СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ
METHOD FOR PRODUCTION OF ENZYME PREPARATION OF PROTEOLYTIC ACTION

Предлагаемое изобретение относится к области пищевой биотехнологии, в частности к способу получения ферментных препаратов, которые используются в пищевой промышленности для ускорения процесса созревания рыбной продукции.
Отходы от переработки рыб, богатые протеолитическими ферментами, являются доступным и дешевым сырьем для получения ферментных препаратов. Протеолитические ферменты, полученные из природного сырья, практически не вызывают побочных явлений при их применении, поэтому могут быть использованы в пищевой промышленности для улучшения качества производимых продуктов питания.
Известен способ получения ферментного препарата протеолитического действия из внутренностей свежих или мороженых рыб (Патент RU 1339917, МПК А23В 4/023, C12N 9/64, опубл. 15.07.1994 г.).
Способ предусматривает измельчение внутренностей (без половых продуктов) свежих или мороженых рыб (сельди иваси, сельди тихоокеанской, скумбрии и других созревающих рыб), консервирование путем добавления хлористого натрия в количестве 6-8% к массе сырья, выдерживание при естественном физиологическом значении рН при температуре 0-25°C в течение 2-3 ч (процесс автолиза) и центрифугирование для отделения жидкой фракции, представляющей собой ферментный препарат.
Недостатком данного способа является проведение автолиза без дополнительного внесения жидкой фракции, что снижает выход ферментного препарата. Применение в качестве консерванта хлористого натрия значительно ограничивает область применения ферментного препарата и снижает активность протеолитических ферментов, имеющих белковую природу. Отсутствие в технологии очистки жидкого ферментного препарата от липидов значительно ускоряет процесс окисления, а, следовательно, снижает качество готового продукта и уменьшает сроки его хранения.
Известен способ получения ферментного препарата протеолитического действия из внутренностей свежих или мороженых рыб без половых продуктов, включающий измельчение сырья, консервирование его хлористым натрием, выдерживание сырья при 25°C в течение 2-3 часов при естественном физиологическом значении рН и отделение жидкой фракции фермента центрифугированием (Патент RU 1339917, C12N 9/64, опубл. 15.07.1994 г.).
Однако протеолитическая активность полученного ферментного препарата низкая и составляет 3,5 ед/г. Кроме того, ферментный препарат содержит балластные белки, микрофлору и соли, т.к. способ не предусматривает стадию очистки.
Известен способ получения протеолитического ферментного препарата из внутренних органов рыб. Измельченное сырье подвергают автолизу в присутствии воды при гидромодуле 1:0,5 при рН 6,2±0,2 в течение 1-5 часов. После проведения автолиза жидкий автолизат, содержащий протеолитические ферменты, отделяют центрифугированием и подвергают очистке изопропиловым спиртом при гидромодуле 3:1 в течение 30-40 минут. Полученный в результате очистки жидкий ферментный препарат высушивают при температуре 150-180°C в течение 5-8 секунд (патент RU 2288951, C12N 9/64, опубл. 10.12.2006 г.).
Недостатками способа является использование изопропилового спирта, которое приводит к частичной потере ферментами каталитической активности, а высокая температура сушки приводит к частичной инактивации ферментов. В результате протеолитическая активность полученного препарата низкая и составляет не более 2,7 ед/г.
Наиболее близким аналогом заявляемого технического решения (прототипом) заявитель считает способ, включающий измельчение внутренних органов свежих или мороженых рыб океанического промысла (сельди иваси, сельди тихоокеанской, лососевых, скумбрии, мойвы, терпуга и других созревающих рыб), консервирование их хлористым натрием в количестве 6-8% к массе сырья, выдерживание гидролизуемой массы при естественном физиологическом значении рН при температуре 0-25°C в течение 2-3 часов и отделение жидкой фракции фермента центрифугированием. В условиях предлагаемой технологии сохраняется активность жидкого ферментного препарата в щелочной, нейтральной и кислой зонах рН. В результате проведенных исследований был получен ферментный препарат с повышенной протеолитической активностью за счет расширения рН-диапазона его действия (Патент RU 1339917, C12N 9/64, опубл. 15.07.1994 г.).
Данный способ осуществляет гидролиз внутренностей для выделения ферментного препарата без воды, что снижает выход ферментного препарата, не проводит очистку жидкого ферментного препарата от примесей, содержащихся в жидкой части и снижающих активность полученных протеолитических ферментов, а также его высушивание, что увеличивает затраты на расфасовку и упаковку препарата, его транспортировку и хранение.
Изобретение решает задачу повышения эффективности способа получения ферментного препарата, позволяя увеличить выход препарата и повысить его активность из внутренностей мороженых пресноводных рыб без половых продуктов, а именно, из судака и леща, имеющих в настоящее время промысловое значение в Калининградской области, за счет подбора опытным путем оптимальных параметров процесса автолиза и применения дополнительного средства его активации.
Для получения необходимого технического результата в способе получения протеолитического ферментного препарата из внутренностей мороженых рыб без половых продуктов, включающем измельчение сырья, выдерживание, отделение жидкой фракции фермента центрифугированием, консервирование хлористым натрием, предлагается в качестве сырья использовать внутренности судака или леща, которые предлагается выдерживать при гидромодуле 1:1 в течение 5-5,5 ч при температуре 38-43°C, причем внутренности судака выдерживать при рН 2,5, а внутренности леща - при рН 9,5, кроме того, в процессе выдерживания предлагается проводить ультразвуковую обработку в течение 4-5 мин с частотой 50 кГц, а полученный жидкий ферментный препарат обезжиривать и консервировать.
На прилагаемых к описанию графических материалах изображено:
на фиг. 1 - влияние ультразвуковой обработки сырья на протеолитическую активность ферментных препаратов;
на фиг. 2 - активность ферментных препаратов при различных температурах при термостатировании в течение 2 часов;
на фиг. 3 - активность (количество) ферментов, активных при различных уровнях рН (по методу Ансона), в ферментных препаратах из внутренних органов леща и судака.
На графиках приняты следующие обозначения:
1 - ферментный препарат из внутренностей леща;
2 - ферментный препарат из внутренностей судака.
Оптимальную температуру и термоустойчивость ферментного препарата из внутренних органов рыб определяли на основе фиксирования методом формольного титрования прироста азота свободных аминогрупп при воздействии фермента на субстрат - мышечную ткань салаки.
В фильтратах, освобожденных от белков при нагревании и последующем фильтровании образцов (контрольных и опытных), определяли азот концевых аминогрупп (амино-аммиачный азот) методом формольного титрования (по ГОСТ 7636-85).
Как видно из данных фиг. 2, ферментный препарат из внутренностей леща имеет наивысшую ферментативную активность при температуре 50°C, а ферментный препарат из внутренних органов судака - при температуре 35°C. Также можно заметить, что у ферментного препарата из внутренних органов судака активность остается постоянной при температурах от 35 до 55°C. Отсюда следует, что ферментный препарат из внутренних органов судака можно использовать в достаточно длинном ферментативном гидролизе сырья (протеины, кератин, коллаген).
Активность протеолитических ферментов в ферментных препаратах из внутренностей судака и леща при различных уровнях рН представлена на фиг 3.
Как показывает данный график (фиг. 3), активность протеолитических ферментов в препаратах проявляется при всех уровнях рН, но наибольшая активность для комплекса из судака при рН 2,5 (2,5 ед/г). Несколько ниже, но достаточно высокая активность в слабокислой зоне (при рН 5,5-2,0 ед/г). Это свидетельствует, что в продукте из внутренних органов судака преобладают кислые и слабокислые протеиназы. Присутствуют также нейтральные и щелочные протеиназы, т.е препарат комплексный.
У протеолитического комплекса из леща максимальная активность наоборот при рН 9,5 (3,3 ед/г). Активность эта выше, чем у препарата из судака при всех значениях рН, начиная с рН 6,4. В нейтральной зоне рН (рН 7,2) также фиксируется ферментативная активность комплекса из леща (1,5 ед/г), что равно максимальной активности кислых протеиназ судака.
Отсюда следует, что ферментный препарат из внутренних органов судака и леща можно будет использовать в производстве созревающей продукции (пресервов), так как пресервы в основном имеют рН 6,5 за исключением пресервов в маринадной заливке.
При сравнении с прототипом предлагаемые режимы получения ферментного препарата повышают его ферментативную активность с 2,5 ед./г при рН 6,0-7,0, указанную в прототипе, до 3,5-4,5 ед./г. При предлагаемых физиологических значениях рН 2,5 и 9,5, увеличивают выход ферментного препарата с 47% (указанный в прототипе) до 55,6% в данном способе из внутренних органов судака и до 56,7% из внутренних органов леща.
Определение протеолитической активности (ПА) ферментного препарата проводилось модифицированным методом Ансона (ГОСТ 20264.2-88). Данная методика основана на гидролизе казеината натрия исследуемым ферментным препаратом при температуре термостатирования 30°C в течение 10 мин. до образования пептидов и аминокислот при различных уровнях рН (2,5; 5,5; 7,2; 9,5) и с последующим их определением.
Эффективность процесса автолиза оценивалась по количеству гидролизованного белка (глубине гидролиза), выраженному в ед./г., и рассчитывалась по следующей формуле:
где:
D - оптическая плотность исследуемого раствора;
4 - отношение объемов реакционной смеси и раствора гомогената после добавления трихлоруксусной кислоты (ТХУ);
3
ТЭ - тирозиновый эквивалент, определяемый по градуировочному графику, мкмоль/см;
10 - продолжительность гидролиза субстрата, мин;
3
m - масса гомогената, взятая на протеолиз (расчет ведется на 1 см раствора гомогената), мг;
1000 - переводной коэффициент полученных единиц на 1 г гомогената.
Примеры осуществления данного способа:
Пример 1. 1 кг внутренних органов судака после разделки и очистки от ожирков замораживали при температуре - 18°C. Затем сырье измельчали и подвергали автолизу в присутствии растворов слабых кислот при гидромодуле 1:1 при температуре 38°C в течение 5,5 часов с рН, 2,5±0,2 и без ультразвуковой обработки, потом отделяли непроферментированный остаток центрифугированием при 2800-3000 оборотах в минуту, далее жидкий автолизат подвергали очистке в сепараторе с частотой вращения барабана 6500 об/мин при температуре 30°C, в дальнейшем жидкий раствор ферментного препарата консервировали хлоридом натрия в соотношении 10% от массы сырья.
Характеристика продукта: однородный раствор, без посторонних включений, цвет светло - желтый, запах рыбный, без порочащих признаков, протеолитическая активность (ПА), 1,8 ед./г; выход ФП (ферментного препарата), % - 40,1.
Пример 2. 1 кг внутренних органов судака после разделки и очистки от ожирков замораживали при температуре - 18°C. Затем сырье измельчали и подвергали автолизу в присутствии растворов слабых кислот при гидромодуле 1:1 при температуре 38°C в течение 5,5 часов с рН, 2,5±0,2 и при ультразвуковой обработке в течение 2 мин с частотой 50 кГц, потом отделяли непроферментированный остаток центрифугированием при 2800-3000 оборотах в минуту, далее жидкий автолизат подвергали очистке в сепараторе с частотой вращения барабана 6500 об/мин при температуре 30°C, в дальнейшем жидкий раствор ферментного препарата консервировали хлоридом натрия в соотношении 10% от массы сырья.
Характеристика продукта: однородный раствор, без посторонних включений, цвет светло - желтый, запах рыбный, без порочащих признаков, протеолитическая активность (ПА), 2,7 ед./г; выход ФП (ферментного препарата), % - 47,3.
Пример 3. 1 кг внутренних органов судака после разделки и очистки от ожирков замораживали при температуре - 18°C. Затем сырье измельчали и подвергали автолизу в присутствии растворов слабых кислот при гидромодуле 1:1 при температуре 38°C в течение 5,5 часов с рН, 2,5±0,2 и при ультразвуковой обработке в течение 4 мин с частотой 50 кГц, потом отделяли непроферментированный остаток центрифугированием при 2800-3000 оборотах в минуту, далее жидкий автолизат подвергали очистке в сепараторе с частотой вращения барабана 6500 об/мин при температуре 30°C, в дальнейшем жидкий раствор ферментного препарата консервировали хлоридом натрия в соотношении 10% от массы сырья.
Характеристика продукта: однородный раствор, без посторонних включений, цвет светло - желтый, запах рыбный, без порочащих признаков, протеолитическая активность (ПА), 3,1 ед./г (в зависимости от времени года); выход ФП (ферментного препарата), % - 55,6.
Пример 4. 1 кг внутренних органов судака после разделки и очистки от ожирков замораживали при температуре - 18°C. Затем сырье измельчали и подвергали автолизу в присутствии растворов слабых кислот при гидромодуле 1:1 при температуре 38°C в течение 5,5 часов с рН, 2,5±0,2 и при ультразвуковой обработке в течение 6 мин с частотой 50 кГц, потом отделяли непроферментированный остаток центрифугированием при 2800-3000 оборотах в минуту, далее жидкий автолизат подвергали очистке в сепараторе с частотой вращения барабана 6500 об/мин при температуре 30°C, в дальнейшем жидкий раствор ферментного препарата консервировали хлоридом натрия в соотношении 10% от массы сырья.
Характеристика продукта: однородный раствор, без посторонних включений, цвет светло - желтый, запах рыбный, без порочащих признаков, протеолитическая активность (ПА), 3,7 ед./г (в зависимости от времени года); выход ФП (ферментного препарата), % - 58,5.
Пример 5. 1 кг внутренних органов судака после разделки и очистки от ожирков замораживали при температуре - 18°C. Затем сырье измельчали и подвергали автолизу в присутствии растворов слабых кислот при гидромодуле 1:1 при температуре 38°C в течение 5,5 часов с рН, 2,5±0,2 и при ультразвуковой обработке в течение 8 мин с частотой 50 кГц, потом отделяли непроферментированный остаток центрифугированием при 2800-3000 оборотах в минуту, далее жидкий автолизат подвергали очистке в сепараторе с частотой вращения барабана 6500 об/мин при температуре 30°C, в дальнейшем жидкий раствор ферментного препарата консервировали хлоридом натрия в соотношении 10% от массы сырья.
Характеристика продукта: однородный раствор, без посторонних включений, цвет светло - желтый, запах рыбный, без порочащих признаков, протеолитическая активность (ПА), 2,5 ед./г (в зависимости от времени года); выход ФП (ферментного препарата), % - 48,8.
Пример 6. 1 кг внутренних органов леща после разделки и очистки от ожирков замораживали при температуре - 18°C. Затем сырье измельчали и подвергали автолизу в присутствии растворов слабых кислот при гидромодуле 1:1 при температуре 43°C в течение 5 часов с рН, 9,5±0,2 и без ультразвуковой обработки, потом отделяли непроферментированный остаток центрифугированием в течение 2800-3000 оборотов в минуту, далее жидкий автолизат подвергали очистке в сепараторе с частотой вращения барабана 6500 об/мин при температуре 30°C, в дальнейшем жидкий раствор ферментного препарата консервировали хлоридом натрия в соотношении 10% от массы сырья.
Характеристика продукта: однородный раствор, без посторонних включений, цвет светло - коричневый, запах рыбный, без порочащих признаков, протеолитическая активность (ПА) - 1.6 ед./г; выход ФП (ферментного препарата), % - 39,7.
Пример 7. 1 кг внутренних органов леща после разделки и очистки от ожирков замораживали при температуре - 18°C. Затем сырье измельчали и подвергали автолизу в присутствии растворов слабых кислот при гидромодуле 1:1 при температуре 43°C в течение 5 часов с рН, 9,5±0,2 и при ультразвуковой обработке в течение 2 мин с частотой 50 кГц, потом отделяли непроферментированный остаток центрифугированием в течение 2800-3000 оборотов в минуту, далее жидкий автолизат подвергали очистке в сепараторе с частотой вращения барабана 6500 об/мин при температуре 30°C, в дальнейшем жидкий раствор ферментного препарата консервировали хлоридом натрия в соотношении 10% от массы сырья.
Характеристика продукта: однородный раствор, без посторонних включений, цвет светло - коричневый, запах рыбный, без порочащих признаков, протеолитическая активность (ПА) - 2.6 ед./г; выход ФП (ферментного препарата), % - 45,1.
Пример 8. 1 кг внутренних органов леща после разделки и очистки от ожирков замораживали при температуре - 18°C. Затем сырье измельчали и подвергали автолизу в присутствии растворов слабых кислот при гидромодуле 1:1 при температуре 43°C в течение 5 часов с рН, 9,5±0,2 и при ультразвуковой обработке в течение 4 мин с частотой 50 кГц, потом отделяли непроферментированный остаток центрифугированием в течение 2800-3000 оборотов в минуту, далее жидкий автолизат подвергали очистке в сепараторе с частотой вращения барабана 6500 об/мин при температуре 30°C, в дальнейшем жидкий раствор ферментного препарата консервировали хлоридом натрия в соотношении 10% от массы сырья.
Характеристика продукта: однородный раствор, без посторонних включений, цвет светло - коричневый, запах рыбный, без порочащих признаков, протеолитическая активность (ПА) - 3.2 ед./г; выход ФП (ферментного препарата), % - 50,8.
Пример 9. 1 кг внутренних органов леща после разделки и очистки от ожирков замораживали при температуре - 18°C. Затем сырье измельчали и подвергали автолизу в присутствии растворов слабых кислот при гидромодуле 1:1 при температуре 43°C в течение 5 часов с рН, 9,5±0,2 и при ультразвуковой обработке в течение 5 мин с частотой 50 кГц, потом отделяли непроферментированный остаток центрифугированием в течение 2800-3000 оборотов в минуту, далее жидкий автолизат подвергали очистке в сепараторе с частотой вращения барабана 6500 об/мин при температуре 30°C, в дальнейшем жидкий раствор ферментного препарата консервировали хлоридом натрия в соотношении 10% от массы сырья.
Характеристика продукта: однородный раствор, без посторонних включений, цвет светло - коричневый, запах рыбный, без порочащих признаков, протеолитическая активность (ПА) - 3.5 ед./г; выход ФП (ферментного препарата), % - 56,7.
Пример 10. 1 кг внутренних органов леща после разделки и очистки от ожирков замораживали при температуре - 18°C. Затем сырье измельчали и подвергали автолизу в присутствии растворов слабых кислот при гидромодуле 1:1 при температуре 43°C в течение 5 часов с рН, 9,5±0,2 и при ультразвуковой обработке в течение 8 мин с частотой 50 кГц, потом отделяли непроферментированный остаток центрифугированием в течение 2800-3000 оборотов в минуту, далее жидкий автолизат подвергали очистке в сепараторе с частотой вращения барабана 6500 об/мин при температуре 30°C, в дальнейшем жидкий раствор ферментного препарата консервировали хлоридом натрия в соотношении 10% от массы сырья.
Характеристика продукта: однородный раствор, без посторонних включений, цвет светло - коричневый, запах рыбный, без порочащих признаков, протеолитическая активность (ПА) - 2.4 ед./г; выход ФП (ферментного препарата), % - 46,2.
Наиболее оптимальным способом получения ферментного препарата из внутренних органов судака и леща являются примеры 4 и 9, так как они имеют наибольшую ПА и достаточный выход ферментного препарата. В процессе увеличения ультразвуковой обработки ферментные комплексы разрушаются.