ТЕСТ-НАБОР ДЛЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА АНТИТЕЛ КЛАССА М ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИЙ TORCH-ГРУППЫ

Полезная модель относится к медицине, в частности, к клинической лабораторной диагностике и касается диагностики возбудителей инфекций TORCH-группы (токсоплазмоза, краснухи, цитомегаловируса, герпеса первого и второго типов) посредством использования твердофазного иммуноферментного анализа - ИФА, который является наиболее часто применяемым при диагностике различных вирусных, бактериальных и других инфекций.
TORCH-инфекции (Toxoplasma, Others, Rubella, Cytomegalovirus, Herpes) представляют собой большую группу инфекционных заболеваний, приводящих к невынашиванию и внутриутробным поражениям плода вплоть до его гибели. В группу Others входят заболевания, передающиеся половым путем (сифилис, трихомониаз, гонорея, бактериальный вагиноз, мико- и уреаплазмоз и др.). Большинство заболеваний TORCH-группы характеризуются достаточно широким распространением среди населения, множественностью путей заражения, возможностью внутриутробного инфицирования плода, частым сочетанием двух и более возбудителей, взаимно усиливающих патогенность, а также скудностью и отсутствием специфичности клинической симптоматики.
Одним из основных способов диагностики и дифференциации таких заболеваний является серологическое обследование пациентов с целью выявления антител (IgG и IgM) к отдельным возбудителям.
Это связано с тем, что выработка иммуноглобулинов класса M нарастает на 4-6 день после инфицирования, после чего их можно определить методом ИФА, достигая пикового значения 16-20 сутки, с последующим падением титра до низких значений. Титр же специфических IgG начинается с 8-14 дня и нарастает в течение нескольких недель. Они сохраняются в организме человека длительное время.
Сегодня в мировой практике известно несколько десятков коммерческих ИФА тест-наборов, для клинико-лабораторной диагностики инфекций TORCH-группы с использованием 96-луночных твердофазных иммуносорбентов отечественных и зарубежных производителей («ЭКОлаб», «Витротест», «Вектор-Бест», «ИммуноКомб», «ГК Алкор Био», «Ниармедик», «НПО «Диагностические системы», «Bio-Rad», «Viro Immun Diagnostics» и др.). Каждый набор предназначается для обнаружения антител к одному определенному возбудителю и все они определяют в основном специфические IgG, но не IgM.
Кроме того, важной особенностью заболеваний группы TORCH является частота их ассоциаций: каждое из этих заболеваний реже встречается в одиночку, значительно чаще обнаруживаются смешанные инфекции, вызванные двумя-тремя возбудителями и даже более. В клинике чаще всего наблюдают соединение цитомегаловирусной, хламидийной инфекций и токсоплазмоза в разных вариантах или же случаи, когда к одной из названных инфекций присоединяется еще какой-либо возбудитель вирусной или бактериальной природы. Именно поэтому наибольшим преимуществом в клинико-лабораторной диагностике инфекций TORCH-группы будут обладать комбинированные тест-наборы (мультиплексные), позволяющие проводить одновременно обнаружение наиболее распространенных возбудителей этой группы.
Из уровня техники известен набор для многопрофильного иммунологического анализа антител, включающий плоскую плотную подложку с нанесенными на ее поверхности антигенами, дополнительно блокированную неспецифическими природными или синтетическими полимерами; растворы для отмывок, разведения образца и конъюгата, конъюгат и систему проявления, при этом плотная подложка выполнена из непористого пластика, на поверхности которого нанесены антигены возбудителей TORCH-инфекций ((Toxoplasma gondii, Clamidia trachomatis, Rubella virus, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealytica, Treponema pallidum, Cytomegalovirus, Herpes simplex virus-1), в качестве конъюгата используют антитела к иммуноглобулинам человека или стафилококковые белки А или G, связанные с каталитически активными солями золота или серебра, в качестве раствора для отмывок и разведения конъюгата используют раствор, содержащий 0,01 моль/л трис HCl с 0,17 моль/л NaCl и 0,1% твин-20, pH 7,2-7,4, а в качестве системы проявления используют «физические проявители», включающие в себя соли серебра и восстанавливающие агенты (патент РФ 2298795, опубликован 10.05.2007).
Однако недостатками данного набора является:
1. Избыточность определения количества возбудителей инфекций TORCH группы - 8 антигенов, по нашим наблюдениям наиболее часто встречаемой комбинацией в клинике является токсоплазмоз, краснуха, цитомегаловирус, герпес первого и второго типа.
2. Отсутствие определения в наборе иммуноглобулинов класса M к вышеуказанным заболеваниям.
3. Сложность предлагаемого набора.
Данный набор включает нестандартный носитель антигенов в виде плоской плотной пластиковой подложки с нанесенными на ее поверхности антигенами, она дополнительно блокируется неспецифическими природными или синтетическими полимерами.
Набор содержит специализированную систему проявления, позволяющую проводить визуальный анализ проводимого определения.
В состав растворов для отмывок, разведения образцов и конъюгата введен неионный детергент (твин-20), а в состав раствора для разведения конъюгата, кроме того, введен лизат клеток E.coli, это позволяет за счет снижения вероятности образования иммунных комплексов с низкой авидностью повысить специфичность анализа и выполнять его при малом разведении образца (1:10).
Таким образом, использование нестандартного носителя и визуальной системы определения наличия инфекций потребовало создать сложную специализированную тест-систему, в которой, в частности, используются различные манипуляции (введение лизата клеток E.coli, использование неионного детергента, и определенного состава растворов для отмывок и разведения образцов) для повышения ее чувствительности.
Целью настоящей полезной модели явилось создание тест-набора для обеспечения одномоментной клинико-лабораторной диагностики возбудителей группы TORCH-инфекций: токсоплазмоза, краснухи, цитомегаловируса, герпеса первого и второго типа, на базе стандартных тест-систем для иммуноферментного анализа.
Техническим результатом полезной модели является возможность одномоментной диагностики возбудителей группы TORCH-инфекций: токсоплазмоза, краснухи, цитомегаловируса, герпеса первого и второго типа, на базе стандартных тест-систем для иммуноферментного анализа, обеспечение высокой чувствительности такой системы с использованием в планшете для анализа зон контроля и антигенов, позволяющих достоверно выявлять антитела IgM к возбудителям группы TORCH-инфекций.
Заявляемый тест-набор содержит полный комплект компонентов и может использоваться в различных лабораториях, как для массового скрининга сывороток, так и для индивидуальных анализов. Чувствительность заявляемого тест набора по чувствительности не уступает выпускающимся планшетным моноспецифическим тестам. Заявляемый тест - набор позволяет определить в одном анализе сразу несколько возбудителей и тем самым значительно сократить время на обследование пациента. Кроме того, поскольку один анализ с использованием предлагаемого набора эквивалентен нескольким анализам в моноспецифических системах и по стоимости эти анализы близки, внедрение изобретения в широкую практику может дать значительный экономический эффект.
Тест-набор для иммунологического анализа антител на наличие возбудителей инфекций TORCH-группы включает отмывающий раствор, раствор для разведения образцов, раствор индикаторный, стоп-реагент, контрольные положительные и отрицательные сыворотки, коньюгат и планшет с иммобилизованными на поверхности лунок антигенами возбудителей инфекций TORCH-группы: токсоплазмоза, краснухи, цитомегаловируса, герпеса первого и второго типа (HSV1,2, CMV, Тохо, Rubella), при этом планшет содержит следующие зоны:
по крайней мере одну зону, содержащую лунки, куда вносится контрольный положительный образец (K+), поливалентный, положительный по всем исследуемым антигенам группы TORCH,
по крайней мере одну зону, содержащую лунки, куда вносится контрольный отрицательный образец (K-), не содержащий антител к HSV1,2, CMV, Тохо, Rubella,
пор mix
по крайней мере одну зону, содержащую лунки, куда вносится контрольный пороговый положительный образец по всем исследуемым антигенам группы TORCH (K+), по существу K пороговая - это контрольная положительная сыворотка, содержащая пороговую концентрацию антител (в пороговом титре). Все исследуемые сыворотки, оптическая плотность которых выше этого значения, считаются положительными, а те, что имеют оптическую плотность ниже -отрицательными.
по крайней мере одну зону, содержащую лунки с антигенами для обнаружения антител класса M по всем исследуемым антигенам группы TORCH, куда вносится исследуемый образец или исследуемые образцы.
Подробное описание полезной модели иллюстрируется, но не ограничивается следующим примером выполнения планшета и реактивом, а также поясняющим рисунком (рис.  1)
Как уже указывалось ранее, тест-набор содержит следующие компоненты.
Контрольные образцы. Контрольные положительные образцы готовили из сывороток больных с установленным диагнозом, полученных из лечебно-профилактических учреждений. Контрольный отрицательный образец готовили из сывороток крови здоровых доноров, полученных из станций переливания крови. Сыворотки проверяли на наличие HBsAg и антител к вирусам иммунодефицита человека и гепатита C (ВИЧ и ВГС), проводили их стерилизующую фильтрацию, после чего с помощью коммерческих тест-систем в сыворотках крови определяли отсутствие видоспецифических антител к возбудителю соответствующей инфекции TORCH-группы, готовили необходимые разведения стабилизирующим буферным раствором и контрольные образцы в стерильных условиях разливали в стерильные флаконы.
Конъюгат. В качестве конъюгата использовали коммерческие препараты антител к иммуноглобулинам человека класса М, меченых пероксидазой хрена (фирма Viro-Immun Labor-Diagnostika, Германия, кат. №Е230)
Неспецифические компоненты тест-набора. В качестве неспецифических компонентов тест-набора использовали традиционно применяемые в практике ИФА композиции реагентов:
Отмывающий раствор (25-кратный концентрат):
- натрий фосфорнокислый двузамешенный 12-водный - 34,5 г;
- натрий фосфорнокислый однозамешенный 2 водный - 4,5 г;
- натрий хлористый - 212, 5 г;
- Твин - 20 - 0,01 л;
- вода очищенная - до 1 литра.
Рафасован в пластиковые флаконы ВМ.100М (светлый пластик) вместимостью 100 мл (фирма "Митра", Беларусь, ТУ РБ 100626757.001-2003), герметично укупоренные пластмассовыми навинчиваемыми крышками.
Раствор для разведение образцов:
- отмывающий раствор (25-кратный концентрат) - 40 мл;
- казеин - 10 г;
- натрий азид - 0,95 г,
- вода очищенная - до 1 л.
Расфасован в пластиковые флаконы ВМ.100М (светлый пластик) вместимостью 100 мл (фирма "Митра", Беларусь, ТУ РБ 100626757.001-2003), герметично укупоренные пластмассовыми навинчиваемыми крышками.
Раствор индикаторный: Стабилизированный раствор тетраметилбензидина (раствор ТМБ в ЦБР, содержащий перекись водорода, стабилизированный циклодекстрином).
Расфасован в пластиковые флаконы ВМ.20 (темный пластик) вместимостью 20 мл (фирма "Митра", Беларусь, ТУ РБ 100626757.001-2003), герметично укупоренные пластмассовыми навинчиваемыми крышками.
Стоп-реагент: 0,5 M раствор серной кислоты.
Расфасован в пластиковые флаконы ВМ.30 (светлый пластик) вместимостью 30 мл (фирма "Митра", Беларусь, ТУ РБ 100626757.001-2003), герметично укупоренные пластмассовыми навинчиваемыми крышками.
Планшет представляет собой стандартный 96-луночный планшет для ИФА, который делится на зоны, предназначенные для представителей инфекций TORCH-группы и зоны контроля по следующей схеме (см. рис. 1):
1. Зона (лунки A1, A2) куда вносится контрольный положительный образец (K+), поливалентный, положительный по всем исследуемым антигенам группы TORCH.
2. Зона (лунки B1, B2) - куда вносится контрольный отрицательный образец (K-), не содержащий антител к HSV1,2, CMV, Тохо, Rubella,
пор mix
3. Зона (лунки C1, C2) - куда вносится контрольный пороговый положительный образец по всем исследуемым антителам группы TORCH (K+)
4. Зона (лунки А3-А12, В3-В12, С3-С12, D1-D12, Е1-Е12, F1-F12, G1-G12, H1-H12) для обнаружения антител класса M к антигенам исследуемой группы TORCH, куда вносится исследуемый образец.
Все антигены нанесены в концентрации 2 мкг/мл на точку.
Антигены представляют собой (используемые виды антигенов)
1. антигены ВПГ-1+2, (штаммы АТСС -VR-539, MS)
2. антиген цитомегаловируса человека, (штамм AD 169)
3. антиген Toxoplasma gondii человека, (штамм RH)
4. антиген вируса краснухи, (штамм HPV77)
Антигены на планшет наносятся стандартным образом.
Предварительно обрабатывают планшет водным 20% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ-20), сушат с последующей адсорбцией на выделенных лунках планшета антигенов искомых инфекций TORCH-группы.
Далее 100 мкл рабочего разведения антигенов группы (концентрация каждого по 2 мкг/мл) в 0,05М карбонатно-бикарбонатном буферном растворе (pH 9,6) вносили в лунки планшетов (в соответствии с рис. 1). Планшеты выдерживали 18-24 ч при температуре 2-8°C, после чего отсасывали содержимое лунок и проводили вакуумную сушку планшетов (уровень вакуума - 0,06 мбар, время сушки - 30 мин). По окончании сушки однократно промывали планшеты отмывающим раствором и вносили в лунки по 200 мкл блокирующего раствора, после чего инкубировали 90 мин при 37°C, удаляли жидкость из лунок и вновь проводили вакуумную сушку (уровень вакуума - 0,3 мбар, время сушки - 3 ч). По окончании сушки планшеты запаивали под вакуумом в пакеты из ламинированной фольги.
Использование тест-набора практике можно иллюстрировать следующей совокупностью действий:
Вносят контрольные и исследуемые образцы (соблюдая указанную последовательность, согласно рис. 1): в две лунки (например, A1, А2) - по 100 мкл контрольного положительного образца (K+), в две лунки (например, В1, В2) - по 100 мкл отрицательного контрольного образца (K-), в лунки (например, C1, С2) вносят по 100 мкл контрольного «порогового» положительного образца (K+пор mix), в последующие лунки - по 100 мкл рабочих разведений (1:100) исследуемых образцов (по 1 лунке на образец, в качестве исследуемых образцов может выступать сыворотка крови больного или больных). Планшет закрывают крышкой или клейкой пленкой. Инкубируют 30 мин при температуре от 21 до 25°C в защищенном от света месте. С помощью промывателя удаляют образцы из лунок, 4 раза промывают планшет промывочным раствором, внося в лунки 350-370 мкл раствора. При наличии промывателя, позволяющего производить промывку в режиме "Overflow", используют именно этот режим. По окончании промывки удаляют остатки влаги из лунок, постукивая планшетом по фильтровальной бумаге, положенной на полиэтиленовую пленку. Во все лунки вносят по 100 мкл конъюгата. Планшет закрывают крышкой или клейкой пленкой. Инкубируют 30 мин при температуре от 21 до 25°C в защищенном от света месте. С помощью промывателя удаляют жидкость из лунок, 4 раза промывают планшет. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора индикаторного, немедленно помещают планшет в защищенное от света место и выдерживают 10-15 мин при температуре от 21 до 25°С. Во все лунки (в той же последовательности, в какой вносился индикаторный раствор) вносят по 100 мкл стоп-реагента, осторожно (постукиванием по планшету) перемешивают содержимое лунок и не более чем через 10 мин приступают к учету результатов.
Α1
А2
Значение оптической плотности K+(ср) - не ниже 1,0. Рассчитывают как среднее из показателей оптической плотности в двух лунках (ΟΠ+ОП)/2.
B1
В2
Значение оптической плотности K-(ср) - не выше 0,15. Рассчитывают как среднее из показателей оптической плотности в двух лунках (ΟΠ+ОП)/2.
пор
C1
С2
Значение оптической плотности K(ср) - не ниже 0,2. Рассчитывают как среднее из показателей оптической плотности в двух лунках (ΟΠ+ОП)/2.
При несоблюдении этих условий анализ необходимо выполнить заново
Исследуемые образцы учитываются по ОП K+пор:
как положительные при ОП>1,1×ОП(K+пор),
как отрицательные при ОП<0,9×ОП(K+пор).
Образцы с ОП в пределах от 0,9×ОП(K+пор) до 1,1×ОП(K+пор), т.е. в так называемой "серой" зоне, рекомендуется исследовать повторно, поскольку результаты, полученные в ней, не могут быть однозначно интерпретированы.
При повторном получении указанного результата, рекомендуется мониторинг наличия антител у пациента для исключения неспецифических реакций, которые также могут давать сомнительные результаты.
Для изучения чувствительности теста использовались: стандартный образец предприятия, содержащий и не содержащий антитела класса M к вирусу краснухи, стандартный образец предприятия, содержащий и не содержащий антитела класса M к токсоплазмозу, стандартный образец предприятия, содержащий и не содержащий антитела класса Μ к ВПГ 1,2, стандартный образец предприятия, содержащий и не содержащий антитела класса M к цитомегаловирусу.
Все сыворотки стандартных образцов, содержащих антитела класса M определены как положительные в тесте скрининга на все инфекции TORCH на одном планшете, т.е. тест показал 100% чувствительность (см. сводную таблицу 1). При этом коэффициенты позитивности положительных сывороток совпадали на 98-100% в сравнении с результатами анализа этих же сывороток в моноспецифических тестах.
Проведены клинические испытания моноспецифических тест-систем и микс-теста на 9 образцах сывороток крови от больных с подозрением на острую фазу заболевания инфекциями группы TORCH. Результаты приведены в сводной таблице 1. Показано полное совпадение результатов.