Способ субретинальной трансплантации клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ), дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, при атрофии ретинального пигментного эпителия в эксперименте
METHOD OF SUBRETINAL TRANSPLANTATION OF RETINAL PIGMENT EPITHELIUM (RPE) CELLS DIFFERENTIATED FROM HUMAN INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS, WITH ATROPHY OF RETINAL PIGMENT EPITHELIUM IN EXPERIMENT

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и может быть использовано для субретинальной трансплантации клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ), дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (далее - ИПСК-РПЭ), для лечения заболеваний сетчатки, сопровождающихся атрофией ретинального пигментного эпителия.
Заболевания, вызванные нарушением работы и атрофическими изменениями РПЭ, включая возрастную макулярную дегенерацию (ВМД) и некоторые формы пигментного ретинита (ПР), приводят к потере зрения, функциональным нарушениям, физическим и психологическим трудностям пациентов. В настоящее время отсутствуют доказанные методы лечения, которые могли бы замедлить или восстановить остроту зрения у пациентов, которые страдают от потери РПЭ.
Существует ряд регенеративных клеточных технологий, которые изучаются с целью дальнейшего применения в терапии дегенеративных заболеваний сетчатки. Успешная трансплантация клеток вместо поврежденных тканей представляется перспективным направлением в разработке новых хирургических стратегий ведения таких больных. Наружные слои сетчатки к тому же являются хирургически доступным пространством, особенно подходящим местом для инъекций и дальнейшей оценки проводимого лечения. [Scruggs ВА, Jiao С, Cranston CM, et al. Optimizing Donor Cellular Dissociation and Subretinal Injection Parameters for Stem Cell-Based Treatments. StemCellsTranslMed. 2019; 8(8):797-809. doi: 10.1002/sctm. 18-0210].
Известен способ трансплантации, при котором дифференцированные ИПСК-РПЭ трансплантируют субретинально в виде клеточной суспензии эквивалентом 1 тысяча клеток мышам - альбиносам Rpe65 rd12 с моделью пигментного ретинита. Гистологическое исследование подтвердило интеграцию ИПСК-РПЭ в сетчатку реципиента - альбиноса, однако провести функциональную оценку интегрированных клеток не удалось у 1/3 животных, так как индуцированная в месте инъекции отслойка сетчатки спустя 6 месяцев самостоятельно не разрешилась. [LiY. et al. Long-term safety and efficacy of human-induced pluripotent stem cell (iPS) grafts in a preclinical model of retinitis pigmentosa // Molecular medicine. - 2012. - T. 18. - №9. - C. 1312-1319].
Известен способ, при котором трансплантацию клеток ИПСК-РПЭ в суспензионной форме эквивалентом 100 тысяч клеток осуществляли мышам в место локальной ятрогенной отслойки сетчатки. При помощи 30 G иглы формировали склероретинотомическое отверстие, через которое в субретинальное пространство медленно вводили клеточную суспензию посредством предварительно загруженного материалом шприца. Относительно простой в технике метод влечет большое количество осложнений, таких как чрезмерное отслоение сетчатки, вызывающее хориоидальные кровоизлияния и рефлюкс ИПСК-РПЭ из субретинального пространства. [Westenskow PD, Kurihara Т, Bravo S, et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. JVisExp. 2015; (95):52247. Published 2015 Jan 23. doi: 10.3791/52247].
Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является способ трансплантации клеток ретинального пигметного эпителия, дифференцированных из эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСК-РПЭ). Этот метод предполагает введение через parsplana клеточной суспензии кроликам с моделью географической атрофии сетчатки. Животным была выполнена субретинальная инъекция. После удаления инструментов для минимизации рефлюкса проводилось «легкое» придавливание сетчатки кончиком канюли, через которую вводили суспензию клеток для предотвращения рефлюкса суспензии. Результаты мультимодальной визуализации, а также результаты иммуногистохимии, свидетельствуют, что субретинальные трансплантаты суспензии ЭСК-РПЭ не интегрировались в области с дегенерацией РПЭ, что связано с рефлюксом во время инъекции и недостаточной адгезией клеток РПЭ. [Petrus-Reurer S. et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy // Investigative ophthalmology & visual science. - 2017. - T. 58. - №2. - C. 1314-1322].
Задачей изобретения явилась разработка оптимальной хирургической техники трансплантации ИПСК-РПЭ в виде клеточной суспензии в субретинальное пространство кроликов с предварительно созданной атрофией РПЭ.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение функциональной активности сетчатки в глазах с атрофией РПЭ с увеличением интеграционной способности и функционирования ИПСК-РПЭ.
Технический результат достигается за счет субретинальной трансплантация ИПСК-РПЭ в виде клеточной суспензии в объеме 0,05 мл в количестве 50000 клеток и предотвращения рефлюкса ИПСК-РПЭ в витреальную полость с обеспечением адекватной адгезии клеток РПЭ с помощью герметизации места введения суспензии аутологичной плазмой, обогащенной тромбоцитами (PRP - Platelet-richplasma).
PRP нашла широкое применение в медицине, в частности в лечении большого спектра офтальмологических заболеваний. PRP позволяет ускорить естественные механизмы регенерации благодаря содержащимся в тромбоцитах факторам роста, которые управляют данными механизмами, влиять на митогенную и хемотаксическую активность клеток ретинальной глии и пигментного эпителия сетчатки, при этом не оказывая токсического воздействия. К этим факторам относятся: полученный из тромбоцитов фактор роста (PDGF), полученный из тромбоцитов фактор ангиогенеза (PDAF), трансформирующий фактор роста бета (TGFb), инсулиноподобный фактор роста (IGF), фактор роста эндотелиальных клеток (PD-ECGF). [Шкворченко Д.О., Майчук Д.Ю., Крупина Е.А., Лошкарева А.О., Малышева З.Г. Применение различных компонентов крови в офтальмологии // Современные технологии в офтальмологии. - 2016. - №1. - С. 206-210].
Известна технология хирургического лечения макулярных разрывов, в которой говорится об эффективном применении аутологичных тромбоцитов в хирургии макулярных разрывов. [Konstantinidis, Aristeidis, et al. Efficacy of autologous platelets in macular hole surgery // j. Clinical Ophthalmology / - 2013. - vol. 7, no. 7, p. 745-750]. Отмечается положительный эффект на фоне применения PRP при лечении хронических эрозий роговицы, возникших вследствие перенесенного герпесвирусного кератита. [Лошкарева А.О., Майчук Д.Ю. Применение богатой тромбоцитами плазмы у пациентов с хроническими эрозиями роговицы, ассоциированными с герпетической и цитомегаловирусной инфекцией. Современные технологии в офтальмологии 2017; (3): 45-47].
Во многих работах отмечено, что данная технология имеет ряд преимуществ: она проще в исполнении, позволяет получить хорошие результаты без больших материальных затрат и является безопасным. [Арсютов Д.Г. Хирургическое лечение не экссудативных формцентральной хориоретинальной дистрофии сетчатки с использованием аутоплазмы крови с повышенным содержанием тромбоцитов (PRP-массы) / Д.Г. Арсютов // Современные технологии в офтальмологии. - 2017. - №1(14). - С. 24-27].
Способ осуществляют следующим образом. Кроликам с атрофией ретинального пигментного эпителия в субретинальное пространство вводят суспензию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ретинального пигментного эпителия (ИПСК-РПЭ) в объеме 0,05 мл в количестве 50000 клеток. После введения стволовых клеток место введения герметизируют с помощью 2-3 капель аутологичной плазмы, обогащенной тромбоцитами (PRP - Platelet-richplasma).
Для получения функциональных клеток пигментного эпителия сетчатки человека была произведена направленная дифференцировка из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК), ранее полученных из фибробластов здорового донора в лаборатории клеточной биологии ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России и хранящихся в клеточном банке лаборатории.
Для получения функциональных клеток пигментного эпителия сетчатки человека была произведена направленная дифференцировка из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК), ранее полученных из фибробластов здорового донора в лаборатории клеточной биологии ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России и хранящихся в клеточном банке лаборатории. ИПСК культивировались на матригеле в культуральных чашках. По достижении 100% монослоя среда менялась на дифференцировочную, содержащую ДМЕМ/F12 (ПанЭко, Россия), 5% заменителя сыворотки (Invitrogene, США), 2 мМ глутамина (ПанЭко, Россия), 1% заменимых аминокислот (ПанЭко, Россия), пенициллин/стрептомицин (50 ед/мл; 50 мкг/мл) (ПанЭко, Россия), N2 и В27 (ПанЭко, Россия), 50 нг/мл Noggin и 20 нг/мл bFGF (все - Invitrogen, США). После двух пассажей клетки пересевали на покрытую матригелем чашку и культивировали в среде альфа-MEM (ПанЭко, Россия), содержащей 20% заменителя сыворотки (Invitrogen, США), 2 мМ глутамина (ПанЭко, Россия), пенициллин/стрептомицин (50 ед/мл; 50 мкг/мл) (ПанЭко, Россия), 10 нг/мл IGF1, 10 нг/мл EGF, 10 нг/мл Dkk1, В27, 100 нг/мл таурина (все - Invitrogen, США), 1 мМ никотинамида, 10 мкМ хетомина (все - Sigma, США). Через 3-4 недели формировались пигментированные кластеры, которые вручную отделялись с помощью 0,05% трипсина в ЭДТА (Gibco, США) от остального клеточного материала и в дальнейшем культивировались в среде ДМЕМ/F12 (ПанЭко, Россия), содержащей 10% FBS (HyClone, США), 2 мМ глутамина (ПанЭко, Россия), пенициллин/стрептомицин (50 ед/мл; 50 мкг/мл) (ПанЭко, Россия), заменимые аминокислоты (ПанЭко, Россия). Морфофизиологическая характеристика полученного пигментного эпителия сетчатки была осуществлена исследованием профиля экспрессии специфических маркеров РПЭ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноцитохимии, а для нескольких линий секвенированием РНК. Изучение физиологических характеристик проводилось путем измерения трансэпителиального сопротивления, секреции VEGF и фагоцитоза. Таким образом, было подтверждено, что полученные клеточные линии обладают морфофизиологическими характеристиками РПЭ, и в дальнейшем быть использованы для трансплантации животным, как в виде суспензии, так и на различных искусственных мембранах. Для получения клеточного материала в виде суспензии, культивируемые клетки промывались раствором Хэнкса (ПанЭко, Россия), инкубировались в течение 5 минут на 37 оС в 0,25% трипсине (Gibco, США). Трипсин инактивировался средой ДМЕМ (ПанЭко, Россия), содержащей 10% FBS (Gibco, США). Клетки подсчитывались на автоматическом счетчике клеток LUNA-II (LogosBiosystems, США). Полученная суспензия центрифугировалась, супернатант отбирался и клетки ресуспендировались PBS (ПанЭко, Россия) до требуемой концентрации (Surdina A, Lebedeva O, Chernonosova V, Zhukova J, Kharitonov A, Bogomazova B, Kiselev S, Laktionov P, Lagarkova M. Obtaining polarized functional retinal pigment epithelium from IPSC son substrates mimicking the Bruch's membrane // The FEBS Journal 284 (Suppl. 1) (2017) 377 DOI: 10.1111 /febs. 14174, A.E. Харитонов, А.В. Сурдина, О.С. Лебедева, А.Н. Богомазова, М.А. Лагарькова. Возможности использования плюрипотентных стволовых клеток для восстановления поврежденного пигментного эпителия сетчатки глаза. ACTA NATURAE | ТОМ 10 №3 (38) 2018).
В работе Lu с соавт. (2009) было показано, что наибольшая выживаемость трансплантируемых клеток РПЭ в виде суспензии достигается при концентрации клеточного материала на уровне 50000 клеток на глаз. При этом авторы отмечают, что, несмотря на то, что выживаемость клеток при введении 100000 была выше, чем более низкие дозы (от 5000 до 75000 клеток на глаз), не было обнаружено прямой корреляционной зависимости между увеличением количества вводимых клеток с 50000 до 100000 и функциональным результатом. [Lu В. et al. Long-Term Safety and Function of RPE from Human Embryonic Stem Cells in Preclinical Models of Macular Degeneration // Stem Cells. - 2009. - №. 27. - C. 2126-2135]. Таким образом, при проведении процедуры введения клеточной суспензии ИПСК-РПЭ была использована концентрация в 50000 клеток/глаз, что позволяет экономно расходовать клеточной материал и достигать необходимого результата.
До оперативного вмешательства подготавливали аутологичную плазму, обогащенную тромбоцитами (PRP - Platelet-richplasma), которую получали следующим образом: забирали кровь из центральной ушной артерии кролика в объеме 2-5 мл в специализированную пробирку без антикоагулянта, пробирку устанавливали в центрифугу и осуществляли центрифугирование при 4000 об/мин в течение 3 минут. После чего из пробирки микропипеткой проводили забор плазмы (надосадочной жидкости) и переносили в другую стерильную пробирку. Проводили повторное центрифугирование в режиме 3000 об/мин в течение 2 минут и собирали 2/3 части плазмы сверху стерильной микропипеткой. Подготавливали стерильный шприц, вынимали поршень. Микропипеткой вводили все содержимое в шприц и присоединяли поршень к шприцу для дальнейшего введения. Полученная PRP биосовместима и является совершенно безопасным как с точки зрения трансмиссивных инвазий, так и в канцерогенном плане [Шкворченко Д.О., Захаров В.Д., Шпак А.А. и др. Наш опыт применения богатой тромбоцитами плазмы крови в хирургии макулярных разрывов // Современные технологии в офтальмологии. - 2016. - №1 (9). - С. 245-246]. Первое исследование о влиянии PRP на паракринную секрецию проводилось в эксперименте на мышах с моделями травматического и лучевого поражения эпителия кожи. Отмечается усиление терапевтического эффекта при синергии мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и PRP, чем при применении их по отдельности. PRP, стимулируя высвобождение ангиогенных факторов МСК, усиливает ангиогенез и регенерацию эпителия при повреждениях, вызванных облучением или механической травмой in vivo. Активная роль PRP в регенерации была продемонстрирована методами ИФА и подтверждена данными гистологического исследования. [Myung, Hyunwook, et al. "Platelet-rich plasma improves the therapeutic efficacy of mesenchymal stem cells by enhancing their secretion of angiogenic factors in a combined radiation and wound injury model." Experimental Dermatology (2019)].
До оперативного вмешательства кроликов взвешивали для того, чтобы обеспечить точную дозировку лекарств. Животных обезболивали внутримышечным введением Золетила и Ксилазина. Операцию проводили на правом глазу, оставляя парный глаз для контроля. Мидриаз достигали закапыванием Аппамида. Перед операцией в конъюнктивальную полость закапывали Вигамокс и Алкаин. Подстригали ресницы ножницами, чтобы уменьшить риск послеоперационных инфекционных осложнений. Накрывали оперируемый глаз стерильной тканью с прорезанным посередине отверстием. Выделяли глазные мышцы и брали на швы-держалки. В проекции плоской части цилиарного тела выполняли склеротомии с установкой портов 23 Ga соответственно 2, 10 и 5 часам. На 5 часах устанавливали ирригационную канюлю. Проводили частичную витрэктомию. Суспензию клеток вводили при помощи шприца объемом 0,05 мл в количестве 50000 клеток, соединенным с удлинительной трубкой (управляемой ассистентом) и канюлей 41G DORK (управляемой хирургом), предварительно срезанной под углом 45°. Канюлю вводили через верхне-височный порт в субретинальное пространство на расстоянии 0,5 pd ниже диска зрительного нерва. После правильного позиционирования кончика, который визуализировался побледнением сетчатки, суспензию с клетками вводили субретинально до образования пузыря, который хорошо визуализируется хирургом с помощью операционного микроскопа. После обмена BSS на воздух и подсушивания сетчатки, на зону введения суспензии наносили 2-3 капли PRP для герметизации дефекта и предупреждения рефлюкса стволовых клеток в витреальную полость. После указанных манипуляций проводили воздушную тампонаду.
После хирургического вмешательства всем кроликам субконъюнктивально вводили раствор Гентамицина и Дексаметазона в дозе 3 мг/кг и 0,2 мг/кг, соответственно. В последующие 7 дней в конъюнктивальную полость закапывали раствор Дексаметазона 0,1% 3р/д. Кроликов укладывали лицом вниз и держали в таком положении в течение одного часа. За день до оперативного вмешательства и в последующие 4 месяца, кролики получали Сандиммуннеорал (раствор для приема внутрь) 100 мг/мл (с расчетом 10 мг на кг массы тела).
Изобретение поясняется следующими экспериментальными данными.
Экспериментальные исследования были проведены на 10 кроликах (10 глаз) породы альбино, массой 2,0-2,5 кг. Продолжительность эксперимента составила 2 месяца. Спустя 2 месяца животных выводили из эксперимента методом воздушной эмболии после введения кролика в наркоз (согласно приказу МинВуза СССР №724 от 13.11.18). Глазные яблоки энуклеировали целиком, после чего фиксировали в нейтральном 10% растворе формалина в течение 1 суток. После фиксации глазные яблоки разрезали на 3 колодки таким образом, чтобы зона индуцированной атрофии с ИПСК РПЭ оказывалась в центральной колодке. После стандартной гистологической проводки центральные колодки заливали в парафин. С парафиновых блоков готовили серийные срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Обзорное микроскопическое исследование проводили на микроскопе, оборудованном цифровой фотокамерой при увеличении ×200-×1000.
Была проведена оптическая когерентная томография на обоих глазах с помощью HeidelbergSpectralis™ SD-OCT (HeidelbergEngineering, Германия) до оперативного вмешательства с целью визуализации зоны предварительно созданной атрофии. Далее определяемые сроки наблюдения - 2 сутки, 14 сутки и спустя 2 месяца после оперативного вмешательства.
Через 2 дня после оперативного вмешательства на ОКТ-изображении визуализировалась зона атрофии ретинального пигментного эпителия, приводящая к повышенному проникновению лазерного луча в подлежащие ткани, гиперрефлективная зона, соответствующая ИПСК РПЭ с прилежащей к ней сетчаткой.
На 14 сутки и спустя 2 месяца после оперативного вмешательства, определялась гиперрефлективная зона, соответствующая ИПСК РПЭ плотно прилегающая к сосудистой оболочке и структурам нейросенсорной сетчатки. При проведении аутофлюоресенции глазного дна определялась зона гипераутофлюоресценции, соответствующая локализации ИПСК РПЭ и вокруг ободок крапчатой гипофлюоресценции соответственно атрофии РПЭ.
Пример. Кролик №6. Создавали модель атрофии РПЭ следующим образом: в субретинальное пространство кроликов на расстоянии 0.5 pd ниже диска зрительного нерва с сформированием субретинального пузыря вводили бевацизумаб в объеме 10 мкл, содержащем 0.025 мг препарата. Через 1 месяц проведена трансплантация ИПСК-РПЭ в виде клеточной суспензии в количестве 50000 клеток с герметизацией места введения с помощью 3 капель PRP. Кролика подвергали эвтаназии спустя 2 месяца после имплантации и энуклеированные глаза отправляли на морфологическое исследование. На гистологическом срезе визуализировался устойчивый монослой дифференцированных клеток, напоминающих клетки РПЭ на мембране Бруха (указана стрелкой) (Фиг. 1) До оперативного вмешательства была проведена оптическая когерентная томография на обоих глазах с целью визуализации зоны предварительно созданной атрофии (Фиг. 2) Далее определяемые сроки наблюдения - 2 сутки, 14 сутки и спустя 2 месяца после оперативного вмешательства. Через 2 дня после оперативного вмешательства на ОКТ-изображении визуализировалась зона атрофии ретинального пигментного эпителия, приводящая к повышенному проникновению лазерного луча в подлежащие ткани, гиперрефлективная зона, соответствующая ИПСК РПЭ с прилежащей к ней сетчаткой (Фиг. 3). На 14 сутки и спустя 2 месяца после оперативного вмешательства, определялась гиперрефлективная зона, соответствующая ИПСК РПЭ плотно прилегающая к сосудистой оболочке и структурам нейросенсорной сетчатки (Фиг. 4). При проведении аутофлюоресенции глазного дна определялась зона гипераутофлюоресценции, соответствующая локализации ИПСК РПЭ и вокруг ободок крапчатой гипофлюоресценции соответственно атрофии РПЭ (Фиг. 5).
С помощью данной методики мы смогли герметизировать ретинотомический дефект и предупредить рефлюкс ИПСК-РПЭ из субретинального пространства в витреальную полость, тем самым минимилизируя интра- и послеоперационные осложнения. Проведенные инструментальные и морфологические исследования показали, что имплантируемые ИПСК-РПЭ правильно интегрированы и адгезированы к сосудистой оболочке в зоне оперативного вмешательства, что положительно сказывается на их дальнейшем функционировании.
Таким образом, данный способ позволяет усовершенствовать технологии трансплантации ИПСК-РПЭ на доклинических этапах исследования, что открывает новые перспективы в лечении дегенеративных заболеваний сетчатки и возможности персонифицированного подхода.