ЛЮМИНЕСЦЕНТНО-КИНЕТИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО РЕАЛИЗАЦИИ
LUMINESCENT-KINETIC METHOD OF DETERMINING PRESENCE OF HEAVY METALS IN AQUEOUS SOLUTIONS AND APPARATUS FOR REALISING SAID METHOD

Изобретение относится к области исследования состояния биологических систем и объектов окружающей среды и может быть использовано в медицине и экологическом мониторинге.
Известны способы определения тяжелых металлов в жидкостях, основанные на методе хроматографии (Чмутов А.К. Хроматография. - М.: Наука, 1968). К недостаткам этого метода следует отнести то, что он очень трудоемок и требует наличия специальной дорогостоящей аппаратуры.
Известен способ определения наличия тяжелых металлов или их ионов в биологических жидкостях, основанный на методе хемилюминесценции (Петрусевич Ю.М. Сравнительная оценка чувствительности определения биоантиоксидантов хемилюминесцентными методами. - М.: МГУ, 1978). Обнаружение токсичных веществ производится с помощью инициированной люминесценции, вызванной химическим воздействием (например, свечение фосфора при медленном окислении). Однако сверхслабое свечение для регистрации требует уникальной аппаратуры, основанной на принципе счета фотонов.
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ определения наличия тяжелых металлов в водных растворах (Патент РФ №2184961, МПК: G01N 33/18, G01N 33/487). Способ заключается в том, что при определении наличия тяжелых металлов в жидкостях в исследуемый раствор добавляют водный раствор белка известной молекулярной массы, затем среду, содержащую раствор белка и исследуемую жидкость, облучают лазерным светом, после этого определяют эффективную массу рассеивающих частиц смеси методом рэлеевского рассеяния света и по изменению этой массы по сравнению с молекулярной массой белка исходного раствора определяют наличие тяжелого металла в исследуемом водном растворе. Недостатками данного способа являются применение метода рэлеевского рассеяния света, требующего точных громоздких расчетов, а также трудность отделения рассеянного света среды от рассеянного света макромолекулярного комплекса.
Известно устройство для регистрации замедленной флуоресценции (Патент РФ №2262094, МПК: 7 G01N 21/64), содержащее блок питания, фотоэлектронный умножитель (ФЭУ), основной усилитель импульсов, счетчик импульсов, светонепроницаемую камеру со шторкой, источник света, блок управления шторкой, кювету и линзу. Недостатком данного устройства являются временная зависимость начала регистрации исследуемого сигнала от начала перемещения образца и сложность конструкции из-за необходимости перемещения кюветы с исследуемым образцом сначала под излучатель, а затем под приемник.
Наиболее близким к предлагаемому устройству является устройство для оценки токсических эффектов химических веществ (Заявка на изобретение №940145220/14, МПК: G01N 21/64, G01N 21/01), содержащее источник света, прозрачную кювету для размещения исследуемого раствора, расположенную на пути следования светового потока, фотоэлектронный умножитель, блок питания, подключенный к источнику света, светофильтры входа светового потока и выхода регистрируемого излучения, расположенные до и после кюветы по ходу следования светового потока, элемент фокусировки регистрируемого излучения, расположенный между фотоэлектронным умножителем и светофильтром выхода регистрируемого излучения, рассеиватель, операционный усилитель, индикатор напряжения, камеру, каналы засветки и приема излучения. Однако данное устройство характеризуется недостаточной фокусировкой излучения на кювете в канале засветки, отсутствием возможности обработки и хранения полученной информации. Кроме того, в устройстве не предусмотрена достаточная защищенность фотоэлектронного умножителя от влияния отраженного света, а также согласованность моментов подачи напряжения на источник света и фотоэлектронный умножитель.
Задачей изобретения является разработка способа и устройства определения наличия тяжелых металлов в водных растворах, обеспечивающих повышение качества регистрируемого сигнала и чувствительности устройства.
Техническим результатом является максимальное исключение влияния рассеянного света среды на регистрируемый сигнал, фокусировка излучения от источника света на кювете, а также согласование моментов подачи напряжения на источник света и фотоэлектронный умножитель.
Поставленная задача решается тем, что способ определения наличия тяжелых металлов включает добавление в исследуемый раствор известного количества белка и люминесцентного зонда, удаление кислорода из раствора (деоксигенация), воздействие на растворенный зонд импульсным источником света, определение люминесцентно-кинетических параметров фосфоресценции зонда и сравнение этих параметров с предварительно полученными эталонными люминесцентно-кинетическими параметрами фосфоресценции зонда в эталонном растворе.
Устройство для определения наличия тяжелых металлов в водных растворах, включающее источник света, кювету для размещения исследуемого раствора, расположенную на пути следования светового потока, фотоэлектронный умножитель, блок питания, подключенный к источнику света, светофильтры на входе светового потока и выходе регистрируемого излучения, расположенные до и после кюветы по ходу следования светового потока, элемент фокусировки регистрируемого излучения, расположенный между фотоэлектронным умножителем и светофильтром на выходе регистрируемого излучения, согласно заявленному техническому решению дополнительно содержит подключенный к фотоэлектронному умножителю блок управления задержкой срабатывания фотоэлектронного умножителя, синхронизирующее устройство, подключенное к блоку питания и блоку управления задержкой, блок обработки и визуализации информации, подключенный к фотоэлектронному умножителю через аналого-цифровой преобразователь, элемент фокусировки светового потока от источника света. При этом в качестве источника света используют импульсный источник света, кювета расположена под острым углом к оптической оси, проходящей через источник света, а фотоэлектронный умножитель расположен с обеспечением минимального влияния проходящего и отраженного от стенок кюветы света на регистрируемое излучение. В качестве элемента фокусировки светового потока от источника света может быть использовано параболическое зеркало.
Заявляемый способ реализуется следующим образом. Перед анализом исследуемого водного раствора на наличие тяжелых металлов готовят эталонный водный раствор температурой и рН, аналогичными исследуемому раствору (при необходимости рН выравнивают добавлением в раствор фосфатного буфера), добавляют в него заданное количество белка и заданное количество люминесцентного зонда, при этом их пропорции должны обеспечивать оптимальное связывание молекул зонда с соответствующими участками белковой молекулы (Добрецов Г.Е. Люминесцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. - М.: Наука, 1989, 277 с.). Затем полученный раствор деоксигенируют (обескислороживают), например, добавлением в него сульфида натрия, после чего подвергают его воздействию светового импульса источника света на длине волны поглощения люминесцентного зонда, например, вспышкой газоразрядной лампы или лазера, что приводит к фотовозбуждению молекул люминесцентных зондов, и измеряют эталонные люминесцентно-кинетические параметры люминесцентного зонда. В качестве люминесцентного зонда (люминофора) могут быть использованы красители ксантенового ряда (органические люминофоры), обладающие люминесценцией высокой интенсивности и значительным временем послесвечения.
Далее в исследуемый водный раствор добавляют белок и люминесцентный зонд в том же количестве, что и в эталонный водный раствор, подвергают исследуемый раствор деоксигенации, облучают вспышкой импульсного источника света и регистрируют аналогичные люминесцентно-кинетические параметры.
Наличие в водном растворе белка тяжелых металлов приводит к образованию наноразмерных комплексов «белок - люминесцентный зонд - тяжелый металл» и вызывает явление тушения фосфоресценции зондов, чувствительных к изменению своего микроокружения.
По сравнению полученных люминесцентно-кинетических параметров (интенсивность фосфоресценции, константа скорости тушения фосфоресценции, время жизни фосфоресценции) люминесцентного зонда исследуемого раствора с эталонными, определяют, имеет ли место явление тушения фосфоресценции, и следовательно, принимают решение о наличии/отсутствии тяжелых металлов в исследуемом водном растворе.
Изобретение поясняется чертежом, на котором представлена блок-схема устройства для реализации предложенного способа. Позициями на чертеже обозначены:
1 - импульсный источник света,
2 - параболическое зеркало,
3 - светофильтр на входе светового потока,
4 - оптическая ось источника света;
5 - кювета,
6 - светофильтр на выходе регистрируемого излучения,
7 - фокусирующая линза,
8 - фотоэлектронный умножитель (ФЭУ),
9 - оптическая ось, проходящая через ФЭУ,
10 - блок синхронизации,
11 - блок питания импульсного источника света,
12 - блок управления задержкой ФЭУ,
13 - аналого-цифровой преобразователь (АЦП),
14 - блок обработки и визуализации информации.
Устройство для реализации предложенного способа включает импульсный источник света 1 (например, газоразрядную лампу), расположенный между параболическим зеркалом 2 и светофильтром 3 вдоль оптической оси 4. Кювету 5 во избежание засветки ФЭУ 8 отраженным и проходящим светом располагают под острым углом ∠α к оптической оси 4, проходящей через источник света 1 и светофильтр 3. Светофильтр 6, фокусирующую линзу 7 и ФЭУ 8 располагают на одной оптической оси 9 под углом к оптической оси 4 таким образом, чтобы обеспечить максимальную защиту ФЭУ 8 от засветки отраженным от грани кюветы и проходящим через нее светом от источника света 1, например, под углом 120°, при этом образованный угол ∠β=180°-120°-∠α=60°-∠α не должен быть равен ∠α. Блок синхронизации 10 подключен к блоку питания импульсного источника света 11 и к блоку управления задержкой ФЭУ 12, который подключен к ФЭУ 8. Выход ФЭУ 8 через АЦП 13 подключен к блоку обработки и визуализации информации 14, в качестве которого может быть использован персональный компьютер.
Устройство работает следующим образом.
Исследуемый водный раствор, прошедший подготовку, помещают в кювету 5. Возбуждение люминесцентного зонда производят импульсным источником света 1, излучение которого фокусируют на кювете 5 с помощью фокусирующего элемента в виде параболического зеркала 2. Светофильтры 3, 6 предусмотрены для выделения спектральных диапазонов возбуждающего излучения, поглощаемого люминесцентным зондом, и регистрируемой фосфоресценции зонда, соответственно. Для ввода излучения фосфоресценции в устройство регистрации ФЭУ 8 установлена собирающая фокусирующая линза 7. В момент вспышки импульсного источника света 1 регистрирующая система (ФЭУ 8) отключена, и регистрация излучения фосфоресценции начинается с задержкой 0,5 мс после вспышки, что обеспечивается блоком 12 управления задержкой срабатывания ФЭУ, который предназначен для экранировки фотокатода ФЭУ от засветки импульсным источником света 1, интенсивность излучения которого гораздо больше регистрируемой фосфоресценции. Блок синхронизации 10 согласует моменты вспышки источника света 1 и начала регистрации фосфоресценции образца. Питание лампы осуществляется с помощью блока питания 11. Зарегистрированный сигнал через АЦП 13 поступает для дальнейшей обработки на блок обработки и визуализации информации 14. Специально разработанная программа обработки экспериментальных данных строит графики зависимостей интенсивности фосфоресценции от времени, прошедшего после импульсного фотовозбуждения раствора; определяет интенсивность фосфоресценции, константу скорости тушения фосфоресценции, и по кинетике затухания фосфоресценции определяет время жизни фосфоресценции.
-6
Пример. Для определения наличия тяжелых металлов в водном растворе (например, нитрата таллия концентрацией 0,15 моль/л) был приготовлен эталонный водный раствор белка в виде сывороточного альбумина человека концентрацией 1 мг/мл в фосфатном буфере рН 7,4 с добавлением в него люминесцентного зонда - эозина концентрацией 4·10 М. Затем полученный раствор деоксигенировали добавлением в него сульфида натрия концентрацией 0,01 М и подвергали облучению импульсом газоразрядной лампы ИФП-600 длительностью 0,4 мс и энергией разряда 250 Дж. Получали люминесцентно-кинетические характеристики (интенсивность фосфоресценции, константу скорости тушения) эталонного раствора. Затем в исследуемый водный раствор добавляли то же количество белка, люминесцентного зонда, сульфида натрия, облучали и получали аналогичные люминесцентно-кинетические характеристики. Построив графики зависимостей интенсивности от времени после импульсного фотовозбуждения раствора, наблюдали сокращение времени жизни фосфоресценции от 3,1 мс до 1,2 мс и снижение интенсивности фосфоресценции при неизменном положении максимума фосфоресценции, что свидетельствовало о наличии в растворе тяжелых металлов.