СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ РОДА Vibrio
METHOD OF IDENTIFYING Vibrio BACTERIA

Изобретение относится к области микробиологии. Может быть использовано при бактериологических исследованиях по идентификации бактерий рода Vibrio и производстве диагностических препаратов для этих исследований.
Известен способ вибриостатического теста с использованием в качестве вибриостатического вещества препарата O129 (2,4-diamino-6,7-diisopropyl-pteridine phosphate) в бумажных дисках по 10 мкг и 150 мкг. Вибриостатический тест применяется при бактериологическом исследовании по идентификации видов Vibrio после определения морфологии чистой культуры при окраске по Граму (грамотрицательные изогнутые палочки) и выявления у бактерий оксидазы. По результатам вибриостатического теста определяется принадлежность бактерий к роду Vibrio и они распределяются по группам видов Vibrio: чувствительные к 10 мкг и 150 мкг O129 - V. cholerae, V. vulnificus, Vibrio spp.; устойчивые к 10 мкг и 150 мкг O129 - бактерии рода Aeromonas или V. cholerae О1, V. cholerae О139; устойчивые к 10 мкг, чувствительные к 150 мкг O129 - V. parahaemolyticus, V. alginolyticus и другие. Окончательная идентификация видов проводится дополнительно коммерческими тест-системами биохимической идентификации и сыворотками к О1 и O139 антигенам V.cholerae (Health Protection Agency. 2011. Identification of Vibrio species. UK Standards for Microbiology Investigations. ID 19. Issue 2.1.P.4). Примечание к способу. Методика постановки вибриостатического теста с вибриостатическим веществом О129 (2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridine phosphate salt) CAS No 84176-65-8. Используют бумажные диски, содержащие 10 мкг и 150 мкг O129 на диск (производства фирм Oxoid, Dalynn Biologicals, Hi-Media). Свежую чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают стерильным тампоном на чашки с неселективной питательной средой (кровяной агар с 0,5% хлорида натрия), чтобы получить сплошной рост; асептично размещают на поверхности среды диски с 10 мкг O129 и 150 мкг O129 на удалении друг от друга; инкубируют в аэробных условиях при 35°С в течение 24 ч, затем отмечают наличие зон подавления роста бактерий и интерпретируют результаты: чувствительность - есть зоны подавления роста бактерий вокруг обоих дисков; частичная чувствительность - нет зоны подавления роста вокруг диска 10 мкг, есть зона подавления роста вокруг диска 150 мкг; устойчивость - нет зон подавления роста бактерий вокруг обоих дисков. Контроли: Vibrio metschnikovii ATCC 7708 - чувствительный; Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 - частичная чувствительность; Aeromonas hydrophila ATCC 49140 - устойчивый (Dalynn Biologicals. Diagnostic Microbiology Catalogue. 2005. No DD 10.11.0129 Disks).
Прототипом заявляемого способа вибриостатического теста нами избран указанный выше аналог по Health Protection Agency. 2011. Identification of Vibrio species. UK Standards for Microbiology Investigations. ID 19. Issue 2.1. P.4 с использованием вибриостатического вещества О129 и методикой его применения по инструкции Dalynn Biologicals. Diagnostic Microbiology Catalogue. 2005. No DD 10.11.0129 Disks. Прототип является наиболее современным стандартизованным способом, наиболее близок заявляемому способу по совокупности существенных признаков и объективно указывает недостатки вибриостатического теста, которые устраняются заявляемым способом.
Недостатком прототипного способа является низкая диагностическая чувствительность вибриостатического теста, ввиду перекрестной устойчивости вибрионов к вибриостатическому веществу O129 и антибактериальному препарату триметоприму, входящему в состав лекарственного препарата ко-тримоксазол - 82,7% штаммов V.cholerae O1, выделенных в Индии от больных холерой, устойчивы к вибриостатику O129 и ко-тримоксазолу (Rama-murthy Т., Pal A., Pal S.C., Nair G.B. Taxonomic implications of the emergence of high frequency of occurrence of 2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridine - resistant strains of Vibrio cholerae from clinical of cholera in Calcuta, India.- J. Clin. Mi-crobiol. - 1992. - Vol.30. - No 3. - P. 742-743. Выявлены также штаммы с перекрестной устойчивостью к O129 и ко-тримоксазолу среди V.cholerae не О1 (Abbott S.L., Cheung W.K., Portoni B.A., Janda J.M. Isolations of vibriostatic agent O129 - resistant Vibrio cholerae non - 1 from a patient with gastroenteritis. - J. Clin. Microbiol. - 1992. - Vol.30. No 6. - P. 1598-1599).
Целью изобретения является повышение диагностической чувствительности вибриостатического теста при идентификации бактерий рода Vibrio.
В соответствии с изобретением поставленная цель достигается тем, что после предварительного отбора материала, подлежащего исследованию, - чистой культуры грамотрицательных, палочковидных, ферментирующих глюкозу, оксидазопозитивных или оксидазоотрицательных бактерий засевают суточную культуру исследуемых бактерий на поверхность неселективного питательного агара (ГРМ-агар) с 1% хлорида натрия; размещают на засеянной поверхности бумажный диск, содержащий 10 мкг или 16 мкг вибриостатического вещества никлозамид (2,5-dichloro-4-nitrosalicylanilide); инкубируют посевы в аэробных условиях при 35°С или 28°С в течение 24 ч; определяют принадлежность бактерий к роду Vibrio по наличию вокруг диска зоны подавления роста бактерий.
Примечание
1. Контроли вибриостатического теста: Vibrio metschnikovii 5H - чувствительный (наличие зоны подавления роста бактерий вокруг диска), Aeromonas caviae 12H - устойчивый (отсутствие зоны подавления роста бактерий вокруг диска).
2. ГРМ - агар (питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой, производства Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии, г.Оболенск, Россия). Состав г/л: панкреатический гидролизат рыбной муки - 12,0; пептон ферментативный - 12,0; хлорид натрия - 6,0; агар микробиологический - 12,0; рН 7,1 - 7,5. Для доведения содержания хлорида натрия до 1% следует добавить 4 г/л хлорида натрия. Приготовление питательного агара из сухой среды - по инструкции к препарату.
3. Методика приготовления бумажных дисков с никлозамидом. Используются диски диаметром 6 мм из картона фильтровального технического (ГОСТ 6722-75) производства НИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург; коммерческий препарат «Фенасал» (Niclosamide, CAS No 50-60-7) производства (Mainland,China); растворитель диметилсульфоксид (CAS No 67-68-5). Навеску фенасала 10 мг или 16 мг помещают в стерильную ступку, добавляют 10 мл диметилсульфоксида и растворяют при растирании препарата. Полученный раствор прозрачный, желтой окраски содержит 1000 мкг/мл или 1600 мкг/мл никлозамида. Вносят микропипеткой по 10 мкл раствора никлозамида на один диск, то есть диск содержит 10 мкг или 16 мкг никлозамида. На контрольные диски вносят по 10 мкл растворителя диметилсульфоксида. Диски высушивают в термостате при 37°С в течение 24 ч, затем помещают во флаконы с силикагелем, хранят при 4°С-8°С. Срок годности дисков 6 месяцев. Контроли дисков с никлозамидом при изготовлении: V. metschnikovii 5H - чувствительный (наличие зоны подавления роста бактерий вокруг диска), A. caviae 12H - устойчивый (отсутствие зоны подавления роста бактерий вокруг диска); оба контрольных тест-штамма не имеют зон подавления роста бактерий вокруг контрольного диска, содержащего только растворитель диметилсульфоксид.
Отличительный существенный признак способа - использование в вибриостатическом тесте в качестве вибриостатического вещества никлозамида (2,5-dichloro-4-nitrosalicylanilide) в количестве 10-16 мкг на диск.
Отличительный существенный признак не применялся в прототипе и не известен из уровня техники. Никлозамид (коммерческий лекарственный препарат «Фенасал») был известен как антигельминтный препарат, который применялся в медицинской практике для лечения кишечных цестодозов - Машковский М.Д. Лекарственные средства (пособие по фармакотерапии для врачей). Часть II. - М.: Медицина, 1977. С.332-333. Нами впервые было выявлено его избирательное антимикробное действие на грамположительные микроорганизмы, на основе которого было создано изобретение по использованию этого препарата в составе питательных сред для выделения грамотрицательных энтеробактерий (Сиволодский Е.П. Авторское свидетельство СССР №1386660 на изобретение «Способ выделения бактерий семейства Entrobacteriaceae». Заявлено 24.12.1985. Опубл. 07.04.1988. Бюл. №13. С.124). Чувствительность вибрионов к этому препарату не изучалась. Только недавно нами была обнаружена избирательная чувствительность к этому препарату вибрионов среди других грамотрицательных бактерий. Об этом впервые сообщается в данной заявке на изобретение (таблица 1).
Отличительный существенный признак не следует явным образом из уровня техники. Не были известны преимущества нового вибриостатического препарата никлозамида в отношении известного вибриостатика O129, определившие достижение технического результата заявляемого изобретения. Не была известной чувствительность к никлозамиду наиболее важных в патологии человека видов вибрионов V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus. Нами впервые на основе изучения многих штаммов V. metschnikovii (28 штаммов), выделенных из реки Невы, были выявлены штаммы V. metschnikovii, устойчивые к вибриостатику O129 (3 штамма). При этом все штаммы, устойчивые к вибриостатику O129 (Oxoid) 150 мкг, а также все остальные штаммы V. metschnikovii были чувствительными к вибриостатику никлозамиду, что свидетельствует о более высокой диагностической чувствительности вибриостатического теста с никлозамидом. Нами установлена также пригодность вибриостатического теста с никлозамидом для изучения вибрионов V. cholerae non O1/non О139, V. parahaemolyticus, V. vulnificus (таблица 2). Выявлено также отсутствие ложноположительных результатов в вибриостатических тестах с никлозамидом и O129 у всех 26 исследованных штаммов 5 видов бактерий рода Aeromonas {A. caviae, A. popoffii, A. salmonicida, A. bestiarum, A. hydrophila).
Отличительный существенный признак способа непосредственно определяет достижение поставленной цели. Нами установлено, что все три штамма V. metschnikovii, устойчивые к вибриостатику O129, имели перекрестную устойчивость к ко-тримоксазолу (по дискодиффузионному методу с диском триметоприм/сульфаметоксазол 1,25/23,75), но были чувствительными к вибриостатику никлозамиду. При этом все остальные штаммы V. metschnikovii были чувствительными к обоим вибриостатикам (таблица 2). Этот научный факт свидетельствует не только о достижении в данном исследовании технического результата поставленной цели - повышения диагностической чувствительности вибриостатического теста, но и указывает на принципиальную возможность «реабилитации» вибриостатического теста в отношении других видов вибрионов, ввиду отсутствия у вибриостатика никлозамида перекрестной устойчивости к триметоприму (ко-тримоксазолу).
Таблица 1
Уровни чувствительности к никлозамину (2,5-dichloro-4-nitrosalicylanilide) на ГРМ - агаре с 1% хлорида натрия бактерий рода Vibrio и других родов грамотрицательных, ферментирующих глюкозу, оксидазоположительных или оксидазоотрицательных бактерий
Род, вид бактерий
Число изученных штаммов
МПК (мкг/мл)
Vibrio metschnikovii
28
1-6
Vibrio vulnificus*
1
6
Vibrio parahaemolyticus*
1
6
Vibrio cholerae non О1/non О139
2
4-8
Aeromonas caviae
17
64-более 64
Aeromonas popoffii
4
32-64
Aeromonas salmonicida
2
64
Aeromonas hydrophila
1
32
Aeromonas bestiarum
1
32
Escherichia coli
3
более 64
Shigella sonnet
3
более 64
Salmonella Enteritidis
3
более 64
Klebsiella pneumoniae
3
более 64
Klebsiella mobilis*
3
более 64
Enterobacter cloacae
3
более 64
Serratia marcescens*
3
более 64
Hafnia alvei*
3
более 64
Citrobacter freundii
3
более 64
Proteus mirabilis
3
более 64
Morganella morganii
3
более 64
Yersinia enterocolitica
3
более 64
Обозначение: * в том числе типовой штамм.
Таблица 2
Сравнительная диагностическая чувствительность идентификации вибрионов вибриостатиками никлозамид (2,5-dichloro-4-nitrosalicylanilide) и О129 на ГРМ-агаре с 1% хлорида натрия
Виды бактерий рода Vibrio
Число изученных штаммов
Вибриостатики
O129 (150 мкг/диск)
Никлозамид (10 мкг/диск)
из них чувствительных
чувствительность P±m%
из них чувствительных
чувствительность P±m%
V. metschnikovii
28
25*
89,2±5,8
28
100
V.parahaemolyticus **
1
1
1
V. vulnificus**
1
1
1
V. cholerae не О1/не O139
2
2
2
Всего
32
29
90,6±5,1
32
100
Обозначения. * 3 штамма имеют перекрестную устойчивость к O129 и ко-тримоксазолу, ** типовой штамм.
Существенными признаками заявляемого способа также являются: характеристика штаммов, подлежащих исследованию (грамотрицательные, палочковидные, ферментирующие глюкозу, оксидазоположительные или оксидазоотрицательные), что ограничивает диапазон исследуемых видов бактерий и включает все виды вибрионов; использование неселективного питательного агара (ГРМ-агара) с конечной концентрацией 1% хлорида натрия, что допускает выращивание негалофильных и галофильных вибрионов; инкубация посевов в аэробных условиях при 35°С.
Примеры, подтверждающие возможность осуществления способа.
Пример 1. Исследуемый материал - суточную бульонную культуру штамма №19, выделенного из реки Невы, содержащую грамотрицательные, палочковидные, ферментирующие глюкозу, оксидазоотрицательные бактерии, засевают стерильным тампоном на поверхность ГРМ-агара с 1% хлорида натрия, размещают на засеянной поверхности бумажный диск с 10 мкг никлозамида и бумажный диск с 150 мкг O129, инкубируют в аэробных условиях при 35°С в течение 24 ч, после чего учитывают результат: вокруг диска с 10 мкг никлозамида имеется зона подавления роста бактерий, вокруг диска с 150 мкг O129 нет зоны подавления роста бактерий. Контроли, проведенные по той же методике с контрольными штаммами: Vibrio metschnikovii 5Н - имеются зоны подавления роста бактерий вокруг дисков с 10 мкг никлозамина и 150 мкг O129; Aeromonas caviae 12H - нет зон подавления роста бактерий вокруг дисков с 10 мкг никлозамина и 150 мкг O129. Вывод: чувствительность штамма №19 к вибриостатику никлозамину указывает на его принадлежность к роду Vibrio, при этом выявлена приобретенная устойчивость к вибриостатику O129. Последующее изучение штамма дополнительными тестами видовой идентификации и чувствительности к антибиотикам установило его принадлежность к виду V. metschnikovii и устойчивость к ко-тримоксазолу.
-
Пример 2. Исследуемый материал - суточную бульонную культуру штамма V. cholerae не О1/ не O139 ctx А №9741, полученного из Северо-Западной противочумной станции, содержащую грамотрицательные, палочковидные, ферментирующие глюкозу, оксидазоположительные бактерии, засевают стерильным тампоном на поверхность ГРМ-агара с 1% хлорида натрия, размещают на засеянной поверхности бумажный диск с 10 мкг никлозамида, инкубируют при 28°С в течение 24 ч, после чего учитывают результат: вокруг диска с 10 мкг никлозамида имеется зона подавления роста бактерий. Контроли, проведенные по той же методике с контрольными штаммами: V. metschnikovii 5H - имеется зона подавления роста бактерий вокруг диска с 10 мкг никлозамида; A. caviae 12H - нет зоны подавления роста бактерий вокруг диска с 10 мкг никлозамида. Вывод: чувствительность штамма №9741 к вибриостатику никлозамину подтверждает его принадлежность к роду Vibrio и возможность исследования этим вибриостатическим тестом вибрионов вида V. cholerae.
Пример 3. Исследуемый материал - суточную бульонную культуру штамма V. parahaemolyticus РПЧИ 13580 (АТСС 17802), полученного из Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института, содержащую грамотрицательные, палочковидные, ферментирующие глюкозу, оксидазоположительные бактерии, засевают стерильным тампоном на поверхность ГРМ-агара с 1% хлорида натрия, размещают на засеянной поверхности бумажный диск с 10 мкг никлозамида, инкубируют при 35°С в течение 24 ч, после чего учитывают результат: вокруг диска с 10 мкг никлозамида имеется зона подавления роста бактерий. Контроли, проведенные по той же методике, соответствуют результатам примера 2. Вывод: чувствительность штамма V. parahaemolyticus РПЧИ 13580 (АТСС 17802) к вибриостатику никлозамиду подтверждает его принадлежность к роду Vibrio и возможность исследования этим вибриостатическим тестом вибрионов вида V. parphaemolyticus.
Пример 4. Исследуемый материал - суточную бульонную культуру штамма V. vulnificus РПЧИ 13344 (АТСС 27562), полученного из Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института, содержащую грамотрицательные, палочковидные, ферментирующие глюкозу, оксидазоположительные бактерии, засевают стерильным тампоном на поверхность ГРМ-агара с 1% хлорида натрия, размещают на засеянной поверхности бумажный диск с 16 мкг никлозамида, инкубируют при 35°С в течение 24 ч, после чего учитывают результат: вокруг диска с 16 мкг никлозамида имеется зона подавления роста бактерий. Контроли, проведенные по той же методике, соответствуют результатам примера 2. Вывод: чувствительность штамма V. vulnificus РПЧИ 13344 (АТСС 27562) к вибриостатику никлозамиду подтверждает его принадлежность к роду Vibrio и возможность исследования этим вибриостатическим тестом вибрионов вида V. vulnificus.
Таким образом, при всех предельных количествах вибриостатика никлозамида в дисках и вариантах температурного режима заявляемого способа получены достоверные результаты определения вибриостатическим тестом принадлежности исследуемых бактерий к роду Vibrio, в том числе видов V. metschnikovii, V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus. Способ идентификации бактерий рода Vibrio с использованием вибриостатика никлозамида позволяет выявлять принадлежность к вибрионам  штаммов, которые приобрели перекрестную устойчивость к вибриостатику O129 и ко-тримоксазолу, и поэтому повышает диагностическую чувствительность идентификации вибрионов.