Способ диагностики степени дисплазии при пищеводе Барретта
METHOD OF DIAGNOSING DEGREE OF DYSPLASIA IN BARRETT'S ESOPHAGUS

Изобретение относится к медицине, в частности к гастроэнтерологии и патологической анатомии, и может быть использовано для определения степени дисплазии слизистой оболочки пищевода при пищеводе Барретта и выработки оптимальной тактики лечения больного.
Пищевод Барретта является предраковым заболеванием дистального отдела пищевода, которое развивается при длительном течении гастроэзофагеальной рефлюксной болезни и представляет собой, по определению Российского общества патологоанатомов 2015 года, морфологически доказанную кишечную метаплазию (Патологическая анатомия пищевода Барретта. Клинические рекомендации // под ред. Зайратьянца О.В., Кононова А.В. / Российское общество патологоанатомов. - 2016. http://ww'w.patolog.ru/news/utverzhdennye-rop-klinicheskie-rekomendacii-po-morfologicheskoy-diagnostike-zabolevaniy).
В ходе опухолевой трансформации сегмента цилиндроклеточной метаплазии дистального отдела пищевода при пищеводе Барретта возникает клеточная атипия и изменение формы желез, а также усиливается пролиферация клеток, эти морфологические изменения нарастают в ряду: дисплазия низкой степени (low-grade дисплазия) - дисплазия высокой степени (high-grade дисплазия) - аденокарцинома.
Заболеваемость раком пищевода у пациентов с пищеводом Барретта составляет 0,5-1% новых случаев в год. У пациентов с дисплазией низкой степени (low-grade дисплазия) риск развития рака пищевода составляет по разным оценкам от 1,83 до 9,1% в год.
У пациентов с пищеводом Барретта и тяжелой дисплазией (high-grade дисплазия) риск малигнизации по разным данным от 19% до 60% в год и составляет 6,58% на 100 пациенто-лет.
У пациентов с пищеводом Барретта без дисплазии, с неопределенной дисплазией и low-grade дисплазией проводится динамическое наблюдение, в то время как пациентам с high-grade дисплазией и аденокарциномой проводят эндоскопическую резекцию, радиочастотную абляцию слизистой пищевода и/или эзофагоэктомию. Поэтому правильная диагностика степени дисплазии важна для определения тактики ведения пациентов.
В то же время, уровень согласия между специалистами-патологами в отношении степени дисплазии оказывается довольно низким. High-grade дисплазию гипердиагностируют в 40% случаев, что приводит к более агрессивному лечению пациентов, включая эзофагоэктомию.
Известен способ диагностики наличия и степени дисплазии при пищиводе Барретта (Montgomery Е. Update on Grading Dysplasia in Barrett's Esophagus. Pathology Case Reviews. - 2002 - V. 7 - Is. 1. - P. 35-42), который учитывает следующие морфологические показатели:
- созревание клеток на поверхности по сравнению с подлежащими железами;
- архитектоника желез;
- цитологические признаки пролиферации клеток;
- наличие воспаления, эрозий или изъязвления.
Градация диспластических изменений в соответствии с другим известным способом (Shi X.Y., Bhagwandeen В., Leong A. S. р16, Cyclin D1, Ki-67, and AMACR as Markers for Dysplasia in Barrett Esophagus. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. - 2008. - V. 16. - N. 5. - P. 447-452. doi: 10.1097/PAT.0b013e318168598b) (прототип) представлена в таблице.
Важнейшая проблема современной классификации дисплазии пищевода связана с тем, что патологоанатомам даже при использовании одинаковых критериев дисплазии крайне сложно прийти к согласию о степени дисплазии ввиду субъективной оценки исследуемых параметров, использования неопределенной (неоднозначно трактуемой) терминологии при характеристике диагностических критериев той или иной степени дисплазии.
В связи с этим иммуногистохимическое исследование ценно в дифференциальной диагностике наличия, отсутствия, а также определения степени дисплазии.
В связи с этим авторы предлагают ряд иммуногистохимических маркеров, которые могут быть ценными в дифференциальной диагностике наличия и отсутствия, а также определения степени дисплазии. Среди них большое внимание уделяют иммуногистохимическому исследованию с антителами к р53, при этом кластерная экспрессия р53 имеет не только диагностическое, но и прогностическое значение: считается, что при кластерной экспрессии р53 повышен риск малигнизации (Kastelein F., Biermann K., Steyerberg E.W., Verheij J., Kalisvaart M, Looijenga L.H., Stoop H.A., Walter L., Kuipers E.J., Spaander M.C., Bruno M.J. Aberrant p53 protein expression is associated with an increased risk of neoplastic progression in patients with Barrett's oesophagus // Gut. - 2013. - V. 62. - N. 12. - P. 1676-83. doi: 10.1136/gutjnl-2012-303594; Davelaar A.L., Calpe S., Lau L., Timmer M.R., Visser M., Ten Kate F.J., Parikh K.B., Meijer S.L., Bergman J.J., Fockens P., Krishnadath K.K. Aberrant TP53 detected by combining immunohistochemistry and DNA-FISH improves Barrett's esophagus progression prediction: a prospective follow-up study // Genes Chromosomes Cancer. - 2015 - V. 54 - N. 2 -P. 82-90. doi: 10.1002/gcc.22220).
Для диагностики дисплазии испробовано большое количество других иммуногистохимических маркеров, среди которых: Ki67, р16, циклин D1, AMACR, β-катенин, CDX2, SOX2, карбангидразы II и IX, pl20ctn, c-myc, Jagged 1, EGFR, HER2/neu, SMAD4, MET, AOL, Le-антигены a (sLea) и x (CD15), WGA и другие (например, Bani-Hani К., Martin I.G., Hardie L.J., Mapstone N., Briggs J.A., Forman D., Wild CP. Prospective study of cyclin D1 overexpression in Barrett's esophagus: association with increased risk of adenocarcinoma // J. Natl. Cancer Inst. - 2000. - V. 92. - P. 1316-21. DOI: 10.1093/jnci/92.16.1316; Kinra P., Gahlot G.P.S., Yadav R. Histological Assessment and use of Immunohistochemical Markers for Detection of Dysplasia in Barrett's Esophageal Mucosa // Pathology Research and Practice. - 2018. - V. 214. - Is. 7. - P. 993-99. doi; 10.1016/j.prp.2018.05.006; Karamchandani D.M., Lehman H.L., Ohanessian S.E., Masse J., Welsh P.A.. Odze R.D., Goldblum J.R.. Berg A.S., Stairs D.B. Increasing diagnostic accuracy to grade dysplasia in Barrett's esophagus using an immunohistochemical panel for CDX2, p120ctn, c-Myc and Jaggedl // Diagn. Pathol. - 2016.- V.11. - Article number 23. doi: 10.1186/s 13000-016-0473-7).
Однако результаты этих исследований противоречивы. Например, показано, что экспрессия AMACR увеличивается в ряду: low-grade дисплазия - high-grade дисплазия - аденокарцинома пищевода (Dorer R., Odze R.D. AMACR immunostaining is useful in detecting dysplastic epithelium in Barrett's esophagus, ulcerative colitis, and Crohn's disease // Am. J. Surg. Pathol. - 2006. -V. 30.-N. 7.-P. 871-77. doi: 10.1097/01.pas.0000213268.30468.b4).
В другом исследовании показано, что экспрессия AMACR в части случаев может быть ложно-положительной (Strater J., Wiesmuller С, Perner S., Kuefer R., Moller P. Alpha-methylacyl-CoA racemase (AMACR) immunohistochemistry in Barrett's and colorectal mucosa: only significant overexpression favours a diagnosis of intraepithelial neoplasia // Histopathology. -2008. - V. 52. - N. 3. - P. 399-402. doi: 10.1111/j. 1365-2559.2007.02923.x).
Применение части исследованных в литературе маркеров в широкой практике затруднено в связи с их малой доступностью, это относится, например, к SOX2, карбангидразам II и IX, c-myc, Jaggedl, SMAD4, МЕТ, AOL, Le-антигенам a (sLea) и х (CD 15), WGA. К тому же в некоторых исследованиях используют неоправданно широкую диагностическую панель, что значительно повышает стоимость исследования, при этом не повышая его информативность. Панель иммуногистохимических маркеров для оценки степени дисплазии пищевода при пищеводе Барретта на практике до сих пор не разработана.
Техническая проблема заключается в разработке доступного и надежного способа иммуногистохимической диагностики степени дисплазии при пищеводе Барретта, позволяющей осуществлять адекватный выбор лечебной тактики.
Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в
- обеспечении возможности своевременного выбора адекватной лечебной тактики (динамическое наблюдение, оперативное лечение) за счет достоверной диагностики степени дисплазии слизистой пищевода (low-grade дисплазия и high-grade дисплазия) при пищеводе Барретта путем создания оригинальной панели иммуногистохимических маркеров и определения дифференциально-диагностических критериев при интерпретации результатов иммуногистохимического исследования;
- доступности предлагаемого иммуногистохимического способа исследования для клинической практики.
Сущность изобретения заключается в следующем. Для диагностики степени дисплазии слизистой оболочки при пищеводе Барретта выполняют биопсию метаплазированного участка слизистой оболочки пищевода. Выявляют в нем фокусы с морфологическими признаками дисплазии и проводят их иммуногистохимическое исследование с антителами к р53, Ki67, циклину D1 и β-катенину. При этом определяют: количество клеток с ядерной экспрессией в пределах одной железы в реакции с антителами к р53, количество эпителиальных клеток с ядерной экспрессией в реакции с антителами к Ki67, циклину D1, а также наличие в эпителиальных клетках ядерной, цитоплазматической и мембранной экспрессии в реакции с антителами к β-катенину. Диагностируют low-grade дисплазию при ядерной экспрессии р53 в пределах одной железы в 30-50% клеток, ядерной экспрессии Ki67 и циклина D1 в диапазоне более 50% и менее 70% эпителиальных клеток, наличии мембранной экспрессии β-катенина в эпителиальных клетках. Диагностируют high-grade дисплазию при ядерной экспрессии р53 в пределах одной железы в 70-100% клеток, ядерной экспрессии Ki67 и циклина D1 в 70-95% эпителиальных клеток и наличии цитоплазматической и ядерной экспрессии β-катенина в эпителиальных клетках.
Изобретение поясняется следующими фигурами.
На фиг. 1 представлена ядерная экспрессии р53 в пределах одной железы в участке с high-grade дисплазией, увеличение ×400.
На фиг. 2 представлена ядерная экспрессия Ki67 в эпителиальных клетках в участке с high-grade дисплазией, увеличение ×400.
На фиг. 3 представлена ядерная экспрессия циклина D1 в эпителиальных клетках в участке с high-grade дисплазией, увеличение ×400.
На фиг. 4 представлена цитоплазматическая и ядерная экспрессии β-катенина в эпителиальных клетках в участке с high-grade дисплазией, увеличение ×400.
На фиг. 5 представлена ядерная экспрессии р53 в пределах одной железы в участке с low-grade дисплазией, увеличение ×400. Способ осуществляется следующим образом.
Биопсийный материал, взятый из участков метаплазии дистального отдела пищевода при пищеводе Баррета при эзофагогастродуоденоскопии (ЭГДС), после стандартной гистологической проводки заливают в парафин и изготавливают гистологические срезы. Метаплазированные участки слизистой пищевода характеризуются следующими морфологическими признаками: слизистая оболочка пищевода представлена множеством крипт, выстланных цилиндрическим эпителием с наличием вариабельного числа бокаловидных клеток, цитоплазма которых при окраске Шифф-реактивом в сочетании с альциановым синим приобретает синий цвет, по краю фрагментов может присутствовать многослойный плоский эпителий, а в строме - железы собственной пластинки слизистой пищевода и их протоки, что доказывает взятие материала именно из пищевода, а не из желудка.
Проводят микроскопическое исследование гистологических срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, а также Шифф-реактивом в сочетании с альциановым синим. Определяют фокусы с морфологическими признаками дисплазии. Морфологическими признаками дисплазии являются: нарушение архитектоники слизистой оболочки в виде сближенности желез, их угловатости, различных размеров и формы желез, формирования сосочковых и криброзных структур, многорядность эпителия желез и поверхности фрагмента со стратификацией ядер и выраженной в различной степени ядерной атипией в виде укрупнения ядер (от легкого до выраженного укрупнения ядер, где ядро занимает более  объема клетки), гиперхромии ядер, ядерного полиморфизма, наличия вариабельного числа фигур митоза, в том числе единичных патологических фигур митоза.
Далее для оценки наличия и степени дисплазии проводят иммуногистохимическое исследование фрагментов с выявленными фокусами дисплазии с готовыми к применению моноклональными антителами к р53 (например, клон DO-7, «Leica Bond-таХ» (Germany)), Ki67 (ММ1, «Leica Bond-таХ» (Germany)), циклину D1 (клон SP4-R, Ventana Bench Mark Ultra» (США)) и (β-катенину (клон 17С2, «Leica Bond-таХ» (Germany)).
Интерпретацию результатов иммуногистохимического исследования с указанными антителами осуществляют с учетом локализации позитивных клеток (в участках дисплазии и вне этих участков) путем подсчета количества окрашенных эпителиальных клеток на 100 клеток в 10 полях зрения (увеличение ×400). Полученные количественные результаты выражают в процентах, принимая за 100% общее число эпителиальных клеток в 10 полях зрения.
При иммуногистохимическом исследовании с антителами к р53 определяют количество клеток с ядерной экспрессией р53 в пределах одной железы.
При иммуногистохимическом исследовании с антителами к β-катенину оценивают паттерн экспрессии β-катенина в эпителиальных клетках слизистой оболочки пищевода: мембранная, цитоплазматическая, ядерная.
При иммуногистохимическом исследовании с антителами к Ki67 и циклину D1 определяют количество эпителиальных клеток с ядерной экспрессией Ki67 и циклина D1.
При иммуногистохимическом исследовании оценивают экспрессию маркеров во всем фрагменте метаплазированной слизистой пищевода для контроля полученных результатов в зоне дисплазии. При отсутствии дисплазии определяют ядерную экспрессию р53 в пределах одной железы в 0-15% клеток, ядерную экспрессию Ki67 и циклина D1 в диапазоне от 10 до 30% эпителиальных клеток, наличие мембранной экспрессии р-катенина в эпителиальных клетках.
Таким образом, мы имеем в одном фрагменте разную величину экспрессии маркеров в очаге дисплазии и вне его, это своеобразный контроль - на фоне слабой экспрессии во всем фрагменте мы видим локальное усиление экспрессии именно в очагах дисплазии.
Диагностируют low-grade дисплазию при ядерной экспрессии р53 в пределах одной железы в 30-50% клеток, ядерной экспрессии Ki67 и циклина D1 в диапазоне более 50% и менее 70% эпителиальных клеток, наличии мембранной экспрессии β-катенина в эпителиальных клетках.
Определяют high-grade дисплазию при ядерной экспрессии р53 в пределах одной железы в 70-100% клеток, ядерной экспрессии Ki67 в 70-95% эпителиальных клеток, циклина D1 в 70-95% эпителиальных клеток и наличии цитоплазматической и ядерной экспрессии β-катенина в эпителиальных клетках.
Таким образом, разработан способ оценки степени дисплазии при пищеводе Барретта в залитом в парафин биопрепарате, что позволяет проводить диагностику не только при поступлении пациента в лечебно-профилактическое учреждение, но и по прошествии времени в случае необходимости уточнения диагноза.
Каждый из используемых маркеров обладает высокой чувствительностью и специфичностью в дисплазированном эпителии пищевода, что позволяет с большой точностью проводить дифференциальную диагностику в ряду: low-grade дисплазия - high-grade дисплазия при пищеводе Барретта.
В качестве доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.
Клинический пример 1.
Пациент К., 40 лет, страдает гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью в течение 22 лет, беспокоят изжоги, жжение в эпигастральной области, периодически возникают эпизоды оталгии, не связанные с воспалением ушей, халитоз. При ЭГДС выявлен сегмент цилиндроклеточной метаплазии протяженностью С1М4 по Пражским критериям, а также признаки аксиальной хиатальной грыжи больших размеров с отчетливыми признаками разобщения и нарушения запирательной функции кардии. Взята биопсия из метаплазированного сегмента для верификации диагноза. Гистологические срезы толщиной 4 мкм были окрашены гематоксилином и эозином, проведена комбинированная ШИК-реакция в сочетании с альциановым синим. Проведено гистологическое исследование биопсированных фрагментов. Выявлено, что слизистая оболочка пищевода представлена множественными криптами, выстланными цилиндрическим эпителием с наличием в железах крипт бокаловидных клеток, цитоплазма которых при ШИК-реакции в сочетании с альциановым синим окрашена в синий цвет, на основании чего морфологически диагностирован пищевод Барретта. Также обнаружен участок со сближенными округлыми и слегка угловатыми железами с несколько увеличенными, местами гиперхромными ядрами, занимающими менее 1/2 объема цитоплазмы - участок дисплазии. Проведено иммуногистохимическое исследование фрагмента с участком дисплазии в соответствии с предлагаемым способом. При оценке результатов в участке дисплазии установлено: ядерная экспрессия р53 в пределах одной железы в 30% клеток, ядерная экспрессия Ki67 в 51% эпителиальных клеток, ядерная экспрессия циклина D1 в 51% эпителиальных клеток, наличие мембранной экспрессии β-катенина в эпителиальных клетках. При этом на остальном протяжении фрагмента ядерная экспрессия р53 в пределах одной железы в 0-15% клеток, ядерная экспрессия Ki67 в 20% эпителиальных клеток, ядерная экспрессия циклина D1 в 20% эпителиальных клеток, наличие мембранной экспрессии β-катенина в эпителиальных клетках. Диагностирована low-grade дисплазия. Диагноз был подтвержден при морфологическом исследовании гистологических препаратов тремя специалистами-патологоанатомами. Клинический пример 2.
Пациентка А., 68 лет, страдает гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью в течение 50 лет, беспокоят изжоги, периодически проходит ЭГДС.Пищевод Барретта установлен 5 лет назад, без дисплазии. При очередной ЭГДС выявлен сегмент цилиндроклеточной метаплазии протяженностью С2М5 по Пражским критериям, а также признаки аксиальной хиатальной грыжи больших размеров с отчетливыми признаками разобщения и нарушения запирательной функции кардии.
Взята биопсия из метаплазированного сегмента для верификации диагноза. Гистологические срезы толщиной 4 мкм были окрашены гематоксилином и эозином, проведена комбинированная ШИК-реакция в сочетании с альциановым синим. Проведено гистологическое исследование биопсированных фрагментов. Выявлено, что слизистая оболочка пищевода представлена множественными криптами, выстланными цилиндрическим эпителием с наличием в железах крипт бокаловидных клеток, цитоплазма которых при ШИК-реакции в сочетании с альциановым синим окрашена в синий цвет, на основании чего морфологически диагностирован пищевод Барретта. Также обнаружено 2 фокуса со сближенными округлыми и слегка угловатыми железами с увеличенными, местами гиперхромными ядрами, занимающими менее 1/2 объема цитоплазмы - участки дисплазии. Проведено иммуногистохимическое исследование фрагментов с участками дисплазии в соответствии с предлагаемым способом. При оценке результатов установлено: ядерная экспрессия р53 в пределах одной железы в 50% клеток, ядерная экспрессия Ki67 в 69% эпителиальных клеток, ядерная экспрессия циклина D1 в 69% эпителиальных клеток, наличие мембранной экспрессии β-катенина в эпителиальных клетках. Вне этих участков ядерная экспрессия р53 в пределах одной железы в 0-15% клеток, ядерная экспрессия Ki67 в 25% эпителиальных клеток, ядерная экспрессия циклина D1 в 20% эпителиальных клеток, наличие мембранной экспрессии β-катенина в эпителиальных клетках. Диагностирована low-grade дисплазия. Диагноз был подтвержден при морфологическом исследовании гистологических препаратов тремя специалистами-патологоанатомами. Клинический пример 3.
Пациент Т., 48 лет, жалобы не беспокоят, единичный эпизод дисфагии. При ЭГДС выявлен длинный сегмент цилиндроклеточной метаплазии в дистальном отделе пищевода протяженностью С11М11 по Пражским критериям с наличием двух эпителиальных новообразования пищевода на 29 и 24 см от резцов IIa+IIc и IIa типа соответственно. Взята биопсия из метаплазированного сегмента и из эпителиальных новообразований для верификации диагноза.
Гистологическое исследование проводилось как в примере 1. Иммуногистохимическое исследование - в соответствии с предлагаемым способом.
При гистологическом исследовании выявлено, что слизистая оболочка пищевода представлена множественными криптами, выстланными цилиндрическим эпителием с наличием бокаловидных клеток, цитоплазма которых при ШИК-реакции в сочетании с альциановым синим окрашена в синий цвет, на основании чего установлен пищевод Барретта. Также обнаружен участок со сближенными железами неправильной формы, с наличием сосочковых и криброзных структур, выстланных цилиндрическим клетками со стратификацией, с увеличенными гиперхромными ядрами, занимающими более 1/2 объема цитоплазмы, с наличием фигур митоза - участок дисплазии.
При оценке результатов иммуногистохимического исследования в участке дисплазии установлено: ядерная экспрессия р53 в пределах одной железы в 100% клеток, ядерная экспрессия Ki67 в 95% эпителиальных клеток, ядерная экспрессия циклина D1 в 95% эпителиальных клеток, наличие цитоплазматической и ядерной экспрессии β-катенина в эпителиальных клетках. Диагностирована high-grade дисплазия. Диагноз был подтвержден при морфологическом исследовании гистологических препаратов тремя специалистами-патологоанатомами.
Клинический пример 4.
Тот же пациент Т., 48 лет, в динамике - через 2 месяца выполнена эндоскопическая резекция слизистой пищевода. Гистологическая картина аналогична примеру 3. При оценке результатов иммуногистохимического исследования в участке с дисплазией установлено: ядерная экспрессия р53 в пределах одной железы в 70% клеток, ядерная экспрессия Ki67 в 70% эпителиальных клеток, ядерная экспрессия циклина D1 в 70% эпителиальных клеток, наличие цитоплазматической и ядерной экспрессии β-катенина в эпителиальных клетках. Диагностирована high-grade дисплазия. Диагноз был подтвержден при морфологическом исследовании гистологических препаратов тремя специалистами-патологоанатомами.
Предлагаемый способ был использован при диагностике степени дисплазии у 80 пациентов с пищеводом Барретта, у которых исследовано всего 288 биопсированных фрагментов из участков метаплазированной слизистой пищевода, low-grade дисплазия была выявлена у 12 больных в 35 из 43 исследованных фрагментов, a high-grade дисплазия - у 2 пациентов в 17 из 32 исследованных фрагментов. Во всех случаях выявленная с помощью предлагаемого способа степень дисплазии слизистой пищевода была подтверждена при морфологическом исследовании гистологических препаратов тремя специалистами-патологоанатомами.