Клиникопатологическое исследование трансмиссивной венерической саркомы у собак, больных лейшманиозом

ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ

Клинико-патологическое исследование трансмиссивной венерической саркомы у собак, больных лейшманиозом

Введение: описаны случаи трансмиссивной венерической саркомы на фоне лейшманиоза; в таких случаях в опухолевых клетках иногда обнаруживаются амас-тиготы лейшманий.

Цели: данное исследование проведено в целях изучения клинико-патологической значимости обоих заболеваний, протекающих параллельно.

Методы: ретроспективное исследование 19 собак с трансмиссивной венерической саркомой и лейшманиозом.

Результаты: у собак, включенных в исследование, опухоли имели крупные размеры и часто характеризовались агрессивным поведением (42 %), признаков спонтанного регресса не наблюдалось. В трех случаях в клетках трансмиссивной венерической саркомы были обнаружены редкие амастиготы лейшманий, вероятно, перенесенные инфицированными макрофагами, которые часто инфильтрируют опухоль. В двух других случаях в опухолевых клетках была обнаружена высокая кон-

Трансмиссивная венерическая саркома (ТВС) собак представляет собой новообразование, развивающееся преимущественно на наружных половых органах и обладающее некоторыми уникальными особенностями. По-видимому, клетки ТВС имеют ретикулоэндотели-альный фенотип [2, 16, 20] и могут передаваться другим собакам, особенно во время вязки [23]. ТВС наиболее распространена среди собак с высокой половой активностью в тропических и субтропических областях, включая Сицилию, при этом распространение заболевания - очаговое [1]. Опухоль может регрессировать спонтанно, и основную роль в этом процессе играет иммунная система. Цикл развития ТВС предсказуем и состоит из пролиферативной фазы (Р), стабильной фазы (S) и фазы регресса (R), однако не все опухоли достигают последней фазы [28]. У собак с иммунодефицитом и у щенков возможен инвазивный рост опухоли и отдаленные метастазы в большинство внутренних органов [22]. Методом выбора является химиотерапия винк-ристином в сочетании с хирургическим иссечением или без [5, 13]. Интересно, что после регресса, индуцированного винкристином, собаки обычно остаются иммунными к повторной инфекции [7].

центрация паразитов, что было подтверждено иммуно-гистохимическими методами.

Клиническая значимость: клетки трансмиссивной венерической саркомы собак способны накапливать большое количество паразитических лейшманий. Кроме того, возможно, системное заболевание (лейшма-ниоз) ослабляет механизмы иммунной защиты против злокачественных новообразований (трансмиссивные венерические опухоли собак).

G. Marino, G. Gaglio and A. Zanghi

Journal of Small Animal Practice (2012) 53, 323-327 DOI: 10.1111/j.1748-5827.2012.01201.x Принято: 8 марта 2012; опубликовано онлайн: 10 апреля 2012

Факультет ветеринарного здравоохранения, Университет Мессины, Polo Universitario Annunziata, Мессина, Италия

Хронический лейшманиоз (ХЛ) - заболевание, вызванное жгутиковыми простейшими, принадлежащими к роду Leishmania и передающимися москитами. Заболевание распространено в странах Средиземноморья, возбудителем является Leishmania infantum [25]. У позвоночных простейшие паразитируют преимущественно в макрофагах. Лейшманиоз - системное заболевание, поражающее внутренние органы, кожу и слизистые оболочки, в том числе мочеполового тракта [10]. В последние годы патогенез заболевания был тщательно пересмотрен. В большинстве случаев лейшманиоз у собак протекает субклинически или в форме легкого самоограничивающегося заболевания, однако возможно тяжелое прогрессирующее течение [27]. Механизмы устойчивости или восприимчивости к инфекции зависят от пола, возраста, питания, генетики организма хозяина, сопутствующих инфекций и/или заболеваний, дефицитных состояний, состава ци-токинов, количества паразитов в организме, вирулентности штамма лейшманий и способа передачи [27]. Для лечения наиболее эффективно сочетание меглумина антимоната с аллопуринолом, которое все еще считается терапией первой линии [9, 19, 24]. Лейшманиоз одновременно с ТВС у одного животного возможен в географических областях, где зоны распространения

ВВЕДЕНИЕ

этих заболеваний перекрываются [1, 17, 18]. Иногда в ткани ТВС обнаруживается большое количество макрофагов, содержащих лейшмании [6], кроме того, сообщалось, что опухолевые клетки сами по себе могут содержать некоторое количество амастигот [2, 14]. Данная работа проведена в целях изучения серии клинических случаев ТВС в сочетании с лейшманиозом у собак и установления патологической значимости этих заболеваний, протекающих параллельно.

Выбор клинических случаев

В настоящее исследование включали собак с ТВС и лейшманиозом, поступивших в клинику акушерства ветеринарного факультета Университета Мессины в период с 1999 по 2010 гг.

Диагностика и определение стадии лейшманиоза

У собак с подозрением на лейшманиоз на основании клинических симптомов и/или лабораторных отклонений диагноз подтверждали обнаружением специфических антител против лейшманий в сыворотке методом иммунофлуоресценции (пороговое значение 1:80) и амастигот в пунктате из лимфатических узлов (окрашивание по Май-Грюнвальду-Гимзе). Каждой собаке проводили плановые диагностические исследования (клинический анализ крови, биохимический анализ, анализ мочи и электрофорез белков сыворотки) и классифицировали заболевание по тяжести, как описано в работе Solano-Gallego and others [27], как легкое, умеренное, тяжелое и очень тяжелое.

Диагностика и определение стадии ТВС

ТВС диагностировали путем цитологического исследования слущенных клеток, окрашенных по Май-Грюнвальду-Гимзе. Фазу роста опухоли определяли цитологически согласно Mukaratirwa and others [21], оценивая число митозов, апоптозных клеток, инфильтрирующих опухоль лимфоцитов и тучных клеток, и обозначали как пролиферативную (Р), стабильную (S) или регресс (R). Размер опухоли измеряли штангенциркулем и относили к одной из трех категорий: менее 1, от 1 до 3 и более 3 см3. Инвазивность опухоли оценивали клинически по степени поражения окружающих структур и указывали как низкую или высокую. Наличие метастазов определяли путем тщательного осмотра всех внешних слизистых оболочек и кожи, пальпации поверхностных лимфатических узлов, УЗИ и рентгена.

Обнаружение лейшманий в ткани ТВС

Мазки опухоли исследовали на наличие и плотность амастигот. Из отобранных образцов опухолевой ткани готовили гистологические препараты и рассматривали под световым микроскопом при большом увеличении после окраски гематоксилином-эозином или толуидиновым синим. Для оптимизации обнару-

жения паразитов использовали иммуногистохимичес-кую технику, предложенную Bourdoiseau and others [3] и модифицированную, как описано ниже. Серии срезов опухоли после удаления парафина обрабатывали микроволновым излучением для демаскировки антигенов, чтобы усилить антигенный сигнал. В качестве первичных антител использовали гипериммунную сыворотку собаки, больной лейшманиозом (титр 1/3200 при исследовании иммунофлуоресцентным методом), разведенную 1:2000 физиологическим раствором с фосфатным буфером. В качестве вторичного антитела использовали биотинированный иммуноглобулин G кролика против собачьих антител (Santa Cruz Biotechnology) в разведении 1:200. Для иммунохимического окрашивания использовали набор Vector VIP (Vector Laboratories), а для окраски ядер - метиловый зеленый. В качестве отрицательных контролей использовали те же срезы, но без добавления первичных антител. В качестве положительных контролей использовали срезы кожи собак с амастиготами лейшманий, обнаруженными при гистологическом исследовании.

Стадию лейшманиоза и характеристики опухоли (размер, инвазивность, фаза роста) анализировали с помощью точного критерия Фишера; за статистическую значимость принимали Р < 0,01.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Выбор животных

В исследование было зачислено 19 собак, содержащихся во дворе и свободно гуляющих; среди них было 10 кобелей и 9 сук, все собаки были больны лейшманиозом в сочетании с ТВС. Средний ± СО возраст животных был 4 ± 2 года. Во всех случаях в предшествующие годы имело место неконтролируемое спаривание, и ни одно из заболеваний не было диагностировано ранее.

Диагностика и определение стадии лейшманиоза

Титры антител против лейшманий при имму-нофлуоресцентном анализе варьировали от 1:80 до 1:5120; по клиническим симптомам и результатам лабораторного исследования шести собакам был поставлен диагноз лейшманиоза легкой, десяти - умеренной и трем - тяжелой степени (табл. 1).

Диагностика и определение стадии ТВС

Во всех исследованных случаях животные поступили в клинику с первичными ТВС гениталий, в частности головки пениса и препуция (у кобелей) и влагалища и, в некоторых случаях, петли (у сук). У 53 % животных опухоль находилась в фазе пролиферации (Р) (10 из 19), у 42 % (8 из 19) - в стабильной фазе (S) и у 5 % - в фазе регресса (R) (1 из 19). При учете групп по тяжести лейшманиоза оценка фаз ТВС выявила следующие цифры: P = 83 % (5 из 6), S = 17 % (1 из 6) у собак с легкой степенью лейшманиоза; P = 30 % (3 из 10), S = 70 % (7 из 10) у собак с умеренной степенью лейшманиоза; P = 66 % (2 из 3), R = 34 % (1 из

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Таблица 1. Данные о животных и диагноз лейшманиоза

n Пол Порода Возраст

1 Кобель Метис 3 1:80 Легкая

2 Кобель Боксер 5 1:160 Легкая

3 Кобель Метис 6 1:320 Умеренная

4 Кобель Метис 7 1:1280 Тяжелая

5 Кобель Метис 7 1:2560 Тяжелая

6 Кобель Метис 6 1:5120 Тяжелая

7 Кобель Метис 4 1:320 Умеренная

8 Кобель Метис 3 1:640 Умеренная

9 Кобель Метис 3 1:80 Легкая

10 Кобель Метис 4 1:320 Умеренная

11 Сука Боксер 1,5 1:160 Легкая

12 Сука Питбуль 4 1:640 Умеренная

13 Сука Метис 1 1:80 Легкая

14 Сука Метис 2 1:80 Легкая

15 Сука Пойнтер 5 1:640 Умеренная

16 Сука Н.о. 3 1:320 Умеренная

17 Сука Метис 2 1:320 Умеренная

18 Сука Метис 3 1:640 Умеренная

19 Сука Сеттер 4 1:1280 Умеренная

Рис. 1.

Случай 11. Агрессивная ТВС у собаки, больной лейшманиозом

3) у собак с тяжелой степенью лейшманиоза. Размер опухоли был менее 1 см3 в 16 % случаев (3 из 19), от 1 до 3 см3 в 37 % случаев (7 из 19) и более 3 см3 в 47 % случаев (9 из 19). В группах по тяжести лейш-маниоза оценка размеров ТВС показала следующие цифры: менее 1 см3 - 50 % (3 из 6), 1-3 см3 - 33 % (2 из 6), более 3 см3 - 17 % (1 из 6) у собак с лейшманиозом легкой степени; 1-3 см3 - 50 % (5 из 10), более 3 см3 - 50 % (5 из 10) у собак с лейшманиозом умеренной степени; более 3 см3 - 100 % (3 из 3) у собак с тяжелым лейшманиозом. У 26 % (5 из 19) животных были обнаружены метастазы, главным образом на коже (шеи, боков, спины), что позволяет предположить вторичное распространение с половых органов.

В оставшихся 16 % (3 из 19) опухоль характеризовалась высокой инвазивностью и прорастала в окру-

Таблица 2. Особенности ТВС в изученных случаях

n Место возникновения Стадия роста Объем (см3) Поведение

1 Головка пениса Р 1-3 Низкая инвазивность

2 Головка пениса Р < 1 Низкая инвазивность

3 Препуций Р > 3 Метастазы в кожу

4 Головка пениса / препуций Р > 3 Метастазы в паховые лимфатические узлы

5 Препуций R > 3 Низкая инвазивность

6 Головка пениса / препуций P > 3 Метастазы в кожу и десну

7 Препуций S 1-3 Низкая инвазивность

8 Головка пениса S > 3 Низкая инвазивность

9 Головка пениса / препуций P > 3 Метастазы в кожу

10 Головка пениса / препуций P > 3 Метастазы в паховые лимфатическе узлы, кожу, глаз

11 Влагалище P 1-3 Низкая инвазивность

12 Петля/влагалище P > 3 Высокая инвазивность

13 Влагалище S < 1 Низкая инвазивность

14 Влагалище P < 1 Низкая инвазивность

15 Влагалище S 1-3 Высокая инвазивность

16 Влагалище S 1-3 Низкая инвазивность

17 Влагалище S 1-3 Низкая инвазивность

18 Влагалище S 1-3 Низкая инвазивность

19 Петля/влагалище S > 3 Высокая инвазивность

жающие ткани (рис. 1), иногда разрушая нормальную структуру гениталий. Процентные соотношения (42%) составили соответственно 17 % (1 из 6), 60 % (6 из 10) и 66 % (2 из 3) в группе собак с легкой, умеренной и тяжелой формой лейшманиоза (табл. 2). Значимой корреляции стадии лейшманиоза и свойств опухоли не обнаружено (Р > 0,01).

Рис. 2. Случай 2. Мазок с ТВС гениталий. Среди опухолевых клеток видно большое количество амастигот лейшманий.

Окраска по Май-Грюнвальду-Гимзе. Увеличение Х400

Обнаружение лейшманий в клетках ТВС

Амастиготы лейшманий были обнаружены в мазках 26 % (5 из 19) животных (случаи 2, 3, 5, 6 и 9); они располагались свободно либо были заключены в цитоплазму макрофагов или клеток опухоли (рис. 2). Результат был подтвержден гистологическим и им-муногистохимическим исследованием биоптатов в 16 % случаев (3 из 16) (случаи 2, 5 и 6). При иммуно-гистохимическом исследовании было идентифицировано большое количество положительных точек, разбросанных среди опухолевых клеток (рис. 3) с очагами концентрации вдоль соединительнотканных перегородок опухоли. В случаях 2 и 5 (ТВС слизистых оболочек) высокая плотность паразитов позволяет предположить истинное заражение опухоли лейшма-ниями. В случае 6 незначительное повышение концентрации паразитов обнаружено лишь в кожной ТВС.

Рис. 3. Случай 5. Паразитические лейшмании, окрасившиеся положительно иммунохимическим методом, внутри опухолевой ткани. Обратите внимание на плотность паразитов. Авидин-биотиновая реакция. Для контрастного окрашивания ядер использовались красители из набора Vector VIP и метиловый зеленый. Увеличение Х200

Полная оценка лечения и последующее наблюдение выходят за рамки настоящего исследования. Однако большинство животных было успешно излечено от ТВС и лейшманиоза. Лишь двое животных (случаи 5 и 9) умерли от тяжелой формы лейшмани-оза через 6 и 9 месяцев соответственно.

ОБСУЖДЕНИЕ

В клиническом анамнезе изученных животных отсутствовали сведения о том, какое заболевание - лейш-маниоз или ТВС - развилось первым. Насколько известно авторам, до настоящего времени не проводилось исследований, которые показали бы большую восприимчивость собак с ТВС к лейшманиозу. Не все собаки восприимчивы к ТВС, и при экспериментальном заражении более чем в 60 % случаев опухоль регрессирует спонтанно [8]. Чтобы имплантат ТВС начал развиваться, необходимо, чтобы у собаки не было контакта с ТВС в прошлом; возможно, для этого необходимо также снижение иммунитета ко времени контакта. Лейшманиоз, влияющий на иммунный ответ организма хозяина [4, 12, 15], может быть одним из предрасполагающих условий для успешной имплантации и развития ТВС. Это может объяснить распространенность собак с двумя заболеваниями одновременно [1, 17, 18]. Возможно, у таких собак изменяется цикл развития опухоли, и в большинстве случаев она не достигает фазы регресса, как в настоящем исследовании, хотя значимой связи фазы опухоли с тяжестью лейшманиоза не обнаружено. По-видимому, на фоне лейшманиоза рост ТВС становится более агрессивным, с прорастанием в окружающие ткани или распространением в отдаленные органы; по опубликованным данным, частота таких случаев варьирует от 5 до 17 % [8, 26]. С другой стороны, клинические проявления лейшманиоза у собак с ТВС сравнимы с симптомами у инфицированных животных в эндемичных областях, где лейшма-ниоз обычно протекает в легкой или умеренной форме за счет естественной резистентности организма [27]. Влияния ТВС на клиническую картину лейшма-ниоза не выявлено.

Интересным аспектом при ТВС на фоне лейшма-ниоза является возможность заражения паразитами опухолевой ткани и самих опухолевых клеток [2, 6, 14]. Простейшие, переносящиеся макрофагами, способны распространяться в ткани вокруг опухоли и в последующем заражать их. Случаи обнаружения лейш-маний в мазких ТВС можно объяснить пассивным транспортом из соседних пораженных зон, что было подтверждено результатами исследования людей с лейшманиозом и саркомой Капоши [11]. В небольшом числе описанных здесь случаев (2 и 5) в ткани опухоли была обнаружена значительная концентрация паразитов. Определенно, что такому проникновению паразитов способствует иммунофенотип гистиоцитов ТВС [2], обусловливающий благоприятное микро-

окружение для паразитов. Паразитические лейшма-нии способны проникать в опухолевые клетки, однако в цитоплазме было обнаружено лишь несколько амастигот (3-4). В частности, во время стабильной фазы и фазы регресса наблюдается сильная инфильтрация ТВС воспалительными клетками, в том числе макрофагами, что вызывает иммунную реакцию против чужеродных клеток [28]. Таким образом, в этих условиях ткань ТВС более чувствительна к заражению паразитами [6]. Гипотетический перенос опухолевых клеток, содержащих паразитов, другим собакам может представлять собой альтернативный способ заражения лейшманиозом [14], имеющий, по нашему мнению, ограниченное эпизоотологическое значение.

В настоящем исследовании использовалась простая и чувствительная методика иммуногистохимическо-го окрашивания, позволявшая идентифицировать паразитов в ткани опухоли, плохо видимых в обычном гистологическом препарате.

Альтернативным методом является цитологическое исследование, позволяющее обнаруживать амас-тиготы лейшманий с высокой чувствительностью, однако отрицательный результат не исключает наличия паразитов в крови. Насколько известно авторам, ТВС -единственное новообразование собак, которое может содержать значительные количества L. Infantum.

Благодарности

Мы выражаем благодарность Элизабет Марчисон, Альберто Фассати и Марии Грациа Пенниси за полезное обсуждение.

Конфликт интересов

Ни один из авторов данной статьи не состоит в финансовых или личных взаимоотношениях с другими лицами или организациями, способными повлиять на точность информации и содержание работы.

Литература

1. Ajello P. Il tumore di Sticker // Annali della Facolta dl Medicina Veterlnarla dl Messina, 1980, 17, 289-339.

2. Albanese F., Poli A., Millanta F. & Abramo F. Primary cutaneous extragenital canine transmissible venereal tumour with Leishmania-laden neoplastic cell: a further suggestion of histiocytic origin? // Veterinary Dermatology, 2002, 13, 243-246.

3. Bourdoiseau G., Marchal T. & Magnol J. P. Immunohistochemical detection of Leishmania infantum in formalin-fixed, paraffin-embedded section of canine skin and lymph nodes // Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 1997, 9, 439-440.

4. Bunn-Moreno M.M., Madeira E.D., Miller K., Menezes J.A. & Campos-Neto A. Hypergammaglobulinemia in Leishmania dovani infected hamsters: possible association with polyclonal activator of B cells and with suppression of T cell function // Clinical & Experimental Immunology, 1985, 59, 427-434.

5. Calvert C.A., Leifer C.E. & MacEwen E.G. Vincristine for treatment of transmissible venereal tumor in the dog // Journal of the American Veterinary Medical Association, 1982, 181, 163-164.

6. Catone G., Marino G., Poglayen G., Gramiccia M., Ludovisi A. & Zanghi A. Canine transmissible venereal tumour parasitized by Leishmania infantum // Veterinary Research Communications, 2003, 27, 549-553.

7. Cohen D. Detection of humoral antibody to the transmissible venereal tumour of the dog // International Journal of Cancer, 1972, 10, 207-212.

8. Cohen D. The canine transmissible venereal tumor: a unique result of tumor progression // Advances in Cancer Research, 1985, 43, 75-112.

9. Denerolle P. & Bourdoiseau G. Combination allopurinol and antimony treatment versus antimony alone and allopurinol alone in the treatment of canine leishmaniasis (96 cases) // Journal of Veterinary Internal Medicine, 1999, 13, 413-415.

10. Font A., Roura X., Fondavila D., Closa J.M., Mascort J. & Ferrer L. Canine mucosal leishmaniasis // Journal of the American Animal Hospital Association, 1996, 32, 131-137.

11. Gallego M.A., Aguillar A., Plaza S., Gomez J. M., Burgos F., Agud J.L., Marco J. & Garcia C. Kaposi’s sarcoma with an intense parasitization by Leishmania // Cutis, 1996, 57, 103-104.

12. Ho M., Leeuwenburg J., Mbugua G., Wamachi A. & Voller A. An enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) for field diagnosis of visceral leishmaniasis // The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 1983, 32, 943-946.

13. Idowu A.L. A retrospective evaluation of four surgical methods of treating canine transmissible venereal tumour // Journal of Small Animal Practice, 1984, 25, 193-198.

14. Levy E., Mylonakis M.E., Saridomichelakis M.N., Polizopoulou, Z.S., Psychogios V. & Koutinas A.F. Nasal and oral masses in a dog // Veterinary Clinical Pathology, 2006, 35, 115-118.

15. Lohoff M., Matzner C. & Rollinghoff M. Polyclonal B cell stimulation by L374+ T cells in experimental leishmaniasis // Infection and Immunity, 1988, 56, 2120-2124.

16. Marchal T., Chabanne L., Kaplanski C., Rigal D. & Magnol J.P. Immunopheno-type of the canine transmissible venereal tumour // Veterinary Immunology and Immunopathology, 1997, 57, 1-11.

17. Marconato L. & del Piero F. Oncologia medica dei piccoli animali. Milano, Italy: Poletto Editore, 2005.

18. Marino G., Barna A., Quartuccio M., Cristarella S., Ajello A. & Zanghi A. Alternative vincristine treatment in dogs with transmissible venereal tumour // Veterinaria, 2008, 22, 13-18.

19. Miro G., Cardoso L., Pennisi M.G., Oliva G. & Baneth G. Canine leishmaniosis -new concepts and insights on an expanding zoonosis: part two // Trends in Parasitology, 2008, 24, 371-377.

20. Mozos E., Mendez A., Gomez-Villamandos J.C., Martin de las Mulas J. & Perez J. Immunohistochemical characterization of canine transmissible venereal tumour // Veterinary Pathology, 1996, 33, 257-263.

21. Mukaratirwa S., Chiwome T., Chitanga S. & Bhebhe E. Canine transmissible venereal tumour: assessment of mast cell numbers as indicators of the growth phase // Veterinary Research Communications, 2006, 30, 613-621.

22. Mukaratirwa S. & Gruys E. Canine transmissible venereal tumour: cytogenetic origin, immunophenotype, and immunobiology. A review // Veterinary, Quarterly 2003, 25, 101-111.

23. Murgia C., Pritchard J.K., Kim S.Y., Fassati A. & Weiss R.A. Clonal origin and evolution of a transmissible cancer // Cell, 2006, 126, 477-487.

24. Noli C. & Auxilia S.T. Treatment of canine Old World visceral leishmaniasis: a systematic review // Veterinary Dermatology, 2005, 16, 213-232.

25. Panaro M.A., Brandonisio O., de Caprariis D., Cavallo P., Cianciulli A., MitoloV. & Otranto D. Canine leishmaniasis in Southern Italy: a role for nitric oxide released from activated macrophages in asymptomatic infection? // Parasites & Vectors, 2008, 1, 10.

26. Rogers K.S. Transmissible venereal tumor // Compendium on Continuing Education for the Practicing Veterinarian, 1997, 19, 1036-1045.

27. Solano-Gallego L., Koutinas A., Miro G., Cardoso L., Pennisi M.G., Ferrer L., Bourdeau P., Oliva G. & Baneth G. Directions for the diagnosis, clinical staging, treatment and prevention of canine leishmaniosis // Veterinary Parasitology, 2009, 165, 1-18.

28. Yang T.J., Chandler J.P. & Dunne-Anway S. Growth stage dependent expression of MHC antigens on the canine transmissible venereal sarcoma // British Journal of Cancer, 1987, 55, 131-134.