Микрометод определения фунгистатической активности белков растительного происхождения

ЗАЩИТА РАСТЕНИЙ

Известия ТСХА, выпуск 5, 2011 год

УДК 579.64: 57.081: 632.08

МИКРОМЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНГИСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БЕЛКОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Е.А. РОГОЖИН1, Д.В. ЗАЙЦЕВ2, А.Н. СМИРНОВ2

(1 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН;

2 Кафедра защиты растений РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева)

В лабораторных условиях адаптировали микрометод тестирования фунгистати-ческой активности для веществ, доступных в ограниченном количестве (растительные белки и пептиды). Метод, названный луночным, основан на задержке роста колоний. При этом основным критерием определения активности при использовании данного метода является способность конидий грибов формировать колонии в присутствии тестируемого вещества, которое имеется в ограниченном количестве. Данным методом проведено сравнительное тестирование антигрибной активности 28-альбуминов семян одуванчика, которое выявило различие между действием разных изоформ белков на скорость роста колоний грибов.

Ключевые слова: биологически активные вещества, луночный метод, фунгистатиче-ская активность, антимикробные белки.

В последние годы на фоне интенсивного роста населения Земли и уменьшения площадей, пригодных для сельского хозяйства, появляется необходимость интенсивного возделывания пахотных земель. При этом обостряется проблема увеличения прямых и косвенных потерь с.-х. продукции, нередко происходящих на фоне активного использования химических средств защиты растений. Применение большинства препаратов неблагоприятно сказывается на окружающей среде [9].

Внедрение биологически активных веществ растительной природы с целью повышения устойчивости с.-х. культур к патогенам и насекомым-вредителям может служить альтернативой применению химических средств защиты растений. Наибольший интерес в последние годы проявляют к поиску в растениях полипептидов, обладающих антимикробными свойствами. Повышение устойчивости растений может быть достигнуто как усилением экспрессии собственных генов, участвующих в защитных реакциях, так и встраиванием в геном культурных растений генов, кодирующих белки и пептиды с антимикробными свойствами, из других видов растений [5].

Первым этапом установления наличия антимикробных свойств у растительных полипептидов является тестирование их биологической активности in vitro.

Существует целый ряд методов определения антимикробной активности биологически активных веществ in vitro. Применительно к грибам-микромицетам все эти методы можно условно разделить на две группы. К первой группе относится визуальное определение ингибирования роста мицелия на мицеллиальном круге (диско-диффузионный метод) [2, 7]. Вторая группа тестирования связана с применением микротехники и представлена турбидиметрическим методом [3, 11], спектрофотометрическим методом при длинах волн видимого диапазона [4, 8], методами количественного определения ингибирования роста грибных пропагул (конидий, фрагментов гиф и др.) с использованием оптической микроскопии в проходящем свете [6].

Следует учитывать, что для тестирования, как правило, доступны очень ограниченные количества веществ белковой природы. Поэтому для определения их ан-тигрибной активности невозможно использовать методы, обычные для испытаний in vitro фунгицидов и антибиотков. Кроме того, для грибов — факультативных паразитов часто проблематично использовать биотесты из-за их нестабильного спорообразования и нередких проблем с заселением растительного субстрата в лабораторных условиях. Предпочтительней для таких грибов использовать тесты на питательных средах, где они развиваются стабильно.

Целью данной работы была отработка микрометода определения биологической активности растительных белков и пептидов, доступных в ограниченном количестве, in vitro. Метод основан на смешивании микроколичеств раствора тестируемого вещества и суспензии конидий фитопатогенных грибов с последующим помещением в лунку на агаризованой среде и измерением линейного роста колоний.

Материалы и методы

Материалом для исследования служили следующие культуры фитопатогенных грибов (табл. 1).

Титр конидий определяли с помощью камеры Горяева (гемоцитометра).

Т а б л и ц а 1

Культуры фитопатогенных грибов для апробации луночного метода

Вид Штамм / изолят Источник выделения Происхождение Год

Fusarium oxysporum (Schl.) ТСХА-4 Салат (листья) Лаборатория защиты растений РГАУ - МСХА 2007

Botrytis cinerea (Pers.) СГР-1 Шиповник (листья) То же 2006

Bipolaris sorokiniana (Shoem.) VKM F-1446 Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии имени Г.К.Скрябина РАН 2006

Aspergillus niger (v.Tiegh.) VKM F-33 — То же 2007

Phoma betae (Fr.) VKM F-2532 — То же 2007

Verticillium albo-atrum (Rein. et Berth.) VKM F-2437 — То же 2007

во

В экспериментах с прорастанием конидий грибов для приготовления суспензий использовали 10%-й морковный бульон (МБ) (В. cinerea, B. sorokiniana, A. niger, Ph. betae, V. аШо-а^ит), 3%-й раствор сахарозы (Е oxysporum). Закладывали варианты как без добавления тестируемых антимикробных белков (контрольные), так и с добавлением их.

С колоний грибов производили смыв конидий соответствующим питательным раствором с последующим разбавлением полученных суспензий до необходимых концентраций. Далее каждую полученную суспензию в объеме 75 цл смешивали с эквивалентным количеством раствора тестируемого образца и инкубировали при температуре 22°С в течение 2 ч. В стерильные чашки Петри наливали питательную среду (картофельно-глюкозный или овсяный агар) объемом по 60 мл на чашку (примерно 3/4 высоты), затем специальным сверлом в центре чашек делали лунки объемом 60-70 цл. После этого в чашки разливали по 50 цл каждой смеси и инкубировали их при температуре 22°С в течение 120 ч. Учет осуществляли через 72, 96 и 120 ч (итоговый учет) инкубации. При учете измеряли средний диаметр каждой колонии по трем измерениям (в мм), затем по данным значениям рассчитывали минимальную ингибирующую концентрацию (ИКмин), вызывающую эффект задержки роста колонии относительно контроля не менее чем на 15%, а также эффективную ингибирующую концентрацию, вызывающую половинный эффект задержки роста колонии относительно контроля (ИК50).

В качестве испытуемых веществ использовали 28 альбумины семян одуванчика (ТоА1-ТоА3). Они были получены из ИБХ РАН. Тестирование белков проводили в диапазоне действующих концентраций 4,5-18 цМ. Ранее было показано, что данное семейство белков растений обладает бифункциональным действием, которое выражается в их способности помимо запасной выполнять также защитную функцию [10].

Для апробации разработанной тест-системы была определена активность запасных белков семян одуванчика — 28 альбуминов. Развитие грибов в опытных вариантах сравнивали с контролями, где они инкубировались и развивались на среде, как описано выше, но без добавления 28 альбуминов.

Статистическая оценка полученных данных осуществлена методом дисперсионного анализа с использованием программного обеспечения 8ТЯА2. Обработку данных проводили путем расчета двухфакторного дисперсионного анализа (фактор А — различные изоформы запасных белков — 28 альбуминов, фактор В — различные виды фитопатогенных грибов).

Результаты и их обсуждение

В таблице 2 представлены средние значения размеров колоний 6 видов грибов после добавления максимальной тестируемой концентрации изоформ 28 альбуминов (18 цМ) при итоговом учете (после 120 ч инкубирования).

Достоверные различия наблюдали по обоим исследуемым факторам как между видами фитопатогенных грибов, так и между изоформами белка. Но наиболее выраженный фунгистатический эффект задержки роста мицелия показал белок ТоА2: из пяти микроорганизмов подавление на уровне 50% от контроля после 120 ч инкубирования отмечено у двух: V. а1Ьо-а^ит, В. sorokiniana, причем у V. аШо-а^ит по всем тестируемым белкам степень ингибирования роста колоний была максимальной (ИК50 на уровне 4,5 цМ (табл. 3)).

Т а б л и ц а 2

Диаметр колоний фитопатогенных грибов при тестировании фунгицидной активности 2в-альбуминов луночным методом (мм) при итоговом учете

Изоформа 2Б альбумина

Я oxyspo-rum B. а-пє^ B. soro-кiniana A. niдer Ph. betae V. albo-atrum

Контроль 61,2 38,0 54,3 30,0 71,0 63,5 53,0

ТоА1 59,5 34,4 25,5 27,2 41,5 13,3 33,6

ТоА2 62,5 61,0 24,9 24,8 62,5 9,4 40,9

ТоАЗ 56,7 37,0 25,4 24,0 58,0 10,8 35,3

В среднем по фактору В (НСР05=0,76) 60,0 42,6 32,5 26,5 58,3 24,3 —

НСР05 взаимодействия факторов АВ=0,76 НСР05 для частных различий=1,53

Как видно из таблицы 3, после 72 ч инкубирования фунгистатическая активность была выражена гораздо слабее, однако по мере дальнейшего развития колонии V. а1Ьо-а^ит и В. sorokiniana в вариантах стали заметно отставать от контрольных.

В целом все исследуемые представители 28-альбуминов семян одуванчика показали сходное действие на скорость роста мицелия, разница была обусловлена различными действующими концентрациями белков в пределах одного патогена (Ph. betae, В. sorokiniana). С точки зрения задержки роста мицелия, исследуемые белки не оказали эффекта на Е oxysporum и В. стегеа, слабый эффект был отмечен в варианте с ТоАЗ при действии на А. niger. Значимых отклонений в морфологических особенностях мицелия, интенсивности конидиального спороношения по сравнению с контролем по всем фитопатогенам не обнаружено.

Т а б л и ц а 3

Значения концентраций изоформ 2в-альбуминов, дающих минимальный и половинный эффект ингибирования роста колоний исследуемых фитопатогенных грибов «луночным» методом

Изоформа белка / Виды грибов

концентрация V. albo-atrum Ph. betae A. niger F. oxysporum B. іїпєгєє B. sorokiniana

1 2 3 4 5 6 7

После 72 ч инкубирования

ИК50, НМ 18,0 9,0

ТоА1

ИКмин, нМ 4,5 4,5 — — — 4,5

ИК50, НМ 18,0

ТоА2

ИКмин, нМ 4,5 4,5 — — — 4,5

ИК50, НМ — — — — — —

ТоА3

ИКмин, нМ 4,5 4,5 — — — 4,5

1 2 3 4 5 б 7 8

После 96 ч инкубирования

ИК50, ММ 4,5 9,0

ToA1

ИКмин, мМ 4,5 4,5 — — — 4,5

ИК50, ММ 4,5 4,5 9,0

ToA2

ИКмин, мМ 4,5 4,5 — — — 4,5

ИК50, ММ 4,5

ToA3

ИКмин, мМ 4,5 4,5 9,0 — — 4,5

После 120 ч инкубирования

ИК50, ММ 4,5 9,0

ToA1

ИКмин, мМ 4,5 4,5 — — — 4,5

ИК50, ММ 4,5 4,5 9,0

ToA2

ИКмин, мМ 4,5 4,5 — — — 4,5

ИК50, ММ 4,5 4,5

ToA3

ИКмин, мМ 4,5 4,5 9,0 — — 4,5

Заключение

Адаптация микологической методики позволила нам эффективно оценивать фунги-статическую активность веществ (антимикробных белков и пептидов), доступных только в малых количествах. Тестирование антигрибной активности 28-альбуминов семян одуванчика выявило различие между действием разных изоформ белков на скорость роста колоний грибов из разных таксономических групп, вызывающих опасные болезни с.-х. культур и существенно снижающие их урожай.

Наиболее выраженный эффект задержки роста мицелия показал белок ToA2: подавление на уровне 50% отмечено у V. albo-atrum и B. sorokiniana. С точки зрения задержки роста мицелия, исследуемые белки не оказали эффекта на F oxysporum и B. cinerea, слабый эффект был отмечен в варианте с ToA3 при действии на A. niger.

Несмотря на ингибирующее действие различных изоформ 28-альбуминов на скорость роста колоний некоторых фитопатогенных грибов из разных таксономических групп, эффективность данных веществ оказалась невысокой. Следовательно, необходимо осуществлять проведение дальнейших экспериментов в этом направлении и поиск новых эффективных веществ той же природы.

Библиографический список

1. Каталог культур микроорганизмов. Всероссийская коллекция микроорганизмов ИБФМ РАН. Пущино-Москва, 1992.

2. Шестибратов К.А. Роль экспрессии гетерологичных генов растительного дефензи-на Rs-AFP2 и суперсладкого белка тауматин II в повышении резистентности к фитопатогенам и изменении вкуса плодов на примере земляники садовой: Автореф. канд. дис., Институт биофизики клетки РАН, 2003.

3. Almeida M.S., Cabral K.S. Characterization of two novel defense peptides from pea Pisum sativum // Arch. Biochem. Biophys., 2000. V. 378 (2). P. 278-286.

4. Broekaert W.F., TerrasF.R.G., CammueB.P.A., Vanderleyden J. An automated quantitative assay for fungal growth inhibition // FEMS Microbiology Lett., 1990. V. 69. P. 55-60.

5. Carlini C.R., Grossi-de-SaM.F. Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on their potentialities as bioinsecticides. Toxicon, 2002. V. 40. P. 1515-1539.

6. Duvick J.P., Rood T., Rao A.G., Marshak D.R. Purification and characterization of a novel antimicrobial peptide from maize (Zea mays L.) kernals // J. Biol. Chem., 1992. V. 267 (15). P. 18814-18820.

7. Lipkin A., Anisimova V., Nikonorova A., Babakov A., Krause E., Bienert M., Grishin E., Egorov T. An antimicrobial peptide Ar-AMP from amaranth (Amaranthus retroflexus L.) seeds // Phytochemistry, 2005. V. 66. P. 2426-2431.

8. Ludwig A., Boller Th. A method for the study of fungal growth inhibition by plant proteins // FEMS Microbiology Lett., 1990. V. 69. P. 61-66.

9. Oerke E.C., Dehne H.W., Schonbeck F., Weber A. Crop Production and Crop Protection: Estimated Losses in Major Food and Cash Crops, 1994. Amsterdam.: Elsevier.

10. Terras F.R.G., Torrekens S., Van Leuven F., Osborn R.W., Vanderleyden J., Cammue B.P.A., Broekaert W.F. A new family of basic cysteine-rich plant antifungal proteins from Brassicaceae species. FEBS Lett., 1993. 316. 233-240.

11. Veshkurova O., Golubenko Z., Pshenichnov E. Malvone A, a phytoalexin found in Malva sylvestris (family Malvaceae) // Phytochemistry, 2006. V. 67. P. 2376-2379.

Рецензент — д. б. н. Ф.С. Джалилов

SUMMARY

Laboratory «hole» method of testing fungistatic activity of both plant proteins and peptides based on growth inhibition has been adapted in this research for strictly limited quantity of tested substances. The main criterion of determining activity by this very method is the ability of fungal conidia to form colonies in vitro with tested substance as an indicator. By this method comparative testing of anifungal activity in 2S albumins of dandelion seeds, which detected a difference between various proteins isoforms effect on rate of fungi colonies growth — Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea, Bipolaris sorokiniana, Aspergillus niger, Phoma betae, Vericillium albo-atrum, has been carried out.

Key words: biologically active substances, hole method, fungistatic activity, antimicrobc proteins.

Рогожин Евгений Александрович — м. н. с. кафедры защиты растений РГАУ - МСХА имени К. А. Тимирязева. Тел. (495) 336-40-22.

Эл. почта: rea21@list.ru.

Зайцев Дмитрий Викторович — аспирант кафедры защиты растений РГАУ - МСХА имени К. А. Тимирязева. Тел. (495) 577-63-36. Эл. почта: victor56@querty.ru.

Смирнов Алексей Николаевич — д. б. н. Тел. (499) 976-03-78.

Эл. почта: smirnov@timacad.ru.