СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭКЗОСОМ ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ
METHOD FOR PLASMA EXOSOME RELEASE

Изобретение относится к области биотехнологии и диагностической медицины, а именно к онкологии и может быть использовано для выделения экзосом из плазмы крови.
Экзосомы - мембранные нано-везикулы (80-130 нм), которые секретируются практически всеми клетками многоклеточных организмов во внеклеточное пространство. Биохимический состав экзосом близок к составу клеток, которые их секретируют. Экзосомы, секретируемые опухолевыми клетками, также имеют особенности биохимического состава, в частности состава коротких регуляторных молекул РНК - 2 микроРНК. На основании этих данных предполагается, что анализ микроРНК циркулирующих экзосом может лежать в основе методов скрининга или ранней диагностики онкологических заболеваний [Gorji-Bahri G, Hashemi А, Moghimi HR: ExomiRs: A Novel Strategy in Cancer Diagnosis and Therapy. Current gene therapy 2018, 18(6):336-350.].
Разработка таких методов активно ведется многими научными лабораториями био-технологическими компаниями, но внедрение таких разработок в практику тормозится отсутствием надежной технологии выделения экзосом из плазмы. Эта задача нетривиальна в силу сложного состава плазмы, различные компоненты которой имеют сходные с экзосомальными размеры, плотность, поверхностный заряд, гидрофильность и другие характеристики. В случае необходимости последующего анализа экзосомальной фракции циркулирующих микроРНК, критическое значение приобретает два фактора: 1. эффективность выделения экзосом; 2. возможность отделения экзосом от фракции протеинов и липопротеинов плазмы, связывающих диагностически незначимые молекулы микроРНК.
Известен способ выделения экзосом из плазмы крови с использованием супер-гидрофильных полимеров, в котором добавление к сыворотке, предварительно очищенной от крупных везикул и клеточного дебриса, концентрированного (30-60%) раствора гидрофильного полимера полиэтиленгликоля (ПЭГ) относительно низкой мол. массой (5-10 кДа) «вытесняет» из раствора менее растворимые компоненты, включая экзосомы, вызывая их агрегацию. Образовавшиеся агрегаты осаждаются при низкоскоростном центрифугировании. Этот принцип реализован в ряде коммерческих наборов для выделения экзосом из различных биологических сред, включая плазму: ExoQuick (System Bioscience), ExoPrep (HansaBioMed), Total exosomes isolation kit (Invitrogen).
К основным недостаткам данного подхода относится высокая стоимость коммерческих реагентов и недостаточная «чистота» выделения - осадок обычно содержит плазменные белки и другие компоненты, затрудняющие последующий анализ экзосомальных микроРНК.
Существует модификация данной методики, которая оптимизирует процедуру и снижает стоимость выделения (патент RU 2678988, опубл. 05.02.2019), но не решает проблему контаминации препарата экзосом плазменными белками.
Известен способ выделения экзосом из плазмы крови, основанный на феномене разделения или формирования двух отдельных фаз в растворе двух полимеров, например, полиэтиленгликоля (ПЭГ) и декстрана. В силу физико-химических особенностей взаимодействия полимеров с мембраной везикул, последние преимущественно концентрируются в одной из фаз - растворе декстрана, в то время как белки переходят в раствор ПЭГ. Для более полной очистки везикул от белков ПЭГ-содержащая фаза может быть заменена несколько раз. В оригинальных исследованиях (Shin Н, Han С, Labuz JM, Kim J, Kim J, Cho S, Gho YS, Takayama S, Park J: High-yield isolation of extracellular vesicles using aqueous two-phase system. Scientific reports 2015, 5:13103.) было предложено использование системы полимеров ПЭГ (35 кДа) и декстран (450-650 кДа), которые образуют две фазы водного раствора. На модельной смеси экзосом и белков, авторы метода доказали эффективность разделения компонентов смеси. Этот способ может быть рассмотрен в качестве ближайшего аналога.
Недостатком способа является то, что он не оптимизирован для работы с плазмой, имеющей сложный состав, и не позволяет эффективно разделить экзосомы и белки в ее составе. Кроме того, в оригинальном исполнении способ является слишком трудоемким для применения в лабораторной или клинической практике.
Техническим результатом изобретения является выделение непосредственно из плазмы крови максимального количества экзосом при минимальной контаминации препарата плазменными белками и липопротеинами, простота реализации и низкая стоимость, повышение эффективности последующего анализа экзосомальной фракции циркулирующих молекул микроРНК в контексте, например, решения задач диагностики или мониторинга онкологических заболеваний.
Указанный технический результат достигается в способе выделения экзосом из плазмы крови, включающем взятие периферической крови, отделение плазмы от клеточной массы путем центрифугирования, добавление к плазме смеси полимеров декстрана и полиэтиленгликоля, инкубацию полимерной смеси и осаждение целевого продукта центрифугированием, в котором полимеры декстран и полиэтиленгликоль растворяют в плазме крови до концентрации 1,5% и 3,5% соответственно с последующей инкубацией в течение 1 часа при температуре +4°С и центрифугированием при ускорении 1000 G, +4°С в течение 10 минут, полученный осадок растворяют в полимерной смеси декстрана и полиэтиленгликоля фосфатно-солевого буфера в той же концентрации, повторно центрифугируют в том же режиме до получения целевого продукта.
Целесообразно полученный целевой продукт использовать для выделения экзосомальной микроРНК с последующим ОТ-ПЦР анализом.
Оптимальное соотношение молекулярных масс и концентраций полимеров, определенные экспериментальным путем, а также оригинальная методика растворения полимеров непосредственно в плазме, позволяют достичь максимального количества экзосом при минимальной контаминации препарата плазменными белками и липопротеинами.
Получение целевого продукта непосредственно из плазмы крови упрощает способ и снижает экономические затраты.
Способ иллюстрируется фигурами 1-4, где представлены характеристики выделенных везикул:
фиг.  1 - лазерная корреляционная спектроскопия осадка, разведение в 500 мкл ФСБ; фиг. 2 - нано-трековый анализ осадка, разведение в 2000 мкл ФСБ; фиг. 3 - атомная силовая микроскопия; фиг. 4 - дот-блот с антителами против CD63, где: 1 - осадок, разведенный в 500 мкл ФСБ; 2 - осадок, разведение в 200 мкл буфера RIPA, 3 - супернатант после первого центрифугирования; 4 - исходная плазма.
Оценка размера и концентрации везикул, выделенных из плазмы здоровых доноров, была проведена с помощью лазерной корреляционной спектроскопии (см. фиг. 1) и нано-трекового анализа (см. фиг. 2).
Оценка экзосомальной природы выделенных везикул и анализ содержания экзосом в супернатанте («промывочном» растворе ПЭГ) были проведены с помощью дот-блоттинга (см. фиг. 3,) и атомной силовой микроскопии (см. фиг. 4).
Способ осуществляют, например, следующим образом.
Проводят сбор периферической крови в вакутейнеры с ЕДТА и в течение 5-10 минут плазму отделяют от клеточной массы путем центрифугирования при 300 G в течение 15 минут. В 2 центрифужные пробирки объемом 2 мл добавляют по 0,0225 г декстрана М=450-650 кДа и по 0,0525 г полиэтиленгликоля М=20 кДа. В одну из проборок добавляют плазму (1,5 мл), в другую - фосфатно-солевой буфер (1,5 мл). Указанные количества декстрана и ПЭГ обеспечивают финальную концентрацию полимеров 1,5% и 3,5%, соответственно. Инкубацию проводят в течение одного часа при интенсивном перемешивании (вортекс), при температуре +4°С. Эффективность растворения контролируют визуально. Разделение полимерной смеси в пробирке с плазмой проводят путем центрифугирования при 1000 G в течение 10 минут, при температуре +4°С. Супернатант удаляют, к осадку добавляют 1,4 мл содержимого пробирки с раствором ПЭГ и декстрана в фосфатно-солевом буфере, осадок перемешивают, смесь центрифугируют при тех же условиях (1000 G в течение 10 минут, при температуре +4°С), супернатант удаляют. Осадок представляет собой смесь экзосом с декстраном с минимальным содержанием белков плазмы. Осадок может быть ре-суспендирован в фосфатно-солевом буфере для анализа физических характеристик экзосом, или лизирован в соответствующем лизис-буфере для анализа состава белков или микроРНК.
С целью оценки заявленного технического результата изобретения было проведено непосредственное сравнение эффективности ОТ-ПЦР анализа нескольких молекул микроРНК, полученной из препаратов экзосом, выделенных заявленным способом и описанными выше аналогами из 1,5 мл донорской плазмы (n.2 формулы).
Пример. Выделение экзосом плазмы и ОТ-ПЦР анализа экзосомальных микроРНК. Образцы венозной крови были получены от пяти здоровых доноров в вакутейнеры с ЕДТА. Непосредственно после получения материала образцы крови центрифугировали при 300 G в течение 15 минут при 4°С. Плазму аккуратно отделяли и переносили в новые пробирки. Для выделения экзосом заявленным способом 1,5 мл плазмы переносили в пробирку, содержавшую 0,0225 г декстрана (мол. масса 450-650 кДа) и 0,0525 г ПЭГ (мол. масса 20 кДа). Параллельно такие же количества полимеров были растворены в 1,5 мл фосфатно-солевого буфера. Растворение проводилось в течение часа, при интенсивном перемешивании (вортекс), при температуре +4°С. После полного растворения полимеров содержимое первой пробирки центрифугировали при 1000 G, 10 минут, при +4°С. Супернатант удалили, к осадку добавили 1,4 мл содержимого второй пробирки (раствор ПЭГ и декстрана в фосфатно-солевом буфере). Осадок ре-суспендировали, смесь центрифугировали при 1000 G, 10 минут, при +4°С. После удаления супернатанта, осадок содержащий экзосомы растворяли в лизис-буфере (реагент «Лира», Биолабмикс / Новосибирск). Далее проводилось выделение микроРНК с помощью колонок и реагентики в составе набора для выделения (LRU-100-50, Биолабмикс / Новосибирск) по протоколу производителя. Параллельно экзосомы были выделены из аналогичных образцов плазмы (1,5 мл) с использованием коммерческих наборов (ближайших аналогов), наиболее близких по принципу работы к заявленному способу: ExoPrep (Hansa Bio Med) и Tota lexosomes isolation kit (Invitrogen). Выделение экзосом проводилось в соответствии с протоколами производителей, микроРНК была выделена аналогичным образом с помощью реагента «Лира» и набора для выделения (LRU-100-50, Биолабмикс / Новосибирск). Во всех трех случаях элюцию РНК проводили 50 мкл буфера (ЕБ), для последующего анализа микроРНК использовали по 2 мкл раствора. С помощью ОТ-ПЦР был проведен анализ относительной концентрации трех молекул микроРНК (miR-29b-1, miR-451a и miR-375) с помощью ранее описанной технологии «two-tailed reverse transcription) [19, 20]. Все реакции были проведены в объемах 20 мкл, были использованы стандартные наборы производства компании Биолабмикс: OT-M-MuLV-RH для проведения реакции обратной транскрипции и HS-qPCRSYBR Blue (2×) для проведения ПЦР.
Последовательности праймеров для ОТ и ПЦР представлены в табл. 1.
Специфичность реакции оценивали по характеру кривой плавления конечного продукта ГЩР. Результаты представлены в табл. 2.
Таким образом, заявляемый способ позволяет выделить непосредственно из плазмы крови максимальное количество экзосом при минимальной контаминации препарата плазменными белками и липопротеинами, прост в реализации и имеет низкую стоимость. Реализация способа повышает эффективность последующего анализа экзосомальной фракции циркулирующих молекул микроРНК, например, для диагностики или мониторинга онкологических заболеваний.