СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ПТИЦ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

1. Способ культивирования зародышевых стволовых клеток (ES) птиц, включающий стадии: а) суспендирования клеток ES, происходящих от диска бластодермы оплодотворенного неинкубированного птичьего яйца (яиц) в основной культуральной среде, дополненной:
инсулиноподобным фактором роста 1 (IGF-1) и реснитчатым нейротрофическим фактором (CNTF);
животной сывороткой, и
необязательно, по меньшей мере одним фактором роста, выбранным из группы, включающей интерлейкин 6 (IL-6), рецептор интерлейкина 6 (IL-6R), фактор стволовых клеток (SCF), фактор роста фибробластов (FGF), ингибирующий лейкемию фактор (LIF), интерлейкин 11 (IL-11), онкостатин и кардиотрофин;
b) засевания суспензии клеток ES, полученных на стадии а), на слой питающих клеток и дальнейшего культивирования клеток ES в течение по меньшей мере от 2 до 10 пассажей;
c) необязательного удаления по меньшей мере одного фактора роста, выбранного из SCF, FGF, IL-6, IL-6R, LIF, онкостатина, кардиотрофина и IL-11 из культуральной среды;
d) дальнейшего культивирования клеток ES в питательной среде стадии с) на слое питающих клеток.
2. Способ культивирования зародышевых стволовых клеток (ES) птиц по п.1, включающий стадии:
a) суспендирования клеток ES, происходящих от диска бластодермы оплодотворенного неинкубированного птичьего яйца (яиц), в основной культуральной среде, дополненной инсулиноподобным фактором роста 1 (IGF-1), реснитчатым нейротрофическим фактором (CNTF), интерлейкином 6 (IL-6), рецептором интерлейкина 6 (IL-6R), фактором стволовых клеток (SCF), фактором роста фибробластов (FGF) и животной сывороткой;
b) засевания суспензии клеток ES, полученной на стадии а), на слой питающих клеток и дальнейшего культивирования клеток ES в течение по меньшей мере от 2 до 10 пассажей;
c) необязательного удаления по меньшей мере одного фактора роста, выбранного из группы, включающей SCF, FGF, IL-6 и IL-6R из культуральной среды;
d) дальнейшего культивирования клеток ES в питательной среде стадии с) на слое питающих клеток.
3. Способ культивирования зародышевых стволовых клеток (ES) птиц по п.1, включающий стадии:
a) суспендирования клеток ES, происходящих от диска бластодермы оплодотворенного неинкубированного птичьего яйца (яиц) в основной культуральной среде, дополненной инсулиноподобным фактором роста 1 (IGF-1), реснитчатым нейротрофическим фактором (CNTF), интерлейкином 6 (IL-6), рецептором интерлейкина 6 (IL-6R), фактором стволовых клеток (SCF), фактором роста фибробластов (FGF) и животной сывороткой;
b) засевания суспензии клеток ES, полученной на стадии а), на слой питающих клеток и дальнейшего культивирования клеток ES в течение по меньшей мере от 2 до 10 пассажей;
c) необязательного удаления по меньшей мере одного фактора роста, выбранного из группы, включающей SCF и FGF, из культуральной среды;
d) дальнейшего культивирования клеток ES в питательной среде стадии с) на слое питающих клеток.
4. Способ по п.1, где птица представляет собой курицу.
5. Способ по п.1, где птица представляет собой утку.
6. Способ генетической модификации птичьих зародышевых стволовых клеток, включающий стадии:
a) трансфекции клеток ES, культивируемых согласно способу по пп.1-5, вектором;
b) отбора трансфицированных клеток ES;
c) поиск и размножение отобранных клонов ES, которые являются генетически модифицированными;
d) культивирование указанной генетически модифицированной клетки ES стадии с) на слое питающих клеток в культуральной среде, содержащей животную сыворотку и по меньшей мере инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), реснитчатый нейротрофический фактор (CNTF), и необязательно по меньшей мере один из факторов роста, выбранный из группы, включающей интерлейкин 6 (IL-6), рецептор интерлейкина 6 (IL-6R), фактор стволовых клеток (SCF), фактор роста фибробластов (FGF).
7. Способ получения химерного птенца, включающий стадии:
а) введения клеток ES, культивируемых согласно способу по пп.1-5, в подзародышевую полость реципиентного птичьего эмбриона; и
b) инкубирования эмбриона, полученного на стадии а), чтобы вылупился птенец;
c) отбора указанного химерного птенца, содержащего чужеродные клетки, колонизировавшие указанного птенца.
8. Способ получения генетически модифицированного химерного птенца, включающий стадии:
a) введения генетически модифицированных клеток ES, полученных на стадии а) п.6, в подзародышевую полость реципиентного птичьего эмбриона; и
b) инкубирования эмбриона, полученного на стадии а), чтобы вылупился птенец;
c) отбора указанного химерного птенца, содержащего генетически модифицированные чужеродные клетки, колонизировавшие указанного птенца.
9. Способ по п.7 или 8, где реципиентный эмбрион получают из недавно отложенного неинкубированного яйца и который содержит от приблизительно 5000 до приблизительно 70000 клеток.
10. Способ по п.9, где указанный реципиентный эмбрион находится на стадии между стадиями VI и XII по классификации Эйял-Гилади и Кохава (Eyal-Giladi & Kochav), предпочтительно примерно на стадии Х по классификации Эйял-Гилади и Кохава.
11. Способ по п.7 или 8, где по меньшей мере 1000 клеток ES, предпочтительно по меньшей мере 15000 клеток ES вводят в подзародышевую полость реципиентного птичьего эмбриона.
12. Способ по п.7 или 8, включающий дополнительную стадию облучения реципиентного эмбриона Х- или гамма-лучами перед введением клеток ES в подзародышевую полость указанного реципиентного эмбриона.
13. Способ по п.7 или 8, где приблизительно 15000 куриных клеток ES вводят в подзародышевую полость реципиентного эмбриона курицы, предварительно облученного приблизительно 4 Грей Х-лучей.
14. Способ по п.7 или 8, где по меньшей мере 30000 куриных клеток ES вводят в подзародышевую полость необлученного реципиентного эмбриона курицы.
15. Способ по п.7 или 8, где указанный реципиентный куриный эмбрион имеет породу белый леггорн и где указанные куриные клетки ES получают от породы, выбранной из группы, состоящей из породы полосатый плимутрок, породы Маран, породы S86N.
16. Способ по п.7 или 8, где указанный реципиентный эмбрион курицы имеет породу, выбранную из группы, состоящей из породы полосатый плимутрок, породы Marans и породы S86N, и где указанные куриные клетки ES получают от породы белый леггорн.
17. Способ получения потомства химерного птенца, где указанный способ включает следующие стадии:
a) выращивания отобранного химерного птенца, полученного на стадии с) п.7 или 8, во взрослую птицу;
b) скрещивания указанной взрослой птицы, содержащей чужеродные клетки, таким образом производя потомство птицы; и
c) отбора интересующих птиц в потомстве.
18. Способ по п.17, дополнительно включающий стадию экспрессии чужеродного полипептида, кодируемого вектором, содержащимся в генетически модифицированных чужеродных клетках.
19. Способ по п.18, где чужеродный полипептид доставляется в белок развивающегося птичьего яйца, отложенного генетически модифицированной птицей.
20. Культуральная среда для птичьих зародышевых стволовых клеток, содержащая по меньшей мере инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), реснитчатый нейротрофический фактор (CNTF), и необязательно по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из интерлейкина 6 (IL-6), рецептора интерлейкина 6 (IL-6R), фактора стволовых клеток (SCF), фактора роста фибробластов (FGF), где указанная среда достаточна для поддержания указанных птичьих зародышевых стволовых клеток в культуре в течение по меньшей мере 7 дней, предпочтительно в течение по меньшей мере 100 дней.