СРЕДСТВО ДЛЯ РАЗРУШЕНИЯ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБ РАЗРУШЕНИЯ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ
REMEDY FOR NUCLEIC ACID DESTRUCTION AND METHOD FOR NUCLEIC ACID DESTRUCTION

Область техники
Настоящее изобретение относится к средству для разрушения нуклеиновой кислоты, содержащему в качестве активного компонента этидий моноазид, и к способу разрушения внутриклеточной нуклеиновой кислоты, включающему этапы добавления этидия моноазида в содержащий клетки образец и светового облучения в видимом спектре содержащего клетки образца для того, чтобы разрушить нуклеиновую кислоту внутри клетки.
Уровень техники
До сих пор спирт, крезол, оксидант и прочее использовали в качестве типичных бактерицидных/дезинфицирующих лекарственных средств. Однако они не обладают немедленным действием, уничтожающим бактерии, так как эти составы денатурируют белки. Кроме того, антибактериальные средства, включающие ингибиторы синтеза клеточной стенки, ингибиторы белкового синтеза, ингибиторы метаболизма нуклеиновых кислот, ингибиторы метаболизма энергии и антиметаболиты, не достаточны для оказания немедленных эффектов, так как все они действуют на пролиферацию бактерий для достижения антибактериальной активности.
Этидий моноазид (3-амино-8-азид-5-этил-6-фенил-фенантридиний хлорид, в дальнейшем в настоящем описании может быть сокращен как EMA) представляет собой соединение соли азотоводородной кислоты, которое в качестве основного каркаса содержит этидий бромид, синтезированный для оптического мечения ДНК (непатентный документ 1). Кроме того, EMA был известен в качестве топоизомеразного токсина для эукариотических клеток (непатентный документ 2) и использовался в качестве средства для теста определения жизнеспособности клеток, наряду с пропидий йодидом, используемым для окрашивания ядер (непатентный документ 3).
До сих пор, однако, действие EMA на расщепление клеточных нуклеиновых кислот по случайности не было известно в данной области.
Непатентный документ 1: Nucleic Acids Res., vol. 5, pages 4891-4903, 1978.
Непатентный документ 2: Biochemistry, No. 50, vol. 36, pages 15884-15891, 1997.
Непатентный документ 3: Appl. Environ. Microbiol., No. 2, vol. 71, pages 1018-1024, 2005.
Описание изобретения
Целью настоящего изобретения является обеспечение средства для разрушения нуклеиновых кислот, которое используется как антибактериальное средство, включая антибактериальное и дезинфицирующее средство.
Авторы настоящего изобретения провели глубокое изучение антибактериальных средств, в частности уничтожающих бактерии средств. Авторы уделили свое внимание средству для разрушения нуклеиновых кислот, которое проникает через клеточную стенку бактерии и затем действует непосредственно на бактериальную нуклеиновую кислоту, расщепляя нуклеиновую кислоту, и провели поиск вещества, обладающего таким действием. В результате авторы закончили настоящее изобретение, обнаружив, что EMA, соединение соли азотоводородной кислоты, обладает способностью проникать через стенку живых бактериальных клеток и расщеплять нуклеиновую кислоту.
Первое изобретение согласно настоящему изобретению для решения вышеупомянутых проблем относится к средству для разрушения нуклеиновой кислоты, содержащему в качестве активного компонента этидий моноазид.
Второе изобретение согласно настоящему изобретению для решения вышеупомянутых проблем относится к антибактериальному средству, содержащему средство для разрушения нуклеиновой кислоты по первому изобретению.
Третье изобретение согласно настоящему изобретению для решения вышеупомянутых проблем относится к способу разрушения нуклеиновой кислоты в образце, содержащем нуклеиновую кислоту, включающему этапы добавления этидия моноазида в образец, содержащий нуклеиновую кислоту, и облучения образца, содержащего нуклеиновую кислоту, световым излучением в видимом спектре для разрушения в нем нуклеиновой кислоты.
Четвертое изобретение согласно настоящему изобретению для решения вышеупомянутых проблем относится к способу разрушения нуклеиновой кислоты в клетке, включающему этапы добавления этидия моноазида в образец, содержащий клетку, и облучения образца, содержащего клетку, световым излучением в видимом спектре для разрушения нуклеиновой кислоты внутри клетки.
Краткое описание фигур чертежей
На фиг.1 представлена фотография электрофореза, на которой показано влияние EMA на хромосомную ДНК и рРНК или подобные из E.coli in vitro, где M обозначает маркер молекулярного веса (λ/EcoT14I гидролизат), IR(-) обозначает отсутствие светового излучения в видимом спектре, IR обозначает световое излучение в видимом спектре (галогеновая лампа 500 Вт, 20 мин), и числовое значение E0-100n или μ обозначает конечную концентрацию EMA (от 0 до 100 нг/мл или мкг/мл).
На фиг.2 представлена фотография электрофореза, на которой показано влияние EMA на хромосомную ДНК и рРНК или подобные из E.coli in vivo, где M обозначает маркер молекулярного веса (λ/EcoT14I гидролизат), IR(-) обозначает отсутствие светового излучения в видимом спектре, IR обозначает световое излучение в видимом спектре (галогеновая лампа 500 Вт, 20 мин), и числовое значение E0-100 n или μ обозначает конечную концентрацию EMA (от 0 до 100 нг/мл или мкг/мл).
На фиг.3 изображены антибактериальное действие и кривая доза-эффект EMA, где ось X обозначает конечную концентрацию EMA (мкг/мл) и ось Y обозначает уменьшение количества живых бактериальных клеток (КОЕ/мл) от исходного количества живых бактериальных клеток посредством общепринятого логарифмического преобразования для каждой обрабатываемой EMA области.
На фиг.4 представлены фотографии, показывающие результаты наблюдений с помощью электронной микроскопии после обработки хромосомной ДНК E.coli DH5α ЕМА и световым излучением в видимом спектре (галогеновая лампа 500 Вт, 20 мин), где конечные концентрации EMA представляют собой (1) 0, (2) 0,01 мкг/мл, (3) 1 мкг/мл и (4) 10 мкг/мл.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления
Далее будут подробно описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Однако настоящее изобретение не ограничивается предпочтительными вариантами осуществления, описанными ниже, и может свободно модифицироваться в рамках настоящего изобретения. В дальнейшем, выражение в процентах основывается на массе, если не указано иначе в этом описании.
Состав для разрушения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению обладает действием случайным образом разрушать нуклеиновую кислоту, действуя непосредственно на выделенную нуклеиновую кислоту, и также обладает действием случайным образом расщеплять нуклеиновую кислоту, находящуюся в образце, который содержит нуклеиновую кислоту, используя EMA, который является активным компонентом и проникает в образец и непосредственно действует на нуклеиновую кислоту.
В дальнейшем, в настоящем изобретении нуклеиновые кислоты включают ДНК и РНК. Нуклеиновые кислоты, чтобы стать мишенью средства для разрушения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, включают одноцепочечную ДНК, двухцепочечную ДНК, одноцепочечную РНК и двухцепочечную РНК. При применении в настоящем изобретении образец может содержать любые из этих нуклеиновых кислот или может содержать две или больше из них. Кроме того, мишени средства для разрушения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включают, например, хромосомную ДНК и плазмидную ДНК, а также рРНК, мРНК и тРНК.
Примеры образца, содержащего нуклеиновую кислоту, включают все виды биологических клеток, таких как прокариотические клетки (бактерии) и эукариотические клетки (например, одноклеточные, Eumycetes, растения и животные), и вирусы. Из них предпочтительными являются бактерии, Eumycetes и вирусы.
Средство для разрушения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению при действии на бактерии, Eumycetes, вирусы или другие имеет действие ограничения их роста и уничтожает их, непосредственно разрушая нуклеиновую кислоту внутри клеток. Поэтому, например, средство для разрушения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению можно использовать против микроорганизмов окружающей среды в качестве антибактериального, бактерицидного/дезинфицирующего средства или другого.
При выборе мишени для антибактериального средства по настоящему изобретению, как правило, не ограничиваются микроорганизмами окружающей среды, а в их пример включают бактерии и Eumycetes. Бактерии включают и грамположительные бактерии, и грамотрицательные бактерии. Грамположительные бактерии включают Staphylococcus, такие как Staphylococcus epidermidis, Streptococcus, Listeria, Bacillus, Mycobacterium и Clostridium. Грамотрицательные бактерии включают Escherichia, такие как Escherichia coli, кишечные бактерии, такие как Enterobacter, Salmonella, Vibrio, Pseudomonas, Legionella и Campylobacter.
При выборе мишени для антибактериального средства по настоящему изобретению Eumycetes включают, но, как правило, не ограничиваются, Candida, Aspergillus, Saccharomyces и Penicillium.
Этидий моноазид (3-амино-8-азид-5-этил-6-фенил-фенантридиний хлорид: EMA), активный компонент по настоящему изобретению, представляет собой соединение, представленное химической формулой (1). Использованный этидий моноазид может быть коммерчески доступным.
Используемое количество средства для разрушения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению можно соответствующим образом подобрать в зависимости от заключения о том, разрушается или внеклеточная или внутриклеточная нуклеиновая кислота, или в зависимости от количества разрушаемой нуклеиновой кислоты. В дальнейшем, количество EMA, содержащееся в средстве для разрушения нуклеиновой кислоты, при использовании может представлять собой от 1 мкг/мл до 1000 мкг/мл, предпочтительно от 10 мкг/мл до 1000 мкг/мл, в частности предпочтительно от 100 мкг/мл до 1000 мкг/мл. Эффективно разрушать нуклеиновую кислоту можно, позволяя средству для разрушения нуклеиновой кислоты воздействовать на мишень в такой концентрации.
Средство для разрушения нуклеиновой кислоты по изобретению может представлять собой раствор или сам EMA. При использовании его можно соответствующим образом разбавить или растворить.
В дальнейшем, средство для разрушения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению можно использовать в качестве антибактериального средства. Даже если средство для разрушения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению используют в качестве антибактериального средства, то оно действует таким же образом как средство для разрушения нуклеиновой кислоты.
В дальнейшем, при разрушении нуклеиновой кислоты воздействуют излучением в видимом спектре. Длина волны светового излучения в видимом спектре представляет собой от 380 нм до 800 нм, предпочтительно от 450 нм до 600 нм. Кроме того, световое излучение в видимом спектре может быть монохромным или состоящим из нескольких длин волн, которые находятся в рамках вышеуказанной области. Световое излучение может содержать длину волны иную, чем вышеуказанная область. Кроме того, расстояние между источником оптического излучения и образцом можно соответствующим образом выбирать, с условием, что образец-мишень облучается достаточным количеством света.
Световое излучение в видимом спектре может быть получено при помещении мишени для средства для разрушения нуклеиновой кислоты или антибактериального средства по настоящему изобретению под излучение естественного света, такого как солнечный свет.
2
В дальнейшем, если средство для разрушения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению облучают с оптической мощностью от 0,5 до 100 Вт/см, то достаточное действие разрушения нуклеиновой кислоты может вызываться за примерно от 5 минут до 1 часа, предпочтительно в пределах примерно от 5 до 30 минут.
Например, если свет излучается 500 Вт галогеновой лампой на расстоянии 20 см, то достаточное действие разрушения нуклеиновой кислоты может вызываться за примерно от 5 минут до 1 часа, предпочтительно в пределах примерно от 5 до 30 минут.
Действие средства для разрушения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению можно оценить, сравнивая электрофореграмму нуклеиновых кислот до и после добавления средства для разрушения нуклеиновой кислоты и облучения световым излучением в видимом спектре. В дальнейшем, если средство для разрушения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению применяют к бактериям, то действие также можно оценить опосредованно, измеряя количество живых бактериальных клеток.
Средство для разрушения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может использоваться отдельно или может использоваться в сочетании с другими компонентами. Например, другие компоненты включают средство для разрушения нуклеиновой кислоты, известное в данной области, такое как экзонуклеазы и эндонуклеазы, например рестриктазы, для ДНК и РНК. Сочетание таких средств может дополнительно усилить эффект разрушения нуклеиновых кислот.
Форма использования антибактериального средства по настоящему изобретению не особенно ограничена, но, например, можно добавлять его в раствор или распылять соответствующий разбавленный раствор его. Кроме того, лекарственную форму антибактериального средства по настоящему изобретению можно соответствующим образом подбирать в зависимости от заявки, их формы использования и так далее. Например, лекарственные формы включают, но, как правило, не ограничиваются ими, жидкую форму, гранулированную форму и форму таблеток.
В дальнейшем, антибактериальное средство по настоящему изобретению может использоваться отдельно или в сочетании с другими компонентами. Другие компоненты могут представлять собой антибактериальные или бактерицидные средства, и их примеры включают антибиотики, спирты, такие как этанол и изопропиловый спирт, окислители, такие как фенол, крезол, соединения галогенов (например, хлора и йода) и пероксиды (например, озон и пероксид водорода) и соединения тяжелых металлов. Сочетание таких компонентов может дополнительно усилить антибактериальный эффект.
Например, антибактериальное средство по настоящему изобретению предпочтительно можно использовать для дезинфекции инструментов и так далее и также дезинфекции рабочих поверхностей, полов и так далее. Кроме того, антибактериальное средство по настоящему изобретению можно распылять в закрытом пространстве, что очень полезно при стерилизации от бактерий (патогенных Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis, botulinum, Bacillus anthracis и так далее), которые имеют высокий риск вызывать тяжелое заболевание при заражении людей.
Антибактериальное средство по настоящему изобретению может действовать непосредственно на внутриклеточную нуклеиновую кислоту, чтобы разрушить нуклеиновую кислоту. Почти нет необходимости учитывать проблему резистентности бактерий, поскольку антибактериальное средство по настоящему изобретению обладает превосходной антибактериальной активностью и широким антибактериальным спектром по сравнению с известными антибактериальными средствами.
Следующим шагом, в дальнейшем настоящее изобретение будет описано подробно со ссылкой на примеры, но изобретение не ограничивается примерами, описанными ниже.
Пример 1
Этот пример осуществляли для изучения влияния EMA на нуклеиновую кислоту, такую как хромосомную ДНК, рРНК E. coli, in vitro.
(1) Способ исследования
6
1 мл суспензии живых бактерий 1,0×10 КОЕ/мл штамма E. coli/DH5α подвергали центрифугированию в охлажденном режиме. После удаления супернатанта к полученному осадку добавляли 0,5 мл 10 мМ Трис-HCl буферного раствора (pH 8,0) и затем добавляли 10 мкл 1250 Ед/мл раствор протеазы K и 200 мкл 10% раствора SDS, с последующим лизисом бактерий при 50°C в течение ночи.
260
Затем каждый обработанный раствор разделяли на два одинаковых объема и разливали в две 2 мл микропробирки, соответственно. В каждую из них добавляли 0,5 мл насыщенного раствора фенола, затем осторожно перемешивали в течение 15 минут и затем добавляли 0,5 мл хлороформа, с последующим осторожным перемешиванием в течение 5 минут. После этого смесь центрифугировали при 6000×g при 4°C в течение 10 минут. Водную фазу, верхний слой, переносили в другие 2 мл микропробирки и затем добавляли 70 мкл 3 M ацетата натрия (pH 5,2) и 1,21 мл 99,5% охлажденного этанола, с последующим осторожным перемешиванием. Затем смесь центрифугировали при 15000×g при 4°C в течение 10 минут и удаляли супернатант. После этого добавляли 0,4 мл 70% охлажденного этанола, таким образом отмывая осадок (преципитация) (в дальнейшем рассмотренную выше последовательность операций можно сокращенно назвать фенол/хлороформной экстракцией). Затем к осадку добавляли 0,5 мл 10 мМ Трис-HCl буфера (pH 8,0), содержащего 1 мМ EDTA/2Na раствор (TE буфер), и затем оставляли на ночь при 4°C, таким образом растворяя нуклеиновую кислоту. Концентрацию очищенного раствора нуклеиновой кислоты определяли на основании оптической плотности при UV260 нм (50 мкг/мл нуклеиновой кислоты определяли как OD=1, длина оптического пути кюветы = 1 см: OD).
Приготовленный таким образом раствор нуклеиновой кислоты доводили стерильной водой до 175 нг/мкл и затем в каждую микропробирку добавляли 4 мкл аликвоты раствора нуклеиновой кислоты. Затем добавляли соответственно 4 мкл водных растворов EMA (0, 0,02, 0,2, 2, 20 и 200 мкг/мл) в микропробирки и затем оставляли при 4°C на 1 час до улавливания света. После этого образец облучали в течение 20 минут световым излучением в видимом спектре от 500 Вт галогеновой лампы (FLOOD PRF 100 В 500 Вт; Iwasaki Electric Co., Ltd., Tokyo) на расстоянии 20 см от образца. Целый объем образца разделяли электрофоретически в 0,7% агарозном геле. В качестве молекулярного маркера веса использовали λ-EcoT14 I гидролизат (произведенный Takara Bio Inc.). После электрофореза гель окрашивали 1 мкг/мл раствором этидия бромида и затем облучали UV при 254 нм, используя UV трансиллюминатор. Полученное изображение записывали на Polaroid film 667. Необработанный раствор нуклеиновой кислоты (EMA: 0 мкг/мл, без светового облучения в видимом спектре) использовали в качестве контроля и затем аналогично тем же способом разделяли электрофоретически.
(2) Результаты исследования
Результаты исследования показаны на фиг.1. Таким образом, интенсивность полосы, полученной из хромосомной ДНК приблизительно 19329 п.н., постепенно уменьшалась от 100 нг/мл до 1 мкг/мл концентрации EMA и в значительной степени исчезала при концентрации EMA 10 мкг/мл. Таким образом, было подтверждено, что EMA разрушил хромосомную ДНК в нуклеиновой кислоте, выделенной из живых бактерий (E. coli).
В дальнейшем было подтверждено, что интенсивность полосы рРНК (16SрРНК и 23SрРНК) уменьшалась при 1 мкг/мл EMA и исчезала при 10 мкг/мл или более EMA. Таким образом, также было подтверждено, что рРНК разрушилась.
Пример 2
Этот пример осуществляли для изучения влияния EMA на нуклеиновую кислоту, такую как хромосомную ДНК, рРНК E. coli, in vitro.
(1) Способ исследования
6
EMA растворяли в стерильной воде для приготовления 1000 мкг/мл раствора EMA. Раствор фильтровали для стерилизации через 0,2 мкм фильтр (Minisart-plus; произведенный Sartorius AG). Добавляли раствор EMA так, чтобы конечная концентрация EMA стала равной 0 (без добавления), 0,01, 0,1, 1, 10, и 100 мкг/мл по отношению к 1 мл 1,0×10 КОЕ/мл суспензии живых бактерий штамма E. coli/DH5α, после оставляли при 4°C в течение 1 часа.
Затем на расстоянии 20 см от вышеупомянутой живой бактериальной суспензии на льду образец облучали в течение 20 минут светом в видимом спектре от 500 Вт галогеновой лампы (FLOOD PRF 100 В 500 Вт; Iwasaki Electric Co., Ltd., Tokyo). Образец подвергали центрифугированию при 15000×g при 4°C в течение 10 минут и затем удаляли супернатант для устранения продукта, полученного путем реакции воды с продуктом светового излучения в видимом спектре EMA (гидроксиаминоэтидий), который не мог ковалентно связываться с нуклеиновой кислотой. К осадку добавляли 0,5 мл 10 мМ Трис-HCl буфер (pH 8,0) и затем добавляли 10 мкл 1250 Ед/мл раствор протеазы K и 200 мкл 10% раствора SDS. Процесс лизиса бактерий осуществлялся при 50°C в течение ночи.
260
260
280
Каждый обработанный раствор разделяли на два равных объема и разливали в две 2 мл микропробирки, соответственно. В каждую из них добавляли 0,5 мл насыщенного раствора фенола, затем осторожно перемешивали в течение 15 минут и затем добавляли 0,5 мл хлороформа, с последующим осторожным перемешиванием в течение 5 минут. После этого смесь центрифугировали при 6000×g при 4°C в течение 10 минут. Водную фазу, верхний слой, переносили в другие 2 мл микропробирки и затем добавляли 70 мкл 3 M ацетата натрия (pH 5,2) и 1,21 мл 99,5% охлажденного этанола, с последующим осторожным перемешиванием. Затем смесь центрифугировали при 15000×g при 4°C в течение 10 минут и затем удаляли супернатант. После этого добавляли 0,4 мл 70% охлажденного этанола, таким образом отмывая осадок (преципитация) (в дальнейшем рассмотренную выше последовательность операций можно сокращенно назвать фенол/хлороформной экстракцией). Затем к осадку добавляли 0,5 мл 10 мМ Трис-HCl буфера, содержащего 1 мМ EDTA/2Na (TE буфер), и затем оставляли на ночь при 4°C, таким образом растворяя нуклеиновую кислоту. Концентрацию очищенного раствора нуклеиновой кислоты определяли на основании оптической плотности при UV260 нм (50 мкг/мл нуклеиновой кислоты определяли как OD=1, длина оптического пути кюветы = 1 см: OD). Чистоту очищенной нуклеиновой кислоты подсчитывали делением OD на OD.
Готовили каждый раствор нуклеиновых кислот в 175 нг/мкл и 4 мкл каждого затем разделяли электрофоретически в 0,7% агарозном геле. В качестве молекулярного маркера веса использовали λ-EcoT14 I гидролизат (произведенный Takara Bio Inc.). После электрофореза гель окрашивали 1 мкг/мл раствором этидия бромида и затем облучали UV при 254 нм, используя UV трансиллюминатор. Полученное изображение записывали на Polaroid film 667. Необработанную живую бактериальную суспензию E. coli (EMA: 0 мкг/мл, без светового облучения в видимом спектре) подвергали экстракции нуклеиновых кислот и использовали в качестве контроля.
(2) Результаты исследования
Результаты исследования показаны на фиг.2. Таким образом, интенсивность полосы, полученной из хромосомной ДНК приблизительно 19329 п.н., постепенно уменьшалась от 10 мкг/мл EMA и в значительной степени исчезала при 100 мкг/мл EMA. Таким образом, было подтверждено, что EMA могла разрушить хромосомную ДНК в нуклеиновой кислоте, выделенной из живых бактерий (E. coli).
В дальнейшем было подтверждено, что интенсивность полосы рРНК (16SрРНК и 23SрРНК) уменьшалась при 10 мкг/мл EMA. Таким образом, также было подтверждено, что рРНК живых бактерий могла разрушиться.
Пример 3
Этот пример осуществляли для изучения антибактериального действия EMA на живые бактерии.
(1) Способ исследования
6
Этидий моноазид (EMA) растворяли в стерильной воде для приготовления 1000 мкг/мл раствора EMA. Раствор фильтровали через 0,2 мкм стерильный фильтр (Minisart-plus; произведенный Sartorius AG). Добавляли раствор EMA так, чтобы конечная концентрация EMA стала равной 0 (без добавления), 0,01, 0,1, 1, 10, и 100 мкг/мл по отношению к 1 мл 1,0×10 КОЕ/мл живой бактериальной суспензии штамма E. coli/DH5α, после оставляли при 4°C в течение 1 часа до улавливания света.
Затем на расстоянии 20 см от вышеупомянутой живой бактериальной суспензии на льду образец облучали в течение 20 минут светом в видимом спектре от 500 Вт галогеновой лампы (FLOOD PRF 100V 500W; Iwasaki Electric Co., Ltd., Tokyo). Образец подвергали центрифугированию при 15000×g при 4°C в течение 10 минут и затем удаляли супернатант для устранения продукта, полученного путем реакции воды с продуктом светового излучения в видимом спектре EMA (гидроксиаминоэтидий), который не мог ковалентно связываться с нуклеиновой кислотой. К осадку добавляли равное количество физиологического раствора и затем серийно разводили, с последующей инкубацией при 37°C в течение 24 часов с использованием культуральной среды агара в L-чашках для определения числа живых бактериальных клеток.
(2) Результаты исследования
2
5
Антибактериальное действие EMA изображено в виде кривой доза-эффект на фиг.3. В результате было подтверждено, как указано далее: при концентрации 10 мкг/мл EMA взаимодействовал с E. coli, число живых бактериальных клеток уменьшалось порядка 10 КОЕ/мл по сравнению с исходным числом живых бактериальных клеток. При концентрации 100 мкг/мл EMA взаимодействовал с E. coli, число живых бактериальных клеток уменьшалось порядка 10 КОЕ/мл по сравнению с исходным числом живых бактериальных клеток.
Таким образом было обнаружено, что EMA обладает антибактериальным действием на E. coli (живые клетки).
Пример 4
Этот пример осуществляли для наблюдения действия EMA на хромосомную ДНК E. coli под электронным микроскопом.
(1) Способ исследования
Нуклеиновую кислоту выделяли способом, сходным с описанным выше примером 1. Затем нуклеиновую кислоту растворяли в 9 мл стерильной воды. Таким образом полученный раствор нуклеиновой кислоты осторожно наслаивали на поверхность градиента плотности 32 мл сахарозы (использовали 16 мл 10% раствора сахарозы и 16 мл 40% раствора сахарозы) и затем подвергали ультрацентрифугированию при 26000 rpm при 20°C в течение 18 часов с плавающим ротором (произведенный Hitachi Koki Co., Ltd.: RPS-27-2). После центрифугирования открывалось маленькое отверстие внизу пласта раствора градиента плотности сахарозы, и затем фракционировали каждые 1 мл.
После этого для каждой фракции добавляли 3 M раствор ацетата натрия (pH 5,2) с тем, чтобы составлял 10% (объем/объем). Затем добавляли 2-кратный объем 99,5% этанола. Затем фракцию подвергали центрифугированию при 15000×g при 4°C в течение 10 минут до получения осадка. Затем отмывали осадок 70% этанолом и растворяли в 100 мкл стерильной воды.
Среди образцов, полученных из соответствующих фракционных растворов, единственный образец, содержащий длинную хромосомную ДНК с 48 kbp в агарозном электрофорезе, далее растворяли в стерильной воде с тем, чтобы концентрация ДНК составляла 175 нг/мкл. Затем 4 мкл каждого водного раствора EMA (0, 0,02, 2 и 20 мкг/мл) добавляли к 4 мкл раствора ДНК и затем оставляли при 4°C в течение 1 часа до улавливания света. Затем образец на льду облучали в течение 20 минут световым излучением в видимом спектре от 500 Вт галогеновой лампы, описанной выше.
Раствор ДНК (8 мкл) после облучения вышеуказанным световым излучением в видимом спектре растворяли пятикратно (добавление 32 мкл) в стерильной воде. Добавляли 1 мкл 0,02% раствора цитохрома C к 5 мкл 8% раствора формальдегида, и общее их количество смешивали с 40 мкл раствора ДНК, после оставляя на 10 минут. Затем микропинцетом собирали мембрану цитохрома С и осуществляли дегидратирующую обработку 90% этанолом. Затем осуществляли окрашивание раствором 0,5 мМ ацетатом урания/0,5 мМ соляной кислоты /90% этанолом, с последующей дегидратирующей обработкой 90% этанолом и изопентаном.
В течение электромикроскопического наблюдения экранирование осуществляли с использованием платинового/палладиевого напыления и затем получали фотографию с помощью электронного микроскопа (произведенного JEOL Ltd., JEOL T-2000 EX).
(2) Результаты исследования
Результаты исследования показаны на фиг.4. На фиг.4 показаны результаты данных наблюдений электронной микроскопии после обработки хромосомной ДНК E. coli EMA в концентрации от 0 до 10 мкг/мл световым излучением в видимом спектре (500 Вт галогеновая лампа, 20 мин). В результате, не наблюдали действие расщепления хромосомной ДНК после реакции с 0 до 0,01 мкг/мл EMA. Однако было подтверждено, что реакция с EMA в концентрации 1 мкг/мл или более вызвана явлением расщепления хромосомной ДНК. Такие результаты соответствуют результатам в примере 1, и было визуально подтверждено явление расщепления хромосомной ДНК EMA.
Промышленное применение
Средство для разрушения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению имеет способность проникать через клеточную стенку живых бактерий и способно случайным образом расщеплять хромосомную ДНК, РНК или подобные у бактерий. Поэтому оно очень полезно в области бактериологии и биохимии в качестве антибактериального средства, в частности бактерицидного/дезинфицирующего средства против микроорганизмов окружающей среды. Кроме того, средство для разрушения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению предпочтительно можно использовать в области научных исследований.