ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ ДОКСОРУБИЦИНА И ФОСФОЛИПИДНЫХ НАНОЧАСТИЦ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION BASED ON DOXORUBICINE AND PHOSPHOLIPID NANOPARTICLES FOR TREATMENT OF ONCOLOGIC DISEASES

Изобретение относится к медицине и фармакологии и касается стабильной при хранении и эффективной по своему специфическому действию лекарственной композиции, которая состоит из наночастиц на основе растительных фосфолипидов, включающих противоопухолевый препарат доксорубицин.
27
29
1
Доксорубицин представляет собой хорошо известный противоопухолевый антибиотик антрациклинового ряда, химическое его название (8S-цис)-10-(3-амино-2,3,6-тридезокси-альфа-L-ликсогексопиранозил)окси-7,8,9,10-тетра-гидро-6,8,11-тригидрокси-8-(гидроксилацетил)-1-метокси-5,12-нафтацендион, брутто-формула CHNO. Молекула доксорубицина состоит из тетрациклического антрахиноидного агликона доксорубицинона, соединенного гликозидной связью с аминосахаром даунозамином
Доксорубицин уже более 30 лет используется при лечении как гематологических онкологических заболеваний, так и солидных опухолей различной локализации [1, 2].
Его цитостатический эффект обусловлен связыванием с ДНК опухолевых клеток, подавляющим их рост и пролиферацию [3]. Препарат может внедряться между слоями пар оснований ДНК, угнетая ДНК-зависимый синтез РНК.
2
2
Доксорубицин применяется только в виде растворов для внутривенного и внутрипузырного введения. Внутривенно его вводят по 60-75 мг/м раз в 3-4 недели, или 30 мг/м раз в неделю в течение 3-4 недель. После в/в введения доксорубицин быстро исчезает из крови, распределяясь по органам и тканям организма: почкам, миокарду, селезенке, легким. В печени он метаболизируется с образованием активного метаболита доксорубицинола. Период полувыведения доксорубицина 20-48 часов, при этом 40% его выводится с желчью в неизмененном виде в течение 7 дней, с мочой в течение 5 дней выводится 5-12% доксорубицина и его метаболитов.
Ограничением для терапевтического использования доксорубицина является его токсичность по отношению к здоровым тканям, в первую очередь кардиотоксичность, проявляющаяся в выраженной сердечной недостаточности. Эффективным способом ее снижения считается использование доксорубицина не в свободной форме, а в составе лекарственных композиций: доксорубицин и переносчик (транспортная система), влияющих на биораспределение лекарства в организме и, в частности, снижающих возможность его поступления в сердце [4].
В связи с этим в последние годы именно доксорубицину посвящено большое количество исследований и разработок новых лекарственных форм доксорубицина, снабженных системой доставки в организме.
Основным требованием к таким формам доксорубицина является сохранение или увеличение терапевтического противоопухолевого действия при снижении побочных эффектов. Наиболее распространенные системы доставки - липосомальные формы, основанные на липидах [4-6]. Преимущества липосомальной формы в настоящее время хорошо известны и связаны в первую очередь с улучшенной фармакокинетикой и снижением побочных эффектов. Для доксорубицина такая форма оказывается весьма продуктивной, так как инкапсулированное в липосомы лекарство практически не попадает в здоровые ткани, проникая лишь через дефектные капилляры опухолей, а амфифильная фосфолипидная мембрана липосом, взаимодействуя с мембраной клетки, может способствовать взаимодействию лекарства с клеткой-мишенью, повышая тем самым его действие. В этом отношении существенным оказывается размер фосфолипидных переносчиков - максимальное его снижение должно способствовать проникновению в опухоли, включая внутриклеточное поступление лекарства, а также повышать устойчивость против захвата частиц ретикулоэндотелиальной системой (РЭС).
Известно несколько липосомальных форм доксорубицина со средним диаметром от 100 до 400 нм, которые представляют собой две группы препаратов. Наиболее часто используется препарат доксил (doxyl), он же келикс (caelyx), производства США [6]. Препарат разрешен к применению в России. Он представляет собой стабилизированные полиэтиленгликолем (ПЭГ) липосомы, содержащие доксорубицин. Для их получения смесь липидов (гидрогенизированный соевый фосфатидилхолин, холестерин и дистеароилфосфатидилэтанолаин с присоединенным ПЭГом в соотношении 56:39:5) суспендируют в растворе 250 мМ сульфата аммония, после чего подвергают экструзии (т.е. гомогенизации с фильтрацией под давлением). Неинкапсулированный сульфат аммония удаляют (например, с помощью колоночной хроматографии), добавляют доксорубицин и инкубируют при 55-60°С. При этом из-за образующегося градиента pH лекарство входит внутрь липосомы, образуя соль с захваченным сульфатным анионом, что стабилизирует его во внутреннем пространстве липосом. После стадии загрузки смесь охлаждают. По такому же принципу, но с использованием преимущественно яичного фосфатидилхолина, сконструирован препарат липодокс (Украина) [7]. В то же время присутствие в таких препаратах ПЭГа может привести к дополнительным побочным взаимодействиям.
Известна также другая форма липосомального доксорубицина, не содержащая ПЭГ. Это препарат Миоцет (TLC D-99, производимый "The Lyposome Company", США), представляющий собой липосомы из фосфатидилхолина с холестерином, содержащие цитрат доксорубицина, с соотношением лекарство:липид 0,28 [8]. Для его получения сначала готовят однослойные липосомы среднего диаметра 180 нм из смеси яичного фосфатидилхолина с холестерином (55:45) в цитратном буфере, и инкубируют их при встряхивании со свежеприготовленным раствором хлорида доксорубицина с метилпарабеном при 55-60°С. Недостатком такой нестабилизированной формы является быстрое поглощение липосом клетками РЭС, чему способствует их относительно большой размер - выше 150 нм, в сочетании с незащищенной поверхностью.
Таким образом, каждая из имеющихся на рынке липосомальных форм доксорубицина обладает определенными недостатками: низкая стабильность или дополнительные побочные действия. В связи с вышеизложенным в настоящее время продолжаются поиски и разработки его новых оптимизированных липидных лекарственных форм. Так, было проведено встраивание доксорубицина в фосфолипидные наночастицы, составляющие инъекционную форму препарата «фосфоглив» с размером частиц ~50 нм [9]. Для этого навеску доксорубицина (100 мг) добавляли к смеси исходных субстанций препарата «фосфоглив»: 5 г соевого фосфатидилхолина (Lipoid S100, фирма Lipoid, Германия), 2 г тринатриевой соли глицирризиновой кислоты (Китай) и 20 г моногидрата мальтозы. Добавляли 100 мл воды для инъекций, перемешивали на вибрационном смесителе и полученную водную суспензию подвергали гомогенизации с использованием гомогенизатора высокого давления RANNIE MiniLab 7.30 VH (Дания) в течение 5 минут. Полученный раствор подвергали стерилизующей фильтрации с использованием фильтров с диаметром пор 0.22 мкм при избыточном давлении азота 1,5-2 атм, разливали в стерильные флаконы по 10 мл и лиофилизировали с помощью лиофильной сушки Liolab F. Препарат проявлял более выраженную противоопухолевую и антиметастатическую активность на мышах с карциномой LLC по сравнению со свободным доксорубицином. Описаны также липосомы с диаметром ~135 нм из фосфатидилхолина, холестерина и олеиновой кислоты, с 0,19 молей доксорубицина на моль липида, получаемые инъекцией этанольного раствора [10], твердые липидные наночастицы из моностеарина, октадециламина и олеиновой кислоты [11], термочувствительные липосомы [12]. Разрабатывались также адресные липосомы с доксорубицином, содержащие в качестве лиганда эстрон [13] или интерлейкин-13 [14] - повышенная экспрессия рецепторов, к которым проявляется по некоторым данным на ряде опухолевых клеток. Описано также получение «наноассамблей» фосфатидилэтаноламина с ПЭГ с размером 10-20 нм, проявляющих выраженный терапевтический эффект на модели карциномы LLC у мышей [15]. В то же время нельзя не упомянуть, что ни в одной из этих работ не обращалось внимания на внутриклеточное проникновение доксорубицина, вводимого в новых транспортных формах, на его взаимодействие с ДНК, которое является основой цитостатического действия, и приобретает особое значение при переходе к частицам наноразмера, которые могут доставлять лекарство не только к клеточной мембране, но и проникать в клетку.
Задачей настоящего изобретения является разработка нежировой фосфолипидной композиции доксорубицина со средним диаметром наночастиц 10-30 нм, обладающей сниженной токсичностью по сравнению со свободным лекарством при сохранении специфического цитостатического действия, способной выдерживать длительное хранение и осуществлять транспорт доксорубицина в ткань опухоли с обеспечением высокой его биодоступности.
Поставленная задача решается путем создания фармацевтической композиции для лечения онкологических заболеваний в форме фосфолипидных наночастиц размером 10-30 нм, включающей фосфатидилхолин растительного происхождения, мальтозу и доксорубицин при следующем соотношении компонентов, % мас.:
Фосфатидилхолин
20-43
Мальтоза
55-78
Доксорубицин
2-8
Используемый фосфатидилхолин является основным компонентом высокоочищенного растительного соевого фосфолипида с содержанием не менее 73-95% мас. Другие фосфолипидные компоненты могут содержаться в количествах, не превышающих допустимые (лизофосфатидилхолина до 4% мас., следовые количества других фосфолипидов).
В качестве вспомогательных фармакологически приемлемых веществ композиция содержит мальтозу, являющуюся криопротектором на стадии сублимационной сушки. Добавление мальтозы дает возможность получения лиофилизата, способного после регидратации полностью восстанавливать свою структуру, в частности размер частиц.
Согласно изобретению предложенная композиция позволяет получать фармацевтический препарат с большим накоплением доксорубицина в опухолевой ткани по сравнению с исходным лекарством.
Способ получения фосфолипидной композиции доксорубицина осуществляется следующим образом.
Материалы и методы
В работе использовались следующие материалы:
1. Соевый фосфолипид фирмы Липоид ГмбХ, Германия, с содержанием фосфатидилхолина 78-95%.
2. Мальтозы моногидрат фирмы MERCK, Германия.
3. Вода для инъекций (по ФС №42-4587-95).
4. Доксорубицин, субстанция (по ФС 42-02402570-02).
Пример 1. Получение Доксорубицина в составе фосфолипидных частиц
А. Получение грубой эмульсии
25 г мальтозы растворяют в 200 мл воды с температурой 45°С (до полного растворения). В полученный раствор мальтозы добавляют 625 мг доксорубицина и 6,25 г фосфолипида. С помощью бытового блендера проводят гомогенизацию полученной смеси и доводят ее объем до 250 мл.
Б. Получение Доксорубицина в составе фосфолипидных наночастиц
Полученную грубую эмульсию пропускают через гомогенизатор (MiniLab 7.3 VH, Rannie, Дания) при давлении 800 бар. Регистрируют светопропускание при 660 нм. Фильтруют препарат через фильтр 0,22 микрон. Повторно регистрируют светопропускание при 660 нм, наблюдают его увеличение. Определяют размер частиц в препарате. Анализируют содержание доксорубицина в полученном препарате с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Разливают препарат во флаконы по 10 мл и лиофильно высушивают.
Содержимое флакона растворяют в 10 мл воды очищенной и определяют размер частиц после растворения лиофильно высушенного порошка препарата. Проводят определение размера частиц через сутки, двое и неделю хранения растворенного препарата при температуре 4°С.
Характеристика композиции доксорубицина в составе фосфолипидных наночастиц
Анализ размера частиц с помощью прибора Beckman N5 (см. таблицу 1) свидетельствует о том, что более 96% частиц имеют размер (20,0±2,0) нм. Встраивание доксорубицина в фосфолипидные наночастицы составляет около 96%.
Таблица 1
Распределение частиц по размеру в препарате доксорубицин в составе нанофосфолипидных частиц
N измерения
Область измерения, нм
Распределение частиц
размер, нм
содержание, %
стандартное отклонение, нм
1
3,0-450,0
19,5
95,17
1,3
2
3,0-450,0
21,3
96,50
1,2
3
3,0-450,0
21,1
96,34
2,1
4
3,0-450,0
20,6
95,97
1,6
5
3,0-450,0
19,7
97,21
1,4
Определение лекарственной субстанции в фосфолипидном препарате осуществляли методом ВЭЖХ. Для этого к препарату и добавляли 9-кратный избыток метанола, тщательно перемешивая на смесителе. ВЭЖХ анализ аликвот приготовленного раствора (1-10 мкл) проводили на приборе Agilent Technology 1200 (США) или «Милихром» (Новосибирск) с использованием линейного градиента ацетонитрила в 0,1% водном растворе ТФУ, от 1% до 60%, со скоростью элюции 200 мкл/мин и детектированием в диапазоне 220-360 нм. Для определения концентрации использовали калибровочную кривую зависимости площади пика от количества соответствующих стандартных образцов субстанций.
По данным ВЭЖХ встраивание доксорубицина в фосфолипидные наночастицы составляет около 96%. После регидратации лиофильно высушенного препарата доксорубицин в составе фосфолипидных наночастиц (НФ-доксорубицин) характер распределения частиц по размеру и размер основной по размеру фракции частиц не изменяется: более 96% частиц имеют размер (20,0±2,0) нм. При хранении растворенного препарата при 4°С в течение 7 суток размер частиц сохраняется.
Таблица 2
Распределение частиц по размеру в растворе препарата НФ доксорубицин в момент выпуска, через 4 и 7 дней хранения
N измерения
Срок хранения
Область измерения, нм
Распределение частиц
размер, нм
содержание, %
стандартное отклонение, нм
1
2
3
4
5
6
в момент
3,0-450,0
1
выпуска
19,5
96,33
1,3
2
18,9
97,13
1,6
3
19,6
96,43
1,9
4
20,1
96,87
2,1
4 дня
3,0-450,0
1
20,3
97,26
1,6
2
19,5
96,37
1,7
3
19,4
96,96
2,0
4
19,6
96,53
1,8
7 дней
3,0-450,0
1
19,8
96,21
1,7
2
20,4
96,15
1,9
3
19,7
95,98
2,3
4
20,9
95,73
1,4
Согласно изобретению предложенная композиция позволяет получать фармацевтический препарат с большей доступностью доксорубицина по отношению к ткани опухоли по сравнению со свободным лекарством.
Для оценки действия полученной лекарственной композиции доксорубицина у экспериментальных животных, накопления его в опухоли и распределения по фракциям крови и плазмы необходимо было на первом этапе отработать метод экстракции доксорубицина из тканей, который позволял бы проводить мониторинг не только свободного лекарства, но связанного с клетками, в частности в составе комплексов с ДНК.
Перечень чертежей
Фиг.1 - связывание с эритроцитами свободного доксорубицина и доксорубицина в составе фосфолипидных наночастиц при инкубации in vitro с гепаринизированной кровью.
Фиг.2 - распределение между фракциями липопротеинов в плазме крови свободного доксорубицина и доксорубицина в составе фосфолипидных наночастиц после инкубации плазмы in vitro с плазмой крови.
Фиг.3 - высвобождение тритоном Х-100 доксорубицина (обнаруживаемого после ультрафильтрации) в плазме, инкубированной со свободным или с НФ-доксорубицином.
Выбор метода экстракции доксорубицина
Был выбран способ экстракции доксорубицина смесью метанола и 0,5% трифторуксусной кислоты (ТФУ) и показана полнота экстракции препарата из комплексов с ДНК (таблица 3). Для этого проводили следующую процедуру:
- к 100 мкл раствора ДНК (10 мкг/мл) добавляли 100 мкл предварительно разведенного (1:100) раствора доксорубицина;
- отбирали 50 мкл раствора комплекса доксорубицин - ДНК и добавляли по 450 мкл экстрагента: а) метанола и б) метанола с 0,5% ТФУ (т.е. концентрация общего доксорубицина в каждом образце была 1000 нг/мл);
- растворы перемешивали на вибраторе, центрифугировали и из каждого раствора отбирали по 20 мкл для анализа доксорубицина методом ВЭЖХ, при этом в каждой пробе количество доксорубицина соответствовало 10 нг препарата в его комплексе с ДНК.
Таблица 3
Полнота экстракции доксорубицина из комплексов с ДНК
Способ экстракции
Обнаруженное количество доксорубицина в экстракте (в 20 мкл), нг
Исходное количество доксорубицина в образце, нг
Процент экстракции доксорубицина из комплекса с ДНК
1
2
3
4
Метанол
1
10
10%
Метанол с 0,5% ТФУ
10
10
100%
Поскольку обработка смесью метанола с 0,5% ТФУ приводит к полной экстракции доксорубицина, эта система была выбрана для последующей экстракции доксорубицина из тканей.
Действие свободного доксорубицина и доксорубицина в составе фосфолипидных наночастиц на мышей с перевитой опухолью
Сравнение накопления препаратов в ткани опухоли и в печени
Проведение эксперимента
Использовали мышей с перевитой аденокарциномой Льюиса LLC.
3
Объем опухоли ~5000 мм
Вес мышей ~20-25 г
Препараты доксорубицина вводили мышам внутрибрюшинно в дозе 15 мг/кг веса.
Через 4 часа животных забивали, извлекали печень и опухоль.
Образцы тканей гомогенизировали в смеси метанола с 0,5% ТФУ, в соотношении 100 мг ткани на 900 мкл растворителя. Гомогенат центрифугировали; в супернатанте определяли концентрацию доксорубицина с помощью ВЭЖХ. Результаты приведены в таблице 4.
Таблица 4
Содержание доксорубицина в печени и в опухоли мышей с опухолью после введения свободного доксорубицина и НФ-доксорубицина
Ткань
Количество доксорубицина, мкг/ г ткани
после введения свободного доксорубицина
после введения НФ-доксорубицина
Печень
2,5
3,1
Опухоль
1,2
5,4
Из приведенных данных следует, что в случае использования НФ-доксорубицина в опухоль (ткань-мишень) попадает в 4,5 раза больше лекарства, чем при ведении его в свободной форме.
Сравнение специфической противоопухолевой активности свободного доксорубицина и доксорубицина в составе фосфолипидных наночастиц
Растворы обеих форм доксорубицина вводили внутрибрюшинно мышам с опухолью LLC в дозе 5 мг/кг. Препараты вводили, начиная с 7 суток после трансплантации опухоли, один раз в неделю (т.е. всего три введения). Определяли размеры опухолей через 3 и 15 дней после начала лечения. Результаты эксперимента даны в таблице 5.
Таблица 5
Торможение роста опухоли при введении мышам доксорубицина и НФ-доксорубицина
Группы
n
Средние объемы опухолей, мм<sup>3</sup>
Сутки после начала лечения
Через 3 суток после 1-го введения
Через 15 суток (т.е после 3-го введения)
Контроль
13
1156 [769÷1543]
6713 [5082÷8344]
Цоксорубицин
10
834 [541÷1127]
5390 [4161÷6619]
Горможение роста опухоли, %
28
20
НФ-доксорубицин
10
349 [199÷499]
2934 [2358÷3510]
Торможение роста опухоли, %
70*
56*
* - достоверно по отношению к группе животных, получавших свободное лекарство, p<0,05.
При введении в указанном режиме НФ-доксорубицин вызывает значительно более выраженное торможение роста опухоли по сравнению со свободным лекарством.
Таким образом, доксорубицин в составе фосфолипидных наночастиц обладает более высокой противоопухолевой активностью на модели экспериментальной опухоли по сравнению со свободным доксорубицином, что проявилось в повышенном накоплении препарата в ткани опухоли и более интенсивном торможении роста опухоли.
Для характеристики свойств доксорубицина в составе фосфолипидных наночастиц, которые могут оказать влияние на его специфическую активность, были проведены эксперименты in vitro по инкубации НФ-доксорубицина с гепаринизированной кровью, взятой у крыс-самцов линии Wistar весом около 400 г. Было рассмотрено распределение препарата в крови как между эритроцитами и плазмой, так и в плазме между отдельными классами липопротеинов у здоровых животных.
Распределение свободного доксорубицина и доксорубицина в составе фосфолипидных наночастиц в крови
Распределение между клетками крови и плазмой
Имеются литературные данные, что доксорубицин, вследствие высокой неспецифической абсорбционной активности, при введении в кровь связывается в большой степени с эритроцитами [16]. Это снижает долю активного лекарства в плазме, ослабляя суммарное терапевтическое воздействие. Поэтому при разработке композиции НФ-доксорубицин представлялось целесообразным оценить возможное изменение такого неспецифического связывания в новой лекарственной форме.
Проведение эксперимента:
1) к 900 мкл гепаринизированной крови добавляли по 100 мкл раствора доксорубицина или НФ-доксорубицина с концентрацией 2 мг/мл (что соответствует концентрации препарата в образце крови 200 мкг/мл);
2) инкубировали при 37°С при перемешивании 30 или 60 минут;
3) отбирали 50 мкл крови, добавляли 450 мкл смеси метанола с 0,5% ТФУ, перемешивали на вибраторе, центрифугировали и отбирали супернатант для анализа;
4) 100 мкл крови из той же пробирки центрифугировали для осаждения форменных элементов. К 50 мкл плазмы добавляли 450 мкл смеси метанола с 0,5% ТФУ, перемешивали на вибраторе и центрифугировали, отбирая супернатант для анализа;
5) в полученных кисло-метанольных экстрактах из цельной крови и плазмы определяли содержание доксорубицина с помощью ВЭЖХ. Результаты пересчитывали на содержание лекарства в 1 мл исходной цельной крови (фиг.1). Содержание доксорубицина в форменных элементах определяли по разности.
На представленном чертеже можно видеть, что при включении доксорубицина в состав фосфолипидных наночастиц (НФ-доксорубицин) снижен процент лекарства, связанного с форменными элементами крови. Это повышает относительную долю свободного лекарства, которое может оказывать терапевтическое действие.
Распределение доксорубицина в плазме крови - для свободного лекарства и НФ-доксорубицина
В последние годы убедительно показано влияние на фармакокинетику и распределение лекарства в организме характера его распределения в плазме крови, т.е. связывания с отдельными классами липопротеинов и с белками плазмы (в первую очередь с альбумином). С 2002 г. в Администрации по контролю пищевых и лекарственных веществ (FDA) США данное исследование является обязательным при регистрации новых лекарств, включающих липофильные компоненты [17]. Поэтому представлялось целесообразным охарактеризовать в этом аспекте и НФ-доксорубицин.
Проведение эксперимента:
1) в пробирку с гепарином собирали кровь крысы (8 мл крови на 1,6 мл раствора гепарина), центрифугировали и отбирали в две пробирки по 3,8 мл плазмы;
2) добавляли по 200 мкл раствора доксорубицина или НФ-доксорубицина до концентрации в плазме 0,1 мг/мл;
3) инкубировали 30 минут при 37°С;
4) с целью фракционирования липопротеинов по плотностям добавляли по 2 г кристаллического NaBr, перемешивали до полного растворения соли и наслаивали 6 мл раствора NaBr с плотностью 1,019 г/мл;
5) центрифугировали на ультрацентрифуге Optima L90K Beckman при 41000 об/мин в угловом роторе 65 Ту при 4°С в течение 2 часов;
6) собирали фракции сверху по высоте пробирки, по 1-2 мл, соответствующие липопротеинам очень низкой (ЛОНП), низкой (ЛНП) и высокой плотности и оставшуюся донную белковую фракцию (без липопротеинов);
7) аликвоты каждой фракции обрабатывали 9-кратным объемом метанола, отделяли осадок белков центрифугированием (10 мин при 3000 об/мин), и анализировали метанольные экстракты с помощью ВЭЖХ. Результаты представлены на фиг.2.
Из представленного чертежа видно, что при использовании НФ-доксорубицина распределение лекарства сдвигается от альбуминовой фракции плазмы к липопротеинам, в основном, к ЛВП, что также может быть частично ответственным за большее его проникновение в ткань опухоли.
Оценка относительной прочности связывания доксорубицина в составе наночастиц композиции НФ-доксорубицин
Дополнительной характеристикой лекарственной композиции доксорубицина является также длительность удерживания лекарства в составе нанофосфолипидной частицы. Критерием этого могла бы послужить степень связывания свободного лекарства с белками плазмы - в случае инкубации плазмы со свободным или с НФ-доксорубицином. Для обнаружения этого связывания была использована ультрафильтрация проинкубированной плазмы в сочетании с обработкой тритоном Х-100, разрушающим белковые комплексы, с высвобождением свободного лекарства.
Проведение эксперимента:
1) к 900 мкл плазмы добавляли свободный или НФ-доксорубицин до концентрации доксорубицина 0,5 мг/мл и инкубировали 4 часа при комнатной температуре;
2) добавляли тритон Х-100 до концентрации 1% и инкубировали 10, 30 или 90 минут;
3) плазму после инкубации с тритоном Х-100 подвергали ультрафильтрации, ультрафильтраты обрабатывали метанолом, как описано выше, и в метанольных экстрактах определяли концентрацию доксорубицина с помощью ВЭЖХ. Результаты представлены на фиг.3.
В связи с тем, что при ультрафильтрации плазмы белки удерживаются и не проходят в фильтрат, отсутствие в нем доксорубицина указывает на отсутствие в плазме свободного лекарства, в обоих случаях. В случае плазмы со свободным доксорубицином появление его при обработке тритоном, вплоть до почти полного выхода, свидетельствует о том, что доксорубицин исходно находился в комплексе с компонентами плазмы, разрушаемыми тритоном. В плазме же, инкубированной с НФ-доксорубицином, высвобождение свободного лекарства происходит в 1,5 раза медленнее. Таким образом, можно сделать вывод о том, что существенная часть лекарства за время 4-часовой инкубации была защищена от комплексообразования с белками плазмы, так как она находилась в составе нанофосфолипидной частицы.
Показатели, характеризующие степень токсичности свободного доксорубицина и доксорубицина в составе фосфолипидных наночастиц
50
Сравнительная оценка токсичности обеих форм доксорубицина проводилась на мышах-самцах BDF1, массой не менее 18-20 г. Было определено значение ЛД при однократном внутривенном введении:
50
ЛД для НФ-доксорубицина - 12,4 мг/кг;
50
ЛД для препарата свободного доксорубицина (ЛЭНС Фарм) - 12,8 мг/кг.
Переносимость лечения также была сопоставимой: ни в одной группах не было отмечено гибели животных.
Таким образом, доксорубицин в составе фосфолипидной композиции в виде наночастиц 10-30 нм активнее накапливается в ткани опухоли и эффективнее тормозит рост опухоли у мышей с аденокарциномой LLC. В экспериментах in vitro для этой композиции (условное название «доксолип») показана большая доля не связывающегося с клетками крови доксорубицина, а также перераспределение его в плазме крови от белковой фракции к липопротеинам. Показана стабильность частиц доксолипа при инкубации с кровью в течение 4-х часов. По показателям токсичности доксолип сопоставим со свободным доксорубицином производства ЛЕНС Фарм.
ЛИТЕРАТУРА
1. Doxorubicin hydrochloride, European Pharmacopoeia. Sixth Edition, 2005, 1389-1390.
2. Регистр лекарственных средств России, М., 2000 г.
3. Terasaki Т., Iga Т., Sugiyama Y., Sawada Y., Hanano М. Nuclear binding as a determinant of tissue distribution of adriamycin, daunomycin, adriamycinol, daunorubicinol and actinomycin D. J. Pharmacobiodyn. 1984, 7(5), 269-277.
4. Abraham S.A., Waterhouse D.N., Mayer L.D., Cullis P.R., Madden T.D., Bally M.B. The liposomal formulation of doxorubicin. Methods Enzymol. 2005, 391, 71-97.
5. Drummond D.C., Noble C.O., Hayes M.E., Park J.W., Kirpotin D.B. Pharmacokinetics and in vivo drug release rates in liposomal nanocarrier development. J Pharm Sci. 2008, 97(11), 4696-4740.
6. Pérez-López M.E., Córiel Т., Gymez J.G., Jorge М. Role of pegylated liposomal doxorubicin (Caelyx) in the treatment of relapsing ovarian cancer. Anticancer Drugs. 2007, 18(5), 611-617.
7. Каплун А.П., Ле Банг Шон, Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ. Вопр. Мед. Химии, (1999) 45, 1-12.
8. Cowens J.W., Creaven P.J, Greco W.R., Brenner D.E. Doxorubicin Encapsulated in Liposomes. Initial Clinical (Phase I) Trial of TLC D-99. Cancer Research 1993, 53, 2796-2802.
9. Ипатова О.М., Зыкова М.Г., Торховская Т.И., Медведева Н.В., Прозоровский В.Н. Возможности использования фосфолипидной наносистемы с глицирризиновой кислотой (Фосфоглив) для оптимизации лекарственных препаратов, на примере доксорубицина и будесонида. Биомедицинская химия, 2009, 55(2), 185-194.
10. Sonar S., D'Souza S.E., Mishra K.P. A simple one-step protocol for preparing small-sized doxorubicin-loaded liposomes. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 2008, 27(3), 181-189.
11. Ying X.Y., Du Y.Z., Chen W.W., Yuan H., Hu F.Q. Preparation and characterization of modified lipid nanoparticles for doxorubicin controlled release. Pharmazie. 2008, 63(12), 878-882.
12. Morita K., Zywietz F., Kakinuma K., Tanaka R., Katoh М. Efficacy of doxorubicin thermosensitive liposomes (40 degrees C) and local hyperthermia on rat rhabdomyosarcoma. Oncol Rep. 2008, 20(2), 365-372.
13. Rai S., Paliwal R., Vaidya В., Khatri K., Goyal A.K., Gupta P.N., Vyas S.P. Targeted delivery of doxorubicin via estrone-appended liposomes. J Drug Target. 2008, 16(6): 455-463.
14. Madhankumar A.B., Slagle-Webb В., Wang X., Yang Q.X., Antonetti D.A., Miller P.A., Sheehan J.M., Connor J.R. Efficacy of interleukin-13 receptor-targeted liposomal doxorubicin in the intracranial brain tumor model. Mol Cancer Ther. 2009 Mar; 8(3): 648-54.
15. Tang N., Du G., Wang N., Liu C., Hang H. Liang W. Improving penetration in tumors with nanoassemblies of phospholipids and doxorubicin. J Natl Cancer Inst. 2007, 99(13), 1004-1015.
16. Marczak A., Kowalczyk A., Wrzesień-Kus A., Robak T., Jóźwiak Z. Interaction of doxorubicin and idarubicin with red blood cells from acute myeloid leukaemia patients. Cell Biol Int. 2006, 30(2), 127-132.
17. Wasan K.M., Brocks D.R., Lee S.D. Impact of lipoproteins on the biological activity and disposition of hydrophobic drugs: implications for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 2008; 7(1): 84-99.