соответственно на-

личие или отсутствие компонента в среде.

Во всех вариантах культуральных сред (см. табл. 1) в качестве источника углеводов использовали мальтозу. В наших предыдущих экспериментах и работах зарубежных исследователей было показано положительное влияние мальтозы на морфологию каллуса и регенерационные возможности ячменя (1, 6-9, 10, 12, 13).

В качестве источника ауксинов и цитокининов среды для каллусообразования содержали соответственно 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) и 6-бензиламинопурин (6-БАП). Сообщалось, что 2,4-Д является оптимальным агентом для инициации дедифференциации клеток у злаковых культур (3, 14, 15). В наших экспериментах частота каллусообразования на среде СМ-1 (см. табл. 1) у ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк составляла соответственно 76, 70 и 68 %. Увеличение содержания 2,4-Д (среда СМ-2) приводило к образованию во всех вариантах в основном рыхлого, неморфогенного каллуса.

2. Частота индукции каллусообразования (%) и качественные показатели каллусов у ярового ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк на разных питательных средах

Сорт Среда

СЫ-1 CM-2 | CM-3 | CM-4 | CM-5

Стимул 76+*abcd 72*ab 83+cdef 89+fgb 96+1

Виконт 70+*ab 70*a 80+bcde 86+efgh 91+ghi

Мамлюк 68+*a 67*a 75+abc 84+defgh 91+hi

П р и м е ч а н и е. Состав сред см. в таблице 1. Морфология каллуса: «+» — плотный, блестящий;

«*» — обводненный, полупрозрачный. Одинаковые буквы в индексе означают отсутствие значимых

различий между соответствующими вариантами (при P = 95 %).

Кроме того, показано, что сочетание 2,4-Д и 6-БАП в питательных средах улучшает морфологические показатели каллусов (8, 16). При одновременном присутствии 2,4-Д и 6-БАП (среды СМ-4 и СМ-5) мы также отмечали увеличение частоты образования морфогенного каллуса, причем различия по вариантам со средами, содержащими и не содержащими 6-БАП, были существенны при Р = 95 %.

75

По результатам дисперсионного анализа различия между вариантами сред и сортов как факторов, влияющих на эффективность каллусообразования, оказались существенными на 5 % уровне значимости (табл. 2).

Наибольшую частоту образования плотных каллусов с большим количеством морфогенных структур у всех сортов регистрировали на средах СМ-4 и СМ-5 (см. табл. 2). Органогенез у изученных сортов проходил по типу геммо-, ризо- и гемморизогенеза (формирование соответственно почки, корня и обоих структурных элементов).

Таким образом, для выявления факторов, влияющих на эффективность регенерации побегов, в качестве исходной среды для инициализации каллусогенеза была выбрана среда CM-5 как наиболее перспективная.

При изучении регенерационной способности ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк на разных средах (см. табл. 1) проявилось отчетливое влияние генотипа: на всех вариантах сред сорт Стимул превосходил сорта Виконт и Мамлюк по частоте регенерации, причем различия были существенными на 5 % уровне значимости (табл. 3).

3. Частота регенерации (%) из каллуса у ярового ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк на разных питательных средах

Сорт Среда

RM-1 | RM-2 1 RM-3 I RM-4 RM-5

Стимул 71* 54d 40bc 771 86m

Виконт 60ef 42c 28a 66h 71*

Мамлюк 60f 41c 27a 668h 72k

П р и м е ч а н и е. Состав сред см. в таблице 1. Одинаковые буквы в индексе значимых различий между соответствующими вариантами (при P = 95 %). означают отсутствие

Оказалось также, что увеличение содержания цитокининов (6-БАП) в регенерационной среде по сравнению с каллусообразующей благоприятно сказывалось на процессах формирования зеленых растений на экс-плантах ячменя всех трех сортов (это согласуется с данными других исследователей) (8, 16), а сочетание 2,4-Д и 6-БАП (среда RM-2) приводило к снижению эффективности регенерации (см. табл. 3).

В среде RM-3 в качестве источника цитокининов содержался тидиазу-рон (TDZ) в концентрации 1 мг/л. Сообщалось (17), что такое количество TDZ оптимально для регенерации ячменя сорта Golden Promise. Тидиазурон — химическое название синтетического цитокинина 3-(1,2,3-тиадиазолин-5)-1-фенилмочевины. Изначально он использовался на посевах хлопчатника как дефолиант. Позднее обнаружилось, что TDZ обладает цитокининовой активностью. TDZ обычно применяли при работе с двудольными растениями, однако в настоящее время его все чаще используют на однодольных.

В наших опытах частота регенерации зеленых растений на среде с TDZ была довольно низкой, однако при этом у сортов Стимул и Виконт наблюдалось увеличение среднего числа побегов на один эксплант по сравнению с другими вариантами (рис.).

Положительно сказалось на регенерационных процессах повышенное (50-кратное по сравнению с базовым) содержание ионов Cu2+ в среде RM-5. При этом снижалась частота появления альбиносных растений, что согласуется с данными литературы (18-20).

Дисперсионный анализ результатов опыта по регенерации выявил существенные различия по вариантам сред и сортам (Р = 95 %) (см. табл. 3). По итогам лучшей регенерационной средой оказалась среда RM-5, содержащая повышенное количество ионов меди, 6-БАП (3 мг/л), а также гидролизат казеина и миоинозитол, которые, по мнению ряда исследователей, благоприятно воздействуют на процессы роста и развития растительных эксплантов in vitro (2, 6, 9).

Из трех использованных нами сортов ячменя по регенерационным способностям наиболее перспективным представляется сорт Стимул: во всех вариантах он превосходил сорта Виконт и Мамлюк, причем различия

76

были существенными на 5 % уровне значимости (см. табл. 3).

Итак, наши эксперименты показали, что морфогенетический потенциал сорта — фактор, который оказывается определяющим для эффективной регенерации ячменя в условиях in vitro (из трех изученных сортов лучшей регенерационной способностью обладал сорт Стимул), однако для успешной реализации регенерационных возможностей генотипа необходимо оптимизировать состав питательной среды. Наиболее эффективно образование морфогенного каллуса ячменя происходило на среде с минеральным составом согласно прописи Мурасиге-Скуга (МС), дополненым миоинозитолом (100 мг/л), гидролизатом казеина (1000 мг/л), 2,4-Д (2,5 мг/л) и 6-БАП (0,5 мг/л), регенерация — на среде с минеральными солями МС при добавлении миоинозитола (100 мг/л), гидролизата казеина (1000 мг/л) и 6-БАП (3,0 мг/л). Кроме того, на регенерационный потенциал эксплантов благоприятное влияние оказало повышенное (50-кратное по сравнению с прописью МС) содержание ионов Cu2+. Использование тидиазурона в качестве источника цитокининов приводило к увеличению числа побегов на экспланте, однако частота регенерации при этом значительно снижалась. Разработанная нами система регенерации позволяет получать зеленые интактные растения ячменя сортов Стимул, Виконт и Мамлюк в условиях in vitro с частотой соответственно 86, 71 и 72 %.

Среднее число побегов на один эксплант у ярового ячменя сортов Стимул (а), Виконт (б) и Мамлюк (в) на разных регенерационных средах. Состав сред см. в разделе «Методика».

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Ч е р н о б р о в к и н а М.А., К а р а в а е в Ч.А., Х а р ч е н к о П.Н. и др. Соматический эмбриогенез и морфогенный потенциал ярового ячменя (Hordeum vulgare L.) в системе технологического процесса генетической трансформации. Изв. РАН (серия биологическая), 2004, 4: 404-409.

2. L u h r s R., L o r z H. Plant regeneration in vitro from embryogenic cultures of spring- and winter-type barley, Hordeum vulgare L. Theor. Appl. Genet., 1987, 75: 16-25.

3. B r e g i t z e r P. Plant regeneration and callus type in barley: effect of genotype and culture medium. Crop Sci., 1992, 32: 1108-1112.

4. L e m a u x P.G., C h o M.-J., Z h a n g S. e.a. Transgenic cereals: Hordeum vulgare L. (barley). In: Molecular improvement of cereal crops /I.K. Vasil (ed.). Kluwer Academic, L., 1999: 255-316.

5. M i f l i n B.J. Crop biotechnology: where is now? Plant Physiol., 2000, 123: 17-27.

6. C a s t i l l o A.M., E g a n a B., S a n z J.M. e.a. Somatic embryogenesis and plant regen-

eration from barley cultivars grown in Spain. Plant Cell Rep., 1998, 17: 902-906.

7. B r e g i t z e r P., D a h l e e n L.S., C a m p b e l l R.D. Enhancement of plant regeneration from embryogenic callus of commercial barley cultivars. Plant Cell Rep., 1998, 17: 941-945.

8. D a h l e e n L.S., B r e g i t z e r P. An improved media system for regeneration rates barley immature embryo-derived callus cultures of commercial cultivars. Crop Sci., 2002, 42: 934-938.

9. W a n Y., L e m a u x P.G. Generation of large numbers of independently transformed fertile barley plants. Plant Physiol., 1994, 104: 37-48.

10. C h a n g Y., von Z i t z e w i t z J., H a y e s P.M. e.a. High frequency plant regeneration from immature embryos of an elite barley cultivar (Hordeum vulgare L. cv. Morex). Plant Cell Rep., 2003, 21: 733-738.

11. M u r a s h i g e T., S k o o g F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 1962, 15: 473-497.

12. Ч е р н о б р о в к и н а М.А., С и д о р о в Е.А., Б а р а н о в И.А. и др. Влияние параметров биолистической трансформации ярового ячменя (Hordeum vulgare L.) на уровень транзиентной экспрессии репортерного гена gfp. Изв. РАН (серия биологическая), 2007, 6: 669-775.

13. M o r d h o r s t A.P., L o r z H. Embryogenesis and development of isolated barley (Hordeum vulgare L.) microspores are influenced by the amount and composition of nitrogen sources in culture media. Plant Physiol., 1993, 142: 485-492.

77

14. K i n g S.P., K a s h a K.J. Optimising somatic embryogenesis and particle bombardment of barley (Hordeum vulgare L.) immature embryos. In vitro Cell Devel. Biol. Plant, 1994, 30: 117-123.

15. B r e g i t z e r P., C a m p b e l l R.D., W u Y. Plant regeneration from barley callus: effects of 2,4-dichlorphenoxyacetic acid and phenylacetic acid. Plant Cell, Tissue and Organ Cult., 1995, 43: 229-235.

16. S h a r m a V.K., H a n s c h R., M e n d e l R.R. e.a. Seasonal effect on tissue culture response and plant regeneration frequency from non-bombarded and bombarded immature scutella of barley (Hordeum vulgare) harvested from controlled environment. Plant Cell, Tissue and Organ Cult., 2005, 81: 19-26.

17. S h a n X., L i D., Q u R. Thidiazuron promotes in vitro regeneration of wheat and barley. In vitro Cell. Devel. Biol. Plant, 2000, 36: 207-210.

18. D a h l e e n L.S. Improved plant regeneration from barley cultures callus by increased copper levels. Plant Cell, Tissue and Organ Cult., 1995, 43: 267-269.

19. N u u t i l a A.M., H a m a l a i n e n J., M a n n o n e n L. Optimization of media nitrogen and copper concentration for regeneration of green plants from polyembryogenic cultures of barley (Hordeum vulgare L.). Plant Sci., 2000, 151: 85-92.

20. T r a v e l l a S., R o s s S.M., H a r d e n J. e.a. A comparison of transgenic barley lines produced by particle bombardment and Agrobacterium-mediated techniques. Plant Cell Rep., 2005, 23: 780-789.

ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной Поступила в редакцию

биотехнологии Россельхозакадемии, 7 апреля 2009 года

127550 г. Москва, ул. Тимирязевская, 42, e-mail: chernobrovkina@yandex.ru

INDUCED MORPHOGENESIS AND PLANT REGENERATION in vitro IN BARLEY VARIETIES OF NATIVE SELECTION

E.A. Sidorov, M.A. Chernobrovkina, A.N. Nikolaeva, P.N. Kharchenko, S. V. Dolgov

S u m m a r y

The authors studied the influence of genotype and components of nutrient medium on processes forming of callus, morphogenesis and regeneration in vitro in three Russian varieties of summer barley — Stimul, Vikont and Mamlyuk. The most effective regeneration in shoots was during the use of explants of Stimul variety and modified medium of Murashige-Skuga, having casein hydrolyzed (1 g/l), myoinositol (100 mg/l) and benzyladenine (3.0 mf/l), and also 50-times over (in comparison with standard) amount of Cu2+ ions.

Научные конференции

Организационный комитет извещает о планах проведения международной научной конференции «Хромосома 2009» в г. Новосибирске с 31 августа по 6 сентября 2009 года.

Конференций, посвященных вопросам структурной и функциональной организации хромосом, не проводилось в нашей стране почти 25 лет. Между тем в последние годы отечественными цитогенетиками получено значительное количество новых данных о хранении и реализации генетической информации в хромосоме, хромосомной эволюции, с учетом возможностей современной научной приборной базы и последних технологий разработан ряд новых методов исследования.

Посвященная цитогенетическим исследованиям конференция «Хромосома 2009» по своему замыслу является возрождением научных семинаров, идейным вдохновителем и организатором которых была Ллександра Алексеевна Прокофьева-Бельговская. Проводимые ею хромосомные конференции в 1970-1980-х годах были первой отечественной удачной попыткой найти общий язык между молекулярными биологами и классическими цитогенетиками, способствовавшими появлению у нас в стране современной молекулярной цитогенетики.

Международная конференция «Хромосома 2009» будет способствовать установлению творческих связей между отечественными и зарубежными генетиками, явится источником профессионального роста молодых ученых России, послужит делу продолжения научных традиций отечественной школы цитогенетики.

Организаторы конференции:

Отдел молекулярной и клеточной биологии Учреждения Российской академии наук Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН

Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН

Новосибирское отделение Всероссийского общества генетиков и селекционеров

Общество с ограниченной ответственностью «Технологии Биосистем» (ООО «ТБ»).

78