Полиморфные системы белков крови как генетические маркеры в селекции и мониторинге микроэволюции оренбургской пуховой породы коз

Полиморфные системы белков крови как генетические маркеры в селекции и мониторинге микроэволюции оренбургской пуховой породы коз

А. Н. Екимов, к.с.-х.н, доцент, Оренбургский ГАУ

В современной стратегии селекции разработка теоретических основ сохранения генофонда и совершенствования локальных пород домашних животных представляет собой фундаментальную проблему перед биологической наукой. При этом заслуживает особого внимания исследование микроэволюционных процессов, происходящих в оренбургской пуховой породе коз, роли и степени влияния на эти процессы генетических факторов, с тем чтобы на основе системного подхода и популяционно-биологической концепции определить наиболее оптимальные приемы селекции.

По мнению А. М. Машурова [1], Ю. П. Алтухова [2] и др., для подхода к дифференциальному анализу генетической изменчивости, оценки ее эволюционной локально-адаптивной либо нейтральной по отношению к этим событиям значимости необходимо иметь метод, который позволил бы одновременно судить об изменчивости конкретных структурных генов и давал информацию об изменчивости дискретных генов, входящих в

целостный интегрированный фенотип. К числу таких методов относится анализ генетических маркеров. По В. И. Глазко [3], существует множество способов, позволяющих маркировать изменчивость генетического материала, в частности, это иммунологическое типирование изменчивости антигенных структур, двухмерный электрофорез, рестрикционный анализ фрагментов ДНК и др. Однако до сих пор наиболее адекватным способом одновременной оценки изменчивости структурных генов и соответствующего состояния отдельных ферментов с относительно изученной функцией в системах цельного организма и кинематических процессах в популяциях остается метод анализа генетически детерминированного полиморфизма белков с известной биохимической функцией. В его основу положен электрофорез на крахмальном геле, разработанный O. Smithies (1955). Путем изменения времени, напряжения и состава буферного раствора достигается оптимальное разделение белков и ферментов крови.

Изучению биохимического полиморфизма белков и ферментов крови коз посвящены работы

Н. Я. Антоновой, Ш. А. Мкртчана [4], H. Singh [5], M. P. P. Bhat [6], D. R. Osterhoff[7], Н. С. Мар-занова [8], Л. В. Ольховской, Л. Н. Чижовой [9] и др. Иммуногенетические методы, выявляющие у коз генетически детерминированные, кодоминан-тно наследуемые и непретерпевающие изменений в постнатальном онтогенезе типы полиморфных белков и ферментов, делают возможность использовать их при решении вопросов мониторинга селекционных процессов в популяциях.

В связи с этим в задачу наших исследований входило: изучить генетическую структуру и алле-лофонд популяции коз оренбургской пуховой породы по типам и аллелям полиморфных белковых систем крови — трансферрина (Tf), гемоглобина (Hb), сывороточной арилэстеразы (AEs) и щелочной фосфотазы (Ap); оценить степень генетического сходства и дивергенции коз основных субпопуляций в породе на разных этапах селекции.

Фенотипирование белков крови проводили методом горизонтального электрофореза на крахмальном геле по О. Смитису [10]. При этом частоту генотипов (фенотипов) вычисляли как долю особей, имеющих данный генотип (фенотип) от общего числа обследованных животных, частоту аллелей рассчитывали, исходя из уравнения Хар-ди-Вайнберга и Бронштейна. Анализ генетической сбалансированности по разным локусам проводили путем сравнения фактического распределения генотипов с теоретически ожидаемыми при помощи критерия соответствия — Хи-квадрат (% 2). О генетической дивергенции коз разных субпопуляций в породе судили по коэффициенту генетического сходства и дистанций Нея (Е. К. Меркурьева, 1977).

В результате проведенных исследований было установлено, что аллелофонд оренбургской пуховой породы коз, представляя собой относительно независимую (от других пород коз) генетическую систему, в то же время входит в более крупную таксономическую единицу — вид со свойственным ему специфическим генофондом. В видовом аспекте изучаемые нами белки и ферменты сыворотки крови коз имеют разную степень полиморфизма своих локусов (табл. 1).

В мировом генофонде коз наибольшей генетической изменчивостью характеризуется гемогло-

биновый локус (НЬ), имеющий в своем спектре шесть аллеломорфов. На один локус трансферрина (ТО приходится пять аллелей; щелочной фосфотазы (Ар) — три аллеломорфа; всего в двух вариантах представлена сывороточная арилэстера-за (АЕ8). Козы оренбургской пуховой породы также характеризуются относительно высоким полиморфным состоянием изучаемых белков и ферментов крови, синтез которых контролируется разным числом кодоминантных аллелей (табл. 2).

В гемоглобиновом (НЬ) локусе из шести теоретически возможных (видоспецифических) аллеломорфов обнаружено два: НЬА и НЬВ. Причем доля «быстрого» гемоглобина НЬА превалирует как в породе в целом (Р=0,676), так и в изучаемых субпопуляциях коз с частотой от 0,644 в стаде СПК «Загорный» до 0,699 в стаде СПК «Заря». Частота встречаемости аллеля НЬВ составила 0,324 в породе, при колебаниях по популяциям: в ГПХ «Гу-берлинский» — 0,313, в СПК «Загорный» — 0,356 и в СПК «Заря» — 0,301. Следует отметить, что во временном аспекте со сменой поколений в субпопуляциях СПК «Загорный» и СПК «Заря» наблюдается тенденция увеличения концентрации аллеля НЬА. Частота встречаемости данного аллеля в дочернем поколении по сравнению с материнским увеличилась на 13,3%, а во внучатом она возросла на 18,3% в стаде коз СПК «Заря» и соответственно на 8,3% и 15% в субпопуляции СПК «Загорный». Незначительная флуктуация частоты встречаемости НЬА в поколениях наблюдалась в стаде коз ГПХ «Губерлинский». В материнском поколении концентрация НЬА составила 0,667, в дочернем и внучатом соответственно 0,717 и 0,677. Противоположными закономерностями характеризовался аллель НЬВ.

В системе трансферринового локуса у коз оренбургской пуховой породы удалось выявить два «быстрых» аллеля — Т^ и ТР и один медленный — ТГ^. Концентрация их в среднем по породе составила соответственно 0,424; 0,347 и 0,229. Распределение аллелей трансферринового локуса по частоте встречаемости в разных субпопуляциях было неодинаковым.

В стаде коз ГПХ «Губерлинский» частота ТГА составила 0,511, аллеля ТР — 0,401, а концентрация аллеля Т^ равнялась всего лишь 0,088. В стаде коз СПК «Загорный» частота ТГА составила

1. Видовой спектр полиморфных белков и ферментов сыворотки крови коз

Локус Видовой спектр аллелей мирового генофонда Выявлено аллелей в оренбургской пуховой породе коз

количество аллелей аллель количество возможных генотипов количество аллелей аллель количество возможных генотипов

Не б А; B; C; D; H; N 21 2 А; B З

Tf 5 A; B; C; D; E 15 З А; B; С б

AEs 2 B; H З 2 B; Н З

Ap З A; B; C б 2 А; B З

2. Частота встречаемости аллелей полиморфных систем белков и ферментов крови коз оренбургской пуховой породы

Локус Аллель Частота встречаемости аллелей

в породе в популяции

ГПХ «Губерлинский» СПК «Загорный» СПК «Заря»

A 0,676 0,687 0,664 0,699

B 0,327 0,313 0,356 0,301

A 0,424 0,511 0,406 0,349

Tf B 0,347 0,401 0,333 0,301

C 0,229 0,088 0,261 0,349

B 0,559 0,522 0,533 0,627

H 0,441 0,478 0,467 0,373

Ap A 0,341 0,363 0,361 0,295

B 0,659 0,637 0,639 0,705

0,406, ТР — 0,333, а аллеля Т^ составили соответственно 0,349; 0,301 и 0,343. Однако разность по частоте встречаемости аллеля ТГА статистически достоверной по первому порогу вероятности безошибочных прогнозов (Р>0,95) наблюдалась только между субпопуляциями коз ГПХ «Губерлинс-кий» и СПК «Заря». Разность в концентрации аллеля ТР между всеми субпопуляциями была статистически недостоверной. Субпопуляция коз

ГПХ «Губерлинский» отличалась самой низкой частотой встречаемости аллеля Т^ +0,088, что на 17,3% (Р>0,99) меньше, чем в СПК «Загорный» и на 26,1% (Р>0,999) меньше, чем концентрация аналогичного аллеля в СПК «Заря».

Структура полиморфизма трансферринового локуса в оренбургской пуховой породе коз оказалась весьма динамичной во временном аспекте (табл. 3).

3. Распределение частот аллелей полиморфных систем белков и ферментов крови в популяциях коз

Локус Аллель Поколение

популяция материнское дочернее внучатое

ГПХ «Губерлинский»

т A B 0,678±0,034 0,313±0,034 0,667±0,061 0,333±0,061 0,717±0,058 0,283±0,052 0,677±0,059 0,323±0,059

Tf A B C 0,511±0,037 0,401±0,036 0,088±0,021 0,483±0,065 0,400±0,063 0,117±0,041 0,517±0,065 0,383±0,063 0,100±0,039 0,532±0,063 0,419±0,063 0,049±0,027

AEs B H 0,522±0,037 0,478±0,037 0,533±0,064 0,467±0,064 0,517±0,064 0,483±0,064 0,516±0,063 0,484±0,063

Ap A B 0,363±0,036 0,637±0,036 0,367±0,062 0,633±0,062 0,330±0,061 0,667±0,061 0,387±0,062 0,613±0,062

СПК «Загорный»

т A B 0,644±0,036 0,356±0,036 0,567±0,064 0,433±0,064 0,650±0,062 0,350±0,062 0,717±0,058 0,283±0,058

Tf A B C 0,406±0,037 0,333±0,035 0,261±0,033 0,417±0,064 0,383±0,063 0,200±0,052 0,400±0,063 0,333±0,061 0,267±0,057 0,400±0,063 0,283±0,058 0,3170,060

AEs B H 0,533±0,037 0,467±0,037 0,483±0,065 0,517±0,065 0,567±0,064 0,433±0,064 0,550±0,064 0,450±0,064

Ap A B 0,361±0,036 0,693±0,036 0,367±0,062 0,633±0,062 0,350±0,062 0,650±0,062 0,367±0,062 0,633±0,062

СПК «Заря»

т A B 0,699±0,036 0,301±0,036 0,600±0,063 0,400±0,063 0,733±0,057 0,267±0,057 0,783±0,061 0,217±0,061

Tf A B C 0,349±0,037 0,301±0,036 0,349±0,037 0,383±0,062 0,350±0,061 0,267±0,057 0,317±0,060 0,267±0,057 0,417±0,064 0,348±0,070 0,283±0,066 0,370±0,071

AEs B H 0,627±0,038 0,373±0,038 0,567±0,064 0,433±0,064 0,583±0,064 0,417±0,064 0,761±0,063 0,239±0,063

Ap A B 0,295±0,035 0,705±0,035 0,330±0,061 0,667±0,061 0,300±0,059 0,700±0,059 0,239±0,063 0,761±0,063

Причем в разных субпопуляциях кинематика частоты исследуемых аллелей имела неодинаковую параллельность. В субпопуляции коз ГПХ «Губерлинский» наблюдается снижение концентрации Т^ в поколениях. Так, если в материнском поколении частота встречаемости Т^ составила 0,117, то в дочернем поколении она снизилась до 0,1, а во внучатом составила всего лишь 0,049. В то время как в субпопуляциях коз двух других хозяйств встречаемость аллеля Т^ возросла по сравнению с материнским в дочернем и внучатом поколениях соответственно на 6,4 и 11,74 в СПК «Загорный» и на 15,0 и 10,3% в СПК «Заря». На наш взгляд, аллель ТГ^ является «ал-лелем-мигрантом» в оренбургскую пуховую породу коз в результате скрещивания с козлами придонской породы на разных этапах ее филогенеза. Факт распространения аллеля Т^ в субпопуляциях коз СПК «Заря», где проводилось плановое скрещивание, и в СПК «Загорный», где было проведено «стихийное» скрещивание коз с козлами придонской породы, а в последующем и интродукция помесного поголовья, подтверждает нашу гипотезу.

Ферментативные системы арилэстераза и щелочная фосфатаза у коз оренбургской пуховой породы контролировались двумя аутосомными аллелями. По локусу сывороточной арилэстера-зы (АЕ8) распределение частот между аллелями АЕ8б и АЕ8н в субпопуляциях коз ГПХ «Губерлинский» и СПК «Загорный» было относительно пропорциональным и составило соответственно 0,522 и 0,478 в первом хозяйстве и 0,533 и 0,467 — во втором.

В субпопуляции коз СПК «Заря» отмечается достоверное превосходство концентрации аллеля АЕ8б = 0,627 над соответствующим показателем аллеля АЕ8н = 0,373. Следует отметить, что со сменой поколений в субпопуляциях коз ГПХ «Губерлинский» и СПК «Загорный» баланс аллеломорфов арилэстераз существенно не изменился, в то время как в субпопуляции коз СПК «Заря» наблюдалось увеличение частоты встречаемости аллеля АЕ8б во внучатом поколении на 19,4% (Р>0,95).

Сравнение частот аллелей, детерминирующих синтез щелочной фосфатазы, показывает, что как в породе в целом, так и в субпопуляциях коз изучаемых хозяйств более часто встречается аллель Арв. Частота встречаемости данного аллеля в породе составляет 0,659, в стаде ГПХ «Губерлинский» — 0,637, СПК «Загорный» — 0,639, а в СПК «Заря» — 0,705. Во временном аспекте в субпопуляциях коз ГПХ «Губерлинский» и СПК «Загор-ный» наблюдается небольшая флуктуация частот аллеломорфов щелочной фосфатазы в поколениях, в субпопуляции коз СПК «Заря» — частота аллеля Арв во внучатом поколении возросла на 9,4% (Р>0,95).

Таким образом, анализ частоты встречаемости аллелей по четырем полиморфным локусам белков и ферментов сыворотки крови показывает, что аллелофонд оренбургской пуховой породы коз, при относительной стабильности во временном и пространственном аспектах, представляет собой сложную динамическую систему. Наблюдается направленное разновекторное изменение частот аллелей в субпопуляциях коз, что, видимо, обусловлено характером и особенностями генетикоавтоматических процессов, происходящих в них.

В теоретическом плане введение в практику популяционно-генетических исследований метода электрофоретического разделения белков и использование их как биохимических маркеров соответствующих структурных генов позволили на новом уровне использовать мониторинг генетических процессов между группами животных локальных пород с ограниченным генофондом. В то же время возможность определения уровня генетической изменчивости через биохимические маркеры усилила интерес к генетическим дистанциям, так как впервые (в отличие от других используемых признаков) стали доступны оценки гомологической изменчивости среди различных популяционных категорий и, следовательно, выявление степени генетических различий между группами, находящимися на различных ступенях родства.

Следует отметить, что анализ генетических расстояний — это продолжение изучения генетической структуры популяций, выявление особенностей генетической дивергенции и, как результат, приближение к пониманию механизмов селекционных изменений. Тем более, что существует возможность оценить ее на различных уровнях, таких, как микропопуляционный и межпопуляци-онный.

В наших исследованиях на козах оренбургской пуховой породы суммарный индекс генетического сходства и генетические дистанции меж-субпопуляционных и генерационных таксонов рассчитаны на основании частот встречаемости аллелей по 4 системам полиморфных белков и ферментов крови. Анализ уровня селекционной дивергенции и степени генетической дифференциации в процессе смены поколений коз в породе осуществляли с использованием метода невзвешенной попарно-групповой кластеризации и построением соответствующих дендрограмм (по М. [11]; А. М. Машурову, В. И. Черкащенко [1]. В результате установлено, что субпопуляции коз трех основных хозяйств в породе имеют во многом сходный генофонд, о чем свидетельствуют индексы генетического сходства, численные значения которых близки к единице (табл. 4).

Однако по суммарной встречаемости аллелей белковых систем и ферментов крови наибольшей близостью характеризуются субпопуляции коз

4. Индексы генетического сходства (I) и генетические дистанции ^м) между субпопуляциями коз

Субпопуляция коз Код 1 2 3

ГПХ «Губерлинский» 1

СПК «Загорный» 2 0,0120 0,9879 0,9520

СПК «Заря» 3 0,0427 0,011 0,9890

СПК «Загорный» и СПК «Заря» (1=0,989). На дендрограмме (рис. 1) они образуют единый кластер, что, видимо, обусловлено кумулятивным эффектом в процессе как случайного дрейфа генов, так и вследствие более частого, планового, обмена производителями между этими хозяйствами.

3 СПК «Заря»

А 0,0111

Б 2 СПК

0,0275 «Загорный»

1 ГПХ

«Г уберлинский»

Код Субпопуляция

Рис. 1 - Дендрограмма генетических расстояний анализируемых субпопуляций коз

Наиболее информативным показателем особенностей микроэволюционных процессов в породе в филогенетическом аспекте может служить кластерный анализ генетических расстояний на протяжении трех последовательно смежных поколений в субпопуляциях коз (рис. 2). На рис. 2 представлена дендрограмма взаимоотношений между материнским, дочерним и внучатым поколениями коз госплемхоза «Губерлинский», СПК «За-горный» и СПК «Заря», построенная с учетом индексов генетического расстояния. Выявлено наличие двух крупных кластеров «Д» и «Е». Кластер

«Д» объединил материнское, дочернее и внучатое поколение коз генофондового госплемхоза «Гу-берлинский». При этом наблюдается возрастание генетической близости в дочернем и внучатом поколениях, образующих кластер «Б» = 0,003),

который уклоняется от материнского поколения на расстояние DN = 0,0094. Данное обстоятельство в какой то мере указывает на замкнутый характер субпопуляции коз госплемхоза «Губерлинский». Кластер «Е» имеет сложное структурное содержание и интегрирован генерациями коз субпопуляций СПК «Загорный» и СПК «Заря». Наименьшее генетическое расстояние отмечалось между материнским поколением коз СПК «Заря» и дочерним поколением коз СПК «Загорный», образовавших кластер «А» (DN = 0,0026).

На расстоянии DN = 0,009 кластер «Г» объединил генерации кластера «А» с материнским поколением коз СПК «Загорный». Дочернее поколение коз СПК «Загорный» и внучатое поколение коз СПК «Загорный» объединены в кластер «В» (DN = 0,0069). Генерации коз кластеров «В» и «Г» на расстоянии DN = 0,0159 интегрированы в кластер «Е». Столь сложная генетическая дифференциация и генетическая взаимосвязь в генерациях коз субпопуляций СПК «Загорный» и СПК «Заря», видимо, обусловлена применением вводного скрещивания козлов придонской породы на маточном поголовье этих хозяйств, а также обменом производителями между ними. На дендрограмме кластер «Ж» (DN = 0,0227) объединил кластер «Д» (генерации коз субпопуляции госплем-хоза «Губерлинский») и кластер «Е» (генерации коз субпопуляции СПК «Загорный» и материнское и дочернее поколение коз СПК «Заря»). Несколько особую позицию на дендрограмме занимает внучатое поколение коз субпопуляции СПК «Заря». Эта генерация коз имеет наибольшее генетическое удаление от общего массива породы (DN = 0,0539), что указывает на выраженную тенденцию

9 СПК «Заря» Внучатое

З

13 8 СПК «Заря» Дочернее

0,0159 ^ 0,0069 6 СПК «Загорный» Внучатое

0,0539 Ж Е А 7 СПК «Заря» Материнское

0,0026

Г п ппоп 5 СПК «Загорный» Дочернее

4 СПК «Загорный» Материнское

0,0227 Д Б 0,0030 3 ГПХ «Губерлинский» Внучатое

0,0094 2 ГПХ «Губерлинский» Дочернее

1 ГПХ «Губерлинский» Материнское

Код Субпопуляция Поколение

Рис. 2 - Дендрограмма генетических расстояний анализируемых субпопуляций и поколений коз

процессов дивергенции. В то же время показатели генетических дистанций между генерационными и субпопуляционными таксонами настолько малы (0,0026—0,077), что могут свидетельствовать

0 высокой степени генетической консолидации животных в породе. Наши исследования, выполненные на генетическом уровне, подтверждают, что оренбургская пуховая порода коз является уникальным феноменом, и селекция, направленная на поддержание определенного комплекса морфофизиологических характеристик, сопровождается формированием породоспецифической генетической структуры по м ол е кул я р н о - ген ети -чес ким маркерам.

Литература

1 Машуров, А. М. Генетические маркеры в селекции животных. М.: Наука, 1980. 315 с.

2 Алтухов, Ю. П. Генетические процессы в популяциях. М.: Наука, 1983. 248 с.

3 Глазко, В. И. Биохимическая генетика овец. Новосибирск: Наука, 1985. 165 с.

4 Антонова, Н. Я. Полиморфизм белков крови и их связь с хозяйственно-полезными признаками у коз высокогорной зоны Алтая / Н. Я. Антонова, Ш. А. Мкртчян. В кн. Биологические основы селекции овец. М.: Колос, 1977. С. 109—111.

5 Singh, Н. et. al. Jndian veter. Pourn. 1997. v.54. № 4. p. 264—267.

6 Bhat, P. P. -Jndian J. Anim. Sc. 1987. 57. 6. p. 598-600. Животовский, Л. А. Показатель сходства популяций по полиморфным признакам // Журнал общей биологии, 1979. Т. 4. № 4. С. 587-602.

7 Osterhoff, D. R., Schinid, D. О. S.Afr. J. Anim. Sci. 1987. 17. № 3. p. 133-137.

8 Марзанов, H. С. Иммунология и иммуногенетика овец и коз. Кишинев: Штиинца, 1991. 237 с.

9 Ольховская, Л. В. Иммуногенетический анализ в селекции коз / Л. В. Ольховская, Л. Н. Чижова и др. Ставрополь. ВНИИОК. 2000. С. 3-11.

10Smithies, J. Zone Electrophorsis in starch Gels. Groups Variatiations the Serium Proteins of Normal. Human Adults. Biochem. G., 1955. № 4. P. 629. nNei, M. Genetic distance between population. Amer. Natur, 1972. V. 106. № 549. P. 283-291.