Использование митотической зиготы для репрограммирования ядра соматической клетки и клонирования

И I II II

Новости клеточных технологий

ЛИТЕРАТУРА:

1. Dalakas Е, Newsome P., Harrison D. and Plevris J. Hematopoietic stem cell trafficking in liver injury. The FASEB Journal. 2005; 19:1225 31.

2. Krause D, Theise N, Collector M. et al. Multi organ, multi lineage engraftment by a single bone marrow derived stem cell. Cell. 2001; 105: 369 77.

3. Askari A., Unzek S., Popovic Z. et al. Effect of stromal cell derived factor 1 on stem cell homing and tissue regeneration in ischaemic cardiomyopathy. Lancet. 2003; 362: 697 -703.

4. Hatch H., Zheng D., Jorgensen M. et al. SDF 1 alpha/CXCR4: a mechanism for hepatic oval cell activation and bone marrow stem cell recruitment to the injured liver of rats. Cloning Stem Cells. 2002; 4: 339-51.

5. Houghton J., Stoicov C., Nomura S., et al. Gastric cancer originating from bone marrow derived cells. Science. 2004; 306: 1568 71.

6. Marx J. Bone Marrow Cells: The Source of Gastric Cancer? Science. 2004, 306; 1455 6.

7. Pawelek J. Tumour cell fusion as a source of myeloid traits in cancer. Lancet Oncol. 2005; 6: 988 993.

8. Avital I., Moreira A., Klimstra D. et al. Donor Derived Human Bone Marrow Cells Contribute to Solid Organ Cancers Developing After Bone Marrow Transplantation. Stem Cells. First published online August 9, 2007.

9. Wang X., Willenbring H., Akkari Y., et al. Cell fusion is the principal source of bone marrow derived hepatocytes. Nature. 2003; 422: 897 901.

Порготовип B.C. Сергеев

По материалам: Cogle С., Theise N„ Fu D. et al. Bone Marrow Contributes to Epithelial Cancers in Mice

and Humans as Developmental Mimicry. Stem Cells 2007; 25: 1881-7

Использование митотической зиготы

для репрограммирования ядра соматической клетки

и клонирования

До сих пор клонирование животных и получение эмбри ональных стволовых клеток (ЭСК) основано на технологии переноса ядра соматической клетки ядер в мейотические овоциты. Попытки перенести ядро соматической клетки в оплодотворенный овоцит (зиготу в интерфазе) чаще всего оканчивались неудачей. В связи с этим с целью получения «собственных» линий чЭСК традиционно для процесса переноса ядра принято использовать неоплодотворенные человеческие овоциты. Исследовательская группа под ру ководством Кевина Еггана из Harvard Stem Cell Institute сообщает о том, что мышиные зиготы (остановленные в ми тозе) способны поддерживать репрограммирование сома тической клетки и могут использоваться как для получе ния линий ЭСК, так и для клонированных животных. Таким образом, человеческие зиготы, и, возможно, бластомеры, помимо овоцитов, могут стать реальными кандидатами для использования в технологии создания индивидуальных ли ний чЭСК.

В первых успешных экспериментах по переносу ядра на грызунах, исследователи провели обмен пронуклеусами между двумя оплодотворенными зиготами [1]. Полученные эмбрионы развились в полноценных взрослых животных. Однако при проведении похожих экспериментов с исполь зованием ядер на стадиях дробления такого результата не получили, поэтому предположили, что клонирование млеко питающих невозможно, т.к. репрограммирование позднего ядра блокировано. Однако вскоре было обнаружено, что ци топлазма неоплодотворенного овоцита способна вносить изменения в программу перенесенного ядра, и тогда были реализованы проекты по клонированию овцы, кролика, сви ньи и мыши (2 4].

Не так давно было показано, что потенциал развития за родыша после переноса ядра в неоплодотворенный овоцит существенно выше такового по сравнению с переносом в оплодотворенный или искусственно активированный овоцит. То есть, потенции яйцеклетки, необходимые для успешного развития особи после переноса ядра, теряются (изменяются) после ее оплодотворения. Таким образом, и для процедуры переноса ядра с целью получения индивидуальных линий чЭСК необходимы неоплодотворенные овоциты.

Группа Кевина Еггана предположила, что факторы, необ ходимые как для репрограммирования или/и эмбрионального развития, присутствующие в цитоплазме неоплодотворен ных мейотических овоцитов, становятся изолированными (уединенными) в пронуклеусах зигот. Такая компартмента лизация может объяснить невозможность энуклеированной интерфазной зиготы поддерживать развитие после переноса ядра, так как удаление пронуклеусов во время энуклеации может элиминировать одновременно и эти факторы, тем самым предотвращая дальнейшее развитие. Удаление кон денсированных хромосом во второй метафазе мейоза из овоцита, напротив, не влияет на эти процессы. Если эта мо дель верна, то разрушение ядерного конверта (ядерной обо лочки) при вступлении в первый эмбриональный митоз, мо жет привести к высвобождению критических факторов в цитоплазму, что позволит удалять хромосомы без удаления тех самых необходимых сигналов к развитию.

Для того, что бы определить? может ли цитоплазма ми тотической зиготы поддерживать репрограммирование ядра, исследователи обратимо затормозили зиготы в ми тозе, удалили хромосомы и заменили их хромосомами либо эмбриональной, либо соматической донорской клетки. Ученым удалось обнаружить, что такие генетически рекон струированные зиготы могут использоваться для получения клонированных животных и линий ЭСК.

Мышиные зиготы синхронизировали на стадии двух от дельных пронуклеусов путем разборки микротрубочек в мито зе. Другие зиготы были синхронизированы таким же спосо бом, но в интерфазе. Затем оба пронуклеуса в интерфазных зиготах были удалены, а вместо них трансплантированы про нуклеусы другой группы зигот. В таком случае происходи ло полное развитие. При пересадке ядер от 2 х дневного эмбриона происходило формирование бластоцисты, одна ко с гораздо более низкой эффективностью (70%).

Важнейшим результатом работы также является полу чение клонированных животных. Для их получения вместо вынесенных хромосом были использованы хромосомы куль тивируемых линий ЭСК, для того, чтобы различить хромосо мы из ЭСК (донора) и хромосомы зиготы (реципиента) хро мосомы донора несли флуоресцентную метку, связанную с

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 3, 2007

ИМИ!

Новости клеточных технологий

гистоном Н2В. ЭСК были остановлены в митозе с помощью специального вещества нокодазола, а их хромосомы были перенесены в делящуюся зиготу без веретена деления. Полученные клетки начинали дробиться, 174 зародыша на стадии морулы и бластоцисты были перенесены в матку псевдобеременным мышам. Из этого количества на 19,5 день (после проведения кесарева сечения) было обнаруже но 9 жизнеспособных плодов. 7 из них не смогли нормально дышать и погибли, двое остались в живых и развились во взрослых особей. Клетки, выделенные из всех 9 зародышей, имели меченые хромосомы в ядре, это свидетельствовало о том, что они являлись клонами клеток доноров хромосом линий ЭСК. Клонированных эмбрионов также отличала зна чительно увеличенная плацента.

Также было показано, что из клонированных зародышей, полученных при переносе хромосом, можно получить линии ЭСК. Так, после переноса хромосом из фибробластов кожи в овоцит эмбрионы развивались до стадии бластоцисты и использовались для получения ЭСК. Из 21 полученной бла стоцисты 14 прикрепились к мышиному фидеру, в 8 слу чаях удалось добиться пролиферации клеток внутренней клеточной массы. В 6 случаях удалось получить собственно линии ЭСК.

Итак, мейотические овоциты и митотические зиготы спо собны изменять ход событий в соматическом геноме, тогда как энуклеированные и интерфазные зиготы - нет. Возмож но, это объясняется тем, что существуют факторы, которые разрушаются (обратимо разбираются) и обновляются во время каждого клеточного цикла, однако, один или более факторов, ответственных за нормальное развитие эмбрио на или репрограммирование, перемещаются в пронуклеусы во время интерфазы.

Таким образом, перемещение пронуклеусов одновремен но перемещает и эти факторы. Во время мейоза и митоза многие регуляторные молекулы выходят из ядра в цитоплаз му, а конденсированные хромосомы могут быть удалены из овоцита или зиготы без перемещения этих молекул или вли яния на их активность.

Клонирование животных было основано почти полностью на использовании неоплодотворенных овоцитов и требова ло искусственной активации овоцитов. В связи с этим появилось предположение о том, не влияет ли такая искус ственная активация на жизнеспособность клонов и их ано малии. Эксперименты подтвердили, что нормально оплодо творенные овоциты, использованные в технологии переноса ядра, могут развиться в нормальные эмбрионы. Перенос хромосом в митотическую зиготу исключает необходимость в искусственной активации, т.к. развитие уже запущено (слия нием со сперматозоидом).

Мыши, полученные после переноса хромосом из ЭСК в зиготы, имели две основные аномалии развития: неонаталь ную дыхательную недостаточность и увеличенную плацен ту. Эти аномалии часто описывали и другие группы, однако они не связывали их с искусственной активацией овоцитов. Кроме того, мыши, полученные при переносе хромосом из бластомер в зиготы, не демонстрировали подобных патоло гических изменений. Эксперименты К. Еггана и соавторов доказывают, что способность к репрограммированию утра чивается оплодотворенным овоцитом не полностью, что со гласуется с настойчивыми попытками получить чЭСК с по мощью технологии переноса ядра взрослой соматической клетки. Нормальные оплодотворенные овоциты (заморожен ные в клиниках ЭКО) являются гораздо более доступным и менее этически противоречивым источником для техноло гии переноса ядра, кроме того, 3-5% из всех человеческих зигот имеют ненормальное количество пронуклеусов после in vitro оплодотворения [5]. Эти зиготы не используются в технологии из за нарушения плоидности, однако они могут использоваться для подобных исследовательских работ. Исследователи проверили, могут ли анэуплоидные мыши ные зиготы поддерживать репрограммирование ядра. Оказалось, что при вступлении в митоз пронуклеусы разру шаются, чрезмерное количество хромосом собирается на единственном веретене в центре зиготы. Когда веретено деления удалено, хромосомы удаляются вместе с ним. Пос ле переноса хромосом из ЭСК клетки реципиенты разви ваются в бластоцисту и могут быть использованы для по лучения новых линий ЭСК с нормальным набором хромосом. Таким образом, эти результаты позволяют об суждать получение индивидуальных линий чЭСК новым методом, который не лимитируется количеством свежевы деленных овоцитов.

Овоциты, зиготы и ЭСК обладают способностью к реп рограммированию, что свидетельствует о том, что эта актив ность переходит от неоплодотворенного яйца к доимплан тационному зародышу и даже линиям ЭСК, полученным из него. Клетки от одно , двух, четых и восьмиклеточных за родышей могут использоваться в качестве реципиентов для переноса хромосом.

Если клетки из человеческих преимплантационных эмб рионов могут использоваться в качестве реципиентов гене тического материала (переноса хромосом), а ЭСК, останов ленные в митозе, могут использоваться для получения «цитопластов» (энуклеированных клеток) со способностью к репрограммированию, то это в значительной степени мо жет приблизить ученых к получению человеческих ЭСК для моделирования заболеваний и использования в регенера тивной медицине.

ЛИТЕРАТУРА:

1. McGrath J., Salter D. Nuclear transplantation in the mouse embryo by microsurgery and cell fusion. Science. 1983; 220: 1300-2.

2. Wakayama Т., Perry A. C., Zuccotti М., et al. Full term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 1998; 394: 369-74.

3. Chesne P., Adenot PG, Viglietta C. et al. Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature Biotechnol. 2002; 20: 366-369.

4. Polejaeva I. A., Chen S.H., Vaught T.D., et al. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature. 2000; 407: 86-90.

5. Munne S., Cohen J. Chromosome abnormalities in human embryos. Hum. Reprod. Update. 1998; 4: 842-855.

Подготовила B.C. Мелихова

По материалам: Egii D„ Rosains J„ Birkhoff G. and Eggan K. Developmental reprogramming after chromosome transfer into mitotic mouse zygotes. Nature 2007; 447: 679-85

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 3, 2007