Биолюминесцентные биотесты на основе светящихся бактерий для экологического мониторинга

Родичева Э.К., Кузнецов A.M., Медведева С.Е.

БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ БИОТЕСТЫ НА ОСНОВЕ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ

ДЛЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА

Биолюминесцентный анализ - один из перспективных экспрессных методов биомониторинга окружающей среды. Биолюминесцентные бактериальные биотесты дают интегральную оценку загрязнения и часто превосходят другие известные биотесты по быстродействию, точности, чувствительности и простоте. В Коллекции культур ИБСО разработана технология производства биотестов на основе лиофиль-но высушенных природных светящихся бактерий P. phosphoreum и рекомбинантного штамма Е. coli с клонированным геном люциферазы. Метод гостирован и используется для экологического мониторинга.

Для решения экологических задач, а также для исследований в области медицины, сельского хозяйства, фундаментальной биологии необходимы быстрые и удобные методы анализа токсичности веществ. Биолюминесцентный анализ стал в настоящее время одним из перспективных экспрессных методов биологического мониторинга окружающей среды. Биолюминесценция бактерий является одной из разновидностей хе-милюминесцентной реакции, для осуществления которой необходимы восстановленный флавин-мононуклеотид, кислород, длинноцепочечный альдегид и фермент - люцифераза, а конечными продуктами являются жирная кислота, вода и видимый свет [1, 2]:

люцифераза

ФМН. Н2 + RCHO + O2 - ФМН + RCOOH + H2O+ свет

Свечение бактерий в благоприятных условиях довольно яркое, в слегка затемненном помещении его хорошо видно невооруженным глазом. Бактериальная биолюминесценция обладает высокой чувствительностью к действию различных ингибиторов биологической активности: анестетиков, наркотиков, промышленных ядов, инсектицидов, пестицидов, отравляющих и лекарственных веществ [1, 3-6]. Широко используются для этих целей бактерии двух родов: Photobacterium и Vibrio (P. phosphoreum, P. leiognathi, V. fischeri, V. harveyi). Эти бактерии используются при изготовлении биолюминесцентных биотестов для оценки загрязнения природных водных источников, промышленных стоков и почв [5-9].

Биотесты с использованием живых бактерий отличаются от современных биотестов, использующих инфузории, дафнии, водоросли, рыб, тем, что в качестве параметра жизнедеятельности используется биолюминесценция. Биотесты на светящихся бактериях дают количественную меру токсичности и часто превосходят известные биотесты по быстродействию, точности, чувствительности и простоте, позволяют контролировать одновременно значительное число токсикантов [8-12].

В основе этих методов лежит изменение интенсивности люминесценции биопрепаратов

после воздействия того или иного анализируемого вещества. Концентрацию анализируемого вещества определяют, измеряя параметры излучения. Исходя из современных требований, предъявляемых к оценке токсичности веществ, биолюминесцентным способом можно определить общепризнанные в токсикологии параметры, такие как эффективная концентрация (ЭК-50) - концентрация вещества, которая подавляет функцию люминесценции на 50%, и пороговая концентрация (ЛК-0) или уровень биологически безопасного разведения (УББР) - концентрация (разведение) исследуемого вещества, при достижении которой уровень свечения исследуемых растворов равен интенсивности свечения в контрольных кюветах.

В последнее время разрабатываются разнообразные биолюминесцентные биотесты на основе рекомбинантных штаммов. Возможность использования lux-генов в качестве маркера генной экспрессии важна в изучении патогеннос-ти, вирулентности, адаптации, а также вторичного метаболизма [13, 14]. Уже имеются примеры использования этого пути для изучения транскрипции [15]. Создаются и используются рекомбинантные биолюминесцентные штаммы для определения различных антибиотиков [1619], тяжелых металлов [20-22]. Использование рекомбинантных штаммов Е. соН с клонированным геном люциферазы оказалось эффективным при разработке биопрепарата для тестирования с помощью методов биолюминесцентного анализа пресных вод [23, 24]. Получены репортер-ные штаммы, обладающие высокой специфичностью к определенному токсическому агенту [25]. Имеется ряд сообщений о создании биолюминесцентных репортеров для определения тяжелых металлов и фенолов в водных и почвенных образцах [26-29].

Светящиеся бактерии из коллекции культур ИБСО были успешно использованы для создания тест-систем на различные фенолы и их производные, сульфопроизводные янтарной кислоты и гексахлоранциклогексана (ГХЦГ) [30-32], а также для разработки биотестов на основе ли-офилизированных природных светящихся бак-

Родичева Э.К. и др.

Биолюминесцентные биотесты на основе светящихся бактерий...

терий P. phosphoreum и трансгенного штамма E. coli c /ux-геном.

В настоящей работе представлены результаты использования биолюминесцентных биотестов на основе лиофилизированных природных светящихся бактерий P. phosphoreum и транс-генноного штамма E. coli c lux-геном для оценки степени загрязнения различных водных источников Сибири.

Методы

Биотесты Микробиосенсор B17-677F (на основе светящихся лиофилизированных бактерий Photobacterium phosphoreum из Коллекции культур ИБСО) и Микробиосенсор ЕСК (на основе генетически модифицированного штамма E. coli Z905, несущего плазмиду PHL1 с lux-геном из Photobacterium leiognathi, любезно предоставленный Б.А. Илларионовым) разработаны в Институте биофизики СО РАН [33, 34]. Биотесты являются стандартными тест-объектами для измерения интегральной токсичности исследуемых водных образцов, исключают необходимость культивирования и поддержания бактериальных культур с маркерным lux-геном.

Пробы воды собирали в определенных точках рек и водоемов, а также исследовали сточные воды некоторых промышленных предприятий. Образцы хранили при 4o C, затем анализировали их с предварительной фильтрацией или без нее. К клеточной суспензии, содержащей 109-1010 клеток/мл (в 3% растворе хлорида натрия), добавляли растворы с определенной концентрацией токсикантов. Интенсивность бактериальной люминесценции измеряли с использованием стандартной методики с помощью биолюминометра, созданного в Институте биофизики.

Токсичность образца оценивалась по величине биолюминесцентного индекса, который рассчитывался по формуле: БИ=1 /Ik

o k

(относительные единицы) или БИ=(1о/1к)100% (проценты),

где БИ - остаточная относительная активность люминесценции,

Io - интенсивность свечения бактерий в опытной кювете,

Ik - интенсивность люминесценции бактерий в контрольной кювете.

«Норма» БИ = 0,8-1,2 отн. ед, или 80-120%.

Результаты и обсуждение

Сравнение действия модельных веществ на микробиосенсоры показало, что Микробиосен-сор B17-677F и Микробиосенсор ЕСК имеют

сходную зависимость люминесценции от концентрации вещества. Анализ полученных результатов показал, что чувствительность Мик-робиосенсора ЕСК к фенольным соединениям выше, чем у Микробиосенсора B17-677F (рис. 1). При этом самым токсичным из исследованных соединений являлся парабензохинон, максимальное ингибирующее действие наблюдалось в диапазоне концентраций 10-5 - 1 мг/мл.

Эффективная концентрация (EC50) равна 6 х 10-5 мг/мл через 5 мин. воздействия. Для гидрохинона эффективная концентрация (EC50) равна 2 х 10-4 мг/мл. EC50 для пирокатехина после 5 мин. воздействия равна 10-2 мг/мл. Полученный ряд токсичности фенольных соединений для Микробиосенсора ЕСК соответствует рядам токсичности фенольных соединений, определенных на интактных клетках светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum и различных гидро-бионтов [32].

Одним из источников поступления феноль-ных соединений и тяжелых металлов в водоемы служат сточные воды целлюлозно-бумажных комбинатов (ЦБК). С использованием лиофи-лизированного препарата Микробиосенсора ECK (рекомбинантный штамм E. coli) проведено тестирование сточной воды ЦБК г. Красноярска. Исследования показали, что угнетение люминесценции на 50% достигается при разведении в 100 раз и сточная вода ЦБК только при разведении в 1000 раз становится не токсичной.

Оценка состояния воды в колодцах, реках и водоемах Алтайского края с помощью биолюминесцентного биотеста Микробиосенсор B17-677F показала, что ряд источников имел значительные отклонения от нормы. B ходе мониторинга выяснилось, что реки Катунь и Бия следует рассматривать как незагрязненные, а реки Алей и Чумыш - как реки со слабо токсичным загрязнением (рис. 2). В большинстве колодцев вода имела отклонения от нормы. B части озер обнаружено значительное отклонение от нормы, что было вызвано, скорее всего, наличием в них большого количества органических веществ или сбросов промышленных отходов (рис. 3). Следует отметить, что по результатам биотестирования определялась необходимость проведения химического анализа, подтвердившего результаты биотестирования и показавшего значительные превышения содержания различных загрязнителей, в первую очередь фенолов и тяжелых металлов, по сравнению с ПДК в пробах, где наблюдалось ингибирование биолюминесценции.

Биотесты на основе лиофилизированных светящихся бактерий были использованы также для

Рисунок 1. Влияние различных фенолов на люминесценцию двух биотестов: парабензохинон (1 - E. coli, 6 - P. phosphoreum); гидрохинон (2 - E. coli, 5 - P. phosphoreum); катехол (3 - E. coli, 4 - P. phosphoreum).

Чумыш

Алей

1 2 3 4 5

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Номер пробы

Рисунок 2. Зоны различного качества воды в реках Алей и Чумыш, определенные биолюминесцентным биотестом Микробиосенсор В17- 677F.

Рисунок 3. В озере Большое Островное воду следует признать токсичной, так как во всех измеренных пробах люминесценция биотеста Микробиосенсор В17- 677Б была ниже нормы, которая лежит в границах 0,8-1,2.

Более половины проб были взяты в местах сброса сточных вод от ферм и промышленных предприятий.

I . 1 БИ P.ph.  БИ E.coli. А Ii t

Hfl № Ч1

Номер пробы

Рисунок 4. Зоны различного качества воды в реке Енисей, определенные двумя биолюминесцентными биотестами Микробиосенсор B17-677F и Микробиосенсор ECK.

оценки загрязнения вод реки Енисей. Рис. 4 демонстрирует зоны плохого качества воды реки Енисей, наблюдавшиеся в 1998 году. Эта зона находится на участке 300 км от г. Красноярска ниже по течению, Сравнение результатов измерений, полученных с помощью двух биолюминесцентных биотестов (Микробиосенсора B17-677F и Микро-биосенсора ECK), показало, что биотест с использованием генетически модифицированного E. coli был более чувствителен к присутствию в среде загрязнителей, чем биотест на P. phosphoreum. Это можно объяснить более высокой проницаемостью клеточной стенки E. coli и, возможно, высаливанием токсикантов (уменьшением концентрации ингибирующих веществ после добавления хлорида натрия в исследуемый раствор) при биотестировании с использованием морских светящихся бактериях P. phosphoreum.

Мониторинг вод реки Ангары биолюминесцентным биотестом (рис. 5) позволил сделать заключение, что природная вода является нетоксичной на большем ее протяжении, так как ин-гибирования биолюминесценции не обнаружено. Однако воду нельзя считать совершенно чистой - многие пробы стимулировали люминесценцию биотеста, иногда очень значительно. Этот факт свидетельствует о наличии в исследуемых образцах большого количества растворенных органических веществ природного и антропогенного происхождения.

Заключение

Методы, основанные на биохемилюминес-центных реакциях, в настоящее время играют важную роль не только в экологических, но и в биомедицинских исследованиях, клинической медицине, иммунологии. Наиболее важным токсикологическим параметром (ЕС50) является концентрация вещества, уменьшающая бактериальную люминесценцию на 50% [35]. Исследования токсичности ведутся по нескольким направлениям: 1) исследование токсичности отдельных веществ; 2) исследование токсичности смеси большого количества известных веществ; 3) экологи-

Рисунок 5. Зоны различного качества воды в реке Ангаре, определенные биолюминесцентным биотестом. Пятиугольник - БИ = норма, овал - БИ около нормы

(отклонение не больше 20% от нормы), звезда -увеличение БИ в 1,5-2,5 раза по сравнению с нормой.

Родичева Э.К. и др.

Биолюминесцентные биотесты на основе светящихся бактерий..,

ческие исследования, в которых определяется интегральное токсическое действие всех присутствующих в пробе поллютантов.

Биолюминесцентные биотесты на основе светящихся бактерий - Microtox, ToxAlert, LUMIStox производятся за рубежом [36-40]. Наибольшее применение нашел биотест Microtox, который используется в лабораторных и полевых исследованиях для контроля качества промышленных и природных вод, определения степени токсичности вновь создаваемых химических соединений и фармацевтических препаратов [20-23, 41-42].

Биотесты могут быть рекомендованы для непрерывного экспресс-контроля состояния окружающей среды промышленных районов и природно-хозяйственных комплексов, контроля залповых вредных выбросов предприятий, для оценки эффективности применяемых методов детоксикации окружающей среды и работы очистных сооружений, а также для экологической паспортизации предприятий и отдельных районов [22, 42-45].

Опытные образцы на основе лиофилизиро-ванных природных светящихся бактерий Микро-биосенсор B17-677F» и «Микробиосенсор ECK» на основе рекомбинантного штамма E. coli, несущего lux-ген из природных светящихся бактерий, успешно использованы в определении токсичности сточных вод и очистных сооружений различных городов России и СНГ. Метод получил положительную оценку специалистов, гости-рован и рекомендован как дополнительный метод экологического мониторинга. Один флакон

микробиосенсора может быть использован для измерения примерно 100 экспериментальных водных образцов. Активность микробиосенсора остается стабильной в течение 6 месяцев при хранении в бытовом холодильнике при температуре +5-10о С и более одного года при хранении при температуре -18о С. Чувствительность разработанных биосенсоров сравнима с зарубежными аналогами, цена значительно ниже имеющихся аналогов.

Наличие в институте Коллекции культур ИБСО, насчитывающей более 700 штаммов светящихся бактерий, открывает широкие возможности для поиска чувствительных к определенным токсикантам штаммов. Кроме того, коллекция ИБСО является базой для получения lux-ге-нов для маркерных рекомбинантных организмов, а также для получения целевых мутантов, необходимых для разработки тест-метода на мутагенность. Выбранные в результате скрининга штаммы могут успешно использоваться для изготовления новых и совершенствования существующих микробиосенсоров, основанных на лиофилизированных бактериях, несущих маркерный lux-ген. Такие биосенсоры могут быть пригодны для биотестирования воды, воздуха, почвы, химических веществ, используемых в быту. Разработанный нами микробиосенсор ЕСК (на основе E. coli) избавляет от необходимости вводить в исследуемый образец дополнительные добавки в виде солей, что повышает его чувствительность по сравнению с использованием природных светящихся бактерий в качестве основы микробиосенсора.

Список использованной литературы:

1. Гительзон И.И., Родичева Э.К., Медведева С.Е. и др. «Светящиеся бактерии». Новосибирск: Наука, 1984. - 277 с.

2. Hastings J.W., Johnson C.H. Bioluminescence and Chemiluminescence // Methods Enzymol., 2003, 360. P. 75-104.

3. Arfsten D.P., Davenport R., Schaeffer D.J. 1994. Reversion of bioluminescent bacteria (Mutatox) to their luminescent state upon exposure to organic compounds, munitions, and metal salts // BiomedEnviron Sci, 7(2), 144-149.

4. Ruiz M.J., Lopez-Jaramillo L., Redondo M.J., Font G., Toxicity assessment of pesticides using the Microtox test: application to environmental samples, // Bull Environ Contam Toxicol, 1997, 59(4), P.619-625.

5. Kudryasheva N., Vetrova E., Kuznetsov A., Kratasyuk V. and Stom D. Bioluminescence Assays: Effects of Quinones and Phenols // Ecotoxicology and Environmental Safety, 2002, 53(3), P. 198-203.

6. Roda A, Guardigli M, Pasini P, Mirasoli M. Bioluminescence and chemiluminescence in drug screening // Anal Bioanal Chem., 2003, 377(5), P. 826-33.

7. Isenberg D.L, Bulich A. / In: Environmental monitoring: use of luminescent bacteria, Chemical Safety 1994, Richardson M, editor, Weinheim VCH, 1994, P. 211-226.

8. Gellert G. Sensitivity and significance of luminescent bacteria in chronic toxicity testing based on growth and bioluminescence // Ecotoxicol Environ Saf.. 2000. 45(1). P. 87-91.

9. Ulitzur S, Lahav T, Ulitzur N. A novel and sensitive test for rapid determination of water toxicity // Environ Toxicol, 2002, 17(3), P. 291-296).

10. Kaiser K.L. Correlations of Vibrio fischeri bacteria test data with bioassay data for other organisms // Environ Health Perspect. 1998; 106 Suppl 2, P. 583-91. Review

11. Jennings V.L.K., Rayner-Brandes M.H., Bird D.J. Assessing Chemical Toxicity With The Bioluminescent Photobacterium (Vibrio fischeri): A Comparison Of Three Commercial Systems // Wat.Res., 2001, 35(14), P. 3448-3456.

12. Hemming J. M., P. K. Turner, B. W. Brooks, W. T. Waller, T. W. La Point. Assessment of Toxicity Reduction in Wastewater Effluent Flowing Through a Treatment Wetland Using Pimephales promelas, Ceriodaphnia dubia, and Vibrio fischeri // Arch. Environ. Contam. Toxicol., 2002, 42, P. 9-16.

13. Nyholm S.V., Deplancke B., Gaskins H.R., Apicella M.A., McFall-Ngai M.J. Roles of Vibrio fischeri and Nonsymbiotic Bacteria in the Dynamics of Mucus Secretion during Symbiont Colonization of the Euprymna scolopes Light Organ // Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(10) P. 5113-5122.

14. Choi S.H., Gu M.B. A portable toxicity biosensor using freeze-dried recombinant bioluminescent bacteria // Biosensors & Bioelectronics, 2002, 17 P. 433-440.

15. Van Dyk, T. K. LuxArray, a High-Density, Genomewide Transcription Analysis of Escherichia coli Using Bioluminescent Reporter Strains // Journal of Bacteriology, 2001, 183(19). P. 5496-5505.

16. Korpela M.T., Kurittu J.S., Karvinen J.T., Karp M.T. A recombinant Escherichia coli sensor strain for the detection of tetracyclines // Anal Chem., 1998, 70(21). P. 4457-4462.

17. Kurittu J., Karp M., Korpela M. Detection of tetracyclines with luminescent bacterial strains // Luminescence, 2000, 15. P. 291-297.

18. Tenhami M., Hakkila K. and Karp K. Measurement of effects of antibiotics in bioluminescent Staphylococcus aureus RN4220 // Antimicrob Agents and Chemother, 2001, 45. P. 3456-3461.

19. Simon L., C. Fremaux, Y. Cenatiempo, J.-M. Berjeaud. Luminescent method for the detection of antibacterial activities. //Appl Microbiol Biotechnol., 2001, 57. P. 757-763.

20. Ren S., Frymier P.D. The use of a genetically engineered pseudomonas species (Shk1) as a bioluminescent reporter for heavy metal toxicity screening in wastewater treatment plant influent // Water Environ Res., 2003, 75(1). P. 21-29.

21. Elke R., Rettberg P., Baumstark-Khan C., Horneck G. SOS-LUX- and LAC-FLUORO-TEST for the quantification of genotoxic and/or cytotoxic effects of heavy metal salts // Analytica Chimica Acta, 2002, 456. P. 31-39.

22. Ritchie J. M., Cresser M., Cotter-Howells J. Toxicological response of a bioluminescent microbial assay to Zn, Pb and Cu in artifical soil solution: relationship with total metal concentrations and free ion activities // Environ. Pollut., 2001, 114. P. 129-136.

23. Wang C., Yediler A., Lienert D., Wang Z., Kettrup A. Toxicity evaluation of reactive dyestuffs, auxiliaries and selected effluents in textile finishing industry to luminescent bacteria Vibrio fischeri // Chemosphere, 2002, 46(2). P. 339-344.

24. Bechor O., Smuski D.R., Van Dyk T.K., LaRossa R.A., Belkin S. Recombinant microorganisms as environmental biosensors pollutants detection by E.coli bearing fabA:lux fusion // Biotechnology, 2002, 94. P. 125-132.

25. Ben-Israel O., Ben-Israel H., Ulitzur S. Identification and quantification of toxic chemicals by use of Escherichia coli carrying lux genes fused to stress promoters // Appl Environ Microbiol, 1998, 64. P. 4346-4352.

26. Belkin, S., D. R. Smulski, S. Dadon, A. C. Vollmer, T. K. Van Dyk and R. A. LaRossa. A panel of stress-responsive luminous bacteria for toxicity detection // Water Res., 1997, 31. P. 3009-3016.

27. Tauriainen S., Karp M., Chang W., Virta M. Luminescent bacterial sensor for cadmium and lead // Biosens. Bioelectron., 1998, 13(9). P. 931-938.

28. Hay A.G., Rice J.F., Applegate B.M., Bright N.G., Sayler G.S. A Bioluminescent Whole-Cell Reporter for Detection of 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid and 2,4-Dichlorophenol in Soil // Applied And Environmental Microbiology, 2000, 66(10). P. 45894594.

29. Abd-El-Haleem D., Ripp S., Scott C., Sayler G.S. A luxCDABE-based bioluminescent bioreporter for the detection of phenol // J Ind Microbiol Biotechnol., 2002, 29(5). P. 233-237.

30. Попова Л.Ю., Медведева С.Е., Могильная О.А., Пузырь А.П., Печуркин Н.С. Исследование светящихся бактерий в качестве тест-системы на гексахлоранциклогексан // Прикл. биохим. микробиол., 1991, т. 27(6). С. 905-910.

31. Кратасюк В.А., Макурина В.И., Кузнецов А.М., Плотникова Н.Б., Медведева С.Е., Гриценко И.С., Черных В.П. Изучение действия на бактериальную люминесценцию активных сульфопроизводных янтарной кислоты // Прикладн. биохим. микробиол., 1991, 27(1). С. 127-133.

32. Stom D.I., Geel T.A., Balayan A.E., Kuznetsov A.M., Medvedeva S.E. Bioluminescent method in studying the complex effect of sewage components // Arch Environ Contam Toxicol, 1992, 22. P. 203-208.

33. Kuznetsov A., Primakova G., Fish A. Lyophilized luminous bacteria as a toxicity biotest // Biological Bioluminescence. B. Jezowska-Trzebiatowska, B. Kochel, J. Slawinski, W. Strek (Edts), World Scientific. 1990. Р. 559-563.

34. Кузнецов А.М., Медведева С.Е., Родичева Э.К. Использование генетически модифицированного светящегося штамма Escherichia coli в биотестировании // Проблемы окружающей среды и природных ресурсов, 2000, 10. С. 67-73.

35. Drzyzga O., Jannsen S., Blotevogel K.H. Toxicity of diphenylamine and some of its nitrated and aminated derivatives to the luminescent bacterium Vibrio fischeri // Ecotoxicol Environ Saf., 1995, 31(2). P. 149-152.

36. Bulich A.A. A practical and reliable method for monitoring the toxicity of aquatic samples // Process Biochem., 1982, 17. P. 45-47.

37. Zieseniss K., Grabert E. A novel method for determining chronic toxicity with the LUMIStox luminescent bacteria test / In: Bioluminescence and chemiluminescence: fundamental and applied aspects. Campbell AK, Kricka LJ, Stanley PE, editors, Chichester: Wiley, 1994. P. 76-78.

38. Blaise C., Forghani R., Legault R., Guzzo J., Dubow M.S. A bacterial toxicity assay performed with microplates, microluminometry and Microtox reagent // Biotechniques, 1994, 16(5). P. 932-937.

39. Corbisier P. Bacterial metal-lux biosensors for a rapid determination of the heavy metal bioavailability and toxicity in solid samples. // Res.Microbiol., 1997, 148(6). P. 534-536.

40. Shao C.Y., Howe C.J., Porter A.J., Glover L.A. Novel cyanobacterial biosensor for detection of herbicides // Appl Environ Microbiol, 2002, 68(10). P. 5026-5033.

41. Hill P.J., Denyer S.P., Stewart GSAB. Rapid assays based on in vivo bacterial bioluminescence // Microbiol Europe, 1993, 1. P. 1621.

42. Richardson M. Ecotoxicity monitoring-use of Vibrio fischeri // Arh Hig Rada Toxicol, 1996, 47(4). P. 389-396.

43. Rathinam K., Mohanan P.V. Microtox system, a new approach to the safety evaluation of medical devices // Biomater Appl, 1998, 13(2). P. 166-171.

44. Wolska L., Polkowska Z. Bacterial luminescence test screening of highly polluted areas in the Odra River // Bull Environ Contam Toxicol., 2001, 67(1). P. 52-58.

45. Kuznetsov A.M., Rodicheva E.K., Medvedeva S.E., 1999. Analysis of river water by bioluminescent biotests // Luminescence, 14 (5). P. 263-265.