СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ C. PERFRINGENS, У ЖИВОТНЫХ
METHOD FOR DETECTING DISEASES CAUSED BY CLOSTRIDIUM PERFRINGENS IN ANIMALS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу выявления заболеваний, вызываемых C. perfringens, у животных. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу определения того, страдает ли животное или популяция животных заболеваниями, вызываемыми C. perfringens, в клиническом или субклиническом состоянии.
Уровень техники изобретения
Clostridium perfringens является общераспространенным патогеном, который использует комплекс токсинов, чтобы вызывать гистотоксические и кишечные инфекции у животных, а также у людей. C. perfringens является грамположительным, палочковидным, спорообразующим, выносливым к кислороду анаэробным организмом. Не все штаммы C. perfringens являются вирулентными. Вирулентные штаммы C. perfringens традиционно подразделяют на пять токсинных типов (A, B, C, D и E) на основании выработки четырех предполагаемых основных токсинов (альфа, бета, эпсилон и йота). В зависимости от вырабатываемых токсинов (основных и дополнительных токсинов, таких как NetB, Cpb2 и другие) у различных организмов-хозяев могут вызываться синдромы/заболевания, специфичные для подвида C. perfringens [Rood, J. I. (1998) «Virulence genes of Clostridium perfringens»; Annual Review of Microbiology 52: 333-360]. Токсины кодируются полинуклеотидными последовательностями, расположенными на хромосоме и/или на плазмидах с генами токсинов [Popoff, M. R. and P. Bouvet (2013). «Genetic characteristics of toxigenic Clostridia and toxin gene evolution» Toxicon 75: 63-89].
Будучи патогеном для животных, C. perfringens является ответственным за несколько серьезных заболеваний, в том числе некротический энтерит птиц, на борьбу с которым в системе мирового сельского хозяйства расходуется примерно 6 миллиардов долларов США в год [Wade, B., Keyburn, A.L. (2015), «The true cost of necrotic enteritis» World Poultry 31, 16-17].
Некротический энтерит (NE) представляет собой кишечное заболевание птиц, которое было впервые описано в 1961 г. NE у кур проявляется как острая или хроническая энтеротоксемия. Острое заболевание приводит к значительным уровням смертности вследствие развития некротических поражений в стенке кишечника, тогда как хроническое заболевание приводит к значительной потере продуктивности и благосостояния. В ранних исследованиях NE предполагали, что основным фактором вирулентности, вовлеченным в заболевание, был альфа-токсин (известный как Cpa или Plc), который обладает активностью фосфолипазы C и сфингомиелиназы [Keyburn, A. L. et al. (2006) «Alpha-toxin of Clostridium perfringens is not an essential virulence factor in necrotic enteritis in chickens», Infection and Immunity 74(11): 6496-6500]. Все штаммы C. perfringens содержат ген, кодирующий альфа-токсин [Rood, J. I. (1998) «Virulence genes of Clostridium perfringens», Annual Review of Microbiology 52: 333-360; Titball, R. W., et al. (1999) «The Clostridium perfringens α-toxin». Anaerobe 5(2): 51-64]. Однако недавние исследования показали, что альфа-токсин, по видимому, не является важным фактором вирулентности, поскольку штаммы, мутантные по альфа-токсину, были способны вызывать NE, что ставит под сомнение роль альфа-токсина в заболевании в целом. В более поздних исследованиях было высказано предположение, что новый порообразующий токсин NetB играет основную ключевую роль в развитии данного заболевания [Keyburn, A. L. et al. (2008) «NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens» PLoS Pathogens 4(2)].
Известно, что NE поражает бройлеров, куриц-несушек, индеек и перепелов. Клиническая форма наиболее часто наблюдается у бройлеров в возрасте от двух до пяти недель. Как правило, это также близко ко времени перевода рациона со стартерного корма на гроуэрный корм и близко к периоду перехода от материнской иммунной системы к адаптивной иммунной системе соответственно, поэтому условно-патогенный C. perfringens может использовать преимущество данного периода перехода в кишечной среде и пролиферировать [Timbermont, L. et al. (2011) «Necrotic enteritis in broilers: An updated review on the pathogenesis». Avian Pathology 40(4): 341-347].
Помимо простой взаимосвязи факторов вирулентности самих по себе с частотой возникновения NE, все еще существует значительная ноша необходимости показать механическую связь между этими факторами и формированием заболевания у птиц или других заболеваний, вызываемых C. perfringens, у других (сельскохозяйственных) животных.
Кроме того, связь субклинической инфекции NE с любым из таких факторов вирулентности крайне сложно установить, поскольку у птиц отсутствуют признаки, которые послужили бы основанием для их обследования, до их убоя. Следовательно, потребность в способе для раннего выявления NE, и, что наиболее важно, субклинических форм NE, остается первостепенной. Аналогичные соображения применимы к другим заболеваниям, вызываемым C. perfringens, у животных, в частности у животных при производстве продукции животноводства, таким как энтерит у свиней, лошадей, жеребят, коз, кроликов, ягнят, собак и крупного рогатого скота; диарея у свиней; энтеротоксемия у овец, коз и крупного рогатого скота; некротизирующий энтерит у поросят, ягнят, жеребят и телят (новорожденных); тифлоколит у лошадей; смертельный геморрагический гастроэнтерит собак; смертельный некротизирующий энтероколит жеребят; газовая гангрена (клостридиальный мионекроз) у овец, крупного рогатого скота, лошадей и других видов [Rood, J. I. (1998) «Virulence genes of Clostridium perfringens» Annual Review of Microbiology 52: 333-360].
Энтеротоксемия коров, вызываемая Clostridium perfringens, представляет собой синдром внезапной смерти с некрогеморрагическими поражениями тонкой кишки, который в основном поражает телят на подсосе и телят для убоя [Goossens, E. et al. (2014), «Clostridium perfringens strains from bovine enterotoxaemia cases are not superior in in vitro production of alpha toxin, perfringolysin O and proteolytic enzymes» BMC Veterinary Research 10; Lebrun M, Mainil JG, Linden A: «Cattle enterotoxaemia and Clostridium perfringens: description, diagnosis and prophylaxis» Vet Rec 2010, 167(1):13-22]. Среди телят для убоя поражаются преимущественно мясные породы крупного рогатого скота. Данный синдром вызывает смерть у таких телят примерно в 20% случаев по сравнению с 4% у телят для убоя молочных и смешанных пород [Pardon B, De Bleecker K, Hostens M, Callens J, Dewulf J, Deprez P: «Longitudinal study on morbidity and mortality in white veal calves in Belgium» BMC Vet Res 2012, 8:26].
Существующие способы основаны на обследовании отдельных животных и использовании вскрытия и последующего гистопатологического анализа или тестов для идентификации патогена. Однако отслеживание уровней тканевых биомаркеров или биомаркеров крови вследствие своей инвазивной природы является времязатратным и непрактичным, если охватывается большое количество образцов, как в случае с сельскохозяйственными животными.
В недавно опубликованной заявке на европейский патент EP 3112474 A1 описан способ выявления NE у птиц посредством выделения микровезикул из образца от птицы и последующего определения наличия и/или уровня РНК-маркеров, указывающих на NE. Образец от птицы может представлять собой биологическую жидкость или экскременты организма, а маркер, указывающий на NE, выбран из специфических последовательностей C. perfringens и хозяина, их гомологов и фрагментов. Однако, микровезикулы должны быть выделены и лизированы до анализа и количественного определения РНК-маркеров.
Таким образом, остается необходимость в обеспечении быстрого и надежного неинвазивного способа определения того, страдает ли популяция животных заболеваниями, вызываемыми C. perfringens, до наступления смерти, который можно проводить при низких затратах и с минимальными усилиями.
Краткое описание изобретения
Соответственно, одной целью настоящего изобретения является обеспечение способа выявления заболеваний, вызываемых C. perfringens, у животных, при этом способ включает:
a) сбор материала образца от конкретного животного или от конкретной группы животных в последовательные моменты времени;
b) определение количества первого маркера и второго маркера, содержащихся в материале образца; и
c) определение соотношения уровней первого маркера и второго маркера, содержащихся в материале образца;
где первый маркер содержит полинуклеотидную последовательность, специфичную для подвида C. perfringens, вызывающего целевое заболевание;
а второй маркер содержит полинуклеотид, специфичный для вида C. perfringens; и
где увеличение соотношения уровней первого маркера и второго маркера в материале анализируемого образца с течением времени указывает на целевое заболевание.
Дополнительной целью настоящего изобретения является обеспечение диагностического набора, содержащего праймеры для ПЦР и зонды как для первого маркера, так и для второго маркера.
Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен способ выявления некротического энтерита птиц, при этом способ включает:
a) сбор материала образца от конкретной птицы или от конкретной группы птиц в последовательные моменты времени;
b) определение количества первого маркера и второго маркера, содержащихся в материале образца; и
c) определение соотношения уровней первого маркера и второго маркера, содержащихся в материале образца;
где первый маркер представляет собой netB, а второй маркер представляет собой cpa;
и
где увеличение соотношения уровней первого маркера и второго маркера в материале анализируемого образца с течением времени указывает на некротический энтерит птиц.
Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен дополнительный способ выявления некротического энтерита птиц, при этом способ включает:
a) сбор образцов экскрементов от конкретной птицы или от конкретной популяции птиц в последовательные моменты времени и
b) отслеживание уровня маркерного гена netB в этих образцах;
где увеличение уровня netB является указанием на некротический энтерит птиц.
Наконец, настоящее изобретение относится к способу определения степени тяжести некротического энтерита птиц, при этом способ включает:
a) сбор образцов экскрементов от конкретной птицы или от конкретной популяции птиц и
b) определение количества маркерного гена netB в этих образцах экскрементов от птиц,
где количество маркерного гена netB указывает на степень тяжести некротического энтерита.
Далее важные аспекты настоящего изобретения описаны подробно.
Подробное описание изобретения
Выявление заболеваний, вызываемых C. perfringens, у животных
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что соотношение уровней первого полинуклеотидного маркера и второго полинуклеотидного маркера в экскрементах животных коррелирует с проявлением заболеваний, вызываемых бактерией C. perfringens. Более конкретно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что увеличение соотношения уровней вышеуказанных маркеров с течением времени указывает на целевое заболевание.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу выявления заболеваний, вызываемых C. perfringens, у животных, при этом способ включает:
a) сбор материала образца от конкретного животного или от конкретной группы животных в последовательные моменты времени;
b) определение количества первого маркера и второго маркера, содержащихся в материале образца; и
c) определение соотношения уровней первого маркера и второго маркера, содержащихся в материале образца;
где первый маркер содержит полинуклеотидную последовательность, специфичную для подвида C. perfringens, вызывающего целевое заболевание;
а второй маркер содержит полинуклеотид, специфичный для вида C. perfringens; и
где увеличение соотношения уровней первого маркера и второго маркера в материале анализируемого образца с течением времени указывает на целевое заболевание.
Используемый в данном документе термин «полинуклеотиды» относится к ДНК или РНК. В особо предпочтительном варианте осуществления термин «полинуклеотиды» относится к ДНК.
Используемый в данном документе термин «заболевание» относится к любому аномальному состоянию у животного, которое препятствует его жизненно важным физиологическим процессам, вызываемому патогенными штаммами C. perfringens . Термин «заболевание» соответствует увеличению уровней факторов патогенности и, таким образом, также включает ранние стадии целевого заболевания, а также некоторый риск вспышки целевого заболевания. В соответствии с этим и как он используется в контексте настоящего изобретения, термин «целевое заболевание» относится к специфическому заболеванию, вызываемому C. perfringens (имеющему место у конкретного вида животного), для выявления которого должен быть проанализирован образец от животного.
Маркеры
Первый маркер содержит полинуклеотидную последовательность, специфичную для подвида C. perfringens, вызывающего целевое заболевание. Иными словами, первый маркер представляет собой специфическую и консервативную область, определяющую вирулентность и патогенность выбранного подвида C. perfringens. В предпочтительном варианте осуществления первый маркер является фактором вирулентности для целевого заболевания.
Первый маркер может представлять собой либо маркерный ген, кодирующий специфический токсин или его гомологи или фрагменты, либо, в качестве альтернативы, остров патогенности. В контексте настоящего изобретения термин «гомолог» относится к полинуклеотидной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, 90% или 95%, наиболее предпочтительно 100% идентичностью последовательности с соответствующим полинуклеотидом или маркерным геном. Термин «фрагмент» относится к полинуклеотидной последовательности, усеченной на не более чем 100 или 80, предпочтительно на не более чем 70, в частности на не более чем 60, наиболее предпочтительно на не более чем 50 нуклеотидов по сравнению с соответствующим полинуклеотидом или маркерным геном.
Используемый в данном документе термин «остров патогенности» (PAI) относится к дискретным генетическим единицам, несущим гены, кодирующие один или более факторов вирулентности [Hacker et al. (1997) «Pathogenicity islands of virulent Bacteria: structure and impact on microbial evolution», Molecular Microbiology 23(6): 1089-1097]. PAI может содержать гены для регуляции генов вирулентности, кодируемых в PAI, либо может содержать гены для регуляции генов за пределами PAI. Острова патогенности включены в состав генома (хромосомно или внехромосомно) патогенного штамма C. perfringens.
Первый маркер может быть расположен на плазмиде с геном токсина C. perfringens и/или на хромосоме C. perfringens.
В качестве примера, ген cpe можно использовать в качестве первого маркерного гена. Указанный ген cpe может находиться в вариабельной области на хромосоме у некоторых штаммов C. perfringens и на больших плазмидах у других штаммов [Petit et al. (1999) «Clostridium perfringens: toxinotype and genotype», Trends in Microbiology Vol. 7, No. 3, 104-110].
В особо предпочтительном варианте осуществления маркерный ген расположен на плазмиде с геном токсина C. perfringens.
Штаммы C. perfringens могут нести несколько больших плазмид с генами токсинов и устойчивости к антибиотикам, при этом такие плазмиды являются близкородственными, имея общие практически идентичные последовательности размером до 35 т.п.н. [Wisniewski et al. (2017) «The Tcp conjugation system of Clostridium perfringens», Plasmid 91, 28-36]. Токсины, кодируемые в плазмидах, представляют собой, например, бета-токсин, бета2-токсин, эпсилон-токсин, йота-токсин, NetB и TpeL [Li, J., et al. 2013); «Toxin plasmids of Clostridium perfringens»; Microbiology and Molecular Biology Reviews 77(2): 208-233].
Основные заболевания, ассоциированные с C. perfringens, у животных и ключевые токсины перечислены в следующей таблице [Popoff, M. R. (2014) «Clostridial pore-forming toxins: Powerful virulence factors». Anaerobe 30: 220-238; Rood, J. I. (1998) «Virulence genes of Clostridium perfringens» Annual Review of Microbiology 52: 333-360; Gohari, I. M. et al. (2015) «A novel pore-forming toxin in type A Clostridium perfringens is associated with both fatal canine hemorrhagic gastroenteritis and fatal foal necrotizing enterocolitis» PLoS ONE 10(4); Keyburn, A. L., et al. (2008) «NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens» PLoS Pathogens 4(2)]:
Соответственно, первый маркерный ген также может быть выбран из группы, состоящей из cpe, бета-токсина (cpb), бета2-токсина (cpb2), эпсилон-токсина (etx), netF и netB и гомологов и фрагментов этих генов. В качестве альтернативы, также можно использовать полинуклеотидные последовательности, содержащие один из вышеуказанных генов. Эти полинуклеотидные последовательности предпочтительно удлинены на не более чем 100 пар оснований или на не более чем 80 пар оснований, предпочтительно на не более чем 70 пар оснований или на не более чем 60 пар оснований, в частности на не более чем 50 пар оснований или на не более чем 40 пар оснований и наиболее предпочтительно на не более чем 30 пар оснований по сравнению с соответствующими маркерными генами.
В предпочтительном варианте осуществления ген netB используют в качестве первого маркера.
Второй маркер содержит полинуклеотидную последовательность, специфичную для вида C. perfringens в целом, и представляет собой консервативную и специфическую область генома C. perfringens (хромосомную или внехромосомную).
Второй маркер может представлять собой полинуклеотидную последовательность или специфический маркерный ген, расположенные на плазмиде C. perfringens или на хромосоме C. perfringens. Маркерный ген, расположенный на хромосоме C. perfringens,, является особенно предпочтительным.
Второй маркерный ген предпочтительно выбран из группы, состоящей из генов cpa, 16S рДНК, virR, virS, pfoA и гомологов и фрагментов этих генов. В качестве альтернативы, также можно использовать полинуклеотидные последовательности, содержащие один из вышеуказанных генов.
Ген cpa является особенно предпочтительным в качестве второго маркера.
Заболевание, вызываемое C. perfringens, может быть выбрано из группы, состоящей из некротического энтерита птиц; энтерита у собак, свиней, лошадей, жеребят, коз, кроликов, ягнят и крупного рогатого скота; диареи у свиней; энтеротоксемии у овец, коз и крупного рогатого скота; некротизирующего энтерита у поросят, ягнят, жеребят и телят (новорожденных); тифлоколита у лошадей; смертельного геморрагического гастроэнтерита собак; смертельного некротизирующего энтероколита жеребят; газовой гангрены (клостридиального мионекроза) у овец, крупного рогатого скота, лошадей и других видов или у людей и некротического энтерита человека. Описанный выше способ особенно подходит для выявления некротического энтерита птиц.
Кроме того, способ в соответствии с настоящим изобретением особенно подходит для выявления заболеваний, вызываемых C. perfringens, в субклиническом или латентном состоянии. При таких субклинических или латентных формах инфекций, вызываемых C. perfringens, не наблюдается явных клинических признаков и обычно отсутствует пик смертности. В особо предпочтительном варианте осуществления описанный выше способ применяют для выявления некротического энтерита птиц в субклиническом или латентном состоянии.
Определение заболеваний, вызываемых C. perfringens, у отдельных животных
Способ согласно настоящему изобретению можно применять для определения того, страдает ли отдельное животное заболеванием, вызываемым C. perfringens. В этом случае материал образца происходит от отдельного животного.
Отдельное животное может являться, например, домашним питомцем или домашним животным, сельскохозяйственным животным, участвующих в стадах скота, дикоживущим животным или животным из зоопарка. Кроме того, отдельных животных, которых транспортируют на убой или на новое местонахождение, можно обследовать с помощью описанного выше способа.
В качестве примера, материал образца, происходящий от отдельной собаки, собранный в последовательные моменты времени, можно анализировать в соответствии с описанным выше способом с целью определения того, страдает ли собака смертельным геморрагическим гастроэнтеритом собак. В данном конкретном случае netF представляет собой подходящий первый маркер, и cpa представляет собой подходящий второй маркер.
Материал образца выбран из группы, состоящей из образцов пыли, мазковых образцов, образцов помета, образцов жидкого навоза, образцов меха, образцов перьев, образцов кожи и образцов экскрементов организма и их растворов или суспензий. Экскременты организма представляют собой мочевые, фекальные или цекальные экскременты. В предпочтительном варианте осуществления материал образца представляет собой фекалии.
В целом, термин «помет» следует понимать как смесь экскрементов животного с материалом подстилки.
Как используется в контексте данного варианта осуществления, термин «образцы помета» относится к выделенным экскрементам отдельного животного. Кроме того, в контексте данного варианта осуществления термин «образцы жидкого навоза» относится к образцу экскрементов, содержащему фекалии и мочу отдельного животного.
Образцы от отдельных животных также можно отбирать непосредственно у животного, например, с помощью тампонов. В качестве альтернативы и особенно в случае содержания животных по отдельности, материал образца можно собирать с пола хлева, клетки или настила. Материал образца должен иметь возможность быть поставленным в соответствие исследуемому животному.
Подходящие значения объема образца составляют, например, от 0,05 мл до 20 мл или от 0,1 до 20 мл, в частности от 0,2 до 10 мл, предпочтительно от 0,5 до 5 мл. Подходящие значения массы образца составляют, например от 0,05 г до 20 г или от 0,1 до 20 г, в частности от 0,2 до 10 г, предпочтительно от 0,5 до 5 г.
Определение заболеваний, вызываемых C. perfringens, в популяциях животных
В альтернативном варианте осуществления способ в соответствии с настоящим изобретением применяют для определения того, страдает ли популяция животных заболеванием, вызываемым C. perfringens.
Используемый в данном документе термин «популяция животных» относится к группе отдельных животных, принадлежащих к одному и тому же виду. Популяция животных может, например, представлять собой группу домашних питомцев или домашних животных, участвующих в разведении животных, группу сельскохозяйственных животных, участвующих в производстве продукции животноводства или разведении скота, или группу дикоживущих животных или животных из зоопарка.
В предпочтительном варианте осуществления популяция животных представляет собой стадо животных, участвующих в процессах производства продукции животноводства. Например, популяция животных или стадо животных может представлять собой стадо птиц; стадо овец, коз или крупного рогатого скота, стадо лошадей или стадо свиней.
Способ согласно настоящему изобретению особенно подходит для определения состояния здоровья популяции животных посредством массового тестирования. Используемый в данном документе термин «массовое тестирование» относится к способу тестирования, в котором материал образца представляет собой объединенный образец от популяции животных. «Объединенный образец» следует понимать как смешанный образец из выбранных произвольным образом отдельных образцов, один образец, отобранный с помощью одного или нескольких увлажненных тканевых тампонов, или объединенные образцы, полученные из отдельных свежих образцов, отобранных произвольным образом из ряда мест в помещении или в месте, в котором содержится популяция животных или стадо животных. Объединенные образцы отображают количество полинуклеотидных маркеров или маркерных генов патогена, присутствующих в популяции животных.
Материал образца выбран из группы, состоящей из образцов пыли, образцов помета, образцов жидкого навоза, образцов меха, образцов перьев, образцов кожи, мазковых образцов и образцов экскрементов организма и их растворов или суспензий. Экскременты организма представляют собой мочевые, фекальные или цекальные экскременты. В предпочтительном варианте осуществления материал образца представляет собой фекалии.
Как используется в контексте данного варианта осуществления, термин «образцы помета» относится к смешанным выделенным экскрементам в хлеву, клетке или на настиле. Кроме того, в контексте данного варианта осуществления термин «образцы жидкого навоза» относится к смешанным образцам экскрементов, содержащим фекалии и мочу.
Такие образцы помета могут быть, например, собраны от популяции животных с помощью метода галоши или с помощью захватов для помета в различных местах хлева.
Тампоны для обуви, обладающие достаточными поглощающими свойствами для впитывания влаги, особенно подходят для сбора объединенных образцов от животных. Трубчатые марлевые чулки также приемлемы.
Подходящие значения объема образца составляют, например, от 0,1 до 20 мл, в частности от 0,2 до 10 мл, предпочтительно от 0,5 до 5 мл. Подходящие значения массы образца составляют, например, от 0,1 до 20 г, в частности от 0,2 до 10 г, предпочтительно от 0,5 до 5 г.
Популяция животных предпочтительно представляет собой стадо птиц. Стадо птиц в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляет собой стадо домашних птиц. Предпочтительными домашними птицами в соответствии с настоящим изобретением являются куры, индейки, утки и гуси. Домашние птицы могут быть оптимизированы для производства молодняка. Данный тип домашних птиц называется также родительскими и прародительскими животными. Предпочтительными родительскими и прародительскими животными являются соответственно (пра)родительские бройлеры, (пра)родительские утки, (пра)родительские индейки и (пра)родительские гуси.
Домашние птицы в соответствии с настоящим изобретением также могут быть выбраны из декоративных домашних птиц и пернатой дичи. Предпочтительными декоративными домашними птицами или пернатой дичью являются павлины, фазаны, куропатки, цесарки, перепела, глухари, гуси, голуби и лебеди. Кроме того, предпочтительными домашними птицами в соответствии с настоящим изобретением являются страусы и попугаи. Наиболее предпочтительными домашними птицами в соответствии с настоящим изобретением являются бройлеры.
Для проведения описанного выше способа образцы от животных собирают в последовательные моменты времени. Образцы предпочтительно отбирают еженедельно, ежедневно или ежечасно. Сбор образцов от животных в последовательные дни является особенно предпочтительным.
В особо предпочтительном варианте осуществления первый и второй маркеры выявляют на уровне ДНК, т.е. полинуклеотиды представляют собой ДНК-полинуклеотиды.
Полинуклеотидные маркеры можно выделять из образцов от животных до количественного определения. Выделение полинуклеотидов, например, можно проводить посредством экстракции с помощью способа с использованием бромида цетилтриметиламмония (CTAB) или с помощью различных коммерческих наборов для экстракции нуклеиновых кислот, в которых лизис клеток достигается посредством химического лизиса и/или посредством механического разрушения клеток, и нуклеиновая кислота захватывается кремнеземными матрицами или магнитными гранулами, покрытыми кремнеземом. Коммерческие наборы для экстракции, предназначенные специально для фекального материала или грубого материала, являются особенно подходящими.
Маркерные гены можно выявлять и/или определять количественно посредством общеизвестных способов, таких как секвенирование, гибридизация или различные методики ПЦР, известные из уровня техники.
В альтернативном варианте осуществления маркерные гены, содержащиеся в образце от животного, можно непосредственно определять количественно, например, с помощью методик ПЦР, количественной ПЦР, секвенирования или гибридизации.
В настоящем изобретении дополнительно предусмотрен диагностический набор, содержащий набор олигонуклеотидов (праймеров и зондов) для амплификации и/или количественного определения по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере один из маркерных генов. В предпочтительном варианте осуществления диагностический набор содержит праймеры для ПЦР и зонды как для первого маркера, так и для второго маркера. Более конкретно, диагностический набор содержит праймеры для ПЦР и зонды для выявления как первого маркера, так и второго маркера, где первый маркер содержит полинуклеотидную последовательность, специфичную для подвида C. perfringens, вызывающего целевое заболевание; а второй маркер содержит полинуклеотид, специфичный для вида C. perfringens. Набор может дополнительно содержать буферные растворы, такие как буфер для ПЦР; соли магния; дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP). Набор может также содержать такие элементы, как пробирки для сбора образцов, реагенты для выделения нуклеиновых кислот и/или инструкции по их применению.
Выявление некротического энтерита птиц
Авторы настоящей заявки неожиданно обнаружили, что наличие некротического энтерита (субклинического) можно определить посредством отслеживания изменения соотношения netB/cpa в образцах от птиц с течением времени.
В соответствии с этим в настоящем изобретении предусмотрен способ выявления некротического энтерита птиц, при этом способ включает:
a) сбор образцов от конкретной птицы или от конкретной популяции птиц в последовательные моменты времени;
b) определение количества первого маркера и второго маркера, содержащихся в материале образца; и
c) определение соотношения уровней первого маркера и второго маркера, содержащихся в материале образца;
где первый маркер представляет собой netB или его гомологи или фрагменты;
второй маркер представляет собой cpa или его гомологи или фрагменты;
и
где увеличение соотношения уровней первого маркера и второго маркера в материале анализируемого образца с течением времени указывает на некротический энтерит птиц.
В качестве альтернативы, первый маркер также может представлять собой полинуклеотидную последовательность, содержащую netB, и/или второй маркер может представлять собой полинуклеотидную последовательность, содержащую cpa. Эти полинуклеотидные последовательности предпочтительно удлинены на не более чем 100 пар оснований или на не более чем 80 пар оснований, предпочтительно на не более чем 70 пар оснований или на не более чем 60 пар оснований, в частности на не более чем 50 пар оснований или на не более чем 40 пар оснований и наиболее предпочтительно на не более чем 30 пар оснований по сравнению с генами netB и cpa.
Термин «некротический энтерит» относится к NE как в клиническом, так и в субклиническом/латентном состоянии.
Следовательно, в особо предпочтительном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрен способ выявления некротического энтерита птиц, при этом способ включает:
a) сбор образцов от конкретной птицы или от конкретной популяции птиц в последовательные моменты времени;
b) определение количества первого маркера и второго маркера, содержащихся в материале образца; и
c) определение соотношения уровней первого маркера и второго маркера, содержащихся в материале образца;
где первый маркер представляет собой netB, а второй маркер представляет собой cpa;
и
где увеличение соотношения уровней первого маркера и второго маркера в материале анализируемого образца с течением времени указывает на некротический энтерит птиц.
Полинуклеотидные последовательности netB и cpa известны из уровня техники. Тем не менее, для целей ясности и полноты консенсусная последовательность netB указана под SEQ ID NO: 1, а консенсусная последовательность cpa указана под SEQ ID NO: 2.
Ген альфа-токсина (cpa) присутствует на хромосоме всех штаммов C. perfringens (патогенных и непатогенных), что означает, что концентрация cpa должна характеризоваться сходными уровнями в образцах экскрементов здоровых и инфицированных NE животных и указывает только на наличие C. perfringens в целом.
Описанный выше способ можно применять для определения того, страдает ли отдельный субъект-птица некротическим энтеритом (субклиническим/латентным), или, в альтернативном варианте осуществления, для определения того, страдает ли популяция птиц некротическим энтеритом (субклиническим/латентным) (посредством «массового тестирования»).
В случае, если необходимо обследовать отдельного субъекта-птицу, материал образца может быть выбран из группы, состоящей из образцов пыли, мазковых образцов, образцов помета, образцов жидкого навоза, образцов перьев и образцов экскрементов организма и их растворов или суспензий. Экскременты организма представляют собой мочевые, фекальные или цекальные экскременты. В предпочтительном варианте осуществления материал образца представляет собой фекалии.
В целом, термин «помет» следует понимать как смесь экскрементов животного с материалом подстилки.
Как используется в контексте данного варианта осуществления, термин «образцы помета» относится к выделенным экскрементам отдельного субъекта-птицы. Кроме того, в контексте данного варианта осуществления термин «образцы жидкого навоза» относится к образцу экскрементов, содержащему фекалии и мочу отдельного животного.
Образцы от отдельных субъектов-птиц также можно отбирать непосредственно у птицы, например, с помощью тампонов. В качестве альтернативы и особенно в случае содержания птиц по отдельности, материал образца можно собирать с пола хлева, клетки или настила. Материал образца должен иметь возможность быть поставленным в соответствие исследуемому животному.
Подходящие значения объема образца составляют, например, от 0,05 мл до 20 мл или от 0,1 до 20 мл, в частности от 0,2 до 10 мл, предпочтительно от 0,5 до 5 мл. Подходящие значения массы образца составляют, например от 0,05 г до 20 г или от 0,1 до 20 г, в частности от 0,2 до 10 г, предпочтительно от 0,5 до 5 г.
В случае, если необходимо определить состояние здоровья популяции птиц, исследуют объединенный образец от популяции птиц (посредством «массового тестирования»). «Объединенный образец» следует понимать как смешанный образец из выбранных произвольным образом отдельных образцов, один образец, отобранный с помощью одного или нескольких увлажненных тканевых тампонов, или объединенные образцы, полученные из отдельных свежих образцов, отобранных произвольным образом из ряда мест в помещении или в месте, в котором содержится популяция птиц. Объединенные образцы отображают количество маркерных генов netB патогена, присутствующих в популяции животных.
Материал образца может быть выбран из группы, состоящей из образцов пыли, образцов помета, образцов жидкого навоза, образцов перьев, мазковых образцов и образцов экскрементов организма и их растворов или суспензий. Экскременты организма представляют собой фекальные или цекальные экскременты. В предпочтительном варианте осуществления материал образца представляет собой фекалии.
Как используется в контексте данного варианта осуществления, термин «образцы помета» относится к смешанным выделенным экскрементам в хлеву, клетке или на настиле. Такие образцы помета могут быть, например, собраны от популяции с помощью метода галоши или с помощью захватов для помета в различных местах хлева. Кроме того, в контексте данного варианта осуществления термин «образцы жидкого навоза» относится к смешанным образцам экскрементов, содержащим фекалии и мочу.
Тампоны для обуви, обладающие достаточными поглощающими свойствами для впитывания влаги, особенно подходят для сбора объединенных образцов от птиц. Трубчатые марлевые чулки также приемлемы.
Популяция животных предпочтительно представляет собой стадо птиц. Стадо птиц в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляет собой стадо домашних птиц. Предпочтительными домашними птицами в соответствии с настоящим изобретением являются куры, индейки, утки и гуси. Домашние птицы могут быть оптимизированы для производства молодняка. Данный тип домашних птиц называется также родительскими и прародительскими животными. Предпочтительными родительскими и прародительскими животными являются соответственно (пра)родительские бройлеры, (пра)родительские утки, (пра)родительские индейки и (пра)родительские гуси.
Домашние птицы в соответствии с настоящим изобретением также могут быть выбраны из декоративных домашних птиц и пернатой дичи. Предпочтительными декоративными домашними птицами или пернатой дичью являются павлины, фазаны, куропатки, цесарки, перепела, глухари, гуси, голуби и лебеди. Кроме того, предпочтительными домашними птицами в соответствии с настоящим изобретением являются страусы и попугаи. Наиболее предпочтительными домашними птицами в соответствии с настоящим изобретением являются бройлеры.
Подходящие значения объема образца составляют, например, от 0,1 до 20 мл, в частности от 0,2 до 10 мл, предпочтительно от 0,5 до 5 мл. Подходящие значения массы образца составляют, например, от 0,1 до 20 г, в частности от 0,2 до 10 г, предпочтительно от 0,5 до 5 г.
Образцы, как правило, следует отбирать и анализировать еженедельно, ежедневно или ежечасно. В предпочтительном варианте осуществления образцы от животных собирают в последовательные дни. Сбор образцов и анализ образцов предпочтительно начинают до дня 14. Например, сбор образцов и анализ образцов начинают с дня 1, с дня 5, с дня 10 или с дня 13 и проводят ежедневно.
Маркерные гены netB и cpa можно выделять из образцов от животных до количественного определения. Выделение полинуклеотидов, например, можно проводить посредством экстракции с помощью способа с использованием бромида цетилтриметиламмония (CTAB) или с помощью различных коммерческих наборов для экстракции нуклеиновых кислот, в которых лизис клеток достигается посредством химического лизиса и/или посредством механического разрушения клеток, и нуклеиновая кислота захватывается кремнеземными матрицами или магнитными гранулами, покрытыми кремнеземом. Коммерческие наборы для экстракции, предназначенные специально для фекального материала или грубого материала, являются особенно подходящими.
Маркерные гены можно выявлять и/или определять количественно посредством общеизвестных способов, таких как секвенирование, гибридизация или различные методики ПЦР, известные из уровня техники.
В альтернативном варианте осуществления маркерные гены, содержащиеся в образце от животного, можно непосредственно определять количественно, например, с помощью методик ПЦР, количественной ПЦР, секвенирования или гибридизации.
Поражения кишечника, вызванные субклиническим или клиническим некротическим энтеритом, оценивали в баллах по шкале от 0 до 6 [Keyburn et al. (2006) «Alpha toxin of Clostridium perfringens is not an essential virulence factor in necrotic enteritis in chickens», Infect. Immun. 74:6496-6500]. В соответствии с этим поражения в тонкой кишке (от двенадцатиперстной кишки до подвздошной кишки) оценивали в баллах следующим образом: балл 0 = отсутствие макроскопических поражений; 1 = скопление крови в слизистой оболочке кишечника; 2 = небольшой очаговый некроз или изъязвление (1-5 очагов); 3 = очаговый некроз или изъязвление (6-15 очагов); 4 = очаговый некроз или изъязвление (16 или больше очагов); 5 = некротические пятна длиной 2-3 см; 6 = типичные примеры диффузного некроза. Баллы поражений 5-6 соответствуют клиническому некротическому энтериту; баллы поражений 1-4 соответствуют субклиническому состоянию.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что соотношение уровней маркерных генов netB/cpa в образцах экскрементов птиц на уровне 0,5 уже указывает на признаки скопления крови в слизистой оболочке кишечника.
Соответственно, в настоящем изобретении также предусмотрен способ выявления некротического энтерита, при этом способ включает:
a) сбор образца от птиц,
b) определение количества маркерных генов netB и cpa в данном образце от птиц, и
c) определение соотношения уровней маркерных генов netB/cpa в образцах от птиц,
где соотношение netB/cpa, составляющее более 0,5, является указанием на некротический энтерит.
Кроме того, в настоящем изобретении также предусмотрены новые праймеры для ПЦР и зонды, подходящие для выявления и/или количественного определения маркерных генов netB и cpa, присутствующих в экскрементах животных, инфицированных некротическим энтеритом. Используемый в данном документе термин «зонд (для ПЦР)» относится к олигонуклеотидной последовательности, которая увеличивает специфичность количественной ПЦР.
Олигонуклеотидные праймеры и зонды, описанные ниже, оказались особенно эффективными. Соответственно, в настоящем изобретении предусмотрены олигонуклеотиды, выбранные из группы, состоящей из:
a) олигонуклеотидов, характеризующихся по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, 90% или 95%, наиболее предпочтительно 100% идентичностью последовательности с полинуклеотидом, представленным под SEQ ID NO: 3;
b) олигонуклеотидов, характеризующихся по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, 90% или 95%, наиболее предпочтительно 100% идентичностью последовательности с полинуклеотидом, представленным под SEQ ID NO: 4;
c) олигонуклеотидов, характеризующихся по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, 90% или 95%, наиболее предпочтительно 100% идентичностью последовательности с полинуклеотидом, представленным под SEQ ID NO: 5;
d) олигонуклеотидов, характеризующихся по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, 90% или 95%, наиболее предпочтительно 100% идентичностью последовательности с полинуклеотидом, представленным под SEQ ID NO: 6;
e) олигонуклеотидов, характеризующихся по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, 90% или 95%, наиболее предпочтительно 100% идентичностью последовательности с полинуклеотидом, представленным под SEQ ID NO: 7;
f) олигонуклеотидов, характеризующихся по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, 90% или 95%, наиболее предпочтительно 100% идентичностью последовательности с полинуклеотидом, представленным под SEQ ID NO: 8;
g) олигонуклеотидов, комплементарных олигонуклеотидам в соответствии с (a) - (f);
h) олигонуклеотидов, содержащих любой из олигонуклеотидов в соответствии с (a) - (g) и удлиненных на не более чем 5 нуклеотидов по сравнению с олигонуклеотидами в соответствии с (a) - (g).
Здесь полинуклеотид, представленный под SEQ ID NO: 3, представляет собой праймер для ПЦР (прямой) для выявления netB. Полинуклеотид, представленный под SEQ ID NO: 4, представляет собой праймер для ПЦР (обратный) для выявления netB. Полинуклеотид, представленный под SEQ ID NO: 5, представляет собой зонд для ПЦР для выявления netB.
Кроме того, полинуклеотид, представленный под SEQ ID NO: 6, представляет собой праймер для ПЦР (прямой) для выявления cpa. Полинуклеотид, представленный под SEQ ID NO: 7, представляет собой праймер для ПЦР (обратный) для выявления cpa. Полинуклеотид, представленный под SEQ ID NO: 8, представляет собой зонд для ПЦР для выявления cpa.
Эти олигонуклеотиды предпочтительно применяются в качестве праймеров и/или зондов в одном из вышеописанных способов выявления некротического энтерита.
Соответственно, олигонуклеотиды, выбранные из группы, состоящей из:
a) олигонуклеотидов, характеризующихся по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, 90% или 95%, наиболее предпочтительно 100% идентичностью последовательности с полинуклеотидом, представленным под SEQ ID NO: 3;
b) олигонуклеотидов, характеризующихся по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, 90% или 95%, наиболее предпочтительно 100% идентичностью последовательности с полинуклеотидом, представленным под SEQ ID NO: 4;
c) олигонуклеотидов, характеризующихся по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, 90% или 95%, наиболее предпочтительно 100% идентичностью последовательности с полинуклеотидом, представленным под SEQ ID NO: 5;
d) олигонуклеотидов, характеризующихся по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, 90% или 95%, наиболее предпочтительно 100% идентичностью последовательности с полинуклеотидом, представленным под SEQ ID NO: 6;
e) олигонуклеотидов, характеризующихся по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, 90% или 95%, наиболее предпочтительно 100% идентичностью последовательности с полинуклеотидом, представленным под SEQ ID NO: 7;
f) олигонуклеотидов, характеризующихся по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, 90% или 95%, наиболее предпочтительно 100% идентичностью последовательности с полинуклеотидом, представленным под SEQ ID NO: 8;
g) олигонуклеотидов, комплементарных олигонуклеотидам в соответствии с (a) - (f);
h) олигонуклеотидов, содержащих любой из олигонуклеотидов в соответствии с (a) - (g) и удлиненных на не более чем 5 пар оснований по сравнению с олигонуклеотидами в соответствии с (a) - (g);
применяют в вышеописанном способе в качестве праймера для ПЦР и/или в качестве зонда для ПЦР.
В настоящем изобретении дополнительно предусмотрен диагностический набор для определения того, страдает ли популяция птиц, такая как стадо птиц, (субклиническим) некротическим энтеритом. Указанный набор содержит набор олигонуклеотидов для амплификации и/или количественного определения по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере один из маркерных генов netB и/или cpa. Диагностический набор предпочтительно содержит праймеры для ПЦР и зонды как для netB, так и для cpa. Набор может содержать один или более олигонуклеотидов, характеризующихся по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, 90% или 95%, наиболее предпочтительно 100% идентичностью последовательности с одним или более полинуклеотидами, представленными под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8; олигонуклеотидов, комплементарных олигонуклеотидам в соответствии с SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8; олигонуклеотидов, содержащих любой из вышеуказанных олигонуклеотидов и удлиненных на не более чем 5 пар оснований по сравнению с олигонуклеотидами в соответствии с SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8. Набор предпочтительно содержит по меньшей мере два праймера или по меньшей мере четыре праймера. Набор, содержащий два праймера и один зонд, или набор, содержащий четыре праймера и два зонда, является особенно предпочтительным. Набор может дополнительно содержать буферные растворы, такие как буфер для ПЦР; соли магния; дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP). Набор может также содержать такие элементы, как пробирки для сбора образцов, реагенты для выделения нуклеиновых кислот и/или инструкции по их применению.
В дополнение к описанному выше, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что увеличенный уровень маркерного гена netB, его гомологов и фрагментов по сравнению с неинфицированным контролем и увеличение уровня netB с течением времени соответственно указывает на некротический энтерит.
Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу выявления некротического энтерита птиц, при этом способ включает:
a) сбор образцов экскрементов от конкретной птицы или от конкретной популяции птиц в последовательные моменты времени и
b) отслеживание уровня маркерного гена netB и/или его гомологов и фрагментов в этих образцах;
где увеличение уровня маркерного гена является указанием на некротический энтерит птиц.
В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного способа настоящее изобретение также относится к способу выявления некротического энтерита птиц, при этом способ включает:
a) сбор образцов экскрементов от конкретной птицы или от конкретной популяции птиц в последовательные моменты времени и
b) отслеживание уровня маркерного гена netB в этих образцах;
где увеличение уровня netB является указанием на некротический энтерит птиц.
В этом отношении и в соответствии с общепринятым пониманием увеличение на приблизительно 0,2-0,3 log (т.е. в два-пять раз) следует считать значимым.
7
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что количество netB, составляющее по меньшей мере 10 копий/г фекалий, является указанием на некротический энтерит.
Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу выявления некротического энтерита птиц, при этом способ включает:
a) сбор образцов экскрементов от конкретной птицы или от конкретной популяции птиц в последовательные моменты времени и
b) отслеживание уровня маркерного гена netB в этих образцах;
7
где количество netB, составляющее по меньшей мере 10 копий/г фекалий, является указанием на некротический энтерит.
Описанные выше способы подходят для выявления некротического энтерита как в клиническом, так и в субклиническом/латентном состоянии.
Авторы настоящего изобретения неожиданно также обнаружили, что количество маркерного гена netB коррелирует со степенью выраженности поражений кишечника у соответствующего субъекта-птицы и, таким образом, со степенью тяжести некротического энтерита. Соответственно, настоящее изобретение также направлено на способ определения степени тяжести некротического энтерита птиц, при этом способ включает определение количества маркерного гена netB и/или его гомологов и фрагментов в образцах экскрементов птиц, где количество указанного маркерного гена указывает на степень тяжести некротического энтерита.
В описанных выше способах олигонуклеотидные праймеры и зонды, описанные ниже, оказались особенно эффективными.
Соответственно, олигонуклеотиды, выбранные из группы, состоящей из:
a) олигонуклеотидов, характеризующихся по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, 90% или 95%, наиболее предпочтительно 100% идентичностью последовательности с полинуклеотидом, представленным под SEQ ID NO: 3;
b) олигонуклеотидов, характеризующихся по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, 90% или 95%, наиболее предпочтительно 100% идентичностью последовательности с полинуклеотидом, представленным под SEQ ID NO: 4;
c) олигонуклеотидов, характеризующихся по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, 90% или 95%, наиболее предпочтительно 100% идентичностью последовательности с полинуклеотидом, представленным под SEQ ID NO: 5;
d) олигонуклеотидов, комплементарных олигонуклеотидам в соответствии с (a) - (c);
e) олигонуклеотидов, содержащих любой из олигонуклеотидов в соответствии с (a) - (d) и удлиненных на не более чем 5 пар оснований по сравнению с олигонуклеотидами в соответствии с (a) - (d);
можно применять в одном из вышеописанных способов для выявления некротического энтерита птиц в качестве праймера для ПЦР и/или в качестве зонда для ПЦР для выявления netB.
Полинуклеотид, представленный под SEQ ID NO: 3, представляет собой праймер для ПЦР (прямой) для выявления netB. Полинуклеотид, представленный под SEQ ID NO: 4, представляет собой праймер для ПЦР (обратный) для выявления netB. Полинуклеотид, представленный под SEQ ID NO: 5, представляет собой зонд для ПЦР для выявления netB.
В настоящем изобретении дополнительно предусмотрен диагностический набор для определения того, страдает ли популяция птиц, такая как стадо птиц, (субклиническим) некротическим энтеритом. Указанный набор содержит набор олигонуклеотидов для амплификации и/или количественного определения полинуклеотида, кодирующего маркерный ген netB. В предпочтительном варианте осуществления набор содержит один или более олигонуклеотидов, характеризующихся по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, 90% или 95%, наиболее предпочтительно 100% идентичностью последовательности с одним или более полинуклеотидами, представленными под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5; олигонуклеотидов, комплементарных олигонуклеотидам в соответствии с SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5; олигонуклеотидов, содержащих любой из вышеуказанных олигонуклеотидов и удлиненных на не более чем 5 пар оснований по сравнению с олигонуклеотидами в соответствии с SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5. Набор предпочтительно содержит два праймера. Набор, содержащий два праймера и один зонд, является особенно предпочтительным. Набор может дополнительно содержать буферные растворы, такие как буфер для ПЦР; соли магния; дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP). Набор может также содержать такие элементы, как пробирки для сбора образцов, реагенты для выделения нуклеиновых кислот и/или инструкции по их применению.
В настоящем изобретении предусмотрены вышеописанные неинвазивные способы выявления некротического энтерита птиц и определения степени тяжести некротического энтерита, которые можно проводить до наступления смерти. Это позволяет фермеру эффективно лечить популяцию птиц, страдающую некротическим энтеритом, при необходимости после проведения вышеуказанного теста. В качестве альтернативы или дополнительно, фермер может также вводить вещества для укрепления здоровья, такие как зоотехнические кормовые добавки.
Терапевтическое средство или вещество для укрепления здоровья предпочтительно выбрано из группы, состоящей из антибиотических средств, пробиотических средств, пребиотических средств, органических/жирных кислот, бактериофагов и бактериолитических ферментов.
В соответствии с этим настоящее изобретение также направлено на антибиотические средства для применения в лечении некротического энтерита, где некротический энтерит выявляют или оценивают путем проведения одного из указанных выше способов. Кроме того, настоящее изобретение направлено на применение пробиотических средств, пребиотических средств, органических/жирных кислот, бактериофагов и бактериолитических ферментов для улучшения состояния здоровья животного или популяции животных.
Пути применения способов в соответствии с настоящим изобретением представляют собой, например, (i) содействие диагностированию и/или прогнозированию заболеваний, вызываемых C. perfringens, таких как некротический энтерит птиц, (ii) отслеживание прогрессирования или повторного появления этих заболеваний, (iii) содействие оцениванию эффективности лечения для популяции животных, которые подвергаются лечению или для которых предполагается лечение, или (iv) контроль эффективности (терапевтической) вакцинации против заболеваний, вызываемых C. perfringens.
Пути применения настоящего изобретения, в частности, помогают избежать потери показателей производительности животных, таких как набор массы тела и конверсия корма.
Далее настоящее изобретение проиллюстрировано неограничивающими примерами и иллюстративными вариантами осуществления.
Примеры
1. Модель in vivo
Использовали модель субклинического некротического энтерита in vivo. В данной модели бройлеров Ross 308 (самок и самцов) разделяли на группы по 27 птиц в каждой группе. Их кормили рационом на основе пшеницы/ржи (43%/7,5%) с соевым шротом в качестве источника белка до дня 16. Начиная с дня 17 и далее, соевый шрот заменяли рыбной мукой (30%) в качестве источника белка. В дни 4 и 9 бройлерам перорально инокулировали Poulvac Bursa Plus (Zoetis) в качестве иммунодепрессанта. В дни 14 и 16 бройлерам перорально инокулировали десятикратную дозу Hipracox.
8
Птиц из 5 групп (P.A - P.E) три раза в день подвергали пероральному контрольному заражению с помощью примерно 4×10 КОЕ netB-положительных патогенных бактерий C. perfringens (в культуре в поздней логарифмической фазе роста) (Cp56) в течение двух последовательных дней (в дни 18 и 19). Две группы птиц (P.F и P.G) подвергали контрольному заражению только один раз в день, чтобы вызвать более легкие некротические поражения, чем в предыдущих группах, подвергавшихся контрольному заражению три раза в день.
Кур подвергали контрольному заражению в течение двух последовательных дней. Всех животных подвергали эвтаназии в день 20. Поражения кишечника в тонкой кишке (от двенадцатиперстной кишки до подвздошной кишки) оценивали в баллах следующим образом: 0 = отсутствие макроскопических поражений; 1 = скопление крови в слизистой оболочке кишечника; 2 = небольшой очаговый некроз или изъязвление (1-5 очагов); 3 = очаговый некроз или изъязвление (6-15 очагов); 4 = очаговый некроз или изъязвление (16 или больше очагов); 5 = некротические пятна длиной 2-3 см; 6 = типичные примеры диффузного некроза. Неинфицированных контрольных птиц обрабатывали таким же образом, за исключением инокуляции C. perfringens. Этим контрольным птицам инокулировали стерильную среду для роста бактерий (бульон BHI).
Ни у одной из птиц в группе отрицательного контроля, получавших стерильную среду для роста бактерий (BHI) вместо патогенной культуры C. perfringens, не развился некротический энтерит. Птицы, подвергнутые контрольному заражению непатогенным штаммом C. perfringens, также не имели некротических поражений. В других группах, подвергнутых контрольному заражению патогенным Cp56, у большинства птиц развился некротический энтерит. При этом у большого количества птиц наблюдались тяжелые поражения.
Краткое описание модели in vivo
2
Свежие клоакальные образцы (т.е. образцы от отдельных животных) собирали непосредственно после смерти и подвергали мгновенному замораживанию в жидком N перед хранением при -80°C.
Клоакальные образцы от отдельных животных: - инфицированные птицы (различные баллы поражений) - неинфицированные контрольные группы - птицы, которым был инокулирован netB-отрицательный C. perfringens
Образцы помета (= смешанные фекальные выделения в хлеву, т.е. объединенные образцы от стада птиц) собирали от каждой группы с помощью метода галоши (только в день 19) и с помощью захватов для помета в 5 различных местах в хлеву с дня перед инокуляцией (дня 17) до дня 19.
Типы и количество собранных образцов
Образцы с бахил собирали только в день 19. Образцы помета собирали с дня 17 до дня 19. Образцы гомогенизировали и разделяли на три части.
2. Экстракция и количественное определение ДНК
ДНК экстрагировали из образцов с помощью способа с использованием CTAB. Соответственно, 100 мг клоакального материала и 200 мг захваченного образца помета или образца с бахил использовали в качестве исходного материала. Общую ДНК элюировали в 100 мкл воды. Концентрацию ДНК определяли с помощью спектрофотометра Nanodrop ND 1000 (Nanodrop Technologies, Уилмингтон, Делавэр, США) и доводили до конечной концентрации 50 нг/мкл.
7
1
Проводили количественную ПЦР с использованием мастер-микса на основе SYBR Green 2x (Bioline, Брюссель, Бельгия) в системе Bio-Rad CFX-384. Каждую реакцию проводили в трех повторностях в реакционной смеси общим объемом 12 мкл с использованием 2 мкл образца ДНК и праймеров для количественной ПЦР в конечной концентрации 0,5 мкМ. Используемые условия количественной ПЦР были одинаковыми для обоих генов: 1 цикл при 95°C в течение 10 мин., затем 40 циклов при 95°C в течение 30 с, 60°C в течение 30 с и ступенчатое увеличение температуры от 65°C до 95°C (при 10 с/0,5°C). Данные кривой плавления анализировали для подтверждения специфичности реакции. Для построения калибровочной кривой продукт ПЦР получали с использованием стандартных праймеров для ПЦР, перечисленных ниже, и ДНК из C. perfringens штамма CP56. После очистки (MSB Spin PCRapace, Stratec Molecular, Берлин, Германия) и определения концентрации ДНК концентрацию линейного стандарта днДНК доводили до величины от 1×10 до 1×10 копий на мкл, причем на каждой стадии концентрация отличалась в 10 раз. Число копий в образцах определяли посредством считывания значений Ct для серии стандартов и образцов.
5
Предел выявления методики количественной ПЦР зависит от концентрации ДНК, полученной после экстракции с помощью CTAB, и составлял около 10 копий гена/г материала.
Праймеры, используемые в ПЦР-анализе:
3. Агрегированное тестирование. Корреляция количества маркерных генов в клоакальных образцах от отдельных животных
В этих примерах исследовали вышеуказанные клоакальные образцы.
В день вскрытия ген альфа-токсина (cpa) присутствовал в клоакальных образцах от всех групп (как неинфицированных, так и инфицированных птиц), и ген netB также присутствовал во всех клоакальных образцах.
3.1 Корреляция количества netB с баллом поражения
7
Только в клоакальных образцах от птиц, подвергнутых контрольному заражению патогенным netB-положительным штаммом C. perfringens , средний сигнал netB превышал 10 копий/г фекалий.
Данный пример показывает, что количество гена netB в анализируемых образцах прямо коррелирует с баллом поражений кишечника у анализируемой птицы, т.е. со степенью тяжести некротического энтерита у инфицированной птицы.
Корреляцию между баллами поражений у птиц, инфицированных патогенным штаммом C. perfringens, и количеством генов (netB/cpa), присутствующих в фекалиях, рассчитывали с использованием корреляции Спирмена. Значение коэффициента корреляции Спирмена r может находиться в диапазоне от 0 до 1: r = 1 → абсолютная корреляция, r = 0 → отсутствие корреляции. Для всех тестируемых генов их наличие демонстрирует корреляцию с тяжестью заболевания, при этом наиболее сильная корреляция наблюдается для гена netB.
Расчет корреляции Спирмена:
Корреляция Спирмена обеспечивает математическое подтверждение корреляции между количеством netB в клоакальном образце и степенью тяжести некротического энтерита.
3.2 Корреляция соотношения netB/cpa с баллом поражения
Исследовали соотношение уровней гена netB и гена cpa в клоакальных образцах от неинфицированных птиц (BHI), птиц, подвергнутых контрольному заражению непатогенным штаммом (не являющимся патогенным), и птиц, подвергнутых контрольному заражению патогенным штаммом C. perfringens.
У птиц проявлялась различная степень тяжести заболевания (от балла 0 до балла 5-6):
4. Массовое тестирование. Отслеживание изменения количества маркерных генов в образцах экскрементов от популяции птиц с течением времени
В этих примерах исследовали образцы помета, указанные выше.
4.1 Отслеживание изменения количества netB с течением времени
Было обнаружено, что количество гена netB в образцах помета значительно увеличивалось, начиная с дня, следующего за днем инокуляции (дня 18) патогенным штаммом C. perfringens:
4.2 Отслеживание изменения соотношения netB/cpa с течением времени
Было обнаружено, что соотношение уровней гена netB и гена cpa в образцах помета, собранных в дни 17-19, значительно увеличивалось, начиная с дня, следующего за днем инокуляции (дня 18) патогенным штаммом C. perfringens:
В описанных выше экспериментах показано, что увеличение количества гена netB и соотношения уровней генов netB/cpa соответственно в объединенных образцах экскрементов от животных, собранных в последовательные моменты времени, коррелирует с развитием или прогрессированием некротического энтерита. Тем самым подтверждается, что способы по настоящему изобретению обеспечивают возможность оценки состояния здоровья целого стада животных в отношении заболеваний, вызываемых C. perfringens.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Эвоник Дегусса ГмбХ
<120>  Способ выявления заболеваний, вызываемых C. perfringens, у животных
<130>  201700020
<160>  16
<170>  PatentIn, версия 3.5
<210>  1
<211>  969
<212>  ДНК
<213>  Clostridium perfringens
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (10)..(10)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (391)..(396)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (418)..(420)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (443)..(443)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (497)..(497)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (502)..(502)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<400>  1
ttgaaaagan taaaaattat ttcaattaca ctagttctta caagtgtaat tagtacaagc       60
cttttttcaa ctcaaactca agtttttgca agtgaattaa atgacataaa caaaattgag      120
ttgaaaaatc taagtggaga aataataaaa gaaaatggaa aggaagctat taaatatact      180
tctagtgata ccgcttcaca taaaggttgg aaggcaactt taagtggaac atttattgaa      240
gatcctcatt ctgataagaa aactgcttta ttaaatttag aaggatttat accttctgat      300
aaacagattt ttggttctaa atattacgga aaaatgaaat ggcctgaaac ttatagaatt      360
aatgtaaaaa gtgctgatgt aaataataat nnnnnnatag caaattctat tcctaaannn      420
actatagata aaaaagatgt atntaattca attggttatt ctataggcgg taatatatct      480
gttgaaggaa aaactgntgg tnctggaata aatgcttcat ataatgtcca aaatactata      540
agctatgaac aacctgattt tagaacaatt caaagaaaag atgatgcaaa tttagcatca      600
tgggatataa aatttgttga gactaaggac ggttataata tagattctta tcatgctatt      660
tatggaaatc aattattcat gaaatcaaga ttgtataata atggtgataa aaatttcaca      720
gatgatagag atttatcaac attaatttct ggtggatttt cacccaatat ggctttagca      780
ttaacagcac ctaaaaatgc taaagaatct gtaataatag ttgaatatca aagatttgat      840
aatgactata ttttaaattg ggaaactact caatggcgag gaacaaacaa actttcgtca      900
acaagtgaat ataacgaatt tatgtttaaa ataaattggc aagatcataa aatagaatat      960
tatctgtaa                                                              969
<210>  2
<211>  1197
<212>  ДНК
<213>  Clostridium perfringens
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (21)..(21)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (23)..(24)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (28)..(28)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (36)..(37)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (40)..(40)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (44)..(44)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (64)..(65)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (78)..(78)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (81)..(81)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (96)..(96)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (102)..(102)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (128)..(128)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (138)..(139)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (147)..(147)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (160)..(160)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (165)..(165)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (167)..(167)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (170)..(170)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (213)..(213)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (225)..(225)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (264)..(264)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (267)..(267)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (274)..(274)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (288)..(288)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (307)..(307)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (318)..(318)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (360)..(360)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (393)..(393)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (420)..(420)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (423)..(423)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (429)..(429)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (453)..(453)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (510)..(510)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (540)..(540)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (552)..(552)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (558)..(558)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (567)..(567)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (584)..(584)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (600)..(600)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (604)..(605)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (613)..(613)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (621)..(621)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (633)..(633)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (680)..(680)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (684)..(684)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (738)..(738)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (741)..(742)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (757)..(757)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (759)..(759)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (783)..(783)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (807)..(807)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (825)..(826)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (840)..(840)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (843)..(843)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (885)..(885)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (963)..(963)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (978)..(978)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (985)..(985)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (993)..(993)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (999)..(999)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (1014)..(1014)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (1020)..(1020)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (1087)..(1087)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (1094)..(1094)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (1117)..(1117)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (1124)..(1124)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (1143)..(1143)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (1149)..(1149)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (1158)..(1158)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<400>  2
atgaaaagaa agatttgtaa ngnncttntt tgtgcnncgn tagnaactag cctatgggct       60
gggnnatcaa ctaaagtnta ngcttgggat ggaaanattg anggaacagg aactcatgct      120
atgattgnaa ctcaaggnnt ttcaatntta gaaaatgatn tgtcnanaan tgaaccagaa      180
agtgtaagaa aaaacttaga gattttaaaa ganaacatgc atgancttca attaggttct      240
acttatccag attatgataa gaangcntat gatntatatc aagatcantt ctgggatcct      300
gatacanata ataatttntc aaaggataat agttggtatt tagcttattc tatacctgan      360
acaggggaat cacaaataag aaaattttca gcnttagcta gatatgaatg gcaaagaggn      420
aantataanc aagctacatt ctatcttgga gangctatgc actattttgg agatatagat      480
actccatatc atcctgctaa tgttactgcn gttgatagcg caggacatgt taagtttgan      540
acttttgcag angaaagnaa agaacantat aaaataaaca cagnaggttg caaaactaan      600
gagnnttttt atnctgatat nttaaaaaac aangatttta atgcatggtc aaaagaatat      660
gcaagaggtt ttgctaaaan aggnaaatca atatactata gtcatgctag catgagtcat      720
agttgggatg attggganta nncagcaaag gtaactntng ctaactctca aaaaggaaca      780
gcnggatata tttatagatt cttacangat gtatcagagg gtaannatcc atcagttggn      840
aanaatgtaa aagaactagt agcttacata tcaactagtg gtganaaaga tgctggaaca      900
gatgactaca tgtattttgg aatcaaaaca aaggatggaa aaactcaaga atgggaaatg      960
ganaacccag gaaatgantt tatgnctgga agnaaagana cttatacttt caanttaaan     1020
gatgaaaatc taaaaattga tgatatacaa aatatgtgga ttagaaaaag aaaatataca     1080
gcattcncag atgnttataa gccagaaaac ataaagntaa tagnaaatgg aaaagttgta     1140
gtngacaang atataaanga gtggatttca ggaaattcaa cttataatat aaaataa        1197
<210>  3
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер
<400>  3
tatacttcta gtgataccgc                                                   20
<210>  4
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер
<400>  4
atcagaatga ggatcttcaa                                                   20
<210>  5
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Зонд
<400>  5
tcacataaag gttggaaggc aac                                               23
<210>  6
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер
<400>  6
tacatatcaa ctagtggtga                                                   20
<210>  7
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер
<400>  7
attcttgagt ttttccatcc                                                   20
<210>  8
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Зонд
<400>  8
tggaacagat gactacatgt attttgg                                           27
<210>  9
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер
<400>  9
agtctacgct tgggatggaa                                                   20
<210>  10
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер
<400>  10
tttcctgggt tgttcatttc                                                   20
<210>  11
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер
<400>  11
tgataccgct tcacataaag gt                                                22
<210>  12
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер
<400>  12
accgtcctta gtctcaacaa at                                                22
<210>  13
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер
<400>  13
gttgatagcg caggacatgt taag                                              24
<210>  14
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер
<400>  14
catgtagtca tctgttccag catc                                              24
<210>  15
<211>  25
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер
<400>  15
tcaattggtt attctatagg cggta                                             25
<210>  16
<211>  25
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер
<400>  16
atatgaagca tttattccag cacca                                             25
<---