Эндотоксин индуцированные изменения функциональной активности лимфатических сосудов

УДК 612.426-02:615.9

Вестник СПбГУ. Сер. 11. 2014. Вып. 4

Н. А. Кубышкина1, В. В. Гайворонская2

ЭНДОТОКСИН ИНДУЦИРОВАННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФАТИЧЕСКИХ СОСУДОВ

1 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И. И. Мечникова, Российская Федерация, 191015, Санкт-Петербург, Кирочная ул., 41

2 Военно-медицинская академия им С. М. Кирова, Российская Федерация, 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6

Сегодня в патогенезе многих заболеваний и осложнений большое значение придается нарушениям, развивающимся на уровне микроциркуляторного русла. В литературе имеются подтверждения того, что лимфатические сосуды играют важную роль в возникновении системной эндотоксемии при несептическом шоке. Лимфатические сосуды в очаге поражения слабо изучены. Между тем функционирование лимфатической системы как второй дренажной системы организма в значительной степени определяет состояние обводнения тканей, развитие патологического процесса и его исход. Цель исследования заключалась в оценке изменений сократительной активности лимфатических сосудов, лежащей в основе их транспортной функции, при действии бактериальных токсинов E. coli и S. typhimurium, а также определения роли эндотелия в механизме дилататорного эффекта липополисахаридов на лимфатические сосуды. Основным объектом исследования были изолированные одиночные лимфангионы отводящих лимфатических сосудов брыжейки быка. Результаты, полученные в ходе проведенной работы, свидетельствуют о том, что липополисахариды E. coli, S. typhimurium оказывают выраженное тормозное влияние на спонтанный ритм и амплитуду фазных сокращений гладкомышечных клеток изолированных брыжеечных лимфатических сосудов. Липополисахариды стимулируют продукцию этими клетками эндотелиального релаксирующего фактора, который по своей химической структуре является оксидом азота. Эндотелиальный релаксирующий фактор активирует гуани-лат-циклазу, которая переводит гуанозинтрифосфат (ГТФ) в циклический гуанозинмонофос-фат (цГМФ), содержание цГМФ в гладкомышечных клетках сосудов повышается, что приводит к дефосфорилированию легких цепей миозина и расслаблению гладкой мускулатуры. Библиогр. 9 назв. Ил. 5.

Ключевые слова: лимфатические сосуды, липополисахариды, эндотелий, кальций-зависимые калиевые каналы, тетраэтиламмоний, нитропруссид натрия, оксид азота.

ENDOTOXIN INDUCED ALTERATIONS OF FUNCTIONAL ACTIVITY OF LYMPHATIC VESSELS

N. A. Kubyshkina, V. V. Gaivoronskaya

1 North-Western State Medical University named after I. I. Mechnikov, 41, Kirochnaia ul., St. Petersburg, 191015, Russian Federation

2 Military Medical Academy named after S. M. Kirov, 6, ul. Akademika Lebedeva, St. Petersburg, 194044, Russian Federation

Today in the pathogenesis of many diseases and conditions, great importance is attached to developing at the level of the microvasculature. There is evidence in the literature that the lymphatic vessels play an important role in causing systemic endotoxemia during non-septic shock. Lymphatic vessels in the hearth of poorly studied. Meanwhile, the functioning of the lymphatic system as a second drainage system of the organism largely determines the status of irrigation, development of pathological process and its outcome. The purpose of the study was to evaluate changes in the contractile activity of lymph vessels, which is the basis of their transport function, under the action of bacterial toxins from E. coli and S. typhimurium, as well as determining the role of endothelium in the mechanism the effect of dilatation of lipopolysaccharides on the lymphatic vessels. The main object of studies were isolated single afterbays of lymphatic vessels lymphangions the mesentery of bull. The results obtained in the course of this work indicate that lipopolysaccharide E. coli, S. typhimurium have a marked inhibitory effect on the spontaneous rhythm and amplitude of phasic contractions of smooth muscle cells isolated mesenteric lymph vessels. Endothelial relaxing factor activates guanylate cyclase, which converts guanosine triphosphate

(GTP) into cyclic guanosine monophosphate (cGMP), cGMP content in vascular smooth muscle cells is increased, which leads to dephosphorylation of myosin light chain and smooth muscle relaxation. Refs 9. Figs 5.

Keywords: lymphatic vessels, lipopolysaccharides, endothelium, calcium-dependent potassium channels, tetraethylammonium, sodium nitroprusside, nitric oxide.

В последние десятилетия в литературе существенно увеличилось количество публикаций, посвященных взаимодействию макроорганизма и микроорганизмов, обитающих в кишечнике, ротовой полости, дыхательных путях и др. Расчеты показывают, что масса бактерий в кишечнике взрослого человека может достигать 1,5-2 кг. При естественной гибели бактерий в просвет кишечника поступают различные вещества, входившие в состав бактериальной мембраны и цитоплазмы бактерий. Сегодня в патогенезе многих заболеваний и осложнений большое значение придается нарушениям, развивающимся на уровне микроциркуляторного русла. В организме человека постоянно присутствуют эндотоксины, которые обнаруживаются в кровотоке в норме и при различных видах инфекционной и неинфекционной патологии, что позволяет рассматривать эндотоксины, в частности кишечной микрофлоры, в качестве одного из очень важных (если не первостепенных) факторов патогенеза различной органопатологии и синдромов при целом ряде заболеваний [1-3]. Эндотоксином называют липополисахарид (ЛПС), входящий в состав внешней мембраны клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Он обладает широким спектром биологической активности и может взаимодействовать практически со всеми клетками человека и животных.

Многочисленными экспериментальными и клиническими исследованиями установлено, что качественные и количественные изменения эндогенной флоры (не только кишечника) вследствие различных влияний закономерно вызывают системные структурно-функциональные нарушения различных органов [4-6]. В литературе имеются подтверждения того, что лимфатические сосуды играют важную роль в возникновении системной эндотоксемии при несептическом шоке [7, 8]. В преимущественном большинстве исследований микроциркуляторного русла изучалось состояние артериол, кровеносных капилляров и венул. Лимфатические сосуды в очаге поражения слабо изучены. Между тем функционирование лимфатической системы как второй дренажной системы организма в значительной степени определяет состояние обводнения тканей, развитие патологического процесса и его исход.

Цель исследования заключалась в оценке изменений сократительной активности лимфатических сосудов, лежащей в основе их транспортной функции, при действии бактериальных токсинов E. coli и S. typhimurium, а также определении роли эндотелия в механизме дилататорного эффекта липополисахаридов на лимфатические сосуды.

Материалы и методы. Основным объектом исследования были изолированные одиночные лимфангионы отводящих лимфатических сосудов брыжейки быка. В наших опытах использовались лимфатические сосуды диаметром 0,8-2,5 мм. Длина препарата, включающего в себя клапанный участок и часть мышечной манжетки лимфангиона, составляла в среднем 7-8 мм.

Сосуды, заполненные лимфой, извлекались из брыжейки животного через 2530 мин после забоя и доставлялись в лабораторию в термосе, заполненном физио-

логическим солевым раствором (в мМ/л: NaCl — 120,4; KCl — 5,9; NaHCO3 — 15,5; NaH2 PO4 — 1,2; MgCl2 — 0-1,2; CaCl2 — 2,5; глюкоза — 11,5), сатурированным газовой смесью (95% O2 + 5% CO2) и охлажденном до +2 ... +4°C. В дальнейшем препараты хранились в холодильнике при такой же температуре. Все исследования проводились на протяжении 6-8 ч после забора материала.

При исследовании уровня тонического напряжения и параметров спонтанных фазных сокращений одиночных лимфангионов использовался механоэлектриче-ский преобразователь 6МХ1С. Механотрон обеспечивал измерение силы сокращений сосудистых препаратов в изометрическом режиме. Аноды механоэлектрическо-го преобразователя подключались к мостовой измерительной схеме. Запись результатов осуществлялась на самопишущем приборе Н 3021/4.

Исходное напряжение и сила, развиваемые препаратом при сокращении, оценивались путем сравнения отклонений пера самопишущего прибора с калибровочным сигналом.

Результаты исследования и их обсуждение. Первая серия экспериментов проводилась на сегментах лимфатических брыжеечных сосудов с интактным эндотелием. При сравнении результатов, полученных после действия липополисахаридов (ЛПС) E. coli и S. typhimurium (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA), обращает на себя внимание то, что эффект от воздействия ЛПС E. coli проявлялся раньше и был более выраженным по сравнению с эффектами S. typhimurium. Было установлено, что данные эндотоксины в концентрации 1 мг/л приводят к урежению частоты и уменьшению амплитуды фазных сокращений (рис. 1).

ЛПС S. typhimurium 1 мг/л

Рис. 1. Действие липополисахарида 5. typhimurium в концентрации 1 мг/л на сократительную функцию лимфатического сосуда брыжейки быка

При действии эндотоксинов более одной минуты в 55% препаратов спонтанная активность прекращалась. При ведении в раствор Кребса на фоне эндотоксинов норадреналина и гистамина в концентрациях 10-6 М/л фазная сократительная активность восстанавливалась, но с более низкой частотой и амплитудой сокращений миоцитов лимфатических сосудов.

В случае если эндотоксин вводился на фоне действия тетраэтиламмония (ТЭА) — блокатора калиевых каналов (ООО «Астрахим» Санкт-Петербург) — в концентрации 1 мМ/л, снижения параметров спонтанной активности не происходило. Наблюдалось лишь незначительное уменьшение амплитуды фазных сокращений.

Добавление ТЭА на фоне подавления спонтанной активности липополисахаридами восстанавливало фазные сокращения гладкомышечных клеток миоцитов лимфан-гионов (рис. 2).

-•-Частота -о- Амплитуда -й- Тонус

140 -| 120 -100 -80 -60 -40 -

Физ. р-р ТЭА ТЭА+Энд

Рис. 2. Обобщенные данные экспериментов по изучению действия эндотоксина E. coli в концентрации 1 мг/л на сократительную функцию гладкомышечных клеток лимфатических сосудов на фоне действия блокатора калиевых каналов мембраны ГМК

На рисунке в физиологическом растворе амплитуда и частота фазных сокращений и уровень тонуса приняты за 100%. В средней части графиков те же показатели на фоне действия тетраэтиламмония хлорида — ТЭА (1-10-5 М/л). Справа — те же показатели через 10 мин действия эндотоксина E. coli (10 мг/л) на фоне ТЭА.

При использовании эндотоксинов в концентрации 10 мг/л наблюдалось быстрое снижение амплитуды и частоты фазных сокращений с последующим прекращением спонтанной активности. В 59% случаев развивалось выраженное и длительное снижение уровня тонического напряжения стенки миоцитов лимфатических сосудов (рис. 3).

Энд

10 1

0--

0 1 mg 10 mg

Концентрация эндотоксина

Рис. 3. Амплитуда тонических сокращений гладкомышечных клеток интактных и деэндотелизированных лимфангионов, предварительно сокращенных норадреналином

а £

S X

11 5 а

< £Р

х

О

о

Добавление в раствор Кребса на фоне действия ЛПС в концентрации 10 мг/л норадреналина и гистамина в концентрации 10-6 М/л несколько повышало уровень тонического напряжения и стимулировало появление фазной активности в 17% исследуемых препаратов брыжеечных лимфатических сосудов. При этом амплитуда и частота вызванных фазных сокращений были существенно меньше по сравнению с исходными.

Добавление в раствор Кребса на фоне действия ЛПС нитропруссида натрия (Pharmachim Holding EAD, Sopharma AD, Болгария) в концентрации 10-6 М/л предотвращало снижение уровня тонического напряжения стенки миоцитов лимфатических сосудов. Введение в раствор ТЭА в концентрации 1 мМ/л на фоне подавления спонтанного ритма липополисахаридом в концентрации 10 мг/л стимулировало появление фазной активности. Последующее добавление в этот раствор, содержащий ТЭА и ЛПС, нитропруссида натрия подавляло вызванную фазную активность. При этом снижения тонуса стенки миоцитов не наблюдалось.

В следующей группе этой серии экспериментов мы изучили роль циклического гунинмонофосфата (цГМФ) в расслаблении миоцитов лимфангиона, вызываемом липополисахаридом. В качестве блокатора синтеза цГМФ использовалась метиле-новая синька в концентрации 10-7 М/л. Препараты выдерживались в этом растворе в течение 1 ч до начала эксперимента. Введение ЛПС в концентрации 10 мг/л на фоне ингибирования гуанилат-циклазы метиленовой синькой сопровождалось незначительным уменьшением частоты и амплитуды фазных сокращений на фоне исходного уровня тонического напряжения стенки миоцитов лимфатических сосудов (рис. 4).

ja

си i-ге m re sc О С

110 100 90 80 70 60 50 40

Частота

фазных

сокращений

Амплитуда

фазных

сокращений

Уровень

тонического

напряжения

Рис. 4. Амплитуда и частота фазных сокращений ГМК лимфангионов при действии ЛПС E. coli (1 мг/л) в растворе Кребса и в присутствии метиленового голубого (110-5 М/л).

1 — исходные параметры — 100%, 2 — параметры на второй минуте действия ЛПС E. coli, 3 — то же, но после предварительной 10-минутной инкубации лимфангиона в растворе с метиленовым голубым (10-5 М/л).

Вторая серия опытов проводилась на деэндотелизированных лимфатических сосудах. Эндотелий удалялся механически. Угнетающий эффект ЛПС на спонтанн-ные сокращения гладкомышечных клеток лимфатических сосудов на таких препаратах проявлялся значительно слабее. Эффект ЛПС в концентрации 1 мг/л на деэн-

3

дотелизированных препаратах обычно проявлялся в небольшом снижении частоты и амплитуды фазных сокращений (рис. 5).

ЛПС E. coli 1 мг/л

Рис. 5. Действие эндотоксина E. coli в концентрации 1 мг/л на сократительную активность гладкомышечных клеток деэндотелизированного лимфатического сосуда

30 с

Введение в раствор Кребса ЛПС в концентрации 10 мг/л подавляло спонтанный ритм сокращений лишь в 26% случаев. При этом тонус стенки гладкомышечных клеток лимфатических сосудов, как правило, не изменялся. Добавление в раствор Кребса на фоне ЛПС в концентрации 10 мг/л тетраэтиламмония (1 мМ/л) сопровождалось увеличением частоты и амплитуды фазных сокращений, причем у 2/3 препаратов эти параметры на фоне действия ТЭА превышали исходные.

Результаты, полученные в ходе проведенной работы, и литературные данные [7, 8] свидетельствуют о том, что липополисахариды E. coli, S. typhimurium и других микроорганизмов оказывают выраженное тормозное влияние на спонтанный ритм и амплитуду фазных сокращений гладкомышечных клеток изолированных брыжеечных лимфатических сосудов быка, лимфатических сосудов овец, мезентериаль-ных лимфатических сосудов морской свинки. Наши наблюдения показывают также, что в случае воздействия высокими концентрациями ЛПС E. coli наблюдается выраженное снижение уровня тонического напряжения миоцитов лимфатических сосудов. Восстановление фазной активности при добавлении ТЭА и предотвращение подавления спонтанного ритма предварительным введением ТЭА дают основания полагать, что ЛПС оказывает свой эффект на мембрану миоцитов лимфатических сосудов посредством открытия дополнительной группы калиевых каналов.

Результаты экспериментов с применением нитропруссида натрия свидетельствуют о том, что эта группа калиевых каналов является Са2+-зависимой. Ограничение входа Са2+ в цитоплазму при использовании нитропруссида натрия во всех экспериментах предотвращало снижение уровня тонического напряжения стенки миоцитов. Таким образом, одной из точек приложения ЛПС на гладкомышечные клетки лимфатических сосудов являются Са2+-зависимые калиевые каналы мембраны миоцитов лимфатических сосудов.

Полученные нами данные позволили выявить роль эндотелиальных клеток в действии ЛПС на лимфатические сосуды брыжейки быка. Удаление эндотелия сопровождалось значительным снижением тормозного эффекта ЛПС на сократительную деятельность лимфатических сосудов. Ингибирование гуанилат-циклазы миоцитов путем применения метиленовой синьки на препаратах с интактным эн-

дотелием также снижало тормозный эффект ЛПС. Результаты экспериментов позволяют сделать заключение о том, что часть тормозного эффекта эндотоксинов на миоциты лимфатических сосудов проявляется за счет стимуляции ЛПС эндотели-альных клеток. Известно, что эндотелиальные клетки лимфатических сосудов при действии ацетилхолина, аденозина и некоторых других агонистов, а также при их механической стимуляции способны выделять оксид азота [9]. Таким образом, второй механизм тормозного влияния ЛПС на миоциты лимфатических сосудов заключается в том, что ЛПС, действуя на эндотелиоциты, стимулируют продукцию этими клетками оксида азота. Эндотелиальный релаксирующий фактор активирует гуанилат-циклазу миоцитов, что приводит к повышению содержания цГМФ, дефос-форилированию легких цепей миозина и расслаблению гладкомышечных клеток лимфатических сосудов.

Литература

1. Арутюнов Г. П., Кафарская Л. И., Власенко В. К. Микрофлора кишечника у больных хронической сердечной недостаточностью как возможный фактор возникновения и генерализации системного воспаления // Журнал сердечной недостаточности. 2003. Т. 4, № 5. С. 256-260.

2. Бондаренко В. М., Мацулевич Т. В. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. М.: ГЭОТАР-медиа, 2007. 304 с.

3. Лиходед В. Г., Яковлев М. Ю., Мосежный А. Е. Антиэндотоксиновый иммунитет в физиологии и патологии человека // Медицина экстрем. ситуаций. 1999. № 1. С. 22-26.

4. Лиходед В. Г., Бондаренко В. М., Гинцбург А. Л. Экзогенные и эндогенные факторы в патогенезе атеросклероза. Рецепторная теория атерогенеза // Рос. кардиол. журнал. 2010. № 2. С. 92-96.

5. Рябиченко, Е. В., Бондаренко В. М. Роль кишечной бактериальной аутофлоры и ее эндотоксина при патологии человека // Журнал микробиол. 2007. № 3. С. 103-111.

6. Рябиченко Е. В., Бондаренко В. М. Роль дисфункции кишечного барьера в поддержании хронического воспалительного процесса различной локализаци // Журнал микробиол. 2010. № 1. С. 92-100.

7. Duquenne P. Measurement of endotoxins inbioaerosols at workplace: a critical review of literatureand a standardization issue // Ann. Occup. Hyg. 2013. N 57 (2). P. 137-172.

8. Fink M. P., Mythen М. G. The role of gut-derived endotoxin in pathogenesis of multiple organ dysfunction / ed. by N. Y. Basel // Endotoxin in health and disease. Bradeetal. 1999. С. 854-864.

9. Яковлев М. Ю. Элементы эндотоксиновой теории физиологии и патологии человека // Физиология человека. 2003. Т. 29, № 4. С. 476-485.

Статья поступила в редакцию 26 сентября 2014 г.

Контактная информация

Кубышкина Наталья Александровна — кандидат медицинских наук, доцент; natkub@mail.ru Гайворонская Валентина Васильевна — кандидат медицинских наук, доцент; docent-g-v-v@mail.ru Kubyshkina N. A. — Candidate of Medicine, Associate Professor; natkub@mail.ru Gaivoronskaya V. V. — Candidate of Medicine, Associate Professor; docent-g-v-v@mail.ru