МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ОТБОР РОДИТЕЛЬСКИХ ФОРМ САХАРНОЙ СВЁКЛЫ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ГИБРИДОВ С ПОВЫШЕННОЙ ПРОДУКТИВНОСТЬЮ

тш

Молекулярный отбор родительских форм сахарной свёклы для создания гибридов с повышенной продуктивностью

Н.Н. БОГАЧЕВА, канд. биолог. наук, Т.П. ФЕДУЛОВА, д-р биолог. наук, А.А. НАЛБАНДЯН, канд. биолог. наук

Введение

Селекция сельскохозяйственных культур на гетерозис является одним из актуальных направлений современных исследований. Идентификация форм, способных дать превосходное гибридное потомство, является одним из самых дорогих и трудозатратных этапов селекции, поэтому предсказание гибридного качества рассматривается как наиболее привлекательный аспект для исследователей, способный увеличить эффективность селекционных программ [5].

Для получения гибридов сахарной свёклы, как и других культур с выраженным гетерозисным эффектом в схемах скрещиваний, необходимо использовать генотипы с высокой комбинационной способностью, которая часто связана со степенью их генетической дивергенции. Если ранее такой отбор проводился исследователями с помощью анализа фенотипических признаков, то в настоящее время он осуществляется с помощью мо-лекулярно-генетических маркеров [9]. В последние годы молекулярные маркеры становятся неотъемлемым элементом селекционного процесса для быстрого и эффективного отбора нужных генотипов растений.

В настоящее время для оценки генетического разнообразия селекционного материала широко ис-

пользуются ДНК-маркеры, в частности микросателлиты (SSR), для которых характерна высокая информативность [2]. SSR-метод выявляет полиморфизм тандемно организованных повторов ДНК (сателлитов). Длина повторяющейся единицы микросателлитных ДНК менее 10 п. н. Длина повторов са-теллитных ДНК не имеет каких-либо ограничений. Она варьирует от 2 п. н. до нескольких сотен [4]. С использованием микросателлитных маркеров изучено генетическое разнообразие у диких, культурных и сорняковых форм Beta vulgaris L. [8, 12, 7].

Наиболее перспективным подходом при получении высокопродуктивных гибридов различных культур является использование комплекса методов молекулярного анализа, основанных на анализе полиморфизма ДНК и белков, которые позволяют сгруппировать изучаемый материал по степени генетического родства.

Так, казахскими учёными проведено RAPD-генотипирование и оценка полиморфизма 23 образцов коллекции сахарной свёклы на основе четырёх RAPD-праймеров, для которых получены генетические профили (паспорта), позволяющие их идентифицировать и различать, составлены генетические формулы [1]. Наибольшим генетическим полиморфизмом характеризуются праймеры PawS 5,

PawS 6. На основе проведённых исследований авторы делают вывод, что идентификация генотипов сахарной свёклы в значительной степени упростит задачи селекционера при анализе результатов скрещивания, а молекулярная паспортизация позволит защитить права селекционеров, контролировать однородность посевного материала.

Исходя из этого большое практическое значение имеет создание надёжных способов ускоренного подбора родительских пар с высокой специфической комбинаци-оннной способностью (СКС) на основе молекулярного маркирования, что позволит значительно экономить затраты времени и материальные средства при создании гибридов сахарной свёклы.

Материалы и методы

исследований

В качестве материалов для исследований были использованы растения родительских форм сахарной свёклы — мужскостерильные линии (МС 1134, МС 1141, МС 1117, МС 1113, МС 1131, МС 1137) и многосемянные опылители (ОП 1165, ОП 1197, ОП 1181, ОП 1203, ОП 1172, ОП 1195), предоставленные лабораторией ЦМС.

Выделение геномной ДНК из растительной ткани осуществлялось фенол-хлороформным методом [6, 10]. Качество выделенной

за ТО, ЧТО наша жизнь не блёкла,

МЫ ГОВОРИМ: СПАСИБО, СВЁКЛА!

28 сахар № 1 • 2018

florimünd

DESPREZ

п 21243, М о( кы, Кугуэо ni кий Ара спсчт, дом ча рпус 1, с ф не 171 *7 L495) 97-1 - 62 - bl in Fo^florim on d  d eí-pr íz.r u www.fla rímon d d «pr iM.tom

КОМПЛЕКСНАЯ РЕКОНСТРУКЦИЯ САХйРНЫХ ЗйКОДОК

ДНК определяли электрофорезом в 1 %-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Полученную ДНК растворяли в 10 мМ трис-НС1-буфера, рН 8,0, содержащем 0,1 мМ ЭДТА и использовали для ПЦР-анализа. Поли-меразно-цепную реакцию проводили на амплификаторе <^епиеБ». В работе использованы следующие праймеры: Вуу 23, Вуу 30, Вуу 32, Вуу 64 [11]. Нуклеотидные последовательности и характеристики данных праймеров указаны в табл. 1.

Величину истинного гетерозиса вычисляли по формуле

Гист. = - Рл) / Рл * 100 %, где Г — истинный гетерозис

ист.

(%);

— значение изучаемого признака у гибридов первого поколения;

Рл — значение признака у растений лучшей родительской формы [3].

Математическую обработку результатов исследований осуществляли с использованием программы Statistica 6.0.

Результаты исследований

и ихобсуждение

Исследование полиморфизма 12 микросателлитных маркеров позволило отобрать две пары В^ 30 + В^ 64 и В^ 23 + В^ 32 праймеров как наиболее информативных для выявления гетерогенности исходных материалов и эффективных для прогнозирования гетерозиса (рис. 1, 2).

ПЦР-анализ 12 линий сахарной свёклы с данными парами микро-сателлитных праймеров позволил выявить специфические ДНК-профили для селекционных материалов сахарной свёклы. В целом было выявлено от 1 до 3 аллелей на пару локусов для индивидуальных генотипов. При проведении молекулярно-генетического анализа исследованных исходных родительских линий всего обнаружено 27 ампликонов.

В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений сахарной свёклы: 1 — МС 1134, 2 — МС 1141, 3 — МС 1117, 4 — МС 1113, 5 — МС 1131, 6 — ОП 1165, 7 — ОП 1197, 8 — ОП 1180, 9 — ОП 1203, 10 — МС 1137, 11 — ОП 1172, 12 — ОП 1195; М — маркер молекулярных масс.

Таблица 1. Характеристика микросателлитных маркеров

Маркер Номер доступа EMBL Прямой праймер (5'-3') Обратный праймер (5'-3') Повторяющийся лейтмотив Температура отжига, град. Размер

Bvv23 [EMBL:AM410756] TCAACCCAGGACTATCACG (GA)16 50 109

GTTTACTGACAAAGCAAATGACCTACTA

GTTTACGCTCCTCCATCATCAGACCA

Bvv30 [EMBL:AM410759] TGTGCCCAAAATCCTGAA (GA)31 51 183

GTTTAATTGGCTGGGTAAAAGAGA

Bvv32 [EMBL:AM410760] AGAAGCCTTTAAAATCCAACT (CA)14 50 142

GTTTACATATGGAACTTTAATGAACAAGTGATA

Bvv64 [EMBL:AM410772] TTTTTGGGAGTTTCATCACTACTTT (CT)18-1(CA)19 51 207

GTTTCATATAAGGGGAGTCTTCTCACAA

№ 1 • 2018 сахар

29

ш

flürim0nd за то, что наша жизнь не блёкла,

DESPREZ мы говорим: спасибо, свёкла!

1 21248, Мо-скеа, Кутузовский проспект, аон 7/4, корпус 1, офис 1 ?~\ (-fl^bj 974-62-51 inFojJRorimcmd- desprez.niwww.Rorimesnd- desprez.com .

тш

В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений сахарной свёклы: 1 — МС 1134, 2 - МС 1141, 3 - МС 1117, 4 - МС 1113, 5 - МС 1131, 6 - ОП 1165, 7 - ОП 1187, 8 -ОП 1180, 9 - ОП 1203, 10 -МС 1137, 11 - ОП 1172, 12 -ОП 1195; М - маркер молекулярных масс.

Аллельные варианты, обнаруженные в четырёх микросателлитах, комбинируются в исследованных генотипах с диапазоном частот 0,08-0,75.

На основе данных ПЦР-анализа составлены молекулярно-генети-ческие формулы для идентификации исходного материала сахарной свёклы (табл. 2).

Результаты ПЦР-анализа с праймерами Вуу 23, Вуу 30, Вуу 32, Вуу 64 использованы для определения уровня дивергенции между исследованными линиями методом кластеризации. На основе полученных данных рассчитаны генетические расстояния (евклидовы) между образцами, которые варьировали от 0,0 до 2,24 (табл. 3).

Значения генетических расстояний между опылителями варьировали от 0,0 до 2,24, между муж-скостерильными линиями от 0,0 до 1,73.

Наименьшие генетические расстояния ф = 0,0-1,0) выявлены для комбинаций скрещивания МС 1117 х ОП 1181, МС 1117 х х ОП 1197, МС 1131 х ОП 1203, МС 1134 х ОП 1203, МС 1113 х х ОП 1203, МС 1137 х ОП 1165 и МС 1117 х ОП 1203.

Наибольшие генетические расстояния ф = 1,73-2,0) выявлены для родительских пар МС 1117 х ОП 1195, МС 1134 х ОП 1195, МС 1131 х ОП 1195, МС 1137 х ОП 1197, МС 1137 х ОП 1195, МС 1141 х ОП 1195 и др.

Все материалы кластеризованы на две группы (рис. 3). В первую группу вошли многосемянные опылители № 1181 и № 1172. Во

вторую - мужскостерильные линии № 1134, 1117, 1113, 1141, 1131, 1137 и многосемянные опылители № 1195,1165,1203,1197.

Процент успеха прогноза получения гетерозисных гибридов по максимальным генетическим дистанциям ф = 1,73-2,0) на основе данных, полученных SSR-анализом, с этими четырьмя праймерами составляет 42,86 %. Гибриды с наибольшей величиной истинного гетерозиса (Гист = 12,72; Гист = 16,28) получены при скрещивании линий МС 1141 х ОП 1165 и МС 1141 х ОП 1197 с генетическими дистанциями D = 1,73 (табл. 4).

Таблица 2. Генетические формулы селекционных материалов сахарной

свёклы*

Материалы Генетические формулы Матрица бинарных признаков

МС 1134 C C C D D 10000

МС 1141 C C C D D М ^0 ^0 ^0 ^0 10000

МС 1117 C C C D D 00000

МС1113 C C C D D 00011

МС 1131 C C C D D 0 0 0 1 1 00011

ОП 1165 C C C D D C1 C1 C0D0D1 11001

ОП 1197 C C C D D 1 0 0 1 1 10011

ОП 1181 C C C D D 1 0 0 1 1 10011

ОП 1203 C C C D D 10001 10001

МС 1137 C C C D D 11001 11001

ОП 1172 C C C D D C1 C1C0D1 D1 11011

ОП 1195 C C C D D 1 0 1 1 1 10111

* Соответствие праймеров и букв латинского алфавита, используемых для записи полученных полиморфных фрагментов: фрагменты ДНК, выявленные с помощью пары праймеров: С - (ВУУ 30 + ВУУ 64), D - (ВУУ 23 + Вуу 32). Нижним индексом обозначено наличие (1) или отсутствие (0) фрагмента на электрофореграмме

Заключение

Использование комплекса праймеров (по двум парам одновременно) позволяет удешевить и ускорить процесс проведения ПЦР-анализа микросателлитных локу-сов сахарной свёклы в два раза.

Результаты проведённых исследований позволили нам разработать методику молекулярного отбора родительских форм сахарной свёклы для создания гибридов с повышенной продуктивностью.

Подбор родительских пар сахарной свёклы для скрещиваний осуществляется в несколько этапов:

♦ взятие проб и выделение суммарной ДНК из растительного материала;

♦ проведение ПЦР с праймерами для микросателлитных локу-сов: Bvv 23, Bvv 30, Bvv 32, Bvv 64. Визуализация результатов поли-меразной цепной реакции электрофорезом в 1 %-ном агарозном геле;

♦ составление матрицы бинарных признаков (присутствие ПЦР-продукта) в электрофоре-тическом спектре — 1, отсутствие — 0) на основе полученных ДНК-профилей;

♦ обработка полученных матриц с использованием программы Statistica 6.0. Расчёт генетических дистанций. Построение дендро-грамм методом кластерного анализа;

♦ рекомендации для проведения скрещиваний комбинаций родительских форм с максимальными генетическими дистанциями.

Список литературы

1. Абекова, А.М. Изучение полиморфизма у гибридов и линий сахарной свёклы (Beta vulgaris L.) c помощью RAPD-праймеров / А.М. Абекова [и др.] // Сахарная свёкла. - № 9. - 2017. - С. 18-21.

2. Азарин, К..В. Оценка комбинационной способности линий подсолнечника и подбор SSR-маркеров, ассоциированных с эф-

ЗА ТО, ЧТО НАША ЖИЗНЬ НЕ БЛЁКЛА,

МЫ ГОВОРИМ: СПАСИБО, СВЁКЛА!

30 сахар № 1 • 2018

FL0RIMÜND

DESPREZ

п 21243, М о( кы, Кугуэо ni кий Ара спсчт, дом ча рпус 1, с ф не 171 *7 L495) 97-1 - 62 - bl in Fo^florira on d  d eí-pr sir u www.fla rímon d d «pr iM.tom

ТЕХНОЛОГИЯ ВЫСОКИХ УРОЖАЕВ

КОМПЛЕКСНАЯ РЕКОНСТРУКЦИЯ -

САХАРНЫХ ЗАП0Д0Я

Таблица 3. Генетические расстояния между исходными линиями сахарной свёклы

№ селекционного материала Генетические расстояния

МС 1131 МС 1134 МС 1141 МС 1113 МС 1137 МС 1117 ОП 1203 ОП 1195 ОП 1197 ОП 1181 ОП 1172 ОП 1165

МС 1131 0,00 0,00 1,00 1,41 1,73 1,41 1,00 1,73 1,41 1,41 1,41 1,41

МС 1134 0,00 0,00 1,00 1,41 1,73 1,41 1,00 1,73 1,41 1,41 1,41 1,41

МС 1141 1,00 1,00 0,00 1,00 1,41 1,73 1,41 2,00 1,73 1,73 1,73 1,73

МС 1113 1,41 1,41 1,00 0,00 1,00 1,41 1,00 1,73 1,41 1,41 2,00 1,41

МС 1137 1,73 1,73 1,41 1,00 0,00 1,73 1,41 2,00 1,73 1,73 1,73 1,00

МС 1117 1,41 1,41 1,73 1,41 1,73 0,00 1,00 1,73 0,00 0,00 2,00 1,41

ОП 1203 1,00 1,00 1,41 1,00 1,41 1,00 0,00 1,41 1,00 1,00 1,73 1,00

ОП 1195 1,73 1,73 2,00 1,73 2,00 1,73 1,41 0,00 1,73 1,73 2,24 1,73

ОП 1197 1,41 1,41 1,73 1,41 1,73 0,00 1,00 1,73 0,00 0,00 2,00 1,41

ОП 1181 1,41 1,41 1,73 1,41 1,73 0,00 1,00 1,73 0,00 0,00 2,00 1,41

ОП 1172 1,41 1,41 1,73 2,00 1,73 2,00 1,73 2,24 2,00 2,00 0,00 1,41

ОП 1162 1,41 1,41 1,73 1,41 1,00 1,41 1,00 1,73 1,41 1,41 1,41 0,00

фектом гетерозиса / К.В. Азарин // Инновационные направления исследований в селекции и технологии возделывания маслич-

Таблица 4. Уровень проявления гетерозиса у пробных гибридов сахарной свёклы, полученных при скрещивании линий с максимальными генетическими дистанциями

Комбинация скрещивания Урожайность корнеплодов у гибридов Fj, т/га Истинный гетерозис, Г , % ист' Генетическое расстояние (евклидово), D

МС 1117 х ОП 1181 32.8 -0,69 0

МС 1117 х ОП 1197 30,90 -0,07 0

МС 1131 х ОП 1203 38,22 0,16 1,0

МС 1134 х ОП 1203 37,59 -1,49 1,0

МС 1113 х ОП 1203 30,83 -19,20 1,0

МС 1137 х ОП 1165 35,19 3,10 1,0

МС 1117 х ОП 1203 34,66 -9,17 1,0

МС 1117 х ОП 1195 34,43 9,3 1,73

МС 1131 х ОП 1195 32,60 -6,75 1,73

МС 1134 х ОП 1195 38,09 11,83 1,73

МС 1137 х ОП 1197 31,26 -8,4 1,73

МС 1137 х ОП 1195 35,63 4,39 2

МС 1141 х ОП 1195 34,86 3,78 2

НСР 0,5 1,1 - -

ных культур: VI Международная конференция молодых учёных и специалистов. — Краснодар, 2011. — С. 5—9.

3. Омаров, Д.С. К методике учёта и оценки гетерозиса у растений / Д.С. Омаров // Сельскохозяйственная биология. — 1975. — Т. 10. — № 1. —

C. 123-127.

4. Хемлебен, В. Сателлитные ДНК / В. Хемлебен [и др.] // Успехи биологической химии. — 2003. - Т. 43. - С. 267-306.

5. Шаптуренко, М.Н. Использование RAPD-маркеров для оптимизации отбора исходного материала перца сладкого (Capsicum annu-um L.) в селекции на гетерозис / М.Н. Шаптуренко [и др.] // Вавилов-ский журнал генетики и селекции. — Т. 17. - 2013. - № 1. - С. 63-71.

6. Chomczynski, P. Single-Step Metod of RNA Isolation by Acid Guanidini-

МС 1134 МС 1141 МС 1117 МС 1113 МС 1131 ОП 1187 ОП 1165 ОП 1203 ОП 1137 ОП 1195 ОП 1180 ОП 1172 - -

-

-

- -

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 Рис. 3. Дендрограмма генетических расстояний между исходными линиями сахарной свёклы, построенная на основе данных SSR-анализа с праймерами Вух 23, Вух 30, Вух 32, Вт 64

№ 1 • 2018 сахар

31

#

fl0r1mdnd зато, что наша жизнь не блёкла,

DESPREZ мы говорим: спасибо, свёкла!

1 ¿124 В, Моаша, Кутузовский прое пект. дон Т/4, кор п yt 1 г офи с 1 71 + 7 Ь) 9 /4-Ы-51 i nFojjHorinio nd desp te i ru ivivw. Яог i me nd dtss reí. с <мч

Журнал

• Теперь в Facebook:

Общайтесь, комментируйте, задавайте вопросы экспертам!

Теперь на журнал «Сахар» можно подписаться в любой момент в электронном каталоге «Почта России»: по индексу ШЗЭЕЭ или по названию «Сахар»:

um Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. - 1987. -V. 162. - P. 156-159.

7. Cureton, A.N. Development of simple sequence repeat (SSR) markers for the assessment of gene flow between sea beet (Beta vulgaris ssp. maritima) populations / A.N. Cureton [and oth.] // Mol. Ecol. Notes. - 2002. - № 2. - P. 402-403.

8. Desplanque, B. Genetic diversity and gene flow between wild, cultivated and weedy forms of Beta vulgaris L. (Chenopodiaceae), assessed by RFLP and microsatellite markers / B. Desplanque [and oth.] // Theor. Appl. Genet. - 1999. - № 98. -P. 1194-1201.

9. Gärtner, T. Improved Heterosis Prediction by Combining Information on DNA- and Metabolic Markers / T. Gärtner [and oth.] // PLoS One. -4 (4). -2009.

10. Rogers, S.O. Extraction of DNA

from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues / S.O. Rogers, A.J. Bendich // Plant Molecular Biologi. - 1985. -V. 5. - P. 69-67.

11. Smulders, M.J.M. Characterisation of sugar beet (Beta vulgaris L. ssp. vulgaris) varieties using microsatellite markers / M.J.M.

Smulders [and oth.] / BMC Genetics.

- 2010. - Vol. 11(41). - P. 1-11. 12. Viard, F. Crop-weed interactions

in the Beta vulgaris complex at a local scale: allelic diversity and gene flow within sugar beet fields / F. Viard, J. Bernard, B. Desplanque // Theor. and Appl. Genet. - 2002. - № 104.

- P. 688-697.

Аннотация. Проведено изучение генетического разнообразия коллекции родительских линий и гибридов сахарной свёклы с использованием SSR-маркеров. Осуществлён кластерный анализ и определены генетические расстояния между изученными образцами. Представлены основные этапы методики молекулярного отбора родительских форм сахарной свёклы для создания гибридов с повышенной продуктивностью. Рекомендованы родительские пары для гибридизации. Ключевые слова: сахарная свёкла, полиморфизм, ПЦР-анализ, гибрид, ДНК, гетерозис, микросателлиты.

Summary. Genetic diversity of parental lines' and sugar beet hybrids' collections has been studied using SSR-markers. Cluster analysis has been conducted and genetic distances between the studied samples have been determined. The main stages of strategy for molecular selection of sugar beet parental forms to develop hybrids with higher productivity are presented. The parental pairs for hybridization have been recommended.

Keywords: sugar beet, polymorphism, PCR-analysis, hybrid, DNA, heterosis, microsatellites.

32 сахар № 1 • 2018