Способ получения остеоиндуктивного покрытия, содержащего гидроксиапатит, на высокопористом открытоячеистом углеродном материале
METHOD FOR CREATING AN OSTEOINDUCTIVE HYDROXYAPATITE-CONTAINING COATING ON A HIGHLY POROUS OPEN-CELL CARBON MATERIAL

Изобретение относится к получению остеоиндуктивного покрытия, содержащего гидроксиапатит, методом электроосаждения на поверхность высокопористого открытоячеистого углеродного материала. Данный материал может быть использован в качестве остеопластического материала при замещении дефектов костной ткани, возникающих в следствии хирургического вмешательства и дегенеративно-дистрофических заболеваний кости, в составе имплантированного материала или в качестве скаффолда при создании тканево-инженерных конструкций. Существующие металлические имплантаты, использующиеся для остеозамещения, имеют большую прочность и малую эластичность, что приводит к резорбции собственной кости в следствие стресс-шилдинг эффекта, то есть снижения плотности костной ткани в результате снятия напряжения с кости на имплантат. Перераспределение физической нагрузки происходит по закону Вольффа [1] и наблюдается у человека и животных. С уменьшением нагрузки на кость последняя становится менее плотной и прочной, за отсутствием стимула для продолжения ремоделирования, необходимого для поддержания костной массы. Керамические имплантаты, в отличие от металлических, более хрупкие, что также ограничивает возможности их применения. Для улучшения остеоиндуктивных и остеокондуктивных свойств имплантаты зачастую покрывают материалами из группы кальцийфосфатов, в частности гидроксиапатитом, являющимися основными компонентами костной ткани. Среди методов нанесения остеоиндуктивных покрытий наиболее распространенными являются: плазменное напыление, золь-гель метод, электрофоретическое и электрохимическое осаждение. Последний способ является наиболее коммерчески доступным и простым по аппаратурному оформлению. Кроме того, электрохимическое осаждение негативно не сказывается на свойства и характеристики биоактивных веществ, в том числе ростовых белковых факторов, которые потенциально возможны к включению в состав покрытий с целью повышения остеоиндуктивности.
2
Известен способ получения гидроксиапатитового покрытия на титановых пластинах и керамических поверхностях [2] (US5759376 A) с предварительным использованием золь-гель метода. Золь-гель нанесение представляет собой взаимное приближение химического состава субстрата и слоя гидроксиапатита, поскольку раствор, используемый для золь-гелевого покрытия, имеет элементы химического состава субстрата и/или слоя покрытия. Подложки предварительно обрабатывают золь-гелевым покрытием с использованием алкоксидов, содержащих элементы 3-5 и 13-15 групп периодической системы химических элементов, или смесей таких алкоксидов, которые содержат ионы фосфата кальция и/или ионы гидрофосфата кальция или сложные эфиры фосфорной кислоты в качестве дополнительных. В результате использования раствора для золь-гелевого покрытия, включающего элементы подложки и/или покрытия из гидроксиапатита, наблюдается значительное увеличение адгезии покрытия на основе гидроксиапатита. После проведения золь-гель осаждения электрохимическим методом с помощью импульсного источника тока наносится покрытие на основе гидроксиапатита. Частота импульсов составляет от 1 до 300 Гц, потенциал осаждения - от 2 до 10 В, время процесса - от 5 до 15 минут, температура проведения процесса - от 20°С до 40°С. По окончанию процесса электрохимического осаждения пластины с покрытием отмываются в воде и сушатся в потоке воздуха до постоянной массы. Толщина образующегося покрытия составляет от 5 до 25 мкм, плотность от 1 до 3 мг/см.
Недостатком данного метода является использование дополнительной подготовки поверхности перед процессом электролиза, что увеличивает время и сложность проведения процесса. Работа импульсного тока, в сравнении с током постоянным, имеет меньший коэффициент полезного действия. Титан в качестве материала для имплантата имеет существенные минусы, так как титан обладает большей, чем костная ткань прочностью, что может вызывать резорбцию кости, кроме того, использование титановых имплантатов в короткий срок (до 6 месяцев) вызывает стресс-шилдинг эффект.
3
2
2
4
2
4
2
2
Известен способ осаждения гидроксиапатита на титановые подложки с помощью импульсного электроосаждения [3] (WO2010055231 A2). Данный метод позволяет наносить гидроксиапатит на искусственные костные имплантаты, варьируя толщину покрытия и пористость, так же имея возможность замещения кальция другими ионами (Sr, Mg), что дает покрытию дополнительные остеоиндуктивные и антибактериальные свойства. Для электролиза используется Са(NO))×4HO и (NH)HPO. Концентрация фосфора в растворе 25 ммоль/л, кальция - 42 ммоль/л. Соотношение ионов Са/Р=1,67. Плотность тока при электроосаждении - от 0,01 мА/см до 10 А/см, напряжение - от 0,01 до 10 В, температура проведения электроосаждения - от 15°С до 95°С, рН электролита - от 1 до 6. После проведения процесса образцы с осажденным покрытием подвергаются термической обработке при температуре не ниже 650°С для улучшения адгезии покрытия с металлической подложкой.
Недостатком данного метода является использование металлической подложки, а также импульсное электроосаждение, которое имеет меньший коэффициент полезного действия. Высокая температура обработки покрытия после его нанесения требует специализированного оборудования и дополнительных экономических затрат. Использование титана в качестве материала для подложки имеет уже упомянутые недостатки в виде снижения плотности костной ткани и ее резорбции в месте крепления имплантата.
2+
3-
2
2
4
Наиболее близким техническим решением является осаждение остеоиндуктивного покрытия на поверхность титана или титанового сплава с использованием раствора электролита, содержащего ионы Саи НРО, при постоянном токе [4] (CN103014801 А). Титановая подложка механически полируется, удаляются загрязнения, промывается, вытравливается, снова промывается и обрабатывается кислотой для оксидирования поверхности. Только после предварительной подготовки титановая подложка помещается в раствор электролита. Соотношение Са/Р - 1,67-2, рН раствора составляет 4,2-5,0. Плотность тока - 1-50 мА/см, потенциал осаждения - от 1 до 10 В, температура проведения процесса 40-80°С.
Главными недостатками прототипа является: использование металлической подложки, уменьшающей плотность костной ткани; проведение предварительной обработки металла для удаления следов загрязнения, проходящей с использованием агрессивных сред, а также кислотную обработку. Использование подобных реагентов на всех стадиях нежелательно и может иметь негативное воздействие на организм при имплантировании материала.
Обозначенные проблемы решаются следующим способом. Использование высокопористого открытоячеистого углеродного материала в качестве подложки для электролитического осаждения, вместо металлических пластин, вызывающих резорбцию костной ткани. Углеродный материал не нуждается в специфической предварительной обработке с использованием агрессивных реагентов. В предложенном методе используется источник постоянного, а не импульсного тока, что увеличивает эффективность электроосаждения. Использование водно-спиртового, вместо водного раствора электролита увеличивает смачиваемость поверхности, повышает диффузию электролита в объем материала и, соответственно, способствует осаждения остеоиндуктивного покрытия во всем объеме высокопористого открытоячеистого углеродного материала.
По сравнению с уже существующими аналогами, данное изобретение имеет ряд преимуществ:
(1) Ни в процессе подготовки высокопористого открытоячеистого углеродного материала к электроосаждению, ни во время самого процесса не используются токсичные вещества и агрессивные кислоты.
(2) Высокопористый открытоячеистый углеродный материал, на котором проводится электроосаждение, является безопасным и инертным в биологических средах материалом. Его модуль упругости сопоставима с модулем костной ткани (прочность при сжатии при этом сопоставима с прочностью трабекулярной костной ткани 2-12 МПа [5]) и не вызывает ее резорбцию, из-за чего снижается необходимость послеоперационных вмешательств и увеличивается срок использования имплантата;
(3) Метод получения остеоиндуктивного покрытия, содержащего гидроксиапатит, изложенный в данном патенте, существенно проще и имеет более низкую стоимость. Использование постоянного тока обеспечивает больший коэффициент полезного действия, чем переменный ток. В отличие от других разработок изобретение не требует постоянного поддержания рН с помощью дополнительных реагентов.
Задачей предлагаемого изобретения является получение остеиндуктивного покрытия, содержащего гидроксиапатит, на поверхности высокопористого открытоячеистого углеродного материала с помощью электрохимического осаждения с минимальными экономическими затратами и модификациями процесса электроосаждения.
Поставленная задача достигается с помощью использования водно-спиртового электролита, способствующего увеличению смачиваемости поверхности, в сравнении с водным раствором электролита. Добавление пероксида водорода ингибирует образование водорода в процессе проведения электрохимического осаждения, что позволяет достигать более однородной поверхности. Перемешивание от 200 до 400 оборотов в минуту увеличивает миграцию вещества в объем материала, что, совместно со смачиваемостью, приводит к образованию остеоиндуктивного покрытия во всем объеме материала.
В качестве подложки для электроосаждения используется высокопористый открытоячеистый углеродный материал, полученный по способу, указанному в заявке на патент RU №2020129066 от 02.09.2020 [6], который имеет пористость 85-97%, прочность на сжатие 3,5-4 МПа, геометрические размеры - диаметр - 2,5 см, не более, высота - 5 см, не более.
Предварительно высокопористый открытоячеистый углеродный материал проходит кипячение в этиловом спирте в течение 30 минут для с целью обезжиривания, удаления механических примесей и повышения адгезии остеиндуктивного покрытия, содержащего гидроксиапатит, к поверхности. Дальнейшее промывание в деионизированной воде до нейтрального рН позволяет удалить оставшийся после кипячения растворитель. Затем проводится сушка до постоянной массы от комнатной температуры с плавным подъемом до 80°С. Такой температурный режим позволяет воде испариться равномерно, не деформируя структуру высокопористого открытоячеистого углеродного материала и не разрушая остеоиндуктивное покрытие.
2+
3-
2+
3-
4
3
2
2
4
4
3
4
Для проведения процесса электролиза готовится раствор электролита, содержащий в себе ионы Саи РО, растворенные в 50% водно-спиртовой смеси. Применение спирта в растворе повышает смачиваемость поверхности высокопористого открытоячеистого углеродного материала на основе стеклоуглерода и способствует нанесению остеоиндуктивного покрытия в объеме материала (фиг. 1 - Снимки СЭМ поверхности высокопористого открытоячеистого углеродного материала с остеоиндуктивным покрытием, содержащим гидроксиапатит: а, 6 - внешняя сторона, в - центр катода). В качестве источника ионов Савыступает Са(NO)×4HO в концентрации 64 ммоль/л. Источник РО - (NH)PO, в концентрации 49 ммоль/л. Данные концентрации дают соотношение Са/Р - 1,67, что соответствует соотношению ионов в гидроксиапате костной ткани. На основе анализа литературных данных эти концентрации были выбраны как оптимальные [7]. Раствор электролита перемешивается до полного растворения солей на магнитной мешалке с подогревом при постоянном перемешивании 300-400 оборотов в минуту и температуре 40°С, обеспечивающие лучшую растворимость веществ. рН получаемого раствора электролита 2,4-2,7.
После приготовления раствор помещается в электролитическую ячейку со спиральным платиновым электродом, выступающим в качестве анода. Высокопористый открытоячеистый углеродный материал, за счет высокой электропроводности пироуглерода, содержащегося на поверхности материала, используется в качестве катода. Высокопористый открытоячеистый углеродный материал помещается в центр платиновой спирали для обеспечения равномерного осаждения. Раствор перемешивается с помощью магнитной мешалки с режимом не менее 200 оборотов в минуту с целью перемешивания электролита и обеспечения диффузии внутрь пор катода, а так же для препятствия выпадения осадка, состоящего из компонентов электролита. В процессе перемешивания к раствору электролита добавляется перекись водорода в концентрации от 1 до 10 мл/л. Перекись водорода способствует уменьшению образования водорода и увеличению адгезии остеоиндуктивного покрытия, содержащего гидроксиапатит, на поверхность катода [8]. Увеличение температуры среды вызывает пропорциональный рост скорости осаждения покрытия. Анализ литературных данных показывает, что наиболее используемый диапазон температур для электроосаждения - от 30° до 85°С [9, 10]. Элекроосаждение проходит и без дополнительного нагрева, экспериментальным образом была установлена оптимальная температура - от 25 до 35°С: при рекомендуемом режиме остеоиндуктивное покрытие не перекрывает поры высокопористого открытоячеистого углеродного материала.
Режим тока электролитического осаждения варьировался от 100 мА до 300 мА. Увеличение силы тока увеличивает скорость образования остеоиндуктивного покрытия, содержащего гидроксиапатит, на поверхности высокопористого открытоячеистого углеродного материала, что приводит к закупориванию наружных пор и нарушению диффузии раствора внутрь. Было установлено, что при силе тока от 100 до 200 мА остеоиндуктивное покрытие проникает в объем высокопористого открытоячеистого углеродного материала, что увеличивает биологическую активность итогового имплантата. Время электроосаждения варьируется от 5 до 40 минут в зависимости от необходимой плотности покрытия: время воздействия прямо пропорционально плотности остеоиндуктивного покрытия (фиг. 2 - Снимки СЭМ остеоиндуктивного покрытия, полученного при проведении электроосаждения в течение: а) 5 минут, б) 40 минут).
Процесс электроосаждения проводится при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке для достижения равномерного распределения ионов электролита в растворе и в пористой структуре катода.
По окончанию процесса высокопористый открытоячеистый углеродный материал с покрытием высушивается на воздухе для увеличения адгезии остеоиндуктивного покрытия, содержащего гидроксиапатит, к поверхности и когезии между нанесенными слоями. После сушки на воздухе при комнатной температуре следует промывание материала в дистиллированной воде для удаления остатков электролита, во избежание их проникновения во внутреннюю среду при имплантировании. Очистка от остатков электролита проводится до достижения нейтрального рН среды, после чего следует этап финальной сушки, направленной на удалении молекул воды из остеоиндуктивного покрытия. Сушка проводится при 140°С в течение 10-16 часов (в зависимости от толщины покрытия), что позволяет удалить связанную воду.
Синтезированное и высушенное остеоиндуктивное покрытие идентифицировалось методами ИК спектроскопии (фиг. 3 - ИК-спектр полученного по настоящему изобретению остеоиндуктивного покрытия), микроскопия с ЭДС (фиг. 4 - Суммарный спектр карты ЭДС высокопористого открытоячеистого углеродного материала с остеоиндуктивным покрытием), рентгеноструктурного анализа (фиг. 5 - Рентгенограмма высокопористого открытоячеистого углеродного материала, с остеоиндуктивным покрытием) и рамановской спектроскопии (фиг. 6).
-1
-1
-1
В соответствии с применяемыми методами исследования было установлено, что материал покрытия является кальцийфосфатом, содержащим гидроксиапатит.Так, пики поглощения (фиг. 3) в области 1379 и 3418 смсоответствуют колебаниям гидроксильной группы, а пики на 1044 и 654 смотносятся к валентным и деформационным колебаниям фосфатной группы, содержание кислорода, фосфора и кальция (фиг. 4) составляют 72, 11, 18 атом. % соответственно, пики (фиг. 6 - Рамановская спектроскопия порошка остеоиндуктивного покрытия) при 835 и 949 см соответствуют гидроксиапатиту.
Пример конкретного исполнения.
3
2
4
3
4
Образец открытоячеистого высокопористого углеродного материала, полученного по способу, описанному в заявке на патент RU №2020129066 от 02.09.2020 с высотой 20 мм и диаметром 10 мм, кипятится в 99,8% этиловом спирте при температуре 78°С в течение 30 минут. После кипячения образец промывается деионизированной водой до достижения нейтрального рН и сушится на воздухе при 25°С в течение 10 часов, а затем в сушильном шкафу при 80°С - 6 часов. Параллельно готовится раствор электролита. К смеси, состоящей из 489 г дистиллированной воды и 489 г этилового спирта, добавляется 15 г Са(NO))×4HO и 7 г (NH)PO, полученный раствор помещается в химически стойкий лабораторный стакан, который располагается на магнитной мешалке. Режим перемешивания - 300 оборотов в минуту, нагрев - 40°С. Перемешивание проводится до полного растворения солей, что составляет ориентировочно 3-4 часа. Затем 200 мл свежеприготовленного раствора электролита помещается в электролитическую ячейку. В эту же ячейку погружается спиральная платиновая проволока, являющаяся анодом в процессе электроосаждения. Платиновая проволока подключается к положительным клеммам источника постоянного тока. Подготовленный образец открытоячеистого высокопористого углеродного материала, являющийся катодом, с помощью держателя помещается в центр платиновой спирали на расстоянии не более 20 мм от проволоки и подключается к отрицательной клемме источника тока. В электролитическую ячейку помещается магнитный элемент, и ячейка помещается на перемешивающее устройство (магнитную мешалку), режим перемешивания - 100 оборотов в минуту, температура - 30°С. После достижения раствором электролита заданной температуры, включается источник тока. Сила тока выставляется 100 мА, напряжение составляет около 8 В. Время проведения электроосаждения - 20 минут. После проведения электролиза открытоячеистый высокопористый углеродный материал с остеоиндуктивным покрытием, содержащим гидроксиапатит, высушивается на воздухе при 25°С в течение 24 часов, после чего проходит отмывание в деионизированной воде от оставшегося электролита до достижения нейтрального рН среды. После отмывания проводится сушка в сушильном шкафу при 140°С в течение 10 часов или до постоянной массы образца для удаления воды.