ДЕРМАТОЛОГИЧЕСКОЕ И/ИЛИ КОСМЕТОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО, ЗАЩИЩАЮЩЕЕ КОЖУ ОТ ПОСЛЕДСТВИЙ ВОЗДЕЙСТВИЯ ПОВРЕЖДАЮЩИХ ФАКТОРОВ, СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ СПОСОБНОСТЬЮ ЭЛИМИНИРОВАТЬ КЛЕТКИ С ВЫРАЖЕННОЙ ХРОМОСОМНОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТЬЮ
DERMATOLOGICAL AND/OR COSMETOLOGY AGENT PROTECTING SKIN FROM CONSEQUENCES OF INFLUENCE OF DAMAGING FACTORS, AGENT POSSESSING ABILITY TO ELIMINATE CELLS WITH EXPRESSED CHROMOSOMAL INSTABILITY

Изобретение относится к области косметологии и дерматологии и касается соответствующих средств, положительно влияющих на функционирование клеток ткани кожи.
Кожа представляет собой наружный защитный покров тела и выполняет многообразные физиологические функции: защитные, рецепторные, обменные.
Обменные функции кожи (выделительная, всасывающая, дыхательная) активно обеспечивают ее главную задачу: быть защитным барьером организма, поддерживать постоянство его внутренней среды. Кожный покров участвует в дыхании, вырабатывает витамин D и накапливает витамин А.
С возрастом и при неблагоприятном воздействии внешней и внутренней среды в коже снижаются процессы регенерации эпидермиса, возрастает восприимчивость к действию повреждающих факторов; нарушается функционирование клеток ткани кожи; кожа теряет эластичность, изменяется рельеф эпидермиса.
К неблагоприятным воздействиям внешней среды относятся воздействие ультрафиолетовыми лучами, термические воздействия (низкая и высокая температура), действие химических агентов (детергенты, перекись водорода, ацетон, хлорсодержащие соединения, бензин и т.д.).
Повреждения, наносимые ультрафиолетом, связаны прежде всего с высвобождением реактивных форм кислорода, или, с так называемым оксидативным стрессом. Как известно, оксидативный стресс, вызванный ультрафиолетовым облучением, приводит к подавлению иммунитета, фотодерматозам, фотостарению и фотокарциногенезу. К оксидативному стрессу приводит также воздействие перекисью водорода или хлорсодержащими соединениями.
Одним из результатов действия реактивных форм кислорода является нарушение правильного деления клеток (Chae S, Yun С, Um Н, Lee JH, Cho H. Centrosome amplification and multinuclear phenotypes are Induced by hydrogen peroxide. Exp Mol Med. 2005 Oct 31;37(5):482-7), что может приводить к нестабильности хромосомного (генетического) состава клеток (Thorn Т, Gniadecki R, Petersen АВ, Vicanova J, Wulf НС. Differences in activation of G2/M checkpoint in keratinocytes after genotoxic stress induced by hydrogen peroxide and ultraviolet A radiation. Free Radic Res. 2001 Oct;35(4):405-16). Патология клеточного деления и явление хромосомной нестабильности наблюдаются также при термических воздействиях, но причиной в данном случае является не появление реактивных форм кислорода, а нарушение структуры аппарата деления клеток (Алов И.А. Механизмы реакции делящихся клеток на гипотермию. Усп. Соврем. Биол. 1982 93 (1):64-72).
Как известно, обновление клеточного состава эпидермиса кожи происходит за счет деления клеток базального и супрабазального слоев, рост волос требует нормального уровня размножения клеток волосяных фолликулов. Дерма кожи, состоящая из клеток соединительной ткани и образуемых ею компонентов внеклеточного матрикса, также нуждается в периодическом обновлении клеточного состава. Сосудистые компоненты кожи подвергаются постоянно ремоделированию, что тоже включает процессы клеточного деления.
Нарушение процессов деления клеток в разных участках кожи может приводить к разным последствиям. В том случае, если в клетках работает система контроля клеточного деления, патологические формы клеточного деления будут подвергаться элиминации в результате так называемой митотической катастрофы. Но если в клетках в результате мутаций, вызванных теми или иными повреждающими воздействиями, механизм удаления патологических форм клеточного деления нарушен, то могут появляться клетки, в которых число хромосом отличается от нормального, а значит, изменен генетический материал. Это явление называют цитогенетической катастрофой (Castedo М., Perfettini J-L, Roumier Т., Andreau К., Medema R., Kroemer G. Cell death by mitotic catastrophe: a molecular definition., Oncogene. 2004. V. 23. P. 2825-2837). Судьба таких клеток может быть различной. В одном случае они также погибают по механизму программированной гибели клеток, в другом случае они могут выживать, что должно приводить к появлению клонов клеток с аномальными свойствами, а в конечном итоге - к появлению опухолей.
В такой ситуации важным является вопрос о том, как можно удалить из клеточной популяции те клетки, в которых нарушился хромосомный состав, и при этом не функционирует программа клеточной гибели.
Техническая задача настоящего изобретения состояла в том, чтобы найти средство, обладающее способностью элиминировать (удалять) клеточные элементы кожи с нестабильным хромосомным составом и использовать его при создании косметических и/или дерматологических средств, защищающих кожу от последствий неблагоприятного воздействия повреждающих факторов.
Применение такого средства позволит защитить кожные покровы, оздоровить кожу, продлить время активной молодости клеток кожи, предотвратить появление патологических образований.
Для решения этой задачи заявителем предложено дерматологическое и/или косметологическое средство, защищающее кожу от последствий воздействия повреждающих факторов, приводящего к появлению клеток с выраженной хромосомной нестабильностью, включающее косметически и/или дерматологически приемлемую основу и R-форму α-липоевой кислоты, и/или ее производных, и/или ее метаболических предшественников в качестве средства, обладающего способностью элиминировать клетки с выраженной хромосомной нестабильностью.
При этом содержание R-формы α-липоевой кислоты и/или ее производных, и/или ее метаболических предшественников в средстве составляет от 0,1 до 10,0 вес.%.
Кроме того, заявитель защищает новое, открытое им и подтвержденное многочисленными исследованиями свойство R-формы α-липоевой кислоты, и/или ее производных, и/или ее метаболических предшественников: способность элиминировать (удалять) клетки с выраженной хромосомной нестабильностью.
Под производными R-формы альфа-липоевой кислоты подразумеваются ее химические производные, содержащие различные реактивные группы.
В качестве примеров, которые не исчерпывают все варианты, можно привести наиболее известные производные альфа-липоевой кислоты - ее соли (особенно соли щелочных металлов), эфиры (особенно эфиры жирных кислот) и амиды (особенно изолированные из липоамидов натурального происхождения или их аналогов), а также редуцированную форму альфа-липоевой кислоты - дигидролипоевую кислоту и ее соли, эфиры и амиды.
В настоящее время известно использование в косметологии альфа-липоевой кислоты, которую применяют как антиоксидантное и антивоспалительное средство, с ее помощью лечат акне и рубцы от них (Патент США №6,365,623, 2002 г.).
Известно использование альфа-липоевой кислоты в качестве лекарственного препарата, применяемого перорально. В медицине с ее помощью лечат авитаминозы, диабет, диабетическую нейропатию, множественный склероз, гиперлипидемию и гиперлипопротеинемию (Патент США №6,518,300, 2003 г.), стимулируют кровообращение после гипоксии (Hagen, Т, Ingersoll R, et al. R-lipoic acid-supplemented old rats have improved mitochondrial function, decrease oxidative damage, and increase metabolic rate. FASEB 13:411-418, 1999 г.), используют как гепатопротектор при циррозах, лечат различные вирусные инфекции, включая СПИД.
В бодибилдинге липоевая кислота используется для наращивания мышечной массы (Патент США №6,620,425, 2003 г.).
Альфа-липоевая кислота (α-липоевая кислота) была открыта в 1948 г., выделена в 1951 г. Образуется в результате биосинтеза в клетках растений и животных, содержится в шпинате, картошке, томатах, брокколи. Синтезируется клетками организма млекопитающих. С возрастом и под воздействием неблагоприятных факторов внешней среды ее количество в организме становится недостаточным. Следствие этого - повышенная чувствительность организма к неблагоприятным внешним и внутренним факторам.
8
14
2
2
α-Липоевая кислота имеет общую формулу CHOS. Ее структурная формула
α-Липоевая кислота имеет два стереоизомера - R- и S-энантиомеры. R-форма является природным стереоизомером и по биохимическим свойствам отличается от S-формы.
Исследование заявителя показали, что накожное применение R-формы α-липоевой кислоты и/или ее производных, и/или ее метаболических предшественников позволяет восстановить и поддерживать гомеостаз кожных покровов, его новый уровень, характерный для молодого и здорового организма независимо от хронологического возраста (заявка №2005135140/14 того же заявителя, по которой принято решение о выдаче патента)
Однако нельзя было предположить и не вытекало с очевидностью из известного уровня знаний, что R-форма α-липоевой кислоты обладает способностью элиминировать (удалять) клетки с выраженной хромосомной нестабильностью в том случае, если не функционирует программа клеточной гибели.
Для подтверждения вышесказанного заявителем были проведены следующие исследования.
Сопоставлены интенсивность пролиферации (размножение) и гибели культивируемых человеческих клеток эпидермоидного происхождения (А 431) при воздействии разных форм альфа-липоевой кислоты (R-) и (смеси R-+S-). Определение митотического и апоптотического индексов показало усиливающий эффект R-формы по сравнению со смесью R-+S на эти процессы, что указывает на возможность ускорения процессов обновления клеточного состава популяций R-формой альфа-липоевой кислотой. Выявлена преимущественная апоптотическая гибель клеток, в которых ядра имеют различные аномальные черты (присутствуют микроядра, форма ядер полиморфная). Для получения результатов были использованы следующие методы.
Методом световой микроскопии определено число клеток А431, содержащих микроядра и ядра, имеющие неправильную форму, т.е. полиморфные, что является тестом на нестабильность хромосомного состава клеток. Проанализировано изменение числа полиморфноядерных клеток при воздействии разных доз α-липоевой кислоты. Обнаружено, что при воздействие 200 и 300 мкМ происходит быстрое (через 24 час) и значительное снижение числа таких клеток. Через 72 час полиморфноядерные практически не обнаруживаются.
Методом световой микроскопии изучено влияние разных концентраций α-липоевой кислоты на интенсивность размножения клеток, определена способность α-липоевой кислоты индуцировать патологические митозы, что в свою очередь может приводить к митотической катастрофе. Воздействие альфа-липоевой кислотой понижает митотическую активность, индуцируя на поздних сроках воздействия (48, 72 час) появление патологических митозов.
Методом световой микроскопии определен уровень гибели клеток при воздействии разных концентраций α-липоевой кислоты. Апоптотический индекс значительно возрастает лишь через 72 часа воздействия 200 и 300 мкМ альфа-липоевой кислоты.
Методом иммунохимического окрашивания клеток антителами к белку р53 определена способность клеток с микроядрами активировать р53-зависимый механизм клеточной гибели. Белок р53 является важным фактором транскрипции, от активности которого зависит экспрессия генов, отвечающих за клеточное размножение и гибель.
Методом иммунохимического окрашивания клеток антителами к каспазе 3 проанализировано, происходит ли апоптоз клеток (программированная гибель клеток) по каспазозависимому механизму. Каспаза 3 является ферментом (цистеиновой протеазой), разрушающим в ходе апоптоза многочисленные белки, которые являются регуляторами гомеостаза, клеточного цикла, взаимосвязи клеток друг с другом, или структурные белки, формирующие мембранные органеллы и цитоскелет.
Ниже приведены результаты исследований.
Объектом исследования служили культивируемые клетки линии А 431 (эпидермоидная карцинома кожи человека). Клетки выращивали на среде DMEM (ПАНЕКО, С140) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (ПАНЕКО, Австрия) и 80 мкг/мл гентамицина при 37 °С. Клетки снимали со стекла раствором Версена и трипсином (3:1), суспендировали в свежей среде и высаживали на покровные стекла в чашки Петри. Через 24 часа в среду культивирования вводились растворы R-формы альфа-липоевой кислоты (Labochim) в следующих концентрациях: 100, 200, 300. Клетки фиксировали холодным метанолом через 24, 48, 72 часа после введения агента и окрашивали гематоксилином для последующей статистической обработки. Статистический анализ проводился на 1000 клеток. Результаты обрабатывались в программе Microsoft Exel.
Для окрашивания антителами клетки фиксировали холодным метанолом (окрашивание антителами к альфа-тубулину (Sigma)) или 4% параформальдегидом на PBS (Sigma) (окрашивание антителами к р53 (Sigma) и активной форме каспазы 3(Sigma)).
Анализ содержания в популяции полиморфноядерных клеток
Статистический анализ показал, что в контроле содержание в популяции полиморфноядерных клеток составляет около 6% через 24 часа после посадки клеток на стекла и к 72 часам увеличивается примерно до 11,5%. Воздействие 100 мкМ α-липоевой кислотой (как R-, так и R+S-формами) достоверно не снижает содержание таких клеток через 24, но затем число таких клеток резко падает до примерно 1% и остается неизменным при использовании R-формы, но вновь увеличивается в присутствии рацемата. При анализе препаратов, обработанных 200 мкМ и 300 мкМ R-формой α-липоевой кислоты было обнаружено уменьшение числа полиморфноядерных клеток уже через 24 часа воздействия (до 0,3%). Через 48 часов воздействия 200 и 300 мкМ α-липоевой кислоты содержание полиморфноядерных клеток не превышало 0,2%. К 72 часам таких клеток в популяции практически нет. В присутствии рацемата в аналогичных концентрациях в популяции сохраняется около 1% полиморфноядерных клеток на протяжении всего эксперимента. На фиг.2 представлены световые фотографии клеток, окрашенных гематоксилином. В контроле стрелками обозначены полиморфноядерные клетки (клетки с микроядрами). При воздействии 200 мкМ α-липоевой кислоты такие клетки отсутствуют.
Интенсивность деления клеток
Митотический индекс контроля составляет от 3 до 4%. Воздействие 100 мкМ α-липоевой кислоты приводит к достоверному снижению митотического индекса через 24 и 48 часов воздействия. Воздействие 200 и 300 мкм α-липоевой кислоты несколько повышает митотическую активность клеток через 24 ч и снижает ее через 48 часов. В целом митотическая активность изменяется сходным образом при воздействии обеими формами α-липоевой кислотой, но в присутствии R-формы клетки митотические клетки выявляются и через 72 часа.
Патологические митозы
Анализ морфологии митотического деления показал, что в контроле в популяции наряду с нормальными митозами присутствуют и патологические (многополюсные митозы и К-митозы). В контроле содержание патологических митозов не превышает 5% на первые и вторые сутки культивирования (фиг.4). Число патологических митозов увеличивается до 20% на третьи сутки, что может быть связано со стратификацией монослоя клеток.
Воздействие R-формы α-липоевой кислоты в концентрациях от 100 до 300 мкМ не приводит к значительному увеличению патологических митозов через 24 часа. Однако через 48 часов воздействия доля таких митозов составляет от 40 (200-300 мкМ) до 60% (100 мкМ). Больший процент нарушений деления клеток при воздействии 100 мкм α-липоевой кислоты может быть связан, во-первых, с тем, что в этой популяции содержится большее число клеток с микроядрами. Во-вторых, более высокие дозы α-липоевой кислоты могут вызывать остановку в прохождении клеточного цикла клеток с нормальным хромосомным составом, не препятствуя продвижению по клеточному циклу клеток с хромосомными нарушениями. Данное предположение косвенно подтверждается снижением митотической активности клеток при воздействии α-липоевой кислоты. К 72 часам воздействия 100 мкМ α-липоевой кислоты доля патологических митозов практически не меняется. При этом воздействие 200 и 300 мкМ α-липоевой кислоты приводит к нарушению митотического деления во всех клетках, что может свидетельствовать и о токсическом эффекте длительного воздействия α-липоевой кислоты. Воздействие рацематом в разных концентрациях резко увеличивает долю патологических митозов уже через 24 часа (до 26%), а через 48 часов их уровень достигает 40-60%.
Апоптотическая гибель
Апоптотический индекс в контроле составляет около 0,4% и достоверно не меняется через 24 часа при всех вариантах воздействия. К 48 часам апоптотический индекс повышается до 1,5% при использовании R-формы и до 4% при использовании рацемата. Через 72 часа воздействия 200 и 300 мкМ α-липоевой кислоты апоптотический индекс увеличивается до 8-14%. 100 мкМ α-липоевой кислоты не оказывают такого сильного эффекта (около 2%). Поскольку значительная элиминация клеток с микроядрами происходит ранее (24 час), можно предположить, что ранняя гибель таких клеток происходит в митозе. На этой стадии клеточного цикла активация программы апоптоза определяется митохондриями. Именно эти органеллы связаны с метаболизмом α-липоевой кислоты.
Окрашивание антителами к Р53. В контроле наблюдается постоянный низкий уровень экспрессии Р53 во всех клетках. В присутствии 100 мкМ α-липоевой кислоты (24 часа) так же окрашиваются ядра всех клеток (и нормальные, и полиморфные). При воздействии более высоких доз (24 часа) наблюдается повышение уровня экспрессии данного белка в полиморфноядерных клетках, что может свидетельствовать о последующей элиминации именно данного типа клеток. По-видимому, в элиминации клеток с микроядрами при воздействии α-липоевой кислотой задействованы два механизма активации апоптоза - ядерный (в интерфазе) и митохондриальный (в митозе).
Окрашивание антителами к активной форме каспазы 3. Окрашивание антителами к активной форме каспазы 3 (Sigma) показывает, что основным механизмом апоптоза является каспазозависимый путь как в контроле, так и в присутствии α-липоевой кислоты.
Окрашивание антителами к альфа-тубулину. Окрашивание антителами к альфа-тубулину показывает, что в контроле микротрубочки формируют рыхлую сеть без ярко выраженного центра организации. Воздействие α-липоевой кислоты не приводит к уменьшению числа микротрубочек в клетке, однако изменяется расположение микротрубочек - они формируют плотную «войлочную» сеть. В клетках в контроле чаще всего обнаруживается один центр организации микротрубочек, в то время как при воздействии α-липоевой кислоты таких центров может быть несколько, что в дальнейшем может приводить к образованию многополюсных патологических митозов. Изменение числа центров организации микротрубочек и самой сети микротрубочек может приводить к нарушению митотического деления и появлению патологических митозов.
В целом полученные результаты показывают, что воздействие α-липоевой кислоты приводит к освобождению популяции клеток А431 от клеток с хромосомной нестабильностью. Нормализация генома может достигаться за счет:
1. Блокирования нормальных клеток на границе G1-S периодов клеточного цикла, что, видимо, связано с уменьшением митотического индекса при воздействии α-липоевой кислоты.
2. Активации апоптоза в интерфазных клетках с хромосомной нестабильностью (полиморфноядерных клеток), что, видимо, связано с накоплением в микроядрах белка р53, который является фактором транскрипции для многих проапоптотических белков.
3. Индукции вступления в митоз других (не микроядерных) клеток с хромосомной нестабильностью с последующей их гибелью путем митотической катастрофы, что, видимо, связано со значительным увеличением числа патологических митозов, не приводящее к увеличению числа клеток с микроядрами.
Абсолютное содержание R-формы α-липоевой кислоты и/или ее производных, и/или ее метаболических предшественников в косметическом и/или дерматологическом средстве может находиться в широких пределах, но в оптимальном случае составляет от 0,1 до 10,0 вес.%.
Косметические средства, содержащие R-форму α-липоевой кислоты и/или ее производные, и/или ее метаболические предшественники, могут быть приготовлены в виде таких традиционных косметических форм, как кремы, маски, лосьоны и подобные. Для их приготовления могут быть использованы традиционно применяемые для таких целей основы и вспомогательные вещества.
В состав косметических средств, содержащих R-форму α-липоевой кислоты и/или ее производные, и/или ее метаболические предшественники, могут быть включены и другие биологически активные вещества, например витамины, фруктовые кислоты, гликолевая кислота и т.д.
Апробация косметических средств, содержащих R-форму α-липоевой кислоты, показала их высокую эффективность.
Приводимые далее Примеры лишь иллюстрируют способ приготовления косметических средств, используемых для защиты кожи от последствий вредного воздействия повреждающих факторов и не носят ограничивающего характера.
Пример 1.
Для приготовления 100 кг косметического крема для кожи нагревают 46,06 кг воды с добавлением 1,5 кг 10% раствора КОН до 70°С. Одновременно готовят эмульсию, для чего смешивают 14,0 кг стеариновой кислоты, 2 кг цетилстеарилового спирта, 1 кг пропиленгликоля изостеарата. Смесь нагревают в плавильном котле до температуры 70°С и перемешивают до получения однородной массы. В реактор заливают воду с 10% раствором КОН и масляную фазу, включают циркуляцию воды и гомогенизатор. После охлаждения эмульсии до 30°С в реактор вносят 1 кг гермабена II и раствор R-формы α-липоевой кислоты (5 кг R-формы α-липоевой кислоты в 29,44 кг 5% раствора КОН). Содержимое перемешивают до однородной массы. Доводят значение рН до величины 6,8 с помощью 10% раствора КОН.
Пример 2.
Для приготовления 100 кг косметического геля засыпают на поверхность 28,65 кг воды, 0,6 кг Карбопола Ультрез 10. В реактор заливают 50 кг воды, включают мешалку и добавляют 1 кг гермабена II, 0,05 кг ЭДТА, 2 кг глицерина, 1,5 кг Бутиленгликоля, включают тихоходную мешалку и добавляют 0,6 кг ПЭГ-40 гидрированного касторового масла. Перемешивают до однородного состояния и добавляют раствор Карбопола Ультрез 10, раствор R-формы α-липоевой кислоты (5 кг R-формы α-липоевой кислоты в 10 кг этилового спирта). Перемешивают 10 минут и добавляют 0,6 кг 10% раствора КОН. Содержимое перемешивают до однородной массы. Доводят значение рН до величины 6,8 с помощью 10% раствора КОН.