Методические подходы к определению окислительно-восстановительной активности антител

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2005

МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИТЕЛ

ГЕНЕРАЛОВ И.И., БОРИСЕВИЧ Т.Н., КУНДЕР Е.В., ВОЛКОВА М.В.

УО «Витебский государственный ордена дружбы народов медицинский университет»;

кафедра клинической микробиологии

Резюме. В настоящем исследовании разработаны методические подходы к оценке супероксиддисмутазной, каталазной и пероксидазной активности иммуноглобулинов. Препараты IgG были выделены от больных аутоиммунной и бактериальной инфекционной патологией (ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, аутоиммунным тиреоидитом, бактериальной дизентерией, гнойно-воспалительными хирургическими заболеваниями и их осложнениями).

Предложенные планшетные микромодификации методов определения оксидоредуктазной активности IgG значительно ускорили постановку и упростили регистрацию абзимной активности. При этом методы сохранили хорошую воспроизводимость и чувствительность, что делает возможным определение абзимной активности в клинических условиях.

Ключевые слова: абзимы, каталазная, оксидоредуктазная, супероксиддисмутазная активность.

Abstract. Several approaches and methods for determination of superoxide dismutase, catalase and peroxidase activities of immunoglobulins were elaborated. IgG preparations were derived from patients with autoimmune and bacterial infectious pathology (rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, autoimmune thyroiditis, shigellosis, surgical suppurative diseases and their complications).

Plate micromodifications of oxyreductase IgG detection facilitated and significantly accelerated abzyme activity testing. The proposed methods were shown to keep their reproducibility and sensitivity thereby enabling clinical evaluation of abzyme activity.

В настоящее время собственная каталитическая (или абзимная) активность антител (АТ) является предметом интенсивного исследования в иммунологии и биохимии.

Считается, что появление абзимов у пациентов с аутоиммунными заболеваниями (АИЗ) связано с процессами аутоиммунизации и/или поликлональной активации В-лимфоци-тов под действием антигенов и митогенов [1]. Однако накапливается все больше данных, подтверждающих наличие абзимной активности и у здоровых лиц.

Адрес для корреспонденции: 21000, Витебск, пр-т Фрунзе, д.78, кв.48, тел. 37-06-12 - Генералов И.И.

В свете вышеизложенного значительный интерес представляет оксидоредуктазная активность антител и иммуноглобулинов (ИГ). Впервые она была описана в 1988-1989 году А.Я. Кульбергом и И.М. Петяевым. Ими было обнаружено ([4, 5, 8]), что все иммуноглобулины способны катализировать супероксидза-висимые процессы, причем их активность резко увеличивается с образованием иммунного комплекса.

Недавними работами P. Wentworth с со-авт. [11, 12] было показано, что иммуноглобулиновые молекулы, независимо от их специфичности, способны катализировать превра-

щение синглетного кислорода в пероксид водорода. Авторы считают, что иммуноглобулины являются уникальным классом белков, которые способны генерировать до 500 молярных эквивалентов перекиси водорода из син-глетного кислорода без снижения активности вследствие окислительного повреждения молекулы катализатора. Другие белки обладают в десятки раз меньшей активностью, причем они достаточно быстро инактивируются в ходе окислительно-восстановительных процессов. По мнению авторов, АТ существенно влияют на протекание дыхательного взрыва в макрофагах, так как при опсонизации антигенов различного происхождения происходит проникновение антител в макрофаг в составе поглощенных иммунных комплексов. Данное открытие - пример редкого совмещения защитных функций распознавания и киллинга в одной молекуле [11, 12].

В свою очередь, образование активных метаболитов кислорода под влиянием АТ может приводить к повреждению окружающих тканей.

С учетом вышесказанного не исключается, что оксидоредуктазные абзимы в определенных условиях могут играть как патогенетическую, так и протективную, защитную роли. При этом их активность должна изменяться с развитием аутоиммунных или инфекционных заболеваний.

Очевидно, однако, что клиническое исследование абзимной функции требует разработки новых или адаптации имеющихся методов определения ферментативной активности. Такие способы должны обладать достаточно высокой чувствительностью и воспроизводимостью, и в то же время быть пригодными для массовой постановки.

С другой стороны, разработка улучшенных способов определения ферментов и абзи-мов в малых объемах реакционной смеси и с возможностью автоматизированного учета активности многих образцов позволила бы расширить границы применимости данных методов. В настоящей работе мы модифицировали способы определения разных видов ферментативной активности (каталазной, пе-роксидазной, супероксиддисмутазной) с це-

лью их использования для оценки окислительно-восстановительной активности абзимов.

Методы

В работе были использованы нитроси-ний тетразолий производства фирмы Chemapol, агароза, конъюгированная с белком А золотистого стафилококка (институт им. Пастера, г. С.-Петербург, Россия), феназин метасульфат (ФМС), восстановленный никоти-намид аденин динуклеотид (НАД*Н), (все -производства фирмы Sigma), остальные реактивы - производства « Реахим» квалификации «хч» и «чда».

Материалом для исследования послужили IgG подклассов 1,2 и 4. Препараты иммуноглобулинов класса G получали из сывороток практически здоровых лиц (доноров и призывников), больных ревматоидным и реактивным артритами, системной красной волчанкой (СКВ), больных хирургическими бактериальными гнойно-воспалительными заболеваниями комбинированным аффинно-хроматографическим методом [2].

Контроль чистоты полученных ИГ проводили с помощью электрофореза в полиак-риаламидном геле (ПАГ, Sigma) в системе буферов по Laemmli с использованием 10% или 12% разделяющего геля в присутствии доде-цилсульфата натрия по методам, изложенным в [7]. Гель окрашивали Кумасси R250 и нитратом серебра. По результатам электрофореза обнаруживалась широкая белковая полоса, мигрирующая в зоне гамма-глобулинов, что свидетельствовало о гомогенности полученных препаратов IgG.

В качестве базового способа для оценки каталазной активности нами был использован метод М. А. Королюка с соавт. [3], основанный на образовании окрашенного комплекса перекиси водорода с раствором молибдата аммония. По данным автора, метод отличается высокой чувствительностью и воспроизводимостью.

За основу определения супероксиддис-мутазной (СОД)-активности IgG нами был взят способ, где в качестве системы генерации супероксидных радикалов используется реак-

ция окисления р-никотинамидаденин динуклеотида (восстановленная динатриевая соль НАДН) феназинметасульфатом (ФМС). Индикатором-перехватчиком радикалов в реакции является индикатор нитросиний тетразолий [10]. Сходный метод был использован А.Я.Кульбергом для оценки СОД-активности синтетических пептидов - гомологов шарнирного участка І§0 [6].

С целью оценки пероксидазной активности 1§0 в образцах из клинического материала был модифицирован предложенный нами ранее метод ее определения [2].

Все модификации методов разрабатывались с целью массового определения соответствующей активности биологических образцов (абзимов, сывороток, препаратов ферментов). Для этого они были адаптированы к регистрации на отечественном колориметре-мультискане АИФ М/340 производства ГУП «Витязь».

Результаты и обсуждение

Оригинальный метод определения ката-лазы [3] выполняется в общем объеме пробы 2,1 мл с 0,03% конечной концентрацией перекиси водорода. Остановка реакции производится добавлением 1 мл 4% молибдата аммония. Учет реакции проводится на спектрофотометре при длине волны 410 нм.

Мы адаптировали реакцию для постановки ее в полистироловых планшетах для иммуноферментного анализа (ИФА).

Исходно схема постановки была следующей: к 0,05 мл раствора перекиси водорода на 0,05М Трис-НС1 буфере, рН 7,4, взятой в разных концентрациях, добавляли 0,05 мл 1§0 на 0,15М №С1 в концентрации 1 мг/мл (в контроле - 0,05 мл 0,15М №С1). Реакцию останавливали добавлением 0,1 мл 4% молибдата аммония и фото-

метрировали планшет на мультискане АИФ М/ 340 с использованием методики .№20 - двухволновое измерение на 405 и 570 нм.

Результаты эксперимента с различными концентрациями перекиси водорода представлены в таблице 1.

Из полученных данных следует, что при концентрации пероксида более 0,3% наступает насыщение перекиси молибдатом аммония и значимого увеличения оптической плотности не происходит.

Для дальнейших экспериментов нами была избрана 0,1% концентрация Н202 во вносимом объеме (0,05 мл).

Далее мы изучили влияние катионов различных металлов на протекание реакции, так как многие каталазы являются металлозависимыми ферментами. Для этого схему реакции видоизменили следующим образом: к 0,05 мл 0,1% раствора перекиси водорода на 0,05М Трис-НС1 буфере, рН 7,4 добавляли 0,05 мл физиологического раствора (или І§0), 0,05 мл соответствующего катиона металла в концентрации 10-3-105М и 0,05 мл 10% молибдата аммония.

Оказалось, что под действием катионов Си(11) и Бе(11) происходит достоверное ускорение распада перекиси водорода. Катионы магния таким действием не обладали. При этом катионы Си(ІІ)и Бе(П) в концентрациях 10"3-10"4М вызывали преципитацию реакционной смеси. Отсюда в дальнейших реакциях для изучения влияния катионов на активность І§0 использовались катионы Си(ІІ) в концентрации 10-5М.

Кроме того, при определении оптимальной концентрации антител для реакции было выявлено, что І§0 в концентрации свыше 1 мг/ мл агрегируют при взаимодействии с молиб-датом аммония, что может влиять на учет реакции. Отсюда конечная концентрация І§0 в

Таблица 1

Определение оптимальной концентрации перекиси водорода в реакции с молибдатом аммония

Концентрация перекиси водорода, % 0,03 0,15 0,3 3,0

Дубль 1, ЕОП 0,206 0,767 1,013 1,232

Дубль 2, ЕОП 0,194 0,729 1,029 1,249

реакционной смеси в дальнейших экспериментах составила 0,33 мг/мл.

Наконец, при остановке реакции сразу после добавления препаратов 1§0 в реакционную смесь (холостая проба) оказалось, что их оптическая плотность до 0,05 ЕОП (обычно -0,035-0,04 ЕОП) ниже средней оптической плотности контролей. Эту поправку учитывали в дальнейшем при оценке каталазной активности абзимов.

Коэффициенты вариации контрольных проб внутри одного определения не превышали 2% как для буферно-субстратной смеси, так и для холостых проб, содержащих 1§0.

С целью определения супероксиддисму-тазной активности нами был модифицирован исходный спектрофотометрический вариант ее оценки предложенный БеисЬашр С. с со-авт. [10]. Объемы реагентов кратно уменьшали для постановки реакции в полистироловых планшетах для иммуноферментного анализа. С учетом внесения в реакционную смесь дополнительного объема, содержащего иммуноглобулины и катионы металлов, концентрацию НАДН и ФМС в смеси увеличивали вдвое.

Окончательный вариант методики выглядел следующим образом: к 0,15 мл раствора НСТ в концентрации 0,0004М на 0,15М фосфатном буфере, рН 7,8 добавляли 0,05 мл 1§0 на 0,15М КаС1 в концентрации 1 мг/мл, 0,02 мл раствора соответствующего катиона (или 0,15М №С1 в пробах без катионов), 0,01 мл раствора ФМС. Реакцию начинали внесением 0,01 мл 0,00166М раствора НАДН (ко -нечная концентрация в реакционной смеси -70 мкМ). Пробы перемешивали в лунках планшета и помещали в термостат при 37оС на 10 минут. По окончании инкубации проводили

учет реакции на мультискане АИФ М/340, определяя оптическую плотность образующегося из НСТ формазана.

С учетом того, что в исходных методиках определения супероксиддисмутазы разные авторы использовали различные длины волн для регистрации СОД-реакции (540 нм в методике БеисЬашр С. С соавт. [10] и 560 нм в методе А.Я. Кульберга с соавт. [6]) мы изучили спектр поглощения формазана, образующегося в ходе реакции в вышеуказанных условиях (регистрация на спектрофотометре СФ-46).

Результаты представлены в таблице 2.

Из полученных данных следует, что продукт реакции обладает широким максимумом спектра поглощения в пределах 540-590 нм. Отсюда нами была избрана методика №6 при регистрации реакции на мультискане АИФ М/ 340 (светофильтр с максимумом на 570 нм).

Воспроизводимость метода внутри одного анализа была высокой (коэффициент вариации контролей составил 3-7%, опытных проб - 5-8%).

Также нами было изучено влияние катионов на протекание реакции, так как природная супероксиддисмутаза является Си-2п-за-висимым ферментом. Для этого в реакционную смесь добавляли 0,02 мл соответствующего катиона металла в концентрации 10-3-104М. Было изучено влияние катионов Си(ІІ), Бе(П), Са(ІІ), М§(П), №(ІІ), Мп(ІІ), 2п(П).

Оказалось, что под действием катионов Бе(ІІ) и 2п(ІІ) происходит ускорение превращения НСТ в формазан. Другие катионы таким действием не обладали, к тому же вызывали помутнение реакционной смеси в концентрации 10-3-10-4М.

Т аблица 2

Характеристика спектра поглощения формазана в реакции восстановления нитросинего тетразолия

Длина волны, нм 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 620 680

ЕОП холостой пробы 0,094 0,105 0,113 0,120 0,123 0,128 0,128 0,129 0,128 0,127 0,128 0,118 0,078

ЕОП формазана 0,630 0,691 0,747 0,791 0,822 0,844 0,859 0,867 0,868 0,868 0,870 0,818 0,517

Была предпринята попытка увеличить время инкубации реакции при 37оС от 10 минут до 1-2 часов и более. Оказалось, что оптическая плотность смеси может незначительно (до 10% от исходной) увеличиваться в течение первых 30 мин инкубации. При дальнейшем увеличении времени оптическая плотность снижалась, что вероятно, было связано с осаждением частиц формазана.

С учетом данных С. БеисЬашр и А.Я. Кульберга для 1§0 нами было выбрано время инкубации 10 минут при 37оС.

При изучении влияния концентрации ИГ на реакцию оказалось, что с ее увеличением скорость восстановления НСТ нарастала. Для анализа проб, взятых от больных, нами использовались 1§0 в концентрации 1 мг/мл (ко -нечная концентрация ИГ в реакционной смеси составила ~ 200 мкг/мл).

Что касается метода определения перок-сидазы, то мы модифицировали разработанную нами ранее методику [2] согласно схеме, предложенной в [9].

Для реакции использовали 0,05М Трис-НС1 буфер, рН 7,4 содержащий 0,06% пероксид водорода и 0,08% раствор орто-фенилен-диамина (ОФД). 0,1 мл буферно-субстратной смеси добавляли к 0,1 мл 1§0 на 0,15М №С1 в концентрации 0,5 мг/мл. При добавлении катионов в концентрации 10-4-10-5 М в реакционную смесь в объеме 0,05 мл уменьшали вдвое объем вносимых в реакцию 1§0 с соответствующим увеличением их концентрации.

Реакцию инкубировали при 37оС начиная с 10 минут и доводя максимальное время инкубации до 20 часов. При увеличении времени инкубации остановку реакции с помощью 1 н. Н2Б04 не проводили, а выполняли непосредственное ее измерение при максимуме поглощения ОФД на 450 нм (мультискан АИФ М/340, методика №21 - двухволновое измерение на 450 и 620 нм).

Также нами было проведено сравнение различных буферных систем, используемых для оценки пероксидазной абзимной реакции. Изучалось протекание реакции в 0,05М Трис-НС1 буфере, рН 7,4 и фосфатно-цитратном буферном растворе, рН 5.0. Последний буфер традиционно используется для определения

пероксидазной активности в биохимии и иммунологии.

В результате проведенных экспериментов оказалось, что активность абзимов (препарат получен от больной СКВ) в присутствии ионов меди сопоставима в обоих буферах, тогда как без катионов активность АТ обнаруживалась только в Трис-HCl буфере и не определялась в фосфатно-цитратном буферном растворе. Аналогично в присутствии ионов магния активность была выше в 0,05М Трис-HCl буфере.

Отсюда при дальнейшей оценке абзим-ной активности был использован Трис-HCl буфер, рН 7,4.

При подборе концентрации ионов металлов было выявлено, что оптимальной для протекания реакции является концентрация 10-5М для катионов Cu(II) и Fe(II) и 10"3-10"4М для ионов Mg(II).

Воспроизводимость метода была достаточной, коэффициенты вариации для контро-лей внутри одного анализа составляли около 5%, между анализами - до 10%

Таким образом, нам удалось разработать модификации методов определения ферментов с различной окислительно-восстановительной активностью и адаптировать их к изучению каталазной, оксидоредуктазной и супе-роксиддисмутазной абзимной активности. Планшетные микромодификации предложенных способов значительно ускорили постановку и во многом упростили регистрацию абзим-ной активности. Для учета в реакции используется отечественный колориметр-мультискан АИФ М/340. Все это значительно облегчает возможность оценки абзимной активности в клинических условиях. При этом методы сохранили хорошую воспроизводимость и чувствительность.

Предложенные модификации могут применяться для широкого определения оксидо-редуктазной абзимной активности поликлональных ИГ в клинических ситуациях. В настоящее время они используются нами для изучения каталитической активности иммуноглобулинов, выделенных от больных аутоиммунными заболеваниями (системной красной волчанкой, аутоиммунным тиреоидитом),

больных бактериальными инфекциями и от здоровых лиц (доноров крови).

Кроме того, данные способы могут быть использованы и для определения соответствующей энзимной активности в сыворотках больных и здоровых лиц, микробных культурах, препаратах ферментов с возможностью анализа малых (менее 0,1 мл) объемов исследуемого образца. Постановка этих реакций возможна в лабораториях самого разного уровня в случае их оснащения отечественными колориметрами для учета планшетных вариантов реакций. С учетом того, что отечественный мультискан АИФ исходно разрабатывался ПО «Витязь» как аппарат для иммунофер-ментного анализа, а также как прибор для биохимической идентификации микроорганизмов и определения их чувствительности к антибиотикам, одновременно можно будет решать и эти важные задачи.

Исследование выполнено при поддержке Белорусского Республиканского Фонда фундаментальных исследований, грант БРФФИ ,№Б04Р-018

Литература

1. Генералов И.И., Новиков Д.К. Поликлональные

каталитические антитела и их возможное биологическое значение. Усп. совр. биол .-1998-Т.118, вып.2.-С.178-193.

2. Генералов И.И., Новиков Д.К., Жильцов И.В. Взаимодействие поликлональных IgG человека с катионами металлов// Весщ НАН РБ (серыя б1ялапчных навук).-1999.-№ 1-С.95-101.

3. Королюк М. А., Иванова Л. И., Майорова И. Г., Токарев В. Е. Метод определения активности ка-талазы// Лаб. дело. - 1987.

4. Кульберг А.Я., Петяев И.М. Каталитические свойства антиидиотипических антител и антирецепторов// Иммунология-1988.-N6.-C.10-13.

5. Кульберг А.Я., Петяев И.М., Замотаева Н.Г. Каталитические свойства продуктов катаболитного распада клеточных рецепторов (R-белков) //Иммунология-1988-N°3.-C37.

6. Кульберг А.Я., Оганян Р.Р., Шибнев В. А. Утилизация радикалов кислорода синтетическими про-лин-богатыми олигопептидами// Биохимия.-1992.-Т.57, вып.11.- С.1744-1749.

7. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие).-М., 1981.-286 с.

8. Петяев И.М., Кульберг А.Я. Ферментативные свойства антител и клеточных рецепторов //Имму-нология.-1988.-№5.-С.12-14.

9. Теория и практика иммуноферментного анализа/ Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М.- М.: Высш. школа, 1991.-С.266-267.

10. Beuchamp C., Fridovich J. Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable acrilamide gels/ / Anal. Biochem. - 1971. - Vol.44, N1. - P.276-287.

11. Wentworth P. Antibody design by man and nature. Science. - 2002. - Vol.296. - P. 2247-2249.

12. Wentworth P., Jones L. H., Wentworth A.D., Zhu Xueyong et.al. Antibody catalysis of the oxidation of water//Science. - 2001. - Vol.293. - P.1806-1811.

Поступила 06.07.2005 г. Принята в печать 26.09.2005 г.