СПОСОБ МОДУЛИРОВАНИЯ МЕТАБОЛИЗМА ЭЙКОЗАНОИДОВ
METHOD OF MODULATION OF EICOSANOID METABOLISM

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительных заявок на патент США: номер 60/690,161, поданной 14 июня, 2005, и номер 60/792,330, поданной 17 апреля, 2006, содержание которых в полном объеме включено в данную заявку посредством ссылок.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
1. Область изобретения
Изобретение относится к способам модулирования процесса метаболизма эйкозаноидов в клетках нуждающегося в этом животного, которые включают введение животному некоторого количества составов согласно настоящему изобретению, эффективного для регуляции активности эйкозаноид оксигеназы. В частности, настоящее изобретение относится к способам модулирования метаболизма арахидоновой кислоты посредством введения некоторого количества составов согласно настоящему изобретению, эффективного для регуляции активности липооксигеназ и циклооксигеназ.
2. Уровень техники
Несмотря на значительные успехи в ранней диагностике и лечении рака, такого как рак предстательной железы, именно рак предстательной железы остается самым распространенным злокачественным новообразованием и является второй основной причиной, приводящей к смерти мужчин от рака в Соединенных Штатах. Одним из наиболее интересных аспектов этого заболевания является тот факт, что латентный рак предстательной железы случается с равными степенями у азиатских и американских мужчин, тогда как частота возникновения клинически значимого рака предстательной железы гораздо выше в США, чем в Азии. Существует множество оснований считать, что указанное различие связано с пищевым рационом различных популяций, и эти наблюдения стимулировали обширные исследования различных диетических факторов, которые могут влиять на развитие рака предстательной железы. Некоторые эпидемиологические исследования позволили предположить, что это может быть отчасти следствием меньшего потребления жиров в азиатских рационах по сравнению с типичным западным рационом, так как рационы с высоким содержанием жиров связывают с повышенным риском рака предстательной железы.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение составов согласно настоящему изобретению ингибирует TNF-индуцируемую активацию NF-кВ в клетках миелоидной лейкемии КВМ-5 и индуцируемую конденсатом сигаретного дыма активацию NF-кВ в клетках аденокарциномы легкого Н1299. Введение составов согласно настоящему изобретению также приводит к супрессии индуцируемой TNF инвазии клеток и нарушенному RANKL-индуцируемому остеокластогенезу. Дополнительно, введение составов согласно настоящему изобретению подавляет TNF-индуцируемую экспрессию различных продуктов антиапоптических, пролиферативных и метастатических генов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу модулирования процесса метаболизма эйкозаноидов в клетках нуждающегося в этом животного, который включает введение указанному животному некоторого количества состава, эффективного для регуляции активности эйкозаноид оксигеназы, при этом
указанный состав содержит терапевтически эффективные количества сверхкритических экстрактов розмарина, куркумы, орегано и имбиря и терапевтически эффективные количества водно-спиртовых экстрактов базилика священного, имбиря, куркумы, Scutellaria baicalensis (шлемника байкальского), розмарина, зеленого чая, хучжана (горца остроконечного), китайской золотой нити (коптиса трехлистного) и барбариса.
Настоящее изобретение также относится к способу доставки 13-гидроксиоктадекадиеновой кислоты (13-S-HODE) нуждающемуся в этом животному, который включает введение указанному животному состава, содержащего терапевтически эффективные количества сверхкритических экстрактов розмарина, куркумы, орегано и имбиря и терапевтически эффективные количества водно-спиртовых экстрактов базилика священного, имбиря, куркумы, Scutellaria baicalensis, розмарина, зеленого чая, хучжана, китайской золотой нити и барбариса.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу ингибирования опосредуемого арахидоновой кислотой воспаления у нуждающегося в этом животного, который включает введение указанному животному состава, содержащего терапевтически эффективные количества сверхкритических экстрактов розмарина, куркумы, орегано и имбиря и терапевтически эффективные количества водно-спиртовых экстрактов базилика священного, имбиря, куркумы, Scutellaria baicalensis, розмарина, зеленого чая, хучжана, китайской золотой нити и барбариса.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу модулирования уровня продуктов генов, регулируемых NF-кВ- в клетках нуждающегося в этом животного, который включает введение указанному животному состава, содержащего терапевтически эффективные количества сверхкритических экстрактов розмарина, куркумы, орегано и имбиря и терапевтически эффективные количества водно-спиртовых экстрактов базилика священного, имбиря, куркумы, Scutellaria baicalensis, розмарина, зеленого чая, хучжана, китайской золотой нити и барбариса.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1 представляет собой график, показывающий ингибирующее действие составов согласно настоящему изобретению на рост линий клеток рака легкого человека А549 и рака предстательной железы человека РС3.
Фигура 2 представляет собой график, показывающий влияние составов согласно настоящему изобретению на образование простагландина Е2 (PGE2).
Фигура 3 представляет собой график, показывающий влияние составов согласно настоящему изобретению на образование PGE2 и 5-гидроксиэйкозатетраеновой кислоты (5-НЕТЕ) в клетках РС3.
Фигура 4 представляет собой график, показывающий зависящее от концентрации влияние составов согласно настоящему изобретению на метаболизм эйкозаноидов в клетках рака легких человека А549.
Фигура 5 показывает данные масс-спектрометрии, демонстрирующие присутствие 13-S-HODE в составах согласно настоящему изобретению.
Фигура 6 представляет собой график, демонстрирующий противовоспалительное действие соединений согласно настоящему изобретению при отеке ушной раковины мыши.
Фигура 7 представляет собой график, показывающий действие 13-S-HODE на пролиферацию различных раковых клеточных линий.
Фигура 8 представляет собой график, показывающий ингибиторное действие соединений согласно настоящему изобретению на рост клеточных линий рака груди человека MCF7 и MDA231.
Фигура 9 представляет собой вестерн-блот, демонстрирующий способность составов согласно настоящему изобретению приводить зависимым от концентрации образом к уменьшению присутствия 5-липоксигеназы в опухолевых клеточных линиях человека (например, РС3).
Фигура 10 представляет собой график, изображающий действие составов согласно настоящему изобретению при отеке ушной раковины мыши, опосредованном арахидоновой кислотой (АК).
Фигура 11(А) представляет собой серию фотографий, показывающих TRAP-положительные клетки RAW 264.7 после их инкубации либо в отсутствие, либо в присутствии 5 нМ RANKL с 0.8 мг/мл состава согласно настоящему изобретению в течение 5 дней.
Фигура 11(В) представляет собой график, показывающий количество многоядерных (три ядра) остеокластов, подсчитанных в клетках RAW 264.7 после их инкубации в отсутствие, либо в присутствии 5 нМ RANKL с 0.8 мг/мл составов согласно настоящему изобретению в течение 5 дней.
Фигура 12 представляет собой график, показывающий результаты теста на инвазию с применением инвазивной камеры Matrigel после ночной коинкубации с 0.3 мг/мл составов согласно настоящему изобретению и 1 нМ TNF в течение 24 ч в присутствии и в отсутствие 1% сыворотки.
Фигура 13 представляет собой серию фотографий, показывающих гибель клеток множественной миеломы человека линии U266, инкубированных с 1 нМ TNF, 1 нМ таксолом и 300 нМ доксорубицином, самих по себе или в комбинации с 0.5 мг/мл составов согласно настоящему изобретению, определенную посредством теста «живой/мертвый» на основе кальцеина AM (ацетооксиметиловый эфир кальцеина), как описано в данной заявке. Красный цвет показывает мертвые клетки, зеленый цвет показывает живые клетки.
Фигура 14(А) представляет собой фотографию, изображающую активацию NF-кВ клеток КВМ-5, предварительно инкубированных с указанными концентрациями составов согласно настоящему изобретению и обработанных 0.1 нМ TNF в течение 30 мин.
Фигура 14(В) представляет собой фотографию, показывающую NF-кВ активацию клеток КВМ-5, которые предварительно инкубировали с 1 мг/мл составов согласно настоящему изобретению, обработанных 0.1 нМ TNF в течение 30 мин.
Фигура 14(С) представляет собой фотографию, показывающую NF-кВ активацию клеток КВМ-5, которые предварительно инкубировали с 1 мг/мл составов согласно настоящему изобретению, обработанных сигаретным дымом (10 мкг/мл) в течение 1 ч.
Фигура 15(А) представляет собой фотографию, показывающую экспрессию пролиферативных и метастатических белков в клетках КВМ-5, инкубированных с 1 мг/мл составов согласно настоящему изобретению в течение 1 ч и обработанных 1 нМ TNF в течение указанных промежутков времени.
Фигура 15(В) представляет собой фотографию, показывающую экспрессию антиапоптических белков в клетках КВМ-5, инкубированных с 1 мг/мл составов согласно настоящему изобретению в течение 1 ч и обработанных 1 нМ TNF в течение указанных промежутков времени.
Фигура 16(А) представляет собой серию графиков, изображающих кривые распределения по клеточному циклу. Верхний левый график показывает нормальное распределение клеток РС3 по клеточному циклу. На верхнем правом графике размер G2/M пика увеличивается. Графики снизу слева и снизу справа показывают повышение блока клеточного цикла вследствие повышенной концентрации составов согласно настоящему изобретению.
Фигура 16(В) представляет собой график, показывающий данные анализа способом проточной цитометрии, представленные на Фигуре 16(А), в виде гистограммы.
Фигура 17(А) представляет собой серию графиков, показывающих клетки РС3, обработанные составами согласно настоящему изобретению при указанных концентрациях и затем окрашенные аннексином V и раствором йодида пропидия (PI).
Фигура 17(В) представляет собой график, показывающий данные анализа способом проточной цитометрии, представленные на Фигуре 17(А), в виде гистограммы.
2
Фигура 18(А) представляет собой график, показывающий образование PGE в зависимости от концентрации указанных составов согласно настоящему изобретению.
Фигура 18(В) представляет собой график, показывающий образование 5-НЕТЕ в зависимости от концентрации указанных составов согласно настоящему изобретению.
Фигура 18(С) представляет собой график, показывающий образование 12-НЕТЕ в зависимости от концентрации указанных составов согласно настоящему изобретению.
Фигура 18(D) представляет собой фотографию вестерн-блота, показывающего обработку клеток РС3 составами согласно настоящему изобретению и содержание белка 5-LOX в клетках.
Фигура 19(А) представляет собой фотографию вестерн-блота, показывающего белок ретинобластомы как в нефосфорилированной (Rb), так и фосфорилированной (pRb) формах.
Фигура 19(В) представляет собой график, показывающий данные, соответствующие Фигуре 19(А), после сканирования гелей в фотометрическом приборе для сканирования, что дает возможность количественного анализа плотности полос.
Фигура 20(А) представляет собой график, показывающий клетки РС3, обработанные составами согласно настоящему изобретению при указанных концентрациях, и ингибирование пролиферации клеток.
Фигура 20(В) представляет собой фотографию вестерн-блота, который демонстрирует зависящее от концентрации снижение экспрессии pRb, которое вызывают составы согласно настоящему изобретению.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
Термин "модулирование/яция" относится к процессу оказания воздействия на биологическую активность, функцию, здоровье или состояние организма, в котором указанная биологическая активность, функция, здоровье или патологическое состояние поддерживается, улучшается, ослабляется или вылечивается способом, который совместим с общим состоянием здоровья и хорошим самочувствием указанного организма.
Термин "улучшение/усиление" биологической активности, функции, здоровья или состояния организма относится к процессу увеличения, укрепления, усиления или улучшения.
Термин "эйкозаноиды" относится к любому соединению, полученному из полиненасыщенных жирных кислот, таких как арахидоновая кислота и линолиновая кислота, и участвующему в клеточной активности.
Термин "оксигеназа" относится к любому ферменту, который катализирует включение молекулярного кислорода в субстрат фермента.
Термин "сверхкритический газ" или "сверхкритическая жидкость", применяемый в данной заявке, относится к газу, который нагревают до температурной критической точки, выше которой газ будет оставаться в газообразном состоянии и не превратится в жидкость вне зависимости от давления. Газ, нагретый до температуры выше его критической точки, станет очень плотным при сжатии, так что его характеристики будут сходны с аналогичными характеристиками для жидкости, но не станет жидкостью. Диоксид углерода широко используют в приложениях, в которых требуется сверхкритическая жидкость. Основные характеристики сверхкритических жидкостей и основное применение сверхкритических жидкостей в процессах экстракции описаны, например, в Taylor, Supercritical Fluid Extraction, Wiley, 1996; McHugh и Krukonis, Supercritical Fluid Extraction: Principles and Practice, 2-e изд., Butterworth-Heinemann, 1994; и Williams и Clifford, Supercritical Fluid Methods and Protocols, Humana Press, 2000, содержание которых включено в данную заявку посредством ссылки.
2
2
Авторы настоящего изобретения разработали смесь, состоящую из травяных экстрактов, и указанная смесь обладает СОХ-2 ингибиторной активностью. Составы согласно настоящему изобретению уникальны в том, что некоторые компоненты состава готовили посредством процесса экстракции сверхкритическим СO. В отличие от традиционных способов экстракции, основанных на растворителе, экстракция сверхкритическим CO позволяет получить натуральные продукты из трав без оставшихся после приготовления химических остатков.
Термин "сверхкритическая экстракция", применяемый в данной заявке, относится к способу, в котором гидрофобные соединения могут быть экстрагированы из образцов с применением сверхкритической жидкости. Способность сверхкритической жидкости растворять повышается при повышении давления и температуры над их критическими значениями, что приводит к образованию эффективного растворителя для выделения гидрофобных молекул. Термин "сверхкритические экстракты" относится к экстрактам, приготовленным посредством сверхкритической экстракции.
Термин "водно-спиртовая экстракция", применяемый в данной заявке, относится к способу, в котором гидрофильные соединения могут быть экстрагированы из образца с применением водно-спиртового раствора с последующим испарением указанного раствора для приготовления экстракта, состоящего из растворенных твердых частиц. Термин "водно-спиртовые экстракты" относится к экстрактам, приготовленным посредством водно-спиртовой экстракции.
Термин "13-S-HODE" относится к 13-гидроксиоктадека-9Z,11Е-диеновой кислоте.
Термин "NF-кВ" или "ядерный фактор каппа В" относится к мультисубъединичному транскрипционному фактору, участвующему в экспрессии генов. Активный NF-кВ состоит из димера белков семейства REL: р65 субъединицы и р50 или р52 субъединицы. NF-кВ удерживается в цитоплазме благодаря взаимодействию со своим ингибитором 1кВ, но после диссоциации перемещается в ядро.
Составы согласно настоящему изобретению
Составы представляют собой вид препаратов на основе множества трав и включают компоненты, которые проявляют антипролиферативные, противовоспалительные, антиоксидантные, антиангиогенные и апоптические активности. Составы согласно настоящему изобретению содержат терапевтически эффективные количества сверхкритических экстрактов розмарина, куркумы, орегано и имбиря и терапевтически эффективных количеств водно-спиртовых экстрактов базилика священного, имбиря, куркумы, Scutellaria baicalensis, розмарина, зеленого чая, хучжана, китайской золотой нити и барбариса.
В одном аспекте настоящего изобретения, активный состав включает:
(A) от приблизительно 4.5% до приблизительно 7.5%, и более предпочтительно, от приблизительно 5.5% до приблизительно 6.5%, по весу водно-спиртового экстракта имбиря;
(B) от приблизительно 5.5% до приблизительно 8.5%, и более предпочтительно, от приблизительно 6% до приблизительно 8%, по весу сверхкритического экстракта имбиря;
(C) от приблизительно 1.0% до приблизительно 1.5%, и более предпочтительно, от приблизительно 1.2% до приблизительно 1.4%, по весу сверхкритического экстракта куркумы;
(D) от приблизительно 10.0% до приблизительно 16.0%, и более предпочтительно, от приблизительно 11.5% до приблизительно 14.5%, по весу сверхкритического экстракта розмарина;
(Е) от приблизительно 4.0% до приблизительно 6.0%, и более предпочтительно от приблизительно 4.5% до приблизительно 5.5%, по весу сверхкритического экстракта орегано;
(F) от приблизительно 10.0% до приблизительно 16.0%, и более предпочтительно, от приблизительно 11.5% до приблизительно 14.5%, по весу водно-спиртовго экстракта куркумы;
(G) от приблизительно 5.5% до приблизительно 8.0%, и более предпочтительно, от приблизительно 6.0% до приблизительно 7.0%, по весу водно-спиртового экстракта розмарина;
(Н) от приблизительно 10.0% до приблизительно 16.0%, и более предпочтительно, от приблизительно 11.5% до приблизительно 14.5%, по весу водно-спиртового экстракта базилика священного;
(I) от приблизительно 10.0% до приблизительно 16.0%, и более предпочтительно, от приблизительно 11.5% до приблизительно 14.5%, по весу водно-спиртового экстракта зеленого чая;
(J) от приблизительно 8.0% до приблизительно 12.0%, и более предпочтительно, от приблизительно 9.0% до приблизительно 11.0%, по весу водно-спиртового экстракта хучжана;
(K) от приблизительно 4.0% до приблизительно 6.0%, и более предпочтительно, от приблизительно 4.5% до приблизительно 5.5%, по весу водно-спиртового экстракта китайской золотой нити;
(L) от приблизительно 4.0% до приблизительно 6.0%, и более предпочтительно, от приблизительно 4.5% до приблизительно 5.5%, по весу водно-спиртового экстракта барбариса и
(М) от приблизительно 2.0% до приблизительно 3.0%, и более предпочтительно от приблизительно 2.25% до приблизительно 2.75%, по весу водно-спиртового экстракта Scutellaria baicalensis.
Возможно, водно-спиртовые экстракты имбиря, розмарина, куркумы или орегано, применяемые в настоящем изобретении, предпочтительно готовят следующим образом. Растение или его часть, которые, предпочтительно криогенно, измельчают для сохранения чувствительных к нагреванию компонентов, подвергают сверхкритической экстракции, предпочтительно диоксидом углерода, для получения масляного экстракта, называемого в данной заявке "сверхкритический экстракт". В дополнительном возможном варианте реализации, не содержащий масла остаток выделяют на первом этапе и затем экстрагируют смесью вода/спирт, предпочтительно вода/этанол, состоящей из 60-80 частей спирта и 40-20 частей воды. Жидкость спирт/вода затем испаряют, оставляя порошкообразный остаток экстракта, называемый в данной заявке "водно-спиртовой экстракт".
Сверхкритические экстракты имбиря, розмарина, куркумы и орегано, возможно, применяемые в настоящем изобретении, могут быть приготовлены согласно известным способам сверхкритической экстракции, таким как раскрытые, например, в публикации Е.Stahl, K.W.Quirin, D.Gerard, Dense Gases for Extraction and Refining, Springer Verlag 4 1988, которая тем самым включена в данную заявку посредством ссылки.
В предпочтительном аспекте, весовое соотношение сверхкритического экстракта имбиря к водно-спиртовому экстракту имбиря составляет от приблизительно 0.8:1 до приблизительно 1.4:1.
Водно-спиртовые экстракты розмарина, куркумы, базилика священного, зеленого чая, хучжана, китайской золотой нити, барбариса и Scutellaria baicalensis, применяемые в настоящем изобретении, могут быть приготовлены согласно общеизвестным способам водно-спиртовой экстракции. Например, указанные водно-спиртовые экстракты могут быть приготовлены посредством экстрагирования части растения в смеси вода/спирт, предпочтительно вода/этанол, предпочтительно составленной из 60-80 частей спирта и 40-20 частей воды, и затем испарения жидкости вода/спирт, оставляя порошкообразный остаток экстракта, называемый в данной заявке "водно-спиртовой экстракт".
В другом дополнительном аспекте настоящего изобретения, весовое соотношение водно-спиртового экстракта куркумы к сверхкритическому экстракту куркумы составляет от приблизительно 8:1 до приблизительно 12:1.
В альтернативном аспекте, весовое соотношение сверхкритического экстракта розмарина к водно-спиртовому экстракту розмарина составляет от приблизительно 1.6:1 до приблизительно 2.4:1.
В еще одном дополнительном аспекте настоящего изобретения, водно-спиртовой экстракт имбиря содержит от приблизительно 2.4% до приблизительно 3.6%, более предпочтительно, от приблизительно 2.7% до приблизительно 3.3%, и наиболее предпочтительно, приблизительно 3.0%, по весу жгучих соединений.
В другом аспекте, сверхкритический экстракт имбиря содержит от приблизительно 24% до приблизительно 36%, более предпочтительно, от приблизительно 27% до приблизительно 33%, и наиболее предпочтительно, приблизительно 30%, по весу жгучих соединений и от приблизительно 6.4% до приблизительно 9.6%, более предпочтительно, от приблизительно 7.2% до приблизительно 8.8%, и наиболее предпочтительно, приблизительно 8%, по весу цингиберена.
В дополнительном аспекте, сверхкритический экстракт куркумы содержит от приблизительно 36% до приблизительно 54%, более предпочтительно, от приблизительно 40.5% до приблизительно 49.5%, и наиболее предпочтительно, приблизительно 45%, по весу турмеронов.
В другом аспекте, сверхкритический экстракт розмарина содержит от приблизительно 18.4% до приблизительно 27.6%, более предпочтительно, от приблизительно 20.7% до приблизительно 25.3%, и наиболее предпочтительно, приблизительно 23%, по весу общего количества фенольных антиоксидантов.
В другом дополнительном аспекте, сверхкритический экстракт орегано содержит больше чем приблизительно 4.0%, более предпочтительно, от приблизительно 4.5% до приблизительно 5.5%, и наиболее предпочтительно, приблизительно 5.0%, по весу общего количества фенольных антиоксидантов.
В еще одном аспекте настоящего изобретения, водно-спиртовой экстракт куркумы содержит от приблизительно 5.6% до приблизительно 8.4%, более предпочтительно, от приблизительно 6.3% до приблизительно 7.7%, и наиболее предпочтительно, приблизительно 7%, по весу куркумина.
В другом аспекте настоящего изобретения, водно-спиртовой экстракт розмарина содержит от приблизительно 18.4% до приблизительно 27.6%, более предпочтительно, от приблизительно 20.7% до приблизительно 25.3%, и наиболее предпочтительно, приблизительно 23%, по весу общего количества фенольных антиоксидантов.
В дополнительном варианте реализации, водно-спиртовой экстракт базилика священного содержит от приблизительно 1.6% до приблизительно 2.4%, более предпочтительно, от приблизительно 1.8% до приблизительно 2.2%, и наиболее предпочтительно, приблизительно 2%, по весу урзоловой кислоты.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения, водно-спиртовой экстракт зеленого чая содержит от приблизительно 36% до приблизительно 54%, более предпочтительно, от приблизительно 40.5% до приблизительно 49.5%, и наиболее предпочтительно, приблизительно 45%, по весу полифенолов.
В другом аспекте, водно-спиртовой экстракт хучжана содержит от приблизительно 6.4% до приблизительно 9.6%, более предпочтительно, от приблизительно 7.2% до приблизительно 8.8%, и наиболее предпочтительно, приблизительно 8%, по весу резерватролов.
При другой реализации, водно-спиртовой экстракт китайской золотой нити содержит от приблизительно 4.8% до приблизительно 7.2%, более предпочтительно, от приблизительно 5.4% до приблизительно 6.6%, и наиболее предпочтительно, приблизительно 6%, по весу берберина.
В дополнительном аспекте, водно-спиртовой экстракт барбариса содержит от приблизительно 4.8% до приблизительно 7.2%, более предпочтительно, от приблизительно 5.4% до приблизительно 6.6%, и наиболее предпочтительно, приблизительно 6%, по весу берберина.
В альтернативном аспекте настоящего изобретения, указанный состав содержит:
(A) от приблизительно 4.5% до приблизительно 7.5% по весу водно-спиртового экстракта имбиря, отличающегося тем, что указанный экстракт содержит от приблизительно 2.4% до приблизительно 3.6% по весу жгучих соединений;
(B) от приблизительно 5.5% до приблизительно 8.5% по весу сверхкритического экстракта имбиря, отличающегося тем, что указанный экстракт содержит от приблизительно 24% до приблизительно 36% по весу жгучих соединений и от приблизительно 6.4% до приблизительно 9.6% по весу цингиберена;
(C) от приблизительно 1.0% до приблизительно 1.5% по весу сверхкритического экстракта куркумы, отличающегося тем, что указанный экстракт содержит от приблизительно 36% до приблизительно 54% по весу турмеронов;
(D) от приблизительно 10.0% до приблизительно 16.0% по весу сверхкритического экстракта розмарина, отличающегося тем, что указанный экстракт содержит от приблизительно 18.4% до приблизительно 27.6% по весу общего количества фенольных антиоксидантов;
(Е) от приблизительно 4.0% до приблизительно 6.0% по весу сверхкритического экстракта орегано, отличающегося тем, что указанный экстракт содержит больше чем приблизительно 4.0% по весу общего количества фенольных антиоксидантов;
(F) от приблизительно 10.0% до приблизительно 16.0% по весу водно-спиртового экстракта куркумы, отличающегося тем, что указанный экстракт содержит от приблизительно 5.6% до приблизительно 8.4% по весу куркумина;
(G) от приблизительно 5.5% до приблизительно 8.0% по весу водно-спиртового экстракта розмарина, отличающегося тем, что указанный экстракт содержит от приблизительно 18.4% до приблизительно 27.6% по весу общего количества фенольных антиоксидантов;
(Н) от приблизительно 10.0% до приблизительно 16.0% по весу водно-спиртового экстракта базилика священного, отличающегося тем, что указанный экстракт содержит от приблизительно 1.6% до приблизительно 2.4% по весу урзоловой кислоты;
(I) от приблизительно 10.0% до приблизительно 16.0% по весу водно-спиртового экстракта зеленого чая, отличающегося тем, что указанный экстракт содержит от приблизительно 36% до приблизительно 54% по весу полифенолов;
(J) от приблизительно 8.0% до приблизительно 12.0% по весу водно-спиртового экстракта хучжана, отличающегося тем, что указанный экстракт содержит от приблизительно 6.4% до приблизительно 9.6% по весу резерватролов;
(K) от приблизительно 4.0% до приблизительно 6.0% по весу водно-спиртового экстракта китайской золотой нити, отличающегося тем, что указанный экстракт содержит от приблизительно 4.8% до приблизительно 7.2% по весу берберина;
(L) от приблизительно 4.0% до приблизительно 6.0% по весу водно-спиртового экстракта барбариса, отличающегося тем, что указанный экстракт содержит от приблизительно 4.8% до приблизительно 7.2% по весу берберина; и
(М) от приблизительно 2.0% до приблизительно 3.0% по весу водно-спиртового экстракта Scutellaria baicalensis;
и отличается тем, что указанный состав дополнительно содержит:
(i) указанный сверхкритический экстракт имбиря и указанный водно-спиртовой экстракт имбиря в весовом соотношении от приблизительно 0.8 до приблизительно 1.4 частей сверхкритического экстракта на 1 часть водно-спиртового экстракта;
(ii) указанный водно-спиртовой экстракт куркумы и указанный сверхкритический экстракт куркумы в весовом соотношении от приблизительно 8 до приблизительно 12 частей водно-спиртового экстракта на 1 часть сверхкритического экстракта и
(iii) указанный сверхкритический экстракт розмарина и указанный водно-спиртовой экстракт розмарина в весовом соотношении от приблизительно 1.6 до приблизительно 2.4 частей сверхкритического экстракта на 1 часть водно-спиртового экстракта.
В альтернативном аспекте, состав согласно настоящему изобретению содержит дополнительный агент, выбранный из группы, состоящей из противоопухолевых агентов, агентов, ингибирующих рост, и питательных веществ.
В таблице 1 приведен предпочтительный вариант реализации состава для перорального назначения, за исключением неактивных ингредиентов, для применения в способах согласно настоящему изобретению. Количества, перечисленные в таблице 1, представляют предпочтительные дозировки перечисленных ингредиентов.
ТАБЛИЦА 1
Трава
Тип экстракта
Часть растения
Кол-во (мг)
Розмарин
сверхкритический
лист
100
Розмарин
водно-спиртовой (23% ТФК 34.5 мг)
лист
50
Куркума
сверхкритический (45% турмеронов 4.5 мг)
ризом
10
Куркума
водно-спиртовой (7% куркумина 7 мг)
ризом
100
Имбирь
сверхкритический
(30% жгучих соединений 16.2 мг 8% цингиберена)
ризом
54
Имбирь
водно-спиртовой (3% жгучих соединений)
ризом
46
Базилик священный
водно-спиртовой (2% урзоловой кислоты 2 мг)
лист
100
Зеленый чай
водно-спиртовой (45% полифенолов 45 мг)
лист
100
Хучжан
водно-спиртовой (8% резерватролов 6.4 мг)
корень и ризом
80
Китайская золотая нить
водно-спиртовой (6% берберина)
корень
40
Барбарис
водно-спиртовой (6% берберина 2.4 мг)
корень
40
Орегано
сверхкритический (≥4.0% ТФК 1.8 мг)
лист
40
Scutellaria baicalensis
водно-спиртовой (5:1)
корень
20
Предпочтительно, состав, приведенный в таблице 1, также содержит оливковое масло однократного прессования и желтый пчелиный воск.
Способы настоящего изобретения
2
Составы настоящего изобретения, как правило, содержат стандартизированные концентрированные экстракты из растительных продуктов (имбирь, розмарин, корень куркумы, базилик священный, зеленый чай, хучжан, китайская золотая нить, барбарис, орегано и шлемник байкальский), полученные сверхкритическим СO, обычно потребляемых в восточном питании.
Составы согласно настоящему изобретению исследовали в отношении их антипролиферативного действия на клетки РС3 человека и специфично анализировали в отношении их влияния на метаболизм эйкозаноидов в этой клеточной линии рака предстательной железы. Обнаружили, что составы согласно настоящему изобретению приводят к зависящему от концентрации ингибированию активности клонированных СОХ-1, СОХ-2 и 5-LOX с более сильным по сравнению с ингибированием образования PGE2 ингибированием образования 5-НЕТЕ.
Было обнаружено, что при исследовании на интактных клетках РС3 составы согласно настоящему изобретению были наиболее действенными в отношении 12-LOX, затем 5-LOX и наконец СОХ активностей. Удивительно, что появление 13-S-HODE в клетках РС3 было за счет присутствия этого эйкозаноида в самом составе согласно настоящему изобретению, но не стимуляции активности 15-LOX в клетках. Зависящее от концентрации ингибирование пролиферации клеток РС3 было связано с селективным G2/M арестом клеточного цикла и индукцией апоптоза, что подтверждается проточной цитометрией клеток РС3, окрашенных против аннексина V и фосфатидилинозитола.
Составы согласно настоящему изобретению также вызывали зависящую от концентрации негативную регуляцию экспрессии 5-LOX и 12-LOX, хотя при высоких концентрациях была замечена позитивная регуляция экспрессии COX-2. Определили статус фосфорилирования некоторых клеточных сигнал-передающих белков. Составы согласно настоящему изобретению вызывали усиление фосфорилирования р21, но подавляли фосфорилирование белков Rb и STAT1. Снижение количества белков pRb, как было показано, происходило вследствие ингибирования 12-LOX и снижения уровня 12-НЕТЕ в клетках. Последующее добавление 12-НЕТЕ к клеткам, обработанным составами согласно настоящему изобретению, приводило к исчезновению способности составов согласно настоящему изобретению ингибировать клеточную пролиферацию, и, соответственно, 12-НЕТЕ блокировал способность составов согласно настоящему изобретению подавлять фосфорилирование белка Rb.
Был сделан вывод, что в основе эффективного контроля пролиферации клеток рака предстательной железы человека составами согласно настоящему изобретению лежит несколько механизмов, но он в том числе включает регуляцию аберрантного метаболизма эйкозаноидов в опухолевой клетке, такого как 12-LOX; применение эйкозаноидных продуктов растительного происхождения, таких как 13-(S)-HODE, так же как и восстановление функции белка опухолевого супрессора Rb через регуляцию его статуса фосфорилирования.
Дополнительно, другие эксперименты продемонстрировали, что в то время как указанные составы демонстрировали сильное ингибирование активности циклооксигеназы (клонированных СОХ-1 и СОХ-2), способность снижать рост опухолевой клетки предстательной железы человека, вызываемая этим продуктом, как считают, по большей части происходит вследствие СОХ-2-независимых механизмов. С применением способа, основанного на жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии ЖХ/МС/МС, который одновременно определяет множество эйкозаноидов в клетках и тканях, изучали изменения в метаболизме эйкозаноидов в клетках и тканях, вызванные этим уникальным травяным составом.
Эндогенные уровни внутриклеточных PGE2, 12-НЕТЕ так же, как и 5-НЕТЕ, снижались зависящим от концентрации образом при воздействии указанных составов. Наоборот, клеточные уровни 15-НЕТЕ и 13-HODE повышались. Повышение 13-HODE было существенным, но, как обсуждалось выше, было вследствие высокого содержания 13-HODE в самом травяном составе и не зависело от продуцирования этого важного эйкозаноида самой клеткой. Уровни 13-HODE рассматривали как достаточно высокие, чтобы объяснить ингибирование роста опухолевой клетки, что было независимо проверено добавлением 13-HODE к культурам опухолевых клеток.
Воздействие состава согласно настоящему изобретению на опухолевые клетки человека (клетки РС3 рака предстательной железы) также приводило к негативной регуляции экспрессии 5-LOX, как определено посредством вестерн-блот анализа. Также была оценена способность состава согласно настоящему изобретению блокировать опосредованное арахидоновой кислотой воспаление ушной раковины у мышей. Составы согласно настоящему изобретению вызывали значительное ингибирование синтеза лейкотриена В4 (LTB4) и позитивно регулировали образование 15-НЕТЕ.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу модулирования процесса метаболизма эйкозаноидов в клетках нуждающегося в этом животного, который включает введение указанному животному некоторого количества состава, эффективного для регуляции активности эйкозаноид оксигеназы,
причем указанный состав содержит терапевтически эффективные количества сверхкритических экстрактов розмарина, куркумы, орегано и имбиря и терапевтически эффективные количества водно-спиртовых экстрактов базилика священного, имбиря, куркумы, Scutellaria baicalensis, розмарина, зеленого чая, хучжана, китайской золотой нити и барбариса.
В одном аспекте объекта настоящего изобретения, клетки представляют собой раковые клетки. В одном варианте реализации настоящего изобретения, раковые клетки включают клетки рака предстательной железы, клетки рака молочной железы, клетки рака легкого, клетки рака толстой кишки или их комбинацию.
При альтернативном варианте реализации, процесс метаболизма эйкозаноидов представляет собой нарушенный (аберрантный) метаболизм, связанный с раковой трансформацией клеток, пролиферацией раковых клеток, метастазированием раковых клеток, инвазивностью раковых клеток, измененным раковыми клетками ангиогенезом, измененной раковыми клетками супрессией апоптоза или их комбинацией.
Метаболизм эйкозаноидов. Арахидоновая кислота и ее предшественник, линолевая кислота, вместе с линолиновой кислотой присутствуют в животных жирах и в ряде овощных масел, которые обычно считают потребляемыми в больших количествах в типичном западном рационе по сравнению с восточным рационом. Повышенное потребление указанных жирных кислот обеспечивает повышенную доступность субстрата для оксигеназ, таких как липоксигеназы (LOX) и циклооксигеназы (СОХ), ферментов, которые отвестствены за преобразование эйкозаноидов, таких как арахидоновая кислота, в сигнальные молекулы, такие как простагландины, лейкотриены, липоксины, 13-S-HODE, 5-НЕТЕ и 12-НЕТЕ. Кроме их жизненно важной роли в качестве вторичных мессенджеров во многих важных биологических путях, эти продукты метаболизма эйкозаноидов вовлечены во все аспекты развития, прогрессирования, пролиферации и метастазирования опухоли.
Липоксигеназы и метаболизм эйкозаноидов. Ферменты липоксигеназы (LOX) известны в качестве ключевых регуляторов выживаемости клетки и апоптоза в клетках. Они составляют гетерогенное семейство ферментов, окисляющих жиры в перекисные соединения, которые группируют в соответствии с их специфичностью окисления определенных участков арахидоновой кислоты. LOX были обозначены как 5-, 8-, 12- и 15-LOX изоформы, которые образуют конечные продукты, известные как 5(S)-, 8(S)-, 12(S)- и 15(S)-HETE. ЖХ/МС/МС анализ СОХ и LOX метаболизма в клетках РС3 проводили с применением ранее опубликованного способа. Результаты показали, что составы согласно настоящему изобретению были, как и ожидалось, ингибиторами активности обоих клонированных ферментов СОХ-1 и СОХ-2. Кроме того, они также ингибировали активность клонированного 5-LOX и, фактически, были более действенны как ингибиторы 5-LOX, чем как ингибиторы СОХ. Обработка клеток РС3 в культуре показала, что способность состава согласно настоящему изобретению ингибировать образование PGE2 через ингибирование СОХ была меньше, чем его способность ингибировать 5-LOX, и она, в свою очередь, была меньше, чем опосредованное составом согласно настоящему изобретению ингибирование фермента 12-LOX, который, как известно, важен для пролиферации и образования метастаз рака предстательной железы человека.
12-НЕТЕ. Некоторые линии доказательств сейчас четко связывают 12-LOX с регуляцией развития раковой клетки. Лаборатория K.Honn, в частности, внесла огромный вклад в понимание роли 12-LOX тромбоцитарного типа и его продукта 12(S)-HETE при раке предстательной железы человека. Они сообщили, например, что 12-LOX экспрессируется в некоторых клеточных линиях рака предстательной железы, что ингибиторы 12-LOX, такие как байкалеин или ВНРР, в значительной степени ингибируют метастазы опухоли предстательной железы и что уровни 12-LOX коррелируют со степенью и тяжестью опухолей предстательной железы человека. В недавней элегантной публикации от этой группы также показано, что ингибирование байкалеином роста и пролиферации клеток предстательной железы специфично связано с ингибированием 12-LOX и что спад 12-НЕТЕ коррелирует с потерей фосфорилированных Rb белков. Сниженное фосфорилирование RB, в свою очередь, приводит к тому, что RB белок остается связанным с транскрипционными факторами, необходимыми для синтеза ДНК и, таким образом, приводит к ингибированию пролиферации раковых клеток.
2
2
Существует множество биоактивных липидов, участвующих в воспалении, связанном с раками, такими как ранняя стадия рака предстательной железы. Это включает убедительно подтвержденную документальными доказательствами способность PGE стимулировать пролиферацию опухолевых клеток. Это обычно происходит через избыточную экспрессию СОХ-2 в опухолях, а также, согласно более позднему открытию, через снижение активности PGDH, фермента, отвечающего за метаболизм PGE. Также было показано, что продукты липооксигеназы, такие как 5-НЕТЕ от 5-липоксигеназы и 12-НЕТЕ от 12-липоксигеназы, специфично запускали пролиферацию опухолевых клеток предстательной железы. Поскольку 12-НЕТЕ связана с пролиферацией, метастазированием и ангиогенезом рака предстательной железы, недавно было сделано предположение, что ингибирование 12-LOX представляет собой потенциальную терапевтическую тактику лечения рака предстательной железы. Другие эйкозаноиды, такие как 13-S-HODE, продукт 15-LOX-1 и 15-НЕТЕ, продукт 15-LOX-2, похоже, оказывают противоположное действие на передачу сигналов при раках, особенно при раке предстательной железы, и могут, фактически, быть селективны в своем действии на различные типы опухоли.
Для лучшего понимания роли выбранных биоактивных эйкозаноидов в прогрессировании тканевого воспаления к злокачественному заболеванию авторы настоящего изобретения провели исследование профилей воспаления клеток предстательной железы с применением тандемной масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, разработанной авторами настоящего изобретения. Этот способ позволяет определение "мини-липидомики" образцов клеток или тканей посредством одновременного анализа до 10 эйкозаноидов, полученных от циклооксигеназы, липоксигеназы и/или цитохрома Р450, без необходимости добавления экзогенных субстратов, таких как арахидоновая кислота или линолевая кислота.
Для лучшего понимания роли эйкозаноидов при раках человека авторы настоящего изобретения применяли этот новый способ анализа воспаления ткани в клетках РС3 для определения влияния составов согласно настоящему изобретению на эйкозаноиды, полученные от циклооксигеназы и липоксигеназы, которые считаются важными для пролиферации указанного заболевания человека. Авторы настоящего изобретения определили, какое влияние, если таковое есть, составы согласно настоящему изобретению оказывали на метаболизм эйкозаноидов после ингибирования циклооксигеназной активности. Наши данные указывают на то, что указанный продукт, который основан на многих растительных компонентах, ингибирует активности 5-LOX и 12-LOX. Последнее открытие может представлять особый интерес, так как было обнаружено, что супрессия активности 12-LOX специфично ассоциирована с ингибированием пролиферации опухолевых клеток и фосфорилирования Rb и, таким образом, с возвращением супрессирующей опухоль активности рефракторным к гормонам опухолевым клеткам предстательной железы РС3.
Таким образом, при предпочтительном варианте реализации, указанный эйкозаноид выбран из группы, состоящей из арахидоновой кислоты и линолиновой кислоты.
При более предпочтительном варианте реализации, указанный эйкозаноид представляет собой арахидоновую кислоту.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения, указанная эйкозаноид оксигеназа представляет собой циклооксигеназу-1, циклооксигеназу-2,5-липоксигеназу, 12-липоксигеназу или их комбинацию.
В предпочтительном варианте реализации, указанная эйкозаноид оксигеназа представляет собой 12-липоксигеназу.
При другом предпочтительном варианте реализации, указанная эйкозаноид оксигеназа представляет собой 5-липоксигеназу.
Циклооксигеназы. Ферменты циклооксигеназы, которые опосредуют метаболизм эйкозаноидов, представлены двумя видами: циклооксигеназа-1 (СОХ-1), которая конститутивно экспрессируется во многих тканях, и циклооксигеназа-2 (СОХ-2), которая обычно индуцируется во время болезненных состояний, таких как воспаление и рак. Данные многих исследований молекулярной и клеточной биологии также указывают на то, что ген СОХ-2 представляет собой ген раннего ростового ответа, влияющий на пути модуляции апоптоза, пролиферации, адгезии, ангиогенеза и дифференцировки.
Ингибирование СОХ и особенно СОХ-2 долгие годы было основной целью дизайна противовоспалительных лекарств, тем не менее, лишь недавно была обнаружена связь между экспрессией СОХ-2 и раком. Наблюдения по некоторым популяционным исследованиям документально доказали значительное снижение риска колоректального рака у людей, которые регулярно принимают нестероидные противовоспалительные препараты, которые имеют потенциальную СОХ ингибиторную активность. Гистологические исследования, которые отслеживали развитие колоректальной опухоли, определили, что большинство колоректальных опухолей человека и животного экспрессируют повышенные уровни СОХ-2, тогда как примыкающие нормальные клетки колоректального эпителия имеют низкие или недетектируемые уровни СОХ-2. Подобно этим наблюдениям, некоторые лаборатории также сообщили, что экспрессия СОХ-2 повышена в клетках опухоли предстательной железы во время как инициации, так и прогрессирования, по сравнению с нормальными эпителиальными клетками, тем не менее, это открытие спорно.
Впрочем, ясно, что некоторые фармакологические СОХ-2 ингибиторные препараты показали способность подавлять рост клеток рака предстательной железы in vitro, индуцировать апоптоз и подавлять рост ксенотрансплантатов опухоли предстательной железы человека в модели иммунодефицитной мыши или трансгенных моделях рака предстательной железы, таких как мышь TRAMP. Поскольку существует непоределенность в отношении, является ли СОХ-2 фактором развития или прогрессирования рака предстательной железы, считают, что некоторые из известных ингибиторов СОХ оказывают несколько СОХ-независимых противораковых воздействий, и эти действия, похоже, различаются среди ингибиторов.
В этом отношении, очень интересно, что многие растения, которые выделяются в региональном рационе, содержат вещества, имеющие СОХ ингибиторную активность. Экстракты из этих растений, как в необработанном состоянии, так и в виде выделенных компонентов, как было обнаружено, имеют потенциальную противовоспалительную и противораковую активности. Салициловая кислота, например, является традиционным ингибирующим воспаление агентом, обнаруженным в коре ивы, и химическое производное этого агента, аспирин, остается одним из самых широко используемых в мире ингибирующих СОХ веществ. В данном исследовании авторы настоящего изобретения рассмотрели потенциальную привлекательность уникального коммерчески доступного травяного препарата, имеющего состав согласно настоящему изобретению, в отношении его способности оказывать влияние на ферментативные активности СОХ-1 и СОХ-2 и влиять на поведение широко используемой клеточной модельной системы рака предстательной железы человека - клеток LNCaP. Как детально обсуждалось выше, составы согласно настоящему изобретению содержат десять стандартизированных травяных экстрактов (розмарина, куркумы, имбиря, базилика священного, зеленого чая, хучжана, китайской золотой нити, барбариса, орегано и Scutellaria baicalensis). Каждая из этих трав, как было показано, содержит уникальные химические составляющие, которые влияют на активность или экспрессию СОХ, и каждая была исследована либо на противовоспалительную, либо на противораковую активность. Это тестирование имеет тенденцию к фокусированию на доминантном соединении, обнаруженном в любой из перечисленных трав, тем не менее, есть основания полагать, что может быть дополнительная польза в комбинировании множества травяных/диетических агентов для применения в отношении заболеваний, таких как рак. Сложные и химически разнообразные составляющие, присутствующие в составе согласно настоящему изобретению, каждая из которых является неотъемлемым компонентом типичного азиатского рациона, могут быть более эффективными против рака предстательной железы, чем экстракт каждой отдельно взятой травы сам по себе.
Таким образом, в альтернативном аспекте настоящего изобретения, указанная эйкозаноид оксигеназа представляет собой циклооксигеназу-1, циклооксигеназу-2 или их комбинацию.
При предпочтительном варианте реализации, указанная эйкозаноид оксигеназа представляет собой циклооксигеназу-1.
В дополнительном предпочтительном варианте реализации, указанная эйкозаноид оксигеназа представляет собой циклооксигеназу-2.
В альтернативном аспекте настоящего изобретения, регуляция активности эйкозаноид оксигеназы представляет собой ингибирование оксигеназы.
В альтернативном аспекте настоящего изобретения, модулирование процесса метаболизма эйкозаноидов включает ингибирование активности NF-кВ в клетках животного.
Настоящее изобретение также относится к способу доставки 13-S-HODE нуждающемуся в этом животному, который включает введение указанному животному состава, содержащего терапевтически эффективные количества сверхкритических экстрактов розмарина, куркумы, орегано и имбиря и терапевтически эффективные количества водно-спиртовых экстрактов базилика священного, имбиря, куркумы, Scutellaria baicalensis, розмарина, зеленого чая, хучжана, китайской золотой нити и барбариса.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу ингибирования опосредованного арахидоновой кислотой воспаления у нуждающегося в этом животного, который включает введение указанному животному состава, содержащего терапевтически эффективные количества сверхкритических экстрактов розмарина, куркумы, орегано и имбиря и терапевтически эффективные количества водно-спиртовых экстрактов базилика священного, имбиря, куркумы, Scutellaria baicalensis, розмарина, зеленого чая, хучжана, китайской золотой нити и барбариса.
2
2
NF-кВ. Ядерный фактор кВ представляет собой семейство белков, содержащих Rel домен, присутствующих в цитоплазме всех клеток, где они поддерживаются в неактивном состоянии с участием семейства белков, содержащих анкириновый домен, которое включает IкВα, IкВβ, IкВγ, IкВε, bcl-3, р105 и р100. В неактивном состоянии NF-кВ состоит из гетеротримера р50, р65 и IкВα в цитоплазме; только после его активации и транслокации в ядро происходит последовательность событий, приводящих к инициации транскрипции. Было показано, что большинство канцерогенов, воспалительных агентов и стимуляторов опухолевого роста, включая конденсат сигаретного дыма, форболовый эфир, окадаиковую кислоту, НO и фактор некроза опухоли (TNF), запускают путь активации NF-кВ. Активация NF-кВ включает фосфорилирование, убиквитинирование и деградацию IкВα и фосфорилирование р65, что, в свою очередь, приводит к транслокации NF-кВ в ядро клетки, где он связывается со специфичными респонсивными элементами в ДНК. Фосфорилирование IкВα катализируется IкВα киназой (IKK), которая необходима для активации NF-кВ большинством веществ. NF-кВ, как было показано, регулирует экспрессию некоторого количества генов, чьи продукты вовлечены в онкогенез. Они включают антиапоптические гены (например, сiар, сурвивин, traf, cflip, bfl-1, bcl-2 и bcl-xl), гены ангиогенеза (сох-2, mmp-9, vegf), гены, кодирующие молекулы адгезии, хемокины и воспалительные цитокины; и регуляторные гены клеточного цикла (например, циклин D1, с-mус).
Без привязки к конкретному механизму действия, авторы настоящего изобретения полагают, что составы согласно настоящему изобретению модулируют активность ядерного фактора кВ ("NF-кВ"), который, в свою очередь, регулирует пролиферацию, инвазию и метастазирование опухолевых клеток, ингибирует активизацию NF-кВ по механизму обратной связи и регулирует экспрессию продуктов NF-кВ-регулируемых генов. В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что составы согласно настоящему изобретению ингибируют индуцированный NF-кВ лигандом рецепторный активатор остеокластогенеза, подавляют индуцированную фактором некроза опухоли (TNF) инвазию и делают возможным апоптоз, индуцированный TNF и химиотерапевтическими агентами. Дополнительно, составы согласно настоящему изобретению подавляют активацию NF-кВ, индуцированную TNF и конденсатом сигаретного дыма. Кроме того, составы согласно настоящему изобретению негативно регулируют экспрессию продуктов NF-кВ-регулируемых генов, участвующих в антиапоптозе, включая белок-ингибитор апоптоза 1/2, Bcl-2, Bcl-xL, схожий с FADD интерлейкин-1β-превращающий фермент (FLICE)/белок, ингибирующий каспазу-8, TNF рецептор-ассоциированный фактор 1 и сурвивин, и дополнительно негативно регулируют экспрессию продуктов генов, участвующих в ангиогенезе, включая фактор роста эндотелия сосудов, циклооксигеназу-2, фактор межклеточной адгезии и матриксную металлопротеиназу. Эти результаты коррелируют с потенцированием апоптоза, индуцированного TNF и химиотерапевтическими агентами. Итоговые результаты, полученные авторами настоящего изобретения, свидетельствуют о том, что составы согласно настоящему изобретению подавляют остеокластогенез, ингибируют инвазию и потенцируют апоптоз через негативную регуляцию активации NF-кВ и негативную регуляцию продуктов NF-кВ-регулируемых генов.
Авторы настоящего изобретения исследовали некоторые эффекты составов согласно настоящему изобретению на активацию пути NF-кВ и на продукты NF-кВ-регулируемых генов, которые контролируют выживаемость, пролиферацию, инвазию, ангиогенез и метастазирование опухолевых клеток, открыв, что составы согласно настоящему изобретению ингибируют RANKL-индуцированный остеокластогенез и TNF-индуцированную инвазию и потенцируют апоптоз, индуцированный TNF и химиотерапевтическими агентами в различных опухолевых клеточных линиях. Экспрессия продуктов генов, ингибирующих апоптоз, включая IАР1, Bfl-1/A1, Bcl-2, TRAF1 и cFLIP, и экспрессия продуктов генов, вовлеченных в метастазирование, включая ММР-9, COX-2, ICAM-1 и VEGF, были также негативно регулированы составами согласно настоящему изобретению.
Данные авторов настоящего изобретения свидетельствуют о том, что составы согласно настоящему изобретению подавляют NF-кВ, активированный посредством TNF в клетках КВМ-5 миелоидной лейкемии человека и конденсатом сигаретного дыма в клетках Н1299 аденокарциномы легкого. Это первое исследование, которое направлено на изучение действия составов согласно настоящему изобретению на NF-кВ, активированный различными стимулами. Эти результаты предполагают, что составы согласно настоящему изобретению действуют на этапе, общем для обоих указанных агентов. Было показано, что некоторые гены, участвующие в пролиферации и метастазировании рака, регулируются NF-кВ (см., например, Aggarwal, В.В. (2004) Nuclear factor-kappa В: the enemy within. Cancer Cell, 6, 203-208.) Авторы настоящего изобретения показали, что составы согласно настоящему изобретению ингибируют экспрессию СОХ-2, ММР-9 и VEGF, регулируемых NF-кВ.
Дополнительно, в то время как в недавних сообщениях было предположено, что составы согласно настоящему изобретению подавляют ферментативные активности как СОХ-1, так и СОХ-2 (см., например, Bemis, D.L., Capodice, J.L., Anastasiadis, A.G., Katz, A.E. и Buttyan, R. (2005) Zyflamend, a unique herbal preparation with nonselective COX inhibitory activity, induces apoptosis of prostate cancer cells that lack СОХ-2 expression. Nutr. Cancer., 52, 202-212), авторы настоящего изобретения показали, что составы согласно настоящему изобретению ингибируют экспрессию белка СОХ-2.
Данные авторов настоящего изобретения указывают на то, что составы согласно настоящему изобретению осуществляют свое противораковое действие на NF-кВ-регулируемых путях (реакций) через непосредственное ингибирование NF-кВ. NF-кВ, как известно, регулирует экспрессию IАР1, xIAP, Bfl-1/A1, TRAF1, Bcl-2, cFLIP и сурвивина, и их чрезмерная экспрессия в ряде опухолей была связана с выживаемостью, хеморезистентностью и радиорезистентностью. (См., например, Takada, Y., Singh, S. и Aggarwal, В.В. (2004) Identification of a p65 peptide that selectively inhibits NF-kappa В activation induced by various inflammatory stimuli and its role in down-regulation of NF-kappa B-mediated gene expression and up-regulation of apoptosis. J. Biol. Chem, 279, 15096-15104.) Данные авторов настоящего изобретения свидетельствуют о том, что обработка составами согласно настоящему изобретению негативно регулирует большинство из указанных генных продуктов. В предыдущих сообщениях было предположено, что составы согласно настоящему изобретению индуцируют апоптоз через каспаз-опосредованный путь в клетках рака предстательной железы человека (см., например, Bemis, и др., (2005)). Результаты авторов настоящего изобретения также показывают, что составы согласно настоящему изобретению потенцируют апоптическое действие TNF, таксола и доксорубицина. Это действие схоже с теми, о которых сообщали при использовании специфичных ингибиторов NF-кВ (см., например, Takada, и др. (2004)).
Снова, без привязки к конкретному механизму действия, авторы настоящего изобретения полагают, что антипролиферативное, проапоптическое, антиинвазивное, антиостеокластогенное, антиангиогенное и антиметастатическое действие, наблюдаемое при введении составов согласно настоящему изобретению, опосредовано супрессией продуктов NF-кВ-регулируемых генов. Тогда как каждая из трав, которые были использованы в рецептуре составов согласно настоящему изобретению, как известно, содержит уникальные противовоспалительные и противораковые соединения, одним общим свойством компонентов составов согласно настоящему изобретению, похоже, является способность подавлять активацию NF-кВ.
Тот факт, что составы согласно настоящему изобретению получены из природных травяных источников и легко доступны из здоровой пищи и пищевых добавок, делает их более удобными и желательными средствами предотвращения и лечения рака, чем отпускаемые по рецепту лекарственные средства от рака.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу модулирования уровня продуктов NF-кВ-регулируемых генов в клетках нуждающегося в этом животного, который включает введение указанному животному состава, содержащего терапевтически эффективные количества сверхкритических экстрактов розмарина, куркумы, орегано и имбиря и терапевтически эффективные количества водно-спиртовых экстрактов базилика священного, имбиря, куркумы, Scutellaria baicalensis, розмарина, зеленого чая, хучжана, китайской золотой нити и барбариса.
Животное во всех способах согласно настоящему изобретению, изложенных выше, может представлять собой млекопитающее, такое как мышь, крыса, кошка, собака, лошадь, корова или другое одомашненное животное, или быть человеком. В предпочтительном варианте реализации, животное представляет собой человека. Дополнительно к применению для лечения заболеваний, расстройств и состояний человека, способы согласно настоящему изобретению могут иметь ветеринарные применения.
Пути введения
При предпочтительном варианте реализации, состав для перорального применения находится в форме одной или более капсул, одной или более таблеток или одной или более пилюль.
Составы согласно настоящему изобретению предпочтительно доставляют пациенту посредством фармацевтически приемлемого носителя. Такие носители хорошо известны в данной области и обычно находятся либо в твердой, либо в жидкой форме. Фармацевтические препараты, находящиеся в твердой форме, которые могут быть приготовлены согласно объекту изобретения, включают порошки, таблетки, диспергируемые гранулы, капсулы, облатки и суппозитории. В целом, препараты, находящиеся в твердой форме, содержат от приблизительно 5% до приблизительно 90% по весу активного вещества.
Твердый носитель может быть одним или более веществами, которые могут также действовать как разбавители, ароматизирующие вещества, солюбилизаторы, лубриканты, суспендирующие вещества, связывающие вещества или дезинтегрирующие таблетку вещества; он также может быть герметизирующим материалом. В порошках носитель представляет собой высокодисперсное твердое вещество, которое находится в смеси с вязким активным соединением. В таблетках активное соединение смешано с носителем, имеющим необходимые связующие свойства, в подходящих пропорциях и уплотнено в желаемую форму и размер. Подходящие твердые носители включают: карбонат магния, стеарат магния, тальк, сахар, лактозу, пектин, декстрин, крахмал, желатин, трагант, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрия, низкоплавкий воск, какао-масло и тому подобные. Термин "препарат" надо понимать включающим подбор состава активного соединения с герметизирующими материалами, такими как носитель, который может обеспечить капсулу, в которой активный компонент (с другими носителями или без них) окружен носителем, который тем самым связан с ним. Также включены облатки. Таблетки, порошки, облатки и капсулы могут быть использованы как твердые лекарственные формы, подходящие для перорального введения. При желании, с целью удобства или принятия пациентом, фармацевтические таблетки, приготовленные согласно настоящему изобретению, могут быть приготовлены в жевательной форме, с применением способов, хорошо известных в данной области.
Для приготовления суппозиториев сначала плавят легкоплавкий воск, такой как смесь глицеридов жирной кислоты или какао-масло, и гомогенно диспергируют в нем активный ингредиент, например, помешивая. Плавленную гомогенную смесь затем выливали в удобного размера формы, позволяли охладиться и тем самым затвердеть.
Препараты в жидкой форме включают растворы, суспензии и эмульсии. В качестве примера могут быть упомянуты вода или растворы воды/пропиленгликоля для парентеральной инъекции. Жидкие препараты также могут быть в форме раствора в водном растворе полиэтиленгликоля. Водные растворы, подходящие для перорального применения, могут быть приготовлены посредством растворения активного компонента в воде и добавления подходящего окрашивающего вещества, вкусоароматических добавок, стабилизаторов и загущающих компонентов, если требуется. Водные суспензии, подходящие для перорального применения, могут быть сделаны диспергированием высокодисперсного активного компонента в воде с вязким материалом, а именно природными или синтетическими камедями, смолами, метилцеллюлозой, карбоксиметилцеллюлозой натрия и другими хорошо известными суспендирующими веществами. Жидкие фармацевтические препараты могут включать до 100% по весу активного вещества изобретения.
В качестве подходящих носителей также рассматривают препараты в твердой форме, которые предназначены для перевода, непосредственно перед применением, в препараты жидкой формы, либо для перорального, либо для парентерального введения. Такие жидкие формы включают растворы, суспензии и эмульсии. Именно эти препараты в твердой форме наиболее удобно обеспечены в стандартной лекарственной форме и в этом виде применяются для обеспечения отдельной жидкой единицы дозирования. С другой стороны, достаточное количество твердого вещества может быть обеспечено таким образом, что после перевода в жидкую форму могут быть получены множество отдельных жидких доз посредством измерения предопределенных объемов препаратов в жидкой форме, например, шприцем, чайной ложкой или другой волюметрической емкостью. Когда множество жидких доз приготовлены таким образом, предпочтительно держать неиспользованную часть указанных жидких доз при низкой температуре (а именно, при охлаждении) с целью замедлить возможное разложение. Препараты в твердой форме, предназначенные для перевода в жидкую форму, могут содержать, дополнительно к активному материалу, ароматизирующие вещества, окрашивающие вещества, стабилизаторы, буферы, искусственные и природные подсластители, дисперганты, загустители, солюбилизирующие вещества и тому подобные. Жидкостью, применяемой для приготовления пригодных препаратов в жидкой форме, может быть вода, изотоническая вода, этанол, глицерин, пропиленгликоль и тому подобные, так же как и их смеси. Естественно, применяемая жидкость будет выбрана в зависимости от пути введения. Например, жидкие препараты, содержащие большие количества этанола, не подходят для парентерального применения.
Фармацевтические препараты согласно настоящему изобретению могут содержать один или более консервантов, хорошо известных в данной области, таких как бензойная кислота, сорбиновая кислота, метилпарабен, пропилпарабен и этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA). Консерванты обычно присутствуют в количествах до приблизительно 1% и предпочтительно от приблизительно 0.05 до приблизительно 0.5% по весу фармацевтического состава.
Подходящие для целей настоящего изобретения буферные системы включают лимонную кислоту-цитрат натрия, фосфорную кислоту-фосфат натрия и уксусную кислоту-ацетат натрия в количествах до приблизительно 1% и предпочтительно от приблизительно 0.05 до приблизительно 0.5% по весу фармацевтического состава. Подходящие суспендирующие вещества или загустители включают целлюлозоподобную метилцеллюлозу, карагенподобную альгиновую кислоту и ее производные, ксантановую камедь, желатин, гуммиарабик и микрокристаллическую целлюлозу в количествах до приблизительно 20% и предпочтительно от приблизительно 1% до приблизительно 15% по весу фармацевтического состава.
Подсластители, которые могут быть использованы, включают такие подсластители, как природные, так и искусственные, которые хорошо известны в данной области. Подслащивающие вещества, такие как моносахариды, дисахариды и полисахариды, такие как твердые ксилоза, рибоза, глюкоза, манноза, галактоза, фруктоза, декстроза, сахаробиоза, мальтоза, частично гидролизованный крахмал или кукурузная патока, и сахарные спирты, такие как сорбитол, ксилитол, маннитол и их смеси, могут быть использованы в количествах от приблизительно 10% до приблизительно 60% и предпочтительно от приблизительно 20% до приблизительно 50% по весу фармацевтического состава. Водорастворимые искусственные подсластители, такие как сахарин и соли сахарина, такие как соли натрия или кальция, соли цикламата, ацесульфам калия, аспартам и тому подобные, и их смеси, могут быть использованы в количествах от приблизительно 0.001% до приблизительно 5% по весу состава.
Ароматизирующие вещества, которые могут быть использованы в фармацевтических продуктах согласно настоящему изобретению, включают как природные, так и искусственные вкусоароматические добавки и мяту, такие как мята перечная, ментол, ваниль, искусственная ваниль, шоколад, искусственный шоколад, корица, ряд фруктовых вкусоароматических добавок, как отдельно, так и смешанные, в количествах от приблизительно 0.5% до приблизительно 5% по весу фармацевтического состава.
Окрашивающие вещества, применяемые в настоящем изобретении, включают пигменты, которые могут быть включены в количествах до приблизительно 6% по весу состава. Предпочтительный пигмент, диоксид титана, может присутствовать в количествах до приблизительно 1%. Также окрашивающие вещества могут включать другие красители, подходящие для пищевых, лекарственных и косметических применений, известные как F.D.&C. красители, и тому подобные. Такие красители обычно присутствуют в количествах до приблизительно 0.25% и предпочтительно от приблизительно 0.05% до приблизительно 0.2% по весу фармацевтического состава.
Полный перечень F.D.&C. и D.&C. красителей и соответствующих им химических структур может быть найден в Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, в томе 5, на страницах 857-884, текст которого, соответственно, включен в данное описание посредством ссылки.
Подходящие солюбилизаторы включают спирт, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и тому подобные и могут быть применены для растворения вкусоароматических добавок. Солюбилизирующие вещества обычно присутствуют в количествах до приблизительно 10%; предпочтительно от приблизительно 2% до приблизительно 5% по весу фармацевтического состава.
Скользящие вещества, которые при желании можно применять в быстрорастворимых составах, включают силиконовые масла или жидкости, такие как замещенные и незамещенные полисилоксаны, например диметилполисилоксан, также известный как диметикон. Могут быть использованы другие хорошо известные скользящие вещества.
Фармацевтический препарат может также быть приготовлен в стандартной лекарственной форме. В такой форме препарат подразделяется на унифицированные дозы, содержащие подходящие количества активного компонента. Стандартная лекарственная форма может представлять собой упакованный препарат, упаковку, содержащую отдельные количества препарата, например пакетированные таблетки, капсулы и порошки в виалах или ампулах. Стандартная лекарственная форма также может представлять собой капсулу, облатку или таблетку саму по себе или может представлять собой подходящее количество любой из этих упакованных форм.
Не ожидается, что соединения согласно настоящему изобретению будут проявлять значительные нежелательные взаимодействия с другими синтетическими или встречающимися в природе веществами. Таким образом, соединение согласно настоящему изобретению может быть введено в комбинации с другими соединениями и составами, применяемыми, например, для лечения рака. В частности, соединения согласно настоящему изобретению можно вводить в комбинации с другими соединениями согласно настоящему изобретению, химиотерапевтическими веществами и прочим.
Оптимальные фармацевтические составы будут определены специалистом в данной области в зависимости от факторов, таких как путь введения и желательная дозировка. См., например, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18-e издание (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), стр.1435-1712, раскрытие которого включено в данную заявку посредством ссылки. Такие составы могут влиять на физическое состояние, стабильность, уровень высвобождения in vivo и уровень чистоты in vivo настоящих терапевтических веществ согласно настоящему изобретению.
Дозировка
Уровни дозировки активных ингредиентов соединения или состава в диапазоне порядка приблизительно 0.001 мг до приблизительно 100 мг на килограмм массы тела применимы для лечения вышеперечисленных состояний, с предпочтительными уровнями в диапазоне от 200 мг в день до 1600 мг в день. Соединения и составы согласно настоящему изобретению обычно можно давать двумя или тремя дозами ежедневно. Начинать с низкой дозы (200-300 мг) дважды в день и медленно переходить на более высокие дозы, при необходимости, является предпочтительной стратегией. Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с несущими материалами для приготовления однократной лекарственной формы, будет варьироваться в зависимости от реципиента, которого лечат, и конкретного варианта введения.
Понятно, тем не менее, что специфичный уровень дозы для любого отдельного пациента будет зависеть от множества факторов, включая активность применяемого специфичного соединения; возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и диеты пациента; времени введения; уровня экскреции; комбинации лекарств; тяжести конкретного расстройства, от которого лечат; и формы введения. Средний специалист в данной области поймет вариативность таких факторов и сможет установить специфичные уровни дозировки путем не более чем рутинного экспериментирования.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры являются показательными для настоящего изобретения и не предполагается, что они накладывают на него какие-либо ограничения. Если не указано иначе, все процентные содержания исходят из 100% по весу конечного состава.
Основные материалы и методы
7
Zyflamend, полученный от New Chapter Inc. (Сент-Луис, Миссури), растворяли в диметилсульфоксиде ("ДМСО") в виде 10 мг/мл сток-раствора и хранили при -20°С. Полученный из бактерии фактор некроза опухоли альфа ("TNF-α") человека, очищенный до гомогенности со специфичной активностью 5×10 ед/мг, был любезно предоставлен Genentech, Inc. (Южный Сан-Франциско, Калифорния). Пенициллин, стрептомицин, среда RPMI 1640, среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков ("IMDM"), среда D-MEM/F12 и эмбриональная бычья сыворотка ("ЭБС") были получены от Invitrogen (Гранд-Айленд, Нью-Йорк). Следующие поликлональные антитела были получены от Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Санта-Круз, Калифорния): против матриксной металлопротеиназы 9 ("ММР-9"); против фактора межклеточной адгезии ("ICAM"); против белка-ингибитора апоптоза 1/2 ("IAP 1/2"); анти-Всl-2; анти-Bfl-1/А1 и против фактора, ассоциированного с рецептором TNF ("TRAF1"). Антитела против СОХ-2 и XIAP были получены от BD Biosciences (Сан-Диего, Калифорния). Конденсат сигаретного дыма ("КСД"), приготовленный, как описано в Anto, R.J., Mukhopadhyay, A., Shishodia, S., Gairola, C.G. и Aggarwal, В.В. (2002) Cigarette smoke condensate activates nuclear transcription factor-kappa В through phosphorylation and degradation of I kappa B(alpha): correlation with induction of cyclooxygenase-2. Carcinogenesis, 23, 1511-1518, был любезно предоставлен Доктором G. Gairola (Университет Кентукки, Лексингтон, Кентукки). Антитело против фактора роста эндотелия сосудов ("VEGF") было приобретено у NeoMarkers (Фримонт, Калифорния). Антитело против сурвивина было получено от R&B Systems (Миннеаполис, Миннесота). Антитела против схожего с FADD интерлейкин-1β-превращающего фермента ("FLICE")/белка, ингибирующего каспазу-8 ("cFLIP"), были любезно предоставлены Imgenex (Сан-Диего, Калифорния).
Клеточные линии, используемые в работе авторов настоящего изобретения, включающие клеточные линии немелкоклеточной карциномы легкого человека (Н1299), миелолейкоза человека (KВМ-5) и множественной миеломы человека (U266), макрофагов мыши (RAW 264.7), были получены от American Type Culture Collection (Манассас, Виргиния). Клетки Н1299 и U266 культивировали в среде RPMI 1640 с 10% ЭБС. Клетки KВМ-5 культивировали в IMDM с 15% ЭБС. Клетки RAW 264.7 культивировали в среде D-MEM/F12, дополненной 10% ЭБС. Все среды были дополнены 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
ПРИМЕР 1
Ингибирование роста клеток
В качестве общей отправной точки исследовали относительную способность продукта или лекарства ингибировать рост клеток в культуре с применением устойчивых клеточных линий грызунов и человека. Целью этого было обеспечение возможности отличать те концентрации, которые либо неэффективны, либо токсичны, от тех, которые значительно ингибиторные или "эффективные". Любое исследование механизмов действия данного продукта следует проводить при концентрациях, которые вызывают некоторое, но не сильное ингибирование роста или массовую смерть клеток. Кроме того, эти виды исследований обеспечивают начальную оценку зависящих от времени изменений в клеточных процессах. То есть когда опосредованные лекарством события, происходящие соотносительно с первыми признаками ингибирования роста или клеточной гибели, различимы. Это, в свою очередь, может предположить последовательность событий, которые в этом задействованы.
В большинстве описанных исследований применяют клеточные линии рака предстательной железы человека. Основанием для этого служит то, что это представляющая интерес клеточная линия, указанные клеточные линии были охарактеризованы нами в отношении метаболизма эйкозаноидов, и авторы настоящего изобретения участвуют в ведущемся клиническом испытании составов согласно настоящему изобретению в лечении/предотвращении интраэпителиальной неоплазии предстательной железы (PIN). Тем не менее, по мере получения данных, возможно применение других клеточных линий и моделей с использованием животных, которые имеют весьма отдаленное отношение к раку предстательной железы самому по себе, но вместо этого пригодны для понимания общей противовоспалительной активности и механизмов.
Фигура 1 показывает ингибиторное действие соединений согласно настоящему изобретению на рост клеточных линий рака легких человека А549 и рака предстательной железы человека РС3. Была применена пероральная рецептура состава. Состав добавляли к клеткам в культуре и оценивали относительное ингибирование роста клеток после 72 часов продолжительного воздействия лекарства. Способ "МТТ" (анализ на основе 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида) применяли для оценки клеточной пролиферации по сравнению с необработанными контрольными клеточными популяциями. Очевидно более сильное ингибирование роста клеток предстательной железы РС3 по сравнению с таковым для клеток аденокарциномы легкого.
Подобным образом, Фигура 8 и таблица 2 изображают ингибиторное действие соединения на рост клеточных линий рака груди человека MCF7 и MDA231. Аналогично, применяли пероральную рецептуру составов согласно настоящему изобретению. Состав добавляли к клеткам в культуре и оценивали относительное ингибирование роста клеток после 72 часов продолжительного воздействия лекарства. Способ "МТТ" применяли для оценки клеточной пролиферации по сравнению с необработанными контрольными клеточными популяциями. Клетки MCF7 были более чувствительными к воздействию состава, чем клетки MDA231.
Таблица 2
Клеточная линия
*IС<sub>50</sub>
PC3, предстательной железы человека
146
Epi, нормального эпителия человека
>1000
MCF7, рака груди человека (чувствительная к эстрогену)
27
MDA231, рака груди человека (рефракторная к эстрогену)
126
А549, аденокарциномы легкого человека
435
*IС<sub>50</sub> определена как та концентрация (мкг/мл) материала, которая вызывает ингибирование роста клеток на 50% (по отношению к необработанным клеткам) при определенных условиях (обычно длительности) воздействия этого вещества.
Относительное отсутствие цитотоксичности по сравнению с единственной тестированной "нормальной" эпителиальной клеточной линией человека, несомненно, представляет интерес в отношении переносимости пациентом медикамента и соответствия протоколу введения. Чувствительность к составу клеточной линии груди человека MCF-7, чувствительной к эстрогену, представляет особый интерес, и эта клеточная линия, определенно, самая чувствительная из тестированных на данный момент. Авторы настоящего изобретения не осведомлены о каком-либо соединении в растительных экстрактах, примененных для приготовления состава согласно настоящему изобретению, которое блокирует связывание эстрогена, что, как считают авторы настоящего изобретения, исключает это альтернативное объяснение наблюдаемой высокой чувствительности.
ПРИМЕР 2
Способность состава согласно настоящему изобретению ингибировать ферменты циклооксигеназу (СОХ) и липоксигеназу (LOX).
Авторы настоящего изобретения исследовали относительное действие составов согласно настоящему изобретению в отношении СОХ-1, СОХ-2 и других интересующих эйкозаноидов. Эти исследования показали, что состав ингибирует как СОХ-1, так и СОХ-2 (в виде клонированных ферментов), как и ожидали авторы настоящего изобретения, основываясь на различных противовоспалительных компонентах, полученных из различных травяных экстрактов, которые образуют указанный состав. Данные также свидетельствуют, что указанный состав также полезен в качестве ингибитора 5-липоксигеназы (5-LOX). Никакого селективного изменения в эйкозаноидных продуктах, полученных от 15-LOX-2, не наблюдали. Данные также демонстрируют, что составы согласно настоящему изобретению ингибируют 12-липоксигеназу зависящим от концентрации образом. Данные, приведенные на Фигурах 2 и 3, свидетельствуют, что указанный состав является действенным с точки зрения получения ингибирования клонированных СОХ ферментов, так же как и ферментов в клетках в культуре. Даже небольших количеств в микролитрах составов согласно настоящему изобретению в жидкости было достаточно для получения значительного ингибирования ферментов циклооксигеназ. Это особенно впечатляет, если вспомнить, что 60% этой конкретной рецептуры состава составляет оливковое масло, которое само по себе не оказывает влияния на метаболизм эйкозаноидов.
Фигура 2 показывает действие состава на образование PGE2 при использовании клонированных ферментов СОХ-1 (овцы) и СОХ-2 (человека), который измеряли инкубацией 10 мкМ АК с ферментами (15 IU) в 0.1 М Трис-HCl буфере, рН 8.0, содержащем 5 мМ EDTA, 2 мМ фенол и 1 мкМ гематин. Аликвоты состава добавляли в пробирки перед добавлением АК. Контрольные инкубации не содержали состав. Прямоугольники со звездочками представляют контроль - "оливковое масло". Инкубацию вели при 37°С в течение 15 мин. Реакции останавливали добавлением 1 N лимонной кислоты. Эйкозаноиды затем экстрагировали с применением растворяющей смеси гексан:этилацетат (1:1); экстракт высушивали в азотной среде. PGE2, образовавшийся в процессе инкубации, экстрагировали, как описано ранее, и затем анализировали с применением опубликованного нами способа ЖХ/МС/МС (Yang и др. Anal Biochem. 308:168-177, 2002). Данные, показанные на Фигуре 2, предполагают, что состав согласно настоящему изобретению ингибирует образование PGE2 посредством обоих СОХ-1 и СОХ-2, хотя продукт более действенен для ингибирования СОХ-1, чем СОХ-2.
Фигура 3 показывает влияние состава на образование PGE2 и 5-НЕТЕ в клетках РС3. Различные концентрации состава добавляли к клеточным культурам в свежей бессывороточной среде, дополненной 15 мкМ БСА, и инкубировали при 37°С в течение 10 мин. Затем добавляли арахидоновую кислоту (100 мкМ) и кофакторы. Через 10 мин клетки промывали и экстрагировали для определения эйкозаноида, образовавшегося внутри клетки (см. подпись к Фигуре 2). Данные свидетельствовали о зависящем от концентрации ингибировании как PGE2, так и 5-НЕТЕ в клетках РС-3. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n=3), * обозначает Р<0.05 по отношению к контролю.
ПРИМЕР 3
Действие составов согласно настоящему изобретению на клеточную экспрессию 5-липоксигеназы
Противовоспалительный агент может достичь своего фармакологического действия посредством многих различных механизмов. Данный продукт может ингибировать селективные ферменты, участвующие в образовании молекул, связанных с воспалением, например ингибировать СОХ-2 для снижения образования PGE2 или ингибировать 5-липоксигеназу для снижения образования 5-НЕТЕ. Составы также ингибируют активацию транскрипционных факторов, которые известны за их непосредственное участие в активации генов, связанных с воспалением, как, например, куркумин-опосредованное ингибирование активации NF-kB.
Кроме того, данный продукт может также действовать, скорее снижая фактический синтез и, следовательно, экспрессию фермента в клетке или ткани, чем непосредственно ингибируя его. Начальные данные, которые мы получили, свидетельствуют, что составы согласно настоящему изобретению обеспечивают зависящее от концентрации ингибирование относительной экспрессии 5-липоксигеназы в клетках кроме ингибирования ими активности фермента. Относительное ингибирование экспрессии фермента не представляется обычным явлением, так как не похоже, чтобы состав ингибировал относительную тканевую экспрессию СОХ-2.
ПРИМЕР 4
Обнаружение 13-S-HODE в составе согласно настоящему изобретению
6
Фигура 4 показывает зависящее от концентрации действие состава согласно настоящему изобретению на метаболизм эйкозаноидов в клетках рака легкого человека А549, показывая очевидно зависящее от концентрации повышение образования 13-S-HODE. Клеткам (1×10) позволяли прикрепиться к культуральной чашке в течение ночи и затем обрабатывали в течение 24 часов различными концентрациями состава, как показано на Фигуре. Клетки затем собирали и экстрагировали для анализа эйкозаноидов посредством ЖХ/МС/МС. Данные свидетельствуют о небольшом ингибировании (32%) PGE2 при концентрации состава 2 мкл/мл, но также показывают "очевидно" сильное образование 13-S-HODE при 1 и 2 мкл/мл.
Изучали действие состава на превращение арахидоновой кислоты в различные эйкозаноидные продукты в некоторых клеточных линиях. Данные, приведенные выше, предполагают что, по крайней мере, для линии клеток легкого человека А459 состав не оказывает сильное действие на ферменты циклооксигеназу или липоксигеназу. Зависящее от концентрации увеличение 13-S-HODE, продукта 15-LOX-1 фермента, тем не менее, поразительно. Такое повышение содержания 13-S-HODE может возникать либо благодаря индукции самого фермента, либо ферментативной активности, добавления подходящего субстрата, такого как линолевая кислота, которая предпочтительно дает 13-S-HODE, или через другой механизм. Индукция 15-LOX-1 действительно происходит при добавлении NSAID к клеткам рака толстой кишки, и это служит частичным объяснением целительного действия аспирина как профилактического средства рака толстой кишки. Тем не менее, посредством вестерн-блота не наблюдали значительной индукции фермента 15-LOX-1 в результате инкубации с составом. Действие состава согласно настоящему изобретению также изучали в отношении содержания линолевой кислоты, субстрата, который может дать 13-S-HODE посредством 15-LOX-1 фермента. С применением аппарата ГХ/МС/МС было обнаружено только минимальное количество линолевой кислоты. Изучение самого состава, тем не менее, свидетельствовало о присутствии высокого количества 13-S-HODE, как обсуждается в Примере 6 ниже.
Фигура 5 показывает данные масс-спектрометрии, показывающие присутствие 13-S-HODE в составах согласно настоящему изобретению. Фигура 5 представляет три графика с соответствующей информацией. Самый верхний график представляет собой итоговую ионную хроматограмму дейтерированной 13-S-HODE (называемой 13-S-HODE-d4). Четыре атома дейтерия обеспечивают более высокий молекулярный вес (добавление 4) к массовому весу самого 13-S-HODE. Массовый вес дейтерированного продукта (указан отношением массы к заряду сверху справа) равен "299". Это, в сущности, массовый вес данного продукта. Обозначение 299>281 отражает тот факт, что авторы настоящего изобретения инструментально отобрали по массе, равной 299, и затем привели в столкновение данную молекулу с аргоном (инертный газ) для приготовления характерного "дочернего" иона с 281. Этот дочерний ион можно применять для количественного анализа.
График посередине показывает ионный след оригинального 13-S-HODE (25 нг/мл), купленного у Cayman Chemicals (Анн-Арбор, Мичиган). Он имеет массовый вес 295.3, и это указано на графике. Авторы настоящего изобретения учитывали дочерний ион с массой 277.2 для характеристики соединения. То есть шансы любой данной молекулы иметь массу 277.2, которая также "разбивается" для образования дочернего иона с 277.2, практически нулевые, кроме конкретной интересующей молекулы: 13-S-HODE.
Нижний график относится к экстракту состава согласно настоящему изобретению. Масс-спектр был построен таким образом, чтобы обнаружить все молекулы с массой 295.3. Авторы настоящего изобретения затем настроили аппарат, чтобы видеть только характерные дочерние ионы при 277.2. Тот факт, что аппарат обнаружил их в изобилии, уверенно свидетельствует о том, что 13-S-HODE присутствует в составах согласно настоящему изобретению. Экстракт был получен всего лишь из 5 мкл состава. Два числа рядом с каждым пиком представляют время удержания пика (например, 6.69 мин) и относительное содержание ионов. Последнее аналогично "количеству" продукта в пределах пика. Тот факт, что оригинальный стандарт 13-S-HODE при 25 нг/мл давал количество в пике 864,412, тогда как лишь 5 мкл состава дает "количество" в пике 6,338,606, четко указывает на высокое содержание этих эйкозаноидов в составе. Что важно знать, это является неоспоримым доказательством, что состав содержит большое количество 13-S-HODE.
Чтобы удостовериться, что имеем дело именно с веществом 13-S-HODE, тестировали присутствие 13-S-HODE в составе согласно настоящему изобретению с применением основанного на антителах набора Enzyme Immunoassay. Антитела обеспечивают специфичность обнаружения 13-S-HODE. Анализы EIA подтвердили присутствие большого количества 13-S-HODE в составах согласно настоящему изобретению.
2
Противовоспалительный агент может осуществлять свое фармакологическое действие через многие различные механизмы. Например, данный продукт может ингибировать селективные ферменты, участвующие в образовании молекул, связанных с воспалением (например, ингибирование СОХ-2 для снижения образования PGE или ингибирование 5-липоксигеназы для снижения образования 5-НЕТЕ). Продукт мог также ингибировать активацию транскрипционных факторов, которые известны по своему непосредственному участию в активации генов, связанных с воспалением (например, куркумин опосредованное ингибирование активации NF-kB). Кроме того, данный продукт может также действовать, скорее, чтобы снизить фактический синтез и тем самым экспрессию указанного фермента в клетке или ткани, чем непосредственно ингибировать его. Полученные начальные данные свидетельствуют о том, что состав согласно настоящему изобретению может, фактически, приводить к зависящему от концентрации ингибированию относительной экспрессии 5-липоксигеназы в клетках, так же как и к ингибированию активности фермента. Относительное ингибирование экспрессии фермента не представляется распространенным явлением, так как не похоже, чтобы состав ингибировал относительную тканевую экспрессию 12-LOX. Также не представляется распространенным результатом исчезновение (негативная регуляция) экспрессии 5-LOX при воздействии на клетки ингибиторов 5-LOX. Также изучали относительное влияние на содержание белка 5-LOX (вестерн-блот) после того, как на клетки РС3 воздействовали признанным ингибитором 5-LOX, зилеутоном. Как показано на Фигуре 9, тогда как зилеутон является потенциальным ингибитором 5-LOX (и применим для лечения астмы, вызванной этой причиной), он не вызывал какого-либо изменения в относительном содержании фермента 5-LOX внутри клетки.
Одним любопытным фактом является зависящее от концентрации повышение экспрессии СОХ-2 белка, которое происходит в результате воздействия на клетки указанного состава. На первый взгляд, это выглядит именно как то, что авторы настоящего изобретения НЕ хотели бы получить. В конце концов, ингибирование СОХ-2 является основанием для большого фармацевтического бизнеса. Но не всегда признают тот факт, что Целебрекс (целекоксиб) является известным индуктором СОХ-2! Воспаление остается задержанным, потому что активность фермента ингибируется, тогда как организм старается преодолеть это посредством повышенного синтеза фермента. В других словах, у людей, постоянно принимающих ингибиторы СОХ-2, все в порядке до тех пор, пока они не перестанут принимать их.
ПРИМЕР 5
Определение противовоспалительного действия составов согласно настоящему изобретению in vivo: модель на ушной раковине мыши
Очень простая, но эффективная модель воспаления на животном использовалась в течение последних нескольких лет. Правое ухо тестируемой мыши предобрабатывали предполагаемым противовоспалительным агентом, затем оставляли на 30 минут. Воспалительный агент (обычно арахидоновая кислота (АК) в ацетоне) затем прикладывали к тому же уху. Носитель наносили на левое ухо в качестве контроля. Через фиксированный промежуток времени после нанесения АК мышей анестезировали и затем использовали круглый ушной дырокол, чтобы получить униформный сегмент ткани. Разница в весе кусочка ткани из каждого уха мыши служит относительным индексом относительного предотвращения воспаления. После взвешивания, образец кусочка уха затем быстро замораживали для последующих анализов на специфичный метаболизм эйкозаноидов с применением нашего способа ЖХ/МС/МС.
Фигура 6 показывает противовоспалительное действие состава согласно настоящему изобретению на отек ушной раковины мыши. Состав (10 мкл) вводили местно в правое ухо, а ацетоновый носитель наносили на левое ухо. Через час после обработки АК мышь анестезировали и уши "прокалывали" для получения униформного кусочка ткани. Вес кусочка правого уха затем вычитали из такового для левого уха, чтобы измерить отек. Данные отражают относительную способность данного тестируемого вещества ингибировать АК-опосредованный отек ушной раковины. Данные представлены как среднее +/-стандартное отклонение для 10 животных. *Р<0.001 обработка против АК (отек) контроля (АК опосредованное воспаление).
Данные на Фигуре 6 показывают, что состав вызывает значительное ингибирование воспаления, опосредованного арахидоновой кислотой.
Схожим образом, Фигура 10 показывает действие состава согласно настоящему изобретению на отек ушной раковины мыши, опосредованный арахидоновой кислотой. Группы лечения состояли из 1) контроль - оливковое масло, 2) контроль - ацетон, 3) оливковое масло + АК, 4) состав согласно настоящему изобретению (10 мкл) + АК, 5) состав согласно настоящему изобретению (5 мкл) + АК и 6) состав согласно настоящему изобретению (2.5 мкл) + АК. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n=10 мышей/группу). Снова, состав ингибировал отек, вызванный АК. Как показано на Фигуре 10, максимальное ингибирование отека было получено при всех трех "дозировках" состава, хотя оказалось, что применение 2.5 мкл состава могло быть чуть менее эффективным, чем любой из двух более высоких концентраций.
ПРИМЕР 6
Травяные источники и относительная важность 13-S-HODE в составах согласно настоящему изобретению
При анализие относительного содержания эйкозаноидов в жидкой форме состава было неожиданно обнаружено большое количество 13-S-HODE. Эти анализы были выполнены с применением ЖХ/МС/МС, в которой применяли оригинальный дейтерированный стандарт, чтобы быть уверенными в правильном определении пика. Чтобы быть вдвойне уверенными в этом наблюдении, жидкий состав также анализировали с применением набора для иммуноферментного анализа (EIA), специально приготовленного для определения 13-S-HODE. Результаты EIA анализа подтвердили данные масс-спектрометрии и представлены в таблице 3.
Таблица 3
Относительное содержание эйкозаноидов, содержащихся в составе согласно настоящему изобретению
Эйкозаноиды
PGE2
15-НЕТЕ
12-НЕТЕ
13-S-HODE
0.10*
7.25
1.35
47.59
*Данные представлены как нг эйкозаноидов/5 мкл состава для перорального введения
Тот факт, что пероральная форма состава на 60% состоит из оливкового масла (которое не содержит 13-S-HODE), свидетельствует о том, что относительное содержание 13-S-HODE в экстрагированном материале даже выше, чем показанное выше.
50
Фигура 7 показывает влияние 13-S-HODE на пролиферацию некоторых раковых клеточных линий. Данные выше свидетельствуют, что 13-S-HODE, продукт фермента 15-LOX-2, может полностью ингибировать рост опухолей предстательной железы человека (РС3) и толстой кишки (LS174), но не рост клеток аденокарциномы легкого (А549). Относительная способность 13-S-HODE ингибировать раковые клеточные линии предстательной железы и толстой кишки имеет IC приблизительно 3-4 мкМ. Это важно, если сравнивать с содержанием 13-S-HODE в составе согласно настоящему изобретению. То есть, как показано выше в таблице 2, в составе содержится достаточно 13-S-HODE, чтобы объяснить ингибирование роста клеток. Нет сомнений, что другие факторы в составе также вносят вклад в его способность ингибировать рост опухолевых клеток предстательной железы и толстой кишки, но способность 13-S-HODE в составе быть способным это делать, очевидно, представляет интерес.
Изучали относительное содержание эйкозаноидов в жидкой форме состава, и было удивительным увидеть большое количество 13-S-HODE. Эти анализы были проведены с применением ЖХ/МС/МС, в которой оригинальный дейтерированный стандарт применяли, чтобы быть уверенными в правильном определении пика. Чтобы быть вдвойне уверенными в этом наблюдении, жидкий состав также анализировали с применением набора для иммуноферментного анализа (EIA), специально приготовленного для определения 13-S-HODE. Результаты EIA анализа подтвердили данными масс-спектрометрии. Тот факт, что пероральная форма состава на 60% состоит из оливкового масла (которое не содержит 13-S-HODE), свидетельствует о том, что относительное содержание 13-S-HODE в экстрагированном материале даже выше, чем показанное выше.
Был предпринят поиск источника эйкозаноидного продукта 13-S-HODE среди различных травяных и растительных экстракционных компонентов, которые использовали для приготовления состава. Подход состоял либо в растворении экстракта, либо воздействии на экстракт смеси органических растворителей, которая, в свою очередь, экстрагирует жирорастворимые эйкозаноиды. Их затем высушивали в азотной среде и перерастворяли в фиксированном объеме буфера, совместимом с масс-спектрометрическим оборудованием. Другую аликвоту использовали для анализа относительного содержания линолевой кислоты с применением ГХ/МС/МС. Стоящее за этим научное обоснование состоит в том, что 13-S-HODE может либо присутствовать в экстрактах как таковая, либо она может также быть доставлена через энзиматическую реакцию в клетках в культуре, если клетки содержали 15-LOX-1 и были обеспечены субстратом, линолевой кислотой.
Данные в таблице 4, ниже, показывают довольно убедительно, что хотя есть экстракты, содержащие и линолевую кислоту, и 13-S-HODE, эйкозаноид сам по себе является компонентом некоторых травяных экстрактов, которые используются для приготовления состава согласно настоящему изобретению. Тот факт, что 13-S-HODE отсутствует в некоторых экстрактах (например, в зеленом чае), также интересен и подтверждает тот факт, что наши измерения верны.
Таблица 4
Компонент состава
Содержание 13-HODE (нг/мг экстракта)
Содержание линолевой кислоты (мкг/мг экстракта)
Куркума, PSE
32.55
0.78
Розмарин, SCE
0.08
1.86
Базилик священный
1.42
1.15
Зеленый чай
0.12
Не обнаружено
Хучжан
0.14
1.50
Имбирь, SCE
62.79
33.79
Орегано, SCE
2.69
27.32
Барбарис
10.41
0.27
Розмарин
0.36
1.46
Куркума, SCE
16.30
31.10
Китайская золотая нить
13.46
0.81
Scutellaria
0.64
Не обнаружено
Имбирь, PSE
17.20
0.37
Определение как 13-HODE, так и линолевой кислоты было выполнено три раза со сравнимыми результатами. 13-S-HODE была определена с применением ЖХ/МС/МС, тогда как содержание линолевой кислоты измеряли с применением ГХ/МС/МС. Источниками 13-S-HODE в составе, по-видимому, в основном являются имбирь и куркума. Интересно, что этот конкретный эйкозаноид присутствует как в PSE, так и в SCE экстрактах имбиря и также в меньших количествах в корне куркумы. Причем присутствие высоких количеств 13-HODE не всегда связано с высокими количествами линолевой кислоты, субстрата для 15-LOX-1, которая производит 13-S-HODE.
ПРИМЕР 7
Тест на дифференцировку остеокластов
4
Для определения влияния составов согласно настоящему изобретению на остеокластогенез, индуцированный лигандом рецептора-активатора NF-кВ (RANKL), авторы настоящего изобретения культивировали клетки RAW 264.7, которые могут дифференцироваться в остеокласты посредством RANKL in vitro. Клетки RAW 264.7 культивировали в 24-луночных планшетах при плотности 1×10 клеток на лунку и позволили за ночь прикрепиться к поверхности. Среду затем заменили и клетки совместно инкубировали с различными концентрациями составов согласно настоящему изобретению и 5 нМ RANKL. На 5 день клетки окрашивали на экспрессию тартрат-резистентной кислой фосфатазы (TRAP), как описано ранее с применением набора для кислых фосфатаз (Sigma-Aldrich), и считали TRAP-положительные многоядерные остеокласты (>3 ядер) на лунку.
4
Клетки RAW 264.7 (1×10 клеток/лунку) инкубировали либо одни, либо в присутствии 5 нМ RANKL с 0.8 мг/мл составов согласно настоящему изобретению в течение 5 дней и окрашивали на экспрессию TRAP. Как показано на Фигуре 11(А), TRAP-положительные клетки фотографировали (кратность увеличения ×100).
4
Клетки RAW 264.7 (1×10 клеток/лунку) инкубировали либо одни, либо в присутствии 5 нМ RANKL с составами согласно настоящему изобретению при указанных концентрациях в течение 5 дней и окрашивали на экспрессию TRAP. Считали многоядерные (три ядра) остеокласты, результаты представлены графически на Фигуре 11(В).
Показано, что составы согласно настоящему изобретению подавляли RANKL-индуцированный остеокластогенез. Так как RANKL, член суперсемейства TNF, индуцирует остеокластогенез посредством активации NF-кВ, авторы настоящего изобретения определили, могут ли составы согласно настоящему изобретению подавлять RANKL-индуцированный остеокластогенез. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что RANKL индуцировал дифференцировку остеокластов, о чем свидетельствует экспрессия TRAP, как показано на Фигуре 11(А), и что составы согласно настоящему изобретению подавляли ее зависящим от дозы образом, как показано на Фигуре 11(В).
ПРИМЕР 8
Тест на инвазию
4
Культуральную систему мембранной инвазии использовали для оценки инвазии клеток, потому что прорастание через внеклеточный матрикс является решающим этапом в метастазировании опухоли. Система BD BioCoat Tumor Invasion представляет собой камеру, в которой есть светонепроницаемая полиэтилентерефталатная мембрана с диаметром пор 8 мкм, которая покрыта гелем, воспроизводящим базальную мембрану (BD Biosciences, Сан-Диего, Калифорния). Все Н1299 (2.5×10 клеток) суспендировали в бессывороточной среде и высевали в указанные выше лунки. После инкубации в течение ночи клетки соинкубировали с различными концентрациями составов согласно настоящему изобретению и 1 нМ TNF в течение дополнительных 24 ч в присутствии 1% ЭБС. Клетки, которые проникали через мембрану Matrigel (a именно, те, которые мигрировали в процессе инкубации в нижнюю камеру), окрашивали 4 мкг/мл кальцеина AM (Molecular Probes, Юджин, Орегон) на PBS в течение 30 мин при 37°С и сканировали флюоресценцию многопланшетным ридером Victor3 (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Бостон, Массачусетс); флюоресцирующие клетки были сосчитаны.
4
Клетки Н1299 (2.5×10 клеток/лунку) высевали в указанные выше лунки инвазивной камеры Matrigel на ночь в отсутствие сыворотки, соинкубировали с 0.3 мг/мл составов согласно настоящему изобретению и 1 нМ TNF в течение 24 ч в присутствии 1% сыворотки и затем подвергали тесту на инвазию, с графическим представлением результатов, как показано на Фигуре 12. Значение при отсутствии составов согласно настоящему изобретению и отсутствии TNF было принято равным 1.0.
Показано, что составы согласно настоящему изобретению подавляли TNF-индуцированную инвазивную активность опухолевых клеток. Известно, что NF-кВ регулирует экспрессию продуктов генов (например, ММР-9, СОХ-2 и VEGF), которые опосредуют инвазию опухолевых клеток. Могут ли составы согласно настоящему изобретению модулировать TNF-индуцированную инвазивную активность опухолевых клеток, было исследовано in vitro. Для определения этого опухолевые клетки высевали в верхнюю камеру инвазивной камеры Matrigel с TNF в присутствии или в отсутствие составов согласно настоящему изобретению и затем изучали на инвазию. Как показано на Фигуре 12, TNF индуцировал инвазию опухолевых клеток почти в 2 раза, и составы согласно настоящему изобретению подавляли эту активность зависимым от дозы образом. Составы согласно настоящему изобретению одни не оказывали действия на инвазивную активность.
ПРИМЕР 9
Тест «живой/мертвый»
6
Для измерения апоптоза, авторы настоящего изобретения применяли тест «живой/мертвый» (Molecular Probes, Юджин, Орегон), который определяет активность внутриклеточной эстеразы и целостность плазматической мембраны. Этот тест задействует кальцеин, полианионный краситель, который задерживается внутри живых клеток и вызывает зеленое флюоресцентное свечение. Он также задействует этидиевый мономерный краситель (красная флюоресценция), который может проникать в клетки только через поврежденные мембраны и связываться с нуклеиновыми кислотами, но не пропускается интактной плазматической мембраной в живые клетки. Вкратце, 1×10 клеток инкубировали с 0.5 мг/мл составов согласно настоящему изобретению в течение 24 ч и затем обрабатывали 1 нМ TNF или различными химиотерапевтическими агентами в течение 16 ч при 37°С. Клетки окрашивали реагентом «живой/мертвый» (5 мкМ гомодимер этидия, 5 мкМ кальцеин АМ) и затем инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Клетки анализировали под флуоресцентным микроскопом (Labophot 2; Nikon, Токио, Япония).
6
Клетки множественной миеломы человека U266 (1×10 клеток/мл) подвергали сывороточному голоданию в течение 24 ч и затем инкубировали с 1 нМ TNF, 1 нМ таксолом и 300 нМ доксорубицином, одними или в комбинации с (0.5 мг/мл) составами согласно настоящему изобретению, как указано, в течение 24 ч. Клеточную гибель определяли посредством теста «живой/мертвый», основанного на кальцеине AM, как показано на Фигуре 13. Красный цвет показывает мертвые клетки, а зеленый цвет - живые клетки.
Составы согласно настоящему изобретению делали возможными апоптическое действие TNF и химиотерапевтических лекарств. Так как было показано, что активация NF-кВ ингибировала индуцированный различными агентами апоптоз, исследовали, будут ли составы согласно настоящему изобретению модулировать апоптоз, индуцированный TNF и химиотерапевтическими агентами. Действие составов согласно настоящему изобретению на апоптоз, индуцированный TNF и химиотерапевтическими агентами, было изучено посредством теста «живой/мертвый». Тест «живой/мертвый», который измеряет активность внутриклеточной эстеразы и целостность плазматической мембраны, свидетельствовал, что составы согласно настоящему изобретению усиливали апоптическое действие TNF, таксола и доксорубицина против опухолевых клеток.
ПРИМЕР 10
Анализ изменения электрофоретической подвижности при активации NF-кВ
6
GGGACTTTC
GGGACTTTC
СТСАСТТТС
CTCACTTTC
Для определения активации NF-кВ авторы настоящего изобретения провели анализ изменения электрофоретической подвижности (EMSA), по существу, как описано ранее в Chaturvedi, M.M., Mukhopadhyay, А. и Aggarwal, В.В. (2000) Assay for redox-sensitive transcription factor. Methods Enzymol., 319, 585-602. Вкратце: ядерные экстракты (1×10 клеток/мл) инкубировали с 32Р-меченым по концу 45-мерным двухцепочечным NF-кВ олигонуклеотидом (15 мкг белка с 16 фемтомолями ДНК) из длинного концевого повтора вируса иммунодефицита человека, 5'-TTGTTACAA  CGCTG  CAGGGAGGCGTGG-3' (выделенный шрифт указывает сайты связывания NF-кВ), в течение 30 мин при 37°С и образовавшийся комплекс ДНК-белок отделяли от свободных олигонуклеотидов на 6.6% полиакриламидных гелях в нативных условиях. Двухцепочечный мутированный олигонуклеотид, 5'-TTGTTACAA  CGCTG  CAGGGAGGCGTGG-3', использовали для изучения специфичности связывания NF-кВ с ДНК. Высушенные гели визуализировали и радиоактивные бэнды анализировали количественно с применением прибора, регистрирующего радиоактивный профиль, Storm 820 Phosphorimager с помощью програмного обеспечения ImageQuant (Amersham, Пискатавей, Нью-Джерси).
6
Клетки KВМ-5 (2×10 клеток/мл) предынкубировали с указанными концентрациями составов согласно настоящему изобретению в течение 1 ч, обрабатывали 0.1 нМ TNF в течение 30 мин. Ядерные экстракты тестировали на активацию NF-кВ посредством EMSA, как показано на Фигуре 14(А).
Составы согласно настоящему изобретению подавляли активацию NF-кВ зависящим от дозы и времени образом. Так как NF-кВ играет важную роль в апоптозе и в инвазии клеток, авторы настоящего изобретения изучили влияние составов согласно настоящему изобретению на активацию этого транскрипционного фактора. Авторы настоящего изобретения сначала исследовали действие составов согласно настоящему изобретению на индуцированную TNF активацию NF-кВ в клетках миелолейкоза человека (KВМ-5). Результаты теста на связывание с ДНК (EMSA) показали, что составы согласно настоящему изобретению сами по себе не оказывают действия на активацию NF-кВ. Тем не менее, они ингибируют TNF-опосредованную активацию NF-кВ зависящим от дозы образом, как показано на Фигуре 14(А).
6
Клетки KВМ-5 (2×10 клеток/мл) предынкубировали с 1 мг/мл составов согласно настоящему изобретению в течение указанных времен и затем обрабатывали 0.1 нМ TNF в течение 30 мин. Ядерные экстракты тестировали на активацию NF-кВ посредством EMSA, как показано на Фигуре 14(В). Супрессия активации NF-кВ составами согласно настоящему изобретению, как оказалось, тоже зависела от времени.
Составы согласно настоящему изобретению ингибируют активацию NF-кВ, индуцированную сигаретным дымом. Клетки Н1299 предынкубировали с составами согласно настоящему изобретению (1 мг/мл) в течение 1 ч, затем обрабатывали сигаретным дымом (10 мкг/мл) в течение 1 ч. Ядерные экстракты тестировали на активацию NF-кВ посредством EMSA, как показано на Фигуре 14(С).
Составы согласно настоящему изобретению блокируют активацию NF-кВ, индуцированную конденсатом сигаретного дыма. Авторы настоящего изобретения затем изучили влияние составов согласно настоящему изобретению на активацию NF-кВ, индуцированную конденсатом сигаретного дыма, в клетках немелкоклеточной аденокарциномы легкого Н1299. Результаты теста на связывание с ДНК (EMSA) показали, что составы согласно настоящему изобретению подавляли активацию NF-кВ, индуцированную конденсатом сигаретного дыма, как показано на Фигуре 14(С). Эти результаты предполагают, что составы согласно настоящему изобретению действовали на этапе активации пути NF-кВ, который является общим для TNF и конденсата сигаретного дыма.
ПРИМЕР 11
Вестерн-блот анализ TNF-индуцированной экспрессии генов
L
6
Чтобы определить влияние составов согласно настоящему изобретению на TNF-индуцированную экспрессию COX-2, VEGF, ICAM-1, MMP-9, cIAP-1/2, сурвивина, Bfl-1/A1, Bcl-2, Всlх, cFLIP, TRAF1 и XIAP в полных клеточных экстрактах обработанных клеток (2×10 клеток/мл), 30 мкг белка разрешали на электрофорезе в ПААГ-ДСН и зондировали вестерн-блоттингом со специфичными антителами согласно протоколу, рекомендованному производителем. Блоты промывали, обрабатывали HRP- конъюгированными вторичными антителами в течение 1 ч и, наконец, проявляли посредством реагента ECL (Amersham Pharmacia Biotechnology, Пискатавей, Нью-Джерси).
Составы согласно настоящему изобретению ингибируют TNF-индуцированные продукты NF-кВ-зависимых генов, участвующих в пролиферации и метастазировании опухолевых клеток. Авторы настоящего изобретения также исследовали, могут ли составы согласно настоящему изобретению модулировать продукты NF-кВ-зависимых генов, участвующие в пролиферации и метастазировании опухолевых клеток. TNF, как было показано, индуцировал COX-2, MMP-9, ICAM-1 и VEGF, каждый из которых имеет сайты связывания NF-кВ в своих промоторах. Как показано на Фигуре 15(А), обработка TNF индуцировала экспрессию продуктов генов СОХ-2, VEGF, ICAM-1 и MMP-9, и составы согласно настоящему изобретению прекращали экспрессию.
6
Клетки KВМ-5 (2×10 клеток/мл) инкубировали с 1 мг/мл составов согласно настоящему изобретению в течение 1 ч и затем обрабатывали 1 нМ TNF в течение указанных времен. Приготавливали полные клеточные экстракты и подвергали их вестерн-блот анализу с применением указанных антител, как показано на Фигуре 15(В).
Составы согласно настоящему изобретению ингибировали TNF-индуцированные продукты NF-кВ-зависимых анти-апоптических генов. NF-кВ позитивно регулирует экспрессию антиапоптических белков IАР1, IAP2, сурвивина, Вfl-1/А1, Bcl-2, Bcl-XL, cFLIP, TRAF1 и XIAP. Авторы настоящего изобретения затем исследовали, влияют ли составы согласно настоящему изобретению на экспрессию продуктов этих генов. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что составы согласно настоящему изобретению ингибируют как TNF-индуцированную, так и базовую экспрессию всех этих белков, как показано на Фигуре 15(В).
ПРИМЕР 12
2
Доказательство G/M ареста клеток РС3, опосредованного составами согласно настоящему изобретению
2
2
0
2
2
2
Как показано на Фигуре 16, обработка клеток РС3 составами согласно настоящему изобретению вызывает зависящее от концентрации ингибирование клеточного цикла. Травяной продукт вызывает четкую G/M аккумуляцию клеток, которая очевидна даже при такой низкой концентрации, как 0.28 мкл/мл. При более высокой концентрации фаза G/M более выражена, как и суб-G пик, указывая на апоптоз. Вместе с увеличением числа клеток в G/M существует возрастающее, зависящее от концентрации падение числа клеток в доли G1 клеточного цикла. Только 10% контрольных клеток обычно присутствуют в фазе G/M, тогда как обработка 0.57 мкл/мл составов согласно настоящему изобретению приводит к более чем 40% клеток в блоке G/M.
Как показано на Фигуре 16А, левый верхний график демонстрирует нормальное распределение по клеточному циклу клеток РС3. Процент G2/M клеток мал (маленький затененный пик справа на фигуре). На втором графике (правый верхний) клетки РС3 обрабатывали 0.28 мкл составов согласно настоящему изобретению/мл культуральной среды. Размер G2/M пика возрастает. Графики слева внизу (0.57 мкл составов согласно настоящему изобретению/мл) и справа внизу (1.14 мкл/мл) показывают повышение блока клеточного цикла вследствие повышенной концентрации составов согласно настоящему изобретению.
Данные анализа способом проточной цитометрии Фигуры 16А представлены в виде гистограммы на Фигуре 16В. Как видно на этой фигуре, существует четкое, зависящее от концентрации повышение процента клеток в G2/M фазах клеточного цикла, тогда как происходит связанное с этим снижение количества клеток в G1 фазе клеточного цикла.
ПРИМЕР 13
Анализ способом проточной цитометрии апоптоза, опосредованного составами согласно настоящему изобретению
2
Как показано на Фигуре 17, концентрации составов согласно настоящему изобретению, которые вызывали лишь низкие уровни блока С/М, как было обнаружено, были связаны с индукцией раннего апоптоза, о чем свидетельствовало окрашивание клеток аннексином V и пропидий йодидом (PI). Даже при самых низких исследованных концентрациях, 0.28 мкл/мл, четкое подтверждение связывания аннексина V с перевернутым мембранным фосфатидилсерином проявляется проточной цитометрией клеток РС3, обработанных составами согласно настоящему изобретению. Дополнительное подтверждение того, что препарат на основе сбора трав опосредует апоптоз, состоит в зависящем от концентрации связывании пропидия йодида с нуклеиновыми кислотами на поздних стадиях клеточной гибели, после нарушения целостности мембраны.
Как показано на Фигуре 17А, клетки РС3 обрабатывали составами согласно настоящему изобретению при указанных концентрациях в течение 24 ч. Клетки затем окрашивали аннексином V и раствором PI. Апоптоз измеряли посредством анализа проточной цитометрии (ФАКС). Даже при низкой концентрации, равной 0.28 мкл/мл, существует четкое свидетельство раннего апоптоза. При концентрации, превышающей 1.1 мкл/мл, большинство клеток умирали и находились на поздней стадии апоптоза (клеточной гибели).
Как показано на Фигуре 17В, данные анализа проточной цитометрии клеток РС3, обработанных составами согласно настоящему изобретению (Фигура 17А), показаны на гистограмме на Фигуре 17В. Видно четкое, зависящее от концентрации, усиление окрашивания PI, которое является индикатором повреждения клеточной мембраны - признака раннего апоптоза. Окрашивание аннексином V, даже при самой низкой концентрации составов согласно настоящему изобретению, свидетельствовало об окрашивании ДНК, связанном с апоптозом. Процент клеток, окрашенных аннексином V, спадал с повышением концентрации составов согласно настоящему изобретению вследствие клеточной гибели.
ПРИМЕР 14
Изменения метаболизма эйкозаноидов, опосредованные составами согласно настоящему изобретению
2
Как показано на Фигурах 18A-18D, обработка клонированных ферментов СОХ-1, СОХ-2 и 5-LOX человека вызывает зависящее от концентрации ингибирование образования соответствующих эйкозаноидных продуктов, РGЕ и 5-НЕТЕ, при этом образование 5-LOX ингибировалось более сильно, чем СОХ-1 или СОХ-2 (данные не представлены). Затем изучали клеточные изменения в метаболизме эйкозаноидов вследствие инкубации с составами согласно настоящему изобретению. Как видно на Фигурах 18(A)-(D), обработка клеток РС3 составами согласно настоящему изобретению вызывала снижение образования PGE2 (Фигура 18А) и 5-НЕТЕ (Фигура 18В). Более впечатляющим, тем не менее, был клеточный спад уровня 12-НЕТЕ, предположительно в результате ингибирования активности 12-LOX. Концентрации составов согласно настоящему изобретению, такие низкие, как 0.25 мкл/мл, вызывали значительное снижение уровня 12-НЕТЕ по сравнению с необработанными контрольными клетками. Наивысшая изученная концентрация составов согласно настоящему изобретению (1 мкл/мл) приводила к приблизительно 80% снижению уровней 12-НЕТЕ в клетках РС3 (Фигура 18С).
Обработка клеток РС3 изобретательскими составами также вызывала четкое снижение клеточного содержания белка 5-LOX, что проявлялось в вестерн-блот анализе (Фигура 18D). Спад в содержании белка 12-LOX был также очевиден при концентрации составов согласно настоящему изобретению выше чем 0.25 мкл/мл. Повышение белка СОХ-2 вследствие инкубации клеток РС3 с более высокими уровнями составов согласно настоящему изобретению напоминает повышение уровня этого фермента вследствие обработки клеток другими противовоспалительными агентами, такими как целекоксиб.
L
Данные в таблице 5 были получены из анализа фосфорилированных белков РС3-клеточных лизатов после обработки нетоксичными концентрациями либо составов согласно настоящему изобретению, либо байкалеина, компонента Scutellaria. Белки разделяли с применением гель-электрофореза и затем гель зондировали моноклональными антителами к белкам. Антитела могли определить разницу в статусе фосфорилирования белков. Гели затем обсчитывали с применением денситометра. Только относительные изменения (хотя значительные) указаны в таблице выше. Было много сходства в изменениях статуса фосфорилирования, говорящего о сходной позитивной или негативной регуляции белков, участвующих в блоке клеточного цикла (например, циклина D1, циклина D3 и pRB), или белков, связанных с апоптозом (например сурвивина, Bcl-X и Bcl-2). Как составы согласно настоящему изобретению, так и байкалеин ингибировали активность 12-LOX. Тем не менее, не все изменения в статусе фосфорилирования этих важных белков идентичны после обработки либо составами согласно настоящему изобретению, либо байкалеином, предполагая, что механизм действия составов согласно настоящему изобретению является сложным и не является следствием только содержания в нем байкалеина.
Таблица 5
Активность или содержание, измеренные в клетках РС3
Обработка составами согласно настоящему изобретению
Обработка байкалеином
Цитотоксичность
Да
Да
Блок клеточного цикла
G2/M
Да
Активность 12-LOX
↓
↓
Содержание pRb
↓
↓
Содержание Rb
↑
↑
Циклин D1
↓
↓
Циклин D3
↓
↓
р21
Без изменений
Сильное ↓
Р27
Без изменений
Сильное ↓
Bcl-X<sub>L</sub>
↓
↓
Вах
Без изменений
↑
Bcl-2
↓
↓
рАKТ
Без изменений
↓
Сурвивин
↓
↓
↓ обозначает снижение, ингибирование или негативную регуляцию
↑ обозначает усиление, активацию или позитивную регуляцию
ПРИМЕР 15
Уменьшение фосфорилирования белка Rb, опосредованное составами согласно настоящему изобретению
2
Как показано на Фигуре 19А, существует зависящее от концентрации ингибирование фосфорилирования Rb. Концентрации, такие низкие, как 0.25 мкл/мл, значительно снижали присутствие pRb по сравнению с контролем, тогда как количество Rb повышалось со снижением pRb. Снижение фосфорилирования белка Rb, происходящее при различных концентрациях составов согласно настоящему изобретению, также связано с G/M блоком клеточного цикла и ранним апоптозом. Количественный анализ данных вестерн-блоттинга представлен на Фигуре 19В.
На Фигуре 19А показан вестерн-блот ретинобластомного белка, как нефосфорилированного (Rb), так и фосфорилированного (pRb) белков. Нижний бэнд (β-актин) показан только как контроль загрузки. Данные получены из клеток РС3, обработанных составами согласно настоящему изобретению при указанных концентрациях в течение промежутка времени 24 ч. Клетки затем лизировали и белки отделяли на геле. Присутствие Rb или pRb белков определяли с использованием специфичных моноклональных антител. Данные также показаны на нижней фигуре после сканирования гелей в фотометрическом приборе для сканирования, чтобы позволить количественный анализ плотности полос. Данные показывают, что даже при концентрации составов согласно настоящему изобретению 0.25 мкл/мл происходит четкая супрессия pRb (фосфорилированной формы) и повышение Rb (нефосфорилированной формы).
Снижение фосфорилирования Rb происходило в множестве аминокислотных сайтов, включая Т356 (59% снижение относительно контроля), S807 (62% ↓), Т821 (62% ↓) и Т826 (78% ↓; другие данные не представлены), в результате инкубации клеток РС3 с составами согласно настоящему изобретению при концентрации 2 мкл/мл в течение 24 ч.
Таблица 6
Данные скрининга на фосфорилирование белков из клеток РС3, обработанных составами согласно настоящему изобретению<sup>a</sup>
Белок
Сайт фосфорилирования
Изменение (%) в обработанном образце по сравнению с контролем
Rb
S807
-62
Rb
T356
-59
Rb
T821
-62
Rb
T826
-78
STAT1
S727
-38
Fos
T232
+383
HspB1
S82
+421
p21
S144/S141/S154
+136
<sup>a</sup>Сокращения следующие: РС3, нечувствительный к андрогену рак предстательной железы человека; Rb, ретинобластомный белок; STAT1, переносчик сигнала и активатор транскрипции 1; Fos, Fos-c транскрипционный фактор, гомолог онкобелка FBJ остеосаркомы мыши; HspB1, 27 kDa белок теплового шока; p21, p21-активированная сериновая протеинкиназа.
ПРИМЕР 16
Способность 12-НЕТЕ составов согласно настоящему изобретению блокировать ингибирование пролиферации РС3
2
2
Как показано на Фигурах 20А-20С, добавление РGЕ или 5-НЕТЕ к клеткам РС3, обработанным ингибирующими рост концентрациями составов согласно настоящему изобретению, не могло блокировать клеточную пролиферацию. Наоборот, Фигура 20А показывает, что добавление 12-НЕТЕ к клеткам, обработанным составами согласно настоящему изобретению (1 мкл/мл; концентрация, которая могла вызывать индукцию апоптоза и G/M арест), приводило к примерно удвоенной клеточной пролиферации, хотя она и не возвращалась к уровню контрольных необработанных клеток.
Добавление 12-НЕТЕ (обозначенного как 12-Н) также приводило к блоку способности составов согласно настоящему изобретению обращать статус фосфорилирования белка RB в клетках РС3 (Фигура 20В); ни PGE2, ни 5-НЕТЕ (обозначенный как 5Н) не имели какого-либо влияния на способность составов согласно настоящему изобретению изменять статус фосфорилирования pRb. Наконец, добавление 12-НЕТЕ к клеткам РС3 также обеспечивало частичное обращение блока G2/M, опосредованного составами согласно настоящему изобретению, таким образом, подчеркивая важность этого конкретного эйкозаноида в ингибировании клеточной пролиферации РС3, опосредованном составами согласно настоящему изобретению.
Таким образом, как показано на Фигуре 20А, в эксперименте "с добавлением обратно" клетки РС3 были обработаны составами согласно настоящему изобретению при указанных концентрациях, которые приводили к зависящему от концентрации ингибированию клеточной пролиферации (относительная флюоресценция свидетельствовала о количестве клеток). Добавление 12-НЕТЕ, продукта 12-липоксигеназы, приводило к небольшому повышению роста клеток РС3. Тем не менее, добавление 12-НЕТЕ к клеткам, обработанным составами согласно настоящему изобретению, сильно блокировало ингибирование пролиферации опухолевых клеток, опосредованное составами согласно настоящему изобретению.
Как показано на Фигуре 20В, составы согласно настоящему изобретению вызывали зависящий от концентрации спад экспрессии pRb. Добавления либо 5-НЕТЕ (5-Н), либо PGE2 не блокировало это действие. Добавление продукта 12-LOX, 12-НЕТЕ, тем не менее, частично возвращало экспрессию pRb. Вместе взятые, эти данные показывают, что ингибирование 12-LOX, опосредованное составами согласно настоящему изобретению, является важным в том, что 12-НЕТЕ может блокировать антипролиферативную активность и способность составов согласно настоящему изобретению восстанавливать экспрессию белка-опухолевого супрессора Rb.
Ссылки
Следующие библиографические ссылки считаются полезными для понимания настоящего изобретения в контексте его места в релевантной области. Ссылки здесь не должны интерпретироваться как притязание или признание, что любая цитируемая ссылка представляет собой материал для патентоспособности настоящего изобретения. Авторы настоящего изобретения должным образом раскроют информационный материал по патентоспособности в Заявлении о раскрытии информации. Содержание каждой ссылки настоящим включено в полном объеме.