ПРОИЗВОДНЫЕ АЛКИЛАММОНИЙНОГО ГЕМИНАЛЬНОГО ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ ЭФФЕКТИВНУЮ ДОСТАВКУ ДНК В КЛЕТКИ
ALKYL AMMONIUM GEMINAL SURFACTANT DERIVATIVE PROVIDING EFFECTIVE DNA DELIVERY INTO CELLS

Изобретение относится к ряду химических соединений, а именно к алкиламмонийным геминальным поверхностно-активным веществам (ГПАВ) формулы (I),
где m=4, 6, 12, обеспечивающих эффективную доставку ДНК в клетки.
Данные соединения являются электролитами и диссоциируют в воде с образованием мицеллообразующего иона, имеющего заряд +2, создаваемого двумя положительно заряженными атомами азота, и двух противоионов: бромид-анионов.
Генная терапия имеет значительный потенциал для терапевтического лечения путем внутриклеточной доставки генов многих человеческих болезней, которые в настоящее время считаются неизлечимыми. Вирусные векторы на основе аденовирусов или ретровирусов очень эффективны в доставке генов. Тем не менее развитие способов доставки ДНК в эукариотические клетки без применения вирусных векторов остается очень актуальным из-за возможности использовать только целевые последовательности ДНК и существенно более низкого риска отдаленных осложнений.
В качестве альтернативы вирусным векторам для доставки ДНК в клетки используются разнообразные катионные полимеры и структуры, такие как полиэтиленимин [Bagnacani V. et al. Macrocyclic nonviral vectors: high cell transfection efficiency and low toxicity in a lower rim guanidinium calix[4]arene. Org Lett. 2008; 10 (18), 3953-6], поли (L-лизин) [Baldini L. et al. Calixarene-based multivalent ligands, Chem Soc Rev. 2007, 36 (2), 254-66], полиамидоамин дендример [Sun X. et al. Cationic polymer optimization for efficient gene delivery. Mini Rev Med Chem. 2010, 10 (2), 108-25] и катионные липосомы [V. Geromel et al. Mitochondria Transfection by Oligonucleotides Containing a Signal Peptide and Vectorized by Cationic Liposomes, Antisense and Nucleic Acid Drug Development. 2001, 11 (3), 175-180]. Эти катионные агенты связываются с ДНК посредством электростатических взаимодействий и формируют комплексы наночастиц [Won Y.W. et al. Intracellular organdie-targeted non-viral gene delivery systems, J Control Release. 2011, 152 (1), 99-109]. В результате ДНК становится защищенной от деградации нуклеазой, в то же время катионные агенты являются посредником при проникновении в клетку и последующем освобождении из эндосом, что повышает эффективность трансфекции.
В литературе есть данные о трансфекции ДНК в присутствии монокатионных ПАВ - цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ) и цетилгидроксиэтилдиметиламмоний бромида (ЦГАБ) [Mel'nikov S.M. et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 2401], [Mel'nikov, S.M. Et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 9951], [Clamme, J. P. et al. Biochim. Biophys. Acta 2000, 1467, 347], [Pinnaduwage, P. et al. Biochim. Biophys. Acta 1989, 985, 33], [Antara Dasgupta et al. J. Phys. Chem. B, Vol.111, No.29, 2007], которые являются монокатионными структурными аналогами заявляемых соединений и выбраны нами в качестве соединений сравнения.
К недостаткам использования вышеуказанных ПАВ в качестве средств доставки ДНК в клетки можно отнести (1) значительно более высокие величины критических концентраций мицеллообразования и более низкий поверхностный потенциал, что требует более высоких концентраций ПАВ для достижения сравнимых эффектов компактизации ДНК и перезарядки комплексов ПАВ/ДНК; (2) пониженную трансфекцию ДНК.
В литературе также имеются данные о применении в качестве трансфектантов геминальных ПАВ [Jagbir Singh et al. Current drug delivery, 2011, 8 (3), 299-306], [Peng Yang et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 75 (2010) 311-320], [Marianna Foldvari et al., J. Experimental Nanoscience, 1, No.2, 2006, 165-176], [Cecilia Bombelli et al., J. Med. Chem. 2007, 50, 6274-6278]. Однако в описанных примерах трансфекция ДНК в клетки животных достигается только при использовании смеси ПАВ с липидами, а в некоторых случаях еще и при добавлении производных полиэтиленгликоля. Существенным моментом является также то, что независимо от соотношения геминальное ПАВ-липид именно липиды являются структурообразующим компонентом: во всех приведенных источниках рассматриваются липосомы и везикулы, которые формируются по специальной методике в системах в присутствии липидов.
Задачей изобретения является создание новых эффективных средств доставки ДНК в эукариотические клетки, используемых в чистом виде (без вспомогательных агентов) и расширяющих арсенал известных средств указанного назначения.
Поставленная задача решается применением геминальных поверхностно-активных веществ (ГПАВ) формулы (I) с гидроксиэтилированной алкиламмонийной головной группой в качестве средств доставки ДНК в клетки.
Для сравнительного описания свойств ГПАВ, являющихся предметом изобретения, получены репрезентативные данные как для заявляемых соединений (3-5), различающихся между собой длиной спейсерного фрагмента (значением m), так и для незамещенных аналогов (1) и (2), где отсутствует гидроксиэтилированный фрагмент в головной группе.
m=4 (соединение 3)
m=6 (соединение 4)
m=12 (соединение 5)
Синтез геминальных алкиламмонийных ПАВ
Алканедил-α, ω-бис(метилдиалкиламмоний бромиды) получают кипячением в ацетоне смеси 2.2 моля метилдиалкиламина, в том числе содержащего гидроксиэтильную группу у атома азота, и 1.0 моля соответствующего α,ω-дибромалкана в течение 40-60-часов. Выпавший после окончания реакции солевой осадок отфильтровывают, промывают ацетоном, перекристаллизуют из смеси растворителей ацетон/метанол и высушивают в вакууме. Строение полученных соединений было подтверждено данными элементного анализа, ИК- и ЯМР-спектроскопии.
Пример 1. Гексанедил-1.6-бис(диметилгексадециламмоний бромид) (1)
получен кипячением 1.0 моли N,N,N',N'-тетраметилгексаметилендиамина в среде ацетонитрила с 2.2 молями гексадецилбромида в течение 40 часов. Выпавший после окончания реакции солевой осадок был отфильтрован, перекристаллизован из смеси растворителей - ацетон/этанол и высушен в вакууме.
1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
3
2
2
13
2
3
2
2
13
2
3
2
2
13
2
3
2
2
4
2
3
2
2
2
13
2
3
2
2
CH
CH
CH
CH
CH
CH
CH
CH
Н ЯМР (CDCl, δ, м.д.; J, Гц): 0.89 [т, 6Н, 2х N CH(CH)CH, J=7.0] 1.26-1.36 [уш.м, 52Н, 2х N CH()CHCH] 1.60 [с, 4Н, 2х N CH(CH)CH] 1.72-2.03 (м, 8Н, NCH()CHN) 3.39 [с, 12Н, 2х N()] 3.45-3.56 [м, 4Н, 2х N(CH)CHCHN sp.] 3.73-3.77 (м, 4Н, 2х Nsp.)
-
ИК-спектр (KBr), ν/см1: 2950, 2919, 2851, 1467, 1402, 1363, 1351, 1122, 1060, 974, 949, 900, 722.
42
90
2
2
Выход (84%). Формула: CHNBr. Вычислено (%): С 64.43, Н 11.58, N 3.58. Найдено (%): С 33, H 11.88, N 3.53.
Пример 2. Гексанедил-1.6-бис(диметилдециламмонимй бромид) (2)
получен кипячением 1.0 моли N,N,N',N'-тетраметилгексаметилендиамина в среде ацетонитрила с 2.2 молями децилбромида в течение 40 часов. Выпавший после окончания реакции солевой осадок был отфильтрован, перекристаллизован из смеси растворителей - ацетон/этанол и высушен в вакууме.
1
+
+
+
+
+
+
+
+
3
2
2
7
2
3
2
2
7
2
3
2
2
7
2
3
2
2
4
2
3
2
2
2
7
2
3
2
CH
СН
CH
CH
CH
СН
CH
Н ЯМР (CDCl, δ, м.д.; J, Гц): 0.89 [т, 6Н, 2х NCH(CH)CH, J=7.0] 1.26-1.36 [уш.м, 28Н, 2х NСН()СНСН] 1.59 [с., 4Н, 2х NСН(CH)CH] 1.72-2.01 (м, 8Н, NCH()CHN) 3.38 [с, 12Н, 2х N()] 3.46-3.56 [м, 4Н, 2х N(СН)СНСН] 3.72-3.76 (м., 4Н, 2х Nsp.)
-
ИК-спектр (KBr), ν/см1: 2953, 2922, 2853, 1485, 1467, 1401, 1377, 1128, 1062, 948, 898, 806, 724.
30
66
2
2
Выход (95%). Формула: CHNBr. Вычислено (%): С 58.62, Н 10.82, N 4.56. Найдено (%): С 58.31, Н 10.58, N 4.36.
Пример 3. Бутанедил-1.4-бис(гидроксиэтилметилгексадециламмоний бромид) (3)
получен кипячением 2.2 молей гидроксиэтилметилгексадециламина в среде ацетонитрила с 1.0 молем соответствующего α,β-дибромбутана в течение 50-60-часов. Выпавший после окончания реакции солевой осадок был отфильтрован, промыт ацетоном, перекристаллизован из смеси растворителей - ацетон/метанол и высушен в вакууме.
1
+
+
+
+
+
+
+
3
2
2
13
2
3
2
2
13
2
3
2
2
13
2
3
2
2
2
2
3
2
3
2
2
2
2
CH
СН
CH
CH
CH
CH
CH
H
Н ЯМР (CDCl, δ, м.д.; J, Гц): 0.89 [т. 6Н, 2х N СН(CH)CH, J=6.75] 1.27-1.36 [уш.м., 52Н, 2х N СН()СНСН] 1.75 (с., 4Н, 2х N CH(CH)CH] 2.12 (с., 4Н, NCH()CHN) 3.27 (с, 6Н, 2х N) 3.43-3.88 (м., 12Н, 2х N) 4.12 (с., 4Н, 2х CHOH) 5.0 (с., 2Н, 2х CHCHO).
-1
ИК-спектр (KBr), ν/см: 3264, 2959, 2920, 2851, 1469, 1404, 1378, 1101, 1085, 1055, 721.
42
90
2
2
2
Выход (83%). Формула: CHONBr. Вычислено (%): С 61.89, Н 11.13, N 3.43. Найдено (%): С 61.72, Н 11.62, N 3.27.
Пример 4. Гексанедил-1.6-бис(гидроксиэтилметилгексадециламмоний бромид) (4)
получен кипячением 2.2 молей гидроксиэтилметилгексадециламина в среде ацетонитрила с 1.0 молем соответствующего α,β-дибромгексана в течение 50-60-часов. Выпавший после окончания реакции солевой осадок был отфильтрован, промыт ацетоном, перекристаллизован из смеси растворителей - ацетон/метанол и высушен в вакууме.
1
+
+
+
+
+
+
+
3
2
2
13
2
3
2
2
13
2
3
2
2
13
2
3
2
2
4
2
3
2
3
2
2
2
2
CH
СН
СН
CH
CH
CH
CH
H
Н ЯМР (CDCl, δ, м.д.; J, Гц): 0.89 [т, 6Н, 2х N CH(CH)CH, J=6.97] 1.27-1.367 [уш.м., 52Н, 2х N СН()СНСН] 1.57 (с, 4Н, 2х N СН(СН)СН] 1.73-1.98 (м, 8Н, NCH()CHN) 3.31 (с, 6Н, 2х N,) 3.50-3.73 (м, 12Н, 2х N) 4.11 (с, 4Н, 2х CHOH) 5.06 (с, 2Н, 2х CHCHO).
-1
ИК-спектр (KBr), ν/см: 3227, 2918, 2850, 1468, 1377, 1095, 1058, 721.
44
94
2
2
2
Выход (87%). Формула: CHONBr. Вычислено (%): С 62.70, Н 11.16, N 3.33. Найдено (%): С 62.85, Н 11.73, N 3.35.
Пример 5. Додеканедил-1.12-бис(гидроксиэтилметилгексадециламмоний бромид) (5)
получен кипячением 2.2 молей гидроксиэтилметилгексадециламина в среде ацетонитрила с 1.0 молем соответствующего α,β-дибромдодекана в течение 50-60-часов. Выпавший после окончания реакции солевой осадок был отфильтрован, промыт ацетоном, перекристаллизован из смеси растворителей - ацетон/метанол и высушен в вакууме.
1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
3
2
2
13
2
3
2
2
13
2
3
2
8
2
2
13
2
3
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
CH
CH
CH
CH
CH
CH
CH
CH
CH
H
Н ЯМР (CDCl, δ, м.д.; J, Гц): 0.85 [т, 6Н, 2х NCH(CH)CH, J=7.13] 1.23-1.34 {уш.м., 68Н, [52Н, 2х NCH()CHCH+16H, ()sp.]} 1.71 {с, 8Н [4Н, 2х NCH(CH)CH+4Н, 2х NCHsp.]} 3.27 (с, 6Н, 2x N) 3.45-3.51 [м, 8H, 2x N()] 3.65 (с, 4Н, 2х NCHOH) 4.07 (с, 4Н, 2х NCHOH) 5.06 (с, 2Н, 2х NCHCHO).
-1
ИК-спектр (KBr), ν/см: 3261, 2919, 2850, 1469, 1379, 1085, 1053, 720.
50
106
2
2
2
Выход (92%). Формула: CHONBr. Вычислено (%): С 64.75, Н 11.52, N 3.02. Найдено (%): С 64.42, Н 11.17, N 3.05.
Биологическая активность (цитотоксичность, доставка ДНК в клетки)
Пример 6. Определение цитотоксичности соединений к клеткам линии 293Т
-3
-2
50
Цитотоксичность определяли с помощью 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола (МТТ реагента). Культуру клеток человека линии НЕК293Т рассаживают по 40 тыс клеток на лунку 96-луночного планшета за день до определения цитотоксичности из расчета получить на следующий день 50-70% монослоя. За час до добавления МТТ-реагента клеткам дают свежую среду DMEM без сыворотки и антибиотика. Делают серию последовательных разведений потенциальных трансфектантов в фосфатно-солевом буфере (ФСБ×1) рН 7.0 с конечной концентрацией 10, 10, 0,1 и 1 мг/мл, добавляют к раствору плазмидной ДНК и аккуратно пипетируют один раз. По истечении 15 минут инкубирования липокомплексы с 0.6 мкг плазмидной ДНК в суммарном объеме 20 мкл добавляют к клеткам без значительного перемешивания. Параллельно к клеткам добавляют индивидуальные вещества без ДНК в соответствующем количестве. По истечении 48 часов инкубации с соединениями к пробам добавляют по 20 мкл р-ра МТТ (5 мг/мл). После 3 часов инкубации с МТТ удаляют среду из лунок, стараясь не затрагивать кристаллы, растворяют кристаллы формазана в 200 мкл ДМСО. Далее определяют оптическую плотность на приборе Тесал Sunrise Basic при длине волны 492 нм с вычитанием фона. По полученным данным определяется CD (концентрация соединения, при которой гибнет 50% популяции клеток). На диаграмме Фиг.1 представлены результаты определения цитотоксичности потенциальных трансфектантов методом МТТ-теста.
Штриховкой отмечены данные, соответствующие пробам ДНК+ исследуемые соединения, ромбами - пробы только с исследуемыми соединениями.
Как видно из диаграммы, заявляемые соединения (3-5) в комплексах с ДНК проявляют цитотоксичность, сравнимую с незамещенными аналогами (1) и (2). Все исследуемые соединения с ДНК оказывают менее токсичное воздействие на клетки, чем без ДНК. Полученные концентрации, при которых наблюдается 50% гибель клеток, оказываются ниже, чем требуется для эффективной доставки ДНК.
Пример 7. Проведение трансфекции с помощью соединения (5)
-3
-2
Монослойную культуру клеток человека линии НЕК293Т рассаживают по 40 тыс клеток на лунку за день до трансфекции из расчета получить на следующий день конфлуэнтность 50-70%. Для трансфекции НЕК293Т используют концентрацию 50-100 тыс клеток на лунку 96-луночного планшета. За час перед трансфекцией клеткам дают свежую среду DMEM без сыворотки и антибиотика. Трансфекции проводят также в 96-луночном планшете, эксперименты проводят в тройном повторе. Сначала делают серию последовательных разведений потенциальных трансфектантов в ФСБ (×1) рН 7.0 с конечной концентрацией 10, 10, 0,1 и 1 мг/мл, добавляют к раствору ДНК и аккуратно пипетируют один раз. По истечении 15 минут инкубирования липокомплексы с 0,6 мкг плазмидной ДНК peGFP-N1 (Clontech) в суммарном объеме 20 мкл добавляют к клеткам без значительного перемешивания. На следующие сутки флуоресценцию популяции клеток в планшете наблюдают на флуоресцентном микроскопе с обращенной оптикой. Через 48 часов после трансфекции проводят анализ методом проточной цитометрии, как описано далее. Получив результаты о предварительной функциональности новых соединений как трансфектантов, проводят оптимизацию соотношения количества трансфектанта к количеству плазмидной ДНК вблизи значений, при которых наблюдается максимальная трансфекционная эффективность. Используемый шаг в выбранном диапазоне составляет последовательное двукратное увеличение концентрации. Также оптимизируют продолжительность инкубации клеток с трансфекционной смесью и возможность комбинирования трансфекции. Оптимальное время инкубации с трансфектантом составляет 4 часа, по истечении которых среду в клетках меняют на полную среду DMEM с сывороткой и антибиотиком.
Определение эффективности трансфекции клеток методом проточной цитометрии
В исследовании степени трансфекции клеток используют метод проточной цитометрии. Каждую лунку планшета с клетками после инкубации с экспериментальными препаратами в течение 48 часов отмывают 200 мкл ФСБ (×1), обрабатывают трипсином, определяют цитотоксичность и фиксируют в 0,5% формалине. В полученной таким образом клеточной суспензии определяют методом проточной цитометрии процент клеток, экспрессирующих eGFP. Эта величина является мерой эффективности трансфекции. Клетки, инкубируемые без экспериментальных препаратов при тех же условиях, используют в качестве отрицательного контроля. Для сравнения проводится измерение процента eGFP положительных клеток, трансфицированных с помощью коммерческого препарата Metafectene easy по протоколу, предлагаемому производителем (Biontex, EU). Далее из полученных данных рассчитывают процент флуоресцентных клеток с использованием программы FACS Diva («Becton Dickinson», США), средние значения и стандартные отклонения для популяций. Результаты представляют как среднее значение и ошибку среднего для анализируемого соединения.
50
Микрофотография культуры трансфицированных клеток в флуоресцентном свете и данные эффективности трансфекции представлены на фигуре 2. Для соединения (5) наибольший процент трансфицированных клеток составляет 52±10% при концентрации 0.01 мг/мл (11 мкмоль/л). Эта рабочая концентрация ниже уровня CD (концентрации, при которой гибнет 50% популяции клеток), что говорит о малой токсичности соединения.
Пример 8. Проведение трансфекции с помощью соединения ЦТАБ
По указанному в примере 7 протоколу проводят тестирование трансфекционной эффективности соединения ЦТАБ. Получены результаты количества трансфицированных клеток на уровне контроля.
Пример 9. Проведение трансфекции с помощью соединения (1)
По указанному в примере 7 протоколу проводят тестирование трансфекционной эффективности соединения (1). Полученные результаты представлены на фигуре 3.
Для соединения (1) наибольший процент трансфицированных клеток составляет 6.2±1.2% при концентрации 0.01 мг/мл (130 мкмоль/л).
Пример 10. Проведение трансфекции с помощью соединения (2)
По указанному в примере 7 протоколу проводят тестирование трансфекционной эффективности соединения (2). Полученные результаты представлены на фигуре 4.
Для соединения (2) наибольший процент трансфицированных клеток составляет 1.6±0.6% при концентрации 0.1 мг/мл (160 мкмоль/л).
Сравнение результатов по исследованию трансфекции при помощи соединений (2) и (1) показывает, что увеличение гидрофобности (длины алкильного радикала) существенно улучшает эффективность трансфекции (процент трансфицированных клеток). Аналогичная корреляция прослеживается и для гидроксиэтилированных ГПАВ. Поэтому в качестве заявляемых соединений предлагаются наиболее активные гексадецильные производные (3-5)
Пример 11. Проведение трансфекции с помощью соединения ЦГАБ
По указанному в примере 7 протоколу проводят тестирование трансфекционной эффективности соединения ЦГАБ. Получены результаты количества трансфицированных клеток на уровне негативного контроля.
Пример 12. Проведение трансфекции с помощью соединения (3)
По указанному в примере 7 протоколу проводят тестирование трансфекционной эффективности соединения (3). Полученные результаты представлены на фигуре 5.
50
Наибольший процент трансфицированных клеток составляет 32±5% при концентрации 0.01 мг/мл (25 мкмоль/л). Таким образом, эта рабочая концентрация ниже уровня CD (концентрации, при которой гибнет 50% популяции клеток), что говорит о малой токсичности соединения.
Пример 13. Проведение трансфекции с помощью соединения (4)
По указанному в примере 7 протоколу проводят тестирование трансфекционной эффективности соединения (4). Полученные результаты представлены на фигуре 6.
Наибольший процент трансфицированных клеток составляет 6.2±0.2% при концентрации 0.1 мг/мл (120 мкмоль/л).
Данные эффективности трансфекции по результатам проточной цитометрии клеток НЕК293Т через 48 часов после трансфекции объединены в таблице 1.
Таблица 1
Соединение
Конц., мг/мл
% GFP(+)
Среднее значение
Станд. Откл.
Конц., мкмоль/л
1
0.001
1
1.2
1.4
1.2
0.2
1
1
0.01
3.6
4.8
4.1
4.2
0.6
13
1
0.1
7.2
6.6
4.9
6.2
1.2
128
1
1
2.9
4.6
2.7
3.4
1.0
640
2
0.001
0.2
1
0.6
0.6
0.4
2
2
0.005
0.6
0.9
0.5
0.7
0.2
7
2
0.01
0.6
1.5
2
1.4
0.7
13
2
0.1
1.2
2.3
1.2
1.6
0.6
163
3
0.001
28
30
37
31.7
4.7
3
3
0.01
18
10
12
13.3
4.2
25
3
0.1
5
6.2
3.7
5.0
1.3
250
3
1
8.2
5.1
10.1
7.8
2.5
2500
4
0.2
4.8
6
5.8
5.5
0.6
238
4
0.1
6.1
6.1
6.4
6.2
0.2
119
4
0.05
4.4
6.2
6.3
5.6
1.1
59
5
0.002
0.6
1
0.6
0.8
0.3
2.3
5
0.004
44
37
50
43.7
6.5
5.5
5
0.01
52
41
61
51.3
10.0
11
5
0.02
6.9
8
5
6.6
1.5
22
ЦТАБ
0.001-0.1
0
ЦГАБ
0.001-0.1
0
Данные табл.1 показывают, что
1. Гидроксиэтильные геминальные ПАВ проявляют более высокую трансфекционную эффективность при более низких концентрациях, чем соединения сравнения (монокатионные ПАВ ЦТАБ и ЦГАБ и незамещенные геминальные аналоги (1) и (2).
2. Среди заявляемых соединений наиболее высокий процент трансфицированных клеток получен для соединений (3) (m=4) и (5) (m=12).
3. Даже незначительное изменение структуры заявляемых ПАВ (изменение количества метиленовых звеньев в спейсере) приводит к значительному, в 5-9 раз, изменению эффективности трансфекции.
Таким образом, заявляемые гидроксиэтильные производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного вещества обладают способностью эффективно доставлять ДНК в клетки без вспомогательных агентов и низкой токсичностью.