Иммуносупрессорная и противоопухолевая активности различных популяций костномозговых клеток

ИММУНОСУПРЕССОРНАЯ И ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ КОСТНОМОЗГОВЫХ КЛЕТОК

Ю. П. Бельский, М.Г. Данилец, Н.В. Бельская, В.К. Патрушев,

Е.С. Трофимова, В.И. Агафонов

НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Проблема актгивации противоопухолевого ответа как способа терапии онкологических заболеваний по-прежнему остается открытой. Одним из недостаточно исследованных ее аспектов является изучение роли естественных супрессорных клеток (ЕСК). ЕСК представляют собой популяцию гемопоэтических клеток, гетерогенную как по степени зрелости., так и по принадлежности к росткам кроветворения. Они обладают неспецифическим иммуносупрессорным действием (подавляют митоген- и антиген-индуциро-ванную пролиферацию Т- и В-лимфоцитов). Известно, что при опухолевом росте активность ЕСК значительно возрастает, они мигрируют из костного мозга в селезенку и опухолевый узел. Показано, что из-за своей иммуносупрессорной активности ЕСК играют негативную роль при опухолевом росте, удаление их из организма приводило к торможению роста опухоли вплоть до ее регресса [18, 19].

ЕСК обладают также способностью подавлять пролиферацию ряда опухолевых клеток in vitro [14, 17]. Противоопухолевая активность ЕСК изучена мало. Имеются данные о том, что в условиях in vivo возрастание активности этих клеток сопровождалось элиминацией опухолевого очага [12]. В литературе последних лет на моделях опухолевого процесса всё чаще обнаруживается в качестве иммуносупрессорного фактора ЕСК оксид азота [1, 3, 8,10], в то время как о противоопухолевых медиаторах информации нет, показано только, что в основе противоопухолевого действия ЕСК лежит МО-не-зависимый механизм [2, 14].

Данные сравнительных исследований in vitro иммуносупрессорной и противоопухолевой активностей разных популяций миелокариоцитов

в зависимости от степени их обогащения незрелыми клетками хотя и представлены в литературе, но фрагментарны и противоречивы [15,17]. Больше известно о ЕСК костного мозга и селезенки в период восстановления гемопоэза после ведения циклофосфана, когда происходит значительное увеличение относительного содержания незрелых гемопоэтических клеток [4, 5, б, 9, 11, 13, 16]. При этом было установлено, что им-муносупрессорный эффект ЕСК в такой экспериментальной ситуации усиливался, а противоопухолевый не изучался.

Целью данной работы явилось сравнение иммуносупрессорной и противоопухолевой активностей клеточных популяций костного мозга, полученных с использованием разных способов обогащения их незрелыми гемопоэтичес-кими клетками как in vitro (удаление прилипающих к пластику клеток, фракционирование по плотности и длительное культивирование), так и in vivo (в период восстановления гемопоэза после ведения циклофосфана), а также определение участия оксида азота в этих активностях.

Материалы и методы

Б работе использовано 36 мышей линии С57В1/6 и 12 мышей DBA/2 обоего пола в возрасте 8—10 нед, полученных из коллекционного фонда НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН. Животные соответствовали 1-й категории (согласно сертификату), содержались в неполной барьерной системе, имели постоянный доступ к воде и пище (кипяченая питьевая вода, подкисленная соляной кислотой до рН 4-4,5, стерилизованный гранулированный корм). Опухоль Р-815 (мастоцитома) поддерживали в асцит-

ной форме на самцах линии DBA/2. Цикло-фосфан вводили мышам линии С57Б1/6 внут-рибрюшинно по 125 мг/кг массы тела в 0,1 мл дистиллированной воды.

Для получения клеточных суспензий животных забивали цервикальной дислокацией, мие-локариоциты получали перфузией бедренной и большеберцовой костей, спленоциты получали гомогенизацией селезенок, опухолевые клетки выделяли из асцитной жидкости. Клетки ресус-пендировали в культуральной среде следующего состава: RPMI1640 (Sigma) с добавлением 10% ЭТС (ICN), 20 мМ HEPES, 0,05 мМ 2-меркап-тоэтанола, 50 мкг/мл гентамицина и 2 мМ L-глютамина. Культивирование проводили в атмосфере с 5% СО, и абсолютной влажности. В экспериментах использовали суспензии, содержащие не менее 95% жизнеспособных клеток. Прилипающие к пластику клетки удаляли культивированием миелокариоцитов в течение 16 ч в пластиковых чашках Петри диаметром 90 мм ("Costar") в концентрации 3-5хЮ6/мл. Затем неприлипшие клетки собирали, отмывали и ресуспендировали в свежей среде. Фракци-онирование,клеток по плавучей плотности про-[ водили с использованием Перколла (Pharmacia, Швеция). На раствор Перколла с плотностью

1,075 г/мл осторожно наслаивали суспензию клеток. После 15-минутного центрифугирования при 400g клетки, сформировавшие кольцо, собирали, трижды отмывали, ресуспендировали в культуральной среде и оценивали их жизнеспособность.

Продукцию NO оценивали по содержанию нитритов в супернатантах при помощи реактива Грейса [7]. Реактив (0,1 мл) смешивали с эквивалентным объемом супериатанта и измеряли абсорбцию при длине волны 550 нм. Концентрацию нитритов определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартных растворов нитрита натрия.

Оценка иммуносупрессорной активности проводилась по способности подавлять пролиферацию клеток-мишеней — сингенных спленоцитов, активированных митогеном. Для этого клетки-эффекторы (миелокариоциты) культивировали 60—64 ч в 9б-луночных планшетах совместно с клетаами-мишенями (2х105 на лунку) в различных соотношениях в присутствии конканавали-на A (Sigma, 4 мкг/мл). За 16 ч до окончания культивирования вносили по 0,5 мкКю/лунку 3Н-ти-мидина. Затем содержимое лунок переносили на стекловолокнистые фильтры и оценивали включение изотопа на р-счетчике "Mark—ИГ'. Про-

Таблица 1

Иммуносупрессорная и противоопухолевая активности цельного костного мозга н его непрнлииающей фракции,

участие оксида азота в этих активностях

Иммуносупрессорная активность

Клетки-эффекторы соотношение эффектор/мишень 1/1 соотношение эффектор/.мишень 2/1

включение тимилина, имп/мин концентрация іптуритов, мкМ включение -тмилина, имп/мин концентрация нитритов, мкМ

Цельный костный мозг (контроль) 31255 ±3166 (16,1%) 8,4 ± 1,1 27232 ± 3800 (26,9%) 12,7 ± 1,9

Неприлипающие миелокариоциты (опыт) 20936 ±1378 (43,8%) 17,5 ± 2,5 12480 ±2086 (66,5%) 28,3 ± 4,1

Противоопухолевая активность

соотношение эффектор/мишень 10/1 соотношение эффектор/мишень 20/1

Клетки-эффекторы включение ТИМИАИНа, имп/мин концентрация нитритов, мкМ включение тимилина, имп/мин концентрация нитритов, мкМ

Цельный костный мозг (контроль) 10289 ±1412 (44,5%) < 2 5019 ±641 (72,9%) < 2

Неприлипаюшие миелокариоциты (опыт) 5331 ±771 (71,3%) < 2 3239 ± 491 (82,5%) < 2

I Примечания: в скобках указан % супрессии; пролиферация клеток-мишеней в отсутствие эффекторов составила 37253 1 1657 имп/мин (спленоциты) и 18554 + 2587 имгт/мин (опухолевые клетки).

СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2004. №2-3

лиферацию клеток выражали в количестве импульсов в минуту либо в процентах супрессии, рассчитанных по следующей формуле:

С = (1 - О/К) хЮО, где О - количество имп/мин в лунках (клетки-эффекторы + клетки-мишени), К — количество имп/мин в лупках с клетками-мишенями.

Противоопухолевая активность определялась по способности подавлять пролиферацию опухолевых мишеней (клетки мастоцитомы Р-815). Для этого клетки-эффекторы в различных концентрациях культивировали 36-40 ч в 9б~луноч-ных планшетах совместно с опухолевыми клетками (2Х101 на лунку), за 16 ч до окончания культивирования вносили по 0,5 мкКю/лунку 3Н-тимидина. Результаты выражались в имп/мин или в процентах супрессии.

Результаты и обсуждение

Сравнение иммуносупрессорной и противоопухолевой активностей цельного костного мозга и его неприлиггающей фракции показало, что в обоих соотношениях эффектор/мишень им-муносупрессорная активность клеток цельного

костного мозга была более чем в 2 раза ниже, чем у фракции неприлипающих к пластику клеток (табл. 1). Оксид азота принимал участие в иммуносупрессорной активности как цельного костного мозга, так и его не прилипающей части, однако концентрация нитритов была более чем вдвое больше в культуре, содержащей неприлипающие клетки. Следует отметить, что клетки-эффекторы обоих типов, культивировавшиеся в отсутствие мишеней, не продуцировали N0. Противоопухолевая активность цельного костного мозга также была ниже его фракции, полученной в результате удаления прилипающих к пластику клеток. При этом N0 не участвовал в подавлении пролиферации опухолевых клеток.

При фракционировании не прилипающих к пластику клеток костного мозга по плавучей плотности в градиенте Перколла были получены следующие результаты (табл. 2). Клетки, имеющие плавучую плотность более 1,075 г/мл, не обладали иммуносупрессорной и противоопухолевой активностями, а также не синтезировали N0. Клетки с плотностью менее 1,075 г/мл практически полностью подавляли пролиферацию как лимфоцитов, так и опухолевых мише-

Таблица 2

Иммуносупрессориая н противоопухолевая активности исприлипающих клеток костного мозга с высокой

Иммуносупрессориая актив!юсть

Клетки-эффекторы соотношение эффектор/мишень 1/1 соотношение эффектор/мишень 2/1

включение тимидина, имп/мин концентрация нитритов, мкМ включение тимидина, имп/мин концентрация нитритов, мкМ

Смешанной плотности (контроль) 20936 ±1378 (43,8%) 17,5 ± 1,5 12480 ±2086 (66,5%) 28,3 ± 2,1

С низкой плотностью 1900 ± 3651 (94,9%) 37,2 ± 2,7 1527 ±2682 (95,9%) 41,7 ± 3,3

С высокой плотностью 43623 ± 3241 (-17,1%) 2,2 ± 0,1 47907 ± 5737 (-28,6%) 2,2 ± 0,1

Противоопухолевая активность

Клетки-эффекторы соотношение эффектор/мишень 10/1 соотношение эффектор/мишень 20/1

включение тимидина, имп/мин концентрация нитритов, мкМ включение тимидина, имп/мин концентрация нитритов, мкМ

Смешанной плотности (контроль) 26795 ±1855 (16,0%) < 2 20486 ± 3093 (35,7%) < 2

С низкой плотностью 2210 ±950 (93,1%) < 2 1157 ±537 (96,4%) < 2

С высокой плотностью 31376 ±3392 (1,6%) < 2 32125 ± 2238 (-0,8%) < 2

Примечания: в скобках указан % супрессии; пролиферация клеток-мишеней в отсутствие эффекторов составил! 37253 ± 1657 имп/мин (спленоциты) и 31880 ± 2336 имп/мин (опухолевые клетки).

СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2004. №2-3

Рис. 1. Иммуносупрессорная (А) и противоопухолевая (Б) активности популяций миелокариоцитов, обогащенных незрелыми клетками в результате культивирования в течение 1, 2, 3 и 4 суток. В легендах указаны соотношения эффектор/мишень

ней (более чем на 95%). Клетки низко плотно с-тной фракции продуцировали в 1,5—2,1 раза больше N0, чем контрольные клетки со смешанной плотностью. В культурах, не содержавших клеток-мишеней, нитритов не было.

С целью обогащения популяции миелокари-одитов незрелыми гемопоэтическими клетками неприлипающие клетки костного мозга культивировали 1, 2, 3 и 4 сут. Уровень иммуносупрес-

сорной и противоопухолевой активностей прокультивированных клеток сравнивали с аналогичными показателями неприлипающих свежевыделенных костномозговых клеток (рис. 1). После культивирования в течение 1-х суток при всех соотношениях эффектор/мишень иммуносупрессорная и противоопухолевая активности клеток мало отличались от контроля. После 2-суточно-го культивирования иммуносупрессорные и про-

СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2004. №2-3

Таблица З

Продукция NO (концентрация нитритов, мкМ) костномозговыми клетками, полученными после культивирования

Клетки-эффекторы Клетки-мишени - лимфоциты, соотношение эффектор/мишень

2/1 1/1 0,5/1 0,25/1

Свежевыделенные (контроль) 45,6 ±4,0 11,8 ±2,4 < 2 < 2

После 1 суток культивирования 51,4 ±2,4 15,6 + 8,1 < 2 < 2

После 2 суток культивирования 64,8 ± 8,2 58,5 ±1,1 33,6 ± 4,0 8,1 ± 2,8

После 3 суток культивирования 70,8 ±63 65,2 ± 6,4 46,8 ± 3,2 18,9 ±5,4

После 4 суток культивирования 79,8 ± 6,7 66,0 ± 5,2 62,3 ±7,2 -

Мишени — опухолевые клетки, соотношение эффектор/мишень

20/1 10/1 5/1

Свежев ыделенные (контроль) < 2 < 2 < 2

После 1 суток культивирования < 2 < 2 < 2

После 2 суток культивирования < 2 < 2 < 2

После 3 суток культивирования <2 < 2 < 2

После 4 суток культивирования < 2 < 2 < 2

тивоопухолевые свойства клеток значительно возрастали, а при соотношениях 2/1 и 1/1 пролиферация лимфоцитов-мишеней подавлялась практически полностью. После 3-суточного культивирования иммуносупрессорное действие клеток при соотношении эффектор /мишень 2/ 1 и 1/1 оставалось на максимальном уровне (99,2% и 96,3%), продолжало увеличиваться в соотношениях 0,5/1 (в 13,8 раза, 77,5%) и 0,25/1 (в 10 раз, 31,3%). После культивирования клеток в течение 4 суток их иммуносупрессорная активность была максимальной (более 95%) при всех соотношениях эффектор/мишень. Уровень противоопухолевой активности после 3-х и 4-х суток культивирования при соотношениях 10/1 и 5/1 достигал максимальных значений — более 92%; при соотношении 5/1 возрастал в 4 и 4,4 раза (63,5% и 68,8%, в контроле 15,8%).

По мере обогащения миелокариоцитов незрелыми элементами, происходящего в процессе культивирования костномозговых клеток in vitro, изменялось и количество клеток-продуцен-тов оксида азота (табл. 3). Концентрация нитритов в культурах, содержащих стимулированные митогеном лимфоциты селезенки в смеси со свежевыделенными или прокультивированными 1 сутки неприлипающими клетками костного мозга, мало различалась, начиная увеличиваться после 2-суточного культивирования. Те

же клетки-эффекторы, но в присутствии других мишеней — опухолевых клеток, а также в монокультуре совсем не продуцировали N0.

Клетки костного мозга животных в период восстановления гемопоэза (на 5-е сутки) после однократной инъекции им циклофосфана проявляли повышенную вдвое иммуносупрессорную и противоопухолевую активности (табл. 4). В случае опухолевых клеток-мишеней миелокарио-циты N0 не синтезировали, а в отношении лимфоцитов! напротив, оксид азота вырабатывался, причем значительно больше, чем клетками контрольных животных.

Таким образом, обогащение популяций миелокариоцитов незрелыми клетками всеми использованными способами сопровождалось повышением как иммуносупрессорной, так и противоопухолевой активностей. Б то же время способность обогащенных популяций миелокариоцитов продуцировать оксид азота (в ответ на соответствующий стимул) в культуре с лимфоцитами увеличивалась, а в смешанной культуре с опухолевыми клетками оксид азота не обнаруживался. Полученные данные позволяют заключить, что усиление иммуносупрессорной активности связано с повышением продукции оксида азота, в то время как увеличение противоопухолевой активности происходит вследствие иных механизмов.

Таблица 4

Иммуносупрессорная и противоопухолевая активности иеприлипагащих клеток костного мозга в восстановительпый период после однократного введения циклофосфана, участие оксида азота

в этих активностях

Иммуносупрессорная активность

Клетки-эффекторы соотношение эффектор/мишень 1/1 соотношение эффектор/мишень 2/1

включение тимидипа, имп/мин концентрация нитритов, мкМ включение тимидина, имп/мин концентрация шпритов, мкМ

Миелокариоциты ннтакшых мышей (контроль) 22481 ±1403 (44,1%) 10,0 ± 0,6 11645 ±3272 (71,1%) 33,0 ± 3,7

Миелокариоциты ЦФ-мышей (опыт) 7505 ± 2621 (81,4%) 38,0 ± 2,8 2683 ± 506 (93.3%) 56,0 ± 4,4

11ротивоопухолевая аюнииость

Клегки-эффекторы соотношение эффектор/мишепь 10/1

включение тимидина, ими/мни концетрапия нитритов, мкМ

Миелокар иоцнты интактных мышей (контроль) 8701 ±1165 (33,6%) < 2

Миелокариоциты 4234 1 799 ’ < 2

ЦФ-мышей

Примечания: в скобках указам % супрессии; пролиферация клеток-мишеней в отсутствие эффекторов составила 40248 ±2512 имп/мин (спленоциты) и 13110 ± 935 имп/мин (опухолевые клетки).

Литература

1. Ъелъская Н.В., Датлец М.Г., Вельский Ю.П. а др. // Бюл. экшерим. биол. и мед. 2000. Т. 129, Прилож. 1. С. 60-63.

2. Вельский Ю.П., Вельская Н.В., Данимец М.Г. и др. // Бюл. экспсрим. биол, и мед. 1999. Т. 127, № 4. С. 452-454.

3. Вельский Ю.П., Вельская Н.В., Данилщ М.Г. и др. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2003. Т. 132, Прилож. 2. С. 68-75.

4. Anguto L, Heras К, Garcha-Bustos ]., el at, // Blood. 2000. Vol. 95, № 1. P 212-220.

5. Bracia/e V.L., Parish CR. // CeU Immunol. 1980. Vol. 51. P. 1-12.

6. Brooks-Kaiser J.C., Boarque L.A., Hoskin D.W. Ц Immunopharmacology. 1993. Vol. 25. P. 117-129.

7. Green L.C., Wagner D.A., Glogomki J. et al. // Anal. Biochem. 1982. Vol. 126. P. 131-H3.

8. Kxsmartsev SA., U Y., Chen S.H. // J. Immunol. 2000. Vol. 165. P. 779-785.

9. Mater Т., HoldaJ.H., Chman H.N. // J. Immunol. 1989. Vol. 143. P. 491-498.

10. Ma^oniA., Bronte V., VisintmA., et al. //J. Immunoi. 2002. Vol. 168. P. 689-695.

11. NikcevichDA., Duffie G.P., YoungM.R., et al. // Cell Immunol. 1987. Vol. 109. P 349-359.

12. PslaeAB., CatnpiUo J-A., Lope%~Asenjo JA., SubiAa J.L. II J. Immunol. 2001. Vol. 166. P. 6608-6615.

13. Segre M., Tomei E., Segre D. // Cell Immunol. 1985. Vol. 91. P 443-454.

14. Seledtsov V.I., Avdeev I.V., Morenkov A.V. II Immunobiol. 1995. Vol. 192. P. 205-217.

15. Seledtsov V.I., Taraban V.Y., Setedtsova G.V. it ai II Cell Immunol 1997. Vol. 182, № 1. P. 12-19.

16. ShimAj4 M., Sabotovic D., QAawa H., Iwaguchi T. П Anticancer Drugs. 1992. Vol. 3. P. 427-433.

17. Sugima K., IkebaraS., InabaM. et al. // Exp. Hematol. 1992. Vol. 20. P. 256-263.

18. YoungM.R., YoungM.E., WrightMA. et al. // Exp. Hematol. 1990. Vol. 18, № 7. P 806-811.

19. Young M.R., Wright MA., Coogan M. el al. // Cancer Immunol. Immunothcr. 1992. Vol. 35. P. 14-18.

Поступила 9.03.04