НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНОМЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ВИДОСПЕЦИФИЧНОЙ ЭКСПРЕСС-ИДЕНТИФИКАЦИИ РНК ВИРУСА ХУНИН МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
SET OF OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND FLUORESCENTLY LABELLED PROBE FOR SPECIES-SPECIFIC EXPRESS-IDENTIFICATION OF RNA OF JUNIN VIRUS BY METHOD OF POLYMERASE CHAIN REACTION IN REAL TIME

Изобретение относится к наборам олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации РНК вируса Хунин методом полимеразной цепной реакции в реальном времени и может быть использовано в медицинской практике для выявления генетического материала вируса Хунин в клинических или секционных образцах для уточнения диагноза, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению свойств вируса Хунин, созданию диагностических, профилактических или лечебных препаратов против вируса Хунин. Использование специфичных праймеров и зондов позволяет выявлять генетический материал вируса Хунин в исследуемых образцах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
Вирус Хунин является представителем рода Arenavirus семейства Arenaviridae (http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=2011). Вирусный геном сегментирован (L- и S-сегменты) и представлен одноцепочечной РНК.
Вирус Хунин является возбудителем Аргентинской геморрагической лихорадки - острого инфекционного заболевания, характеризующегося природной очаговостью; аспирационным (воздушно-пылевой путь), фекально-оральным и контактным механизмами передачи возбудителя; тяжелым течением с общеинтоксикационным синдромом, экзантемой, геморрагическим синдромом.
2
Эндемичными районами для инфекции, общая площадь которых составляет около 150000 км, являются провинции Аргентины. Ежегодно регистрируются вспышки заболевания с числом заболевших от 100 до 3500 человек. Однако, по приблизительным подсчетам, потенциальный риск на эндемичной территории данная инфекция представляет для 5 млн. человек. Переносчиком вируса Хунин и источником заражения для человека являются грызуны Calomis laucha и Calomis musculinus, которые выделяют вирус со слюной и мочой. Люди инфицируются в результате контактов с инфицированными животными, их экскрементами и мочой, содержащими вирус. Заболевание регистрируется чаще у жителей сельских районов [Маркин В.А., Пантиухов В.Б., Марков В.И., Бондарев В.П. Аргентинская геморрагическая лихорадка //ЖМЭИ. - 2012. - 2. - Стр. 78-87].
Летальность при заболевании аргентинской геморрагической лихорадкой колеблется от 15 до 30 %.
Актуальность своевременной диагностики лихорадки Хунин в странах, не являющихся эндемичными территориями, связана с возможностью завоза этой инфекции из Южной Америки.
Известна тест-система для диагностики Аргентинской геморрагической лихорадки на основе метода ИФА с возможностью определения наличия специфических иммуноглобулинов к вирусу Хунин [ S.,  H.,  T. et al. Serological Assays Based on Recombinant Viral Proteins for the Diagnosis of Arenavirus Hemorrhagic Fevers // Viruses. - 2012. - 4(10). - P.2097-114].
Однако иммуноглобулины класса М появляются на 10-20 сут после заражения, что приводит к поздней диагностике заболевания.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является ПЦР тест-система для выявления РНК вируса Хунин методом обратной транскрипции в режиме реального времени. [Vieth S., Drosten Ch., Charrel R. et al. Establishment of conventional and fluorescence resonance energy transfer-based real-time PCR assays for detection of pathogenic New World arenaviruses // J. Clin. Virol. - 2005. - 32. - P.229-35].   Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является методом ранней диагностики данной инфекции и позволяет обнаруживать РНК вируса Хунин в первые дни появления клинических признаков [Lozano M.E., Enría D., Maiztegui J.I. et al. Rapid diagnosis of Argentine hemorrhagic fever by reverse transcriptase PCR-based assay. // J Clin Microbiol. - 1995. - 33(5). - P.1327-1332].
50
Однако чувствительность вышеуказанной тест-системы составляла около 50 ТЦД/реакцию, а аналитическая чувствительность - около 1000 геномных эквивалентов/реакцию.
Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка более чувствительного набора специфичных олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления генетического материала вируса Хунин в клинических образцах и биологических жидкостях, образцах внешней среды и других вируссодержащих пробах (культуральная вируссодержащая жидкость и др.) методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
Указанный технический результат достигается тем, что   набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации РНК вируса Хунин методом полимеразной цепной реакции в реальном времени включает последовательности олигонуклеотидов,  видоспецифичные для вируса Хунин и имеющие следующую структуру:
внешний:
5΄→3΄  5΄ TCTTCTTCCCCCYTTTTAGTCTTTCT 3΄
внутренний:
5΄→3΄  5΄ CGCACAGTGGATCCTAGGCA 3΄
зонд:
FAM - TGAGTCCATCTAAAGCTTGGNACCTCCTT - BHQ1
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг. 1 и 2 представлены кривые флуоресценции на канале R6G/Yellow (530 nm/555 nm) амплификатора Rotor Gene 6000.
В приложении приведены олигонуклеотидные последовательности, видоспецифичные РНК вируса Хунин.
Методика получения набора праймеров и зонда. Диагностические праймеры и флуоресцентно-меченый зонд конструировались для участка S-сегмента генома вируса Хунин и оптимизации концентраций компонентов реакционной смеси и условий проведения ПЦР.   Для контроля амплификации были получены рекомбинантные плазмиды, несущие вирусспецифический участок ДНК-матрицы.
На начальном этапе был проведен анализ нуклеотидных последовательностей геномов вируса Хунин, имеющихся в базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), и определены консервативные участки. В качестве мишени для диагностических праймеров и зонда был выбран находящийся в S-сегменте вирусного генома участок гена N, кодирующего нуклеокапсидный белок.
Анализ свойств олигонуклеотидных праймеров и зондов проводился с использованием программы Vector NTI 9.0.0 (InforMax).
Для идентификации генетического материала вируса Хунин методом ПЦР в реальном времени были подобраны праймеры и зонд, представленные ниже:
F/JUNV
TCTTCTTCCCCCYTTTTAGTCTTTCT
R/JUNV
CGCACAGTGGATCCTAGGCA
Z/JUNV
(FAM)-TGAGTCCATCTAAAGCTTGGNACCTCCTT-(BHQ1)
Пример 1. Проверка аналитической чувствительности набора праймеров и зондов.
Для контроля амплификации были получены положительные контрольные образцы (ПКО), представляющие собой рекомбинантные плазмиды, несущие вирусспецифические вставки, являющиеся матрицей для амплификации вирусспецифических ДНК-фрагментов.
Для проведения ПЦР в режиме реального времени, в качестве анализируемых образцов использовали рекомбинантную плазмидную ДНК, включающую вставку ДНК, соответствующую детектируемому участку генома вируса Хунин.
Условия проведения амплификации оптимизировались по следующим параметрам: концентрация ионов магния в реакционной смеси; концентрация праймеров и зонда в реакционной смеси; температура отжига праймеров.
Для определения аналитической чувствительности из концентрированного раствора плазмидной ДНК были приготовлены последовательные 10-кратные разведения. Определение концентрации ДНК   осуществляли при помощи флуориметра QUBIT (Invitrogen, США) и наборов реагентов того же производителя. ПЦР в режиме реального времени для детекции генетического материала вируса Хунин проводили в приборе Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия), детекцию результатов амплификации (рисунок 1) осуществляли по каналу FAM/Green (470 nm/510 nm).
9
8
7
6
5
4
3
2
На фиг. 1 приведены кривые флуоресценции на канале FAM/Green (470 nm/510 nm) амплификатора Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия). Обозначение образцов, содержащих разные концентрации ДНК-матрицы, и положительного контрольного образца (ПКО): 1 - 10 ГЭ; 2 - 10 ГЭ; 3 - 10 ГЭ; 4 - 10 ГЭ; 5 - ПКО; 6 - 10 ГЭ; 7 - 10 ГЭ; 8 - 10 ГЭ; 9 - 10 ГЭ в образце.
2
Минимальное количество ДНК-матриц, детектируемое в ПЦР после оптимизации условий проведения реакции, выраженное в ГЭ (геномных эквивалентах), составило 10 ГЭ в образце.
Пример 2. Определение РНК вируса Хунин в вируссодержащих образцах.
Инактивацию образцов и выделение РНК проводили в условиях, регламентированных Методическими указаниями МУ 1.3. 2569 -09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности».
4
5
50
50
Для оценки специфичности использовали несколько образцов культуральной вируссодержащей жидкости, полученные с использованием различных культур клеток - Vero, Vero E6 и гомогенатов мозга сосунков мыши с титром вируса Хунин  от 2.6х10ТЦД/мл до 8.9х10ТЦД/мл.
Процедуру выделения РНК из исследуемого материала проводили с использованием набора реагентов «Рибо-сорб» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией по применению.
Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора реагентов «Реверта-L» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией по применению.
ПЦР в режиме реального времени проводили в реакционной смеси следующего состава (на 1 исследование):
кДНК
5 мкл
10×Taq буфер без Mg<sup>2+</sup>
3 мкл
100 mM раствор MgCl<sub>2</sub>
1 мкл
5 mM раствор dNTP
1 мкл
Смесь праймеров и зондов (по 2 о.е. каждого)
по 1 мкл каждого
Smart Taq DNA-Полимераза 5 ед/ мкл
0,3 мкл
Вода для ПЦР
До 30 мкл общего объема
ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в приборе Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) по следующей программе, представленной в таблице 1.
Таблица 1. Программа проведения ПЦР
Температура (<sup>°</sup>С)
Время (минуты:секунды)
Количество циклов
95
05:00
1
95
00:10
45
54
00:20
72
00:20
°
Измерение флуоресценции осуществляли при температуре 54 С на канале FAM/Green.
Результаты интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат считали положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную «сигмовидную» форму и пересекала пороговую линию. При этом значение Ct для данного образца было не больше 40 (рисунок 1).
На фиг. 2 приведены кривые флуоресценции образцов, содержащих кДНК вируса Хунин, на канале FAM/Green (470 nm/510 nm) амплификатора Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия).
Во всех используемых для анализа образцах в оптимизированных условиях проведения реакции ПЦР используемые праймеры и зонды позволяли выявлять РНК вируса Хунин.
Таким образом, минимальное количество РНК вируса, детектируемое в ПЦР после оптимизации условий проведения реакции, выраженное в ГЭ (геномных эквивалентах), составило 100 ГЭ в образце, вследствие чего чувствительность заявляемых праймеров значительно выше прототипа.
Приложение
<110>  Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный
научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"» (ФБУН
ГНЦ ВБ "Вектор")
<120>  Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации РНК вируса Хунин методом полимеразной цепной реакции в реальном времени
<210>  1
<223>  Последовательности олигонуклеотидов видоспецифические к вирусу Хунин,
<400>  1   для выявления РНК вируса Хунин:
внешний:
5΄→3΄  5΄ TCTTCTTCCCCCYTTTTAGTCTTTCT 3΄
внутренний:
5΄→3΄  5΄ CGCACAGTGGATCCTAGGCA 3΄
зонд:
FAM - TGAGTCCATCTAAAGCTTGGNACCTCCTT - BHQ1