Применение пептида Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (семакса) для коррекции дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе
USE OF PEPTIDE Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (Semax) FOR DYSBIOSIS CORRECTION IN CHRONIC IMMOBILIZATION STRESS

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, патофизиологии, фармакологии, и может быть использовано для коррекции дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе.
Актуальной проблемой современной медицинской науки является изучение микробиоценоза кишечника. Изменения состава микрофлоры кишечника регистрируют практически у 90% населения. Рост частоты и тяжести острых инфекционных заболеваний, торпидное течение и склонность к хронизации воспалительных процессов часто связано с развивающимися или уже имевшими место нарушениями микробиоты. Важно отметить, что микрофлора организма человека, являясь «экстракорпоральным органом», представляет неспецифический барьер защиты от патогенных бактерий и других экзогенных факторов агрессии на метаболическом, клеточном и молекулярно-генетическом уровнях. (Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбактериозы актуальная проблема медицины // Вестн. РАМН. - 1997. - №3. - С. 4-7. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека. // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 1998. - №1. - С. 61-65).
Одним из наиболее значимых доказанных этиологических факторов дисбиоза является стресс. В общебиологическом плане стресс представляет собой совокупность неспецифических физиологических, психологических и биохимических реакций организма в ответ на действие стрессоров - раздражителей чрезвычайной силы любой природы, к числу таких раздражителей относится вынужденное ограничение подвижности. Гиподинамия и гипокинезия относятся к актуальным проблемам современной биологии и медицины, что обусловлено рядом физических, физиологических и социальных причин (чрезвычайные ситуации природного и техногенного характера, снижение нагрузки на опорно-двигательный аппарат, пребывание в помещениях малого объема, информационные перегрузки, малоподвижный образ жизни и др.) Кроме того, лечение ряда заболеваний и травм требует соблюдения строгого постельного режима, который так же ограничивает двигательную активность пациентов.
Стрессовая реакция направлена на обеспечение гомеостаза организма и его адаптацию к новым условиям окружающей среды, однако при чрезмерно выраженном или продолжительном воздействии стрессоров происходит перегрузка адаптационных возможностей, что приводит к возникновению стрессорных заболеваний (Воробьева Е. Эпидемиология неинфекционных заболеваний: задачи на современном этапе / Воробьева Е., Бабанов С., Агаркова И. // Профилактическая медицина. - 2002. - №3. - С. 12-14).
В научной и клинической литературе неоднократно описывалось изменение состояния микробиоты после действия различных стрессов (холодовой, иммобилизационный, этаноловый). Было показано, что стресс приводит к дисбалансу в составе микробиоценоза со снижением уровня полезной составляющей. При частичной или полной элиминации бифидобактерий и лактобактерий происходит угнетение иммунных сил организма, нарушаются важные процессы в кишечнике, включая пищеварение, всасывание и минеральный, белковый и жировой обмен, в том числе снижение витаминсинтезирующей функции кишечной микрофлоры. Повышается воздействие условно-патогенной микробиоты, которая отличается от полезных микроорганизмов обменом веществ и многими физиологическими функциями (de Lartigue G. Vagal afferent neurons in high fat diet-induced obesity; intestinal microflora, gut inflammation and cholecystokinin / de Lartigue G., de La Serre C.B., Raybould H.E. // Physiol. Behav. - 2011. - V. 105. - P. 100-105). Нарушение нормального микробиоценоза влечет развитие или обострение психических расстройств, сопровождающихся воспалением и нарушениям в функционировании ЦНС через изменения в активации блуждающего нерва и/или спинномозгового нервного пути (Communication between gastrointestinal bacteria and the nervous system / Bravo J.A., Julio-Pieper M., Forsythe P. et al. // Curr. Opin. Pharmacol. - 2012. - V. 12. - P. 667-672). В связи с вышеизложенным большой интерес представляет восстановление стрессиндуцированных нарушений кишечного микробиоценоза.
В настоящее время коррекция дисбиотических нарушений проводится в соответствии с Отраслевым стандартом (Отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника». Москва, 2003). Однако применение пробиотиков не обеспечивает требуемый терапевтический эффект для профилактики или лечения дисбактериозов. Это обусловлено тем обстоятельством, что они являются «чужеродными» для микроорганизмов (биоценоза) конкретного человека. Иммунитет биопленки практически сводит на нет действие пробиотиков. Микробы, выращенные искусственно, являются инородными, они отторгаются вследствие бионесовместимости (Сателлитный симпозиум. Коррекция и профилактика дисбактериоза. Новые подходы терапии заболеваний желудочно-кишечной системы. Под ред. Н.А. Токаревой. Эффективная фармакотерапия. Гастроэнтерология. 2011, №3, стр. 77-84.), (Дармов И.В. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека / И.В. Дармов, И.Ю. Чичерин, И.П. Погорельский и др. // Эксперимент, и клин. гастроэнтерол. - 2011. - №3. - С. 6-11; Дармов И.В. Сравнительная оценка выживаемости микроорганизмов пробиотиков в составе коммерческих препаратов в условиях in vitro / И.В. Дармов, И.Ю. Чичерин, А.С. Ердякова и др. // Эксперимент, и клин. гастроэнтерол. - 2011. - №9. - С. 96-101).
Таким образом, пробиотики уступают в своей эффективности пребиотикам и метабиотикам, которые не содержат микроорганизмы и лишены вышеотмеченного отрицательного действия.
Известен способ коррекции дисбиоза, вызванного иммобилизационным стрессом, с использованием экзополисахаридов молочнокислых бактерий - лаксаранов 1596, 1936 и Z, который был выбран в качестве прототипа нашего изобретения (М.И. Правдивцева, Л.В. Карпунина, М.Д. Сметанина. Влияние экзополисахаридов лактобацилл на микрофлору толстого отдела кишечника самок крыс при различных видах стресса / Известия Саратовского университета. - 2011.- Т. 11. Сер. Химия. Биология. Экология, вып. 2. - С. 82-94).
К недостаткам данного метода можно отнести недостаточную изученность биологической роли бактериальных экзополисахаридов в макроорганизме, отсутствие влияния на содержание стафилококков и кишечных палочек, отсутствие данных о воздействии данных препаратов на состав условно-патогенных представителей кишечного микробиоценоза.
При этом представляет интерес одновременное воздействие препаратов для коррекции стресс-индуцированного дисбиоза на состояние микробиоценоза кишечника и купирование стресса.
До настоящего времени наиболее распространенными средствами лечения тревожных и стресс-ассоциированных расстройств остаются бензодиазепины, основным механизмом действия которых является влияние на ГАМК-бензодиазепиновый рецепторный комплекс. Несмотря на значительный терапевтический потенциал данных соединений, их применение сопровождается развитием нежелательных побочных эффектов (седация, привыкание) (Вальдман А.В. Модулирующее действие коротких пептидов на моноаминергические процессы мозга как основа их психотропного эффекта // Вопр. мед. хим. - 1984. - Т. 30. - С. 36-63).
Однако в последнее время особый интерес представляют препараты, разработанные на основе регуляторных пептидов, в частности, семакс. Известно, что регуляторные пептиды являются полифункциональными, но в то же время высокоспецифичными к определенным рецепторам (Зозуля А.А., Кост Н.В., Соколов О.Ю., Габаева М.В., Гривенников И.А., Андреева Л.А., Золотарев Ю.А., Иванов С.В., Андрющенко А.В., Мясоедов Н.Ф., Смулевич А.Б. Эффективность и значимость регуляторных пептидов возрастает при воздействии негативных факторов окружающей среды (Ашмарин И.П., Стукалов П.В., Ещенко Н.Д. Биохимия мозга. / СПб - 1999. - Изд-во С.-Петербургского университета. - 325 с.).
4-7
4-10
4-10
Семакс является синтетическим аналогом фрагмента гормона АКТГ (Met-Glu-His-Phe), стабилизированным к действию экзо- и эндопептидаз последовательностью аминокислот Pro-Gly-Pro. Семакс обладает значительными преимуществами перед природным АКТГ: не оказывает токсического воздействия, не имеет побочных эффектов, обладает длительным действием (более чем в 20 раз по сравнению с природным пептидом). Препарат не обладает гормональными свойствами, сохраняя при этом эффекты нейропептида, и не вызывает привыкание (Левицкая Н.Г. Исследование спектра физиологической активности аналога АКТГ гептапептида семакс / Н.Г. Левицкая [и др.] // Нейрохимия. - 2008. - Т. 25, №1. - С. 111-118. Пономарева-Степная М.А. Аналог АКТГ(4-10) - стимулятор обучения пролонгированного действия / М.А. Пономарева-Степная [и др.] // Хим.-фарм. журн. - 1984. - №7. - С. 790-795.).
Препарат нивелирует стресс-эффекты, оказывает нейропротекторное, антиастеническое, антиамнестическое, антигипоксическое и ноотропное действие, регулирует метаболические процессы в нервной системе, уменьшает первичную и отсроченную гибель нейроцитов (Романова Г.А. Нейропротективное и антиамнестическое действие семакса при экспериментальном ишемическом инфаркте коры головного мозга / Г.А. Романова [и др.] // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2006. - Т. 142, №12. - С. 618-621. Ашмарин И.П. Ноотропный аналог адренокортикотропина 4-10 - семакс (15-летний опыт разработки и изучения)/ И.П. Ашмарин [и др.] // Журн. высш. нерв, деятельности им. И.П. Павлова. - 1997. - Т. 47, №2. - С. 420-130.).
Семакс увеличивает выживаемость холинергических нейронов основания переднего мозга, активируя холинацетилтрансферазу и не влияя на число ГАМК-ергических нейронов. В условиях оксидативного стресса пептид значительно сокращает количество поврежденных клеток (Effects of behaviorally active ACTH (4-10) analogue - Semax on rat basal forebrain cholinergic neurons / I.A. Grivennikov [et al.] // Restor. Neurol. Neurosci. - 2008. - Vol. 26, Iss. 1. - P. 35-43.).
Семакс влияет на экспрессию генов NGF и BDNF и рецепторов к ним в различных структурах головного мозга (Neurotrophin gene expression in rat brain under the action of Semax, an analogue of ACTH 4-10 / T.Y. Agapova [et al.] // Neurosci. Lett. - 2007. - Vol. 417, Iss. 2. - P. 201-205.). В свою очередь, сфера влияния NGF распространяется на нейроны периферической нервной системы и холинергические нейроны базальных отделов переднего мозга, а BDNF - на синаптическую передачу импульсов и ее долговременное потенцирование, пластичность мозговых структур, формирование памяти, реакций тревоги и депрессии, когнитивные процессы. (Skaper, S.D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview // Methods Mol. Biol. - 2012. - Vol. 846. - P. 1-12. Nerve growth factor: From the early discoveries to the potential clinical use / L. Aloe [et al.] // J. Transl. Med. - 2012. - Vol. 10.).
Однако использование пептида Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (семакса) для коррекции дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе не изучено.
Техническим результатом изобретения является применение по новому назначению пептида Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (семакса) для коррекции дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе.
Технический результат изобретения достигается путем применения пептида Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (семакса) для коррекции дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе.
Химическая формула данного пептида известна. Нами был использован препарат, синтезированный в Институте молекулярной генетики РАН. Пептид растворяют в физиологическом растворе и вводят экспериментальным животным (крысам) парентерально (внутрибрюшинно) в дозе 50 мкг/кг массы тела за 15 минут до начала иммобилизации.
Пример конкретного выполнения
Экспериментальные животные (крысы Вистар) массой 200-230 г были разделены на две группы по 10 особей в каждой. Первая группа представлена животными, которым вводили физиологический раствор и моделировали иммобилизационный стресс, животным второй группы вводили семакс и моделировали иммобилизационный стресс. Животные содержались в помещении при температуре воздуха 22-24°С, световом режиме 12 часов - свет, 12 часов - темнота и получали стандартный гранулированный корм и воду в свободном доступе в соответствии с требованиями Министерства здравоохранения РФ от 1 апреля 2016 г. №199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики», принципами 3R, изложенными в рекомендациях ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments, 2010). На момент выполнения эксперимента все животные были здоровыми, изменений поведения, аппетита, режима сна и бодрствования не выявлено.
Пептид Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (семакс) растворяли в физиологическом растворе и вводили экспериментальным животным парентерально (внутрибрюшинно) в дозе 50 мкг/кг массы тела за 15 минут до начала стрессорного воздействия в объеме из расчета 1 мл на 1 кг массы тела.
Контрольным животным вводили эквивалентные объемы физиологического раствора.
Хронический иммобилизационный стресс моделировали помещением крыс в индивидуальные тесные пластиковые боксы с отверстиями для вентиляции ежедневно на 2 часа в течение 14 дней. По истечении указанного срока животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом обескровливанием путем забора крови из правого желудочка сердца.
Количественное и качественное исследование мукозной микрофлоры толстого кишечника мышей проводили по известной методике Л.И. Кафарской и В.М. Коршунова (Богданова, Е.А. Исследование пристеночной микрофлоры желудочно-кишечного тракта крыс при пероральном введении пробиотических препаратов / Е.А. Богданова, Ю.В. Несвижский, А.А. Воробьев // Вестн. РАМН. - 2006. - №2. - С. 6-10). Биоптаты слизистой оболочки толстого кишечника освобождали от химуса и взвешивали в асептических условиях. После этого материал помещали в стерильный раствор фосфатного буфера в соотношении 1:10 и выдерживали в нем 2 часа для разжижения муцина.
-2
-4
Из подготовленных образцов кишечника готовили разведения материала до концентраций 10-10. По 0,1 мл каждого разведения взвесей засевали газоном на поверхность питательных сред (Эндо, Сабуро, SSA-агар, ЦПХ-агар, желточно-солевой агар, висмут-сульфит агар, лактоагар MRS, бифидоагар) и инкубировали при температуре 37°С в аэробных и анаэробных условиях.
Идентификацию микроорганизмов проводили с помощью масс-спектрометра Maldi Biotyper Bruker. Количество микроорганизмов в 1 грамме материала рассчитывали исходя из числа выросших колоний микроорганизмов - колониеобразующих единиц (КОЕ) при посеве из максимального разведения, где отмечался рост не менее 10 колоний, учитывая при этом объем посевного материала. Для расчета использовали формулу: К=Е/к*v*n, где К - колониеобразующая единица, Е - общее количество бактерий, к - количество внесенного материала, v - количество чашек Петри, n - разведение. Удельное содержание микроорганизмов вычисляли как количество микроорганизмов, выделенных из биопроб, и выражали в lg КОЕ/г массы биологического материала.
Статистическую значимость различий средних величин вычисляли по t-критерию Стьюдента после проверки нормальности распределения изучаемых показателей.
После применения пептида Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (семакса) происходило увеличение содержания облигатных представителей микробиоценоза - лактобактерий и бифидобактерий (в 1,2 раза и 1,3 раза соответственно). При этом lg КОЕ/г для лактобактерий составил 12,67±0,79 (против 10,54±0,48 в контроле), а для бифидобактерий - 12,84±1,58 (против 9,7±0,76 в контроле).
Число кишечных палочек с нормальной ферментативной активностью после применения нейропептида увеличилось в 1,3 раза и составило 5,03±0,45, количество кишечных палочек со сниженной ферментативной активностью уменьшилось в 2,7 раза (против 3,05±0,68 в контроле). При этом также отмечалось снижение количества других грамотрицательных микроорганизмов: содержание цитробактеров уменьшилось с 1,37±0,48 до 0,19±0,19 (в 7,2 раза), морганелл - с 2,77±0,63 до 0,98±0,52 (в 2,8 раза).
Введение пептида Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (семакса) в дозе 50 мкг/кг стрессированным животным приводило к уменьшению содержания стафилококков и грибов рода Candida. Золотистые стафилококки обнаруживались в количестве 0,58±0,4 (в контрольной группе - 2,42±0,56), число коагулазоотрицательных стафилококков снизилось с 4,36±0,17 до 2,75±0,68, а содержание грибов рода Candida уменьшилось с 3,56±0,46 до 1,67±0,58.
Достоверных различий между значениями определяемого показателя для бактерий родов Enterobacter, Proteus, Klebsiella, Acinetobacter не было выявлено, однако число данных факультативных представителей кишечного микробиоценоза снизилось. Исключение составили только энтерококки, количество которых увеличилось в 2 раза по сравнению с контролем.
Таким образом, результаты проведенных исследований показывают, что использование пептида Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (семакса) в дозе 50 мкг/кг оказывает выраженное корригирующее влияние на стрессиндуцированные изменения состава кишечной микрофлоры в условиях хронического иммобилизационного стресса в виде увеличения количества облигатных представителей кишечной микробиоты и уменьшения содержания условно-патогенных микроорганизмов. Данный способ основан на применении регуляторного пептида, относящегося к классу биологически активных веществ, обладающих выраженным модуляторным эффектом и полифункциональностью, является патогенетически обоснованным, не трудоемкий и не требует использования сложного оборудования.