СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОЙ ГЕНОДИАГНОСТИКИ ДВУХ МУТАНТНЫХ АЛЛЕЛЕЙ, ВЫЗЫВАЮЩИХ CVM И BLAD У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, И ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
METHOD OF SIMULTANEOUS GENODIAGNOSTIC OF TWO MUTANT ALLELES CAUSING CVM AND BLAD IN CATTLE, AND TEST SYSTEM FOR IT

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в ветеринарной практике при диагностике мутаций, вызывающих две наследственные болезни: комплекс аномалий позвоночника (CVM - Complex Vertebral Malformation) и дефицит лейкоцитарной адгезии (BLAD - Bovine Leucocyte Adhesion Deficiency) у крупного рогатого скота. Предложенный способ и тест-система для его осуществления позволяют одновременно идентифицировать CV и BL мутации соответственно в локусах SLC35A3 и CD 18 ДНК с помощью ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на основе праймеров и аллель-специфических зондов.
В настоящее время у крупного рогатого скота описано около 60 наследственных заболеваний, которые выявляются на уровне ДНК (ICAR Guidelines…, 2011). Они вызывают морфологические и функциональные аномалии, негативно влияют на здоровье и продуктивность животного. Поэтому важной задачей ветеринарных врачей является своевременная диагностика и искоренение источника, вызывающего данную болезнь. Знание молекулярной структуры, определение гетерозиготного носителя являются основой для эффективной борьбы с наследственным заболеванием.
Быстрота и точность диагностики комплекса аномалий позвоночника (CVM) и дефицита лейкоцитарной адгезии (BLAD) значительно повысилась  благодаря установлению генетической природы данных молекулярных болезней (Kehrli M.E. et al., 1990; Tammen I., 1994; Batt C.A. et al., 1994; Марзанов Н.С. и др., 1997; Амерханов Х.А., Марзанов Н.С., 1999; Agerholm J.S. et al., 2001; Яковлев А.Ф. и др., 2004; Eggen A. et al., 2004; Oguni T. et al., 2004; Rusc A., Kaminski S., 2007; Калашникова Л.А., 2010; Марзанова С.Н. и др., 2011; 2012).
В развитых странах Европы и Северной Америки созданы специальные программы по элиминации мутантных CV и BL аллелей в популяциях черно-пестрой породы (Shuster D.E. etal., 1992 a,b; Czarnik U. et al., 2007; Schutz E. et al., 2008).
В Российской Федерации выдающихся производителей и ремонтный молодняк проверяют на носительство мутантных аллелей, а результаты в обязательном порядке, наряду с группами крови и каппа-казеином, регулярно публикуют в каталогах по племенным быкам (Шапочкин В.В., Ескин Г.В., 2004; Попов Н.А. и др., 2004; Савенко Н.А. и др., 2007; Ескин Г.В., 2010).
В открытой печати предложены ряд методов диагностики CVM и BLAD (Kehrli M.E.et al., 1990; Shuster D.E. et al., 1992a; Tammen I., 1994; Nagahata H. et al., 1997; Kanae Y. et al., 2005; Rusc A., Kaminski S., 2007). Однако диагностика при раздельном их выявлении занимает много времени.
Таким образом, в молекулярной биологии существует очевидная потребность в разработке высокочувствительного, специфичного и быстрого способа диагностики двух мутантных аллелей, вызывающих CVM и BLAD у крупного рогатого скота, а также тест-системы для его осуществления, которая может быть применима в ветеринарной практике.
Из уровня техники известен генетический тест для идентификации носителей рецессивного гена комплексных вертебральных мальформаций у крупного рогатого скота (Патент на изобретение №2276690 опубл. 20.05.2006). Данное изобретение принято в качестве ближайшего аналога. Отличительной особенностью заявленного изобретения от выявленного аналога является возможность определения CVM вместе с BLAD, т.е. идет одновременное определение двух мутаций по методике  ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), с  помощью праймеров и аллель-специфических зондов. Точка мутации CV та же, что и в указанном аналоге, однако подход детекции принципиально иной.
В заявленном изобретении осуществляется идентификация полиморфизма в локусе SLC35A3 (G/T) с помощью ПЦР-РВ и использованием TaqMan зондов. Время исследования данного полиморфизма занимает не более 3-х часов. В ближайшем аналоге диагностируют CVM с помощью микросателлитов, с использованием электрофоретического метода детекции, что является принципиально другим методом диагностики данного полиморфизма и занимает больше времени и необходимого оборудования.
Целью изобретения является создание способа одновременной диагностики мутантных CV и BL аллелей с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) и разработка тест-системы для его осуществления с использованием наборов олигонуклеотидов-праймеров и зондов, имеющих специфические последовательности.
В изобретении представлен способ одновременной диагностики мутантных CV и BL аллелей у черно-пестрого генеалогического корня, куда относятся такие известные породы, как голштинская, черно-пестрая, холмогорская, ярославская, тагильская и красно-пестрая порода, а также синтетические популяции с примесью голштинской крови. Тест-система разработана для тестирования быков-производителей, быковоспроизводящих групп коров, ремонтного молодняка, а также семени из спермобанка и эмбрионов.
Техническим результатом заявленного изобретения является возможность диагностики одновременно двух мутантных аллелей, вызывающих CVM и BLAD у крупного рогатого скота; сокращение времени выполнения полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) (через 3 часа получен результат); нетрудоемкость; возможность выполнять повторности; проводить контроль правильности исследования.
2
Указанный технический результат достигается тем, что проводят выделение ДНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием реакционной смеси с CVM/BLAD. Реакционная смесь содержит 50 мМKCl, 50 мMTRIS-HCl, 250 нMdNTP, 2,5 мMMgCl, праймеры - в концентрации 200 нМ, аллель-специфические зонды - в концентрации 100 нМ, разбавитель, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, три положительных и один отрицательный контрольных образца. При подготовке к проведению реакции рассчитывают необходимый объем компонентов, исходя из количества исследуемых образцов плюс 4, где три положительных контрольных образца и один отрицательный контрольный образец. Реактивы смешивают, затем в подготовленные для ПЦР пробирки вносят по 20 мкл приготовленной ПЦР-смеси, в каждую ПЦР пробирку добавляют по 5 мкл контрольных и исследуемых образцов. Пробирки помещают в амплификатор. Отжиг праймеров проходит на этапе циклирования при 64°С в течение 30 с при числе циклов амплификации равном 40. Анализ полученных данных проводят путем сравнения амплифицированных участков генов, результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией.
2
Тест-система для одновременной генодиагностики двух мутантных аллелей, вызывающих CVM и BLAD у крупного рогатого скота методом постановки полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, содержит реакционную смесь с CVM/BLAD (50 мМKСl, 50 мMTRIS-HCl, 250 нMdNTP, 2,5 мMMgCl, праймеры - в концентрации 200 нМ, аллель-специфические зонды - в концентрации 100 нМ), разбавитель, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, 3 положительных контрольных образца, один отрицательный контрольный образец.
Праймеры и зонды для осуществления заявленного изобретения имеют следующие последовательности:
CVM_up - gattctcaagagcttaattctaagga
CVM_low - aagtaaaccccagcaaagccac
CVM_Wt - (FAM) aggtctcatggca(G-LNA)ttct-(BHQ1)
CVM_m - (R6G) catggcatttctcacagcat-(BHQ2),
BLAD_up - ttaggcagttgcgttc
BLAD_low - acgttgacgaggtcatccacca,
BLAD_Wt - (ROX) accccatcgacctgtacta-(BHQ1),
BLAD_m (Cy5) ccatcggcctgtactacct-(BHQ2),
Экспериментально установлен оптимальный состав реакционной смеси для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, подобрано сочетание праймеров, необходимое и достаточное соотношение компонентов реакционной смеси и определен режим постановки ПЦР, что является важным при проведении ПЦР-анализа. Система рассчитана на проведение 100 реакций объемом 25 мкл (20 мкл + 5 мкл исследуемого образца).
Подбор праймеров и аллель-специфических зондов (табл. 1) проводили при помощи пакета прикладных программ «Oligo 6.0» на основании анализа нуклеотидных последовательностей локусов SLC35A3 и CD 18 ДНК, опубликованных в базе NSBI.
Источником для проведения диагностики служит предварительно выделенная ДНК из образцов биологического материала (цельной крови, спермы, эмбрионов, молока или кожи).
Выделение ДНК проводили сорбентным методом (ДНК-сорб-В, ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва). Далее выделенную ДНК использовали в реакции: 5 мкл образца добавляли к реакционной смеси ПЦР.
2
Реакционная смесь для ПЦР-анализа имеет следующий состав: 50 мМKС1, 50 мMTRIS-HCl, 250 нMdNTP, 2,5 мMMgCl, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, праймеры в концентрации 200 нМ, флуоресцентные зонды - в концентрации 100 нМ, при этом праймеры и аллель-специфические зонды имеют определенные специфические последовательности (табл. 1).
Подготовку к проведению реакции осуществляли следующим образом.
Необходимый объем компонентов рассчитывали исходя из количества исследуемых образцов плюс 4 (три положительных контрольных образца и один отрицательный контрольный образец). Набор компонентов для реакции представлен в таблице 2.
Компоненты разморозили, перемешали и центрифугировали. Приготовили смесь компонентов, добавляя их в порядке, указанном в таблице 3, перемешали и центрифугировали.
ПЦР пробирки маркировали. В подготовленные для ПЦР пробирки внесли по 20 мкл смеси компонентов. Затем в каждую ПЦР пробирку внесли по 5 мкл контрольных и исследуемых образцов в соответствии с маркировкой, перемешали многократным пипетированием и плотно закрыли крышку. Пробирки поместили в карусель амплификатора, затем программировали работу прибора.
Профиль реакции:
1. Удержание температуры 94°С - 3 мин, один повтор.
2. Циклирование 1
94°С - 20 с
61°С - 20 с
64°С - 30 с
Цикл повторить 10 раз.
3. Циклирование 2 (с детекцией)
94°С - 20 с
61°С - 20 с
64°С - 30 с - детекция по каналам: Green, Yellow, Orange, Red
Цикл повторить 30 раз.
В процессе циклирования денатурация, отжиг праймеров и синтез новой цепи ДНК происходит при температуре 64°С. При первом циклировании провели 10 повторов - детекции нет, так как данные нерепрезентативны. При втором циклировании провели 30 повторов, в результате получили стабильные данные, которые являются окончательными в плане диагностики.
Создание шаблона ПЦР-РВ, а также анализ результатов исследования проводили при помощи программного обеспечения «Rotor-Gene 6000 1.8» к прибору RotorGene Q (CorbettResearch, Австралия).
Результатом анализа является определение мутантных аллелей, вызывающих комплекс аномалий позвоночника (CVM) и дефицит лейкоцитарной адгезии (BLAD) у крупного рогатого скота.
Интерпретацию результатов анализа исследуемых образцов проводили в соответствии с табл. 4:
1. Результат реакции для ПКО1 (положительный контрольный образец) должен быть положительным по каналам Green и Orange, отрицательным по каналам Yellow и Red.
2. Результат реакции для ПКО2 должен быть положительным по каналам Green, Yellow,Orange, Red.
3. Результат реакции для ПКО3 должен быть положительным по каналам Yellow и Red, отрицательным по каналам Green и Orange.
4. Результат реакции для ОКО (отрицательный контрольный образец) должен быть отрицательным по всем каналам.
В случае получения положительных результатов для ОКО по любому из каналов результаты исследования считаются недействительными. Требуется предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и провести повторный анализ.
Результат анализа для образца считается неопределенным, если результаты реакций по каналам Green, Yellow, Orange, Red отрицательные.
В этом случае необходимо повторное исследование образца.
Прогноз получаемого потомства в зависимости от присутствия или отсутствия мутантных CV и BL аллелей. Наличие CV, как и BL аллеля, является ярким примером носительства мутации с одной стороны, а с другой, проявления однонуклеотидного полиморфизма или SNP (singlenucleotidepolymorphism) в ДНК у крупного рогатого скота.
В заявленном изобретении использована технология аллель-специфических TaqMan зондов. В данном случае флуоресцентным зондом является олигонуклеотид, комплементарный продукту ПЦР.
Зонд метят флуорофором и гасителем флуоресценции, при этом используют концевое мечение олигонуклеотида. При отсутствии мишени, т.е. последовательности, комплементарной зонду, флуорофор и гаситель сближаются, в результате подавляется флуоресценция зонда. При наличии комплементарного зонду фрагмента ДНК зонд гибридизуется с ампликоном, что ведет к его расщеплению в процессе синтеза за счет 5′-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы. Интенсивность сигнала возрастает на соответствующем флуорофору канале флуоресценции с каждым циклом ПЦР, пропорционально накоплению ампликонов.
Аллель-специфические зонды эффективны при детекции CV и BL мутаций в исследуемом фрагменте генома. Для локуса с мутацией подбирают пару зондов, так чтобы один из них специфически гибридизовался при температуре проведения синтеза цепей с аллелем нормального (дикого) типа, а второй зонд - с аллелем мутантного типа.
Эти зонды метят разными флуорофорами, а результаты реакций с ними регистрируют на двух различных каналах детекции прибора для ПЦР-РВ. Для определения СТ и CV аллелей используют 2 канала - Green и Yellow. Нормальный СТ аллель дает рост сигнала по каналу Green, детектируемый флуорофором FAM, а мутантный аллель CV - по каналу Yellow, детектируемый флуорофором R6G.
Что касается TL и BL аллелей, то для их определения используют тоже 2 канала, только Orange и Red. Нормальный TL аллель дает рост сигнала по каналу Orange, детектируемый флуорофором ROX, а мутантный аллель BL -по каналу Red, детектируемый флуорофором Су5.
Результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией.
Переход порога - это характеристика количества копий ДНК отдельного гена. При оптимальном количестве копий ДНК кривая располагается между двумя пороговыми значениями 10 и 15 циклами амплификации.
При перемещении кривой влево по оси абсцисс это говорит о высокой концентрации ДНК, если вправо - о ее недостатке в реакции. Все образцы, графики флуоресценции которых пересекают линию порога, будут считаться положительными по определенному каналу, т.е. содержащими соответствующий каналу флуоресценции аллель.
Получаемая картина результатов реакций с использованием указанных зондов на контрольных образцах приведена ниже при определении мутантного CV аллеля. На рис. 1 - результаты исследований гомозиготного дикого типа или здорового животного или неносителя, флуоресценция представлена двумя линиями.
Кривая без маркеров располагается между 10 и 15 циклами над красной пороговой линией. Вторая кривая с окружностями - ниже пороговой линии. Данная ситуация характерна для здорового исследуемого животного.
На рис. 2 представлены результаты исследования гетерозиготного животного или носителя мутантного CV аллеля. Как видно на рис. 2, обе кривые флуоресценции пересекают установленную на соответствующем уровне пороговую линию в обозначенном районе, между 10 и 15 циклами ПЦР-РВ.
В то же время следует отметить, что кривая с окружностями располагается выше кривой без маркеров. Данная картина характерна для гетерозиготного животного или носителя мутации.
При налаживании данного способа не было возможности получения больных телят опытным путем в хозяйственных условиях. В этой связи впервые удалось смоделировать синтетические рецессивные генотипы больных телят по локусам SLC35A3 и CD 18, в лабораторных условиях, на основе знания структур мутантных CV и BL аллелей.
На рис. 3 представлен модельный образец животного, гомозиготного по мутантному CV аллелю. Как видно на рис. 3, модельный образец отражает ситуацию, характерную для больного теленка. В данном случае кривая с окружностями располагается выше порога, кривая флуоресценции без окружностей, характерная для здорового животного, оказывается под пороговой линией.
Что касается принципа определения BL аллеля, то он аналогичен тому, что описано в отношении диагностики CV мутации. Анализ проводится по описанной выше методике, только по каналам Orange и Red и вся процедура осуществляется одновременно.
Основными преимуществами заявляемого изобретения являются:
1. Одновременная аттестация элитных животных черно-пестрого генеалогического корня и красно-пестрой породы по двум мутациям (CV и BL) при помощи заявленной тест-системы позволит направленно формировать аллелофонд быков-производителей, быковоспроизводящих групп коров, ремонтный молодняк, а также накапливать племенной материал (банк семени и эмбрионов) от здоровых животных.
2. Наличие генетического паспорта на CV и BL мутации элитных животных позволит эффективно вести селекционно-племенную работу в племенных стадах черно-пестрого генеалогического корня и красно-пестрой породы.
3. При завозе племенного материала в Российскую Федерацию из-за рубежа обязательно наличие генетического паспорта. С целью купирования двух наследственных болезней закупленные животные после карантина должны пройти повторную аттестацию на наличие мутантных CV и BL аллелей.
Литература
1. Амерханов Х.А., Марзанов Н.С. Генетики смотрят в будущее // Племенное дело. - 1999. - №1. - С. 7-9.
2. Калашникова Л.А. Геномная оценка молочного скота // Молочное и мясное скотоводство. - 2010. - N1. - С. 10-12.
3. Каталог быков-производителей ОАО «Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных» / под ред. Ескина Г.В. Быково. - 2010. - 36 с.
4. Марзанов Н.С, Попов А.Н., Зиновьева Н.А., Полежаева В.А., Игнатьев В.М., Брем Г. Скрининг BLAD-синдрома у животных черно-пестрого корня // Вестник РАСХН. - 1997. - №4. - С. 59-61.
5. Марзанова С.Н., Алексеев Я.И., Коновалова Н.В., Турбина И.С., Девришов Д.А., Сочивко Д.Г., Марзанов Н.С. Разработка метода диагностики комплексной аномалии позвоночника (CVM) методом ПЦР в реальном времени у черно-пестрого скота. Научно-практическая конференция: «Практическое использование современных научных разработок в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота» // Научно-теоретический журнал: Проблемы биологии продуктивных животных. - 2011. - №4. Спецвыпуск. - С. 79-82.
6. Марзанова С.Н., Алексеев Я.И., Коновалова Н.В., Турбина И.С., Девришов Д.А., Сочивко Д.Г., Марзанов Н.С.Диагностика CVM и BLAD у черно-пестрого скота. Материалы международной научно-практической конференции: «Роль ветеринарной науки и практики в эффективном развитии животноводства». Алматы - 2012. - С. 348-353.
7. Попов Н.А., Червяков Н.А., Белявин Н.А. и др. Каталог быков-производителей ОАО «Кировское». - Киров. - 2004. - 73 с.
8. Савенко Н.А., Бошляков В.Н., Жуков В.Ф. и др. Каталог быков-производителей ОАО «Московское» по племенной работе. - Москва: МСХиП МО. - 2007. - 104 с.
9. Шапочкин В.В., Ескин Г.В. Каталог быков-производителей ФГУП «ЦСИО». Подольск. - 2002. - 51 с.
10. Яковлев А., Терлецкий В., Митрофанова О., Дементьева Н. Определение носителей генетических дефектов среди быков-производителей // Молочное и мясное скотоводство. - 2004. - №7. - С. 31-32.
11. Agerholm J.S., Bendixen С, Arnbjerg J., Anderson О. Complex vertebral malformation in Holstein calves // J. Vet. Diagn. Invest. - 2001. - Vol. 13. - P. 283-289.
12. Batt C.A., Wagner P., Wiedmann M., Luo J., Gilbert R.O. Detection of bovine leukocyte adhesion deficiency by nonisotopic ligase chain reaction // Anim. Genet. - 1994. - Vol. 25. - P. 95-98.
13. Czarnik U., Grzybovski G., Kaminski S., Prusak B, Zabolewicz T. Effectiveness of a program aimed at the elimination of BLAD-carrier bulls from Polish Holstein-Friesian cattle // J. Appl. Genet. - 2007. - Vol. 48. - P. 375-377.
14. Eggen A., Duchesne A., Laurent P., Grohs C, Denis C, Gautier M., Boichard D., Ducos A. Controlling genetic disorders in the French dairy cattle population // 2 International Conference on Animal Genetics. Tokyo. Japan-2004. - P.35.
15. ICARGuidelines approved by the General Assembly held in Riga, Latvia on June 2010. Copyright ICAR. - 2011. - 485p.
16. Kanae Y., Endoh D., Nagahata H., Hayashi M.A method for detecting complex vertebral malformation in Holstein calves using polymerase chain reaction-primer introduced restriction analysis // J. Vet. Diagn. Invest. - 2005. - Vol. 17. - P. 258-262.
17. KehrliM.E., SchmalstiegC, AndersonD.C, VanDerMaatenM.J., HughesB.J., AkermannM.R., WilhemsenC.L., BrownG.B., StevensM.G., WhetstoneC.A. MolecularidentificationofdeficiencyoftheMac-1 (CD11b/CD18) glycoprotein // Am. J. Vet. Res. - 1990. - Vol. 51. - P. 1826-1836.
18. Nagahata H., Miura Т., Tagaki K., Ohtake M., Noda H., Yasuda Т., Nioka K. Prevalence and allele frequency estimation of bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD) in Holstein-Friesian cattle in Japan // J. Vet. Med. Sci - 1997. - Vol. 59. - P. 233-238.
th
19. Oguni Т., Takeda Ray M., Tsuji Т., Sugimoto Y., Moritomo Y., Matsumoto M., Mishina Y., Kunieda T. Identification and control of a dwarfism gene in Japanese brown cattle // 29 International Conference on Animal Genetics. Tokyo. Japan, 2004. P.35.
20. Rusc A., Kaminski S. Prevalence of complex vertebral malformation carriers among Polish Holstein-Friesian bull // J. Appl. Genet - 2007. - Vol. 48. - P. 247-252.
21. Shuster D.E., KehrliM.E.Jr., Ackermann M.R., Gilbert R.O. Identification and prevalence of a genetic defect that causes leukocyte adhesion deficiency in Holstein cattle // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1992a. - Vol. 89. - P.9225-9229.
22. Shuster D.E., Bosworth B.T., KehrliM.E.Jr. Sequence of the bovine CD18-encoding cDNA: comparison with the human and murine glycoproteins // Gene. - 1992b. - Vol. 114. - P. 267-271.
23. Schutz E., Scharfenstein M., Brenig B. Implication of complex vertebral malformation and bovine leukocyte adhesion deficiency DNA-based Testing on disease frequency in the Holstein population // J. Dairy Sci - 2008. - Vol. 91. - P. 4854-4859.
24. Tammen I. Weiterentwicklung des DNA-Tests auf BLAD (Bovine Leukozyten Adhasionsdefizienz) fur den Einsatz in Rinderzucht und klinischer Diagnostik. Hannover. - 1994. - 128s.