Ячейка для изучения структуры белковых кристаллов в процессе их роста

Полезная модель относится к устройствам, предназначенным для проведения in situ исследований структуры кристаллов белков и тонких пленок, и может быть использовано для изучения эволюции во времени структуры кристаллов белков, имеющих промышленное и медицинское значение.
Проведение in situ исследований кристаллов белков и изучение эволюции во времени их структуры представляется в настоящее время весьма актуальной задачей с точки зрения создания гибридных схем, сочетающих в себе традиционные полупроводники и высокомолекулярные органические соединения, и являющихся одним из наиболее перспективных направлений развития молекулярной электроники. При разработке таких схем используют различные органические материалы, причем в основном акценты смещены на полимерные материалы, но также применяются низкомолекулярные соединения, углеродные наноматериалы, макромолекулярные биополимеры (белки, полисахариды) и т.п.
Обычно белковые кристаллы остаются за рамками вышеуказанных исследований, и кристаллизованный белок используется, главным образом, для точной расшифровки структуры белка, и поэтому свойствам кристаллов белков уделяется существенно меньшее внимание. Для изучения возможностей использования белков в гибридных структурах необходимо получить кристаллические белковые пленки и монокристаллы, исследовать их свойства и найти способ сохранять их в течение достаточно длительного времени.
Известно микрофлюидное устройство для кристаллизации белков в условиях невесомости, содержащее емкости с растворами различных белков и осадителей, попарно подключенные через отдельные каналы, в которых установлены микрозатворы, к кристаллизационным камерам, при этом названные каналы подключены к одному трубчатому элементу, внутри которого формируют отдельные кристаллизационные камеры для каждого из белков, один конец трубчатого элемента соединен через микрозатвор с микронасосом, подающим из резервуара в полость трубчатого элемента рабочую среду, служащую для разделения полостей кристаллизационных камер, а другой конец трубчатого элемента соединен со сборником рабочей среды, причем для подачи растворов белков и осадителей через отдельные каналы в кристаллизационные камеры применяют отдельные микронасосы, функционирующие по индивидуальным программам [1].
Устройство позволяет проводить эксперименты, как по подбору условий кристаллизации, так и по кристаллизации различных белков в одном канале - благодаря конструкции с параллельными и независимыми друг от друга микронасосами. При работе с устройством возможно без дополнительных действий по перемещению кристаллов сразу отправлять их на последующие исследования.
Недостатком данного устройства является сложность конструкции и снижение надежности в результате наличия большого количества отдельных трубчатых элементов, в которых формируются отдельные кристаллизационные камеры.
Известно также микрофлюидное устройство пригодное, как пишут авторы, для выращивания кристаллов белков, содержащее корпус и оптически прозрачную крышку и представляющее собой, по существу, микрочип с разветвленными каналами куда заливается кристаллизационный раствор [2]. Устройство монтируется на столик оптического микроскопа, с помощью которого фиксируются появляющиеся кристаллы исследуемого вещества.
К числу недостатков устройства можно отнести необходимость предварительного определения концентрационно-температурной фазовой диаграммы. Кроме того, решая проблему малого расхода дефицитных веществ, данное устройство в случае использования для белков не решает проблему быстрого поиска условий кристаллизации из-за очень низких скоростей роста белковых кристаллов. Время, которое требуется для большинства белков до появления кристалла, занимает от нескольких дней до нескольких месяцев.
Однако основным недостатком устройства является невозможность проведения рентгеновских экспериментов для изучения эволюции структуры кристаллов и пленок во времени.
Технической задачей настоящей полезной модели является создание простой по конструкции ячейки пригодной для проведения различных исследований, связанных с выращиванием кристаллов белка.
Техническим результатом является возможность проведения in situ исследования кристаллов белков на различных этапах процесса кристаллизации: стадия зарождения и роста кристаллов, сформировавшиеся кристаллы, деградация кристаллической структуры и полное разрушение при различных внешних условиях.
Решение поставленной технической задачи и достижение требуемого технического результата обеспечиваются в результате того, что в ячейке для определения условий кристаллизации белков, содержащей корпус и оптически прозрачную крышку, в центре корпуса установлена чаша - для размещения подложки с кристаллизационным раствором, вокруг чаши выполнена кольцевая канавка для осадителя, на крышку цилиндрической формы радиусом 50 мм нанесена оптически и рентгенопрозрачная пленка толщиной 30 мкм. Крышка может быть выполнена из фторопласта, а пленка из лавсана. Диаметр подложки 10 мм, а внутренний и внешний диаметры канавки 15 мм и 25 мм соответственно.
Существо полезной модели поясняется на фигурах.
Фиг. 1. Схема ячейки.
Фиг. 2. Схема исследовательской установки, в которой применяется ячейка.
Фиг. 3. Экспериментальные рентгеновские зависимости θ-2θ-сканирования (1-4) на начальной стадии формирования кристаллов тетрагонального лизоцима (а). Схематично показаны расположение на подложке Si капель, в которых происходит кристаллизация белка (k1 и k3), «реперной» капли осадителя без белка (k2), и положения рентгеновского пучка при проведении измерений (I-III) (б). Изображения, полученные на оптическом микроскопе на стадии зарождения (в) и начальной стадии роста (г) кристаллов: 1-«реперная» капля (k2) осадителя без белка, положение III; 2 - рассеяние от подложки Si, положение пучка II; 3, 4 - капля с кристаллами, положение I, на стадии зарождения (3), через 96 ч после загрузки ячейки, и на начальной стадии роста (4), через 122 ч после загрузки ячейки. На вставке - дифракционный пик на стадии зарождения кристаллов. Наблюдается расщепление пика и уширение дифракционной кривой.
Фиг. 4. Обзорная экспериментальная кривая θ-2θ-сканирования. Представлена серия дифракционных пиков кристаллов тетрагонального лизоцима; отмечены брэгговские углы 2θ, соответствующие регистрируемым порядкам отражения 110. На вставке - КДО (440), полуширина (FWHM) составляет 28.3 угл. с (а). Фото трех основных форм выращенных кристаллов; отмечены индексы граней кристаллов (б). Дифракционные пики соответствуют ориентации кристалла, показанного на фиг.6-2.
Фиг. 5. Эволюция серии дифракционных пиков, кривых θ-2θ-сканирования (1-5), соответствующих семейству отражений (110) кристаллов тетрагонального лизоцима после испарения осадителя в процессе их разрушения - стадия деградации кристаллов. На вставке - изменения КДО (440) и (220). На графиках для каждой кривой 1-5 указано время (в часах), прошедшее после загрузки кристаллизационной ячейки (а). Изображения, полученные на оптическом микроскопе на стадии деградации и разрушения кристаллов (б). Фото б-3 получено после вскрытия кристаллизационной ячейки.
Фиг. 6. Экспериментальные кривые РР (точки), соответствующие им расчетные кривые (сплошные линии) и рассчитанные профили электронной плотности (нормированные на электронную плотность подложки), полученные для: пленки лизоцима, сформированной из монодисперсного раствора (а, б); пленки лизоцима, полученной из полидисперсного раствора с добавлением осадителя NaCl (в, г). Исследования были выполнены с использованием специализированной ячейки.
Фиг. 7. Кривые РР (а и в) и соответствующие им профили электронной плотности (б и г) от двух типов пленок: пленки чистого белка (а и б) и пленки белка с добавлением осадителя NaCl ((в) и (г)). Кривые были получены по истечении времени 6, 12 и 20 часов (красная, синяя и зеленая кривые соответственно) после переноса пленки на твердую подложку.
Описание устройства
Внутри ячейки 1 находится выбранное количество кристаллизационного раствора 2 (белок+осадитель). Раствор размещен на подложке 3, которая установлена на чаше (не показано). Вокруг подложки выполнена кольцевая канавка 4 для осадителя. Корпус 5 ячейки закрыт крышкой 6. Герметизация рабочего объема, ограниченного корпусом 5 и крышкой 6 обеспечивается пленкой 7, которая натянута на крышку 6. Крышка имеет цилиндрическую форму с радиусом 50 мм и может быть выполнена из фторопласта. Пленка 7, которая является рентгенопрозрачной, имеет толщину 30 мкм. Диаметр подложки 10 мм, а внутренний и внешний диаметры канавки, 15 мм и 25 мм соответственно.
Ячейку применяют следующим образом. При комнатной температуре готовят растворы для роста кристаллов белка. При открытой крышке 6 на подложку 3 наносят выбранное количество растворителя для обеспечения роста кристаллов. В кольцевую канавку 4 добавляют противораствор (осадитель). После этого на корпус 5 ячейки 1 устанавливают крышку 6 с натянутой на нее пленкой 7 для создания герметичной замкнутой атмосферы, в которой происходит рост кристаллов. При проведении экспериментов луч от источника 7 рентгеновского излучения через монохроматор 8 направляют на ячейку 1, которая в собранном виде установлена на столике 9 гониометра (фиг. 2). Рентгеновский луч падает на ячейку под углом θ, а дифрагированный луч под углом ω поступает на приемник рентгеновского излучения 10.
с
Следует отметить, что ячейку устанавливают на гониометр рентгеновского дифрактометра в горизонтальной геометрии, когда плоскость дифракции располагается вертикально (в частности, на синхротронной станции). Конструкция ячейки позволяет реализовать различные экспериментальные схемы: дифракция в скользящей геометрии, сильно асимметричная дифракция (диапазон 2θ до 180°); схемы в геометрии полного внешнего отражения (в области малых углов, порядка нескольких критических α); in-plane и out-of-plane геометрии (диапазон по 2θ/χ до 35°).
Используемые материалы и конструкция ячейки рассчитаны на обеспечение химической чистоты внутреннего объема ячейки и ее герметичности в течение примерно четырех недель.
Примеры применения ячейки для проведения экспериментов.
α1
Рентгенодифракционные эксперименты выполнялись на дифрактометре SmartLab Rigaku [1] в стандартной схеме высокоразрешающей двухкристальной дифрактометрии в геометрии на отражение. Дифрактометр оснащен источником излучения с вращающимся молибденовым анодом мощностью 9 кВт. Интенсивность дифрагированного пучка регистрировалась сцинтилляционным (NaI) детектором. Пучок формировался с использованием симметричного двукратного монохроматора Ge (220), после чего устанавливались щели, ограничивающие падающий пучок в плоскости дифракции (0.03-1.00 мм) и поперечном направлении (5.0, 2.0 или 0.5 мм). Это позволяло использовать спектральную линию MoK (λ=0.70932 Å), а также варьировать пространственное разрешение (локальность) измерений при проведении экспериментов. При этом имелась возможность регулировки двух приемных щелей, расположенных перед детектором на расстоянии 113.0 мм друг от друга, в диапазоне 0.03-20.00 мм.
2
Также дифрактометр оснащен специальной XY-подвижкой (диапазон перемещения охватывает всю подложку), что позволило установить исследуемый образец относительно пучка в требуемом положении с точностью 0.01 мм. Указанные размеры щелей и весьма точное XY-позиционирование подложки относительно пучка позволяют сформировать пятно засветки ~0.1×0.5 мм и локализовать отдельные кристаллы для рентгенодифракционных in situ-исследований.
Измерения in situ роста белковых кристаллов
На стадии формирования кристаллов, начиная с размеров ~ 200-300 мкм, кристаллизационная ячейка устанавливалась на гониометр рентгеновского дифрактометра и проводилась серия рентгенодифракционных in situ-экспериментов. Измерения проводились на протяжении всего «цикла жизни» кристаллов, вплоть до деградации и разрушения кристаллической структуры.
После установки ячейки на гониометре измерения проводились по следующей схеме. Рентгеновский пучок на образце позиционировался так, чтобы отражение осуществлялось от подложки Si, не захватывая капли с белком (k1) или осадителем (k2). Это отмечено индексом II на фиг. 3б. В этом положении проводилась стандартная юстировка ориентации кристаллической подложки для проведения измерений методом высокоразрешающей двухкристальной дифрактометрии [i].
Начальная стадия формирования кристаллов. Первые измерения были проведены через 96 ч после загрузки кристаллизационной ячейки (помещения на подложку из кремния раствора белка и осадителя и герметизации ячейки). Средний размер кристаллов составлял ~ 200-300 мкм.
Проводилась серия θ-2θ-сканирований в диапазоне углов 2θ от 1° до 6° в трех положениях области засветки ячейки рентгеновским пучком. Первое положение (отмеченное индексом I на фиг.3б) соответствует отражению от капли с белком, тогда как второе и третье положения (отмеченные индексами II и III на фиг.3б) соответствовали отражению от кремниевой подложки и от капли с осадителем соответственно. Регистрировалось рентгеновское рассеяние от капли с кристаллами белка (k1), подложки Si и капли осадителя без белка (k2), используемой в качестве репера (фиг. 3б). Измерения проводились в поисковом режиме, щель перед детектором не устанавливалась. Полученные зависимости представлены на фиг. 3а для трех указанных положений пучка I, II, III (фиг. 3б).
Отметим, что шкала углов θ-2θ на фиг. 3а соответствует указанной выше юстировке ориентации кристаллической подложки относительно рентгеновского пучка. В этом случае углы отсчитываются от нулевого положения, в котором пучок параллелен поверхности подложки Si. При этом щель перед детектором не устанавливалась, вследствие чего точные углы Брэгга регистрируемых рефлексов могут значительно отличаться от углов, на которых они расположены по шкале фиг. 3а. Индексация дифракционных пиков и определение соответствующих им точных углов Брэгга проводились в дальнейших измерениях (разд. «Стадия сформированных кристаллов»).
На графиках фиг. 3а видно, что в отличие от рассеяния от подложки и «пустой» капли осадителя (кривые 1, 2) при рассеянии от капли с кристаллами через 96 ч (кривая 3) наблюдается дополнительное рассеяние (дифракционные пики) от кристаллов лизоцима.
Аналогичным образом проводились измерения на следующий день (122 ч после начала кристаллизации). Как и в предыдущем случае, проводилась стандартная юстировка образца при позиционировании пучка в положении II (фиг. 3б). Затем путем θ-2θ-сканирования регистрировалось рассеяние от капель k1 и k2. Полученная зависимость от капли с кристаллами представлена на экспериментальной кривой 4 фиг. 3а.
Из фиг. 3а видно, что при переходе от кривой 3 к кривой 4 за 26 ч дифракционные пики не только формируются более узкими и интенсивными, но и происходит их смещение по шкале углов θ-2θ. При этом некоторые пики по истечении указанного времени исчезают, например, пики в диапазоне углов 3.5-5°, имевшие место на кривой 3, практически отсутствуют на кривой 4.
Проведенный анализ дифракционных пиков на стадии формирования - вставка на фиг. 4, пик вблизи угла θ-2θ ~ 3.8° - показал, что уширение данных пиков связано с их сложной структурой, в частности с расщеплением дифракционной кривой, что, вероятно, отражает малые размеры и «рыхлую» структуру кристаллов на стадии их зарождения. Аналогичный вид кривых дифракционного отражения (КДО) наблюдается в кристаллах с такими дефектами кристаллической структуры, как двойники, блоки, зерна и т.п.
«Улучшение» КДО, наблюдаемое на кривой 4 по сравнению с кривой 3, может быть связано как с увеличением размеров кристаллов лизоцима, так и с более высоким совершенством их структуры, которое обычно происходит при росте и оформлении спонтанно зародившихся кристаллов.
Стадия сформированных кристаллов. Следующие измерения кривых качания (КДО) и их индексация проводились через 192 ч на стадии роста, когда кристаллы уже сформировались и достигали размеров ~ 500-700 мкм. Для измерений с высоким угловым разрешением был выбран самый яркий дифракционный пик, вблизи 2θ≈3.4° (кривая 4, фиг. 3а). Проведенная процедура точной юстировки выбранного рефлекса и записи его КДО позволила определить его брэгговский угол 2θ=2.9145° и соответственно индексы отражения - (440). Полученная КДО представлена на вставке фиг. 3а. В ходе процедуры определения брэгговского угла 2θ использовались щели перед детектором размером 0.05 и 0.2 мм. Представленная на фиг. 4а зависимость θ-2θ получена с установленными щелями перед детектором после юстировки 2θ-рефлекса (440), вследствие чего углы, на которых расположены дифракционные пики (по шкале фиг.4а), отличаются от углов, представленных на фиг. 3а.
3
1
a
Были проведены расчеты с использованием данных [7] (пр. гр. Р422, параметры решетки =b=79.535, с=38.118 Å). В таблице приведены значения углов Брэгга, полученные из эксперимента и в результате указанных расчетов, также приведены соответствующие им индексы отражений и экспериментальные значения полуширин КДО (FWHM).
Из таблицы видно, что регистрируемые в эксперименте дифракционные отражения соответствуют отражениям от грани (110) и значения полуширин КДО свидетельствуют о высоком качестве выращенных кристаллов. Однако сравнительно большие значения полуширин для отражений высоких порядков свидетельствуют о том, что кристаллическая решетка исследуемых белков не являлась идеальной.
Регистрируемая дифракционная картина оставалась стабильной в течение длительного времени (более 100 ч) и кристаллы сохранялись до полного испарения осадителя, предотвращающего разложение белка. После испарения осадителя начиналась стадия деградации кристаллов.
Деградация кристаллов. На фиг. 5 показана эволюция дифракционной кривой, приведенной на фиг. 4, в процессе испарения осадителя, иллюстрирующая деградацию (разрушение) кристаллической структуры выращенных белковых кристаллов тетрагонального лизоцима.
-3
Дифрактограммы θ-2θ-сканирования регистрировались с интервалом не менее 24 ч (время указано на графиках фиг. 5а). В ходе эксперимента интенсивности дифракционных отражений падают, а полуширины увеличиваются. По-видимому, это связано с дефектами кристаллической структуры, которые соответствуют деформациям кристаллической решетки порядка Δd/d~10. Отметим, что необходимы дополнительные детальные исследования данного факта.
Деградация кристаллов лизоцима обусловлена постепенным изменением равновесного состояния среды вследствие испарения осадителя, а также регулярным воздействием рентгеновского излучения. По фотографиям (фиг. 5б) видно, что изменение формы происходит неоднородно.
Измерения структуры белковых тонких пленок
Пленки белков на твердых подложках сформированы методом Ленгмюра-Шеффера (ЛШ), заключающегося в переносе ленгмюровского слоя путем горизонтального соприкосновения подложки с монослоем на поверхности жидкости с помощью ленгмюровской ванны. После переноса образцы помещаются в специализированную ячейку, используемую для проведения изучения структуры пленок рентгеновскими методами исследования латеральной структуры. Выдерживание в ячейке приводит к медленному высыханию капли субфазы, захваченной с монослоем, в парах осадителя.
В [2, 3] описано проведение исследования структуры пленок лизоцима на кремниевых подложках с применением специализированной ячейки, описанной в [1]. Экспериментальные кривые рентгеновской рефлектометрии (РР) показаны на фиг. 6. Была продемонстрирована принципиальная возможность с помощью специализированной ячейки выращивания плотных упорядоченных белковых пленок для дальнейшего их использования в различных областях, таких как биотехнология и сенсорная промышленность.
Также с использованием специализированной ячейки было проведено исследование процесса формирования белковых пленок на твердых подложках непосредственно после их переноса с поверхности субфазы. Экспериментальные кривые РР были зарегистрированы после переноса пленок лизоцима и лизоцима с осадителем NaCl по истечении времени 6, 12 и 20 часов после осуществления переноса их на твердые подложки (фиг. 7). В период проведения съемки образцы находились в герметичной ячейке.
В результате определено, что формирование белковой пленки происходит через приблизительно 20 часов после переноса с поверхности водной субфазы на подложку. Также можно видеть, что основные изменения по мере высыхания пленки происходят на границе пленка-подложка.
Таким образом, предлагаемая ячейка обеспечивает проведение различных измерений, связанных с изучением структуры белковых кристаллов в процессе их роста, и соответствует критерии, промышленная применимость
Источники информации
1. RU 2522613 «Микрофлюидное устройство для кристаллизации белков в условиях невесомости», МПК С30 В 30/08, опубл. 27.02.2014.
2. Takahito Tokuhisa, Masashi Kawasaki, David isailus, Masamichi Yuda, Tadashi Matsunaga, and Atsushi Arakaki, опубликованной в журнале Crystal. Growth&Design., 2015, 75 (9), pp 4549-4555.