СПОСОБ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПОЛНОЦЕННОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ
METHOD OF ASSESSMENT OF GENETIC FULL-VALUE OF SPERM

Способ оценки генетической полноценности сперматозоидов
Изобретение относится к области ветеринарии и животноводства и может быть использовано при искусственном осеменении для выявления генетически неполноценных сперматозоидов, их выбраковке и недопустимости использования для искусственного осеменения.
Известны различные способы оценки активности и прогнозирования оплодотворяющей способности спермы. В практике искусственного осеменения наибольшее применение получила оценка качества спермы по органолептическим признакам, концентрации, подвижности и переживаемости сперматозоидов [ABS Global, Inc. Руководство по искусственному осеменению. Пятое издание, 2002]. Также известны способы оценки качества спермы путем определения процента сперматозоидов с аномальной морфологией, осмотической резистентности, устойчивости (толерантности) к холодовому и другим видам стресса, содержания высокоэнергетических молекул, активности различных дегидрогеназ и гидролаз (гиалуронидазы, акрозина и другие) [Руководство ВОЗ для лабораторного исследования и обработки человеческой спермы, 2010]. Для выявления фертильности и аномальных сперматозоидов предложено определение статуса метилирования ДНК. Данный подход направлен на выявление эпигенетических нарушений в сперматозоидах, зависимых от многих факторов (в том числе, возраста), и требует применения сложной дорогостоящей аппаратуры и не может быть воспроизведен в зоотехнических и ветеринарных лабораториях [US Patent No. WO 2009059327, G01N 33/48, 30 December, 2009].
Одним из важнейших подходов к анализу генетической полноценности сперматозоидов является определение фрагментации (целостности) окрашенного хроматина/ДНК сперматозоидов путем измерения размера гало [Ferna′ndez J.L., Muriel L., Rivero M.T., Goyanes V., Va′zquez R. et al. // The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation // J. Androl., 2003; 24: 59-66].
Известен способ определения суммарной антиокислительной активности спермоплазмы для оценки оплодотворяющей способности сперматозоидов путем регистрации железо-индуцируемой хемилюминисценции модельной системы до и после добавления спермоплазмы [RU 2278382, МПК G01N 33/487, опубл. 20.06.2006 г.].
Недостатком известных способов является отсутствие комплексного подхода, позволяющего учесть широкий спектр нарушений в генетическом аппарате сперматозоидов, неоднозначность оценки генетического аппарата и целесообразности применения для искусственного осеменения.
Необходимость применения комплексного подхода к оценке генетической полноценности сперматозоидов обусловлена многообразием факторов, влияющих на структурно-функциональное состояние хроматина и, как следствие, на оплодотворяющую способность сперматозоидов, жизнеспособность и полноценность потомства. К их числу в первую очередь следует отнести: окислительные модификации ДНК, образование сшивок, одноцепочечные и двухцепочечные разрывы (фрагментация хроматина), обусловленные высоким уровнем свободнорадикальных процессов, включая перекисное окисление липидов и образование активных форм кислорода; стимуляцию и запуск процессов апоптоза в сперматозоидах.
При этом современные методы оценки патологических нарушений в сперматозоидах основаны на выявлении уже имеющихся клеточных и молекулярных дефектов, не позволяя выявлять «скрытые» нарушения, связанные с недостаточностью антиоксидантной и репарационной систем, что ограничивает возможности диагностики на генетическом уровне.
Технический результат заключается в повышении диагностики патологических нарушений в сперматозоидах на хроматиновом уровне посредством оценки генетической полноценности сперматозоидов и целесообразности дальнейшего их использования для оплодотворения.
Сущность изобретения заключается в том, что в пробы эякулята in vitro в среде для разбавления добавляют перекись водорода в концентрации 0,5-1,0 мМоль с последующим выявлением в сперматозоидах первичных морфологических признаков апоптоза, одноцепочечных разрывов и фрагментации ДНК, интенсивности процессов перекисного окисления липидов. При выявлении низкого процента апоптотически гибнущих сперматозоидов до 10-15%, достаточно яркого и выраженного свечения Гало, возрастания содержания ТБК-реактивных продуктов не более чем на 30-40% по отношению к контролю, оценивают сперматозоиды как генетически полноценные.
Для оценки генетической полноценности сперматозоидов использован прием воздействия на сперматозоиды генотоксикантом, в качестве которого применяется перекись водорода, приводящая к окислительной модификации биомолекул (включая белки, липиды и ДНК). В высоких концентрациях и при продолжительном воздействии перекись водорода приводит к развитию окислительного стресса, сопровождающегося повреждением ДНК (образование сшивок, разрыв цепей), которые проявляются при наличии нарушений в репарационной системе клетки и недостаточности антиоксидантной системы.
Реакция сперматозоидов на действие перекиси водорода оценивается с помощью комплекса методик и сравнивается с аналогичными показателями сперматозоидов контрольной группы.
Первоначальный отбор генетически полноценных сперматозоидов может осуществляться путем обследования нативных, не подвергающихся влиянию перекиси водорода сперматозоидов контрольной группы. Изначально высокий процент гибнущих клеток и высокий апоптотический индекс (ниже 80%), фрагментация хроматина, высокое содержание ТБК-реактивных продуктов в сперматозоидах контрольной группы уже указывают на то, что в их геномах могут быть генетические нарушения, обусловленные недостаточной активностью антиоксидантной и репарационной систем дефектных сперматозоидов, то есть их можно отнести к генетически неполноценным.
При воздействии на сперматозоиды перекисью водорода величины показателей, определяемых с помощью комплекса методик и характеризующих проапоптическую активность, фрагментацию хроматина, интенсивность процессов перекисного окисления липидов может возрастать в пределах не более 10-20% от исходных величин. В этом случае сперматозоиды характеризуются как генетически полноценные, обладающие нормальной функциональной активностью.
Другой вариант реакции сперматозоидов на действие перекиси водорода заключается в том, что ответ клеток на воздействие генотоксиканта связан с резким повышением процента гибнущих клеток, усилением процессов фрагментации хроматина и активизацией перекисного окисления липидов, свидетельствующих о наличии генетических дефектов, обуславливающих генетическую неполноценность сперматозоидов.
Если концентрация перекиси водорода будет меньше 0,5 мМоль, то прооксидантное действие будет недостаточным для выявления генетической неполноценности сперматозоидов. Если концентрация перекиси водорода будет выше 1 мМоль, то вследствие повышения прооксидантной активности отмечается повышенная гибель сперматозоидов.
Способ осуществляется следующим образом. Для определения качества спермы исследования проводят при температуре 38-40°C. Полученный препарат спермы разбавляют в среде для разбавления и делят на две равные части. Одну пробу оставляют в нативном состоянии (контроль), а ко второй добавляют перекись водорода в концентрации 0,5-1,0 мМоль с последующим выявлением и определением в сперматозоидах, полученных образцов, с помощью комплекса методик структурно-функциональных изменений ядра и хроматина, одноцепочечных разрывов ДНК, уровня процессов перекисного окисления липидов. При оценке генетической полноценности сперматозоидов используются методики морфологической оценки структурного состояния ядра и хроматина с помощью флуоресцентного ядерного красителя Hoechst 33258, определяется фрагментация ДНК методом Гало, анализируется интенсивность перекисного окисления липидов с помощью ТБК-теста [Mikhailenko V.M., Philchenkov A.A. Analysis of 1Н NMR-detectable mobile lipid domains for assessment of apoptosis induced by inhibitors of DNA synthesis and replication // Cell Biology International, 2005, 29, 33-39; Fernandez J. L. The Sperm Chromatin Dispersion Test: A Simple Method for the Determination of Sperm DNA Fragmentation // Journal of Andrology. Volume 24, Issue 1, January-February, 2003, pages 59-66; Janero D.R. Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury // Free Radical Biology and Medicine. Volume 9, Issue 6, 1990, Pages 515-540].
Генетически полноценные сперматозоиды не имеют патологических аномалий и дефектов, характеризуются отсутствием или слабой степенью агглютинации, слабой склонностью к апоптозу (не более 10-15%), отсутствием разрывов в ДНК, ярким и выраженным свечением Гало, низким уровнем содержания ТБК-реактивных продуктов (0,24±0,05 мкМоль/л).
При действии перекиси водорода генетически полноценные сперматозоиды характеризуются высокой жизнеспособностью (количество гибнущих сперматозоидов возрастает в среднем на 20%), имеют достаточно яркое и выраженное свечение Гало, при этом содержание ТБК-реактивных продуктов возрастает не более чем на 30-40% по отношению к контролю.
Генетически неполноценные сперматозоиды могут иметь патологические аномалии и дефекты, склонны к индуцированному или спонтанному апоптозу, имеют высокую частоту встречаемости одноцепочечных разрывов в ДНК и менее яркое и выраженное свечение Гало, а также высокий уровень ТБК-реактивных продуктов, чем генетически полноценные сперматозоиды.
При действии перекиси водорода у генетически неполноценных сперматозоидов возрастает склонность к индуцированному апоптозу (процент гибнущих сперматозоидов возрастает на 50% и более), подавляется свечение Гало, отмечается резкое повышение содержания ТБК-реактивных продуктов на 50-80% и выше по отношению к контролю.
По сравнению с известными решениями предлагаемое позволяет повысить диагностику патологических нарушений в сперматозоидах на хроматиновом уровне посредством оценки генетической полноценности сперматозоидов и целесообразности дальнейшего их использования для оплодотворения.