СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ РАЗВИВАЮЩЕГОСЯ ПРОЛАПСА ТАЗОВЫХ ОРГАНОВ У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА ПРИ ОТСУТСТВИИ КЛИНИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ
EARLY DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR DEVELOPING PELVIC PROLAPSE IN FEMALES OF REPRODUCTIVE AGE WITH NO CLINICAL SIGNS

Изобретение относится к медицине, а именно к методам ранней диагностики заболеваний.
Рост заболеваемости пролапсом тазовых органов, наблюдаемый в последние годы во всем мире, приобретает масштаб скрытой эпидемии. Пролапс тазовых органов и дисфункция тазового дна у женщин приводит к их социальной дезадаптации, снижению качества жизни. Эта проблема актуальна для современного здравоохранения в связи с ее широкой распространенностью (до 38%) и высокими материальными затратами на лечение, в том числе и хирургическое, данного заболевания. Наиболее значимыми предрасполагающими факторами этой патологии являются: вагинальные роды и паритет, родовый травматизм, старение, генетические факторы, дисплазия соединительной ткани (Hilton P, Donald L.M., 2004, DeLancey JOL., 2005, Rachel N. Pauls, John A. Occhino, Vicki Dryfhout and Mickey M. Karram, 2008).
В связи с этим чрезвычайно важно определение начальных признаков разрушения соединительной ткани - разрушение эластина, как маркера начальных доклинических признаков развивающегося пролапса тазовых органов, связанного с ослаблением эластичности соединительной ткани. стороны тазового дна особенно у женщин молодого репродуктивного возраста.
Наиболее близким аналогом изобретения является способ прогнозирования релаксации тазового дна, заключающийся в отборе материала ткани стенки влагалища, проведении гистохимического и морфологического анализа по определению содержания коллагена в соединительной ткани (Sharon A.S. et al.. Striae and pelvic relaxation: Two disorders of connective tissue with strong association, J. of Investigative dermatology, 23 March 2006, v.126, p.1745-1748 - прототип). Однако этот способ не отражает в полной мере патогенетические аспекты деградации и синтеза элементов соединительной ткани тазового дна, а именно процессов эластогенеза.
Задачей изобретения явилась разработка объективного и информативного способа, позволяющего оценить патофизиологические процессы при начальных доклинических признаках развития пролапса тазовых органов, что позволит наиболее точно интерпретировать причины развития дисфункции тазового дна и разработать основные принципы профилактики развития данной патологии у женщин репродуктивного возраста.
Патентуемый способ ранней диагностики развивающегося пролапса тазовых органов у женщин репродуктивного возраста при отсутствии клинических признаков заключается в отборе материала ткани стенки влагалища, проведении гистохимического анализа, определении количества и состояния эластиновых фибрилл, содержания матриксных белков LOXL1 и FBLN5. Развивающийся пролапс тазовых органов диагностируют при снижении количества эластиновых фибрилл и их фрагментации и при одновременном уменьшении содержания матриксных белков LOXL1 и в эпителии, эндотелии сосудов, фибробластах, экстрацелюлярном матриксе по отношению к одноименным показателям у здоровых женщин.
Технический результат - выявление критериев прогноза развития заболевания у женщин репродуктивного возраста, не имеющих клинических признаков.
В основе патентуемого способа лежат следующие предпосылки. Целостность и функциональность тазового дна сохраняется и обеспечивается посредством сложных процессов взаимодействия между мышцами и соединительной тканью мочеиспускательного канала, прямой кишки и влагалища. Установлено, что ответственны за эти процессы матриксные белки LOXL1 (лизилоксидазаподобный белок-1) и (фибулин-5), FBLN5 принимающие непосредственное и ведущее участие в формировании и соединении эластинового волокна.
3
В связи с поставленной задачей сравнили содержание белков LOXL1 и FBLN5 у женщин репродуктивного возраста с нормальным состоянием тазового дна (без пролапса) и с пролапсом ≥1 ст. (POPQ). Биопсийный материал в области передней и задней стенок влагалища в объеме 1 см забирается во время гинекологической манипуляции (у больных без пролапса) и/или во время хирургической операции (2 фрагмента ткани). Биопсийный материал фиксировали в 10% нейтральном формалине с фосфатным буфером, обрабатывали в аппарате гистологической проводки тканей фирмы «Pool Scientific Instruments» (Швейцария) и заливали в парафин. Готовились серийные парафиновые срезы (не менее 12 серийных срезов), толщиной 4-5 микрон. Срезы фиксировали на предметные стекла, покрытые адгезивом (полилизин, APES) и инкубировали в термостате при 37°С в течение 12 часов. Далее срезы депарафинировали и обезвоживали в батарее из 3-х ксилолов, 2-х абсолютных спиртов, 2-х 95% спиртов, 80% и 70% спирта и дистилированной воды. По стеклу от каждого случая окрашивали гематоксилин-эозином. В ходе морфологического исследования установлено отсутствие различий в строении передней и задней стенки влагалища.
2
2
Иммуногистохимические реакции проводились на депарафинированных срезах толщиной 4-5 мкм, расположенных на стеклах, покрытых APES-слоем (Janice A., 1983). Неокрашенные срезы от каждого случая обрабатывались с помощью стандартного микроволнового метода иммуногистохимии. Демаскировка антигенов для ИГХ проводилась в микроволновой печи. Стекла погружались в цитратный буфер (рН 6,0) и нагревались в микроволновой печи в течение 15 минут при мощности 600 Вт. Далее стекла остывали 20 минут при комнатной температуре. Остывшие стекла помещали во влажные камеры (для предотвращения высыхания срезов) и инкубировали 15 минут с 3% раствором HO. После обработки перекисью стекла ополаскивали в фосфатном буфере (рН 7,0-7,6). Далее стекла инкубировали с 1% раствором альбумина во влажных камерах в течение 30 минут. По окончании инкубации излишки альбумина аккуратно стряхивали со стекол и наносили первичные антитела при помощи микропипетки. В качестве первичных антител использовались моноклональные антитела к FBLN5 (Abbiotec, 1:100) и LOXL1 (Abbiotec, 1:100). Срезы инкубировали с первичными антителами от 30 минут до 1 часа, в зависимости от времени воздействия, предусмотренного в спецификации к антителу от фирмы производителя. Далее срезы отмывали в фосфатном буфере (рН 7,0-7,6) от первичных антител, не связавшихся с эпитопами, и обрабатывали вторичными антителами. Срезы инкубировали с вторичными антителами во влажных камерах в течение 1 часа, затем ополаскивались в фосфатном буфере (рН 7,0-7,6). Для метки вторичных антител использовался стрептовидин-биотиновый комплекс (SBK KIT, DAKO). Для визуализации места связывания антитела с антигеном использовали метку - фермент, пероксидазу хрена, в присутствии субстрата - перекиси водорода - и колориметрического реактива с 3,3-диаминобензидином (ДАБ), (LSAB, Dako Cytomation). В результате образовывался нерастворимый в органических растворителях конечный продукт реакции, который визуализировался в виде коричневого окрашивания структур клеток. Далее стекла ополаскивали в дистиллированной воде и подкрашивали ядра гематоксилином. Затем стекла проводили по батарее из дистиллированной воды, 70% спирта, 80% спирта, 2-х 95% спиртов, 2-х абсолютных спиртов и 3-х ксилолов. После чего срезы заключали в синтетическую среду, используя покровные стекла.
Для ИГХ реакций ставили положительные и отрицательные контроли. В качестве отрицательных контролей брали образцы исследуемых срезов, которые подвергались стандартной процедуре иммуногистохимии, но без добавления первичных антител. Положительные контроли для каждого антитела выбирали в соответствии со спецификациями от фирмы производителя.
Проводилась полуколичественная и количественная оценка результатов реакций. Результаты ИГХ реакции для исследуемых антител оценивались полуколичественным методом в баллах по количеству позитивно окрашенных клеток, причем отдельно оценивались эпителиальные клетки, фибробласты, эндотелий сосудов и строма, если продукт реакции выявлялся в указанных выше структурах. Оценка интенсивности реакции проводилась по 6-бальной системе: 2 балла - до 20% окрашенных клеток; 4 балла - от 20 до 40% окрашенных клеток; 6 баллов - более 40% окрашенных клеток. Статистическая обработка полученных результатов проведена при помощи программного пакета "SPSS 13 for Windows". Для выбора статистических методов первоначально определялось, к какой статистической шкале (номинальной, порядковой или интервальной) относятся переменные. Для переменных, относящихся к интервальной шкале (результаты ИГХ исследований) при помощи построения гистограмм с расчетом среднего значения и стандартного отклонения, проверялось, подчиняются ли их значения нормальному распределению. Поскольку полученное распределение значительно отклонялось от нормального, при анализе применялись непараметрические методы, так же как и для анализа переменных, относящихся к порядковой шкале. Для сравнения средних величин использовались следующие непараметрические тесты: (1) Тест Уайта для малых выборок (обработка результатов ИГХ анализа с малыми выборками была проведена вручную при помощи калькулятора и таблиц значений F); (2) U тест по методу Манна-Уитни при сравнении 2-х независимых выборок.
От каждой пациентки в ходе операции был взят материал ткани влагалища с передней и задней его стенки. В ходе морфологического исследования установлено отсутствие различий в строении передней и задней стенки влагалища.
В морфологической структуре стенки влагалища женщин репродуктивного возраста пациенток определялись различия. Так, стенка влагалища женщин из группы репродуктивного возраста была покрыта многослойным плоским неороговевающим эпителием, в подлежащей строме определялись сосуды, а также компактные соединительнотканные волокна, фибробласты, единичные гистиоциты. Особенностью женщин с пролапсом гениталий было наличие в подлежащей строме более фиброзированной соединительной ткани, причем в группе с пролапсом гениталий также выявлялось венозное полнокровие и лимфостаз.
Для определения состояния эластического компонента стенки влагалища проведены гистохимические реакции на определение эластических волокон (окрашивание по Вейгерту). В контрольной группе (без пролапса) количество эластиновых волокон в эндотелии сосудов и в строме стенки влагалища значительно. В группе с пролапсом гениталий количество эластиновых волокон снижено и большинство из них фрагментировано.
На фигуре 1 показаны гистограммы результатов иммуногистохимического исследования матриксных белков FBLN5 и LOXL-1 в стенке влагалища. Белок FBLN5 выявлялся в виде коричневого окрашивания цитоплазмы фибробластов, эндотелия сосудов, в экстрацеллюлярном матриксе и в эпителиальных клетках многослойного плоского эпителия. Белок LOXL-1 локализовался в фибробластах, эндотелии сосудов, экстрацеллюлярном матриксе, а также в клетках многослойного плоского эпителия в виде цитоплазматического окрашивания. В группе женщин с пролапсом гениталий окрашивание антителом к лизилоксидазе ниже, чем в группе контроля (р<0,05).
Наименьшее количество белков FBLN5 и LOXL1 выявляется у молодых женщин с доклиническими признаками пролапса тазовых органов в ЭЦМ (экстрацеллюлярный матрикс) стенки влагалища.
При сравнении средних уровней экспрессии белков FBLN5 и LOXL-1 выявлены различия по окрашиванию эпителиальных (ЭП), эндотелиальных клеток (ЭНД), фибробластов (Ф) и экстрацеллюлярному матриксу (ЭЦМ):
Пациентки репродукт. возраста
Белок FBLN5
Белок LOXL-1
ЭП
ЭНД
Ф
ЭЦМ
ЭП
ЭНД
Ф
ЭЦМ
Пролапс
3,5
3,5
3,5
2,5
3
4
2,5
2,0
Контроль
5,33
5,33
5,33
5,33
4
4,67
4
3
Исследования показали, что уже в репродуктивном возрасте у пациенток с доклиническими признаками пролапса тазовых органов начинается деградация соединительной ткани: она становится более рыхлой, легко разрушаемой вследствие происходящих процессов фрагментации эластинового волокна. Также происходит уменьшение и количества самого эластинового волокна в стенке влагалища, что является доклиническим признаком развивающегося пролапса тазовых органов.
Таким образом, у пациенток с доклиническими признаками пролапса тазовых органов в репродуктивном возрасте отмечается достоверное нарушение эластогенеза, которое характеризуется изменением эластического каркаса стенки влагалища. Отмечается снижение количества эластинового волокна, а также нарушение структуры, что проявляется его фрагментацией. Выявлено снижение экспрессии ферментов - белков LOXL-1 и FBLN5, необходимых для синтеза и объединения эластиновых волокон.
Патентуемый способ позволяет обеспечить выявление пациенток с высокой вероятностью развития пролапса тазовых органов для формирования групп высокого риска по данной патологии и провести своевременные и целенаправленные мероприятий по профилактике патологии.